(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＣＣ２９１３（ＣＮＣＭ  Ｉ−３８５４）である、ビフィズス菌。
【請求項２】
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＣＣ２９１３（ＣＮＣＭ  Ｉ−３８５４）を含む組成物。
【請求項３】
前記組成物が医薬又は食品である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
少なくとも１つのプレバイオティクスをさらに含有し、前記プレバイオティクスが、オリゴ糖からなる群から選択される、請求項２または３に記載の組成物。
【請求項５】
フルクトース、ガラクト―ス、マンノース、大豆及び／又はイヌリン、及び／又は食物繊維をさらに含有する、請求項２〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記医薬が、１日用量当たり１０３〜１０１０ｃｆｕ及び／又は１０３〜１０１０細胞のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＣＣ２９１３（ＣＮＣＭ  Ｉ−３８５４）を含み、又は前記食品が、食品組成物の乾燥重量１ｇ当たり１０３〜１０１２ｃｆｕ及び／又は１０３〜１０１２細胞のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＣＣ２９１３（ＣＮＣＭ  Ｉ−３８５４）を含むことを特徴とする、請求項３〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
製品中の生きたプロバイオティクス細菌Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＣＣ２９１３（ＣＮＣＭ  Ｉ−３８５４）の数を増加させるための、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＣＣ２９１３（ＣＮＣＭ  Ｉ−３８５４）又は請求項２〜６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項８】
前記プロバイオティクス細菌に対するストレスに曝露した後の、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記ストレスが、４０〜１２０℃の熱への３０秒〜２時間の曝露、温度変化、機械的ストレス、又は長期保管、低湿保管及び／又は噴霧乾燥である、請求項８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、一般にビフィズス菌の分野に関する。特に、本発明は、ストレス耐性が調節されたビフィズス菌の分野に関する。
【０００２】
プロバイオティクス細菌はそれらの健康促進特性のため選択される。プロバイオティクスが生きた細菌してその有益性を発揮するため（Ｇｕａｍｅｒ，Ｆ．及びＧ．Ｊ．Ｓｃｈａａｆｓｍａ．１９９８年「Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ」、ｌｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３９：２３７〜２３８頁）、この細菌は胃腸管の条件下で生存しているはずである。産業上の利用において、大量生産するには、食品加工及び保管に耐える、プロバイオティクスのさらなる能力が必要である。こうした生産段階は、細菌の良好な生存を危うくする種々のストレスによって特徴付けられる。こうしたストレスのうち、高温又は低温、高浸透圧、酸化、及び湿度が重要な要因であろうと考えられる。
【０００３】
いくつかの種のプロバイオティクス細菌は、温度、酸素、又は噴霧乾燥耐性が低いことが特に知られている。ストレス耐性の低いこのようなプロバイオティクスの顕著な例は、例えば、ビフィズス菌、特にビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）である（Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．、Ｃ．Ｓｔａｎｔｏｎ、Ｇ．Ｆ．Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、及びＲ．Ｐ．Ｒｏｓｓ．２００５年「Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｔｏ  ｈｅａｔ  ａｎｄ  ｏｘｙｇｅｎ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｓｐｒａｙ  ｄｒｙｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｔｏｒａｇｅ」、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９９：４９３〜５０１頁）。
【０００４】
この問題に対処し、食品製造中のプロバイオティクスの生存率を増加させるために、マイクロカプセル化、保護剤の添加、酸素不透過性包装、及び増殖又は加工条件の改良を含むいくつかのアプローチが現在使用されている。
【０００５】
しかしながら、これらのアプローチは複雑で実行するには労力を要し、また、副作用を有する可能性があり、最終的な食品において必要とされない可能性があるさらなる化合物の添加を必要とすることが多い。
【０００６】
一方、製品中の生菌が可能な限り少ないことが望ましい用途がある。現在、このような滅菌製品は、極度の熱及び／又は圧力を加えることによって調製されている。この場合において、高エネルギー処理を必要としないでも有効に不活性化することができる利用可能なプロバイオティクスを有することが望ましいであろう。
【０００７】
従来技術のこうした問題を克服するために、本発明者らは、製品中の生きたプロバイオティクス細菌、特にビフィズス菌の数を調節、特に増加又は減少させるための異なるアプローチを選択した。本発明者らは、ストレス耐性が調節された、天然に存在するビフィズス菌株を探索した。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、調節された、特に増加又は減少したストレス耐性を示すプロバイオティクスビフィズス菌、また、食品又は医薬品において生存可能なプロバイオティクスの数を調節する、特に増加又は減少させる方法を提供することであった。
【０００９】
本発明のこの目的は、請求項１に記載のビフィズス菌、請求項１０に記載の組成物、請求項１３に記載の使用及び請求項１５に記載の方法によって解決される。
【００１０】
特に驚くことに、本発明者らは、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ及び／又はＣｌｐＢの発現が構成的に調節されたビフィズス菌が本発明の目的を解決することを見出した。
【００１１】
本発明者らは、驚くべきことに、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ及び／又はＣｌｐＢの発現を構成的に調節することによってビフィズス菌のストレス耐性を制御することが可能であることを見出した。特に、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ及び／又はＣｌｐＢの発現を構成的に上方制御すると、ストレス耐性が増加し、一方、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ及び／又はＣｌｐＢの発現を構成的に下方制御すると、ストレス耐性が低下する。
【００１２】
したがって、本発明の好ましい一実施形態は、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ及び／又はＣｌｐＢの発現が構成的に上方制御されるビフィズス菌である。ストレス耐性の向上は、いくつかの利点を有する。ビフィズス菌のプロバイオティクス効果は、細菌が腸に到達しその効果を発揮できるように、細菌が生きた状態で投与される場合に、さらには細菌が生きた状態で腸内に到達することができる場合に、増加させることができる。ストレス耐性ビフィズス菌は、例えば、食品又は医薬の製造における場合のようなストレスを引き起こす処理を切り抜けて生存する可能性が高い。ストレス耐性ビフィズス菌はまた、腸へ向かう途中の人体内の条件下で生存する可能性が高い。
【００１３】
例えば、投与前に細菌の完全な不活性化が求められる場合において、ストレス耐性が低下した利用可能なビフィズス菌を有することが望ましい場合もある。これにより、コロニー形成による効果の増加を排除することができるため、ビフィズス菌の効果を正確に、特別に適合することができるという利点を有する。ストレス耐性のより低いビフィズス菌が、滅菌組成物において、又は実験用若しくは生産目的のために望ましい場合もある。
【００１４】
ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ及び／又はＣｌｐＢの発現が調節される場合、一般に、ビフィズス菌のストレス耐性に効果をもたらすいかなる程度の調節も想定され、本発明の範囲内にある。
【００１５】
しかしながら、上方制御の場合において好ましくは、本発明によるビフィズス菌は、標準条件下のビフィズス菌と比較して約１．５〜１００倍上方制御されるＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ及び／又はＣｌｐＢの発現を示すことができる。
【００１６】
標準条件は、以下の通り定義される。０．０５％（ｗｔ／ｖｏｌ）システイン含有ＭＲＳ培地（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＡＧ（バーゼル、スイス）、１０ｇカゼインペプトン、１０ｇ肉エキス、５ｇ酵母エキス、２０ｇグルコース、１ｇツイーン８０、２ｇ  Ｋ２ＨＰＯ４、５ｇ酢酸Ｎａ、２ｇクエン酸（ＮＨ４）２、０．２ｇ  ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．０５ｇＭｎＳＯ４×Ｈ２Ｏ、１リットル蒸留水、ｐＨ６．２〜６．５に調整）中３７℃で嫌気的培養。細胞は、対数増殖期（０．７のＯＤ６００ｎｍ）にあっても、又は定常期にあってもよい。
【００１７】
一般に、標準条件で自然界に存在する所与の基準収率より高い量又は収率で発現又は産生される場合に、タンパク質発現は「上方制御」、又はタンパク質は「過剰発現」される。
【００１８】
タンパク質の過剰発現は、例えば、（ａ）宿主細胞の増殖又は生存条件、（ｂ）制御因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｃ）細胞におけるポリヌクレオチドの発現及びそのコピー数を制御するために使用されるプロモーター、及び（ｄ）宿主細胞自体のうちいずれか１つ又は複数を変更することによって達成することができる。
【００１９】
同様に、標準条件で自然界に存在する所与の基準収率のタンパク質の量又は収率より低い量又は収率で産生される場合に、タンパク質発現は「下方制御」され、又はタンパク質は「過少発現」される。この文脈において、発現レベル又は収率とは、活性な又は機能的な形態であるかどうかにかかわらず、発現されるタンパク質、又は産生されるタンパク質（すなわち、発現産物）の量又は濃度のことを指す。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態は、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ及び／又はＣｌｐＢの発現が、熱ショック後、特に中期対数期において、野生型ビフィズス菌とほぼ同じレベルまで上方制御されるビフィズス菌である。
【００２１】
遺伝子発現測定のための熱ショックは、以下の通り定義される。０．０５％（ｗｔ／ｖｏｌ）システイン含有ＭＲＳ培地（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＡＧ（バーゼル、スイス）、組成については上記参照）中３７℃で嫌気的に増殖させた細菌を、中期対数期（０．７のＯＤ６００ｎｍ）に回収する。次いで、２００ｍｌのアリコートを遠心分離にかけ、ペレットを９０ｍｌの５０℃に予熱したＭＲＳ−ｃｙｓ培地に懸濁した。濃縮された細菌懸濁液を５０℃で７分インキュベートする。次いで、遺伝子発現測定の前に試料１０ｍｌを回収し、遠心分離にかけ、ペレットを直ちに液体窒素中で凍結する。
【００２２】
このことにより、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ及び／又はＣｌｐＢの発現の上方制御が、ビフィズス菌が外部刺激によって到達することができるレベルに確実に対応することになる。重要なことには、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ及び／又はＣｌｐＢの発現レベルの増加は、細胞にとって有毒になる恐れがある天然レベルを超える過剰発現が回避されるように、自然に到達することができるレベルに対応する。
【００２３】
本発明によるビフィズス菌におけるＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ及び／又はＣｌｐＢの発現の調節は、ＨｓｐＲの発現及び／又はＨｓｐＲの機能の調節によって達成することができる。
【００２４】
理論に拘束されるつもりはないが、本発明者らは、ビフィズス菌においてＨｓｐＲがＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ及び／又はＣｌｐＢの発現を制御し得ると考える。ＨｓｐＲの発現及び／又はＨｓｐＲの機能を調節することによるＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ及び／又はＣｌｐＢの発現の調節は、１つの分子の発現レベル及び／又は機能に影響を及ぼすことによって、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ及び／又はＣｌｐＢの発現を同時に制御することができるという利点を有する。負の制御因子ＨｓｐＲによる発現制御は、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ及び／又はＣｌｐＢの発現の上方又は下方制御のどちらが必要であるかという事実に応じて、増加又は減少され得る。一般に、ＨｓｐＲ濃度の低下は、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ及び／又はＣｌｐＢの発現の上方制御、したがってストレス耐性の向上をもたらすことになる。同様に、ＨｓｐＲの機能低下は、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ及び／又はＣｌｐＢの発現の上方制御、並びにストレス耐性の向上をもたらすことになる。
【００２５】
ストレス耐性を減少させる場合、ＨｓｐＲの細胞内濃度を増加させること（発現増加）、及び／又はＨｓｐＲの機能を高めることによって、ＨｓｐＲ制御を強化することができる。
【００２６】
ＨｓｐＲの機能及び／又は発現は、当業者に知られている任意の方法によって影響を及ぼすことが可能である。
【００２７】
例えば、本発明によるビフィズス菌は、ＨｓｐＲの発現及び／又はＨｓｐＲの機能を調節する少なくとも１つの突然変異を含んでもよい。この少なくとも１つの突然変異は、ｈｓｐＲ遺伝子内に位置していてもよい。
【００２８】
少なくとも１つの突然変異は、ｈｓｐＲ遺伝子のコード配列内に位置していることが好ましい。突然変異は、当業者に知られている任意の種類の突然変異とすることができる。遺伝子の任意の種類の配列変更が、突然変異とみなされる。好ましくは、突然変異は、点突然変異、特にミスセンス突然変異及びナンセンス突然変異、挿入並びに欠失からなる群から選択される。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態において、ビフィズス菌は、ｈｓｐＲ遺伝子中に少なくとも１つの点突然変異を含む。本明細書において使用される用語「点突然変異」は、核酸置換及び／又は欠失を意味する。代替的に又は同時に、少なくとも１つの突然変異は、ＨｓｐＲの発現及び／又はＨｓｐＲの機能を少なくとも部分的に妨害し得る。
【００３０】
「コード配列」は、発現されたときにタンパク質の産生をもたらすヌクレオチド配列、すなわち、そのタンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。好ましくは、コード配列は、細胞においてインビトロ又はインビボで、適切な制御配列の制御下に置かれた場合にポリペプチドに転写及び翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシル）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列は、細胞において転写及び翻訳制御配列の「制御下」にあってもよい。
【００３１】
用語「遺伝子」は、１つ又は複数のタンパク質の全部又は一部を含み、また、例えば、遺伝子が発現される条件を決定するプロモーター配列などの制御ＤＮＡ配列を含んでも、含まなくてもよい、特定のアミノ酸配列をコードする、又は同アミノ酸に対応するＤＮＡ配列を意味する。
【００３２】
突然変異が、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＣｌｐＢ及び／又はＨｓｐＲ遺伝子のコード配列内に位置する場合、この突然変異はタンパク質の機能を変更することが好ましい。コード配列中の突然変異は、タンパク質の機能を向上又は低下させる役割を果たし得る。
【００３３】
突然変異が、例えば、転写及び翻訳制御下において、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＣｌｐＢ及び／又はＨｓｐＲ遺伝子の制御ＤＮＡ配列内に位置する場合、この突然変異はタンパク質の発現を調節することが好ましい。制御ＤＮＡ配列中の突然変異は、タンパク質の発現を上方制御又は下方制御する役割を果たし得る。
【００３４】
制御ＤＮＡ配列は、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどの、宿主細胞においてコード配列の発現をもたらす転写又は翻訳制御配列を含む。
【００３５】
転写又は翻訳制御配列は、例えば、遺伝子の、上方制御又は下方制御を誘導する、又は転写又は翻訳にそれぞれ影響を及ぼす転写因子を含む。
【００３６】
「プロモーター」は、細胞においてＲＮＡポリメラーゼに結合することができ、下流（３’方向）コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ制御領域である。
【００３７】
本発明によるビフィズス菌は、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アングラータム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｇｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アステロイデス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｓｔｅｒｏｉｄｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ボーム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・カテニュレイタム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・チョエリナム（Ｂｉｆｉｄｏａｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｏｅｒｉｎｕｍ）、ビフィドバクテリウム・コリネフォルメ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍｅ）、ビフィドバクテリウム・クニキュウリ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｕｎｉｃｕｌｉ）、ビフィドバクテリウム・デンティコレンス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｃｏｌｅｎｓ）、ビフィドバクテリウム・デンティウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ガリカム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ガリナラム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インディカム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｄｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・イノピナータム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｏｐｉｎａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・マグナム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｇｎｕｍ）、ビフィドバクテリウム・メリシカム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｒｙｃｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ミニマム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｎｉｍｕｍ）、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・プローラム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｕｌｌｏｒｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ルミナンティウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・サーキュラーレ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｅｃｕｌａｒｅ）、ビフィドバクテリウム・サブチル（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｕｂｔｉｌｅ）、ビフィドバクテリウム・スイス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｕｉｓ）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍａｃｉ���ｏｐｈｉｌｕｍ及びビフィドバクテリウム・サーモフィラム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）からなる群から選択することができる。
【００３８】
好ましくは、ビフィズス菌はＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍである。
【００３９】
自然選択によって、本発明者らは、本発明の特定の好ましい実施形態としてＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＣＣ２９１２株、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＣＣ２９１３株、及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＣＣ２９２３株を提供することができた。菌株は、ブダペスト条約の下、ＣＮＣＭ（ｌｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２５、Ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、Ｆ−７５７２４  パリ  Ｃｅｄｅｘ１５）に寄託された。ＮＣＣ２９１２はＣＮＣＭ  Ｉ−３８５３として寄託され、ＮＣＣ２９１３はＣＮＣＭ  Ｉ−３８５４として寄託され、ＮＣＣ２９２３はＣＮＣＭ  Ｉ−３８５５として寄託された。自然選択により得られた菌株は、遺伝子技術によって改変されることなく本発明の目的を解決するという利点を有する。
【００４０】
本発明はまた、本発明のビフィズス菌を含む組成物も含む。組成物は任意の組成物とすることができるが、好ましくは医薬又は食品である。
【００４１】
ビフィズス菌は、投与されると、宿主に対して健康上の利益を与える。ビフィズス菌の健康上の利益は多種多様であり、消化の補助、アレルギー発生率低下との関連、ある種の腫瘍増殖の予防及び体重管理を含む。
【００４２】
好ましくは、医薬又は食品はヒト、ペット又は家畜用であり、またペット又は家畜は、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ及び／又は家禽からなる群から選択することができる。
【００４３】
組成物は、少なくとも１つの炭水化物源、少なくとも１つの脂質源及び／又は少なくとも１つのタンパク質源を含む栄養組成物であってもよい。
【００４４】
タンパク質源として、任意の適切な食物タンパク質、例えば、動物性タンパク質（乳タンパク質、食肉タンパク質及び卵タンパク質など）、植物性タンパク質（大豆タンパク質、小麦タンパク質、米タンパク質、及びエンドウ豆タンパク質など）、遊離アミノ酸の混合物、又はこれらの組合せを使用することができる。カゼイン及び乳清などの乳タンパク質、及び大豆タンパク質は特に好ましい。タンパク質は、未処理であってもよく、又は加水分解されていてもよく、又は未処理のタンパク質及び加水分解されたタンパク質の混合物であってもよい。例えば、牛乳アレルギーを発症するリスクがあると考えられる動物には、部分的に加水分解されたタンパク質（加水分解度２〜２０％）を供給することが望ましい。加水分解されたタンパク質が必要とされる場合、加水分解プロセスは、所望の通り、また当技術分野において知られているように行うことができる。例えば、乳清タンパク質加水分解物は、１つ又は複数のステップにおいて乳清画分を酵素的に加水分解することによって調製することができる。出発物質として使用される乳清画分が実質的にラクトースを含まない場合、加水分解プロセス中にタンパク質が受けるリシン遮断がはるかに少ないことが分かる。このことは、リシン遮断の程度を全リシンの約１５重量％からリシンの約１０重量％未満まで、例えば、タンパク質源の栄養価を大幅に向上させるリシンの約７重量％まで、低下させることを可能にする。
【００４５】
組成物が脂肪源を含む場合、脂肪源は好ましくは組成物のエネルギーの５％〜４０％、例えば、エネルギーの２０％〜３０％を提供する。適切な脂肪プロフィールは、菜種油、トウモロコシ油及び高オレイン酸ヒマワリ油の混合を使用して得ることができる。
【００４６】
炭水化物源は、好ましくは組成物のエネルギーの４０％〜８０％を提供する。任意の適切な炭水化物、例えば、スクロース、ラクトース、グルコース、フルクトース、コーンシロップ固形物、マルトデキストリン、及びこれらの混合物を使用することができる。
【００４７】
所望であれば、食物繊維を添加することもできる。食物繊維は、酵素によって消化されずに小腸を通過し、天然の膨張性薬剤及び下剤として機能する。食物繊維は、水溶性又は不溶性であってもよく、一般に２種類の混合が好ましい。適切な食物繊維源は、大豆、エンドウ豆、オート麦、ペクチン、グアーガム、アラビアゴム、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、シアリルラクトース及び動物乳由来のオリゴ糖を含む。好ましい繊維混合物は、イヌリン及び短鎖フラクトオリゴ糖の混合物である。好ましくは、繊維が存在する場合、繊維含量は摂取される組成物１ｌ当たり２〜４０ｇ、より好ましくは４〜１０ｇ／ｌである。
【００４８】
組成物はまた、ＵＳＲＤＡなどの政府機関の勧告に従って、ミネラル並びに微量元素及びビタミンなどの微量栄養素を含有してもよい。例えば、組成物は、与えられた範囲において以下の微量栄養素の１つ又は複数を１日用量当たり含有してもよい：３００〜５００ｍｇのカルシウム、５０〜１００ｍｇのマグネシウム、１５０〜２５０ｍｇのリン、５〜２０ｍｇの鉄、１〜７ｍｇの亜鉛、０．１〜０．３ｍｇの銅、５０〜２００μｇのヨウ素、５〜１５μｇのセレン、１０００〜３０００μｇのベータカロテン、１０〜８０ｍｇのビタミンＣ、１〜２ｍｇのビタミンＢ１、０．５〜１．５ｍｇのビタミンＢ６、０．５〜２ｍｇのビタミンＢ２、５〜１８ｍｇのナイアシン、０．５〜２．０μｇのビタミンＢ１２、１００〜８００μｇの葉酸、３０〜７０μｇのビオチン、１〜５μｇのビタミンＤ、３〜１０μｇのビタミンＥ。
【００４９】
１つ又は複数の食品等級の乳化剤、例えば、モノ−及びジ−グリセリドのジアセチル酒石酸エステル、レシチン並びにモノ−及びジ−グリセリドを、所望であれば組成物中に組み込むことができる。同様に、適切な塩及び安定剤を含めることもできる。
【００５０】
組成物は、経口、非経口又は局所投与用であってもよい。経口適用は、本発明の目的では腸内投与を含む。
【００５１】
組成物は、少なくとも１つの他の種類の食品等級の細菌を含んでもよい。「食品等級の細菌」とは、食品に使用しても安全であるとして使用され、一般にみなされている細菌を意味する。食品等級の細菌は、乳酸菌、プロバイオティクス細菌及び／又はビフィズス菌からなる群から選択することができる。「プロバイオティクス細菌」とは、宿主の健康又は福祉に有益な効果を有する微生物細胞製剤又は微生物細胞成分を意味する。（Ｓａｌｍｉｎｅｎ  Ｓ、Ｏｕｗｅｈａｎｄ  Ａ．Ｂｅｎｎｏ  Ｙ．ら「Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ：ｈｏｗ  ｓｈｏｕｌｄ  ｔｈｅｙ  ｂｅ  ｄｅｆｉｎｅｄ」Ｔｒｅｎｄｓ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９年：１０  １０７〜１０頁）。組成物は、少なくとも１つのプレバイオティクスをさらに含んでもよい。「プレバイオティクス」は、腸においてプロバイオティクス細菌の増殖を促進することを目的とする食品物質を意味する。プレバイオティクスは、オリゴ糖からなる群から選択することができ、任意選択でフルクトース、ガラクトース、マンノース、大豆及び／又はイヌリン、及び／又は食物繊維を含有する。
【００５２】
本発明の組成物は、保護ハイドロコロイド（ゴム、タンパク質、加工デンプンなど）、結合剤、被膜形成剤、カプセル化剤／材、壁／殻材、マトリックス化合物、コーティング、乳化剤、界面活性剤、可溶化剤（油、脂肪、ワックス、レシチンなど）、吸着剤、担体、充填剤、共化合物（ｃｏ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）、分散剤、湿潤剤、加工助剤（溶媒）、流動剤、風味マスキング剤、増量剤、ゼリー化剤、ゲル形成剤、酸化防止剤及び抗菌剤をさらに含有してもよい。組成物はまた、水、任意の起源のゼラチン、植物性ガム、リグニンスルホネート、タルク、糖、デンプン、アラビアゴム、植物油、ポリアルキレングリコール、香味剤、防腐剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤、滑剤、着色剤、湿潤剤、充填剤などを含むがこれらに限定されない、従来の医薬添加物及びアジュバント、賦形剤並びに希釈剤も含有することができる。全ての場合において、このようなさらなる成分は、意図されるレシピエントに対する適合性を考慮して選択されることになる。
【００５３】
本発明の組成物は、任意の数の本発明によるビフィズス菌を含有してもよい。原理的には、腸に到達してコロニーを生成することができる単一のビフィズス菌は、宿主に有益な効果を生むのに十分である。
【００５４】
組成物が医薬である場合、組成物は、典型的には、１日用量当たり１０３〜１０１０ｃｆｕの本発明による少なくとも１つのビフィズス菌を含むことができる。組成物が医薬である場合、組成物はまた、１日用量当たり１０３〜１０１０細胞の本発明によるビフィズス菌の少なくとも１つを含むこともできる。
【００５５】
組成物が食品である場合、組成物は典型的には、食品組成物の乾燥重量１ｇ当たり１０３〜１０１２ｃｆｕの本発明によるビフィズス菌の少なくとも１つを含むことができる。組成物が食品である場合、組成物はまた、食品組成物の乾燥重量１ｇ当たり１０３〜１０１２細胞の本発明によるビフィズス菌の少なくとも１つを含むこともできる。
【００５６】
本発明はまた、製品中の生きたプロバイオティクス細菌、特に生きたビフィズス菌の数を増加させるための、本発明によるビフィズス菌の使用にも関する。同様に、本発明は、製品中の生きたプロバイオティクス細菌の数を増加させるための、本発明の組成物の使用に関する。最後に、本発明はまた、製品中の生きたプロバイオティクス細菌、特に生きたビフィズス菌の数を増加させるための本発明の組成物を調製するための、本発明によるビフィズス菌の使用にも関する。
【００５７】
本発明の使用はまた、プロバイオティクス細菌に対するストレスに曝露した後の製品中のプロバイオティクス細菌、特にビフィズス菌の数を増加させるのにも役立つ。
【００５８】
ストレスは、約４０〜１２０℃の熱への３０秒〜２時間の曝露、温度変化、機械的ストレス、又は長期保管、低湿保管及び／又は凍結乾燥又は噴霧乾燥からなる群から選択することができる。
【００５９】
温度変化は、−８０℃〜＋１２０℃の温度範囲において２時間以内に５℃を超える振幅を有する少なくとも２つの続発する温度変動であってもよい。
【００６０】
長期保管は、０．３３以下の水分活性で、２５℃〜４５℃の範囲内の温度での１週間を超える、好ましくは１カ月を超える、さらにより好ましくは６カ月を超える保管である。
【００６１】
最後に、本発明は、特に、ＨｓｐＲの発現及び／又はＨｓｐＲの機能が妨害されるようにビフィズス菌のｈｓｐＲ遺伝子中に少なくとも１つの点突然変異を導入することによって、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ及び／又はＣｌｐＢの発現を構成的に上方制御するステップを含む、ビフィズス菌のストレス耐性を増加させる方法に関する。
【００６２】
開示されている本発明の範囲を逸脱することなく、本明細書中に記述されている本発明の任意の特徴を自由に組み合わせることができることが当業者には明らかである。
【００６３】
本発明のさらなる実施例及び特徴が、以下の実施例及び図面から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】新たなＢ．ｌｏｎｇｕｍ分離株ＮＣＣ２９１２、ＮＣＣ２９１３及びＮＣＣ２９２３が、熱ショックに対してより顕著に耐性を有することを示す図である。エラーバーは、３〜１５回の反復実験の信頼区間（Ｐ＝０．０５）を示す；＊、検出限界外。
【図２】本発明者らが行ったマイクロアレイによる、分離株のトランスクリプトームの網羅的解析を示す図である。３つの全ての株において、本発明者らはｄｎａＫオペロン及びｃｌｐＢ遺伝子が過剰発現されていることを見出した（ＮＣＣ２９２３についてデータは示さず）。各遺伝子の発現レベルを、対数増殖期（Ａ及びＤ）、７分間の熱ショック後の対数増殖期（Ｂ及びＥ）、及び定常期（Ｃ及びＦ）において、野生型Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ  ＮＣＣ２７０５株の発現レベルに対して表す。ｄｎａＫオペロンの遺伝子は黒色で（ＢＬ０５１６＝ｈｓｐＲ、ＢＬ０５１７＝ｄｎａＪ、ＢＬ０５１９＝ｇｒｐＥ、及びＢＬ０５２０＝ｄｎａＫ）、ｃｌｐＢ（＝ＢＬ１２５０）は白色で示す。他の遺伝子は灰色で示す。
【図３】ｄｎａＫ及びｃｌｐＢの負の制御因子をコードするｈｓｐＲ遺伝子を配列決定したときに発見された点突然変異を示す図である。黒塗りの四角は新たなＢ．ｌｏｎｇｕｍ株における突然変異、下線部は放線菌亜綱において保存されている残基、太字はこのファミリーの制御因子においてＤＮＡ分子との相互作用が観察された残基、ＨＴＨはヘリックスターンヘリックスモチーフ、Ｗ１及びＷ２はウイングドヘリックスモチーフ。
【図４】これらの突然変異が、観察された熱耐性表現型に関与していたことを（ＮＣＣ２９１２について）実証する結果を示す図である。野生型制御因子ＨｓｐＲによる突然変異株の補完は、熱感受性を回復させる。図は、５９℃で１３分間の熱ショック後の生存能力低下、及び野生型ｈｓｐＲ遺伝子による熱耐性株の補完の影響を示す。Ｍｕｔ１＝ＮＣＣ２９１２、野生型＝ＮＣＣ２７０５、エラーバーは３回の反復実験の標準偏差を示す。
【図５】野生株におけるＨｓｐＲ制御因子の構成的な過剰発現が、野生株に熱感受性の増加をもたらすことを示す図である。図は、５９℃で１３分間の熱ショック後の生存能力低下、及び野生型ｈｓｐＲ遺伝子による野生株の補完の影響を示す。野生型＝ＮＣＣ２７０５、エラーバーは３回の反復実験の標準偏差を示す；＊、検出限界外。
【実施例】
【００６５】
実施例１：本発明のビフィズス菌の単離
最初の野生株の熱耐性突然変異体の連続的な自然選択により、新たなＢ．ｌｏｎｇｕｍ分離株を得た。選択の各サイクルは、０．０５％（ｗｔ／ｖｏｌ）システイン含有ＭＲＳ培地（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＡＧ（バーゼル、スイス））（ＭＲＳ−ｃｙｓ）中で１３分の熱ショック（ＨＳ）ストレスを５ｍｌのＯ／Ｎ（一晩）培養物に加えることからなっていた。ＨＳは、培養物の連続希釈により行った。培養物は、４５ｍｌの予熱した培地中に１０×希釈し、加熱した水浴中に置いた。同様に、５０ｍｌを２２５ｍｌの室温の培地で希釈することにより温度を急速に低下させた。得られた培養物を、嫌気的に（ＡｎａｅｒｏＧｅｎ、Ｏｘｏｉｄ  ＡＧ（バーゼル、スイス））３７℃で１６時間（定常期まで）増殖させた後、新たな選択サイクルにかけた。最後に、約２５サイクルの後、クローンを２回画線することによって単離して、ＨＳ後に得られたコロニーから純粋培養を作製した。
【００６６】
同様の手法を適用して、酸素に対する耐性の増加を示す自然突然変異体を選択した。この周期的な選択のために、制御された濃度の酸素の存在下で細菌集団をＭＲＳ寒天表面上にプレーティングした。嫌気的に４〜５時間予備インキュベーションした後、空気及び純窒素の混合物でフラッシュしたジャーにおいて寒天プレートをインキュベートした。並行して、細胞もまた参照として嫌気的に増殖させた。好気的インキュベーションからコロニーを回収し、ＭＲＳ−ｃｙｓｔ液体培地中で嫌気的に増殖させ、酸化的ストレスの次のサイクルにかけた。酸素処理の濃度は、酸素処理されたプレートの細胞数が嫌気的参照の細胞数と等しくなるたびに増加させた。最終的に、クローンを単離した。本発明者らは、生存率が低下せずに１５％酸素圧下でＭＲＳ寒天プレート上に増殖する新たなＢ．ｌｏｎｇｕｍ株を得た。
【００６７】
実施例２：ＮＣＣ２９１２、ＮＣＣ２９１３及びＮＣＣ２９２３の熱ショック耐性
ＮＣＣ２９１２、ＮＣＣ２９１３、ＮＣＣ２９２３、ＮＣＣ２７０５及びＮＣＣ３００１を、熱ショック耐性について試験した。ＮＣＣ２７０５及びＮＣＣ３００１は、参照として使用した野生型Ｂ．ｌｏｎｇｕｍである。熱ショックは、以下の通り行った。１．５ｍｌのＯ／Ｎ培養物を、１３．５ｍｌの予熱した、０．０５％（ｗｔ／ｖｏｌ）システイン含有ＭＲＳ培地（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＡＧ（バーゼル、スイス）、組成については上記参照）に入れて希釈し、１３分インキュベートし、次いで希釈マイクロタイタープレートにおいて１００μｌを冷却した。選択プロセス及びＨＳアッセイの間、ＨＳの前及び後に細胞計数を行った。計数前に、プレートを３７℃で４８時間インキュベートした。生存能力低下は、ＨＳ後の計数をＨＳ前の計数で割った後の対数で表す。図１は、５９℃で１３分の熱ショック後の生存能力低下（対数）を示す。図１は、新たなＢ．ｌｏｎｇｕｍ分離株ＮＣＣ２９１２、ＮＣＣ２９１３及びＮＣＣ２９２３が、熱ショックに対してより顕著に耐性を有することを示す。
【００６８】
実施例３：熱耐性株のトランスクリプトーム解析
マイクロアレイによる熱耐性株のトランスクリプトームの網羅的解析を、以下の通り行った。０．０５％（ｗｔ／ｖｏｌ）システイン含有ＭＲＳ培地（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＡＧ（バーゼル、スイス）、組成については上記参照）中、３７℃で細菌を増殖させた。事前培養は嫌気的条件においてインキュベートしたのに対して、熱ショック実験用の培養は、０．５リットルＳｉｘｆｏｒｓ発酵槽（Ｉｎｆｏｒｓ  ＡＧ（ボットミンゲン、スイス））においてＣＯ２雰囲気下で撹拌しながら（１５０ｒｐｍ）増殖させた。全ての発酵は２連で行った。中期対数期（０．７のＯＤ６００ｎｍ）において、ＨＳ前に菌培養物を採取し、２５ｍｌをＲＴで５分間３６００ｇで遠心分離にかけた。次いで、ペレットを直ちに液体窒素中で凍結し、−８０℃で保存した。並行して、２００ｍｌのアリコートを遠心分離にかけ、ペレットを９０ｍｌの５０℃に予熱したＭＲＳ−ｃｙｓ培地に懸濁した。濃縮された細菌懸濁液を５０℃で７分インキュベートした。試料１０ｍｌを回収し、遠心分離にかけ、ペレットを直ちに液体窒素中で凍結した。定常期のサンプリングでは、１０ｍｌチューブで行ったバッチ培養のＯＤ６００ｎｍを、定常期に達するまで（１６時間）モニターした。次いで、細胞を上述のように回収した。ＲＮＡ抽出及び品質検査は、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用する前に行ったさらなるＤＮａｓｅＩ処理（Ａｍｂｉｏｎ）を除いて、以前に記述されている（Ｒｅｚｚｏｎｉｃｏ，Ｅ．、Ｓ．Ｌａｒｉａｎｉ、Ｃ．Ｂａｒｒｅｔｔｏ、Ｇ．Ｃｕａｎｏｕｄ、Ｇ．Ｇｉｌｉｂｅｒｔｉ、Ｍ．Ｄｅｌｌｅｙ、Ｆ．Ａｒｉｇｏｎｉ、及びＧ．Ｐｅｓｓｉ。２００７年。「Ｇｌｏｂａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ」。ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２７１：１３６〜１４５頁）通り行った。Ａｇｉｌｅｎｔ６０−ｍｅｒオリゴマイクロアレイは、１遺伝子につき４〜５個のプローブを用いて設計された（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、米国）。ＲＮＡ標識化及びｃＤＮＡ合成は、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｐｌｕｓと組み合わせて３ＤＮＡ  Ａｒｒａｙ９００ＭＰＸ  Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅキット（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ  Ｉｎｃ．、ハットフィールド、ペンシルベニア州、米国）を使用して行った。ハイブリダイゼーション条件及びスライドの洗浄は以下の通り行った。２０μｌのｃＤＮＡ（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅキットを用いて得られた）に、２５μｌの対照標的Ａｇｉｌｅｎｔ、６０μｌのＨ２Ｏ及び１０５μｌのＡｇｉｌｅｎｔバッファーを加えた。８０℃で１０分、及び６５℃で１５分のインキュベーション後、反応物をハイブリダイゼーションチャンバー中の予熱したスライド上に添加し、６５℃で１６時間、Ａｇｉｌｅｎｔオーブンにおいて４ｒｐｍでインキュベートした。ｃＤＮＡハイブリダイゼーションを４２℃で１０分、６×ＳＣＣ、０．００５％Ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１００中で、ＲＴで１０分、０．２×ＳＳＣ、０．０００１６％Ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１００中で洗浄した。３ＤＮＡハイブリダイ���ーションは、２０４μｌに増加させたハイブリダイゼーション量を除いて、Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅプロトコール中に記述されている通り行い、洗浄は以下の通り変更した：２×ＳＳＣ、０．００１６％Ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１００中６５℃で１０分、２×ＳＳＣ、０．００１６％Ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１００中ＲＴで５分、及び０．２×ＳＳＣ、０．０００１６％Ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１００中ＲＴで１０分。Ｓｃａｎａｒｒａｙ４０００  （Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ビルリカ、マサチューセッツ州、米国）を用いて１０μｍでスライドをスキャンし、Ｉｍａｇｅｎｅ５．６（Ｂｉｏｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、エルセガンド、カリフォルニア州、米国）によってデータを抽出した。Ｐｙｔｈｏｎ言語（ｗｗｗ．ｐｙｔｈｏｎ．ｏｒｇ）の自家製スクリプト及びＡｒｒａｙＰｉｐｅウェブサーバー（Ｈｏｋａｍｐ，Ｋ．、Ｆ．Ｍ．Ｒｏｃｈｅ、Ｍ．Ａｃａｂ、Ｍ．Ｅ．Ｒｏｕｓｓｅａｕ、Ｂ．Ｋｕｏ、Ｄ．Ｇｏｏｄｅ、Ｄ．Ａｅｓｃｈｌｉｍａｎ、Ｊ．Ｂｒｙａｎ、Ｌ．Ａ．Ｂａｂｉｕｋ、Ｒ．Ｅ．Ｈａｎｃｏｃｋ、及びＦ．Ｓ．Ｂｒｉｎｋｍａｎ。２００４年。ＡｒｒａｙＰｉｐｅ：ａ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｐｉｐｅｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｄａｔａ。Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：Ｗ４５７〜Ｗ４５９頁）のローカルインストールによってデータを処理した。ローカルバックグラウンドの標準偏差の２倍より小さいシグナルを示すプローブは、シグナルを有さないとみなした。両方のチャネルにおいてシグナルを示さない、又はシグナルの飽和を示すプローブは解析から除外した。染色シグナルの強度依存的変動を想定して、（ｌｉｍｍａ）ｌｏｅｓｓグローバルノーマライゼーションをシグナル比に適用した。１遺伝子につきいくつかのプローブを有しているので、本発明者らは各遺伝子に関する結果を以下の通りまとめた。各ハイブリダイゼーションデータセットにおいて、遺伝子倍率変化は対応するプローブの値の中央値で示した。平均強度は、同じ「選択された」プローブに基づいて算出した。ハイブリダイゼーション間で、各ハイブリダイゼーションから得られた遺伝子の値の平均によって遺伝子の値を示す。
【００６９】
図２は、網羅的トランスクリプトーム解析の結果を示す。３つの全ての株において、本発明者らはｄｎａＫオペロン及びｃｌｐＢ遺伝子が過剰発現されていることを見出した（ＮＣＣ２９２３についてはデータは示さず）。各遺伝子の発現レベルは、対数増殖期において（Ａ及びＤ）、７分間の熱ショック後の対数増殖期において（Ｂ及びＥ）、及び定常期において（Ｃ及びＦ）、野生型Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ  ＮＣＣ２７０５株の発現レベルに対して表す。ｄｎａＫオペロンの遺伝子は黒色で（ＢＬ０５１６＝ｈｓｐＲ、ＢＬ０５１７＝ｄｎａＪ、ＢＬ０５１９＝ｇｒｐＥ、及びＢＬ０５２０＝ｄｎａＫ）、ｃｌｐＢ（＝ＢＬ１２５０）は白色で示す。他の遺伝子は灰色で示す。
【００７０】
実施例４：ストレス耐性株の配列決定
ストレス耐性株ＮＣＣ２９１２、ＮＣＣ２９１３、ＮＣＣ２９２３を、その顕著なストレス耐性並びにｄｎａＫオペロン及びｃｌｐＢ遺伝子の過剰発現の分子的な理由を特定するために、配列決定した。配列決定は、Ｆａｓｔｅｒｉｓ  ＳＡ（ジュネーブ）によって行った。図３は、ｄｎａＫ及びｃｌｐＢの負の制御因子をコードするｈｓｐＲ遺伝子を配列決定したときに発見された点突然変異を示す。これらの点突然変異は、プロモーターＤＮＡへの制御因子の結合に関与しているようであるタンパク質ドメインに影響を及ぼす。白抜き部分は新たなＢ．ｌｏｎｇｕｍ株における突然変異、下線部は放線菌亜綱において保存されている残基、太字はこのファミリーの制御因子においてＤＮＡ分子との相互作用が観察された残基、ＨＴＨはヘリックスターンヘリックスモチーフ、Ｗ１及びＷ２はウイングドヘリックスモチーフ。
【００７１】
実施例５：補完実験
本発明者らは、ｈｓｐＲ遺伝子中の突然変異が、観察された熱耐性表現型に関与していたことを遺伝子補完によって実証した。結果を図４に示す。野生型制御因子ＨｓｐＲによる突然変異株の補完は、熱感受性を回復させる。補完は以下の通り行った。ＮＣＣ２７０５のｈｓｐＲ遺伝子を、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ、ドイツ）並びに２つのプライマーＣＣＣＧＧＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＣＧＣＧＧＴＴＡＧＣＣＡＡＣＣ及びＣＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＣＡＡＣＣＣＣＡＣＡＧＧＡＣＣによって、ゲノムＤＮＡから増幅させた。６００ｂｐアンプリコンを、ｐＧＵＳＡプラスミドのＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。ＤＮＡ配列を、配列決定（Ｆａｓｔｅｒｉｓ、ジュネーブ）によって確認した。プラスミドを、ＮＣＣ２９１２に形質転換した。Ｅ．ｃｏｌｉ及びＢ．ｌｏｎｇｕｍのＤＮＡ操作、プラスミド単離、形質転換は、以前に記述されている通り行った（Ｋｌｉｊｎ，Ａ．、Ｄ．Ｍｏｉｎｅ，Ｍ．Ｄｅｌｌｅｙ、Ａ．Ｍｅｒｃｅｎｉｅｒ、Ｆ．Ａｒｉｇｏｎｉ、及びＲ．Ｄ．Ｐｒｉｄｍｏｒｅ．２００６年。「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ」。Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７２：７４０１〜７４０５頁）。プラスミドｐＧＵＳＡは、この最後の参考文献に記述されている。図は、５９℃で１３分間の熱ショック後の生存能力低下、及び野生型ｈｓｐＲ遺伝子による熱耐性株の補完の影響を示す。Ｍｕｔ１＝ＮＣＣ２９１２、野生型＝ＮＣＣ２７０５、エラーバーは３回の反復実験の標準偏差を示す。
【００７２】
実施例６：野生株におけるＨｓｐＲ制御因子の過剰発現は、野生株に熱感受性の増加をもたらす
実施例５と同様に、本発明者らは、野生株ＮＣＣ２７０５においてＮＣＣ２７０５のＨｓｐＲ制御因子を過剰発現させ、野生株におけるＨｓｐＲ制御因子の構成的な過剰発現が、野生株に熱感受性の増加をもたらすことを示した。５９℃で１３分の熱ショック後の生存能力低下を示す結果を図５に示す。野生型＝ＮＣＣ２７０５。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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