(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物であって
ａ）１つ以上のカオトロープ、
ｂ）１つ以上の界面活性剤、
ｃ）１つ以上の還元剤、
ｄ）１つ以上のキレート剤、
ｅ）１つ以上のバッファー、および
ｆ）核酸セグメントであって、
（１）核酸セグメントの検出に特異的である１２から４０ヌクレオチド長の標識プローブと特異的に結合する第一の配列ドメインを含み、
（２）２０から４０ヌクレオチド長のフォワードＰＣＲ増幅プライマーと特異的に結合する第二の配列ドメインを含み、ならびに
（３）２０から４０ヌクレオチド長のリバースＰＣＲ増幅プライマーと特異的に結合する第三の配列ドメインを含む
核酸セグメントを含む６０から５００ヌクレオチド長の単離、一本鎖核酸分子
を含み、
第二の配列ドメインと第三の配列ドメインが操作可能に位置して、フォワードおよびリバースプライマーからの、核酸セグメントの少なくとも第一部分のＰＣＲ定方向増幅を、前記少なくとも第一部分を増幅するのに有効な条件下で容易にし、
前記分子が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、哺乳動物ゲノム、または哺乳動物に対して病原性である細菌、真菌、またはウイルスのゲノムと結合せず、ならびに
さらに（ａ）−（ｅ）が、サンプルと組成物の接触時に、１つ以上のタンパク質を変性する、１つ以上のヌクレアーゼを不活性化する、１つ以上の病原体を殺滅する、または核酸集団を含有する疑いがあるサンプル中で１つ以上の核酸が分解するのを妨げるのに十分な量で組成物中に存在する、組成物。
【請求項２】
（ａ）−（ｅ）のそれぞれが、１日から９０日の間１０℃から４０℃の温度で保存するとき、一本鎖核酸分子を含むヌクレオチド集団の分解を阻害または予防するのに十分な量で組成物中に存在する、請求項１の組成物。
【請求項３】
ａ）１つ以上のカオトロープが０．５Ｍから６Ｍの量でそれぞれ存在し、
ｂ）１つ以上の界面活性剤が０．１％から１％（重量／体積）の量でそれぞれ存在し、
ｃ）１つ以上の還元剤が０．０５Ｍから０．３Ｍの量でそれぞれ存在し、
ｄ）１つ以上のキレート剤が０．０１ｍＭから１ｍＭの量でそれぞれ存在し、および
ｅ）１つ以上のバッファーが１ｍＭから１Ｍの量でそれぞれ存在する、
請求項１から２のいずれかに記載の組成物。
【請求項４】
標識プローブが、少なくとも第一の副溝結合剤、放射性標識、発光標識、化学発光標識、蛍光標識、酵素標識、磁気標識、またはスピン共鳴標識、またはこれらの組合せを含む、請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
ａ）１つ以上のカオトロープが、グアニジンチオシアネート、グアニジンイソシアネート、グアニジン塩酸塩、またはこれらの組合せを含み、
ｂ）１つ以上の界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、Ｎ−ラウロイルサルコシン、またはこれらの組合せを含み、
ｃ）１つ以上の還元剤が、２−メルカプトエタノール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、ジチオスレイトール、ジメチルスルホキシド、またはこれらの組合せを含み、
ｄ）１つ以上のキレート剤が、エチレングリコール四酢酸、ヒドロキシエチレンジアミン三酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン、エチレンジアミン四酢酸、無水クエン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸第二鉄アンモニウム、クエン酸リチウム、またはこれらの組合せを含み、または
ｅ）１つ以上のバッファーが、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、クエン酸、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、重炭酸塩、リン酸塩、またはこれらの組合せを含む、
請求項１から４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
ｇ）シリコーンポリマー、ポリソルベート、およびこれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の表面活性剤、
ｈ）メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、またはヘキサノール、およびこれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の短鎖アルカノール、ならびに
ｉ）シリコーンポリマー、ポリソルベート、およびこれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の消泡剤、ならびにこれらの組合せ
の１つ以上をさらに含む、請求項１から５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
ａ）６．０から７．０のｐＨに緩衝されている、
ｂ）ＲＮＡｓｅもしくはＤＮＡｓｅ活性を含まない、または
ｃ）ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、もしくはこれらの組合せを含む細菌、ウイルスもしくは真菌起源の単離ポリヌクレオチドの集団をさらに含む、
請求項１から６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
ａ）４Ｍのグアニジンチオシアネート、３０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．２５％（重量／体積）のドデシル硫酸ナトリウム、０．２５％（重量／体積）のＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、（ｖ）０．１Ｍの２−メルカプトエタノール、および０．１％の（重量／体積）シリコーンポリマー、
ｂ）３Ｍのグアニジンチオシアネート、１ｍＭのＴＣＥＰ、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５％のＮ−ラウロイルサルコシン、０．０００２％のシリコーンポリマー、１００ｍＭの２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール（ＴＲＩＳ）、および０．１ｍＭのＥＤＴＡ、
ｃ）１Ｍから４Ｍのグアニジンチオシアネート、０．５ｍＭから１０ｍＭのＴＣＥＰ、１ｍＭから１００ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．１％から１％のＳＤＳもしくはＮＬＳ、０．００１％から０．０００１％のシリコーンポリマー、１０ｍＭから５００ｍＭのＴＲＩＳ、０．１ｍＭから１ｍＭのＡＰＣＡ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＨＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＮＴＡ、もしくはクエン酸、および１０％から２５％のエタノール（体積／体積）、または
ｄ）３Ｍのグアニジンチオシアネート、１ｍＭのＴＣＥＰ、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５％のＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、０．０００２％のシリコーンポリマー、１００ｍＭのＴＲＩＳ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、および１０％から２５％のエタノール（体積／体積）
を含む、請求項１から７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
核酸の集団を、組成物を含む単一反応容器中に回収および保存する、請求項１から８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
サンプルが臨床、獣医学的、疫学的、環境、法医学的、もしくは病理学的起源の生物サンプルである、またはサンプルが、ウイルス、細菌、真菌、または哺乳動物起源の１つ以上のポリヌクレオチドを含有する、もしくは含有する疑いがある、請求項１から９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
単離、一本鎖核酸分子が配列：
【化１】
0005442105.tif 000026
からの少なくとも２０の隣接ヌクレオチドを含む、請求項１から１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
微生物、真菌またはウイルス感染の診断または療法において使用するための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
微生物感染、またはその１つ以上の症状を診断するための医薬品の製造における、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１４】
細菌、ウイルス、または真菌感染、またはその１つ以上の症状を診断するための、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
ａ）請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物、および
ｂ）微生物感染の診断において組成物を使用するための説明書
を含む、診断キットまたはサンプル回収システム。
【請求項１６】
生物サンプルからポリヌクレオチドの精製集団を入手する有効性を増大するのに十分な量および時間、請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離、一本鎖核酸分子を含む組成物と前記サンプルを接触させることを含む、ポリヌクレオチドの精製集団を、そのようなポリヌクレオチドを含有する疑いがある生物サンプルから入手する有効性を増大するための方法。
【請求項１７】
生物サンプル中のポリヌクレオチド集団の完全性またはポリヌクレオチドの１つの少なくとも第一配列の適合度が、前記サンプルを含む組成物を（ａ）７日から１４日の間、または（ｂ）１４日から３０日の間、１０℃から４０℃の温度で保存するときに、少なくとも保たれる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）サンプルを含む組成物を、回収時から内部のポリヌクレオチド集団を単離、精製、または特徴付けする時間まで、１０℃から４０℃の温度で保存する、または（ｂ）サンプルを含む組成物を７日から３０日の間１０℃から４０℃の温度で保存した後に、サンプル中に含有されるポリヌクレオチド集団の５％未満が分解される、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
サンプルを含む組成物を、（ａ）２４時間から９６時間の間１０℃から４０℃、または（ｂ）７日から３０日の間１０℃から３０℃の温度で保存する、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
精製サンプルから入手したポリヌクレオチド集団を分析または定量化するステップをさらに含む、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
定量化のステップが分子のＰＣＲサイクル閾値（ＣＴ）の決定を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
核酸を含有する疑いがある生物サンプルからポリヌクレオチド集団を入手する方法であって、サンプルを含む組成物を少なくとも７日から３０日の間１０℃から４０℃の温度で保存した後に、サンプル中に含有されるポリヌクレオチド集団の３０％未満が分解されるように、ポリヌクレオチド集団を安定化するのに十分な量で存在する、
１Ｍから４Ｍのグアニジンチオシアネート、
０．５ｍＭから１０ｍＭのＴＣＥＰ、
１ｍＭから１００ｍＭのクエン酸ナトリウム、
０．１％から１％のＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩
０．００１％から０．０１０％の１０％Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ａ（登録商標）溶液
１０ｍＭから５００ｍＭのＴｒｉｓ、
０．１ｍＭから１ｍＭのＥＤＴＡ、
１０％から２５％のエタノール（体積／体積）、および
配列
【化２】
0005442105.tif 000027
を有する核酸分子
を含む一定量の組成物を、サンプルと接触させることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、１つ以上の従来法またはアッセイを使用して後に単離、精製および／または特徴付けすることができる核酸の集団を含有する生物サンプルの回収、輸送、および保存のための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
分子分析および診断分析の分野では、核酸を首尾よく分析することができるかどうかは、遠隔位置、医院または研究室のいずれにおいて試料を得るかに関わらず、生物サンプル中の核酸（特に、ヒト患者から入手する診断サンプル中に含有される核酸）を安定状態に保つ能力によって決定されることが多い。生物サンプル中の核酸は、室温ですぐに分解および／または変性し、安定状態に保つために凍結温度下で一般に保存しなければならない。しかし、それでも、ある程度の分解が経時的に依然として起こる。この問題は、試料を遠隔位置、または医院もしくは研究室環境から相当な距離で回収するとき、特に、電源、または冷凍／凍結機器へのアクセスが信頼できないか、存在しないかのいずれかの場合など、サンプルを分析するまで持続的および一定の冷却／冷蔵／凍結状態へのアクセスが限られる、または存在しない可能性がある場合、拡大する。そこから核酸を入手することが望ましい生物試料の回収および処理に関する問題は、下流分析に望ましい核酸が、内因性または外因性ヌクレアーゼ活性による分解を特に受けやすいリボ核酸（ＲＮＡ）を含むとき、さらに悪化する。市販の試料輸送法は、回収地点から分析地点まで輸送するための生物サンプル用の特別な輸送媒体を使用することが多く、特に、サンプルを保存することができる時間に制約を課すパッケージングは、輸送または長期保存中でさえ低温での連続的なサンプル維持を必要とし、回収場所と診断研究室の間の考えられる時間および距離に実際制約を与える。
【０００３】
試料の安定性に関する懸念に加えて、回収サンプルの保存および輸送において使用する試薬の処理および／または保存に関するさらなる懸念がしばしば存在する。例えば、試薬自体は、安定状態を維持するために低温または他の特別なケアを必要とすることが多い。これらの安定性に関する問題のため、例えば、現場への試薬の輸送、使用前の現場での保存、および生物試料および試薬の試験場への再輸送は主たる懸念である。
【０００４】
生物試料を用いた作業時の別の重大な懸念は、試料から環境への生きた感染病原体または生物因子の考えられる接種、放出、または播種である。感染する可能性があるか、または他の場合健康上もしくは安全上のリスクをもたらす可能性があるサンプルの処理時に利用される、具体的なプロトコールが現在存在する。サンプルを生存状態および／または生物学的に完全な状態に維持して、試験用にその完全性を保つ場合、回収、移動、および試験プロセスに関与する個体は非常に危険な病原体に曝される恐れがある。さらに、病原体の放出が起こる場合、現場もしくはサンプル回収場所近辺（または輸送中近辺）の局外者が曝される可能性がある。結果として、必要とされる安全対策は、一箇所から別の箇所にこのようなサンプルを移動するのに必要とされる支出および尽力を典型的には増大する。
【０００５】
近年まで、病原体を検出するための臨床試験法は、具体的経験を有する高度に知識がある専門の科学者を必要とする、労働集約的で、高価な方法であった。大部分の臨床試験研究室は、ウイルス培養に３−７日、およびいくつか他の細菌標的にはさらに長期間を典型的に必要とする従来の培養法の使用を用いた。さらに、従来の培養は、例えば、エボラ、鳥類インフルエンザ、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）などのおそらく感染性がある生物因子の回収、輸送、ならびに研究室内での増殖および処理を必要とする。
【０００６】
臨床用分子診断の分野は８０年代半ばにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の出現と共に劇的に変化したが、しかしながら、その直後９０年代半ばにリアルタイムＰＣＲが出現した。例えば定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）または逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）および定量、リアルタイム、逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）アッセイを利用する核酸ベースの検出プラットホームは、従来の培養および単離法が何日間かを必要とするのに対して、何時間かのうちに結果をもたらすことができ、分子検出法を現代の研究室の診断分析の主流にすることができる。新たな改善されたレポーティング／クエンチングフルオロ、副溝結合剤（ＭＧＢ）（ＴａｑＭａｎ  ＭＧＢ（商標）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；一般的な参照に関しては、例えば、Ｂａｒａｌｄｉら、Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ、７５（２−３）：１８７−１９４頁、２００３年も参照）、および安定化増幅試薬などの検出用化学物質の近年の改善は、さらに感度が良く高度に特異的な核酸検出アッセイへの道を開き、従来の細胞培養ベースの方法よりタイムリー、確実、および経済的であることを証明した。転写仲介増幅、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、およびいわゆる「チップ上実験室」多重化アッセイなどの他の核酸検出戦略の進歩は、臨床研究室における培養バイアルからマイクロアレイへの移行にも貢献している。
【０００７】
いくつかの民間企業（例えば、Ｑｉａｇｅｎ［Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ］、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ［Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ］、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ［Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ］、およびｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ［Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ、ＵＳＡ］）は、サンプル単離から分子分析までの核酸抽出プロセスを自動化するための装置を開発している。例えば、Ｔｉｇｒｉｓ  ＤＴＳ（登録商標）（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）は検出プロセス全体を自動化し、２００４年後半には、Ｇｅｎ−ＰｒｏｂｅのＡＰＴＩＭＡ  ＣＯＭＢＯ−２（登録商標）増幅核酸試験（ＮＡＴ）アッセイを使用したクラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）とネイセリア・ゴノロエア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）の同時検出に関して、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂａｒａｌｄｉら、Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ、７５（２−３）：１８７−１９４頁、２００３年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
現代の検出およびアッセイシステムにおける高品質の核酸サンプルに関する要件を鑑みて、様々な生物サンプルおよび試料中に含有される核酸の完全性および質を維持する、安全で容易な回収、保存および輸送システムが当技術分野で現在必要とされている。さらに、回収試薬（複数可）、生物サンプル自体、またはその中に含有される核酸集団の冷凍、凍結、または他の特別処理なしで、長期間の周囲環境（すなわち、非理想的）条件下において、遠隔地または現場でサンプル（特に有害または病原体生物を含有するサンプル）を回収、保存、および輸送することも現在必要とされている。さらに、作業者または局外者が病原体に曝されるリスクを最小限にし、ワンステップ製剤の使用を可能にし、長距離または長時間にわたる、高適合度、高品質の核酸集団を含有する生物試料の好都合な周辺輸送を容易にする、安価で、より好都合な回収／輸送／保存媒体が現在必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、１つ以上の生物供給源から核酸を調製するための従来の回収、溶解、輸送および保存法を有利に改善することができる、新規で有用な組成物、ならびにそれらを作製および利用する方法を包含する。したがって、本発明は有利なことに、核酸を含有する生物試料を不活性化および溶解するため、および核酸の完全性が少なくとも実質的に維持される、および好ましくは全て維持されるように、核酸の一部分が分子学的診断分析に容易に利用可能であるように、生物試料内、好ましくは全て単一反応容器中に核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）を保存するための、回収および保存製剤を提供する。本発明の他の利点は、冷蔵または冷凍など持続的および一定冷却温度を必要とせずに、製剤が分離または放出された核酸を少なくとも実質的に安定状態に保つことができることである。
【００１１】
本明細書で開示するワンステップ製剤は、以下の主な機能、サンプル内の病原体の不活性化または殺滅、細胞の溶解および細胞からの核酸の分離または放出、サンプル中に存在する核酸の分解を予防するための内因性または外因性ヌクレアーゼおよび他の細胞酵素の不活性化、ならびに周囲温度でのサンプルの回収および処理の簡便化、サンプルのその後の輸送および保存中の核酸の安定化、処理サンプルの適合度をモニタリングするための内部陽性対照（ＩＰＣ）としても働くゲノム外、ナンセンスＲＮＡ担体分子の使用によるサンプル完全性の保持を実施する。
【００１２】
単一ステップ製剤において、好ましくは単一反応帯または反応容器においてこれら全ての望ましい機能を遂行できることは、現在利用可能な能力に優る特に顕著な利点である。現在存在する技術は、核酸を含有する生物要素の不活性化、細胞の溶解による核酸の放出、および核酸の分離または放出、遊離核酸集団の完全性の維持をもたらす単一ステップ組成物、および試料の適合度を定量化するのに好都合なＩＰＣを含まない。本発明は、診断試験用の試料中に存在する核酸を安定化し、それらの完全性を維持し、一方で容易に検出可能で、定量可能なＲＮＡ担体分子を利用する回収培地の適合度をモニタリングするのに好都合な方法も提供する。
【００１３】
本発明のワンステップ製剤は、好ましくは、核酸を含有する生物要素の同時不活性化、核酸の溶解および分離または放出、安定化、および保存を可能にする。一実施形態では、一部分または全ての不活性化、溶解および分離または放出、安定化、および保存が連続的である。好ましい実施形態では、しかしながら、大部分または好ましくは全てのこれらの機能が同時に生じる。全ての実施形態において、ワンステップ製剤をサンプルと組合せてこれらの機能を開始させる。これは、不活性化が必ずしも起こらず、溶解、安定化、および保存が一連の別個のステップで起こり、それぞれのステップが別々に加えられた１つ以上の異なる試薬およびプロトコールを典型的に使用する以前の技術とは対照的である。
【００１４】
誤差を最小にし、試薬の不適合性を回避し、結果の段階的制御をもたらすために、多数の連続ステップを必要とした従来の核酸単離法と異なり、本発明は、１つのワンステップ製剤において全てのこれらの利点を提供し、核酸の完全性を維持し、内部ナンセンスＲＮＡ担体分子の使用により保存／回収／輸送プロセスの適合度をモニタリングし、サンプル核酸の高い抽出効率と精製効率の両方を容易にし、およびそれらの最終収率を改善する、さらなる利点も加える。本発明のワンステップ製剤は、核酸を含有する生物要素の同時不活性化、細胞残骸からの核酸の溶解および放出、安定化、および溶解前、最中、または後に存在し得る生物サンプル中に含有される核酸集団の分解に関する可能性を低減する核酸の保存を容易にすることが好ましい。
【００１５】
開示する組成物は、１）臨床または環境試料からの高品質の核酸の調製を容易にし、２）生物サンプル中のおそらく感染性がある病原体を不活性化、殺滅、または他の場合は中和して、回収試料の安全な処理および輸送を容易にし、および３）放出された核酸の加水分解またはヌクレアーゼ分解なしで長期間、放出された（すなわち「裸状態の」）ＤＮＡ／ＲＮＡを安定化するように開発および最適化されている。本明細書に記載する組成物は、臨床、現場および開発用途、または高容量サンプルの回収／抽出に理想的である。１つ以上の開示する組成物において回収する試料は生物学的に不活性であり、典型的には冷蔵またはドライアイスなしでも安全に出荷することができる。
【００１６】
特定の実施形態では、核酸（例えば、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）の添加は、ａ）「担体」として（少量の補充ＲＮＡ／ＤＮＡの添加は、サンプル／試料、特に少量の標的、すなわち細胞、ウイルス、細菌を含有し得る原型試料の全体収率を増加／増大することが以前に示されている）、ｂ）下流分子プロセスのＩＰＣとして、および検出用サンプル回収からの核酸調製物の適合度を追跡またはモニタリングするための、およびｃ）下流定量分析、例えばｑＲＴ−ＰＣＲなどの「キャリブレーター」と比較するための、開示する方法の様々な目的および適用例に有益であると企図される。このような実施形態では、１つ以上の公知または「対照」核酸を、約１ａｇから約１ｍｇ、より好ましくは約１ｆｇから約１μｇ、およびより好ましくはさらに、約１ｐｇから約１ｎｇの最終濃度で組成物に加えることが可能である。
【００１７】
例示的な実施形態では、本発明は、（ａ）核酸を含有する疑いがある生物サンプルからのポリヌクレオチドの回収を容易にするための担体分子として、および／または（ｂ）試料回収およびポリヌクレオチド単離／安定化の完全性および適合度をモニタリングするためのＩＰＣ（すなわち、「公知」、「レポーター」、「対照」、「標準」、または「マーカー」）配列として有用である、単離単鎖（ｓｓ）または二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、またはこれらのハイブリッドを提供する。特定の実施形態では、本発明は、担体分子および／またはＩＰＣとして有用である、単離ｄｓ−ＲＮＡ、ｄｓ−ＤＮＡ、ｄｓ−ＰＮＡ、またはこれらのハイブリッドを提供する。他の実施形態では、本発明は、担体分子としておよび／またはＩＰＣ配列として有用である、単離ｓｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｓｓＰＮＡ、またはこれらのハイブリッドを提供する。例示的な実施形態では、本発明は、担体分子とＩＰＣ配列の両方として有用である、単離ｓｓＲＮＡ分子を提供する。
【００１８】
このような分子は、研究室内で調製した天然供給源、または代替的に、天然配列と非天然配列の両方を含有するハイブリッドから単離することができる。本明細書に記すように、本発明の組成物は、病原体起源のポリヌクレオチドを含有する疑いがある哺乳動物（特に、ヒト）供給源から得た生物試料を単離および特徴付けするのに特に有用であるので、担体および／または陽性対照化合物として利用する配列（複数可）は、哺乳動物のゲノム内、またはこのような哺乳動物に対して病原性がある生物のゲノム内で通常見られない一次ヌクレオチド配列を実質的に含有することが好ましい。例示的な哺乳動物には、非制限的に、ウシ、ヒツジ、ブタ、オオカミ、イヌ、ウマ、ネコ、クマ、ネズミ、ライオン、ウサギ、ヤギ、および非ヒト霊長類がある。
【００１９】
好ましくは、この非哺乳動物、非病原体特異的担体／レポーター配列は交差反応性がない、すなわち、実質的、または好ましくは、哺乳動物または病原体特異的配列とハイブリダイズせず、したがって非コード、非縮重（すなわちナンセンス）配列は、対照／担体配列と回収試料から得たポリヌクレオチドの単離集団のメンバーのハイブリダイゼーションを最小にするための、対照／担体配列の調節において特に好ましい。例示的な対照／担体配列は、したがって、実質的、または好ましくは、哺乳動物ゲノムから単離したポリヌクレオチドの集団と、または哺乳動物に対して病原性である細菌、真菌、ウイルスのゲノムから単離したポリヌクレオチドの集団と結合しない（例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下においてハイブリダイズしない）。当業者に知られている例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、非制限的に、（ａ）約５×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、および１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する溶液中での事前洗浄、（ｂ）一晩５×ＳＳＣ中での約６０℃から約７０℃の温度におけるハイブリダイゼーション、および（ｃ）０．１％のＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣのそれぞれを用いた２０分間約６５から約７０℃における後の洗浄、またはこれらと同等のハイブリダイゼーション条件がある。
【００２０】
任意の実長の担体分子を、本発明の組成物において、特に、本明細書で開示する製剤（例えば、ＰＳＳ製剤）において利用することはできるが、好ましくは、担体分子の長さは約４０から約９００ヌクレオチド長、より好ましくは約５０から約８００、または代替的に約６０から約７００ヌクレオチド長、さらにより好ましくは約７０から約６００、または代替的に、約８０から約５００ヌクレオチド長、およびさらにより好ましくはさらに、約９０から約４００ヌクレオチド、または代替的に、約１００から約３００などのヌクレオチド長である。
【００２１】
このように、全ての中間長のポリヌクレオチドは、約４５ヌクレオチド長、約５０ヌクレオチド長、約５５ヌクレオチド長、約６０ヌクレオチド長、約６５ヌクレオチド長、約７０ヌクレオチド長、約７５ヌクレオチド長、約８０ヌクレオチド長、約８５ヌクレオチド長、約９０ヌクレオチド長、約９５ヌクレオチド長、約１００ヌクレオチド長、約１２０ヌクレオチド長、約１４０ヌクレオチド長、約１６０ヌクレオチド長、約１８０ヌクレオチド長、約２００ヌクレオチド長、約２２０ヌクレオチド長、約２４０ヌクレオチド長、約２６０ヌクレオチド長、約２８０ヌクレオチド長、またはさらに約３００などのヌクレオチド長である担体分子配列を非制限的に含む、本開示の範囲の範疇にあると企図される。
【００２２】
任意の実用的、ナンセンス／最小限にクロスハイブリダイズしたポリヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチドの標的集団の改善単離を容易にするための担体配列の調製において有用であると企図されるが、対照配列が望ましい状況では、分子の一次核酸配列の追加的要件が課される、すなわち、配列は１つ以上の従来の分子生物学技法を使用して検出可能および／または定量可能でなければならない。
【００２３】
その目的のため、本発明は、分子標識プローブおよびそれらの誘導体を非制限的に含む、適切に検出可能なプローブと特異的にハイブリダイズする（すなわち結合する）少なくとも第一の配列ドメインを含有する担体／レポーター分子を提供する。例示的な標識プローブは、分子技術分野の当業者に知られている、放射性、発光、化学発光、蛍光、酵素、磁気、またはスピン共鳴標識を含むプローブである。例示的な実施形態では、標識プローブは少なくとも第一の副溝結合剤を含有する。特定の実施形態では、従来の検出可能な標識プローブの結合を容易にするために、本発明の担体／レポーター分子は、少なくとも第一の検出可能なプローブと特異的に結合する、約１０から約６０ヌクレオチド長の少なくとも第一の配列ドメインを含有する。
【００２４】
第一の配列ドメインは担体配列全体内の任意の実長であってよいが、好ましくは、第一の配列ドメインは、約１２から約５０ヌクレオチド長、より好ましくは、約１４から約４５ヌクレオチド長、さらにより好ましくは約１６から約４０などのヌクレオチド長、およびさらにより好ましくはさらに、約１８から約３０などのヌクレオチド長である。
【００２５】
このように、全ての中間長のプローブハイブリダイズ配列ドメインは、約１３ヌクレオチド長、約１４ヌクレオチド長、約１５ヌクレオチド長、約１６ヌクレオチド長、約１７ヌクレオチド長、約１８ヌクレオチド長、約１９ヌクレオチド長、約２０ヌクレオチド長、約２１ヌクレオチド長、約２２ヌクレオチド長、約２３ヌクレオチド長、約２４ヌクレオチド長、約２５ヌクレオチド長、約２６ヌクレオチド長、約２７ヌクレオチド長、約２８ヌクレオチド長、またはさらに約２９または３０などのヌクレオチド長であるプローブ結合ドメインを非制限的に含む、本開示の範囲の範疇にあると企図される。
【００２６】
担体／レポーター配列が１つ以上の増幅ベースの方法（ＰＣＲベースの方法を非制限的に含む）によって検出可能であることが望まれる場合、担体／レポーター配列に関する他の分子特性が望まれる、すなわち、配列、またはその少なくとも一部分が、１つ以上のポリメラーゼ連鎖反応ベースのアッセイを使用して増幅可能であることが望まれる。ＰＣＲまたはＦＲＥＴベースの方法に関しては、例えば、担体／レポーター分子が、フォワードＰＣＲ増幅プライマー（典型的には約２０から約４０ヌクレオチド長）と特異的に結合する少なくとも第二の配列ドメイン、およびリバースＰＣＲ増幅プライマー（これも典型的には約２０から約４０ヌクレオチド長）と特異的に結合する第三の配列ドメインを含有することが望まれる。第二の配列ドメインと第三の配列ドメインが操作可能に位置して、少なくとも第一部分を増幅するのに有効な条件下でフォワードおよびリバースプライマーからの核酸セグメントの少なくとも第一部分のＰＣＲ定方向増幅を容易にすることが好ましい。
【００２７】
担体／レポーター配列が１つ以上の非対称増幅ベースの方法（不斉ＰＣＲ、分子ハイブリダイゼーション、親和性−標識ベースの方法などを非制限的に含む）によって検出可能であることが望まれる場合、一対のフォワードプライマーとリバースプライマーの結合ドメインが必要とされることは必須ではなく、ただ１つの第二の配列ドメインが適切な診断アッセイを使用して担体配列を検出するのに十分であり得る。このような実施形態では、１つの検出／複製プライマー（またはポリメラーゼ結合ドメイン）を利用することができる。典型的には、このような配列ドメインは約１５から約３５などのヌクレオチド長であるが、従来の分析法を使用して任意の従来の標的ドメインを利用することができる。このようなドメインの設計および一次配列は分子技術分野では一般的であると考えられ、このように、当業者の技術範囲内にある。
【００２８】
ＩＰＣ配列の長さおよび一次ヌクレオチドに応じて、特定の実施形態では、第一の配列ドメインは、第二、第三、またはさらに第二配列ドメインと第三配列ドメインの両方と、少なくとも第一の共通ヌクレオチド配列領域を共有する。このような配列の重複部分は１つ以上のヌクレオチドのみ、または代替的に、５から１０個以上のヌクレオチドからなる重複部分の大領域であってよい。
【００２９】
例示的な実施形態では、ＩＰＣ配列は、１つ以上の適切な分子生物学の技法によって、例えば、対照の配列を含む、または代替的に、対照自体の配列と相補的である核酸配列を含むポリヌクレオチドのインビトロ転写を含めた技法によって調製することができる。以下の実施例中に記載するように、対照配列を調製する１つの方法は、そこから一本鎖ＲＮＡ対照配列を合成することができるＤＮＡデュプレックスの調製を含む。
【００３０】
例示的な一本鎖ＲＮＡ対照配列には、ＲＮＡ配列：
【００３１】
【化１】
0005442105.tif 000002
由来の少なくとも約１０５、少なくとも約９５、少なくとも約８５、少なくとも約７５、少なくとも約６５、少なくとも約５５、少なくとも約４５、少なくとも約３５、または少なくとも約２５などの隣接ヌクレオチドを含有する配列があるが、これらだけには限られない。例示的な実施形態では、単離一本鎖リボ核酸分子を、配列番号２の核酸配列を含む、この配列から本質的になる、または代替的に、この配列からなるポリヌクレオチドのインビトロ転写を含む方法によって調製する。
【００３２】
このような一実施形態では、一本鎖ＲＮＡ対照配列は、配列：
【００３３】
【化２】
0005442105.tif 000003
0005442105.tif 000004
由来の少なくとも約９０、少なくとも約８０、少なくとも約７０、少なくとも約６０、少なくとも約５０、少なくとも約４０、少なくとも約３０、または少なくとも約２０以下の隣接ヌクレオチドを含有するＤＮＡ配列からインビトロで合成することができる。例示的な実施形態では、単離一本鎖リボ核酸分子を、配列番号１の核酸配列を含む、この配列から本質的になる、または代替的に、この配列からなるポリヌクレオチドのインビトロ転写を含む方法によって調製する。
【００３４】
本発明の一態様では、ＰＳＳ製剤を非制限的に含む本明細書に記載する１つ以上の製剤を非制限的に含む、開示するサンプル回収／保存製剤を使用して調製した生物サンプルから得た複数のポリヌクレオチド内の、ＲＮＡ担体分子の有無を検出するための方法を提供する。サンプル内のＲＮＡ担体分子の量を定量化し、単離ポリヌクレオチドの分子適合度を安定化および保護する際の製剤の有効度をモニタリングするための方法もある。一定時間経過後サンプル中に残存する担体分子の量と、開始溶液中に存在する既知量の担体分子の量を比較することによって、生物サンプル中に存在する間に担体分子が経た分解の量を決定することができる。原型サンプルから遊離したポリヌクレオチド集団中で経時的に起こった分解度の推定値として、この関係を使用することができる。
【００３５】
他の態様では、本発明は、ＩＰＣ配列の配列などの特定のポリヌクレオチド配列を、生物サンプル中で迅速に検出するための方法を提供する。全体的および一般的な意味で、この方法は、ＰＣＲ、ならびに標的配列に特異的であるフォワードおよびリバースプライマー、特異的プローブセットと生成する一本鎖ＰＣＲ産物のハイブリダイゼーション、融解曲線分析の実施、および一本鎖ＰＣＲ産物とハイブリダイゼーションプローブのハイブリッドのＴｍ変化の分析などの従来法を使用した、特定配列を含有する疑いがあるヌクレオチド集団の増幅を含む。
【００３６】
一実施形態では、本発明は、ＰＣＲベースの方法を使用して（担体ＩＰＣ配列などの）ポリヌクレオチドの存在を迅速に検出するための方法を提供し、この方法は一般に、（ａ）分析するサンプルからポリヌクレオチドを単離するステップ、（ｂ）標的配列に特異的であるプライマーセットを使用してＰＣＲによりポリヌクレオチドを増幅するステップ、（ｃ）対象のポリヌクレオチドに特異的である１つ以上の標識プローブと、ステップ（ｂ）から得た一本鎖ＰＣＲ産物をハイブリダイズさせるステップ、および（ｄ）単離ポリヌクレオチドの集団内の特異的標的配列の存在を示す、サンプル中の標識プローブの存在を検出するステップを含む。
【００３７】
標識「プローブ」配列を使用してポリヌクレオチドを検出するための１つのこのような方法は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のプロセスを利用する。例示的なＦＲＥＴ検出法は、ドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォアを含むフルオロフォア対に関することが多く、この場合ドナーフルオロフォアは、アクセプターフルオロフォアに共鳴エネルギーを移動することができる。例示的なＦＲＥＴアッセイでは、ドナーフルオロフォアの吸収スペクトルはアクセプターフルオロフォアの吸収スペクトルと実質的に重複しない。本明細書で使用する「ドナーオリゴヌクレオチドプローブ」は、蛍光共鳴エネルギー移動対のドナーフルオロフォアで標識されるオリゴヌクレオチドを指す。本明細書で使用する「アクセプターオリゴヌクレオチドプローブ」は、蛍光共鳴エネルギー移動対のアクセプターフルオロフォアで標識されるオリゴヌクレオチドを指す。本明細書で使用する「ＦＲＥＴオリゴヌクレオチド対」は、「アンカー」または「ドナー」オリゴヌクレオチドプローブおよび「アクセプター」または「センサー」オリゴヌクレオチドプローブを典型的に含み、ドナーオリゴヌクレオチドプローブとアクセプターオリゴヌクレオチドプローブがいずれもそれらの相補標的核酸配列とハイブリダイズするとき、このような対はＦＲＥＴ関係を形成する。蛍光共鳴エネルギー移動対として使用するのに許容されるフルオロフォア対は当業者に知られており、フルオレセイン／ローダミン、フィコエリスリン／Ｃｙ７、フルオレセイン／Ｃｙ５、フルオレセイン／Ｃｙ５．５、フルオレセイン／ＬＣＲｅｄ６４０、およびフルオレセイン／ＬＣＲｅｄ７０５などだけには限られないが、これらを含む。
【００３８】
特定ＩＰＣ配列の増幅において有用なプライマーは、例えばＯＬＩＧＯ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  Ｉｎｃ．、Ｃａｓｃａｄｅ、ＣＯ、ＵＳＡ）などのコンピュータプログラムを使用して設計することができる。典型的には、オリゴヌクレオチドプライマーは約１０から約６０などのヌクレオチド長であるが（全ての間の整数、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９を非制限的に含む、またはさらに６０以上のヌクレオチド長）、任意の実長のプライマーが本発明を実施する際に有用であり得る。
【００３９】
本発明は、ポリヌクレオチドを含有する疑いがある生物サンプルからこのようなポリヌクレオチドの精製集団を入手する有効性を増大するための方法も提供する。全体的および一般的な意味で、この方法は、生物サンプルからポリヌクレオチドの精製集団を入手する有効性を増大するのに十分な量および時間、（ＰＳＳ製剤を非制限的に含めた）本明細書に記載する１つ以上の製剤、ならびに担体および／またはＩＰＣ核酸セグメントを含む組成物とサンプルを接触させることを含む。
【００４０】
例示的な実施形態では、サンプルを含む組成物を約７日から約１４日以上の間約−２０℃から約４０℃の温度で、あるいは約７日から約１４日以上の間約−２０℃から約４０℃の温度で、またはあるいは約１４日から約３０日以上の間約２０℃から約４０℃の温度で保存するとき、生物サンプル中のポリヌクレオチド集団の完全性、および／またはサンプルから得たポリヌクレオチドの少なくとも１つの少なくとも第一配列の適合度は、少なくとも実質的に保たれる（すなわち、集団内の少なくとも７５％のヌクレオチドが実質的に完全長である）。
【００４１】
あるいは、生物サンプル中のポリヌクレオチド集団の完全性は、サンプルを最初に回収したとき溶液中に存在した量と比較したとき、集団内の少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％以上のヌクレオチドが溶液中に存在するように、少なくとも実質的に保たれる。好ましい実施形態では、サンプルの完全性は、初期サンプル中に存在した全ての、またはほぼ全てのポリヌクレオチドが経時的に保たれる（すなわち、検出可能なほど分解されない）ように実質的に保たれる。
【００４２】
開示する方法を実施する際に、回収時から内部のポリヌクレオチド集団を単離、精製、または特徴付けする時間まで、回収サンプル中に本来存在した約２０％未満のポリヌクレオチド集団が、後の保存中に経時的に分解することが好ましい。好ましくは、回収サンプル中に本来存在した実質的に約１５％未満のポリヌクレオチド集団が後の保存中に経時的に分解され、より好ましくは、回収サンプル中に本来存在した約１０％未満のポリヌクレオチド集団が後の保存中に経時的に分解され、およびより好ましくはさらに、回収サンプル中に本来存在した約５％未満のポリヌクレオチド集団が後の保存中に経時的に分解される。特に好ましい実施形態では、回収サンプル中に本来存在した約５％、約４％、約３％、約２％または約１％を超えないポリヌクレオチド集団が後の保存中に経時的に分解される。サンプル品質のこのような高い完全性の保持は、サンプルを保存する条件とは無関係に好ましく、少なくとも約７日、少なくとも約１４日、少なくとも約２１日、少なくとも約３０日、少なくとも約４５日、少なくとも約６０日、またはさらに少なくとも約９０日以上の時間の間、実質的に保たれる。
【００４３】
そこから１つ以上の核酸集団を得ることができる生物起源のサンプルを回収、保存、および／または輸送するための開示する方法は、（ａ）サンプルから得た１つ以上のポリヌクレオチドを分析および／または定量化するステップ、（ｂ）回収サンプル中の担体分子（すなわちＩＰＣ）の存在を検出するステップ、（ｃ）回収サンプル中のＩＰＣの量を定量化するステップ、および／または（ｄ）回収サンプル中のＩＰＣの配列適合度を測定する、またはその分解度を決定するステップを非制限的に含む、１つ以上のステップも任意にさらに含むことができる。
【００４４】
本発明の実施で得られる、または利用される個々のポリヌクレオチド配列の存在、完全性、または配列適合度は、分子技術分野の当業者に知られている任意の従来法を使用して決定することができるが、一実施形態ではＰＣＲ増幅を利用する。同様に、対象ポリヌクレオチドの完全性の決定は所与の条件下でのＰＣＲサイクル閾値（ＣＴ）の決定を含むことができ、回収した核酸の配列適合度、品質完全性の決定は、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔの化学ベースの方法、Ｓａｎｇｅｒらのジデオキシ鎖末端法、Ｍａｔｈｉｅｓらの色素フルオロフォアベースの方法、またはＮｙｒｅｎ  ａｎｄ  Ｒｏｎａｇｈｉによって記載されたピロシークエンシング技法を非制限的に含めた、従来のＤＮＡまたはＲＮＡ配列決定法によって決定することができる。
【００４５】
本発明の例示的な製剤は、後のＲＮＡおよび／またはＤＮＡ単離、検出、定量化、増幅、および／または分析用の生物サンプルから調製した核酸を溶解する、安定化する、およびそれらの完全性を保つワンステップ回収溶液を含む。特定の実施形態では、本発明のナンセンス、担体／ＩＰＣ組成物を、ａ）１つ以上のカオトロープ（組成物中にそれぞれ約０．５Ｍから約６Ｍの量で存在することが好ましい）、ｂ）１つ以上の界面活性剤（組成物中にそれぞれ約０．１％から約１％の量で存在することが好ましい）、ｃ）１つ以上のキレート剤（組成物中にそれぞれ約０．０１ｍＭから約１ｍＭの量で存在することが好ましい）、ｄ）１つ以上の還元剤（組成物中にそれぞれ約０．０５Ｍから約０．３Ｍの量で存在することが好ましい）、およびｅ）１つ以上の消泡剤（組成物中にそれぞれ約０．０００１％から約０．３％の量で存在することが好ましい）を含む、ワンステップサンプル回収／保存／輸送媒体で製剤化する。
【００４６】
例示的なカオトロープには、非制限的に、グアニジンチオシアネート（ＧｕＳＣＮ）、グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）、グアニジンイソシアネート、カリウムチオシアネート（ＫＳＣＮ）、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、尿素、またはこれらの任意の組合せがある。他の例示的なカオトロープおよびカオトロープ塩の記載は、（その明確な参照によりその全容を具体的に本明細書に組み込む）米国特許第５，２３４，８０９号中で見ることができる。
【００４７】
例示的な界面活性剤には、非制限的に、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）、タウロデオキシコール酸ナトリウム（ＮａＴＤＣ）、タウロコール酸ナトリウム（ＮａＴＣ）、グリココール酸ナトリウム（ＮａＧＣ）、デオキシコール酸ナトリウム（ＮａＤＣ）、コール酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＮａＡＢＳ）、Ｎ−ラウロイルサルコシン（ΝＬＳ）、カルボン酸の塩（すなわち石鹸）、スルホン酸の塩、硫酸の塩、リン酸およびポリリン酸エステル、アルキルホスフェート、モノアルキルホスフェート（ＭＡＰ）、およびペルフルオロカルボン酸の塩、（その明確な参照によりその全容を具体的に本明細書に組み込む）米国特許第５，６９１，２９９号中に記載される界面活性剤を含めたアニオン性界面活性剤、またはこれらの任意の組合せがある。
【００４８】
例示的な還元剤には、非制限的に、２−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、またはこれらの任意の組合せがある。好ましい実施形態では、還元剤はＴＣＥＰを含む、またはＴＣＥＰである。
【００４９】
例示的なキレート剤には、非制限的に、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ヒドロキシエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン（ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、無水クエン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸カリウム、クエン酸マグネシウム、クエン酸第二鉄アンモニウム、クエン酸リチウム、またはこれらの任意の組合せがある。好ましい実施形態では、キレート剤はＥＤＴＡ、クエン酸、またはこれらの組合せを含む。より好ましい実施形態では、キレート剤はＥＤＴを含む。
【００５０】
本発明の組成物は、製剤中の界面活性剤の存在に典型的に起因する泡の形成を予防するために、消泡剤をさらに含むことができる。消泡剤は、開示する組成物のピペット操作および処理を容易にする。例示的な表面活性剤／消泡剤には、非制限的に、コカミドプロピルヒドロキシサルタイン、アルキルアミンプロピオン酸、イミダゾリンカルボン酸、ベタイン、スルホベタイン、サルタイン、アルキルフェノールエトキシレート、アルコールエトキシレート、ポリオキシエチレン化ポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化メルカプタン、長鎖カルボン酸エステル、アルカノールアミド、第三級アセチレングリコール、ポリオキシエチレン化シリコーン、Ｎ−アルキルピロリドン、アルキルポリグリコシダーゼ、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ａ（登録商標）などのシリコーンポリマー、またはＴｗｅｅｎ（登録商標）などのポリソルベート、またはこれらの任意の組合せがある。好ましい実施形態では、消泡剤はシリコーンポリマーを含む。
【００５１】
必要に応じて、本発明の組成物は、１つ以上のバッファーをさらに含むことができる（最終組成物中にそれぞれ約１ｍＭから約１Ｍの量で存在することが好ましい）。例示的なバッファーには、非制限的に、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、クエン酸、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−ｌ−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−Ν，Ν＼’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ−２−アセトアミド−２−イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、重炭酸塩、リン酸塩、またはこれらの任意の組合せがある。好ましい実施形態では、バッファーはクエン酸を含む。
【００５２】
核酸抽出は約５から７のｐＨ範囲で最適であることが分かっているので、１つ以上のこのような任意であるが、好ましいバッファーの封入は製剤のｐＨを調節するのに望ましい。約６のｐＨから約８のｐＨの範囲、より好ましくは約６から約７のｐＨ範囲内、およびより好ましくはさらに、約６．２から約６．８のｐＨ範囲内で、開示する組成物において利用する１つ以上のバッファーを選択して有意な緩衝能力を与えることが好ましい。例示的な実施形態では、（本明細書で「ＰＳＳ」とも呼ぶ）ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（商標）溶液のｐＨは約６．９±０．２５であることが好ましい。
【００５３】
本発明の組成物は、１つ以上の短鎖（好ましくは１から６炭素の［すなわちＣ１−Ｃ６］アルコール）アルカノールも任意にさらに含むことができる（組成物中にそれぞれ約１％から約２５％の量で存在することが好ましいが、高い割合のアルコールを望む場合利用することができる）。例示的な短鎖アルカノールには、非制限的に、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、またはこれらの任意の組合せなどの、直鎖状および分岐状アルコールがある。
【００５４】
本発明の組成物は、（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン、コカミドプロピルベタインなどを非制限的に含めた）ベタインなどのカチオン官能性双性イオン性化合物、（ウシ、ウマ、またはヒト起源のオボアルブミン、および血清アルブミンを非制限的に含めた）アルブミノイド、および（トリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）、ジメチルスルホニオプロピオネート、サルコシン、およびトレハロース、マルトース、ラムノース、スクロース、アラビノース、フコース、マンニトール、ソルビトール、アドニトールなどを非制限的に含めた糖類または糖アルコールを非制限的に含めた）オスモライトを非制限的に含めた、１つ以上の他の化合物もしくは試薬も任意にさらに含むことができる。
【００５５】
本発明の組成物は、サンプルから得たポリヌクレオチドの集団を適切に安定化するのに十分な緩衝能力を与えることが好ましく、本明細書に記載する保存／回収用製剤とサンプルを接触させるとき、製剤化中に約６．４から６．９のｐＨに緩衝剤で処理し、類似したｐＨ範囲にポリヌクレオチドの単離集団を維持することが最も好ましい。
【００５６】
本発明の組成物は、典型的には、後のインビトロまたはインビボ分析用のサンプルの回収、溶解、保存、および輸送中に、サンプルの核酸がいかなる分解も実質的に含まない、好ましくは分解しない、または完全性を失わないように、サンプル中に存在する任意の内因性または外因性ＲＮＡｓｅｓもしくはＤＮＡｓｅを少なくとも実質的に不活性化し、好ましくは完全に不活性化する。
【００５７】
本発明の保存／輸送／回収組成物の例示的な製剤は本明細書の実施例中に記載し、約４Ｍのカオトロープ（グアニジンチオシアネート、グアニジン塩酸塩、グアニジンイソシアネート、またはこれらの任意の組合せなど）、約１０ｍＭから３０ｍＭのキレート剤（ＥＧＴＡ、ＨＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＮＴＡ、ＥＤＴＡ、無水クエン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸第二鉄アンモニウム、クエン酸リチウム、またはこれらの任意の組合せなど）、約０．２５％の界面活性剤（ＳＤＳ、ＬＤＳ、ＮａＴＤＣ、ＮａＴＣ、ＮａＧＣ、ＮａＤＣ、コール酸ナトリウム、ＮａＡＢＳ、ＮＬＳ、またはこれらの任意の塩もしくは組合せなど）、約０．１Ｍの還元剤（β−ＭＥ、ＤＴＴ、ＤＭＳＯ、ホルムアミド、ＴＣＥＰ、またはこれらの任意の組合せなど）、および約０．１％の表面活性剤／消泡剤（シリコーンポリマー［例えばＡｎｔｉｆｏａｍ  Ａ（登録商標）］またはポリソルベート［例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）］、またはこれらの任意の組合せなど）を含む組成物を非制限的に含む。
【００５８】
本発明の試料回収組成物の他の例示的な製剤は、約３Ｍのカオトロープ（グアニジンチオシアネート、グアニジン塩酸塩、グアニジンイソシアネート、またはこれらの任意の組合せなど）、約１ｍＭから０．５Ｍの還元剤（例えばβ−ＭＥ、ＴＣＥＰ、ホルムアミド、ＤＴＴ、ＤＭＳＯ、またはこれらの任意の組合せなど）、約１ｍＭから約１０ｍＭのキレート剤（例えばＥＧＴＡ、ＨＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＮＴＡ、ＥＤＴＡ、無水クエン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸第二鉄アンモニウム、クエン酸リチウム、またはこれらの任意の組合せなど）、約０．２５％の界面活性剤（ＳＤＳ、ＬＤＳ、ＮａＴＤＣ、ＮａＴＣ、ＮａＧＣ、ＮａＤＣ、コール酸ナトリウム、ＮａＡＢＳ、ＮＬＳ、またはこれらの任意の塩もしくは組合せなど）、および任意に、ただし好ましくは約０．０００２％の消泡剤（抗泡剤とも呼ぶ）（シリコーンポリマーまたはポリソルベート、またはこれらの任意の組合せなど）、および約１００ｍＭのバッファー（Ｔｒｉｓ、ＭＥＳ、ＢＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、重炭酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、またはこれらの任意の組合せなど）を含む組成物を非制限的に含む。
【００５９】
開示するポリヌクレオチド単離および安定化組成物の別の例示的な製剤は、グアニジンチオシアネート、グアニジン塩酸塩、またはグアニジンイソシアネートなどの約１から約４Ｍのカオトロープ剤、ＥＤＴＡ、またはクエン酸ナトリウム、または両方などの約０．５から１００ｍＭのキレート剤、ＳＤＳまたはＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩などの約０．１から約１％のアニオン性界面活性剤、シリコーンポリマー、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ａ（登録商標）などの約０．００１から約０．０００１％の表面活性剤もしくは湿潤剤、ｅ）；Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなどの約１０から約５００ｍＭの緩衝剤、およびエタノールなどの約１０から約２５％の短鎖アルカノールを含む組成物を非制限的に含む。
【００６０】
特定の実施形態では、本発明は、約２．５Ｍのグアニジンチオシアネート、約０．５ｍＭのＴＣＥＰ、約１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、約０．４％のＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、約０．０００２％の抗泡剤Ａ、約１０ＯｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、約０．１ｍＭのＥＤＴＡ、および約２３％エタノールを含む組成物を提供する。
【００６１】
本発明は、核酸を含有する疑いがあるサンプルから、ポリヌクレオチドの集団を得るための方法も提供する。この方法は一般に、サンプルからポリヌクレオチド集団を得るのに有効な条件下で、一定量の開示する一組成物とサンプルを結合させることを含む。本発明はサンプルを「得る」ための集団の分離を必要としない。後の診断がこのような分離を必要とし得る、または必要とし得ないからである。
【００６２】
本発明は、ＲΝＡおよび／またはＤΝＡなどの核酸の回収用の、本明細書に記載する回収／溶解／輸送／保存組成物のワンステップ水性製剤を調製する方法も提供する。全体的な意味で、この方法は一般に、反応帯中で約２０℃から９０℃の温度において１つ以上のカオトロープとヌクレアーゼを含まない水を組合せること、次いで反応帯中で溶解した１つ以上のカオトロープと、１つ以上の還元剤、１つ以上のキレート剤、および１つ以上の界面活性剤を組合せて中間体組成物を形成すること、ワンステップ水性製剤のさらなる調製中の泡形成を最小にするのに十分な量で、シリコーンポリマーと中間体組成物を任意に組合せること、十分な量のバッファーと中間体組成物を組合せて約６から６．９のｐＨを維持すること、第二のキレート剤と反応帯を任意に組合せること、次いで約１から３０分間で約６０℃から９５℃の温度まで第二の中間体組成物の温度を上げ、周囲条件まで温度を下げること、Ｃ１−Ｃ６アルコールと反応帯の含有物を任意に次いで組合せること、および約６．４から６．９にｐＨを任意に調節することを含む。
【００６３】
別の実施形態では、本発明は、核酸を含有する疑いがある生物サンプルまたは試料からのポリヌクレオチド集団の入手に適合させた、ワンステップ水性製剤を調製するための方法を提供する。この方法は一般に、
ａ）ｉ）サンプル中のおそらく感染性がある病原体を少なくとも実質的に殺滅または不活性化する
ｉｉ）細胞の一部分を少なくとも溶かしてサンプルからＲＮＡおよび／またはＤＮＡを放出する、および
ｉｉｉ）サンプル中に放出されたポリヌクレオチドをさらなる加水分解または酵素分解、修飾、または不活性化から少なくとも実質的に阻害または予防して、サンプルからポリヌクレオチド集団を得る
のに有効な量のワンステップ水性製剤とサンプルを接触させるステップを少なくとも含む。
【００６４】
本発明の方法は、このような組成物と接触するサンプル内に含有される核酸の実質的劣化、分解、酵素による切断、および／または核酸分解による消化、修飾、またはプロセシングを引き起こさずに、少なくとも２４時間の時間期間、より好ましくは少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間以上の時間期間、０℃から約４０℃の温度（より好ましくは４℃から約３５℃の温度、およびさらにより好ましくは１０℃から約３０℃の温度）で、一定量の１つ以上の開示する組成物とサンプルを接触させることを少なくとも含むことが好ましい。
【００６５】
特定の実施形態では、本発明の方法は、このように処理するサンプル内に含有される核酸の実質的劣化、分解、酵素による切断、および／または核酸分解によるプロセシングを引き起こさずに、少なくとも７日間の時間期間、より好ましくは少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日以上の時間期間、約０℃から約４０℃の温度（より好ましくは約４℃から約３５℃の温度、さらにより好ましくは約１０℃から約３０℃の温度、およびより好ましくはさらに約１５℃から約２５℃の温度）で、一定量の１つ以上の開示する組成物とサンプルを接触させることを少なくとも含む。サンプルと本発明の組成物の接触は短時間で行うことのみが必要であるが、サンプルおよび本発明のワンステップ組成物からの核酸の即時分離の必要性を回避し、全ての物質は核酸の任意の実質的、または任意の分解なしで前に示した時間接触状態であり得ることは理解されるはずである。サンプルを含む組成物を周囲温度で、および約１０日間を超える、約２０日間を超える、またはさらに約３０日間を超える、またはそれより長い保存を非制限的に含めてさらに長期間保存するときでさえ、サンプルから組成物中に放出されるポリヌクレオチド集団の完全性は実質的に保たれることが好ましい。同様に、サンプルを含む組成物を亜熱帯および熱帯温度で、さらに約５日間以上、約１０日間以上、約１５日間以上、またはさらに約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約６０、または約９０日間以上、またはさらにそれより長い保存を非制限的に含めて長期間保存するときでさえ、サンプルから組成物中に放出されるポリヌクレオチド集団の完全性は実質的に保たれることが望ましい。
【００６６】
本発明の方法を実施する際に、サンプル内に含有される少なくとも１つ以上の生物細胞を実質的に溶かし、組成物中にこのような細胞内に含有される少なくとも第一の集団または第一の複数のポリヌクレオチドを放出することが好ましい。開示する組成物の構成要素は、全てまたは実質的に全ての残存細胞／組織および／またはサンプル残骸から、このような集団を放出するのに十分であることが好ましい（脂質、リン脂質、ペプチド、タンパク質、多糖、リポ多糖、ポリオール、細胞オルガネラ、膜構成要素などを非制限的に含む）。
【００６７】
本発明の方法を実施する際に、サンプル自体の中、上、または周辺に存在し得る少なくとも１つ以上の外因性または内因性ヌクレアーゼが、サンプル内に含有される生物細胞が実質的に溶けて細胞からポリヌクレオチドの集団が放出されるときに、生成する核酸が破壊、損傷、または核酸分解によって切断されないように、組成物の１つ以上の構成要素によって十分に不活性化されることも望ましい。開示する組成物の１つ以上の構成要素は、このようなタンパク質がサンプル中に存在するとき、ＤＮＡｓｅまたはＲＮＡｓｅの生物活性を殺滅、不活性化、または実質的に阻害するのに有効であることが好ましい。
【００６８】
本発明の方法を実施する際、対象の１つ以上の微生物、ウイルス、真菌、および／または他の病原体もしくは生物が回収時にサンプル中、上、または周辺に存在するとき、このような対象の微生物、ウイルス、真菌、および／または他の病原体もしくは生物は、組成物との接触によって、溶解、十分に不活性化、または実質的に殺滅され、これによって実践者によるサンプルの安全な処理が容易になることも望ましい。開示する組成物の１つ以上の構成要素は、組成物への別の構成要素の添加を必要とせずに、病原性サンプルを実質的または好ましくは完全に、非病原性にするのに有効であることが好ましい。しかしながら、特定の適用例では、１つ以上の別の抗菌、抗ウイルス、または抗真菌剤を組成物に封入して、それらを実質的に非病原性にする、したがって実践者による処理に安全にすることが望ましい可能性もある。
【００６９】
サンプルを含有する組成物は、試料またはサンプルを実質的に回収した時間から、そのサンプル内からの少なくとも第一のポリヌクレオチド集団を分析または特徴付けする時間まで、周囲、ほぼ周囲、またはさらに低温もしくは高温状態において少なくとも実質的に（または完全に）組成物中のサンプルを保存することができるほど、少なくとも十分に安定状態であることが好ましい。本明細書で使用する「周囲温度」は、約１８℃から２５℃の温度、またはいくつかの実施形態では、より好ましくは約２０℃から約２２℃を指すことができる。
【００７０】
特定の実施形態では、サンプルを含有する組成物を、１つ以上の従来の分子生物学の方法を使用して、少なくとも実質的に回収時からサンプルから得たポリヌクレオチドをさらに単離、精製、または特徴付けする時間まで、約０℃から約４０℃の温度、より好ましくは約４℃から約３０℃の温度、より好ましくは約１０℃から約２５℃の温度で保存することができる。
【００７１】
特定の実施形態では、核酸を含有する疑いがあるサンプルを含有する組成物は、周囲、冷蔵、またはゼロ℃未満の温度で組成物を長期保存したときでさえ核酸が少なくとも実質的に非分解状態である（すなわち、少なくとも実質的に安定状態である）程度まで、核酸を安定状態にする。この安定性によって、保存サンプル内に含有される少なくとも約７０％、少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、またはさらにより好ましくは、少なくとも約９８％のポリヌクレオチドが、サンプルの長期保存によって分解しないことが望ましい。特定の実施形態では、サンプル内に含有される実質的に全てのポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの本来の完全性が処理サンプルの回収、溶解、保存、および輸送中に保たれるように安定状態である。
【００７２】
特定の実施形態では、方法は、サンプルを組成物中に最初に導入した後少なくとも２４、４８、７２、または９６時間以上の間−２０℃から約４０℃の温度における組成物での保存後、その中でサンプル内に含有される約１５％未満のポリヌクレオチドがサンプルの回収、溶解、保存、および輸送中に分解される生物サンプルから調製される核酸の集団をもたらすことが好ましい。
【００７３】
関連実施形態では、方法は、サンプルを組成物中に最初に導入した後少なくとも２４、４８、７２、または９６時間以上の間−２０℃から約４０℃の温度における組成物での保存後、その中でサンプル内に含有される約１０％未満のポリヌクレオチドがサンプルの回収、溶解、保存、および輸送中に分解される生物サンプルから調製される核酸の集団をもたらすことが好ましい。
【００７４】
同様に、本明細書で開示する方法のいくつかの適用例では、開示する組成物の使用は、サンプルを組成物中に最初に導入した後少なくとも２４、４８、７２、または９６時間以上の間−２０℃から約４０℃の温度における組成物での保存後、その中でサンプル内に含有される約５％未満のポリヌクレオチドがサンプルの回収、溶解、保存、および輸送中に分解される生物サンプルから調製される核酸の集団をもたらすことが好ましい。
【００７５】
いくつかの場合、本方法によって調製した核酸の集団を、数日から数週間の間０℃から約４０℃の温度で組成物を保存するときでさえ約１または２％を超えないサンプルが分解するように、十分な完全性で維持することができる。実際、本発明者らは、開示する方法を使用して単離した核酸のサンプルは、１０℃から約４０℃の温度で核酸を含有する組成物を保存するときでさえ、数週間からさらに数カ月以上の間、それらの非分解形で、少なくとも実質的に安定状態である、好ましくは安定状態であることを示している。好ましい一実施形態では、前に記した温度範囲に関する上限は約３７℃である。したがって、本明細書で使用する用語「安定状態」は、所与温度での特定時間経過後の核酸集団の完全性に関して前に記した、様々な実施形態を指すことができる。
【００７６】
本発明のポリヌクレオチド、特にＩＰＣの調製において有用なポリヌクレオチドは、陽性対照配列（ＰＣＳ）と操作可能に連結した少なくとも第一のポリメラーゼ転写領域を含有することが好ましい。このような領域は、適切な反応条件下で適切なポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、ＳＰ６、またはＴ７ポリメラーゼなど）とＰＣＳが接触するときＰＣＳが増幅するように、ＰＣＳの上流に操作可能に位置し得る。この構築物は１つのプライマーをさらに含むことができ、または代替的に、２つ以上のプライマー（例えば、「フォワード」および「リバース」プライマー）を使用してＰＣＳの発現を容易にすることができる。本発明を実施する際に有用な例示的なプライマーには、非制限的に、ＰＣＳ自体またはＰＣＳのすぐ上流（５’）およびまたは下流（３’）の領域と特異的に結合するプライマー配列がある。例示的な実施形態では、ＰＣＳは、（本明細書に記載する発光、蛍光、化学発光、またはＦＲＥＴプローブを非制限的に含めた）第一の検出プローブが特異的に結合する少なくとも第一の領域を含有する。
【００７７】
ＩＰＣの調製において有用なポリヌクレオチドは、１つ以上の天然、合成、同型、異型、またはハイブリッドプロモーター（複数可）、エンハンサー（複数可）、制御エレメント（複数可）、リンカー（複数可）、スペーサー（複数可）、結合ドメイン（複数可）、または転写活性化部位（複数可）なども任意にさらに含むことができる。
【００７８】
例示的な実施形態では、本発明者らは、周囲の環境条件で保存したときでさえ、開示するサンプル回収／輸送媒体を首尾よく利用して、数日、数週間、数カ月の間に、生物サンプルを回収および保存することができることを実証している。このように、開示する製剤は、サンプル内に含有されるポリヌクレオチドの品質の重大な劣化なしで、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、またはさらに約１０週間以上、単離核酸の集団の適合度および完全性を維持するのに有効な組成物をもたらす。実際、サンプルの長期保存は、数カ月以上の間、周囲および周囲に近い条件下でも可能であり、任意の従来の市販製剤に優る有意な改善が本発明中で本発明者らによって調べられた。回収試料のインビトロ分析を使用して得たデータは、数日から数週間、数カ月以上の間溶液中に保存すると、開示する回収／保存／輸送製剤の１つで回収および保存したサンプルは実質的に非分解状態、および機能上活性があることを実証している。約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、またはさらに約８週間以上の後に得た結果の比較は、単離ポリヌクレオチドに対する実質的ヌクレアーゼ活性の予防、および汚染または分子分解からの単離分子の予防における溶液の有効性を実証した。
【００７９】
本発明は、ａ）１つ以上のカオトロープ、ｂ）１つ以上の界面活性剤、ｃ）１つ以上の還元剤、ｄ）１つ以上のキレート剤、ｅ）１つ以上のバッファー、およびｆ）（１）核酸セグメントの検出に特異的である約１２から約４０ヌクレオチド長の標識プローブと特異的に結合する第一の配列ドメインを含み、（２）約２０から約４０ヌクレオチド長のフォワードＰＣＲ増幅プライマーと特異的に結合する第二の配列ドメインを含み、（３）約２０から約４０ヌクレオチド長のリバースＰＣＲ増幅プライマーと特異的に結合する第三の配列ドメインを含む、核酸セグメントを含む約６０から５００ヌクレオチド長の単離、一本鎖核酸分子を含み、第二の配列ドメインと第三の配列ドメインが操作可能に位置して、フォワードおよびリバースプライマーからの、核酸セグメントの少なくとも第一部分のＰＣＲ定方向増幅を、少なくとも第一部分を増幅するのに有効な条件下で容易にし、分子がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、哺乳動物ゲノム、または哺乳動物に対して病原性である細菌、真菌、またはウイルスのゲノムと実質的に結合せず、さらに（ａ）−（ｅ）が、サンプルと組成物の接触時に、１つ以上のタンパク質を変性する、１つ以上のヌクレアーゼを不活性化する、１つ以上の病原体を殺滅する、または核酸集団を含有する疑いがあるサンプル中で１つ以上の核酸が分解するのを妨げるのに十分な量で組成物中に存在する、組成物を包含する。
【００８０】
一実施形態では、（ａ）−（ｅ）のそれぞれが、約１日から約９０日の間約１０℃から約４０℃の温度で保存するとき、一本鎖核酸分子を含むヌクレオチド集団の実質的分解を阻害または予防するのに十分な量で組成物中に存在する。別の実施形態では、ａ）１つ以上のカオトロープが約０．５Ｍから約６Ｍの量でそれぞれ存在し、ｂ）１つ以上の界面活性剤が約０．１％から約１％の量でそれぞれ存在し（重量／体積）、ｃ）１つ以上の還元剤が約０．０５Ｍから約０．３Ｍの量でそれぞれ存在し、ｄ）１つ以上のキレート剤が約０．０１ｍＭから約１ｍＭの量でそれぞれ存在し、およびｅ）１つ以上のバッファーが約１ｍＭから約１Ｍの量でそれぞれ存在する。さらに別の実施形態では、標識プローブは、少なくとも第一の副溝結合剤、放射性標識、発光標識、化学発光標識、蛍光標識、酵素標識、磁気標識、またはスピン共鳴標識、またはこれらの組合せを含む。
【００８１】
好ましい一実施形態では、組成物は、ａ）グアニジンチオシアネート、グアニジンイソシアネート、グアニジン塩酸塩、またはこれらの任意の組合せを含む１つ以上のカオトロープ、ｂ）ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、Ｎ−ラウロイルサルコシン、またはこれらの任意の組合せを含む１つ以上の界面活性剤、ｃ）２−メルカプトエタノール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、ジチオスレイトール、ジメチルスルホキシド、またはこれらの任意の組合せを含む１つ以上の還元剤、ｄ）エチレングリコール四酢酸、ヒドロキシエチレンジアミン三酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン、エチレンジアミン四酢酸、無水クエン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸第二鉄アンモニウム、クエン酸リチウム、またはこれらの任意の組合せを含む１つ以上のキレート剤、またはｅ）トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、クエン酸、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、重炭酸塩、リン酸塩、またはこれらの任意の組合せを含む１つ以上のバッファーを含む。別の好ましい実施形態では、組成物は以下の：ｇ）シリコーンポリマー、ポリソルベート、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ以上の表面活性剤、ｈ）メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、またはヘキサノール、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ以上の短鎖アルカノール、およびｉ）シリコーンポリマー、ポリソルベート、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ以上の消泡剤の１つ以上、ならびにこれらの任意の組合せをさらに含む。
【００８２】
さらに別の実施形態では、組成物はａ）約６．０から７．０のｐＨに緩衝剤されている、ｂ）ＲＮＡｓｅもしくはＤＮＡｓｅ活性を実質的に含まない、またはｃ）ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、もしくはこれらの任意の組合せを含む細菌、ウイルスもしくは真菌起源の単離ポリヌクレオチドの集団をさらに含む。好ましい実施形態では、組成物はａ）約４Ｍのグアニジンチオシアネート、約３０ｍＭのクエン酸ナトリウム、約０．２５％（重量／体積）のドデシル硫酸ナトリウム、約０．２５％（重量／体積）のＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、（ｖ）約０．１Ｍの２−メルカプトエタノール、および約０．１％の（重量／体積）シリコーンポリマー、ｂ）約３Ｍのグアニジンチオシアネート、約１ｍＭのＴＣＥＰ、約１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、約０．５％のＮ−ラウロイルサルコシン、約０．０００２％のシリコーンポリマー、約１００ｍＭの２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール（ＴＲＩＳ）、および約０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｃ）約１Ｍから約４Ｍのグアニジンチオシアネート、約０．５ｍＭから１０ｍＭのＴＣＥＰ、約１ｍＭから１００ｍＭのクエン酸ナトリウム、約０．１％から約１％のＳＤＳもしくはＮＬＳ、約０．００１％から約０．０００１％のシリコーンポリマー、約１０ｍＭから５００ｍＭのＴＲＩＳ、約０．１ｍＭから１ｍＭのＡＰＣＡ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＨＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＮＴＡ、もしくはクエン酸、および約１０％から約２５％のエタノール（体積／体積）、またはｄ）約３Ｍのグアニジンチオシアネート、１ｍＭのＴＣＥＰ、約１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、約０．５％のＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、約０．０００２％のシリコーンポリマー、約１００ｍＭのＴＲＩＳ、約０．１ｍＭのＥＤＴＡ、および約１０％から約２５％のエタノール（体積／体積）を含む。
【００８３】
別の実施形態では、核酸の集団を、組成物を含む単一反応容器中に回収および保存する。他のさらなる実施形態では、サンプルは臨床、獣医学的、疫学的、環境、法医学的、もしくは病理学的起源の生物サンプルであり、またはサンプルは、ウイルス、細菌、真菌、または哺乳動物起源の１つ以上のポリヌクレオチドを含有する、もしくは含有する疑いがある。好ましい実施形態では、単離、一本鎖核酸分子は配列：
【００８４】
【化３】
0005442105.tif 000005
からの少なくとも２０の隣接ヌクレオチドを含む。一実施形態では、前に記した組成物のそれぞれを、微生物、真菌またはウイルス感染の診断または療法における使用に適合させる。
【００８５】
本発明は、微生物感染、またはその１つ以上の症状を診断または治療するための医薬品の製造における、前の実施形態のいずれか１つに記載の組成物の使用も包含する。好ましい実施形態では、本発明は、細菌、ウイルス、または真菌感染、またはその１つ以上の症状を診断または治療するために使用する。
【００８６】
本発明は、ａ）請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物、およびｂ）微生物感染の診断または治療において組成物を使用するための説明書を含む、診断キットまたはサンプル回収システムをさらに包含する。
【００８７】
本発明は、生物サンプルからポリヌクレオチドの精製集団を入手する有効性を増大するのに十分な量および時間、請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離、一本鎖核酸分子を含む組成物とサンプルを接触させることを含む、ポリヌクレオチドの精製集団を、そのようなポリヌクレオチドを含有する疑いがある生物サンプルから入手する有効性を増大するための方法をさらに包含する。一実施形態では、生物サンプル中のポリヌクレオチド集団の完全性またはポリヌクレオチドの１つの少なくとも第一配列の適合度が、サンプルを含む組成物を（ａ）約７日から約１４日の間、または（ｂ）約１４日から約３０日の間、約１０℃から約４０℃の温度で保存するときに、少なくとも実質的に保たれる。別の実施形態では、（ａ）サンプルを含む組成物を、回収時から内部のポリヌクレオチド集団を単離、精製、または特徴付けする時間まで、実質的に約１０℃から約４０℃の温度で保存する、または（ｂ）サンプルを含む組成物を約７日から約３０日の間約１０℃から約４０℃の温度で保存した後に、サンプル中に含有されるポリヌクレオチド集団の約５％未満が分解される。好ましい実施形態では、サンプルを含む組成物を、（ａ）約２４時間から約９６時間の間約１０℃から約４０℃、または（ｂ）約７日から約３０日の間約１０℃から約３０℃の温度で保存する。好ましい実施形態では、方法は、精製サンプルから入手したポリヌクレオチド集団を分析または定量化することをさらに含む。さらに別の実施形態では、定量化のステップは分子のＰＣＲサイクル閾値（ＣＴ）の決定を含む。
【００８８】
本発明は、サンプルを含む組成物を少なくとも約７日から約３０日の間約１０℃から約４０℃の温度で保存した後に、サンプル中に含有されるポリヌクレオチド集団の約３０％未満が分解されるように、ポリヌクレオチド集団を安定化するのに十分な量で存在する、約１Ｍから約４Ｍのグアニジンチオシアネート、約０．５ｍＭから１０ｍＭのＴＣＥＰ、約１ｍＭから１００ｍＭのクエン酸ナトリウム、約０．１％から約１％のＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、約０．００１％から約０．０１０％の１０％消泡剤Ａ溶液、約１０ｍＭから約５００ｍＭのＴｒｉｓ、約０．１ｍＭから約１ｍＭのＥＤＴＡ、約１０％から約２５％のエタノール（体積／体積）、および配列
【００８９】
【化４】
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を有する核酸分子を含む一定量の組成物を、サンプルと接触させることを含む、核酸を含有する疑いがある生物サンプルからポリヌクレオチド集団を入手する方法も包含する。
【００９０】
市販の製剤およびキット
本発明は、開示する組成物および本明細書に開示する回収／保存／輸送溶液を使用する、診断キットおよびサンプル回収システムも提供する。特定の実施形態では、このようなサンプル回収システムは、１つ以上の本明細書に開示する組成物を含有する、スワブ、キューレット、または培養ループ、およびバイアル試験管、または試料カップなどの回収容器などの回収デバイスを含むことができる。回収容器は、それを開放してワンステップ組成物を挿入することができ、閉鎖および梱包する、開放してサンプルおよび任意に回収デバイスの一部分を挿入し、保存および輸送用に閉鎖する、またはその両方ができるように、放出可能なように開放可能であることが好ましい。回収容器は、スクリューキャップ、スナップトップ、プレス−アンド−ターントップなどを非制限的に含む、任意の適切な放出可能または開放可能なメカニズムを使用することができる。このようなシステムは、１つ以上の他の試薬、保存デバイス、輸送デバイス、および／またはこのようなシステムにおいてサンプルを入手、回収、溶解、保存、または輸送するための説明書も任意にさらに含むことができる。好ましい実施形態では、本発明のワンステップ組成物を、サンプルが結合可能である反応帯中に事前に置くことができる。このような実施形態では、本発明は、回収デバイスと回収容器のみを必要とする。キットは、同定、検出、またはさらなる分子分析に適した少なくとも部分的、または実質的に精製された核酸を得るために、１つ以上の他の生物分子もしくはサンプル構成要素からのサンプル内に含有される１つ以上の核酸集団もしくは多数の核酸の遊離および／または分離を助長するための、１つ以上の単離または抽出デバイスも含むことができる。
【００９１】
キットは流通用にパッケージすることもでき、サンプルまたは試料回収、操作、または処理用の、１つ以上の回収、送達、輸送、または保存デバイスを任意にさらに含むことができる。このようなキット用の容器（複数可）は、その中に個々の試料回収、輸送、および／または保存用に組成物（複数可）を置く、および好ましくは、適切に等分することができる、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、キャップ、または他の適切な容器または回収デバイスを典型的には含むことができる。キットは、前に記したより小さな個々の容器、および他の回収デバイス、機器、試薬、説明書などを含む、ケースなどのより大きな容器も含むことができる。キットは１つ以上の他のバッファー、化合物、または組成物も任意に含むことができ、１つ以上の生物、臨床、診断、環境、または法医学的サンプルの回収または保存のいずれかにおけるキットの用途（複数可）を詳述する１つ以上の説明書も必要に応じてさらに含むことができる。必要に応じて、キットは１つ以上の開示する組成物を中に置いた後のサンプルの輸送に関する説明書もさらに与えることができ、サンプルまたは試料から単離した核酸を利用する１つ以上の後の分析法またはアッセイを詳述する説明書、または他の試薬をさらに含むことができる。このようなキットは、多数の様々な回収デバイスおよび回収容器および含まれる任意の他の構成要素も含むことができ、したがって、このようなキットを使用して、同じ供給源または異なる供給源から多数のサンプルを回収することができる。１つの市販用途では、好都合な販売および使用のためにキットを５つ以上のセットでパッケージする。
【００９２】
本発明の原理の理解を促進するために、図面中に例示する実施形態、または実施例をここで参照し、具体的な用語を使用してこれらを記載する。それにもかかわらず、本発明の範囲の限界はそれらによって意図されないことは理解される。記載した実施形態中の任意の変更およびさらなる修正、および本明細書に記載する本発明の原理の任意のさらなる適用例が、本発明に関する当技術分野の当業者が通常思い浮かべるように企図される。
【００９３】
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様を実証するためにこれらを含める。本発明は、同じ参照番号が同じ要素を示す添付の図面と共に、以下の記載を参照することによってさらによく理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】ＰＳＳ（バージョン１）の抽出効率を示す図である。標準量の完全インフルエンザＡウイルスを使用してＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（登録商標）−マイクロキット（Ａｍｂｉｏｎ、カタログ番号ＡＭ１９３１）中に与えられた溶解溶液と比較したＰＳＳ（バージョン１［ここでは「ワンステップ＋」として示す］）。比較用に、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（登録商標）−マイクロキット中に与えられたワンステップ製剤または溶解溶液のいずれかをウイルスＲＮＡ溶解用に使用し、次いで製造者のプロトコールに従い抽出した。複製反応混合物を処理し、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＢＩ７５００配列検出システム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、ｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した。
【図２】市販のキットと比較したＰＳＳ（バージョン１）の抽出効率を示す図である。２００６−０７期の間に回収済みのインフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）またはヒト臨床インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）サンプルで攻撃した均質コットンラット鼻部（＊）はＰＳＳ中で溶解し、または３つの市販のキット：ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（登録商標）−マイクロキット（Ａｍｂｉｏｎ）、ＱｉａＡｍｐ（商標）ウイルスミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）、およびＡＩ／ＮＣＤ  ＭａｘＭａｇ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）キットからの、それぞれの溶解溶液、プロトコール、および抽出手順を使用して溶解した。抽出効率は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＢＩ７５００プラットホームおよび比較ＣＴ法を使用して評価した。ＰＳＳ（「ワンステップ製剤」として示す）を、それぞれの標準的な市販のキット中に与えられたそれぞれの溶解バッファーの代わりに利用したとき、相対ＣＴ値および検出したウイルスコピー数は最適であった。
【図３】ＰＳＳ中対Ａｍｂｉｏｎ社製ＲＮＡ保存溶液中での裸状態のＲＮＡの保存を示す図である。一本鎖の鳥類Ｈ５ＲＮＡは、９６時間周囲温度（２２−２４℃）で、ＰＳＳ、ＲＮＡ保存溶液（Ａｍｂｉｏｎ）、または水中に保存した。合計５ｐｇのＲＮＡを、製造者の奨励に従いＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（登録商標）−マイクロキット（Ａｍｂｉｏｎ、カタログ番号ＡＭ１９３１）を使用して抽出し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＢＩ７５００プラットホーム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でｑＲＴ−ＰＣＲを使用して後に分析した。絶対定量法を使用してＣＴとして値を与える。
【図４Ａ】臨床診断用回収のためのＰＳＳパッケージング形式の一例を示す図である。臨床回収用スワブ（Ｃｏｐａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）および１．５ｍＬのＰＳＳを含有する５ｍＬの回収用試験管を使用したサンプル回収の説明。
【図４Ｂ】臨床診断用回収のためのＰＳＳパッケージング形式の一例を示す図である。臨床回収用スワブ（Ｃｏｐａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）および１．５ｍＬのＰＳＳを含有する５ｍＬの回収用試験管を使用したサンプル回収の説明。
【図４Ｃ】臨床診断用回収のためのＰＳＳパッケージング形式の一例を示す図である。臨床回収用スワブ（Ｃｏｐａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）および１．５ｍＬのＰＳＳを含有する５ｍＬの回収用試験管を使用したサンプル回収の説明。
【図４Ｄ】臨床診断用回収のためのＰＳＳパッケージング形式の一例を示す図である。臨床回収用スワブ（Ｃｏｐａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）および１．５ｍＬのＰＳＳを含有する５ｍＬの回収用試験管を使用したサンプル回収の説明。
【図４Ｅ】臨床診断用回収のためのＰＳＳパッケージング形式の一例を示す図である。臨床回収用スワブ（Ｃｏｐａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）および１．５ｍＬのＰＳＳを含有する５ｍＬの回収用試験管を使用したサンプル回収の説明。
【図５】ＰＳＳの例示的な市販の製剤を示す図である。３つの例示的な市販の溶液回収形式：２５ｍＬの容器、ならびに５ｍＬおよび１．５ｍＬの試験管を示す。
【図６】微生物を早急に殺滅するＰＳＳの能力を示す図である。培養培地（ＴＳＢ）中、またはＰＳの溶液中のいずれかにおける、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）の細胞増殖の比較を示す。ＰＳＳにおいて１０秒後、生命力のある細菌病原体は検出しなかった。
【図７Ａ】ＰＳＳ（バージョン１）におけるニワトリ排出腔試料の不活性化を示す図である。ＰＳＳ（バージョン１）は細菌因子を１時間以内に不活性化した。４つの原型ニワトリ排出腔サンプルをＰＳＳ（バージョン１）（上列）または水中に浸し（下列）、血液寒天プレート上に後に平板培養した。
【図７Ｂ】ＰＳＳが室温で３０日間ＲＮＡ塩基加水分解を阻害することを示す図である。ＲＮＡは室温（２２−２６℃）においてＰＳＳ（ゲルレーン１および３）および水中（ゲルレーン２および４）で温置し、第０日および第３０日でその後ＲＴ−ＰＣＲ増幅した（１５００塩基対）。ＰＳＳは回収ＲＮＡを保存し、第３０日まで室温においてＲＮＡ／ＤＮＡ分解を妨げた。
【図８Ａ】ＲＮＡ／ＤＮＡヌクレアーゼ中での温置後ＰＳＳ中に保存した「裸状態の」インフルエンザＡ鳥類Ｈ５ＲＮＡ鋳型のｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。Ｈ５ｃＲＮＡ（２ｎｇ）を３７℃で１時間＠リボヌクレアーゼＡおよびＴ１、およびＤＮＡｓｅＩと温置し、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（登録商標）−マイクロキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して抽出した。三連の反応混合物をそれぞれの反応条件に関して含めた。ヌクレアーゼを加えたＰＳＳ中に保存した裸状態ＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲのＣＴ値（平均ＣＴ：２２．８８）は、等量の鋳型ｃＲＮＡ対照と同等であった（平均ＣＴ：２３．７０）。ＰＳＳなしのヌクレアーゼ消化に曝した鋳型ｃＲＮＡ反応混合物はほぼ完全に分解された（平均ＣＴ：３９．５８）。
【図８Ｂ】７日間３７℃におけるＲＮＡ／ＤＮＡヌクレアーゼ中での温置後ＰＳＳ中に保存した「裸状態の」インフルエンザＡ鳥類Ｈ５ＲＮＡ鋳型のｑＲＴ−ＰＣＲ分析およびゲル電気泳動を示す図である。２ナノグラムのＨ５ｃＲＮＡをＲＮａｓｅＡ、ＲＮａｓｅＴ１、およびＤＮＡｓｅＩと温置し、次いで７日後ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（登録商標）−マイクロキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して抽出した。二連の反応混合物をそれぞれの反応に関して含めた。ヌクレアーゼを加えたＰＳＳ中に保存した裸状態ＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲのＣＴ値（平均ＣＴ：３３．５１）は７日後に検出した。ＰＳＳなしのヌクレアーゼ消化に曝した鋳型ｃＲＮＡ反応混合物は完全に分解され、ＮＴＣ反応混合物と同等であった。
【図８Ｃ】ＰＳＳ製剤が内因性ヌクレアーゼによるサンプルポリヌクレオチドの消化を実質的に阻害したことを実証する図である。増幅後産物のゲル電気泳動。レーン３は７日間３７℃での鋳型ＲＮＡ＋ＰＳＳ由来のＰＣＲ産物であり、およびレーン５は陽性対照ＲＮＡの増幅である。レーン５（増幅なし）はＰＳＳなしでＲＮＡを含有し、レーン２および６は、それぞれ１００−ｂｐラダー、およびＮＴＣ反応混合物である。
【図９】ＰＳＳ中に得た核酸の保存状態が他の溶液のそれより良いことを示す図である。３０日間周囲温度（２２−２５℃）においてＱｉａｇｅｎ  ＡＶＬバッファー、エタノール、およびウイルス輸送媒体（ＶＴＭ）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）と比較した、インフルエンザＡウイルス由来のＲＮＡのＰＳＳ（ｖｅｒ．２およびｖｅｒ．２．２）保存状態。
【図１０】様々な温度で３０日間、ＰＳＳ（ｖｅｒ．２．２）中に保存したインフルエンザＡウイルスの抽出効率を示す図である。環境（２１−３７℃）、凍結−解凍（−２５℃；３２×）、周囲温度（２２−２６℃）、およびレーン５：冷凍（４℃）。
【図１１】完全インフルエンザＡウイルスおよび還元剤としてＴＣＥＰを使用したＣＴ対モル濃度のグラフである。
【図１２】Ｈ５Ｎ１鳥類インフルエンザｓｓＲＮＡおよび還元剤としてＴＣＥＰを使用したＣＴ対モル濃度のグラフである。
【図１３Ａ】ＰＳＳ製剤中の還元剤要素としてのＴＣＥＰとβ−ＭＥ、および対照としてのみ働く水の比較を示す図である。図１３Ａ中では、Ｈ５鳥類インフルエンザＲＮＡを利用し、一方図１３Ｂ中では、完全ウイルスを使用した。
【図１３Ｂ】ＰＳＳ製剤中の還元剤要素としてのＴＣＥＰとβ−ＭＥ、および対照としてのみ働く水の比較を示す図である。図１３Ａ中では、Ｈ５鳥類インフルエンザＲＮＡを利用し、一方図１３Ｂ中では、完全ウイルスを使用した。
【図１４Ａ】血液由来の核酸を保存する際にＰＳＳを利用した試験の結果を示す図である。ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄミニキットにおける溶解溶液と比較したＲＮＡをスパイクした全血のＰＳＳ抽出効率。０．１ｐｇおよび１ｐｇのインフルエンザＡＲＮＡをスパイクし、ＰＳＳまたはＡＬ溶解バッファーを使用して抽出した。両方のＲＮＡ濃度において、ｑＲＴ−ＰＣＲのＣＴ値によって明らかなように、ＰＳＳは優れた結果をもたらした。
【図１４Ｂ】血液回収用試験管からの「裸状態の」Ｈ５鳥類インフルエンザｓｓＲＮＡの抽出に関する図１４Ａ中に示した試験からのデータを表にした図である。異なる抗凝血剤を使用した、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄミニキットにおける溶解溶液と比較したＲＮＡをスパイクした全血のＰＳＳ抽出効率。一般的な抗凝血剤回収用試験管中でＲＮＡをスパイクした血液を使用して、ＱｉａｇｅｎからのＡＬ溶解バッファーと比較してＰＳＳは優れていた。および
【図１４Ｃ】ＰＳＳ対市販の抽出キット保存試薬（ＱＩＡａｍｐ（登録商標）、Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．）の比較に関する図１４Ａ中に示した試験からのデータを表にした図である。ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄミニキットにおける溶解溶液と比較したＲＮＡをスパイクした全血に関するＰＳＳの抽出効率を示す。０．１ｐｇおよび１ｐｇのインフルエンザＡウイルスＲＮＡをスパイクし、ＰＳＳまたはＡＶＬ溶解バッファーを使用して抽出した。両方のＲＮＡ濃度において、ｑＲＴ−ＰＣＲのＣＴ値によって明らかなように、ＰＳＳは優れた結果をもたらした。
【図１５ａ】ＩＰＣを検出するのに特異的なアッセイを使用した、１４１ヌクレオチド一本鎖ＤＮＡのｑＰＣＲ増幅を示す図である。図１５ａ：１０−６から１０−１３（すなわち８ｌｏｇ）の連続希釈ＤＮＡ鋳型を使用して、二連の反応で増幅を実施した。図１５ｂ：ＤＮＡ増幅のＩＰＣ標準曲線。アッセイ勾配は−３．３９であり、Ｅ＝１０（−１／ｓｌｏｐｅ）−１を使用して計算したＰＣＲ効率は９７．２３％であった。ｑＰＣＲはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＢＩ７５００プラットホームを使用して実施した。
【図１５ｂ】ＩＰＣを検出するのに特異的なアッセイを使用した、１４１ヌクレオチド一本鎖ＤＮＡのｑＰＣＲ増幅を示す図である。図１５ａ：１０−６から１０−１３（すなわち８ｌｏｇ）の連続希釈ＤＮＡ鋳型を使用して、二連の反応で増幅を実施した。図１５ｂ：ＤＮＡ増幅のＩＰＣ標準曲線。アッセイ勾配は−３．３９であり、Ｅ＝１０（−１／ｓｌｏｐｅ）−１を使用して計算したＰＣＲ効率は９７．２３％であった。ｑＰＣＲはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＢＩ７５００プラットホームを使用して実施した。
【図１６ａ】ＩＰＣとして働くことができる１３０ヌクレオチドｓｓＲＮＡ担体分子のｑＲＴ−ＰＣＲ増幅を示す図である。図１６ａ中に示すのは：５ピコグラム（ｐｇ）（２．７５×１０７コピー）から５アトグラム（ａｇ）（約２−１０コピー）の連続希釈ＲＮＡ鋳型を使用して、二連の反応で増幅を実施した。図１６ｂ中、担体ｓｓＲＮＡ分子の増幅に関するＩＰＣ標準曲線を示す。アッセイ勾配は−３．１４４であり、Ｅ＝１０（−１／ｓｌｏｐｅ）−１を使用して計算したＰＣＲ効率は１００％であった。ｑＲＴ−ＰＣＲはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＢＩ７５００プラットホームを使用して実施した。
【図１６ｂ】ＩＰＣとして働くことができる１３０ヌクレオチドｓｓＲＮＡ担体分子のｑＲＴ−ＰＣＲ増幅を示す図である。図１６ａ中に示すのは：５ピコグラム（ｐｇ）（２．７５×１０７コピー）から５アトグラム（ａｇ）（約２−１０コピー）の連続希釈ＲＮＡ鋳型を使用して、二連の反応で増幅を実施した。図１６ｂ中、担体ｓｓＲＮＡ分子の増幅に関するＩＰＣ標準曲線を示す。アッセイ勾配は−３．１４４であり、Ｅ＝１０（−１／ｓｌｏｐｅ）−１を使用して計算したＰＣＲ効率は１００％であった。ｑＲＴ−ＰＣＲはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＢＩ７５００プラットホームを使用して実施した。
【図１７】合成ｓｓＲＮＡ担体／ＩＰＣ分子を含有するＰＳＳが裸状態ＲＮＡ病原体標的の保存状態を向上したことを示す図である。この試験では、裸状態のインフルエンザＡＲＮＡ鋳型（１．２７ｎｇ／μｌ）をヒト鼻部洗浄試料に加え、３７℃で合成ＲＮＡ添加物の存在下（黒い四角形）または不在下（黒い丸）においてＰＳＳで保存した。ＲＮＡを抽出し、次いでｑＲＴ−ＰＣＲによって後に検出した。製剤中の合成ｓｓＲＮＡ担体／ＩＰＣ分子の存在は、サンプルポリヌクレオチドの高い初期抽出（第０日）と、長期間にわたる単離ポリヌクレオチドの安定した保存状態の両方をさらにもたらした（例えば、第３１日参照）。
【図１８】溶液中でサンプルポリヌクレオチドを安定化し保存するＰＳＳの能力は、ＰＳＳ製剤に合成ｓｓＲＮＡ担体／ＩＰＣ核酸を加えることによって向上することを示す図である。この試験では、完全インフルエンザＡウイルスを、３５日間３７℃で合成ｓｓＲＮＡ担体／ＩＰＣ添加物の存在下（黒い四角形）または不在下（黒い丸）においてＰＳＳ中に保存した。完全インフルエンザウイルスはＶＴＭ（黒い三角形）中にも保存した。ＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して検出した。製剤中の合成担体ＲＮＡ分子の存在は、サンプルポリヌクレオチドの高い初期抽出（第０日）と、長期間にわたる単離ポリヌクレオチドの安定した保存状態の両方をさらにもたらした（例えば、第３５日参照）。
【図１９】室温および３７℃での合成ｓｓＲＮＡ担体分子の安定性を示す図である。この試験では、合成ＲＮＡ（０．１ｐｇ／μｌ）をＰＳＳに加え、１４日間室温（ＲＴ）または３７℃で保存した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＢＩ７５００プラットホームを使用し、ＩＰＣアッセイを使用してｑＲＴ−ＰＣＲの関数としてＲＮＡの安定性を測定した。合成ＲＮＡは１４日間ＲＴおよび３７℃において安定状態であり、ＣＴ値の著しい消失はなかった。二連反応の平均を示す。
【発明を実施するための形態】
【００９５】
例示的実施形態の詳細な説明
本発明の例示的な実施形態を以下に記載する。明確性のため、実際の履行の全ての特徴を本明細書に記載するわけではない。当然ながら、任意のこのような実際の実施形態の開発において、多数の履行特異的な決定をして、一履行と別の履行で変わるシステム関連およびビジネス関連の制約があるコンプライアンスなどの、開発者の特異的な目標を達成しなければならないことは理解される。同様に、このような開発努力は複雑または時間を浪費する可能性がある一方で、それにもかかわらずそれらは、本開示の利点を有する当業者には通常の作業であることも理解される。
【００９６】
開示する製剤によって与えられる長期の安定化、回収、輸送、および保存は、サンプルまたは試料が試験施設から離れた地理領域に位置するとき特に有利である。現場とも呼ばれる遠隔位置は、診断試験が典型的には実施されない様々な環境を包含する。これらの現場には、医院、トリアージセンター、空港、広域境界、疫病発生領域、および様々な屋外箇所がある。それらの用途のため開示する組成物および方法は、電気および／または冷凍装置が利用可能ではない、またはアクセスが一貫していない場所で特定の利点を与える。室温での長期の安定性のため、サンプルは任意の遠隔位置から、例えば非制限的にアフリカでのマラリア発生領域で得ることができ、サンプルは研究室での診断分析用に米国またはヨーロッパに出荷することができる。開示する回収製剤は室温以下、および好ましくはさらに熱帯もしくは亜熱帯温度で一定期間は安定状態なので、それらは通常、典型的には回収地点から遠く離れた場所でサンプルを分析することができるまでに、試薬成分（ＲＮＡ対照など）自体が分解する心配無く現場に持ち込むことができる。
【００９７】
本発明の組成物は、溶液、縣濁液（コロイド縣濁液含む）、スラリー、エマルジョン、ホモジェネートなどだけには限られないが、これらを含めた、本明細書に記載する任意の適切な水性製剤であってよい。好ましい水性製剤は溶液であり、したがって用語「溶液」は好ましい実施形態の詳細な説明を通じて例示的な意味で使用しており、本発明の任意の水性組成物を指す。
【００９８】
本発明の重要な態様は、単離ＲＮＡおよびＤＮＡセグメント、ならびにそれらを含む組換えベクターおよびポリヌクレオチド集団、ならびにｑＰＣＲ、ｑＲＴ−ＰＣＲなどを非制限的に含む従来の分子生物学技術の適用によってＲＮＡ担体分子を調製するための組換え法の作製および使用に関する。
【００９９】
本発明はさらに、本明細書に記載する試料回収／保存／輸送媒体を使用して１つ以上の生物サンプルまたは試料から単離可能なＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡ、または担体分子および／またはＩＰＣとして利用される単離ＲＮＡもしくはＤＮＡセグメントを非制限的に含む核酸組成物に関する。
【０１００】
本明細書で使用する用語「ＤＮＡセグメント」は、特定種のゲノムＤＮＡ全体から単離除去されたＤＮＡ分子を指す。したがって、本明細書に開示する組成物の１つを使用して生物サンプルから得たＤＮＡセグメントは、哺乳動物もしくはヒトゲノムＤＮＡ全体から単離除去された、または精製除去された１つ以上のＤＮＡセグメントを指す。用語「ＤＮＡセグメント」内に含まれるのは、ＤＮＡセグメントおよびこのようなセグメントのさらに小さな断片、および例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどを含めた組換えベクターである。
【０１０１】
同様に、用語「ＲＮＡセグメント」は、特定種の細胞ＲＮＡ全体から単離除去されたＲＮＡ分子を指す。したがって、本明細書に開示する組成物の１つを使用して生物サンプルから得たＲＮＡセグメントは、他のＲＮＡから単離除去された、または精製除去された１つ以上のＲＮＡセグメント（天然または合成起源のいずれか）を指す。用語「ＲＮＡセグメント」内に含まれるのは、ＲＮＡセグメントおよびこのようなセグメントのさらに小さな断片である。
【０１０２】
単離および／または精製ポリヌクレオチドを含む核酸セグメントは、回収および後の分析を経る生物サンプル中に存在し得る他の天然に存在する遺伝子またはタンパク質コード配列から、実質的に単離除去された核酸セグメントを指す。
【０１０３】
特定の実施形態では、本発明は、このようなサンプルから得た核酸の単離および安定化を容易にするための第一の担体分子を含む核酸サンプル回収、保存、および輸送媒体に関する。担体分子は一本鎖ＲＮＡ分子であることが好ましいが、いくつかの状況では、ＲＮＡ：ＲＮＡ、またはＲＮＡ：ＤＮＡデュプレックス分子も利用することができる。
【０１０４】
特に本明細書で開示する試料回収／保存／輸送製剤への、外因性担体分子、およびＲＮＡ分子の取り込み方に関する特定の分子機構を本発明の通常の実施のために解明する必要はないが、いかなる特定の理論によっても制限されることなく、本発明者らは、本明細書に記載するＰＳＳおよび関連製剤に外から供給されるＲＮＡ担体分子の存在は、ＰＳＳとの接触時に細胞物質から遊離するポリヌクレオチドの沈殿および安定化を容易にし、ポリヌクレオチド凝集または沈殿に好ましい防御分子型で遊離したサンプル核酸を「コーティング」または「エンロービング」するための方法として働くこともできると考える。
【０１０５】
作用機構と無関係に、本発明者らは、回収、単離、保存、および輸送プロセス中に分解および汚染を被る従来のサンプルにおいて通常観察される有害な影響を除去した、高品質、高適合度の核酸集団の調製において従来のポリヌクレオチド単離溶液に優り与えられる驚くべき利点を実証している。
【０１０６】
担体分子および／またはＩＰＣ含有配列は、当技術分野で知られている従来の方法を使用して部分的または完全に合成することができ、または（インビトロ転写および／またはＰＣＲ増幅などの翻訳法を非制限的に含めた）組換え分子生物学法から調製することができ、または天然生物供給源から（好ましくは非哺乳動物供給源、および哺乳動物種に対して病原性がない供給源から）得ることができる。あるいは、本発明の担体ＲＮＡ分子は、分子遺伝学および組換えＤＮＡ／ＲＮＡ分野における１つ以上の従来法を使用して操作可能に連結した、天然部分と合成部分の両方を含有するハイブリッド分子であってよい。特定の適用例では、ＲＮＡ担体分子は、１つ以上の転写開始配列、プライマーまたはプローブ結合ドメイン、官能性結合部位、エクソ−またはエンド−ヌクレアーゼ切断部位、および／または官能性モチーフまたは活性部位から構成され得る。
【０１０７】
用語「本質的に配列番号Ｘで示す配列」は、配列が配列番号Ｘの一部に実質的に相当すること、および配列番号Ｘのヌクレオチドと同一、または生物学上機能的に同等ではない、比較的少ないヌクレオチド（またはポリペプチド配列の場合アミノ酸）を有することを意味する。用語「生物学上機能的に同等」は当技術分野で十分理解されており、本明細書においてさらに詳細に定義する。したがって、本明細書で提供する１つ以上のヌクレオチド配列と同一または機能的に同等である、約８５％から約９０％、またはより好ましくは、約９１％から約９５％、またはさらにより好ましくは、約９６％から約９９％のヌクレオチドを有する配列は、本発明の実施において有用であると特に企図される。
【０１０８】
本発明に適した標準ハイブリダイゼーション条件は、例えば、１６時間４２℃における、５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＣ、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ中でのハイブリダイゼーション、次に所望量のバックグラウンドシグナルを除去するための６０℃における０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液で１時間の連続洗浄を含む。本発明の低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、例えば、１６時間４２℃における、３５％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＣ、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡまたはイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡ中でのハイブリダイゼーション、次に５５℃における０．８×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液での連続洗浄を含む。当業者は、条件を容易に調節して望ましいレベルのストリンジェンシーを得ることができることを理解している。
【０１０９】
当然ながら本発明は、本明細書で述べる１つ以上の特異的配列と相補的である、または本質的に相補的であるＤＮＡセグメントも包含する。「相補的」である核酸配列は、標準的なワトソン−クリック相補性の法則に従い塩基対形成することができる核酸配列である。本明細書で使用する用語「相補的配列」は、前述したのと同じヌクレオチド比較によって評価する、または直前に記載した条件などの比較的ストリンジェントな条件下で、本明細書で開示する１つ以上の特異的核酸セグメントとハイブリダイズすることができるとして定義することができるように、実質的に相補的である核酸配列を意味する。
【０１１０】
前に記載したように、本発明のプローブおよびプライマーは任意の長さであってよい。配列に数値、例えば、第一の残基は１であり、第二の残基は２であるなどを割り当てることによって、全てのプライマーを定義するアルゴリズムを示すことができる：
ｎからｎ＋ｙ
上式でｎは１から配列の最後の数までの整数であり、ｙはプライマーの長さ−１であり、ｎ＋ｙは配列の最後の数を超えない。したがって、２５量体に関して、プローブは塩基１から２５、２から２６、３から２７などに相当する。４５量体に関して、プローブは塩基１から４５、２から４６、３から４７などに相当する。６０量体に関して、プローブは塩基１から６０、２から６１、３から６２などに相当する。
【０１１１】
特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションを測定するのに適した検出可能マーカー（すなわち「標識」）と組合せて、本発明の核酸配列を利用することが有利である。検出することが可能である、蛍光、放射性、酵素または他のリガンド、例えばアビジン／ビオチンなどを非制限的に含めた、広く様々で適切な指標化合物および組成物は当技術分野で知られている。特定の実施形態では、放射性または他の環境上あまり望ましくない試薬の代わりに、蛍光標識、またはウレアーゼ、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼなどの酵素タグの利用を望むことができる。酵素タグの場合、人間の目に見える、または例えばシンチグラフィー、蛍光定量法、分光測定法などの分析法によりサンプルを検出して、１つ以上の相補的もしくは実質的に相補的である核酸配列を含有するサンプルとの特異的ハイブリダイゼーションを確認する方法をもたらすために利用することができる、比色定量、色素生成、または蛍光生成指標基質が知られている。
【０１１２】
一般に、本明細書に記載するハイブリダイゼーションプローブは、特定ヌクレオチドを検出するため、および固相を利用する実施形態において、溶液中ハイブリダイゼーションとＰＣＲの両方の試薬として有用であると想定される。
【０１１３】
ハイブリダイズ後、核酸：プライマー複合体を、鋳型依存性核酸合成を容易にする１つ以上の酵素と接触させる。「サイクル」とも呼ばれる複数ラウンドの増幅を、十分な量の増幅産物が生成するまで実施する。
【０１１４】
次に、増幅産物を検出する。特定の適用例では、目視によって検出を実施することができる。あるいは検出は、取り込まれた放射標識または蛍光標識の化学発光、放射線シンチグラフィーによる、またはさらに電気または熱衝撃シグナルを使用するシステムによる、産物の間接的同定を含むことができる。
【０１１５】
いくつかの鋳型依存性プロセスが、所与の鋳型サンプル中に存在するマーカー配列を増幅するために利用可能である。最もよく知られている増幅法の１つは、それぞれ参照により全容を本明細書に組み込む米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号および同第４，８００，１５９号中に詳細に記載される、（ＰＣＲと呼ばれる）ポリメラーゼ連鎖反応である。
【０１１６】
別の増幅法は、例えば、その明確な参照によりその全容をそれぞれ本明細書に組み込むＥＰＡ  Ｎｏ．３２０３０８および米国特許第４，８８３，７５０号中に開示された、リガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）である。
【０１１７】
その中で制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼを使用して、制限部位の一鎖中のヌクレオチド５’−［α−チオ］−３リン酸を含有する標的分子の増幅を実施する等温増幅法も、本発明の核酸の増幅において有用である可能性がある。
【０１１８】
鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、複数ラウンドの鎖置換および合成、すなわちニックトランスレーションを含む、核酸の等温増幅を実施する別の方法である。鎖修復反応（ＲＣＲ）と呼ばれる同様の方法は、増幅標的領域全体の数個のプローブのアニーリング、次にその中で４塩基の２つのみが存在する修復反応を含む。他の２塩基は、容易な検出のためビオチニル化誘導体として加えることができる。同様の手法がＳＤＡにおいて使用される。標的特異的配列は、環状プローブ反応（ＣＰＲ）を使用して検出することもできる。ＣＰＲでは、非特異的ＤＮＡの３’および５’配列ならびに特異的ＲＮＡの中心配列を有するプローブを、サンプル中に存在するＤＮＡとハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション時、反応混合物はＲＮａｓｅＨで処理し、プローブの産物は消化後に放出される特徴的産物として同定する。原型鋳型は別の環状プローブとアニーリングし、反応は繰り返される。
【０１１９】
生成する「ジ−オリゴヌクレオチド」の配列を有し、したがってジ−オリゴヌクレオチドを増幅する核酸の存在下での２つ（またはより多くの）オリゴヌクレオチドの連結に基づく方法も、本発明の増幅ステップにおいて使用することができる。
【０１２０】
任意の増幅後、特異的増幅が起こったかどうか決定するために、鋳型および過剰プライマーから増幅産物を分離することは望ましい可能性がある。一実施形態では、当業者に知られている従来の方法を使用して、アガロース、アガロース−アクリルアミドまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動によって増幅産物を分離する。
【０１２１】
ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド組成物
本明細書に記載する「核酸」または「ポリヌクレオチド」組成物は、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドのいずれか、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはこれらの任意の組合せもしくは誘導体（例えば、ゲノム、ゲノム外、プラスミド、コスミド、組換え、人工、および／または合成を含む）などを含有する組成物だけには限られないが、これらを含む。このような配列はコードまたは非コード配列、センス、ナンセンス、またはアンチセンス配列であってよく、１つ以上の集団以上のポリヌクレオチド内に存在し得るが、必ずしもその必要はない（本発明のいずれか、ポリヌクレオチドは他の分子および／または担体物質と連結し得るが、必ずしもその必要はない）。
【０１２２】
同様に、本発明のポリヌクレオチド、特に開示する試料回収／輸送媒体において担体ポリヌクレオチドまたはＩＰＣ分子として機能するポリヌクレオチドは、本明細書で例示する本発明の様々な実施形態中で利用する個々の配列と同一、またはさらに実質的に相同である必要はない。本発明者らは、完全性および品質をモニタリングする、および好ましくは、本明細書に記載する組成物において回収、輸送、または保存されるポリヌクレオチドの安定性を増大するためのツールとしての、個々のＤＮＡおよびＲＮＡ対照配列の使用を例示しているが、このような対照配列は、利用する個々のヌクレオチド配列を含有する必要はない。
【０１２３】
実際、いくつかの状況では、開示する回収／輸送／保存組成物において内部対照配列として有用であるポリヌクレオチドは、このような目的で入手、調製、修飾、または合成することが可能である任意の適切な配列を含むことができる。さらに、このような内部対照配列は、開示する製剤を使用として同定しようと努めたウイルス、細菌、真菌、または他の病原体種と有意な相同性または同一性を共有しないことが好ましい。
【０１２４】
あるいは、ＩＰＣとして適したポリヌクレオチドは、本明細書で開示する１つ以上の代表的ＩＰＣ配列と相同的、またはさらに実質的に同一であってよく、およびこのように、適度にストリンジェントな、高度にストリンジェントな、および／またはさらに非常に高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、本明細書で開示する特異的ＩＰＣ配列（またはそれらと相補的である配列）の１つとハイブリダイズすることができる。
【０１２５】
核酸のハイブリダイゼーションに関する方法は分子生物学の分野の当業者には一般的であると考えられ、およびこのように、それらを利用した分析法の詳細な考察を本明細書で与える必要はない。しかしながら、指針として、Ｓｏｕｔｈｅｒｎらによって普及した「適度にストリンジェントな」ハイブリダイゼーション条件は、例えば、約５×標準クエン酸ナトリウムバッファー（ＳＳＣ）、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１．０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（例えばｐＨ８．０）を含有する溶液中での予備洗浄、一晩５×ＳＳＣ中で約５０℃から約６０℃の温度におけるハイブリダイゼーション、次に０．１％のＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣのそれぞれを用いた２０分間約６０から６５℃で２回の洗浄を含むと当技術分野では一般に考えられる。同様に、「ストリンジェントな」ハイブリダイゼーション条件は、例えば、約５×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する溶液中での予備洗浄、一晩５×ＳＳＣ中で約６０℃から約７０℃の温度におけるハイブリダイゼーション、次に０．１％のＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣのそれぞれを用いた２０分間約６５から７０℃で２回の洗浄を典型的には含む。同様に、「高度にストリンジェントな」ハイブリダイゼーション条件の代表例には、約５×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する溶液中での予備洗浄、一晩５×ＳＳＣ中で約７０℃から約７５℃の温度におけるハイブリダイゼーション、次に０．１％のＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣのそれぞれを用いた２０分間約７０℃から約７５℃で２回の洗浄があるが、これらだけには限られない。
【０１２６】
遺伝コードの縮重の結果として、所与の一次アミノ酸配列をコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが、当業者によって理解される。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列と最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドン使用の差が原因で変化するポリヌクレオチドは本発明によって具体的に企図される。
【０１２７】
ＩＰＣは従来の分子生物学の組換え法によって調製することができ、または代替的に、化学合成（例えば、固相ホスホラミダイト化学合成）などを含めた、当技術分野で知られている従来の方法によって全部または一部分を合成することができる。ポリヌクレオチド配列の修飾も、オリゴヌクレオチド定方向部位特異的突然変異誘発などの、標準的な突然変異誘発技法を使用して導入することができる。ＩＰＣのＲＮＡ分子は直接合成することもでき、または代替的に、適切な系（例えば、Ｔ３、Ｔ７、およびＳＰ６ポリメラーゼなど）を使用してＤＮＡ配列のインビトロまたはインビボ転写によって調製することもできる。
【０１２８】
本発明のポリヌクレオチド、特にＩＰＣを調製するために使用するポリヌクレオチドを修飾して、インビトロおよび／またはインビボいずれかでの安定性を増大することができる。このような修飾には、非制限的に、５’末端、３’末端、または両方での隣接配列の添加、骨格中のホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは２’−ｏ−メチルの使用、および／またはイノシン、クエオシンおよびワイブトシン、ならびにアセチル−、メチル−、チオ−、または他の修飾型のアデニン、シチジン、グアニン、チミンおよびウリジン、またはこれらの任意の組合せなどの非従来型塩基の封入がある。
【０１２９】
本明細書に記載するヌクレオチド配列は、確立した組換え技法を使用して、様々な他のヌクレオチド配列と接合または連結させることが可能である。例えば、ＩＰＣとして有用なポリヌクレオチドは、１つ以上のプラスミド、ファージミド、λファージ誘導体およびコスミドを含めた、様々なクローニングベクターのいずれかへのクローニングによって生成することができる。特定対象のベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、および配列決定ベクターがある。一般にベクターは、少なくとも１種の生物において機能的な複製起点、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位および１つ以上の選択可能マーカーを含有する。他のエレメントは所望の用途に依存し、当業者には明らかである。あるいは、ＩＰＣ配列は１つ以上の鋳型依存性、またはアンプリコン定方向組換え生成法によって調製することができる。
【０１３０】
特定の実施形態では、本発明は、開示する回収／保存／輸送媒体に加えて１つ以上のＩＰＣを与える、本明細書で利用するサンプリング／保存／および輸送プロセスの適合度および完全性をモニタリングすることができる、ポリヌクレオチド組成物を提供する。このようなポリヌクレオチド組成物は、特異的ポリメラーゼ、オリゴヌクレオチドプライマー、および／または組換えプローブが結合することができる１つ以上の配列ドメインを含有することができる。例示的な実施形態では、１つ以上の特異的増幅プライマー配列を使用して増幅することができ、ＰＣＳの少なくとも第一配列ドメインと特異的にハイブリダイズする１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを使用して検出および／または定量化することができる陽性対照配列（ＰＣＳ）を含有する、例示的なＩＰＣを利用することができる。特定の実施形態では、所与サンプル中のＰＣＳの量を検出および／または定量化するために蛍光、化学発光、またはＦＲＥＴ特異的検出法を利用する検出プローブを利用することができる。サンプル中のＰＣＳの検出によって、本明細書で利用するワンステップ回収／保存／輸送溶液の有効性および適合度をモニタリングするための内部参照標準をもたらすことができる。本発明のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、１つ以上のＰＣＳの選択的増幅および検出用に設計することができる。このようなプライマー配列は、ハイブリダイゼーション法中、および（例えば、リアルタイムＰＣＲ分析、ＲＴ−ＰＣＲなどを含めた）ＰＣＲベースの増幅法などの増幅法中での使用に適している。同様に、開示するオリゴヌクレオチド検出プローブは、本明細書に開示する１つ以上対の増幅プライマーを使用した核酸の増幅から生じた産物の、検出および定量化に適した標識による標識に適している。
【０１３１】
適切なマーカーで標識するとき、オリゴヌクレオチド検出プローブは、例えばＦＲＥＴベースの分析を介した検出を含めた、回収／保存媒体（非制限的にＰＳＳ製剤含む）中に含有されるＩＰＣ特異的ヌクレオチド配列の蛍光ベースの検出に特に適している。ＦＲＥＴ標識検出プローブは、例えばＦＲＥＴベースの微小体積蛍光検出デバイスを含めた蛍光検出法において特に有用である。１つ以上の増幅および検出用オリゴヌクレオチドの使用は、組合せリアルタイムＰＣＲ／微小体積蛍光ＦＲＥＴベースの方法（リアルタイムＰＣＲ−ＦＲＥＴ）において特に、特にＩｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．（Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ、ＵＴ、ＵＳＡ）によって開発され、現在Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）によって製造および市販されている「ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）」装置によって容易になる分析において企図される。
【０１３２】
内部陽性対照（ＩＰＣ）配列
例示的な実施形態では、本発明は、前に開示した任意の１つ以上の配列、特に配列番号２から配列番号１３のいずれか１つで開示する配列と好ましくは少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上同一である核酸配列を含む、これらから本質的になる、またはこれらからなるＩＰＣ配列をさらに提供する。
【０１３３】
関連実施形態では、本発明は、配列番号１、または配列番号１４から配列番号２３で開示する配列の任意の１つ以上由来の少なくとも３０隣接ヌクレオチド配列と好ましくは少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上同一である核酸配列を含む、これらから本質的になる、またはこれらからなる鋳型アンプリコンを使用してインビトロで合成されるＩＰＣ配列をさらに提供する。
【０１３４】
ポリヌクレオチド増幅キット
本発明は、ＩＰＣ、特に、ＰＳＳ製剤を非制限的に含む本明細書に開示する製剤の１つの中に含有されるＲＮＡまたはＤＮＡＩＰＣ配列を検出および／または増幅するためのキットをさらに提供する。このようなキットは、ＩＰＣ特異的配列を増幅するのに必要な２個以上の構成要素を典型的に含み、このような構成要素は化合物、試薬、容器および／または機器であってよい。例えば、キット内の一容器は第一のプライマーを含有することができ、一方キット内の第二の容器は第二のプライマーを含有することができる。キット内の第三の容器は、一組のハイブリダイゼーションプローブ、またはプローブを標識するための１つ以上の蛍光プローブを含有することができる。さらに、本発明のキットは、使用説明書、例えば、本明細書に記載する増幅および／または検出反応中でプライマー、および１つ以上の蛍光分子、または必要に応じて、例えば、バッファー、酵素、ポリメラーゼ、ＲＮａｓｅｓなどだけには限られないが、これらを含めた他の試薬を使用するための説明書も含むことができる。
【０１３５】
本発明は、診断ツールの単離、検出、増幅、または定量化において利用することができる、１つ以上の担体ＲＮＡまたはＤＮＡ組成物、ならびに１つ以上の回収／輸送／保存溶液（ＰＳＳ製剤を非制限的に含む）、または適合性のある賦形剤、バッファー担体、希釈剤、アジュバント、および／または他の構成要素を提供する。
【０１３６】
リアルタイムＰＣＲベースのＦＲＥＴ検出
リアルタイムＰＣＲおよびＦＲＥＴ法は文献中で十分記載されている（例えば、その明確な参照によりその全容をそれぞれ本明細書に具体的に組み込む、米国特許第４，９９６，１４３号、同第５，５６５，３２２号、同第５，８４９，４８９号、同第６，１６２，６０３号を参照）。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）プラットホームは、遺伝子突然変異スクリーニングおよび分析における著しい躍進である。このシステムは、２０分未満で３０ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）サイクルを実施することができる、迅速な、エア駆動式の熱循環装置を組み込む。それは蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブを検出し定量化するためのインライン微小体積蛍光検出装置を利用し、融解曲線の分析値を決定するのに必要なデータを提供する。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）プラットホームは、遺伝子分析ツールの開発を容易にするため、および特異的ヌクレオチド配列、および遺伝子突然変異のアッセイ用の迅速な定量法をもたらすための革新的装置となる。増幅および検出法における装置の詳細な適用は、製造者のウエブサイト上、および製品適用マニュアル中で見ることができる。この技術は、例えば（その明確な参照によりその全容をそれぞれ本明細書に具体的に組み込む）ＰＣＴ  Ｉｎｔｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｕｂｌ．Ｎｏｓ．ＷＯ９７／４６７０７、ＷＯ９７／４６７１４およびＷＯ９７／４６７１２を含めてさらに記載されている。
【０１３７】
臨床診断検査所用の試料回収
回収は、ウイルスを含めた病原体からのおそらく最小量の核酸の検出を必要とする、診断基盤または分子学的プロトコールにおける第一のステップである。核酸ベースの検出戦略の機能的進展および主流診断検査所へのそれらの組み込みを容易にするために、前述の基盤などの下流の核酸ベースの検出に利用する目的で具体的に開発された、確かな、確固たる、標準化された回収システムに関する多大な必要性が存在する。本発明は代替的に、医院または手術室からの核酸の運搬、または代替的に病院などの総括局への運搬に適合させることが可能である。
【０１３８】
臨床または獣医学的試料または法医学的または環境サンプル回収システムは、効率よく、
１）当技術分野で現在入手可能な収量を超える高収量の適切な試料を入手し、
２）おそらく感染性がある生物病原体を、それらがもはや生命力がなく、病原体放出もしくは汚染の恐れが最小限で、処理、出荷、または運搬することができるように不活性化し、または
３）サンプルを診断検査所で処理することができるまで、および好ましくはこれらの目標の２つ以上、または３つ全てを達成するため、周囲温度で長期間、加水分解またはヌクレアーゼ分解から溶解した「裸状態の」ＲＮＡ／ＤＮＡポリマーを有効に安定化し保存するための、
１つ以上の回収ツールおよび１つ以上の試薬を含むことができる。
【０１３９】
本明細書で記すように、本発明のサンプル回収／輸送／保存溶液は、従来技術で入手可能な改善に優るいくつかの有意な改善をもたらすことができる。例示的な利点は、以下の１つ以上を非制限的に含む：
・微生物、ウイルス、または病原体の不活性化、殺滅、および／または溶解、
・ＲＮａｓｅおよび／またはＤＮａｓｅを非制限的に含む外因性または内因性ヌクレアーゼの破壊および／または不活性化、
・様々な従来の核酸抽出、精製、および増幅システムとの適合性、
・サンプル内のＲＮＡおよび／またはＤＮＡ完全性の保存、
・周囲温度、さらに長期間、または極端な温度変化での運搬および出荷の容易化、および
・単離核酸の短期（数時間から数日間）、中期（数日間から数週間）、または長期（数週間から数カ月）期間の保存の適性。
【０１４０】
開示する組成物は、ポイントオブケア、実地試験、在宅ヘルスケアまたは試験、トリアージ／緊急性および災害評価（複数可）、モバイルフォレンジック、病理学、疫学的サンプリング、犯罪現場捜査、父親鑑定、妊娠前および妊娠後遺伝子スクリーニング、レイプ／近親相姦鑑定、ファミリーカウンセリング、性感染症の機密試験（ＨＩＶ、梅毒、クラミジア、淋病、および他の性病などを非制限的に含む）に非常に良く適している。同様に、開示する組成物は、特にウイルス「転位および移動」を予想および管理するため、および出現中もしくは発生中の流行性疾患、汎発性疾患などを同定または管理するための、インフルエンザ含有試料の回収および分析を含めて、病因のモニタリング、および国内と海外両方でのヒトもしくは動物集団中の流行性もしくは汎発性疾患の調整とも非常に関連し得る。
【０１４１】
特定の実施形態では、本発明の方法を使用して単離した核酸は、遺伝子フィンガープリント法、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）ＰＣＲ、制限酵素断片長多型分析（ＲＦＬＰ）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド分析（ＡＳＯＡ）、マイクロサテライト分析、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、様々な数のタンデムリピート（ＶＮＴＲ）ＰＣＲ、ドットブロットハイブリダイゼーション、ポリメラーゼサイクリングアセンブリー（ＰＣＡ）、ネストＰＣＲ、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、非対称ＰＣＲ、ＤＮＡフットプリンティング、一塩基多型（ＳＮＰ）遺伝子型決定、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、多重ＰＣＲ（ｍ−ＰＣＲ）、多重連結反応依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）、連結反応仲介型ＰＣＲ（ＬｍＰＣＲ）、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＰＣＲ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、オーバーラップエクステンションＰＣＲ（ＯＥ−ＰＣＲ）、完全ゲノム増幅（ＷＧＡ）、プラスミド単離、対立遺伝子増幅、部位特異的突然変異誘発、ハイスループット遺伝子スクリーニングなど、またはこれらの任意の組合せを非制限的に含めた、１つ以上の後の分子生物学用途、アッセイ、または技法において鋳型として働くことができる。
【０１４２】
一実施形態では、試料回収／保存／輸送製剤は、長期間、特に、例えば、従来のサンプル回収媒体によって与えられる時間期間より実質的に長い時間期間、試料から遊離したポリヌクレオチド集団中の少なくとも第一の核酸の安定性を保持、延長、容易化、または維持する。
【０１４３】
組成物は、周囲環境条件下でサンプルを回収、または保存するときでさえ、回収サンプルの冷蔵、または凍結を必要とせずに、少なくとも約７日、好ましくは少なくとも約１４日、より好ましくは、少なくとも約２１日、およびより好ましくはさらに、少なくとも約２８、３５、４２、５６、６３、または約７０日以上を非制限的に含めた時間の間、このようなポリヌクレオチド単離集団が由来する１つ以上の核酸セグメントの保持および安定化を容易にすることが好ましい。このような改善された試料保存性は、遠隔位置、または温帯、亜熱帯もしくは熱帯気候で、このようなサンプルを回収または保存するとき特に望ましい。
【０１４４】
別の実施形態では、本発明は、冷凍または凍結条件下でのサンプルの選別を必要とせずに、少なくとも約５日、少なくとも約１０日、好ましくは少なくとも約１５日、より好ましくは、少なくとも約２０日、またはより好ましくはさらに、少なくとも約２５日以上を非制限的に含めた長時間の間、サンプルから放出されたポリヌクレオチド集団内に含有される１つ以上の核酸の完全性および適合度の維持において、生物起源のサンプルから核酸を調製するための開示する組成物の使用を提供する。
【０１４５】
開示する方法を実施する際に得られる核酸は、いくつかの従来の分子および診断単離、精製、検出、および／または分析法と有利に適合する。開示する組成物は、核酸単離、精製、増幅、および分子分析および／または診断試験、アッセイ、分析、または特徴付けなどを非制限的に含めた様々な後の方法において使用するための、安定状態の、実質的に非分解状態のポリヌクレオチドの集団の、回収保存、および運搬を容易にする。
【０１４６】
本発明の例示的な市販のキット
以下の概要は、本発明のＰＳＳ製剤を利用する例示的な市販のキットを与える（図５）。
【０１４７】
剥離ポーチ回収システム
１．５ｍＬのＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（商標）溶液を含有する５ｍＬチューブ、回収用スワブ（例えば、ＦｌｏｃｋｅｄＳＷＡＢＳ（登録商標）［Ｃｏｐａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．、Ｍｕｒｒｉｅｔａ、ＣＡ、ＵＳＡ］）、およびサンプルの回収および／または処理に関する説明書。（例えば、５０ポーチ／単位でパック状態）（このようなシステムの概略的実証に関しては図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、および図４Ｅを参照）。
【０１４８】
ＰＲＩＭＥＳＴＯＲＥ（商標）ストック溶液
製剤化後、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（商標）ストック溶液は、少なくとも１年以上の間４℃以下で安定状態である。製剤化ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（商標）溶液は、数カ月の間周囲温度（例えば、約２０−３０℃）で安定状態であることも示されている。
【０１４９】
本明細書に開示するＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（商標）製剤とサンプルを接触させた後、核酸組成物、サンプルの適合度または完全性を著しく消失せずに、冷蔵下で少なくとも１年以上０℃以下の温度で（例えば、約４℃、および少なくとも３０日以上、周囲温度（例えば、約２０−３０℃）で）無期限に保存されることは、道理的に予想することができる。例えば、非制限的に、サンプルを含む組成物を、約３０日から約６０日の間約−２０℃から約４０℃の温度で保存するとき、サンプルから得るポリヌクレオチド集団の完全性は、検出可能な分解なしで少なくとも実質的に維持される、および好ましくは完全に維持される。
【０１５０】
環境サンプル用の回収キット
環境サンプルの回収用の開示する製剤の例示的な市販のパッケージは、有効量の保存溶液を含有する回収容器（例えば、０．１ｍＬ、０．２ｍＬ、０．２５ｍＬ、０．５ｍＬ、０．７５ｍＬ、または１ｍＬのＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（商標）溶液をそれぞれ含有する、０．１−、０．２−、０．５−、１−、２−、または３−ｍＬ回収バイアル）、およびサンプルの回収および／または処理に関する説明書を非制限的に含む。回収容器は、示される試料（複数可）または回収法（複数可）に応じて、必要に応じてより小さいまたはより大きい大きさに分類またはパッケージすることができる。特定の適用例では、多数の容器に個々の回収デバイスをパッケージすることが望ましい可能性もある（例えば、１０または２０回収デバイス／単位パッケージを含有する市販のパックを非制限的に含む）。
【０１５１】
配列の比較、同一性、および相同性
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈での用語「同一」または「同一性」の割合は、以下に記載する配列比較アルゴリズム（または当業者が利用可能な他のアルゴリズム）の１つを使用してまたは目視により測定して、最大対応性に関して比較しアラインメントをとるとき、同一であり、または同一である特定割合のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有する、２つ以上の配列または部分列を指す。
【０１５２】
２つ以上の核酸の文脈での語句「実質的に同一な」は、配列比較アルゴリズムを使用してまたは目視により測定して、最大対応性に関して比較しアラインメントをとるとき、少なくとも約９０％、好ましくは９１％、最も好ましくは約９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％以上のヌクレオチド残基同一性を有する、２つ以上の配列または部分列を指す。このような「実質的に同一な」配列は、実際の起源を参照せずに「相同的」であると典型的に考えられる。
【０１５３】
配列比較および相同性決定用に、典型的には１つの配列が、試験配列と比較する参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験配列と参照配列はコンピュータへの入力値であり、部分列座標を示し、必要な場合、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを示す。次いで、配列比較アルゴリズムを使用して、示されるプログラムのパラメータに基づき、参照配列に対する試験配列（複数可）の配列同一率を計算することができる。
【０１５４】
比較用配列の最適アラインメントは、例えば局所相同性アルゴリズムによって（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ、１９８１参照）、相同性アラインメントアルゴリズムによって（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ、１９７０参照）、類似性比較検索法によって（例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ、１９８８参照）、コンピュータによるＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡなどのアルゴリズムの実行によって、または目視によって実施することができる。配列同一率および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０）およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９８９参照）である。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して公に利用可能である。
【０１５５】
配列同一率を計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２配列間の類似性の統計分析も実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ、１９９３参照）。有用な配列アラインメントアルゴリズムの別の例は、累進、ペアワイズアラインメントを使用して一群の関連配列から多重配列アラインメントを作成するＰＩＬＥＵＰプログラムである。それはアラインメントを作成するために使用するクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは累進アラインメント比較法の簡略化を使用し（例えば、Ｆｅｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８７参照）、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ（１９８９）により記載されたのと同様の一般的なアラインメントマトリクスを利用する。
【０１５６】
例示的な定義
他に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載するのと同等または均等な任意の方法および組成物を、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および組成物を本明細書に記載する。本発明の目的で、以下の用語を以下に定義する：
本明細書で使用する用語「約」と「およそ」は交換可能であり、所与の数値周辺の一定範囲の数値、および列挙する数値範囲内の全ての数値を指すと一般に理解されるはずである（例えば、他に言及しない限り「約５から１５」は「約５から約１５」を意味する）。さらに、本明細書における全ての数値範囲は、その範囲内のそれぞれの完全整数を含むと理解されるはずである。
【０１５７】
本明細書で使用する用語「担体」は、関連動物への投与に薬学的に許容され、または該当する場合診断目的に許容される、任意の溶媒（複数可）、分散媒、コーティング（複数可）、希釈剤（複数可）、バッファー（複数可）、等張剤（複数可）、溶液（複数可）、縣濁液（複数可）、コロイド（複数可）、不活性剤（複数可）など、またはこれらの組合せを含むものとする。一般に化学化合物、ならびに特にペプチドおよびエピトープの１つ以上の送達媒体の使用は、薬剤分野の当業者によく知られている。いずれかの従来の培地または作用物質が活性成分と不適合である場合を除いて、診断、予防、および治療組成物におけるその使用が企図される。１つ以上の補助活性成分（複数可）を、１つ以上の開示する免疫原性組成物と共に取り込む、または投与することも可能である。
【０１５８】
本明細書で使用する用語「核酸」は、１つ以上の型の（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有する）ポリデオキシリボヌクレオチド、（Ｄ−リボースを含有する）ポリリボヌクレオチド、およびプリンもしくはピリミジン塩基、または修飾プリンもしくはピリミジン塩基（脱塩基部位を含む）のＮ−グリコシドである任意の他の型のポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用する用語「核酸」は、典型的にはサブユニット間のホスホジエステル結合によって、ただしいくつかの場合はホスホロチオエート、メチルホスホネートなどによって共有結合した、リボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドのポリマーも含む。「核酸」は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖ＲＮＡを含む。例示的な核酸には、非制限的に、ｇＤＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小核小体ＲＮＡ（ｓｎＯＲＮＡ）、低分子小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、および低分子一過性ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）など、およびこれらの任意の組合せがある。
【０１５９】
本明細書で使用する用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は交互に使用し、２つ以上のアミノ酸残基が一緒になって結合した少なくとも１つのアミド結合を含む分子を含む。交互に使用するが、一般に、ペプチドは比較的低分子であり（例えば、２から約１００アミノ酸残基長）、一方タンパク質またはポリペプチドは比較的長鎖のポリマーである（例えば、１００以上の残基長）。しかしながら、鎖の長さによって具体的に定義しない限り、用語ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質は交互に使用する。
【０１６０】
本明細書で使用する「サンプル」は、対象の物質を含有する、またはそれを含有すると推定される任意の物体を含む。したがって、それは対象の核酸、タンパク質、または別の生物分子を含有する組成物であってよい。したがって用語「サンプル」は、溶液、細胞、組織、または核酸（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、他の細胞分子など）の集団を含む１つ以上のこれらの集団を包含することができる。用語「核酸供給源」、「サンプル」、および「試料」は、広い意味で本明細書において交互に使用し、対象の核酸、タンパク質、１つ以上の他の生物分子、またはこれらの任意の組合せを含有する様々な生物供給源を包含するものとする。例示的な生物サンプルには、全血、血漿、血清、喀痰、尿、大便、白血球細胞、赤血球細胞、バフィーコート、スワブ（口腔スワブ、咽頭スワブ、膣スワブ、尿道スワブ、頸部スワブ、直腸スワブ、病巣スワブ、膿瘍スワブ、鼻咽頭スワブなどを非制限的に含む）、尿、大便、喀痰、涙、粘液、唾液、精液、膣液、リンパ液、羊水、髄液または脳脊髄液、腹膜滲出液、胸膜滲出液、滲出物、皮膚病変、上皮スメア、バイオプシー、骨髄サンプル、嚢胞または膿瘍含有物由来の液体、滑液、硝子体液または水様液、洗眼薬または吸引液、肺洗浄液または肺吸引液、ならびに肝臓、脾臓、腎臓、肺、腸、脳、心臓、筋肉、膵臓など、およびこれらの任意の組合せだけに限られないが、これらを含めた臓器および組織があるが、これらだけには限られない。いくつかの実施形態では、サンプルは、蚊、またはダニ、または他の昆虫（複数可）などのベクターとして働く生物であってよく、またはこれらに由来してよい。
【０１６１】
移植材料、初代細胞、二次細胞系などを含めた組織培養細胞、ならびに任意の細胞から得た溶解物、ホモジェネート、抽出物、または材料も、本明細書で使用する用語「生物サンプル」の意味の範囲内にある。生物サンプル上または中に存在し得る、微生物（原始細菌および真正細菌、シアノバクテリア、真菌、酵母、カビ、放線菌、スピロヘータ、およびマイコプラズマなどの原核生物を非制限的に含む）、ウイルス（オルソヘパドナウイルス属［例えば、Ａ、Ｂ、およびＣ型肝炎ウイルスを含む］、ヒトパピローマウイルス、フラビウイルス属［例えば、デングウイルスを含む］、リサウイルス属［例えば、狂犬病ウイルスを含む］、モルビリウイルス属［例えば、麻疹ウイルスを含む］、シンプレックスウイルス属［例えば、単純ヘルペスウイルスを含む］、ポリオーマウイルス属、ルブラウイルス属［例えば、ムンプスウイルスを含む］、ルビウイルス属［例えば、風疹ウイルスを含む］、バリセロウイルス属［例えば、水痘ウイルスを含む］、ロタウイルス、コロナウイルス、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、パルボウイルス、レトロウイルス、ワクシニア、ポックスウイルスなどを非制限的に含む）、藻類、原生動物、原生生物、植物、コケ類など、および前述のいずれかの任意の組合せも本発明の範囲内にあり、臨床または法医学設定から得られる１つ以上の核酸を含有する任意の材料も本発明の範囲内にある。当業者は、任意の前述の例示的生物サンプルから得た溶解物、抽出物、または材料も、本発明の範囲内にあることをさらに理解している。
【０１６２】
本明細書で使用する用語「バッファー」は、酸またはアルカリをバッファーを含む溶液または組成物に加えるとき、ｐＨの変動に耐性がある１つ以上の組成物、またはその水溶液を含む。ｐＨの変化に対するこの耐性はこの溶液の緩衝能力によるものであり、組成物中に含まれる１つ以上の特定化合物の関数であり得る。したがって、緩衝活性を示す溶液または他の組成物はバッファーまたはバッファー溶液と呼ぶ。バッファーは一般に、溶液または組成物のｐＨを維持する無限の能力を有するわけではなく、そうではなく、バッファーは典型的に、特定範囲内、例えば約５から７のｐＨにｐＨを維持することができる。
【０１６３】
本明細書で使用する用語「生物分子」は、細胞内で見られる、またはウイルスを含む生きた生物によって生成される任意の分子を指す。生物分子は、核酸、タンパク質、炭水化物、および脂質だけには限られないが、これらを含むことができる。本明細書で使用する「細胞」は、独立して働くことができ、細胞膜によって囲まれた細胞質および様々なオルガネラで構成される生物の最小構造単位を指す。これは、細菌および原生生物などの独立して働く細胞、または白血球および赤血球などのより大きな生物内で生存する細胞だけには限られないが、これらを含むことができる。本明細書で定義するように、成熟ヒト赤血球細胞など、細胞は核を有していない可能性がある。
【０１６４】
本発明の実施においてサンプルは新鮮な状態で使用することができ、または、例えば凍結乾燥、凍結、もしくは冷蔵サンプルなどを含めて、一定期間、もしくは長期間保存した後に使用することができ、臨床、獣医学的、環境または法医学的起源の材料を含むことができ、食品、飲料、供給材料、飲料水源、排水流、工業排水または流出水、天然水源、土壌、空気伝染源、パンデミックもしくはエピデミック集団、疫学サンプル、研究材料、病理集団、疑わしいバイオテロ因子、犯罪現場の証拠などから単離することができる。
【０１６５】
本明細書で使用する用語「患者」（「宿主」または「対象」とも交互に呼ぶ）は、本明細書で論じる１つ以上の生物サンプルもしくは試料の供給源として働くことができる任意の宿主を指す。特定の態様では、ドナーは任意の動物種（および好ましくは、人間などの哺乳動物種）を示すと考えられる脊椎動物である。特定の実施形態では、「患者」は、家畜、集団または移動性動物もしくは鳥類、外来または動物学的試料、ならびにコンパニオンアニマル、ペット、および獣医師のケア下の任意の動物を非制限的に含む、ヒトおよび非ヒト霊長類、鳥類、爬虫類、両生類、ウシ、イヌ、ヤギ、テンジクネズミ、カラス、エピン、ウマ、ネコ、ヤギ、去勢ウサギ、ウサギ、オオカミ、ネズミ、ヒツジ、ブタ、競走馬、キツネなどだけには限られないが、これらを含めた任意の動物宿主を指す。本発明を使用して、有蹄類の消耗性疾患、結核、エボラ、ＳＡＲＳ、および鳥インフルエンザを非制限的に含む様々な世界人口に関する疾患の大発生、進行、および疫学統計をモニタリングすることもできる。特定の実施形態では、サンプルは哺乳動物起源であることが好ましく、およびより好ましくはヒト起源である。
【０１６６】
本明細書で使用する用語「カオトロープ」または「カオトロープ剤」は、例えば、非制限的に、一次構造を完全に保ちながらのタンパク質または核酸の二次、三次、または四次構造の変化によって、タンパク質または核酸の障害を引き起こす物質を含む。
【０１６７】
本明細書で使用する用語「例えば」は単に例によって使用し、制限することは目的とせず、明確に列挙する項目のみを指すと解釈すべきではない。
【０１６８】
本明細書で使用する用語「実質的に含まない」または「本質的に含まない」は、組成物が約１０重量パーセント未満、好ましくは約５重量パーセント未満、およびより好ましくは約１重量パーセント未満の化合物を含有することを典型的に意味する。好ましい実施形態では、これらの用語は、約０．５重量パーセント未満、より好ましくは約０．１重量パーセント未満、またはさらに約０．０１重量パーセント未満を指す。この用語は、化合物または他の言及する性質を完全に含まない組成物も包含する。分解または劣化に関して、用語「実質的」は前述の重量パーセントを指すこともでき、したがって実質的分解の予防は、約１５重量パーセント未満、約１０重量パーセント未満、好ましくは約５重量パーセント未満などが損害を受けて分解することを指す。他の実施形態では、これらの用語は、用語「実質的に」が約１０パーセント未満、約５パーセント未満などの病原活性が残存することを指す、用語「実質的に非病原性」に関してと同様に、重量パーセントではなく単なるパーセントを指す。
【０１６９】
本明細書で使用する用語「異種」は、所定の参照核酸配列に関して定義する。例えば、構造遺伝子配列に関して、異種プロモーターは、参照構造遺伝子と隣接して本来存在しないが、分子生物学分野の当業者により通常使用される１つ以上の研究室内操作で人の手によって配置されるプロモーターとして定義する。同様に、異種遺伝子または核酸セグメントは、参照配列、プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメント（複数可）などと隣接して本来存在しない遺伝子または核酸セグメントとして定義する。
【０１７０】
本明細書で使用する用語「相同性」は、２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の相補性の程度を指す。語句「同一性」は、第一の核酸またはアミノ酸配列が第二の核酸またはアミノ酸配列と全く同じ一次配列を有するとき、語句「相同性」に置き換えることができる。配列相同性および配列同一性は、当技術分野で知られているアルゴリズムおよびコンピュータプログラムを使用して、２つ以上の配列を分析することによって決定することができる。このような方法を使用して、所与の配列が別の選択配列と同一または相同であるかどうか評価することができる。
【０１７１】
本明細書で使用する「相同的」は、ポリヌクレオチドを指すとき、異なる起源から生じたにもかかわらずほぼ同じヌクレオチド配列を有する配列を意味する。典型的には、相同的核酸配列は、密接に関連した遺伝子、または１つ以上の実質的に類似したゲノム配列を有する生物に由来する。対照的に、「類似的」ポリヌクレオチドは、異なる種または生物に由来するポリヌクレオチドと同じ機能を共有するが、類似した機能を果たす１つ以上のタンパク質もしくはポリペプチドをコードする有意に異なる一次ヌクレオチド配列を有し、または類似した生物活性を保有する可能性があるポリヌクレオチドである。類似的ポリヌクレオチドは、しばしば、（例えば、遺伝的もしくは系統的のいずれかで）密接に関係がない２種以上の生物に由来し得る。
【０１７２】
２つ以上の核酸またはポリヌクレオチド配列の文脈での用語「同一的」または「同一性」率は、配列比較アルゴリズムを使用して、または手動アラインメントおよび目視により測定して、比較ウインドウで最大対応性に関して比較しアラインメントをとるとき、同一でありまたは同一である特定割合のヌクレオチドを有する２つ以上の配列または部分列を指す。
【０１７３】
「プライマー」または「プライマー配列」は、相補的鋳型核酸鎖（「標的配列」）と選択的にハイブリダイズし、鋳型鎖を複製するためのヌクレオチド付加の開始地点として機能する、任意の核酸配列またはセグメントを含むことができる。本発明のプライマー配列は標識することができ、または増幅産物の検出および／または分析を可能にする他の修飾を含有することができる。標的ＤＮＡ配列のポリメラーゼ仲介複製の開始剤として働く以外に、プライマー配列は、対応するＤＮＡへの鋳型ＲＮＡの逆転写に使用することもできる。
【０１７４】
本明細書で使用する「標的配列」または「標的ヌクレオチド配列」は、ポリメラーゼ活性を有する酵素がプライマー配列を延長させ、それによって相補鎖を複製する条件下で、前記プライマー配列の１つがハイブリダイズする任意のヌクレオチド配列を含む。
【０１７５】
本明細書で使用する用語「操作可能に連結している」は、機能的関係における２つ以上のポリヌクレオチドまたは２つ以上の核酸配列の連結を指す。それが別の核酸配列と機能的関係に位置するとき、核酸は「操作可能に連結している」。例えば、それがコード配列の転写に影響を与える場合、プロモーターまたはエンハンサーはコード配列と操作可能に連結している。「操作可能に連結している」は、連結している核酸配列は典型的には隣接しており、または実質的に隣接しており、および必要な場合、隣接およびリーディングフレームの２つのタンパク質コード領域と接合していることを意味する。エンハンサーは一般にプロモーターから数キロベース離れているときに機能し、イントロン配列は様々な長さであり得るが、しかしながら、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは隣接しておらず、操作可能に連結している可能性がある。
【０１７６】
「転写単位」は、少なくとも第一のシス作用性プロモーター配列と操作可能に連結し、および任意に構造遺伝子配列の有効な転写に必要な１つ以上の他のシス作用性核酸配列と操作可能に連結した、少なくとも第一の構造遺伝子を含むポリヌクレオチド配列、およびプロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントの制御下で操作可能に位置する構造遺伝子配列の適切な組織特異的および発生段階転写に必要とされ得る少なくとも第一の遠位制御エレメント、および有効な転写および翻訳に必要な任意の別のシス配列（例えば、ポリアデニル化部位（複数可）、ｍＲＮＡ安定化制御配列（複数可）など）を指す。
【０１７７】
語句「単離」または「生物学的に純粋」は、それがその天然状態で見られる物質に通常付随する構成要素を実質的、または本質的に含まない物質を指す。したがって、本発明による単離ポリヌクレオチドは、それらの天然、またはインシチュー、環境においてポリヌクレオチドと通常結合した物質を含有しないことが好ましい。
【０１７８】
「連結」または「接合」は、組換え融合、共有結合、ジスルフィド結合、イオン結合、水素結合、静電気的結合などを非制限的に含む、１つ以上のタンパク質、ペプチド、核酸、またはポリヌクレオチドを機能的に結びつけるための当技術分野で知られている任意の方法を指す。
【０１７９】
用語「病原体」は、例えば、ウイルス、プリオン、原生動物、寄生虫、ならびに例えば細菌、酵母、カビ、真菌などの微生物を含めた、任意の種類の感染因子として本明細書では定義する。
【０１８０】
本明細書で使用する用語「プラスミド」は、遺伝物質（すなわち、核酸）で構成される遺伝子構築物を指す。典型的にプラスミドは、細菌宿主細胞、例えばイーコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）において機能性がある複製起点、およびプラスミドを含む細菌宿主細胞を検出するための検出可能マーカーを含有する。本発明のプラスミドは、挿入コード配列が真核細胞内で転写および翻訳することができるように配置した、本明細書に記載する遺伝子エレメントを含むことができる。さらにプラスミドは、天然または人工供給源由来の１つ以上の核酸を含むことができる。
【０１８１】
本明細書で使用する用語「ポリペプチド」は、１つの「ポリペプチド」および複数の「ポリペプチド」を包含し、２つ以上のアミノ酸の任意の１つ以上の鎖を含むものとする。したがって、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「タンパク質」、「酵素」、「アミノ酸鎖」、および「隣接アミノ酸配列」だけには限られないが、これらを含めた本明細書で使用する用語はいずれも「ポリペプチド」の定義内に包含され、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはこれらと交互に使用することができる。この用語は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化、タンパク質分解切断、翻訳後プロセシング、または１つ以上の非天然アミノ酸の封入による修飾だけには限られないが、これらを含めた、１つ以上の翻訳後修飾（複数可）を経たポリペプチドをさらに含む。ポリヌクレオチドおよびポリペプチド構造に関する従来の命名が当技術分野に存在する。例えば、一文字および三文字の略語がアミノ酸を記載するために広く利用されている。アラニン（Ａ；Ａｌａ）、アルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）、アスパラギン（Ｎ；Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ｄ；Ａｓｐ）、システイン（Ｃ；Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｑ；Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｅ；Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇ；Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈ；Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉ；Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌ；Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍ；Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｆ；Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐ；Ｐｒｏ）、セリン（Ｓ；Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔ；Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｗ；Ｔｒｐ）、チロシン（Ｙ；Ｔｙｒ）、バリン（Ｖ；Ｖａｌ）、およびリシン（Ｋ；Ｌｙｓ）。本明細書に記載するアミノ酸残基は「Ｌ」異性体型であることが好ましい。しかしながら、ポリペプチドの望ましい性質が保持されるという条件で、「Ｄ」異性体型の残基を任意のＬ−アミノ酸残基に置換することができる。
【０１８２】
「タンパク質」は本明細書では「ペプチド」および「ポリペプチド」と交互に使用し、合成、組換え、またはインビトロで生成したペプチドとポリペプチドの両方、ならびに核酸配列を宿主動物またはヒト対象に投与した後にインビボで発現したペプチドおよびポリペプチドを含む。用語「ポリペプチド」は、約２から約２０アミノ酸残基長の短鎖ペプチドのポリペプチド、約１０から約１００アミノ酸残基長のオリゴペプチド、および約１００以上のアミノ酸残基長を含むポリペプチドを含めた、全てのアミノ酸鎖長を指すことを意図することが好ましい。用語「配列」は、アミノ酸を指すとき、所与のアミノ酸鎖内の直線状Ｎ末端からＣ末端順のアミノ酸の全部または一部、例えばポリペプチドまたはタンパク質に関するものであり、「部分列」は、配列内のアミノ酸の任意の連続延長部分、例えば、所与のタンパク質またはポリペプチド配列内の少なくとも３連続アミノ酸を意味する。ヌクレオチドおよびポリヌクレオチド鎖を参照すると、「配列」と「部分列」は５’から３’順のヌクレオチドに関して類似した意味を有する。
【０１８３】
本明細書で使用する用語「実質的に相同的」は、一次ヌクレオチド配列レベルで互いに有意に類似した２つ以上の生物分子配列を包含する。例えば、２つ以上の核酸配列の文脈で、「実質的に相同的」は、少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、およびより好ましくは少なくとも約８５％または少なくとも約９０％同一である、およびさらにより好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９７％同一である、より好ましくは少なくとも約９８％同一である、より好ましくは少なくとも約９９％同一である、およびさらにより好ましくはさらに、少なくとも実質的にまたは完全に１００％同一であること（すなわち「不変」）を指すことができる。
【０１８４】
同様に、本明細書で使用する用語「実質的に同一」は、ヌクレオチドレベルで互いに高度の同一性を示す２つ以上の生物分子配列（特にポリヌクレオチド配列）を包含する。例えば、２つ以上の核酸配列の文脈で、「実質的に同一」は、少なくとも約８０％、およびより好ましくは少なくとも約８５％または少なくとも約９０％互いに同一である、およびさらにより好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９７％同一である、より好ましくは少なくとも約９８％同一である、より好ましくは少なくとも約９９％同一である、およびさらにより好ましくは一層、少なくとも実質的にまたは完全に１００％同一である（すなわち「非縮重」）配列を指すことができる。用語「組換え体」は、物質（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）が人間の介入によって人為的または合成的に（不自然に）変化したことを示す。その天然環境または状態内、またはそこから除去した物質に、変更を実施することができる。具体的には、例えばプロモーター配列は、人間の手により操作された核酸セグメントの発現によってそれが生成されるとき「組換え体」である。例えば、「組換え核酸」は、例えばクローニング、ＤＮＡシャッフリングもしくは他の手順中の核酸の組換えによって、または化学的もしくは他の突然変異誘発によって作製される核酸であり、「組換えポリペプチド」または「組換えタンパク質」は、組換え核酸の発現によって生成されるポリペプチドまたはタンパク質であり、および「組換えウイルス」、例えば「組換えインフルエンザウイルス」は組換え核酸の発現によって生成される。
【０１８５】
本発明によれば、ポリヌクレオチド、核酸セグメント、核酸配列などは、ＤＮＡ（ゲノムまたはゲノム外ＤＮＡだけには限られないが、これらを含む）、遺伝子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡだけには限られないが、これらを含む）、ヌクレオシド、および天然源から得た、人間の手により全部または一部を化学合成、修飾、または他の方法で調製もしくは合成したいずれかの適切な核酸セグメントだけには限られないが、これらを含む。
【０１８６】
同様に、長期間続く特許法の慣習によれば、語句「ａ」および「ａｎ」は、特許請求の範囲を含めて本出願中で使用するとき、「１つ以上」を示す。
【０１８７】
（実施例）
以下の実施例は、本発明の例示的な実施形態を実証するために含める。以下の実施例中に開示する技法は本発明を実施する際に十分機能することが発見された技法を表し、したがって本発明を実施するのに好ましい形態を構成すると考えることができることは、当業者によって理解されるはずである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示する具体的な実施形態の多くの変形を作製することができ、本発明の精神および範囲から逸脱せずに、同様または類似の結果をさらに得ることができることを理解するはずである。
【実施例１】
【０１８８】
例示的な保存溶液の製剤
この実施例は、本発明のＰＳＳ（ＰａｎＦｌｕ）組成物の一般的な製剤を提供する。ＰＳＳ組成物の他の製剤も実施例２から実施例５中に例示する。
【０１８９】
材料
グアニジンチオシアネート、クエン酸ナトリウム、消泡剤Ａ（登録商標）Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、およびＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩は、いずれもＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）はＳｏｌｔｅｃ  Ｖｅｎｔｕｒｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）から得た。２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール（ＴＲＩＳ）はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）から得た。２−［２−（ビス（カルボキシメチル）アミノ）エチル−（カルボキシメチル）アミノ］酢酸（ＥＤＴＡ）ＧＩＢＣＯ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  ＰｕｒｅはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）から得た。全ての他の試薬はＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈまたはＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている。
【０１９０】
【表１】
0005442105.tif 000008
【実施例２】
【０１９１】
例示的な保存溶液の製剤
この実施例は、本発明の組成物の第一の例示的な製剤を記載する。この製剤は、本発明者らによって「ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（商標）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」または「ＰＳＳ」バージョン１とも代替的に呼ばれている。
【０１９２】
【表２】
0005442105.tif 000009
【実施例３】
【０１９３】
第二の例示的な保存溶液の調製
この実施例は、本発明による別の例示的な保存溶液の調製を記載する。この製剤は、本発明者らによってＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（商標）バージョン２とも代替的に呼ばれている。
【０１９４】
【表３】
0005442105.tif 000010
【実施例４】
【０１９５】
第三の例示的な保存溶液の調製
この実施例は、本発明による別の例示的な保存溶液の調製を記載する。この製剤は、本発明者らによってＰＳＳバージョン２．２とも代替的に呼ばれている。
【０１９６】
【表４】
0005442105.tif 000011
【０１９７】
ＰＳＳ（バージョン２．２）の調製用の例示的なプロトコール
１．  攪拌棒を用いて新たなビーカーに４０ｍＬのヌクレアーゼを含まない水を加える。
２．  ホットプレート／攪拌機上にビーカーを置き、６０−６５℃に温度を調節する。攪拌スピードは中程度に設定する。
３．  ３５．４８８ｇｍのグアニジンチオシアネートをゆっくりと水に加え、添加時にそれが溶けるようにする。
４．  ０．０２８７ｇｍのＴＣＥＰをビーカーに加え、攪拌スピードを増大して結晶の溶解を助長する。
５．  ０．２９３１ｇｍのクエン酸ナトリウムをビーカーに加える。
６．  ０．５ｇｍのＮＬＳを溶液に加える。攪拌スピードを増大してビーカー内に攪拌状態を作製する。これによってＮＬＳは溶液中に引き込まれ、試薬の溶解を助長する。
７．  調製した１０％消泡剤Ａ溶液（１ｍＬの消泡剤Ａ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ＋９ｍＬのヌクレアーゼを含まない水）を攪拌する。２００μＬの１０％消泡剤Ａを溶液にピペッティングする。
８．  １０ｍＬの１Ｍ  ＴＲＩＳを溶液にピペッティングする。
９．  ２０μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを溶液にピペッティングする。
１０．  温度を上昇させ溶液を７５−８０℃にし、３−５分間攪拌する。
１１．  熱源からビーカーを遠ざけ、溶液は室温（約２２−２５℃）まで冷やす。
１２．  ２３ｍＬのエタノールを溶液に加え、完全に混合する。
１３．  ＨＣｌを用いてｐＨを６．９に調節する。
１４．  新たな１００ｍＬの目盛りつきシリンダーに溶液を注ぐ。
１５．  ヌクレアーゼを含まない水を加え合計体積を１００ｍＬにする。
１６．  溶液をラベル付き滅菌容器に移す。室温（約２２−２５℃）で保存する。
＊注：次の添加前にそれぞれの試薬が完全に溶けていることを、確認することが好ましい。
【実施例５】
【０１９８】
ＰＲＩＭＥＳＴＯＲＥ（商標）溶液と従来の製剤の比較
インフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）で攻撃したコットンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ  ｈｉｓｐｉｄｕｓ）由来の均質鼻部組織のサンプル、または２００６−０７期の間のヒト臨床用鼻部洗浄時に回収したヒト臨床インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）サンプルをＰＳＳ（バージョン１）中に置き、３つの市販のキット：ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（登録商標）−マイクロキット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）、ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡミニキット（カタログ番号５２９０４、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）、およびＭａｇＭａｘ  ＡＩ／ＮＤウイルスＲＮＡ単離キット（カタログ番号ＡＭ１９２９、Ａｍｂｉｏｎ）からの、それぞれの溶解製剤およびプロトコール、および抽出手順と比較して試験した。抽出効率は、ＡＢＩ７５００配列検出システムおよび比較ＣＴ法を使用して評価した（図２参照）。
【０１９９】
図２中、「ｄｅｌｔａ  Ｒｎ」は、蛍光レポーターシグナル−ベースライン量を表す。図１および図２中に示すように、相対ＣＴ値および検出したウイルスコピー数は、各市販品キットのそれぞれの従来型溶解バッファーの代わりに一定製剤を使用したとき最適であった。これらの２サンプル型では、本発明の組成物は、抽出目的で２つの従来型キットより良く働いた。ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（商標）溶液（バージョン１）組成物は、市販の核酸抽出キットに容易に適合することも示された。図１は、バージョン１のＰＳＳを３つの市販のキット：Ｑｉａｇｅｎウイルスミニ、Ａｍｂｉｏｎ  ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ  Ｍｉｎｉ、およびＡｍｂｉｏｎ  Ａｌ／ＮＣＤ  ＭａｇＭａｘと共に使用したＲＮＡ抽出結果を示す。図１によって示されるように、抽出キットの溶解バッファーを一定製剤と交換すると（この図で「ワンステップ＋」として示す）、標準プロトコールに従うキットを使用した抽出と比較して（この図で「ワンステップ−」として示す）、優れた核酸抽出を得た。抽出効率は、リアルタイム（ｒ）逆転写（ＲＴ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）［ｒＲＴ−ＰＣＲ］によって測定した。
【０２００】
図３は、予備溶液、および対照として使用した水中での保存と比較した、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（商標）溶液中での裸状態のＲＮＡの保存を示す図である。図３中に示すように、（蛍光による）検出は、アッセイした全時間地点においてＰＳＳ（バージョン１）中に保存したＲＮＡの初期増幅サイクルで行った。
【実施例６】
【０２０１】
鼻部洗浄試料の回収用のＰＲＩＭＥＳＴＯＲＥ（商標）溶液
予期臨床検出試験を、１）症候性小児患者および２）無症候性または症候性家人由来の鼻部洗浄試料を使用して実施した。それぞれｑＲＴ−ＰＣＲおよび従来の培養法によって、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（商標）溶液およびＶＴＭに回収した鼻部洗浄試料と比較したインフルエンザウイルスの検出。ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、およびマトリクス表面（ＭＡ）タンパク質をコードするインフルエンザ遺伝子の遺伝的特徴付けを、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（商標）溶液中に保存した選択鼻部洗浄試料を使用して実施して、ウイルス株内のワクチン有効性および薬剤感受性を評価した。
【０２０２】
インフルエンザは、米国で毎年２００，０００を超える入院および約３６，０００の死の原因である、高度に進化した、ＲＮＡベースの呼吸器系ウイルスである。現在循環しているヒトウイルス間でのインフルエンザ連続変異体の広範囲の出現は、来る２００８／０９期の全３個のワクチンコンポーネントの変化を促した。２００７／０８期中の高い罹患率および死亡率には、循環ウイルス株内の７２のインフルエンザ関連の小児の死、および連続的薬剤耐性（オセルタミビル［タミフル（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｕｔｌｅｙ、ＮＪ、ＵＳＡ］およびアダマンタジン）があった。
【０２０３】
材料および方法
インフルエンザ感染および１２６の家族間接触に関する臨床試験基準に適合した合計１００人の小児（指標）患者をこの試験に登録した。鼻部洗浄試料をＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（商標）溶液およびＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＶＴＭ中に置き、それぞれｒＲＴ−ＰＣＲまたは培養分析によって分析した。ｒＲＴ−ＰＣＲは、Ｄａｕｍら（２００７）に従いインフルエンザ（ＡまたはＢ）型および（Ｈ３、Ｈ１、Ｈ５）亜型特異的プライマー／プローブを使用して実施した。ＰＳＳ中に保存した選択臨床サンプルのさらなる遺伝的特徴付けを、ヘマグルチニンＨＡ、ＮＡ、およびＭＡウイルスタンパク質の標準的なＲＴ−ＰＣＲおよび直接的ヌクレオチド配列決定を使用して実施した。
【０２０４】
結果
評価した全サンプル（Ｎ＝２２６；１００指標、１２６の家族間接触）の中で、６６人（２９％）がｒＲＴ−ＰＣＲによってインフルエンザウイルスに陽性反応を示した（４５人がＨ３Ｎ２、２人がＨ１Ｎ１および１９人がＢ）。ＰＳＳ中に保存した鼻部洗浄試料からのｒＲＴ−ＰＣＲによって、培養法によって検出されなかった１１人の患者（９人がインフルエンザＡおよび２人がインフルエンザＢ）からインフルエンザウイルスを検出した（表５および表６）。これらの１１試料のうち、５試料が家族間接触として登録した患者由来であった。
【０２０５】
インフルエンザＡおよびＢのＨＡ遺伝子の系統学的分析は２００７／０８ワクチン株と比較して連続変異を示し、２００８／０９ブリスベンワクチン株に対して高い遺伝的相同性を明らかにした。家人間、特にインフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）株間の、ウイルスのある程度の遺伝的差異が示された。ＭＡ分析は、全てのインフルエンザＡＨ３Ｎ２株におけるアダマンタン耐性、ただし両Ｈ１Ｎ１ウイルスにおける感受性を明らかにした。全てのインフルエンザＢ株（ｎ＝１８）は、ＮＡ遺伝子中のアミノ酸１９７（インフルエンザＢのナンバリング）におけるアスパラギン酸（Ｄ）の存在に基づいて、ノイラミニダーゼ阻害剤薬剤ザナミビル（リレンザ（登録商標）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、ＮＣ、ＵＳＡ）およびオセルタミビル（タミフル（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）に対して感受性があった。
【０２０６】
ＱＲＴ−ＰＣＲ対従来の培養法
ｑＲＴ−ＰＣＲは、ＰＳＳ中に保存した原型鼻部洗浄試料からのインフルエンザウイルスの検出に関して従来の培養法より優れており、インフルエンザは２時間以内に検出し（ちなみに、従来の培養法に関しては２から７日）、この分析はより感度が高かった（１１個の試料；培養限界未満で検出した９個のインフルエンザＡおよび２個のインフルエンザＢ）。さらに、従来の生物培養に代わる分子診断法の使用はおそらく感染性があるウイルスを増殖させず、同時にインフルエンザウイルス型および亜型をもたらさなかった。
【０２０７】
遺伝子分析
ワクチン関連性
Ｈ３Ｎ２株：インフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）ヘマグルチニン（ＨＡ）のＨＡ１遺伝子の分析は、２００７−０８Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５ワクチン株と比較して全てのテキサス株において、５個のアミノ酸差異を含めた遺伝的浮動を明らかにした。全てのテキサス株において示された１つのＨＡ１突然変異（Ｄ１２２Ｎ）は潜在的グリコシル化部位であった。全てのＡ／テキサス（Ｈ３Ｎ２）株は、新たに選択した２００８−０９Ａ／ブリスベン／１０／２００７株に対して高いＨＡ相同性（９９．０−９９．７％）を示した。
【０２０８】
Ｈ１Ｎ１株：２インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）のヘマグルチニンのＨＡ１遺伝子は、Ａ／ソロモン諸島／３／２００６ワクチン株と比較して７個のアミノ酸変化を示した。４個の置換（Ｒ９０Ｋ、Ｔ１４５Ｖ、Ｋ２１０ＴおよびＥ２９０Ｋ）が、公知のＨ１抗体結合部位の内部に存在した。両方のテキサスＨ１Ｎ１株が、新たに選択した２００８−０９Ａ／ブリスベン／５９／２００７ワクチン株に対して高いＨＡ相同性（９８．８％および９９．４％）を示した。
【０２０９】
インフルエンザＢ株：ＨＡ１ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ遺伝子の分析は、全てのテキサス株はＢ／Ｙａｍａｇａｔａ系統であり、２００７／０８Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４ワクチン株より２００８−０９Ｂ／ブリスベン／５／２００７ワクチン株に対して遺伝的に相同性があったことを明らかにした。
【０２１０】
家族性突然変異
家人間でＮＡ、ＨＡ１、Ｍ１およびＭ２ｅにおいてアミノ酸変化が示された。ＨＡ１ヘマグルチニンは分析したインフルエンザ遺伝子の最も高度な突然変異を示し、１家族は５個のアミノ酸変化を示した。
【０２１１】
高度に保存された２４アミノ酸Ｍ２ｅウイルス表面プロトンポンプの分析は、家族内のある程度の変異を示した。１つの指標患者株は、家人ウイルス株内では「野生型」であった３個の特有アミノ酸Ｍ２ｅ置換を含有した。
【０２１２】
抗ウイルス感受性
アダマンタン：マトリクス遺伝子（ＭＡ）の遺伝子分析、具体的には位置３１（Ｓ３１Ｎ）におけるセリンからアスパラギンへの置換によって、全てのインフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）株におけるアダマンタン耐性、ただし両インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスにおける感受性が明らかになった。
【０２１３】
ノイラミニダーゼ阻害剤：全てのテキサスインフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）分離株は、ＮＡ遺伝子中のＥ１１９Ｖ、Ｒ２９２Ｋ、およびＮ２９４Ｓ置換の遺伝子分析によってオセルタミビルに感受性があることが示された。インフルエンザＢのＮＡ遺伝子の遺伝子分析によって、全てのテキサス株が位置１９７にアスパラギン酸（Ｄ）残基を含有し、したがっておそらくオセルタミビルに感受性があることが明らかになった。
【０２１４】
本明細書のプロトコールおよび試験は、抗菌感受性を早急に知ることが必要である場合、結核菌、マラリア、スタフィロコッカスなどのような他の微生物、および他の病原体に適合させることが可能である。
【実施例７】
【０２１５】
ＰＲＩＭＥＳＴＯＲＥ（商標）溶液を使用したインフルエンザサンプルの回収
本発明の組成物は、１）臨床または環境試料からの高品質の核酸の調達、２）試料の安全な処理および輸送のためのおそらく感染性がある生物病原体の不活性化、および３）周囲温度における長期の加水分解／ヌクレアーゼ分解を予防する放出された「裸状態の」ＲＮＡ／ＤＮＡの安定化および保存を容易にする１つのサンプル回収、輸送、および保存試薬となる。１つのこのような試験の結果は以下の実施例中に表す。この実施例は、病原性微生物（複数可）を殺滅する際のＰＳＳ（バージョン２．２）の有効性を例示する。
【０２１６】
【表５】
0005442105.tif 000012
【０２１７】
【表６】
0005442105.tif 000013
【０２１８】
方法
ｑＲＴ−ＰＣＲを使用してＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（商標）溶液中に保存したインフルエンザＡ（Ｈ５Ｎ１）ウイルス核酸をアッセイした。室温での時間行程試験を実施して臨床試料、排出腔サンプルの完全性を評価し、クローン鋳型鳥類インフルエンザＡウイルス（Ｈ５）ＲＮＡを、ＰＳＳ、ＶＴＭ、ＲＮＡ保存溶液、またはヌクレアーゼを含まない水から抽出し保存した。ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（商標）溶液の抽出効率を３つの市販の核酸抽出キットと比較した。さらに、ヌクレアーゼ分解に耐性を示すＰＳＳ中に含有されるＲＮＡの能力を評価した。
【０２１９】
結果
ＰＳＳ（バージョン２、ただしエタノールを含まず）は、臨床材料、すなわち鼻部洗浄液、咽頭スワブ、または環境サンプルから放出されたＲＮＡ／ＤＮＡを保存しながら微生物因子を不活性化した。この溶液中に置いた臨床試料または環境サンプルは３０日まで室温で安定状態であり、一方で核酸の分解が他の輸送媒体中で起こった。ＰＳＳは市販のＲＮＡ単離キットと適合性があり、高い核酸収率をもたらした。
【実施例８】
【０２２０】
ＰＲＩＭＥＳＴＯＲＥ（商標）溶液中でのＭＲＳＡ（ＡＴＣＣ３３５９２）の殺滅
この実施例は、細菌病原体を殺滅する際のＰＳＳ（バージョン２．２）の有効性を例示する。メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）株ＡＴＣＣ３３５９２を、ＰＳＳ（バージョン２．２）中に１０倍および１０００倍希釈し定量化した（図６参照）。
【０２２１】
実験プロトコール
日数  手順
０    ＭＲＳＡ（ＡＴＣＣ３３５９２）をＣｕｌｔｉ−ｌｏｏｐ（登録商標）（Ｒｅｍｅｌ）から１５ｍｌ円錐形試験管中の１．５ｍＬＴＳＢに移す。約１５分間３７℃で温置する。縣濁液を軽く攪拌し、１００μＬを血液寒天プレートに移す。プレートを一晩３７℃で温置する。
【０２２２】
１    １２時間の温置後に多量で均一なコロニー増殖を観察する。約１０％のコロニーを滅菌状態の１リットルフラスコ中の３００ｍＬのトリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ）に移す。３７℃および２００ｒｐｍでシェイカー上にフラスコを置く。
【０２２３】
約４−６時間の温置後、約５０ｍＬの細菌縣濁液を、３００ｍＬの新たなＴＳＢを含有する新たな１リットルフラスコに移す。
【０２２４】
約４−６時間の温置後、約１００μＬの培養液を９００μＬのＴＳＢに移す（１：１０対照希釈）。この縣濁液から、１０μＬを９９０μＬのＴＳＢに移した（１：１０００対照希釈）。
【０２２５】
１００μＬの培養液を９００μＬのＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（商標）溶液に移す（１：１０ＰＳＳ希釈）。この縣濁液から、１０μＬを９９０μＬのＴＳＢに移した（１：１０００ＰＳＳ希釈）。
【０２２６】
ＴＳＢまたはＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（商標）溶液（バージョン２．２）への移動直後、縣濁液を軽く攪拌し、対照とＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（商標）縣濁液の両希釈液からの１００μＬを血液寒天プレート上に平板培養した。ＴＳＢまたはＰＳＳへの細菌の添加後、時間ゼロの時間地点は実際は約２分であった。
【０２２７】
ＴＳＢおよびＰＳＳ（バージョン２．２）中の縣濁液を室温で維持した。
【０２２８】
ＴＳＢおよびＰＳＳ中の縣濁液の調製後５、１５、３０、６０、１２０および２４０分でさらに１００μＬを血液寒天プレート上に平板培養した。
【０２２９】
プレート上の細菌縣濁液を乾燥させ、反対に平板培養し、プレートは３７℃で一晩温置した。
【０２３０】
攪拌培養物の滴定も、攪拌培養物からの１００μＬ縣濁液と９００μＬのＴＳＢを混合することによって実施した（１０−１希釈）。連続１０倍希釈液を１０−９まで調製した。１０−１以外の全希釈液からの１００μＬのサンプルを、血液寒天プレート上に平板培養した。
【０２３１】
２    細菌コロニーに関してプレートを観察した。必要な場合、後の観察用に全てのプレートは４℃で保存した。
【０２３２】
結果
結果は表７および表８中に表す。簡単に言うと、細菌縣濁液は約４．７×１０９ｃｆｕ／ｍｌを含有した。したがって、１：１０希釈は約４．７×１０８ｃｆｕ／ｍｌを含有し、１：１０００希釈は４．７×１０６ｃｆｕ／ｍｌを含有した。全ての時間地点で、ＴＳＢ中に縣濁した細菌は数え切れなかった。全ての時間地点で、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（商標）溶液中に縣濁し、血液寒天プレート上に平板培養した細菌は、検出可能なコロニーは有していなかった。
【０２３３】
【表７】
0005442105.tif 000014
【０２３４】
【表８】
0005442105.tif 000015
【０２３５】
さらなる試験を実施して、ＰＳＳ（バージョン２．２）に１０倍希釈したときのＭＲＳＡＡＴＣＣ３３５９２を殺滅するのに必要な露出時間を決定し、ＰＳＳへの露出後、ただし平板培養前の、細菌の希釈の影響を決定した。
【０２３６】
実験プロトコール
日数  手順
０    ＭＲＳＡ（ＡＴＣＣ３３５９２）を前に記載した試験からのＴＮＴＣプレートから４ｍＬのＴＳＢに移す。これらのプレートは約４８時間４℃で保存した。細菌は軽く攪拌し、使用前に約１０分間室温で放置した。０．１ｍＬの細菌縣濁液を０．９ｍＬのＰＳＳに移し、軽く攪拌した。約６０秒後、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（商標）中の細菌を再度軽く攪拌し、０．１ｍＬの細菌縣濁液を０．３ｍＬのＴＳＢに移した（１：４希釈）。１００μＬのＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（商標）溶液中の細菌（「非希釈」と示す）、および１：４希釈からＴＳＢに血液寒天プレート上に平板培養した（５％ヒツジＲＢＣ、ＴＳＡ中）。このプロセスを５分と１５分で繰り返し、次いでＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（商標）溶液の代わりにＴＳＢに再度希釈した。血液寒天プレート上の液体細菌縣濁液を室温で乾燥させ、次いで３７℃において一晩温置した。
【０２３７】
１    約１６時間の温置後、プレートをインキュベーターから除去し、コロニーを計数した。
【０２３８】
結果
細菌縣濁液は１ｍＬ当たり未知数のコロニー形成単位（ｃｆｕ）を含有していた。全ての時間地点で、トリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ）中に縣濁した細菌は数え切れなかった（ＴＮＴＣ）。全ての時間地点で、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（商標）組成物中に縣濁し血液寒天プレート上に平板培養した細菌はコロニーを生成しなかった（表９）。
【０２３９】
【表９】
0005442105.tif 000016
【実施例９】
【０２４０】
ＰＲＩＭＥＳＴＯＲＥ（商標）溶液を評価したさらなる試験
図７Ｂ中に示すデータは、微生物を不活性化するＰＳＳの能力を例示する。示すのは、ニワトリクローン試料をＰＳＳ（バージョン１）中に回収した試験である。ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（商標）溶液は細菌因子を１時間以内に不活性化した。４つの原型ニワトリ排出腔サンプルをＰＳＳまたは水中に浸し、血液寒天プレート上に後に平板培養した。これらの結果は、開示する組成物が、サンプル中の微生物を迅速に殺滅または不活性化することが可能であったことを示した。
【０２４１】
図７Ｃ中に示すデータは、室温で３０日間ＲＮＡ塩基加水分解を阻害するＰＳＳの能力を例示する。ＲＮＡは室温（２２−２６℃）ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（商標）において（ゲルレーン１および３）および水中（ゲルレーン２および４）で温置し、第０日および第３０日でその後ＲＴ−ＰＣＲ増幅した（１５００塩基対）。ＰＳＳは回収ＲＮＡを保存し、第３０日まで室温においてＲＮＡ／ＤＮＡ分解を妨げた（例えば、表１１をさらに参照）。
【０２４２】
インフルエンザ阻害アッセイ
このアッセイの試薬は以下の試薬を含む：
（ａ）４５ｍＬの滅菌Ｎ／ＣＥＭＥＭ、（ｂ）３ｍＬのストック７．５％重炭酸ナトリウム（２％）、（ｃ）１．５ｍＬのＳＰＧ（１％）、（ｄ）７５μＬのトリプシン（０．０５％）、（ｅ）１．５ｍＬのファンギゾン（１％）および（ｆ）１５０μＬのゲンタマイシンを含有するトリプシン培地。
【０２４３】
（ａ）１５０ｍｌのグルタル酸ジアルデヒド、（ｂ）２ｇｍのクリスタルバイオレット、および（ｃ）２８５０ｍＬの脱イオン水を含有するクリスタルバイオレット。
【０２４４】
アッセイ用の血清サンプルの調製
血清サンプルを解凍し攪拌する。それぞれのサンプルに関して、対応するＳｐｉｎ−Ｘ（商標）チューブの蓋にラベルを付ける。４５０μＬの非完全ＥＭＥＭと５０μＬの血清をＳｐｉｎ−Ｘ（商標）チューブ中に組合せる。３０分間５６℃の水浴中で血清およびＥＭＥＭを含有するチューブを温める。室温において２分間８０００ＲＰＭでチューブを遠心分離にかける。サンプルにラベルを付け、アッセイするまで−２０℃のフリーザー中に置く。
【０２４５】
希釈用プレート
１６０μＬのそれぞれの非希釈化合物または血清サンプルをウエルＡ１からＡ１２に充填する。残りのウエルには１２０μＬのトリプシン培地を充填する。マルチチャンネルピペットを使用して、４０μＬの非希釈サンプルを列Ａから取り出し、列Ｂ中の対応するウエルに希釈する。それぞれの列に関して希釈を繰り返し、それぞれの移動後ウエルを混合する。列Ｈでは、混合後、列Ｇから移動させ、それぞれのウエルから４０μＬを取り出し廃棄する。−８０℃のフリーザーからウイルスストック（１０６）を得て解凍する。ウイルスストックはトリプシン培地中に１０３希釈まで希釈する。連続希釈が終了した後、１２０μＬのインフルエンザウイルス（１ｍｌ当たり１０４ＴＣＩＤ５０）を希釈用プレート中の全てのウエルに移す。これは全てのウエルで合計２４０μＬをもたらす。室温で１時間、希釈用プレート（複数可）を温置する。
【０２４６】
ＭＤＣＫセルプレート
ガラス容器、コームディスペンサーおよびチューブを滅菌し、ヒュームフード中に置く。フード中では、チューブを容器に接続し、コームのノズルを充填する。アスピレーター用チューブをコームの真空ノズルに接続する。容器を上昇面に置き、アスピレーターのスイッチを入れる。ＰＢＳを容器に入れる（プレートの数に応じて１Ｌ以上が必要とされ得る）。セルプレートはＰＢＳコームで３回洗浄し、（培地を吸引し、次いでボタンを約１秒押してウエルを洗浄し、２回繰り返す）。マルチチャンネルピペットを使用して、希釈用プレートの縦列１中のそれぞれのウエルからの５０μＬを、セルプレートの縦列１から４に移す。希釈用プレートの縦列２中のそれぞれのウエルからの５０μＬは、セルプレートの縦列５から８に移す。縦列３中のそれぞれのウエルからの５０μＬは、セルプレートの縦列９から１２に移す。残りのサンプルに関して他のセルプレートへの移動を繰り返す。セルプレートは３７℃で１時間温置する。温置時間後、５０μＬのトリプシン培地をセルプレートの全てのウエルに加える。プレートは温置チャンバーに戻し、感染後４日間温置する。
【０２４７】
染色
１００μＬのクリスタルバイオレットを全てのウエルに加える。１時間放置する。プレートは冷たい流水ですすぎ、空気で乾燥させる。
【０２４８】
【表１０】
0005442105.tif 000017
【０２４９】
ＰＲＩＭＥＳＴＯＲＥ（商標）組成物の長期安定性の時間行程試験
以下のデータは、室温で保存したサンプルで３０日間核酸の完全性を保つ際の、様々なＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（商標）組成物の有効性を実証する。ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（商標）組成物を、水単独、エタノール単独、ＶＴＭおよびＡＶＬなどの市販のバッファーと比較している。
【０２５０】
【表１１】
0005442105.tif 000018
【実施例１０】
【０２５１】
ＩＰＣを含有する保存溶液
本明細書で記すように、特定の実施形態では、核酸担体分子および／またはＩＰＣ配列を含めて単離ポリヌクレオチドの調製、安定化、および定量化を容易にすることが望ましい。
【０２５２】
一実施形態では、本発明者らは、以下の配列：
【０２５３】
【化５】
0005442105.tif 000019
を含有する配列番号２の配列を含む一本鎖ＲＮＡ分子を利用している。
【０２５４】
図１５Ａから図１９中に表すデータは、ポリヌクレオチドの単離集団を安定化し、アッセイ可能な対照配列として作用する際の、このようなＩＰＣ分子の有効性を実証する。特に、図１５Ａおよび図１５Ｂは、ＩＰＣの検出に特異的なアッセイを使用した、一本鎖ＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ増幅を例示する。同様に、図１６Ａおよび図１６Ｂは、１３０ヌクレオチドｓｓＲＮＡの同様のｑＲＴ−ＰＣＲ増幅を例示する。
【０２５５】
図１７中のデータは、合成ＲＮＡを含有するＰＳＳは、裸状態のＲＮＡ病原体標的の保存を延長したことを実証した。その試験では、裸状態のインフルエンザＡのＲＮＡ鋳型をヒト鼻部洗浄試料に加え、次いで合成ＲＮＡを含有するか、またはそれを欠くかのいずれかのＰＳＳ中に保存した。これらの結果は、合成ＲＮＡの存在が標的サンプルの増大した初期抽出、および長期保存を容易にしたことを実証した。
【０２５６】
同様に、図１８中のデータは、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（商標）溶液の安定性は、合成担体ＲＮＡの添加によって増大したことを実証した。この試験では、完全インフルエンザＡウイルスを、合成ＲＮＡを含有するか、またはそれを欠くかのいずれかのＰＳＳ中に保存した。これらの結果は、合成ＲＮＡは、標的ポリヌクレオチドの初期抽出、および長期保存を増大したことを実証した。
【０２５７】
最後に、図１９中のデータは、室温およびヒト体温（３７℃）での合成ＲＮＡの安定性を実証した。この試験では、合成ＲＮＡ担体分子をＰＳＳに加え、いずれかの温度で２週間保存した。ＲＮＡの安定性はｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。合成担体ＲＮＡは、ＣＴ値の著しい低下なしで少なくとも２週間、室温と３７℃の両方において安定状態であった。
【０２５８】
本発明の実施において有用なＩＰＣは本明細書に記載する例示的配列の１つを含む必要はなく、ＩＰＣは本明細書に含まれる任意のＩＰＣ配列と実質的相同性がある必要もないことを記すことは重要である。この点を例示するため、以下の配列は、縮重配列：
【０２５９】
【化６】
0005442105.tif 000020
0005442105.tif 000021
を有するにもかかわらず、担体ＲＮＡ／ＩＰＣ配列としても機能性がある配列番号２の変異体を表す。
【実施例１１】
【０２６０】
ｓｓＲＮＡ  ＩＰＣ配列のインビトロ転写
前に記したように、本発明のＩＰＣは、従来の方法を使用して直接化学合成することができ、または代替的に、組換えＤＮＡ技術を使用して調製することができる。この実施例は後者の方法の例を与え、ＰＣＲおよびインビトロＲＮＡ転写アッセイを使用したｄｓＤＮＡアンプリコンの調製を例示する。このような組換え技法を使用して、病原体特異的配列のｑＰＣＲに関する正規化群として働く安定状態のＩＰＣとしてＰＳＳに加えるための、オリゴヌクレオチドを生成する。１４１ヌクレオチド（ｎｔ）の配列を５’から３’に表し、１）Ｔ７ＲＮＡ転写開始（一本下線）部位、２）内部フォワードおよびリバースプライマー（二本下線）、および３）リアルタイム内部プローブ配列（太線）を示す。ＲＮＡはＴ７フォワード（一本下線）およびＩＰＣリバース（二本下線）プライマーを使用したＰＣＲ増幅によって合成し、ＧｒｅｅｎＴ７転写開始部位を使用してインビトロ転写する。生成する一本鎖ＲＮＡポリマーは１３０ヌクレオチド長であり、ＩＰＣ配列はＲＮＡ転写産物内に（フォワードおよびリバースプライマーにより結合して）位置する。
【０２６１】
【化７】
0005442105.tif 000022
この試験で利用した例示的なＤＮＡ配列に関する仕様は以下の通りである：ＤＮＡヌクレオチドの合計数は１４１であり、一方ＲＮＡヌクレオチドの合計数は１３０である。
【０２６２】
Ａの％＝２６．９５  （３８ヌクレオチド）
Ｇの％＝２２．７０  （３２ヌクレオチド）
Ｔの％＝２６．２４  （３７ヌクレオチド）
Ｃの％＝２４．１１  （３４ヌクレオチド）
Ｇ＋Ｃの含有率：
Ａ＋Ｔの％＝５３．１９  （７５ヌクレオチド）
Ｃ＋Ｇの％＝４６．８１  （６６ヌクレオチド）
塩基数：３８（Ａ）、３４（Ｃ）、３２（Ｇ）、および３７（Ｔ）。
【０２６３】
例示的なＩＰＣアッセイ用のプライマーおよびプローブ配列は、合成ＤＮＡ／ＲＮＡポリマー内に位置する（以下に示す）。生成する増幅産物は１００ｂｐ長である。プライマーおよびプローブアッセイを設計して、それぞれ逆転写およびホットスタート活性化に関する５０℃で２０分間および９５℃で５分間の１サイクルからなる２ステップの熱循環プロトコールを使用して操作した。次いでこれに９５℃で１５秒および６０℃で３０秒の４０サイクルを続けた。
【０２６４】
フォワードプライマー：５’−ＧＴＧＣＡＧＴＣＡＧＴＣＣＣＴＣＧＧＴＴＡ−３’（配列番号２４）。
【０２６５】
リバースプライマー：５’−ＴＴＧＡＣＴＴＴＧＡＡＡＣＣＴＧＧＡＣＴＧＡＴＣ−３’（配列番号２５）。
【０２６６】
プローブ：５’−（ＦＡＭ）−ＡＡＡＴＡＴＣＣＧＴＡＣＣＧＴＡＧＴＣＧ−（ＭＧＢ）−３’（配列番号２６）。
【０２６７】
【表１２】
0005442105.tif 000023
【０２６８】
前に記したように、いずれも非ゲノム性であり、哺乳動物ゲノム、または対象の病原体種のゲノムと有意にハイブリダイズしないＩＰＣ配列を調製することが望ましい。
【０２６９】
その目的のため、配列番号１からＰＣＲ増幅によってインビトロで生成したＩＰＣを、いくつかのウイルスおよび細菌種、ならびに全ヒトＲＮＡおよびＤＮＡ由来の一群の全ゲノム配列に対してスクリーニングした。表１２はスクリーニングした種を列挙し、いずれもＩＰＣ配列とクロスハイブリダイズせず、試験したいずれの生物とも有意な相同性を欠く「ナンセンス」対照配列としてのその所望性を示した。
【０２７０】
前に記したように、本発明のＩＰＣは、配列番号１として本明細書に開示する通りの例示的ＤＮＡアンプリコンから調製する必要はない。適切な担体ＲＮＡ分子のインビトロ調製において有用なＤＮＡ配列の他の例には、非制限的に、１つ以上の以下の配列がある。それぞれの場合、ポリメラーゼ転写部位（ここでは、Ｔ７転写部位）は一本下線で示し、一方で例示的なフォワードおよびリバースＰＣＲプライマー結合ドメインの配列は二本下線で示す。適切な標識分子プローブが結合する例示的な配列ドメインは太線で示す。
【０２７１】
【化８】
0005442105.tif 000024
0005442105.tif 000025
【０２７２】
本明細書で開示および特許請求する全ての組成物および方法は、本開示に照らして過度の実験なしで作製し実施することができる。本発明の組成物および方法を例示的な実施形態に関して記載してきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱せずに、本明細書に記載する組成物、方法、および方法のステップまたはステップの順序に変形を施すことができることは、当業者には明らかである。より具体的には、同じまたは類似の結果を得ながら、化学的と生理的の両方で関連がある特定の作用物質は本明細書に記載する作用物質で置換することができることは明らかである。当業者には明らかである全てのこのような類似した置換および修飾は、添付の特許請求の範囲によって定義するように、本発明の精神、範囲および概念の範囲内にあると考えられる。したがって、特許請求すべき専有権は以下の特許請求の範囲に記載する通りである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
0005442105.tif 000039
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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