(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ基およびカルボキシル基を同一分子中に有する両性高分子化合物を生理溶液中に３〜３０重量％含み、プロピレングリコールを１０重量％から２０重量％含有し、前記両性高分子化合物がε−ポリ−Ｌ−リジンに無水コハク酸を反応させてカルボキシル化した高分子化合物であることを特徴とする動物幹細胞凍結保存液。
【請求項２】
生理的溶液中に、前記両性高分子化合物に加え、デキストランを１重量％から２０重量％含有する請求項１に記載の動物幹細胞凍結保存液。
【請求項３】
動物幹細胞がヒト間葉系幹細胞である請求項１又は２に記載の動物幹細胞凍結保存液。
【請求項４】
動物幹細胞がヒト脂肪由来幹細胞である請求項１〜３のいずれか一項に記載の動物幹細胞凍結保存液。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の動物幹細胞凍結保存液に懸濁したヒト幹細胞を−８０℃以下まで冷却し凍結させる冷却工程における冷却速度を１分間に０．５℃から１０℃の比率とすることを特徴とする凍結保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、再生医療用ヒト幹細胞の凍結解凍障害を軽減可能な凍害防御剤に関する。
【背景技術】近年の再生医療の飛躍的研究の発展に伴い、ヒト由来幹細胞の医療応用が盛んとなってきている。ヒト体性幹細胞にはおもに骨髄などから採取される間葉系幹細胞や脂肪から採取される脂肪由来幹細胞がある。これらの幹細胞は骨や軟骨、脂肪に分化する能力を有しており、それぞれ骨再生や軟骨再生、脂肪再生に利用されている。また、これらの幹細胞は採取したのち大量に増やすことが可能であるため、余剰の細胞を凍結保存しておき複数回にわたって移植することや、別の患者に移植することが想定される。通常凍結保存は細胞に致命的ダメージを与えるため、凍害防御剤を添加する。その際、５〜２０％のジメチルスルホキシド、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコールなどの凍害防御剤を含む培養液などの生理的溶液に細胞を懸濁しクライオチューブに詰めて冷却し、最終的に−８０℃もしくは−１９６℃の極低温で凍結保存するのが一般的である（特許文献１，２）。そのなかで最も効果が高く、よく用いられているのがジメチルスルホキシドである（非特許文献１）。しかしジメチルスルホキシドが特に高い濃度では生理学的に有毒であり、凍結保存された細胞を注入された患者に高血圧、悪心、嘔吐を引き起こすことも知られている。ジメチルスルホキシドの毒性により解凍した細胞の培養時もしくは生体に注入した後の生存率や機能が低下する問題もある。
また、グリセリンなどの多価アルコール類は効果が低いため、細胞を懸濁してしばらく室温もしくは冷蔵で放置してから凍結する必要や、プログラムフリーザーなどによる厳密な温度管理が必要とされる（非特許文献２）。また、凍結保護効果が低く、解凍後の機能が低下するなどの問題があり、ジメチルスルホキシドと併用するなどの工夫が必要である。
このように培養細胞の凍結保存には基本的にジメチルスルホキシドが不可欠となっているのが現状であるが、先述した毒性に加え、ジメチルスルホキシドはＨＬ−６０細胞などの分化を誘導することやＥＳ細胞の分化に影響を及ぼすことが報告されており、ヒト幹細胞のように未分化維持が必要な細胞保存には適さないことが考えられる（非特許文献３，４）。
【特許文献１】特表平１０−５１１４０２
【特許文献２】特許第３６９４７３０号
【非特許文献１】Ｌｏｖｅｌｏｃｋ  ＪＥ  ａｎｄ  Ｂｉｓｈｏｐ  ＭＷＨ，Ｎａｔｕｒｅ  １８３：１３９４−１３９５，１９５９
【非特許文献２】Ｐｏｌｇｅ  Ｃ，Ｓｍｉｔｈ  ＡＵ，Ｐａｒｋｅｓ  ＡＳ，Ｎａｔｕｒｅ  １６４：６６６−６６６，１９４９
【非特許文献３】Ｍｉｓｚｔａ−Ｌａｎｅ  Ｈ，Ｇｉｌｌ  Ｐ，Ｍｉｒｂｏｌｏｏｋｉ  Ｍ，Ｌａｋｅｙ  ＪＲＴ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｓｅｒｖ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ５，１６−２４，２００７
【非特許文献４】Ｒｏｓｓｉ  ＧＢ，Ｆｒｉｅｎｄ  Ｃ．ＰＮＡＳ  ５８：１３７３−１３８０，１９６７．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】  現状の凍結保存法では、凍結解凍後の幹細胞の増殖率や分化能を完全な形で保存することは困難であり、毒性の低いジメチルスルホキシドに代わる新たな凍結保存物質が待ち望まれている。
そこで本発明は、ジメチルスルホキシドに代わる、低毒性で分化に影響を及ぼさない幹細胞の保護効果に優れた凍結保存液を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】  本発明の凍結保存液は、カルボキシル基を導入したε−ポリ−Ｌ−リジンを実質上３−３０％含み、その他組成は生理食塩水や培養液成分などの生理的溶液である。その生理的溶液にポリエチレングリコール、フィコール、デキストラン、ヒドロキシエチルスターチ、ポリビニルアルコール、ポリビニールビロリドン、パーコール、アルブミンなどの高分子化合物を添加することも可能である。また、エチレングリコールやグリセリン、プロピレングリコールなどの多価アルコールを１−２０％添加することも有効である。
【発明の効果】  再生医療に応用可能なヒト幹細胞を該保存液に浸漬して−８０℃または液体窒素中もしくは液体窒素蒸気中で凍結保存することで毒性の高いジメチルスルホキシドを使用せずに生存率、分化能を維持したまま保存することが可能である。既存の凍害防御剤であるジメチルスルホキシドを使用しないため、凍結する細胞に対する毒性が低く抑えられ、機能を維持したまま長期間凍結保存することが可能である。また、ウシ胎児血清、アルブミンなどのタンパク質成分を使用しないため感染症などの心配がなく、生物製剤によるロット間格差も影響しない。
カルボキシル基を導入したε−ポリ−Ｌ−リジンは、そのアミノ基により細胞膜親和性を持ち、細胞の保護効果があると考えられるが、一方でカルボキシル基のマイナス電荷が細胞膜との親和性を低減させている。すなわち、細胞膜に対して非常に弱い相互作用を示すことが考えられ、この作用が毒性を与えずに細胞膜保護による凍害防御効果を示すと考えられる。また、本発明の凍結保存剤はジメチルスルホキシドに比べて毒性が低いため解凍後の洗浄が不要で、そのまま培地に添加することですぐに培養を行うことができる。
冷却工程においては、急激に冷却した場合には、細胞内と細胞外の水分の氷結に差が生じ、細胞の微細構造を破壊してしまうため、１分間に０．５℃から１０℃の比率で冷却を行うことが好ましい。最も好ましいのは１分間に０．５℃から２℃の冷却速度である。また、保存工程は、−８０℃以下で可能となるが、より安定な保存の面から液体窒素中または液体窒素蒸気層中で保存することが好ましい。本発明の作用の詳細は明らかではないが、ヒト間葉系幹細胞およびヒト脂肪由来幹細胞はマウスやラットの幹細胞や一般のヒト培養用細胞と比較して、凍結時の障害が大きいことが考えられ、通常よりも高い濃度の両性高分子凍害防御剤を使用することで、もしくは既存の多価アルコールなどの凍害防御剤と併用することにより、凍結障害が低く押さえられ再培養時の生存率が著しく向上するに至ったものと推測される。本発明によって、ヒト間葉系幹細胞およびヒト脂肪由来幹細胞を簡便且つ高い生存率で凍結保存を可能とする、凍結保存液および凍結保存方法が得られた。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の凍結保存液は、生理的溶液に、ポリリジンなどの高分子化合物が１−５０ｗ／ｗ％溶解されてなる。好ましくは２〜２０ｗ／ｗ％、特に好ましくは３〜１５ｗ／ｗ％、さらに好ましくは５〜１０ｗ／ｗ％溶解されてなる。生理的溶液としては、生理食塩水の他、各種の細胞または組織用の一般的な培養液を用いることができる。例えば、ダルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ）を好ましいものとして挙げることができる。ポリリジンに代えて同一分子内にカチオン性置換基とアニオン性置換基の両方をもつ単量体が重合した形の高分子化合物でも可能である。特には、ポリアミノ酸を好ましいものとして挙げることができる。すなわち、高分子化合物の繰り返し単位が、アミノ基及びカルボキシル基を共に有するのが特に好ましい。ポリリジンは、ε−ポリ−Ｌ−リジンもしくはε−ポリ−Ｄ−リジン、α−ポリ−Ｌ−リジン、α−ポリ−Ｄ−リジンのいずれであっても良い。凍結保護成分である高分子化合物は分子量が１００〜１００，０００である。最も好ましい高分子種として、微生物または酵素により生産される数平均分子量がｂ１０００〜２万、特には１０００〜１万のε−ポリ−Ｌ−リジンを挙げることができる。ε−ポリ−Ｌ−リジンは、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する放線菌により生産されてもっぱら食品添加物として用いられており（ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｃｈｉｓｓｏ．ｃｏ．ｊｐ／ｆｉｎｅ／ｊｐ／ｐｏｌｙｌｉｓｉｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）、重合度１５〜３５のものの他、重合度が２０以下のものの生産も試みられている（例えば、特開２００３−１７１４６３、特開２００５−３１８８１５）。数平均分子量または数平均重合度の測定は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）法により、例えば、アトー（株）製の電気泳動装置及びデンシトグラフ（ＡＥ−６９２０Ｖ型）を用いて容易に測定することができる。このとき、標準タンパクマーカーを用いる。なお、ポリリジンは、加熱処理による高分子量化により分子量３万以上として用いることもできる。しかし、粘度の上昇を防ぐ等の観点から上記の分子量範囲が好ましい。末端のみにフリーのカルボキシル基を有するポリリジンは、側鎖に１級アミノ基のみを有しているが、後述するように無水カルボン酸を用いて部分的にアミド化することで、優れた混和性能ないし可溶化性能を発揮するものと考えられる。特には、無水ジカルボン酸などを反応させて部分的にカルボキシル化することで、優れた性能を発揮することができる。
ポリアミンのアミノ基は、好ましくは、部分的に、無水コハク酸によってカルボキシル化される。この際、ポリアミンのアミノ基について、好ましくは５０〜９９モル％、特には５０〜９３％、より好ましくは５０〜９０モル％、さらに好ましくは５５〜８０モル％、最も好ましくは５８〜７６モル％をカルボキシル化する。ここで用いられる無水コハク酸に代えて、無水酢酸、無水クエン酸、無水グルタル酸、無水リンゴ酸、無水フマル酸、及び無水マレイン酸などでも可能である。これらのうち、無水コハク酸を特に好ましいものとして挙げることができる。
一方、本発明の凍結保存剤には、ジメチルスルホキシドやグリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トレハロースやスクロースなどの既存の凍結保護物質が０．１−５０ｗ／ｗ％、特には１〜２０ｗ／ｗ％共存することでさらなる有効性の向上が期待される。細胞が凍結から解凍される際に酸化ストレスによるダメージを受けると言われており、抗酸化剤を添加することで効果が高まることも期待される。抗酸化剤は例えば、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、エピガロカテキンガレートなどのポリフエノール類またはグルタチオンなどが挙げられる。
【実施例】  以下、この発明の実施例及び比較例を示す。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
＜実施例１  凍結保存溶液の調整＞
ε−ポリ−Ｌ−リジン（チッソ社製、分子量４０００）は２５％水溶液のものを用い、分子中のアミノ基に対し、モル％で０−１００％の無水コハク酸（和光純薬工業製）を添加することでカルボキシル基導入率の異なるポリリジンを作成した。ポリリジン分子中のアミノ基のカルボキシル基への置換率はＴＮＢＳ法により求めた。（たとえばポリリジンのアミノ基のうち６５モル％をカルボキシル基に置換した場合、ＰＬＬ（０．６５）と表示する。）それぞれのカルボキシル基導入ポリリジン溶液をダルベッコ改変培地（ＤＭＥＭ、シグマアルドリッチ製）に０−２０ｗ／ｗ％となるように添加した。この際、ｐＨが６．４−８．０の範囲内になるように１Ｎの塩酸もしくは水酸化ナトリウム水溶液で中和した。
＜実施例２  ヒト間葉系幹細胞の凍結保存＞
１×１０６個のヒト間葉系幹細胞（理研バイオリソースセンター）をクライオバイアル（Ｓｉｍｐｏｒｔ  Ｐｌａｓｔｉｃｓ）中で各凍結保存液１ｍＬに懸濁し、−８０℃のフリーザー中で凍結保存を行った。このとき、冷却速度を簡易的に−１℃／分とするため、冷却イソプロピルアルコールを封入した冷却チャンバー（ミスターフロスティ、Ｎｕｎｃ製）中に凍結バイアルを放置し、−８０℃冷凍庫内で凍結を行った。１週間後、３７℃の温浴中で速やかに融解し、ＤＭＥＭで洗浄したのち、６ｗｅｌｌカルチャーディッシュに１×１０５個ずつ播種し、６時間後の生存率をトリパンブルー染色により評価した。比較例としては一般的によく用いられている保存液である１０％ＤＭＳＯ／ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を用いた。６時間後の生存率を持って評価したことの理由としては、解凍直後の生存率評価ではトリパンブルーの取り込みは排除できるがその後ディッシュに生着できずに死んでいく細胞が多数いる場合、過大評価してしまうおそれがあるためであり、ディッシュに播種して６時間後にはそれら付着できなかった細胞はすべて死滅し、実質正常に増殖に向かう細胞のみを生細胞として評価できるためである。
表１に示すように、ヒト間葉系幹細胞を凍結保存するにあたり、アミノ基のうち４６％以上をカルボキシル基に変換したカルボキシル化ポリリジン１０％溶液を用いた場合、比較例のＤＭＳＯ溶液を用いた場合に比べて播種後６時間においてほぼ同じか、より良好な生存率を示した。特にアミノ基の変換率が６５％であるとき最も良い保存効果が得られた。また、デキストラン（分子量７万、名糖産業）を１０％添加した保存液ではほとんど生存率は向上しなかったが、ヒト血清アルブミン（三菱ウェルファーマ）を１０％添加した保存液およびプロピレングリコール（和光純薬）を１０％添加した保存液ではいずれも９０％を超える保存効果が得られ、相乗効果が確認された。プロピレングリコールは毒性が低く、生物由来でないため、ジメチルスルホキシドおよび生物由来原料を用いない凍結保存液組成としてカルボキシル化ポリリジンと併用することでさらなる再生医療用凍害防御液として応用可能な凍害防御効果が得られることが確認された。
【表１】
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次に、ＰＬＬ（０．６５）１０％凍結保存液にて凍結保存後に解凍した後、分化誘導をかけることにより骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞への分化能を評価したところ、図１に示すように未凍結系、ＤＭＳＯ系とほぼ同様に多分化能を維持していることが以下のように確認された。図１は、カラーの顕微鏡写真の画像データについて、光の３原色（ＲＧＢ）への色分解を行い、赤色（Ｒ）の色要素のみを示したものである。したがって、赤色部分が白色に表現され、青色部分が黒色に表現されている。骨分化能はカルシウムの沈着をアリザリンレッドＳ染色により評価した結果、いずれの場合も同じく赤く染色された。また、アルカリ性ホスファターゼ活性はいずれの保存液で凍結した場合でも未凍結系と同じく高い値を示した。脂肪分化能は、細胞中の脂肪滴をオイルレッド０を用いて染色したところ、いずれの保存液で凍結した場合でも未凍結系と同じく赤く染色された脂肪滴（図１中段にて、径が数十μｍの淡色の円形ないし楕円形パターンとして表された部分）が確認された。軟骨分化能に関しては、細胞塊中のプロテオグリカンをアルシアンブルーで染色したところ、いずれの保存液で凍結した系でも未凍結と同じく青く染まるプロテオグリカン（図１の右段にて濃い黒色部分として表された部分）が確認された。すなわち、本発明の凍結保存液にて凍結することにより分化に影響を及ぼすことはないことが確認され、再生医療用幹細胞の凍結保存に十分有用であることが示された。
＜実施例３  ヒト脂肪由来幹細胞の凍結保存＞
脂肪は骨髄に比べ容易にしかも多量に採取可能であり、幹細胞のソースとして注目されている。以下に、今回実験に使用したヒト脂肪由来幹細胞脂肪の採取方法を記載した。吸引により採取した脂肪組織を５％抗生剤含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄した。３７℃で３０分間０．０７５％Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎで脂肪を消化し、遠心操作により細胞群を分離した。分離された細胞群を、ＤＭＥＭ−Ｆ１２，１０％ＦＢＳおよび抗生物質を含む培地内に混合して細胞懸濁液を生成し、培養容器に播種した。培養容器内に播種された細胞群に含まれている細胞のうち、接着性の高い脂肪組織由来幹細胞が培養容器の底面に接着し、それ以外のより接着性の低い細胞は培養容器の底面に接着できずに、洗浄ステップにおいて上清とともに除去される。このようにして、純度よく分離された脂肪組織由来幹細胞を得た。
【表２】
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【表３】
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次に実施例２と同様、１×１０６個のヒト脂肪由来幹細胞をクライオバイアル中で各凍結保存液１ｍＬに懸濁し、−８０℃のフリーザー中で凍結保存を行った。このとき、冷却速度を簡易的に−１℃／分とするため、冷却イソプロピルアルコールを封入した冷却チャンバー中に凍結バイアルを放置し、−８０℃冷凍庫内で凍結を行った。１週間後、３７℃の温浴中で速やかに融解し、ＤＭＥＭで洗浄したのち、６ｗｅｌｌカルチャーディッシュに１×１０５個ずつ播種し、６時間後の生存率をトリパンブルー染色により評価した。比較例としては一般的によく用いられている保存液である１０％ＤＭＳＯ／ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を用いた。その結果を表２に示した。ヒト間葉系幹細胞と同じくＰＬＬ（０．６５）で最も保存後の生存率が高く、アルブミンやプロピレングリコールを添加することでさらに保存効率の向上が確認された。
また、ＰＬＬ（０．６５）の濃度を０−１２ｗ／ｗ％まで変化させてヒト脂肪由来幹細胞を凍結させたところ、表３に示すような結果が得られた。すなわち、ＰＬＬ（０．６５）の濃度が７％あたりからかなり生存率が高くなってきており、１２％程度で最も高くなっている。これはＬ９２９の生存率がＰＬＬ（０．６５）７．５％以上でほぼ９５％を示すのに対し、より高濃度が必要という結果である。つまり、ヒト脂肪由来幹細胞はＬ９２９のような不死化細胞に比べると増殖率も弱く、凍結に対する感受性も高いからではないかと予想される。従ってより高濃度の凍害防御剤が必要となるが、ジメチルスルホキシドのような毒性の高い保存剤は濃度を高めることがすなわち毒性につながるため、最適な保存液の設計が困難であったといえる。しかしながらＰＬＬ（０．６５）の様な高分子物質は毒性も低く、浸透圧も低く抑えることが可能であることから濃度を高めることが容易であり、幹細胞の凍結保存には適していることが示唆される。また、毒性の低いエチレングリコールやグリセリン、プロピレングリコールと共存させることにより相乗効果が見られることも有用な知見である。
次にヒト脂肪由来幹細胞の凍結解凍後の増殖を調べ、細胞の倍加時間を測定したところ、表４に示すようにジメチルスルホキシド凍結保存に関しては未凍結保存に比べて約１０時間以上も倍加時間が長くなっている。これは細胞が正常な増殖状態に戻るまでに時間を要することを意味している。一方、ＰＬＬ系ではＰＬＬ（０．６５）での保存が最も倍加時間が短くなる傾向にあり、また濃度は１０−１２％で最も短い倍加時間を取ることから、最適な濃度域も１０％前後であることが確認された。この場合もプロピレングリコール添加で若干倍加時間の短縮が見られ、相乗効果が確認されている。
また、ヒト脂肪由来幹細胞の本発明凍結保存液にて凍結解凍後の分化能に関してもヒト間葉系幹細胞の凍結保存と同様、未凍結系、ジメチルスルホキシド系と比較して全く同等の分化能を維持していたことから、ヒト脂肪由来幹細胞においても本発明凍結保存液は有効であることが確認された。
【表４】
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＜実施例４  毒性試験＞
ヒト脂肪由来幹細胞に対するＰＬＬ（０．６５）の毒性試験を行った。１０％ウシ胎児血清を含有したダルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ）に懸濁させたヒト脂肪由来肝細胞を、９６ｗｅｌｌマイクロプレートに１０×１０３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ播種し、３７℃で７２時間培養後、ＰＬＬ（０．６５）を、最終濃度０−１４％となるように添加し、４８時間後、未添加系をコントロールとして細胞の増殖が５０％阻害される濃度をＩＣ５０とし、ＭＴＴ法で求めた。その結果を図２に示す。比較例はＤＭＳＯ系（１０％ＤＭＳＯ／ウシ胎児血清）とした。図２の結果から知られるように、ＰＬＬ（０．６５）は１４％でも細胞の増殖抑制は起こらず、ＩＣ５０が約４％であったジメチルスルホキシドよりも明らかに毒性が低いことがわかった。これはＰＬＬ（０．６５）がマイナス電荷を帯びているため細胞膜との相互作用が低いことと、高分子化合物であるため高濃度においても浸透圧が低く抑えられることなどが原因と考えられる。したがって本凍結保存剤を使用することで既存の凍結保存液に比べ細胞毒性を低くすることができ、幹細胞のような比較的弱い細胞の凍結保存に適したものが得られることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＬＬ（０．６５）の１０％溶液、及び、１０％ＤＭＳＯ／ウシ胎児血清を凍結保存液として用いヒト間葉系幹細胞を凍結保存後に、多分化能（骨、脂肪、軟骨への分化誘導）を評価した結果を示す図である。
【図２】ＰＬＬ（０．６５）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のヒト脂肪由来幹細胞への毒性試験の結果を示す図。横軸にそれぞれの化合物の濃度、縦軸に化合物添加後の各濃度における細胞数の未添加系に対する割合をプロットしてある。縦軸の生存率が５０％を示す際の化合物の濃度をＩＣ５０と呼び、毒性の指標とする。この場合ＰＬＬ（０．６５）はＩＣ５０が存在せず、測定濃度域では無毒性である。ＤＭＳＯはＩＣ５０が約４％である。
【図１】
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【図２】
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