(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高められた炭素使用効率を示すトリコデルマ  レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）をスクリーニングする方法であって、
ａ）セルロース基質上の試験トリコデルマ  レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の集団をスクリーニングして、セルロース基質の代謝速度に基づいて前記トリコデルマ  レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）を選択し、トリコデルマ  レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の集団の成長速度において、５０パーセンタイルより速い成長速度を示す予め決められた代謝速度を有するトリコデルマ  レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のサブ集団を得る工程と、
ｂ）予め決められた選択パラメーターに基づいてトリコデルマ  レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のサブ集団から所望のトリコデルマ  レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）を選択する工程であって、前記選択パラメーターが、親株よりも高められた特異活性を有する選択されたトリコデルマ  レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）におけるセルラーゼの生産であり、前記選択パラメーターが、選択されたリコデルマ  レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の高められた炭素使用効率を示すことを特徴とする、所望のトリコデルマ  レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）をスクリーニングする方法。
【請求項２】
選択パラメーターが試験トリコデルマ  レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）に提供される予め決められた量の炭素に対する試験トリコデルマ  レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）による、セルラーゼの生産を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
選択パラメーターが更に選択されたトリコデルマ  レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）におけるタンパク質の生産性に対応する指標を含む、請求項１の方法。
【請求項４】
選択されたトリコデルマ  レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）におけるセルラーゼの生産性を選択されたトリコデルマ  レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の予め決められた量に対する決められた時間におけるセルラーゼの生成により決定する工程を含む、請求項１の方法。
【請求項５】
選択パラメーターが、試験トリコデルマ  レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の予め決められた量に対する選択されたトリコデルマ  レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）において発現されたセルラーゼの生産に対応する指標を含む、請求項１の方法。
【請求項６】
サブ集団のために試験トリコデルマ  レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）集団をスクリーニングすることが固形相アッセイで行われる、請求項１の方法。
【請求項７】
試験トリコデルマ  レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の集団が抗生物質に対して予め選択されたトリコデルマ  レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の集団である、請求項１の方法。
【請求項８】
試験トリコデルマ  レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の集団がポリエン抗生物質に対して予め選択されたトリコデルマ  レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の集団である、請求項１の方法。
【請求項９】
前記抗生物質が、ナイスタチン（ｎｙｓｔａｔｉｎ）、アンフォテリシン（Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ）Ｂ、ビアラホス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）、シクロヘキサミジン（ｃｙｃｌｏｈｅｘａｍｉｄｉｎｅ）、ツニカマイシン（Ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ）、グリセオフルビン（Ｇｒｉｓｅｏｆｕｌｖｉｎ）、ニッコマイシン（Ｎｉｋｋｏｍｙｃｉｎ）Ｚ、カスポファンギン（ｃａｓｐｏｆｕｎｇｉｎ）、アクチノマイシン（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）Ｄ、ブレフェルジン（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ）Ａ、及びハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）からなる群より選択される、請求項７の方法。
【請求項１０】
試験トリコデルマ  レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）がセルロースを炭素源として使用する、請求項１の方法。
【請求項１１】
第一選択パラメーター及び第二選択パラメーターに基づいて、試験トリコデルマ  レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の集団をスクリーニングする工程を含み、第一選択パラメーターが試験トリコデルマ  レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の代謝速度であり、第二選択パラメーターが抗生物質に対する試験トリコデルマ  レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の性能を示す、所望のトリコデルマ  レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）をスクリーニングする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第一選択パラメーターが微生物の分解に耐性を有するトリコデルマ  レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の基質の代謝速度である、請求項１１の方法。
【請求項１３】
予め決められた選択パラメーターに基づいて試験トリコデルマ  レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の集団をスクリーニングする方法を含み、予め決められた選択パラメーターが試験トリコデルマ  レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の代謝速度を示し、試験トリコデルマ  レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の集団が抗生物質に対して予め選択されたトリコデルマ  レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の集団である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、２００７年６月１５日に提出された米国継続出願ＵＳ６０／９３４，６７７に対して優先権を主張する。該文献を参照により本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００２】
糸状菌はセルラーゼ酵素の有効な生産者であり、これらの酵素を生産するそれらの能力が開発され続けている。セルラーゼは布製品、洗剤、製紙工業において商業的に価値のあるものであり、植物原料を発酵可能な糖類に加水分解することを必要とする、生物燃料を生成するための必要性が増加している。３つの主要な酵素活性はエキソグルカナーゼ又はセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、及びβ−グルコシダーゼである。これらの３つの異なるタイプのセルラーゼ酵素が相互的に作用して、セルロースをグルコースに転換する。所望の糸状菌、特に、例えばセルラーゼ酵素の高い生産性及び／又は生産等の、所望のタンパク質生産性及び／又は生産を示す糸状菌を同定することが必要とされている。
【０００３】
本願発明は、少なくとも部分的に、所望の糸状菌をスクリーニングする方法において特定の指標を組み合わせることができるという発見に基づいている。従って、本願発明は、少なくとも２つのパラメーター、例えば、代謝及び炭素使用に関するパラメーターに基づく所望の糸状菌のスクリーニング方法及びこの方法から得られた糸状菌に関係する。
【０００４】
幾つかの態様において、本発明は所望の糸状菌のスクリーニングのための方法を提供する。本明細書では試験糸状菌の集団は予め決定された代謝速度を有する糸状菌のサブ集団についてスクリーニングされる。この所望の糸状菌は試験している糸状菌の効果的な炭素利用を示す、予め決定された選択パラメーターにもとづいて糸状菌のサブ集団から選択される。幾つかの態様において、本発明はこのスクリーニング方法により得られた糸状菌を提供する。
【０００５】
幾つかの態様において、本発明は所望の糸状菌をスクリーニングするための方法を提供する。試験糸状菌の集団は第一選択パラメーター及び第二選択パラメーターに基づいてスクリーニングされる。この第一選択パラメーターは試験している糸状菌の代謝速度を示し、第二選択パラメーターは抗生物質に耐性を示す試験している糸状菌の能力を示す。
【０００６】
幾つかの態様において、本発明は所望の糸状菌をスクリーニングするための方法を提供する。ここにおいて、試験している糸状菌の集団は抗生物質に対して予め選択されており、試験している糸状菌の代謝速度を示す予め決定されている選パラメーターに基づいてスクリーニングされる。
【０００７】
本発明のこれらの及び他の特徴を以下で説明する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
当業者は以下の図面が説明の目的のみに使用されることを理解するであろう。
【図１】図１は４１Ｇ株と比較してＡ８３の改善されたタンパク質生成を示す。
【図２】図２はＡ８３株と比較した４１Ｇ株の特異活性の利点を示す。
【図３】図３は生産性（グレイボックス）及び／又は繁殖性（ホワイトボックス）の進化を示す。
【０００９】
図４は糖化アッセイにおける４１ＧとＡ８３の性能を示す。
【発明の詳細な説明】
【００１０】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は以下の定義及び実施例を参照して詳細に説明される。別の方法で定義しない限り、本明細書で用いる全ての技術的及び科学的用語は本願発明の属する分野における当業者により通常理解されているのと同じ意味に用いる。数値範囲はこの範囲を定義している数値を含むものとする。本明細書における標題本願発明の各種側面又は態様を限定するものではなく、これらは明細書全体を参照することにより明らかにされるべきである。即ち、以下で定義される用語は明細書全体を参照することにより、より完全に定義される。
【００１１】
本明細書で用いる「ポリペプチド」の語はペプチド結合により結合されたアミノ酸残基の１本の鎖から成る化合物を意味する。本明細書で用いる「タンパク質」の語は「ポリペプチド」と互換的に使用される。
【００１２】
「核酸」及び「ポリヌクレオチド」の語は互換的に使用され、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、１本鎖又は二本鎖、及び化学修飾されたものを包含する。遺伝子コードの退縮により、１つ以上のコドンが特定のアミノ酸をコードするのに用いられ、本願発明は、特定のアミノ酸配列をコードしている全てのポリヌクレオチドを包含する。
【００１３】
「回収された」、「単離された」、及び「分離された」の語は本明細書において互換的に使用され、本来関係している少なくとも１つの成分から除去されたタンパク質、細胞、核酸、アミノ酸等を意味する。
【００１４】
本明細書において、「遺伝子」の語は、個々のコードセグメント（エキソン）の間の介在領域（イントロン）だけでなく、（例えば、５’未翻訳（５’ＵＴＲ）又はリーダー配列及び３’ＵＴＲ又は「トレーラー」配列等のコード領域の前及び後に続く領域を含んでいてもいなくてもよい）ポリペプチド鎖の生成に含まれるポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡセグメント）を意味する。
【００１５】
本明細書で用いる「発現」の語は、遺伝子の核酸配列に基づいて生成されたポリペプチドによるプロセスを意味する。このプロセスは転写及び翻訳を含む。
【００１６】
「分泌されたタンパク質」の語は、タンパク質分泌の間に細胞から放出されたポリペプチドの分布（領域）を意味する。幾つかの態様において、分泌されたタンパク質は本発明の組換融合ポリペプチドから放出又は切断されたタンパク質である。
【００１７】
「分泌」の語は細胞外スペース又は周辺媒体へ宿主細胞中の膜をタンパク質が横断する選択的動きを意味する。
【００１８】
本明細書において、「生成された」又は「〜の生成」の語は特に、タンパク質又は酵素に関して、タンパク質又は酵素の発現及び／又は分泌を意味する。
【００１９】
本明細書において、「培養」の語は液体、半固体、又は固体培地における好適な条件下で、細胞集団を形成することを意味する。
【００２０】
本明細書において、「置換された」及び「修飾された」の語は互換的に使用され、自然発生配列の欠失、置換、又は挿入を含むアミノ酸配列又は核酸配列などの配列を意味する。本発明の文脈上、置換された配列は、例えば、自然発生残基の置き換えを意味する。
【００２１】
本明細書において、「修飾された酵素」の語は自然発生配列の欠失、挿入、置換、又は阻害を含む酵素を意味する。
【００２２】
「変異体」の語は、参照タンパク質、例えば、自然発生又は野生型タンパク質と比較して１つ以上の異なるアミノ酸を含むタンパク質の領域を意味する。
【００２３】
本明細書において「親株」の語は遺伝的多様性を引き起こす因子に曝される前に存在している糸状菌の株を意味する。幾つかの態様において、この親株は既に高繁殖性の株であるか、好ましい又は所望の性質を有している。ある因子に曝した後、この「親株」は遺伝的に多様化された試験細胞集団となる。遺伝的多様性を生成するための方法はランダムな性質があるため、多くの異なるタイプの細胞が生成されることが予測される。それゆえ、選択技術を適用したときに、数多くの異なる試験細胞が選択下におかれる。
【００２４】
「試験細胞」又は「試験糸状菌の集団」の語は、本明細書において互換的
に使用され、通常、糸状菌の親株から生成された遺伝的態様性のある糸状菌を意味する。この語は試験細胞の子孫を含む。
【００２５】
「改善された細胞」の語はそれらの育成性質、酵素生成のレベル、及び／又は本明細書で述べるアッセイにおいて決定される他の選択基準に対して選択される。この語は改善された細胞の任意の子孫を含む。この改善された細胞は単離することができ、新しい改善された糸状菌株を確立するために繁殖させることもできる。この改善された細胞の非限定的な例は以下の特徴を有する。（ｉ）親細胞と比較して炭素使用効率が高い、（ｉｉ）親細胞と比較して１つ以上の炭素又は酵素の特異活性が改善されている、（ｉｉｉ）例えば、流入炭素１グラム当たりで生産されるタンパク質又は酵素のグラム数を測定することにより決定される全体の生産性が改善されている、（ｉｖ）通常の温度における１つ以上の態様において、又は酵素のより高い生産レベル、及び／又は（ｖ）高い温度における親細胞よりも高いタンパク質又は酵素のレベルを維持するための能力。
【００２６】
非限定的な例のように、トリコデルマレーシによるセルラーゼの生産のための通常の温度範囲は、２４℃乃至２８℃である。本明細書に従って、トリコデルマレーシの選択温度は２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、又は４８℃である。幾つかの態様において、この培養は液相で行われる。実験の設定に依存して、選択温度の範囲を用いることができる。培養のための選択温度の選択は、成長速度、生存率、及び細胞により生産されるセルラーゼの異なるタイプ分布を含むがこれらに限定されない各種因子に依存しており、当業者により決定される。
【００２７】
「セルラーゼ」又は「セルロース分解酵素」の語は本明細書において互換的に使用され、セルロース（ベータ−１，４−グルカン、又はベータ−Ｄグルコシド結合）ポリマーを短鎖セロオリゴサッカライドオリゴマー、セロビオース、及び／又はグルコースに加水分解する能力を意味する。通常、酵素のカテゴリーは、（ｉ）エンドグルカナーゼ（ＥＧ）又は１，４−β−ｄ−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．４）、（ｉｉ）（セロデキストリナーゼとしても知られている）１，４−β−ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼ及び１，４−β−ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ（エキソ−セロビオヒドロラーゼ、ＣＢＨ）（ＥＣ３．２．１．９１）を含むエキソグルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．７４）、及び（ｉｉｉ）β−グルコシダーゼ（ＢＧ）又はβ−グルコシドグルカノヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）を含むがこれらに限定されない。
【００２８】
「エキソセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）」の語は、ＥＣ３．２．１．９１として分類されるセルラーゼ酵素及び／又はＧＨファミリー５、６、７、９、又は４８に分類されているものを含むがこれらに限定されない特定のＧＨファミリーに置けるものを含むがこれらに限定されないセルラーゼ酵素のグループを意味する。これらの酵素はエキソグルカナーゼ又はセロビオヒドロラーゼとして知られている。ＣＢＨ酵素はセルロースの還元又は非還元末端からセロビオースを加水分化する。通常、ＣＢＨＩタイプ酵素は、好ましくはセルロースの還元末端からセロビオースを加水分解し、ＣＢＨＩＩタイプ酵素は好ましくはセルロースの非還元末端から加水分解する。
【００２９】
「セロビオヒドロラーゼ活性」の語は、鎖の末端からセロビオースを放出する、セルロース、セロテトリオース、又は任意のベータ−１，４−結合したグルコース含有ポリマーのおける１，４−ベータ−Ｄ−グルコシド結合の加水分解を触媒する、１，４−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ活性として定義される。本明細書において、セロビオヒドロラーゼ活性はＬｅｖｅｒら、１９７２、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２７３−２７９のＰＨＢＡＨ法により測定されるセルロースからの水溶性還元糖の放出により決定される。セロビオヒドロラーゼのアタックのエキソグルカナーゼモード及びアタックのエンドグルカナーゼモードの間の区別はセルロース又はヒドロキシメチルセルロース（Ｇｈｏｓｅ、１９８７、Ｐｕｅｒ＆Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．５９：２５７−２６８）等の置換されたセルロースからの還元糖の放出を測定の同様の測定によりなされる。本当のセロビオヒドロラーゼは未置換セルロース対置換セルロースのおける活性の非常に高い活性を有する。
【００３０】
「内性（ＥＧ）」の語はＥＣ３．２．１．４に分類されるセルラーゼ酵素及び／又はＧＨファミリー５、６、７、８、９、１２、１７、３１、４４、４５、４８、５１、６１、６４、７４、又は８１におけるものを含むがこれらに限定されない特定のＧＨファミリーのものを意味する。ＥＧ酵素はセルロースの内部ベータ−１，４−グルコシド結合を加水分解する。「エンドグルカナーゼ」の語は、セルロース、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース）、リケニウム、シリアルベータ−Ｄ−グルカン又はキシログルカン等の混合されたベータ−１，３−グルカンにおけるベータ−１，４結合中の１，４−ベータ−Ｄ−グルコシド結合の末端加水分解を触媒する、エンド−１，４−（１，３；１，４−）ベータ−Ｄ−グルカン４−グルカノヒドロラーゼと定義される。本明細書において、エンドグルカナーゼ活性はＧｈｏｓｅ、１９８７、Ｐｕｒｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．５９：２５７−２６８の手順に記載のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を用いて決定される。
【００３１】
「ベータグルコシダーゼ」の語はＥＣ３．２．１．２１として分類されるベータ−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ及び／又はベータ−Ｄ−グルコースの放出伴うセロビオースの加水分解を触媒する、ＧＨファミリー１、３、９、又は４８におけるものを含むがこれらに限定されない特定のＧＨファミリーのものであると定義される。本明細書において、ベータグルコシド活性は、例えば、ＨＰＬＣのような方法により測定される。「セルロース分解活性」の語は、エキソグルカナーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、又は両タイプの酵素、又はラビにベータグルコシド活性を含む。
【００３２】
「糸状菌」の語は、当業者に糸状菌であると認識される任意の又は全ての糸状菌を意味する。通常、糸状菌は真菌微生物であり、Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ亜種を形成する全ての糸状菌を含む。これらの糸状菌はキチン、ベータグルカン、及び他のポリサッカライドから構成されている細胞壁を有する栄養ｍｙｌｉｕｍにより特徴付けられる。幾つかの態様において、本発明の糸状菌は形態学的、生理学的、及び遺伝的に、酵母とは区別される。幾つかの態様において、この糸状菌は以下の種を含むがこれらに限定されない。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、ウエロバシディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ベアウベリア（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ）、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、セリオリオポシス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、チャエトニウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）、ペシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、クラビセプス（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ）、コキオボウス（Ｃｏｃｈｉｏｂｏｌｕｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、チャタス（Ｃｙａｔｈｕｓ）、エンドセイア（Ｅｎｄｏｔｈｉａ）、エンドセイア（Ｅｎｄｏｔｈｉａ）、ムコール（ｍｕｃｏｒ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、グロカジウム（Ｇｉｌｏｃｌａｄｉｕｍ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ミセリオフィソラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、  ミロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ファニルカエテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、ポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピリクラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｕｍ）、スタゴノスポラ（Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、セルモマイセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスクス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、シエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）、及びトラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、プレウロタス（Ｐｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）。幾つかの態様において、この糸状菌はアスペルギルスニヂュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルスニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルスアワモリ（Ａ．ａｗｏｍａｒｉ）、例えば、ＮＲＲＬ３１１２、ＡＴＣＣ２２３４２（ＮＲＲＬ３１１２）、  ＡＴＣＣ４４７３３、ＡＴＣＣ１４３３１及びＵＶＫ１４３ｆ、アスペルギルスオリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、例えば、ＡＴＣＣ  １１４９０、ニュロスポラクラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）、トリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、例えば、ＮＲＲＬ１５７０９、ＡＴＣＣ１３６３１、５６７６４、５６７６５、５６４６６、５６７６７、及びトリコデルマビリデ（Ｔ���ｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、例えば、ＡＴＣＣ３２０９８及び３２０８を含むがこれらに限定されない。
【００３３】
本明細書で用いる「トリコデルマ」又は「トリコデルマ株」の語は、明らかにトリコデルマ種又は株に分類されている任意の糸状菌、又は近年トリコデルマ種又は株、あるいはハイポクレア種又は株に分類された任意の糸状菌を意味する。幾つかの態様において、この種は、トリコデルマブンギルラキアタム、トリコデルマレーシ、トリコデルマビリデ、又はハイポクレアジェコリーナを含む。有機体株として用いる意図しているものは、トリコデルマロンギブラキアタム／レーシ（Ｔ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ／ｒｅｅｓｅｉ）ＲＬ−Ｐ３７（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０（１９８４）ｐｐ．４６−５３；Ｍｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ  Ｂ．Ｓ．、Ｃａｎ．、１−２０、１９８７）、及びｒｕｔ−Ｃ３０（ＡＴＣＣＮｏ．５６７６５）及びＱＭ９４１４（ＡＴＣＣＮｏ．２６９２１）等のセルラーゼ過剰生産株である。
【００３４】
幾つかの態様において、本明細書は代謝のあらかじめ決められた代謝速度を有する糸状菌のサブ集団について試験糸状菌のスクリーニングにすること及びあらかじめ決められたパラメーターに基づいた糸状菌の亜種から所望の糸状菌を選択することによる、所望の糸状菌についてのスクリーニングのための方法を提供する。試験している糸状菌の集団は選択される所望の糸状菌を形成するのに好適な集団である。幾つかの態様において、試験している糸状菌の集団は通常の糸状菌の多様性の集団である。試験している糸状菌の通常の多様性集団を得るための方法は当業者に知られており、例示的方法を本明細書に記載する。幾つかの態様において、試験している糸状菌の集団は条件を含む変異体に曝した後の糸状菌の集団である。
【００３５】
本発明に従って、通常の多様性の糸状菌集団は細胞のゲノムにおいて遺伝的態様性を生成する因子に糸状菌の集団を曝すことにより得ることができる。１つの態様において、遺伝的多様性を生成する因子はゲノムにおいて局所的なヌクレオチド変化を生じる変異である。親細胞及び試験細胞は当業者に知られている任意の変異により変異させられる。例えば、細胞の変異は例えば紫外線、Ｘ線、又はガンマ線の照射により達成することができる。代替的に、変異は、例えば、硝酸、ニトロソアミン、メチルニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネート、及び５−ブロモウラシル等の塩基アナログの化学変異を伴う処置により達成することができる。１つの態様において、挿入変異は、トランスポゾン、制限酵素仲介取り込み（ＲＥＭＩ）又はアグロバクテリウム仲介形質転換を用いて使用される。
【００３６】
幾つかの態様において、親細胞又は試験細胞において遺伝的多様性を生成する因子は、ゲノムにおいて、オートポリプロイドフォーメーション、染色体リアソートメント、染色体アベラーション、クロマチドロス、ラージスケール組換え等のしかしこれらに限定されない、サイトジェニック又は染色体レベルでの、グロス変化を引き起こすサイトジェネティック因子である。そのような多くの因子が知られており、コルチサイン（通常０．１％Ｗ／ｖで用いられる）を含むがこれらに限定されない。
【００３７】
幾つかの態様において、変異は親株又は試験株の胞子に適用され、生き残った胞子は固形培地上で平板培養される。この細胞は各種細胞密度で平板培養され、育成を促進して、各種調査又の他の手段により同定される。他の態様において、胞子以外の糸状菌微生物の他の形成も遺伝的多様性を生成する工程に用いることができる。幾つかの態様において、因子は約１乃至９９．９％の致死率を生成する投与量で適用する変異である。各種態様において、因子は約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は約９５％の致死率を生成する投与量で適用される。幾つかの態様において、この変異因子はニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ‘−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン−ＭＮＮＧ）又はエチルメタンスルホン酸（窒素マスタードガス）である。
【００３８】
試験している糸状菌の集団は、当業者において現在知られている又は後に発見されるであろう任意の手段により、あらかじめ決められた速度代謝を有する糸状菌のサブ集団についてスクリーニングすることができる。幾つかの態様において、試験している糸状菌の遺伝的多様集団は糸状菌により代謝される基質を含む培地中で培養され、あらかじめ決められた代謝速度を有する糸状菌のサブ集団が糸状菌の集団のレストのものよりも早い生育を示す糸状菌である。代謝速度を決定するために提供された基質は代謝の速度において、区別可能な違いを示すことが当業者に知られているものである。糸状菌の培養のための本分野で知られている任意の最小培地をこの培地の調製に用いることができる。幾つかの態様において、この基質は微生物分解に耐性がある。幾つかの態様において、この基質はセルロースである。幾つかの態様において、この培地はセルロース及び含み、セルロースは炭素源としての唯一のものである。幾つかの態様において、この培地は二糖類及び単糖類が実質的にフリーである。幾つかの態様において、この培地はバッチにおいて試験細胞の大きな集団の培養及びスクリーニングを可能にする固形相において実施される。幾つかの態様において、このセルロースは、非常に安定なｔｈｉｏｘｏｔｒｏｐｉｃ  ｇｅｌを形成する不溶性ミクロ結晶からなる３次元マトリックスを形成する、水中でせん断力を有する、ＡＶＩＣＥＬ（商標）（ＦＭＣバイオポリマー、フィラデルフィア、ＰＡ）等のミクロ結晶セルロースを含むがこれらに限定されない精製されたセルロースである。
【００３９】
幾つかの態様において、サブ集団のための試験している糸状菌の集団のスクリーニングは固形相アッセイで行われる。好適な、固形相アッセイの非限定的な例としては、セルロースプレートスクリーン（ＣＰＳ）である。試験する糸状菌の集団を固形相の１２つの層において、培養する。培地の各層はセルロースを唯一の源として含むか、又はエネルギー又は炭素の源が限定されている。この２つの層は同じ濃度で同じ成分を含み、プレート上に調製することが好ましい。この固形培地は好ましくは、例えば、１．５％（ｗ／ｖ）アガーのようなアガーを含むことが好ましい。ボトム層は試験細胞の集団、好ましくは胞子を含み、上層は如何なる糸状菌も含まない。上層及と糸状菌を含む下層とを含むプレートは、糸状菌が固形培地内で育成できる時間、所定の温度でインキュベーションする。上層の厚みはプレート全体に渡り均一であり、上層の表面においてセルロースをエネルギーとして消費する糸状菌の最も早い育成となるように制御する。幾つかの態様において、糸状菌の集団に改善された細胞は、試験細胞の前記醜態の育成速度において、５０ｔｈ、６０ｔｈ、７０ｔｈ、８０ｔｈ、９０ｔｈ、９５ｔｈ、９８ｔｈ、のものよりも高い育成速度を示す。上層の表面を壊した試験細胞は視認でき、既知の方法で単離することができる。通常、上層の厚みの範囲は約２．５ｍｍ、５ｍｍ、７．５ｍｍ、１０ｍｍ、１２ｍｍ、５ｍｍ、１５ｍｍ、１７．５ｍｍ、２０ｍｍ、２５ｍｍ、乃至約３０ｍｍである。
【００４０】
幾つかの態様において、この固形相アッセイは独立して、又は改善された細胞の単離促進のための選択の最後及びセルロースにおける育成速度により改善された細胞をランキングする最後にもちいることができる。幾つかの態様において、この固形相アッセイは試験糸糸状菌の集団がセルラーゼ酵素を通常生産している温度よりも高い温度で行われる。
【００４１】
本発明の技術は、更に、予め決められた選択パラメーターに基づいて糸状菌のサブ集団か所望の糸状菌の選択を提供する。この予め決められた選択パラメーターは、例えば、試験糸状菌により用いられる炭素の効率のような、アッセイ可能なパラメーター又は指標でよい。炭素使用効率は、試験糸状菌により千三される１つ以上の所望のポリペプチド又は酵素の生産性、糸状菌の繁殖性、及び糸状菌により生成された酵素の特異的な活性を含むがこれらに限定されない各種パラメーターによりアッセイすることができる。幾つかの態様において、この予め決められた選択パラメーターは、例えば、通常の温度における１つ以上の例えば、又は酵素のより高い生産レベルにより、又は高い温度において親細胞よりも優れたタンパク質又は酵素生産を維持している能力により決定される熱安定性を示している。
【００４２】
本発明に従って、この生産性は炭素インプット１グラム当たりから生産されるポリペプチド又は酵素の量（グラム）を測定することにより決定することができる。幾つかの態様において、インプット炭素は糸状菌に提供された炭素の量に対応している、又はそれは試験糸状菌により消費される炭素量に対応している。生産性は態様において、タンパク質の生産を測定することにより、例えば、予め決められた量の試験糸状菌が、所定の時間ごとに生産するポリペプチド又は酵素の量（グラム）を測定することにより決定することができる。幾つかの態様において、本発明の方法は、高い生産性、高い繁殖性、高い特異活性、又はこれらの任意の組合せを有するポリペプチド又は酵素を生産する糸状菌の選択を提供する。幾つかの態様において、この糸状菌は更に改善された熱安定性を有するポリペプチド又は酵素を生産する。
【００４３】
本発明の所望の酵素又はポリペプチドはセルラーゼ、キシラナーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、ラッカーゼ、ピロテアーゼ、フィターゼ、又はへミセルラーゼを含むがこれらに限定されない。幾つかの態様において、選択パラメーターはセルラーゼ、キシラナーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、ラッカーゼ、プロテアーゼ、フィターゼ、又はヘミセルラーゼを生産する糸状菌の炭素利用効率を示している。幾つかの態様において、選択パラメーターは更に、試験糸状菌において発現しているセルラーゼ、キシラナーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、ラッカーゼ、プロテアーゼ、フィターゼ、又はヘミセルラーゼの生産に対応している。
【００４４】
幾つかの態様において、試験糸状菌の集団は予め選択された糸状菌である。この予め決められた基準は任意のアッセイ可能な基準でよく、抗生物質耐性を含むがこれらに限定されない。この抗生物質は当業者に知られており、Ｂｉａｌａｐｈｏｓ、ｃｙｃｌｏｈｅｘａｍｉｄｉｎｅ、Ｔｕｎｉｃｙａｍｉｎ、Ｇｒｉｓｅｏｆｕｌｖｉｎ、ＮｉｋｋｏｍｙｃｉｎＺ、ｃａｓｐｏｆｕｎｇｉｎ、ＡｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎｅＤ、ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ、及びポリエン抗生物質を含むがこれらに限定されない。ポリエン抗生物質の好適な非限定的な例としては、ｎｙｓｔａｔｉｎ及びＡｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎＢを含む。
【００４５】
本発明の方法は所望の株の糸状菌をスクリーニングするために用いることができる。幾つかの態様において、試験糸状菌は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アウロバシディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、バウベリア（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ）、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、セリオプリオシス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、チャエトリウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）、ペシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、クラビセプス（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ）、コキオボルス（Ｃｏｃｈｉｏｂｏｌｕｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、チャタス（Ｃｙａｔｈｕｓ）、エンドセリア（Ｅｎｄｏｔｈｉａ）、フラリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ギロクラジウム（Ｇｉｌｏｃｌａｄｉｕｍ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ミセリオフィソラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ミロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ファネロカエテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、ポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、フィリクラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、シゾフィリウム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｕｍ）、スタゴノスポラ（Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、セルモマイセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）、セルモアスクス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、シエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、及びプレウロタス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）からなる群より選択される。幾つかの態様において、試験糸状菌はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）である。幾つかの態様において、試験糸状菌はトリコデルマレーシである。幾つかの態様において、この試験糸状菌は炭素源としてセルロースを利用するトリコデルマレーシである。
【００４６】
幾つかの態様において、本発明は上記方法で得られた糸状菌を提供する。幾つかの態様において、この糸状菌はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、例えば、トリコデルマレーシである。幾つかの態様において、本発明の方法により得られた糸状菌はトリコデルマレーシであり、予め決められた活性を有するセルラーゼを生産する。この活性は改善された性質を有する株についての任意の活性でよい。幾つかの態様において、この活性は糖化である。
【００４７】
幾つかの態様において、本発明は２つ以上の選択パラメーターの組合せに基づいて、試験糸状菌の集団をスクリーニングすることにより、所望の糸状菌についてスクリーニングする方法を提供する。幾つかの態様において、試験糸状菌の集団は第一の選択パラメーター及びダイに選択パラメーターの、２つの選択パラメーターに基づいて選択される。選択パラメーターの任意の組合せが糸状菌の所望の改善された株を得るために選択される。幾つかの態様において、この選択パラメーターは試験糸状菌の代謝速度であり、第二選択パラメーターは抗生物質に対する試験糸状菌の耐性能力である。幾つかの態様において、第一選択パラメーターは微生物分解に対して耐性を有する基質、例えば、セルロースの代謝速度を示す。
【００４８】
幾つかの態様において、本発明は試験糸状菌の代謝速度、例えば、微生物分解に耐性を有する基質の代謝速度を示している。ここで、試験糸状菌の集団は抗生物質に対して予め決められた耐性を有する。
【００４９】
本発明の側面は更に、以下の実施例において更に理解される。この実施例は本発明の範囲を限定するものではない。本発明の範囲を逸脱せずに、材料及び方法の両方において多くの変更が可能であることは当業者に明らかである。
７．実施例
実施例７．１
変異調製、培地、及び溶液
【００５０】
セルラーゼスクリーニング培地を用いて改善されたタンパク質生成を有する変異体を単離した。セルラーゼスクリーニング培地は２０ｍｌの５０ＸＶｏｇｅｌｓストック、０．５ｇのＡＶＩＣＥＬ（商標）（ＭＦＣビポリマー、フィラデルフィア、ＰＡ）、及び２０ｇのアガー、９８０ｍｌのｄＨ２Ｏを含んでいた。５０ＸＶｏｌｇｅｓストックは、（１）３００ｍｌｄＨ２Ｏ中１５０ｇのＮａ３Ｃｉｔｒａｔｅ・２Ｈ２Ｏ；１０ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；及び５ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；（２）５００ｍｌｄＨ２Ｏ中、２５０ｇのＫＨ２ＰＯ４；（３）２００ｍｌｄＨ２Ｏ中、１００ｇのＮＨ４ＮＯ３を溶解することにより調製した。この溶液を５ｍｌのＶｏｌｇｅｓ微量元素溶液と一緒にして、２．５ｍｌのＶｏｌｇｅｓビオチン溶液を添加した。Ｖｏｌｇｅｓ微量元素溶液は、１リットルのＨ２Ｏ、５０ｇのクエン酸、５０ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｇのＦｅ（ＮＨ４）２ＳＯ４・６Ｈ２Ｏ；２．５ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．５ｇのＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ，０．５ｇのＨ３ＢＯ３（硼酸）；及び０．５ｇのＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏを含む（Ｄａｖｉｓら、１９７０、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １７Ａ、７９−１４３；及びＤａｖｉｓら、２０００、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａ  Ｍｏｄｅｌ  Ｏｒｇａｎｉｓｍ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ｆｏｒ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｖｏｇｅｌｓ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｍｅｄｉｕｍ参照）。Ｖｏｌｇｅｓビオチン溶液は１リットルの水に０．１ｇのｄ−ビオチンを含む。振とうフラスコ中の総タンパク質生産量は、ｐＨを５．５に維持するために１００ｍＭのピペラジン−Ｎ，Ｎ‘−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ；カルビオケム）を含む以外はＩｌｍｅｎら  １９９７、Ａｐｐ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６３、１２９８−１３０６に記載されているのと同様の５０ｍＬラクトース最小培地を含む２５０ｍｌフラスコにおいて、２８℃、１５０ｒｐｍ、９６時間インキュベートすることにより評価された。タンパク質アッセイはＰｉａｃｅ（ロックフォード、ＩＬ）によるＢＣＡアッセイを用いてＴＣＡ沈殿の後の情勢を用いて行った。
【００５１】
糸状菌を培養するために当業者に知られている最小培地を用いて培養工程に用いる培地を調製することができる。
【００５２】
ＲＬ−３７に関係する高い繁殖性を有するトリコデルマレーシ株Ａ８３を用いて以下の実験を行った。遺伝的多様性を生成するために、細胞をメチル化化合物Ｎ−メチル−Ｎ‘−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＴＮＧ）を用いて変異させた。（ＡＴからＧＣ変異、逆変異、及びフレームシフトが低い確率で生じるけれども）ＮＴＧは最も変異可能性の高いものの１つである。これは主にＧＣからＡＴタイプへの塩基移動変異を誘発する。０時間から開始して、サンプルを３０分ごとに採取し、利用可能な胞子の数を記録した。一旦、ｋｉｌｌ曲線が確立されると、０時間及び最終的に生き残っていた胞子の数を正しい％ｋｉｌｌを得るために用いた。例えば、５０％ｋｉｌｌライブラリー及び９９％ｋｉｌｌライブラリーは１．５時間及び３重量％間についての、ＮＴＧを有する奉仕のインキュベーションにより調整された。Ａ８３、Ｔ４、ＮＹ７２及び４１Ｇを含むＲＬ−３７由来の改善された株を９９％ｋｉｌｌライブラリーより得た。インキュベーションの後、ＮＴＧを水で胞子を即ち、３回洗浄して除去した。アリコートを変異胞子で調製し、それらを−７０℃、グリコール中で保存した。
【００５３】
新しい糸状菌プレートを調製し、約１Ｘ１０９胞子形成単位／ｍｌを含む胞子懸濁液を得るために用いた。胞子形成単位／ｍｌの数はヘモサイトメーターを用いて決定した。ＮＴＧの溶液（Ａｌｄｒｉｃｈ―４９９１）の溶液をＤＭＳＯ中１５ｍｇ／ｍｌの濃度で新たに調製して、糸状菌胞子懸濁液に１．０ｍｇ／ｍｌの採集濃度となるように添加した。この糸状菌胞子懸濁液をその後、室温の暗室で、９９％のｋｉｌｌが得られるまでインキュベートした。
【００５４】
Ｔ４の単離
セルラーゼスクリーニング培地を調製し、５５℃の水浴中で冷却した。小さなペトリ皿（８２ｍｍ）において、約１００万の成熟胞子を含むアリコートをプレートの中心と端の間に半円を描くように注ぎ、１０ｍｌのセルラーゼスクリーニング培地（上で説明）を添加した。このプレートを、次いで、旋回させて、胞子がプレートの中央に分散するが、端かでには分散しないようにして、５乃至１０分間固定した。２５ｍｌのセルラーゼスクリーニング培地を添加し、固定した。他の１０ｍｌのセルラーゼスクリーニング培地を添加し、このプレートを２８℃で一晩インキュベートした。次の日に、このプレートの表面をチェックし、４時間毎に解剖顕微鏡を用いて育成を観察した。各ライブラリーについて、ピレートの表面にコロニーが到達するおおよその時間を決定した。
【００５５】
アガー表面に到達した第一の１乃至３固体を滅菌ラザーブレードを用いて収集して、端の周りに飛び出したコロニーは無視した。このコロニーを顕微鏡で観察し、このコロニーの表面に触れるために、そしてアガーを切らないように注意深くかみそりを使用した。禁止の長編を除去し、ＰＤＡ上に置き、２８℃でインキュベートした。一旦成長すると、この単離体は振とうフラスコにおいて総タンパク質生成について評価した。
【００５６】
スクリーニングの第一ラウンドの後、Ｔ４は親Ａ−８３と比較して約２５％より多い総タンパク質を生産することがわかった（表１）。
【００５７】
表１．ＲＬ−３７、Ａ−８３、Ｔ４、ＮＹ２７、及び４１Ｇによる振とうフラスコ内でのタンパク質生成
0005526022.tif 000002
【００５８】
ＮＹ２７の単離
前述のように、Ｔ４胞子をＮＴＧで変異させ、９９％ｋｉｌｌが得られるまで変異させた。変異胞子を１０μｇ／ｍＬｎｙｓｔａｉｎを含むＰＤＡアガーで平板培養した。
【００５９】
ｎｙｓｔａｔｉｎ等のポリエン抗生物質は、糸状菌の細胞膜においてスチロール、エルゴステロースを結合して、細胞質膜をリークさせて、死に至らしめる。理論に拘束されることを意図しないけれども、改善されたタンパク質生産性は細胞膜における変化に起因する改善された分泌に寄与して、その結果、高い浸透性及び／又は流出物輸送遺伝子の過剰発現となる。
【００６０】
Ｎｙｓｔａｔｉｎに耐性を有するコロニーを単離して、振とうフラスコにおいて総タンパク質生成について評価した。最も好適な変異体はＮＹ２７であり、振とうフラスコにおいてＴ４よりも約３３％おおいタンパク質を生産していた。
【００６１】
４１Ｇの単離
ＮＹ２７をＮＴＧを用いて９９％ｋｉｌｌを得るまで変異させた。変異胞子をＴ４の単離と同様の方法でスクリーニングした。
【００６２】
セルラーゼスクリーニング培地を調整し、５５℃の水浴中で冷却した。小ペトリ皿（８２ｍｍ）に、約１００万の胞子を含むアリコートをプレートの中央と端の間に半円を描くように分散させ、１０ｍｌのセルラーゼスクリーニング培地（前述）を添加した。このプレートを続いて、胞子がプレートの中央に分散し、端の先端まで分散しないように旋回させて、５乃至１０分間固定した。２５ｍｌのセルラーゼスクリーニング培地を添加し、硬化させた。他の１０ｍｌのセルラーゼスクリーニング培地を添加し、プレートを２８℃で一晩インキュベートした。次の日、解剖顕微鏡を用いて、プレートの表面を４時間ごとにチェックした。各ライブラリーのために、プレートの表面にコロニーが到達するのに好適な時間が決定された。
【００６３】
アガーの表面に到達した第一の１乃至３単離体を滅菌かみそりを用いて収集し、端から飛び出しているコロニーは無視した。コロニーを顕微鏡下で観察して、かみそりを用いて、アガーをきらないように気をつけながらコロニーの表面に接触させた。胞子の小さなピースを除去し、ＰＤＡ上に置き、２８℃でインキュベートした。一旦成長したら、単離体を振とうフラスコ内で総タンパク質について評価した。
【００６４】
変異４１Ｇは親ＮＹ２７と比較して、約２５％より多いタンパク質を生成することがわかった（表１）。図１は１４Ｌセルラーゼ発酵で、１２０時間、Ａ８３と４１Ｇによる総タンパク質生成量を示している。総タンパク質はＡ８３（対照）の総タンパク質で示している。乾燥細胞重量（ＤＣＷ）はｇ／Ｌである。ＤＣＷは既知の全体ブロスをろ過して細胞分を取り除き、この細胞分を乾燥し、全体ブロス中の１リットル当たりの重量部を決定する。図２はＡ８３対照と比較した、１４リットルセルラーゼ発酵、１２０時間における４１Ｇの特異活性を示す。特異生産性（ＤＣＷ／ＬＨグラム当たりのタンパク質のグラム）をＡ８３（対象）に対する％として示す。乾燥細胞重量部（ＤＣＷ）はｇ／Ｌである。図３はセルロースプレートスクリーン（ＣＰＳ）及びｎｙｓｔａｔｉｎ耐性スクリーンを用いた４１Ｇの評価及び４１Ｇにおける、１４ｌ発酵における生産性（タンパク質のグラム／炭素のグラム／ＬＨ）及び繁殖性（タンパク質のグラム／ＬＨ）を示す。結果はＡ８３（対照）に対する％として示す。
【００６５】
１００ｍＭピペラジン−Ｎ−Ｎ‘−ビル（２−メタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ；カルビオケム）以外はＩｌｍｅｎらによる、Ａｐｐ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６３、１２９８−１３０６に記載の培地を用いてセルラーゼ生成について、フェドバッチ発酵において１４Ｌの発酵槽で育成した。他の方法は当業者に典型的である。図３はＡ８３株に対する改善された繁殖性と生産性を示す。
実施例７．２糖化
【００６６】
Ｔ４反応をセルロース１グラム当たり５、１０、及び２０ミリグラムセルラーゼを用いて産処理コーンストーバー（１３％固形分、約７％セルロース）で、５０℃、５日間、標準的なマイウロタイタープレートにおいて行った。平均されたＡ８３反応サンプル（ｎ＝２で実施）と平均された別のＴ４サンプル（ｎ＝２及びｎ＝４で実施）との間に違いが見られた。プレートアッセイにおいて行われたＡ−８３をＴ４セルラーゼは追放した。４１Ｇについて、２．５％（ｗ／ｖ）セルロースを含むＰＹＰ（希釈酸処理黄色ｐｏｐｕｌａｒ）の固形を４．３％（ｗ／ｖ）含む８ｍｇ／ｇセルロースを当量のＡ８３と１４Ｇに添加して、１６８時間、密閉管において、（２０分ごとに）回転させながら連続的に混合して、ｐＨ５．０、３８℃でインキュベートした。ＰＹＰセルロースの糖化％を全ての時間に渡って、決定した。Ｔ４により生成されたセルラーゼを用いて、糖化％はＡ８３に比して１０乃至１５％改善された。４１ＧセルラーゼはＡ８３セルラーゼに比して、改善された糖化％を示した（図４）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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