(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドが配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、且つ該ポリヌクレオチドの５’末端から３９０番目の塩基はＴ、Ｃ、Ａから選択される塩基であり、５’末端から３９１番目〜３９３番目の塩基はＴＡＴ、ＴＡＣから選択される塩基配列である、請求項１記載のポリヌクレオチド（尚、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンをそれぞれ表す。以下同じ。）。
【請求項３】
３９１番目から３９３番目の塩基配列がＴＡＴである、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
３９０番目の塩基がＣである、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号３で表される、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる、ヒアルロン酸結合能を有するタンパク質。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組換え発現ベクターを組み込んだバキュロウイルスでトランスフェクションされた宿主細胞又は該組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して得られた形質転換体を培養し、培養液からタンパク質を分離・精製することを特徴とする、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるヒアルロン酸結合能を有するタンパク質の製造方法
【請求項８】
試料中のヒアルロン酸と、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるヒアルロン酸結合能を有するタンパク質を接触させてヒアルロン酸と該タンパク質との複合体を形成させ、次いで該複合体と、該タンパク質に特異的な抗体を担持させた担体とを反応させ、該反応により生じた凝集物による光学的変化を測定し、該測定値からヒアルロン酸量を算出することを特徴とする、ヒアルロン酸の測定方法。
【請求項９】
該担体がラテックスである、請求項８に記載の測定方法。
【請求項１０】
配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるヒアルロン酸結合能を有するタンパクを構成成分として含有する、ヒアルロン酸測定用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安価で且つ品質の安定性に優れた、新規なヒアルロン酸結合能を有するタンパク質（ヒアルロン酸バインディングプロテイン。以下、「ＨＡＢＰ」と略す場合がある。）、及びこれを用いた、高精度なヒアルロン酸の測定方法並びにその試薬キットに関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸はムコ多糖の一種で、主として動物の関節液や眼球ガラス体液、臍帯、真皮表層などの結合組織等に含まれる。その血中濃度は、リウマチ、癌、肝臓疾患時に上昇することが知られ、これら疾患に対する診断に有用なものとされており、種々の測定方法が現在開発されている。【０００３】
ヒアルロン酸の測定方法としては、ＨＡＢＰを用い、酵素免疫測定法（ELISA）により測定する方法（特許文献１，特許文献２等）や、ラテックス粒子を用いた免疫学的測定方法が知られている。【０００４】
中でも、ラテックス粒子を用いた免疫学的測定方法は、その簡便さや汎用装置への対応が容易なことから、広く使用されるようになっている。ヒアルロン酸測定用試薬として、ラテックス粒子を用いた測定法としては、ＨＡＢＰを担体粒子に担持させ、試料中のヒアルロン酸と反応させて反応混合物を生成させ、それを検出することによりヒアルロン酸を測定する方法（特許文献３）等が知られている。【０００５】
一方、ＨＡＢＰとしては、アグレカン等のプロテオグリカン、リンクプロテイン、ヒアルロネクチン等が知られている。その中で、アグレカン（aggrecan）は、軟骨に存在するプロテオグリカンの約９０％を占める高分子量のプロテオグリカンで、コンドロイチン硫酸を含み、ヒアルロン酸と結合した形で軟骨組織に存在する。また、ヒアルロン酸の測定にも用いられている。【０００６】
しかしながら、従来よりヒアルロン酸の測定に用いられているアグレカンは、ウシの軟骨精製品であり、また天然品であるが故にロット差があり、価格も高いという問題点を有していた。【０００７】
そのため、品質にばらつきのない、安価なＨＡＢＰ、及び該ＨＡＢＰを得る方法の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第2073041号特許公報
【特許文献２】特許第2732718号特許公報
【特許文献３】特許第3424504号特許公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記状況に鑑み、本発明は、新規なＨＡＢＰ、及びこれを品質にばらつきがなく、且つ安価に得る方法、及び該ＨＡＢＰを用いた高精度なヒアルロン酸測定方法及び試薬キットの提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ウシ軟骨ｍＲＮＡより調製したｃＤＮＡライブラリーより、ＨＡＢＰの一つであるウシアグレカンの公知のアミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するｃＤＮＡが得られることを見出した。更に、該ｃＤＮＡを含有する組換え発現ベクターによって宿主細胞をトランスフェクションさせ、該宿主細胞を培養することによって、該ｃＤＮＡを発現させて本発明のＨＡＢＰを得ることができることを見出した。【００１１】
更に本発明のＨＡＢＰを用いてヒアルロン酸の測定を行えば、従来の天然品アグレカンを用いたヒアルロン酸の測定方法と比較して、品質のばらつきがなく、プロゾーン現象を抑えることができ、高精度のヒアルロン酸測定を行うことが出来ることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１２】
即ち、本発明は、下記の構成よりなる。
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、該アミノ酸配列のＮ末端から１３０番目のアミノ酸残基がイソロイシン残基であり、１３１番目のアミノ酸残基は、チロシン，セリン，トレオニン，システイン，アスパラギン及びグルタミンからなる群より選択されるアミノ酸由来の残基であり、且つヒアルロン酸結合能を有するタンパク質、のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列のＮ末端から１３０番目のアミノ酸残基がイソロイシン残基であり、１３１番目のアミノ酸残基は、チロシン，セリン，トレオニン，システイン，アスパラギン及びグルタミンからなる群より選択されるアミノ酸由来の残基である、ヒアルロン酸結合能を有するタンパク質。
（３）配列番号１で表される塩基配列のポリヌクレオチドを含有する組換え発現ベクターを組み込んだバキュロウイルスでトランスフェクションされた宿主細胞又は該組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体を培養し、培養液からタンパク質を分離・精製することを特徴とする、上記（２）に記載のヒアルロン酸結合能を有するタンパク質の製造方法
（４）試料中のヒアルロン酸と、上記(２)に記載のヒアルロン酸結合能を有するタンパク質を接触させてヒアルロン酸と該タンパク質との複合体を形成させ、次いで該複合体と、該タンパク質に特異的な抗体を担持させた担体とを反応させ、該反応により生じた凝集物による光学的変化を測定し、該測定値からヒアルロン酸量を算出することを特徴とする、ヒアルロン酸の測定方法。
（５）上記（２）に記載のヒアルロン酸結合能を有するタンパク質を構成成分として含有する、ヒアルロン酸測定用試薬キット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、製品のばらつきのない、新規で且つ安価なＨＡＢＰを提供する。本発明のＨＡＢＰは、リコンビナント品であるため、天然品のアグレカンと比較して、安価に且つ大量に得ることができ、また品質のばらつきもないという、優れた品質を有する。【００１４】
また、本発明のＨＡＢＰは、上記の特長を有することから、これを用いれば、安価に且つ高精度なヒアルロン酸の測定を行うことが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、実施例１(１)において得られた、ウシ鼻中隔軟骨より回収したtotal ＲＮＡ溶液を１％  アガロースゲルで電気泳動した結果を示す。また、図１中の矢印は、18S rRNA、28S rRNAの画分をそれぞれ示す。
【図２】図２は、実施例１(３)において得られた、ＰＣＲ産物をエチジウムブロミドを含むアガロースで電気泳動した結果を示す。図２において、レーン１は分子量マーカーを、レーン２はＰＣＲ産物断片を試料として用いた場合の結果をそれぞれ示す。また、矢印はＰＣＲ産物断片の画分を示す。
【図３】図３は、実施例１(７)において得られた結果を示す。図３において、(ａ)はSDS-PAGE後のゲルを銀染色した結果、(ｂ)はペルオキシダーゼ標識抗Aggrecan抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結果をそれぞれ示す。また、図３（ａ）及び（ｂ）において、レーン１は蛋白質分子量マーカー、レーン２はアフィニティー精製前の培養上清、レーン３はアフィニティー精製後の培養上清、レーン４はアフィニティー精製で得られたタンパク質を試料とした場合の結果をそれぞれ示す。また、図３（ｂ）の矢印は、本発明のＨＡＢＰの画分を示す。
【図４】図４は、実施例２及び比較例１で得られた、試料中のヒアルロン酸濃度と、試料の８０５ｎｍにおける吸光度との関係を示す検量線である。
【図５】図５は、実施例３及び比較例２で得られた、試料中のヒアルロン酸濃度に対する、試料の８０５ｎｍにおける吸光度をプロットした結果である。
【図６】図６は、実施例４及び比較例３で得られた、各濃度の本発明のＨＡＢＰ又は公知アミノ酸配列のＨＡＰＢを用いた場合の、第一誌液中の各ＨＡＢＰ濃度に対する、ヒアルロン酸１０００ｎｇ／ｍＬを含有する試料の８０５ｎｍにおける吸光度をプロットした結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
ウシ軟骨のアグレカン（Bos taurus aggrecan）は、ヒアルロン酸結合能を有するタンパク質、すなわちＨＡＰＢで、全２３２７個のアミノ酸からなる。また、その遺伝子配列も解読されており、DDBJ(DNA Data Bank of Japan)データベースに、その遺伝子配列と全アミノ酸配列が開示されている。上記データベースに開示された、ウシアグレカンの公知の全アミノ酸配列を配列番号７に示す。ウシアグレカンのヒアルロン酸結合部位は、該配列のＮ末端から１５３番目〜３５２番目のアミノ酸残基の部分にある。
【００１７】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号７で表される、公知のウシアグレカンの全アミノ酸配列のうち、ヒアルロン酸結合部位を含むＮ末端から６９２番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドと類似したものであるが、公知のアグレカンのアミノ酸配列のＮ末端から１３１番目のロイシン残基が、それ以外のアミノ酸由来の残基に置き換わったアミノ酸配列（すなわち配列番号２で表されるアミノ酸配列）、をコードする塩基配列からなるものである。
【００１８】
すなわち、本発明のポリヌクレオチドは、「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、該アミノ酸配列のＮ末端から１３０番目のアミノ酸残基がイソロイシン残基であり、１３１番目のアミノ酸残基は、チロシン，セリン，トレオニン，システイン，アスパラギン及びグルタミンからなる群より選択されるアミノ酸由来の残基であり、且つヒアルロン酸結合能を有するタンパク質、のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド。」である。
【００１９】
中でも、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、該アミノ酸配列のＮ末端から１３０番目のアミノ酸がイソロイシン残基であり、且つ１３１番目のアミノ酸残基がチロシン残基であるアミノ酸配列（すなわち、配列番号４で表されるアミノ酸配列）をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドが好ましい。
【００２０】
また、本発明のポリヌクレオチドは、ウシアグレカンの公知の全アミノ酸配列のうちヒアルロン酸結合部位を含むＮ末端から６９２番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドに類似するものであるが、ウシアグレカンの公知の塩基配列では、ウシアグレカンの公知のアミノ酸配列のＮ末端から１３０−１３１番目のアミノ酸残基（Ile−Leu）をコードする塩基配列は「ＡＴＴＣＴＡ」であるが、これに対応するアミノ酸配列をコードする、５'末端から３８８〜３９３番目の塩基配列が、「ＡＴＴＣＴＡ」から別の塩基配列に置き換わった塩基配列（すなわち配列番号１で表される塩基配列）を有するものである。
【００２１】
すなわち、本発明のポリヌクレオチドは、「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、該ポリヌクレオチドの５'末端から３９０番目の塩基はＴ、Ｃ、Ａから選択される塩基であり、５'末端から３９１番目〜３９３番目の塩基はＴＡＴ、ＴＡＣ、ＴＣＴ，ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、ＡＣＧ、ＴＧＴ、ＴＧＣ、ＡＡＴ、ＡＡＣ、ＣＡＡ，ＣＡＧから選択される塩基配列であるポリヌクレオチド（尚、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンをそれぞれ表す。以下同じ。）。」である。
【００２２】
尚、配列番号１で表される塩基配列から明らかな如く、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列のうち３８８〜３８９番目の塩基配列は「ＡＴ」である。
【００２３】
上記本発明のポリヌクレオチドの中でも、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、且つ該ポリヌクレオチドの５'末端から３９１番目〜３９３番目の塩基がＴＡＴであるポリヌクレオチドが好ましい。
【００２４】
更に、５'末端から３９１番目〜３９３番目の塩基がＴＡＴであって、且つ５'末端から３９０番目の塩基がＣである塩基配列（すなわち、配列番号３で表される塩基配列）のポリヌクレオチドが好ましい。
【００２５】
比較のために、ウシアグレカンの公知の全２３２７アミノ酸のアミノ酸配列のうち、ヒアルロン酸結合部位を含むＮ末端から６９２番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列をコードする、公知の塩基配列を配列番号８に示す。また、該塩基配列がコードするアミノ酸配列（ウシアグレカンの公知の全アミノ酸配列のうち、ヒアルロン酸結合部位を含むＮ末端から６９２番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列）を配列番号９に示す。
【００２６】
本発明のＨＡＢＰは、上記したウシアグレカンの公知の全アミノ酸配列のうち、ヒアルロン酸結合部位を含むＮ末端から６９２番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列からなるタンパク質に類似するものであるが、ウシアグレカンの公知のアミノ酸配列では、そのＮ末端から１３１番目のアミノ酸残基はロイシン残基であるが、これがそれ以外のアミノ酸残基に置き換わったアミノ酸配列（すなわち配列番号２で表されるアミノ酸配列）からなるものである。
【００２７】
すなわち、本発明のＨＡＢＰとは、「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列のＮ末端から１３０番目のアミノ酸残基がイソロイシン残基であり、１３１番目のアミノ酸残基は、チロシン，セリン，トレオニン，システイン，アスパラギン及びグルタミンからなる群より選択されるアミノ酸由来の残基であるＨＡＢＰ。」である。
【００２８】
好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列であって、且つＮ末端から１３１番目のアミノ酸残基がチロシン残基であるアミノ酸配列（すなわち、配列番号４で表されるアミノ酸配列）からなるタンパク質が挙げられる。
【００２９】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００３０】
Ｉ．本発明のポリヌクレオチドの調製
本発明のポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成法で得ることができる。例えば、ＤＮＡの合成に通常行われている、ＤＮＡシンセサイザーを用い、通常のホスホアミダイト法にてポリヌクレオチドを合成し、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いる常法により精製することにより得ることができる。
【００３１】
また、本発明のポリヌクレオチドは、例えば動物組織等からｍＲＮＡを抽出し、該ｍＲＮＡをもとに、既知の方法によって合成したｃＤＮＡとして得ることもできる。
【００３２】
本発明のＨＡＢＰを合成するｍＲＮＡは、鼻中隔軟骨、気管軟骨等の動物の軟骨組織等から得ることができる。
【００３３】
以下に、例えばウシ鼻中隔軟骨等の動物の軟骨組織から、本発明のポリヌクレオチドを調製する方法を例示する。
【００３４】
（１）total ＲＮＡの回収
まず、ウシの鼻中隔軟骨等の組織を常法により破壊した後、total ＲＮＡを常法により抽出する。
例えば、Chirgwinら（Biochemistry, 18, 5294-5299, 1979）の方法に従って、グアニジン・チオシアネート処理後、塩化セシウム密度勾配遠心を行うことによって、total ＲＮＡを調製する方法や、グアニジン・チオシアネート−ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシアネート−フェノール・クロロホルム法等が挙げられる。
また、total ＲＮＡを得るためのキットが種々市販されているので、それを用いてもよい。例えば、RNeasy Lipid Tissue Midi Kit、 RNeasy Lipid Tissue Mini Kit（QIAGEN社製）等が挙げられる。
【００３５】
（２）ｍＲＮＡの精製
total ＲＮＡからｍＲＮＡを精製する方法も、常法により行えばよい。例えば、ｍＲＮＡのpolyＡテールにハイブリダイズする担体を利用して、total ＲＮＡ中のｍＲＮＡのみを精製するオリゴｄＴセルロースカラム法や、塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシアネート法等が挙げられる。
ｍＲＮＡの精製も、そのためのキットが種々市販されているので、それを用いてもよい。例えば、OligotexTM-dT30<Super>（タカラバイオ社製）等が挙げられる。
【００３６】
（３）ｃＤＮＡの作製及びクローニング
得られたｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる常法により、ｃＤＮＡを合成・増幅する。市販の合成、クローニング用キットを用いてもよい。
例えば、ＰＣＲを行う場合には、目的とする本発明のポリヌクレオチドの塩基配列をもとに、その部分を複製するようにプライマー対を設計する。そして、そのプライマー対を用いて常法によりＰＣＲを行えば、目的とする本発明のＨＡＢＰをコードする本発明のポリヌクレオチドの塩基配列（すなわち本発明の配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド）を持つｃＤＮＡが得られる。
【００３７】
（４）ｃＤＮＡの塩基配列決定
増幅したｃＤＮＡの塩基配列の決定は、サイクルシークエンス法等の常法により行えばよい。
【００３８】
ＩＩ．本発明のＨＡＢＰの調製
（１）本発明の組換え発現ベクター、トランスフェクションされた宿主細胞及び形質転換体の産生
本発明のＨＡＰＢの製造方法は、「配列番号１で表される塩基配列のポリヌクレオチドを含有する組換え発現ベクターを組み込んだバキュロウイルスでトランスフェクションされた宿主細胞又は該組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して得られた形質転換体を培養し、培養液からタンパク質を分離・精製することを特徴とする」方法である。
【００３９】
すなわち、本発明のＨＡＢＰは、本発明のポリヌクレオチドを適当なプラスミドやファージなどの発現ベクターに組み込み、宿主細胞を該組換え発現ベクターを用いてトランスフェクション又は形質転換させ、得られた宿主細胞を増幅（培養）させて、細胞内又は細胞外に分泌させる、という遺伝子組み換え技術を用いた周知の方法で、得ることができる。
【００４０】
一般的なのは、大腸菌の様な原核生物を用いた発現系、又は一般的な哺乳動物細胞、酵母菌、昆虫細胞等の真核細胞を用いた発現系を利用する方法である。
【００４１】
中でも、バキュロウイルスを感染させた昆虫細胞を用いた発現系は、簡便で、目的とするタンパク質を大量に得ることができることから、近年良く行われている。即ち、バキュロウイルスは感染細胞の核内に多角体と呼ばれる封入体を多量に作る特徴がある。多角体はポリヘドリンと呼ばれるタンパク質からなり、その発現量は感染後期に全細胞タンパク質の半分近くにも達すると言われている。そこで、このポリヘドリン遺伝子の非常に強力なプロモーターを利用して昆虫細胞内でリコンビナントタンパク質の合成を行わせることが行われている。
【００４２】
本発明でも、バキュロウイルス−昆虫細胞を用いた発現系を利用することができる。
【００４３】
１）バキュロウイルス−昆虫細胞系を利用し、宿主細胞をトランスフェクションする方法
以下に、バキュロウイルスー昆虫細胞の発現系を利用した、本発明のＨＡＢＰを得る方法を例に挙げて説明するが、これに特に限定されず、通常この分野で用いられているバキュロウイルス、昆虫細胞等を用いて、通常この分野で行われている常法により行えばよい。
【００４４】
バキュロウイルス−昆虫細胞を用いた発現系に用いられるバキュロウイルスとしては、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus）等が挙げられる。
【００４５】
宿主となる昆虫細胞としては、Spodoptera Frugiperda由来のSf9、Sf20等、Trichoplusia ni由来のHigh 5、BTI-TN-5B1-4（インビトロジェン社製）等が挙げられる。
【００４６】
本発明のポリヌクレオチドをバキュロウイルスに組み込む場合、直接バキュロウイルスに組み込むのではなく、常法のように、一旦トランスファーベクターに組み込んでから、バキュロウイルスゲノムＤＮＡと共に、宿主となる昆虫細胞にコトランスフェクションすることが好ましい。
【００４７】
トランスファーベクター（発現ベクターとして用いられる）としては、pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII（以上、インビトロジェン社製）、pBacPAK9、Autographa california NPV由来のAcNPV等の昆虫細胞用ベクターが挙げられる。
【００４８】
トランスファーベクターは、クローニングサイトの前にポリヘドリンプロモーターを持っているので、本発明のポリヌクレオチドをこのポリヘドリンプロモーターの下流に、常法によって挿入する。この操作より、本発明のポリヌクレオチドを組み込んだ、本発明に係る組換え発現ベクターが得られる。
【００４９】
本発明のポリヌクレオチドを組み込んだトランスファーベクター（組換え発現ベクター）とバキュロウイルスゲノムＤＮＡを一緒に、宿主である昆虫細胞に、例えばリン酸カルシウム法（特開平2-227075号公報）、リポフェクション法（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413, 1987）等の常法によりコトランスフェクションさせる。コトランスフェクションにより、ポリヘドリン部位で相同組換えを誘発し、本発明のポリヌクレオチドが導入された組換えバキュロウイルスを高効率で産生させることができる。
【００５０】
コトランスフェクションから３〜４日後に培養上清を回収し、培養液中に出現した非組換え体と組換え体バキュロウイルスの中から、限界希釈法、プラーク法等の常法により組換えバキュロウイルスを選択純化する。以上の方法で、本発明に係る組換え発現ベクターを組み込んだ、本発明に係る組換えバキュロウイルスが得られる。
【００５１】
得られた組換えバキュロウイルスを、宿主となる昆虫細胞に感染（トランスフェクション）させる。通常はMOI（Multiphcity of Infection）＝５〜１０程度でトランスフェクションさせる。以上の方法で、本発明に係る組換えバキュロウイルスでトランスフェクションさせた、本発明に係る宿主細胞が得られる。
【００５２】
２）宿主細胞の形質転換体を得る方法
また、上記のバキュロウイルス−昆虫細胞発現系以外にも、下記の方法で本発明のポリヌクレオチドを発現させることができる。
【００５３】
まず、得られたｃＤＮＡを、例えば常法に従いベクターＤＮＡに組み込む。
【００５４】
本発明のポリヌクレオチドを発現させ、本発明のＨＡＢＰを生産させる目的に於いては、発現ベクターが有用である。
【００５５】
発現ベクターとしては、原核細胞及び／または真核細胞の各種の宿主細胞中で複製保持または自己増殖できるものであって、且つ本発明のポリヌクレオチドを発現し、生産する機能を有するものであれば特に制限されない。プラスミドベクター，ファージベクター及びウイルスベクターが包含される。
【００５６】
かかるベクターとして、具体的には、大腸菌（Escherichia coli.）由来のプラスミドとして例えばpUC119（宝酒造社製）、pQE-TRIプラスミド (Qiagen社製)、pBluescript II KS+（Stratagene社製）、pBR322（宝酒造社製）、pGEM、pGEX、pUC、pBS、pET、pGEM-3ZpMALなどが、酵母由来プラスミドとして例えばpB42AD、pESP、pESCなどが、枯草菌由来プラスミドとして例えばpHT926、pTB51、pHY481などが挙げられる。ほ乳動物細胞由来プラスミドとしてはpCAT3、pcDNA3.1、pCMV等が挙げられる。
【００５７】
また、ファージとしては、λENBL３（Stratagene社製），λDASHII（フナコシ社製）、λgt10、λgt11（いずれも東洋紡績(株)製）等のλファージなどのバクテリオファージが、Charomid DNA（和光純薬工業(株)製）、Lorist6（和光純薬工業(株)製）等のコスミドベクター等が挙げられる。
【００５８】
更にレトロウィルス、ワクシニヤウィルス、核多角体ウィルスなどの動物や昆虫のウィルスが例示される。
【００５９】
本発明のポリヌクレオチドを組み込んだ組換え発現ベクターは、上記したベクター等に、本発明のポリヌクレオチドを常法により組み込むことにより調製することができる。
【００６０】
宿主細胞として細菌、特にE.coliを用いる場合、一般に発現ベクターは少なくともプロモーター−オペレーター領域、開始コドン、本発明のポリヌクレオチド、終始コドン、ターミネーター領域及び複製可能単位から構成される。
【００６１】
宿主として酵母または動物細胞を用いる場合、発現ベクターは少なくともプロモーター、開始コドン、本発明のポリヌクレオチド、終止コドンを含んでいることが好ましい。また、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、本発明のポリヌクレオチドの5’側及び3’側の非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位なども発現ベクターに組み込むことが可能である。
【００６２】
細菌中で本発明のポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーター−オペレーター領域は、プロモーター、オペレーター及びShine-Dalgarno（SD）配列（例えば、AAGGなど）を含むものである。例えば宿主がEscherichia属菌の場合、好適にはTacプロモーター、Trcプロモーター、Trpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモータ、バクテリオファージ由来のT7プロモーター、T3プロモーター、SP6プロモーター、λPLプロモーターなどを含むものが挙げられる。
【００６３】
酵母中で本発明のポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターとしては、ADHプロモーター、GAL1プロモーターなどが挙げられ、宿主がBacillus属菌の場合は、penPプロモーターなどが挙げられる。また、宿主が動物細胞等の真核細胞である場合、SV40由来のプロモーター、CMV由来のプロモーター、レトロウィルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、核多角体ウィルスの有するポリヘドリンプロモーターなどが挙げられる。しかし、特にこれらに限定されるものではない。また、発現にはエンハンサーの利用も効果的な方法である。
【００６４】
好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ＡＴＧ）が例示される。
【００６５】
終止コドンとしては常用の終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡなど）が例示される。ターミネーター領域としては、天然または合成のターミネーターが挙げられる。
【００６６】
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することが出来る機能を持つＤＮＡをいい、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたＤＮＡフラグメント）及び合成プラスミド等が含まれる。
【００６７】
エンハンサー配列としては、CMV、SV40、ポリオーマ、アデノ、パピローマ等のＤＮＡ主要ウィルスのエンハンサー配列、レトロウィルスLTR（Long Terminal Repeat）、免疫グロブリンＨ鎖、Ｌ鎖遺伝子のエンハンサー配列などが例示される。
【００６８】
発現ベクターは、プロモーター、開始コドン、本発明のポリヌクレオチド、終止コドン、及びターミネーター領域を連続的且つ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することが出来る。また、この際、所望により制限酵素での消化やT4 DNAリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他のレストリクションサイトなど）を用いることができる。
【００６９】
本発明に係る形質転換体は、上述の組み換え発現ベクター等を宿主細胞に導入することにより調製することが出来る。
【００７０】
宿主細胞としては、例えば微生物〔細菌（例えば、Escherichia属菌、Bacillus属菌）、酵母（例えばサッカロマイセス属など）、動物細胞及び昆虫細胞など〕が挙げられる。具体的には、Escherichia属菌では、Escherichia coli.（Escherichia coli. BL21, BL21(DE3), DH1, DH5, DH5α, M15，HB101, C600, XL-1 Blue, JM109, JM105， JM127, XL1-Blue）などが、Bacillus属菌では、B. subtilis, B. brevis, B. borstelenisなどが挙げられる。酵母としてはS. cerevisiae, Scizo. pombe, A. nidulans, Pichia pastoriaなど、或いはAsperigillus nidulansなどのAspergillus属糸状菌も挙げられる。動物細胞としては、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、マウスL細胞、ヒトHeLa細胞, FL細胞などが挙げられる。昆虫細胞としてはBmN4，Sf9などが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００７１】
宿主細胞の形質転換や形質導入は、従来公知の方法を用いて行うことが出来る。例えば、形質転換は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、塩化ルビジウム法、リポフェクション法、DEAE-デキストラン法、リチウム法、スフェロプラスト法、ウイルスを用いる方法等により行うことができ、又、形質導入は、例えば、B.Hohnの方法（Method in Enzymology,68,299-309,1979）や、Meyerowitz,E.M., Gvild,G.H., Prestidge,L.S. and Honess,S.S., Gene, 11, 271 (1980)に記載のパッケージング法等により行うことができる。
【００７２】
（２）宿主細胞の培養
本発明のＨＡＢＰは、上記の方法で得られた本発明のポリヌクレオチドを組み込んだ組換え発現ベクターを含むウイルスでトランスフェクションされた宿主細胞、又は該組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して得られた形質転換体を、その宿主細胞に応じた適切な培地中で培養し、培養物中に本発明のＨＡＢＰを産生させ、該培養物から分離・精製することによって製造することが出来る。
【００７３】
培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源若しくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源若しくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが挙げられる。また所望により他の栄養素〔例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム〕、ビタミン類、抗生物質を含んでいても良い。
【００７４】
培養は当業界に於いて知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のpH及び発酵時間は、本発明のＨＡＰＢの最高力価が得られるように選択される。
【００７５】
尚、下記に宿主細胞に応じて用いられる具体的な培地及び培養条件を例示するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
【００７６】
宿主が昆虫細胞の場合、培地としては、例えばＴＮＭ−ＦＨ培地、Grace's InsectMedium培地〔Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., (1985) 82,8404〕、Sf-100 II SFM培地（ライフ・テクノロジーズ社製）、ExCell400、ExCell405（いずれもＪＲＨバイオサイエンシーズ社製）等が挙げられる。またはこれら培地にウシ胎児血清（FCS）等を添加した培地等を用いることができる、そのpHは5〜8であることが望ましい。
【００７７】
上記で得られた、組換えバキュロウイルスでトランスフェクションさせた宿主細胞の培養は、通常20〜40℃、好ましくは25〜30℃、約12時間〜10日間行われ、必要により通気、攪拌を行うこともできる。
【００７８】
宿主が細菌、放線菌、酵母、糸状菌である場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当である。その際、pHが5〜8であることが望ましい。
【００７９】
宿主がE.coliの場合、好ましい培地としてLB培地、2YT培地、Terrific Broth、M9培地〔Molecular Cloning, 3rd ed., appendix 2.2 (2001) Cold Spring Harbor Laboratory, New York〕が例示される。かかる場合、培養は、必要により通気、攪拌をしながら、通常14〜42℃、好ましくは28〜39℃、約3〜24時間行うことができる。
【００８０】
宿主がBacillus属菌の場合、必要により通気、攪拌をしながら、通常14〜42℃、好ましくは28〜39℃、約3〜96時間行うことが出来る。
【００８１】
宿主が酵母である場合、培地としては、例えばYPD培地 (Molecular Cloning, 3rd ed., appendix 2.2(2001) Cold Spring Harbor Laboratory, New York)が挙げられ、pHは5〜8であることが望ましい。培養は通常14〜42℃、好ましくは20〜35℃、約12時間〜10日間行われ、必要により通気、攪拌を行うこともできる。
【００８２】
宿主が動物細胞の場合、培地として例えば約5〜20％のＦＣＳを含むMEM培地〔Science, (1952) 122,501〕、DMEM培地〔Virology, (1959)8,396〕、RPMI1640培地〔J.Am.Med.Assoc., (1967) 199,519〕、199培地〔proc.SSoc. Exp.Biol.Med., (1950) 73,1〕、ダイゴＴ２培地(和光純薬工業(株)製)等を用いることが出来る。培地のpHは約6〜8であるのが好ましく、培養は通常約30〜40℃、好ましくは34〜38℃で約12〜72時間行われ、必要に応じて通気や攪拌を行うこともできる。
【００８３】
（３）本発明のＨＡＢＰの調製
上記(２)で得られた培養物を、濾過または遠心分離等の方法を行って細胞を除き、回収し、培養濾液または培養上清を得る。次いで当該培養濾液または培養上清から、天然または合成タンパク質を分離並びに精製するために一般に用いられる常法に従って本発明のＨＡＢＰを分離・精製する。
【００８４】
本発明のＨＡＢＰの分離・精製方法としては、公知の塩析、溶媒沈殿法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
【００８５】
一方、本発明のＨＡＢＰが、培養された形質転換体のペリプラズムまたは細胞質内に存在する場合は、培養物を濾過または遠心分離などの常法に付して菌体或いは細胞を集め、適当な緩衝液に懸濁し、例えば超音波やリゾチーム及び凍結融解などの方法で細胞等の細胞壁及び／または細胞膜を破壊した後、遠心分離や濾過などの方法で本発明のＨＡＢＰを含有する粗抽出液を得る。そして、当該粗抽出液から、本発明のＨＡＢＰを、先に例示したような常法を用いることにより、単離、精製することができる。
【００８６】
本発明のＨＡＢＰの精製指標又はその確認には、本発明のHAPBに対する反応性を有する抗体をプローブとして用いたウエスタンブロット法や、ＥＬＩＳＡ法等を用いることができる。
【００８７】
このようにして取得されるタンパク質としては、例えば、配列番号２、又は４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。
【００８８】
また、本発明のＨＡＢＰは、そのアミノ酸配列に従って、一般的な化学的製法により製造することができる。例えば、フルオレニルメチルオキシカルボニル法（Ｆｍｏｃ法）、ｔ−ブチルオキシカルボニル法（ｔＢｏｃ法）等の通常の化学合成法により、本発明のＨＡＢＰを得ることができる。また、市販のペプチド合成機を用いて化学合成することもできる。
【００８９】
本発明のヒアルロン酸測定方法としては、例えば、試料中のヒアルロン酸と本発明のＨＡＢＰを接触させてヒアルロン酸／本発明のＨＡＢＰ複合体を形成させ、次いで該複合体と、抗ＨＡＢＰ抗体を担持させた担体とを反応させ、該反応により生じた凝集物による光学的変化を測定し、該測定値からヒアルロン酸量を算出する方法が挙げられる。
【００９０】
尚、ここでいう光学的変化の測定とは、免疫凝集の結果生じる光学的変化を測定することであり、具体的には、逆受身凝集反応法、免疫比ろう法、免疫比濁法等の免疫凝集法等が挙げられる。これら測定方法は、自体公知の方法に準じて行えばよいが、例えば、逆受身凝集反応法を用いる場合には、「東京化学同人  続生化学実験講座５  免疫生化学研究法  p.36-37」、「金原出版株式会社   臨床検査法提要  第30版  p.844-845」等に、例えば、免疫比ろう法を用いる場合には「金原出版株式会社  臨床検査法提要  第30版  p.851-853等」等に、免疫比濁法を用いる場合には、「金原出版株式会社  臨床検査法提要  第30版  p.853-854」等に記載の方法に準じて行えばよい。
【００９１】
本発明のヒアルロン酸の測定に用いられる抗ＨＡＢＰ抗体としては、本発明のＨＡＢＰに対する反応性を有する抗体であればポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でも何れでもよいが、単一エピトープのアフィニティー精製をしたポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体が好ましく、効率よく本発明のＨＡＢＰと結合できるモノクローナル抗体が特に好ましい。中でもペプシン、パパイン等の酵素を用いて適宜消化し、Fab、Fab’、(Fab')２等として用いることが好ましい。抗ＨＡＢＰ抗体としてポリクローナル抗体を用いる場合、該抗体は、常法、例えば「免疫学実験入門、第２刷、松橋直ら、（株）学会出版センター、１９８１」等に記載の方法に準じて馬、牛、羊、兎、山羊、ラット、マウス等の動物に本発明のＨＡＢＰを免疫して調製され、また、抗ＨＡＢＰ抗体としてモノクローナル抗体を用いる場合、該抗体は、常法、即ちケラーとミルスタイン（G.Kohler and C.milstein;nature,256,495,1975）により確立された細胞融合法に従い、例えばマウスの腫瘍ラインからの細胞と、本発明のＨＡＢＰで予め免疫されたマウスの脾細胞とを融合させて得られるハイブリドーマ等により産生される。尚、本発明のＨＡＢＰの代わりに公知のアミノ酸配列を有するウシアグレカンや、天然のウシアグレカンを抗原として用いて作製された抗体も、本発明における「抗ＨＡＢＰ抗体」として用いることが出来る。
【００９２】
ヒアルロン酸の測定に用いられる担体としては、通常の免疫学的測定法で用いられる担体であれば何れも使用可能であるが、例えば、赤血球、バクテリア、細胞片等の天然有機高分子物質、リポソーム、高分子ミセル等の分子会合体、ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリグリシジルメタクリレート、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニール、ポリエチレン、ポリクロロカーボネート、シリコーン樹脂、シリコーンラバー等の合成高分子化合物、多孔性ガラス、スリガラス、アルミナ、シリカゲル、活性炭、金属酸化物等の無機物質等を材料として調製されたものが好ましいものとして挙げられる。また、これら担体は、チューブ、ビーズ、ディスク状片、微粒子、ラテックス粒子等多種多様の形態で使用し得る。中でも、ラテックス粒子は、人工担体であり、目的に応じて担体表面を化学的処理し易いこと、また非特異反応が起こりにくいこと等の点から特に好ましい。その材質は特に限定されないが、例えばポリスチレンラテックス粒子等のスチレン系ラテックス粒子、アクリル酸系ラテックス粒子等が好ましいものとして挙げられる。
【００９３】
尚、これらラテックス粒子のうち、乳化剤を用いない乳化重合によって得られるポリスチレンラテックス粒子等は、表面の疎水性が強いため、タンパク質或いはペプチドをスムースに吸着し、且つ表面の負電荷同士の反発に基づき、乳化剤なしでも溶液中で安定に分散するという性質を有しているので、特に好ましい。また、種々の変性ラテックス粒子（例えば、上記ポリスチレン中にカルボキシル基を導入したカルボン酸変性ラテックス粒子）、磁性ラテックス粒子（磁性粒子を内包させたラテックス粒子）等も使用できる。
【００９４】
また、ヒアルロン酸の測定に用いられるラテックス粒子としては、市販のものが使用できるが、ラテックス粒子の平均粒径が小さいもの、即ち、単位重量あたりの表面積が大きいものが、抗体を効率良く担持させることができ且つ保存時の安定性（水溶液中での分散性）も良好であるので好ましいものとして用いられる。より具体的には、通常０．０５〜０．５μm、好ましくは０．１〜０．４μmの平均粒径のものが好ましい。このような平均粒径の小さいものを用いることにより、ラテックス粒子の沈降を抑えることができ、また、抗ＨＡＢＰ抗体をラテックス粒子に効率よく担持させることが可能となる。即ち、このような抗ＨＡＢＰ抗体担持ラテックス粒子を用いることにより測定用試薬の安定性を向上させ、精度の高い測定が可能となる。
【００９５】
上記担体に上記抗ＨＡＢＰ抗体を担持させる方法は、抗ＨＡＢＰ抗体と担体とを接触させることによってなされればよく、特に限定されない。通常この分野で利用される自体公知の担持方法は全て挙げられ、例えば、抗ＨＡＢＰ抗体を担体に物理的に吸着させて抗ＨＡＢＰ抗体を担体に担持させる、所謂物理的吸着法〔特公平5-41946号公報、スミロン  テクニカルレポート，ＳＵＭＩＬＯＮ   ＥＬＩＳＡシリーズ  １  ＥＬＩＳＡ測定法の紹介，住友ベークライト（株）発行、スミロン  テクニカルレポート，ＳＵＭＩＬＯＮ  ＥＬＩＳＡシリーズ  ２  ＥＬＩＳＡ製品の固相表面，住友ベークライト（株）発行等〕が、代表的なものとして挙げられる。該方法は、通常、例えば、ポリスチレン，ポリプロピレン，ポリ塩化ビニール，ポリエチレン，ポリクロロカーボネート等の合成高分子化合物、活性炭、例えば多孔性ガラス，スリガラス，アルミナ，シリカゲル，金属酸化物，ヒドロキシアパタイト等の無機物質を担体として用いた場合に、好ましい方法として用いられる。なかでも、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニール等を、例えばチューブ、ビーズ、ディスク片、微粒子、ラテックス粒子等の形態として用いた場合が、特に好ましい。
【００９６】
また、市販の担体を用いる場合には、その取扱説明書で推奨されている担持方法に従って、抗ＨＡＢＰ抗体を担体に担持させればよい。
【００９７】
例えばラテックス粒子に抗ＨＡＢＰ抗体を担持させる場合を例に取ると、抗ＨＡＢＰ抗体を通常０．０５〜２mg/ml、好ましくは０．１〜１mg/ml含む緩衝液等の溶媒中にラテックス粒子を通常０．１〜１０％(w/v)、好ましくは０．２〜５％(w/v)となるように添加、懸濁させ、通常５〜３０℃で通常２〜３時間反応させた後、この分野で行われる後処理、例えば遠心分離、例えば牛血清アルブミン（BSA）等の適当なタンパク質を含有する溶液を用いるブロッキング処理等の処理を行うことにより担持させることができる。尚、この分野で用いられる化学結合を用いる方法を用いても抗ＨＡＢＰ抗体を担体に担持させることができる。
【００９８】
本発明のＨＡＢＰを用いたヒアルロン酸の測定方法を、例えば担体としてラテックス粒子を用いた免疫比濁法を例にとって、より具体的に以下に説明する。即ち、ヒアルロン酸を含む試料（より具体的には、例えば血液、血漿、血清、関節液、肋膜液、リンパ液、骨髄液等の体液や尿等）と本発明のＨＡＢＰを含む試薬とを接触混合させてヒアルロン酸／本発明のＨＡＢＰ複合体を形成させる。次いで、例えば上記の如き抗ＨＡＢＰ抗体を例えば平均粒径０．０５〜０．５μm、好ましくは０．１〜０．４μmのラテックス粒子に担持(感作)させたものからなる試薬と、上記複合体とを反応させ、その結果生じた凝集の度合いを例えば吸光度を用いて測定し、予め求めてあった標準品の検量線からその濃度を求めることによって試料中のヒアルロン量を定量する。
【００９９】
尚、吸光度の測定波長は、通常３４０〜１０００nm、好ましくは５００〜９００nmで測定すればよい。また、凝集の度合いは、吸光度に限定されるものではなく、自体公知の方法であればいずれでもよく、例えばネフェロメトリー、カウンティングイムノアッセイ等の方法により値を測定してもよい。また、ヒアルロン酸／本発明のＨＡＢＰ複合体と、抗ＨＡＢＰ抗体をラテックス粒子等の担体に担持させたもの（以下、抗ＨＡＢＰ抗体担持担体と略記する場合がある）からなる試薬を反応させる際、適当な凝集促進剤を添加してもよい。
【０１００】
本発明のＨＡＢＰを用いたヒアルロン酸の測定方法に於ける、本発明のＨＡＢＰ反応時の本発明のＨＡＢＰの使用濃度としては、ヒアルロン酸の検量限界をどの程度に設定するかによって変動はあるが、通常設定された検量限界濃度に相当するヒアルロン酸全てと結合し得る濃度以上、好ましくはその５倍濃度以上、より好ましくは１０倍濃度以上である。尚、この際の上限としては測定に影響を与えない量であれば特に限定はされないが、経済的な量を考慮すると、通常その５万倍以下、好ましくはその１万倍以下である。具体的には、通常０.１〜１０００μg/ml、好ましくは０.５〜１０００μg/ml、より好ましくは０.５〜１００μg/mlである。例えば、血清中のヒアルロン酸濃度を測定する場合、その検量限界は通常１０〜１０００ng／mlであるので、本発明のＨＡＢＰ反応時の本発明のＨＡＢＰの使用濃度は、この検量限界に基づいて上記範囲内で適宜設定すればよい。
【０１０１】
また、該反応時のpHとしては、複合体が形成されるのを妨げない範囲であれば特に限定はされず、通常５〜１０、好ましくは６〜８の範囲が挙げられ、反応時の温度も複合体が形成されるのを妨げない範囲であれば特に限定されず、通常５〜４０℃の範囲が挙げられる。また、その反応時間は、数秒間乃至数時間適宜反応させればよい。
【０１０２】
本発明のＨＡＢＰを用いたヒアルロン酸の測定方法に於ける、抗ＨＡＢＰ抗体担持担体とヒアルロン酸／本発明のＨＡＢＰ複合体を反応させる際の抗ＨＡＢＰ抗体担持担体の使用濃度としては、上記で用いられる本発明のＨＡＢＰの濃度により異なるが、抗ＨＡＢＰ抗体の担持量が０．０１〜０．１mg/mgのラテックス粒子を用いる場合には、通常０．２〜２５mg/ml、好ましくは０．５〜１２mg/mlであり、該濃度範囲内であれば、試料中のヒアルロン酸を精度よく測定することができる。尚、抗ＨＡＢＰ抗体担持担体とヒアルロン酸／本発明のＨＡＢＰ複合体を反応させる際の反応条件及び反応時間は、上記の本発明のＨＡＢＰとヒアルロン酸とを反応させる時のそれに準じて行われればよい。
【０１０３】
本発明のヒアルロン酸測定用試薬キットとしては、本発明のＨＡＢＰを構成成分として含有するものである。
【０１０４】
また、抗ＨＡＢＰ抗体担持担体を含んでなる試薬を含んでいてもよい。さらに、標準物質を含んでいてもよく、該標準物質としては、通常この分野で用いられているもので、例えばヒアルロン酸カリウム（鶏冠由来：和光純薬工業（株）製）、ヒアルロン酸ナトリウム（ストレプトコッカス属由来：和光純薬工業（株）製）等が挙げられる。
【０１０５】
本発明のヒアルロン酸測定用試薬キットに於けるＨＡＢＰは、具体的には本発明のＨＡＢＰを含む試薬であればよく、適当な緩衝液中に本発明のＨＡＢＰを溶解させたものである。この目的に使用される緩衝剤としては、例えばトリス緩衝剤、リン酸緩衝剤、ベロナール緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッド緩衝剤等、通常の免疫学的測定法において用いられている緩衝剤は全て挙げられ、その濃度としては通常５〜３００mM、好ましくは１０〜１５０mMであり、そのpHは、通常５〜１０、好ましくは６〜８の範囲から適宜選択される。
【０１０６】
上記本発明のＨＡＢＰを含んでなる試薬中の、本発明のＨＡＢＰの濃度としては、反応時の濃度が上記濃度となるように設定されればよく、通常０.１〜５００μg/ml好ましくは０.５〜１００μg/mlの範囲になるように適宜選択される。
【０１０７】
本発明のヒアルロン酸測定用試薬キットに於ける抗ＨＡＢＰ抗体担持担体を含んでなる試薬は、上記抗ＨＡＢＰ抗体担持担体を含むものであればよく、適当な緩衝液中に抗ＨＡＢＰ抗体担持担体を懸濁させたもの若しくはこれを凍結乾燥したものである。この目的に用いられる緩衝剤としては、本発明に係る抗ＨＡＢＰ抗体が本発明のＨＡＢＰに結合するのを妨げる性質を有さないものであればよく、上記本発明のＨＡＢＰを含んでなる試薬で用いられる緩衝剤と同じものが挙げられ、そのpH及び濃度も同様に上記の値に準じて設定すればよい。
【０１０８】
また、抗ＨＡＢＰ抗体担持担体を含んでなる試薬は、緩衝液等の溶液に懸濁させた懸濁液の形態で測定に供される場合が多いが、このような懸濁液を調製するために用いられる緩衝液としては、通常この分野で使用されるものであれば特に限定されないが、通常pH5.0〜10.0、好ましくはpH6.5〜8.5の中性付近に緩衝作用を有するもの、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等が好ましい。尚、使用する不溶性微粒子の性質によっては、懸濁液の状態で放置しておくと自然凝集を起こしやすいものもあるが、このような場合には、弱アルカリ性のグリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等を使用して懸濁液を調製する方が保存安定性の面から好ましい。また、これらの緩衝液の緩衝剤濃度としては、通常10〜500mM、好ましくは10 〜300mMの範囲から適宜選択される。尚、該試薬には、通常この分野で使用されている、例えば、糖類，タンパク質，界面活性剤等の安定化剤、ＮａＣｌ等の塩類、防腐剤等を、通常この分野で使用される範囲内で添加してもよい。
【０１０９】
上記のような緩衝液に、本発明に係る抗ＨＡＢＰ抗体担持担体を懸濁させる場合、抗ＨＡＢＰ抗体担持担体の濃度は、使用する担体及び抗ＨＡＢＰ抗体の種類により異なるが、反応時の濃度が上記濃度となるように設定されればよく、通常１〜１００mg/ml、好ましくは２〜５０mg/mlの範囲になるように適宜選択される。
【０１１０】
更に、本発明に係る抗ＨＡＢＰ抗体担持担体を含んでなる試薬中には、免疫反応促進剤(凝集反応促進剤)(例えばポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール等)が通常この分野で用いられる濃度範囲で共存していてもよく、これら凝集反応促進剤共存下であっても本発明の方法によれば、測定用試薬中の蛋白成分が、何らかの要因により変性されて非特異的濁りとなることを、抑制或いは低減することができる。また、上記試薬中には、特開2002-365296号公開公報記載の凝集促進剤として用いられるモノマーやポリマーを、凝集促進剤として含んでいてもよく、その濃度範囲は特開2002-365296号公開公報記載の値に準じて選択されればよい。尚、該モノマーやポリマーは、上記公開公報記載の方法に準じて調製されればよい。
【０１１１】
本発明に係る試料としては、ヒアルロン酸を含む試料であればよいが、具体的には、例えば血液、血漿、血清、関節液、肋膜液、リンパ液、骨髄液等の体液や尿等が挙げられ、中でも血清、尿等が好ましいものとして挙げられる。
【０１１２】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。
【０１１３】
実施例１
（１）ＲＮＡの回収
QIAGEN社製、RNeasy Lipid Tissue Kitを用い、その製品プロトコルに従って、下記の通り、ウシ鼻中隔軟骨よりtotal  ＲＮＡの回収を行った。
まず、キットに付属のQIAzol Lysis Reagent  ５ｍｌを入れたチューブにウシ鼻中隔軟骨（ニュージーランド産）を１ｇ入れ、ポリトロンを用いて組織を破砕した。
【０１１４】
得られたホモジネートを室温で５分間インキュベートした後、１ｍｌのクロロホルムを添加し、15秒間攪拌し、更に室温で３分間インキュベートした。その後ホモジネートを、４℃、５０００Gで１５分間遠心分離した後、水相を新しいチューブに移し、等量の７０％エタノールを添加した。攪拌後、得られた溶液の３ｍＬを、キットに付属のコレクションチューブ（１５ｍＬ）にセットしたRNeasy Midi Spin Columnに移し、２５℃、３０００Gで５分間遠心を行った。この操作により、total ＲＮＡは、RNeasy Midi Spin Columnの膜に結合した。次いで、キットに付属のBuffer RW1 ４ｍｌをカラムに添加して、２５℃、３０００Gで５分間遠心分離を行った。その後、Buffer RPEを２．５ｍｌ入れて２５℃、３０００Gで２分間遠心分離を行った。さらに、Buffer RPEを２．５ｍｌ入れて２５℃、３０００Gで５分間遠心分離を行った。
【０１１５】
以上の処理を行った、totalＲＮＡの結合したRNeasy Midi Spin Columnを新しいコレクションチューブに移した。１５０μｌ滅菌水をRNeasy Midi Spin Columnの膜に加えて、２５℃、３０００Gで３分間遠心分離する操作を２回繰り返して、total ＲＮＡを膜から溶出させた。得られた溶出液の吸光度を測定して、ウシ鼻中隔軟骨１ｇから、５００μｇのtotal  ＲＮＡが回収できたことを確認した。
回収したtotal  ＲＮＡ溶液  の５μｌ分を１％  アガロースゲルで電気泳動した。
【０１１６】
得られた結果を図１に示す。
図１から明らかな如く、18S rRNAと28S rRNAの明確なバンドが確認できたので、以上の方法で、total ＲＮＡが分解されずに回収できたことが確認された。
【０１１７】
（２）ｍＲＮＡの精製
OligotexTM-dT30<Super>（タカラバイオ社製）を用い、下記の方法で、ｍＲＮＡを精製した。
まず、上記(１)で得られた250μｌのtotal ＲＮＡ水溶液に、250μｌのElution Buffer（キットに付属）を添加し、更にOligotexTM-dT30を500μｌ添加した。６５℃で５分間インキュベートし、その後反応液を氷上に３分間置いた。反応液に５M  NaClを０．１ｍｌ添加し、37℃で１０分間インキュベートした。反応液を１５０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を除いてペレットを４５０μｌ  TE（Tris-EDTA buffer、pH8.0）に溶解させた。その後、溶液を６５℃で５分間インキュベートし、氷上に３分間置いた。その後、溶液を１５０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、４００μｌ分の上清を回収した。通常のエタノール沈殿処理した後、沈殿物を１０μｌ  TEに溶解して、精製ｍＲＮＡの溶液を得た。
【０１１８】
（３）ｃＤＮAの作製及びＰＣＲクローニング
上記(２)で得られた精製ｍＲＮＡを用い、以下の通り、ＰＣＲによりｃＤＮＡの合成を行った。
【０１１９】
１）プライマー
DDBJ(DNA Data Bank of Japan)データベースに開示された、公知のウシアグレカン（Bos taurus aggrecan）の遺伝子配列をもとに、下記のプライマー配列を設計し、常法の合成法により合成した。該プライマーは、上記公知のウシアグレカンのヒアルロン酸結合部位を含むＮ末端から６９２番目までのアミノ酸配列をコードする、公知の塩基配列の一部に対応する配列を有する。また、primer Fとprimer ＲにはEcoRIの制限酵素部位が挿入してあり、さらにprimer Rには、終止コドンが付加されている。
【０１２０】
プライマー配列
primer F    atgaattcatgaccactttactcttggtgtttg  （配列番号５）
primer R    atgaattctcatggagagggcgccgctgaaacacc  （配列番号６）
【０１２１】
２）ＰＣＲ
上記プライマーの組合せと、上記(２)で得られた精製ｍＲＮＡを鋳型として用い、ｍＲＮＡからｃＤＮＡをＰＣＲによって複製する常法により、公知のウシアグレカンのヒアルロン酸結合部位を含むＮ末端から６９２番目までのアミノ酸配列をコードする、公知の塩基配列に類似する配列を持つｃＤＮＡを増幅させた。
【０１２２】
ＰＣＲは、下記の反応条件で、98℃で2分間加熱の後、95℃  15秒、63℃  30秒、68℃  2分を３０回繰り返して行い、最後に６８℃  ５分の条件で行った。
ＰＣＲ反応条件
滅菌水            ７１μｌ
RNA溶液            １μｌ
primer F            １μｌ
primer R            １μｌ
MgCl2              ４μｌ
ｄNTP（dATP, dGTP, dCTP, dTTPの混合物）            １０μｌ
Buffer              １０μｌ
KOD                ２μｌ
得られたＰＣＲ産物は、制限酵素EcoRIの配列を含む。そこで、この制限酵素サイトで、得られたＰＣＲ産物を消化・切断した。
【０１２３】
得られたＰＣＲ産物断片を、エチジウムブロミド１μｇ／ｍＬを含む１％アガロースで電気泳動した。
【０１２４】
結果を図２に示す。図２において、レーン１は分子量マーカーである、ＤＮＡ  Ｍａｒｋｅｒ６(λ/Sty I、(株)ニッポンジーン製)を、レーン２はＰＣＲ産物断片を試料として用いた場合の結果をそれぞれ示す。また、矢印はＰＣＲ産物断片の画分を示す。
図２から明らかな如く、およそ2100ｂｐのところに、主要バンドが確認された（図２の矢印で示した画分。）。
この画分を切り出し、GENEPURE（(株)ニッポンジーン製）を用いて、ＰＣＲ産物断片を精製した。
【０１２５】
（４）組換えベクターの調製と塩基配列の決定
次いで、バキュロゴールドスターターキット（べクトンデッキンソン社製）を用い、キットに付属の昆虫細胞用トランスファーベクター（transfer bector）ｐVL１３９２のポリへドリンプロモーターの下流にあるEcoRIサイトに、上記(３)で調製したＰＣＲ産物断片をつないで、組換えベクターを調製した。得られた組換えベクターは、上記(３)２)で得られたｃＤＮＡと同じ塩基配列が挿入されているので、得られた組換えベクターを、以下「ｐVL１３９２/ｃＤＮＡ」と記載する。
組換えベクターｐVL１３９２/ｃＤＮＡ 200ngを鋳型として用い、上記(３)１)で用いたプライマーの組合せを用いて、DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit ( GE ヘルスケア社製 )を使用し、添付のマニュアル記載の方法に準じて、ＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を得た。
【０１２６】
（５）塩基配列の相同性検索
得られたＰＣＲ産物（上記(３)で得られたｃＤＮＡと同じ塩基配列を持つ。）の塩基配列の解読を、BaseStation（バイオラッドラボラトリーズ(株)）を用いて行った。
【０１２７】
次いで、DDBJ(DNA Data Bank of Japan)データベースを用いて、得られたＰＣＲ産物の塩基配列の相同性検索(BLAST)を行った。その結果、得られたＰＣＲ産物の塩基配列、すなわちｃＤＮＡの塩基配列は公知のウシアグレカン（Bos taurus aggrecan）の遺伝子配列と、高い相同性を示すことが明らかとなった。
【０１２８】
すなわち、公知のウシアグレカンの遺伝子配列では、Ｎ末端から１２９−１３０番目のアミノ酸（Ile−Leu）をコードする塩基は「ＡＴＴＣＴＡ」であるが、得られたｃＤＮＡの、それに対応する位置の３８８〜３９３番目の塩基は「ＡＴＣＴＡＴ」であった。それ以外の塩基配列は両方とも一致した。
【０１２９】
以上のことから、上記(３)で得られたｃＤＮＡの塩基配列は、配列番号３で表される配列であり、また、上記(４)で得られた組換えベクター（ｐVL１３９２/ｃＤＮＡ）は、該ｃＤＮＡを組み込んだ組換えベクターであることが確認された。
【０１３０】
また、配列番号３の塩基配列から推定される、配列番号３の塩基配列がコードするアミノ酸配列は、配列番号４で表される、全長６９２個のアミノ酸配列である。このアミノ酸配列を公知のウシアグレカンの全２３２７アミノ酸配列と比較したところ、公知のウシアグレカンのアミノ酸配列では、Ｎ末端から１３１番目のアミノ酸がロイシンであるが、配列番号４ので表されるアミノ酸配列のＮ末端から１３１番目のアミノ酸はチロシンであった。それ以外のアミノ酸配列は、公知のウシアグレカンの全長２３２７アミノ酸のうち、Ｎ末端から６９２番目のアミノ酸残基までの配列と、配列番号４で表されるアミノ酸配列は一致した。
【０１３１】
（６）バキュロウイルスの作製
バキュロゴールドスターターキット（ベクトンーディッキンソン社製）を用い、以下の方法でｃＤＮＡを組み込んだバキュロウイルスの作製を行った。
【０１３２】
まず、キットに付属の直鎖状化したバキュロウイルスＤＮＡ（modified Autographa californica nuclear polyhedrosis virus：AcNPV）  0.5μｇ分と、上記(４)で得られた組換えベクター ｐVL１３９２/ｃＤＮＡを混ぜて、室温に5分間置き、１ｍｌのBuffer  Bと混合しＤＮＡ溶液とした。
【０１３３】
ｓｆ９細胞を、１０％ ＦＣＳを含むＴＮＭ−ＦＨ培地 ４ｍＬで培養した後、培地を１ｍｌのBuffer  Aに置換し２×１０６/２５ｃｍ２に調製した。そこに、上記で調製したＤＮＡ溶液１ｍｌを滴下し、そのまま２７℃で4時間インキュベートして、コトランスフェクションを行った、その後、ｓｆ９細胞を新しいTNM-FH培地で洗浄し、新たに３ｍｌTNM-FH培地を加え3日間培養を行った。
組換えベクター ｐVL１３９２/ｃＤＮＡをそのゲノムＤＮＡに組み込んだ組換えウイルスは培養液中に出てくるので、３日間ｓｆ９細胞を培養後、培養液を回収した。
【０１３４】
（７）本発明のＨＡＢＰの発現
上記(６)で得られた培養液中の組換えウイルスの数を、常法であるプラークアッセイ法で調べた。
次いで、該組換えウイルスを、ｓｆ９細胞にMOI=５で感染（トランスフェクション）させた後、１０％ＦＣＳを含むGrace's Insect Mediumで4日間、２７℃で培養した。
培養後、培養液を遠心分離し、得られた培養上清を回収した。次いで培養上清をAggrecanの抗体カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにかけて、タンパク質の精製を行った。
【０１３５】
尚、用いたAggrecanの抗体カラムは、(1)ウシ鼻中隔軟骨よりLaurentらの変法で精製されたAggrecan（生化学工業(株)製）を抗原として用いて常法により作製された抗ＨＡＢＰモノクローナル抗体を用い、(2)担体としてNHS-activated Sepharose 4fast Flow（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用い、該担体に添付のマニュアルに記載された推奨法により作製した。
【０１３６】
本発明のＨＡＢＰの産生は、ウエスタンブロットにより、以下の方法で確認した。
アフィニティー精製前の培養上清、アフィニティー精製後の培養上清、アフィニティー精製で得られたタンパク質を試料として用いて、それぞれSDS−PAGEを行った後、ＰＶＤＦ膜に転写した。ＰＶＤＦ膜をブロッキング処理後、ペルオキシダーゼ標識抗Aggrecan抗体を室温で１時間反応させた。ＰＶＤＦ膜をＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、ECLplus（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いて発光させ、ＵＶフイルムに感光させた。
【０１３７】
尚、上記で用いたペルオキシダーゼ標識抗Aggrecan抗体は、上記アフィニティークロマトグラフィーのAggrecan抗体カラムに用いたと同じ、抗Aggrecanモノクローナル抗体を、常法によりワサビペルオキシダーゼで標識したものである。
別に、SDS-PAGE後のゲルを、常法により銀染色した。
【０１３８】
結果を図３に示す。図３において、(ａ)はSDS-PAGE後のゲルを銀染色した結果、(ｂ)はペルオキシダーゼ標識抗Aggrecan抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結果をそれぞれ示す。
【０１３９】
また、図３（ａ）及び（ｂ）において、レーン１は蛋白質分子量マーカー  プレシジョンプラス  プロテインスタンダード（BIO-RAD製）、レーン２はアフィニティー精製前の培養上清、レーン３はアフィニティー精製後の培養上清、レーン４はアフィニティー精製で得られたタンパク質を試料とした場合の結果をそれぞれ示す。また、図３（ｂ）の矢印は、本発明のＨＡＢＰの画分を示す。
【０１４０】
図３(ａ)と(ｂ)の結果を比較すると明らかな如く、アフィニティー精製前の培養上清（レーン２）には、ペルオキシダーゼ標識抗Aggrecan抗体と交叉した画分が検出されたが、アフィニティー精製後の培養上清（レーン３）にはペルオキシダーゼ標識抗Aggrecan抗体と交叉した画分が検出されなかった。また、アフィニティー担体を溶出緩衝液で溶出した後の精製タンパク分画（レーン４）には、ペルオキシダーゼ標識抗Aggrecan抗体と交叉した画分が検出された。
また、SDS-PAGEで確認された、Aggrecan抗体と交叉した画分のタンパク質の大きさは約９０kDaで、データベースに開示された公知のウシアグレカンのアミノ酸配列から推測させる分子量よりも大きく、糖鎖が付加されていることが推測された。
以上のことから、発現したタンパク質は、抗Aggrecan抗体と交叉するタンパク質であることが確認された。
よって、以上の方法により目的の本発明のＨＡＢＰを発現させることができたことが確認された。
【０１４１】
実施例２．ヒアルロン酸の測定１（検量線の作成）
（１）試液の調製
１）第１試液（本発明のＨＡＢＰ含有）の調製
実施例１(７)で得られた、アフィニティークロマトグラフィー精製後の本発明のＨＡＢＰ１００μｇ分を、１０mlの１００mM ＨＥＰＥＳ緩衝液（０.１％ＢＳＡ及び１％ＮａＣｌ含む、pH７.０）に溶解した。これを第１試液とした。
【０１４２】
２）第２試液（抗ＨＡＢＰモノクローナル抗体感作ラテックス粒子）の調製
２mlのポリカーボネート製遠心チューブに、精製水８００μl、ラテックス粒子溶液１００μl(積水化学工業（株）製：Ｅ０５Ｋ２９Ｓ、１０ｗｔ％、ラテックス粒径０.３μm)、５００mMホウ酸緩衝液（pH７.３）１００μl、抗ＨＡＢＰモノクローナル抗体含有５０mMＡＳＥＳ緩衝液１００μl（抗ＨＡＢＰモノクローナル抗体濃度：４.２４mg/ml，pH６.５）を添加し、攪拌しながら室温で１００分間インキュベートし、抗ＨＡＢＰモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子浮遊液を得た。インキュベート時の抗ＨＡＢＰモノクローナル抗体の濃度は約０．３８５ｍｇ／ｍＬである。
【０１４３】
尚、上記抗ＨＡＢＰモノクローナル抗体は、ウシ鼻中隔軟骨よりLaurentらの変法で精製されたヒアルロン酸バインディングプロテイン（生化学工業（株）製）を抗原として、常法により作製されたものである。
【０１４４】
次いで、得られた抗ＨＡＢＰモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子浮遊液を１５０００rpmで１５分間遠心分離した。その上清を除去し、容器底部のペレットに５０mMホウ酸緩衝液（２.５％ＢＳＡ含む、pH７.３）１mlを添加した後、氷冷しながら１分間超音波処理し、ペレットを再浮遊させた。更に、攪拌しながら室温で１２０分間インキュベートし、ラテックス粒子表面上に抗体が担持されていない領域をＢＳＡで被覆した。
【０１４５】
次いで、該ラテックス粒子の懸濁液を１５０００rpmで１５分間遠心分離した。その上清を除去し、容器底部のペレットに５０mMホウ酸緩衝液（０.５％ＢＳＡ含む、pH７.３）１mlを添加した。その後、氷冷しながら１分間超音波処理してペレットを再浮遊させ、これを５０mMホウ酸緩衝液（０.５％ＢＳＡ含む、pH７.３）で３.３３倍に希釈したものを、第２試液とした。
【０１４６】
３）ヒアルロン酸溶液の調製
ヒアルロン酸ナトリウム（(株)紀文フードケミファ製）を、ヒアルロン酸溶液中の濃度が５０、１００、２００、５００、１０００ng/mlとなるように５０mMリン酸緩衝液（pH７．０）で希釈し、ヒアルロン酸溶液とした。
【０１４７】
（２）ヒアルロン酸の測定
上記(１)３)で調製したヒアルロン酸溶液を試料として用い、以下の測定条件で、全自動測定装置システム（日本電子：ＢＭ−８形）を用いて、試料の８０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
試    料：２．４μl
第１試液：９０μl
第２試液：３０μl
測定方法：２ポイントエンド法
主波長  ：８０５ｎｍ
測定時の本発明のＨＡＢＰの濃度は、約７．３５μｇ／ｍＬである。
【０１４８】
（３）結果
得られた結果を、図４に（―○―）で示す。
尚、図４中の縦軸の値は、測定で得られた吸光度からブランク値（ヒアルロン酸濃度が０の時に得られた値）を減算し、１００００倍にした値である。
【０１４９】
比較例１
（１）試液の調製
１）第１試液（天然品ＨＡＢＰ含有）の調製
２０μｇのヒアルロン酸バインディングプロテイン（ウシ鼻中隔軟骨よりLaurentらの変法で精製されたもの（生化学工業（株）製）。以下、「天然品ＨＡＢＰ」とする。）を１０mlの１００mM ＨＥＰＥＳ緩衝液（０.１％ＢＳＡ及び１％ＮａＣｌ含む、pH７.０）に溶解した。これを第１試液とした。
２）第２試液（抗ＨＡＢＰモノクローナル抗体感作ラテックス粒子）の調製
実施例２(１)２)で調製したと同じ第２試液を用いた。
３）ヒアルロン酸溶液
実施例２(１)３)で調製したと同じヒアルロン酸溶液を用いた。
【０１５０】
（２）ヒアルロン酸の測定
上記(１)３)で調製したヒアルロン酸溶液を試料として用い、実施例２(２)と同じ機器を用い、同じ方法で、試料の８０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
測定時の天然品ＨＡＢＰの濃度は、約１．４７μｇ／ｍＬである。
【０１５１】
（３）結果
得られた結果を、図４に（―◆―）で、実施例２の結果と併せて示す。
【０１５２】
図４の結果から明らかな如く、本発明のＨＡＢＰを用いてヒアルロン酸の測定を行った結果、従来の天然品ＨＡＢＰを用いた場合と同様、良好な検量線が得られた。このことから、本発明のＨＡＢＰを用いて、ヒアルロン酸の測定を行えることが判る。
【０１５３】
実施例３．ヒアルロン酸の測定２（プロゾーン現象の影響）
（１）試液の調製
１）第１試液（本発明のＨＡＢＰ含有）の調製
実施例１(７)で得られたアフィニティークロマトグラフィー精製後の本発明のＨＡＢＰ１００μｇ分を、１０mlの１００mM ＨＥＰＥＳ緩衝液（０.１％ＢＳＡ及び１％ＮａＣｌ含む、pH７.０）に溶解した。これを第１試液とした。
２）第２試液（抗ＨＡＢＰモノクローナル抗体感作ラテックス粒子）の調製
実施例２(１)２)で調製したと同じ第２試液を用いた。
３）高濃度ヒアルロン酸溶液調製
ヒアルロン酸ナトリウム（紀文フードケミファ製）を、高濃度ヒアルロン酸溶液中の濃度が５０００、１００００、２００００、５００００、１０００００、２０００００、５０００００、１００００００ng/mlとなるように５０mMリン酸緩衝液（pH７．０）で希釈し、高濃度ヒアルロン酸溶液とした。
【０１５４】
（２）ヒアルロン酸の測定
上記(１)３)で調製した高濃度ヒアルロン酸溶液を試料として用い、以下の測定条件で、全自動測定装置システム（日本電子：ＢＭ−８形）を用いて、試料の８０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
試    料：２．４μl
第１試液：９０μl
第２試液：３０μl
測定方法：２ポイントエンド法
主波長  ：８０５ｎｍ
測定時の本発明のＨＡＢＰの濃度は、約７．３５μｇ／ｍＬである。
【０１５５】
（３）結果
得られた結果を、図５に（―○―）で示す。
また、実施例２で得られた、ヒアルロン酸溶液中のヒアルロン酸濃度が５０、１００、２００、５００、１０００ng/mlの試料を用いて測定を行った場合の結果も、図５に（―○―）で併せて示す。
尚、図５中の縦軸の値は、得られた吸光度からブランク値（ヒアルロン酸濃度が０の時に得られた値）を減算し、１００００倍にした値である。
【０１５６】
比較例２
（１）試液の調製
１）第１試液（天然品ＨＡＢＰ含有）の調製
２０μｇの天然品ＨＡＢＰ（生化学工業（株）製））を１０mlの１００mM ＨＥＰＥＳ緩衝液（０.１％ＢＳＡ及び１％ＮａＣｌ含む、pH７.０）に溶解した。これを第１試液とした。
２）第２試液（抗ＨＡＢＰモノクローナル抗体感作ラテックス粒子）の調製
実施例３(１)２)で調製したと同じ第２試液を用いた。
３）高濃度ヒアルロン酸溶液
実施例３(１)３)で調製したと同じ高濃度ヒアルロン酸溶液を用いた。
【０１５７】
（２）ヒアルロン酸の測定
上記(１)３)で調製した高濃度ヒアルロン酸溶液を試料として用い、実施例３(２)と同じ機器を用い、同じ方法で、試料の８０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
測定時の天然品ＨＡＢＰの濃度は約１．４７μｇ／ｍＬである。
【０１５８】
（３）結果
得られた結果を、図５に（―◆―）で、実施例３の結果と併せて示す。
図５から明らかな如く、抗原過剰域のヒアルロン酸濃度を測定した場合、本発明のＨＡＢＰを用いた方が、従来の天然品ＨＡＢＰを用いるよりもプロゾーン現象による吸光度の減少が少なかった。
以上のことから、本発明のＨＡＢＰを用いてヒアルロン酸濃度の測定を行えば、抗原過剰域においてもより高濃度まで、高精度なヒアルロン酸濃度の測定が行えることが判る。
【０１５９】
実施例４．ヒアルロン酸の測定３
（１）試液の調製
１）第１試液（本発明のＨＡＢＰ含有）の調製
実施例１(７)で得られた、アフィニティークロマトグラフィー精製後の本発明のＨＡＢＰを、第１試液中の濃度が２μｇ／ｍｌ〜８μｇ／ｍｌの濃度になるように、１００mM ＨＥＰＥＳ緩衝液（０.１％ＢＳＡ及び１％ＮａＣｌ含む、pH７.０）に溶解した。これを第１試液とした。
２）第２試液（抗ＨＡＢＰモノクローナル抗体感作ラテックス粒子）の調製
実施例２(１)２)で調製したと同じ第２試液を用いた。
３）ヒアルロン酸溶液の調製
ヒアルロン酸ナトリウム（(株)紀文フードケミファ製）を、ヒアルロン酸溶液中の濃度が１０００ｎｇ／ｍｌとなるように５０mMリン酸緩衝液（pH７．０）で希釈し、ヒアルロン酸溶液とした。
【０１６０】
（２）ヒアルロン酸の測定
上記(１)３)で調製したヒアルロン酸溶液を試料として用い、以下の測定条件で、全自動測定装置システム（日本電子：ＢＭ−８形）を用いて、試料の８０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
試    料：２．４μl
第１試液：９０μl
第２試液：３０μl
測定方法：２ポイントエンド法
主波長  ：８０５ｎｍ
【０１６１】
得られた結果を、図６に（―◇―）で示す。
尚、図６中の縦軸の値は、測定で得られた吸光度からブランク値（ヒアルロン酸濃度が０の時に得られた値）を減算し、１００００倍にした値である。
【０１６２】
比較例３
（１）公知アミノ酸配列のHABPの調製
実施例１(１)ＲNAの回収〜(５)塩基配列の相同性検索までの操作を行い、得られたｃＤＮＡについて、Mutan-K（タカラバイオ社製）を用い、製品プロトコールに従って、塩基配列の修正を行った。
【０１６３】
すなわち、上記した通り、ウシアグレカンの公知のアミノ酸配列の、Ｎ末端から１２９−１３０番目のアミノ酸（Ile−Leu）をコードする塩基配列は「ＡＴＴＣＴＡ」であるが、実施例１(５)で得られたｃＤＮＡの、公知のウシアグレカンの上記部分に対応する位置の３８８〜３９３番目の塩基配列は「ＡＴＣＴＡＴ」であった。そこで、実施例１(５)で得られたｃＤＮＡを用い、このｃＤＮＡの塩基配列の、３８８番目〜３９３番目の塩基を「ＡＴＣＴＡＴ」から「ＡＴＴＣＴＡ」に変える処理を行った。
【０１６４】
次いで、Base Station（バイオラッドラボラトリーズ（株））を用い、以上の処理を行った修正ｃＤＮＡの塩基配列の解読を行った。そして、該修正ｃＤＮＡの塩基配列が、公知のウシアグレカンのN末端から６９２番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列をコードする、公知の塩基配列と同じ塩基配列（配列番号８）（すなわち公知のアグレカンのＮ末端から１２９−１３０番目のアミノ酸残基がIle−Leuであるアミノ酸配列をコードしている）であることを確認した。
【０１６５】
次いで、組換えベクターとして、実施例１(３)で調製したPCR産物断片の代わりに、上記で得られた修正ｃＤＮＡを用いる以外は実施例１(４)と同様の方法で、組換えベクターｐＶＬ１３９２／修正ｃＤＮＡを調製した。
【０１６６】
得られた組換えベクターｐＶＬ１３９２／修正ｃＤＮＡを用いる以外は、実施例１(６)〜(７)と同様の方法で、修正ｃＤＮＡを発現させることにより、データベースに開示された公知のウシアグレカンのアミノ酸配列のＮ末端から６９３番目までのアミノ酸配列（配列番号９で表される配列）と同じ配列を持つ、ＨＡＢＰを得た（以下、「公知アミノ酸配列のＨＡＢＰ」と記載する。）。
【０１６７】
（２）試液の調製
１）第１試液（公知アミノ酸配列のＨＡＢＰ含有）の調製
上記(１)で得られた公知アミノ酸配列のＨＡＢＰを、第１試液中の濃度が２μｇ／ｍｌ〜８μｇ／ｍｌの濃度になるように、１００mM ＨＥＰＥＳ緩衝液（０.１％ＢＳＡ及び１％ＮａＣｌ含む、pH７.０）に溶解した。これを第１試液とした。
２）第２試液（抗ＨＡＢＰモノクローナル抗体感作ラテックス粒子）の調製
実施例４(１)２)で調製したと同じ第２試液を用いた。
３）ヒアルロン酸溶液
実施例４(１)３)で調製したと同じヒアルロン酸溶液を用いた。
【０１６８】
（２）ヒアルロン酸の測定
上記(１)３)で調製したヒアルロン酸溶液を試料として用い、実施例４(２)と同じ機器を用い、同じ方法で、試料の８０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１６９】
（３）結果
得られた結果を、図６に（―■―）で、実施例４の結果と併せて示す。
図６の結果から明らかな如く、「データベースに開示された公知のウシアグレカンの塩基配列に基づいて調製したｃＤＮＡを発現させることによって得られた公知アミノ酸配列のＨＡＢＰ」を用いてヒアルロン酸の測定を行った場合には、公知アミノ酸配列のＨＡＢＰの濃度を高くしても吸光度の上り方が少なく、すなわち、感度が低く、そのため、血清中のヒアルロン酸濃度が低い場合には、測定が行えないことが判る。
【０１７０】
一方、本発明のＨＡＢＰを用いてヒアルロン酸の測定を行った場合には、本発明のＨＡＢＰの濃度を上げるに従い吸光度が増加した。すなわち、ＨＡＢＰの濃度を調製することにより、ヒアルロン酸の測定に十分な感度が得られることが判る。
【０１７１】
また、以上のことから明らかな通り、本発明のＨＡＢＰは、ヒアルロン酸の測定を実施し得るだけの反応性を有するものであるため、本発明のＨＡＢＰを用いれば、一定濃度のＨＡＢＰを用いて、一定濃度のヒアルロン酸を測定する測定キットを供給できるようになる、という効果も有することが判る。
【産業上の利用可能性】
【０１７２】
本発明のＨＡＢＰは、リコンビナント品であるため、天然品のアグレカンと比較して、安価に且つ大量に得ることができ、また品質のばらつきもないという、優れた品質を有する。
また、本発明のＨＡＢＰは、上記の特長を有することから、これを用いれば、安価に且つ高精度なヒアルロン酸の測定を行うことが出来る。
【符号の説明】
【０１７３】
図４において、―○―は、本発明のＨＡＢＰを含有する第１試液を用いて測定を行った場合の結果を、―◆―は、天然品ＨＡＢＰを含有する第１試液を用いて測定を行った場合の結果をそれぞれ示す。【０１７４】
図５において、―○―は、本発明のＨＡＢＰを含有する第１試液を用いて測定を行った場合の結果を、―◆―は、天然品ＨＡＢＰを含有する第１試液を用いて測定を行った結果をそれぞれ示す。【０１７５】
図６において、−◇−は、本発明のＨＡＢＰを含有する第１試液を用いて測定を行った場合の結果を、―■―は、公知アミノ酸配列のＨＡＢＰを含有する第１試液を用いて測定を行った場合の結果をそれぞれ示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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