(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＣ２−ＬＺドメインのアミノ酸配列（配列番号３）を特徴とする、哺乳動物ＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメインの結晶であって、
結晶が以下の単位格子パラメーター：
−  ａ＝ｂ＝６３．５±５Å；
−  ｃ＝４３７．５±５Å；及び
−  α＝β＝γ＝９０；
を有すること、及び結晶が空間群Ｐ４３２１２を有することを特徴とする結晶。
【請求項２】
ＣＣ２−ＬＺドメインのアミノ酸配列（配列番号４）を特徴とする、哺乳動物ＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメインの結晶であって、
結晶が以下の単位格子パラメーター：
−  ａ＝ｂ＝６３．５±５Å；
−  ｃ＝４３７．５±５Å；及び
−  α＝β＝γ＝９０；
を有すること、及び結晶が空間群Ｐ４３２１２を有することを特徴とする結晶。
【請求項３】
表１に記載する結晶学的配置を有することを特徴とする、請求項１または２記載の結晶。
【請求項４】
哺乳動物ＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメイン及び複合体を安定化することが可能である少
なくとも１つのアンキリン又はその断片を含むことを特徴とする、請求項１または２記載の結晶。
【請求項５】
アンキリン１Ｄ５（配列番号５）を含むことを特徴とする、請求項４記載の結晶。
【請求項６】
ＣＣ２−ＬＺタンパク質が突然変異Ｖａｌ３１６Ｐｒｏ（Ｖ３１６Ｐ）及び／又は突然変異Ｐｈｅ３０５Ａｌａ（Ｆ３０５Ａ）を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項記載の結晶。
【請求項７】
ＣＣ２−ＬＺタンパク質が突然変異Ａｌａ３２３Ｐｒｏ（Ａ３２３Ｐ）及び／又は突然
変異Ｐｈｅ３１２Ａｌａ（Ｆ３１２Ａ）を含むことを特徴とする、請求項２〜５のいずれか一項記載の結晶。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の哺乳動物ＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメインの結晶の産生方法であって、以下の工程：
−  少なくとも１つのアンキリン又はアンキリン断片及びＣＣ２−ＬＺドメインのインキ
ュベーション；
−  蒸気拡散により結晶を成長させることによるアンキリン又はアンキリン断片／ＣＣ２−ＬＺタンパク質複合体の共結晶化
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項９】
請求項８記載の方法により産生される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の哺乳動物ＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメインの結晶。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項記載のＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメインの結晶の三次元構造を決定する方法であって、以下の工程：
−  ＣＣ２−ＬＺタンパク質の結晶を得ること；
−  Ｘ線への結晶の暴露；
−  Ｘ線回折データの回収；
−  該結晶の電子密度マップを算出するためのデータの使用；
−  電子密度マップから開始するモデルの構築及び精密化
を含むことを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、構造データをＸ線回折結晶学により得ることを可能にするために十分なサイズ及び質のＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメインの結晶に関する。
【０００２】
本発明は、特に、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路を調節する化合物を同定、モデル化、及びデザインする際でのＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメインの結晶学的データ及び三次元構造の使用に関する。
【０００３】
ＮＦ−κＢ経路は、種々の細胞外刺激、例えば細菌のＬＰＳなど、炎症性サイトカイン、例えばＩＬ−１及びＴＮＦαなどに反応して活性化される（M. S. Hayden and S. Ghosh, Signaling to NF-kappaB, Genes Dev 18 (2004), no.18, 2195-2224）。シグナルは、一般的に、細胞受容体からＩＫＫ複合体（ＮＦ−κＢシグナル伝達経路の中枢的な調節因子）に伝達される。ＩＫＫ複合体は、２つのキナーゼ（ＩＫＫα及びＩＫＫβ）、及び調節タンパク質ＮＥＭＯ（ＮＦ−κＢの必須修飾因子）で構成される（S. Yamaoka et al., Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation, Cell 93 (1998), no. 7, 1231-1240）。ＮＥＭＯは、種々の刺激から来るシグナルを統合する際、及び、ＩＫＫ複合体の活性化をもたらす際に決定的な役割を果たす。
【０００４】
ＮＥＭＯタンパク質は、そのＮ末端部分のＩＫＫ複合体結合ドメイン及びそのＣ末端部分のオリゴマー化ドメインで構成される（図１）。マウス（配列番号１）及びヒト（配列番号２）ＮＥＭＯタンパク質は、特定ドメインＣＣ２の直ぐ上流のヒトタンパク質における７個のアミノ酸の挿入を除き、高度の配列相同性を有することに注目すべきである。
【０００５】
ＩＫＫ複合体の活性化は、ＮＥＭＯタンパク質が、ＩＫＫＫキナーゼを介したトランス活性化により、又は、ＩＫＫキナーゼの二量体化を介したトランス自己活性化によりオリゴマー化する能力と関連する機構を経由して進む。
【０００６】
現在、ＮＥＭＯを介したＩＫＫ複合体の活性化の機構は、完全には解明されていないが、多数の報告において、オリゴマー化、及び最小ＣＣ２−ＬＺドメインを含むＫ−６３ポリユビキチンへの結合が必須の役割を果たすことが示されている（J. L. Poyet et al., Activation of the IkappaB kinases by RIP via Ikkgamma/NEMO-mediated oligomerization, J Biol Chem 275 (2000), no.48, 37966-37977）（F. Agou et al., Inhibition of NF-kappab activation by peptides targeting NF-kappaB essential modulator (NEMO) oligomerization, J Biol Chem 279 (2004), no.52, 54248-54257）（C. K. Ea et al., Activation of IKK by TNFalpha requires site-specific ubiquitination of RIP1 and polyubiquitin binding by NEMO, Mol Cell 22 (2006), no.2, 245-257）（C. J. Wu, et al., Sensing of lys 63-linked polyubiquitination by NEMO is a key event in NF-kappaB activation, Nat Cell Biol 8 (2006), no.4, 398-406）。ＮＥＭＯのオリゴマー化又はＫ−６３ポリユビキチン鎖（ｐｏｌｙＵｂ  Ｋ  ６３）への結合を破壊するＣＣ２−ＬＺ中に位置する全ての突然変異によって、サイトカインによる刺激に続くＩＫＫ活性が阻害される（E. Vinolo et al., A point mutation in NEMO associated with anhidrotic ectodermal dysplasia with immunodeficiency pathology results in destabilization of the oligomer and reduces lipopolysaccharide- and tumour necrosis factor-mediated NF-kappaB activation, J Biol Chem 281 (2006), no.10, 6334-6348）。
【０００７】
ＮＥＭＯの最小オリゴマー化ドメインＣＣ２−ＬＺ（マウスにおけるａａ  ２５１−３３７、ヒトにおけるａａ  ２５８−３４４）は、２つの連続モチーフ、コイルドコイルモチーフＣＣ２（マウスにおけるａａ  ２５１−２９０、ヒトにおけるａａ  ２５８−２９７）及びロイシンジッパーモチーフＬＺ（マウスにおけるａａ  ２９３−３３７、ヒトにおけるａａ  ３００−３４４）で構成される。１つ又は２つのアミノ酸のバリエーションが、ＣＣ２及びＬＺ構造の予測のために使用されるソフトウェアに依存して、ＣＣ２−ＬＺドメインの末端で見ることができる。ひとたび活性化されると、ＩＫＫ複合体はＩκＢタンパク質をリン酸化し、それにより、２６Ｓプロテアソームによる後者の分解が誘発され、次に、ＮＦ−κＢ転写因子を遊離させ、それはＩκＢタンパク質により細胞質中に捕捉される。ＮＦ−κＢ転写因子は、次に、核中に移動し、炎症、免疫、アポトーシス、及び細胞生存に関与する遺伝子の発現を調節する。ＮＦ−κＢ経路の構成的活性化は、発癌に関与する。
【０００８】
それは、種々の固形腫瘍及び白血病ならびに自己免疫疾患及び炎症性疾患においても観察されている（D. S. Basseres and A. S. Baldwin, Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression, Oncogene 25 (2006), no.51, 6817-6830）（M. S. Hayden et al., NF-kappaB and the immune response, Oncogene 25 (2006), no.51, 6758-6780）（J. Inoue et al., NF-kappaB activation in development and progression of cancer, Cancer Sci 98 (2007), no.3, 268-274）。従って、ＩＫＫ複合体は、抗炎症化合物及び抗腫瘍化合物の開発のための、重要な目的となる標的と考えられてきた（M. A. Calzado et al., NF-kappaB inhibitors for the treatment of inflammatory diseases and cancer, Curr Med Chem 14 (2007), no.3, 367-376）（T. D. Gilmore and M. Herscovitch, Inhibitors of NF-kappaB signaling: 785 and counting, Oncogene 25 (2006), no.51, 6887-6899）（F. D’Acquisto et al., Inhibition of nuclear factor kappa B (NF-kB): An emerging theme in anti-inflammatory therapies, Mol Interv 2 (2002), no.1, 22-35）。キナーゼよりむしろＮＥＭＯを標的とする化合物をデザインすることによって、刺激依存性ＩＫＫ活性を選択的に抑制し、それにより化合物の細胞毒性を低下させることが可能になる。
【０００９】
ＮＦ−κＢシグナル伝達経路の調節の基礎となる機構を解明する努力において、ＩＫＫ複合体の、及び特に調節タンパク質ＮＥＭＯの結晶構造が研究されている。三次元構造の知識は、さらに、実際のスクリーニングに起因するリガンドとの相互作用部位を立証する際に必須の利点となる。三次元構造は、また、仮想スクリーニング又はインシリコモデル化アプローチにおける情報の供給源である。ＮＥＭＯの結晶化プロセスが研究されてきたが、成功していない（D.Gopaul et al., M. Delepierre及びF. Cordier（未発表））。特に、ジンクフィンガーモチーフ（ＮＥＭＯのａａ  ２５１−４１２）を持つ又はそのモチーフ（ＮＥＭＯのａａ  ２５１−３８８）を伴わないＣＣ２−ＬＺドメインの結晶化での無駄な試みが言及されうる。従って、ＮＥＭＯタンパク質及び特にＣＣ２−ＬＺドメインの結晶を得ることを目指したそのような研究は、これまで不成功であった。
【００１０】
本発明は、従って、ＮＥＭＯタンパク質のＣＣ２−ＬＺドメインの結晶化を得るための新たな戦略を提案することを目的とする。この代替戦略は、ＮＥＭＯの最小オリゴマー化ドメインの硬性を増加させることに基づく。結晶構造は、解像度３．２５Åを使用したＸ線回折による結晶学により解析された。続いて、結晶構造は、解像度２．９Åを使用したＸ線回折による結晶学により解析された。
【００１１】
本発明は、また、ＣＣ２−ＬＺドメインの結晶化の方法に関する。ＣＣ２−ＬＺ結晶及びそれに由来する情報は、ＣＣ２−ＬＺとの相互作用に入る化合物を同定及びデザインする目的のために分析することができる。
【００１２】
本発明は、従って、哺乳動物ＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメインの結晶、アミノ酸配列（配列番号３）を有するそのＣＣ２−ＬＺペプチドドメイン、及び該アミノ酸配列に由来するそのペプチド変異体に関する。
【００１３】
本発明に関連して、「結晶」、「ＣＣ２−ＬＺドメインの結晶」、「ＣＣ２−ＬＺ複合体の結晶」、及び「ＣＣ２−ＬＺドメインの共結晶」という用語は、区別なしに使用され、少なくとも２つの別々の成分を含む複合体の結晶を指し、本発明の結晶の１つの成分がＣＣ２−ＬＺドメイン又はその変異体の１つである。
【００１４】
本発明は、また、哺乳動物ＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメインの複合体の結晶、アミノ酸配列（配列番号４）を有するそのＣＣ２−ＬＺペプチドドメイン、及び該アミノ酸配列に由来するそのペプチド変異体に関する。
【００１５】
「アミノ酸配列」は、天然状況から単離されるペプチド配列として理解すべきである。それは、特に、単離され、化学合成され、及び／又は精製され、恐らくは遺伝子工学により改変された配列を含む。「変異体」は、前文に記載されるペプチドのアミノ酸配列を意味すると理解され、保存置換又は保存点突然変異を含み、配列（配列番号３及び配列番号４）によりそれぞれコード化されるペプチドと実質的に同じ特性、又は、即ち、オリゴマー化して、Ｋ−６３ポリユビキチンに結合する能力を有する。
【００１６】
本発明は、さらに、哺乳動物ＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメインの複合体の結晶に関し、その単位格子パラメーターは以下の通りである：
−  ａ＝ｂ＝６３．５±５Å；
−  ｃ＝４３７．５±５Å；及び
−  α＝β＝γ＝９０°；
及び、結晶は空間群Ｐ４３２１２を有する。
【００１７】
本発明に関連する共通の理解に従い、「単位格子パラメーター」という表現は、結晶の単位格子のパラメーターａ、ｂ、及びｃを示し、同一平面上の基底ベクトルの長さ（ａ、ｂ、ｃ）及びベクトルの間に形成される角α、β、及びγ（ａ、ｂ、ｃ）に対応する。角αはベクトルｂとｃの間の角であり、βはベクトルａとｃの間の角であり、γはベクトルａとｃの間の角である。単位格子は、ベクトル（ａ、ｂ、ｃ）により構築される平行６面体であると理解される。
【００１８】
結晶を実質的に不変のままにし、結晶が有限モチーフの反復により形成される無限オブジェクトである対照操作は群である。結晶が三次元である場合、これらは「空間群」と称される。
【００１９】
本発明のＣＣ２−ＬＺドメインの複合体の結晶が、天然ＣＣ２−ＬＺドメインに限定されないことを理解すべきである。本発明の複合体の結晶は、実際に、天然ＣＣ２−ＬＺの突然変異体を含む。そのような突然変異体は、天然ＣＣ２−ＬＺのポリペプチド配列における少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、又は置換により得られ、天然ＣＣ２−ＬＺドメインの三次元構造と実質的に同じ三次元構造を有する。「実質的に同じ三次元構造を有する」とは、５Å、好ましくは２Å未満又はそれと等しい平均偏差を有する結晶から得られる一組の原子構造座標を有すること（それらを突然変異体が由来した天然ＣＣ２−ＬＺの原子構造座標に重ね合わせた場合、天然ＣＣ２−ＬＺのアルファ炭素原子の少なくとも５０%〜約１００%が重ね合わせに含まれる場合）を意味すると理解される。
【００２０】
本発明は、好ましくは、哺乳動物ＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメイン、及びＣＣ２−ＬＺドメインと形成される複合体を安定化することが可能である少なくとも１つのアンキリン又はその断片を含む共結晶に関し、その単位格子パラメーターは以下の通りである：
−  ａ＝ｂ＝６３．５±５Å；
−  ｃ＝４３７．５±５Å；及び
−  α＝β＝γ＝９０；
及び、その共結晶は空間群Ｐ４３２１２を有する。
【００２１】
「アンキリン」は、多数のタンパク質間相互作用に関与する種々のサイズの調節タンパク質を指すと理解される。アンキリンは遺伝的に保存されたタンパク質である。なぜなら、それらは細菌、植物、真菌、及び動物において見出され、それらの構造は約３３のアミノ酸の反復構造単位に基づくからである。本発明の「アンキリン断片」は、ＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメインと形成される複合体に結合し、それを安定化することが可能である。
【００２２】
本発明は、好ましくは、哺乳動物ＮＥＭＯタンパク質のＣＣ２−ＬＺドメイン及びアンキリン１Ｄ５（配列番号５）の結晶に関する。本発明は、また、哺乳動物ＮＥＭＯタンパク質のＣＣ２−ＬＺドメイン及びアンキリン２Ａ１又は２Ｆ６の結晶（Wyler et al., Inhibition of NF-kappaB activation with designed ankyrin-repeat proteins targeting the ubiquitin-binding/oligomerization domain of NEMO, Protein Sci 16 (2007), no.9, 2013-2022により記載される）に関する。
【００２３】
結晶生成を促進させるために、ＣＣ２−ＬＺドメインは、実際に、アンキリン１Ｄ５と複合体を形成し、それは強い親和性でＣＣ２−ＬＺに結合し、ペプチドドメインを硬直化させる。アンキリン１Ｄ５と複合体を形成したＣＣ２−ＬＺの結晶から得られる回折プロファイルを使用して、分子置換によりＣＣ２−ＬＺの三次元構造を決定する。アンキリン又はアンキリン断片は、より具体的にはそれを安定化させるために、好ましくは、ＣＣ２−ＬＺドメインのＬＺモチーフと複合体を形成する。ＬＺモチーフは、実際に、ＣＣ２−ＬＺドメインのＣＣ２モチーフよりも柔軟で、熱力学的に不安定である。
【００２４】
ＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメインとアンキリンタンパク質との共結晶は、以下の工程：
−  少なくとも１つのアンキリン又はアンキリン断片及びＣＣ２−ＬＺドメインのインキュベーション；
−  蒸気拡散により結晶を成長させることによるアンキリン又はアンキリン断片／ＣＣ２−ＬＺタンパク質複合体の共結晶化；
を含む結晶化方法により得ることができる。
好ましい実施態様において、ＣＣ２−ＬＺ結晶化方法は、実施例１に記載される方法に対応する。
【００２５】
本発明は、好ましくは、ＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメインの複合体の結晶、又は、表１に記載される結晶学的配置を有するＣＣ２−ＬＺの共結晶に関する。
【００２６】
好ましくは、本発明のＣＣ２−ＬＺドメインの結晶及び共結晶は、各々の場合において、Ｘ線回折により得られるそれらの三次元構造により定義され、それを図２及び３において示す。
【００２７】
ＣＣ２−ＬＺの三次元構造は、互いに会合してコイルドコイル構造を形成する２つの並行αヘリックスで構成される伸長した二量体を形成する（図２）（図３）。ＣＣ２−ＬＺ二量体は、２つのアンキリン１Ｄ５分子と相互作用し、各々のアンキリンが２つのＬＺ鎖上のαヘリックスとの接触を形成する。ＣＣ２モチーフとＬＺモチーフの間に位置する３つ残基（ａａ  ２９１−２９３、マウスナンバリング）は、疑似コイルドコイルを形成する。Ｋ−６３ポリユビキチン鎖への結合ドメインは、Ea et al.において記載されており、ＣＣ２のＣ末端領域及びＬＺのＮ末端領域に対応する６７のアミノ酸（２５９−３２５ヒトナンバリング、２５２−３１８マウスナンバリング）で構成される。三次元構造から、定方向突然変異誘発から、及びＣＣ２−ＬＺ配列アラインメントから得られた相互参照データにより、ユビキチンへの結合部位を形成する領域が、ＮＥＭＯのマウスポリペプチド配列中のアミノ酸２９３と３２３の間（ａａ  ３００−３３０ヒトナンバリング）として決定された。
【００２８】
本発明のＣＣ２−ＬＺ結晶及び共結晶の三次元構造は、以下の工程：
−  ＣＣ２−ＬＺタンパク質の結晶又は共結晶を得ること；
−  Ｘ線への結晶の暴露；
−  Ｘ線回折データの回収；
−  結晶の電子密度マップを算出するためのデータの使用；
−  電子密度マップから開始するモデルの構築及び精密化
を含む方法により得られる。
【００２９】
有利に、ＣＣ２−ＬＺの三次元構造を決定する方法は、実施例１において記載する方法に対応する。
【００３０】
本発明は、また、一方で、突然変異Ｖａｌ３１６Ｐｒｏ（Ｖ３１６Ｐ）及び／又は突然変異Ｐｈｅ３０５Ａｌａ（Ｆ３０５Ａ）を含むマウスＣＣ２−ＬＺタンパク質の結晶に、及び、他方で、突然変異Ａｌａ３２３Ｐｒｏ（Ａ３２３Ｐ）及び／又は突然変異Ｐｈｅ３１２Ａｌａ（Ｆ３１２Ａ）を同様に含むヒトＣＣ２−ＬＺタンパク質の結晶に関する。
【００３１】
ヒトＣＣ２−ＬＺタンパク質における定方向突然変異誘発により得られる種々の突然変異を図４において示す。突然変異Ｇｌｕ２９６Ａｌａ（Ｅ２９６Ａ、マウスにおける位置２８９）は、ＣＣ２のＣ末端に位置付けられ、ユビキチンとの相互作用部位の外側である（位置ａａ  ２５９−３２５、ヒトナンバリング、及びａａ  ２５２−３１８、マウスナンバリング）。突然変異Ｐｈｅ３１２Ａｌａ（Ｆ３１２Ａ、マウスにおける位置３０５）及びＧｌｕ３１５Ａｌａ（Ｅ３１５Ａ、マウスにおける位置３０８）は、ユビキチンへの結合部位内に位置付けられる。突然変異Ｇｌｕ３１５Ａｌａ及びＡｌａ３２３Ｐｒｏ（Ａ３２３Ｐ、マウスにおける位置３１６）は、２つのヒトの病理、免疫不全を伴う無汗性外胚葉形成不全症（ＡＥＤ−ＩＤ）（R. Doffinger et al., Genetic heterogeneity of mendelian susceptibility to mycobacterial infection, Microbes Infect 2 (2000), no.13, 1553-1557）及び色素失調症（ＩＰ）（A. Smahi et al., Genomic rearrangement in nemo impairs NF-kappaB activation and is a cause of incontinentia pigmenti.The international incontinentia pigmenti (IP) consortium, Nature 405 (2000), no.6785, 466-472）にそれぞれ関与する。二重突然変異Ｌｅｕ３２９Ａｌａ  Ｌｅｕ３３６Ａｌａ（Ｌ３２９Ａ  Ｌ３３６Ａ、マウスにおけるそれぞれ位置３２２及び３２９）は、ＣＣ２−ＬＺのロイシンジッパードメイン中に位置付けられる。
【００３２】
炎症性サイトカインＴＮＦ−αに応答してＮＦ−κＢ経路の活性化を回復する際の野生型ＮＥＭＯタンパク質及び上で定義する突然変異ＮＥＭＯタンパク質の能力を、図５において比較及び例証する。その目的のために、ＮＥＭＯ欠損マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を、一方ではＩｇκルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするプラスミド、及び他方では種々のタンパク質をコードするプラスミドを一過性にコトランスフェクトし、次にＴＮＦαで２４時間刺激する。野生型タンパク質によってＮＦ−κＢ経路が完全に回復されるのに対し、ＮＦ−κＢ経路のＴＮＦα依存的活性化は、突然変異タンパク質により異なる程度で影響を受ける。突然変異Ａ３２３Ｐ及びＦ３１２Ａによって、２つの最も強い阻害、即ち、９５%及び７８%の阻害がそれぞれ生じる。突然変異Ａ３２３Ｐについて、それは重症型の色素失調症の原因であり、ＮＥＭＯ二量体化の欠陥が、ＮＦ−κＢ経路の不活化の原因であり、Sebban-Benin et al.（Identification of TRAF6-dependent NEMO polyubiquitination sites through analysis of a new NEMO mutation causing incontinentia pigmenti, Hum Mol Genet 16 (2007), no.23, 2805-2815）により得られた結果と類似の結果である。位置Ｆ３１２Ａで突然変異したＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメインのタンパク質は、ゲルろ過上で野生型ＣＣ２−ＬＺタンパク質の溶出プロファイルと同じ溶出プロファイルを示し、この突然変異が二量体の安定化に影響を与えないが、しかし、ＮＦ−κＢ経路の活性化を修飾することを示す（図５）。この突然変異体の試験によって、初めて、活性化の欠陥が、ユビキチンとの相互作用部位での二量体化における欠陥ではなく、むしろ、Ｋ６３ポリユビキチン鎖との相互作用における欠陥に起因することが実証されている（Ea et al.により示された通り）。結果的に、これらの結果によって、ＮＥＭＯの二量体化を修飾することにより、又は、ＮＥＭＯのポリユビキチン鎖との相互作用を阻害することにより、ＮＦ−κＢ経路を阻害する可能性が強調される。
【００３３】
本発明によって、一方では、定方向突然変異誘発によるＮＥＭＯの活性立体構造の構造的な検証、及び、他方では、タンパク質のオリゴマー化のため、及びその結果としての、ＩＫＫ複合体の活性化のために決定的である残基ならびにＫ−６３ポリユビキチンへの結合に関与する残基の決定が可能になる。
【００３４】
本発明は、好ましくは、ＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメインに結合することが可能な化合物を、本発明において得られる結晶学的データに基づき同定する方法に関する。ＣＣ２又はＬＺ配列を模倣するペプチドを、ＮＥＭＯのオリゴマー化を破壊し、それにより培養中の細胞におけるＮＦ−κＢ経路の活性化を抑制することが可能であるとして示される。有利には、本発明は、ＣＣ２−ＬＺドメインのオリゴマー化を妨げる化合物の合成及び同定に関し、それはドメインのＫ−６３ポリユビキチンへの結合を阻害する。
【００３５】
本発明に関連して、「化合物」は、ＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメインの二量体化を阻害し、又はＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメインのポリユビキチン鎖との相互作用を阻害する全ての化学分子であると理解される。ＮＥＭＯのドメインの結晶学的データによって、従って、このタンパク質に高い親和性を有するペプチドをデザインすることが可能になっている。インビボでＮＥＭＯの活性複合体を形成することを可能にするＣＣ２−ＬＺ：ＣＣ２−ＬＺ相互作用は、多数の非共有結合を含む。小分子によるそれらの複合体の不安定化は、ハイスループットスクリーニングの状況において実証することが非常に困難であるため、ペプチドの還元部分にわたる相互作用を模倣し、より高い親和性を有するペプチドプローブを同定することが必要である。そのようなペプチドプローブを次に蛍光基で標識することができ、ＣＣ２−ＬＺとのその会合は蛍光偏光測定により実証することができる。このシステムによって、続いてハイスループットスクリーニングキャンペーンを準備することが可能になる。このペプチドプローブを作製するための合理的で効果的なアプローチを有するためには、ＣＣ２−ＬＺドメインの三次元構造の知識が絶対的に不可欠である。既に２つのペプチド（Ｐ８ＲＤ及びＰＨ４と称される）が、この原理を使用してデザインされている（図１１）。
【００３６】
本発明のペプチドプローブは、好ましくは、ペプチドＰＨ４及びペプチドＰ８ＲＤであり、それらはアミノ酸配列（配列番号６及び配列番号７）をそれぞれ有する。
【００３７】
Ｐ８ＲＤが６０nMの親和性を有するのに対し、ペプチドＰＨ４は１７０nMの親和性を有する。これらの測定は、ｐＨ７で、外界温度で、２０mM  Ｔｒｉｓ−酢酸−ＭＥＳ（２００mM塩化カリウム及び０．５%  Ｔｗｅｅｎ  ２０含有）に対応するストリンジェントなバッファー中で行う。それらは、蛍光偏光により、Ｎ末端でフルオロフォアフルオレセイン又はＣｙ５と共役させたペプチドを活用して行う。本発明のペプチドプローブを形成するために、ペプチドを任意の種類のフルオロフォアに共役させることができる。
【００３８】
最終的に、本発明は、ＮＥＭＯの二量体化の、又は、ＮＥＭＯとポリユビキチン鎖との、本発明のペプチドプローブとＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメインの間での相互作用の化合物を同定する方法に関する。このＨＴＳ（ハイスループットスクリーニング）方法は、以下の工程：
−  ペプチドとＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメインを接触させること；
−  試験中の化合物を加えること；
−  試験中の化合物の存在下において蛍光偏光を測定すること；
−  試験中の化合物の非存在下において測定値を比較すること
を含む。
【００３９】
これらのペプチドの構造−活性関係及びまたＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺ標的の三次元構造によって、ユビキチン及び／又は任意の種類の側鎖（Ｋ６３、Ｋ４８、Ｋ６、Ｎ末端）を有するポリユビキチン鎖についてのＮＥＭＯの相互作用ゾーンを支持することにより、nMオーダーの大きさの親和性を有する他のペプチドをデザインすることが可能になる。
【００４０】
ＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメイン／ユビキチン複合体のモデルを図７、８、及び１０において示す。「・・・複合体のモデル」は、ＣＣ２−ＬＺ／ユビキチン複合体の三次元構造を意味すると理解される。ＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺ／ユビキチン複合体のモデルが、使用されるＲａｂｅｘ−５  ＩＵＩＭ／ユビキチン複合体から得られる構造情報に基づき構築された（Lee S. et al. Structural basis for ubiquitin recognition and autoubiquitination by Rabex-5. Nat Struct Mol Biol 13, 264-271, 2006）。ＣＣ２−ＬＺ／ユビキチン複合体のモデルを、ユビキチンとＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメインの間での相互作用のＮＭＲにより観察される化学シフトを用いて実験的に立証した（図９）。ＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメインの三次元構造を、ＣＣ２−ＬＺ／ユビキチン複合体のモデルから推定する。ＣＣ２−ＬＺのこの三次元構造を、ＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメインに結合することが可能な化合物のインシリコデザイン又はインシリコスクリーニングのために使用することができる。本発明は、従って、本発明の結晶の結晶学的配置から得られるＣＣ２−ＬＺドメインの三次元構造を使用して、ＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメインに結合することが可能である化合物をデザインする方法に関する。
【００４１】
最終的に、本発明は、上の同定及びデザイン方法により同定される化合物に関する。好ましくは、これらの化合物によって、ＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメインの二量体化が阻害され、又は、ＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメインとポリユビキチン鎖との相互作用が阻害される。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
本発明は、結果として限定はされないが、続く図面及び実施例により例証される：
【図１】ＮＥＭＯタンパク質の描写。
【図２】２つのアンキリン分子と複合体を形成したＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメインの三次元構造。ＣＣ２−ＬＺの２つのサブユニットが濃い灰色であり、アンキリンは薄い灰色である。
【図３】アンキリン１Ｄ５と複合体を形成したＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメインの構造。側面図における複合体のリボンダイアグラム。ＮＥＭＯヘリックスを、ドメインに依存して灰色のレベルで示す：ＣＣ２、ＮＯＡ、又はＬＺ。アンキリン１Ｄ５鎖は、側面の位置において濃い灰色である。
【図４】ヒトＣＣ２−ＬＺドメイン内における、定方向突然変異誘発により得られる種々の突然変異の位置。ポリユビキチンへの結合ドメインを白色で示す。アミノ酸について使用されるナンバリングは、ヒトタンパク質でのナンバリングに対応する。
【図５】ＮＦ−κＢ経路の活性化に対する種々の突然変異の効果。突然変異のナンバリングは、ヒトＣＣ２−ＬＺタンパク質でのナンバリングに対応する。
【図６】ＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメイン／ユビキチン複合体のモデル。Ｒａｂｅｘ−５（ＭＩＵ／ＩＵＩＭ）（第１ライン）とＮＥＭＯ（ＮＯＡモチーフ）（第２ライン）の間のアラインメント配列（以下にＮＯＡ（ａ−ｇ）の構造モチーフの位置を伴う）。垂直の実線及び垂直の破線は、同一の又は類似の残基をそれぞれ示す。斜めの線は、本発明の構造モデルの観点から、空間的に類似の残基を示す。ＮＯＡモチーフ中の厳密に保存された残基を＊で示す。
【図７】ＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺ／ユビキチン複合体の側面図。ＮＥＭＯヘリックスには図３の通りに色を付けている。ユビキチン分子は、側面に対する位置において灰色であり、共結晶のアンキリン１Ｄ５分子は、同じく側面に対する位置において半透明の薄い灰色である。
【図８】ＮＯＡ／ユビキチン界面のクローズアップ写真。相互作用に関与する残基を「球棒」タイプの描写において描き、炭素原子は灰色（ユビキチン）及び白色（ＮＥＭＯ）である。
【図９】ＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメインに結合したユビキチンのＮＭＲにより観察された化学シフト。化学残基の機能としての化学シフトΔδａｖにおける平均変動。対応する二次構造のエレメントを、化学シフトのグラフ上に示す。
【図１０】ユビキチンとＣＣ２−ＬＺドメインのＮＯＡ領域の間での相互作用の描写。濃い灰色が、強い相互作用に関与する残基について使用される。ユビキチンの残基が、薄い灰色で、０．０５＜Δδａｖ＜０．０８５ppmについて示される。
【図１１】ＣＣ２−ＬＺドメインの結晶学的構造を考慮に入れてデザインされたペプチド配列ＰＨ４及びＰ８ＲＤ。Ｎキャップ又はＣキャップに属する下線を引いた残基は、Ｎ末端及びＣ末端でαヘリックスを熱力学的に安定化させる効果を有する。
【００４３】
実施例１：ＣＣ２−ＬＺドメインの結晶学的構造
１．１  アンキリン１Ｄ５及びＣＣ２−ＬＺタンパク質のプラスミドの構築、発現、及び精製
アンキリン１Ｄ５の進化は、選択のためのＮ２Ｃ  ＤＡＲＰｉｎ（デザインされたアンキリンリピートタンパク質）ライブラリー（H. K. Binz et al., High-affinity binders selected from designed ankyrin repeat protein libraries, Nat Biotechnol 22 (2004), no.5, 575-582）を使用したリボソームディスプレイにより行われる。本試験の結果及びまた最初のモデルとは異なるアンキリン１Ｄ５のアミノ酸が、Wyler et al.の論文において記載されている。アンキリン１Ｄ５のｃＤＮＡを、Ｎ末端に位置するヒスチジンタグと共にベクターｐＱＥ３０（Qiagen）中にクローニングする。ｐＱＥ３０−１Ｄ５プラスミドをＥ．  ｃｏｌｉ  ＸＬ−１  ｂｌｕｅ株中に導入し、１Ｄ５タンパク質の発現を、ＩＰＴＧ  １mMを培養液に３〜３．５時間にわたり３７℃で加えることにより誘導する。細菌を沈降により回収し、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー５０mM、ｐＨ８中で洗浄し、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー５０mM、ｐＨ８、ＮａＣｌ  ０．５M（バッファーＡ）中で、プロテアーゼインヒビター（Complete free EDTA, Roche）の存在下において超音波処理により溶解させる。可溶性抽出物を遠心後に回収し、バッファーＡで事前に平衡化させたニッケルカラム上に添加する。１Ｄ５タンパク質を、直線勾配のイミダゾールを使用して溶出する。タンパク質を含む分画を回収し、次に、カットオフ閾値６〜８kDaを有する透析バッグ（Spectra/Por）を使用して２０mM  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．６、５０mM  ＫＣｌのバッファーに対して透析する。タンパク質を、カットオフ閾値５kDaを有するAmiconチューブ（Millipore）中での限外ろ過により濃縮する。
【００４４】
ＣＣ２−ＬＺ（配列番号３）（マウスＮＥＭＯのａａ  ２５１−３３７）を、Ｎ末端に位置するヒスチジンタグと共にプラスミドｐＥＴ２８中にクローニングする。このドメインは、ヒトＮＥＭＯ（配列番号４）の残基２５８〜３４４に対応する。タンパク質を、Ｅ．  ｃｏｌｉ、ＢＬ２１−ｇｏｌｄ（ＤＥ３）株中で発現させ、アンキリン１Ｄ５の精製について記載される通りにニッケルカラム上で精製する。ＣＣ２−ＬＺタンパク質を、次に、陽イオン交換Poros 20-HSカラム（Perseptive Biosystem）上で精製する。カラムを、５０mM  ＭＥＳ  ｐＨ７．１、５０mM  ＫＣｌのバッファー中で事前に平衡化させ、タンパク質を直線勾配のＫＣｌにより溶出させる。目的の分画を回収し、２０mM  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１００mM  ＫＣｌのバッファーに対して透析し、次に限外ろ過により濃縮する。タンパク質の純度は、変性条件下での電気泳動及びクマシーブルーでの染色による分析に従って９８%超として決定される。タンパク質濃度は、ブラッドフォードの方法により、及び、吸収係数２３１２M-1cm-1（ＣＣ２−ＬＺ）及び１４９０M-1cm-1（１Ｄ５）を使用して２８０nmでの吸光度の測定により決定する。
【００４５】
１Ｄ５及びＣＣ２−ＬＺタンパク質を一緒に３０分間にわたり氷上でインキュベートし、複合体を、２０mM  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８、１００mM  ＫＣｌのバッファー中で平衡化したSuperdex 200 HRカラム（Pharmacia）上で精製する。複合体における結合化学量論は１：１である。複合体を限外ろ過により濃縮し、タンパク質濃度１０〜１３mg/mlを得る。
【００４６】
１．２  アンキリン１Ｄ５／ＣＣ２−ＬＺタンパク質複合体のための結晶化条件
結晶は、再現可能な様式で、２つの異なる条件（Jena Bioscience ref：３Ａ４及び８Ｂ５）下で成長した。リザーバー溶液３Ａ４は、１０%  ＰＥＧ  ４００００、５%イソプロパノール、１００mM  Ｎａ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５を含み、溶液８Ｂ５は、５%  ＭＰＤ（２−メチル−２，４−ペンタジオール）、５%エタノール、１００mM  Ｎａ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５を含む。結晶は、蒸気拡散下で、微結晶とシードされた（マイクロシーディング）懸濁液滴中で成長した。１μlのタンパク質複合体を１μlのリザーバー溶液に加えて、蒸気拡散下で、１８〜２０℃で３６時間以上にわたり平衡化する。結晶の断片から開始して得られる微結晶（０．１μl）を液滴中に導入する。シーディング後、結晶が数日間で成長し、３００×１５０×２０μmに達する。低温保存のために、結晶を、ＰＥＧ  ４０００及び２０%Ｃグリセロール（３Ａ４）又は３０%  ＭＰＤ（８Ｂ５）を追加で含むリザーバー溶液中に３０秒間にわたりプランジする。結晶をナイロンループ中に乗せて、データ収集前に非常に迅速に凍結する。
【００４７】
１．３  アンキリン１Ｄ５／ＣＣ２−ＬＺタンパク質複合体の分析
Ｘ線回折データ（ｌ＝０．９７９４Å）を、ＳＬＳ（Swiss Synchrotron Light Source）でのPX06SAビームライン及びPilatus 6Mハイブリッドピクセル検出器（結晶‐検出器の距離：６４０mm及び０．５°振動／工程１００°Ｋ）を使用して記録する。データセットを、ＸＤＳプログラムパッケージを使用して処理する。全ての結晶は、以下の結晶単位格子パラメーター：
ａ＝ｂ＝６３．５Å及びｃ＝４３７．５Å。
を伴う同じ空間群（Ｐ４３２１２）に属する。
【００４８】
１．４  ＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメインの結晶学的構造の決定及び精密化
構造を、アンキリン２ＪＡＢの原子モデル（Zhand et al.、発表予定）及びＮＥＮＯヘリックスについての理論モデルを使用したＡｍｏＲｅプログラムを使用して、分子置換により解析した。１５〜３．５Å解像度のデータをこれらの計算において使用した。電子密度マップの分析後、モデルの手動構築を、Ｏを使用して行った。ＴＬＳを用いた精密化を、Ｒｅｆｍａｃプログラムを使用して実施した。モデルを、アンキリン（鎖Ｃ及びＤ）について及びＮＥＭＯヘリックス（残基２５１〜２９０、Ｎ末端領域、及び残基２９４〜３３７、Ｃ末端領域）についての非結晶学的対称制約を維持しながら精密化した。最終モデルは、溶媒の２６分子及びグリセロールの１分子を含み、解像度は３．５ÅでＲｃｒｙｓｔ／Ｒｆｒｅｅ＝２０．８%／２６．１%である。立体化学的データ及びＲ因子を表１に示す。モデルの立体化学的な質をPRO CHECKを使用して分析した。
【００４９】
１．５  ＮＥＭＯのＣＣ２−ＬＺドメイン／ユビキチン複合体のモデルの取得
ＣＣ２−ＬＺ／ユビキチン複合体をモデル化するための最善の候補は、単純αヘリックスを含む構造、例えばＵＩＭ（ユビキチン相互作用モチーフ）及びＲａｂｅｘ−５から得られる逆ＵＩＭ（ＩＵＩＭ又はＭＩＵ）などである。配列の比較後、ＣＣ２−ＬＺドメインのＮＯＡモチーフとＲａｂｅｘ−５のＩＵＩＭの間での約２０%の配列同一性が観察された（図６）。Ｒａｂｅｘ−５のＩＵＩＭモチーフは、残基Ｉｌｅ  ４４を中心とするユビキチンの疎水性領域に結合する。また、この同じ残基Ｉｌｅ  ４４は、ＮＥＭＯとポリユビキチンＫ６３の間の相互作用において必要であることが示されており（Bloor S. et al., Signal processing by its coil zipper domain activates IKK gamma, Proc Natl Acad Sci USA 105, 1279-84, 2008）、ユビキチンが、等価な様式で、ＮＥＭＯのＮＯＡモチーフ及びＲａｂｅｘ−５  ＩＵＩＭに結合することを明確に示唆する。結果的に、Ｒａｂｅｘ−５  ＩＵＩＭ／ユビキチン複合体の公知の三次元構造合成を、ＣＣ２−ＬＺ／ユビキチン複合体のモデルの合成におけるガイドとして使用した。対称を尊重するために、ユビキチンの２分子をＮＥＭＯヘリックスに結合させる。ＣＣ２−ＬＺ／ユビキチン複合体についての相補性指数は０．６９であり、ＣＣ２−ＬＺ／アンキリン１Ｄ５複合体の相補性指数（ＳＣ＝０．６５）よりも高い。ユビキチンの分子はＮＯＡの疎水性領域（その結合部位は、アンキリン１Ｄ５と部分的に重複する）に結合する。ＮＯＡの残基Ｄ３０４は、ＣＣ２−ＬＺ／ユビキチン界面の中心に埋め込まれ、ユビキチンのＨ６８残基とＨ結合を形成する。他の主な相互作用は、非極性残基（Ａｌａ  ３０７を含む）を含み、ＩＵＩＭモチーフ中に見出される不変Ａｌａ残基及びＮＥＭＯ／ポリユビキチンＫ６３相互作用に関与する残基Ｆ３０５に対応する。これらの相互作用は、ＮＯＡの疎水性表面をマスクし、それは溶媒からのエネルギー項において支持されず、この領域の安定化に寄与する。ＣＣ２−ＬＺ／ユビキチンモデルの三次元構造は、種々の実験、例えば定方向突然変異誘発又はＮＭＲにより観察される化学シフトなどを用いてさらに立証される（図９）。
【００５０】
【表２】
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【００５１】
実施例２：ＮＥＭＯの活性立体構造での定方向突然変異誘発による構造検証
２．１  プラスミドの構築及び定方向突然変異誘発
ＮＥＭＯのヒトＣＣ２−ＬＺドメインをコードするｃＤＮＡは、Ｔａｘ  ＣＣ２−ＬＺと命名され、Ｍｅｔ  ２１５からＧｌｕ  ３６２（ヒトナンバリング）まで伸長し、以下の２つのヌクレオチドプライマーを使用したＰＣＲにより得られる：ＮＥＭＯ  １配列番号８（５’−ＣＣＣＣＡＴＡＴＧＧＡＧＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧＣＣＴＣ）及びＮＥＭＯ  ２配列番号９（５’−ＴＧＡＧＧＡＡＧＣＧＧＡＴＧＴＣＧＡＧＴＡＧＣＴＣＧＡＧＧＧＧ）。このｃＤＮＡを、細菌発現ベクターｐＥＴ  ２８ｂ（Novagen）のＮｄｅＩとＸｈｏＩの制限酵素部位の間に導入し、ベクターｐＥＴ−ＮＥＭＯを生成する。
配列ＤＹＫＤＤＤＤＫに対応するＦＬＡＧタグを、哺乳動物ベクターｐｃＤＮＡ３中に、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩの制限酵素部位の間に導入し、プラスミドｐｃＦＬＡＧを作製する。
ヒト型のＮＥＭＯをコードするｃＤＮＡを、以下の２つのヌクレオチドプライマーを使用したＰＣＲにより増幅させる：ＮＥＭＯ  ３配列番号１０（５’−ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＧＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＡＡＧＡＧ）及びＮＥＭＯ  ４配列番号１１（５’−ＣＡＴＧＧＡＧＴＧＣＡＴＴＧＡＧＴＡＧＣＴＣＧＡＧＧＧＧ）。そして、次に、ｐｃＦＬＡＧプラスミド中に、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩの制限酵素部位の間に導入し、プラスミドｐｃＮＥＭＯ−ＷＴを作製する。
点突然変異Ｇｌｕ２９６Ａｌａ、Ｐｈｅ３１２Ａｌａ、Ｇｌｕ３１５Ａｌａ、Ａｌａ３２３Ｐｒｏ及び二重突然変異体Ｌｅｕ３２９Ａｌａ  Ｌｅｕ３３６Ａｌａを、一方で、細菌ベクターｐＥＴ−ＮＥＭＯ−ＷＴ中に、他方で、哺乳動物ベクターｐｃＤＮＡ３／ＮＥＭＯ−ＷＴ中に、定方向突然変異誘発（プロトコールがStratageneからのキット「Quikchange II Site-Directed Mutagenesis」において記載されている）を使用して導入する。
【００５２】
２．２  マウス胚線維芽細胞における機能的相補性
ＮＥＭＯ欠損マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を細胞培養ジャー中で培養し、βガラクトシダーゼをコードする０．２μgのプラスミドｐＥＦ１、Ｉｇｋルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む０．５μgのプラスミド、及びＮＥＭＯの異なる変異体を発現する２μgのプラスミドを含む混合物で一過性にトランスフェクトする。トランスフェクションから２４時間後、細胞をＴＮＦα（２０ng/ml）で２４時間にわたり活性化する。細胞を次に回収し、次にプロテアーゼのカクテルを加えた１１０μlのバッファー（２５mM  Ｔｒｉｓ／リン酸  ｐＨ７．８、８mM  ＭｇＣｌ２、１%  Ｔｒｉｔｏｎ、１mMジチオスレイトール、１５%グリセロール）（Roche）中で溶解させる。細胞ライセートを１３  ０００rpmで２０分間にわたり４℃で遠心する。レポーター遺伝子の活性を測定する。
【００５３】
２．３  野生型タンパク質及び突然変異体Ｆ３１２Ａの発現及び精製
精製は、AKTA Purifier 100装置（Amersham Pharmacia Biotech）を使用して行う。種々のタンパク質の精製を、種々のｐＥＴ  ２８プラスミドを用いて、カナマイシン（５０μg/ml）の存在下において形質転換されたＢＬ２１−Ｇｏｌｄ  Ｄ３細菌（Stratagene）の３リットルの培養物から開始して、実施する。タンパク質の発現は、１mM  ＩＰＴＧを使用して、３７℃で４時間にわたり誘導させる。６０００g、４℃で２０分間にわたる遠心後、細菌を、１０mM  ＭｇＣｌ２を含むＴｒｉｓ／ＨＣｌ  １００mM  ｐＨ８のバッファー中で洗浄する。細菌沈降物を−２０℃で凍結させる。沈降物を、次に、２ml/g（細菌）の濃度でプロテアーゼインヒビターの混合物（Complete EDTA-free, Roche）を含む抽出バッファー（Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ５０mM  ｐＨ８、ＫＣｌ  ２０mM、及びグリセロール５%）中に再懸濁し、フレンチプレスを使用して圧力１５００psi下で粉砕させる。細菌ライセートを３回、１０秒間の超音波処理（９０Ｗ）に供して、それにより、ＤＮＡの断片化により培地の粘性を低下させることが可能になる。ライセートを、次に、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ５０mM  ｐＨ８、ＮａＣｌ  １Mのバッファー中で２．５倍希釈し、次に１０  ０００ｇで３０分間にわたり４℃で遠心する。上清を、次に、前述のバッファー中で先に平衡化させた20ml Ni-NTA Superflowアフィニティーカラム（Qiagen）上に置く。カラムを一晩にわたり洗浄し、全ての非吸着タンパク質及びまたＤＮＡを除去した後、タンパク質をカラムの平衡化バッファー中の直線勾配（０〜５００mM）のイミダゾール（ACS, Merck）により溶出する。目的のタンパク質を含む分画を回収し、ＨＥＰＥＳ  ２０mM  ｐＨ７．５、ＫＣｌ  ５０mM、ＥＤＴＡ  １mMのバッファーに対して透析する。透析液は、そのｐＨがＭＥＳ  １Ｍを使用して６にされており、ＭＥＳ  ５０mM  ｐＨ６、ＫＣｌ  ５０mMのバッファー中で事前に平衡化したPoros 20-HS陽イオン交換カラム（Perseptive Biosystem）上に添加する。溶出は、直線勾配のＫＣｌ（５０mM−１M）を用いて行う。タンパク質分画を合わせて、次に限外ろ過（Amicon-Ultra、カットオフ閾値１０  ０００）により濃縮し、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ２０mM  ｐＨ８、ＫＣｌ  １００mMのバッファーに対して透析する。タンパク質を少量で、−８０℃で保存する。種々のタンパク質の純度は、変性条件下での電気泳動及びクマシーブルーでの染色による分析に従って＞９８%として決定される。タンパク質濃度は、モル減衰係数５９６０M-1cm-1を使用して、２８０nmでの吸光度の測定により決定する。
【００５４】
２．４  野生型タンパク質及び突然変異体Ｆ３１２Ａのゲルろ過
ゲルろ過実験は、Superdex 75 HR 10/30カラム（Amersham Biosciences）上で、４℃で行う。カラムは、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ５０mM  ｐＨ７．５、ＮａＣｌ  ２００mM、ＤＴＥ  ０．２mMのバッファー中で、４℃、流速０．５ml/分で平衡化する。一定容積（２００μl）のサンプル（濃度０．３μM）を、カラム上に速度０．５ml/分で注入する。タンパク質をカラムの平衡化バッファー中で希釈し、平衡化を可能にするために、注入前に４℃で２時間にわたり静置させる。タンパク質の溶出を検出するために、RF-10 AXL分光蛍光光度計（Shimadzu）をオンラインでＡＫＴＡ装置に接続する。内在性の蛍光を記録し、２８０nmでの励起後、３１０nmでのチロシン残基の蛍光放出を測定する。
【００５５】
【表１】
0005529759.tif 000003
0005529759.tif 000004
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１】
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【図５】
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【図９】
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【図１１】
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【配列表】
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