(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に設けられた基板電極と対向電極との間に交流電圧を与えて、当該基板電極上に結合した被検体に備えられたマーカーから得られる信号の観察により、当該被検体を評価する被検体評価方法であって、
前記交流電圧の周波数を変更して前記マーカーから信号を発生させ、
前記観察が、前記マーカーからの信号を、前記交流電圧の周波数とは無関係なある周期で断続的に受信して得られる信号の平均値の挙動を観察するものである、
被検体評価方法。
【請求項２】
前記周波数の変更が、少なくとも一つの異なる周波数への段階的な変更である、請求項１に記載の被検体評価方法。
【請求項３】
前記被検体が、前記マーカーを備えたプローブ分子と当該プローブ分子に特異的に結合したターゲット分子とを含む、請求項１に記載の被検体評価方法。
【請求項４】
前記周波数の変更が、少なくとも一つの異なる周波数への段階的な変更である、請求項３に記載の被検体評価方法。
【請求項５】
前記周波数の変更が連続的な変更である、請求項３または４に記載の被検体評価方法。
【請求項６】
前記交流電圧の電圧値の段階的または連続的な変更を含む、請求項３〜５のいずれかに記載の被検体評価方法。
【請求項７】
前記交流電圧の波形がサイン波または矩形波である、請求項３〜６のいずれかに記載の被検体評価方法。
【請求項８】
異なるターゲット分子を結合させた被検体について、それぞれ事前に前記観察を行い、その比較により被検体を評価する、請求項３〜７のいずれかに記載の被検体評価方法。
【請求項９】
前記マーカーが蛍光マーカーであり、前記信号が当該蛍光マーカーの発光／消光である、請求項３〜８のいずれかに記載の被検体評価方法。
【請求項１０】
前記被検体が、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、天然または人工の１本鎖のヌクレオチド体、天然または人工の２本鎖のヌクレオチド体、アプタマー、抗体を蛋白質分解酵素で限定分解して得られる産物、蛋白質に対して親和性を有する有機化合物、蛋白質に対して親和性を有する生体高分子、これらの複合体、プラスまたはマイナスに帯電したイオン性ポリマーおよびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選ばれた少なくとも一つの物質を含んでなる、請求項３〜９のいずれかに記載の被検体評価方法。
【請求項１１】
前記ターゲット分子が蛋白質である、請求項３〜１０のいずれかに記載の被検体評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡチップ等のバイオチップに利用される、評価対象の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ナノをキーワードとして、ナノテクノロジーが多くの人々の関心を集めている。
【０００３】
このナノテクノロジーの中でも、半導体微細加工技術（半導体ナノテクノロジー）とバイオテクノロジーとの融合領域であるナノバイオテクノロジーは、既存の問題を根底から解決できる可能性を持つ新分野として、多くの研究開発が精力的に行われるようになってきている。
【０００４】
このナノバイオテクノロジーの中でも特に、ＤＮＡチップ（またはＤＮＡマイクロアレイ）に代表され、ガラス、シリコン、プラスチック、金属等で形成された基板上に、ＤＮＡ、蛋白質等の生体高分子からなる多数の異なった被検体を高密度に整列化してスポット状に配置したバイオチップは、臨床診断や薬物治療等の分野で、核酸や蛋白質の試験を簡素化でき、特に遺伝子解析に有効な手段として注目されている（非特許文献１および２参照）。
【０００５】
更に、近年では、固体基板上に、機能性分子や機能性分子と結合させた分子を結合させて、部分的に機能性表面（評価部）を形成し、マイクロマシニング技術やマイクロセンシング技術と組み合わせて、微小なターゲットを評価する技術のもとに作製される、「ＭＥＭＳ」や「μＴＡＳ」と呼ばれるデバイスが、従来の評価感度や評価時間を大幅に向上させるものとして注目されている。「ＭＥＭＳ」は、マイクロエレクトロメカニカルシステム（Ｍｉｃｒｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の略であり、半導体の加工技術をもとに非常に微細なものを作る技術、またはその技術を用いて作製された精密微細機器を意味し、一般に、機械、光学、流体等の複数の機能部分を複合化、微細化したシステムを意味する。また、「μＴＡＳ」は、マイクロトータルアナリシスシステム（Ｍｉｃｒｏ  Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）の略であり、マイクロポンプ、マイクロバルブ、センサ等を小型、集積、一体化した化学分析システムを意味する。これらのデバイスは、一般に、特定の機能を有する機能性分子や、この機能性分子と結合させた分子を、基板上に自己組織的に固定（結合）させた機能性表面を有している。そして、これらのデバイスにおいては、機能性表面での反応を電気的または光学的に評価する手法が多く取られている。
【０００６】
中でも、光学的に評価する手法は、評価対象であるターゲットを蛍光色素等の光学的なラベルで修飾し、光学的な強度から、ターゲットを定量的に評価する手法で、その感度の高さから、ＤＮＡチップ等に幅広く利用されている。
【０００７】
しかしながら、この手法では、ターゲットをラベルで修飾する手順が不可欠であり、ラベリングや洗浄等の煩雑な工程が必要となる。また、ラベルのみの混入による誤評価や、プローブとの特異的な結合の結果でない、単に非特異的に評価部に付着したターゲットも評価してしまう問題があった。
【０００８】
したがって、ターゲットにラベルを修飾する必要が無く（ノンラベルで）、非特異吸着したターゲットの誤評価等を回避して、高選択性で低ノイズの評価技術の開発が望まれているのが現状である。
【０００９】
ラベルフリーのターゲット分子を評価する方法としては、マーカーを荷電性被検体に修飾し、この被検体を電極に固定して電場で駆動し、マーカーからの信号で駆動状態をモニターし、ターゲット分子が被検体と特異的に結合した際に、プローブの駆動状態が変化し、この変化をプローブに修飾したマーカーで評価する方法が知られている（非特許文献３，特許文献１，２参照）。荷電性被検体が電場に引き寄せられたり、反発したりして、被検体の先端に付けたマーカーと基板との距離が変化することで発生するマーカーからの信号の変化を観察することがこの手法の原理である。駆動周波数としては、電場のもととなる電気二重層の形成が可能な周波数帯（おおよそ１ＭＨｚ以下）であれば、駆動電位に同期したマーカーからの信号を観察することで、ターゲット分子の評価が可能である。
【特許文献１】特願２００４−２３８６９６（請求の範囲）
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／０６９９３２号明細書（クレーム）
【特許文献３】特開２００５−２８３５６０号公報（請求の範囲）
【非特許文献１】T. G. Drummond et al.，「電気化学的ＤＮＡセンサー（Electrochemical DNA sensors）」，ネイチャーバイオテクノロジー（Nature Biotech.），2003年,第21巻，第10号，ｐ．1192-1199
【非特許文献２】J. Wang，「ＤＮＡバイセンサーから遺伝子チップまでのサーベイと纏め（SURVEY AND SUMMARY From DNA biosensors to gene chips）」，Nucleic Acids Research, 2000年,第28巻，第16号，ｐ．3011-3016
【非特許文献３】U. Rant et al.，「金属表面上のＤＮＡ層の動的電気的スイッチング（Dynamic Electrical Switching of DNA Layers on a Metal Surface）」，Nano Lett.，2004年，第4巻，第12号，ｐ．2441-2445
【非特許文献４】A. Ulman，「自己組織化モノレイヤーの形成（Formation and Structure of Self-Assembled Monolayers）」，Chem. Rev.，1996年，第96巻，第4号，ｐ．1533-1554
【非特許文献５】U. Rant et al.，「電気的操作中の金属表面上の１本鎖、２本鎖ＤＮＡの異なる動特性（Dissimilar Kinetic Behavior of Electrically Manipulated Single- and Double-Stranded DNA Tethered to a Gold Surface）」，Biophysical Journal，2006年，第90巻，ｐ．3666-3671
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、従来評価ターゲットに必要不可欠であった、インターカレーターや蛍光色素、酸化還元マーカー等の修飾無しに、ラベルフリーで評価対象を高選択性かつ低ノイズで評価する技術を提供することを目的としている。本発明の更に他の目的および利点は、以下の説明から明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一態様によれば、基板上に設けられた基板電極と対向電極との間に交流電圧を与えて、基板電極上に結合した被検体に備えられたマーカーから得られる信号の観察により、被検体を評価する被検体評価方法であって、交流電圧の周波数を変更してマーカーの信号の平均値の挙動を観察する、被検体評価方法が提供される。
【００１２】
本発明態様によれば、評価対象へのマーカーの修飾を必要とせず、評価対象への修飾に用いられるマーカーの評価用マーカーが幾分でも残存することによる評価への悪影響、非特異吸着したターゲットの誤評価等を防止できる、高選択性、で低ノイズの評価方法が実現する。
【００１３】
マーカーは蛍光マーカーであることが好ましく、被検体は、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、天然または人工の１本鎖のヌクレオチド体、天然または人工の２本鎖のヌクレオチド体、アプタマー、抗体を蛋白質分解酵素で限定分解して得られる産物、蛋白質に対して親和性を有する有機化合物、蛋白質に対して親和性を有する生体高分子、これらの複合体、プラスまたはマイナスに帯電したイオン性ポリマーおよびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選ばれた少なくとも一つの物質を含んでなることが好ましい。ターゲット分子としては、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、高選択性で低ノイズの新規な評価対象の評価方法が実現する。すなわち、評価対象へのマーカーの修飾を必要とせず、評価対象への修飾に用いられるマーカーの評価用マーカーが幾分でも残存することによる評価への悪影響、非特異吸着したターゲットの誤評価等を防止できる評価方法が実現する。
【００１５】
本発明に係る高選択性、低ノイズ分子評価方法と評価装置は、ナノバイオテクノロジーの分野に極めて有用であり、ＤＮＡチップや蛋白質チップ等のバイオチップに好適な、評価方法とその方法を用いた評価装置を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下に、本発明の実施の形態を図、実施例等を使用して説明する。なお、これらの図、実施例等および説明は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。本発明の趣旨に合致する限り他の実施の形態も本発明の範疇に属し得ることは言うまでもない。
【００１７】
本発明に係る被検体評価方法では、基板上に設けられた基板電極と対向電極との間に交流電圧を与えて、基板電極上に結合した被検体に備えられたマーカーから得られる信号の観察により、被検体を評価する。この際、交流電圧の周波数を変更してマーカーの信号の平均値の挙動を観察する。この交流電圧の周波数を、マーカーの信号挙動の元になる被検体の運動（たとえば伸縮運動）を起こさせる周波数と言う意味で、駆動周波数と呼び、このような被検体の運動を起こさせることを被検体を駆動すると言うことがある。
【００１８】
基板上に設けられた基板電極と対向電極との間に交流電圧を与えて、基板電極上に結合した被検体に備えられたマーカーから得られる信号の観察により、被検体を評価する方法は、たとえば特許文献３に開示されている。
【００１９】
本発明方法では、評価対象の高選択性で低ノイズの新規な評価が可能である。具体的には、評価対象へのマーカーの修飾を必要とせず、評価対象への修飾に用いられるマーカーの評価用マーカーが幾分でも残存することによる評価への悪影響、非特異吸着したターゲットの誤評価等を防止できる評価方法が実現する。
【００２０】
本発明に係る高選択性、低ノイズ分子評価方法と評価装置は、ナノバイオテクノロジーの分野に極めて有用であり、ＤＮＡチップや蛋白質チップ等のバイオチップに好適な、評価方法とその方法を用いた評価装置を提供することができる。
なお、ここで、「評価」とは、評価対象の有無の検出、相違の検出および／または定量を行うことを意味する。
【００２１】
（被検体評価装置）
上記の被検体を評価する方法は、基板上に設けられた基板電極と対向電極と、基板電極上に結合し、マーカーを備えた被検体と、基板電極と対向電極との間に電圧を印加するための電圧印加手段と、マーカーからの信号を検出する信号検出手段とを含む被検体評価装置を用いて評価することができる。信号検出手段には、蛍光検出手段の場合の蛍光を発光／消光させるための光照射手段のように補助的手段が含まれる場合もある。このような基板電極や対向電極は水溶液中に浸漬して使用される。
【００２２】
以下、主に、マーカーの蛍光の発光／消光を観察する場合について説明するが、後述するとおり、本発明における信号は蛍光に限られるわけではない。
【００２３】
上記装置において、被検体を基板電極に結合せしめ、クエンチング効果でマーカーが消光した状態となし、電圧を印加することによりマーカーを発光／消光させ、その発光／消光挙動を観察することにより、評価対象を評価できる。マーカーの発光／消光は、マーカーと基板電極との距離が変化することにより可能になるものと考えられている。マーカーは基板電極から離れると発光／消光し、基板電極に近づきあるいは接触すると消光する。このようなマーカーの運動は、被検体がプラスまたはマイナスに帯電し得ることで可能になると考えられる。たとえば、被検体がマイナスに帯電している場合は、基板電極の電位を負にすることによりマーカーが基板電極から離れ、基板電極の電位を正にするとマーカーが基板電極に近づく。
【００２４】
図１−Ａ〜Ｃに、そのような挙動を模式的に示す。図１−Ａは、被検体１が基板電極２と結合し、縮まった状態を示す模式図、図１−Ｂは、被検体１が基板電極２と結合し、横に倒れた状態を示す模式図、図１−Ｃは、被検体１が基板電極２から伸長した状態を示す模式図である。図１−Ａ，Ｂの場合にマーカー３は基板電極に近づきあるいは接触し、図１−Ｃの場合には、マーカー３は基板電極から離れる。恐らくこのような挙動が生じているものと考えられる。なお、本明細書において、被検体について「伸縮」を説明する場合の「伸縮」は図１−Ａ〜Ｃのような挙動を意味するものと考えられているが、マーカーと基板電極との間の距離が変化する挙動であればどのような挙動でもこの「伸縮」の範疇に属する。したがって、「伸縮」が上記の挙動に限られるわけではない。
【００２５】
（評価対象）
評価対象は、被検体そのものであってもよく、後に説明するように被検体と結合し得るまたは結合した物質であってもよい。なお、評価対象が被検体と結合し得るまたは結合した物質である場合における「被検体」および「評価対象」を、それぞれ、「プローブ分子」および「ターゲット分子」と呼称する場合がある。プローブ分子にターゲット分子を結合させない状態で評価を行えば、評価対象が被検体そのものである場合に該当することになる。「評価対象の評価」には、プローブ分子の有無の検出、相違の検出および／または定量を行うことを意味する場合も、ターゲット分子の有無の検出、相違の検出および／または定量を行うことを意味する場合もあり得る。
【００２６】
評価対象としては、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、天然または人工の１本鎖のヌクレオチド体、天然または人工の２本鎖のヌクレオチド体、アプタマー、抗体を蛋白質分解酵素で限定分解して得られる産物、蛋白質に対して親和性を有する有機化合物、蛋白質に対して親和性を有する生体高分子、これらの複合体およびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選ばれたものまたはこれらを含むものが好ましい。プラスまたはマイナスに帯電したイオン性ポリマーを含んでいてもよい。なお本発明において、上記複合体の例としては、ＤＮＡとマイナスに帯電したポリマーとの結合体等、上記の物質と他の物質との結合体を挙げることができる。評価対象としては、上記の他に、血漿蛋白、腫瘍マーカー、アポ蛋白、ウイルス、自己抗体、凝固・線溶因子、ホルモン、血中薬物、核酸、ＨＬＡ抗原、リポ蛋白、糖蛋白、ポリペプチド、脂質、多糖類、リポ多糖類等も挙げられる。
【００２７】
ここで、本発明において「ヌクレオチド体」とは、モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドよりなる群のいずれか一つまたはその混合物を意味する。このような物質は、マイナスに帯電していることが多い。１本鎖あるいは２本鎖を用いることができる。なお、蛋白質、ＤＮＡ、ヌクレオチド体が混在していてもよい。また、生体高分子には、生体に由来するものの他、生体に由来するものを加工したもの、合成された分子も含まれる。
【００２８】
ここで、上記「産物」とは、抗体を蛋白質分解酵素で限定分解して得られるものであり、本発明の趣旨に合致する限り、抗体のＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメントや抗体のＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメントに由来する断片、さらにはその誘導体等どのようなものを含めることもできる。
【００２９】
抗体としては、たとえば、モノクローナルな免疫グロブリンＩｇＧ抗体を使用することができる。また、ＩｇＧ抗体に由来する断片として、たとえばＩｇＧ抗体のＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメントを使用することもできる。更に、そのようなＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメントに由来する断片などを使用することもできる。蛋白質に対して親和性を有する有機化合物として使用可能な例を挙げると、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）等の酵素基質アナログや酵素活性阻害剤、神経伝達阻害剤（アンタゴニスト）などがある。蛋白質に対して親和性を有する生体高分子の例としては、蛋白質の基質または触媒となる蛋白質、分子複合体を構成する要素蛋白質同士等を挙げることができる。
【００３０】
（被検体）
被検体は、基板電極と結合し得るものであれば、本発明の趣旨に反しない限り、どのようなものでもよいが、マーカーを、「ターゲット分子」との結合前に備えたものであることが好ましい。
【００３１】
被検体は、「プローブ分子」として、「ターゲット分子」に対して特異的に結合する性質を有することが好ましい。特異的に結合する性質を有することにより、「ターゲット分子」としての評価対象や「ターゲット分子」と「プローブ分子」を含めた評価対象の高選択性と低ノイズの精密な評価がより容易になる。結合の種類および結合箇所については特に制限はないが、結合力が特に弱い結合は避けた方がよいであろう。
【００３２】
被検体は、交流電圧の印加により、マーカーと基板電極との距離が変化させる機能を有するものであることが一般的である。先述のごとく、交流電圧の印加によって、マーカーと基板電極との間の距離の変化を生ぜしめるためには、被検体がプラスまたはマイナスに帯電し得ることが好ましい。このような被検体を荷電性被検体と呼ぶ場合がある。
【００３３】
被検体の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、線状、粒状、板状、これらの２以上の組合せ、等が挙げられるが、これらの中でも線状が好ましい。
【００３４】
このような被検体の種類には、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、病気の治療、診断等への応用等の観点からは生体分子等が好適に挙げられる。具体的には、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、天然または人工の１本鎖のヌクレオチド体、天然または人工の２本鎖のヌクレオチド体、アプタマー、抗体を蛋白質分解酵素で限定分解して得られる産物、蛋白質に対して親和性を有する有機化合物、蛋白質に対して親和性を有する生体高分子、これらの複合体、プラスまたはマイナスに帯電したイオン性ポリマーおよびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選ばれた少なくとも一つの物質を含むものが好ましい。伸縮を行い易い場合や、プローブ分子としてターゲット分子と特異的に結合し易い場合が多いからである。
【００３５】
正に帯電したイオンポリマーとしては、例えば、主鎖にグアニジド結合を用いてプラスに帯電させたＤＮＡ（グアニジンＤＮＡ）、ポリアミン等が好適に挙げられる。負に帯電したイオンポリマーとしては、例えば、マイナスに帯電した天然のヌクレオチド体、ポリヌクレオチド、ポリリン酸等が好適に挙げられる。これらの分子は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００３６】
ここで、上記「ヌクレオチド体」、「産物」、「抗体」、「蛋白質に対して親和性を有する有機化合物」、「蛋白質に対して親和性を有する生体高分子」等の持つ意味は既に説明した通りである。
【００３７】
被検体として、天然のヌクレオチド体や人工のヌクレオチド体を使用することができる。人工のヌクレオチド体には、完全に人工のものも、天然のヌクレオチド体から誘導されるものも含まれる。人工のヌクレオチド体を使用すれば、検出の感度を上げたり、安定性を向上させたりすることができるため有利な場合がある。
【００３８】
また、１本鎖ヌクレオチド体でも、互いに相補的な関係にある１本鎖ヌクレオチド体の対である２本鎖ヌクレオチド体でもよい。なお、伸長や収縮のし易さからすると１本鎖ヌクレオチド体が好ましく、基板電極上で横たえたり、立ち上げたりするには２本鎖ヌクレオチド体が好ましい場合が多い。電極毎に異なるヌクレオチド体を使用することもできる。ヌクレオチド体鎖の長さは１残基以上あればよい。すなわち、モノヌクレオチド鎖でもよい。
【００３９】
被検体は、また、モノクローナル抗体や蛋白質分解酵素で限定分解して得られる産物を使用することもできる。抗原抗体反応に類する反応によって生じる結合を利用でき、ターゲット分子と特異的に結合するプローブ分子としても機能するので有用である。
【００４０】
被検体としては、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体のＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメント、もしくはモノクローナル抗体のＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメントに由来する断片を使用することも好ましい。なお、モノクローナル抗体のＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメントに由来する断片とは、モノクローナル抗体のＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメントを細分化した断片やその誘導体を意味する。
【００４１】
さらに、被検体として、ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ抗体のＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメント、ＩｇＧ抗体もしくはＩｇＧ抗体Ｆａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメントに由来する断片を使用することがより好ましい。なお、ＩｇＧ抗体Ｆａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメントに由来する断片とは、ＩｇＧ抗体Ｆａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメントを細分化した断片やその誘導体を意味する。アプタマーであることも好ましい。一般的に分子量の小さいものの方が検出感度がよいことが、これらが好まれる理由である。
【００４２】
基板電極との結合の容易性の観点からは、被検体が、チオール基（−ＳＨ）またはジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）を有するポリヌクレオチドであることまたはジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）を有するポリヌクレオチドを含むことが好ましく、末端にチオール基（−ＳＨ）またはジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）を有する、ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらと蛋白質との複合体等が特に好ましい。なお、ＤＮＡおよびＲＮＡは、一本鎖であってもよいし、二本鎖であってもよい。
【００４３】
被検体の大きさまたは長さとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、被検体がポリヌクレオチドである場合、少なくとも６塩基であるのが好ましい。
【００４４】
（電極）
本発明に係る基板電極は、被検体と結合することができ、基板電極と対向電極との間に与えられた交流電圧により、基板電極上に結合した被検体に備えられたマーカーから得られる信号が変化し得れば、本発明の趣旨に反しない限りどのようなものでもよく、その形状にも特別な制限はない。この場合の結合には、共有結合、配位結合のような化学的結合の他、生物学的結合、静電気的結合、物理吸着、化学吸着等、本発明の趣旨に反しない限りどのような結合を使用することもできる。外部電場による被検体の運動の安定性からは、化学結合が好ましく、化学結合の中でも、硫黄原子（Ｓ）を含む結合が結合の容易性、制御性等の点で好ましく、具体的には、チオール基（−ＳＨ）、ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）等を用いたＳと基板電極との結合が好ましい。
【００４５】
例えば、基板表面に電極を設け、その電極表面に被検体と結合し得る構造部分（被検体結合部）を設けることで本発明の基板電極とすることができる。基板電極は単層であっても多層であってもよく、層状以外の構造を有していてもよい。
【００４６】
この場合の基板の材質については特に制限はなく、例えば、ガラス（たとえば石英ガラス）、セラミックス、プラスチック、金属、シリコン、酸化ケイ素、窒化ケイ素、サファイヤ、等が好適に挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００４７】
基板電極の形状、構造、大きさ、表面性状、数等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。形状としては、例えば、平板状、円状、楕円状等が挙げられる。表面性状としては、例えば、光沢面、粗面等が挙げられる。大きさとしては、特に制限はなく目的に応じて適宜選択することができる。
【００４８】
基板電極は、その表面に絶縁膜を被覆して基板電極の一部のみが露出するようにして、基板電極の大きさ、形状等を適宜所望の程度に調節してもよい。基板の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、一つであってもよいし、２以上であってもよい。
【００４９】
この場合の絶縁膜としては、その材質、形状、構造、厚み、大きさ等については特に制限はなく、目的に応じて公知のものの中から適宜選択することができるが、材質としては、例えば、レジスト材料が好適に挙げられる。レジスト材料としては、例えば、ｇ線レジスト、ｉ線レジスト、ＫｒＦレジスト、ＡｒＦレジスト、Ｆ２レジスト、電子線レジスト等が挙げられる。
【００５０】
基板電極の材質は導電性を有する限り特に制限はなく、目的に応じて任意に定めることができる。たとえば、金属、合金、導電性樹脂、炭素化合物、等が挙げられる。金属としては、例えば、金、白金、銀、銅、亜鉛、等が挙げられる。合金としては、例えば、前記金属として例示したものの２種以上の合金等が挙げられる。導電性樹脂としては、例えば、ポリアセチレン、ポリチオフェン、ポリピロール、ポリｐ−フェニレン、ポリフェニレンビニレン、ポリアニリン、等が挙げられる。炭素化合物としては、例えば、導電性カーボン、導電性ダイヤモンド、等が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。Ａｕに代表される貴金属は化学的に安定であり、好ましく使用できる。生体高分子を被検体として使用する場合に、基板電極への固定が容易に行えるからである。基板上には複数個の基板電極を設けてもよい。
【００５１】
特に被検体結合部を設けなくても被検体と結合し得る場合は、表面に被検体結合部を設ける必要はない。被検体がヌクレオチド体よりなり、そのチオール基を介して、Ａｕ層と直接結合できる場合を例示すると、ポリッシュしたＡｕ電極と室温で２４時間反応させて、図２に示すように、サファイア基板４上に設けたＡｕ電極（基板電極２）に、マーカー３と天然の１本鎖オリゴヌクレオチド構造を持つ感応部５と評価対象結合部６とを持つプローブ分子（マーカー３と感応部５と評価対象結合部６とから構成される部分）とターゲット分子７とが結合した状態の被検体１を挙げることができる。感応部５は伸縮する機能を有する部分を意味し、評価対象結合部６は、この場合の評価対象であるターゲット分子と結合する部分を意味する。評価対象結合部６が評価対象と特異的に結合する機能を有していれば、プローブ分子がターゲット分子７と特異的に結合することになる。１本鎖オリゴヌクレオチド構造の下部にあるＳは、プローブ分子がチオール基を介して、Ａｕ電極２と直接結合していることを表している。なお、チオール基と結合する電極表面としてＡｕ以外の公知の金属を使用することもできる。図２では、オリゴヌクレオチド鎖の末端にモノクローナルな免疫グロブリンＩｇＧのＦａｂフラグメントを、評価対象（ターゲット分子）に対して特異的に結合する性質を有する評価対象結合部６として固定してある。
【００５２】
図２の左側は被検体が伸長した状態、右側は被検体が縮まった状態を表す。縮まった状態のプローブ分子は、Ａｕ電極２と対向電極８との間に外部電場印加装置９により所定の電位差を印加することにより、伸長した状態とすることができる。
【００５３】
このとき、光照射装置１０から光１１を照射すると蛍光１２が得られる。図２では、プローブ分子と結合したターゲット分子を評価対象としている。プローブ分子そのもの（すなわち、ターゲット分子と結合する前の被検体そのもの）を評価対象とする場合には、プローブ分子にターゲット分子を結合させずに蛍光の発光／消光を評価する。
【００５４】
図２において、チオール基とマーカーとは予め１本鎖オリゴヌクレオチドに導入しておいた。チオール基とマーカーとは、１本鎖の末端に導入することが望ましく、チオール基を５’末端に導入した場合はマーカーを３’末端に導入することが好ましく、またこの反対でもよい。この例では、オリゴヌクレオチド鎖は、直径１ｍｍの円形状のＡｕ電極上に固定した。
【００５５】
基板電極の一部として被検体結合部を設ける場合、その材料としては、被検体と結合できる限り、どのようなものでもよく、例えば、被検体と化学結合または分子間力により結合できる分子を挙げることができる。被検体結合部が被検体と結合した後は、被検体結合部と被検体とよりなる部分を被検体と考えることもできる。被検体結合部が伸縮し得るものであれば、被検体結合部と結合する前の被検体が伸縮機能を有しなくてもよい。
【００５６】
なお、一般的に基板電極と被検体との結合は定量的であることが理想的であるが、結合によっては、かなり大きな解離定数を有するものもあり得る。この解離定数があまり大きいと、たとえは緩衝液での洗浄の際に、結合が徐々に減少することになる。この意味で、一般的に、基板電極と被検体との結合における解離定数が１０-5以下であることが好ましい。
【００５７】
このような基板電極を媒体である水溶液に浸漬し、水溶液中に配した対向電極との間に交流電場を印加すると、被検体が伸縮することができるようになる。
【００５８】
基板電極を基板上に設ける場合、基板電極と基板との密着性を向上させる目的で、これらの間に密着層を設けてもよい。密着層の材質、形状、構造、厚み、大きさ等については、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、材質としては、例えば、クロム、チタン等が挙げられ、構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、単層構造であってもよいし、積層構造であってもよい。
【００５９】
本発明に係る対向電極は、基板電極と対向して配置され、これらに電位を直接印加するための電極である。対向電極の形状や材料については特に制限はなく、公知の形状と公知の材料とから適宜選択することができる。たとえば、白金ワイヤ、白金板，白金コイル、金ワイヤ等を上げることができる。対向電極の数についても制限はなく複数個あってもよい。
【００６０】
被検体評価装置には、二電極法に代えて、参照電極を使用する三電極法を採用してもよい。参照電極は、基板電極と対向電極との間の電位を調整するための電極である。参照電極の形状や材料については特に制限はなく、公知の形状と公知の材料とから適宜選択することができる。たとえば、銀−塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）、水銀−塩化水銀（Ｈｇ／Ｈｇ２Ｃｌ２：飽和カロメル電極等を上げることができる。参照電極の数についても制限はなく複数個あってもよい。
【００６１】
（電圧印加手段、信号検出手段）
電圧印加手段や、信号検出手段には特に制限はなく、公知の手段から適宜選択すれば十分である。
【００６２】
電圧印加手段で与えられる交流電圧の波形には特に制限はないが、通常サイン波または矩形波が採用される。電圧値については、被検体と基板との結合を切断しないように調整された電位幅を使用することが好ましく、Ｓと基板電極との結合の場合には絶対値を０．５ Ｖ以下にすることが好ましい。ここで、「交流電圧」には直流成分が含まれていてもよい。したがって平均値が０Ｖである場合も、正の値である場合も、負の値である場合もあり得る。交流電圧の周波数についても特に制限はないが、電場のもととなる電気二重層の形成が可能な周波数帯（１ ＭＨｚ以下）が望ましい。
【００６３】
検出される信号が蛍光の場合には、蛍光を発光／消光させるための光照射手段が補助的手段として必要である。このような光照射手段としては、蛍光マーカーに対応した可視光や紫外線が使用される。
【００６４】
検出される信号が酸化還元電流の場合には、酸化還元マーカーの酸化還元電位をはさんで交流電圧を印加し、酸化還元電流を観察することが望ましい。
【００６５】
（マーカー）
被検体中におけるマーカーの数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、少なくとも一つであり、２以上であってもよい。被検体中におけるマーカーの位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、被検体が線状である場合にはその末端等が挙げられ、被検体がポリヌクレオチドである場合またはポリヌクレオチドを含む場合には、３’末端であってもよいし、５’末端であってもよい。
【００６６】
マーカーは、場合によっては評価対象の一部として共有結合により付加されていてもよいが、評価対象と結合する前の被検体（プローブ分子）の一部として共有結合により付加されていてもよく、あるいは、隣接する相補的結合の間に挿入（インタカレーション）されている例のようにヌクレオチド体等の中に含有されていてもよく、あるいはヌクレオチド体等の一部に置換により組み込まれていてもよい。マーカーは、被検体の先端の近傍に存在するようにされるのが好ましい。
【００６７】
マーカーは、基板電極と対向電極との間に交流電圧が与えられた場合に信号を発し得るものであり、本発明の趣旨に反しないものであればどのようなものでもよい。この場合の信号には、任意の物理的信号、化学的信号または生物学的信号を含めることができるが、その中でも、電磁波および酸化還元電流が好ましく、電磁波とりわけ光の作用で励起されて生じる蛍光マーカーが好ましい。
【００６８】
蛍光マーカーとしては、例えば、蛍光色素、金属、半導体ナノスフィアー、等が好適に挙げられる。
【００６９】
蛍光色素は、基板電極が金属である場合には、その金属と相互作用している間（例えば、金属の近傍に位置している間）は、吸収可能な波長の光が照射されても発光せず、金属と相互作用しなくなった時（例えば、金属とは離接している時）には、吸収可能な波長の光が照射されるとその光エネルギーにより発光可能であり、発光／消光部として特に好適に使用可能である。蛍光色素としては、特に制限はなく、目的に応じて公知のものの中から適宜選択することができるが、例えば、図６で示される化合物等が好適に挙げられる。
【００７０】
このようなマーカーとして好適に使用できるものの例を挙げると、インドカルボシアニン３（商標Ｃｙ３）などがある。
【００７１】
マーカーが酸化還元マーカーである場合は、上記信号が酸化還元電流である。このような酸化還元マーカーとしては、メチレンブルー（Ｃ１６Ｈ１８ＣｌＮ３Ｓ：図７参照）、フェロセン（Ｃ１０Ｈ１０Ｆｅ：図８参照）を挙げることができる。
【００７２】
（交流電圧の周波数の変更）
図３の被検体評価装置を用いて、得られる蛍光信号の挙動を観察した。図３は、基板４上の基板電極にマーカーの付いた被検体１が結合しており、光照射手段１０によって励起された蛍光が蛍光検出手段１３によって検出される様子を示している。
【００７３】
このような状態で印加する電圧の周波数を変更した。その様子を図４に示す。図４は、ｓｓＤＮＡ（シングルストランドのＤＮＡ）とｄｓＤＮＡ（ダブルストランドのＤＮＡ）とについて、サイン波の交流電圧を印加し、その周波数を変更したときの蛍光強度の様子を示すグラフである。この場合にはｓｓＤＮＡがプローブ分子に該当し、ｄｓＤＮＡにおける相補ＤＮＡがターゲット分子に該当する。なお、ここで蛍光強度は、交流電圧の印加により発光／消光する蛍光強度を平均した値である。
【００７４】
図４より、ｓｓＤＮＡの場合は検討範囲内では蛍光強度がわずかに減少するのに対し、ｄｓＤＮＡではある値を超えると蛍光強度が急激に増大することが判明した。これは、ｓｓＤＮＡが、立ち上がりの時間に比べ、立ち下りの時間が短いのに対して、ｄｓＤＮＡは反対に、立ち上がりの時間が立ち下りの時間より短く、従って、周波数を上げるに従って、ｓｓＤＮＡは立ち下りが優位になり、平均の蛍光強度が減少するためであろうと考えられる。反対に、ｄｓＤＮＡは立ち上がりが優位になり、平均の蛍光強度は増加する。（たとえば非特許文献５参照）。
【００７５】
この結果より、与える電圧の周波数を変更することにより、得られる信号の挙動が、被検体の種類に応じて種々変化し得ると考えることができる。このような特性を纏めて周波数特性と呼ぶことができる。
【００７６】
したがって、この周波数特性を利用すれば、別途各種のデータを集積しておくことにより、得られる信号の観察により、評価対象の有無の検出や評価対象の種類の相違の検出が可能になると考えられる。この評価対象の種類には、分子量の相違、形状の相違（たとえばバルキーな分子とそうでない分子との相違や、線状分子と枝分かれ分子との相違）、フレキシビリティの相違（ｄｓＤＮＡでのニックやスニップスの存在）、電荷の相違等を含めることができる。また、単位面積あたりに付着した被検体の量に応じて、周波数の変更に対する信号の挙動の変化が異なることが考えられるので、単位面積あたりに付着した被検体の量の定量、すなわち、被検体の濃度の定量も可能になるものと考えられる。
【００７７】
周波数の変更の仕方には特に制限はなく、適宜選択して、マーカーの有用な信号挙動が観察されるかどうかを調べればよい。図４のｄｓＤＮＡの場合のように大きな変化が予測される場合には、異なる周波数への一回の段階的な変更で十分であるときもあり得る。多段階の変更により、どの周波数でどのような信号変化が観察されるかを調べることも有用である。更に、周波数の変更を連続的に行えば、より詳細な信号の変化が得られる。
【実施例】
【００７８】
次に本発明の実施例および比較例を詳述する。
【００７９】
［実施例１］
図３に本発明の実施に必要な装置構成図を示す。図３は、基板４上の金電極（基板電極、図示せず）に、蛍光色素（蛍光ラベル、すなわちマーカー）３を分子中に有する被検体１を固定（結合）させ、この被検体分子に光ファイバー（入射光ファイバー）１０を用いて、蛍光色素が励起され、発光／消光を生じ得る波長の光を照射すると共に、蛍光色素からの発光／消光を検知する光ファイバー（受光ファイバー）１３を備えた状態の装置の一例を説明するための概略説明図である。
【００８０】
金電極には溶液電位に対して高周波駆動可能なＡＣ電源とオフセット電位印加用のＤＣ電源が接続されていた。
【００８１】
被検体として、一端にチオール基（−ＳＨ）を有し、他端に上記蛍光色素としての蛍光シアニン色素（Ｃｙ３）を有する１本鎖のＤＮＡ（４８塩基プローブＤＮＡ：ｓｓ−４８ｍｅｒ−ｐｒｏｂｅ−ＤＮＡ）を用い、非特許文献４に記載された方法によって、上記ＤＮＡを自己組織化により、金電極（２ｍｍφ）上に硫黄原子を介して固定（結合）し、金電極上に上記ＤＮＡによる分子膜を形成した。
【００８２】
ここで、ＤＮＡを固定した金電極と対向電極である白金電極との間に交流電場（サイン波、Ｅ＝−０．１５±０．２５Ｖｒｍｓ）を印加しながら、蛍光ラベルからの信号を観察した。交流電場の周波数を変化させ、１００Ｈｚの低周波から１５０ｋＨｚの高周波まで交流電場で駆動したときの蛍光ラベルの信号の平均値（ホトカウンターのシャッター開は１Hｚで行った）を記録した。測定には緩衝溶液（Ｔｒｉｓが１０ｍＭ，ＮａＣｌが５０ｍＭ，ｐＨ７．３）を使用した。結果を図４のｓｓＤＮＡとしてプロットした。
【００８３】
次に、基板に固定された上記ＤＮＡをノンラベルの相補鎖ＤＮＡと特異的にハイブリダイズさせ、２本鎖ＤＮＡを形成した。ハイブリダイゼーションの条件は、相補鎖ＤＮＡを１μＭ含んだ緩衝溶液（Ｔｒｉｓが１０ｍＭ，ＮａＣｌが２００ｍＭ，ｐＨ７．３）中で１時間保持後、相補鎖ＤＮＡを含まない緩衝溶液（Ｔｒｉｓが１０ｍＭ，ＮａＣｌが５０ｍＭ，ｐＨ７．３）にて洗浄し、この後、上記測定法と同様に交流電場の周波数を変化させて、蛍光ラベル（蛍光色素）からの信号を記録した。結果は図４のｄｓＤＮＡとしてプロットした。図４より明らかなように、ｓｓＤＮＡとｄｓＤＮＡは高周波側で全く異なった振る舞いをしていることが理解される。
【００８４】
このとき、相補鎖ＤＮＡが評価したいターゲット分子であった場合には、蛍光ラベルからの信号の駆動周波数特性を観察することにより、対象溶液中のターゲット分子の有無の検出が可能となる。この場合、ターゲット分子をラベリングする必要は無い。
【００８５】
蛍光ラベルからの信号は、ｓｓＤＮＡやｄｓＤＮＡの分子の運動特性を反映した独特のものであるため、対象ターゲットを評価する上で、他のコンタミ物質の共存による影響や非特異吸着したターゲットの誤評価等を回避できることによる、高選択性や低ノイズと言った利点がある。
【００８６】
本実施例では、蛍光ラベルからの信号の平均値としては、駆動周波数の上限値に比べて十分低い周波数であればどの周波数を用いてもよく、連続（ＤＣ）で記録してもよい。また、ＤＮＡの駆動周波数特性を１００Ｈｚから１５０ｋＨｚまで詳細に測定しているが、図４から明らかなように有意差のある任意の２点以上の周波数を観察することによってもターゲット分子の評価が可能である。また、あらかじめターゲット分子の結合前後のシグナルの変化が予想できる場合、または、予備実験により変化が既知の場合は、結合前後のシグナルを評価する必要はなく、ターゲット分子の結合に相当する実験後のみのシグナルを評価し、ターゲット分子の有無を評価することができる。
【００８７】
更に、本実施例では被検体をｓｓＤＮＡ、ターゲット分子をその相補鎖ＤＮＡとしているが、被検体と被検体−ターゲット分子結合体の駆動周波数特性に違いがあるものであれば、どのようなものでも対象となることは言うまでもない。
【００８８】
［実施例２］
図２に本発明の実施に必要な装置構成図を示す。図２は、基板４上の金電極２に、蛍光色素（蛍光ラベル、すなわちマーカー）３とターゲット分子７と特異的に結合するプローブ分子６を分子中に有する被検体１を固定（結合）させ、この被検体分子に光ファイバー（入射光ファイバー）１０を用いて、蛍光色素が励起され、発光／消光を生じ得る波長の光を照射すると共に、蛍光色素からの発光／消光を検知する光ファイバー（受光ファイバー、図示せず）を備えた状態の装置の一例を説明するための概略説明図である。
【００８９】
金電極には溶液電位に対して高周波駆動可能なＡＣ電源とオフセット電位印加用のＤＣ電源が接続されていた。
【００９０】
被検体として、一端にチオール基（−ＳＨ）を有し、他端に上記蛍光色素としての蛍光シアニン色素（Ｃｙ３）を有する１本鎖のＤＮＡ（４８塩基プローブＤＮＡ：ｓｓ−４８ｍｅｒ−ｐｒｏｂｅ−ＤＮＡ）を用い、非特許文献４に記載された方法によって、上記ＤＮＡを自己組織化により、金電極（２ｍｍφ）上に硫黄原子を介して固定（結合）し、金電極上に上記ＤＮＡによる分子膜を形成した。さらに、ターゲット分子（アンチジゴキシゲニン：ＡｎｔｉＤｉｇ）と特異的に結合するプローブ分子（ジゴキシゲニン：図９参照）を一端に有する相補鎖ＤＮＡと基板に固定された上記ＤＮＡをハイブリダイズさせ、２本鎖ＤＮＡを形成した。ハイブリダイゼーションの条件は、相補鎖ＤＮＡを１μＭ含んだ緩衝溶液（Ｔｒｉｓが１０ｍＭ，ＮａＣｌが２００ｍＭ，ｐＨ７．３）中で１時間保持後、相補鎖ＤＮＡを含まない緩衝溶液（Ｔｒｉｓが１０ｍＭ，ＮａＣｌが５０ｍＭ，ｐＨ７．３）にて洗浄し、基板上に蛍光色素とプローブ分子を有する２本鎖ＤＮＡを形成した。
【００９１】
ここで、ＤＮＡを固定した金電極と対向電極である白金電極との間に交流電場（サイン波、Ｅ＝−０．１５±０．２５Ｖｒｍｓ）を印加しながら、蛍光ラベルからの信号を観察した。交流電場の周波数を変化させ、１００Ｈｚの低周波から１５０ｋＨｚの高周波まで交流電場で駆動したときの蛍光ラベルの信号の平均値を記録した。ホトカウンターのシャッター開は１Hｚで行った。測定には緩衝溶液（Ｔｒｉｓが１０ｍＭ，ＮａＣｌが５０ｍＭ，ｐＨ７．３）を使用した。結果を図５のＡｎｔｉＤｉｇ結合前としてプロットした。
【００９２】
次に、基板に固定された上記２本鎖ＤＮＡのプローブ分子とターゲット分子を結合させた。結合の条件は、ターゲット分子を５０ｎＭ含んだ緩衝溶液（Ｔｒｉｓが１０ｍＭ，ＮａＣｌが２００ｍＭ，ｐＨ７．３）中で１時間保持後、ターゲット分子を含まない緩衝溶液（Ｔｒｉｓが１０ｍＭ，ＮａＣｌが５０ｍＭ，ｐＨ７．３）にて洗浄し、この後、上記測定法と同様に交流電場の周波数を変化させて、蛍光ラベル（蛍光色素）からの信号を記録した。結果は図５のＡｎｔｉＤｉｇ結合後としてプロットした。図５より明らかなように、ターゲット結合前と結合後は高周波側で全く異なった振る舞いをしていることが理解される。
【００９３】
このとき、蛍光ラベルからの信号の駆動周波数特性を観察することにより、対象溶液中のターゲット分子の有無の検出が可能となる。この場合、ターゲット分子をラベリングする必要は無い。
【００９４】
蛍光ラベルからの信号は、ターゲット結合前後の分子の運動特性を反映した独特のものであるため、対象ターゲットを評価する上で、他のコンタミ物質の共存による影響や非特異吸着したターゲットの誤評価等を回避できることによる、高選択性や低ノイズと言った利点がある。
【００９５】
本実施例では、蛍光ラベルからの信号の平均値として、駆動周波数の上限値に比べて十分低い周波数であればどの周波数を用いてもよく、連続（ＤＣ）で記録してもよい。また、ＤＮＡの駆動周波数特性を１００Ｈｚから１５０ｋＨｚまで詳細に測定しているが、図４から明らかなように有意差のある任意の２点以上の周波数を観察することによってもターゲット分子の評価が可能である。また、あらかじめターゲット分子の結合前後のシグナルの変化が予想できる場合、または、予備実験により変化が既知の場合は、結合前後のシグナルを評価する必要はなく、ターゲット分子の結合に相当する実験後のみのシグナルを評価し、ターゲット分子の有無を評価することができる。
【００９６】
更に、本実施例では被検体をジゴキシゲニン付きＤＮＡ、ターゲット分子をアンチジゴキシゲニンとしているが、被検体と被検体−ターゲット分子結合体の駆動周波数特性に違いがあるものであれば、どのようなものでも対象となることは言うまでもない。
【００９７】
なお、上記に開示した内容から、下記の付記に示した発明が導き出せる。
【００９８】
（付記１）  基板上に設けられた基板電極と対向電極との間に交流電圧を与えて、当該基板電極上に結合した被検体に備えられたマーカーから得られる信号の観察により、当該被検体を評価する被検体評価方法であって、
前記交流電圧の周波数を変更して前記マーカーの信号の平均値の挙動を観察する、被検体評価方法。
【００９９】
（付記２）  前記被検体が、前記マーカーを備えたプローブ分子と当該プローブ分子に特異的に結合したターゲット分子とを含む、付記１に記載の被検体評価方法。
【０１００】
（付記３）  前記周波数の変更が、少なくとも一つの異なる周波数への段階的な変更である、付記１または２に記載の被検体評価方法。
【０１０１】
（付記４）  前記周波数の変更が連続的な変更である、付記１〜３のいずれかに記載の被検体評価方法。
【０１０２】
（付記５）  前記交流電圧の電圧値の段階的または連続的な変更を含む、付記１〜４のいずれかに記載の被検体評価方法。
【０１０３】
（付記６）  前記交流電圧の波形がサイン波または矩形波である、付記１〜５のいずれかに記載の被検体評価方法。
【０１０４】
（付記７）  異なるターゲット分子を結合させた被検体について、それぞれ事前に前記観察を行い、その比較により被検体を評価する、付記２〜６のいずれかに記載の被検体評価方法。
【０１０５】
（付記８）  前記被検体がプラスまたはマイナスに帯電し得る、付記１〜７のいずれかに記載の被検体評価方法。
【０１０６】
（付記９）  前記交流電圧の印加により、前記マーカーと前記基板電極との距離が変化する、付記１〜８のいずれかに記載の被検体評価方法。
【０１０７】
（付記１０）  前記マーカーが蛍光マーカーであり、前記信号が当該蛍光マーカーの発光／消光である、付記１〜９のいずれかに記載の被検体評価方法。
【０１０８】
（付記１１）  前記マーカーが酸化還元マーカーであり、前記信号が当該酸化還元電流である、付記１〜９のいずれかに記載の被検体評価方法。
【０１０９】
（付記１２）  前記被検体が、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、天然または人工の１本鎖のヌクレオチド体、天然または人工の２本鎖のヌクレオチド体、アプタマー、抗体を蛋白質分解酵素で限定分解して得られる産物、蛋白質に対して親和性を有する有機化合物、蛋白質に対して親和性を有する生体高分子、これらの複合体、プラスまたはマイナスに帯電したイオン性ポリマーおよびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選ばれた少なくとも一つの物質を含んでなる、付記１〜１１のいずれかに記載の被検体評価方法。
【０１１０】
（付記１３）  前記被検体が、天然または人工の１本鎖のヌクレオチド体、あるいは、天然または人工の２本鎖のヌクレオチド体を含んでなる、付記１２に記載の被検体評価方法。
【０１１１】
（付記１４）  前記被検体が、抗体のＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメントを含んでなる、付記１２に記載の被検体評価方法。
【０１１２】
（付記１５）  前記被検体が、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧ抗体のＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメントに由来する断片を含んでなる、付記１２に記載の被検体評価方法。
【０１１３】
（付記１６）  前記被検体がアプタマーを含んでなる、付記１２に記載の被検体評価方法。
【０１１４】
（付記１７）  前記被検体が、チオール基を介して前記基板電極と結合したものである、付記１〜１６のいずれかに記載の被検体評価方法。
【０１１５】
（付記１８）  前記ターゲット分子が、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは抗体である、付記１〜１７のいずれかに記載の被検体評価方法。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１−Ａ】被検体の挙動を示す模式図である。
【図１−Ｂ】被検体の挙動を示す模式図である。
【図１−Ｃ】被検体の挙動を示す模式図である。
【図２】被検体の各部位の挙動を示す被検体評価装置の模式図である。
【図３】実施例で使用した被検体評価装置の模式図である。
【図４】交流電圧の周波数を変更した場合におけるマーカーの信号挙動を示すグラフである。
【図５】実施例２における、交流電圧の周波数を変更した場合のマーカーの信号挙動を示すグラフである。
【図６】蛍光色素の一例としてＣｙ３の構造を示す図である。
【図７】酸化還元マーカーの一例としてメチレンブルーの構造を示す図である。
【図８】酸化還元マーカーの一例としてフェロセンの構造を示す図である。
【図９】実施例２に記載のジゴキシゲニンの構造を示す図である。
【符号の説明】
【０１１７】
１    被検体
２    基板電極
３    マーカー
４    基板
５    感応部
６    評価対象結合部
７    ターゲット分子
８    対向電極
９    外部電場印加装置
１０  光照射装置
１１  光
１２  蛍光
１３  蛍光検出手段
【図１−Ａ】
0005584954.tif 000002
【図１−Ｂ】
0005584954.tif 000003
【図１−Ｃ】
0005584954.tif 000004
【図２】
0005584954.tif 000005
【図３】
0005584954.tif 000006
【図４】
0005584954.tif 000007
【図５】
0005584954.tif 000008
【図６】
0005584954.tif 000009
【図７】
0005584954.tif 000010
【図８】
0005584954.tif 000011
【図９】
0005584954.tif 000012