(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶塩である、式（Ｉ）：
【化２】
0005394238.tif 000019
の化合物のエシレート塩。
【請求項２】
６．２、９．２、１２．３、１５．０、１７．２、および２０．６度２θに特性ピークを含むＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターンを示す結晶多型である、請求項１に記載のエシレート塩。
【請求項３】
前記塩は、３．６、６．４、７．１、１２．３、１４．１、および１７．１度２θに特性ピークを含むＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターンを示す結晶多型である、請求項１に記載のエシレート塩。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の塩、および薬剤として許容可能な担体、賦形剤、または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項５】
薬剤として使用するための請求項１〜３のいずれかに記載の塩。
【請求項６】
対象において鎮静または催眠を生成するための薬剤の製造における、鎮静性の量または催眠性の量の請求項１〜３のいずれかに記載の塩の使用。
【請求項７】
対象において不安緩解を生成するための薬剤の製造における、不安緩解性の量の請求項１〜３のいずれかに記載の塩の使用。
【請求項８】
対象において筋弛緩を生成するための薬剤の製造における、筋弛緩性の量の請求項１〜３のいずれかに記載の塩の使用。
【請求項９】
対象のけいれんを処置するための薬剤の製造における、鎮痙性の量の請求項１〜３のいずれかに記載の塩の使用。
【請求項１０】
請求項１に記載の塩を作製する方法であって、式（Ｉ）の化合物の遊離塩基をエタンスルホン酸と反応させる工程を包含する、方法。
【請求項１１】
溶液において式（Ｉ）の化合物の遊離塩基をエタンスルホン酸と接触させて前記エシレート塩の沈殿物を形成する工程を包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記沈殿物を単離する工程をさらに包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記遊離塩基は、トルエンまたは酢酸エチルに溶解される、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記エタンスルホン酸は、エタノールに溶解される、請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
請求項２に記載の塩を調製する請求項１１に記載の方法であって、トルエン、エタノール、酢酸エチル、ＭｔＢＥ、ＤＣＭ、アセトン、酢酸イソプロピル、ギ酸エチル、またはメタノール中の式（Ｉ）の化合物の遊離塩基の溶液をエタノール中のエタンスルホン酸の溶液と接触させて該塩の沈殿物を形成する工程を包含する、方法。
【請求項１６】
請求項３に記載の塩を調製する請求項１１に記載の方法であって、請求項２に記載の塩をＤＣＭまたはＤＣＭ水溶液において室温より高い温度でスラリーにして溶液を生成する工程、および該溶液を蒸発乾固する工程を包含する、方法。
【請求項１７】
請求項１〜３のいずれかに記載の塩を調製する方法であって、式（Ｉ）の化合物のエシレートを溶媒から、または溶媒／貧溶媒混合物もしくは溶媒／共溶媒混合物から結晶化する工程を包含する、方法。
【請求項１８】
対象において鎮静または催眠を生成するための組成物であって、請求項１〜３のいずれかに記載の塩を鎮静性の有効量または催眠性の有効量で含む、組成物。
【請求項１９】
対象において不安緩解を生成するための組成物であって、請求項１〜３のいずれかに記載の塩を不安緩解性の有効量で含む、組成物。
【請求項２０】
対象において筋弛緩を生成するための組成物であって、請求項１〜３のいずれかに記載の塩を筋弛緩性の有効量で含む、組成物。
【請求項２１】
対象のけいれんを処置するための組成物であって、請求項１〜３のいずれかに記載の塩を鎮痙性の有効量で含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、短時間作用型ベンゾジアゼピンの塩、および、特に、鎮静もしくは催眠、不安緩解、筋弛緩、または鎮痙を目的としたこの塩の薬剤としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１には、カルボン酸エステル部分を含み、非特異的組織エステラーゼにより不活性化される短時間作用型ベンゾジアゼピンが記載されている。このベンゾジアゼピンの特徴は、除去機構が器官に依存しないことであり、薬力学的プロフィールの予測および再現が容易である。この化合物は、鎮静−催眠、不安緩解、筋弛緩、および鎮痙の目的を含む治療目的に適している。この化合物は、以下の臨床設定での静脈内投与に有用な短時間作用型ＣＮＳ抑制剤である：周術期の出来事に対する術前鎮静、不安緩解、および健忘のための使用；短時間の診断、手術、または内視鏡的処置時の意識下鎮静；他の麻酔薬または鎮痛薬の投与前および／または投与時に全身麻酔の誘導および維持のための成分として；ＩＣＵにおける鎮静。
【０００３】
特許文献１が開示する化合物の１つ（実施例Ｉｃ−８、３６ページ）は、下記式（Ｉ）に示すメチル３−［（４Ｓ）−８−ブロモ−１−メチル−６−（２−ピリジニル）−４Ｈ−イミダゾール［１，２−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］プロパノアートである。
【０００４】
【化１】
0005394238.tif 000002
式（Ｉ）の遊離塩基は５℃で保存すると安定するが、４０℃／７５％相対湿度（開放）で保存した試料は潮解し、色が黄色からオレンジ色になり、最初と比べて含有量の減少が顕著になることが観察される（下記の実施例１参照）。
【０００５】
現在では、意外なことに、式（Ｉ）の化合物は、様々な薬剤として許容可能な溶媒から容易に単離されるとともに、良好な熱安定性、低吸湿性、および高水溶解度を示す高結晶質のモノエシレート（エタンスルホン酸）塩を形成することが分かっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】欧州特許第１，１８３，２４３号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、式（Ｉ）の化合物のエシレート（ｅｓｙｌａｔｅ）塩が提供される。この塩は結晶塩であることが好ましい。エシレート塩の多型形態の調製および特性化は、下記の実施例で説明する。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
式（Ｉ）：
【化２】
0005394238.tif 000003
の化合物のエシレート塩。
（項目２）
結晶塩である、項目１に記載の塩。
（項目３）
約６．２、９．２、１２．３、１５．０、１７．２、および２０．６度２θに特性ピークを含むＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターンを示す結晶多型である、項目２に記載のエシレート塩。
（項目４）
前記塩は、約３．６、６．４、７．１、１２．３、１４．１、および１７．１度２θに特性ピークを含むＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターンを示す結晶多型である、項目２に記載のエシレート塩。
（項目５）
項目１〜４のいずれかに記載の塩、および薬剤として許容可能な担体、賦形剤、または希釈剤を含む医薬組成物。
（項目６）
薬剤として使用するための項目１〜４のいずれかに記載の塩。
（項目７）
対象において鎮静または催眠を生成するための薬剤の製造における、鎮静性の量または催眠性の量の項目１〜４のいずれかに記載の塩の使用。
（項目８）
対象において不安緩解を生成するための薬剤の製造における、不安緩解性の量の項目１〜４のいずれかに記載の塩の使用。
（項目９）
対象において筋弛緩を生成するための薬剤の製造における、筋弛緩性の量の項目１〜４のいずれかに記載の塩の使用。
（項目１０）
対象のけいれんを処置するための薬剤の製造における、鎮痙性の量の項目１〜４のいずれかに記載の塩の使用。
（項目１１）
項目１に記載の塩を作製する方法であって、式（Ｉ）の化合物の遊離塩基をエタンスルホン酸と反応させる工程を包含する、方法。
（項目１２）
溶液において式（Ｉ）の化合物の遊離塩基をエタンスルホン酸と接触させて前記エシレート塩の沈殿物を形成する工程を包含する、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記沈殿物を単離する工程をさらに包含する、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記遊離塩基は、トルエンまたは酢酸エチルに溶解される、項目１２または１３に記載の方法。
（項目１５）
前記エタンスルホン酸は、エタノールに溶解される、項目１２〜１４のいずれかに記載の方法。
（項目１６）
項目３に記載の塩を調製する項目１２に記載の方法であって、トルエン、エタノール、酢酸エチル（ｅｔｈｙｌｅ  ａｃｅｔａｔｅ）、ＭｔＢＥ、ＤＣＭ、アセトン、酢酸イソプロピル、ギ酸エチル、またはメタノール中の式（Ｉ）の化合物の遊離塩基の溶液をエタノール中のエタンスルホン酸の溶液と接触させて該塩の沈殿物を形成する工程を包含する、方法。
（項目１７）
項目４に記載の塩を調製する項目１２に記載の方法であって、項目３に記載の塩をＤＣＭまたはＤＣＭ水溶液において室温より高い温度でスラリーにして溶液を生成する工程、および該溶液を蒸発乾固する工程を包含する、方法。
（項目１８）
項目２〜４のいずれかに記載の塩を調製する方法であって、式（Ｉ）の化合物のエシレートを溶媒から、または溶媒／貧溶媒混合物もしくは溶媒／共溶媒混合物から結晶化する工程を包含する、方法。
（項目１９）
対象において鎮静または催眠を生成するための方法であって、項目１〜４のいずれかに記載の塩を鎮静性の有効量または催眠性の有効量で該対象に投与する工程を包含する、方法。
（項目２０）
対象において不安緩解を生成するための方法であって、項目１〜４のいずれかに記載の塩を不安緩解性の有効量で該対象に投与する工程を包含する、方法。
（項目２１）
対象において筋弛緩を生成するための方法であって、項目１〜４のいずれかに記載の塩を筋弛緩性の有効量で該対象に投与する工程を包含する、方法。
（項目２２）
対象のけいれんを処置するための方法であって、項目１〜４のいずれかに記載の塩を鎮痙性の有効量で該対象に投与する工程を包含する、方法。
【０００８】
本発明によれば、約６．２、９．２、１２．３、１５．０、１７．２、または２０．６度２θに特性ピークを含むＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターンを示す式（Ｉ）の化合物のエシレート塩（本明細書ではエシレート形態１と示す）の結晶多型も提供される。
【０００９】
エシレート形態１結晶多型は、約６．２、９．２、１２．３、１５．０、１７．２、および２０．６度２θに特性ピークを含むＸＲＰＤパターンを示すことが好ましい。
【００１０】
エシレート形態１結晶多型は、６．１７（１９．３０）、９．２１（２０．５０）、１２．２８（１６．４０）、１４．９７（２３．４０）、１７．１８（５２．８０）、２０．６３（１００．００）［角度２θ°（相対強度パーセント）］に特性ピークを含むＸＲＰＤパターンを示すことがより好ましい。
【００１１】
エシレート形態１結晶多型は、１９５〜２０５℃、好ましくは、約２０１〜２０２℃の範囲の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）開始溶解温度を有することが好ましい。
【００１２】
本発明によれば、約３．６、６．４、７．１、１２．３、１４．１、または１７．１度２θに特性ピークを含むＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターンを示す式（Ｉ）の化合物のエシレート塩（本明細書ではエシレート形態２として示す）の結晶多型がさらに提供される。
【００１３】
エシレート形態２結晶多型は、約３．６、６．４、７．１、１２．３、１４．１、および１７．１度２θに特性ピークを含むＸＲＰＤパターンを示すことが好ましい。
【００１４】
上記結晶多型は、３．５７（１５．６０）、６．４２（２１．１０）、７．１３（５８．３０）、１２．２９（５１．５０）、１４．１０（５８．９０）、１７．１３（６８．００）［角度２θ°（相対強度パーセント）］に特性ピークを含むＸＲＰＤパターンを示すことがより好ましい。
【００１５】
エシレート形態２結晶多型は、１８５〜１９５℃、好ましくは、約１９０〜１９１℃の範囲の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）開始溶解温度を有することが好ましい。
【００１６】
形成、収率、純度、ならびに化学的および固体安定のロバスト性に基づくと、好ましい塩はエシレート形態１である。
【００１７】
本発明によれば、式（Ｉ）の化合物のエシレート塩を作製する方法であって、式（Ｉ）の化合物の遊離塩基をエタンスルホン酸と反応させる工程を含む方法も提供される。
【００１８】
また、本発明によれば、上記発明の塩を作製する方法であって、溶液において式（Ｉ）の化合物の遊離塩基をエタンスルホン酸に接触させ、それぞれのエシレート塩の沈殿物を形成する工程を含む方法が提供される。この方法は、沈殿物を単離する工程をさらに含むことが好ましい。
【００１９】
遊離塩基は、トルエン、エタノール、酢酸エチル、ＭｔＢＥ、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、酢酸イソプロピル、ギ酸エチル、メタノール、またはアセトンに溶解することが好ましい。遊離塩基は、トルエンまたは酢酸エチルに溶解することがより好ましい。エタンスルホン酸は、エタノールに溶解することが好ましい。
【００２０】
エシレート形態１は、式（Ｉ）の化合物の遊離塩基のトルエン、エタノール、酢酸エチル、ＭｔＢＥ、ＤＣＭ、アセトン、酢酸イソプロピル、ギ酸エチル、またはメタノール溶液をエタノール中のエタンスルホン酸の溶液に接触させて上記塩の沈殿物を形成することによって調製してもよい。
【００２１】
本発明によれば、上記方法で得ることが可能な式（Ｉ）の化合物のエシレート塩も提供される。
【００２２】
エシレート形態２は、エシレート形態１をＤＣＭまたはＤＣＭ水溶液（好ましくは、２．５％ＤＣＭ水溶液）において室温より高い温度（好ましくは、６０℃）でスラリーにして溶液を生成し、その溶液を蒸発乾固することによって調製してもよい。
【００２３】
本発明によれば、上記方法で得ることができる式（Ｉ）の化合物のエシレート塩も提供される。
【００２４】
本発明の塩はまた、適切な溶媒から、または適切な溶媒／貧溶媒（ａｎｔｉ−ｓｏｌｖｅｎｔ）もしくは溶媒／共溶媒混合物から式（Ｉ）の化合物のエシレートを結晶化することによって調製してもよい。適切であれば、この溶液または混合物を冷却および／または蒸発させて結晶化を行ってもよい。
【００２５】
エシレート形態１は、エタノールから、またはトルエン／エタノール、酢酸エチル／エタノール、ＭｔＢＥ／エタノール、ＤＣＭ／エタノール、アセトン／エタノール、酢酸イソプロピル／エタノール、ギ酸エチル／エタノール、メタノール／エタノール、もしくはエタノール／水から結晶化してもよい。
【００２６】
エシレート形態２は、ＤＣＭまたはＤＣＭ水溶液中のエシレート形態１の溶液から結晶化してもよい（エシレート形態１は、熱溶媒、適切には、約６０℃に溶解することが好ましい）。
【００２７】
本発明によれば、上記方法のいずれかで得ることが可能な式（Ｉ）の化合物のエシレート塩も提供される。
【００２８】
本発明の塩を調製する方法は、下記の実施例でより詳細に説明する。
【００２９】
本発明の塩は、特に、鎮静もしくは催眠、不安緩解、筋弛緩、または鎮痙を目的とした薬剤として使用することができる。
【００３０】
本発明の塩をバルク活性薬品として投与することは可能であるが、医薬組成物の形態で薬剤として許容可能な担体、賦形剤、または希釈剤とともに提供することが好ましい。担体、賦形剤、または希釈剤は、当然ながら、当該組成物の他の成分と適合するという意味において許容可能である必要があり、服用者に有害であってはならない。
【００３１】
それゆえ、本発明は、上記発明の塩、および薬剤として許容可能な担体、賦形剤、または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
【００３２】
本発明の医薬組成物は、経口、直腸、局所、口腔（例えば、舌下）、および非経口（例えば、皮下、筋内、皮内、または静脈内）投与に適したものを含む。
【００３３】
本発明の塩は、例えば、溶液の静脈内または筋内注射による非経口投与用の医薬組成物の形態で提供されることが好ましい。医薬組成物が非経口投与用である場合、この組成物は、水溶液もしくは非水溶液、または液体混合物（菌静剤、抗酸化剤、緩衝剤、または他の薬剤として許容可能な添加剤を含み得る）であってもよい。
【００３４】
本発明の塩の好ましい剤形は、ｐＨ２〜４の酸性水媒体、またはシクロデキストリン（ＣＤ）の水溶液である。これらの剤形に使用可能なシクロデキストリンは、ＣｙＤｅｘ，Ｉｎｃ．よりＣａｐｔｉｓｏｌの商品名で販売されるβ−ＣＤ、詳細には、ＳＢＥ７−β−ＣＤの陰イオン的に帯電したスルホブチルエーテル（ＳＢＥ）誘導体（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１４（１），１−１０４（１９９７））、またはヒドロキシプロピルＣＤのいずれかである。
【００３５】
本発明の塩のさらに好ましい剤形は、当該塩の他に以下の薬剤の少なくとも１つを含む凍結乾燥製剤である：アスコルビン酸、クエン酸、マレイン酸、リン酸、グリシン、塩酸グリシン、コハク酸、または酒石酸。これらの薬剤は、緩衝剤、ケーキング剤、または可視化剤に有用であると考えられる。上記製剤に塩化ナトリウム、マンニトール、ポリビニルピロリドン、または他の成分を含むことが有利な場合もある。
【００３６】
好ましい調合法（すなわち、酸緩衝剤またはＣＤ系）は、特定の塩の物理化学的特性（例えば、水溶解度、ｐＫａ等）に依存し得る。代替的には、上記塩は、（注射のために）水で再構成する凍結乾燥固体、またはデキストロースもしくは食塩水として用意してもよい。そのような製剤は、通常、アンプルまたは使い捨て注射器具等の単位投与形態として用意される。これらはまた、適切な用量を取り出すことが可能なボトル等の複数回投与形態として用意してもよい。そのような製剤の全ては無菌である必要がある。
【００３７】
本発明によれば、被験者を鎮静化または催眠する方法であって、上記発明の塩を鎮静性の有効量または催眠性の有効量で被験者に投与する工程を含む方法が提供される。
【００３８】
本発明によれば、被験者の不安を緩解する方法であって、上記発明の塩を不安緩解性の有効量で被験者に投与する工程を含む方法も提供される。
【００３９】
本発明によれば、被験者の筋肉を弛緩する方法であって、上記発明の塩を筋弛緩に効果的な量で被験者に投与する工程を含む方法がさらに提供される。
【００４０】
本発明によれば、被験者のけいれんを処置する方法であって、上記発明の塩を鎮痙に効果的な量で被験者に投与する工程を含む方法がさらに提供される。
【００４１】
本発明によれば、被験者を鎮静化または催眠する薬剤の製造における上記発明の塩の鎮静性の量または催眠性の量での使用も提供される。
【００４２】
本発明によれば、被験者を鎮静化または催眠する上記発明の塩も提供される。
【００４３】
本発明によれば、被験者の不安を緩解する薬剤の製造における上記発明の塩の不安緩解性の量での使用も提供される。
【００４４】
本発明によれば、被験者の不安を緩解する上記発明の塩も提供される。
【００４５】
本発明によれば、被験者の筋肉を弛緩する薬剤の製造における上記発明の塩の筋弛緩性の量での使用がさらに提供される。
【００４６】
本発明によれば、被験者の筋肉を弛緩する上記発明の塩がさらに提供される。
【００４７】
本発明によれば、被験者のけいれんを処置する薬剤の製造における上記発明の塩の鎮痙性の量での使用がさらに提供される。
【００４８】
本発明によれば、被験者のけいれんを治療する上記発明の塩がさらに提供される。
【００４９】
被験者としては哺乳動物が適しており、ヒトであることが好ましい。
【００５０】
ヒトに対する投与に適した非経口医薬品は、本発明の塩の溶液を０．１〜２０ｍｇ／ｍｌ含有するか、または複数回投与バイアル用にその数倍含有することが好ましい。
【００５１】
静脈内投与は、ボーラス注入、または、より適切には、持続注入の形態を取るようにすることができる。各被験者に対する投与量は異なり得るが、哺乳動物の鎮静化または催眠に適した本発明の塩の静脈内量または投与量は、体重１ｋｇにつき０．０１〜５．０ｍｇ、より詳細には、体重１ｋｇにつき０．０２〜０．５ｍｇであり、これは、活性成分である塩の質量に基づく。哺乳動物の不安を緩解するために適した本発明の塩の静脈内量または投与量は、体重１ｋｇにつき０．０１〜５．０ｍｇ、より詳細には、体重１ｋｇにつき０．０２〜０．５ｍｇであり、これは、活性成分である塩の質量に基づく。哺乳動物の筋肉を弛緩するために適した本発明の塩の静脈内量または投与量は、体重１ｋｇにつき０．０１〜５．０ｍｇ、より詳細には、体重１ｋｇにつき０．０２〜０．５ｍｇであり、これは、活性成分である塩の質量に基づく。哺乳動物のけいれんの治療に適した本発明の塩の静脈内量または投与量は、体重１ｋｇにつき０．０１〜５．０ｍｇ、より詳細には、体重１ｋｇにつき０．０２〜０．５ｍｇであり、これは、活性成分である塩の質量に基づく。
【００５２】
本発明の塩は、以下の臨床設定での静脈内投与に有用な短時間作用型ＣＮＳ抑制剤である：周術期の出来事に対する術前鎮静、不安緩解、および健忘のための使用；短時間の診断、手術、または内視鏡的処置時の意識下鎮静；他の麻酔薬または鎮痛薬の投与前および／または投与時に全身麻酔の誘導および維持のための成分として；ＩＣＵにおける鎮静。
【００５３】
下記の実施例において添付の図面を参照しながら本発明の好適な実施態様を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】式（Ｉ）の化合物の含有量（初期量に対する％）対保存温度のグラフを示す。
【図２】Ｔ０およびＴ４でのＬＪＣ−０３９−０３４−１（エシレート塩）のクロマトグラフを示す（表１０の結果に対応する）。
【図３】４週間安定性試験の前後のＬＪＣ−０３９−０３４−１（エシレート塩）を比較するＸＲＰＤを示す。
【図４】新形態のエシレートのＸＲＰＤオーバーレイを示す。
【図５】ＤＣＭで生成したエシレートおよびＤＣＭでスラリーにしたエシレートのＸＲＰＤオーバーレイを示す。
【図６Ａ】エシレート形態１の結果を示す：Ａ）１００ｍｇバッチＬＪＣ−０３９−０３４−１のＸＲＰＤ。
【図６Ｂ】エシレート形態１の結果を示す；Ｂ）１００ｍｇバッチＬＪＣ−０３９−０３４−１のＤＳＣ。
【図６Ｃ】エシレート形態１の結果を示す；Ｃ）１００ｍｇバッチＬＪＣ−０３９−０３４−１のＴＧＡ。
【図６Ｄ】エシレート形態１の結果を示す；Ｄ）１００ｍｇスケールバッチＬＪＣ−０３９−０３４−１の１Ｈ  ＮＭＲ。
【図６Ｅ】エシレート形態１の結果を示す；Ｅ）１００ｍｇバッチＬＪＣ−０３９−０３４−１のＧＶＳ。
【図６Ｆ】エシレート形態１の結果を示す；Ｆ）１００ｍｇバッチＬＪＣ−０３９−０３４−１のＧＶＳ後のＸＲＰＤ。
【図６Ｇ】エシレート形態１の結果を示す；Ｇ）ＬＪＣ−０３９−０３４−１の４０℃／７５％ＲＨでの安定性試験後のＸＲＰＤ。
【図６Ｈ】エシレート形態１の結果を示す；Ｈ）１００ｍｇバッチＬＪＣ−０３９−０３４−１のＶＴ  ＸＲＰＤ。
【図６Ｉ】エシレート形態１の結果を示す；Ｉ）１００ｍｇバッチＬＪＣ−０３９−０３４−１の偏光顕微鏡検査。
【図７Ａ】エシレート形態２の結果を示す：Ａ）ＬＪＣ−０３９−０７９−１のＸＲＰＤ。
【図７Ｂ】エシレート形態２の結果を示す：Ｂ）ＬＪＣ−０３９−０７９−１のＤＳＣ。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
（実施例１）
式（Ｉ）の化合物の固体安定性試験
方法／手法  正確に計量した式（Ｉ）の化合物の２ｍｇの試料を４ｍＬ透明ガラスねじ口バイアルに入れた。試料を最初にテストしてから５℃／周囲相対湿度（ＡＭＲＨ）（密閉）、３０℃／６０％ＲＨ（密閉）、４０℃／７５％ＲＨ（開放）、および６０℃／ＡＭＲＨ（密閉）で保存し、３４日後にテストした。
【００５６】
試料の外観を目視検査した。式（Ｉ）の化合物の含有量の値を表１のＨＰＬＣ法で判定した。式（Ｉ）の化合物の標準的な試料（Ｂａｔｃｈ  Ｕ１２４３８／７９／１）に対する重量％／重量（％ｗ／ｗ）の値を測定した。式（Ｉ）の化合物のピーク面積を総ピーク面積で割って面積％の値を求めた。
【００５７】
【表１】
0005394238.tif 000004
結果
外観  表２は、外観についての結果を示す。
【００５８】
【表２】
0005394238.tif 000005
式（Ｉ）の化合物の含有量（％ｗ／ｗ）  ％ｗ／ｗ含有量の値（表３参照）は、ばらつきが非常に大きく、初期値と５℃／ＡＭＲＨ（密閉）、３０℃／６０％ＲＨ（密閉）、または４０℃／７５％ＲＨ（開放）での３４日後に測定した値の誤差を検出できないことを示す。６０℃／ＡＭＲＨ（密閉）で保存した試料の３４日後に測定した平均％ｗ／ｗは、初期値から１０％ｗ／ｗの減少を示す。
【００５９】
式（Ｉ）の化合物の含有量（％面積）  式（Ｉ）の化合物の面積％含有量（表３および図１参照）は、５℃／ＡＭＲＨ（密閉）で保存した３４日後には有意な変化を示していないが、３０℃／６０％ＲＨ（密閉）、４０℃／７５％ＲＨ（開放）、または６０℃／ＡＭＲＨ（密閉）の試料では保存温度の上昇とともに徐々に減少している。主要な分解ピークは、ＲＲＴ０．６８、０．８７、およびＲＲＴ０．９０で観察されるが、最初の時点（２３個のピーク）でも相対的に複雑なクロマトグラムは、多数の新たな小分解ピーク（small degradent peaks）（例えば、３０℃／６０％ＲＨ（密閉）では７個のピーク；６０℃／ＡＭＲＨ（密閉）では１３〜２０個のピーク）も示している。これらの観察結果は、複数の分解経路を示唆している。ＲＲＴ０．６８の分解生成物（ｄｅｇｒａｄａｎｔ）は、暫定的にエステル加水分解生成物（式（Ｉ）の化合物の遊離酸）と同定する。これは、加水分解生成物について予想されるように、４０℃／７５％ＲＨ（開放）試料で最も優勢である。
【００６０】
【表３】
0005394238.tif 000006
注釈
１．  オートサンプラーシーケンサーのエラーにより１つの試料しかテストしなかった。
【００６１】
結論
式（Ｉ）の化合物は、５℃／ＡＭＲＨ（密閉）で保存してから少なくとも３４日間は外観および含有量に関して安定している。３０℃／６０％ＲＨ（密閉）では外観に変化は見られなかったが、初期面積％に対する式（Ｉ）の化合物の含有量にはおよそ０．６％の低下が観察された。４０℃／７５％ＲＨ（開放）または６０℃／ＡＭＲＨ（密閉）で保存した試料は潮解し、色が黄色からオレンジ色になり、式（Ｉ）の化合物の含有量は初期値から顕著な減少（１．５〜８％）を示した。ＲＲＴ０．６８、０．８７、およびＲＲＴ０．９０の主要な分解ピークが、多数のより小さなピークとともに観察されており、複数の分解経路を示唆している。ＲＲＴ０．６８の分解生成物は、暫定的にエステル加水分解生成物として同定する。これらの結果は、式（Ｉ）の化合物は長期間保存する場合には冷蔵保存する必要があることを示す。
【００６２】
（実施例２）
様々な有機溶媒における式（Ｉ）の化合物の溶解度を判定した。溶解度データを下記の表４に示す。
【００６３】
【表４】
0005394238.tif 000007
上記データは、式（Ｉ）の化合物が一般的な有機溶媒において高い溶解度を有することを明確に示す。好ましい溶媒はエタノールおよびトルエンである。
【００６４】
上記化合物の遊離塩基の２つの塩基中心のｐＫａを測定した。しかしながら、ピリジン環の塩基中心のｐＫａは１．９９であった。イミダゾール環の塩基中心のｐＫａは、４．５３と測定された。
【００６５】
エタンスルホン酸を用いて式（Ｉ）の化合物のエシレート塩を生成した。６種類の容積の溶媒を用いて２０ｍｇスケールで実験を行った。全ての反応は、溶解度に応じて、酸をエタノール（１Ｍ）原液または固体として充填し周囲温度で行った。
【００６６】
単離した全ての固体は、１Ｈ  ＮＭＲにおいて有意なピークシフトを示し、塩形成が確認された。Ｘ線粉末回折（ＸＲＰＤ）は、全ての塩が結晶化の徴候を有することを示した。表５は、単離した塩形態の一覧を示す。
【００６７】
【表５】
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これらの塩を引き続き４０℃／７５％ＲＨで２週間保存した後、化学的純度についてＸＲＰＤおよびＨＰＬＣで再分析し、上記原料の安定性を評価した。上記塩は、上記湿度条件に曝した後も同じ粉末パターンを保持するとともに、高い化学的純度を保持しており、安定性が改善したことを裏付けている。
【００６８】
単離した塩のＴ１の純度結果（下記の表６）から、特に、トルエンのエシレート塩が安定性試験の前後に高い純度値を示したことが分かる。
【００６９】
【表６】
0005394238.tif 000009
上記の結果は、エシレート塩形態が高い純度および好ましい安定性結果を示したことを示す。
【００７０】
（実施例３）
実施例２のデータに基づいてエシレート塩を１００ｍｇに増量した。トルエンがエシレート塩の単離に好ましい溶媒であることが分かった。
【００７１】
式（Ｉ）の化合物のエシレート塩
上記プロセスの規模が大きくなるかどうか、および単離した原料がより小規模の実験で見られた結晶形態（形態１）と同じであることを確認するために、投入原料を５０ｍｇに増量した。分析により上記塩が形態１であること、およびその特性が予想したものと一致していることを確認すると、完全な特性化、および試料の４０℃／７５％ＲＨでの４週間安定性試験を可能にするために１００ｍｇの投入原料で他の規模の拡大化を行った。規模を拡大した反応はともに、エタンスルホン酸をエタノール溶液（１Ｍ）として加えたトルエンで行った。この段階で、トルエンは相対的に高い収率での高結晶質原料の生成に関して最良の結果を示し、選択溶媒に関しても同様であった。
【００７２】
エシレート実験手順
式（Ｉ）の化合物の遊離塩基（１００ｍｇ、バッチ７０４−１７）をバイアルに充填し、酢酸エチル（６００μｌ）を周囲温度で加えた。この溶液にエタンスルホン酸（２５０μｌ、１Ｍのエタノール溶液）を加え、反応混合物を一晩撹拌した。一晩撹拌した後固体が沈殿し、溶液をろ過し、酢酸エチルで洗浄し、真空下において４０℃でオーブン乾燥した。ＸＲＰＤによる分析は、この固体が生成した他のエシレートと同一の粉末パターンであることを示し、１Ｈ−ＮＭＲにおいて、有意なピークシフトおよびエタンスルホン酸対イオンに対応するピークにより塩形成を確認した。
【００７３】
上記エシレート塩は、５つの異なる溶媒（トルエン、エタノール、酢酸エチル、ＭｔＢＥ、およびＤＣＭ）から単離した際に同じ粉末パターンを示した。上記酢酸エチルから単離した塩を、完全な特性化を行う塩として選択した（表７）。
【００７４】
【表７】
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プロセス最適化
エシレート塩（形態１）の収率をさらに改善するために、４種類の溶媒（酢酸イソプロピル、ギ酸エチル、メタノール、およびアセトン）をスクリーニングした。関連する酸をエタノール原液として加えたこれらの溶媒において１００ｍｇスケール反応を合計８回行い、先の実験の全てと比較した。式（Ｉ）の化合物（バッチ７０４−３８、１００ｍｇ）を溶媒（６００μｌ）に周囲温度に溶解した。酸（２５０μｌ、１Ｍエタノール原液）を加え、全ての反応混合物を周囲温度で４８時間静置した。結果を表８に示す。
【００７５】
【表８】
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全ての反応が形態１を示した。
【００７６】
上記研究から酢酸イソプロピル等の溶媒が塩の純度を増したが、回収率を低減させたと結論づけた。先に選択した溶媒（酢酸エチル）により、純度値が高い塩が高収率で得られたため、最終的なスケールアップ実験に酢酸エチルを用いることを決定した。
【００７７】
エシレート水溶媒実験
実施例２では、エタノールからのエシレート塩の形成により、純度が低減しただけでなく、エステル加水分解の結果として酸と思われる不純物が生じたことが観察された。これに該当するかどうかを判定するために、水の量を変更しながらエタノールを溶媒として用いて実験を行った。基本手順は以下のとおりであった。
【００７８】
式（Ｉ）の化合物（４×２０ｍｇ）をエタノール（４×１２０μｌ、加熱、２、５、または１０％Ｈ２Ｏ）に溶解した。エタンスルホン酸（５０μｌ、１Ｍエタノール溶液）を上記溶液に加えた。反応混合物を周囲温度で１６時間静置した後、全てが溶液のままであった。これらの溶液を１６時間蒸発濃縮した。５％および１０％Ｈ２Ｏを入れたバイアルに沈殿を促進するために貧溶媒処理を必要としたが、ニートエタノール反応混合物が油状になったため、ジエチルエーテルで粉末にした。この２％Ｈ２Ｏを含有する反応混合物は、油が結晶化したような固体を含んでいた。ＸＲＰＤ分析では４つの固体全てが結晶質であり、それら全てが先に単離したエシレート塩と同じ粉末パターンを示した。これらの試料の化学的純度を調べた。
【００７９】
【表９】
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上記実験は、ニートまたは含水エタノール混合物から得た試料の純度に有意な変化がないことを示した。ＨＰＬＣにより微量の酸不純物が存在することも示されており、系内の少量の水は加水分解を触媒するには不十分であったことを暗示している。
【００８０】
次の段階では、全ての塩を４週間の間４０℃／７５％ＲＨの条件にし、それらの純度をＨＰＬＣで監視することでそれらの安定性を判定した（表１０）。
【００８１】
（実施例４）
塩安定性試験
【００８２】
【表１０】
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エシレートの結晶質試料を合計４週間の間４０℃／７５％ＲＨで保存し、７日ごとにＨＰＬＣのために試料を取り出した。試験中、これらのエシレート塩には純度の変化はなかった。
【００８３】
０週および４週目の時点のエシレート塩形態のクロマトグラフを図２に示す。
【００８４】
図２に示すクロマトグラフから、エシレート塩の不純物プロフィールに変化がほとんどないことが分かる。親ピーク上に小さなショルダー部ができている。
【００８５】
湿度実験前後の塩の粉末パターンから、形態に変化がないことが分かる。
【００８６】
図３は、４週間安定性試験の前（トレース１）および後（トレース２）のＬＪＣ−０３９−０３４−１（エシレート塩）を比較するＸＲＰＤを示す。
【００８７】
（実施例５）
多型性検査
多型性を示すエシレート塩の傾向を判定するために、３０種類の溶媒（１５種類のニートおよびそれらの２．５％含水対応物）を用いて熟成実験を試みた。各種の溶媒中で１週間周囲温度〜６０℃の加熱／冷却周期で固体をスラリーにした（表１１参照）。１週間後、それらのスラリーを蒸発させ、その固体をＸＲＰＤおよびＨＰＬＣで分析した。
【００８８】
表１１  エシレートについての多型性検査の結果
・開始純度９８．６％
【００８９】
【表１１】
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エシレートの熟成試験では、ＤＣＭおよびＤＣＭ水溶液から新たな形態（形態２）が示された。この熟成後の純度結果は、メタノール、ＭＥＫ水溶液、およびジオキサン水溶液でスラリー化したものだけが分解したことを示しており、エシレートの高温での溶液安定性は良好であることを示唆している。
【００９０】
新形態のエシレートの検査
上記の新たに同定した形態についてさらなる情報を得るために、より大きなＬＪＣ−０３９−０５８−１の試料をＤＣＭおよび２．５％ＤＣＭ水溶液中において６０℃でスラリーにした。両方の試料を溶解し、周囲温度で蒸発乾固させて分析した。両方の試料について粉末パターンは同じであり、熟成試験で観察したものと一致した。
【００９１】
図４は、上記新形態のエシレートのＸＲＰＤオーバーレイを示す。トレース１は、熟成試験の投入原料として用いられたエシレート塩（ＬＪＣ−０３９−０６５−１）を示す。トレース２および３は、それぞれ、ＤＣＭおよびＤＣＭ水溶液の熟成結果を示す。トレース４および５は、異なるバッチのエシレート（ＬＪＣ−０３９−０５８−１）を用いたＤＣＭおよびＤＣＭ水溶液の反復熟成試験を示す。
【００９２】
興味深いことに、エシレートが先にＤＣＭから単離し、他の溶媒から単離したエシレート塩と同じ形態（すなわち、形態１）を示した。形態１をＤＣＭにおいてより高い温度でスラリーにした場合のみ形態２が顕著になった。
【００９３】
図５は、ＤＣＭで生成したエシレートおよびＤＣＭでスラリーにしたエシレートのＸＲＰＤオーバーレイを示す。トレース１は、ＤＣＭ（ＬＪＣ−０３９−０３４−５）から単離した形態１のエシレートを表し、トレース２は、ＤＣＭ（ＬＪＣ−０３９−０７９−１）でスラリーにした後の形態１のエシレートの結果を表す。
【００９４】
塩のスクリーニング検査では、式（Ｉ）の化合物がｐＫａの適切な範囲内で多数の塩を形成すること、およびそれらが様々な溶媒から容易に単離されることが示された。これらの塩の完全な特性化から、それらエシレート塩が湿度について良好な安定性を有すると判定した。エシレートには２つの多型形態があると結論づけた。
【００９５】
完全な分析データを添付の図６〜図７に示す。
【００９６】
実施例２〜５の実験方法
実施例２
式（Ｉ）の化合物（５ｍｇ／ｗｅｌｌ）をＨＰＬＣバイアル内の溶媒１（３０μｌ）に溶解した。これらの溶液に、エタンスルホン酸（１１．４μｌ、１Ｍエタノール溶液）を加え、その反応混合物を周囲温度で一晩静置した。固体を入れたこれらのバイアルを真空下において４０℃で乾燥させ、溶液のままであったものを蒸発濃縮した後、ヘプタンで処理した。沈殿したものを上述したように乾燥させ、油状になったものを４℃で保存した。
【００９７】
１エタノール、トルエン、およびアセトントリル（ａｃｅｔｏｎｔｒｉｌｅ）
エシレート形態１の増量
式（Ｉ）の化合物（１００ｍｇ）を酢酸エチル（６００μｌ）に溶解し、エタンスルホン酸（２５０μｌ、１Ｍエタノール溶液）を加えた。およそ５分後に沈殿が生じ、その反応混合物を８０分間周囲温度で撹拌した。この固体をろ過し、酢酸エチルで洗浄し、真空下において４０℃で１６時間オーブン乾燥した。
【００９８】
分析方法
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
５０ポジションオートサンプラーを備えたＴＡ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製Ｑ１０００でＤＳＣデータを収集した。エネルギーおよび温度較正基準はインジウムとした。２５〜３５０℃の間で１０℃／分の割合で試料を加熱した。試料に対して３０ｍｌ／分の窒素パージを維持した。特に明示しない限り、０．５〜３ｍｇの試料を用いて、全ての試料をピンホールアルミパンに入れた。
【００９９】
熱重量分析（ＴＧＡ）
アルメルで較正し、１０℃／分の走査速度で動作するＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製Ｑ５００  ＴＧＡ１でＴＧＡデータを収集した。試料に対して６０ｍｌ／分の窒素パージを維持した。典型的には、特に明示しない限り、５〜１０ｍｇの試料を予めタラ秤量した（ｐｒｅ−ｔａｒｅｄ）白金るつぼ上に載せた。
【０１００】
ＮＭＲ
オートサンプラーを備えたＢｒｕｋｅｒ社製４００ＭＨｚ機で全てのスペクトルを収集した。特に明示しない限り、試料はｄ６−ＤＭＳＯで調製した。
【０１０１】
ＸＲＰＤ（Ｘ線粉末回折）
Ｂｒｕｋｅｒ社製ＡＸＳ  Ｃ２  ＧＡＤＤＳ回折装置
Ｃｕ−Ｋα線（４０ｋＶ、４０ｍＡ）、自動ＸＹＺステージ、自動的な試料の位置決めのためのレーザービデオ顕微鏡、およびＨｉＳｔａｒ２次元面積検出器を用いてＢｒｕｋｅｒ社製ＡＸＳ  Ｃ２  ＧＡＤＤＳ回折装置で試料のＸ線粉末回折パターンを得た。Ｘ線光学は、０．３ｍｍのピンホールコリメータに接続した単一のゲーベル多層膜ミラーで構成される。
【０１０２】
ビーム広がり、すなわち、試料上において効果的なＸ線ビームのサイズはおよそ４ｍｍであった。試料と検出器との距離を３．２〜２９．８°の効果的な２θ範囲が得られる２０ｃｍにしてθ−θ連続走査モードを用いた。試料の典型的な露光時間は１２０秒であった。
【０１０３】
周囲条件下でテストした試料を、未粉砕の粉末を用いて平板試験片として調製した。およそ１〜２ｍｇの試料をスライドガラス上に軽く押えつけて表面を平にした。非周囲条件下でテストした試料を、熱伝導性化合物を塗布したシリコンウエハ上に載せた。次いで、この試料を約２０℃／分で適温に加熱し、引き続き約１分間等温に維持した後データ収集を開始した。
【０１０４】
純度分析：
化学的方法
Ａｇｉｌｅｎｔ社のＨＰ１１００で純度分析を行った。
【０１０５】
方法：勾配、逆相
方法実施時間（分）：３４
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８  ５μｍ（２．０×５０ｍｍ）（ガードカートリッジ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８ガードカートリッジ２×４ｍｍ）
カラム温度（℃）：４０
注入（μｌ）：５
流量（ｍｌ／分）：０．８
検出：ＵＶ
波長（ｎｍ）：２５５（９０ｎｍの帯域幅）、２４０（８０ｎｍの帯域幅）、２５４（８ｎｍの帯域幅）
相Ａ：２ｍｍｏｌ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ＮＨ３溶液でｐＨ１０に調節）
相Ｂ：アセトニトリル
タイムテーブル：
【０１０６】
【表１２】
0005394238.tif 000015
キラル法
Ｇｉｌｓｏｎ社製ＨＰＬＣシステムで純度分析を行った。
【０１０７】
方法：無勾配、順相
方法実施時間（分）：５０
カラム：Ｄｉａｃｅｌ  Ｃｈｒｉａｌｃｅｌ  ＯＪ−Ｈ（５μｍ）４．６×２５０ｍｍ（ガードカートリッジ：Ｄｉａｃｅｌ  Ｃｈｒｉａｌｃｅｌ  ＯＪ−Ｈ分析ガードカートリッジ５μｍ  ４．０×１０ｍｍ）
カラム温度（℃）：４０
注入（μｌ）：１０
流量（ｍｌ／分）：１．０
検出：ＵＶ
波長（ｎｍ）：２２５（単一波長検出器）
相Ａ：ヘキサン
相Ｂ：エタノール
タイムテーブル：
【０１０８】
【表１３】
0005394238.tif 000016
重量蒸気収着（Ｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ  Ｖａｐｏｕｒ  Ｓｏｒｐｔｉｏｎ）（ＧＶＳ）試験
ＣＦＲＳｏｒｐソフトウェアを実行するＨｉｄｅｎ社製ＩＧＡＳｏｒｐ水分収着分析装置で全ての試料をテストした。試料サイズは、典型的には、１０ｍｇであった。水分吸脱着等温線法を下記に示すように行った（２回の走査で１周期を完了する）。典型的な室内湿度および温度（４０％ＲＨ、２５℃）で全ての試料を脱着した。ＧＶＳ後のＸＲＰＤ分析で全ての試料を分析した。特に明示しない限り、０〜９０％ＲＨ範囲に対して１０％ＲＨ間隔で２５℃で基準等温線法を行った。
【０１０９】
【表１４】
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溶解度
この測定は、０．２５ｍｌの溶媒（水）中に十分な化合物を懸濁し、１０ｍｇ／ｍｌの親遊離形態の化合物の最大最終濃度を得ることにより行った。２５℃で２４時間懸濁液を平衡化した後、ｐＨチェックを行い、グラスファイバーＣ９６ウェルプレートでろ過した。次いで、ろ液を１０１倍に希釈する。ＨＰＬＣにより、およそ０．１ｍｇ／ｍｌのＤＭＳＯに溶解した基準溶液を参照して定量を行った。異なる容積の基準希釈試験液および不希釈試験液を注入した。基準液注入におけるピーク最大値と同じ保持時間で見られるピーク面積を積分して溶解度を算出した。ろ板に十分な固体が存在する場合、ＸＲＰＤは、通常、相変化、水和物形成、非晶質化、結晶化等についてチェックされる。
【０１１０】
【表１５】
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ｐＫａ判定
Ｄ−ＰＡＳアタッチメントを装着したＳｉｒｉｕｓ社製ＧＩｐＫａ器具でｐＫａ判定を行った。２５℃のＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ混合物において電位差滴定で測定を行った。滴定媒体は、０．１５Ｍ  ＫＣＩでイオン強度を調節した。ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ混合物で見られた値をＹａｓｕｄａ−Ｓｈｅｄｌｏｖｓｋｙ外挿法により０％共溶媒に当てはめて推定した。
【０１１１】
３種類の比のＯｃｔｏｎｏｌ：ＩＳＡ水を用いてＳｉｒｉｕｓ社製ＧＩｐＫａ器具で行った電位差滴定によりＬｏｇ  Ｐ、Ｌｏｇ  Ｐｉｏｎ、およびＬｏｇ  Ｄ値を得た。
【０１１２】
高温顕微鏡検査（Ｈｏｔ  Ｓｔａｇｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）
２５〜３５０℃の温度範囲において１０〜２０℃／分の範囲の通常の加熱速度でＭｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ社製ＭＴＦＰ８２ＨＴホットステージと組み合わせたＬｅｉｃａ社製ＬＭ／ＤＭ偏光顕微鏡を用いて高温顕微鏡検査（Ｈｏｔ  Ｓｔａｇｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を行った。少量の試料を個々の粒子ができる限り分離するようにスライドガラス上に分散した。２０倍対物レンズを備えた（λ擬似カラーフィルタに接続した）ライトの普通光または交差偏光の下で試料を観察した。
【０１１３】
キラル純度法
システム構成
ポンプ：Ｇｉｌｓｏｎ社製３２２バイナリポンプ
検出器：Ｇｉｌｓｏｎ社製１５２ＵＶ／Ｖｉｓ
オートサンプラー：Ｇｉｌｓｏｎ社製２３３ＸＬラック＋Ｇｉｌｓｏｎ社製４０２デュアルシリンジポンプ
カラムオーブン：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製Ｔｈｅｒｍａｓｐｈｅｒｅ  ＴＳ−１３０
ソフトウェア：Ｇｉｌｓｏｎ社製Ｕｎｉｐｏｉｎｔ  ＬＣソフトウェア
カラム：Ｄａｉｃｅｌ社製Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＪ−Ｈ、５μｍ、４．６×２５０ｍｍ
ガードカラム：Ｄａｉｃｅｌ社製Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＪ−Ｈ分析ガードカートリッジ、５μｍ、４．６×１０ｍｍ。
【０１１４】
ＨＰＬＣ条件
チャネルＡ：ヘキサン（９３％）
チャネルＢ：エタノール（７％）
流量：１．０ｍｌ／分
検出器波長  ２２５ｎｍ
カラム温度：４０℃
実行時間：５０．０分。
【０１１５】
試料条件
およそ０．２ｍｇの試料を適切な体積のヘキサン：エタノール（１：１（ｖ／ｖ））に溶解し、０．２ｍｇ／ｍｌ溶液を得た。これに蓋をして、約１５秒の間高速でボルテックスミキサーにかけた。この時点で固体が残っている場合、試料バイアルをおよそ１０秒間超音波分解した後、さらに１０〜１５秒間ボルテックスミキサーにかけた。１０μｌをＨＰＬＣシステムに注入した。繰り返し注入の最初にヘキサン：エタノール（１：１（ｖ／ｖ））をブランクとして注入した後、試料を繰り返し注入した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
0005394238.tif 000027
【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
0005394238.tif 000029
【図６Ｆ】
0005394238.tif 000030
【図６Ｇ】
0005394238.tif 000031
【図６Ｈ】
0005394238.tif 000032
【図６Ｉ】
0005394238.tif 000033
【図７Ａ】
0005394238.tif 000034
【図７Ｂ】
0005394238.tif 000035