(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原体に対する抵抗性を有するカキを得る方法であって、前記病原体に対する抵抗性を有する地中海のヨーロッパ・ヒラガキと、反対の性別の非抵抗性のカキとの交配を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記病原体が、細菌、寄生虫およびウィルスから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非抵抗性のカキが、ヨーロッパ・ヒラガキ、オストレア・アンガシ、オストレア・コンチャフィーラ、オリンピアガキ、イタボガキ、オストレア・プエルカナ、ワニガキ、オストレア・ステンティナ、チリガキ、アメリカガキ、マングローブガキおよびカリブガキからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記病原体が、ボナミア症、マルテイリア症、ハプロスポリジウム症、小血球症、パーキンサス症およびイリボウィルス症（ｉｒｉｖｏｖｉｒｏｓｅ）のうちの少なくとも１つの疾患に関与する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記病原体が、ボナミア症およびマルテイリア症の少なくともいずれか一方に関与する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記交配が、
ａ）前記病原体に対する抵抗性を有する地中海のヨーロッパ・ヒラガキを供給するステップと、
ｂ）前記病原体に対して非抵抗性のカキであって、前記抵抗性を有するヨーロッパ・ヒラガキとは性別が反対であるカキを供給するステップと、
ｃ）交配を可能にする塩分濃度を有する水を含有するタンクに、前記カキを一緒に入れるステップと、
ｄ）成熟に十分な給餌をともなう光周期の増加により、前記タンク中で前記カキを成熟させるステップと、
ｅ）前記カキに適用される誘発剤を使用して、雄性配偶子の放出を誘発するステップと、
ｆ）ステップｅ）で放出された前記雄性配偶子により、雌性配偶子を受精させるステップと、
ｇ）８〜１０日間、幼生を培養するステップと、
ｈ）ステップｇ）で得られた前記幼生に植物プランクトンを供給して発眼した幼生を得るステップと、
ｉ）得られた発眼した幼生を採取するステップと、
ｊ）前記病原体に対する抵抗性を有する少なくとも１匹のカキを得るために、前記幼生を、発育支持体上に固定するステップと
を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップｅ）〜ｇ）はインビトロで行われ、前記配偶子は、生殖腺の乱切によって得られる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップｅ）〜ｇ）はインビボで行われ、ステップｆ）の、ステップｅ）で放出された前記配偶子の受精は、雌のカキの外とう腔における配偶子の選別の後に行われ、かつステップｇ）の培養は、幼生の娩出がなされるように、雌のカキの外とう腔内で行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記タンクは、水回路により連続的に給水され、かつ、ステップｅ）の実施のために前記水回路が閉じられる、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記水回路は独立している、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップｄ）の前記成熟は、２０〜３０℃の温度で行われる、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンクは、養殖タンクである、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップｅ）で定義された誘発手段は、熱衝撃および少なくとも１種のタンパク質の少なくともいずれか一方である、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記熱衝撃は、温度を５〜５５℃の値に連続的に下降および上昇させることによって行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記給餌は、養殖場で成長した生きた単細胞藻類で構成される、請求項６〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記単細胞藻類は、イソクリシス・ガルバナ、スケレトネマ・コスタータム、パブロバ・ルテリ、キートセラス・カリストランス、テトラセルミス属からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ステップｉ）は、幼生の娩出から、８〜１０日後に行われる、請求項６〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ステップｉ）の前記発育支持体は、２５０〜５００μｍの、微粉砕貝殻およびふるいにかけられた物質の少なくともいずれか一方である、請求項６〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記抵抗性のヨーロッパ・ヒラガキは、交配に適切なレベルの炭水化物貯蔵物質を有する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記地中海の抵抗性のヨーロッパ・ヒラガキは、最初の養殖世代のものであり、かつ直径が６０ｍｍより大きい、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記抵抗性のヨーロッパ・ヒラガキおよび前記非抵抗性のカキは、性的潜伏期の期間後に選択される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記交配は、一生殖期にのみ行われる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記非抵抗性のカキは、大西洋、太平洋またはインド洋からのカキの系統である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法により得られるカキ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病原体に対して抵抗性を有するカキを得る方法、および結果として得られたカキに関する。
より詳細には、本発明は、ボナミア・オストレア（Ｂｏｎａｍｉａ  ｏｓｔｒｅａｅ）およびマルテイリア・レフリンゲンス（Ｍａｒｔｅｌｉａ  ｒｅｆｒｉｎｇｅｎｓ）のような病原体に対して抵抗性を有する養殖カキの商業的な生産において使用されるものに関する。
【０００２】
以下の明細書の記載において、角かっこ（［］）内の参考文献は、実施例の後に示された参考文献のリストに掲載されている。
【背景技術】
【０００３】
ヒラガキのＯｓｔｒｅａ  ｅｄｕｌｉｓ（ヨーロッパ・ヒラガキ）は、ヨーロッパで最も養殖されているカキの一つであるが、米国およびカナダでも養殖されている。
１９７０〜１９８０年の間、寄生虫であるマルテイリア・レフリンゲンスおよびボナミア・オストレアの出現により、カキの生産が大きく減少し、カキの養殖者は、そのような寄生虫を克服する手段を捜し求めている。
【０００４】
カキにおける感染を制限するために、いくつかの方法が取られている。それらの方法の一つは、カキを１つの養殖場から別の養殖場へ置き換えること、および幼生のカキを一つの区域から他の区域へ置き換えることを制限することにあった。
【０００５】
他の方法は、寄生虫であるボナミア・オストレアに対する抵抗性を有するカキを選択しようとするものであった。非特許文献１［１］。このような選択は、前記寄生虫に対する寛容性の促進を可能にしたが、寄生虫に対する抵抗性は促進されず、また、養殖カキの遺伝的多様性の弱体化およびカキの血族関係における有害性の増加を引き起こした。非特許文献２［２］。
【０００６】
他の研究では、大西洋からの感受性である幼生のカキを使用して、カキを養殖するための、感染していない領域を特定することが行われた。これらの研究の一つは、８０年代にコルシカ島のディアナ湖で行われ、水産養殖生成物を調整する動物の健康状態に関連する欧州理事会指令９１／６７／ＣＥＥにより、ＩＦＲＥＭＥＲの提案を受けて、そのような池を感染領域として分類することになった。コルシカ島全体を包囲するゾーン１は、ボナミア症およびマルテイリア症が存在するとして分類された。
【０００７】
種々の研究は、寄生虫に感染している領域の地図の作成を可能にし、各領域において、より寄生虫寛容性であるカキを選択することさえ可能にしたが、これは、カキの遺伝的多様性を弱体化させた。
【０００８】
前記寄生虫に対する抵抗性を有するカキの生産を可能にする研究は存在しない。
したがって、従来技術の欠点、弱点および障害に対処して、病原体に対して抵抗性を有するカキを得ることを可能にし、かつ低価格で産業的生産を行うことを可能にする方法が真に求められている。また、この方法は、容易に実施されなければならない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｎａｃｉｒｉ−Ｇｒａｖｅｎら（１９９８）「Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｌａｔ  ｏｙｓｔｅｒ  Ｏｓｔｒｅａ  ｅｄｕｌｉｓ  （Ｌ．）ｆｏｒ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｗｈｅｎ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｐａｒａｓｉｔｅ  Ｂｏｎａｍｉａ  ｏｓｔｒｅａ」Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍａｒ  Ｂｉｏｌ．Ｅｃｏｌ．，２２４：９１−１０７
【非特許文献２】Ｎ．Ｔａｒｉｓら「Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｇｅｎｅｔｉｑｕｅｓ  ｄｅ  ｌａ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｅｓ  ｌａｒｖｅｓ  ｄ’ｈｕiｔｒｅｓ  ｅｎ  ｅｃｌｏｓｅｒｉｅ：ｅｔｕｄｅ  ｄｅｓ  ｐｒｏｃｅｓｓｕｓ  ｄｅ  ｄｅｒｉｖｅ  ｅｔ  ｄｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．」，Ｌｅｓ  ａｃｔｅｓ  ｄｕ  ＢＲＧ，６（２００６）５２１−５４１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、より正確には、病原体に対する抵抗性を有するカキを得る方法を提供することによって、先に記載した要求および欠点に対処することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の方法は、そのような病原体に対する抵抗性を有する地中海のヨーロッパ・ヒラガキと、非抵抗性のカキとの交配を含むことを特徴とする。
また、本発明は、本発明の方法により得ることのできる可能性の高い、病原体に対する抵抗性を有するカキに関する。
【００１２】
本発明では、「抵抗性のカキ」とは、病原体に対する抵抗性を有する任意の地中海のヨーロッパ・ヒラガキを意味する。抵抗性の地中海のヨーロッパ・ヒラガキは、病原体に対する抵抗性を有する任意の野生のカキで、地中海を起源とする。たとえば、大西洋を起源とする養殖系統の養殖および／または移植による人為的な選択的圧力も、遺伝子混入も受けていない地中海のヨーロッパ・ヒラガキの全てである。地中海起源のカキは、アロザイム・マーカまたはマイクロサテライト・マーカ、Ｌａｕｎｅｙ  Ｓ．ら「Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｆｌａｔ  ｏｙｓｔｅｒ（Ｏｓｔｒｅａ  ｅｄｕｌｉｓ  Ｌ．）ａｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ．」Ｊ  Ｈｅｒｅｄ．２００２Ｓｅｐｔ−Ｏｃｔ；９３（５）：３３１−５１．（２００２）［３］、あるいはＲＮＡ配列による、系統の分子分析によってチェックすることができる。たとえば、Ｄｉａｚ−Ａｌｍｅｌａらの科学記事「Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｆｅｍａｌｅ  ｇｅｎｅ  ｆｌｏｗ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｆｌａｔ  ｏｙｓｔｅｒ  Ｏｓｔｒｅａ  ｅｄｕｌｉｓ」Ｊ  Ｈｅｒｅｄ．２００４Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；９５（６）：５１０−６．（２００４）［４］に記載されるように、地中海沿岸起源の層（ｃｏｕｃｈｅ）を示すように使用することができる分子マーカは、前記系統のミトコンドリア１２ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の３１３ペアの塩基の配列に対応する。
【００１３】
抵抗性のカキは、成長及び状態の指数（全体重に対する食べられる肉の比を意味する）に関する養殖品質を好ましく有するように選択されてもよく、それは交配方法に最も適合したものである。たとえば、前記比は、０．１０〜０．２０の間でありえ、好ましくは０．１５を超え得る。測定は、たとえば、ある世代の、貝殻が適合した形を持つ、すなわち、貝殻の下半分が凸状の最も大きなカキで行うことができる。抵抗性のカキは、たとえば、コルシカ島のカキに関し、８０ｇ未満の重さの若い第一成熟度のカキから選択してもよく、最も大きなカキは、殻の比がより大きくなる傾向がある。これらの中でも、平均直径における厚さの比で定義される凸度［（長さ＋幅）／２］が０．３３を超えるカキが、好ましく選択され得る。
【００１４】
抵抗性のカキは、寸法、重さなどの表現型特性に応じて選択することができる。たとえば、抵抗性の地中海のヨーロッパ・ヒラガキは、６０ｍｍを超える直径を有するものを好ましいものとして選択してもよい。
【００１５】
また、抵抗性のカキは、天然の成長培地に関してそれらの所在地に応じて選択することもできる。たとえば、天然培地に関し、堆積物の表面上に散在した遊離型のものと、岩に固定されたカキとの間では、養殖に対してより適合する特性を示すので、遊離型が好ましい。
【００１６】
好ましくは、自然環境でのカキのサンプリング領域は、最も高い生産性を意味する、最も重要な集団を含む領域である。軟質堆積物を占める遊離型に関して、カキは、たとえば、１匹の個体／ｍ２を超える密度、好ましくは２匹の個体／ｍ２を超える密度を有する集団の中から選択することができる。
【００１７】
抵抗性のヨーロッパ・ヒラガキは、たとえば、コルシカ島の潟、モロッコのナドル、チュニジアのガベス、リビア、ギリシャ、スペインのムルシアのマールメノイル湖、トルコのボスフォラス海峡のエーゲ海区域、バレアレス諸島のミノルカ島、ウクライナのセバストポリ、紅海および／またはバルト海を起源とする、抵抗性の地中海のヨーロッパ・ヒラガキの中のカキから選択することができる。
【００１８】
本発明の方法を実施するために、抵抗性のヨーロッパ・ヒラガキは、ディアナ湖、ウルビーノの池、ポルトベッキオ湾、サンタマンザ湾およびサルジニアの潟からの、野生のコルシカ島のヨーロッパ・ヒラガキを含む群から選択することが好ましい。本発明の方法を実施するために、選択された抵抗性のヨーロッパ・ヒラガキは、ディアナ湖からの野生のコルシカ島のヨーロッパ・ヒラガキであることが好ましい。
【００１９】
本発明によれば、抵抗性の地中海のカキは、古い地中海集団を起源とするカキであってもよい。そのカキは、移植や養殖による外部からの遺伝的変化を受けていない野生のヒラガキおよび/または地理的に限定された地中海の潟を起源とするカキであることが好ましい。地中海の潟に長期間住む野生の集団は、特に、それらの生息場所に関連する適応性特性、とりわけ、温度のレベルおよび幅、塩分濃度のレベルおよび変化度、培地の酸素負荷、培地および潮流の栄養価および自然集団の陸地出現に対する抵抗性の可能性における変化に特有な遺伝子型、表現型および養殖的特性を有する。たとえば、モロッコのナドル潟のカキの天然集団は、満潮の間、数時間、殻を開き、死ぬことなく、亜熱帯陽光区域に曝すことができる。本発明の方法の実施形態において、大西洋での養殖の潮間帯に適合させた交配種を得る抵抗性のカキは、ナドルからのカキであってもよい。
【００２０】
しかし、開かれた生息場所であって餌料供給が少ない場所を起源とする抵抗性の地中海系統は、交配の特性としては一般的にあまり適さない、一般的な適応特性を受け継ぐ。これは、ギリシャのキクラデス諸島、クロアチア、カラブリア、シチリアおよびカマルグ(ポール・サン・ルイ・デュ・ローヌ)を起源とする抵抗性系統に関する場合である。
【００２１】
地中海起源のカキは、たとえば、アロザイム・マーカ、マイクロサテライト・マーカ［３］、または先に記載したＲＮＡ配列［４］による系統の分子分析によってチェックすることができる。
【００２２】
本発明によれば、選択された抵抗性のカキは、交配に適したレベルの炭水化物を貯蔵する物質を有するのが有利である。グリコーゲンで構成されるそのような貯蔵物質は、革新的に、その生殖腺を発達させ、その配偶子を生み出すことができる「太った」カキの態様を与えるであろう。そのような貯蔵物質は、配偶子を作成するために春に、および全配偶子形成の間、使用することができ、したがって、産卵の栄養は、受精率および動員を決定する。炭水化物貯蔵物質は、カキの受精率を十分発現するように働き、したがって、本発明の方法の実現に有利に働く。
【００２３】
本発明によれば、抵抗性の地中海のヨーロッパ・ヒラガキは、好ましくは養殖世代、好ましくは第一養殖世代で選択される。第一養殖世代でのカキの選択により、交配を行うための配偶子の最高生存率を保証することを可能にできる。
【００２４】
本発明によれば、「非抵抗性のカキ」は、起源、その属または種には関係なく、病原体に対して脆弱な任意の感受性のカキを意味する。病原体に対するカキの非抵抗性は、たとえば、カキの成長の変性、遅延または停止に必然的に伴い得る、任意のカキの生物学的機能の変更によって現れ得る。また、病原体への非抵抗性は、カキの死を引き起こし得る。ボナミア症の場合、その感染症の第一徴候は、成長の遅れ、エラの損傷、殻の解放に加えて、一般的に最初の性的成熟移行から現れる高い死亡率がしばしば挙げられる。「Ａｂｅｒ病」とも称されるマルテイリア症に関しては、以下の臨床的徴候、すなわち、グリコーゲン貯蔵の減少および枯渇、消化腺の完全な変色、給餌の停止およびカキの弱体化が、リアスまたは他の潮間帯のいずれかにおいて養殖場において現れ、これらは続いて高い死亡率が起こる徴候である。
【００２５】
換言すれば、非抵抗性のカキは、養殖カキの病気に対して感受性である任意のカキと言える。たとえば、イタボガキ科の二枚貝カキであってもよい。
たとえば、非抵抗性のカキは、カキのヘルペス・ウィルス１（「イタボガキヘルペスウィルス−１（ＯｓＨＶ−１）」）に対して感受性であるカキであってもよい。
【００２６】
たとえば、非抵抗性のカキとしては、環境因子、すなわち、毒性因子、環境の汚染または物理学的因子の変化のため、免疫防御が弱体化しているカキが可能である（Ｇａｇｎａｉｒｅ  Ｂ．，２００５）［１０］。
【００２７】
たとえば、非抵抗性のカキは、養殖場における選択に関し、養殖作業または圧力に起因する遺伝的浮動により、感染物質に対して感受性にされたカキであってもよい（Ｔａｒｉｓ  Ｎ．，２００７）［１５］。
【００２８】
本発明によれば、本発明の方法により交配され得る非抵抗性のカキは、自然採取によってまたは孵化場で得られる野生のカキ、養殖カキ、天然のカキ系統、地中海に土着のカキおよび地中海の外を起源とするカキの中から選択することができる。たとえば、非抵抗性のカキは、大西洋、太平洋および／またはインド洋からのカキであってもよい。
【００２９】
本発明によれば、非抵抗性のカキは、たとえば、カキの養殖作業によって変質した地中海のカキ、または、大西洋、太平洋および／またはインド洋からの感受性かつ／または汚染されたカキの移送によって汚染された地中海のカキであってもよい。
【００３０】
本発明によれば、非抵抗性のカキは、抵抗性のヨーロッパ・ヒラガキと同じまたは異なる属または種のものであってもよい。たとえば、ヒラガキまたはポルトガルガキであり得る。たとえば、本発明で使用することができる非抵抗性のカキの種は、以下の属および／または種、ヨーロッパ・ヒラガキ、オストレア・アンガシ（Ｏｓｔｒｅａ  ａｎｇａｓｉ）、オストレア・コンチャフィーラ（Ｏｓｔｒｅａ  ｃｏｎｃｈａｐｈｉｌａ）、オリンピアガキ（Ｏｓｔｒｅａ  ｌｕｒｉｄａ）、イタボガキ（Ｏｓｔｒｅａ  ｄｅｎｓｅｌａｍｅｌｌｏｓａ）、オストレア・プエルカナ（Ｏｓｔｒｅａ  ｐｕｅｌｃｈａｎａ）、ワニガキ（Ｏｓｔｒｅａ  ｆｏｌｉｕｍ）、ムラサキガキ（Ｏｓｔｒｅａ  ｐｅｒｍｏｌｌｉｓ）、オストレア・ステンティナ（Ｏｓｔｒｅａ  ｓｔｅｎｔｉｎａ）、チリガキ（Ｔｉｏｓｔｒｅａ  ｃｈｉｌｅｎｓｉｓ）、アメリカガキ（Ｃｒａｓｓｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｇｉｎｉｃａ）、マングローブガキ（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ  ｇａｓａｒ）およびカリブガキ（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ  Ｒｈｉｚｏｐｏｒａｅ）などに属するものが可能であるが、これらに限定されない。
【００３１】
非抵抗性のカキは、たとえば、東アフリカの河口およびマングローブ林の、マングローブ木のカキであるマングローブガキ、およびインド洋−太平洋のマングローブ木カキであるカリブガキなどを含む群から選択することができる。
【００３２】
非抵抗性のヨーロッパ・ヒラガキは、たとえば、タウ湖からのヒラガキ「ブジーグ」（Ｂｏｕｚｉｇｕｅｓ）、ベニスの潟からのカキ、ベニスからのヒラガキ、シャラントおよび／またはバンデからの、アルカション池からのヒラガキ「グラヴェット」（Ｇｒａｖｅｔｔｅｓ）、リアスおよびモルビアン湾を起源とする、南ブルターニュからのヒラガキ「ブロン」、北ブルターニュおよびノルマンディーを起源とする「カンカル」（Ｃａｎｃａｌｅ）、スペインのガリシアを起源とするカキ、ポルトガルを起源とするカキ、英国、コーンウォールからのカキ、南および北アイルランドからのカキ、オランダからのカキ、デンマークからのカキ、米国およびカナダ、西大西洋、フロリダからケベックまでのカキ、ＵＳＡおよびカナダの海岸を起源とする東太平洋からのカキ、カリフォルニアとアラスカとの間の海岸からのカキを含む群から選択することができる。
【００３３】
本発明の方法の実施のために、非抵抗性のカキは、病原体に対して感染していてもあるいは感染していなくても、あるいは寛容性があってもなくてもよい。前記カキは、それが有している病変を発現する前に最初の生殖を行う傾向にある場合、寛容性があると称される。
【００３４】
本発明によれば、本発明の方法の実施のために、抵抗性の地中海のヨーロッパ・ヒラガキおよび非抵抗性のカキは、性的潜伏期後に選択することが好ましい。こうした期間は、通常冬に生じる。次いで、そのような抵抗性のカキおよび非抵抗性のカキは、たとえば養殖場のタンク中、たとえば日照時間が増加する中で、交配のために調整されることが好ましい。
【００３５】
本発明によれば、病原体に対して抵抗性であるか、または非抵抗性であるかの特性に応じてカキを個別にマークすることができる。マーキングは、当業者に公知の任意の方法、たとえば、乱切法又は接着剤、たとえばエポキシ接着剤を用いてラベルを固定することによって行うことができる。このようなカキの個々のマーキングは、交配種幼生カキの均質なバッチを構成することを可能にする。
【００３６】
本発明によれば、交配に使用されるカキは、反対の性を有する。オストレア属のヒラガキは、周期的な連続雌雄性を有する非同期的な二枚貝である。一般的に、雄性先熟は、ひとつの季節の間に性を数回変えることができ、雄および雌系統は同時に存在するので、雌雄の選別を難しくする。オストレア属に関連する生殖のこの特定モードは、大量生産の場合、遺伝的同一性のいかなる制御も阻止する。したがって、交配がオストレア属の抵抗性のカキおよび非抵抗性のカキを扱う場合、カキを２匹ずつ分離することが好ましい。換言すると、カキを２匹ずつ分離することが好ましい。理論的には、分離したカキは、各２つのペアのうち、１つのペアのみが雄−雌の組になるはずである。本発明では、前記組の７０〜８０％が受精することが有利である。実際のところ、最も早熟のカキの成熟は、２匹目のカキの、逆の性への方向付けを引き起こし得る。したがって、本発明によって得られる交配の数は、推定される理論的数よりも高い。
【００３７】
カキは、広温性で、広塩性であることが非常に多いことに気をつけるべきである。そのような寛容性は、成熟の同期化および配偶子の放出、ならびに単一の地理的培地を起源とする２匹のカキの交配を促進する。
【００３８】
本発明によれば、病原体は、細菌、寄生虫およびウィルスを含む群から選択することができる。
本発明によれば、「病原体」は、ある種類の病原体または数種の病原体、または複数の、ある種の病原体、あるいは細菌、ウィルス症状、寄生虫病またはこれらに関与する症状に関連する他の物質との組合せを意味する。
【００３９】
本発明によれば、病原体は、略胞子虫類、原生動物、マルテイリア、寄生虫およびカキの中の全身細胞および／または体液性免疫機構を必要とする外部汚染物質、たとえば、病原体、ボナミア・オストレアおよびマルテイリア・レフリンゲンスを含む群から選択することができる。
【００４０】
本発明によれば、病原体は、病状、たとえば、ボナミア症、マルテイリア症、ハプロスポリジウム症、小血球症、パーキンサス症および／またはイリボウィルス症（ｉｒｉｖｏｖｉｒｏｓｅ）に関与する可能性があり、病原体は、好ましくは、ボナミア症および／またはマルテイリア症に関与する。
【００４１】
本発明によれば、病原体は、動物間流行病、大量のまたは反復性致死症候群、たとえば、培養培地の温度の上昇にともなう夏の死亡率および／またはカキのヘルペス・ウィルス１（「カキ・ヘルペス・ウィルス−１（ＯｓＨＶ−１）”）に関連する可能性があり、および日和見病原体、たとえば、ノカルディア・クラッソストレア（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａｅ）に関連する可能性がある。経済的利益のある軟体動物に見られるこのような病原体および／または日和見病原体は、「Ｓｙｎｏｐｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｐａｒａｓｉｔｅｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ  Ｅｘｐｌｏｉｔｅｄ  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ」（Ｂｏｗｅｒら、１９９４）［１３］、（Ｂｏｗｅｒ＆ＭｃＧｌａｄｅｒｒｙ，２００３）［１４］）において分類されている。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明の方法を実施する方法を以下に記載する。
本発明によれば、交配は、カキの交配の実施が可能な、当業者に公知の任意のタンクで行うことができる。タンクは、たとえば、ガラス、木、金属、合成材料、または石造り製の養殖容器、水槽、任意のタンク、容器またはたらい、あるいは任意の適用可能な導管であってもよい。本発明の方法の実現のために使用されるタンクの容量は、たとえば、１〜１００リットルの容積が可能であり、好ましくは５〜２０リットルである。
【００４３】
本発明によれば、タンクは水の酸素供給手段を含んでもよい。たとえば、水は、当業者に公知の任意の手段、たとえば、空気をタンクの水に放出することができるポンプを使用して酸素供給することができる。また、酸素供給は、水回路レベルで行うこともできる。水の酸素供給の速度は、交配の実現の間に適合することができ、好ましくは、本発明に必要な温度および塩分濃度のレベルがいかなるものでも、水性培地を溶解した酸素で飽和することを目的として適合する。酸素濃度は、５ｍｇ／Ｌ〜１１ｍｇ／Ｌが可能であり、好ましくは６．５ｍｇ／Ｌを超える。本発明によれば、交配すべきカキを含むタンクには、たとえば、予め水を満たし、連続してまたは非連続的に、水回路によって給水することができる。水の循環速度は、０Ｌ／時間〜１００Ｌ／時間の間が可能であり、好ましくは５Ｌ／時間〜２０Ｌ／時間の間である。その速度は、カキおよび幼生の呼吸および給餌の要求基準に合わせることができる。
【００４４】
本発明によれば、前記水回路は、１つのタンクから別のタンクに分離することができる。より詳しくは、水回路の分離により、交配されるべきカキへの外部からの影響を避けることが可能になり、したがって、交配種幼生の純度を保証することが可能になる。そのような分離は、たとえば、望ましくない遺伝的汚染をともなう交配種生成を防止することができるようにする。
【００４５】
本発明によれば、本発明で使用される水は、交配の実施に適合された任意の水であり得る。本発明の実施に適合された水は、たとえば、非抵抗性のカキの最初の培地および／または抵抗性のカキの培地の特性と同じ、中間のあるいは異なる物理化学的特性、たとえば、塩分濃度、ｐＨ、温度などを有する水であり得る。
【００４６】
本発明によれば、水は、本発明の方法のステップに応じて、異なる組成を有することができる。
本発明によれば、使用する水は、塩分濃度を３‰〜５０‰の間とすることができ、好ましくは１２‰〜３８‰の間である。水は、ｐＨを６．５〜９の間とすることができ、好ましくは７〜８．５の間である。水は、温度を−８℃〜＋５５℃の間とすることができ、好ましくは１２℃〜４０℃の間である。
【００４７】
本発明によれば、本発明を実現するために供給される餌料は、カキおよび／または交配されるカキを養殖するための、当業者に公知の任意の餌料で構成することができる。前記供給餌料は、たとえば、単細胞藻類、植物プランクトン、餌料微粒子の供給のための海底の細菌、組合せ餌料製品、炭水化物、タンパク質、ビタミン類、その他のような溶解した有機物質の供給物、またはこれらの混合物で構成することができる。
【００４８】
植物プランクトン、底生細菌および単細胞藻類は、カキの孵化場および／または天然の培養培地に由来し得る。微粒子は、天然または人工の起源を持ち得る。たとえば、有機質廃棄物および／または養殖廃棄物を起源とすることができる。
【００４９】
単細胞藻類および／または植物プランクトンは、たとえば、冷却ペーストの形態で遠心操作により濃縮することができ、餌料微粒子は、たとえば、懸濁および／または乳化することができ、配合餌料は、たとえば、乾燥したものでも、または水和されたものでも、グリシドおよび／または脂肪および／またはタンパク質物質を配合したものでもよく、押出され、検量され、またはマイクロカプセル化されてもよい。
【００５０】
孵化場および／または天然の培地で育った単細胞藻類は、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）、スケレトネマ・コスタータム（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ  ｃｏｓｔａｎｕｍ）、パブロバ・ルテリ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｌｕｔｈｅｒｉ）、キートセラス・カリストランス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｃａｌｃｉｔｒａｎｓ）、テトラセルミス属などを含む群から選択され得る。たとえば、植物プランクトンは、イソクリシス・ガルバナ、パルボバ・ルテリ、キートセラス・フォルマ・プミラム（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｆｏｒｍａ  ｐｕｍｉｌｕｍ）などを含む群から選択され得る。使用される植物プランクトンおよび単細胞藻類の量および品質は、本発明の方法の製品に適合していることが好ましい。栄養分は、卵塊の受精率および幼生および交配種カキの動員の成功に重要な要素である。
【００５１】
本明細書では、「交配」は、抵抗性のカキ少なくとも１匹と、先に記載したような非抵抗性のカキ１匹との間の交配の実現を可能にする当業者に公知の任意の方法を意味する。また、交配は、精子細胞凍結法技術を使用し、Ｌａｎｎａｎ  Ｊ．Ｅ，１９７１による実験、太平洋のカキであるクラッソストレア・ギガス（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ  ｇｉｇａｓ）の実験的自家受精に従い、細胞凍結された精子、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，６８：５９９−６０１［５］，ＢｏｕｇｒｉｅｒおよびＲａｂｅｄｏｍａｎａｎａ，１９８６、日本のカキ、クラッソストレア・ギガス（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅｅａ  ｇｉｇａｓ）の精子の細胞凍結法、Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，５８：２２７−２８０［６］を利用し、または多選択性保存を使用し、配偶子の希釈装置を洗浄するＨａｆｆｒａｙら「Ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｉｏｎ  ｅｔ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｑｕｅ  ｄｅｓ  ｃｈｅｐｔｅｌｓ  ｐｉｓｃｉｃｏｌｅｓ  ｄａｎｓ  ｌｅ  ｃａｄｒｅ  ｄｕ  ＳＹＳＡＡＦ」，ＩＮＲＡ  Ｐｒｏｄ．Ａｎｉｍ．，２００４，１７（３），２４３−２５２［７］ことによって、先に記載した抵抗性および／または非抵抗性のカキの配偶子で直接実現することもできる。畜産の知識は、性別のコントロール、卵塊の独立した成熟、産卵の同期化、および卵塊間の化学的交換によって、同定された個体の人工繁殖を支配することを可能にすることができる。このような知識は、化学合成刊行物、Ｇｅｒａｒｄ  Ａ．，Ｎａｃｉｒｉ−Ｇｒａｖｅｎ  Ｙ．，Ｂｏｕｄｒｙ  Ｐ．，Ｌａｕｎｅｙ  Ｓ．，Ｈｅｕｔｅｂｉｓｅ  Ｓ．，Ｌｅｄｕ  Ｃ．，Ｐｈｅｌｉｐｏｔ  Ｐ．，（１９９７）．Ｃｏｎｔｒｏｌｅ  ｄｅ  ｌａ  ｇａｍｅｔｏｇｅｎｅｓｅ  ｄｅｓ  ｈｕｉｔｒｅｓ  ｃｒｅｕｓｅｓ  ｅｔ  ｐｌａｔｅｓ．Ｉｎ：Ｌａ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｎａｔｕｒｅｌｌｅ  ｅｔ  ｃｏｎｔｒｏｌｅｅ  ｄｅｓ  Ｂｉｖａｌｖｅｓ  ｃｕｌｔｉｖｅｓ  ｅｎ  Ｆｒａｎｃｅ，Ｄｅｖａｕｃｈｅｌｌｅ  Ｎ．，Ｂａｒｒｅｔ  Ｊ．，Ｓａｌａｕｎ  Ｇ．，（１９９７），ＤＲＶ／ＲＡ／ＲＳＴ９７−１１，Ｉｆｒｅｍｅｒ  Ｂｒｅｓｔ，２１７ｐｐ．［８］の主題である。
【００５２】
本発明の特定の実施形態によれば、交配は、以下の、
ａ）病原体に対する抵抗性を有する地中海のヨーロッパ・ヒラガキを供給するステップと、
ｂ）前記病原体に対して非抵抗性のカキであって、前記ヨーロッパ・ヒラガキと性別が反対であるカキを供給するステップと、
ｃ）交配を可能にする塩分濃度を有する水を含有するタンクに、前記カキを一緒に入れるステップと、
ｄ）成熟に十分な給餌をともなう光周期の増加により、前記タンク中で前記カキを成熟させるステップと、
ｅ）カキに適用される誘発剤を使用して、雄性配偶子の放出を誘発するステップと、
ｆ）ステップｅ）で放出された雄性配偶子により、雌性配偶子を受精させるステップと、
ｇ）ステップｆ）で得た幼生を、８〜１０日間培養するステップと、
ｈ）ステップｇ）で得られた幼生に植物プランクトンを供給して発眼した幼生を得るステップと、
ｉ）得られた発眼した幼生を採取するステップと、
ｊ）前記病原体に対する抵抗性を有する少なくとも１匹のカキを得るために、前記幼生を、発育支持体上に固定するステップと、
を含み得る。
【００５３】
本発明の方法によれば、ステップａ）で供給される病原体に対する抵抗性を有する地中海のヨーロッパ・ヒラガキは、先に記載した抵抗性のカキである。
本発明の方法によれば、ステップｂ）で供給される、病原体に対して抵抗性のないカキは、先に記載したような非抵抗性のカキである。
【００５４】
本発明の方法によれば、ステップｃ）は、ステップａ）で得られた少なくとも１匹のカキと、ステップｂ）で得られた少なくとも１匹のカキとを、一緒にタンクに入れることからなる。たとえば、ステップａ）で得られた数匹のカキを、ステップｂ）で得られた１匹のカキとともに、タンク内に入れることもでき、その反対も行うことができる。また、ステップａ）で得られた数匹のカキを、ステップｂ）で得られた数匹のカキと一緒に、タンク内に入れることもできる。
【００５５】
本発明による方法では、ステップａ）およびｂ）で供給されたカキは、本発明の方法のステップｃ）において２匹ずつ分離される。すなわち、各タンクは、ステップａ）で得られたカキに該当するものと、ステップｂ）で供給されたカキに該当するもう１匹のものとの、２匹のカキのみを有することが好ましい。
【００５６】
本発明の方法で使用するタンクとして、先に記載したタンクであり得る。
ステップｄ）〜ｉ）は、前記実施手段によって行うことができる。そのような手段は、本発明の方法の各ステップに適合することができる。
【００５７】
本発明の方法によれば、本発明の方法のステップｄ）で行われる成熟は、カキの成熟を可能にする、当業者に公知の任意の方法で行うことができる。カキの成熟は、日照時間を徐々に長くすることによって行うことが好ましい。この増加は、１週間から６ヶ月の期間行うことができ、１ヶ月から３ヶ月が好ましい。最小照明時間は、１時間〜１２時間の間であり、最大照明時間は、１２時間〜２３時間であり得る。成熟のステップは、本発明の方法の実現を可能にするいかなる温度でも行うことができる。好ましくは、前記成熟は、好ましくは２０℃〜３０℃の間の温度までの温度で徐々に上げることによって行うことができる。成熟は、２０℃〜３０℃の間の温度で行うことが好ましい。より詳しくは、最終成熟温度の選択は、交配の方法の間に使用された系統、および成熟に対するそれらの反応に依存する。温度は、交配すべきカキに応じて適合させることができる。このステップにおけるカキの応答の制御は、生殖腺の成熟度および配偶子の形成を制御することによって行うことができる。カキには、性的潜伏期に対応する０と番号が付けられた段階から、配偶子の放出に該当する４ｂと番号が付けられた段階までの異なる成熟段階がある。成熟度のコントロールは、たとえば、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）を使用した麻酔浴中の殻片の開き具合の観察のような、当業者に公知の方法を用いて行うことができる。本発明の方法では、生殖腺成熟が第三段階に達した時、カキは成熟したとみなされる。
【００５８】
この成熟ステップの間、餌料供給は、任意の適正な当業者に公知の手段で行うことができる。たとえば、先に規定したような餌料供給が可能である。たとえば、単細胞藻類、植物プランクトン、底生細菌、微粒子の餌料などであり得る。
【００５９】
成熟ステップの間、タンクが水回路によって給水される特定の実施形態において、前記回路は、１つのタンクから別のものに分離することができる。水回路の分離は、とりわけ、１つのタンクから別のタンクへの水の交換、したがって、物質、たとえば、他のタンク内で繁殖した成熟カキによって放出された、タンパク質および／または病原体および／または化学物質の交換を回避することを可能にする。そのような物質は、卵塊の性を決定することができる。本発明の実現の望ましくない、他のタンクで繁殖した成熟カキによって放出された配偶子の交換は、望ましくない姉妹系統間の自家受精を引き起こす可能性がある。
【００６０】
本発明によれば、本発明の方法のステップｅ）で規定された配偶子の放出の誘発は、成熟カキ、たとえば、生殖腺の成熟が第三段階のカキで行うことが好ましい。そのような成熟カキは、たとえば、本発明の方法のステップｄ）で得られたカキであり得る。本発明の方法のステップｅ）で使用される誘発の媒介は、当業者に公知の誘発手段、たとえば、少なくとも熱衝撃および／または少なくともタンパク質、たとえば、ホルモン、化学物質、または神経伝達物質、たとえばセロトニンであってもよい。
【００６１】
好ましくは、誘発媒介は、１回または数回の熱衝撃であり得る。温度の経時的な下降および増加、本発明の方法の実現に適合される温度における変化に該当する。たとえば、最高温度は、２５℃〜５５℃の間、最低温度は、５℃〜２０℃の間であることができる。
【００６２】
誘発、たとえば熱衝撃は、先ず、雄性配偶子の放出を可能にし、これは、雌性配偶子の産卵を刺激する。雌性配偶子の放出の誘発は、雄性配偶子によって化学的に実現される。たとえば、ホルモンまたは神経伝達物質、たとえばセロトニンであり得る。
【００６３】
また、雌性配偶子の放出の誘発は、雌性配偶子の放出を誘発する当業者に公知の任意の物質によって行うことができる。たとえば、化学物質、ホルモンまたは神経伝達物質、たとえばセロトニン、たとえば、雄性配偶子を含有する水、配偶子を含有するろ過水、および／または細胞凍結法により得られた活性精子を含有する希釈培地がある。
【００６４】
特定の実施形態では、ステップｅ）のカキの配偶子の放出の誘発は、配偶子の分散を防ぐように、水を循環せずに、タンクの中で行われることが好ましい。この場合、水循環が先のステップで行われていれば、このステップｅ）のために、水回路を閉鎖する。
【００６５】
また、ステップｅ）の別の特定の実施形態では、別のタンク内のホルモンや雄性配偶子のような物質の分散を防ぐために、１つのタンクから別のタンクへの水の循環を分離することができる。
【００６６】
本発明の方法によれば、ステップｆ）は、雄性配偶子による雌性配偶子の受精に該当し、その雄性配偶子は、雌カキによって予め選別されている。受精は、カキの外とう腔内で起こる。このステップの実施手段は、先に記載した手段、または当業者に公知の任意の手段であり得る。これらの手段は、当然、受精の実現に適合することが好ましい。
【００６７】
本発明の方法によれば、ステップｇ）で規定するような幼生の培養は、好ましくは、カキの外とう腔内で行うことができる。幼生培養のこのステップの間、このステップを実施する手段は、先に記載した手段または当業者に公知の任意の他の手段であり得る。このような手段は、そのような培養の実現に適合されることが好ましい。培養のこのステップは、８〜１０日間行うことができる。培養のこのステップの間、カキおよび幼生の給餌は、たとえば、本明細書の先に記載したような植物プランクトン、または他の任意の適正な餌料で行うことができる。培養のこの期間の後、幼生を生息地に放出する。
【００６８】
本発明の方法によれば、産卵、受精の誘発および幼生の培養に対応するステップｅ）およびｇ）は、外とう腔外のインビトロで、または雌の外とう腔内のインビボで行うことができる。ステップｇ）を、インビボ、すなわち雌のカキの外とう腔内で行う場合、配偶子は、選別され、受精され、雌のカキの外とう腔内で培養される。培養は、幼生の娩出をステップｇ）において可能にするような方法で行われる。
【００６９】
インビトロで、配偶子を生殖腺の乱切（「ストリッピング」技法）によって得ることにより、発育および受精の段階をプログラムし制御することが可能になる。
本発明の方法によれば、ステップｈ）は、発眼した幼生を得るための、ステップｇ）で培地に放出された幼生への給餌に該当する。先に記載されたような幼生への給餌を可能にする植物プランクトンは、そのようなステップの実現を可能にする当業者に公知の任意の植物プランクトンであり得る。そのようなステップを実施する手段は、先に記載した手段または当業者に公知の任意の手段であり得る。そのような手段は、好ましくは幼生の給餌の実施に適する。
【００７０】
本発明の方法によれば、ステップｉ）は、ステップｈ）で得られた発眼した幼生の採取に対応する。発眼した幼生の採取は、幼生の娩出の後、たとえば、８〜１０日間行うことができる。発眼した幼生を採取する手段は、当業者に公知の任意の手段、たとえば、幼生の採取を可能にする直径の孔を持つフィルタ、スクリーンであってもよい。たとえば、スクリーンは、メッシュサイズが１０μｍ〜１８０μｍ、好ましくは５０μｍ〜１５０μｍのものであってもよい。メッシュサイズは、放出された幼生のサイズに応じて選択することができ、そのサイズは、放出された幼生のサイズより小さくなければならない。
【００７１】
本発明の方法によれば、ステップｊ）は、発育支持体上への幼生の固定に対応する。前記固定は、本明細書で先に記載したように、タンク内で実現することができる。このステップの実施手段は、本明細書の先に記載した手段または当業者に公知の任意の手段であってもよい。これらの手段は、受精の実現に適合されることが好ましい。タンクは、その壁に同じまたは異なる発育支持体を含むことができる。幼生の発育支持体は、本発明の方法の実効を可能にする任意の支持体であり得る。たとえば、発育支持体として、微粉砕されたカキ殻またはムール貝の殻、微粉砕されたガラスおよび／または、たとえば、２５０μｍ〜５００μｍの間でスクリーニングされた任意の材料であって、本発明の方法によって得られた幼生の継承および遊離の幼生カキの取得を可能にする。
【００７２】
固定ステップの後、幼生カキを発育させて少なくとも１匹の交配種カキを得る。そのような発育ステップを実施する手段は、本明細書の先に記載した手段または当業者に公知の任意の他の手段であってもよい。そのような手段は、幼生の発育に適合することが好ましい。
【００７３】
本発明によれば、交配は、たとえば、一生殖期の間のみ、たとえば、第一成熟年の間の６ヶ月間に行うことができる。したがって、温度および給餌条件は、各カキが、第一成熟期間の間に数回性別を変えることができるように選択することができる。前記カキは、１０日間〜７０日間の間の間隔で新しい配偶子を放出することができる。
【００７４】
第一成熟年の間の本発明の方法の実現は、配偶子および若いカキから発生する幼生が、最適品質を有することができるようにするのが有利である。
本発明の方法により得られる交配種カキは、完全兄弟型のものであり、それらは、異型接合性によって加えられた、それらの異なる、相補的な、地理的および経済的同一性に起因する、特定の遺伝子多型を持つ親のみから生じる。異型接合体のこのような交配および形成は、病原体に対して抵抗性を有する交配種を得ることを可能にする。
【００７５】
本発明の方法による交配は、オストレア属の生殖の生態および遺伝学的に異なる野生集団間の地理的距離のため、現実には決して起こることはない。養殖の系は、普通、イタボガキ科が特に脆弱な血縁退行のため、雑種強勢質が次の世代で急速に失われるため、Ｆ１交配種のみを使用する。したがって、本発明の方法は、第一世代の抵抗性のカキを得ることを可能にする。
【００７６】
抵抗性の交配種カキは、種々の条件下で発育することができる。得られる交配に応じて、それらは、親の本来の環境で発育することができる。たとえば、コルシカ島の抵抗性のヨーロッパ・ヒラガキと、大西洋からの非抵抗性のカキとの交雑からは、大西洋海岸、また地中海海岸で発育し得る病原体に対して抵抗性を有する交配種が得られる。本発明のそのような態様は、技術水準に関し、大きな利点があり、コルシカ島のカキは、たとえば、潮流現象、したがって、浸水および出現現象、培地の変化、たとえば、塩分濃度、温度に対して適合しないため、抵抗性のコルシカ島カキは大西洋海岸では発育できないことがわかる。
【００７７】
交配により得られた抵抗性のカキは、その抵抗性および培地に対する適合性の能力のため、価格を下げ、病原体に感染した角の養殖場におけるカキの生産を大きく改善できるようにする。
【００７８】
本発明の方法で得られた抵抗性のカキには、さらに、天候の変化、たとえば、培地の温度の上昇に対して適合する特性もある。
さらに、交配種は、それらの起源である親の日成長に対して３０％まで増加した日成長を有する。この態様は、カキ生産養殖場において、抵抗性の交配種を使用する関心を増加させる。
【００７９】
また、交配によって得たこのような抵抗性のカキは、輸入されたまたはされていないに関わりなく、病原体に感染した地域を、人によって、感染カキの養殖を介して、ストックすることを可能にし、および海洋生態系の回復を可能にすることができる。
【００８０】
また、交配によって得られたそのような抵抗性のカキは、血族関係がますます重要になるカキ養殖場で成長した系統の生物学的多様性の生殖を可能にする。血族関係は、系統の生殖の発生源であり、カキ養殖場の生産性の減少の原因である。
【００８１】
カキ養殖場における流行病の発生の増大が、１９２０年から観察されているため［１６］、カキの血族関係は、病原体に対する抵抗を減少する原因となる可能性がある。
本発明により得られた抵抗性の交配種カキは、当業者に公知のウィルス、細菌および／または寄生虫病原体に対する抵抗性の特性を増加させている。抵抗性の増加としては、たとえば、特に血球防御が関わる限り、細胞および体液性免疫応答の増加があり得る。そのような特性は、たとえば、異型接合性に起因する遺伝的多様性の回復に由来する可能性がある［１５］。
【００８２】
本発明により得られる抵抗性の交配種カキは、カキ養殖場内で繰り返される流行病、水温の上昇に起因する流行病、またはカキのヘルペス・ウィルス１（「イタボガキ科のヘルペス・ウィルス−１（ＯｓＨＶ−１）」）［１６］に起因する流行病の問題の解決を可能にする。実際のところ、本発明の方法により得られるカキの遺伝的多様性は、血縁カキに、より大きな耐久力および免疫を与え、したがって、環境の変化、特に気候変化に起因する偶発的な感染に対し抵抗することを可能にする［１０］。
【００８３】
他の利点は、説明のために掲載される本明細書の以下にある実施例を読めば、さらに当業者には明らかになるであろう。
【実施例】
【００８４】
（実施例１）
コルシカ島のディアナ湖からの抵抗性のヨーロッパ・ヒラガキ
１９８０年代から寄生虫、ボナミア・オストレアおよびマルテイリア・レフリンゲンスで汚染され、養殖場で繁殖に成功したと考えられているディアナ湖から、野生のカキを採取した。０．２ｇに成長した幼生カキにより、その湖において、良好な品質の実験的生産を得ることができる。この成功は、以下の結論を導きだすことを可能にする。
【００８５】
−ボナミア・オストレアおよびマルテイリア・レフリンゲンスで汚染されているゾーンで、上市サイズになるまで病状を持たないということは、ヒラガキ、ヨーロッパ・ヒラガキのコルシカ島系統に特有の特定の遺伝的多型性に関連する寄生虫病に対する抵抗性を示唆する。
【００８６】
−最初のロットとして、０．２ｇの幼生カキから１８ヶ月で、ｎ°１およびｎ°０のサイズを得ることは、コルシカ島系統は、成長が高い可能性があることを明らかにしている。成長周期は、大西洋のブロンヒラガキの成長周期に対して、５０％を超えて減少する。
【００８７】
−状態指数は１６％（総重量に対する食べられる肉の重量）であり、これは、南ブルターニュのブロンカキの指数より高い。十分な味覚試験により、商業的観点から、コルシカ島系統は注目に値する品質があることが確認される。
【００８８】
次に、その系統の健康状態および病原体に対する抵抗性をテストした。そのようなテストは、Ｏ．Ｉ．Ｅ．（ボナミア症およびマルテイリア症に関する動物の世界保険機構）のプロトコルに従って行った。
【００８９】
−心室およびエラの組織プリントの顕微鏡を使用した細胞診：染色後、血球内部に２〜５μｍの小さな球形または卵形の生物は観察されず（ボナミア）。
−エラ、消化腺、固定し染色した生殖腺サンプルの組織の顕微鏡を使用した病理組織学的試験：自由条件下または血球内部に、２〜５μｍの寄生虫細胞は観察されず（ボナミア）。消化腺の奇形も、マルテイリアの存在を証明する２０〜３０μｍの球形生物の存在もなし。
【００９０】
−モノクローナル抗体免疫蛍光法を使用する検出により、コルシカ島系統は、自然環境に存在する寄生虫、ボナミアおよびマルテイリアに対する抵抗性を有することを示す。
−連鎖重合反応（ＰＣＲ）：寄生虫のＩＴＳ１域を標的とする特定のＤＮＡプローブにより、マルテイリア・レフリンゲンスは検出されず。
【００９１】
−ＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析（制限断片長多型）：寄生虫ボナミア・オストレアのフラグメント、ＳＳＵ  ｒＤＮＡ特性を標的とする、カキ組織から抽出したＤＮＡの負の対照により、コルシカ島系統は汚染されていないことが証明される。
【００９２】
−分子の原位置交配法（ＩＳＨ）：ボナミア・オストレア、フラグメント、ＳＳＵ  ｒＤＮＡおよびマルテイリア・レフリンゲンス、フラグメントＩＴＳ１のＤＮＡの特定のプローブを、カキ組織の組織サンプルと接触させる。顕微鏡を使用する観察により行われた負の対照により、コルシカ島系統の組織内にＢ．オストレアおよびＭ．レフリンゲンスは存在しないことが証明される。そのような試験では、ディアナ湖からのヒラガキの野生の集団は、Ｂ．オストレアおよびＭ．レフリンゲンス・ボナミアと接触するが、この自然環境で、そのような寄生虫に感染していないことが示される。
【００９３】
これらの寄生虫の人工接種テストを行った。
−コルシカ島からのヒラガキを、ボナミア・オストレアにひどく汚染されたカキとともに、タンクに数ヶ月閉じ込めた。それらのカキは、病気を発症せず、本明細書の先に記載した検出テストにも陰性を示した。
【００９４】
−Ｍｉａｌｈｅら（１９８８）の方法により単離した５×１０６匹の生きた寄生虫、ボナミア・オストレアを含有するろ過海水５０μｌを、コルシカ島からのカキの外とう腔に注射した。殻を開くように、予めカキを３．５％のＭｇＣｌ２−６Ｈ２Ｏ溶液浴で麻酔した。
【００９５】
汚染量の接種液を外とう腔へ注射した後、カキを水の外に１時間置き、その後バブリングにより曝気した海水を満たした養殖タンクに戻した。１ヶ月の養殖後、死亡は観察されず、カキは、本明細書の先に記載したボナミア・オストレアの検出テストに対して陰性を示した。浴または外とう腔への注射による実験的感染のこの手法は、この寄生虫の直接水平伝播の不存在下で、マルテイリア・レフリンゲンスに対する抵抗性をテストするためには使用することができない。
【００９６】
そのような試験は、コルシカ島およびサルジニア、より詳しくは、ウルビーノのディアナ湖、ポルトベッキオ湾およびサンタマンザ湾、サルジニアの潟からの野生ヒラガキは、寄生虫、ボナミア・オストレア、ハプロスポラ（Ｈａｐｌｏｓｐｏｒｉｄｅｓ）ファミリの原生動物に対し、１００％抵抗性であることを示す。そのような試験は、自生系統のヨーロッパ・ヒラガキは、原生動物に起因する病気によって撲滅されるであろうという科学的知識の現状に大きく矛盾し、このような間違った記載は、文献（ＭＩＮＩＣＯＮＩ  Ｒ．，２０００，Ｌｅｓ  ｆｒｕｉｔｓ  ｄｅ  ｍｅｒ  ｄｅｓ  ｃｏｔｅｓ  ｄｅ  Ｃｏｒｓｅ，Ｅｄｉｔｉｏｎｓ  Ａｌａｉｎ  Ｐｉａｚｚｏｌａ，Ｐ．９０［９］）中にあり、事実、その文献は、大西洋から輸入された抵抗性を有しないおよび／または感染した幼生カキのテスト養殖を記載している。
【００９７】
コルシカ島からのヒラガキで行われた全ての観察の照合確認により、二枚貝の細胞免疫（血球）および体液性免疫の一般的メカニズムを呼び起こす（ここで免疫系は、非適合性を残し、すなわち、いかなる免疫系記憶もない）、ハプロスポラ、原生動物、マルテイリア、寄生虫、日和見病原体、および外部の汚染物質に対する野生系統の抵抗性が示される。
【００９８】
地中海からのヒラガキの他の野生集団を、先のプロトコルに従ってテストし、寄生虫、ボナミア・オストレアおよびマルテイリア・レフリンゲンスに対して、全て抵抗性を示した。これは、コルシカ島、モロッコ（ナドルの潟）、チュニジア（ガベス湾）、ビリア（チュニジアとギリシャとの国境に近い潟）からの野生集団に関する。
（実施例２）
コルシカ島のディアナ湖からの抵抗性のヨーロッパ・ヒラガキ
野生のカキを、病原体、ボナミア・オストレアおよびマルテイリア・レフリンゲンスによって汚染された地域、ディアナ湖から採取し、養殖場で繁殖させた。野生のカキは、天然の場所から直接採集され、病原体に対して抵抗性を有する。
【００９９】
サンプルされた野生のカキは、直径が６０ｍｍより大きい第一養殖世代のものである。
サンプル採取を行い、塩分濃度が３７‰、温度が１３℃、ｐＨが８．１の海水、容量が２０Ｌで満たされたタンクにカキを入れ、養殖場に送った。輸送の前に、エポキシ接着剤付きのラベルを使用してサンプルされたカキに印をつけた。
（実施例３）
非抵抗性のカキ
この実施例では、天然採取から、サイズが６０ｍｍのブロン品質の未成熟カキ（「キブロン」系統、南ブルターニュ）を選んだ。本発明の方法を実施するために使用したカキは、病状を発現していないカキである。
（実施例４）
受精用のカキの成熟
実施例２および実施例３で交配されるカキのサンプル採取の後、これらを分離し、２匹ずつ組み合わせる、すなわち、感受性のカキと抵抗性のカキとを組み合わせる。それにより、２０対の組が構成される。次いで、それらの組をそれぞれ容量が２０リットルの２０個の予め満たされたタンクに入れる。各タンクは、予め、塩分濃度が３７‰の海水２０リットルで満たされている。水のｐＨは８．１である。水の初期温度は１３℃であり、２週間で２０℃に上昇させる。各タンクで、２０Ｌ／時間の空気流量でポンプシステムを使用して、水に酸素供給する。
【０１００】
成熟の間の水の供給は、閉じた水回路で行い、各タンクは独立している。水の物理化学的特性は、成熟の間一定に保たれる。
日照時間を９時間から１５時間に増やし、水温を２０〜３０℃に達するように徐々に上昇させ、１５〜９０日間、カキの成熟を行う。
【０１０１】
成熟期間の間、餌料供給は、養殖場またはＳＡＴＭＡＲ社の冷凍濃縮ペーストから得た、単細胞藻類株、イソクリシス・ガルバナ、スケレトネマ・コスタータム、パブロバ・ルテリ、イイートセラス・カリストランスを培地に添加することによって行った。餌料供給は、カキの採食が観察される限り、任意に１日３回行う。餌料供給は、有機物、より詳しくは稚魚を飼育しているプールの廃棄物から得た有機物の添加によって、一斉に行う。
【０１０２】
成熟を、当業者に公知の方法を使用し、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）を使用する麻酔浴中で、生殖腺の成熟度の段階を観察することによってチェックするＧａｇｎａｉｒｅ  Ｂ．，２００５，「Ｅｔｕｄｅ  ｄｅｓ  ｅｆｆｅｔｓ  ｄｅ  ｐｏｌｌｕａｎｔｓ  ｓｕｒ  ｌｅｓ  ｐａｒａｍｅｔｒｅｓ  ｈｅｍｏｃｙｔａｉｒｅｓ  ｄｅ  ｌ’ｈｕｉｔｒｅ  ｃｒｅｕｓｅ  Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ  ｇｉｇａｓ−Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｅｎｔｒｅ  ｅｎｖｉｒｏｎｎｅｍｅｎｔ，ｍｅｃａｎｉｓｍｅｓ  ｄｅ  ｄｅｆｅｎｓｅ，ｅｔ  ｍａｌａｄｉｅｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｅｕｓｅｓ」、博士論文、Ｌａ  Ｒｏｃｈｅｌｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，４１２ページ［１０］。
【０１０３】
カキは、生殖腺の成熟が第三段階に達した時、配偶子の放出に関し、成熟している。
（実施例５）
配偶子放出の誘発および配偶子の受精
配偶子の放出の誘発を、実施例４により、成熟とされたカキで行う。
【０１０４】
配偶子の放出の誘発を、実施例４と同じ条件下、同じ方法を使用し、同じカキの対に関し行う。
培地中に配偶子が分散することを避けるため、誘発の前に水の循環を止める。
【０１０５】
配偶子の放出を、熱衝撃により誘発する。最低温度を２３℃〜３０℃の間、最高温度を３０℃〜３７℃の間とし、温度を交互に４℃〜７℃で上昇および下降させる。
雄が最初に放出し、これは雌カキによる雌性配偶子の放出を化学的に誘発する。
【０１０６】
培地中に放出された精子は、雌によって選別される。受精は雌の外とう腔内で行われ、ここで、８〜１０日間幼生を育て、その後それらを雌１匹あたり１００万個の数で外に娩出する。
【０１０７】
外とう腔内での幼生の抱卵のステップの間、水を再循環させる。幼生には植物プランクトン餌を与える。幼生の給餌のために使用した植物プランクトンは、養殖場の外に位置するタンク内の大量培養物から得られた、イソクリシス・ガルバナ、パブロバ・ルテリ、キートセラス・フォルマ・プミラムで構成され、必要であれば、ＳＡＴＭＡＲ社から得た藻類の濃縮ペーストを加える。使用した植物プランクトンのサイズは、第一段階に幼生に関しては、２０μｍ〜４０μｍの間、成体段階までの変態時は、５０〜２００μｍである。タンク内部の餌料の循環、および食餌中、中断される水の循環を観察しながら、植物プランクトンの日量を任意に培地に加える。
（実施例６）
幼生の採取および固定
実施例５の培地に放出された幼生の採取は、スクリーンを使用して行う。幼生の採取および固定の条件は、実施例３と同じである。使用するスクリーンの目は、直径１２０μｍである。スクリーンを使用することにより、培地中に存在する幼生の採取を可能にする。これらを、それらの親に応じて均質バッチにグループ分けする。グループ分けはタンク中で行い、そのタンクの底を２５０μｍ〜５００μｍの間のスクリーンで測定した微粉砕したカキおよびムール貝の貝殻で覆う。
【０１０８】
タンクの容量は、２ｍ３〜５ｍ３の間である。タンクを、塩分濃度が３７‰、ｐＨが８．２、および温度が２０〜２５℃の水で満たす。閉じた循環中のタンクを、２ｍ３／時間〜５ｍ３／時間の間の空気流量でポンプを使って酸化させる。培養８〜１０日後、幼生を発育支持体上に固定する。幼生の固定方法は、幼生を支持体上に固定させる従来からの方法、さらに詳しくは、ＩＦＲＥＭＥＲの技術雑誌、Ｉｆｒｅｍｅｒ，２００７、２００７年３月１７日付けの養殖業者のデータベース「Ｌｅｓ  ｅｃｌｏｓｅｒｉｅｓ：ｃａｓ  ｄｅ  ｌ’ｈｕｉｔｒｅ  ｃｒｅｕｓｅ」［１１］およびＨｅｌｍ，Ｍ．Ｍ．，Ｂｏｕｒｎｅ，Ｎ．，Ｌｏｖａｔｅｌｌｉ，Ａ．，（ｃｏｍｐ．／ｅｄ．）Ｅｃｌｏｓｅｒｉｅｓ  ｄｅ  ｂｉｂａｌｖｅｓ，Ｕｎ  ｍａｎｕｅｌ  ｐｒａｔｉｑｕｅ．ＦＡＯ  ｄｏｃｕｍｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｓｕｒ  ｌｅｓ  ｐeｃｈｅｓ  Ｎｏ．４７１．Ｒｏｍｅ，ＦＡＯ．２００６．１８４ｐ．［１２］に記載されている方法である。
（実施例７）
抵抗性および非抵抗性のカキ
以下の表に、本発明の方法のための、抵抗性および非抵抗性のカキの他の実施例を示す。
表１：抵抗性の地中海のヨーロッパ・ヒラガキ
表２：抵抗性の地中海のヨーロッパ・ヒラガキ
表３：非抵抗性の地中海のヨーロッパ・ヒラガキ
表４：非抵抗性のヨーロッパ・ヒラガキ
表５：他の非抵抗性のカキ
【０１０９】
【表１】
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【０１１０】
【表２】
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【０１１１】
【表３】
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【０１１２】
【表４】
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【０１１３】
【表５】
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（実施例８）
他の交配の実施例
以下の表に、本発明の範囲内の他の実施例を示す。本発明の交配を行うことにより、長い期間、国産カキの利用の拡大することを視野に入れた、病状に対する抵抗性を得ることが可能となり、この特性は、すでに、物理的、生物的、および商業的義務に見合うように選択されてきている。
【０１１４】
表６：本発明の方法により抵抗性のカキを得る交雑の実施例
【０１１５】
【表６】
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【０１１６】
【表６−２】
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すでに記載したような、本発明の方法で得られた交配種は、ヒラガキの従来の生産法の必要性を満たし、そのような交配で必要とされる特定の特性を有する。交配種は、ボナミア症およびマルテイリア症に対する抵抗性を有する。さらに、それらは、日和見性病原体に対しても抵抗性を有する。交配種は、培地の変動、たとえば、潮による陸地出現または水没、温度、塩分濃度の差に対し、耐久性および寛容性を持つ。それらは、高い成長能力を有する。それらは、潮間帯、栄養および有機物が豊富な水中での養殖、沿岸の水を加熱する気候に起因する制約に適合する。最後に、交配種は、無酸素、乾燥および輸送の制約に対しても寛容性がある。
（実施例９）
コルシカ島の湖からの野生のカキと、モロッコのナドルの潟からのカキとの間の交配
コルシカ島の湖の野生のカキとナドルの潟のカキとを、本発明の方法により交雑させた。この場合、２種類の抵抗性カキの間での交雑である。ジブラルタル海峡に近いナドルでは、潟で２ｍに達し得る潮が発生し、モロッコカキの自然集団の仮の陸地出現が発生する。ディアナ湖のカキとナドルのカキとの交配により、致死的な病状に対して抵抗性を有するとともに大西洋の潮の制約に適合した重要な成長を示し、暖かい天候による温度の上昇に対して寛容性があり、かつ販売用の輸送の間の乾燥に対して抵抗性を有する交配種の作成が可能になる。
【０１１７】
交配種幼生カキの生産を、養殖場で同時に生産されるナドルカキの生産と比べた。交配種は、変態後の月の間のモロッコの幼生カキの対照バッチの平均日成長より３０％まで高い平均日成長を有する。さらに、国産交配種幼生カキの相対サイズは、非常に均質に見える対照バッチのものより、大きく均質である。次いで、交配のコントロールによって示される、雑種強勢効果（活発な交配種）は、高い畜産技術を持つ国産ヒラガキの製造の範囲内で確認される。
【０１１８】
このようにして作成された国産交配種Ｆ１は、大西洋沿岸の養殖場におけるヒラガキ、「ブロン」の変性症の問題を解決する。
その結果、そのような本発明の方法による交配のため、得られた広い適合性は、ポルトガル、ガリシア、ブルターニュ、ノルマンディー、アイルランドおよびオランダにおけるヒラガキの従来の生産の必要を満たす。交配種は、ボナミア症およびマルテイリア症に対して抵抗性を有する。また、それらは、日和見病原体に対しても抵抗性を有する。交配種は、潮の差および培地の変化、たとえば、温度および塩分濃度に対して、耐久性および寛容性を有する。それらは、高い生育能を有する。また、それらは、潮間帯での養殖（干満帯での養殖）、栄養および有機物が豊富な水中での養殖（リアスの改良、カキピットの改良）、沿岸の水の加熱に起因する制約にも適合する。最後に、交配種は、無酸素、乾燥および輸送に関連する制約、コルシカ島からブルターニュの市場に小包を送る場合に認められた抵抗に対しても寛容性がある。
【０１１９】
【表７】
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【０１２０】
【表８】
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