(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の微生物から誘導される少なくとも１ストレッチのアミノ酸を含んでなる少なくとも１個の付着性ペプチドに接合した、または結合した反応性基を含んでなる物質であって、該物質が第２の微生物の細胞壁に付着し得るものであり、該アミノ酸ストレッチが
Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３Ｘａａ４Ｘａａ５Ｇｌｙ６Ｘａａ７Ｘａａ８Ｘａａ９Ｘａａ１０Ｘａａ１１Ｘａａ１２Ｘａａ１３Ｘａａ１４Ｘａａ１５Ｘａａ１６Ｘａａ１７Ｘａａ１８Ｘａａ１９Ｘａａ２０Ｘａａ２１Ｘａａ２２Ｘａａ２３Ｘａａ２４Ｘａａ２５Ｘａａ２６Ａｓｎ２７Ｘａａ２８Ｘａａ２９Ｘａａ３０Ｘａａ３１Ｘａａ３２Ｘａａ３３Ｘａａ３４Ｘａａ３５Ｘａａ３６Ｘａａ３７Ｘａａ３８Ｇｌｙ３９Ｇｌｎ４０Ｘａａ４１Ｘａａ４２Ｘａａ４３Ｘａａ４４Ｘａａ４５
で示される共通配列を有し、前記共通配列において、
Ｘａａ１は、ＴｙｒまたはＨｉｓを表し、
Ｘａａ３は、Ｖａｌ、ＩｌｅまたはＬｅｕを表し、
Ｘａａ４は、ＬｙｓまたはＡｒｇを表し、
Ｘａａ７は、ＡｓｐまたはＧｌｕを表し、
Ｘａａ８は、ＴｈｒまたはＳｅｒを表し、
Ｘａａ９は、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＩｌｅを表し、
Ｘａａ１２は、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＶａｌを表し、
Ｘａａ１３は、ＡｌａまたはＳｅｒを表し、
Ｘａａ２３は、ＬｅｕまたはＩｌｅを表し、
Ｘａａ３０は、ＬｅｕまたはＩｌｅを表し、
Ｘａａ３６は、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＶａｌを表し、
Ｘａａ４２は、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＶａｌを表し、
Ｘａａ４４は、Ｖａｌ、ＩｌｅまたはＬｅｕを表し、
Ｘａａ２、Ｘａａ５、Ｘａａ１０、Ｘａａ１１、Ｘａａ１４−２２、Ｘａａ２４−２６、Ｘａａ２８、Ｘａａ２９、Ｘａａ３１−３５、Ｘａａ３７、Ｘａａ３８、Ｘａａ４１、Ｘａａ４３、Ｘａａ４５は任意のアミノ酸を表す
ことを特徴とするキメラタンパク質性物質。
【請求項２】
該アミノ酸ストレッチが図１１に掲載した配列から選択される配列に対応する配列をもつことを特徴とする請求項１記載の物質。
【請求項３】
該付着性ペプチドが少なくとも１つのＡｃｍＡ繰返し体を含んでなることを特徴とする請求項１または２記載の物質。
【請求項４】
該第２の微生物が非組換え微生物であることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１つに記載の物質。
【請求項５】
該第２の微生物がグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌のいずれかから選択されることを特徴とする請求項４記載の物質。
【請求項６】
該反応性基が抗生物質、ホルモン、芳香性化合物およびレポーター分子の群から選択されることを特徴とする請求項１ないし５のいずれか１つに記載の物質。
【請求項７】
該反応性基が抗原決定基、酵素、（一本鎖）抗体またはそのフラグメント、ポリヒスチジルタグ、蛍光性タンパク質、結合タンパク質またはペプチドの群から選択されることを特徴とする請求項１ないし５のいずれか１つに記載の物質。
【請求項８】
少なくとも一つの該付着性ペプチドに反応基が融合しているタンパク質性物質をエンコードする請求項７記載の核酸分子。
【請求項９】
請求項８記載の核酸分子を含んでなるベクター。
【請求項１０】
請求項８記載の核酸分子または請求項９記載のベクターを含んでなるか、あるいは請求項１ないし５または７のいずれか１つに記載の物質を発現する微生物または発現系。
【請求項１１】
微生物細胞壁に物質を付着させる方法であって、
１ストレッチのアミノ酸を含む付着性ペプチドの使用を含み、該アミノ酸ストレッチが
Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３Ｘａａ４Ｘａａ５Ｇｌｙ６Ｘａａ７Ｘａａ８Ｘａａ９Ｘａａ１０Ｘａａ１１Ｘａａ１２Ｘａａ１３Ｘａａ１４Ｘａａ１５Ｘａａ１６Ｘａａ１７Ｘａａ１８Ｘａａ１９Ｘａａ２０Ｘａａ２１Ｘａａ２２Ｘａａ２３Ｘａａ２４Ｘａａ２５Ｘａａ２６Ａｓｎ２７Ｘａａ２８Ｘａａ２９Ｘａａ３０Ｘａａ３１Ｘａａ３２Ｘａａ３３Ｘａａ３４Ｘａａ３５Ｘａａ３６Ｘａａ３７Ｘａａ３８Ｇｌｙ３９Ｇｌｎ４０Ｘａａ４１Ｘａａ４２Ｘａａ４３Ｘａａ４４Ｘａａ４５
で示される共通配列を有し、前記共通配列において、
Ｘａａ１は、ＴｙｒまたはＨｉｓを表し、
Ｘａａ３は、Ｖａｌ、ＩｌｅまたはＬｅｕを表し、
Ｘａａ４は、ＬｙｓまたはＡｒｇを表し、
Ｘａａ７は、ＡｓｐまたはＧｌｕを表し、
Ｘａａ８は、ＴｈｒまたはＳｅｒを表し、
Ｘａａ９は、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＩｌｅを表し、
Ｘａａ１２は、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＶａｌを表し、
Ｘａａ１３は、ＡｌａまたはＳｅｒを表し、
Ｘａａ２３は、ＬｅｕまたはＩｌｅを表し、
Ｘａａ３０は、ＬｅｕまたはＩｌｅを表し、
Ｘａａ３６は、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＶａｌを表し、
Ｘａａ４２は、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＶａｌを表し、
Ｘａａ４４は、Ｖａｌ、ＩｌｅまたはＬｅｕを表し、
Ｘａａ２、Ｘａａ５、Ｘａａ１０、Ｘａａ１１、Ｘａａ１４−２２、Ｘａａ２４−２６、Ｘａａ２８、Ｘａａ２９、Ｘａａ３１−３５、Ｘａａ３７、Ｘａａ３８、Ｘａａ４１、Ｘａａ４３、Ｘａａ４５は任意のアミノ酸を表すことを特徴とする方法。
【請求項１２】
図１１に掲載した配列群から選択される配列を含むタンパク質から誘導される該付着性ペプチドである請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）の主要ペプチドグリカン加水分解酵素から誘導される付着性ペプチドの使用を含むことを特徴とする請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項１ないし７のいずれか１つの物質が付着した微生物。
【請求項１５】
請求項１ないし７のいずれか１つに記載の物質または請求項１０または１４に記載の微生物を含んでなる食品。
【請求項１６】
請求項１ないし７のいずれか１つに記載の物質または請求項１０または１４に記載の微生物の使用を含むことを特徴とする食品の製造法。
【請求項１７】
請求項１ないし７のいずれか１つに記載の物質または請求項１０または１４に記載の微生物の、ヒトまたは動物の医学的処理あるいはヒトまたは動物に行うことを含まない、診断テストにおける使用。
【請求項１８】
請求項１ないし７のいずれか１つに記載の物質または請求項１０または１４に記載の微生物の、ヒトまたは動物の医学的処理あるいはヒトまたは動物に行うことを含まない、生物吸着方法における使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】  宿主細胞、例えば、酵母、カビ、哺乳動物と植物細胞、および細菌などの外表面に非相同のタンパク質を標的化および固定化することを介し、組換え微生物上にタンパク質を非相同表面提示すること（シュタールおよびウーレン（Stahl and Uhlen）、TIBTECH、1997年5月、15、185〜192）が可能となって数年になる。これら細胞表面での非相同タンパク質の提示は多くの形状を採るが、反応性基、例えば、抗原決定基、非相同酵素、（一本鎖）抗体、ポリヒスチジルタグ、ペプチド、および他の化合物などの発現とは異なる。非相同表面提示は、微生物学、分子生物学、ワクチン学および生物工学などにおける応用研究と基礎研究の手段として応用されており、幾つもの特許出願が出願されている。
【０００２】  細菌表面提示のさらに他の応用は、生菌−ワクチン送達システムの開発である。非相同抗原決定因子の細胞表面提示は、組換え生細胞を免疫化に使用する場合に、抗原特異免疫応答の誘発に有利であると考えられている。他の応用は、環境目的、微生物触媒、および診断手段用の全細胞生物吸着剤またはバイオフィルターを生成させる際に、細菌表面提示を使用することである。
【０００３】  一般には、使用する組換え体に特異的であり選択的である固定化または標的化部分からなるキメラタンパク質を使用し、この部分を上記の反応性基を含んでなる部分と結合させる、例えば、周知の固定化部分は、いわゆるＬＰＸＴＧボックスからなり、それがスタフィロコッカス（Staphylococcus）の細菌表面に、すなわち、完全に組込まれた膜タンパク質の形で共有結合により結合する。この方式において、キメラタンパク質は、正常ペプチド結合により結合した異なる遺伝子起源の少なくとも２つの（ポリ）ペプチドから構成される。例えば、複雑な混合物から化合物を単離および固定化するリガンド（生物吸着剤）の調製に関する特許出願ＷＯ９４／１８８３０には、かかるリガンドを入手するための方法が特許請求されているが、該方法は組換え細胞の細胞壁外面に結合タンパク質を固定化することを含む。該結合タンパク質は実質的に該組換え細胞により産生されたキメラタンパク質であり、例えば、抗体から誘導されるＮ−末端部分から構成され、それがＣ−末端固定化部分と結合した特定化合物に結合することが可能であり、固定化部分は、選択した特定の細胞において機能的であるように意図的に選択した固定化タンパク質から誘導される。特許出願ＷＯ９７／０８５５３には、スタフィロコッカス種（Staphylococcus ssp）の細胞壁に選択的にタンパク質を標的とする方法が特許請求されているが、その方法では固定化タンパク質として、スタフィロコッカス（Staphylococcus）細胞壁成分に選択的に結合するタンパク質をエンコードするスタフィロコッカス（Staphylococcus）のリソスタフィン遺伝子またはアミダーゼ遺伝子から誘導される、少なくとも８０〜９０アミノ酸長の長いストレッチのアミノ酸細胞壁−標的化シグナルを用いる。
【０００４】  広範な疾患に対する明確な抗原決定因子を発現する弱毒化細菌ベクター株を介してワクチンを送達または免疫化する方法が、現在一般に開発されつつある。最近、かかるベクターを用いて、粘膜（例えば、鼻腔または口腔）での予防接種がかなりの注目を受けている。例えば、スズメバチ毒の抗原決定因子に対する全身性および粘膜の抗体応答は、その表面上で該抗原決定因子を発現する、遺伝子工学的に調製したヒト口腔共生ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Streptococcus gordonii）により口腔内コロニー形成したマウスにおいて検出された（メダグリーニ（Medaglini）ら、PNAS 1995,2:6868〜6872）。また、防御免疫応答は、破傷風菌毒素のフラグメントＣをラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）で構成的に発現した組換え細菌ワクチンの経口送達により誘出し得た（ロビンソン（Robinson）ら、Nature Biotechnology 1997,15:653〜657）。特に、粘膜表面の特異病原体に対し向けられたＩｇＧと分泌ＩｇＡ抗体を誘発する手段としての粘膜免疫化は、予防接種の有効な経路と考えられる。細菌ベクターにより発現される免疫原は、特有の形状で免疫系の抗原提示細胞（例えば、Ｍ−細胞）に提示され、したがって、可溶性抗原よりも耐容性を誘発しそうにない。さらに、共通の粘膜免疫系が存在することは、１つの特定粘膜表面上免疫化を可能として抗原特異ＩｇＡの分泌を誘発し、他の特異免疫は離れた粘膜の部位で応答する。この研究法の欠点は、細菌株がそれ自身で炎症と疾病の原因となり、潜在的に発熱と菌血症に至らしめる潜在力となることである。替わり得る研究法は、それ自体が病原性となる可能性のある弱毒化細菌株の使用を避けることであるが、その際、ワクチンの担体として組換え共生細菌、例えば、ストレプトコッカス種（Streptococcus spp. ）およびラクトコッカス種（Lactococcus spp. ）などを選択する。
【０００５】  しかし、かかる組換え体での潜在的な問題は、組換え体が粘膜表面にコロニーを形成し、それによって、これらの組換え微生物により発現、放出される標的抗原に長期間露呈される可能性のあることである。かかる長期露呈は免疫寛容を誘引する。さらに、かかる微生物体が遺伝的に修飾され、組換え核酸を含むというそれだけの事実で、全体として（素人の）大衆から相当の反対に遭遇するが、それは組換えＤＮＡまたはＲＮＡを含む産物に対する一般の受け入れ体制が低いレベルにあることから起こることである。同様の反対は病原性をもつ株（弱毒化してあっても）の使用に対して、または病原性株から誘導されるタンパク質またはタンパク質の部分に対しても存在する。しかし、上に説明したように、タンパク質の非相同表面提示の現行技法は、一般に組換えまたは病原性性質のある微生物の限られたセットの微生物に対し特異的で選択的である固定化または標的化タンパク質の使用を必然的に伴い、それによってその潜在的な応用を大きく制限することになる。
【０００６】  本発明は物質および広範な微生物の細胞壁または細胞壁成分に該物質を固定または付着させる方法を提供する。本発明の好適な態様は、物質および非組換え微生物に該物質を固定または付着させる方法を提供する。本発明により提供される該物質は（キメラ）タンパク質のみに限定されるものではなく、ペプチドの性質の全部または一部のみのものであって、それによってペプチド部分が非ペプチドの部分に（共役結合により）結合する。本発明は第１の微生物から誘導される少なくとも１ストレッチのアミノ酸を含んでなる物質であって、その物質が第２の微生物の細胞壁に付着し得るものであることを特徴とするタンパク質性物質を提供する。本発明による該物質は、例えば、第１の微生物により産生される（例えば、ある微生物であって、その微生物からアミノ酸の該ストレッチの配列について知見が得られたものであるが、他の（組換え）微生物も同様に該物質を産生し得る）。その産生後に該物質を収獲し、場合により将来用に貯蔵し、次いで該第２の微生物と接触させるが、その際、該物質がその細胞壁に付着する。あるいは、該物質は確立されたペプチド合成技術により合成的に製造する。本発明の好適な態様は、該第２の微生物が非組換え微生物である場合の物質を提供する。本発明が提供する物質により、非毒性非組換え微生物に、例えば、組換え微生物が産生する非相同またはキメラタンパク質を付着または固定することが今や可能である。
【０００７】  本発明の好適な態様は、アミノ酸の該ストレッチが図１０に掲載した共通配列に対応する配列をもつタンパク質性物質、またはアミノ酸の該ストレッチ（本明細書では付着性ペプチドともいう）が図１１に掲載した配列から選択される配列に対応する配列をもつタンパク質性物質、あるいは他の種から誘導される相同配列を提供する。図１１に掲載した配列およびそれに相同の配列は、様々な種、微生物およびより高等な生物体双方に見出されており、かかる高等な生物体の一例がシー・エレガンス（C.elegans）である。好ましくは、付着ペプチドは図１１に掲載したタンパク質のいずれか１つから誘導されるが、より好ましくは、該付着性ペプチドは図１０に示したアミノ酸配列またはその誘導された配列を含んでなる。例えば、本発明はタンパク質性物質を提供するが、その場合の該付着性ペプチドはラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）の主要ペプチドグリカン加水分解酵素から誘導される。
【０００８】  本発明のさらに他の好適な態様は、タンパク質性物質を提供するが、その場合の該第２の微生物はグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の群のいずれかから選択される。微生物を例示すると、例えば、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis)、クロストリジウム・ベイジェリンキイ（Clostridium beijerinckii）、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバシラス・ブッフネリ（Lb. buchneri）、リステリア・イノキュア（Listeria inocua)、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus)、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）、イー・コリ（E. coli）などである。
【０００９】  本発明はさらに反応性基を含んでなるタンパク質性物質を提供する。例えば、本発明は反応性基、例えば、抗原決定因子、異種酵素、（一本鎖）抗体またはそのフラグメント、ポリヒスチジル・タグ、蛍光性タンパク質、ルシフェラーゼ、結合性タンパク質またはペプチド、またはその他の物質、例えば、抗生物質、ホルモン、非ペプチド抗原決定因子、炭水化物、脂肪酸、芳香性物質およびレポーター分子など、および広範囲の微生物の細胞壁成分と広く反応性である非相同表面提示に有用な固定化もしくは標的タンパク質またはその部分（本明細書では付着性ペプチドとも呼ぶ）とを含んでなるタンパク質性物質を提供する。
【００１０】  例えば、本発明は１つの物質を提供するが、その場合、該反応性基は非タンパク質部分であり、例えば、抗生物質、ホルモン、芳香性物質およびレポーター分子の群から選択される。該物質は本発明により提供される付着性ペプチドに、例えば、ペニシリンまたはテトラサイクリンなどの抗生物質（他の種々の抗生物質も使用し得る）またはステロイドホルモンなどのホルモン、または他のいずれかの化合物を結合させることにより構築する。かかる結合は技術上既知の様々な技法により達成し得るが、それによって付着性ペプチドを標識または「信号化」することができる。好適な例は、ＦＩＴＣなどのレポーター分子またはＨＲＰＯに付着性ペプチドを結合することであるが、それによって診断アッセイに使用し得る手段を生み出し、それによってペプチドグリカンを有する微生物が検出される。同様に、抗生物質を結合させた付着性ペプチドは、例えば、ヒトまたは動物の血流に非経口投与することにより生体内で、または生体外でペプチドグリカンを有するかかる微生物に結合させるために使用し、それによって該菌体周辺に抗生物質の濃度を上昇させることができるが、該菌体は次いで該抗生物質作用により死滅するに至る。
【００１１】  本発明は１つの物質を提供するが、その場合、該反応性基はタンパク質部分、例えば、抗原決定基、酵素、（一本鎖）抗体またはそのフラグメント、ポリヒスチジル・タグ、蛍光性タンパク質、結合タンパク質またはペプチドなどの群から選択される部分である。例えば、本発明は、反応性基としてタンパク質または（ポリ）ペプチドを含んでなるタンパク質を提供する。また、本発明は本発明が提供するタンパク質をエンコードする核酸分子を提供する。かかる核酸分子（一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡ）は付着性ペプチドを特異的にエンコードする核酸配列並びに反応性基ポリペプチドを特異的にエンコードする核酸配列を少なくとも含んでなるが、さらに他の核酸配列を含んでもよく、それが例えば、シグナルペプチドをエンコードするか、あるいは例えば、プロモーターおよび／または調節核酸配列を含む。本発明はまた、本発明が提供するタンパク質をエンコードする核酸分子を含むベクターをも提供する。
【００１２】  本発明は図１０に掲載した共通アミノ酸配列に対応するアミノ酸の１ストレッチを含んでなる少なくとも１個の付着性ペプチドに接合した、または結合した反応性基を含んでなるタンパク質性物質を提供するが、該物質は微生物の細胞壁成分に付着または固定化することが可能である。
【００１３】  対応するとは、図１０に掲載した共通アミノ酸配列に相同のアミノ酸配列を有すること、あるいは図１０に掲載した配列から誘導されるアミノ酸配列を有することと定義されるが、該誘導される配列はアミノ酸の機能的に等価のストレッチを含んでなる。
【００１４】  好ましくは、該付着性ペプチドは図１１に掲載したタンパク質のいずれか１つ、または図１０に掲載した配列に関連するまたは相同の反復配列を有するタンパク質から誘導されるものであり、より好ましくは、該付着性ペプチドは図１０に示したアミノ酸配列またはその誘導された配列を含んでなる。本発明が提供する関連付着性ペプチドの種々アミノ酸配列間の相同性は、例えば、アミノ酸配列間の相同性検索を実施することにより決定されるが、例えば、タンパク質のデータベース、例えば、スイスプロット（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ）、ＰＩＲおよびジェンバンクデータベースに見出すことが可能であり、コンピュータープログラム、例えば、ＢＬＡＳＴプログラムを用い、そのアミノ酸配列間の相同性を決定することができる。例えば、本発明はタンパク質性物質を提供するが、その場合の該付着性ペプチドはラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）の主要ペプチドグリカン加水分解酵素から誘導される。本発明は反応性化合物を含んでなるタンパク質性物質を提供するが、その場合、少なくとも２つのアミノ酸ストレッチが、付着性ペプチドに対応して互いに隣接して位置するが、ストレッチは１個以上のアミノ酸残基により多分、分け隔てられている。該ストレッチまたは繰返し体は短い距離、例えば、３〜６ないし１０〜１５アミノ酸離れて、または中間的な距離、１５〜１００アミノ酸離れて、またはより長い距離（＞１００アミノ酸残基離れて）により分離されている。かかる距離の例は図１１に見出されるが、より長い距離も可能である。該ストレッチまたは繰返し体間の距離は（追加の）反応性基にも使用することが可能であり、それにより反応性基は繰返し体の間に挿入され、それによって細胞壁組成にさらによりよい固定化を可能にする。本発明により提供される好適な態様は、１個の反応性基と図１０に掲載した共通アミノ酸配列に対応する配列を有するアミノ酸ストレッチを含む少なくとも１個の付着性ペプチドを含んでなるタンパク質性物質であり、その場合の該物質は微生物の細胞壁成分に付着することが可能であって、例えば、酵母、カビ、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の群のいずれかに見出すことができる。微生物の例としては、例えば、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis)、クロストリジウム・ベイジェリンキイ（Clostridium beijerinckii)、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum)、ラクトバシラス・ブッフネリ（Lb. buchneri)、リステリア・イノキュア（Listeria inocua)、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus)、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis)、イー・コリ（E. coli）などである。本発明により提供される好適な態様は、通常の（非組換え）微生物の細胞壁成分に付着し得るタンパク質性物質である。この態様において、本発明は、例えば、非相同タンパク質を提示する非組換え菌体を提供するが、これらは免疫寛容などの問題を起こすことなく粘膜表面にコロニーを形成することが可能であり、その理由は発現された標的抗原にそれらが長時間暴露されることにはならないからである。さらに、本発明により提供されるかかる菌体が遺伝子的に修飾されておらず、また組換え核酸を含まないというそれだけの事実が、��体として組換え微生物に対する（素人）大衆からの反対を緩和するであろうが、その反対は組換えＤＮＡまたはＲＮＡを含む産物に対する一般の受け入れ体制が低いレベルにあることから起こることである。同様の反対は病原性をもつ株（弱毒化してあっても）の使用に対して、または病原性株から誘導されるタンパク質またはタンパク質の部分に対しても存在するが、それが今や本発明によて克服され、本発明において、一般に安全であると考えられているラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）などの非病原性微生物にタンパク質性物質を付着させることが今や可能である。本発明は、例えば、抗原決定因子、（異種）酵素、（一本鎖）抗体またはそのフラグメント、ポリヒスチジル・タグ、蛍光性タンパク質、ルシフェラーゼ、結合性タンパク質またはペプチド、またはその他の物質、例えば、抗生物質、ホルモン、非ペプチド抗原決定因子、炭水化物、脂肪酸、芳香性物質およびレポーター分子などの反応性基、および広範囲の微生物の細胞壁成分と広く反応性である非相同表面提示に有用な固定化もしくは標的タンパク質またはその部分（本明細書では付着性ペプチドとも呼ぶ）とを含んでなるタンパク質性物質を提供する。該付着性ペプチドは、好ましくは、安全であることが一般に認識されている（Ｇ．Ｒ．Ａ．Ｓ．）微生物から誘導されるが、それによって非相同表面提示技法応用の潜在力を大きく上昇させることになる。ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）は非病原性、非浸襲性、そして非コロニー形成グラム陽性バクテリアであり、身体または腸管でさえ増殖に適していない。該菌は乳酸菌の共生種には属していない。ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）は数千年もの間、安全に使用してきた歴史をもつ。グラム陽性細菌ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）亜種クレモリスＭＧ１３６３の主要細胞壁加水分解酵素ＡｃｍＡは細胞分離を必要とするＮ−アセチルムラミダーゼであり、安定期の細胞溶解の原因となる。該タンパク質は３種の別個のドメインからなり（図９、ブイスト（Buist）ら、J.Bacteriol.(1995)177:1554〜1563）、そのＮ−末端ドメインの最初の５７個アミノ酸は分泌に必要なシグナルペプチドを包含する。このドメインには５８位のＡｌａから２１８位のＳｅｒに連なる活性部位ドメインがつながっている。この活性部位ドメインはチオレドキシン融合タンパク質として大腸菌中で過剰に産生され、精製される。ＡｃｍＡ部分はエンテロキナーゼによるタンパク質分解切断により放出され、生体外で活性であることが示された。３５〜５５アミノ酸残基、より多くの場合、４０〜５０アミノ酸残基の３種の相同反復領域（またはアミノ酸のストレッチ）は、例えば、非相同配列により分離されているＡｃｍＡのＣ−末端に存在する（図１０）。ＡｃｍＡの反復配列（ｃＡ）は切除可能であり、細胞壁水解活性を損なうことなく、さらなる反復配列を生体外で付加することができる。１つまたは２つの反復配列を欠くＡｃｍＡ欠失誘導体および少なくとも１つのさらなる繰返し体を含むタンパク質は、外部から添加した場合に、ラクトコッカス細胞に結合し得た。３つの繰返し体すべてを欠く誘導体は該細胞に結合せず、また精製した活性部位ドメインにも結合しなかった。本発明は、図１０に示した少なくとも１つの反復配列または図１０の配列に類似の配列を含んでなる付着性ペプチドを提供するが、図１１に示した共通配列の少なくとも一部からなると定義したのに類似している。また、本発明が提供する付着性ペプチドは図１１に示した配列から誘導されるアミノ酸配列を含んでなる。本明細書において誘導されるとは、とりわけ非相同配列と比較して、それによって共通配列が得られる場合、または通常のアミノ酸置換を経て誘導され、それによってアミノ酸が同種のアミノ酸に置換される場合、または置換を経て誘導され、それによって機能性アミノ酸が、ＰＥＰＳＣＡＮ技法または置換マッピングなどの方法により同定した機能的に同様のまたはよりよいアミノ酸に置換えることを意味する。本発明は、反応性基と、図１０に示した共通アミノ酸配列の少なくとも一部に対応する配列を有するアミノ酸のストレッチからなる少なくとも１つの付着性ペプチドとを含んでなるタンパク質性物質を提供する。ＡｃｍＡの繰返し体に類似の繰返し体は、例えば、種々の細胞壁加水分解酵素およびグラム陽性とグラム陰性細菌並びに他の微生物の他の（分泌）タンパク質に存在し、これらタンパク質の一般的細胞壁結合ドメインを構成することが示された。少なくとも１つのＡｃｍＡ繰返し体または本発明により提供されるＡｃｍＡ繰返し体に類似のアミノ酸配列を含んでなる付着性ペプチドは、微生物の細胞壁に、反応性基、例えば、抗原決定基、酵素、抗体、タンパク質またはペプチドなどを結合させる、または付着させる一般的な、また広汎な反応性手段を代表する。該繰返し体は図１０に示した共通アミノ酸配列の少なくとも一部に対応する配列を有するアミノ酸のストレッチから構成されるペプチドを含んでなる。さらに、我々は本発明により提供される付着性ペプチドが、他の細胞、例えば、非組換え微生物、例えば、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis)、クロストリジウム・ベイジェリンキイ（Clostridium beijerinckii)、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum)、ラクトバシラス・ブッフネリ（Lb. buchneri)、リステリア・イノキュア（Listeria inocua)、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis)、イー・コリ（E. coli)などに結合または付着することを証明した。付着性ペプチドおよびそれと結合する反応性基の結合は、本発明により提供されるように、ｐＨ２〜１０の範囲の値で安定である。さらに、本発明が提供する付着性ペプチドは、細胞壁に付着させたとき、タンパク質分解に対し保護される。本発明の一態様は、付着性ペプチドが図１１に掲載したタンパク質のいずれかから誘導されるようなタンパク質である。かかる付着性ペプチドの一例は本明細書記載の実験の部に提供されるが、そこでは図１０に示した配列またはそれに類似の配列を有する付着性ペプチドが使用される。さらに、本発明は反応性基としてタンパク質または（ポリ）ペプチドを含んでなるタンパク質を提供する。また、本発明は、本発明が提供するタンパク質をエンコードする核酸分子を提供する。かかる核酸分子（一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡである）は、少なくとも付着性ペプチドを特異的に���ンコードする核酸配列並びに反応性基ポリペプチドを特異的にエンコードする核酸配列からなるが、さらに他の核酸配列、例えば、シグナルペプチドをエンコードする配列を含ませること、あるいは例えば、プロモーターおよび／または調節核酸配列を含ませることも可能である。本発明はまた本発明が提供するタンパク質をエンコードする核酸分子を含んでなるベクターを提供する。かかるベクターは、例えば、プラスミド、ファージ、またはウイルスであり、本発明が提供する核酸と通常の技能を使用して今や構築することができる。かかるベクターの例は詳細な説明の実験の部に見られるが、他の例示としては、例えば、バキュロウイルス・ベクター、または本発明が提供するタンパク質を（昆虫）細胞内で発現または産生し得る相当するベクターウイルスである。本発明はまた本発明による核酸分子または本発明によるベクターを含んでなる宿主細胞または発現系を提供する。かかるタンパク質発現宿主細胞はそれ自体微生物として本発明により提供されるが、この微生物に本発明が提供するタンパク質が付着する。かかる宿主細胞または発現系は、例えば、グラム陽性またはグラム陰性細菌、または酵母細胞または昆虫細胞、または植物または哺乳動物細胞、または網状細胞溶解液などの無細胞発現系などであって、本発明が提供する核酸またはベクターと通常の技能を使用して今や構築または入手することができる。かかる宿主細胞または発現系の例は詳細な説明の実験の部に見られるが、他の例は、本発明が提供する核酸またはベクターと通常の技能を使用して入手することができる。
【００１５】  本発明は微生物の細胞壁に物質を付着させる方法を提供するが、該方法は図１０に示した共通アミノ酸配列の少なくとも一部に対応する配列を有する１ストレッチのアミノ酸を含んでなる付着性ペプチドを使用することを特徴とする。本発明が提供する方法の一例は、（グラム陽性）細菌の細胞壁に、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）ＭＧ１３６３のＡｃｍＡ細胞壁固定化繰返し体に融合した（キメラ）タンパク質である組換えポリ（ペプチド）を固定化することである。組換えタンパク質はこれら組換え（ポリ）ペプチドをエンコードするＤＮＡ配列を適切な産生株（例えば、イー・コリー（E. coli）またはエル・ラクティス（L. lactis））において発現し、次いで発現産物を精製することにより入手される。次いで、該組換えタンパク質は生体外または生体内で非組換え標的細菌と混合し、細胞壁に結合させる。本発明が提供する方法の他の例は、該タンパク質それ自体を産生する該組換えラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）の細胞壁に、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）のＡｃｍＡ細胞壁固定化繰返し体に融合した（キメラ）タンパク質である組換えポリ（ペプチド）を固定化することである。本発明が提供する方法の好適な態様において、（精製した）タンパク質を外部からの添加により細菌細胞に結合させるが、該方法は非組換え細菌細胞に組換えタンパク質または他の物質を固定するためのすぐれた手段である。
【００１６】  本発明による好適な方法はラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）の主要ペプチドグリカン加水分解酵素から誘導される付着性ペプチドを使用することを特徴とする。本発明による他の方法は、該物質が（ポリ）ペプチドまたはタンパク質、例えば、本発明により提供されるタンパク質の部分である場合について提供される。かかる（ポリ）ペプチドまたはタンパク質に生じる翻訳後の修飾は、使用する宿主細胞または発現系に本来的なものであり、したがって、本発明により提供されるものとして、翻訳後修飾タンパク質も提供される。しかし、本発明によるさらに他の方法が、該化合物が抗生物質、ホルモン、抗原決定因子、炭化水素鎖、脂肪酸、芳香性化合物およびレポーター分子からなる群から選択される場合について提供される。該物質は、本発明により提供される付着性ペプチドに、例えば、ペニシリンまたはテトラサイクリンなどの抗生物質（他の種々の抗生物質も使用可能である）、あるいはステロイドホルモンなどのホルモン、またはその他の化合物を結合させることにより構築される。かかる結合は技術上既知の様々な技法により達成可能であり、それによって付着性ペプチドを標識または「信号化」することができる。好適な例は、ＦＩＴＣなどのレポーター分子またはＨＲＰＯに付着性ペプチドを結合することであるが、それによって診断アッセイに使用し得る手段を生み出し、それによってペプチドグリカンを有する微生物が検出される。同様に、抗生物質を結合させた付着性ペプチドは、例えば、ヒトまたは動物の血流に非経口投与することにより生体内で、または生体外でペプチドグリカンを有するかかる微生物に結合させるために使用し、それによって該菌体周辺に抗生物質の濃度を上昇させることができるが、該菌体は次いで該抗生物質作用により死滅するに至る。該微生物は、好ましくは、酵母、カビ、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の群のいずれかから選択される。例えば、本詳細な説明の実験の部には、β−ラクタマーゼ：：ｃＡ融合タンパク質をラクトコッカス細胞と混合し、細胞に結合させることが記載されているが、一方で付着タンパク質と結合していない成熟β−ラクタマーゼを加えた場合には、これは当てはまらない。また、大腸菌のβ−ラクタマーゼおよびバシラス・リヘニフォルミス（Bacillus licheniformis）のα−アミラーゼを本発明により提供される付着性ペプチドに融合し、次いでこれらの融合タンパク質を産生させると、エル・ラクティス（L. lactis）細胞壁に位置（付着）した活性な分泌タンパク質に至った。ＡｃｍＡおよびβ−ラクタマーゼ：：ｃＡ融合タンパク質の結合は、単離したラクトコッカス細胞壁とＳＤＳ洗浄細胞壁にも証明された（このフラクションの主要部分はペプチドグリカンである）。
【００１７】  非組換え微生物、例えば、ラクトコッカス（または他の細菌）またはカビなどに、組換えタンパク質を固定化することは、組換え細菌の使用が望ましくない場合、例えば、食品工程で、またはワクチンとして、あるいは抗細菌療法などの医療用に医薬として使用する場合、とりわけ魅力的である。本発明は、例えば、本発明により提供される、別個の抗原決定因子で標識した微生物を介してのワクチン送達または免疫化法を提供するが、これらは多様な疾患を目標とすることができる。防御的免疫応答は、例えば、本発明により提供される細菌ワクチンの経口送達により誘発し得るが、その場合、本発明が提供するタンパク質を介して、破傷風毒素フラグメントＣを非組換えラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）に付着させる。本発明が提供する微生物により発現されるかかる免疫原は、特別の形状で免疫系の抗原提示細胞（例えば、Ｍ−細胞）に提示され、それ故に、可溶性抗原よりも寛容を誘発するようには思えない。さらに、共通の粘膜免疫系の存在は、１つの特定粘膜表面に免疫化することを可能として、抗原特異ＩｇＡの分泌を誘発し、他の特異免疫は離れた粘膜部位で応答する。本発明は初期の細菌ワクチンの欠点を解決するが、初期ワクチンの欠点は、使用した菌株（弱毒または組換え）が粘膜表面上で繁殖する潜在力をもち、それがそれ自体で炎症および疾患などの問題を引起し、潜在的に発熱および細菌血症に、または免疫寛容の誘導に導くことである。また、本発明は予防接種用の細菌ベクターを含む組換えＤＮＡを使用する際に関与してくる潜在的な危険を回避する。本発明により提供されるさらに他の可能なワクチンおよびワクチンの使用においては、アジュバント性をもつある一定の（死菌）微生物（ＢＣＧに使用するマイコバクテリウムなど）は、抗原決定因子と付着性ペプチドからなるタンパク質または物質により標識または負荷される。これらの微生物は次いでアジュバントとして機能し、それによって特定の抗原決定因子に向けられた免疫応答を顕著に上昇させる。さらに本発明により提供される他の用途は、通常、該微生物が過剰発現（および／または分泌）し得ないタンパク質またはペプチドの提示手段を備える微生物に、外部からのタンパク質を固定化することを含む。例えば、コレラ毒素のサブユニット（ＣＴＢ）は大腸菌において過剰生産されるが、ラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）での発現はこれまで不成功であった。実験的組換えワクチンにおけるＣＴＢのアジュバント活性は、文献上よくまとまっており、真核細胞表面上ＧＭ１ガングリオシドに結合するＣＴＢまたはその部分の能力は、特に粘膜表面に標的化することを要するワクチンにおいて、ラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）（または他のグラム陽性菌）を使用することと関連して興味がある。さらに本発明により提供される他の医療用途は、細菌感染と闘うヒトまたは動物の血流に、生体内非経口投与で、（精製した）抗原：：ｃＡ融合タンパク質を添加することである。この場合、抗原：：ｃＡ融合タンパク質は免疫系への「信号」として用いる。本発明により提供されるタンパク質の抗原決定因子は、ヒト（好ましくは小児）または動物の免役化に通常使用するワクチンのサブユ���ット、例えば、風疹、百日咳、ポリオ、破傷風または麻疹ワクチンのサブユニットである。血流に送達後、「信号」はＡｃｍＡ繰返し体を介して血液中に存在する病原細菌に結合する。本発明が提供する「信号」タンパク質は、記憶応答、すなわち、該タンパク質に存在する抗原決定因子への応答を次いで活性化する。このように産生された抗体は「信号」標識化細菌を認識し、それが次いで免疫系により中和される。この様式で、該タンパク質は、細菌感染に関係しない既存の（記憶）免役応答を刺激するのに用い、系から細菌感染を取除く。さらに本発明により提供される他の用途は（これは、あるいは医療用途または食品用途と考えてもよい）、本発明が提供するタンパク質が、例えば、腸管の粘膜細胞などの細胞に結合する能力をもつ場合の用途である。かかるタンパク質の反応性基は、例えば、部分的にまたは全体として線毛状タンパク質または他の腸管付着タンパク質から誘導されるような場合のものであり、例えば、種々の大腸菌株に存在するようなものである。かかるタンパク質が付着する微生物は、腸管のある一定領域に特異的に居を構えるか結合するが、その性質は、例えば、共生体として用いられるある種細菌株（すなわち、ラクトコッカスまたはラクトバシラス株）にとって有益である。本発明により提供される他の食品または食品の用途において、本発明により提供されるタンパク質または物質は、付着性ペプチドと結合して、品質、風味、貯蔵期間、食品の価値または歯ごたえなどに影響を与える食品添加物（酵素または風味化合物）から構成されるが、これらは引続き微生物に付着または固定化され、次いで食品と混合される。かかるタンパク質を細菌担体に固定化することは、さらなる利点を与えるが、その利点は、該添加物が食品の製造過程で、固形の（細菌含有）マトリックス（例えば、凝乳品）、例えば、チーズまたは豆腐などを標的とし得ることである。さらに本発明により提供されるタンパク質性物質または微生物の他の用途は、環境目的、微生物触媒、および診断手段用の全細胞生物吸着剤またはバイオフィルターを生成させる際に、細菌表面提示を使用することである。
【００１８】  本発明を実験の部においてさらに説明するが、これは本発明を制限するものと見なしてはならない。
【００１９】  （実験の部）
導入部
ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）亜種クレモリス（cremoris）ＭＧ１３６３の主要自己分解酵素ＡｃｍＡは細胞分離を必要とするＮ−アセチルムラミダーゼであり、安定期の細胞溶解の原因となる（５，６）。４０．３ｋＤａの分泌成熟タンパク質は、ラクトコッカス培養物上清のザイモグラムにおいて多数の活性バンドを生じる。２９ｋＤａのタンパク質に対応する小さいバンドが検出された。ラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）ａｃｍＡ欠失突然変異体は明瞭なバンドを生じないので、すべてのバンドはＡｃｍＡの産物を表す（６）。実験データおよび相同性の研究から、我々はＡｃｍＡが３つのドメインから恐らく構成されていると推論した；シグナル配列は活性部位ドメインに続き、Ｃ−末端領域は細胞壁結合に関わる約４５個のアミノ酸からなる３つの高度相同性繰返し体を含んでいる。最小の活性タンパク質が２９ｋＤａなので、該タンパク質はＣ−末端部分においてタンパク質の酵素加水分解を受けていることが示唆された（５，６）。
【００２０】  種々の細菌およびバクテリオファージの細胞壁加水分解酵素は、ＡｃｍＡに存在する繰返し体に類似の繰返し体を含む（４，９，１０，１７）。部分的に精製したエンテロコッカス・ハイレ（Enterococcus hirae）のムラミダーゼ−２は、ＡｃｍＡに類似のタンパク質であって、６つの類似繰返し体を含んでおり、該株のペプチドグリカンフラグメントに結合する（１１）。リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）のｐ６０タンパク質は２つのかかる繰返し体を含み、細胞表面と会合することが示された（２４）。しかし、これら酵素のどの部分が結合能力を含んでいるのか、これらの研究のいずれでも評価はされなかった。
【００２１】  これまで検討した殆どすべての細胞壁加水分解酵素は、触媒ドメインからなるように思われ、通常、常にではないが、ドメインは多くの特異アミノ酸繰返し体を含んでいる。幾つかの研究において、細胞壁加水分解酵素のある一部分のみが、酵素活性にとって必要であることが示されている（１３，１４，１７，１９，２２，３４）。ラシッド（Rashid）らは、バチルス・スブチリス（Bcillus subtilis）の９０ｋＤａグルコサミニダーゼをエンコードする遺伝子のクローニングを報告したが、そのＣ−末端はエス・アウレウス（S.aureus）自己分解酵素のグルコサミニダーゼ・ドメインと有意な類似性を示す（２３）。該タンパク質はそのＮ−末端に２つの反復配列を含み、中間部のドメインに２つの異なる繰返し体を含む。Ｃ−末端１８７アミノ酸を欠く欠失誘導体は細胞壁に確りと結合したままであるが、ビー・サチリス（B.subtilis）で発現されたときには触媒活性が観察されなかった。Ｎ−末端から欠失させることにより、大腸菌において、略３分の２のタンパク質が、細胞壁加水分解活性を完全に喪失することなしに除去し得たが、１個を超える繰返し体の喪失が劇的に溶解活性を減少させた。
【００２２】  ストレプトコッカス・ニューモニエ（Steptococcus pneumonia）の自己分解酵素ＬｙｔＡのＮ−末端ドメインは、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニン・アミダーゼの触媒機能を備えているが、一方、Ｃ−末端ドメインは６つの反復配列を含み、細胞壁に結合する特異性を決める（総説、文献１８参照）。該タンパク質はシグナル配列を欠き、コリン−含有テイコ酸を必要としてニューモコッカス細胞壁を完全に分解する。さらに、少なくとも６つの繰返し体の内の４つは、ニューモコッカス細胞壁のコリン残基の有効な認識と評価し得る水解活性の保持のために必要であることが示された（７）。
【００２３】  ＬｙｔＡ、ニューモコッカス・ファージ溶解素、並びにクロストリジウムおよびラクトコッカス細胞壁加水分解酵素は、活性タンパク質の構築に用いられており、その結果、活性ドメインと細胞壁認識ドメインが交換された。ラクトコッカス・ファージ酵素のＮ−末端の半分をＬｙｔＡのＣ−末端ドメインに融合させた（２８）。キメラ酵素はエス・ニューモニア（S.pneumonia）のコリン含有細胞壁を水解し得るグリコシダーゼ活性を示した。この結果は、ラクトコッカス・ファージ溶解素がそのＮ−末端に含まれるグルコシダーゼ活性をもつ少なくとも２つのドメインと、Ｃ−末端におけるＡｃｍＡのと同様の２つの繰返し体から構成されていることを示した（６）。３分節ニューモコッカス・ペプチドグリカン加水分解酵素は、ファージＣＰＬ１リゾチームのＮ−末端触媒ドメインを、アミダーゼ活性とコリン結合ドメインをもつタンパク質であるＨＢＬ３に融合することにより構築されている（２７）。該融合タンパク質はアミダーゼ、リゾチームおよびコリン依存性酵素として振る舞ったように、３つのドメインは適切なコンホメーションを獲得した。
【００２４】  また、性質から酵素は２つの別個の機能的活性ドメインを有することが知られている；スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）からの自己分解酵素遺伝子は、アミダーゼを含むタンパク質および３つの高度に類似の繰返し体により分けられたエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼドメインをエンコードする（２０）。このタンパク質は翻訳後に２つの構成的活性ドメインに処理加工される。
【００２５】  本研究の目的は、ＡｃｍＡのモジュラー構造を検討することであった。それはＣ−末端繰返し体を連続的に欠失させることにより、また繰返し体を非相同タンパク質に融合することによりなされた。細胞分画と、全細胞を含めての結合研究にもとづき結論づけたことは、ＡｃｍＡのＣ−末端繰返し体は自己分解酵素をエル・ラクティス（L.lactis）の細胞壁に結合させるということである。
【００２６】  材料と方法
菌株、プラスミド、および増殖条件
本研究に使用した株とプラスミドを表１に掲載する。ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）は、０．５％グルコースおよび０．９５％β−グリセロホスフェート（シグマケミカル（株）、セントルイス、ミズーリ）を含む２倍希釈したＭ１７ブロス（ディフコラボラトリーズ、デトロイト、ミシガン）中、３０℃で静置培養増殖させた（１／２Ｍ１７）。同じ培地の寒天平板は１．５％の寒天を含有していた。必要の場合、エリスロマイシン５μｇ／ｍｌ（ベーリンガーＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）を添加した。大腸菌はＴＹ培地（ディフコ）中激しくかき混ぜながら、または１．５％寒天で固相としたＴＹ培地上、３７℃で増殖した。必要の場合、培地は１ｍｌあたりアンピシリン１００μｇ（シグマ）、エリスロマイシン１００μｇ、またはカナマイシン５０μｇ（共にベーリンガーから）を含んでいた。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）（共にシグマから）をそれぞれ１ｍＭおよび０．００２％の濃度で使用した。
【００２７】  一般的なＤＮＡ技法および形質転換
分子クローニング技法は、実質的にサムブルーク（Sambrook）ら記載のとおりに実施した（２５）。制限酵素、クレノウ酵素およびＴ４ＤＮＡリガーゼはベーリンガーから入手し、供給者の指示通りに使用した。デオキシヌクレオチドはファルマシア（ファルマシア・バイオテック、ウプサラ、スゥエーデン）から入手した。化学試薬類はすべて分析用基準のものとし、メルク（ダルムシュタット、ドイツ）またはＢＤＨ（プール、イギリス）からのものであった。大腸菌およびエル・ラクティス（L. lactis）の電気形質転換は、それぞれザバロフスキーおよびウインベルグ（Zabarovsky and Winberg）（３７）とリーンフーツおよびべネマ（Leenhouts and Venema）（１６）の記載通りに、遺伝子パルサー（バイオ−ラッド・ラボラトリーズ、リッチモンド、カリフォルニア）を使用して実施した。プラスミドＤＮＡはキアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）プラスミドＤＮＡ単離キット（キアゲンＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイツ）を用いて、またはＣｓＣｌ−臭化エチジウム密度勾配遠心分離により単離し、ＤＮＡフラグメントはキアゲン・ゲル抽出キットとキアゲンのプロトコールを用いて、アガロースゲルから単離した。
【００２８】  プライマー合成、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定
合成オリゴデオキシリボヌクレオチドはアプライド・バイオシステムズ３９２ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（アプライド・バイオシステムズ・インク、フォスターシティ、カリフォルニア）を用い合成した。使用したオリゴヌクレオチドの配列を表２に掲載した。
【００２９】  ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、バイオ−メッド・サーモサイクラー６０（バイオ・メッドＧｍｂＨ、テレス、ドイツ）により、スーパーＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよび製造業者（ＨＴバイオテクノロジー（株）、ケンブリッジ、イギリス）の指示書を用い実施した。ＰＣＲフラグメントはヌクレオチド除去キットおよびキアゲンのプロトコールを用いて精製した。
【００３０】  二本鎖プラスミド鋳型のヌクレオチド配列は、ジデオキシ鎖終結法（２６）を用い、Ｔ７配列決定キットおよびプロトコール（ファルマシア）またはビストラ・システムズの自動化蛍光ＤＮＡシーケンサー７２５（アマーシャム・ライフサイエンス・インク、バッキンガムシャー、イギリス）により決定した。
【００３１】  ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＰＣ／ＧＥＮＥ配列分析プログラム（バージョン６．８、インテリジェネティックス・インク、ジュネーブ、スイス）により分析した。スイスプロット、ＰＩＲ、およびジェンバンク（１９９６年９月２３日発表）のデータベースによるタンパク質相同性検索は、ブラスト（ＢＬＡＳＴ）プログラム（１）により実施した。
【００３２】  ＡｃｍＡ誘導体の構築
終止コドンとＥｃｏＲＩ制限酵素部位を、ａｃｍＡの繰返し体エンコードヌクレオチド配列末端と活性部位ドメインを特定する配列の末端に、プライマーＲＥＰＤＥＬ−１、ＲＥＰＤＥＬ−２とＲＥＰＤＥＬ−３および鋳型としてプラスミドｐＡＬ０１を用いるＰＣＲにより導入した。ＡｃｍＡのシグナルペプチドをエンコードする配列内にアニーリングするプライマーＡＬＡ−４をすべての場合に上流プライマーとして使用した。３種すべてのＰＣＲ産物をＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ｐＤＥＬ１、ｐＤＥＬ２、およびｐＤＥＬ３に導くｐブルースクリプトＳＫ＋の対応する部位にクローン化した。続いて、ｐＧＫＡＬ１の１，１８７ｂｐ ＰｆｌｍＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント（５）は、それぞれｐＤＥＬ１、２および３の挿入断片の５１３、２８２および７６ｂｐ ＰｆｌｍＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントと置換えた。タンパク質を特定し、１、２または３個すべての繰返し体（それぞれ、ｐＧＫＡＬ５、４、および３）を含む適切なプラスミドをエル・ラクティス（L lactis）ＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１中に得た。ｐＧＫＡＬ１をＳｐｅＩで切断した。付着末端をクレノウ酵素で平滑にし、自己連結反応によりＵＡＧ終止コドンをａｃｍＡのＳｅｒ３３９コドンの後に導入した。得られたプラスミドをｐＧＫＡＬ６と命名した。
【００３３】  最初の繰返し体の半分から第二繰返し体の中間部のＳｐｅＩ部位までをエンコードするＤＮＡフラグメントを、プライマーＲＥＰ−４ＡおよびＢを用いるＰＣＲにより合成した。２５０ｂｐのＰＣＲ産物の末端にあるＮｈｅＩおよびＳｐｅＩ部位を切断し、そのフラグメントをｐＧＫＡＬ１のユニークＳｐｅＩ部位にクローン化し、プラスミドｐＧＫＡＬ７とした。
【００３４】  ＡｃｍＡ活性部位ドメインの過剰発現と単離
ＡｃｍＡの活性部位ドメインをエンコードするＤＮＡフラグメントは、プラスミドｐＡＬ０１を鋳型として、プライマーＡＣＭＨＩＳとＲＥＰＤＥＬ−３を用い入手した。５０４ｂｐのＰＣＲフラグメントをＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩにより消化し、ｐＥＴ３２ＡのＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位にサブクローン化した（ノバゲンＲ＆Ｄシステム・ヨーロッパ（株）、アビンドン、イギリス）。適切な構築物ｐＥＴＡｃｍＡが大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に得られた（３０）。チオレドキシン／ＡｃｍＡ融合タンパク質の発現は、この株においてＩＰＴＧ（１ｍＭの最終濃度まで）を０．７のＯＤ600で加えることにより誘導した。誘導の４時間後、遠沈により１ｍｌの培養物から細胞を収集し、融合タンパク質をタロン（商標）メタルアフィニティ樹脂（クロンテック・ラボラトリー・インク、パロアルト、カリフォルニア）上、８Ｍウレウム溶出バッファーと供給者のプロトコールを用い精製した。溶出物（２００μｌ）を５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２０ｍＭトリス（ｐＨ７）含有溶液に対し透析し、その後、ＣａＣｌ2を２ｍＭの最終濃度まで加えた。エンテロキナーゼ（ノバゲン）１単位を加え、混合物を室温で２０時間培養した。タンパク質混合物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析と細胞結合の研究前に、数種変化させた脱塩水に対し透析した。
【００３５】  ＡｃｍＡ反復ドメインに対するβ−ラクタマーゼおよびα−アミラーゼ融合体の構築
大腸菌ＴＥＭ−β−ラクタマーゼの終止コドン位置にユニークＮｄｅＩ部位を導入するために、オリゴヌクレオチドＢＥＴＡ−１およびＢＥＴＡ−２を、プラスミドｐＧＢＬ１（２１）を鋳型としてＰＣＲに用いた。４０３ｂｐのＰＣＲフラグメントをＮｄｅＩおよびＰｓｔＩで切断し、３１１ｂｐフラグメントとしてｐＵＫ２１の同一部位にクローン化した。得られるプラスミドｐＵＫｂｌａｃをＮｄｅＩで消化し、クレノウ酵素で処理し、続いてＸｂａＩで消化した。β−ラクタマーゼ・エンコード・フラグメントを、ＡｃｍＡの反復領域をエンコードするａｃｍＡ部分含有のｐＡＬ０１からの１，１０４ｂｐ ＰｖｕＩＩ−ＸｂａＩＤＮＡフラグメントに連結した。得られたプラスミドｐＵＫｂｌａｃｒｅｐをＰｓｔＩおよびＤｒａＩで消化し、１３４９ｂｐのフラグメントをｐＧＢＬ１のＰｓｔＩ−ＳｎａＢＩ部位に挿入し、プラスミドｐＧＢＬＲに導いた。ｐＧＡＬ９（２１）をＣｌａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、バシラス・リヘニフォルミス（Bacillus licheniformis）のα−アミラーゼ遺伝子の３'−末端を包含する１，０４９ｂｐフラグメントをｐＵＫ２１の対応する部位にサブクローン化した。ペレッツ・マルチネッツ（Perez Martinez）ら（２１）の報文に従い、このフラグメントは１，４０２ｂｐであるべきであったが、制限酵素分析の後、より小さい約３５０ｂｐであることが判明した。得られたプラスミドをｐＵＫＡＬ１と呼称した。ユニークＥｃｏＲＶ制限酵素部位をＰＣＲにより、プラスミドｐＧＡＬ９を鋳型としてオリゴヌクレオチドＡＬＦＡ−ＡおよびＡＬＦＡ−Ｂを用い、バシラス・リヘニフオルミスのα−アミラーゼ遺伝子の終止コドン位置に導入した。５１４ｂｐのＰＣＲフラグメントをＳａｌＩおよびＥｃｏＲＶで制限した後、４４０ｂｐのフラグメントをｐＵＫＡＬ１の同じ部位にクローン化し、プラスミドｐＵＫＡＬ２とした。このプラスミドのＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩ部位を用いてＡｃｍＡの繰返し体をエンコードするｐＡＬ０１の１，１０４ｂｐ  ＰｖｕＩＩ−ＸｂａＩフラグメントをクローン化した。得られるプラズミドｐＵＫＡＬＲの１，９１５ｂｐ ＣｌａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを使用し、ｐＧＡＬ９（ｐＧＡＬＲ）の対応する１，０４９ｂｐフラグメントに置換えた。上記クローニング工程のすべてを大腸菌ＮＭ５２２で実施した。プラスミドｐＧＢＬ１、ｐＧＢＬＲ、ｐＧＡＬ９およびｐＧＡＬＲを用い、エル・ラクティス（L.lactis）ＭＧ１３６３およびＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１を形質転換した。
【００３６】  ＡｃｍＡとα−アミラーゼ活性のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）および検出
終末指数増殖期のラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）培養物２ｍｌを遠心分離に付した。上清フラクション０．５ｍｌを数変化の脱塩水に対し透析し、凍結乾燥し、変性バッファー０．２５ｍｌに溶解した（３）。細胞ペレットを新鮮な１／２Ｍの１７培地２ｍｌで洗浄し、変性バッファー１ｍｌに再懸濁した。細胞抽出物はヴァンデグーテ（van de Guchte）らの記載通りに調製した（３２）。
【００３７】  ＡｃｍＡ活性は、オートクレーブし凍結乾燥したミクロコッカス・リソデイクチカス（Micrococcus lysodeikticus）ＡＴＣＣ４６９８細胞（シグマ）含有のＳＤＳ−ＰＡＡ（１２．５％または１７．５％）ゲルを用いるザイモグラム染色技法により、前記のように検出した（６）。α−アミラーゼ活性の分析のために、１％デンプンを１２．５％ＰＡＡゲルに包含させた。電気泳動の後、タンパク質をＡｃｍＡ復元溶液（３）を用いて再生させ、ゲルをＩ2／ＫＩ溶液（それぞれ、１２ｍＭおよび１８ｍＭの最終濃度）により染色した（３３）。
【００３８】  ＳＤＳ−ＰＡＧＥをレムリー（Laemmli）（１５）に従い、プロテアンＩＩミニゲル・システム（バイオ−ラッド）により実施し、ゲルはクマシーブリリアントブルー（バイオ−ラッド）により染色した。標準低範囲および事前染色した低／高範囲のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分子量マーカー（バイオ−ラッド）を参照として用いた。
【００３９】  エル・ラクティス（L. lactis）の中間−および終末対数増殖期の培養物分画はバーンクレイス（Baankreis）（２）のプロトコールに従い実施した。
【００４０】  ラクトコッカス細胞に対するＡｃｍＡとその誘導体の結合
ＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１の対数増殖期培養物２ｍｌの細胞を、プラスミドｐＧＫ１３、ｐＧＫＡＬ１、−３、−４、−５、−６または−７のいずれかを担持する同様に増殖するＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１の上清等容量に、ゆるやかに再懸濁し、３０℃で２０分間培養した。引き続き、該混合物を遠心分離した。細胞ペレットを２ｍｌの１／２Ｍ１７で洗浄し、細胞抽出物を上記のように変性バッファー１ｍｌに調製した。一方、上清０．４ｍｌを脱塩水に透析し、凍結乾燥して、変性バッファー０．２ｍｌに溶解した。
【００４１】  １個の繰返し体または２個の繰返し体を含むＡｃｍＡ誘導体間の競合的結合を分析するために、ｐＧＫＡＬ３またはｐＧＫＡＬ４を含むＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１の上清等容量を培養に先立ちＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１細胞と混合した。サンプルを上記のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に処理した。
【００４２】  ＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１の中間対数増殖期培養物の３種サンプル５００μｌを遠沈した。１サンプルからの上清５０μｌをＡｃｍＡ活性部位ドメイン（上記参照）含有溶液５０μｌと置換えた。２番目のサンプルの上清１００μｌを脱塩水５０μｌおよびＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１（ｐＧＫＡＬ４）の中間対数増殖期培養物の上清５０μｌと置換えた。３番目のサンプル上清１００μｌをＡｃｍＡ活性部位ドメイン含有溶液５０μｌおよびＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１（ｐＧＫＡＬ４）の上清５０μｌと置換えた。続いて、３つのサンプルをボルテックスして細胞を再懸濁させ、３０℃で１５分間培養した。遠沈後、細胞と上清フラクションを上記のＳＤＳ−（１７．５％）ＰＡＧＥにおけるＡｃｍＡ活性分析用の脱塩バッファー５００μｌ中に調製した。
【００４３】  β−ラクタマーゼ／ＡｃｍＡ融合タンパク質の結合につき、ｐＧＫ１３、ｐＧＢＬ１またはｐＧＢＬＲ含有ＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１を中間対数増殖期まで増殖させることにより検討した。ＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１（ｐＧＫ１３）培養物１ｍｌの細胞を他の２つの培養物上清それぞれの等容量に再懸濁した。混合物は２シリーズ調製し、その１シリーズを３０℃で５分間培養し、他シリーズをその温度で１５分間維持した。次いで、フラクションの細胞と上清をＡｃｍＡ結合研究のために上記のように処理し、変性バッファーに当初容量の半量で再懸濁し、ＳＤＳ−（１２．５％）ＰＡＧＥに付して、次いでウエスタンブロット分析に付した。
【００４４】  ウエスタンブロッティングおよび免疫検出
タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＡゲルからＢＡ８５ニトロセルロース膜（シュライヒャーおよびシュエル、ダッセル、ドイツ）に以前に記載のように移した（３１）。α−アミラーゼとβ−ラクタマーゼ抗原を２０００倍希釈したウサギポリクローナル抗アンピシリナーゼ抗体（５プライム→３プライム、インク、ボウルダー（株））およびアルカリホスファターゼ接合ヤギ抗ウサギ抗体（プロメガ・コーポレーション、マディソン、ウイスコンシン）により、ウエスタン−ライト化学発光検出システムおよびプロトコール（トロピックス・インク、ベッドフォード、マサチューセッツ）を用いて検出した。
【００４５】  酵素アッセイおよび光学濃度測定
ＡｃｍＡ活性は、オートクレーブし凍結乾燥した０．２％ミクロコッカス・リソデイクチカス（M. lysodeikticus）細胞含有１／２Ｍ１７寒天平板上、３０℃で一夜増殖後のコロニー周辺の光輪として可視化した。
【００４６】  α−アミラーゼ活性は、一夜培養物１０μｌをデンプン（シグマ）１％含有１／２Ｍ１７寒天平板上にスポットすることにより検出した。３０℃で１８時間培養後、スミス（Smith）らのプロトコールに従い、ヨード溶液で染色して光輪を可視化した（２９）。同様の方法をβ−ラクタマーゼ活性の検出に使用した（２９）。
【００４７】  Ｘ−プロリル・ジペプチジル・アミノペプチダーゼ（ＰｅｐＸ）は色素原基質Ａｌａ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリド（ＢＡＣＨＥＭファインケミカルＡＧ、ブーベンドルフ、スイス）を用い測定した。エッペンドルフのミクロ遠心機で２分間遠沈後、培養上清７５μｌを基質（２ｍＭ）５０μｌおよびヘペスバッファー（ｐＨ７）７５μｌに加えた。混合物をマイクロタイタープレートウエルにピペットで入れ、発色をサーモマックス・マイクロタイタープレートリーダー（モレキュラー・ディバイス・コーポレーション、メンローオークス、カリフォルニア）により、３７℃２０分間、４０５ｎｍでモニターした。光学濃度はノバスペックＩＩ分光光度計（ファルマシア）により６００ｎｍで測定した。
【００４８】  結  果
ＡｃｍＡの３つの繰返し体の内２つが自己分解と細胞分離に十分である。
数種の突然変異ＡｃｍＡ誘導体を構築し、ＡｃｍＡのＣ−末端における３つの繰返し体機能を検討した。終止コドンはＴｈｒ−２８７（ｐＧＫＡＬ４）またはＳｅｒ−３６３（ｐＧＫＡＬ３）のコドンの後に導入した（図１参照）。プラスミドｐＧＫＡＬ４−特異ＡｃｍＡ（Ａ１）は３つの繰返し体の最初のもの（もっともＮ−末端）を含むのみであるが、一方、ｐＧＫＡＬ３は最初の２つの繰返し体を担持するＡｃｍＡ変異体（Ａ２）であることを明確に示す。ｐＧＫＡＬ５は、Ｓｅｒ−２１８の後の終止コドン導入により、繰返し体を欠くＡｃｍＡ誘導体（Ａ０）であることを明確に示す。ｐＧＫＡＬ６により示されるＡｃｍＡは、Ｓｅｒ−３３９コドンの後に終止コドンが存在するために、１個半の繰返し体（Ａ１．５）を含む。ｐＧＫＡＬ７からは、ＡｃｍＡ突然変異体（Ａ４）が産生されるが、これはＳｅｒ−２６３からＴｈｒ−３３８までのポリペプチド複製の結果としてさらなる（第４の）繰返し体を担持する。タンパク質はすべてＡｃｍＡ−陰性株エル・ラクティス（L. lactis）ＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１においてａｃｍＡプロモーターから発現された。ＡｃｍＡの様々な欠失を以下の性質に関して検討した：（Ｉ）ミクロコッカス・リソデイクチカス（M. lysodeikticus）の細胞壁フラグメントを含むプレート上、光輪形成に対するそれらの影響、（ＩＩ）突然変異体ＡｃｍＡを発現する細胞の鎖長、および静置培養における細胞の沈降、（ＩＩＩ）細胞と上清フラクション双方におけるそれらの酵素活性、および（ＩＶ）自己分解。
【００４９】  光輪形成。ミクロコッカス・リソデイクチカス（M. lysodeikticus）の細胞壁フラグメントを含む１／２Ｍ１７プレート上、ＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１がｐＧＫ１３またはｐＧＫＡＬ５を担持する場合、光輪は存在しなかった。他の株はすべて異なるサイズの明瞭な光輪を生じた。光輪のサイズは存在する全長繰返し体の数と明確に相関したが、余分の繰返し体を加えると、光輪サイズは縮小するに至った（表３参照）。明らかに、最適細胞壁溶解活性にとっては、完全に成立した繰返し体が必要である。
【００５０】  細胞分離および沈降。１個半、２個および３個すべての繰返し体を欠失させると、その鎖長および一夜増殖後の細胞沈降に明瞭な影響がある（表３参照）。このように、有効な細胞分離はＡｃｍＡ中、少なくとも２個の繰返し体の存在を必要とする。
【００５１】  酵素活性。株すべての一夜培養細胞と上清を、ＡｃｍＡ活性についてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。細胞のフラクションには、Ａ０については活性が検出されず、タンパク質の復元１週間後でさえ検出されなかった（表３）。他の誘導体については、２つの主要活性バンドがこのフラクションに存在した。それぞれの場合に、ゲルにおけるそれらの位置は、未処理および処理加工された形状の計算分子量をもつタンパク質に対応した（表３および未提示）。図１に示すように、ＡｃｍＡ誘導体すべてが上清フラクションにおいてなお活性であった。ＡｃｍＡは以前に決定したように、特徴的なパターンを生じた（図１、レーン１および３；（６））。Ａ０およびＡ１を除くＡｃｍＡ誘導体すべてが独特の非常に再現性の高い分解パターンを示した。Ａ４は長期の復元後、２つのさらなる崩壊産物を示した（結果は未開示）。これらのデータは、繰返し体を除去するとＡｃｍＡ活性を分解しないことを物語り、会合した酵素細胞を維持するには繰返し体１個で十分であることを示唆する。
【００５２】  自己分解。安定期の自己溶解に繰返し体が及ぼす影響を分析するために、すべての株の一夜培養物を１００倍に希釈して、３０℃で６日間培養し、光学濃度（ＯＤ600）の減少を追跡した。培養物すべてが同様の増殖速度を示し、同じ最大光学濃度に達して、対数増殖期の増殖の間、溶解しなかった。約６０時間の培養後、ＯＤ600における最大の減少がすべての場合に達成された。結果を表３に提示するが、ＯＤ600での減少はＡｃｍＡ繰返し体数の減少と相関することを示す。ＯＤ600での低下が実際に自己分解を反映しているかを検討するために、細胞間酵素ＰｅｐＸの活性を測定した。培養の６０時間後、培地中のＰｅｐＸ活性もすべてのサンプルで最大となり、さらに培養を続けるとすべての場合に減少した。ａｃｍＡΔ１突然変異体の上清およびＡ０、Ａ１またはＡ１．５産生培養では、ＰｅｐＸ活性は殆ど検出されなかった。それに対して、Ａ２およびＡ３産生培養物の上清には、相当量のＰｅｐＸが放出されていた。このように、ＡｃｍＡにおける２つの繰返し体はエル・ラクティス（L. lactis）の自己分解にとって十分である。Ａ２またはＡ４の産生は産生体細胞の溶解減少につながる。総合すると、これらの結果は、ＡｃｍＡの繰返し体が有効な自己分解において機能し、細胞分離に必要とされることを示している。
【００５３】  ＡｃｍＡの活性部位ドメインはＮ−末端部分に存在する。
活性部位がＡｃｍＡのＮ−末端ドメインに位置しているかを検討するために、ａｃｍＡのコドン５８から始まってコドン２１８に至るＤＮＡフラグメントをＰＣＲにより合成し、プラスミドｐＥＴ３２Ａのチオレドキシン遺伝子に融合した。融合タンパク質は３２６個のアミノ酸を含む。予測した分子量（３５ｋＤａ）を有するタンパク質を大腸菌ＢＬ２１（ｐＥＴＡｃｍＡ）の培養物から単離した（図２、レーンＡ２）。エンテロキナーゼでの切断により、該タンパク質を１７ｋＤａのチオレドキシン部分と１８ｋＤａのＡｃｍＡドメイン（ｎＡ）に開裂させた（図２、レーンＡ１）。ザイモグラム（図２．Ｂ）は、融合タンパク質が認知し得る細胞壁の水解活性をもたず、一方、放出されたＡｃｍＡのドメインは活性であったことを示し（図２、レーンＢ１およびＢ２）、活性部位ドメインはＡｃｍＡのＮ−末端部分にあったことを物語っている。
【００５４】  ＡｃｍＡの繰返し体をα−アミラーゼとβ−ラクタマーゼに融合させると活性な酵素を生じる。
【００５５】  ＡｃｍＡの３個のＣ−末端繰返し体（ｃＡ）を、バシラス・リヘニフォルミスのα−アミラーゼおよび大腸菌ＴＥＭのβ−ラクタマーゼに、材料と方法の項に記載したように、また図３に示したように、Ｃ−末端にて融合させた。融合タンパク質をラクトコッカスのシグナル配列ＡＬ９およびＢＬ１にそれぞれ融合させた（２１）。両融合タンパク質は、β−ラクタマーゼ／ＡｃｍＡ融合タンパク質（βｃＡ）についてのみ示してあるように、平板アッセイで活性であった（図４）。融合タンパク質を生成するコロニー周辺の光輪は野生型酵素が発するものよりも小さかったが、これは繰返し体の存在のために本来の酵素活性が低下したことによるのか、またはタンパク質加水分解の受け易さが増大したことが原因であろう。しかし、キメラタンパク質により生じるより小さい光輪は、細胞壁結合により拡散が妨害されたことに原因があるかもしれない（下記参照）。α−アミラーゼおよびαｃＡ融合タンパク質の活性は、１％デンプン含有の復元ＳＤＳ−（１２．５％）ＰＡＡゲルにおいても検出された。α−アミラーゼ遺伝子の一次翻訳産物は、３７個のアミノ酸のシグナル配列を含む５２２個のアミノ酸残基からなるタンパク質である（２１）。これは５５ｋＤａのタンパク質として分泌される。αｃＡは７４１個のアミノ酸から構成され、処理加工され、分泌された場合には７８ｋＤａのタンパク質となる。ｐＧＡＬ９またはｐＧＡＬＲを担持するエル・ラクティス（L. lactis）ＭＧ１３６３とＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１の細胞と上清フラクションとを、該株の一夜増殖後に分析した。結果を図５に提示するが、明瞭なバンドが両成熟タンパク質に対し期待される位置に存在する。明らかに、αｃＡは活性である。明瞭に、より小さい産物が融合タンパク質を生成する細胞の上清に存在し、最小のものは野生型成熟α−アミラーゼのサイズに近似している（図５および未提示）。
【００５６】  β−ラクタマーゼ融合タンパク質は優先して細胞壁に存在する。
ＡｃｍＡのＣ−末端ドメインの存在が、βｃＡを細胞壁に結合させるに至るか否かを検討するために、ｐＧＢＬ１を含有し、β−ラクタマーゼをエンコードするか、またはｐＧＢＬＲを含有し、βｃＡを特定するエル・ラクティス（L. lactis）ＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１の中間対数増殖期培養物を分画し、ウエスタンブロット分析に付した（図６）。ｐＧＢＬ１からは、β−ラクタマーゼが４７個のアミノ酸のシグナル配列を含む３２２個のアミノ酸からなるタンパク質として発現された。分泌されたタンパク質は３０ｋＤａである。βｃＡは５４０個のアミノ酸からなり、５２ｋＤａの分子質量をもつタンパク質として分泌される。図６は野生型β−ラクタマーゼの殆どが培養上清に存在し、細胞質には存在しないことを示す。僅かに大きなバンドは、恐らく未処理加工形を提示するものであって、この株の膜フラクションに見出される。対して、βｃＡは細胞壁フラクションに優位に保持されるが、相当量が細胞質に存在しており、ＡｃｍＡの繰返し体がハイブリッド酵素を細胞壁に固定したことを強く示唆する。両細胞質フラクションに存在するより小さいバンドは、非特異ラクトコッカスタンパク質に対し抗体が交差ハイブリッド形成したことが原因である（未公開観察）。βｃＡ産生細胞の上清フラクションには、ほんの僅かの全長タンパク質が観察された。数種の明確な小さい産物がこのフラクションに存在し、これらはフィルムに長時間露出した後に、細胞壁フラクションに極微量検出し得るが（未提示）、他のフラクションからのものには存在しない。
【００５７】  ＡｃｍＡのＣ−末端繰返し体が細胞壁結合に必要である。
前項に提示した結果は、Ｃ−末端繰返し体が細胞壁のタンパク質保持にとって必要であることを強く示唆するが、確かな証拠は、ＡｃｍＡを含む終末対数期培養物の上清フラクションまたはその欠失誘導体の１つ（図１参照）を、ＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１（ｐＧＫ１３）の等容量培養物からの細胞と混合することにより得られた。培養後、細胞と上清フラクションはＡｃｍＡの存在について検討した。Ａ０の場合を除いて、すべてのタンパク質はＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１細胞に結合することができた（表３）。また、ＡｃｍＡとその誘導体の分解産物はすべて結合することができた。Ａ０が結合し得なかったという知見は、エンテロキナーゼ放出のｎＡとチオレドキシンとの混合物をＡ１含有上清に添加することにより確証された。ＡｃｍＡマイナス細胞と培養した場合には、Ａ１のみが細胞フラクションに検出されたので、このタンパク質のみがラクトコッカス細胞に結合した（図７）。ｎＡは上清のみに検出された。このことは実験をｎＡのみについて繰返した場合にも当てはまる（未提示）。
【００５８】  異なるｐＨにおけるＡｃｍＡまたはβｃＡのラクトコッカス細胞への結合。
中間対数増殖期のエル・ラクティス（L. lactis）ＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１培養物の上清フラクションを中間対数増殖期のエル・ラクティス（L. lactis）ＭＧ１３６３培養物の上清と置換えた。この混合物を３０℃で５分間培養した。その後、上清を遠沈により除去し、細胞ペレットをＭ１７で洗浄した。細胞ペレットをｐＨ２ないし１０のＭ１７に溶解し、３０℃で３０分間培養した。細胞および上清フラクションを分離し、すでに記載のように処理し、ＡｃｍＡ活性の存在について分析した。同様の実験を中間対数増殖期のエル・ラクティス（L. lactis）ＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１細胞とエル・ラクティス（L. lactis）ＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１（ｐＧＢＬＲ）培養物とで実施した。βｃＡの存在につきウエスタンブロッティングおよび免疫検出により、記載のとおりに分析した。
【００５９】  すべての異なるｐＨで、ＡｃｍＡおよびβｃＡがラクトコッカス細胞に結合することが見出された。ＡｃｍＡおよびβｃＡ両方の結合が、ザイモグラムでの活性と免役検出後の細胞抽出物に、βｃＡ融合タンパク質量が可視化して存在することから判定されるように、低いｐＨでより良好であった。
【００６０】  プロナーゼおよびトリプシンによるＡｃｍＡのタンパク質分解。
中間対数増殖期のＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１培養物の上清フラクションを中間対数増殖期のＭＧ１３６３培養物の上清と置換えた。この混合物を３０℃で１５分間培養した。その後、上清と細胞フラクションを分離し、細胞ペレットを同じ容量のＭ１７に溶解した。両フラクションに、１０ｍＭ ＮａＰｉバッファー（ｐＨ＝７）に溶かしたプロナーゼとトリプシン（１ｍｇ／ｍｌ）を終濃度１０μｇ／ｍｌで加え、混合物を３０℃で培養した。培養の５分、３０分および２時間後にサンプルを採取した。各サンプルの細胞と上清フラクションを分離し、上記のようにザイモグラフ分析用に調製した。
【００６１】  プロナーゼによるＡｃｍＡの完全加水分解が、培養の２時間後、上清フラクションに観察された一方、この時点で活性はなお細胞の抽出物に存在した。トリプシンによるＡｃｍＡの加水分解は遅く、活性は培養２時間後にもなお上清に存在した。やがて、細胞の抽出物に存在する活性部分は、上清に観察されるものよりも常に高くなった。これらの結果はＡｃｍＡタンパク質が細胞に結合した場合、保護されることを物語る。
【００６２】  異なる型の細菌細胞に対するＡｃｍＡの結合。
菌株、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）ＤＢ１０４、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）８０、ストレプトコッカス・フェカーリス（Streptococcus faecalis）ＪＨ２−２、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）ＡＴＣＣ１９２５８、リステリア・ピー（Listeria P）、ラクトバシラス・ブッフネリ（Lactobacillus buchneeri）Ｌ４、クロストリジウム・ベイジェリンキイ（Clostridium beijerinckii）ＣＮＲＺ５３０、およびエシェリキア・コリ（Escherichia coli）ＮＭ５２２をＧＭ１７中一夜増殖させた。各一夜培養物の２フラクションを遠沈し、その上清をエル・ラクティスＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１（ｐＧＫＡＬ１）またはＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１（ｐＧＫ１３）の一夜培養物上清と置換えた。この混合物を３０℃で１５分間培養した。続いて、細胞と上清フラクションを分離し、細胞はＭ１７で一度洗浄し、上記のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に調製して、ＡｃｍＡ活性につき分析した。
【００６３】  細胞抽出物すべてにＡｃｍＡ活性が存在したが、一方、かかる活性は、ＡｃｍＡの存在を欠くＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１（ｐＧＫ１３）の上清と培養した細胞の抽出物には存在しなかった。
【００６４】  結合に対する反復数の影響を検討するために、ＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１（ｐＧＫＡＬ３、Ａ２エンコード）およびＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１（ｐＧＫＡＬ４、Ａ１を特定）の培養物上清等容量を混合した。未希釈および１０倍希釈混合物をＡｃｍＡ不含細胞と培養した。段階希釈のザイゴグラム分析は、２つの活性が細胞と上清フラクションに等しく分布していることを示し、両タンパク質が均等に結合していることを物語っている（結果未提示）。
【００６５】  ＡｃｍＡのＣ−末端反復配列が非相同細胞外酵素をラクトコッカス細胞に結合する能力を有するか否かを検討するために、βｃＡの結合について、ＡｃｍＡ−マイナス・エル・ラクティス（L. lactis）細胞を、分泌された野生型β−ラクタマーゼまたはβｃＡ含有培養上清と培養することにより評価した。図８が示すように、野生型β−ラクタマーゼは上清フラクションにもっぱら存在したが、一方、βｃＡはラクトコッカス細胞で分画され、したがって、これらの細胞に結合していた。
【００６６】  考  察
本研究で提示された結果は、ラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）のＮ−アセチルムラミダーゼＡｃｍＡの成熟型が２つの別個のドメインから成り立っていることを示している。過剰生産され、精製されたＮ−末端は、プレタンパク質においてアミノ酸残基５８ないし２１８からなり、ミクロコッカス・リソデイクチカス（M. lysodeikticus）細胞壁上で活性であって、かくして酵素の活性部位を含んでいる。これは反復のないＡｃｍＡ突然変異体Ａ０が、大きく有効性を減じているにかかわらず、ミクロコッカス・リソデイクチカス（M. lysodeikticus）細胞壁をなお水解し得るという知見と一致している。生体外で酵素活性を検出するためには長期の復元が必要であったが、タンパク質を産生するコロニーは光輪を形成しなかった。酵素Ａ１およびＡ２は、野生型のタンパク質と略同じ活性の生体外活性を示したが、プレートアッセイではＡ１がＡ２よりも小さい光輪を生じ、それはさらに野生型の光輪よりも小さかった。Ａ１産生株はＡ２発現細胞よりも長い連鎖状に増殖し、Ａ２産生細胞に対比して、沈降するが、自己分解はしなかった。総合するとこれらの結果は、ＡｃｍＡのＮ−末端は活性部位を含むが、少なくとも１つの完全繰返し体の存在が評価し得る活性を維持する酵素にとって必要であることを示している。第２に、２つまたは３つの完全長繰返し体を含むＡｃｍＡ産生培養物のみが自己分解を受け易く、野生型の連鎖を生ずる。ＡｃｍＡの触媒有効性におけるこの明らかな上昇は、酵素の基質である細胞壁のペプチドグリカンに酵素が結合することにより、反復ドメインによって引起されると想定するのは魅惑的である。セロビオヒドラーゼのセルラーゼ結合ドメインについてノウレス（Knowles）らが仮定した（１２）ように、かかる結合は酵素の局所濃度を増加させる。繰返し体は結合にのみ関与するか、または触媒ドメインがその基質に向かって適切に位置づけられるために重要であろう。野生型酵素において、反復数が３個まで増大するにつれＡｃｍＡ活性が上昇することは、適切な酵素機能にとって最適となるための繰返し体増幅の進化過程を示唆する。Ａ１、Ａ１．５およびＡ４の結合は野生型ＡｃｍＡの結合と比較し得るが、これら酵素の多様性は自己分解の原因とならないか、原因となってもほんの僅かであった。これらの観察は３個の繰返し体がＡｃｍＡの適切な機能にとって最適であるとする考えを支持しているように思える。エンテロコッカス・フェカーリスおよびエンテロコッカス・ハイレの非常に近似した酵素において、５個および６個の繰返し体の存在は、細胞壁構造および／または触媒ドメインの僅かな差異を反映しており、最適酵素活性のために余分の繰返し体をこれら自己分解酵素によって補強することを必要とする。
【００６７】  ＡｃｍＡのＣ−末端ドメインが細胞の結合に関与しているとする仮説（６）はこの研究において確証された。先ず第一に、ＡｃｍＡが事実上細胞に結合し得ることを我々は示す。ＡｃｍＡおよびその誘導体Ａ１、Ａ１．５、Ａ２およびＡ４すべてが、外部から添加してエル・ラクティス（L. lactis）の細胞に結合した。それは結合を容易にしたＡｃｍＡのＣ−末端であって、Ｎ−末端ドメインの本来的細胞壁結合能力によるものではないことを証明するために、反復ドメインを、通常細胞壁と会合しない２つの非相同タンパク質に融合した。αｃＡとβｃＡにより生じる光輪が野生型タンパク質に比較してより小さいこと、および細胞壁フラクションに殆どのβｃＡが存在することは、融合タンパク質の細胞結合がＡｃｍＡ特異繰返し体を介していることを暗示している。
【００６８】  βｃＡ結合の研究は、細胞壁結合能力を明確にしているのはＡｃｍＡ反復ドメインであるということを明らかに示している。野生型のβ−ラクタマーゼ（および関連して反復なしのＡｃｍＡ）はラクトコッカス細胞に結合しなかったが、βｃＡは外部から加えたときにこれらの細胞に結合した。結合アッセイにおいてＡ１で得られた結果は、ＡｃｍＡの有効な結合を可能とするには１個の繰返し体で十分であることを示す。別の研究で（５）、我々はＡｃｍＡが細胞間で作用することを示した。ＡｃｍＡ不含ラクトコッカス細胞は、ＡｃｍＡ産生細胞とともに増殖すると溶解される。この観察を上記の結果と合わせると、ＡｃｍＡは外部からの細胞と向き合ったときに結合するのみならず、事実上、細胞壁を水解し、同時に細胞を溶解すると結論することができる。
【００６９】  ＡｃｍＡ様繰返し体は、ジェンバンクデータベースのタンパク質配列（リリース２３）と、ＡｃｍＡの繰返し体アミノ酸配列を比較した結果、３０種を超えるタンパク質の異なる位置に存在することが判明した。１ないし６個の繰返し体をもつこれらタンパク質は、すべてではないが、細胞壁の加水分解酵素である。繰返し体すべてのアミノ酸配列を整列させると、バークランドおよびアワドウ（Birkeland and Hourdou）らが推定した配列と類似の共通配列を与えた（４、９）。興味深いことに、一定数の修飾が共通繰返し体に許されるならば、セノルハブディティス・エレガンスの２種のタンパク質において、繰返し体はそれぞれ１２倍および４倍存在し、両タンパク質はエンドキチナーゼと相同性を示す（遺伝子受託番号Ｕ６４８３６およびＵ７０８５８）（３６）。多分、これらの繰返し体はこの菌体が摂取したカビにこれら酵素を固定する。異なる細菌種のタンパク質に同様の繰返し体が存在することは、それらがペプチドグリカンの共通するユニットを認識し、結合することを強く示唆する。将来の興味あるゴールは、それらが結合するユニットと結合の性質を解明することであろう。
【００７０】  未処理ＡｃｍＡについて初期に報告されているように（５）、そして我々がそのＣ−末端欠失誘導体についてここに示すように、該酵素をタンパク質加水分解に付す。分解産物は全細胞の細胞抽出物に存在しなかったが、このことはそれらが細胞内部に形成されていないことを示す（データ未提示）。各ＡｃｍＡ誘導体の分解パターンは特異的であり、再現性も高い。分解産物のサイズにもとづくと、多くのタンパク質切断部位は、多分、介在配列に存在する。かかる部位の１つ（図１の１）は繰返し体１と２の間に存在する。この位置での切断は約２８ｋＤａの活性タンパク質に至り、それは実際に１．５またはそれ以上の繰返し体をもつＡｃｍＡ産生株すべての上清に見出される。第２の切断部位は、第２および第３繰返し体の間に恐らく位置する（図１の２）。この部位での切断はむしろ稀であるか、あるいは得られる分解産物があまり活性ではないものであり、いずれの場合でも、図１に提示したザイモグラムのレーン１および３に観察されるかすかな活性バンドとなる。ＡｃｍＡの繰返し体間に切断部位の存在することは、αｃＡおよびβｃＡに観察される特異分解産物の存在によりさらに示唆される。それらのサイズはＡｃｍＡに推定される切断部位の位置に一致する。さらに、野生型α−アミラーゼおよびβ−ラクタマーゼのサイズのバンドもまた観察されるので、さらなる切断部位はこれら酵素の融合点とＡｃｍＡの細胞壁結合ドメインの周辺に存在すると思われる。
【００７１】  ＡｃｍＡ分解産物および２つの融合タンパク質の分解産物はすべて主として上清に、またある程度細胞壁フラクションに存在するが、細胞には存在しない。用いたエル・ラクティス（L. lactis）株はいずれも細胞壁固定化プロティナーゼＰｒｔＰを産生しなかったので、この酵素がＡｃｍＡまたは融合タンパク質の特異分解に関わっていることはあり得ない。明らかなことは、細胞外プロティナーゼが該繰返し体を除去し得るエル・ラクティス（L. lactis）に存在し、それがＡｃｍＡ活性調節のメカニズムを表している可能性がある。
【００７２】
【表１】
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【００７３】
【表２】
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【００７４】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  以下の終末対数増殖期の培養物上清フラクションにおけるＡｃｍＡ活性の分析。０．１５％ミクロコッカス・リソデイクチカス（M. lysodeikticus）のオートクレーブ細胞含有の復元ＳＤＳ−（１２．５％）ＰＡＡゲルにて実施。（１）ｐＧＫ１３を含むＭＧ１３６３。ＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１であって、（２）ＡｃｍＡをエンコードしないｐＧＫ１３を含む、（３）酵素Ａ３をエンコードするｐＧＫＡＬ１を含む、（４）酵素Ａ２をエンコードするｐＧＫＡＬ３を含む、（５）酵素Ａ１をエンコードするｐＧＫＡＬ４を含む、（６）酵素Ａ０をエンコードするｐＧＫＡＬ５を含む、（７）酵素Ａ１．５をエンコードするｐＧＫＡＬ６を含む、または（８）酵素Ａ４をエンコードするｐＧＫＡＬ７を含む。標準タンパク質（レーンＭ）の分子質量（キロダルトン、ｋＤａで表示）を左欄外に示す。ゲルの下、同じゲルのレーン５、６および７の下の部分は復元の１週間後を示す。図の右半分は種々のＡｃｍＡ誘導体を図示したものである。ＳＳ（黒色）、シグナル配列。Ｒｘ（暗灰色）、繰返し体：明灰色、Ｔｈｒ、ＳｅｒおよびＡｓｎに富む介在配列（６）。矢印、４個の繰返し体を含むＡｃｍＡ誘導体の人工的に複製した領域。活性部位ドメインは白抜きで示す。ＭＷ、ＡｃｍＡ誘導体分泌型のｋＤａによる予測分子サイズ。ＡｃｍＡ誘導体の番号はゲルのレーン番号に対応する。番号を付した矢印はタンパク質分解切断部位の推定位置を示す。
【図２】  ＡｃｍＡ活性部位ドメイン（ｎＡ）の精製。ＩＰＴＧで４時間誘導した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴＡｃｍＡ）（レーン３）の細胞抽出液１０μｌのＳＤＳ−（１２．５％）ＰＡＧＥ。レーン２、誘導大腸菌培養物２５μｌから単離した精製融合タンパク質１０μｌ、およびレーン１、エンテロキナーゼ切断タンパク質１０μｌ。（Ｂ）Ａ項で示したサンプル１および２の同一量を用い、０．１５％ミクロコッカス・リソデイクチカス（M. lysodeikticus）のオートクレーブ細胞を有する復元ＳＤＳ−（１２．５％）ＰＡＧＥ。標準タンパク質の分子質量（キロダルトンで表示）をゲルの左欄に示す。負荷する前に、サンプルは等容量の２×サンプルバッファーと混合した（１５）。
【図３】  プラスミドｐＧＢＬＲおよびｐＧＡＬＲの図式であって、それぞれβ−ラクタマーゼおよびα−アミラーゼとＡｃｍＡ繰返し体とのＣ−端融合物を担持する。α−ａｍｙ、バシラス・リヘニフォルミス（B. licheniformis）のα−アミラーゼ遺伝子。β−ｌａｃ、大腸菌のβ−ラクタマーゼ。ａｃｍＡ、３つの繰返し体をエンコードするラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）ＭＧ１３６３のＮ−アセチルムラミダーゼ遺伝子の３−プライム末端。ＥｍＲおよびＣｍＲ、エリスロマイシンおよびクロラムフェニコール耐性遺伝子。ＡＬ９およびＢＬ１、ラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）ＭＧ１３６３からのタンパク資分泌シグナル（２１）。ｒｅｐＡおよびＯＲＩ、それぞれ、ラクトコッカスプラスミドｐＷＶ０１の複製タンパク質に対する遺伝子および複製の起源。Ｐｓｐｏ２、バシラス・サチラスのファージＳｐｏ２プロモーター。黒塗り部分は、それぞれα−アミラーゼおよびβ−ラクタマーゼ遺伝子の終止コドン位置で導入に使用した制限酵素部位ＥｃｏＲＶおよびＮｄｅＩのＰＣＲフラグメントを示す。白抜き部分は構築作業のためにｐＵＫ２１にサブクローン化した部分を示す。灰色部分はα−アミラーゼおよびβ−ラクタマーゼ遺伝子にａｃｍＡの３'−末端を融合するために使用したｐＡＬ０１のフラグメントを示す。関連する制限酵素部位のみを示す。
【図４】  ラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）のβ−ラクタマーゼ活性。ｐＧＫ１３、ｐＧＢＬＩまたはｐＧＢＬＲを含むラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）ＭＧ１３６３およびＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１の細胞により産生される野生型β−ラクタマーゼとそのＡｃｍＡ融合誘導体（βｃＡ）の活性。１／２Ｍ１７寒天平板を、スミス（Smith）らのプロトコール（２９）に従い、コロニーの一夜増殖後に、ヨードで染色した。
【図５】  ラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）の上清におけるα−アミラーゼ活性。１％デンプン含有ＳＤＳ−（１２．５％）ＰＡＡゲルにおける野生型α−アミラーゼ（α）とαｃＡ融合タンパク質の活性。ゲルをトリトンＸ−１００で洗浄してタンパク質を復元し、次いでヨードで染色した（３３）。ｐＧＡＬ９またはｐＧＡＬＲを含むラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）ＭＧ１３６３（Ｍ）およびＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１（Δ）の１／２Ｍ１７培養物上清４０μｌ相当量をゲル上に負荷した。標準タンパク質の分子質量（ｋＤａで表示）をゲルの左欄外に示す。
【図６】  ラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）におけるβ−ラクタマーゼの局在化。β−ラクタマーゼに対するポリクローナル抗体を用いて、β−ラクタマーゼ（ｐＧＢＬ１から）またはβｃＡ融合タンパク質（ｐＧＢＬＲによりエンコード）を発現するＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１フラクションのウエスタンブロット分析。負荷したサンプル量は培養物２００μｌに等しい。フラクション：Ｓ、上清；ＣＷ、細胞壁；ＣＹ、細胞質；ＭＢ、会合膜；およびＭ、膜。
【図７】  ０．１５％ミクロコッカス・リソデイクチカス（M. lysodeikticus）のオートクレーブ細胞を含む復元ＳＤＳ−（１７．５％）ＰＡＧＥによるＡｃｍＡ誘導体ｎＡおよびＡ１の結合の分析。ｐＧＫＡＬ４を含むＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１の培養上清からのｎＡおよびＡ１で培養したＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１細胞の細胞（Ｃ）と上清（Ｓ）フラクション。サンプル６０μｌを負荷した。標準タンパク質の分子質量（ｋＤａで表示）をゲルの左欄外に示す。
【図８】  ラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）に対するβｃＡの結合。図はβ−ラクタマーゼに対するポリクローナル抗体を用いるウエスタンブロットを示す。ｐＧＫ１３（レーン１，２）、ｐＧＢＬＲ（レーン３、４）またはｐＧＢＬ１（レーン５、６）をそれぞれ含むＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１の上清と５分間培養した中間対数増殖期のＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１（ｐＧＫ１３）細胞の細胞抽出液（レーン１、３、５）および上清（レーン２、４、６）。野生型β−ラクタマーゼ（β）およびβｃＡ融合タンパク質の位置を右側に示した。標準タンパク質の分子質量（ｋＤａで表示）をゲルの左欄外に示す。サンプル２０μｌを１２．５％ＰＡＡゲル上に負荷した。
【図９】  ＡｃｍＡタンパク質の図式。ＳＳ（黒色）、シグナル配列。Ｒ（暗灰色）、繰返し体。陰影領域、介在配列。活性部位ドメインを白抜きで示す。
【図１０】  ラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）のＡｃｍＡ繰返し体アミノ酸配列の整列と共通配列。
【図１１】  様々な種における繰返し体アミノ酸配列の整列。ａ）掲載したタンパク質はスイスプロット、ＰＩＲ、およびジェンバンクのデータベースによるＡｃｍＡ繰返し体との相同性検索により、ブラスト（ＢＬＡＳＴ）プログラム（１）を用い入手した。ｂ）＊；細胞壁加水分解酵素をエンコードする遺伝子。    ＃；平均より長い繰返し体を含むタンパク質。ｃ）繰返し体間のアミノ酸残基数を括弧内に示す。ｄ）一次翻訳産物のアミノ酸数。ｅ）ジェンバンク受託番号。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１１−１】
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