(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の核酸集団から少なくとも１つの変異ヌクレオチドを有する標的核酸を濃縮するための方法であって、
（ａ）前記試料を前記標的核酸配列の第１の鎖についての濃縮プライマーおよび増幅プライマーで処理して、二本鎖の混合物を作製する工程であって、
前記二本鎖の混合物は、ハイブリダイズ条件下で前記標的核酸鋳型にアニールされた、前記濃縮プライマー及び前記増幅プライマーを含み、
前記濃縮プライマーのヌクレオチド配列は、変異被疑ヌクレオチドが位置する診断領域に実質的に相補的であるが、
３’末端のヌクレオチド、または３’末端の１、２もしくは３ヌクレオチド以内のヌクレオチドは変異ヌクレオチドまたは対応する正常ヌクレオチドのいずれかに相補的であり、
前記増幅プライマーは、前記標的核酸にアニールされ、それによって、前記増幅プライマーの３’末端は、前記濃縮プライマーの５’末端の上流にある、工程と、
（ｂ）適切なヌクレオシド三リン酸および熱安定性である核酸ポリメラーゼを含む伸長条件下で工程（ａ）の前記混合物を維持して、前記アニールされたプライマーを伸長し、伸長可能な場合、プライマー伸長産物を合成する工程であって、
前記アニールされた濃縮プライマーが前記正常ヌクレオチドを有する前記標的核酸の診断領域にアニールする場合、前記アニールされた濃縮プライマーの伸長が起こり、濃縮プライマー伸張産物を合成し、前記正常ヌクレオチドを有する標的核酸にアニールされた前記増幅プライマーから開始される伸長が、前記濃縮プライマー伸張産物によって阻止され、
前記アニールされた濃縮プライマーが、前記変異ヌクレオチドを含む前記診断領域にアニールする場合、前記アニールされた濃縮プライマーは伸長できず、
それによって、前記濃縮プライマーが、前記伸長条件下で前記標的配列から解離され、それによって、前記増幅プライマーの伸長が、前記変異ヌクレオチドを含む前記診断領域を通過することを可能にする工程と、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）が増幅反応において繰り返される工程と、を含み、
前記変異ヌクレオチドを有する前記標的核酸の優先的増幅を可能にする方法。
【請求項２】
前記濃縮プライマーの３’末端ヌクレオチドは対応する前記正常ヌクレオチドに相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記濃縮プライマーは、前記濃縮プライマーの前記伸長産物を指数関数的増幅に適さないようにする部分を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記部分は、核酸ポリメラーゼについての鋳型として適切でない阻止部分であり、前記濃縮プライマーの全てまたは一部の複製が阻止され、前記阻止部分は、
（ｉ）炭化水素の腕、非ヌクレオチド結合、ペプチド核酸、ヌクレオチド誘導体、脱塩基リボースまたは染料であるか、
（ｉｉ）前記濃縮プライマーの３’末端から３ヌクレオチド未満、離間して位置するか、
（ｉｉｉ）前記濃縮プライマーの３’末端から６ヌクレオチド未満、離間して位置するか、または
（ｉｖ）前記濃縮プライマーの３’末端から１８ヌクレオチド未満、離間して位置する、
請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記濃縮プライマーは、前記濃縮プライマーの全てまたは一部をヌクレアーゼ切断に対して耐性となるようにする修飾されたヌクレオチドまたは結合を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記３’末端および／または５’末端における最後の５ヌクレオチドまたは結合は、前記濃縮プライマーがヌクレアーゼ切断に対して耐性となるように修飾され、かつ／または前記３’末端および／または５’末端における最後のヌクレオチドまたは結合は、前記濃縮プライマーがヌクレアーゼ切断に対して耐性となるように修飾される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記増幅反応はＰＣＲである、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ａ）において、前記反応混合物は、前記標的配列の第１の鎖に相補的である前記標的配列の第２の鎖についてのさらなる濃縮プライマーおよび／または増幅プライマーを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
前記濃縮された標的核酸を検出する工程を含み、前記検出は、ブリッジプローブにより媒介され、前記ブリッジプローブは、ブリッジ部分によって連結された少なくとも２つの結合部分を含み、第１の結合部分は、核酸鋳型の第１の領域にハイブリダイズでき、
第２の結合部分は、前記核酸鋳型の前記第１の領域に隣接または実質的に隣接する前記核酸鋳型の第２の領域にハイブリダイズでき、
前記標的核酸鋳型の前記第１の領域は、前記変異被疑ヌクレオチドを含み、
前記ブリッジ部分は、前記核酸鋳型にハイブリダイズできない少なくとも１つのヌクレオチド化学部分または少なくとも１つの非ヌクレオチド化学部分を有する配列を含み、
前記ブリッジ部分の長さおよび／または組成は、個々の結合部分の融点（Ｔｍ）および／または前記ブリッジプローブのＴｍを決定するのに適応される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
（ｉ）前記核酸鋳型の前記第１の領域は、プライマーの伸長産物の伸長された部分上の領域であり、前記第２の領域は、前記プライマーまたはプローブの一部であるか、または
（ｉｉ）前記核酸鋳型の前記第１の領域および前記第２の領域は、増幅プライマーまたはプローブの両方の部分である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ブリッジプローブの結合部分は、異なる融点にてマッチしたヌクレオチドまたはミスマッチしたヌクレオチドを有する前記標的核酸にハイブリダイズし、前記異なる融点が測定され、変異被疑ヌクレオチドの有無の指標となる、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
（ｉ）前記ブリッジ部分の一端は、前記第１の結合部分の５’末端に結合され、前記ブリッジ部分の他端は、前記第２の結合部分の３’末端に結合されるか、または、
（ｉｉ）前記ブリッジ部分の一端は、前記第１の結合部分の５’末端に結合され、前記ブリッジ部分の他端は、前記第２の結合部分の５’末端に結合されるか、
または、前記ブリッジ部分の一端は、前記第１の結合部分の３’末端に結合され、前記ブリッジ部分の他端は、前記第２の結合部分の３’末端に結合される、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
（ｉ）前記ブリッジプローブが標的核酸にハイブリダイズする場合、前記ブリッジプローブの末端は互いの方向を向くか、または
（ｉｉ）前記ブリッジプローブが標的核酸にハイブリダイズする場合、前記ブリッジプローブの末端は反対の方向を向くか、または、
（ｉｉｉ）前記ブリッジプローブが標的核酸にハイブリダイズする場合、前記ブリッジプローブの末端は同じ方向を向く、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記プローブおよび／または前記プライマーは、検出ラベルを含む、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の結合部分は第１のラベルに結合され、前記第２の結合部分は第２のラベルに結合され、
（ｉ）前記第１のラベルおよび前記第２のラベルは、接触クエンチング対となり、前記ラベルの１つはクエンチャーであり、
前記プローブと前記標的配列とのハイブリダイゼーションの際に、前記第１のラベルおよび前記第２のラベルは、接触クエンチング関係となるか、または
（ｉｉ）前記第１のラベルおよび前記第２のラベルは、蛍光エネルギー移動対となり、
前記プローブと前記標的配列とのハイブリダイゼーションの際に、前記第１のラベルおよび前記第２のラベルは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）関係となる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２の結合部分および前記ブリッジプローブの前記第２の結合部分とハイブリダイズできる前記プライマーの一部は、各々、フルオロフォアおよびクエンチャー結合対の１つのメンバーに結合され、
それにより、前記ブリッジプローブと前記プライマー伸長鎖とのハイブリダイゼーションの際に、前記フルオロフォアおよびクエンチャーは、接触クエンチング関係となる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記クエンチャーは、
（ｉ）非蛍光性実体、または
（ｉｉ）ナノ粒子、または
（ｉｉｉ）Ｇ残基または複数のＧ残基
である、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記濃縮された標的核酸を検出する工程を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の核酸集団からの所望の核酸の検出および濃縮、特に変異を含む稀少核酸の濃縮の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
一塩基多型（ＳＮＰ）は、ヒトゲノムにおいて最も多発する型の変異である。点突然変異は通常はＳＮＰでもあるが、この用語の変異は普通、頻度が１％よりも稀少であるＳＮＰのものおよび／または変異と疾患との間の既知の相関関係もしくは機能的関連性のある場合のものである（非特許文献１）。多型の遺伝子型特定、および稀少突然変異の検出には、多くの応用例がある。稀少変異の検出は、病理学的突然変異の初期検出にとって、特に癌において重要である。例えば、癌に関わる点突然変異の臨床検体における検出によって、化学療法の際の微小残存病変の同定を改善でき、また再発患者での腫瘍細胞の出現を検出することができる。稀少点突然変異の検出は、環境変異誘発物質への曝露の評価、内在ＤＮＡ修復のモニター、および高齢の個体における体細胞性突然変異の蓄積の研究にも重要である。また、感度がより高い、稀少変異の検出方法は、出生前診断に大きな変革をもたらすことができ、母方の血液中に存在する胎児細胞の特徴付けが可能になる。おびただしい数の方法が導入されているが、単一の方法で広く認められているものはない。ゲノムＤＮＡでの低頻度変異を検出するための多くの方法で、突然変異体および野生型の標的を増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が使用される。ＰＣＲ産物は、配列決定、オリゴヌクレオチドライゲーション、制限酵素消化、質量分析、またはアレル特異的ハイブリダイゼーションを含む様々な方法で分析され、野生型ＤＮＡのバックグラウンドに対する変異産物が同定される。他の方法では、付加的な選択を行うかまたは行わずに、アレル特異的ＰＣＲを用いて低頻度変異からの選択的増幅を行う。例えば、野生型産物を特異的に切断する制限酵素でＰＣＲ産物を消化することによって行なわれる。擬陽性をもたらす、ＰＣＲの際のアレル特異的プライマーの総体的特異性欠如のせいで、現今のアプローチには固有の限界がある。その結果、現今のアプローチはすべて、感度および精度に限度があった（非特許文献２に総説）。
【０００３】
ほとんどの変異検出システムは、検出される変異分子の数の観点から、確認することが困難であるアッセイ信号を生じた。これは、複数の試料（各々の試料が限定されたＤＮＡを含む（典型的には５０ゲノム等価物））を解析して、試料中の変異分子の数を測定することにより部分的に克服できる（デジタルＰＣＲ；非特許文献３）。しかしながら、ＰＣＲの間のヌクレオチドの誤取り込みから生じるバックグランドノイズと合わせて、必要とされる多数のＰＣＲ反応により、１０００個の核酸集団中の約１個の変異のレベルを検出するこのアプローチには限度があるようである。多くの変異検出手順の別の限度は、それらが、変異部位をＰＣＲプライマー配列と置換し、推定変異アレルの存在以外の、いくらかでもあれば、少しの情報を含む短い単位複製配列を生じることである（非特許文献２）。
【０００４】
稀少変異体を検出するためのこれらのＰＣＲアプローチの全てに潜む一元的な課題は、増幅時の複製の背信である。ＪｅｆｆｒｅｙｓおよびＭａｙは、ＰＣＲによって変異ＤＮＡ分子を解析する前にゲノムＤＮＡから変異ＤＮＡ分子を濃縮することによる解決策；アレル特異的ハイブリダイゼーションによるＤＮＡ濃縮（ＤＥＡＳＨ）と呼ばれるプロセスを与えている（非特許文献２）。この方法は、ビオチン化ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションを利用する従来の核酸濃縮技術の改変である。これは、単一の塩基置換が異なるＤＮＡ分子を断片化するためにアレル特異的オリゴヌクレオチドを使用する。しかしながら、このＤＮＡ濃縮の方法は複数の工程を含み、大量の出発物質を必要とし、低い感度および効率に悩まされる。
【０００５】
別の濃縮方法は、ＰＣＲ増幅産物が、正常なアレルまたは突然変異アレルのいずれかを選択的に消化できる制限酵素で消化される制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）に基づく。濃縮されるＰＣＲは、ＲＦＬＰ解析に導入される修飾である。このアプローチの原理は、正常な配列内にのみ制限酵素部位を作製することであり、それによって、第１の増幅工程において増幅される正常なアレルの選択的消化を可能にする。これにより、非変異ＤＮＡが第２の増幅工程においてさらに増幅することを防止するが、その後の増幅の際に、変異アレルは濃縮される（特許文献１；Ｋａｈｎら、１９９１）。しかしながら、このアプローチは、制限酵素部位が天然に存在する場合のものと一致する部位での変異の解析には限度がある。この限度を克服するために、当業者は、点突然変異の部位の近くに制限酵素部位を人工的に導入して、正常アレルと変異アレルとを区別することがきできる。このアプローチにおいて、プライマーが特定の点突然変異に隣接する場合、塩基対置換は、制限酵素部位のみを生じるＰＣＲに使用されるプライマーに導入される。このアプローチは、おそらくは任意の遺伝子の中の既知の部位で、点突然変異の選択的同定を可能にする。
【０００６】
ミスマッチした３’末端増幅は、３’末端で修飾されているプライマーを利用して、１つの特異的点突然変異のみをマッチするＰＣＲ技術である。この方法は、特定のミスマッチに相補的な３’末端を有するプライマーからの伸長を可能にする条件に頼るが、野生型配列は伸長されない。この手順は、各々の変異についての特定のプライマーを必要とし、ＰＣＲ条件はかなり厳密である。
【０００７】
最近、ＰＮＡ（またはＬＮＡ）クランプＰＣＲと呼ばれる濃縮方法が開発されている。ペプチド核酸（ＰＮＡ）などの高親和性核酸類似体を使用して、核酸増幅を阻害する（特許文献２）。しかしながら、これらの方法は問題があり得る。ＰＮＡ／ＬＮＡクランプについての最適な条件を見つけることが難しく；長期にわたる試験および再設計がしばしば必要とされ、特殊な機器の購入が必要とされ得る。さらに、ＰＮＡは高価であり、合成することが難しく、阻害の効力がしばしば低い。
【０００８】
特許文献３は、検出プライマーを用いて目的の核酸配列における配列変異を検出および同定するための方法に関連する。この公報の主題は、検出プライマーと、それが存在する標的との間の診断上のミスマッチを利用することである。検出プライマーは、目的の配列とハイブリダイズし、ポリメラーゼで伸長される。検出プライマー伸長の効率は一般に、標的中の配列変異の存在および／または同一性の指標として直接検出される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５，７４１，６７８号明細書
【特許文献２】米国特許第５，８９１，６２５号明細書
【特許文献３】欧州特許第１０６１１３５号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｇｉｂｓｏｎ  ＮＪ，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ．，２００６年，３６３（１−２），ｐ３２−４７
【非特許文献２】Ｊｅｆｆｒｅｙｓ  ＡＪおよびＭａｙ  ＣＡ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，２００３年，１３（１０），ｐ．２３１６−２４
【非特許文献３】ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよびＫｉｎｚｌｅｒ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１９９９年，９６（１６），ｐ．９２３６−４１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、それでもやはり、稀少点突然変異の感度の高い濃縮および検出に適合される新規方法およびプローブを提供することは、当該分野において貢献をもたらすはずであると理解されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の方法は、迅速で、感度が高く、改善された、核酸集団からの所望の核酸の濃縮および検出を可能にする。改善された方法およびプローブはまた、迅速で、感度が高い、遺伝的疾患または腫瘍形成（ｎｅｏｐｌａｓｉａｓ）を有する患者由来の試料中の核酸における遺伝的変異の検出を可能にする。
【００１３】
本発明の種々の態様は、以下の態様、実施形態および特許請求の範囲に記載される。
【００１４】
一般的に言えば、一態様において、本発明は、試料中の核酸集団から特定の標的配列（例えば、少なくとも１つの変異ヌクレオチド）を有する所望の核酸を濃縮および／または検出するための方法を提供し、当該方法は、
（ａ）ハイブリダイゼーション条件下で、核酸集団を、標的核酸配列の第１の鎖についての第１の濃縮プライマーおよび第１の増幅プライマーで処理し、それによって、前記プライマーは、標的核酸の第１の鎖にアニールし、それによって、増幅プライマーの３’末端は、濃縮プライマーの５’末端に隣接するか、または濃縮プライマーの５’末端の上流にある工程であって、
前記濃縮プライマーのヌクレオチド配列は、第１の鎖の診断領域（例えば、変異被疑ヌクレオチドが位置する場所および濃縮プライマーの３’末端ヌクレオチドが、変異被疑ヌクレオチドまたは対応する正常な非変異ヌクレオチドのいずれかに相補的である場所）と実質的に相補的である工程と、
（ｂ）伸長条件（例えば、この条件は、工程（a）において適切なヌクレオシド三リン酸および核酸ポリメラーゼ、ならびに適切なリバースプライマーの存在を含んでもよい）下で工程（ａ）の混合物を維持する工程であって、
アニールされた濃縮プライマーの伸長は、標的核酸における正常ヌクレオチドまたは変異ヌクレオチドの存在に依存し、それにより、濃縮プライマー伸長産物の合成は、増幅プライマー（これは、正常ヌクレオチドを含む標的核酸にハイブリダイズする）の伸長を阻止するか、または増幅プライマーの（変異ヌクレオチドを含む標的核酸に対する）ハイブリダイゼーションおよび伸長を促進する工程と、を含む。
【００１５】
従って、手短に言えば、本発明の１つの好ましい実施形態において、増幅プライマーの伸長（これによる指数関数的増幅）は、濃縮プライマーからの伸長がないことに依存する。従って、伸長されない濃縮プライマーは、伸長条件下で標的配列から解離され、それにより、増幅プライマーの伸長が変異被疑ヌクレオチドを含む診断領域を通過することができ、好ましくは指数関数的増幅を生じる。
【００１６】
別の実施形態において、工程（ａ）において核酸鋳型は、ハイブリダイゼーション条件下でステムループ構造を形成し、二本鎖のステムは増幅プライマー結合部位を含み、ループは標的核酸配列を含み、濃縮プライマーはループ中の診断領域にアニールする。工程（ｂ）において、濃縮プライマーが変異ヌクレオチドを含む診断領域にアニールする場合、その濃縮プライマーは伸長され；この伸長によりステムループ構造が開き、それにより、ハイブリダイゼーション条件下で、増幅プライマーがプライマー結合部位にアニールすることを可能にして、増幅を促進し、濃縮プライマーが正常ヌクレオチドを有する診断領域にアニールする場合、その濃縮プライマーは伸長できず、それにより、ステムループ構造はインタクトな状態であり、増幅プライマーがプライマー結合部位にアニールすることを防ぐ。
【００１７】
従って、両方の実施形態において、２つの異なる濃縮プライマーが存在し、そのうちの１つは、それが正常ヌクレオチドを含む診断領域にアニールする場合、伸長され、もう１つは、それが変異ヌクレオチドを含む診断領域にアニールする場合、伸長される。
【００１８】
両方の実施形態において、変異配列の優先的増幅は、濃縮プライマーの一方の伸長に依存するが、他方には依存しない。
【００１９】
しかしながら、第１の実施形態において、図１の例に示したように、「正常」濃縮プライマーの伸長は、最終的に、（「正常」標的にアニールされた増幅プライマーの伸長を阻止することによって）変異配列の優先的増幅を導く。
【００２０】
第２の実施形態において、図１１の例に示したように、「変異」濃縮プライマーの伸長は、最終的に、（「変異」標的にアニールされた増幅プライマーの伸長のみを可能にすることによって）変異配列の優先的増幅を導く。
【００２１】
好ましくは、濃縮プライマーそれ自体の伸長産物は、例えば、適切な部分の導入によって、またはその配列（これはそれ自体折り畳まれて、プライマーがアニールすることを防ぐことができる）に起因するかのいずれかで、濃縮プライマーをコピーするのに適さないものにすることによって、指数関数的増幅に適さない状態にする。
【００２２】
以下に記載するように、アニールされた濃縮プライマーの伸長は、多くの方法で、標的核酸中の正常ヌクレオチドまたは変異ヌクレオチドの存在に依存するようにしてもよい。
【００２３】
例えば、プライマーは、その３’末端において、正常配列または野生型配列に相補的なヌクレオチドを含んでもよい。これはプライマー伸長に必要とされる。この文脈において、本明細書の任意の態様または特許請求の範囲で「３’末端ヌクレオチド」または「３’末端」を指す場合、同じ効果を成し遂げるように、すなわち関連プライマーがそれぞれ相補的または非相補的である診断部分にアニールする場合に伸長を許容または防止するように、末端ヌクレオチドに充分近接した非末端ヌクレオチドを用いて、本発明を同様に実施してもよいことが理解されよう。典型的には、このような非末端ヌクレオチドはやはり、末端から１、２または３のヌクレオチドだけは、離間したことになろう。
【００２４】
例えば、プライマーは、その３’末端において、正常配列または野生型配列に相補的でないブロッキングヌクレオチドを含んでもよい。ミスマッチに起因するこの末端ヌクレオチドを取り除く条件（例えば、プローフリーディングポリメラーゼ）が適用され、阻止効果が取り除かれ、伸長を可能にする。
【００２５】
例えば、プライマーは、その３’末端において、正常配列に相補的なブロッキングヌクレオチドを含んでもよい。この末端ヌクレオチドを取り除く条件（例えば、ピロホスホリル分解（ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｙｓｉｓ））が適用され、阻止効果が取り除かれ、伸長を可能にする。
【００２６】
別の態様において、本発明は、標的核酸を検出するための方法を提供し、前記検出は、ブリッジプローブにより媒介され、このブリッジプローブはブリッジ部分によって結合される少なくとも２つのブリッジ部分を含み、第１の結合部分は、核酸鋳型の第１の領域にハイブリダイズでき、第２の結合部分は、核酸鋳型の第１の領域に隣接するか、または実質的に隣接する核酸鋳型の第２の領域にハイブリダイズでき、核酸鋳型の第１の領域は変異被疑ヌクレオチドを含む。
【００２７】
もしあれば、核酸鋳型の第１の領域と第２の領域との間の分離度と合わせた前記結合部分の長さおよび／または組成により、個々の結合部分のＴｍ（融点）および／またはブリッジプローブのＴｍを調節でき、これらの変更は、当業者により（例えば、従来のソフトウェアを用いて）本開示を考慮して容易に選択または適合できる。
【００２８】
核酸鋳型の第１の領域は、プライマー伸長産物の伸長された標的配列上の領域であってもよく、前記第２の領域は、増幅プライマーまたはプローブの一部である。
【００２９】
使用時に、ブリッジプローブの１つの結合部分は、標的が相補的ヌクレオチドを含むか、または非相補的ヌクレオチドを含むかどうかに依存する異なる融点で標的核酸にハイブリダイズする。温度が測定され、これは変異被疑ヌクレオチドの有無の指標となる。
【００３０】
ブリッジ部分は、少なくとも１つのヌクレオチドまたは少なくとも１つの非ヌクレオチド化学部分を含む。
【００３１】
ブリッジプローブおよび／またはプライマーもしくはプローブは、検出ラベルを含んでもよい。第１の結合部分は１つ以上の第１のラベルが付けられ、第２の結合部分は１つ以上の第２のラベルが付けられ、前記第１のラベルおよび第２のラベルは、接触クエンチング対となり、ラベルのうちの１つはクエンチャーであり、プローブと標的配列とのハイブリダイゼーションの際に、第１のラベルおよび第２のラベルは接触クエンチング関係となる。あるいは、第１の結合部分は第１のラベルが付けられ、第２の結合部分は第２のラベルが付けられ、前記第１のラベルおよび第２のラベルは蛍光エネルギー移動対となり、プローブと標的配列とのハイブリダイゼーションの際に、第１のラベルおよび第２のラベルは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）関係となる。
【００３２】
第２の結合部分およびブリッジプローブの第２の結合部分とハイブリダイズできるプライマーの領域は、各々、フルオロフォアの１つのメンバーおよびクエンチャー対に結合でき、それによって、ブリッジプローブと標的配列とのハイブリダイゼーションの際に、フルオロフォアおよびクエンチャーは、接触クエンチング関係となる。クエンチャーが非蛍光実体であることが好ましい。クエンチャーはナノ粒子であってよい。クエンチャーはＧ残基または複数のＧ残基であってよい。
【００３３】
本発明はまた、生物学的試料の標的ＤＮＡ配列を解析するための方法を提供し、前記方法は、
（ａ）生物学的試料に有効量の増幅プライマーおよび核酸プローブを加える工程であって、
前記増幅プライマーの１つおよびプローブは、各々、フルオロフォアおよびクエンチャーの１つのメンバーでラベルされ、それによって、プローブと、ラベルされた増幅プライマーを含む増幅産物とのハイブリダイゼーションの際に、フルオロフォアおよびクエンチャーは接触クエンチング関係となる工程と、
（ｂ）増幅法により標的核酸配列を増幅する工程と、
（ｃ）生物学的試料に、前記フルオロフォアによって吸収される選択された波長の光を照射する工程と、
（ｄ）前記フルオロフォアの蛍光発光を検出する工程または前記フルオロフォアからの温度依存性蛍光をモニターする工程と、を含む。
【００３４】
一般的に言えば、ラベルされたプローブは、プライマーに充分に近接する増幅産物にハイブリダイズして、そのハイブリダイズを達成し、従って、当業者は、例えば、プライマー付近の伸長された領域内に近接するラベルされた部位に依存して、および／または一部はプライマー自体にハイブリダイズする、そのプライマーを標的化できる。典型的に、５またはそれより少ない（例えば、０、１、２、３または４）ヌクレオチドが、プローブの末端付近およびプライマー伸長増幅産物の「末端」を分離する。
【００３５】
別の実施形態において、生物学的試料の標的ＤＮＡ配列を解析するための方法は、
（ａ）生物学的試料に、有効量の増幅プライマーおよび標的配列の隣接する領域にハイブリダイズする２つの核酸プローブを加える工程であって、
前記プローブの１つはフルオロフォアでラベルされ、もう１つのプローブは接触クエンチング対のクエンチャーでラベルされ、それにより、プローブと、標的核酸の増幅産物とのハイブリダイゼーションの際に、フルオロフォアおよびクエンチャーは接触クエンチング関係となり、フルオロフォアおよびクエンチャーは互いの５個のヌクレオチド内にある工程と、
（ｂ）増幅法により標的核酸配列を増幅する工程と、
（ｃ）生物学的試料に、前記フルオロフォアによって吸収される選択された波長の光を照射する工程と、
（ｄ）前記フルオロフォアの蛍光発光を検出する工程または前記フルオロフォアからの温度依存性蛍光をモニターする工程と、を含む。
【００３６】
上記方法は、プローブおよび標的二重鎖の融解プロファイルを測定する工程をさらに含んでもよい。前記核酸プローブの１つはブリッジプローブであり、このブリッジプローブは、ブリッジ部分によって連結された少なくとも２つの結合部分を含み、第１の結合部分は、核酸鋳型（ここでは標的配列の増幅産物）の第１の領域にハイブリダイズでき、第２の結合部分は、核酸鋳型の第１の領域に隣接するかまたは実質的に隣接する核酸鋳型の第２の領域にハイブリダイズでき、前記ブリッジ部分は、核酸鋳型にハイブリダイズできない少なくとも１つのヌクレオチドまたは少なくとも１つの非ヌクレオチド化学部分を含み、前記ブリッジ部分の長さおよび／または組成は、個々の結合部分のＴｍおよび／またはブリッジプローブのＴｍを決定する因子の１つであり、核酸鋳型の第１の領域は変異被疑ヌクレオチドを含むことが好ましい。
【００３７】
関連する方法および材料（例えば、キットおよびプローブ）も提供される。
【００３８】
以下に記載する種々の実施形態および特許請求の範囲（従属請求項を含む）の全ての組み合わせを、上記の本発明の態様に準用する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】診断領域への濃縮プライマーのアニーリングを示す本発明の実施形態の概略図であり、濃縮プライマーの３’末端ヌクレオチド（Ｔ、チミジン）は正常ヌクレオチド（Ａ、アデノシン）にマッチし、標的配列の診断領域の変異ヌクレオチド（Ｃ、シチジン）にミスマッチする。アニールされた濃縮プライマーは、適切な正常ヌクレオチドを含む鋳型で伸長され、この正常ヌクレオチドは上流の増幅プライマーからの伸長を阻止する。アニールされた濃縮プライマーは変異ヌクレオチドを含む鋳型で伸長されず、鋳型から解離され、上流の増幅プライマーの伸長が診断領域を通過することができる。濃縮プライマー伸長産物は直線的に部分的にコピーされ得るが、増幅プライマー伸長産物は指数関数的に増幅され得る。
【図２】診断領域への濃縮プライマーのアニーリングを示す本発明の実施形態の概略図であり、リン酸基によって阻止される濃縮プライマーの３’末端ヌクレオチド（Ｇ、グアニン）は変異ヌクレオチド（Ｃ、シチジン）にマッチするが、それは診断領域の正常ヌクレオチド（Ａ、アデノシン）にミスマッチする。アニールされた濃縮プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼのプルーフリーディング活性によって除去される末端Ｇは除去されて、適切な正常ヌクレオチドを含む鋳型で伸長され、この正常ヌクレオチドは上流の増幅プライマーからの伸長を阻止する。アニールされた濃縮プライマーは変異ヌクレオチドを含む鋳型で伸長されず、鋳型から解離され、上流の増幅プライマーの伸長が、診断領域を通過することができる。濃縮プライマー伸長産物は直線的に部分的にコピーされ得るが、増幅プライマー伸長産物は指数関数的に増幅され得る。
【図３】診断領域への濃縮プライマーのアニーリングを示す本発明の実施形態の概略図であり、濃縮プライマーの３’末端ヌクレオチド（ｄｄＴ、ジデオキシチミジン一リン酸）は正常ヌクレオチド（Ａ、アデノシン）にマッチするが、それは診断領域の変異ヌクレオチド（Ｃ、シチジン）にミスマッチする。アニールされた濃縮プライマーは、末端Ｔ残基が適切な正常ヌクレオチドを含む鋳型でＤＮＡポリメラーゼの加ピロリン酸分解（ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｏｌｙｓｉｓ）活性によって除去された後に伸長され、濃縮プライマー伸長産物は上流の増幅プライマーの伸長を阻止する。アニールされた濃縮プライマーは変異ヌクレオチドを含む鋳型で伸長されず、鋳型から解離され、上流の増幅プライマーの伸長が診断領域を通過することができる。濃縮プライマー伸長産物は直線的に部分的にコピーされ得るが、増幅プライマー伸長産物は指数関数的に増幅され得る。
【図４】診断領域への濃縮プライマーのアニーリングを示す本発明の実施形態の概略図であり、濃縮プライマーの３’末端ヌクレオチド（Ｔ、チミジン）は正常ヌクレオチド（Ａ、アデノシン）にマッチし、標的配列の診断領域の変異ヌクレオチド（Ｃ、シチジン）にミスマッチする。アニールされた濃縮プライマーは、伸長条件下で適切な正常ヌクレオチドを含む鋳型で伸長され、この伸長条件は少なくとも１つの修飾されたデオキシヌクレオシド三リン酸を含む。伸長鎖内の濃縮プライマーは、５’エキソヌクレアーゼ活性によって分解されるが、伸長鎖（修飾されたデオキシヌクレオシド三リン酸を含む）は切断に対して耐性があり、それにより、上流の増幅プライマーからの伸長を阻止する。アニールされた濃縮プライマーは変異ヌクレオチドを含む鋳型で伸長されず、鋳型から解離され、上流の増幅プライマーの伸長が診断領域を通過することができる。（部分的に分解された）濃縮プライマー伸長産物は直線的に部分的にコピーされ得るが、増幅プライマー伸長産物は指数関数的に増幅され得る。
【図５】５’尾部配列を含む濃縮プライマーを示す本発明の実施形態の概略図である。５’尾部配列は、標的配列の第２の鎖についての第２の増幅プライマーの配列と同一または実質的に同一であり、その標的配列の第２の鎖は標的配列の第１の鎖に相補的であり、その標的配列の第１の鎖に、濃縮プライマーおよび第１の増幅プライマーはアニールできる。濃縮プライマーは診断領域にアニールし、濃縮プライマーの３’末端ヌクレオチド（Ｔ、チミジン）は正常ヌクレオチド（Ａ、アデノシン）にマッチし、標的配列の診断領域の変異ヌクレオチド（Ｃ、シチジン）にミスマッチする。アニールされた濃縮プライマーは適切な正常ヌクレオチドを含む鋳型で伸長され、伸長鎖は上流の増幅プライマーからの伸長を阻止する。アニールされた濃縮プライマーは変異ヌクレオチドを含む鋳型で伸長されず、鋳型から解離され、上流の増幅プライマーの伸長が診断領域を通過することができる。濃縮プライマー伸長産物は、変性条件およびハイブリダイズ条件に供される際に、折り畳まれて、ステムループ構造を形成し、そのステムループ構造は第２の増幅プライマーについての結合部位を阻止するが、増幅プライマー伸長産物は指数関数的に増幅できる。
【図６−Ａ】標的核酸にハイブリダイズした種々のブリッジプローブを示す。（Ａ）ブリッジプローブが標的核酸にハイブリダイズする場合、ブリッジプローブの末端は互いの方向を向く。ブリッジプローブの末端は異なるラベルが付けられる。ブリッジプローブが標的にハイブリダイズされる場合、２つのラベルは近接する。（Ｂ）ブリッジプローブが標的核酸にハイブリダイズする場合、ブリッジプローブの末端は同じ方向を向く。ブリッジプローブは２つのラベルが付けられる。ブリッジプローブが標的にハイブリダイズされる場合、２つのラベルは近接する。（Ｃ）ブリッジプローブが標的核酸にハイブリダイズする場合、ブリッジプローブの末端は互いから離れた方向を向く。結合部分は異なるラベルでラベルされる。ハイブリダイゼーションにより、２つのラベルが近接する。（Ｄ）２つの結合部分は標的にハイブリダイズし、第１の結合部分とハイブリダイズした標的核酸の領域は、第２の結合部分とハイブリダイズした領域からいくらか離れている。
【図６−Ｂ】標的核酸にハイブリダイズした種々のブリッジプローブを示す。（Ｅ）ブリッジプローブはラベル１でラベルされ、別のプローブはラベル２でラベルされる。２つのプローブが標的にハイブリダイズする場合、２つのラベルは近接する。（Ｆ）２つの核酸プローブは標的配列の隣接する領域にハイブリダイズし、前記プローブの１つはフルオロフォアでラベルされ、もう１つのプローブは接触クエンチング対のクエンチャーでラベルされ、それによって、プローブと増幅産物とのハイブリダイゼーションの際に、フルオロフォアおよびクエンチャーは接触クエンチング関係となる。（Ｇ）、（Ｈ）および（Ｉ）増幅プライマーおよびブリッジプローブであり得る核酸プローブは、各々、フルオロフォアおよびクエンチャーの１つのメンバーでラベルされ、それによって、プローブと増幅産物とのハイブリダイゼーションの際に、フルオロフォアおよびクエンチャーは接触クエンチング関係となる。
【図７】試料中の点突然変異を濃縮および検出するための本発明の方法の典型的な反応を示す。この反応において、第１の増幅プライマーおよび濃縮プライマーは、標的核酸の第１の鎖にアニールし；第２の増幅プライマーおよびブリッジプローブは標的核酸の第２の鎖にアニールし、その標的核酸の第２の鎖は、標的核酸の第１の鎖に相補的である。濃縮プライマーは診断領域にアニールし、その濃縮プライマーの３’末端ヌクレオチド（Ｔ、チミジン）は正常ヌクレオチド（Ａ、アデノシン）にマッチし、標的配列の診断領域の変異ヌクレオチド（Ｃ、シチジン）にミスマッチする。ブリッジプローブの第１の結合部分は、変異被疑ヌクレオチドを有する標的核酸の第２の鎖の診断領域にアニールする。ブリッジプローブの第２の結合部分は標的領域にアニールし、その標的領域は第２の標的鎖上の診断領域に隣接するが、濃縮プライマーの配列と実質的に同一な配列を有する標的領域と重複しないか、または限られた重複を有する。つまり、ブリッジプローブおよび濃縮プライマーは相補性を有さないか、または限られた相補性を有し、それによって、互いにアニールすることを回避する。標的核酸へのハイブリダイゼーションまたは標的核酸から解離する場合、ブリッジプローブはラベルされ、検出可能な信号を生じる。ブリッジプローブは増幅および濃縮の際のリアルタイム検出に使用されてもよいか、または終点検出についての融解曲線の解析に使用されてもよい。ブリッジプローブの第１の結合部分は、異なる融点で完全にマッチした標的核酸またはミスマッチした標的核酸にハイブリダイズし、その異なる融点は測定され、変異被疑ヌクレオチドの有無の指標となる。
【図８】ブリッジプローブのセットを使用して未知の変異をスキャンする方法を例示する。
【図９】実施例２および３からのブリッジプローブの融点曲線の解析の結果を示す。
【図１０】ＳＮＰまたは点突然変異の検出のためのブリッジプローブの使用を示す。
【図１１】濃縮プライマーおよび増幅プライマーを用いて標的核酸を濃縮および／または検出する方法を示し；核酸鋳型はステムループ構造を形成できる。
【図１２】５’尾部配列を有する増幅プライマーを示す。（Ａ）ステムループ構造を形成できる核酸鋳型は、５’尾部配列を有する第１の増幅プライマーの伸長によって作製される。５’尾部配列は、第２の増幅プライマーの結合部位に相補的なヌクレオチド配列または非ヌクレオチド配列を含む。つまり、５’尾部配列は、第２のプライマーの配列と同一または実質的に同一のヌクレオチド配列または非ヌクレオチド配列を含む。第１の増幅プライマーおよび第２の増幅プライマーは、それぞれ、第２の増幅プライマーおよび第１の増幅プライマーの伸長産物にハイブリダイズできる。（Ｂ）ステムループ構造を形成できる核酸鋳型は、同じ５’尾部配列を有する第１の増幅プライマーおよび第２の増幅プライマーの伸長によって作製される。５’尾部配列は、第３の増幅プライマーの結合部位に相補的なヌクレオチド配列または非ヌクレオチド配列を含む。つまり、５’尾部配列は、第３のプライマーの配列と同一または実質的に同一のヌクレオチド配列または非ヌクレオチド配列を含む。第３のプライマーは、標的配列に関係のない任意のユニバーサルプライマーであってよい。（Ｃ）は、標的核酸の第２の鎖の診断領域にアニールされたさらなる第２の濃縮プライマーを除いて（Ｂ）と類似の構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明は、試験試料中の遺伝子発現または稀少変異を検出およびモニターするためのアッセイに使用するための混合核酸集団から所望の核酸を検出および濃縮するための感度が高く、改善された方法およびプローブに関する。
【００４１】
（Ｉ．材料）
（Ａ．試料中の標的核酸）
試料とは、核酸を含有しているか、または含有すると推定される任意の物質をいい、一個体または複数個体から単離した組織または体液の試料が挙げられる。本願明細書の、「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、プライマー、プローブ、検出すべきオリゴマー断片、オリゴマーコントロール、およびラベルされていないブロッキングオリゴマーをいい、またポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボース含有）や、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボース含有）や、プリンもしくはピリミジン塩基のＮ−グリコシド、または修飾されたプリンもしくはピリミジン塩基である他の任意の型のポリヌクレオチドを示す総称たるべきものである。「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」の用語間で長さの区別は意図せず、これらの用語は互換的に使用される。これら用語では、分子の一次構造のみを言及する。よって、これらの用語には二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、さらには二本鎖および一本鎖ＲＮＡが包含される。オリゴヌクレオチドは、指定されたヌクレオチド配列の領域に対応する、およそ少なくとも６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１０〜１２ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１５〜２０ヌクレオチドの配列で構成される。
【００４２】
本願明細書で用いる「標的配列」または「標的核酸配列」の用語は、増幅、検出のいずれかまたは両方を行うべき領域をいう。この標的配列は、増幅および検出の対象であり、任意の核酸であることができる。この標的配列は、疾病を引き起こす微生物またはウイルス由来のＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＤＮＡであり得る。この標的配列は、化学試薬、様々な酵素または物理的曝露によって処理されたＤＮＡであることもできる。試料中の目的とする標的核酸配列は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、他のＲＮＡなどの一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡとして、または分離された相補鎖として呈示されてもよい。標的核酸の相補鎖の分離は、物理的、化学的または酵素的手段によって成し遂げることができる。
【００４３】
（Ｂ．プライマー）
本願明細書で用いる「プライマー」という用語は、自然発生のものでも、または合成により生産したものでも、ある核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下に、すなわちヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼなどの重合用薬剤との存在下に好適な温度およびバッファーに置かれた場合に、合成の開始点として作用できるオリゴヌクレオチドをいう。このプライマーは、増殖の効率を最大にするために好ましくは一本鎖であるが、代わりに二本鎖であってもよい。このプライマーは、誘導剤の存在下に伸長産物の合成のプライミングをするのに充分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源およびその使用方法を含む多くの因子に依存することになろう。
【００４４】
本明細書でヌクレオチドに関連した「〜に相補的な」という用語は、別の特異的ヌクレオチドと塩基対を形成することになるヌクレオチドを意味するのに用いる。従って、アデノシン三リン酸はウリジン三リン酸またはチミジン三リン酸に相補的であり、グアノシン三リン酸はシチジン三リン酸に相補的である。チミジン三リン酸とグアノシン三リン酸は特定環境下に塩基対を形成し得るが、本明細書の目的とするところでは相補的とはみなされないことは理解される。シトシン三リン酸とアデノシン三リン酸は特定環境下に塩基対を形成し得るが、本明細書の目的とするところでは相補的とはみなされないことも理解されよう。同じことが、シトシン三リン酸とウラシル三リン酸にもあてはまる。
【００４５】
本明細書でプライマーは、複製すべき各特異的配列の異なる鎖に「実質的に」相補的となるように選択される。これは、そのプライマーがそれらのそれぞれの鎖にハイブリダイズするよう、充分に相補的でなければならないことを意味する。従って、そのプライマー配列は鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば、３’末端ヌクレオチドが変異被疑ヌクレオチドまたは対応する正常ヌクレオチドのいずれかに相補的であるヌクレオチド配列を濃縮プライマーが含む場合、非相補的ヌクレオチド断片をそのプライマーの５’端に付け、かかるプライマー配列の残部は標的塩基配列の診断部分に相補的であるものとしてもよい。しかし、プライマーは通常、非相補的ヌクレオチドが以上に記載したような所定のプライマー終端で存在しえない限り、正確な相補性を有する。
【００４６】
しかし、特定環境では、たとえ非相補的３’末端残基の存在下であってもプライマー伸長産物の合成が誘導されて生じるかもしれないことは理解されるであろう。このアーチファクトは、低すぎるアニーリング／インキュベーション温度（この場合温度を上昇させるとよい）、長すぎるインキュベーション／アニーリング時間（この場合時間を短縮するとよい）、高すぎる塩濃度（この場合塩濃度を低減するとよい）、高すぎる酵素またはヌクレオシド三リン酸濃度、不正確なｐＨ、または不正確なオリゴヌクレオチドプライマー長に起因し得る。アーチファクトによる結果は、１以上のよりミスマッチの残基を故意に導入することによって、または所望の場合、診断用プライマー内での欠失または挿入で、プライマーを不安定化することによりハイブリダイゼーション時の結合をさらに低減することによって回避し得る。
【００４７】
本願明細書で用いる「濃縮プライマー」という用語は、ヌクレオチド配列を有し、それによって、変異被疑ヌクレオチドが位置する診断領域に実質的に相補的であるプライマーをいう。濃縮プライマーが標的配列にアニールする場合、その濃縮プライマーは変異被疑ヌクレオチドの有無に依存して伸長されてもよいか、または伸長されなくてもよい。一実施形態において、その濃縮プライマーが変異被疑ヌクレオチドを含む診断領域にアニールする場合、アニールされた濃縮プライマーは伸長可能ではなく、それにより、濃縮プライマーは伸長条件下で標的配列から解離され、それにより、増幅プライマーの伸長が、変異被疑ヌクレオチドを含む診断領域を通過することができる。その濃縮プライマーが対応する正常ヌクレオチドを含む診断領域にアニールする場合、アニールされた濃縮プライマーは伸長して、濃縮プライマー伸長産物を合成し、それにより、上流の増幅プライマーからの伸長を濃縮プライマー伸長産物によって阻止する。別の実施形態において、核酸鋳型はハイブリダイゼーション条件下でステムループ構造を形成する。二本鎖のステム部分は増幅プライマー結合部位を含み；ループは標的核酸配列を含む。濃縮プライマーはループ中の診断領域にアニールする。濃縮プライマーが変異ヌクレオチドを有する診断領域にアニールする場合、その濃縮プライマーは伸長され、この伸長によりステムループ構造が開き、それにより、増幅プライマーがプライマー結合部位にアニールすることを可能にし、増幅を促進する。濃縮プライマーが正常ヌクレオチドを有する診断領域にアニールする場合、その濃縮プライマーは伸長可能ではなく、それにより、ステムループ構造はインタクトな状態であり、増幅プライマーがプライマー結合部位にアニールすることを防ぐことができる。
【００４８】
濃縮プライマーの末端ヌクレオチドは、変異被疑ヌクレオチドまたは対応する正常ヌクレオチドのいずれかに相補的であるように選択され、それによって、濃縮プライマーが特定のヌクレオチドを含む診断領域にアニールする場合、濃縮プライマーの伸長産物は合成されるが、濃縮プライマーが標的核酸配列の特定のヌクレオチドを含まない診断領域にアニールする場合、かかる伸長産物は合成されないことが好ましい。
【００４９】
本願明細書で用いる「診断領域」という用語は、潜在的な変異ヌクレオチドを、その末端ヌクレオチドまたはその内部ヌクレオチドとして含み、その変異ヌクレオチドの有無が検出される標的核酸配列の領域を意味する。「変異ヌクレオチド」、「正常ヌクレオチド」または「突然変異ヌクレオチド」という用語の使用は、状況に依存し、互換可能であってもよいことは理解されるべきである。ある状況において、ヌクレオチドは変異または突然変異と呼ばれてもよいが、別の状況において、それは正常ヌクレオチドと呼ばれてもよい。
【００５０】
濃縮プライマーは、その濃縮プライマーの伸長産物を指数関数的増幅に適切でないものにする部分を含んでもよい。一実施形態において、その部分は阻止部分（またはコピー可能でない部分と称される）であってもよく、前記濃縮プライマーのすべてまたは一部の複製が阻止され、それにより、濃縮プライマー伸長鎖の鋳型から生じるプライマー伸長分子は、プライマー結合部位を欠くことから、さらなるプライマー伸長のための鋳型としては適切でない。この阻止部分は、炭化水素の腕、ＨＥＧ、非ヌクレオチド結合、脱塩基リボース、ヌクレオチド誘導体、または染料であってもよい。この阻止部分は、濃縮プライマーの３’末端から１８ヌクレオチド未満、離間して位置してもよい。この阻止部分は、濃縮プライマーの３’末端から６ヌクレオチド未満、離間して位置し得ることが好ましい。この阻止部分は、濃縮プライマーの３’末端から３ヌクレオチド未満、離間して位置し得ることがより好ましい。
【００５１】
本発明において開示された方法に使用するためのプライマーは標的配列に相補的な３’配列を含み、その標的配列は通常、伸長反応をプライミングするために使用される。プライマーのこの部分は、濃縮プライマーの３’プライミング部分と称される。別の実施形態において、濃縮プライマーは、標的配列に相補的であってもなくてもよい濃縮プライマーのプライミング部分の５’の追加配列を含んでもよく；この追加配列は尾部と称される。一実施形態において、濃縮プライマーは、濃縮プライマー伸長産物上のプライマー結合部位に相補的または実質的に相補的な５’尾部配列を含む。濃縮プライマー伸長産物は、変性条件およびハイブリダイズ条件に供される際に、折り畳まれて、さらなるプライマー結合を防ぐステムループ構造を形成する。
【００５２】
濃縮プライマーは、天然ヌクレオチドおよびホスホジエステル結合からなる通常のオリゴヌクレオチドプライマーであってもよい。つまり、それは非ヌクレオチド、連結化学部分または修飾されたヌクレオチドを含まなくてもよい。この実施形態において、濃縮プライマーの一部または全てはヌクレアーゼ活性によって分解可能である。濃縮プライマーが標的配列上の対応する正常ヌクレオチドを含む診断領域にアニールする場合、濃縮プライマーは、少なくとも１つの修飾されたデオキシヌクレオシド三リン酸を含む伸長条件下で、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。濃縮プライマーの一部または全ては前記５’エキソヌクレアーゼ活性によって分解されるが、伸長鎖の一部または全ては切断に対して耐性がある（図４）。
【００５３】
一実施形態において、所定のヌクレオチド変異、例えば点突然変異は、正常ヌクレオチドに相補的な適切な末端ヌクレオチドを有して、濃縮プライマー伸長産物の合成が上流の増幅プライマーの伸長を阻止するように濃縮プライマーを設計することによって濃縮および検出される。濃縮プライマーが変異ヌクレオチドを含む診断領域にアニールする場合、濃縮プライマーのミスマッチした３’末端は伸長できず、濃縮プライマーは伸長条件下で鋳型から解離される。これに関し、本明細書でいう「適切な末端ヌクレオチド」は、使用時に可能であればそこから合成が開始されることになるはずであるプライマーの末端ヌクレオチドを意味する。従って、一般に重合用の試薬はプライマーの３’末端で合成を開始するはずなので、適切な末端ヌクレオチドは一般に、３’末端ヌクレオチドであろうはずである。濃縮プライマーの３’末端ヌクレオチドまたは他のヌクレオチドがヌクレアーゼ活性によって消化されることを防ぐために、濃縮プライマーは、その濃縮プライマーの全てまたは一部をヌクレアーゼ切断に対して耐性にする、修飾されたヌクレオチドまたは結合を含んでもよい。濃縮プライマーがヌクレアーゼ切断に対して耐性となるように、３’末端および／または５’末端の最後の５つのヌクレオチドまたは結合を修飾することが好ましい。濃縮プライマーがヌクレアーゼ切断に対して耐性となるように、３’末端および／または５’末端の最後のヌクレオチドまたは結合を修飾することが好ましい。プライマーをエキソヌクレアーゼ切断に対して耐性とする任意の種類の修飾を使用することができる。
【００５４】
例として、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、ＬＮＡ、ＰＮＡ、オリゴ−２’−ＯＭｅ−ヌクレオチド等が挙げられる。
【００５５】
別の実施形態において、所定のヌクレオチド変異は、変異被疑ヌクレオチドに相補的な適切な末端ヌクレオチドを有するように濃縮プライマーを設計するために濃縮され、かつ、それらを設計することによって検出される。この場合、濃縮プライマーの３’末端ヌクレオチドは、ポリメラーゼ伸長に適切でないように修飾され、それにより、変異被疑ヌクレオチドを含む診断領域にアニールする濃縮プライマーは伸長できなくなる。濃縮プライマーが、対応する正常ヌクレオチドを含む診断領域にアニールする場合、濃縮プライマーのミスマッチした３’末端ヌクレオチドは、核酸ポリメラーゼのプルーフリーディング活性によって除去され、それにより、濃縮プライマーを伸長可能にする。さらに別の実施形態において、濃縮プライマーは、診断領域上の正常ヌクレオチドに相補的な阻止された３’末端ヌクレオチドを有する。この阻止された３’末端ヌクレオチドが鋳型上の正常ヌクレオチドにマッチする場合、それは、酵素、好ましくはＤＮＡポリメラーゼの加ピロリン酸分解活性によって除去される。濃縮プライマーの３’末端の阻止は、当該分野における公知の任意の手段によってなされ得る。阻止部分は核酸に付加されて、核酸ポリメラーゼによって触媒される核酸重合を阻害できる化学部分である。阻止部分は典型的に、濃縮プライマーの終端の３’末端に位置し、それはヌクレオチドまたはその誘導体から構成される。例えば、終端の３’ＯＨに阻止基を付けることにより、その３’ＯＨ基は、もはや重合反応においてヌクレオシド三リン酸を受け入れることができなくなる。多数の異なる基が付加されて、濃縮プライマーの３’末端を阻止し得る。このような基の例としては、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、ホスホロチオエート、アルカンジオール残基、ペプチド核酸、および３’ＯＨを欠くヌクレオチド誘導体（例えば、コルジセピン、ジデオキシヌクレオチド、またはアシクロヌクレオチド）が挙げられる。
【００５６】
本明細書で用いる「第１の増幅プライマー」という用語は、濃縮プライマーの標的配列上流にハイブリダイズでき、増幅のために使用されるプライマーをいう。反応において、第１および第２の「増幅プライマー」が使用される場合、増幅プライマーの対が診断領域にわたる標的領域を増幅する。１つの「増幅プライマー」は、その相補体からの分離後、他の増幅プライマーの伸長産物にハイブリダイズできるようにヌクレオチド配列を有し、それにより、１つのプライマー伸長産物は、別の増幅プライマーの伸長産物を合成するための鋳型として役立つ。２つの異なる、非重複オリゴヌクレオチドが、同じ直鎖状の相補的核酸配列の異なる領域にアニールし、かつ１つのオリゴヌクレオチドの３’末端が他の５’末端の方へ向いている場合、前者を「上流」オリゴヌクレオチドと称し、そして後者は「下流」オリゴヌクレオチドと称し得る。
【００５７】
本発明のいくつかの実施形態において、ステムループ構造を形成できる核酸鋳型は、５’尾部配列を有する第１の増幅プライマーの伸長によって作製され得る。５’尾部配列は、第２の増幅プライマーの結合部位に相補的なヌクレオチド配列または非ヌクレオチド配列を含む。つまり、５’尾部配列は、第２のプライマーの配列と同一または実質的に同一なヌクレオチド配列または非ヌクレオチド配列を含む。第１の増幅プライマーおよび第２の増幅プライマーは、それぞれ、第２の増幅プライマーおよび第１の増幅プライマーの伸長産物にハイブリダイズできる。あるいは、ステムループ構造を形成できる核酸鋳型は、同じ５’尾部配列を有する第１の増幅プライマーおよび第２の増幅プライマーの伸長によって作製され得る。５’尾部配列は、第３の増幅プライマーの結合部位に相補的なヌクレオチド配列または非ヌクレオチド配列を含む。つまり、５’尾部配列は、第３のプライマーの配列と同一または実質的に同一なヌクレオチド配列または非ヌクレオチド配列を含む。第３のプライマーは標的配列に関係のない任意のユニバーサルプライマーであってもよい。
【００５８】
濃縮プライマーまたは増幅プライマーはラベルされたオリゴヌクレオチドであってもよい。本明細書で用いる「ラベル」という用語は、検出可能（好ましくは定量化可能）な信号を与えるのに使用され得、かつ核酸またはタンパク質に結合できる任意の原子または分子をいう。ラベルは、蛍光、放射活性、比色分析、重量測定、磁性、酵素活性などによって検出可能な信号を与えてもよい。
【００５９】
一実施形態において、本発明は同じ試料中の１つより多い変異被疑ヌクレオチドを濃縮することに関する。この場合、異なるＳＮＰまたは変異を標的化する１つより多い濃縮プライマーを反応に含んでもよい。
【００６０】
（Ｂ．プローブ）
本明細書で用いる「プローブ」という用語は、プローブ中の少なくとも１つの配列と鋳型領域中の配列との相補性に起因して、核酸鋳型中の配列と二本鎖構造を形成するラベルされたオリゴヌクレオチドをいう。通常、プローブは、増幅をプライムするのに使用される配列（複数も含む）に相補的な配列を含まない。しかし本発明のいくつかの実施形態において、プローブはプライマーの一部に相補的な配列を含む。一般的に、プローブの３’末端は「阻止され」て、プローブのプライマー伸長産物への導入を防ぐ。しかし本発明のいくつかの実施形態において、いくつかのプローブはまた、プライマーとしても作用し、従って、３’末端で阻止されない。「阻止」は、非相補的塩基を用いることによって、またはビオチンもしくはリン酸基などの化学部分を、最後のヌクレオチドの３’ヒドロキシルに付加することによってなされ得て、この最後のヌクレオチドの３’ヒドロキシルは、選択された部分に依存して、ラベルを付けられた核酸のその後の検出または捕捉のためのラベルとしても作用することにより、二重の目的の役割を果たすことができる。阻止はまた、３’−ＯＨを除去することによって、またはジデオキシヌクレオチドなどの３’−ＯＨを欠くヌクレオチドを用いることによってなされてもよい。
【００６１】
種々のプローブを本発明とともに使用してもよい。使用するプローブはブリッジプローブであることが好ましい。ブリッジプローブは、ブリッジ部分によって連結された少なくとも２つの結合部分を含み、第１の結合部分は核酸鋳型の第１の領域にハイブリダイズでき、第２の結合部分は、核酸鋳型の第１の領域に隣接するかまたは実質的に隣接する第２の領域にハイブリダイズできる。
【００６２】
本明細書で用いる「隣接する」または「実質的に隣接する」という用語は、核酸鋳型の第１の結合部分の相補鎖上のその第１の結合部分に対する第２の結合部分の位置をいう。ブリッジプローブの第１の結合部分および第２の結合部分によってハイブリダイズされた２つの鋳型領域は隣接していてもよい。すなわち、２つの鋳型領域の間に隙間はない。あるいは、ブリッジプローブの第１の結合部分および第２の結合部分によってハイブリダイズされた２つの鋳型領域は、１〜約２００ヌクレオチド、より好ましくは約１〜１００ヌクレオチド離間していてもよい。あるいは、本方法が、本明細書に教示されるＰＣＲ濃縮法および検出法に使用される場合、「隣接」は、増幅されるべき配列内のいずれの場所、または増幅プライマーの下流のいずれの場所であってもよい。
【００６３】
核酸鋳型の第１の領域は、標的核酸上の目的の領域であってもよく、その標的核酸は、変異被疑ヌクレオチドを有する診断領域であってもよい（図６Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）。あるいは、核酸鋳型の第１の領域は、プライマー伸長産物上の領域であってもよく、第２の領域はプライマーまたはプローブの一部である（図６Ｇ、Ｈ）。別の態様において、核酸鋳型の第１の領域および核酸鋳型の第２の領域は、プライマーまたはプローブの両方の部分であってもよい（図６Ｉ）。
【００６４】
ブリッジ部分は結合部分の間のプローブに位置する。ブリッジ部分は、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド化学部分を含んでもよく、任意の長さであってもよい。しかしながら、核酸鋳型の第１の領域と第２の領域との間の所定の隙間の距離に関して、ブリッジ部分の長さおよび／または組成により、個々の結合部分のＴｍおよび／または結合された分子としてのブリッジプローブのＴｍを調節できる。定義により、融点（Ｔｍ）は、ＤＮＡ二本鎖の半分が解離して、一本鎖になる温度であり、二本鎖の安定性を示す。ＤＮＡポリメラーゼについての鋳型として適切でない、いくつかの非ヌクレオチド化学部分を含むことはブリッジ部分にとって利点があり、それにより、非特異的プライミングを減少させる。いくつかの化学部分はまた、よりフレキシブルであってもよい。すなわち、天然ヌクレオチド結合ほど硬直ではなくてもよく、従って、折り畳み易く、低いＴｍ結合部分についての実際のＴｍを増加させてもよい。このような非ヌクレオチド部分としては、ＨＥＧ、非ヌクレオチド結合、ヌクレオチド誘導体もしくは類似体、または染料が挙げられ得るが、これらに限定されない。ブリッジ部分は、２つの結合部分を連結するのみではなく、ブリッジプローブ、特に低い個々のＴｍを有するブリッジプローブの結合部分の結合特性も調節する。通常、２つの結合部分は、１つの結合部分が別の結合部分より高いＴｍを有する場合、別の分子とみなされる。ブリッジ部分の長さは、結合部分、特に低いＴｍを有する結合部分が鋳型にアニールするか、または鋳型から解離する温度に影響を与える。ブリッジプローブの２つの結合部分によってハイブリダイズされた核酸鋳型の２つの領域の間の距離に依存して、連結された分子としてのブリッジプローブ、および個別に考慮される場合の結合部分は、一般に、ブリッジ部分の長さが、ブリッジプローブの２つの結合部分によってハイブリダイズされた２つの鋳型領域の間の距離に対する長さに近い場合、より高いＴｍを有する。この規則は、ブリッジプローブの２つの結合部分によってハイブリダイズされた２つの鋳型領域の間の距離が、そんなに長くない場合、そして２００ヌクレオチドより長くなり得ない場合のみ、適用できる。この目的のために、結合部分の長さは、０〜２００のヌクレオチドの範囲またはその等価物、より好ましくは約１〜１００のヌクレオチドの範囲またはその等価物であってよい。
【００６５】
ブリッジ部分の末端に結合された結合部分は、核酸鋳型の特異的配列との特異的および安定なハイブリッドを形成するように設計される。結合部分は所望の任意の長さであってよく、一般には２〜６０のヌクレオチド長が好ましく、６〜４０のヌクレオチド長が最も好ましい。結合部分は、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、類似体、または非ヌクレオチド化学部分を含んでもよい。
【００６６】
結合部分は特異的標的核酸配列と相補的であってもよく、ある遺伝子座で特定の変異と特異的に設計されてもよい。少なくとも１つの結合部分（第１の結合部分）は、変異被疑ヌクレオチドが位置する診断領域に相補的であることが好ましい。２つ以上の結合部分が、各々が変異ヌクレオチドを含む複数の診断領域に相補的であることもまた望ましい。
【００６７】
本発明の実施において、ブリッジプローブの異なる結合部分は、同時に相補的核酸にアニールされてもよい。あるいは、各々の結合部分は、特に、マッチした標的核酸またはミスマッチした標的核酸にハイブリダイズする場合、別個のハイブリダイゼーション特性を有するように設計されてもよい。本発明の概念を最もよく理解するために、２つの融点（Ｔｍ）が各結合部分に割り当てられる：Ｔｍ−ｓは、各結合部分を別のオリゴヌクレオチドとみなした場合の融点であり；Ｔｍ−ｐは、ブリッジプローブにおける結合部分を結合した分子とみなした場合の実際の融点である。すなわち、実際の状況において、結合部分は、Ｔｍ−ｐにてマッチした標的核酸にハイブリダイズする。結合部分の所定の配列に関して、そのＴｍ−ｓは一定であり、変化しないが、そのＴｍ−ｐはブリッジ部分の長さおよび／または組成に部分的に依存する。適切なブリッジ部分について、結合部分のＴｍ−ｐは通常、そのＴｍ−ｓより高い。これは、点突然変異または単一のヌクレオチドの差を検出するのに非常に有用である。
【００６８】
一実施形態において、第１の結合部分は変異被疑ヌクレオチドを有する診断領域にハイブリダイズするが、第２の結合部分は診断領域に対して近接する領域にハイブリダイズする。第２の結合部分のＴｍ−ｓは第１の結合部分のＴｍ−ｓより高くなるように設計される。異なるＴｍを有するオリゴヌクレオチドを設計する知識は当該分野において周知である。例えば、高Ｇ／Ｃ含量を有するより長いオリゴヌクレオチドは高いＴｍを有することができる。第２の結合部分は高いＴｍ−ｓを有するため、最初に標的核酸にアニールし、かつ高いアニーリング温度でアニールする。適切なブリッジ部分による第１の結合部分の第２の結合部分への連結に起因して、第１の結合部分のＴｍ−ｐはそのＴｍ−ｓより高い。例えば、ブリッジプローブの第２の結合部分が６５℃のＴｍ−ｓを有する場合、ブリッジプローブの第１の結合部分は３６℃の低いＴｍ−ｓを有する。実際に、第１の結合部分のＴｍ−ｐは５５℃であってもよい。通常、第１の結合部分は低いＴｍ−ｓを有するので、長さは短くてもよい。第１の結合部分を短い長さにするように設計することは利点があり、低いＴｍ−ｓを生じるが、Ｔｍ−ｐは高くなる。プローブが適切な高いＴｍを有し得るが、単一のヌクレオチド差を見分ける能力を損失し得るか、または制限された能力を有し得る他のプローブ設計とは異なって、本発明の設計は単一のヌクレオチド差の間を見分ける大きな能力を有する。第１の結合部分は、広範な異なるＴｍ−ｐにてマッチした診断領域およびミスマッチした診断領域にハイブリダイズし、このＴｍ−ｐは容易に観測できる。上記の例に従って、第１の結合部分は５５℃にてマッチした診断領域にハイブリダイズしてもよいが、それは容易に識別可能な温度の異なる５０℃にてミスマッチした診断領域にハイブリダイズしてもよい。
【００６９】
プローブ結合を促進し得るプローブの修飾としては、プローブおよび標的のポリアニオン骨格の反発を減少させるための、正電荷を帯びたまたは中性のホスホジエステル結合のプローブへの導入（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８８，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０を参照のこと）；塩基の積み重ねを増加させるための、アルキル化またはハロゲン化塩基（例えば５−ブロモウリジンなど）のプローブへの導入；プローブ：標的二本鎖を、塩基の積み重ねが増加する「Ａ」構造へと強制するための、リボヌクレオチドのプローブへの導入；およびプローブ内のアデノシンの一部または全てについての２，６−ジアミノプリン（アミノアデノシン）の置換；ＬＮＡ（ロックされた核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ））、ＰＮＡ（ペプチド核酸）などのヌクレオチド誘導体の導入が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
ブリッジ部分によって連結された２つの結合部分は、種々の配向において存在することができる。ブリッジ部分の一方の末端は第１の結合部分の５’末端に結合してもよく、ブリッジ部分のもう一方の末端は第２の結合部分の３’末端に結合してもよい（図６Ａ、ＣおよびＤ）。別の実施形態において、ブリッジ部分の一方の末端は第１の結合部分の５’末端に結合してもよく、ブリッジ部分のもう一方の末端は第２の結合部分の５’末端に結合してもよい。あるいは、ブリッジ部分の一方の末端は第１の結合部分の３’末端に結合してもよく、ブリッジ部分のもう一方の末端は第２の結合部分の３’末端に結合してもよい（図６Ｂ）。
【００７１】
ブリッジプローブの結合部分は、結合部分の末端が異なる方向に向いてもよい、このような異なる方法で核酸鋳型にハイブリダイズできる。一実施形態において、ブリッジプローブが核酸鋳型にハイブリダイズする場合、ブリッジプローブの末端は互いの方向を向く。ハイブリダイゼーションのこの形態は、ブリッジプローブの２つの末端を近接し得る（図６Ａ）。別の実施形態において、ブリッジプローブが核酸鋳型にハイブリダイズする場合、ブリッジプローブの末端は互いから離れた方向を向く（図６ＣおよびＤ）。さらなる実施形態において、ブリッジプローブが核酸鋳型にハイブリダイズする場合、ブリッジプローブの末端は同じ方向を向く（図６Ｂ）。
【００７２】
一実施形態において、ブリッジプローブの第２の結合部分はプライマーの一部に相補的であるが、第１の結合部分はプライマーの伸長鎖上の配列の一部に相補的である。第２の結合部分の３’末端およびプライマーの適切な位置は、相互作用するラベル対でラベルされて、それにより、ブリッジプローブとプライマー伸長鎖とのハイブリダイゼーションの際に、２つのラベルはＦＲＥＴまたは接触クエンチング関係にある（図６Ｇ、Ｈ）。プライマー上のラベルは、それがブリッジプローブ上のラベルと相互作用する限り、いずれの場所に位置してもよい。別の実施形態において、ブリッジプローブの第２の結合部分は、プライマー／第２のプローブの５’部分に相補的であるが、第１の結合部分は、プライマー／第２のプローブの３’部分に相補的である。第２の結合部分の３’末端およびプライマー／第２のプローブの５’末端は、相互作用するラベル対でラベルされる（図６Ｉ）。この実施形態において、プライマーまたは第２のプローブが標的核酸にハイブリダイズする場合、ブリッジプローブはプライマーまたは第２のプローブから部分的または完全に解離し、それにより、検出可能な信号を生じる。この実施形態において、ブリッジプローブの結合部分によってハイブリダイズされたプライマーまたは第２のプローブの鋳型領域は、任意の配列であり、異なるプライマーまたはプローブの中で一定であるように設計され得ることが好ましい。従って、プライマーまたは第２のプローブに対するブリッジプローブの結合は、プライマーまたは第２のプローブのセットによって共有され得るユニバーサルプローブであってもよい。
【００７３】
別の実施形態において、ブリッジプローブのセットは、未知の変異をスキャンするために提供される。複数のブリッジプローブは、標的核酸配列上の目的の全領域を覆うように設計される。各ブリッジプローブは異なる染料でラベルされてもよい。標的核酸にハイブリダイズするブリッジプローブの融解特性は、正常標的および変異を含むと推定される標的にハイブリダイズされたブリッジプローブの融解特性と比較される（図８）。
【００７４】
ブリッジプローブは検出ラベルを含むことが好ましい。ラベルは、標的核酸へのプローブのハイブリダイゼーションの間、または標的核酸からのプローブの解離の間に検出可能な信号を生成する。ブリッジプローブは単一のラベルを含んでもよいか；あるいはブリッジプローブは第１のラベルおよび第２のラベルを含んでもよい（図６Ａ、Ｂ、Ｃ）。ブリッジプローブおよびその相互作用するプライマー／プローブは、それぞれ、第１のラベルおよび第２のラベルを含んでもよい（図６Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ）。
【００７５】
一実施形態において、第１の結合部分は第１のラベルが付けられ、第２の結合部分は第２のラベルが付けられ、前記第１のラベルおよび第２のラベルは接触クエンチング対となり、そのラベルのうちの１つはクエンチャーであり、プローブと標的配列とのハイブリダイゼーションの際に、第１のラベルおよび第２のラベルは接触クエンチング関係となる。
【００７６】
別の実施形態において、第１のブリッジ部分は第１のラベルが付けられ、第２のブリッジ部分は第２のラベルが付けられ、前記第１のラベルおよび第２のラベルは蛍光エネルギー移動対となり、プローブと標的配列とのハイブリダイゼーションの際に、第１のラベルおよび第２のラベルは蛍光共鳴エネルギー移動関係（ＦＲＥＴ）となる。
【００７７】
さらに別の実施形態において、ブリッジプローブは、図６Ｅ、６Ｇ、６Ｈおよび６Ｉに示すように別のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーと一緒に作用することを必要とし得る。図６Ｅにおいて、ブリッジプローブおよび別のプローブは、標的配列の隣接領域にハイブリダイズし、プローブの一方はフルオロフォアでラベルされ、もう一方のプローブはＦＲＥＴまたは接触クエンチング対のクエンチャーでラベルされ、それによって、プローブと増幅産物とのハイブリダイゼーションの際に、フルオロフォアおよびクエンチャーは接触クエンチング関係となり、フルオロフォアおよびクエンチャーは互いの５ヌクレオチド内にある。図６Ｇおよび６Ｈにおいて、増幅反応は増幅プライマーおよびブリッジプローブを含み、前記増幅プライマーの１つおよびプローブは、各々、フルオロフォアおよびクエンチャーの１つのメンバーでラベルされ、それによって、プローブと増幅産物とのハイブリダイゼーションの際に、フルオロフォアおよびクエンチャーは接触クエンチング関係となり、ラベルされたプローブは、ラベルされたプライマーの５ヌクレオチド内の標的核酸配列の増幅されたコピーにハイブリダイズするか、またはラベルされたプローブは、標的核酸配列およびラベルされたプライマーの一部にハイブリダイズする。
【００７８】
均一ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、２つの相互作用するフルオロフォアは、２つの異なるオリゴデオキシリボヌクレオチドプローブの末端、または同じオリゴデオキシリボヌクレオチドプローブの２つの末端に結合され得ることは公知である。標的核酸は、供与体フルオロフォアおよび受容体フルオロフォアを互いに近接して、それらの間にエネルギー移動を生じさせることによって、またはそれらを互いから分離して、エネルギー移動を排除することのいずれかによって、その標的核酸自体を曝露する（Ｍａｒｒａｓ  Ｓ．Ａ．Ｅ．ら，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０（２１））。均一ハイブリダイゼーションアッセイについての最も初期の形態は、標的鎖上の隣接部位に結合するように設計された一対のオリゴデオキシリボヌクレオチドプローブのそれぞれの５’末端および３’末端にてラベルしたそれらの一対のオリゴデオキシリボヌクレオチドプローブを利用し、従って、供与体部分および受容体部分を互いに近接させる（欧州特許第ＥＰＯ０７０６８５号およびＣａｒｄｕｌｌｏ  Ｒ．Ａ．ら、１９８８年）。第２のアプローチは、一対の相互相補的オリゴデオキシリボヌクレオチドを利用し、そのオリゴデオキシリボヌクレオチドの１つは、一本鎖標的配列についてのプローブとして役立つ。一方のオリゴデオキシリボヌクレオチドの５’末端は供与体フルオロフォアでラベルされ、もう一方のオリゴデオキシリボヌクレオチドの３’末端は受容体フルオロフォアでラベルされ、それによって、２つのオリゴデオキシリボヌクレオチドが互いにアニールする場合、２つのラベルは互いに近接する。小さな相補的オリゴデオキシリボヌクレオチドが動的平衡において互いに結合するため、標的鎖はプローブに対する結合を競合し、ラベルされたオリゴデオキシリボヌクレオチドの分離を引き起こす（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  Ｌ．Ｅ．ら，１９８９，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８３；２３１−２４４）。第３のアプローチにおいて、供与体フルオロフォアおよび受容体フルオロフォアは、同じオリゴデオキシリボヌクレオチドの末端に結合され、それはプローブとして役立つ。溶液中のオリゴデオキシリボヌクレオチドは、ランダムコイルのように作用するため、その末端は時折、互いに近接し、エネルギー移動の測定可能な変化を生じる。しかしながら、プローブがその標的に結合する場合、プローブ−標的ヘリックスの剛性は、プローブの２つの末端を互いから離すことを維持し、供与体部分と受容体部分との間の相互作用を排除する（Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ  Ｋ．Ｍ．およびＰａｒｋｈｕｒｓｔ，Ｌ．Ｊ．１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４；２８５−２９２）。第４のアプローチにおいて、分子指標と呼ばれる一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドは、互いに相補的なプローブ配列の末端のいずれかで短いさらなる配列を有し、ヘアピンステムの形成を介して末端のラベルが近接することを可能にする。このプローブのその標的への結合は、ヘアピンステムの分裂および受容体部分の近接からの供与体部分の除去を生じる比較的剛性のプローブ−標的ハイブリッドを生じ、それによって、供与体の蛍光を修復する（Ｔｙａｇｉ  Ｓ．およびＫｒａｍｅｒ，Ｆ．Ｒ．１９９６���Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４；３０３−３０８）。これらのハイブリダイゼーションベースのスキームおよびそれらのバリエーションに加えて、ＰＣＲの間に、鋳型鎖に結合する二重にラベルされたランダムにコイル状にされたプローブは、ＤＮＡポリメラーゼ（「ＴａｑＭａｎ」（商標）プローブ）の５’→３’エンドヌクレアーゼ活性によって酵素的に切断され得て、供与体部分と受容体部分とを分離し、リアルタイムにおいて核酸合成をモニターすることを可能にする（Ｈｅｉｄ  Ｃ．Ａ．，Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｊ．，Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．およびＷｉｌｌｉａｍｓ，Ｐ．Ｍ．１９９６，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，６：９８６−９９４）。
【００７９】
供与体フルオロフォアが２０〜１００□の範囲内の供与体フルオロフォアに近接する場合、受容体フルオロフォアの蛍光強度は増加するが、供与体フルオロフォアの蛍光強度は減少する。これは、供与体フルオロフォアから受容体フルオロフォアへの蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）効率の増加に起因する。しかしながら、２つの部分が任意に近づく場合、供与体フルオロフォアおよび受容体フルオロフォアの両方の蛍光強度は減少する。これらの密接距離にて、吸収されたエネルギーのほとんどは熱として消失し、少量のエネルギーのみが光として放出され、時々、静的または接触クエンチングと称される現象になる（Ｌａｋｏｗｉｃｚ  Ｊ．Ｒ．１９９９，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。
【００８０】
隣接するプローブおよびランダムコイル状にされたプローブにおいて、供与体部分および受容体部分は、ＦＲＥＴがクエンチングの主なメカニズムである、そのような互いからの距離のままである。一方、競合ハイブリダイゼーションプローブおよび分子指標が、標的にハイブリダイズされない場合、２つの部分は互いに非常に近接し、接触クエンチングがクエンチングの主なメカニズムである。接触クエンチングの有用な特性の１つは、フルオロフォアの発光スペクトルがクエンチャーの吸収スペクトルに重複するか、ＦＲＥＴ効率を決定する重要な条件の１つであるどうかに関わらず、全てのフルオロフォアが同様にクエンチされる（Ｔｙａｇｉ  Ｓ．，Ｂｒａｔｕ，Ｄ．Ｐ．およびＫｒａｍｅｒ，Ｆ．Ｒ．１９９８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：４９−５３）。
【００８１】
蛍光ラベルされたプローブを利用する均一アッセイのさらなる単純化は、受容体またはクエンチャーとしての非蛍光染料の使用である。非蛍光染料によるクエンチングは、モニターすることがより困難である発光スペクトルの形の変化よりむしろ、蛍光強度の変化を直接的に測定することができる。この改良はまた、クエンチャーの蛍光によって占められているスペクトルの部分は、代わりに、より多くの標的の検出についてのさらなるフルオロフォアの蛍光のために保存され得るため、より高い程度の多重化を導いた（Ｍａｒｒａｓ  Ｓ．Ａ．，Ｋｒａｍｅｒ，Ｆ．Ｒ．およびＴｙａｇｉ，Ｓ．１９９９，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．，１４：１５１−１５６）。
【００８２】
最近、ヌクレオチドから金粒子までの範囲にわたる、多くの特有の非蛍光クエンチャーが、蛍光プローブにおける使用のために導入されている（Ｄｕｂｅｒｔｒｅｔ  Ｂ．，Ｃａｌａｍｅ，Ｍ．およびＬｉｂｃｈａｂｅｒ，Ａ．Ｊ．２００１，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９：３６５−３７０）。数千倍までのクエンチング効率が、これらのクエンチャーの一部について報告されている。
【００８３】
先行技術の上記の議論において、研究者は主に、プローブの標的配列へのハイブリダイゼーションの際に、ラベルの増大した蛍光を検出することに依存するアプローチを使用している。ＦＲＥＴはこれらのアプローチの背後にある主なメカニズムである。ハイブリダイゼーションプローブ（米国特許第６，１７４，６７０号）は、ＦＲＥＴ効果に依存する２つの蛍光染料を使用している。このアプローチは、単一の反応において検出され得る複数の標的の数を限定する。
【００８４】
本発明において、発明者は、プローブの標的配列へのハイブリダイゼーションの際の接触クエンチングに起因するラベルの減少した蛍光の検出が、ＦＲＥＴより高い感度であることを見出した。本発明の一実施形態において、増幅反応は増幅プライマーおよび核酸プローブを含み、前記増幅プライマーの１つおよびプローブは、各々、フルオロフォアおよびクエンチャーの１つのメンバーでラベルされ、それによって、プローブと増幅産物とのプローブのハイブリダイゼーションの際に、フルオロフォアおよびクエンチャーは接触クエンチング関係となる。核酸プローブの１つはブリッジ−プローブであってもよい。
【００８５】
本発明の別の実施形態において、増幅反応は、増幅プライマーおよび標的配列の隣接する領域にハイブリダイズする２つの核酸プローブを含み、前記プローブの一方はフルオロフォアでラベルされ、もう一方のプローブは接触クエンチング対のクエンチャーでラベルされ、それによって、プローブと増幅産物とのハイブリダイゼーションの際に、フルオロフォアおよびクエンチャーは接触クエンチング関係となり、フルオロフォアおよびクエンチャーは互いの５個のヌクレオチド内にある。核酸プローブの１つはブリッジプローブであってもよい。
【００８６】
効果的な接触クエンチングに関して、フルオロフォアおよびクエンチャーは約０〜１０個のヌクレオチドの距離に存在することが好ましい。フルオロフォアおよびクエンチャーは約０〜５個のヌクレオチドの距離に存在することがより好ましい。フルオロフォアおよびクエンチャーは約０〜２個のヌクレオチドの距離に存在することが最も好ましい。クエンチャーは好ましくは、非蛍光実体である。クエンチャーはナノ粒子であってもよい。ナノ粒子は金ナノ粒子であってもよい。クエンチャーはＧ残基または複数のＧ残基であることも可能である。
【００８７】
上記の実施形態において、ラベルは相互作用するフルオロフォア染料または非フルオロフォア染料あるいは任意の実体であってもよい。このような相互作用するラベルの１つの例は、フルオロフォア−クエンチャー対である。本明細書で用いる「フルオロフォア」という用語は、規定した励起波長で光エネルギーを吸収し、異なる規定した波長で光エネルギーを放出する部分をいう。蛍光ラベルの例として、限定しないが、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ染料（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０）、ＡＭＣＡ、ＡＭＣＡ−Ｓ、ＢＯＤＩＰＹ染料（ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５）、カルボキシローダミン６Ｇ、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、カスケードブルー、カスケードイエロー、シアニン染料（Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５．５）、ダンシル、ダポキシル、ジアルキルアミノクマリン、４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、ＤＭ−ＮＥＲＦ、エオシン、エリスロシン、フルオレセイン、ＦＡＭ、ヒドロキシクマリン、ＩＲ染料（ＩＲＤ４０、ＩＲＤ  ７００、ＩＲＤ  ８００）、ＪＯＥ、リサミンローダミンＢ、マリーナブルー、メトキシクマリン、ナフトフルオレセイン、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、ＰｙＭＰＯ、ピレン、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ロードルグリーン、２’，４’，５’，７’−テトラブロモスルホンフルオレセイン、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テキサスレッドおよびテキサスレッド−Ｘが挙げられる。
【００８８】
本明細書で用いる「クエンチャー」という用語には、それが蛍光ラベルに近接するように位置する場合に励起蛍光ラベルのエネルギーを吸収でき、そのエネルギーを散逸させることができる任意の部分が包含される。クエンチャーは蛍光クエンチャーであってもよいか、またはダーククエンチャーとも称される非蛍光クエンチャーであってもよい。上記のフルオロフォアは、別のフルオロフォアに近接する場合、クエンチャーの役割を果たすことができ、ＦＲＥＴクエンチングまたは接触クエンチングのいずれかが発生し得る。可視光を１つも発光しないダーククエンチャーを使用することが好ましい。ダーククエンチャーの例としては、限定しないが、ＤＡＢＣＹＬ（４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸）スクシンイミジルエステル、ジアリールローダミンカルボン酸、スクシンイミジルエステル（ＱＳＹ−７）、および４’，５’−ジニトロフルオレセインカルボン酸、スクシンイミジルエステル（ＱＳＹ−３３）、クエンチャーｌ、または「ブラックホールクエンチャー類」（ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２およびＢＨＱ−３）、ヌクレオチド類似体、ヌクレオチドＧ残基、ナノ粒子、および金粒子が挙げられる。
【００８９】
（Ｃ．ヌクレオシド三リン酸）
「ヌクレオシド三リン酸」の用語は、本明細書でＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかにて存在するヌクレオシドをいうのに用いられ、よって塩基としてアデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルを組み込み、糖部分がデオキシリボースまたはリボースであるヌクレオシドを含む。一般にデオキシリボヌクレオシドは、ＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて用いられることになる。しかし、通常の塩基であるアデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルの１つと塩基対を形成できる他の修飾塩基を用い得ることが理解されるであろう。このような修飾塩基としては、例えば８−アザグアニンおよびヒポキサンチンが挙げられる。
【００９０】
本願明細書で用いる「ヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかにて存在するヌクレオチドをいうことができ、よって塩基としてアデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルを組み込み、糖部分がデオキシリボースまたはリボースであるヌクレオチドを含む。しかし、通常の塩基であるアデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルの１つと塩基対を形成できる他の修飾塩基を、本発明で用いるプライマーにて使用し得ることが理解されるであろう。このような修飾塩基には、例えば８−アザグアニンおよびヒポキサンチンが挙げられる。
【００９１】
本発明の一実施形態において、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用する場合、伸張条件は全ての４つのデオキシヌクレオシド三リン酸を含み、そのうちの少なくとも１つは置換（または修飾）される。置換されたデオキシヌクレオシド三リン酸は修飾されるべきであり、その結果、ＤＮＡポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する。このような修飾されたデオキシヌクレオシド三リン酸の例としては、２’−デオキシアデノシン５’−Ｏ−（１−チオ三リン酸）、５−メチルデオキシシチジン５’−三リン酸、２’−デオキシウリジン５’−三リン酸および７デアザ−２’−デオキシグアノシン５’−三リン酸が挙げられ得る。
【００９２】
（Ｄ．酵素）
開示の方法は、プライマー伸長のための核酸ポリメラーゼを使用する。任意の核酸ポリメラーゼが使用可能である。いくつかの実施形態において、濃縮プライマーの伸長は、増幅プライマーから開始された伸長を阻止し、好ましくは、使用するポリメラーゼは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼまたはＴａｑポリメラーゼのＳｔｏｆｆｅｌフラグメントなどの鎖置換活性を有さない。他の実施形態において、濃縮プライマーは、除去されない場合、プライマー伸長を防ぐ３’阻止部分を含み、ＤＮＡポリメラーゼはプルーフリーディング活性または加ピロリン酸分解活性を含む（例えば、Ｐｆｕ、ＰＷＯ、Ｐｆｘ、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑＦＳまたはＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ）。他の実施形態において、濃縮プライマーの伸長は増幅プライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長を促進し、好ましくは使用したポリメラーゼは、鎖置換活性または５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を有する（例えば、Ｖｅｎｔ（エキソ−）ポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ）。特に、ＤＮＡポリメラーゼが熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであることが好ましい。
【００９３】
（ＩＩ  方法）
従来の方法（米国特許第５，８９１，６２５号）は、ＰＮＡまたはＬＮＡなどのヌクレオチド類似体のオリゴを使用し、それは核酸に強力にハイブリダイズして、核酸増幅手順を阻害する。本発明の方法は、本開示を考慮して実施するのに簡単であり、非常に特異的である。本明細書で特許請求される特定の実施形態において、濃縮プライマーは診断領域にアニールし、標的配列の診断領域が特定のヌクレオチドを含む場合のみ、伸長される。一実施形態において、濃縮プライマー伸長産物は、上流プライマーから開始される伸長を特異的に阻止し、それによって、特定のヌクレオチドを含む標的領域の増幅を防ぐが、変異ヌクレオチドを含む標的領域は指数関数的に増幅する。別の実施形態において、濃縮プライマーの伸長は鋳型のステムループ構造を開き、増幅プライマーがアニールおよび伸長することを可能にする。増幅は、診断領域の他に標的配列にアニールする１対の増幅プライマーを使用するが、いくつかの以前の方法は、診断領域に直接アニールする増幅プライマーを使用し、ＰＣＲエラーはしばしば、稀少変異の存在についての陽性結果として誤解釈される。さらに、本発明の増幅産物は所望の標的核酸について濃縮され、それは、本発明において提供されるブリッジプローブによって、またはリアルタイムＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定などの任意の他の方法によって確実に分類され、解析され得る。
【００９４】
本発明の方法は、点突然変異を含む標的核酸の診断領域を濃縮し、検出する際の特定の目的についてのものであるが、この方法は、１つより多いヌクレオチドの欠失および挿入を含む、欠失および挿入を有する診断領域を濃縮し、検出することに等しく適用できることは理解されるべきである。本発明はまた、１つより多いヌクレオチドの置換を含む標的領域を濃縮するのに有益である。この点に関して、関連性のあるヌクレオチドを知ることが単に必要であるため、必要な濃縮プライマー（複数も含む）が適切に設計され得る。従って、本明細書で用いる「変異ヌクレオチド」は、置換だけでなく、可能性のある挿入または欠失でもあり、それによって（例えばプローブまたはプライマーの）必要とされる相補性が調整されることが理解される。
【００９５】
本発明の１つの方法は、試料中の核酸集団から少なくとも１つの変異ヌクレオチドを有する標的核酸を濃縮および／または検出することを提供し、当該方法は、
（ａ）核酸集団を、標的核酸配列を含む核酸鋳型の第１の鎖についての濃縮プライマーおよび増幅プライマーで処理して、（プライマー（単数または複数）と、変異ヌクレオチドまたは正常ヌクレオチドを有する標的核酸との間の）二重鎖の混合物を作製する工程であって、濃縮プライマーおよび増幅プライマーは、増幅プライマーの３’末端が、濃縮プライマーの５’末端の上流（一般に隣接するか、または実質的に隣接する）であるような位置で鋳型にアニールすることができ、前記濃縮プライマーのヌクレオチド配列は、変異被疑ヌクレオチドが位置する診断領域に実質的に相補的であり、前記二重鎖は、鋳型にアニールされた濃縮プライマーおよび増幅プライマーを含むか、または鋳型にアニールされた濃縮プライマーを含む工程と、
（ｂ）適切なヌクレオシド三リン酸および核酸ポリメラーゼを含む伸長条件下で、工程（ａ）の混合物を維持して、伸長可能な場合、アニールされたプライマーを伸長して、プライマー伸長産物を合成する工程と、を含む。
【００９６】
下記のように、一実施形態において、アニールされた濃縮プライマーが変異被疑ヌクレオチドを有する診断領域にアニールする場合、そのアニールされた濃縮プライマーは伸長できないが、アニールされた濃縮プライマーが対応する正常ヌクレオチドを含む診断領域にアニールする場合、そのアニールされた濃縮プライマーは伸長されて、濃縮プライマー伸長産物を合成し、濃縮プライマーの伸長は増幅プライマーの伸長を阻止するか、または増幅プライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長を促進するかのいずれかである。より具体的には、工程（ａ）において、濃縮プライマーおよび増幅プライマーの両方は核酸鋳型にアニールし、工程（ｂ）において、アニールされた濃縮プライマーが変異被疑ヌクレオチドを有する診断領域にアニールする場合、そのアニールされた濃縮プライマーは伸長できず、それにより、濃縮プライマーは伸長条件下で標的配列から解離され、それにより、増幅プライマーの伸長が変異被疑ヌクレオチドを有する診断領域を通過することができ、アニールされた濃縮プライマーが対応する正常ヌクレオチドを有する診断領域にアニールする場合、そのアニールされた濃縮プライマーは伸長されて、濃縮プライマー伸長産物を合成し、それにより、増幅プライマーの伸長は濃縮プライマーの伸長産物によって阻止される。
【００９７】
別の実施形態において、工程（ａ）において、核酸鋳型はハイブリダイゼーション条件下でステムループ構造を形成し、二本鎖ステムは増幅プライマー結合部位を含み、ループは標的核酸配列を含み、濃縮プライマーはループ中の診断領域にアニールし、工程（ｂ）において、濃縮プライマーが変異ヌクレオチドを有する診断領域にアニールする場合、その濃縮プライマーは伸長され、この伸長によりステムループ構造が開き、それにより、増幅プライマーがプライマー結合部位にアニールすることを可能にし、増幅を促進し、濃縮プライマーが正常ヌクレオチドを有する診断領域にアニールする場合、その濃縮プライマーは伸長できず、それにより、ステムループ構造はインタクトな状態であり、増幅プライマーがプライマー結合部位にアニールすることを防ぐ。この実施形態において、方法はさらに、ハイブリダイゼーション条件下で工程（ｂ）の混合物を処理して、増幅プライマーが、開いたステムループ鋳型のプライマー結合部位にアニールすることを可能にする、工程（ｃ）と、工程（ｃ）の混合物を伸長条件下に維持して、アニールされた増幅プライマーを伸長する工程（ｄ）であって、前記伸長条件は、適切なヌクレオチド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、および鎖置換活性を有する薬剤、または５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を有する薬剤を含み、前記鎖置換活性は、濃縮プライマーの伸長産物を置換することを可能にし、前記５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性は、濃縮プライマーの伸長産物が分解することを可能にする工程（ｄ）とを含む。濃縮プライマー伸長産物の分解は、濃縮プライマーまたはヌクレオシド三リン酸上のラベルに起因する検出信号を生成し得る。工程（ａ）〜（ｄ）は、ＰＣＲまたは等温増幅であり得る増幅反応において繰り返されることが好ましい。鎖置換活性は好ましくは、ポリメラーゼによって提供される。５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性は好ましくは、ポリメラーゼによって提供される。
【００９８】
濃縮プライマーは、その濃縮プライマーの伸長産物を指数関数的増幅に適さないようにする部分を含んでもよい。いくつかの実施形態において、使用する核酸ポリメラーゼは、プルーフリーディング活性を有するか、または有さないＤＮＡポリメラーゼであってもよい。プルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用する場合、濃縮プライマーは、修飾されたヌクレオチドまたは結合、特に３’末端ヌクレオチドまたは結合を含んでもよく、それにより、濃縮プライマーはヌクレアーゼ切断に対して耐性となる。濃縮プライマーは、天然のヌクレオチドおよびホスホジエステル結合からなる通常のオリゴヌクレオチドプライマーであってもよい。つまり、それは化学部分または修飾されたヌクレオチドを含まなくてもよい。この実施形態において、濃縮プライマーの一部または全てはヌクレアーゼ活性によって分解可能である。濃縮プライマーが標的配列上の対応する正常ヌクレオチドを含む診断領域にアニールする場合、濃縮プライマーは、少なくとも１つの修飾されたデオキシヌクレオシド三リン酸を含む伸長条件下で、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。濃縮プライマーの一部または全ては前記５’エキソヌクレアーゼ活性によって分解されるが、伸長鎖の一部または全ては切断に対して耐性となる。
【００９９】
（ａ）核酸集団を、標的核酸配列の第１の鎖についての第１の濃縮プライマーおよび第１の増幅プライマーで処理して、ハイブリダイゼーション条件下で標的核酸にアニールされた濃縮プライマーおよび増幅プライマーを含む二重鎖の混合物を作製する工程であって、前記濃縮プライマーのヌクレオチド配列は、変異被疑ヌクレオチドが位置する診断領域に実質的に相補的であり、濃縮プライマーの３’末端ヌクレオチドは変異被疑ヌクレオチドに相補的であり、濃縮プライマーの３’末端ヌクレオチドは、ポリメラーゼ伸長に適さないように修飾され、それにより、変異被疑ヌクレオチドを含む診断領域にアニールする濃縮プライマーは伸長できず、濃縮プライマーが対応する正常ヌクレオチドを含む診断領域にアニールする場合、濃縮プライマーのミスマッチした３’末端ヌクレオチドは核酸ポリメラーゼのプルーフリーディング活性によって除去され、それにより、濃縮プライマーを伸長可能にし、二重鎖は濃縮プライマーおよび増幅プライマーにアニールされた標的核酸を含み、それにより、増幅プライマーの３’末端は濃縮プライマーの５’末端に隣接するか、または５’末端の上流にある、工程と、
（ｂ）適切なヌクレオシド三リン酸およびプルーフリーディング活性を有する核酸ポリメラーゼを含む伸長条件下で、工程（ａ）の混合物を維持して、伸長可能な場合、アニールされたプライマーを伸長して、プライマー伸長産物を合成する工程であって、アニールされた濃縮プライマーが変異被疑ヌクレオチドを含む診断領域にアニールする場合、阻止された３’末端のために、そのアニールされた濃縮プライマーは伸長できず、それにより、濃縮プライマーは、ハイブリダイズ条件について使用したものより高い温度を有し得る伸長条件下で標的配列から解離され、それにより、増幅プライマーの伸長が変異被疑ヌクレオチドを含む診断領域を通過することができ、アニーリングプライマーが対応する正常ヌクレオチドを含む診断領域にアニールする場合、ミスマッチした３’末端ヌクレオチドは除去され、それによって伸長されて、濃縮プライマー伸長産物を合成し、それにより、増幅プライマーの伸長は濃縮プライマー伸長産物によって阻止される、工程とを含む、本発明の別の方法が提供される。
【０１００】
本発明のさらなる実施形態において、濃縮プライマーは、診断領域の正常ヌクレオチドとマッチするが、変異ヌクレオチドとミスマッチする阻止された３’末端ヌクレオチドを含む。プライマーの末端ヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼの加ピロリン酸分解活性によって除去された後、アニールされた濃縮プライマーは、適切な正常ヌクレオチドを含む標的配列の鋳型上で伸長され、濃縮プライマー伸長産物は上流の増幅プライマーの伸長を阻止する。アニールされた濃縮プライマーは、変異ヌクレオチドを含む鋳型上で伸長されず、鋳型から解離され、上流の増幅プライマーの伸長が診断領域を通過することを可能にする。濃縮プライマー伸長産物は、直線的に部分的にコピーされ得るが、増幅プライマー伸長産物は指数関数的に増幅され得る。
【０１０１】
本発明の別の方法において、濃縮プライマーは、濃縮プライマーのプライミング部分に対してヌクレオチドまたは非核酸５’の尾部配列を含んでもよく、この５’尾部配列は、濃縮プライマー伸長産物上のプライマー結合部位に相補的または実質的に相補的である。変性およびハイブリダイゼーションの際に、濃縮プライマー伸長産物は折り畳まれて、第２の増幅プライマーについての結合部位を阻止するステムループ構造を形成するが、増幅プライマー伸長産物は指数関数的に増幅できる。
【０１０２】
本発明のさらなる方法は、（ａ）標的核酸配列の第１の鎖についての第１の濃縮プライマーおよび第１の増幅プライマー、ならびに標的核酸の第１の鎖に相補的な標的核酸配列の第２の鎖についてのブリッジプローブおよび第２の増幅プライマーで、試料を処理して、ハイブリダイゼーション条件下で標的核酸にアニールされた濃縮プライマーおよび増幅プライマーを含む二重鎖の混合物を作製する工程であって、前記濃縮プライマーのヌクレオチド配列は、変異被疑ヌクレオチドが位置する標的核酸の第１の鎖上の診断領域に実質的に相補的であり、ブリッジプローブの第１の結合部分は、標的核酸の第２の鎖上の診断領域に実質的に相補的である、工程と；（ｂ）適切なヌクレオシド三リン酸および核酸ポリメラーゼを含む伸長条件下で工程（ａ）の混合物を維持して、伸長可能な場合、アニールされたプライマーを伸長して、プライマー伸長産物を合成する工程であって、アニールされた濃縮プライマーが変異被疑ヌクレオチドを含む診断領域にアニールする場合、そのアニールされた濃縮プライマーは伸長できず、それにより、濃縮プライマーは、ハイブリダイゼーション条件について使用されるものより高い温度を有し得る伸長条件下で標的配列から解離され、それにより、増幅プライマーの伸長が変異被疑ヌクレオチドを含む診断領域を通過することができ、アニールされた濃縮プライマーが対応する正常ヌクレオチドを含む診断領域にアニールする場合、そのアニールされた濃縮プライマーは伸長して、濃縮プライマー伸長産物を合成し、それにより、増幅プライマーの伸長は濃縮プライマー伸長産物により阻止される、工程とを含む。
【０１０３】
上記の方法はさらに、増幅法において工程（ａ）および（ｂ）を繰り返す工程を含む。任意の増幅システムは、これらの工程（例えば、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＬＡＭＰ、３ＳＲなど）を含んで使用してもよい。ＰＣＲはこれらの工程を組み込むための好ましい増幅法である。
【０１０４】
本明細書に記載されるいずれの方法においても、目的の標的核酸およびヌクレオチド変異を含むと推定される試料が提供される。試料に含まれる標的核酸は、二本鎖ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであってもよく、必要な場合、当業者に公知である物理的、化学的または酵素的手段を含む任意の適切な変性方法を用いて変性される。鎖分離のための好ましい物理的手段は、完全に（９９％より高く）変性されるまで核酸を加熱することを含む。典型的な熱変性は、数秒〜数分にわたる時間、約８０℃〜約１０５℃の範囲の温度に関わる。変性するのでなくその代わりに、標的核酸が試料中で一本鎖形態、例えば一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスにて存在してもよい。
【０１０５】
変性した核酸鎖は次いでハイブリダイゼーション条件下に、オリゴヌクレオチドプライマーとインキュベートされ、この条件は、核酸一本鎖へのプライマーの結合を可能にするものとする。濃縮プライマーは診断領域にアニールし、伸長されてもよいか、またはされなくてもよい。増幅プライマーは、濃縮プライマーの核酸鎖上流にアニールし、伸長する場合、診断領域を通過するか、またはその伸長は濃縮プライマー伸長産物により阻止される。一態様において、反応は、標的配列の第１の鎖にアニールする第１の増幅プライマーおよび第１の濃縮プライマー、ならびに標的配列の第１の鎖に相補的である標的配列の第２の鎖にアニールする第２の増幅プライマーを含む。別の態様において、反応は、標的配列の第１の鎖にアニールする第１の増幅プライマーおよび第１の濃縮プライマー、ならびに標的配列の第１の鎖に相補的である標的配列の第２の鎖にアニールする第２の増幅プライマーおよび第２の濃縮プライマーを含む。
【０１０６】
一実施形態において、核酸鋳型はステムループ構造を形成する。ステムループ構造を形成できる核酸鋳型は、試料中の標的核酸上での第１の増幅プライマーの伸長によって作製され得る。第１の増幅プライマーは５’尾部配列を含み、その５’尾部配列は第２の増幅プライマーの結合部位に相補的なヌクレオチド配列または非ヌクレオチド配列を含む。第１の増幅プライマーおよび第２の増幅プライマーは、その相補体から、またはステムループ構造から分離後、それぞれ、第２の増幅プライマーおよび第１の増幅プライマーの伸長産物にハイブリダイズできる。核酸鋳型は、試料中の標的核酸上での第１の増幅プライマーおよび第２の増幅プライマーの両方の伸長によって作製され得る。別の実施形態において、第１の増幅プライマーおよび第２の増幅プライマーの両方は同じ５’尾部配列を含み、前記５’尾部配列は第３の増幅プライマーの結合部位に相補的なヌクレオチドまたは非ヌクレオチド配列を含む。第３の増幅プライマーは、反応における第１の増幅プライマーおよび第２の増幅プライマーの濃度を大きく超える濃度で存在する。第３の増幅プライマーは、第１の増幅プライマーおよび第２の増幅プライマーの濃度より少なくとも２倍高い濃度で反応中に存在してもよい。好ましくは、第３の増幅プライマーは、第１の増幅プライマーおよび第２の増幅プライマーの濃度より少なくとも３倍高い濃度で反応中に存在してもよい。
【０１０７】
第１の増幅プライマーから合成された伸長物が、その伸長物がその鋳型（相補体）から分離されると、第２の増幅プライマーの伸長についての鋳型として役立つように、増幅プライマーが二重鎖配列に沿って相対的に位置するように、増幅プライマーは選択される。
【０１０８】
本発明の実施において、濃縮プライマーはまず、相補的核酸にアニールされなければならず、その後、増幅プライマー伸長が濃縮プライマー結合部位を阻止する。このことを達成するために、種々の技術を利用できる。濃縮プライマーの５’末端が、増幅プライマーの３’末端から比較的遠く離れるように、濃縮プライマーを配置して、それにより、濃縮プライマーにアニールするより多くの機会を与えることができる。また、増幅プライマーよりも高いＴｍを有する濃縮プライマーを使用することもできる。例えば、濃縮プライマーを増幅プライマーよりも長くなるように設計できる。濃縮プライマーのヌクレオチド組成は、Ｇ／Ｃ含量がより高くなって、その結果、増幅プライマーよりも熱安定性が高くなるように選択できる。同様に、天然由来の核酸に典型的に存在する塩基よりも安定性の高い塩基対を形成する塩基類似体を含む修飾されたヌクレオチドを、濃縮プライマーに組み込ませることができる。
【０１０９】
熱サイクルパラメータを変動させて、濃縮プライマーと増幅プライマーとの間の差次的熱安定性を活用することもできる。例えば、熱サイクルにおける変性工程後に、濃縮プライマー結合にとっては許容できるが増幅プライマー結合にとっては許容できない中間温度を導入してもよく、その後伸長温度（例えば７２℃）にまで昇温して、それによりマッチした濃縮プライマーの伸長を許容すると共に伸長されない濃縮プライマーを融解除去する。できるだけ多くの標的鋳型上で、マッチした濃縮プライマーの伸長を可能とするのに、中間温度と伸長温度とのサイクルをできるだけ多くの回数繰り返すことができる。その後、温度を下げて、増幅プライマーのアニーリングおよび伸長を許容することができる。
【０１１０】
本発明のいくつかの実施形態において、濃縮プライマー伸長産物は、上流プライマー伸長物のブロッカーとして機能し、好ましくは、増幅についての鋳型として使用されず；濃縮プライマーの一部または全ての複製を阻止する濃縮プライマーに組み込まれるコピーできない部分を使用でき、好ましい。原則として、濃縮プライマーに含まれるコピーできない部分（阻止部分）は、ポリメラーゼによって適切な鋳型と認識されない任意の実態であってもよい。阻止部分（例えば、ｄＲ−ビオチン、ｄＲ−アミン）は、オリゴヌクレオチドの生体外合成の間の適切な前駆体（例えば、ホスホロアミダイト）の組み込みによって合成オリゴヌクレオチドに挿入できることが望ましい。
【０１１１】
オリゴヌクレオチドプライマー（複数も含む）の、鋳型に依存した伸長は、適量の４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ）または上記のようなそれらの類似体の存在下に、適切な塩、金属カチオン、およびｐＨ緩衝系を含む反応媒体中で重合剤により触媒される。適切な重合剤は、プライマーと鋳型とに依存するＤＮＡ合成を触媒することが知られている酵素である。これらＤＮＡポリメラーゼでＤＮＡ合成を触媒するための反応条件は、当該分野において周知である。
【０１１２】
加ピロリン酸分解はＤＮＡ重合の逆反応である。ピロリン酸塩の存在下において、３’ヌクレオチドは二重鎖ＤＮＡから除去されて、三リン酸塩および３’末端短縮二重鎖ＤＮＡを生成する：［ｄＮＭＰ］n＋ＰＰｉ−［ｄＮＭＰ］n-1＋ｄＮＴＰ。加ピロリン酸分解が、阻止された３’末端を有する濃縮プライマーを活性化するのに必要とされる本発明の方法において、伸長条件は、当該分野において周知である加ピロリン酸分解に好適な適切な条件を含んでもよい。
【０１１３】
濃縮プライマーが伸長される場合、別の診断領域についての上流の増幅プライマーまたは上流の濃縮プライマーもまた伸長されるが、それらの伸長鎖が下流の濃縮プライマー伸長産物に到達すると、停止する。濃縮プライマーがコピーできない（阻止）部分を含むか、または濃縮プライマー伸長産物上の濃縮プライマーの一部が分解される場合、濃縮プライマー伸長産物のさらなる増幅が防がれる。本明細書中で「さらなる増幅」という表現は、特に指数関数的増幅を意味する。いくつかの実施形態において、産物全体ではないが、濃縮プライマー伸長産物の直線的（または多項式増幅（ｐｏｌｙｎｏｍｉａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ））複製が可能である（図１、２、３および４）。別の実施形態において、濃縮プライマー伸長産物の直線的複製および指数関数的複製の両方が防がれる（図５）。アニールされた濃縮プライマーが伸長できない場合、それは鋳型から解離され、２つの増幅プライマーに隣接する標的配列の指数関数的増幅を可能にし、それによって、所望の標的配列を濃縮する。
【０１１４】
本発明の方法はさらに、濃縮された所望の配列を検出することを含む。検出は濃縮のプロセスと同時に実施されてもよい（例えばリアルタイム検出）。検出プローブは濃縮／増幅反応に含まれてもよい。任意の検出プローブが使用でき；好ましい検出プローブはブリッジプローブである。代替の検出が濃縮反応の終わりに実施されてもよい。プローブが前記濃縮反応の開始または終わりに加えられてもよい。融解曲線解析を実施して、濃縮された増幅産物に存在する変異被疑ヌクレオチドを検出してもよい。定量的データが検出により得られることが好ましい。
【０１１５】
所望の核酸の濃縮の検出または検証が濃縮後に実施されることも可能であり、その濃縮はリアルタイムＰＣＲまたはＤＮＡ配列決定などの種々の方法によってなされ得る。
【０１１６】
検出のためのブリッジプローブを用いる本発明の典型的な方法は図７に記載される。ブリッジプローブは、第１の結合部位の短い長さおよび高いＴｍに起因する単一のヌクレオチド差を見分ける改良された能力を有するだけではなく、第２の結合部分が標的領域の他の領域にハイブリダイズし、濃縮プライマーがその標的領域の他の領域にハイブリダイズするように設計される事実に起因して、濃縮プライマーの全長に対してアニールすることも回避する。本発明のブリッジプローブが広い用途を有することは理解されるべきである。それは、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＬＣＲ、ＲＣＡ、ＬＡＭＰ、ＮＡＳＢＡなどの任意の増幅法と併せて標的核酸を検出するのに使用できる。それはまた、終点検出および融解曲線解析にも使用できる。
【０１１７】
本発明の一実施形態において、生物学的試料の標的ＤＮＡ配列を解析するための方法であり、当該方法は、
（ａ）生物学的試料に有効量の増幅プライマーおよび核酸プローブを加える工程であって、前記増幅プライマーの１つおよびプローブは、各々、フルオロフォアおよびクエンチャーの１つのメンバーでラベルされ、それによって、プローブと増幅産物とのハイブリダイゼーションの際に、フルオロフォアおよびクエンチャーは接触クエンチング関係となり、ラベルされたプローブは、そのラベルされたプライマーの５個のヌクレオチド内の標的核酸配列の増幅されたコピーにハイブリダイズするか、またはラベルされたプローブは標的核酸配列およびラベルされたプライマーの一部にハイブリダイズする工程と、
（ｂ）増幅法により標的核酸配列を増幅する工程と、
（ｃ）生物学的試料に、前記フルオロフォアによって吸収される選択された波長の光を照射する工程と、
（ｄ）前記フルオロフォアの蛍光発光を検出する工程または前記フルオロフォアからの温度依存性蛍光をモニターする工程と、を含む。核酸プローブはブリッジプローブであることが好ましい。
【０１１８】
本発明の別の実施形態において、生物学的試料の標的ＤＮＡ配列を解析するための方法であり、当該方法は、
（ａ）生物学的試料に、有効量の増幅プライマーおよび標的配列の隣接する領域にハイブリダイズする２つの核酸プローブを加える工程であって、前記プローブの１つはフルオロフォアでラベルされ、もう１つのプローブは接触クエンチング対のクエンチャーでラベルされ、それにより、プローブと増幅産物とのハイブリダイゼーションの際に、フルオロフォアおよびクエンチャーは接触クエンチング関係となり、フルオロフォアおよびクエンチャーは互いの５個のヌクレオチド内にある工程と、
（ｂ）増幅法により標的核酸配列を増幅する工程と、
（ｃ）生物学的試料に、前記フルオロフォアによって吸収される選択された波長の光を照射する工程と、
（ｄ）前記フルオロフォアの蛍光発光を検出する工程または前記フルオロフォアからの温度依存性蛍光をモニターする工程と、を含む。核酸プローブの１つがブリッジプローブであることが好ましい。
【０１１９】
増幅法は等温増幅であってもよい。増幅は、好ましくはＰＣＲである熱サイクル増幅であることが好ましい。
【０１２０】
この方法はさらに、プローブおよび標的二重鎖の融解プロファイルを決定する工程を含んでもよい。
【０１２１】
ブリッジプローブはＳＮＰの遺伝子型を同定するか、または変異を検出するのに使用できる。一実施形態（図１０Ａ）において、第１のアレル特異的プライマーは第１のフルオロフォア、例えばＦａｍでラベルされ、一方、第２のアレル特異的プライマーは第２のフルオロフォア、例えばＨｅｘでラベルされる。フルオロフォアは３’末端付近のＴ残基に付けられてもよい。標的ＳＮＰまたは変異が試料中に存在する場合、アレル特異的プライマーの１つまたは両方が伸長されて、プライマー伸長鎖を生成する。３’末端にてクエンチャー（例えばＢＨＱ−１）でラベルされたブリッジプローブは、第１の結合部分を有するプライマー伸長鎖にハイブリダイズし、一方、第２の結合部分はプライマー配列にハイブリダイズする。このハイブリダイゼーションにより、フルオロフォアおよびクエンチャーが近接接触クエンチング関係となる。ブリッジプローブのブリッジ部分は、プライマーにハイブリダイズしない１〜３個のヌクレオチドを有し、それにより、プライマーはプローブにアニールできず、伸長できないことが非常に重要である。プライマーにハイブリダイズする第２の結合部分は長さが短いが、標的にハイブリダイズするのに十分であることもまた重要である。ブリッジ部分はまた、非ヌクレオチド化学部分を含んでもよく、それにより、それは鋳型として作用できず、従ってポリメラーゼによってコピーできない。プライマー伸長産物へのプローブのハイブリダイゼーションは蛍光を減少させるので、特定の蛍光の減少の検出は、特定のＳＮＰまたは変異の存在の指標である。
【０１２２】
別の実施形態（図１０Ｂ）において、ＳＮＰに近接する領域にアニールできる増幅プライマーの１つは、フルオロフォア、例えばＦａｍでラベルされる。フルオロフォアはプライマーの３’末端付近のＴ残基に付けられてもよい。検出反応において、ラベルされたプライマーは伸長されて、プライマー伸長鎖を生成する。３’末端にてクエンチャー（例えば、ＢＨＱ−１）でラベルされたブリッジプローブは、第１の結合部分を有するプライマー伸長鎖にハイブリダイズし、一方、第２の結合部分はプライマー配列にハイブリダイズする。ブリッジプローブの第１の結合部分に結合する第１の領域は、ＳＮＰまたは変異部位を含む。このハイブリダイゼーションにより、フルオロフォアおよびクエンチャーが近接接触クエンチング関係となる。ブリッジプローブのブリッジ部分は、プライマーにハイブリダイズしない１〜３個のヌクレオチドを有し、それにより、プライマーはプローブにアニールできず、伸長できないことが非常に重要である。プライマーにハイブリダイズする第２の結合部分は短いが、標的にハイブリダイズするのに十分であることもまた重要である。ブリッジ部分はまた、非ヌクレオチド化学部分を含んでもよく、それにより、それは鋳型として作用できず、従ってポリメラーゼによってコピーできない。プライマー伸長産物へのプローブのハイブリダイゼーションは、プローブ上のクエンチャーからのクエンチング効果に起因してラベルの蛍光を減少させるため、特定のＴｍ値での特定の蛍光信号の損失を測定することは、特定のＳＮＰまたは変異の存在の指標となる。ブリッジプローブ結合のＴｍは融解曲線解析によって決定されてもよい。
【０１２３】
本発明の方法は、プローブからの蛍光の最大損失率についての温度を測定する工程を含んでもよい。温度の関数としての反応の蛍光は、ポリメラーゼ連鎖反応の間に測定できる。
【０１２４】
一本鎖産物がラベルされたプライマーによって生成され得る場合、上記の反応の感度は非常に増加するだろう。一本鎖の最終産物を生成する１つの方法は、ポリメラーゼ連鎖置換反応（ＰＣＤＲ）と呼ばれる方法（Ｆｕ，Ｇ．２００７，国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００３７９３号）であってもよい。一本鎖の最終産物の生成を誘発できる連結されたプライマーは、ブリッジプローブが標的配列を検出するのに使用され得るＰＣＤＲ反応に組み込まれる。
【０１２５】
米国特許第６，１７４，６７０号に記載されるハイブリダイゼーションプローブ設計において、一対のラベルされたプローブは、標的配列上で互いに近接してハイブリダイズし、ＦＲＥＴによって相互作用するように設計され、供与体フルオロフォアおよび受容体フルオロフォアは、フルオロフォアの発光強度が減少するため、互いに即座に接触されない。従って、各プローブについての標的配列は、通常、接触クエンチングを防ぎ、受容体からの発光を最大化するため、少なくとも５ヌクレオチド離れてる。一方、本発明の実施形態において、一対のラベルされたプローブは、標的配列上で互いに近接してハイブリダイズし、接触クエンチングによって相互作用するように設計され、フルオロフォアおよびクエンチャーは、クエンチング効率を最大化するため、互いに即座に接触するはずであるので、これにより、フルオロフォアの発光を減少させる。従って、各プローブについての標的配列は、通常、接触クエンチングを達成するために、少なくとも５ヌクレオチドである。ＦＲＥＴよりむしろ接触クエンチングを用いることにいくつかの利点が存在する。第１に、本発明の方法は、最大多重化を可能にするが、受容体および供与体フルオロフォアの両方は、ＦＲＥＴベースのプローブ中の検出チャネルを専有し、検出され得る標的の数を制限する。第２に、接触クエンチングはより効果的であり、従って、接触クエンチングからの信号減少は、ＦＲＥＴからのものより大きい。第３に、ＦＲＥＴプローブを設計することは、接触クエンチングプローブを設計することより複雑である。ＦＲＥＴプローブに関して、２つのラベルは、生じるためにはＦＲＥＴについての適切な距離内に配置されなければならず、フルオロフォアの発光スペクトルと受容体の吸収スペクトルとの間のスペクトル重複は、ＦＲＥＴ効率の重要な決定因子である。スペクトル重複は、接触クエンチングにおけるクエンチング効率の重要な決定因子ではなく、クエンチング効率はスペクトル重複がない場合、非常に高いままである。
【０１２６】
さらなる実施形態において、複数のブリッジプローブは、標的核酸の多重検出、単一の標的核酸における変異ヌクレオチドの多重検出、または未知の変異をスキャンするための多重検出を可能にするように提供される。各々のブリッジプローブは、ブリッジ部分によって連結された少なくとも２つの結合部分を含み、第１の結合部分は標的核酸上の目的の領域にハイブリダイズでき、第２の結合部分は標的核酸上の目的の領域に隣接するか、または実質的に隣接する領域にハイブリダイズできる。標的核酸上の目的の領域は変異被疑ヌクレオチドを有する診断領域であってもよい。
【０１２７】
本発明の方法で用いられる試薬は、診断用キットの中に包装することができる。診断用キットは、標的核酸配列の各診断領域に対する濃縮プライマーを含み、濃縮プライマーの３’末端における末端ヌクレオチドは、変異被疑ヌクレオチドまたは対応する正常ヌクレオチドのいずれかに相補的であり、それにより、使用時に、前記濃縮プライマーの末端ヌクレオチドが、対応する正常ヌクレオチドを有する診断領域にアニールする場合、濃縮プライマーの伸長産物が合成されるが、前記濃縮プライマーの末端ヌクレオチドが、変異ヌクレオチドを含む診断領域にアニールする場合、濃縮プライマーは伸長できず；そして標的配列を増幅するための対応する第１のプライマーおよび第２のプライマーは、濃縮プライマーがアニールする診断領域を含む。このキットはまた、他の好適に包装された、増幅に必要な試薬及び材料、例えば、増幅プライマー、バッファー、ｄＮＴＰ、および／または重合手段、さらには検出解析用のものや、アッセイの実施についての使用説明を含んでもよい。
【０１２８】
別の実施形態において、診断用キットは、標的核酸配列の各診断領域に対するプローブおよびプライマーを含み、そのプローブおよびプライマーは、接触クエンチング対となるラベルを含み、標的核酸とのハイブリダイゼーションの際に、そのラベルは接触クエンチング関係となる。このキットはまた、ブリッジ部分によって連結された少なくとも２つの結合部分を含むブリッジプローブを含んでもよく、第１の結合部分は核酸鋳型の第１の領域にハイブリダイズでき、第２の結合部分は核酸鋳型の第１の領域に隣接するかまたは実質的に隣接する第２の領域にハイブリダイズできる。核酸鋳型の第１の領域は、変異被疑ヌクレオチドを有する診断領域であり得る標的核酸上の目的の領域であってもよい。
【０１２９】
従って、本発明の特定のキットは、本明細書に規定の方法の性能に適応したものであり、例えば、濃縮プライマーおよび増幅プライマーと、本明細書に規定の任意の方法を実施するための使用説明書との組み合わせを含んでいる。従って、第１の態様に関して、典型的に、濃縮プライマーは、変異被疑ヌクレオチド、または対応する正常ヌクレオチドのいずれかに相補的な３’末端ヌクレオチドを有する。典型的に、増幅プライマーは、その増幅プライマーの３’末端が濃縮プライマーの５’末端に隣接するか、または濃縮プライマーの５’末端の上流になるように標的にアニールするように適応される。濃縮プライマーは、好ましくは、その濃縮プライマーの伸長産物を、指数関数的増幅に適さないようにする部分、すなわち上記のようにそれをコピーできなくさせる部分を含む。必要に応じて、濃縮プライマーはまた、濃縮プライマーの全てまたは一部をヌクレアーゼ切断に対して耐性となるようにする修飾されたヌクレオチドまたは結合を含む。このキットはまた、５’エキソヌクレアーゼ活性を含む核酸ポリメラーゼを含んでもよい。
【０１３０】
本発明をさらにここで、以下の非限定的な実施例を参照して記載する。本発明の他の実施例は、これらを考慮して当業者が想到するであろう。
【０１３１】
本明細書に引用するすべての参考文献の開示は、それが本発明を実施する当業者によって使用され得る程度まで、相互参照によって本明細書に特に援用される。
【実施例】
【０１３２】
（実施例１）
以下の実験で用いた全てのプライマーおよびプローブは、ＥＵＲＯＧＥＮＴＥＣ，ＵＫによって合成された。リアルタイムＰＣＲおよび融解曲線解析は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｈｒｏｍｏ４リアルタイムＰＣＲまたはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＭＸ３００５Ｐ機で実施した。プライマーは、正常ＢＲＡＦ遺伝子断片および突然変異ＢＲＡＦ遺伝子断片（Ｖ５９９Ｅを保有している）を含むプラスミドから標的ＤＮＡ配列ＢＲＡＦ遺伝子を増幅するように設計した。この遺伝子断片の配列は、以下の配列を含む。
【化１】
0005394937.tif 000002
【０１３３】
プライマーの配列は、以下である。
【化２】
0005394937.tif 000003
配列中、「１」はｄＲ−ビオチンであり、「２」はホスホロチオエート結合である。全ての核酸配列は、特に明記しない限り５’から３’に記載する。ここで、ＢｒａＦＡＭＲ２は濃縮プライマーである。
【０１３４】
プライマーは、１０μＭの最終濃度に希釈した。増幅は、以下の成分および条件、すなわち、１０×ＰＣＲバッファー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のストッフェルフラグメント（ｓｔｏｆｆｅｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）バッファー）を２．５μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰを０．５μｌ、添加する場合、各プライマーを０．５μｌ、ストッフェルフラグメント、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）を０．２５μｌ、プラスミドＤＮＡを０．５μｌ（１０5分子）、および最終体積を２５μｌとする量の水を用いて実施した。反応は、９４℃で１分間と、９４℃で１５秒、５７℃で３０秒、６８℃で１秒、６０℃で１５秒の４０サイクルで、ＢｉｏＭｅｔｒａ  ＰＣＲ機にて行った。反応に加えたプライマーは以下のとおりである。
【０１３５】
【表１】
0005394937.tif 000004
Ｍ／Ｎ＝１／１００ＤＮＡは、１：１００の比で突然変異ＤＮＡおよび正常ＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡを意味する。
【０１３６】
ＰＣＲ後に、増幅したＤＮＡ産物をアガロースゲルに付した。チューブ番号２、４、５、７および８からのＤＮＡを、ＧＡＴＣ  ｌｔｄによるプライマーＢｒａｆｅｎｄＲ２およびＢｒａｆｅｎｄｉｎＲ２（配列ＧＣＣＴＣＡＡＴＴＣＴＴＡＣＣＡＴＣＣＡＣＡＡを有する）を用いて配列決定した。ＰＣＲチューブ５からの突然変異濃縮ＰＣＲ産物は、配列決定した塩基が突然変異型であることを示したが、チューブ４からの濃縮していないＰＣＲ産物は、配列決定した塩基が正常型であることを示した。
【０１３７】
（実施例２）
（マッチした鋳型およびミスマッチした鋳型にハイブリダイズしたブリッジプローブの融解曲線解析）
ブリッジプローブＰａｄＬｆａｍは、配列ＧＡＧＣＣＧＴＣＧＧＴＧＧＴＣａａａａａａａａａａＣＡＴＧＡＣＧＡＧＣＣＣＴＡを有するように設計し、５’末端を６−Ｆａｍでラベルし、３’末端をＢＨＱ１でラベルした。結合部分は大文字であり、ブリッジ部分は小文字である。
【０１３８】
２つの鋳型のオリゴはまた、ＰａｄＬＴｅｍｐ
ＡＴＡＧＡＣＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＡＴＴＡＧＧＧＣＴＣＧＴＣＡＴＧＴＡＡＣ、
およびＰａｄＬＴｅｍｐＭ
ＡＴＡＧＡＣＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＡＴＴＡＧＧＧＣＴＡＧＴＣＡＴＧＴＡＡＣであるように設計し、ＰａｄＬＴｅｍｐＭは、下線を引いた１個のヌクレオチドの相違である。
【０１３９】
ブリッジプローブＰａｄＬｆａｍは、図６のような形態でその鋳型にハイブリダイズする。融解曲線解析を図９Ａに示すように実施した。６℃のＴｍの差がマッチした鋳型（ライン２）と、ブリッジプローブにハイブリダイズした１個のヌクレオチドの相違（ライン１）を有する鋳型との間で観測される。
【０１４０】
（実施例３）
（ブリッジプローブのブリッジ部分の異なる長さはＴｍに影響を与える）
２つのブリッジプローブＳｕｎＤａｂおよびＳｕｎＤａｂＡ１３を以下のように設計し、３’末端をＤａｂｃｙｌでラベルした。プローブＳｕｎＤａｂはブリッジ部分を有さないが、プローブＳｕｎＤａｂＡ１３は１３個のＡを有するブリッジ部分を含む。第２のプローブのＳｕｎＦａｍは、ブリッジプローブの第１の結合部分および第２の結合部分に相補的な２つの領域を含み、５’末端にて６−Ｆａｍでラベルした。別のオリゴヌクレオチドのＳｕｎＴｅｍｐを、第２のプローブの一部に相補的な領域を有するように設計した。結合領域を示すアラインメントは以下のとおりであり、配列中の「Ｆ」は６−Ｆａｍを意味し、「Ｑ」はｄａｂｃｙｌを意味し、「−」はヌクレオチドがないことを意味し、「Ｉ」は相補的塩基を意味し、「Ｐ」はリン酸基を示す。
【化３】
0005394937.tif 000005
【０１４１】
融解曲線解析を以下のオリゴの組み合わせを用いて実施した。
【０１４２】
【表２】
0005394937.tif 000006
【０１４３】
結果を図９Ｂに示し、これは、ブリッジ部分の差（チューブ２および５）がＴｍに大きな影響を与えることを示す。長いブリッジ部分を有するブリッジプローブＳｕｎＤａｂＡ１３は、特に短い配列（チューブ５）を有する結合部分に対して高いＴｍを示す。
【０１４４】
（実施例４）
（接触クエンチング対のラベルを用いる増幅）
増幅プライマーおよびプローブは、ＢｒａｆＥｎｄｉｎＲ２、ＧＣＣＴＣＡＡＴＴＣＴＴＡＣＣＡＴＣＣＡＣＡＡ；ＢｒａｆＥｎｄＲ２、ＧＡＣＴＴＴＣＴＡＧＴＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＴＣＴＣＡ；ＢｒａＦＡＭＲ２、ＧＧＡＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＣＧ１ＧＡＴＴＴＣ２Ａ（「１」はｄＲ−ビオチンであり、「２」はホスホロチオエート結合である）；  ＢｒａＰＣＤＲＦ、ｃｔａｃａｃｃｔｃａｇａｔａｔａｔｔｔｃｔｔｃａｔｇａａｇ、５’をＦａｍでラベルした；ＢｒａＢｒｉｄｇｅ、ＡＴＣＡＣＣＴＡＴＴＴＴＴＡＣＴＧＴＧＡＧＧＴＣａａａｇａＧＧＴＧＴＡＧ、３’をＢＨＱ−１でラベルした。
【０１４５】
増幅プライマーＢｒａＰＣＤＦおよびプローブＢｒａＢｒｉｄｇｅは、各々、ＦａｍおよびＢＨＱ−１のそれぞれでラベルされ、それにより、プローブと増幅産物とのハイブリダイゼーションの際に、フルオロフォアおよびクエンチャーは接触クエンチング関係となる。
【０１４６】
プライマーは、１０μＭの最終濃度に希釈する。増幅は、以下の成分および条件、すなわち、１０×ＰＣＲバッファー（ＮＥＢ  ｔｈｅｒｍｏ  ｂｕｆｆｅｒ）を２．５μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰを０．５μｌ、添加する場合、各プライマーを０．５μｌ、Ｖｅｎｔ（エキソ−）またはＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）を０．２５μｌ、プラスミドＤＮＡを０．５μｌ（１０5分子）、および最終体積を２５μｌとする量の水を用いて実施した。反応は、９４℃で１分間と、９４℃で９秒、５１℃で３０秒（蛍光を読み取った）、７２℃で３０秒、５１℃で３０秒（蛍光を読み取った）、および７２℃で３０秒の３６サイクルで、ＢｉｏＲａｄ  ｃｈｒｏｍｏ４リアルタイムＰＣＲ機にて実施した。反応に加えるプライマーは以下のとおりである。
【０１４７】
【表３】
0005394937.tif 000007
【０１４８】
リアルタイムＰＣＲ法によって標的核酸配列を増幅する工程；Ｆａｍによって吸収される４９２ｎｍ波長の光を生物学的試料に照射する工程；ならびに前記フルオロフォアの蛍光発光を検出する工程および前記フルオロフォアから温度依存性蛍光をモニターする工程。
【０１４９】
脱脂した（ｄｅｇｒｅａｓｅｄ）蛍光信号を全ての反応において観測し、標的が全ての試料に存在することが示された。
【０１５０】
（実施例５）
増幅プライマー対を、一方のプライマーが５’尾部配列を含み、その５’尾部配列が対のもう一方のプライマーに同一であるように設計した。
【０１５１】
増幅プライマーおよびプローブは、ＪＫＲ３ｃｃＦ２、ＧＡＴＧＣＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＧＣＡＴＴＡＧＡＡＡＧＣＡＴＣＴＴＴＡＴＴＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＧＡＡ；ＪＫＲ３、ＧＡＴＧＣＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＧＣＡＴＴＡＧＡ；ＪＫＦａｍｄＲ、ＧＴＴＴＴＡＣＴＴＡＣＴＣＴＣＧＴＣＴＣＣＡＣ６ＧＡＡ、このプライマーにおける１１位の「Ｔ」はＢＨＱ−１（ｄＴ）であり、「６」はＦａｍ−ｄＲである。
【０１５２】
プライマーは、１０μＭの最終濃度に希釈する。増幅は、以下の成分および条件、すなわち、１０×ＰＣＲバッファー（ＮＥＢ  ｔｈｅｒｍｏ  ｂｕｆｆｅｒ）を３μｌ、５μｌのベタイン、１０ｍＭ  ｄＮＴＰを０．５μｌ、添加する場合、プライマーＪＫＲ３を１．２５μｌ、プライマーＪＫＲ３ｃｃＦ２を０．５μｌ、ＪＫＦａｍｄＲを１μｌ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）を０．２５μｌ、プラスミドＤＮＡを０．５μｌ（１０5分子）、および最終体積を２５μｌとする量の水を用いて実施した。反応は、９４℃で１分間と、９５℃で１５秒、６１℃で１８秒、５４℃で１８秒、７２℃で１８秒、６０℃で２０秒、７２℃で２５秒、および７２℃で３０秒（データは各温度で収集した）の４０サイクルで、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＭＸ３００５リアルタイムＰＣＲ機にて実施した。プラスミド鋳型は、Ｖ６１７Ｆを含む突然変異ＤＮＡと、野生型ＤＮＡとを混合したものである。この方法は、リアルタイムＰＣＲ法によって標的核酸配列を増幅する工程；Ｆａｍによって吸収される４９２ｎｍ波長の光を生物学的試料に照射する工程；ならびに前記フルオロフォアの蛍光発光を検出する工程および前記フルオロフォアから温度依存性蛍光をモニターする工程を含む。
【０１５３】
変性したＪＫＲ３ｃｃＦ２プライマー伸長産物は、アニーリング条件下でステムループ構造を形成する。Ｒ３プライマーはステムループ構造に起因してアニールできない。濃縮プライマーＪＫＦａｍｄＲはループ部分にアニールし、それが突然変異ヌクレオチドにアニールする場合、伸長される。ＪＫＦａｍｄＲプライマーの伸長はステムループ構造を開き、それにより、Ｒ３プライマーがアニールし、伸長することを可能にする。Ｒ３プライマーの伸長は、Ｔａｑポリメラーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼの性質に起因して濃縮プライマー伸長産物を分解する。ポリメラーゼが鎖置換活性を有する場合、濃縮プライマー伸長産物も置換してもよい。濃縮プライマーが野生型ＤＮＡ（これはプライマーの末端ヌクレオチドとミスマッチを形成するヌクレオチドを含む）にアニールする場合、濃縮プライマーは伸長されず、それにより、ステムループ構造はインタクトな状態である。これにより、突然変異ヌクレオチドを含むＤＮＡの濃縮が生じる。濃縮プライマーはラベルのＦａｍおよびＢＨＱを含む。濃縮プライマー伸長産物の分解により蛍光信号が得られる。この反応により、単一のチューブにおける標的核酸の濃縮および検出が可能になる。
【図１】
0005394937.tif 000008
【図２】
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【図３】
0005394937.tif 000010
【図４】
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【図５】
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【図６−Ａ】
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【図６−Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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