(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）：
【化１】
0005392528.tif 000023
（式中、Ｌは下記式（３）：
【化３】
0005392528.tif 000024
（式中、ｍは１〜５の整数である。）で示される親水性スペーサーであり、ＸはＯまたはＳであり、Ｒ１は−ＯＨまたは−ＮＨＣＯＣＨ３であり；Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して水素原子または下記式（２）：
【化２】
0005392528.tif 000025
で示されるシアル酸残基（式中、−ＣＯＯＭは、−ＣＯＯＨまたはその生理的に許容される塩であり、Ａｃはアセチル基を意味する。）である。）
で表されるラクトース誘導体を含む無機系多孔質体であって、
該ラクトース誘導体の末端アミノ基にアミド結合するカルボキシル基を含め、総カルボキシル基が１ｇ当たり０．２５ｍｍｏｌ以上、表面又は細孔内面に結合し、かつ該ラクトース誘導体が１ｇ当たり０．００５ｍｍｏｌ以上結合した該無機系多孔質体を流路の少なくとも一部に充填する工程、
該ラクトース誘導体と特異的に結合する毒素またはウィルスを含む汚染液を、該無機系多孔質体が充填された流路に流下させる工程を含み、
該汚染液中の毒素またはウィルスを該無機系多孔質体のラクトース誘導体に固定することにより該汚染液から固相抽出および除去する、汚染液の毒素またはウィルスの固相抽出方法および無毒化方法。
【請求項２】
前記Ｒ２および前記Ｒ３が水素原子である、請求項１に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
【請求項３】
前記Ｒ２がシアル酸残基であり、前記Ｒ３が水素原子である、請求項１に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
【請求項４】
前記Ｒ２が水素原子であり、前記Ｒ３がシアル酸残基である、請求項１に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
【請求項５】
前記毒素がリシン６０である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
【請求項６】
前記ウィルスがサーズウィルス、またはインフルエンザウィルスである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
【請求項７】
前記ラクトース誘導体のアミノ基とアミド結合していない前記無機系多孔質体上の遊離のカルボキシル基がエンドキャップ処理された、請求項１〜６のいずれか一項に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
【請求項８】
前記無機系多孔質体が、３次元網目状に連続した孔径０．５〜５００μmの貫通孔と、無機系多孔質体の表面および該貫通孔の内壁面に形成された孔径０〜４００ｎｍの細孔とを有し、骨格径が５００ｎｍ以上のモノリス型シリカゲルである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
【請求項９】
前記汚染液が、使用済み洗浄液である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
【請求項１０】
下記一般式（１）：
【化４】
0005392528.tif 000026
（式中、Ｌは下記式（３）：
【化６】
0005392528.tif 000027
（式中、ｍは１〜５の整数である。）で示される親水性スペーサーであり、ＸはＯまたはＳであり、Ｒ１は−ＯＨまたは−ＮＨＣＯＣＨ３であり；Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して水素原子または下記式（２）：
【化５】
0005392528.tif 000028
で示されるシアル酸残基（式中、−ＣＯＯＭは、−ＣＯＯＨまたはその生理的に許容される塩であり、Ａｃはアセチル基を意味する。）である。）
で表されるラクトース誘導体の末端アミノ基とアミド結合したカルボキシル基を含め、総カルボキシル基が表面又は細孔内面に１ｇ当たり少なくとも０．２５ｍｍｏｌ以上結合し、かつ該ラクトース誘導体が１ｇ当たり０．００５ｍｍｏｌ以上結合した無機系多孔質体を含む、毒素またはウィルス含有汚染液用の固相抽出用捕集剤および除染剤。
【請求項１１】
前記Ｒ２および前記Ｒ３が水素原子である、請求項１０に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
【請求項１２】
前記Ｒ２がシアル酸残基であり、前記Ｒ３が水素原子である、請求項１０に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
【請求項１３】
前記Ｒ２が水素原子であり、前記Ｒ３がシアル酸残基である、請求項１０に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
【請求項１４】
前記毒素がリシン６０である、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
【請求項１５】
前記ウィルスがサーズウィルス、またはインフルエンザウィルスである、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
【請求項１６】
前記ラクトース誘導体のアミノ基とアミド結合していない前記無機系多孔質体上の遊離のカルボキシル基がエンドキャップ処理された、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
【請求項１７】
前記無機系多孔質体が、３次元網目状に連続した孔径０．５〜５００μmの貫通孔と、無機系多孔質体の表面および該貫通孔の内壁面に形成された孔径０〜４００ｎｍの細孔とを有し、骨格径が５００ｎｍ以上のモノリス型シリカゲルである、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
【請求項１８】
前記汚染液が、使用済み洗浄液である、請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトース誘導体で修飾された無機系多孔質体を利用した毒素またはウィルス含有汚染液の固相抽出方法および無毒化方法、並びに毒素またはウィルス含有汚染液用固相抽出用捕集剤および除染剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
東京地下鉄サリン事件、合衆国郵便物炭疽菌事件発生以来、化学剤や生物剤（生物化学剤）を用いたテロは顕在化し、またこれらに類する危険物質による災害、感染症流行の可能性が高まっている。テロや大規模災害に対処するための行政の危機管理の取り組みにおいて、危険物質の検知・モニタリング、適切な解毒・治療を行うために危険物質を特定する迅速分析手法が重要となるが、併せて被害の最小化を目的とした危険物質からの防護、除染を的確に実施することが求められている。
【０００３】
ところで、毒素タンパク質として知られるリシンは、トウゴマ（ヒマ：Ricinus communis）の種子から抽出され、２種の構造的に関連した蛋白質の混合物として得られる。一つは分子量が６０ｋＤａのリシン６０、他の一つはリシン６０とホモロジーが約９０％と極めて類似なタンパク質の２量体である分子量１２０ｋＤａのリシン１２０である。
【０００４】
分子量６０ｋＤａのリシン６０の場合、Ａ鎖（分子量２８ｋＤａ）とＢ鎖（分子量３２ｋＤａ）の２つのサブユニットで構成され、両鎖は−Ｓ−Ｓ−結合でつながっている。Ｂ鎖は、細胞表面の糖鎖（ラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン）に結合し、−Ｓ−Ｓ−結合を還元した後、エンドサイトーシスによって、Ａ鎖を細胞の中に取り込む。Ａ鎖は、２８ＳリボソームＲＮＡに作用し、Ａ４３２４を加水分解することで、タンパク質の生合成を阻害し、細胞を死滅させる。このような性質を持つリシン６０は、３〜５μｇ／ｋｇ（吸引）投与量で死に至らしめる強力な毒素である。
【０００５】
これまでのところ、リシンを利用したテロ発生現場等において有効に利用できる除染方法や除染剤はほとんど存在しないが、その一方で、当該毒素を特異的に検出する方法として、ラクトース含有セラミド化合物およびガラクトース含有セラミド化合物を利用したものが知られている（特許文献１、２）。
【０００６】
また、新型肺炎（ＳＡＲＳ（サーズ）；Severe Acute Respiratory Syndrome）は、２００３年に中国、台湾、カナダで流行した。この感染症は、ＳＡＲＳコロナウィルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）によるもので、死亡率は１０％以上に達する。ＳＡＲＳ−ＣｏＶの表面には、スパイクタンパク質とよばれるタンパク質が多数存在しており、このスパイクタンパク質がホスト細胞上の特定のレセプターと結合して感染が始まると考えられている。このウィルスは、発見後歴史が新しく、ヒトＳＡＲＳウィルスのレセプターに関しても現段階では不明な点が多い。サーズウィルスの検出方法、吸着剤としては、サーズウィルスの表面に存在するスパイクタンパク質と結合しうる糖鎖化合物を利用するものなどが知られている（特許文献３、４）。
【０００７】
一方、トリインフルエンザやＨ５Ｎ１型のインフルエンザといった新興感染症の発生も危惧されている。これらのインフルエンザウィルスは、ウィルス表面のヘマグルチニンが、細胞表層の特定の糖鎖に結合することが知られている（非特許文献１）。しかしながら、有効なワクチン開発は発展途上であり、インフルエンザの流行を確実に阻止する手段は知られていない。
【０００８】
多くの感染性因子である生物毒素や細菌、ウィルスは、糖鎖を認識して結合し感染することが知られており、この感染機構を材料工学的に応用して糖複合体を分子認識ツールとして活用できるものと考えられる。そのため、上記の他にも特異な糖鎖が化学的に独自に合成され（非特許文献１、２）、腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７の生産するベロ毒素（非特許文献３−８）や狂牛病の異常プリオン蛋白質の増殖を効果的に抑制する方法、除去する方法（特許文献５、非特許文献９）などが報告されている。
【０００９】
一方、物質を分析あるいは除去する技術として、クロマトグラフィーの分離原理があり、吸着、分配、イオン交配、サイズ排除、生物学的アフィニティーなどが知られている。クロマトグラフィー用充填剤としては、シリカゲルが一般的であり、粒子状充填剤の粒径は、数μｍ〜数十μｍが広く使用され、粒子表面上には無数の細孔が存在する。
【００１０】
クロマトグラフィーを利用した、タンパク質等の吸着剤としては、シリカゲルなど無機系多孔質体を利用できることが知られている。具体的には、例えば無機系多孔質の連続構造体であるモノリス型シリカゲル構造体をピペットチップ等のデバイスの通液孔に固定させ、反応液をピペッティングし活性基を修飾させると共に、ピペッティングによりリガンドを固定するアフィニティクロマトグラフィ用デバイスの製法（特許文献６）や、モノリス型シリカゲル構造体の通孔に対応する大きさの核酸を吸着させ、洗浄液で洗浄後、溶出させるＤＮＡの分離精製方法（特許文献７、８）などが報告されている。また、無機系多孔質体を用い、クロマトグラフィー分析のための固相抽出用捕集剤として利用することが報告されている（特許文献９）。
モノリス型シリカゲルは、最近、粒子状充填剤を用いたクロマトグラフィー分離カラムを上回る性能を発揮することが知られている（非特許文献１０）。
【００１１】
固相抽出法とは、対象目的物質を固相捕集剤と相互作用させて選択的に単離・精製・濃縮を行う手法である。固相に対象物質を捕集する場合、妨害物を捕集して除去する場合、また段階的に分離溶出させる場合とがある。カラムから目的成分を回収する際は、なるべく希釈しないように次の操作に適した溶媒で抽出する。機器分析の前処理にかぎらず、細胞からの核酸の抽出や、固相上での医薬品の合成と抽出など薬学、臨床医学、食品分析、有機合成、環境分析など広範囲に利用されている。（非特許文献１１）
【特許文献１】国際公開第２００５／０７５４９３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００７／０１５３７７号パンフレット
【特許文献３】特開２００６−３４７９０８号公報
【特許文献４】特開２００６−３４７９０９号公報
【特許文献５】国際公開第２００５／０７７３８２号パンフレット
【特許文献６】特開２００５−３４５３７９号公報
【特許文献７】特開２００５−２２４１６７号公報
【特許文献８】国際公開第２００５／０７８０８８号パンフレット
【特許文献９】国際公開第２００２／０８６４８８号パンフレット
【非特許文献１】Angew. Chem. Int. Ed., Vol.41 (No.23), P.4463、2002年
【非特許文献２】Biomacromolecules, Vol.1、P.68, 2000年
【非特許文献３】ChemBioChem, Vol.8、P.2117, 2007年
【非特許文献４】Tetrahedron, Vol.61、P.5895, 2005年
【非特許文献５】Trends in Glycoscience and Glycotechnology, Vol.17 (No.95), P107、2005
【非特許文献６】Bioorg. Med. Chem., Vol.7、P.2053, 1999年
【非特許文献７】Tetrahedron Lett., Vol.39、P.8681, 1998年
【非特許文献８】Biomacromolecules, Vol.3、P.411, 2002年
【非特許文献９】BBRC, Vol.349、P.485, 2006年
【非特許文献１０】ぶんせき、１０、ｐ５７６、２００４年
【非特許文献１１】分離分析化学辞典、朝倉書店、ｐ１６５、２００１年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
生物化学剤を用いたテロや感染症流行の対策として、現状では、ＨＥＰＡフィルター、次亜塩素酸塩、アルデヒド、短波長電磁波、酸化剤（過酸化水素、過酢酸）、界面活性剤などが用いられている。しかしながら、これらの試薬は毒性が強く、また環境負荷が大きく、除染が完了するまでに長時間を要し、効果の持続性がない等の深刻な問題点が浮き彫りにされている。
さらに、これらの試薬は、非特異的で無害な一般物質にまで作用するため、除染効率は非常に低いものであり、生物化学テロ事案発生時や感染症流行時の現場事後管理を適切に行えるとは言い難い。
【００１３】
また、上記の文献などに開示された糖鎖化合物あるいは糖鎖ポリマーは、主にバイオセンサーの検出における特異性の証明に用いられており、生物化学剤を用いたテロや大規模災害発生時や感染症流行時に散布等された大量の毒素やウィルスを効率的に処理するための現場除染システムとして、必ずしも開発されたものではないし、また、言及もされていない。
【００１４】
さらに、無機系多孔質体に係る上記文献には、無機系多孔質体の生物化学兵器に対する固相抽出用捕集剤および除染技術への応用について何の示唆も与えていなかった。
【００１５】
従って、本発明は、このような問題点を解決すべく、周囲環境に悪影響を与えることなく、人体に有害な毒素やウィルスを迅速に無毒化する方法、並びに該毒素やウィルスの固相抽出用捕集剤および除染剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは前記課題を解決するために鋭意研究した結果、親水性スペーサーを介し高密度に糖鎖を導入した無機系多孔質体が、毒素やウィルスを特異的に吸着し、生物化学テロ事案発生時や感染症流行時における毒素やウィルスの分析システムや現場除染システムに有効に利用できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち本発明は以下を含む。
〔１〕下記一般式（１）
【化１】
0005392528.tif 000002
（式中、Ｌは親水性スペーサーであり、ＸはＯまたはＳであり、Ｒ１は−ＯＨまたは−ＮＨＣＯＣＨ３であり；Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して水素原子または下記式（２）
【化２】
0005392528.tif 000003
で示されるシアル酸残基（式中、−ＣＯＯＭは、−ＣＯＯＨまたはその生理的に許容される塩であり、Ａｃはアセチル基を意味する。）である。）
で表されるラクトース誘導体を含む無機系多孔質体であって、
該ラクトース誘導体の末端アミノ基にアミド結合するカルボキシル基を含め、総カルボキシル基が１ｇ当たり０．２５ｍｍｏｌ以上、表面又は細孔内面に結合した該無機系多孔質体を流路の少なくとも一部に充填する工程、
該ラクトース誘導体と特異的に結合する毒素またはウィルスを含む汚染液を、該無機系多孔質体が充填された流路に流下させる工程を含み、
該汚染液中の毒素またはウィルスを該無機系多孔質体のラクトース誘導体に固定することにより該汚染液から固相抽出および除去する、汚染液の毒素またはウィルスの固相抽出方法および無毒化方法。
〔２〕  前記Ｒ２および前記Ｒ３が水素原子である、〔１〕に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
〔３〕  前記Ｒ２がシアル酸残基であり、前記Ｒ３が水素原子である、〔１〕に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
〔４〕  前記Ｒ２が水素原子であり、前記Ｒ３がシアル酸残基である、〔１〕に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
〔５〕  前記Ｌが下記式（３）
【化３】
0005392528.tif 000004
（式中、ｍは１〜５の整数である。）で示される基である、〔１〕〜〔４〕のいずれか一項に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
〔６〕  前記毒素がリシン６０である、〔１〕〜〔５〕のいずれか一項に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
〔７〕  前記ウィルスがサーズウィルス、またはインフルエンザウィルスである、〔１〕〜〔５〕のいずれか一項に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
〔８〕  前記ラクトース誘導体のアミノ基とアミド結合していない前記無機系多孔質体上の遊離のカルボキシル基がエンドキャップ処理された、〔１〕〜〔７〕のいずれか一項に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
〔９〕  前記無機系多孔質体が、３次元網目状に連続した孔径０．５〜５００μmの貫通孔と、無機系多孔質体の表面および該貫通孔の内壁面に形成された孔径０〜４００ｎｍの細孔とを有し、骨格径が５００ｎｍ以上のモノリス型シリカゲルである、〔１〕〜〔８〕のいずれか一項に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
〔１０〕  前記汚染液が、使用済み洗浄液である、〔１〕〜〔９〕のいずれか一項に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
〔１１〕  下記一般式（１）
【化４】
0005392528.tif 000005
（式中、Ｌは親水性スペーサーであり、ＸはＯまたはＳであり、Ｒ１は−ＯＨまたは−ＮＨＣＯＣＨ３であり；Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して水素原子または下記式（２）
【化５】
0005392528.tif 000006
で示されるシアル酸残基（式中、−ＣＯＯＭは、−ＣＯＯＨまたはその生理的に許容される塩であり、Ａｃはアセチル基を意味する。）である。）
で表されるラクトース誘導体の末端アミノ基とアミド結合したカルボキシル基を含め、総カルボキシル基が表面又は細孔内面に１ｇ当たり少なくとも０．２５ｍｍｏｌ以上結合した無機系多孔質体を含む、毒素またはウィルス含有汚染液用の固相抽出用捕集剤および除染剤。
〔１２〕  前記Ｒ２および前記Ｒ３が水素原子である、〔１１〕に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
〔１３〕  前記Ｒ２がシアル酸残基であり、前記Ｒ３が水素原子である、〔１１〕に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
〔１４〕  前記Ｒ２が水素原子であり、前記Ｒ３がシアル酸残基である、〔１１〕に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
〔１５〕  前記Ｌが下記式（３）
【化６】
0005392528.tif 000007
（式中、ｍは１〜５の整数である。）で示される基である、〔１１〕〜〔１４〕のいずれか一項に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
〔１６〕  前記毒素がリシン６０である、〔１１〕〜〔１５〕のいずれか一項に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
〔１７〕  前記ウィルスがサーズウィルス、またはインフルエンザウィルスである、〔１１〕〜〔１５〕のいずれか一項に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
〔１８〕  前記ラクトース誘導体のアミノ基とアミド結合していない前記無機系多孔質体上の遊離のカルボキシル基がエンドキャップ処理された、〔１１〕〜〔１７〕のいずれか一項に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
〔１９〕  前記無機系多孔質体が、３次元網目状に連続した孔径０．５〜５００μmの貫通孔と、無機系多孔質体の表面および該貫通孔の内壁面に形成された孔径０〜４００ｎｍの細孔とを有し、骨格径が５００ｎｍ以上のモノリス型シリカゲルである、〔１１〕〜〔１８〕のいずれか一項に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
〔２０〕  前記汚染液が、使用済み洗浄液である、〔１１〕〜〔１９〕のいずれか一項に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
【００１８】
本発明に係る「親水性スペーサー」とは、一般式（１）で示されるラクトース誘導体のＸ原子と２−アミノエチル基とを結合することができ、親水性を示す任意の原子団のことをいう。
【００１９】
本発明に係る「無機系多孔質体」とは、シリカやチタンなどの無機系材料を利用した粒子状またはモノリス型の多孔質材料であり、クロマトグラフィー用分離カラムの充填剤などに利用される。
【００２０】
本発明に係る「総カルボキシル基」とは、前記無機系多孔質体上に存在する、前記ラクトース誘導体と結合したカルボキシル基、及び前記無機系多孔質体と前記ラクトース誘導体とが結合していない遊離のカルボキシル基との合計のカルボキシル基をいう。
【００２１】
本発明に係る「無機系多孔質体表面」とは、無機系多孔質体の最外面をいい、「細孔内面」とは、無機系多孔質体内部に存在する微少開孔あるいは微少な開空隙の表面をいう。
【００２２】
本発明に係る「毒素またはウィルスを含む汚染液」、及び「毒素またはウィルス含有汚染液」とは、毒素またはウィルスを少なくとも１種以上含み、該毒素またはウィルスが無毒化あるいは除染処理されていない液のことをいう。
【００２３】
本発明に係る「モノリス型シリカゲル」とは、前記無機系多孔質体のうち、上端から下端まで３次元網目状に連通した貫通孔（スルーポア）と、無機系多孔質体の表面、及び貫通孔の内壁面に形成された細孔（メソポア）とを有する一体型多孔質体のことをいう。
ここで一体型多孔質体とは、３次元網目構造状の骨格と空隙（貫通孔）とが一体となった無機系多孔質体をいい、必ずしも骨格内に細孔（メソポア）を有しなくてもよい。
【００２４】
本発明に係る「固相抽出用捕集剤」とは、生物化学兵器として使用され得る毒素またはウィルスを固相抽出法により濃縮した、分析用前処理を目的とする組成物のことをいう。
【００２５】
本発明に係る「除染剤」とは、生物化学兵器として使用され得る毒素またはウィルスの無毒化あるいは除染を目的とする、組成物のことをいう。
【発明の効果】
【００２６】
本発明は、毒素またはウィルスと特異的に結合可能なラクトース糖鎖部分、あるいはシアリルラクトース糖鎖部分を親水性スペーサーを介して高密度に導入した無機系多孔質体からなる充填層に、毒素またはウィルスを含有する汚染液を流下させることにより、毒素またはウィルスを効率的かつ迅速に固相抽出（濃縮）および除染（無毒化する）ことが可能である。また、本発明に係るラクトース誘導体修飾無機系多孔質体を用いた固相抽出方法および無毒化方法、並びに固相抽出用捕集剤および除染剤は、使用の際、周辺環境に悪影響を与えることがない。
したがって、本発明に係る固相抽出方法および無毒化方法、並びに固相抽出用捕集剤および除染剤は、生物化学剤を用いたテロや感染症流行時に散布等された、大量の毒素やウィルスを迅速分析するための固相抽出用捕集剤および効率的に処理するための現場除染システムとして有効である。
【００２７】
〔発明を実施するための形態〕
本発明に係る毒素またはウィルスの無毒化に用いることができる無機系多孔質体は、下記一般式（１）
【化７】
0005392528.tif 000008
で表されるラクトース誘導体の末端アミノ基とアミド結合したカルボキシル基を少なくとも含む。
【００２８】
式中、Ｒ１は、−ＯＨまたは−ＮＨＣＯＣＨ３である。無毒化の対象となる毒素がリシンの場合には、−ＯＨが好ましく、無毒化の対象となるウィルスがサーズウィルスの場合には、サーズウィルス表面に存在するスパイクタンパク質との結合が強いＮＨＣＯＣＨ３が好ましい。また、インフルエンザウィルスの場合には、−ＯＨが好ましい。
【００２９】
本明細書において「リシン」という場合は、「リシン６０」および「リシン１２０」の両方を意味することがあるが、主に「リシン６０」を指す。また、「スパイクタンパク質」とは、コロナウィルスに特異的なタンパク質である。このスパイクタンパク質は、サーズウィルス（サーズウィルスは、コロナウィルスに属する）の膜表面に存在する突起状のタンパク質である。これは、Ｓ１サブユニットとＳ２サブユニットから構成される（Clinical Immunology, 113, 145-150, 2004）。また、ホスト細胞に感染する（結合する）ために必要なタンパク質である（感染機構の詳細は、Trend in Microbiology, 12, 466-472 (2004)に掲載されている。）。
【００３０】
式中、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して水素原子または下記式（２）
【化８】
0005392528.tif 000009
で示されるシアル酸残基（式中、−ＣＯＯＭは、−ＣＯＯＨまたはその生理的に許容される塩）である。無毒化の対象となる毒素がリシンの場合には、Ｒ２およびＲ３は、いずれも水素原子が好ましい。また、無毒化の対象となるウィルスがサーズウィルス、またはインフルエンザウィルスの場合には、Ｒ２およびＲ３のいずれか一方が上記式（２）で示されるシアル酸残基であり、残りの一方が水素原子であることが好ましい。
【００３１】
前記式（２）で示されるシアル酸残基における−ＣＯＯＭが、その生理的に許容される塩である場合、その塩の形態は特に限定されず、例えば、無機塩基塩、有機塩基塩などが挙げられる。
【００３２】
無機塩基塩の好ましい例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられ、有機塩基塩の好ましい例としては、例えばジエチルアミン塩、ジエタノールアミン塩、メグルミン塩、Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン塩、トリメチルアミン塩、ピリジニウム塩などが挙げられる。
【００３３】
Ｌは、親水性スペーサーを示す。このような親水性スペーサーとして具体的には、下記式（３）
【化９】
0005392528.tif 000010
（式中、ｍは１〜５の整数を示す。）で表されるポリエチレングリコール由来の２価の基、デキストラン由来の２価の基などが挙げられる。これらのうちでは、ｍが２、３または４である基が好ましい。
【００３４】
本発明に係る親水性スペーサーを有するラクトース誘導体と無機系多孔質体とを結合させた場合には、疎水性スペーサーを介した場合やスペーサーを介さない場合と比べて、きわめて高精度にリシンやサーズウィルスなどの病原体を結合あるいは捕捉できるため、毒素またはウィルスの固相抽出および無毒化に有効に使用することができる。
【００３５】
式中、Ｘは酸素原子または硫黄原子を示す。これらのうちでは、酸素原子が好ましい。
【００３６】
本発明に係る無機系多孔質体としては、ガラス又はガラスセラミックス、好ましくはシリカＳｉＯ２などの無機物、あるいは無機物に有機物を含有するハイブリッド体からなり、微少細孔あるいは微少な空隙を有する多孔質体などが挙げられる。
ハイブリット体とは、具体的にはメチル基やフェニル基など有機基がケイ素やチタンなどに結合した金属酸化物のことである。
【００３７】
このような無機系多孔質体は、毒素またはウィルスを含む汚染溶液の流速あるいは流量を確保し、効率的に汚染液を流下させる観点から、上端から下端まで３次元網目状に連続した孔径０．５〜５００μm、好ましくは０．５〜５０μｍの貫通孔（スルーポア）と、無機系多孔質体の表面、及び該貫通孔の内壁面に形成された孔径０〜４００ｎｍ、好ましくは１０〜１００ｎｍの細孔（メソポア）とを有し、骨格径が５００ｎｍ以上であるモノリス型シリカゲルが好ましい。
なお、本明細書において骨格径とは、三次元網目構造を構成している骨格の太さをいう。
モノリス型シリカゲルの電子顕微鏡写真を図１に示す。
【００３８】
また、モノリス型シリカゲルの空隙率は、好ましくは２０〜９０％、より好ましくは６０〜９０％であり、全気孔中の細孔の占める容積率が、好ましくは１０％以上、より好ましくは３０％以上である。また、無機系多孔質体１ｇあたりの細孔の全容積は、１０ｍ３／ｔ以下であることが機械的強度を保つために好ましい。かかる貫通孔や細孔の孔径や全容積は、標的とする毒素やウィルスの種類、および汚染液溶媒の種類などに応じて、適宜選択することができるが、リシンの場合、貫通孔が０．５μｍ〜５０μｍ、細孔が５ｎｍ〜１００ｎｍ、全容積が３ｍ３／ｔ以下であることが好ましい。
【００３９】
このようなモノリス型シリカゲルの具体的なものとしては、ジーエルサイエンス社から商品名「ＭｏｎｏＴｉｐ（登録商標）」や「ＭｏｎｏＣａｐ（登録商標）」の下で入手できるモノリスが挙げられる。
【００４０】
また、例えば特開２００５−３４５３７９号公報や特開２００５−２２４１６７号公報、国際公開第２００５／０７８０８８号パンフレットに記載された製法により製造されたモノリスを使用することもできる。
具体的には、例えば、まず１００ｎｍ以上の巨大空孔となる溶媒リッチ相を持つゾルをゾルーゲル法によって作製し、そのバルク状ゲルを粉砕せずに様々な組成を持つ水溶液に浸漬することにより、巨大空孔の内壁が最大２０ｎｍ程度の狭い細孔分布を持った、二重気孔の多孔質体に変化させることにより製造されたものを利用できる。
【００４１】
本明細書における「カルボキシル基修飾無機系多孔質体（以下、本明細書においてカルボキシル基修飾体という場合がある。）」とは、前記無機系多孔質体の表面または細孔内部にカルボキシル基が共有結合した無機系多孔質体をいう。このカルボキシル基修飾体は、前記ラクトース誘導体を高密度に結合させる観点から、１ｇあたり少なくとも０．２５ｍｍｏｌ以上のカルボキシル基を有することが好ましく、０．５ｍｍｏｌ以上のカルボキシル基を有することがより好ましい。
【００４２】
カルボキシル基修飾体としては、例えば、前記モノリス型シリカゲルにアミノ基やエポキシ基を導入する場合と同様に、カルボキシル基を有するシランカップリング剤を用いる方法や、酸無水物を有するシランカップリング剤を修飾後、加水分解によって調整した、カルボキシル基が共有結合したカルボキシル基修飾モノリス型シリカゲルを好ましく用いることができる。また、このカルボキシル基修飾モノリス型シリカゲルは、例えば特許第２８９３１０４号公報などに記載された以下の方法により製造されたものを利用することもできる。
「ホルムアミドあるいは水溶性高分子等の共存物質を酸性水溶液に溶かし、それに金属・炭素結合を介して結合した非加水分解性の有機官能基と加水分解性の官能基を有する有機金属化合物を添加して加水分解反応を行う。なお、共存物質が高分子成分の場合、混合時から均一状態になるまでに長時間を要するため、あらかじめ溶媒に高分子を溶解あるいは分散させておくのが望ましい、ホルムアミドなどの低分子成分のみを共存物質として含む系の場合にはその必要がないので、共存物質及び有機金属化合物を同時に混合して、加水分解してもよい。
そうすると、系のゾル−ゲル転移と重合反応に起因する溶媒相とゲル構成成分との相分離がほぼ同時に起こるような原料組成・温度を選んだ場合にのみ、溶媒リッチ相と骨格相とに分離したゲルが生成する。
「ゾル−ゲル転移と相分離がほぼ同時に起こるような原料組成・温度」の一般的な範囲は定かでないが、高分子成分を用いる場合と、極性溶媒のみを用いる場合に大別すると、およそ次のような範囲となる。高分子成分を用いる場合、重量基準で、高分子成分０〜３０％、金属アルコキシド２０〜７０％、溶媒０〜６０％、加水分解のための水（触媒を含む）５〜５０％の組成とし、０℃程度から、溶媒相の沸点程度までの温度で反応させる。極性溶媒のみを用いる場合、重量基準で、金属アルコキシド２０〜５０％、溶媒０〜６０％、加水分解のための水５〜５０％の組成とし、０℃程度から、溶媒相の沸点程度までの温度で反応させる。
有機金属化合物に含まれる有機官能基の極性が低い場合には、系がゾル−ゲル転移に至るまでに相分離が起こりやすい。このような場合、溶媒相の極性を下げたり、共存物質としての高分子の分子量あるいは添加量を調節することによって、相分離の起こる時期を遅らせるのが望ましい。
また、有機官能基中にカルボキシル基あるいはアミノ基のような、酸性あるいは塩基性の基が含まれる場合には、局所的なｐＨ変化によって不均一なゲル形成反応が起こることを防ぐために、通常の加水分解条件よりも酸あるいは塩基触媒の量を加減するのが望ましい。すなわち、例えば、塩基性の有機官能基を含む有機金属化合物に対しては、加水分解の触媒としてかなり多い酸を使って、全体の反応が酸性条件下で進むようにするとよい。
有機官能基を含む有機金属化合物の加水分解・重合反応が遅いために、相分離がゾル−ゲル転移よりもはるかに早く起こってしまう場合には、加水分解性の官能基をより多く含む有機金属化合物を混合してゾル−ゲル転移を早めることにより、１００ナノメートル以上の３次元網目状に連続したゲル骨格相と溶媒相とからなる構造を作製することができる。
上記の連続したゲル骨格相と溶媒相とからなる構造を持つゲルは、溶媒を気化させることによって収縮を伴って乾燥し、乾燥ゲルとなる。この乾燥ゲル中には、出発溶液中の共存物質が残存する可能性があるので、有機官能基が分解されないような適当な温度および雰囲気下で熱処理を行い、共存物質のみを揮発・分解することによって、目的の無機系多孔質体を得ることができる。
ただし、硫酸根や硝酸根などの無機系結晶は、有機官能基の分解温度よりも高温でなければ分解・揮発しない。従って、このような場合、既述の溶媒置換法によって、一旦触媒や共存物質等の不要物質を除去した後、加熱乾燥する必要がある。」
【００４３】
本発明に係る、「ラクトース誘導体の末端アミノ基にアミド結合するカルボキシル基を含む、カルボキシル基が結合した無機系多孔質体（以下、本明細書において「ラクトース誘導体修飾体」という場合がある。）」とは、少なくとも１分子以上の前記ラクトース誘導体の末端アミノ基と前記カルボキシル基修飾体のカルボキシル基とがアミド結合により結合した前記カルボキシル基修飾体をいう。
高精度かつ迅速に毒素またはウィルスを吸着あるいは捕捉する観点から、カルボキシル基修飾体の１ｇ当たり、ラクトース誘導体が０．００５ｍｍｏｌ以上結合することが好ましく、０．５ｍｍｏｌ以上結合することがより好ましい。
【００４４】
本発明にかかるラクトース誘導体修飾体は、例えば熱変性処理への抵抗性が強いなど、固体として安定に存在し、しかも生体に対する毒性が低いため取扱いが容易で環境負荷が小さい。さらに、該ラクトース誘導体修飾体表面に存在する糖鎖と該毒素・ウィルスとの特異的な相互作用、いわゆる、「糖鎖-毒素相互作用」により、リシン６０やサーズウィルスなどの除染すべき有害物質のみを特異的（選択的）に吸着あるいは捕捉することができる。従って、かかるラクトース誘導体修飾体からなる充填層は、毒素やウィルスを含む汚染溶液の固相抽出および無毒化（除染）にきわめて実用的であり、例えば分析前処理用カートリッジカラムやろ過フィルター、カートリッジとして使用することができる。
【００４５】
また、このラクトース誘導体修飾体には、さらにエンドキャップ処理を施すことができる。
本発明に係る「エンドキャップ処理」とは、ラクトース誘導体修飾体上に存在する、遊離のカルボキシル基を特定の有機官能基と結合させる処理のことをいう。エンドキャップ処理後のラクトース誘導体修飾体は、遊離のカルボキシル基と標的毒素あるいは標的ウィルス以外の物質との非特異的な結合を防止することができるため、より選択的に標的毒素あるいはウィルスを吸着させることができる。
【００４６】
上記の目的を達成できればエンドキャップ処理に用いる有機官能基は限定されないが、具体的にはアミノアルコール基が挙げられる。アミノアルコール基のうちでは、アミノエタノール基が好ましい。
【００４７】
本発明に係る汚染液は、毒素またはウィルスを一種以上含有しており、ラクトース誘導体修飾体からなる充填層を流下できれば、毒素やウィルスは液に溶解していても、懸濁していても良い。
【００４８】
本発明に係る「使用済み洗浄液」とは、洗浄液を散布して毒素を洗浄した後に回収した汚染液のことをいう。このような洗浄液としては、周囲環境に悪影響を与えない観点から、例えば、水、無機塩水溶液などを好ましく用いることができる。これらのうちでは、ラクトース誘導体修飾体と除染対象の毒素またはウィルス以外の物質との静電的な相互作用による非特異的吸着を排除し、除染効率を向上させる観点から、無機塩水溶液が好ましく、無機塩水溶液のうちでは、塩化ナトリウム水溶液がより好ましい。
【００４９】
ラクトース誘導体の合成方法
本発明に係るラクトース誘導体は例えば、下記に示すスキームにより合成することができる。
【００５０】
スキーム１−１
【化１０】
0005392528.tif 000011
スキーム１−１において、ＬおよびＸは、前記一般式（１）のＬおよびＸと同意義を意味する。
【００５１】
スキーム１−１における第一工程は、化合物（Ａ）に「−Ｘ−Ｌ−（ＣＨ２）２Ｃｌ」基を導入し、化合物（Ｂ）を合成する工程であり、溶媒中、試薬存在下、ＨＸ−Ｌ−（ＣＨ２）２Ｃｌを加えて攪拌することにより合成することができる。試薬としては、ボロントリフルオロエテラート（ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ）、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（ＴＭＳＯＴｆ）、tert-ブチルジメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（ＴＢＤＭＳＯＴｆ）、メチルトリフレート（ＭｅＯＴｆ）などを好ましく用いることができ、溶媒としては、ジクロロエタン、トルエン、ジクロロメタンなどの無極性溶媒を好ましく用いることができる。第一工程の反応温度は、通常−７８℃〜２０℃であり、反応時間は通常３０分〜２４時間である。
【００５２】
スキーム１−１における第二工程は、化合物（Ｂ）の末端塩素原子をアジド基に変換し、化合物（Ｃ）を合成する工程であり、溶媒中、アジ化ナトリウムを加えて攪拌することにより合成することができる。溶媒としては、ＤＭＦ、ＤＭＳＯなどの極性溶媒を好ましく用いることができる。第一工程の反応温度は、通常０℃〜１４０℃であり、反応時間は通常６時間〜４８時間である。また、反応には１５−クラウン−５−エーテル、１２−クラウン−４−エーテル、１８−クラウン−６−エーテルなどのクラウンエーテルを加えることが好ましい。また、ＮａＢｒ，ＫＢｒ、ＮａＩ，ＫＩなどを添加してもよい。
【００５３】
スキーム１−１における第三工程は、化合物（Ｃ）のアセチル基を脱保護し、化合物（Ｄ）を合成する工程であり、例えば「Green and Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis"（第２版、John Wiley & Sons 1991）」に記載の方法により行うことができる。具体的には、例えば、溶媒中、触媒量のナトリウムメトキシドを加えて一定時間攪拌後、イオン交換樹脂を加えてさらに攪拌することにより脱保護することができる。
【００５４】
スキーム１−１における第四工程は、化合物（Ｄ）のアジド基をアミノ基に変換し、化合物（Ｅ）を合成する工程であり、溶媒中、好ましくは酸存在下、触媒を利用した水素添加反応により合成することができる。溶媒としては、メタノール、エタノール、水、あるいはこれらの混合溶液などの極性溶媒が好ましく、酸としては、塩酸、硫酸、酢酸などを好ましく添加することができる。また、水素源としては、水素ガスや蟻酸を用いることができ、これらのうちでは、水素ガスを好ましく用いることができる。触媒としては、パラジウム触媒などを用いることができる。パラジウム触媒のうちでは、酸を添加する場合は、水酸化パラジウムが好ましく、酸を添加しない場合には、パラジウムブラックが好ましい。反応温度は、通常、１５〜４０℃であり、反応時間は通常１〜４８時間である。
【００５５】
一般式（１）で示されるラクトース誘導体のＲ１が、ＮＨＣＯＣＨ３基の場合には、前記化合物（Ａ）の還元末端側のグルコースの２位がＮＨＣＯＣＨ３基に置換された化合物を出発原料とすることによりスキーム１−１と同様に合成することができる。
【００５６】
一般式（１）で示されるラクトース誘導体のＲ２およびＲ３のいずれか一方が、前記式（２）で示されるシアル酸残基であり、他の一方が水素原子の場合には、下記に示すスキーム１−２により製造することができる。
【００５７】
スキーム１−２
【化１１】
0005392528.tif 000012
（スキーム１−２中、Ｒ１、ＬおよびＸは、前記一般式（１）のＲ１、ＬおよびＸと同意義を意味する。）
【００５８】
すなわち、一般式（１）で示されるラクトース誘導体のＲ２およびＲ３のいずれか一方が、前記式（２）で示されるシアル酸残基であり、他の一方が水素原子である化合物は、スキーム１−１により合成することができる化合物にＣＭＰ−シアル酸、およびシアリルトランスフェラーゼを作用させて酵素的にシアル酸残基を導入する方法により製造することができる。その場合、Ｒ２にシアル酸残基を導入するには、α２，３−シアリルトランスフェラーゼを、Ｒ３にシアル酸残基を導入するには、α２，６−シアリルトランスフェラーゼを好ましく使用することができる。
【００５９】
この酵素反応には、カゴジル酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）緩衝液を好ましく添加することができる。また、ｐＨは５〜７が好ましく、反応温度は、３０℃〜４０℃が好ましい。反応時間は、通常３０分〜８時間である。反応に用いるシアリルトランスフェラーゼは微生物由来でも、哺乳動物由来でも、組み換え体でもよく、哺乳動物由来の場合には、アルブミンを添加してもよい。
【００６０】
ラクトース誘導体修飾体の製造方法
本発明に係るラクトース誘導体修飾体は、例えば、下記に示すスキームにより製造することができる。
【００６１】
スキーム２
【化１２】
0005392528.tif 000013
スキーム２において、Ｒ１〜Ｒ３、ＬおよびＸは、前記一般式（１）に記載されたＲ１〜Ｒ３、ＬおよびＸと同意義を意味する。
【００６２】
スキーム２の第一工程は、化合物（１）に活性エステル化無機系多孔質体（４）を加えて、ラクトース誘導体修飾体（５）を製造する工程である。溶媒中、塩基存在下、活性エステル化無機系多孔質体（４）を加え、マイクロ波を用いて加熱することにより製造することができる。
【００６３】
第一工程における溶媒としては、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＨＭＰＴなどの極性溶媒を好ましく用いることができ、塩基としては、トリエチルアミン、トリメチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンなどのＮ−アルキルアミン類を好ましく用いることができる。マイクロ波の電力は、通常１００〜５００Ｗ、好ましくは２００〜４００Ｗである。また加熱温度は、通常５０℃〜２００℃であり、ラクトース誘導体を高密度に導入する観点から、８０℃〜２００℃が好ましい。また、加熱時間は、通常１０分〜２時間であり、好ましくは２０分〜１時間である。
【００６４】
第一工程で用いる活性エステル化無機系多孔質体（４）は、カルボキシル基修飾体のカルボキシル基を活性エステル化することにより合成される。活性エステルの種類は、化合物（Ａ）で示されるラクトース誘導体の末端アミノ基とアミド結合を形成できれば良く、例えば、スクシンイミド基、１−ベンゾトリアゾール、７−アザベンゾトリアゾールなどにより活性エステル化することが好ましい。
【００６５】
カルボキシル基修飾体のスクシンイミド基による活性エステル化は、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させ、カルボキシル基修飾無機系多孔質体を加えた後に、減圧脱気を数回繰り返すことにより製造することができる。
【００６６】
スキーム２の第二工程は、ラクトース誘導体修飾体（５）の遊離のカルボキシル基にアミノアルコール基によるエンドキャップ処理を施す工程である。具体的には、ラクトース誘導体修飾体の遊離のカルボキシル基を前記と同様の方法により活性エステル化した後、アミノアルコールを加え、マイクロ波を用いて加熱することにより製造することができる。アミノアルコールとしては、２−アミノエタノールを好ましく用いることができる。マイクロ波の電力は、通常１００〜５００Ｗ、好ましくは２００〜４００Ｗであり、加熱温度は、通常５０℃〜２００℃、好ましくは８０℃〜１６０℃である。また、加熱時間は、通常１０分〜２時間であり、好ましくは２０分〜１時間である。
【００６７】
汚染液の無毒化方法
本発明に係る汚染液の無毒化方法は、前記ラクトース誘導体修飾体を流路の少なくとも一部に充填する工程、およびラクトース誘導体と特異的に結合する毒素またはウィルスを含む汚染液を、該流路に流下させる工程を含む。
【００６８】
ラクトース誘導体修飾体の流路における充填量や、充填箇所数（充填層数）は、毒素またはウィルスを無毒化できれば、限定されない。ラクトース修飾体の単位重量あたりに結合したラクトース誘導体の結合量にも依存するが、汚染液の流速または流量を確保しつつ、効率的に毒素またはウィルスをラクトース誘導体に固定（吸着）する観点に基づき、充填層を設けることができる。
【００６９】
親水性スペーサーを介して糖鎖部分が結合した無機系多孔質体は、毒素やウィルス、特にリシンやサーズウィルス、インフルエンザウィルスを特異的に吸着あるいは捕捉するため、該毒素やウィルスを含む汚染液を迅速（例えば、６０分以内に）に無毒化することができる。
【００７０】
また、本発明に係る固相抽出方法は、前記無毒化方法と同一の工程に、さらに危険物質の回収工程を追加することもでき、かかる回収工程を経て調製される分析用試料を機器分析（定性、定量）することができる（図１３）。
【００７１】
本発明の別の態様は、前記ラクトース誘導体修飾体を含む、毒素またはウィルス含有汚染液用の固相抽出用捕集剤および除染剤である。前記ラクトース誘導体修飾体は、リシンやサーズウィルスなどの毒素またはウィルスを特異的に吸着するので、かかる毒素やウィルスを含有する汚染液用の固相抽出用捕集剤および除染剤として使用することができる。
【００７２】
固相抽出用捕集剤は、汚染液から危険物質を吸着後、溶離して汚染物質を分析する用途で使用され、除染剤は、汚染液から危険物質を吸着し、該汚染液を無毒化する用途で使用される。
【００７３】
本発明に係る固相抽出用捕集剤および除染剤は、好ましくは粉末状であり、各種のフィルター用充填剤として使用したり、汚染液に散布して使用することができる。除染剤には、生体に悪影響を与えない範囲内で、ＮａＣｌ、ＫＣｌなどの成分を添加することもできる。
【実施例】
【００７４】
以下に、本発明の実施例および比較例を挙げ、具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００７５】
［２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］エトキシβ−Ｄ−ラクトシド 塩酸塩（化合物Ｖ）の合成］
以下のスキーム３−１に従って２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］エトキシβ−Ｄ−ラクトシド 塩酸塩を合成した。
【００７６】
スキーム３−１
【化１３】
0005392528.tif 000014
【００７７】
ラクトシルイミデイト（化合物（Ｉ））の合成
オクタアセチルラクトシド（和光純薬社製）１９．１ｇ（２８．１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（和光純薬社製）１５０ｍＬに溶かし、ベンジルアミン（アルドリッチ社製）７．５ｍＬを加えた。１晩攪拌した後、反応混合物を濃縮し、その残渣を酢酸エチル（和光純薬社製）６００ｍＬに溶かした。分液ロートを用いて、酢酸エチル溶液を、特級塩酸（和光純薬社製）を希釈して調製した１Ｎの塩酸５０ｍＬで２回洗浄した。さらに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水の順で洗浄した後、硫酸マグネシウム（和光純薬社製）で乾燥した。その溶液を減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（シリカゲル６０，ヘキサン／酢酸エチル＝２／３）により分離した。分離後の化合物に窒素雰囲気下で脱水ジクロロメタン（アルドリッチ社製）３８．５ｍＬ、トリクロロアセトニトリル１２．３ｍＬ、１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデセー７ーエン（東京化成社製）３．４７ｍＬを加え、１晩攪拌した後、反応混合物をシリカゲルクロマトグラフィー（シリカゲル６０，ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）により分離し、目的とする化合物（Ｉ）（９．８ｇ，４６％）を得た。
【００７８】
1H-NMR (400MHz, CDCl3) : δ 8.66 (s, 1H, NH), 6.49 (d, 1H, J 3.6 Hz Glc-1), 5.56 (t, 1H, J 9.6 Hz, Glc-3), 5.36 (dd, 1H, J 0.8, 3.6 Hz, Gal-4), 5.13 (dd, 1H, J 8.0, 10.4 Hz, Gal-2), 5.06 (dd, 1H, J 3.6, 9.6 Hz, Glc-2), 4.96 (dd, 1H, J 3.6, 10.4 Hz, Gal-3), 4.52 (d, 1H, J 8.0 Hz, Gal-1), 4.46-4.51 (m, 1H, Glc-6), 4.07 -4.18 (m, 4H, Glc-5, Glc-6, Gal-6, Gal-6), 3.87 -3.90 (m, 1H, Gal-5), 3.79 (t, 1H, J 9.6 Hz, Glc-4), 2.16 (s, 3H, Ac), 2.11 (s, 3H, Ac), 2.070 (s, 3H, Ac), 2.068 (s, 3H, Ac), 2.01 (s, 3H, Ac), 1.97 (s, 3H, Ac). 13C-NMR (100.5MHz, CDCl3) : δ 170.5, 170.4, 170.34, 170.29, 170.27, 169.6, 169.3, 161.2, 101.4, 93.1, 90.9, 76.1, 71.3, 71.1, 70.9, 70.2, 69.8, 69.3, 66.8, 61.7, 61.0, 21.1, 21.0, 20.89, 20.86, 20.73, 20.69.
【００７９】
１−［２−｛２−（クロロエトキシ）エトキシ｝エトキシ］パー−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ラクトシド（化合物（ＩＩ））の合成
フラスコ内の粉末状のモレキュラーシーブ３Ａ ４００ｍｇ（アルドリッチ社製）をガスバーナーで加熱することにより活性化させた。フラスコが冷えた後に、化合物（Ｉ）２．８５ｇ（３．６５ｍｍｏｌ）をすばやく加え、窒素に置換した。そこに脱水ジクロロメタン（アルドリッチ社製）５ｍＬと２−［２−（２−クロロエトキシ）エトキシ］エタノール（和光純薬社製）８６３ｍｇ（７４５Ｌ，５．１２ｍｍｏｌ）を入れ攪拌した。窒素雰囲気下、１時間室温で攪拌した後に、０℃に冷却し、ボロントリフルオリドエテラート（ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ）３００μＬ（アルドリッチ社製）をゆっくり加えた。２時間そのまま攪拌した後、モレキュラーシーブ３Ａをろ過により除いた。そのろ液を酢酸エチル（和光純薬社製）９０ｍＬで希釈し、分液ロートを用いて水で９回洗浄した。有機層をさらに飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウム（和光純薬社製）で乾燥させた。乾燥させた溶液を減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（シリカゲル６０，ヘキサン／酢酸エチル＝１／１−１／２）による分離により目的とする化合物（ＩＩ）（１．４８ｇ，５２％）を得た。
【００８０】
1H-NMR (400MHz, CDCl3) : δ 5.35 (dd, 1H, J 1.2, 3.6 Hz Gal-H4), 5.20 (t, 1H, J 9.6 Hz, Glc-3), 5.11 (dd, 1H, J 8.0, 10.4 Hz, Gal-2), 4.95 (dd, 1H, J 3.6, 10.4 Hz, Gal-3), 4.90 (dd, 1H, J 8.0, 9.6 Hz, Glc-2), 4.57 (d, 1H, J 8.0 Hz, Glc-1), 4.49 (dd, 1H, J 2.0, 12.0 Hz, Glc-6), 4.48 (d, 1H, J 8.0 Hz, Gal-1), 4.16 -4.04 (m, 3H, Glc-6, Gal-6, Gal-6), 3.94 -3.89 (m, 1H, CH), 3.87 (m, 1H, Gal-5), 3.79 (t, 1H, J 9.6 Hz, Glc-4), 3.77-3.59 (m, 12H, Glc-5, CH), 2.15 (s, 3H, Ac), 2.12 (s, 3H, Ac), 2.06 (s, 3H, Ac), 2.05 (s, 9H, Ac) , 1.97 (s, 3H, Ac). 13C-NMR (100.5MHz, CDCl3) : δ 170.6, 170.5, 170.3, 170.2, 170.0, 169.8, 169.3, 101.2, 100.8, 76.4, 73.0, 72.8, 71.8, 71.5, 71.2, 70.8, 70.5, 69.3, 69.2, 66.8, 62.2, 61.0, 43.0, 21.1, 21.0, 20.9, 20.8, 20.7.
【００８１】
１−［２−｛２−（アジドエトキシ）エトキシ｝エトキシ］パー−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ラクトシド（化合物（ＩＩＩ））の合成
化合物（ＩＩ）（１．５０ｇ、１．９１ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（和光純薬社製）１５ｍＬに溶解し、１５−クラウン−５−エーテル（和光純薬社製）１滴とアジ化ナトリウム（アルドリッチ社製）６２１ｍｇ（９．５５ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で１６時間攪拌した。未反応のアジ化ナトリウムをろ過により除いた後、ろ液を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル（和光純薬社製）７０ｍＬに溶解させた。その溶液を分液ロートを用いて水、飽和食塩水の順で十分洗浄した後、硫酸マグネシウム（和光純薬社製）で乾燥させた。乾燥させた溶液を減圧濃縮することで目的とする化合物（ＩＩＩ）（１．３１ｇ，８６％）を得た。
【００８２】
1H-NMR (400MHz, CDCl3) : δ 5.26 (dd, 1H, J 1.2, 3.2 Hz, Gal-H4), 5.11 (t, 1H, J 9.6 Hz, Glc-3), 5.02 (dd, 1H, J 8.0, 10.4 Hz, Gal-2), 4.88 (dd, 1H, J 3.2, 10.4 Hz, Gal-3), 4.81 (dd, 1H, J 8.0, 9.6 Hz, Glc-2), 4.50 (d, 1H, J 8.0 Hz, Glc-1), 4.42 (d, 1H, J 8.0 Hz, Gal-1), 4.40 (dd, 1H, J 2.0, 12.0 Hz, Glc-6), 4.08-3.98 (m, 3H, Glc-6, Gal-6, Gal-6), 3.86 -3.83 (m, 1H, CH), 3.81 (m, 1H, Gal-5), 3.72 (t, 1H, J 9.6 Hz, Glc-4), 3.67-3.52 (m, 12H, Glc-5, CH), 3.32 (t, 2H, J 4.8 Hz, CH), 2.07 (s, 3H, Ac), 2.05 (s, 3H, Ac), 1.98 (s, 3H, Ac), 1.97 (s, 9H, Ac) , 1.88 (s, 3H, Ac). 13C-NMR (100.5MHz, CDCl3) : δ 170.5, 170.5, 170.3, 170.2, 169.9, 169.8, 169.2, 101.2, 100.8, 76.4, 73.0, 72.8, 71.8, 71.1, 70.9, 70.8, 70.5, 70.2, 69.3, 69.2, 66.8, 62.2, 61.0, 50.8, 21.0, 21.0, 20.9, 20.8, 20.7.
【００８３】
１−［２−｛２−（アジドエトキシ）エトキシ｝エトキシ］−β−Ｄ−ラクトシド（化合物（ＩＶ））の合成
化合物（ＩＩＩ）（４７７ｍｇ、０．６０１ｍｍｏｌ）をメタノール（和光純薬社製）１０ｍＬに溶解させ、触媒量のナトリウムメトキシド（和光純薬社製）を加えて室温で攪拌した。５．５時間後にイオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ（Ｈ＋）ｆｏｒｍ、ダウエックス社製）を加え１０分攪拌した後、ろ過によりイオン交換樹脂を除いた。そのろ液を減圧濃縮することで目的とする化合物（ＩＶ）（２９６ｍｇ，９９％）を得た。
【００８４】
1H-NMR (400MHz, CD3OD) : δ 4.35 (d, 1H, J 7.6 Hz, Gal-1), 4.33 (d, 1H, J 8.0 Hz, Glc-1), 4.06 (m, 1H, CH), 3.89 (dd, 1H, J 2.4, 12.4 Hz, Glc-6), 3.82 (dd, 1H, J 4.0, 12.4 Hz, Glc-6), 3.81 (d, 1H, J 3.2 Hz, Gal-4), 3.78 -3.63 (m, 11H, Gal-6, Gal-6, CH), 3.59 -3.52 (m, 4H, Gal-5, Glc-4, Glc-3, Gal-2), 3.48 (dd, 1H, J 3.2, 9.6 Hz, Gal-3), 3.40 (m, 1H, Glc-5), 3.48 (t, 2H, J 5.2 Hz, CH2), 3.26 (dd, 1H, J 8.0, 8.0 Hz, Glc-2).  13C-NMR (100.5MHz, CD3OD): δ 103.9, 103.1, 79.4, 75.9, 75.3, 75.1, 73.6, 73.5, 71.4, 70.4, 70.3, 70.3, 69.9, 69.1, 68.6, 61.3, 60.7, 50.6. ESI-MS: calcd for C18H32N3O13 (M-H-), 498.2; found, 498.2
【００８５】
２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］エトキシ−β−Ｄ−ラクトシド塩酸塩（化合物（Ｖ））の合成
化合物（ＩＶ）（１２６ｍｇ、０．２５２ｍｍｏｌ）をメタノール（和光純薬社製）１０ｍＬに溶解し、そこに１０等量の塩酸（和光純薬社製）と触媒量の水酸化パラジウムカーボン（アルドリッチ社製）を加え、水素に置換した。水素雰囲気下、室温で１．５時間攪拌した後、水酸化パラジウムカーボンをろ過により除き、そのろ液を減圧濃縮した。残渣をメタノールに溶解し、減圧濃縮を繰り返すことで塩酸を除き、目的の化合物（Ｖ）（１２８ｍｇ，９９％）を得た。
【００８６】
1H-NMR (400MHz, D2O) : δ 4.40 (d, 1H, J 8.0 Hz, Gal-1), 4.32 (d, 1H, J 8.0 Hz, Glc-1), 3.95 (ddd, 1H, J 4.0, 4.0, 11.2 Hz, CH), 3.85 (dd, 1H, J 2.0, 12.0 Hz, Gal-6) 3.79 (d, 1H, J 3.2 Hz, Gal-4), 3.75 -3.59 (m, 13H, Gal-6, Gal-5, Glc-6, , Glc-6, Glc-4, CH), 3.55 -3.50 (m, 2H, Gal-3, Glc-4), 3.53 (dd, 1H, J 2.8, 10.0 Hz, Glc-3), 3.47 (m, 1H, Glc-5), 3.41 (dd, 1H, J 8.0, 10.0 Hz, Glc-2), 3.26 (dt, 1H, J 2.8, 8.0 Hz, Gal-2), 3.08 (t, 2H, J 5.2 Hz, CH2). 13C-NMR (100.5MHz, D2O): δ 103.1, 102.2, 78.5, 75.5, 74.9, 74.5, 73.0, 72.7, 71.1, 69.84, 69.81, 69.6, 68.9, 68.7, 66.5, 61.2, 60.2, 39.3. ESI-MS: calcd for C18H36NO13 (M+H+), 474.2; found, 474.2
【００８７】
［シアリルラクトース３糖体（化合物VIII、化合物ＩＸ）の合成］
以下のスキーム３−２に従い、シアリルラクトース３糖体を合成した。
【００８８】
スキーム３−２
【化１４】
0005392528.tif 000015
【００８９】
アルファ２，３−シアリルラクトース（化合物（VIII））の合成
組み換えラット由来アルファ２，３−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼを用いて化合物（VIII）をシアル化し、シアリルラクトース３糖体化合物（VIII）を合成した。
２本のＰＣＲチューブにそれぞれ２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］エトキシ−β−Ｄ−ラクトシド塩酸塩（化合物（Ｖ））５０ｍｇ（０．１０６ｍｍｏｌ）、ＣＭＰシアル酸２ナトリウム塩（ヤマサ醤油社製）７３ｍｇを、７．２ｍｇ/ｍＬの子牛血清アルブミン(ＢＳＡ) (キシダ化学社製)と１２０ｍＭの塩化マンガン(キシダ化学社製)とを含む１Ｍの２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．３，１００μＬ）に加え、溶かした。そこにアルカリフォスファターゼ（和光純薬社製）９０Ｕ、アルファ２，３−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼ２５０ｍＵ（カルビオケム社製）を加え、３７℃でインキュベーションした。４０時間インキュベーションした後、この反応混合物をＯＤＳ（水、メタノール混合液）、およびＢｉｏｇｅｌ Ｐ２カラムクロマトグラフィーで精製し、シアリルラクトース３糖体化合物（VIII）を合成し、ドナーを基にして２１％(２本の合計２９．９ｍｇ)の収量で得た。
【００９０】
1H-NMR (400MHz, D2O) : δ 4.39 (d, 2H, J 8.0 Hz, Gal-1, Glc-1), 3.97 (dd, 1H, J 3.2, 10.0 Hz, Gal-3), 3.95-3.91 (m, 1H, CH) 3.86 (dd, 1H, J 2.0, 12.0 Hz, Gal-6), 3.82 (d, 1H, J 3.2 Hz, Gal-4), 3.77-3.46 (m, 23H, Gal-6, Gal-5, Glc-6, Glc-6, Glc-5, Glc-4, Glc-3, NeuAc, CH), 3.44 (dd, 1H, J 8.0, 10.0 Hz, Gal-2), 3.46-3.41 (m, 1H, Glc-2) 3.06 (t, 2H, J 4.8 Hz, CH2), 2.66 (dd, 1H, J 5.6, 12.0 Hz, NeuAc H-3eq), 1.89 (s, 3H, Ac), 1.66(t, 1H, J 12.0 Hz, NeuAc H-3ax). 13C-NMR (100.5MHz, D2O): δ 175.2, 174.0, 102.8, 102.2, 100.0, 78.4, 75.7, 75.4, 74.9, 74.5, 73.05, 72.96, 71.9, 69.84, 69.79, 69.6, 69.5, 68.9, 68.5, 68.3, 67.6, 66.8, 62.8, 61.2, 60.2, 51.8, 39.8, 39.3, 22.2. ESI-MS: calcd for C29H53N2O21 (M+H+), 765.3; found, 765.3
【００９１】
アルファ２、６−シアリルラクトース（化合物（ＩＸ））の合成
組み換えフォトバクテリア由来アルファ２，６−シアリルトランスフェラーゼを用いて化合物（ＩＸ）をシアル化し、シアリルラクトース３糖体化合物（ＩＸ）を合成した。
２本のＰＣＲチューブにそれぞれ、２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］エトキシ−β−Ｄ−ラクトシド（化合物（Ｖ））４８ｍｇ（０．１０１ｍｍｏｌ）、ＣＭＰシアル酸２ナトリウム塩（ヤマサ醤油社製）６４ｍｇを、１．２ｍｇ/ｍＬの子牛血清アルブミン(ＢＳＡ) (キシダ化学社製)と２０ｍＭの塩化マンガン(キシダ化学社製)とを含む１Ｍの２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．３，０．５ｍＬ）に加え、溶かした。そこにアルカリフォスファターゼ（和光純薬社製）９０Ｕ、アルファ２，６−シアリルトランスフェラーゼ２００ｍＵを加え、３７℃でインキュベーションした。２４時間インキュベーションした後、この反応混合物をＯＤＳ（水、メタノール混合液）、およびＢｉｏｇｅｌ Ｐ２カラムクロマトグラフィーで精製し、シアリルラクトース３糖体化合物（ＩＸ）を合成し、ドナーを基にして１５％(２本の合計２３．６ｍｇ)の収量で得た。
【００９２】
1H-NMR (400MHz, D2O) : δ 4.40 (d, 1H, J 8.0 Hz, Glc-1), 4.29 (d, 1H, J 8.0 Hz, Gal-1), 3.97-3.92 (m, 1H, CH), 3.80 (d, 1H, J 3.2 Hz, Gal-4), 3.86-3.37 (m, 25H, Gal-6, Gal-6, Gal-5, Gal-3, Glc-6, Glc-6, Glc-5, Glc-4, Glc-3, NeuAc, CH), 3.39 (dd, 1H, J 8.0, 10.0 Hz, Gal-2), 3.23 (dd, 1H, J 8.0, 8.0 Hz, Glc-2) 3.02 (t, 2H, J 4.8 Hz, CH2), 2.57 (dd, 1H, J 4.8, 12.4 Hz, NeuAc H-3eq), 1.89 (s, 3H, Ac), 1.60(t, 1H, J 12.0 Hz, NeuAc H-3ax). 13C-NMR (100.5MHz, D2O): δ 175.1, 173.6, 103.4, 102.1, 100.5, 79.8, 74.8, 74.7, 73.9, 72.9, 72.7, 72.5, 72.0, 70.9, 69.8, 69.6, 68.9, 68.6, 68.5, 66.9, 63.8, 62.8, 60.4, 51.9, 40.3, 39.3, 22.2. ESI-MS: calcd for C29H53N2O21 (M+H+), 765.3; found, 765.3
【００９３】
［モノリス型シリカゲルへのラクトース誘導体の導入］
〔製造例１−１〕
トリエチレングリコールスペーサーを有するラクトース誘導体のカルボキシル基修飾モノリス型シリカゲル（２．７μｍｏｌカルボキシル基／個））への導入（ＴＧＬａｃ修飾モノリス型シリカゲルの合成）
１個当たり２．７μｍｏｌ（１．２ｍｍｏｌ／ｇ）のカルボキシル基が修飾されたモノリス型シリカゲル（φ２．８×厚１ｍｍ、２．３ｍｇ、スルーポア：１５〜２０μｍ、メソポア：２５〜３０ｎｍ、細孔容積：０．８ｍ３／ｔ、ジーエルサイエンス社製）４０個を、ディーンスターク管を用いてトルエン（和光純薬社製）中で加熱することにより脱水した。脱水後、減圧しトルエンを除去した。
【００９４】
モノリス型シリカゲル表面上のカルボン酸を活性エステル化するため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（略称「ＥＤＣ」、国産化学社製）２０７ｍｇ（１．０８ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（略称「ＮＨＳ」、和光純薬社製）１２４ｍｇ（１．０８ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（略称「ＤＭＦ」、和光純薬社製）０．５０４ｍＬに溶かした溶液に、脱水および溶媒除去したモノリス型シリカゲル４０個を入れた。このモノリス型シリカゲルの入った溶液を３回、減圧脱気することにより、モノリス型シリカゲルに含まれる空気を除いた。そのまま室温で１晩放置し、ＮＨＳで活性エステル化されたモノリス型シリカゲルを、ＤＭＦ（和光純薬社製）、アセトン（和光純薬社製）で洗浄した。洗浄後のモノリス型シリカゲルを１晩、減圧し、溶媒を除去した。
【００９５】
モノリス型シリカゲルへラクトース誘導体を導入するため、２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］エトキシ−β−Ｄ−ラクトシド塩酸塩（化合物（Ｖ））１２８ｍｇ（２５１μｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（和光純薬社製）２２μＬをＤＭＦ（和光純薬社製）０．３ｍＬに溶解させ、バイアル容器（容量１ｍＬ）に入れた。そこに活性エステル化されたモノリス型シリカゲル４０個を入れ、減圧脱気を３回行うことによりモノリス型シリカゲルに含まれる空気を除いた。減圧脱気した溶液を、３００Ｗのマイクロ波（東京理化器械社製、ＭＷＯ−１０００）により８０℃（最大１００℃）で３０分間加熱することによりラクトース誘導体を導入した。加熱後、モノリス型シリカゲルをＤＭＦ（和光純薬社製）、メタノール（和光純薬社製）で洗浄した。さらに洗浄するため、ＤＭＦ（和光純薬社製）中で３００Ｗのマイクロ波（東京理化器械社製、ＭＷＯ−１０００）により８０度（最大１００度）で３０分間加熱し、再度、モノリス型シリカゲルをＤＭＦ（和光純薬社製）、メタノール（和光純薬社製）で洗浄した、このマイクロ波による加熱、洗浄操作をさらに一回繰り返した。洗浄後のモノリス型シリカゲルを１晩、減圧し、溶媒を除去することによりトリエチレングリコールスペーサーを介してモノリス型シリカゲルと糖鎖とが結合したラクトース修飾モノリス型シリカゲルを得た。
【００９６】
〔製造例１−２〕
２−アミノエタノールによるエンドキャップ処理
製造例１−１で調製したラクトース修飾モノリス型シリカゲルには未反応のカルボキシル基（遊離のカルボキシル基）が残っているため、２−アミノエタノールによるエンドキャップ処理を行った。
未反応のカルボン酸をＮＨＳで活性エステル化するため、ＥＤＣ（国産化学社製）１０４ｍｇ（０．５４ｍｍｏｌ）、及びＮＨＳ（和光純薬社製）６２ｍｇ（０．５４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（和光純薬社製）０．２５２ｍＬに溶解させた溶液に、ラクトース修飾モノリス型シリカゲルを２０個加え、３回、減圧脱気することによりモノリス型シリカゲルに含まれる空気を除いた。室温で１晩放置し、ＮＨＳで活性エステル化されたラクトース修飾モノリス型シリカゲルをＤＭＦ（和光純薬社製）、アセトン（和光純薬社製）で洗浄した。洗浄後のモノリス型シリカゲルを１晩、減圧し、溶媒を除去した。活性エステル化されたラクトース修飾モノリス型シリカゲルを、２−アミノエタノール（和光純薬社製）が０．７ｍＬ入ったバイアル容器（容量１ｍＬ）に加え、３回、減圧脱気することによりモノリス型シリカゲルに含まれる空気を除いた。減圧脱気した溶液を３００Ｗのマイクロ波（東京理化器械社製、ＭＷＯ−１０００）により８０度（最大１００度）で３０分間加熱することにより、２−アミノエタノールによるエンドキャップを行った。加熱後、モノリス型シリカゲルをＤＭＦ、メタノールで洗浄し、さらに洗浄するためＤＭＦ（和光純薬社製）中で３００Ｗのマイクロ波（東京理化器械社製、ＭＷＯ−１０００）により８０度（最大１００度）で３０分間加熱した。加熱後、モノリス型シリカゲルをＤＭＦ（和光純薬社製）、メタノール（和光純薬社製）で再度洗浄した。このマイクロ波による加熱、洗浄操作をさらに一回繰り返した。洗浄後のモノリス型シリカゲルを１晩、減圧し、溶媒を除去することによって２−アミノエタノールによるエンドキャップ処理が施されたラクトース修飾モノリス型シリカゲルを得た。
【００９７】
〔製造例２−１〕
トリエチレングリコールスペーサーを有するラクトース誘導体のカルボキシル基修飾モノリス型シリカゲル（１．０μｍｏｌカルボキシル基／個））への導入（ＴＧＬａｃ修飾モノリス型シリカゲルの合成）
製造例１−１と同様に、１個当たり１．０μｍｏｌ（０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）のカルボン酸が修飾された多孔質モノリス型シリカゲル（φ２．８×厚１ｍｍ、２．２ｍｇ、スルーポア：１５〜２０μｍ、メソポア：２５〜３０ｎｍ、細孔容積：０．８ｍ３／ｔ、ジーエルサイエンス社製）４０個を、ディーンスターク管を用いてトルエン（和光純薬社製）中で加熱することにより脱水した。脱水後、減圧し、トルエンを除去した。
モノリス型シリカゲル表面上のカルボン酸を活性エステル化するため、ＥＤＣ（国産化学社製）２０１ｍｇ（１．０５ｍｍｏｌ）、ＮＨＳ（和光純薬社製）１２４ｍｇ（１．０８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（和光純薬社製）０．５０５ｍＬに溶かした溶液に、脱水および溶媒除去を行ったモノリス型シリカゲル４０個を加えた。このモノリス型シリカゲルの入った溶液を３回、減圧脱気することにより、モノリス型シリカゲルに含まれる空気を除いた。そのまま室温で１晩放置し、ＮＨＳで活性エステル化されたモノリス型シリカゲルを、ＤＭＦ（和光純薬社製）、アセトン（和光純薬社製）で洗浄した。洗浄後のモノリス型シリカゲルを１晩、減圧し、溶媒を除去した。
【００９８】
モノリス型シリカゲルへラクトース誘導体を導入するため、２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］エトキシ−β−Ｄ−ラクトシド塩酸塩（化合物（Ｖ））５９９ｍｇ（１９５μｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（和光純薬社製）１７μＬをＤＭＦ（和光純薬社製）０．２３３ｍＬに溶解させ、バイアル容器（容量１ｍＬ）に入れた。そこに活性エステル化されたモノリス型シリカゲル４０個を加え、減圧脱気を３回行うことによりモノリス型シリカゲルに含まれる空気を除いた。減圧脱気した溶液を、３００Ｗのマイクロ波（東京理化器械社製、ＭＷＯ−１０００）により８０℃（最大１００℃）で３０分間加熱することによりラクトース誘導体を導入した。加熱後、モノリス型シリカゲルをＤＭＦ（和光純薬社製）、メタノール（和光純薬社製）で洗浄した。さらに洗浄するため、ＤＭＦ（和光純薬社製）中で３００Ｗのマイクロ波（東京理化器械社製、ＭＷＯ−１０００）により８０度（最大１００度）で３０分間加熱し、再度、モノリス型シリカゲルをＤＭＦ（和光純薬社製）、メタノール（和光純薬社製）で洗浄した。このマイクロ波による加熱、洗浄操作をさらに一回繰り返した。洗浄後のモノリス型シリカゲルを１晩、減圧し、溶媒を除去することによりトリエチレングリコールスペーサーを介してモノリス型シリカゲルと糖鎖とが結合したラクトース修飾モノリス型シリカゲルを得た。
【００９９】
〔製造例２−２〕
２−アミノエタノールによるエンドキャップ処理
製造例２−１で調製したラクトース修飾モノリス型シリカゲルには未反応のカルボキシル基（遊離のカルボキシル基）が残っているため、２−アミノエタノールによるエンドキャップ処理を行った。
未反応のカルボン酸をＮＨＳで活性エステル化するため、ＥＤＣ（国産化学社製）１００ｍｇ（０．５３ｍｍｏｌ）、及びＮＨＳ（和光純薬社製）６２ｍｇ（０．５４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（和光純薬社製）０．２５２ｍＬに溶解させた溶液に、ラクトース修飾モノリス型シリカゲルを２０個加え、３回、減圧脱気することによりモノリス型シリカゲルに含まれる空気を除いた。室温で１晩放置し、ＮＨＳで活性エステル化されたラクトース修飾モノリス型シリカゲルをＤＭＦ（和光純薬社製）、アセトン（和光純薬社製）で洗浄した。洗浄後のモノリス型シリカゲルを１晩、減圧し、溶媒を除去した。活性エステル化されたラクトース修飾モノリス型シリカゲルを、２−アミノエタノール（和光純薬社製）が４ｍＬ入ったバイアル容器（容量５ｍＬ）に加え、３回、減圧脱気することによりモノリス型シリカゲルに含まれる空気を除いた。減圧脱気した溶液を３００Ｗのマイクロ波（東京理化器械社製、ＭＷＯ−１０００）により８０度（最大１００度）で３０分間加熱することにより、２−アミノエタノールによるエンドキャップを行った。加熱後、モノリス型シリカゲルをＤＭＦ、メタノールで洗浄し、さらに洗浄するためＤＭＦ（和光純薬社製）中で３００Ｗのマイクロ波（東京理化器械社製、ＭＷＯ−１０００）により８０度（最大１００度）で３０分間加熱した。加熱後、モノリス型シリカゲルをＤＭＦ（和光純薬社製）、メタノール（和光純薬社製）で再度洗浄した。このマイクロ波による加熱、洗浄操作をさらに一回繰り返した。洗浄後のモノリス型シリカゲルを１晩、減圧し、溶媒を除去することによって２−アミノエタノールによるエンドキャップ処理が施されたラクトース修飾モノリス型シリカゲルを得た。
【０１００】
〔製造例３〕
トリエチレングリコールスペーサーを有するアルファ２，３−シアリルラクトース誘導体のカルボキシル基修飾モノリス型シリカゲル（１．０μｍｏｌカルボキシル基／個））への導入
１個当たり１．０μｍｏｌ（０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）のカルボキシル基が修飾されたモノリス型シリカゲル（φ２．８×厚１ｍｍ、２．２ｍｇ、スルーポア：１５〜２０μｍ、メソポア：２５〜３０ｎｍ、細孔容積：０．８ｍ３／ｔ、ジーエルサイエンス社製）２２個を、ディーンスターク管を用いてトルエン（和光純薬社製）中で加熱することにより脱水した。脱水後、減圧によりトルエンを除去した。
【０１０１】
モノリス型シリカゲル表面上のカルボン酸を活性エステル化するため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩）（略称「ＥＤＣ」、国産化学社製）１１０ｍｇ（０．５５８ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（略称「ＮＨＳ」、和光純薬社製）６８ｍｇ（０．５９１ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（略称「ＤＭＦ」、和光純薬社製）０．２８０ｍＬに溶かした溶液に、脱水そして溶媒除去を行ったモノリス型シリカゲル２２個を入れた。このモノリス型シリカゲルの入った溶液を３回、減圧脱気することにより、モノリス型シリカゲルに含まれる空気を除いた。そのまま室温で１晩放置し、ＮＨＳで活性エステル化されたモノリス型シリカゲルを、ＤＭＦ（和光純薬社製）、アセトン（和光純薬社製）で洗浄した。洗浄後のモノリス型シリカゲルを１晩、減圧し、溶媒を除去した。
【０１０２】
モノリス型シリカゲルへアルファ２、３−ラクトース誘導体を導入するため、アルファ２，３−シアリルラクトース（化合物（VIII））２９．９ｍｇ（３９μｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（和光純薬社製）５μＬをＤＭＦ（和光純薬社製）９４μＬに溶解させ、バイアル容器（容量１ｍＬ）に入れた。そこに活性エステル化されたモノリス型シリカゲル２０個を入れ、減圧脱気を３回行うことによりモノリス型シリカゲルに含まれる空気を除いた。減圧脱気した溶液にＤＭＦ（和光純薬社製）１５０μＬを加え、３００Ｗのマイクロ波（東京理化器械社製、ＭＷＯ−１０００）により８０℃（最大１００℃）で３０分間加熱することによりアルファ２，３−シアリルラクトース誘導体を導入した。加熱後、モノリス型シリカゲルをＤＭＦ（和光純薬社製）、メタノール（和光純薬社製）で洗浄した。さらに洗浄するため、ＤＭＦ（和光純薬社製）中で３００Ｗのマイクロ波（東京理化器械社製、ＭＷＯ−１０００）により８０度（最大１００度）で３０分間加熱し、再度、モノリス型シリカゲルをＤＭＦ（和光純薬社製）、メタノール（和光純薬社製）で洗浄した。さらに洗浄するため、純水（ＭｉｌｌｉＱ）中で３００Ｗのマイクロ波（東京理化器械社製、ＭＷＯ−１０００）により７０度（最大１００度）で３０分間加熱し、再度、モノリス型シリカゲルを純水（ＭｉｌｌｉＱ）、メタノール（和光純薬社製）で洗浄した。洗浄後のモノリス型シリカゲルを１晩、減圧し、溶媒を除去することによりトリエチレングリコールスペーサーを介してモノリス型シリカゲルと糖鎖とが結合したアルファ２，３−シアリルラクトース修飾モノリス型シリカゲルを得た。
【０１０３】
〔製造例４〕
トリエチレングリコールスペーサーを有するアルファ２，６−シアリルラクトース誘導体のカルボキシル基修飾モノリス型シリカゲル（１．０μｍｏｌカルボキシル基／個））への導入
製造例３と同様に、１個当たり１．０μｍｏｌ（０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）のカルボキシル基が修飾されたモノリス型シリカゲル（φ２．８×厚１ｍｍ、２．２ｍｇ、スルーポア：１５〜２０μｍ、メソポア：２５〜３０ｎｍ、細孔容積：０．８ｍ３／ｔ、ジーエルサイエンス社製）２０個を、ディーンスターク管を用いてトルエン（和光純薬社製）中で加熱することにより脱水した。脱水後、減圧し、トルエンを除去した。
【０１０４】
モノリス型シリカゲル表面上のカルボン酸を活性エステル化するため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩）（略称「ＥＤＣ」、国産化学社製）１１０ｍｇ（０．５５８ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（略称「ＮＨＳ」、和光純薬社製）６８ｍｇ（０．５９１ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（略称「ＤＭＦ」、和光純薬社製）０．２８０ｍＬに溶かした溶液に、脱水そして溶媒除去を行ったモノリス型シリカゲル２０個を入れた。このモノリス型シリカゲルの入った溶液を３回、減圧脱気することにより、モノリス型シリカゲルに含まれる空気を除いた。そのまま室温で１晩放置し、ＮＨＳで活性エステル化されたモノリス型シリカゲルを、ＤＭＦ（和光純薬社製）、アセトン（和光純薬社製）で洗浄した。洗浄後のモノリス型シリカゲルを１晩、減圧し、溶媒を除去した。
【０１０５】
モノリス型シリカゲルへアルファ２、６−ラクトース誘導体を導入するため、アルファ２，６−シアリルラクトース（化合物（ＩＸ））１９ｍｇ（２５μｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（和光純薬社製）３μＬをＤＭＦ（和光純薬社製）６０μＬに溶解させ、バイアル容器（容量１ｍＬ）に入れた。そこに活性エステル化されたモノリス型シリカゲル１３個を入れ、減圧脱気を３回行うことによりモノリス型シリカゲルに含まれる空気を除いた。減圧脱気した溶液にＤＭＦ（和光純薬社製）１６０μＬを加え、３００Ｗのマイクロ波（東京理化器械社製、ＭＷＯ−１０００）により８０℃（最大１００℃）で３０分間加熱することによりアルファ２，６−シアリルラクトース誘導体を導入した。加熱後、モノリス型シリカゲルをＤＭＦ（和光純薬社製）、メタノール（和光純薬社製）で洗浄した。さらに洗浄するため、ＤＭＦ（和光純薬社製）中で３００Ｗのマイクロ波（東京理化器械社製、ＭＷＯ−１０００）により８０度（最大１００度）で３０分間加熱し、再度、モノリス型シリカゲルをＤＭＦ（和光純薬社製）、メタノール（和光純薬社製）で洗浄した。さらに洗浄するため、純水（ＭｉｌｌｉＱ）中で３００Ｗのマイクロ波（東京理化器械社製、ＭＷＯ−１０００）により７０度（最大１００度）で３０分間加熱し、再度、モノリス型シリカゲルを純水（ＭｉｌｌｉＱ）、メタノール（和光純薬社製）で洗浄した。洗浄後のモノリス型シリカゲルを１晩、減圧し、溶媒を除去することによりトリエチレングリコールスペーサーを介してモノリス型シリカゲルと糖鎖とが結合したアルファ２，６−シアリルラクトース修飾モノリス型シリカゲルを得た。
【０１０６】
比較製造例に用いたパラアミノフェニルラクトシド（ｐＡＰＬａｃ）の合成
以下のスキーム４に従ってパラアミノフェニルラクトシド（ｐＡＰＬａｃ）を合成した。
【０１０７】
スキーム４
【化１５】
0005392528.tif 000016
【０１０８】
パラニトロフェニルラクトシド（化合物ＶＩ）（アルドリッチ社製）５００ｍｇ（１．０７ｍｍｏｌ）をメタノール（和光純薬社製）４００ｍＬに溶解し、１滴の特級塩酸（和光純薬社製）と触媒量の水酸化パラジウムカーボン（アルドリッチ社製）を加え、水素に置換した。水素雰囲気下、室温で２時間攪拌した後、水酸化パラジウムカーボンをろ過により除き、そのろ液を減圧濃縮することで目的のパラアミノフェニルラクトシド（化合物ＶＩＩ）（４６５ｍｇ，９９％）を得た。
【０１０９】
1H-NMR (400MHz, D2O) : δ 7.24 (d, 2H, J 9.2 Hz, pNP), 7.09 (d, 2H, J 9.2 Hz, pNP),5.04 (d, 1H, J 7.6 Hz, Glc-1), 4.34 (d, 1H, J 8.0 Hz, Gal-1), 3.86(d, 1H, J 11.2 Hz, Glc-6), 3.79 (d, 1H, J 3.2 Hz, Gal-4), 3.86(dd, 1H, J 4.4, 12.0 Hz, Gal-6), 3.72 -3.58 (m, 7H, Gal-6, Gal-6, Gal-5, Glc-6, Glc-5, Glc-4 Glc-3), 3.55 -3.50 (m, 2H, Glc-4), 3.53 (dd, 1H, J 3.2, 10.0 Hz, Gal-3), 3.42 (dd, 1H, J 8.0, 10.0 Hz, Gal-2), 3.51-3.47 (m, 1H, Glc-2). 13C-NMR (100.5MHz, D2O): δ 156.8, 124.9, 124.5, 117.9, 103.1, 100.0, 78.2, 75.6, 75.2, 74.3, 72.7, 71.1, 68.7, 61.2, 60.0.
【０１１０】
〔比較製造例１−１〕
パラアミノフェニル（ｐＡＰ）スペーサーを介したラクトースのカルボキシル基修飾モノリス型シリカゲル（２．７μｍｏｌカルボキシル基／個））への導入（ｐＡＰ修飾モノリス型シリカゲルの合成）（８０℃で縮合させた場合）
製造例１−１と同様に、１個当たり２．７μｍｏｌ（１．２ｍｍｏｌ／ｇ）のカルボン酸が修飾された多孔質モノリス型シリカゲル（φ２．８×厚１ｍｍ、２．３ｍｇ、スルーポア：１５〜２０μｍ、メソポア：２５〜３０ｎｍ、細孔容積：０．８ｍ３／ｔ、ジーエルサイエンス社製）５０個を、ディーンスターク管を用いてトルエン（和光純薬社製）中で加熱することにより脱水した。脱水後、減圧し、トルエンを除去した。
モノリス型シリカゲル表面上のカルボン酸を活性エステル化するため、ＥＤＣ（国産化学社製）２５９ｍｇ（１．３５ｍｍｏｌ）、ＮＨＳ（和光純薬社製）１５５ｍｇ（１．３５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（和光純薬社製）０．６３ｍＬに溶かした溶液に、脱水および溶媒除去を行ったモノリス型シリカゲル５０個を加えた。このモノリス型シリカゲルの入った溶液を３回、減圧脱気することにより、モノリス型シリカゲルに含まれる空気を除いた。そのまま室温で１晩放置し、ＮＨＳで活性エステル化されたモノリス型シリカゲルをＤＭＦ（和光純薬社製）、アセトン（和光純薬社製）で洗浄した。洗浄後のモノリス型シリカゲルを１晩、減圧し、溶媒を除去した。
【０１１１】
モノリス型シリカゲルへ糖鎖を導入するため、パラアミノフェニル−β−Ｄ−ラクトシド（化合物（ＶＩＩ））１２５ｍｇ（２８９μｍｏｌ）をＤＭＦ（和光純薬社製）０．２３３ｍＬに溶解させ、バイアル容器（容量１ｍＬ）に入れた。そこに活性エステル化されたモノリス型シリカゲル５０個を加え、減圧脱気を３回行うことによりモノリス型シリカゲルに含まれる空気を除いた。減圧脱気した溶液を、３００Ｗのマイクロ波（東京理化器械社製、ＭＷＯ−１０００）により８０℃（最大１００℃）で３０分間加熱することにより糖鎖を導入した。加熱後、モノリス型シリカゲルをＤＭＦ（和光純薬社製）、メタノール（和光純薬社製）で洗浄した。さらに洗浄するため、ＤＭＦ（和光純薬社製）中で３００Ｗのマイクロ波（東京理化器械社製、ＭＷＯ−１０００）により８０度（最大１００度）で３０分間加熱し、再度、モノリス型シリカゲルをＤＭＦ（和光純薬社製）、メタノール（和光純薬社製）で洗浄した、このマイクロ波による加熱、洗浄操作をさらに一回繰り返した。洗浄後のモノリス型シリカゲルを１晩、減圧し、溶媒を除去することによりｐＡＰスペーサーを介してモノリス型シリカゲルと糖鎖とが結合したラクトース修飾モノリス型シリカゲルを得た。
【０１１２】
〔比較製造例１−２〕
２−アミノエタノールによるエンドキャップ処理
比較製造例１−１で調製したラクトース修飾モノリス型シリカゲルには未反応のカルボキシル基（遊離のカルボキシル基）が残っているため、２−アミノエタノールによるエンドキャップ処理を行った。
未反応のカルボン酸をＮＨＳで活性エステル化するため、ＥＤＣ（国産化学社製）１３０ｍｇ（０．６８ｍｍｏｌ）、及びＮＨＳ（和光純薬社製）７６ｍｇ（０．６８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（和光純薬社製）０．３１５ｍＬに溶解させた溶液に、ラクトース修飾モノリス型シリカゲルを２５個加え、３回、減圧脱気することによりモノリス型シリカゲルに含まれる空気を除いた。室温で１晩放置し、ＮＨＳで活性エステル化されたラクトース修飾モノリス型シリカゲルをＤＭＦ（和光純薬社製）、アセトン（和光純薬社製）で洗浄した。洗浄後のモノリス型シリカゲルを１晩、減圧し、溶媒を除去した。活性エステル化されたラクトース修飾モノリス型シリカゲルを、２−アミノエタノール（和光純薬社製）が０．６ｍＬ入ったバイアル容器（容量５ｍＬ）に加え、３回、減圧脱気することによりモノリス型シリカゲルに含まれる空気を除いた。減圧脱気した溶液を３００Ｗのマイクロ波（東京理化器械社製、ＭＷＯ−１０００）により８０度（最大１００度）で３０分間加熱することにより、２−アミノエタノールによるエンドキャップを行った。加熱後、モノリス型シリカゲルをＤＭＦ、メタノールで洗浄し、さらに洗浄するためＤＭＦ（和光純薬社製）中で３００Ｗのマイクロ波（東京理化器械社製、ＭＷＯ−１０００）により８０度（最大１００度）で３０分間加熱した。加熱後、モノリス型シリカゲルをＤＭＦ（和光純薬社製）、メタノール（和光純薬社製）で再度洗浄した。このマイクロ波による加熱、洗浄操作をさらに一回繰り返した。洗浄後のモノリス型シリカゲルを１晩減圧することにより溶媒を除去し、２−アミノエタノールによるエンドキャップ処理が施されたラクトース修飾モノリス型シリカゲルを得た。
【０１１３】
〔比較製造例２〕
パラアミノフェニル（ｐＡＰ）スペーサーを介したラクトースのカルボキシル基修飾モノリス型シリカゲル（２．７μｍｏｌカルボキシル基／個））への導入（ｐＡＰ修飾モノリス型シリカゲルの合成）（１６０℃で縮合させた場合）
製造例１−１と同様に、１個当たり２．７μｍｏｌ（１．２ｍｍｏｌ／ｇ）のカルボン酸が修飾された多孔質モノリス型シリカゲル（φ２．８×厚１ｍｍ、２．３ｍｇ、スルーポア：１５〜２０μｍ、メソポア：２５〜３０ｎｍ、細孔容積：０．８ｍ３／ｔ、ジーエルサイエンス社製）４２個を、ディーンスターク管を用いてトルエン（和光純薬社製）中で加熱することにより脱水した。脱水後、減圧し、トルエンを除去した。
モノリス型シリカゲル表面上のカルボン酸を活性エステル化するため、ＥＤＣ（国産化学社製）８２ｍｇ（０，４２８ｍｍｏｌ）、ＮＨＳ（和光純薬社製）５２ｍｇ（０．４４９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（和光純薬社製）０．２５７ｍＬに溶かした溶液に、脱水および溶媒除去を行ったモノリス型シリカゲル４２個を加えた。このモノリス型シリカゲルの入った溶液を３回、減圧脱気することにより、モノリス型シリカゲルに含まれる空気を除いた。そのまま室温で１晩放置し、ＮＨＳで活性エステル化されたモノリス型シリカゲルをＤＭＦ（和光純薬社製）、アセトン（和光純薬社製）で洗浄した。洗浄後のモノリス型シリカゲルを１晩、減圧し、溶媒を除去した。残っているカルボン酸をさらに活性エステル化するため、ＥＤＣ（国産化学社製）８２ｍｇ（４２８ｍｍｏｌ）、ＮＨＳ（和光純薬社製）５２ｍｇ（４４９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（和光純薬社製）０．２５７ｍＬに溶かした溶液に、一度目の活性エステル化処理後のモノリス型シリカゲルを４０個加えた。この溶液を３回、減圧脱気し、モノリス型シリカゲルに含まれる空気を除いた。そのまま室温で１晩放置し、ＮＨＳで活性エステル化されたモノリス型シリカゲルをＤＭＦ（和光純薬社製）、アセトン（和光純薬社製）で洗浄した。洗浄後のモノリス型シリカゲルを１晩、減圧し、溶媒を除去した。
【０１１４】
モノリス型シリカゲルへ糖鎖を導入するため、パラアミノフェノキシβ−Ｄ−ラクトシド（ｐＡＰＬａｃ）１００ｍｇ（２３１μｍｏｌ）をＤＭＦ（和光純薬社製）０．５ｍＬに溶解させ、バイアル容器（容量１ｍＬ）に入れた。そこに活性エステル化されたモノリス型シリカゲル４０個を加え、減圧脱気を３回行うことによりモノリス型シリカゲルに含まれる空気を除いた。減圧脱気した溶液を、３００Ｗのマイクロ波（東京理化器械社製、ＭＷＯ−１０００）により１６０℃で３０分間加熱することにより糖鎖を導入した。加熱後、モノリス型シリカゲルをＤＭＦ（和光純薬社製）、メタノール（和光純薬社製）で洗浄した。さらに洗浄するため、ＤＭＦ（和光純薬社製）中で３００Ｗのマイクロ波（東京理化器械社製、ＭＷＯ−１０００）により１６０度で３０分間加熱し、再度、モノリス型シリカゲルをＤＭＦ（和光純薬社製）、メタノール（和光純薬社製）で洗浄した。このマイクロ波による加熱、洗浄操作をさらに一回繰り返した。洗浄後のモノリス型シリカゲルを１晩、減圧し、溶媒を除去することによりｐＡＰスペーサーを介してモノリス型シリカゲルと糖鎖とが結合したラクトース修飾モノリス型シリカゲルを得た。
【０１１５】
製造例１−１〜比較製造例２で調製したラクトース修飾モノリス型シリカゲルの特徴を表１−１に示す。
【表１−１】
0005392528.tif 000017
※ＴＧはトリエチレングリコールスペーサーを、ｐＡＰは、パラアミノフェニルスペーサーを意味する。
【０１１６】
ＴＧ／ＤＴＡによるモノリスに固定化した糖鎖の重量測定
モノリスに固定化した糖鎖の重量を測定するため、示差熱熱重量同時測定装置（ＴＧＤＴＡ、ＥＸＳＴＡＲ６０００、エスアイアイ・ナノテクノロジー株式会社製）を用いて重量減少率を測定した。
ＴＧ／ＤＴＡ測定に用いたモノリスは５０℃、１４時間減圧下で乾燥させた。ＴＧ/ＤＴＡ測定における昇温は、室温から１３０℃まで１分間あたり２０度の速度で温度を上昇させた。１３０℃で５分間保った後、さらに１３０℃から８００℃まで１分間あたり４０℃の速度で温度を上昇させ、８００℃で５分間保持した。
糖鎖が未修飾のカルボキシル基修飾モノリスを含め、それぞれのモノリスの重量減少率と、重量減少率から次の計算式に基づき計算したラクトースまたはラクトースと２−アミノエタノールの修飾量を以下の表１−２に示す。
修飾量（μｇ）＝｛［ラクトース修飾モノリスの重量（ｍｇ）×［１００（％）−１３０度までにおける重量減少率（％）］／１００｝×｛［ラクトース修飾モノリスの重量減少率（％）−糖鎖未修飾モノリスの重量減少率（％）］／１００｝×１０００
ラクトース誘導体の固定化量（ｎｍｏｌ）＝修飾量（μｇ）／（ラクトース誘導体の分子量−水の分子量）×１０００
【表１−２】
0005392528.tif 000018
＊糖鎖または糖鎖＋２−アミノエタノールの修飾量
ラクトース修飾モノリスはカルボキシル基修飾モノリスにラクトースを修飾したものであり、その修飾量は糖鎖未修飾のカルボキシル基修飾モノリスの重量減少を引いた値になる。
【０１１７】
ＴＧ／ＤＴＡの結果から比較製造例１−１、１−２、２で調製したｐＡＰスペーサーのラクトース修飾モノリスに比べて、製造例１−１、１−２、２−１、２−２で調製したトリエチレングリコールスペーサーのラクトース修飾モノリスのラクトース修飾量は大きく、ラクトースが多く固定化されていることがわかった。また、エンドキャップ修飾時の重量減少量の変化は、エンドキャップ基が修飾されることによる重量変化と、修飾官能基の脱離による変化によるものであり、ラクトース修飾時の重量変化よりも僅かであった。
【０１１８】
〔実施例１〕
ＳＰＲセンサーによる糖結合性タンパク質の検出
１）ラクトース固定化センサーチップの作成
Ｂｉａｃｏｒｅ社より市販されているSIA kit Auの金基板を、６３μｍｏｌ／Ｌのラクトシル−セラミドのチオオクト酸誘導体のメタノール（和光純薬社製）溶液２ｍＬに、室温で２４時間浸漬した。その後、メタノール、水の順で３回洗浄することにより、ラクトース固定化センサーチップを作成した。得られたセンサーチップは、自己組織化により高密度にラクトースが固定化されている。糖結合性タンパク質であるリシンと、センサーチップに高密度に固定化されたラクトースとの高い親和性を利用して、表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用いてリシンを高感度に検出、定量できる。
【０１１９】
２）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定
得られたラクトース固定化センサーチップを、市販の表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ３０００またはＴ−１００、Ｂｉａｃｏｒｅ社製）に装着して、設定温度２５℃、流速１０μＬ／ｍｉｎでＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ、ｐＨ：７．５、ＮａＣｌ：０．１５Ｍ）緩衝液を流した。計測前にセンサーグラムが安定したことを確認した。糖結合性タンパク質はリシン１２０（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ１２０、Ｖｅｃｔｏｒ社製）を用い、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ、ｐＨ：７．５、ＮａＣｌ：０．１５Ｍ）緩衝液で調製した。該ＨＥＰＥＳ緩衝液で１μｇ／ｍＬ（８．３ ｎＭ）に調製したリシン１２０溶液を、流速１０μＬ／ｍｉｎで５０μＬインジェクトした。その結果、図２に示すように、リシン１２０の検出強度は実施例１で６９７ＲＵであった。なお、「ＲＵ」は「Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｕｎｉｔ」の略で、基板表面に物質が吸着、付着、固定化されると、その量に応じて値が増大することを意味する。Ｂｉａｃｏｒｅ社によると、１ＲＵ＝約１ｐｇ／ｍｍ２である。
【０１２０】
３）糖修飾モノリス型シリカゲルによる糖結合性タンパク質の吸着能力のＳＰＲによる評価
製造例１−１、１−２および比較製造例１−１、１−２で調製した、４種類のラクトース修飾モノリス型シリカゲルをエッペンドルフのチップ先に熱で融着させることにより取り付けた。ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ、ｐＨ：７．５、ＮａＣｌ：０．１５Ｍ）緩衝液で調製した各濃度のリシン１２０（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ １２０、Ｖｅｃｔｏｒ製）１００μｇ／ｍＬ・１００μＬ、１０μｇ／ｍＬ・１００ μＬ、１μｇ／ｍＬ・２００μＬを、それぞれトリエチレングリコールスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲル（未エンドキャッピング）を取り付けたエッペンドルフのチップへ入れ、吐出、吸引を１０往復繰り返してモノリス型シリカゲルにリシン１２０を吸着させた。それらの溶液を１００μｇ／ｍＬの濃度では該ＨＥＰＥＳ緩衝液で１００倍（１０×１０）に希釈し、１０μｇ／ｍＬの濃度では該ＨＥＰＥＳ緩衝液で１０倍に希釈した。この希釈操作により、モノリス型シリカゲルにリシン１２０が全く吸着していない場合のリシン１２０の濃度は１μｇ／ｍＬになる。なお１μｇ／ｍＬの濃度ではモノリス型シリカゲルを通した溶液をそのまま使用した。
【０１２１】
ラクトース固定化センサーチップを、市販の表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ３０００、Ｂｉａｃｏｒｅ社製）に装着後、設定温度２５℃、流速１０μＬ／ｍｉｎでＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ：７．５、ＮａＣｌ：０．１５Ｍ）を流して、計測前にセンサーグラムが安定したことを確認した。製造例１−１で調製したラクトース修飾モノリス型シリカゲルに通し、さらに希釈した液（１００μｇ／ｍＬの濃度では１００倍（１０×１０）に希釈、１０μｇ／ｍＬの濃度では１０倍に希釈）、または１μｇ／ｍＬの濃度では通した液を、この表面プラズモン共鳴バイオセンサーにそれぞれ５０μＬ（５分間）打ち込み、センサーグラムを測定した。また比較のためモノリス型シリカゲルに通していない１μｇ／ｍＬの濃度のリシン１２０のＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ：７．５、ＮａＣｌ：０．１５Ｍ）５０μＬ（５分間）を標準として打ち込み、センサーグラムを測定した。
【０１２２】
その結果、図２に示すように、モノリス型シリカゲルに通していないＨＥＰＥＳ緩衝液では良好なセンサーグラムが得られ、リシン１２０の検出強度は６９７ＲＵであった。
【０１２３】
一方、製造例１−１で調製したラクトース修飾モノリス型シリカゲルに通した溶液（１００μｇ／ｍＬの濃度では１００倍（１０×１０）に希釈、１０μｇ／ｍＬの濃度では１０倍に希釈、１μｇ／ｍＬでは希釈なし）のセンサーグラムの強度は、流速１００μｇ／ｍＬでは５２ＲＵ、１０μｇ／ｍＬでは３２ＲＵ、１μｇ／ｍＬでは２１０ＲＵであった。モノリス型シリカゲルに通していない１μｇ／ｍＬのリシン１２０のセンサーグラムの検出強度６９７ＲＵとの差がモノリス型シリカゲルに吸着された量である。
【０１２４】
この結果から、製造例１−１で調製したラクトース修飾モノリス型シリカゲルが効率よくリシン１２０を吸着、除染できることが確認できた。
【０１２５】
同様の手順で、製造例１−２で調製した、２−アミノエタノールによるエンドキャップ処理が施されたラクトース修飾モノリス型シリカゲルによるリシン１２０の吸着能を評価した。
その結果、図３に示すように、エンドキャップ処理が施された該ラクトース修飾モノリス型シリカゲルに通した溶液（１００μｇ／ｍＬの濃度では１００倍（１０×１０）に希釈、１０μｇ／ｍＬの濃度では１０倍に希釈、１μｇ／ｍＬでは希釈なし）のセンサーグラムの強度は、１００μｇ／ｍＬでは１５４ＲＵ、１０μｇ／ｍＬでは１９０ＲＵ、１μｇ／ｍＬでは５００ＲＵであった。モノリス型シリカゲルに通していない溶液（１μｇ／ｍＬ）のリシン１２０のセンサーグラムの検出強度９０３ＲＵとの差がモノリス型シリカゲルに吸着された量である。
【０１２６】
この結果から、製造例１−２で調製したラクトース修飾モノリス型シリカゲルが効率よくリシン１２０を吸着、除染できることが確認できた。
【０１２７】
〔比較例１〕
また同様の手順で、比較製造例１−１で調製した、ｐＡＰスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲルによるリシン１２０の吸着能を評価した。
【０１２８】
その結果、図４に示すように、ｐＡＰスペーサーの該ラクトース修飾モノリス型シリカゲルに通した溶液（１００μｇ／ｍＬの濃度では１００倍（１０×１０）に希釈、１０μｇ／ｍＬの濃度では１０倍に希釈、１μｇ／ｍＬでは希釈なし）のセンサーグラムの強度は、１００μｇ／ｍＬでは５６４ＲＵ、１０μｇ／ｍＬでは１３９ＲＵ、１μｇ／ｍＬでは２８３ＲＵであった。モノリス型シリカゲルに通していない１μｇ／ｍＬのリシン１２０のセンサーグラムの検出強度７６８ＲＵとの差がモノリス型シリカゲルに吸着された量である。
【０１２９】
この結果から、比較製造例１−１で調製したｐＡＰスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲルでは、製造例１−１で調製したトリエチレングリコールスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲルほど効率よくリシン１２０を吸着、除染できないことが確認された。
【０１３０】
また同様の手順で、比較製造例１−２で調製した、２−アミノエタノールによるエンドキャップ処理が施されたｐＡＰスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲルを用いてリシン１２０の吸着能を評価した。
【０１３１】
その結果、図５に示すように、比較製造例１−２で調製したラクトース修飾モノリス型シリカゲルに通した溶液（１００μｇ／ｍＬの濃度では１００倍（１０×１０）に希釈、１０μｇ／ｍＬの濃度では１０倍に希釈、１μｇ／ｍＬでは希釈なし）のセンサーグラムの強度は、１００μｇ／ｍＬでは７４０ＲＵ、１０μｇ／ｍＬでは５２８ＲＵ、１μｇ／ｍＬでは４６４ＲＵであった。モノリス型シリカゲルに通していない１μｇ／ｍＬのリシン１２０のセンサーグラムの検出強度７８３ＲＵとの差がモノリス型シリカゲルに吸着された量である。
【０１３２】
この結果から、比較製造例１−２で調製した、２−アミノエタノールによるエンドキャップ処理が施されたｐＡＰスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲルは、製造例１−１、または１−２で調製したトリエチレングリコールスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲルほど効率よくリシン１２０を吸着、除染できないことが確認された。
【０１３３】
〔実施例２〕
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるリシン６０の吸着能の評価
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いたリシン１２０の吸着能の評価と同様の手順で、製造例１−１で調製したラクトース修飾モノリス型シリカゲルのリシン６０（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ６０、ホーネン社製）の吸着能を評価した。
【０１３４】
その結果、図６に示すように、製造例１−１で調製したラクトース修飾モノリス型シリカゲルに通した溶液（１００μｇ／ｍＬの濃度では１００倍（１０×１０）に希釈、１０μｇ／ｍＬの濃度では１０倍に希釈、１μｇ／ｍＬでは希釈なし）のセンサーグラムの強度は、１００μｇ／ｍＬでは５７ＲＵ、１０μｇ／ｍＬでは４３ＲＵ、１μｇ／ｍＬでは１１８ＲＵであった。モノリスモノリス型シリカゲルに通していない１μｇ／ｍＬのリシン６０のセンサーグラムの検出強度３６８ＲＵとの差がモノリス型シリカゲルに吸着された量である。
【０１３５】
この結果から、製造例１−１で調製したトリエチレングリコールスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲルが、効率よくリシン６０を吸着、除染できることが確認できた。
【０１３６】
また同様の手順で、製造例１−２で調製したラクトース修飾モノリス型シリカゲルのリシン６０の吸着能を評価した。
【０１３７】
その結果、図７に示すように、製造例１−２で調製したのラクトース修飾モノリス型シリカゲルに通した溶液（１００μｇ／ｍＬの濃度では１００倍（１０×１０）に希釈、１０μｇ／ｍＬの濃度では１０倍に希釈、１μｇ／ｍＬでは希釈なし）のセンサーグラムの強度は、１００μｇ／ｍＬでは８４ＲＵ、１０μｇ／ｍＬでは４１ＲＵ、１μｇ／ｍＬでは７６  ＲＵであった。モノリス型シリカゲルに通していない１μｇ／ｍＬのリシン６０のセンサーグラムの検出強度５００ＲＵとの差がモノリス型シリカゲルに吸着された量である。
【０１３８】
この結果から、製造例１−２で調製した２−アミノエタノールによるエンドキャップ処理が施されたトリエチレングリコールスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲルが、効率よくリシン６０を吸着、除染できることが確認できた。
【０１３９】
以下の実施例３−１〜４−１において、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を用いたタンパク質の定量を行った。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法とは、タンパク質サンプル溶液とクーマシーブルー試薬とを混和し、タンパク質を含まないバックグラウンドとの波長５９５ｎｍにおける吸光度の差を分光光度計により測定することによる、タンパク質の定量方法である。
【０１４０】
〔実施例３−１〕
Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を用いたラクトース修飾モノリス型シリカゲルのリシン６０除染能の定量的評価
製造例１−１、１−２、及び比較製造例１−１、１−２で調製したラクトース修飾モノリス型シリカゲルをエッペンドルフのチップにそれぞれ取り付け、超純水（ＭｉｌｌｉＱ水）または５００ｍＭの塩化ナトリウム水溶液で調製したリシン６０溶液（１５０μｇ／ｍＬ、１００μＬ）による吐出、吸引を１０往復繰り返すことにより、該モノリス型シリカゲルにリシン６０溶液を通した。
【０１４１】
超純水（ＭｉｌｌｉＱ水）または５００ｍＭＮａＣｌ水溶液で調製した０、１、５、２５、５０、１００、１５０μｇ／ｍＬの各濃度のリシン６０溶液５０μＬをＢｒａｄｆｏｒｄ試薬（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ＰｌｕｓＴＭ−Ｔｈｅ Ｂｅｔｔｅｒ Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、ＰＩＥＲＣＥ社製）１ｍＬに加え、３０分後に吸光光度計（日本分光社製Ｖ−５８０）による、５９５ｎｍにおける吸光度の測定から、検量線を作成した。
【０１４２】
またラクトース誘導体とカルボキシル基修飾モノリス型シリカゲルとの縮合反応で用いた試薬（ＮＨＳ、ＥＤＣ、およびＤＭＦ）をＢｒａｄｆｏｒｄ試薬に加え、その５９５ｎｍの吸光度が有意に変化しないことから、これらの試薬が、本測定に影響しないことを確認した。
【０１４３】
超純粋（ＭｉｌｌｉＱ水）または５００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液で調製したリシン６０溶液を製造例１−１、１−２、２−１、２−２、及び比較製造例１−１、１−２、２の計７種のラクトース修飾モノリス型シリカゲルにそれぞれ通した（計１４溶液）。その溶液５０μＬを量り取り、Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬１ｍＬに加え、３０分後に吸光光度計により５９５ｎｍにおける吸光度を測定した。それぞれの溶液の５９５ｎｍの吸光度を測定し、検量線を用いて７種のラクトース修飾モノリス型シリカゲルに吸着されずに残っているリシン６０の濃度を定量した。
【０１４４】
７種のラクトース修飾モノリス型シリカゲルに通した後の溶液中に残っているリシン６０濃度、および除染率を表２に示す。
【表２】
0005392528.tif 000019
※除染率＝（１５０−定量されたリシン６０の濃度）／１５０×１００
【０１４５】
これらの結果から、トリエチレングリコールスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲル（製造例１−１）、およびエンドキャップ処理が施されたトリエチレングリコールスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲル（製造例１−２）は、純水（ＭｉｌｌｉＱ水）中および５００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液の双方で、効率よくリシン６０を吸着、除染できることが確認できた。
【０１４６】
一方、エンドキャップ処理を施したｐＡＰスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲル（比較製造例１−２）では、ほとんどリシン６０を吸着することができなかった。エンドキャップ処理を施していないｐＡＰスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲル（比較製造例１−１）では、純水中のみリシン６０を吸着することができたが、５００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液中ではリシン６０をほとんど吸着することができなかった。これらの結果は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるリシン６０の吸着能の評価の結果とほぼ一致した。
【０１４７】
〔実施例３−２〕
ラクトース修飾モノリス型シリカゲルに吸着されたリシン６０の溶出実験
ラクトース修飾モノリス型シリカゲルに吸着されたリシン６０が、モノリス型シリカゲル表面上のラクトースと結合して吸着されているのかを調べるため、下記の手順でラクトース修飾モノリス型シリカゲルに吸着されたリシン６０の溶出実験を行った。
【０１４８】
実施例３−１において使用したリシン６０吸着後のラクトース修飾モノリス型シリカゲル（計１４個）のそれぞれを３ｍＬの超純水（ＭｉｌｌｉＱ水）で洗浄した。洗浄後のモノリス型シリカゲルに５０ｍＭのラクトース水溶液１００μＬを加え、吐出、吸引を１０往復繰り返した。そのラクトース水溶液を５０μＬ量り取り、Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬１ｍＬに加え、３０分後に吸光光度計により５９５ｎｍにおける吸光度を測定した。モノリス型シリカゲルから溶出するリシン６０の濃度を、検量線を用いて定量した結果を表３に示す。
なお、５０ｍＭのラクトース水溶液５０μＬをＢｒａｄｆｏｒｄ試薬に加え、その５９５ｎｍの吸光度が有意に変化しないことから、５０ｍＭのラクトース水溶液が、本測定に影響しないことを確認した。
【０１４９】
【表３】
0005392528.tif 000020
※溶出率（％）＝定量されたリシン６０の濃度／１５０×１００
【０１５０】
トリエチレングリコールスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲル（製造例１−１、２−２）、エンドキャップ処理を施したトリエチレングリコールスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲル（製造例１−２、２−１）は、超純水中および５００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液中の双方において、リシン６０の吸着量が大きいほど、ラクトースにより溶出されるリシン６０の濃度が高い。一方、ｐＡＰスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲル（比較製造例１−１、１−２、２）では、純水中および５００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液中の双方において、リシン６０の吸着に関係なくラクトースにより溶出されるリシン６０の濃度は低かった。
【０１５１】
これは、トリエチレングリコールスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲルでは、リシン６０は、該モノリス型シリカゲル上の糖鎖と特異的に結合し、安定に吸着されている一方で、ｐＡＰスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲルでは、モノリス型シリカゲル上のカルボキシル基との静電的な相互作用やモノリス型シリカゲルの空隙との物理的相互作用などにより、リシン６０が不安定に吸着されていることを示唆する。すなわち、トリエチレングリコールスペーサーを用いたラクトース修飾モノリス型シリカゲルは、ｐＡＰスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲルと比べて、リシン６０との親和力が高く、リシン６０を効率的に除去できる。
【０１５２】
ラクトース修飾モノリス型シリカゲルが、他のタンパク質と非特異的に結合しないかを調べるため、一般的なタンパク質であるアルブミンやレクチン（糖結合性タンパク質）を用いて、その吸着能力を調べた。
【０１５３】
〔実施例４−１〕
Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を用いたＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）の吸着評価
製造例２−１で調製したトリエチレングリコールスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲル、製造例２−２で調製したエンドキャップ処理を施したトリエチレングリコールスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲル、および未修飾のカルボン酸モノリス型シリカゲル（未エンドキャッピング、１個当たり１．０μｍｏｌカルボン酸修飾）のそれぞれを取り付けたエッペンドルフのチップに、実施例３−１と同様、超純水（ＭｉｌｌｉＱ水）または５００ｍＭの塩化ナトリウム水溶液で調整したＢＳＡ（１５０μｇ／ｍＬ、１００μＬ）をそれぞれ入れ、吐出、吸引を１０往復繰り返した。
【０１５４】
超純水（ＭｉｌｌｉＱ水）および５００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液で調製した０、１、５、２５、５０、１００、１５０μｇ／ｍＬの各濃度のＢＳＡ溶液５０μＬをＢｒａｄｆｏｒｄ試薬１ｍＬに加え、３０分後に吸光光度計により５９５ｎｍにおける吸光度を測定し、検量線を作成した。
【０１５５】
前記３種類のモノリス型シリカゲルに通した溶液（超純水（ＭｉｌｌｉＱ水）、５００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液  計６溶液）５０μＬを量り取り、Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬１ｍＬに加え、３０分後に、吸光光度計により５９５ｎｍにおける吸光度を測定した。それぞれの溶液の５９５ｎｍ吸光度から、検量線を用いてモノリス型シリカゲルに吸着されずに残っているＢＳＡの濃度を定量した。その結果を表４に示す。
【０１５６】
【表４】
0005392528.tif 000021
※吸着率（％）＝（１５０−定量されたＢＳＡの濃度）／１５０×１００
【０１５７】
以上の結果からラクトース修飾モノリス型シリカゲルは、ＢＳＡの非特異的な吸着が僅少であることがわかった。
【０１５８】
〔実施例４−２〕
Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を用いたＮ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸結合性タンパク質ＷＧＡ（Ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、小麦胚芽レクチン）の吸着評価
製造例２−１で調製したトリエチレングリコールスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲル、製造例２−２で調製したエンドキャップ処理を施したトリエチレングリコールスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲル、および未修飾のカルボン酸モノリス型シリカゲル（未エンドキャッピング、１個当たり１．０μｍｏｌカルボン酸修飾）のそれぞれを取り付けたエッペンドルフのチップに実施例３−１、実施例４−１と同様、超純水（ＭｉｌｌｉＱ水）または５００ｍＭの塩化ナトリウム水溶液で調製したＷＧＡ（１５０μｇ／ｍＬ、１００μＬ）をそれぞれ入れ、吐出、吸引を１０往復繰り返した。
【０１５９】
超純水（ＭｉｌｌｉＱ水）および５００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液で調製した０、１、５、２５、５０、１００、１５０μｇ／ｍＬの各濃度のＷＧＡ溶液５０μＬをＢｒａｄｆｏｒｄ試薬１ｍＬに加え、３０分後に、吸光光度計により５９５ｎｍにおける吸光度を測定し、検量線を作成した。
【０１６０】
前記３種類のモノリス型シリカゲルに通した溶液（超純水（ＭｉｌｌｉＱ水）、５００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液  計６溶液）５０μＬを量り取り、Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬１ｍＬに加え、３０分後に、吸光光度計により５９５ｎｍにおける吸光度を測定した。それぞれの溶液の５９５ｎｍ吸光度から、検量線を用いてモノリス型シリカゲルに吸着されずに残っているＷＧＡの濃度を定量した。その結果を表５に示す。
【表５】
0005392528.tif 000022
※吸着率（％）＝（１５０−定量されたＷＧＡの濃度）／１５０×１００
【０１６１】
以上の結果からラクトース修飾モノリス型シリカゲルは、ＷＧＡの非特異的な吸着が僅少であることがわかった。
【０１６２】
実施例４−１及び４−２の測定結果は、本発明に係るラクトース誘導体修飾体が、リシン以外のタンパク質を非特異的に吸着せず、極めて効率的にリシン含有汚染液を無毒化できることを示す。これに対し、一般的な活性炭カラムを使用した場合には、タンパク質など汚染液中に含まれる様々な夾雑物が活性炭に吸着することから、目詰まりを起こし、すぐに使用できなくなる。また、一般的な活性炭カラムは、リシン以外のタンパク質を非特異的に吸着することから、リシン吸着能を著しく減少させる。
【０１６３】
〔実施例５〕
ＳＰＲセンサーによる糖結合性タンパク質の検出
１）アルファ２，３−シアリルラクトース及びアルファ２，６−シアリルラクトース固定化センサーチップの作成
特開２００６−３４７９０８号公報に記載されているアルファ２，３−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミニド及びアルファ２，６−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミニドのチオオクト酸誘導体の合成方法と同様に、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）で活性化したチオオクト酸と、アルファ２，３−シアリルラクトース又はアルファ２，６−シアリルラクトースとを、ＤＭＦ中で反応させることにより、アルファ２，３−シアリルラクトース及びアルファ２，６−シアリルラクトースのチオオクト酸誘導体を合成した。
【０１６４】
Ｂｉａｃｏｒｅ社より市販されているSIA kit Auの金基板を１００ｍｇ／Ｌのアルファ２，３−シアリルラクトースまたは、アルファ２，６−シアリルラクトースのチオオクト酸誘導体のメタノール（和光純薬社製）溶液１ｍＬに室温で２４時間浸漬した。その後、メタノール、水の順で３回洗浄することにより、アルファ２，３−シアリルラクトース及びアルファ２，６−シアリルラクトース固定化センサーチップを作成した。得られたセンサーチップは、自己組織化により高密度にアルファ２，３−シアリルラクトースまたはアルファ２，６−シアリルラクトースが固定化されている。糖結合性タンパク質でありインフルエンザの表面タンパクでもあるヘマグルチニンと、センサーチップに高密度に固定化されたアルファ２，３−シアリルラクトースまたは、アルファ２，６−シアリルラクトースとの高い親和性を利用して、表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用いてインフルエンザの表面タンパクであるヘマグルチニンを高感度に検出、定量できる。
【０１６５】
２）シアリルラクトース修飾モノリス型シリカゲルによるインフルエンザのヘマグルチニンの吸着能力のＳＰＲによる評価
製造例３、４で調製した、２種類のシアリルラクトース修飾モノリス型シリカゲルをエッペンドルフのチップ先に熱で融着させることにより取り付けた。
ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ、ｐＨ：７．５、ＮａＣｌ：０．１５Ｍ）緩衝液で調製した各濃度のヘマグルチニン１００μｇ／ｍＬ・１００μＬ、１０μｇ／ｍＬ・１００ μＬ、１μｇ／ｍＬ・１００μＬをそれぞれシアリルラクトース修飾モノリス型シリカゲルを取り付けたエッペンドルフのチップへ入れ、吐出、吸引を１０往復繰り返してシアリルラクトース修飾モノリス型シリカゲルにヘマグルチニンを吸着させた。それらの溶液を１００μｇ／ｍＬの濃度では該ＨＥＰＥＳ緩衝液で１００倍（１０×１０）に希釈し、１０μｇ／ｍＬの濃度では該ＨＥＰＥＳ緩衝液で１０倍に希釈した。この希釈操作により、モノリス型シリカゲルにヘマグルチニンが全く吸着していない場合のインフルエンザのヘマグルチニンの濃度は１μｇ／ｍＬになる。なお１μｇ／ｍＬの濃度ではモノリス型シリカゲルを通した溶液をそのまま使用した。
【０１６６】
吸着実験にはヘマグルチニンＨ５Ｎ１  Ａ  Ｖｉｅｔｎｕｍ１２０３／２００４(Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製)を用いた。
アルファ２，３−シアリルラクトース固定化センサーチップを市販の表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ３０００、Ｂｉａｃｏｒｅ社製）に装着後、設定温度２５℃、流速１０μＬ／ｍｉｎでＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ：７．５、ＮａＣｌ：０．１５Ｍ）を流して、計測前にセンサーグラムが安定したことを確認した。製造例３で調製したアルファ２，３−シアリルラクトース修飾モノリス型シリカゲルに通し、さらに希釈した液（１００μｇ／ｍＬの濃度では１００倍（１０×１０）に希釈、１０μｇ／ｍＬの濃度では１０倍に希釈）、または１μｇ／ｍＬの濃度では通した液を、この表面プラズモン共鳴バイオセンサーにそれぞれ５０μＬ（５分間）打ち込み、センサーグラムを測定した。また比較のためモノリス型シリカゲルに通していない１μｇ／ｍＬの濃度のヘマグルチニンのＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ：７．５、ＮａＣｌ：０．１５Ｍ）５０μＬ（５分間）を標準として打ち込み、センサーグラムを測定した。
【０１６７】
その結果、図８に示すように、モノリス型シリカゲルに通していないヘマグルチニンＨ５Ｎ１の緩衝液では良好なセンサーグラムが得られ、ヘマグルチニンＨ５Ｎ１の検出強度は１０００ＲＵであった。
【０１６８】
一方、製造例３で調製したアルファ２，３−シアリルラクトース修飾モノリス型シリカゲルに通した溶液（１００μｇ／ｍＬの濃度では１００倍（１０×１０）に希釈、１０μｇ／ｍＬの濃度では１０倍に希釈、１μｇ／ｍＬでは希釈なし）のセンサーグラムの強度は、１００μｇ／ｍＬでは２３５ＲＵ、１０μｇ／ｍＬでは１０２ＲＵ、１μｇ／ｍＬでは７９ＲＵであった。モノリス型シリカゲルに通していない１μｇ／ｍＬのヘマグルチニンのセンサーグラムの検出強度１０００ＲＵとの差がモノリス型シリカゲルに吸着された量である。
【０１６９】
この結果から、製造例３で調製したアルファ２，３−シアリルラクトース修飾モノリス型シリカゲルが効率よくヘマグルチニンＨ５Ｎ１を吸着、除染できることが確認できた。
【０１７０】
また同様の手順で、製造例３で調製した、アルファ２，３−シアリルラクトース修飾モノリス型シリカゲルを用いてヘマグルチニンＨ３Ｎ１  Ａ  Ｐａｎａｍａ２００７／９９（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）の吸着能を評価した。なお表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ３０００、Ｂｉａｃｏｒｅ社製）にはアルファ２，６−シアリルラクトース固定化センサーチップを用いた。
【０１７１】
その結果、図９に示すように、製造例３で調製したアルファ２，３−シアリルラクトース修飾モノリス型シリカゲルに通した溶液（１００μｇ／ｍＬの濃度では１００倍（１０×１０）に希釈、１０μｇ／ｍＬの濃度では１０倍に希釈、１μｇ／ｍＬでは希釈なし）のセンサーグラムの強度は、１００μｇ／ｍＬでは５６ＲＵ、１０μｇ／ｍＬでは１５５ＲＵ、１μｇ／ｍＬでは２００ＲＵであった。モノリス型シリカゲルに通していない１μｇ／ｍＬのヘマグルチニンのセンサーグラムの検出強度８７２ＲＵとの差がモノリス型シリカゲルに吸着された量である。
【０１７２】
この結果から、製造例３で調製したアルファ２，３−シアリルラクトース修飾モノリス型シリカゲルが効率よくヘマグルチニンＨ３Ｎ１を吸着、除染できることが確認できた。
【０１７３】
また同様の手順で、製造例４で調製した、アルファ２，６−シアリルラクトース修飾モノリス型シリカゲルを用いてヘマグルチニンＨ３Ｎ１  Ａ  Ｐａｎａｍａ２００７／９９(Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製)の吸着能を評価した。なお表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ３０００、Ｂｉａｃｏｒｅ社製）にはアルファ２，６−シアリルラクトース固定化センサーチップを用いた。
【０１７４】
その結果、図１０に示すように、製造例４で調製したアルファ２，６−シアリルラクトース修飾モノリス型シリカゲルに通した溶液（１００μｇ／ｍＬの濃度では１００倍（１０×１０）に希釈、１０μｇ／ｍＬの濃度では１０倍に希釈、１μｇ／ｍＬでは希釈なし）のセンサーグラムの強度は、１００μｇ／ｍＬでは３７ＲＵ、１０μｇ／ｍＬでは３２ＲＵ、１μｇ／ｍＬでは４７ＲＵであった。モノリス型シリカゲルに通していない１μｇ／ｍＬのヘマグルチニンのセンサーグラムの検出強度７５８ＲＵとの差がモノリス型シリカゲルに吸着された量である。
【０１７５】
この結果から、製造例４で調製したアルファ２，６−シアリルラクトース修飾モノリス型シリカゲルが効率よくヘマグルチニンＨ３Ｎ１を吸着、除染できることが確認できた。
【０１７６】
また同様の手順で、製造例３で調製した、アルファ２，３−シアリルラクトース修飾モノリス型シリカゲルを用いて不活性化インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２  Ａ  Ｐａｎａｍａ２００７／９９（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）の吸着能を評価した。なお表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ３０００、Ｂｉａｃｏｒｅ社製）にはアルファ２，６−シアリルラクトース固定化センサーチップを用いた。
【０１７７】
その結果、図１１に示すように、製造例３で調製したアルファ２，３−シアリルラクトース修飾モノリス型シリカゲルに通した溶液（１００μｇ／ｍＬの濃度では５０倍（１０×５）に希釈、１０μｇ／ｍＬの濃度では５倍に希釈、２μｇ／ｍＬでは希釈なし）のセンサーグラムの強度は、１００μｇ／ｍＬでは８ＲＵ、１０μｇ／ｍＬでは１９ＲＵ、２μｇ／ｍＬでは９５ＲＵであった。モノリス型シリカゲルに通していない２μｇ／ｍＬの不活性化インフルエンザウイルスのセンサーグラムの検出強度１５７ＲＵとの差がモノリス型シリカゲルに吸着された量である。
【０１７８】
この結果から、製造例３で調製したアルファ２，３−シアリルラクトース修飾モノリス型シリカゲルが効率よく不活性化インフルエンザウイルスを吸着、除染できることが確認できた。
【０１７９】
また同様の手順で、製造例４で調製した、アルファ２，６−シアリルラクトース修飾モノリス型シリカゲルを用いて不活性化インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２  Ａ  Ｐａｎａｍａ２００７／９９（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）の吸着能を評価した。なお表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ３０００、Ｂｉａｃｏｒｅ社製）にはアルファ２，６−シアリルラクトース固定化センサーチップを用いた。
【０１８０】
その結果、図１２に示すように、製造例４で調製したアルファ２，６−シアリルラクトース修飾モノリス型シリカゲルに通した溶液（１００μｇ／ｍＬの濃度では５０倍（１０×５）に希釈、１０μｇ／ｍＬの濃度では５倍に希釈、２μｇ／ｍＬでは希釈なし）のセンサーグラムの強度は、１００μｇ／ｍＬでは７ＲＵ、１０μｇ／ｍＬでは１９ＲＵ、２μｇ／ｍＬでは４２ＲＵであった。モノリス型シリカゲルに通していない２μｇ／ｍＬの不活性化インフルエンザウイルスのセンサーグラムの検出強度１５５ＲＵとの差がモノリス型シリカゲルに吸着された量である。
【０１８１】
この結果から、製造例４で調製したアルファ２，６−シアリルラクトース修飾モノリス型シリカゲルが効率よく不活性化インフルエンザウイルスを吸着、除染できることが確認できた。
【０１８２】
実施例５の測定結果は、本発明に係るシアリルラクトース誘導体修飾体が、極めて効率的にインフルエンザウイルス含有汚染液を無毒化できることを示す。これに対し、一般的な活性炭カラムを使用した場合には、タンパク質など汚染液中に含まれる様々な夾雑物が活性炭に吸着することから、目詰まりを起こし、すぐに使用できなくなる。また、一般的な活性炭カラムは、インフルエンザウイルス以外のタンパク質を非特異的に吸着することから、インフルエンザウイルス吸着能を著しく減少させる。
【産業上の利用可能性】
【０１８３】
以上のとおり、本発明は、周囲環境に悪影響を与えることなく、毒素またはウィルスに汚染された洗浄液等の液を簡便かつハイスループットで固相抽出する方法および無毒化する方法、並びにそれを用いる固相抽出用捕集剤および除染剤を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１８４】
【図１】モノリス型シリカゲルの電子顕微鏡写真  （図中、（ａ）は、モノリス型シリカゲルの電子顕微鏡写真であり、Ｗ．Ｄ．（ワーキングディスタンスの略）は、物質に焦点を合わせる為の入力値を、ｋＶは、加速電圧値を、ｘは、測定倍率を、μｍは、単位長さ（１０μｍの場合には、数値の上部の１０個のドットで１０μｍを表現する）をそれぞれ意味する。また、（ｂ）は（ａ）の拡大図である。）
【図２】製造例１−１で調製したトリエチレングリコールスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲルによるリシン１２０の除染効果を評価するためのＳＰＲセンサーグラム（図中、ａ）は、該モノリス型シリカゲルに通していないリシン１２０溶液（１μｇ／ｍＬ）のセンサーグラムを、ｂ）は、該モノリス型シリカゲルに通したリシン１２０溶液（１００μｇ／ｍＬ、１００μＬ）を１００倍に希釈した溶液のセンサーグラムを、ｃ）は、該モノリス型シリカゲルに通したリシン１２０溶液（１０μｇ／ｍＬ、１００μＬ）を１０倍に希釈した溶液のセンサーグラムを、ｄ）は、該モノリス型シリカゲルに通したリシン１２０溶液（１μｇ／ｍＬ、２００μＬ）のセンサーグラムをそれぞれ意味する。）
【図３】製造例１−２で調製したエンドキャップ処理が施されたトリエチレングリコールスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲルによるリシン１２０の除染効果を評価するためのＳＰＲセンサーグラム（図中、ａ）は、該モノリス型シリカゲルに通していないリシン１２０溶液（１μｇ／ｍＬ）のセンサーグラムを、ｂ）は、該モノリス型シリカゲルに通したリシン１２０溶液（１００μｇ／ｍＬ、１００μＬ）を１００倍に希釈した溶液のセンサーグラムを、ｃ）は、該モノリス型シリカゲルに通したリシン１２０溶液（１０μｇ／ｍＬ、１００μＬ）を１０倍に希釈した溶液のセンサーグラムを、ｄ）は、該モノリス型シリカゲルに通したリシン１２０溶液（１μｇ／ｍＬ、２００μＬ）のセンサーグラムをそれぞれ意味する。）
【図４】比較製造例１−１で調製したｐＡＰスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲルによるリシン１２０の除染効果を評価するためのＳＰＲセンサーグラム（図中、ａ）は、該モノリス型シリカゲルに通していないリシン１２０溶液（１μｇ／ｍＬ）のセンサーグラムを、ｂ）は、該モノリス型シリカゲルに通したリシン１２０溶液（１００μｇ／ｍＬ、１００μＬ）を１００倍に希釈した溶液のセンサーグラムを、ｃ）は、該モノリス型シリカゲルに通したリシン１２０溶液（１０μｇ／ｍＬ、１００μＬ）を１０倍に希釈した溶液のセンサーグラムを、ｄ）は、該モノリス型シリカゲルに通したリシン１２０溶液（１μｇ／ｍＬ、２００μＬ）のセンサーグラムをそれぞれ意味する。）
【図５】比較製造例１−２で調製したエンドキャップ処理が施されたｐＡＰスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲルによるリシン１２０の除染効果を評価するためのＳＰＲセンサーグラム（図中、ａ）は、該モノリス型シリカゲルに通していないリシン１２０溶液（１μｇ／ｍＬ）のセンサーグラムを、ｂ）は、該モノリス型シリカゲルに通したリシン１２０溶液（１００μｇ／ｍＬ、１００μＬ）を１００倍に希釈した溶液のセンサーグラムを、ｃ）は、該モノリス型シリカゲルに通したリシン１２０溶液（１０μｇ／ｍＬ、１００μＬ）を１０倍に希釈した溶液のセンサーグラムを、ｄ）は、該モノリス型シリカゲルに通したリシン１２０溶液（１μｇ／ｍＬ、２００μＬ）のセンサーグラムをそれぞれ意味する。）
【図６】製造例１−１で調製したトリエチレングリコールスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲルによるリシン６０の除染効果を評価するためのＳＰＲセンサーグラム（図中、ａ）は、該モノリス型シリカゲルに通していないリシン６０溶液（１μｇ／ｍＬ）のセンサーグラムを、ｂ）は、該モノリス型シリカゲルに通したリシン６０溶液（１００μｇ／ｍＬ、１００μＬ）を１００倍に希釈した溶液のセンサーグラムを、ｃ）は、該モノリス型シリカゲルに通したリシン６０溶液（１０μｇ／ｍＬ、１００μＬ）を１０倍に希釈した溶液のセンサーグラムを、ｄ）は、該モノリス型シリカゲルに通したリシン６０溶液（１μｇ／ｍＬ、２００μＬ）のセンサーグラムをそれぞれ意味する。）
【図７】製造例１−２で調製したエンドキャップ処理が施されたトリエチレングリコールスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲルによるリシン６０の除染効果を評価するためのＳＰＲセンサーグラム（図中、ａ）は、該モノリス型シリカゲルに通していないリシン６０溶液（１μｇ／ｍＬ）のセンサーグラムを、ｂ）は、該モノリス型シリカゲルに通したリシン６０溶液（１００μｇ／ｍＬ、１００μＬ）を１００倍に希釈した溶液のセンサーグラムを、ｃ）は、該モノリス型シリカゲルに通したリシン６０溶液（１０μｇ／ｍＬ、１００μＬ）を１０倍に希釈した溶液のセンサーグラムを、ｄ）は、該モノリス型シリカゲルに通したリシン６０溶液（１μｇ／ｍＬ、２００μＬ）のセンサーグラムをそれぞれ意味する。）
【図８】製造例３で調製したアルファ２，３−シアリルラクトース修飾モノリス型シリカゲルによるヘマグルチニンＨ５Ｎ１の除染効果を評価するためのＳＰＲセンサーグラム（図中、ａ）は、該モノリス型シリカゲルに通していないヘマグルチニンＨ５Ｎ１溶液（１μｇ／ｍＬ）のセンサーグラムを、ｂ）は、該モノリス型シリカゲルに通したヘマグルチニンＨ５Ｎ１溶液（１００μｇ／ｍＬ、１００μＬ）を１００倍に希釈した溶液のセンサーグラムを、ｃ）は、該モノリス型シリカゲルに通したヘマグルチニンＨ５Ｎ１溶液（１０μｇ／ｍＬ、１００μＬ）を１０倍に希釈した溶液のセンサーグラムを、ｄ）は、該モノリス型シリカゲルに通したヘマグルチニンＨ５Ｎ１溶液（１μｇ／ｍＬ、１００μＬ）のセンサーグラムをそれぞれ意味する。）
【図９】製造例３で調製したアルファ２，３−シアリルラクトース修飾モノリス型シリカゲルによるヘマグルチニンＨ３Ｎ１の除染効果を評価するためのＳＰＲセンサーグラム（図中、ａ）は、該モノリス型シリカゲルに通していないヘマグルチニンＨ３Ｎ１溶液（１μｇ／ｍＬ）のセンサーグラムを、ｂ）は、該モノリス型シリカゲルに通したヘマグルチニンＨ３Ｎ１溶液（１００μｇ／ｍＬ、１００μＬ）を１００倍に希釈した溶液のセンサーグラムを、ｃ）は、該モノリス型シリカゲルに通したヘマグルチニンＨ３Ｎ１溶液（１０μｇ／ｍＬ、１００μＬ）を１０倍に希釈した溶液のセンサーグラムを、ｄ）は、該モノリス型シリカゲルに通したヘマグルチニンＨ３Ｎ１溶液（１μｇ／ｍＬ、１００μＬ）のセンサーグラムをそれぞれ意味する。）
【図１０】製造例４で調製したアルファ２，６−シアリルラクトース修飾モノリス型シリカゲルによるヘマグルチニンＨ３Ｎ１の除染効果を評価するためのＳＰＲセンサーグラム（図中、ａ）は、該モノリス型シリカゲルに通していないヘマグルチニンＨ３Ｎ１溶液（１μｇ／ｍＬ）のセンサーグラムを、ｂ）は、該モノリス型シリカゲルに通したヘマグルチニンＨ３Ｎ１溶液（１００μｇ／ｍＬ、１００μＬ）を１００倍に希釈した溶液のセンサーグラムを、ｃ）は、該モノリス型シリカゲルに通したヘマグルチニンＨ３Ｎ１溶液（１０μｇ／ｍＬ、１００μＬ）を１０倍に希釈した溶液のセンサーグラムを、ｄ）は、該モノリス型シリカゲルに通したヘマグルチニンＨ３Ｎ１溶液（１μｇ／ｍＬ、１００μＬ）のセンサーグラムをそれぞれ意味する。なお、図中（Ｂ）は、（Ａ）におけるヘマグルチニンＨ３Ｎ１溶液注入前５０秒から注入後３００秒までのセンサーグラムの拡大図である。）
【図１１】製造例３で調製したアルファ２，３−シアリルラクトース修飾モノリス型シリカゲルによる不活性化インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２の除染効果を評価するためのＳＰＲセンサーグラム（図中、ａ）は、該モノリス型シリカゲルに通していない不活性化インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２溶液（２μｇ／ｍＬ）のセンサーグラムを、ｂ）は、該モノリス型シリカゲルに通した不活性化インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２溶液（１００μｇ／ｍＬ、１００μＬ）を５０倍に希釈した溶液のセンサーグラムを、ｃ）は、該モノリス型シリカゲルに通した不活性化インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２溶液（１０μｇ／ｍＬ、１００μＬ）を５倍に希釈した溶液のセンサーグラムを、ｄ）は、該モノリス型シリカゲルに通した不活性化インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２溶液（２μｇ／ｍＬ、１００μＬ）のセンサーグラムをそれぞれ意味する。）
【図１２】製造例４で調製したアルファ２，６−シアリルラクトース修飾モノリス型シリカゲルによる不活性化インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２の除染効果を評価するためのＳＰＲセンサーグラム（図中、ａ）は、該モノリス型シリカゲルに通していない不活性化インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２（２μｇ／ｍＬ）のセンサーグラムを、ｂ）は、該モノリス型シリカゲルに通した不活性化インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２溶液（１００μｇ／ｍＬ、１００μＬ）を５０倍に希釈した溶液のセンサーグラムを、ｃ）は、該モノリス型シリカゲルに通した不活性化インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２溶液（１０μｇ／ｍＬ、１００μＬ）を５倍に希釈した溶液のセンサーグラムを、ｄ）は、該モノリス型シリカゲルに通した不活性化インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２溶液（２μｇ／ｍＬ、１００μＬ）のセンサーグラムをそれぞれ意味する。）
【図１３】本発明の処理過程を模式的に示す図
【図２】
0005392528.tif 000029
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１】
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