(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
互いに相補的な配列の２つの相補鎖を含む単離された２本鎖ＲＮＡであって、該相補鎖のうち１つが以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群から選択される１つのポリリボヌクレオチドを含むものであり、
（ｉ）配列番号１、２５、４９〜５５、１６３または１６６のいずれかで示される標的遺伝子の少なくとも２１個の隣接したヌクレオチドと相補的なポリリボヌクレオチド、
（ｉｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする標的遺伝子の少なくとも２１個の隣接したヌクレオチドと相補的なポリリボヌクレオチド、
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）のポリリボヌクレオチドと少なくとも９０％同一であるポリリボヌクレオチド、
前記標的遺伝子の発現を阻害する２本鎖ＲＮＡ。
【請求項２】
コロラドハムシによる２本鎖ＲＮＡの摂取により、コロラドハムシの成長が阻止される、請求項１に記載の２本鎖ＲＮＡ。
【請求項３】
請求項１または２記載の２本鎖ＲＮＡをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１または２に記載の２本鎖ＲＮＡを含む組成物。
【請求項５】
少なくとも１つの補助剤をさらに含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
少なくとも１つの界面活性剤をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
少なくとも１つの好適な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
制御配列が操作可能に連結された請求項３に記載のポリヌクレオチドで形質転換された細胞。
【請求項９】
細胞が、グラム陽性もしくはグラム陰性細菌細胞を含む原核生物細胞、または酵母細胞もしくは藻類細胞を含む真核生物細胞である、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
細胞は細菌細胞である、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
細胞は酵母細胞である、請求項９に記載の細胞。
【請求項１２】
請求項１または２に記載の少なくとも１つの２本鎖ＲＮＡを含む少なくとも１つの細菌細胞または酵母細胞を含む組成物。
【請求項１３】
細菌または酵母細胞は、熱処理または機械的処理により不活性化されるか、または死滅する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
少なくとも１つの好適な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含む、請求項１２または１３に記載の組成物。
【請求項１５】
組成物は、化学殺虫剤、パタチン、バチルス・チューリンジェンシス(Bacillus thuringiensis)殺虫性タンパク、キセノラブドゥス(Xenorhabdus)殺虫性タンパク、フォトラブダス(Photorhabdus)殺虫性タンパク、バチルス・ラテロスポラウス(Bacillus laterosporous)殺虫性タンパク、およびバチルス・スフェアリカス(Bacillus sphearicus)殺虫性タンパクからなる群から選択される少なくとも１つの殺虫剤を含み、前記殺虫剤はコロラドハムシに対して活性であるか、または前記殺虫剤は１つもしくは複数の他の植物昆虫害虫に対して活性であることをさらに含む、請求項４〜７および１２〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
少なくとも１つの細菌または酵母細胞は、化学殺虫剤、パタチン、バチルス・チューリンジェンシス(Bacillus thuringiensis)殺虫性タンパク、キセノラブドゥス(Xenorhabdus)殺虫性タンパク、フォトラブダス(Photorhabdus)殺虫性タンパク、バチルス・ラテロスポラウス(Bacillus laterosporous)殺虫性タンパク、およびバチルス・スフェアリカス(Bacillus sphearicus)殺虫性タンパクからなる群から選択される少なくとも１つの殺虫剤をさらに含むか、またはさらに発現し、前記殺虫剤はコロラドハムシに対して活性であるか、あるいは前記殺虫剤は１つまたは複数の他の植物昆虫害虫に対して活性である、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
化学殺虫剤、パタチン、バチルス・チューリンジェンシス(Bacillus thuringiensis)殺虫性タンパク、キセノラブドゥス(Xenorhabdus)殺虫性タンパク、フォトラブダス(Photorhabdus)殺虫性タンパク、バチルス・ラテロスポラウス(Bacillus laterosporous)殺虫性タンパク、およびバチルス・スフェアリカス(Bacillus sphearicus)殺虫性タンパクからなる群から選択される少なくとも１つの殺虫剤をさらに含むか、または発現する少なくとも１つの細菌または酵母細胞をさらに含み、前記殺虫剤はコロラドハムシに対して活性であるか、あるいは前記殺虫剤は１つまたは複数の他の植物昆虫害虫に対して活性である、請求項４〜７および１２〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
バチルス・チューリンジェンシス(Bacillus thuringiensis)殺虫性タンパクがＣｒｙ１、Ｃｒｙ３、ＴＩＣ８５１、ＣｒｙＥＴ１７０、Ｃｒｙ２２、二成分殺虫性タンパクＣｒｙＥＴ３３およびＣｒｙＥＴ３４、二成分殺虫性タンパクＣｒｙＥＴ８０およびＣｒｙＥＴ７６、二成分殺虫性タンパクＴＩＣ１００およびＴＩＣ１０１、および二成分殺虫性タンパクＰＳ１４９Ｂ１からなる群から選択される、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の組成物を有効成分とする、コロラドハムシを死滅させるための薬剤。
【請求項２０】
請求項４〜７および１２〜１８のいずれか１項に記載の少なくとも１つの組成物または請求項１９に記載の薬剤を含む、スプレー。
【請求項２１】
少なくとも１つの補助剤および少なくとも一つの界面活性剤をさらに含む、請求項２０に記載のスプレー。
【請求項２２】
請求項４〜７および１２〜１８のいずれか１項に記載の組成物、または請求項１９に記載の薬剤を含むコロラドハムシに使用するための収容ケース。
【請求項２３】
請求項４〜７および１２〜１８のいずれか１項に記載の組成物、または請求項１９に記載の薬剤を含むコロラドハムシに使用するための罠。
【請求項２４】
請求項４〜７および１２〜１８のいずれか１項に記載の組成物、または請求項１９に記載の薬剤を含むコロラドハムシに使用するための餌。
【請求項２５】
コロラドハムシを死滅または成長を阻止するための、請求項４〜７および１２〜１８のいずれかに記載の組成物、請求項１９に記載の薬剤、請求項２０または２１に記載のスプレー、請求項２２に記載の収容ケース、請求項２３に記載の罠または請求項２４に記載の餌の使用。
【請求項２６】
医薬品用途または獣医学用途における、請求項４〜７および１２〜１８のいずれか１項に記載の組成物、請求項１９に記載の薬剤、請求項２０または２１に記載のスプレー、請求項２２に記載の収容ケース、請求項２３に記載の罠または請求項２４に記載の餌の使用。
【請求項２７】
請求項４〜７および１２〜１８のいずれか１項に記載の組成物、請求項１９に記載の薬剤、または請求項２０または２１に記載のスプレーであって、請求項１または２に記載の２本鎖ＲＮＡを含む、該組成物、該薬剤または該スプレーを植物に適用することを含む、植物でのコロラドハムシの成長を阻止するか、または植物のコロラドハムシの横行を阻止する方法。
【請求項２８】
請求項４〜７および１２〜１８のいずれか１項に記載の組成物、請求項１９に記載の薬剤、または請求項２０または２１に記載のスプレーの有効量を植物に適用することを含む、植物の収穫量改善方法。
【請求項２９】
植物は、アルファルファ、リンゴ、アプリコット、アーティチョーク、アスパラガス、アボカド、バナナ、オオムギ、マメ、ビート、ブラックベリー、ブルーベリー、ブロッコリ、芽キャベツ(Brussel sprouts)、キャベツ、アブラナ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、穀物、セロリ、チェリー、柑橘類、クレメンタイン、コーヒー、コーン、ワタ、キュウリ、ナス、エンダイブ、ユーカリ、イチジク、ブドウ、グレープフルーツ、落花生、ホウズキ、キウィフルーツ、レタス、ニラ、レモン、ライム、パイン、トウモロコシ、マンゴ、メロン、キビ、キノコ、ナット・オート(nut aot)、オクラ、タマネギ、オレンジ、鑑賞植物または花または木、パパイア、パセリ、エンドウ豆、モモ、ピーナッツ、ピート、コショウ、カキ、パイナップル、オオバコ、プラム、ザクロ、ポテト、カボチャ、ラディッキョ、ダイコン、ナタネ、ラズベリー、コメ、ライムギ、モロコシ、ダイズ(soy)、ダイズ(soybean)、ホウレンソウ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、タンジェリン、茶、タバコ、トマト、ツルクサ、スイカ、コムギ、トロロイモ、およびズッキーニからなる群から選択される、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項４〜７および１２〜１８のいずれか１項に記載の組成物、請求項１９に記載の薬剤、または請求項２０または２１に記載のスプレーであって、請求項１または２に記載の２本鎖ＲＮＡを含む、該組成物、該薬剤または該スプレーを基質に適用することを含む、基質上でのコロラドハムシの成長を阻止する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は昆虫種の２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）仲介遺伝子サイレンシングの分野に関する。より具体的には、本発明は新規な標的遺伝子に対応するｄｓＲＮＡの発現を設計した遺伝子構築物に関する。これらの構築物は特にＲＮＡｉ仲介植物害虫制御に有用である。本発明は、さらに昆虫を制御する方法、昆虫横行を阻止する方法およびＲＮＡｉを利用する昆虫における下流遺伝子発現のための方法に関する。また、本発明は昆虫横行に抵抗性ある遺伝子組換え植物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
昆虫および他の害虫は、その虫刺され（bitesor stings）による損傷、さらには死亡の原因となる。さらに、多くの害虫は疾患を生じる細菌および他の病原体を伝達する。例えば、蚊はマラリア、黄熱病、脳炎および他の疾患を生じる病原体を伝達する。腺ペスト、または黒死病はラットや他のげっ歯類に感染する細菌によって生じる。顕微鏡的害虫横行を制御する組成物は、抗生物質、抗ウイルス製剤、および抗真菌剤組成物の形態で提供されている。線虫および昆虫などの害虫による横行を制御する方法は、通常、害虫が住む表面に適用されるか、または横行する動物にペレット、粉末、錠剤、ペースト剤またはカプセルの形態で使用される化学組成物の形態である。
【０００３】
農学的に重要な農作物での昆虫害虫の制御は重要であり、特にソラナセアエ(Solanaceae)科、特にトマト（ソラナム・チュベロスム(Solanum tuberosum)）のみならず、トマト（ソラナム・リコペルシクム（Solanum lycopersicum））、ナス（ソラナム・メロンゲナ（Solanum melongena））、トウガラシ（ソラナム・キャプシクム（Solanum capsicum））、およびイヌホオズキ（例えば、ソラナム・アキュレアストラム（Solanum aculeastrum）、Ｓ．ブルボカスタナム（S. bulbocastanum）、Ｓ．カルディオフィルム（S.cardiophyllum）、Ｓ．ドウグラシー（S.douglasii）、Ｓ．デュルカマラ（S.dulcamara）、Ｓ．ランセオラツム（S. lanceolatum）、Ｓ．ロブスタム（S. robustum）、およびＳ．トリクェトラム（S.triquetrum））に属する植物に被害を与える昆虫害虫、特に甲虫目害虫の制御は重要である。
【０００４】
植物での昆虫の横行を制御するためのより有効な方法および組成物を開発することにむけて、ここ数十年間に、実質的な進歩がなされてきた。化学的殺虫剤は害虫の横行を非常に効率よく除去するものであった。
インドセンダン種子の抽出物を使用する生物学的制御は、野菜の甲虫目害虫に対して作用することが示されている。商業的に入手可能なインドセンダン系殺虫剤は、一次活性成分としてアザディラクチンを有する。これらの殺虫剤は広い範囲の昆虫に対して適用可能である。これらは昆虫成長制御因子として作用し、すなわち、アザディラクチンは昆虫ホルモン、エクジソンの生成を阻害することによって昆虫が脱皮することを阻止する。
【０００５】
バチルス・チューリンジェンシス（Bacillusthuringiensis）変異体テネブリオ二ス（teneobrionis）およびサン・ジェゴ（sandiego）からのタンパクＣｒｙ３Ａおよび誘導昆虫性タンパクを使用する生物学的制御が化学制御の代替品である。Ｂｔ毒素タンパクは葉上へ噴霧されるか、あるいはジャガイモの葉で発現される製剤のいずれかで、コロラド・ポテト・ビートル(Colorado potato beetles)の幼虫を制御することに有効である。
【０００６】
別の生物学的製剤としては、ｄｓＲＮＡがある。最近、数年にわたってＲＮＡ干渉または「ＲＮＡｉ」による多細胞生物の遺伝子の下方制御（「遺伝子サイレンシング」とも呼ばれる）が十分に確立された技術となっている。
【０００７】
ＲＮＡ干渉または「ＲＮＡｉ」は、下方制御される標的遺伝子の領域に対して配列が相補的である２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって開始される遺伝子発現の配列特異的下方制御方法（「遺伝子サイレンシング」または「ＲＮＡ仲介遺伝子サイレンシング」とも呼ばれる）である（Fire, A,Trends Genet, Vol. 15,358-363, 1999（非特許文献１）; Sharp,P.A. Genes Dev. Vol. 15,485-490, 2001（非特許文献２））。
【０００８】
最近、数年にわたって、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による多細胞生物の標的遺伝子の下方制御は、十分に確立された技術となっている。Carnegie Institutionによる国際公開第９９／３２６１９号（特許文献１）および本出願人による国際公開第００／０１８４６号（特許文献２）が参照される。
【０００９】
ｄｓＲＮＡ遺伝子サイレンシングは、多くの異なった領域、例えば臨床用途（国際公開第２００４／００１０１３号（特許文献３））および植物におけるｄｓＲＮＡ仲介遺伝子サイレンシングなどにその用途を見出す。植物では、遺伝子サイレンシングにおいて有用なｄｓＲＮＡ構築物もまた、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に切断され、そして、プロセシングされるように設計されている。
【００１０】
ＲＮＡｉの技術は植物の分野で一般的に知られているけれども、現在まで数年間、Ｃ．エレガンス(C. elegans)および哺乳動物細胞では、昆虫での遺伝子発現を下方制御するＲＮＡｉの使用についてほとんど知られていない。国際公開第００／０１８４６号および国際公開第９９／３２６１９号の出願公開後、昆虫に対して植物を保護するためにＲＮＡｉを使用することに関して、ごくわずかの他の特許が公開されているにすぎない。これらは国際公開第０１／３７６５４号（DNA Plant Technologies）（特許文献４）、国際公開第２００５／０１９４０８１号(Bar Ilan University) （特許文献５）、国際公開第２００５／０３９８４１号(CSIRO, Bayer Cropscience）（特許文献６）、国際公開第０５／０４７３００号(University of Research Foundation) （特許文献７）および米国特許出願公開第２００３／００１５００１７号(Mesaら) （特許文献８）を含む。本発明はＲＮＡｉ仲介昆虫害虫制御、特に昆虫植物病原体の制御において有用な標的遺伝子および構築物、を提供する。本発明はまた、特定昆虫害虫内の標的遺伝子発現を阻止、遅延または別の減少による昆虫害虫の横行を制御するための方法を提供する。
【非特許文献１】Fire, A,Trends Genet, Vol. 15,358-363, 1999
【非特許文献２】Sharp,P.A. Genes Dev. Vol. 15,485-490, 2001
【特許文献１】国際公開第９９／３２６１９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第００／０１８４６号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００４／００１０１３号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０１／３７６５４号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００５／０１９４０８１号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２００５／０３９８４１号パンフレット
【特許文献７】国際公開第２００５／０４７３００号パンフレット
【特許文献８】米国特許出願公開第２００３／００１５００１７号明細書
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は昆虫農作物害虫の制御における新規で非化合物、非タンパクによるアプローチを記載する。活性成分は核酸、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、これは例えば葉上に噴霧する殺虫剤として使用され得る。ｄｓＲＮＡの配列は必須昆虫遺伝子の部分または全体に対応し、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を経て昆虫標的の下方制御を生じる。ｍＲＮＡの下方制御の結果として、ｄｓＲＮＡは標的昆虫タンパクの発現を阻止し、それゆえ、昆虫の死、成長停止または不妊を生じる。
【００１２】
本発明の方法は、昆虫の生存、成長、発生および生殖を阻害する、あるいは昆虫の病原性または伝染性を低下させることが望ましい技術分野で、実用的な応用を見出すことができる。本発明の方法は、さらに昆虫の１つまたは複数の標的遺伝子の発現を特に下方制御することが望ましい実用的な応用を見出す。特に有用な実用的な応用としては、（１）昆虫害虫の横行に対して植物を保護すること；（２）ヒトまたは動物における医薬用途または獣医学的用途（例えば、ヒトおよび動物における昆虫の横行を制御、処理または阻止すること）；（３）昆虫によって生じる損害に対して物質を保護すること；（４）昆虫により生じる損害に対して（食料、種子など）腐敗しやすい材料を保護すること；および昆虫が制御される必要がある場合、および／または昆虫が生じる損害が阻止される必要がある場合の一般的なすべての用途を含むが、これらに限定されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
１つの実施態様では、本発明は細胞または生物上で昆虫の成長を制御する、または昆虫感染に感受性を有する細胞または生物の昆虫の横行を阻止するための方法に関し、この方法は昆虫を２本鎖ＲＮＡに接触させることを含み、２本鎖ＲＮＡはアニールされた相補鎖を含み、そのうちの１つは昆虫標的遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的であるヌクレオチド配列を有し、その際、２本鎖ＲＮＡは昆虫によって摂取され、それによって成長を制御または横行を阻止する。
【００１４】
したがって、本発明は昆虫標的遺伝子の単離された新規なヌクレオチド配列を提供し、この単離されたヌクレオチド配列は下記群から選択された少なくとも１つの核酸配列を含む：
（ｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４０〜２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５０８〜５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０６６〜１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６または２４８１または２４８６のいずれかで示される配列、またはこれらの相補鎖
（ii）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４０〜２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５０８〜５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０６６〜１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、２４８１または２４８６、またはこれらの相補鎖によって示される配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列、
（iii）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４０〜２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５０８〜５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０６６〜１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、２４８１または２４８６のいずれかによって示される配列のいずれかの少なくとも１７個の隣接したヌクレオチドを含む配列、、またはこれらの相補鎖によって示される配列、
または、前記核酸配列は配列番号４９〜１５８、２７５〜４７２、５３３〜５７５、６２１〜７６７、８１３〜８６２、９０８〜１０４０、１１６１〜１５７１、１７３０〜２０３９、２１２０〜２３３８、２３８４〜２４６０のいずれかの少なくとも１７個の隣接したヌクレオチドを含む遺伝子のオーソログ、またはこれらの相補鎖であり、
前記核酸配列は昆虫成長を制御するための本発明の２本鎖ＲＮＡを調製するために有用である。
【００１５】
本発明で使用する「害虫を制御すること」とは、害虫を殺すこと、または害虫の発生または成長を阻止するか、または害虫が感染または横行することを阻止することを意味する。ここで使用する害虫を制御することは、また、害虫の子孫（卵の発生）を制御することを包含する。ここで使用する害虫を制御することは、害虫の生存、成長、発達または再生を阻害し、または害虫の病原性または感染性を減少する。ここで記載する化合物および／または組成物は、生物を健康に維持するために使用され、害虫を制御するか、または害虫の成長または発達または感染または横行を避けるために、治癒的に、予防的にまたは系統的に使用される。
【００１６】
本発明で認識される特定の害虫は、植物病原性昆虫害虫である。すなわち、ここで使用する「昆虫を阻害すること」は、また、昆虫の子孫（卵の発生など）を制御することを包含する。ここで使用する昆虫を制御することは、また、昆虫の生存、成長、発生または生殖を抑制すること、または昆虫の病原性または感染力を減少させることを包含する。本発明では、昆虫を制御することは昆虫の生物活性を抑制して、下記１つまたは複数の性状：昆虫による摂食の低下、昆虫の生存の低下、昆虫の死、昆虫の分化および発達の阻害、昆虫による有性生殖のための能力の欠損または低下、筋形成、幼若ホルモン形成、幼若ホルモン調節、イオン調節および輸送、潜在的細胞膜の維持、アミノ酸生合成、アミノ酸分解、精子形成、フェロモン合成、フェロモン感覚性(sensing)、触覚形成、羽形成、脚形成、発達および分化、卵形成、幼虫成熟、消化酵素形成、血リンパ合成、血リンパ維持、神経伝達、細胞分割、エネルギー代謝、呼吸、アポトーシス、および真核細胞の細胞骨格構造の成分、例えば、アクチンまたはチューブリンなどを生じる。ここに記載する化合物および／または組成物は、生物を健康に維持するために使用され、昆虫を制御するために、または昆虫の成長または発達または感染または横行を回避するために、治癒的に、予防的にまたは体系的に使用される。すなわち、本発明は既に感受性ある生物が昆虫生物による横行に対する抵抗性を発生させることが可能となる。
【００１７】
ここで使用する「少なくとも一部に相補的である」との表現は、ヌクレオチオド配列が２つ以上のヌクレオチオド、例えば、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４またはそれ以上の隣接するヌクレオチドをもつ標的のヌクレオチド配列に完全に相補的であることを意味する。
【００１８】
別な実施態様では、本発明は昆虫の標的遺伝子の発現を下方制御する方法に関し、この方法は前記昆虫を２本鎖ＲＮＡに接触させることを含み、２本鎖ＲＮＡはアニールされた相補鎖を含み、そのうちの１つは下方制御させるべき昆虫の標的遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部と相補的であるヌクレオチド配列を有し、その際、２本鎖ＲＮＡは昆虫に摂取され、それによって昆虫の標的遺伝子の発現を下方制御する。
【００１９】
用語「ａ」が「a target gene（標的遺伝子）」の文脈内で使用されるときはいつも、これは「少なくとも１つの」標的遺伝子を意味する。同じことは「少なくとも１つの」標的生物を意味する「ａ」標的生物、および「少なくとも１つの」ＲＮＡ分子または宿主細胞を意味する「ａ」ＲＮＡ分子または宿主細胞にも適用する。これはまた、以下にさらに詳述される。
【００２０】
１つの実施態様では、本発明の方法は昆虫の外側に存在する２本鎖ＲＮＡの昆虫による摂取に依存し（例えば、餌による）、昆虫の細胞内の２本鎖ＲＮＡの発現を必要としない。さらに、本発明はまた、昆虫が２本鎖ＲＮＡを含む組成物と接触する上記方法を包含する。
【００２１】
前記２本鎖ＲＮＡは原核細胞（例えば、細菌、これに限定されない）または真核細胞（例えば、酵母、これに限定されない）の宿主細胞または宿主生物で発現される。
【００２２】
昆虫は、動物界(Kingdom animal)、より具体的には節足動物門、および昆虫綱または蜘蛛型綱に属する生物を意味する全ての昆虫である。本発明の方法はＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングに感受性を有し、その身の回りの環境から２本鎖ＲＮＡを内部移行することが可能である全ての昆虫に適用される。本発明はまた、発達中のいかなる段階でも昆虫に適用可能である。昆虫は無生命(non-living)外骨格を有するから、それらは一様な速度で成長できず、むしろ、その外骨格を周期的に脱ぎ変えて成長が進む。この過程は脱皮(moultingまたはecdysis)と呼ばれる。脱皮間の段階は「中間形態」と呼ばれ、これらの段階は本発明で標的にされる。また、昆虫の卵または生きている子供もまた、本発明で標的にされる。発達サイクル中の全ての段階は、有翅亜綱の変態を含み、本発明で標的にされる。すなわち、発達の段階である幼虫、蛹、若虫などの個々の段階は全て標的にされる。
【００２３】
本発明の１つの実施態様では、昆虫は、次の目：ダニ目(Acari)、クモ目(Araneae)、シラミ目(Anoplura)、コウチュウ目(Coleoptera)、トビムシ目(Collembola)、ハサミムシ目(Dermaptera)、網翅目(Dictyoptera)、コムシ目(Diplura)、双翅目(Diptera)、シロアリモドキ目(Embioptera)、カゲロウ目(Ephemeroptera)、グリロバラトデア目（Grylloblatodea）、半翅目(Hemiptera)、同翅亜目(Homoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、等翅目(Isoptera)、鱗翅目(Lepidotera)、食毛目（Mallophaga）、長翅目(Mecoptera)、脈翅目(Neuroptera)、トンボ目(Odonata)、バッタ目(Orthoptera)、ナナフシ目(Phasmida)、せき翅目(Plecoptera)、カマアシムシ目(Protura)、噛虫目(Psocoptera)、隠翅目(Siphonaptera)、吸蝨類(Siphunculata)、シミ目(Thysanura)、撚翅目(Strepsiptera)、アザミウマ目(Thysanoptera)、トビケラ目(Trichoptera)、および絶翅目(Zoraptera)に属する。
【００２４】
本発明の好ましい実施態様および方法では、これに限定されないが、昆虫は下記（１）〜（４）からなる群から選択される。
（１）昆虫はニラパルヴァータ属（Nilaparvata spp.）（例えば、Ｎ．ルーゲンス(N.lugens)(トビイロウンカ, brown planthopper));ラオデルファックス属(Laodelphax spp.)（例えば、Ｌ．ストリアテラス(L. striatellus)（ヒメトビウンカ, small brown planthopper））；ネフォテティックス属(Nephotettix spp.)（例えば、Ｎ．ヴィレセンス(N. virescens)またはＮ．チンクチセプス(N. cincticeps)（ツマグロヨコバイ, green leafhopper）、またはＮ．ニグロピクタス(N. nigropictus)(クロスジツマグロヨコバイ, rice leafhopper)）；ソガテッラ属(Sogatella spp.)（例えば、Ｓ．フルシフェラ(furcifera)（セジロウンカ, white-backed planthopper））；ブリッサス属(Blissus spp.)(例えば、Ｂ．ロイコプテラス・ロイコプテルス(B.leucopterus leucopterus)（ナガカメムシ, chinch bug）)；スコチノフォラ属(Scotinophora spp.)（例えば、Ｓ．ヴェルミデュレイテ(S. vermidulate)（クロカメムシ, rice balckbug））；アクロステマム属(Acrostemum spp.)（例えば、Ａ．ヒラーレ(A. hilare)(アオカメムシ, green stink bug)）;パルナラ属(Parnara spp.)(例えば、Ｐ．グッタータ(P. guttata)(イチモンジセセリ, rice skipper));キロ属(Chilo spp.)(例えば、Ｃ．サプレッサリス(C. suppressalis)(ニカメイチュウ, rice striped stem borer)、Ｃ．オーリチリウス(C. auricilius)（縁が金色の茎食い虫, gold-fringed stem borer）、またはＣ．ポリクリサス(C. polychrysus)( 頭部が暗色の茎食い虫, dark-head stem borer));キロトラエア属(Chilotraea spp.)（例えば、Ｃ．ポリクリサ(C. polychrysa)(コメ茎穴あけ虫, rice stalk borer)）；セサミア属(Sesamia spp.)(例えば、Ｓ．インフェレンス(S. inferens)(イネヨトウ, pink rice borer));トリポリザ属(Tryporyza spp.)(例えば、Ｔ．イノタータ(T. innotata)(シロメイチュウ, white rice borer)またはＴ．インセルツーラス(T. incertulas)(キイロメイチュウ, yellow rice borer))；クナファロクロシス属(Cnaphalocrosis spp.)（例えば、Ｃ．メディナリス(C. medinalis)(コブノメイガ, rice leafroller)）;アグロマイザ属(Agromyza spp.)（例えば、Ａ．オリゼー(A. oryzae)(ハモグリバエ, leafminer)、またはＡ．パルヴィコミス(A. parvicomis)(コーンブロットハモグリバエ, corn blot leafminer)）;ディアトラエア属(Diatraea spp.)（例えば、Ｄ．サッカラリス(D. saccharalis)(サトウキビ穴あけ虫, sugarcane borer)、またはＤ．グランディオセッラ(D. grandiosella)(南西部アワノメイガ, southwestern corn borer)）;ナルナガ属(Narnaga spp.)（例えば、Ｎ．エアネセンス(N. aenescens)(フタオビコヤガ, green rice caterpillar)）;ザントデス属(Xanthodes spp.)（例えば、Ｘ．トランスベルサ(X. transversa)(イモムシ, green caterpillar)）；スポドプテラ属(Spodoptera spp.)(例えば、Ｓ．フルジペルダ(S. frugiperda)(ヨトウガの一種, fall armyworm)、Ｓ．エクシグア(S. exigua)(シロイチモジヨトウ,  beet armyworm)、Ｓ．リットラリス(S. littoralis)(クライミングカットウォーム, climbing cutworm)またはＳ．プラエフィカ(S. praefica)(ウエスタン・イエローストライプド・アーミーウォーム, western yellowstripped armyworm));ミシムナ属(Mythimna spp.)(例えば、ミシムナ(Mythimna)(シューダレチア(Pseudodaletia)セパラーテ(separate)(アワヨトウ, armyworm));ヘリコヴェルパ属(Helicoverpa spp.)（例えば、Ｈ．ゼア(H. zea)(オオタバコガ, corn earworm)）;コラスピス属(Colaspis spp.)(例えば、Ｃ．ブルンネア(C. brunnea)(グレープコラスピス, grape colaspis)）；リソルホプトラス属(Lissorhoptrus spp.)(例えば、Ｌ．オリゾフィラス(L. orysophilus)(イネミズゾウムシ, rice water weevil));エチノクネムス属(Echinocnemus spp.)（例えば、Ｅ．スクワモス(E. squamos)(イネゾウムシ, rice plant weevil);ディクロディスパ属(Diclodispa spp.)（例えば、Ｄ．アルミジェラ(D. armigera)(ライスヒスパ, rice hispa)）；オーレマ属(Oulema spp.)（例えば、Ｏ．オリゼー(O. oryzae)(イネドロオイムシ, leaf beetle)）;シトフィラス属(Sitophilus spp.)(例えば、Ｓ．オリゼー(S. oryzae)(ココクゾウムシ, rice weevil)); パチディプロシス属(Pachydiplosis spp.)(例えば、Ｐ．オリゼー(P. oryzae)(イネノシントメタマバエ, rice gall midge));ヒドレリア属(Hydrellia spp.)(例えば、Ｈ．グリセオラ(H. griseola)(イネミギワバエ, small rice leafminer) またはＨ．ササキ(H. sasakii)( イネカラバエ, rice stem maggot))；クロロプス属(Chlorops spp.)（例えば、Ｃ．オリゼー(C.  oryzae)(カラバエ, stem maggot)）；ディアブロチカ属(Diabrotica spp.)（例えば、Ｄ．ヴィルジフェラ・ヴィルジフェラ(D. virgifera virgifera)(ウエスターン・コーン・ルートウォーム, western corn rootworm)、Ｄ．バルバリ(D. barberi)(ノザン・コーン・ルートウォーム, northern corn rootworm)、Ｄ．ウンデシムプンクタータ・ホワルディ(D. undecimpunctata  howardi)(サザン・コーン・ルートウォーム, southern corn rootworm)、Ｄ．ヴィルジフェラ・ゼアエ(D. virgifera zeae)(メキシカン・コーン・ルートウォーム, Mexican corn rootworm)；Ｄ．バルテアタ(D. balteata)(バンデド・キューカムバー・ビートル, banded cucumber beetle)）；オストリニア属(Ostrinia spp.)（例えば、Ｏ．ヌビラリス(O. nubilalis)(アワノメイガ, European corn borer)）;アグロティス属(Agrotis spp.)（例えば、Ａ．イプシロン(A. ipsilon)(タマナヤガ, black cutworm)）;エラスモパルプス属(Elasmopalpus spp.)（例えば、Ｅ．リグノセラス(E. lignosellus)(モロコシマダラメイガ, lesser cornstalk borer)、メラノトス属(Melanotus spp.)(ハリガネムシ, wireworms);シクロセファーラ属(Cyclocephala spp.)（例えば、Ｃ．ボレアリス(C. borealis)(ノザン・マスクド・チェーファー, northern masked chafer)またはＣ．イムマキュラータ(C. immaculate)(サザン・マスクド・チェーファー, southern masked chafer)）;ポピリア属(Popillia spp.)（例えば、Ｐ．ジャポニカ(P. japonica)(マメコガネ, Japanese beetle)）；チェトクネマ属(Chaetocnema spp.)（例えば、Ｃ．プリカリア(C. pulicaria)(トウモロコシトビハムシ, corn flea beetle)）；スフェノフォラス属(Sphenophorus spp.)（例えば、Ｓ．マイディス(S. maidis)(メイズ・ビルバグ, maize billbug)）；ローパロシフム属(Rhopalosiphum spp.)（例えば、Ｒ．マイディス(R. maidis)(トウモロコシアブラムシ, corn leaf aphid)）;アニュラフィス属(Anuraphis spp.)（例えば、Ａ．マイディラディシス(A. maidiradicis)(コーン・ルート・アフィド, corn root aphid)）；メラノプラス属(Melanoplus spp.)（例えば、Ｍ．フェムルブルム(M. femurrubrum)(レッドレッグド・グラスホッパー, redlegged grasshopper)、Ｍ．ディッファレンチアティス(M. differentiates)(ディファレンシャル・グラスホッパー, differential grasshopper)またはＭ．サングイニペス(M. sanguinipes)(ミグラトリー・グラスホッパー, migratory grasshopper)）；ハイレミア属(Hylemya spp.)（例えば、Ｈ．プラツーラ(H. platura)(タネバエ, seedcorn maggot)）;アナホスリップス属(Anaphothrips spp.)（例えば、Ａ．オブスクルルス(A. obscrurus)(グラス・スリップス, grass thrips)）;ソレノプシシ(Solenopsis spp.)（例えば、Ｓ．ミレスタ(S. milesta)(シーフ・アント, thief ant)）;またはテラニチュス属(Tetranychus spp.)(例えば、Ｔ．ウルチカエ(T. urticae)(ナミハダニ, twospotted spider mite)、Ｔ．シンアバリナス(T. cinnabarinus)(ニセナミハダニ, carmine spider mite);ヘリコヴェルパ属(Helicoverpa spp.)（例えば、Ｈ．ゼア(H. zea)(コットン・ボウルウォーム, cotton bollworm)、またはＨ．アーミジェラ(H. armigera)(アメリカン・ボウルウォーム, American bollworm)）;ペクチノフォラ属(Pectinophora spp.)（例えば、Ｐ．ゴッシピエラ(P. gossypiella)(ワタギバガ, pink bollworm)）;イーリアス属(Earias spp.)(例えば、Ｅ．ビッテラ(E. vittella)(スポッテド・ボウルウォーム, spotted bollworm));ヘリオディス属(Heliothis spp.)（例えば、Ｈ．ヴィレセンス（H. virescens）(タバコガ, tobacco budworm)）;アントノムス属(Anthonomus spp.)（例えば、Ａ．グランディス(A. grandis)(ワタミハナゾウムシ, boll weevil)）;シューダトモスセリス属(Pseudatomoscelis spp.)（例えば、Ｐ．セリアツス(P. seriatus)(コットン・フリーホッパー, cotton fleahopper)）;トリアリューロデス属(Trialeurodes spp.)（例えば、Ｔ．アブチロネウス(T. abutiloneus)(バンデド−ウイングド・ホワイトフライ, banded-winged whitefly)、Ｔ．ヴァポラリオラム(T. vaporariorum)(オンシツコナジラミ, greenhouse whitefly)）;ベミシア属(Bemisia spp.)（例えば、Ｂ．アルジェンチフォリ(B. argentifoli)(シルバーリーフコナジラミ, silverleaf whitefly)）;アフィス属(Aphis spp.)（例えば、Ａ．ゴッシッピー(A. gossypii)(ワタアブラムシ, cotton aphid)）;リガス属(Lygus spp.)（例えば、Ｌ．リネオラリス(L. lineoraris)(サビイロカスミカメ, tarnished plant bug)またはＬ．ヘスペルス(L. Hesperus)(ウエスターン・ターニシュド・プラントバッグ, western tarnished plant bug)）；ユーシスツス属(Euschistus spp.)（例えば、Ｅ．コンスパーサス(E. consepersus)(コンスパース・スティンク・バッグ, consperse stink bug)）;クロロクロア属(Chlorochroa spp.)（例えば、Ｃ．サイ(C. sayi)(サイ・スティンクバッグ, Say stinkbug)）;ネザラ属(Nezara spp.)（例えば、Ｎ．ヴィリデュラ(N. viridula)(ミナミアオカメムシ, southern green stinkbug)）;スリップス属(Thrips spp.)（例えば、Ｔ．タバチ(T. tabaci)(ネギアザミウマ, onion thrips)）;フランクリニエラ属(Frankliniella spp.)（例えば、Ｆ．フスカ(F. fusca)(タバコアザミウマ, tobacco thrips)、またはＦ．オッキデンタリス(F. occidentalis)(ミカンキイロアザミウマ, western flower thrips)）;レプチノタルサ属(Leptinotarsa spp.)（例えば、Ｌ．デセムリネアータ(L. decemlineata)(コロラドハムシ, Colorado potato beetle)、Ｌ．ジュンクタ(L. juncta)（フォールス・ポテト・ビートル, false potato beetle)、またはＬ．テクサーナ(T. texana)(テクサン・フォールス・ポテト・ビートル, Texan false potato beetle)）;レマ属(Lema spp.)（例えば、Ｌ．トリリネアータ(L. trilineata)(スリーラインド・ポテト・ビートル, three-lined potato beetle)）;エピトリックス属(Epitrix spp.)（例えば、Ｅ．ククメリス(E. cucumeris)(ポテトトビハムシ, potato flea beetle)、Ｅ．ヒルチペニス(E. hirtipennis)(トビハムシ, flea beetle)、またはＥ．ツベリス(E. tuberis)(ツーバー・フリー・ビートル, tuber flea beetle)）;エピカウタ属(Epicauta spp.)（例えば、Ｅ．ヴィッタータ(E. vittata)(ストリップド・ブリスター・ビートル, striped blister beetle)）;ファエドン属(Phaedon spp.)（例えば、Ｐ．コクレアリアエ(P. cochleariae)(マスタード・リーフ・ビートル, mustard leaf beetle)）;エピラクナ属(Epilachna spp.)（例えば、Ｅ．ヴァリヴェティス(E. varivetis)(インゲンテントウ, Mexican bean beetle)）;アチェタ属(Acheta spp.)(例えば、Ａ．ドメスティカス(A. domesticus)(��エコオロギ, house cricket));エムポアスカ属(Empoasca spp.)(例えば、Ｅ．ファバエ(E. fabae)(ジャガイモヒメヨコバイ, potato leafhopper));ミズス属(Myzus spp.)（例えば、Ｍ．ペルシカエ(M. persicae)(モモアカアブラムシ, green peach aphid)）;パラトリオザ属(Paratrioza spp.)（例えば、Ｐ．コケレリ(P. cockerelli)(キジラミ, psyllid)）;コノデルス属(Conoderus spp.)（例えば、Ｃ．フォーリ(C. falli)(サザン・ポテト・ワイアウォーム, southern potato wireworm)、またはＣ．ヴェスペルチヌス(C. vespertinus)(タバコ・ワイアウォーム, tobacco wireworm)）;フソロマエア属(Phthorimaea spp.)(例えば、
Ｐ．オ ペルクレッラ(P. operculella)(ジャガイモガ, potato tuberworm));ヘリコヴェルパ属(Helicoverpa spp.)（例えば、Ｈ．ゼア(H. zea)(トマト・フルーツウォーム, tomato fruitworm)）；ケイフェリア属(Keiferia spp.)（例えば、Ｋ．リコペリシセラ(K. lycopersicella)(トマト・ピンウォーム, tomato pinworm)）;リモニウス属(Limonius spp.)（ワイアウォーム, wireworms）;マンデュカ属(Manduca spp.)（例えば、Ｍ．セクタ(M. sexta)(タバコ・ホーンウォーム, tobacco hornworm)、またはＭ．クウィンケウェマクラタ(M. quinquemaculata)(トマト・ホーンウォーム, tomato hornworm)）;リリオマイザ属(Liriomyza spp.)（例えば、Ｌ．サチヴァエ(L. stivae)、Ｌ．トリフォリ(L. trifolli)またはＬ．ウィドブレンシス(L. huidobrensis)(ハモグリバエ, leafminer)）;ドロソフィラ属(Drosophilla spp.)（例えば、Ｄ．メラノガスター(D. melanogaster)、Ｄ．ヤクバ(D. yakuba)、Ｄ．シュードオブスキューラ(D. pseudoobscura)またはＤ．シムランス(D. simulans)；カラブス属(Carabus spp.)（例えば、Ｃ．グラヌラタス(C. granulatus);キロノムス属(Chironomus spp.)（例えば、Ｃ．テンタヌス(C. tentanus)；クテノセファリデス属(Ctenocephalides spp.)（例えば、Ｃ．フェリス(C. felis)(ネコノミ, cat flea)）;ディアプレペス属(Diaprepes spp.)（例えば、Ｄ．アブレヴィアタス(D. abbreviatus) (ルート・ウィーヴィル, root weevil)）；アイプス属(Ips spp.)（例えば、Ｉ．ピニ(I. pini)(パイン・エングレーバー, pine engraver)）;トリボリウム属(Tribolium spp.)（例えば、Ｔ．カスタニュウム(T. castaneum)(コクヌストモドキ, red flour beetle)）;グロッシナ属(Glossina spp.)（例えば、Ｇ．モルシタンス(G. morsitans)(ツェツェバエ, tsetse fly)）;アノフェレス属(Anopheles spp.)（例えば、Ａ．ガムビアエ(A. gambiae)(マラリア蚊, malaria mosquito)）;ヘリコヴェルパ属(Helicoverpa spp.)（例えば、Ｈ．アーミジェラ(H. armigera)(アフリカン・ボールウォーム, African Bollworm)）;アシルソシフォン属(Acyrthosiphon spp.)（例えば、Ａ．ピスム(A. pisum)(ソラマメヒゲナガアブラムシ, pea aphid)）;アピス属（Apis spp.）（例えば、Ａ．メリフェラ(A. melifera)( セイヨウミツバチ, honey bee)）;ホマロディスカ(Homalodisca spp.)（例えば、Ｈ．コーギュレーテ(H. coagulate)(グラッシーウイングド・シャープシューター, glassy-winged sharpshooter)）;エアデス属(Aedes spp.)（例えば、Ａｅ．エアジプチ(Ae. Aegypti)(ネッタイシマカ, yellow fever mosquito)）;ボムビックス属(Bombyx spp.)（例えば、Ｂ．モリ(B. mori)(カイコ, silkworm)）;ロカスタ属(Locusta spp.)（例えば、Ｌ．ミグラトリア(L. migratoria)(トノサマバッタ, migratory locust)）;ブーフィラス属(Boophilus spp.)（例えば、Ｂ．ミクロプラス(B. microplus)(ウシマダニ, cattle tick)）;アカンソスクリア属(Acanthoscurria spp.)(例えば、Ａ．ゴメシアナ(A. gomesiana)(レッドヘアード・チョコレート・バード・イーター, red-haired chololate bird eater));ディプロプテラ属(Diploptera spp.)（例えば、Ｄ．プンクタータ(D. punctata)(パシフィック・ビートル・コックローチ, pacific beetle cockroach)）;ヘリコニウス属(Heliconius spp.)（例えば、Ｈ．エラート(H. erato)(レッド・パッション・フラワー・バタフライ, red passion flower butterfly)またはＨ．メルポメネ(H. melpomene)(ポストマン・バタフライ, postman butterfly)）;クルクリオ属(Curculio spp.)（例えば、Ｃ．グランディウム(C. glandium)(アコーン・ウィーヴィル, acorn weevil)）;プルテッラ属(Plutella spp.)（例えば、Ｐ．キシロステッラ(P. xylostella)(コナガ, diamondback moth)）;��ムブリオムマ属(Amblyomma spp.)（例えば、Ａ．ヴァリエガツム(A. variegatum)(ウシマダニ, cattle tick)）;アンテラエア属(Anteraea spp.)（例えば、Ａ．ヤママイ(A. yamamai)(カイコガ, silkmoth)）;およびアーミジェレス属(Armigeres spp.)（例えば、Ａ．スバルバツス(A. subalbatus)）；などの植物害虫である昆虫；
【００２５】
（２）蚊、蜂、スズメバチ、シラミ、ノミおよびアリなどのヘミプテラ(Hemiptera)およびあるヒメノプテラ(Hymenoptera)およびディプテラ(Diptera)に見られる、穿刺−吸引口器を有するものなどのヒトおよび／または動物を侵襲するか、または損傷することができる昆虫ならびにマダニおよびダニなどのアラクニダエ(Arachnidae)、アカリナ(Acarina)(マダニおよびダニ)の綱または科、例えば、アルガシダエ(Argasidae)、デルマニッシダエ(Dremanyssidae)、イクソジダエ(Ixodidae)、プソロプチダエ(Psoroptidae)またはサルコプチダエ(Sarcoptidae)科の代表例；およびアムブリオムマ属(Amblyomma spp.)、アノセンター属(Anocentor spp.)、アルガス属(Argas spp.)、ブーフィルス属(Boophilus spp.)、チェイレチエラ属(Cheyletiella spp.)、コリオプテス属(Choriotptes spp.)、デモデックス属(Demodex spp.)、デルマセンター属(Dermacentor spp.)、デルマニサス属(Dermanyssus spp.)、ヘモフィサリス属(Haemophysalis spp.)、ヒアロムマ属(Hyalomma spp.)、イクソデス属(Ixodes spp.)、リンクサカルス属(Lynxacarus spp.)、メソスティグマタ属(Mesostigmata spp.)、ノトエドレス属(Notoedres spp.)、オルニソドロス属(Ornithodoros spp.)、オルニソニサス属(Ornithonyssus spp.)、オトビウス属(Otobius spp.)、オトデクテス属(Otodectes spp.)、ニューモニサス属(Pneumonyssus spp.)、プソロプテス属(Psoroptes spp.)、リピセファルス属(Rhipicephalus spp.)、サルコプテス属(Sarcoptes spp.)、またはトロムビクラ属(Trombicula spp.)の代表例；アノプラ（吸引およびかみつきシラミ）、例えばボヴィコラ属(Bovivola spp.)、ヘマトピナス属(Haematopinus spp.)、リノグナタス属(Linognathus spp.)、メノポン属(Menopon spp.)、ペディクラス属(Pediculus spp.)、ペムフィガス属(Pemphigus spp.)、フィロクエラ属(Phylloxera spp.)またはソレノポテス属(Solenopotes spp.)の代表例；ディプテラ(Diptera)(ハエ)、例えば、イーデス属(Aedes spp.)、アノフェレス属(Anopheles spp.)、カリホラ属(Calliphora spp.)、クリソミア属(Chrysomyia spp.)、クリソプス属(Chrysops spp.)、コクリオミア属(Cochliomyia spp.)、キュレックス属(Culex spp.)、キュリコイデス属(Culicoides spp.)、クテレブラ属(Cuterebra spp.)、デルマトビア属(Dermatobia spp.)、ガストロフィラス属(Gastrophilus spp.)、グロッシナ属(Glossina spp.)、ヘマトビア属(Haematobia spp.)、ヘマトポータ属(Haematopota spp.)、ヒッポボスカ属(Hippobosca spp.)、ヒポデルマ属(Hypoderma spp.)、ルチリアラ属(Lucilia spp.)、リペロシア属(Lyperosia spp.)、メロファガス属(Melophagus spp.)、エストラス属(Oestrus spp.)、フェニシア属(Phaenicia spp.)、フレボトムス属(Phlebotomus spp.)、フォルミア属(Phormia spp.)、サルコファーガ属(Sarcophaga spp.)、シムリウム属(Simulium spp.)、ストモクシーズ属(Stomoxys spp.)、タバナス属(Tabanus spp.)、タンニア属(Tannia spp.)またはチプラ属(Tipula spp.)の代表例；マロファーガ(Mallophaga)（かみつきシラミ）、例えば、ドマリナ属(Domalina spp.)、フェリコラ属(Felicola spp.)、ヘテロドクサス属(Heterodoxus spp.)またはトリコデクテス属(Trichodectes spp.)の代表例；またはシフォナプテラ(Siphonaptera)（無翅昆虫）、例えば、セラトフィラス属(Ceratophyllus spp.)、プレックス属(Pulex spp.)またはゼノサイラ(Xenopsylla spp.)の代表例；シミシダエ(Cimicidae)(トコジラミ)、例えば、シメックス属(Cimex spp.)、トリトミナエ属(Tritominae spp.)、ローディニウス属(Rhodinius spp.)またはトリアトーマ属(Triatoma spp.)の代表例など、
および
（３）食品、種子、木、ペンキ、プラスチック、衣類などを攻撃する昆虫など、基質または材料に望ましからぬ損害を生じる昆虫、
（４）例として、ハエ、クモ、ダニ、アザミウマ、マダニ、赤家禽ダニ、アリ、ゴキブリ、シロアリ、イエコオロギを含むコオロギ、シミ、チャタテムシ、カブトムシ、ハサミムシ、蚊およびノミなどの家屋昆虫および外部寄生虫を含む、公衆の健康および衛生に関連する昆虫またはクモ類であるが、これらに限定されない。より好ましい標的は、ブラッテラ属(Blatella spp.)（例えば、ブラッテラ・ゲルマニカ(Blatella germanica)( チャバネゴキブリ, german cockroach)）、ペリプラネータ属(Periplaneta spp.)（例えば、ペリプラネータ・アメリカーナ(Periplaneta Americana)( ワモンゴキブリ, American cockroach)、およびペリプラネータ・オーストラリアシアエ(Periplaneta australiasiae)(コワモンゴキブリ,Australian cockroach)）、ブラッタ属(Blatta spp.)（例えば、ブラッタ・オリエンタリス（Blatta orientalis）(トウヨウゴキブリ, Oriental cockroach)）、およびスペッラ属(Supella  spp.)（例えば、スペッラ・ロンジパルパ(Supella longipalpa)  (茶帯ゴキブリ, brown-banded cockroach)）などのゴキブリ(Blattodes)；ソレノプシス属(Solenopsis spp.)）（例えば、ソレノプシス・インヴィクタ(Solenopsis invicta)（ヒアリ, RedFire Ant））、モノモリウム属(Monomorium spp.)（例えば、モノモリウム・ファラオニス(Monomorium pharaonis)(イエヒメアリ, Pharaoh Ant)）、キャムポノツス属(Camponotus spp.)（例えば、キャムポノツス属(Camponotus spp.)(カーペンター・アンツ, Carpenter Ants)）、ラシウス属(Lasius spp.)（例えば、ラシウス・ニガー(Lasius niger)（スモール・ブラック・アンツ, Small Black Ant））、テトラモリウム属(Tetramorium spp.)（例えば、テトラモリウム・セスピツム(Tetramorium caespitum)(トビイロシロアリ, Pavement Ant)）、ミルミカ属(Myrmica spp.)（例えば、ミルミカ・ルブラ(Myrmica rubra)(ヒアリ, Red Ant)、フォルミカ属(Formica spp.)(ヤマアリ, wood ants)、クレマトガスター属(Crematogaster spp)(例えば、クレマトガスター・リネオラータ(Crematogaster lineolata)(ツヤシリアゲアリ, Acrobat Ant))、イリドミルメックス属(Idiromyrmex spp.)（例えば、イリドミルメックス・フミリス(Iridomyrmex humilis)(アルゼンチンアリ, Argentina Ant)、フェイドール属(Pheidole spp.)(オオズアリ, Big Headed Ants)およびダシムチラ属(Dasymutilla spp.)（例えば、ダシムチラ・オッチデンタリス(Dasymutilla occidentalis)(ミカドアリバチ, Velvet Ant)）などのアリ（フォルミコイデア（Formicoidea）；アミテルメス属(Amitermes spp.)（例えば、アミテルメス・フロリデンシス(Amitermes floridensis)(フロリダ・ダークウィングド・サブテラニアン・ターマイト, Floridadark-wingedsubterranean termite)）、レティクリテルメス属(Reticulitermes spp.)（例えば、レティクリテルメス・フラヴィペス(Reticulitermes flavipes)(イースタン・サブテラニアン・ターマイト,theeastern subterranean terimite)）、レティクリテルメス・ヘスペルス(Reticulitermes hesperus)(ウエスタン・サブテラニアン・ターマイト, WesternSubterranean Termite)、コプトテルメス属(Coptotermes spp.)（例えば、コプトテルメス・フォルモサヌス(Coptotermes formosanus)(イエシロアリ, Formosan Substerranean Termite)）、インシサイテルメス属(Incisitermes spp.)（例えば、インシサイテルメス・マイナー(Incisitermes minor)(ウエスタン・ドライウッド・ターマイト, WesternDrywood Termite)）、ネオテルメス属(Neotermes spp.)（例えば、ネオテルメス・コンネクサス, Neotermesconnexus)(フォレスト・ツリー・ターマイト, Forest Tree Termite)）などのシロアリ��イソプテラ（Isoptera）および／またはターマイチダエ(Termitidae)）である。
【００２６】
本発明から利益を得る「感受性を有する生物」との用語では、害虫の横行に感受性を有するいかなる生物をも含まれる。害虫は多くの異なった生物、例えば、ヒト、家庭内の動物（ネコ、イヌなどのペットなど）および家畜（ヒツジ、ウシ、ブタ、ニワトリなどを含む）などの動物の害虫である。
【００２７】
本発明の好ましい実施態様では、昆虫またはクモ類の節足動物は、下記（１）〜（１５）からなる群から選択されるが、これらに限定されない：
（１）アカリ(Akari)：マダニ類(Ixodida)（マダニ)を含むダニ
（２）アラクニダ(Arachnida)：例えば、ラトロデクタス・マクタンス(Latrodectus mactans)（ゴケグモ, black widow）およびロクソセレス・レクルーズ(Loxosceles recluse)(トクイトグモ, Brown Recluse Spider)を含むアラネアエ(Araneae)(クモ, spides)およびオピリオネス(Opiliones)(ザトウムシ,harvestman)。
（３）アノプルラ(Anoplura)：ペディキュルス・ヒューマヌス(Pediculushumanus)(ヒトシラミ, human body louse)などのシラミ。
（４）ブラットデア(Blattodea)：チャバネゴキブリ(German cockroach)（ブラテッラ・ゲルマニカ（Blatella germanica））、ワモンゴキブリ(American cockroach)（ペリプラネータ・アメリカーナ(Periplaneta Americana)）およびコワモンゴキブリ(Australian cochroach)（ペリプラネータ・オーストラリアシアエ(Periplaneta australiasiae)）を含むペリプラネータ(Periplaneta)属、トウヨウゴキブリ(Oriental cockroach)（ブラッタ・オリエンタリス(Blattaorientalis)）を含むブラッタ(Blatta)属、および茶帯ゴキブリ(brown-bandedcockroach)（スペッラ・ロンジパルパ(Supella longipalpa)）を含むスペッラ(Supella)属のゴキブリ
（５）コレオプテラ(Coleoptera)：例えば、ナガシンクイムシ(Powder post bettle)（ボストリコイデア(Bostrichoidea)科)）の同類、デンドロクトナス属(Dendroctonus spp.)(ブラック・ターペンチン・ビートル, Black Turpentine Beetle; サザン・パイン・ビートル, Southern Pine Beetles, ＩＰＳエンクレイブ・ビートル, IPS Engrave Beetle)；ヒメマルカツオブシムシ(Carpet Beetles)（アンスレナス属(Anthrenus spp.)、アッタゲナス属(Attagenus  spp.)；オールド・ハウス・ボウラー(Old House Borer)（セラムビシダエ(Cerambycidae)の同類：ヒロトルペス・バジュルス(Hylotrupes bajulus)）；アノビウム・パンクタツム(Anobium punctatum)；トリボリウム属(Tribolium spp.)（フラウア・ビートルflour beetle）；トロゴデルマ・グラナリウム(Trogodermagranarium)（ヒメアカカツオブシムシKhapra Beetle））；オリゼフィラス・サリナメンシス(Oryzaephilussarinamensis)（トゥースド・グレイン・ビートルToothed Grain Beetle）など（本の虫）を含む甲虫(beetles)。
（６）デルマプテラ(Dermaptera)：ハサミムシの同類
（７）ディプテラ(Diptera)：例えば、アノフェレス属(Anopheles spp.)などのアノフェリナエ(Anophelinae)、およびエーデス・フルブス(Aedes fulvus)などのクリチナエ(Culicinae)；タバナス・プンクチファ(Tabanus punctifer)(ウマバエ,Horse fly)、グロッシーナ・モルシタンス(Glossina morsitans)(ツェツェバエ, testse fly)、ドレイン・フライ(drainflies)(サイコディアエ（Psychodidae）)などのタバニダエ(Tabanidae)、およびムスカ・ドメスティカ(Musca domestica)(イエバエ,House fly)などのカリプトラタエ(Calyptratae)、ニクバエ, flesh flies (サルコファジダエ(Sarcophagidae)のファミリー)などの蚊（クリシダエ(Culicidae)）およびハエ（ブラキセラ（Brachycera））。
（８）ヘテロプテラ(Heteroptera)：シメックス・レクツタリウス(Cimexlectularius)(ナンキンムシ, bed bug)などの甲虫。
（９）ヒメノプテラ(Hymenoptera)：アリ（フォルミコイデア（Formicoidea））、ハチ（アポイデア(Apoidea)）を含む：ソレノプシス・インヴィクタ(Solenopsisinvicta)(ヒアリ, Red Fire Ant)、モノモリウム・ファラオニス(Monomoriumpharaonis)(イエヒメアリPharaoh Ant))、カンポノツス属(Camponotus spp.)(オオアリ, Carpenter Ants)、イアシアス・ニガー(Iasius niger)(スモール・ブラック・アント, SmallBlack Ant)、テトラモリウム・セスピツム(tetramorium caespitum)(トビイロシロアリ, Pavement Ant)、ミルミカ・ルブラ(Myrmicarubra)(ヒアリ, Red Ant)、フォルミカ属(Formica spp.)(ヤマアリ, wood ants)、クレマトガスター・リネオラータ(Crematogaster lineolata)(ツヤシリアゲアリ, AcrobatAnt)、イリドミルメックス・フミリス(Iridomyrmex humilis)(アルゼンチンアリ,Argentine Ant)、フェイドール属(Pheidole spp.)(オオズアリ, Big Headed Ants)、ダシムチラ・オッチデンタリス(Dasymutilla occidentalis)(ミカドアリバチ,Velvet Ant)などを含むスズメバチ(wasp)(アポクリタ（Apocrita）)。
（１０）イソプテラ(Isoptera)：例えば、アミテルメス・フロリデンシス(Amitermesfloridensis)( フロリダ・ダークウィングド・サブテラニアン・ターマイト, Floridadark-winged subterranean termite)、イースタン・サブテラニアン・ターマイト, theeastern subterranean terimite)(レティクリテルメス・フラヴィペス(Reticulitermes flavipes)、Ｒ．ヘスペルス(R. hesperus) (ウエスタン・サブステラニアン・ターマイト, WesternSubsterranean Termite))、コプトテルメス・フォルモサヌス(Coptotermes formosanus)(イエシロアリ, Formosan Substerranean Termite)）、インシサイテルメス・マイナー(Incisitermes minor)(ウエスタン・ドライウッド・ターマイト, Western Drywood Termite)）、ネオテルメス・コンネクサス(Neotermes connexus)(フォレスト・ツリー・ターマイト, Forest Tree Termite)）およびシロアリ科(Termitidae)を含むシロアリ。
（１１）レピドプテラ(Lepidoptera)：例えば、チネオラ・ビッセリエッラ(Tineola bisselliella)(小衣蛾, Common Clothes Moth)などのチネイダエ(Tineidae)およびエコフォリダエ(Oecophorodae)、およびピラリス・ファリナリス(Pyralis farinalis)(カシノシマメイガ, Meal Moth)などのピラリダエ(Pyralidae)を含む蛾
（１２）プソコプテラ(Psocoptera)：チャタテムシ(booklice)（プソシド(Psocids)）
（１３）シフォナプテラ(Siphonaptera)：プレックス・イッリタンス(Pulex irritans)などのノミ
（１４）ステルノリンチャ(Sternorrhyncha)：アブラムシ（アフィジダエ(Aphididae)）
（１５）ザイゲントーマ(Zygentoma)：例えば、テルモビア・ドメスティカ(Thermobia domestica)およびレピスマ・サッカリーナ(Lepisma saccharina)であるシミ。
【００２８】
本発明の好ましい植物病原性昆虫は、レプチノタルサ属(Leptinotarsa spp.)（例えば、Ｌ．デセムリネアータ(L. decemlineata)(コロラドハムシ, Colorado potato beetle)、Ｌ．ジュンクタ(L. juncta)（フォールス・ポテト・ビートル,falsepotato beetle)、またはＬ．テクサーナ(T.texana)(テクサン・フォールス・ポテト・ビートル,Texan false potato beetle)）;ニラパルヴァータ属（Nilaparvata spp.）（例えば、Ｎ．ルーゲンス(N.lugens)(トビイロウンカ, brown planthopper)); ラオデルファックス属(Laodelphax spp.)（例えば、Ｌ．ストリアテラス(L. striatellus)（ヒメトビウンカ,smallbrown planthopper））；ネフォテティックス属(Nephotettix spp.)（例えば、Ｎ．ヴィレセンス(N. virescens)またはＮ．チンクチセプス(N.cincticeps)（ツマグロヨコバイ, green leafhoppr）、またはＮ．ニグロプクタス(N. nigropictus)(クロスジツマグロヨコバイ, rice leafhopper)）；ソガテッラ属(Sogatella spp.)（例えば、Ｓ．フルシフェラ(furcifera)（セジロウンカ,white-backed planthopper））；キロ属(Chilo spp)(例えば、Ｃ．サプレッサリス(C. suppressalis)(ニカメイチュウ, ricestriped stem borer)、Ｃ．オーリチリウス(C. auricilius)（縁が金色の茎食い虫, gold-fringedstem borer）、またはＣ．ポリクリサス(C. polychrysus)(頭部が暗色の茎食い虫, dark-headstem borer)); セサミア属(Sesamia spp.)(例えば、Ｓ．インフェレンス(S. inferens)(イネヨトウ, pink rice borer));トリポリザ属(Tryporyza spp.)(例えば、Ｔ．イノタータ(T. innotata)(シロメイチュウ, white riceborer)またはＴ．インセルツーラス(T. incertulas)(キイロメイチュウ, yellow riceborer))； ディアブロチカ属(Diabrotica spp.)（例えば、Ｄ．ヴィルジフェラ・ヴィルジフェラ(D. virgiferavirgifera)(ウエスターン・コーン・ルートウォーム,western corn rootworm)、Ｄ．バルバリ(D.barberi)(ノザン・コーン・ルートウォーム,northerncorn rootworm)、Ｄ．ウンデシムプンクタータ・ホワルディ(D. undecimpunctata  howardi)(サザン・コーン・ルートウォーム,southern corn rootworm)、Ｄ．ヴィルジフェラ・ゼアエ(D.virgifera zeae)(メキシカン・コーン・ルートウォーム, Mexican corn rootworm)；オストリニア属(Ostrinia spp.)（例えば、Ｏ．ヌビラリス(O.nubilalis)(アワノメイガ, European corn borer)）; アナホスリップス属(Anaphothrips spp.)（例えば、Ａ．オブスクルルス(A. obscrurus)(グラス・スリップス, grass thrips)）; ペクチノフォラ属(Pectinophora spp.)（例えば、Ｐ．ゴッシピエラ(P. gossypiella)(ワタギバガ, pink bollworm)）; ヘリオディス属(Heliothis spp.)（例えば、Ｈ．ヴィレセンス（H.virescens）(タバコガ, tobacco budworm)）; トリアリューロデス属(Trialeurodes spp.)（例えば、Ｔ．アブチロネウス(T. abutiloneus)(バンデド−ウイングド・ホワイトフライ, banded-winged whitefly)、Ｔ．ヴァポラリオラム(T. vaporariorum)(オンシツコナジラミ, greenhouse whitefly)）; ベミシア属(Bemisia spp)（例えば、Ｂ．アルジェンチフォリ(B. argentifoli)(シルバーリーフコナジラミ, silverleaf whitefly)）; アフィス属(Aphis spp.)（例えば、Ａ．ゴッシッピー(A.gossypii)(ワタアブラムシ, cotton aphid)）; リガス属(Lygus spp.)（例えば、Ｌ．リネオラリス(L. lineoraris)(サビイロカスミカメ, tarnishedplant bug)またはＬ．ヘスペルス(L. Hesperus)(ウエスターン・ターニシュド・プラントバッグ, western tarnished plantbug)）；ユーシスツス属(Euschistus spp.)（例えば、Ｅ．コンスパーサス(E. consepersus)(コンスパース・スティンク・バッグ, consperse stink bug)）; クロロクロア属(Chlorochroa spp)（例えば、Ｃ．サイ(C.sayi)(サイ・スティンクバッグ, Say stinkbug)）; ネザラ属(Nezara spp.)（例えば、Ｎ．ヴィリデュラ(N.viridula)(ミナミアオカメムシ, southern green stinkbug)）; スリップス属(Thrips spp.)（例えば、Ｔ．タバチ(T.tabaci)(ネギアザミウマ, onion thrips)）; フランクリニエラ属(Frankliniella spp.)（例えば、Ｆ．フスカ(F. fusca)(タバコアザミウマ,tobaccothrips)、またはＦ．オッキデンタリス(F.occidentalis)(ミカンキイロアザミウマ,western flower thrips)）;ミズス属(Myzus spp.)（例えば、Ｍ．ペルシカエ(M.persicae)(モモアカアブラムシ, greenpeach aphid)）; マクロシフム属(Macrosiphum spp.)(例えば、Ｍ．ユーフォルビアエ(M. euphorbiae)(チューリップヒゲナガアブラムシ, potato aphid)); ブリッサス属(Blissus spp.)(例えば、Ｂ．ロイコプテラス・ロイコプテルス(B. leucopterus leucopterus)（ナガカメムシ, chinch bug）)；アクロステマム属(Acrostemum spp.)（例えば、Ａ．ヒラーレ(A.hilare)(アオカメムシ, greenstink bug)）;リソルホプトラス属(Lissorphoptrus spp.)(例えば、Ｌ．オリゾフィラス(L.orysophilus)(イネミズゾウムシ, rice waterweevil)); ローパロシフム属(Rhopalosiphum spp.)（例えば、Ｒ．マイディス(R. maidis)(トウモロコシアブラムシ,corn leaf aphid)）;およびアニュラフィス属(Anuraphis spp.)（例えば、Ａ．マイディラディシス(A. maidiradicis)(コーン・ルート・アフィド,corn root aphid)）からなる群から選択される植物害虫です。
【００２９】
より具体的な実施態様では、本発明の方法はレプチノタルサ(Leptinotarsa)種に適用可能である。レプチノタルサ(Leptinotarsa)は、クリソメリダエ(Chrysomelidae)またはヨモギハムシの系統群に属する。トビハムシ(Flea Beetle)およびトウモロコシ根切りムシ(Corn Rootworms) などのクリソメリド・ビートル(Chrysomelid beetles)およびアルファルファタコゾウムシ(Alfalfa beetles)などのクルクリオニズ(Curculionids)は、特に重要な害虫である。ドビハムシ(Flea Beetle)は、多くの草、穀物および薬草の葉を食べる多数の小さな葉食性カブトムシを含む。トビハムシ(Flea Beetle)は、多数の属（例えば、アティッカ(Attica)、アッフソナ(Apphthona)、アルゴピステス(Argopostes)、ディソニチャ(Disonycha)、エピトリックス(Epitrix)、ロンジタルサス(Longitarsus)、プロダグリコメラ(Prodagricomela)、システーナ(Syntena)およびフィロトレータ(Phyllotreta)を含む。ナタネトビハムシ(Rape Flea Beetle)としても公知であるトビハムシ(Flea Beetle)、フィロトレタ・クルシフェラエ(Phyllotretacruciferae)は、特に重要な害虫である。トウモロコシ根切りムシ(Corn Rootworms)は、ディアブロチカ(Diabrotica)属（例えば、Ｄ．ウンデシムプンクタータ・ウンデシムプンクタータ(D.undecimpunctata undecimpunctata)、Ｄ．ウンデシムプンクタータ・ホワルディイ(D. undecimpunctata howardii)、Ｄ．ロンジコルニス(D. longicornis)、Ｄ．ヴィルジフェラ(D.virgifera)およびＤ．バルテアタ(D.balteata)中に見出される種を含む。トウモロコシ根切りムシ(Corn Rootworms)は、トウモロコシおよびニガウリに大規模な損害を引き起こす。ウエスターン・スポッテド・キューカンバー・ビートル(Western Spotted Cucumber Beetle)、Ｄ．ウンデシムプンクタータ・ウンデシムプンクタータ(D. undecimpunctataundecimpunctata)は、アメリカ西部におけるニガウリの害虫である。（クローバタコゾウムシとしても公知である）アルファルファタコゾウムシ(Alfalfa weevils)は、ハイペラ属(Hypera)（Ｈ．ポスティカ(H.postica)、Ｈ．ブルンネイペンニス(H. brunneipennis)、Ｈ．ニグリオストリス(H. nigriostris)、Ｈ．プンクタータ(H. punctata)およびＨ．メレス(H.meles)）に属し、マメ科植物の重要な害虫と考えられる。エジプトアルファルファタコゾウムシ(Egyptianalfalfa weevil)、Ｈ．ブルンネイペンニス(H.brunneipennis)は、アメリカ西部におけるアルファルファの重要な害虫である。
【００３０】
３０種類以上のレプチノタルサ種(Leptinotarsa species)が存在する。すなわち、本発明はレプチノタルサ種(Leptinotarsa species)を制御する方法、より具体的には、昆虫を殺傷するか、またはレプチノタルサ(Leptinotarsa)昆虫の発生または成長を阻止するか、または昆虫が感染または横行することを阻止する方法を包含する。本発明により制御する具体的なレプチノタルサ種(Leptinotarsa species)は、コロラドハムシ（レプチノタルサ・デセムリネアータ(Leceptinotarsa decemlineata)(セイ(Say))およびフォールス・ポテト・ビートル（レセプチノタルサ・ジュンクタ(Leceptinotarsa juncta)(セイ(Say))を含む。
【００３１】
ＣＰＢは、我々の国産ジャガイモ（ソラヌム・ツベロスム(Solanum tuberosum)、他の栽培または野生のジャガイモ近縁および非近縁種（例えば、Ｓ．デミッスム(S. demissum)、Ｓ．フレジャ・エイ・オー(S.phureja a.o.)および下記種を含む他のソラナセオウス(Solanaceous)（イヌホウズキ）植物種の（深刻な）害虫である；
（ａ）作物種、トマト（いくつかのリコペルシコン種(Lycopersicon species)）、ナス（ソラヌム・メロンジェナ(Solanum melongena)、コショウ（いくつかのカプシクム種(Capsicum species)）、タバコ（観賞植物を含むいくつかのニコチアーナ種(Nicotiana species)）およびセンナリホウズキ（フィサリス種(Physalis species)）；
（ｂ）ウィード／ハーブ種、ワルナスビ（Ｓ．カロリネンス(S. carolinense)）、イヌホオズキ（Ｓ．デュルカマラ(S. dulcamara)）、ベラドンナ（アスロパ種(Asropa species)）、チョウセンアサガオ（ダツーラ種(Ｄatura species)）、ヒヨス（ヒオスシアムス種(Hyoscyamus species)）およびバッファロー・バー（Ｓ．ロストラツム(S.rostratum)）。
ＦＰＢはワルナスビに主に見られるが、イヌホオズキ、センナリホウズキ、およびショクヨウホウズキ（フィサリス種(Physalis species)）にも生じる。
【００３２】
「昆虫」との用語は、卵、幼虫または若虫、蛹および成虫の段階を含む発達の全段階における全てのタイプの昆虫を包含する。
本発明は、昆虫がレプチノタルサ・デセムリネアータ(Leptinotarsa decemlineata)（コロラドハムシ）であり、植物がジャガイモ、ナス、トマト、コショウ、タバコ、センナリホウズキまたはコメ、コーンまたはワタである、ここに記載される方法にまで及び。
本発明は、昆虫がファエドン・コクレアリアエ(Phaedon cochleariae)(マスタード・リーフ・ビートル)であり、植物がカラシナ、ハクサイ、カブの葉、コラード若葉または青梗菜である、ここに記載される方法にまで及び。
本発明は、昆虫がエピラクナ・ヴァリヴェティス(Epilachna varivetis)(インゲンテントウ)であり、植物がマメ、フィールド・ビーン、ガーデン・ビーン、インゲンマメ、ライマメ、ヤエナリ、サヤインゲン、黒目豆、ベルベット・ビーン、ダイズ、ササゲ、キマメ、クローバーまたはアルファルファである、ここに記載される方法にまで及ぶ。
本発明は、昆虫がアントノムス・グランディス(Anthonomus grandis)(ワタミハナゾウムシ)であり、植物がワタである、ここに記載される方法にまで及ぶ。
本発明は、昆虫がトリボリウム・カスタニュウム(Tribolium castaneum)(コクヌストモドキ)であり、植物が小麦粉、穀物、食事、クラッカー、マメ、スパイス、パスタ、ケーキミックス、乾燥ペットフード、ドライフラワー、チョコレート、ナッツ、種子、およびイーブン・ドライド・ミュージアム・スペーシメンなどの貯蔵された穀物製品の形態である、ここに記載される方法にまで及ぶ。
本発明は、昆虫がミズス・ペルシカエ(Myzus persicae)(モモアカアブラムシ)であり、植物が特にモモ、アプリコットおよびプラムなどのプラナス（Prunus）などの樹木；朝鮮アザミ、アスパラガス、マメ、ビーツ、ブロッコリ、芽キャベツ(Brusselsprouts)、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、カンタロープ、セロリ、コーン、キュウリ、ウイキョウ、ケイル、球茎甘藍、カブ、ナス、レタス、カラシナ、オクラ、パセリ、マメ、コショウ、ジャガイモ、ダイコン、ホウレンソウ、カボチャ、トマト、カブ、オランダガラシおよびスイカを含むソラナセアエ（Sokanaceae）、ケノポディアセアエ(Chenopodiaceae)、コムポシタエ（Compositae）、クルシフェラエ（Cruciferae）およびククルビータアエ(Cucurbitaceae)科の野菜作物；タバコ、サトウ、ビートおよびヒマワリなどの畑作物；花作物または他の観賞用植物である、ここに記載される方法にまで及ぶ。
本発明は、昆虫がニラパルヴァータ・ルーゲンス(Nilaparvata lugens)であり、植物がイネである、ここに記載される方法にまで及ぶ。
本発明は、昆虫がキロ・サプレッサリス(Chilo suppressalis)(ニカメイチュウ)であり、植物がイネ、オオムギ、ソルガム、トウモロコシ、コムギまたは草であるが、これらに限定されず、ここに記載された方法にまで及び。
本発明は、昆虫がプルテッラ・キシロステッラ(Plutella xylostella)(コナガ)であり、植物がキャベツ、ハクサイ、芽キャベツ、ケイル、アブラナ、ブロッコリ、カリフラワー、カブ、カラシナまたはダイコンなどのブラッシカ種(Brassica species)であるが、これらに限定されず、ここに記載される方法にまで及ぶ。
本発明は、昆虫がアチェタ・ドメスティカス(Acheta domesticus)(イエコオロギ)であり、植物はここに記載されるいかなる植物であるか、またはいかなる有機物である、ここに記載される方法にまで及ぶ。
【００３３】
この文脈中で、「植物」との用語は昆虫の成長および／または昆虫の横行を阻止または減少させるために処理することが望まれるいかなる植物材料をも包含する。これは、とりわけ、植物全体、実生、種子などの増殖または再生材料、挿し木、接木、外植体など、および植物細胞および組織培養物も含む。植物材料は害虫生物の少なくとも１つの標的遺伝子のセンス鎖のヌクレオチド配列の少なくとも一部のＲＮＡ相補鎖であるか、あるいはこれのＲＮＡ均等物を表示する、少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子を発現するか、あるいは発現する能力を有するべきであり、このようにして、ＲＮＡ分子は植物と害虫の相互作用時に害虫に取り込まれ、前記ＲＮＡ分子はＲＮＡ干渉によって標的遺伝子を阻害するか、または標的遺伝子の発現を下方制御することが可能である。
標的遺伝子はここに記載される標的遺伝子のすべてであり、例えば、害虫の生存、成長、発達または再生に必須である標的遺伝子である。本発明は下方制御され得る、昆虫において興味あるいかなる遺伝子（「標的遺伝子」としてここに引用される）にも関する。
【００３４】
「遺伝子発現の下方制御」および「遺伝子発現の阻害」との用語は、同じ意味で使用され、遺伝子発現の測定可能または観察可能な低下または標的遺伝子からのタンパク生成物および／またはｍＲＮＡ生成物の濃度における検出可能な遺伝子発現の完全な消滅をいう。好ましくは、下方制御は昆虫の他の遺伝子の発現を実質的には直接に阻害しない。遺伝子発現におけるｄｓＲＮＡの下方制御効果は、通常の遺伝子発現に比べて、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、好ましくは７０％、８０％またはさらに好ましくは９０％または９５％であると計算される。標的遺伝子の性質に応じて、昆虫の細胞中での遺伝子発現の下方制御または阻害は、細胞または昆虫全体の表現形の分析によって、またはＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、ヌクレアーゼプロテクション、ノザンハイブリダイゼーション、逆転写、マイクロアレーによる遺伝子発現モニタリング、抗体結合、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロッティング、放射性免疫分析（ＲＩＡ）、他の免疫測定法、または蛍光標識細胞分析（ＦＡＣＳ）などの分子技術を使用するｍＲＮＡまたはタンパク発現の測定によって確認され得る。
【００３５】
「標的遺伝子」は、本質的には、これは昆虫の成長または病原性または感染性と干渉するから、阻止されることが望ましい全ての遺伝子である。例えば、もしも本発明の方法が昆虫の成長および／または横行を阻止するために使用される場合、昆虫の生存、成長、発達または再生にとって必須である標的遺伝子、または昆虫の病原性または感染性に関与する全ての遺伝子を選択することが好ましく、このようにして標的遺伝子の特定の阻害が致命的な表現型となるか、あるいは昆虫の横行を減少または停止させる。
【００３６】
非限定的な実施態様では、標的遺伝子は本発明の方法を使用してその発現が下方制御されるか、または阻害される場合、昆虫が殺されるか、または昆虫の再生または成長が停止されるか、または遅延されるようなものである。このタイプの標的遺伝子は昆虫の生存にとって必須であると考えられ、必須遺伝子と呼ばれる。したがって、本発明は標的遺伝子が必須遺伝子である、ここに記載される用法を包含する。
【００３７】
さらなる非限定実施態様では、標的遺伝子は、これが本発明の方法を使用して下方制御される場合、昆虫による横行または感染、昆虫が生じる損害、および／または宿主生物を荒らすか、または感染する、および／またはこのような損害を生じる昆虫の能力が低下されるものである。「横行する」および「感染する」または「横行」および「感染」との用語は、一般的に全体にわたって同じ意味で使用される。このタイプの標的遺伝子は昆虫の病原性または感染力に関与すると考えられる。したがって、本発明は、標的遺伝子が昆虫の病原性または感染力に関与する、ここに記載される方法にまで及ぶ。後者タイプの標的遺伝子を選択する利点は、昆虫がさらに植物または植物の部分に感染することをブロックし、さらなる世代を形成することを阻害することである。
【００３８】
１つの実施態様では、標的遺伝子は保存遺伝子または昆虫特異的遺伝子である。
さらに、ＲＮＡｉまたはＲＮＡ−仲介遺伝子サイレンシングまたは昆虫標的遺伝子の阻害を行う能力を有する好適な２本鎖ＲＮＡ断片が、本発明の方法で使用される。
他の実施態様では、本質的に（昆虫などの）害虫の成長、発達および再生に関与する遺伝子が選択される。遺伝子の例としては、リボソームタンパクの構造サブユニットおよびＣＨＤ３遺伝子などのベータ−コータマー(beta-coatamer)が挙げられるが、これらに限定されない。Ｓ４（ＲｐＳ４）およびＳ９（ＲｐＳ９）などのリボソームタンパクは、タンパク生合成に関与するリボソームの構造上の成分であり、そして細胞内可溶質の小さなリボソームサブユニットの構成成分であり、Ｌ９およびＬ１９などのリボソームタンパクはリボソームに局在化するタンパク生合成に関与するリボソームの構造上の成分である。Ｃ．エレガンス(C. elegance)のベータ−コートマー遺伝子は、膜小胞外皮を形成する多量複合体のサブユニットであるタンパクをコードする。同様な配列はアラビドプシス・サリアーナ(Arabidopsis thaliana)、ドロソフィラ・メラノガスター(Drosophila melanogaster)、およびサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)などの種々の生物に見出されている。関連した配列はレピチノタルサ・デセムリネアータ(Leptinotarsa decemlineata)、ファエドン・コクレアリアエ(Phaedon cochleariae)、エピラクナ・ヴァリヴェスティス(Epilachna variestis)、アンソノムス・グランディス(Anthonomus grandis)、トリボリウム・キャスタニュウム(Tribolium castaneum)、ミズス・ペルシカエ(Myzus persicae)、ニラパルヴァータ・ルーゲンス(Nilaparvata lugens)、キロ・サプレッサリス(Chilo suppressalis)、プルテッラ・キシロステッラ(Plutella xylostella)およびアチェタ・ドメスティカス(Acheta domesticus)などの種々の生物に見出されている。
【００３９】
本発明に使用する他の標的遺伝子は、例えば、生存、成長、発達、再生および感染性において重要な役割を果たすものを含む。これらの標的遺伝子は、例えば、シノラブダイティス(Caenorhabditis)またはドロソフィラ(Drosophila)のハウスキーピング遺伝子、転写因子、および害虫特異的遺伝子または致死突然変異を含む。本発明に使用する標的遺伝子はまた、他の生物、例えば、昆虫またはアラクニダエ(arachniae)（例えば、レプチノタルサ属(Leptinotarsa spp.)、ファエドン属(Phaedon spp.)、エピラクナ属(Epilachna spp.)、アントノムス(Anthonomus spp.)、トリボリウム属(Tribolium spp.)、ミズス属(Myzus spp.)、ニラパルヴァータ属(Nilaparvata spp.)、キロ属(Chilo spp.)、プルテッラ(Plutella spp.)またはアチェタ属(Acheta spp.)）から得たものであってもよい。
【００４０】
好ましい標的遺伝子は、表１Ａに特定されるもの、および他の害虫生物など他の標的生物から得たオーソログ遺伝子を含む。
本発明の方法では、ｄｓＲＮＡは昆虫の成長を阻害するか、または病原性または感染性を干渉するために使用される。
すなわち、本発明はアニールされた相補鎖を含む単離２本鎖ＲＮＡに関し、そのうちの１つは、昆虫の標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的であるヌクレオチド配列を有する。標的遺伝子はここに記載される標的遺伝子のすべてであるか、あるいは同じ機能を発揮するその一部である。
【００４１】
本発明の一実施態様では、単離された２本鎖ＲＮＡはアニールされた相補鎖を含み、そのうちの１つは、昆虫標的遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的であるヌクレオチド配列を有する。ここで、前記標的遺伝子は下記群から選択される配列を含む：
（ｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、または２４８１のいずれかに示される配列と少なくとも７５％同一であるか、またはこれらの相補鎖および
（ii）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、または２４８１のいずれかの少なくとも１７個の隣接したヌクレオチド、またはこれらの相補鎖によって示される配列、
または、前記昆虫標的遺伝子は、配列番号４９〜１５８、２７５〜４７２、５３３〜５７５、６２１〜７６７、８１３〜８６２、９０８〜１０４０、１１６１〜１５７１、１７３０〜２０３９、２１２０〜２３３８、２３８４〜２４６０のいずれかの少なくとも１７個の隣接したヌクレオチドを含む遺伝子、またはこれらの相補鎖の昆虫オーソログである。
【００４２】
遺伝子サイレンシングを測定するために使用される分析法に依存して、成長阻害はコントロールｄｓＲＮＡで処理された害虫生物に比べて、約５％、１０％、より好ましくは約２０％、２５％、３３％、５０％、６０％、７５％、８０％、最も好ましくは約９０％、９５％、または約９９％以上であると定量され得る。
【００４３】
本発明の他の実施態様では、単離された２本鎖ＲＮＡは、前記アニールされた相補鎖の少なくとも１つが配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、または２４８１のいずれかに示されるヌクレオチド配列の少なくとも１つと均等であるＲＮＡを含むか、または前記アニールされた相補鎖はその長さが少なくとも１７塩基対の断片のＲＮＡ均等物、その長さが好ましくは少なくとも１８、１９、２０または２１、より好ましくは少なくとも２２、２３または２４塩基対を含む。
【００４４】
もしも本発明の方法が、宿主細胞または宿主生物に特別な昆虫の成長または横行を特に制御するために使用されるなら、２本鎖ＲＮＡがいかなる宿主遺伝子とも有意な相同性を共有しないか、または宿主の必須遺伝子を少なくとも共有しないことが好ましい。この文脈では、２本鎖ＲＮＡは宿主細胞のいかなる遺伝子とも３０％以下、より好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、およびさらにより好ましくは５％以下同一である核酸配列を示すことが好ましい。配列の同一性（％）は２本鎖ＲＮＡ領域の完全長に対して計算される。もしもゲノム配列データが宿主生物において入手可能であるなら、標準的なバイオ情報ツールを使用して、２本鎖ＲＮＡとの配列同一性をクロスチェックする。１つの実施態様では、ｄｓＲＮＡと宿主配列の間に２１個以上の隣接したヌクレオチドの配列同一性が存在しない。これはｄｓＲＮＡの２１個の隣接塩基対が宿主生物のゲノム中に生じていないことが好ましいことを意味する。他の実施態様では、ｄｓＲＮＡの２４個以上の隣接ヌクレオチドは宿主種からのいかなるヌクレオチド配列とも約１０％以下または約１２．５％の以下の配列同一性を有する。
【００４５】
２本鎖ＲＮＡはアニールされた相補鎖を含み、そのうちの１つは下方制御される標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列に対応するヌクレオチオド配列を有する。２本鎖ＲＮＡの他の鎖は第１番目の鎖と塩基対を有することができる。
標的昆虫遺伝子の「標的領域」または「標的ヌクレオチド配列」との表現は、遺伝子の好適な領域またはヌクレオチド配列である。標的領域は標的遺伝子の少なくとも１７、少なくとも１８または少なくとも１９個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも２０または少なくとも２１個のヌクレオチドおよびより好ましくは標的遺伝子の少なくとも２２、２３または２４個のヌクレオチドを含むべきである。
【００４６】
２本鎖ＲＮＡ（の少なくとも一部）は昆虫標的遺伝子の標的領域と配列同一性１００％を共有するであろうことが好ましい。しかしながら、２本鎖領域の全長にわたって配列同一性１００％が機能的ＲＮＡ阻害には必須でない。標的配列に対して、挿入、欠失および単一変異を有するＲＮＡ配列は、ＲＮＡ阻害において効果的であると判断されている。ここで使用される「に対応する」または「に相補的である」との用語は同じ意味で使用され、これらの用語が２本鎖ＲＮＡと標的遺伝子の標的領域の間の配列対応を呼ぶ場合、それらはしたがって配列同一性１００％を絶対的に必要としないと解釈される。しかし、２本鎖ＲＮＡと標的領域の間の配列同一性（％）は一般的に少なくとも８０％または８５％、好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、またはより好ましくは少なくとも９７％、９８％およびなおより好ましくは少なくとも９９％同一である。２本の核酸鎖はそれらの塩基対が少なくとも８５％の場合、「実質的に相補的」である。
【００４７】
ここで使用される「相補的である」との用語は、ＤＮＡ−ＲＮＡ相補性とともにＤＮＡ−ＤＮＡ相補性の両方に関する。これと同様に、「ＲＮＡ均等」との用語はＤＮＡ配列において、塩基「Ｔ」がリボ核酸に通常、存在する対応する塩基「Ｕ」によって置換されることを実質的に意味する。
ｄｓＲＮＡは標的遺伝子の標的領域に対応する配列を含むけれども、ｄｓＲＮＡ全体が標的領域の配列に対応することを絶対的に必須としない。例えば、もしもこのような配列が物質(material extent)へのＲＮＡ阻害において、ｄｓＲＮＡの実行に影響を与えないなら、ｄｓＲＮＡは標的特異的配列に隣接する短い非標的領域を含でいてもよい。
【００４８】
ｄｓＲＮＡはＲＮＡｉの実行を最適化するために、１つまたはそれ以上の置換塩基を含む。ｄｓＲＮＡのそれぞれの塩基をいかに変化させ、そして所与のｄｓＲＮＡの実行を最適化するために、得られたｄｓＲＮＡの活性を試験する（例えば、好適なインビトロ・テスト・システムで）ことは、当業者には自明であろう。
ｄｓＲＮＡはさらにＤＮＡ塩基、非天然塩基または非天然骨格連鎖または糖−リン酸骨格心の修飾を、例えば、貯蔵中の安定性を増強するために、またはヌクレアーゼによる分解に対する抵抗性を増強するために含む。
【００４９】
約２１ｂｐの短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の形成が、有効な遺伝子サイレンシングにおいて望ましいことが既に報告されている。しかしながら、本出願人の出願ではある害虫生物により有効に摂取されるためには、ｄｓＲＮＡの最小の長さは好ましくは少なくとも約８０〜１００ｂｐであることが示されている。自由生活する線虫、Ｃ．エレガンス(C. elegans)、または植物寄生線虫、メロイドジーン・インコグニータ(Meloidogyne incognita)などの無脊椎動物では、これらのより長い断片はたぶん無脊椎動物によるこれらの長いｄｓＲＮＡのより有効な摂取により、遺伝子サイレンシングにおいてより有効であるとの徴候が存在する。
【００５０】
２７−マー平滑末端または２９ｂｐステムおよび２−ｎｔ  ３'突出部を有する短いヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡのいずれかからなる合成ＲＮＡ二重鎖は、従来の２１−マーｓｉＲＮＡよりもＲＮＡ干渉のより潜在的誘導物質であることも最近、示唆されている。すなわち、上記同定される標的に基づき、２７−マー平滑末端または２９−ｂｐステムおよび２−ｎｔ（ヌクレオチド）の３'突出部を有する短いヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡのいずれかである分子もまた、本発明の範囲内に含まれる。
【００５１】
したがって、１つの実施態様では２本鎖ＲＮＡ断片（または領域）はそれ自体、好ましくは少なくとも長さ１７ｂｐ、好ましくは長さ１８または１９ｂｐ、より好ましくは少なくとも長さ２０ｂｐ、より好ましくは少なくとも２１ｂｐ、または少なくとも２２ｂｐ、または少なくとも２３ｂｐ、または少なくとも２４ｂｐ、２５ｂｐ、２６ｂｐまたは少なくとも２７ｂｐである。「２本鎖ＲＮＡ断片」または「２本鎖ＲＮＡ領域」との表現は標的遺伝子（の部分）に対応する２本鎖ＲＮＡの小さな実体(small entity)をいう。
【００５２】
一般的には、２本鎖ＲＮＡは約１７ｂｐ、１８ｂｐ、１９ｂｐ、２０ｂｐ、２１ｂｐ、２２ｂｐ、２３ｂｐ、２４ｂｐ、２５ｂｐ、２７ｂｐ、５０ｂｐ、８０ｂｐ、１００ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、２５０ｂｐ、３００ｂｐ、３５０ｂｐ、４００ｂｐ、４５０ｂｐ、５００ｂｐ、５５０ｂｐ、６００ｂｐ、６５０ｂｐ、７００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、または１５００ｂｐの２本鎖ＲＮＡ領域などの好ましくは約１７〜１５００ｂｐ、なおより好ましくは約８０〜１０００ｂｐ、最も好ましくは約１７〜２７ｂｐ、または約８０〜２５０ｂｐである。
【００５３】
２本鎖ＲＮＡの長さの上限は、ｉ）昆虫により摂取されるｄｓＲＮＡの必要条件およびii）ＲＮＡｉを行う断片中への細胞内に加工されるｄｓＲＮＡの必要条件に依存する。選択された長さはまた、ＲＮＡの合成法およびＲＮＡの細胞への輸送法によっても影響される。好ましくは、本発明方法に使用されるべき２本鎖ＲＮＡは長さ１０，０００ｂｐ以下、より好ましくは１０００ｂｐまたはそれ以下、より好ましくは５００ｂｐまたはそれ以下、より好ましくは３００ｂｐまたはそれ以下、より好ましくは１００ｂｐまたはそれ以下であろう。いかなる所与の標的遺伝子および昆虫においても、有効な阻害に最適なｄｓＲＮＡの長さは実験によって決定されるであろう。
【００５４】
２本鎖ＲＮＡは完全にまたは部分的に２本鎖である。ＲＮＡがなおも昆虫によって摂取され、ＲＮＡｉを実行することが可能であるという条件のもとに、部分的に２本鎖であるＲＮＡは２本鎖部分の一方または両末端に短い1本鎖突出部(overhang)を含む。
【００５５】
本発明方法は、多数の標的遺伝子の下方制御または阻害を実施するために、または１本の標的遺伝子の複数の潜在的阻害を達成するために、同じ昆虫に対して２つまたはそれ以上の異なった２本鎖ＲＮＡまたはＲＮＡ構築物の同時または連続的提供を包含する。
【００５６】
他方、多数の標的は多数の標的配列をヒットする１つの２本鎖ＲＮＡの提供によってヒットされ、そして１つの標的は、標的遺伝子に対応する２本鎖ＲＮＡ断片の１つ以上のコピーの存在によってより有効に阻害される。すなわち、本発明の１つの実施態様では２本鎖ＲＮＡ構築物は多数のｄｓＲＮＡ領域を含み、各ｄｓＲＮＡ領域の少なくとも１つの鎖は昆虫標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的であるヌクレオチド配列を含む。本発明によると、ＲＮＡ構築物のｄｓＲＮＡ領域は同じまたは異なった標的遺伝子に相補的であり、および／またはｄｓＲＮＡ領域は同じ昆虫種からの標的に相補的であるか、または異なった昆虫種からの標的に相補的である。
【００５７】
「ヒットする(hit,hits およびhitting)」との用語は、ｄｓＲＮＡの鎖の少なくとも１つが標的遺伝子またはヌクレオチド配列に相補的であり、そして結合することを示す代替可能な言葉である。
１つの実施態様では、２本鎖ＲＮＡ領域は標的遺伝子に相補的であるヌクレオチド配列の多数のコピーを含む。他方、ｄｓＲＮＡは同じ標的遺伝子の１つ以上の標的配列をヒットする。すなわち、本発明は昆虫標的のヌクレオチド配列の少なくとも部分に相補的である前記ヌクレオチド配列の少なくとも２つのコピーを含む単離された２本鎖ＲＮＡ構築物を包含する。
【００５８】
本発明の文脈中、「多数」との用語は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６などを意味する。
「さらなる標的遺伝子」または「少なくとも１つの他の標的遺伝子」との表現は、例えば、第２番目、第３番目または第４番目などの標的遺伝子を意味する。
上記標的のうちの１つ以上をヒットするｄｓＲＮＡ、または上記標的の異なったものに対する異なったｄｓＲＮＡの組み合わせが開発され、本発明の方法に使用される。
【００５９】
したがって、本発明は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、または２４８１のいずれかで示されるヌクレオチド配列の少なくとも１つのＲＮＡ均等物の少なくとも２つのコピー、またはその長さが少なくとも１７塩基対、好ましくは長さ少なくとも１８、１９、２０または２１、より好ましくは少なくとも２２、２３または２４塩基対の断片のＲＮＡ均等物の少なくとも２つのコピーを含む単離された２本鎖ＲＮＡ構築物に関する。好ましくは、前記２本鎖ＲＮＡは配列番号１５９または１６０に示されるヌクレオチド配列のＲＮＡ均等物、あるいはその長さが少なくとも１７、好ましくは少なくとも１８、１９、２０または２１、より好ましくは少なくとも２２、２３または２４塩基対を含む。さらなる実施態様では、本発明は配列番号１５９または１６０に示されるヌクレオチド配列のＲＮＡ均等物の少なくとも２つのコピーを含む単離された２本鎖ＲＮＡ構築物に関する。
【００６０】
したがって、本発明はｄｓＲＮＡがアニールされた相補鎖を含み、そのうちの１つが昆虫標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的であり、そして互いに独立して選択される少なくとも２つのヌクレオチド配列のＲＮＡ均等物を含むヌクレオチド配列を有する、ここに記載される方法にまで及ぶ。１つの実施態様では、ｄｓＲＮＡは配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、または２４８１のいずれかで示される配列から独立して選択される、少なくとも２、好ましくは少なくとも３、４または５のヌクレオチド配列のＲＮＡ均等物、または長さが少なくとも１７塩基対、好ましくは少なくとも１８、１９、２０または２１、より好ましくは少なくとも２２、２３または２４塩基対のその断片を含む。
【００６１】
少なくとも２つのヌクレオチド配列はここに記載される標的遺伝子から誘導される。１つの好ましい実施態様では、ｄｓＲＮＡは昆虫の生存、成長、発達または再生において必須である少なくとも１つの標的遺伝子をヒットし、そして上記した病原性または感染性に関与する少なくとも１つの遺伝子をヒットする。他方、ｄｓＲＮＡは同じカテゴリーの多数遺伝子をヒットする。例えば、ｄｓＲＮＡは少なくとも２つの必須遺伝子または同じ細胞機能に関与する少なくとも２つの標的遺伝子をヒットする。さらなる実施態様では、ｄｓＲＮＡは少なくとも２つの標的遺伝子をヒットし、その標的遺伝子は異なった細胞機能に関与する。例えば、ｄｓＲＮＡはタンパク合成（例えば、リボソームサブユニット）、細胞内タンパク輸送、核ｍＲＮＡスプライシングに関与するか、または表１Ａに記載される機能のうちの１つに関与する２つまたはそれ以上の遺伝子をヒットする。
【００６２】
好ましくは、本発明は前記昆虫標的遺伝子が下記群から選択される配列を含み、
（ｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、または２４８１のいずれかによって示される配列と少なくとも７５％同一である配列、またはそれらの相補鎖、および
（ii）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、または２４８１のいずれかの少なくとも１７個の隣接したヌクレオチドを含む配列、またはそれらの相補鎖、
または、前記昆虫遺伝子は配列番号４９〜１５８、２７５〜４７２、５３３〜５７５、６２１〜７６７、８１３〜８６２、９０８〜１０４０、１１６１〜１５７１、１７３０〜２０３９、２１２０〜２３３８、２３８４〜２４６０のいずれかの少なくとも１７個の隣接したヌクレオチドを含む配列、またはそれらの相補鎖の少なくとも７５％同一である配列を含む、ここに記載される方法にまで及ぶ。
【００６３】
２本鎖ＲＮＡのｄｓＲＮＡ領域（または断片）は、以下のように結合される。
ａ）１本の標的遺伝子を標的とする多数のｄｓＲＮＡ領域が結合される場合、それらはＲＮＡ構築物で元来の順（すなわち、その領域が標的遺伝子に現れる順）で結合される。
ｂ）他方、断片の元来の順は無視されて、それらは２本鎖ＲＮＡ構築物中へ任意の順序でランダムまたは意図して順不同に、結合される。
ｃ）他方、１つの単断片はｄｓＲＮＡ構築物中で数回、例えば、１〜１０回、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回、繰り返される。
ｄ）ｄｓＲＮＡ領域（単一または異なった標的遺伝子を標的とする）はセンスまたはアンチセンス方向に結合される。
【００６４】
さらに、結合されるべき標的遺伝子は、下記遺伝子カテゴリーの１つまたは複数から選択される：
ｅ）上記記載された「必須」遺伝子または「病原性遺伝子」とは、１つまたは複数の標的昆虫において生命維持に必要であり、サイレンスされると、致死的または重大な表現型（例えば、摂食、再生、成長）となる遺伝子を包含する。強力な致死的標的遺伝子の選択は、潜在的ＲＮＡｉ効果となる。本発明のＲＮＡ構築物では、同じまたは異なった（非常に有効な）致死的遺伝子を標的とする多数のｄｓＲＮＡ領域は、昆虫制御のＲＮＡｉの潜在性、効果および速度をさらに増加するために結合される。
ｆ）「弱い」遺伝子はここに記載される細胞経路の１つで特別に興味ある機能をもつ標的遺伝子を包含する。しかし、独立してサイレンシングされると弱い表現型効果となる。本発明のＲＮＡ構築物では、１つまたは異なった弱い遺伝子を標的とする多数のｄｓＲＮＡ領域はより強いＲＮＡｉ効果を得るために結合される。
ｇ）「昆虫特異的」遺伝子は、生命情報科学の相同性検索、例えば、ＢＬＡＳＴ検索によって決定されるように、非昆虫生物に実質的な相同性ある対応物を有しない遺伝子を包含する。昆虫特異的標的遺伝子の選択は、非標的生物において効果が全くないか、または実質的な（有害）作用を有しない種特異的ＲＮＡｉ効果となる。
ｈ）「保存された遺伝子」は標的生物と非標的生物との間に（アミノ酸レベルで）保存される遺伝子を包含する。非標的種に可能性ある効果を減少させるために、このように有効であるが、保存された遺伝子は分析され、これらの保存された遺伝子の可変領域から得た標的配列は、ＲＮＡ構築物のｄｓＲＮＡ領域によって標的化されるように選択される。ここで、保存とは核酸配列のレベルで利用される。すなわち、このような可変領域は核酸配列のレベルで保存標的遺伝子の最小の保存セクションを包含する。
ｉ）「保存経路」遺伝子は、同じ生物学的経路または細胞過程に関与する遺伝子を包含するか、または特異的および潜在的ＲＮＡｉ効果となる異なった昆虫種において同じ機能性およびより有効な昆虫制御を有する遺伝子を包含する。
ｊ）他方、本発明のＲＮＡ構築物は異なった生物学的経路から得た多数の遺伝子を標的とし、広い細胞性ＲＮＡｉ効果およびより有効な昆虫制御となる。
【００６５】
本発明では、全ての２本鎖ＲＮＡ領域はここに記載される標的遺伝子のすべてのヌクレオチド配列の少なくとも部分または一部分に相補的である少なくとも１つの鎖を含む。しかし、２本鎖ＲＮＡ領域の１つがここに記載される標的遺伝子の１つのヌクレオチド配列の一部分に相補的である少なくとも１つの鎖を含むなら、他の２本鎖ＲＮＡ領域は他の昆虫標的遺伝子の一部分に相補的である少なくとも１本の鎖（公知標的遺伝子を含む）を含む。
【００６６】
本発明のなおも他の実施態様では、さらに、少なくとも１つのさらなる配列および所望によりリンカーを含む、ここに記載される単離された２本鎖ＲＮＡまたはＲＮＡ構築物が提供される。１つの実施態様では、さらなる配列は、（ｉ）ｄｓＲＮＡ構築物の大規模生産を促進する配列；（ii）ｄｓＲＮＡの安定性を増加または減少させる配列；（iii）タンパクまたは他の物質が昆虫によるＲＮＡ構築物の摂取を促進することを可能とする配列；（iv）受容体または表面上の分子に結合するアプタマーである配列、または昆虫による摂取、飲食細胞運動および／または経細胞輸送を促進する昆虫の細胞質中の配列；または（v）ｄｓＲＮＡ領域のプロセッシングを触媒するさらなる配列を含む群から選択される。１つの実施態様では、リンカーは従来の自己切断ＲＮＡ配列、好ましくはｐＨ感受性リンカーまたは疎水性感受性リンカーである。１つの実施態様では、リンカーはイントロンである。
【００６７】
１つの実施態様では、２本鎖ＲＮＡ構築物の多数ｄｓＲＮＡ領域は１つまたはそれ以上のリンカーに接続する。他の実施態様では、リンカーはＲＮＡ構築物のある部位に存在し、ｄｓＲＮＡ領域は他の目的の領域と離れている。ｄｓＲＮＡ構築物における異なったリンカータイプが本発明で提供される。
他の実施態様では、２本鎖ＲＮＡ構築物の多数ｄｓＲＮＡ領域はリンカーなくても結合される。
本発明の特別な実施態様では、リンカーは害虫生物のより小さなｄｓＲＮＡ領域を連絡切断するために使用される。有利にも、この状況ではリンカー配列は特別な環境下により小さなｄｓＲＮＡ領域中に長いｄｓＲＮＡの分割を促進して、これらの環境下に分離したｄｓＲＮＡ領域の放出となり、これらのより小さなｄｓＲＮＡ領域によるより有効な遺伝子サイレンシングにつながる。好適な従来の自己切断リンカーの例としては、高ｐＨ条件で自己切断するＲＮＡ配列である。このようなＲＮＡ配列の好適な例としては、ボーダ(Borda)ら、(Nucleic AcidsRes. 2003 May15;31(10):2595-600)に記載される。この参考資料は本明細書中に参考として導入される。この配列はハンマーヘッド型リボザイムＨＨ１６の触媒作用をもつ核部に由来する。
【００６８】
本発明の他の態様では、リンカーはＲＮＡ構築物のある部位に局在し、ｄｓＲＮＡ領域は他のもの、例えば他の目的の配列と分離している。これは好ましくはＲＮＡ構築物にいくつかのさらなる機能を提供する。
本発明の１つの特別な実施態様では、本発明のｄｓＲＮＡ構築物は昆虫によるｄｓＲＮＡの摂取を促進するアプタマーを備えている。アプマーは昆虫によって摂取される物質に結合するように設計される。このような物質は昆虫または植物起源に由来する。アプタマーの１つの具体的な例としては、膜貫通タンパク、例えば昆虫の膜貫通タンパクに結合するアプタマーである。他方、アプタマーは昆虫によって摂取される（植物）代謝産物または栄養素に結合する。
他方、リンカーはエンドソーム内で自己切断性である。これは、本発明の構築物が飲食細胞運動または経細胞輸送を経て昆虫によって摂取される場合、有利であり、したがって、昆虫種のエンドソームにおいて区画化される。エンドソームは低ｐＨ環境を有し、リンカーの切断となる。
疎水条件で自己切断する上記したリンカーは、１つの細胞から他の細胞へ細胞壁中の移行を経て移動するために使用される場合、例えば、昆虫害虫生物の細胞壁を横断する場合、本発明のｄｓＲＮＡ構築物において特に有用である。
【００６９】
イントロンもまたリンカーとして使用される。ここで使用される「イントロン」とはメッセンジャーＲＮＡの非コードＲＮＡ配列である。本発明の構築物における特別に好適なイントロン配列は、（１）Ｕ−リッチ（３５〜４５％）；（２）塩基対がランダムに選択されるか、または公知イントロン配列に基づく平均長さ１００ｂｐ（約５０〜約５００ｂｐの間を変化する）を有する；（３）−ＡＧ：ＧＴ−または−ＣＧ：ＧＴ−を有する５'末端で始まる、および／または（４）−ＡＧ：ＧＣ−または−ＡＧ：ＡＡを有する３'末端に有する。
約１塩基対から約１０，０００塩基対にわたる非相補的ＲＮＡ配列もまたリンカーとして使用される。
【００７０】
特別な理論またはメカニズムによって拘束されることを望まない場合、長い２本鎖ＲＮＡはその当面の環境から昆虫によって摂取されると考えられる。腸中に摂取され、腸上皮細胞へ移送された２本鎖ＲＮＡは、次いで内因性エンドヌクレアーゼの作用によって、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる短い２本鎖ＲＮＡに細胞内で加工される。次いで、得られたｓｉＲＮＡはＲＩＳＣまたはＲＮＡ干渉サイレンシングコンプレックスと称する多成分ＲＮＡａｓｅコンプレックスの生成を経て、ＲＮＡｉを仲介する。
昆虫細胞内で標的遺伝子の下方制御を達成するために、細胞壁の外部へ添加された２本鎖ＲＮＡは、細胞中へ摂取され、次いで、ｓｉＲＮＡ中に細胞内で加工され得るｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ構築物であり、これは次いでＲＮＡｉを仲介するか、または細胞の外部へ添加されたＲＮＡはそれ自体、細胞中に摂取され得るｓｉＲＮＡであり、それによってＲＮＡｉを実施することができる。
ｓｉＲＮＡは一般的に１９〜２５塩基対、または２０〜２４塩基対の範囲である長さを有する短い２本鎖ＲＮＡである。好ましい実施態様では、下方制御されるべき標的遺伝子に対応して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基対、特に２１または２２塩基を有するｓｉＲＮＡが使用される。しかしながら、本発明はこのようなｓｉＲＮＡの使用に限定されることを意図していない。
ｓｉＲＮＡは２本鎖部分に隣接して、一方または両方の端に１本鎖の突出部を含む。特に好ましい実施態様では、ｓｉＲＮＡは３'突出ヌクレオチド、好ましくは２つの３'突出チミジン（ｄＴｄＴ）またはウリジン（ＵＵ）を含む。３'ＴＴまたはＵＵ突出部は、もしもｄｓＲＮＡの２本鎖部分に含まれる配列のすぐ上流の標的遺伝子の配列がＡＡであるなら、ｓｉＲＮＡに含まれる。これはｓｉＲＮＡのＴＴまたはＵＵ突出部が標的遺伝子にハイブリダイズすることを可能とする。３'ＴＴまたはＵＵ突出部もまたｓｉＲＮＡの他の末端に含まれるけれども、ｓｉＲＮＡの２本鎖部分に含まれる配列の下流の標的配列がＡＡを有することは必須としない。この文脈では、ＲＮＡ／ＤＮＡキメラであるｓｉＲＮＡもまた予期される。これらのキメラは、例えば上記したようにＤＮＡ塩基（例えば、ｄＴｄＴ）の３'突出部を有する２本鎖ＲＮＡを含むｓｉＲＮＡを含み、そして１つまたは複数のＲＮＡ塩基またはリボヌクレオチド、または全鎖が全てリボヌクレオチドであるポリヌクレオチドの２本鎖ＲＮＡは、ＤＮＡ塩基またはデオキシヌクレオチドで代替される。
【００７１】
ｄｓＲＮＡは（非共有）塩基対によって互いにアニールされる２本の別個の（センスおよびアンチセンス）ＲＮＡ鎖から形成される。他方、ｄｓＲＮＡは折りたたみ式ステムループまたはヘアピン構造を有し、その際、ｄｓＲＮＡの２本のアニールされた鎖は共有結合される。この実施態様では、ｄｓＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖は、部分的に自己相補的である１本のポリヌクレオチド分子の異なった領域から形成される。もしもｄｓＲＮＡがインビボでの発現によって、例えば、以下に説明される宿主細胞または生物中で、またはインビトロ転写によって合成されるべきなら、この構造を有するＲＮＡが便宜的である。２本のＲＮＡ鎖に結合する「ループ」の正確な性質および配列は、ＲＮＡｉを仲介する分子の２本鎖部分の能力を損なうべきでないことを除いて、本発明では一般的には重要でない。ＲＮＡｉで使用する「ヘアピン」または「ステム−ループ」ＲＮＡの態様は、一般的にはＣＳＩＲＯとの名前で当業界において公知である（例えば、ＷＯ９９／５３０５０参照、その内容は本明細書中に参考として導入される）。本発明の他の実施態様では、ループ構造はリンカー配列および上記した付加的配列を含む。
【００７２】
２本鎖ＲＮＡまたは構築物は、自体公知の方法で調製される。例えば、２本鎖ＲＮＡは当該技術分野で周知である化学的または酵素的ＲＮＡ合成技術を使用して、インビトロで合成される。１つのアプローチでは、２本の別々なＲＮＡ鎖は別個に合成され、次いでアニールされて２本鎖を形成する。別の実施態様では、２本鎖ＲＮＡまたは構築物は好適な発現ベクターから得た宿主細胞または生物で細胞内発現によって合成される。このアプローチはさらに詳細に以下に説明される。
【００７３】
昆虫が接触する２本鎖ＲＮＡの量は、１つまたは複数の標的遺伝子の特異的下方制御が達成されるような量である。ＲＮＡは細胞当たり少なくとも１つのコピーの輸送を可能とする量で導入される。しかしながら、ある実施態様では、２本鎖ＲＮＡのより多い用量（例えば、細胞当たり、少なくとも５、１０、１００、５００または１０００コピー）がより有効な阻害を達成する。いかなる所与の昆虫遺伝子標的でも、有効な阻害のためのｄｓＲＮＡの最適量は日常的な実験によって決定される。
【００７４】
昆虫は好適な方法で２本鎖ＲＮＡに接触することができ、昆虫による２本鎖ＲＮＡの直接的摂取を達成する。例えば、昆虫は純粋または実質的に純粋な形態で、例えば、ｄｓＲＮＡを含む水溶液中で２本鎖ＲＮＡと接触する。この実施態様では、昆虫は２本鎖ＲＮＡを含む水溶液で単に「浸漬」される。別の実施態様では、昆虫は２本鎖ＲＮＡを含む液体組成物を昆虫にスプレーして２本鎖ＲＮＡと接触され得る。
【００７５】
他方、２本鎖ＲＮＡは昆虫によるｄｓＲＮＡの摂取を増加させるために、哺乳動物病原性昆虫のための食品組成物など、昆虫の食品組成物に結合される。
２本鎖ＲＮＡはまた、昆虫が成長する媒体、または昆虫によって侵襲される材料または基質に導入されるか、または昆虫による横行に感受性を有する基質または材料中に浸漬される。
他の実施態様では、ｄｓＲＮＡは細菌または真菌細胞中で発現され、細菌または真菌細胞は昆虫種によって摂取されるか、または食べられる。
実施例にて説明されるように、細菌は本発明のｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ構築物のいずれかを産生するために操作される。これらの細菌は昆虫種によって食べられ得る。摂取されると、ｄｓＲＮＡはＲＮＡｉ反応を開始することができ、標的ｍＲＮＡの分解および食した昆虫の弱体化または死滅につながる。
【００７６】
したがって、より具体的な実施態様では、前記２本鎖ＲＮＡまたはＲＮＡ構築物は細菌などの原核細胞、または酵母などの真核細胞、宿主細胞または宿主生物によって発現される。この実施態様では、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ構築物を発現することができるいかなる細菌または酵母細胞も使用することができる。細菌は大腸菌（例えば、Ｅ．コリ(Ｅ．ｃｏｌｉ)）、バチルス属(Bacillus spp.)（例えば、Ｂ．チューリンジェンシス(B.thuringiensis)）、リゾビウム属(Rhizobium spp.)、ラクトバチルス属(Lactobacillus spp.)、ラクトコッカス属(Lactococcus spp.)などのグラム陰性およびグラム陽性細菌を含む群から選択されるが、これらに限定されない。酵母はサッカロマイセス属(Saccharomyces spp.)などを含む群から選択される。
【００７７】
いくつかの細菌は、レグミノセア(Legminosea)を有する共生リゾビウム(Rhizobium)などの宿主植物（例えば、ダイズ）と近接な相互作用を有するが、これらに限定されない。このような組換え細菌は、種子と混合して（例えば、被覆層として）および土壌改良剤として使用される。
したがって、本発明はまた、ここに記載されるヌクレオチド配列または組換えＤＮＡ構築物のいずれかを含む細胞を包含する。本発明はさらに、原核細胞（グラム陽性およびグラム陰性細菌細胞など、これらに限定されない）および真核細胞（酵母細胞または植物細胞など、これらに限定されない）を包含する。好ましくは、前記細胞は細菌細胞または酵母細胞または藻類細胞である。
【００７８】
他の実施態様では、昆虫はさらにここに記載される組成物と接触される。本組成物はｄｓＲＮＡまたはＤＮＡに加えて、さらに賦形剤、希釈剤または担体を含む。このような組成物の好ましい態様はより詳細に以下に説明される。
他方、ｄｓＲＮＡ生産細菌または酵母細胞は穀物上に直接、スプレーされ得る。
すなわち、上記したように、本発明は本発明のＲＮＡ構築物および／またはＤＮＡ構築物および／または発現構築物を含む宿主細胞を提供する。好ましくは、宿主細胞は細菌または酵母細胞であるが、例えばウイルスであってもよい。特に昆虫を侵襲するバキュロウイルスなどのウイルスが使用される。ウイルスは哺乳動物に感染せず、そのため望ましくないＲＮＡｉ効果が生じないから、これは哺乳動物、特にヒトに対しての安全性を保証する。
【００７９】
細菌細胞または酵母細胞は例えば、この薬剤がヒトまたは他の哺乳動物との接触がありうる環境（キッチンなど）にて使用されるべきときは、好ましくは生物学的殺虫剤として使用される前に不活性化されるべきである。不活性化は熱処理、フェノールまたはホルムアルデヒド処理など、または機械的処理などいかなる手段で達成してもよい。
【００８０】
なおも別な実施態様では、適当に変性されたバキュロウイルスなどの不活性化ウイルスは、本発明のｄｓＲＮＡ領域を輸送するために使用され、昆虫害虫にＲＮＡｉを仲介する。
可能性ある用途としては、例えば、ＧＭＯ（遺伝子組換え生命体）の立場からみて興味がない穀物、ならびにダイズなどのより広い畑の穀物などの集約的な温室栽培を含む。
【００８１】
このアプローチはいくつかの利点を有する。例えば、植物宿主による可能性あるダイシングの問題は存在しないから、摂取する害虫の腸管内腔中へ大きなｄｓＲＮＡ断片を輸送することが可能となり、特に、遺伝子組換え変異体を得ることが困難であるある種の穀物においては、殺虫剤のような細菌の使用は遺伝子組換え穀物の産生に関与しない。異なった穀物が同時に同じ畑で処理され得ることに広くかつ柔軟な用途が存在し、および／または異なった害虫は、例えば別のｄｓＲＮＡを産生する異なった細菌と組み合わせて、同時に標的化され得る。
【００８２】
本発明の他の態様は、ここに記載される昆虫標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列である。このような標的ヌクレオチド配列は本発明のｄｓＲＮＡ構築物を設計するために特に重要である。このような標的ヌクレオチド配列は、長さが好ましくは少なくとも１７、好ましくは少なくとも１８、１９、２０または２１、より好ましくは少なくとも２２、２３または２４ヌクレオチドである。好ましい標的ヌクレオチド配列の非限定例は、実施例で示される。
【００８３】
１つの実施態様では、本発明はここに記載される２本鎖ＲＮＡまたは２本鎖ＲＮＡ構築物をコードする単離されたヌクレオチド配列を提供する。
より具体的な実施態様では、本発明は配列番号４９〜１５８、２７５〜４７２、５３３〜５７５、６２１〜７６７、８１３〜８６２、９０８〜１０４０、１１６１〜１５７１、１７３０〜２０３９、２１２０〜２３３８、２３８４〜２４６０のいずれかに示される配列からなる単離された核酸配列、またはそれらのうち、少なくとも１７、好ましくは少なくとも１８、１９、２０または２１、より好ましくは少なくとも２２、２３または２４ヌクレオチドの断片に関する。
当業者は、これらの標的遺伝子の相同体が見いだされ得ること、およびこれらの相同体は本発明の方法で有用であることを認識するであろう。
【００８４】
タンパク、またはヌクレオチド配列は、もしもそれらが「有意な」レベルの配列類似性またはより好ましくは配列同一性を示すなら、相同と考えられる。真に相同である配列は、共通の祖先の遺伝子からの分岐により関連している。配列相同性は２つのタイプ：（ｉ）相同性が異なった種に存在する場合、それらはオーソログとして公知であり、例えば、マウスとヒトのα−グロビン遺伝子はオーソログである。（ii）パラローグは１つの種内で相同である遺伝子であり、例えば、マウスのα−およびβ−グロビンはパラローグである。
【００８５】
好ましい相同体は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６または２４８１によって示される配列の群から選択される配列と少なくとも約８５％または８７．５％、なおもより好ましくは約９０％、なおもより好ましくは少なくとも約９５％および最も好ましくは少なくとも約９９％同一である配列、またはそれらの相補体を含む遺伝子である。配列の同一性を決定する方法は、当業界では日常的であり、Blast ソフトウェアおよびEMBOSSソフトウェア（TheEuropean Molecular Biology OpenSoftwear Suite (2000), Rice, P. Longden I. and Bleasby, A. Trends in Genetics 16, (6) pp267-277）の使用を含む。ここで使用される「同一性(identity)」との用語は、ヌクレオチドレベルでの配列間の関係をいう。「同一性％」との表現は、最適に整列した配列、例えば、２つまたはそれ以上を比較ウインドウの上で比較することによって決定される。その際、比較ウインドウの配列の一部は最適に整列した配列の参考配列と比較される挿入または欠失を含む。参照配列は挿入または欠失を含まない。参照ウインドウは少なくとも１０個の連続したヌクレオチオドから約５０、約１００または約１５０のヌクレオチド、好ましくは約５０から１５０ヌクレオチドの間から選択される。次いで、「同一性％」がウインドウの配列間で同一であるヌクレオチドの��を測定し、ウインドウのヌクレオチドの数で同一のヌクレオチドの数を割って、１００倍して計算される。
【００８６】
他の相同体は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６または２４８１のいずれかによって示される配列を含む遺伝子のアレル変異体である遺伝子である。さらに好ましい相同体は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６または２４８１のいずれかによって示される配列を含む遺伝子に比べて、少なくとも１つのヌクレオチド多型（ＳＮＩＰ）を含む遺伝子である。
【００８７】
他の実施態様では、本発明は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６または２４８１のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子の昆虫オーソログである標的遺伝子を包含する。実施例として、オーソログは配列番号４９〜１２３、２７５〜４３４、５３３〜５６２、６２１〜７３８、８１３〜８５２、９０８〜１０１０、１１６１〜１４３７、１７３０〜１９８７、２１２０〜２２９０、および２３８４〜２４３８のいずれかに示されるヌクレオチド配列、または少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７ヌクレオチドのその断片を含む。昆虫または蛛形綱(arachnida)のオーソログ遺伝子または本発明の配列のうちの１つの少なくとも１７ｂｐの断片を含む配列は、表４に示される。
【００８８】
他の実施態様では、本発明は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６または２４８１のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子の線虫オーソログである標的遺伝子を包含する。例として、線虫オーソログは、配列番号１２４〜１３５、４３５〜４４６、５６３〜５６４、７３９〜７５１、８５３、８５４、１０１１〜１０２５、１４３８〜１４７３、１９８８〜２００１、２２９１〜２２９８、２４３９または２４４０のいずれかに示されるヌクレオチド配列、またはそのうちの少なくとも１７、１８、１９、２０または２１ヌクレオチドの断片を含む。他の態様では、すなわち本発明は生物での線虫の成長を制御するか、または線虫感染に感受性のある生物の線虫横行を阻止するために、ここに記載される方法のいずれも包含する。この方法は線虫細胞を２本鎖ＲＮＡと接触させることを含み、ここで２本鎖ＲＮＡはアニールされた相補鎖を含み、そのうちの１つは配列番号１２４〜１３５、４３５〜４４６、５６３〜５６４、７３９〜７５１、８５３、８５４、１０１１〜１０２５、１４３８〜１４７３、１９８８〜２００１、２２９１〜２２９８、２４３９または２４４０に示されるヌクレオチド配列、またそのうちの少なくとも１７、１８、１９、２０または２１ヌクレオチドの断片を含む標的遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的であるヌクレオチド配列を有する。ここで、２本鎖ＲＮＡは線虫によって摂取され、それによって成長を制御するか、または横行を阻止する。本発明の配列のうちの１つの少なくとも１７ｂｐの断片を含む線虫オーソログ遺伝子または配列の非限定的リストは、表５に示される。
【００８９】
他の実施態様では、本発明は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６または２４８１のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子の真菌オーソログである標的遺伝子を包含する。その例としては、真菌オーソログは配列番号１３６〜１５８、４４７〜４７２、５６５〜５７５、７５２〜７６７、８５５〜８６２、１０２６〜１０４０、１４７５〜１５７１、２００２〜２０３９、２２９９〜２３３８、２４４１〜２４６０のいずれかに示されるヌクレオチド配列、またはそのうちの少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７ヌクレオチドの断片を含む。他の態様では、すなわち本発明は細胞または生物上の真菌の成長を制御するか、または真菌感染に感受性を有する細胞または生物の真菌横行を阻止するためのここに記載される方法のいずれも包含する。この方法は真菌を２本鎖ＲＮＡと接触させることを含む。ここで、２本鎖ＲＮＡはアニールされた相補鎖を含み、そのうちの１つは配列番号１３６〜１５８、４４７〜４７２、５６５〜５７５、７５２〜７６７、８５５〜８６２、１０２６〜１０４０、１４７５〜１５７１、２００２〜２０３９、２２９９〜２３３８、２４４１〜２４６０で示される配列のいずれかの少なくとも１７、１８、１９、２０または２１の断片を含む標的遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部と相補的であるヌクレオチド配列を有する。ここで、２本鎖ＲＮＡは真菌によって摂取され、それによって成長を制御するか、または横行を阻止する。真菌オーソログ遺伝子または本発明の配列のうちの１つの少なくとも１７ｂｐの断片を含む配列の非限定的リストは、表６に示される。
【００９０】
「制御配列」との用語は広い文脈で受け取られるべきであり、それが操作可能に結合される配列の発現を実行することができる制御核酸をいう。
核酸の発現を活性化するか、または増強するプロモーターおよび核酸または合成融合分子またはその誘導体、いわゆる活性化剤またはエンハンサーは上記用語に包含される。ここに使用される「操作可能に結合された」との用語は、「プロモーター」配列と目的の核酸との間の機能的結合を呼び、その結果、「プロモーター」配列は核酸分子の転写を開始することができ、適当なｄｓＲＮＡを産生する。
【００９１】
好ましい制御配列はプロモーターであり、構成的または誘導的プロモーターである。好ましいプロモーターは、ＲＮＡ分子の発現の密接した制御を可能とする誘導的プロモーターである。ＩＰＴＧなどの適当な薬品の使用により誘導可能なプロモーターが好ましい。他方、ＲＮＡ分子をコードする導入遺伝子は強い構成的プロモーターの制御下に配置される。好ましくは、使用されるいかなるプロモーターもＲＮＡの強い発現を指示するであろう。使用されるプロモーターの性質は、部分的にＲＮＡを産生するために使用される特定の宿主細胞によって決定される。１つの実施態様では、制御配列はＴ７、Ｔ３、ＳＶ４０またはＳＰ６プロモーターなどのバクテリオファージプロモーター、最も好ましくはＴ７プロモーターを含む。本発明のなおも他の実施態様では、ＲＮＡの発現に有用な他のプロモーターも使用され、ＲＮＡ  ＰｏｌＩまたはＲＮＡ  ＰｏｌIIまたはRNA  ＰｏｌIIIポリメラーゼからのプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。酵母またはウイルス遺伝子から誘導される他のプロモーターもまた適当に使用される。
【００９２】
他の実施態様では、制御配列は周知のｔａｃ、ｔｒｃまたはｌａｃプロモーターから選択されるプロモーターを含む。細菌宿主とともに使用するのに適した誘導性プロモーターとしては、β−ラクタマーゼプロモーター、大腸菌λファージＰＬおよびＰＲプロモーター、および大腸菌ガラクトースプロモーター、アラビノースプロモーターおよびアルカリホスファターゼプロモーターが挙げられる。したがって、本発明は本発明のＲＮＡ分子またはＲＮＡ構築物のいずれかを生成する方法を包含する。この方法は（宿主細胞が標的生物によって経口摂取されるとき、または宿主細胞またはそれから誘導される抽出物が標的生物によって摂取されるとき、）前記核酸または組換え（ＤＮＡ）構築物の転写が目的の標的遺伝子を下方制御することを行うＲＮＡを産生することを可能とする条件下に、本発明の単離された核酸または組換え（ＤＮＡ）構築物を本発明の宿主細胞中へ（例えば、形質転換、形質移入、または注入によって）導入する工程を含む。
【００９３】
所望により、１つまたは複数の転写終結配列または「ターミネーター」もまた、本発明の組換え構築物中に導入される。「転写終結配列」との用語は転写単位の末端の制御配列を包含し、これは一次転写物の３'プロセッシングとポリ−アデニル化および転写物の終結を合図とする。転写終結配列は転写による読み(read)を阻止するのに有用であり、その結果、ＲＮＡ分子が正確に宿主細胞中に、またはそれによって産生される。１つの実施態様では、ターミネーターはＴ７、Ｔ３、ＳＶ４０またはＳＰ６ターミネーター、好ましくはＴ７ターミネーターを含む。酵母またはウイルス遺伝子由来の他のターミネーターもまた、適当に使用される。
【００９４】
転写または翻訳エンハンサーなどのさらなる制御要素は、発現構築物中に導入される。
本発明の組換え構築物はさらに、特定細胞タイプの維持および／または複製のために必要である複製のオリジンを含む。１つの例は、発現構築物が細胞中でエピソームの遺伝的要素（例えば、プラスミドまたはコスミド分子）として細菌細胞中に維持されることを必要とする場合がある。好ましい複製のオリジンとしては、ｆ１−ｏｒｉおよびｃｏｌＥ１  ｏｒｉが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
組換え構築物は所望により、選択可能なマーカー遺伝子を含む。ここで使用する、「選択可能なマーカー遺伝子」との用語は、細胞の同定および／または選択を容易にするために発現される細胞中の表現形を細胞上に与えるいかなる遺伝子をも含む。これは本発明の組換え（発現）構築物でもって形質移入または形質転換される。好適な選択可能なマーカーとしては、アンピシリン（Ａｍｐｒ）、テトラマイシン（Ｔｃｒ）、カナマイシン（Ｋａｎｒ）、ホスフィノスリシンおよびクロラムフェニコール（ＣＡＴ）遺伝子に対する抵抗性遺伝子が挙げられる。他の好適なマーカー遺伝子は代謝特性、例えば、ｍａｎＡを提供する。可視的マーカー遺伝子もまた使用され、例えば、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）が挙げられる。
【００９６】
本発明のなおも他の実施態様では、ｄｓＲＮＡの発現に有用である他のプロモーターとしては、ＲＮＡ  ＰｏｌＩ、ＲＮＡ  ＰｏｌII、ＲＮＡ  ＰｏｌIII、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ由来のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。これらのプロモーターは通常、ｄｓＲＮＡのインビトロ生産に使用され、次いでｄｓＲＮＡは抗殺虫剤、例えば抗殺虫性液体、スプレーまたは粉末に含まれる。
したがって、本発明はまた本発明の２本鎖ＲＮＡまたはＲＮＡ構築物のいずれかを生成する方法を包含する。この方法は下記工程を含む；
単離核酸または組換えＤＮＡ構築物の転写を可能とし、ｄｓＲＮＡまたはＲＮＡ構築物を産生する条件下に、
ａ．本発明の単離核酸または組換えＤＮＡ構築物を無細胞成分に接触させるか、または
ｂ．本発明の単離核酸または組換えＤＮＡ構築物を細胞中に（例えば、形質転換、形質移入または注入して）導入する。
【００９７】
所望により、１つまたは複数の転写終結配列もまた、本発明の組換え構築物中に導入される。「転写終結配列」との用語は、転写単位の末端の制御配列を包含し、これは一次転写物の３'プロセッシングおよびポリアデニル化および転写の終結を合図とする。転写または翻訳エンハンサーなどの他の制御要素は発現構築物中に導入される。
本発明の組換え構築物はさらに特定細胞タイプ中で維持および／または複製に必要である複製のオリジンを含む。１つの例は、発現構築物が細胞中でエピソームの遺伝的要素（例えば、プラスミドまたはコスミド分子）として細菌細胞中に維持されることを必要とする場合がある。好ましい複製のオリジンとしては、ｆ１−ｏｒｉおよびｃｏｌＥ１  ｏｒｉが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
組換え構築物は所望により、選択可能なマーカー遺伝子を含む。ここで使用する、「選択可能なマーカー遺伝子」との用語は、細胞の同定および／または選択を容易にするために発現される表現形を細胞上に与えるいかなる遺伝子をも含む。これは本発明の発現構築物でもって形質移入または形質転換される。好適な選択可能なマーカーの例としては、アンピシリン（Ａｍｐｒ）、テトラマイシン（Ｔｃｒ）、カナマイシン（Ｋａｎｒ）、ホスフィノスリシンおよびクロラムフェニコール（ＣＡＴ）遺伝子に対する抵抗性遺伝子が挙げられる。他の好適なマーカー遺伝子は代謝特性、例えば、ｍａｎＡを提供する。可視的マーカー遺伝子もまた使用され、例えば、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）が挙げられる。
【００９９】
本発明は植物での昆虫の成長を阻止するか、または植物での昆虫の横行を阻止する方法に関する。本発明の方法で処理されるべき植物は、アルファルファ、リンゴ、アプリコット、アーティチョーク、アスパラガス、アボカド、バナナ、オオムギ、マメ、ビート、ブラックベリー、ブルーベリー、ブロッコリ、芽キャベツ(Brussel sprouts)、キャベツ、アブラナ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、穀物、セロリ、チェリー、柑橘類、クレメンタイン、コーヒー、コーン、ワタ、キュウリ、ナス、エンダイブ、ユーカリ、イチジク、ブドウ、グレープフルーツ、落花生、ホウズキ、キウィフルーツ、レタス、ニラ、レモン、ライム、パイン、トウモロコシ、マンゴ、メロン、キビ、キノコ、ナット・オート(nut aot)、オクラ、タマネギ、オレンジ、鑑賞植物または花または木、パパイア、パセリ、エンドウ豆、モモ、ピーナッツ、ピート、コショウ、カキ、パイナップル、オオバコ、プラム、ザクロ、ジャガイモ、カボチャ、ラディッキョ、ダイコン、ナタネ、ラズベリー、コメ、ライムギ、モロコシ、ダイズ(soy)、ダイズ(soybean)、ホウレンソウ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、タンジェリン、茶、タバコ、トマト、ツルクサ、スイカ、コムギ、トロロイモ、およびズッキーニ、好ましくは、ジャガイモ、ナス、トマト、コショウ、タバコ、ホウズキ、コメ、トウモロコシ、またはワタ植物、または種子または塊茎（例えば、アルファルファ、リンゴ、アプリコット、アーティチョーク、アスパラガス、アボカド、バナナ、オオムギ、マメ、ビート、ブラックベリー、ブルーベリー、ブロッコリ、芽キャベツ(Brussel sprouts)、キャベツ、アブラナ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、穀物、セロリ、チェリー、柑橘類、クレメンタイン、コーヒー、コーン、ワタ、キュウリ、ナス、エンダイブ、ユーカリ、イチジク、ブドウ、グレープフルーツ、落花生、ホウズキ、キウィフルーツ、レタス、ニラ、レモン、ライム、パイン、トウモロコシ、マンゴ、メロン、キビ、キノコ、ナット・オート(nut aot)、オクラ、タマネギ、オレンジ、鑑賞植物または花または木、パパイア、パセリ、エンドウ豆、モモ、ピーナッツ、ピート、コショウ、カキ、パイナップル、オオバコ、プラム、ザクロ、ジャガイモ、カボチャ、ラディッキョ、ダイコン、ナタネ、ラズベリー、コメ、ライムギ、モロコシ、ダイズ(soy)、ダイズ(soybean)、ホウレンソウ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、タンジェリン、茶、タバコ、トマト、ツルクサ、スイカ、コムギ、トロロイモ、およびズッキーニからなる群から選択される植物を包含する。
【０１００】
好ましくは経口摂取により標的生物に摂取される標的ＲＮＡの量は、１つまたは複数の標的遺伝子の特定下方制御が達成されるような量である。ＲＮＡは細胞当たり少なくとも１つのコピーの輸送を可能とする量で、宿主細胞によって発現される。しかしながら、ある実施態様では、より多いＲＮＡの用量（標的生物の細胞当たり、例えば、少なくとも５、１０、１００、５００または１０００コピー）がより有効な阻害をもたらす。いかなる所与の標的遺伝子および標的生物でも、有効な阻害のための標的化されたＲＮＡ分子の最適量は日常的な実験によって決定される。
【０１０１】
標的生物は好適な方法でＲＮＡ分子を発現する宿主細胞と接触して、標的生物による摂取を可能とする。好ましくは、ｄｓＲＮＡを発現する宿主細胞は標的生物によるｄｓＲＮＡの摂取を増加させるために標的生物の食品成分中に結合させる。ｄｓＲＮＡを発現する宿主細胞はまた、標的生物が成長する培地、または害虫生物によって侵襲される材料または基質に導入されるか、または害虫生物による侵襲に感受性を有する基質または材料に浸漬される。
【０１０２】
別な実施態様では、ＲＮＡ分子を発現する宿主細胞から誘導される好適な抽出物は、標的生物の標的遺伝子の下方制御を達成するために使用される。ここで、抽出物はＲＮＡ分子を発現する宿主細胞を溶解する好適な手段によって誘導される。例えば、超音波処理、フレンチプレス、凍結−解凍、およびリゾチーム処理などの技術（Sambrook およびRussel-  MolecularCloning: A laboratory manual- ３版 および表１５−４に提供される参考文献参照）が粗宿主細胞抽出物（溶解物）を調製するために使用される。抽出物のさらなる精製は、標的遺伝子発現の標的化された下方制御を仲介する抽出物の能力は不利な影響を与えないとの条件で、適当に実施される。例えば、アフィニティ精製が使用される。ＲＮＡ分子の分解を阻止するために、抽出物にある種の成分を添加することも好適である。例えば、ＲＮａｓｅ阻害剤はＲＮＡを発現する宿主細胞由来の抽出物に添加される。１つの例では、標的生物は純粋または実質的に純粋な形態で、例えば細胞抽出物を含む水溶液とＲＮＡを発現する宿主細胞と接触させる。この実施態様では、標的生物、特に昆虫などの害虫生物は、宿主細胞抽出物を含む水溶液に単に「浸漬」させる。別な実施態様では、標的生物に細胞抽出物を含む液体組成物をスプレーして、標的生物はＲＮＡ分子を発現する宿主細胞と接触され得る。
【０１０３】
もしも本発明の方法が特定害虫の成長または横行を特別に制御するために使用されるなら、宿主細胞で発現されるＲＮＡは非害虫生物から得た遺伝子と有意な相同性を共有しないこと、特に非害虫生物の必須遺伝子と有意な相同性を共有しないことが好ましい。すなわち、非害虫生物は通常、害虫による横行に感受性を有する生物であり、したがって、これは本発明の方法による害虫から保護される。それゆえ、例えば、非害虫種は植物または哺乳動物種を含む。好ましくは、哺乳動物種はヒト(Homo sapiens)である。非標的種はまた、横行に対して保護された生物または基質に露呈されるヒト以外の動物を含む。例としては、保護された植物を餌とするトリ、およびネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ニワトリ、ブタ、ヒツジなどの家畜(livestock and domestic animals)が挙げられる。この文脈では、ｄｓＲＮＡは、感受性あるか、または非標的の生物の遺伝子と３０％以下、より好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、およびさらにより好ましくは５％以下の核酸配列同一性を示すことが好ましい。配列同一性のパーセントは標的化ＲＮＡ領域の全長に対して計算されるべきである。もしもゲノム配列データが本発明により保護されるべき生物、または非標的生物において入手可能であるなら、標準的生命情報科学のツールを使用して、標的化されたＲＮＡとの配列同一性をクロスチェックする。１つの実施態様では、ＲＮＡ分子と非害虫生物の遺伝子との間の２１個以上の隣接したヌクレオチドの配列同一性は存在しない。これはこの文脈ではＲＮＡの２１個の隣接したヌクレオチドは非害虫生物のゲノムには生じないことが好ましいことを意味する。他の実施態様では、非害虫（感受性ある）種から得たヌクレオチド配列とＲＮＡの２１個以上の隣接したヌクレオチドとの約１０％以下、または約１２．５％以下の配列同一性が存在する。害虫生物からの必須遺伝子は、本発明の方法でしばしば標的化されるから、特に、非害虫種からのオーソログ遺伝子は特に注目すべきことである。すなわち、１つの実施態様ではＲＮＡ分子は非害虫種からのオーソログ遺伝子の対応するヌクレオチド配列と１２．５％以下の配列相同性を有する。
【０１０４】
さらなる実施態様では、本発明は少なくとも１つの２本鎖ＲＮＡを含み、前記２本鎖ＲＮＡはアニールされた相補鎖を含み、そのうちの１つは昆虫標的遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部と相補的であるヌクレオチド配列を有する、昆虫の成長を制御し、および／または昆虫の横行を阻止または減少させる組成物に関する。本発明はまた、ここに記載されるヌクレオチド配列の少なくとも１つまたは少なくとも１つの組換えＤＮＡ構築物を含む組成物に関する。本発明はまた、ここに記載される少なくとも１つの２本鎖ＲＮＡまたは２本鎖ＲＮＡ構築物を発現するか、またはここに記載される少なくとも１つのヌクレオチド配列または組換えＤＮＡ構築物を発現する少なくとも１つの細菌細胞または酵母細胞を含む組成物に関する。所望により、この組成物はさらに少なくとも１つの好適な担体、賦形剤または希釈剤を含む。標的遺伝子はここに記載されるすべての標的遺伝子である。好ましくは、昆虫標的遺伝子は昆虫の生存、成長、発達または再生に必須である。
【０１０５】
他の態様では、本発明は上記した組成物に関し、昆虫標的遺伝子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４０〜２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５０８〜５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０６６〜１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、２４８１または２４８６のいずれかに示される配列の群から選択される配列、またはこれらの相補鎖に対して少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９８％または９９％同一である配列を含む。
あるいは、前記昆虫標的遺伝子は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４０〜２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５０８〜５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０６６〜１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、２４８１または２４８６のいずれか、またはこれらの相補鎖の少なくとも１７個の隣接したヌクレオチドを含む遺伝子の昆虫オーソログである。
【０１０６】
本発明はさらに少なくとも１つの２本鎖ＲＮＡ、少なくとも１つの２本鎖ＲＮＡ構築物、少なくとも１つのヌクレオチド配列、少なくとも１つの組換えＤＮＡ構築物および／または本発明のｄｓＲＮＡを発現する少なくとも１つの宿主細胞（例えば、細菌または酵母）、または本発明のｄｓＲＮＡをコードするウイルスを含む組成物に関し、所望により、さらに少なくとも１つの好適な担体、賦形剤または希釈剤を含む。
本組成物は昆虫への適用において好適な物理的形態を有する。本組成物は例えば固状形態（粉末、ペレットまたは餌など）、液状形態（スプレーなど）またはゲル形態である。
最も好ましい実施態様では、本組成物は昆虫による摂取に好適な形態である。
本組成物はｄｓＲＮＡを安定化するのに役立つ、および／または本組成物の長期保存中にｄｓＲＮＡの分解を阻止する成分をさらに含む。
本組成物は、なおもさらに、昆虫によるｄｓＲＮＡの摂取を増強または促進する成分を含む。これらは例えば、一般的に細胞中にＲＮＡの摂取を促進する化学薬剤、例えばリポフェクタミンなどを含む。
本組成物は長期保存中に宿主細胞の生存を保持するのに役立つ成分をなおもさらに含む。
【０１０７】
本組成物は昆虫、基質、細胞（例えば植物細胞）または昆虫によって感染された、または昆虫による侵襲を受けやすい生物への用途には、いかなる好適な物理的形態であってもよい。
１つの実施態様では、本組成物はスプレーの形態で提供される。すなわち、ユーザーであるヒトは、この組成物を直接に昆虫または基質にスプレーすることができる。
【０１０８】
すなわち、本発明はここに記載される少なくとも１つの２本鎖ＲＮＡまたは２本鎖ＲＮＡ構築物を発現する、またはここに記載される少なくとも１つのヌクレオチド配列または組換えＤＮＡ構築物を発現する少なくとも１つの細菌または酵母細胞を含む組成物を含むスプレーに関する。より具体的には、本発明は上記規定されるスプレーに関し、ここで前記細菌細胞は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４０〜２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５０８〜５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０６６〜１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、２４８１または２４８６のいずれかに示される配列、または少なくとも１７個の隣接するヌクレオチドのその断片の少なくとも１つを含む。好ましくは、前記スプレーは配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４０〜２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５０８〜５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０６６〜１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、２４８１または２４８６のいずれかに示される配列、または少なくとも１７個の隣接するヌクレオチドのその断片の少なくとも１つを含む。
【０１０９】
本発明はまた、ここに記載される少なくとも１つの組成物を含むか、または少なくとも１つの宿主細胞を含み、さらに少なくとも１つの補助剤および所望により少なくとも１つの界面活性剤を含むスプレーに関する。
【０１１０】
殺虫剤の有効性はスプレー使用の有効性に依存する。補助剤は殺虫剤安定性、溶解性、不適合性、懸濁性、気泡性、浮動、蒸発、揮発、分解、粘着、浸透、表面張力および適用範囲に関与する多くのスプレー使用問題を最小化するか、または排除することができる。補助剤は、湿潤、延展、固着、蒸発低下、揮発低下、緩衝化、乳化、分散、スプレー浮動低下、および気泡低下を含む特定の機能を実施するように設計されている。これらの機能全てを発揮する１つの補助剤はないが、異なった適合性を有する補助剤をしばしば組み合わせて同時に複数の機能を発揮することができる。湿潤剤および展着剤と呼ばれるこれらの化学薬品はまた、物理的にスプレー液滴の表面張力を変える。その機能を適当に発揮する殺虫剤では、スプレー液滴は葉を潤し、葉の上を平らに展開することができなければならない。表面活性剤は殺虫剤の適用範囲を拡大し、それによって化学薬品に対する害虫の暴露を大きくする。界面活性剤は蝋状または毛深い葉の殺虫剤を適用する場合、特に重要である。適当な湿潤剤または展着剤がないと、スプレー液滴はしばしば放出するか、または十分にこれらの表面上を覆うことができない。しかしながら、界面活性剤は多過ぎると、過剰の放出または沈着の損失を生じて、したがって殺虫剤効果を低下する。殺虫剤製剤はしばしば殺虫剤の活性成分の懸濁を改善するために界面活性剤を含む。これは特に乳剤（ＥＣ）製剤として知られている。
【０１１１】
ここで使用される「補助剤」との用語は、スプレータンク中の製品の混合および安定性、ならびに使用を改善するために、殺虫剤製品または殺虫剤スプレー混合物に添加される非殺虫剤材料を意味する。ここでさらに使用される「表面活性剤」との用語は、表面張力を変更する化学薬品を意味する。表面活性剤は液体の湿潤および展着に影響を与えることができ、水中の殺虫剤の分散、懸濁または沈殿を変更することができる。非イオン性界面活性剤（無電荷）、陰イオン性界面活性剤（陰電荷）、および陽イオン性界面活性剤（陽電荷）が存在する。
【０１１２】
特定の実施態様では、スプレーに含まれる宿主細胞は、例えば熱不活性化または機械的破壊によって不活性化される（ここに詳細に説明されるように）。
賦形剤の性質および本組成物の物理的形態は、処理することが望まれる基質の性質に依存して変化する。例えば、本組成物は処理されるべき材料または基質上にブラシかけされるか、またはスプレーされるか、またはその中に刷り込まれる液体であるか、または処理されるべき材料または基質に適用される塗布剤または粉末である。すなわち、１つの実施態様では本組成物は接着する好適な表面上での塗布剤の形態であり、そして、塗布剤と接触した昆虫によって究極的に摂取される。
【０１１３】
好ましい実施態様では、基質は昆虫害虫の横行に対して処理されるべき植物または穀物である。次いで、本組成物は昆虫によって吸収されるか、または食べられ、そこからＲＮＡ干渉を仲介し、このようにして昆虫を制御する。スプレーは好ましくは加圧式／エアロゾル式スプレーまたはポンプスプレーである。微粒子は処理されるべき基質、または昆虫、例えば昆虫および／またはクモ類の外骨格に接着し、それから吸収されるような適当な大きさを有する。
【０１１４】
１つの実施態様では、本組成物は餌の形態である。餌は昆虫が本組成物に接触するようにおびき出すように設計される。次いで、これに接触するに当たり、本組成物は昆虫によって例えば摂取により内部移行され、そしてＲＮＡｉを仲介して昆虫を死滅させる。前記餌はタンパク系食品、例えば魚肉などの食品物質を含む。ホウ酸もまた餌として使用される。餌は標的とする種に依存する。誘引物質も使用される。誘引物質は例えば男性または女性フェロモンなどのフェロモンである。例として、「昆虫フェロモンおよび害虫管理におけるその使用」(Howseら、Chapman andHall, 1998)との本に記載されるフェロモンが本発明で使用される。誘引物質は昆虫を餌までおびき出すように作用し、特定の昆虫を標的とするか、または全範囲の昆虫を誘引する。餌は固体、ペースト、ペレットまたは粉末状など、いなかる好適な形態であってもよい。
【０１１５】
餌はまた昆虫によってコロニーまで運び去られる。次いで餌はコロニーの他のメンバーの食品源となり、多数の昆虫、そして潜在的に昆虫害虫コロニーの全ての有効な制御をもたらす。これは、２本鎖ＲＮＡの使用および本発明のｄｓＲＮＡを発現する細菌に関与する利点である。なぜなら、害虫へのＲＮＡｉ仲介効果の遅れた作用は、餌がコロニーまで運び去られ、昆虫への暴露において最大のインパクトを与えることができるからである。
さらに、昆虫に接触する組成物は昆虫の角質に残存する。洗浄時、個々の昆虫自体の洗浄または昆虫の互いの洗浄のいずれも、本組成物は摂取され、昆虫にその効果を仲介する。これは本組成物が十分に安定であり、その結果、ｄｓＲＮＡまたはＲＮＡを発現する宿主細胞はそのままであり、そしてある長さの時間、例えば、ある日数期間、外部環境条件に露呈されても、ＲＮＡｉを仲介することができる。
【０１１６】
餌は好適な「収容ケース」または「罠」に準備される。このような収容ケースまたは罠は市販のものであり、既存の罠は本発明の組成物を含むように改造される。昆虫が入るように誘引する収容ケースまたは罠は、本発明の範囲内に含まれる。収容ケースまたは罠は例えば、箱形であり、前もって形成された状態で用意されるか、あるいは例えば、折りたたまれたカードボードの形態であってもよい。収容ケースまたは罠の好適な材料は、プラスチックおよびカードボード、特に波形のカードボードを含む。このような収容ケースまたは罠の好適な大きさは、例えば幅７〜１５ｃｍ、長さ１５〜２０ｃｍおよび高さ１〜５ｃｍである。罠の内表面は、罠の内側で昆虫の動きを制限するために、粘着物質で裏打ちされている。収容ケースまたは罠は餌を所定位置に保持する好適な凹型内側を含む。罠は昆虫が入った直後に容易に罠から出ることができないから、収容ケースと区別される。一方、収容ケースは餌を採り、捕獲者から安全を感じる好ましい環境を昆虫およびクモ類に提供する「給餌ステーション」として作用する。
したがって、さらなる態様では、本発明は本発明の組成物を含む昆虫のための収容ケースまたは罠を提供する。これはここに記載される組成物の態様の全てを含む。
【０１１７】
本発明の「組成物」は１つの容器に２本鎖ＲＮＡを、そして別の容器に好適な希釈剤、賦形剤、またはＲＮＡ含有成分（ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ構築物、ＤＮＡ構築物、発現構築物など）のための担体を、または、１つの容器に宿主細胞を、別な容器に好適な希釈剤、賦形剤、宿主細胞のための担体または保存剤を含む「部品のキット（kit-of-parts）」として提供されると理解される。本発明はまた、さらなる成分を含まない２本鎖ＲＮＡまたは宿主細胞のみを供給することに関する。これらの実施態様では、ｄｓＲＮＡまたは宿主細胞が濃縮された水溶液などの濃縮形態で供給される。これは等しく凍結形態または凍結乾燥(free-dried or lyophilized)形態で供給される。後者は長期間保存においてより安定であり、脱凍結され、および／または使用直前に好適な希釈剤で再構成される。
【０１１８】
本発明はさらに、害虫生物の生長を制御する、および／または害虫生物による感受性ある生物への横行を基質上で阻止する方法を包含する。この方法は前記基質に本組成物、および／またはここに記載されるスプレーのいずれかの有効量を適用することを含む。
本発明はさらに、標的生物が生じる疾患または症状を処理および／または阻止する方法を包含し、この方法はこのような処理および／または阻止を必要とする対象に、ここに記載される組成物またはスプレーを投与することを含み、その際、組成物またはスプレーが生じる標的生物の標的遺伝子の発現の下方制御は、標的生物によって生じる疾患を処理および／または阻止するのに有効である。好ましい標的生物は害虫、特にここにより詳細に説明する昆虫である。
【０１１９】
本発明はさらに、ここに記載される２本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡ構築物、ヌクレオチド配列、組換えＤＮＡ構築物または組成物のいずれかの医療用途に関する。
昆虫および他の節足動物は、その咬傷または虫刺されによって損傷および死すらも生じ得る。毎年、米国では多くの人々が蛇による咬傷よりも蜂およびスズメバチの針で亡くなっている。多くの昆虫は細菌および疾患を生じる他の病原体を伝達する。国の間での大きな戦争のたびに、より多くの人々が銃弾や爆弾によって損傷を受けるか、または死亡するよりも、昆虫が伝達する疾患によって損傷を受けるか、または死亡している。ヒトおよび家畜に咬みつく昆虫は、半翅目またはある双翅目に見られるように、ほとんど刺す−吸う口器を有するものである。咬傷からの多くの不快さは、昆虫が被害者中に注ぎ込んだ酵素の効果である。マダニとツツガムシは動物の血液を吸収するダニの異なった種類（クモ網目）である。マダニはまた、ライム病およびロッキー山紅斑熱を含む疾患を生じるウイルスおよび他の病原体を伝達することができる。他の種類のダニはヒト、イヌ、ネコおよび他の動物の疥癬を生じることができる。カメムシ目(Order Hemiptera)は、ナンキンムシ(bedbugs)、サシガメ(kissingbugs)、および吸血昆虫(assassin bugs)を含み、その全てはその宿主を刺す嘴を有する。全ての昆虫の中で、最も痛い咬傷は吸血昆虫によるものである。サシガメは中央および南アメリカのシャーガス病を生じることに関与している。ある蛾の毛虫は「針で刺す」ことができる。双翅目は昆虫のうち人々に影響を与える最も重要な目である。咬合するハエは、蚊、ブユ(Black flies)、ヌカカ(bitinggnats)、アブ(horseflies)、およびその他の多くの種を含む。これらのアブ(biting flies)の多くはアフリカ睡眠病を伝達するツェツェバエなどの疾患伝達者である。イエバエなどのスポンジ状口器を有するハエもまた、腸チフス熱および他の疾患を生じる細菌および他の病原体を伝達する。双方のハエのラセンウジバエ(screwworm)およびウジ(maggot)は、動物の生組織に侵入するハエの幼虫である。蚊はマラリア、黄熱病、脳炎、および他の疾患を生じる病原体を伝達する。マラリアはハマダラカ(Anopheles mosquitoes)の生活環の一部およびヒトの生活環の一部で生存する原生動物の寄生虫によって生じる。腺ペストまたは黒死病として知られる溶菌班はラットおよび他のげっ歯類に横行する細菌によって生じる。この疾患のヒトへの主な伝達体は東洋ネズミノミ(Oriental rat flea) (隠翅目(Order Siphonaptera))である。多くの蜂、スズメバチおよび蟻（膜翅目(Order Hymenoptera)）は刺すことによって痛み、さらには死すら引き起こす。死は通常、毒液に対するアレルギー反応の結果である。他の主要な毒針はスズメバチ(hornets)、キイロスズメバチ（yellowjackets)、およびアシナガバチ(paper wasp)を含む。アフリカ化ミツバチ、または「キラー」ビーは我々が順化したミツバチの１種である。２つの種はほとんど同じ容姿である。しかしながら、アフリカ化ミツバチはより攻撃的であり、多数でもって攻撃する。
【０１２０】
１つの特定の実施態様では、本組成物はヒトまたは動物の昆虫の疾患または横行をそれぞれ処理または阻止するための医薬または獣医学の組成物である。このような組成物は少なくとも１つの２本鎖ＲＮＡまたはＲＮＡ構築物、または２本鎖ＲＮＡまたはＲＮＡ構築物をコードするヌクレオチド配列または組換えＤＮＡ構築物を含み、その際、２本鎖ＲＮＡはアニールされた相補鎖を含み、そのうちの１本は疾患または感染を生じる昆虫標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列、および少なくとも１つの医薬用途に適した担体、賦形剤または希釈剤を有する。
【０１２１】
本組成物は例えば、点滴薬、ゲル、エアロゾルのように皮膚へ適用される液体組成物として、または局所投与用のはけ塗り、スプレー、クリーム、軟膏などにより、または経皮パッチとして、動物またはヒトの皮膚への適用など局所的用途に適している組成物である。
他方、昆虫ｄｓＲＮＡは食品に含まれ、そして昆虫横行に対する経口ワクチンとして機能する、細菌（例えば、ラクトバチルス(lactobacillus)）または真菌（例えば、サッカロマイセス属(Saccharomyces spp.)によって産生される。
【０１２２】
錠剤、カプセル、膣坐薬、経皮パッチ、坐薬などを含む、他の従来の医薬服用形態もまた生産される。選択された形態は、標的昆虫の性質および処理されることが望まれる疾患の性質に依存するであろう。
１つの特定実施態様では、本組成物は昆虫および／またはクモ網による横行から前記基質を保護するために、基質に適用され得る塗布剤、ペーストまたは粉末である。この実施態様では、本組成物は昆虫による横行または損害に感受性を有する基質または物質、例えば食品および他の腐敗しやすい物質、および木材などの基質を保護するために使用され得る。家屋および他の木材製品はシロアリ、ヒラタキクイムシ(powder post beetles)およびクマアリ(carpenter ants)によって破壊され得る。サブテラニアン・ターマイト(subterraneantermites)および台湾シロアリ(Formosan termites)はアメリカ南部および熱帯領域で家屋の最も深刻な害虫である。いかなる収穫された植物または動物製品も昆虫によって攻撃され得る。フラウア・ビートル(flour beetle)、グラナリヤコクゾウ(grainweevils)、カシノシマメイガ(mealmoths)および他の貯蔵産物害虫は、貯蔵された種子、穀物、ペットフード、粉末化チョコレートおよび保護されていないキッチン食料品室の他のほとんど全てものを餌にする。衣類の蛾の幼虫は柔毛、絹および羊毛などの動物製品から作られた衣類を食べる。カーペット甲虫(carpetbeetle)の幼虫は、毛皮、柔毛、綿、貯蔵種子を含む動物および植物の両製品、および博物館の標本すら食べる。ヒラタチャタテ(booklice)および紙魚(silverfish)は図書館の害虫である。これらの昆虫は製本のデンプン糊を食べる。家屋に侵入する他の昆虫は、ほとんど何でも食べるゴキブリを含む。ゴキブリは特定の疾患の伝達体であると知られていないが、これらは食品を汚染し、好ましくない匂いを発する。これらは非常に迷惑であり、多くの害虫制御企業はこれらを制御する試みに歩みを止めない。家屋、食料品店およびレストランで最も一般的なゴキブリは、チャバネゴキブリ(German cockroach)、ワモンゴキブリ(American cockroach)、トウヨウゴキブリ(Oriental cockroach)および茶帯ゴキブリ(brown-banded cockroach)を含む。
【０１２３】
賦形剤の性質および本組成物の物理的形態は、処理することが望まれる基質の性質に依存して変化する。例えば、本組成物が処理される材料または基質上にブラシかけまたはスプレーされるか、またはその中に刷り込まれる液体であるか、または処理される材料または基質に適用される塗布剤である。
【０１２４】
本発明はさらに、前記基質にここに記載される組成物またはスプレーのいずれかの有効量を適用することを含む、昆虫の横行を基質上で処理および／または阻止する方法を包含する。
本発明はさらに、このような処理および／または阻止を必要とする対象に投与することを含む、昆虫の疾患または症状を処理および／または阻止する方法を包含する。ここに記載される組成物またはスプレーはアニールされた相補鎖を含む少なくとも１つの２本鎖ＲＮＡまたは２本鎖ＲＮＡ構築物を含み、そのうちの１つは昆虫の疾患または症状を生じる昆虫の昆虫標的遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部と相補的であるヌクレオチド配列を有する。より具体的な実施態様では、投与される前記組成物またはスプレーは、ここに記載される少なくとも１つの２本鎖ＲＮＡまたは２本鎖ＲＮＡ構築物を発現する少なくとも１つの細菌細胞または酵母細胞を含み、および／または発現するか、またはここに記載される少なくとも１つのヌクレオチド配列または組換えＤＮＡ構築物を含み、および／または発現し、前記ＲＮＡまたはヌクレオチド配列は昆虫の疾患または症状を生じる昆虫の昆虫標的遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的である。
【０１２５】
本発明の他の実施態様では、本組成物は植物のための殺虫剤、または種子などの植物の増殖または再生材料のための殺虫剤として使用される。例としては、本組成物は植物組織上にスプレーまたは適用するか、小植物の出芽の前後に土壌上にスプレーするか、または混合する。
なおも他の実施態様では、本発明は植物または植物の増殖または再生材料の昆虫の成長および／または昆虫の横行を処置および／または阻止する方法を提供する。この方法は本組成物またはここに記載される組成物またはスプレーの有効量を植物または植物の増殖または再生材料に適用することを含む。
【０１２６】
他の実施態様では、本発明は２本鎖ＲＮＡまたはＲＮＡ構築物、または２本鎖ＲＮＡまたはＲＮＡ構築物をコードするヌクレオチド配列または組換えＤＮＡ構築物、または本発明のｄｓＲＮＡ、またはここに記載されるｄｓＲＮＡをコードするウイルスを発現する少なくとも１つの宿主細胞（例えば、細菌または酵母）、または上記のものを含み、昆虫の成長を制御するために使用される本組成物またはスプレーの全て、昆虫横行に感受性を有する植物の昆虫横行を阻止するか、または植物の昆虫横行を処理するための使用に関する。特定の昆虫種によって生じる昆虫感染のために処理されるべき特定の植物は、先に記載され、かつ、前記用途に包含される。
【０１２７】
より具体的な実施態様では、本発明は少なくとも１つの宿主細胞または本発明のｄｓＲＮＡを発現する少なくとも１つの宿主細胞（例えば、細菌または酵母）、またはここに記載されるｄｓＲＮＡをコードするウイルスを含むスプレーの使用、または昆虫の成長を制御するため、昆虫横行の感受性を有する植物の昆虫横行を阻止するため、または植物の昆虫感染を処置するための上記のものを含む組成物のいずれかに関する。好ましくは、前記宿主細胞は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、４９〜１５８、１５９、１６０〜１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１５、２２０、２２５、２３０、２４０〜２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２７５〜４７２、４７３、４７８、４８３、４８８、４９３、４９８、５０３、５０８〜５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５３３〜５７５、５７６、５８１、５８６、５９１、５９６、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６２１〜７６７、７６８、７７３、７７８、７８３、７８８、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８１３〜８６２、８６３、８６８、８７３、８７８、８８３、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、９０８〜１０４０、１０４１、１０４６、１０５１、１０５６、１０６１、１０６６〜１０７１、１０７３、１０７５、１０７７、１０７９、１０８１、１０８３、１０８５、１０８７、１０８９、１０９１、１０９３、１０９５、１０９７、１０９９、１１０１、１１０３、１１０５、１１０７、１１０９、１１１１、１１１３、１１６１〜１５７１、１５７２、１５７７、１５８２、１５８７、１５９２、１５９７、１６０２、１６０７、１６１２、１６１７、１６２２、１６２７、１６３２、１６３７、１６４２、１６４７、１６５２、１６５７、１６６２、１６６７、１６７２、１６７７、１６８２、１６８４、１６８６、１６８８、１６９０、１６９２、１６９４、１６９６、１６９８、１７００、１７０２、１７０４、１７３０〜２０３９、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０２、２１０４、２１０６、２１０８、２１２０〜２３３８、２３３９、２３４４、２３４９、２３５４、２３５９、２３６４、２３６６、２３６８、２３７０、２３７２、２３８４〜２４６０、２４６１、２４６６、２４７１、２４７６、２４８１または２４８６のいずれかに示される配列、または少なくとも１７個の隣接するヌクレオチドのその断片を含む。
【０１２８】
さらなる態様では、本発明はまた、害虫の横行を阻止し、植物を保護するための方法と組成物の組み合わせを提供する。例えば、１つの手段は２本鎖ＲＮＡ分子と標的害虫に対して毒性を有する１つまたは複数のＢｔ殺虫性タンパクまたは化学（有機）薬品を有する組成物を使用する方法を提供する。他の手段は細菌または酵母で２本鎖ＲＮＡ分子の発現と同じ酵母または細菌または異なった細菌または酵母でのこのようなＢｔ殺虫性タンパクの発現を組み合わせたを遺伝子組換えアプローチを提供する。これらのアプローチでは、例えば１つの昆虫がＲＮＡｉに基づく方法または技術を使用して標的化されるか、または死滅され、他の昆虫はＢｔ殺虫剤または化学（有機）系殺虫剤を使用して標的化されるか、または死滅する。
【０１２９】
したがって、本発明はまた、ここに記載される植物を処理するための組成物、スプレーまたは方法のいずれかに関する。ここで、前記組成物は前記ＲＮＡ分子を発現する細菌細胞または酵母を含み、さらに、殺虫剤（細菌または酵母細胞は前記したものと同じかまたは異なる）を含むか、または発現する細菌細胞または酵母を含み、前記殺虫剤は、化学（有機）殺虫剤、パタチン、バチルス・チューリンジェンシス(Bacillus thruringiensis)殺虫性タンパク、キセノラブドゥス(Xenorhabdus)殺虫性タンパク、フォトラブダス(Photorhabdus)殺虫性タンパク、バチルス・ラテロスポラウス(Bacillus laterosporous)殺虫性タンパク、およびバチルス・スフェアリカス(Bacillus sphearicus)殺虫性タンパクからなる群から選択される。好ましくは、前記バチルス・チューリンジェンシス(Bacillus thruringiensis)殺虫性タンパクはＣｒｙ１、Ｃｒｙ３、ＴＩＣ８５１、ＣｒｙＥＴ１７０、Ｃｒｙ２２、二成分殺虫性タンパクＣｒｙＥＴ３３およびＣｒｙＥＴ３４、二成分殺虫性タンパクＣｒｙＥｔ８０およびＣｒｙＥＴ７６、二成分殺虫性タンパクＴＩＣ１００およびＴＩＣ１０１、および二成分殺虫性タンパクＰＳ１４９Ｂ１からなる群から選択される。
【０１３０】
スプレーは温室または畑で使用され得る。細菌含有バイオ農薬（例えば、乳化可能な懸濁液として）の通常の適用割合は、約２５％（ｖ／ｖ）の「細菌細胞」プラス７５％（ｖ／ｖ）の「他の成分」を含む調製品であって、ヘクタール当たり調製品（乳化可能な懸濁液）約２．５〜５リットルを含み、水系スプレーで２５〜１００リットル／ｈａ（１０〜４０リットル／エーカー）に達する。細菌細胞の量は単位で測定され、例えば１単位は１ｍｌ中、１０９細菌細胞として規定される。ヘクタール当たりの穀物密度および植物当たりの葉表面に依存して、１リットルの調製品は細菌０．００１〜１００００単位、好ましくは細菌少なくとも０．００１、０．００３、０．００５、０．００７、０．０１、０．０３、０．０５、０．０７、０．１、０．３、０．５、０．７、より好ましくは１、３、５、７、１０、３０、５０、７０、１００、３００、５００、７００、またはより好ましくは少なくとも１０００、３０００、５０００、７０００または１００００単位を含む。
【０１３１】
例えば、ジャガイモ作物植物の通常の植栽密度は、平方メートル当たり約４．５の植物であるか、またはヘクタール当たり４５，０００の植物である（列間の空間、７５ｃｍ、および列内の植物間の空間、３０ｃｍをもつ列に植栽する）。すなわち、本発明は少なくとも１つのここに記載されるｄｓＲＮＡ分子またはｄｓＲＮＡ構築物を発現する細菌の少なくとも０．００１、０．００３、０．００５、０．００７、０．０１、０．０３、０．０５、０．０７、０．１、０．３、０．５、０．７、より好ましくは少なくとも１、３、５、７、１０、３０、５０、７０、１００、３００、５００、７００、またはより好ましくは少なくとも１０００、３０００、５０００、７０００または１００００単位を含むスプレーに関する。
【０１３２】
さらに、本発明は植物の昆虫横行を処理するための先に記載された少なくとも１つの２本鎖ＲＮＡ、または２本鎖ＲＮＡ構築物、またはヌクレオチド配列、または組換えＤＮＡ構築物、または宿主細胞、または組成物またはスプレーを含むキットに関する。キットは適当な使用説明書を含む。使用説明書は適当な包装材上に印刷され、それには、他の成分が供給されるか、または別個のもの、例えば、シートまたはリーフレットの形態として提供される。使用説明書は貯蔵状態では例えば巻かれるか、または折りたたまれ、次いでキットの残りの成分の使用を指示するために広げられ、そして開かれる。
さらに、本発明は以下の非限定的実施例を参照して理解されるであろう。
【実施例】
【０１３３】
実施例１：ハイスループットスクリーニングにおけるＣ．エレガンス（C.elegans）のＣ．エレガンス標的遺伝子サイレンシング
Ａ  Ｃ．エレガンスのゲノムワイドライブラリを、２つの同一のＴ７プロモーターとターミネーターとの間で、ｐＧＮ９Ａベクター（ＷＯ０１／８８１２１）において調製した。それは、ＩＰＴＧにより誘導されたＴ７ポリメラーゼの発現時に、センスおよびアンチセンス方向でのその発現を駆動する。
【０１３４】
このライブラリは、９６穴プレート形式にて、ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）細菌株に形質転換された。ゲノムワイドスクリーニングのために、これらの細菌細胞をヌクレアーゼ欠損Ｃ．エレガンスｎｕｃ−１（ｅ１３９２）株に餌として与えた。
【０１３５】
ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）細菌株において生成されたｄｓＲＮＡをＣ．エレガンスｎｕｃ−１（ｅ１３９２）線虫へ餌として与えることは、以下のように９６穴プレートにて行った：ｎｕｃ−１の卵を別個のプレートに移し、Ｌ１世代の同期化のために２０℃で同時に孵化させた。ＩＰＴＧを含む液体成長培地１００μＬと、ｄｓＲＮＡ発現のためのＣ．エレガンスゲノムフラグメントを持つベクターの各々を有するＣ．エレガンスｄｓＲＮＡライブラリのＯＤ６００１  ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）の細菌細胞培養物１０μＬとで、９６穴プレートを満たした。各ウェルに、４つの同期化Ｌ１線虫を添加し、２５．０℃で少なくとも４〜５日間インキュベートした。これらの実験を４回行なった。スクリーニングでは、６つの対照を用いた：
−ｐＧＮ２９＝陰性対照、野生型
−ｐＧＺ１＝ｕｎｃ−２２＝トゥイッチャー（ｔｗｉｔｃｈｅｒ）表現型
−ｐＧＺ１８＝キチン合成酵素＝胚致死
−ｐＧＺ２５＝ｐｏｓ−１＝胚致死
−ｐＧＺ５９  ＝ｂｌｉ−４Ｄ＝急性致死
−ＡＣＣ＝アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ＝急性致死
【０１３６】
５日後、ｄｓＲＮＡを生成する細菌を与えたＣ．エレガンスｎｕｃ−１（ｅ１３９２）線虫の表現型を、空ベクター（ｐＧＮ２９）および他の対照を与えた線虫の表現型と比較した。ｄｓＲＮＡを与えた線虫を、親（Ｐｏ）世代の致死性（急性もしくは幼虫）、第１（Ｆ１）世代の（胚）致死性、またはＰｏの成長遅延について、以下のようにスクリーニングした：（ｉ）Ｐｏの急性致死性：Ｌ１のものは成長せずに死亡し、この表現型は子孫を残すことなく、ウェルは完全に空にみえる；（ｉｉ）（幼虫）Ｐｏの致死性：ＰｏはＬ１より遅い段階で死亡し、この表現型も子孫を残さない。死亡した幼虫または死亡した線虫がウェル内に見られた；（ｉｉｉ）Ｆ１の致死性：Ｌ１のものは成虫段階まで発生し、生存したままである。この表現型は子孫を持たない。これは不妊、胚致死（ウェルの底に死亡した卵）、胚停止または幼虫停止（最終的に、致死することで終わる）による可能性がある：（ｉｖ）成長の停止および成長の遅延／遅れ：通常の発生および通常の子孫の数をもつウェルと比較して。
【０１３７】
表１Ａに提示した標的配列について、結論としては、Ｃ．エレガンスのような線虫におけるＣ．エレガンス標的遺伝子のｄｓＲＮＡ媒介サイレンシングは、線虫の成長および生存に致命的な影響を持っていた。
【０１３８】
上記ｄｓＲＮＡサイレンシング実験に続いて、より詳細な表現型実験を、２４穴プレートでハイスループット形式にて、Ｃ．エレガンスにおいて行った。上記のような細菌株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）において作製されたｄｓＲＮＡライブラリを、以下のとおり２４穴プレートにてＣ．エレガンスｎｕｃ−１（ｅ１３９２）線虫に餌として与えた：ｎｕｃ−１の卵を別個のプレートに移し、Ｌ１世代の同期化のために２０℃で同時に孵化させた。続いて、１００の同期化Ｌ１線虫を、５μｇ／ｍＬコレステロール、４μＬ／ｍＬ  ＰＥＧおよび１ｍＭ  ＩＰＴＧを含むＳ完全餌培地５００μＬと、ｄｓＲＮＡ発現のためのＣ．エレガンスゲノムフラグメントを持つベクターの各々を有するＣ．エレガンスｄｓＲＮＡライブラリのＯＤ６００１  ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）の細菌細胞培養液５００μＬとの混合物中に浸した。浸したＬ１線虫を、２時間、２５℃で回転させておいた。
【０１３９】
遠心分離後、上清９５０μＬを除去し、残余の５μＬと再懸濁した沈殿物（約１０〜１５の線虫を含む）を、２４穴プレートの各ウェルの中央に移し、寒天ＬＢブロスの層で満たした。接種したプレートを、２５℃で２日間インキュベートした。成虫段階で、１の成線虫を選抜し、２５℃で２日間、子孫の検査のためにインキュベートした。他の成線虫は、元の２４穴プレートでｉｎ  ｓｉｔｕで検査された。これらの実験は、４回行った。
【０１４０】
この詳細な表現型のスクリーニングを、線虫の第２の群で繰り返したが、唯一異なることは、第２群の線虫を２０℃で３日間インキュベートしたことである。
Ｃ．エレガンスｄｓＲＮＡを与えた線虫の表現型を、空ベクターを与えたＣ．エレガンスｎｕｃ−１（ｅ１３９２）線虫の表現型と比較した。
【０１４１】
この実験に基づくと、結論は、表１Ａに提示したようなＣ．エレガンス標的遺伝子サイレンシングが、線虫の成長および生存率に致命的な影響を有していたということ、および、標的遺伝子が線虫の生存に必須であるということであった。したがって、これらの遺伝子は、ｄｓＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングを介した線虫を制御する（殺す、もしくは成長を阻害する）ための好適な標的遺伝子である。したがって、本発明は、植物の線虫侵入のような線虫侵入を制御するための上記Ｃ．エレガンス標的遺伝子の線虫オルソログの使用を包含する。
【０１４２】
実施例２：Ｄ．メラノガスター（D.melanogaster）オルソログの同定
実施例１にて上述したとおり、多数のＣ．エレガンス致死性配列が同定され、他の種および属においてオルソログを同定するために用いられ得る。例えば、Ｃ．エレガンスの致死性配列は、Ｄ．メラノガスターオルソログ配列を同定するために用いられ得る。つまり、各々のＣ．エレガンス配列は、Ｄ．メラノガスターにおけるオルソログ配列について、ＧｅｎＢａｎｋのような公的データベース対して探し出され得る。高い配列相同性を有する（Ｅ値は好ましくは、１Ｅ−３０より小さいか等しい）潜在的なＤ．メラノガスターオルソログが選択され、配列はｂｌａｓｔ  ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｂｅｓｔ  ｈｉｔｓであり、後者は異なる生物由来の配列（例えばＣ．エレガンスとＤ．メラノガスター）がお互いのトップブラストヒットであることを意味する。例えば、Ｃ．エレガンス由来の配列Ｃが、ＢＬＡＳＴを用いてＤ．メラノガスターにおける配列と比較される。もし配列ＣがＤ．メラノガスターの配列Ｄをベストヒットとしてもち、そして、ＤがＣ．エレガンスの全ての配列と比較されると、結局のところ配列Ｃに到達し、そしてＤとＣがｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｂｅｓｔ  ｈｉｔｓである。この基準はしばしばオルソロジーを定義するの使われ、異なる種の同様の配列を意味し、同様の機能を有するものである。Ｄ．メラノガスター配列の識別子(identifier)は、表１Ａに提示されている。
【０１４３】
実施例３：レプチノタルサ・デセムリネアータ（Leptinotarsa decemlineata）（コロラドハムシ）
Ａ．レプチノタルサ・デセムリネアータの部分遺伝子配列のクローニング
高品質の無傷ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｃａｔ．Ｎｒ．１５５９６−０２６／１５５９６−０１８，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を用いて、製造者の指示に従って、レプチノタルサ・デセムリネアータ（コロラドハムシ；入手元：Ｊｅｒｏｅｎ  ｖａｎ  Ｓｃｈａｉｋ，Ｅｎｔｏｃａｒｅ  ＣＶＢｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅ  Ｇｅｗａｓｂｅｓｃｈｅｒｍｉｎｇ，Ｐｏｓｔｂｕｓ  １６２，６７００  ＡＤ  Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の４つの異なる幼虫段階から単離した。ＲＮＡ調製物に存在するゲノムＤＮＡは、製造者の指示（Ｃａｔ．Ｎｒ．１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってＤＮａｓｅ処理により除去した。ｃＤＮＡは市販のキット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃａｔ．Ｎｒ．１８０８００４４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を用いて、製造者の指示に従って生成した。
【０１４４】
ＬＤ００１、ＬＤ００２、ＬＤ００３、ＬＤ００６、ＬＤ００７、ＬＤ０１０、ＬＤ０１１、ＬＤ０１４、ＬＤ０１５、ＬＤ０１６、ＬＣ０１８およびＬＤ０２７遺伝子の一部を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、変性プライマーを用いて一連のＰＣＲ反応を、Ａｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ｃａｔ．Ｎｒ．Ｎ８０８０２４０，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、製造者の指示に従って行った。
【０１４５】
遺伝子の各々の増幅に用いた変性プライマーの配列は、表２−ＬＤに示されており、プライマー配列と得られたｃＤＮＡ配列を含むレプチノタルサ・デセムリネアータ標的遺伝子を示す。これらのプライマーは、以下の条件のそれぞれのＰＣＲ反応にて用いた：９５℃で１０分、その後９５℃で３０秒、５５℃で１分、および７２℃で１分を４０サイクル、その後７２℃で１０分。生じたＰＣＲフラグメントを、アガロースゲルで解析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ８／ＧＷ／ｔｏｐｏベクター（Ｃａｔ．Ｎｒ．Ｋ２５００  ２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、配列決定した。生じたＰＣＲ生成物の配列は、表２−ＬＤに示したそれぞれの配列番号により示され、部分配列として示されている。対応する部分アミノ酸配列が、表３−ＬＤに示したそれぞれの配列番号により示され、読み枠の開始が括弧で示されている。
【０１４６】
Ｂ．レプチノタルサ・デセムリネアータ遺伝子のｄｓＲＮＡ生成
市販のＴ７  Ｒｉｂｏｍａｘ（商標）  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＲＮＡｉ  Ｓｙｓｔｅｍキット（Ｃａｔ．Ｎｒ．Ｐ１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ミリグラム量でｄｓＲＮＡを合成した。まず、２つの別個の単一５'Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター鋳型を、２つの別個のＰＣＲで生成し、各反応物はＴ７プロモーターに対して異なる向きで標的配列を含む。
【０１４７】
標的遺伝子の各々について、センスＴ７鋳型を、特異的Ｔ７フォワード、および特異的リバースプライマーを用いて生成した。標的遺伝子の各々に対するセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８−ＬＤに示す。ＰＣＲ反応の条件は、以下のとおりである：９５℃４分、続いて９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル、続いて７２℃で１０分。アンチセンスＴ７鋳型を、特異的フォワード、および特異的Ｔ７リバースプライマーを用いて、上記と同じ条件のＰＣＲ反応で生成した。標的遺伝子の各々に対するアンチセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列は、表８−ＬＤに示す。生じたＰＣＲ反応物を、アガロースゲルで解析し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８１０６，Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、そして、ＮａＣｌＯ４沈澱を行った。製造者の指示に従って、生成したＴ７フォワードおよびリバース鋳型を、転写させるために混合し、生じたＲＮＡ鎖をアニーリングさせ、ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅで処理し、酢酸ナトリウムで生成した。標的遺伝子の各々について生じたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、表８−ＬＤに示す。表８−ＬＤは、プライマー配列を含むレプチノタルサ・デセムリネアータの標的配列と、コンカテマー配列のｄｓＲＮＡフラグメントを調製するための配列を示す。
【０１４８】
Ｃ．レプチノタルサ・デセムリネアータに対する活性のための人工食餌を用いたｄｓＲＮＡ標的スクリーニング
コロラドハムシ用の人工食餌を以下のように作製した（Ｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｉｎｓ．Ｓｃ，ｖｏｌ．１，ｎｏ．７，１−１０から採用）：水と寒天をオートクレーブし、残りの成分（下記表Ａに示す）を、温度が５５℃まで下がったら添加した。この温度で、食餌を１ウェルごとの食餌１ｍｌの量で２４穴プレート（Ｎｕｎｃ）に食餌を等分する前に、成分をよく混合した。人工食餌を、室温に冷ますことによって凝固させた。食餌は、３週間まで４℃で保存した。
【０１４９】
表Ａ：人工食餌の成分
成分                                        １Ｌに対する容量
水                                          768ml
寒天                                        14g
ひいたコムギ                                40g
トルラ酵母                                  60g
ラクトアルブミンハイドロライセート          30g
カゼイン                                    10g
フルクトース                                20g
Ｗｅｓｓｏｎ塩混合物                        4g
トマト果実粉末                              12.5g
ジャガイモ葉粉末                            25g
ｂ−シトステロール                          1g
ソルビン酸                                  0.8g
メチルパラベン                              0.8g
Ｖａｎｄｅｒｚａｎｔビタミン混合物          12g
ネオマイシン硫酸物                          0.2g
オーロマイシン                              0.130g
リファムピシン                              0.130g
クロラムフェニコール                        0.130g
ニスタチン                                  0.050g
ダイズ油                                    2ml
コムギ胚芽油                                2ml
【０１５０】
濃度１ｍｇ／ｍｌのｄｓＲＮＡ溶液５０μＬを、マルチウェルプレートのウェル上の固体人工食餌上に、局部的に塗布した。食餌を層流室で乾燥させた。処理ごとに、２４のコロラドハムシの幼虫（第２段階）を、１ウェル毎に２昆虫で試験した。プレートを２５±２℃、６０％相対湿度、１６：８時間の明暗光周期の昆虫飼育室で保存した。昆虫を、１、２または３日ごとに生または死について評価した。７日後、標的ＬＤ００６、ＬＤ００７、ＬＤ０１０、ＬＤ０１１、およびＬＤ０１４について、食餌を同じ濃度（１ｍｇ／ｍｌ）で局所的に塗布したｄｓＲＮＡを含む新鮮な食餌に交換した；標的ＬＤ００１、ＬＤ００２、ＬＤ００３、ＬＤ０１５およびＬＤ０１６について、食餌を新鮮な食餌のみのものに交換した。ｄｓＲＮＡ標的を、食餌のみ、もしくは配列（配列番号２３５）をコードするＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）のフラグメントに対応するｄｓＲＮＡを局所的に塗布した食餌と比較した。
【０１５１】
無傷の裸のｄｓＲＮＡを含む人工食餌をＬ．デセムリネアータの幼虫に与えた場合、２つの別個のバイオアッセイにて示されるように（図１ＬＤ−２ＬＤ）幼虫の致死率の有意な増加を生じた。
【０１５２】
試験された全てのｄｓＲＮＡは、７〜１４日後に、１００％の致死率を最終的にはもたらした。ＧＦＰ  ｄｓＲＮＡを有する食餌もしくは有さない食餌は、バイオアッセイ中、非常に小さな致死率もしくは致死率がない状態で昆虫を維持した。
【０１５３】
典型的には、全てのアッセイにみられたように、ＣＰＢ第２段階の幼虫は２日間、ｄｓＲＮＡを有する食餌もしくは有さない食餌を通常与えられ、第３の幼虫段階へと脱皮した。この新しい幼虫段階において、ＣＰＢはそれらの摂食を有意に減らすか、完全に停止するのが観察され、結果として致死率の上昇をもたらした。
【０１５４】
Ｄ．レプチノタルサ・デセムリネアータに対する活性についてのジャガイモ葉円盤状組織を用いたｄｓＲＮＡ標的のパイオアッセイ
代わりのバイオアッセイ法を、ＣＰＢの食糧源として人工食餌ではなくジャガイモ葉材料を用いて行った。直径約１．１ｃｍの円盤状組織（または０．９５ｃｍ２）を２〜３週齢のジャガイモ植物の葉から、好適な大きさの穿孔器を用いて、切り取った。処理された葉の円盤状組織を、１０ｎｇ／μｌ溶液の標的ＬＤ００２  ｄｓＲＮＡまたは対照ｇｆｐ  ｄｓＲＮＡ  ２０μｌを、向軸葉表面に塗布することにより調製した。葉の円盤状組織を乾燥させ、個別に２４穴マルチプレート（Ｎｕｎｃ）の２４ウェルに置いた。単一の第２幼虫段階ＣＰＢを、各ウェルに置き、その後ティッシュペーパとマルチウェルプラスチック蓋により覆った。昆虫と葉の円盤状組織を含むプレートを、２８℃、１６時間明／８時間暗の光周期の昆虫室に保持した。昆虫を２日間、葉円盤状組織上で飼育し、その後昆虫を新鮮な処理した葉の円盤状組織を含む新しいプレートに移した。その後、昆虫を７日まで毎日、未処理の葉の円盤状組織を含むプレートに移した。昆虫の致死率と重量スコアを記録した。
【０１５５】
表面に塗布した標的ＬＤ００２の無傷の裸のｄｓＲＮＡを有するジャガイモ葉円盤状組織をＬ．デセムリネアータの幼虫に与えると、幼虫の致死率に有意な増加をもたらし（すなわち、７日目には全昆虫が死んだ；１００％の致死率）、一方、対照ｇｆｐ  ｄｓＲＮＡはＣＰＢ生存に全く影響を与えなかった。標的ＬＤ００２ｄｓＲＮＡは、２〜３日後に幼虫の成長に大幅な影響を与え、一方、同濃度でｇｆｐ  ｄｓＲＮＡを与えた幼虫は、正常なものと同様に発達した（図３−ＬＤ）
【０１５６】
Ｅ．レプチノタルサ・デセムリネアータに対する活性についての人工食餌を用いた短いバージョンのｄｓＲＮＡのスクリーニング
この実施例は、より短い（６０または１００ｐｂ）ｄｓＲＮＡフラグメントのそれ自体またはコンカテマー構築体が、コロラドハムシに対する毒性を引き起こすのに十分であることの発見を例示する。
【０１５７】
ＬＤ０１４、コロラドハムシの致死率を誘導すると知られている標的を、この実施例のために選択した。この遺伝子は、Ｖ−ＡＴＰａｓｅサブユニットＥ（配列番号１５）をコードする。
１００塩基対フラグメント、ＬＤ０１４＿Ｆ１、配列番号１５の位置１９５−２９４（配列番号１５９）と、６０塩基対フラグメント、ＬＤ０１４＿Ｆ２、配列番号１５の位置２３５−２９４（配列番号１６０）をさらに選択した。表７−ＬＤも参照されたい。
【０１５８】
３００塩基対の２つのコンカテマー、ＬＤ０１４＿Ｃ１とＬＤ０１４＿Ｃ２を設計した（配列番号１６１と配列番号１６２）。ＬＤ０１４＿Ｃ１は、上記の１００塩基対フラグメント（配列番号１５９）の３回繰り返しを含み、ＬＤ０１４＿Ｃ２は上記の６０塩基対（配列番号１６０）の５回繰り返しを含む。表７−ＬＤも参照されたい。
【０１５９】
フラグメントＬＤ０１４＿Ｆ１とＬＤ０１４＿Ｆ２を、センスおよびアンチセンスプライマーとして合成した。これらのプライマーを、クローニングの前に二本鎖ＤＮＡ分子を作成するためにアニーリングさせた。クローニングを容易するために、ＸｂａＩとＸｍａＩの制限酵素部位を、プライマーの５'および３'末端にそれぞれ含ませた。
【０１６０】
コンカテマーは、３００塩基対の合成遺伝子として作製した。クローニングを容易するために、ＸｂａＩとＸｍａＩの制限酵素部位を合成ＤＮＡフラグメントの５'および３'末端にそれぞれ含ませた。
【０１６１】
４のＤＮＡ分子、すなわち２の単一単位（ＬＤ０１４＿Ｆ１とＬＤ０１４＿Ｆ２）および２コンカテマー（ＬＤ０１４＿Ｃ１とＬＤ０１４＿Ｃ２）を、ＸｂａＩとＸｍａＩで消化し、ＸｂａＩとＸｍａＩとの消化により線状化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋にサブクローン化し、組み換えプラスミドｐ１、ｐ２、ｐ３、およびｐ４を、それぞれ得た。
【０１６２】
２本鎖ＲＮＡ生成：ｄｓＲＮＡを市販のキットＴ７  Ｒｉｂｏｍａｘ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＲＮＡｉ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ．Ｎｒ．Ｐ１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて合成した。まず、２つの別個のシングル５'Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター鋳型を、２つの別個のＰＣＲ反応において生成し、各々の反応物はＴ７プロモーターに対して異なる方向で標的配列を含む。ＬＤ０１４＿Ｆ１、センスＴ７鋳型を、特異的Ｔ７フォワードプライマーｏＧＢＭ１５９と、特異的リバースプライマーｏＧＢＭ１６４（ここでは配列番号２０４と配列番号２０５として、それぞれ示される）を用いて、以下の条件のＰＣＲ反応で生成した：９５℃で４分、その後９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を３５サイクル、続いて７２℃で１０分。アンチセンスＴ７鋳型を、特異的フォワードプライマーｏＧＢＭ１６３および特異的Ｔ７鋳型リバースプライマーｏＧＢＭ１６０（ここでは配列番号２０６と配列番号２０７として、それぞれ示される）を用いて、上記の条件のＰＣＲ反応で生成した。生じたＰＣＲ産物を、アガロースゲルで解析し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８１０６，Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、ＮａＣｌＯ４沈澱した。製造者の指示に従って、生成したＴ７フォワードおよびリバース鋳型を混合して、転写させ、生じたＲＮＡ鎖をアニーリングさせ、ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅで処理し、酢酸ナトリウムにより精製した。生じたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、ここでは配列番号２０３で示す。
【０１６３】
ＬＤ０１４＿Ｆ２について、センスＴ７鋳型を、特異的Ｔ７フォワードプライマーｏＧＢＭ１６１と、特異的リバースプライマーｏＧＢＭ１６６（ここでは配列番号２０９と配列番号２１０としてそれぞれ示される）を用いて、以下の条件のＰＣＲ反応で生成した：９５℃で４分、その後９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を３５サイクル、続いて７２℃で１０分。アンチセンスＴ７鋳型を、特異的フォワードプライマーｏＧＢＭ１６５および特異的Ｔ７リバースプライマーｏＧＢＭ１６２（ここでは配列番号２１１と配列番号２１２として、それぞれ示される）を用いて、上記の条件のＰＣＲ反応で生成した。生じたＰＣＲ産物を、アガロースゲルで解析し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８１０６，Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、ＮａＣｌＯ４沈澱した。製造者の指示に従って、生成したＴ７フォワードおよびリバース鋳型を混合して、転写させ、生じたＲＮＡ鎖をアニーリングさせ、ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅで処理し、酢酸ナトリウムにより精製した。生じたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、ここでは配列番号２０８で示す。
【０１６４】
また、コンカテマーについて、別個のシングル５'Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター鋳型を、２つの別個のＰＣＲ反応において生成し、各々の反応物はＴ７プロモーターに対する異なる方向で標的配列を含む。ＬＤ０１４＿Ｃ１とＬＤ０１４＿Ｃ２を含む組み換えプラスミドｐ３とｐ４を、ＸｂａＩまたはＸｍａＩで線状化し、各々の構築物のための２つの線状フラグメントを精製し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写アッセイの鋳型としてクローニング部位に隣接したＴ７プロモーター用いて使用した。２本鎖ＲＮＡをＴ７Ｒｉｂｏｍａｘ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＲＮＡｉ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により調製した。ＬＤ０１４＿Ｃ１とＬＤ０１４＿Ｃ２の生じたｄｓＲＮＡセンス鎖を、ここでは配列番号２１３と２１４により、それぞれ示す。
標的ＬＤ０１４とコンカテマーの短い配列は、図４−ＬＤに示すとおり、レプチノタルサ・デセムリネアータで致死を誘導することが可能であった。
【０１６５】
Ｆ．レプチノタルサ・デセムリネアータに対する活性のための人工食餌を用いた異なる濃度でのｄｓＲＮＡスクリーニング
１μｇ／μｌから０．０１ｎｇ／μｌへの連続した１０倍希釈濃度（０．１μｇ／μｌからの標的ＬＤ０２７のために）のｄｓＲＮＡ溶液５０μｌを、２４穴プレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上の固体の人工食餌へ局所的に塗布した。食餌を層流室で乾燥させた。処理ごとに、２４のコロラドハムシ幼虫（第２段階）を、ウェル毎に２昆虫で試験した。プレートを、２５±２℃、６０％相対湿度、１６：８時間の明暗周期での昆虫飼育室に保存した。昆虫を１４日まで、一定の間隔で生もしくは死を評価した。７日後、食餌を同じ濃度でｄｓＲＮＡの局所塗布された新鮮な食餌と交換した。ｄｓＲＮＡ標的を、食餌のみと比較した。
デセムリネアータ幼虫に対して異なる標的の無傷の裸のｄｓＲＮＡｓを含む人工食餌を与えることは、図５−ＬＤに示すように、０．１〜１０ｎｇのｄｓＲＮＡ／μｌと同程度の低い濃度で、高い幼虫の致死率をもたらした。
【０１６６】
Ｇ．昆虫活性２本鎖ＲＮＡの細菌生成に適したベクターにおけるＣＰＢ遺伝子断片のクローニング
いかなる効率的な細菌プロモータをも用いることができるが、ＣＰＢ遺伝子標的に対応するＤＮＡ断片を、細菌宿主における２本鎖ＲＮＡの発現のためにベクターにクローン化した（ＷＯ  ００／０１８４６参照）。
【０１６７】
標的遺伝子増幅のために用いる特異的プライマーの配列を表８−ＬＤに示す。用いた鋳型は、標的配列のいずれかを含むｐＣＲ８／ＧＷ／ｔｏｐｏベクターである。プライマーは以下の条件によるＰＣＲ反応に用いる：９８℃で５分、続いて９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、そして７２℃で２分を３０サイクル、続いて７２℃で１０分。生じたＰＣＲ断片を、アガロースゲルで解析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、Ｓｒｆ Ｉ線状化ｐＧＮＡ４９Ａベクター（ＷＯ００／１８８１２１Ａ１を参照）に平滑末端クローニングし、配列決定した。生成したＰＣＲ産物の配列は、表８−ＬＤに示すそれぞれの配列に対応する。この配列を持つ組換えベクターを、ｐＧＢＮＪ００３と称する。
【０１６８】
標的遺伝子断片ＬＤ０１０の増幅のために用いた特異的プライマーの配列を、表８−ＬＤに示す（フォワードプライマー  配列番号１９１と、リバースプライマー  配列番号１９０）。用いた鋳型は、ＬＤ０１０配列（配列番号１１）を含むｐＣＲ８／ＧＷ／ｔｏｐｏベクターであった。プライマーは以下の条件によるＰＣＲ反応に用いた：９８℃で５分、続いて９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、そして７２℃で２分を３０サイクル、続いて７２℃で１０分。生じたＰＣＲ断片をアガロースゲルで解析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、Ｓｒｆ Ｉ線状化ｐＧＮＡ４９Ａベクター（ＷＯ００／１８８１２１Ａ１を参照）に平滑末端クローニングし、配列決定した。生成したＰＣＲ産物の配列は、表８−ＬＤに示す配列番号１８８に対応する。この配列を持つ組換えベクターを、ｐＧＢＮＪ００３と称する。
【０１６９】
Ｈ．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの二つの株：（１）ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）と（２）ＢＬ２１（ＤＥ３）における２本鎖ＲＮＡ標的の発現と生成
細菌において好適なレベルの標的ＬＤ０１０の昆虫活性２本鎖ＲＮＡを発現するため、以下に記載の手法に従った。ＲＮａｓｅＩＩＩ欠損株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）を、野生型のＲｎａｓｅＩＩＩ含有細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）と比較して用いた。
【０１７０】
ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３とＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換
プラスミド３００ｎｇを添加し、氷冷した化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）またはＢＬ２１（ＤＥ３）の５０μｌ分割量中でゆっくりと混合した。細胞を、３７℃５分間の熱ショック処理にさらす前に、２０分間、氷上でインキュベートし、その後、細胞をさらに５分間氷上に戻した。４５０μｌの室温ＳＯＣ培地を細胞に添加し、懸濁物を３７℃１時間でシェイカー（２５０ｒｐｍ）でインキュベートした。１００μｌの細菌細胞懸濁物を、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン抗生物質を補充した１５０ｍｌ液体Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロスを含む５００ｍｌ三角フラスコに移した。培養物をＩｎｎｏｖａ４４３０シェイカー（２５０ｒｐｍ）で、３７℃で一晩（１６〜１８時間）インキュベートした。
【０１７１】
ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）とＢＬ２１（ＤＥ３）における２本鎖ＲＮＡ発現の化学的誘導
発現制御のための全ての遺伝的成分が存在するので、細菌株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）またはＢＬ２１（ＤＥ３）における組換えベクターｐＧＢＮＪ００３からの２本鎖ＲＮＡの発現が可能となった。化学的誘導剤イソプロピルチオガラクトシドまたはＩＰＴＧの存在下で、Ｔ７ポリメラーゼはアンチセンスとセンス方向の両方において標的遺伝子の転写を駆動した。これは、反対に配向したＴ７プロモータによりこれらが隣接されるからである。
【０１７２】
一晩細菌培養物の６００ｎｍでの光学密度を、適切な分光光度計を用いて測定し、新鮮なＬＢ培地を添加することにより値を１に調節した。この培養物５０ｍｌを、５０ｍｌファルコンチューブに移し、培地をその後３０００ｇで１５℃で１０分間遠心分離した。上清を除去し、細菌ペレットを１００μｇ／ｍｌカルベニシリンと１ｍＭＩＰＴＧを補充した新鮮なＳ完全培地（ＳＮＣ培地と５μｇ／ｍｌのコレステロール）５０ｍｌと再懸濁した。細菌を２〜４時間室温で誘導した。
【０１７３】
細菌の熱処理
細菌を試験プレート中の人工餌の汚染の危険を最小限にするために熱処理によって殺した。しかし、２本鎖ＲＮＡを発現する細菌の熱処理は、ＲＮＡ干渉による昆虫に対する毒性の誘導のための必要条件ではない。誘導された細菌培養物を、３０００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを８０℃２０分間の温浴に供した。熱処理後、細菌ペレットを、ＭｉｌｌｉＱ水１．５ｍｌで再懸濁し、上清を微量遠心管に移した。いくつか試験管を準備し、各リフレッシュメントのためのバイオアッセイにおいて用いた。試験管を−２０℃でさらなる使用まで貯蔵した。
【０１７４】
Ｉ．レプチノタルサ・デセムリネアータ(Leptinotarsa decemlineata)に対するｄｓＲＮＡ標的ＬＤ０１０を発現する大腸菌を試験するための実験室での試み
２つのバイオアッセイ法を、コロラドハムシの幼虫に対して大腸菌において生成した２本鎖ＲＮＡを試験するために用いた：（１）人工餌ベースのバイオアッセイと（２）植物ベースのバイオアッセイ。
【０１７５】
人工餌ベースのバイオアッセイ
コロラドハムシ用人工餌を、実施例３Ｃにて先に記載したとおり調製した。餌０．５ミリリットルを、４８穴マルチウェル試験プレート（Ｎｕｎｃ）の各ウェルに分注した。処理ごとに、ｄｓＲＮＡを発現する熱処理細菌ＯＤ１懸濁物（約５ｘ１０７細菌細胞に相当する）５０μｌを、ウェル中の固体餌上に局所的に付与して、プレートを層流室で乾燥させた。処理ごとに、４８の第２段階のコロラドハムシ幼虫を、餌と細菌を含む各ウェルに１匹づつで試験した。プレートの各列（つまり８ウェル）を、１つのリプリケート（複製？）として考えた。プレートを、昆虫飼育室２５±２℃、６０±５％相対湿度、１６：８時間の明暗光周期の昆虫飼育室で飼育した。４日経過ごとに、昆虫を局所的に付与された細菌を含む新鮮な餌に移した。侵入後の１日もしくは３日おきに、昆虫を生死に関して評価した。生存に関しては、侵入後７日目に幼虫重量の点で成長と発達を記録した。
【０１７６】
ＲＮａｓｅＩＩＩ−欠損Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）について、プラスミドｐＧＢＮＪ００３を含む細菌と、空ベクターｐＧＮ２９（ＷＯ００／１８８１２１Ａ１参照）を含むものを、ＣＰＢ毒性についてのバイオアッセイにて試験した。ｐＧＢＮＪ００３プラスミドを持つ細菌は、時間の経過に伴って昆虫死亡率の明らかな増加を示したが、一方ｐＧＮ２９と餌のみの対照については、ほとんど、またはまったく死亡が見られなかった（図６ａ−ＬＤと７ａ−ＬＤ）。生存コロラドハムシ幼虫の成長と発達は、ｄｓＲＮＡ標的ＬＤ０１０を発現する細菌を含む人工餌での飼育７日後には、大幅に阻止された（表１０−ＬＤ、図８ａ−ＬＤ、図１３−ＬＤ）。
【０１７７】
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）について、プラスミドｐＧＢＮＪ００３を含む細菌と空ベクターｐＧＮ２９を含むものを、コロラドハムシ幼虫に対して試験した。同様の有害な効果がＲＮＡｓｅＩＩＩ欠損株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）に関して、ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌を補充した餌で飼育した幼虫に見られた（図６ｂ−ＬＤ＆７ｂ−ＬＤ）。しかし、５クローンの生存の数が、ＢＬ２１（ＤＥ３）がＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）よりも多く；１２日目で平均死亡率の値も、ＲｎａｓｅＩＩＩ欠損株に比較してこの株については約２５％低かった。また、標的ＬＤ０１０に対応するｄｓＲＮＡを発現するＢＬ２１（ＤＥ３）を含む餌で飼育した生き残りの平均重量は大幅に減少した（表１０−ＬＤ、図８ｂ−ＬＤ）。
【０１７８】
プラスミドｐＧＢＮＪ００３を持つ２つの細菌株のいずれかを含む餌で飼育したＣＰＢ幼虫の成長と発達の遅延は、摂食阻害に直接的に相関する。なぜなら空ベクターｐＧＮ２９を持つ細菌または餌のみのプレートと比較して、４日以後、リフレッシュしたプレートのウェルでは、糞粉がまったく見られなかったからである。この観察結果は、人工餌（実施例３Ｄを参照）に局所的に付与したインビトロ転写された２本鎖ＲＮＡをＣＰＢに与えた場合に似ており；ここで、処理餌において２日以後から摂食の中断が発生した。
【０１７９】
植物べースのバイオアッセイ
ＣＰＢ幼虫に植物を与える前に、ジャガイモ植物全体にｄｓＲＮＡを発現する細菌を化学的に誘導する懸濁物を噴霧した。種々の「ラインＶ」（Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のジャガイモ植物を、以下の条件：２５±２℃、６０％相対湿度、１６：８時間明暗光周期の植物生育室で８〜１２個の広がった葉を持つ段階になるまで生育させた。５００ｍｌプラスチック瓶をさかさまにおくことで、鉢の土壌にしっかりと置いた瓶の首により植物を覆って、植物を閉じ込め、底は切って開き、通気可能なように細かいナイロンメッシュで覆い、内部の結露を減少させ、幼虫が逃げるのを防いだ。１５のＬ１段階のコロラドハムシ幼虫を、ケージ内の処理された各植物においた。植物をｐＧＢＮＪ００３プラスミド（クローン１、図７ａ−ＬＤ）またはｐＧＮ２９プラスミド（クローン１、図７ａ−ＬＤ参照）を持つ大腸菌ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）の懸濁物で処理した。異なる量の細菌を植物に付与した：６６、２２、７単位で、１単位は波長６００ｎｍの光学密度での値が１で、細菌懸濁物１ｍｌ中１０９細菌細胞として定義される。それぞれの場合において、全量１．６ｍｌを噴霧器の補助により植物に噴霧した。１植物を、この試みの１処理ごとに用いた。生存数を計数し、各生き残りの重量を記録した。
【０１８０】
ｐＧＢＮＪ００３からの標的ｄｓＲＮＡを発現する大腸菌細菌株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）の懸濁物による植物の噴霧はｐＧＮ２９対照と比較して昆虫の死亡率の劇的な増加を導いた。死亡率の計算は、細菌細胞懸濁物の量が、９倍に希釈されたときまで維持された（図９−ＬＤ）。ｐＧＢＮＪ００３ベクターを持つ細菌を噴霧された植物における１１日目の幼虫の生き残りの平均重量は、ｐＧＮ２９のそれより約１０倍小さかった（図１０−ＬＤ）。ｐＧＢＮＪ００３プラスミドを含む細菌を噴霧されたジャガイモ植物のＣＰＢ幼虫による摂食障害は、空ベクターｐＧＮ２９を含む細菌で噴霧されたジャガイモ植物で被った障害に比べて大きく減少した（図１１−ＬＤ）。
【０１８１】
これらの実験は、野生型もしくはＲＮａｓｅＩＩＩ欠損細菌発現システムのいずれかで生成した昆虫遺伝子標的配列に対応する２本鎖ＲＮＡは、昆虫死亡率および幼虫生き残りの成長／発達の遅延における大きな増加という観点で昆虫に対する毒性があることを示した。これらの実験より明らかなのは、例証が昆虫遺伝子標的に対応する２本鎖ＲＮＡを発現する細菌からなる製剤のスプレーの使用により、昆虫障害から植物／作物の効果的保護を与えることである。
【０１８２】
Ｊ．レプチノタルサ・デセムリネアータ(Leptinotarsa decemlineata)に対するｄｓＲＮＡ標的ＬＤ０１０を発現する大腸菌の様々な培養懸濁物の濃度の試験
細菌培養物の調製および処理は、実施例３Ｊに記載されている。標的ＬＤ０１０の２本鎖ＲＮＡを発現するＲＮＡｓｅＩＩＩ欠損株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）大腸菌の培養物の３倍の連続希釈物（０．２５単位等量から開始）を、８〜１２の開いた葉を持つ段階で亜種「Ｂｉｎｔｊｅ」のジャガイモ植物の群葉に適用した。Ｌ．デセムリネアータのＬ１幼虫を、処理ごとに１つの植物を用いて処理植物上においた。昆虫の死亡率と生育の妨げの採点を７日目に行った（すなわち、侵入後７日）。
【０１８３】
図１４−ＬＤに示すとおり、昆虫が濃度０．２５、０．０８および０．０２５細菌単位で（標的１０ｄｓＲＮＡ発現のための）ｐＧＢＮＪ００３プラスミドを持つ大腸菌の熱不活性化培養物の細かいスプレーによる局所適用により処理されたジャガイモ植物を与えられた場合、高いＣＰＢ幼虫死亡率（９０〜１００％）が１週間後に記録された。０．００８単位で、昆虫の３分の１が死亡し、しかし生き残った昆虫は対照群（空ベクターｐＧＮ２９を持つ大腸菌と水のみ）よりも有意に小さかった。空ベクターｐＧＮ２９を含む細菌で噴霧されたジャガイモ植物で被った障害と比較して、濃度０．０２５または０．００８単位で、ｐＧＢＮＪ００３プラスミドを含む細菌を噴霧されたジャガイモ植物のＣＰＢ幼虫による摂食障害は、大きく減少した（図１５−ＬＤ）。
【０１８４】
Ｋ．成虫は標的遺伝子に対応するｄｓＲＮＡの経口摂取に極端に敏感である
下記の例は、成虫（および幼虫の段階の昆虫のみならず）は、標的遺伝子に対応するｄｓＲＮＡの経口摂取に極端に敏感であるとの発見を強調する。
【０１８５】
４つの標的は、この実験のために選択された：標的２、１０、１４、１６（配列番号１６８、１８８、１９８、２２０、各々）。ＧＦＰフラグメントのｄｓＲＮＡ（配列番号２３５）は対照として使用した。若い成虫（２〜３日齢）を、昆虫の性別に偏りなく、我々の研究室で飼育した培養物から無差別に抽出した。１０の成虫を処理ごとに選択した。成虫を処理の開始前少なくとも６時間、事前に空腹にさせた。処理の初日に、各々の成虫を円盤状組織ごとに（実施例３Ａで記載されたとおりに合成した：実施例３Ｅに記載したとおりに局所適塗布した）０．１μｇ／μｌ標的ｄｓＲＮＡの２５μｌの局所塗布により前処理した４つのジャガイモ葉円盤状組織（直径１．５ｃｍ２）を与えた。各成虫を、全昆虫が等量の食糧を摂食し、従って等用量のｄｓＲＮＡを受け取ることを確実にするために、小さなペトリ皿（直径３ｃｍ）に閉じ込めた。次の日に、各成虫は上記の４つのジャガイモ葉円盤状組織を再び接触した。３日目に処理ごとの全ての１０成虫を、回収し、プラスチック箱からなるケージ（寸法３０ｃｍ  ｘ  ２０ｃｍ  ｘ  １５ｃｍ）で、良好な通気性を付与するために蓋に細かいナイロンメッシュが組み込まれたものに一緒に置いた。箱の中に、幾分か湿ったろ紙を底面においた。いくつかの（未処理の）ジャガイモ群葉を、実験中の成虫を維持するため、ろ紙の上面においた。５日から、定期的な評価を、死、生（動く）および瀕死の昆虫の数を計数することにより行った。昆虫の瀕死かどうかは、成虫を背中を向けておき、それらが、数分間で自分で正しい位置に戻れるかどうかで確認した：昆虫は、もし、それが、その正面に回転できないのみであれば、瀕死であると考えられた。
【０１８６】
コロラドハムシ、レプチノタルサ・デセムリネアータの成虫に対する異なる標的に対応する２本鎖ＲＮＡの明確な特異的毒性効果は、この実験で実証された（図１２−ＬＤ）。Ｇｆｐフラグメントに対する２本鎖ＲＮＡは、最後の評価の日に（１９日）で、ＣＰＢ成虫に対する毒性を示さなかった。この実験は、ＣＰＢ成虫の生存が経口で送達され、ｄｓＲＮＡにさらされた２、３日後のみに、大幅に減少したことを明確に示した。例えば、標的１０について、５日に、１０成虫のうちの５が瀕死となった（病的でゆっくり動く）：６日に、１０成虫のうちの４が瀕死の生存しているもののうちの３匹とともに死んだ；９日、全成虫が死んだのが観察された。
【０１８７】
この実験の結果として、害虫に対する標的２本鎖ＲＮＡの適用を、コロラドハムシの場合と同様に、それは、広大な農作物の損害を引き起こし得る害虫の２つの生活段階（幼虫と成虫）を含むように広げ得る。
【０１８８】
実施例４：ファエドン・コクレアリアエ（Phaedon cochleariae）（マスタード・リーフ・ビートル（mustard leaf beetle））
Ａ．ファミリーＰＣＲを介したファエドン・コクレアリアエ（マスタード・リーフ・ビートル）ＰＣ００１、ＰＣ００３、ＰＣ００５、ＰＣ０１０、ＰＣ０１４、ＰＣ０１６およびＰＣ０２７遺伝子の部分配列のクローニング
高品質、無傷のＲＮＡを、ファエドン・コクレアリアエの第３段階の幼虫（マスタード・リーフ・ビートル；ｓｏｕｒｃｅ：Ｄｒ．Ｃａｒｏｌｉｎｅ  Ｍｕｌｌｅｒ，Ｊｕｌｉｕｓ−ｖｏｎ−Ｓａｃｈｓ−ｌｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｕｅｒｚｂｕｒｇ，Ｊｕｌｉｕｓ−ｖｏｎ−Ｓａｃｈｓ−Ｐｌａｔｚ  ３，Ｄ−９７０８２  Ｗｕｅｒｚｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃａｔ．Ｎｒ．１５５９６−０２６／１５５９６−０１８，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を用いて、製造者の指示に従って、単離した。ＲＮＡ調製物に存在するゲノムＤＮＡは、ＤＮａｓｅ（Ｃａｔ．Ｎｒ．１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）処理により製造者の指示に従って除去した。ｃＤＮＡを、市販のキット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃａｔ．Ｎｒ．１８０８００４４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を用いて、製造者の指示に従って生成した。
【０１８９】
ＰＣ００１、ＰＣ００３、ＰＣ００５、ＰＣ０１０、ＰＣ０１４、ＰＣ０１６およびＰＣ０２７遺伝子の部分を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、変性プライマーによる一連のＰＣＲ反応を、Ａｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ｃａｔ．Ｎｒ．Ｎ８０８０２４０，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、製造者の指示に従って行った。
【０１９０】
各々の遺伝子の増幅に用いた変性プライマーの配列を、表２−ＰＣに記載する。これらのプライマーを、以下の条件によりそれぞれのＰＣＲ反応において用いた：９５℃１０分、続いて、９５℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で１分を４０サイクル、続いて、７２℃で１０分。生じたＰＣＲフラグメントを、アガロースゲルで解析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ４／ＴＯＰＯ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｃａｔ．Ｎｒ．Ｋ４５３０−２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、配列決定した。生じたＰＣＲ産物の配列を、表２−ＰＣに記載のそれぞれの配列番号により示し、これらは部分配列として言及される。
【０１９１】
対応する部分アミノ酸配列を、表３ＰＣに記載のそれぞれの配列番号により示した。表３ＰＣは、ｃＤＮＡクローンのアミノ酸配列を提供し、読み枠の最初は、括弧で示す。
【０１９２】
Ｂ．ファエドン・コクレアリアエ遺伝子のｄｓＲＮＡの生成
ｄｓＲＮＡを、市販のキットＴ７  Ｒｉｂｏｍａｘ（商標）；  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＲＮＡｉ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｃａｔ．Ｎｒ．Ｐ１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）．を用いてミリグラム量で合成した。まず、二つの別個のシングル５'Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター鋳型を、二つの別個のＰＣＲ反応で生成し、各反応物はＴ７プロモーターに対して異なる向きで標的配列を含む。
【０１９３】
標的遺伝子のそれぞれについて、センスＴ７鋳型を、特異的Ｔ７フォワードおよび特異的リバースプライマーを用いて生成した。標的遺伝子の各々についてセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８−ＰＣに示す。表８−ＰＣは、プライマー配列を含むファエドン・コクレアリアエ標的配列のｄｓＲＮＡフラグメントを調整するための詳細を提供する。
【０１９４】
ＰＣＲ反応における条件は以下のとおりである：９５℃１分、続いて９５℃３０秒、６０℃３０秒、そして７２℃１分を２０サイクル、続いて９５℃３０秒、５０℃３０秒、そして７２℃１分を１５サイクル、続いて７２℃１０分。アンチセンスＴ７鋳型を上記と同じ条件のＰＣＲ反応で特異的フォワードおよび特異的Ｔ７リバースプライマーを用いて生成した。標的遺伝子の各々についてアンチセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を表８ＰＣに示す。生じるＰＣＲ反応物を、アガロースゲルにて解析し、ＰＣＲ精製キットにより精製し（Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８１０６，Ｑｉａｇｅｎ）、ＮａＣＩＯ４沈澱をおこなった。生成したＴ７フォワードおよびリバース鋳型を、製造者の指示に従って、転写させるために混合し、そして生じたＲＮＡ鎖をアニーリングさせ、ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅで処理し、酢酸ナトリウムにより精製した。標的遺伝子の各々について生じたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、表８ＰＣに示す。
【０１９５】
Ｃ．形質転換アラビドプシス・サリアーナ（Arabidopsisthaliana）植物におけるＭ．ペルシカエMyzus persicae（モモアカアブラムシ（green peachaphid））新入の実験室の試み
形質転換植物の生成
アラビドプシス・サリアーナ植物を、ｆｌｏｒａｌ  ｄｉｐ  ｍｅｔｈｏｄ（Ｃｌｏｕｇｈ  ａｎｄ  Ｂｅｎｔ（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ１６：７３５−７４３）を用いて形質転換した。植物の気生部分を、５％ｓｕｃｒｏｓｅを含む溶液中で数秒間インキュベートし、一晩培養したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｔｒａｉｎ  Ｃ５８Ｃ１  Ｒｉｆ細胞と、０．０３％の界面活性剤Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７に再懸濁した。接種後、植物を、湿度を保つために、透明なプラスチックで１６時間覆った。形質転換効率を上昇させるために、この手順を、１週間後に繰り返した。水やりを、種が成熟したら停止し、乾燥した種を回収し、２日間冷処理した。滅菌後、種子を形質転換植物の選択のために、カナマイシン含有生育培地に播いた。
選択した植物を、最適なＴ２種子生産のために土壌に移した。
【０１９６】
バイオアッセイ
形質転換アラビドプシス・サリアーナ植物を、分離Ｔ２種子を、適切な選択培地に発芽させることにより選択した。これら遺伝子組み換え植物の根が、うまく定着したら、その後、それらを新鮮な人工生育培地もしくは土壌に移し、最適な条件で生育させた。遺伝子組み換え植物全体を、モモアカアブラムシ（Ｍ．ペルシカエ）の幼虫に対して試験すると、（１）食べる幼虫によって植物損害に対する有意な抵抗性、（２）幼虫の致死率の増大、および／または（３）生存する幼虫の重量の減少（または他の異常な昆虫の発生）を示した。
【０１９７】
Ｄ．ファエドン・コクレアリアエ幼虫に対する活性について、ナタネ葉円盤状組織を用いたｄｓＲＮＡ標的を試験する実験室の試み
下記に提供される実施例は、マスタード・リーフ・ビートル（ＭＬＢ）幼虫が、自身の標的遺伝子に対する経口摂取したｄｓＲＮＡに対して感受性があることを見出した例である。
【０１９８】
ＭＬＢ幼虫に対する異なる２本鎖ＲＮＡ試料を試験するために、葉の円盤状組織のアッセイをナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ  ｖａｒｉｅｔｙ  ＳＷ  Ｏｂａｎ；ｓｏｕｒｃｅ：Ｎｉｃｋ  Ｂａｌａａｍ，Ｓｗ  Ｓｅｅｄ  Ｌｔｄ．，４９  Ｎｏｒｔｈ  Ｒｏａｄ，Ａｂｉｎｇｔｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＣＢ１  ６ＡＳ，ＵＫ）の葉材料を食物源として用いて行った。２５±２℃、および６０±５％相対湿度、１６ｈ明／８ｈ暗光周期を有する昆虫室において、昆虫培養を維持するために、ナタネの同一の品種が使用された。約直径１．１ｃｍの円盤状組織（または０．９５ｃｍ２）を、好適なサイズの穿孔器を用いて４〜６週齢のナタネ植物の葉から切り取った。２本鎖ＲＮＡ試料を、０．０５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＭｉｌｌｉ−Ｑで、０．１μｇ／μｌに希釈した。処理した葉の円盤状組織を、標的ＰＣ００１、ＰＣ００３、ＰＣ００５、ＰＣ０１０、ＰＣ０１４、ＰＣ０１６、ＰＣ０２７  ｄｓＲＮＡの希釈溶液および、対照ｇｆｐ  ｄｓＲＮＡまたは０．０５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を２５μｌ、葉の向軸面に、塗布することにより調製した。葉の円盤状組織を、乾燥させて、葉の円盤状組織を完全に乾燥することから防ぐのを助けるゲル化(gellified)した２％寒天の１ｍｌを含む２４ウェルマルチプレートの２４ウェルのそれぞれに別個に置いた。二匹の新生のＭＬＢ幼虫を、プレートの各ウェルにおき、それをその後、マルチウェルプラスチック蓋で覆った。プレート（４８昆虫を含む一つの処理）を、１レプリケートごとに１２昆虫の４レプリケートに分けた（各列）。昆虫と葉の円盤状組織を含むプレートを、２５±２℃、および６０±５％相対湿度、１６ｈ明／８ｈ暗光周期を有する昆虫室で保持した。昆虫は、新鮮な処理した葉の円盤状組織を含む新しいプレートに移した後２日間、葉の円盤状組織が与えられた。
その後、バイオアッセイ開始後４日に、各レプリケートからの昆虫を回収し、未処理の新鮮なナタネの葉を含むペトリ皿に移した。幼虫の致死率および平均重量を、２、４、７、９、１１日に記録した。
【０１９９】
無傷の裸の標的ｄｓＲＮＡ処理されたナタネ葉を食餌されたファエドン・コクレアリアエ幼虫は、図１（ａ）に示されたような、試験されたすべての標的について幼虫の致死率の有意な増加を生じた。標的ＰＣ０１０に対して試験された２本鎖ＲＮＡは、９日目で１００％の幼虫の致死率を導き、標的ＰＣ０２７に関しては１１日目であった。対照ｇｆｐ  ｄｓＲＮＡ、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００のみ、または未処理の葉のみと比較した場合、他の全ての標的について、有意に高い致死率の値が、１１日目に到達した：（百分率での平均値±α０．０５を有する信頼区間）ＰＣ００１（９４．４±８．２）；ＰＣ００３（８６．１±４．１）；ＰＣ００５（８３．３±７．８）；ＰＣ０１４（６３．９±２０．６）；ＰＣ０１６（７５．０±１６．８）；ｇｆｐ  ｄｓＲＮＡ（１１．１±８．２）；０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（１９．４±１０．５）；葉のみ（８．３±１０．５）。
【０２００】
幼虫の生存したものは、それらの平均重量に基づいて評価された。試験されたすべての標的について、マスタード・リーフ・ビートル幼虫は、バイオアッセイの４日後、平均重量を有意に減少させた。対照ｇｆｐ  ｄｓＲＮＡまたは０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００のみを与えられた昆虫、葉のみ与えられた幼虫に関しても、正常に発達した（図１（ｂ）−ＰＣ）。
【０２０１】
Ｅ．ファエドン・コクレアリアエ幼虫に対する活性について、ナタネ葉円盤状組織を用いて、異なる濃度でのｄｓＲＮＡをスクリーニングする実験室での試み
標的ＰＣ０１０またはＰＣ０２７からのｄｓＲＮＡの２５μｌの溶液を、０．１μｇ／μｌから０．１ｎｇ／μｌまで連続して１０倍希釈したものを、上述の実施例４Ｄに記載のように、ナタネ葉の円盤状組織に局所的に塗布した。陰性対照としては、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００のみを、葉円盤状組織に投与した。処理ごとに、２４マスタード・リーフ・ビートル新生幼虫を、１ウェル毎に２匹の昆虫を用いて、試験した。プレートを２５±２℃、６０±５％相対湿度、１６：８時間明暗光周期の昆虫生育室に保持した。２日目に、幼虫を新鮮なｄｓＲＮＡで処理した葉円盤状組織を含む新しいプレーとに移した。標的ＰＣ０１０については４日目に、標的ＰＣ０２７については５日目に、各レプリケートから昆虫を、豊富な未処理葉材料を含むペトリディッシュに移した。幼虫は、生死について、標的ＰＣ０１０については２、４、７、８、９、１１日目に評価し、ＰＣ０２７については２、５、８、９、１２日目に評価した。
【０２０２】
二つの異なる無傷の裸の標的ｄｓＲＮＡ、ＰＣ０１０とＰＣ０２７を含むナタネ葉円盤状組織をファエドン・コクレアリアエ幼虫に与えると、図２（ａ）と（ｂ）に示すとおり、１ｎｇ  ｄｓＲＮＡ／μｌ溶液という低く減らした濃度でも、高い致死率を生じた。標的ＰＣ０１０について１１日目での、ｄｓＲＮＡの異なる濃度について、百分率での平均致死率の値±α０．０５を有する信頼区間は、０μｇ／μｌ：８．３±９．４；０．１μｇ／μｌ：１００；０．０１μｇ／μｌ：７９．２±２０．６；０．００１μｇ／μｌ：５８．３±９．４；０．０００１μｇ／μｌ：１２．５±１５．６；および、標的ＰＣ０２７についての１２日目では、０μｇ／μｌ：８．３±９．４；０．１μｇ／μｌ：９５．８±８．２；０．０１μｇ／μｌ：９５．８±８．２；０．００１μｇ／μｌ：８３．３±１３．３；０．０００１μｇ／μｌ：１２．５±８．２である。
【０２０３】
Ｆ．昆虫活性２本鎖ＲＮＡの細菌生成に適したベクターにおけるＭＬＢ遺伝子断片のクローニング
細菌における効率的な転写のためのＴ７プロモータもしくは他のいずれかのプロモータを含むいかなるベクターを用いてもく（参照ＷＯ０００１８４６）、以下のものは細菌宿主における２本鎖ＲＮＡの発現のためのベクターにおけるＭＬＢ遺伝子標的に対応するＤＮＡ断片をクローニングする例示である。
【０２０４】
標的遺伝子断片ＰＣ０１０の増幅のために用いる特異的プライマーの配列を表８−ＰＣに示す。用いた鋳型はＰＣ０１０配列（配列番号２５３）を含むｐＣＲ８／ＧＷ／ｔｏｐｏベクターである。プライマーは以下の条件によるタッチダウンＰＣＲ反応に用いた：９５℃で１分、続いて９５℃で３０秒、６０℃で３０秒１サイクルごとに−０．５℃の温度減少、そして７２℃で１分を２０サイクル、続いて９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、そして、７２℃で１分を１５サイクル、続いて７２℃で１０分。生じたＰＣＲ断片を、アガロースゲルで解析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ，Ｃａｔ．  Ｎｒ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、Ｓｒｆ Ｉ線状化ｐＧＮＡ４９Ａベクター（ＷＯ００１／８８１２１Ａ１参照）に平滑末端クローニングし、配列決定した。生成したＰＣＲ産物の配列は、表８−ＰＣに示す配列番号４８８に対応する。この配列を持つ組換えベクターを、ｐＧＣＤＪ００１と称する。
【０２０５】
Ｇ．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）の１つの株における２本鎖ＲＮＡ標的の発現と生成
細菌における昆虫標的の昆虫活性２本鎖ＲＮＡの好適なレベルを発現するために以下に記載の手法に従う。この実験において、ＲＮａｓｅＩＩＩ欠損株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）を用いた。
【０２０６】
ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）の形質転換
プラスミド３００ｎｇを添加し、氷冷した化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）５０μｌ分割量に徐々に混合した。細胞を、３７℃５分間の熱ショック処理にさらす前に、２０分間、氷上でインキュベートし、その後細胞をさらに５分間氷上に戻した。４５０μｌの室温ＳＯＣ培地を細胞に添加し、懸濁物を３７℃１時間でシェイカー（２５０ｒｐｍ）でインキュベートした。１００μｌの細菌細胞懸濁物を、１００μｇ／ｍｌカルベニシリン抗生物質を補充したの液体Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス１５０ｍｌを含む５００ｍｌ三角フラスコに移した。培養物をＩｎｎｏｖａ４４３０シェイカー（２５０ｒｐｍ）で、３７℃で一晩（１６〜１８時間）インキュベートした。
【０２０７】
ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）における２本鎖ＲＮＡ発現の化学的誘導
細菌株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）における組換えベクターｐＧＸＸＸ０ＸＸからの２本鎖ＲＮＡの発現が、制御した発現のための遺伝的成分の全てが存在するため、可能となった。化学的誘導剤イソプロピルチオガラクトシドまたはＩＰＴＧの存在下で、Ｔ７ポリメラーゼが、アンチセンスとセンス方向の両方において標的遺伝子の転写を駆動する。というのも、これらが反対に配向したＴ７プロモータにより隣接されているからである。
【０２０８】
細菌の一晩培養物の６００ｎｍの光学密度を、適切な分光光度計を用いて測定し、新鮮なＬＢ培地を添加することにより、値を１に調節した。この培養物５０ｍｌを、５０ｍｌファルコンチューブに移し、培養物をその後３０００ｇで１５℃で１０分間遠心分離した。上清を除去し、細菌ペレットを１００μｇ／ｍｌカルベニシリンと１ｍＭ  ＩＰＴＧを補充した新鮮なＳ完全培地（ＳＮＣ培地と５μｇ／ｍｌコレステロール）５０ｍｌに再懸濁した。細菌を２〜４時間室温で誘導した。
【０２０９】
細菌の熱処理
試験プレート内の人工餌の汚染の危険を最小限にするために、細菌を熱処理によって殺した。しかし、２本鎖ＲＮＡを発現する細菌の熱処理は、ＲＮＡ干渉による昆虫に対する毒性の誘導のための必要条件ではない。誘導された細菌培養物を、３０００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを、８０℃、２０分間の温浴にさらした。熱処理後、細菌ペレットを全量５０ｍｌの０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液で再懸濁した。チューブを４℃でさらに使用するまで貯蔵した。
【０２１０】
Ｈ．ファエドン・コクレアリア(Phaedon  cochleariae)に対するｄｓＲＮＡ標的を発現する大腸菌を試験するための実験室の試み
葉のディスクのバイオアッセイ
葉のディスクのバイオアッセイ法を、カラシナ葉甲虫の幼虫に対して大腸菌において（プラスミドｐＧＣＤＪ００１から）生成した標的ＰＣ０１０からの２本鎖ＲＮＡを試験するために用いた。葉のディスクを、実施例４に記載のとおりにナタネ群葉から調製した。細菌懸濁物、６００ｎｍの波長で１の光学密度測定値を有するもの２０μｌを、各ディスクにピペットした。葉ディスクを、１ｍｌゲル化寒天を含む２４マルチウェルプレートのウェルにおいた。各葉のディスク上に、生後すぐの幼虫を２匹加えた。各処理について、リプリケートごとに１６の生後すぐの幼虫の３リプリケートを調製した。プレートを２５±２℃と、６０±５％相対湿度、１６：８時間明：暗光周期の昆虫飼育室に維持した。３日目に（すなわち、バイオアッセイの開始後３日）、幼虫を新鮮な処理した（同じ用量）葉のディスクを含む新しいプレートに移した。葉の材料を、５日後から一日おきに取り換えた。バイオアッセイを、死亡率と平均重量について採点した。陰性対照は、ｐＧＮ２９（空ベクター）のプラスミドを持つ細菌により処理された葉のディスクと、葉のみである。
ｐＧＣＤＪ００１プラスミドを含むＲＮａｓｅＩＩＩ欠損大腸菌株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）の懸濁物で処理されたナタネ葉で昆虫が飼育された後、時間とともにＰ．コクレアリアの幼虫の死亡率の明らかな増加がみられた。一方、プラスミドｐＧＮ２９を持つ細菌もしくは葉のみの対照の場合では、極めて少数の死亡率、もしくは致死が見られなかった（図３−ＰＣ）。
【０２１１】
植物べースのバイオアッセイ
ＭＬＢに植物を与えるまえに、植物全体にｄｓＲＮＡを発現するように化学的に誘導した細菌を懸濁物を噴霧した。植物を、植物生育室で生育させた。５００ｍｌプラスチック瓶をさかさまにおき鉢の土壌に固定して置いた瓶の首で植物を覆うことにより植物を閉じ込め、底は切って開き、通気可能なように細かいナイロンメッシュで覆い、内部の結露を減少させて、虫が逃げるのを防いだ。ＭＬＢを、ケージ内の処理された各植物に置いた。植物を、ｐＧＣＤＪ００１プラスミドまたはｐＧＮ２９プラスミドを持つ大腸菌ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）の懸濁物で処理した。異なる量の細菌：例えば、６６、２２、７単位を植物に適用し、ここで１単位は６００ｎｍ波長の光学密度の値が１の細菌懸濁物１ｍｌ中１０９細菌細胞として定義される。各々の場合において、全量１〜１０ｍｌが噴霧器の補助により植物に噴霧された。１植物をこの試みの１処理ごとに用いる。生存数を計数し、各生き残りの重量を記録する。
【０２１２】
ｐＧＮ２９対照と比較して、ｐＧＣＤＪ００１からの標的ｄｓＲＮＡを発現する大腸菌細菌株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）の懸濁物による植物の噴霧は、昆虫の死亡率の劇的な増加を導いた。これらの実験は、野生型もしくはＲＮａｓｅＩＩＩ欠損細菌発現システムのいずれかで生成された昆虫遺伝子標的配列に対応する２本鎖ＲＮＡは、昆虫死亡率および幼虫生き残りの成長／発達の遅れにおける大きな増加という観点で昆虫に対する毒性があることを示した。また、これらの実験より明らかなのは、例証が、昆虫遺伝子標的に対応する２本鎖ＲＮＡを発現する細菌からなる製剤のスプレーの使用により、昆虫障害から植物／作物の効果的保護を与えることである。
【０２１３】
実施例５：Ｅ．ヴァリヴェティス（Epilachna varivetis）（インゲンテントウ（Mexican beenbeetle））
Ａ．Ｅ．ヴァリヴェティス部分遺伝子配列のクローニング
高品質、無傷のＲＮＡを、Ｅ．ヴァリヴェティス（インゲンテントウ；ｓｏｕｒｃｅ：Ｔｈｏｍａｓ  Ｄｏｒｓｅｙ，Ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｎｇ  Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｉｓｔ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｂｕｒｅａｕ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｅｓｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｐｈｉｌｌｉｐ  Ａｌａｍｐｉ  Ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ＰＯ  Ｂｏｘ  ３３０，Ｔｒｅｎｔｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ０８６２５−０３３０，ＵＳＡ）の４つの異なる幼虫段階から、ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃａｔ．Ｎｒ．１５５９６−０２６／１５５９６−０１８，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を用いて、製造者の指示に従って単離した。ＲＮＡ調製物中に存在するゲノムＤＮＡを、製造者の指示に従って（Ｃａｔ．Ｎｒ．１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）．、ＤＮａｓａ処理により除去した。ｃＤＮＡを、市販のキット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）  ＩＩＩ  ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃａｔ．Ｎｒ．１８０８００４４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を用いて、製造者の指示に従って、生成した。
【０２１４】
ＥＶ００５、ＥＶ００９、ＥＶ０１０、ＥＶ０１５およびＥＶ０１６遺伝子の部分を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、一連のＰＣＲ反応を変性プライマーにより、Ａｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ｃａｔ．Ｎｒ．Ｎ８０８０２４０，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて製造者の指示に従って、行った。
【０２１５】
遺伝子のそれぞれの増幅について用いた変性プライマーの配列を、表２−ＥＶに示す。それは、プライマーの配列を含むＥ．ヴァリヴェティス標的遺伝子と、得られたｃＤＮＡ配列を示す。これらのプライマーは、それぞれのＰＣＲ反応において、以下の条件により用いられた：ＥＶ００５とＥＶ００９について、９５℃で１０分、続いて、９５℃で３０秒、５０℃で１分、７２℃で１分３０秒を４０サイクル、続いて、７２℃で７分；ＥＶ０１４について、９５℃で１０分、続いて、９５℃で３０秒、５３℃で１分、７２℃で１分を４０サイクル、続いて、７２℃で７分；ＥＶ０１０とＥＶ０１６について、９５℃で１０分、続いて、９５℃で３０秒、５４℃で１分、７２℃で１分４０秒を４０サイクル、続いて、７２℃で７分。生じたＰＣＲフラグメントを、アガロースゲルで解析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ４／ＴＯＰＯベクター（Ｃａｔ．Ｎｒ．Ｋ４５３０−２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、配列決定した。生じたＰＣＲ産物の配列を、表２−ＥＶに示すように、それぞれ配列番号により表し、部分配列として言及している。対応する部分アミノ酸配列を、表３−ＥＶに示すようにそれぞれの配列番号により表し、そこでは、読み枠の開始が、括弧で示されている。
【０２１６】
Ｂ．Ｅ．ヴァリヴェティス遺伝子のｄｓＲＮＡ産物
ｄｓＲＮＡを、市販のキットＴ７  Ｒｉｂｏｍａｘ（商標）  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＲＮＡｉ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ．Ｎｒ．Ｐ１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてミリグラム量で合成した。最初の二つの別個のシングル５'Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター鋳型を、二つの別個のＰＣＲ反応において生成し、それぞれの反応物は、標的配列をＴ７プロモーターに対して異なる向きで含む。
【０２１７】
標的遺伝子のそれぞれについて、センスＴ７鋳型を、特異的Ｔ７フォワード、および特異的リバースプライマーを用いて生成した。標的遺伝子のそれぞれについてセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８−ＥＶに示す。
ＰＣＲ反応における条件を以下に示す：９５℃で１分、続いて、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分を２０サイクル、続いて、９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で１分を１５サイクル、続いて、７２℃で１０分。アンチセンスＴ７鋳型を、上記と同じ条件のＰＣＲ反応中で、特異的フォワードおよび特異的リバースプライマーを用いて、生成した。標的遺伝子のそれぞれに対するアンチセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８−ＥＶに示す。
生じたＰＣＲ産物をアガロースゲルで解析し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８１０６，Ｑｉａｇｅｎ）で製造者の指示に従って精製し、ＮａＣＩＯ４沈澱を行った。生成したＴ７フォワードおよびリバース鋳型を、転写させるために混合し、生じたＲＮＡ鎖をアニーリングさせ、ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅで処理し、酢酸ナトリウムにより精製した。標的遺伝子のそれぞれについて生じたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、表８−ＥＶに示す。
【０２１８】
Ｃ．Ｅ．ヴァリヴェティス幼虫に対する活性について、マメ葉円盤状組織を用いて、ｄｓＲＮＡ標的を試験する実験室の試み
下記に提供される実施例は、インゲンテントウ（ＭＢＢ）幼虫が、自身の標的遺伝子に対する経口摂取したｄｓＲＮＡに対して感受性があることを見出した例である。
【０２１９】
ＭＢＢ幼虫に対する異なる２本鎖ＲＮＡ試料を試験するために、葉の円盤状組織のアッセイをスナップマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｖａｒｉｅｔｙ  Ｍｏｎｔａｎｏ；ｓｏｕｒｃｅ：Ａｖｅｖｅ  ＮＶ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）の葉材料を食物源として用いて行った。２５±２℃、および６０±５％相対湿度、１６ｈ明／８ｈ暗光周期を有する昆虫室において、昆虫培養を維持するために、豆の同一の品種が使用された。約直径１．１ｃｍの円盤状組織（または０．９５ｃｍ２）を、好適なサイズの穿孔器を用いて１〜２週齢までのマメ植物の葉から切り取った。２本鎖ＲＮＡ試料を、０．０５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＭｉｌｌｉ−Ｑで、１μｇ／μｌに希釈した。処理した葉の円盤状組織を、標的Ｅｖ００５、Ｅｖ０１０、Ｅｖ０１５、Ｅｖ０１６ｄｓＲＮＡの希釈溶液および、対照ｇｆｐ  ｄｓＲＮＡまたは０．０５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を２５μｌ、葉の向軸面に、塗布することにより調製した。葉の円盤状組織を、乾燥させて、葉の円盤状組織を完全に乾燥することから防ぐのを助けるゲル化した２％寒天の１ｍｌを含む２４ウェルマルチプレートの２４ウェルのそれぞれに別個に置いた。一匹の新生のＭＢＢ幼虫を、プレートの各ウェルにおき、それをその後、マルチウェルプラスチック蓋で覆った。プレートを、１レプリケートごとに８昆虫の３レプリケートに分けた（各列）。昆虫と葉の円盤状組織を含むプレートを、２５±２℃、および６０±５％相対湿度、１６ｈ明／８ｈ暗光周期を有する昆虫室で保持した。昆虫は、新鮮な処理した葉の円盤状組織を含む新しいプレートに移した後２日間、葉の円盤状組織が与えられた。
その後、バイオアッセイ開始後４日に、昆虫を１０日目まで、毎日未処理の新鮮なマメ葉を含むペトリ皿に移した。未処理の新鮮なナタネの葉を含むペトリ皿に移した。昆虫の致死率を、２日目と、その後一日おきに記録した。
【０２２０】
表面に塗布された無傷の裸の標的ｄｓＲＮＡを含むスナップマメ葉をＥ．ヴァリヴェティス幼虫に与えると、図１に示すとおり、幼虫致死率の有意な増加を生じた。標的Ｅｖ０１０、Ｅｖ０１５、およびＥｖ０１６の試験した２本鎖ＲＮＡは、８日後１００％の致死率を導き、一方、標的Ｅｖ００５のｄｓＲＮＡは、１０日経過すると、すべての幼虫を殺した。対照ｇｆｐｄｓＲＮＡまたは界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００のみを含む処理した葉円盤状組織で飼育された昆虫の大部分は、バイオアッセイの間中、維持された（図１−ＥＶ）。
【０２２１】
Ｄ．Ｅ．ヴァリヴェティス成虫に対する活性について、マメ葉円盤状組織を用いて、ｄｓＲＮＡ標的を試験する実験室の試み
下記に提供される実施例は、インゲンテントウ（ＭＢＢ）成虫が、経口摂取した自身の標的遺伝子に対するｄｓＲＮＡに対して感受性があることを見出した例である。
【０２２２】
インゲンテントウ幼虫に関して設定された同様のバイオアッセイにおいて、成虫ＭＢＢを、マメ葉円盤状組織に局所的に塗布された２本鎖ＲＮＡに対して試験した。各標的Ｅｖ０１０、Ｅｖ０１５およびＥｖ０１６からの試験ｄｓＲＮＡを、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で、最終濃度０．１μｇ／μｌまで希釈した。マメ葉円盤状組織を、それぞれの円盤状組織に試験溶液３０μｌの局所的塗布により処理した。円盤状組織を、２４穴マルチウェルプレートのそれぞれのウェル中のゲル化した２％寒天のスライス上にそれぞれを置く前に完全に乾燥させた。３日齢の成虫を、培養ケージから回収し、バイオアッセイプレートの各ウェルに一つの成虫を置く前に７〜８時間何も与えなかった（従って、処理ごとに２４成虫）。プレートを、昆虫飼育室に置き（ＭＢＢ幼虫と同じ条件下で２４時間）、その後成虫を、新鮮なｄｓＲＮＡ処理葉円盤状組織を含む新しいプレートに移した。さらに２４時間後、それぞれの処理からの成虫を回収し、そして二つの鉢植えの未処理の３週齢のマメ植物を含む寸法３０ｃｍ  ｘ  １５ｃｍ  ｘ  １０ｃｍのプラスチック箱に置いた。昆虫の致死率を、４日から１１日まで評価した。
【０２２３】
Ｅ．ヴァリヴェティスの成虫に摂取された全ての３つの標的ｄｓＲＮＡ（Ｅｖ０１０、Ｅｖ０１５およびＥｖ０１６）は、図２（ａ）−ＥＶに示すように、４日から（バイオアッセイ開始後４日）の致死率において有意な増加を生じた。５日から、食餌パターンに大きな変化が、標的ｄｓＲＮＡ処理マメ葉円盤状組織を最初に食べた昆虫と対照ｇｆｐ  ｄｓＲＮＡまたは界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む円盤状組織を与えた昆虫との間で見られた。未処理のマメ植物のＭＢＢ成虫による、葉状の障害の減少は、ｇｆｐ  ｄｓＲＮＡおよび界面活性剤のみの対照と比較した場合、さまざまなレベルではあるものの、すべての３つの標的について明らかにみることができ、標的１５を食べた昆虫は、マメ葉に対して少なくとも障害を引き起こした（図２（ｂ）−ＥＶ）。
【０２２４】
Ｅ．昆虫活性２本鎖ＲＮＡの細菌生成に適したベクターにおけるＭＢＢ遺伝子断片のクローニング
細菌における効率的な転写のためにＴ７プロモータもしくは他のプロモータを含むいかなるベクターを用いてもよいけれども（参照ＷＯ０００１８４６）、以下のものは、細菌宿主における２本鎖ＲＮＡの発現のためのベクターにおけるＭＢＢ遺伝子標的に対応するＤＮＡ断片をクローニングする例示である。
【０２２５】
標的遺伝子の増幅のために用いる特異的プライマーの配列を表８−ＥＶに示す。用いた鋳型は、標的配列のいずれかを含むｐＣＲ８／ＧＷ／ｔｏｐｏベクターである。プライマーは以下の条件によるＰＣＲ反応に用いた：９８℃で５分、続いて９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、そして７２℃で２分を３０サイクル、続いて７２℃で１０分。生じたＰＣ断片を、アガロースゲルで解析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、Ｓｒｆ Ｉ線状化ｐＧＮＡ４９Ａベクター（ＷＯ００１８８１２１Ａ１を参照）に平滑末端クローニングし、配列決定した。生成したＰＣＲ産物の配列は、表８−ＥＶに示すそれぞれの配列に対応する。この配列を持つ組換えベクターを、ｐＧＸＸＸ０ＸＸと称する。
【０２２６】
Ｆ．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：（１）ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）および（２）ＢＬ２１（ＤＥ３）の二つの株における２本鎖ＲＮＡ標的の発現と生成
以下に記載の手法は、細菌における昆虫標的の昆虫活性２本鎖ＲＮＡの好適なレベルを発現するために用いられる。ＲＮａｓｅＩＩＩ欠損株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）を、野生型のＲＮａｓｅＩＩＩ含有細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に比較して用いた。
【０２２７】
ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）とＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換
プラスミド３００ｎｇを添加し、氷冷した化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）またはＢＬ２１（ＤＥ３）の５０μｌ分割量に徐々に混合する。細胞を、３０℃５分間の熱ショック処理にさらす前に、２０分間、氷上でインキュベートし、その後、細胞をさらに５分間氷上に戻す。４５０μｌの室温ＳＯＣ培地を細胞に添加し、懸濁物を３７℃１時間でシェイカー（２５０ｒｐｍ）でインキュベートする。１００μｌ細菌細胞懸濁物を、１００μｇ／ｍｌカルベニシリン抗生物質を補充した液体Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス１５０ｍｌを含む５００ｍｌ三角フラスコに移す。培養物を、Ｉｎｎｏｖａ４４３０シェイカー（２５０ｒｐｍ）で、３７℃で、一晩（１６〜１８時間）インキュベートする。
【０２２８】
ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）およびＢＬ２１（ＤＥ３）における２本鎖ＲＮＡ発現の化学的誘導
制御された発現のための遺伝的成分の全てが存在するため、細菌株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）またはＢＬ２１（ＤＥ３）における組換えベクターｐＧＸＸＸ０ＸＸからの２本鎖ＲＮＡの発現が可能となった。化学的誘導剤イソプロピルチオガラクトシドまたはＩＰＴＧの存在下で、Ｔ７ポリメラーゼがアンチセンスとセンス方向の両方において標的遺伝子の転写を駆動する。というのも、反対に配向させたＴ７プロモータによりこれらが隣接されるからである。
【０２２９】
細菌の一晩培養物の６００ｎｍの光学密度を、適切な分光光度計を用いて測定し、新鮮なＬＢ培地を添加することにより、値を１に調節した。この培養物５０ｍｌを、５０ｍｌファルコンチューブに移し、培養物をその後３０００ｇで、１５℃で、１０分間遠心分離する。上清を除去し、細菌ペレットを１００μｇ／ｍｌカルベニシリンと１ｍＭ  ＩＰＴＧを補充した新鮮なＳ完全培地（ＳＮＣ培地と５μｇ／ｍｌコレステロール）５０ｍｌに再懸濁した。細菌を２〜４時間室温で誘導した。
【０２３０】
細菌の熱処理
試験プレート内の人工餌の汚染の危険を最小限にするために細菌を熱処理によって殺した。しかし、２本鎖ＲＮＡを発現する細菌の熱処理は、ＲＮＡ干渉による昆虫に対する毒性誘導のための必要条件ではない。誘導された細菌培養物を、３０００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを８０℃、２０分間の温浴にさらした。熱処理後、細菌ペレットを、１．５ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水で再懸濁し、懸濁物を微量遠心管チューブに移した。いくつかのチューブを準備し、各リフレッシュメントのためのバイオアッセイにおいて用いた。該チューブを−２０℃でさらに使用するまで貯蔵した。
【０２３１】
Ｇ．エピラクナ・バリベティス(Epilachna  varivetis)に対するｄｓＲＮＡ標的を発現する大腸菌を試験するための実験室の試み 
植物べースのバイオアッセイ
ＭＢＢに植物を与えるまえに、植物全体にｄｓＲＮＡを発現する化学的に誘導した細菌の懸濁物を噴霧する。植物は、植物生育室で生育される。植物を、５００ｍｌプラスチック瓶をさかさまにおいて鉢の土壌に固定して置いた瓶の首により植物を覆って閉じ込め、底は切って開き、通気可能なように細かいナイロンメッシュで覆い、内部の結露を減少させ、昆虫が逃げるのを防ぐ。ＭＢＢをケージ内の各々の処理された植物上に置いた。植物を、ｐＧＢＮＪ００１プラスミドまたはｐＧＮ２９プラスミドを持つ大腸菌ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）の懸濁物で処理した。異なる量の細菌：例えば６６、２２、７単位で植物に適用し、ここで１単位は６００ｎｍ波長の光学密度の値が１である細菌懸濁物１ｍｌ中１０９細菌細胞として定義される。各々の場合において、全量１〜１０ｍｌが、噴霧器の補助により植物に噴霧される。１植物をこの試みの１処理ごとに用いた。生存数を計数し、各生き残りの重量を記録する。
【０２３２】
ｐＧＮ２９対照と比較して、ｐＧＸＸＸ０ＸＸからの標的ｄｓＲＮＡを発現する大腸菌細菌株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）の懸濁物による植物の噴霧は、昆虫の死亡率の劇的な増加を導く。これらの実験は、野生型もしくはＲＮａｓｅＩＩＩ欠損細菌発現システムのいずれかで生成された昆虫遺伝子標的配列に対応する２本鎖ＲＮＡは、昆虫死亡率および幼虫生き残りの成長／発達の遅れにおける大きな増加という観点で昆虫に対する毒性があることを示した。また、これらの実験より明らかなのは、例証が、昆虫遺伝子標的に対応する２本鎖ＲＮＡを発現する細菌からなる製剤のスプレーの使用により、昆虫障害からの植物／作物の効果的保護を与えることである。
【０２３３】
実施例６：アントノムス  グランディス(Anthonomus grandis)（ワタミハナゾウムシ）
Ａ．アントノムス  グランディス部分配列のクローニング
ＴＲＩｚｏｌＲｅａｇｅｎｔ  （Ｃａｔ．Ｎｒ．１５５９６−０２６／１５５９６−０１８，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を製造者の指示にどおりに使用し、3齢幼虫のアントノムス  グランディス（ワタミハナゾウムシ；供給源：Ｄｒ．Ｇａｒｙ  Ｂｅｎｚｏｎ，Ｂｅｎｚｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，７  Ｋｕｈｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｃａｒｌｉｓｌｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  １７０１３，ＵＳＡ）から、高品質で、インタクトなＲＮＡを単離した。製造者の指示に従ったＤＮａｓｅ処理（Ｃａｔ．Ｎｒ．１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）により、ＲＮＡ調製物中に存在するゲノムＤＮＡを除去した。市販のキット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃａｔ．Ｎｒ．１８０８００４４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を製造者の指示に従い使用し、ｃＤＮＡを生成した。
【０２３４】
ＡＧ００１、ＡＧ００５、ＡＧ０１０、ＡＧ０１４およびＡＧ０１６遺伝子の一部を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、製造者の指示に従いＡｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ｃａｔ．Ｎｒ．Ｎ８０８０２４０，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、変性プライマーでの一連のＰＣＲ反応を行った。
【０２３５】
それぞれの遺伝子の増幅に用いた変性プライマーの配列を、表２−ＡＧに示す。これらのプライマーは、それぞれのＰＣＲ反応において、以下の条件により用いられた：ＡＧ００１、ＡＧ００５およびＡＧ０１６に関しては、９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５０℃で１分、そして７２℃で１分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃で７分；ＡＧ０１０に関しては、９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５４℃で１分、そして７２℃で２分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃で７分；ＡＧ０１４関しては、９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５５℃で１分、そして７２℃で１分を４０サイクル、続いて７２℃で７分を行った。得られたＰＣＲフラグメントを、アガロースゲルで解析、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯベクター（Ｃａｔ．Ｎｒ．Ｋ２５００−２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列を決定した。得られたＰＣＲ産物の配列を、それぞれ配列番号により表２−ＡＧに示し、部分配列として記載する。対応する部分アミノ酸配列を、それぞれの配列番号により表３−ＡＧに表す。
【０２３６】
Ｂ．アントノムス  グランディス（ワタミハナゾウムシ）遺伝子のｄｓＲＮＡ産物
ｄｓＲＮＡを、市販のキットＴ７  Ｒｉｂｏｍａｘ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＲＮＡｉ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ．Ｎｒ．Ｐ１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてミリグラム量で合成した。最初に別々に２つの単一５'Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター鋳型を別々な２つのＰＣＲ反応において作製するが、ここでそれぞれの反応において標的配列はＴ７プロモーターに対して別な向きで含んでいる。
【０２３７】
それぞれの標的遺伝子について、センスＴ７鋳型は、特異的Ｔ７フォワードプライマーおよび特異的リバースプライマーを用いて生成した。それぞれの標的遺伝子についてセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８−ＡＧに示す。タッチダウンＰＣＲを以下の通り行った：９５℃で１分、続いて９５℃で３０秒、１サイクルごとに０．５℃温度減少させて６０℃で３０秒、７２℃で１分を２０サイクル、続いて９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、そして７２℃で１分を１５サイクル、続いて７２℃で１０分を行った。アンチセンスＴ７鋳型を、特異的フォワードプライマーおよび特異的リバースプライマーを用いて、上記と同じ条件を用いて生成した。標的遺伝子のそれぞれに対するアンチセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８−ＡＧに示す。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで解析し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８１０６，Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、ＮａＣｌＯ４沈澱を行った。製造者の指示に従って、得られたＴ７フォワード鋳型およびリバース鋳型を、転写させるために混合し、得られたＲＮＡ鎖をアニーリングさせ、ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅで処理し、酢酸ナトリウムにより精製した。それぞれの標的遺伝子について得られたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、表８−ＡＧに示す。
【０２３８】
Ｃ．昆虫活性２本鎖ＲＮＡの細菌生成に適したベクターにおけるＣＢＷ遺伝子断片のクローニング
細菌における効率的な転写のためにＴ７プロモータもしくは他のプロモータを含むいかなるベクターを用いてもよいけれども（参照ＷＯ０００１８４６）、以下のものは、細菌宿主における２本鎖ＲＮＡの発現のためのベクターにおけるＣＢＷ遺伝子標的に対応するＤＮＡ断片をクローニングする例示である。 
【０２３９】
標的遺伝子の増幅のために用いる特異的プライマーの配列を表８−ＡＧに示す。用いた鋳型は、標的配列を含むｐＣＲ８／ＧＷ／ｔｏｐｏベクターである。プライマーは以下の条件によるＰＣＲ反応に用いる：９８℃で５分、続いて９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、そして７２℃で２分を３０サイクル、続いて７２℃で１０分。生じたＰＣＲ断片をアガロースゲルで解析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、Ｓｒｆ  Ｉ線状化ｐＧＮＡ４９Ａベクター（ＷＯ００１８８１２１Ａ１参照）に平滑末端クローニングし、配列決定した。生成したＰＣＲ産物の配列は、表８−ＡＧに示すそれぞれの配列に対応する。この配列を持つ組換えベクターを、ｐＧＸＸＸ０ＸＸと称する。
【０２４０】
Ｄ．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの二つの株（１）ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）および（２）ＢＬ２１（ＤＥ３）における２本鎖ＲＮＡ標的の発現と生成
以下に記載の手法は、細菌における昆虫標的の昆虫活性２本鎖ＲＮＡの好適なレベルを発現するために続けられる。ＲＮａｓｅＩＩＩ欠損株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）を、野生型のＲＮａｓｅＩＩＩ含有細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に比較して用いる。
【０２４１】
ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）およびＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換
プラスミド３００ｎｇを添加し、氷冷した化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ株  ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）またはＢＬ２１（ＤＥ３）の５０μｌ分割量に徐々に混合する。細胞を、３７℃５分間の熱ショック処理にさらす前に、２０分間氷上でインキュベートし、その後細胞をさらに５分間氷上に戻した。室温ＳＯＣ培地４５０μｌを細胞に添加し、懸濁物を３７℃１時間でシェイカー（２５０ｒｐｍ）でインキュベートする。１００μｌ細菌細胞懸濁物を、１００μｇ／ｍｌカルベニシリン抗生物質を補充した液体Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス１５０ｍｌを含む５００ｍｌ三角フラスコに移す。培養物を、Ｉｎｎｏｖａ４４３０シェイカー（２５０ｒｐｍ）で、３７℃で一晩（１６〜１８時間）インキュベートする。
【０２４２】
ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）およびＢＬ２１（ＤＥ３）における２本鎖ＲＮＡ発現の化学的誘導
制御した発現のための遺伝的成分全てが存在するため、細菌株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）またはＢＬ２１（ＤＥ３）における組換えベクターｐＧＸＸＸ０ＸＸからの２本鎖ＲＮＡの発現が可能となった。化学的誘導剤イソプロピルチオガラクトシドまたはＩＰＴＧの存在下で、Ｔ７ポリメラーゼがアンチセンスとセンス方向の両方において標的遺伝子の転写を駆動する。これは、反対に配行させたＴ７プロモータによりこれらが隣接されるからである。
【０２４３】
細菌の一晩培養物の６００ｎｍの光学密度を、適切な分光光度計を用いて測定し、新鮮なＬＢ培地を添加することにより、値を１に調節した。この培養物５０ｍｌを、５０ｍｌファルコンチューブに移し、培地をその後３０００ｇで１５℃で１０分間遠心分離した。上清を除去し、細菌ペレットを１００μｇ／ｍｌカルベニシリンと１ｍＭ  ＩＰＴＧを補充した新鮮なＳ完全培地（ＳＮＣ培地と５μｇ／ｍｌコレステロール）５０ｍｌに再懸濁した。細菌を２〜４時間室温で誘導した。
【０２４４】
細菌の熱処理
細菌を、試験プレート内の人工餌の汚染の危険を最小限にするために熱処理によって殺した。しかし、２本鎖ＲＮＡを発現する細菌の熱処理は、ＲＮＡ干渉による昆虫に対する毒性の誘導のための必要条件ではない。誘導された細菌培養物を、３０００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを８０℃２０分間の温浴にさらした。熱処理後、細菌ペレットを１．５ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水で再懸濁し、懸濁物を微量遠心管チューブに移した。いくつかのチューブを準備し、各リフレッシュメントのためのバイオアッセイにおいて用いた。チューブを−２０℃でさらに使用するまで貯蔵した。
【０２４５】
Ｅ．アントノムス  グランディスに対してｄｓＲＮＡ標的を発現する大腸菌を試験する研究室の試験
植物ベースの生物検定
植物にＣＢＷを与える前に、化学的に誘導したｄｓＲＮＡを発現する細菌を懸濁液により植物全体に噴射した。それらを、植物生育室で生育させた。植物へ５００ｍｌプラスチック瓶をさかさまにしておくことにより、閉じ込めて、鉢中の土壌中にしっかりと置いた瓶の首で植物を覆い、底を切って開いて、吸気できるように細かいナイロンメッシュで覆い、内側の凝縮を減少させて、昆虫が逃げるのを防いだ。ＣＢＷを、かごの中のそれぞれ処理した植物においた。植物を、ｐＧＸＸＸ０ＸＸプラスミドまたはｐＧＮ２９プラスミドを持つ大腸菌ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）の懸濁液により処理した。異なる量の細菌が、植物に適用されている：例えば、６６、２２および７ユニット、ここで１ユニットは、６００ｎｍ波長での光学密度値で、細菌の懸濁液の１ｍｌ中に１０９細菌細胞として定義する。それぞれの場合に、噴霧器の補助により、植物に１〜１０ｍｌの全量が噴霧される。生存数を計数し、各生存の重量を記録した。
【０２４６】
ｐＧＮ２９コントロールと比較した場合において、ｐＧＸＸＸ０ＸＸ由来の標的ｄｓＲＮＡを発現する大腸菌細菌株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）の懸濁液を植物に噴霧は、昆虫の致死率の増大を引き起こす。これらの実験は、昆虫遺伝子標的配列に対応する２本鎖ＲＮＡが、野生型かＲＮａｓｅＩＩＩ欠損細菌発現システムのいずれかで産生され、昆虫致死率の増大の観点から昆虫に対して毒性であること、生存幼虫に対しては成長／発達を遅らせることを示す。また、標的昆虫遺伝子に対応する２本鎖ＲＮＡを発現する細菌からなる製剤のスプレーを用いることにより、昆虫の損害から植物／穀物の効果的な保護を与えることが実証されることが、これらの実験から明らかである。
【０２４７】
実施例７：トリボリウム  カスタニュウム(Tribolium castaneum)（コクヌストモドキ）
Ａ．トリボリウム  カスタニュウム部分配列のクローニング
ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃａｔ．Ｎｒ．１５５９６−０２６／１５５９６−０１８，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を製造者の指示にどおりに使用し、異なる全ての昆虫ステージのトリボリウム  カスタニュウム（コクヌストモドキ；供給源：Ｄｒ．Ｌａｒａ  Ｓｅｎｉｏｒ，Ｉｎｓｅｃｔ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ．，Ｃａｐｉｔａｌ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｐａｒｋ，Ｗｅｎｔｌｏｏｇ，Ｃａｒｄｉｆｆ，ＣＦ３  ２ＰＸ，Ｗａｌｅｓ，ＵＫ）から、高品質で、インタクトなＲＮＡを単離した。製造者の指示に従ったＤＮａｓｅ処理（Ｃａｔ．  Ｎｒ．  １７００，  Ｐｒｏｍｅｇａ）により、ＲＮＡ調製物中に存在するゲノムＤＮＡを除去した。市販のキット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃａｔ．Ｎｒ．１８０８００４４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を製造者の指示に従い使用し、ｃＤＮＡを生成した。
【０２４８】
ＴＣ００１、ＴＣ００２、ＴＣ０１０、ＴＣ０１４およびＴＣ０１５遺伝子の一部を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、製造者の指示に従い、Ａｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ｃａｔ．Ｎｒ．Ｎ８０８０２４０，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、変性プライマーでの一連のＰＣＲ反応を行った。それぞれの遺伝子の増幅に用いた変性プライマーの配列を、表２−ＴＣに示す。これらのプライマーは、それぞれのＰＣＲ反応において、以下の条件により用いられた：９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５０℃で１分、そして７２℃で１分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃で７分；ＡＧ０１０に関しては、９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５４℃で１分、そして７２℃で２分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃で７分（ＴＣ００１、ＴＣ０１４、ＴＣ０１５）；９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５４℃で１分、そして７２℃で３０秒を４０サイクル、続いて７２℃で７分を行った（ＴＣ０１０）；９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５３℃で１分、そして７２℃で１分を４０サイクル、続いて７２℃で７分を行った（ＴＣ００２）。得られたＰＣＲフラグメントを、アガロースゲルで解析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯベクター（Ｃａｔ．Ｎｒ．Ｋ２５００−２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列を決定した。得られたＰＣＲ産物の配列を、それぞれ配列番号により表２−ＴＣに示し、部分配列として記載する。対応する部分アミノ酸配列を、それぞれの配列番号により表３−ＴＣに表す。
【０２４９】
Ｂ．トリボリウム  カスタニュウム遺伝子のｄｓＲＮＡ産物
ｄｓＲＮＡを、市販のキットＴ７  Ｒｉｂｏｍａｘ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＲＮＡｉ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ．Ｎｒ．Ｐ１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてミリグラム量で合成した。最初に別々に２つの単一５'Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター鋳型を別々な２つのＰＣＲ反応において作製するが、ここでそれぞれの反応において標的配列はＴ７プロモーターに対して別な向きで含んでいる。
【０２５０】
それぞれの標的遺伝子について、センスＴ７鋳型は、特異的Ｔ７フォワードプライマーおよび特異的リバースプライマーを用いて生成した。それぞれの標的遺伝子についてセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８−ＴＣに示す。ＰＣＲ反応における条件は以下のとおりである：９５℃で１分、続いて９５℃で３０秒、６０℃で３０秒（−０．５℃／ｃｙｃｌｅ）、そして７２℃で１分を２０サイクル、続いて９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、そして７２℃で１分を１５サイクル、続いて７２℃で１０分。アンチセンスＴ７鋳型を、特異的フォワードプライマーおよび特異的リバースプライマーを用いて、上記と同じ条件を用いて生成した。標的遺伝子のそれぞれに対するアンチセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８ＴＣに示す。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで解析し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８１０６，Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、ＮａＣｌＯ４沈澱を行った。製造者の指示に従って、得られたＴ７フォワード鋳型およびリバース鋳型を、転写させるために混合し、得られたＲＮＡ鎖をアニーリングさせ、ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅで処理し、酢酸ナトリウムにより精製した。それぞれの標的遺伝子について得られたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、表８−ＴＣに示す。
【０２５１】
Ｃ．トリボリウム  カスタニュウム幼虫に対する活性について、人工食餌を用いたｄｓＲＮＡ標的を試験する研究室の試験
以下に与える実施例は、コクヌストモドキ（ｒｅｄｆｌｏｕｒ  ｂｅｅｔｌｅ（ＲＦＢ））幼虫が、自身の標的遺伝子に対応するｄｓＲＮＡの経口摂取に感受性があることを見いだした例示である。
【０２５２】
コクヌストモドキ（トリボリウム  カスタニュウム）をＩｎｓｅｃｔ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ．で維持した（供給源：Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｓｉｌｗｏｏｄ  Ｐａｒｋ，  Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ，ＵＫ）。昆虫を、ｃｏｍｐａｎｙ  ＳＯＰ／２５１／０１により飼育した。簡単にいうと、甲虫は、プラスチック瓶もしくはタンクに収容した。これらはふたがなく、換気が可能である。網が先端部を覆うように備えられ、逃げるのを防ぐための弾性バンドで固定されている。幼虫飼育培地（小麦粉）を、容器の中に置き、昆虫はそこで繁殖することができる。保存された甲虫群は、１６：８時間の明：暗サイクル、２５±３℃で制御された温度の部屋で維持した。
【０２５３】
標的ＴＣ０１４（配列番号７９９に対応する配列を有する）由来の２本鎖ＲＮＡは、小麦粉およびミルク粉末の混合物（全粒粉：牛乳粉末の比率４：１）に組み込まれ、一晩乾燥させた。それぞれのレプリケートを、個別に調製した：１０μｇ／μｌのｄｓＲＮＡの溶液１００μｌ（１ｍｇ  ｄｓＲＮＡ）を、０．１ｇ小麦粉／牛乳混合物に添加した。乾燥した混合物を、挽いて細かい粉末にした。昆虫を、二枚のろ紙を敷いたペトリ皿（直径５５ｍｍ）内で維持した。処理した餌を、二枚のろ紙の間においた。１０の一齢幼虫、雌雄混合幼虫は、各々の皿（レプリケート）においた。それぞれの処理を４つのレプリケートについて行った。コントロールはＭｉｌｌｉ−Ｑとした。評価（生存数）を定期的に行った。試験中、２５〜３３℃、２０〜２５％の相対湿度、１２：１２時間の明：暗光周期の条件とした。
標的ＴＣ０１４ｄｓＲＮＡにより処理された人工食餌による長期のトリボリウム  カスタニュウムの幼虫の生存は、図１−ＴＣに示すように、コントロールのみを与えたのに比較すると、有意に減少した。
【０２５４】
Ｄ．昆虫活性２本鎖ＲＮＡの細菌生成に適したベクターにおけるＲＦＢ遺伝子断片のクローニング 
細菌における効率的な転写のためにＴ７プロモータもしくは他のプロモータを含むいかなるベクターを用いてもよいけれども（参照ＷＯ０００１８４６）、以下のものは、細菌宿主における２本鎖ＲＮＡの発現のためのベクターにおけるＲＦＢ遺伝子標的に対応するＤＮＡ断片をクローニングする例示である。
【０２５５】
標的遺伝子の増幅のために用いる特異的プライマーの配列を表８−ＴＣに示す。用いた鋳型は、標的配列を含むｐＣＲ８／ＧＷ／ｔｏｐｏベクターである。プライマーは以下の条件によるＰＣＲ反応に用いる：９８℃で５分、続いて９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、そして７２℃で２分を３０サイクル、続いて７２℃で１０分。生じたＰＣ断片をアガロースゲルで解析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、Ｓｒｆ Ｉ線状化ｐＧＮＡ４９Ａベクター（ＷＯ００１８８１２１Ａ１参照）に平滑末端クローニングし、配列決定した。生成したＰＣＲ産物の配列は、表８−ＴＣに示すそれぞれの配列に対応する。この配列を持つ組換えベクターを、ｐＧＸＸＸ０ＸＸと称する。
【０２５６】
Ｅ．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの二つの株（１）ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）および（２）ＢＬ２１（ＤＥ３）における２本鎖ＲＮＡ標的の発現と生成
以下に記載の手法は、細菌における昆虫標的の昆虫活性２本鎖ＲＮＡの好適なレベルを発現するために続けられる。ＲＮａｓｅＩＩＩ欠損株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）を、野生型のＲＮａｓｅＩＩＩ含有細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）と比較して用いる。
【０２５７】
ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）およびＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換
プラスミド３００ｎｇを添加し、氷冷した化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）またはＢＬ２１（ＤＥ３）の５０μｌ分割量に徐々に混合した。細胞を、３７℃５分間の熱ショック処理にさらす前に、２０分間氷上でインキュベートし、その後細胞をさらに５分間氷上に戻す。４５０μｌの室温ＳＯＣ培地を細胞に添加し、懸濁物を３７℃１時間でシェイカー（２５０ｒｐｍ）でインキュベートした。１００μｌ細菌細胞懸濁物を、１００μｇ／ｍｌカルベニシリン抗生物質を補充した液体Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス１５０ｍｌを含む５００ｍｌ三角フラスコに移した。培養物をＩｎｎｏｖａ４４３０シェイカー（２５０ｒｐｍ）で、３７℃で、一晩（１６〜１８時間）インキュベートした。
【０２５８】
ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）およびＢＬ２１（ＤＥ３）における２本鎖ＲＮＡ発現の化学的誘導
制御した発現のための遺伝的成分が全て存在するため、細菌株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）またはＢＬ２１（ＤＥ３）における組換えベクターｐＧＸＸＸ０ＸＸからの２本鎖ＲＮＡの発現が可能となった。化学的誘導剤イソプロピルチオガラクトシドまたはＩＰＴＧの存在下で、Ｔ７ポリメラーゼが、アンチセンスとセンス方向の両方において標的遺伝子の転写を駆動する。これは、反対に配向させたＴ７プロモータによりこれらが隣接されるからである。
【０２５９】
細菌の一晩培養物の６００ｎｍの光学密度を、適切な分光光度計を用いて測定し、新鮮なＬＢ培地を添加することにより、値を１に調節した。この培養物５０ｍｌを、５０ｍｌファルコンチューブに移し、培養物をその後、３０００ｇで１５℃で１０分間遠心分離した。上清を除去し、細菌ペレットを、１００μｇ／ｍｌカルベニシリンと１ｍＭ  ＩＰＴＧを補充した新鮮なＳ完全培地（ＳＮＣ培地と５μｇ／ｍｌコレステロール）５０ｍｌに再懸濁した。細菌を２〜４時間室温で誘導した。
【０２６０】
細菌の熱処理
細菌を、試験プレート内の人工餌の汚染の危険を最小限にするために熱処理によって殺した。しかし、２本鎖ＲＮＡを発現する細菌の熱処理は、ＲＮＡ干渉による昆虫に対する毒性の誘導のための必要条件ではない。誘導された細菌培養物を、３０００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを８０℃２０分間の温浴にさらした。熱処理後、細菌ペレットを１．５ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水で再懸濁し、懸濁物を微量遠心管チューブに移した。いくつかのチューブを準備し、各リフレッシュメントのためのバイオアッセイにおいて用いた。チューブを−２０℃でさらに使用するまで貯蔵した。
【０２６１】
Ｆ．トリボリウム・カスタネウム(Tribolium  castaneum)に対するｄｓＲＮＡ標的を発現する大腸菌を試験するための実験室の試み 
植物べースのバイオアッセイ 
ＲＦＢに植物を与えるまえに、植物全体にｄｓＲＮＡを発現する化学的に誘導した細菌の懸濁物を噴霧した。植物は植物生育室で生育される。植物を、５００ｍｌプラスチック瓶をさかさまにおき鉢の土壌に固定して置いた瓶の首により植物を覆って閉じ込め、底は切って開き、通気可能なように細かいナイロンメッシュで覆い、内部の結露を減少させ、昆虫が逃げるのを防ぐ。ケージ内の各々の処理された植物にＲＦＢを置いた。植物を、ｐＧＸＸＸ０ＸＸプラスミドまたはｐＧＮ２９プラスミドを持つ大腸菌ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）の懸濁物で処理した。異なる量の細菌：例えば、６６、２２、７単位を植物に適用し、ここで１単位は６００ｎｍ波長の光学密度の値が１の細菌懸濁物１ｍｌ中１０９細菌細胞として定義される。各々の場合において、全量１〜１０ｍｌが噴霧器の補助により植物に噴霧された。１植物を、この試みの１処理ごとに用いた。生存数を計数し、各々生き残りの重量を記録する。
【０２６２】
ｐＧＮ２９対照と比較して、ｐＧＸＸＸ０ＸＸからの標的ｄｓＲＮＡを発現する大腸菌細菌株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）の懸濁物による植物の噴霧は、昆虫の死亡率の劇的な増加を導く。これらの実験は、野生型もしくはＲＮａｓｅＩＩＩ欠損細菌発現システムのいずれかで生成した昆虫遺伝子標的配列に対応する２本鎖ＲＮＡは、昆虫死亡率および幼虫生き残りの成長／発達の遅れにおける大きな増加という観点で昆虫に対する毒性があることを示した。これらの実験より明らかなのは、例証が、昆虫遺伝子標的に対応する２本鎖ＲＮＡを発現する細菌からなる製剤のスプレーの使用により、昆虫障害からの植物／作物の効果的保護を与えることである。
【０２６３】
実施例８：ミズス  ペルシカエ（Myzus persicae）（モモアカアブラムシ）
Ａ．ミズス  ペルシカエ部分配列のクローニング
ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｃａｔ．  Ｎｒ．  １５５９６−０２６／１５５９６−０１８，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，  ＵＳＡ）を製造者の指示に従って使用し、ミズス  ペルシカエ（モモアカアブラムシ）；  供給源：Ｄｒ．Ｒａｃｈｅｌ  Ｄｏｗｎ，Ｉｎｓｅｃｔ  ＆  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＳｃｉｅｎｃｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｓａｎｄ  Ｈｕｔｔｏｎ，Ｙｏｒｋ，ＹＯ４１  １  ＬＺ，ＵＫ）の若虫から、高品質で、インタクトなＲＮＡを単離した。製造者の指示に従ったＤＮａｓｅ処理（Ｃａｔ．Ｎｒ．１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）により、ＲＮＡ調製物中に存在するゲノムＤＮＡを除去した。市販のキット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃａｔ．Ｎｒ．１８０８００４４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を製造者の指示に従い使用し、ｃＤＮＡを生成した。
【０２６４】
ＭＰ００１、ＭＰ００２、ＭＰ０１０、ＭＰ０１６およびＭＰ０２７遺伝子の一部を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、製造者の指示に従いＡｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ｃａｔ．Ｎｒ．Ｎ８０８０２４０，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、変性プライマーでの一連のＰＣＲ反応を行った。
【０２６５】
それぞれの遺伝子の増幅に用いた変性プライマーの配列を、表２−ＭＰに示す。これらのプライマーは、それぞれのＰＣＲ反応において、以下の条件により用いられた：ＭＰ００１、ＭＰ００２およびＭＰ０１６に関しては、９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５０℃で１分、そして７２℃で１分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃で７分；ＭＰ０２７に関しては、タッチダウンプログラムを使用した：９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、１サイクルごとに１℃温度減少して６０℃で４０秒、そして７２℃で１分１０秒を４０サイクル、続いて９５℃で３０秒、５０℃で４０秒、そして７２℃で１分１０秒を３０サイクル、続いて７２℃で７分；ＭＰ０１０に関しては、９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５４℃で１分、そして７２℃で３分を４０サイクル、続いて７２℃で７分を行った。得られたＰＣＲフラグメントを、アガロースゲルで解析、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯベクター（Ｃａｔ．Ｎｒ．Ｋ２５００−２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列を決定した。得られたＰＣＲ産物の配列を、それぞれ配列番号により表２−ＭＰに示し、部分配列として記載する。対応する部分アミノ酸配列を、それぞれの配列番号により表３−ＭＰに表す。
【０２６６】
Ｂ．ミズス  ペルシカエ遺伝子のｄｓＲＮＡ産物
ｄｓＲＮＡを、市販のキットＴ７  Ｒｉｂｏｍａｘ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＲＮＡｉ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ．Ｎｒ．Ｐ１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてミリグラム量で合成した。最初に別々に２つの単一５'Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター鋳型を別々な２つのＰＣＲ反応において作製するが、ここでそれぞれの反応において標的配列はＴ７プロモーターに対して別な向きで含んでいる。
【０２６７】
それぞれの標的遺伝子について、センスＴ７鋳型は、特異的Ｔ７フォワードプライマーおよび特異的リバースプライマーを用いて生成した。それぞれの標的遺伝子についてセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８−ＭＰに示す。タッチダウンＰＣＲを以下の通り行った：９５℃で１分、続いて９５℃で３０秒を２０サイクル、１サイクルごとに０．５℃温度減少させて、５５℃で３０秒（ＭＰ００１、ＭＰ００２、ＭＰ０１６、ＭＰ０２７およびｇｆｐについて）または５０℃で３０秒（ＭＰ０１０について）、そして７２℃で１分、続いて９５℃で３０秒を１５サイクル、５０℃で３０秒、そして７２℃で１分、続いて７２℃で１０分。アンチセンスＴ７鋳型を、特異的フォワードプライマーおよび特異的リバースプライマーを用いて、上記と同じ条件を用いて生成した。標的遺伝子のそれぞれに対するアンチセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８−ＭＰに示す。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで解析し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８１０６，Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、ＮａＣｌＯ４沈澱を行った。製造者の指示に従って、得られたＴ７フォワード鋳型およびリバース鋳型を、転写させるために混合し、得られたＲＮＡ鎖をアニーリングさせ、ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅで処理し、酢酸ナトリウムにより精製した。それぞれの標的遺伝子について得られたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、表８−ＭＰに示す。
【０２６８】
Ｃ．マイザス・ペリスカエ(Myzus  periscae)（モモアカアブラムシ）の遺伝子組み換えアラビドプシス・タリアーナ(Arabidopsis  thaliana)植物への侵入の実験室の試み 
遺伝子組み換え植物の生成
アラビドプシス・タリアーナ植物を、フローラルディップ法（Clough  and  Bent(1998)  Plant  Jounal  16:735-743）を用いて形質転換した。植物の空中部分を、５％スクロース、再懸濁した一晩培養物からのアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium  tumefaciens)株Ｃ５８Ｃ１  Ｒｉｆ細胞と、０．０３％の界面活性剤Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７とを含有する溶液内で数秒インキュベートした。接種後、植物を湿度を保つために、透明なプラスチックで１６時間覆った。形質転換効率を上昇させるために、手順を１週間後に繰り返した。水やりを、種子が成熟したら停止し、乾燥した種子を回収し、２日間冷処理した。滅菌後、種子を形質転換植物の選択のために、カナマイシン含有生育培地に播いた。
選択した植物を、最適なＴ２種子生産のために土壌に移した。
【０２６９】
バイオアッセイ
分離したＴ２種子を適切な選択培地に発芽させることにより、遺伝子組み換えアラビドプシス・タリアーナ植物を選択した。これら遺伝子組み換え物の根がうまく定着したら、その後、それらを新鮮な人工生育培地もしくは土壌に移し、最適な条件で生育させた。遺伝子組みかえ植物全体を、モモアカアブラムシ（マイザス・ペリスカエ）の若虫に対して試験すると、（１）摂食する若虫による植物損害に対する有意な抵抗性、（２）若虫の死亡率の増大、および／または（３）若虫の生き残りの重量の減少（または他の異常な昆虫の発達）をしめした。
【０２７０】
Ｄ．ミズス  ペルシカエに対する活性について、液体人工食餌を用いたｄｓＲＮＡ標的を試験する研究室の試験
モモアカアブラムシ（ミズス  ペルシカエ）に対する液体人工食餌は、Ｆｅｂｖａｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）［Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｂａｌａｎｃｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｄｉｅｔ  ｆｏｒａ  ｂｉｏｔｙｐｅ  ｏｆ  Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ：Ａｐｈｉｄｉｄａｅ）．Ｃａｎ．Ｊ．Ｚｏｏｌ．６６：２４４９−２４５３］に記載のソラマメヒゲナガアブラムシ（アシルソシフォン  ピスム（Acyrthosiphon pisum））に適した食餌に多少の変更を加えて作製した。食餌のアミノ酸成分を、以下の通り調製した：アラニン１７８．７１、ベータアラニン６．２２、アルギニン２４４．９、アスパラギン２９８．５５、アスパラギン酸  ８８．２５、システイン２９．５９、グルタミン酸１４９．３６、グルタミン４４５．６１、グリシン１６６．５６、ヒスチジン１３６．０２、イソロイシン１６４．７５、ロイシン２３１．５６、塩酸リジン３５１．０９、メチオニン７２．３５、オルニチン（ＨＣｌ）９．４１、フェニルアラニン２９３、プロリン１２９．３３、セリン１２４．２８、スレオニン１２７．１６、トリプトファン４２．７５、チロシン３８．６３、Ｌ−バリン１９０．８５（ｍｇ／１００ｍｌ）。チロシンは、アミノ酸混合物に添加する前に１ＭＨＣｌを２、３滴落とした後に溶解し、チロシン以外のアミノ酸は、３０ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ  Ｈ２Ｏに溶解した。食餌中のビタミン混合物の成分を、以下の通り５×濃縮ストックとして調製した：アミノ安息香酸１００、アスコルビン酸１０００、ビオチン１、パントテン酸カルシウム５０、塩化コリン５００、葉酸１０、ミオイノシトール４２０、ニコチン酸１００、塩酸ピリドキシン２５、リボフラビン５、チアミン塩酸塩２５（ｍｇ／Ｌ）。リボフラビンは、５０℃で１ｍｌのＨ２Ｏ中に溶解した後、ビタミン混合物ストックに添加した。ビタミン混合物を、一定分量２０ｍｌに分注し、−２０℃で貯蔵した。ビタミン混合物の一定分量１つを、アミノ酸溶液に添加した。スクロースとＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを、それぞれ２０ｇおよび２４２ｍｇの量で混合物に添加した。微量金属ストック溶液を以下の通り作製した：ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ４．７、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ４４．５、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ６．５、ＮａＣｌ２５．４、ＺｎＣｌ２８．３（ｍｇ／１００ｍｌ）。微量金属溶液１０ｍｌと、ＫＨ２ＰＯ４２５０ｍｇを、食餌に添加し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を加え、最終液体食餌容量が１００ｍｌになるようにした。食餌のｐＨを、１Ｍ  ＫＯＨ溶液で７に調整した。溶液試料を、０．２２μｍのｆｉｌｔｅｒ  ｄｉｓｃ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通してろ過滅菌した。
【０２７１】
モモアカアブラムシ（ミズス  ペルシカエ；供給源：Ｄｒ．Ｒａｃｈｅｌ  Ｄｏｗｎ，  Ｉｎｓｅｃｔ＆Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｓａｎｄ  Ｈｕｔｔｏｎ，Ｙｏｒｋ，ＹＯ４１  １ＬＺ，ＵＫ）を、第４〜６週齢のアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ  ｖａｒｉｅｔｙ  ＳＷ  Ｏｂａｎ；供給源：Ｎｉｃｋ  Ｂａｌａａｍ，Ｓｗ  Ｓｅｅｄ  Ｌｔｄ．，４９Ｎｏｒｔｈ  Ｒｏａｄ，Ａｂｉｎｇｔｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＣＢ１  ６ＡＳ，ＵＫ）上で、７０μｍメッシュを含むアルミニウムの枠のケージ中において、２３±２℃および６０±５％の相対湿度、１６：８時間明：暗の光周期の環境条件に制御されている部屋で飼育した。
【０２７２】
生物検定の開始の１日前に、飼育ケージから回収した成虫を、ペトリ皿中の摘みたて新鮮なナタネ葉の上におき、昆虫室で一晩放置した。次の日、一齢若虫を選択して、餌室に移した。餌室は、薄く伸ばしたパラフィルムＭの単一層でおおわれた小さなペトリ皿（直径３ｃｍ）の上に５０μｌの餌を添加しており、１０の一齢幼虫を含む。餌室は、パラフィルムの第二の層で密閉され、成虫飼育と同じ条件下で飼育した。ｄｓＲＮＡの餌は、一日おきに新しいものに交換し、昆虫の生存が８日目、すなわち生物検定開始後８日目に評価を行った。処理ごとに、５つの生物検定餌室（レプリケート）を、同時に設定した。最終濃度が２μｇ／μｌになるように、試験とコントロール（ｇｆｐ）のｄｓＲＮＡ溶液を、餌に組み入れた。餌室は、２３±２℃、６０±５％相対湿度、１６：８時間の明：暗の光周期で維持した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４により測定し、平均が標的２７（ＭＰ０２７）と、ｇｆｐｄｓＲＮＡとの間で有意に異なるか否かを明確にするために、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験で決定した。
【０２７３】
生物検定の結果、餌室を用いて標的２７（配列番号１０６１）由来のインタクトな裸のｄｓＲＮＡを添加した液体人工餌をミズス  ペルシカエの幼虫に与えることにより、図１に示すとおり、致死率の有意な増加をもたらした。標的２７、ｇｆｐｄｓＲＮＡ、餌のみで処理した生存数の平均百分率は、それぞれ、２、３４および８２であった。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験をもちいた標的０２７とｇｆｐｄｓＲＮＡとの比較において、片側０．０４のＰ値を生じた。このことは標的０２７の平均が、ｇｆｐｄｓＲＮＡの期待された大きな平均から有意に異なる（Ｐ  ＜  ０．０５）ことを示す。標的０２７ ｄｓＲＮＡを組み入れた液体食餌におけるモモアカアブラムシは、餌のみ、もしくはｇｆｐ  ｄｓＲＮＡコントロールを与えられたものより、著しく小さかった（データは示さず）。
【０２７４】
Ｅ．昆虫活性２本鎖ＲＮＡの細菌生成に適したベクターにおけるＧＰＡ遺伝子断片のクローニング
細菌における効率的な転写のためにＴ７プロモータもしくは他のプロモータを含むいかなるベクターを用いてもよいけれども（参照ＷＯ０００１８４６）、以下のものは、細菌宿主における２本鎖ＲＮＡの発現のためのベクターにおけるＧＰＡ遺伝子標的に対応するＤＮＡ断片をクローニングする例示である。
【０２７５】
標的遺伝子の増幅のために用いる特異的プライマーの配列を表８−ＭＰに示す。用いた鋳型は、標的配列のいずれかを含むｐＣＲ８／ＧＷ／ｔｏｐｏベクターである。プライマーは以下の条件によるＰＣＲ反応に用いる：９８℃で５分、続いて９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、そして７２℃で２分を３０サイクル、続いて７２℃で１０分。生じたＰＣ断片をアガロースゲルで解析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、Ｓｒｆ  Ｉ線状化ｐＧＮＡ４９Ａベクター（ＷＯ００１８８１２１Ａ１参照）に平滑末端クローニングし、配列決定した。生成したＰＣＲ産物の配列は、表８−ＭＰに示すそれぞれの配列に対応する。この配列を持つ組換えベクターを、ｐＧＸＸＸ０ＸＸと称する。
【０２７６】
Ｆ．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの二つの株（１）ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）および（２）ＢＬ２１（ＤＥ３）における２本鎖ＲＮＡ標的の発現と生成
以下に記載の手法は、細菌における昆虫標的の昆虫活性２本鎖ＲＮＡの好適なレベルを発現するために続けられる。ＲＮａｓｅＩＩＩ欠損株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）を、野生型のＲＮａｓｅＩＩＩ含有細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）と比較して用いる。
【０２７７】
プラスミド３００ｎｇを添加し、氷冷した化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）またはＢＬ２１（ＤＥ３）の５０μｌ分割量に徐々に混合した。細胞を３７℃５分間の熱ショック処理にさらす前に、２０分間氷上でインキュベートし、その後細胞をさらに５分間氷上に戻した。４５０μｌの室温ＳＯＣ培地を細胞に添加し、懸濁物を３７℃１時間でシェイカー（２５０ｒｐｍ）でインキュベートした。１００μｌ細菌細胞懸濁物を、１００μｇ／ｍｌカルベニシリン抗生物質を補充した液体Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス１５０ｍｌを含む５００ｍｌ三角フラスコに移した。培養物を、Ｉｎｎｏｖａ４４３０シェイカー（２５０ｒｐｍ）で、３７℃で、一晩（１６〜１８時間）インキュベートした。
【０２７８】
ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）およびＢＬ２１（ＤＥ３）における２本鎖ＲＮＡ発現の化学的誘導
制御した発現のための遺伝的成分が全て存在するため、細菌株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）またはＢＬ２１（ＤＥ３）における組換えベクターｐＧＸＸＸ０ＸＸからの２本鎖ＲＮＡの発現が可能となった。化学的誘導剤イソプロピルチオガラクトシドまたはＩＰＴＧの存在下で、Ｔ７ポリメラーゼが、アンチセンスとセンス方向の両方において標的遺伝子の転写を駆動する。これは、反対に配向させたＴ７プロモータによりこれらが隣接されるからである。
【０２７９】
細菌の一晩の培養物の６００ｎｍの光学密度を、適切な分光光度計を用いて測定し、新鮮なＬＢ培地を添加することにより、値を１に調節した。この培養物５０ｍｌを５０ｍｌのファルコンチューブに移し、培養物をその後３０００ｇで、１５℃で、１０分間遠心分離した。上清を除去し、細菌ペレットを、１００μｇ／ｍｌカルベニシリンと１ｍＭ  ＩＰＴＧを補充した新鮮なＳ完全培地（ＳＮＣ培地と５μｇ／ｍｌコレステロール）５０ｍｌに再懸濁した。細菌を２〜４時間室温で誘導した。
【０２８０】
細菌の熱処理
細菌を、試験プレート内の人工餌の汚染の危険を最小限にするために熱処理によって殺した。しかし、２本鎖ＲＮＡを発現する細菌の熱処理は、ＲＮＡ干渉による昆虫に対する毒性の誘導のための必要条件ではない。誘導された細菌培養物を、３０００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを８０℃２０分間の温浴にさらした。熱処理後、細菌ペレットを１５ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水で再懸濁し、懸濁物を微量遠心管チューブに移した。いくつかのチューブを準備し、各リフレッシュメントのためのバイオアッセイにおいて用いた。チューブを−２０℃でさらに使用するまで貯蔵した。
【０２８１】
Ｇ．マイザス・ペリスカエに対するｄｓＲＮＡ標的を発現する大腸菌を試験するための実験室の試み
植物べースのバイオアッセイ
ＧＰＡに植物を与えるまえに、植物全体にｄｓＲＮＡを発現する化学的に誘導した細菌の懸濁物を噴霧した。植物は植物生育室で生育される。植物を、５００ｍｌプラスチック瓶をさかさまにおいて鉢の土壌に固定して置いた瓶の首により植物を覆って閉じ込め、底は切って開き、通気可能なように細かいナイロンメッシュで覆い、内部の結露を減少させ、昆虫が逃げるのを防ぐ。ケージ内の各々の処理した植物にＧＰＡを置いた。植物を、ｐＧＸＸＸ０ＸＸプラスミドまたはｐＧＮ２９プラスミドを持つ大腸菌ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）の懸濁物で処理した。異なる量の細菌：例えば６６、２２、７単位を植物に適用し、ここで１単位は６００ｎｍ波長の光学密度の値が１の細菌懸濁物１ｍｌ中１０９細菌細胞として定義される。各々の場合において、全量１〜１０ｍｌが噴霧器の補助により植物に噴霧された。１植物を、この試みの１処理ごとに用いた。生存数を計数し、各々の生き残りの重量を記録する。
【０２８２】
ｐＧＮ２９対照と比較して、ｐＧＸＸＸ０ＸＸからの標的ｄｓＲＮＡを発現する大腸菌細菌株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）の懸濁物による植物の噴霧は、昆虫の死亡率の劇的な増加を導く。これらの実験は、野生型もしくはＲＮａｓｅＩＩＩ欠損細菌発現システムのいずれかで生成した昆虫遺伝子標的配列に対応する２本鎖ＲＮＡは、昆虫死亡率および幼虫生き残りの成長／発達の遅れにおける大きな増加という観点で昆虫に対する毒性があることを示した。また、これらの実験より明らかなのは、例証が、昆虫遺伝子標的に対応する２本鎖ＲＮＡを発現する細菌からなる製剤のスプレーの使用により、昆虫障害からの植物／作物の効果的保護を与えることである。
【０２８３】
実施例９：ニラパルヴァータ  ルーゲンス（Nilaparvata lugens)（トビイロウンカ）
Ａ．ニラパルヴァータ  ルーゲンス部分配列のクローニング
市販のキット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃａｔ．Ｎｒ．１８０８００４４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を製造者の指示に従う使用方法で、ニラパルヴァータ  ルーゲンス（供給源：Ｄｒ．Ｊ．Ａ．Ｇａｔｅｈｏｕｓｅ，Ｄｅｐｔ．  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄｕｒｈａｍ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＵＫ）の高品質全ＲＮＡからｃＤＮＡを作製した。
【０２８４】
ニラパルヴァータ  ルーゲンス  ＮＬ００１、ＮＬ００２、ＮＬ００３、ＮＬ００４、ＮＬ００５、ＮＬ００６、ＮＬ００７、ＮＬ００８、ＮＬ００９、ＮＬ０１０、ＮＬ０１１、  ＮＬ０１２、ＮＬ０１３、ＮＬ０１４、ＮＬ０１５、ＮＬ０１６、ＮＬ０１８、ＮＬ０１９、ＮＬ０２１、ＮＬ０２２およびＮＬ０２７遺伝子の一部を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、Ａｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ｃａｔ．Ｎｒ．Ｎ８０８０２４０，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造者の指示に従う使用方法で、変性プライマーでの一連のＰＣＲ反応を行った。
【０２８５】
遺伝子のそれぞれの増幅について用いた変性プライマーの配列を、表２−ＮＬに示す。これらのプライマーは、それぞれのＰＣＲ反応において、以下の条件により用いられた：  ＮＬ００１について、９５℃で５分、続いて９５℃で３０秒、５５℃で１分、そして７２℃で１分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ００２について、９５℃で３分、続いて９５℃で３０秒、５５℃で１分、そして７２℃で１分を４０サイクル、続いて、７２℃で１０分；ＮＬ００３について、９５℃で３分、続いて９５℃で３０秒、６１℃で１分、そして７２℃で１分を４０サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ００４について、９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５１℃で１分、そして７２℃で１分を４０サイクル；ＮＬ００５について、９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５４℃で１分、そして７２℃で１分を４０サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ００６について、９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５５℃で１分、そして７２℃で３分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ００７について、９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５４℃で１分、そして７２℃で１分１５秒を４０サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ００８とＮＬ０１４について、９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５３℃で１分、そして７２℃で１分を４０サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ００９、ＮＬ０１１、ＮＬ０１２、ＮＬ０１９について、９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５５℃で１分、そして７２℃で１分を４０サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ０１０について、９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５４℃で１分、そして７２℃で２分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ０１３について、９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５４℃で１分、そして７２℃で１分１０秒を４０サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ０１５、ＮＬ０１６について、９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５４℃で１分、そして７２℃で１分４０秒を４０サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ０１８について、９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５４℃で１分、そして７２℃で１分３５秒を４０サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ０２１、ＮＬ０２２、ＮＬ０２７について、９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５４℃で１分、そして７２℃で１分４５秒を４０サイクル、続いて７２℃で１０分。得られたＰＣＲフラグメントを、アガロースゲルで解析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯベクター（Ｃａｔ．Ｎｒ．Ｋ２５００−２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列を決定した。得られたＰＣＲ産物の配列を、それぞれ配列番号により表２−ＮＬに示し、部分配列として記載する。対応する部分アミノ酸配列を、それぞれの配列番号により表３−ＮＬに表す。
【０２８６】
Ｂ．ニラパルヴァータ  ルーゲンス  ＮＬ０２３遺伝子のＥＳＴ配列を介した部分配列のクローニング
市販のキット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃａｔ．Ｎｒ．１８０８００４４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を製造者の指示に従う使用方法で、ニラパルヴァータ  ルーゲンス（供給源：Ｄｒ．Ｊ．Ａ．Ｇａｔｅｈｏｕｓｅ，Ｄｅｐｔ．  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｄｕｒｈａｍ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  ＵＫ）の高品質全ＲＮＡから、ｃＤＮＡを作製した。
【０２８７】
公的データベースＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＣＡＨ６５６７９．２のニラパルヴァータ  ルーゲンスのＥＳＴ配列に対応するニラパルヴァータ  ルーゲンスｃＤＮＡから部分ｃＤＮＡ配列であるＮＬ０２３を増幅した。ＮＬ０２３遺伝子の一部を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、特異的プライマーに基づいたＥＳＴによる一連のＰＣＲ反応をＰｅｒｆｅｃｔＳｈｏｔ（商標）ＥｘＴａｑ（Ｃａｔ  Ｎ０．ＲＲ００５Ａ，ＴａｋａｒａＢｉｏ  Ｉｎｃ．）を用いて、製造者の指示に従い行った。
【０２８８】
ＮＬ０２３に関する特異的なプライマーは、ｏＧＢＫＷ００２およびｏＧＢＫＷ００３（それぞれ配列番号１１５７と配列番号１１５８で示される）であるが、以下の条件による二つの独立したＰＣＲで使用した：９５℃で３分、続いて９５℃で３０秒、５６℃で３０秒、そして７２℃で２分を３０サイクル、続いて７２℃で１０分。得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲルで解析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯベクター（Ｃａｔ．Ｎｒ．Ｋ２５００−２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定を行った。両方のＰＣＲ産物の配列決定から得られたコンセンサス配列を、ここでは配列番号１１１１で表し、ＮＬ０２３遺伝子の部分配列として記載する。対応する部分アミノ酸配列を、配列番号１１１２に表す。
【０２８９】
Ｃ．ニラパルヴァータ  ルーゲンス遺伝子のｄｓＲＮＡ産物
ｄｓＲＮＡを、市販のキットＴ７  Ｒｉｂｏｍａｘ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＲＮＡｉ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ．Ｎｒ．Ｐ１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてミリグラム量で合成した。最初に別々に２つの単一５'Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター鋳型を別々な２つのＰＣＲ反応において作製するが、ここでそれぞれの反応において標的配列はＴ７プロモーターに対して別な向きで含んでいる。
【０２９０】
それぞれの標的遺伝子について、センスＴ７鋳型は、特異的Ｔ７フォワードプライマーおよび特異的リバースプライマーを用いて生成した。それぞれの標的遺伝子についてセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８−ＮＬに示す。ＰＣＲ反応における条件は以下のとおりである：  ＮＬ００１、ＮＬ００２について、９４℃で４分、続いて９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、そして７２℃で１分を３５サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ００３について、９４℃で４分、続いて９４℃で３０秒、６６℃で３０秒、そして７２℃で１分を３５サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ００４、ＮＬ００６、ＮＬ００８、ＮＬ００９、ＮＬ０１０、ＮＬ０１９について、９５℃で４分、続いて９５℃で３０秒、５４℃で３０秒、そして７２℃で１分を３５サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ００５、ＮＬ０１６について、９５℃で４分、続いて９５℃で３０秒、５７℃で３０秒、そして７２℃で１分を３５サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ００７、ＮＬ０１４について、９５℃で４分、続いて９５℃で３０秒、５１℃で３０秒、そして７２℃で１分を３５サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ０１１、ＮＬ０１２、ＮＬ０２２について、９５℃で４分、続いて９５℃で３０秒、５３℃で３０秒、そして７２℃で１分を３５サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ０１３、ＮＬ０１５、ＮＬ０１８、ＮＬ０２１について、９５℃で４分、続いて９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、そして７２℃で１分を３５サイクル、続いて７２℃で１０分；ＮＬ０２３、ＮＬ０２７について、９５℃で４分、続いて９５℃で３０秒、５２℃で３０秒、そして７２℃で１分を３５サイクル、続いて、７２℃で１０分。アンチセンスＴ７鋳型を、特異的フォワードプライマーおよび特異的リバースプライマーを用いて、上記と同じ条件を用いて生成した。標的遺伝子のそれぞれに対するアンチセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８−ＮＬに示す。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで解析し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８１０６，Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、ＮａＣｌＯ４沈澱を行った。製造者の指示に従って、得られたＴ７フォワード鋳型およびリバース鋳型を、転写させるために混合し、得られたＲＮＡ鎖をアニーリングさせ、ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅで処理し、酢酸ナトリウムにより精製したが、以下の変更を行った：ＲＮＡペレットを、７０％エタノールで洗浄した。それぞれの標的遺伝子について得られたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、表８−ＮＬに示す。
【０２９１】
緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）コントロールがのっているＴ７プライマーによるＰＣＲ反応に用いた鋳型ＤＮＡは、ｐｌａｓｍｉｄ  ｐＰＤ９６．１２  （ｔｈｅ  Ｆｉｒｅ  Ｌａｂ，ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−  ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｇｒｏｕｐ／ｆｉｒｅ／）であり、３つの人工イントロンにより分散した野生型ｇｆｐコード配列を含む。２本鎖ＲＮＡを市販のキットＴ７  ＲｉｂｏＭＡＸ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＲＮＡｉ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ．Ｎ０．Ｐ１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて合成した。最初に別々に２つの単一５'Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター鋳型を別々な２つのＰＣＲ反応において作製するが、ここでそれぞれの反応において標的配列はＴ７プロモーターに対して別な向きで含んでいる。ｇｆｐに関して、センスＴ７鋳型は、特異的Ｔ７フォワードｏＧＡＵ１８３、および特異的リバースプライマーｏＧＡＵ１８２２（それぞれ、配列番号２３６、配列番号２３７）を用いて、以下の条件のＰＣＲ反応で生成した：９５℃で４分、続いて９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、そして７２℃で１分を３５サイクル、続いて７２℃で１０分。アンチセンスＴ７鋳型は、特異的Ｔ７フォワードｏＧＡＵ１８１、および特異的リバースプライマーｏＧＡＵ１８４（それぞれ、配列番号２３６８、配列番号２３９）を用いて、上記と同じ条件のＰＣＲ反応で生成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで解析し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８１０６，Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、ＮａＣｌＯ４沈澱を行った。製造者の指示に従って、得られたＴ７フォワード鋳型およびリバース鋳型を、転写させるために混合し、得られたＲＮＡ鎖をアニーリングさせ、ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅで処理し、酢酸ナトリウムにより精製したが、以下の変更を行った：ＲＮＡペレットを、７０％エタノールで２回洗浄した。得られたｄｓＲＮＡのセンス鎖を配列番号２３５で示す。
【０２９２】
Ｄ．ニラパルヴァータ  ルーゲンスに対する活性について液体人工餌を用いてｄｓＲＮＡをスクリーニングする研究室で試験
トビイロウンカ（ニラパルヴァータ  ルーゲンス）のための液体人工餌（ＭＭＤ−１）をＫｏｙａｍａ（１９８８）［Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｒｅａｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒｓ  ａｎｄ  ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒｓ（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ：  Ｄｅｌｐｈａｃｉｄａｅ  ａｎｄ  Ｄｅｌｔｏｃｅｐｈａｌｉｄａｅ）ｏｎ  ａｈｏｌｉｄｉｃ  ｄｉｅｔ．  Ｊ／ＡＲＱ  ２２：２０−２７］に記載のとおり調製したが、食餌成分のスクロースの終濃度に変更を加え、１４．４％（容量分の重量）とし、食餌成分を別個の濃度で調製した：１０ｘミネラルストック（４℃保存）、２ｘアミノ酸ストック（−２０℃保存）、１０ｘビタミンストック（−２０℃保存）。各ストック成分を、試験ｄｓＲＮＡ溶液（４ｘ濃縮）を用いて希釈するために、生物検定の開始直前に混合して４／３ｘ濃縮とし、ｐＨ６．５に調節し、フィルタ滅菌を、約５００μｌ一定分量とした。
【０２９３】
トビイロウンカ（ニラパルヴァータ  ルーゲンス）を、２〜３か月齢のコメ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｃｖ  Ｔａｉｃｈｕｎｇ  Ｎａｔｉｖｅ  １）植物上で、２７±２℃、相対湿度８０％、１６：８時間の明：暗光周期の環境条件に制御された部屋で飼育した。餌室は、薄く伸ばしたパラフィルムＭの単一層でおおわれた小さなペトリ皿（直径３ｃｍ）の上に５０μｌの餌を添加しており、１０の一齢もしくは二齢幼虫を含む。餌室は、パラフィルムの第二の層で密閉され、直接光にさらされない以外は成虫飼育と同じ条件下で飼育した。ｄｓＲＮＡのある餌は、一日おきに新たにされ、昆虫の生存を毎日評価した。処理ごとに、５つの生物検定餌室（レプリケート）を、同時に設定した。最終濃度が２μｇ／μｌになるように、試験とコントロール（ｇｆｐ）のｄｓＲＮＡ溶液を、餌に組み入れた。餌室は、２７±２℃、相対湿度８０％、１６：８時間の明：暗光周期の環境条件で維持した。昆虫の生存データを、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線モデルを用いて解析し、群間の生存を、ｌｏｇｒａｎｋ  ｔｅｓｔ（Ｐｒｉｓｍｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０）を用いて比較した。
【０２９４】
インビトロで、インタクトな裸のｄｓＲＮＡを添加した液体人工餌をニラパルヴァータ  ルーゲンスに餌室を用いて与えた結果、４つの別個の生物検定（図１（ａ）−（ｄ）−ＮＬ；表１０−ＮＬ（ａ）−（ｄ））（Ｄｕｒｈａｍ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）に示すように幼虫の致死率において有意な増加を生じた。これらの結果は、異なる必須ＢＰＨ遺伝子に対応するｄｓＲＮＡが、トビイロウンカに対して有意な毒性を示したことを示す。
【０２９５】
ＢＰＨ生存に対する生物検定におけるｇｆｐ ｄｓＲＮＡの効果は、餌のみでの生存と、有意な違いはない。
【０２９６】
表１０−ＮＬ（ａ）〜（ｄ）は、以下の標的の２ｍｇ／ｍｌ（最終濃度）を添加した人工餌における、ニラパルヴァータ  ルーゲンス生存の概要を示す：表１０−ＮＬ（ａ）：ＮＬ００２、ＮＬ００３、ＮＬ００５、ＮＬ０１０；表１０−ＮＬ（ｂ）：ＮＬ００９、ＮＬ０１６；表１０−ＮＬ（ｃ）：ＮＬ０１４、ＮＬ０１８；表１０−ＮＬ（ｄ）：  ＮＬ０１３、ＮＬ０１５、ＮＬ０２１。生存解析欄において、ＲＮＡｉの効果は、以下の通りに示される：＋＝ｇｆｐｄｓＲＮＡコントロールと比較して有意に生存が減少（α＜０．０５）；−＝ｇｆｐ ｄｓＲＮＡコントロールと比較して有意な違いがない。生存曲線を、（餌のみと試験ｄｓＲＮＡを含む人工餌；ｇｆｐｄｓＲＮＡと試験ｄｓＲＮＡ；餌のみとｇｆｐｄｓＲＮＡの間で、）ｌｏｇｒａｎｋ  ｔｅｓｔを用いて比較した。
【０２９７】
Ｅ．ニラパルヴァータ  ルーゲンスに対する活性に関し、異なる濃度の人工餌を用いてｄｓＲＮＡをスクリーニングする研究室での試験
異なる濃度の標的ＮＬ００２ ｄｓＲＮＡを添加した液体人工餌５０μｌ、すなわち１、０．２、０．０８および０．０４ｍｇ／ｍｌ（最終濃度）を、トビイロウンカ餌室に与えた。ｄｓＲＮＡのある餌は、一日置きに新たにし、昆虫の生存を毎日評価した。処理ごとに５生物検定餌室（レプリケート）を、同時に設定した。餌室を、２７±２℃、相対湿度８０％、１６：８時間の明：暗光周期に維持した。昆虫の生存データを、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線モデルを用いて解析し、群間の生存を、ｌｏｇｒａｎｋ  ｔｅｓｔ（Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０）を用いて比較した。
【０２９８】
異なる濃度で標的ＮＬ００２のインタクトな裸のｄｓＲＮＡを添加した液体人工餌を与えた結果、図２−ＮＬおよび表１１−ＮＬに示すように、餌のみの生存と比較すると、餌１ｍｌあたり０．０４ｍｇのｄｓＲＮＡと同程度の低い最終濃度において、有意に高いＢＰＨ致死率を生じた。表１１−ＮＬは、ニラパルヴァータ  ルーゲンスの標的ＮＬ００２の１、０．２、０．０８および０．０４ｍｇ／ｍｌ（最終濃度）を添加した人工餌における生存の概要を示す。生存解析欄において、ＲＮＡｉの効果は、以下の通りに示される：＋＝ｇｆｐｄｓＲＮＡコントロールと比較して有意に生存が減少（α＜０．０５）；−＝ｇｆｐ ｄｓＲＮＡコントロールと比較して有意な違いがない。生存曲線を、（餌のみと試験ｄｓＲＮＡを含む人工餌；ｇｆｐｄｓＲＮＡと試験ｄｓＲＮＡ；餌のみとｇｆｐｄｓＲＮＡの間で、）ｌｏｇｒａｎｋ  ｔｅｓｔを用いて比較した。
【０２９９】
Ｆ．昆虫活性２本鎖ＲＮＡの細菌生成に適したベクターにおけるＢＰＨ遺伝子断片のクローニング
細菌における効率的な転写のためにＴ７プロモータもしくは他のプロモータを含むいかなるベクターを用いてもよいけれども（参照ＷＯ０００１８４６）、以下のものは、細菌宿主における２本鎖ＲＮＡの発現のためのベクターにおけるＲＦＢ遺伝子標的に対応するＤＮＡ断片をクローニングする例示である。
【０３００】
標的遺伝子の増幅のために用いる特異的プライマーの配列を表８−ＮＬに示す。用いた鋳型は、標的配列のいずれかを含むｐＣＲ８／ＧＷ／ｔｏｐｏベクターである。プライマーは以下の条件によるＰＣＲ反応に用いる：９８℃で５分、続いて９８℃で１０秒、５５℃で３０秒そして７２℃で２分を３０サイクル、続いて７２℃で１０分。生じたＰＣ断片を、アガロースゲルで解析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、Ｓｒｆ  Ｉ線状化ｐＧＮＡ４９Ａベクター（ＷＯ００１８８１２１Ａ１参照）に平滑末端クローニングし、配列決定した。生成したＰＣＲ産物の配列は、表８−ＮＬに示すそれぞれの配列に対応する。この配列を持つ組換えベクターを、ｐＧＸＸＸ０ＸＸと称する。
【０３０１】
Ｇ．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの二つの株（１）ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）および（２）ＢＬ２１（ＤＥ３）における２本鎖ＲＮＡ標的の発現と生成
以下に記載の手法は、細菌における昆虫標的の昆虫活性２本鎖ＲＮＡの好適なレベルを発現するために続けられる。ＲＮａｓｅＩＩＩ欠損株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）を、野生型のＲＮａｓｅＩＩＩ含有細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）と比較して用いた。
【０３０２】
ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）およびＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換
プラスミド３００ｎｇを添加し、氷冷した化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ株  ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）またはＢＬ２１（ＤＥ３）の５０μｌ分割量に徐々に混合した。細胞を、３７℃５分間の熱ショック処理にさらす前に、２０分間、氷上でインキュベートし、その後、細胞を、さらに５分間氷上に戻した。４５０μｌの室温ＳＯＣ培地を細胞に添加し、懸濁物を３７℃１時間でシェイカー（２５０ｒｐｍ）でインキュベートした。１００μｌの細菌細胞懸濁物を、１００μｇ／ｍｌカルベニシリン抗生物質を補充した液体Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス１５０ｍｌを含む５００ｍｌ三角フラスコに移した。培養物をＩｎｎｏｖａ４４３０シェイカー（２５０ｒｐｍ）で、３７℃で、一晩（１６〜１８時間）インキュベートした。
【０３０３】
ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）およびＢＬ２１（ＤＥ３）における２本鎖ＲＮＡ発現の化学的誘導
制御した発現のための全ての遺伝的成分が存在するため、細菌株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）またはＢＬ２１（ＤＥ３）における組換えベクターｐＧＸＸＸ０ＸＸからの２本鎖ＲＮＡの発現が可能となった。化学的誘導剤イソプロピルチオガラクトシドまたはＩＰＴＧの存在下で、Ｔ７ポリメラーゼがアンチセンスとセンス方向の両方において標的遺伝子の転写を駆動する。これは、反対に配向させたＴ７プロモータによりこれらが隣接されるからである。
【０３０４】
細菌の一晩培養物の６００ｎｍの光学密度を、適切な分光光度計を用いて測定し、新鮮なＬＢ培地を添加することにより、値を１に調節した。この培養物５０ｍｌを、５０ｍｌファルコンチューブに移し、培養物をその後、３０００ｇで、１５℃で、１０分間遠心分離した。上清を除去し、細菌ペレットを１００μｇ／ｍｌカルベニシリンと１ｍＭ  ＩＰＴＧを補充した新鮮なＳ完全培地（ＳＮＣ培地と５μｇ／ｍｌコレステロール）５０ｍｌに再懸濁した。細菌を２〜４時間室温で誘導した。
【０３０５】
細菌の熱処理
細菌を、試験プレート内の人工餌の汚染の危険を最小限にするために熱処理によって殺した。しかし、２本鎖ＲＮＡを発現する細菌の熱処理は、ＲＮＡ干渉による昆虫に対する毒性の誘導のための必要条件ではない。誘導された細菌培養物を、３０００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを８０℃、２０分間の温浴にさらした。熱処理後、細菌ペレットを１．５ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水で再懸濁し、懸濁物を微量遠心管チューブに移した。いくつかのチューブを準備し、各リフレッシュメントのためのバイオアッセイにおいて用いた。チューブを−２０℃でさらに使用するまで貯蔵した。
【０３０６】
Ｈ．ニラパルバータ・ルゲンス(Nilaparvata  lugens)に対するｄｓＲＮＡ標的を発現する大腸菌を試験するための実験室の試み
植物べースのバイオアッセイ
ＢＰＨに植物を与えるまえに、植物全体にｄｓＲＮＡを発現する化学的に誘導した細菌の懸濁物を噴霧した。植物は、植物生育室で生育される。植物を、５００ｍｌプラスチック瓶をさかさまにおき鉢の土壌に固定して置いた瓶の首により植物を覆って閉じ込め、底は切って開き、通気可能なように細かいナイロンメッシュで覆い、内部の結露を減少させ、昆虫が逃げるのを防ぐ。ケージ内の各々の処理された植物にＢＰＨを置いた。植物を、ｐＧＸＸＸ０ＸＸプラスミドまたはｐＧＮ２９プラスミドを持つ大腸菌ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）の懸濁物で処理した。異なる量の細菌：例えば、６６、２２、７単位を植物に適用し、ここで１単位は、６００ｎｍ波長の光学密度の値が１である細菌懸濁物１ｍｌ中１０９  細菌細胞として定義される。各々の場合において、全量１〜１０ｍｌが、噴霧器の補助により植物に噴霧された。１植物を、この試みの１処理ごとに用いた。生存数を計数し、各々生き残りの重量を記録した。
【０３０７】
ｐＧＮ２９対照と比較して、ｐＧＸＸＸ０ＸＸからの標的ｄｓＲＮＡを発現する大腸菌細菌株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）の懸濁物による植物の噴霧は、昆虫の死亡率の劇的な増加を導く。これらの実験は、野生型もしくはＲＮａｓｅＩＩＩ欠損細菌発現システムのいずれかで生成された昆虫遺伝子標的配列に対応する２本鎖ＲＮＡは、昆虫死亡率および幼虫生き残りの成長／発達の遅れにおける大きな増加という観点で昆虫に対する毒性があることを示した。これらの実験より明らかなのは、例証が、昆虫遺伝子標的に対応する２本鎖ＲＮＡを発現する細菌からなる製剤のスプレーの使用により、昆虫障害からの植物／作物の効果的保護を与えることである。
【０３０８】
実施例１０：キロ  サプレッサリス(Chilo suppressalis)（ニカメイチュウ）
Ａ．キロ  サプレッサリス遺伝子のファミリーＰＣＲを介したクローニング
ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｃａｔ．  Ｎｒ．  １５５９６−０２６／１５５９６−０１８，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，  ＵＳＡ）を製造者の指示に従って使用し、キロ  サプレッサリス（ニカメイチュウ）の４つの異なる幼虫段階から高品質で、インタクトなＲＮＡを単離した。製造者の指示に従ったＤＮａｓｅ処理（Ｃａｔ．Ｎｒ．１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）により、ＲＮＡ調製物中に存在するゲノムＤＮＡを除去した。市販のキット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃａｔ．Ｎｒ．１８０８００４４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を製造者の指示に従い使用し、ｃＤＮＡを生成した。
【０３０９】
ＣＳ００１、ＣＳ００２、ＣＳ００３、ＣＳ００６、ＣＳ００７、ＣＳ００９、ＣＳ０１１、ＣＳ０１３、ＣＳ０１４、ＣＳ０１５、ＣＳ０１６およびＣＳ０１８遺伝子の一部を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、製造者の指示に従いＡｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ｃａｔ．Ｎｒ．Ｎ８０８０２４０，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、変性プライマーでの一連のＰＣＲ反応を行った。
【０３１０】
それぞれの遺伝子の増幅に用いた変性プライマーの配列を、表２−ＣＳに示す。これらのプライマーは、それぞれのＰＣＲ反応において、以下の条件により用いられた。：９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５５℃で１分、そして７２℃で１分を４０サイクル、続いて７２℃で１０分。得られたＰＣＲフラグメントを、アガロースゲルで解析、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ４／ＴＯＰＯベクター（Ｃａｔ．Ｎｒ．Ｋ２５００−２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列を決定した。得られたＰＣＲ産物の配列を、それぞれ配列番号により表２−ＣＳに示し、部分配列として記載する。対応する部分アミノ酸配列を、それぞれの配列番号により表３−ＣＳに表す。
【０３１１】
Ｂ．キロ  サプレッサリス遺伝子のｄｓＲＮＡ生成
ｄｓＲＮＡを、市販のキットＴ７  Ｒｉｂｏｍａｘ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＲＮＡｉ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ．Ｎｒ．Ｐ１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてミリグラム量で合成した。最初に別々に２つの単一５'Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター鋳型を別々な２つのＰＣＲ反応において作製するが、ここでそれぞれの反応において標的配列はＴ７プロモーターに対して別な向きで含んでいる。
【０３１２】
それぞれの標的遺伝子について、センスＴ７鋳型は、特異的Ｔ７フォワードプライマーおよび特異的リバースプライマーを用いて生成した。それぞれの標的遺伝子についてセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８−ＣＳに示す。ＰＣＲ反応の条件は、以下のとおりである：９５℃で４分、続いて９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を３５サイクル、続いて７２℃で１０分。アンチセンスＴ７鋳型を、特異的フォワードプライマーおよび特異的リバースプライマーを用いて、上記と同じ条件を用いて生成した。標的遺伝子のそれぞれに対するアンチセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８−ＣＳに示す。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで解析し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８１０６，Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、ＮａＣｌＯ４沈澱を行った。製造者の指示に従って、得られたＴ７フォワード鋳型およびリバース鋳型を、転写させるために混合し、得られたＲＮＡ鎖をアニーリングさせ、ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅで処理し、酢酸ナトリウムにより精製した。それぞれの標的遺伝子について得られたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、表８−ＣＳに示す。
【０３１３】
Ｃ．キロ  サプレッサリス幼虫に対する活性について、人工餌を用いたｄｓＲＮＡ標的を試験する研究室の試験
ニカメイチュウ（キロ  サプレッサリス）（供給源：Ｓｙｎｇｅｎｔａ，Ｓｔｅｉｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、ＫａｍａｎｏａｎｄＳａｔｏ，１９８５（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｒｅａｒｉｎｇ．Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ＆  ＩＩ．  Ｐ  Ｓｉｎｇｈ  ａｎｄ  ＲＦＭｏｏｒｅ，ｅｄｓ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５，ｐｐ４４８）の記載に基づいて変更を加えた人工餌で維持した。簡単にいうと、１リットルの餌を、以下の通り作製した：２０ｇの寒天を、９８０ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に添加し、オートクレーブした；該寒天溶液を、約５５℃まで冷まし、残りの成分を添加し、完全に混合した：トウモロコシ粉（挽いた）４０ｇ、セルロース２０ｇ、ショ糖３０ｇ、カゼイン３０ｇ、小麦粉（あぶった）２０ｇ、ウェッソン（Ｗｅｓｓｏｎ）混合塩８ｇ、Ｖａｎｄｅｒｚａｎｔ混合ビタミン１２ｇ、ソルビン酸１．８ｇ、ｎｉｐａｇｉｎ（メチルパラベン）１．６ｇ、オーレオマイシン０．３ｇ、コレステロール０．４ｇおよびＬ−システイン０．６ｇ。餌を約４５℃まで冷やし、餌やりトレーかカップに注いだ。餌を、水平積層フローキャビンに取り付けて放置した。産み付けられた卵のあるコメの葉部分を、成虫蛾を収容するケージから除去し、餌やりカップもしくはトレーに固体餌にピン止めした。卵は、放置して孵化させ、新生幼虫は、生物検定および昆虫飼育の維持が利用可能となった。試験と飼育中、２８±２℃および８０±５％相対湿度、１６：８時間明：暗の光周期の環境条件とした。
【０３１４】
同じ人工餌を、生物検定に用いたが、食餌を２４マルチウェルプレートに等量注ぎ、各ウェルが１ｍｌ餌を有するようにした。餌がいったん設置されたら、試験製剤を、食餌の表面（２ｃｍ２）に適用し、１μｇ／μｌ標的ｄｓＲＮＡを５０μｌの割合とした。ｄｓＲＮＡ溶液を、放置して乾燥させ、二つの一齢蛾幼虫を、各ウェルにおいた。７日後、幼虫を新鮮な処理した餌があるマルチウェルプレート上に移した。１４日目（すなわち、生物検定開始後１４日）に、昆虫の生死の数を記録し、異常性について検討した。全部で２４幼虫が処理あたり試験された。
【０３１５】
別の生物検定として、処理されたコメ葉を、ニカメイチュウの新生幼虫に与えた。インディカ米の亜種Ｔａｉｃｈｕｎｇ  ｎａｔｉｖｅ  １の小さな葉の部分を、１μｇ／μｌ標的ｄｓＲＮＡ含有０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液に浸漬し、放置して乾燥させ、各部分をゲル化した２％寒天を含む２４マルチウェルプレートのウェルに置いた。２つの新生幼虫を、餌やりトレーから各ｄｓＲＮＡ処理葉部分（処理あたり、２４幼虫）に移した。４および８日後、幼虫を、新鮮な処理コメ葉部分に移した。幼虫の生死の数を、４、８、１２日に評価し、いかなる異常も記録した。
【０３１６】
Ｄ．昆虫活性２本鎖ＲＮＡの細菌生成に適したベクターにおけるＳＳＢ遺伝子断片のクローニング
細菌における効率的な転写のためにＴ７プロモータもしくは他のプロモータを含むいかなるベクターを用いてもよいけれども（参照ＷＯ０００１８４６）、以下のものは、細菌宿主における２本鎖ＲＮＡの発現のためのベクターにおけるＲＦＢ遺伝子標的に対応するＤＮＡ断片をクローニングする例示である。
【０３１７】
標的遺伝子の増幅のために用いる特異的プライマーの配列を表８−ＣＳに示す。用いた鋳型は、標的配列のいずれかを含むｐＣＲ８／ＧＷ／ｔｏｐｏベクターである。プライマーは以下の条件によるＰＣＲ反応に用いた：９８℃で５分、続いて９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、そして７２℃で２分を３０サイクル、続いて７２℃で１０分。生じたＰＣ断片を、アガロースゲルで解析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、Ｓｒｆ  Ｉ線状化ｐＧＮＡ４９Ａベクター（ＷＯ００１８８１２１Ａ１参照）に平滑末端クローニングし、配列決定した。生成したＰＣＲ産物の配列は、表８−ＣＳに示すそれぞれの配列に対応する。この配列を持つ組換えベクターを、ｐＧＸＸＸ０ＸＸと称する。
【０３１８】
Ｅ．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの二つの株（１）ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）および（２）ＢＬ２１（ＤＥ３）における２本鎖ＲＮＡ標的の発現と生成
以下に記載の手法は、細菌における昆虫標的の昆虫活性２本鎖ＲＮＡの好適なレベルを発現するために続けられる。ＲＮａｓｅＩＩＩ欠損株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）を、野生型のＲＮａｓｅＩＩＩ含有細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）と比較して用いた。
【０３１９】
ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）およびＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換
プラスミド３００ｎｇを添加し、氷冷した化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ株  ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）またはＢＬ２１（ＤＥ３）の５０μｌ分割量に徐々に混合した。細胞を、３７℃５分間の熱ショック処理にさらす前に、２０分間、氷上でインキュベートし、その後、細胞を、さらに５分間氷上に戻した。４５０μｌの室温ＳＯＣ培地を細胞に添加し、懸濁物を３７℃１時間でシェイカー（２５０ｒｐｍ）でインキュベートした。１００μｌの細菌細胞懸濁物を、１００μｇ／ｍｌカルベニシリン抗生物質を補充した液体Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス１５０ｍｌを含む５００ｍｌ三角フラスコに移した。培養物をＩｎｎｏｖａ４４３０シェイカー（２５０ｒｐｍ）で、３７℃で、一晩（１６〜１８時間）インキュベートした。
【０３２０】
ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）およびＢＬ２１（ＤＥ３）における２本鎖ＲＮＡ発現の化学的誘導
制御した発現のための全ての遺伝的成分が存在するため、細菌株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）またはＢＬ２１（ＤＥ３）における組換えベクターｐＧＸＸＸ０ＸＸからの２本鎖ＲＮＡの発現が可能となった。化学的誘導剤イソプロピルチオガラクトシドまたはＩＰＴＧの存在下で、Ｔ７ポリメラーゼがアンチセンスとセンス方向の両方において標的遺伝子の転写を駆動する。これは、反対に配向させたＴ７プロモータによりこれらが隣接されるからである。
【０３２１】
細菌の一晩培養物の６００ｎｍの光学密度を、適切な分光光度計を用いて測定し、新鮮なＬＢ培地を添加することにより、値を１に調節した。この培養物５０ｍｌを、５０ｍｌファルコンチューブに移し、培養物をその後、３０００ｇで、１５℃で、１０分間遠心分離した。上清を除去し、細菌ペレットを１００μｇ／ｍｌカルベニシリンと１ｍＭ  ＩＰＴＧを補充した新鮮なＳ完全培地（ＳＮＣ培地と５μｇ／ｍｌコレステロール）５０ｍｌに再懸濁した。細菌を２〜４時間室温で誘導した。
【０３２２】
細菌の熱処理
細菌を、試験プレート内の人工餌の汚染の危険を最小限にするために熱処理によって殺した。しかし、２本鎖ＲＮＡを発現する細菌の熱処理は、ＲＮＡ干渉による昆虫に対する毒性の誘導のための必要条件ではない。誘導された細菌培養物を、３０００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを８０℃、２０分間の温浴にさらした。熱処理後、細菌ペレットを１．５ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水で再懸濁し、懸濁物を微量遠心管チューブに移した。いくつかのチューブを準備し、各リフレッシュメントのためのバイオアッセイにおいて用いた。チューブを−２０℃でさらに使用するまで貯蔵した。
【０３２３】
Ｆ．キロ・サプレサリス(Chilo  suppressalis)に対するｄｓＲＮＡ標的を発現する大腸菌を試験するための実験室の試み
植物べースのバイオアッセイ
ＳＳＢに植物を与えるまえに、植物全体にｄｓＲＮＡを発現する化学的に誘導した細菌の懸濁物を噴霧した。植物は、植物生育室で生育される。植物を、５００ｍｌプラスチック瓶をさかさまにおき鉢の土壌に固定して置いた瓶の首により植物を覆って閉じ込め、底は切って開き、通気可能なように細かいナイロンメッシュで覆い、内部の結露を減少させ、昆虫が逃げるのを防ぐ。ケージ内の各々の処理された植物にＳＳＢを置いた。植物を、ｐＧＸＸＸ０ＸＸプラスミドまたはｐＧＮ２９プラスミドを持つ大腸菌ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）の懸濁物で処理した。異なる量の細菌：例えば、６６、２２、７単位を植物に適用し、ここで１単位は、６００ｎｍ波長の光学密度の値が１である細菌懸濁物１ｍｌ中１０９  細菌細胞として定義される。各々の場合において、全量１〜１０ｍｌが、噴霧器の補助により植物に噴霧された。１植物を、この試みの１処理ごとに用いた。生存数を計数し、各々生き残りの重量を記録した。
【０３２４】
ｐＧＮ２９対照と比較して、ｐＧＸＸＸ０ＸＸからの標的ｄｓＲＮＡを発現する大腸菌細菌株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）の懸濁物による植物の噴霧は、昆虫の死亡率の劇的な増加を導く。これらの実験は、野生型もしくはＲＮａｓｅＩＩＩ欠損細菌発現システムのいずれかで生成された昆虫遺伝子標的配列に対応する２本鎖ＲＮＡは、昆虫死亡率および幼虫生き残りの成長／発達の遅れにおける大きな増加という観点で昆虫に対する毒性があることを示した。これらの実験より明らかなのは、例証が、昆虫遺伝子標的に対応する２本鎖ＲＮＡを発現する細菌からなる製剤のスプレーの使用により、昆虫障害からの植物／作物の効果的保護を与えることである。
【０３２５】
実施例１１：プルテッラ キシロステッラ(Plutella xylostella)（コナガ）
Ａ．プルテッラ キシロステッラ遺伝子のクローニング
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｃａｔ．Ｎｒ．１５５９６−０２６／１５５９６−０１８，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を製造者の指示にどおりに使用し、異なる全ての幼虫段階のプルテッラキシロステッラ（コナガ；供給源：Ｄｒ．Ｌａｒａ  Ｓｅｎｉｏｒ，Ｉｎｓｅｃｔ  ＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓＬｔｄ．，Ｃａｐｉｔａｌ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｐａｒｋ，  Ｗｅｎｔｌｏｏｇ，Ｃａｒｄｉｆｆ，ＣＦ３  ２ＰＸ，Ｗａｌｅｓ，ＵＫ）から高品質で、インタクトなＲＮＡを単離した。ＲＮＡ調製物において存在するゲノムＤＮＡは、製造者の指示に従ったＤＮａｓｅ処理（Ｃａｔ．Ｎｒ．１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）により、ＲＮＡ調製物中に存在するゲノムＤＮＡを除去した。市販のキット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃａｔ．Ｎｒ．１８０８００４４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を製造者の指示に従い使用し、ｃＤＮＡを生成した。
【０３２６】
ＰＸ００１、ＰＸ００９、ＰＸ０１０、ＰＸ０１５、ＰＸ０１６遺伝子の一部を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、製造者の指示に従い、Ａｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ｃａｔ．Ｎｒ．Ｎ８０８０２４０，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、変性プライマーでの一連のＰＣＲ反応を行った。
【０３２７】
それぞれの遺伝子の増幅に用いた変性プライマーの配列を、表２−ＰＸに示す。これらのプライマーは、それぞれのＰＣＲ反応において、以下の条件により用いられた：９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５０℃で１分、そして７２℃で１分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃で７分（ＰＸ００１、ＰＸ００９、ＰＸ０１５、ＰＸ０１６）；９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５４℃で１分、そして７２℃で２分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃で７分を行った（ＰＸ０１０）。得られたＰＣＲフラグメントを、アガロースゲルで解析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯベクター（Ｃａｔ．Ｎｒ．Ｋ２５００−２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列を決定した。得られたＰＣＲ産物の配列を、それぞれ配列番号により表２−ＰＸに示し、部分配列として記載する。対応する部分アミノ酸配列を、それぞれの配列番号により表３−ＰＸに表す。
【０３２８】
Ｂ．プルテッラ キシロステッラ遺伝子のｄｓＲＮＡ生成
ｄｓＲＮＡを、市販のキットＴ７  Ｒｉｂｏｍａｘ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＲＮＡｉ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ．Ｎｒ．Ｐ１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてミリグラム量で合成した。最初に別々に２つの単一５'Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター鋳型を別々な２つのＰＣＲ反応において作製するが、ここでそれぞれの反応において標的配列はＴ７プロモーターに対して別な向きで含んでいる。
【０３２９】
それぞれの標的遺伝子について、センスＴ７鋳型は、特異的Ｔ７フォワードプライマーおよび特異的リバースプライマーを用いて生成した。それぞれの標的遺伝子についてセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８−ＰＸに示す。ＰＣＲ反応の条件は、以下のとおりである：９５℃で１分、続いて９５℃で３０秒を２０サイクル、６０℃で３０秒（−０．５℃／ｃｙｃｌｅ）、７２℃で１分、続いて９５℃で３０秒を１５サイクル、５０℃で３０秒、７２℃で１分、続いて７２℃で１０分。アンチセンスＴ７鋳型を、特異的フォワード、および特異的Ｔ７リバースプライマーを用いて、上記と同じ条件のＰＣＲ反応で生成した。標的遺伝子の各々に対するアンチセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列は、表８−ＰＸに示す。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで解析し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８１０６，Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、ＮａＣｌＯ４沈澱を行った。製造者の指示に従って、得られたＴ７フォワード鋳型およびリバース鋳型を、転写させるために混合し、得られたＲＮＡ鎖をアニーリングさせ、ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅで処理し、酢酸ナトリウムにより精製した。それぞれの標的遺伝子について得られたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、表８−ＰＸに示す。
【０３３０】
Ｃ．プルテッラ キシロステッラ幼虫に対する活性について、人工餌を用いたｄｓＲＮＡ標的を試験する研究室の試験
コナガ（プルテッラ キシロステッラ）を、Ｉｎｓｅｃｔ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ．（供給源：Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ−ｕｐｏｎ−Ｔｙｎｅ，ＵＫ）で維持した。昆虫を、キャベツの葉で飼育した。一齢幼虫、雌雄混合幼虫（約１日齢）を、試験に使用するために選択した。昆虫を、エッペンドルフチューブ（１．５ｍｌ容量）にいれて、維持した。市販のコナガ餌（Ｂｉｏ−Ｓｅｒｖ，  ＮＪ，ＵＳＡ）を、製造者の指示に従って調製し、各チューブの蓋に乗せた（０．２５ｍｌ容量、８ｍｍ直径）。液体状態において、食餌の過剰分を取り除くことにより滑らかにし、平らな表面を作った。
【０３３１】
餌が一旦セットされたら、試験製剤を食餌表面にのせ、レプリケートあたり２５μｌの非希釈製剤（１μｇ／μｌ  標的ｄｓＲＮＡ）の割合とした。試験製剤を乾燥させて、１つの一齢蛾幼虫を各チューブに置いた。幼虫を蓋の食餌の表面におき、チューブを注意深く閉じた。チューブをさかさまにして保存し、各幼虫が蓋の上の食餌の表面に残るようにした。１週間に２回、幼虫を新鮮な食餌の入った新しいエッペンドルフチューブに移す。試験の最初の２週間、昆虫に処理された餌を与え、その後未処理の餌を与えた。
【０３３２】
評価を、全ての幼虫が死ぬ時点で、全３８日の間、週に２回行った。各評価にて、昆虫を、生死について評価し、異常性について試験した。４０の単一幼虫レプリケートが、各々の処理について行われる。試験中、２３〜２６℃、５０〜６５％の相対湿度、１６：８時間の明：暗光周期の条件とした。
【０３３３】
Ｄ．昆虫活性２本鎖ＲＮＡの細菌生成に適したベクターにおけるＤＢＭ遺伝子断片のクローニング
細菌における効率的な転写のためにＴ７プロモータもしくは他のプロモータを含むいかなるベクターを用いてもよく（参照ＷＯ０００１８４６）、以下のものは、細菌宿主における２本鎖ＲＮＡの発現のためのベクターにおけるＤＢＭ遺伝子標的に対応するＤＮＡ断片をクローニングする例示である。
【０３３４】
標的遺伝子の増幅のために用いる特異的プライマーの配列を表８−ＰＸに示す。用いた鋳型は、標的配列のいずれかを含むｐＣＲ８／ＧＷ／ｔｏｐｏベクターである。プライマーは以下の条件によるＰＣＲ反応に用いた：９８℃で５分、続いて９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、そして７２℃で２分を３０サイクル、続いて７２℃で１０分。生じたＰＣ断片を、アガロースゲルで解析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、Ｓｒｆ  Ｉ線状化ｐＧＮＡ４９Ａベクター（ＷＯ００１８８１２１Ａ１参照）に平滑末端クローニングし、配列決定した。生成したＰＣＲ産物の配列は、表８−ＰＸに示すそれぞれの配列に対応する。この配列を持つ組換えベクターを、ｐＧＸＸＸ０ＸＸと称する。 
【０３３５】
Ｅ．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの二つの株（１）ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）および（２）ＢＬ２１（ＤＥ３）における２本鎖ＲＮＡ標的の発現と生成
以下に記載の手法は、細菌における昆虫標的の昆虫活性２本鎖ＲＮＡの好適なレベルを発現するために続けられる。ＲＮａｓｅＩＩＩ欠損株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）を、野生型のＲＮａｓｅＩＩＩ含有細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）と比較して用いた。
【０３３６】
ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）およびＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換
プラスミド３００ｎｇを添加し、氷冷した化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ株  ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）またはＢＬ２１（ＤＥ３）の５０μｌ分割量に徐々に混合した。細胞を、３７℃５分間の熱ショック処理にさらす前に、２０分間、氷上でインキュベートし、その後、細胞を、さらに５分間氷上に戻した。４５０μｌの室温ＳＯＣ培地を細胞に添加し、懸濁物を３７℃１時間でシェイカー（２５０ｒｐｍ）でインキュベートした。１００μｌの細菌細胞懸濁物を、１００μｇ／ｍｌカルベニシリン抗生物質を補充した液体Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス１５０ｍｌを含む５００ｍｌ三角フラスコに移した。培養物をＩｎｎｏｖａ４４３０シェイカー（２５０ｒｐｍ）で、３７℃で、一晩（１６〜１８時間）インキュベートした。
【０３３７】
ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）およびＢＬ２１（ＤＥ３）における２本鎖ＲＮＡ発現の化学的誘導
制御した発現のための全ての遺伝的成分が存在するため、細菌株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）またはＢＬ２１（ＤＥ３）における組換えベクターｐＧＸＸＸ０ＸＸからの２本鎖ＲＮＡの発現が可能となった。化学的誘導剤イソプロピルチオガラクトシドまたはＩＰＴＧの存在下で、Ｔ７ポリメラーゼがアンチセンスとセンス方向の両方において標的遺伝子の転写を駆動する。これは、反対に配向させたＴ７プロモータによりこれらが隣接されるからである。
【０３３８】
細菌の一晩培養物の６００ｎｍの光学密度を、適切な分光光度計を用いて測定し、新鮮なＬＢ培地を添加することにより、値を１に調節した。この培養物５０ｍｌを、５０ｍｌファルコンチューブに移し、培養物をその後、３０００ｇで、１５℃で、１０分間遠心分離した。上清を除去し、細菌ペレットを１００μｇ／ｍｌカルベニシリンと１ｍＭ  ＩＰＴＧを補充した新鮮なＳ完全培地（ＳＮＣ培地と５μｇ／ｍｌコレステロール）５０ｍｌに再懸濁した。細菌を２〜４時間室温で誘導した。
【０３３９】
細菌の熱処理
細菌を、試験プレート内の人工餌の汚染の危険を最小限にするために熱処理によって殺した。しかし、２本鎖ＲＮＡを発現する細菌の熱処理は、ＲＮＡ干渉による昆虫に対する毒性の誘導のための必要条件ではない。誘導された細菌培養物を、３０００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを８０℃、２０分間の温浴にさらした。熱処理後、細菌ペレットを１．５ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水で再懸濁し、懸濁物を微量遠心管チューブに移した。いくつかのチューブを準備し、各リフレッシュメントのためのバイオアッセイにおいて用いた。チューブを−２０℃でさらに使用するまで貯蔵した。
【０３４０】
Ｆ．プルテラ・キシロステラ(Plutella  xylostella)に対するｄｓＲＮＡ標的を発現する大腸菌を試験するための実験室の試み 
植物べースのバイオアッセイ
ＤＢＭに植物を与えるまえに、植物全体にｄｓＲＮＡを発現する化学的に誘導した細菌の懸濁物を噴霧した。植物は、植物生育室で生育される。植物を、５００ｍｌプラスチック瓶をさかさまにおき鉢の土壌に固定して置いた瓶の首により植物を覆って閉じ込め、底は切って開き、通気可能なように細かいナイロンメッシュで覆い、内部の結露を減少させ、昆虫が逃げるのを防ぐ。ケージ内の各々の処理された植物にＤＢＭを置いた。植物を、ｐＧＸＸＸ０ＸＸプラスミドまたはｐＧＮ２９プラスミドを持つ大腸菌ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）の懸濁物で処理した。異なる量の細菌：例えば、６６、２２、７単位を植物に適用し、ここで１単位は、６００ｎｍ波長の光学密度の値が１である細菌懸濁物１ｍｌ中１０９  細菌細胞として定義される。各々の場合において、全量１〜１０ｍｌが、噴霧器の補助により植物に噴霧された。１植物を、この試みの１処理ごとに用いた。生存数を計数し、各々生き残りの重量を記録した。
【０３４１】
ｐＧＮ２９対照と比較して、ｐＧＸＸＸ０ＸＸからの標的ｄｓＲＮＡを発現する大腸菌細菌株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）の懸濁物による植物の噴霧は、昆虫の死亡率の劇的な増加を導く。これらの実験は、野生型もしくはＲＮａｓｅＩＩＩ欠損細菌発現システムのいずれかで生成された昆虫遺伝子標的配列に対応する２本鎖ＲＮＡは、昆虫死亡率および幼虫生き残りの成長／発達の遅れにおける大きな増加という観点で昆虫に対する毒性があることを示した。これらの実験より明らかなのは、例証が、昆虫遺伝子標的に対応する２本鎖ＲＮＡを発現する細菌からなる製剤のスプレーの使用により、昆虫障害からの植物／作物の効果的保護を与えることである。
【０３４２】
実施例１２：アチェタ ドメスティカス(Acheta domesticus)(イエコオロギ）
Ａ．アチェタ ドメスティカスの部分遺伝子配列のクローニング
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｃａｔ．  Ｎｒ．  １５５９６−０２６／１５５９６−０１８，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ，  ＵＳＡ）を製造者の指示に従って使用し、アチェタドメスティカス（イエコオロギ；供給源：Ｄｒ．Ｌａｒａ  Ｓｅｎｉｏｒ，Ｉｎｓｅｃｔ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ．，Ｃａｐｉｔａｌ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｐａｒｋ，Ｗｅｎｔｌｏｏｇ，Ｃａｒｄｉｆｆ，ＣＦ３  ２ＰＸ，Ｗａｌｅｓ，ＵＫ）の全ての異なる幼虫段階から高品質で、インタクトなＲＮＡを単離した。製造者の指示に従ったＤＮａｓｅ処理（Ｃａｔ．Ｎｒ．１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）により、ＲＮＡ調製物中に存在するゲノムＤＮＡを除去した。市販のキット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃａｔ．Ｎｒ．１８０８００４４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を製造者の指示に従い使用し、ｃＤＮＡを生成した。
【０３４３】
ＡＤ００１、ＡＤ００２、ＡＤ００９、ＡＤ０１５およびＡＤ０１６遺伝子の一部を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、製造者の指示に従いＡｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ｃａｔ．Ｎｒ．Ｎ８０８０２４０，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、変性プライマーでの一連のＰＣＲ反応を行った。
【０３４４】
それぞれの遺伝子の増幅に用いた変性プライマーの配列を、表２−ＡＤに示す。これらのプライマーは、それぞれのＰＣＲ反応において、以下の条件により用いられた：９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５０℃で１分、そして７２℃で１分３０秒を４０サイクル、続いて７２℃で７分。得られたＰＣＲフラグメントを、アガロースゲルで解析、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯベクター（Ｃａｔ．Ｎｒ．Ｋ２５００−２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列を決定した。得られたＰＣＲ産物の配列を、それぞれ配列番号により表２−ＡＤに示し、部分配列として記載する。対応する部分アミノ酸配列を、それぞれの配列番号により表３−ＡＤに表す。
【０３４５】
Ｂ．アチェタ ドメスティカス遺伝子のｄｓＲＮＡ生成
ｄｓＲＮＡを、市販のキットＴ７  Ｒｉｂｏｍａｘ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＲＮＡｉ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ．Ｎｒ．Ｐ１７００，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてミリグラム量で合成した。最初に別々に２つの単一５'Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター鋳型を別々な２つのＰＣＲ反応において作製するが、ここでそれぞれの反応において標的配列はＴ７プロモーターに対して別な向きで含んでいる。
【０３４６】
それぞれの標的遺伝子について、センスＴ７鋳型は、特異的Ｔ７フォワードプライマーおよび特異的リバースプライマーを用いて生成した。それぞれの標的遺伝子についてセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８−ＡＤに示す。ＰＣＲ反応の条件は、以下のとおりである：９５℃で１分、続いて９５℃で３０秒、６０℃で３０秒（−０．５℃／ｃｙｃｌｅ）、７２℃で１分を２０サイクル、続いて９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で１分を１５サイクル、続いて７２℃で１０分。アンチセンスＴ７鋳型を、特異的フォワードプライマーおよび特異的リバースプライマーを用いて、上記と同じ条件を用いて生成した。標的遺伝子のそれぞれに対するアンチセンス鋳型を増幅するためのそれぞれのプライマーの配列を、表８−ＡＤに示す。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで解析し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８１０６，Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、ＮａＣｌＯ４沈澱を行った。製造者の指示に従って、得られたＴ７フォワード鋳型およびリバース鋳型を、転写させるために混合し、得られたＲＮＡ鎖をアニーリングさせ、ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅで処理し、酢酸ナトリウムにより精製した。それぞれの標的遺伝子について得られたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、表８−ＡＤに示す。
【０３４７】
Ｃ．アチェタ ドメスティカス幼虫に対する活性について、人工餌を用いて、ｄｓＲＮＡ標的を試験する研究室の試験
イエコオロギ（アチェタ ドメスティカス）を、Ｉｎｓｅｃｔ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ．（供給源：ＢｌａｄｅｓＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌｔｄ．，Ｋｅｎｔ，ＵＫ）で維持した。昆虫を、ペレット状の糠とキャベツ葉で飼育した。大きさが同じ雌雄混合幼虫と、５日齢以上でないものを、試験使用のために選択した。２本鎖ＲＮＡを、コムギベースのペレット状げっ歯類食餌（ｒａｔ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｄｉｅｔ，Ｂ  ＆  Ｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｌｔｄ．，Ｇｒｉｍｓｔｏｎ，Ａｌｄｂｒｏｕｇｈ，Ｈｕｌｌ，ＵＫ）と混合した。食餌ＢＫ００１Ｐは、重量順に以下の成分を含む：コムギ、ダイズ、小麦餌、オオムギ、ペレット結合剤、げっ歯類５ビタミン、脂質混合物、  第二リン酸カルシウム、成形炭水化物。ペレット状げっ歯類食餌を、細かく磨砕し、混合前にいかなる酵素成分をも不活性化するために電子レンジで熱処理した。全てのげっ歯類食餌は、同一性を確保するために、同じバッチからとられた。磨砕後の食餌およびｄｓＲＮＡを、完全に混合し、等重量の小さなペレットに製剤化し、室温で一晩乾燥させた。
【０３４８】
標的およびｇｆｐコントロールからの２本鎖ＲＮＡ試料、濃度１０μｇ／μｌを、ｄｓＲＮＡ溶液１ｍｌに磨砕食餌１ｇを加える割合で適用し、それにより、ペレット１ｇあたり１０ｍｇのｄｓＲＮＡの適用割合となる。ペレットを、週毎に取り換えた。試験の最初の３週間、昆虫に処理したペレットを提供した。その後、未処理のペレットを提供した。昆虫を、蓋つきプラスチック容器内で維持し（直径９ｃｍ、深さ４．５ｃｍ）、容器あたり１０匹を維持した。各アリーナは、一つの処理餌ペレットを含み、一つの水分供給源（湿った脱脂綿の玉）を含み、それぞれを個別の小型の計量計に置いた。実験中、適時水分を補充した。
【０３４９】
すべてのコントロール昆虫が、死ぬかもしくは成虫段階（８４日）に脱皮するまで、評価期間は４日以上あけずに、評価を週に２回の間隔でおこなう。各評価において、昆虫の生死を評価し、異常について検査した。４６日以後、成虫への脱皮がいったん開始すると、すべての昆虫（生および死）を、幼虫もしくは成虫として評価した。生き残る昆虫を、試験の５５日目に計量した。４レプリケートを、処理のそれぞれについて行った。試験中、試験条件は、２５〜３３℃、２０〜２５％の相対湿度、１２：１２時間の明：暗光周期とした。
【０３５０】
Ｄ．昆虫活性２本鎖ＲＮＡの細菌生成に適したベクターにおけるＨＣ遺伝子断片のクローニング
細菌における効率的な転写のためにＴ７プロモータもしくは他のプロモータを含むいかなるベクターを用いてもよいけれども（参照ＷＯ０００１８４６）、以下のものは、細菌宿主における２本鎖ＲＮＡの発現のためのベクターにおけるＨＣ遺伝子標的に対応するＤＮＡ断片をクローニングする例示である。
【０３５１】
標的遺伝子の増幅のために用いる特異的プライマーの配列を表８−ＡＤに示す。用いた鋳型は、標的配列のいずれかを含むｐＣＲ８／ＧＷ／ｔｏｐｏベクターである。プライマーは以下の条件によるＰＣＲ反応に用いた：９８℃で５分、続いて９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、そして７２℃で２分を３０サイクル、続いて７２℃で１０分。生じたＰＣ断片を、アガロースゲルで解析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｒ．２８７０６，Ｑｉａｇｅｎ）、Ｓｒｆ  Ｉ線状化ｐＧＮＡ４９Ａベクター（ＷＯ００１８８１２１Ａ１参照）に平滑末端クローニングし、配列決定した。生成したＰＣＲ産物の配列は、表８−ＡＤに示すそれぞれの配列に対応する。この配列を持つ組換えベクターを、ｐＧＸＸＸ０ＸＸと称する。 
【０３５２】
Ｅ．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの二つの株（１）ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）および（２）ＢＬ２１（ＤＥ３）における２本鎖ＲＮＡ標的の発現と生成
以下に記載の手法は、細菌における昆虫標的の昆虫活性２本鎖ＲＮＡの好適なレベルを発現するために続けられる。ＲＮａｓｅＩＩＩ欠損株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）を、野生型のＲＮａｓｅＩＩＩ含有細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）と比較して用いた。
【０３５３】
ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）およびＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換
プラスミド３００ｎｇを添加し、氷冷した化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ株  ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）またはＢＬ２１（ＤＥ３）の５０μｌ分割量に徐々に混合した。細胞を、３７℃５分間の熱ショック処理にさらす前に、２０分間、氷上でインキュベートし、その後、細胞を、さらに５分間氷上に戻した。４５０μｌの室温ＳＯＣ培地を細胞に添加し、懸濁物を３７℃１時間でシェイカー（２５０ｒｐｍ）でインキュベートした。１００μｌの細菌細胞懸濁物を、１００μｇ／ｍｌカルベニシリン抗生物質を補充した液体Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス１５０ｍｌを含む５００ｍｌ三角フラスコに移した。培養物をＩｎｎｏｖａ４４３０シェイカー（２５０ｒｐｍ）で、３７℃で、一晩（１６〜１８時間）インキュベートした。
【０３５４】
ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）およびＢＬ２１（ＤＥ３）における２本鎖ＲＮＡ発現の化学的誘導
制御した発現のための全ての遺伝的成分が存在するため、細菌株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）またはＢＬ２１（ＤＥ３）における組換えベクターｐＧＸＸＸ０ＸＸからの２本鎖ＲＮＡの発現が可能となった。化学的誘導剤イソプロピルチオガラクトシドまたはＩＰＴＧの存在下で、Ｔ７ポリメラーゼがアンチセンスとセンス方向の両方において標的遺伝子の転写を駆動する。これは、反対に配向させたＴ７プロモータによりこれらが隣接されるからである。
【０３５５】
細菌の一晩培養物の６００ｎｍの光学密度を、適切な分光光度計を用いて測定し、新鮮なＬＢ培地を添加することにより、値を１に調節した。この培養物５０ｍｌを、５０ｍｌファルコンチューブに移し、培養物をその後、３０００ｇで、１５℃で、１０分間遠心分離した。上清を除去し、細菌ペレットを１００μｇ／ｍｌカルベニシリンと１ｍＭ  ＩＰＴＧを補充した新鮮なＳ完全培地（ＳＮＣ培地と５μｇ／ｍｌコレステロール）５０ｍｌに再懸濁した。細菌を２〜４時間室温で誘導した。
【０３５６】
細菌の熱処理
細菌を、試験プレート内の人工餌の汚染の危険を最小限にするために熱処理によって殺した。しかし、２本鎖ＲＮＡを発現する細菌の熱処理は、ＲＮＡ干渉による昆虫に対する毒性の誘導のための必要条件ではない。誘導された細菌培養物を、３０００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを８０℃、２０分間の温浴にさらした。熱処理後、細菌ペレットを１．５ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水で再懸濁し、懸濁物を微量遠心管チューブに移した。いくつかのチューブを準備し、各リフレッシュメントのためのバイオアッセイにおいて用いた。チューブを−２０℃でさらに使用するまで貯蔵した。
【０３５７】
Ｆ．アケタ・ドメスティカス(Acheta  domesticus)に対するｄｓＲＮＡ標的を発現する大腸菌を試験するための実験室の試み 
植物べースのバイオアッセイ
ＨＣに植物を与えるまえに、植物全体にｄｓＲＮＡを発現する化学的に誘導した細菌の懸濁物を噴霧した。植物は、植物生育室で生育される。植物を、５００ｍｌプラスチック瓶をさかさまにおき鉢の土壌に固定して置いた瓶の首により植物を覆って閉じ込め、底は切って開き、通気可能なように細かいナイロンメッシュで覆い、内部の結露を減少させ、昆虫が逃げるのを防ぐ。ケージ内の各々の処理された植物にＨＣを置いた。植物を、ｐＧＸＸＸ０ＸＸプラスミドまたはｐＧＮ２９プラスミドを持つ大腸菌ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）の懸濁物で処理した。異なる量の細菌：例えば、６６、２２、７単位を植物に適用し、ここで１単位は、６００ｎｍ波長の光学密度の値が１である細菌懸濁物１ｍｌ中１０９  細菌細胞として定義される。各々の場合において、全量１〜１０ｍｌが、噴霧器の補助により植物に噴霧された。１植物を、この試みの１処理ごとに用いた。生存数を計数し、各々生き残りの重量を記録した。
【０３５８】
ｐＧＮ２９対照と比較して、ｐＧＸＸＸ０ＸＸからの標的ｄｓＲＮＡを発現する大腸菌細菌株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）の懸濁物による植物の噴霧は、昆虫の死亡率の劇的な増加を導く。これらの実験は、野生型もしくはＲＮａｓｅＩＩＩ欠損細菌発現システムのいずれかで生成された昆虫遺伝子標的配列に対応する２本鎖ＲＮＡは、昆虫死亡率および幼虫生き残りの成長／発達の遅れにおける大きな増加という観点で昆虫に対する毒性があることを示した。これらの実験より明らかなのは、例証が、昆虫遺伝子標的に対応する２本鎖ＲＮＡを発現する細菌からなる製剤のスプレーの使用により、昆虫障害からの植物／作物の効果的保護を与えることである。
【０３５９】
【表１】
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【０３６０】
【表２】
0005474356.tif 000003
【０３６１】
【表３】
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【０３６２】
【表４】
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【０３６３】
【表５】
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【０３６４】
【表６】
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【０３６５】
【表７】
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【０３６６】
【表８】
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【０３６７】
【表９】
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【０３６８】
【表１０】
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【０３６９】
【表１１】
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【０３７０】
【表１２】
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【０３７１】
【表１３】
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【０３７２】
【表１４】
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【０３７３】
【表１５】
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【０３７４】
【表１６】
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【０３７５】
【表１７】
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【０３７６】
【表１８】
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【０３７７】
【表１９】
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【０３７８】
【表２０】
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【０３７９】
【表２１】
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【０３８０】
【表２２】
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【０３８１】
【表２３】
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【表２４】
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【０３８２】
【表２５】
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【０３８３】
【表２６】
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【０３８４】
【表２７】
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【０３８５】
【表２８】
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【０３８６】
【表２９】
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【０３８７】
【表３０】
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【０３８８】
【表３１】
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【０３８９】
【表３２】
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【０３９０】
【表３３】
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【０３９１】
【表３４】
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【０３９２】
【表３５】
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【０３９３】
【表３６】
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【０３９４】
【表３７】
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【０３９５】
【表３８】
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【０３９６】
【表３９】
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【表４０】
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【０３９７】
【表４１】
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【０３９８】
【表４２】
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【０３９９】
【表４３】
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【０４００】
【表４４】
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【０４０１】
【表４５】
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【表４６】
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【０４０２】
【表４７】
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【０４０３】
【表４８】
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【０４０４】
【表４９】
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【表５０】
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【０４０５】
【表５１】
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【０４０６】
【表５２】
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【０４０７】
【表５３】
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【表５４】
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【０４０８】
【表５５】
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【０４０９】
【表５６】
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【０４１０】
【表５７】
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【０４１１】
【表５８】
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【０４１２】
【表５９】
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【０４１３】
【表６０】
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【０４１４】
【表６１】
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【０４１５】
【表６２】
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【０４１６】
【表６３】
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【０４１７】
【表６４】
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【０４１８】
【表６５】
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【０４１９】
【表６６】
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【表６７】
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【表６８】
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【０４２２】
【表６９】
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【０４２３】
【表７０】
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【０４２４】
【表７１】
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【０４２５】
【表７２】
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【０４２６】
【表７３】
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【０４２７】
【表７４】
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【０４２８】
【表７５】
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【０４２９】
【表７６】
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【０４３０】
【表７７】
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【０４３１】
【表７８】
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【０４３２】
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【０４３３】
【表８０】
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【０４３４】
【表８１】
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【０４３５】
【表８２】
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【０４３６】
【表８３】
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【０４３７】
【表８４】
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【０４３８】
【表８５】
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【０４３９】
【表８６】
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【０４４０】
【表８７】
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【０４４１】
【表８８】
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【０４４２】
【表８９】
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【０４４３】
【表９０】
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【０４４４】
【表９１】
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【０４４５】
【表９２】
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【０４４６】
【表９３】
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【０４４７】
【表９４】
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【０４４８】
【表９５】
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【０４４９】
【表９６】
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【０４５０】
【表９７】
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【０４５１】
【表９８】
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【０４５２】
【表９９】
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【０４５３】
【表１００】
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【表１０１】
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【０４５４】
【表１０２】
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【０４５５】
【表１０３】
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【０４５６】
【表１０４】
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【０４５７】
【表１０５】
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【０４５８】
【表１０６】
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【０４５９】
【表１０７】
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【０４６０】
【表１０８】
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【０４６１】
【表１０９】
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【０４６２】
【表１１０】
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【０４６３】
【表１１１】
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【０４６４】
【表１１２】
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【０４６５】
【表１１３】
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【０４６６】
【表１１４】
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【０４６７】
【表１１５】
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【０４６８】
【表１１６】
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【０４６９】
【表１１７】
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【０４７０】
【表１１８】
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【０４７１】
【表１１９】
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【０４７２】
【表１２０】
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【０４７３】
【表１２１】
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【０４７４】
【表１２２】
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【０４７５】
【表１２３】
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【０４７６】
【表１２４】
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【０４７７】
【表１２５】
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【０４７８】
【表１２６】
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【０４７９】
【表１２７】
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【０４８０】
【表１２８】
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【０４８１】
【表１２９】
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【０４８２】
【表１３０】
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【０４８３】
【表１３１】
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【０４８４】
【表１３２】
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【０４８５】
【表１３３】
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【０４８６】
【表１３４】
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【０４８７】
【表１３５】
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【０４８８】
【表１３６】
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【０４８９】
【表１３７】
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【０４９０】
【表１３８】
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【０４９１】
【表１３９】
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【０４９２】
【表１４０】
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【０４９３】
【表１４１】
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【０４９４】
【表１４２】
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【０４９５】
【表１４３】
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【表１４４】
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【０４９７】
【表１４５】
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【０４９８】
【表１４６】
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【０４９９】
【表１４７】
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【０５００】
【表１４８】
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【０５０１】
【表１４９】
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【０５０２】
【表１５０】
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【０５０３】
【表１５１】
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【０５０４】
【表１５２】
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【０５０５】
【表１５３】
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【０５０６】
【表１５４】
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【０５０７】
【表１５５】
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【０５０８】
【表１５６】
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【０５０９】
【表１５７】
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【０５１０】
【表１５８】
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【０５１１】
【表１５９】
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【０５１２】
【表１６０】
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【０５１３】
【表１６１】
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【０５１４】
【表１６２】
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【０５１５】
【表１６３】
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【０５１６】
【表１６４】
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【０５１７】
【表１６５】
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【０５１８】
【表１６６】
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【０５１９】
【表１６７】
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【０５２０】
【表１６８】
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【０５２１】
【表１６９】
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【０５２２】
【表１７０】
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【０５２３】
【表１７１】
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【０５２４】
【表１７２】
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【０５２５】
【表１７３】
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【０５２６】
【表１７４】
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【０５２７】
【表１７５】
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【０５２８】
【表１７６】
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【０５２９】
【表１７７】
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【０５３０】
【表１７８】
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【０５３１】
【表１７９】
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【０５３２】
【表１８０】
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【０５３３】
【表１８１】
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【０５３４】
【表１８２】
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【０５３５】
【表１８３】
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【０５３６】
【表１８４】
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【０５３７】
【表１８５】
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【０５３８】
【表１８６】
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【０５３９】
【表１８７】
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【０５４０】
【表１８８】
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【０５４１】
【表１８９】
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【図面の簡単な説明】
【０５４２】
【図１】図１−ＬＤ：ｄｓＲＮＡで処理された人工食餌でのＬ．デセムリネアータ(L. decemlineata)の生存を示す。  第２幼虫段階の昆虫に、５０μｌのｄｓＲＮＡ（標的またはｇｆｐコントロール）の局所投与溶液で処理した食餌を与えた。食餌は７日後に局所投与ｄｓＲＮＡを含む新鮮な食餌に置き換えた。生存する昆虫の数は２、５、７、８、９および１３日目に評価した。生存幼虫のパーセントは０日（評価開始）に対して計算した。標的ＬＤ００６：（配列番号１７８）；標的ＬＤ００７（配列番号１８３）；標的ＬＤ０１０（配列番号１８８）；標的ＬＤ０１１（配列番号１９３）；標的ＬＤ０１４（配列番号１９８）；ｇｆｐ  ｄｓＲＮＡ（配列番号２３５）。
【図２】図２−ＬＤ：ｄｓＲＮＡで処理された人工食餌でのＬ．デセムリネアータ(L. decemlineata)の生存を示す。  第２幼虫段階の昆虫に５０μｌのｄｓＲＮＡ（標的またはｇｆｐコントロール）の局所投与溶液で処理した食餌を与えた（標的またはｇｆｐ制御）。食餌を７日後のみ、新鮮な食餌に置き換えた。生存する昆虫の数は２、５、６、７、８、９、１２および１４日目に評価した。生存幼虫のパーセントは０日（評価開始）に対して計算した。標的ＬＤ００１：（配列番号１６３）；標的ＬＤ００２（配列番号１６８）；標的ＬＤ００３（配列番号１７３）；標的ＬＤ０１５（配列番号２１５）；標的ＬＤ０１６（配列番号２２０）；ｇｆｐ  ｄｓＲＮＡ（配列番号２３５）。
【図３】図３−ＬＤ：ｄｓＲＮＡで処理されたジャガイモ葉の円盤状組織上でのＬ．デセムリネアータ(L. decemlineata)の幼虫の平均体重を示す。  第２幼虫段階の昆虫に、２０μｌのｄｓＲＮＡ（標的ＬＤ００２またはｇｆｐ）の局所投与溶液（１０ｎｇ／μｌ）で処理された葉の円盤状組織を与えた。２日後、昆虫は毎日、未処理葉に移送した。
【図４】図４−ＬＤ：より短い標的ＬＤ０１４ｄｓＲＮＡおよびコンカテマーｄｓＲＮＡで処理された人工食餌でのＬ．デセムリネアータ(L. decemlineata)の生存を示す。第２幼虫段階の昆虫に、５０μｌのｄｓＲＮＡ（ｇｆｐまたは標的）の局所投与溶液で処理された食餌を与えた。生存する昆虫の数は３、４、５、６および７日に評価した。生存幼虫のパーセントは０日（評価開始）に対して計算した。
【図５ａ】図５−ＬＤ：標的ＬＤ００２（ａ）の異なった濃度のｄｓＲＮＡで処理された人工食餌でのＬ．デセムリネアータ(L. decemlineata)の生存を示す。第２幼虫段階の昆虫に、５０μｌのｄｓＲＮＡの局所投与溶液で処理された食餌を与えた。食餌は７日後に局所投与ｄｓＲＮＡを含む新鮮な食餌で置き換えた。生存する昆虫の数は一定の間隔で評価した。生存する幼虫のパーセントは０日（評価開始）に対して計算した。
【図５ｂ】図５−ＬＤ：標的ＬＤ００７（ｂ）の異なった濃度のｄｓＲＮＡで処理された人工食餌でのＬ．デセムリネアータ(L. decemlineata)の生存を示す。第２幼虫段階の昆虫に、５０μｌのｄｓＲＮＡの局所投与溶液で処理された食餌を与えた。食餌は７日後に局所投与ｄｓＲＮＡを含む新鮮な食餌で置き換えた。生存する昆虫の数は一定の間隔で評価した。生存する幼虫のパーセントは０日（評価開始）に対して計算した。
【図５ｃ】図５−ＬＤ：標的ＬＤ０１０（ｃ）の異なった濃度のｄｓＲＮＡで処理された人工食餌でのＬ．デセムリネアータ(L. decemlineata)の生存を示す。第２幼虫段階の昆虫に、５０μｌのｄｓＲＮＡの局所投与溶液で処理された食餌を与えた。食餌は７日後に局所投与ｄｓＲＮＡを含む新鮮な食餌で置き換えた。生存する昆虫の数は一定の間隔で評価した。生存する幼虫のパーセントは０日（評価開始）に対して計算した。
【図５ｄ】図５−ＬＤ：標的ＬＤ０１１（ｄ）の異なった濃度のｄｓＲＮＡで処理された人工食餌でのＬ．デセムリネアータ(L. decemlineata)の生存を示す。第２幼虫段階の昆虫に、５０μｌのｄｓＲＮＡの局所投与溶液で処理された食餌を与えた。食餌は７日後に局所投与ｄｓＲＮＡを含む新鮮な食餌で置き換えた。生存する昆虫の数は一定の間隔で評価した。生存する幼虫のパーセントは０日（評価開始）に対して計算した。
【図５ｅ】図５−ＬＤ：標的ＬＤ０１４（ｅ）の異なった濃度のｄｓＲＮＡで処理された人工食餌でのＬ．デセムリネアータ(L. decemlineata)の生存を示す。第２幼虫段階の昆虫に、５０μｌのｄｓＲＮＡの局所投与溶液で処理された食餌を与えた。食餌は７日後に局所投与ｄｓＲＮＡを含む新鮮な食餌で置き換えた。生存する昆虫の数は一定の間隔で評価した。生存する幼虫のパーセントは０日（評価開始）に対して計算した。
【図５ｆ】図５−ＬＤ：標的ＬＤ０１５（ｆ）の異なった濃度のｄｓＲＮＡで処理された人工食餌でのＬ．デセムリネアータ(L. decemlineata)の生存を示す。第２幼虫段階の昆虫に、５０μｌのｄｓＲＮＡの局所投与溶液で処理された食餌を与えた。食餌は７日後に局所投与ｄｓＲＮＡを含む新鮮な食餌で置き換えた。生存する昆虫の数は一定の間隔で評価した。生存する幼虫のパーセントは０日（評価開始）に対して計算した。
【図５ｇ】図５−ＬＤ：ＬＤ０１６（ｇ）の異なった濃度のｄｓＲＮＡで処理された人工食餌でのＬ．デセムリネアータ(L. decemlineata)の生存を示す。第２幼虫段階の昆虫に、５０μｌのｄｓＲＮＡの局所投与溶液で処理された食餌を与えた。食餌は７日後に局所投与ｄｓＲＮＡを含む新鮮な食餌で置き換えた。生存する昆虫の数は一定の間隔で評価した。生存する幼虫のパーセントは０日（評価開始）に対して計算した。
【図５ｈ】図５−ＬＤ：標的ＬＤ０２７（ｈ）の異なった濃度のｄｓＲＮＡで処理された人工食餌でのＬ．デセムリネアータ(L. decemlineata)の生存を示す。第２幼虫段階の昆虫に、５０μｌのｄｓＲＮＡの局所投与溶液で処理された食餌を与えた。食餌は７日後に局所投与ｄｓＲＮＡを含む新鮮な食餌で置き換えた。生存する昆虫の数は一定の間隔で評価した。生存する幼虫のパーセントは０日（評価開始）に対して計算した。
【図６ａ】図６−ＬＤ：コロラドハムシ、レプチノタルサ・デセムリネアータ(Leptinotarsa decemlineata) の幼虫の生存におけるｄｓＲＮＡ標的ＬＤ０１０を発現する大腸菌株の経時的効果。２つの細菌種は別の人工餌に基づくバイオ分析法：（ａ）ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）；ｐＧＢＮＪ００３およびｐＧＮ２９におけるデータポイントは、５つの異なった細菌クローンから得た平均死亡率を示す。誤差棒は標準偏差を示す。
【図６ｂ】図６−ＬＤ：コロラドハムシ、レプチノタルサ・デセムリネアータ(Leptinotarsa decemlineata) の幼虫の生存におけるｄｓＲＮＡ標的ＬＤ０１０を発現する大腸菌株の経時的効果。２つの細菌種は別の人工餌に基づくバイオ分析法：（ｂ）ＢＬ２１（ＤＥ３）；ｐＧＢＮＪ００３およびｐＧＮ２９におけるデータポイントは、５つの異なった細菌クローンと１つの細菌クローンから得た平均死亡率をそれぞれ示す。誤差棒は標準偏差を示す。
【図７ａ】図７−ＬＤ：コロラドハムシ、レプチノタルサ・デセムリネアータ(Leptinotarsa decemlineata) の幼虫の生存におけるｄｓＲＮＡ標的ＬＤ０１０を発現する大腸菌株（ａ）ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）の異なったクローンの横行後、１２日の効果。データポイントはｐＧＮ２９およびｐＧＢＮＪ００３の各クローンの平均死亡率である。プラスミドｐＧＢＮＪ００３を有するＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）のクローン１は、このタイムポイントでＣＰＢに対して死亡率１００％を示した。誤差棒は標準偏差を示す。
【図７ｂ】図７−ＬＤ：コロラドハムシ、レプチノタルサ・デセムリネアータ(Leptinotarsa decemlineata) の幼虫の生存におけるｄｓＲＮＡ標的ＬＤ０１０を発現する大腸菌株（ｂ）ＢＬ２１（ＤＥ３）の異なったクローンの横行後、１２日の効果。データポイントはｐＧＮ２９およびｐＧＢＮＪ００３の各クローンの平均死亡率である。プラスミドｐＧＢＮＪ００３を有するＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）のクローン１は、このタイムポイントでＣＰＢに対して死亡率１００％を示した。誤差棒は標準偏差を示す。
【図８ａ】図８−ＬＤ：コロラドハムシ、レプチノタルサ・デセムリネアータ(Leptinotarsa decemlineata) の幼虫の生き残りの成長および発達におけるｄｓＲＮＡ標的ＬＤ０１０を発現する大腸菌株（ａ）ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）の異なったクローンの横行後、７日の効果。データポイントは表１０のデータに基づく各クローン（ｐＧＮ２９の１つのクローンおよびｐＧＢＮＪ００３の５つのクローン）における％平均幼虫重量値である。食餌のみの処理は１００％正常幼虫重量を示す。
【図８ｂ】図８−ＬＤ：コロラドハムシ、レプチノタルサ・デセムリネアータ(Leptinotarsa decemlineata) の幼虫の生き残りの成長および発達におけるｄｓＲＮＡ標的ＬＤ０１０を発現する大腸菌株（ｂ）ＢＬ２１（ＤＥ３）の異なったクローンの横行後、７日の効果。データポイントは表１０のデータに基づく各クローン（ｐＧＮ２９の１つのクローンおよびｐＧＢＮＪ００３の５つのクローン）における％平均幼虫重量値である。食餌のみの処理は１００％正常幼虫重量を示す。
【図９】図９−ＬＤ：２本鎖ＲＮＡ生産細菌をスプレーされたジャガイモ植物におけるコロラドハムシ、レプチノタルサ・デセムリネアータ(Leptinotarsa decemlineata) の幼虫の横行後、７日の生存。幼虫生存数は計測され、死亡率％で示された。使用された細菌宿主種は、ＲＮＡａｓｅIII欠損株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）であった。昆虫遺伝子標的はＬＤ０１０であった。
【図１０】図１０−ＬＤ：ｄｓＲＮＡ産生細菌をスプレーされたジャガイモ植物を食べたコロラドハムシ、レプチノタルサ・デセムリネアーテ(Leptinotarsa decemlineate) の生存幼虫の横行後、１１日の成長／発達遅延。使用された細菌宿主種は、ＲＮａｓｅIII欠損株ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）であった。データ数は正常幼虫の重量％として示した；餌のみの処理に正常幼虫重量１００％が与えられた。昆虫遺伝子標的はＬＤ０１０であった。誤差棒は標準偏差を示す。
【図１１】図１１−ＬＤ：２本鎖ＲＮＡ生産細菌によるコロラドハムシ、レプチノタルサ・デセムリネアータ(Leptinotarsa decemlineata) の幼虫によって生じたジャガイモ損害に対する横行後、７日の抵抗性。左はｐＧＮ２９プラスミドを含む細菌ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）７単位をスプレーした植物；右はｐＧＢＮＪ００３プラスミドを含む細菌ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）７単位をスプレーした植物。１単位は６００ｎｍでのＯＤ値１の細菌懸濁液１ｍｌの均等として規定される。昆虫遺伝子標的はＬＤ０１０であった。
【図１２】図１２−ＬＤ：ｄｓＲＮＡで処理されたジャガイモの葉のディスク上のＬ．デセムリネアータ(L. decemlineata)成虫の生存。若い成虫に最初の２日間、２本鎖ＲＮＡ処理された葉のディスクを餌に与え、次いで未処理ジャガイモの葉上に置いた。昆虫の生存数を定期的に評価した；動く昆虫を生存している昆虫として記録し、正常に動くようであり；瀕死の昆虫は生存しているが、病気であり、ゆっくり動くようであると記録し、これらの昆虫は一旦、仰向けにおくと立ち直ることができなかった。標的ＬＤ００２（配列番号１６８）；標的ＬＤ０１０（配列番号１８８）；標的ＬＤ０１４（配列番号１９８）；標的ＬＤ０１６（配列番号２２０）；ｇｆｐ  ｄｓＲＮＡ（配列番号２３５）
【図１３ａ】図１３−ＬＤ：レプチノタルサ・デセムリネアータ(Leptinotarsa decemlineata)の幼虫に対する細菌産生標的２本鎖ＲＮＡの効果。ｄｓＲＮＡ（配列番号１８８）を発現する熱処理細菌ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）のＯＤ１懸濁液５０μｌを４８穴プレートの各穴においた固体人工餌上に局所的に適用した。Ｌ２段階のＣＰＢ幼虫を各穴に置いた。７日目に（ａ）標的１０の２本鎖ＲＮＡを発現する細菌を含む餌を含むプレートにＣＰＢ幼虫の写真を撮った。
【図１３ｂ】図１３−ＬＤ：レプチノタルサ・デセムリネアータ(Leptinotarsa decemlineata)の幼虫に対する細菌産生標的２本鎖ＲＮＡの効果。ｄｓＲＮＡ（配列番号１８８）を発現する熱処理細菌ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）のＯＤ１懸濁液５０μｌを４８穴プレートの各穴においた固体人工餌上に局所的に適用した。Ｌ２段階のＣＰＢ幼虫を各穴に置いた。７日目に（ｂ）空ベクターｐＧＮ２９を有する細菌を含む餌を含むプレートにＣＰＢ幼虫の写真を撮った。
【図１３ｃ】図１３−ＬＤ：レプチノタルサ・デセムリネアータ(Leptinotarsa decemlineata)の幼虫に対する細菌産生標的２本鎖ＲＮＡの効果。ｄｓＲＮＡ（配列番号１８８）を発現する熱処理細菌ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）のＯＤ１懸濁液５０μｌを４８穴プレートの各穴においた固体人工餌上に局所的に適用した。Ｌ２段階のＣＰＢ幼虫を各穴に置いた。７日目に（ｃ）餌のみを含むプレートにＣＰＢ幼虫の写真を撮った。
【図１４】図１４−ＬＤ：昆虫横行の前にジャガイモの葉に局所的に適用したプラスミドｐＧＢＮＪ００３を有する異なった量の不活性化大腸菌ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）のＣＰＢ幼虫の生存および成長における影響。１０匹のＬ１幼虫に処理されたジャガイモを７日間、餌として与えた。植物にスプレーされた細菌懸濁液の量：標的１０の０．２５Ｕ、０．０８Ｕ、０．０２５Ｕ、０．００８Ｕ、およびｐＧＮ２９の０．２５Ｕ（負のコントロール；Milli-Q水も含む）。１単位（Ｕ）は６００ｎｍでの光学的密度値１を有する培養液１ｍｌ中に存在する均等の細菌量として規定される。１．６ｍｌの全容量は各植物にスプレーされた。昆虫遺伝子標的はＬＤ０１０であった。
【図１５】図１５−ＬＤ：プラスミドｐＧＢＮＪ００３を有する不活性化大腸菌ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）種によるＣＰＢ幼虫によって生じるジャガイモ損害に対する横行後、７日の抵抗性。（ａ）水、（ｂ）ｐＧＮ２９を有する大腸菌ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）０．２５Ｕ、（ｃ）ｐＧＢＮＪ００３を有する大腸菌ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）０．０２５Ｕ、（ｄ）ｐＧＢＮＪ００３を有する大腸菌ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）０．００８Ｕ。１単位（Ｕ）は６００ｎｍでの光学的密度値１を有する培養液１ｍｌ中に存在する平均の細菌量として規定される。１．６ｍｌの全容量は各植物にスプレーされた。昆虫遺伝子標的はＬＤ０１０であった。
【図１６】図１−ＰＣ：Ｐ．コクレアリアエ (P.cochleariae)の幼虫の生存および成長における摂取された標的ｄｓＲＮＡの効果を示す。新生幼虫に０．１μｇ／μｌｄｓＲＮＡ（標的またはｇｆｐコントロール）の２５μｌの局所投与溶液で処理されたアブラナの葉の円盤状組織を食餌とした。２日後、昆虫を新鮮なｄｓＲＮＡ処理された葉の円盤状組織上に移送した。４日目に、各処理において、１つの複製物から幼虫が集められ、新鮮な未処理アブラナの葉を含むペトリ皿に置いた。昆虫を２、４、７、９および１１日目に評価した。（ａ）ｄｓＲＮＡで処理されたアブラナの葉の円盤状組織上のＥ．ヴァリヴェスティス(E. varivestis)の幼虫の生存。生存幼虫のパーセントは０日（評価の開始）に対して計算した。（ｂ）ｄｓＲＮＡで処理されたアブラナの葉の円盤状組織上のＰ．コクレアリアエ(P. cochleariae)の幼虫の平均重量。各複製物からの昆虫を互いに重量測定し、そして１匹の幼虫当たりの平均重量を計算した。誤差棒は標準偏差を示す。標的１：配列番号４７３；標的３：配列番号４７８；標的５：配列番号４８３；標的１０：配列番号４８８；標的１４：配列番号４９３；標的１６：配列番号４９８；標的２７：配列番号５０３；ｇｆｐ  ｄｓＲＮＡ：配列番号２３５。
【図１７】図２−ＰＣ：（ａ）標的ＰＣ０１０および（ｂ）標的ＰＣ０２７の異なった濃度のｄｓＲＮＡで処理されたアブラナの葉の円盤状組織でのＰ．コクレアリアエ(P. cochleariae)の生存を示す。  新生幼虫をｄｓＲＮＡの２５μｌの局所投与溶液で処理された葉の円盤状組織上に置いた。２日目に昆虫を新鮮な処理された葉の円盤状組織に移送した。標的ＰＣ０１０では４日目に、標的ＰＣ０２７では５日目に、昆虫を未処理葉へ移送した。生存する昆虫の数はＰＣ０１０では２、４、７、８、９および１１日目に、ＰＣ０２７では２、５、８、９および１２日目に評価した。生存幼虫のパーセントは０日（評価開始）に対して計算した。
【図１８】図３−ＰＣ：カラシナ葉甲虫(mustard leaf beetles)、Ｐ．コクレアリア(P.cochleariae)の幼虫の生存におけるｄｓＲＮＡ標的ＰＣ０１０を発現する大腸菌ＡＢ３０１−１０５（ＤＥ３）の経時的効果。各処理におけるデータポイントは３つの異なった複製物から得た平均死亡率を示す。誤差棒は標準偏差を示す。標的１０：配列番号４８８。
【図１９】図１−ＥＶ：ｄｓＲＮＡで処理されたマメの葉の円盤状組織でのＥ．ヴァリヴェスティス(E. varivestis)幼虫の生存を示す。  新生幼虫に１μｇ／μｌのｄｓＲＮＡ（標的またはｇｆｐコントロール）の２５μｌの局所投与溶液で処理したマメ葉の円盤状組織を食餌とした。２日後、昆虫を新鮮なｄｓＲＮＡ処理された葉の円盤状組織上に移送した。４日目に１つの処理から得た幼虫を集め、新鮮な未処理のマメの葉を入れたプラスチックボックス中へ置いた。２、４、６、８および１０日目の死亡率についてこの昆虫を評価した。生存する幼虫のパーセントは０日（評価開始）に対して計算した。標的５：配列番号５７６；標的１０：配列番号５８６；標的１５：配列番号５９１；標的１６：配列番号５９６；ｇｆｐ  ｄｓＲＮＡ：配列番号２３５。
【図２０ａ】図２−ＥＶ：Ｅ．ヴァリヴェスティス(E.varivesis)の成虫の生存における摂取された標的ｄｓＲＮＡの効果およびサヤインゲンの葉の昆虫損害に対する抵抗性を示す。（ａ）ｄｓＲＮＡで処理されたマメの葉におけるＥ．ヴァリヴェスティス(E. varivestis)成虫の生存を示す。成虫に０．１μｇ／μｌｄｓＲＮＡ（標的またはｇｆｐコントロール）の７５μｌの局所投与溶液で処理されたマメの葉の円盤状組織を与えた。２４時間後、昆虫を新鮮なｄｓＲＮＡ処理された葉の円盤状組織へ移送した。さらに２４時間後、１つの処理から得た成虫を集め、ポット化された(potted)未処理全マメ植物を含むプラスチックボックス中に置いた。４、５、６、７、８および１１日目に死亡率について昆虫を評価した。生存する成虫のパーセントは、０日（評価の開始）に対して計算した。標的１０：配列番号５８６；標的１５：配列番号５９１；標的１６：配列番号５９６；ｇｆｐ  ｄｓRNA：配列番号２３５。
【図２０ｂ】図２−ＥＶ：Ｅ．ヴァリヴェスティス(E.varivesis)の成虫の生存における摂取された標的ｄｓＲＮＡの効果およびサヤインゲンの葉の昆虫損害に対する抵抗性を示す。（ｂ）ｄｓＲＮＡによるＥ．ヴァリヴェスティス(E. varivesis)の成虫が生じるマメの葉の損害に対する抵抗性を示す。１つの処理（（ａ）参照）から得た昆虫を含む全植物を９日目に葉の損害について可視的にチェックした。（ｉ）標的１０；（ii）標的１５；（iii）標的１６；(iv)ｇｆｐ  ｄｓＲＮＡ；(v)未処理。
【図２１ａ】図１−ＴＣ：標的１４のｄｓＲＮＡで処理された人工食餌でのＴ．カスタニュウム(T. castneum)の生存を示す。新生幼虫に１ｍｇｄｓＲＮＡ標的１４と小麦粉／牛乳混合物に基づく食餌を与えた。コントロールは食餌中の水（ｄｓＲＮＡなし）であった。複製物当たり、１０の１齢幼虫のうち４つの複製物に、それぞれの処理を行った。６、１７、３１、４５および６０日目に平均パーセント手段で生存について昆虫を評価した。生存幼虫のパーセントは０日（評価の開始）に対して計算した。誤差棒は標準偏差を示す。標的ＴＣ０１４：配列番号８７８．  図１−ＭＰ：ミズス・ペリシカエ(Myzus persicae)の若虫の生存について摂取された標的２７ｄｓＲＮＡの効果を示す。  １齢幼虫を２μｇ／μｌｄｓＲＮＡ（標的２７またはｇｆｐ  ｄｓＲＮＡコントロール）とともに５０μｌの液体食餌を含む飼育室中に置いた。１処理当たり、５つの飼育室で各資料室に１０の幼虫をセットアップした。生存数は生物検定の開始後、８日目に評価した。誤差棒は標準偏差を示す。標的ＭＰ０２７：配列番号１０６１；ｇｆｐ  ｄｓＲＮＡ：配列番号２３５．
【図２１ｂ】図１−ＮＬ：ｄｓＲＮＡで処理された液体人工食餌でのニラパルヴァータ・ルーゲンス(Nilaparvata lugens)の生存を示す。  第１幼虫段階から第２幼虫段階への若虫に、別々な生物検定：（ａ）ＮＬ００２、ＮＬ００３、ＮＬ００５、ＮＬ０１０；（ｂ）ＮＬ００９、ＮＬ０１６でのｄｓＲＮＡ標的の２ｍｇ／ｍｌ溶液を補給した食餌を与えた。標的での昆虫生存を食餌のみと比較し、かつ同じ濃度でｇｆｐ  ｄｓＲＮＡコントロールを含む食餌と比較した。２日毎に、ｄｓＲＮＡを含む新鮮な食餌で食餌を置き換えた。生存する昆虫の数は毎日、評価した。
【図２１ｃ】図１−ＮＬ：ｄｓＲＮＡで処理された液体人工食餌でのニラパルヴァータ・ルーゲンス(Nilaparvata lugens)の生存を示す。  第１幼虫段階から第２幼虫段階への若虫に、別々な生物検定：（ｃ）ＮＬ０１４、ＮＬ０１８；（ｄ）ＮＬ０１３、ＮＬ０１５、ＮＬ０２１でのｄｓＲＮＡ標的の２ｍｇ／ｍｌ溶液を補給した食餌を与えた。標的での昆虫生存を食餌のみと比較し、かつ同じ濃度でｇｆｐ  ｄｓＲＮＡコントロールを含む食餌と比較した。２日毎に、ｄｓＲＮＡを含む新鮮な食餌で食餌を置き換えた。生存する昆虫の数は毎日、評価した。
【図２２】図２−ＮＬ：異なった濃度の標的ｄｓＲＮＡ  ＮＬ００２で処理された液体人工食餌でのニラパルヴァータ・ルーゲンス(Nilaparvata lugens)の生存を示す。  第１幼虫段階から第２幼虫段階への若虫に、１、０．２、０．０８および０．０４ｍｇ／ｍｌ（最終濃度）のＮＬ００２を補給した食餌を与えた。２日毎にｄｓＲＮＡを含む新鮮な食餌で食餌を置き換えた。生存する昆虫の数を毎日、評価した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【図５ｆ】
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【図５ｇ】
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【図５ｈ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【図２１ａ】
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【図２１ｂ】
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【図２１ｃ】
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【図２２】
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【配列表】
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