(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
担腫瘍患者由来の腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を表す細胞傷害性細胞のｅｘ ｖｉｖｏの作製方法であって、
少なくとも１つの腫瘍抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質、腫瘍壊死因子α、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を、前記患者から単離した単球と同時に接触させることによって、前記単球から抗原負荷した抗原提示細胞を産生させること、ならびに
前記患者から単離した細胞傷害性細胞前駆体と前記抗原負荷した抗原提示細胞を前記前駆体が成熟する条件で共培養して細胞傷害性細胞を形成させること
を含み、前記抗原負荷した抗原提示細胞が４日未満で作製される、作製方法。
【請求項２】
抗原性物質が、抗原ペプチド、ペプチド模倣物、タンパク質、ポリタンパク質、免疫複合体、瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、ウイルスベクター及びリポソームからなる群から選択される１又は２以上の物質からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗原性物質が、可溶性抗原性物質からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
抗原性物質が、瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、又はその両方からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
抗原負荷した抗原提示細胞を、表面マーカー（ＣＤ１ａ＋ＣＤ２０７＋）を有する細胞、表面マーカー（ＣＤ１ａ＋ＣＤ２０７−）を有する細胞、表面マーカー（ＣＤ１ａ−ＣＤ１４−）を有する細胞、及び表面マーカー（ＣＤ１４＋ＣＤ１ａ−ＣＤ２０９＋）を有する細胞からなる群から選択される１又は２以上のサブセットを含む画分に分けることをさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前駆体、具体的には単球と、可溶性または粒子状抗原、さらに具体的には死滅した腫瘍細胞とから抗原負荷した樹状細胞を迅速に産生させるための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、２００２年１２月４日に出願した米国特許仮出願第６０／４３０７９１号の利権を主張する。
【０００３】
癌免疫療法という概念は、ヒト癌抗原の分子が同定されたことにより過去１０年間に勢いづいた。これらの治療上の取り組みは、細胞上で癌抗原をＴ細胞に提示することができる樹状細胞（ＤＣ）を多数発生させるｉｎｖｉｔｒｏ培養法を突き止めることによってさらに容易になった。動物を用いた無数の研究から、ＤＣ上に送達された腫瘍抗原を免疫することが防御性の抗腫瘍応答を誘導することが実証された。先駆的な臨床治験は血液由来ＤＣまたは単球由来ＤＣを使用し、いくらかの臨床応答と、さらに最近では免疫応答も示した。（Ｂｅｌｌら、１９９９「Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ」、Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７２：２５５頁；Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉら、１９９６「Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ ｐｕｌｓｅｄ ｗｉｔｈＲＮＡ ａｒｅ ｐｏｔｅｎｔａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ」、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ１８４：４６５〜４７２頁； Ｃｅｌｌｕｚｚｉら、１９９６「Ｐｅｐｔｉｄｅ−ｐｕｌｓｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｕｃｅａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＴＬ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ」、ＪＥｘｐ Ｍｅｄ １８３：２８３〜２８７頁；Ｆｌａｍａｎｄら、１９９４「Ｍｕｒｉｎｅｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｐｕｌｓｅｄｉｎ ｖｉｔｒｏ ｗｉｔｈ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎｄｕｃｅｔｕｍｏｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｖｉｖｏ」、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２４：６０５〜６１０頁；Ｇｉｌｂｏａら、１９９８「Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ−ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ」、ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ４６：８２頁；Ｇｉｌｂｏａ、Ｅ．１９９９「Ｔｈｅ ｍａｋｉｎｇｓ ｏｆ ａ ｔｕｍｏｒ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ」、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １１：２６３〜２７０頁；Ｈｓｕら、１９９６「Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｂ−ｃｅｌｌｌｙｍｐｈｏｍａ ｕｓｉｎｇ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓａｎｔｉｇｅｎ−ｐｕｌｓｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ」、ＮａｔＭｅｄ ２：５２頁；Ｍａｙｏｒｄｏｍｏら、１９９５「Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓｐｕｌｓｅｄ ｗｉｔｈ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃｔｕｍｏｕｒ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｅｌｉｃｉｔｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｎｔｉｔｕｍｏｕｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ」、Ｎａｔ Ｍｅｄ １：１２９７〜１３０２頁；Ｍａｙｏｒｄｏｍｏら、１９９７「Ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓｓｅｒｖｅ ａｓ ｐｏｔｅｎｔ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １５：９４〜１０３頁；Ｍｕｋｈｅｒｊｉら、１９９５「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃＴ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｓｉｔｕ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ｂｙ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｐｕｌｓｅｄａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎ���ｃｅｌｌｓ」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ ＡｃａｄＳｃｉ ＵＳＡ ９２：８０７８頁；Ｎｅｓｔｌｅら、１９９８「Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐｅｐｔｉｄｅ− ｏｒ ｔｕｍｏｒ ｌｙｓａｔｅ−ｐｕｌｓｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ」、Ｎａｔ Ｍｅｄ ４：３２８頁；Ｐｏｒｇａｄｏｒ、Ａ．およびＧｉｌｂｏａ、Ｅ．１９９５「Ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓｐｕｌｓｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｃｌａｓｓ Ｉ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｒｅ ｐｏｔｅｎｔｉｎｄｕｃｅｒｓ ｏｆ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」、Ｊ ＥｘｐＭｅｄ １８２：２５５〜２６０頁；Ｓｏｎｇら、１９９７「Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｅｎｃｏｄｉｎｇｔｈｅ ｃＤＮＡ ｆｏｒａ ｍｏｄｅｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎｄｕｃｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ」、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８６：１２４７〜１２５６頁；Ｓｏｎｇ、Ｊ．Ａ．１９９８「Ｔｕｍｏｒｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ ｇｌａｓｓ ｉｓ ｈａｌｆ ｆｕｌｌ」、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ９：７５７〜７６３頁；Ｓｐｅｃｈｔら、１９９７「Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｌｙ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｍｏｄｅｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｇｅｎｅ ａｒｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｇａｉｎｓｔｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ」、ＪＥｘｐ Ｍｅｄ １８６：１２１３〜１２２１頁；Ｔｊｏａら、１９９８「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆ ｐｈａｓｅ Ｉ／ＩＩ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ ｉｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄＰＳＭＡ ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３６：３９〜４４頁；Ｔｏｅｓら、１９９６「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ」、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ ５６：３７８２〜３７８７頁；Ｚｉｔｖｏｇｅｌら、１９９６「Ｔｈｅｒａｐｙｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｔｕｍｏｒｓ ｗｉｔｈ ｔｕｍｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｐｕｌｓｅｄｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ：ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ，Ｂ７ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ｃｅｌｌ １−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ」、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ１８３：８７〜９７頁；Ｓｃｈｕｌｅｒ−Ｔｈｕｒｎｅｒら、２０００「Ｍａｇｅ−３ ａｎｄｉｎｆｌｕｅｎｚａ−ｍａｔｒｉｘ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｔａｇｅ ＨＬＡ−Ａ２．１＋ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｙ ｍａｔｕｒｅ ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ」、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１６５：３４９２〜３４９６頁；Ｍａｃｋｅｎｓｅｎら、２０００「Ｐｈａｓｅ Ｉ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａ��ｉｅｎｔｓ ｏｆ ａ ｖａｃｃｉｎｅ ｗｉｔｈ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｐｕｌｓｅｄｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｒｏｍ ＣＤ３４（＋）ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ」、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８６：３８５〜３９２頁；Ｇｅｉｇｅｒら、２００１「Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｕｍｏｒｌｙｓａｔｅ−ｐｕｌｓｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓｃａｎ ｅｘｐａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃＴ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍｅｄｉａｔｅ ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ」、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ ６１：８５１３〜８５１９頁；Ｈｅｉｓｅｒら、２００２「Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈ ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ＲＮＡ ｓｔｉｍｕｌａｔｅＣＴＬ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｔｕｍｏｒｓ」、ＪＣｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０９：４０９〜４１７頁；Ｌｏｄｇｅら、２０００「Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ：ｉｍｍｕｎｅｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ａ ｐｈａｓｅ ＩＩ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ」、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６０：８２９〜８３３頁；Ｆｏｎｇら、２００１「Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｖｉａｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｏｕｔｅｓ ｉｎｄｕｃｅｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ」、Ｊ ｌｍｍｕｎｏｌ １６６：４２５４〜４２５９頁；およびＢａｎｃｈｅｒｅａｕら、２００２「Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ ａｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｃｅｌｌ １０６：２７１〜２７４）。これらの結果は有望であるものの、とりわけＤＣの種類を含めたＤＣワクチン接種のいくつかのパラメーターを確立する必要がある。
【０００４】
現在、長期培養で造血前駆細胞から、または血液前駆体すなわち単球からＤＣを作製している。（Ｃａｕｘら、１９９２「ＧＭ−ＣＳＦａｎｄ ＴＮＦ−ａｌｐｈａ ｃｏｏｐｅｒａｔｅｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ ｃｅｌｌｓ」、Ｎａｔｕｒｅ ３６０：２５８〜２６１頁；Ｒｏｍａｎｉら、１９９４「Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ」、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８０：８３〜９３頁；Ｓａｌｌｕｓｔｏ、Ｆ．およびＬａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ、Ａ．１９９４「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｙ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓｉｓ ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ ｐｌｕｓ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ４ ａｎｄ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ」、Ｊ ＥｘｐＭｅｄ １７９：１１０９〜１１１８頁；Ｒｅｉｄら、１９９２「Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｏｆ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄｏｔｈｅｒ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｏｒｍ ｂｉｐｏｔｅｎｔ ＣＤ３４＋ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ」、Ｊ ｌｍｍｕｎｏｌ１４９：２６８１〜２６８８頁；Ａｒｒｉｇｈｉら、１９９９「Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｃｕｌｔｕｒｅｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ３４（＋）ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓｗｉｔｈ ＦＬＴ３−ｌｉｇａｎｄ，ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ，ａｎｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｉｎｄｕｃｅｓ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ ａ ＣＤ３４（−）ＣＤ１４（−）ａｎｄａ ＣＤ３４（−）ＣＤ１４（＋）ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ」、Ｂｌｏｏｄ ９３：２２４４〜２２５２頁；Ｃａｕｘら、１９９０「Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ α ｓｔｒｏｎｇｌｙ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３ ａｎｄ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ３４＋ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ」、Ｂｌｏｏｄ ７５：２２９２〜２２９８頁；Ｃｈａｎｇら、２０００「Ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ＣＤ１ａ＋ ａｎｄ ＣＤ１ａ−ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔｓｄｉｆｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅｉｒ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ，ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｉｅｓ ｔｏ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｃａｐａｃｉｔｉｅｓ ｔｏ ｄｉｒｅｃｔ Ｔｈ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ」、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６５：３５８４〜３５９１頁；およびＷｅｉｓｓｍａｎら、２０００「ＨＩＶ ｇａｇｍＲＮＡ ｔｒ���ｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ（ＤＣ）ｄｅｌｉｖｅｒｓｅｎｃｏｄｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｔｏ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｃａｕｓｅｓＤＣ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｓａ ｐｏｔｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｉｍａｒｙ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ」、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６５：４７１０〜４７１７頁）。
【０００５】
ＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）をＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦと共に（ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦ）培養すると、２つの異なるＤＣサブセットであるランゲルハンス細胞（ＬＣ）および間質ＤＣ（ｉｎｔＤＣ）から構成されるＤＣ調製物が得られる。これは、単球をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４と共に（ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４）培養することにより発生する、ｉｎｔＤＣに類似した未熟ＤＣの均一集団を含んだＤＣとは対照的である。ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４により誘導されたＤＣは追加の成熟因子を必要とするが、ＤＣ活性化因子であるＴＮＦαの存在下で発生するＣＤ３４−ＤＣは必要としない。米国特許第６００４８０７号は、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清を補充した組織培養培地を用いてＣＤ３４造血前駆細胞から樹状細胞を発生させることについて教示している。
【０００６】
別個の生物学的機能を有する２つのＤＣサブセットがさい帯血ＣＤ３４＋ＨＰＣの培養物から出現する：さい帯血ＣＤ３４＋ＨＰＣを用いて初期の研究が実施され、ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦまたはＩＬ−３／ＴＮＦと共に培養した場合それらの細胞の分化はＤＣに向いた。これらの培養条件では、ＴＮＦ−αとＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３との間の協同がＣＤ３４＋ＨＰＣからのＤＣの発生に重大である。実際、初期の研究はＴＮＦが造血の阻害物質であることを示唆したが、最近になるとＴＮＦはＩＬ−３またはＧＭ−ＣＳＦの一方に誘導されるＣＤ３４＋ＨＰＣの増殖の刺激物質であることが観察された。限界希釈分析は、ＴＮＦがＩＬ−３応答細胞数とＩＬ−３依存性クローンの平均サイズとの両方を増加させることを示した。液体培養を１２日間行った後で、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦと共に培養したＣＤ３４＋ＨＰＣは樹状形態を有する接着細胞と非接着細胞との両方を生じる。ＤＣを最適に発生させるためには、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３／ＩＬ−５受容体の共通鎖サブユニットの発現がアップレギュレーションされる培養開始後の数日にＴＮＦが主に必要である。ＣＤ３４＋ＨＰＣの培養におけるＴＮＦの別の重要な作用部位は、顆粒球を生成する分化および増殖の阻害である。具体的には、ＴＮＦは分化の方向付けがされていないＣＤ１３−ＣＤ１５−芽細胞のレベルで顆粒球への分化を可逆的に遮断し、芽細胞がＴＮＦ強化培養物中に蓄積する。さらに、分化の方向付けが終わった顆粒球前駆細胞（ＣＤ１５＋）の成長は、Ｇ０／Ｇ１に細胞周期が停止することで阻害される（Ｃａｕｘら、１９９１「Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆ ｅａｒｌｙ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓｂｙ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ ｉｓ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒａｎｕｌｏｐｏｉｅｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ」、Ｂｌｏｏｄ ７８：６３５〜６４４頁；Ｊａｃｏｂｓｅｎら、１９９２「Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ ｄｉｒｅｃｔｌｙａｎｄ ｉｎｄｉｒｅｃｔｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ：ｒｏｌｅｏｆ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ」、ＪＥｘｐ Ｍｅｄ １７５：１７５９〜１７７２頁）。ＴＮＦはこれらの培養における赤血球生成も遮断する。成長中のＣＤ３４＋ＨＰＣに及ぼすＴＮＦのこれらの作用は、ｐ５５ＴＮＦ受容体に仲介される（Ｒｕｓｔｅｎら、１９９４「Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ（ＴＮＦａｌｐｈａ）ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈｏｆ ｍａｔｕｒｅ ａｎｄ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ：ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐ５５ ａｎｄ ｐ７５ ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」、Ｂｌｏｏｄ８３：３１５２〜３１５９頁）。
【０００７】
上記のように、これらの培養条件で前駆体の２つの亜細胞集団であるＣＤ１ａ＋およびＣＤ１４＋が出現し、これらの亜集団はそれぞれＬＣおよびｉｎｔＤＣに分化できる（Ｃａｕｘら、１９９６「ＣＤ３４＋ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｃｏｒｄｂｌｏｏｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ａｌｏｎｇ ｔｗｏ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｐａｔｈｗａｙｓｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ＧＭ−ＣＳＦ＋ＴＮＦ ａｌｐｈａ」、Ｊ ＥｘｐＭｅｄ １８４：６９５〜７０６頁；Ｃａｕｘら、１９９７「ＣＤ３４＋ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｃｏｒｄｂｌｏｏｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ａｌｏｎｇ ｔｗｏ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｐａｔｈｗａｙｓｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ ｐｌｕｓ ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ：ＩＩ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｂｌｏｏｄ ９０：１４５８〜１４７０頁）。両前駆体サブセットは第１２〜１４日に典型的な形態、表現型（ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ５８、高ＨＬＡクラスＩＩ）および機能を有するＤＣに分化する。ＣＤｌａ＋前駆体はランゲルハンス細胞の特徴を有する細胞を生じる（バーベック顆粒、Ｌａｇ抗原およびＥ−カドヘリン）。対照的に、ＣＤ１４＋前駆体は、バーベック顆粒、Ｅ−カドヘリンおよびＬａｇ抗原を欠くが、ＣＤ２、ＣＤ９、ＣＤ６８および凝固因子ＸＩＩＩａを発現するＣＤ１ａ＋ＤＣに成熟することが皮膚樹状細胞では記載されている。興味深いことに、ＣＤ１ａ＋前駆体ではなくＣＤ１４＋前駆体は、Ｍ−ＣＳＦに応答して誘導されＴ細胞のための補助機能を欠くマクロファージ様細胞に分化できる両能細胞を表す。これらのＤＣサブセットは以下の点で異なる：（１）抗原捕捉（ｉｎｔＤＣはＬＣよりもデキストランの取り込みおよび免疫複合体との結合に有効である）、（２）リソソーム活性（ｉｎｔＤＣの方が高レベルの酵素活性を発現する）、（３）ナイーブＢ細胞の分化誘導能（ｉｎｔＤＣはＩＬ−１２の分泌を介してナイーブＢ細胞のプライミングおよびそれらのＩｇＭ分泌形質細胞への分化を独自に誘導できる）（Ｄｕｂｏｉｓら、１９９７「Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ ｅｎｈａｎｃｅ ｇｒｏｗｔｈａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ４０−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ１８５：９４１〜９５１頁；Ｄｕｂｏｉｓら、１９９８「Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｏｌｅｏｆ ＩＬ−１２ ｉｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｉｖｅ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」、Ｊ ｌｍｍｕｎｏｌ１６１：２２２３〜２２３１頁）、および（４）両サブセットはＣＤ４０が連結した際にＩＬ−１２を発現するがｉｎｔＤＣだけがＩＬ−１０を発現する。ＬＣの独特な機能を今後確立すべきであるが、ＬＣ成分を有するＣＤ３４−ＤＣの方が単球由来ＤＣよりもＣＤ８Ｔ細胞のプライミングに有効であることを示唆する報告がいくつかある（Ｍ���ｒｔａｒｉｎｉら、１９９７「Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍ ＣＤ３４＋ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓａｎｄ ｆｒｏｍ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓａｒｅ ｎｏｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｌａｎ−Ａ／Ｍａｒｔ−１（２７−３５）−ｓｐｅｃｉｆｉｃＣＴＬｓ ｆｒｏｍ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆ ＣＴＬ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ」、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ ５７：５５３４〜５５４１頁；およびＦｅｒｌａｚｚｏら、２０００「Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｆｒｏｍＣＤ３４＋ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｆｌｔ３ｌｉｇａｎｄ，ｃ−ｋｉｔ ｌｉｇａｎｄ，ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−４，ａｎｄ ＴＮＦ−ａｌｐｈａ ａｒｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｒｅｓｅｍｂｌｉｎｇｍａｔｕｒｅ ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ」、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ２３：４８〜５８頁）。 ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１５の存在下で単球を培養することによる誘導したランゲルハンス細胞の表現型を有するＤＣが、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４ＤＣよりもｉｎ ｖｉｔｒｏのＣＴＬ応答の誘導に有効であると実証した我々自身の研究において、これらの観察を確認している（Ｍｏｈａｍａｄｚａｄｅｈら、２００１「Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１５ ｓｋｅｗｓ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｆｅａｔｕｒｅｓｏｆ Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ ｃｅｌｌｓ」、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９４：１０１３〜２０頁）。このように、腫瘍特異的ＣＴＬを誘導するような状況では、ＣＤ３４−ＤＣまたはランゲルハンス細胞を含む他の任意のＤＣ調製物が有利である可能性がある。
【０００８】
Ｇ−ＣＳＦにより動員した血液ＣＤ３４＋ＨＰＣも２つのＤＣサブセットをもたらす：Ｇ−ＣＳＦにより動員され進行メラノーマの患者から単離された末梢血は、さい帯血で認識された分化経路にしたがい、培養第９日で２つの細胞集団、すなわちＣＤ１ａ＋ＣＤ１４−ＬＣおよびＣＤ１ａ−ＣＤ１４＋ｉｎｔＤＣを確認できる。しかし、これらの培養物中の細胞の約５０％が前駆細胞／前駆体段階に留まり、さらなる培養でＤＣを生じることができる。このように、これらの培養物は非同調性であり、このことはこれらのＤＣ調製物をワクチンとして使用する場合に考慮する必要のあるパラメーターである。両サブセットはＣＤ８３ｌｏｗＣＤ８６＋ＨＬＡ−ＤＲ＋、ＭＨＣクラスＩ＋であり（ｉｎｔＤＣの方がわずかに高レベルのクラスＩを発現する）、ＬＣの方が高レベルのＣＤ１１ｃおよびＣＤ８０を発現する。Ｌａｇの発現およびバーベック顆粒に対応する細胞質構造はどちらも主にＬＣにみられるが、それらを示す共焦点顕微鏡像から、それらがランゲルハンス細胞の表現型であることを確認した。第９日の培養物から選別したＬＣおよびｉｎｔＤＣは、１）形態（ギムザ染色で顕著な樹枝状突起を有する明瞭な核および細胞質構造を示す）、２）抗原の捕捉（ｉｎｔＤＣの方がＬＣよりもかなり多くのＦＩＴＣ−デキストランを捕捉する）、および３）Ｔ細胞応答の誘導（ＣＤ１ａ＋ＣＤ１４−細胞およびＣＤ１ａ−ＣＤ１４＋細胞の両方が同種Ｔ細胞の増殖を誘導できるが、選別されたＣＤ１ａ＋細胞の方がＣＤ１４＋細胞よりも（自己ＣＤ４Ｔ細胞を使用した）ＴＴに対するリコール応答および同種ＣＤ８Ｔ細胞の増殖の誘導がずっと効果的である）から決定されるようにＤＣの性質を示す。ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮαまたは合成ｄｓＲＮＡ（ポリＩ：Ｃ）により、ＬＣおよびｉｎｔＤＣは誘導されて成熟し、Ｔ細胞の増殖応答の同等な増加を生じる。
【０００９】
抗原負荷したＣＤ３４＋ＨＰＣから得られたＤＣは免疫応答および臨床応答を誘発する：国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／０７２３２号（ＷＯ０２／０７２０１３）に開示されたように、６つのＡｇ、すなわちインフルエンザマトリックスペプチド（Ｆｌｕ−ＭＰ）、ＫＬＨ、ならびに４つのメラノーマＡｇであるＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、ｇｐ１００、チロシナーゼおよびＭＡＧＥ−３から得られたペプチドをパルスしたＣＤ３４＋ＨＰＣ由来ＤＣを、ステージＩＶメラノーマのＨＬＡＡ＊０２０１＋患者１８人にワクチン接種した。ＫＬＨ、Ｆｌｕマトリックスペプチド、ならびに４つのメラノーマ抗原ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ−１／ＭＥＬＡＮＡ、ＧＰ−１００およびチロシナーゼから得られたＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドをＤＣに負荷し、６週間にわたり隔週（ｓ．ｃ．注射４回）投与した。上記のように、これらのＤＣはランゲルハンス細胞構成要素を含む。抗原をパルスしたＣＤ３４−ＤＣを用いた、進行メラノーマを有する患者に対するワクチン接種は耐容性が良好であり、「非自己」抗原（ウイルスペプチドおよびＫＬＨタンパク質）と「自己」抗原（メラノーマペプチド）との両方に対する免疫の強化を生じることが証明された。血液における免疫応答のレベルは腫瘍部位での早期の転帰と相関することが観察されたため、血液における免疫応答の測定がワクチンの有効性の評価を助けるという考えをさらに刺激した。実際に、抗原をパルスしたＣＤ３４＋ＨＰＣ由来ＤＣは直接血液から検出できる一次免疫応答およびリコール免疫応答を誘導した。抗原（ＫＬＨ、Ｆｌｕ−ＭＰ）を防除するための免疫応答を患者１８人中１６人で観察した。これらと同じ患者１６人で１つまたは複数のメラノーマ抗原（ＭｅｌＡｇ）に対する免疫応答の強化がみられ、そのうち患者１０人は２つを上回るＭｅｌＡｇに対して応答した。ＭｅｌＡｇ特異的Ｔ細胞はＤＣワクチンが機能的となり、予めｅｘｖｉｖｏで増大する必要なしにエフェクターＴ細胞アッセイで検出できた後に誘発した。それらのＴ細胞は、外来サイトカインまたは抗原による多数回の再刺激を必要とせずに抗原保有ＤＣと短期間（１週間）共培養した後で増殖できエフェクター機能を示すこともできた。対照抗原および腫瘍抗原のどちらにも応答しなかった患者２人は腫瘍の急速な進行を経験した。評価できる疾患を有する患者１７人の内、２つ以下のＭｅｌＡｇに対する免疫を有する患者７人中６人が、研究に参加した１０週間後に進行性の疾患を有した。これは、２つを超えるＭｅｌＡｇに対して免疫を有する患者１０人中わずか１人に腫瘍の進行を認めたこととは対照的である。１つを超える腫瘍転移の退縮をこれらの患者の内７人で観察した。ＤＣワクチン接種後のメラノーマ抗原に対する全体的免疫は臨床転帰と関連していた（ｐ＝０．０１５）。
【００１０】
血中免疫応答の分析から、ＡｇをパルスしたＣＤ３４−ＤＣがＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞免疫を速やかに誘導できることが実証された。実際、ＤＣの単回ワクチン接種が患者６人でのＫＬＨ特異的応答および患者８人でのＦｌｕ−ＭＰ特異的応答を十分に誘導できた。単回のＤＣワクチンは、患者５人に１つ以上のメラノーマ抗原に対して腫瘍特異的エフェクターを十分に誘導できた。これらの５人の患者のうち１人も疾患の早期の進行を示さなかった。急速なＫＬＨ応答を有する患者６人のうちわずか１人が疾患の早期の進行を経験した。Ｆｌｕ−ＭＰに対する迅速応答者と遅延応答者は疾患の進行に差を示さなかった。このように、患者がＣＤ４エピトープまたはメラノーマＡｇに迅速に応答する能力は、ＤＣに基づくワクチン接種後の臨床転帰の早期の指標になり得た。
【００１１】
患者１１人に追加の「ブースト」接種を４回行った。研究に参加してからの全体的な生存の分析から、１年目に１８人中１２人の患者が生存し、２年目に１８人中９人の患者が生存していることが示された。研究に参加してからの全体的な生存は、第１０週で検出されたワクチン特異的免疫応答のレベル、すなわち、最初の４回の接種後の（１）強度、すなわちメラノーマＡｇ特異的ＩＦＮγのＥＬＩＳＰＯＴの数および（２）幅、すなわちＴ細胞が応答するメラノーマ抗原数により測定されたレベルと関係していた。最後に、長期持続性の腫瘍退縮はエピトープの分散と関連していた。このように、ＤＣワクチン中のランゲルハンス細胞構成要素は有益であることが示された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
樹状細胞は、例えば癌を有する患者に抗原特異的免疫応答を誘導するワクチン接種用のベクターとしてますます使用されてきている。ＤＣ上に送達された腫瘍抗原を免疫することが抗腫瘍防御応答を誘導し、抗原負荷したＤＣを患者にワクチン接種することが腫瘍抗原に対する免疫応答の増加をもたらすことができるという事実を考慮して、抗原負荷したＤＣのワクチン接種が腫瘍および感染性因子の治療に推奨されてきた。このように、抗原負荷したＤＣの発生方法の改良はどのようなワクチン接種プロトコルにも有益である。ｅｘｖｉｖｏでＤＣワクチンを発生させる現行法は、ＣＤ３４＋造血前駆細胞（米国特許第６００４８０７号）または樹状細胞前駆体を構成する単球（ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を加え、その後成熟ステップを行う）の一方を培養することに基づいている。しかし、これらの培養には時間がかかり、前駆細胞および前駆体に対してそれぞれ少なくとも９および７日間を必要とする。さらに、樹状細胞が発生した後に、ＤＣに抗原をパルスする必要があり、これに追加の培養を必要とする。
【００１３】
抗原負荷した樹状細胞ワクチンを３日という短期間で迅速に発生させる方法が発見された。この方法により発生した抗原負荷した樹状細胞を、任意の治療、診断、予防または研究プロトコルに使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
一態様において、本発明はｅｘ ｖｉｖｏで単球から抗原負荷した抗原提示細胞を産生させる方法であり、その方法は可溶性または粒子状抗原性物質、腫瘍壊死因子α、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を単球に同時接触させることを含む。好ましくは、抗原負荷した抗原提示細胞が４日未満で産生する。本方法に有用な抗原性物質は、抗原ペプチド、ペプチド模倣物、タンパク質、ポリタンパク質、免疫複合体、瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、ウイルスベクターおよびリポソームからなる群から選択される１つまたは複数の物質からなる。好ましい方法では、抗原性物質は可溶性抗原性物質からなる。別の好ましい方法では、抗原性物質は瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、またはその両方からなる。別の好ましい方法では、表面マーカー（ＣＤ１ａ＋ＣＤ２０７＋）を有する細胞、表面マーカー（ＣＤ１ａ＋ＣＤ２０７−）を有する細胞、表面マーカー（ＣＤ１ａ−ＣＤ１４−）を有する細胞、および表面マーカー（ＣＤ１４＋ＣＤ１ａ−ＣＤ２０９＋）を有する細胞からなる群から選択される１つまたは複数のサブセットを含む画分に、抗原負荷した抗原提示細胞を分けることができる。
【００１５】
別の態様において、本発明はｅｘ ｖｉｖｏで単球から抗原負荷した抗原提示細胞を産生させる方法であり、その方法は第一時点で腫瘍壊死因子αおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を単球と接触させて抗原提示細胞を形成させ、第二時点で可溶性または粒子状抗原性物質をその抗原提示細胞と接触させて抗原負荷した抗原提示細胞を形成させ、その抗原負荷した抗原提示細胞が４日未満で産生するものである。本方法に有用な抗原性物質は、抗原ペプチド、ペプチド模倣物、タンパク質、ポリタンパク質、免疫複合体、瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、ウイルスベクターおよびリポソームからなる群から選択される１つまたは複数の物質からなる。好ましい方法では、抗原性物質は可溶性抗原性物質からなる。別の好ましい方法では、抗原性物質は瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、またはその両方からなる。別の好ましい方法では、表面マーカー（ＣＤ１ａ＋ＣＤ２０７＋）を有する細胞、表面マーカー（ＣＤ１ａ＋ＣＤ２０７−）を有する細胞、表面マーカー（ＣＤ１ａ−ＣＤ１４−）を有する細胞、および表面マーカー（ＣＤ１４＋ＣＤ１ａ−ＣＤ２０９＋）を有する細胞からなる群から選択される１つまたは複数のサブセットを含む画分に、抗原負荷した抗原提示細胞を分けることができる。
【００１６】
別の態様において、本発明は可溶性または粒子状抗原性物質、腫瘍壊死因子α、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子をｅｘ ｖｉｖｏで単球と同時接触させて抗原負荷した抗原提示細胞を形成させるステップにしたがって製造される抗原負荷した抗原提示細胞を有するワクチンである。好ましくは、抗原負荷した抗原提示細胞が４日未満で産生する。このワクチン中の抗原性物質は抗原ペプチド、ペプチド模倣物、タンパク質、ポリタンパク質、免疫複合体、瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、ウイルスベクターおよびリポソームからなる群から選択される１つまたは複数の物質からなる。好ましいワクチンでは、抗原性物質は可溶性抗原性物質からなる。別の好ましいワクチンでは、抗原性物質は瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、またはその両方からなる。
【００１７】
別の態様において、本発明は第一時点で腫瘍壊死因子αおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子をｅｘ ｖｉｖｏで単球と接触させて抗原提示細胞を形成させるステップおよび第二時点で可溶性または粒子状抗原性物質をその抗原提示細胞と接触させて抗原負荷した抗原提示細胞を形成させるステップにしたがって作製される抗原負荷した抗原提示細胞を有するワクチンであり、抗原負荷した抗原提示細胞が４日未満で産生する。このワクチン中の抗原性物質は抗原ペプチド、ペプチド模倣物、タンパク質、ポリタンパク質、免疫複合体、瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、ウイルスベクターおよびリポソームからなる群から選択される１つまたは複数の物質からなる。好ましいワクチンでは、抗原性物質は可溶性抗原性物質からなる。別の好ましいワクチンでは、抗原性物質は瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、またはその両方からなる。
【００１８】
別の態様において、本発明は単球由来の抗原負荷した抗原提示細胞を有するワクチンであり、抗原提示細胞はランゲルハンス細胞および間質樹状細胞を含む。
【００１９】
別の態様において、本発明は単球由来の抗原負荷した抗原提示細胞を有するワクチンであり、抗原提示細胞は表面マーカー（ＣＤ１ａ＋ＣＤ２０７＋）を有する細胞、表面マーカー（ＣＤ１ａ＋ＣＤ２０７−）を有する細胞、表面マーカー（ＣＤ１ａ−ＣＤ１４−）を有する細胞、および表面マーカー（ＣＤ１４＋ＣＤ１ａ−ＣＤ２０９＋）を有する細胞からなる群から選択される２つ以上のサブセットからなる。
【００２０】
別の態様において、本発明は担腫瘍患者での腫瘍特異的免疫応答の誘導方法であり、その方法は、（１）少なくとも１つの腫瘍抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質、腫瘍壊死因子α、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を単球と同時に接触させることによってｅｘｖｉｖｏでその単球から得られる抗原負荷した抗原提示細胞を有するワクチンを製造すること、ならびに（２）そのワクチンを患者に投与することを含む。ここで、患者の細胞はワクチン中の抗原負荷した抗原提示細胞と接触すると成熟して、腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を表す細胞傷害性細胞を形成する。別の実施形態では、第一時点で腫瘍壊死因子αおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子をｅｘ ｖｉｖｏで単球と接触させて抗原提示細胞を形成させること、および第二時点で少なくとも１つの腫瘍抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質を抗原提示細胞と接触させて抗原負荷した抗原提示細胞を形成させることによって抗原負荷した抗原提示細胞を作製し、前記抗原負荷した抗原提示細胞が４日未満で産生する。好ましい方法では、抗原性物質は可溶性抗原性物質からなる。別の好ましい方法では、抗原性物質は瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、またはその両方からなる。好ましい一方法では、標的細胞傷害性細胞はＣＤ４ポジティブである。別の好ましい方法では、標的細胞傷害性細胞はＣＤ８ポジティブである。
【００２１】
別の態様において、本発明は担腫瘍患者での腫瘍特異的免疫応答の誘導方法であり、その方法は、（１）患者から単球および細胞傷害性細胞前駆体を単離すること、（２）少なくとも１つの腫瘍抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質、腫瘍壊死因子α、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を単球と同時に接触させることによって患者の単球から抗原負荷した抗原提示細胞を産生させること、（３）抗原負荷した抗原提示細胞と、単離した細胞傷害性細胞前駆体を前駆体が成熟する条件で共培養して細胞傷害性細胞を形成させること、ならびに（４）その細胞傷害性細胞を患者に投与することを含む。ここで、細胞傷害性細胞は腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を表す。別の実施形態では、第一時点で腫瘍壊死因子αおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子をｅｘ ｖｉｖｏで単球と接触させて抗原提示細胞を形成させること、ならびに第二時点で少なくとも１つの腫瘍抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質を前記抗原提示細胞と接触させて抗原負荷した抗原提示細胞を形成させることによって抗原負荷した抗原提示細胞を作製し、前記抗原負荷した抗原提示細胞が４日未満で産生する。好ましい方法では、抗原性物質は可溶性抗原性物質からなる。別の好ましい方法では、抗原性物質は瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、またはその両方からなる。好ましい一方法では、細胞傷害性細胞はＣＤ４ポジティブである。別の好ましい方法では、細胞傷害性細胞はＣＤ８ポジティブである。
【００２２】
別の態様において、本発明は患者に免疫応答を誘導する方法であり、その方法は、（１）免疫応答が望まれる少なくとも１つの抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質、腫瘍壊死因子α、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を単球と同時に接触させることによってｅｘｖｉｖｏでその単球から得られる抗原負荷した抗原提示細胞を有するワクチンを製造すること、ならびに（２）患者にそのワクチンを投与することを含む。ここで、患者の細胞はワクチン中の抗原負荷した抗原提示細胞と接触すると成熟してその抗原に対して免疫活性を表す細胞を形成する。好ましい実施形態において、第一時点で腫瘍壊死因子αおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子をｅｘ ｖｉｖｏで単球と接触させて抗原提示細胞を形成させること、ならびに第二時点で免疫応答が望まれる少なくとも１つの抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質を前記抗原提示細胞に接触させて抗原負荷した抗原提示細胞を形成させることによって、抗原負荷した抗原提示細胞を作製する。ここで、前記抗原負荷した抗原提示細胞が４日未満で産生する。好ましい方法では、抗原性物質は可溶性抗原性物質からなる。別の好ましい方法では、抗原性物質は瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、またはその両方からなる。好ましい一方法では、標的細胞傷害性細胞はＣＤ４ポジティブである。別の好ましい方法では、標的細胞傷害性細胞はＣＤ８ポジティブである。
【００２３】
別の態様において、本発明は細胞傷害性Ｔ細胞により仲介される免疫応答を備えさせる方法であり、その方法は、（１）免疫応答が望まれる少なくとも１つの抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質、腫瘍壊死因子α、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を単球と同時に接触させることによってｅｘｖｉｖｏでその単球から抗原負荷した抗原提示細胞を産生させること、（２）ナイーブＴ細胞と抗原負荷した抗原提示細胞を、Ｔ細胞成熟条件で共培養して細胞傷害性Ｔ細胞を形成させること、ならびに（３）抗原を保有する標的細胞を細胞傷害性Ｔ細胞と接触させることを含む。ここで、細胞傷害性Ｔ細胞は抗原を保有する標的細胞に対して細胞傷害活性を表す。別の実施形態では、第一時点で腫瘍壊死因子αおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子をｅｘ ｖｉｖｏで単球と接触させて抗原提示細胞を形成させること、ならびに第二時点で免疫応答が望まれる対象の少なくとも１つの抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質を前記抗原提示細胞と接触させて抗原負荷した抗原提示細胞を形成させることによって、抗原負荷した抗原提示細胞を作製する。ここで、前記抗原負荷した抗原提示細胞が４日未満で産生する。好ましい方法では、抗原性物質は可溶性抗原性物質からなる。別の好ましい方法では、抗原性物質は瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、またはその両方からなる。好ましい一方法では、細胞傷害性細胞はＣＤ４ポジティブである。別の好ましい方法では、細胞傷害性細胞はＣＤ８ポジティブである。
【００２４】
別の態様において、本発明は患者における免疫応答の修飾方法であり、その方法は、（１）免疫応答が望まれる少なくとも１つの抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質、腫瘍壊死因子α、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を単球と同時に接触させることによってｅｘｖｉｖｏで単球から得られる抗原負荷した抗原提示細胞を産生させること、ならびに（２）抗原提示細胞を患者に投与することを含む。ここで、患者の細胞は抗原負荷した抗原提示細胞と接触した場合その抗原に対して免疫活性を表さないようにモジュレートされる。
【００２５】
そのうえ別の態様において、本発明は２つ以上のサブセットから構成される抗原負荷した抗原提示細胞画分の製造方法であり、その方法は、（１）可溶性または粒子状抗原性物質、腫瘍壊死因子α、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子をｅｘ ｖｉｖｏで単球と同時に接触させて抗原負荷した抗原提示細胞を形成させること（２）抗原負荷した抗原提示細胞から２つ以上のサブセットを単離すること、ならびに（３）２つ以上のサブセットを組み合わせて抗原負荷した抗原提示細胞画分を形成させることを含み、ここで、各サブセットは患者に投与された場合に別個のＴ細胞応答を誘発し別個の免疫応答を備えることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明は、ｅｘ ｖｉｖｏでヒト抗原提示細胞を産生させるための組成物および方法に関する。本発明は、さらに具体的にはＴＮＦαを含むがそれに限定されない活性化物質を、好ましくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含むがそれに限定されない増殖因子と組み合わせて用いて抗原提示細胞を産生させるための方法および組成物に関する。本発明は血液前駆体から樹状細胞をｅｘｖｉｖｏで産生させるために具体的には適している。
【００２７】
本発明は、治療目的（ワクチン）、診断目的（免疫モニタリング）、および研究目的（腫瘍抗原の同定）でｅｘｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで単球のような血液前駆体から抗原提示細胞を産生させる方法であり、その方法は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αを含むがそれに限定されない活性化物質を、好ましくはＧＭ−ＣＳＦを含むがそれに限定されない少なくとも１つの増殖因子と組み合わせて有する組成物を血液前駆体と接触させることを含む。本明細書において使用するように、ＴＮＦαはＴＮＦα、または本発明の方法で活性化物質として機能する任意のＴＮＦもしくはＴＮＦ様タンパク質として定義される。本発明に関連する増殖因子ならびに／または活性化物質の製剤は、組換え分子ならびに／またはウイルスベクターならびに／またはペプトイドならびに／または増殖因子および／もしくは活性化物質を内因性放出するように前駆体を誘発できる任意の分子を含むがそれらに限定されない。間質ＤＣとランゲルハンス細胞（ＬＣ）との混合を含むこれらの樹状細胞を抗原に対して感作して、患者における抗原に対する免疫応答をモジュレートするためにその患者に投与できる。本発明は、本方法にしたがって産生した樹状細胞を有する組成物も含む。本発明に有用な抗原性物質には可溶性および粒子状抗原性物質がある。抗原性物質に腫瘍細胞全体を使用する場合、細胞は死滅していても瀕死であってもよく、本明細書に使用されるようにどちらの用語も同等とみなされる。
【００２８】
一態様において、本発明はｅｘ ｖｉｖｏの単球からワクチンを製造するワンステップ法であり、その方法は例えば好ましくは少なくとも１つの増殖因子、例えばＧＭ−ＣＳＦおよび少なくとも１つの可溶性または粒子状抗原と組み合わせてＴＮＦαを有する組成物を単球と接触させることを含む。本発明は、本方法にしたがって製造されたワンステップ・ワクチンも含む。本発明の方法にしたがって、抗原負荷した樹状細胞ワクチンを３日間という短期間で発生させることができる。増殖因子（例えばＧＭ−ＣＳＦ）および活性化物質（例えばＴＮＦα）と共に、単球および可溶性または粒子状抗原（例えば死滅した腫瘍細胞）を培養することによって、これらの樹状細胞を作製する。重要なことには、癌ワクチンとしての単球由来樹状細胞の発生は、インターロイキン４（ＩＬ−４）またはＩＬ−１３と組み合わせたＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−３の使用を必要とすることが報告されている。これらのサイトカインの両方が２型Ｔ細胞または制御性Ｔ細胞に向けたＴ細胞応答の偏向を強く伴い、これは腫瘍ワクチン接種の状況では望ましくないおそれがある。したがって、本発明は樹状細胞ワクチンの発生を容易にし、そのようなワクチンを今や臨床治験で大規模に使用することができる。
【００２９】
ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦαのような前炎症性サイトカインは、樹状細胞の少なくとも４つのサブセット、すなわち表面マーカー（ＣＤ１ａ＋ＣＤ１４−ＣＤ２０７＋）を有するランゲルハンス細胞（ＬＣ）、表面マーカー（ＣＤ１ａ＋ＣＤ１４＋ＣＤ２０７−）を有する間質ＤＣ（ｉｎｔＤＣ）、表面マーカー（ＣＤ１ａ−ＣＤ１４−）を有するダブルネガティブＤＣ（ＤＮ−ＤＣ）、および表面マーカー（ＣＤ１ａ−ＣＤ１４＋ＣＤ２０９＋）を有する第四のサブセットを含む樹状細胞に単球が分化するのを促進することが今や発見された。これらの樹状細胞前駆体は抗原を捕捉した後にｅｘｖｉｖｏで抗原負荷した抗原提示樹状細胞に分化でき、その細胞を臨床治験に使用できる。さらに、樹状細胞ワクチンの発生に必要な３つの因子、すなわち、樹状細胞前駆体、抗原およびサイトカインを同時に一緒に合わせ抗原負荷した樹状細胞ワクチンを迅速に発生させることができることが今や見出された。時間がかかり３つのステップ（すなわちそれぞれ９および７日かかる前駆細胞または前駆体からの樹状細胞のｅｘｖｉｖｏ発生、その後の抗原負荷、および単球から細胞が発生した場合の樹状細胞の活性化）を要する現行の技術とは異なり、本発明は、本方法に必要な全ての因子を組み合わせた、樹状細胞ワクチンの迅速オール・イン・ワンステップ発生を可能にする。
【００３０】
本発明の方法にしたがって、単球が接着または枯渇または正の選択のいずれかにより単離される血中白血球搬出からワクチンを作製する。そのように単離された単球を、次に組織培養バッグまたはプラスチック製培養皿またはＮｕｎｃＣｅｌｌファクトリー（登録商標）のいずれかに入れて培養する。第１日にサイトカインを添加し、抗原を例えば死滅した腫瘍細胞の形で第１日または第２日のどちらかで添加し、第３日にワクチンを投与する。
【００３１】
本発明の別の態様において、ワクチンを凍結してブースト注射に用いる。別の態様において、ブースト注射用のエキソソームを製造するためにワクチンを用いる。別の態様において、このワクチンから製造したエキソソームを抗原の製剤として使用して単球およびサイトカインと混合してワクチンを製造する。
【００３２】
本発明の方法にしたがって、血液ユニットからワクチンを作製し、ここで接着または枯渇または正の選択により単球を単離する。そのように単離された単球を次に組織培養バッグまたはプラスチック製培養皿またはＮｕｎｃＣｅｌｌファクトリー（登録商標）のいずれかに入れて培養する。第１日にサイトカインを添加し、抗原を例えば死滅した腫瘍細胞の形で第１日または第２日のどちらかで添加し、第３日にワクチンを投与する。本発明のこの実施形態では、各注射についてワクチンを新鮮調製し、毎月採血する。
【００３３】
一態様において、本発明はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘｖｉｖｏで抗原特異的ＣＤ４＋Ｔリンパ球を産生させる方法であり、その方法は、例えばＴＮＦαを好ましくは少なくとも１つの増殖因子、例えばＧＭ−ＣＳＦと組み合わせて有する組成物を血液前駆体と接触させて樹状細胞を形成させること、少なくとも１つの可溶性または粒子状抗原に対して樹状細胞を感作して抗原感作樹状細胞を形成させること、およびＴリンパ球を含む細胞集団を抗原感作樹状細胞と接触させて活性化抗原特異的ＣＤ４＋Ｔリンパ球を形成させることによって調製される抗原感作樹状細胞をもたらすことを含む。患者における免疫応答をモジュレートするために、これらの抗原特異的ＣＤ４＋Ｔリンパ球をその患者に投与できる。本発明には、本発明にしたがって産生した抗原特異的ＣＤ４＋Ｔリンパ球を有する組成物も含む。
【００３４】
一態様において、本発明はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘｖｉｖｏで抗原特異的ＣＤ４＋Ｔリンパ球を産生させる方法であり、その方法は、例えばＴＮＦαを好ましくは少なくとも１つの増殖因子、例えばＧＭ−ＣＳＦおよび少なくとも１つの可溶性または粒子状抗原と組み合わせて有する組成物を血液前駆体と接触させて抗原感作樹状細胞を形成させること、ならびにＴリンパ球を含む細胞集団を抗原感作樹状細胞と接触させて活性化抗原特異的ＣＤ４＋Ｔリンパ球を形成させることによって調製される抗原感作樹状細胞をもたらすことを含む。患者における免疫応答をモジュレートするために、これらの抗原特異的ＣＤ４＋Ｔリンパ球を患者に投与できる。本発明は、本方法にしたがって産生した抗原特異的ＣＤ４＋Ｔリンパ球を有する組成物も含む。
【００３５】
一態様において、本発明はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘｖｉｖｏで抗原特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球を産生させる方法であり、その方法は、例えばＴＮＦαを好ましくは少なくとも１つの増殖因子、例えばＧＭ−ＣＳＦと組み合わせて有する組成物を血液前駆体と接触させて樹状細胞を形成させること、抗原に対して樹状細胞を感作して抗原感作樹状細胞を形成させること、およびＴリンパ球を含む細胞集団を抗原感作樹状細胞と接触させて活性化抗原特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球を形成させることによって調製される抗原感作樹状細胞をもたらすことを含む。患者における免疫応答をモジュレートするために、これらの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球を患者に投与できる。本発明は、本方法にしたがって産生した抗原特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球を有する組成物も含む。
【００３６】
一態様において、本発明はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘｖｉｖｏで抗原特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球を産生させる方法であり、その方法は、例えばＴＮＦαを好ましくは少なくとも１つの増殖因子、例えばＧＭ−ＣＳＦおよび少なくとも１つの可溶性または粒子状抗原と組み合わせて有する組成物を血液前駆体と接触させて抗原感作樹状細胞を形成させること、ならびにＴリンパ球を含む細胞集団を抗原感作樹状細胞と接触させて活性化抗原特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球を形成させることによって調製される抗原感作樹状細胞をもたらすことを含む。患者における免疫応答をモジュレートするために、これらの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球を患者に投与できる。本発明は、本方法にしたがって産生した抗原特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球を有する組成物も含む。
【００３７】
一般的な方法
本明細書において使用される本発明の抗原負荷したＤＣの迅速発生法を以下に詳述する。これらの方法は代表を意味し、当技術分野で公知であるような変更は、本発明の一部として意図される。
【００３８】
細胞培養。健康志願者または進行メラノーマを有する患者の末梢血からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離により単核細胞を単離する。マイクロビーズを使った枯渇または２時間プラスチック接着法のどちらかによって単球を濃縮する。２ｍＭＬ−グルタミン、２００ＵＩ／ｍｌペニシリン、２００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充し、かつ１０％ＦＢＳまたは５％自己血清の一方を血清補充したＲＰＭＩ１６４０培地３ｍｌを入れた６穴平板に単球を１×１０６細胞／穴となるように蒔く。その６穴平板に死滅した腫瘍細胞を１×１０６死細胞／穴の密度で加える。単球をＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｉｍｍｕｎｅｘ、シアトル、ワシントン州）およびＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ）と共に３日間培養する。
【００３９】
腫瘍細胞系の死滅
多様な癌細胞系から、腫瘍死細胞を調製できる。腫瘍細胞の起源は、本明細書に挙げたものを含むがそれらに限定されず、追加の細胞系の選択およびこれらの細胞を死滅させる方法の変動は当業者の知識の範囲内に十分入る。本発明に有用な癌細胞の死滅法には、放射線照射のようなＤＮＡ損傷を引き起こす条件、またはＦａｓ連結、ＴＮＦ、もしくはＴＲＡＩＬのいずれかを介した受容体介在性細胞死があるが、それに限定されない。例示的な方法を以下に示す。
【００４０】
いったん集密になってから細胞系を回収し、小フラスコに入れて１×１０６細胞／ｍｌの密度で培養する。１８０６乳癌細胞系およびＣｏｌｏ８２９メラノーマ細胞系については、ＴＮＦ−α（１００ｎｇ／ｍｌで使用）を用いた感作ステップの後に、細胞に９０分間放射線照射し、無血清培地に入れて４８時間培養した。Ｍｅ２７５メラノーマ細胞系については、ベツリン酸（ＢＡ）（１０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、セントルイス、ミズーリ州）と共に細胞を４８時間培養した。ＦＩＴＣ−Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖおよびヨウ化プロピジウムを用いた二重染色およびトリパンブルーを用いた排除試験により細胞死を評価した（生存率＜２５％）。
【００４１】
フローサイトメトリー分析（ＦＲＣＳ）による分析。培養を３日間行った後に、細胞を加工してＦＩＴＣ−ＣＤ１ａと、ＰＥ−ＣＤ１４、ＰＥ−ＣＤ８０、ＰＥ−ＣＤ８３またはＰＥ−ＣＤ８６とを用いた二重染色（４℃、３０分間）に供した。
【００４２】
自己増殖アッセイ。培養を３日間行った後に、自己ＣＤ４Ｔ細胞用の刺激物質として細胞を使用した。１０％ヒトＡＢ血清を加えた完全ＲＰＭＩ１６４０培地を入れた微量検査用丸底組織培養平板に１×１０５個のＣＤ４＋Ｔ細胞と共に刺激物質である細胞の段階用量を蒔いた。培養を４日間行った後に、［３Ｈ］チミジン１μＣｉで細胞を一晩パルスし、Ｔ細胞の増殖を測定した。
【００４３】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）発生アッセイ．培養を３日間行った後に、自己ＣＤ８Ｔ細胞および／または自己末梢血リンパ球（ＰＢＬ）用の刺激物質として細胞を使用した。培養物を毎週再刺激し、最初の週にＩＬ−７を、次の週からはＩＬ−２を補充した。メラノーマ細胞を用いた標準クロム放出アッセイでＣＴＬ活性を試験し、そのメラノーマ細胞から標的として腫瘍体を発生させた。
【００４４】
ワクチンの発生
免疫応答能のあるＤＣの発生に有用な本発明のワクチンは、多数のステップと長期の培養時間を要するすでに報告された方法から大きく進歩している。ワンステップ・ワクチンを発生させるための詳細で例示的な方法について以下に記載する。当業者の能力の範囲内である培養条件および調製法の変更または変動は、本発明の一部として意図されることを理解すべきである。
【００４５】
健康志願者または進行メラノーマを有する患者の末梢血から単核細胞を単離する。血液を採取する前に、末梢血幹細胞を動員するために組換えヒトＧ−ＣＳＦ（Ａｍｇｅｎ、サウザンドオークス、カリフォルニア州）を任意選択で個体に投与してもよい（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、２００１）。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離を用いて単球を集め、ＣＭ培地に懸濁する。プラスチック皿（Ｆａｌｃｏｎ製６穴、フランクリンレークス、ニュージャージー州）上に３７℃で２時間接着させることにより単球を濃縮できる。代わりに、Ｄｙｎａｌ（登録商標）単球ネガティブ単離キット（Ｄｙｎａｌ、レークサクセス、ニューヨーク州）を製造業者の使用説明書にしたがって用い、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、および顆粒球を除くことにより単球を濃縮できる。
【００４６】
２ｍＭ Ｌ−グルタミン、２００ＵＩ／ｍｌペニシリン、２００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（全てＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、セントルイス、ミズーリ州から入手）を補充し、かつ１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）または５％自己血清（Ｒ＆Ｄ）の一方を血清補充したＲＰＭＩ１６４０培地３ｍｌを入れた６穴平板（Ｆａｌｃｏｎ）に単球を１×１０６細胞／穴となるように蒔く。濃度１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Ｉｍｍｕｎｅｘ、シアトル、ワシントン州）および２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ）と共に単球を３日間培養した。その６穴平板に死滅した腫瘍細胞を１×１０６死細胞／穴の密度で加えた。別の実施形態では、ＤＣの免疫応答能に影響することなしに、死滅した腫瘍細胞を第１日ではなく第２日に加える。培養物を３７℃で３日間培養する。
【００４７】
多数の方法で培養物を評価できる：（１）ＤＣの形態検査、（２）下記のＦＡＣＳ分析による細胞マーカーの存在、（３）下の自己増殖アッセイの項に記載するようなＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖促進能、および（４）細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）発生アッセイの項に記載するような細胞傷害性Ｔ細胞が誘導する腫瘍細胞の溶解誘導能。
【実施例１】
【００４８】
ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦαと共に３日間培養した単球は、抗原を捕捉でき免疫応答を誘導できる２つの樹状細胞サブセットを生じる
ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦαと共に３日間培養した単球から発生した２種のＤＣ
枯渇により単球を単離し、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４またはＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦαの一方と共に３日間培養した。ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４培養物およびＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦα培養物の両方が典型的な樹状細胞の形態を示し、その形態は位相差顕微鏡で生細胞を観察すると細胞体から多方向に突出した大きく繊細な突起またはベールを特徴的とする（ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、１９９８）。培養した単球はサイトカインの刺激を受けて細胞マーカーを作り出す。蛍光色素で標識したモノクローナル抗体で細胞を染色することによって、これらの新しい細胞マーカーを認めることができ、蛍光顕微鏡で形態および細胞での分布を観察できる。代わりに、細胞集団にある種のマーカーを有する細胞が占める割合を図１Ａ〜１Ｆのようにフローサイトメトリーで分析できる。
【００４９】
ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を加えた対照培養物（以後ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ４−ＤＣと表記）で予想されたように、第３日の細胞はＣＤ１４−（ネガティブ）となり、細胞のおよそ５０％が、ｉｎｔＤＣになる運命のＤＣに分化したことと一致するＣＤ１ａの発現を獲得した（図１Ｅ）。ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦαを加えた第３日の培養物（以後ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦ−ＤＣと表記）はそれとは異なり、ＣＤ１ａまたはＣＤ１４を主に発現する２つの別々の細胞集団が観察された。ＣＤ１ａ＋ＣＤ１４−およびＣＤ１ａ−ＣＤ１４＋細胞は、細胞集団のそれぞれおよそ２０％および２４％となり、それぞれランゲルハンスＤＣおよびｉｎｔＤＣを表している（図１Ｂ）。
【００５０】
ランゲルハンス細胞および間質ＤＣを区別するために別のセットのマーカーを使用できる。ランゲルハンス細胞（ＬＣ）はランゲリンマーカーだけを発現し、一方、間質ＤＣ（ｉｎｔＤＣ）はＤＣ−ＳＩＧＮのみを発現する。蛍光色素であるＦＩＴＣ標識ＤＣ−ＳＩＧＮまたはＰＥ−ＣＤ２０７で染色した場合、細胞集団についてこれらの２つのマーカーの存在または不在を検査でき、それらの割合をフローサイトメトリーの援助で計算できる。図２Ｂに示すように、ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦαと共に培養した第３日の単球は、ランゲルハンス細胞および間質細胞の両方の形成を示すＤＣ−ＳＩＧＮ（％）およびランゲリン（％）を分別発現する細胞を含んでいた。対照的に、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ４の存在下で培養した第３日の単球は、ＦＩＴＣ−ＤＣ−ＳＩＧＮのみに染色され、ＰＥ−ＣＤ２０７／ランゲリンに染色されなかった。これはランゲルハンス細胞だけが発生したことを示している（図２Ａ）。上の結果は、ＴＮＦが樹状細胞の２つのサブセット、すなわちランゲルハンス細胞および間質ＤＣに単球の分化を誘導したことを示した。
【００５１】
ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦαに誘導されたＤＣは抗原の捕捉に効果的である
本発明は、ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦαの存在下で発生した樹状細胞がＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ４を用いた現行法と同じく抗原の捕捉に有効であることを示した。
【００５２】
未熟ＤＣの主な機能は、抗原の捕捉および細胞表面への抗原の提示の過程における初発第一ステップとして抗原を捕捉することである。ＤＣは、（１）大きな粒子を捕捉できる食作用または（２）受容体介在性エンドサイトーシスを含めたいくつかの異なる方法により抗原を捕捉する。図３Ａ〜３Ｆは、ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦまたはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４の存在下で発生した樹状細胞が可溶性抗原または大きな粒子を捕捉する能力を例示している。可溶性抗原については以前に記載されたようにＦＩＴＣ−標識デキストラン（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．、ユージーン、オレゴン州）を使用した（Ｃａｕｘら、１９９７「ＣＤ３４＋ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｃｏｒｄｂｌｏｏｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ａｌｏｎｇ ｔｗｏ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｐａｔｈｗａｙｓｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ ｐｌｕｓ ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ：ＩＩ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｂｌｏｏｄ ９０：１４５８〜１４７０頁）。大きな粒子状抗原については、瀕死の腫瘍細胞（メラノーマまたは乳癌）を回収し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、以前に記載されたようにＤＮＡ特異的蛍光色素である７−アミノアクチノマイシン（７−ＡＡＤ）（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、セントルイス、ミズーリ州）で標識した（Ｎｏｕｒｉ−Ｓｈｉｒａｚｉら、２０００「Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ ｃａｐｔｕｒｅ ｔｕｍｏｒｃｅｌｌ ｂｏｄｉｅｓ ａｎｄｐｒｏｃｅｓｓ／ｐｒｅｓｅｎｔ ｔｈｅｉｒ ａｎｔｉｇｅｎｓｔｏ ｅｌｉｃｉｔ ｐｒｉｍａｒｙ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ」、Ｊ ｌｍｍｕｎｏｌ １６５：３７９７〜３８０３頁；およびＢｅｒａｒｄら、２０００「Ｐｒｉｍｉｎｇｏｆ ｎａｉｖｅ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｇａｉｎｓｔ ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｕｓｉｎｇｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｌｏａｄｅｄｗｉｔｈ ｋｉｌｌｅｄ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ」、Ｊ ＥｘｐＭｅｄ １９２：１５３５〜１５４４頁）。未熟ＤＣを回収し、洗浄し、蛍光色素フィコエリトリン（ＢＤＩＳ）で慣例的な方法を使って標識した抗ＣＤ１１ｃモノクローナル抗体で標識した。染色後、ＤＣを洗浄し２×１０５細胞／ｍｌの濃度となるよう再懸濁した。濃度１ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ−デキストランを４℃または３７℃のいずれかでＤＣ細胞と共培養した。一方、死滅した腫瘍細胞をＤＣ細胞と１：１の比で３７℃で１時間共培養した。
【００５３】
ＤＣによるＦＩＴＣ−デキストランまたは７−ＡＡＤ標識腫瘍細胞体の負荷について、ＣＤ１１ｃおよびデキストランに対して（図３Ａ、３Ｂ、３Ｄおよび３Ｅ）、またはＣＤ１１ｃおよび７−ＡＡＤに対して（図３Ｃおよび３Ｆ）ダブルポジティブであるＤＣの割合をフローサイトメトリーで測定した。第３日のＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦ−ＤＣは、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４−ＤＣと類似したレベルの可溶性抗原（ＦＩＴＣ−デキストラン）および粒子状抗原（死滅腫瘍細胞）の両方を捕捉した。
【００５４】
ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦにより発生した第３日のＤＣは免疫反応を効果的に開始する
本発明は、ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦ法により発生した第３日のＤＣがＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の増殖を誘導することにより免疫反応を効果的に開始することを示した。
【００５５】
抗原の捕捉およびプロセシング後に、未熟ＤＣは成熟し免疫応答を誘導する能力を獲得する。ＤＣは多様なＴ細胞の生育および活性化を刺激でき、例えばＣＤ８Ｔ細胞がＭＨＣクラスＩ保持ＤＣを経由して細胞傷害性Ｔ細胞に、またはＣＤ４＋Ｔ細胞がＭＨＣクラスＩＩ保持ＤＣを経由してヘルパーＴ細胞になるのを刺激する（ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、１９９８）。
【００５６】
増殖アッセイにおいて、ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦまたはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ４から発生した第３日のＤＣを、１穴あたり０〜２５００個の段階用量の抗原提示細胞（ＡＰＣ）の入った９６穴平板に蒔いた。健康な個体のＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌで分離して精製したＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞を得、種々のモノクローナル抗体を使って他の種類の細胞を枯渇させ（Ｎｏｕｒｉ−Ｓｈｉｒａｚｉら、２０００「Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ ｃａｐｔｕｒｅ ｋｉｌｌｅｄｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄｐｒｅｓｅｎｔ ｔｈｅｉｒ ａｎｔｉｇｅｎｓｔｏ ｅｌｉｃｉｔ ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ」、Ｊ ｌｍｍｕｎｏｌ １６５：３７９７〜３８０３頁）、５×１０４／穴／２００μｌの密度でＤＣを含む穴に加えた。培養を４日行った後に、トリチウムチミジン（Ｗａｌｌａｃｅ、Ｉｎｃ．、ゲーサーズバーグ 、メリーランド州）を１μＣｉ／穴の放射能で加えた。平板を１６時間後に回収し、製造業者の取扱説明書にしたがって液体シンチグラフィーで取り込まれた放射能を測定した。
【００５７】
図４に示すように、第３日のＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦ−ＤＣは免疫反応を開始できた。これは、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ４ＤＣと同じくらい効率的に同種ＣＤ４Ｔ細胞の増殖を誘導することにより実証され、この能力は用量に依存するようである。ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦαからのＤＣおよびＧＭ／ＣＳＦ／ＩＬ４からのＤＣの両方が比較的低細胞数でＣＤ８型Ｔ細胞の増殖を刺激できた（図５）。
【００５８】
まとめると、本発明は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦαを加えて３日間培養した単球がランゲルハンス細胞およびｉｎｔＤＣの両方を産生し、これらのＤＣは抗原を捕捉し免疫応答を誘導できることを実証した。
【実施例２】
【００５９】
ワンステップ・ワクチンは抗原を捕捉でき免疫応答を誘導できる樹状細胞の２つのサブセットを生じる
本発明は、免疫応答能を有するＤＣをわずか３日で発生できる新規なワンステップ法を提示している。多数のステップと長期の培養とを必要とする、単球から樹状細胞を作製するすでに報告された方法とは対照的に、本発明の方法はＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦαの存在下で抗原性物質と共に単球を同時培養することを含み、抗原は初期段階でＤＣに対して提示される。この方法により発生したＤＣはいくつかの尺度により成熟している：（１）捕捉されプロセシングされた抗原、（２）ＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞の増殖誘導能、ならびに（３）Ｔ細胞に対する抗原提示能。以下に本ワンステップ・ワクチンの種々の態様を記述する。
【００６０】
単球と腫瘍死細胞とを混合し、ＧＭ−ＣＳＦの存在下で、ＩＬ４もしくはＴＮＦαを添加するかまたは添加せずに３日間培養することによって、本ワンステップ・ワクチンが抗原を捕捉する能力を実証した。第３日にギムザ染色した細胞は死滅した腫瘍細胞の捕捉を示した。具体的には、第３日のＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦ培養において未捕捉の腫瘍体はほとんど残っていなかった。
【００６１】
死滅した腫瘍細胞と共に培養した第３日のＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦ細胞はＤＣの性質を保持し、ＣＤ４型（図６Ａおよび６Ｂ）およびＣＤ８型（図７Ａおよび７Ｂ）両方の同種Ｔ細胞の増殖を誘導できた。死滅した腫瘍細胞と共に培養した第３日のＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦ細胞は、抗原の非存在下で発生したＤＣよりもＣＤ８型Ｔ細胞の増殖を刺激する能力が高かった（図７Ｂ）。さらに重要なことには、ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦ−ＤＣが同種ＣＤ４Ｔ細胞の増殖を誘導する能力から実証されるように、それらの細胞は腫瘍細胞抗原を提示できた（図８Ｂ）。このワンステップ・ワクチンを介して発生する際に抗原に出会ったＤＣは、自己ＣＤ４Ｔ細胞に対する腫瘍細胞抗原の提示がはるかに優れている。
【００６２】
腫瘍体およびＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦαと共に培養した単球の表現型の詳細な分析は、単球が樹状細胞の２つのサブセット、すなわちランゲルハンス細胞および間質ＤＣに分化する能力を保持していることを示した（図９Ａ〜９Ｌ）。単球：腫瘍死細胞比が１：０．１で最適な分化を認めた。１：１および１：０．３のようなそれよりも高い単球：腫瘍体比では、ランゲリンマーカーの存在で実証されるランゲルハンス細胞の比率が減少する。図１０Ａ〜１０Ｉに示すように、腫瘍死細胞を第２日に単球培養物に加えることもできる。この場合単球はランゲルハンス細胞およびｉｎｔＤＣに分化する。フローサイトメトリーのフォワードスキャッター／サイドスキャッタープロットは、細胞集団がランゲルハンス細胞およびｉｎｔＤＣの両方を示すＣＤ１４＋型およびＣＤ１ａ型の両方を含むことを示す（図１０Ｅ〜１０Ｆ）。これらの実験は、第１日または第２日に抗原を加えることが２つの種類の樹状細胞を発生させるプロセスに影響しないことを例示している。さらに、これらの実験は、現行の希釈力価を案内として使用して特定の抗原比を実験的に測定する必要を例示している。
【００６３】
ワンステップ・ワクチンの細胞も免疫エフェクターの混合に対して腫瘍細胞抗原を提示できた。実際、図１１に示すように腫瘍死細胞およびＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦαと共に３日間培養した単球は自己末梢血リンパ球の増殖を誘導できた。この場合、単球：腫瘍体比は１：０．３で最適である。
【００６４】
ワンステップ・ワクチンは細胞傷害性Ｔ細胞を誘導してメラノーマを死滅させる
本発明のワンステップ・ワクチンはメラノーマに対して細胞傷害効果を誘導する能力が実証された。抗原性物質としてメラノーマＣｏｌｏ８２９死細胞が単球培養物中に存在したことを除き、ワンステップ・ワクチンの発生を実施例１および２に記載したように行う。
【００６５】
いったん集密になってから、Ｃｏｌｏ８２９メラノーマ細胞系を回収し、小フラスコに入れて１×１０６細胞／ｍｌの密度で培養した。ＴＮＦ−α（１００ｎｇ／ｍｌ）を用いた感作ステップ後に、細胞を９０分間放射線照射し、無血清培地に入れて４８時間培養した。ＦＩＴＣ−ＡｎｎｅｘｉｎＶおよびヨウ化プロピジウムを用いた二重染色およびトリパンブルーを用いた排除試験により細胞死を評価した（生存率＜２５％）。
【００６６】
ＣＴＬ発生アッセイ。培養を３日間行った後に、自己ＣＤ８Ｔ細胞および／または自己末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の刺激物質として細胞を使用した。培養物を毎週再刺激し、最初の週にＩＬ−７を、次の週からはＩＬ−２を補充した。メラノーマ細胞を用いた標準クロム放出アッセイでＣＴＬ活性を試験し、そのメラノーマ細胞から標的として腫瘍体を発生させた。
【００６７】
最後に、ワンステップ・ワクチンの細胞は、自己ＣＤ８Ｔ細胞を誘導して抗原として使用したメラノーマ細胞を死滅できるＣＴＬに分化させた（図１２Ａ、１２Ｂ、１３Ａ、１３Ｂ、１４Ａおよび１４Ｂ）。抗原（Ｃｏｌｏ８２９メラノーマ死細胞）をパルスされなかったワクチンは、Ｋ５６２およびＣｏｌｏメラノーマ腫瘍のうち一方の腫瘍細胞の細胞傷害性Ｔ細胞介在性溶解を誘導できなかった。Ｃｏｌｏ８２９メラノーマ死細胞でパルスしたワンステップ・ワクチンは、細胞傷害性Ｔ細胞の刺激により、対照腫瘍細胞系Ｋ５６２ではなくメラノーマ腫瘍細胞の溶解を選択的に引き起こした。細胞傷害性Ｔ細胞の２回刺激は３回刺激と同程度に有効であった（図１３Ｂおよび１４Ｂ）。さらに、このワンステップ・ワクチンがメラノーマ細胞に仲介される細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する能力は以前に報告された方法のＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４ワクチンと同様であった。
【００６８】
ここに示した方法を用いて、他の種類の腫瘍細胞をＤＣ細胞のパルスに使用でき、そうするとこれらの腫瘍に及ぼす毒性をここに概略を述べたアッセイを用いて測定でき、エフェクター対標的比として最適な比を本明細書において概略を述べた方法および範囲を用いて実験的に決定できよう。全体的にみて、本明細書において提示されたデータから、メラノーマの治療及び根絶においてワンステップ・ワクチンがメラノーマに対して発揮する能力が実証された。さらに、本明細書において概略を述べた方法を用いて、本方法が他の種類の癌を治療する可能性が実証されている。
【実施例３】
【００６９】
ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦαと共に３日間培養した単球から得られた樹状細胞のさらなるキャラクタリゼーション
別の研究では、枯渇により単球を単離しＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦαと共に３日間培養した。生じたＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦ−ＤＣは自己Ｔ細胞に抗原を提示できた。図１５Ｄに示すように、Ｆｌｕ−ＭＰペプチドをパルスされたＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦ−ＤＣは１週間培養物中のＦｌｕ−ＭＰ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増大を誘導するために有効であった。
【００７０】
さらなる検査で、ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦ−ＤＣは異なる生物学的性質を有する別個のサブセットであるＬＣ（ＣＤ１ａ＋ＣＤ１４−ＣＤ２０７＋）、ｉｎｔＤＣ（ＣＤ１ａ＋ＣＤ１４＋ＣＤ２０７−）およびＤＮ−ＤＣ（ＣＤ１ａ−ＣＤ１４−）からなることが分かった。表示した表面マーカーＣＤ１ａ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）、ＣＤ２０７（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＣＤ１４（ＢＤＩＳ）に対する抗体で表面染色しフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ、ＢＤＩＳ）を用いて選別してこれらのサブセットを分離する。マイクロアレイ分析から、これらのＤＣサブセットは、独特の生物学的機能に変換されうる独特の分子シグネチャーを表出することを確認した。特異的遺伝子ファミリーの予備分析は抗原プロセシング分子、ケモカインおよびそれらの受容体、サイトカインおよびそれらの受容体、ならびに接着分子が分別発現していることを示した。分別発現の２、３の例を図１６および１７に示す。図１６に示すように表面表現型と一致してＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦ−ＤＣのＣＤ１ａ＋サブセットは高レベルのＣＤ１ａおよびランゲリンｍＲＮＡ（ＣＤ２０７＋）を発現し、ランゲルハンス細胞に分化したことを示す。ＣＤ１４＋サブセットはＤＣ−ＳＩＧＮのｍＲＮＡ（ＣＤ２０９＋）を発現し、間質ＤＣに分化したことと一致した。ＤＮ−ＤＣは選択したマーカーのどれもあまり発現しなかった。図１７に示すように、３つのサブセットは異なるサイトカインを発現し、ＣＤ１ａ＋ＤＣはＴＧＦαおよびＩＬ−８を専ら発現し、ＣＤ１４＋ＤＣはＩＬ−１を発現した。興味深いことにＤＮ−ＤＣは高レベルのリンホトキシンβ（ＬＴＢ）のｍＲＮＡ、およびＣＤ８＋エフェクター／記憶Ｔ細胞の成熟に必須のサイトカインであるＩＬ−１５を発現した。
【００７１】
ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦ−ＤＣの別個のサブセットが異なるＴ細胞応答を誘導することにより異なる機能を示した。非活性化ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦ−ＤＣの選別後のサブセットを同種ナイーブＣＤ８Ｔ細胞またはＣＤ４Ｔ細胞と共に培養した。Ｔ細胞応答を２つのレベルで分析した：（ａ）培養５日後の増殖（トリチウムチミジンの取り込み）および（ｂ）Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイチップを用いた全体的ｍＲＮＡ分析。ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦ−ＤＣの全てのサブセットは同種ナイーブＣＤ８Ｔ細胞の活発な増殖を誘導した。全てのサブセットはナイーブＣＤ４Ｔ細胞をプライミングすることもできたが、ｉｎｔＤＣ（ＣＤ１４＋）を加えた培養物中のＣＤ４Ｔ細胞の増殖はあまり顕著ではなかった（図１８）。ＣＤ４Ｔ細胞における全体的なｍＲＮＡの発現の分析は、ｉｎｔＤＣ（ＣＤ１４＋）に対するＣＤ４Ｔ細胞応答が他のＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦ−ＤＣサブセットに比べて著しい差を示した。例えばＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦ−ＤＣの別個のサブセットによりプライミングされたＣＤ４Ｔ細胞ではケモカイン受容体（ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ２、およびＣＣＲ７）が分別発現することを観察した（図１９）。これは、これらのＴ細胞が異なる遊走能を表す可能性があることを示している。
【００７２】
ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦ−ＤＣのさらなる検討では、第４のサブセットを（ＣＤ１ａ− ＣＤ１４＋ＣＤ２０９＋）とキャラクタリゼーションした。
【実施例４】
【００７３】
単球由来ワクチンを用いたメラノーマを有する患者の治療
本発明の単球由来ワクチンを用いてメラノーマを有する患者の治療を実証するために、ＣＤ３４＋前駆細胞由来ＤＣを用いた治験と類似したプロトコルで、生検により証明されたステージＩＶのメラノーマを有する患者にワクチンを投与する（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、２００１「Ｉｍｍｕｎｅ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ ｔｏ ＣＤ３４（＋）ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｖａｃｃｉｎｅ」、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ ６１：６４５１〜６４５８頁）。
【００７４】
ワクチンを調製するために、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離により各患者の末梢血から単球を単離し、枯渇法または接着法により濃縮し、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦαを含む培地を入れたマイクロプレートに蒔く。以下の方法の１つによりワクチンを作製する：（１）第１日に当技術分野で公知の好ましい方法により（Ｃｏｌｏ８２９細胞系またはそれぞれの患者からの）メラノーマ細胞を死滅させ、単球およびＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦαを含む培地に加える、（２）第１日に全ての細胞にキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を曝露し、細胞のサブセットすなわち２０％に限定的なインフルエンザマトリックスペプチド（Ｆｌｕ−ＭＰ）をパルスし、残りの細胞（すなわち８０％）にＭａｌａｎＡ／ＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ−３およびｇｐ１００のような４つのメラノーマ抗原に由来するペプチドをパルスする、（３）第２日に放射線照射により（Ｃｏｌｏ８２９細胞系またはそれぞれの患者からの）メラノーマ細胞を死滅させ、単球およびＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦαを含む培地に加える、または（４）第２日に全ての細胞にキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を曝露し、細胞のサブセットすなわち２０％に限定的なインフルエンザマトリックスペプチド（Ｆｌｕ−ＭＰ）をパルスし、残りの細胞（すなわち８０％）にＭａｌａｎＡ／ＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ−３およびｇｐ１００のような４つのメラノーマ抗原に由来するペプチドをパルスする。培養第３日に抗原負荷した抗原提示細胞を回収し、洗浄し、ワクチンに製剤化する。次に実施例１および２に十分定義された方法を用いて以下を含めるがそれに限定されない基準により患者に使用する前にワクチンを評価する：ＤＣの形態、表現型分析により測定された細胞調製物中のＤＣ最小値が少なくとも２０％であること（残りの部分はＤＣ前駆体などを含む）、ならびに／または細胞マーカーを決定するためのモノクローナル抗体パネルとの反応性および／もしくはリンパ球の反応を刺激する能力。
【００７５】
６週間の外来患者コースで本発明のワクチンを用いて患者を治療し、１４日毎に合計４回ワクチン接種する。患者の腿および上腕を含めた３つの注射部位にワクチンを投与する。ワクチン接種前の少なくとも２時点、ならびにワクチン接種の各回後５および／または１４日ならびに４回目のワクチン接種後１４または２８日に免疫モニタリングを行う。治験前および４回目のワクチン接種後４週間目に全ての患者について腫瘍状態の評定を行う。疾患の進行を標的病巣での２５％を超える増加および／または新しい病巣の出現と定義する。患者の応答の分析をいくつかの群、すなわち少なくとも１つのメラノーマ抗原に対する応答、多数のメラノーマ抗原に対する応答、死滅したメラノーマ全細胞に対する応答、ならびにＫＬＨおよびＦｌｕ−ＭＰのような対照抗原に対する応答に分割する。免疫応答は腫瘍の進行データと相関する。
【実施例５】
【００７６】
単球由来の抗原負荷した抗原提示細胞を用いた抗原特異的非応答性の誘導
本発明にしたがって作製した樹状細胞に抗原性物質を負荷する。その物質に対してＴ細胞を非応答性にできる。この方法では、ＧＭ−ＣＦＳおよびＴＮＦαにより発生した抗原負荷したＤＣのＣＤ１４＋ＣＤ１ａ−サブセットをＴ細胞に曝露する。このようにして、Ｔ細胞は抗原を認識できるが、非応答性になり同抗原で再刺激した場合に増殖できない。
【００７７】
Ｆｉｃｏｌｌで分離した健康被験者のＰＢＭＣから精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を得て、ＣＤ８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ｂ９．１１）、ＣＤ１４ｍＡｂ（ＲＭＯ５２）、ＣＤ１６ｍＡｂ（３Ｇ８）、ＣＤ１９ｍＡｂ（Ｊ４．１１９）、ＣＤ５６ｍＡｂ（ＮＫＨ−１）、抗ＨＬＡ−ＤＲｍＡｂ（Ｂ８．１２．２）、抗グリコホリンＡ ｍＡｂ（Ｄ２．１０）（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ、マイアミ、フロリダ州）およびヤギ抗マウスＩｇＧＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ、レークサクセス、ニューヨーク州）を用いて他の細胞を枯渇させる。濃縮後の細胞集団の純度は＞９０％であった。抗原負荷したＤＣを調製し、本明細書に記載したようにナイーブＣＤ４Ｔ細胞の刺激に使用した。
【００７８】
本明細書に記載したようにＴＮＦαおよびＧＭ−ＣＳＦを用いて調製した単球由来ＤＣのＣＤ１４＋ＣＤ１ａ−サブセットと共に２４穴平板で精製ＣＤ４＋Ｔ細胞（１０６／穴）を共培養する。その５日後にＴ細胞を回収し、洗浄し、さらに２日間休止させる。増殖アッセイでは初代培養からのＴ細胞に適当な抗原を再攻撃誘発し、トリチウムチミジン（最終１６時間に１μＣｉ／穴）の取り込みから増殖を測定する。
【００７９】
まとめると、本発明は３日で樹状細胞ワクチンを作製する方法である。好ましい方法では、ワンステップで樹状細胞を発生させ抗原を負荷し、抗原負荷した樹状細胞ワクチンが３日で利用できる。別の方法では、樹状細胞の発生および抗原負荷をツーステップで実施し、抗原負荷した樹状細胞ワクチンを３日で利用できる。好ましい方法では、血中白血球搬出で樹状細胞ワクチンを調製する。別の好ましい方法では、血液ユニットからワクチンを調製する。好ましい方法では、サイトカインを模倣する化学物質／ペプチド／ペプトイドを前駆体に曝露することによってワクチンを作製できる。別の好ましい方法では、単球からのサイトカイン放出を誘発する分子および／または粒子を用いてワクチンを作製できる。本発明の好ましい方法にしたがって作製された樹状細胞ワクチンは、ＴＮＦαを含めるがそれに限定されない活性化物質を、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含めるがそれに限定されない増殖因子と好ましくは組み合わせて用いて、インターロイキン４およびインターロイキン１３のどちらも用いずに単球から得られる。好ましくは本発明の好ましい方法にしたがって製造された樹状細胞ワクチンは、ランゲルハンス細胞を含み、ＴＮＦαを含めるがそれに限定されない活性化物質を、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含めるがそれに限定されない増殖因子と好ましくは組み合わせて用いて、インターロイキン４、形質転換増殖因子β、およびインターロイキン１５のいずれも用いずに単球から得られる。抗原負荷に関しては、本発明の樹状細胞ワクチンは、免疫複合体のような可溶性タンパク質または腫瘍死細胞を含めるがそれに限定されない可溶性または粒子状抗原性物質を好ましくは負荷している。別の方法では、本発明の樹状細胞ワクチンはエキソソームを用いて負荷している。
【００８０】
これらの方法にしたがって、生じたワクチンは、ランゲルハンス細胞および間質樹状細胞を含めるがそれに限定されない血液前駆体からの樹状細胞の２つのサブセットから好ましくは構成される。以下を含めるがそれに限定されない多様な目的に本発明の方法にしたがって製造された樹状細胞ワクチンを使用できる：（１）癌、感染症、ウイルス性疾患、および自己免疫疾患を含めるがそれに限定されない疾患の治療、（２）エキソソームの発生、（３）ｉｎｖｉｔｒｏアッセイでの腫瘍特異的免疫応答のモニタリング、および（４）ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイでの抗原特異的免疫応答のモニタリング。
【００８１】
本発明は、ワンステップ３日の樹状細胞ワクチンをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで用いて腫瘍細胞に対する細胞傷害性免疫応答を誘導する方法でもある。本発明の方法にしたがって、分配された腫瘍抗原または多数の腫瘍抗原に対して細胞傷害性免疫応答を誘導することができる。生じた免疫エフェクター細胞はＣＤ４ポジティブ細胞、ＣＤ８ポジティブ細胞、ナチュラルキラー細胞またはナチュラルキラーＴ細胞でありうる。好ましい方法では、ｉｎｖｉｖｏで免疫エフェクター細胞を発生させる。別の好ましい方法では、ｅｘ ｖｉｖｏで免疫エフェクター細胞を発生させ患者に投与する。別の好ましい方法では、ｉｎｖｉｔｒｏ研究目的で免疫エフェクター細胞を発生させる。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】ＦＳＣ／ＳＳＣ、ＣＤ１ａ／ＣＤ１４、およびＣＤ１ａ／ＨＬＡ−ＤＲに関して、ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦαと共に培養した単球の第３日の表現型（図１Ａ〜１Ｃ）を、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４と共に培養した単球（図１Ｄ〜１Ｆ）と比較した図である。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を加えた対照培養で予想されるように、細胞はＣＤ１４ネガティブになり、細胞のおよそ５０％がＤＣへの分化と一致するＣＤ１ａの発現を獲得した（図１Ｅ）。しかし、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦαを伴う第３日の培養物では２つの別々の細胞集団であるＣＤ１ａ＋ＣＤ１４−細胞（２０％）およびＣＤ１ａ−ＣＤ１４＋細胞（２４％）がみられた（図１Ｂ）。
【図２】それぞれ間質ＤＣ（ｉｎｔＤＣ）およびランゲルハンス細胞（ＬＣ）の表面マーカーであるＤＣ−ＳＩＧＮおよびランゲリンの発現に関して、ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦαと共に培養した第３日の単球の表現型（図２Ｂ）を、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４と共に培養した単球（図２Ａ）と比較した図である。ＴＮＦ培養物はＤＣ−ＳＩＧＮおよびランゲリンを分別発現する細胞を含んでいた。ＴＮＦ−ＤＣとは逆に、ＩＬ４−ＤＣは均質で大部分の細胞がｉｎｔＤＣへの分化と一致するＤＣ−ＳＩＧＮ＋ランゲリン−であった。
【図３】ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦαと共に３日間単球を培養することによって発生した樹状細胞の抗原捕捉の有効性を、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４処理法により作製した樹状細胞と比較した図である。ＴＮＦ−ＤＣは可溶性抗原（ＦＩＴＣ−デキストラン）（図３Ａ〜３Ｂ）および粒子状抗原（死滅した腫瘍細胞）（図３Ｃ）の両方の捕捉においてＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４ＤＣと同様の有効性を示した（可溶性ＦＩＴＣ−デキストランを図３Ｄおよび３Ｅに、粒子状抗原を図３Ｆに示す）。
【図４】同種ＣＤ４Ｔ細胞の増殖誘導により実証される第３日のＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦ ＤＣが免疫応答を開始する能力をＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４ ＤＣと比較した図である。第３日のＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦＤＣおよびＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４ ＤＣの両方がＣＤ４Ｔ細胞の増殖を誘導する能力を実証した。
【図５】第３日のＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦ ＤＣが同種ＣＤ８Ｔ細胞の増殖を誘導する能力をＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４ ＤＣと比較した図である。第３日のＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦＤＣおよびＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４ ＤＣの両方がＣＤ８Ｔ細胞の増殖を誘導する能力を実証した。
【図６】腫瘍死細胞の存在下または非存在下で、ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦα（図６Ｂ）またはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４（図６Ａ）の一方と共に３日間培養した単球が、同種ＣＤ４Ｔ細胞の増殖を誘導する能力を示す図である。第３日のＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦα／腫瘍死細胞のワンステップ・ワクチンは同種ＣＤ４Ｔ細胞の増殖を誘導できた。
【図７】腫瘍死細胞の存在下または非存在下で、ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦα（図７Ｂ）またはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４（図７Ａ）の一方と共に３日間培養した単球が、同種ＣＤ８Ｔ細胞の増殖を誘導する能力を示す図である。第３日のＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦα／腫瘍死細胞のワンステップ・ワクチンは同種ＣＤ８Ｔ細胞増殖を誘導できた。
【図８】腫瘍死細胞の存在下または非存在下で、ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦα（図８Ｂ）またはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４（図８Ａ）の一方と共に３日間培養した単球が、自己ＣＤ４Ｔ細胞に腫瘍細胞抗原を提示する能力を示す図である。第３日のＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦα／腫瘍死細胞のワンステップ・ワクチンは、自己ＣＤ４Ｔ細胞の増殖を誘導できることから実証されるように、自己ＣＤ４Ｔ細胞に腫瘍細胞抗原を提示できた。
【図９】死滅した腫瘍細胞の存在下または非存在下で、ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦαと共に３日間培養した単球が、樹状細胞の２つのサブセット、すなわちランゲルハンス細胞（ランゲリン＋およびＤＣ−ＳＩＧＮ−）および間質樹状細胞（ランゲリン＋およびＤＣ−ＳＩＧＮ＋）に分化する能力を示す図である。腫瘍体のタイトレーションは単球：腫瘍体比１：０．１で最適な分化を示す（図９Ｌ）。
【図１０】単球培養の第２日に段階用量で加えた腫瘍死細胞の存在下で、ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦαと共に３日間培養した単球が、樹状細胞の２つのサブセット、すなわちランゲルハンス細胞（ランゲリン＋およびＤＣ−ＳＩＧＮ−）および間質樹状細胞（ランゲリン＋およびＤＣ−ＳＩＧＮ＋）に分化する能力を示す図である。
【図１１】腫瘍死細胞の存在下または非存在下で、ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦαと共に３日間培養した単球が、自己免疫エフェクター（末梢血リンパ球）に腫瘍細胞抗原を提示する能力を示す図である。単球：腫瘍体比１：０．３で最適な提示が観察される。
【図１２】腫瘍死細胞の存在下（図１２Ｂ）または非存在下（図１２Ａ）で、ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦαと共に３日間培養した単球が、自己ＣＤ８＋Ｔ細胞から、培養２週間後ですでにメラノーマ細胞を死滅できる細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）への分化を誘導する能力を示す図である。
【図１３】腫瘍死細胞の存在下（図１３Ｂ）または非存在下（図１３Ａ）で、ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦαと共に３日間培養した単球が、自己ＣＤ８＋Ｔ細胞から、３回の刺激でメラノーマ細胞を死滅できる細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）への分化を誘導する能力を示す図である。
【図１４】腫瘍死細胞の存在下（図１４Ｂ）または非存在下（図１４Ａ）で、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４と共に３日間培養した単球が、自己ＣＤ８＋Ｔ細胞から、２回の刺激でメラノーマ細胞を死滅できる細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）への分化を誘導する能力を示す図である。
【図１５】ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦα ＤＣがペプチド特異的リコールＣＤ８Ｔ細胞応答を誘導する能力を示す図である。Ｆｌｕ−ＭＰペプチドをパルスしたＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４ＤＣまたはＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦα ＤＣを自己ＣＤ８Ｔ細胞と共に１：１０の比で、サイトカインを補充して（ＩＬ−７およびＩＬ−２、１０Ｕ／ｍｌ）培養した。第１０日に抗ＣＤ８（横座標）およびＦｌｕ−ＭＰ四量体（縦座標）でＴ細胞を標識し、特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増大を測定した。Ｆｌｕ−ＭＰペプチドをパルスしたＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦα ＤＣは、１０日培養物中でＦｌｕ−ＭＰ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増大の誘導に有効であることが示される（図１５Ｄ）。
【図１６】ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦα ＤＣの別個のサブセットの表面表現型に関してＤＣの遺伝子発現パターンを示す図であり、ＣＤ１４＋ｉｎｔＤＣ（横縞）、ＣＤ１ａ＋ＬＣ（水玉）およびＣＤ１４−ＣＤ１ａ−ＤＮ−ＤＣ（縦縞）について表示した遺伝子（横座標）の発現倍率（縦座標）を示している。これらのＤＣサブセットの間で分別発現する統計的に有意な遺伝子から、表示した遺伝子ＣＤ１ａ、ＤＣ−ＳＩＧＮ（ＣＤ２０９とも知られている）、およびランゲリン（ＣＤ２０７としても知られている）を選択した。ＣＤ１４＋サブセットは、ｉｎｔＤＣであることを示すＤＣ−ＳＩＧＮを発現した。ＣＤ１ａ＋サブセットはＬＣであることを示すランゲリンを発現した。ＤＮ（ダブルネガティブ）サブセットは選択したマーカーのいずれもあまり発現しなかった。
【図１７】ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦα ＤＣの別個のサブセットのサイトカインｍＲＮＡの分別発現を示す図であり、ＣＤ１４＋ｉｎｔＤＣ（横縞）、ＣＤ１ａ＋ＬＣ（水玉）およびＣＤ１４−ＣＤ１ａ−ＤＮ−ＤＣ（縦縞）について表示した遺伝子（横座標）の発現倍率（縦座標）を示している。ＤＣサブセットはサイトカインＩＬ−１、ＩＬ−１５、ＩＬ−８、ＬＴＢ（リンホトキシンβ）およびＴＧＦＡ（形質転換増殖因子α）の有意に異なる発現を示し、ＣＤ１４＋サブセットはＩＬ−１を発現し、ＣＤ１ａ＋ＤＣサブセットは専らＴＧＦＡおよびＩＬ−８を発現し、ＤＮサブセットはＩＬ−１５およびＬＴＢを発現した。
【図１８】ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦα ＤＣサブセットがナイーブ同種ＣＤ４Ｔ細胞の著しい増殖を誘導する能力を示す図である。ＤＣの総培養物または選別したサブセットをナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ−）ＣＤ４＋Ｔ細胞と共に段階的な用量（横座標）で平板培養する。第５日にチミジンの取り込み（縦座標）により増殖を測定する。全てのサブセットがナイーブＣＤ４Ｔ細胞をプライミングできたが、ｉｎｔＤＣ（ＣＤ１４＋）を加えた培養ではＣＤ４Ｔ細胞の増殖はあまり顕著ではない。
【図１９】ＧＭ−ＣＳＦ／ＴＮＦα ＤＣの別個のサブセットでプライミングしたＣＤ４Ｔ細胞におけるケモカイン受容体の分別発現を示す図であり、ｉｎｔＤＣ（ＣＤ１４、横縞）、ＣＤ１ａＤＣ（ＬＣ、水玉）またはＤＮ−ＤＣ（縦縞）を加えた培養における発現倍率（縦座標）を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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