(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの増幅配列の存在によりＭＲＳＡを同定する核酸共増幅アッセイにおける偽陽性ＭＲＳＡ判定の発生率を低減する方法であって、
（ａ）ＭＲＳＡの存在について試験される臨床試料からゲノムＤＮＡを取得するステップであり、この結果、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ核酸およびメチシリン耐性をコードする核酸の混合物がもたらされるステップであって、該臨床試料は鼻腔のスワブ試料を含む、ステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で取得された前記ゲノムＤＮＡを鋳型として用いて実施されるｉｎ  ｖｉｔｒｏの核酸増幅反応で、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列およびメチシリン耐性マーカーを共増幅するステップであって、該Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的リボソーム核酸配列を含み、そして該メチシリン耐性マーカーはｍｅｃＡ標的配列を含む、ステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で共増幅された前記Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列および前記メチシリン耐性マーカーに対して、核酸増幅反応における所定レベルの進行を示すリアルタイムの反応曲線のＣｔ値を決定するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で決定された前記リアルタイムの反応曲線のＣｔ値の両方の関数であるΔＣｔの数値を計算するステップであって、該ΔＣｔの数値は、ステップ（ｃ）で決定されたリアルタイムの反応曲線のＣｔ値の間の差として計算される、ステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）で計算された前記ΔＣｔの数値を、ＭＲＳＡを同定する閾値基準と比較するステップであり、ＭＳＳＡ菌およびＭＲ−ＣｏＮＳ細菌の混合物は含むがＭＲＳＡ細菌は含まない臨床試料を示すΔＣｔの数値の部分集合を、前記閾値基準により除外するステップと、
（ｆ）前記閾値基準が満たされる場合に限り前記臨床試料中にＭＲＳＡが存在することを判定するステップであり、これにより、偽陽性ＭＲＳＡ判定の発生率が低下するステップと
を含む方法。
【請求項２】
ステップ（ｄ）で計算される前記ΔＣｔの数値が、上限閾値カットオフ値から下限閾値カットオフ値にわたる範囲内にあることを、ステップ（ｅ）の前記閾値基準が必要とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ΔＣｔの数値が、経験的に決定される上限閾値カットオフ値から経験的に決定される下限閾値カットオフ値にわたるΔＣｔ範囲内にあることを、ステップ（ｅ）の前記閾値基準が必要とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記メチシリン耐性マーカーがｍｅｃＡ標的配列を含み、
ステップ（ｄ）の前記ΔＣｔの数値が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列に対して決定されたリアルタイムの反応曲線のＣｔ値から、ｍｅｃＡ標的配列に対して決定されたリアルタイムの反応曲線のＣｔ値を減じることにより計算され、
前記ΔＣｔの数値が、経験的に決定された閾値カットオフ値よりも大きいことを、ステップ（ｅ）の前記閾値基準が必要とする、
請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願）
本願は、２００７年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／０１５，９５４号；および２００８年３月３１に出願された米国仮特許出願第６１／０４１，１４６号の利益を主張する。これらの、より早い出願の全体の開示は、参照により本明細書により援用される
本発明は、核酸診断に関連するバイオテクノロジーの亜分野に関する。より具体的に述べると、本発明は、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）などの抗生剤耐性菌の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）は、それ以外のメチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）に対しては有効な特定の抗生剤に対して耐性な細菌性病原体である。より具体的に述べると、オキサシリンおよびメチシリンに対して耐性な、従来ＭＲＳＡと呼ばれてきたＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株は、セファロスポリンおよびカルバペネムを含むすべてのβ−ラクタム剤に対して耐性である。病院関連のＭＲＳＡ分離株が、エリトロマイシン、クリンダマイシン、およびテトラサイクリンを含む他の一般に用いられる抗微生物剤に対して多剤耐性であることが多いのに対し、地域関連のＭＲＳＡ分離株は、β−ラクタム剤およびエリトロマイシンのみに対して耐性であることが多い（非特許文献１を参照されたい）。２００５年において重度のＭＲＳＡ感染（すなわち、侵襲性の感染）を発生させた人々の推定人数は、約９４，３６０人であった（非特許文献２）。
【０００３】
ＭＲＳＡ問題はますます大きくなりつつあり、人的および経済的な被害が増大しつつある。実際、米国人口の約３２％には既にＳ．ａｕｒｅｕｓがコロニー形成しており、同約０．８％には既にＭＲＳＡがコロニー形成している（非特許文献３）。ＭＲＳＡに起因する医療関連のブドウ球菌感染（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）の比率もまた上昇している：１９７４年には米国の集中治療室内におけるＳ．ａｕｒｅｕｓ感染の２％がＭＲＳＡであり、１９９５年には同２２％であり、２００４年には同６４％であった（非特許文献４）。証拠が示すように、ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡによる感染は、同等の直接的な医療費と関連するが、ＭＲＳＡ感染は、ＭＳＳＡによる感染と比較した場合、２倍を超える死亡率と関連する（すなわち、８％に対して２１％）（非特許文献５）。早期の介入を支持するために、ＭＲＳＡを検出する各種の診断アッセイおよびスクリーニングアッセイが開発されている。
【０００４】
ＭＲＳＡのコロニー形成に対するスクリーニングは従来、例えば、選択培養液または寒天培地を用いる検体培養物に依拠してきたが、診断までの時間を短縮する分子法が開発されている。例えば、非特許文献６は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉの混合物を含有する検体内においてＭＲＳＡを検出するリアルタイムＰＣＲアッセイについて説明した。アッセイは、「ｏｒｆＸ」と称する未知の機能のオープンリーディングフレームの３’端に組み込まれる、ＳＣＣｍｅｃ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｍｅｃ）と呼ばれる可動性遺伝因子の検出に依拠した。ＭＲＳＡ細菌に薬剤耐性を賦与するｍｅｃＡ遺伝子を保有するＳＣＣｍｅｃは、増幅反応において検出される組込み接合部から少なくとも９ｋｂ離れて位置する。Ｈｕｌｅｔｓｋｙらにより説明される技法では、ＳＣＣｍｅｃ右端配列の片側にハイブリダイズする５種のプライマー、ならびにＳ．ａｕｒｅｕｓ染色体のｏｒｆＸ遺伝子に対して特異的な１種のプライマーおよび３種の分子ビーコンによるハイブリダイゼーションプローブのコレクションが必要である。多数種のｏｒｆＸプライマーに対する必要は、異なるＭＲＳＡ分離株間における公知の配列多様性を反映する。代替的な分子アッセイでは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに特異的な第１の遺伝子配列と、ｍｅｃＡ遺伝子に特異的な第２の遺伝子配列とが個別に検出されるが、２つの配列間における物理的な連結を確立することはできない。
【０００５】
公表された報告は、ＭＲＳＡ検出のための既存の分子法の各々における特定の欠点を強調している。例えば、非特許文献７は、接合部ベースの増幅手順を用いて鼻腔検体を試験するための市販のＭＲＳＡアッセイを用いて実施される手順に由来する結果について説明した。略述すると、同著者らは、リアルタイムアッセイにおいてＭＲＳＡ陽性として同定された試料に由来するＭＳＳＡ分離株の回収に注目した。この偽陽性結果の発生は、例えば、抗生剤選択圧の不在下における遺伝子不安定性の結果としてｍｅｃＡ遺伝子を喪失した細菌内における接合部の存在により説明されうる。さらに、本発明者らは、おそらく、接合部の配列が高度に多様であり、増幅プライマーに効率的にハイブリダイズしなかったために、同じ市販のアッセイが、少なくとも１種の高度に薬剤耐性のＭＲＳＡ分離株を検出できなかったことを観察している。該スクリーニング戦略の有用性は、ＳＣＣ接合部がメチシリン耐性と固有な形では関連していない事実によってさらに危ういものとなっている（非特許文献８（２３１頁）を参照されたい）。したがって、接合部ベースのＭＲＳＡ検出法は、偽陽性結果および偽陰性結果の両方により脅かされている。
【０００６】
ＭＲＳＡスクリーニングのために他の分子法も考案されているが、これもまた、欠点を克服できていない。例えば、非特許文献８は、メチシリン耐性コアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｃｉ（ＭＲ−ＣｏＮＳ）株およびＭＳＳＡ菌株の両方による鼻腔コロニー形成が、分子法による偽陽性ＭＲＳＡ判定の危険性を表わすのに十分な頻度で生じるのではないかという問題を提起した。病院での医療処置を受けた患者試料集団の３〜４％が、ＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳによる鼻腔コロニー形成の証拠を示すことを、同著者らは示した。したがって、コロニー形成した個体に由来する試料は、ｍｅｃＡのＤＮＡ配列およびＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的ＤＮＡ配列の両方を含んでいた。同研究は、ｍｅｃＡ遺伝子およびＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的遺伝子を個別に標的とする分子的なＭＲＳＡスクリーニング検査が、低度のＭＲＳＡ状況下にある臨床検体へと直接に適用されると、４０％という許容不可能な陽性推定値と関連すると結論した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】米国ＣＤＣ刊行物、「Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ：  Ｏｘａｃｉｌｌｉｎ／Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ」（２００５年）
【非特許文献２】ＪＡＭＡ、第２９８巻、１７６３〜１７７１頁（２００７年）
【非特許文献３】Ｋｕｅｈｎｅｒｔら、Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、第１９３巻、１７２頁（２００６年）
【非特許文献４】Ｋｌｅｖｅｎｓら、Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、第４２巻、３８９頁（２００６年）
【非特許文献５】Ｒｕｂｉｎら、Ｅｍｅｒｇ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、第５巻、９頁（１９９９年）
【非特許文献６】Ｈｕｌｅｔｓｋｙら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第４２巻、１８７５頁（２００４年）
【非特許文献７】Ｄｅｓｊａｒｄｉｎｓら、Ｊ  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第４４巻、１２１９頁（２００６年）
【非特許文献８】Ｂｅｃｋｅｒら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第４４巻、２２９頁（２００６年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
鼻腔スワブ試料などの複合試料に対するＭＲＳＡスクリーニングの既存の手法は、あるレベルの誤判定をもたらす傾向がある。したがって、特に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ａｕｒｅｕｓ以外のメチシリン耐性細菌（例えば、ＭＲ−ＣｏＮＳ）による重感染の場合には、偽陽性ＭＲＳＡ判定を低減する迅速な分子法が必要である。本発明は、この必要を満たす。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の態様は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列をコードする核酸配列を増幅するための組成物に関する。本発明の組成物は、配列番号１からなる標的相補的塩基配列を有する第１のオリゴヌクレオチドと、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列に対して相補的でない５’配列を場合によって含む、配列番号４からなる標的相補的塩基配列を有する最長６０塩基までの長さの第２のオリゴヌクレオチドとを含む。好ましい実施形態では、第１および第２のオリゴヌクレオチドのうちの一方のみが、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼにより伸長しうる３’端を有する。該組成物は、検出可能に標識されているハイブリダイゼーションプローブをさらに含むことがより好ましい。
【００１０】
本発明の別の態様は、メチシリン耐性をコードする核酸配列を増幅するための組成物に関する。本発明の組成物は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９からなる群から選択される標的相補的塩基配列を有する第１のオリゴヌクレオチドを含む。該組成物はまた、メチシリン耐性をコードする核酸配列に対して相補的でない５’配列を場合によって含む、配列番号１３からなる標的相補的塩基配列を有する第２のオリゴヌクレオチドも含む。好ましい実施形態では、第１および第２のオリゴヌクレオチドのうちの一方のみが、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼにより伸長しうる３’端を有する。該組成物は、検出可能に標識されているハイブリダイゼーションプローブをさらに含むことがより好ましい。
【００１１】
本発明の別の態様は、２つの増幅配列の存在によりＭＲＳＡを同定する核酸共増幅アッセイにおける偽陽性ＭＲＳＡ判定の発生率を低減する方法に関する。まず、ＭＲＳＡの存在について試験することになっている臨床試料からゲノムＤＮＡを取得するステップが実施される。本発明の方法によれば、この結果、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ核酸およびメチシリン耐性をコードする核酸の混合物がもたらされる。次に、取得されたゲノムＤＮＡを鋳型として用いて実施されるｉｎ  ｖｉｔｒｏの核酸増幅反応において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列およびメチシリン耐性マーカーを共増幅するステップが実施される。これに、共増幅されたＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列およびメチシリン耐性マーカーに対して、時間依存的な増幅指標を決定するステップが後続する。次に、決定された時間依存的な増幅指標両方の関数である数値を計算するステップが実施される。次に、計算された数値を、ＭＲＳＡを同定する閾値基準と比較するステップであり、ＭＳＳＡ菌およびＭＲ−ＣｏＮＳ細菌の混合物は含むがＭＲＳＡ細菌は含まない臨床試料を示す数値の部分集合を、該閾値基準により除外するステップが実施される。最後に、該閾値基準が満たされる場合に限り臨床試料中にＭＲＳＡが存在することを判定するステップが実施され、これにより、偽陽性ＭＲＳＡ判定の発生率が低下する。好ましい実施形態では、計算される数値が、上限閾値カットオフ値から下限閾値カットオフ値にわたる範囲内にあることを、閾値基準が要請する。異なる好ましい実施形態において、計算される数値は、決定された時間依存的な増幅指標の間の差として計算されるΔＣｔの数値である。より好ましくは、ΔＣｔの数値が、経験的に決定された上限閾値カットオフ値から経験的に決定された下限閾値カットオフ値にわたるΔＣｔ範囲内にあることを、閾値基準が要請する。さらにより好ましくは、メチシリン耐性マーカーがｍｅｃＡ標的配列を含み、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列に対して決定された時間依存的な増幅指標から、ｍｅｃＡ標的配列に対して決定された時間依存的な増幅指標を減じることによりΔＣｔの数値が計算され、ΔＣｔの数値が、経験的に決定された閾値カットオフ値よりも大きいことを、閾値基準が要請する。本発明のより一般的な実施形態によれば、臨床試料は鼻腔スワブ試料である。本発明の異なる一般的な実施形態によれば、メチシリン耐性マーカーはｍｅｃＡ標的配列を含む。臨床試料が鼻腔スワブ試料である場合、メチシリン耐性マーカーは、ｍｅｃＡ標的配列を含むことが好ましい。極めて好ましい実施形態において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的リボソーム核酸配列を含む。
【００１２】
本発明の別の態様は、臨床試料がメチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）細菌を含有することを確立する方法に関する。一般に、該方法は、臨床試料から核酸を取得するステップを含む。これは、洗浄剤およびアルカリによる試料の処理など、従来の手順を伴いうる。次に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの核酸増幅反応において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列およびメチシリン耐性特異的標的配列を共増幅するステップが実施される。この反応は、該手順の先行するステップにおいて取得された核酸を鋳型として用いて実施される。本発明の方法は、最初の取得するステップにおいて取得された核酸の中に、示した２つの標的配列の各々が含まれる試料を伴う操作に特に用いられる。実際、標的配列の両方についての増幅産物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの核酸増幅反応において生成および検出される。これに、共増幅されたＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列およびメチシリン耐性特異的標的配列についての時間依存的な増幅指標を決定するステップが後続する。次に、該決定するステップに由来する、該時間依存的な増幅指標両方の関数である数値を計算するステップが実施される。次に、計算された数値が閾値基準を満たす場合に、該生物学的試料がメチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細菌を含有することを確立するステップが実施される。メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細菌から取得される核酸の共増幅反応速度と、メチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細菌およびメチシリン耐性コアグラーゼ陰性細菌の混合物から取得される核酸の共増幅反応速度とを、該閾値基準により区別する。好ましい一実施形態において、臨床試料は鼻腔スワブ試料である。別の好ましい実施形態において、メチシリン耐性特異的標的配列は、ｍｅｃＡ標的配列を含む。さらに別の好ましい実施形態において、閾値基準は、計算された数値の、経験的に決定された下限閾値カットオフ値との比較、および経験的に決定された上限閾値カットオフ値との比較を伴う。さらに別の好ましい実施形態において、計算される数値は、決定された時間依存的な増幅指標の間の差として計算されるΔＣｔの数値である。より好ましくは、メチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細菌の存在を確立するのに、ΔＣｔの数値が経験的に決定された下限閾値カットオフ値よりも小さいか、またはΔＣｔの数値が経験的に決定された上限閾値カットオフ値よりも大きいことを、閾値基準が要請する。代替的に、ΔＣｔの数値は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列に対して決定された時間依存的な増幅指標から、ｍｅｃＡ標的配列に対して決定された時間依存的な増幅指標を減じることにより計算することもできる。さらに、メチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細菌の存在を確立するのに、ΔＣｔの数値が、経験的に決定された閾値カットオフ値よりも小さいことも、閾値基準が要請する。異なる代替法によれば、ΔＣｔの数値は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列に対して決定された時間依存的な増幅指標から、ｍｅｃＡ標的配列に対して決定された時間依存的な増幅指標を減じることにより計算することもできる。さらに、メチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細菌の存在を確立するのに、ΔＣｔの数値が、経験的に決定された閾値カットオフ値よりも大きいことも、閾値基準が要請する。さらに別の好ましい実施形態において、該取得するステップは、ゲノムＤＮＡを取得することを伴う。さらにまた別の好ましい実施形態において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの核酸増幅反応は、逆転写酵素を含む。さらにまた別の実施形態において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓリボソーム核酸配列である。さらにまた別の好ましい実施形態において、該決定するステップは、単位複製配列の生成を示す検出可能なシグナルの所定レベルに到達する時間を決定することを伴う。本発明のより一般的な実施形態によれば、臨床試料が鼻腔スワブ試料である場合、メチシリン耐性特異的標的配列は、ｍｅｃＡ標的配列を含む。これに該当する場合、計算される数値は、該決定するステップにおける時間依存的な増幅指標の間の差として計算されるΔＣｔの数値であることが好ましい。好ましい一代替法によれば、閾値基準は、ΔＣｔの数値を経験的に決定された下限閾値カットオフ値との比較、および経験的に決定された上限閾値カットオフ値の比較を伴う。好ましい別の代替法によれば、メチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細菌の存在を確立するのに、ΔＣｔの数値が経験的に決定された下限閾値カットオフ値よりも小さいか、またはΔＣｔの数値が経験的に決定された上限閾値カットオフ値よりも大きいことを、閾値基準が要請する。さらに別の好ましい代替法によれば、ΔＣｔの数値は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列に対して決定された時間依存的な増幅指標から、ｍｅｃＡ標的配列に対して決定された時間依存的な増幅指標を減じることにより計算することもでき、メチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細菌の存在を確立するのに、ΔＣｔの数値が、経験的に決定された閾値カットオフ値よりも小さいことを、閾値基準が要請する。さらにまた別の好ましい代替法によれば、ΔＣｔの数値は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列に対して決定された時間依存的な増幅指標から、ｍｅｃＡ標的配列に対して決定された時間依存的な増幅指標を減じることにより計算することもでき、メチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細菌の存在を確立するのに、ΔＣｔの数値が、経験的に決定された閾値カットオフ値よりも大きいことを、閾値基準が要請する。
【００１３】
本発明の別の態様は、臨床試料がメチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）細菌を含有することを、制御可能な偽陽性判定発生率で指摘する方法に関する。該方法は、臨床試料からゲノムＤＮＡを取得するステップで始まり、この結果、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ核酸およびメチシリン耐性をコードする核酸の混合物がもたらされる。これに、取得されたゲノムＤＮＡを鋳型として用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏの核酸増幅反応において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列およびメチシリン耐性マーカーを共増幅するステップが後続する。次に、共増幅されたＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列およびメチシリン耐性マーカーに対して、時間依存的な増幅指標を決定するステップが実施される。次に、決定された時間依存的な増幅指標両方の関数である数値を計算するステップが実施される。最後に、ＭＲＳＡから取得された核酸の増幅を、ＭＳＳＡ菌およびＭＲ−ＣｏＮＳ細菌の混合物から取得された核酸の増幅と区別する閾値基準を、計算された数値が満たす場合に、臨床試料がＭＲＳＡを含有することを指摘するステップが実施される。この手順により、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列およびメチシリン耐性マーカーの両方を定性的に検出することによりＭＲＳＡの存在を判定する方法と比較して、臨床試料中におけるＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳの混合物から結果としてもたらされる偽陽性ＭＲＳＡ判定が減少する。好ましい一実施形態では、計算される数値が、経験的に決定された上限閾値カットオフ値から経験的に決定された下限閾値カットオフ値にわたる範囲内にあることを、閾値基準が要請する。異なる好ましい実施形態において、計算される数値は、決定された時間依存的な増幅指標の間の差として計算されるΔＣｔの数値である。より好ましくは、ΔＣｔの数値が、経験的に決定された上限閾値カットオフ値から経験的に決定された下限閾値カットオフ値にわたるΔＣｔ範囲内にあることを、閾値基準が要請する。本発明のより一般的な実施形態によれば、臨床試料は鼻腔スワブ試料である。異なる一般的な実施形態によれば、メチシリン耐性マーカーは、ｍｅｃＡ標的配列を含む。臨床試料が鼻腔スワブ試料である実施形態によれば、メチシリン耐性マーカーは、ｍｅｃＡ標的配列を含む。極めて好ましい実施形態において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列は、リボソーム核酸配列を含む。
【００１４】
本発明の別の態様は、臨床試料が、メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）細菌を含有するか、メチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）細菌およびメチシリン耐性コアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（ＭＲ−ＣｏＮＳ）細菌の混合物を含有するか確立する方法に関する。該方法は、臨床試料からゲノムＤＮＡを取得するステップで始まり、この結果、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ核酸およびメチシリン耐性をコードする核酸の混合物がもたらされる。次に、取得されたゲノムＤＮＡを鋳型として用いて実施されるｉｎ  ｖｉｔｒｏの核酸増幅反応において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列およびメチシリン耐性マーカーを共増幅するステップが実施される。これに、共増幅されたＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列およびメチシリン耐性マーカーに対して、時間依存的な増幅指標を決定するステップが後続する。次に、時間依存的な増幅指標両方の関数である数値を計算するステップが実施される。最後に、以下の２つの相互に排他的な条件のいずれが存在するかを確立するステップが実施される。第１の場合において、ＭＲＳＡ細菌から取得される核酸の共増幅反応速度と、ＭＳＳＡ菌およびＭＲ−ＣｏＮＳ細菌の混合物から取得される核酸の共増幅反応速度とを区別する閾値基準を、計算された数値が満たす場合、臨床試料はＭＲＳＡを含有する。第２の場合において、計算された数値が該閾値基準を満たさない場合、臨床試料は、ＭＲ−ＣｏＮＳと混合されたＭＳＳＡを含有し、ＭＲＳＡを含有しない。好ましい一実施形態では、該数値が、経験的に決定された上限閾値カットオフ値から経験的に決定された下限閾値カットオフ値にわたる範囲内にあることを、閾値基準が要請する。異なる好ましい実施形態において、ステップ（ｄ）において計算された数値は、ステップ（ｃ）において決定された時間依存的な増幅指標の間の差として計算されるΔＣｔの数値である。より好ましくは、ΔＣｔの数値が、経験的に決定された上限閾値カットオフ値から経験的に決定された下限閾値カットオフ値にわたるΔＣｔ範囲内にあることを、閾値基準が要請する。さらにより好ましくは、ΔＣｔの数値が経験的に決定された下限閾値カットオフ値よりも小さく、これにより、ＭＲ−ＣｏＮＳ細菌を超える量でＭＳＳＡ菌が存在するＭＳＳＡ菌およびＭＲ−ＣｏＮＳ細菌の混合物を、臨床試料が含有することを示す。本発明のより一般的な実施形態によれば、臨床試料は鼻腔スワブ試料である。本発明の異なる一般的な実施形態によれば、メチシリン耐性マーカーは、ｍｅｃＡ標的配列を含む。臨床試料が鼻腔スワブ試料である場合において、メチシリン耐性マーカーは、ｍｅｃＡ標的配列を含むことが好ましい。これに該当する場合、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列は、リボソーム核酸配列でありうる。
【００１５】
本発明の別の態様は、臨床検査試料中におけるＭＲＳＡ細菌の存在と符合する反応速度プロファイルを同定するリアルタイム核酸共増幅アッセイにおいて、感度および特異性のパラメータを設定する方法に関する。該方法は、ＭＲＳＡ細菌を含むことが既知である臨床試料コレクションと、ＭＳＳＡ菌およびＭＲ−ＣｏＮＳ細菌は含むがＭＲＳＡ細菌は含まないことが既知である臨床試料コレクションとを取得するステップで始まる。これに、該臨床試料コレクションの中における各試料からゲノムＤＮＡを単離するステップが後続し、この結果、ＭＲＳＡを含む細菌から単離されたゲノムＤＮＡ試料のコレクションと、ＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮは含むがＭＲＳＡは含まない細菌から単離されたゲノムＤＮＡ試料のコレクションとがもたらされる。次に、該単離されたゲノムＤＮＡ試料の各々についての個別の核酸増幅反応において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列およびメチシリン耐性マーカーを共増幅するステップが実施される。次に、核酸増幅反応において共増幅されたＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列およびメチシリン耐性マーカーに対して、時間依存的な増幅指標を決定するステップが実施される。次に、核酸増幅反応の各々について、先行するステップにおいて決定された時間依存的な増幅指標両方の関数である数値を計算するステップが実施される。この結果、ＭＲＳＡを含む試料についての数値コレクションと、ＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳは含むがＭＲＳＡは含まない試料についての数値コレクションとがもたらされる。最後に、臨床検査試料中におけるＭＲＳＡ細菌の存在と符合する反応速度プロファイルを同定するのに必要とされる、計算された数値に対する閾値基準を選択するステップが実施される。ＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳは含むがＭＲＳＡは含まない試料についての数値コレクションの中における値の部分集合を、該閾値基準により除外する。これは、リアルタイム核酸共増幅アッセイにおいて、感度および特異性のパラメータを設定することに帰着する。好ましい実施形態において、閾値基準により除外される値の部分集合は、ＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳは含むがＭＲＳＡは含まない試料についての数値コレクションの中における最高値および最低値を含む。異なる好ましい実施形態では、選択された閾値基準を変更し、これにより、リアルタイム核酸共増幅アッセイの感度および特異性のパラメータを改変するさらなるステップが実施される。したがって、本願は以下をも提供する。
（１）  Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列をコードする核酸配列を増幅するための組成物であって、
配列番号１からなる標的相補的塩基配列を有する第１のオリゴヌクレオチドと、
前記Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列に対して相補的でない５’配列を場合によって含む、配列番号４からなる標的相補的塩基配列を有する最長６０塩基までの長さの第２のオリゴヌクレオチドと
を含む組成物。
（２）  前記第１および第２のオリゴヌクレオチドのうちの一方のみが、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼにより伸長しうる３’端を有する、項目１に記載の組成物。
（３）  検出可能に標識されているハイブリダイゼーションプローブをさらに含む、項目２に記載の組成物。
（４）  メチシリン耐性をコードする核酸配列を増幅するための組成物であって、
配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９からなる群から選択される標的相補的塩基配列を有する第１のオリゴヌクレオチドと、
メチシリン耐性をコードする前記核酸配列に対して相補的でない５’配列を場合によって含む、配列番号１３からなる標的相補的塩基配列を有する第２のオリゴヌクレオチドと
を含む組成物。
（５）  前記第１および第２のオリゴヌクレオチドのうちの一方のみが、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼにより伸長しうる３’端を有する、項目４に記載の組成物。
（６）  検出可能に標識されているハイブリダイゼーションプローブをさらに含む、項目５に記載の組成物。
（７）  ２つの増幅配列の存在によりＭＲＳＡを同定する核酸共増幅アッセイにおける偽陽性ＭＲＳＡ判定の発生率を低減する方法であって、
（ａ）ＭＲＳＡの存在について試験される臨床試料からゲノムＤＮＡを取得するステップであり、この結果、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ核酸およびメチシリン耐性をコードする核酸の混合物がもたらされるステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で取得された前記ゲノムＤＮＡを鋳型として用いて実施されるｉｎ  ｖｉｔｒｏの核酸増幅反応で、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列およびメチシリン耐性マーカーを共増幅するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で共増幅された前記Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列および前記メチシリン耐性マーカーに対して、時間依存的な増幅指標を決定するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で決定された前記時間依存的な増幅指標両方の関数である数値を計算するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）で計算された前記数値を、ＭＲＳＡを同定する閾値基準と比較するステップであり、ＭＳＳＡ菌およびＭＲ−ＣｏＮＳ細菌の混合物は含むがＭＲＳＡ細菌は含まない臨床試料を示す数値の部分集合を、前記閾値基準により除外するステップと、
（ｆ）前記閾値基準が満たされる場合に限り前記臨床試料中にＭＲＳＡが存在することを判定するステップであり、これにより、偽陽性ＭＲＳＡ判定の発生率が低下するステップと
を含む方法。
（８）  ステップ（ｄ）で計算される前記数値が、上限閾値カットオフ値から下限閾値カットオフ値にわたる範囲内にあることを、ステップ（ｅ）の前記閾値基準が必要とする、項目７に記載の方法。
（９）  ステップ（ｄ）で計算される前記数値が、ステップ（ｃ）で決定された前記時間依存的な増幅指標の間の差として計算されるΔＣｔの数値である、項目７に記載の方法。
（１０）  前記ΔＣｔの数値が、経験的に決定される上限閾値カットオフ値から経験的に決定される下限閾値カットオフ値にわたるΔＣｔ範囲内にあることを、ステップ（ｅ）の前記閾値基準が必要とする、項目９に記載の方法。
（１１）  前記メチシリン耐性マーカーがｍｅｃＡ標的配列を含み、
ステップ（ｄ）の前記ΔＣｔの数値が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列に対して決定された時間依存的な増幅指標から、ｍｅｃＡ標的配列に対して決定された時間依存的な増幅指標を減じることにより計算され、
前記ΔＣｔの数値が、経験的に決定された閾値カットオフ値よりも大きいことを、ステップ（ｅ）の前記閾値基準が必要とする、
項目９に記載の方法。
（１２）  前記臨床試料が鼻腔スワブ試料を含む、項目７に記載の方法。
（１３）  前記メチシリン耐性マーカーがｍｅｃＡ標的配列を含む、項目７に記載の方法。
（１４）  前記メチシリン耐性マーカーがｍｅｃＡ標的配列を含む、項目１２に記載の方法。
（１５）  前記Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的リボソーム核酸配列を含む、項目１４に記載の方法。
（１６）  臨床試料がメチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細菌を含有することを確立する方法であって、
（ａ）前記臨床試料から核酸を取得するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で取得された核酸を鋳型として用いて実施される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの核酸増幅反応で、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列およびメチシリン耐性特異的標的配列を共増幅するステップであり、
前記標的配列の各々がステップ（ａ）で取得された核酸の中に含まれ、
前記標的配列の両方についての増幅産物が、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏの核酸増幅反応で生成および検出されるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で共増幅された前記Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列および前記メチシリン耐性特異的標的配列についての時間依存的な増幅指標を決定するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で決定された、前記時間依存的な増幅指標両方の関数である数値を計算するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）で計算された前記数値が、
（ｉ）メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細菌から取得される核酸の共増幅反応速度と、
（ｉｉ）メチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細菌およびメチシリン耐性コアグラーゼ陰性細菌の混合物から取得される核酸の共増幅反応速度と
を区別する閾値基準を満たす場合に、前記生物学的試料がメチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細菌を含有することを確立するステップと
を含む方法。
（１７）  前記臨床試料が鼻腔スワブ試料を含む、項目１６に記載の方法。
（１８）  前記メチシリン耐性特異的標的配列がｍｅｃＡ標的配列を含む、項目１６に記載の方法。
（１９）  ステップ（ｅ）の前記閾値基準が、ステップ（ｄ）で計算された前記数値の、経験的に決定された下限閾値カットオフ値との比較、および経験的に決定された上限閾値カットオフ値との比較を含む、項目１６に記載の方法。
（２０）  ステップ（ｄ）で計算される前記数値が、ステップ（ｃ）で決定された前記時間依存的な増幅指標の間の差として計算されるΔＣｔの数値である、項目１６に記載の方法。
（２１）  メチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細菌の存在を確立するために、前記ΔＣｔの数値が経験的に決定された下限閾値カットオフ値よりも小さいこと、または前記ΔＣｔの数値が経験的に決定された上限閾値カットオフ値よりも大きいことを、ステップ（ｅ）の前記閾値基準が必要とする、項目２０に記載の方法。
（２２）  前記Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列に対して決定された前記時間依存的な増幅指標から、前記ｍｅｃＡ標的配列に対して決定された前記時間依存的な増幅指標を減じることによりステップ（ｄ）の前記ΔＣｔの数値が計算され、
メチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細菌の存在を確立するために、前記ΔＣｔの数値が経験的に決定された閾値カットオフ値よりも小さいことを、ステップ（ｅ）の前記閾値基準が必要とする、
項目２０に記載の方法。
（２３）  前記Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列に対して決定された前記時間依存的な増幅指標から、前記ｍｅｃＡ標的配列に対して決定された前記時間依存的な増幅指標を減じることによりステップ（ｄ）の前記ΔＣｔの数値が計算され、
メチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細菌の存在を確立するために、前記ΔＣｔの数値が経験的に決定された閾値カットオフ値よりも大きいことを、ステップ（ｅ）の前記閾値基準が必要とする、
項目２０に記載の方法。
（２４）  前記取得するステップが、ゲノムＤＮＡを取得することを含む、項目１６に記載の方法。
（２５）  ステップ（ｂ）における前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏの核酸増幅反応が逆転写酵素を含む、項目１６に記載の方法。
（２６）  前記Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓリボソーム核酸配列である、項目１６に記載の方法。
（２７）  前記決定するステップが、単位複製配列の生成を示す検出可能なシグナルの所定レベルに到達する時間を決定することを含む、項目１６に記載の方法。
（２８）  前記メチシリン耐性特異的標的配列が、ｍｅｃＡ標的配列を含む、項目１７に記載の方法。
（２９）  ステップ（ｄ）で計算される前記数値が、ステップ（ｃ）で決定された前記時間依存的な増幅指標の間の差として計算されるΔＣｔの数値である、項目２８に記載の方法。
（３０）  ステップ（ｅ）の前記閾値基準が、ステップ（ｄ）の前記ΔＣｔの数値の、経験的に決定された下限閾値カットオフ値との比較、および経験的に決定された上限閾値カットオフ値との比較を含む、項目２９に記載の方法。
（３１）  メチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細菌の存在を確立するために、前記ΔＣｔの数値が経験的に決定された下限閾値カットオフ値よりも小さいこと、または前記ΔＣｔの数値が経験的に決定された上限閾値カットオフ値よりも大きいことを、ステップ（ｅ）の前記閾値基準が必要とする、項目２９に記載の方法。
（３２）  前記Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列に対して決定された前記時間依存的な増幅指標から、前記ｍｅｃＡ標的配列に対して決定された前記時間依存的な増幅指標を減じることによりステップ（ｄ）の前記ΔＣｔの数値が計算され、
メチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細菌の存在を確立するために、前記ΔＣｔの数値が経験的に決定された閾値カットオフ値よりも小さいことを、ステップ（ｅ）の前記閾値基準が必要とする、
項目２９に記載の方法。
（３３）  前記Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列に対して決定された前記時間依存的な増幅指標から、前記ｍｅｃＡ標的配列に対して決定された前記時間依存的な増幅指標を減じることによりステップ（ｄ）の前記ΔＣｔの数値が計算され、
メチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細菌の存在を確立するために、前記ΔＣｔの数値が、経験的に決定された閾値カットオフ値よりも大きいことを、ステップ（ｅ）の前記閾値基準が必要とする、
項目２９に記載の方法。
（３４）  臨床試料がメチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）細菌を含有することを、制御可能な偽陽性判定発生率で示す方法であって、
（ａ）前記臨床試料からゲノムＤＮＡを取得するステップであり、この結果、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ核酸およびメチシリン耐性をコードする核酸の混合物がもたらされるステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で取得された前記ゲノムＤＮＡを鋳型として用いて実施されるｉｎ  ｖｉｔｒｏの核酸増幅反応で、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列およびメチシリン耐性マーカーを共増幅するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で共増幅された前記Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列および前記メチシリン耐性マーカーに対して、時間依存的な増幅指標を決定するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で決定された、前記時間依存的な増幅指標両方の関数である数値を計算するステップと、
（ｅ）ＭＲＳＡから取得された核酸の増幅を、ＭＳＳＡ細菌およびＭＲ−ＣｏＮＳ細菌の混合物から取得された核酸の増幅から区別する閾値基準を、ステップ（ｄ）で計算された前記数値が満たす場合に、前記臨床試料がＭＲＳＡを含有することを示すステップであり、これにより、前記Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列および前記メチシリン耐性マーカーの両方の存在を定性的に検出することによりＭＲＳＡの存在を判定する方法と比較して、臨床試料中におけるＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳの混合物からもたらされる偽陽性ＭＲＳＡ判定が低減されるステップと
を含む方法。
（３５）  ステップ（ｄ）で計算される前記数値が、経験的に決定される上限閾値カットオフ値から、経験的に決定される下限閾値カットオフ値にわたる範囲内にあることを、ステップ（ｅ）の前記閾値基準が必要とする、項目３４に記載の方法。
（３６）  ステップ（ｄ）で計算される前記数値が、ステップ（ｃ）で決定された前記時間依存的な増幅指標の間の差として計算されるΔＣｔの数値である、項目３４に記載の方法。
（３７）  前記前記ΔＣｔの数値が、経験的に決定される上限閾値カットオフ値から、経験的に決定される下限閾値カットオフ値にわたるΔＣｔ範囲内にあることを、ステップ（ｅ）の前記閾値基準が必要とする、項目３６に記載の方法。
（３８）  前記臨床試料が鼻腔スワブ試料を含む、項目３４に記載の方法。
（３９）  前記メチシリン耐性マーカーがｍｅｃＡ標的配列を含む、項目３４に記載の方法。
（４０）  前記メチシリン耐性マーカーがｍｅｃＡ標的配列を含む、項目３８に記載の方法。
（４１）  前記Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列が、リボソーム核酸配列を含む、項目４０に記載の方法。
（４２）  臨床試料が、メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）細菌を含有するか、メチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）細菌およびメチシリン耐性コアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（ＭＲ−ＣｏＮＳ）細菌の混合物を含有するか確立する方法であって、
（ａ）前記臨床試料からゲノムＤＮＡを取得するステップであり、この結果、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ核酸およびメチシリン耐性をコードする核酸の混合物がもたらされるステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で取得された前記ゲノムＤＮＡを鋳型として用いて実施されるｉｎ  ｖｉｔｒｏの核酸増幅反応で、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列およびメチシリン耐性マーカーを共増幅するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で共増幅された前記Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列および前記メチシリン耐性マーカーに対して、時間依存的な増幅指標を決定するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で決定された前記時間依存的な増幅指標両方の関数である数値を計算するステップと、
（ｅ）以下の相互に排他的な条件、
（ｉ）ＭＲＳＡ細菌から取得される核酸の共増幅反応速度と、ＭＳＳＡ細菌およびＭＲ−ＣｏＮＳ細菌の混合物から取得される核酸の共増幅反応速度とを区別する閾値基準を、ステップ（ｄ）で計算された前記数値が満たす場合に、前記臨床試料はＭＲＳＡを含有すること、または
（ｉｉ）ステップ（ｄ）で計算された前記数値が前記閾値基準を満たさない場合、前記臨床試料は、ＭＲ−ＣｏＮＳと混合されたＭＳＳＡを含有し、ＭＲＳＡを含有しないこと
のいずれが存在するかを確立するステップと
を含む方法。
（４３）  前記数値が、経験的に決定される上限閾値カットオフ値から、経験的に決定される下限閾値カットオフ値にわたる範囲内にあることを、ステップ（ｅ）の前記閾値基準が必要とする、項目４２に記載の方法。
（４４）  ステップ（ｄ）で計算される前記数値が、ステップ（ｃ）で決定された前記時間依存的な増幅指標の間の差として計算されるΔＣｔの数値である、項目４２に記載の方法。
（４５）  前記ΔＣｔの数値が、経験的に決定される上限閾値カットオフ値から、経験的に決定される下限閾値カットオフ値にわたるΔＣｔ範囲内にあることを、ステップ（ｅ）の前記閾値基準が必要とする、項目４４に記載の方法。
（４６）  ステップ（ｄ）で計算される前記ΔＣｔの数値が前記経験的に決定された下限閾値カットオフ値よりも小さく、これにより、ＭＲ−ＣｏＮＳ細菌を超える量でＭＳＳＡ細菌が存在するＭＳＳＡ細菌およびＭＲ−ＣｏＮＳ細菌の混合物を前記臨床試料が含有することを示す、項目４５に記載の方法。
（４７）  前記臨床試料が鼻腔スワブ試料を含む、項目４２に記載の方法。
（４８）  前記メチシリン耐性マーカーがｍｅｃＡ標的配列を含む、項目４２に記載の方法。
（４９）  前記メチシリン耐性マーカーがｍｅｃＡ標的配列を含む、項目４７に記載の方法。
（５０）  前記Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列が、リボソーム核酸配列を含む、項目４９に記載の方法。
（５１）  臨床検査試料中におけるＭＲＳＡ細菌の存在と符合する反応速度プロファイルを同定するリアルタイム核酸共増幅アッセイで、感度および特異性のパラメータを設定する方法であって、
（ａ）ＭＲＳＡ細菌を含むことが既知である臨床試料コレクションと、ＭＳＳＡ細菌およびＭＲ−ＣｏＮＳ細菌は含むがＭＲＳＡ細菌は含まないことが既知である臨床試料コレクションとを取得するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）における前記臨床試料コレクションの中における各試料からゲノムＤＮＡを単離するステップであり、この結果、ＭＲＳＡを含む細菌から単離されたゲノムＤＮＡ試料のコレクションと、ＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳは含むがＭＲＳＡは含まない細菌から単離されたゲノムＤＮＡ試料のコレクションとがもたらされるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）からの前記単離されたゲノムＤＮＡ試料の各々についての個別の核酸増幅反応で、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列およびメチシリン耐性マーカーを共増幅するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の前記核酸増幅反応で共増幅されたＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列およびメチシリン耐性マーカーに対して、時間依存的な増幅指標を決定するステップと、
（ｅ）ステップ（ｃ）の前記核酸増幅反応の各々について、ステップ（ｄ）で決定された前記時間依存的な増幅指標両方の関数である数値を計算するステップであり、この結果、ＭＲＳＡを含む試料についての数値コレクションと、ＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳは含むがＭＲＳＡは含まない試料についての数値コレクションとがもたらされるステップと、
（ｆ）前記臨床検査試料中におけるＭＲＳＡ細菌の存在と符合する反応速度プロファイルを同定するのに必要とされる、ステップ（ｅ）で計算された前記数値に対する閾値基準を選択するステップであり、ＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳは含むがＭＲＳＡは含まない試料についての前記数値コレクションの中における値の部分集合を前記閾値基準により除外し、これにより、前記リアルタイム核酸共増幅アッセイで、感度および特異性のパラメータを設定するステップと
を含む方法。
（５２）  前記閾値基準により除外される前記値の部分集合が、ＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳは含むがＭＲＳＡは含まない試料についての前記数値コレクションの中における最高値および最低値を含む、項目５１に記載の方法。
（５３）  ステップ（ｆ）で選択された前記閾値基準を変更し、これにより、前記リアルタイム核酸共増幅アッセイの感度および特異性のパラメータを改変するステップ（ｇ）をさらに含む、項目５１に記載の方法。
【００１６】
定義
以下の用語は、異なる意味を有することが明示的に示されない限り、本明細書において示される意味を有する。
【００１７】
「試料」または「検査試料」とは、標的生物または該標的生物に由来する核酸を含有することが疑われる任意の物質を意味する。該物質は、例えば、鼻腔スワブ検体など、未処理の臨床検体、該検体を含有する緩衝培地、該検体および該標的生物に属する核酸を放出させる溶解作用物質を含有する培地、あるいは反応容器内または反応材料上もしくは反応デバイス上で単離および／または精製された、該標的生物に由来する核酸を含有する培地でありうる。
【００１８】
「由来する」とは、言及された核酸が、生物から直接取得されるか、または核酸増幅の産物であることを意味する。したがって、生物に由来する核酸は、例えば、該生物内に天然では存在しないアンチセンスのＲＮＡ分子でありうる。
【００１９】
「試料調製」とは、その後、試料中に存在する核酸を増幅および検出するために、該試料を調製する任意のステップまたは方法を指す。試料調製は、より大きな試料容量または実質的に水性の混合物から成分を分離するかまたは濃縮する任意の公知の方法を含みうる。試料調製は、細胞成分の溶解および残骸の除去を含むことがあり、二本鎖核酸の変性を含むことがあり、他の試料成分から標的核酸を選択的に捕捉する核酸オリゴマーの使用を含むことがある。
【００２０】
細胞に関する場合の「溶解させる」または「溶解」とは、該細胞から核酸を放出させる状態への変化を引き起こすことを意味する。
【００２１】
「単離する」または「単離」とは、反応容器または反応デバイスまたは固体担体（例えば、試験管、キュベット、マイクロ滴定プレートウェル、ニトロセルロースフィルター、スライド、またはピペットチップ）から無視できない量の標的核酸が失われることなく該標的核酸を精製しうるように、該容器、デバイス、または担体内において、検査試料中に存在する該標的核酸の少なくとも一部を、固定した形であるかまたは放出可能な形で濃縮することを意味する。
【００２２】
「分離」または「精製」とは、生物学的試料の１つまたは複数の成分を、該試料の１つまたは複数の他の成分から取り出すこと意味する。試料成分には、タンパク質、炭水化物、脂質、および標識プローブなどの物質も含みうる、通常は水性の溶液相中の核酸も含まれる。好ましくは、分離または精製するステップにより、試料中に存在する他の成分の少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％、またさらにより好ましくは少なくとも約９５％が除去される。
【００２３】
「核酸」とは、ホスホジエステル結合または他の結合により連結されてポリヌクレオチドを形成する含窒素ヘテロ環塩基または同塩基類似体を有するヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を含む多量体化合物を指す。核酸は、ＲＮＡポリマー、ＤＮＡポリマー、またはキメラＤＮＡ−ＲＮＡポリマー、およびこれらの類似体を含む。核酸の「骨格」は、１つまたは複数の糖ホスホジエステル結合、ペプチド核酸（ＰＮＡ）結合（ＰＣＴ第ＷＯ９５／３２３０５号）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、またはこれらの組み合わせを含む各種の結合からなる可能性がある。核酸の糖部分は、リボースもしくはデオキシリボース、または２’メトキシ置換および２’ハロゲン化物置換（例えば、２’−Ｆ）など、公知の置換を有する類似の化合物でありうる。含窒素塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、これらの類似体（例えば、イノシン）、Ｎ４−メチルデオキシグアノシン、デアザプリンまたはアザプリン、デアザピリミジンまたはアザピリミジンなど、プリン塩基またはピリミジン塩基の誘導体、５または６の位置において置換基を有するピリミジン塩基、２−アミノ−６−メチルアミノプリンなど、２、６、および／または８の位置において変更または置換された置換基を有するプリン塩基、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン、４−アミノ−ピリミジン、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン、およびＯ４−アルキル−ピリミジン、ならびに非置換または３−置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（米国特許第５，３７８，８２５号、同第６，９４９，３６７号、およびＰＣＴ第ＷＯ９３／１３１２１号）などのピラゾロ化合物でありうる。核酸は、骨格が１つまたは複数の残基に含窒素塩基を含まない「脱塩基」位置を含みうる（米国特許第５，５８５，４８１号を参照されたい）。核酸はまた、「ロック核酸」（ＬＮＡ）、糖の立体構造を模倣するＲＮＡ内にロックされる二環式フラノース単位を伴う、１種または複数種のＬＮＡヌクレオチド単量体を含有する類似体（Ｖｅｓｔｅｒら、２００４年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４３巻、第４２号、１３２３３〜４１頁）も含む。核酸は、従来の糖、塩基、ならびにＲＮＡおよびＤＮＡにおいて見出される結合のみを含む場合もあり、従来の成分および置換（例えば、２’メトキシ骨格により連結される従来の塩基、または従来の塩基および１種もしくは複数種の塩基類似体の混合物を含む核酸）を含む場合もある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて核酸を合成する方法は、当技術分野において周知である。
【００２４】
「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」とは、ともに結合した２つ以上のヌクレオシドサブユニットまたは核酸塩基サブユニットからなるポリマーを意味する。オリゴヌクレオチドは、好ましくは１０〜１００ヌクレオチド、より好ましくは１０〜８０ヌクレオチド、またさらにより好ましくは１５〜６０ヌクレオチドの範囲の長さを有する。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡならびにこれらの類似体でありうる。ヌクレオシドサブユニットの糖基は、リボース、デオキシリボース、また例えば、リボフラノシル部分への２’−Ｏ−メチル置換を有するリボヌクレオシドを含むこれらの類似体でありうる。２’置換を有するヌクレオシドサブユニットを含み、検出プローブ、捕捉オリゴ、および／または増幅オリゴヌクレオチドとして有用なオリゴヌクレオチドは、Ｂｅｃｋｅｒらにより、米国特許第６，１３０，０３８号において開示されている。該ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合、修飾結合などの結合によるか、またはその相補的な標的核酸配列に対する該オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを妨げない非ヌクレオチド部分により接合されうる。修飾結合は、標準的なホスホジエステル結合が、ホスホロチオエート結合またはメチルホスホネート結合などの異なる結合により置き換えられる結合を含む。核酸塩基サブユニットは、例えば、中央の二級アミンに対するカルボキシメチル結合により核酸塩基サブユニットを連結する２−アミノエチルグリシン骨格などの擬似ペプチド骨格により、ＤＮＡの天然リン酸デオキシリボース骨格を置き換えることにより接合することができる（擬似ペプチド骨格を有するＤＮＡ類似体は一般に、「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」と称し、Ｎｉｅｌｓｅｎら、「Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」、米国特許第５，５３９，０８２号により開示されている）。本発明により意図されるオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの他の非限定的な例は、二環式および三環式のヌクレオシドを含有する核酸類似体、および「ロック核酸」、「ロックヌクレオシド類似体」、または「ＬＮＡ」と称するヌクレオチド類似体（ロック核酸は、Ｗａｎｇ、「Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、米国特許第６，０８３，４８２号；Ｉｍａｎｉｓｈｉら、「Ｂｉｃｙｃｌｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ」、米国特許第６，２６８，４９０号；およびＷｅｎｇｅｌら、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ」、米国特許第６，６７０，４６１号により開示されている）を含む。改変オリゴヌクレオチドが厳密なハイブリダイゼーション条件または増幅反応条件の下で標的核酸にハイブリダイズしうる場合、任意の核酸類似体が本発明により意図される。
【００２５】
「増幅オリゴヌクレオチド」またはその同等物である「増幅オリゴマー」は、標的核酸またはその相補体にハイブリダイズし、核酸増幅反応に関与するオリゴヌクレオチドである。増幅オリゴヌクレオチドの例は、鋳型核酸にハイブリダイズし、増幅工程においてポリメラーゼにより伸長する３’ヒドロキシル端を含有する「プライマー」である。別の例は、例えば、３’端が遮断されているため、増幅に関与しこれを促進するが、ポリメラーゼにより伸長しないオリゴヌクレオチドである。増幅オリゴヌクレオチドに好ましいサイズ範囲は、約１０〜約６０ヌクレオチド長であり、標的核酸配列（またはその相補的配列）の領域に相補的な少なくとも約１０の連続塩基、また、より好ましくは少なくとも１２の連続塩基を含有するサイズ範囲を含む。連続塩基は、増幅オリゴヌクレオチドが結合する標的配列に、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、また最も好ましくは約１００％相補的である。増幅オリゴヌクレオチドは、場合によって、改変ヌクレオチドまたは類似体を含むこともあり、場合によって、増幅反応に関与するが標的配列もしくは鋳型配列に相補的ではないか、またはこれに含有されるかもしくはこれに相補的であるさらなる配列を含むこともある。例えば、「プロモータープライマー」とは、標的核酸に相補的ではないが、プライマーの相補的配列に隣接するかまたはこれに近接する、５’側プロモーター配列を含む増幅オリゴヌクレオチドである。当業者は、プライマーとして機能する増幅オリゴヌクレオチドを、５’側プロモーター配列を含み、したがって、プロモーター−プライマーとして機能するように改変することができ、プロモーター−プライマーは、そのプロモーター配列から独立したプライマーとして機能しうる（すなわち、該オリゴヌクレオチドを、そのプロモーター配列を除去することによって改変することもでき、これなしで合成することにより改変することもできる）ことを理解するであろう。同じ意味で「プロモーター供給体」または「プロモーターオリゴヌクレオチド」とも称する増幅オリゴヌクレオチドは、重合化のための鋳型として用いられるプロモーター配列を含むが、該オリゴヌクレオチドは、遮断されたその３’端から伸長することがなく、したがって、ＤＮＡポリメラーゼ活性による伸長には用いられない。
【００２６】
「実質的に相同な」、「実質的に対応すること（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ）」、または「実質的に対応する（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ）」とは、対象のオリゴヌクレオチドが、基準塩基配列（ＲＮＡ同等物およびＤＮＡ同等物を除く）内に存在する少なくとも１０の連続塩基領域に少なくとも８０％相同であり、好ましくは少なくとも９０％相同であり、最も好ましくは１００％相同な、少なくとも１０の連続塩基領域を含有する塩基配列を有することを意味する。当業者は、ハイブリダイゼーションのアッセイ条件に対して、多様な相同性百分率での改変を行うことで、許容不可能なレベルの非特異的ハイブリダイゼーションを阻止しながら、標的配列に対してオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせうることを容易に理解するであろう。類似性の程度は、２つの配列を構成する核酸塩基の順序を比較することにより決定され、それらが相補的塩基との水素結合を阻止しない限り、２つの配列間に存在しうる他の構造的な差異は考慮されない。２つの配列間における相同性の程度はまた、比較される少なくとも１０の連続塩基の各セット内に存在する塩基ミスマッチの数との関連でも表わすことができ、これは、０〜２塩基の差の範囲でありうる。
【００２７】
「実質的に相補的な」とは、対象のオリゴヌクレオチドが、標的核酸配列（ＲＮＡ同等物およびＤＮＡ同等物を除く）内に存在する少なくとも１０の連続塩基領域に少なくとも７０％相補的であり、好ましくは少なくとも８０％相補的であり、より好ましくは少なくとも９０％相補的であり、最も好ましくは１００％相補的な、少なくとも１０の連続塩基領域を含有する塩基配列を有することを意味する。相補性の程度は、２つの配列を構成する核酸塩基の順序を比較することにより決定され、それらが相補的塩基との水素結合を阻止しない限り、２つの配列間に存在しうる他の構造的な差異は考慮されない。２つの配列間における相同性の程度はまた、比較される少なくとも１０の連続塩基の各セット内に存在する塩基ミスマッチの数との関連でも表わすことができ、これは、０〜３塩基のミスマッチの範囲でありうる。
【００２８】
本明細書で用いられる「増幅」または「増幅すること」とは、多数コピーの標的核酸配列、その相補体、またはこれらのフラグメントを取得するｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける手順を指す。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける増幅反応とは、多数コピーの標的核酸配列、その相補体、またはこれらのフラグメントの合成を結果としてもたらす酵素触媒反応である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける増幅反応を準備するのに用いうる増幅法の例を以下に示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける「等温の」増幅反応とは、一定の温度で（すなわち、熱サイクリングなしに）多数コピーの標的核酸配列、その相補体、またはこれらのフラグメントを合成するｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける増幅反応である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける好ましい増幅反応では、指数関数的な形で単位複製配列が合成され、これは、１つの単位複製配列が、新たな単位複製配列の鋳型として用いられることを意味する。
【００２９】
本明細書で用いられる通り、「時間の関数としての」単位複製配列生成のモニタリングとは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの増幅反応において存在する単位複製配列量を周期的に測定し、その測定量を経過した反応時間と関連付ける過程を指す。例えば、周期的な測定は、増幅反応の異なるサイクルの同じ時点において行うこともでき、反応工程の物理的なサイクリングを伴わない反応中における周期的な時間間隔（２０秒間ごとなど）で行うこともできる。
【００３０】
本明細書で用いられる「増幅指標」という表現は、核酸増幅反応における所定レベルの進行を示す、リアルタイムの反応曲線の形状特徴を指す。このような指標は一般に、その強度が、時間、サイクル数などの関数としての、反応混合物中に存在する単位複製配列量と関連する測定可能なシグナル（蛍光リーディングなど）を示す、「増殖曲線」と呼ばれることもある反応曲線の数学的解析により決定される。
【００３１】
「標的核酸」または「標的」とは、標的核酸配列を含有する核酸分子を意味する。
【００３２】
「標的核酸配列」または「標的配列」または「標的領域」とは、一本鎖核酸分子のヌクレオチド配列の全部または一部を含む特異的なデオキシリボヌクレオチド配列またはリボヌクレオチド配列を意味し、（指摘される場合、）これに相補的なデオキシリボヌクレオチド配列またはリボヌクレオチド配列を含む可能性がある。一般に、増幅される標的核酸配列は、２つの反対方向に配置された増幅オリゴヌクレオチドの間に位置し、増幅オリゴヌクレオチドの各々に対して部分的または完全に相補的な標的核酸分子の一部を含む。本発明との関連において、標的核酸分子は、例えば、リボソーム核酸分子またはｍｅｃＡ核酸分子でありうる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの核酸増幅反応において増幅される標的核酸分子の部分を、増幅される「標的核酸配列」と称する。
【００３３】
本明細書で用いられる「メチシリン耐性マーカー」、「メチシリン耐性特異的標的配列」、または「メチシリン耐性標的」とは、メチシリン耐性菌には存在するが、メチシリンによる増殖阻害に対して感受性の細菌には存在しない核酸配列を意味する。メチシリン耐性マーカーの例は、本明細書で説明される核酸増幅反応において検出されるｍｅｃＡ核酸配列である。
【００３４】
本明細書で用いられる「Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的」標的配列とは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓには存在するがＣｏＮＳ細菌には存在しない核酸配列である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列はまた、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属内の細菌にも存在しないことが好ましい。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列は、他のグラム（＋）細菌内において見出される配列と比較した場合に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに固有であることがさらにより好ましい。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列の例は、本明細書で説明される核酸増幅反応において検出される２３ＳｒＤＮＡ配列である。他のＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列は、当業者に公知である。
【００３５】
本明細書で用いられる、ハイブリダイゼーションプローブまたは増幅オリゴヌクレオチドの「標的にハイブリダイズする配列」とは、適切な標的核酸にハイブリダイズしたときに二重鎖構造に関与するプローブまたは増幅オリゴヌクレオチドの塩基配列を指す。標的核酸に対して相補的な下流配列および標的核酸に対して相補的でない上流のＴ７プロモーター配列を含むプロモーター供給体の場合、増幅オリゴヌクレオチドの非相補的なプロモーター配列は、標的にハイブリダイズする配列とは考えられない。逆に、標的核酸にハイブリダイズしたときに二重鎖構造を形成しうる、標的核酸に対して十分に相補的な下流のプライマー配列は、標的にハイブリダイズする配列である。該プライマーの標的にハイブリダイズする配列が標的核酸配列に対する偶発的なミスマッチを含有する場合、それは、標的核酸分子内における標的核酸配列に対して完全に相補的とはならない。
【００３６】
「完全に相補的な」とは、標的にハイブリダイズする配列の全長にわたる、２つの核酸分子間における１００％の塩基相補性を意味する。
【００３７】
「単位複製配列」または「増幅産物」とは、核酸増幅反応において生成される核酸分子を意味する。単位複製配列または増幅産物は、標的核酸と同じ方向であるかまたは反対方向でありうる標的核酸配列を含有する。
【００３８】
「増幅条件」とは、核酸を増幅させる条件を意味する。許容される増幅条件は、用いられる特定の増幅法に応じて、日常的な実験を超えない範囲で、当業者により容易に確認されうる。例示的な増幅条件は、本明細書で与えられる。
【００３９】
「転写を伴う増幅」とは、ＲＮＡポリメラーゼを用いて核酸鋳型から多数のＲＮＡ転写物を生成する任意の種類の核酸増幅を意味する。従来、これらの増幅反応では、ＤＮＡポリメラーゼの活性により伸長しうる３’端を有する少なくとも１つのプライマーを用いる。「転写媒介増幅（ＴＭＡ）」と呼ばれる、転写を伴う増幅法の一例では一般に、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、および標的核酸に対して相補的な、プロモーターを含有するオリゴヌクレオチドを用いる。Ｂｕｒｇら、米国特許第５，４３７，９９０号；Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，５５４，５１６号；Ｋａｃｉａｎら、ＰＣＴ第ＷＯ９３／２２４６１号；Ｇｉｎｇｅｒａｓら、ＰＣＴ第ＷＯ８８／０１３０２号；Ｇｉｎｇｅｒａｓら、ＰＣＴ第ＷＯ８８／１０３１５号；Ｍａｌｅｋら、米国特許第５，１３０，２３８号；Ｕｒｄｅａら、米国特許第４，８６８，１０５号および同第５，１２４，２４６号；ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら、ＰＣＴ第ＷＯ９４／０３４７２号；ならびにＲｙｄｅｒら、ＰＣＴ第ＷＯ９５／０３４３０号において詳細に開示されている通り、ＴＭＡの変化形は、当技術分野において周知である。米国特許出願第１１／２１３，５１９号において開示されている通り、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長しうるただ１つのプライマーを用いる、他の転写を伴う増幅法が本定義では特に受け入れられ、本明細書で開示される方法と関連する使用に極めて好ましい。
【００４０】
「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズする」とは、完全にまたは部分的に相補的な２本の核酸鎖が、指摘されたハイブリダイゼーションアッセイ条件下において対合し、二本鎖領域を有する安定的な構造を形成する能力を意味する。「ハイブリッド体」と呼ばれることもあるこの二本鎖構造の２本の構成鎖は、水素結合により結び付けられる。これらの水素結合は、単一の核酸鎖上における塩基であるアデニンおよびチミンもしくはウラシル（ＡおよびＴまたはＵ）またはシトシンおよびグアニン（ＣおよびＧ）を含有するヌクレオチド間において形成されることが最も一般的であるが、塩基対合はまた、これらの「標準的な」対のメンバーではない塩基間においても形成されうる。標準以外の塩基対合は、当技術分野において周知である。
【００４１】
本明細書で用いられる「ハイブリダイゼーションプローブ」とは、ハイブリダイゼーションを促進して検出可能なハイブリッド体を形成する条件下において、核酸内、好ましくは増幅核酸内における標的配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。プローブは場合によって、該プローブの（１つまたは複数の）端部に結合する場合もあり、その内部の場合もある、検出可能部分を含有しうる。標的ポリヌクレオチドと結合するプローブのヌクレオチドは、該プローブの配列に対して内部にある検出可能部分の場合がそうであるように、厳密に連続する必要はない。検出は、直接（すなわち、標的配列または増幅核酸に直接にハイブリダイズするプローブから結果としてもたらされる）の場合もあり、間接（すなわち、標的配列または増幅核酸にプローブを連結する介在的な分子構造にハイブリダイズするプローブから結果としてもたらされる）の場合もある。プローブの「標的」とは一般に、標準的な水素結合（すなわち、塩基対合）を用いるプローブオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に特異的にハイブリダイズする、増幅核酸配列内に含有される配列を指す。プローブは、標的特異的配列、また場合によって、検出される標的配列に対して非相補的な他の配列を含みうる。これらの非相補的な配列は、プロモーター配列、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、またはプローブの３次元的構造に寄与する配列（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号、同第５，３１２，７２８号、米国特許第６，８４９，４１２号、同第６，８３５，５４２号、同第６，５３４，２７４号、および同第６，３６１，９４５号、ならびにＵＳ２００６−００６８４１７Ａ１において説明されている）を含みうる。「十分に相補的な」配列は、プローブオリゴヌクレオチドが、該プローブの標的特異的配列に対して完全に相補的でない標的配列に対する安定的なハイブリダイゼーションを可能とする。
【００４２】
「十分に相補的な」とは、標準的な塩基対合（例えば、Ｇ：Ｃ、Ａ：Ｔ、またはＡ：Ｕの対合）により配列内の各位置において相補的な場合もあり、標準的な水素結合による相補的な塩基でない脱塩基位置を含む１つまたは複数の位置を含有する場合もある別の配列に対して、一連の相補的な塩基間における水素結合によりハイブリダイズすることが可能な連続配列を意味する。連続塩基は、オリゴマーが特異的にハイブリダイズすることを意図する配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、またより好ましくは約１００％相補的である。「十分に相補的な」配列は、該配列が完全に相補的ではない場合であっても、選択されたハイブリダイゼーション条件下において、核酸オリゴマーが、その標的配列に対して安定的にハイブリダイズすることを可能とする。適切なハイブリダイゼーション条件は当技術分野において周知であり、塩基配列の組成に基づいて容易に予測することもでき、日常的な試験を用いて決定することもできる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、（ニューヨーク州、コールドスプリングハーバー、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ社、１９８９年）、第１．９０〜１．９１節、第７．３７〜７．５７節、第９．４７〜９．５１節、および第１１．４７〜１１．５７節、特に、第９．５０〜９．５１節、第１１．１２〜１１．１３節、第１１．４５〜１１．４７節、および第１１．５５〜１１．５７節）。
【００４３】
「アンチセンス」、「反対方向」、または「負の方向」とは、基準核酸分子またはセンス核酸分子に対して完全に相補的な核酸分子を意味する。
【００４４】
「センス」、「同じ方向」、または「正の方向」とは、基準の核酸分子に対して完全に相同な核酸分子を意味する。
【００４５】
「ＲＮＡ同等物およびＤＮＡ同等物」とは、同じ相補的塩基対ハイブリダイゼーション特性を有するＲＮＡ分子およびＤＮＡ分子を意味する。ＲＮＡ同等物およびＤＮＡ同等物は、異なる糖部分（すなわち、デオキシリボースに対するリボース）を有し、ＲＮＡにおけるウラシルおよびＤＮＡにおけるチミンの存在により異なりうる。ＲＮＡ同等物およびＤＮＡ同等物は特定の配列に対して同程度の相補性を有するので、両者間の違いは、相同性の違いに寄与しない。
【００４６】
「核酸二重鎖」、「二重鎖」、「核酸ハイブリッド体」、または「ハイブリッド体」とは、二本鎖の水素結合領域を含む安定的な核酸構造を意味する。このようなハイブリッド体は、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、およびＤＮＡ：ＤＮＡの二重鎖分子ならびにこれらの類似体を含む。該構造は、プローブを伴う標識が不要な手段を含む、任意の公知の手段により検出可能な程度に十分に安定的である。
【００４７】
「捕捉オリゴヌクレオチド」とは、標的核酸（検出プローブにより標的とされる領域以外の領域であることが好ましい）および直接的または間接的な形での固体支持体に対する結合が可能であり、これにより、検査試料中における標的核酸を固定化および単離する手段を提供するオリゴヌクレオチドを意味する。捕捉オリゴは、標的核酸にハイブリダイズする標的結合領域と、固体支持体に結合した固定化プローブにハイブリダイズする固定化プローブ結合領域とを含む。標的結合領域および固定化プローブ結合領域は、直接に隣接し合うかまたは場合によって改変される１つもしくは複数のヌクレオチドを介して隔てられて同じオリゴヌクレオチド内に含有される場合もあり、これらの領域は、ヌクレオチド以外のリンカーにより接合し合う場合もある。標的核酸にハイブリダイズする標的結合領域は、配列特異的な機構によりハイブリダイズする場合もあり、非特異的な機構によりハイブリダイズする場合もある。
【００４８】
「固定化プローブ」または「固定化核酸」とは、捕捉オリゴヌクレオチドを固定化支持体に接合するオリゴヌクレオチドを意味する。固定化プローブは、これらの条件が同じ場合であれ異なる場合であれ、捕捉プローブを標的核酸にハイブリダイズさせるのに用いられる条件下において安定を維持する結合または相互作用により固体支持体へと直接的または間接的に接合される。固定化プローブは、試料中における未結合物質からの、結合標的核酸の分離を容易とする。
【００４９】
本明細書で用いられる「検出可能標識」とは、検出が可能であるか、または検出可能な応答をもたらしうる化学種である。本発明による検出可能標識は、直接的または間接的にポリヌクレオチドプローブに連結することができ、放射性同位元素、酵素、ハプテン、色素または検出可能な色を付与する粒子（例えば、ラテックスビーズまたは金属粒子）、発光化合物（例えば、生物発光部分、リン光部分、または化学発光部分）、および蛍光化合物などの発色団を含む。
【００５０】
「ホモジニアスな検出可能標識」とは、標的配列にハイブリダイズしたプローブ上に標識が存在するかどうかを決定することにより、ホモジニアスな形で検出されうる標識を指す。すなわち、ホモジニアスな検出可能標識は、標識または標識プローブのハイブリダイズした形態をハイブリダイズしなかった形態から物理的に取り去ることなしに検出することができる。ホモジニアスな検出可能標識は、核酸の検出に標識プローブを用いる場合に好ましい。ホモジニアスな標識の例は、Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，２８３，１７４号；Ｗｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号；およびＮｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号により詳細に説明されている。ホモジニアスアッセイにおいて用いるのに好ましい標識は、化学発光化合物を含む（例えば、Ｗｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号；Ｎｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号；およびＡｒｎｏｌｄ，  Ｊｒ．ら、米国特許第５，６３９，６０４号を参照されたい）。好ましい化学発光標識は、標準的なアクリジニウムエステル（「ＡＥ」）またはこれらの誘導体などのＡＥ化合物（例えば、ナフチル−ＡＥ、オルト−ＡＥ、１−メチル−ＡＥまたは３−メチル−ＡＥ、２，７−ジメチル−ＡＥ、４，５−ジメチル−ＡＥ、オルト−ジブロモ−ＡＥ、オルト−ジメチル−ＡＥ、メタ−ジメチル−ＡＥ、オルト−メトキシ−ＡＥ、オルト−メトキシ（シンナミル）−ＡＥ、オルト−メチル−ＡＥ、オルト−フルオロ−ＡＥ、１−メチル−オルト−フルオロ−ＡＥまたは３−メチル−オルト−フルオロ−ＡＥ、１−メチル−メタ−ジフルオロ−ＡＥまたは３−メチル−メタ−ジフルオロ−ＡＥ、および２−メチル−ＡＥ）である。
【００５１】
「ホモジニアスアッセイ」とは、特異的プローブのハイブリダイゼーションの程度を決定する前に、ハイブリダイズしたプローブをハイブリダイズしなかったプローブから物理的に分離する必要がない検出手順を指す。本明細書で説明されるアッセイなどの例示的なホモジニアスアッセイでは、分子トーチ、分子ビーコン、またはステムループ構造を有し、適切な標的にハイブリダイズしたときに蛍光シグナルを発する自己報告プローブ、ハイブリッドの二重鎖で存在しない場合は化学的手段により選択的に破壊されうるアクリジニウムエステルによる化学発光標識、および当業者には周知の他のホモジニアスな検出可能標識を用いることができる。
【００５２】
「厳密なハイブリダイゼーション条件」または「厳密な条件」とは、検出プローブを標的核酸には優先的にハイブリダイズさせるが非標的核酸にはハイブリダイズさせない条件を意味する。厳密なハイブリダイゼーション条件は、プローブのＧＣ含量および長さ、プローブ配列および検査試料中に存在しうる非標的配列と標的配列との間における類似性の程度を含む因子に応じて変化しうる。ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション試薬またはハイブリダイゼーション溶液の温度および組成を含む。本発明のプローブにより標的核酸を検出するのに好ましいハイブリダイゼーションアッセイの条件は、塩濃度が０．６〜０．９Ｍの範囲にある場合、約６０℃の温度に対応する。ハイブリダイゼーションアッセイの具体的な条件は、実施例の節において記載される。許容される他の厳密なハイブリダイゼーション条件は、当業者により容易に確認されうる。
【００５３】
「アッセイ条件」とは、標的核酸に対してオリゴヌクレオチドを安定的にハイブリダイズさせる条件を意味する。例えば、リアルタイム形式の増幅は、プローブのハイブリダイゼーションおよび検出が、核酸増幅反応を実施するのに用いられる同じアッセイ条件下で生じうることを可能とする。本明細書では、標的の増幅および単位複製配列に対するプローブのハイブリダイゼーションの両方を許容する増幅アッセイ条件の例が与えられる。
【００５４】
本明細書で用いられる「許容基準」は、特定の標的核酸が増幅されたことを示すものと判定されるために、リアルタイムの核酸増幅反応が満たさなければならないことがらを、測定可能な項目により定義する。例えば、単位複製配列の存在を示す蛍光シグナルは、時間の関数としてモニタリングすることができ、リアルタイムの反応曲線の解析に基づいて増幅指標を確立するのに用いることができる。陽性であると考えるには、蛍光シグナルが、所定の時間枠内において閾値の値を超えることを、許容基準が要請することができる。代替的に、予め設定したある要請（例えば、測定された指標が特定の時間枠内に位置しなければならないこと）を満たす増幅指標と組み合わせて、最小限の蛍光シグナルの生成を許容基準が要請することもできる。
【００５５】
本明細書で用いられる「偽陽性」の結果とは、真の陰性試料が陽性であると誤って同定される結果である。例えば、真のＭＲＳＡ陰性試料がＭＲＳＡ陽性であると同定されるなら、偽陽性結果となる。
【００５６】
本明細書で用いられる「偽陰性」の結果とは、真の陽性試料が陰性であると誤って同定される結果である。例えば、真のＭＲＳＡ陽性試料がＭＲＳＡ陰性であると同定されるなら、偽陰性結果となる。
【００５７】
本明細書で用いられる「参照表」とは、閾値の値との関係で（例えば、＜または≧）表わされるΔＣｔ値と関連する陽性および陰性の増幅結果の可能な組み合わせを表わすデータのコレクションを指す。該コレクション中における各組合せは、生物の種類に対して陽性または陰性の状態を判定する解釈と関連する。参照表は、コンピュータにより読み取り可能な媒体上に保存することができ、従来、実験結果を解読して生物を同定するのに用いられている。
【００５８】
本発明との関係では、特定の方法を用いて、診断的決定を行うかまたは下すことができる。例えば、データセットに基づき、特定の生物が存在する可能性が極めて高いという結論が下される。本方法により下される結果は、特定の生物が存在するか、またはおそらく存在しないことを「判定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）」か、または「指定する（ａｓｓｉｇｎｉｎｇ）」か、または「確立する」か、または「定める（ｃａｌｌｉｎｇ）」ステップとして示すことができる。すべての診断アッセイは、偽陽性結果および偽陰性結果のレベルと関連することを理解されたい。本発明の方法の１つの特徴は、アッセイの感度および特異性により反映されうるこれらの間のバランスを制御する手法に関する。
【００５９】
本明細書においてオリゴヌクレオチドを指して用いられる場合の「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「から本質的になること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」とは、該オリゴヌクレオチドが指摘された塩基配列と実質的に相同な塩基配列を有し、最大４つの付加的塩基を有し、かつ／またはそこから最大２つの塩基を欠失しうることを意味する。したがって、これらの表現は、配列の長さの限定および配列の変異の限定の両方を含意する。任意の付加または欠失は、厳密なハイブリダイゼーション条件下において、その非標的核酸よりもその標的核酸に対して優先的にハイブリダイズすることが可能であるなどの、その主張される特性を該オリゴヌクレオチドが有することを阻止しない、指摘された塩基配列の重要でない変異である。オリゴヌクレオチドは、付加または欠失なしに、指摘された核酸配列と実質的に同様な塩基配列を含有しうる。しかし、基本的に指摘された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含有するプローブまたはプライマーは、標的核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションに関与せず、このようなハイブリダイゼーションを損なわない、他の核酸分子を含みうる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１Ａ】１６０ＣＦＵのＭＲＳＡと、１００，０００ＣＦＵずつのＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓとを用いて実施された反応におけるＳ．ａｕｒｅｕｓマーカー（パネルＡ）およびｍｅｃＡマーカー（パネルＢ）の増幅に対するリアルタイムの反応曲線のグラフ表示である。垂直軸は、５２例の増幅反応について、ＲＦＵ単位で測定された蛍光シグナルを示す。垂直軸上の５，０００ＲＦＵ（パネルＡ）および２，５００ＲＦＵ（パネルＢ）において引かれた水平線は、陽性増幅結果を決定するのに用いられる部分的な基準を表わす。
【図１Ｂ】１６０ＣＦＵのＭＲＳＡと、１００，０００ＣＦＵずつのＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓとを用いて実施された反応におけるＳ．ａｕｒｅｕｓマーカー（パネルＡ）およびｍｅｃＡマーカー（パネルＢ）の増幅に対するリアルタイムの反応曲線のグラフ表示である。垂直軸は、５２例の増幅反応について、ＲＦＵ単位で測定された蛍光シグナルを示す。垂直軸上の５，０００ＲＦＵ（パネルＡ）および２，５００ＲＦＵ（パネルＢ）において引かれた水平線は、陽性増幅結果を決定するのに用いられる部分的な基準を表わす。
【図２Ａ】１６０ＣＦＵのＭＲＳＡ細菌および１００，０００ＣＦＵのＭＳＳＡ菌を用いて実施された反応におけるＳ．ａｕｒｅｕｓマーカー（パネルＡ）およびｍｅｃＡマーカー（パネルＢ）の増幅に対するリアルタイムの反応曲線のグラフ表示である。垂直軸は、５０例の増幅反応について、ＲＦＵ単位で測定された蛍光シグナルを示す。垂直軸上の５，０００ＲＦＵ（パネルＡ）および２，５００ＲＦＵ（パネルＢ）において引かれた水平線は、陽性増幅結果を決定するのに用いられる部分的な基準を表わす。
【図２Ｂ】１６０ＣＦＵのＭＲＳＡ細菌および１００，０００ＣＦＵのＭＳＳＡ菌を用いて実施された反応におけるＳ．ａｕｒｅｕｓマーカー（パネルＡ）およびｍｅｃＡマーカー（パネルＢ）の増幅に対するリアルタイムの反応曲線のグラフ表示である。垂直軸は、５０例の増幅反応について、ＲＦＵ単位で測定された蛍光シグナルを示す。垂直軸上の５，０００ＲＦＵ（パネルＡ）および２，５００ＲＦＵ（パネルＢ）において引かれた水平線は、陽性増幅結果を決定するのに用いられる部分的な基準を表わす。
【図３Ａ】１６０ＣＦＵのＭＳＳＡ菌と、１００，０００ＣＦＵずつのＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓとを用いて実施された反応におけるＳ．ａｕｒｅｕｓマーカー（パネルＡ）およびｍｅｃＡマーカー（パネルＢ）の増幅に対するリアルタイムの反応曲線のグラフ表示である。垂直軸は、５２例の増幅反応について、ＲＦＵ単位で測定された蛍光シグナルを示す。垂直軸上の５，０００ＲＦＵ（パネルＡ）および２，５００ＲＦＵ（パネルＢ）において引かれた水平線は、陽性増幅結果を決定するのに用いられる部分的な基準を表わす。
【図３Ｂ】１６０ＣＦＵのＭＳＳＡ菌と、１００，０００ＣＦＵずつのＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓとを用いて実施された反応におけるＳ．ａｕｒｅｕｓマーカー（パネルＡ）およびｍｅｃＡマーカー（パネルＢ）の増幅に対するリアルタイムの反応曲線のグラフ表示である。垂直軸は、５２例の増幅反応について、ＲＦＵ単位で測定された蛍光シグナルを示す。垂直軸上の５，０００ＲＦＵ（パネルＡ）および２，５００ＲＦＵ（パネルＢ）において引かれた水平線は、陽性増幅結果を決定するのに用いられる部分的な基準を表わす。
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、真の陽性ＭＲＳＡ試料（「Ｘ」）および真の陰性ＭＲＳＡ試料（「ｘ」）を用いる、異なる多重増幅試験に対するΔＣｔ値の図式的プロットを示す図である。パネルＡは、１５例の純粋なＭＲＳＡ培養物（すなわちＭＳＳＡまたはＭＲ−ＣｏＮＳを含有しないＭＲＳＡ陽性試料）についての結果を示し、これらの多重増幅反応から決定されるΔＣｔ値が実質的に一定であることを裏付ける。該結果により、プロット上における水平線または閾値の値が指摘される。パネルＢは、真の陽性ＭＲＳＡ試料８例と、偽陽性として記録された真の陰性ＭＲＳＡ試験８例とに対して決定されたΔＣｔ値を示す。
【図５Ａ】陰性対照および陽性対照のほか、微生物学的試験によりＭＲＳＡ陰性であると確立された３例の異なる臨床試料を用いて実施された多重増幅反応に対するリアルタイムの反応曲線を示すグラフである。各グラフは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ２３Ｓ  ｒＤＮＡ（□）、ｍｅｃＡ（○）、および内部対照（△）の核酸標的に対して時間の関数として測定された蛍光シグナルを示す。パネルＡは、陰性対照についての結果を示す。パネルＢは、ＭＳＳＡまたはＭＲ−ＣｏＮＳを含まないＭＲＳＡ陽性対照についての結果を示す。パネルＣは、試料３１３６についての結果を示す。パネルＤは、試料１２５３についての結果を示す。パネルＥは、試料１２３８についての結果を示す。増幅反応は、２連または３連で実施された。特に、対照グラフのｙ軸は、シグナル対ノイズ値を示す。臨床試料を用いて得られたグラフのｙ軸は、生の蛍光データを示す。
【図５Ｂ】陰性対照および陽性対照のほか、微生物学的試験によりＭＲＳＡ陰性であると確立された３例の異なる臨床試料を用いて実施された多重増幅反応に対するリアルタイムの反応曲線を示すグラフである。各グラフは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ２３Ｓ  ｒＤＮＡ（□）、ｍｅｃＡ（○）、および内部対照（△）の核酸標的に対して時間の関数として測定された蛍光シグナルを示す。パネルＡは、陰性対照についての結果を示す。パネルＢは、ＭＳＳＡまたはＭＲ−ＣｏＮＳを含まないＭＲＳＡ陽性対照についての結果を示す。パネルＣは、試料３１３６についての結果を示す。パネルＤは、試料１２５３についての結果を示す。パネルＥは、試料１２３８についての結果を示す。増幅反応は、２連または３連で実施された。特に、対照グラフのｙ軸は、シグナル対ノイズ値を示す。臨床試料を用いて得られたグラフのｙ軸は、生の蛍光データを示す。
【図５Ｃ】陰性対照および陽性対照のほか、微生物学的試験によりＭＲＳＡ陰性であると確立された３例の異なる臨床試料を用いて実施された多重増幅反応に対するリアルタイムの反応曲線を示すグラフである。各グラフは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ２３Ｓ  ｒＤＮＡ（□）、ｍｅｃＡ（○）、および内部対照（△）の核酸標的に対して時間の関数として測定された蛍光シグナルを示す。パネルＡは、陰性対照についての結果を示す。パネルＢは、ＭＳＳＡまたはＭＲ−ＣｏＮＳを含まないＭＲＳＡ陽性対照についての結果を示す。パネルＣは、試料３１３６についての結果を示す。パネルＤは、試料１２５３についての結果を示す。パネルＥは、試料１２３８についての結果を示す。増幅反応は、２連または３連で実施された。特に、対照グラフのｙ軸は、シグナル対ノイズ値を示す。臨床試料を用いて得られたグラフのｙ軸は、生の蛍光データを示す。
【図５Ｄ】陰性対照および陽性対照のほか、微生物学的試験によりＭＲＳＡ陰性であると確立された３例の異なる臨床試料を用いて実施された多重増幅反応に対するリアルタイムの反応曲線を示すグラフである。各グラフは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ２３Ｓ  ｒＤＮＡ（□）、ｍｅｃＡ（○）、および内部対照（△）の核酸標的に対して時間の関数として測定された蛍光シグナルを示す。パネルＡは、陰性対照についての結果を示す。パネルＢは、ＭＳＳＡまたはＭＲ−ＣｏＮＳを含まないＭＲＳＡ陽性対照についての結果を示す。パネルＣは、試料３１３６についての結果を示す。パネルＤは、試料１２５３についての結果を示す。パネルＥは、試料１２３８についての結果を示す。増幅反応は、２連または３連で実施された。特に、対照グラフのｙ軸は、シグナル対ノイズ値を示す。臨床試料を用いて得られたグラフのｙ軸は、生の蛍光データを示す。
【図５Ｅ】陰性対照および陽性対照のほか、微生物学的試験によりＭＲＳＡ陰性であると確立された３例の異なる臨床試料を用いて実施された多重増幅反応に対するリアルタイムの反応曲線を示すグラフである。各グラフは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ２３Ｓ  ｒＤＮＡ（□）、ｍｅｃＡ（○）、および内部対照（△）の核酸標的に対して時間の関数として測定された蛍光シグナルを示す。パネルＡは、陰性対照についての結果を示す。パネルＢは、ＭＳＳＡまたはＭＲ−ＣｏＮＳを含まないＭＲＳＡ陽性対照についての結果を示す。パネルＣは、試料３１３６についての結果を示す。パネルＤは、試料１２５３についての結果を示す。パネルＥは、試料１２３８についての結果を示す。増幅反応は、２連または３連で実施された。特に、対照グラフのｙ軸は、シグナル対ノイズ値を示す。臨床試料を用いて得られたグラフのｙ軸は、生の蛍光データを示す。
【図６Ａ】微生物学的試験によりＭＲＳＡ陽性であると確立された３例の異なる臨床試料を用いて実施された多重増幅反応に対するリアルタイムの反応曲線を示すグラフである。各グラフは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ２３Ｓ  ｒＤＮＡ（□）、ｍｅｃＡ（○）、および内部対照（△）の核酸標的に対して時間の関数として測定された蛍光シグナルを示す。パネルＡは、試料１６３０についての結果を示す。パネルＢは、試料２１１５についての結果を示す。パネルＣは、試料１３０１についての結果を示す。増幅反応は、２連または３連で実施された。特に、すべてのグラフにおけるｙ軸が、シグナル対ノイズ値を示す。
【図６Ｂ】微生物学的試験によりＭＲＳＡ陽性であると確立された３例の異なる臨床試料を用いて実施された多重増幅反応に対するリアルタイムの反応曲線を示すグラフである。各グラフは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ２３Ｓ  ｒＤＮＡ（□）、ｍｅｃＡ（○）、および内部対照（△）の核酸標的に対して時間の関数として測定された蛍光シグナルを示す。パネルＡは、試料１６３０についての結果を示す。パネルＢは、試料２１１５についての結果を示す。パネルＣは、試料１３０１についての結果を示す。増幅反応は、２連または３連で実施された。特に、すべてのグラフにおけるｙ軸が、シグナル対ノイズ値を示す。
【図６Ｃ】微生物学的試験によりＭＲＳＡ陽性であると確立された３例の異なる臨床試料を用いて実施された多重増幅反応に対するリアルタイムの反応曲線を示すグラフである。各グラフは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ２３Ｓ  ｒＤＮＡ（□）、ｍｅｃＡ（○）、および内部対照（△）の核酸標的に対して時間の関数として測定された蛍光シグナルを示す。パネルＡは、試料１６３０についての結果を示す。パネルＢは、試料２１１５についての結果を示す。パネルＣは、試料１３０１についての結果を示す。増幅反応は、２連または３連で実施された。特に、すべてのグラフにおけるｙ軸が、シグナル対ノイズ値を示す。
【図７Ａ】微生物学的試験により当初ＭＲＳＡ陽性（白色ダイアモンド）およびＭＲＳＡ陰性（黒色四角）として同定された臨床試料を表わすデータ点に対するΔＣｔ値を示すグラフのプロットである。パネルＡは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列（すなわち、２３Ｓ  ｒＤＮＡ配列）およびメチシリン耐性マーカー（すなわち、ｍｅｃＡ配列）の両方に対して陽性の増幅結果を与えたすべてのデータ点に対するΔＣｔ値の分布を示す。パネルＢは、パネルＡに示したのと同じデータ点を示すが、ΔＣｔ＝−２分間で引いた任意の閾値カットオフをさらに含む。
【図７Ｂ】微生物学的試験により当初ＭＲＳＡ陽性（白色ダイアモンド）およびＭＲＳＡ陰性（黒色四角）として同定された臨床試料を表わすデータ点に対するΔＣｔ値を示すグラフのプロットである。パネルＡは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列（すなわち、２３Ｓ  ｒＤＮＡ配列）およびメチシリン耐性マーカー（すなわち、ｍｅｃＡ配列）の両方に対して陽性の増幅結果を与えたすべてのデータ点に対するΔＣｔ値の分布を示す。パネルＢは、パネルＡに示したのと同じデータ点を示すが、ΔＣｔ＝−２分間で引いた任意の閾値カットオフをさらに含む。
【図８】反応速度解析を用いてＭＲＳＡまたはＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳの混合集団をどのような形で同定しうるかについて図式的に示す図である。上限および下限のカットオフ値は水平線により示され、これらにより、ＭＲＳＡに特徴的であるか、または実質的に等しい数で存在する場合はおそらくＭＲ−ＣｏＮＳおよびＭＳＳＡの混合物に特徴的なΔＣｔ範囲が画定される。指摘されたΔＣｔ範囲の外の領域は、「＋」の符号により表わされるレベル（より多数の「＋」符号により、より多くの相対量が表わされる）のＭＳＳＡ、ＭＲ−ＣｏＮＳ、およびＭＲＳＡの混合物に特徴的である。
【図９】臨床試料の解析に由来する実際のデータを示す図である。下方の水平軸上に示される判定は、臨床試料の標準的な微生物学的検査によりなされた。プロット上においてデータ点として現れるために、共増幅アッセイは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列およびメチシリン耐性特異的標的配列の両方を含有していなければならないが、臨床試料の細菌によりもたらされるこれらの核酸のレベルは大きく異なる可能性がある。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
一般的に述べると、本発明は、検査試料中における生物の遺伝子署名を検出する方法に関する。好ましい実施形態において、検査試料は、単一の個体から取得される臨床試料である（すなわち、複数の個体から取得される、プールされた臨床試料から区別される）。臨床試料は、個体が２種以上の生物に重感染している場合に取得されうる生物の混合集団を含みうる。異なる好ましい実施形態によれば、検査を受ける試料は、複数の個体から取得される臨床試料を最初に組み合わせることにより調製される、プールされた試料でありうる。当然ながら、本発明の方法はまた、単一種の生物のみを表わす培養試料の解析にも適用することができる。
【００６２】
本発明の方法は、生物または生理学的条件に特徴的な特定の比率で存在する２つの遺伝子マーカー（すなわち、核酸配列「Ａ」および「Ｂ」）の存在を検出することにより実施することが好ましい。該特定の比率は、一定の比率でありうる。例えば、該マーカーのコピー数、またこれにより、一方の他方に対する比率が一定であるように、該２つのマーカーは、細菌細胞の単一の染色体上に存在しうる。代替的に、該２つのマーカーは、生物の単一の細胞内における異なる染色体上に存在する場合もあるが、やはり、その生物の細胞内において一定の比率を示す。遺伝子マーカーは、臨床試料から取得されたＤＮＡ（例えば、細菌ＤＮＡ試料）内に存在する場合もあり、臨床試料から取得されたＲＮＡ内に存在する場合もある。
【００６３】
リアルタイムの反応曲線の解析用に開示される閾値ベースの手法により、先行するシステムおよび手法を上回るある利点がもたらされる。実際、該手法では、両方の遺伝子マーカーを有する生物を含有する試料（すなわち、Ａ／Ｂ）を、各種類がただ１つのマーカーに個別に寄与する２種の異なる生物の混合物（すなわち、Ａ＋Ｂ）から区別することができる。さらに、該手法ではまた、２つのマーカーのうちのただ１つのみ（例えば、Ｂのみ）を有する別の生物と混合される場合であっても、両方の遺伝子マーカーを有する生物（すなわち、Ａ／Ｂ）の存在を検出することもできる。例えば、該技法を用いて、生物種特異的マーカー（例えば、リボソーム核酸配列）および抗生剤耐性菌の特定の種を検出する抗生剤耐性マーカーの存在を検出することができる。開示される方法により検出されうる抗生剤耐性菌の具体例はＭＲＳＡである。該方法を実施すると、ＭＲＳＡ細菌の試料を、ＭＳＳＡ菌およびＭＲ−ＣｏＮＳ細菌の両方を含有する試料から区別することができる。さらに、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ以外のメチシリン耐性菌（例えば、ＭＲ−ＣｏＮＳ細菌）の存在下において、ＭＲＳＡ細菌を検出することができる。
【００６４】
本発明の増幅反応を実施する方式には、柔軟性もまた存在する。一実施形態において、生物を同定するのに用いられる２つの核酸標的は、個別に増幅される（すなわち、互いに流体連絡されない増幅反応）。異なる標的の各々に対して増幅指標を決定することができ、これらの指標を用いて生物の存在または不在を評価することができる。異なる実施形態では、２つの核酸標的が単一の増幅反応において共増幅される多重増幅反応が実施される。多重増幅形式の１つの利点は、個別の増幅反応を用いて決定されるΔＣｔに対して、測定されるΔＣｔ差が増強される可能性である。２つの核酸標的を増幅する反応が共通の供給源（例えば、リボヌクレオチド三リン酸、プライマーなど）について競合する場合に、この増強が結果としてもたらされうる。特に、本明細書で開示される技法により行われる生物の同定は、各標的核酸のコピー数を定量化する必要を回避する閾値カットオフに基づく。
【００６５】
ＭＲＳＡ細菌およびＭＳＳＡ菌を検出する核酸ベースの方法、組成物、アルゴリズム、システム、およびキットが特に開示される。本発明は、反応が生じる時間の関数として（すなわち、リアルタイム形式で）単位複製配列の合成がモニタリングされた、等温の多重増幅反応を用いて例示される。メチシリン耐性の核酸マーカーは、ｍｅｃＡ核酸配列であった。Ｓ．ａｕｒｅｕｓの核酸マーカーは、この生物に固有の２３ＳリボソームＤＮＡ配列であった。
【００６６】
本分野において許容される実践と対照的に、本発明は、２つの異なる核酸標的配列を検出することによりＭＲＳＡ細菌およびＭＳＳＡ菌の両方を検出し、２つの標的の検出に基づく他のスクリーニングシステムを特徴づける誤解釈に対して、閾値ベースのアルゴリズムを用いる。さらに、開示される手法は、ＳＣＣｍｅｃ挿入接合部の検出に基づく市販のＭＲＳＡスクリーニングキットにより看過されていた、高度に薬剤耐性のＭＲＳＡ単離物を検出する点で有利であった。したがって、本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに特異的なマーカーを保有する１種の生物と、メチシリン耐性に特異的な第２のマーカーを保有する１種の生物とによる、重感染を表わす混合生物集団により交絡することなく、多種多様なＭＲＳＡ単離物を検出する能力という問題に対する解答を与える。
【００６７】
序説および概要
以下では、ＭＲＳＡ細菌およびＭＳＳＡ菌の核酸を調製、増幅、および検出する方法の例が説明される。より具体的に述べると、ｍｅｃＡ核酸配列およびＳ．ａｕｒｅｕｓリボソーム核酸配列の組合せを検出することにより、環境試料または生物学的試料中におけるＭＲＳＡ細菌の存在を判定する方法が開示される。該技法は、メチシリン感受性ＣｏＮＳ細菌（すなわち、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）の高バックグラウンド中、およびＭＳＳＡの高バックグラウンド中においてＭＲＳＡを検出する点で有利であった。加えて、該技法は、メチシリン感受性ＣｏＮＳ細菌（すなわち、表皮ブドウ球菌およびＳ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）の高バックグラウンド中においてＭＳＳＡを検出する点でも有利であった。ｍｅｃＡ核酸配列およびＳ．ａｕｒｅｕｓリボソーム核酸配列に対する個別の増幅反応が意図され、これらは本発明の範囲内にあるが、単一の多重核酸増幅反応（すなわち、単一の反応試験管または反応容器内における）においてこの核酸配列の組合せを増幅および検出することが好ましい。リアルタイムの増幅結果に対する反応速度解析を用いて、ＭＲＳＡ感染を、ＭＳＳＡ（すなわち、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ配列の供給源をもたらす）およびＭＲ−ＣｏＮＳ（すなわち、ｍｅｃＡ配列の供給源をもたらす）の重感染から区別し、臨床試料を用いて、ＭＳＳＡを、ＭＲ−ＣｏＮＳまたはＭＲＳＡから区別することが可能であった。
【００６８】
好ましい方法は、核酸増幅反応を実施するステップと、典型的には、増幅産物に特異的にハイブリダイズする核酸プローブを用いて、検査試料中におけるｍｅｃＡ核酸およびＳ．ａｕｒｅｕｓのリボソーム核酸の存在を示す検出可能なシグナルをもたらすことにより、増幅産物を検出するステップとを含む。該増幅ステップは、試料を、２３Ｓ  ｒＤＮＡ内の標的配列に特異的な１種または複数種の増幅オリゴヌクレオチドと接触させ、試料中にＳ．ａｕｒｅｕｓのｒＤＮＡが存在する場合に増幅産物を生成するステップを含むことが好ましい。リボソームの標的核酸およびｍｅｃＡ標的核酸に対して個別の反応を引き起こしうるが、該増幅ステップが、試料を、ｍｅｃＡの標的ＤＮＡに特異的な１種または複数種の増幅オリゴヌクレオチドに接触させて、試料がメチシリン耐性生物を含有する場合に増幅産物を生成するステップをさらに含むことが好ましい。ｍｅｃＡ標的配列およびＳ．ａｕｒｅｕｓリボソーム核酸配列の両方が検出される場合、時間の関数としてモニタリングされる増幅反応の反応速度解析により、ＭＲＳＡの存在を推定することができる。
【００６９】
相補的配列を含む２３Ｓ  ｒＤＮＡおよびｍｅｃＡ  ＤＮＡの標的配列を認識する、選択されたオリゴヌクレオチド配列が特に開示される。このようなオリゴヌクレオチドは、増幅オリゴヌクレオチドとして（例えば、プライミングオリゴヌクレオチド、プロモーターオリゴヌクレオチド、ターミネーティングオリゴヌクレオチド、およびプロモータープライマーオリゴヌクレオチドとして）機能しうる。本明細書で開示される配列を有するオリゴヌクレオチドは、解析対象の核酸を検出するアッセイにおいて、代替的な機能を果たしうる。例えば、代替的な検出アッセイにおいて、本明細書で開示される捕捉オリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーションプローブとして用いることもでき、本明細書で開示されるハイブリダイゼーションプローブは増幅オリゴヌクレオチドとして用いることもでき、本明細書で開示される増幅オリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーションプローブとして用いることもできる。
【００７０】
好ましい増幅反応では、少なくとも１つの核酸ポリメラーゼを用いて鋳型依存的な形で増幅オリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）を伸長させることにより、標的配列またはその相補体の多数のコピーが合成される。増幅産物を検出するのに好ましい実施形態は、増幅産物を、増幅された配列に特異的な少なくとも１つのプローブと接触させるステップを伴う（例えば、増幅オリゴヌクレオチドの対に挟まれる標的配列またはその相補体に含有される配列）。該検出するステップは、増幅反応が完了した後で実施することもでき（すなわち、「終了点」検出と称する場合もある）、「リアルタイム」増幅と称する形式における増幅反応と同時に実施する場合もある。好ましい実施形態では、ホモジニアスな反応において検出可能なプローブを用いて、増幅産物が検出される。核酸のホモジニアスな検出の例は、米国特許第５，６３９，６０４号および同第５，２８３，１７４号で与えられている。該増幅ステップに近接するかまたはその終了時において増幅産物を検出する好ましい実施形態では、増幅産物にプローブがハイブリダイズして、増幅された配列に対する該プローブのハイブリダイゼーションを示すシグナルをもたらす。リアルタイムの検出を用いる他の好ましい実施形態では、増幅産物にプローブが結合するときに検出されるシグナルをもたらすレポーター部分を含むことが好ましい。例えば、プローブは、プローブの一方の端部に結合したフルオロフォアなどの検出可能な部分または標識と、ステム構造が「閉じた」立体構造にあり、増幅産物とハイブリダイズしない場合にはシグナルの生成を阻害するステムループ構造の反対側の端部に結合した消光剤などの相互反応部分とを含みうる。相補的配列にハイブリダイズすると、プローブは、検出可能なシグナルを生成しうる「開かれた」立体構造へと転換される。好ましいプローブの具体例は、分子トーチ、分子ビーコン、およびハイブリダイゼーションスイッチプローブを含む（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号および同第５，３１２，７２８号、Ｌｉｚａｒｄｉら；米国特許第５，９２５，５１７号および同第６，１５０，０９７号、Ｔｙａｇｉら；米国特許第６，８４９，４１２号、同第６，８３５，５４２号、同第６，５３４，２７４号、および同第６，３６１，９４５号、Ｂｅｃｋｅｒら；米国第１１／１７３，９１５号、Ｂｅｃｋｅｒら；および米国公開第２００６−０１９４２４０  Ａ１号、Ａｒｎｏｌｄ  Ｊｒ．ら）。
【００７１】
有用な試料調製法
一般的に述べると、開示される増幅手順で用いるのに好ましい試料の調製法は、細菌試料を回収するステップと、次いで、これを溶解させてゲノムＤＮＡを放出させるステップと、次いで、少なくとも部分的にゲノムＤＮＡを変性させるステップとを含む。該方法は、該溶解ステップの前に、試料中に含有される生物を他の試料成分から分離および／または濃縮する手順（例えば、試料からの粒子物質の濾過）を含みうる。試料調製は、化学的、機械的、および／または酵素的な細胞の破壊による、２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡおよびｍｅｃＡ遺伝子を含む細胞内内容物の放出を含みうる。細菌を溶解させ、ゲノムＤＮＡを放出させ、放出されたゲノムＤＮＡ固体支持体上に捕捉するのに好ましい特定の方法は、任意選択の加熱するステップを含む。任意選択の加熱するステップを省き、細菌溶解、ゲノムＤＮＡの放出、および固体支持体上へのゲノムＤＮＡの捕捉を含む全試料調製手順を室温において実行することがより好ましい。試料調製にリソスタフィンなどの酵素を用いることもできるが、極めて好ましい手順では酵素を用いない。核酸増幅前の標的捕捉ステップでは、標的の核酸配列に基づいて他の試料成分から標的核酸を特異的または非特異的に分離することができる。非特異的な標的調製法では、実質的に水性の混合物から核酸を選択的に沈殿させるか、核酸を支持体に結合させ、これを洗浄して他の試料成分を除去するか、または他の手段を用いて、他の成分を含有する混合物から核酸を物理的に分離することができる。ある実施形態において、捕捉された核酸は、増幅前に固体支持体から放出される。他の実施形態において、捕捉された核酸は、最初に固体支持体から放出されることなく増幅される。
【００７２】
異なる各種の手法により、検査試料から核酸を単離することができる。場合によって、溶解において補助となる酵素を含む、アルカリ溶解プロトコールを用いることが好ましい。アルカリ溶解手順の１つの変化形は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、（ニューヨーク州、コールドスプリングハーバー、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ社、１９８９年）、第１．２５〜１．２８節において詳述されている。好ましいアルカリ溶液は、ＮａＯＨ、ＬｉＯＨなどの強塩基を含みうる。アルカリ溶解手順において有用な洗浄剤は、陰イオン洗浄剤、非イオン洗浄剤、両性イオン洗浄剤、または陽イオン洗浄剤でありうる。これらのうちでは、陰イオン洗浄剤が最も好ましい。アルキルアルコールおよびＮ−アシルアミノ酸の硫酸塩を含む強陰イオン洗浄剤が、極めて好ましい。試料調製手順に用いられる洗浄剤の正確な性質が極めて重要であるとは考えられないが、特に好ましい洗浄剤の例は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）を含む。周囲室温で試料調製手順を実行することが極めて好ましい。本明細書で説明される手順において用いられる、核酸を単離する具体的な方法が、極めて重要であるとは考えられない。
【００７３】
核酸は、スワブ試料などの臨床試料から単離されることが好ましい。これは一般に、回収スワブの先端をディスポーザブルのプラスチック製反応試験管へと移すステップと、該試験管にある容量の緩衝ＥＤＴＡ溶液を添加するステップと、次いで、ボルテックスして、任意の細胞物質を懸濁させるステップとを伴った。懸濁液のアリコートを、ラウリル硫酸リチウムおよびＬｉＯＨを含むある容量の溶解緩衝液と混合し、次いで、該混合物を短時間にわたりボルテックスすることが典型的であった。室温における短時間にわたるインキュベーションの後、捕捉プローブおよびオリゴ（ｄＴ）を提示する磁気ビーズを含有するある容量のＨＥＰＥＳ緩衝液を添加することにより、該混合物を中和した。核酸増幅反応において鋳型として用いる前に、中和された混合物に由来する核酸を捕捉し、ＫＩＮＧＦＩＳＨＥＲ９６プラットフォーム（マサチューセッツ州、ウォルサム、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて洗浄した。
【００７４】
有用な増幅法
本発明との関連で有用な増幅法は、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ならびに自己複製ポリヌクレオチド分子と、ＭＤＶ−１  ＲＮＡ酵素およびＱ−ベータ酵素などの複製酵素とを用いる増幅法を含む。これらの各種増幅法を実施する方法は、それぞれ、米国特許第５，３９９，４９１号、米国特許第５，５５４，５１７号、米国特許第４，９６５，１８８号、米国特許第５，４５５，１６６号、米国特許第５，４７２，８４０  号、およびＬｉｚａｒｄｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第６巻、１１９７頁（１９８８年）において見出すことができる。増幅される配列を含有する標的核酸は、一本鎖核酸、または少なくとも部分的な一本鎖核酸として増幅反応混合物に供給されることが好ましい。
【００７５】
本発明の好ましい一実施形態において、核酸配列は、ＴＭＡプロトコールを用いて増幅される。このプロトコールによれば、ＤＮＡポリメラーゼ活性をもたらす逆転写酵素はまた、内因性ＲＮアーゼＨ活性も保有する。この手順において用いられるプライマーの１つは、増幅される標的核酸の１本の鎖に対して相補的な配列の上流に位置するプロモーター配列を含有する。増幅の第１段階において、プロモーター−プライマーは、既定の部位において標的ＤＮＡにハイブリダイズする。逆転写酵素は、プロモーター−プライマーの３’端からの伸長により、標的ＤＮＡの第１の相補的なＤＮＡコピーをもたらす。次いで、ディスプレイサーオリゴヌクレオチドが標的ＤＮＡ鎖にハイブリダイズし、これもまた、逆転写酵素により伸長し、これにより、標的ＤＮＡ鋳型から標的ＤＮＡの第１の相補的なＤＮＡコピーが分離する。反対方向鎖のプライマーが第１の相補的ＤＮＡ鎖と相互作用した後で、該プライマーの逆転写酵素を介する伸長により第２のＤＮＡ鎖（すなわち、元の標的ＤＮＡ鋳型と同じ極性を有する）が合成され、これにより、二本鎖ＤＮＡ分子がもたらされる。ＲＮＡポリメラーゼが二本鎖プロモーター配列を認識し、転写を開始する。新たに合成されたＲＮＡの単位複製配列の各々がＴＭＡ工程へと再び導入され、新たな複製ラウンドのための鋳型として用いられ、これにより、ＲＮＡ単位複製配列の指数関数的な増殖がもたらされる。全工程は自己触媒性であり、一定温度で実施される。
【００７６】
本発明の別の好ましい実施形態において、転写を伴う異なる増幅法では、１つのプライマーと、１つまたは複数のさらなる増幅オリゴヌクレオチドとを用いて、試料中における標的核酸の存在を示す転写物を作製することによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで核酸を増幅する。この方法は、Ｂｅｃｋｅｒら、Ｕ．Ｓ．２００６−００４６２６５Ａ１により詳述されている。略述すると、この方法では、プライマーまたは「プライミングオリゴマー」、その３’端からの合成による伸長を阻止するように改変された（例えば、３’遮断部分を含むことにより）「プロモーターオリゴヌクレオチド」、また場合によって、指摘の３’端における標的鎖からのｃＤＮＡの伸長を終結させる３’遮断「ターミネーティングオリゴ」を用いる。この方法は、標的配列を含有する標的ＤＮＡを、プライミングオリゴおよびターミネーティングオリゴヌクレオチドと結合させるステップを含む。プライミングオリゴが標的鎖の３’端にハイブリダイズし、酵素ＲＴ活性がプライミングオリゴの３’端からのプライマーの伸長を誘発してｃＤＮＡを生成し、これにより、新たなｃＤＮＡ鎖と標的ＤＮＡ鎖との二重鎖（すなわち、ｃＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖）がもたらされる。ターミネーティングオリゴマーは、増幅される標的配列の５’端に隣接する標的鎖にハイブリダイズする。ＲＴのＤＮＡポリメラーゼ活性によりプライミングオリゴヌクレオチドが伸長してｃＤＮＡ鎖が生成される場合、標的鎖にハイブリダイズしたターミネーティングオリゴヌクレオチドにプライマーの伸長産物が到達し、したがって、標的配列上におけるターミネーティングオリゴヌクレオチドの位置によりｃＤＮＡの３’端が決定され、該ｃＤＮＡの３’端が標的配列の５’端に対して相補的となるときに重合化が停止する。二重鎖のｃＤＮＡ鎖は、例えば、ディスプレイサーオリゴヌクレオチドの伸長による変性または置換により鋳型鎖から分離する。次に、プロモーターオリゴヌクレオチドが、ｃＤＮＡ鎖の３’端付近でこれにハイブリダイズする。プロモーターオリゴヌクレオチドは、５’側プロモーター配列と、ｃＤＮＡの３’側領域内の配列に相補的な３’側領域と、その３’端からのＤＮＡ合成の開始を阻害する遮断部分を含む改変３’端とを含む。プロモーターオリゴヌクレオチドおよびｃＤＮＡ鎖を含む二重鎖では、機能的な二本鎖プロモーターをもたらす鋳型としてプロモーターオリゴヌクレオチドを用いるＲＴ酵素のＤＮＡポリメラーゼ活性により、ｃＤＮＡの３’端が伸長する。次いで、機能的なプロモーター配列に特異的なＲＮＡポリメラーゼがプロモーターに結合し、最初の標的鎖から増幅された標的領域配列と実質的に同一なｃＤＮＡに相補的なＲＮＡ転写物を転写する。次いで、プライミングオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、さらなるｃＤＮＡ生成のための鋳型として用いられることにより、増幅されたＲＮＡ転写物が増幅工程内における基質として用いられる。
【００７７】
増幅オリゴヌクレオチドの構造的特徴
プロモーターオリゴヌクレオチド
当技術分野で周知の通り、プロモーターとは、核酸に結合し、特異的な部位におけるＲＮＡ転写を開始するためのシグナルとしてＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識される、特異的な核酸配列である。鋳型核酸（転写される配列）は、二本鎖である必要はない。個々のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、転写の促進におけるそれらの有効性において顕著に異なりうる各種の異なるプロモーター配列を認識する。ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合して転写を開始する場合、そのプロモーター配列は、転写される配列の一部ではない。したがって、これにより生成されるＲＮＡ転写物は、その配列を含まない。
【００７８】
本発明によれば、「プロモーターオリゴヌクレオチド」とは、第１および第２の領域を含み、その３’末端からのＤＮＡ合成の開始を阻止するように改変されることが好ましいオリゴヌクレオチドを指す。本発明のプロモーターオリゴヌクレオチドの「第１の領域」は、ＤＮＡ鋳型にハイブリダイズする塩基配列を含み、ここで、ハイブリダイズする配列は、プロモーター領域の３’側に位置するが、必ずしもこれに隣接しない。本発明のプロモーターオリゴヌクレオチドのハイブリダイズする部分は、少なくとも１０ヌクレオチドの長さであることが典型的であり、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０ヌクレオチド以上の長さまで伸長しうる。「第２の領域」は、ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーターを含む。本発明のプロモーターオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）による伸長が不可能であるように改変され、その３’末端において遮断部分を含むことが好ましい。本明細書では、適切で好ましいプロモーターオリゴヌクレオチドが説明されている。
【００７９】
プライミングオリゴヌクレオチド
プライミングオリゴヌクレオチドは、その少なくとも３’端が核酸鋳型に相補的であり、該鋳型にハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによる合成の開始に適するプライマー：鋳型複合体を与えるオリゴヌクレオチドである。プライミングオリゴヌクレオチドは、鋳型依存的な形における、その３’末端に対するヌクレオチドの付加により伸長する。結果は、プライマー伸長産物である。本発明のプライミングオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチドの長さであることが典型的であり、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０ヌクレオチド以上の長さまで伸長しうる。本明細書では、適切で好ましいプライミングオリゴヌクレオチドが説明される。公知のほとんどすべてのＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素を含む）は、一本鎖鋳型に対するオリゴヌクレオチドの複合体化（「プライミング」）によるＤＮＡ合成の開始を必要とすることが知られるが、ＲＮＡの転写（ＤＮＡからのＲＮＡのコピー生成）は一般に、プライマーを必要としない。ＤＮＡポリメラーゼにより伸長するまさにその性質により、プライミングオリゴヌクレオチドは、３’遮断部分を含まない。
【００８０】
ディスプレイサーオリゴヌクレオチド
「ディスプレイサーオリゴヌクレオチド」とは、標的配列の３’端にハイブリダイズした近接するプライミングオリゴヌクレオチド（本明細書では、「順方向プライミングオリゴヌクレオチド」とも称する）よりも上流の鋳型核酸にハイブリダイズするプライミングオリゴヌクレオチドである。「上流」とは、ディスプレイサーオリゴヌクレオチドの３’端が、順方向プライミングオリゴヌクレオチドの３’端に対して５’側の鋳型核酸と複合体化することを意味する。鋳型核酸にハイブリダイズすると、ディスプレイサーオリゴヌクレオチドの３’末端塩基は、順方向プライミングオリゴヌクレオチドの５末端塩基に隣接するかまたはこれとは隔てられることが好ましい。ディスプレイサーオリゴヌクレオチドの３’末端塩基は、順方向プライミングオリゴヌクレオチドの５’末端塩基から５〜３５塩基隔てられていることがより好ましい。ディスプレイサーオリゴヌクレオチドは、順方向プライミングオリゴヌクレオチドと同時であるか、または順方向プライミングオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とハイブリダイズするのに十分な時間を経た後に、反応混合物に供給することができる。順方向プライミングオリゴヌクレオチドの伸長は、ディスプレイサーオリゴヌクレオチドが反応混合物に供給される前に開始させることもでき、該供給の後に開始させることもできる。増幅条件下において、ディスプレイサーオリゴヌクレオチドは、鋳型依存的な形で伸長し、これにより、鋳型核酸と複合体化した順方向プライミングオリゴヌクレオチドを含むプライマー伸長産物を置換する。鋳型核酸から置換されると、順方向プライミングオリゴヌクレオチドを含むプライマー伸長産物は、プロモーターオリゴヌクレオチドとの複合体化に用いられる。順方向プライミングオリゴヌクレオチドおよびディスプレイサーオリゴヌクレオチドは共に、標的核酸に対して優先的にハイブリダイズする。ディスプレイサーオリゴヌクレオチドおよびそれらの使用の例は、Ｂｅｃｋｅｒら、米国特許出願第１１／６８１，１０４号により開示されている。
【００８１】
遮断部分
核酸ポリメラーゼにより伸長しないオリゴマーは、増幅反応におけるオリゴマーの酵素を介する伸長を阻止するように３’ＯＨを置換する「遮断部分」を含むことが好ましい。本明細書で用いられる遮断部分は、核酸ポリメラーゼによる効果的な伸長が不可能であるように、オリゴヌクレオチドまたは他の核酸の３’末端を「遮断する」のに用いられる物質である。遮断部分は、小型分子（例えば、リン酸基またはアンモニウム基）の場合もあり、改変ヌクレオチド（例えば、３’２’−ジデオキシヌクレオチドまたは３’デオキシアデノシン５’−三リン酸（コルジセピン））または他の改変ヌクレオチドの場合もある。さらなる遮断部分は、例えば、３’末端における遊離ヒドロキシル基、３’側アルキル基、３’側非ヌクレオチド部分（Ａｒｎｏｌｄら、「Ｎｏｎ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｎｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ」、米国特許第６，０３１，０９１号を参照されたい）、ホスホロチオエート、アルカンジオール残基、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、３’末端において３’側ヒドロキシル基を欠くヌクレオチド残基、または核酸結合タンパク質を存在させないような、３’から５’への方向性を有するヌクレオチドまたは短いヌクレオチド配列を含む。３’遮断部分は、３’から５’への方向性を有するヌクレオチドもしくはヌクレオチド配列または３’側非ヌクレオチド部分を含むが、３’２’−ジデオキシヌクレオチドまたは遊離ヒドロキシル基を有する３’末端は含まないことが好ましい。３’遮断オリゴヌクレオチドを調製するさらなる方法は、当業者に周知である。
【００８２】
ターミネーティングオリゴヌクレオチド
「ターミネーティングオリゴヌクレオチド」とは、プライミングオリゴヌクレオチドを含む新生核酸のプライマー伸長を「終結させ」、これにより、新生核酸鎖に指摘の３’端をもたらすように、標的配列の５’端の近傍における標的核酸の領域に対して相補的である塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである。ターミネーティングオリゴヌクレオチドは、新生核酸鎖に望ましい３’端を達成するのに十分な位置において標的酢酸にハイブリダイズするように設計される。ターミネーティングオリゴヌクレオチドの位置取りは、その設計に応じて柔軟である。ターミネーティングオリゴヌクレオチドは、改変の場合もあり、非改変の場合もある。ある実施形態において、ターミネーティングオリゴヌクレオチドは、少なくとも１種または複数種のＬＮＡヌクレオチド類似体により合成される。これらの改変ヌクレオチドは、ＤＮＡを含む相補的二重鎖のより高度な熱安定性を示している。２’−Ｏ−ＭＥリボヌクレオチドなど、他の改変もまた、一部の実施形態において用いることができる。本発明のターミネーティングオリゴヌクレオチドは、その３’末端において伸長を阻止する遮断部分を含むことが典型的である。本発明のターミネーティングオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０塩基の長さであることが典型的であり、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０ヌクレオチド以上の長さまで伸長させることができる。本明細書では、適切で好ましいターミネーティングオリゴヌクレオチドが説明されている。ターミネーティングオリゴヌクレオチドが３’遮断部分を含むことは典型的であるかまたは必要であるが、「３’遮断された」オリゴヌクレオチドは、必ずしもターミネーティングオリゴヌクレオチドではない。
【００８３】
有用なプローブおよび標識システム
本明細書で開示される種類の核酸増幅産物は、従来の任意の手段により検出することができる。例えば、増幅産物は、検出可能な標識プローブとのハイブリダイゼーションおよび結果としてもたらされるハイブリッド体の測定により検出することができる。具体的な標的配列を検出するプローブの選択における設計基準は当技術分野において周知であり、例えば、Ｈｏｇａｎら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｋｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｎ−Ｖｉｒａｌ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ」、米国特許第６，１５０，５１７号において説明されている。Ｈｏｇａｎは、（１つまたは複数の）標的配列に対する相同性を最大化し、可能な非標的配列に対する相同性を最小化するようにプローブを設計すべきであることを教示している。非標的配列との安定性を最小化するため、Ｈｏｇａｎは、グアニンおよびシトシンに富む領域を回避し、プローブとの不安定化ミスマッチが可能な限り多数にわたり、非標的配列に対する完全な相補性の長さを最小化するべきであることを示唆している。（１つまたは複数の）標的配列とのプローブの安定性を最大化すべきであり、アデニンおよびチミンに富む領域を回避すべきであり、プローブ：標的ハイブリッド体がグアニンおよびシトシンの塩基対により終結することが好ましく、広範にわたる自己相補性は一般に回避すべきであり、プローブ：標的ハイブリッド体の融解温度をアッセイ温度よりも２〜１０℃高温とすべきである。
【００８４】
本明細書で開示される解析対象の核酸配列を検出するのに好ましい特定のプローブは、１０〜１００ヌクレオチドの範囲の長さにおいて、検出される核酸に対して相補的でない任意の塩基配列と共に、標的相補的塩基配列を含むプローブ配列を有する。増幅された解析対象である核酸配列を検出するのに好ましいある特定のプローブは、１０〜５０ヌクレオチド、１０〜２０ヌクレオチド、または１０〜１５ヌクレオチドの範囲の長さの標的相補的配列を有する。当然ながら、これらの標的相補的配列は直鎖配列の場合もあり、検出される解析対象の標的核酸に対して非相補的な１つまたは複数の任意選択の核酸配列を有する分子トーチ、分子ビーコン、または他の構築物の構造内に含有される場合もある。プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡの組合せ、核酸類似体からなる場合もあり、１つまたは複数の改変ヌクレオシド（例えば、リボフラノシル部分に対する２’−Ｏ−メチル置換を有するリボヌクレオシド）を含有する場合もある。
【００８５】
具体的な実施形態において、増幅産物は、化学発光オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、アクリジニウムエステル標識（「ＡＥ」）プローブ）を標的配列にハイブリダイズさせるステップと、ハイブリダイズしなかったプローブ上に存在する該化学発光標識を選択的に加水分解するステップと、発光測定器内に残存するプローブから生成される化学発光を測定するステップとを含む、ホモジニアス防護アッセイ（「ＨＰＡ」）によりアッセイすることができる。ＨＰＡアッセイ法は、Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，２８３，１７４号により詳述されている。
【００８６】
さらなる実施形態において、本発明は、本明細書で説明される方法によるリアルタイムにおける増幅工程の評価を提供する。「リアルタイム」における増幅工程の評価は、増幅反応時において、連続的または周期的に反応混合物中における単位複製配列の量を決定するステップを伴う。決定された値を用いて、試料中において当初に存在する標的配列の量を計算することができる。リアルタイムの増幅に基づき試料中に存在する当初の標的配列の量を決定する、各種の方法が用いられる。これらは、Ｗｉｔｔｗｅｒら、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｎａｌｙｔｅ」、米国特許第６，３０３，３０５号およびＹｏｋｏｙａｍａら、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ａｓｓａｙｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ」、米国特許第６，５４１，２０５号により開示された方法を含む。試料中において当初に存在する標的配列の量を決定するが、リアルタイムの増幅には基づかない別の方法は、Ｒｙｄｅｒら、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｐｒｅ−Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ａ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｏｓｔ−Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｕｃｔ」、米国特許第５，７１０，０２９号により開示されている。増幅産物は、その大半がステムループ構造を有する各種の自己ハイブリダイジングプローブの使用によりリアルタイムで検出することができる。このような自己ハイブリダイジングプローブは、プローブが自己ハイブリダイズ状態にあるか、または標的配列にハイブリダイズしているかに応じて、異なる形で検出可能なシグナルを発するように標識されている。
【００８７】
例として述べると、「分子トーチ」は、接合領域（例えば、非ヌクレオチドリンカー）により連結され、所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下において互いにハイブリダイズする、異なる自己相補性領域（「標的結合ドメイン」および「標的閉鎖ドメイン」）を含む自己ハイブリダイジングプローブの種類である。好ましい実施形態において、分子トーチは、１〜約２０塩基の長さの標的結合ドメイン内において一本鎖塩基領域を含有し、鎖置換条件下における増幅産物中に存在する標的配列に対するハイブリダイゼーションにアクセス可能である。鎖置換条件下では、標的結合ドメイン内に存在する一本鎖領域に結合し、標的閉鎖ドメインの全部または一部を置換する標的配列の存在下にある場合を除き、分子トーチの２つの相補性領域（完全にまたは部分的に相補的でありうる）のハイブリダイゼーションが優先される。分子トーチの標的結合ドメインおよび標的閉鎖ドメインは、分子トーチが自己ハイブリダイズする場合において、分子トーチが標的配列にハイブリダイズする場合とは異なるシグナルが生成され、これにより、ハイブリダイズしていない分子トーチの存在下にある検査試料中においてプローブ：標的二重鎖が検出されるように配置される、検出可能標識または相互作用型標識対（例えば、発光標識／消光剤の対）を含む。分子トーチおよび各種の相互作用型標識対は、Ｂｅｃｋｅｒら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｏｒｃｈｅｓ」、米国特許第６，５３４，２７４号により開示されている。
【００８８】
自己相補性を有する検出プローブの別の例は、「分子ビーコン」である。分子ビーコンは、標的相補体配列を有する核酸分子、増幅産物中に存在する標的配列の不在下ではプローブを閉じた立体構造に保持する親和性対（または核酸アーム）、およびプローブが閉じた立体構造にある場合に相互作用する標識対を含む。標的配列と標的相補的配列とのハイブリダイゼーションにより親和性対のメンバーが分離し、これにより、プローブが開いた立体構造へと移行する。開いた立体構造への移行は、例えば、フルオロフォアと消光剤（例えば、ＤＡＢＣＹＬおよびＥＤＡＮＳ）でありうる標識対の相互作用の低下により検出可能である。分子ビーコンは、Ｔｙａｇｉら、「Ｄｅｔｅｃｔａｂｌｙ  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｄｕａｌ  Ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ａｓｓａｙｓ  ａｎｄ  Ｋｉｔｓ」、米国特許第５，９２５，５１７号；およびＴｙａｇｉら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｎｏｎ−ＦＲＥＴ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｋｉｔｓ  ａｎｄ  Ａｓｓａｙｓ  Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｓｕｃｈ  Ｐｒｏｂｅｓ」、米国特許第６，１５０，０９７号により開示されている。
【００８９】
本発明で用いられる他の自己ハイブリダイジングプローブは、当業者に周知である。例えば、ＰＣＲ反応用にＭｏｒｒｉｓｏｎ、「Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  Ａｓｓａｙ」、米国特許第５，９２８，８６２号；およびＧｅｌｆａｎｄら、米国特許第５，８０４，３７５号により開示される標識などの相互作用型標識を有するプローブ結合対もまた、本発明における使用に適応させることができる。さらなる検出システムは、Ａｒｎｏｌｄら、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｗｉｔｃｈ」、米国特許出願公開第ＵＳ２００５−００４２６３８Ａ１号により開示される「分子スイッチ」を含む。挿入色素および／または蛍光色素を含むプローブなど、他のプローブも、本発明における増幅産物の検出に有用でありうる。例えば、Ｉｓｈｉｇｕｒｏら、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、米国特許第５，８１４，４４７号を参照されたい。
【００９０】
最初の標的配列とＲＮＡ転写産物とが同じ方向を共有する本発明の方法では、リアルタイムの検出のためにプローブを添加する前に増幅を開始することが望ましい場合がある。増幅反応を開始する前にプローブを添加すると、標的配列の相補体を有するプライマー伸長産物を完成させるプライマー伸長ステップ中において、最初の標的配列に結合するプローブを置換するか、または別の形でこれを除去することになるので、増幅速度が遅くなる場合がある。増幅の開始は、増幅酵素（例えば、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼ）の添加により判断される。
【００９１】
有用な相互作用標識
分子トーチおよび分子ビーコンは、検出可能標識の相互作用対により標識することが好ましい。標識の相互作用対のメンバーとして好ましい検出可能標識の例は、ＦＲＥＴまたは非ＦＲＥＴによるエネルギー移動機構により互いに相互作用する。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、熱エネルギーへの転換がなく、またドナーおよびアクセプターが運動論的衝突を来すこともない、原子間距離よりもはるかに大きな距離にわたる発色団間の共鳴相互作用を介する、分子または分子システム内における吸収部位からその使用部位へのエネルギー量子の非放射性移動を伴う。「ドナー」とは、エネルギーを最初に吸収する部分であり、「アクセプター」とは、エネルギーがその後そこへ移動する部分である。ＦＲＥＴに加え、励起エネルギーをドナー分子からアクセプター分子へと移動させうる、少なくとも３つの他の「非ＦＲＥＴ」エネルギー移動過程が存在する。
【００９２】
ＦＲＥＴ機構による場合であれ、非ＦＲＥＴ機構による場合であれ、１つの標識により放出されるエネルギーが第２の標識により受容または吸収されうる程度に十分に近接して２つの標識が保持される場合、該２つの標識を互いに「エネルギー移動関係」にあるという。これは、例えば、分子ビーコンがステム二重鎖の形成により閉鎖状態に維持され、該プローブの１つのアームに結合したフルオロフォアからの蛍光の発光が、反対側のアーム上にある消光剤部分により消光される場合である。
【００９３】
ＦＲＥＴ対を非ＦＲＥＴ対から区別しようとは試みない本発明との関連で用いうるドナー／アクセプター標識対の例は、フルオレセイン／テトラメチルロダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、クマリン／ＤＡＢＣＹＬ、フルオレセイン／フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ／ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、フルオレセイン／ＤＡＢＣＹＬ、ルシファーイエロー／ＤＡＢＣＹＬ、ＢＯＤＩＰＹ／ＤＡＢＣＹＬ、エオシン／ＤＡＢＣＹＬ、エリトロシン／ＤＡＢＣＹＬ、テトラメチルロダミン／ＤＡＢＣＹＬ、テキサスレッド／ＤＡＢＣＹＬ、ＣＹ５／ＢＨ１、ＣＹ５／ＢＨ２、ＣＹ３／ＢＨ１、ＣＹ３／ＢＨ２、およびフルオレセイン／ＱＳＹ７色素を含む。ドナー色素とアクセプター色素とが異なる場合、アクセプターの感光による蛍光の出現、またはドナーの蛍光に対する消光によりエネルギー移動を検出しうることを当業者は理解するであろう。ドナー分子種とアクセプター分子種とが同じである場合、結果としてもたらされる蛍光偏光解消によりエネルギーを検出することができる。ＤＡＢＣＹＬ色素およびＱＳＹ７色素などの非蛍光アクセプターは、直接の（すなわち、非感光の）アクセプター励起から生じるバックグラウンド蛍光の潜在的な問題を解消する点で有利である。ドナー−アクセプター対の１つのメンバーとして用いうる好ましいフルオロフォア部分は、フルオレセイン色素、ＲＯＸ色素、およびＣＹ色素（ＣＹ５色素など）を含む。ドナー−アクセプター対の別のメンバーとして用いうる極めて好ましい消光剤部分は、ＤＡＢＣＹＬ部分、ＴＡＭＲＡ部分、およびＢｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（カリフォルニア州、ノバート）製のＢＬＡＣＫ  ＨＯＬＥ  ＱＵＥＮＣＨＥＲ部分を含む。
【００９４】
有用な増幅指標の例
本明細書で開示される方法により、核酸増幅反応における所定レベルの進行を示す数値（本明細書では、「増幅指標」と称する）を比較することで、試料中におけるＭＲＳＡ細菌の存在についての情報を得た。この目的では多くの異なる増幅指標を用いうるが、閾値ベースの増幅指標（「Ｃｔ」値の決定を結果としてもたらす）を用いて本発明を例示した。等温条件下において実行された多重核酸増幅反応を用いて本発明をさらに例示した。増幅サイクルの関数としての反応進行をモニタリングするのではなく、反応時間の関数としての反応進行をモニタリングした。したがって、本明細書で報告されるＣｔ値は、閾値の値に達した蛍光シグナルを結果としてもたらすのに十分な量の単位複製配列を生成する特定の増幅反応に必要とされる時間を表わした。当然ながら、多数の変化形は同等であることが示唆されるであろう。例えば、満たされるかまたは超えられる閾値の値が生の蛍光リーディング以外のものでありうるような標準化ステップおよび／またはバックグラウンド減算ステップが存在しうる。多重増幅反応における２つの核酸標的に対する増幅指標を比較するのに好ましい方法は、減算、加算、除算、および乗算を含む。比較は、増幅指標間の差に基づくことが好ましい。
【００９５】
上記の通り、開示される方法との関連で、各種の増幅指標を用いることができる。例えば、当業者が熟知する数学的技法および計算法を用いて、リアルタイムの反応曲線の一次導関数の最大値の発生時または同二次導関数の最大値の発生時を同定することができる。増殖曲線のこれらの形状特徴を決定する手法は、Ｗｉｔｔｗｅｒら、米国特許第６，５０３，７２０号により詳述されている。他の有用な手法は、増殖曲線の導関数を計算するステップと、増殖曲線の特性を同定するステップと、次いで、該導関数の特性に対応する閾値時間または閾値サイクル数を決定するステップとを伴う。このような技法は、米国特許第６，７８３，９３４号において開示されている。他の有用な増幅指標は、公開された欧州特許出願第ＥＰ０６４０８２８Ａ１号においてＨｉｇｕｃｈｉらにより説明される指標、または米国特許出願第６０／６５９，８７４号（これらの出願の開示は、参照により本明細書に組み込まれる）において開示される方法により決定される「Ｔ時間」値などの閾値ベースの指標を含む。簡単に述べると、閾値ベースの増幅指標により、リアルタイムの増幅反応において単位複製配列の生成を示す特定の閾値を超える時点が推定される。さらに他の有用な指標は「ＴＡｒｃ」および「ＯＴＡｒｃ」を含み、これらの各々は、リアルタイムの反応曲線に対するベクトルベースの解析を用いて決定される。これらの増幅指標により、増殖曲線が上方へと曲がるかまたは「屈曲」し始める時点が同定される。ＴＡｒｃ値およびＯＴＡｒｃ値の決定および使用に関する詳細な記載は米国特許出願第１１／４７４，６９８号において見られ、この出願の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９６】
増幅指標の比較
本発明によれば、共増幅されたＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的核酸およびｍｅｃＡ標的核酸について決定される増幅指標の関数である数値が計算される。簡単に述べると、２つの共増幅された核酸標的の増幅反応速度から標的のレベル差を推定することができる。単一の共増幅反応に由来する２つの増幅指標（すなわち、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的核酸およびｍｅｃＡ標的核酸の各々に対する指標）を変数として用いて、ある種の方程式を解くことが好ましい。この目的で用いられて有用であることが意図される数学的関係の例は、乗算、除算、加算、および減算である。減算による２つの増幅指標の数学的な関連付け（すなわち、該指標間の差の確立）が極めて好ましく、これにより閾値カットオフ値の確立が簡略化される。２つの増幅指標間の差は、項「ΔＣｔ」により表わすことができる。これらのΔＣｔ値を閾値ベースの基準と比較して、診断法の出力結果についての判定を行うことができる。
【００９７】
閾値カットオフ値の確立および使用
本発明によれば、閾値カットオフ値は、検査試料がＭＲＳＡまたはＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳの混合物のいずれを含むのかを判定するのに用いられる。例えば、ＭＲＳＡ陽性試料に対して、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的核酸およびｍｅｃＡ標的核酸について決定される増幅指標（例えば、ΔＣｔ値）を変数として用いる数学的方程式の解として計算された数値が−１であり、ＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳの混合物を含むがＭＲＳＡは含まない試料に対する増幅指標を用いて同様に計算された値が−３である場合、閾値カットオフ値を−２に設定すれば、１つの試料が他の試料から区別される。別の形で述べれば、この場合、ＭＲＳＡ試料に対するΔＣｔ値（すなわち、−１）は、−２に設定された閾値カットオフ値により、ＭＳＳＡ試料に対するΔＣｔ値（すなわち、−３）から「分離」される。特に、閾値カットオフ値の調整または変更により、アッセイの感度および特異性が改変される。これは、図７Ｂにおける水平線として示される閾値カットオフ値を−２から−４へと変化させると、さらに１〜２例のＭＲＳＡ陽性試料を正当に含むことにはなるが、また、さらなるＭＲＳＡ陰性試料を含むことにもなる（すなわち、偽陰性判定を増大させる）ことを理解することにより認めうる。したがって、互いに排除的なＭＲＳＡ判定またはＭＳＳＡ判定を行うのに用いられる閾値カットオフ値を調整するのみで、アッセイの感度および特異性が改変される。
【００９８】
アルゴリズムを実装するための装置
本明細書で開示される方法は、コンピュータまたは類似の処理デバイス（以下では「コンピュータ」）を用いて部分的に実装することができる点で簡便である。異なる好ましい実施形態では、フリースタンディングコンピュータのメモリー構成要素内、または解析を受ける産物の量を、好ましくは時間の関数としてモニタリングするのに用いられるデバイスに連結されたコンピュータのメモリー構成要素内に、アルゴリズムを実行するソフトウェアまたはマシンで実行可能な命令をロードするかまたは他の形で保持することができる。極めて好ましい実施形態において、アルゴリズムを実行するソフトウェアは、反応混合物中に存在する単位複製配列の量を時間の関数としてモニタリングすることが可能なデバイスに連結されるか、またはこの統合部分であるコンピュータのメモリー構成要素内に保持される。
【００９９】
実際、リアルタイムの増幅デバイスを制御するコントローラーシステムおよび／またはリアルタイムの増幅デバイスの検出システムの一方または両方を、予めプログラムされるかまたは使用者が入力する命令に従ってこれらの機器の動作を命令するように機能する、適切にプログラムされたコンピュータに連結することができる。該コンピュータはまた、これらの機器からデータまたは情報を受け取り、この情報を解釈し、操作し、使用者へと報告することも可能であることが好ましい。アルゴリズムの出力は、用紙へのプリントアウト、またはコンピュータのモニター、ディスプレイデバイス、もしくは他のインターフェースへの出力を含む各種の形態をとりうる。結果はまた、電子媒体または磁気媒体に保存することもできる。
【０１００】
一般に、コンピュータは、一連のパラメータフィールドへの使用者による入力の形態、または予めプログラムされた命令の形態（例えば、各種の異なる特定の動作について予めプログラムされた）における使用者の命令を受け取るのに適切なソフトウェアを含むことが典型的である。次いで、ソフトウェアにより、これらの命令が、所望の動作を実行するリアルタイムの増幅コントローラーの作動を命令するのに適切な言語に変換される。コンピュータはまた、システム内に含まれる１つまたは複数のセンサー／検出器からデータを受け取ることも可能であり、プログラム設定に従い該データを解釈する。システムは、検出器により検出される、時間の関数としての対象核酸の増幅コピー量を表わす増殖曲線の形状特徴を、検査試料中に存在する対象核酸のコピー数と相関させるソフトウェアを含むことが好ましい。
【０１０１】
開示される方法を実施するのに用いられるコンピュータが、リアルタイムの核酸増幅反応を実施および解析する装置の統合的構成要素である場合、該装置は、温度制御型インキュベータ、シグナルを収集する検出デバイス、シグナルを解析する解析デバイス（例えば、コンピュータまたはプロセッサー）、および解析デバイスにより得られるかまたは生成されるデータを表示する出力デバイスを含むことが好ましい。解析デバイスは、当技術分野で公知の入力デバイスを介して温度制御型インキュベータに接続することもでき、かつ／またはデータディスプレイのための当技術分野で公知の出力デバイスに接続することもできる。一実施形態において、温度制御型インキュベータは、温度サイクリングが可能である。
【０１０２】
一般的に述べると、開示される方法との関連で有用な、リアルタイムの核酸増幅を実施する装置の各種の構成要素は、当業者が熟知する従来の構成要素である。リアルタイムの核酸増幅を実施および解析するのに用いられる温度制御型インキュベータは、複数の反応試験管を保持しうるか、または標準的な増幅反応試験管内もしくはマルチウェルプレートウェル内の温度制御型ブロックに反応試料を保持しうる従来の設計でありうる。一態様において、検出システムは、１種または複数種の蛍光標識に由来する光学シグナルを検出するのに適する。検出システムの出力（例えば、増幅反応中に発生するシグナルに対応するシグナル）をコンピュータにフィードし、データの保存および操作を行うことができる。一実施形態において、システムは、複数の異なる種類の蛍光標識など、複数の異なる種類の光学シグナルを検出し、マイクロプレート蛍光リーダーの能力を有する。検出システムは、可視光レーザーの場合もあり紫外線灯の場合もありハロゲン灯の場合もある励起光源、個々の反応試験管に励起光を分配し、反応試験管から蛍光を受容するマルチプレクサーデバイス、それらの波長により励起光から蛍光を分離する濾過手段、および蛍光強度を測定する検出手段を含有するマルチプレックス型蛍光光度計であることが好ましい。温度制御型インキュベータの検出システムは、フルオロフォア選択の柔軟性、高感度、および優れたシグナル対ノイズ比を可能とする広範な検出範囲をもたらすことが好ましい。検出システムにより受信される光学シグナルは一般に、プロセッサーにより引き続き操作されて、該プロセッサーと接続された使用者用デバイスのディスプレイ上における使用者による参照が可能なデータをもたらしうるシグナルに変換される。使用者用デバイスは、使用者用インターフェースを含む場合もあり、キーボードおよびビデオモニターを伴う従来の市販のコンピュータシステムの場合もある。使用者用デバイスにより表示しうるデータの例は、アセンブリー内におけるすべての試験管または反応容器および用いられるすべての標識についての増幅図、散布図、試料値スクリーン、光学シグナル強度スクリーン（例えば、蛍光シグナル強度スクリーン）、最終判定結果、文章による報告書などを含む。
【０１０３】
好ましい増幅オリゴヌクレオチド
増幅反応を実施するのに有用な増幅オリゴヌクレオチドは、標的結合に関与せず、増幅手順または検出手順に実質的に影響を及ぼさないこともある外来配列の存在を受け入れる、異なる長さを有しうる。例えば、本発明による増幅反応を実施するのに有用なプロモーターオリゴヌクレオチドは、標的核酸にハイブリダイズする少なくとも最小限の配列と、その最小限の配列の上流に位置するプロモーター配列とを有する。しかし、標的結合配列とプロモーター配列との間における配列の挿入により、増幅反応におけるその有用性を損なわずにプライマーの長さを変化させることができる。加えて、増幅プライマーおよび検出プローブの長さは、これらのオリゴヌクレオチドの配列が、所望の相補的配列にハイブリダイズする最小限の不可欠な要件を満たす限りにおいて、選択の問題である。
【０１０４】
表１〜３は、本発明を例示するのに用いられたオリゴヌクレオチド配列の具体例を示す。表１は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ２３Ｓ  ｒＤＮＡ配列を増幅するのに用いられる増幅オリゴヌクレオチドの配列を示す。表２は、ｍｅｃＡ  ＤＮＡ配列を増幅するのに用いられる増幅オリゴヌクレオチドの配列を示す。表３は、内部対照ＤＮＡを増幅するのに用いられる増幅オリゴヌクレオチドの配列を示す。本発明を例示するのに用いられるすべてのプロモーターオリゴヌクレオチドは、その３’端において標的配列の１つに相補的な配列を含み、その５’端においてＴ７プロモーター配列（小文字で示す）を含む。加えて、すべてのプロモーターオリゴヌクレオチドの３’末端は、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長が不可能な逆極性のＣヌクレオチドを用いて遮断した。配列番号３のターミネーティングオリゴヌクレオチドにおいて、位置１〜３、６、９〜１０、１７〜１８、２１、および２５はＬＮＡヌクレオチド類似体であり、３’末端はＤＮＡポリメラーゼによる伸長が不可能な逆極性Ｃヌクレオチドを用いて遮断した。配列番号１２のターミネーティングオリゴヌクレオチドにおいて、位置３〜５、１１〜１３、１７〜１９はＬＮＡヌクレオチド類似体であり、３’  末端はＤＮＡポリメラーゼによる伸長が不可能な逆極性Ｃを用いて遮断した。配列番号１６のターミネーティングオリゴヌクレオチドにおいて、位置５〜７、１１〜１３、および１７〜１９はＬＮＡ類似体により占められ、３’端はＤＮＡポリメラーゼによる伸長が不可能な逆極性Ｃを用いて遮断した。
【０１０５】
【表１】
0005498954.tif 000002
【０１０６】
【表２】
0005498954.tif 000003
【０１０７】
【表３】
0005498954.tif 000004
好ましい検出プローブ
解析対象の核酸配列を検出するのに有用なハイブリダイゼーションプローブは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓｒＤＮＡ標的核酸配列、ｍｅｃＡ標的核酸配列、または内部対照標的核酸に対して実質的に相補的な塩基配列を含む。したがって、本発明のプローブは、増幅された標的核酸配列の１本の鎖またはその相補体にハイブリダイズすることが好ましい。これらのプローブは、場合によって、検出される標的核酸に対して相補的な場合もありそうでない場合もある標的核酸領域の外側において、さらなる塩基を有することがある。
【０１０８】
極めて好ましいプローブは、本明細書で説明される条件など、核酸増幅反応を実施するのに適する条件下において、増幅されたＳ．ａｕｒｅｕｓ  ２３Ｓリボソーム核酸、ｍｅｃＡ核酸、または内部対照核酸にハイブリダイズすることが可能である。表４〜６は、それぞれ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ２３Ｓリボソーム単位複製配列、ｍｅｃＡ単位複製配列、および内部対照単位複製配列を検出するのに用いられた一部のハイブリダイゼーションプローブの全配列を示す。表４に示される分子トーチは、その５’端においてヘキサクロロ−フルオレセイン部分により標識され、その３’端においてＤＡＢＣＹＬ消光剤部分により標識された。表５に示される分子トーチは、その５’端においてフルオレセイン部分により標識され、その３’端においてＤＡＢＣＹＬ消光剤部分により標識された。表６に示される分子トーチは、その３’端においてＲＯＸ部分により標識され、その３’端においてＴＡＭＲＡ消光剤部分により標識された。表４〜５に示される分子トーチでは塩基位置５〜６、表６に示される分子トーチでは塩基位置１７〜１８が、非ヌクレオチドの９炭素（Ｃ９）スペーサーにより隔てられた。すべてのプローブは、２’メトキシヌクレオチド類似体を用いて合成された。
【０１０９】
【表４】
0005498954.tif 000005
【０１１０】
【表５】
0005498954.tif 000006
【０１１１】
【表６】
0005498954.tif 000007
上記に示した通り、任意の数の異なる骨格構造を、本発明のハイブリダイゼーションプローブの核酸塩基配列のための足場として用いることができる。特定の極めて好ましい実施形態において、ＲＮＡ単位複製配列を検出するのに用いられるプローブ配列は、メトキシ骨格、または核酸骨格内における少なくとも１つのメトキシ結合を含む。
【０１１２】
捕捉オリゴヌクレオチドの選択および使用
簡単に述べると、好ましい標的捕捉法では、標的核酸に非特異的にハイブリダイズし、次いで、それを試料調製物の他の成分から分離するのに、１種または複数種の核酸オリゴマーを用いる。増幅前に核酸を精製するのに極めて好ましい非特異的な標的捕捉法に関する詳細は、第１１／８３２，３６７号の番号により同定される米国特許出願において、Ｂｅｃｋｅｒらにより与えられる。
【０１１３】
増幅前に標的核酸を単離する方法は、標的核酸を含有する試料を、非特異的捕捉プローブと混合するステップ伴うことが好ましい。捕捉プローブは、標的核酸と非特異的にハイブリダイズする第１の塩基配列を含むことが好ましい。第１のオリゴヌクレオチド配列は、ＧヌクレオチドおよびＴヌクレオチドまたはＧヌクレオチドおよびＵヌクレオチドを含む、無作為的なポリ（Ｋ）配列であることが好ましい。好ましい捕捉オリゴヌクレオチドは、固体支持体上への固定化のための標的として用いられる第２の配列（すなわち、「テール」配列）に共有結合している。捕捉オリゴヌクレオチドの３’端にあることが好ましいテール配列を用いて、固体支持体上において固定化された相補的な塩基配列にハイブリダイズすることで、ハイブリダイズした解析対象の核酸を、生物学的試料中における他の成分に優先して捕捉する手段がもたらされる。捕捉プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションにより、該支持体に固定化されるハイブリダイゼーション複合体を形成させるハイブリダイゼーション条件下において、固体支持体、標的核酸、および非特異的捕捉プローブを含有する反応混合物をインキュベートすることができる。その後、反応混合物の溶液相から固体支持体を分離して、それに結合したハイブリダイゼーション複合体を他の試料成分から分離し、これにより標的核酸を他の試料成分から単離するステップが実施される。好ましい実施形態において、該捕捉するステップは、捕捉オリゴヌクレオチドを標的核酸と逐次的にハイブリダイズさせ、次いで、捕捉オリゴヌクレオチドのテール部分を固定化された相補的配列とハイブリダイズさせるハイブリダイゼーション条件を調整することにより実施される（例えば、ＰＣＴ第ＷＯ９８／５０５８３号において説明される）。
【０１１４】
標的核酸：捕捉オリゴヌクレオチド：固定化プローブ複合体を回収することにより、生物学的試料中におけるその濃度に対して標的核酸が効果的に濃縮され、生物学的試料中に存在しうる増幅阻害剤から標的核酸が精製される。捕捉された標的核酸を１回または複数回にわたり洗浄することができ、例えば、結合した標的核酸：捕捉オリゴヌクレオチド：固定化プローブ複合体を伴う粒子を洗浄液中において再懸濁させ、次いで、上記で説明した通りに、洗浄液から結合複合体を伴う粒子を回収することにより、標的をさらに精製する。次いで、該捕捉するステップおよび任意選択の洗浄するステップが完了した後において、標的核酸を増幅することができる。操作するステップの数を制限するために、標的核酸は、場合によって、それを捕捉オリゴヌクレオチドから放出させることなく増幅することもできる。
【０１１５】
本発明を例示するのに用いられる捕捉オリゴヌクレオチドを表７に示す。捕捉オリゴヌクレオチドの位置１〜１８は、Ｇ塩基およびＴ塩基による無作為のポリ（Ｋ）配列であった。ポリ（ｄＡ）テール配列は、該オリゴヌクレオチドの３’端に配置した。捕捉オリゴヌクレオチドはまた、標的にハイブリダイズする非特異的配列とポリ（ｄＡ）テールとの間に挿入される３つの任意選択のチミジンヌクレオチドからなるスペーサーも含んだ。これらのチミジンヌクレオチドの存在は、捕捉手順の成功に不可欠であるとは考えられない。ＤＮＡ前駆体およびＬＮＡヌクレオチド類似体の組合せを用いて、該オリゴヌクレオチドの標的にハイブリダイズする非特異的部分が合成される一方、ＤＮＡ前駆体を用いて、３つのチミジンヌクレオチドおよびポリ（ｄＡ）テールが合成された。より具体的に述べると、位置１〜３、７〜９、および１３〜１５におけるＬＮＡ類似体を除き、捕捉オリゴヌクレオチドはＤＮＡであった。該オリゴヌクレオチドの３’末端は、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長が不可能な逆極性Ｃヌクレオチドを用いて遮断した。
【０１１６】
【表７】
0005498954.tif 000008
内部対照
増幅核酸を検出するアッセイは、場合によって、同じ増幅反応混合物中において増幅および検出される内部対照（ＩＣ）核酸を含む。ＩＣは、ＩＣ配列に特異的な増幅オリゴヌクレオチドおよび検出プローブを用いることにより増幅することができる。意図される解析対象の核酸に対するシグナルが得られない場合（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびｍｅｃＡによる解析対象の核酸に対して陰性結果をもたらす試料の場合）、増幅されたＩＣ配列からのシグナルの検出により、アッセイ試薬、アッセイ条件、およびアッセイ手順のステップがアッセイにおいて適正に用いられて実施されたことが示される。ＩＣの好ましい実施形態は、天然の供給源に由来している無作為的配列（無作為的な形で再配列されたＨＩＶ配列）である。好ましいＩＣは、天然の供給源から単離されるか、または化学合成されるか、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏの技法によるＲＮＡ転写物またはＤＮＡ分子でありうる。プライマーおよびプローブが、解析対象の標的配列を増幅および検出するのに用いられるのと実質的に同じアッセイ条件を用いるＩＣ配列の増幅および検出に機能する場合、ＩＣ標的配列のプライマーおよびプローブは、任意の周知の方法を用いて設計および合成される。標的捕捉ベースの精製ステップを含む好ましい実施形態において、ＩＣ標的に特異的な標的捕捉プローブは、該ＩＣが、すべてのアッセイステップにおいて意図される解析対象に用いられるのと同じ条件において処理されるように、標的捕捉ステップ内に組み入れられる。
【０１１７】
代替的なＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列
Ｓ．ａｕｒｅｕｓに特異的なリボソーム核酸配列に加えて、他のＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的核酸配列も、本明細書で開示される該リボソーム核酸配列に代用することができる。例えば、上記で言及されたｏｒｆＸ遺伝子配列はＳ．ａｕｒｅｕｓ内で高度に保存されることが公知であり、ＳＣＣｍｅｃの組込み部位であることが公知である。したがって、本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的核酸配列の代わりにＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的なｏｒｆＸ核酸配列を増幅および検出するステップを含む方法を包含することを意図する。当然ながら、これらの手順は、メチシリンに対して耐性を付与する組込み配列に近接するかまたはこれを含むｏｒｆＸの一部の増幅など、ｏｒｆＸ配列の一部のみの増幅を伴いうる。組込み接合部を超えた増幅に依拠する本発明の実施形態は、ｍｅｃＡ配列との共増幅反応において特に好ましい。このような増幅反応において得られる反応速度結果に対する閾値基準の適用により、ＭＲＳＡの同定に関する特異性を増強することができる。より具体的に述べれば、このような適用により、それがなければ（１）臨床試料中におけるＭＲＳＡの存在についての直接の指標としての挿入接合部の検出、または（２）臨床試料（例えば、鼻腔スワブ試料）中におけるＭＲＳＡの存在についての直接の指標としての挿入接合部およびｍｅｃＡ核酸配列の定性的検出から生じる偽陽性ＭＲＳＡ同定の発生率を低下させることができる。ＭＲＳＡ細菌内に含有されるｏｒｆＸ配列の一部に対する増幅、またはｏｒｆＸ接合部を超える増幅のための組成物および方法は、当業者に容易に使用可能である（例えば、米国特許第６，１５６，５０７号および同第７，４４９，２８９号を参照されたい）。
【０１１８】
臨床試料中における細菌の複合混合物を分解する方法
本明細書で説明されるリアルタイムの増幅システムを用いて得られる結果から進んで、本発明者らは、ゴールドスタンダードの微生物学法を用いてＭＲＳＡ陽性またはＭＲＳＡ陰性として類別された臨床検体（すなわち、鼻腔スワブ）を検討した。
【０１１９】
図１〜３に示された結果により、重感染試料の検出法が裏付けられた。図１は、多数の非標的細菌の存在下において少数のＭＲＳＡ細菌に由来する鋳型を用いる多重反応におけるＳ．ａｕｒｅｕｓ標的配列およびｍｅｃＡ標的配列の増幅についての結果を示す。図２は、多数のＭＳＳＡ菌の存在下において少数のＭＲＳＡ細菌に由来する鋳型を用いる多重反応におけるＳ．ａｕｒｅｕｓ標的配列およびｍｅｃＡ標的配列の増幅についての結果を示す。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ標的配列のコピー数は、図１Ａにおいて示される結果と比較した場合、図２Ａにおいて示される結果をもたらす反応において実質的により多数であったので、これに比例してより多数のＳ．ａｕｒｅｕｓ  ２３Ｓ  ｒＤＮＡ標的を有する試験の場合、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ標的に対する反応曲線は一般に、反応時のより早期においてバックグラウンドの蛍光レベルから立ち上がった。同時に、ｍｅｃＡ標的配列に対する反応曲線は一般に、反応時のより後期においてバックグラウンドレベルから立ち上がった（例えば、図２Ｂおよび２Ａにおける反応曲線を比較されたい）。別の形で述べると、ＭＲＳＡ細菌が寄与する鋳型のみを用いて実施された試験と比べて、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ標的に対するＣｔ値（すなわち、「Ｃｔ（Ｓａｕ）」）は低下し、ｍｅｃＡ標的に対するＣｔ値（すなわち、「Ｃｔ（ｍｅｃ）」）は上昇した。したがって、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ標的核酸およびｍｅｃＡ標的核酸に対して決定されるＣｔ値間の差（すなわち、ΔＣｔ＝Ｃｔ（Ｓａｕ）−Ｃｔ（ｍｅｃＡ）として計算される）は、多重増幅反応における２つの標的配列の寄与を反映した。特に、１つの標的のコピー数の相対的な増大は、その標的に対する反応曲線のより急速な立ち上がり（すなわち、より小さなＣｔ値）、および同じ多重増幅反応において第２の標的を表わす反応曲線の立ち上がり時間における対応する遅延と関連する。
【０１２０】
特に、ΔＣｔ値を用いて細菌（例えば、ＭＲＳＡ細菌およびＭＳＳＡ菌）の複合混合物を評価する方法は、例えば、多重反応における増幅供給源についての競合により、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的増幅反応とｍｅｃＡ特異的増幅反応とが互いに影響し合うことを要請しない。ＭＳＳＡおよびＭＲＳＡの両方が検査を受ける試料中に存在する場合、ＭＳＳＡに由来するＳ．ａｕｒｅｕｓ標的の増幅が増幅供給源について競合し、多重反応におけるｍｅｃＡ標的配列の増幅は遅くなる（すなわち、両方の標的が単一の反応において増幅される）。この競合の程度は増幅システムの性質により異なり、例えば、ＰＣＲにおける場合のように、実質的に存在しない可能性もある。にもかかわらず、ΔＣｔはやはり存在する。したがって、ΔＣｔは競合に依存しない。
【０１２１】
このことの帰結は、複数の理由で重大であった。まず、これにより、ＭＲＳＡ細菌およびＭＳＳＡ菌の混合物を含有する検査試料について予測される傾向が明示された。より具体的に述べると、これらの標的生物の混合物は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的増幅反応に対する反応曲線のＣｔと、ｍｅｃＡ特異的増幅反応に対する反応曲線のＣｔとの間の隔たりの増大（すなわち、ΔＣｔの大きさが増大すること）により認識することができる。ΔＣｔが上記で与えられた方程式により計算される場合、ΔＣｔ値は、ＭＲＳＡのみを含有する試料について予測されるΔＣｔ値よりもいっそう負となる。これに対し、ＭＲＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳの混合物は、純粋なＭＲＳＡ試料を用いて得られる反応曲線と比較した場合、間隔がより近接して一体となった反応曲線をもたらすことが予測される。これは、多重増幅反応におけるｍｅｃＡ鋳型数の増大により、ＭＲＳＡ対照と比べてより早期においてバックグラウンドからｍｅｃＡの反応曲線が立ち上がり、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的反応曲線が、ＭＲＳＡ対照と比べてその立ち上がり時間において遅延するからである。この場合において、上記で与えられた方程式により計算されるΔＣｔ値は、ＭＲＳＡのみを含有する試料について予測される値と比較して増大する（すなわち、いっそう正となる）。最後に、ＭＳＳＡおよびＭＲＳＡの混合物は、ごくまれに（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的鋳型とｍｅｃＡ特異的鋳型との相対数が、真正のＭＲＳＡ細菌において見出される相対数にちょうど符合する場合に）、純粋のＭＲＳＡ培養物対照に特徴的な量のみ間隔を置いたＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的反応曲線およびｍｅｃＡ特異的反応曲線をもたらすことが予測される。このような混合物について計算されるΔＣｔ値が、純粋なＭＲＳＡ試料から単離される鋳型を用いて実施される反応に特徴的なΔＣｔ値よりも大きいかまたは小さいかは予測できなかった。
【０１２２】
反応速度解析手順の目的には、（１）ＭＲＳＡによる感染の同定、（２）ＭＳＳＡによる感染の同定、（３）ＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳによる重感染から生じる偽陽性ＭＲＳＡ同定の最小化、および（４）偽陰性結果の最小化を組み入れた。好ましい手法は、試料がＭＲＳＡ陽性であることを指摘する、少なくとも１つの経験的に決定された閾値の使用に依拠する。
【０１２３】
上記の説明に基づき、ＭＲＳＡを含んだがＭＳＳＡまたはＭＲ−ＣｏＮＳを含まなかった試料は、経験的に決定された値に実質的に等しいΔＣｔ値をもたらすことが予測された。これを、図４Ａにおいて引かれた水平線によって示す。本発明者らの実験において、ΔＣｔは約−２分間に等しかった。臨床試料が、（１）ＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳの混合物、（２）ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡの混合物、（３）ＭＲＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳの混合物を含む細菌の複合混合物を表わすことは、合理的な仮定であった。これらの異なる細菌の相対数が、異なる試料を通じてある程度無作為に分布することを踏まえると、図４Ｂに示される結果が予測された。該図において示される通り、真のＭＲＳＡ陽性試料（Ｘ）は、線上にあるΔＣｔ値（すなわち、ＭＲＳＡによる単独感染を示す）、線の上方にあるΔＣｔ値（すなわち、ＭＲＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳによる重感染を示す）、および線の下方にあるΔＣｔ値（すなわち、ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡによる重感染を示す）をもたらす。同様に、ＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳによる重感染から生じる偽陽性試験（ｘ）は、線上にあるΔＣｔ値（すなわち、２つの標的核酸の相対比率が、ＭＲＳＡ細菌内において天然で見出される比率に符合する場合）、線の上方にあるΔＣｔ値（すなわち、ＭＲＳＡ細菌内において天然で見出される量と比較して相対的に過剰なｍｅｃＡ鋳型から生じる）、および線の下方にあるΔＣｔ値（すなわち、ＭＲＳＡ細菌内において天然で見出される量と比較して相対的に過剰なＳ．ａｕｒｅｕｓ鋳型から生じる）を有することが予測される。
【０１２４】
図４Ｂに示したモデルに基づく予測に反して、また、以下の実施例に示す経験的な観察によって裏付けられる通り、真の陽性結果および偽陽性結果の分布は、ΔＣｔの閾値の値に関して劇的に異なる区分を示した。より具体的に述べると、ＭＲＳＡとＭＳＳＡとの重感染ではなく、ＭＲＳＡとＭＲ−ＣｏＮＳとの重感染を同定する驚くべき傾向が見られた。これらの試験は、図４Ａ〜４Ｂにおいて引かれた水平線の上方にクラスター化した。ＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳによる重感染から生じる偽陽性は、何らかの形でクラスター化するのではなく、ΔＣｔの閾値の上方および下方において実質的に均等に分布したが、偽陽性試験は、該図に示される線の下方にやや優先的に区分されると思われた。これらの観察に基づき、ＭＲＳＡ陽性試料を指摘または判定するのに用いうる閾値の値を確立することが可能であった。したがって、本発明により、閾値の値に実質的に等しいかまたはこれを実質的に超えるΔＣｔ値をもたらす試料としてＭＲＳＡ陽性試料を同定した。
【０１２５】
ＭＲＳＡ核酸およびＭＳＳＡ核酸を検出するためのキット
本明細書で説明される方法に加えて、本発明は、本明細書で説明される方法を実施するのに必要とされる１種または複数種の試薬を含むキットにも関する。本発明を実施するのに用いられる各種の成分を含むキットは、核酸標的分子の増幅を必要とする任意の手順において用いられるように構成することができ、このようなキットは、各種の異なる末端使用者向けにカスタマイズすることができる。本発明のキットは、本発明による核酸増幅を実行するのに必要な１つまたは複数の成分を提供する。キットは、１つの特定の標的から核酸を増幅するのに適する試薬を含む場合もあり、複数の標的を増幅するのに適する試薬を含む場合もある。本発明のキットは、単一の試料中における１つまたは複数の核酸標的のリアルタイムでの検出のための試薬、例えば、上記で説明したステムループ構造を有する１種または複数種の自己ハイブリダイジングプローブをさらに提供しうる。キットは、バイアル、試験管、ウェルなど、１つまたは複数の容器を厳重な密封下で封入するように区分されうる携帯袋を含みうる。少なくとも１つのこのような容器は、本発明の増幅法を実施するのに必要な１種もしくは複数種の成分または成分の混合物を含有する。
【０１２６】
本発明の一実施形態によるキットは、例えば、１つまたは複数の容器内に、プライミングオリゴヌクレオチド、プライマーの伸長反応を終結させるターミネーティングオリゴヌクレオチド、また場合によって、伸長オリゴヌクレオチドおよび／またはキャッピングオリゴヌクレオチドを含みうる。リアルタイムの検出が用いられる場合、１つまたは複数の容器は、単一の試料中における少なくとも１つの核酸標的配列をリアルタイムで検出するための１種または複数種の試薬、例えば、上記で説明した、ステムループ構造を有する１種または複数種の自己ハイブリダイジングプローブを含みうる。別の容器は、ＰＣＲ反応もしくはＲＴ−ＰＣＲ反応を実施するための熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素の混合物（ＲＮアーゼＨ活性を伴うものであれ伴わないものであれ）、ＲＮＡポリメラーゼ、また場合によって、転写ベースの増幅反応のためのさらなる選択的なＲＮＡアーゼ酵素などの酵素試薬を含有しうる。これらの酵素は、濃縮形態または作業濃度において、通常、酵素の安定性を促進する形態において供給することができる。酵素試薬はまた、例えば、米国特許第５，８３４，２５４号においてＳｈｅｎらにより教示される凍結乾燥形態においても供給することができる。別の１つまたは複数の容器は、濃縮形態、または作業濃度における増幅試薬を含有しうる。増幅試薬は、増幅反応を実施するのに必要な１つまたは複数の成分（例えば、緩衝液、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰ、ＥＤＴＡ）、安定化剤などを含有する。該成分の一部（ＭｇＣｌ２およびｒＮＴＰ）は、残りの成分とは別に供給することができ、これにより、末端使用者は、これらの試薬を漸増して、より最適化された増幅反応を達成することができる。別の１つまたは複数の容器は、１種または複数種の標識オリゴヌクレオチドプローブを含む、増幅産物の検出のための試薬を含みうる。プローブは、多数の代替的な方法でも標識することができる（例えば、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、核タグ、生物発光標識、挿入色素、または酵素標識による）。一部の実施形態において、本発明のキットはまた、末端使用者により実施される検査増幅を検証するための増幅実験において用いうる、１つまたは複数の陽性および陰性の対照標的核酸を有する１つまたは複数の容器も含む。場合によって、上記で列挙された１種または複数種の試薬は、内部対照と組み合わせることもできる。当然ながら、単一の試験管または他の容器内において、１種または複数種のこれらの試薬を組み合わせることも可能である。本発明による使用に適する支持体（例えば、試験管、多試験管ユニット、マルチウェルプレート、マイクロ流体カートリッジなど）もまた、本発明のキットと共に供給することができる。最後に、本発明のキットは、１種または複数種の指示マニュアルを含みうる。
【０１２７】
本発明のキットは、上記の成分または本明細書の他の個所で説明される成分の事実上任意の成分を含有しうる。当業者が認める通り、本発明のキットにより供給される成分は、キットの意図される使用、および意図される末端使用者により変化する。したがって、キットは、本出願で記載される各種の機能を実施するように特に設計することができ、このようなキットの成分はこれに従って変化する。
【実施例】
【０１２８】
本発明の一般的な原理は、以下の非限定的な実施例を参照することにより、より完全に理解することができる。
【０１２９】
実施例１は、多重リアルタイム増幅アッセイを用いる、ＭＲＳＡ細菌およびＭＳＳＡ菌の検出について例示する。単一の試験管内におけるＳ．ａｕｒｅｕｓ  ２３Ｓ  ｒＤＮＡ、ｍｅｃＡ  ＤＮＡ、および非類縁の人工内部対照ＤＮＡの増幅および検出に、３つの個別の単一プライマー転写を伴う増幅アッセイを用いた。該手順における３つの核酸標的の各々は、固有の増幅オリゴヌクレオチドを用いて増幅され、固有の分子トーチを用いて検出された。以下で説明される通り、（ａ）２種の異なるメチシリン感受性コアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌（すなわち、Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓおよび表皮ブドウ球菌）、または（ｂ）ＭＳＳＡを極めて過剰に含有する試料中における少量のＭＲＳＡ細菌の検出を評価する手順を実施した。同様にまた、２種のメチシリン感受性コアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌を極めて過剰に含有する試料中における少量のＭＳＳＡ菌の検出も評価した。
【０１３０】
（実施例１）
密接な類縁生物の存在下におけるＭＲＳＡおよびＭＳＳＡの検出
検査に用いられる細菌標的を含有する試料は、以下の通りに調製した。Ｓｔｕａｒｔ培地を含有する付属の試験管内に無菌のＢＢＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ  ＳＷＡＢＳ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  および  Ｃｏｍｐａｎｙ社製）を挿入し、室温で少なくとも６時間にわたり静置し、バッチ回収条件をシミュレートした。１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）および１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる２５０μｌの試料緩衝液を含有する１．７ｍｌ  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製反応試験管内に、個々のスワブを移した。スワブアプリケーターハンドルの過剰長部分を除去して、反応試験管内にスワブを収めた。その後、試験管に施栓し、３０秒間にわたりボルテックスした。ボルテックスの直後にスワブを取り出した。次に、２本の１．７ｍｌ  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製反応試験管各々に残りの試料緩衝液８０μｌを移した。次に、３つの異なる負荷条件の１つに応じて、公知量の細菌を含有する２０μｌのアリコートを多連試験管に受け入れた。これらの条件は、（ａ）１６０コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＭＲＳＡ細菌、ならびに各々１００，０００ＣＦＵずつの表皮ブドウ球菌およびＳ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、（ｂ）１６０ＣＦＵのＭＲＳＡ細菌および１００，０００ＣＦＵのＳ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ菌）、ならびに（ｃ）１６０ＣＦＵのＭＳＳＡ菌、ならびに各々１００，０００ＣＦＵずつの表皮ブドウ球菌およびＳ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓであった。次いで、５，０００コピーの内部対照ＤＮＡを含有する１００μｌの溶解緩衝液アリコートを各試験管に受け入れた。試験管を１〜２秒間にわたりボルテックスし、１０分間にわたり室温で静置した。次いで、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．５）により作製された４０μｌの標的捕捉試薬（ＴＣＲ）アリコートと、５００μｇ／ｍｌのオリゴ（ｄＴ）磁気ビーズ（インディアナ州、インディアナポリス、Ｓｅｒａｄｙｎ社製）と、配列番号２１の３’遮断非特異的標的捕捉オリゴヌクレオチド２００ｐｍｏｌ／ｍｌとを各試験管に受け入れた。短時間にわたるボルテキシングの後、２００μｌの混合物アリコートを９６ウェルＫＦ２００プレート（マサチューセッツ州、ウォルサム、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）のウェル内に移し、その後の処理を行った。これをプレート１と名付けた。
【０１３１】
ＫＩＮＧＦＩＳＨＥＲ９６（マサチューセッツ州、ウォルサム、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）磁気粒子プロセッサーを用いて、磁気ビーズ上に非特異的に捕捉された核酸の自動洗浄を行った。まず、各々が２００μｌずつの洗浄試薬を含有する２枚のマイクロプレート（プレート２および３）を準備した。洗浄試薬は、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウムを含むＨＥＰＥＳ緩衝液であった。増幅反応を実施するための別のマイクロ滴定プレート（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製の９６ウェルプレート）（プレート４）もまた準備し、各ウェルを３０μｌずつの増幅試薬を含有する反応に用いた。当業者が熟知する通り（例えば、米国特許出願第１１／６８１，１０４号を参照されたい）、増幅試薬は、リボヌクレオチド三リン酸、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、塩、および補因子のｐＨ緩衝混合物を含んだ。増幅試薬は、プライミングオリゴヌクレオチド（配列番号１、配列番号５、および配列番号１４）、ターミネーティングオリゴヌクレオチド（配列番号３、配列番号１２、および配列番号１６）、およびプロモーターオリゴヌクレオチド（配列番号４、配列番号１３、および配列番号１７）をさらに含んだ。特に、ある手順では、配列番号６〜９の１つにより配列番号５のオリゴヌクレオチドを置換してｍｅｃＡ配列を増幅し、すぐれた結果を得た。したがって、配列番号６〜９は、単独または他の増幅オリゴヌクレオチドおよび検出オリゴヌクレオチドとの組合せにおいて、本発明による好ましいオリゴヌクレオチドを表わす。４枚のプレート（プレート１〜４）すべてを、磁気粒子プロセッサーユニット内に投入した。プレート１から核酸複合体を保持する磁気ビーズを単離し、まずプレート２内において洗浄し、プレート３へと移して再度の洗浄サイクルにかけ、最後にプレート４のウェル内に移して増幅を準備したが、これらすべてにおいて、当業者が熟知する標準的な手順を用いた。
【０１３２】
温度制御型ＭＸ３００５ｐ測定器（カリフォルニア州、ラホーヤ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、等温核酸増幅反応のリアルタイムでのモニタリングを実施した。まず、ＫＩＮＧＦＩＳＨＥＲ９６磁気粒子プロセッサーユニットからプレート４を取り出し、次いで、これを温度制御型測定器内に入れた。まず、プレートを６０℃で３分間にわたりインキュベートし、次いで、４２℃で５分間にわたりインキュベートした。次に、マイクロ滴定プレートを、４４℃に設定されたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ  ＴＨＥＲＭＯＭＩＸＥＲ  Ｒ（ニューヨーク州、ウェストベリー、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ社製）上に移した。ディスプレイサーオリゴヌクレオチド（配列番号２、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１５）および分子トーチ（配列番号１８、配列番号１９、および配列番号：２０）を含有する１０μｌの酵素試薬アリコートを各反応ウェルに受け入れた。酵素試薬は、当業者が熟知する通り（例えば、米国特許出願第１１／６８１，１０４号を参照されたい）、モロニーマウス白血病ウイルス（「ＭＭＬＶ」）逆転写酵素、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのｐＨ緩衝混合物を含んだ。接着式カバーによりプレートをシールし、１分間にわたり静かに振とうし、次いで、４２℃でインキュベートし、１６秒間ごとに３種の分子トーチからの蛍光シグナルを読み取るように設定されたリアルタイム式測定器内に移した。蛍光シグナルは、相対蛍光単位（ＲＦＵ）で測定した。単位複製配列合成量の指標として用いられる閾値ベースのＴ時間値は、基本的に、米国特許公開第２００６−０２７６９７２Ａ１号においてＬｉｇｈｔらにより開示される方法によりモニタリングされた蛍光シグナルから決定された。
【０１３３】
正当な結果に対する許容基準は、多重反応における３つの反応の少なくとも１つが、すぐ下に記載される基準を用いる陽性増幅結果をもたらすことを要請した。より具体的に述べると、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびｍｅｃＡの増幅反応に対する陰性の増幅結果は、内部対照核酸の陽性増幅が正当であると報告されることを要請した。内部対照増幅反応の成功は、他の２つの解析対象が陰性結果をもたらした場合にのみ重要であった。３つの反応すべてに対する陰性結果は、例えば、反応成分が含まれないか、または反応が強力に阻害される場合に生じうるように、増幅反応の失敗を示す。
【０１３４】
一般的に述べると、２つの条件が満たされた場合に、多重反応における解析対象の１つの存在を示す陽性の増幅結果が判定された。第１に、該解析対象の増幅反応時において測定される最小の蛍光シグナルと最大の蛍光シグナルとの間の差の大きさは、所定の閾値の値を超えていなければならない。第２に、多重反応における該解析対象について決定されるＴ時間値は、所定の範囲内において生じていなければならない。多重増幅反応における解析対象の１つについて両方の基準が満たされた場合、その解析対象の存在が判定された。
【０１３５】
陽性シグナルの基準は、多重増幅反応における３つの解析対象の各々に対して異なるように選択した。反応時間内における蛍光シグナルの範囲が５，０００を超えた場合、またＴ時間値が２０．６５分以下の場合には、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ２３Ｓ  ＤＮＡ標的が存在するものとして記録された。反応時間内における蛍光シグナルの範囲が２，５００を超えた場合、またＴ時間値が３２．８分以下の場合には、ｍｅｃＡ  ＤＮＡ標的が存在するものとして記録された。最後に、反応時間内における蛍光シグナルの範囲が５，０００を超えた場合には、内部対照が陽性であると考えられた。この解析対象に対する増幅ではばらつきが大きかったため、Ｔ時間の閾値は得られなかった。
【０１３６】
図１〜３は、リアルタイムの核酸増幅反応に由来する代表的な結果を示す。図１Ａ〜１Ｂは、高レベルのメチシリン感受性コアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌により負荷された、低レベルのＭＲＳＡ細菌を含有する試料中におけるＳ．ａｕｒｅｕｓ  ２３Ｓ  ｒＤＮＡ（パネルＡ）およびｍｅｃＡ  ＤＮＡ（パネルＢ）の単位複製配列の合成に対する時間依存的なモニタリングに由来する生の蛍光結果を示す。図２Ａ〜２Ｂは、高レベルのＭＳＳＡ菌により負荷された、低レベルのＭＲＳＡ細菌を含有する試料中におけるＳ．ａｕｒｅｕｓ  ２３Ｓ  ｒＤＮＡ（パネルＡ）およびｍｅｃＡ  ＤＮＡ（パネルＢ）の単位複製配列の合成に対する時間依存的なモニタリングに由来する生の蛍光結果を示す。図３Ａ〜３Ｂは、高レベルのメチシリン感受性コアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌により負荷された、低レベルのＭＳＳＡ菌を含有する試料中におけるＳ．ａｕｒｅｕｓ  ２３Ｓ  ｒＤＮＡ（パネルＡ）およびｍｅｃＡ  ＤＮＡ（パネルＢ）の単位複製配列の合成に対する時間依存的なモニタリングに由来する生の蛍光結果を示す。ここでもまた予測される通り、この最後のグラフセットに現れるすべての試験において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ標的は検出されたが、ｍｅｃＡ標的は検出されなかった。どの場合においても、図１〜３において表わされる増幅反応時において測定された最小の蛍光シグナルと最大の蛍光シグナルとの間の差は、許容基準を満たした。したがって、各反応により、内部対照に対する正当な陽性の増幅結果が与えられたが、内部対照結果を参照して該手順を検証する必要はなかった。表８では、試験を受けたすべての試料について得られた結果が定量化される。
【０１３７】
【表８】
0005498954.tif 000009
基本的に上記で説明した通り、多重増幅システムは、ゴールドスタンダードの微生物学法を用いてＭＲＳＡに対して陰性であることが示された臨床試料（鼻腔スワブ）のコレクションを検査するのに用いた。臨床試料は細菌の複合混合物（例えば、ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲ−ＣｏＮＳなど）を含有していたので、異なる生物に由来する２つの核酸標的（すなわち、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ２３Ｓ  ｒＤＮＡ標的およびｍｅｃＡ標的）を検出することが可能であった。結果として、試料中に存在するＭＳＳＡに由来するＳ．ａｕｒｅｕｓ  ２３Ｓ  ｒＤＮＡ標的配列を検出すること、および同じ試料中に存在するＭＲ−ＣｏＮＳ細菌に由来するｍｅｃＡ標的配列を検出することが可能であった。試料中における両方の標的の存在がＭＲＳＡの存在を示すと結論づけるならば、この場合誤りとなるであろう。したがって、重感染は、個別の標的核酸を用いる臨床試料の解析に対して難題を提示する。したがって、臨床試料を解析する場合には、偽陽性ＭＲＳＡ判定の数を抑制または無化する必要があった。
【０１３８】
以下の実施例では、別個の解析によりＭＲＳＡ陰性であることが確立された臨床試料（すなわち、鼻腔スワブ試料）を用いて得られる結果について説明する。個々の被験者から３例ずつのスワブ試料を取得した。第１のスワブをゴールドスタンダードの微生物学的検査にかけて、ＭＲＳＡ細菌の存在または不在を確立した。第２のスワブは凍結アーカイブに保存した。第３のスワブは、基本的に実施例１の下で説明した通り、試料処理にかけてＤＮＡを単離し、単離されたＤＮＡをＳ．ａｕｒｅｕｓ  ２３Ｓ  ｒＤＮＡ標的およびｍｅｃＡ標的の多重増幅のための鋳型供給源として用いた。
【０１３９】
（実施例２）
ＭＲＳＡ陰性臨床試料に対するリアルタイム解析
基本的に実施例１の下で説明した通りに、ＭＲＳＡに対して陰性の鼻腔スワブ試料５５例を多重リアルタイム増幅システムにおいて検査し、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ標的核酸およびｍｅｃＡ標的核酸の存在または不在について判定を行った。ＭＸＰＲＯ  ＱＰＣＲリアルタイム解析ソフトウェア（カリフォルニア州、ラホーヤ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、リアルタイムの反応曲線を解析し、閾値蛍光値の達成に基づき増幅指標を決定した。Ｃｔ値を決定したら、該値を平均し、ΔＣｔ値の計算に用いた。
【０１４０】
リアルタイムの増幅手順に由来する代表的な反応曲線を図５Ａ〜５Ｅに示す。すべてのパネルは、内部対照配列、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ２３Ｓ  ｒＤＮＡ配列、およびｍｅｃＡ標的配列の増幅結果をグラフで示す。基本的に実施例１の下で説明した許容基準を用いて、個別の増幅反応を陽性として記録した。図５Ａは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ核酸またはｍｅｃＡ核酸を含まなかった陰性対照試験についての結果を示す。予測される通り、内部対照シグナルのみが増幅の証拠を示した。図５Ｂは、陽性のＭＲＳＡ対照反応（すなわち、約５００ｃｆｕのＭＲＳＡ細菌を用いる）についての結果を示す。この場合、Ｓ．ａｕｒｅｕｓシグナル、ｍｅｃＡシグナル、および内部対照シグナルのすべてが増幅の証拠を示した。特に、図５Ａ〜５Ｂにおいて示される対照はまた、以下の実施例３の下に示される結果を解釈するのにも有用であった。図５Ｃは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓシグナルおよび内部対照シグナルは増幅の証拠を示したが、ｍｅｃＡシグナルは実質的に遅延し、陽性結果を記録するのに必要とされる基準が満たされなかった結果を示す。このパネルに示されるプロファイルは、ＭＲＳＡ感染に特徴的ではないであろうが、その代わり、ＭＳＳＡによる感染に特徴的であり、おそらく、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ以外のｍｅｃＡ含有細菌を少量伴う。図５Ｄは、ｍｅｃＡシグナルおよび内部対照シグナルは増幅の証拠を示したが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓは該証拠を示さなかった結果を示す。このプロファイルは、ＭＲ−ＣｏＮＳ細菌による感染に特徴的であろう。図５Ｅは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓシグナルおよびｍｅｃＡシグナルの両方が増幅の証拠を示した結果を示し、内部対照も、ある程度遅延した（例えば、多重反応における他の２つの標的配列の頑健な増幅の結果として）が陽性であった。このプロファイルは、ＭＳＳＡ菌およびＭＲ−ＣｏＮＳ細菌による重感染に特徴的であろう。公知のＭＲＳＡ陰性臨床試料を用いて実施されたすべての試験に由来する結果を表９に示す。
【０１４１】
【表９−１】
0005498954.tif 000010
【０１４２】
【表９−２】
0005498954.tif 000011
【０１４３】
【表９−３】
0005498954.tif 000012
表９に見られる結果により、これはまたＭＲＳＡ細菌についても予測されるプロファイルである、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびｍｅｃＡ両方の標的核酸に対して陽性な７例のＭＲＳＡ陰性臨床試料（すなわち、１４２４、１２３８、１３１４、３１１８、１４２７、１４１８、および３２７６）が同定された。しかし、表９にまとめられた、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびｍｅｃＡの核酸の存在のみに基づいてＭＲＳＡ陽性として同定された臨床試料は、「偽陽性」であろう。これは、表９にまとめられた結果を得るのに用いられたすべての臨床試料が、微生物学的特徴づけに基づき、ＭＲＳＡ陰性であることが確立されていたからである。
【０１４４】
７例の偽陽性試料のＣｔ値を表１０にまとめる。ΔＣｔ値が−２分間の任意の閾値カットオフを超えることを任意に要請すると、７例の偽陽性のうち４例が除去され、これにより結果が改善される。任意の閾値の選択基準を、実施例４の下に示す。
【０１４５】
【表１０】
0005498954.tif 000013
以下の実施例では、ゴールドスタンダードの微生物学的検査を用いて当初にＭＲＳＡ陽性と同定された臨床試料を用いる手順について説明する。以下において説明される手順では、鼻腔スワブ試料から核酸を単離し、次いで、単離された核酸を、上記で説明したリアルタイムの多重増幅手順において用いた。
【０１４６】
（実施例３）
ＭＲＳＡ陽性臨床試料に対するリアルタイム解析
基本的に実施例１の下で説明した通りに、ＭＲＳＡに対して陽性の鼻腔スワブ試料５０例を多重リアルタイム増幅システムにおいて検査し、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ標的核酸およびｍｅｃＡ標的核酸の存在または不在について判定を行った。反応は、２連または３連で実施した。前出の実施例下で説明した通りに、増幅指標（すなわち、Ｃｔ値）を決定した。Ｃｔ値を決定したら、該値を平均し、ΔＣｔ値の計算に用いた。
【０１４７】
これらの手順に由来する代表的な反応曲線を図６Ａ〜６Ｃに示す。図６Ａは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓシグナル、ｍｅｃＡシグナル、および内部対照シグナルのすべてが増幅の証拠を示した結果を示す。この試験について計算された平均のΔＣｔ値は、−７．７分間であった。以下で論じる通り、この大きさのΔＣｔ値は、ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡによる重感染を表わす試料と符合した。図６Ｂもまた、Ｓ．ａｕｒｅｕｓシグナル、ｍｅｃＡシグナル、および内部対照シグナルのすべてが増幅の証拠を示した結果を示す。しかし、図５Ｂにおいて示したＭＲＳＡ陽性対照試験に反して、バックグラウンドレベルからはまずｍｅｃＡシグナルが立ち上がった。結果として、この試験について計算されたΔＣｔ値は、０．８分間（すなわち、正の数）であった。この結果は、ＭＲＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳによる重感染を表わす試料と符合した。図６Ｃは、ｍｅｃＡシグナルおよび内部対照シグナルは頑健な増幅の証拠を示したが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓシグナルは陽性スコアの基準が満たされない時点まで遅延した。この結果を得るのに用いられた試料がゴールドスタンダードの微生物学的検査によりＭＲＳＡ陽性と同定されていた事実に対して、リアルタイムの増幅結果に対する反応速度解析に基づく結論は一致しなかった。より具体的に述べると、リアルタイムの反応曲線からＣｔ（Ｓａｕ）値を計算することができなかったので、該試料はＭＲＳＡ陰性と分類された。
【０１４８】
予備的な微生物学的検査によりＭＲＳＡ陽性として同定された臨床試料を用いて実施されたすべての試験に由来する結果を表１１にまとめる。表中で示される通り、微生物学的検査により当初ＭＲＳＡ陽性として同定された３例の試料（すなわち、試料３０７６、１３０１、および３０２８）では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ２３Ｓ  ｒＤＮＡ標的核酸の増幅に対する陰性結果がもたらされた。これらの試料の１つ（すなわち、３０２８）はまた、ｍｅｃＡ標的核酸の増幅に対する証拠も示さなかった。３例の不一致試料の各々を、微生物学法と分子（例えば、ＤＮＡ配列決定）法との組合せを用いる厳密な追跡解析にかけた。これらの解析に由来する結果により、元のＭＲＳＡ判定が偽陽性判定であることが確認された。これは、リアルタイムのアッセイが臨床試料中のＭＲＳＡをどの程度正確に同定し、他の検査システムにおいて発生した偽陽性結果をどの程度減少させるかを示す。該表の第５列では、残る真のＭＲＳＡ陽性試料が、リアルタイムアッセイを用いて正確に同定されたことが確認される。したがって、ＭＲＳＡ含有試料が、偽陰性として誤同定されることもなかった。３例の異なる臨床試料（すなわち試料１６３０、１２３７、および３３８７）では、決定されたＣｔ値間における隔たりが、表中に列挙された他の試験に対する場合よりも実質的に大きいリアルタイムの反応曲線がもたらされた。これらの結果は、ＭＲＳＡとＭＳＳＡとの重感染により説明することができたであろう。内部対照シグナルは、表１１において表わされるすべての試験に対して一様に陽性であり、したがって、該アッセイパラメータは示さない。上記の通り、ΔＣｔ値は、Ｃｔ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）値からＣｔ（ｍｅｃＡ）値を減じることにより計算された。
【０１４９】
【表１１−１】
0005498954.tif 000014
【０１５０】
【表１１−２】
0005498954.tif 000015
前出により、（１）Ｓ．ａｕｒｅｕｓには特異的であるがＣｏＮＳ細菌には特異的でない第１の標的（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに特異的な２３Ｓ  ｒＤＮＡ配列）、および（２）多重増幅反応においてメチシリン耐性に特異的であった第２の標的（例えば、ｍｅｃＡ標的配列）に対するリアルタイムの増幅により、どの程度ＭＲＳＡ細菌が検出されうるかについて説明した。この手法により、真のＭＲＳＡ陽性であった臨床試料（表１１を参照されたい）が１００％正確に検出され、ＭＲＳＡについて真の陰性であった一部の偽陽性試料（表１０を参照されたい）もまた検出された。これらの偽陽性は、ＭＳＳＡ菌とＭＲ−ＣｏＮＳ細菌との重感染から生じた可能性が高い。上記ではまた、リアルタイム結果の反応速度解析により、ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡの混合物、ＭＲＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳの混合物、ならびにＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳの混合物をどの程度分解しうるかを示す証拠も提示されている。以下では、偽陽性の発生率を最小化する一般的な手法が説明される。
【０１５１】
反応曲線から決定される増幅指標（例えば、Ｃｔ値）を含むリアルタイム増幅反応の正確な性質は、多くの変数に依存することが明らかである。例えば、温度および試薬濃度などの反応条件は、反応曲線のプロファイルに劇的に影響しうる。所定の反応パラメータが達成される時点を決定する曲線解析アルゴリズムが異なる場合もまた、同じ反応曲線を解析にかけたときに得られる数値は異なる。にもかかわらず、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ２３Ｓ  ｒＤＮＡ）に対する増幅指標と、メチシリン耐性マーカー（例えば、ｍｅｃＡ  ＤＮＡ）に特異的な標的に対する増幅指標とを関係づけ、この関係から閾値の値を確立しうることを本発明者らは発見した。この閾値の値は、偽陰性ＭＲＳＡ同定数が若干増加することを代償として、偽陽性ＭＲＳＡ同定の発生率を低減する点で有利であった。
【０１５２】
以下の実施例では、ＭＲＳＡ陽性臨床試料を指摘し、ＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳの混合物を含む試料から生じる偽陽性同定数を減少させるための任意閾値の選択について説明する。経験的に決定された閾値カットオフを実施例２〜３の下で得られた実験結果に適用したところ、偽陽性同定が実質的に減少した。
【０１５３】
（実施例４）
偽陽性結果を最小化する任意閾値の選択
実施例２〜３から集めた結果を図７にプロットして、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ標的核酸とｍｅｃＡ標的核酸とを含有する臨床試料を用いて得られる結果の分布に対するΔＣｔ値を視覚化した。一般的に述べると、プロットされたデータには、微生物学的検査によりＭＲＳＡ陽性と確認された複数例の臨床試料に由来する結果のほか、複数の偽陽性結果も含まれた。偽陽性結果は、ＭＳＳＡとＭＲ−ＣｏＮＳとの重感染を表わす臨床試料に起因する可能性が高かった。図７中の２枚のパネルにより示される場合、プロットには実施例３において解析された４７例の陽性試料に由来するΔＣｔ値が含まれた。特に、該実施例において検査された５０例の鼻腔スワブ試料のうち、３例は真の陰性であることが分かり、このため図７から除外された。また、プロットには、表１０にまとめた、実施例２に由来する７例の偽陽性結果も含まれる。これらの結果は、５５例のＭＲＳＡ陰性臨床試料の解析後に得られた。図７Ａは、ＭＲＳＡ陽性試料を１００％適正な形で検出した結果のプロットコレクションを示す。当然ながら、この結果のコレクションには、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ以外のメチシリン耐性菌と組み合わせたＭＳＳＡを含む重感染から生じる７例の偽陽性結果が含まれたであろう。図７Ｂは同一の結果についてのプロットを示すが、試料をＭＲＳＡ陽性として指摘する任意閾値を表わす水平線をさらに含む。この場合、該閾値の上方にあるデータ点は、ＭＲＳＡ陽性として分類することができる。当然ながら、該閾値の値は、閾値ベースの判定により組み入れられる真のＭＲＳＡ陽性数と偽陽性数との間の望ましい均衡を達成するように選択することができる。図７Ｂに示される通り、−２分間に任意閾値を確立し、この値を超えるΔＣｔ値がＭＲＳＡ陽性試料と関連することを指摘することにより、７例の偽陽性から４例が除外される一方で、４７例の真の陽性のうち４４例が捕捉された。
【０１５４】
検査試料がＭＲＳＡ核酸を含有するかどうかを評価する上述の方法に加えて、本発明は、検査試料がＭＳＳＡ菌を含有するかどうかを評価する方法にもさらに関する。より具体的に述べると、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的（例えば、２３Ｓ  ｒＤＭＡ）標的核酸およびメチシリン耐性特異的（例えば、ｍｅｃＡ）標的核酸の両方が検出されるある状況下であっても、単回の多重リアルタイム核酸増幅反応に由来する結果を解析して、該検査試料が、（１）ＭＲＳＡ、または（２）ＭＳＳＡのいずれを含有するかを評価することができる。該解析に基づき、判定が行われる。ＭＳＳＡおよびＭＲＳＡの各々が「陽性」または「陰性」の状態として判定され、結果は、相互排除的である（すなわち、試料は両方の生物に対して陰性であるか、または２種の生物の一方のみに対して陽性である）。簡単に述べると、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列に対して陽性結果が得られ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的およびメチシリン耐性標的配列についてのリアルタイムの反応曲線に対する増幅指標から決定されるΔＣｔ値が閾値の値を満たすかまたはこれを超える場合に、試料はＭＲＳＡ陽性として判定される。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列に対して陽性結果が得られ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的およびメチシリン耐性標的配列についてのリアルタイムの反応曲線に対する増幅指標から決定されるΔＣｔ値が閾値の値を満たさないかまたはこれを超えない場合に、試料はＭＳＳＡ陽性として判定される。この後者の場合は、メチシリン耐性マーカーが増幅されなかったためにΔＣｔ値が計算できない（すなわち、標的が不在である）か、またはΔＣｔ値が指摘された閾値の値未満の場合に当てはまりうる。
【０１５５】
（実施例５）
単回の多重増幅反応に由来する結果を用いるＭＲＳＡおよびＭＳＳＡの存在についての評価
閾値ベースの基準を用いると偽陽性ＭＲＳＡ判定の数をどの程度減少させうるかについて示したので、本発明者らは、検査試料がＭＳＳＡ核酸を含有するかどうかを決定する方法を包含するように、該手法を拡張した。表１２には、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的核酸配列（例えば、２３Ｓ  ｒＤＮＡ配列）およびメチシリン耐性マーカー（例えば、ｍｅｃＡ配列）を増幅および検出するリアルタイムのプロトコールを用いて検査しうる各種の個別の細菌標的核酸（第１〜４行）および２種の細菌核酸の組合せ（第５〜１０行）が記載される。該表の第２列および第３列は、任意の許容基準を用いて決定されるＳ．ａｕｒｅｕｓ標的およびｍｅｃＡ標的の存在（すなわち、「（＋）」）または不在（すなわち「（−）」）を示す予測の定性的結果を示す。この目的に有用な例示的許容基準は、実施例１の下に上記で与えられている。第４列は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ標的配列およびｍｅｃＡ標的配列に対する増幅指標を用いてΔＣｔ値を計算する任意閾値ベースの基準に対する結果を示す。この列において、「ＮＡ」は、ΔＣｔ関係を計算するのに用いられる必要な２つの増幅指標を欠いているために該基準が適用できないことを示す。「＜」および「≧」の符号はそれぞれ、ΔＣｔ値が任意の閾値カットオフ「未満」およびこれ「以上」であることを示す。この例示において、任意の閾値カットオフは、図７Ｂに示される通り、−２分間に設定された。第５列および第６列はそれぞれ、先行する３列において見られる情報に基づくＭＳＳＡ判定およびＭＲＳＡ判定を示す。これらのカラムにおいて、「陽性」とは生物が存在すると判定されることを示し、「陰性」とは生物が不在であると判定されることを示す。表１２中の項目についての詳細な説明を以下で行う。特に、表１２はまた、リアルタイムの結果を解読または解釈するための「参照表」としても用いることができる。
【０１５６】
【表１２】
0005498954.tif 000016
表１２には、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列およびメチシリン耐性標的配列に対するリアルタイムの増幅に由来する結果の解釈がまとめられている。一覧された情報を用いて、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的、メチシリン耐性標的、また好ましくは内部対照が単の増幅反応において共増幅される多重アッセイと別個に（例えば、異なる反応容器において実施された）またはこれと代替的に実施された増幅反応に由来する結果を解釈することができる。一覧された結果は、３つの標的配列（すなわち、内部対照、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的、およびメチシリン耐性標的）の少なくとも１つがリアルタイムの増幅反応において増幅されることを仮定する。
【０１５７】
表１２の第１行に示す通り、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（すなわち、ＭＳＳＡ）核酸のみを用いて実施される試験では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的に対する陽性の増幅結果と、メチシリン耐性標的に対する陰性結果とがもたらされる。メチシリン耐性標的核酸が増幅されないため、ΔＣｔ値は計算することができない。結果をこのようなパターンに統合することにより、陽性ＭＳＳＡ判定および陰性ＭＲＳＡ判定がもたらされる。
【０１５８】
表１２の第２行に示す通り、ＭＲ−ＣｏＮＳ核酸のみを用いて実施される試験では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的に対する陰性の増幅結果と、メチシリン耐性標的に対する陽性結果とがもたらされる。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的核酸が増幅されないため、ΔＣｔ値は計算することができない。結果をこのようなパターンに統合することにより、ＭＳＳＡおよびＭＲＳＡの両方に対する陰性判定がもたらされる。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的に対する陽性結果の不在下では、ＭＳＳＡおよびＭＲＳＡに対する陰性判定のみが可能となる。
【０１５９】
表１２の第３行に示す通り、ＣｏＮＳ核酸のみを用いて実施される試験では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的およびメチシリン耐性標的の両方に対する陰性の増幅結果がもたらされる。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的核酸もメチシリン耐性標的核酸も増幅されないため、ΔＣｔ値は計算することができない。結果をこのようなパターンに統合することにより、ＭＳＳＡおよびＭＲＳＡの両方に対する陰性判定がもたらされる。
【０１６０】
表１２の第４行に示す通り、ＭＲＳＡ核酸のみを用いて実施される試験では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的およびメチシリン耐性標的の両方に対する陽性の増幅結果がもたらされる。この結果の組合せは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的およびメチシリン耐性標的によるリアルタイムの反応曲線を用いて決定される増幅指標間の関係が閾値の値（例えば、所定の閾値の値）を満たすかまたはこれを超える場合に、ＭＲＳＡに対して陽性であり、ＭＳＳＡに対して陰性であると判定される。例えば、図７Ｂ中に引かれた任意の閾値線上にあるかまたはこの上方にあるΔＣｔ値をもたらした試験であれば、ＭＲＳＡ陽性判定をＭＲＳＡ陰性判定から区別する閾値を満たすかまたはこれを超えるため、ＭＲＳＡに対して陽性であり、ＭＳＳＡに対して陰性であると適正に判定されるであろう。代わって、該試験が、任意の閾値線の下方にある予測外のΔＣｔ値をもたらした場合であれば、ＭＲＳＡに対して陽性であるとは判定されず（すなわち、偽陰性判定）、またこのため、ＭＳＳＡに対して陽性であると判定される（すなわち、偽陽性判定）であろう。
【０１６１】
表１２の第５行に示す通り、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（すなわち、ＭＳＳＡ）核酸およびＭＲ−ＣｏＮＳ核酸の混合物を用いて実施される試験では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的およびメチシリン耐性標的の両方に対する陽性の増幅結果がもたらされる。ＭＲＳＡ核酸のみを用いて実施される試験の場合と同様、この結果の組合せは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的およびメチシリン耐性標的によるリアルタイムの反応曲線を用いて決定される増幅指標間の関係が閾値の値（例えば、所定の閾値の値）を満たすかまたはこれを超える場合に、ＭＲＳＡに対して陽性であり、ＭＳＳＡに対して陰性であると判定される。例えば、図７Ｂ中に引かれた任意の閾値線上にあるかまたはこの上方にあるΔＣｔ値をもたらした試験であれば、ＭＲＳＡ陽性判定をＭＲＳＡ陰性判定から区別する閾値を満たすかまたはこれを超えるため、ＭＲＳＡに対して陽性（すなわち、偽陽性判定）であり、ＭＳＳＡに対して陰性（すなわち、偽陰性判定）であると判定されるであろう。代わって、該試験が、任意の閾値線の下方にあるΔＣｔ値をもたらした場合であれば、ＭＲＳＡに対して陽性であるとは判定されず、またこのため、ＭＳＳＡに対して陽性であると適正に判定されるであろう。
【０１６２】
表１２の第６行に示す通り、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（すなわち、ＭＳＳＡ）核酸およびＣｏＮＳ核酸の混合物を用いて実施される試験では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的に対する陽性結果と、メチシリン耐性標的に対する陰性結果とがもたらされる。これにより、ＭＳＳＡに対する陽性判定およびＭＲＳＡに対する陰性判定がもたらされる。ＣｏＮＳ細菌が寄与する核酸の存在は、リアルタイムの増幅結果に影響を及ぼさない。
【０１６３】
表１２の第７行に示す通り、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（すなわち、ＭＳＳＡ）核酸およびＭＲＳＡ核酸の混合物を用いて実施される試験では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的およびメチシリン耐性標的の両方に対する陽性結果がもたらされる。ＭＲＳＡ核酸のみを用いて実施される試験の場合と同様、この結果の組合せは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的およびメチシリン耐性標的によるリアルタイムの反応曲線を用いて決定される増幅指標間の関係が閾値の値（例えば、所定の閾値の値）を満たすかまたはこれを超える場合に、ＭＲＳＡに対して陽性であり、ＭＳＳＡに対して陰性であると判定される。例えば、図７Ｂ中に引かれた任意の閾値線上にあるかまたはこの上方にあるΔＣｔ値をもたらした試験であれば、ＭＲＳＡ陽性判定をＭＲＳＡ陰性判定から区別する閾値を満たすかまたはこれを超えるため、ＭＲＳＡに対して陽性であり、ＭＳＳＡに対して陰性（すなわち、偽陰性判定）であると判定されるであろう。代わって、該試験が、任意の閾値線の下方にあるΔＣｔ値をもたらした場合であれば、ＭＲＳＡに対して陰性であると判定され（すなわち、偽陰性判定）、ＭＳＳＡに対して陽性であると判定されるであろう。
【０１６４】
表１２の第８行に示す通り、ＣｏＮＳ核酸およびＭＲ−ＣｏＮＳ核酸の混合物を用いて実施される試験では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的に対する陰性結果と、メチシリン耐性標的に対する陽性結果とがもたらされる。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的に対する陽性結果の不在下では、ＭＳＳＡおよびＭＲＳＡの両方に対する陰性判定のみが可能となる。
【０１６５】
表１２の第９行に示す通り、ＣｏＮＳ核酸およびＭＲＳＡ核酸の混合物を用いて実施される試験では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的およびメチシリン耐性標的の両方に対する陽性結果がもたらされる。ＭＲＳＡ核酸のみを用いて実施される試験の場合と同様、この結果の組合せは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的およびメチシリン耐性標的によるリアルタイムの反応曲線を用いて決定される増幅指標間の関係が閾値の値（例えば、所定の閾値の値）を満たすかまたはこれを超える場合に、ＭＲＳＡに対して陽性であり、ＭＳＳＡに対して陰性であると判定される。例えば、図７Ｂ中に引かれた任意の閾値線上にあるかまたはこの上方にあるΔＣｔ値をもたらした試験であれば、ＭＲＳＡ陽性判定をＭＲＳＡ陰性判定から区別する閾値を満たすかまたはこれを超えるため、ＭＲＳＡに対して陽性であり、ＭＳＳＡに対して陰性であると判定されるであろう。代わって、該試験が、任意の閾値線の下方にある予測外のΔＣｔ値をもたらした場合であれば、ＭＲＳＡに対して陰性であると判定され（すなわち、偽陰性判定）、ＭＳＳＡに対して陽性であると判定される（すなわち、偽陽性判定）であろう。ＣｏＮＳ細菌が寄与する核酸の存在は、リアルタイムの増幅結果に影響を及ぼさない。
【０１６６】
表１２の最終行に示す通り、ＭＲ−ＣｏＮＳ核酸およびＭＲＳＡ核酸の混合物を用いて実施される試験では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的およびメチシリン耐性標的の両方に対する陽性結果がもたらされる。ＭＲＳＡ核酸のみを用いて実施される試験の場合と同様、この結果の組合せは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的およびメチシリン耐性標的によるリアルタイムの反応曲線を用いて決定される増幅指標間の関係が閾値の値（例えば、所定の閾値の値）を満たすかまたはこれを超える場合に、ＭＲＳＡに対して陽性であり、ＭＳＳＡに対して陰性であると判定される。例えば、図７Ｂ中に引かれた任意の閾値線上にあるかまたはこの上方にあるΔＣｔ値をもたらした試験であれば、ＭＲＳＡ陽性判定をＭＲＳＡ陰性判定から区別する閾値を満たすかまたはこれを超えるため、ＭＲＳＡに対して陽性であり、ＭＳＳＡに対して陰性であると判定されるであろう。代わって、該試験が、任意の閾値線の下方にある予測外のΔＣｔ値をもたらした場合であれば、ＭＲＳＡに対して陰性であると判定され（すなわち、偽陰性判定）、ＭＳＳＡに対して陽性と判定される（すなわち、偽陽性判定）であろう。
【０１６７】
前出の議論により、単一の細菌種、またはアッセイ中で増幅されうる核酸を含有する細菌種の混合物に由来する核酸の増幅から生じる陽性判定、陰性判定、ならびに偽陽性判定および偽陰性判定の由来が明らかとなる。細菌種の混合物は、鼻腔スワブ試料などの臨床試料中に潜在的に存在する生物集団を代表した。特に、単回のみの多重増幅反応に由来する結果を解析することにより、ＭＳＳＡまたはＭＲＳＡに対する断定的判定を行いうる。アッセイによって、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（すなわち、ＭＳＳＡ）のみに存在し、ＭＲＳＡには存在しない核酸標的配列が増幅されない場合であっても、これは当てはまる。表１２に見られる情報はまた、リアルタイムの増幅反応に由来する結果を解釈するための「参照」表の創出にとっても重要である。
【０１６８】
例示的な参照表を表１３に示す。表中の第１列では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列の検出結果が与えられる。該第２列では、メチシリン耐性特異的標的配列の検出結果が与えられる。該第３列では、増幅されたＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的およびメチシリン耐性標的に対するリアルタイムの反応曲線間の関係についての選択肢が示される。これらの選択肢は、任意に決定された閾値の値未満（すなわち、「（＜）」）およびこれ以上（すなわち、「（≧）」）のΔＣｔ値により示される。最初の２列における両方の標的配列が検査を受ける試料中に存在する場合、ＭＳＳＡ状態およびＭＲＳＡ状態の判定はΔＣｔ値、また、それが該閾値とどのような形で関係するかに依存する。参照表で示される通り、閾値の値未満のΔＣｔ値は、ＭＳＳＡに対しては陽性であり、ＭＲＳＡに対しては陰性であると判定される。閾値の値を超えるΔＣｔ値は、ＭＳＳＡに対しては陰性であり、ＭＲＳＡに対しては陽性であると判定される。
【０１６９】
適切な許容基準を用いる定性形式アッセイにおいて、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的核酸およびメチシリン耐性標的核酸の両方を陽性の状態で検出し、次いで、ＭＲＳＡ陰性であり、ＭＳＳＡ陽性であると判定する（すなわち、ＭＳＳＡが２つの標的核酸配列の一方のみを保有する場合）のは、直観に反すると考えられる可能性がある。しかし、該解析手法は、臨床試料の解析との関連で上記に示した結果により裏付けられている。さらに、この手法により、ＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳによる重感染に起因するＭＲＳＡ偽陽性結果の数が最小化されたことは有利である。
【０１７０】
【表１３】
0005498954.tif 000017
特に、任意に選択されたΔＣｔの閾値カットオフの数値（すなわち、図７Ｂにおいて−２分間に引かれた水平線により示される）は、ＭＳＳＡ判定およびＭＲＳＡ判定の両方に対する％感受性および％特異性に影響を及ぼす。したがって、（１つまたは複数の）ΔＣｔ閾値カットオフに用いられる値を調整して、これらのパラメータに望ましいレベルを与えることができる。例えば、−２分間、−４分間、−６分間のいずれかまたはこれらの間の任意の値にΔＣｔ閾値カットオフを設定し、％感受性および％特異性のアッセイパラメータを調整することができる。表１３に見られる通り、これにより、閾値カットオフを用いて実験結果を解釈する手法の柔軟性が示される。
【０１７１】
前出の実施例において用いられた臨床試料コレクションは、極めて低レベルのＭＳＳＡ菌が極めて高レベルのＭＲ−ＣｏＮＳ細菌と混合される場合を含まなかった。上記で示した通り（図７Ａ〜７Ｂもまた参照されたい）、前出の実施例で用いられた臨床試料は、比較的高レベルのＭＳＳＡおよび比較的低レベルのＭＲ−ＣｏＮＳを有するＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳの混合物を優先する形で幾分偏っていると考えられた。にもかかわらず、前出の証拠および推論は、ＭＲＳＡに対して陰性であるがＭＳＳＡ（低レベルにおける）およびＭＲ−ＣｏＮＳ（高レベルにおける）の混合物に対しては陽性である試料を同定することが可能であり、これらの試料が、ＭＲＳＡを含む臨床試料を、ＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳの混合物を含む臨床試料から区別する上限を指摘するのに有用であることを示唆した。図８は、臨床試料中におけるＭＲＳＡ細菌およびＭＳＳＡ菌を同定するΔＣｔ範囲が、どのような形で上限および下限のカットオフにより定められるのかを図式的に示している。より具体的に述べると、２つの閾値間にあるΔＣｔ値は、ＭＲＳＡ判定を示すかまたはこれと符合する。これに対し、２つの閾値により画定される範囲の外にあるΔＣｔ値ならば、ＭＲＳＡを含まなかったかまたはＭＲＳＡを極めて小さな比率で含んだ感染を示すかまたはこれと関連するであろう。これらの場合をＭＲＳＡ陰性として指摘した。本明細書に示す証拠に基づくなら、示されたΔＣｔ範囲内にあるΔＣｔ値は、ＭＲ−ＣｏＮＳおよびＭＳＳＡの混合物による感染ではなく、臨床的なＭＲＳＡ感染と関連する可能性が実質的により高かった。したがって、診断法または診断アッセイとの関連において、上限閾値カットオフ値と下限閾値カットオフ値との間の範囲内にあるΔＣｔ値を、ＭＲＳＡ陽性結果として指摘または「判定」した。該ΔＣｔ範囲の外にある任意のΔＣｔ値を、ＭＲＳＡ陰性として指摘または「判定」した。下限のカットオフより下方にある任意のΔＣｔ値を、ＭＳＳＡ陽性として指摘または「判定」した。このアルゴリズムにより、すぐれた結果が達成された。
【０１７２】
実施例６は、臨床試料の広範なコレクションに対する検査に由来する結果を示し、上限および下限のカットオフ値を確立する値が、ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡの同定のための範囲を指摘することを裏付ける。
【０１７３】
（実施例６）
臨床試料の広範な検査によりΔＣｔ範囲の有用性が裏付けられる
３８７例の臨床鼻腔スワブ試料を処理して、核酸検査および標準的な微生物学的検査のためのアリコートを供給した。より具体的に述べると、まず試料スワブを１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）および１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる試料緩衝液のアリコートと組み合わせ、次いで、ボルテックスして付着物質を放出させた。後続の核酸検査のために液相を単離した後、スワブにより寒天プレートのコレクション上に画線を引いて、これにより、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、ＭＲＳＡ、およびコアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓを同定した。この微生物学的検査に由来する結果を用いて、該臨床試料を、（１）ＭＲ−ＣｏＮＳのみ、（２）ＭＲＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳの混合物、（３）ＭＲＳＡのみ、（４）ＭＳＳＡ、（５）ＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳによる重感染、ならびに（６）陰性試料の６つの類型の１つであると判定した。
【０１７４】
核酸の増幅およびモニタリングの手順は、基本的に上記の通りに実行した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的標的配列、メチシリン耐性マーカー、および内部対照の捕捉、増幅、および検出に用いられるオリゴヌクレオチドは、配列番号５のｍｅｃＡプライマーに対する配列番号９のプライマーによる置換を除き、実施例１の下で説明した通りであった。前段で説明した液相のアリコートを用いてゲノムＤＮＡを単離し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける核酸増幅反応のための鋳型供給源として用いた。基本的に前記で説明した通り、多重増幅反応で共増幅された３つの解析対象の各々に対する許容基準もまた、良好な増幅結果を確認するのに用いた。
【０１７５】
図９は、類別された臨床試料に対する核酸検査に由来する結果を示す。水平軸は、微生物学的検査により同定される臨床試料の異なる群を示す。垂直軸は、＋５〜−５に広がるΔＣｔ値を示す。図中におけるデータ点として現れるには、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ標的配列およびメチシリン耐性マーカーのいずれもが、共増幅反応において増幅されていなければならない。下限閾値カットオフ値は、約−１．４分間に引かれた水平線として示される。この線の位置は、核酸検査結果と、微生物学的判定に由来する結果との間における一致を最大化するように選択した。上限閾値カットオフ値は、約＋０．４分間に引かれた水平線として示される。下限閾値カットオフ値から上限閾値カットオフ値へと広がる範囲により、臨床試料がＭＲＳＡを含有することを確立、指摘、または「判定」するのに有用なΔＣｔ範囲が指摘された。より具体的に述べると、上限閾値カットオフ値と下限閾値カットオフ値との間にあるΔＣｔ値を与える形で、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ標的配列およびメチシリン耐性マーカーを共増幅するための鋳型として用いられうるゲノムＤＮＡをもたらす臨床試料ならば、ＭＲＳＡを含有するものとして同定、指摘、または「判定」されるであろう。上限閾値カットオフ値と下限閾値カットオフ値との間の範囲の外にあるΔＣｔ値を与える形で、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ標的配列およびメチシリン耐性マーカーを共増幅するための鋳型として用いられうるゲノムＤＮＡをもたらす臨床試料ならば、ＭＲＳＡを含有するものとしては同定されないであろう。代わって、特に、ΔＣｔ値が、下限閾値カットオフ値の下方の、ＭＳＳＡの相対レベルが高いと予測されるプロット領域（図８を参照されたい）にあった場合、これらの試験は、ＭＳＳＡを含有するものとして同定されるであろう。図９を検討すると、ＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳの混合物を表わす臨床試料により、ＭＲＳＡを同定するΔＣｔ範囲内にある一部のデータ点が与えられたことが明らかとなるが、共増幅反応におけるＳ．ａｕｒｅｕｓ標的配列およびメチシリン耐性マーカー両方の存在を定性的に検出することのみによりＭＲＳＡの存在を判定した代替的な手順と比べて、偽陽性ＭＲＳＡ判定の数を減少させる点で、ΔＣｔ範囲の使用は有利であったことを理解されたい。この前者の方法が用いられたとすると、図７Ａ〜７Ｂおよび９に示されるすべてのデータ点はＭＲＳＡであると判定されるであろうし、これは明らかに不正確である。
【０１７６】
最後に、図９におけるデータ点の分布により、臨床試料の一部が、予測外の反応速度（すなわち、ΔＣｔ）プロファイルをもたらすことが示される。例えば、「ＭＲ−ＣｏＮＳのみ」であるものとして分類された６３例の臨床試料のうち、それらの試料の少数が、ＭＲＳＡ判定のためのΔＣｔ範囲の外に位置し、また、上限閾値カットオフ値の上方に位置するΔＣｔ値を最終的にもたらした。図８に図式的に示した通り、該プロットの上方部分は、極めて低レベルのＭＳＳＡ（すなわち、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ標的配列の供給源）と組み合わされた、極めて高レベルのＭＲ−ＣｏＮＳ（すなわち、メチシリン耐性マーカー配列の供給源）に対する共増幅が予測される。図９の「ＭＲ−ＣｏＮＳのみ」の類型内のデータ点を最終的にもたらす試料中におけるＭＳＳＡレベルは極めて低かったため、微生物学的検査によって検出されなかった可能性がある。同様に、微生物学的検査により「ＭＳＳＡ」として同定された試料は、実際に含有するＭＲ−ＣｏＮＳが極めて低レベルであったためこれらは看過されたが、核酸増幅アッセイでは検出された可能性がある。
【図１Ａ】
0005498954.tif 000018
【図１Ｂ】
0005498954.tif 000019
【図２Ａ】
0005498954.tif 000020
【図２Ｂ】
0005498954.tif 000021
【図３Ａ】
0005498954.tif 000022
【図３Ｂ】
0005498954.tif 000023
【図４】
0005498954.tif 000024
【図５Ａ】
0005498954.tif 000025
【図５Ｂ】
0005498954.tif 000026
【図５Ｃ】
0005498954.tif 000027
【図５Ｄ】
0005498954.tif 000028
【図５Ｅ】
0005498954.tif 000029
【図６Ａ】
0005498954.tif 000030
【図６Ｂ】
0005498954.tif 000031
【図６Ｃ】
0005498954.tif 000032
【図７Ａ】
0005498954.tif 000033
【図７Ｂ】
0005498954.tif 000034
【図８】
0005498954.tif 000035
【図９】
0005498954.tif 000036
【配列表】
0005498954000001.app