(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌｙｓ−Ｐｒｏを構成繰り返し単位とする重合度が８のペプチド、９のペプチド、１０のペプチド、１１のペプチド、１２のペプチド、１３のペプチド、１４のペプチド、１５のペプチド、及び１６のペプチドの混合物であることを特徴とする細胞凝集塊誘導用ペプチド。
【請求項２】
請求項１記載の細胞凝集塊誘導用ペプチドを、培養細胞の培地に添加して細胞凝集塊を形成することを特徴とする細胞凝集塊の形成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞凝集塊誘導ペプチド、及びその細胞凝集塊誘導用ペプチドを用いた細胞凝集塊の形成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、ディッシュやマルチウェルプレート等の一般的な培養容器を使用して細胞を培養する場合、細胞は容器表面に接着・伸展し、敷石状に増殖するが、そのような培養方法では基材からの影響や細胞間のインタラクションが不足することによって、本来その細胞が生体内において有している機能を発現しない場合がある。その様な機能を発現させるために、三次元培養と呼ばれる、細胞をより生体内に近い凝集塊（スフェロイド）の状態にして培養する方法が知られている。
【０００３】
従来、このような三次元培養により細胞凝集塊を誘導する技術としては、下記非特許文献１に記載されているように、ハンギングドロップ法、容器底部の非接着表面を用いた方法、旋回培養法、３次元スカフォールド法、遠心法等が採用されている。ハンギングドロップ法は、水滴状に垂れ下げた培養液の中で細胞を培養する方法であり、マルチウェルプレート等の蓋の各ウェル上に細胞を含む培養懸濁液を液滴となるようにスポッティングし、マルチウェルプレートにかぶせて培養する方法である。このようなハンギングドロップ法は、たとえば下記非特許文献２、３等に記載されている。
【０００４】
また、容器底部の非接着表面を用いた方法は、培養ディッシュ等の容器底部に超親水性処理を施して非接着表面とする技術であり、そのような技術として、たとえば下記特許文献１のような特許出願がなされている。
【０００５】
その他、旋回培養法、３次元スカフォールド法、遠心法等の方法も採用されているが、上記ハンギングドロップ法や容器底部の非接着表面を用いた方法も含め、これら各種の方法は、いずれも物理的な手法であるため、細胞凝集塊の作成方法の検討や、細胞凝集塊の大きさ等をコントロールすることが困難であった。いずれにしても、化学物質を添加するだけで細胞凝集塊を作成する手法は未だに見出されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｒ．−Ｚ．Ｌｉｎ，ｅｔ．ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ．，Ｊ．３，１１７２−１１８４（２００８）
【非特許文献２】ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ ＣＥＬＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，２００，３２６−３３２（１９９２）
【非特許文献３】Ｋｅｌｌｅｒ，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄ）１６８：１３１−１３９，１９９８
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００１−５０２９５９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、このような問題点を解決するためになされたもので、細胞培養系に添加するだけで、細胞凝集塊を形成することができる、細胞凝集塊誘導用ペプチドを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、このような課題を解決するためになされたもので、Ｌｙｓ−Ｐｒｏを構成繰り返し単位とする重合度が８のペプチド、９のペプチド、１０のペプチド、１１のペプチド、１２のペプチド、１３のペプチド、１４のペプチド、１５のペプチド、及び１６のペプチドの混合物であることを特徴とする細胞凝集塊誘導用ペプチドを提供するものである。
【００１１】
さらに本発明は、上記のような細胞凝集塊誘導用ペプチドを、培養細胞の培地に添加して細胞凝集塊を形成することを特徴とする細胞凝集塊の形成方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によって、上記のようなペプチドを細胞培養液に添加するだけで、細胞凝集塊を容易に作成することが可能となる効果がある。
【００１４】
また、上記のようなペプチドの濃度を変化させることで細胞凝集塊の大きさを調整することができるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】一例としての合成ペプチドについてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳのチャート。
【図２】他の例の合成ペプチドについてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳのチャート。
【図３】さらに他の例の合成ペプチドについてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳのチャート。
【図４】一例としての合成ペプチドを組織培養用プレートに添加した顕微鏡写真。
【図５】他の例の合成ペプチドを組織培養用プレートに添加した顕微鏡写真。
【図６】さらに他の例の合成ペプチドを組織培養用プレートに添加した顕微鏡写真。
【図７】一例としての合成ペプチドを添加した組織培養用プレートのウェルで形成した細胞凝集塊の個数を示すグラフ。
【図８】一例としての合成ペプチドを添加した浮遊培養用プレートのウェルで形成した細胞凝集塊の個数を示すグラフ。
【図９】他の例の合成ペプチドを添加した組織培養用プレートのウェルで形成した細胞凝集塊の個数を示すグラフ。
【図１０】他の例の合成ペプチドを添加した浮遊培養用プレートのウェルで形成した細胞凝集塊の個数を示すグラフ。
【図１１】さらに他の例の合成ペプチドを添加した組織培養用プレートのウェルで形成した細胞凝集塊の個数を示すグラフ。
【図１２】さらに他の例の合成ペプチドを添加した浮遊培養用プレートのウェルで形成した細胞凝集塊の個数を示すグラフ。
【図１３】一例としての合成ペプチドを添加した組織培養用プレートのウェルで形成した細胞凝集塊の大きさを示すグラフ。
【図１４】他の例の合成ペプチドを添加した組織培養用プレートのウェルで形成した細胞凝集塊の大きさを示すグラフ。
【図１５】さらに他の例の合成ペプチドを添加した組織培養用プレートのウェルで形成した細胞凝集塊の大きさを示すグラフ。
【図１６】一例としての合成ペプチドを添加した組織培養用プレートのウェルで形成した細胞凝集塊の大きさの分布を示すグラフ（ペプチドの濃度１．０ｍｇ／ｍｌ）。
【図１７】一例としての合成ペプチドを添加した組織培養用プレートのウェルで形成した細胞凝集塊の大きさの分布を示すグラフ（ペプチドの濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）。
【図１８】一例としての合成ペプチドを添加した組織培養用プレートのウェルで形成した細胞凝集塊の大きさの分布を示すグラフ（ペプチドの濃度０．２ｍｇ／ｍｌ）。
【図１９】一例としての合成ペプチドを添加した組織培養用プレートのウェルで形成した細胞凝集塊の大きさの分布を示すグラフ（ペプチドの濃度０．１ｍｇ／ｍｌ）。
【図２０】生死判別試験の方法を示す概略平面図。
【図２１】生死判別試験の方法を示す概略斜視図。
【図２２】細胞凝集塊の生死判別試験の結果を示す播種直後の顕微鏡写真。
【図２３】細胞凝集塊の生死判別試験の結果を示す２日後の顕微鏡写真。
【図２４】細胞凝集塊の生死判別試験の結果を示す４日後の写真。
【図２５】細胞凝集塊の生死判別試験の結果を示す６日後の写真。
【図２６】生死判別試験の他の方法を示す概略平面図。
【図２７】生死判別試験の他の方法を示す概略斜視図。
【図２８】細胞凝集塊の生存率を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の細胞凝集塊誘導用ペプチドは、上述のように、Ｌｙｓ−Ｐｒｏを構成繰り返し単位とする重合度が８のペプチド、９のペプチド、１０のペプチド、１１のペプチド、１２のペプチド、１３のペプチド、１４のペプチド、１５のペプチド、及び１６のペプチドの混合物である。
【００２０】
さらに本発明は、上記のような細胞凝集塊誘導用ペプチドを、培養細胞の培地に添加して細胞凝集塊を形成する細胞凝集塊の形成方法を提供するものである。
【００２３】
上記のような細胞凝集塊の形成方法に用いる培養細胞の培地の種類は特に限定されるものではないが、たとえばウシ胎児血清を含有させたＭＥＭ培地のようなものを用いることができる。
【００２４】
また、上記のようなペプチドの合成方法は特に限定されるものではなく、一般的な固相合成方法や液相合成方法を任意に用いることができる。たとえば、固相合成方法の一般的な工程は次のとおりである。
【００２５】
保護基でＮ末端の保護されたアミノ酸（保護アミノ酸）を、固相担体に、該保護アミノ酸のＣ末端で、リンカーを介して結合させる。次に、未反応の保護アミノ酸、すなわち担体に結合していない保護アミノ酸を除去する。次いで、担体に結合された保護アミノ酸が担体から遊離しない条件で、保護アミノ酸の保護基を除去する。別途、担体に結合されたアミノ酸と結合させるアミノ酸のＮ末端を保護基で保護した第２の保護アミノ酸を調製しておく。第２の保護アミノ酸を担体に結合したアミノ酸に添加し、担体に結合したアミノ酸のＮ末端と第２の保護アミノ酸のＣ末端を縮合する。次に、未反応の第２の保護アミノ酸を除去し、次いで、第２の保護アミノ酸の保護基を除去する。保護基でＮ末端の保護された第３のアミノ酸を添加して、第２のアミノ酸のＮ末端と第３の保護アミノ酸のＣ末端を縮合する。この操作を繰り返し、担体と結合した所望のアミノ酸配列を有するペプチドを合成する。このペプチドを担体から分離することによって所望のペプチドが得られる。
【００２６】
固相担体としては、たとえばスチレン樹脂、アクリルアミド樹脂、ポリエチレングリコール−アクリルアミド複合樹脂、ポリオキシエチレングラフテッドスチレン樹脂等が例示されるが、これらに限定されない。これらはジビニルベンゼンで架橋されていてもよく、また、１種単独若しくは２種以上組み合わせてもよい。
【００２７】
またリンカーとしては、たとえばクロロメチル、ヒドロキシメチル、ベンズヒドリルアミン、アミノメチル、４−ベンジルオキシベンジルアルコール、４−メチルベンズヒドリルアミン、フェニルアセトアミドメチル、４−ヒドロキシメチルフェニルアセトアミドメチル、４−（２',４'−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ、２−クロロトリチルクロライド樹脂、４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸（ＨＭＰＡ）、４−ヒドロキシメチル安息香酸（ＨＭＢＡ）、２，４−ジメトキシ−４−ヒドロキシベンゾフェノン等が例示されるが、これらに限定されない。これらは１種単独でも又は２種以上組み合わせてもよい。
【００２８】
さらにアミノ酸又はペプチドのアミノ基の保護基としては、たとえば、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ターシャリーブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ターシャリーアミルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、２−クロロベンジルオキシカルボニル（Ｃｌ−Ｚ）、２−ブロモベンジルオキシカルボニル（Ｂｒ−Ｚ）、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）等が例示される。
【００２９】
またカルボキシル基の保護基としては、たとえばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル等のアルキル基を有するアルキルエステル、ベンジルエステル、２−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル、フェナシルエステル、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド、トリチルヒドラジド等が例示される。
【００３０】
一方、液相合成方法では、生成するペプチドを保持するための固相担体は利用しないが、保護アミノ酸及び／又は保護ペプチド以外の試薬（例えば縮合剤、塩基等）を樹脂に保持させた形態で試薬を利用することがあり、このような合成方法も本発明で用いることができる。アミノ基の保護基やカルボキシル基の保護基には、上記固相合成と同様のものを用いることができる。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明の実施例について説明する。
（合成例１）
本合成例では、固相合成法によって、リシンとプロリンを構成繰り返し単位とするペプチドを合成した。固相合成には、アミノ酸としてＮ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−プロリン（Ｆｍｃｏ−Ｐｒｏ−ＯＨ）［渡辺化学工業株式会社製］、及びＮ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｏ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リシン（Ｆｍｃｏ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ）［渡辺化学工業株式会社製］を用いた。
また、アミノ酸の保護基には、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｃｏ）を用いた。
さらに、不溶性樹脂担体としては、Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｏ−ブトキシカルボニル−Ｌ−プロリントリエチルアミドメチルエステルポリエチレングリコールハンドルポリスチレン（Ｆｍｃｏ−Ｐｒｏ−ＴｒｔＡ−ＰＥＧ  Ｒｅｓｉｎ）［渡辺化学工業株式会社製］を用いた。
さらに縮合剤としては、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリウムクロライド（ＤＭＴ−ＭＭ）を用い、その縮合剤の合成原料としては、炭酸水素ナトリウム［シグマアルドリッチジャパン株式会社製］、塩化シアヌル［東京化成工業株式会社製］、及びＮ−メチルモルフォリン［シグマアルドリッチジャパン株式会社製］を用いた。
さらに、保護基除去剤としてはピペリジン［シグマアルドリッチジャパン株式会社製］を用い、樹脂の膨潤及び切り出しには、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）［和光純薬株式会社製］を用いた。
さらに脱保護、脱樹脂反応には、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）［渡辺化学工業株式会社製］を用いた。
分離、精製用の担体としては、セファデックスＧ−２５Ｍ  ＰＤ−１０カラム［ＧＥヘルスケア社製］を用いた。
【００３２】
（試験例１）
合成例１で合成したペプチドについて、マトリックス支援レーザー脱イオン化法（ＭＡＬＤＩ：Matrix Assisted Laser Desorption Ionization）と飛行時間型（ＴＯＦ：Time Of Flight）質量分析計（ＭＳ）を組み合わせたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いて質量分析を行った。
【００３３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳとしては、株式会社島津製作所社製のＡＸＩＭＡ−ＣＦＲを用いた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳのマトリックスには、ＣＨＣＡ（α−シアノ−４−ヒドロキシ−けい皮酸）を用い、カチオン化剤にはトリフルオロ酢酸ナトリウムを用いた。
【００３４】
質量分析の結果を図１に示す。図１からも明らかなように、〔Ｍ＋Ｎａ〕+のピークが９４２．３の位置に現れ、〔Ｍ＋Ｈ〕+のピークが９２０．４の位置に現れた。一方、上記（１）式の（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）nにおけるｎが４の場合の（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）4の式量は、９１９．１６である。図１のピークの位置が、（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）4の式量とほぼ一致することから、上記合成例１で合成されたペプチドが（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）4であることが確認できた。
【００３５】
（合成例２）
本合成例では、固相合成法によって、リシンとプロリンを構成繰り返し単位とする別のペプチドを合成した。アミノ酸、不溶性樹脂担体、縮合剤及びその合成原料、保護基除去剤、樹脂の膨潤及び切り出しの薬剤、脱保護、脱樹脂反応の薬剤、及び分離、精製用の担体には、上記合成例１と同じものを用いた。
【００３６】
（試験例２）
合成例２で合成したペプチドについて、上記試験例１と同じＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いて質量分析を行った。マトリックスやカチオン化剤も上記試験例１と同じものを用いた。
【００３７】
質量分析の結果を図２に示す。図２からも明らかなように、〔Ｍ＋Ｈ〕+のピークが１８２１．５の位置に現れ、〔Ｍ＋Ｋ〕+のピークが１８５８．８の位置に現れ、
〔Ｍ＋Ｎａ〕+のピークが１８４２．９の位置に現れた。一方、上記（１）式の（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）nにおけるｎが８の場合の（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）8の式量は、１８２０．３２である。図２のピークの位置が、（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）8の式量とほぼ一致することから、上記合成例２で合成されたペプチドが（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）8であることが確認できた。
【００３８】
（合成例３）
本合成例では、液相合成法によって、リシンとプロリンを構成繰り返し単位とする、さらに別のペプチドを合成した。液相合成には、アミノ酸としてＮ−α−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−プロリン（Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ）［渡辺化学工業株式会社製］、及びＮ−α−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｏ−塩化ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リシン（Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｚ−Ｃｌ）−ＯＨ）［渡辺化学工業株式会社製］を用いた。
また液相合成のアミノ基側の保護基にはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルを用い、カルボキシル基側の保護基にはフェナシルエステル（Ｐａｃ）を用いた。
さらに縮合剤としては、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリウムクロライド（ＤＭＴ−ＭＭ）を用い、その縮合剤の合成原料としては、炭酸水素ナトリウム［シグマアルドリッチジャパン株式会社製］、塩化シアヌル［東京化成工業株式会社製］、及びＮ−メチルモルフォリン［シグマアルドリッチジャパン株式会社製］を用いた。
さらに、カルボキシル基側の保護基除去剤としては酢酸及び亜鉛を用い、アミノ基側の保護基除去剤としては、４ｍｏｌ／ｌ−ＨＣｌ／ジオキサン（４ｍｏｌ／ｌ−ＨＣｌ／ＤＩＯ［渡辺化学工業株式会社製］を用いた。
さらに、脱保護反応には、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）［渡辺化学工業株式会社製］を用いた。
【００３９】
（試験例３）
合成例３で合成したペプチドについて、上記試験例１、２と同じＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いて質量分析を行った。マトリックスやカチオン化剤も上記試験例１と同じものを用いた。
【００４０】
質量分析の結果を図３に示す。図３からも明らかなように、ｎが８〜１６の範囲でピークが現れ、Ｌｙｓ−Ｐｒｏを繰り返し単位とする重合度が８〜１６のペプチドであるｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）が合成されていることが確認できた。
【００４１】
（合成例４）
本合成例では、液相合成法によって、リシンとプロリンを構成繰り返し単位とする、さらに別のペプチドを合成した。上記合成例１〜３では、直鎖状のペプチドを合成したのに対し、本合成例では、枝分かれしたペプチドであるｂｒａｎｃｈｅｄ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−（Ｈ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）mＬｙｓ−Ｐｒｏ）n〔以下、単にｂｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）と略す〕を合成した。液相合成のアミノ基側の保護基、カルボキシル基側の保護基、縮合剤及びその合成原料、カルボキシル基側の保護基除去剤、アミノ基側の保護基除去剤、脱保護反応の薬剤には、上記合成例３と同じものを用いた。
【００４２】
（合成例５）
本合成例では、液相合成法によって、リシンを構成繰り返し単位とするペプチドであるｐｏｌｙ（Ｌｙｓ）を合成した。液相合成のアミノ酸には、Ｎ−α−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｏ−塩化ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リシン（Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ）［渡辺化学工業株式会社製］を用いた。また保護基にはフェナシルエステル（Ｐａｃ）を用い、保護基除去剤には酢酸及び亜鉛を用いた。さらに縮合剤及びその合成原料、脱保護反応の薬剤には、上記合成例３、４と同じものを用いた。
【００４３】
（合成例６）
本合成例では、液相合成法によって、アルギニンを構成繰り返し単位とするペプチドであるｐｏｌｙ（Ａｒｇ）を合成した。液相合成のアミノ酸には、Ｎ−α−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｏ−メシチレンスルフォニル−Ｌ−アルギニン（Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｍｔｓ）−ＯＨ）［渡辺化学工業株式会社製］を用いた。また保護基にはフェナシルエステル（Ｐａｃ）を用い、保護基除去剤には酢酸及び亜鉛を用いた。さらに縮合剤及びその合成原料、脱保護反応の薬剤には、上記合成例３〜５と同じものを用いた。
【００４４】
（合成例７）
本合成例では、液相合成法によって、アルギニンとプロリンを構成繰り返し単位とするペプチドであるｐｏｌｙ（Ａｒｇ−Ｐｒｏ）を合成した。液相合成のアミノ酸には、Ｎ−α−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−プロリン（Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ）［渡辺化学工業株式会社製］、及びＮ−α−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｏ−メシチレンスルフォニル−Ｌ−アルギニン（Ｂｏｃ−Ａｒｇ（ＭＴｓ）−ＯＨ）［渡辺化学工業株式会社製］を用いた。
また液相合成のアミノ基側の保護基にはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルを用い、カルボキシル基側の保護基にはフェナシルエステル（Ｐａｃ）を用いた。さらに、カルボキシル基側の保護基除去剤としては酢酸及び亜鉛を用い、アミノ基側の保護基除去剤としては、４ｍｏｌ／ｌ−ＨＣｌ／ジオキサン（４ｍｏｌ／ｌ−ＨＣｌ／ＤＩＯ［渡辺化学工業株式会社製］を用いた。
さらに脱保護反応の薬剤には、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳＡ）［渡辺化学工業株式会社製］を用いた。
さらに縮合剤及びその合成原料、脱保護反応の薬剤には、上記合成例３〜６と同じものを用いた。
【００４５】
（調製例１）
マウス由来繊維芽細胞（Ｌ９２９）を、１０重量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有させたＭＥＭ培地で培養し、さらにトリプシン処理を行った。トリプシン／ＥＤＴＡ溶液の除去を行い、無血清ＭＥＭ培地で再懸濁させ、２．５×１０4ｃｅｌｌ／ｍｌに細胞数を調整した培養液を調製した。Ｌ９２９は理化学研究所製のものを用い、ＦＢＳはハイクローン社製のものを用い、ＭＥＭ培地は日水製薬製のイーグルＭＥＭを用い、トリプシンはＭＰバイオメディカル社製のＴＲＹＰＳＩＮ  １：２５０  ＶＩＲＵＳＦＲＥＥを用い、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム）は片山化学工業株式会社製のものを用いた。
【００４６】
（調製例２）
また、上記合成例１〜７で合成したペプチドについて、１．０ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、及び０．１ｍｇ／ｍｌの４種類の濃度の調製液を調製し、計２８種類の調製液の試料を準備した。分散媒としては、水とｐＨ７．４に調整したリン酸緩衝液を用いた。
【００４７】
（試験例４）
上記調製例１のように調整した培養液２００μｌ（５．０×１０4ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）を、９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、さらに上記調製例２のように調整した７種類のペプチドの計２８種類の試料を、９６ウェルプレートの各ウェルにそれぞれ５０μｌずつ添加した。
【００４８】
９６ウェルプレートとしては、プレート底部に細胞が接着する一般の細胞培養基盤とした組織培養用プレートと、プレート底部に細胞が接着しにくい細胞培養基盤とした浮遊培養用プレートとの２種を用い、細胞の接着、伸展が生物活性に及ぼす影響を検討した。一方、上記調製例２のように調整した計２８種類の試料をウェルに添加していないものをネガティブコントロールとした。組織培養用プレートとしてはＩＷＡＫＩ社製のものを用い、浮遊培養用プレートとしては住友ベークライト株式会社製の浮遊培養用マルチプレートを用いた。
【００４９】
上記のような調製後、２４時間毎に形態を顕微鏡（位相差顕微鏡）によって観察した。７日後の観察結果の顕微鏡写真を図４〜６に示す。図４は、濃度を１．０ｍｇ／ｍｌに調整した（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）4を組織培養用プレートに添加したものの顕微鏡写真である。図４からも明らかなように、濃度１．０ｍｇ／ｍｌの（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）4を組織培養用プレートに添加したものの場合には、７日後においても、細胞凝集塊が認められなかった。これは、ネガティブコントロールの場合と同様の形態を示していた。
【００５０】
また、図で顕微鏡写真を示してはいないが、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、及び０．１ｍｇ／ｍｌの３種の濃度の（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）4を組織培養用プレートに添加したものの場合にも、７日後において細胞凝集塊は認められなかった。さらに、１．０ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、及び０．１ｍｇ／ｍｌの４種の濃度の（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）4を浮遊培養用プレートに添加したものの場合にも、７日後において細胞凝集塊は認められなかった。
【００５１】
さらに、リシン−プロリンの繰り返し単位の重合度が８である（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）8を１．０ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、及び０．１ｍｇ／ｍｌに調製した４種の試料を組織培養用プレートに添加した場合にも７日後において細胞凝集塊は認められず、またこれらを浮遊培養用プレートに添加した場合にも７日後において細胞凝集塊は認められなかった。
【００５２】
次に、図５は、濃度を１．０ｍｇ／ｍｌに調整したｐｏｌｙ（Ａｒｇ−Ｐｒｏ）を組織培養用プレートに添加したものの顕微鏡写真である。図５からも明らかなように、濃度１．０ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ａｒｇ−Ｐｒｏ）を組織培養用プレートに添加したものの場合には、７日後において細胞凝集塊が認められないばかりでなく、細胞毒性を示し、細胞膜に凹凸が観察された。
【００５３】
また、図で顕微鏡写真を示してはいないが、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、及び０．１ｍｇ／ｍｌの３種の濃度のｐｏｌｙ（Ａｒｇ−Ｐｒｏ）を組織培養用プレートに添加したものの場合にも、７日後において細胞凝集塊は認められず、また細胞毒性を示し、細胞膜に凹凸が観察された。さらに、１．０ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、及び０．１ｍｇ／ｍｌの４種の濃度のｐｏｌｙ（Ａｒｇ−Ｐｒｏ）を浮遊培養用プレートに添加したものの場合にも、７日後において細胞凝集塊は認められず、細胞毒性を示し、細胞膜に凹凸が観察された。
【００５４】
さらに、ｐｏｌｙ（Ａｒｇ）を１．０ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、及び０．１ｍｇ／ｍｌに調製した４種の試料を組織培養用プレートに添加した場合にも７日後において細胞凝集塊は認められないばかりか、細胞毒性を示し、細胞膜に凹凸が観察された。またこれらを浮遊培養用プレートに添加した場合にも、７日後において同様に細胞毒性を示し、細胞膜に凹凸が観察された。
【００５５】
次に、図６は、濃度を０．５ｍｇ／ｍｌに調整したｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を組織培養用プレートに添加したものの顕微鏡写真である。図６からも明らかなように、濃度０．５ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を組織培養用プレートに添加した場合にも、７日後において細胞凝集塊の形成が認められた。
【００５６】
また、図で顕微鏡写真を示してはいないが、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、及び０．１ｍｇ／ｍｌの３種の濃度のｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を組織培養用プレートに添加したものの場合にも、７日後において細胞凝集塊の形成が認められた。さらに、１．０ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、及び０．１ｍｇ／ｍｌの４種の濃度のｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を浮遊培養用プレートに添加した場合にも、７日後において細胞凝集塊の形成が認められた。
【００５７】
さらに、図で顕微鏡写真を示してはいないが、４種の濃度のｂｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を、それぞれ組織培養用プレート及び浮遊培養用プレートに添加した場合にも、７日後において細胞凝集塊の形成が認められた。
【００５８】
さらに、図で顕微鏡写真を示してはいないが、４種の濃度のｐｏｌｙ（Ｌｙｓ）を、それぞれ組織培養用プレート及び浮遊培養用プレートに添加した場合にも、７日後において細胞凝集塊の形成が認められた。
【００５９】
〔総括〕
以上の試験例４の結果を総括すると、ｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）、ｂｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）、及びｐｏｌｙ（Ｌｙｓ）の場合には、いずれの濃度の場合にも、また組織培養用プレート及び浮遊培養用プレートのいずれの場合にも、細胞凝集塊の形成が認められ、細胞凝集塊を誘導する作用を有することが確認できた。
【００６０】
これに対して、（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）4及び（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）8の場合には、いずれの濃度の場合にも、また組織培養用プレート及び浮遊培養用プレートのいずれの場合にも、細胞凝集塊が認められず、ネガティブコントロールの場合と同様の形態を示していた。
【００６１】
さらに、ｐｏｌｙ（Ａｒｇ−Ｐｒｏ）及びｐｏｌｙ（Ａｒｇ）の場合には、いずれの濃度の場合にも、また組織培養用プレート及び浮遊培養用プレートのいずれの場合にも、細胞凝集塊が認められないばかりでなく、細胞毒性を示し、細胞膜に凹凸が観察された。
【００６２】
（試験例５）
本試験例は、組織培養用プレート、浮遊培養用プレートの各ウェルで形成した細胞凝集塊の個数を計数したものである。
【００６３】
細胞凝集塊の個数の計数は、位相差顕微鏡での肉眼観察によって行った。
【００６４】
計数の結果を図７〜１２に示す。図７〜１２において、縦軸には形成された細胞凝集塊の個数（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）が示され、横軸には培養日数が示されている。図７は、ｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加した組織培養用プレートのウェルで形成した細胞凝集塊の個数を棒グラフで示したものである。１〜７日後にそれぞれ計数した細胞凝集塊の個数が、ｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）の４種類の濃度１．０ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌについてそれぞれ示されている。
【００６５】
図７からも明らかなように、１日後には未だ細胞凝集塊の形成は認められなかったが、２日後には、濃度１．０ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したウェルの細胞凝集塊の個数が１００個を超えていた。また３日後には、濃度０．５ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したウェルの細胞凝集塊の個数が約１００個となり、濃度０．２ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したウェルの細胞凝集塊の個数が１００個を超えていた。さらに、４日後には、濃度０．１ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したウェルの細胞凝集塊の個数が１００個を超えた。ただし、いずれの濃度のｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したウェルの細胞凝集塊の個数は、１〜７日の間、２００個を超えることはなかった。
【００６６】
図８は、ｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加した浮遊培養用プレートのウェルで形成した細胞凝集塊の個数を棒グラフで示したものである。図７と同様に、１〜７日後の細胞凝集塊の個数が、ｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）の４種類の濃度についてそれぞれ示されている。
【００６７】
図８からも明らかなように、１日後には未だ細胞凝集塊の形成は認められなかったが、２日後には、１．０ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したウェルの細胞凝集塊の個数が１００個を超え、０．５ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したウェルの細胞凝集塊の個数は２００個を超え、０．２ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したウェルの細胞凝集塊の個数は２００個を超えていた。また０．１ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したウェルの細胞凝集塊の個数は、６日後に１００個を超えた。さらに、１．０ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したウェルの細胞凝集塊の個数は、６日後には２００個を超えた。
【００６８】
図７及び図８からも明らかなように、ｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したものに関しては、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度のものを除けば、全体として、浮遊培養用プレートのウェルで形成した細胞凝集塊の個数は、組織培養用プレートのウェルで形成した細胞凝集塊の個数よりも多かった。
【００６９】
図９は、ｂｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加した組織培養用プレートのウェルで形成した細胞凝集塊の個数を棒グラフで示したものである。図７及び図８と同様に、１〜７日後の細胞凝集塊の個数が、４種類の濃度についてそれぞれ示されている。
【００７０】
図９からも明らかなように、１日後には未だ細胞凝集塊の形成は認められなかったが、２日後には、濃度１．０ｍｇ／ｍｌのｂｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したウェルの細胞凝集塊の個数が１００個を超えていた。また３日後には、濃度０．５ｍｇ／ｍｌのｂｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したウェルの細胞凝集塊の個数が１００個を超え、濃度０．２ｍｇ／ｍｌのｂｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したウェルの細胞凝集塊の個数が約１００個となった。さらに、５日後には、濃度０．１ｍｇ／ｍｌのｂｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したウェルの細胞凝集塊の個数が１００個を超えた。
【００７１】
図１０は、ｂｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加した浮遊培養用プレートのウェルで形成した細胞凝集塊の個数を棒グラフで示したものである。図７〜９と同様に、１〜７日後の細胞凝集塊の個数が、４種類の濃度についてそれぞれ示されている。
【００７２】
図１０からも明らかなように、１日後には未だ細胞凝集塊の形成は認められなかったが、２日後には、濃度０．２ｍｇ／ｍｌのｂｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したウェルの細胞凝集塊の個数が１００個を超えていた。また３日後には、濃度０．５ｍｇ／ｍｌのｂｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したウェルの細胞凝集塊の個数が１００個を超え、５日後には、濃度１．０ｍｇ／ｍｌのｂｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したウェルの細胞凝集塊の個数が約１００個となった。
【００７３】
図９及び図１０からも明らかなように、ｂｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したものに関しては、全体として、浮遊培養用プレートのウェルで形成した細胞凝集塊の個数と、組織培養用プレートのウェルで形成した細胞凝集塊の個数とに、さほどの相違はなかった。
【００７４】
図１１は、ｐｏｌｙ（Ｌｙｓ）を添加した組織培養用プレートのウェルで形成した細胞凝集塊の個数を棒グラフで示したものである。図７〜図１０と同様に、１〜７日後の細胞凝集塊の個数が、４種類の濃度についてそれぞれ示されている。
【００７５】
図１１からも明らかなように、１日後には未だ細胞凝集塊の形成は認められなかったが、２日後には、濃度０．２ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｌｙｓ）を添加したウェルの細胞凝集塊の個数が約３００個となり、濃度０．１ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｌｙｓ）を添加したウェルの細胞凝集塊の個数が約１００個となった。また３日後には、濃度０．１ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｌｙｓ）を添加したウェルの細胞凝集塊の個数が３００個に近い数値となった。しかし、濃度１．０ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｌｙｓ）を添加したウェルの細胞凝集塊の個数と、濃度０．５ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｌｙｓ）を添加したウェルの細胞凝集塊の個数は、１〜７日経過の間に５０個を超えることはなかった。
【００７６】
図１２は、ｐｏｌｙ（Ｌｙｓ）を添加した浮遊培養用プレートのウェルで形成した細胞凝集塊の個数を棒グラフで示したものである。図７〜図１１と同様に、１〜７日後の細胞凝集塊の個数が、４種類の濃度についてそれぞれ示されている。
【００７７】
図１２からも明らかなように、１日後には未だ細胞凝集塊の形成は認められなかったが、２日後には、濃度１．０ｍｇ／ｍｌ、及び濃度０．５ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｌｙｓ）を添加したウェルの細胞凝集塊の個数が２００個近くとなり、濃度０．２ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｌｙｓ）を添加したウェルの細胞凝集塊の個数が２００個を超えた。また３日後には、濃度１．０ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｌｙｓ）を添加したウェルの細胞凝集塊の個数は２００個を超え、濃度０．５ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｌｙｓ）を添加したウェルの細胞凝集塊の個数は約３００個となり、濃度０．２ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｌｙｓ）を添加したウェルの細胞凝集塊の個数は３００個を超えた。しかし、濃度０．１ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｌｙｓ）を添加したウェルの細胞凝集塊の個数は、６日経過後に１００個を超えるにとどまった。
【００７８】
図１１及び図１２からも明らかなように、ｐｏｌｙ（Ｌｙｓ）を添加したものに関しては、１．０ｍｇ／ｍｌの濃度のもの、及び０．５ｍｇ／ｍｌの濃度のものについては、浮遊培養用プレートのウェルで形成した細胞凝集塊の個数は、組織培養用プレートのウェルで形成した細胞凝集塊の個数よりも非常に多かった。これに対して、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度のものについては、浮遊培養用プレートのウェルで形成した細胞凝集塊の個数の方が多かった。０．２ｍｇ／ｍｌの濃度のものについては、浮遊培養用プレートのウェルで形成した細胞凝集塊の個数と、組織培養用プレートのウェルで形成した細胞凝集塊の個数とに、さほどの相違はなかった。
【００７９】
〔総括〕
以上の試験例５の結果を総括すると、ｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）、及びｐｏｌｙ（Ｌｙｓ）を浮遊培養用プレートのウェルに添加した場合に、細胞凝集塊の個数が多くなり、特にｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）の濃度０．５ｍｇ／ｍｌ及び０．２ｍｇ／ｍｌの濃度のものを浮遊培養用プレートのウェルに添加した場合に、細胞凝集塊の個数が多くなることがわかった。このことから、細胞凝集塊の個数を調整するに際して、細胞凝集塊の個数を増加させるには、濃度０．２〜０．５ｍｇ／ｍｌの範囲に調整したｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）が最適であることがわかった。
【００８０】
（試験例６）
本試験例は、組織培養用プレートの各ウェルで形成した細胞凝集塊の大きさを測定したものである。
【００８１】
細胞凝集塊の大きさの測定は、位相差顕微鏡で観察したものをデジタルカメラで撮影し、顕微鏡写真の倍率及びデジタルカメラの画素数から細胞凝集塊の大きさを算出した。
【００８２】
測定の結果、細胞凝集塊の大きさの分布が図１３〜１５に示されている。図１３〜１５において、縦軸には、細胞凝集塊の大きさの分布の割合（％）が示され、横軸には、細胞凝集塊の大きさ（μｍ）の範囲が示されている。図１３〜１５では、細胞凝集塊の大きさの分布が、４種類の濃度１．０ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌについてそれぞれ示されている。それぞれの濃度についての割合の総数が１００％となる。
【００８３】
図１３は、ｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加した組織培養用プレートのウェルで形成した細胞凝集塊の大きさの分布を示したものである。図１３からも明らかなように、濃度１．０ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したウェルの細胞凝集塊に関しては、３０〜４５μｍの大きさのものが全体の７０〜７５％程度を占め、１５〜３０μｍの大きさのものが全体の１０〜１５％程度を占め、４５〜６０μｍの大きさのものが全体の１０％程度を占めていた。また、わずかではあるが、６０〜７５μｍの大きさのものや７５〜９０μｍの大きさのものも存在していた。また濃度０．５ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したウェルの細胞凝集塊に関しては、４５〜６０μｍの大きさのものが全体の約５０％を占め、６０〜７５μｍの大きさのものが全体の２０〜２５％程度を占め、３０〜４５μｍの大きさのものが全体の１０〜１５％程度を占めていた。また、大きい７５〜９０μｍのものや、９０〜１０５μｍの大きさのものも、全体の約５％程度存在していた。
【００８４】
さらに、濃度０．２ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したウェルの細胞凝集塊に関しては、３０〜４５μｍの大きさのものが全体の５０〜５５％程度を占め、４５〜６０μｍの大きさのものが全体の２５〜３０％程度を占め、６０〜７５μｍの大きさのものが全体の１５〜２０％程度を占めていた。１５〜３０μｍの大きさのものは全体の５％以下であった。大きい７５〜９０μｍのものや、９０〜１０５μｍの大きさのものも、わずかではあるが存在していた。また濃度０．１ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したウェルの細胞凝集塊に関しては、１５〜３０μｍの大きさのものが全体の約５５％を占め、３０〜４５μｍの大きさのものが全体の３５〜４０％を占め、４５〜６０μｍの大きさのものが全体の５〜１０％を占めていた。
【００８５】
図１４は、ｂｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加した組織培養用プレートのウェルで形成した細胞凝集塊の大きさの分布を示したものである。図１４からも明らかなように、濃度１．０ｍｇ／ｍｌのｂｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したウェルの細胞凝集塊に関しては、３０〜４５μｍの大きさのものが全体の４５〜５０％程度を占め、１５〜３０μｍの大きさのものが全体の４０〜４５％程度を占め、４５〜６０μｍの大きさのものが全体の５〜１０％程度を占めていた。６０〜７５μｍや７５〜９０μｍの大きさのものも、わずかではあるが存在していた。濃度０．５ｍｇ／ｍｌのｂｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したウェルの細胞凝集塊に関しては、３０〜４５μｍの大きさのものが全体の約４５％程度を占め、１５〜３０μｍの大きさのものが全体の３０〜３５％程度を占め、４５〜６０μｍの大きさのものが全体の約１５％程度を占めていた。また６０〜７５μｍの大きさのものも５〜１０％程度存在していた。
【００８６】
さらに、濃度０．２ｍｇ／ｍｌのｂｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したウェルの細胞凝集塊に関しては、３０〜４５μｍの大きさのものが全体の５０〜５５％程度を占め、１５〜３０μｍの大きさのものが全体の３０％程度を占め、４５〜６０μｍの大きさのものが全体の５％程度を占めていた。また６０〜７５μｍの大きさのものも５％程度存在し、７５〜９０μｍのものもわずかではあるが存在していた。濃度０．１ｍｇ／ｍｌのｂｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したウェルの細胞凝集塊に関しては、１５〜３０μｍの大きさのものが全体の４５〜５０％程度を占め、３０〜４５μｍの大きさのものが全体の４５％程度を占め、４５〜６０μｍの大きさのものが全体の５％程度を占めていた。また６０〜７５μｍのものや、７５〜９０μｍの大きさのものも、わずかではあるが存在していた。
【００８７】
図１５は、ｐｏｌｙ（Ｌｙｓ）を添加した組織培養用プレートのウェルで形成した細胞凝集塊の大きさの分布を示したものである。図１５からも明らかなように、濃度１．０ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したウェルの細胞凝集塊に関しては、３０〜４５μｍの大きさのものが全体の６０〜６５％程度を占め、４５〜６０μｍの大きさのものが全体の２５〜３０％程度を占め、１５〜３０μｍの大きさのものが全体の１０％程度を占めていた。また濃度０．５ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｌｙｓ）を添加したウェルの細胞凝集塊に関しては、３０〜４５μｍの大きさのものが全体の約５０％を占め、１５〜３０μｍの大きさのものが全体の約４５％を占め、４５〜６０μｍの大きさのものは全体の５％以下であった。
【００８８】
また、濃度０．２ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したウェルの細胞凝集塊に関しては、３０〜４５μｍの大きさのものが全体の５０〜５５％程度を占め、１５〜３０μｍの大きさのものが全体の約２５％を占め、４５〜６０μｍの大きさのものは全体の１５〜２０％程度であった。６０〜７５μｍの大きさのものや７５〜９０μｍの大きさのものも、わずかではあるが存在していた。さらに、濃度０．１ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したウェルの細胞凝集塊に関しては、１５〜３０μｍの大きさのものが全体の４５〜５０％を占め、３０〜４５μｍの大きさのものが全体の４０〜４５％程度を占め、４５〜６０μｍの大きさのものは全体の５〜１０％程度であった。６０〜７５μｍの大きさのものも、わずかではあるが存在していた。
【００８９】
〔総括〕
以上の試験例６の結果を総括すると、ｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）の場合に、４５μｍ以上の大きさの細胞凝集塊の占有率が高いことがわかった。特に、濃度０．５ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を用いた場合に、４５μｍ以上の大きさの細胞凝集塊の占有率が高かった。たとえば再生医学への応用等の観点からは、４５μｍ以上の大きさの細胞凝集塊を利用することが有用であり、その意味では、ｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したものが、再生医学等への応用の可能性があると認められる。
【００９０】
（試験例７）
本試験例は、組織培養用プレートの各ウェルで形成した細胞凝集塊の大きさの分布を示したものである。具体的には、ｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加した組織培養用プレートのウェルで形成した細胞凝集塊の大きさを、１５〜８０μｍの分布範囲で示している。細胞凝集塊の大きさの測定は、位相差顕微鏡で観察したものをデジタルカメラで撮影し、顕微鏡写真の倍率及びデジタルカメラの画素数から細胞凝集塊の大きさを算出した。
【００９１】
測定の結果、細胞凝集塊の大きさの分布が図１６〜１９に示されている。図１６〜１９において、縦軸には、細胞凝集塊の大きさの分布の割合（％）が示され、横軸には、細胞凝集塊の大きさ（μｍ）が示されている。それぞれの細胞凝集塊の大きさについての割合の総数が１００％となる。
【００９２】
図１６はｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）の濃度が１．０ｍｇ／ｍｌの場合のグラフであり、図１７はｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）の濃度が０．５ｍｇ／ｍｌの場合のグラフであり、図１８はｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）の濃度が０．２ｍｇ／ｍｌの場合のグラフであり、図１９はｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）の濃度が０．１ｍｇ／ｍｌの場合のグラフである。
【００９３】
図１６においては、大きさ３０〜４５μｍの範囲の細胞凝集塊が多く存在しており、図１７においては、大きさ４０〜６５μｍの範囲の細胞凝集塊が多く存在しており、図１８においては、大きさ３０〜７０μｍの範囲に平均的に分布して細胞凝集塊が存在しており、図１９においては、大きさ２０〜３５μｍの範囲の細胞凝集塊が多く存在していた。
【００９４】
（試験例８）
本試験例は、細胞凝集塊を形成している細胞の生死を判別する試験についての試験例である。
【００９５】
本試験例においては、９６ウェルプレートにおいて細胞凝集塊を形成している各ウェル中、濃度０．５ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したウェルにおける細胞凝集塊を、図２０に示すようにピペッティングにより物理的に回収し、図２１に示すようにＥＭＥＭ血清含有培地で培養し、２４時間毎に細胞凝集塊の形態を顕微鏡によって観察した。
【００９６】
その結果を図２２〜２５に示す。図２２は播種直後の顕微鏡写真であり、図２３は２日後の顕微鏡写真であり、図２４は４日後の顕微鏡写真であり、図２５は６日後の顕微鏡写真である。図２２〜２５からも明らかなように、播種直後に比べて２日後には細胞凝集塊が大きくなっていた。４日後、６日後には、細胞凝集塊の大きさに変化はなかった。ただし、図２５では、細胞凝集塊の中心部が黒化しており、細胞凝集塊の中心部の細胞は死滅していると認められる。
【００９７】
（試験例９）
本試験例は、細胞凝集塊崩壊後の細胞の生存率についての試験例である。９６ウェルプレートにおいて、細胞凝集塊を形成している各ウェルにトリプシン処理を行い、図２６に示すようにエリスロシンを用いて生死細胞を染色し、図２７に示すように、セルカウンターにより生存率を算出した。
【００９８】
その生存率の試験結果を図２８のグラフに示す。図２８のグラフでは、細胞凝集塊の形成が認められたｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）、ｂｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）、及びｐｏｌｙ（Ｌｙｓ）を添加した場合であって、濃度１．０ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌの４種類のものについて、細胞の生存率を示した。
【００９９】
図２８からも明らかなように、ｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したウェルの細胞凝集塊については、４種類のいずれの濃度のものに関しても生存率が８０％を超えていた。またｂｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したウェルの細胞凝集塊については、４種類のいずれの濃度のものに関しても、生存率は７５〜８０％程度であった。さらにｐｏｌｙ（Ｌｙｓ）を添加したウェルの細胞凝集塊については、濃度１．０ｍｇ／ｍｌ及び０．５ｍｇ／ｍｌのものは生存率が７０％を少し超えていたが、濃度０．２ｍｇ／ｍｌ及び０．１ｍｇ／ｍｌのものは生存率が６５％程度であった。
【０１００】
〔総括〕
以上の試験例８及び試験例９の結果を総括すると、上記試験例８では、ｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加したウェルにおける細胞凝集塊の中心部に、６日後の観察で、中心部に死滅していると認められる部分が存在したが、試験例９の細胞凝集塊崩壊後の細胞の生存率の試験では、生存率が８０％を超え、ｂｐｏｌｙ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を添加した場合やｐｏｌｙ（Ｌｙｓ）を添加した場合に比べて良好な結果となっていた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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