(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
パント−化合物が産生される条件下で少なくとも１種のＢａｃｉｌｌｕｓパントテネート生合成酵素を過剰発現し、
配列番号２３に示されたＢａｃｉｌｌｕｓ由来のｐａｎＢ核酸配列に９０％以上の同一性を有するｐａｎＢ核酸配列を有する核酸分子、
配列番号２５に示されたＢａｃｉｌｌｕｓ由来のｐａｎＣ核酸配列に９０％以上の同一性を有するｐａｎＣ核酸配列を有する核酸分子、
配列番号２７に示されたＢａｃｉｌｌｕｓ由来のｐａｎＤ核酸配列に９０％以上の同一性を有するｐａｎＤ核酸配列を有する核酸分子、及び
配列番号２９に示されたＢａｃｉｌｌｕｓ由来のｐａｎＥ１核酸配列に９０％以上の同一性を有するｐａｎＥ核酸配列を有する核酸分子の過剰発現を含む微生物を培養することを含む、β−アラニン供給の必要性から独立したパント−化合物の産生法。
【請求項２】
微生物は、少なくとも１種のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓパントテネート生合成酵素を過剰発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
パントテネート生合成酵素は、ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、パントテネートシンターゼ、アスパルテート−α−デカルボキシラーゼおよびケトパントエートレダクターゼからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
微生物は、少なくとも２種のパントテネート生合成酵素を過剰発現する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
微生物は、少なくとも３種のパントテネート生合成酵素を過剰発現する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
パント−化合物は、パントテネート、パントエート、ケトパントエートおよびβ−アラニンからなる群から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ケトパントエートレダクターゼ過剰発現（ＫＰＡＲ−Ｏ）微生物を、パント−化合物が産生される条件下で培養することを含む、請求項１に記載のパント−化合物の産生法。
【請求項８】
パント−化合物は、パントテネートまたはパントエートである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ケトパントエートレダクターゼは、バクテリア由来である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
ケトパントエートレダクターゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓから得られる、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１１】
ケトパントエートレダクターゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓから得られる、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１２】
ＫＰＡＲ−Ｏ微生物はさらに、ケトパントエートレダクターゼの過剰発現に加えて、少なくとも１種のパントテネート生合成酵素を過剰発現する、請求項７から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＫＰＡＲ−Ｏ微生物はさらに、ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、パントテネートシンターゼおよびアスパルテート−α−デカルボキシラーゼの少なくとも１種を過剰発現する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
パントテネートが産生されるような条件下で、調節解除されたイソロイシン−バリン（ｉｌｖ）経路を有するアスパルテート−α−デカルボキシラーゼ過剰発現（ＡαＤ−Ｏ）微生物を培養することを含む請求項１に記載の方法を用いる、前駆体供給とは独立的な様式でのパントテネートの産生法。
【請求項１５】
パントテネートが産生されるような条件下で、アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ過剰発現（ＡαＤ−Ｏ）微生物を培養することを含む請求項１に記載の方法を用い、アスパルテート及びβ−アラニン供給、またはβ−アラニン供給とは独立的な様式で、少なくとも２ｇ／Ｌのパントテネートを産生する方法。
【請求項１６】
パントテネートが産生されるような条件下で、調節解除されたイソロイシン−バリン（ｉｌｖ）生合成経路を有する微生物を培養することを含む請求項１に記載の方法を用い、バリンまたはα−ケトイソバレレート供給とは独立的な様式で、少なくとも２ｇ／Ｌのパントテネートを産生する方法。
【請求項１７】
パントテネートが産生されるような条件下で、アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ過剰発現（ＡαＤ−Ｏ）微生物を培養することを含む請求項１に記載の方法を用い、アスパルテート及びβ−アラニン供給、またはβ−アラニン供給とは独立的な様式で、少なくとも３０ｇ／Ｌのパントテネートを産生する方法。
【請求項１８】
パントテネートが産生されるような条件下で、調節解除されたイソロイシン−バリン（ｉｌｖ）生合成経路を有する微生物を培養することを含む請求項１に記載の方法を用い、バリンまたはα−ケトイソバレレート供給とは独立的な様式で、少なくとも３０ｇ／Ｌのパントテネートを産生する方法。
【請求項１９】
β−アラニンが産生されるような条件下で、ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、ケトパントエートレダクターゼおよびパントテネートシンターゼからなる群から選択されたパントテネート生合成酵素をコードする核酸配列に変異を有する、アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ過剰発現（ＡαＤ−Ｏ）微生物を、培養することを含む請求項１に記載の方法を用いる、β−アラニンの産生法。
【請求項２０】
配列番号２３に示されたＢａｃｉｌｌｕｓ由来のｐａｎＢ核酸配列に９０％以上の同一性を有するｐａｎＢ核酸配列を有する核酸分子、
配列番号２５に示されたＢａｃｉｌｌｕｓ由来のｐａｎＣ核酸配列に９０％以上の同一性を有するｐａｎＣ核酸配列を有する核酸分子、
配列番号２７に示されたＢａｃｉｌｌｕｓ由来のｐａｎＤ核酸配列に９０％以上の同一性を有するｐａｎＤ核酸配列を有する核酸分子、及び
配列番号２９に示されたＢａｃｉｌｌｕｓ由来のｐａｎＥ１核酸配列に９０％以上の同一性を有するｐａｎＥ核酸配列を有する核酸分子の過剰発現を含む、Ｂａｃｉｌｌｕｓパントテネート生合成酵素を過剰発現する、組換え微生物。
【請求項２１】
配列番号３０に示されたアミノ酸配列に９０％以上の同一性を有するＢａｃｉｌｌｕｓケトパントエートレダクターゼをコードする単離核酸分子。
【請求項２２】
配列番号３０に示されたアミノ酸配列に９０％以上の同一性を有するＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓケトパントエートレダクターゼをコードする単離核酸分子。
【請求項２３】
配列番号３０に示されたアミノ酸配列に９０％以上の同一性を有する単離Ｂａｃｉｌｌｕｓケトパントエートレダクターゼポリペプチド。
【請求項２４】
配列番号３０に示されたアミノ酸配列に９０％以上の同一性を有する単離Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓケトパントエートレダクターゼポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】    （発明の背景）
パントテン酸またはビタミンＢ５としても知られるパントテネートは、ビタミンのＢ複合体のメンバーであり、家畜およびヒトを含む哺乳動物の栄養必要条件である（例えば、食物源から、水溶性ビタミンサプリメントとして、または食物添加物として）。細胞では、パントテネートは、主に、補酵素Ａ（ＣｏＡ）およびアシルキャリヤータンパク質（ＡＣＰ）の生合成に使用される。これらの補酵素は、これらの分子の４’−ホスホパンテテイン部分のスルフヒドリル基とチオエステルを形成する、アシル部分の代謝に機能する。これらの補酵素は、全ての細胞で必須であり、細胞代謝における１００を超える異なる中間反応に参与している。
【０００２】  パントテネート（特に、生物活性Ｄ異性体）合成の慣用的な手段は、過度の基質費用並びにラセミ中間体の光学分割の必要性により妨げられるプロセスである、原体化学物質からの化学合成を介してである（例えば、ＤＬ−パントラクトンを分割して、β−アラニンと化学的に縮合するためのＤ−パントラクトンを得る）。従って、研究者は、近年、パントテネート生合成プロセスに有用な酵素を産生する、細菌または微生物系を探索している（細菌はそれ自体、パントテネートを合成できるので）。特に、例えば、ＤＬ−パントテン酸エステルをＤ−パントテン酸に選択的に加水分解する微生物；Ｌ−パントラクトンを選択的に分解して、Ｄ−パントラクトンのみを生じる微生物、および、ＤＬ−パントラクトンをＤ−パントイン酸に選択的に加水分解する微生物を使用して、パントテン酸のＤ異性体の産生を優先する手段として生物変換プロセスが評価されている。
【０００３】  しかし、依然として、改良されたパントテネート産生プロセス、特に、基質量の減少したおよび／またはより安価な基質を必要とするプロセスが有意に必要である。この目的のために、直接的な微生物による合成法が、近年、Ｄ−パントテネート産生を向上する手段として研究されている。微生物では、パントテネート生合成は、パントエート（α−ケトイソバレレート）とβ−アラニンが縮合してＤ−パントテネートを形成する、多段階経路である。イソロイシン−バリン（ｉｌｖ）経路生合成酵素のアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ｉｌｖＢＮまたはａｌｓＳ遺伝子産物）、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ｉｌｖＣ遺伝子産物）およびジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ｉｌｖＤ遺伝子産物）は、ピルベートからα−ケトイソバレレートへの変換を触媒する。反応は、さらに、パントテネート（ｐａｎ）経路生合成酵素のケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ｐａｎＢ遺伝子産物）、ケトパントエートレダクターゼ（ｐａｎＥ遺伝子産物）、アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ（ｐａｎＤ遺伝子産物）およびパントテネートシンターゼ（ｐａｎＣ遺伝子産物）により触媒される。
【０００４】  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおけるパントテン酸の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子が近年同定および特徴づけられた（ＦｒｏｄｙｍａおよびＤｏｗｎｓ（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：５５７２〜５５７６およびＪａｃｋｏｗｓｋｉ（１９９６）６８７〜６９４項、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら（編）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ：細胞および分子生物学、第２版、Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｗａｓｈ，Ｄ．Ｃ．）。Ｅ．ｃｏｌｉでは、例えば、パントテン酸の生合成は、４つの重要な段階からなる。第一反応は、ｐａｎＢ遺伝子産物のケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼにより触媒され、Ｌ−バリン中間体のα−ケトイソバレレートを使用してケトパントエートを生成し、これを続いて、ｐａｎＥ遺伝子産物のケトパントエートレダクターゼによりパントエートに還元する。ｐａｎＤ遺伝子産物のアスパルテート−α−デカルボキシラーゼは、アスパルテートからβ−アラニンを生成する。ｐａｎＣ遺伝子産物のパントテネートシンターゼは、続いて、β−アラニンをパントエートとライゲートして、Ｄ−パントテネートを生成する。
【０００５】  筆者のＤｕｓｃｈらは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｐａｎＤ遺伝子の同定を記載し、Ｅ．ｃｏｌｉでのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｐａｎＤ遺伝子の発現は、１時間あたり１ｍｇ（乾燥重量）あたり、１４０ｎｇのパントテネートの比生産性でパントテネートを産生する株を生じることを報告した（Ｄｕｓｃｈら（１９９９）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６５：１５３０〜１５３９）。
【０００６】  筆者ＳａｈｍおよびＥｇｇｅｌｉｎｇは、さらに、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｐａｎＢおよびｐａｎＣ遺伝子を同定し、ｐａｎＢＣ遺伝子を過剰発現する遺伝子工学したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株を記載した（ＳａｈｍおよびＥｇｇｅｌｉｎｇ（１９９９）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６５：１９７３〜１９７９）。工学した株は、パントテネートを産生するが、パントテン酸の産生を検出できるように、宿主生物中でα−ケトイソバレレート産生に関与する遺伝子を過剰発現することが必要であった。さらに、β−アラニンを添加しなければ、作成した株では、美質的な量のパントテネートは全く蓄積しなかった。
【０００７】  同様に、β−アラニンの存在下で培養した場合にＤ−パントテン酸を産生する、Ｅ．ｃｏｌｉのサリチル酸ナトリウム耐性変異株を利用した、Ｄ−パントテン酸の産生法が記載されている（米国特許第５，５１８，９０６号）。サリチル酸に加えて、α−ケトイソ吉草酸および／またはα−ケト酪酸、および／またはα−アミノ酪酸、および／またはβ−ヒドロキシアスパラギン酸および／またはＯ−メチル−トレオニンに耐性なＥ．ｃｏｌｉ株の作成により、さらに、パントテン酸の産生は増加した。さらに、ｐａｎＢ、ｐａｎＣ、およびｐａｎＤ遺伝子を有するプラスミドＤＮＡのサリチル酸耐性変異株への形質転換により、パントテネート産生は増加したが、示した例では２０ｇ／Ｌのβ−アラニンまたはそれ以上を供給した。ｐａｎＢ−ｐａｎＣ−ｐａｎＤ遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体上に集合させる。
【０００８】  最後に、パントテネート生合成遺伝子含有ＤＮＡ断片および／または分枝アミノ酸生合成遺伝子含有ＤＮＡ断片で形質転換し、β−アラニンの存在下で培養した、サリチル酸耐性、α−ケトイソバレレート耐性、α−ケトブチレート耐性、β−ヒドロキシアスパルテート耐性、ｏ−メチルトレオニン耐性Ｅ．ｃｏｌｉ株を使用した、Ｄ−パントテン酸の産生法が記載されている（米国特許第５，９３２，４５７号）。
【０００９】  細菌でのパントテネート産生は、パントエートとβ−アラニンの縮合により生じ、パントテネート生合成酵素のパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ｐａｎＢ遺伝子産物）、ケトパントエートレダクターゼ（ｐａｎＥ遺伝子産物）、アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ（ｐａｎＤ遺伝子産物）およびパントテネートシンターゼ（ｐａｎＣ遺伝子産物）が関与する。パントテネートはビタミンとして生物学的に活性であるが、それは、トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクル、脂肪酸代謝および多くの他の中間体代謝反応においてアシル基キャリヤーとして参与する、補酵素Ａ（ＣｏＡ）に全細胞においてさらに代謝される。パントテネートから補酵素Ａ（ＣｏＡ）の変換における最初の（おそらく律速）段階は、パントテネートキナーゼによるパントテネートのリン酸化である。パントテネートキナーゼ活性は、許容的な温度ではＣｏＡを合成するが、非許容的な温度ではパントテネートを分泌する、温度感受性変異体についてスクリーニングすることにより、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍで初めて同定された。変異は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ染色体にマッピングされ、遺伝子座はｃｏａＡと称した。この遺伝子は、パントテネートから補酵素Ａの生合成における第一段階を触媒する酵素をコードする（ＤｕｎｎおよびＳｎｅｌｌ（１９７９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４０：８０５〜８０８）。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ温度感受性変異体も同定および特徴づけられている（ＶａｌｌａｒｉおよびＲｏｃｋ（１９８７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５７９５〜５８００）。これらの変異体（ｃｏａＡ１５（Ｔｓ）と命名）は、パントテネートからＣｏＡの変換に欠陥があり、さらに、温度感受性増殖表現型を示し、これは、パントテネートキナーゼ活性が増殖に必須であることを示す。さらに、ＣｏＡは、変異体において、パントテネートキナーゼ活性を、野生型酵素と比べて同程度阻害することが認められた。
【００１０】  ＣｏＡによるフィードバック阻害を受けにくい、パントテネートキナーゼ活性を有する、フィードバック耐性Ｅ．ｃｏｌｉ変異体（ｃｏａＡ１６（Ｆｒ）と命名）も単離された（ＶａｌｌａｒｉおよびＪａｃｋｏｗｓｋｉ（１９８８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：３９６１〜３９６６）。復帰に関与する変異は、驚くべきことに、形質導入によりｃｏａＡ遺伝子に遺伝的に連関していない。ここに記載されたさらなるデータにより、全細胞ＣｏＡ含量は、パントテネートキナーゼ段階での生合成の変調、および、おそらくＣｏＡの４’−ホスホパンテテインへの分解の両方により制御されるという見解が支持される。
【００１１】  野生型Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｏａＡ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ温度感受性変異体の機能的補完によりクローニングした。野生型遺伝子の配列を決定した（ＳｏｎｇおよびＪａｃｋｏｗｓｋｉ（１９９２）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：６４１１〜６４１７およひＦｌａｍｍら（１９８８）Ｇｅｎｅ（Ａｍｓｔ．）７４：５５５〜５５８）。ｃｏａＡ遺伝子の複数のコピーを含む株は、７６倍高いパントテネートキナーゼの比活性を有するが、ＣｏＡの定常状態レベルは僅か２．７倍の増加していた（ＳｏｎｇおよびＪａｃｋｏｗｓｋｉ、上記）。原核酵素（Ｅ．ｃｏｌｉおよび多種多様の他の微生物でｃｏａＡによりコードされる）は、インビボおよびインビトロの両方でＣｏＡによりフィードバック阻害され、ＣｏＡは、酵素阻害において、アセチル−ＣｏＡよりも約５倍強力であるとさらに報告された（ＳｏｎｇおよびＪａｃｋｏｗｓｋｉ、上記およびＶａｌｌａｒｉら、上記）。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｐａｎＢ遺伝子産物は、ＣｏＡにより阻害されると報告された（ＰｏｗｅｒｓおよびＳｎｅｌｌ（１９７６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１：３７８６〜３７９３）。これらのデータにより、さらに、パントテネートキナーゼ活性のフィードバック阻害は、細胞内ＣｏＡ濃度を制御する重要な因子であるという見解が支持される。
【００１２】  標準的な探索およびアラインメントツールを使用して、ｃｏａＡ相同体が、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて同定された。対照的に、有意な類似性を有するタンパク質は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含む真核細胞、または、哺乳動物発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースにおいて同定できなかった。遺伝子選択戦略を使用して、パントテネートキナーゼ活性をコードするｃＤＮＡが近年、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓから同定された（Ｃａｌｄｅｒら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２０１４〜２０２０）。真核パントテネートキナーゼ遺伝子（ｐａｎＫ）は、その原核対応物とは明瞭に区別される、別個の一次構造および独特な調節特性を有する。Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ  ＰａｎＫタンパク質、および、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムで同定されたＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号９２７７９８の予測遺伝子産物に相同性を有するタンパク質をコードする、哺乳動物パントテネートキナーゼ遺伝子（ｍｐａｎＫｌα）も単離された（Ｒｏｃｋら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１３７７〜１３８３）。
【００１３】
（発明の要約）
本発明は、少なくとも一部には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのパントテネート生合成経路の重要な酵素をコードする遺伝子の発見に基づく。特に、本発明らは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのｐａｎＥ遺伝子を同定した。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおけるｐａｎＥ遺伝子の過剰発現または調節解除により、ｐａｎＥ遺伝子産物であるケトパントエートレダクターゼの産生は増強し、さらに、パントテネートの産生は増加する。同様に、この遺伝子の変異により、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおけるパントテネートの産生は＞９０％減少する。本発明者らは、さらに、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおける推定ｐａｎＢＣＤオペロンを同定し、その過剰発現または調節解除により、パントテネート産生は増加する。本発明らは、さらに、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおけるｐａｎＤ遺伝子の過剰発現または調節解除により（ｐａｎＤ遺伝子産物であるアスパルテート−α−デカルボキシラーゼの産生は増強する）、さらに、特に、イソロイシン−バリン（ｉｌｖ）生合成経路の重要な酵素をコードする遺伝子の調節解除と組合せると、パントテネートの産生を増加することを実証した。
なお、明細書において、特許請求の範囲に記載された構成以外の記載は参考例である。
【００１４】  従って、本発明は、パントテネートまたは他の所望のパント−化合物が産生されるように、パントテネート生合成経路および／またはイソロイシン−バリン生合成経路が操作されている微生物を使用して、パントテネート、並びに、本明細書で「パント−化合物」と称するパントテネート生合成経路の他の化合物（例えば、ケトパントエート、パントエートおよびβ−アラニン）を産生する方法を特徴とする。１つの実施形態において、本発明は、パント−化合物（例えばパントテネートまたはパントエート）が産生されるような条件下で、ｐａｎＥ遺伝子産物であるケトパントエートレダクターゼを過剰発現する微生物（本明細書では、ケトパントエートレダクターゼ過剰発現すなわち「KＰＡＲ−Ｏ」微生物とも称する）を培養することを含む、パント−化合物（例えばパントテネートまたはパントエート）を産生する方法を特徴とする。別の実施形態において、本発明は、パント−化合物（例えばパントテネートまたはパントエート）が産生されるような条件下で、好ましくはＫＰＡＲ−Ｏ微生物で、少なくとも１つのパントテネート生合成酵素（例えば、ｐａｎＢ、ｐａｎＣまたはｐａｎＤ遺伝子産物の少なくとも１つ）を過剰発現する微生物を培養することを含む、パント−化合物（例えばパントテネートまたはパントエート）を産生する方法を特徴とする。
【００１５】  本発明のさらに別の態様は、前駆体（例えばβ−アラニンまたはアスパルテートおよび／またはα−ケトイソバレレートまたはバリン）を供給する必要性から独立した、パント−化合物の産生法を特徴とする。１つの実施形態において、本発明は、パントテネートが産生されるような条件下で、調節解除されたイソロイシン−バリン（ｉｌｖ）経路を有するアスパルテート−α−デカルボキシラーゼ過剰発現（ＡαＤ−Ｏ）微生物を培養することを含む、前駆体供給とは独立した様式でパントテネートを産生する方法を特徴とする。別の実施形態において、本発明は、パントテネートが産生されるような条件下で、調節解除されたパントテネート（ｐａｎ）経路および調節解除されたイソロイシン−バリン（ｉｌｖ）経路を有するＡαＤ−Ｏ微生物を培養することを含む、前駆体供給とは独立した様式でパントテネートを産生する方法を特徴とする。別の実施形態において、本発明は、パントテネートが産生されるような条件下で、ＡαＤ−Ｏ微生物を培養することを含む、アスパルテートまたはβ−アラニン供給とは独立した様式でパントテネートを産生する方法を特徴とする。別の実施形態において、本発明は、パントテネートが産生されるような条件下で、調節解除されたイソロイシン−バリン（ｉｌｖ）生合成経路を有する微生物を培養することを含む、バリンまたはα−ケトイソバレレート供給とは独立した様式でパントテネートを産生する方法を特徴とする。さらに別の実施形態において、本発明は、パントテネートが有意に高い収率で（例えば１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌまたは４０ｇ／Ｌより高いレベルで）産生されるような条件下で、操作した微生物を培養することを含む、パントテネートを産生する高収率な産生法を特徴とする。
【００１６】  本発明の方法は、さらに、アセトヒドロキシ酸シンターゼまたはアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼを過剰発現する微生物（例えば、ｉｌｖＢＮＣ核酸配列を含むベクターで形質転換した微生物）、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼを過剰発現する微生物（例えば、ｉｌｖＤ核酸配列を含むベクターで形質転換した微生物）、アスパルテート−α−デカルボキシラーゼを過剰発現する微生物（ｐａｎＤ核酸配列を含むベクターで形質転換した微生物）、調節解除されたイソロイシン−バリン（ｉｌｖ）生合成経路を有する微生物および調節解除されたパントテネート生合成経路を有する微生物（例えば、ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、ケトパントエートレダクターゼ、パントテネートシンターゼおよびアスパルテート−α−デカルボキシラーゼのいずれかを過剰発現する微生物、例えば、ｐａｎＢＣＤ核酸配列を含むベクターまたはｐａｎＥ１核酸配列を含むベクターで形質転換した微生物）を特徴とする。１つの実施形態において、組換え微生物はグラム陽性（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｏｒｎｙｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、ＬａｃｔｏｃｏｃｃｉまたはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する微生物）である。別の実施形態において、組換え微生物はグラム陰性である。特に好ましいのは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ組換え微生物（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ等）である。Ｂａｃｉｌｌｕｓパントテネートおよび／またはイソロイシン−バリン生合成酵素（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓパントテネートおよび／またはイソロイシン−バリン生合成酵素）をコードする遺伝子を含む組換えベクターも記載する。
【００１７】  また、β−アラニンが産生されるような条件下でアスパルテート−α−デカルボキシラーゼ過剰発現（ＡαＤ−Ｏ）微生物を培養することを含む、β−アラニンの産生法、および、β−アラニンが産生されるような条件下で、アスパルテートを含む組成物を、単離Ｂａｃｉｌｌｕｓアスパルテート−α−デカルボキシラーゼ酵素と接触させることを含むβ−アラニンの産生法も特徴とする。
【００１８】  本発明の産生法は、さらに、パント−化合物（例えばパントテネートまたはパントエート）を回収することを含み得る。
【００１９】  本発明はさらに、組換え微生物（例えば、ＡαＤ−Ｏ微生物、調節解除されたイソロイシン−バリン（ｉｌｖ）経路を有する微生物、ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ｐａｎＥ遺伝子産物）、パントテネートシンターゼ（ｐａｎＣ遺伝子産物）、アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ（ｐａｎＤ遺伝子産物）、ケトパントエートレダクターゼ（ｐａｎＥ１遺伝子産物）の少なくとも１つを過剰発現する微生物、および、調節解除されたｐａｎＢＣＤオペロンを有する微生物を特徴とする。また、ｐａｎＢ、ｐａｎＣ、ｐａｎＤ、ｐａｎＥ、ｉｌｖＢ、ｉｌｖＮ、ａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、および／またはｉｌｖＤ核酸分子、並びに、前記核酸分子を含むベクターおよび前記核酸分子によりコードされる遺伝子産物も特徴とする。
【００２０】  本発明の方法論は、さらに、例えば、少なくとも１つのパントテネート生合成経路を過剰発現することに加えて、第二のパントテネート生合成酵素を欠失または変異することを含み、前記の第二のパントテネート生合成酵素は、好ましくは、パントテネート生合成経路の所望の産物の下流にある。例えば、ｐａｎＥ遺伝子産物を過剰発現することに加えて、ｐａｎＣの変異により、パントエートの産生のさらなる増強または増加が生じる。従って、１つの実施形態において、本発明は、ｐａｎＥ遺伝子産物を過剰発現し、ｐａｎＣ遺伝子に欠失を有する、微生物を培養することを含む、パントエートの産生法を特徴とする。別の実施形態において、本発明は、ｐａｎＥ遺伝子産物および／またはｐａｎＣ遺伝子産物を過剰発現し、ｐａｎＣ遺伝子に欠失を有する、微生物を培養することを含む、パントエートの産生法を特徴とする。他の例示的な実施形態は、ｐａｎＢ遺伝子産物を過剰発現し、ｐａｎＥ遺伝子に欠失を有する、微生物を培養することを含むケトパントエートの産生法、並びに、ｐａｎＤ遺伝子産物を過剰発現し、ｐａｎＣ遺伝子に欠失を有する微生物を培養することを含むケトパントエートの産生法を含む。また、少なくとも１つのパントテネート生合成酵素の欠失した微生物において、少なくとも１つのバリン生合成酵素を過剰発現することを含む、パント−化合物の産生法も含む。
【００２１】  本発明はまた、少なくとも一部には、以前に未同定の微生物パントテネートキナーゼ遺伝子ｃｏａＸの同定および特徴づけに基づく。ＣｏａＸは、最初に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓで同定され、ｆｔｓＨ遺伝子の５’末端、およびｙａｃＢ、ｙａｃＣ、ｙａｃＤ、ｃｙｓＫおよびｐａｂＢ遺伝子の全部を含む、染色体ＤＮＡの一部のオープンリーディングフレームに対応する。本発明らは、ｙａｃＢオープンリーディングフレームは、新規パントテネートキナーゼ活性をコードし、前記遺伝子は、全ての以前に既知のパントテネートキナーゼ遺伝子への相同性に関連していないことを実証した。前記遺伝子は、パントテネートからＣｏａＡへの経路の第一段階を触媒する酵素をコードするので、ｃｏａＸと再度命名された。
【００２２】  従って、本発明は、パントテネートキナーゼ活性の修飾された微生物を利用して、パントテネートおよびパントテネート生合成経路の他の重要な化合物（例えばパント−化合物）を産生する新規かつ改良された方法を特徴とする。特に、本発明は、パントテネートキナーゼ活性の減少した、ｃｏａＸ遺伝子を含む、または、変異ｃｏａＸ遺伝子を含む、組換え微生物を特徴とする。１つの実施形態において、本発明は、調節解除されたパントテネート生合成経路をさらに有する、前記組換え微生物を特徴とする。別の実施形態において、本発明は、調節解除されたイソロイシン−バリン（ｉｌｖ）経路をさらに有する、前記組換え微生物を特徴とする。好ましい実施形態において、微生物はＢａｃｉｌｌｕｓ（例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）属に属する。
【００２３】  本発明はまた、パントテネートキナーゼ活性の減少した、所望によりｃｏａＸ遺伝子またはその変異体を含む、ｃｏａＡ遺伝子を含む、または、変異ｃｏａＡ遺伝子を含む、組換え微生物（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに属する微生物）を特徴とする。１つの実施形態において、本発明は、調節解除されたパントテネート生合成経路を有する、または、調節解除されたイソロイシン−バリン（ｉｌｖ）経路をさらに有する前記組換え微生物を特徴とする。
【００２４】  また、単離ｃｏａＸまたはｃｏａＡ遺伝子、並びに、変異ｃｏａＸおよび／またはｃｏａＡ遺伝子を含むベクターも特徴とする。単離ＣｏａＸタンパク質および変異ＣｏａＸタンパク質に加えて、単離ｃｏａＸ遺伝子または変異ｃｏａＸ遺伝子を含む、単離核酸分子も特徴とする。
【００２５】  上記の核酸、ベクターおよび組換え微生物は、特に、本発明の方法論に有用である。特に、本発明は、パント−化合物の産生が増強するような条件下で、変異ｃｏａＸ遺伝子を有する組換え微生物を培養することを含む、パント−化合物の産生（例えば、ケトパントエート、パントエートおよびまたはパントテネートの産生）を増強する方法を特徴とする。１つの実施形態において、組換え微生物はさらに、変異ｃｏａＡ遺伝子を含む。別の実施形態において、組換え微生物はさらに、変異ａｖｔＡおよび／または変異ｉｌｖＥ遺伝子および／または変異ａｎｓＢ遺伝子および／または変異ａｌｓＤ遺伝子を含む。また、本発明の組換え微生物および精製ＣｏａＸタンパク質を利用して、パントテネートモジュレーターを同定する方法も特徴とする。
【００２６】  本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【００２７】    （発明の詳細な説明）
本発明は、パントテネートまたは他の所望のパント−化合物が産生されるように、パントテネート生合成経路を操作した微生物を使用して、パントテネート、および、パントテネート生合成経路の他の重要な化合物（本明細書では、「パント−化合物」、例えば、パントテネート、ケトパントエート、パントエートおよびβ−アラニンと称する）を産生する新規かつ改良された方法を特徴とする。
【００２８】  本発明の新規かつ改良された方法論は、パントテネートまたは他の所望のパント−化合物が産生（例えばより高いレベルで産生）するように操作したパントテネート生合成経路の少なくとも１つの酵素を有する微生物において、パント−化合物（例えばパントテネート）を産生する方法を含む。例えば、本発明は、パントテネートまたは他の所望のパント−化合物が産生されるように操作した、ケトパントエート、ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、ケトパントエートレダクターゼ、パントテネートシンターゼまたはアスパルテート−α−デカルボキシラーゼの少なくとも１つを有する微生物において、パント−化合物（例えばパントテネート）を産生する方法を特徴とする。本発明の方法論はまた、パントテネートまたは他の所望のパント−化合物が産生するように操作した、本明細書に記載の少なくとも１つのバリン−イソロイシン生合成酵素を有する微生物において、パント−化合物（例えばパントテネート）を産生する方法も含む。例えば、本発明は、パントテネートまたは他の所望のパント−化合物が産生されるように操作した、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼまたはジヒドロキシ酸デヒドラターゼの少なくとも１つを有する微生物において、パント−化合物（例えばパントテネート）を産生する方法を特徴とする。
【００２９】  本発明はまた、パント−化合物が産生されるような条件下で、ケトパントエートレダクターゼ過剰発現（ＫＰＡＲ−Ｏ）微生物を培養することを含む、パント−化合物を産生する方法を特徴とする。本発明はまた、パントテネートが産生されるような条件下で、アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ過剰発現（ＡαＤ−Ｏ）微生物を培養することを含む、前駆体供給とは独立した様式でパントテネートを産生する方法を特徴とする。また、β−アラニン独立的な高収率なパントテネート産生法、並びに、β−アラニン産生法も特徴とする。本発明はまた、パントテネートキナーゼ変異体を培養することを含む、パント−化合物の産生を増強する方法を特徴とする。特に、本発明は、パントテネートキナーゼ活性の修飾された微生物、例えば、パントテネートキナーゼ活性の減少した、ｃｏａＸ遺伝子を含む、または、変異ｃｏａＸ遺伝子を含む微生物を利用して、パントテネート、および、パントテネート生合成経路の他の重要な化合物（例えばパント−化合物）を産生する新規かつ改良された方法を特徴とする。
【００３０】  本発明をより容易に理解できるように、特定の用語を、最初に本明細書で定義する。
【００３１】  「パントテネート生合成経路」なる語は、パントテネートの形成または合成に利用される、パントテネート生合成酵素（例えば、生合成酵素をコードする遺伝子によりコードされるポリペプチド）、化合物（例えば、前駆体、基質、中間体または産物）、補因子等を含む、生合成経路を含む。「パントテネート生合成経路」なる語は、微生物（例えばインビボ）においてパントテネートの合成に至る生合成経路、並びに、インビトロでのパントテネートの合成に至る生合成経路を含む。図１は、パントテネート生合成経路の図解を含む。パントテネート生合成酵素を太字で示し、その対応する遺伝子をイタリック体で示す。
【００３２】  「パントテネート生合成酵素」なる語は、パントテネート生合成経路の化合物（例えば中間体または産物）の形成に利用される任意の酵素を含む。図１によると、α−ケトイソバレレート（α−ＫＩＶ）からのパントエートの合成は、中間体であるケトパントエートを介して進行する。ケトパントエートの形成は、パントテネート生合成酵素のケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ｐａｎＢ遺伝子産物）により触媒される。パントエートの形成は、パントテネート生合成酵素ケトパントエートレダクターゼ（ｐａｎＥ遺伝子産物）により触媒される。アスパルテートからのβ−アラニンの合成は、パントテネート生合成酵素のアスパルテート−α−デカルボキシラーゼ（ｐａｎＤ遺伝子産物）により触媒される。パントエートとβ−アラニンからの（例えば縮合）パントテネートの形成は、パントテネート生合成酵素のパントテネートシンターゼ（ｐａｎＣ遺伝子産物）により触媒される。
【００３３】  「イソロイシン−バリン生合成経路」なる語は、ピルベートからバリンまたはイソロイシンの変換の形成または合成に利用される、イソロイシン−バリン生合成酵素（例えば生合成酵素をコードする遺伝子によりコードされるポリペプチド）、化合物（例えば前駆体、基質、中間体または産物）、補因子等の関与する、生合成経路を含む。「イソロイシン−バリン生合成経路」なる語は、微生物において（例えばインビボで）バリンまたはイソロイシンの合成に至る生合成経路、並びに、インビトロでバリンまたはイソロイシンの合成に至る生合成経路を含む。図１は、イソロイシン−バリン生合成経路の図解を含む。イソロイシン−バリン生合成酵素を太字のイタリック体で示し、その対応する遺伝子をイタリック体で示す。
【００３４】  「イソロイシン−バリン生合成酵素」なる語は、イソロイシン−バリン生合成経路の化合物（例えば中間体または産物）の形成に利用される任意の酵素を含む。図１によると、ピルベートからのバリンの合成は、中間体であるアセトラクトン、α，β−ジヒドロキシイソバレレート（α，β−ＤＨＩＶ）およびα−ケトイソバレレート（α−ＫＩＶ）を介して進行する。ピルベートからのアセトラクトンの形成は、イソロイシン−バリン生合成酵素のアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ｉｌｖＢＮ遺伝子産物、または別に、ａｌｓＳ遺伝子産物）により触媒される。アセトラクトンからのα，β−ＤＨＩＶの形成は、イソロイシン−バリン生合成酵素アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ｉｌｖＣ遺伝子産物）により触媒される。α，β−ＤＨＩＶからのα−ＫＩＶの合成は、イソロイシン−バリン生合成酵素のジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ｉｌｖＤ位産物）により触媒される。さらに、バリンおよびイソロイシンは、分枝鎖アミノ酸トランスアミナーゼにより相互変換し得る。
【００３５】  本明細書に使用したような、ケトパントエート、パントエート、β−アラニンおよびパントテネートの各々は、「パント−化合物」である。「パント−化合物」なる語は、特定のパントテネート生合成酵素の下流である、パントテネート生合成経路の化合物（例えば基質、中間体または産物）を含む。一例において、パント−化合物は、パントテネート生合成酵素のケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ｐａｎＢ遺伝子産物）の下流にあり、ケトパントエート、パントエートおよび／またはパントテネートを含み得る。別の例において、パント−化合物は、パントテネート生合成酵素ケトパントエートレダクターゼ（ｐａｎＥ遺伝子産物）の下流にあり、パントエートおよび／またはパントテネートを含み得る。さらに別の例において、パント−化合物は、パントテネート生合成酵素のパントテネートシンターゼ（ｐａｎＣ遺伝子産物）の下流にあり、パントテネートを含み得る。さらに別の例において、パント−化合物は、パントテネート生合成酵素のアスパルテート−α−デカルボキシラーゼ（ｐａｎＤ遺伝子産物）の下流にあり、β−アラニンおよび／またはパントテネートを含み得る。
【００３６】  好ましいパント−化合物は、パントテネートおよびパントエートを含む。「パントテネート」なる語は、遊離酸形のパントテネート（「パントテン酸」とも称される）、並びに、その任意の塩（例えば、パントテネートまたはパントテン酸の酸性水素を、カチオン、例えばカルシウム、ナトリウム、カリウム、アンモニウムで置換することにより得られる）（「パントテン酸塩」とも称する）を含む。「パント−化合物」はまた、パントテネートのアルコール誘導体も含む。好ましいパントテン酸塩は、パントテン酸カルシウムまたはパントテン酸ナトリウムである。好ましいアルコール誘導体はパントテノールである。本発明のパントテネート塩および／またはアルコールは、本明細書に記載の遊離酸から慣用的な方法を介して調製した塩および／またはアルコールを含む。別の実施形態において、パントテン酸カルシウムは、本発明の微生物により直接合成される。本発明のパントテネン酸塩は、同様に、慣用的な方法論により、パントテネートの遊離酸形またはパントテン酸に変換できる。
【００３７】  「パントエート」なる語は、パントエートの遊離酸形（「パントイン酸」とも称する）、並びに、任意のその塩（例えば、パントエートまたはパントイン酸の酸性水素をカチオン、例えば、カルシウム、ナトリウム、カリウム、アンモニウムで置換することにより得られる）（「パントイン酸塩」とも称する）を含む。好ましいパントイン酸塩は、パントイン酸カルシウムまたはパントイン酸ナトリウムである。本発明のパントイン酸塩は、本明細書に記載の遊離酸から慣用的な方法を介して調製する塩を含む。本発明のパントイン酸塩は、同様に、慣用的な方法論により、パントエートの遊離酸形またはパントイン酸に変換できる。さらに、パントエートの遊離酸形またはパントイン酸は、慣用的な方法論によりパントラクトンに変換できる。
【００３８】  「ＣｏＡ生合成経路」なる語は、パントテネートからのＣｏＡの形成または合成に利用される、ＣｏＡ生合成酵素（例えば、生合成酵素のコードする遺伝子によりコードされるポリペプチド）、化合物（例えば、前駆体、基質、中間体または産物）、補因子等の関与する、生合成経路を含む。Ｅ．ｃｏｌｉでのＣｏＡ生合成経路の図解を図１６として示す（示した経路はまた、他の微生物にも利用されるものとする）。「ＣｏＡ生合成経路」なる語は、微生物（例えばインビボ）においてＣｏＡの合成に至る生合成経路、並びに、インビトロでＣｏＡの合成に至る生合成経路を含む。「補酵素ＡまたはＣｏＡ生合成酵素」なる語は、ＣｏＡ生合成経路の化合物（例えば中間体または産物）の形成に利用される任意の酵素、例えば、パントテネートのリン酸化を触媒して４’−ホスホパントテネートを形成するｃｏａＡ、ｐａｎＫまたはｃｏａＸ遺伝子産物、または、４’−ホスホパンテテインのデホスホ補酵素Ａへの変換を触媒するｃｏａＤ遺伝子産物を含む。
【００３９】  Ｉ．組換え微生物、および、パント−化合物が産生されるように微生物を培養する方法
本発明の方法論は、好ましくは本明細書に記載したおよび／または所望の産物（例えばパント−化合物またはパント−化合物群）の産生する様式で培養した、ベクターまたは遺伝子（例えば野生型および／または変異遺伝子）を含む、微生物、例えば組換え微生物を特徴とする。「組換え」微生物なる語は、それが由来する天然微生物と比べて、変化、修飾または異なる遺伝子型および／または表現型を示すように（例えば、遺伝子修飾が、微生物のコード核酸配列に影響を及ぼす場合）、遺伝子的に変化、修飾または工学（例えば遺伝子工学）した、微生物（例えば細菌、酵母細胞、真菌細胞等）を含む。好ましくは、本発明の「組換え」微生物は、本明細書に記載の少なくとも１つの細菌遺伝子または遺伝子産物（例えばパントテネートまたはイソロイシン−バリン生合成酵素コード遺伝子）、好ましくは本明細書に記載のような組換えベクター内に含まれる生合成酵素コード遺伝子、および／または組換えベクターから発現される生合成酵素を過剰発現するように遺伝子工学されている。当業者は、遺伝子産物を発現または過剰発現する微生物は、核酸配列および／または遺伝子産物をコードする遺伝子の発現または過剰発現の結果として、遺伝子産物を産生または過剰産生することを理解するだろう。
【００４０】  「操作した微生物」なる語は、微生物が、パントテネートまたは他の所望のパント−化合物が産生されるように修飾した、パントテネート生合成経路の少なくとも１つの酵素および／またはイソロイシン−バリン生合成経路の少なくとも１つの酵素を有するように、工学（例えば遺伝子工学）または修飾された微生物を含む。前記微生物の修飾または工学は、生合成経路の調節解除および／または少なくとも１つの生合成酵素の過剰発現を含むがこれに限定されない、本明細書に記載の任意の方法論に従い得る。「操作した」酵素（例えば「操作した」生合成酵素）は、例えば、対応する野生型または天然酵素と比べて、酵素の少なくとも１つの上流または下流前駆体、基質または産物が変化または修飾されるように発現または産生が変化または修飾されている、酵素を含む。
【００４１】  「過剰発現された」または「過剰発現」なる語は、微生物の操作前または操作していない相当する微生物において発現されるよりも高いレベルでの、遺伝子産物（例えば、パントテネート生合成酵素またはイソロイシン−バリン生合成酵素）の発現を含む。１つの実施形態において、微生物を、遺伝子操作（例えば遺伝子工学）して、微生物の操作前または操作していない相当する微生物において発現されるよりも高いレベルの遺伝子産物を過剰発現することができる。遺伝子操作は、特定の遺伝子の発現に関連した調節配列または部位を変化または修飾すること（例えば、強力なプロモーター、誘導性プロモーターまたは複数のプロモーターの添加により、または、発現が構成性となるように調節配列を除去することによる）、特定の遺伝子の染色体座を修飾すること、リボソーム結合部位または転写終結因子などの特定の遺伝子に隣接する核酸配列を変化させること、特定の遺伝子のコピー数を増加すること、特定の遺伝子の転写および／または特定の遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質（例えば、調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写アクチベーター等）を修飾すること、または当分野で慣用的な特定の遺伝子の発現の調節解除の任意の他の慣用的な手段（例えば、リプレッサータンパク質の発現を遮断するための、アンチセンス核酸分子の使用を含むがこれに限定されない）を含むがこれに限定されない。
【００４２】  別の実施形態において、微生物を、物理的または環境的に操作して、微生物の操作前または操作していない相当する微生物において発現されるよりも高いレベルの遺伝子産物を過剰発現することができる。例えば、微生物は、転写および／または翻訳が増強または増加するように特定の遺伝子の転写および／または特定の遺伝子産物の翻訳を増加することが知られるまたは疑われる物質で処理するか、またはその存在下で培養できる。別法として、微生物は、転写および／または翻訳が増強または増加するように、特定の遺伝子の転写および／または特定の遺伝子産物の翻訳が増加するように選択した温度で培養できる。
【００４３】  「調節解除された」または「調節解除」なる語は、微生物の生合成酵素のレベルまたは活性が変化または修飾されるように、生合成経路の酵素をコードする、微生物の少なくとも１つの遺伝子の変化または修飾を含む。好ましくは、生合成経路の酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子を、遺伝子産物が増強または増加するように変化または修飾する。「調節解除された経路」なる語はまた、生合成経路の酵素をコードする１つより多い遺伝子が、１つより多くの生合成酵素のレベルまたは活性が変化または修飾されるように変化または修飾された、生合成経路を含むことができる。微生物において経路を「調節解除」する（例えば、ある生合成経路の１つより多くの遺伝子を同時に調節解除する）能力は、１つより多くの酵素（例えば２または３個の生合成酵素）が、「オペロン」と称される遺伝子物質の連続片上に互いに隣接して存在する遺伝子によりコードされる、微生物の特定の現象から生じる。
【００４４】  「オペロン」なる語は、１つ以上、好ましくは少なくとも２つの構造遺伝子（例えば、酵素、例えば生合成酵素をコードする遺伝子）に関連したプロモーターおよびおそらく調節エレメントを含む、協調された遺伝子発現単位を含む。構造遺伝子の発現は、例えば、調節エレメントへの調節タンパク質の結合により、または、転写の抗終止により、協調的に調節できる。構造遺伝子を転写して、全構造タンパク質をコードする単一のｍＲＮＡを与えることができる。オペロンに含まれる遺伝子の協調調節に因り、単一のプロモーターおよび／または調節エレメントの変化または修飾により、オペロンによりコードされる各遺伝子産物の変化または修飾が可能となる。調節エレメントの変化または修飾は、内因性プロモーターおよび／または調節エレメント（群）の除去、強力なプロモーター、誘導性プロモーターまたは複数のプロモーターの添加、または遺伝子産物の発現が修飾されるような調節配列の除去、オペロンの染色体座の修飾、リボソーム結合部位などのオペロンに隣接したまたはオペロン内の核酸配列の変化、オペロンのコピー数の増加、オペロンの転写および／またはオペロンの遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質（例えば、調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写アクチベーター等）の修飾、または、当分野で慣用的な遺伝子の発現の調節解除の任意の他の慣用的な手段（リプレッサータンパク質の発現を遮断するための、アンチセンス核酸分子の使用を含むがこれに限定されない）を含み得るがこれに限定されない。調節解除はまた、１つ以上の遺伝子をのコード領域を変化させ、例えば、フィードバック耐性であるか、または、より高いまたは低い比活性を有する酵素を生じることができる。
【００４５】  本発明の特に好ましい「組換え」微生物を、遺伝子工学し、細菌由来遺伝子または遺伝子産物を過剰発現できる。「細菌由来」または例えば細菌「から得られた」なる語は、細菌に天然に見られる遺伝子または細菌遺伝子（例えばｐａｎＢ、ｐａｎＥ、ｐａｎＣ、ｐａｎＤ、ｉｌｖＢ、ｉｌｖＮ、ａｌｓＳ、ｉｌｖＣまたはｉｌｖＤ）によりコードされる遺伝子産物（例えば、ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、ケトパントエートレダクターゼ、パントテネートシンターゼ、アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼまたはジヒドロキシ酸デヒドラターゼ）を含む。
【００４６】  本発明の方法論は、ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、ケトパントエートレダクターゼ、パントテネートシンターゼまたはアスパルテート−α−デカルボキシラーゼの少なくとも１つを過剰発現する、組換え微生物を特徴とする。本発明の特に好ましい組換え微生物を遺伝子工学して、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ等）、生合成酵素（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓケトパントエートレダクターゼ（ｐａｎＥ遺伝子産物）（ケトパントエートレダクターゼは、配列番号３０のアミノ酸配列を有するか、または、配列番号２９の核酸配列によりコードされている））、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ｐａｎＢ遺伝子産物）（例えばケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼは、配列番号２４のアミノ酸配列を有するか、または配列番号２３のヌクレオチド配列を有する核酸配列によりコードされている）、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓパントテネートシンターゼ（ｐａｎＣ遺伝子産物）（例えば、パントテネートシンターゼは、配列番号２６のアミノ酸配列を有するか、または、配列番号２５のヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされている）および／またはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓアスパルテート−α−デカルボキシラーゼ（ｐａｎＤ遺伝子産物）（例えばアスパルテート−α−デカルボキシラーゼは、配列番号２８のアミノ酸配列を有するか、または、配列番号２７のヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされている）の少なくとも１つを過剰発現するように工学されている。
【００４７】  例示的実施形態において、本発明は、ｐａｎＥ核酸配列（例えば配列番号２９に示したｐａｎＥ核酸配列）を含むベクターで形質転換しておいた微生物（例えばＫＰＡＲ−Ｏ微生物）を特徴とする。別の実施形態において、本発明は、ｐａｎＢ核酸配列（例えば配列番号２３に示したｐａｎＢ核酸配列）を含むベクター、ｐａｎＣ核酸配列（配列番号２５に示したｐａｎＣ核酸配列）を含むベクター、または、ｐａｎＤ核酸配列（例えば、配列番号２７に示したｐａｎＤ核酸配列）を含むベクターで形質転換した微生物を特徴とする。さらに別の実施形態において、本発明は、調節解除されたｐａｎＢＣＤ（例えば配列番号５９）を有する微生物を特徴とする。
【００４８】  本発明の他の好ましい「組換え」微生物は、調節解除されたイソロイシン−バリン（ｉｌｖ）経路を有する。「調節解除されたイソロイシン−バリン（ｉｌｖ）経路を有する微生物」なる語は、イソロイシン−バリン（ｉｌｖ）経路の酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の変化または修飾を有する、または、イソロイシン−バリン（ｉｌｖ）経路の酵素をコードする１つより多い遺伝子を含むオペロンの変化または修飾を有する微生物を含む。好ましい「調節解除されたイソロイシン−バリン（ｉｌｖ）経路を有する微生物」を遺伝子工学し、Ｂａｉｌｌｕｓ（例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｉｌｖ生合成酵素（例えば、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ｉｌｖＢＮ遺伝子産物またはａｌｓＳ遺伝子産物）（例えばアセトヒドロキシ酸は、配列番号３２および配列番号３４のアミノ酸配列を有するサブユニットを有するか、または、配列番号３１および配列番号３３のヌクレオチド配列または１〜２２４６のヌクレオチドからの配列番号５８のヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされるか、またはアセトヒドロキシ酸シンターゼは、配列番号８６のヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされる）、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ｉｌｖＣ遺伝子産物）（例えば、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼは、配列番号３６のアミノ酸配列を有するか、または、配列番号３５のヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされる）、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ｉｌｖ遺伝子産物）（例えば、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼは、配列番号３８のアミノ酸配列を有するか、または、配列番号３７のヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされる）の少なくとも１つを過剰発現するように工学されている）を過剰発現するように遺伝子工学されているか、および／または、ｉｌｖＢＮＣ核酸配列（配列番号５８、ヌクレオチド１〜１７２５、１７２２〜２２４６および２２６３〜３２９１由来のコード領域）および／またはｉｌｖＤ核酸配列（配列番号３７）を含むベクターで形質転換されている。
【００４９】  別の好ましい実施形態において、組換え微生物は、変異ＣｏａＡおよび／またはＣｏａＸ生合成酵素が発現され、少なくとも１つのパントテネート生合成酵素および／または少なくとも１つのイソロイシン−バリン生合成酵素が過剰発現または調節解除されるように設計または工学される。
【００５０】  別の好ましい実施形態において、本発明の微生物は、細菌由来の遺伝子または生合成酵素（例えば、ＣｏＡ生合成酵素、パントテネート生合成酵素またはイソロイシン−バリン生合成酵素）について過剰発現または変異している。「細菌由来」または例えば細菌「から得られた」なる語は、細菌遺伝子（例えば、ｐａｎＢ、ｐａｎＥ、ｐａｎＣ、ｐａｎＤ、ｉｌｖＢＮ（またはａｌｓＳ）、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＤ、或いはｃｏａＡまたはｃｏａＸによりコードされる）によりコードされる、遺伝子産物（例えば、ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、ケトパントエートレダクターゼ、パントテネートシンターゼ、アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼまたはパントテネートキナーゼ）を含む。
【００５１】  本発明のさらに他の好ましい組換え微生物は、変異微生物である。本明細書に使用したような「変異微生物」なる語は、遺伝子工学して、微生物により通常または天然に発現される、変異遺伝子またはタンパク質を発現するように遺伝子工学した、組換え微生物を含む。好ましくは、変異微生物は、微生物が、変化、修飾または異なる表現型を示すような（例えば、変異ＣｏＡ生合成酵素、例えばパントテネートキナーゼを発現するように工学されている）変異遺伝子またはタンパク質を発現する。１つの実施形態において、変異微生物は、それが本明細書に定義したような変異ｃｏａＸ遺伝子を含むように、設計または工学されている。別の実施形態において、組換え微生物は、それが本明細書に定義したような変異ｃｏａＡ遺伝子を含むように、設計または工学されている。別の実施形態において、変異微生物は、ｃｏａＸ遺伝子が欠失（すなわちｃｏａＸ遺伝子によりコードされるタンパク質は産生されない）するように設計または工学する。別の実施形態において、変異微生物は、ｃｏａＡ遺伝子が欠失（すなわちｃｏａＡ遺伝子によりコードされるタンパク質は産生されない）するように設計または工学する。好ましくは、変異微生物は、変異ｃｏａＸ遺伝子または変異ｃｏａＡ遺伝子を有するか、または、変異遺伝子微生物が「減少したパントテネートキナーゼ活性」をコードするように、ｃｏａＸ遺伝子および／またはｃｏａＡが欠失するように工学されている。全微生物に関して、「減少したパントテネートキナーゼ活性」は、微生物（例えば、微生物から単離または得られた溶解液）または微生物を培養する培地中での（図１６参照）、ＣｏＡ生合成経路の中間体または産物の減少を測定またはアッセイすることにより、例えば、４’−ホスホパントテネート、４’−ホスホパントテニルシステイン、４’−ホスホパンテテイン、デホスホ補酵素Ａ、補酵素Ａ、アポ−アシルキャリヤータンパク質（アポ−ＡＣＰ）またはホロ−アシルキャリヤータンパク質（ＡＣＰ）を測定またはアッセイすることにより決定できる。別法として、「減少したパントテネートキナーゼ活性」は、微生物の増殖の減少を測定またはアッセイすることにより決定できる。別法として、「減少したパントテネートキナーゼ活性」は、パント−化合物はＣｏＡ生合成経路の上流にあり、その第一段階はパントテネートキナーゼにより触媒されるので、微生物または周囲の培地中の、パント−化合物（例えばパントテネート）の増加を測定またはアッセイすることにより決定できる。本発明はまた、パントテネートキナーゼ活性の減少に加えて（例えば、変異ｃｏａＡおよび／または変異ｃｏａＸ遺伝子を発現する）、調節解除されたパントテネート生合成経路および／または調節解除されたイソロイシン−バリン（ｉｌＶ）生合成経路を有する、組換え微生物を特徴とする。
【００５２】  １つの実施形態において、本発明の組換え微生物は、グラム陽性生物（例えば、微生物を囲むグラム陽性壁の存在に因り、塩基性ダイ、例えば、クリスタルバイオレットを保持する微生物）である。好ましい実施形態において、組換え微生物はＢａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｏｒｎｙｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｉ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓからなる群から選択された属に属する微生物である。より好ましい実施形態において、組換え微生物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属である。好ましい実施形態において、組換え微生物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｉｍｏｒｂｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｎｔｏｔｈｅｎｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、および、１６ＳｒＲＮＡ型により特徴づけられるような他の１群のＢａｃｉｌｌｕｓ種（Ｐｒｉｅｓｔ（１９９３）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓおよび他のグラム陽性細菌、Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎら編、ＡＳＭ、ワシントンＤ．Ｃ．６項）からなる群から選択される。別の好ましい実施形態において、組換え微生物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓである。別の好ましい実施形態において、組換え微生物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓからなる群から選択される。
【００５３】  別の実施形態において、組換え微生物はグラム陰性（塩基性ダイを除外する）生物である。好ましい実施形態において、組換え微生物は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、ＳｅｒｒａｔｉａおよびＰｒｏｔｅｕｓからなる群から選択される属に属する微生物である。より好ましい実施形態において、組換え微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属のものである。さらにより好ましい実施形態において、組換え微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである。別の実施形態において、組換え微生物はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【００５４】  本発明の重要な態様は、所望の化合物（例えば所望のパント−化合物）が産生されるように、本明細書に記載の組換え微生物を培養することを含む。「培養」なる語は、本発明の生微生物を維持および／または増殖（例えば培養液または株を維持および／または増殖）することを含む。１つの実施形態において、本発明の微生物は、液体培地で培養する。別の実施形態において、本発明の微生物は、固体培地または半固体培地で培養する。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、微生物の維持および／または増殖に必須または有利な栄養（例えば、炭素源または炭素基質、例えば複合炭水化物、例えばマメまたは穀物の食事、デンプン、糖、糖アルコール、炭化水素、油、脂肪、脂肪酸、有機酸およびアルコール；窒素源、例えば、植物性タンパク質、ペプトン、穀物、マメおよび塊茎から得られるペプチドおよびアミノ酸、肉、ミルクおよび動物副産物などの動物源から得られるタンパク質、ペプチドおよびアミノ酸、例えば、ペプトン、肉抽出物およびカゼイン加水分解物；無機窒素源、例えば尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムおよびリン酸アンモニウム；リン源、例えば、リン酸、そのナトリウムおよびカリウム塩；微量元素、例えば、マグネシウム、鉄、マンガン、カルシウム、銅、亜鉛、ホウ素、モリブデン、および／またはコバルト塩；並びに、増殖因子、例えばアミノ酸、ビタミン、増殖促進因子等）を含む、培地（例えば無菌の液体培地）中で培養する。
【００５５】  好ましくは、本発明の微生物は、制御されたｐＨ下で培養する。「制御されたｐＨ」なる語は、所望の産物（例えばパント−化合物）の産生する任意のｐＨを含む。１つの実施形態において、微生物はｐＨ約７で培養する。別の実施形態において、微生物は、６．０ないし８．５のｐＨで培養する。所望のｐＨは、当業者に既知の任意の数の方法により維持し得る。
【００５６】  また好ましくは、本発明の微生物は、制御された曝気下で培養する。「制御された曝気」なる語は、所望の産物（例えばパント−化合物）が産生されるに十分な曝気（例えば酸素）を含む。１つの実施形態において、曝気は、例えば、培養培地に溶かす酸素の量を調節することにより、培養液中の酸素レベルを調節することにより制御される。好ましくは、培養液の曝気は、培養液の撹拌により制御される。撹拌は、増殖容器（例えば発酵槽）を回転または振とうすることにより、または、様々のポンプ装置により、プロペラまたは類似の機械的撹拌装置により行ない得る。曝気はさらに、培地を通る（例えば発酵混合物を通る）滅菌空気または酸素の通過により制御し得る。また好ましくは、本発明の微生物は、過剰の泡を形成せずに（例えば、消泡剤の添加により）培養する。
【００５７】  さらに、本発明の微生物は、制御温度下で培養できる。「制御温度」なる語は、所望の産物（例えばパント−化合物）が産生される任意の温度を含む。１つの実施形態において、制御温度は、１５℃ないし９５℃の温度を含む。別の実施形態において、制御温度は、１５℃ないし７０℃の温度を含む。好ましい温度は、２０℃ないし５５℃であり、より好ましくは３０℃ないし４５℃または３０℃ないし５０℃である。
【００５８】  微生物は、液体培地中で培養（例えば維持および／または増殖）でき、好ましくは、静置培養、試験管培養、振とう培養（例えば回転振とう培養、振とうフラスコ培養等）、曝気撹拌培養、または発酵などの慣用的な培養法により連続的または断続的に培養する。好ましい実施形態において、微生物は振とうフラスコ中で培養するより好ましい実施形態において、微生物は発酵槽中で培養する（例えば発酵プロセス）。本発明の発酵プロセスは、バッチ式、流加式および連続式発酵法を含むがこれに限定されない。「バッチ式プロセス」または「バッチ式発酵」なる語は、培地、栄養分、補助添加物等の組成が、発酵の開始時に設定され、発酵中に変化を受けない、閉じた系を意味するが、ｐＨおよび酸素濃度などの因子を制御して、過度の培地酸性化および／または微生物死滅を防止する試みを行ない得る。「流加式プロセス」または「流加式」発酵なる語は、発酵が進行するにつれて１つ以上の基質または補助物を添加する（例えば段階的にまたは連続的に添加する）ことを除き、バッチ式発酵を意味する。「連続的プロセス」または「連続的発酵」なる語は、規定の発酵培地を、連続的に発酵槽に加え、等量の使用または「ならし」培地を同時に、好ましくは所望の産物（例えばパント−化合物）の回収のために取り出す、系を意味する。多種多様の前記プロセスが開発され、当分野で公知である。
【００５９】  「所望の化合物（例えばパント−化合物、例えばパントテネート）が産生されるような条件下で培養」なる語は、所望の化合物の産生を得るか、または、産生する特定の化合物の所望の収率を得るのに適切または十分な条件（例えば温度、圧力、ｐＨ、期間等）下で微生物を維持および／または増殖することを含む。例えば、培養は、所望の量のパント−化合物（例えばパントテネート、パントエートまたはβ−アラニン）を産生するに十分な時間継続する。好ましくは、培養は、最大のパント−化合物の産生に実質的に達成するに十分な時間継続する。１つの実施形態において、培養は、１２から２４時間継続する。別の実施形態において、培養は約２４から３６時間、３６から４８時間、４８から７２時間、７２から９６時間、９６から１２０時間、１２０から１４４時間、または１４４時間以上継続する。別の実施形態において、培養は、パント−化合物の産生収率を達成するに十分な時間継続し、例えば、細胞は、少なくとも約１５〜２０ｇ／Ｌのパント−化合物が産生されるように、少なくとも２０〜２５ｇ／Ｌのパント−化合物が産生されるように、少なくとも約２５〜３０ｇ／Ｌのパント−化合物が産生されるように、少なくとも約３０〜３５ｇ／Ｌのパント−化合物が産生されるように、少なくとも約３５〜４０ｇ／Ｌのパント−化合物（例えば少なくとも約３７ｇ／Ｌのパント−化合物）が産生されるように、または少なくとも約４０〜５０ｇ／Ｌのパント化合物が産生されるように培養する。さらに別の実施形態において、微生物は、パント−化合物の好ましい収率、例えば、上記に示した範囲内の収率が、約２４時間で、約３６時間で、約４８時間で、約７２時間で、または約９６時間で産生されるような条件下で培養する。
【００６０】  本発明の方法論は、さらに、所望の化合物（例えばパント−化合物）を回収する段階を含むことができる。所望の化合物（例えばパント−化合物）を「回収する」なる語は、培養培地からの化合物の抽出、収集、単離または精製を含む。化合物の回収は、慣用的なレジン（例えばアニオンまたはカチオン交換レジン、非イオン性吸着レジン等）による処理、慣用的な吸着剤（例えば活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロース、アルミナ等）による処理、ｐＨの変化、溶媒抽出（例えば、アルコール、酢酸エチル、ヘキサン等の慣用的な溶媒を用いる）、透析、ろ過、濃縮、結晶化、再結晶、ｐＨ調整、凍結乾燥等を含むがこれに限定されない、当分野で既知の任意の慣用的な単離または精製方法論に従って実施できる。例えば、化合物（例えばパント−化合物）は、最初に培養液から微生物を回収することにより、培養培地から回収できる。次いで、培地を、カチオン交換レジンを通ってまたはその上に通して、望まれないカチオンを除去し、次いでアニオン交換レジンを通ってまたはその上に通して、望まれない無機アニオンおよび目的のパント−化合物（例えばパントテネート）よりも強い酸性を有する有機酸を除去する。得られたパント−化合物（例えばパントテネート）を続いて、パントテン酸塩（例えばパントテン酸カルシウム）に変換できる。
【００６１】  好ましくは、所望の本発明の化合物は、得られた調製物が、実質的に他の成分を含まない（例えば、培地成分および／または発酵副産物を含まない）ように、「抽出」、「単離」または「精製」する。「実質的に他の成分を含まない」なる語は、化合物が、産生した培養液の培地成分または発酵副産物から分離（例えば精製または部分精製）されている、所望の化合物の調製物を含む。１つの実施形態において、調製物は、約８０％（乾燥重量で）より多い所望の化合物（例えば、約２０％未満の他の培地成分または発酵副産物）、より好ましくは約９０％より多い所望の化合物（例えば、約１０％未満の他の培地成分または発酵副産物）、さらにより好ましくは約９５％より多い所望の化合物（例えば、約５％未満の他の培地成分または発酵副産物）、最も好ましくは約９８〜９９％より多い所望の化合物（例えば約１〜２％未満の他の培地成分または発酵副産物）を有する。所望の化合物が、塩に誘導体化されたパント−化合物（例えばパントテン酸塩またはパントイン酸塩）である場合、パント−化合物は、好ましくは、さらに、塩の形成に関連した化学物質混入物を含まない（例えば実質的に含まない）。所望の化合物が、アルコールに誘導体化されたパント−化合物である場合、パント−化合物は、好ましくは、アルコールの形成に関連した化学物質混入物をさらに含まない（例えば実質的に含まない）。
【００６２】  別の実施形態において、所望のパント−化合物は、例えば、微生物が生物学的に有害でない（例えば安全である）場合、微生物から精製しない。例えば、全培養液（または培養上清）を、産物（例えば粗産物）の源として使用できる。１つの実施形態において、培養液（または培養上清）は修飾せずに使用する。別の実施形態において、培養液（または培養上清）は濃縮する。さらに別の実施形態において、培養液（または培養上清）は、乾燥または凍結乾燥する。
【００６３】  ＩＩ．ケトパントエートレダクターゼ過剰発現微生物を特徴とする、パント−化合物産生の方法論
本発明の１つの態様は、ケトパントエートレダクターゼ過剰発現（ＫＰＡＲ−Ｏ）微生物を、パント−化合物が産生されるような条件下で培養することを含む、パント−化合物の産生法を特徴とする。「ケトパントエートレダクターゼ過剰発現（ＫＰＡＲ−Ｏ）微生物」なる語は、ケトパントエートレダクターゼ（例えば配列番号３０のアミノ酸配列を有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓケトパントエートレダクターゼタンパク質）を過剰発現するように操作しておいた、および／または、ｐａｎＥ１核酸配列（例えば、配列番号２９に示したＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐａｎＥ１核酸配列）を含むベクターで形質転換しておいた、微生物を含む。１つの実施形態において、パント−化合物は、パントテネートである。別の実施形態において、パント−化合物はパントエートである。別の実施形態において、ケトパントエートレダクターゼは細菌由来である。別の実施形態において、ケトパントエートレダクターゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓから得られる（例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓから得られる）。さらに別の実施形態において、ＫＰＡＲ−Ｏ微生物はグラム陽性である。さらに別の実施形態において、ＫＰＡＲ−Ｏ微生物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、ＬａｃｔｏｃｏｃｃｉおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓからなる群から選択された属に属する微生物である。好ましい実施形態において、ＫＰＡＲ−Ｏ微生物はＢａｃｉｌｌｕｓ属である。さらに好ましい実施形態において、ＫＰＡＲ−Ｏ微生物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓからなる群から選択される。特に好ましい実施形態において、ＫＰＡＲ−Ｏ微生物はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓである。
【００６４】  さらに他の実施形態において、ＫＰＡＲ−Ｏ微生物はさらに、ケトパントエートレダクターゼに加えて、少なくとも１つのパントテネート生合成酵素を過剰発現する。例示的な実施形態において、ＫＰＡＲ−Ｏ微生物はさらに、ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、パントテネートシンターゼおよびアスパルテート−α−デカルボキシラーゼの少なくとも１つを過剰発現する。また、パント−化合物の産生法、例えば、ＫＰＡＲ−Ｏ微生物を培養することを含む方法も特徴とし、これはさらに、パント−化合物を回収する段階も含む。
【００６５】  ＩＩＩ．前駆体供給の必要性とは独立したパント−化合物を産生する方法
操作した生合成酵素または生合成酵素の組合せに応じて、パントテネートまたは他の所望のパント−化合物が産生されるように、少なくとも１つのパントテネート生合成前駆体を本発明の微生物に提供（例えば供給）することが望ましいまたは必要であり得る。「パントテネート生合成前駆体」または「前駆体」なる語は、微生物の培養培地に提供されるか、それと接触するか、またはそれに含められる場合、パントテネート生合成を増強または増加するように作用する、物質または化合物を含む。１つの実施形態において、パントテネート生合成前駆体または前駆体は、アスパルテートである。別の実施形態において、パントテネート生合成前駆体または前駆体は、β−アラニンである。添加するアスパルテートまたはβ−アラニンの量は、好ましくは、微生物の生産性を増強するに十分な培養培地中の濃度（例えば、パント−化合物、例えばβ−アラニン、ケトパントエート、パントエートまたはパントテネートの産生を増強するに十分な濃度）が得られる量である。本発明のパントテネート生合成前駆体は、濃縮溶液または懸濁液の形（例えば、水または緩衝液などの適切な溶媒中）または固体形（例えば粉末形）で添加できる。さらに、本発明のパントテネート生合成前駆体は、一定の期間におよび、連続的または断続的に、単一のアリコートとして添加できる。
【００６６】  さらに別の実施形態において、パントテネート生合成前駆体は、バリンであり、例えば実施例ＩＩＩ参照。さらに別の実施形態において、パントテネート生合成前駆体は、α−ケトイソバレレートである。好ましくは、バリンまたはα−ケトイソバレレートは、所望の産物（例えばパント−化合物）の産生に十分な培地中の濃度が生じる量で添加する。パントテネート生合成前駆体はまた、本明細書で「補助的パントテネート生合成基質」と称する。
【００６７】  本発明のパントテネート生合成方法論へのパントテネート生合成前駆体の提供は、例えば、方法論を使用して高収率のパント−化合物を産生する場合、高い費用を伴い得る。従って、本発明の好ましい方法論は、パントテネートまたは他の所望のパント−化合物が前駆体供給とは独立した様式で産生されるように操作した、少なくとも１つの生合成酵素または生合成酵素の組合せ（例えば、少なくとも１つのパントテネート生合成酵素および／またはバリン−イソロイシン生合成酵素）を有する微生物を特徴とする。「前駆体供給とは独立した様式」なる語は、例えば、所望の化合物（例えばパント−化合物）を産生する方法に言及する場合、所望の化合物を産生するために利用する微生物に提供（例えば供給）される前駆体に依存または依拠しない、所望の化合物の産生のアプローチまたは形態を含む。例えば、本発明の方法論を特徴とする微生物を使用して、前駆体アスパルテート、β−アラニン、バリンおよび／またはα−ＫＩＶの供給を全く必要としない様式でパント−化合物を産生できる。
【００６８】  本発明の別の好ましい方法論は、パントテネートまたは他の所望のパント−化合物が、前駆体供給とは実質的に独立した様式で産生されるように操作した、少なくとも１つの生合成酵素または生合成酵素の組合せを有する微生物を特徴とする。「前駆体供給とは実質的に独立した様式」なる語は、利用する微生物に提供（例えば供給）される前駆体により少ない程度で依存または依拠する、所望の化合物の産生のアプローチまたは方法を含む。例えば、本発明の方法論に特徴的な微生物を使用して、実質的に量の減少した前駆体アスパルテート、β−アラニン、バリンおよび／またはα−ＫＩＶの供給を必要とする様式で、パント−化合物を産生できる。１つの実施形態において、本発明は、対照微生物（例えば、所望の化合物を効率的に産生するために、前駆体供給に依存している、例えば、完全に依存している微生物）により必要とされる量の５％〜１０％未満の供給を必要とする様式で、パント−化合物（例えばパントテネート）を産生する方法を特徴とする。別の実施形態において、本発明は、対照微生物により必要とされる前駆体の量の１５〜２０％未満の供給を必要とする様式で、パント−化合物を産生する方法を特徴とする。別の実施形態において、本発明は、対照微生物の必要とする量の２５〜３０％、３５〜４０％、４５〜５０％または５５〜６０％未満の供給を必要とする様式で、パント−化合物を産生する方法を特徴とする。本明細書の実施例Ｉ〜ＩＩＩに記載したように、本発明の方法論に特徴的な特定の微生物は、例えば、５ｇ／Ｌのアスパルテート、β−アラニン、バリンまたはα−ＫＩＶ（例えば試験管または振とうフラスコ培養中）を必要とする。従って、好ましい実施形態において、本発明は、０．２５ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、０．７５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、１．２５ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、１．７５ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、２．２５ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、２．７５ｇ／Ｌまたは３ｇ／Ｌ未満の供給を必要とする様式で、パント−化合物（例えばパントテネート）を産生する方法を特徴とする。
【００６９】  前駆体共有とは独立した様式で、または別に、前駆体供給とは実質的に独立した様式で所望の化合物（例えばパント−化合物）を産生する好ましい方法は、少なくとも１つのパントテネート生合成酵素および／または少なくとも１つのイソロイシン−バリン生合成酵素の発現が修飾されるように、操作（例えば、設計または工学、例えば遺伝子工学）しておいた、微生物を培養することを含む。例えば、１つの実施形態において、微生物を、少なくとも１つの生合成酵素および／または少なくとも１つのイソロイシン／バリン生合成酵素の産生が調節解除されるように、操作（例えば設計または工学）する。好ましい実施形態において、微生物は、本明細書に定義したような、調節解除生合成経路、例えば調節解除パントテネート生合成経路および／または調節解除イソロイシン−バリン生合成経路を有するように操作（例えば設計または工学）する。別の好ましい実施形態において、微生物を、少なくとも１つのパントテネート生合成酵素および／または少なくとも１つのイソロイシン−バリン生合成酵素が過剰発現されるように、操作（例えば設計または工学）する。
【００７０】  前駆体供給とは独立した様式で、または別に、前駆体供給とは実質的に独立した様式で所望の化合物（例えばパント−化合物）を産生する好ましい方法は以下の通りである。１つの実施形態において、本発明は、パントテネートが産生されるような条件下で、調節解除イソロイシン−バリン（ｉｌｖ）経路を有する、アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ過剰発現（ＡαＤ−Ｏ）微生物を培養することを含む、前駆体供給とは独立した様式でパントテネートを産生する方法を特徴とする。別の実施形態において、本発明は、パントテネートが産生されるような条件下で、調節解除パントテネート（ｐａｎ）経路および調節解除イソロイシン−バリン（ｉｌｖ）経路を有する、アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ過剰発現（ＡαＤ−Ｏ）微生物を培養することを含む、前駆体供給とは独立した様式でパントテネートを産生する方法を特徴とする。別の実施形態において、本発明は、パントテネートが産生されるような条件下で、アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ過剰発現（ＡαＤ−Ｏ）微生物を培養することを含む、アスパルテートまたはβ−アラニン供給とは独立した様式で、パントテネートを産生する方法を特徴とする。さらに別の実施形態において、本発明は、パントテネートが産生されるような条件下で、調節解除イソロイシン−バリン（ｉｌｖ）生合成経路を有する微生物を培養することを含む、バリンまたはα−ケトイソバレレート供給とは独立した様式で、パントテネートを産生する方法を特徴とする。
【００７１】  「アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ過剰発現（ＡαＤ−Ｏ）微生物」なる語は、アスパルテート−α−デカルボキシラーゼが過剰発現されるように操作された微生物を含む。好ましい「アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ過剰発現（ＡαＤ−Ｏ）微生物」は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐａｎＤ核酸配列を含むベクターで形質転換されている（例えば、配列番号２８のアミノ酸配列を有するアスパルテート−α−デカルボキシラーゼタンパク質をコードするｐａｎＤ核酸配列、例えば、配列番号２７に示したｐａｎＤ核酸配列）。
【００７２】  「調節解除イソロイシン−バリン（ｉｌｖ）経路を有する微生物」なる語は、イソロイシン−バリン（ｉｌｖ）経路の酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の変化または修飾を有するか、または、イソロイシン−バリン（ｉｌｖ）経路の酵素をコードする１つより多い遺伝子を含むオペロン中の変化または修飾を有する、微生物を含む。好ましい「調節解除イソロイシン−バリン（ｉｌｖ）経路を有する微生物」は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（例えば、配列番号３２および配列番号３４のアミノ酸配列を有するサブユニットを有するアセトヒドロキシ酸シンターゼ、または、配列番号８７のアミノ酸配列を有するアセトヒドロキシ酸シンターゼ）、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（配列番号３６のアミノ酸配列を有する）、またはジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（配列番号３８のアミノ酸を有する）を過剰発現し、および／または、ｉｌｖＢ、ｉｌｖＮ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＢＮ、ｉｌｖＢＮＣまたはａｌｓＳ核酸配列（それぞれ、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号５８のヌクレオチド１〜２２４６、ヌクレオチド１〜１７２５、１７２２〜２２４６および２２６３〜３２９１のコード領域を有する配列番号５８、または配列番号８６）および／またはｉｌｖＤ核酸配列（配列番号３７）を含むベクターで形質転換されている。
【００７３】  ＩＶ．高収率産生方法論
本発明の特に好ましい実施形態は、パントテネートが有意に高い収率で産生されるような条件下で、操作した微生物を培養することを含む、パントテネートを産生する高収率産生法である。「高収率産生法」なる語、例えば、所望の化合物を産生するための（例えばパント−化合物を産生するための）高収率産生法は、同等な産生法について通常であるレベルよりも上昇または上のレベルで所望の化合物が産生される方法である。好ましくは、高収率産生法により、所望の化合物が有意に高い収率で産生される。「有意に高い収率」なる語は、同等な産生法について通常であるレベルよりも十分に上昇または上である、例えば、所望の産物の商業的な産生（例えば、商業的に実行可能な費用での産物の産生）に十分なレベルまで上昇した、産生または収率のレベルを含む。１つの実施形態において、本発明は、パントテネートが、２ｇ／Ｌよりも高いレベルで産生されるような条件下で、操作した微生物を培養することを含む、パントテネートを産生する高収率な産生法を特徴とする。別の実施形態において、本発明は、パントテネートが、１０ｇ／Ｌよりも高いレベルで産生されるような条件下で、操作した微生物を培養することを含む、パントテネートを産生する高収率な産生法を特徴とする。別の実施形態において、本発明は、２０ｇ／Ｌよりも高いレベルで産生されるような条件下で、操作した微生物を培養することを含む、パントテネートを産生する高収率な産生法を特徴とする。さらに別の実施形態において、本発明は、３０ｇ／Ｌよりも高いレベルで産生されるような条件下で、操作した微生物を培養することを含む、パントテネートを産生する高収率な産生法を特徴とする。さらに別の実施形態において、本発明は、４０ｇ／Ｌよりも高いレベルで産生されるような条件下で、操作した微生物を培養することを含む、パントテネートを産生する高収率な産生法を特徴とする
【００７４】  本発明はさらに、商業的に望ましい時間内で十分に上昇したレベルの化合物が産生されるような条件下で、操作した微生物を培養することを含む、所望の化合物を産生する（例えばパント−化合物を産生する）高収率の産生法を特徴とする。例示的実施形態において、本発明は、パントテネートが３６時間で１５〜２０ｇ／Ｌよりも高いレベルで産生されるような条件下で、操作した微生物を培養することを含む、パントテネートを産生する高収率産生法を特徴とする。別の実施形態において、本発明は、パントテネートが４８時間で２５〜３０ｇ／Ｌより高いレベルで産生されるような条件下で、操作した微生物を培養することを含む、パントテネートを産生する高収率の産生法を特徴とする。別の実施形態において、パントテネートが７２時間で３５〜４０ｇ／Ｌより高い、例えば、７２時間で３７ｇ／Ｌより高いレベルで産生されるような条件下で、操作した微生物を培養することを含む、パントテネートを産生する高収率の産生法を特徴とする。別の実施形態において、本発明は、パントテネートが６０時間で３０〜４０ｇ／Ｌより高い、例えば、６０時間で３０、３５または４０ｇ／Ｌより高いレベルで産生されるような条件下で、操作した微生物を培養することを含む、パントテネートを産生する高収率の産生法を特徴とする。含まれる数値および範囲および／または本明細書に示した範囲内の中間値も、本発明の範囲内であるものとする。例えば、６０時間で少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８および３９ｇ／Ｌのレベルでのパントテネート産生は、６０時間で３０〜４０ｇ／Ｌの範囲内に含めるものとする。別の例において、３０〜３５ｇ／Ｌまたは３５〜４０ｇ／Ｌの範囲は、６０時間で３０〜４０ｇ／Ｌの範囲内に含めるものとする。さらに、当業者は、操作した微生物を培養して、例えば「６０時間で３０〜４０ｇ／Ｌ」の産生レベルを達成することは、さらなる時間（例えば、６０時間より長い時間）微生物を培養し、所望によりさらに高い収率のパントテネートが産生されることを含むことを、認識しているだろう。
【００７５】  Ｖ．パントテネートキナーゼ変異微生物を特徴とするパント−化合物の産生方法論
本発明は、高収率のパントテネート並びに他のパント−化合物を産生するように工学した微生物を使用して、パントテネートを産生する方法に関する。パントテネートを過剰産生する細胞により、ＣｏＡによるパントテネートキナーゼのフィードバック阻害を克服し得、ＣｏＡの過剰産生をもたらし得る、高い細胞内パントテネートレベルが生じる。パントテネートを消費する他に、ＣｏＡの合成の増加が、ＰａｎＢ、ＰａｎＤ、ＰａｎＥまたはＰａｎＣ反応のフィードバック阻害を引き起こし得、これによりパントテネート産生は限定し得る。従って、パントテネートキナーゼ活性の減少により、ＣｏＡレベルは減少し得、結果としてＰａｎＢ、ＰａｎＤ、ＰａｎＥまたはＰａｎＣ活性およびパントテネート産生は増加し得る。
【００７６】  従って、本発明のある方法論は、少なくとも一部には、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｃｏａＡ遺伝子の同定および特徴づけ、および、遺伝子はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ増殖に必須でなく（すなわちＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの染色体からのｃｏａＡ遺伝子の欠失は致死的事象ではない）、また、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおけるパントテネートキナーゼ活性にも必須ではないという実証に基づく。第二のパントテネートキナーゼコード遺伝子が、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓで同定および特徴づけられ、「ｃｏａＸ」と称する。この遺伝子は、温度感受性パントテネートキナーゼを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ変異体を補完し、全ての以前に既知のパントテネートキナーゼ遺伝子に対する相同性に関連していない。
【００７７】  １つの態様において、本発明の方法論は、パントテネートキナーゼ活性の減少した、ｃｏａＸ遺伝子を含むか、または、変異ｃｏａＸ遺伝子を含む、組換え微生物を特徴とする。１つの実施形態において、方法論は、調節解除パントテネート生合成経路をさらに有する前記組換え微生物を特徴とする。別の実施形態において、方法論は、調節解除イソロイシン−バリン（ｉｌｖ）経路をさらに有する、前記組換え微生物を特徴とする。好ましい実施形態において、微生物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属（例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する。
【００７８】  本発明の方法論はまた、パントテネートキナーゼ活性の減少した、所望によりｃｏａＸ遺伝子またはその変異体を含む、ｃｏａＡ遺伝子を含むか、または、変異ｃｏａＡ遺伝子を含む、組換え微生物（微生物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに属する）を特徴とする。１つの実施形態において、方法論は、調節解除パントテネート生合成経路をさらに有するか、または、調節解除イソロイシン−バリン（ｉｌｖ）経路を有する、前記組換え微生物を特徴とする。また、単離ｃｏａＸまたはｃｏａＡ遺伝子、並びに、変異ｃｏａＸおよび／またはｃｏａＡ遺伝子を含むベクターも特徴とする。単離ＣｏａＸタンパク質および変異ＣｏａＸタンパク質に加えて、単離ｃｏａＸ遺伝子または変異ｃｏａＸ遺伝子を含む、単離核酸分子も特徴とする。
【００７９】  上記の核酸分子（例えば遺伝子）、タンパク質、ベクターおよび組換え微生物（例えば変異微生物）は、パント−化合物の産生法および／またはパント−化合物産生の増強法に使用するのに特に適切である。１つの実施形態において、本発明は、パント−化合物が産生されるような条件下で、パントテネートキナーゼ変異体（例えば、誤発現する、例えば、本明細書に定義したようなパントテネートキナーゼについて変異している、組換え微生物）を培養することを含む、パント−化合物（例えばパントテネート）の産生法を特徴とする。別の実施形態において、本発明は、パント−化合物が産生されるような条件下で、パントテネートキナーゼ変異体（例えば、誤発現する、例えば、本明細書に定義したようなパントテネートキナーゼについて変異している組換え微生物）を培養することを含む、パント−化合物（例えばパントネート）の産生の増強法を特徴とする。本明細書に定義したような、「増強」（例えば、「産生の増強」なる語の内容から）なる語は、非変異微生物（例えば、正常パントテネートキナーゼ遺伝子（群）を有する、および／または、正常パントテネート産生速度および／またはレベルを有する微生物）における産生レベルまたは速度と比べて、パント−化合物（例えばパントテネート）産生レベルまたは速度の増加することを含む。
【００８０】  好ましくは、本発明のパントテネートキナーゼ変異体を特徴とする方法論で産生されるパント−化合物のレベルは、非変異体（例えば、非変異パントテネートキナーゼを発現する組換え微生物）により産生されるレベルと比べて、少なくとも５％増加している。さらにより好ましくは、パント−化合物のレベルは、非変異体を特徴とする方法論に比べて１０％増加している。さらにより好ましくは、パント−化合物レベル（例えばパントテネートレベル）は、非変異体を特徴とする方法論に比べて、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上増加している。
【００８１】  ＶＩ．パント−化合物産生の増強をもたらす追加の変異
本発明の方法論は、さらに、例えば、パントテネート生合成酵素および／またはイソロイシン−バリン生合成酵素の過剰発現または調節解除に加えて、または、パントテネート−キナーゼコード遺伝子の変異に加えて、重要なパントテネート生合成基質または前駆体を望まないまたは望ましくない産物に変換するのを触媒する酵素を欠失または変異することを含むことができる。例えば、パントテネートキナーゼをコードする酵素を変異することに加えて、ｉｌｖＥ遺伝子（Ｋｕｒａｍｉｔｓｕら（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９７：９９３〜９９９）またはその相同体（配列番号６２または配列番号６４）を変異し、これによりα−ケトイソバレレートのバリンへの変換を制限することは、パント−化合物の産生のさらなる増強または増加を生じると予測される。別に、パントテネートキナーゼをコードする酵素を変異することに加えて、ａｎｓＢ遺伝子（ＳｕｎおよびＳｅｆｌｏｗ（１９９１）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：３８３１〜３８４５）またはその相同体（配列番号６６）を変異し、これによりアスパルテートの分解を制限することは、パント−化合物の産生のさらなる増強または増加を生じると予測される。別に、パントテネートキナーゼをコードする酵素を変異することに加えて、ａｌｓＤ遺伝子（Ｒｅｎｎａら（１９９３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：３８６３〜３８７５）またはその相同体（配列番号６８）を変異し、これによりアセトラクトンのアセトインへの変換を制限することは、パント−化合物の産生のさらなる増強または増加を生じると予測される。別に、パントテネートキナーゼをコードする酵素を変異することに加えて、アラニン−バリントランスアミナーゼまたはその相同体をコードするａｖｔＡ遺伝子を変異し、これによりα−ケトイソバレレートのバリンへの変換を制限することは、パント−化合物の産生のさらなる増強または増加を生じると予測される。ａｖｔＡ遺伝子を変異することは、例えば、配列番号７０のヌクレオチド配列を有するａｖｔＡ遺伝子（例えばＥ．ｃｏｌｉ  ａｖｔＡ遺伝子）またはその構造的相同体（例えば、配列番号７１のアミノ酸配列と３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％またはそれ以上の同一性を有するタンパク質をコードする相同体）またはその機能的相同体（例えば、アラニン−バリントランスアミナーゼ活性を有する構造的に関連していないタンパク質をコードする遺伝子）を変異することを含み得る。前記変異は、実施例（例えば実施例ＸＩＩＩ、ＸＶ、ＸＶＩおよびＸＶＩＩ）に例示した方法論を使用して達成できる。
【００８２】  従って、１つの実施形態において、本発明は、変異パントテネートキナーゼコード遺伝子を有する微生物を培養することを含み、そして、ａｖｔＡ、ｉｌｖＥ、ａｎｓＢおよび／またはａｌｓＤ遺伝子またはその相同体に欠失または変異をさらに有する、パント−化合物を産生する方法を特徴とする。別の実施形態において、本発明は、変異パントテネートキナーゼコード遺伝子および調節解除パントテネート生合成経路酵素を有する微生物を培養することを含み、そして、ａｖｔＡ、ｉｌｖＥ、ａｎｓＢ、および／またはａｌｓＤ遺伝子またはその相同体に欠失または変異をさらに有する、パント−化合物を産生する方法を特徴とする。別の実施形態において、本発明は、変異パントテネートキナーゼコード遺伝子および調節解除イソロイシン−バリン生合成経路酵素を有する微生物を培養することを含み、そして、ａｖｔＡ、ｉｌｖＥ、ａｎｓＢ、および／またはａｌｓＤ遺伝子またはその相同体に欠失または変異をさらに有する、パント−化合物を産生する方法を特徴とする。
【００８３】  ａｌｓＤ遺伝子の変異は、例えば、α−ＫＩＶ産生に利用される前駆体プールから炭素（例えばアセトラクトン）が引き抜かれるのを防ぐために、ａｌｓＳ遺伝子の過剰発現または調節解除と共に行なう場合に、特に有用であり得る。従って、ａｌｓ遺伝子座のパント−化合物産生に対する寄与を最大限にするために、ａｌｓＳ遺伝子を過剰発現することに加えて、ａｌｓＤ遺伝子を破壊することが望ましい。ａｌｓＤ遺伝子を破壊するために、ａｌｓＤ遺伝子にフランキングするａｌｓオペロンの適切な断片を、ＰＣＲにより増幅し、クローニングして、破壊の創製のために相同性を提供する。薬物耐性遺伝子、例えばｃａｔ遺伝子を、ａｌｓＤ遺伝子の場所に、フランキングＤＮＡ断片の間にクローニングし、線形化ＤＮＡを、ＰＡ８２４などのパントテネート産生株に形質転換し、薬物耐性について選択する。ａｌｓＳを過剰発現するために、ａｌｓＳコード配列（例えば、発現のためにＰＣＲにより工学されたａｌｓＳコード配列）を、発現ベクターにクローニングする。ａｌｓＳを発現するベクター（または別に、ａｌｓＳとｉｌｖＣを発現するベクター）を、パント−化合物産生株（例えばパントテネート産生株ＰＡ８２４）に導入する。
【００８４】  本発明の方法論は、さらに、例えば、パントテネート生合成酵素および／またはイソロイシン−バリン生合成酵素の過剰発現または調節解除に加えて、または、パントテネート−キナーゼコード遺伝子の変異に加えて、所望のパント−化合物を望まないまたは望ましくない下流産物に変換するのを触媒する酵素を欠失または変異することを含むことができる。
【００８５】  ＶＩＩ．単離核酸分子および遺伝子
本発明の別の態様は、Ｂａｃｉｌｌｕｓタンパク質（例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、例えばＢａｃｉｌｌｕｓパントテネート生合成酵素（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓパントテネート生合成酵素）またはＢａｃｉｌｌｕｓバリン−イソロイシン生合成酵素（例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓバリン−イソロイシン生合成酵素）をコードする、単離核酸分子を特徴とする。また、単離ｃｏａＸおよび／またはｃｏａＡ核酸分子（例えば、単離ｃｏａＸおよび／またはｃｏａＡ遺伝子）、並びに、ｃｏａＸおよび／またはｃｏａＡ核酸分子または遺伝子を含む単離核酸分子を特徴とする。
【００８６】  「核酸分子」なる語は、ＤＮＡ分子（例えば線形、環状、ｃＤＮＡまたは染色体ＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ）およびヌクレオチド類似体を使用して作成したＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を含む。核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。「単離」核酸分子なる語は、核酸が得られた生物の染色体ＤＮＡ中の核酸分子に天然にフランキングする配列（すなわち、核酸分子の５’および３’末端に位置する配列）を含まない、核酸分子を含む。種々の実施形態において、単離核酸分子は、核酸分子が得られた微生物の染色体ＤＮＡ中の核酸分子に天然にフランキングする、約１０ｋｇ、５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、０．１ｋｂ、５０ｂｐ、２５ｂｐまたは１０ｂｐ未満のヌクレオチド配列を含み得る。さらに、「単離」核酸分子、例えばｃＤＮＡ分子は、組換え技術により産生した場合に他の細胞物質を実質的に含まないか、または、化学合成した場合には化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。
【００８７】  本明細書に使用したような「遺伝子」なる語は、生物中で、遺伝子間ＤＮＡ（すなわち、生物の染色体ＤＮＡ中の遺伝子および／または別々の遺伝子に天然にフランキングしている介入またはスペーサーＤＮＡ）により、別の遺伝子または他の遺伝子から分離している、核酸分子（例えばＤＮＡ分子またはそのセグメント）、例えば、タンパク質またはＲＮＡコード核酸分子を含む。遺伝子は、酵素または他のタンパク質分子の合成を指令し得るか（例えば、コード配列、例えばタンパク質をコードする連続的オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み得る）、または、それ自体、生物中で機能し得る。生物中の遺伝子は、本明細書に定義したようなオペロンにクラスター形成し得、前記オペロンは、遺伝子間ＤＮＡにより、他の遺伝子および／またはオペロンから分離している。オペロン内に含まれる個々の遺伝子は、前記の個々の遺伝子間の遺伝子間ＤＮＡを有さずに重複し得る。本明細書に使用したような「単離遺伝子」は、遺伝子が得られた生物の染色体ＤＮＡ中の遺伝子に天然にフランキングしている配列を実質的に含まない（すなわち、第二または別個のタンパク質またはＲＮＡ分子をコードする隣接コード配列、隣接構造配列または類似物を含まない）遺伝子を含み、所望により、５’および３’調節配列、例えばプロモーター配列および／または終結配列を含む。１つの実施形態において、単離遺伝子は、主に、タンパク質のコード配列を含む（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓタンパク質をコードする配列）。別の実施形態において、単離遺伝子は、タンパク質（タンパク質Ｂａｃｉｌｌｕｓタンパク質）のコード配列、および、遺伝子が得られた生物の染色体ＤＮＡからの隣接５’および／または３’調節配列（例えば、隣接５’および／または３’Ｂａｃｉｌｌｕｓ調節配列）を含む。好ましくは、単離遺伝子は、遺伝子が得られた生物の染色体ＤＮＡ中の遺伝子に天然にフランキングする、約１０ｋｂ、５ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、０．２ｋｂ、０．１ｋｂ、５０ｂｐ、２５ｂｐまたは１０ｂｐ未満のヌクレオチド配列を含む。
【００８８】  １つの態様において、本発明は、単離ｐａｎＢ核酸配列または遺伝子、単離ｐａｎＣ核酸配列または遺伝子、単離ｐａｎＤ核酸配列または遺伝子、単離ｐａｎＥ核酸配列または遺伝子、単離ｉｌｖＢ、ｉｌｖＮ、ｉｌｖＢＮ核酸配列または遺伝子、単離ａｌｓＳ核酸配列または遺伝子、単離ｉｌｖＣ核酸配列または遺伝子および／または単離ｉｌｖＤ核酸配列または遺伝子を特徴とする。
【００８９】  好ましい実施形態において、核酸または遺伝子は、Ｂａｃｉｌｌｕｓから得られる（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ由来）。「Ｂａｃｉｌｌｕｓから得られる」または「Ｂａｃｉｌｌｕｓ由来」なる語は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の微生物に天然に見られる、核酸または遺伝子を含む。好ましくは、核酸または遺伝子は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｉｍｏｒｂｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｎｔｏｔｈｅｎｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、および、１６ＳｒＲＮＡ型により特徴づけられるような他の１群のＢａｃｉｌｌｕｓ種（Ｐｒｉｅｓｔ、上記）からなる群から選択される微生物から得られる。別の好ましい実施形態において、核酸または遺伝子は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから得られる。別の好ましい実施形態において、本発明の核酸分子および／または遺伝子は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓからなる群から選択される微生物から得られる。特に好ましい実施形態において、核酸分子または遺伝子は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓから得られる（例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来である）。「Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓから得られる」または「Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来」なる語は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓに天然に見られる、核酸または遺伝子を含む。さらに別の好ましい実施形態において、核酸または遺伝子は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ遺伝子相同体（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓとは別個の種から得られるが、本発明のＢａｃｉｌｌｕｓ遺伝子、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｎ遺伝子またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｉｌｖ遺伝子に有意な相同性を有する）である。
【００９０】  本発明の範囲内に含まれるのは、細菌由来核酸分子または遺伝子および／またはＢａｃｉｌｌｕｓ由来核酸分子または遺伝子（例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来核酸分子または遺伝子）、例えば、本発明らにより同定された遺伝子、例えば、ＢａｃｉｌｌｕｓまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｃｏａＸ遺伝子、ｃｏａＡ遺伝子、ｐａｎ遺伝子および／またはｉｌｖ遺伝子である。さらに本発明の範囲内に含まれるのは、天然の細菌および／またはＢａｃｉｌｌｕｓ核酸分子または遺伝子（例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ核酸分子または遺伝子）とは異なる、細菌由来核酸分子または遺伝子および／またはＢａｃｉｌｌｕｓ由来核酸分子または遺伝子（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来核酸分子または遺伝子）（例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ核酸分子または遺伝子）、例えば、置換、挿入または欠失した核酸を有するが、本発明の天然遺伝子産物と実質的に類似したタンパク質をコードする核酸分子または遺伝子である。１つの実施形態において、単離核酸分子は、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号８６、配列番号３５または配列番号３７として示したヌクレオチド配列の少なくとも１つを含む。別の好ましい実施形態において、単離核酸分子は、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号８８、配列番号３５または配列番号３７として示したヌクレオチド配列の少なくとも２、３または４つを含む。例えば、本発明の好ましい単離核酸分子は、配列番号２３、配列番号２５および配列番号２７のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質が、各々、単離核酸分子が微生物中で発現された場合に（配列番号５９）産生されるように、好ましくは連結された、配列番号２３、配列番号２５および配列番号２７のヌクレオチド配列を含み得る。別の例において、本発明の好ましい単離核酸分子は、配列番号３１および配列番号３３のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質が、各々、単離核酸分子が微生物中で発現された場合に（配列番号５８のヌクレオチド１〜２２４６）産生されるように、好ましくは連結された、配列番号３１および配列番号３３のヌクレオチド配列を含み得る。別の例において、本発明の好ましい単離核酸分子は、配列番号８６のヌクレオチド配列を含み得る。別の例において、本発明の好ましい単離核酸分子は、配列番号３１、配列番号３３および配列番号３５のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質が、各々、単離核酸分子が微生物中で発現された場合に（例えば配列番号５８）産生されるように、好ましくは連結された、配列番号３１、配列番号３３および配列番号３５のヌクレオチド配列を含み得る。
【００９１】  別の実施形態において、本発明の単離核酸分子は、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号８８、配列番号３５または配列番号３７として示したヌクレオチド配列に少なくとも約６０〜６５％、好ましくは少なくとも約７０〜７５％、より好ましくは少なくとも約８０〜８５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０〜９５％またはそれ以上同一である、ヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、単離核酸分子は、ストリンジェントな条件下で、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号８８、配列番号３５または配列番号３７として示したヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズする。前記ストリンジェント条件は、当業者に公知であり、分子生物学の現在のプロトコル、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１〜６．３．６に見出し得る。ストリンジェントな（例えば高ストリンジェントな）ハイブリダイゼーション条件の好ましい非制限的な例は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でのハイブリダイゼーション、次いで５０〜６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄である。好ましくは、ストリンジェントな条件下で、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号８８、配列番号３５または配列番号３７にハイブリダイズする本発明の単離核酸分子は、天然核酸分子に対応する。本明細書に使用したような「天然」核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド配列を有する、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子を意味する。
【００９２】  本発明の核酸分子（例えば、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号８８、配列番号３５または配列番号３７のヌクレオチド配列を有する核酸分子）は、標準的な分子生物学の技術および本明細書に提供した配列情報を使用して単離できる。例えば、核酸分子は、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術を使用して単離できるか（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ、Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ、分子クローニング；実験マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバー研究所、コールドスプリングハーバー研究所プレス、コールドスプリングハーバー、ＮＹ、１９８９）、または、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号８８、配列番号３５または配列番号３７の配列に基づいて設計した合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応により単離できる。本発明の核酸は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは別にゲノムＤＮＡを、鋳型および適切なオリゴヌクレオチドプライマーとして使用して、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って増幅できる。別の好ましい実施形態において、本発明の単離核酸分子は、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３１、配列番号３３、配列番号８８、配列番号３５に示したヌクレオチド配列の相補体である、核酸分子を含む。
【００９３】  追加のｐａｎＣ核酸配列は、配列番号２５のヌクレオチド配列を含むか、配列番号２６に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドの相同体をコードするか（例えば、配列番号２６に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドに少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上の同一性、および、前記ポリペプチドと実質的に同一の活性を有する、ポリペプチドをコードする）、ストリンジェントな条件下で、配列番号２５のヌクレオチド配列を有する核酸分子の全部または一部に、または、配列番号２６のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子の全部または一部にハイブリダイズするか、または、本明細書に示したようなｐａｎＣヌクレオチド配列に相補的であるものを含む。
【００９４】  追加のｐａｎＤヌクレオチド配列は、配列番号２７のヌクレオチド配列を含むか、配列番号２８に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドの相同体をコードするか（例えば、配列番号２８に示したようなアミノ酸配列を有するポリペプチドに少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上の同一性、および、前記ポリペプチドと実質的に同一の活性を有する、ポリペプチドをコードする）、ストリンジェントな条件下で、配列番号２７のヌクレオチド配列を有する核酸分子の全部または一部に、または、配列番号２８のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子の全部または一部にハイブリダイズするか、または、本明細書に示したようなｐａｎＤヌクレオチド配列に相補的であるものを含む。
【００９５】  追加のｐａｎＥ核酸配列は、配列番号２９のヌクレオチド配列を含むか、配列番号３０に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドの相同体をコードするか（例えば、配列番号３０に示したようなアミノ酸配列を有するポリペプチドに少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上の同一性、およひ、前記ポリペプチドと実質的に同一の活性を有する、ポリペプチドをコードする）、ストリンジェントな条件下で、配列番号２９のヌクレオチド配列を有する核酸分子の全部または一部に、または、配列番号３０のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子の全部または一部にハイブリダイズするか、または、本明細書に示したようなｐａｎＥヌクレオチド配列に相補的であるものを含む。
【００９６】  追加のｉｌｖＢ核酸配列は、配列番号３１のヌクレオチド配列を含むか、配列番号３２に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドの相同体をコードするか（例えば、配列番号３２に示したようなアミノ酸配列を有するポリペプチドに少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上の同一性、および、前記ポリペプチドと実質的に同一の活性を有する、ポリペプチドをコードする）、ストリンジェントな条件下で、配列番号３１のヌクレオチド配列を有する核酸分子の全部または一部に、または、配列番号３２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子の全部または一部にハイブリダイズするか、または、本明細書に示したようなｉｌｖＢヌクレオチド配列に相補的であるものを含む。
【００９７】  追加のｉｌｖＮ核酸配列は、配列番号３３のヌクレオチド配列を含むか、配列番号３４に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドの相同体をコードするか（例えば、配列番号３４に示したようなアミノ酸配列を有するポリペプチドに少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上の同一性、および、前記ポリペプチドと実質的に同一の活性を有する、ポリペプチドをコードする）、ストリンジェントな条件下で、配列番号３３のヌクレオチド配列を有する核酸分子の全部または一部に、または、配列番号３４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子の全部または一部にハイブリダイズするか、または、本明細書に示したようなｉｌｖＮヌクレオチド配列に相補的であるものを含む。
【００９８】  追加のｉｌｖＣ核酸配列は、配列番号３５のヌクレオチド配列を含むか、配列番号３６に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドの相同体をコードするか（例えば、配列番号３６に示したようなアミノ酸配列を有するポリペプチドに少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上の同一性、および、前記ポリペプチドと実質的に同一の活性を有する、ポリペプチドをコードする）、ストリンジェントな条件下で、配列番号３５のヌクレオチド配列を有する核酸分子の全部または一部に、または、配列番号３６のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子の全部または一部にハイブリダイズするか、または、本明細書に示したようなｉｌｖＣヌクレオチド配列に相補的であるものを含む。
【００９９】  追加のｉｌｖＤ核酸配列は、配列番号３７のヌクレオチド配列を含むか、配列番号３８に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドの相同体をコードするか（例えば、配列番号３８に示したようなアミノ酸配列を有するポリペプチドに少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上の同一性、および、前記ポリペプチドと実質的に同一の活性を有する、ポリペプチドをコードする）、ストリンジェントな条件下で、配列番号３７のヌクレオチド配列を有する核酸分子の全部または一部に、または、配列番号３８のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子の全部または一部にハイブリダイズするか、または、本明細書に示したようなｉｌｖＤヌクレオチド配列に相補的であるものを含む。
【０１００】  追加のａｌｓＳ核酸配列は、配列番号８６のヌクレオチド配列を含むか、配列番号８７に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドの相同体をコードするか（例えば、配列番号８７に示したようなアミノ酸配列を有するポリペプチドに少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上の同一性、および、前記ポリペプチドと実質的に同一の活性を有する、ポリペプチドをコードする）、ストリンジェントな条件下で、配列番号８６のヌクレオチド配列を有する核酸分子の全部または一部に、または、配列番号８７のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子の全部または一部にハイブリダイズするか、または、本明細書に示したようなａｌｓＳヌクレオチド配列に相補的であるものを含む。
【０１０１】  別の実施形態において、単離核酸分子は、ｃｏａＸ遺伝子またはその一部または断片であるか、それを含む。１つの実施形態において、単離ｃｏａＸ核酸分子または遺伝子は、配列番号１９に示したようなヌクレオチド配列を含む（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｃｏａＸヌクレオチド配列を含む）。別の実施形態において、単離ｃｏａＸ核酸分子または遺伝子は、配列番号９に示したようなアミノ酸配列をコードする（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＣｏａＸアミノ酸配列をコードする）ヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態において、単離ｃｏａＸ核酸分子または遺伝子は、配列番号９のアミノ酸配列を有するＣｏａＸタンパク質の相同体をコードする。本明細書に使用したような「相同体」なる語は、本明細書に記載の野生型タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも約３０〜３５％、好ましくは少なくとも約３５〜４０％、より好ましくは少なくとも約４０〜５０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の同一性を共有し、前記野生型タンパク質またはポリペプチドと実質的に等価な機能的または生物的活性を有する、タンパク質またはポリペプチドを含む。例えば、ＣｏａＸ相同体は、配列番号９に示したようなアミノ酸配列を有するタンパク質と、少なくとも約３０〜３５％、好ましくは少なくとも約３５〜４０％、より好ましくは少なくとも約４０〜５０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の同一性を共有し、配列番号９として示したアミノ酸配列を有するタンパク質の実質的に等価な機能的または生物的活性を有する（すなわち機能的等価体である）（例えば、実質的に等価なパントテネートキナーゼ活性を有する）。好ましい実施形態において、単離ｃｏａＸ核酸分子または遺伝子は、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号７４または配列番号７５のいずれか１つに示したようなポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、単離ｃｏａＸ核酸分子は、配列番号１９に示したヌクレオチド配列を有する核酸分子の全部または一部にハィブリダイズするか、または、配列番号７〜１８、７４または７５のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子の全部または一部にハイブリダイズする。前記ハイブリダイゼーション条件は、当業者に公知であり、分子生物学の現在のプロトコル、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社（１９９５）第２、４および６章に見出し得る。追加のストリンジェントな条件は、分子クローニング：実験マニュアル、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、コールドスプリングハーバープレス、コールドスプリングハーバー、ＮＹ（１９８９）、第７、９および１１章に見出し得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非制限的な例は、約６５〜７０℃での４×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション（または、約４２〜５０℃での４×ＳＳＣと５０％ホルムアミド中でのハイブリダイゼーション）、次いで、約６５〜７０℃での１×ＳＳＣ中での１回以上の洗浄を含む。高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非制限的な例は、約６５〜７０℃での１×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション（または、約４３〜５０℃での１×ＳＳＣと５０％ホルムアミド中でのハイブリダイゼーション）、次いで、約６５〜７０℃での０．３×ＳＳＣ中での１回以上の洗浄を含む。低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非制限的な例は、約５０〜６０℃での４×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション（または別に、約４０〜４５℃での６×ＳＳＣと５０％ホルムアミド中でのハイブリダイゼーション）、次いで、約５０〜６０℃での２×ＳＳＣ中での１回以上の洗浄を含む。上記に列挙した数値の中間の範囲、例えば、６５〜７０℃または４２〜５０℃も、本発明により包含されるものとする。ハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液中の、ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）は、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）で代用でき；洗浄は、ハイブリダイゼーションが完了した後、１５分間実施する。５０塩基長未満であると予期されるハイブリッドにおけるハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５〜１０℃低くすべきであり、ここでのＴｍは、以下の式に従って決定する。１８塩基長未満のハイブリッドでは、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）である。１８ないし４９塩基長のハイブリッドでは、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃ％）−（６００／Ｎ）であり、ここでのＮは、ハイブリッド中の塩基の数であり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度（１×ＳＳＣについての［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）である。当業者により、遮断剤（例えば、ＢＳＡまたはサケまたはニシン精子キャリヤーＤＮＡ）、洗浄剤（例えばＳＤＳ）、キレート剤（例えばＥＤＴＡ）、フィコール、ＰＶＰ等を含むがこれに限定されない、追加の試薬を、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄緩衝液に添加して、核酸分子が、メンブラン、例えばニトロセルロースまたはナイロンメンブランに非特異的ハイブリダイゼーションするのを減少し得る。ナイロンメンブランを使用する場合、特に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の追加の好ましい非制限的な例は、約６５℃での０．２５〜０．５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、７％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、次いで６５℃での０．０２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、１％ＳＤＳでの１回以上の洗浄（例えば、ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１９９１〜１９９５参照）（または別に、０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ）である。別の好ましい実施形態において、単離核酸分子は、本明細書に示したようなｃｏａＸヌクレオチド配列に相補的である（例えば、配列番号１９に示したヌクレオチド配列の完全な相補体である）ヌクレオチド配列を含む。
【０１０２】  別の好ましい実施形態において、単離核酸分子は、ｃｏａＡ遺伝子、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｃｏａＡ遺伝子、またはその一部または断片であるか、またはそれを含む。例示的な単離ｃｏａＡ核酸分子および／または遺伝子は、（１）配列番号２０〜２２のいずれか１つに示したようなヌクレオチド配列を含む、単離ｃｏａＡ核酸分子または遺伝子；（２）配列番号３に示したようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離ｃｏａＡ核酸分子または遺伝子；（３）ＣｏａＡ相同体（例えば、配列番号３に示したアミノ酸配列と少なくとも約３０〜３５％、好ましくは少なくとも約３５〜４０％、より好ましくは少なくとも約４０〜５０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の同一であるアミノ酸配列を有し、そして、実質的に等価な酵素活性を有する、ポリペプチド）をコードする、ヌクレオチド配列を含む、単離ｃｏａＡ核酸分子または遺伝子；（４）配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５または配列番号６のいずれか１つに示したようなポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む、単離ｃｏａＡ核酸分子または遺伝子；（５）ストリンジェントな条件下で、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２２に示したヌクレオチド配列を有する核酸分子の全部または一部にハイブリダイズするか、または、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子の全部または一部にハイブリダイズする、単離核酸分子；および（６）本明細書に示したようなｃｏａＡヌクレオチド配列に相補的である（例えば、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２２に示したヌクレオチド配列の完全な相補体である）ヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子を含む。
【０１０３】  本発明の核酸分子（例えば、ｃｏａＸ核酸分子または遺伝子またはｃｏａＡ核酸分子または遺伝子）は、標準的な分子生物学の技術および本明細書に提供した配列情報を使用して単離できる。例えば、核酸分子は、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術を使用して単離できるか（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．Ｆｒｔｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ、分子クローニング：実験マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバー研究所、コールドスプリングハーバー研究所プレス、コールドスプリングハーバー、ＮＹ、１９８９に記載のように）、または、本明細書に示したｃｏａＸまたはｃｏａＡヌクレオチド配列またはそのフランキング配列に基づいて設計した合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応により単離できる。本発明の核酸（例えば、ｃｏａＸ核酸分子または遺伝子またはｃｏａＡ核酸分子または遺伝子）は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは別に染色体ＤＮＡを、鋳型および適切なオリゴヌクレオチドプライマーとして使用して、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って増幅できる。
【０１０４】  本発明のさらに別の実施形態は、変異ｃｏａＸおよびｃｏａＡ核酸分子または遺伝子を特徴とする。本明細書に使用したような「変異核酸分子」または「変異遺伝子」なる語は、前記変異によりコードされ得るポリペプチドまたはタンパク質が、野生型核酸分子または遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質とは異なる活性を示すような、少なくとも１つの変化（例えば置換、挿入、欠失）を含む、ヌクレオチド配列を有する核酸分子または遺伝子を含む。好ましくは、変異核酸分子または変異遺伝子（例えば、変異ｃｏａＡまたはｃｏａＸ遺伝子）は、類似の条件下でアッセイした場合に（例えば、同温度で培養した微生物中でアッセイする）、野生型核酸分子または遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質と比べて、活性の減少した（例えば、パントテネートキナーゼ活性の減少した）ポリペプチドまたはタンパク質をコードする。変異遺伝子はまた、ポリペプチドを全くコードしないか、または、野生型ポリペプチド産生レベルが減少している。
【０１０５】  本明細書に使用したような「活性の減少」または「酵素活性の減少」は、野生型核酸分子または遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質の活性よりも少なくとも５％低く、野生型核酸分子または遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質よりも、好ましくは少なくとも５〜１０％低く、より好ましくは少なくとも１０〜２５％低く、さらにより好ましくは少なくとも２５〜５０％、５０〜７５％、または７５〜１００％低い。上記に列挙した数値の中間の範囲、例えば、７５〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％も、本発明により包含されるものとする。本明細書に使用したような「活性の減少」または「酵素活性の減少」は、欠失または「ノックアウト」（例えば、野生型核酸分子または遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質の活性よりも約１００％低い活性）された活性も含む。活性は、特定の目的のタンパク質の活性を測定するための、任意のよく受け入れられているアッセイに従って決定できる。活性は、例えば、細胞から単離または精製したタンパク質の活性を測定して、直接的に測定またはアッセイできる。別に、活性は、細胞内で、または細胞外培地で測定またはアッセイできる。例えば、変異ｃｏａＡ遺伝子または変異ｃｏａＸ遺伝子（すなわち、パントテネートキナーゼ活性の減少をコードする前記変異体）のアッセイは、微生物で、例えば、温度感受性様式でパントテネートキナーゼを発現する変異微生物で変異遺伝子を発現し、パントテネートキナーゼ活性について温度感受性（Ｔｓ）変異体を補完する能力について変異遺伝子をアッセイすることにより行なうことができる。「パントテネートキナーゼ活性の減少」をコードするｃｏａＸ遺伝子またはｃｏａＡ変異遺伝子は、例えば、対応する野生型ｃｏａＸ遺伝子またはｃｏａＡ遺伝子よりも低い効率で、Ｔｓ変異体を補完するものである。
【０１０６】  当業者は、核酸または遺伝子配列における１つの置換でさえ（例えば、対応するアミノ酸配列中のアミノ酸変化をコードする１塩基置換）、対応する野生型ポリペプチドまたはタンパク質と比べて、コードポリペプチドまたはタンパク質の活性に劇的に影響を及ぼし得ることを認識しているだろう。本明細書に定義したような、変異核酸または変異遺伝子（例えば、変異ポリペプチドまたはタンパク質をコードする）は、容易に、上記のようなタンパク質相同体をコードする核酸または遺伝子から識別でき、ここでは、変異核酸または変異遺伝子は、活性の変化したタンパク質またはポリペプチドをコードし、野生型遺伝子または核酸を発現しているか、または、前記変異タンパク質またはポリペプチドを産生している対応する微生物に比べて、前記変異遺伝子または核酸を発現しているか、または、前記変異タンパク質またはポリペプチドを産生している微生物（すなわち変異微生物）において異なるまたは別個の表現型として所望により観察できる。これに対し、タンパク質相同体は、野生型遺伝子または核酸を発現している対応する微生物に比べて、微生物で産生された場合に、所望により表現型的に眼に見えない、同一または実質的に類似した活性を有する。従って、相同体と変異体を識別するのに役立つのは、例えば、核酸分子、タンパク質またはポリペプチドの間の配列同意度ではなく、むしろ、相同体と変異体を識別するのは、コードされたタンパク質またはポリペプチドの活性である：相同体は、例えば、低い（例えば３０〜５０％の配列同一性）配列同一性を有するが、実質的に等価な機能的活性を有する、変異体は、例えば、９９％の配列同一性を有するが、劇的に異なるまたは変化した機能的活性を有する。例示的相同体を図２０（すなわちＣｏＡ相同体）および図２３（すなわちＣｏａＸ相同体）に示す。例示的変異体は、本明細書の実施例ＸＶおよびＸＶＩＩＩに記載する。
【０１０７】  ＶＩＩＩ．組換え核酸分子およびベクター
本発明は、さらに、本明細書に記載の核酸分子および／または遺伝子（例えば、単離核酸分子および／または遺伝子）、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ遺伝子、より好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ遺伝子、さらにより好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓパントテネートキナーゼ遺伝子（例えば、ｃｏａＸ遺伝子またはｃｏａＡ遺伝子）、パントテネート生合成遺伝子（例えば、パントテネート生合成酵素をコードする遺伝子、例えば、ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードするｐａｎＢ遺伝子、ケトパントエートレダクターゼをコードするｐａｎＥ遺伝子、パントテネートシンターゼをコードするｐａｎＣ遺伝子、および／またはアスパルテート−α−デカルボキシラーゼをコードするｐａｎＤ遺伝子）、および／または、イソロイシン−バリン（ｉｌｖ）生合成酵素（例えば、アセトヒドロキシ酸シンターゼをコードするｉｌｖＢＮまたはａｌｓ遺伝子、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードするｉｌｖＣおよび／またはジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードするｉｌｖＤ遺伝子）を含む、組換え核酸分子（例えば組換えＤＮＡ分子）を特徴とする。
【０１０８】  本発明はさらに、本明細書に記載の核酸分子（例えば、単離または組換え核酸分子および／または遺伝子）を含むベクター（例えば組換えベクター）を特徴とする。特に、本明細書に記載のような細菌遺伝子産物、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ遺伝子産物、より好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ遺伝子産物、さらにより好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓパントテネート生合成遺伝子産物（例えばパントテネート生合成酵素、例えば、ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、ケトパントエートレダクターゼ、パントテネートシンターゼおよび／またはアスパルテート−α−デカルボキシラーゼ）および／またはイソロイシン−バリン生合成遺伝子産物（例えばアセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼおよび／またはジヒドロキシ酸デヒドラターゼ）をコードする核酸配列を含む組換えベクターを特徴とする。
【０１０９】  「組換え核酸分子」なる語は、組換え核酸分子を得た天然または自然核酸分子とは、ヌクレオチド配列が異なるように（例えば、１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失または置換により）、変化、修飾または工学した、核酸分子（例えばＤＮＡ分子）を含む。好ましくは、組換え核酸分子（例えば組換えＤＮＡ分子）は、調節配列に作動可能に連結した本発明の単離核酸分子または遺伝子（例えば、単離ｃｏａＸ、ｃｏａＡ、ｐａｎまたはｉｌｖ遺伝子）を含む。
【０１１０】  「組換えベクター」なる語は、組換えベクターを得た天然または自然核酸分子に含まれるものよりも多い、少ないまたは異なる核酸配列を含むように、変化、修飾または工学した、ベクター（例えばプラスミド、ファージ、ファージミド、ウイルス、コスミドまたは他の精製核酸ベクター）を含む。好ましくは、組換えベクターは、ｃｏａＸ、ｃｏａＡ、ｐａｎまたはｉｌｖ遺伝子、または、例えば本明細書に定義したようなプロモーター配列、終結因子配列および／または人工リボソーム結合部位（ＲＢＳ）に作動可能に連結した、前記ｃｏａＸ、ｃｏａＡ、ｐａｎまたはｉｌｖ遺伝子を含む組換え核酸分子を含む。
【０１１１】  「調節配列（群）に作動可能に連結」なる語は、目的の核酸分子または遺伝子のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現（例えば、増強、増加、構成性、基本、減弱、減少または抑制された発現）、好ましくはヌクレオチド配列によりコードされる遺伝子産物の発現（例えば、組換え核酸分子を、本明細書に定義したような組換えベクターに含め、微生物に導入する場合）を可能とする様式で、調節配列（群）に連結していることを意味する。
【０１１２】  「調節配列」なる語は、他の核酸配列の発現に影響を及ぼす（例えば変調または調節）核酸配列を含む。１つの実施形態において、調節配列は、天然に出現するような、例えば、天然の位置および／または配向での、目的の調節配列および遺伝子に観察されるような特定の目的の遺伝子に比べて、類似または同一の位置および／または配向で、組換え核酸分子または組換えベクターに含まれる。例えば、目的の遺伝子は、天然生物中の目的の遺伝子に随伴するかまたは隣接する、調節配列に作動可能に連結した（例えば、「天然」調節配列、例えば「天然」プロモーターに作動可能に連結した）、組換え核酸分子または組換えベクターに含めることができる。別に、目的の遺伝子は、自然生物中の別の（例えば異なる）遺伝子に随伴するか、または隣接する、調節配列に作動可能に連結した組換え核酸分子または組換えベクターに含めることができる。別に、目的の遺伝子は、別の生物からの調節配列に作動可能に連結した組換え核酸分子または組換えベクターに含めることができる。例えば、他の微生物由来の調節配列（例えば、他の細菌調節配列、バクテリオファージ調節配列等）を、特定の目的の遺伝子に作動可能に連結できる。
【０１１３】  １つの実施形態において、調節配列は、非天然または自然に存在しない配列（例えば化学合成した配列を含む、修飾、変異、置換、誘導体化、欠失した、配列）である。好ましい調節配列は、プロモーター、エンハンサー、終結シグナル、抗終結シグナルおよび他の発現制御エレメント（例えば、リプレッサーまたは誘導因子が結合する配列、および／または、例えば転写ｍＲＮＡ中における転写および／または翻訳調節タンパク質の結合部位）を含む。前記調節配列は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．分子クローニング；実験マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバー研究所、コールドスプリングハーバー研究所プレス、コールドスプリングハーバー、ＮＹ、１９８９に記載されている。調節配列は、微生物中でヌクレオチド配列の構成性発現を指令するもの（例えば、構成性プロモーターおよび強力な構成性プロモーター）、微生物中でヌクレオチド配列の誘導性発現を指令するもの（例えば、誘導性プロモーター、例えばキシロース誘導性プロモーター）、および、微生物中でヌクレオチド配列の発現を減弱または抑制するもの（例えば、減弱シグナルまたはリプレッサー配列）を含む。調節配列を除去または欠失することにより、目的の遺伝子の発現を調節することも本発明の範囲内である。例えば、転写の負の調節に関与する配列は、目的の遺伝子の発現が増強されるように除去できる。
【０１１４】  １つの実施形態において、本発明の組換え核酸分子または組換えベクターは、プロモーターまたはプロモーター配列に作動可能に連結した少なくとも１つの細菌遺伝子産物（例えば、パントテネート生合成酵素、イソロイシン−バリン生合成酵素、またはＣｏａＡ生合成酵素、例えばＣｏａＡまたはＣｏａＸ）をコードする核酸配列または遺伝子を含む。本発明の好ましいプロモーターは、Ｂａｃｉｌｌｕｓプロモーターおよび／またはバクテリオファージプロモーター（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓに感染するバクテリオファージ）を含む。１つの実施形態において、プロモーターは、Ｂａｃｉｌｌｕｓプロモーター、好ましくは強力なＢａｃｉｌｌｕｓプロモーター（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ中の生化学的ハウスキーピング遺伝子に関連したプロモーターまたはＢａｃｉｌｌｕｓ中の解糖経路遺伝子に関連したプロモーター）である。別の実施形態において、プロモーターは、バクテリオファージプロモーターである。好ましい実施形態において、プロモーターは、バクテリオファージＳＰ０１由来である。特に好ましい実施形態において、プロモーターは、Ｐ１５、Ｐ２６またはＰｖｅｇからなる群から選択され、例えば、配列番号３９、配列番号４０または配列番号４１に示したプロモーターである。追加の好ましいプロモーターは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中で高レベルの発現を促進する、ｔｅｆ（翻訳伸長因子（ＴＥＦ）プロモーター）およびｐｙｃ（ピルベートカルボキシラーゼ（ＰＹＣ）プロモーター）を含む。例えばグラム陽性微生物で使用する追加の好ましいプロモーターは、ａｍｙＥプロモーターまたはファージＳＰ０２プロモーターを含むがこれに限定されない。例えばグラム陰性微生物で使用する追加の好ましいプロモーターは、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｒ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｌａｃＩｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ＳＰ６、λ−ＰＲまたはλ−ＰＬを含むがこれに限定されない。
【０１１５】  別の実施形態において、本発明の組換え核酸分子または組換えベクターは、終結配列または終結配列群（例えば転写終結配列）を含む。「終結配列」なる語は、遺伝子の転写を終結するように作用する調節配列を含む。終結配列（またはタンデム転写終結因子）は、さらに、例えばヌクレアーゼに対して、ｍＲＮＡを安定化（例えば、ｍＲＮＡに構造を添加することにより）するように作用できる。
【０１１６】  さらに別の実施形態において、本発明の組換え核酸分子または組換えベクターは、前記配列を含むベクターの検出が可能となる配列（例えば検出および／または選択マーカー）、例えば、栄養要求変異体を克服する配列、例えば、ｕｒａ３またはｉｌｖＥ、蛍光マーカー、および／または比色マーカー（例えばｌａｃＺ／β−ガラクトシダーゼ）および／または抗生物質耐性遺伝子（例えばａｍｐまたはｔｅｔ）を含む。
【０１１７】  さらに別の実施形態において、本発明の組換え核酸または組換えベクターは、人工リボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含む。「人工リボソーム結合部位（ＲＢＳ）」なる語は、少なくとも１つのヌクレオチド分、天然ＲＢＳ（例えば自然に存在する遺伝子に見られるＲＢＳ）とは異なる、リボソームが結合する（例えば翻訳を開始するために）ｍＲＮＡ分子内の部位（例えばＤＮＡ内にコードされる）を含む。好ましい人工ＲＢＳは、約５〜６、７〜８、９〜１０、１１〜１２、１３〜１４、１５〜１６、１７〜１８、１９〜２０、２１〜２２、２３〜２４、２５〜２６、２７〜２８、２９〜３０またはそれ以上のヌクレオチドを含み、その約１〜２、３〜４、５〜６、７〜８、９〜１０、１１〜１２、１３〜１５またはそれ以上が、天然ＲＢＳ（例えば目的の遺伝子の天然ＲＢＳ）とは異なる。好ましくは、異なるヌクレオチドは、比較のために最適にアラインした場合に、それらが理想的なＲＢＳ（例えば配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７または配列番号４８）の１つ以上のヌクレオチドに同一であるように置換されている。人工的ＲＢＳを使用して、特定の遺伝子で、自然に存在すなわち天然ＲＢＳを置換できる。人工ＲＢＳは、好ましくは、特定の遺伝子の翻訳を増加させる。好ましい人工ＲＢＳ（例えば、ｐａｎＢの、例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐａｎＢの翻訳を増加するＲＢＳ）を表１Ａに示す（配列番号４９および配列番号５０）。
【０１１８】
【表１】
0005392957.tif 000002
【０１１９】  追加の好ましい人工ＲＢＳ（例えば、ｐａｎＤ、例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐａｎＤの翻訳を増加させるＲＢＳ）を表１Ｂに示す（例えば、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３および配列番号５４）。
【０１２０】
【表２】
0005392957.tif 000003
【０１２１】  追加の好ましい人工ＲＢＳ（例えば、ｐａｎＤ、例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐａｎＤの翻訳を増加させるＲＢＳ）を表１Ｃに示す（例えば、配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７）。ＰａｎＣタンパク質のＣ末端の予測したアミノ酸配列を示す。ＰａｎＤ翻訳の開始コドンに下線を付す。
【０１２２】
【表３】
0005392957.tif 000004
【０１２３】  従って、１つの実施形態において、本発明のベクターは、配列番号４９または配列番号５０に示したような人工ＲＢＳを含む。別の実施形態において、本発明のベクターは、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３または配列番号５４に示したような人工ＲＢＳを含む。さらに別の実施形態において、本発明のベクターは、配列番号５５、配列番号５６または配列番号５７に示したような人工ＲＢＳを含む。
【０１２４】  別の実施形態において、本発明の組換えベクターは、細菌中での複製を増強する配列を含む（例えば、複製増強配列）。１つの実施形態において、複製増強配列は、Ｅ．ｃｏｌｉから得られる。別の実施形態において、複製増強配列は、ｐＢＲ３２２から得られる（例えば、ｐＢＲ３２２内に含まれる配列は、図に示したようなｐＡＮベクターのいずれかの部分、すなわち、図３Ａに示したベクターの約５．０ｋＢから９．０ｋＢまでのＮｏｔＩ−ＮｏｔＩ配列から派生する）。
【０１２５】  さらに別の実施形態において、本発明の組換えベクターは、抗生物質耐性遺伝子を含む。「抗生物質耐性遺伝子」なる語は、宿主生物（例えばＢａｃｉｌｌｕｓ）に対して抗生物質に対する耐性を促進または付与する配列を含む。１つの実施形態において、抗生物質耐性遺伝子は、ｃａｔ（クロラムフェニコール耐性）遺伝子、ｔｅｔ（テトラサイクリン耐性）遺伝子、ｅｒｍ（エリスロマイシン耐性）遺伝子、ｎｅｏ（ネオマイシン耐性）遺伝子およびｓｐｅｃ（スペクチノマイシン耐性）遺伝子からなる群から選択される。本発明の組換えベクターは、さらに、相同的組換え配列（例えば、目的の遺伝子を、宿主生物の染色体に組換えることのできるように設計された配列）を含む。例えば、ａｍｙＥ配列を、宿主染色体への組換えの相同性標的として使用できる。
【０１２６】  本発明の好ましいベクターは、図２〜１５、１７、１９、２２、２５および２６に示したベクターを含むがこれに限定されない。ベクターの設計は、遺伝子工学する微生物の選択、所望の遺伝子産物の発現レベル等の因子に応じてテーラーメイドできることが当業者によりさらに理解されるだろう。
【０１２７】  ＩＸ．単離タンパク質
本発明の別の態様は、単離タンパク質（例えば、単離パントテネート生合成酵素および／またはバリン−イソロイシン生合成酵素および／または単離ＣｏＡ生合成酵素、例えば単離ＣｏａＡまたはＣｏａＸ）を特徴とする。１つの実施形態において、タンパク質（例えば、単離パントテネート生合成酵素および／またはバリンーイソロイシン生合成酵素および／または単離ＣｏａＡ生合成酵素、例えば単離ＣｏａＡまたはＣｏａＸ）を、組換えＤＮＡ技術により産生し、標準的なタンパク質精製技術を使用して、適切な精製スキームにより本発明の微生物から単離できる。別の実施形態において、タンパク質は、標準的なペプチド合成技術を使用して化学合成する。
【０１２８】  「単離」または「精製」タンパク質（例えば、単離または精製生合成酵素）は、タンパク質が得られる微生物由来の細胞物質または他の混入タンパク質を実質的に含まないか、または、化学合成した場合には化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。１つの実施形態において、単離または精製タンパク質は、約３０％（乾燥重量）未満の混入タンパク質または化学物質、より好ましくは約２０％未満の混入タンパク質または化学物質、さらにより好ましくは約１０％未満の混入タンパク質または化学物質、最も好ましくは約５％未満の混入タンパク質または化学物質を有する。
【０１２９】  好ましい実施形態において、タンパク質または遺伝子産物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓから得られる（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ由来）。「Ｂａｃｉｌｌｕｓから得られる」または「Ｂａｃｉｌｌｕｓ由来」なる語は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ遺伝子によりコードされるタンパク質または遺伝子産物を含む。好ましくは、遺伝子産物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｉｍｏｒｂｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｎｔｏｔｈｅｎｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、および、１６ＳｒＲＮＡ型により特徴づけられるような他の１群のＢａｃｉｌｌｕｓ種（Ｐｒｉｅｓｔ、上記）からなる群から選択された微生物から得られる。別の好ましい実施形態において、タンパク質または遺伝子産物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから得られる。別の好ましい実施形態において、タンパク質または遺伝子産物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓからなる群から選択された微生物から得られる。特に好ましい実施形態において、タンパク質または遺伝子産物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓから得られる（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来）。「Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓから得られる」または「Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来」なる語は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ遺伝子によりコードされる、タンパク質または遺伝子産物を含む。さらに別の好ましい実施形態において、タンパク質または遺伝子産物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ遺伝子相同体によりコードされる（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓとは別個であるが、本発明のＢａｃｉｌｌｕｓ遺伝子、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｎ遺伝子またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｉｌｖ遺伝子に有意な相同性を有する種から得られた遺伝子）。
【０１３０】  本発明の範囲内には、自然に存在する細菌および／またはＢａｃｉｌｌｕｓ遺伝子（例えばＢａｃｉｌｌｕｓ遺伝子）、例えば、本発明らにより同定された遺伝子、例えば、ＢａｃｉｌｌｕｓまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｃｏａＸ遺伝子、ｃｏａＡ遺伝子、ｐａｎ遺伝子および／またはｉｌｖ遺伝子によりコードされる、細菌由来タンパク質または遺伝子産物および／またはＢａｃｉｌｌｕｓ由来タンパク質または遺伝子産物（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来遺伝子産物）が含まれる。本発明の範囲内にはさらに、自然に存在する細菌および／またはＢａｃｉｌｌｕｓ遺伝子（例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ遺伝子）とは異なる細菌および／またはＢａｃｉｌｌｕｓ遺伝子（例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ遺伝子）、例えば、変異、挿入または欠失しているが、本発明の自然に存在する遺伝子産物に実質的に類似したタンパク質をコードする核酸を有する遺伝子によりコードされる、細菌由来タンパク質または遺伝子産物および／またはＢａｃｉｌｌｕｓ由来タンパク質または遺伝子産物（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来遺伝子産物）も含まれる。例えば、当業者は、遺伝子コードの縮重により、自然に存在する遺伝子によりコードされるものと同一のアミノ酸をコードする、核酸を変異（例えば置換）できることがよく理解される。さらに、当業者は、保存的アミノ酸置換をコードする核酸を変異（例えば置換）できることがよく理解される。当業者は、自然に存在する遺伝子産物と比べて、遺伝子産物の機能に実質的に影響を及ぼすことなく、ある程度まで、アミノ酸を置換、付加または欠失できることがさらによく理解され、その各々の場合が本発明の範囲内に含まれるものとする。
【０１３１】  好ましい実施形態において、本発明の単離タンパク質（例えば単離パントテネート生合成酵素および／または単離イソロイシン−バリン生合成酵素および／または単離ＣｏａＡ生合成酵素、例えば単離ＣｏａＡまたはＣｏａＸ）は、配列番号３、配列番号９、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８または配列番号８７に示したアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、本発明の単離タンパク質は、配列番号３、配列番号９、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８または配列番号８７として示したタンパク質の少なくとも１つの相同体である（例えば、配列番号３、配列番号９、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８または配列番号８７のアミノ酸配列に少なくとも約３０〜４０％同一、好ましくは約４０〜５０％同一、より好ましくは約５０〜６０％同一、さらにより好ましくは約６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含み、それぞれ、配列番号３、配列番号９、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８または配列番号８７のアミノ酸配列によりコードされるタンパク質の活性と実質的に類似した活性を有する。
【０１３２】  ２つのアミノ酸配列の、または２つの核酸の相同率を決定するために、最適に比較するために配列をアラインする（例えば、ギャップを、第二のアミノまたは核酸配列と最適にアラインするために、第一のアミノ酸または核酸配列の配列中に導入できる）。第一配列中の位置が、第二配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占有される場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一率は、好ましくは、最適アラインメントの作成に必要なギャップの数および前記ギャップのサイズを考慮した、配列の共有する同一位置の数の関数（すなわち同一％＝同一位置の数／位置の全数×１００）である。
【０１３３】  配列比較および２つの配列間の相同率の決定は、数学的アルゴリズムを使用して行なうことができる。配列の比較に使用する数学的アルゴリズムの好ましい非制限的な例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜７７のように修飾した、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４〜６８のアルゴリズムである。前記アルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２５：４０３〜１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に取込む。ＢＬＡＳＴヌクレオチド探索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、文字長さ＝１２を用いて実施し、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列番号を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質探索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、文字長さ＝３を用いて実施し、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較のためにギャップを入れたアラインメントを得るために、ギャップを入れたＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５（１７）：３３８９〜３４０２に記載のように利用できる。ＢＬＡＳＴおよびギャップを入れたＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォールトパラメータ（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）を使用できる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照。配列の比較に使用する数学的アルゴリズムの別の好ましい非制限的な例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ  ４：１１〜１７のアルゴリズムである。前記アルゴリズムは、例えば、フランスのＩＧＨＭｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒのＧＥＮＥＳＴＲＥＡＭネットワークサーバーで（ｈｔｔｐ：／／ｖｅｇａ．ｉｇｈ．ｃｎｒｓ．ｆｒ）またはＩＳＲＥＣ（ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ）で入手できる、ＡＬＩＧＮプログラムに取込む。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表、ギャップ長さペナルティー１２、およびギャップペナルティー４を使用できる。
【０１３４】  別の好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列間の相同率は、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、およびギャップウェイト１２、１０、８、６、または４および長さウェイト２、３または４を使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手できる）のＧＡＰプログラムを使用して決定できる。さらに別の好ましい実施形態において、２つの核酸配列間の相同率は、ギャップウェイト５０および長さウェイト３を使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手できる）のＧＡＰプログラムを使用して行なうことができる。
【０１３５】    Ｘ．生体内転換および生物変換
本発明の別の態様は、本明細書に記載の組換え微生物（例えば変異微生物）および／または単離ＣｏＡ、パントテネートまたはイソロイシン−バリン生合成酵素を特徴とする生体内変換プロセスを含む。「生体内転換プロセス」なる語（本明細書では、「生物変換プロセス」とも称する）は、ＣｏＡ、パントテネートまたはイソロイシン−バリン生合成酵素の上流にある任意の化合物（例えば中間体または産物）の、前記ＣｏＡ、パントテネートまたはイソロイシン−バリン生合成酵素の下流にある化合物（例えば基質、中間体または産物）への産生（例えば転換または変換）をもたらす、生物学的プロセス含む。
【０１３６】  １つの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのパントテネート生合成酵素を過剰発現する微生物を、少なくとも１つの適切な基質または前駆体と、前記パント−化合物が産生される条件下で接触し、前記パント−化合物を回収することを含む、パント−化合物を産生する生体内転換プロセスを特徴とする。好ましい実施形態において、本発明は、ケトパントエートレダクターゼ（ｐａｎＥ遺伝子産物）を過剰発現する微生物を、適切な基質（例えばケトパントエート）と、パントエートが産生されるような条件下で接触し、前記パントエートを回収することを含む、パントエートを産生する生体内転換プロセスを特徴とする。別の好ましい実施形態において、本発明は、ケトパントエートレダクターゼおよびパントテネートシンターゼを過剰発現する微生物を、適切な基質（例えばケトパントエートおよびβ−アラニン）と、パントテネートが産生されるような条件下で接触し、前記パントテネートを回収することを含む、パントテネートを産生する生体内転換プロセスを特徴とする。さらに別の好ましい実施形態において、本発明は、ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、ケトパントエートレダクターゼおよびパントテネートシンターゼを過剰発現する微生物を、適切な基質（例えば、α−ケトイソバレレートおよびβ−アラニン）と、パントテネートが産生されるような条件下で接触し、前記パントテネートを回収することを含む、パントテネートを産生する生体内転換プロセスを特徴とする。上記の生体内転換を実施するのに好ましい組換え微生物は、パントテネートキナーゼ変異体を含む。パントエートまたはパントテネートが産生される条件は、それぞれパントエートまたはパントテネートの所望の産生が生じる任意の条件を含み得る。
【０１３７】  さらに別の実施形態において、本発明は、アスパルテート−α−デカルボキシラーゼを過剰発現する微生物を、β−アラニンが産生されるような条件下で培養することを含む、β−アラニンの産生法を特徴とする。好ましくは、アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ過剰発現微生物は、ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、ケトパントエートレダクターゼおよびパントテネートシンターゼからなる群から選択されたパントテネート生合成酵素をコードする核酸配列に変異を有する。
【０１３８】  本発明はさらに、アスパルテートを含む組成物を、単離Ｂａｃｉｌｌｕｓアスパルテート−α−デカルボキシラーゼ酵素と、β−アラニンが産生されるような条件下で（例えばインビトロ合成法）接触することを含む、β−アラニンの産生法を特徴とする。
【０１３９】  生体内転換反応に使用する微生物（群）および／または酵素は、その目的の機能（例えば、所望の化合物を産生する）を実施することができる形である。微生物は、全細胞でも、または、所望の最終結果を得るために必要な細胞の一部のみでもよい。微生物は、懸濁するか（例えば、緩衝溶液などの適切な溶液または培地）、濯ぐか（例えば、微生物の培養からの培地を含まないように濯ぐ）、アセトンで乾燥するか、固定するか（例えば、ポリアクリルアミドゲルまたはｋ−カラゲナンまたは合成支持体上、例えばビーズ、マトリックス等上）、固定するか、架橋するか、または透過処理できる（例えば、メンブランおよび／または壁を透過処理し、よって、化合物、例えば基質、中間体または産物が、前記メンブランまたは壁を通って容易に通過できるようにする）。
【０１４０】  精製または未精製ＣｏＡ生合成酵素（群）（例えばＣｏａＡおよび／またはＣｏａＸ）パントテネート生合成酵素（群）および／またはバリン−イソロイシン生合成酵素（群）も、生体内転換プロセスに使用できる。酵素は、その目的の機能（例えば所望の化合物を得る）を実施できる形であり得る。例えば、酵素は、遊離形であるか、または固定され得る。精製または未精製ＣｏＡ生合成酵素（群）、パントテネート生合成酵素（群）および／またはバリン−イソロイシン生合成酵素（群）は、所望の産物が産生されるように、１つ以上のインビトロ反応で、適切な基質（群）と接触できる。
【０１４１】  少なくとも上記の方法論に関して（例えば、本発明の産生方法論）、本発明の少なくとも１つの態様は以下を特徴とする：方法はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の微生物および／またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の微生物を使用しない実施形態；方法は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからなる群から選択される微生物を使用しない実施形態；方法は、グラム陰性微生物を使用しない実施形態；利用する微生物は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の微生物および／またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の微生物から得られた、核酸分子、遺伝子またはタンパク質（例えば生合成酵素）を含有、発現、または産生しない実施形態；微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからなる群から選択される微生物から得られる核酸分子、遺伝子またはタンパク質（例えば生合成酵素）を含有、発現または産生しない実施形態。
【０１４２】  ＸＩ．スクリーニングアッセイ
ＣｏＡは、細菌の必須因子であるので、ＣｏＡの生合成に関与するタンパク質（例えば酵素）は、新規抗生物質の探索に価値あるツールを提供する。特に、ＣｏａＸタンパク質は、殺細菌化合物の同定の価値ある標的である。なぜなら、それは、哺乳動物パントテネートキナーゼ酵素に一次配列が、全く似ていないからである。従って、本発明はまた、モジュレーター、すなわち、ＣｏａＸに結合するか、または、例えばｃｏａＸ発現またはＣｏａＸ活性に対して刺激または阻害作用を有する、候補または試験化合物または物質（例えばペプチド、ペプチド模倣体、小分子または他の薬物）を同定する方法（本明細書では「スクリーニングアッセイ」とも称する）を提供する。
【０１４３】  １つの実施形態において、本発明は、ＣｏａＸタンパク質または生物学的に活性なその一部に結合できる、候補または試験化合物をスクリーニングするアッセイを提供する。別の実施形態において、本発明は、ＣｏａＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を変調する、候補または試験化合物をスクリーニングするアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、生物学的ライブラリー；空間を指定可能な平行固相または液相ライブラリー；デコンボルーションを必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；および、アフィニティークロマトグラフィー選択を使用した合成ライブラリー法を含む、当分野で公知のコンビナトリアルライブラリーの多くのアプローチのいずれかを使用して得ることができる。生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されるが、一方、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは小分子の化合物ライブラリーに適用できる（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５）。
【０１４４】  分子ライブラリーの合成法の例は、例えば、ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２：Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３に見出し得る。化合物ライブラリーは、溶液中（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２〜４２１）、またはビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２〜８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５〜５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ米国特許第’４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５〜１８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８０〜３９０）；（Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｃｎｅ  ２４９：４０４〜４０６）；（Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８〜６３８２）；（Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１〜３１０）；（Ｌａｄｎｅｒ上記）に見出し得る。
【０１４５】  １つの実施形態において、アッセイは、ＣｏａＸタンパク質または生物学的に活性なその一部を発現する組換え微生物を、試験化合物と接触させ、試験化合物がＣｏａＸ活性を変調する能力を決定する、微生物をベースとしたアッセイである。試験化合物のＣｏａＸ活性の変調能の決定は、例えば、細胞内ホスホパントエートまたはＣｏＡ濃度または分泌パントテネート濃度（ＣｏａＸを阻害する化合物は、試験微生物でパントテネートを構築するので）をモニタリングすることにより行なうことができる。ＣｏａＸ基質は、放射性同位体または酵素標識で標識でき、よって、ＣｏａＸ活性の変調を、標識基質から、中間体または産物への変換の検出により決定できる。例えば、ＣｏａＸ基質は、３２Ｐ、１４Ｃ、または３Ｈで、直接的にまたは間接的に標識でき、放射性同位体を、放射線放出の直接的計測により、またはシンチレーション計測により検出できる。化合物のＣｏａＸ活性変調能の決定は、別に、レポーター遺伝子（検出マーカー、例えばルシフェラーゼをコードする核酸に作動可能に連結した、ＣｏＡ応答性調節エレメントを含む）の誘導の検出により、または、ＣｏＡ調節細胞応答の検出により決定できる。
【０１４６】  さらに別の実施形態において、本発明のスクリーニングアッセイは、ＣｏａＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分をインビトロで試験化合物と接触させ、試験化合物が、ＣｏａＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分への結合能またはその活性の変調能を決定する、細胞非含有アッセイである。好ましい実施形態において、アッセイは、ＣｏａＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、既知の基質と接触させ、アッセイ混合物を形成し、アッセイ混合物を試験化合物と接触させ、そして試験化合物の、その基質上のＣｏａＸの酵素活性変調能を決定することを含む。
【０１４７】  スクリーニングアッセイは、微生物、タンパク質、および／または反応物を含むのに適した任意の容器中で行ない得る。前記容器の例は、マイクロタイタープレート、試験管、および微量遠心管を含む。本発明の上記のアッセイ法の１つより多い実施形態において、ＣｏａＸタンパク質またはＣｏａＸタンパク質を発現している組換え微生物を固定し、産物および／または基質の分離を容易にし、並びに、アッセイの自動化を実行することが望ましくあり得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＣｏａＸ融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（ＭＯ州セントルイス所在シグマケミカル）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着できる。マトリックス上にタンパク質を固定する他の技術（例えば、ビオチン−コンジュゲーションおよびストレプトアビジン固定または抗体コンジュゲーション）を、本発明のスクリーニングアッセイに使用できる。
【０１４８】  別の実施形態において、ＣｏａＸ発現のモジュレーターを、細胞を候補化合物と接触させ、細胞中のｃｏａＸｍＲＮＡまたはＣｏａＸポリペプチドの発現を決定する方法で同定する。候補化合物の存在下での発現レベルを、候補化合物の非存在下での発現レベルと（または、適切な対照と、例えば、適切な緩衝液対照または標準と）比較する。次いで、候補化合物を、この比較に基づいて、ｃｏａＸｍＲＮＡまたはＣｏａＸポリペプチド発現のモジュレーターとして同定できる。
【０１４９】  本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイにより同定した新規物質に関する。従って、適切な動物モデルで本明細書に記載のように同定した物質をさらに使用することは本発明の範囲内である。例えば、本明細書に記載のように同定したＣｏａＸ変調剤（例えば、抗殺細菌化合物）を、感染動物モデルで使用して、前記物質での処理の効力、毒性、または副作用を決定できる。
【０１５０】  本発明はさらに、以下の実施例によりさらに説明され、これは限定と捉えるべきではない。全ての参考文献、特許、特許出願（本願が関する、１９９９年９月２１日に提出された米国特許出願番号第０９／４００，４９４号（係属中）、２０００年６月７日に提出された仮米国特許出願番号第６０／２１０，０７２号、２０００年７月２８日に提出された仮米国特許出願番号第６０／２２１，９３８号および２０００年８月２４日に提出された仮米国特許出願番号第６０／２２７，８６０号を含む）および本願全体で引用した公開特許出願を参照してここに組み込まれる。
【０１５１】  実施例
一般的方法論：
株：本発明のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ株は、一般に、２つの株のいずれかから得られる。第一は、「１６８」、「１Ａ１」または「ＲＬ−１」と様々に命名される。遺伝子型はｔｒｐＣ２である。この株は、野生型「Ｍａｒｂｕｒｇ」株から変異誘発により得られ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに関して実施された多くの分子生物学研究の基礎である。第二の株は、野生型Ｗ２３株から形質導入によりＴｒｐ＋となった、１６８の屈光性誘導体である、ＰＹ７９である。
【０１５２】  培地。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの標準的な最小培地は、１×Ｓｐｉｚｉｚｅｎ塩および０．５％スクロースからなる。標準的な固形「強化培地」は、トリプトン血液寒天ブロス（ディフコ）であり、標準的な液体「強化培地」は、ビールインヒュージョンブロスおよび酵母抽出物の混合物であるＶＹである。液体試験管培養液中でのパントテネートの産生を試験するために、「特別ＶＹ」すなわち「ＳＶＹ」と称される、強化形のＶＹを使用する。バッチ発酵のために、ＳＶＹＧおよびＰＥＭＧを使用する。これらの培地の組成を以下に示す。
【０１５３】  ＶＹ、強化液体培地：２５ｇのディフコビールインヒュージョンブロス、５ｇのディフコ酵母抽出物、１Ｌの水（オートクレーブ）。
【０１５４】  ＴＢＡＢ、強化固体培地：３３ｇのディフコトリプトン血液寒天ブロス、１Ｌの水（オートクレーブ）。
【０１５５】  ＭＩＮ、最小培地：１００ｍｌの１０×Ｓｐｉｚｉｚｅｎ塩；１０ｍｌの５０％グルコース；２ｍｌの１０％アルギニンＨＣｌ*；１０ｍｌの０．８％トリプトファン**：水で１リットルとする（*ある場合では、アルギニンを省略するか、または、０．０４％の最終濃度のグルタミン酸ナトリウムと交換する。一般に、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓは、アルギニン、グルタミン、グルタメート、またはプロリンなどの特定のアミノ酸を補助窒素源として添加すると、最小培地中でより速く増殖する。）（**トリプトファン栄養要求性の株では、トリプトファンを、慣用的には、大半の最小培地に添加する。）
【０１５６】  １０×Ｓｐｉｚｉｚｅｎ塩：１７４ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ；２０ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４；６０ｇのＫＨ２ＰＯ４；１０ｇのクエン酸Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ；２ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；水で９９３ｍｌとする；次いで、３．５ｍｌのＦｅＣｌ３溶液および３．５ｍｌの微量元素溶液を添加する。
【０１５７】  ＦｅＣｌ３溶液：４ｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ；１９７ｇのクエン酸Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ；水で１リットルとする（ろ過滅菌）。
【０１５８】  微量元素溶液：０．１５ｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ；２．５ｇのＨ３ＢＯ３；０．７ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；０．２５ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；１．６ｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；０．３ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；水で１リットルとする（ろ過滅菌）。
【０１５９】  ＳＶＹ、特別ＶＹ、試験管培養液中でのパントテネート産生を試験するために補助*した強化培地：２５ｇのディフコビールインヒュージョンブロス；５ｇのディフコ酵母抽出物：５ｇのグルタミン酸ナトリウム；２．７ｇの硫酸アンモニウム；７４０ｍｌの水（オートクレーブ）；２００ｍｌの１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７．０）を添加；６０ｍｌの５０％グルコース。（*液体ＳＶＹ試験管培養液中のパントテネート産生を試験するために、Ｎａα−ケトイソバレレートおよび／またはβ−アラニンを添加して、ろ過滅菌ストックから５ｇ／Ｌの濃度とできる。
【０１６０】  ＰＦＭＧ、発酵槽に使用する酵母抽出物をベースとした培地：２０ｇのＡｍｂｅｒｅｘ１００３（登録商標）酵母抽出物；５ｇのグルタミン酸ナトリウム、２ｇの硫酸アンモニウム；５ｇのトリプトファン；１０ｇのＫＨ２ＰＯ４；２０ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ；１ｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；０．１ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；１ｇのクエン酸ナトリウム；０．０１ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１ｍｌの微量元素溶液；２０ｇのグルコース；水を添加して１Ｌとする。グルコースまたは他の糖は、必要であれば供給する。供給溶液は、ミネラル、規定または食物等級の栄養分を含むことができる。
【０１６１】  ＰＦ、パントテネート栄養要求性を試験するための、化学的に規定されたパントテネート非含有培地：１００ｍｌの１０×Ｓｐｉｚｉｚｅｎ塩；１００ｍｌの１×ディフコパントテネートアッセイ培地；１０ｍｌの５０％グルコース；水を添加して１リットルとする。
【０１６２】  パントテネート栄養要求体のために、１ｍＭのパントテン酸Ｎａを、最小培地および強化培地の両方に加える。なぜなら、一般に、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐａｎ変異体を支持するに十分なパントテネートが強化培地には存在しないからである。アミノ酸は、使用する場合、１リットルあたり１００ｍｇである。抗生物質耐性の選択は、５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール、１００ｍｇ／ＬのスペクチノマイシンＨＣｌ、１５ｍｇ／ＬのテトラサイクリンＨＣｌまたは１ｍｇ／Ｌのエリスロマイシンと２５ｍｇ／Ｌのリンコマイシンを用いて実施する。
【０１６３】  パントテネートアッセイ：生物学的アッセイ：指標生物のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍは、増殖にパントテネートを必要とし、低濃度（μｇ／Ｌ）に応答する。従って、連続希釈液を使用して、種々の濃度をアッセイできる。市販の培地（例えば、パントテネートアッセイ培地（ＰＡＭ）、ディフコ）を使用できる。しかし、パントテネートを補充したディフコＰＡＭは、ディフコにより明記される個々の成分からなる、新しく混合したバージョンのパントテネートアッセイ培地（ＦＭ−ＰＡＭ）を使用して得られるのと同じレベルまで増殖を支持せず、従って、これは市販の製品の代わりに慣用的に使用される。
【０１６４】  Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ培養上清をアッセイする前に、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞を、除去または殺滅しなけれならない。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ培養上清は、上清を滅菌ろ過した場合と比べて、上清をオートクレーブにかけた場合、ほぼ同じパントテネート力価を示す。従って、慣用的な手順は、生物学的アッセイの前に５分間、試料をオートクレーブにかけることを含む。
【０１６５】  パントテネートアッセイ：ＨＰＬＣアッセイ。パントテン酸産生は、１９７ｎｍの検出波長および４５０ｎｍの標準物質を用いて、ＨＰＬＣにより測定する。手順は、水溶性ビタミンについて、ヒューレットパッカードにより推奨されるものの変形である。培養ブロスの試料を、等量の６０％アセトニトリル（ＡＣＮ）に希釈し、遠心分離し、ろ過する。典型的には、分析前にさらなる１０倍希釈により、最終希釈度は２０倍となる。より高濃度の産物をさらに希釈する。化合物を、Ｃ１８  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ５μＡｑｕａ２５０×４．６ｍｍカラムで、５％アセトニトリル（ＡＣＮ）を用いて、ｐＨ２．５の５０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液中で分離する。５％から９５％のＡＣＮ勾配が、各試料間のカラムを洗浄する。パントテネートピークの面積は、５ないし１０００ｍｇ／Ｌの濃度に比例する。他のパント−化合物も分離し、この方法により定量する。
【０１６６】  アミノ酸分析：ＨＰＬＣアッセイ。発酵培地中および発酵を通じて存在するアミノ酸を、３３８ｎｍの検出波長および３９０ｎｍの標準物質を用いてＨＰＬＣにより測定する。手順は、アミノ酸分析について、ヒューレットパッカードにより推奨されるものの変形である。培養ブロスの試料を、パント−化合物の分析と同様に調製する。化合物を、Ｃ１８Ｈｙｐｅｒｓｉｌ５μＯＤＳ２００×２．１ｍｍカラムで分離する。溶媒Ａは、ｐＨ７．２の２０ｍＭ酢酸Ｎａ緩衝液である。溶媒Ｂは、４０％ＡＣＮおよび４０％メタノールを含む。１００％溶媒Ａから１００％溶媒Ｂまでの勾配により、アミノ酸は分離し、各試料間のカラムを洗浄する。
【０１６７】  バッチ発酵。パントテネート産生株を、撹拌タンク発酵槽、例えばＣＦ３０００Ｃｈｅｍａｐ１４リットル容器中で、１０リットルの作業容量を用いて増殖する。コンピューター制御およびデータ収集は、市販のソフトウェア、例えばＢ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＭＦＣＳソフトウェアによる。発酵はバッチプロセスであり得るが、好ましくは、糖の限定された供給バッチプロセスである。いくつかの培地成分（例えばＳＶＹＧおよびＰＭＦＧ）を発酵槽に加え、その場で滅菌する。培地の一部を別々に滅菌し、発酵槽に無菌的に添加する。この手順は、当業者には公知である。供給物中の追加の窒素源を別々に滅菌し、冷却後に炭素源に添加する。
【０１６８】  培地中の最初の糖は、約６時間で消費する。その後、グルコースまたは他の糖を、ミネラル、および規定または食物等級の栄養分のあり得る添加と共に、供給する。別に、供給は、以前の発酵から採取した試料の栄養要求の共通プロフィルに基づいて計画する。
【０１６９】  接種後、撹拌を、比較的低い速度、例えば２００ｒｐｍに設定する。溶解した酸素（ｐＯ２）が３０％に下降すると、コンピューター制御は自動的に、撹拌を調整し、溶解した酸素濃度を２５ないし３０％ｐＯ２に維持する。
【０１７０】  実施例Ｉ：ｐａｎＢＣＤ遺伝子産物を過剰発現する細菌を使用した、パント−化合物の産生増強
本実施例は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐａｎＢＣＤオペロンのクローニング、および、ｐａｎＢＣＤ遺伝子産物を過剰発現する微生物の作成を記載する。
【０１７１】  Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐａｎＢＣＤオペロンをクローニングするために、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＧＰ２７５（１６８の誘導体）ゲノムＤＮＡのプラスミドライブラリーを、Ｅ．ｃｏｌｉＢＭ４０６２（ｂｉｒＡｔｓ）に形質転換し、温度耐性クローンを４２℃で選択した。ゲノム配列に対して制限地図を比較することにより、１つの特定のクローンが、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｂｉｒＡ遺伝子および隣接ｐａｎＢＣＤ遺伝子を含むと推定された。このプラスミドはｐＡＮ２０１と命名した。
【０１７２】  ｐａｎＢＣＤオペロンを過剰発現し、パントテネートを産生するために、ｐａｎＢＣＤオペロンの天然プロモーターを、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓバクテリオファージＳＰ０１から得られた２つの強力な構成性プロモーターのいずれかと交換した。これらの２つのプロモーターはＰ２６およびＰ１５と命名する。さらに、２つの人工リボソーム結合部位（ＲＢＳ）のいずれかを使用して、天然ｐａｎＢ  ＲＢＳと交換した。これらの２つの人工ＲＢＳ（配列番号４９および配列番号５０として示す）は、ｐａｎＢＣＤの翻訳を増加すると推定され；その配列を表１Ａに示す。３つの前記工学ｐａｎＢＣＤ発現カセットを、Ｅ．ｃｏｌｉ中で複製できる環式プラスミドに構築した。プラスミドの他の特徴は、Ｔ１Ｔ２と称される、Ｅ．ｃｏｌｉリボソームＲＮＡ転写単位からの強力なｒｈｏ依存的転写終結因子、ｐＣ１９４から得られたグラム陽性クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）、および、Ｅ．ｃｏｌｉレプリコンと、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓへの組込みを目的としたセグメントの間の接合部での１対のＮｏｔＩ制限部位を含む。このシリーズの３つのプラスミド、ｐＡＮ００４、ｐＡＮ００５、およびｐＡＮ００６を作成した。ｐＡＮ００４は、Ｐ２６プロモーター、ＲＢＳ１、およびコピー数の低いＥ．ｃｏｌｉレプリコンを含む。ｐＡＮ００５は、Ｐ１５プロモーターを含み、これは、我々の経験では、Ｐ２６、ＲＢＳ１およびコピー数の低いレプリコンほど強力ではない。ＰＡＮ００６は、Ｐ２６プロモーター、ＲＢＳ２およびコピー数の中程度なレプリコンを含む。
【０１７３】  上記の３つのプラスミドに含まれる３つのｐａｎＢＣＤ発現カセットを、全て、天然ｐａｎＢ遺伝子のすぐ上流に天然に存在する配列からなるＤＮＡ断片にライゲートし、野生型オペロンを置換して、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＲＬ−１およびＰＹ７９株のｐａｎＢＣＤ遺伝子座への相同的組換えにより１コピーで組込んだ。これを２段階で行なった。第一に、約３分の２のｐａｎＢコード領域を、グラム陽性スペクチノマイシン耐性遺伝子（ｓｐｅｃ）と交換する、欠失置換を、ｐａｎＢに組込み、Ｓｐｅｃ−のパントテネート栄養要求体を生成した。次いで、これらの中間体株を、それらを、ｐａｎＢのちょうど上流の染色体配列を含むＤＮＡ断片にライゲートした後に、ｐＡＮ００４、ｐＡＮ００５およびｐＡＮ００６のｐａｎＢＣＤ発現カセットで形質転換した。来るカセットの選択は、パントテネート原栄養体についてであった。得られた株は、それぞれＰＡ２２１、ＰＡ２２２およびＰＡ２２３（ＲＬ−１から）、およびＰＡ２３５、ＰＡ２３２およびＰＡ２３３（ＰＹ７９から）であった。ＰＡ２２１での組込み株にある、接続された上流配列を含む、プラスミドの一例は、ｐＡＮ２４０である（図２参照）。ｐＡＮ２４０のヌクレオチド配列は、配列番号７６として示す。
【０１７４】  適切なプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応を使用して、これらの工学株の正しい染色体構造を確認した。ＰＡ２２１株の抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べると、２つのタンパク質が、過剰発現されていることが判明した。一方のタンパク質は、２９，０００の見かけの分子量を有し、他方のタンパク質は、３９，０００ダルトンのようであった。２９，０００ダルトンバンドはおそらくＰａｎＢ（予測分子量２９，７６１）である。より大きなタンパク質バンドはおそらくＰａｎＣ（予測サイズ３１，９６０ダルトン）を示す。
【０１７５】  これらの株が、試験管培養液中でパントテネートを産生できることは、以下のように評価した。各株を、５ｇ／Ｌのα−ケトイソバレレート（α−ＫＩＶ）および５ｇ／Ｌのβ−アラニンで補充したＳＶＹ培地中で増殖し、これらの前駆体が限定因子にならないようにした。培養上清をオートクレーブにかけ、バイオアッセイを使用してアッセイした。ＲＬ−１およびＰＹ７９の親株と比べて、工学株は、約８から３０倍のパントテネートを産生し、１ｇ／Ｌのパントテネートが得られる場合もあった。
【０１７６】
【表４】
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【０１７７】  Ｐ２６プロモーターは、Ｐ１５プロモーターよりも約３から４倍より効果的であり、一方、ＲＢＳ１およびＲＢＳ２は、ほぼ等価であった。ｐＡＮ００４、ｐＡＮ００５、ｐＡＮ００６などのプラスミドは、キャンプベル型（単一クロスオーバー）組込みによるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ野生型ｐａｎＢＣＤ遺伝子座に環状として組込むことができ、５ｍｇ／Ｌでクロラムフェニコール耐性について選択できる。このように得られた株は、それぞれＰＡ２２１、ＰＡ２２２およびＰＡ２２３株とほぼ同じ量のパントテネートを産生する。Ｐ２６プロモーター、ＲＢＳ１およびコピー数の低いＥ．ｃｏｌｉレプリコンを含むｐＡＮ００４を、図３Ａに図で示す。プラスミドｐＡＮ００４のヌクレオチド配列を配列番号９３として示す。Ｐ２６プロモーター、ＲＢＳ２およびコピー数の中程度なＥ．ｃｏｌｉレプリコンを含むｐＡＮ００６を図３Ｂに図で示す。プラスミドｐＡＮ００６のヌクレオチド配列は、配列番号９４として示す。ｐａｎＢＣＤのヌクレオチド配列は、配列番号５９として示し、ＰａｎＢ、ＰａｎＣおよびＰａｎＤの予測アミノ酸配列は、配列番号２４、配列番号２６および配列番号２８としてそれぞれ示す。Ｂａｃｉｌｌｉの操作法は、例えば、英国チチェスター所在Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社のＨａｒｗｏｏｄ，Ｃ．Ｒ．およびＣｕｔｔｉｎｇ，Ｓ．Ｍ．（著）、Ｂａｃｉｌｌｕｓの分子生物学的方法（１９９０）により記載され、その内容を参照してここに組み込まれる。
【０１７８】  実施例ＩＩ：ｐａｎＥ１遺伝子産物−ケトパントエートレダクターゼを過剰発現する細菌を使用した、パント−化合物産生の増強
本実施例は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐａｎＥ１遺伝子のクローニングおよびｐａｎＥ１遺伝子産物を過剰発現する微生物の作成を記載する。
【０１７９】  Ｐａｎ−Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株（例えば、パントテン酸の合成で遮断されるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ変異体）が以前に単離され、その１つが、ケトパントエートレダクターゼ活性に影響を及ぼすと報告された（Ｂａｉｇｏｒｉら（１９９１）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：４２４０〜４２４２）。しかし、これらの株の変異は、ｐａｎＥまたはｐａｎＢＣＤ遺伝子を含まない、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ遺伝子地図のｐｕｒＥ−ｔｒｅ間隔に不正確にマッピングされた。さらに以下に示したように、ｐａｎＥ変異体はＰａｎ−表現型を有さない。なぜなら、ｉｌｖＣ遺伝子産物は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの他の細菌株と同じようにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて、ｐａｎＥ遺伝子産物の代用ができるからである。より近年には、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｕｉｍ  ｐａｎＥ遺伝子が位置づけられ、嫌気性プリン生合成に必要な遺伝子である、ａｐｂＡの対立遺伝子であることが決定された（Ｆｒｏｄｙｍａら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：５５７２〜５５７６）。Ｅ．ｃｏｌｉは、同じ地図位置で高度に相同な遺伝子を有する。Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｕｉｍにおけるｐａｎＥ遺伝子の同定は、ｉｌｖ遺伝子産物であるアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼも、ケトパントエートレダクターゼ反応を実施できるという事実により複雑化した。結果として、パントテネート栄養要求性は、ｐａｎＥおよびｉｌｖＣの両方が変異しなければ得られない。
【０１８０】  Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐａｎＥ１遺伝子を同定するために、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムを、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｕｉｍ  ＡｐｂＡ（ＰａｎＥ）のタンパク質配列を使用して探索し、２つのオープンリーディングフレームを、ｙｌｂＱおよびｙｋｐＢと命名されたＡｐｂＡに対する相同性を有すると同定された。これらの遺伝子は、パントテネート生合成におけるその提案された機能に因り、ｐａｎＥ１およびｐａｎＥ２と再度命名された。ｐａｎＥ１およびｐａｎＥ２の両方が、鋳型としてＲＬ−１ゲノムＤＮＡから作成されたＰＣＲ産物としてクローニングされた。両方の遺伝子が、スペクチノマイシン耐性遺伝子（ｓｐｅｃ）またはクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）のいずれかにより破壊された。中断遺伝子は、各々、ＰＹ７９への二重クロスオーバーにより組込まれ、ＰＡ２４０（ΔｐａｎＥ１：：ｓｐｅｃ）およびＰＡ２４１（ΔｐａｎＥ２：：ｃａｔ）が得られた。これらの株のどちらも、パントテネート非含有（ＰＦ）プレート上で試験すると、パントテネート栄養要求体ではなかったが、ΔｐａｎＥ１：：ｓｐｅｃを含むＰＡ２４０は、１ｍＭのパントテネート補充物の存在下よりも、パントテネートを添加せずにＴＢＡＢ上での方が、僅かによりゆっくりと増殖した。比較により、ΔｐａｎＢ：：ｓｐｅｃ株は、ＴＢＡＢ上で単一のコロニーを産生せず、おそらくこれは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓは、パントテネートの活発な取込み系を有していないからであろう。
【０１８１】  Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ遺伝子のｉｌｖＣは、Ｅ．ｃｏｌｉで示されたように、ｐａｎＥに機能できると仮定された。従って、ｐａｎＥ１およびｐａｎＥ２破壊は、ｔｒｐＣ２ｉｌｖ４ｌｅｕＣ１２４であると報告された、ＣＵ５５０株に導入した。単一のｐａｎＥ１および二重ｐａｎＥ１、ｐａｎＥ２破壊物の両方が、ＰＦ培地上でパントテネート栄養要求体であった。
【０１８２】
【表５】
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【０１８３】  従って、ｐａｎＥ１およびｉｌｖＣの両方の変異により、パントテネート栄養要求体となり、一方、ｐａｎＥ１のみの変異は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｕｉｍで報告されたのと類似して、パントテネート栄養要求体とならない。
【０１８４】  次に、パントテネート過剰産生株（本明細書に記載のＰＡ２３５）におけるｐａｎＥ１およびｐａｎＥ２ノックアウトの定量効果を調べた。ｐａｎＥ１およびｐａｎＥ２破壊物をＰＡ２３５に、単独でまたは共に導入し、ＰＡ２４５（ΔｐａｎＥ１：：ｓｐｅｃ）、ＰＡ２４８（ΔｐａｎＥ２：：ｃａｔ）およびＰＡ２４４（ΔｐａｎＥ１：：ｃａｔ、ΔｐａｎＥ２：：ｓｐｅｃ）を産生した。次いで、パントテネート産生に対する各変異の効果を液体試験管培養液中で試験した。
【０１８５】
【表６】
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【０１８６】  従って、検出分析により、ｐａｎＥ１遺伝子は、パントテネート産生の９０％以上に寄与し、一方、ｐａｎＥ２の検出は、パントテネート産生に対して有意な効果を示さなかった。それ故、ｐａｎＥ１は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中のケトパントテネートレダクターゼ活性の大半を占めるが、必ずしも全てを占めるわけではないと結論づけられる。ケトパントエートレダクターゼ活性の残りは、ｉｌｖＣにより供給されると予測される。
【０１８７】  ｐａｎＥ１をパントテネート産生に重要な遺伝子と同定したので、ｐａｎＥ１発現の増加を試験して、ＰＡ２２１またはＰＡ２３５などの株でパントテネート産生を増強できるかどうかを決定した。ｐａｎＥ１コード配列を、ｂｐｒ遺伝子座（非必須プロテアーゼ遺伝子）またはクローニングした挿入断片の遺伝子座で組込みおよび増幅するように設計されたベクターのｐＯＴＰ６１において、Ｐ２６プロモーターおよびＲＢＳ２の下流に設置した。得られたプラスミドｐＡＮ２３６（図４）をＰＡ２２１に形質転換し、１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンに対する耐性について選択する。ｐＡＮ２３６のヌクレオチド配列を配列番号７７として示す。ＰＡ２３６と称される１つの形質転換体をさらなる試験のために選択した。
【０１８８】  ＰＡ２３６は、約３１，０００ダルトンのタンパク質を過剰発現することが示され、これは、ｐａｎＥ１タンパク質に期待された分子量３３，２９０ダルトンに近い。簡潔には、全細胞抽出物を、ＰＹ７９、ＲＬ−１、ＰＡ２２１、ＰＡ２２１／ｐＯＴＰ６１およびＰＡ２３６（２試料）から調製した。細胞抽出物をゲル電気泳動により分離し、ゲルをクーマシー染色して、タンパク質を可視化した。ｐａｎＥ（ＰＡ２３６−１およびＰＡ２３６−２）を過剰発現するように工学した細胞において、約３１，０００ダルトン（分子量マーカーと比較して）のおよその分子量を有するバンドが見えた。さらに、ＰＡ２２１およびＰＡ２３６は、ｐａｎＢ遺伝子産物に対応する、約２９，０００ダルトンバンド、および、ｐａｎＣ遺伝子産物におそらく対応する約３９，０００ダルトンバンドの増加したレベルを発現した。さらに、ｐＡＮ００６（図３Ｂ）で形質転換したＥ．ｃｏｌｉは、ｐａｎＢおよびｐａｎＣ遺伝子産物に関連したバンドを発現し、ＰＡＮ２３６でトランスフェクトしたＥ．ｃｏｌｉは、ｐａｎＥ遺伝子産物に対応する約３１，０００ダルトンバンドを発現した。
【０１８９】  次に、ＰＡ２３６を、５ｇ／Ｌのβ−アラニンおよび５ｇ／Ｌのα−ＫＩＶで補充した液体試験管培養液中のパントテネート産生について、空のベクターｐＯＴＰ６１を有するＰＡ２２１と比較した。
【０１９０】
【表７】
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【０１９１】  ｐａｎＥ１の過剰発現により、親株と比べて、パントテネート産生の２倍の増加が起こり（例えば、２ｇ／Ｌより僅かに高い）、一方、ｐａｎＥ２の過剰発現により、親株よりも約３５％低いパントテネートを産生する株が得られた。ｐａｎＥ１ヌクレオチド配列および予測アミノ酸配列を配列番号２９および配列番号３０として示す。
【０１９２】  実施例ＩＩＩ：バリンの存在下でｐａｎＥ１またはｐａｎＢＣＤを過剰発現する細菌を培養することによる、パント−化合物の産生の増強
ｐａｎＢＣＤオペロンおよびｐａｎＥ１を過剰発現するように工学した株において、バリンが培地補充物として（例えば、α−ＫＩＶの代用物として）機能できるかを、評価した。バリンは、アミノ基転移によりα−ＫＩＶに密接に関連し、α−ＫＩＶより安価であり、キログラムの量で市販で入手できる。バリンは、ＳＶＹ培地中の標準的な液体試験管培養液中で、α−ＫＩＶを代用する。バリンの濃度は５から５０ｇ／Ｌまで変化した。５ｇ／Ｌのバリンは、パントテネート産生の促進において、α−ＫＩＶよりも僅かに効力が低いが、１０または２０ｇ／Ｌのバリンは、パントテネート産生の促進において、５ｇ／Ｌのα−ＫＩＶと同等またはそれに優った。
【０１９３】  実施例ＩＶ−Ｘ  前駆体依存的様式でパントテネートを産生できる微生物の作成
ＰＡ２２１およびＰＡ２３５（ｐａｎＢＣＤを過剰発現するように工学）およびＰＡ２３６（ｐａｎＢＣＤおよびｐａｎＥ１を過剰発現するように工学）などのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株は、最大のパントテネート産生を達成するために、α−ケトイソバレレート（α−ＫＩＶ）（またはバリン）およびアスパルテート（またはβ−アラニン）の供給を必要とする。なぜなら、これらの両方の前駆体がパントテネート合成の限定因子であるからである。従って、操作した微生物を、パントテネート産生において、限定因子であるパントテネート生合成の前駆体を供給する必要がないように設計した。これらの株は、種々のパントテネート生合成経路中間体の産生にも有用である。
【０１９４】  実施例ＩＶ：アスパルテート（またはβ−アラニン）独立的様式でパントテネートを産生できる微生物の作成
ｐａｎＤ遺伝子を、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ発現ベクターｐＯＴＰ６１にクローニングし、ｐＡＮ４２３を作成した（図５）。ｐＡＮ４２３のヌクレオチド配列を配列番号７８として示す。ｐａｎＤを含むＮｏｔＩ制限断片を、ｐＡＮ４２３から単離し、自己ライゲートし、これを使用してＰＡ２２１を形質転換した。Ｔｅｔ１５、Ｔｅｔ３０およびＴｅｔ６０に耐性な形質転換体を単離し、さらなる分析のために保存した。
【０１９５】  ６つのｐＡＮ４２３形質転換体と２つの対照形質転換体を、５ｇ／ｌのα−ＫＩＶを含み、１０ｇ／ｌのアスパルテートを含むおよび含まないＳＶＹ中で増殖し、次いでパントテネート産生についてアッセイした（表６）。
【０１９６】
【表８】
0005392957.tif 000009
【０１９７】  ｐＡＮ４２３形質転換体は、対照と比べて、ほぼ２倍の量のパントテネートを産生した（すなわち、培養培地へのβ−アラニンの添加により、以前の実験で得られたレベルまで、またはそのレベルの近くまで）。データにより、アスパルテートを添加しなければ、追加のコピーのｐａｎＤ遺伝子発現カセットを含む形質転換体は、対照形質転換体よりも多くのパントテネートを産生することも示される。形質転換体の１つである４２３  １−５番は、対照の約５倍のパントテネートを産生した。これらの結果により、ＰａｎＤタンパク質のレベルの増加は、利用可能なアスパルテートの変換をβ−アラニンの方へ「引張り」、ｐａｎＤ遺伝子発現の増加により、アスパルテートを添加および添加しない両方において、パントテネート産生を増強し得ることが示された。
【０１９８】  形質転換体の４２３  １−５番は、ＰＡ４０１と再度命名し、振とうフラスコ発酵槽でさらに試験した。振とうフラスコ培地は、グルコースを含むＳＶＹの代わりに、マルトースを含むＳＶＹであった。振とうフラスコ実験の結果は、最初の２４時間の間、試験管実験とよく一致した。β−アラニンを添加しない振とうフラスコ実験において、ＰＡ４０１は、２４時間で約１．５ｇ／ｌのパントテネートを産生した。β−アラニンの培養培地への添加により、パントテネート力価はさらに向上せず（表７）、これは、この株およびこれらの発酵条件では、β−アラニンはパントテネート産生の限定因子ではないことを示す。事実、β−アラニンを全く供給しない場合、ＰＡ４０１は、有意な量でβ−アラニンを培地に分泌することを観察できる。
【０１９９】
【表９】
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各値は、振とう（２００ｒｐｍ）しながら３７℃でインキュベートした、５０ｍｌの培地を含む、２つの２５０ｍｌバッフルドフラスコの平均を示す。
基本培地：１０ｇ／ｌのα−ＫＩＶ、３０ｇ／ｌのマルトースを含むＳＶＹ。
２％接種：Ｔｅｔ１５を含むＳＶＹを２４時間増殖
【０２００】  実施例Ｖ：アスパルテートデカルボキシラーゼの合成のさらなる増加およびパントテネート産生の増強のための、ｐａｎＤ遺伝子の工学
本実施例は、ｐａｎＤｍＲＮＡの翻訳を増加するために、ｐａｎＤ遺伝子中の改良リボソーム結合部位（ＲＢＳ）の作成を記載する。
【０２０１】  合成ｐａｎＤ  ＲＢＳの作成による、ｐａｎＤ遺伝子ｍＲＮＡの翻訳の増加
ｐＡＮ４２３においてｐａｎＤの発現に使用されるＲＢＳ（配列番号８８）は、合成ＲＢＳであり、高いレベルでＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて他のタンパク質を成功裡に産生するために使用されている。しかし、それは、「理想的な」Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＲＢＳ（配列番号４５）にアラインした場合に、６つのミスマッチを含む（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓリボソーム内に１６Ｓ  ＲＮＡ配列に相補的な配列を有するＲＢＳ）。（例えば、表１Ｂの太字のミスマッチ参照）。２つの新規ＲＢＳを、理想的なＲＢＳにより近く模倣するように設計した。新規デザインＡ（ＮＤＡ）および新規デザイン（ＮＤＢ）（本明細書ではＲＢＳ３およびＲＢＳ４とも称する）と命名された、これらの合成ＲＢＳを、配列番号５１および配列番号５２として示し、表１Ｂの理想的なＲＢＳと共にアラインさせる。
【０２０２】  各々の新規ＲＢＳの上および下の鎖に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、アニーリングし、次いで、ｐＡＮ４２０のＲＢＳを置換するのに使用し、プラスミドｐＡＮ４２６およびｐＡＮ４２７を作成した。これらの作成物を図６に示す。ｐＡＮ４２６およびｐＡＮ４２７におけるＮＤＡおよびＮＤＢ  ＲＢＳの存在は、ＤＮＡ配列解析により確認した。次に、ｐＡＮ４２６およびｐＡＮ４２７からのｐａｎＤ遺伝子を、図７に示したようなＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ発現ベクターｐＯＴＰ６１に移し、ｐＡＮ４２８およびｐＡＮ４２９を創製する。ｐＡＮ４２９のヌクレオチド配列を配列番号７９として示す。
【０２０３】  Ｅ．ｃｏｌｉベクター配列を欠失したＮｏｔＩ制限断片を、ｐＡＮ４２８およびｐＡＮ４２９から単離し、自己ライゲートし、これを使用してＰＡ２２１株を、Ｔｅｔ１５に耐性へと形質転換した。Ｔｅｔ６０に耐性な４つの単離株を、各形質転換から拾い上げ、パントテネートおよびβ−アニリン産生について、空のベクター（ｐＯＴＰ６１）で形質転換したＰＡ２２１およびｐＡＮ４２３（ＰＡ４０１株）で形質転換したＰＡ２２１と共にアッセイした（表８参照）。
【０２０４】
【表１０】
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【０２０５】  ５ｇ／ｌのα−ＫＩＶ（α−ＫＩＶ５）で補充した培地中で増殖すると、ｐＡＮ４２８−１形質転換体および４つ全てのｐＡＮ４２９形質転換体が、ＰＡ４０１よりも多くのパントテネートを産生し、これは、これらの形質転換体が、より高いレベルのアスパルテートデカルボキシラーゼ活性を含むことを示唆する。α−ＫＩＶ５およびＡｓｐ１０で補充した培地中で増殖すると、ｐＡＮ４２８またはｐＡＮ４２９形質転換体のいずれも、ＰＡ４０１より多くのパントテネートを産生しなかった。しかし、ｐＡＮ４２８−１形質転換体および４つ全てのｐＡＮ４２９形質転換体が、ＰＡ４０１よりも有意に多くのβ−アラニンを産生した。アスパルテートの添加により産生された過剰のβ−アラニンは、パントテネート産生の阻害を引き起こすことが可能である。別に、β−アラニンは、パントエートはこれらの株で限定因子であるので、蓄積し得る。
【０２０６】  最も高いレベルのβ−アラニンを産生した株、ｐＡＮ４２８−１およびｐＡＮ４２９−４形質転換体を、それぞれ、ＰＡ４０２およびＰＡ４０３と再度命名した。これらの２つの株を、種々の中間体で補充したＳＶＹ培地中で増殖し、パントテネートおよびβ−アラニン産生について再度アッセイした。ＰＡ２２１およびＰＡ４０１を対照として含めた。アッセイの結果を表９に提示する。
【０２０７】
【表１１】
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【０２０８】  α−ＫＩＶ５またはパントエート５で補充した培地中で増殖すると、ＰＡ４０２およびＰＡ４０３は、ＰＡ４０１よりも有意に多くのパントテネートを産生した。前のように、ＰＡ４０２およびＰＡ４０３は、α−ＫＩＶ５およびＡｓｐ１０で補充した培地中で増殖した場合、ＰＡ４０１よりも有意に多くのβ−アラニンを産生したが、それらは、パントテネートの比例的な増加はもたらさなかった。しかし、パントエート５とＡｓｐ１０で補充した培地中で増殖すると、ＰＡ４０２およびＰＡ４０３の両方が、ＰＡ４０１よりも有意に多くのパントテネートを産生し、約３０％の増加であった。
【０２０９】  ｐＡＮ４２８およびｐＡＮ４２９にそれぞれ工学した、改良ＮＤＡおよびＮＤＢ  ｐａｎＤリボソーム結合部位により、アスパルテートデカルボキシラーゼ活性のレベルは増加すると、これらの実験から結論づけることができる。
【０２１０】  ｐａｎＢＣＤオペロン内の合成ｐａｎＤ  ＲＢＳの作成による、ｐａｎＤ遺伝子ｍＲＮＡの翻訳の増加
ＰＡ２２１に（および本明細書に記載の他の工学パントテネート産生株に）存在するＰ２６ｐａｎＢＣＤオペロンカセットに見られる、天然Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐａｎＤ遺伝子リボソーム結合部位（ＲＢＳ）（配列番号４３）を、理想的なリボソーム結合部位（配列番号４７）と共にアラインして表１Ｃに示す。アラインメントにより、天然Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐａｎＤ遺伝子ＲＢＳ（これは、ＰａｎＣのコード配列内に位置する）と理想的なＲＢＳの間のミスマッチが示される。３つの新規ＲＢＳ（Ｐ２６  ｐａｎＢＣＤオペロンカセット内）を作成して、ｐａｎＤ遺伝子ｍＲＮＡの翻訳を増加し、アスパルテートデカルボキシラーゼの合成を増加した。これらの合成ＲＢＳ（ＮＤＩ、ＮＤＩＩ、およびＮＤＩＩＩと称する、また本明細書ではＲＢＳ５、ＲＢＳ６およびＲＢＳ７とも称する）は、配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７としてそれぞれ示し、表１Ｃに含める。ｐａｎＢＣＤオペロン内のｐａｎＤ  ＲＢＳの変化は、そのオペロンによりコードされるＰａｎＣタンパク質のＣ末端アミノ酸配列を変化させ、既知および疑われるＰａｎＣタンパク質アミノ酸配列のアラインメントにより、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＰａｎＣタンパク質の最後の９つのアミノ酸の配列は、全ての保存アミノ酸残基に影響を及ぼすことなく変化できることが示され、これは、前記変化は、パントテネートシンターゼ活性または発現を低下しないことを注意すべきである。新規ＲＢＳを合成し、以下のようにＰ２６ｐａｎＢＣＤオペロン発現カセットに取込む。
【０２１１】  第一に、ＰＣＲプライマーを、以下の要素を含むように設計した：（１）ＰＣＲによりｐａｎＤに前以て導入されている、独特なＢｓｉＷＩ制限部位までおよびそれを含む、ＰａｎＤの最初の５つのアミノ酸をコードする、核酸配列；（２）ｐａｎＣの終止コドン；（３）少なくとも１つの合成ＲＢＳ；および（４）ｐａｎＤ  ＲＢＳの上流のｐａｎＣに１００％の同一性を有する、３０〜３９ｂｐの核酸配列。プライマーはＴＰ１０２、ＴＰ１０３、およびＴＰ１０４と命名され、ＮＤＩ、ＮＤＩＩおよびＮＤＩＩＩリボソーム結合部位をそれぞれ含む。これらの３つのプライマーを、３つの独立したＰＣＲ反応で、ｐａｎＣの開始コドンの近くにハイブリダイズする、５’プライマーＴＰ１０１と共に使用し、ＮＤＩ、ＮＤＩＩ、およびＮＤＩＩＩ  ＰＣＲ産物を作成した。ＰＣＲ産物を精製し、ＸｂａＩで消化し、次いで、ＸｂａＩおよびＳｍａＩで消化しておいた、プラスミドベクターｐＡＳＫ−１ＢＡ３にクローニングした。得られたプラスミドをｐＡＮ４３１、ｐＡＮ４３２およびｐＡＮ４３３と命名した。ｐＡＮ４３１の作成を図８に示し、３つ全てのプラスミド作成物の代表である。各新規プラスミド中の所望の合成ｐａｎＤ遺伝子ＲＢＳの存在を、ＤＮＡシークエンスにより確認した。
【０２１２】  次に、新規ｐａｎＤ  ＲＢＳを含む修飾ｐａｎＣ遺伝子を、独特なＢｓｉＷＩ制限部位を使用して、ｐａｎＤ遺伝子と接続した。これは、ｐＡＮ４３１、ｐＡＮ４３２、およびｐＡＮ４３３から適切なＮｓｉＩ−ＢｓｉＷＩ制限断片を単離し、それらを、ｐＡＮ４２０由来の２３９５ｂｐのＮｓｉＩ−ＢｓｉＷＩ制限断片とライゲートし、ＢｓｉＷＩ修飾ｐａｎＤ遺伝子を供給することにより行なった。これらの作成物により、それぞれｐＡＮ４４１、ｐＡＮ４４２およびｐＡＮ４４３が得られた。代表的な作成物（ｐＡＮ４４１）を図９に示す。ｐＡＮ４４３のヌクレオチド配列を配列番号８０として示す。
【０２１３】  次いで、新規ｐａｎＤ遺伝子ＲＢＳを、以下のように、Ｐ２６ｐａｎＢＣＤオペロン発現カセットに置換した。第一に、ｐａｎＤ  ＲＢＳを含むｐａｎＣの領域を除去する、欠失−挿入変異を創製した。これは、ｐＡＮ４３０を、ＢｓｐＥ１およびＢｇｌＩＩの混合物で消化し、ｐａｎＣの３’末端およびｐａｎＤの５’末端をここで欠失している４２３５ｂｐの断片を回収することにより作成した。この断片を、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子を含む、プラスミドｐＥＣＣ４由来のＡｖａＩ−ＢａｍＨＩ制限断片とライゲートした。ＡｖａＩ消化により産生された５’伸長は、ＢｓｐＥＩにより産生されたものと適合性であるが、ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩ伸長も適合性である。得られたプラスミドは、ｐＡＮ４４０と命名し、その作成を図１０に示す。
【０２１４】  得られた欠失−挿入変異を、ＰＡ２２１を線形ｐＡＮ４４０で形質転換し、１ｍＭのパントテネートを含むＣａｍ５プレート上でクロラムフェニコールに対する耐性について選択することにより、相同的組換えを介して、Ｐ２６ｐａｎＢＣＤオペロンに交雑させた。数個の形質転換体を試験し、全部が、期待された通り、増殖に１ｍＭのパントテネートを必要とすることが判明した。これらの形質転換体の２つをＰＡ４０８ＡおよびＰＡ４０８Ｂと再度命名し、パントテネート産生についてアッセイした。どちらの株も、パントテネートおよび５ｇ／ｌのβ−アラニンを含む培地中で増殖した場合でさえ、測定可能な量のパントテネートを合成せず、これは、株は、パントテネートシンターゼ活性を欠損していることを示す。次に、新規ｐａｎＤ  ＲＢＳを、ＰＡ４０８を線形ｐＡＮ４４１、ｐＡＮ４４２およびｐＡＮ４４３プラスミドＤＮＡで形質転換し、パントテネートを補充していないＴＢＡＢプレート上で増殖について選択することにより、Ｐ２６ｐａｎＢＣＤオペロンに交雑させた。線形ｐＡＮ４３０（天然ｐａｎＤ  ＲＢＳを含む）での形質転換を対照として含め、本明細書に記載のＰＡ２２１と同一な形質転換体を生じることが期待された。各形質転換からの４つの単離株を、種々の中間体で補充したＳＶＹ培地中でのパントテネートおよびβ−アラニンについてアッセイした（表１０および１１）。
【０２１５】
【表１２】
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【０２１６】
【表１３】
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【０２１７】  ＰＡ２２１を使用した以前の実験から期待されるように、天然ｐａｎＤ  ＲＢＳを含むどの形質転換体も、パントエートを補充した培地中で増殖した場合、測定可能な量のパントテネートを産生しなかった。しかし、修飾ｐａｎＤ  ＲＢＳを含むと期待される１２中９個の形質転換体が、これらの条件下で、有意な量のパントテネート（１６０〜２３０ｍｇ／ｌ）を産生し、これは、それらが、上昇したレベルのアスパルテートデカルボキシラーゼ活性を有することを示す。パントエートおよびアスパルテートの両方を補充した培地で増殖した場合、これらの同じ９つの形質転換体は、天然ｐａｎＤ  ＲＢＳの場合の約４倍のパントテネートを産生した。さらに、これらの９つの形質転換体は、測定可能な量のβ−アラニン（２３０〜４１０ｍｇ／ｌ）を蓄積した。全形質転換体が、パントエートおよびβ−アラニンを含む培地中で増殖した場合、ほぼ等量のパントテネートを産生し、これは各々が、機能的なパントテネートシンターゼを含むことを実証する。
【０２１８】  これらのデータにより、合成ｐａｎ  ＲＢＳは、ｐａｎＤ遺伝子ｍＲＮＡの翻訳の指令において、天然ｐａｎＤ  ＲＢＳの約４倍効率的であり、パントテネート産生の増強における、前記合成ＲＢＳの有用性を証明することが実証される。パントテネート産生の増加に対する追加のアプローチは、例えば、ｐａｎＤ遺伝子ｍＲＮＡの半減期の増加、ｐａｎＤ転写プロモーターの強度の増加、および／またはＰａｎＤタンパク質の安定性の増加を含み得る。
【０２１９】  実施例ＶＩ：抗生物質耐性遺伝子を含まない、組込まれたＰ２６ｐａｎＥ１カセットを含む、株の作成
実施例ＩＩは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのケトパントエートレダクターゼ活性の大半に関与する、酵素をコードする、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐａｎＥ１遺伝子の同定を記載する。ＰＡ２３６（ｐＡＮ２３６プラスミドを含む）は、２４時間のＳＶＹ試験管培養液中、その親株ＰＡ２２１（１ｇ／ｌ）の約２倍のパントテネート（２ｇ／ｌ）を産生した。ＰＡ２３６は、テトラサイクリン耐性の選択に基づいて、増幅された（約３コピー）組込みｐＡＮ２３６プラスミドを含むと推定された（ｔｅｔＲ遺伝子産物は、Ｐ２６ｐａｎＥ１カセットに加えて、ｐＡＮ２３６プラスミド上にコードされる）。本発明の方法論には、例えば、株に抗生物質耐性遺伝子を含まない、１つの組込まれた増幅不可能なＰ２６ｐａｎＥ１コピーを、ｐａｎＥ１遺伝子座に含む株も有用である。
【０２２０】  ｐＡＮ２５１と命名されたプラスミドは、追加の染色体配列を、Ｐ２６ｐａｎＥ１カセットのちょうど上流およびちょうど下流に挿入することにより、ｐＡＮ２３６から得られた。これらの追加の配列（これは、二重クロスオーバーにより、Ｐ２６ｐａｎＥ１カセットの組込みを可能とする相同性を提供する）は、ＰＣＲにより、鋳型として染色体ＤＮＡから得られた。ｐＡＮ２５１を図１１に示す。ｐＡＮ２５１のヌクレオチド配列を配列番号８１として示す。
【０２２１】  次に、来るＰ２６ｐａｎＥ１カセットの選択の可能な株を作成した。株は、以下の３つの成分を含んだ：（１）Ｐ２６ｐａｎＢＣＤ；（２）ΔｐａｎＥ１；および（３）ｉｌｖＣ。なぜなら、ｐａｎＥ１およびｉｌｖＣは両方共、Ｐａｎ−表現型を有するように変異しなければならないからである。開始株はＣＵ５５０（ｔｒｐＣ２、ｉｉｖＣ４、ｌｅｕＣ２４）であった。ＰＡ２２１染色体ＤＮＡからのＰ２６ｐａｎＢＣＤカセットを、２段階で導入して、ＰＡ２９０株を創製した。次に、ΔｐａｎＥ１：：ｓｐｅｃを、ＰＡ２４０株からの染色体ＤＮＡを使用して、ＰＡ２９０に形質転換し、ＰＡ２９４株（ｔｒｐＣ、ｉｌｖＣ４、ｌｅｕＣ１２４、Ｐ２６ｐａｎＢＣＤ、ΔｐａｎＥ１：：ｓｐｅｃ）を得、これは、厳しいパントテネート栄養要求体である。最後に、ＰＡ２９４を、プラスミドｐＡＮ２５１で形質転換し、パントテネート原栄養体について選択し、ＰＡ３０３株を得た。この株は、遺伝子型ｔｒｐＣ２、ｉｌｖＣ４、ｌｅｕＣ１２４、Ｐ２６ｐａｎＢＣＤ、Ｐ２６ｐａｎＥ１を有すると期待された。ＰＡ３０３を、ｐａｎＥ１のちょうど上流のＰ２６挿入断片にフランキングするプライマーを使用して、ＰＣＲにより、ｐａｎＥ１遺伝子座での正しい染色体構造について確認した。ＰＡ３０３からのＰＣＲ産物は期待されたサイズであり、野生型ｐａｎＥ１遺伝子からのＰＣＲ産物を同時に欠失し、所望の二重クロスオーバー事象で得られたのと一致する。さらに、ＰＡ３０３はテトラサイクリン感受性であり、キャンプベル型のプラスミドの染色体への単一クロスオーバーとは逆に、所望の二重クロスオーバー事象と一致する。親株からのｔｒｐ、ｉｌｖ、およびｌｅｕ栄養要求体は全てＰＡ３０３に維持した。
【０２２２】  ２４時間の液体ＳＶＹ試験管培養液中で、ＰＡ３０３は、陽性対照ＰＡ２３６と同レベル、および、表１２に示したような工学ｐａｎＥ１を含まないＰＡ２２１の約２倍のパントテネートを産生した。
【０２２３】
【表１４】
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【０２２４】  実施例ＶＩＩ：α−ＫＩＶ（またはバリン）依存的様式でパントテネートを産生できる微生物の作成
α−ケトイソバレレート（α−ＫＩＶ）は、パントテネート合成について調節解除された特定の株におけるパントテネート産生の律速中間体である。５ｇ／ｌのα−ＫＩＶまたはバリンの添加により、ＰＡ２２１などの株を含む試験管培養液中で、パントテネート産生を約５倍増加する。α−ＫＩＶまたはバリンを供給する必要性を軽減するために、α−ＫＩＶの合成能の増加した株を工学した。
【０２２５】  α−ＫＩＶは、４つの遺伝子、ｉｌｖＢおよびｉｌｖＮ、ｉｌｖＣ、およびｉｌｖＤによりコードされる３つの酵素の連続作用によりピルベートからＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて産生される。野生型Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて、３つの遺伝子（ｉｌｖＢ、ｉｌｖＮ、およびｉｌｖＣ）が、大ｉｌｖ−ｌｅｕオペロンの最初の３つの遺伝子である。α−ＫＩＶ合成に必要な第四の遺伝子のｉｌｖＤは、単独で、染色体上のどこにでも位置する。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｉｌｖ−ｌｅｕオペロンは、ロイシンレベルによってのみ調節されると考えられる。外来性ロイシンの供給は、おそらく減弱機序（Ｇｒａｎｄｏｎｉら（１９９２）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：３２１２〜３２１９）により、ｉｌｖ−ｌｅｕオペロンの転写を約１３倍減少させる。ｉｌｖ−ｌｅｕ経路における唯一の既知のフィードバック調節は、ロイシンによるｌｅｕＡ遺伝子産物の阻害である。
【０２２６】  α−ＫＩＶの合成を調節解除する第一の段階として、野生型Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｉｌｖ−ｌｅｕオペロンからの１コピーのｉｌｖＢＮＣ領域をＰＣＲにより単離し、ａｍｙＥ遺伝子座で二重組換えにより単一のＰ２６発現カセットを組込むように設計された、ベクターｐＯＬＬ８上のＰ２６プロモーターおよびＲＢＳ２に隣接して設置した。ａｍｙＥ遺伝子は、非必須α−アミラーゼをコードし、発現カセットの設置に有用な遺伝子座である。得られたプラスミドｐＡＮ２６７を図１２に示す。ｐＡＮ２６７のヌクレオチド配列を配列番号８２として示す。ｐＡＮ２６７は、容易に、以下の詳述したように、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株のａｍｙＥ遺伝子座での二重クロスオーバーにより安定な形質転換体を与える。
【０２２７】  ロイシン栄養要求体であるパントテネート過剰産生株の作成
最初に、ｉｌｖＣ３およびΔｐａｎＥ１を含むＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株を使用して、抗生物質耐性遺伝子を使用することなく、１コピーのＰ２６ｐａｎＥ１を染色体に導入した。二重変異体が、来るＰ２６ｐａｎＥ１カセットの選択に必要であった。なぜなら、ΔｐａｎＥ１変異のみでは、パントテネート栄養要求体は得られないからである。ｉｌｖＣ４を含む、この型の株の作成の基礎として使用する、ＣＵ５５０と命名した株が得られた。しかし、ＣＵ５５０はまた、密接に連関したｌｅｕＣ１２４変異も含み、よってＣＵ５５０から得られた全ての株が、ロイシンを必要とした。Ｐ２６ｐａｎＢＣＤとＰ２６ｐａｎＥ１の組合せが、パントテネート産生に好ましいことが示されたので、次の段階は、ロイシン栄養要求体で２つのカセットのこの組合せを再度集合させることであった。
【０２２８】  従って、２つのカセットを、２つの異なる株バックグラウンドのＲＬ−１およびＰＹ７９に合わせた。抗生物質耐性遺伝子を使用することなく、染色体Ｐ２６ｐａｎＥ１をＰＹ７９およびＲＬ−１株バックグラウンドに導入するために、ｉｌｖＣ４に依拠しない戦略を使用した。（戦略は、ΔｐａｎＥ１変異は、ＴＢＡＢ（強化）プレート上の比較的小さなコロニーにより顕示される、パントテネート栄養要求性を引き起こすという観察を利用した）。最初に、ΔｐａｎＢ：：ｃａｔおよびΔｐａｎＥ：：ｓｐｅｃを、両方の株バックグラウンドに導入した。次に、得られた株は、２つの株ＰＡ２２１（Ｐ２６ｐａｎＢＣＤ）およびＰＡ３０３（Ｐ２６ｐａｎＥ１）からのＤＮＡで同時に形質転換し、ＴＢＡＢプレート上にＰａｎ＋を選択した。２つの別個のサイズのコロニーは、選択プレート上で増殖し、より大きなサイズは約２％のコロニーを含む。より大きなコロニーは、Ｐ２６ｐａｎＢＣＤおよびＰ２６ｐａｎＥ１の両方を受けた同時形質転換体を示すと推測され、より小さなコロニーはＰ２６ｐａｎＢＣＤのみを受けた。この予想に一致して、より大きなコロニーは、ＣａｍｒおよびＳｐｅｃｒの両方を欠失し、一方、より小さなコロニーはｃａｔ遺伝子のみを欠失し、ｓｐｅｃ遺伝子を維持した。さらに、ＰＡ３２７と命名されたＰＹ７９の代表的な誘導体、および、ＰＡ３２８と命名されたＲＬ−１の代表的な誘導体は、両方共、試験管培養液中で上昇したレベルのパントテネートを産生し、これは約１．６から１．７ｇ／ｌであった（表１３）。
【０２２９】
【表１５】
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【０２３０】  従って、ＰＡ３２７およびＰＡ３２８は、Ｐ２６ｐａｎＢＣＤおよびＰ２６ｐａｎＥ１の両方を含むと結論づけられ、以下に記載したようなさらなる作成に使用した。ＰＣＲ解析により、２つのカセットの存在が確認された。
【０２３１】  ２つの系統のパントテネート過剰産生株への安定なＰ２６ｉｌｖＢＮＣカセットの設置
Ｐ２６ｐａｎＢＣＤおよびＰ２６ｐａｎＥ１を含み、Ｌｅｕ＋である、ＰＹ７９およびＲＬ−１の誘導体であるＰＡ３２７およびＰＡ３２８を作成したので、次の段階は、Ｐ２６ｉｌｖＢＮＣの安定なコピーを導入することであった。これは、ＰＡ２３７およびＰＡ３２８を、プラスミドｐＡＮ２６７で形質転換し、Ｓｐｅｃｒについて選択することにより行なった。ＰＣＲによるスクリーニングにより、得られた形質転換体の約８５％が、二重クロスオーバーによりａｍｙＥで組込まれたＰ２６ｉｌｖＢＮＣを含むことが示された。ＰＡ３４０と命名されたＰＡ３２７の１つの形質転換体、およびＰＡ３４２と命名されたＰＡ３２８の１つの形質転換体をさらなる試験のために選択した。
【０２３２】  ５ｇ／ｌのβ−アラニンを含むが、α−ＫＩＶは添加していないＳＶＹ培地中で増殖した試験管培養液中で、ＰＡ３４０およびＰＡ３４２の両方が、パントテネート産生において、ＰＡ３２７およびＰＡ３２８のそれよりも、約１．３から２ｇ／ｌまでの期待された増加を示した（表１４）。
【０２３３】
【表１６】
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【０２３４】  ２つの新規な株も、バリン分泌の僅かな増加を示し、これは、ｉｌｖＢＮＣ遺伝子が調節解除されたことを示す。しかし、同株を、５ｇ／ｌのα−ＫＩＶを添加して増殖すると、パントテネート産生のさらなる増加が、ＰＡ３４２から生じ、これは、α−ＫＩＶが依然として、この株バックグラウンドの律速であることを示唆する。より多くの増殖および従ってより高いパントテネートレベルのみを有する類似の結果が、振とうフラスコ培養液で見られた（表１５）。
【０２３５】
【表１７】
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実施例ＶＩＩＩ：ｐａｎＥ１を過剰産生するように工学した株でのｐａｎＤコピー数の増加およびｉｌｖＢＮＣ遺伝子産物はパントテネート産生を増強する
β−アラニンを、工学したＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株の培養液に供給する実験により一貫して、β−アラニンは、パントテネート合成の律速中間体であることが示された。ＰＡ３４０およびＰＡ３４２におけるパントテネート産生に対する追加のコピー数のｐａｎＤの効果を調べた。ＰＡ３４０およびＰＡ３４２株を、１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むプレート（Ｔｅｔ１５プレート）上で選択してＰＡ４０１から単離した染色体ＤＮＡで形質転換した。各親から得られた形質転換体を、Ｔｅｔ６０プレートに当て、複数のコピーの発現カセットを含むようであるものを同定した。Ｔｅｔ６０上で増殖した各形質転換からの１２個の形質転換体を、培地上で単一コロニーについて画線し、次いでパントテネート産生についてＳＶＹ培地試験管培養液中でアッセイした。各群からの１つの形質転換体が、２４時間で３００ｍｇ／ｌより高いパントテネートを産生することが判明した。これらの２つの形質転換体を保存し、ＰＡ４０４（ＰＡ３４０株バックグラウンド）およびＰＡ４０５（ＰＡ３４２株バックグラウンド）と命名した。両方の株がスペクチノマイシンに耐性であり、これは、Ｐ２６ｉｌｖＢＮＣ発現カセットが依然として、ａｍｙＥに存在することを示す。各株から単離した染色体ＤＮＡのＰＣＲ解析により、調節解除されたｐａｎＥ１遺伝子も保持されることが確認された。
【０２３６】  次に、ＰＡ４０４およびＰＡ４０５を、炭素原としてマルトースを含み、種々の中間体で補充したＳＶＹ培地中で増殖した、振とうフラスコ培養液中で評価した。培養液を２４および４８時間増殖し、次いで、パントテネート、β−アラニンおよびバリン産生についてアッセイした。この実験の結果を表１６に提示する。親株（ＰＡ３４０およびＰＡ３４２）の類似振とうフラスコ培養データを、比較のために表に含める。
【０２３７】
【表１８】
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【０２３８】  あらゆる培地の補充がなければ、ＰＡ４０４およびＰＡ４０５は、その同質遺伝子親株と比べて、２４時間で４から５倍のパントテネートを作成した（表１６）。β−アラニンの供給は、明らかに、ＰＡ３４０およびＰＡ３４２株で律速であった。増幅したＰ２６ｐａｎＤの添加は、β−アラニンの供給を大きく増加させた。
【０２３９】  実施例ＩＸ：Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｉｌｖＤ遺伝子の調節解除は、パントテネート産生を増強する
ｉｌｖＤ遺伝子の発現を調節解除するために、標準的な手順（上記）を使用して、ｉｌｖＤコード領域のちょうど上流に、構成性Ｐ２６プロモーターおよび人工リボソーム結合部位ＲＢＳ２を組込んだ。ｉｌｖＤ遺伝子地図はそれ自体、ｉｌｖＢＮＣオペロンに連結していない。最初に、ｉｌｖＤコード領域を含む２．４ｋｂのＲＬ−１染色体の領域および７３０ｂｐの上流配列を、ＰＣＲにより、ｐＯＫ１２と呼ばれるコピー数の低い（１つのＥ．ｃｏｌｉ細胞あたり約１５）ベクターにクローニングし、図１３に示したプラスミドｐＡＮ２５７を得た。
【０２４０】  天然ｉｌｖＤ遺伝子プロモーターのちょうど上流にある天然ＥｃｏＲＩ部位、およびｉｌｖＤ開始コドンでの天然ＮｃｏＩ部位を利用して、Ｐ２６およびＲＢＳ２を含む人工配列を、ｐＡＮ２５７に挿入し、ｐＡＮ２６３を得た（図１４）。ｐＡＮ２６３のヌクレオチド配列を配列番号８３として示す。この作成と平行して、ｃａｔ遺伝子も、ｐＡＮ２５７の、同じ上流ＥｃｏＲＩと、ｉｌｖＤコード領域の中間のＢｇｌＩＩ部位の間に挿入し、ｉｌｖＤ領域の大部分を欠失したｐＡＮ２６１を得る（図１５）。ｐＡＮ２６１およびｐＡＮ２６３を使用して、次いでＰ２６ｉｌｖＤカセットを、２段階でＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ染色体に設置し得る。第一段階で、ｐＡＮ２６１を、形質転換により導入し、クロラムフェニコール耐性について選択し、次いでＩｌｖ−表現型を確認する。第二段階で、ｐＡＮ２６３を導入し、Ｉｌｖ＋を選択し、クロラムフェニコール感受性について調べ、ＰＣＲにより正しい局在構造を確認する。
【０２４１】  ｐＡＮ２６１は、最初に、ＲＬ−１株（高度にコンピテント）に形質転換し、ＰＡ３４３株（ΔｉｌｖＤ：：ｃａｔ）を得、次いでＰＡ３４３からの染色体ＤＮＡを使用して、ＰＡ３４０およびＰＡ３４２を、Ｉｌｖ−栄養要求性に変換し、ＰＡ３４８およびＰＡ３４９とそれぞれ命名された株を得た。染色体ＤＮＡは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの形質転換において、本質的に、単量体プロモーターより効率的である。同様に、ｐＡＮ２６３ＤＮＡを、ＰＡ３４３（中程度にコンピテント）に形質転換し、ＰＡ３４５株（Ｐ２６ｉｌｖＤ）を得、次いでＰＡ３４５染色体ＤＮＡを使用して、ＰＡ３４８およびＰＡ３４９をＩｌｖ＋原栄養体とし、それぞれＰＡ３７４およびＰＡ３５４株を得た。
【０２４２】  予測されたように、ＰＡ３７４およびＰＡ３５４はさらに、約２．５から２．９ｇ／ｌまで、ＳＶＹと５ｇ／ｌのβ−アラニン中で増殖した試験管培養液中で、パントテネート産生を増加した（表１７）。
【０２４３】
【表１９】
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【０２４４】  β−アラニンを添加せずに、ＰＡ３７４およびＰＡ３５４株は、試験管培養液中で僅か約０．２ｇ／ｌのパントテネートを産生し、これは、ＰａｎＤ活性は有意に律速であることを示す。
【０２４５】  この制限を軽減するために、ＰＡ４０１株からの増幅可能なＰ２６ｐａｎＤカセットを設置した。ＰＡ４０１染色体ＤＮＡを、ＰＡ３７４およびＰＡ３５４に形質転換し、１５ｍｇ／ｌのＴｅｔｒを選択し、ＰＡ３７７およびＰＡ３６５株をそれぞれ得た。形質転換体を得た後、株を、３０および６０ｍｇ／ｌのテトラサイクリンを含むプレート上で画線し、ｂｐｒ遺伝子座で組込んだＰ２６ｐａｎＤカセットのコピー数を再増幅した。α−ＫＩＶまたはβ−アラニンを含まないＳＶＹ中で増殖した試験管培養液では、ＰＡ３７４およびＰＡ３５４よりもパントテネート力価の実質的な向上が観察された（表１８および１９）。
【０２４６】
【表２０】
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【０２４７】
【表２１】
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【０２４８】  グルコースを含むＳＶＹでは、パントテネート産生の増加は依然として、５ｇ／ｌのβ−アラニンを供給することにより達成され、これは、ｐａｎＤ発現の増加は、さらに、パントテネート産生を増加し得ることを示唆する。マルトースを含むＳＶＹでは、パントテネートのさらなる増加は、β−アラニンの供給により全く得られず、これは、β−アラニンおよび／またはアスパルテート合成はグルコースにより抑制されることを示唆する。ＰＡ３７７およびＰＡ３６５株は、１０リットルの発酵槽で評価し、ここで、それらは典型的には、以下に詳述した補助的なβ−アラニンおよびα−ＫＩＶまたはバリンの非存在下で、４８時間で２０ｇ／ｌを超えるパントテネートを産生する。
【０２４９】  実施例Ｘ：パントテネート産生微生物の１０リットルの発酵槽
Ｐ２６ｉｌｖＢＮＣおよびＰ２６ｉｌｖＤカセットの工学により、ＰＡ３４２およびＰＡ３５４株を得ることにより、バリンまたはα−ＫＩＶを発酵培地に添加することなく、２２および２６ｇ／ｌのパントテネートの産生がそれぞれ可能となった（表２０）。４８時間目に、両方の株が、約０．５ｇ／ｌのバリンを培地に分泌した。
【０２５０】
【表２２】
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【０２５１】  発酵槽でのパントテネート合成
Ｐ２６ｐａｎＤカセットをＰＡ３５４およびＰＡ３７４株に添加して、ＰＡ３６５およびＰＡ３７７株を創製し、β−アラニンもα−ＫＩＶも、発酵槽に添加する必要がなかった。ＰＡ３６５株は、培地に前駆体を全く添加せずに、４８時間で２１ｇ／ｌ、７２時間で２７ｇ／ｌのパントテネートを産生した（表２０）。ＰＡ３７７は、幾分良好であり、３６時間で１８ｇ／ｌ、４８時間で２２ｇ／ｌ、７２時間で３１ｇ／ｌのパントテネートを産生した。バリンは、ＳＶＹＧ培地中で４８時間で、ＰＡ３６５およびＰＡ３７７についてそれぞれ０．８５および１．５ｇ／ｌで測定した。ＰＡ３７７株は、大半の発酵を通じて１〜１．５ｇ／ｌのバリン、および、０．２ないし０．５ｇ／ｌのβ−アラニンを維持した。
【０２５２】  ＰＡ３７７株は、酵母抽出物をベースとしたＰＦＭＧ培地中で１０リットルの発酵槽でさらに評価した。ＰＦＭＧおよびＳＶＹＧ培地中のパントテネートは類似していた。ＰＦＭＧ中では、ＰＡ３７７は、３６時間で１９ｇ／ｌ、４８時間で２５ｇ／ｌ、７２時間で２９ｇ／ｌのパントテネートを産生した。ＳＶＹＧでは、ＰＡ３８８は、３６時間で１８ｇ／Ｌ、４８時間で２２ｇ／Ｌ、７２時間で３１ｇ／Ｌのパントテネートを産生した（表２０）。
【０２５３】  実施例ＸＩ：ＰＡ３７７株をトリプトファン原栄養体に変換
ＰＡ３７７（Ｔｒｐ−）は、ＰＹ７９からの染色体ＤＮＡを使用してＴｒｐ＋に形質転換し、ＰＡ８２４株を得た。Ｐ２６ｐａｎＤカセットの再増幅後、ＰＡ８２４を、５ｇ／Ｌのβ−アラニンを含むまたは含まないＳＶＹグルコース中で増殖した試験管培養液中でのパントテネート産生についてＰＡ３７７と比較した（表２１）。
【０２５４】
【表２３】
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【０２５５】  Ｔｒｐ＋株は、ＰＡ３７７よりも僅かに高い密度まで増殖した。外来性β−アラニンの非存在下で、全株が、類似レベルのパントテネートを産生したが、β−アラニンを添加した場合には、Ｔｒｐ＋誘導体は、幾分より多くのパントテネートを産生した。
【０２５６】  ＰＡ８２４を用いた発酵槽研究
ＰＡ８２４を、１０リットルの作業容量を用いて、ＣＦ３０００Ｃｈｅｍａｐ１４リットル容器中で評価した。発酵槽で使用した２つの培地の調合を表２２および２３に示す。
【０２５７】
【表２４】
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【０２５８】
【表２５】
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【０２５９】  全ての発酵は、グルコース限定流加式プロセスであった。接種直後、撹拌を２００ｒｐｍで設定した。最初のバッチした２％グルコースは、指数対数増殖中に消費された。その後、グルコース濃度は、６０％グルコース溶液の連続供給により、０．２ないし１．０ｇ／Ｌに維持した。可変速度の供給ポンプはコンピューター制御し、アルゴリズムにより、タンク中の溶解酸素濃度［ｐＯ２］に連関した。［ｐＯ２］が３０％に下降した場合、コンピューター制御は、撹拌速度を自動的に調整し、溶解酸素濃度を２５ないし３０％［ｐＯ２］に維持した。コンピューター制御およびデータ記録は、Ｂｒａｕｎ  ＭＦＣＳソフトウェアによった。
【０２６０】  １つの研究において、ＰＡ２８４は、表２２に記載の培地中で２つの温度（４０℃および４３℃）で発酵槽中で増殖した。２つの実験の結果により、初期の時点で最もパントテネート力価は、４３℃で産生されることが実証された。細胞塊は、４３℃でＯＤ６００および５６時間で１５０光学密度単位に近づき、パントテネート力価は、３６、４８および７２時間後にそれぞれ２１ｇ／Ｌ、２８ｇ／Ｌおよび３６ｇ／Ｌであった。４０℃での平行発酵において、細胞塊は、ＯＤ６００および５６時間で１２０光学密度単位に近づき、パントテネート力価は、３６、４８および７２時間後にそれぞれ１８ｇ／Ｌ、２６ｇ／Ｌおよび３７ｇ／Ｌであった。
【０２６１】  別の研究では、ＰＡ８２４は、表２３に記載の培地中で４３℃で発酵槽中で増殖した。細胞塊は、ＯＤ６００および３６時間後に１６０光学密度単位に近づき、パントテネート力価は、２４、３６、４８および６０時間後にそれぞれ、２３ｇ／Ｌ、３４ｇ／Ｌ、３７ｇ／Ｌおよび４０ｇ／Ｌであった。別の発酵では、グルコース供給物における微量元素量の増加（例えば、ＳＭの濃度の１倍から２倍への増加）により、パントテネートの力価はさらに高くなった。
【０２６２】  実施例ＸＩＩ：Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｃｏａＡ遺伝子産物の同定および特徴づけ
「Ｓｕｂｔｉｌｉｓｔ」ウェブサイト上で入手可能な注釈バージョンのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノム配列は、ｃｏａＡとして標識された遺伝子を全く含まない。しかし、質問配列としてＥ．ｃｏｌｉパントテネートキナーゼのタンパク質配列を使用した相同性探索により、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ遺伝子ｙｑｊＳと良好なマッチが得られ、これは、「未知；パントテネートキナーゼに類似」として注釈される。この遺伝子は、５つのオープンリーディングフレームを含むオペロン中の最後から２番目の遺伝子のようである（図１８）。オープンリーディングフレームの２つは、Ｄ−セリンデヒドラターゼおよび「ケトアシルレダクターゼ」に類似したタンパク質をコードし；他の２つは既知の相同性を全く有さない。ｃｏａＡに対応するオープンリーディングフレームでは、３つの可能な開始コドンが存在し；各々が、それに会合した可能なリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を有する。３つの可能性あるｃｏａＡ  ＯＲＦを、最も長いものから最も短いものまで、ｃｏａＡ１、ｃｏａＡ２、およびｃｏａＡ３と命名した。
【０２６３】  全３つの可能性あるｃｏａＡオープンリーディングフレームは、そのそれぞれのＲＢＳと共に、ＰＣＲによりクローニングし、次いで発現プラスミドｐＡＮ２２９にライゲートした。ｐＡＮ２２９は、ＳＰ０１ファージＰ１５プロモーターからの発現を提供するＥ．ｃｏｌｉでのコピー数の低いベクターであり、テトラサイクリン選択でｂｐｒで単一のクロスオーバーにより組込むことができる。代表的な得られたプラスミドｐＡＮ２８１を図１９に示す。
【０２６４】  クローニングした推定ｃｏａＡ  ＯＲＦが実際に、パントテネートキナーゼ活性をコードするかどうかを決定するために、全３つのプラスミドの数個の単離株を、ｃｏａＡ１５（Ｔｓ）対立遺伝子を含む、Ｅ．ｃｏｌｉＹＨ１株に形質転換した。形質転換体をプレートに画線し、３０℃および４３℃でインキュベートし、温度感受性対立遺伝子の補完について試験した。ｐＡＮ２８２の１つの単離株を除いた、全３つのｃｏａＡ変異体の全単離株が４３℃でよく補完し、これは、全３つのプラスミド作成物が、活性パントテネートキナーゼをコードすることを示す。従って、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｙｑｊＳオープンリーディングフレームは、活性パントテネートキナーゼをコードすると結論づけられる。
【０２６５】  実施例ＸＩＩＩ：Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムからのｃｏａＡ遺伝子の欠失
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ｙｑｊＳ）のｃｏａＡ遺伝子を、慣用的な手段により、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株の染色体から欠失した。ｃｏａＡコード配列の大半を、プラスミドクローンから欠失し、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）により置換し、一方、約１ｋｂの上流および下流配列を残して、染色体内での相同的組換えが可能となるようにし、プラスミドｐＡＮ２９６を得た（図１７参照）。次いで、ｐＡＮ２９６を使用して、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株（ＰＹ７９）を形質転換し、クロラムフェニコール耐性について選択した。大半の形質転換体は、ｃａｔ遺伝子をｃｏａＡ遺伝子と効果的に置換する二重クロスオーバー事象から生じる。ｃｏａＡ欠失−ｃａｔ挿入を含む形質転換株は、本明細書に記載の第二のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓパントテネートキナーゼコード遺伝子の存在に因り正常に増殖した。
【０２６６】  実施例ＸＩＶ：パントテネートキナーゼ活性をコードする第二のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ遺伝子の同定および特徴づけ
本明細書に詳述したように、パントテネート産生を最大化するために、例えば、パントテネートからＣｏＡまでの経路の最初の酵素である、パントテネートキナーゼの活性を減少することにより、パントテネートの補酵素Ａ（ＣｏＡ）ヘの流れを制限することが必要である。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの染色体からのｃｏａＡ遺伝子の欠失は致命的事象ではないという知見が判明した後（実施例ＸＩＩＩ参照）、パントテネートは必須な酵素活性であるので、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓは、活性パントテネートキナーゼをコードする第二の遺伝子を含まなければならないと結論づけられた。
【０２６７】  第二のパントテネートキナーゼコード遺伝子が、Ｅ．ｃｏｌｉＹＨ１株（ｃｏａＡ１５（Ｔｓ））を、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ遺伝子バンクで補完し、４３℃で増殖できる形質転換体を選択することにより同定された。形質転換体の中に、各ファミリー内に重複した制限地図を有するが、ファミリー間には有さない、２つのプラスミドファミリーが発見された。期待された通り、１つのファミリーの制限地位は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｏａＡ遺伝子（これは我々はｃｏａＡとも命名した、上記参照）の相同体のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノム配列および周囲の配列から予測されたものと同一であった。他のファミリーは、最初と完全に重複していない制限地図を有した。
【０２６８】  第二ファミリーからのクローニング挿入断片の末端のＤＮＡシークエンスにより、クローンは、ｆｔｓＨ遺伝子の３’末端、ｓｕｌ遺伝子の５’末端、およびｙａｃＢ、ｙａｃＣ、ｙａｃＤ、ｃｙｓＫ、ｐａｂＢ、ｐａｂＡおよびｐａｂＣ遺伝子の全部を含む、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ染色体の領域から来たことが示された。これらのクローニングした挿入断片のオープンリーディングフレームはどれも、原核または真核の全ての既知のパントテネートキナーゼ配列に相同性を示さなかった。
【０２６９】  数個の欠失が、クローニング挿入断片中のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノム配列を通じて創製された。各欠失を、Ｅ．ｃｏｌｉ温度感受性パントテネートキナーゼの補完について試験した。特に、クローニングベクター中のＳｔｕＩ部位と、ｙａｃＣ遺伝子のＳｗａＩ部位の間の全てのＤＮＡを除去した欠失により、クローニング挿入断片には唯一の無傷オープンリーディングフレームとしてｙａｃＢが残された（図２１参照）。この欠失プラスミドは依然として、Ｅ．ｃｏｌｉパントテネートキナーゼ変異体を補完した。しかし、ｙａｃＣのＳｗａＩ部位から（すでに部分切断した）ｆｔｓＨ遺伝子のＢｓｔ１１０７Ｉ部位のＤＮＡを除去した別の欠失は、Ｅ．ｃｏｌｉパントテネートキナーゼ変異体を補完できなかった。これらの結果から、ｙａｃＢオープンリーディングフレームは、補完活性に関与すると結論づけられた。ｙａｃＢはパントテネートキナーゼ遺伝子であることを確認するために、ｙａｃＢ  ＯＲＦと１１２塩基対の下流フランキング配列を、２つの独立的な反応でＰＣＲにより増幅し、構成性プロモーターの下流にクローニングし、プラスミドｐＡＮ３４１およびｐＡＮ３４２を得た（図２２）。ｐＡＮ３４１およびｐＡＮ３４２は、４４℃でＹＨ１の欠陥を補完し、一方、同じ骨格を有するが、ｙａｃＢの代わりにｐａｎＢＣＤを発現する対照プラスミドは補完しなかった。これにより、ｙａｃＢオープンリーディングフレームは、ＹＨ１の補完に関与することが確認された。
【０２７０】  従って、あらゆる以前に既知のパントテネートキナーゼ遺伝子に対する相同性に関連していない、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓでパントテネートキナーゼ活性をコードする新規遺伝子が発見された。この遺伝子は、パントテネートからＣｏａＡまでの経路の第一段階を触媒する酵素をコードする第二の別の遺伝子として、ｃｏａＸと再度命名された。ＣｏａＡ酵素の活性の減少と共に、ｃｏａＡの欠失について上記した方法によるｃｏａＸの欠失は、所望のレベルまでパントテネートキナーゼ活性を減少させる手段を提供する。
【０２７１】  Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｃｏａＸ遺伝子の数個の相同体が、公表されたｙａｃＢ（ｃｏａＸ）オープンリーディングフレーム配列および予測アミノ酸配列（配列番号８４および８５としてそれぞれ示す）を使用して、種々の公共的に入手できるデータベースの相同性探索により同定した。２つの場合（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）では、相同ｃｏａＸ遺伝子は、パントテネート生合成遺伝子に隣接しているか、またはほぼ隣接し、パントテネート代謝に役割を有するこれらの相同体と一致する。ＣｏａＸタンパク質は、パントテネートキナーゼのＣｏａＡファミリーにも、また、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＰａｎＫにより例示されたパントテネートキナーゼの真核ファミリーにも相同性を全く示さない。
【０２７２】  数個の細菌ＣｏａＸ相同体のアミノ酸配列と、公表されたＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノム配列に記載のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｙａｃＢ  ＯＲＦの翻訳から予測されるアミノ酸配列のアラインメントにより、他の細菌由来のＣｏａＸタンパク質は、そのカルボキシ末端に追加のアミノ酸残基を含まないことが判明した。さらに、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ遺伝子産物の予測アミノ酸の末端を超えたこれらの伸長は、２つの相対的によく保存された配列セグメントを含んだ。
【０２７３】  異なるリーディングフレーム中のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｙａｃＢ  ＯＲＦの終止コドンのちょうど下流のヌクレオチド配列の翻訳により、他の細菌ＣｏａＸタンパク質のカルボキシ末端伸長物に非常に類似したアミノ酸配列の存在が判明した。従って、人為現象的な下流アミノ酸配列および中途終結に至るフレームシフトを引き起こす、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｙａｃＢ  ＯＲＦ配列の公表されたＤＮＡ配列に間違いが存在することが考えられる。
【０２７４】  ｐＡＮ３４１およびｐＡＮ３４２（上記）のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＣｏａＸのＰＣＲにより作成した配列は、上記した推定カルボキシ末端伸長をコードするに十分な下流フランキング配列を含み、これは、クローンが補完アッセイで機能的であるという結果と一致する。しかし、３’ＰＣＲプライマーが、公表された配列から予測される唯一より短いｙａｃＢ  ＯＲＦを含むように、しかし、推定カルボキシ末端伸長は含まないように位置する場合、得られたプラスミドｐＡＮ３２９およびｐＡＮ３３０（ｐＡＮ３４１およびｐＡＮ３４２構造が類似；図２２参照）は、ＹＨ１の欠陥を補完しなかった。この結果は、公表されたｙａｃＢコード配列は、フレームシフトエラーを含み、ＣｏａＸのカルボキシ末端は、パントテネートキナーゼ活性に必要であることを支持する。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｃｏａＸの予測された正しいヌクレオチド配列を配列番号１９として示し、部分切断アミノ酸配列は配列番号９として示す。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのＣｏａＸアミノ酸配列およびその１１個の相同体のマルチプル配列アラインメントを図２３に示す。
【０２７５】  実施例ＸＶ：減少したまたは温度感受性の活性を有する、パントテネートキナーゼをコードする変異ｃｏａＡ遺伝子の作成
本実施例は、ｃｏａＡ遺伝子を修飾（すなわち、点変異の導入により）し、ｃｏａＸがゲノムから欠失した後にパントテネートキナーゼ活性を減少する戦略を記載する。
【０２７６】  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｏａＡ遺伝子の温度感受性対立遺伝子のクローニングおよびシークエンス
２つのＥ．ｃｏｌｉ株（各々、異なる変異ＣｏａＡ表現型を示す）を、Ｅ．ｃｏｌｉジェネティック・ストック・センターから得た。ＤＶ６２株は、ｃｏａＡ１５（Ｔｓ）対立遺伝子を含み、ＤＶ７９は、ｃｏａＡ１６（Ｆｒ）変異を含む。ＤＶ６２は、４３℃で温度感受性であり、温度感受性であるパントテネートキナーゼを産生する。ＤＶ７９は、ＤＶ６２を温度耐性に復帰することにより得られ、温度に安定な、フィードバック耐性パントテネートキナーゼ活性を産生する。これらの対立遺伝子のＤＮＡ配列は、文献で入手できるので、２つの変異株からのｃｏａＡ遺伝子をＰＣＲによりクローニングし、ｃｏａＡ遺伝子座で野生型である株ＭＭ２９４からのｃｏａＡ遺伝子に加えてシークエンスした。５’末端でのＰＣＲプライマーを、上流に開始コドンと４塩基を含むように設計し、自由に選択したリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を加えた。３つのＰＣＲ作成断片を、各々、ｐＡＮ２２９のＸｂａＩとＢａｍＨＩ部位の間にライゲートし、ｐＡＮ２８４（ｃｏａＡ１５（Ｔｓ）から）、ｐＡＮ２８５（野生型ｃｏａＡから）およびｐＡＮ（ｃｏａＡ１６（Ｆｒ）から）を得た。ｐＡＮ２２９は、Ｐ１５プロモーターからの発現を提供し、テトラサイクリン選択でＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓでｂｐｒでの単一クロスオーバーにより組込むことのできる、コピー数の低いＥ．ｃｏｌｉベクターである。
【０２７７】  全３つのプラスミドを、補完試験のために、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＹＨ株に形質転換した。全３つのプラスミドが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＹＨ１での温度感受性ｃｏａＡ変異を補完した。ｐＡＮ２８４のｃｏａＡ１５（Ｔｓ）遺伝子は、おそらく、正常染色体遺伝子に比べて有意に過剰発現され、よって、過剰産生は、温度感受性欠陥を補完する。過剰産生による欠陥の補完は、Ｅ．ｃｏｌｉで十分に文書化されている現象である。
【０２７８】  ｐＡＮ２８４、２８５、および２８６からのｃｏａＡコード領域を、ｐＧＥＭ７にサブクローニングし、ＤＮＡシークエンス用に、ｐＡＮ３０６、３０７および３０８をそれぞれ得た。期待されたように、ｐＡＮ３６７（野生型ｃｏａＡからの）の挿入断片のＤＮＡ配列は、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標））からのｃｏａＡ配列とマッチした。ｐＡＮ３０６からの配列は、Ｓ１７６Ｌ置換を引き起こす１塩基変化（すなわち、配列番号２として示したアミノ酸配列のＳｅｒ→Ｌｅｕ置換）を含む。興味深いことに、フィードバック耐性株から得られた、ｐＡＮ３０８挿入断片のＤＮＡ配列は、その温度感受性株（ｐＡＮ３０６に示す）から得られたものと同一であった。これは、温度感受性変異の復帰が、ｃｏａＡ遺伝子に連関していない第二の部位で生じ得ることを示す遺伝子データと一致する。
【０２７９】  Ｅ．ｃｏｌｉパントテネートキナーゼで温度感受性欠陥を引き起こすと予測される、Ｓ１７６Ｌ変異は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのそれを含む、全ての既知または疑われる細菌ｃｏａＡコードパントテネートキナーゼで保存されたセリン残基を変化させた（配列番号３参照およびアラインメントを参照）。これに基づいて、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓパントテネートキナーゼでの相同的残基でのセリンからロイシンへの変化により、温度感受性酵素またはより活性の低い酵素が得られると予測される。従って、変異Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｃｏａＡ遺伝子を産生するために、この特異的変化をＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｃｏａＡ遺伝子に導入した。変異バージョンを、ｃｏａＸについて欠失したＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株の染色体に設置し、例えば、組換え微生物を温度感受性（例えば、４３℃で増殖減少）について調べる。次いで、変異を、パントテネート過剰産生株に、好ましくは標準的な方法により上記の変異ｃｏａＸ遺伝子の欠失した株に設置し、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおけるパントテネート産生に好ましい株、すなわち、典型的な発酵条件下でパントテネートキナーゼ活性の減少した株を得た。
【０２８０】  パントテネートキナーゼ活性の減少をもたらす追加のｃｏａＡ点変異
勿論、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｃｏａＡにおける多くの他の点変異または１つより多くの点変異の組合せにより、活性は減少することが予期される。適切な変異は、変異誘発性ポリメラーゼ連鎖反応およびインビトロでの組換えにより作成でき、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｏａＡ１５（Ｔｓ）変異体を弱く補完する対立遺伝子についてスクリーニングすることにより同定できる。この型の前記変異の一例は、変異誘発性ポリメラーゼ連鎖反応により作成された、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｃｏａＡのアミノ酸１８１でのチロシンからヒスチジン置換である（配列番号３および図２４のアラインメントの第一列参照）。
【０２８１】  単離ｐＡＮ２８２Ａは、実施例ＸＩＩに記載した中間のサイズのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｃｏａＡオープンリーディングフレームから得られた。ｐＡＮ２８２Ａは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｏａＡ１５（Ｔｓ）変異体を非常に弱く補完したが、それにも関わらず、バックグラウンドより上で検出可能なレベルであった。Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｏａＡクローンについて実施したように、ｐＡＮ２８２Ａからのオープンリーディングフレームを、ｐＧＥＭ７にサブクローニングし、ｐＡＮ３０３を得た。ｐＡＮ３０３の挿入断片のＤＮＡ配列は、配列番号３のＹ１８１に対応するチロシンからヒスチジンへのアミノ酸変化をもたらす１塩基変化を示した。このチロシン残基は、ＧｅｎＢａｎｋに存在する全ての細菌ｃｏａＡ遺伝子／相同体に保存されている（図２４）。上記のＥ．ｃｏｌｉ温度感受性パントテネートキナーゼで変化した、このチロシン残基およびセリンは、細菌パントテネートキナーゼに高度に保存されている領域において僅か３つのアミノ酸しか分離しておらず、一方、ｐＡＮ２８２Ｂからの、中間サイズのオープンリーディングフレームの第二単離株のＤＮＡ配列は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムシークエンスプロジェクトの野生型配列と同一であった。ｐＡＮ３０３に見られる１塩基変化はおそらく、ｃｏａＡ遺伝子のＰＣＲによる増幅中に生じたのだろう。このｃｏａＡ２の変異体がＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて十分な残留生物活性を有する場合、減少したパントテネートキナーゼ活性を提供するために将来有用であり得る。
【０２８２】  ｃｏａＡオープンリーディングフレームの変異誘発のための基礎として作用できる好ましいプラスミドは、ｐＡＮ２９４である（例えば、図２５および実施例ＸＩＩ参照）。簡潔には、変異誘発ＰＣＲは、鋳型としてｐＡＮ２９４を使用して実施し、パントテネートキナーゼ活性の減少したｃｏａＡの変異体を上記のようにスクリーニングする。別に、ｐＡＮ２８２Ａで単離したものなどの変異は、ｐＡＮ２９３に設置できる。次いで、所望の変異を、適切なｐＡＮ２９４誘導体でも形質転換によりＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株の染色体に導入し、５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール耐性について選択する。得られた形質転換体の中には、所望の変異を含む単離株もあるだろう。
【０２８３】  同じように、ＣｏａＸ酵素活性を減少させる変異を作成および同定でき、前記変異は、上記のようなＣｏＡ産生を減少することによりパントテネート産生の最適化に使用できる。
【０２８４】  実施例ＸＶＩ：Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓから第二のパントテネートキナーゼ遺伝子であるｃｏａＸ遺伝子を欠失
ｃｏａＸの存在および性質に関して上記で得られた知見を用いて、コード活性を取り除き、ｃｏａＸから下流の遺伝子の発現に有害な影響を及ぼさない、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ染色体からのｃｏａＸオープンリーディングフレームの欠失を創製できる。前記欠失株において、ｃｏａＡ遺伝子は、パントテネートキナーゼをコードする唯一の遺伝子である。
【０２８５】  Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓからｃｏａＸ遺伝子を欠失するたあに、二重クロスオーバーの上流および下流相同性を含む、プラスミドｐＡＮ３３６（配列番号９２）を、カナマイシン耐性遺伝子を用いて、大半のｃｏａＸ  ＯＲＦを置換して作成した（図２６）。ＰＹ７９株は、ｐＡＮ３３６によりカナマイシン耐性に形質転換されたので、ＰＣＲにより二重クロスオーバーから生じたと確認された単離株はＰＡ８７６と命名された。予測されたように、ｃｏａＸそれ自体の欠失は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに致命的ではない。さらに、ＰＡ８７６からの染色体ＤＮＡは、コンピテントＰＡ８６１（ＰＹ７９ΔｃｏａＡ：：ｃａｔ）をカナマイシン耐性に形質転換しない。これらの結果により、それは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに致命的である、ΔｃｏａＡ：：ｃａｔおよびΔｃｏａＸ：：ｋａｎの組合せであり、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓは、パントテネートキナーゼ、ｃｏａＡおよびｃｏａＸをコードする２つの連関していない遺伝子を含み、どちらかの遺伝子は単独で、正常な増殖速度に十分なパントテネートキナーゼを供給できることが示される。
【０２８６】  実施例ＸＶＩＩ：Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｃｏａＡ遺伝子の部位特異的変異誘発を可能とするように設計されたプラスミドの作成
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ染色体に変異ｃｏａＡ遺伝子を容易に導入するために、ｃｏａＡ遺伝子に隣接して抗生物質耐性遺伝子を設置することが必要であった。これは、ベクターｐＧＥＭ５に３つのＤＮＡ断片を共に接続することにより達成された：（１）ｃｏａＡおよびｃｏａＡオープンリーディングフレームの上流に２．５ｋｂのゲノム配列を含む、３．４ｋｂのＤＮＡ配列；（２）クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）を含む１．１ｋｂのＤＮＡ配列；および（３）ｃｏａＡを含むオペロンから下流にある領域を含む１．４ｋｂのＤＮＡ。ｐＡＮ２９４と命名された得られたプラスミドは、オープンリーディングフレームｙｑｊＴ（ｃｏａＡからちょうど下流にあるオープンリーディングフレーム）を、ｃａｔ遺伝子の両側にフランキングする十分な相同性をもって、ｃａｔ遺伝子で効率的に置換し、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ染色体への二重組換えが可能となる（図２５）。ｐＡＮ２９４は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＰＹ７９株に形質転換し、５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコール耐性について選択し、ＰＡ８３６およびＰＡ８３７株を得、これはおそらく同一である。ＰＡ８３６および８３７を診断ＰＣＲにより調べ、ｃａｔ遺伝子は、単一クロスオーバーに対して、二重クロスオーバーにより組込まれたことが示される。ＰＡ８３６およびＰＡ８３７は正常に増殖し、オープンリーディングフレームｙｑｊＴは必須ではないという結論に至った（すなわち、ｙｑｊＴオープンリーディングフレームは、増殖またはパントテネート産生に対して全く有意な作用なく、ＰＡ８３６およびＰＡ８３７株から欠失できる）。従って、ｃｏａＡの変異対立遺伝子（すなわち変異）を、ｐＡＮ２９４に導入し、得られたプラスミドを使用して、例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株の染色体に対立遺伝子変異体を導入できる。
【０２８７】  実施例ＸＶＩＩＩ：減少したまたは温度感受性活性を有する、パントテネートキナーゼをコードする変異ｃｏａＸ遺伝子の作成
変異ｃｏａＸ遺伝子は、点変異を遺伝子に導入し、得られた変異体を、実施例ＸＩＩに記載のようにＥ．ｃｏｌｉ  ＹＨ１株を補完する能力について試験することにより作成する。ｃｏａＸ遺伝子配列中の好ましい変異は、種々の細菌起源からのＣｏａＸ配列間で保存された残基の置換をコードするものである（例えば、図２３に示した保存残基）。別に、ｃｏａＸ遺伝子配列のランダム変異を、変異誘発ＰＣＲおよびインビトロ組換えにより作成し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｏａＡ１５（Ｔｓ）変異体を弱く補完する対立遺伝子をスクリーニングすることにより同定する。
【０２８８】  かくして、作成した変異体（すなわち、ｃｏａＸ活性の減少した変異体）を、さらに工学して、内因性ｃｏａＡ遺伝子を欠失する（実施例ＸＩＩＩに記載）。ＣｏａＸ活性減少変異体もさらに工学して、実施例ＸＶに記載したような活性の減少したＣｏａＡ遺伝子産物を含むことができる。
【０２８９】  実施例ＸＩＸ：１つ以上のパントテネート生合成酵素に欠失を有する細菌を使用した、パント−化合物産生の増強
所望のパント−化合物がパントテネートではない場合、パントテネート過剰産生株からの１つ以上のパントテネート生合成遺伝子の適切な欠失により、前記の所望のパント−化合物を産生する株が提供される。本実施例において、所望のパント−化合物はパントエートである。例えば、ＰＡ２３６、ＰＡ３１３またはＰＡ８２４株で開始し、ｐａｎＣおよびｐａｎＤ遺伝子の一方または両方を欠失する。別の例において、ケトパントエートが所望のパント−化合物である。例えば、ＰＡ２４４、ＰＡ２４５またはＰＡ８２４株で開始して、ｉｌｖＣ、ｐａｎＥ１、ｐａｎＣおよびｐａｎＤ遺伝子の１つ、２つまたは全てを、開始株から欠失する。β−アラニンが所望のパント−化合物である場合、ｐａｎＢおよびｐａｎＣを、好ましくは、ＰＡ２２１、ＰＡ２３５、ＰＡ２４５またはＰＡ３１３から、ｐａｎＣの３’末端の小部分と共に、ｐａｎＢの５’末端の小部分のインフレーム融合を取り去る様式で、欠失できる。上記の全実施例において、パント−化合物産生株は、パントテネート栄養要求体である。従って、増殖培地は、適切な増殖のために十分なパントテネートを必要とする。次いで、上記のようなｐａｎＤを過剰発現するように設計されたベクターを上記の株に形質転換し、さらにβ−アラニン産生を増強する。
【０２９０】  上記の欠失は、当業者に公知の方法により、例えば、抗生物質耐性遺伝子の挿入および標的遺伝子（群）から十分な配列を除去して、前記標的配列（群）を失活することにより行なわれる。他には、標的配列の除去は、前記標的遺伝子への抗生物質耐性遺伝子の同時導入を伴わずに行なわれ、次いで、集結（任意の他の適切な選択可能なＤＮＡ配列での同時形質転換）し、次いでレプリカプレーティングにより前記標的遺伝子の機能の欠失についてスクリーニングすることにより行なわれる。
【０２９１】
【表２６】
0005392957.tif 000027
【０２９２】  均等物。当業者は、慣用的な実験のみを使用して、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識しているか、または、確信しているだろう。前記均等物は、以下の特許請求の範囲により包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、パントテネート生合成経路の図解である。
【図２】  図２は、ＰＡ２２１株の組込みバージョンに等価である、Ｐ２６ｐａｎＢＣＤカセットの上流にライゲートした配列を含む、プラスミドｐＡＮ２４０の図解である。
【図３】  図３Ａは、Ｐ２６およびＲＢＳ１から発現されるｐａｎＢＣＤオペロンを含む、プラスミドｐＡＮ００４の図解である。図３Ｂは、Ｐ２６およびＲＢＳ２から発現されるｐａｎＢＣＤオペロンを含む、プラスミドｐＡＮ００６の図解である。
【図４】  図４は、組込み可能および増幅可能であるＰ２６−ＲＢＳ２−ｐａｎＥ１発現カセットを含む、プラスミドｐＡＮ２３６の図解である。
【図５】  図５は、プラスミドｐＡＮ４２３の作成の図解である。
【図６】  図６は、プラスミドｐＡＮ４２６およびｐＡＮ４２７の作成の図解である。
【図７】  図７は、プラスミドｐＡＮ４２８およびｐＡＮ４２９の作成の図解である。
【図８】  図８は、プラスミドｐＡＮ４３１の作成の図解である。
【図９】  図９は、プラスミドｐＡＮ４４１の作成の図解である。
【図１０】  図１０は、プラスミドｐＡＮ４４０の作成の図解である。
【図１１】  図１１は、二重クロスオーバーによりｐａｎＥ１遺伝子座に１コピーのＰ２６−ｐａｎＥ１カセットを組込むように設計された、プラスミドｐＡＮ２５１の図解である。
【図１２】  図１２は、ａｍｙＥ１遺伝子座に１コピーのＰ２６−ｉｌｖＢＮＣカセットを組込むように設計された、プラスミドｐＡＮ２６７の図解である。
【図１３】  図１３は、コピー数の低いベクターにおけるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｉｌｖＤの１クローンである、プラスミドｐＡＮ２５７の図解である。
【図１４】  図１４は、ｉｌｖＤ遺伝子座での１コピーのＰ２６−ｉｌｖＤカセットを組込むように設計された、プラスミドｐＡＮ２６３の図解である。
【図１５】  図１５は、ｃａｔ遺伝子でＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｉｌｖＤ遺伝子を破壊するように設計された、プラスミドｐＡＮ２６１の図解である。
【図１６】  図１６は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける補酵素Ａ生合成経路の図解である。
【図１７】  図１７は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｃｏａＡ遺伝子の大半を欠失し、クロラムフェニコール耐性遺伝子を置換するように設計されたプラスミドである、ｐＡＮ２９６の構造の図解である。
【図１８】  図１８は、ｃｏａＡ遺伝子の領域におけるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムの図解である。尺度は、塩基対であり、重要なオープンリーディングフレームは白抜きの矢印により示す。
【図１９】  図１９は、ｂｐｒ遺伝子座での組込み後の、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｃｏａＡを発現しているプラスミドである、プラスミドｐＡＮ２８１の図解である。
【図２０】  図２０Ａ〜Ｂは、６つの既知または予測微生物ｃｏａＡ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列のマルチプル配列アラインメント（ＭＳＡ）を示す。配列番号４〜６および１〜３は、それぞれ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ（登録商標）アクセッション番号Ｑ９Ｘ７９５）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ（登録商標）アクセッション番号Ｏ５３４４０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ（登録商標）アクセッション番号Ｏ８６７９９）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ（登録商標）アクセッション番号Ｐ４４７９３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ（登録商標）アクセッション番号Ｐ１５０４４）およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ（登録商標）アクセッション番号Ｐ５４５５６）のアミノ酸配列に対応する。アラインメントは、京都大学化学研究所のゲノムネットＣＬＵＳＴＡＬＷサーバーのＣｌｕｓｔａｌＷ  ＭＳＡソフトウェアを使用して作成した。以下のパラメータを使用した：対のアラインメント、Ｋ−タプル（文字）サイズ＝１、ウィンドウサイズ＝５、ギャップペナルティー＝３、Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ｔｏｐ  Ｄｉａｇｏｎａｌｓ＝５、スコアリング法＝％；マルチプルアラインメント、ギャップオープンペナルティー＝１０、ギャップ伸長ペナルティー＝０．０、ウェイト転移＝Ｎｏ、親水性残基＝Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＡｒｇおよびＬｙｓ、疎水性ギャップ＝Ｙｅｓ；およびスコアリングマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ。
【図２１】  図２１は、ｃｏａＸ（ｙａｃＢ）遺伝子の領域におけるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノム構造の図解である。尺度は塩基対であり、重要なオープンリーディングフレームは白抜きの矢印により示し、ある予測制限断片は太い棒により示す。
【図２２】  図２２は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｙａｃＢ（本明細書ではｃｏａＸと再度命名）の２つの独立的なＰＣＲから得られたクローンである、ｐＡＮ３４１およびｐＡＮ３４２構造の図解である。
【図２３】  図２３Ａ〜Ｄは、１４個の既知または予測微生物ｃｏａＸ遺伝子によりコードされる、アミノ酸配列のマルチプル配列アラインメント（ＭＳＡ）を示す。配列番号９、７４、７〜８、７５、１１、１０および１２〜１８は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ（登録商標）アクセッション番号Ｐ３７６５４）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｌｙｔｉｃｕｍ（ＷＩＴ（登録商標）アクセッション番号ＲＣＡ０３３０１、Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ研究所）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ（ＲＩＲ（登録商標）アクセッション番号Ｔ３６３９１、）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ（登録商標）アクセッション番号Ｏ０６２８２）、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＷＩＴ（登録商標）アクセッション番号ＲＲＣ０２４７３）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ（ＤＢＪ（登録商標）アクセッション番号ＢＡＡ２１４７６．１）、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ（登録商標）アクセッション番号Ｑ９ＲＸ５４）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＡＤ３５９６４．１）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ（登録商標）アクセッション番号Ｏ８３４４６）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ（登録商標）アクセッション番号Ｏ５１４７７）、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ（登録商標）アクセッション番号Ｏ６７７５３）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ（登録商標）アクセッション番号Ｐ７４０４５）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ（登録商標）アクセッション番号Ｏ２５５３３）、およびＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ（登録商標）アクセッション番号Ｑ４５３３８）のアミノ酸配列にそれぞれ対応する。アラインメントは、京都大学化学研究所のゲノムネットＣＬＵＳＴＡＬＷサーバーのＣｌｕｓｔａｌＷ  ＭＳＡソフトウェアを使用して作成した。以下のパラメータを使用した：対のアラインメント、Ｋ−タプル（文字）サイズ＝１、ウィンドウサイズ＝５、ギャップペナルティー＝３、Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ｔｏｐ  Ｄｉａｇｏｎａｌｓ＝５、スコアリング法＝％；マルチプルアラインメント、ギャップオープンペナルティー＝１０、ギャップ伸長ペナルティー＝０．０、ウェイト転移＝Ｎｏ、親水性残基＝Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＡｒｇおよびＬｙｓ、疎水性ギャップ＝Ｙｅｓ；およびスコアリングマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ。
【図２４】  図２４は、以下の微生物からのｃｏａＡ遺伝子産物のタンパク質配列の一部のマルチプル配列アラインメントを示す；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ。Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｏａＡ１５（Ｔｓ）およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｃｏａＡ２８２Ａで変異した残基を、それぞれアラインメントの下および上に示す。部分は、配列番号３の１６８〜１８７、配列番号２の１６７〜１８６、配列番号１の１６５〜１８４、配列番号４の１６９〜１８８、配列番号５の１６９〜１８８、および配列番号６の１７９〜１９８のアミノ酸残基にそれぞれ対応する。
【図２５】  図２５は、その天然遺伝子座で変異Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｃｏａＡを組込むためのプラスミドである、ｐＡＮ２９４の構造の図解である。
【図２６】  図２６は、その染色体座からＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｃｏａＸを欠失し、それを、カナマイシン耐性遺伝子で置換するように設計されたプラスミドである、ｐＡＮ３３６の構造の図解である。
【図１】
0005392957.tif 000028
【図２】
0005392957.tif 000029
【図３Ａ】
0005392957.tif 000030
【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
0005392957.tif 000033
【図６】
0005392957.tif 000034
【図７】
0005392957.tif 000035
【図８】
0005392957.tif 000036
【図９】
0005392957.tif 000037
【図１０】
0005392957.tif 000038
【図１１】
0005392957.tif 000039
【図１２】
0005392957.tif 000040
【図１３】
0005392957.tif 000041
【図１４】
0005392957.tif 000042
【図１５】
0005392957.tif 000043
【図１６】
0005392957.tif 000044
【図１７】
0005392957.tif 000045
【図１８】
0005392957.tif 000046
【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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