(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
ＰＢ−（Ｌ１−Ｎ＋（Ｒａ）（Ｒｂ）−Ｌ２−Ａ（＝Ｏ）−ＯＲｃ）ｎ  （Ｘ−）ｎ
を有するポリマーであって、式中、
ＰＢはｎ個のペンダント基Ｌ１−Ｎ＋（Ｒａ）（Ｒｂ）−Ｌ２−Ａ（＝Ｏ）−ＯＲｃを有するポリマー骨格であり；
Ｎ＋はカチオン性中心であり、前記カチオン性中心が、アンモニウム、イミダゾリウム、トリアザオリウム、ピリジニウム、モルホリニウム、オキサゾリジニウム、ピラジニウム、ピリダジニウム、ピリミジニウム、ピペラジニウムおよびピロリジニウムからなる群から選択され；
Ｒａは水素であり、そしてＲｂは、水素、アルキルおよびアリールから独立に選択され；
Ａ（＝Ｏ）−ＯＲｃは、ＡがＣ、Ｓ、ＳＯ、ＰまたはＰＯからなる群から選択され、Ｒｃが１つまたは複数の置換基でさらに置換されてもよいアルキル、アリール、アシルまたはシリル基である加水分解性基であり；
Ｌ１は、前記カチオン性中心を前記ポリマー骨格に共有結合させるリンカーであり；
Ｌ２は、前記カチオン性中心を前記加水分解性基に共有結合させるリンカーであり；
Ｘ−は、前記カチオン性中心と結合している対イオンであり；
ｎは、約１０〜約１０，０００の整数である、
ポリマー。
【請求項２】
前記対イオンが疎水性の有機対イオンである、請求項１に記載のポリマー。
【請求項３】
前記加水分解性基が加水分解の際に疎水性の有機基を放出する、請求項１に記載のポリマー。
【請求項４】
Ｒｂが、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖および分枝状アルキル基からなる群から独立に選択される、請求項１に記載のポリマー。
【請求項５】
Ｌ１が−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−および−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−からなる群から選択され、式中、ｎは１〜２０の整数である、請求項１に記載のポリマー。
【請求項６】
Ｌ２が−（ＣＨ２）ｎ−であり、式中、ｎは１〜２０の整数である、請求項１に記載のポリマー。
【請求項７】
Ａが、Ｃ、ＳＯおよびＰＯからなる群から選択される、請求項１に記載のポリマー。
【請求項８】
ＲｃがＣ１〜Ｃ２０アルキルである、請求項１に記載のポリマー。
【請求項９】
Ｘ−が、ハライド、カルボキシレート、アルキルスルホネート、サルフェート；ナイトレート、パークロレート、テトラフルオロボレート、ヘキサフルオロホスフェート、トリフルオロメチルスルホネート、ビス（トリフルオロメチルスルホニル）アミド、ラクテートおよびサリチレートからなる群から選択される、請求項１に記載のポリマー。
【請求項１０】
複数の反復単位を有するポリマーであって、前記反復単位が、式
−［ＣＨ２−Ｃ（Ｒｄ）］ｎ−Ｌ１−Ｎ＋（Ｒａ）（Ｒｂ）−Ｌ２−Ａ（＝Ｏ）−ＯＲｃ  Ｘ−
を有し、式中、
−［ＣＨ２−Ｃ（Ｒｄ）］ｎ−は、ｎ個の反復単位を有するポリマー骨格を定義し；
Ｒｄは、水素、フッ素、トリフルオロメチルおよびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され；
ｎは、１０〜１０，０００であり；
Ｎ＋はカチオン性中心であり、前記カチオン性中心が、アンモニウム、イミダゾリウム、トリアザオリウム、ピリジニウム、モルホリニウム、オキサゾリジニウム、ピラジニウム、ピリダジニウム、ピリミジニウム、ピペラジニウムおよびピロリジニウムからなる群から選択され；
Ｒａは水素であり、そしてＲｂは、水素、アルキルおよびアリールから独立に選択され；
Ａ（＝Ｏ）−ＯＲｃは、ＡがＣ、Ｓ、ＳＯ、ＰまたはＰＯからなる群から選択され、Ｒｃが１つまたは複数の置換基でさらに置換されてもよいアルキル、アリール、アシルまたはシリル基である加水分解性基であり；
Ｌ１は、前記カチオン性中心を前記ポリマー骨格に共有結合させるリンカーであり；
Ｌ２は、前記カチオン性中心を前記加水分解性基に共有結合させるリンカーであり；
Ｘ−は、前記カチオン性中心と結合している対イオンである、ポリマー。
【請求項１１】
前記ポリマーがホモポリマーである、請求項１０に記載のポリマー。
【請求項１２】
前記ポリマーが共重合体である、請求項１０に記載のポリマー。
【請求項１３】
前記共重合体がランダム共重合体である、請求項１２に記載のポリマー。
【請求項１４】
前記共重合体がブロック共重合体である、請求項１２に記載のポリマー。
【請求項１５】
前記共重合体が、疎水性反復単位、アニオン性反復単位および双性イオン反復単位からなる群から選択される反復単位を含む、請求項１２から１４のいずれか一項に記載のポリマー。
【請求項１６】
基材の表面であって、請求項１から１５のいずれか一項に記載のポリマーを含む表面。
【請求項１７】
前記基材が、粒子、薬剤担体、非ウイルス遺伝子送達系、バイオセンサー、膜、移植可能なセンサー、皮下センサー、インプラントおよびコンタクトレンズからなる群から選択される、請求項１６に記載の表面。
【請求項１８】
前記基材が、耳排液管、供給管、緑内障排液管、水頭症シャント、人工角膜移植、神経誘導管、尿カテーテル、組織接着剤、Ｘ線ガイド、人工関節、人工心臓弁、人工血管、ペースメーカ、左室補助装置（ＬＶＡＤ）、動脈移植片、組織足場およびステントからなる群から選択される移植可能な医療装置である、請求項１６に記載の表面。
【請求項１９】
（ａ）請求項１から１５のいずれか一項に記載のポリマー；および
（ｂ）前記ポリマーと可逆的に結合する治療剤
を含む治療剤を送達するためのキット。
【請求項２０】
前記治療剤が、小分子、核酸、アミノ酸、ペプチドおよびタンパク質からなる群から選択される、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記ポリマーが共重合体である、請求項１９に記載のキット。
【請求項２２】
前記共重合体が第一の反復単位および第二の反復単位を含み、前記第一の反復単位は第三級アミン基を含み、前記第二の反復単位は第一級、第二級または第四級のアミン基を含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記第二の反復単位が第四級アミン基を含む、請求項２２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
カチオン性ポリマーは、多くの特異な生物学的、化学的および物理的特性を有する。
【背景技術】
【０００２】
カチオン性ポリマーが、ＤＮＡまたはタンパク質、または、遺伝子送達もしくは薬物送達のためのタンパク質を濃縮することができることは周知である。ポリカチオンは、細菌の膜を破壊する抗微生物剤として用いることができる。しかし、カチオン性ポリマーは細胞毒性を示し、それらの生物医学的な適用を制限するタンパク質と結合する傾向がある。抗微生物性材については、死滅微生物が表面に集積して、それらの抗微生物活性を減じることがある。
【０００３】
生物医学的な適用のためのカチオン性ポリマーの有用性にもかかわらず、それらの関連する欠点のない、カチオン性ポリマーの有利な特性を提供する新しいポリマー物質の必要性が存在する。本発明はこの必要性を満たすことを目指し、さらなる関連する利点を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、双性イオンポリマーに加水分解性であるカチオン性ポリマー、重合可能でありカチオン性ポリマーを提供するカチオン性モノマー、カチオン性ポリマーでコーティングされる表面、カチオン性ポリマーを表面に適用する方法、カチオン性ポリマーを含む治療剤送達系、カチオン性ポリマーを用いる治療剤を送達する方法、および、カチオン性ポリマーおよびカチオン性モノマーを作製する方法を提供する。
【０００５】
一態様では、本発明は、双性イオンポリマーに加水分解性であるカチオン性ポリマーを提供する。一実施形態では、カチオン性ポリマーは、
（ａ）ポリマー骨格；
（ｂ）それぞれが第一のリンカーによって前記ポリマー骨格に共有結合している複数のカチオン性中心；
（ｃ）各カチオン性中心に結合している対イオン；および
（ｄ）第二のリンカーを介して各カチオン性中心に共有結合している加水分解性基であって、アニオン性中心に加水分解性であり、前記第二のリンカーを介して前記カチオン性中心に共有結合しているアニオン性中心を有する双性イオンポリマーを提供する加水分解性基を含む。
【０００６】
一実施形態では、カチオン性ポリマーは、式：
ＰＢ−（Ｌ１−Ｎ＋（Ｒａ）（Ｒｂ）−Ｌ２−Ａ（＝Ｏ）−ＯＲｃ）ｎ  （Ｘ−）ｎ
を有し、上式で、ＰＢはｎ個のペンダント基Ｌ１−Ｎ＋（Ｒａ）（Ｒｂ）−Ｌ２−Ａ（＝Ｏ）−ＯＲｃ）を有するポリマー骨格であり；Ｎ＋はカチオン性中心であり；ＲａおよびＲｂは、水素、アルキルおよびアリールから独立に選択され；Ａ（＝Ｏ）−ＯＲｃは、加水分解性基であって、ＡはＣ、Ｓ、ＳＯ、ＰまたはＰＯからなる群から選択され、Ｒｃは、１つまたは複数の置換基でさらに置換されてもよいアルキル、アリール、アシルまたはシリル基であり；Ｌ１は、カチオン性中心をポリマー骨格に共有結合させるリンカーであり；Ｌ２は、カチオン性中心を加水分解性基に共有結合させるリンカーであり；Ｘ−は、カチオン性中心に結合している対イオンであり；ｎは、約１０〜約１０，０００の整数である。
【０００７】
ある実施形態では、対イオンは疎水性の有機対イオンである。代表的な疎水性の有機対イオンには、Ｃ１〜Ｃ２０カルボキシレートおよびＣ１〜Ｃ２０アルキルスルホネートが含まれる。
【０００８】
ある実施形態では、対イオンは治療剤である。代表的な治療剤には、抗微生物性、抗細菌性および抗真菌性の薬剤が含まれる。一実施形態では、治療剤はサリチル酸である。
【０００９】
ある実施形態では、対イオンは、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ）、アミノ酸、タンパク質およびペプチドから選択される。
【００１０】
ある実施形態では、加水分解性基は、加水分解時に疎水性の有機基を放出する。代表的な疎水性の有機基には、Ｃ４〜Ｃ２０カルボキシレート（例えば、ｎ−Ｃ４〜Ｃ２０アルキル−ＣＯ２−）が含まれる。
【００１１】
ある実施形態では、加水分解性基は、加水分解時に治療剤を放出する。代表的な治療剤には、抗微生物性、抗細菌性および抗真菌性の薬剤が含まれる。一実施形態では、治療剤はサリチル酸である。
【００１２】
カチオン性中心は、アンモニウム、イミダゾリウム、トリアザオリウム、ピリジニウム、モルホリニウム、オキサゾリジニウム、ピラジニウム、ピリダジニウム、ピリミジニウム、ピペラジニウムおよびピロリジニウムカチオン性中心から選択される。
【００１３】
ある実施形態では、ＲａおよびＲｂは、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖および分枝状アルキル基からなる群から、独立に選択される。
【００１４】
ある実施形態では、Ｌ１は−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−および−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−からなる群から選択され、式中、ｎは１〜２０の整数である。
【００１５】
ある実施形態では、Ｌ２は−（ＣＨ２）ｎ−であり、式中、ｎは１〜２０の整数である。
【００１６】
ある実施形態では、Ａは、Ｃ、ＳＯおよびＰＯからなる群から選択される。
【００１７】
ある実施形態では、ＲｃはＣ４〜Ｃ２０アルキルである。
【００１８】
ある実施形態では、Ｘ−は、ハライド、カルボキシレート、アルキルスルホネート、サルフェート；ナイトレート、パークロレート、テトラフルオロボレート、ヘキサフルオロホスフェート、トリフルオロメチルスルホネート、ビス（トリフルオロメチルスルホニル）アミド、ラクテートおよびサリチレートから選択される。
【００１９】
別の態様では、本発明は、本発明のカチオン性ポリマーを作製するためのモノマーを提供する。一実施形態では、モノマーはカチオン性化合物であって、
（ａ）重合可能な基；
（ｂ）第一のリンカーによって重合可能な基に共有結合しているカチオン性中心；
（ｃ）カチオン性中心に結合している対イオン；および
（ｄ）第二のリンカーを介してカチオン性中心に共有結合している加水分解性基であって、アニオン性中心に加水分解性であり、前記第二のリンカーを介して前記カチオン性中心に共有結合しているアニオン性中心を有する双性イオン化合物を提供する加水分解性基を含む化合物である。
【００２０】
一実施形態では、化合物は、式
ＣＨ２＝Ｃ（Ｒｄ）−Ｌ１−Ｎ＋（Ｒａ）（Ｒｂ）−Ｌ２−Ａ（＝Ｏ）−ＯＲｃ  Ｘ−
を有し、上式で、ＣＨ２＝Ｃ（Ｒｄ）は重合可能な基であり、Ｒｄは、水素、フッ素、トリフルオロメチルおよびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され；Ｎ＋はカチオン性中心であり；ＲａおよびＲｂは、水素、アルキルおよびアリールから独立に選択され；Ａ（＝Ｏ）−ＯＲｃは、加水分解性基であって、ＡはＣ、Ｓ、ＳＯ、ＰまたはＰＯからなる群から選択され、Ｒｃは、１つまたは複数の置換基でさらに置換されてもよいアルキル、アリール、アシルまたはシリル基であり；Ｌ１は、カチオン性中心を重合可能な基に共有結合させるリンカーであり；Ｌ２は、カチオン性中心を加水分解性基に共有結合させるリンカーであり；Ｘ−は、カチオン性中心に結合している対イオンである。
【００２１】
Ｌ１、Ｎ＋、Ｒａ、Ｒｂ、Ｌ２、Ａ（＝Ｏ）−ＯＲｃおよびＸ−は、カチオン性ポリマーについて上で述べた通りである。
【００２２】
別の態様では、本発明は、上記のモノマーの１つまたは複数を重合させることから獲得できるポリマーを提供する。一実施形態では、上記のモノマーの１つまたは複数を重合させることから獲得できるポリマーは、ホモポリマーである。別の実施形態では、ポリマーは共重合体である。代表的な共重合体には、ランダムおよびブロック共重合体が含まれる。一実施形態では、共重合体は、上記のモノマーの１つまたは複数を、１つまたは複数の第二のコモノマーと共重合させることによって獲得できる。代表的なコモノマーには、重合可能な双性イオンモノマー、疎水性モノマーおよびアニオン性モノマーが含まれる。
【００２３】
ある実施形態では、本発明のカチオン性モノマーから入手できるポリマーは、複数の反復単位（ｒｅｐｅａｔｉｎｇ  ｕｎｉｔ）を有し、前記反復単位は、式：
−［ＣＨ２−Ｃ（Ｒｄ）］ｎ−Ｌ１−Ｎ＋（Ｒａ）（Ｒｂ）−Ｌ２−Ａ（＝Ｏ）−ＯＲｃ  Ｘ−
を有し、上式で、−［ＣＨ２−Ｃ（Ｒｄ）］ｎ−は、ｎ個の反復単位を有するポリマー骨格を定義し；Ｒｄは、水素、フッ素、トリフルオロメチルおよびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され；ｎは、１０〜１０，０００であり；Ｎ＋はカチオン性中心であり；ＲａおよびＲｂは、水素、アルキルおよびアリールから独立に選択され；Ａ（＝Ｏ）−ＯＲｃは、加水分解性基であって、ＡはＣ、Ｓ、ＳＯ、ＰまたはＰＯからなる群から選択され、Ｒｃは、１つまたは複数の置換基でさらに置換されてもよいアルキル、アリール、アシルまたはシリル基であり；Ｌ１は、カチオン性中心をポリマー骨格に共有結合させるリンカーであり；Ｌ２は、カチオン性中心を加水分解性基に共有結合させるリンカーであり；Ｘ−は、カチオン性中心に結合している対イオンである。
【００２４】
Ｌ１、Ｎ＋、Ｒａ、Ｒｂ、Ｌ２、Ａ（＝Ｏ）−ＯＲｃおよびＸ−は、カチオン性ポリマーについて上で述べた通りである。
【００２５】
一実施形態では、ポリマーはホモポリマーである。一実施形態では、ポリマーは共重合体である。一実施形態では、共重合体はランダム共重合体である。別の実施形態では、共重合体はブロック共重合体である。他の実施形態では、共重合体は、疎水性の反復単位、アニオン性反復単位および双性イオン反復単位から選択される反復単位を含む。
【００２６】
別の態様では、本発明は、本発明の１つまたは複数のポリマーで処理、コーティング、修飾されるか、さもなければそれを組み込む表面を提供する。ある実施形態では、本発明は、本発明の１つまたは複数のポリマーで処理、コーティング、修飾されているか、さもなければそれを組み込む基材の表面を提供する。代表的な基材には、粒子、薬物担体、非ウイルス遺伝子送達系、バイオセンサー、膜、移植可能なセンサー、皮下センサー、インプラントおよびコンタクトレンズが含まれる。他の代表的な基材には、移植可能な医療装置、例えば耳排液管、供給管、緑内障排液管、水頭症シャント、人工角膜移植、神経誘導管、尿カテーテル、組織接着剤、Ｘ線ガイド、人工関節、人工心臓弁、人工血管、ペースメーカ、左室補助装置（ＬＶＡＤ）、動脈移植片、組織足場およびステントが含まれる。
【００２７】
基材の表面に対して本発明の１つまたは複数のポリマーを塗布、コーティング、修飾するか、さもなければ組み込む方法も提供される。ポリマーは、例えば、溶媒に溶解もしくは懸濁し、次にスピンコート、塗布または噴霧することを含む、様々な沈着技術によって表面に直接塗布することができる。あるいは、他の実施形態では、表面は、適するモノマーを含む従来の重合技術によってその上にポリマーが形成される基材であってよい。
【００２８】
本発明の別の態様では、治療剤送達系が提供される。一実施形態では、治療剤送達系は、本発明のポリマー、およびポリマーと可逆的に結合する治療剤を含む。代表的な治療剤には、小分子、核酸、アミノ酸、ペプチドおよびタンパク質が含まれる。一実施形態では、治療剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡなどの核酸である。ある実施形態では、ポリマーは共重合体である。代表的な共重合体は、第一の反復単位および第二の反復単位を有する。適する第一の反復単位には第三級（３°）アミン基が含まれ、適する第二の反復単位には、第一級（１°）、第二級（２°）または第四級（４°）アミン基が含まれる。これらの共重合体は、３°／１°、３°／２°および３°／４°と命名することができる。一実施形態では、第二の反復単位には、第四級アミン基が含まれる（例えば、３°／４°共重合体）。一実施形態では、共重合体はランダム共重合体である。別の実施形態では、共重合体はブロック共重合体である。
【００２９】
さらなる態様では、本発明は、本発明のカチオン性ポリマーを用いる治療剤を投与する方法を提供する。この方法では、治療剤は、本発明のポリマー、およびポリマーと可逆的に結合する治療剤を含む治療剤送達系を投与することによって、それを必要とする対象に投与される。
【００３０】
本発明の前述の態様および付随する利点の多くは、付随する図と合わせて、以下の詳細な説明への参照によってそれがより深く理解されるにつれて、より容易に理解されるようになる。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
（ａ）ポリマー骨格；
（ｂ）それぞれが第一のリンカーによって前記ポリマー骨格に共有結合している複数のカチオン性中心；
（ｃ）各カチオン性中心と結合している対イオン；および
（ｄ）第二のリンカーを介して各カチオン性中心に共有結合している加水分解性基であって、該加水分解性基はアニオン性中心に加水分解性であり、前記第二のリンカーを介して前記カチオン性中心に共有結合している前記アニオン性中心を有する双性イオンポリマーを提供する加水分解性基
を含むカチオン性ポリマー。
（項目２）
式
ＰＢ−（Ｌ１−Ｎ＋（Ｒａ）（Ｒｂ）−Ｌ２−Ａ（＝Ｏ）−ＯＲｃ）ｎ  （Ｘ−）ｎを有し、式中、
ＰＢはｎ個のペンダント基Ｌ１−Ｎ＋（Ｒａ）（Ｒｂ）−Ｌ２−Ａ（＝Ｏ）−ＯＲｃを有する前記ポリマー骨格であり；
Ｎ＋は前記カチオン性中心であり；
ＲａおよびＲｂは、水素、アルキルおよびアリールから独立に選択され；
Ａ（＝Ｏ）−ＯＲｃは、ＡがＣ、Ｓ、ＳＯ、ＰまたはＰＯからなる群から選択され、Ｒｃが１つまたは複数の置換基でさらに置換されてもよいアルキル、アリール、アシルまたはシリル基である前記加水分解性基であり；
Ｌ１は、前記カチオン性中心を前記ポリマー骨格に共有結合させるリンカーであり；
Ｌ２は、前記カチオン性中心を前記加水分解性基に共有結合させるリンカーであり；
Ｘ−は、前記カチオン性中心と結合している前記対イオンであり；
ｎは、約１０〜約１０，０００の整数である、
項目１に記載のポリマー。
（項目３）
前記対イオンが疎水性の有機対イオンである、項目１または２に記載のポリマー。
（項目４）
前記対イオンがＣ１〜Ｃ２０カルボキシレートおよびＣ１〜Ｃ２０アルキルスルホネートからなる群から選択される、項目１または２に記載のポリマー。
（項目５）
前記対イオンが治療剤である、項目１または２に記載のポリマー。
（項目６）
前記対イオンが抗菌剤、抗細菌剤および抗真菌剤からなる群から選択される、項目１または２に記載のポリマー。
（項目７）
前記対イオンが核酸、アミノ酸、タンパク質およびペプチドからなる群から選択される、項目１または２に記載のポリマー。
（項目８）
前記加水分解性基が加水分解の際に疎水性の有機基を放出する、項目１または２に記載のポリマー。
（項目９）
前記加水分解性基が加水分解の際にＣ１〜Ｃ２０カルボキシレートを放出する、項目１または２に記載のポリマー。
（項目１０）
前記加水分解性基が加水分解の際に治療剤を放出する、項目１または２に記載のポリマー。
（項目１１）
前記加水分解性基が加水分解の際に抗菌剤、抗細菌剤または抗真菌剤を放出する、項目１または２に記載のポリマー。
（項目１２）
前記カチオン性中心が、アンモニウム、イミダゾリウム、トリアザオリウム、ピリジニウム、モルホリニウム、オキサゾリジニウム、ピラジニウム、ピリダジニウム、ピリミジニウム、ピペラジニウムおよびピロリジニウムからなる群から選択される、項目１または２に記載のポリマー。
（項目１３）
ＲａおよびＲｂが、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖および分枝状アルキル基からなる群から独立に選択される、項目２に記載のポリマー。
（項目１４）
Ｌ１が−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−および−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−からなる群から選択され、式中、ｎは１〜２０の整数である、項目２に記載のポリマー。
（項目１５）
Ｌ２が−（ＣＨ２）ｎ−であり、式中、ｎは１〜２０の整数である、項目２に記載のポリマー。
（項目１６）
Ａが、Ｃ、ＳＯおよびＰＯからなる群から選択される、項目２に記載のポリマー。
（項目１７）
ＲｃがＣ１〜Ｃ２０アルキルである、項目２に記載のポリマー。
（項目１８）
Ｘ−が、ハライド、カルボキシレート、アルキルスルホネート、サルフェート；ナイトレート、パークロレート、テトラフルオロボレート、ヘキサフルオロホスフェート、トリフルオロメチルスルホネート、ビス（トリフルオロメチルスルホニル）アミド、ラクテートおよびサリチレートからなる群から選択される、項目２に記載のポリマー。
（項目１９）
（ａ）重合可能な基；
（ｂ）第一のリンカーによって前記重合可能な基に共有結合しているカチオン性中心；
（ｃ）前記カチオン性中心と結合している対イオン；および
（ｄ）第二のリンカーを介して前記カチオン性中心に共有結合している加水分解性基であって、該加水分解性基はアニオン性中心に加水分解性であり、前記第二のリンカーを介して前記カチオン性中心に共有結合している前記アニオン性中心を有する双性イオン化合物を提供する加水分解性基
を含むカチオン性化合物。
（項目２０）
式
ＣＨ２＝Ｃ（Ｒｄ）−Ｌ１−Ｎ＋（Ｒａ）（Ｒｂ）−Ｌ２−Ａ（＝Ｏ）−ＯＲｃ  Ｘ−
を有し、式中、
ＣＨ２＝Ｃ（Ｒｄ）は前記重合可能な基であり、
Ｒｄは、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され；
Ｎ＋は前記カチオン性中心であり；
ＲａおよびＲｂは、水素、アルキルおよびアリールから独立に選択され；
Ａ（＝Ｏ）−ＯＲｃは、ＡがＣ、Ｓ、ＳＯ、ＰまたはＰＯからなる群から選択され、Ｒｃが１つまたは複数の置換基でさらに置換されてもよいアルキル、アリール、アシルまたはシリル基である前記加水分解性基であり；
Ｌ１は、前記カチオン性中心を前記重合可能な基に共有結合させるリンカーであり；
Ｌ２は、前記カチオン性中心を前記加水分解性基に共有結合させるリンカーであり；
Ｘ−は、前記カチオン性中心と結合している前記対イオンである、
項目１９に記載の化合物。
（項目２１）
前記対イオンが疎水性の有機対イオンである、項目１９または２０に記載の化合物。
（項目２２）
前記対イオンがＣ１〜Ｃ２０カルボキシレートおよびＣ１〜Ｃ２０アルキルスルホネートからなる群から選択される、項目１９または２０に記載の化合物。
（項目２３）
前記対イオンが治療剤である、項目１９または２０に記載の化合物。
（項目２４）
前記対イオンが抗菌剤、抗細菌剤および抗真菌剤からなる群から選択される、項目１９または２０に記載の化合物。
（項目２５）
前記対イオンが核酸、アミノ酸、タンパク質およびペプチドからなる群から選択される、項目１９または２０に記載の化合物。
（項目２６）
前記加水分解性基が加水分解の際に疎水性の有機基を放出する、項目１９または２０に記載の化合物。
（項目２７）
前記加水分解性基が加水分解の際にＣ１〜Ｃ２０カルボキシレートを放出する、項目１９または２０に記載の化合物。
（項目２８）
前記加水分解性基が加水分解の際に治療剤を放出する、項目１９または２０記載の化合物。
（項目２９）
前記加水分解性基が加水分解の際に抗菌剤、抗細菌剤または抗真菌剤を放出する、項目１９または２０に記載の化合物。
（項目３０）
前記カチオン性中心が、アンモニウム、イミダゾリウム、トリアザオリウム、ピリジニウム、モルホリニウム、オキサゾリジニウム、ピラジニウム、ピリダジニウム、ピリミジニウム、ピペラジニウムおよびピロリジニウムからなる群から選択される、項目１９または２０に記載の化合物。
（項目３１）
ＲａおよびＲｂが、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖および分枝状アルキル基からなる群から独立に選択される、項目２０に記載の化合物。
（項目３２）
Ｌ１が−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−および−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−からなる群から選択され、式中、ｎは１〜２０の整数である、項目２０に記載の化合物。
（項目３３）
Ｌ２が−（ＣＨ２）ｎ−であり、式中、ｎは１〜２０の整数である、項目２０に記載の化合物。
（項目３４）
Ａが、Ｃ、ＳＯおよびＰＯからなる群から選択される、項目２０に記載の化合物。
（項目３５）
ＲｃがＣ１〜Ｃ２０アルキルである、項目２０に記載の化合物。
（項目３６）
Ｘ−が、ハライド、カルボキシレート、アルキルスルホネート、サルフェート；ナイトレート、パークロレート、テトラフルオロボレート、ヘキサフルオロホスフェート、トリフルオロメチルスルホネート、ビス（トリフルオロメチルスルホニル）アミド、ラクテートおよびサリチレートからなる群から選択される、項目２０に記載の化合物。
（項目３７）
項目１９から３６のいずれか一項に記載の化合物を重合させることによって得られるポリマー。
（項目３８）
項目１９から３６のいずれか一項に記載の化合物および第二のモノマーを重合させることによって得られるポリマー。
（項目３９）
複数の反復単位を有するポリマーであって、前記反復単位が、式
−［ＣＨ２−Ｃ（Ｒｄ）］ｎ−Ｌ１−Ｎ＋（Ｒａ）（Ｒｂ）−Ｌ２−Ａ（＝Ｏ）−ＯＲｃ  Ｘ−
を有し、式中、
−［ＣＨ２−Ｃ（Ｒｄ）］ｎ−は、ｎ個の反復単位を有するポリマー骨格を定義し；
Ｒｄは、水素、フッ素、トリフルオロメチルおよびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され；
ｎは、１０〜１０，０００であり；
Ｎ＋はカチオン性中心であり；
ＲａおよびＲｂは、水素、アルキルおよびアリールから独立に選択され；
Ａ（＝Ｏ）−ＯＲｃは、ＡがＣ、Ｓ、ＳＯ、ＰまたはＰＯからなる群から選択され、Ｒｃが１つまたは複数の置換基でさらに置換されてもよいアルキル、アリール、アシルまたはシリル基である加水分解性基であり；
Ｌ１は、前記カチオン性中心を前記ポリマー骨格に共有結合させるリンカーであり；
Ｌ２は、前記カチオン性中心を前記加水分解性基に共有結合させるリンカーであり；
Ｘ−は、前記カチオン性中心と結合している前記対イオンである、ポリマー。
（項目４０）
前記ポリマーがホモポリマーである、項目３９に記載のポリマー。
（項目４１）
前記ポリマーが共重合体である、項目３９に記載のポリマー。
（項目４２）
前記共重合体がランダム共重合体である、項目４１に記載のポリマー。
（項目４３）
前記共重合体がブロック共重合体である、項目４１に記載のポリマー。
（項目４４）
前記共重合体が、疎水性反復単位、アニオン性反復単位および双性イオン反復単位からなる群から選択される反復単位を含む、項目４１から４３のいずれか一項に記載のポリマー。
（項目４５）
基材の表面であって、項目１から１８および３７から４４のいずれか一項に記載のポリマーを含む表面。
（項目４６）
前記基材が、粒子、薬剤担体、非ウイルス遺伝子送達系、バイオセンサー、膜、移植可能なセンサー、皮下センサー、インプラントおよびコンタクトレンズからなる群から選択される、項目４５に記載の表面。
（項目４７）
前記基材が、耳排液管、供給管、緑内障排液管、水頭症シャント、人工角膜移植、神経誘導管、尿カテーテル、組織接着剤、Ｘ線ガイド、人工関節、人工心臓弁、人工血管、ペースメーカ、左室補助装置（ＬＶＡＤ）、動脈移植片、組織足場およびステントからなる群から選択される移植可能な医療装置である、項目４５に記載の表面。
（項目４８）
（ａ）項目１から１８および３７から４４のいずれか一項に記載のポリマー；および
（ｂ）前記ポリマーと可逆的に結合する治療剤
を含む治療剤送達系。
（項目４９）
前記治療剤が、小分子、核酸、アミノ酸、ペプチドおよびタンパク質からなる群から選択される、項目４８に記載の送達系。
（項目５０）
前記ポリマーが共重合体である、項目４８に記載の送達系。
（項目５１）
前記共重合体が第一の反復単位および第二の反復単位を含み、前記第一の反復単位は第三級アミン基を含み、前記第二の反復単位は第一級、第二級または第四級のアミン基を含む、項目５０に記載の送達系。
（項目５２）
前記第二の反復単位が第四級アミン基を含む、項目５１に記載の送達系。
（項目５３）
それを必要とする対象に項目４８から５２のいずれか一項に記載の治療剤送達系の有効量を投与することを含む、治療剤を投与するための方法。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明のカチオン性ポリマーを作製するのに有用な３つの代表的なカチオン性モノマー、すなわち、異なるカルボキシベタインエステル基を有する３つのアクリルアミドモノマー、ＣＢＡＡ−１−エステル、ＣＢＡＡ−３−エステルおよびＣＢＡＡ−５−エステルの構造を例示する図である。
【図２】本発明の代表的なカチオン性ポリマーの加水分解、すなわち、双性イオンポリカルボキシベタインへのカチオン性ポリカルボキシベタインエステルの加水分解を例示する図である。
【図３】（ａ）１０ｍＭ（３％加水分解）、（ｂ）１００ｍＭ（８２％加水分解）および（ｃ）１Ｍ（１００％加水分解）の水酸化ナトリウム濃度の溶液で１時間処理した後の、本発明の代表的なカチオン性ポリマー、ポリＣＢＡＡ−３−エステルの加水分解の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを比較する図である。
【図４】１０ｍＭおよび１００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液での本発明の代表的なカチオン性ポリマーの加水分解速度を比較する図である。
【図５】本発明の代表的なポリマー、すなわち加水分解の前後のポリカルボキシベタインエステル；（ａ）ポリＣＢＡＡ−１−エステル、（ｂ）ポリＣＢＡＡ−３−エステルおよび（ｃ）ポリＣＢＡＡ−５−エステルを移植した表面でのフィブリノーゲン吸着のＳＰＲセンサーグラムを示す図である。ポリマーブラシを有する表面を、１００ｍｍＮａＯＨ溶液で１〜２時間加水分解した。
【図６】本発明の３つの代表的なカチオン性ポリマー、ポリＣＢＡＡ−エステルの加水分解の前後の抗微生物活性を比較するグラフである。Ｅ．ｃｏｌｉ（１０８個の細胞／ｍＬ）を、各ポリマー溶液（反復単位モル濃度：  ２ｍＭ）と３０分間インキュベートした。ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４および１５０ｍＭ）を、陰性対照として用いる。
【図７】カチオン性ポリマーでコーティングした本発明の代表的な表面の略図である。表面は、加水分解時に、抗細菌性表面から非汚染性表面に切り替わる：（ａ）抗微生物性カチオン性ｐＣＢＭＡ−１  Ｃ２は、細菌を効果的に殺傷し、（ｂ）ｐＣＢＭＡ−１  Ｃ２は、加水分解時に非汚染性双性イオンｐＣＢＭＡ−１に変換され、（ｃ）表面にとどまっている死菌は、非汚染性双性イオンｐＣＢＭＡ−１から放出され、（ｄ）双性イオンｐＣＢＭＡ−１自体は、細菌の接着に高度抵抗性であることを証明する。
【図８】本発明の代表的なカチオン性ポリマー、切替可能なｐＣＢＭＡ−１  Ｃ２；抗微生物性カチオン性ｐＣ８ＮＭＡ；および非汚染性双性イオンｐＣＢＭＡ−２の化学構造を例示する図である。
【図９】Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２に対するｐＣＢＭＡ−１  Ｃ２およびｐＣ８ＮＭＡの殺菌活性を比較するグラフである。抗微生物性ポリマーでコーティングされた表面で増殖した生存Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２コロニーの割合は、ｐＣＢＭＡ−２対照（ｎ＝３）の上で増殖したコロニー数と相対的である。
【図１０】様々なポリマーで被覆した表面への１時間曝露についての、１０１０個の細胞・ｍＬ−１の懸濁液からの付着したＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２細胞（赤色）の蛍光顕微鏡検査画像を示す図である：（ａ）、（ｃ）および（ｅ）は、それぞれ加水分解前のｐＣＢＭＡ−１  Ｃ２、ｐＣ８ＮＭＡおよびｐＣＢＭＡ−２のものであり、（ｂ）、（ｄ）および（ｆ）は、それぞれ加水分解後の同じポリマーのものである。加水分解は、１０ｍＭ  ＣＡＰＳ（ｐＨ１０．０）で８日間であった。
【図１１】加水分解の前後のｐＣＢＭＡ−１  Ｃ２、ｐＣ８ＮＭＡおよびｐＣＢＭＡ−２への１時間の曝露についての、１０１０個の細胞・ｍＬ−１の懸濁液からのＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２の結合を比較するグラフである（ｎ＝３）。
【図１２】図１２Ａは、（ａ）加水分解の前、ならびに（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）は、それぞれ水、ｐＨ９．０の１０ｍＭ  ＣＥＨＳ、ｐＨ１０．０の１０ｍＭ  ＣＡＰＳによる２４時間の加水分解の後の、ＡＴＲＰを通してｐＣＢＭＡ−１  Ｃ２を移植した表面への、ＰＢＳ緩衝液中の１ｍｇ・ｍＬ−１フィブリノーゲンの吸着を示すＳＰＲセンサーグラムを比較する図である。図１２Ｂは、ｐＨ１０．０の１０ｍＭ  ＣＡＰＳとのインキュベーションの（ａ）前、および（ｂ）２４時間の後のｐＣ８ＮＭＡを移植した表面、ならびに、ｐＨ１０．０の１０ｍＭ  ＣＡＰＳによる（ｃ）加水分解の前および（ｄ）２４時間の加水分解の後のｐＣＢＭＡ−２を移植した表面への、ＰＢＳ緩衝液中の１ｍｇ・ｍＬ−１フィブリノーゲンの吸着を示すＳＰＲセンサーグラムを比較する図である。
【図１３】本発明のカチオン性ポリマーを作製するのに有用な代表的なカチオン性モノマー：ＣＢＭＡ−１  Ｃ２  ＳＡ、サリチル酸対イオンを有するＣＢＭＡ−１のエチルエステルの構造を例示する図である。
【図１４】ＣＢＭＡ−１  Ｃ２  ＳＡを重合させることによって調製したヒドロゲルからの、４つの条件：（ａ）水、中性ｐＨ；（ｂ）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）；（ｃ）水、ｐＨ１０；および（ｄ）０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ１０の下での、２５℃でのサリチル酸の経時的（１２時間、３９時間および６３時間）放出速度（ｍｇ／ｈ）を比較する図である。
【図１５】ＣＢＭＡ−１  Ｃ２  ＳＡを重合させることによって調製したヒドロゲルからの、４つの条件：（ａ）水、中性ｐＨ；（ｂ）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）；（ｃ）水、ｐＨ１０；および（ｄ）０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ１０の下での、３７℃でのサリチル酸の経時的（１２時間、３９時間および６３時間）放出速度（ｍｇ／ｈ）を比較する図である。
【図１６】本発明の代表的なカチオン性ポリマーによるＤＮＡ複合体の電気泳動遅滞を例示するアガロース電気泳動ゲルの写真である：レーン１、ＤＮＡのみ；レーン２、ポリＣＢＡＡ−１−エステル／ＤＮＡ；レーン３、加水分解ポリＣＢＡＡ−１−エステル／ＤＮＡ；レーン４、ポリＣＢＡＡ−３−エステル／ＤＮＡ；レーン５、加水分解ポリＣＢＡＡ−３−エステル／ＤＮＡ；レーン６、ポリＣＢＡＡ−５−エステル／ＤＮＡ；レーン７、加水分解ポリＣＢＡＡ−５−エステル／ＤＮＡ。
【図１７】第四級（４°）カルボキシベタインメタクリレートエチルエステルモノマーの第二級（２°）および第三級（３°）類似体の構造を例示する図である。モノマーを別々の比で共重合させ、ＤＮＡをパッケージ化し、Ｎ／Ｐ＝４０でＣＯＳ−７細胞をトランスフェクトするために用いたポリマーを提供した。
【図１８】図１７で例示したモノマーから調製したホモポリマーおよび共重合体のナノ粒子サイズのグラフである：１００％２°、１００％３°、１００％４°、７５％２°／２５％３°、７５％３°／２５％４°、７５％４°／２５％２°、５０％２°／５０％３°、５０％３°／５０％４°、５０％４°／５０％２°、２５％２°／７５％３°、２５％３°／７５％４°、２５％４°／７５％２°。７５％４°／２５％２°および５０％４°／５０％２°共重合体を除くすべてのポリマーが、クラスリン媒介エンドサイトーシスを通して細胞に入るのに十分小さなナノ粒子にＤＮＡを縮合させることが判明した。
【図１９】図１７で例示したモノマーから調製したホモポリマーおよび共重合体のナノ粒子表面電荷のグラフである：１００％２°、１００％３°、１００％４°、７５％２°／２５％３°、７５％３°／２５％４°、７５％４°／２５％２°、５０％２°／５０％３°、５０％３°／５０％４°、５０％４°／５０％２°、２５％２°／７５％３°、２５％３°／７５％４°、２５％４°／７５％２°。すべての２°／４°および３°／４°は正に荷電したが、すべての２°／３°は負に荷電した。
【図２０】ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）のトランスフェクション効率（ＣＯＳ−７細胞）を図１７に例示したモノマーから調製したホモポリマーおよび共重合体と比較するグラフである：１００％２°、１００％３°、１００％４°、７５％２°／２５％３°、７５％３°／２５％４°、７５％４°／２５％２°、５０％２°／５０％３°、５０％３°／５０％４°、５０％４°／５０％２°、２５％２°／７５％３°、２５％３°／７５％４°、２５％４°／７５％２°。ＣＯＳ−７細胞は、混合アミンポリマーによるＤＮＡの縮合を通して調製したナノ粒子でトランスフェクトした。
【図２１】ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）でトランスフェクトした細胞の細胞生存率を図１７に例示したモノマーから調製したホモポリマーおよび共重合体と比較するグラフである：１００％２°、１００％３°、１００％４°、７５％２°／２５％３°、７５％３°／２５％４°、７５％４°／２５％２°、５０％２°／５０％３°、５０％３°／５０％４°、５０％４°／５０％２°、２５％２°／７５％３°、２５％３°／７５％４°、２５％４°／７５％２°。
【図２２】加水分解性第三級アミンＣＢＭＡエステルまたは非加水分解性第三級アミンジメチルアミノエチルメタクリレートによるトランスフェクションを比較するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、ポリマー、ポリマーから作製される物質、ならびにポリマーおよびポリマー物質を作製および使用する方法を提供する。
【００３３】
本発明の一態様では、カチオン性ポリマーが提供される。本発明のカチオン性ポリマーは、加水分解して双性イオンポリマーを提供することができる加水分解性基を含む。双性イオンポリマーは、正および負の電荷の均衡を有するポリマーである。双性イオンポリマーは、タンパク質吸着および細菌接着に高度抵抗性であることができる。双性イオンポリマー（例えば、ホスホベタイン、スルホベタインおよびカルボキシベタインポリマー）は、それらの生物模倣性質のために、高い生体適合性を示す。
【００３４】
制御された加水分解。カチオン性ポリマーの構造上の特徴の変動は、それらの制御された加水分解、ならびに生物学的、化学的および物理的な特性の制御を可能にする。加水分解の速度は、加水分解性基（例えば、エステルの場合、−ＯＲ）の性質の選択によってかなり影響を与えること、および制御することができる。
【００３５】
下記のように、ある実施形態では、本発明のカチオン性ポリマーは、加水分解後に官能基を都合よく放出する。例えば、本発明のカチオン性エステルについては、加水分解エステルは−ＯＲ基を放出する。これらの実施形態では、放出される基は、治療剤（例えば、抗微生物性、抗細菌性、抗真菌性の薬剤）であってもよい。同様に、ある実施形態では、カチオン性ポリマーはそれらの対イオン（Ｘ−）を放出することができ、それらも、治療剤（例えば、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質およびサリチル酸）であってよい。
【００３６】
遺伝子もしくは薬剤送達の担体としての用途については、複合体がその標的に到達する場合、コンジュゲートされたＤＮＡまたはタンパク質を、カチオン性ポリマー担体の加水分解を通して放出することができる。抗微生物剤としての用途については、抗微生物性カチオン性ポリマーを双性イオンポリマーに変換し、有毒残留物を環境に残さないこと、および死菌を表面に残さないことができる。
【００３７】
加水分解性基を加水分解によってだけでなく、他の手段によって起こる切断（例えば、分解または侵食）によっても切断することができることはいうまでもない。カチオン性ポリマーは、とりわけ、酵素触媒反応、酸化還元、熱、光、イオン強度、ｐＨおよび加水分解による環境変化によって、それらの対応する双性イオンポリマーに変換することができる。下記の治療剤送達用途については、切断はおそらく、酵素作用および／またはｐＨ変化によって起こる。
【００３８】
本発明の代表的なカチオン性ポリマーおよびそれらの対応する双性イオンポリマー対応物を、下に記載する。
【００３９】
カチオン性ポリマー
本発明のカチオン性ポリマーは、加水分解されるとポリマーを双性イオンにするアニオン基を提供する加水分解性基を含む。各ポリマーでは、加水分解性基の数はカチオン基の数と実質的に同等であり、したがって、加水分解性基が加水分解されると生じるポリマーは双性イオン性である。本明細書で用いるように、用語「双性イオンポリマー」は、実質的に同等数のカチオン基およびアニオン基を有するポリマーを指す。
【００４０】
本発明の代表的なカチオン性ポリマーは、式（Ｉ）
ＰＢ−（Ｌ１−Ｎ＋（Ｒａ）（Ｒｂ）−Ｌ２−Ａ（＝Ｏ）−ＯＲｃ）ｎ  （Ｘ−）ｎ  （Ｉ）
を有し、上式で、ＰＢはｎ個のペンダント基（すなわち、Ｌ１−Ｎ＋（Ｒａ）（Ｒｂ）−Ｌ２−Ａ（＝Ｏ）−ＯＲｃ）を有するポリマー骨格であり；Ｎ＋はカチオン性中心であり；ＲａおよびＲｂは、水素、アルキルおよびアリール基から独立に選択され；Ａ（＝Ｏ）−ＯＲｃは加水分解性基であって、式中、ＡはＣ、Ｓ、ＳＯ、ＰまたはＰＯであり、Ｒｃは、１つまたは複数の置換基でさらに置換されてもよいアルキル、アリール、アシルまたはシリル基であり；Ｌ１は、カチオン性中心をポリマー骨格に共有結合させるリンカーであり；Ｌ２は、カチオン性中心を加水分解性基に共有結合させるリンカーであり；Ｘ−は、カチオン性中心に結合している対イオンであり；ｎは、約１０〜約１０，０００である。式（Ｉ）のポリマーの平均分子量は、約１ｋＤａ〜約１，０００ｋＤａである。
【００４１】
式（Ｉ）のカチオン性ポリマーの加水分解は、式（ＩＩ）
ＰＢ−（Ｌ１−Ｎ＋（Ｒａ）（Ｒｂ）−Ｌ２−Ａ（＝Ｏ）Ｏ−）ｎ  （ＩＩ）
を有する双性イオンポリマーを提供し、上式で、ＰＢ、Ｌ１、Ｎ＋、Ｒａ、Ｒｂ、Ｌ２、Ａおよびｎは上に述べた通りであり、Ａ（＝Ｏ）Ｏ−はアニオン基である。
【００４２】
この実施形態では、式（Ｉ）のポリマーは、ｎ個のペンダント基を含み、式（ＩＩＩ）
ＣＨ２＝Ｃ（Ｒｄ）−Ｌ１−Ｎ＋（Ｒａ）（Ｒｂ）−Ｌ２−Ａ（＝Ｏ）−ＯＲｃ  Ｘ−  （ＩＩＩ）
を有するモノマーの重合によって調製することができ、上式で、Ｌ１、Ｎ＋、Ｒａ、Ｒｂ、Ａ（＝Ｏ）ＯＲｃおよびＬ２、およびＸ−は、上で述べた通りであり、Ｒｄは、水素、フッ素、トリフルオロメチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ６〜Ｃ１２アリール基から選択される。
【００４３】
以下は、上記の式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のポリマーおよびモノマーの記載である。
【００４４】
式（Ｉ）および（ＩＩ）において、ＰＢはポリマー骨格である。代表的なポリマー骨格には、ビニルモノマー（例えば、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、スチレン）に由来するビニル骨格（すなわち、−Ｃ（Ｒ’）（Ｒ’’）−Ｃ（Ｒ’’’）（Ｒ’’’’）−、式中、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は、水素、アルキルおよびアリールから独立に選択される）が含まれる。他の適する骨格には、双性イオン基に変換することができる加水分解性基を含むペンダントカチオン基を提供するポリマー骨格、およびカチオン基を含み、双性イオン基に変換することができるペンダント加水分解性基を提供する骨格が含まれる。他の代表的なポリマー骨格には、ペプチド（ポリペプチド）、ウレタン（ポリウレタン）およびエポキシ骨格が含まれる。
【００４５】
同様に、式（ＩＩＩ）で、ＣＨ２＝Ｃ（Ｒｄ）−は、重合可能な基である。上記のものを含む他の重合可能な基を、本発明のモノマーおよびポリマーを提供するために用いることができることはいうまでもない。
【００４６】
式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）で、Ｎ＋はカチオン性中心である。ある実施形態では、カチオン性中心は、第四級アンモニウム（ＮがＬ１；Ｒａ、ＲｂおよびＬ２に結合）である。アンモニウムに加えて、他の有用なカチオン性中心には、イミダゾリウム、トリアザオリウム、ピリジニウム、モルホリニウム、オキサゾリジニウム、ピラジニウム、ピリダジニウム、ピリミジニウム、ピペラジニウムおよびピロリジニウムが含まれる。
【００４７】
ＲａおよびＲｂは、水素、アルキルおよびアリール基から独立に選択される。代表的なアルキル基には、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖および分枝状のアルキル基が含まれる。ある実施形態では、アルキル基は、例えばアリール基（例えば、−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、ベンジル）を含む、１つまたは複数の置換基でさらに置換される。一実施形態では、ＲａおよびＲｂは、メチルである。代表的なアリール基には、例えばフェニルを含む、Ｃ６〜Ｃ１２アリール基が含まれる。式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のある実施形態については、Ｒ２またはＲ３は存在しない。
【００４８】
Ｌ１は、カチオン性中心をポリマー骨格に共有結合させるリンカーである。ある実施形態では、Ｌ１は、Ｌ１の残りをポリマー骨格（または式（ＩＩＩ）のモノマーの重合可能な部分）に結合させる官能基（例えば、エステルまたはアミド）を含む。官能基に加えて、Ｌ１はＣ１〜Ｃ２０アルキレン鎖を含むことができる。代表的なＬ１基には、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−および−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−が含まれ、式中、ｎは１〜２０（例えば、３）である。
【００４９】
Ｌ２は、カチオン性中心を加水分解性基（または、式（ＩＩ）の双性イオンポリマーのアニオン基）に共有結合させるリンカーである。Ｌ２は、Ｃ１〜Ｃ２０アルキレン鎖であることができる。代表的なＬ２基には−（ＣＨ２）ｎ−が含まれ、式中、ｎは１〜２０（例えば、１、３または５）である。
【００５０】
式（Ｉ）のカチオン性ポリマーの疎水性および加水分解速度は、Ｌ１および／またはＬ２によって制御することができる。Ｌ１またはＬ２の疎水性が強いほど、加水分解性基の加水分解および双性イオンポリマーへのカチオン性ポリマーの変換はより遅い。
【００５１】
Ａ（＝Ｏ）−ＯＲｃは、加水分解性基である。加水分解性基は、エステル、例えばカルボン酸エステル（ＡはＣである）、スルフィン酸エステル（ＡはＳである）、スルホン酸エステル（ＡはＳＯである）、ホスフィン酸エステル（ＡはＰである）またはホスホン酸エステル（ＡはＰＯである）であることができる。加水分解性基は、無水物であることもできる。Ｒｃは、１つまたは複数の置換基でさらに置換されてもよいアルキル、アリール、アシルまたはシリル基である。
【００５２】
代表的なアルキル基には、Ｃ１〜Ｃ３０直鎖および分枝状のアルキル基が含まれる。ある実施形態では、アルキル基は、例えばアリール基（例えば、−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、ベンジル）を含む、１つまたは複数の置換基でさらに置換される。ある実施形態では、ＲｃはＣ１〜Ｃ２０直鎖アルキル基である。一実施形態では、Ｒｃはメチルである。別の実施形態では、Ｒｃはエチルである。一実施形態では、ＲｃはＣ３〜Ｃ２０アルキルである。一実施形態では、ＲｃはＣ４〜Ｃ２０アルキルである。一実施形態では、ＲｃはＣ５〜Ｃ２０アルキルである。一実施形態では、ＲｃはＣ６〜Ｃ２０アルキルである。一実施形態では、ＲｃはＣ８〜Ｃ２０アルキルである。一実施形態では、ＲｃはＣ１０〜Ｃ２０アルキルである。比較的遅い加水分解が所望される用途の場合、ＲｃはＣ４〜Ｃ２０  ｎ−アルキル基またはＣ４〜Ｃ３０  ｎ−アルキル基である。
【００５３】
代表的なアリール基には、例えば置換されたフェニル基（例えば安息香酸）を含むフェニルを含む、Ｃ６〜Ｃ１２アリール基が含まれる。
【００５４】
代表的なアシル基（−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｅ）には、ＲｅがＣ１〜Ｃ２０アルキルまたはＣ６〜Ｃ１２アリールであるアシル基が含まれる。
【００５５】
代表的なシリル基（−ＳｉＲ３）には、ＲがＣ１〜Ｃ２０アルキルまたはＣ６〜Ｃ１２アリールであるシリル基が含まれる。
【００５６】
本発明のある実施形態では、加水分解生成物ＲｃＯ−（またはＲｃＯＨ）は、治療剤（例えば、抗微生物剤、例えばサリチル酸（２−ヒドロキシ安息香酸）、ベンゾエート、ラクテート、ならびに抗生物質および抗真菌性薬剤のアニオン形態）である。
【００５７】
ある他の実施形態では、加水分解生成物ＲｃＯ−（またはＲｃＯＨ）は、ラクテート、グリコレートまたはアミノ酸である。
【００５８】
式（Ｉ）のカチオン性ポリマーの加水分解速度は、Ｒｃによって制御することもできる。例えば、Ｒｃによる立体的および／または速度論的効果により加水分解性基の加水分解がより遅いほど、双性イオンポリマーへのカチオン性ポリマーの変換はより遅い。
【００５９】
Ｘ−は、カチオン性中心に結合している対イオンである。対イオンは、式（Ｉ）のカチオン性ポリマーの合成または式（ＩＩＩ）のモノマーから生じる対イオンであってよい（例えば、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−）。カチオン性中心の合成から最初に生成される対イオンは、他の適する対イオンと交換して、制御可能な加水分解特性および他の生物的特性を有するポリマーを提供することもできる。
【００６０】
式（Ｉ）のカチオン性ポリマーの加水分解速度は、対イオンによって制御することもできる。対イオンの疎水性が強いほど、加水分解性基の加水分解はより遅く、双性イオンポリマーへのカチオン性ポリマーの変換はより遅い。代表的な疎水性対イオンには、カルボン酸、例えば安息香酸および脂肪酸アニオン（例えば、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＯ２−、式中、ｎ＝１〜１９）；アルキルスルホネート（例えば、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＳＯ３−、式中、ｎ＝１〜１９）；サリチレート；ラクテート；ビス（トリフルオロメチルスルホニル）アミドアニオン（Ｎ−（ＳＯ２ＣＦ３）２）；およびそれらの誘導体が含まれる。他の対イオンを、塩化物、臭化物、ヨウ化物、サルフェート；ナイトレート；パークロレート（ＣｌＯ４）；テトラフルオロボレート（ＢＦ４）；ヘキサフルオロホスフェート（ＰＦ６）；トリフルオロメチルスルホネート（ＳＯ３ＣＦ３）；およびそれらの誘導体から選択することもできる。
【００６１】
他の適する対イオンには、疎水性対イオン、および、治療活性のある対イオン（例えば、抗微生物剤、例えばサリチル酸（２−ヒドロキシ安息香酸）、ベンゾエート、ラクテート、ならびに抗生物質および抗真菌性薬剤のアニオン形態）が含まれる。
【００６２】
式（ＩＩＩ）のモノマーについては、Ｒｄは、水素、フッ化物、トリフルオロメチルおよびＣ１〜Ｃ６アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル）から選択される。一実施形態では、Ｒｄは水素である。一実施形態では、Ｒｄはメチルである。別の実施形態では、Ｒｄはエチルである。
【００６３】
カチオン性ポリマーの構造上の特徴の変動は、それらの制御された加水分解、ならびに生物学的、化学的および物理的な特性の制御を可能にする。所望の制御されたポリマー加水分解を達成するために変更することができる、上記カチオン性ポリマーの構造上の特徴には、Ｌ１、Ｌ２、Ｒａ、Ｒｂ、Ａ、ＲｃおよびＸ−が含まれる。一般には、ポリマーまたは記載の構造上の特徴が疎水性であるほど、双性イオンポリマーへのカチオン性ポリマーの加水分解はより遅い。
【００６４】
ホモポリマー、ランダム共重合体、ブロック共重合体。本発明のカチオン性ポリマーには、ホモポリマー、ランダム共重合体およびブロック共重合体が含まれる。
【００６５】
一実施形態では、本発明は、式（ＩＩＩ）によって定義されるようなカチオン性モノマーを重合させることによって調製される、式（Ｉ）によって定義されるようなカチオン性ホモポリマーを提供する。式（Ｉ）によって定義されるポリマーを含む本発明のカチオン性ポリマーに付随する有利な特性を、他の重合物質に付与することができることはいうまでもない。
【００６６】
一実施形態では、本発明は、式（ＩＩＩ）の２つの異なるカチオン性モノマーを共重合することによって調製されるランダム共重合体を提供する。
【００６７】
別の実施形態では、本発明は、式（ＩＩＩ）によって定義される本発明の１つまたは複数のカチオン性モノマーを、１つまたは複数の他のモノマー（例えば、疎水性のモノマー、アニオン性モノマーまたは双性イオンモノマー、例えばホスホリルベタイン、スルホベタインもしくはカルボキシベタインモノマー）と共重合することによって調製されるカチオン性反復単位を含む、ランダム共重合体を提供する。
【００６８】
一実施形態では、本発明は、カチオン性反復単位を含む１つまたは複数のブロック、および１つまたは複数の他のブロックを有するブロック共重合体を提供する。この実施形態では、カチオン性反復単位を含む１つまたは複数のブロックは、カチオン性反復単位（例えば、式（ＩＩＩ）のカチオン性モノマーから調製されるホモポリマーまたは共重合体）だけを含む。あるいは、カチオン性反復単位を含む１つまたは複数のブロックは、カチオン性反復単位および他の反復単位（例えば、疎水性、アニオン性、双性イオン性の反復単位）を含む。
【００６９】
他の適するポリマー
本発明は、以下のポリマーも提供する。
【００７０】
一実施形態では、カチオン性ポリマーは、以下の構造を有し：
【００７１】
【化１】
0005474808.tif 000002
Ｒ１＝−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５
Ｒ２＝原子なし、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５
Ｒ３＝−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５
ｘ＝１〜８。
【００７２】
Ｒ＝任意のアルキル鎖、芳香族またはラクテートまたはグリコレート
【００７３】
【化２】
0005474808.tif 000003
Ｒ４＝−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５
Ｙ＝１〜１０
Ｚ＝０〜２２
またはＣ（＝Ｏ）Ｒ’
Ｒ’＝任意のアルキル鎖または芳香族基。
【００７４】
別の実施形態では、カチオン性ポリマーは、以下の構造を有し：
【００７５】
【化３】
0005474808.tif 000004
ｎ＞５
ｘ＝１〜５
ｙ＝１〜５
Ｒ１＝Ｈ、またはアルキル鎖
Ｒ２＝原子なし、Ｈ、またはアルキル鎖
Ｒ３＝アルキル鎖。
【００７６】
別の実施形態では、本発明は以下の構造を有するポリマーを提供し：
【００７７】
【化４】
0005474808.tif 000005
Ｒ１は、任意のアルキル鎖であり
Ｒ３は、任意のアルキル鎖であり
Ｒ２、Ｒ４は任意のアルキル鎖であり
ｘ＝１〜１８
ｙ＝１〜１８
ｎ＞３。
【００７８】
別の実施形態では、本発明は以下の構造を有するポリマーを提供し：
【００７９】
【化５】
0005474808.tif 000006
Ｒは、アルキル鎖であり
ｘ＝１〜１８
ｙ＝１〜１８
ｎ＞３。
【００８０】
別の実施形態では、本発明は以下の構造を有するポリマーを提供し：
【００８１】
【化６】
0005474808.tif 000007
Ｒ＝任意のアルキル鎖
ｘ＝０〜１１
ｎ＞３。
【００８２】
別の実施形態では、本発明は以下の構造を有するポリマーを提供し：
【００８３】
【化７】
0005474808.tif 000008
ｎ＞３
ｘ＝１〜１０
Ｒ＝任意のアルキル鎖、芳香族またはラクテートまたはグリコレート。
【００８４】
【化８】
0005474808.tif 000009
Ｒ４＝−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５
ｙ＝１〜１０
ｚ＝０〜２２
またはＣ（＝Ｏ）Ｒ’
Ｒ’＝任意のアルキル鎖、芳香族基。
【００８５】
別の実施形態では、本発明は以下の構造を有するポリマーを提供し：
【００８６】
【化９】
0005474808.tif 000010
ｎ＞３
ｘ＝１〜６
ｙ＝０〜６
Ｒ＝任意のアルキル鎖、芳香族またはラクテートまたはグリコレート
【００８７】
【化１０】
0005474808.tif 000011
Ｒ４＝−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５
ｙ＝１〜１０
ｚ＝０〜２２
またはＣ（＝Ｏ）Ｒ’
Ｒ’＝任意のアルキル鎖、芳香族基。
【００８８】
別の実施形態では、本発明は以下の構造を有するポリマーを提供し：
【００８９】
【化１１】
0005474808.tif 000012
ｎ＞５
ｘ＝０〜５。
【００９０】
別の実施形態では、本発明は以下の構造を有するポリマーを提供し：
【００９１】
【化１２】
0005474808.tif 000013
ｘ＝０〜１７
ｎ＞５
Ｒ＝Ｈまたはアルキル鎖。
【００９２】
別の実施形態では、本発明は以下の構造を有するポリマーを提供し：
【００９３】
【化１３】
0005474808.tif 000014
ｎ＞５
Ｒ２＝Ｈまたは任意のアルキル鎖、例えばメチル
ｘ、ｙ＝１〜６
Ｒ１＝任意のアルキル鎖、
【００９４】
【化１４】
0005474808.tif 000015
Ｒ４＝−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５
ｙ＝１〜１０
ｚ＝０〜２２
別の実施形態では、本発明は以下の構造を有するポリマーを提供し：
【００９５】
【化１５】
0005474808.tif 000016
ｎ＞３
Ｒ１＝任意のアルキル鎖。
【００９６】
式（Ｉ）のカチオン性ポリマーおよび究極的に式（ＩＩ）の双性イオンポリマーを作製するために有用である、式（ＩＩＩ）の３つの代表的なカチオン性モノマーを図１に例示する。図１を参照すると、カチオン性カルボキシベタインエステル基を運ぶペンダント基を有する、３つの正荷電のポリアクリルアミドを例示する。３つのモノマーは、第四級アンモニウム基（カチオン性中心）とエステル（加水分解性）基：ＣＢＡＡ−１−エステル（ｎ＝１）；ＣＢＡＡ−３−エステル（ｎ＝３）；およびＣＢＡＡ−５−エステル（ｎ＝５）との間に、異なるスペーサー基（Ｌ２：−（ＣＨ２）ｎ−）を有する。モノマーの重合は、対応するカチオン性ポリマーを提供する。３つのモノマーは、線状ポリマーを形成するフリーラジカル重合を用いて、または、ＳＰＲセンサーにポリマーブラシを調製する表面開始ＡＴＲＰを用いて重合させた。異なるスペーサー基（Ｌ２）およびエステル基を有するポリマーは、異なる化学的、物理的および生物学的特性を有すると予想された。３つのモノマーの合成およびそれらの重合を、実施例１に記載する。
【００９７】
フリーラジカル重合を通して重合された線状ポリマーについては、それらの分子量は、水溶液でゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いて測定した。ポリＣＢＡＡ−１−エステル、ポリＣＢＡＡ−３−エステルおよびポリＣＢＡＡ−５−エステルは、それぞれ、１４ｋＤａ、１３ｋＤａおよび９．６ｋＤａの平均分子量であった。
【００９８】
カチオン性ポリマーの加水分解は、双性イオンポリマー（すなわち、双性イオンポリカルボキシベタイン）を提供する。本発明の代表的なカチオン性ポリマーの加水分解は、実施例２で記載し、図２で図示する。図２で、ｎは１、３または５である（それぞれ、ポリＣＢＡＡ−１−エステル、ポリＣＢＡＡ−３−エステルおよびポリＣＢＡＡ−５−エステルに対応する）。３つのカルボキシベタインエステルポリマーを異なる水酸化ナトリウム濃度の下で溶解し、それらの加水分解挙動を研究した。しばらくして、１Ｈ  ＮＭＲを用いてポリマーの上に保持されているエステル基を測定することによって、ポリマーの加水分解速度を分析した。すべての３つのポリマーは水中で安定であり、４日後に明白な加水分解は検出されなかった。ＮａＯＨの濃度は、カルボキシベタインエステルポリマーの加水分解のために重要である。図３は、ＮａＯＨの３つの異なる濃度で１時間処理した後の、ポリＣＢＡＡ−３−エステルのＮＭＲスペクトルを図示する。１０ｍＭの濃度のＮａＯＨ溶液については、わずかな加水分解が検出されただけであった（約３％）。１００ｍＭ  ＮａＯＨ溶液については、約８２％のポリマーが加水分解された。１ＭのＮａＯＨ濃度については、ポリマーは１時間で完全に加水分解された。図４は、時間の関数としての、１００ｍＭまたは１０ｍＭのＮａＯＨの下での加水分解速度をグラフ化する。図４を参照すると、これらの２つのＮａＯＨ濃度の下で、ほとんどの加水分解は最初の１時間で起こる。その後、加水分解速度は時間とともにわずかに変化する。
【００９９】
上記したように、本発明のカチオン性ポリマーの加水分解速度は、それらの構造を修飾することによって制御することができる。異なる加水分解挙動を得るために、エステル基（加水分解性基）、スペーサー基（Ｌ１およびＬ２）および対イオン（Ｘ−）などの様々な構造パラメータを有するカチオン性ポリマー。加水分解挙動は、ポリマー分子量を変えること、または他のモノマーと共重合することによって制御することもできる。加水分解性エステル基（例えばｔ−ブチルおよびアルキル置換シリル）または無水物基は、酸性または塩基性の条件下で容易に加水分解することができる。第四級アンモニウム基（カチオン性中心）とエステル（加水分解性）基との間のスペーサー基（Ｌ２：−（ＣＨ２）ｎ−）を変えることも、加水分解速度を調整することができる。短いスペーサーは、加水分解速度を増加させることができる。さらに、親水性のアニオン（例えば、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、ＳＯ４）などの対イオンも加水分解速度を増加させ、低いポリマー分子量および他の親水性モノマーとの共重合も、加水分解速度を増加させるのを助ける。
【０１００】
タンパク質吸着
本発明の加水分解性カチオン性ポリマーは、ポリマーで処理された表面へのタンパク質吸着の低減で有効な物質として、有利に用いることができる。カチオン性ポリマーは、低汚染性表面を調製するために用いることができる。これらの表面は、装置表面へのタンパク質吸着が有害である環境での装置のために、有利に使用することができる。
【０１０１】
低いタンパク質吸着を有する表面の提供における本発明の代表的なカチオン性ポリマーの有用性を証明するために、実施例３に記載の代表的なカチオン性ポリマーからポリマーブラシを調製し、それらのタンパク質吸着を測定した。
【０１０２】
３つのモノマー（ＣＢＡＡ−１−エステル、ＣＢＡＡ−３−エステルおよびＣＢＡＡ−５−エステル）を、表面開始ＡＴＲＰを用いてＳＰＲセンサーの表面に移植した。ＸＰＳ分析からの推定で、ポリマーブラシは、厚さが５〜２０ｎｍであった。３つのポリマーブラシの上の１ｍｇ／ｍＬフィブリノーゲン溶液からのタンパク質吸着を、ＳＰＲを用いて測定した。フィブリノーゲンは粘着性のタンパク質で、医用材料の上での血小板凝集および血液凝固で重要な役割を演ずる。ポリＣＢＡＡ−１−エステル、ポリＣＢＡＡ−３−エステルおよびポリＣＢＡＡ−５−エステルのフィブリノーゲン吸着は、それぞれ１９５ｎｇ／ｃｍ２、２５５ｎｇ／ｃｍ２および６００ｎｇ／ｃｍ２であった（図５Ａ〜５Ｃを参照）。全３つのポリマーは、それらの正電荷のために明白なタンパク質吸着を有する。ポリＣＢＡＡ−１−エステルは、より疎水性のＬ２（すなわち、それぞれＣ３およびＣ５）を有する他の２つのエステルと比較してそのより高い親水性のために、比較的より低いフィブリノーゲン吸着を有した。メチレンからプロピレン、さらにペンチレンへのＬ２の増加に伴い、ポリマーの疎水性が増加し、より高いフィブリノーゲン吸着をもたらす。
【０１０３】
１００ｍＭで１〜２時間の加水分解の後、表面特性は劇的に変化した。図５Ａ〜５Ｃは、３つのポリマーの各々を移植した表面が、フィブリノーゲン吸着に高度抵抗性である表面に変換されたことを示す。加水分解されたポリＣＢＡＡ−１−エステルおよび加水分解されたポリＣＢＡＡ−３−エステルを有する表面では、フィブリノーゲン吸着はＳＰＲの検出限界である０．３ｎｇ／ｃｍ２未満である。加水分解されたポリＣＢＡＡ−５−エステルの上でのフィブリノーゲン吸着は、約１．５ｎｇ／ｃｍ２であった。加水分解を制御することによって、ポリマー移植表面は、高タンパク質吸着からタンパク質吸着高抵抗性にそれらの特性を変えることができる。さらに、加水分解後に生じた双性イオンポリマーを有する表面は生体適合性であり、血液血漿／血清および細菌接着／バイオフィルム形成からの非特異的タンパク質吸着に高度抵抗性である。
【０１０４】
抗微生物特性
本発明の加水分解性カチオン性ポリマーは、抗微生物性特性を示す。本発明の代表的なカチオン性ポリマーの抗微生物性特性の評価は、実施例４で記載される。
【０１０５】
カチオン性ポリカルボキシベタインエステルの抗微生物特性を評価するために、ポリＣＢＡＡ−１−エステル、ポリＣＢＡＡ−３−エステルおよびポリＣＢＡＡ−５−エステルのポリマー溶液を、Ｅ．ｃｏｌｉとインキュベートした。２ｍＭの濃度（反復単位モル濃度）で、ポリＣＢＡＡ−１−エステル、ポリＣＢＡＡ−３−エステルおよびポリＣＢＡＡ−５−エステルは、それぞれ９５％、８７．３％および４６．２％の生細胞割合を示すことが判明した（図６を参照）。抗微生物活性は、Ｌ２の長さの増加と一緒に増加するようである。加水分解後、双性イオンポリマー、ポリＣＢＡＡ−１、ポリＣＢＡＡ−３およびポリＣＢＡＡ−５は、それぞれ、９３．７％、９６．３％および９５．３％の生細胞割合を示し、抗微生物活性は、双性イオンポリマー（すなわち、ポリカルボキシベタイン）へのカチオン性ポリマー（すなわち、ポリカルボキシベタインエステル）の加水分解に従って低下することを示す。
【０１０６】
いくつかの両親媒性ポリカチオンを、それらの抗細菌活性について調査した。異なるポリカチオンの殺菌効率を比較するために、ポリカチオンのアルキルペンダント鎖長を調べた。第四級アミン基およびより長い疎水性ペンダント鎖を有するポリマーは、より高い疎水性のためにより良好な抗微生物活性を有することが分かる。カルボキシベタインエステルを有する小分子第四級アンモニウム化合物（ＱＭＣ）は、それらがより長い炭化水素基を有する場合、速やかな殺菌作用を有することが見出された。これらのＱＭＣは、腸内細菌の外膜および細胞質膜に結合し、細菌の膜内に浸透することができた。抗微生物効果は、本発明のカチオン性ポリマー（例えば、ポリカルボキシベタインエステル）のスペーサー長（Ｌ２）を増加させることで高まる。
【０１０７】
ポリＣＢＡＡ−５−エステルの抗微生物効力は、類似したアルキル鎖長を有する他の四級化ポリマーのそれと同等である。より高い抗微生物効力は、より長いアルキル鎖長（例えば、Ｃ１〜Ｃ２０）で達成することができる。
【０１０８】
従来の抗微生物性コーティングについては、死滅微生物および吸着タンパク質が表面に通常集積し、それらの抗微生物活性を劇的に低下させる。対照的に、本発明のカチオン性ポリマーから作製される抗微生物性コーティングは、双性イオンポリマーに加水分解され、様々な生体分子の吸着に高度抵抗性である表面を提供する。これらの双性イオンポリマーは、バルク材としておよび表面コーティングとして、無毒性、生体適合性および非汚染性である。
【０１０９】
本発明の代表的な架橋双性イオンポリマー、ポリカルボキシベタインヒドロゲルは、無細胞傷害性で、カブトガニの血球溶解成分（ＬＡＬ）エンドトキシンアッセイキット（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗａｌｋｅｒｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を用いると、０．０６単位（ＥＵ）／ｍＬ未満のエンドトキシンを含む。ポリカルボキシベタインヒドロゲルは、最高４週間の間マウスの皮下に移植した。結果は、ポリカルボキシベタインが、移植のためによく受け入れられているモデルの医用材料であるポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリラート）（ポリＨＥＭＡ）ヒドロゲルのそれと同等のインビボ生体適合性を有することを示した。双性イオンポリマーの無毒特性は、それらのカチオン性ポリマー前駆体の毒性を変換し、死滅微生物および吸着タンパク質が表面に集積することを防止することができる非汚染特性をさらに提供する。
【０１１０】
切替可能なポリマーコーティングおよび医療装置におけるそれらの使用
双性イオンポリマーに加水分解性である本発明のカチオン性ポリマーは、例えば医療装置を含む様々な装置の表面のコーティングとして、有利に用いることができる。この実施形態では、本発明のカチオン性ポリマーは、自己滅菌性および非汚染性能力を有する切替可能な生体適合性ポリマー表面を提供する。
【０１１１】
図７は、自己滅菌性および非汚染性能力を有する切替可能な生体適合性ポリマー表面の略図である。図７を参照すると、抗微生物性表面（ａ）は、細菌を効果的に死滅させる本発明の代表的なカチオン性ポリマー（すなわち、ｐＣＢＭＡ−１  Ｃ２、図８を参照）でコーティングした表面である。加水分解後、（ｂ）代表的なカチオン性ポリマーは非汚染性双性イオンポリマー（すなわち、ｐＣＢＭＡ−１、ｐＣＢＭＡ−１  Ｃ２エステルに対応するカルボキシレート）に変換され、表面にとどまっている死細菌は非汚染性双性イオンポリマー（すなわち、ｐＣＢＭＡ−１）から放出され（ｃ）、双性イオンポリマーでコーティングされている表面を提供し、それは、細菌接着に高度抵抗性である（ｄ）。
【０１１２】
本発明の物質（例えば、ポリマー、ヒドロゲル）は、生体適合性、抗微生物性および非汚染性の表面を提供するために表面をコーティングするために、有利に用いられる。したがって、別の態様では、本発明は、本発明の１つまたは複数の物質が適用された（例えば、コーティング、共有結合、イオン的に結合、疎水的に結合した）表面（すなわち、１つまたは複数の表面）を有する装置および材料を提供する。本発明の物質で有利に処理すること、本発明の物質を含むように、または本発明の物質を組み込むように修飾することができる代表的な装置には、以下のものが含まれる：
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有する粒子（例えば、ナノ粒子）；
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有する薬剤担体；
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有する非ウイルス遺伝子送達系；
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有するバイオセンサー；
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有する、バイオプロセスまたは生物分離のための装置、例えば、微生物懸濁液、ホルモン分離、タンパク質分画、細胞分離、廃水処理、オリゴ糖バイオリアクター、タンパク質限外ろ過およびダイアリープロセシングのための膜；
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有する移植可能なセンサー；
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有する皮下センサー；
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有する、乳房インプラント、蝸牛インプラントおよび歯科用インプラントなどのインプラント；
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有するコンタクトレンズ；
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有する組織足場；
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有する、人工関節、人工心臓弁、人工血管、ペースメーカ、左室補助装置（ＬＶＡＤ）、動脈移植片およびステントなどの移植可能な医療装置；ならびに
本発明の物質で処理され、それを含むか組み込むように修飾された表面を有する、耳排液管、供給管、緑内障排液管、水頭症シャント、人工角膜移植、神経誘導管、尿カテーテル、組織接着剤およびＸ線ガイドなどの医療装置。
【０１１３】
移植された医用材料の上への微生物接着およびその後のバイオフィルムの形成は、生物医学装置の失敗の主因の１つである。抗菌性および非汚染性のコーティングの使用は、移植可能な材料の表面への微生物の付着および拡散の防止のための２つの戦略である。共有結合されている第四級アンモニウム化合物（ＱＡＣ）を含む抗微生物性表面は、様々な微生物を効果的に死滅させることができることが判明した。ＱＡＣ表面の主要な問題点は、抗微生物性コーティングの上にとどまる死滅微生物の付着であり、それは、免疫応答および炎症を誘発することができ、その抗微生物性官能基をブロックすることができる。さらに、そのような抗微生物性コーティングは、移植可能な医用材料としての非汚染性および生体適合性の要件を満たすことができない。ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）誘導体または双性イオンポリマーは、細菌付着およびバイオフィルム形成を減少させる非汚染性材料として、広く用いられている。しかし、酸化損傷に対するＰＥＧの感受性は、複合媒体でのその長期適用を制限している。ポリ（スルホベタインメタクリレート）（ｐＳＢＭＡ）などの双性イオン物質は、細菌付着およびバイオフィルム形成を激減させることができ、また、未希釈の血漿および血清からのものでさえ、非特異的タンパク質吸着に高度抵抗性である。双性イオンコーティングは初期の付着を減少させ、表面への微生物の定着を遅らせることができるが、移植手術およびカテーテル挿入の間に、病原菌を患者に導入する可能性があり、それは移植装置の失敗につながる。このように、これらの微生物を除去するのに抗微生物剤の使用が必要となる。広域な用途のために表面応答性物質が開発されているが、抗微生物性および非汚染性の両方の能力を有する生体適合性物質を開発することは、まだ大きな難問である。
【０１１４】
上記のように、一実施形態では、本発明は、非汚染性表面の利点を組み合わせ、１時間で９９．９％を超えるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２を死滅させることができ、カチオン性誘導体が非汚染性双性イオンポリマーに加水分解されると死菌の９８％が放出される、切替可能なポリマー表面コーティングを提供する。ｐＣＢＭＡ−１−Ｃ２（式（Ｉ）のカチオンポリマーであって、式中、Ｌ１は−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ２ＣＨ２−であり、Ｌ２は−ＣＨ２−であり、ＲｃはＣＨ２ＣＨ３であり、Ｘ−はＢｒ−である）対照コーティングを、表面開始原子転移ラジカル重合（ＡＴＲＰ）によって、イニシエーターで被覆された金表面に移植した。得られたポリマーコーティングの、原子間力鏡検（ＡＦＭ）によって測定した厚みは、２６〜３２ｎｍであった（表１）。
【０１１５】
【表１】
0005474808.tif 000017
ｐＣＢＭＡ−１  Ｃ２表面の殺菌活性は、修正した文献方法（Ｔｉｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ９８巻：５９８１頁、２００１年）に従ってＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２を用いて測定した。恒久カチオン性ポリ（メタクリロイルオキシエチル−ジメチルオクチルアンモニウムブロミド）（ｐＣ８ＮＭＡ、カチオン対照、図８を参照）、および双性イオンポリ（２−カルボキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［２’−（メタクリロイルオキシ）エチル］エタナミニウム）（ｐＣＢＭＡ−２、双性イオン対照、図８を参照）を、それぞれ陽性対照および陰性対照の表面として用いた。抗微生物効果は、ｐＣＢＭＡ−２表面の生細胞の量と比較した、試験表面の生細胞の量と定義された。図９は、ｐＣＢＭＡ−１  Ｃ２およびｐＣ８ＮＭＡ表面が、ｐＣＢＭＡ−２表面と比較して、１時間でそれぞれ９９．９％および９９．６％を超えるＥ．ｃｏｌｉを死滅させることを示す。陰性対照表面としても用いられた金表面の生細菌細胞の総数は、ｐＣＢＭＡ−２表面のそれに類似している。
【０１１６】
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２の付着および放出は、加水分解の前後にｐＣＢＭＡ−１  Ｃ２表面で試験した。カチオン性ｐＣ８ＮＭＡおよび双性イオンｐＣＢＭＡ−２は、それぞれ陰性および陽性の非汚染性対照表面として、また、それぞれ陽性および陰性の抗微生物性対照表面として用いた。図１０Ａ〜１０Ｆは、加水分解の前に大量の細菌がカチオン性ｐＣＢＭＡ−１  Ｃ２およびｐＣ８ＮＭＡ表面に付着したが、双性イオンｐＣＢＭＡ−２表面には極めて少ない細菌細胞しか付着しなかったことを示す。ｐＣ８ＮＭＡと対照的に、ｐＣＢＭＡ−１  Ｃ２は加水分解の後に大多数の細胞を放出したが、ｐＣＢＭＡ−２は非汚染のままであった。図１１は、加水分解の前後に全３つのポリマー表面にとどまっていた細菌細胞の量の定量データを示す。加水分解の前にはカチオン性ｐＣＢＭＡ−１  Ｃ２およびｐＣ８ＮＭＡの両方の表面に類似した量の細菌残留物があったが、ｐＣＢＭＡ−２表面の付着細胞の量は、カチオン性ｐＣＢＭＡ−１  Ｃ２およびｐＣ８ＮＭＡの両方の表面のそれの０．３％未満である。細菌残留物の放出を試験するために、３つの表面をＮ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ１０．０）に３７℃で８日間インキュベートした。ｐＣＢＭＡ−１  Ｃ２表面はポリ（Ｎ−（カルボキシメチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−［（２−メチル−１−オキソ−２−プロペン−１−イル）−オキシ］エタナミニウム）（ｐＣＢＭＡ−１）に加水分解され、死細菌細胞の９８％が放出された。対照的に、ｐＣ８ＮＭＡ表面では死細胞の放出は観察されなかった（ｐ＞０．１）が、ｐＣＢＭＡ−２表面は非常に低い細菌接着を保持した。
【０１１７】
付着細菌細胞の放出は、双性イオンｐＣＢＭＡ−１へのカチオン性ｐＣＢＭＡ−１  Ｃ２の変換に依存する。ベタインエステルの加水分解速度は、いくつかの因子、例えば第四級アミンとカルボキシル基間のスペーサー（Ｌ２）の長さ、加水分解性基の性質、温度およびｐＨ値によって影響される。用いたエステル基のポリマー鎖の大多数が加水分解された。ベタインエステルの加水分解速度は、細菌細胞およびタンパク質が表面に付着した後にも、より遅い。１つのメチレンスペーサー（Ｌ２）を有するｐＣＢＭＡ−１  Ｃ２を選択し、実験温度は、速い加水分解速度を達成し、生理的に関連した温度を提供するために３７℃に設定した。タンパク質吸着結果（表２を参照）は、清潔なカチオン性ｐＣＢＭＡ−１  Ｃ２表面は、３７℃およびｐＨ１０．０でわずか２４時間後に非汚染性双性イオン表面に加水分解されたが、非汚染性表面を形成し、１０７個の細胞・ｍＬ−１のＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２懸濁液からの細菌の付着の後に細菌残留物を放出するのに、４８時間を必要とすることを示した。１０１０個の細胞・ｍＬ−１の懸濁液から細菌細胞がｐＣＢＭＡ−１  Ｃ２表面に付着した場合、同じ加水分解条件の下で付着細菌の放出に８日を要した。
【０１１８】
表面の非汚染性特性を測定するために、様々な表面への非特異的タンパク質吸着を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーで測定した（表２を参照）。ｐＣＢＭＡ−１  Ｃ２および対照表面の加水分解条件を、ＳＰＲセンサーによりインシトゥーで調査した。図１２Ａおよび１２Ｂは、ｐＣＢＭＡ−１  Ｃ２および対照表面へのフィブリノーゲンの経時的吸着の、代表的なＳＰＲセンサーグラムを示す。加水分解前のｐＣＢＭＡ−１  Ｃ２へのフィブリノーゲン吸着は、２２９．２ｎｇ・ｃｍ−２であった。ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１０．０）との２４時間のインキュベーションの後、ｐＣＢＭＡ−１  Ｃ２表面への測定可能なタンパク質吸着はなかったが、そのことは、ｐＣＢＭＡ−１  Ｃ２が非汚染性双性イオンｐＣＢＭＡ−１に完全に加水分解されることを示した。対照的に、ｐＣＢＭＡ−１  Ｃ２の加水分解は、水またはＮ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＥＨＳ）緩衝液（ｐＨ９．０）のいずれでの２４時間のインキュベーションの後にも完全でなかった。図１２Ｂに示すように、表面を３７℃で２４時間ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１０．０）とインキュベートした前後に、高いフィブリノーゲン吸着がｐＣ８ＮＭＡ表面で観察された。しかし、同一条件下でも、ｐＣＢＭＡ−２表面は優れた非汚染特性を示し、２ｎｇ・ｃｍ−２未満のフィブリノーゲン吸収であった。この結果は、得られた双性イオン表面がタンパク質吸着に高度抵抗性であって、移植可能な医療装置の表面コーティングに必要とされる、超低汚染性表面として適格であることを示す。
【０１１９】
この実施形態では、本発明は、抗微生物性および非汚染性の特性を組み込み、生体適合性である切替可能なポリマー表面を提供する。代表的なカチオン性ポリマー（すなわち、ｐＣＢＭＡの前駆体）は、細菌細胞を効果的に死滅させることができ、加水分解後に双性イオン非汚染性表面に切り替わり、死細菌細胞を放出する。さらに、生じた非汚染性双性イオン表面は、さらにタンパク質および微生物の付着を防止することができ、表面でのバイオフィルムの形成を減少させることができる。抗微生物性から非汚染性表面への切替可能な過程は、適用の特定の要件のために、これらのポリマーの加水分解速度の調節を通して調整することができる。
【０１２０】
上記のように、本発明のカチオン性ポリマーは、疎水性の対イオンまたは治療活性（例えば、抗微生物性または抗細菌性の活性）を有する対イオンを含むことができる。サリチル酸対イオン（ポリＣＢＭＡ−１  Ｃ２）を有する代表的なポリマーは、図１３に例示するモノマー：ＣＢＭＡ−１  Ｃ２（「１」は２つの荷電基の間の１つの炭素を示し、「Ｃ２」はＣ２エステルを示す）から調製することができる。その対イオンとしてサリチル酸（ＳＡ）を加えたポリＣＢＭＡ−１  Ｃ２ヒドロゲルは、１ｍＭ  ＣＢＭＡ−１  Ｃ２  ＳＡモノマー（図面１３）を、１ｍｌの溶媒（エチレングリコール：水：エタノール＝１：２：１）中で０．０５ｍＭテトラエチレングリコールジメタクリレートと６５℃で２時間共重合することによって調製した。生じたヒドロゲルは、脱イオン水に１２時間浸した。ヒドロゲルは、直径１ｃｍの円形ディスクに切断した。次に、ヒドロゲルディスクを、異なるｐＨおよびイオン強度の溶液に移し、２５℃または３７℃でインキュベートした。異なる時点で、水相を完全に除去し、新しい溶液を加えた。水相へのＳＡの放出は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定した。ＳＡの放出速度は、時間で割った放出されたＳＡの量（ｍｇ／ｈ）と定義される。ｐＣＢＭＡ−１  Ｃ２  ＳＡヒドロゲルからのＳＡの放出速度は、温度、イオン強度およびｐＨによって決まる。図１４および図１５は、より高いｐＨがＳＡの放出を促進し、より高いイオン強度がＳＡの放出速度をわずかに増加させることができることを示した。図１４および図１５を比較することによって、上昇温度が水およびリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中でＳＡのより速い放出をもたらすことが観察される。ＳＡの放出速度は、すべての条件で時間の関数として低下する。
【０１２１】
治療薬送達
本発明の別の態様では、治療剤送達系が提供される。本発明のカチオン性ポリマーは、ポリマーと可逆的に結合することができる治療剤の送達における担体として有利に働く。一実施形態では、治療剤送達系は、本発明のポリマー、およびポリマーと可逆的に結合する治療剤を含む。本明細書で用いるように、用語「可逆的に結合する」は、結合相互作用（例えば、イオン性）を通してカチオン性ポリマーと効果的に縮合（すなわち、パッケージ化または結合）することができ、その後、送達系がその標的に到達すると放出させることができる治療剤を指す。適する治療剤には、関心の標的においてカチオン性ポリマーの加水分解および対応する双性イオンポリマーへのその変換の結果として、治療剤がポリマーから解離する標的への輸送の間、カチオン性ポリマーと結合するのに十分な電荷特性を有する小分子、核酸（例えば、遺伝子）、タンパク質およびペプチドが含まれる。一実施形態では、治療剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡなどの核酸である。
【０１２２】
ある実施形態では、ポリマーは共重合体である。代表的な共重合体は、第一の反復単位および第二の反復単位を有する。適する第一の反復単位には第三級（３°）アミン基が含まれ、適する第二の反復単位には、第一級（１°）、第二級（２°）または第四級（４°）アミン基が含まれる。これらの共重合体は、３°／１°、３°／２°および３°／４°と命名することができる。一実施形態では、第二の反復単位には、第四級アミン基が含まれる（例えば、３°／４°共重合体）。一実施形態では、共重合体はランダム共重合体である。別の実施形態では、共重合体はブロック共重合体である。
【０１２３】
さらなる態様では、本発明は、本発明のカチオン性ポリマーを用いる治療剤を投与する方法を提供する。本方法では、治療剤は、治療剤送達系を投与することによって、それを必要とする対象に投与される。一実施形態では、本方法は、治療剤送達系の有効量を投与することを含む。本明細書で用いるように、用語「有効量」は、所望の治療作用の達成に十分な治療剤の量を含む送達系の量を指す。当業者は、対象、治療する状態および投与の方法に基づき、治療剤の有効量を容易に決定することができる。
【０１２４】
核酸送達における本発明の代表的なカチオン性ポリマーの調製および有用性は、実施例５に記載する。
【０１２５】
代表的なカチオン性ポリマー、ポリＣＢＡＡ−１−エステル（１４ｋＤａ）、ポリＣＢＡＡ−３−エステル（１３ｋＤａ）およびポリＣＢＡＡ−５−エステル（９．６ｋＤａ）を溶解してポリマー溶液を提供し、プラスミドＤＮＡと混合した。図１６は、アガロースゲル上のプラスミドＤＮＡの移動を示すが、それは、アガロースゲル電気泳動遅滞を通して、それらの電荷およびサイズに基づいてポリマーまたは複合体を分離することができる。バンド１は、ＤＮＡだけを含む。ポリマー溶液の添加で、高い分子量を有する１つのバンドだけが各場合について見出され、全３つのカチオン性ポリマーがプラスミドＤＮＡを縮合させ、ＤＮＡ／ポリマー複合体（バンド２、４および６）を形成することを示している。ポリＣＢＡＡ−１−エステル／ＤＮＡ複合体は、強い染色シグナルを示した。アガロースゲル電気泳動遅滞は、加水分解の前後の明白な変化を示す。１００ｍＭ水酸化ナトリウムを用いる１時間の加水分解の後、３つのポリマー溶液はプラスミドＤＮＡと複合体を形成することができず、混合液の全ＤＮＡがアガロースゲルの上で移動した（バンド３、５および７を参照）。
【０１２６】
光散乱からの結果に基づくと、３つのポリマー、ポリＣＢＡＡ−１−エステル、ポリＣＢＡＡ−３−エステルおよびポリＣＢＡＡ−５−エステルのそれぞれは、それぞれ１０６、１３６および１１２ｎｍの平均直径を有する複合体を形成した。粒子は、低い多分散でよく形成される（表２）。細胞による内在化を可能にするために、より小さなサイズのポリマー／ＤＮＡ複合体（１５０ｎｍ未満）が望まれる。結果は、全３つのポリマーが、ＤＮＡを遺伝子送達担体のために適当なサイズで縮合させることができることを示す。全３つのポリマー／ＤＮＡ複合体は、溶液中の迅速な分散を可能にする正電荷を有する。ポリＣＢＡＡ−１−エステル、ポリＣＢＡＡ−２−エステルおよびポリＣＢＡＡ−３−エステルは、それぞれ＋３．１３±０．９８、＋６．４７±０．３３および＋１１．８０±１．４４の平均ζ電位を有した。
【０１２７】
【表２】
0005474808.tif 000018
他のカチオン性ポリマーと同様に、本発明のカチオン性ポリマーは、負荷電ＤＮＡと相互作用する。結果は、本発明のカチオン性ポリマーが、ポリマー／ＤＮＡ複合体を形成するだけでなく、加水分解の後にＤＮＡを放出することを示す。さらに、加水分解の生成物、双性イオンポリマー（例えば、ポリカルボキシベタイン）は、無毒性、生体適合性および非汚染性である。遺伝子送達のために、カルボキシベタインエステル基を有するポリマーは、エステラーゼを通して加水分解することができる。異なるスペーサー基（Ｌ１および／またはＬ２）、ベンジルエステルなどのエステル基のアルコール成分を有するポリカルボキシベタインエステルを、細胞内での制御可能な加水分解のために調製することができる。
【０１２８】
さらに、第三級アミンを「プロトンスポンジ」として導入することができる。第三級アミンは、生理的範囲の近くのｐＫａ値を有する。これらのアミンは、プロトンの流入が酸性化および潜在的ＤＮＡ分解を引き起こすエンドソーム区画を緩衝することができるので、この特性は細胞内送達のために有利である。プロトンのアミン媒介性結合は、プロトンスポンジ効果として知られる小胞膨潤および破裂をもたらすことができる、エンドソームとサイトゾルとの間の浸透勾配の形成をもたらす。
【０１２９】
エンドソーム緩衝能を生体適合性と組み合わせるために、カルボキシベタインメタクリレート（ＣＢＭＡ）モノマーの第二級（２°−）、第三級（３°−）、第四級（４°−）アミン類似体を合成した。図１７を参照。モノマーを、１００％／０％、７５％／２５％、５０％／５０％、２５％／７５％および０％／１００％の比で共重合させ、３０〜３５ｋＤａのポリマーをもたらした。
【０１３０】
次に、ポリマーを用いて、ルシフェラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを、別々のナノ粒子に縮合させた。ナノ粒子のサイズおよび表面電荷は、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  ＺｅｔａＰＡＬＳ器具で測定した（それぞれ、図１８および１９を参照）。７５％４°／２５％２°および５０％４°／５０％２°共重合体を除くすべてのポリマーが、クラスリン媒介エンドサイトーシスを通して細胞に入るのに十分小さなナノ粒子にＤＮＡを縮合させることが判明した。すべての３°／４°および４°／２°共重合体はＤＮＡを正に荷電したナノ粒子に縮合させたが、すべての２°／３°共重合体ナノ粒子は負に荷電した。正電荷は、特異的結合がない場合に細胞との静電的相互作用を可能にする。
【０１３１】
次に、ナノ粒子を用いて、ＣＯＳ−７細胞をルシフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトさせた。３°／４°混合ポリマー、１００％４°および７５％４°／２５％２°からのナノ粒子でトランスフェクトさせた細胞だけが、送達された遺伝子の測定可能な発現を有した。５０／５０の３°／４°共重合体は、トランスフェクションにおいて他の共重合体よりも１桁効率的であった。
【０１３２】
トランスフェクションの後、トランスフェクトされた細胞コロニーを、細胞生存度の尺度として、タンパク含有量について試験した。すべての混合アミンナノ粒子（２つの例外）が、培地だけで処理した細胞よりも優れていないものの、それと同等の細胞生存度を有することが判明した。混合アミンナノ粒子のトランスフェクション効率および細胞生存度を、ポリマー遺伝子送達の標準と広くみなされているポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）と比較した。図２０を参照。３°および４°ＣＢＭＡエステルの５０／５０混合物は、誤差の範囲内でＰＥＩと同等のトランスフェクション効率を有した（ＣＢＭＡについては３．３×１０６±１×１０６ＲＬＵ／ウェル、対してＰＥＩでは３．１×１０６±４×１０５ＲＬＵ／ウェル）。
【０１３３】
【表３】
0005474808.tif 000019
ほとんどすべてのポリマーの細胞生存度は、培地だけで処理した細胞の細胞生存度よりも優れ、３°および４°ＣＢＭＡエステルの５０／５０混合物は特異的に２倍の増加を示した。他方、ＰＥＩは、我々の系ではわずか１２％の細胞生存度を有した。図２１を参照。３°および４°ＣＢＭＡエステル共重合体の５０／５０混合物は、ＰＥＩと同じトランスフェクション能力を有し、細胞生存度の２５倍の増加を提供する。
【０１３４】
モノマー上の加水分解性部分の重要性を試験するために、第三級モノマーを、ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）で置換した。ＤＭＡＥＭＡはＣＢＭＡエチルエステルの３°類似体に構造的に非常に類似しているが、その側鎖はアミン基の後ろで切断されている。したがって、それは同じエンドソーム緩衝能を有すると予想されたが、加水分解して双性イオン性になる能力がない。ＤＭＡＥＭＡモノマーが同じ２°および４°モノマーで共重合された場合、生じた共重合体はベースラインのトランスフェクションだけを示し、エチルエステル基の加水分解が３°ＣＢＭＡエステルのトランスフェクション能力の鍵であることを示した。図２２を参照。
【０１３５】
３°および４°ＣＢＭＡエステルの５０／５０混合物から調製される共重合体の成功は、それが別々のサイズの正荷電のナノ粒子にＤＮＡをパッケージ化することを可能にする正電荷、および、エンドソーム緩衝を可能にする第三級アミンのその均衡に帰することができる。これらの特性は、加水分解してＤＮＡを放出し、非汚染性で生体適合性の副生成物を残すポリマー側鎖の能力によって、さらに高められる。
【０１３６】
以下の実施例は、請求される発明を限定するものではなく、例示するために提供される。
【実施例】
【０１３７】
（実施例１）
代表的なカチオン性ポリマーの合成および特性評価
材料。Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）アクリルアミド（＞９８％）を、ＴＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲから購入した。ブロモ酢酸メチル（９７％）、エチル４−ブロモ酪酸（≧９７．０％）、エチル６−ブロモヘキサン酸（９９％）、臭化銅（Ｉ）（９９．９９９％）、臭化ブロモイソブチリル（ＢＩＢＢ９８％）、１１−メルカプト−１−ウンデカノール（９７％）および２，２’−ビピリジン（ＢＰＹ９９％）、および２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）（ＡＩＢＮ９８％）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。フィブリノーゲン（ウシ血漿からの分画Ｉ）およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ、１３８ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ）を、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から購入した。エタノール（無水２００プルーフ）は、ＡＡＰＥＲ  Ａｌｃｏｈｏｌ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から購入した。実験で用いた水は、ミリポア純水装置を１８．０ＭΩ．ｃｍの最小比抵抗で用いて精製した。
【０１３８】
ω−メルカプトウンデシルブロモイソブチレート（１）を、Ｉｌｋｅｒ，  Ｍ．  Ｆ．；Ｎｕｅｓｓｌｅｉｎ，  Ｋ．；Ｔｅｗ，  Ｇ．  Ｎ．；Ｃｏｕｇｈｌｉｎ，  Ｅ．  Ｂ．、「Ｔｕｎｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ  Ｐｏｌｙｎｏｒｂｏｒｎｅｎｅ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ１２６巻（４８号）：１５８７０〜１５８７５頁、２００４年に記載の方法を用いて、ＢＩＢＢおよび２の反応を通して合成した。
１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  ４．１５  （ｔ，  Ｊ＝６．９，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２），  ２．５１  （ｑ，  Ｊ＝７．５，  ２Ｈ，  ＳＣＨ２），  １．９２  （ｓ，  ６Ｈ，  ＣＨ３），  １．５７−１．７２  （ｍ，  ４Ｈ，  ＣＨ２），  および１．２４−１．４０  （ｍ，  １６Ｈ，  ＣＨ２）．
カチオン性モノマー合成
ＣＢＡＡ−１−エステル：（２−カルボキシメチル）３−アクリルアミドプロピルジメチルアンモニウムブロミド、メチルエステル。
【０１３９】
Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）アクリルアミド（２５ｍｍｏｌ）、ブロモ酢酸メチル（３７．５ｍｍｏｌ）およびアセトニトリル（２５ｍＬ）を、１００ｍＬ丸底フラスコに加えた。混合液を、室温で６時間、窒素雰囲気の下で撹拌した。沈殿物を収集し、約５００ｍＬの無水アセトンで洗浄した。溶媒を回転蒸発装置で除去し、白色粉末（９６％収率）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ）：  ２．０２  （ｍ，  ２Ｈ，  −ＣＨ２−），  ３．２５  （ｓ，  ６Ｈ，  Ｎ＋（ＣＨ３）２），  ３．３７  （ｔ，  ２Ｈ，  ＣＨ２−Ｎ＋），  ３．５８  （ｍ，  ２Ｈ，  ＣＨ２−Ｎ），  ３．７９  （ｓ，  ３Ｈ，  Ｏ−ＣＨ３），  ４．２９  （ｓ，  ２Ｈ，  ＣＨ２−Ｃ＝Ｏ），  ５．７７  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ＝Ｃ−ＣＯＮ−ｔｒａｎｓ）；  ６．１９  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ＝Ｃ−ＣＯＮ−  ｃｉｓ），  ６．２３  （ｍ，  １Ｈ，  ＝ＣＨ−ＣＯＮ−）．
ＣＢＡＡ−３−エステル：（４−カルボキシプロピル）３−アクリルアミドプロピルジメチルアンモニウムブロミド、エチルエステル。
【０１４０】
Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）アクリルアミド（５０ｍｍｏｌ）、エチル４−ブロモブチレート（６０ｍｍｏｌ）およびアセトニトリル（２５ｍＬ）を、１００ｍＬ丸底フラスコに加えた。混合液を、室温で３日間、窒素雰囲気の下で撹拌した。溶媒を回転蒸発装置で除去し、無色油（９２％収率）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ）：１．２２  （ｔ，  ３Ｈ  ＣＨ３），  ２．００  （ｍ，  ４Ｈ，  Ｃ−ＣＨ２−Ｃ），  ２．４７  （ｔ，  ２Ｈ，  ＣＨ２−Ｃ＝Ｏ），  ３．０６  （ｓ，  ６Ｈ，    Ｎ＋（ＣＨ３）２），  ３．２８−３．３５  （６Ｈ，  ＣＨ２−ＮおよびＣＨ２−Ｎ＋−ＣＨ２  ），    ４．１４  （ｑ，  ２Ｈ，  Ｏ−ＣＨ２），  ５．７５  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ＝Ｃ−ＣＯＮ−ｔｒａｎｓ）；  ６．１９  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ＝Ｃ−ＣＯＮ−  ｃｉｓ），  ６．２６  （ｍ，  １Ｈ，  ＝ＣＨ−ＣＯＮ−）．
ＣＢＡＡ−５−エステル：（６−カルボキシペンチル）３−アクリルアミドプロピルジメチルアンモニウムブロミド、エチルエステル。
【０１４１】
Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）アクリルアミド（５０ｍｍｏｌ）、エチル６−ブロモヘキサノエート（５５ｍｍｏｌ）およびアセトニトリル（２５ｍＬ）を、１００ｍＬ丸底フラスコに加えた。混合液を、４５℃で５日間、窒素雰囲気の下で撹拌した。溶媒を回転蒸発装置で除去し、わずかに黄色を帯びた油（８７％収率）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ）：  １．２０  （ｔ，  ３Ｈ  ＣＨ３），  １．３４  （ｍ，  ２Ｈ，  Ｃ−Ｃ−ＣＨ２−Ｃ−Ｃ），  １．６０−１．７２  （４Ｈ，  Ｃ−ＣＨ２−Ｃ−ＣＨ２−Ｃ），  ２．００  （ｍ，  ２Ｈ，  Ｎ−Ｃ−ＣＨ２−Ｃ−Ｎ），  ２．３４  （ｔ，  ２Ｈ，  ＣＨ２−Ｃ＝Ｏ），  ３．０４  （ｓ，  ６Ｈ，    Ｎ＋（ＣＨ３）２），  ３．２４−３．３７  （６Ｈ，  ＣＨ２−ＮおよびＣＨ２−Ｎ＋−ＣＨ２），  ４．１２  （ｑ，  ２Ｈ，  Ｏ−ＣＨ２），  ５．７５  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ＝Ｃ−ＣＯＮ−ｔｒａｎｓ）；  ６．２０  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ＝Ｃ−ＣＯＮ−  ｃｉｓ），  ６．２４  （ｍ，  １Ｈ，  ＝ＣＨ−ＣＯＮ−）．
代表的なカチオン性ポリマーの合成
表面開始ＡＴＲＰ。３つのモノマー、ＣＢＡＡ−１−エステル、ＣＢＡＡ−３−エステルおよびＣＢＡＡ−５−エステルを、表面開始ＡＴＲＰを用いて金コーティングＳＰＲセンサーチップまたは金コーティングシリコンチップに融合させた。ポリマーブラシの調製および特性評価は、Ｚｈａｎｇ，  Ｚ．；Ｃｈｅｎ，  Ｓ．；Ｃｈａｎｇ，  Ｙ．；Ｊｉａｎｇ，  Ｓ．、「Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｇｒａｆｔｅｄ  Ｓｕｌｆｏｂｅｔａｉｎｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｖｉａ  Ａｔｏｍ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｓ  Ｓｕｐｅｒｌｏｗ  Ｆｏｕｌｉｎｇ  Ｃｏａｔｉｎｇｓ」。Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂ１１０巻（２２号）、：１０７９９〜１０８０４頁、２００６年、およびＺｈａｎｇ，  Ｚ．；Ｃｈｅｎ，  Ｓ．；Ｊｉａｎｇ，  Ｓ．、「Ｄｕａｌ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ：  Ｎｏｎｆｏｕｌｉｎｇ  Ｐｏｌｙ（ｃａｒｂｏｘｙｂｅｔａｉｎｅ）  Ｗｉｔｈ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ」、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ７巻（１２号）：３３１１〜３３１５頁、２００６年に記載される。過去の刊行物。簡潔には、ＣｕＢｒ（１ｍｍｏｌ）およびＢｒ−チオールＳＡＭを有するＳＰＲチップまたは金ディスクを、窒素パージした反応試験管に入れた。ＣＢＡＡエステル（６．５ｍｍｏｌ）を有する脱気溶液（１：１の容量比の純水およびメタノール、１０ｍＬ）およびＢＰＹ（２ｍｍｏｌ、５ｍＬの脱気したメタノール中）を、注射器で試験管に移した。窒素の下で１時間を超える反応の後、ＳＰＲチップまたは金ディスクを取り出し、エタノール、水およびＰＢＳ溶液で洗浄した。試料は、試験の前にＰＢＳ溶液で保存した。
【０１４２】
ポリマー合成および特性評価
メタノール中の約０．３ＭのＣＢＡＡ−１−エステル溶液を、窒素で３０分間パージした。次に、イニシエーターとして３モル％ＡＩＢＮを用いて、窒素下６０℃で約４８時間重合を実施して、ポリＣＢＡＡ−１−エステルを提供した。ポリＣＢＡＡ−３−エステルまたはポリＣＢＡＡ−５−エステルの調製のために、溶媒としてエタノールを用いて同様の方法を適用した。ポリマーをエチルエーテルで洗浄し、次に溶媒を除去した。ポリマーの構造は、ＮＭＲで確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ）：  ポリＣＢＡＡ−１−エステル：  １．６２  （ｂｒ，  ２Ｈ），  ２．０５  （ｂｒ，  ３Ｈ），  ３．２５−３．３２  （ｂｒ，  ８Ｈ），  ３．６２  （ｂｒ，  ２Ｈ），  ３．８３  （ｓ，  ３Ｈ），  ４．３８  （ｓ，  ２Ｈ）；    ポリＣＢＡＡ−３−エステル  １．２１  （ｔ，  ３Ｈ），  １．６１  （ｂｒ，  ２Ｈ），  ２．０４  （ｂｒ，  ５Ｈ），  ２．５０  （ｔ，  ２Ｈ），  ３．３７  （ｂｒ，  ６Ｈ），  ３．１２  （ｓ，  ６Ｈ），  ４．１４  （ｑ，  ２Ｈ）；    ポリＣＢＡＡ−５−エステル：  １．２２  （ｔ，  ３Ｈ），  １．３７  （ｍ，  ２Ｈ），  １．６２−１．８０  （ｂｒ  ｍ，  ６Ｈ），  ２．０１  （ｂｒ，  ３Ｈ），  ２．３９  （ｔ，  ２Ｈ），  ３．０３  （ｓ，  ６Ｈ），  ３．２４  （ｂｒ  ｍ，  ６Ｈ），  ４．１２  （ｑ，  ２Ｈ）．
線状ポリＣＢＡＡの分子量は、Ｗａｔｅｒｓ  Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ  １０００カラムを備えたＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９５  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｍｏｄｕｌｅを用いて推定し、Ｗａｔｅｒｓ  ２４１４  Ｒｅｆｌｅｘ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒで検出した。移動相は、０．５ｍＬ／分の流速の水溶液であった。器具およびカラムは、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのポリ（エチレンオキシド）標準で較正した。すべての測定は、３５℃で実施した。ポリマーの分子量は、ＷａｔｅｒｓからのＥｍｐｏｗｅｒ  Ｐｒｏを用いて計算した。
【０１４３】
（実施例２）
代表的なカチオン性ポリマー加水分解
実施例１に記載のように調製されたカチオン性ポリマーを、５０ｍｇ／ｍＬの濃度で、異なる濃度（１０ｍＭ、１００ｍＭおよび１Ｍ）のＮａＯＨ溶液に溶解させた。適当な時間の後、希ＨＣｌ溶液でポリマー溶液を中和し、水は減圧除去した。１Ｈ  ＮＭＲ分光法（Ｄ２Ｏ）を実施し、変化していないエステル基の量を測定し、内部標準として他の非加水分解性ペンダント基と比較することによって、分解速度を測定した。結果を、図３に示す。
【０１４４】
（実施例３）
代表的なカチオン性ポリマーのタンパク質吸着および放出
実施例１に記載のように調製されたカチオン性ポリマーを、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、タンパク質吸着について評価した。
【０１４５】
タンパク質吸着は、波長調査に基づくカスタムメイドのＳＰＲセンサーで測定した。ＳＰＲチップをプリズムの基部に付着させ、屈折率マッチング流体（Ｃａｒｇｉｌｌｅ）を用いて光学接触を確立した。２つの独立した並流チャネルを有する二重チャネル流動セルを用いて、実験の間、液体試料を封じ込めた。臑動ポンプ（Ｉｓｍａｔｅｃ）を利用して、流動セルの２つのチャネルに液体試料を送達した。ＰＢＳ（０．１５Ｍ、ｐＨ７．４）中の１．０ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲン溶液を、０．０５ｍＬ／分の流速で表面に流した。表面感受性ＳＰＲ検出器を用いて、リアルタイムでタンパク質−表面相互作用を監視した。表面濃度（単位面積質量）の変化を測定するために、波長シフトを用いた。結果を、図５Ａ〜５Ｃに示す。
【０１４６】
（実施例４）
代表的なカチオン性ポリマーの抗微生物特性
実施例１に記載のように調製されたカチオン性ポリマーを、それらの抗微生物特性について評価した。
【０１４７】
ＬＢ寒天プレート上で、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２を３７℃で一晩別々の純粋な培養で先ず培養し、次に、それを振盪させながら３７℃で２４時間インキュベートした。４℃で保存される場合、寒天プレート上の培養物は２週間にわたって用いることができる。数個のコロニーを用いて、２５ｍｌのＬＢ（２０ｇ／Ｌ）に接種した。これらの最初の培養物は、３７℃で振盪させながら１００ｒｐｍで１８時間インキュベートし、次に、２００ｍｌの適当な培地で各種の第二の培養物に接種するために用いた。第二の懸濁培養物が６００ｎｍで１．０の光学濃度に到達したとき、４℃で１０分間の８，０００×ｇでの遠心分離によって細菌を収集した。細胞ペレットを滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で３回洗浄し、その後、１０８個の細胞／ｍＬの最終濃度にＰＢＳで懸濁した。
【０１４８】
細菌細胞を含む培養物を、３０℃で前平衡させて振盪させた上記のポリマー懸濁液に加えたときに、代表的なポリマー溶液への細菌細胞の曝露を開始し、混合液を室温で３０分間インキュベートした。最終溶液は約１０８個の細胞／ｍＬのＥ．ｃｏｌｉ、および２ｍＭの反復単位濃度を含み、それは、ポリマーの反復単位のモル濃度である（ＣＢＡＡおよびＣＢＡＡ−エステルの分子量に基づき約０．６〜０．７６ｍｇ／ｍＬ）。細菌をＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  ＢａｃＬｉｇｈｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）で染色し、その後、細菌懸濁液を０．２μｍ孔径のポリカーボネート膜フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）でろ過し、１００×油浸レンズ付きのＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８０ｉに載せたＣＣＤ−ＣｏｏｌＳＮＡＰカメラ（Ｒｏｐｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）で直接観察した。生細胞および死細胞の数を、Ｃｈｅｎｇ，  Ｇ．；Ｚｈａｎｇ，  Ｚ．；Ｃｈｅｎ，  Ｓ．；Ｂｒｙｅｒｓ，  Ｊ．  Ｄ．；Ｊｉａｎｇ，  Ｓ．、「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｆｉｌｍ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ２８巻（２９号）：４１９２〜４１９９頁、２００７年に記載のものと同じ顕微鏡で、ＦＩＴＣおよびローダミンフィルターを通してそれぞれ測定した。結果を、図６に示す。
【０１４９】
（実施例５）
代表的なカチオン性ポリマーの核酸縮合および放出
実施例１に記載のように調製されたカチオン性ポリマーを、それらの核酸縮合および放出について評価した。
【０１５０】
ポリマー／ＤＮＡ複合体の調製およびアガロースゲルシフトアッセイ。実施例１に記載のように調製された３つのカルボキシベタインエステルポリマーを、５０ｍｇ／ｍＬの濃度で水に溶解した。次に、ＤＭＳＯを用いて、ポリマー溶液を１４〜１９ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した。次に、水を加えて、１．６〜２．２ｍｇ／ｍＬのポリマー最終濃度にした。５００μＬのポリマー／ＤＭＳＯ／水溶液を、撹拌下１．５ｍｌのＤＮＡ溶液（３４．５μｇ／ｍＬ）に徐々に加え、複合体またはナノ粒子を形成した。
【０１５１】
８．３マイクロリットルの各ナノ粒子溶液を、１．７マイクロリットルの６×ローディングバッファー（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）と混合し、０．８％アガロースゲルに加えた。ゲルを、６５Ｖで２．５時間流した。用いた対照は、１．７マイクロリットルの６×ローディングバッファーを含む８．３マイクロリットルの３０マイクログラム／ｍＬ  ＤＮＡ水溶液であった。ＤＮＡバンドは、臭化エチジウム染色によって可視化した。結果を、図１６に示す。
【０１５２】
動的レーザー光線散乱およびζ電位測定。粒子サイズおよびζ電位の測定は、ＺｅｔａＰＡＬＳ動的光散乱検出器（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌｅ、ＮＹ、ＵＳＡ；１５ｍＷレーザー、６７６ｎｍの入射光線）を用いて行った。ポリマー／ＤＮＡ複合体を上に述べたように調製し、次に、複合体を１．４ｍｌの２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ７．２に希釈した。相関関数を９０°の散乱角度で収集し、粒子サイズは、Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇソフトウェア（バージョン３．５５）を用いて計算した。平均電気泳動移動度は、ＢＩＣ  ＰＡＬＳζ電位分析ソフトウェア（Ｖｅｒ  ３．８２）を用いて測定した。
【０１５３】
例示的な実施形態を例示し、記載したが、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、それに様々な変更を加えることができることはいうまでもない。
【０１５４】
排他的専有権または特権が請求される本発明の実施形態は、添付の特許請求の範囲に定義される。
【図１】
0005474808.tif 000020
【図２】
0005474808.tif 000021
【図４】
0005474808.tif 000022
【図５】
0005474808.tif 000023
【図８】
0005474808.tif 000024
【図９】
0005474808.tif 000025
【図１０Ａ−１０Ｆ】
0005474808.tif 000026
【図１１】
0005474808.tif 000027
【図１２】
0005474808.tif 000028
【図１３】
0005474808.tif 000029
【図１４】
0005474808.tif 000030
【図１５】
0005474808.tif 000031
【図１７】
0005474808.tif 000032
【図３】
0005474808.tif 000033
【図６】
0005474808.tif 000034
【図７】
0005474808.tif 000035
【図１６】
0005474808.tif 000036
【図１８】
0005474808.tif 000037
【図１９】
0005474808.tif 000038
【図２０】
0005474808.tif 000039
【図２１】
0005474808.tif 000040
【図２２】
0005474808.tif 000041