(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光を放射可能で、光によってスイッチング可能な複数の実体を提供する工程であって、前記光によってスイッチング可能な複数の実体のうちの少なくともいくつかが、放射される光の波長よりも短い分離距離離れている、工程と、
前記光によってスイッチング可能な複数の実体の一部分を活性化させ、光を放射させる工程と、
前記放射された光を測定する工程と、
前記光によってスイッチング可能な複数の実体の活性化された部分を不活性化する工程と、
前記光によってスイッチング可能な複数の実体を活性化し、不活性化する工程を繰り返して、前記光によってスイッチング可能な複数の実体により放射される光により形成された前記光によってスイッチング可能な複数の実体の画像を用いて、前記光によってスイッチング可能な複数の実体のｘ位置、ｙ位置、およびｚ位置を決定する工程とを含み、
前記画像は、前記光によってスイッチング可能な複数の実体から放射される光の通過方向に対して非点収差を付与する光学系を介して形成された非点収差像であり、
前記画像が楕円ガウシアン関数にフィッティングされて、前記光によってスイッチング可能な複数の実体のｘ位置、ｙ位置、およびｚ位置が決定され、
前記光によってスイッチング可能な複数の実体のｘ位置、ｙ位置、およびｚ位置は、３Ｄ空間座標であり、各々は、前記光によってスイッチング可能な複数の実体により放射される光の波長よりも小さい精度で決定される、方法。
【請求項２】
前記光によってスイッチング可能な複数の実体のそれぞれのｘ位置、ｙ位置、およびｚ位置を用いて、前記光によってスイッチング可能な複数の実体の超高解像度画像を構築する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
検出器での前記光によってスイッチング可能な複数の実体の画像の形状から、前記光によってスイッチング可能な複数の実体のｚ位置を決定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
検出器での前記光によってスイッチング可能な複数の実体の画像の強度から、前記光によってスイッチング可能な複数の実体のｚ位置を決定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記光によってスイッチング可能な複数の実体の一部分により放射される光にレンズを通させる工程を含み、前記レンズは、前記光によってスイッチング可能な複数の実体の前記一部分により放射される光が前記レンズを通る方向に対して、円対称でない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記光によってスイッチング可能な複数の実体の一部分により放射される光を複数の検出器で集める工程をさらに含み、前記光によってスイッチング可能な複数の実体の一部分のうちのいくつかが、前記複数の検出器のうちの少なくとも１つの検出器の焦点領域にはない、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
２点以上の時間点で、および／または時間の関数として、前記光によってスイッチング可能な複数の実体の位置を決定する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府の支援）
本発明の様々な局面を導く研究は、少なくとも一部を、国立衛生研究所によって後援された。米国政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
【０００２】
（関連出願）
本出願は、２００７年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／００８，６６１号（発明の名称：「Ｓｕｂ−Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｌｉｍｉｔ  Ｉｍａｇｅ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ｔｈｒｅｅ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ」、Ｚｈｕａｎｇらによる）の利益を主張し、この出願は、本明細書中に参考として援用される。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、三次元画像化技術を含む、回折限界未満の画像解像技術（ｓｕｂ−ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｌｉｍｉｔ  ｉｍａｇｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）および他の画像化技術に関する。
【背景技術】
【０００４】
（背景）
蛍光顕微鏡法は、分子生物学および細胞生物学、およびその他の非侵襲性の時間分解画像化用途において広く使用されている。標準的な蛍光顕微鏡法は、上述のような利点があるにもかかわらず、光の回折による解像度の限界があるため、超微細構造の画像化には有用ではない。この回折限界を超えるために、近接場光学顕微鏡法（ＮＳＯＭ）、誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）、可逆的飽和性光学蛍光遷移（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｓａｔｕｒａｂｌｅ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｌｉｎｅａｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）（ＲＥＳＯＬＦＴ）および飽和構造化照射顕微鏡法（ｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ−ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）（ＳＳＩＭ）を含むいくつかのアプローチが用いられているが、それぞれ特定の満足できない限界を有する。電子顕微鏡法は、生体サンプルを高解像度で画像化するために使用されることが多いが、電子顕微鏡法は、光ではなく電子を使用し、調製する必要があるため、生体サンプルに用いるのは困難である。したがって、生体サンプルおよび他のサンプルを超高解像度で画像化するために、蛍光顕微鏡の利点を活かす（例えば、生きた生体サンプルに対し、分子特異性および／または分子適合性を有するように）、非侵襲性の技術を含む新しい技術が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、一般的に、三次元画像化技術を含む、回折限界未満の画像解像技術および他の画像化技術に関する。本発明の主題は、いくつかの場合には、相互に関連する製品、特定の問題に対する代替的な解決法、および／または１つ以上のシステムおよび／または物品の複数の異なる用途に関する。
【０００６】
一態様では、本発明は、ある方法に関する。ある一連の実施形態では、この方法は、約１０００ｎｍ未満の距離離れた第１の実体および第２の実体を提供する工程と、第１の実体から放射される光を測定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ）工程と、第２の実体から放射される光を測定する工程と、第１の実体から放射される光と第２の実体から放射される光とを用い、第１の実体および第２の実体のｘ位置、ｙ位置、およびｚ位置を決定する工程とを含む。この方法は、別の一連の実施形態では、所定の分離距離離れた第１の実体および第２の実体を提供する工程と、第１の実体から放射される光を測定する工程と、第２の実体から放射される光を測定する工程と、第１の実体から放射される光と第２の実体から放射される光とを用い、第１の実体および第２の実体のｘ位置、ｙ位置、およびｚ位置を決定する工程とを含む。
【０００７】
さらに別の一連の実施形態では、この方法は、約１０００ｎｍ未満の距離離れた第１の実体および第２の実体を提供する工程と、第２の実体を活性化せずに、第１の実体を活性化する工程と、第１の実体から放射される光を測定する工程と、第２の実体を活性化する工程と、第２の実体から放射される光を測定する工程と、第１の実体から放射される光と第２の実体から放射される光とを用い、第１の実体および第２の実体のｘ位置、ｙ位置、およびｚ位置を決定する工程とを含む。さらに別の一連の実施形態では、この方法は、所定の分離距離離れた第１の実体および第２の実体を提供する工程と、第２の実体を活性化せずに、第１の実体を活性化する工程と、第１の実体から放射される光を測定する工程と、第２の実体を活性化する工程と、第２の実体から放射される光を測定する工程と、第１の実体から放射される光と第２の実体から放射される光とを用い、第１の実体および第２の実体のｘ位置、ｙ位置、およびｚ位置を決定する工程とを含む。
【０００８】
ある一連の実施形態では、この方法は、光を放射することが可能な複数の実体（このうちの少なくともいくつかは、約１０００ｎｍ未満離れている）を提供する工程と、複数の実体の一部分を活性化して光を放射させる工程と、この放射した光を測定する工程と、複数の実体のうち、上述のように活性化した部分を不活性化する工程と、複数の実体を活性化し、不活性化する工程を繰り返し、この複数の実体のｘ位置、ｙ位置、およびｚ位置を決定する工程とを含む。この方法は、さらに別の一連の実施形態では、光を放射することが可能な複数の実体を提供する工程と、複数の実体の一部分を活性化して光を放射させる工程と、この放射した光を測定する工程と、複数の実体のうち、上述のように活性化した部分を不活性化する工程と、複数の実体を活性化し、不活性化する工程を繰り返し、この複数の実体のｘ位置、ｙ位置、およびｚ位置を決定する工程とを含む。
【０００９】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の１つ以上の実施形態を行う方法に関する。別の態様では、本発明は、本明細書に記載の１つ以上の実施形態を使用する方法に関する。
【００１０】
本発明の他の利点および新規な特徴は、添付の図面と組み合わせて考えると、本発明の非限定的な種々の実施形態に関する以下の詳細な記載から明らかになる。本明細書および参考により援用した文献の開示内容が矛盾点および／または不一致点を含んでいる場合、本明細書が優先する。参考により援用した２つ以上の文献の開示内容が矛盾点および／または不一致点を互いに含んでいる場合、最近の有効日付を有する文献の内容が優先する。
【００１１】
本発明の非限定的な実施形態を、添付の図面を参照し、一例として記載する。図面は模式的なものであり、縮尺どおりに描画することを意図していない。図面では、同じ要素またはほぼ同じ要素は、典型的には同じ数字であらわしている。明確にするために、すべての要素に数字を付してはおらず、当業者が本発明を理解するのに、その要素の説明が必要ではない場合、本発明の各実施形態のすべての要素を示してはいない。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
約１０００ｎｍ未満の距離離れた第１の実体および第２の実体を提供する工程と、
前記第１の実体から放射される光を測定する工程と、
前記第２の実体から放射される光を測定する工程と、
前記第１の実体から放射される光と前記第２の実体から放射される光とを用い、前記第１の実体および前記第２の実体のｘ位置、ｙ位置、およびｚ位置を決定する工程とを含む、方法。
（項目２）
分離の距離離れた第１の実体および第２の実体を提供する工程と、
前記第１の実体から放射される光を測定する工程と、
前記第２の実体から放射される光を測定する工程と、
前記第１の実体から放射される光と前記第２の実体から放射される光とを用い、前記第１の実体および前記第２の実体のｘ位置、ｙ位置、およびｚ位置を決定する工程とを含む、方法。
（項目３）
約１０００ｎｍ未満の距離離れた第１の実体および第２の実体を提供する工程と、
前記第２の実体を活性化せずに、前記第１の実体を活性化する工程と、
前記第１の実体から放射される光を測定する工程と、
前記第２の実体を活性化する工程と、
前記第２の実体から放射される光を測定する工程と、
前記第１の実体から放射される光と前記第２の実体から放射される光とを用い、前記第１の実体および前記第２の実体のｘ位置、ｙ位置、およびｚ位置を決定する工程とを含む、方法。
（項目４）
分離距離離れた第１の実体および第２の実体を提供する工程と、
前記第２の実体を活性化せずに、前記第１の実体を活性化する工程と、
前記第１の実体から放射される光を測定する工程と、
前記第２の実体を活性化する工程と、
前記第２の実体から放射される光を測定する工程と、
前記第１の実体から放射される光と前記第２の実体から放射される光とを用い、前記第１の実体および前記第２の実体のｘ位置、ｙ位置、およびｚ位置を決定する工程とを含む、方法。
（項目５）
前記第１の実体から放射される光が、前記分離距離よりも大きい波長を有する、項目２または項目４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記第１の実体および前記第２の実体のそれぞれのｘ位置、ｙ位置、およびｚ位置を用い、前記第１の実体および前記第２の実体の画像を構築する工程をさらに含む、項目１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
検出器での前記第１の実体および／または前記第２の実体の画像の形状から、前記第１の実体および／または前記第２の実体のｚ位置を決定する工程をさらに含む、項目１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
検出器での前記第１の実体および／または前記第２の実体の画像の強度から、前記第１の実体および／または前記第２の実体のｚ位置を決定する工程をさらに含む、項目１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
前記第１の実体から放射される光がレンズを通る方向に対して、円対称でないレンズを、前記第１の実体から放射される光が通る工程を含む、項目１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記第１の実体から放射される光が、円筒形のレンズを通る工程をさらに含む、項目１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
前記第１の実体から放射される光を検出器で集める工程をさらに含み、前記第１の実体から放射される光が、前記検出器に焦点を有さない、項目１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
前記第１の実体から放射される光を検出器で集める工程をさらに含み、前記第１の実体が、検出器の共役面にはない、項目１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
前記第２の実体から放射される光を検出器で集める工程をさらに含み、前記検出器によって前記第２の実体から放射される光が、前記検出器の検出領域に焦点を有さない、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記第２の実体から放射される光を検出器で集める工程をさらに含み、前記検出器によって前記第２の実体から放射される光が、前記検出器の共役面に焦点を有さない、項目１１に記載の方法。
（項目１５）
前記第２の実体から放射される光が、前記第２の実体を含まない焦点領域を規定するレンズを通る工程を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１６）
前記第２の実体から放射される光がレンズを通る方向に対して、円対称でないレンズを、前記第２の実体から放射される光が通る工程を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１７）
前記第２の実体から放射される光が、円筒形のレンズを通る工程をさらに含む、項目１１に記載の方法。
（項目１８）
前記第２の実体から放射される光を検出器で集める工程をさらに含み、前記検出器によって前記第２の実体から放射される光が、前記検出器の検出領域に焦点を有さない、項目９に記載の方法。
（項目１９）
前記第２の実体から放射される光を検出器で集める工程をさらに含み、前記検出器によって前記第２の実体から放射される光が、前記検出器の共役面に焦点を有さない、項目９に記載の方法。
（項目２０）
前記第２の実体から放射される光が、前記第２の実体を含まない焦点領域を規定するレンズを通る工程を含み、項目９に記載の方法。
（項目２１）
前記第２の実体から放射される光がレンズを通る方向に対して、円対称でないレンズを、第２の実体から放射される光が通る工程を含む、項目９に記載の方法。
（項目２２）
前記第２の実体から放射される光が、円筒形のレンズを通る工程を含む、項目９に記載の方法。
（項目２３）
前記第１の実体から放射される光を複数の検出器で集める工程をさらに含み、前記第１の実体から放射される光が、前記複数の検出器のうちの少なくとも１つによって規定される焦点領域にはない、項目１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４）
前記第１の実体から放射される光を複数の検出器で集める工程をさらに含み、前記第１の実体から放射される光が、前記複数の検出器のうちの１つ以上に焦点を有さない、項目１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５）
前記第２の実体から放射される光を複数の検出器で集める工程をさらに含み、前記検出器によって前記第２の実体から放射される光が、前記複数の検出器のうちの少なくとも１つの検出器の検出領域に焦点を有さない、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記第２の実体から放射される光を複数の検出器で集める工程をさらに含み、前記検出器によって前記第２の実体から放射される光が、前記複数の検出器のうち、少なくとも１つの検出器の共役面に焦点を有さない、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
前記第１の実体から放射される光と、前記第２の実体から放射される光とでは、波長が異なっている、項目１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
前記第１の実体から放射される光と、前記第２の実体から放射される光の波長が実質的に同じである、項目１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
前記第１の実体および前記第２の実体は、異なる波長で活性化される、項目１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記第１の実体および前記第２の実体は、実質的に同じ波長で活性化される、項目１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記第１の実体が、前記第２の実体とは化学的に異なっている、項目１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
前記第１の実体は、前記第２の実体と化学的に実質的に同じである、項目１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
前記第１の実体は、光によって活性化可能なプローブまたは光によってスイッチング可能なプローブであるか、または前記第１の実体が、光によって活性化可能であるか、または光によってスイッチング可能である、項目１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３４）
前記第１の実体は、第１の光放射部分と、外側から刺激を加えると前記第１の部分を活性化させる第２の活性化部分とを含む、項目１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
前記第２の実体は、光によって活性化可能なプローブまたは光によってスイッチング可能なプローブであるか、または前記第２の実体が、光によって活性化可能であるか、または光によってスイッチング可能である、項目１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
前記第２の実体は、第１の光放射部分と、外側から刺激を加えると前記第１の部分を活性化させる第２の活性化部分とを含む、項目１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
前記第１の実体から放射される光の波長が、約４００ｎｍ〜約１０００ｎｍである、項目１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３８）
前記第１の実体と、前記第２の実体とが、共通の実体に対して固定されている、項目１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３９）
前記第１の実体の位置および前記第２の実体の位置を、少なくとも約３００ｎｍの精度で決定する、項目１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
（項目４０）
前記第１の実体と、前記第２の実体とが、約１０００ｎｍ未満の距離離れた、項目２または４のいずれか１項に記載の方法。
（項目４１）
前記第１の実体の位置および前記第２の実体の位置を、少なくとも約１００ｎｍの精度で決定する、項目１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
（項目４２）
前記第１の実体の位置および前記第２の実体の位置を、少なくとも約５０ｎｍの精度で決定する、項目１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
（項目４３）
前記第１の実体の位置および前記第２の実体の位置を、少なくとも約２０ｎｍの精度で決定する、項目１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
（項目４４）
前記第１の実体の位置および前記第２の実体の位置を、少なくとも約１０ｎｍの精度で決定する、項目１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
（項目４５）
前記第１の実体の位置および前記第２の実体の位置を、前記第１の実体から放射される光の波長および／または前記第２の実体から放射される光の波長よりも小さな精度で決定する、項目１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
（項目４６）
第１の時間点で前記第１の実体の位置および前記第２の実体の位置を決定する工程と、第２の時間点で前記第１の実体の位置および前記第２の実体の位置を決定する工程とを含む、項目１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
（項目４７）
２点以上の時間点で、および／または時間の関数として、前記第１の実体の位置および前記第２の実体の位置を決定する工程を含む、項目１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
（項目４８）
前記工程を、記載された順序で行う、項目１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
（項目４９）
光を放射可能な複数の実体のうちの少なくともいくつかが約１０００ｎｍ未満の距離離れたような、光を放射可能な複数の実体を提供する工程と、
前記複数の実体の一部分を活性化させ、光を放射させる工程と、
前記放射した光を測定する工程と、
前記複数の実体の活性化した部分を不活性化する工程と、
前記複数の実体を活性化し、不活性化する工程を繰り返し、この複数の実体のｘ位置、ｙ位置、およびｚ位置を決定する工程とを含む、方法。
（項目５０）
光を放射可能な複数の実体を提供する工程と、
前記複数の実体の一部分を活性化させ、光を放射させる工程と、
前記放射した光を測定する工程と、
前記複数の実体の活性化した部分を不活性化する工程と、
前記複数の実体を活性化し、不活性化する工程を繰り返し、この複数の実体のｘ位置、ｙ位置、およびｚ位置を決定する工程とを含む、方法。
（項目５１）
前記複数の実体のうちの少なくともいくつかが、前記放射した光の波長よりも短い分離距離離れた、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記複数の実体のそれぞれのｘ位置、ｙ位置、およびｚ位置を用い、前記複数の実体の画像を構築する工程をさらに含む、項目４９または５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目５３）
検出器での前記複数の実体の画像の形状から、前記複数の実体のｚ位置を決定する工程をさらに含む、項目４９または５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目５４）
検出器での前記複数の実体の画像の強度から、前記複数の実体のｚ位置を決定する工程をさらに含む、項目４９または５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目５５）
前記複数の実体の一部分から放射される光が、前記複数の実体のいくつかから放射される光がレンズを通る方向に対して、円対称でないレンズを通る工程を含む、項目４９または５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目５６）
前記複数の実体の一部分から放射される光が、円筒形のレンズを通る工程をさらに含む、項目４９または５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目５７）
前記複数の実体の一部分から放射される光を検出器で集める工程をさらに含み、前記複数の実体の一部分のうちのいくつかから放射される光が、前記検出器に焦点を有さない、項目４９または５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目５８）
前記複数の実体の一部分から放射される光を複数の検出器で集める工程をさらに含み、前記複数の実体の一部分のうちのいくつかが、前記複数の検出器のうち、少なくとも１つの検出器の焦点領域にはない、項目４９または５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目５９）
前記複数の実体の一部分から放射される光が、前記複数の実体の一部分のうちの少なくとも一つの部分を含まない焦点領域を規定するレンズを通る工程を含む、項目４９または５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目６０）
前記複数の実体の一部分から放射される光を検出器で集める工程をさらに含み、前記複数の実体の一部分のうちの少なくとも一つの部分から放射される光が、前記検出器の共役面にはない、項目４９または５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目６１）
前記複数の実体の一部分から放射される光を複数の検出器で集める工程をさらに含み、前記複数の実体の一部分のうち、少なくとも一部分から放射される光が、前記複数の検出器のうちの１つ以上に焦点を有さない、項目４９または５０のいずれか１項に記載の方法。（項目６２）
前記複数の実体の少なくともいくつかが、異なる波長で光を放射する、項目４９または５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目６３）
前記複数の実体が、それぞれ実質的に同じ波長で光を放射する、項目４９または５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目６４）
前記複数の実体の少なくともいくつかが、異なる波長の光によって活性化される、項目４９または５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目６５）
前記複数の実体が、それぞれ実質的に同じ波長の光で活性化される、項目４９または５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目６６）
前記複数の実体の少なくともいくつかが、光によって活性化可能なプローブまたは光によってスイッチング可能なプローブである、項目４９または５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目６７）
前記複数の実体の少なくともいくつかが放射した光の波長が、約４９０ｎｍ〜約１０００ｎｍである、項目４９または５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目６８）
前記複数の実体の位置を、少なくとも約１０００ｎｍの精度で決定する、項目４９または５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目６９）
前記複数の実体の位置を、少なくとも約３００ｎｍの精度で決定する、項目４９または５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目７０）
前記複数の実体の位置を、少なくとも約１００ｎｍの精度で決定する、項目４９または５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目７１）
前記複数の実体の位置を、少なくとも約５０ｎｍの精度で決定する、項目４９または５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目７２）
前記複数の実体の位置を、少なくとも約２０ｎｍの精度で決定する、項目４９または５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目７３）
前記複数の実体の位置を、少なくとも約１０ｎｍの精度で決定する、項目４９または５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目７４）
前記複数の実体の位置を、前記複数の実体から放射される光の波長よりも小さな精度で決定する、項目４９または５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目７５）
第１の時間点で前記複数の実体の位置を決定する工程と、第２の時間点で前記複数の実体の位置を決定する工程とを含む、項目４９または５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目７６）
２点以上の時間点で、および／または時間の関数として、前記複数の実体の位置を決定する工程を含む、項目４９または５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目７７）
前記工程を、記載された順序で行う、項目４９または５０のいずれか１項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】図１Ａは、三次元での実体の位置を決定するのに有用な本発明の一実施形態を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、三次元での実体の位置を決定するのに有用な本発明の一実施形態を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、三次元での実体の位置を決定するのに有用な本発明の一実施形態を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、三次元での実体の位置を決定するのに有用な本発明の一実施形態を示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、三次元での実体の位置を決定するのに有用な本発明の一実施形態を示す。
【図１Ｆ】図１Ｆは、三次元での実体の位置を決定するのに有用な本発明の一実施形態を示す。
【図１Ｇ】図１Ｇは、三次元での実体の位置を決定するのに有用な本発明の一実施形態を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、細胞を画像化するのに有用な本発明の実施形態を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、細胞を画像化するのに有用な本発明の実施形態を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、細胞を画像化するのに有用な本発明の実施形態を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、細胞を画像化するのに有用な本発明の実施形態を示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、細胞を画像化するのに有用な本発明の実施形態を示す。
【図２Ｆ】図２Ｆは、細胞を画像化するのに有用な本発明の実施形態を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明の別の実施形態による、細胞の三次元画像化を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明の別の実施形態による、細胞の三次元画像化を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、本発明の別の実施形態による、細胞の三次元画像化を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、本発明の別の実施形態による、細胞の三次元画像化を示す。
【図３Ｅ】図３Ｅは、本発明の別の実施形態による、細胞の三次元画像化を示す。
【図３Ｆ】図３Ｆは、本発明の別の実施形態による、細胞の三次元画像化を示す。
【図３Ｇ】図３Ｇは、本発明の別の実施形態による、細胞の三次元画像化を示す。
【図３Ｈ】図３Ｈは、本発明の別の実施形態による、細胞の三次元画像化を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、本発明の一実施形態による、種々のビーズの三次元画像化を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、本発明の一実施形態による、種々のビーズの三次元画像化を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、本発明の一実施形態による、種々のビーズの三次元画像化を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、本発明の一実施形態による、種々のビーズの三次元画像化を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、本発明の一実施形態による、細胞画像化の精度を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、本発明の一実施形態による、細胞画像化の精度を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、本発明の一実施形態による、細胞画像化の精度を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、本発明の特定の実施形態で有用な種々の蛍光化合物を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、本発明の特定の実施形態で有用な種々の蛍光化合物を示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、本発明の特定の実施形態で有用な種々の蛍光化合物を示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、本発明の特定の実施形態で有用な種々の蛍光化合物を示す。
【図６Ｅ】図６Ｅは、本発明の特定の実施形態で有用な種々の蛍光化合物を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（詳細な説明）
本発明は、一般的に、三次元画像化技術を含む、回折限界未満の画像解像技術および他の画像化技術に関する。一態様では、本発明は、入射光の回折限界未満の距離離れた２つ以上の実体からの光を測定することおよび／または画像化することに関する。例えば、これらの実体は、約１０００ｎｍ未満の距離離れていてもよく、可視光の場合には、約３００ｎｍ未満の距離離れていてもよい。ある場合には、実体の位置を、三方向すべての空間次元について（すなわち、ｘ方向、ｙ方向、およびｚ方向について）決定することができ、特定の場合には、三次元すべての位置を、約１０００ｎｍ未満の精度で決定することができる。ある一連の実施形態では、これらの実体を選択的に活性化してもよい。すなわち、他の実体を活性化させることなく、ある実体を活性化して光を発生させることができる。第１の実体を活性化し、測定し（例えば、その実体から放射される光を測定することによって）、次いで、第２の実体を活性化し、測定してもよい。放射光を用い、例えば、これらの実体の画像の位置を決定することによって、ある場合には、回折限界未満の解像度で第１の実体および第２の実体のｘ位置およびｙ位置を決定してもよい。ある場合には、ｚ位置を決定するために、強度または焦点に関する情報（例えば、焦点が存在しないこと）を利用する種々の技術の１つを用いて、ｚ位置を決定してもよい。このような技術の非限定的な例としては、非点収差を利用した画像化、オフフォーカス状態での画像化、または複数の焦点面を有する画像化が挙げられる。本発明の他の態様は、回折限界未満の画像解像技術のためのシステム、回折限界未満の画像解像技術のためのコンピュータプログラムおよびコンピュータ技術、回折限界未満の画像解像技術を促進する方法などに関する。
【００１４】
本発明の一態様は、一般的に、２つ以上の実体から放射される光の波長より短い分離距離の場合、または放射光の回折限界より短い分離距離の場合であっても、この２つ以上の実体を解像する技術に関する。実体の解像度は、例えば、本明細書に記載のように、１μｍ（１０００ｎｍ）以下のオーダーであってもよい。例えば、放射光が可視光である場合、解像度は、約７００ｎｍ未満であってもよい。ある場合には、２つ（またはそれ以上）の実体が、約５００ｎｍ未満の距離離れている場合、約３００ｎｍ未満の距離離れている場合、約２００ｎｍ未満の距離離れている場合、約１００ｎｍ未満の距離離れている場合、約８０ｎｍ未満の距離離れている場合、約６０ｎｍ未満の距離離れている場合、約５０ｎｍ未満の距離離れている場合、約４０ｎｍ未満の距離離れている場合であっても、解像できる場合がある。ある場合には、約２０ｎｍ未満の距離または約１０ｎｍ未満の距離離れた２つ以上の実体を、本発明の実施形態を用いて解像することができる。
【００１５】
実体は、光を放射可能な任意の実体であってもよい。例えば、実体は、単一の分子であってもよい。放射性実体の非限定的な例としては、蛍光発光実体（フルオロフォア）またはリン光発光実体、例えば、シアニン染料（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７など）、金属ナノ粒子、半導体ナノ粒子または「量子ドット」または蛍光タンパク質、例えば、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）が挙げられる。他の光放射性実体は、当業者が簡単に知り得るものである。本明細書で使用される場合、用語「光」は、一般的に、任意の適切な波長（または同等の意味で、周波数）を有する電磁放射を指す。例えば、いくつかの実施形態では、上述の光は、光領域または可視光領域の波長（例えば、約４００ｎｍ〜約１０００ｎｍの波長を有し、すなわち「可視光」）、赤外波長（例えば、約３００μｍ〜７００ｎｍの波長を有する）、紫外波長（例えば、約４００ｎｍ〜約１０ｎｍの波長を有する）などの波長を含んでもよい。特定の場合には、以下に詳細に記載するように、２つ以上の実体を使用してもよい。すなわち、化学的に異なるかまたは別個の（例えば構造的に別個の）実体を使用してもよい。しかし、他の場合には、上述の実体は、化学的に同じであるか、または少なくとも実質的に化学的に同じであってもよい。
【００１６】
ある場合には、上述の１つ以上の実体は、「スイッチング可能」である。すなわち、上述の実体は、２つ以上の状態をスイッチング可能であり、この状態の少なくとも１つは、所望の波長を有する光を放射する。他の状態では、この実体は光を放射しなくてもよく、または異なる波長の光を放射してもよい。例えば、ある実体を「活性化」し、所望の波長を有する光を発生可能な第１の状態にし、「不活性化」して第２の状態にしてもよい。ある場合には、上述の実体のうち、少なくとも１つは、光によって活性化可能であるか、または光によってスイッチング可能である。ある実体は、適切な波長の入射光によって活性化可能である場合、「光によって活性化可能」である。ある実体は、異なる波長の入射光によって、異なる光を放射する状態または光を放射しない状態にスイッチング可能である場合、「光によってスイッチング可能」である。典型的には、「スイッチング可能な」実体は、第１の状態の実体を励起波長に曝露すると、実体が光を放射し、例えば、スイッチングする波長を有する光に曝露すると、第１の状態から第２の状態に実体がスイッチングし、一方で、第２の状態の実体を励起波長に曝露すると、実体は光を放射しない（または減少した強度で光を放射する）か、または異なる波長で光を放射するような条件を決定することによって、当業者によって同定することができる。スイッチング可能な実体の例は、以下に詳細に記載しており、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１７６１８（２００７年８月７日出願、名称「Ｓｕｂ−Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｌｉｍｉｔ  Ｉｍａｇｅ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、国際特許公開番号ＷＯ  ２００８／０９１２９６として２００８年７月３１日に公開、本明細書に援用する）にさらに記載されている。
【００１７】
ある態様では、２つ以上の実体の空間位置を決定するために、光を処理してもよい。ある場合には、ある画像に分布している１つ以上の実体の位置を個々に決定してもよく、ある場合には、実体の位置を三次元で決定してもよい（すなわち、ｘ次元、ｙ次元、およびｚ次元で決定してもよい。ここで、ｚ次元は、画像化システムの光軸の方向であり、ｘ次元およびｙ次元は、ｚ方向に対して垂直であり、互いに垂直である）。ある一連の実施形態で、Ｇａｕｓｓｉａｎフィッティング技術または他の適切な技術を用いて放射光を処理し、放射性の実体のそれぞれの位置を特定してもよい。適切なＧａｕｓｓｉａｎフィッティング技術の詳細は、以下の実施例に記載しており、当業者は、本開示内容の利益を有する他の適切な画像処理技術を認識することができるであろう。
【００１８】
本発明の別の実施形態によって、画像処理技術の別の例を記載する。一連の画像サンプル（例えば動画）から出発し、それぞれの光放射ピーク（例えば、蛍光、リン光などにより）を特定し、ピークの存在する時間を決定する。例えば、時間点に対し、一連の画像でほぼ同じ強度のピークが存在してもよい。ピークを、いくつかの場合、Ｇａｕｓｓｉａｎ関数および／または楕円Ｇａｕｓｓｉａｎ関数にフィッティングし、重心の位置、強度、幅および／または楕円率を決定してもよい。これらのパラメータに基づき、位置決定精度を満足いくレベルまで高めるために、特定の場合には、さらなる分析から、輪郭のはっきりしないピーク、幅広すぎるピーク、曲がりすぎているピークなどを除外してもよい。散発性のピーク、移動しているピーク、不連続に存在するピークなども破棄してもよい。例えば、最小二乗によって、ピーク強度を２次元Ｇａｕｓｓｉａｎ関数にフィッティングし、ピークの中心位置を決定することによって、ピークの供給源（例えば、本明細書に記載されるように、光を放射可能な任意の１つ以上の実体）の位置を決定することができる。サンプル内の任意のピークまたはすべてのピークについて、このプロセスを必要なだけ繰り返してもよい。
【００１９】
ある一連の実施形態では、入射光の回折限界よりも小さな解像度で、ある実体のｚ位置を決定することができる。例えば、可視光の場合、ある実体のｚ位置を、約８００ｎｍ未満、約５００ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、約２０ｎｍ未満、または約１０ｎｍ未満の解像度で決定することができる。実体のｚ位置を決定することが可能な任意の顕微鏡技術、例えば、非点収差を利用した画像化、オフフォーカス状態での画像化、複数の焦点面を有する画像化、共焦点顕微鏡、二光子顕微鏡などを使用してもよい。ある場合では、上述の実体が、単一の光の点としてあらわれず、ある領域をもった画像として、例えば、わずかに解像されていない画像または焦点の合っていない画像としてあらわれるように上述の実体を配置し、画像化してもよい。一例として、上述の実体を、検出器で上述の実体の画像の焦点が合わないように、上述の実体を含有しない１つ以上の焦点領域（例えば、１つ以上の焦点面）を規定するレンズまたは検出システムによって画像化してもよい。上述の実体がどれほど焦点が合わないかという程度を利用し、上述の実体と、焦点領域の１つとの距離を決定することができ、これを利用して、上述の実体のｚ位置を決定することができる。
【００２０】
ある実施形態では、非点収差を利用した画像化を用い、ｚ位置を決定することができる。実体から放射される光がレンズを通る方向に対して、円対称でない（ｎｏｔ  ｃｉｒｃｕｌａｒｌｙ  ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ）レンズを使用してもよい。例えば、このレンズは、円筒形であってもよく（図１Ａに示したように）、楕円形などであってもよい。ある場合では、レンズは、異なる面に異なる半径の曲率を有していてもよい。実体から放射される光は、円対称でないレンズ（ｎｏｎ−ｃｉｒｃｕｌａｒｌｙ  ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｌｅｎｓ）を含む画像化光学システムを通った後に、検出器で円形または楕円形であってもよい。
【００２１】
ある場合では、画像の大きさおよび楕円率を利用し、上述の実体と、レンズまたは検出器の焦点領域との距離を決定することができ、次いで、これを利用して、ｚ位置を決定することができる。非限定的な例として、図１Ｂに示したように、焦点（ｚ＝０ｎｍ）での画像は、円形であり、焦点からはずれた画像は、徐々に楕円形に広がっていき（ｚ＝±２００ｎｍまたは±４００ｎｍ）、楕円率の方向は、この実体が、焦点領域の上にあるか下にあるかを示している。
【００２２】
別の実施形態では、ｚ位置を、オフフォーカス状態での画像化を用いて決定することができる。実体を画像化するために用いられるレンズまたは検出システムによって規定される焦点領域の１つに存在しない実体は、焦点が合っていない状態であらわれ、上述の画像がどれほど焦点が合わないかという程度を利用し、上述の実体と、レンズの焦点領域との距離を決定することができ、これを利用して、上述の実体のｚ位置を決定することができる。ある場合では、焦点の合っていない実体の画像は、一般的に、円形であらわれてもよく（この領域は、実体と、レンズの焦点領域との距離を示す指標である）、ある場合では、焦点の合っていない実体の画像は、一連の環状構造としてあらわれてもよく、より大きな環は、距離がより遠いことを示す）。
【００２３】
いくつかの実施形態では、例えば、複数の焦点面を有する画像化によって、実体から放射される光を、複数の検出器で集めてもよい。ある場合では、１つ以上の検出器で、光の焦点は合っていなくてもよい。画像の焦点が合っていない程度を利用し、ｚ位置を決定してもよい。
【００２４】
本発明の適切な画像処理技術の別の非限定的な例では、一連の画像サンプル（例えば動画）は、活性化フレーム（例えば、中に活性化光あり）および画像化フレーム（例えば、中に画像化光あり）の繰り返しを備えていてもよい。１つ以上の画像化フレームで、それぞれのフレームについて蛍光ピークを測定し、位置、強度、幅、楕円率などを測定してもよい。これらのパラメータに基づき、位置決定精度を満足いくレベルまで高めるために、さらなる分析から、輪郭のはっきりしないピーク、幅広すぎるピーク、曲がりすぎているピークなどを除外してもよい。いくつかの場合には、散発性のピーク、移動しているピーク、不連続に存在するピークなども破棄してもよい。ピークの中心位置、形状および／または大きさを測定することによって、ピークの発生源（例えば、本明細書に記載されるように、光を放射可能な任意の１つ以上の実体）の位置を決定することができる。ある場合では、この位置を三次元で決定してもよい。サンプル内の任意のピークまたはすべてのピークについて、このプロセスを必要なだけ繰り返してもよい。
【００２５】
実体の測定を容易にするために他の画像処理技術を使用してもよく、例えば、ドリフト補正またはノイズフィルタを使用してもよい。一般的に、ドリフト補正では、例えば、固定点を特定し（例えば、基準マーカーとして、例えば、蛍光粒子を基板に固定してもよい）、固定点の移動度（すなわち、機械的なドリフトによるもの）を使用し、測定済のスイッチング可能な実体の位置を補正してもよい。ドリフト補正の別の例では、異なる画像化フレームまたは活性化フレームから得た画像の相関関数を算出し、ドリフト補正に使用してもよい。いくつかの実施形態では、ドリフトは、約１０００ｎｍ／分未満、約５００ｎｍ／分未満、約３００ｎｍ／分未満、約１００ｎｍ／分未満、約５０ｎｍ／分未満、約３０ｎｍ／分未満、約２０ｎｍ／分未満、約１０ｎｍ／分未満または約５ｎｍ／分未満であってもよい。このようなドリフトは、例えば、顕微鏡対物レンズに対し、サンプルスライドのｘ−ｙ位置決めのために取り付けられた移動ステージを有する顕微鏡で起こることがある。スライドは、適切な制限機構（例えば、ばね仕掛けのクリップ）を用いて移動ステージに固定されていてもよい。それに加えて、ステージと顕微鏡スライドとの間に緩衝層を取り付けてもよい。緩衝層は、例えば、スライドがいくつかの様式で滑るのを防ぐことによって、移動ステージに対し、スライドのドリフトをさらに制限してもよい。緩衝層は、一実施形態では、ゴム膜またはポリマー膜、例えば、シリコーンゴム膜である。したがって、本発明の一実施形態は、移動ステージと、移動ステージに接続してスライドを固定する制限機構（例えば、ばね仕掛けのクリップ）とを備え、任意に、緩衝層（例えば、シリコーンゴム膜）を、制限機構が緩衝層と接触することにより、スライドの動きが制限されるように配置して備えるデバイスに関する。データ収集中に顕微鏡の焦点を安定化させるために、いくつかの場合では、「フォーカスロック」デバイスを使用してもよい。非限定的な例として、フォーカスロックを達成するために、サンプルを保持した基板でレーザー光を反射させ、反射した光を位置感応型検出器（例えば、象限（ｑｕａｎｄｒａｎｔ）フォトダイオード）に向かわせてもよい。ある場合では、反射したレーザーの位置は、基板と対物レンズとの距離に感応性（ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）であってもよく、この位置が、ｚ方向の位置決めステージ（例えば、圧電性のステージ）にフィードバックされ、焦点ドリフトが補正されてもよい。
【００２６】
ある一連の実施形態では、上述のように、スイッチング可能な実体を使用してもよい。スイッチング可能な実体の非限定的な例は、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１７６１８（２００７年８月７日出願、名称「Ｓｕｂ−Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｌｉｍｉｔ  Ｉｍａｇｅ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、国際特許公開番号ＷＯ  ２００８／０９１２９６として２００８年７月３１日に公開）にさらに記載されており、この内容を参考により本明細書に援用する。スイッチング可能な実体の非限定的な例として、Ｃｙ５は、異なる波長の光によって制御された様式および可逆的な様式で、蛍光状態と暗状態とをスイッチング可能である。例えば、６３３ｎｍまたは６５７ｎｍの赤色の光によって、Ｃｙ５をスイッチングするか、または不活性化して安定な暗状態にすることができ、５３２ｎｍの緑色の光によって、Ｃｙ５をスイッチングするか、活性化して蛍光状態に戻すことができる。スイッチング可能な実体の他の非限定的な例としては、光によって活性化可能な蛍光タンパク質または光によってスイッチング可能な蛍光タンパク質、または光によって活性化可能な無機粒子または光によってスイッチング可能な無機粒子（例えば、本明細書に記載するもの）が挙げられる。ある場合には、上述の実体は、例えば、適切な刺激にさらされると、２つ以上の状態を可逆的にスイッチング可能である。例えば、第１の刺激（例えば、第１の波長の光）を使用し、このスイッチング可能な実体を活性化してもよく、一方、第２の刺激（例えば、第２の波長の光）を使用し、このスイッチング可能な実体を不活性化し、例えば放射しない状態にしてもよい。任意の適切な方法を使用し、上述の実体を活性化してもよい。例えば、一実施形態では、適切な波長の入射光を使用し、上述の実体を活性化し、光を放射させてもよい。すなわち、上述の実体は、光スイッチング可能である。したがって、光スイッチング可能な実体は、例えば、異なる波長を有する入射光によって、異なる光を放射する状態または光を放射しない状態にスイッチングさせることができる。上述の光は、単色（例えば、レーザーを用いて作製）または多色であってもよい。別の実施形態では、上述の実体を、電場および／または磁場によって刺激し、活性化してもよい。他の実施形態では、上述の実体は、例えば、ｐＨを調整することによって、または実体が関与する可逆性化学反応を誘発することなどによって、適切な化学環境におくことによって活性化してもよい。同様に、上述の実体を不活性化するために任意の適切な方法を使用してもよく、上述の実体を活性化する方法と、不活性化する方法とは、同じである必要はない。例えば、上述の実体を、適切な波長の入射光に曝露して不活性化させてもよく、または上述の実体は、十分な時間が経過することによって不活性化してもよい。
【００２７】
いくつかの実施形態では、スイッチング可能な実体は、第１の光放射部分（例えば、フルオロフォア）と、第１の部分を活性化させるか、または「スイッチング」させる第２の部分とを備えている。例えば、光に曝露すると、スイッチング可能な実体の第２の部分は、第１の部分を活性化させ、第１の部分が光を放射してもよい。活性化部分の例としては、限定されないが、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ  ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃｙ２（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃｙ３（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃｙ３．５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＣｙ５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）または他の適切な染料が挙げられる。光放射部分の例としては、限定されないが、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＣｙ７（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または他の適切な染料が挙げられる。これらの部分は、例えば、直接的に、またはリンカーを介して、例えば共有結合によって結合し、例えば、限定されないが、Ｃｙ５−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ｃｙ５−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ｃｙ５−Ｃｙ２、Ｃｙ５−Ｃｙ３、Ｃｙ５−Ｃｙ３．５、Ｃｙ５．５−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ｃｙ５．５−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ｃｙ５．５−Ｃｙ２、Ｃｙ５．５−Ｃｙ３、Ｃｙ５．５−Ｃｙ３．５、Ｃｙ７−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ｃｙ７−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ｃｙ７−Ｃｙ２、Ｃｙ７−Ｃｙ３、Ｃｙ７−Ｃｙ３．５またはＣｙ７−Ｃｙ５のような化合物を形成してもよい。Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７の構造を図６に示し、Ｃｙ３−Ｃｙ５の結合態様の非限定的な例を図６Ｅに示す。当業者は、これらの化合物および他の化合物の構造を認識しており、これらの化合物の多くは市販されている。
【００２８】
任意の適切な方法を用い、第１の光放射部分と第２の活性化部分とを結合してもよい。ある場合には、例えば、ある様式では、光放射部分がどんな態様で不活性化される場合であっても、活性化部分が光放射部分を所望な程度に活性化するように、第１部分と第２部分との距離が十分に近い位置になるようにリンカーが選択される。典型的には、これらの部分は、５００ｎｍ以下、例えば、約３００ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、約２０ｎｍ未満、約１０ｎｍ未満、約５ｎｍ未満、約２ｎｍ未満、約１ｎｍ未満などのオーダーの距離離れている。リンカーの例としては、炭素鎖（例えば、アルカンまたはアルケン）、ポリマー単位などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
特定の場合には、光放射部分および活性化部分は、互いに分離すると、それぞれフルオロフォアになってもよい（すなわち、励起波長のような刺激にさらされると、特定の放射波長の光を放射する実体になってもよい）。しかし、第１のフルオロフォアと第２のフルオロフォアとを含むスイッチング可能な実体を形成する場合、第１のフルオロフォアは、第１の光放射部分を形成し、第２のフルオロフォアは、刺激に応答して第１の部分を活性化させるか、または「スイッチング」させる活性化部分を形成する。例えば、スイッチング可能な実体は、第２のフルオロフォアに直接結合した第１のフルオロフォアを含んでいてもよく、または第１の実体および第２の実体が、リンカーを介して、または共通の実体に結合していてもよい。光放射部分と活性化部分の対が、適切なスイッチング可能な実体を生成するか否かは、当業者に既知の方法によって試験することができる。例えば、種々の波長を有する光を使用して、この対を刺激し、光放射部分から放射される光を測定し、この対が適切なスイッチとなるかどうかを決定することができる。
【００３０】
したがって、本発明の一実施形態では、第１の光放射部分と、第２の活性化部分とを含む、光を放射するスイッチング可能な実体が提供される。上述の実体は、第１の光放射部分によって決定される最大放射波長と、第２の活性化部分によって決定される最大活性化波長とを有する。特に、この２つの波長は、同じ分子実体によって制御されず、有効に分けられている。ある場合には、放射部分を活性化して蛍光状態にする場合および、この蛍光状態から励起させて放射させ、放射部分を不活性化する場合の両方に、同じ波長の光を使用することができる。さらに、あるサンプル内にある多種類のスイッチング可能な実体を独立して決定してもよい。例えば、同じ活性化部分を有するが、光放射部分が異なる２つのスイッチング可能な実体は、サンプルに適用する同じ波長の光によって活性化されてもよいが、光放射部分が異なるため、異なる波長で放射し、これらは回折限界未満の解像度未満の分離距離の場合であっても、容易に識別することができる。このことにより、２色の画像を有効に得ることができる。同様に、同じ光放射部分を有するが、活性化部分が異なる２つのスイッチング可能な実体は、活性化部分が異なるため、サンプルに適用するのとは異なる波長の光によって活性化されてもよく、そして光放射部分は、同じ波長で放射されてもよく、これらは回折限界未満の解像度未満の分離距離の場合であっても、容易に識別することができる。この方法でも、２色の画像を有効に得ることができる。これらの方法を組み合わせると、４色（またはそれ以上）の色画像を容易に作製することができる。この原理を用い、スイッチング可能な実体および／または活性化実体によっては、多色画像化を６色、９色などにまで広げることができる。この多色画像化の原理を、本明細書に記載の画像化方法とともに使用し、（ある場合には、３つの次元すべてにおいて）回折限界未満の解像度を得ることもでき、および／または回折限界未満の解像度に制限されない他の画像化方法とともに使用し、多色画像を得てもよい。
【００３１】
いくつかの実施形態では、上記に記載の第１の光放射部分と、第２の活性化部分とを、直接的に共有結合によって結合するのでもなく、リンカーを介して結合するのでもなく、それぞれを共通の実体に固定してもよい。他の実施形態では、２個以上のスイッチング可能な実体（特定の場合には、このうちいくつかは、第１の光放射部分と、第２の活性化部分とが、直接的に結合しているか、またはリンカーを介して結合してもよい）を、本発明のある態様で、共通の実体に固定していてもよい。これらのいずれか実施形態で、共通の実体は、非生体実体であってもよく、生体実体であってもよく、例えば、細胞、組織、基質、表面、ポリマー、核酸などの生体分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡなど）、脂質分子、タンパク質またはポリペプチドなど、生体分子の複合体、または生体構造（例えば、オルガネラ、微小管、クラスリン被覆小窩（ｐｉｔ）など）であってもよい。
【００３２】
ある一連の実施形態では、スイッチング可能な実体は、結合対（すなわち、特定の検体と結合可能な分子）に対して、例えば共有結合によって固定することができる。結合対としては、当業者に既知の特異的な結合対、半特異的な結合対および非特異的な結合対が挙げられる。用語「特異的に結合する」は、結合対（例えば、タンパク質、核酸、抗体など）を指している場合、異なる分子の混合物（例えば、タンパク質および他の生体物質）中の結合対の１つまたは他の対の存在および／または正体を決定する要因となる反応を指す。したがって、例えば、レセプター／リガンド結合対の場合、リガンドは、分子の複雑な混合物から特異的および／または優先的にそのレセプターを選択し、逆に、レセプターは、分子の複雑な混合物から特異的および／または優先的にリガンドを選択する。他の例としては、限定されないが、酵素は、その基質と特異的に結合し、核酸は、その相補体と特異的に結合し、抗体は、その抗原と特異的に結合する。このような結合は、１つ以上の種々の機構（限定されないが、イオン性相互作用および／または共有結合性相互作用および／または疎水性相互作用および／またはファンデルワールス力による相互作用などが挙げられる）によって行われてもよい。標的分子または標的構造（例えば、細胞内のＤＮＡまたはタンパク質）の結合対にスイッチング可能な実体を固定することによって、スイッチング可能な実体を、種々の測定または画像化に使用することができる。例えば、アミン反応性基を有するスイッチング可能な実体は、アミンを含む結合対（例えば、抗体、タンパク質または酵素）と反応してもよい。
【００３３】
いくつかの実施形態では、２つ以上のスイッチング可能な実体を使用してもよく、この実体は、同じであっても異なっていてもよい。いくつかの場合には、第１の実体から放射される光の波長と、第２の実体から放射される光の波長とは同じである。上述の実体を異なる時間点で活性化し、各実体からの光を別個に測定してもよい。これにより、２つの実体の位置を別個に決定することができ、いくつかの場合には、以下に詳細に記載するように、実体から放射される光の波長未満の分離距離の場合または放射光の回折限界未満の分離距離の場合であっても、２つの実体を空間的に解像してもよい（すなわち、「回折限界未満」の解像）。特定の場合、第１の実体から放射される光の波長と、第２の実体から放射される光の波長とは、異なっている（例えば、第１の実体および第２の実体が化学的に異なっており、および／または異なる環境に配置されている場合）。実体から放射される光の波長未満の分離距離の場合または放射光の回折限界未満の分離距離の場合であっても、実体を空間的に解像してもよい。特定の場合、第１の実体から放射される光の波長と、第２の実体から放射される光の波長とは、実質的に同じであるが、２つの実体を異なる波長の光で活性化し、各実体からの光を別個に測定してもよい。実体から放射される光の波長未満の分離距離の場合または放射光の回折限界未満の分離距離で隔てられている場合であっても、実体を空間的に解像してもよい。
【００３４】
ある場合では、実体は、独立してスイッチング可能であってもよい。すなわち、第２の実体を活性化させることなく、第１の実体を活性化し、光を放射させてもよい。例えば、実体が異なっている場合、第１の実体および第２の実体をそれぞれ活性化する方法は、異なっていてもよい（例えば、異なる波長の入射光を用いて、それぞれの実体を活性化してもよい）。別の非限定的な例として、実体が実質的に同じ場合、入射光の範囲内の実体の部分的な集合または実体の一部分のみを（すなわち、確率的またはランダムに）活性化するように、十分弱い強度を実体に適用してもよい。活性化する特定の強度は、当業者であれば、通常の範囲内の技術を用いて決定することができる。入射光の強度を適切に選択することによって、第２の実体を活性化させることなく、第１の実体を活性化させてもよい。別の非限定的な例として、画像化されるサンプルは、複数の実体を含んでいてもよく、この複数の実体のうち、いくつかは実質的に同じであり、いくつかは、実質的に異なっている。この場合、上述の１つ以上の方法を適用し、実体を独立してスイッチングさせてもよい。
【００３５】
各スイッチング可能な実体から放射される光は、例えば、画像またはマトリックスとして決定してもよい。例えば、第１の実体を活性化し、第１の実体から放射される光を測定してもよく、第２の実体を活性化し（第１の実体を不活性化しても不活性化しなくてもよい）、第２の実体から放射される光を測定してもよい。複数の実体それぞれから放射される光の波長は、同じであっても異なっていてもよい。任意の適切な方法を使用し、放射光を測定してもよい。例えば、光の検出器は、ＣＣＤカメラのようなカメラ、フォトダイオード、フォトダイオードアレイ、光電子増倍器、光電子増倍器アレイ、または分光計であってもよく、当業者は、他の適切な技術を知っているであろう。いくつかの場合には、２つ以上の検出器を使用してもよく、それらの検出器はそれぞれ独立して、同じでも異なっていてもよい。いくつかの場合には、例えば、解像度を高め、および／またはノイズを減らすために、複数の画像（または他の決定因子）を使用してもよい。例えば、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００などの画像を、用途に応じて決定してもよい。
【００３６】
いくつかの場合には、入射光の範囲内の実体の部分的な集合または実体の一部分のみを（すなわち、確率的またはランダムに）活性化するように、十分に強度の弱い入射光を複数の実体に照射してもよい。活性化する量は、任意の適切な一部分であってよく、例えば、用途に応じて、実体の約０．１％、約０．３％、約０．５％、約１％、約３％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％を活性化してもよい。例えば、入射光の強度を適切に選択することによって、実体の少なくともいくつかが他の実体と光学的に解像可能で、位置が決定可能であるように、実体のまばらな部分的な集合を活性化させてもよい。いくつかの場合には、実体の部分的な集合の活性化が、短期間の入射光の照射により、同時に起こることが可能である。繰り返しの活性化サイクルにより、すべての実体の位置または実体のかなりの部分を決定することができる。いくつかの場合には、この情報を用いて、回折限界未満の解像度を有する画像を構築することができる。
【００３７】
サンプルの複数の位置をそれぞれ分析し、その位置にある実体を決定してもよい。例えば、サンプルは、種々の複数の実体を含有していてもよく、そのいくつかは、実体から放射される光の波長未満の分離距離にあるか、または放射光の回折限界未満の分離距離にある。サンプル内の異なる位置を決定してもよく（例えば、画像内でピクセルの違いとして）、これらの位置をそれぞれ独立して分析し、その位置にある１つ以上の実体を決定してもよい。いくつかの場合には、それぞれの位置にある実体を、すでに記載したように、実体から放射される光の波長未満の解像度または放射光の回折限界未満の解像度で決定してもよい。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態では、実体は、時間の関数として解像されてもよい。例えば、２つ以上の実体を種々の時間点で観察し、時間で変動するプロセス（例えば、化学反応、細胞の挙動、タンパク質または酵素の結合など）を決定してもよい。したがって、一実施形態では、２つ以上の実体の位置を、第１の時間点で決定し（例えば、本明細書に記載されるように）、その後の何回かの時間点で決定してもよい。特定の例として、２つ以上の実体が共通の実体に固定されている場合、共通の実体を、時間の関数、例えば、時間で変動するプロセス（例えば、共通の実体の移動、共通の実体の構造変化および／または形状変化、共通の実体が関与する反応など）として決定してもよい。時間分解による画像化は、スイッチング可能な実体が複数のサイクルでスイッチング可能であり、各サイクルが実体の位置について１個のデータ点を与えるため、いくつかの場合には容易であり得る。
【００３９】
本発明の別の態様は、コンピュータで実行される方法に関する。例えば、本明細書に記載のいずれかの方法を自動的および／または繰り返し実行可能なコンピュータおよび／または自動化システムが提供されてもよい。本明細書で使用される場合、「自動化」デバイスは、ヒトが命令することなく作動可能なデバイスを指す。すなわち、自動化デバイスは、任意のヒトが、ある機能を促進するための任意の操作を終了した後も、例えば、コンピュータに指示を与えることによって、一定期間、その機能を実行することができる。典型的には、自動化装置は、その時間点の後に、繰り返してその機能を実行することができる。処理工程は、いくつかの場合には、機械可読媒体に記録されてもよい。
【００４０】
本発明のさらに別の態様は、一般的に、本明細書に記載の１つ以上の実施形態を実行可能なシステムに関する。例えば、このシステムは、顕微鏡と、実体を活性化および／またはスイッチングさせ、所望の波長の光を発生させるデバイス（例えば、レーザー源および／または他の光源）、実体から放射される光を測定するデバイス（例えば、カメラ、例えば光学フィルタのような色フィルタデバイスを備えていてもよい）と、２つ以上の実体の空間配置を決定するためのコンピュータとを備えていてもよい。いくつかの場合には、鏡（例えば、二色性ミラーまたは多色性ミラー）、プリズム、レンズ、回折格子なども、光源からの光の向きを変えるために配置されていてもよい。いくつかの場合には、光源は、時間によって調節可能（例えば、シャッター、音響光学変調器などによって）であってもよい。したがって、光源は、プログラムされた様式または周期的な様式で活性化し、不活性化することが可能なものであってもよい。一実施形態では、２つ以上の光源を使用してもよく、例えば、異なる波長または色でサンプルを照射するために使用してもよい。例えば、光源は、異なる周波数の光を発してもよく、および／または光学フィルタなどのような色フィルタデバイスを使用し、異なる波長または色の光をサンプルに照射するように、光源からの光を調節してもよい。
【００４１】
いくつかの実施形態では、顕微鏡は、他の蛍光源からの光（例えば、「バックグラウンドノイズ」）を最小限にしつつ、スイッチング可能な実体から放射される光を集めるような構成になっていてもよい。特定の場合、撮像幾何（例えば、限定されないが、全反射の幾何、回転円板の共焦点の幾何、走査共焦点の幾何、落射蛍光（ｅｐｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）の幾何などが挙げられる）を、サンプルを励起させるために使用してもよい。いくつかの実施形態では、サンプルの薄層または平面を励起光にさらし、サンプル平面外側への蛍光の励起を減らしてもよい。非常に多くの開口レンズを使用し、サンプルから放射される光を集めてもよい。この光を、例えば、励起光を除去するためのフィルタを用いて処理して、サンプルからの放射光の集合を得てもよい。いくつかの場合には、画像を集める拡大因子は、例えば、画像の各ピクセルの縁の長さが、画像の回折限界点の標準偏差の長さに対応する場合、最適化することができる。
【００４２】
ある場合では、スイッチング可能な実体の励起およびスイッチング可能な実体の画像の獲得を制御するためにコンピュータを使用してもよい。ある一連の実施形態では、種々の波長および／または強度を有する光を用いてサンプルを励起させてもよく、サンプルを励起させるのに使用する一連の光の波長と、スイッチング可能な実体を含有するサンプルから得た画像とをコンピュータを用いて相互に関連づけてもよい。例えば、コンピュータは、目的の各領域中の活性化されたスイッチング可能な要素の異なる平均値（例えば、１つの場所あたり１個の活性化された実体、１つの場所あたり２個の活性化された実体など）を得るために、種々の波長および／または強度を有する光をサンプルに適用してもよい。いくつかの場合には、この情報を用いて、いくつかの場合には、上述のように、回折限界未満の解像度でスイッチング可能な実体の画像を構築してもよい。
【００４３】
本発明の他の態様では、本明細書に記載のシステムおよび方法を、当業者に既知の他の画像化技術、例えば、高解像度蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）または免疫蛍光画像化法、ライブセルイメージング、共焦点画像化法、落射蛍光画像化法、全反射蛍光画像化法などと組み合わせてもよい。
【００４４】
以下の文献を、参考により本明細書に援用する。米国特許出願番号第１２／０１２，５２４号（２００８年２月１日出願、表題「Ｓｕｂ−Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、米国特許公開番号第２００８／０１８２３３６号として、２００８年７月３１日に公開）；国際特許公開番号ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１７６１８号（２００７年８月７日出願、表題「Ｓｕｂ−Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｌｉｍｉｔ  Ｉｍａｇｅ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、国際特許公開番号ＷＯ  ２００８／０９１２９６号として、２００８年７月３１日に公開）；米国特許出願番号第１１／６０５，８４２号（２００６年１１月２９日出願、表題「Ｓｕｂ−Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、米国特許公開番号第２００８／００３２４１４号として、２００８年２月７日に公開）；米国特許仮出願番号第６０／８３６，１６７号（２００６年８月７日出願、表題「Ｓｕｂ−Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ」）；米国特許仮出願番号第６０／８３６，１７０号（２００６年８月８日出願、表題「Ｓｕｂ−Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ」；米国特許仮出願番号第６１／００８，６６１号（２００７年１２月２１日出願、表題「Ｓｕｂ−Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｌｉｍｉｔ  Ｉｍａｇｅ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｔｈｒｅｅ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ」）。
【００４５】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を説明することを意図しているが、本発明の範囲全体を例示するものではない。
【実施例】
【００４６】
（実施例１）
本実施例は、サンプルを呼び出すことなく、または光学ビームによるスキャニングをすることなく、三次元すべてについて回折限界よりも約１０倍高い空間解像度を有する三次元画像化を示す。国際特許公開番号ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１７６１８（２００７年８月７日出願、表題「Ｓｕｂ−Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｌｉｍｉｔ  Ｉｍａｇｅ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、国際特許公開番号ＷＯ２００８／０９１２９６として、２００８年７月３１日に公開、参考により本明細書に援用する）では、特定のフルオロフォアが有する、光によってスイッチング可能な性質を利用し、この方法以外では空間的に重なり合ってしまう多くの分子の画像を分割し、個々の蛍光染料について、高い位置決定精度で横方向の寸法を得た。
【００４７】
しかし、本実施例および以下の実施例は、光によってスイッチング可能なプローブのうち、光学的に分割可能な一部分を確率論的に活性化し、それぞれのプローブの座標を高い精度で決定し、複数の活性化サイクルを経て高い解像度を有する三次元画像を構築することによって、三次元すべてについての画像化を示す。いくつかの場合では、粒子（または他の適切な実体）の画像の重心から、この粒子の横方向の位置を決定することができ、この画像の形状には、粒子の軸またはｚ位置についての情報も含まれている場合がある。
【００４８】
本実施例は、非点収差を利用した画像化を利用し、三次元の画像化を行うが、他の場合では、他の技術（限定されないが、オフフォーカス状態での画像化、複数の焦点面を有する画像化などが挙げられる）を使用することもできる。この目的のために、弱い円筒形のレンズを画像化経路に導入し、２個のわずかに異なる焦点面をｘ方向およびｙ方向に作製した（図１Ａ）。この図は、個々のフルオロフォアの三次元での位置決定を示している。単純化した光路図は、円筒形のレンズを画像化経路に導入することによって、蛍光性実体の画像の楕円率から、この実体のｚ座標を決定する原理を示す。右側の図は、種々のｚ位置でのフルオロフォアの画像を示す。
【００４９】
結果として、フルオロフォアの画像の楕円率および向きは、ｚの位置が変化すると変わり、フルオロフォアが、平均焦点面（ｘ焦点面とｙ焦点面のほぼ中間の位置であり、点広がり関数（ＰＳＦ）が、ｘ方向とｙ方向に本質的に同じ幅を有する位置）にある場合、画像は円形であらわれると考えられ、フルオロフォアが、この平均焦点面よりも上にある場合、画像は、ｘ方向よりもｙ方向で大きく集束し、したがって、ｘ方向に長軸を有する楕円であらわれると考えられた。反対に、フルオロフォアがこの平均焦点面よりも下にある場合、画像は、ｙ方向に長軸を有する楕円であらわれると考えられた。２次元の楕円Ｇａｕｓｓｉａｎ関数を用いてこの画像をフィッティングし、ピーク位置のｘ座標およびｙ座標を得ることができ、同様に、ピーク幅ｗｘおよびｗｙを得ることができ、次いで、フルオロフォアのｚ座標を決定することができた。
【００５０】
ｗｘおよびｗｙの較正曲線をｚの関数として実験的に作製するために、Ａｌｅｘａ  ６４７で標識されたストレプトアビジン分子をガラス表面に固定し、ｚ方向にサンプルをスキャンして、個々の分子を画像化し、ｗｘ値およびｗｙ値を決定した（図１Ｃ）。図１Ｃは、本実施例で、単一のＡｌｅｘａ  ６４７分子から得た画像幅ｗｘおよびｗｙをｚの関数として示した較正曲線である。それぞれのデータ点は、６個の分子から得た平均値をあらわす。このデータを、以下に記載するように、デフォーカス関数（赤色の曲線）にフィッティングした。
【００５１】
この画像分析では、光によって活性化されるそれぞれのフルオロフォアのｚ座標を、画像から測定したｗｘ値およびｗｙ値を、較正曲線と比較することによって決定した。さらに、ガラス基板を水溶液に浸したサンプルでは、ガラスと水との反射係数の違いをあらわす因子０．７９によって、すべてのｚ位置決定をやりなおした（さらなる詳細は、以下を参照）。
【００５２】
いくつかの場合では、本実施例の技術の三次元解像度は、光によってスイッチング可能な個々のフルオロフォアを、スイッチングサイクルの間に、どの程度の精度で三次元すべてについて位置決定可能かということによって制限された。国際特許公開番号ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１７６１８（２００７年８月７日出願、表題「Ｓｕｂ−Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｌｉｍｉｔ  Ｉｍａｇｅ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、国際特許公開番号ＷＯ２００８／０９１２９６として、２００８年７月３１日公開、参考により本明細書に援用する）は、光によってスイッチング可能なシアニン染料群（Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７）を開示しており、これらのシアニン染料群は、異なる波長の光によって、蛍光状態および暗状態を可逆的に繰り返すことが可能である。光によってスイッチング可能なこれらの「リポーター」を再び活性化させる際の効率は、「アクチベーター」染料（種々の染料分子のうち、任意のものであってよい（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５））との近さにかなり依存する。この特定の例では、Ｃｙ３およびＡｌｅｘａ  ６４７をアクチベーターおよびリポーターの対として使用し、画像化を行った。赤色レーザー（６５７ｎｍ）を使用し、Ａｌｅｘａ  ６４７分子を画像化し、この分子を不活性化して暗状態にした。一方、緑色レーザー（５３２ｎｍ）を使用し、このフルオロフォアを再び活性化させた。それぞれのアクチベーター−リポーター対について、永久的に光退色が起こるまでに、何百回とオンオフサイクルを繰り返すことができ、対物型全反射照明蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦ）または落射蛍光型撮像の幾何学を用い、各スイッチングサイクルで平均６０００個の光子が検出された。この可逆性のスイッチング挙動は、位置決定の精度を測定するための内部制御を提出する。
【００５３】
ある実験では、Ｃｙ３とＡｌｅｘａ  ６４７で二重に標識されたストレプトアビジン分子をガラス表面に固定した。次いで、この分子について、複数回のオンオフサイクルを繰り返し、それぞれのスイッチングサイクルでｘ座標、ｙ座標、およびｚ座標を決定した。この手順によって、それぞれの分子について、複数回の位置決定結果が得られた（図１Ｄ）。この図では、同じ分子を複数回活性化しているため、それぞれの分子から、複数回の位置決定結果が得られる。１４５個の集合の位置決定によって、これらの質量中心を合わせ、位置分布をあらわす全体的な３Ｄ図を作製した（左側の図）。ｘ方向、ｙ方向、およびｚ方向の分布ヒストグラム（右側の図）をＧａｕｓｓｉａｎ関数にフィッティングさせ、ｘ方向の標準偏差９ｎｍ、ｙ方向の標準偏差１１ｎｍ、ｚ方向の標準偏差２２ｎｍを得た。位置分布の標準偏差（ＳＤ：ｘ方向に９ｎｍ、ｙ方向に１１ｎｍ、ｚ方向に２２ｎｍ）または半値全幅（ＦＷＨＭ：ｘ方向に２１ｎｍ、ｙ方向に２６ｎｍ、ｚ方向に５２ｎｍ）から、三次元における位置決定精度の定量的な測定値を得た（図１Ｅ〜１Ｇ）。２つの横方向の寸法の位置決定精度は、円筒形のレンズを使わずに得た以前の結果とほぼ同じであった。ｚ方向の位置決定精度は、これらの実験では、ｘ方向およびｙ方向の精度のほぼ２倍であった。フルオロフォアが焦点面から離れるにつれて、画像の幅が大きくなるため、ｚ値が大きくなるにつれて、特に横方向の寸法の位置決定精度が減少する。したがって、ある実験では、焦点面からほぼ６００ｎｍのｚ方向の画像深さを選択し、この範囲内で、平均焦点面で得た値と比較して、横方向の位置決定精度は１．６倍未満、軸方向の位置精度は１．３倍未満変化した。しかし、画像化の深さは、将来的な実験で、例えばｚ方向のスキャニングを用いることによって大きくなることも考えられる。
【００５４】
初期試験として、ビーズ模型サンプルを画像化した。ビーズ模型サンプルは、２００ｎｍのビオチン化したポリスチレンビーズをガラス表面に固定し、このサンプルをＣｙ３−Ａｌｅｘａ  ６４７で標識したストレプトアビジンとともにインキュベートし、光によってスイッチング可能なプローブでこのビーズをコーティングすることによって調製した。光学的に分割可能な、Ａｌｅｘａ  ６４７分子がまばらに存在する部分を繰り返し確率論的に活性化することによって、このビーズの三次元画像を得て、個々の分子のｘ座標、ｙ座標、およびｚ座標を決定することができた。一連の複数回の活性化サイクルで、多くのフルオロフォアの位置を決定し、これを利用して、完全な三次元画像を構築した。このビーズ画像の図は、すべての三方向にそって観察すると、ほぼ球形であり、平均直径は、ｘ方向で２１０±１６ｎｍ、ｙ方向で２２５±２５ｎｍ、ｚ方向で２２８±２５ｎｍであり（図４）、このことは、三次元すべてについて正確に位置決定されていることを示す。それぞれのフルオロフォアの画像について、同時にｘ座標、ｙ座標、およびｚ座標にコード化するので、三次元の画像化時間と比較しても、それぞれの分子の三次元での位置を決定するのに余分な時間は必要なかった。
【００５５】
図４は、Ｃｙ３−Ａｌｅｘａ  ６４７で標識されたストレプトアビジンでコーティングされた、直径が２００ｎｍのビーズの三次元画像を示す。図４Ａは、ガラス表面の１．７μｍ（ｘ）×１０μｍ（ｙ）の領域にある２個のビーズのｘ−ｚ図を示す。この表面は、ビーズの下に存在する位置決定のための線によって規定され、ストレプトアビジン分子がガラス表面に非特異的に吸着することを結果として得る。非特異的に吸着したストレプトアビジンは、ガラス表面にまばらにしか分布されないが、大きな領域の図では、ほぼ連続した位置決定用の線を生じる。図４Ａの差し込み図は、右側のビーズ周囲の小さな塊（４００ｎｍ×４００ｎｍ×４００ｎｍ）のｘ−ｚ図を示しており、非特異的に吸着したストレプトアビジン分子がいくつか存在していた。図４Ｂおよび４Ｃは、２個のビーズのｘ−ｙ図を示す。円形がわずかにひずんでいるのは、一部分は、ストレプトアビジンのコーティングが不完全なため、および／または元々理想的なビーズ形状ではないためであり得る。
【００５６】
図４Ｄは、ｘ方向、ｙ方向、およびｚ方向でのビーズの直径分布を示す。主観的ではない様式で直径を決定するために、ストレプトアビジン分子が、ビーズ表面に均一にコーティングされていると仮定した。このように、球形表面で３Ｄに均一に分布している場合、ｘ軸、ｙ軸、およびｚ軸のいずれかについて考える場合、１Ｄの均一な分布に従うはずである。ｘ方向、ｙ方向、またはｚ方向の１Ｄ分布の幅は、ｘ軸、ｙ軸またはｚ軸にそったビーズ直径の測定値をそれぞれ与える。さらに、ある場合には、均一分布の場合の幅（ｄ）と標準偏差（ＳＤｕｎｉｆｏｒｍ）との数学的な関係（すなわち、ＳＤ２ｕｎｉｆｏｒｍ＝ｄ２／１２）、および有限の位置精度（ＳＤｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を考慮した、標準偏差の測定値ＳＤｍｅａｓｕｒｅと、真に均一な分布を有する場合のＳＤｕｎｉｆｏｒｍとの関係（すなわち、ＳＤ２ｍｅａｓｕｒｅ＝ＳＤ２ｕｎｉｆｏｒｍ＋ＳＤ２ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を使用することができる。図１Ｅ〜１Ｆに示したような、個々に測定した位置決定精度と、ビーズの３Ｄ画像のｘ方向、ｙ方向、およびｚ方向の投影分布のＳＤｍｅａｓｕｒｅとから、ビーズの直径（ｄ）をｘ軸、ｙ軸、およびｚ軸に沿って導き出した。５３個のビーズを測定した直径分布をここに示しており、平均直径は、それぞれ、ｘ方向で２１０±１６ｎｍ、ｙ方向で２２６±２５ｎｍ、ｚ方向で２２８±２５ｎｍであった。測定した直径は、このビーズについて製造業者が示している直径（２００ｎｍ）と定量的に同じである。値がわずかに大きくなっているのは、一部分には、ストレプトアビジンコーティングの有限の厚みによるものであり得る。
【００５７】
別の例として、細胞画像化を記載する。この例では、ミドリザルの腎臓上皮（ＢＳ−Ｃ−１）細胞の微小管ネットワークについて、間接的な免疫蛍光画像化を行った。細胞を一次抗体で免疫染色し、Ｃｙ３およびＡｌｅｘａ  ６４７で二重に標識された二次抗体で免疫染色した。得られた三次元画像は、従来の広視野蛍光画像と比較して、解像度がかなり向上している（図２Ａ〜２Ｂ）だけではなく、従来の画像（図２Ａ）では得られなかった、ｚ次元の情報も得られた（図２Ｂ）。図２Ａは、ＢＳ−Ｃ−１細胞の大きな領域にわたる微小管の従来の間接的な免疫蛍光画像であり、図２Ｂは、本明細書に記載の技術を用いて画像化した同じ領域の画像であり、ｚ位置の情報によって影がついている。微小管線維の複数の層が、細胞のｘ−ｙ断面図、ｘ−ｚ断面図またはｙ−ｚ断面図から明らかに視覚化された（図２Ｃ〜２Ｅ）。この領域は、図２Ｂの白い四角で囲んだ領域であり、５個の微小管線維が示されている。
【００５８】
細胞画像化の解像度をさらに定量的に特性決定するために、細胞において、任意の識別可能な微小管線維から離れた位置にある小さな集団として存在する点状の実体を位置決定するために特定した。これらの集団は、細胞に非特異的に結合した個々の抗体であってもよい。細胞を測定した全ｚ範囲にわたって上述の集団を無作為に選択し、この集団のＦＷＨＭは、ｘ方向に２２ｎｍ、ｙ方向に２８ｎｍ、およびｚ方向に５５ｎｍであり（図５）、この値は、ガラス表面に固定した個々の分子について決定した値と定量的にほぼ同じであった（図５と、図１Ｅ〜１Ｇとを比較）。ｚ方向に１０２ｎｍ離れた２個の微小管線維は、三次元画像で良好に離れているようであり（図２Ｆ）、図２Ｆは、２個の微小管のｚプロフィールをｘ−ｙ方向に切断したものを示している。このヒストグラムは、位置決定のｚ座標分布と、同じ幅を有する二重Ｇａｕｓｓｉａｎにフィッティングさせた結果（曲線）とを示している。微小管線維のｚ次元の見かけ幅は６６ｎｍであり、この値は、ｚ方向の固有の画像解像度よりもわずかに大きく、画像解像度の畳み込みと、抗体でコーティングされた微小管について、独立して測定した幅値とに定量的に一致していた（図２Ｆ）。固有の画像解像度と、ラベル（例えば抗体）の大きさを組み合わせることによって有効解像度を決定したため、次の実施例に示されているように、間接的な免疫蛍光の代わりに直接的な方法を用い、標識する抗体の１つの層を除去することによって、またはＦａｂフラグメントまたは遺伝的にコードされるペプチドタグを抗体の代わりに用いることによって、解像度の改善が達成されてもよい。
【００５９】
図５では、細胞において、任意の識別可能な微小管線維から離れた位置にある小さな集団として存在する点状の実体の位置決定の精度を決定した。これらの点状の集合内で、ｘ次元、ｙ次元、ｚ次元の位置決定の空間分布をここに示す。２０２個の集合の質量中心を合わせることによって、位置決定のヒストグラムを作製した。それぞれの集合には、８個以上の位置決定が含まれていた。このヒストグラムをＧａｕｓｓｉａｎ関数にフィッティングさせ、それぞれ、ｘ方向の標準偏差９ｎｍ、ｙ方向の標準偏差１２ｎｍ、およびｚ方向の標準偏差２３ｎｍを得る。対応するＦＷＨＭ値は、２２ｎｍ、２８ｎｍ、および５５ｎｍであった。
【００６０】
最後に、細胞においてナノスケールの構造の三次元形態を解像可能であることを示すために、クラスリン被覆小窩（ＣＣＰ）をＢＳ−Ｃ−１細胞中で画像化した。ＣＣＰは、細胞膜の細胞質上にあるクラスリン、アダプタータンパク質および他の補因子を組み合わせた１５０ｎｍ〜２００ｎｍの球状のカゴ型構造をしており、エンドサイトーシスを促進する。ＣＣＰを画像化するために、クラスリンについて、Ｃｙ３およびＡｌｅｘａ  ６４７で二重に標識された一次抗体を使用し、直接的な免疫蛍光スキームを使用した。従来の蛍光顕微鏡法で画像化する場合、すべてのＣＣＰは、まったく構造を区別できない、ほぼ回折限界の点であった（図３Ａ、この図は、ＢＳ−Ｃ−１細胞のある領域の従来の直接的な免疫蛍光画像である）。本明細書に記載の技術を用い、ｚ次元の情報を破棄した二次元画像では、ＣＣＰの丸い形状を観測することができた（図３Ｂおよび図３Ｄ）。この２Ｄ投影画像から測定したＣＣＰの粒径分布（１８０±４０ｎｍ）は、電子顕微鏡法を用いて決定した粒径分布と定量的に一致している。ｚ次元の情報を含めると、この小窩の３Ｄ構造を視覚化することができる（図３Ｃ、図３Ｅ〜３Ｈ）。図３Ｃおよび図３Ｅは、細胞表面にある小窩の開口部付近の領域から選択した、この画像のｘ−ｙ断面図を示している。図３Ｃは、図３Ａ〜３Ｂに示したのと同じ領域の厚み５０ｎｍのｘ−ｙ断面図であり、プラスマ膜でＣＣＰの開口部が円形の構造をしていることを示している。一方、図３Ｅは、２個の隣接するＣＣＰの厚み１００ｎｍのｘ−ｙ断面図の拡大図である。
【００６１】
小窩の外周の環状構造が、明確に解像されていた。小窩の連続的なｘ−ｙ断面図およびｘ−ｚ断面図（図３Ｆ〜３Ｈ）から、二次元画像では観測することができなかった、これらのナノスケール構造の半球状のカゴ型三次元構造が明らかになった。これらの図面は、ＣＣＰのｘ−ｙ断面図（ｚ方向にそれぞれ厚み５０ｎｍ）（図３Ｆ）および連続的なｘ−ｚ断面図（ｙ方向にそれぞれ厚み５０ｎｍ）（図３Ｇ）を示し、３Ｄ斜視図であらわされたｘ−ｙ断面図およびｘ−ｚ断面図（図３Ｈ）は、小窩の半球状のカゴ型構造を示している。
【００６２】
まとめると、これらの実施例は、１００ｎｍ以下のオーダーの解像度を有する、高解像度の三次元画像を示す。以前には電子顕微鏡でしか見ることができなかった解像度で、現在は周囲条件下で分子特異性を有した状態で、光学的に細胞構造のナノスケールの特徴が解像された。この発見によって、分子組織と、細胞内の相互作用ネットワークとを視覚化する能力を顕著に高めることが可能である。
【００６３】
（実施例２）
本実施例は、実施例１に関して有用な特定の技術について記載する。実施例１の光によってスイッチング可能なプローブの三次元位置決定の精度を特性決定するために、製造業者が指示したプロトコルにしたがってタンパク質をアミン反応性染料とともにインキュベートすることによって、ストレプトアビジン分子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、光によってスイッチング可能なＡｌｅｘａ  ６４７フルオロフォア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、アクチベーター染料Ｃｙ３（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とで標識した。Ｎａｐ−５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたゲル濾過によって、未反応の染料分子を除去した。標識比をＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計で特徴付けして、吸収スペクトルから、標識比は、ストレプトアビジン１分子あたり、Ｃｙ３が約２、Ａｌｅｘａ  ６４７が約０．１であることを示していた。次いで、標識されたストレプトアビジンを、ガラススライドと１．５番のカバーガラスとを使って組み立てたガラスフローチャンバ表面に固定した。１Ｍ水酸化カリウムで１５分間超音波処理し、ＭｉｌｌｉＱ水でさらに洗浄し、圧縮窒素で乾燥することによって、スライドおよびカバーガラスを洗浄した。標識されたストレプトアビジンサンプルをフローチャンバに注入し、ストレプトアビジンが、表面に非特異的に直接吸着させるか、またはビオチン化したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でコーティングされた表面に対し、ビオチン−ストレプトアビジン結合を介して吸着させた。ｚ位置決定の測定値に関する較正曲線を作製するために、Ａｌｅｘａ  ６４７で標識されたストレプトアビジンまたは量子ドット（タンパク質Ａ被覆Ｑｄｏｔ  ６５５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）も使用した。Ｃｙ３およびＡｌｅｘａ  ６４７で二重に標識されたストレプトアビジンと同じ様式で、１個の標識されたストレプトアビジンをチャンバ表面に固定し、量子ドットを、非特異的な結合によって、チャンバ表面に直接固定した。
【００６４】
光によってスイッチング可能なフルオロフォアでコーティングされた２００ｎｍのポリスチレンビーズを作製するために、最初に、０．２５ｍｇ／ｍＬの標識されていないストレプトアビジン溶液を上記のフローチャンバに流し、次いで、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄することによって、カバーガラス表面をストレプトアビジンでコーティングした。次いで、直径２００ｎｍのビオチン化ポリスチレンビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をこのチャンバに加え、表面に固定した。最後に、Ｃｙ３およびＡｌｅｘａ  ６４７で二重に標識されたストレプトアビジン３μｇ／ｍＬを流し、ビオチン化したビーズ表面をコーティングした。この手順の間、いくつかの蛍光ストレプトアビジンも、カバーガラス表面に非特異的に吸着された。次いで、このフローチャンバをＰＢＳで洗浄し、溶液中の遊離ストレプトアビジン分子を除去した。
【００６５】
ＢＳ−Ｃ−１細胞を８ウェルチャンバーのカバーガラス（ＬａｂＴｅｋ−ＩＩ、Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｎｕｎｃ）に密度４０ｋ／ウェルで置いた。１６〜２４時間後、ＰＢＳ中の３％パラホルムアルデヒドおよび０．１％グルタルアルデヒドを用いて１０分間固定し、次いで０．１％ホウ化水素ナトリウムで７分間処理し、未反応のアルデヒド基と、固定中に生成した蛍光産物を還元した。加水分解を防ぐために、ホウ化水素ナトリウム溶液は使用直前に調製した。固定したサンプルをＰＢＳで３回洗浄し、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ中、３％（ｗ／ｖ）  ＢＳＡ、０．５％（ｖ／ｖ）  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で１５分間透過処理した。
【００６６】
微小管をマウスモノクローナルβ−チュブリン抗体（ＡＴＮ０１、Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ）で３０分間染色し、次いで、ヤギ抗−マウス二次抗体で３０分間染色した。この二次抗体は、アミン反応性のＡｌｅｘａ  ６４７およびＣｙ３で標識されており、標識の化学量論は、抗体あたり、平均でＣｙ３が約４．０、Ａｌｅｘａ  ６４７が約０．４であることを特徴としていた。それぞれの染色工程の後に、ＰＢＳ中の０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を用いて３回洗浄した。
【００６７】
直接的な免疫蛍光法によってクラスリンを染色するために、マウスモノクローナル抗−クラスリン重鎖（クローンＸ２２、ａｂ２７３１、Ａｂｃａｍ）および抗−クラスリン軽鎖（クローンＣＯＮ．１、Ｃ１９８５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を同時に使用した。両抗体を、抗体あたり、約１．０のＣｙ３、約１．０のＡｌｅｘａ  ６４７で標識した。このサンプルを３０分間染色し、ＰＢＳで３回洗浄し、すぐに画像化するために使用した。
【００６８】
免疫蛍光画像化法は、広範囲の染料標識比でうまく機能することを注記しておくべきである。典型的には、抗体あたり、標識比が１以上のアクチベーター（この例では、Ｃｙ３）を選択し、抗体の大部分がアクチベーターを有するようにした。一方、同じ抗体に非常に近い位置に、光によってスイッチング可能な２個以上のリポーター（この例では、Ａｌｅｘａ  ６４７）をアミノ酸残基に結合させた場合、ある場合では、リポーター−リポーター相互作用が生じ、オフ状態にスイッチングする速度が顕著に遅くなることがある。以前の特性決定では、２ｎｍ離れた２個のリポーターがオフ状態になる速度は、１個のリポーターがオフ状態になる速度よりも約５倍遅く、一方で、７ｎｍ離れた２個のリポーターがオフ状態になる速度は、他から隔離されたリポーターがオフ状態になる速度と同程度である。したがって、この効果を最少にするために、染料／タンパク質の比率が１以下になるように選択した。
【００６９】
データを収集する直前に、サンプルのバッファー溶液を画像化バッファーと交換した。画像化バッファーには、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍｇ／ｍＬ  グルコースオキシダーゼ（Ｇ２１３３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、４０μｇ／ｍＬ  カタラーゼ（１０６８１０、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１０％（ｗ／ｖ）グルコースおよび１％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノールが含まれていた。β−メルカプトエタノール（または、システインのような他のチオールを含有する試薬）は、シアニン染料を光によってスイッチングさせるのに重要であることがわかっていた。低濃度のβ−メルカプトエタノール（例えば、０．１％（ｖ／ｖ））でも画像化を実施することができ、このことは、生きている細胞の画像化に適している。この研究では、上述の画像化実験のすべてを、固定した細胞で行った。
【００７０】
実施例１に記載したすべての画像化実験を、倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ−７１）で行った。励起源として２種類の固体状態レーザーを使用した（光によってスイッチング可能なリポーターフルオロフォア（Ａｌｅｘａ  ６４７）を励起させ、これを暗状態にスイッチングするために、６５７ｎｍのレーザー（ＲＣＬ−２００−６５６、Ｃｒｙｓｔａｌａｓｅｒ）と、Ｃｙ３によって促進される様式でＡｌｅｘａ  ６４７を再び活性化させるために、５３２ｎｍのレーザー（ＧＣＬ−２００−Ｌ、Ｃｒｙｓｔａｌａｓｅｒ））。この２種類のレーザービームを組み合わせ、光ファイバー（Ｐ３−６３０Ａ−ＦＣ−５、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）内で合わせて、結合させる。光ファイバーの出口を平行にして、顕微鏡の後ろ側のポートから、高開口数油浸対物レンズ（１００×  ＵＰｌａｎＳＡｐｏ、ＮＡ  １．４、Ｏｌｙｍｐｕｓ）の後ろ側の焦点面で集束させた。移動ステージは、両レーザーを対物レンズの端に向かってシフトさせ、その結果、対物レンズから出る光は、ガラス−水界面の臨界角度を超えないが、この角度に近い大きな入射角でサンプルに届いた。この励起スキームによって、表面から数マイクロメートル以内にあるフルオロフォアが励起し、溶液からのバックグラウンド蛍光量が小さくなった。蛍光放射を同じ対物レンズによって集め、多色ミラー（ｚ４５８／５１４／６４７ｒｐｃ、Ｃｈｒｏｍａ）、バンドパスフィルタ（ＨＱ７１０／７０ｍ、Ｃｈｒｏｍａ）、およびロングパスフィルタ（ＨＱ６６５ＬＰ、Ｃｈｒｏｍａ）によって選別した。選別した放射光を弱い円筒形のレンズ（焦点長さ１ｍ）を間に挿入したリレーレンズ対に通し、ＥＭＣＣＤカメラ（Ｉｘｏｎ  ＤＶ８９７ＤＣＳ−ＢＶ、Ａｎｄｏｒ）で画像化した。
【００７１】
データ収集中に顕微鏡の焦点を安定化させるために、ガラス−水界面で反射した赤色励起レーザーを、顕微鏡の後ろ側のポートにある反射プリズムによって、象限フォトダイオードに向かわせた。象限フォトダイオードは、反射したレーザーの位置を読み取り、この象限フォトダイオードは、カバーガラス表面と対物レンズとの距離に感応性である。次いで、この情報が、顕微鏡の焦点においてｚ−ドリフトを補正するように、ソフトウェアによって、ｚ方向の圧電性のステージ（ＮａｎｏＶｉｅｗ−Ｍ，  ＭａｄＣｉｔｙ  Ｌａｂｓ）にフィードバックされた。この「フォーカスロック」システムは、ＳＴＯＲＭデータ収集中に、４０ｎｍ以内の焦点位置を維持することができた。以下に記載するように、データ分析中、ｚの残ったドリフトを補正した。
【００７２】
データ収集の間、相対的に強い画像化／不活性化レーザー（６５７ｎｍで約４０ｍＷ）および相対的に弱い活性化レーザー（５３２ｍｍで２ｍＷ未満）をサンプルに同時に適用した。活性化レーザーおよび不活性化レーザーの両方を同時に照射すると、リポーターフルオロフォアが、蛍光状態と暗状態との間を確率論的にスイッチングした。相対的に強い画像化／不活性化レーザーの出力を選択することによって、放射強度が大きくなり、オフにスイッチングする速度が速くなり、そして、相対的に弱い活性化レーザーを選択することによって、所定の時間に活性化するフルオロフォアの一部分が十分に少なく、これらのフルオロフォアを光学的に解像可能にする事ができる。ＥＭＣＣＤカメラは、２０Ｈｚのフレーム速度で連続的に画像を撮影し、「動画」を得た。
【００７３】
単一の分子の画像幅からｚ座標を導くために、図１Ｃに示すような較正曲線を作製した。較正実験を、実施例１で３つの方法で行った。１．Ａｌｅｘａ  ６４７で標識されたストレプトアビジンを低密度でカバーガラス表面に吸着させ、個々のストレプトアビジン分子を互いに解像可能な状態にした。画像化バッファー中のβ−メルカプトエタノールを、２ｍＭ  Ｔｒｏｌｏｘと交換し、フルオロフォアの点滅（ｂｌｉｎｋｉｎｇ）を抑制した。圧電ステージを用い、一定速度でｚ方向にサンプルステージをスキャンし、個々のストレプトアビジン分子の蛍光画像を記録した。２．量子ドットをカバーガラスに吸着させた。１％  β−メルカプトエタノールのＰＢＳ溶液を画像化バッファーとして使用し、量子ドットの点滅を抑制した。一定速度でｚ方向にサンプルステージをスキャンし、個々の量子ドットの蛍光画像を得た。  ３．Ｃｙ３−Ａｌｅｘａ  ６４７で標識されたストレプトアビジンを高密度でカバーガラス表面に吸着させた。データ収集を行う間、同様に測定を行った。ただし、一定速度で、ｚ方向にサンプルをゆっくりとスキャンした。視野の中にある小さな領域（通常は、８μｍ×４μｍ）での光による活性化事象を使用し、較正曲線を測定した。３種類の測定をすべて行い、同様の較正曲線を得た。
【００７４】
較正実験の１つの画像フレームにおける蛍光ピークを、楕円Ｇａｕｓｓｉａｎ関数にフィッティングした。
【００７５】
【化１】
0005526036.tif 000002
式中、ｈは、ピーク高さであり、ｂは、バックグラウンドであり、（ｘ０，ｙ０）は、ピークの中心位置であり、ｗｘおよびｗｙは、それぞれｘ方向およびｙ方向での画像の幅（点広がり関数、ＰＳＦ）をあらわす。同時に、対応する分子のｚ位置を、圧電状態のｚの軌道から決定した。次いで、ｗｘ値およびｗｙ値を、ｚの関数として、典型的なデフォーカス曲線の改変型にフィッティングした。
【００７６】
【化２】
0005526036.tif 000003
式中、ｗ０は、分子が焦点面にある場合のＰＳＦ幅であり、ｃは、平均焦点面からみた、ｘ焦点面またはｙ焦点面のオフセットであり、ｄは、顕微鏡の焦点深さであり、ＡおよびＢは、画像化光学部の非理想性を補正するための高次項の係数である。平均焦点面は、この平均焦点面に位置するフルオロフォアが、ｘ方向およびｙ方向に等しい幅の画像ＰＳＦを有し、球状の画像を作製するように規定される。ｗｘ測定値およびｗｙ測定値を、対応するｚ位置で検索した較正曲線と比較する場合、自動的なｚ位置決定を容易にするために、これらのフィッティング曲線を作製することを注記しておくべきである。その曲線が、測定した較正データに十分精密に合うならば、曲線をフィッティングするのに使用する実際の関数は、あまり重要ではなかった。
【００７７】
すでに記載した方法と似た方法でデータを分析した（国際特許公開番号ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１７６１８（２００７年８月７日出願、表題「Ｓｕｂ−Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｌｉｍｉｔ  Ｉｍａｇｅ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、国際特許公開番号ＷＯ２００８／０９１２９６として、２００８年７月３１日公開、本明細書に援用する）を参照）が、個々の活性化したフルオロフォアの画像の形状から、ｚ次元のさらなる情報を誘導した。ＳＴＯＲＭ動画のそれぞれの画像フレームにおける蛍光ピークを、楕円Ｇａｕｓｓｉａｎ関数と局所的に最大限フィッティングさせることによって特定し、ピーク高さｈ’と、横方向の２つの次元における中心位置ｘ０’およびｙ０’、横方向の２つの次元におけるピーク幅ｗｘ’およびｗｙ’を推定した。弱すぎるピーク、幅広すぎるピーク、曲がりすぎているピークを除外し、満足のいく位置決定精度を得るために、ピーク高さ（ｈ’）、幅
【００７８】
【化３】
0005526036.tif 000004
および楕円率（ｗｘ’／ｗｙ’）に閾値を適用した。さらに、複数のフルオロフォアの画像が重なっている特定のピークも除外した。連続的なフレームで特定したピークの中心位置が、１ピクセル未満空間的に離れている場合、これらの位置は、１つの光活性化事象の間に、同じ分子から発生したものであると考えた。異なるフレームにおいて、同じフルオロフォアの同じ光活性化事象から得たすべての画像を平均し、楕円Ｇａｕｓｓｉａｎ関数への第２のフィッティングを行い、精密な中心位置ｘ０およびｙ０、精密な幅ｗｘおよびｗｙの推定を実行した。最初のフィッティングで得たピーク幅によって、第２のフィッティングで使用した画像の領域を決定した。
【００７９】
第２のフィッティングの後、較正曲線を検索し、フィッティングから得た幅ｗｘおよびｗｙの測定値に最もよく適合するｚ０点を見つけた。ｗｘ１／２−ｗｙ１／２空間で距離を最少化することによって、この検索を自動的に行った。
【００８０】
【化４】
0005526036.tif 000005
幅の二乗根を用いることによって、幅を直接使用する手順と比較すると、検索手順においてｚの位置決定精度が高まることを、シミュレーションし、分析的に処理することによって示すことができる。あらかじめ設定した閾値よりも大きな最小距離Ｄを有する活性化事象は、その画像がゆがめられていること示し、これは、同じ画像フレームにおいて、非常に近い位置に位置し、光活性化される２個以上の分子によって生じていると考えられる。これらの事象は、さらなる分析の際には除外した。この手順によって、それぞれの活性化したフルオロフォアの３Ｄ位置（ｘ０、ｙ０、およびｚ０）を得て、この様式で、三次元画像を構築した。
【００８１】
ガラス基板に支持された生体サンプルについて、油浸対物レンズを用いて水溶液中で３Ｄ  ＳＴＯＲＭ測定を行う際に、ガラスの屈折率（ｎ＝１．５１５）と画像化バッファーの屈折率（１０％グルコース溶液でｎ＝１．３５）があわないことを考慮してもよい。このように、屈折率が異なることによって、ガラス表面から離れた実体の見かけｚ位置が効率的にシフトする。表面から数μｍ以内では、この屈折率の違いによって誘導されるｚ方向の距離の倍率が、一定になるように処理され、倍率のファクターが、対物レンズで１．２６であり、屈折率を、上述の画像化条件で使用することを示した（対物レンズ：ＮＡ＝１．４、ガラス：ｎ＝１．５１５、バッファー：ｎ＝１．３５）。この小さな拡大効果は、ファクター１／１．２６＝０．７９によって、較正曲線と直接比較から得られた、すべてのｚ値を計算しなおすことによって、ｚ方向の位置決定分析にしたがって補正された。
【００８２】
画像化光学部における収差によって、ＰＳＦは、フルオロフォアが焦点の外側にあると、非対称となる場合があり、その結果、画像の中心が、フルオロフォアの実際の横向きの位置よりもわずかにずれる場合がある。これにより、３Ｄ画像において、見かけ上、傾いた形状のねじれが生じる。平均的な傾きは、上述の実験では４°を超えず、傾きプロフィールをあらかじめ較正しておくことによって補正することができる。
【００８３】
位置決定の精度に影響を与える重要な因子は、画像を収集している間のサンプルステージのドリフトである（ｘ−ｙ面のドリフト、ｚ方向のドリフトの両方を含む）。実施例１で用いた設定では、ｚ方向のドリフトが最少になるようにフォーカスロックを設定したが、それでも約４０ｎｍの残りのドリフトが存在している。上述の実施例では、２つの方法を用いて、このドリフトを補正している。１つの方法は、基準マーカー（蛍光ビーズ）を加え、サンプルのドリフトを追跡し、画像分析中のマーカーの移動を引き算する方法である。もう１つの方法では、ドリフト補正のために、画像の相関関数を使用した。第２の方法を使用し、上述の実施例で、ｘ方向、ｙ方向、およびｚ方向のドリフトを補正した。動画を等時間部分に時間を分け、それぞれの動画部分から画像を構築した。次いで、第１の部分の画像と、すべてのそれ以外の部分の画像との相関関数を算出し、この相関関数の中心位置を決定した。これらの中心位置に基づく補間を用い、それぞれの画像化フレームについて、時間の関数として中心位置の曲線を作製した。次いで、位置決定結果からドリフトを引き、異なる時間点でのすべての位置決定結果を含め、ドリフト補正した画像を作製した。
【００８４】
本発明のいくつかの実施形態を本明細書に記載し、図示してきたが、当業者は、本明細書に記載の機能を実施し、および／または本明細書に記載の結果および／または１つ以上の利点を得るための種々の他の手段および／または構造を容易に想像でき、このような変形例および／または改変例はそれぞれ、本発明の範囲内にあると考えられる。さらに一般的には、当業者は、本明細書に記載のすべてのパラメータ、寸法、物質および構成が例示であることを意図しており、実際のパラメータ、寸法、物質および／または構成は、本発明の教示内容が使用される特定の１つ以上の適用例に依存することを容易に理解するであろう。当業者は、通常の実験を超えない範囲で、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態の多くの等価物を理解するか、または解明することができるであろう。したがって、上述の実施形態が単に一例をあらわすものであり、添付の特許請求の範囲およびその等価物の範囲内で、本発明は、特定的に記載され、特許請求の範囲に記載されたもの以外のやり方で実施してもよいことを理解するべきである。本発明は、本明細書に記載のそれぞれの個々の特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法に関する。それに加え、２つ以上のこのような特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法の任意の組み合わせは、このような特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法が互いに矛盾していない場合には、本発明の範囲内に含まれる。
【００８５】
本明細書で定義され、使用されるすべての定義は、辞書の定義、援用する文書に記載の定義、および／または定義された用語の一般的な意味よりも優先すると理解されるべきである。
【００８６】
不定冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、そうでないと明確に示されていない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
【００８７】
句「および／または」は、本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、その接続された要素の「いずれかまたは両方」、すなわち、いくつかの場合には接続的に存在する要素および他の場合には非接続的に存在する要素を意味すると理解されるべきである。「および／または」で列挙される複数の要素は、同じ様式で解釈されるべきである。すなわち、接続された要素の「１つ以上」であると解釈されるべきである。「および／または」の節で具体的に特定された要素以外の他の要素が任意に存在してもよく、他の要素は、具体的に特定された要素と関係ある要素でもよいし、無関係な要素であってもよい。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」とは、例えば「〜を含む」のような非限定的な語句と組み合わせて使用される場合、一実施形態では、Ａのみ（場合により、Ｂ以外の要素を含む）を指し、別の実施形態では、Ｂのみ（場合により、Ａ以外の要素を含む）を指し、さらに別の実施形態では、ＡおよびＢの両方（場合により、他の要素を含む）などを指す。
【００８８】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「または」は、上に定義した「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リストで項目に分けられている場合、「または」または「および／または」は、包括的に解釈されるべきであり、すなわち、多くの要素または要素のリストのうち、少なくとも１つを含むが、２つ以上も含み、そして任意に、列挙されていない項目をさらに含むと解釈されるべきである。それとは反対に、示されているもののみを示す用語、例えば、「〜のうち１つのみ」または「〜のうち実際に１つ」または請求項で使用される場合、「〜からなる」は、多くの要素または要素のリストのうち、実際に１つの要素を含むことを指す。一般的に、用語「または」は、本明細書で使用される場合、排他的な用語（例えば、「いずれか」、「〜のうち１つ」、「〜のうち１つのみ」または「実際に〜のうち１つ」）が前にある場合、排他的な代替物のみを示すと解釈される（すなわち、「片方または他方であり、両方ではない」）。「〜から本質的になる」は、特許請求の範囲で使用される場合、特許法の分野で通常使用される意味を有する。
【００８９】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、句「少なくとも１つ」は、１つ以上の要素のリストを参照している場合、その要素のリストにある任意の１つ以上の要素から選択される、少なくとも１つの要素を意味するが、その要素のリストに特定的に列挙された各要素およびすべての要素のうち少なくとも１つを必ず含むわけではなく、その要素のリストにある要素の任意の組み合わせを排除するものではないと理解されるべきである。この定義では、要素が、任意に、句「少なくとも１つ」が指す要素のリストに具体的に特定された要素以外の要素（具体的に特定された要素と関係のある要素であってもよいし、無関係の要素であってもよい）が存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢのうち少なくとも１つ」（または、同じ意味で、「ＡまたはＢのうち少なくとも１つ」、または同じ意味で、「Ａおよび／またはＢのうち少なくとも１つ」）は、一実施形態では、少なくとも１つ、任意に２つ以上のＡを含み、Ｂが存在しないこと（Ｂ以外の要素を任意に含む）を指し、別の実施形態では、少なくとも１つ、任意に２つ以上のＢを含み、Ａが存在しないこと（Ａ以外の要素を任意に含む）を指し、さらに別の実施形態では、少なくとも１つ、任意に２つ以上のＡを含み、そして少なくとも１つ、任意に２つ以上のＢを含むこと（他の要素を任意に含む）などを指してもよい。
【００９０】
そうでないと明確に示されていない限り、２つ以上のステップまたは工程を含む本明細書で請求される任意の方法では、その方法のステップまたは工程の順序は、本方法のステップまたは工程操作が列挙されている順序に必ずしも限定されるものではないことも理解されるべきである。
【００９１】
特許請求の範囲および上の記載では、すべての移行句（例えば、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「〜を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「〜を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「〜を含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「〜を保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「〜から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ）」などは、非限定的であると理解されるべきである。すなわち、含むことを意味するが限定するものではないと理解されるべきである。移行句の中で、「〜からなる」および「〜から本質的になる」は、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、Ｓｅｃｔｉｏｎ  ２１１１．０３に記載されるように、それぞれ、限定的な移行句または半限定的な移行句である。
【図１Ａ】
0005526036.tif 000006
【図１Ｂ】
0005526036.tif 000007
【図１Ｃ】
0005526036.tif 000008
【図１Ｄ】
0005526036.tif 000009
【図１Ｅ】
0005526036.tif 000010
【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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