(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−８およびＧＲＯ−αからなる群から選択される少なくとも一つに対する遊走性（tropism）を有し、かつ、脳腫瘍を治療するための遺伝子治療用のキャリアとしての機能を有する、臍帯血から単離された間葉系幹細胞および／または該間葉系幹細胞から増殖させた間葉系幹細胞を含む、脳腫瘍の予防または治療用の薬学的組成物。
【請求項２】
抗腫瘍遺伝子が、臍帯血から単離された間葉系幹細胞および／または該間葉系幹細胞から増殖させた間葉系幹細胞に導入された、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
抗腫瘍遺伝子が、腫瘍抑制遺伝子、アポトーシス誘導因子遺伝子、細胞周期調節遺伝子および血管新生抑制遺伝子からなる群から選択される、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
腫瘍抑制遺伝子が、ホスファターゼおよびテンシンホモログ（PTEN）の遺伝子、Maspinの遺伝子、ＲＵＮＸ３の遺伝子、Caveolin−１の遺伝子、ｎｍ２３の遺伝子、Ｒｂタンパク質の遺伝子、Brush−１の遺伝子、腫瘍増殖の阻害因子（ＩＮＧ−４）の遺伝子、survivinの遺伝子、X染色体連鎖性アポトーシス阻害タンパク質 （ＸＩＡＰ）の遺伝子、神経アポトーシス阻害タンパク質（ＮＡＩＰ）の遺伝子、およびそれらの遺伝子の調節と関連するタンパク質の遺伝子からなる群から選択される、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
アポトーシス誘導因子遺伝子が、サイトカインの遺伝子、インターロイキンの遺伝子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の遺伝子、インターフェロン（ＩＮＦ−α、ＩＮＦ−β、ＩＮＦ−γ）の遺伝子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）の遺伝子、ｐ５３の遺伝子、Ａｐａｆ−１の遺伝子、ＴＲＡＩＬの遺伝子、カスパーゼの遺伝子、Ｂａｘの遺伝子、Ｂａｄの遺伝子、ＦＡＤＤの遺伝子、ＪＮＫの遺伝子、ｐ３８キナーゼの遺伝子、およびそれらの遺伝子の調節と関連するタンパク質の遺伝子からなる群から選択される、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
細胞周期調節遺伝子が、ｃｄｃ２の遺伝子、サイクリン（サイクリンＡ、サイクリンＤ、サイクリンＥ）の遺伝子、ｃｄｃ２５Ｃの遺伝子、ｐ２１ＷＡＦの遺伝子、ｐ１６ＩＮＫ４の遺伝子、ＣＤＫ（ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６）の遺伝子、Ｒｂタンパク質の遺伝子、Ｅ２Ｆの遺伝子、それらのアンチセンスまたはＳｉＲＮＡおよびそれらの遺伝子の調節と関連するタンパク質の遺伝子からなる群から選択される、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
血管新生抑制遺伝子が、トロンボスポンジン−１の遺伝子、エンドスタチンの遺伝子、タムスタチンの遺伝子、カンスタチン（canstatin）の遺伝子、バスタチン（vastatin）の遺伝子、レスチン（restin）の遺伝子、血管内皮増殖抑制因子の遺伝子、マスピン（maspin）の遺伝子、アンジオポエチンの遺伝子、プロラクチンの１６−ｋｄ断片の遺伝子、およびエンドレペリン（endorepellin）の遺伝子からなる群から選択される、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
プロドラッグ転換酵素遺伝子が、臍帯血から単離された間葉系幹細胞および／または該間葉系幹細胞から増殖させた間葉系幹細胞に導入された、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記プロドラッグ転換酵素遺伝子が、シトシンデアミナーゼ遺伝子およびＣＹＰ２Ｂ１遺伝子から選択される、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
脳腫瘍と関連する遺伝子のアンチセンスまたはＳｉＲＮＡが、臍帯血から単離された間葉系幹細胞および／または該間葉系幹細胞から増殖させた間葉系幹細胞に導入された、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
脳腫瘍と関連する遺伝子が、Ｒａｓファミリーの遺伝子、ｃ−ｍｙｃの遺伝子、ａｂｌの遺伝子、ｅｒｂＢ−１の遺伝子、ＥＧＦ−Ｒの遺伝子、Ｂａｘの遺伝子、Ａｐａｆ−１相互作用タンパク質（ＡＰＩＰ）の遺伝子、Ｗｎｔ−１誘導性分泌タンパク質１（ＷＩＳＰ−１）の遺伝子、Ｗｎｔの遺伝子、Ｒａｆ−１の遺伝子、Ｓｒｃの遺伝子、Ａｋｔの遺伝子、Ｅｒｋ−１、２の遺伝子、およびＢｃＬ−２の遺伝子からなる群から選択される、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
腫瘍崩壊ウイルスが、臍帯血から単離された間葉系幹細胞および／または該間葉系幹細胞から増殖させた間葉系幹細胞に導入された、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
腫瘍崩壊ウイルスが、単純ヘルペスウイルスおよびレオウイルス３型から選択される、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記脳腫瘍が、星状細胞腫、毛様細胞性星状細胞腫、低悪性度星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形性膠芽腫、脳幹神経膠腫、上衣細胞腫、上衣下細胞腫、神経節細胞腫、混合性神経膠腫、乏突起細胞腫、視神経膠腫、聴神経腫、脊索腫、CNSリンパ腫、頭蓋咽頭腫、血管芽細胞腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体腫瘍、下垂体腫瘍、未分化神経外胚葉性腫瘍、ラブドイド腫瘍、神経鞘腫、嚢胞、神経線維腫症、偽脳腫瘍、および結節硬化症からなる群から選択される、請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
ＩＬ−８およびＧＲＯ−αからなる群から選択される選択される少なくとも一つに対する遊走性（tropism）を有し、検出可能なマーカーで標識される、臍帯血から単離された間葉系幹細胞および／または該間葉系幹細胞から増殖させた間葉系幹細胞を含む、脳腫瘍を診断するまたは脳腫瘍の治療経過をモニタリングするための組成物。
【請求項１６】
前記検出可能なマーカーがルシフェラーゼを含む酵素に基づく蛍光検出剤およびTatペプチド誘導体化磁性ナノ粒子から選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記脳腫瘍が星状細胞腫、毛様細胞性星状細胞腫、低悪性度星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形性膠芽腫、脳幹神経膠腫、上衣細胞腫、上衣下細胞腫、神経節細胞腫、混合性神経膠腫、乏突起細胞腫、視神経膠腫、聴神経腫、脊索腫、CNSリンパ腫、頭蓋咽頭腫、血管芽細胞腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体腫瘍、下垂体腫瘍、未分化神経外胚葉性腫瘍、ラブドイド腫瘍、神経鞘腫、嚢胞、神経線維腫症、偽脳腫瘍、および結節硬化症からなる群から選択される、請求項１５または１６に記載の組成物。
【請求項１８】
プロドラッグ転換酵素遺伝子を含む発現ベクター、
ＩＬ−８およびＧＲＯ−αからなる群から選択される選択される少なくとも一つに対する遊走性（tropism）を有し、プロドラッグ転換酵素遺伝子をコードする遺伝子を有する発現ベクターでトランスフェクトされる、臍帯血から単離された間葉系幹細胞および／または該間葉系幹細胞から増殖させた間葉系幹細胞、および
抗がん剤のプロドラッグ
を含む、脳腫瘍を治療するためのキット。
【請求項１９】
前記プロドラッグ転換酵素をコードする遺伝子が、シトシンデアミナーゼ遺伝子およびシトクロム P450 ２Ｂ１遺伝子から選択される、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記脳腫瘍が星状細胞腫、毛様細胞性星状細胞腫、低悪性度星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形性膠芽腫、脳幹神経膠腫、上衣細胞腫、上衣下細胞腫、神経節細胞腫、混合性神経膠腫、乏突起細胞腫、視神経膠腫、聴神経腫、脊索腫、CNSリンパ腫、頭蓋咽頭腫、血管芽細胞腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体腫瘍、下垂体腫瘍、未分化神経外胚葉性腫瘍、ラブドイド腫瘍、神経鞘腫、嚢胞、神経線維腫症、偽脳腫瘍、および結節硬化症からなる群から選択される、請求項１８または１９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン−８（ＩＬ−８）またはＧＲＯ−アルファ（ＧＲＯ−α）を発現し、かつ臍帯血（ＵＣＢ：umbilical cord blood）由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ：mesenchymal stem cell）または、臍帯血から単離した間葉系幹細胞、および／または該間葉系幹細胞から増殖させた間葉系幹細胞 (UCB-MSC)の遊走性（tropism）を誘導する細胞に、治療的遺伝子、マーカー遺伝子、あるいはその産物を伝達するための遺伝子治療用の組成物であって、臍帯血由来の間葉系幹細胞(UCB-MSC)を含むものである、遺伝子治療用の組成物に関する。
【０００２】
本発明はまた、臍帯血由来の間葉系幹細胞を含む組成物を利用した遺伝子治療において、ＩＬ−８またはＧＲＯ−αを発現する細胞に関連する疾患、または脳腫瘍を治療することに関する。
【０００３】
本発明はまた、臍帯血由来の間葉系幹細胞を利用した脳腫瘍の診断、予防、治療、または治療経過モニタリングのための組成物またはキットに関する。
【背景技術】
【０００４】
幹細胞は、病変部位に移動するということは知られている。最近、骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭ−ＵＣＢ）が腫瘍に対する遊走性を有しており、腫瘍部位に移動するということが明らかになった。特定腫瘍部位に移動できるこのような骨髄由来の間葉系幹細胞は、遺伝子治療における有用なツールとして使われうる。例えば、腫瘍に対する遊走性を有する骨髄由来の間葉系幹細胞は、治療用自殺遺伝子を腫瘍部位に伝達するためのビヒクルとして使用可能である（Ponte Ａ．Ｌ．ら，Stem Cells，２５，１７３７−１７４５（２００５）（非特許文献１）、Kahler Ｃ．Ｍ．ら，Respir Res ８，５０（２００７）（非特許文献２））。しかし、このような興味深い現象にもかかわらず、間葉系幹細胞が腫瘍に移動する現象を調節する分子メカニズムについては、まだ明確に明らかにされていない。
【０００５】
数年間にわたり、骨髄由来の間葉系幹細胞の移動の誘導がいくつかの可溶性因子によって刺激されているようであるという証拠が出てきている。最近、乳がん細胞から分泌されるＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質−１）が骨髄由来の間葉系幹細胞の移動を刺激するということが示された（Dwyer Ｒ．Ｍ．ら，Clin Cancer Res １３，５０２０−５０２７（２００７）（非特許文献３））。また、ケモカインリガンド２（ＣＣＬ２）およびケモカインリガンド１０（ＣＣＬ−１０）は、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡｏ：middle cerebral artery occlusion）卒中モデルで、神経前駆細胞の損傷した部位への移動を誘導できる（J Neurosci Res ８５，２１２０−２１２５（２００７）（非特許文献４））。インシュリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１：insulin-like growth factor−１）は、ラットＢＭ−ＭＳＣの移動反応を顕著に増大させた（Li Ｙ．ら，Biochem Biophys Res Commun ３５６，７８０−７８４（２００７）（非特許文献５））。従って、間葉系幹細胞の移動事象に影響を与える可溶性因子を確認することは、間葉系幹細胞がどのように腫瘍組織または損傷した組織に移動するかを理解するのに重要である。
【０００６】
骨髄由来の間葉系幹細胞に導入された遺伝子は、インビボで過剰発現され、生理活性を示した。例えば、ヒト・アンジオポエチン−１遺伝子（ｈＡｎｇ１遺伝子）が導入されたＢＭ−ＭＳＣは、急性心筋梗塞モデル動物の梗塞部位で、血管生成を促進させ（Sun Ｌ．ら，Biochemical Biophysical Research Communication ３５７（２００７）７７９−７８４（非特許文献６））、Ａｋｔが過剰発現しているＢＭ−ＭＳＣは、驚くべきことに心筋梗塞を治療し、心臓機能を向上させ（Nicolas Ｎ．ら，Molecular Therapy １４（６），８４０−８５０，２００６（非特許文献７））、Ｂｃｌ−２遺伝子で修飾されたＢＭ−ＭＳＣは、アポトーシスを阻害し、心臓機能を向上させ（Stem Cells ２５，２１１８−２１２７（２００７）（非特許文献８））、内皮型一酸化窒素合成酵素を過剰発現するＢＭ−ＭＳＣは、肺高血圧に起因した右心室の損傷を回復させる（Sachikoら，Circulation，１１４［ｓｕｐｐｌ Ｉ］：Ｉ−１８１〜Ｉ−１８５（非特許文献９））。このような結果は、遺伝子が導入された間葉系幹細胞を遺伝子治療のツールとして使用できるということを示唆する。
【０００７】
一方、脳と脊髄とからなる中枢神経系の細胞は、普通良好に調節される。しかし、この調節が崩れることになれば、細胞は絶えず分裂し、腫瘍を形成することになる。腫瘍は、良性腫瘍と悪性腫瘍に分類されうる。中枢神経系は、神経細胞と、神経細胞を支持して保護するグリア細胞を有している。グリア細胞に生じた腫瘍は、神経膠腫といい、一次性（原発性）脳腫瘍の５０％、一次性脊髄腫瘍の１５％を占める。加えて、脳腫瘍は、神経腫瘍、血管腫瘍、及び腺（gland）腫瘍を含む。脳腫瘍には、身体の他の部位に生じた他の腫瘍によって引き起こされた二次性（続発性）脳腫瘍も含まれ、二次性腫瘍は脳腫瘍の最も一般的な型である。
【０００８】
脳腫瘍は、その位置の特性上、治療が困難である。脳腫瘍は、物理的な手術および化学療法によって治療することができる。物理的手術については、腫瘍部位を完全に摘出することになれば、合併症が生じやすい。化学療法については、血液脳関門のために、高濃度の抗がん剤の投与が必要になり、他の臓器に深刻な損傷を与えることになる。最近、脳腫瘍治療のために、遺伝子治療が使用されている。遺伝子治療において、遺伝子ががん細胞の増殖を抑制するために、ウイルス・ベクターを使用して導入される。ウイルス・ベクターは、目的とするがん部位に選択的に移動する能力がないので、そのような能力を得るために表面が改変される。しかし、十分な量のウイルス・ベクターを標的腫瘍部位に移動させるには限界がある。
【０００９】
幹細胞が病変部位に移動するホーミング現象（homing effect）についての研究結果が明らかにされ、幹細胞が脳腫瘍治療のための伝達媒体として有用に使われる可能性があるということを示しているが、腫瘍への幹細胞の輸送を調節するメカニズムは、明確に知られていない。神経幹細胞が脳腫瘍の一つのタイプ、すなわち、悪性神経膠腫への遊走性があるということが知られている。これを基に、ビヒクルとして機能する神経幹細胞を用いることで、脳腫瘍部位へ遺伝子を伝達する方法に係わる研究が進められている（Yip Ｓら，The Cancer Ｊ ９（３），１８９−２０４，２００３（非特許文献１０）、Kim ＳＫら，Clin Cancer Res １２（１８），５５５０−５５５６，２００６（非特許文献１１））。Yipらは、免疫調節遺伝子、アポトーシス促進遺伝子、プロドラッグ転換酵素、腫瘍崩壊ウイルスなどを担持する神経幹細胞によって、脳腫瘍を治療できることを明らかにした。Brownらは、抗がん剤である５−ＦＵ（５−フルオロウラシル）のプロドラッグである５−ＦＣ（５−フルオロシトシン）を５−ＦＵに転換させることができるシトシンデアミナーゼ遺伝子を含むベクターを脳に注入することによって、効果的に脳腫瘍が治療されることを確認した（Brown Ａ Ｂら，Human Gene Ther．１４（１８），１７７７−１７８５，２００３（非特許文献１２））。Ehteshamらは、インターロイキン−１２または腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドを伝達するように処理された神経幹細胞を注入した結果、脳腫瘍の成長が遅くなったと報告した（Cancer Res ６２，５６５７−５６６３，２００２（非特許文献１３）、Cancer Res ６２，７１７０−７１７４，２００２（非特許文献１４））。しかし、神経幹細胞を臨床実験に使用することは、神経幹細胞をどのように得るかに関する倫理的な問題と、同種移植による免疫拒絶反応とを引き起こす。従って、かような問題点がなく、さらに容易に入手できる他のタイプの幹細胞を見出す必要性がある。
【００１０】
Akiraらは、骨髄由来の間葉系幹細胞が脳腫瘍に対する遊走性があるということを開示した(Akiraら，Cancer Res ６５（８），３３０７−３３１６，２００５（非特許文献１５）)。骨髄由来の間葉系幹細胞は、患者から得ることができる。自家移植を介して投与される場合、免疫拒絶反応は起こらず、臨床での使用において利点を有する。研究において、頭蓋骨内にヒト神経膠腫細胞株を移植したヌードマウスに、ヒトＢＭ−ＭＳＣを頚動脈を介して注入した結果、ヒトＢＭ−ＭＳＣは、神経膠腫でのみ発見され、神経膠腫付近の正常な脳の部分では、観察されなかった。加えて、ヒトＢＭ−ＭＳＣが頭蓋骨内に移植された場合にも、ヒトＢＭ−ＭＳＣは神経膠腫に向かって移動した。前記ヒトＢＭ−ＭＳＣをＩＦＮ−β遺伝子のｃＤＮＡを含有するアデノウイルス・ベクターに感染させた後、生じたベクターを神経膠腫が移植されたヌードマウスの頭蓋骨内に頚動脈を介して注入した場合、前記ヌードマウスの生存期間を延長させた。国際特許ＷＯ０７／０３７６５３Ａ１号パンフレット（特許文献１）は、シトシンデアミナーゼ遺伝子を発現するＢＭ−ＭＳＣを含むがん治療用の組成物について記載している。しかし、この場合、ＢＭ−ＭＳＣは、多くの複雑な過程を通じて採取されるために、採取対象者は、長期間精神的および肉体的ストレスをこうむることになる。従って、他のタイプの幹細胞を見出す必要性がある。
【００１１】
骨髄とは異なり、多量の間葉系幹細胞が存在する臍帯血は、分娩過程で捨てられる臍帯から容易に採集される。また、臍帯血の保管産業は十分確立されており、供与者を容易に見つけることが可能である。他家由来の臍帯血(other human-induced UCB)から得た間葉系幹細胞が使用される場合にも、移植後に免疫拒絶反応は起こらない。そのため、高い免疫学的安定性が得られる。従って、臍帯血由来の間葉系幹細胞の遊走性に基づいて、脳腫瘍のような疾患が治療されうるか否かを確認することが非常に重要である。しかし、臍帯血由来の間葉系幹細胞の利用性を確認するためのかような試みはまだなされていない。本発明の明細書に引用される全ての先行文献は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。また、本明細書に記載されたあらゆる情報は、単に、本発明の技術的背景に係わる理解の一助とするために使用されたものであり、先行技術になりえない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際特許ＷＯ０７／０３７６５３Ａ１号パンフレット
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ponte Ａ．Ｌ．ら，Stem Cells，２５，１７３７−１７４５（２００５）
【非特許文献２】Kahler Ｃ．Ｍ．ら，Respir Res ８，５０（２００７）
【非特許文献３】Dwyer Ｒ．Ｍ．ら，Clin Cancer Res １３，５０２０−５０２７（２００７）
【非特許文献４】J Neurosci Res ８５，２１２０−２１２５（２００７）
【非特許文献５】Li Ｙ．ら，Biochem Biophys Res Commun ３５６，７８０−７８４（２００７）
【非特許文献６】Sun Ｌ．ら，Biochemical Biophysical Research Communication ３５７（２００７）７７９−７８４
【非特許文献７】Nicolas Ｎ．ら，Molecular Therapy １４（６），８４０−８５０，２００６
【非特許文献８】Stem Cells ２５，２１１８−２１２７（２００７）
【非特許文献９】Sachikoら，Circulation，１１４［ｓｕｐｐｌ Ｉ］：Ｉ−１８１〜Ｉ−１８５
【非特許文献１０】Yip Ｓら，The Cancer Ｊ ９（３），１８９−２０４，２００３
【非特許文献１１】Kim ＳＫら，Clin Cancer Res １２（１８），５５５０−５５５６，２００６
【非特許文献１２】Brown Ａ Ｂら，Human Gene Ther．１４（１８），１７７７−１７８５，２００３
【非特許文献１３】Cancer Res ６２，５６５７−５６６３，２００２
【非特許文献１４】Cancer Res ６２，７１７０−７１７４，２００２
【非特許文献１５】Akiraら，Cancer Res ６５（８），３３０７−３３１６，２００５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
最近開発された標的遺伝子治療は、間葉系幹細胞の特異的移動性を利用し、この治療では、治療用遺伝子がＭＳＣに導入され、生じたＭＳＣが疾患部位に移動し、疾患が治療される。間葉系幹細胞の遊走性を利用した遺伝子治療の開発のためには、間葉系幹細胞の腫瘍への移動を調節する分子メカニズムが、完全に理解されねばならない。しかし、分子メカニズムは、まだ特定されていない。よって、本発明の概念は、臍帯血由来の間葉系幹細胞が腫瘍細胞に移動する分子メカニズムを明らかにし、これを遺伝子治療に活用することである。
【００１５】
脳腫瘍治療を、神経幹細胞または骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）によって治療できるか否かに係わる研究が進められているが、神経幹細胞およびＢＭ−ＭＳＣの採取は、倫理的な問題や免疫拒絶反応、採取対象の物理的及び精神的ストレスを引き起こす。従って、本発明の概念は、かような問題点なしに入手でき、脳腫瘍に対しより良い遊走性を有する幹細胞も提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の発明者らは、前記課題を解決するために研究し、臍帯血から単離した間葉系幹細胞及び／または該間葉系幹細胞から増殖された間葉系幹細胞（ＵＣＢ−ＭＳＣ）が脳腫瘍細胞への遊走性を有し、骨髄から単離した間葉系幹細胞及び／または該間葉系幹細胞から増殖された間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）よりも大きい移動能を有するということを見出した。本発明者らは、ＵＣＢ−ＭＳＣを利用した、脳腫瘍治療のための治療的適用を提供した。
【００１７】
また本発明の発明者らは、前記ＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性がインターロイキン−８（ＩＬ−８）またはＧＲＯ−αの影響を受けるということを見出した。この知見を基に、本発明者らは、ＩＬ−８またはＧＲＯ−αを発現し、ＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性を誘導する細胞に、治療的遺伝子またはその産物を伝達する方法およびその治療的適用を提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明による組成物に含まれたＵＣＢ−ＭＳＣは、ＩＬ−８またはＧＲＯ−αを発現する細胞に対して選択的遊走性を有しており、それによってＵＣＢ−ＭＳＣまたは脳腫瘍細胞の遊走性を誘導する。前記ＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性能は、他の幹細胞の遊走性能よりもすぐれており、従って、従来の他の幹細胞が使用される場合に比べて、治療的遺伝子またはその産物がさらに効果的に伝達されうる。よって、本発明のＵＣＢ−ＭＳＣを含む薬学的組成物またはキットは、ＩＬ−８またはＧＲＯ−αを発現する細胞に関連する疾患または脳腫瘍の診断、予防及び治療するのに用いられうる。
[本発明101]
臍帯血から単離された間葉系幹細胞および/または該間葉系幹細胞から増殖させた間葉系幹細胞を含む、脳腫瘍の予防または治療用の薬学的組成物。
[本発明102]
臍帯血から単離された間葉系幹細胞および/または該間葉系幹細胞から増殖させた間葉系幹細胞が、脳腫瘍を治療するための遺伝子治療用のキャリアとして機能する、本発明101の薬学的組成物。
[本発明103]
抗腫瘍遺伝子が、臍帯血から単離された間葉系幹細胞および/または該間葉系幹細胞から増殖させた間葉系幹細胞に導入された、本発明101の薬学的組成物。
[本発明104]
抗腫瘍遺伝子が、腫瘍抑制遺伝子、アポトーシス誘導因子遺伝子、細胞周期調節遺伝子および血管新生抑制遺伝子からなる群から選択される、本発明103の薬学的組成物。
[本発明105]
腫瘍抑制遺伝子が、ホスファターゼおよびテンシンホモログ(PTEN)の遺伝子、Maspinの遺伝子、RUNX3の遺伝子、Caveolin-1の遺伝子、nm23の遺伝子、Rbタンパク質の遺伝子、Brush-1の遺伝子、腫瘍増殖の阻害因子(ING-4)の遺伝子、survivinの遺伝子、X染色体連鎖性アポトーシス阻害タンパク質 (XIAP)の遺伝子、神経アポトーシス阻害タンパク質(NAIP)の遺伝子、およびそれらの遺伝子の調節と関連するタンパク質の遺伝子からなる群から選択される、本発明104の薬学的組成物。
[本発明106]
アポトーシス誘導因子遺伝子が、サイトカインの遺伝子、インターロイキンの遺伝子、腫瘍壊死因子(TNF)の遺伝子、インターフェロン(INF-α、INF-β、INF-γ)の遺伝子、コロニー刺激因子(CSF)の遺伝子、p53の遺伝子、Apaf-1の遺伝子、TRAILの遺伝子、カスパーゼの遺伝子、Baxの遺伝子、Badの遺伝子、FADDの遺伝子、JNKの遺伝子、p38キナーゼの遺伝子、およびそれらの遺伝子の調節と関連するタンパク質の遺伝子からなる群から選択される、本発明104の薬学的組成物。
[本発明107]
細胞周期調節遺伝子が、cdc2の遺伝子、サイクリン(サイクリンA、サイクリンD、サイクリンE)の遺伝子、cdc25Cの遺伝子、p21WAFの遺伝子、p16INK4の遺伝子、CDK(CDK1、CDK2、CDK4、CDK6)の遺伝子、Rbタンパク質の遺伝子、E2Fの遺伝子、それらのアンチセンスまたはSiRNAおよびそれらの遺伝子の調節と関連するタンパク質の遺伝子からなる群から選択される、本発明104の薬学的組成物。
[本発明108]
血管新生抑制遺伝子が、トロンボスポンジン-1の遺伝子、エンドスタチンの遺伝子、タムスタチンの遺伝子、カンスタチン(canstatin)の遺伝子、バスタチン(vastatin)の遺伝子、レスチン(restin)の遺伝子、血管内皮増殖抑制因子の遺伝子、マスピン(maspin)の遺伝子、アンジオポエチンの遺伝子、プロラクチンの16-kd断片の遺伝子、およびエンドレペリン(endorepellin)の遺伝子からなる群から選択される、本発明104の薬学的組成物。
[本発明109]
プロドラッグ転換酵素遺伝子が、臍帯血から単離された間葉系幹細胞および/または該間葉系幹細胞から増殖させた間葉系幹細胞に導入された、本発明101の薬学的組成物。
[本発明110]
前記プロドラッグ転換酵素遺伝子が、シトシンデアミナーゼ遺伝子およびCYP2B1遺伝子から選択される、本発明109の薬学的組成物。
[本発明111]
脳腫瘍と関連する遺伝子のアンチセンスまたはSiRNAが、臍帯血から単離された間葉系幹細胞および/または該間葉系幹細胞から増殖させた間葉系幹細胞に導入された、本発明101の薬学的組成物。
[本発明112]
脳腫瘍と関連する遺伝子が、Rasファミリーの遺伝子、c-mycの遺伝子、ablの遺伝子、erbB-1の遺伝子、EGF-Rの遺伝子、Baxの遺伝子、Apaf-1相互作用タンパク質(APIP)の遺伝子、Wnt-1誘導性分泌タンパク質1(WISP-1)の遺伝子、Wntの遺伝子、Raf-1の遺伝子、Srcの遺伝子、Aktの遺伝子、Erk-1、2の遺伝子、およびBcL-2の遺伝子からなる群から選択される、本発明111の薬学的組成物。
[本発明113]
腫瘍崩壊ウイルスが、臍帯血から単離された間葉系幹細胞および/または該間葉系幹細胞から増殖させた間葉系幹細胞に導入された、本発明101の薬学的組成物。
[本発明114]
腫瘍崩壊ウイルスが、単純ヘルペスウイルスおよびレオウイルス3型から選択される、本発明113の薬学的組成物。
[本発明115]
前記脳腫瘍が、星状細胞腫、毛様細胞性星状細胞腫、低悪性度星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形性膠芽腫、脳幹神経膠腫、上衣細胞腫、上衣下細胞腫、神経節細胞腫、混合性神経膠腫、乏突起細胞腫、視神経膠腫、聴神経腫、脊索腫、CNSリンパ腫、頭蓋咽頭腫、血管芽細胞腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体腫瘍、下垂体腫瘍、未分化神経外胚葉性腫瘍、ラブドイド腫瘍、神経鞘腫、嚢胞、神経線維腫症、偽脳腫瘍、および結節硬化症からなる群から選択される、本発明101〜本発明114のいずれかの薬学的組成物。
[本発明116]
臍帯血から単離された間葉系幹細胞および/または該間葉系幹細胞から増殖させた間葉系幹細胞を含む、脳腫瘍を診断するまたは脳腫瘍の治療経過をモニタリングするための組成物。
[本発明117]
前記臍帯血から単離された間葉系幹細胞および/または該間葉系幹細胞から増殖させた間葉系幹細胞が、検出可能なマーカーで標識される、本発明116の組成物。
[本発明118]
前記検出可能なマーカーがルシフェラーゼを含む酵素に基づく蛍光検出剤およびTatペプチド誘導体化磁性ナノ粒子から選択される、本発明117の組成物。
[本発明119]
前記脳腫瘍が星状細胞腫、毛様細胞性星状細胞腫、低悪性度星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形性膠芽腫、脳幹神経膠腫、上衣細胞腫、上衣下細胞腫、神経節細胞腫、混合性神経膠腫、乏突起細胞腫、視神経膠腫、聴神経腫、脊索腫、CNSリンパ腫、頭蓋咽頭腫、血管芽細胞腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体腫瘍、下垂体腫瘍、未分化神経外胚葉性腫瘍、ラブドイド腫瘍、神経鞘腫、嚢胞、神経線維腫症、偽脳腫瘍、および結節硬化症からなる群から選択される、本発明116〜本発明118のいずれかの組成物。
[本発明120]
プロドラッグ転換酵素遺伝子を含む発現ベクター、臍帯血由来の間葉系幹細胞、および抗がん剤のプロドラッグを含む、脳腫瘍を治療するためのキット。
[本発明121]
前記プロドラッグ転換酵素遺伝子が、シトシンデアミナーゼ遺伝子およびCYP2B1遺伝子から選択される、本発明120のキット。
[本発明122]
臍帯血から単離された間葉系幹細胞および/または該間葉系幹細胞から増殖させた間葉系幹細胞が、プロドラッグ転換酵素遺伝子を有する発現ベクターでトランスフェクトされる、本発明121のキット。
[本発明123]
前記脳腫瘍が星状細胞腫、毛様細胞性星状細胞腫、低悪性度星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形性膠芽腫、脳幹神経膠腫、上衣細胞腫、上衣下細胞腫、神経節細胞腫、混合性神経膠腫、乏突起細胞腫、視神経膠腫、聴神経腫、脊索腫、CNSリンパ腫、頭蓋咽頭腫、血管芽細胞腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体腫瘍、下垂体腫瘍、未分化神経外胚葉性腫瘍、ラブドイド腫瘍、神経鞘腫、嚢胞、神経線維腫症、偽脳腫瘍、および結節硬化症からなる群から選択される、本発明120〜本発明122のいずれかのキット。
[本発明124]
細胞に治療的遺伝子またはその産物を伝達する遺伝子治療用の組成物であって、該遺伝子治療用の組成物が、臍帯血から単離された間葉系幹細胞および/または該間葉系幹細胞から増殖させた間葉系幹細胞を含み、細胞が、IL-8またはGRO-αを発現し、かつ臍帯血から単離された間葉系幹細胞および/または該間葉系幹細胞から増殖させた間葉系幹細胞の遊走性(tropism)を誘導する、遺伝子治療用の組成物。
[本発明125]
臍帯血から単離された間葉系幹細胞および/または該間葉系幹細胞が遺伝子治療のためのキャリアとして機能する、本発明124の遺伝子治療用の組成物。
[本発明126]
抗腫瘍遺伝子が、臍帯血から単離された間葉系幹細胞および/または該間葉系幹細胞から増殖させた間葉系幹細胞に導入された、本発明124の遺伝子治療用の組成物。
[本発明127]
抗腫瘍遺伝子が、腫瘍抑制遺伝子、アポトーシス誘導因子遺伝子、細胞周期調節遺伝子および血管新生抑制遺伝子からなる群から選択される、本発明126の遺伝子治療用の組成物。
[本発明128]
腫瘍抑制遺伝子が、ホスファターゼおよびテンシンホモログ(PTEN)の遺伝子、Maspinの遺伝子、RUNX3の遺伝子、Caveolin-1の遺伝子、nm23の遺伝子、Rbタンパク質の遺伝子、Brush-1の遺伝子、腫瘍増殖の阻害因子(ING-4)の遺伝子、Survivinの遺伝子、X染色体連鎖性アポトーシス阻害タンパク質 (XIAP)の遺伝子、神経アポトーシス阻害タンパク質(NAIP)の遺伝子、およびそれらの遺伝子の調節と関連するタンパク質の遺伝子からなる群から選択される、本発明127の遺伝子治療用の組成物。
[本発明129]
アポトーシス誘導因子遺伝子が、サイトカインの遺伝子、インターロイキンの遺伝子、腫瘍壊死因子(TNF)の遺伝子、インターフェロン(INF-α、INF-β、INF-γ)の遺伝子、コロニー刺激因子(CSF)の遺伝子、p53の遺伝子、Apaf-1の遺伝子、TRAILの遺伝子、カスパーゼの遺伝子、Baxの遺伝子、Badの遺伝子、FADDの遺伝子、JNKの遺伝子、p38キナーゼの遺伝子、およびそれらの遺伝子の調節と関連するタンパク質の遺伝子からなる群から選択される、本発明127の遺伝子治療用の組成物。
[本発明130]
細胞周期調節遺伝子が、cdc2の遺伝子、サイクリン(サイクリンA、サイクリンD、サイクリンE)の遺伝子、cdc25Cの遺伝子、p21WAFの遺伝子、p16INK4の遺伝子、CDK(CDK1、CDK2、CDK4、CDK6)の遺伝子、Rbタンパク質の遺伝子、E2Fの遺伝子、それらのアンチセンスまたはSiRNA、およびそれらの遺伝子の調節と関連するタンパク質の遺伝子からなる群から選択される、本発明127の遺伝子治療用の組成物。
[本発明131]
血管新生抑制遺伝子が、トロンボスポンジン-1の遺伝子、エンドスタチンの遺伝子、タムスタチンの遺伝子、カンスタチン(canstatin)の遺伝子、バスタチン(vastatin)の遺伝子、レスチン(restin)の遺伝子、血管内皮増殖抑制因子の遺伝子、マスピン(maspin)の遺伝子、アンジオポエチンの遺伝子、プロラクチンの16-kd断片の遺伝子、およびエンドレペリン(endorepellin)の遺伝子からなる群から選択される、本発明127の遺伝子治療用の組成物。
[本発明132]
プロドラッグ転換酵素遺伝子が、臍帯血から単離された間葉系幹細胞および/または該間葉系幹細胞から増殖させた間葉系幹細胞に導入された、本発明124の遺伝子治療用の組成物。
[本発明133]
前記プロドラッグ転換酵素遺伝子が、シトシンデアミナーゼ遺伝子およびCYP2B1遺伝子からなる群から選択される、本発明132の遺伝子治療用の組成物。
[本発明134]
腫瘍と関連する遺伝子のアンチセンスまたはSiRNAが、臍帯血から単離された間葉系幹細胞および/または該間葉系幹細胞から増殖させた間葉系幹細胞に導入された、本発明124の遺伝子治療用の組成物。
[本発明135]
腫瘍と関連する遺伝子が、Rasファミリーの遺伝子、c-mycの遺伝子、ablの遺伝子、erbB-1の遺伝子、EGF-Rの遺伝子、Baxの遺伝子、Apaf-1相互作用タンパク質(APIP)の遺伝子、Wnt-1誘導性分泌タンパク質1(WISP-1)の遺伝子、Wntの遺伝子、Raf-1の遺伝子、Srcの遺伝子、Aktの遺伝子、Erk-1、2の遺伝子、およびBcL-2の遺伝子からなる群から選択される、本発明134の遺伝子治療用の組成物。
[本発明136]
腫瘍崩壊ウイルスが、臍帯血から単離された間葉系幹細胞および/または該間葉系幹細胞から増殖させた間葉系幹細胞に導入された、本発明124の遺伝子治療用の組成物。
[本発明137]
腫瘍崩壊ウイルスが、単純ヘルペスウイルスおよびレオウイルス3型からなる群から選択される、本発明136の遺伝子治療用の組成物。
[本発明138]
細胞を含む部位に発生した疾患を診断するための、または疾患の治療経過をモニタリングするための組成物であって、該組成物が、臍帯血から単離された間葉系幹細胞および/または該間葉系幹細胞から増殖させた間葉系幹細胞を含み、細胞が、IL-8またはGRO-αを発現し、かつ臍帯血から単離された間葉系幹細胞および/または該間葉系幹細胞から増殖させた間葉系幹細胞の遊走性を誘導する、組成物。
[本発明139]
前記臍帯血から単離された間葉系幹細胞および/または該間葉系幹細胞から増殖させた間葉系幹細胞が、検出可能なマーカーで標識される、本発明138の組成物。
[本発明140]
前記検出可能なマーカーが、ルシフェラーゼを含む酵素に基づく蛍光検出剤およびTatペプチド誘導体化磁性ナノ粒子からなる群から選択される、本発明139の組成物。
[本発明141]
前記IL-8またはGRO-αを発現する細胞が、脳腫瘍細胞、肝臓がん細胞、結腸がん細胞およびB細胞新生物細胞、例えば一般的なB急性リンパ性白血病細胞、前駆B急性リンパ性白血病細胞、B細胞慢性リンパ性白血病細胞、マントル細胞リンパ腫細胞、バーキットリンパ腫細胞および濾胞性リンパ腫細胞からなる群から選択される、本発明124〜本発明137のいずれかの遺伝子治療用の組成物。
[本発明142]
前記IL-8またはGRO-αを発現する細胞が、脳腫瘍細胞、肝臓がん細胞、結腸がん細胞およびB細胞新生物細胞、例えば一般的なB急性リンパ性白血病細胞、前駆B急性リンパ性白血病細胞、B細胞慢性リンパ性白血病細胞、マントル細胞リンパ腫細胞、バーキットリンパ腫細胞および濾胞性リンパ腫細胞からなる群から選択される、本発明138〜本発明140のいずれかの組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】間葉系幹細胞（MSC）の収集過程を図式化した図面である。
【図２】本発明の臍帯血由来の間葉系幹細胞（ＵＣＢ−ＭＳＣ）と各種細胞株との共培養に使うトランスウェル・チャンバの模式図である。
【図３】トランスウェル・チャンバの上の区画に置いた、ＰＫＨで標識したＵＣＢ−ＭＳＣ、および、トランスウェル・チャンバの下の区画に置いたＵ８７−ＭＧ、ＬＳ１７４−Ｔ、ＮＣ−３７、およびＮＩＨ３Ｔ３細胞のそれぞれを共培養した場合に、トランスウェル・チャンバの下の区画に移動したUCB-MSCの数のグラフである。（Ａ）では、左側バーは、トランスウェル・チャンバ下の区画の細胞株の数が１×１０５細胞である場合を示し、右側バーは、トランスウェル・チャンバの下の区画の細胞株の数が５×１０５細胞である場合を示し、両方の場合でUCB-MSCの数は、１×１０５である。（Ｂ）では、左の蛍光顕微鏡イメージは、ヒト細胞株がない培地のみ使用した場合（対照）のトランスウェル・チャンバの下の区画に移動したＰＫＨ２６で標識したUCB-MSCを示し、右の蛍光顕微鏡イメージは、ＵＣＢ−ＭＳＣをＵ８７−ＭＧ細胞と共培養した場合の、トランスウェル・チャンバの下の区画に移動したＰＫＨ２６で標識したUCB-MSCを示す。
【図４】トランスウェル・チャンバの上の区画に置いた、ＰＫＨで標識したＵＣＢ−ＭＳＣ、および、トランスウェル・チャンバの下の区画に置いたＵ８７−ＭＧ、ＫＡＴＯ ＩＩＩ、Ａ５４９、ＰＬＣ／ＰＲＦ５、ＬＮ１８、Ｕ１３８、及びＵ２５１細胞のそれぞれを共培養した場合に、トランスウェルチャンバの下の区画に移動したＵＣＢ−ＭＳＣの数のグラフである（ＡおよびＣ）。（Ｂ）は、下の区画に移動した、ＰＫＨ２６で標識したＵＣＢ−ＭＳＣの蛍光顕微鏡イメージであり、（Ｄ）は、UCB-MSCを、Ｕ−８７ ＭＧ細胞と、またはＵ８７ ＭＧ細胞を含まない、Ｕ８７ ＭＧ細胞を培地中で培養しこの培地からＵ８７ ＭＧ細胞を除去して調製する馴化培地(cultured-conditioned media)と、共培養した場合に移動したＵＣＢ-ＭＳＣの数のグラフである。
【図５】ＢＭ−ＭＳＣおよびＵＣＢ−ＭＳＣの、Ｕ-８７ ＭＧ細胞への遊走性を比較したグラフであり、トランスウェル・チャンバの上の区画に置いた、ＰＫＨで標識したＵＣＢ−ＭＳＣおよびＰＫＨで標識したＢＭ−ＭＳＣのそれぞれ、ならびに、トランスウェル・チャンバの下の区画に置いたＵ-８７ ＭＧ細胞を共培養し、下の区画に移動した、ＰＫＨで標識したＵＣＢ−ＭＳＣの数を、ＰＫＨで標識したＢＭ−ＭＳＣの数と比較した。ここで、左側バーは、Ｕ-８７ ＭＧ細胞が存在しない場合を示し、右側バーは、Ｕ-８７ ＭＧ細胞が存在する場合（Ｕ-８７ ＭＧ細胞の数は５×１０５）を示し、いずれの場合にも、ＭＣＳの数は１×１０５である。
【図６】ＵＣＢ−ＭＳＣをがん細胞株（Ａ５４９細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＵ-８７ ＭＧ細胞）と共培養した場合の、ＵＣＢ−ＭＳＣの走化性インデックスのグラフである。
【図７】NC37細胞、LS174-T細胞、及びＵ-８７ ＭＧ細胞のそれぞれをＵＣＢ−ＭＳＣと共培養した後、細胞溶解物および細胞培養の上清をサイトカインアレイを介して分析して得られた結果を示す。
【図８】ＵＣＢ−ＭＳＣを単独で培養、Ｕ−８７ ＭＧ細胞を単独で培養、ならびにＵＣＢ−ＭＳＣおよびＵ−８７ ＭＧ細胞の両方を共培養したものから馴化培地を収集し、前記馴化培地をアレイ膜上で培養し、その後ＥＣＬ試薬を用いてインキュベートして視覚化することによって得られた分析結果を示す。（Ａ）は、ＵＣＢ−ＭＳＣを用いた馴化培地、および培地対照からの、サイトカイン抗体アレイの分析結果を示す。（Ｂ）は、Ｕ−８７ ＭＧのみを培養した馴化培地を使用した場合、ならびにＵＣＢ−ＭＳＣおよびＵ−８７ ＭＧを共培養した培地を使用した場合の、分析結果を示す。（Ｃ）は、Ｕ−８７ ＭＧ細胞またはＵＣＢ−ＭＳＣ細胞が、存在するとき、または存在しないときに培養したＵＣＢ−ＭＳＣ（左側）、および、またはＵＣＢ−ＭＳＣが存在するとき、または存在しないときに培養したＵ−８７ ＭＧ細胞から得られた、ｍＲＮＡを分離した結果を示す。ここで、ＩＬ−８特異的プライマーを使用してＲP−ＰＣＴを遂行し、ＧＡＰＤＨを対照群として使用した。
【図９】図８で分析されたサイトカインのうち、ＩＬ−８およびＧＲＯ−αがＭＳＣの移動に及ぼす影響を確認したグラフである。（Ａ）は、ＭＣＳを、０，１，１０，および１００ｎｇの組換えＩＬ−８タンパク質で２４時間処理した場合の、下の区画への細胞移動のグラフである。（Ｂ）は、細胞におけるＩＬ−８の受容体として公知のＣＸＣケモカイン受容体１（ＣＸＣＲ１）の抗体０．０２，０．２，及び２μｇで、ＵＣＢ−ＭＳＣを前処理し、その後５０ｎｇのＩＬ−８で処理して、ＭＳＣの移動を促進した場合の、下の区画への細胞移動のグラフである（＊,ｐ＝０．００７；＊＊,ｐ＜０．００１）。（Ｃ）は、ＵＣＢ−ＭＳＣをＧＲＯ−αで処理した場合の、下の区画への細胞移動のグラフである（＊,ｐ＜０．００５）。（Ｄ）は、ＭＳＣを単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）で処理した場合の、細胞移動のグラフである。
【図１０】（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）からなる。（Ａ）および（Ｂ）は、Ｕ−８７ ＭＧ、ＫＡＴＯ ＩＩＩ、Ａ５４９、ＰＬＣ／ＰＲＦ５、ＬＮ１８、Ｕ１３８、およびＵ２５１細胞と培養した培地中に分泌されたＩＬ−８の量をＥＬＩＳＡで測定したグラフである。（Ｃ）は、ＩＬ−８の分泌量が低いＡ５４９細胞に、ＩＬ−８遺伝子を導入させて過剰発現させた場合の、細胞移動のグラフである。（Ｄ）は、（Ｃ）の条件で培地中に分泌されたＩＬ−８の量をＥＬＩＳＡで測定したグラフである。
【図１１】ＵＣＢ−ＭＳＣおよびＢＭ−ＭＳＣの、Ｕ−８７ ＭＧ細胞への遊走性を比較したグラフである。（Ａ）は、Ｕ-８７ ＭＧ細胞に対して、下の区画へ動いたＵＣＢ−ＭＳＣおよびＢＭ−ＭＳＣの遊走性を比較したグラフである。（Ｂ）は、ＵＣＢ−ＭＳＣおよびＢＭ−ＭＳＣをＩＬ−８で１４時間処理した場合の、ＵＣＢ−ＭＳＣおよびＢＭ−ＭＳＣの遊走性を比較したグラフである。
【図１２】ＩＬ−８受容体として公知の、ＣＸＣケモカイン受容体１およびＣＸＣケモカイン受容体２（ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２）の、ＵＣＢ−ＭＳＣおよびＢＭ−ＭＳＣにおける発現レベルを、ｍＲＮＡおよびタンパク質を測定して比較した分析結果を示す。（Ａ）は、ＵＣＢ−ＭＳＣおよびＢＭ−ＭＳＣのそれぞれからｍＲＮＡを分離し、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２プライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲを行った場合の分析結果を示す。ここで、分離されたＲＮＡは、各試料に反応したＧＡＰＤＨを参照して定量した。（Ｂ）は、（Ａ）で収集した各ゲルのｍＲＮＡのバンド強度を濃度計で測定して得られたCXCR1およびCXCR2の発現レベルのグラフである（＊および＊＊,ｐ＜０．００１；ｎ＝４）。（Ｃ）は、ＵＣＢ−ＭＳＣおよびＢＭ−ＭＳＣにおけるＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２のタンパク質の発現レベルを、抗ＣＸＣＲ１抗体および抗ＣＸＲ２抗体（×４００）を利用し、免疫染色法を行った分析結果を示す。（Ｄ）は、抗ＣＸＣＲ１抗体および抗ＣＸＣＲ２抗体の抗原特異性を確認するために、ＵＣＢ−ＭＳＣおよびＢＭ−ＭＳＣを、抗ＣＸＣＲ１抗体および抗ＣＲＣＸ２抗体の代わりに、二次抗体のみで免疫染色することによって得られた分析結果を示す。
【図１３】ＵＣＢ−ＭＳＣに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子を導入して過剰発現させた、ＵＣＢ−ＭＳＣの蛍光顕微鏡イメージである。
【図１４】ＧＦＰをコードする遺伝子および空の遺伝子のそれぞれを、ＵＣＢ−ＭＳＣにおいて過剰発現させた実験の結果を示す。該ＵＣＢ−ＭＳＣをトランスウェルの上の区画に置き、Ｕ-８７ ＭＧ細胞をトランスウェルの下の区画に置いて２４時間共培養し、その後、下の区画に移動したＵＣＢ−ＭＳＣを確認する。
【図１５】本発明の実施例において使われたプライマー配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の発明者らは、腫瘍に対する効果的な遊走性を有する幹細胞を見つけるための研究を行った結果、驚くべきことに、臍帯血由来の間葉系幹細胞（ＵＣＢ−ＭＳＣ）が、脳腫瘍に対する強い遊走性を有し、特に、骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）よりも脳腫瘍に対する遊走性がより大きいということを初めて見出した。また、本発明の発明者らは、ＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性には、インターロイキン−８（ＩＬ−８）またはＧＲＯ−αが関与するということを見出した。
【００２１】
本発明の発明者らは、ＵＣＢ−ＭＳＣと代表的な腫瘍細胞株とを共培養し、ＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性の特性を同定し、またこれらのヒト腫瘍細胞株に関連するサイトカインを同定した。特に、トランスウェル・チャンバを利用してＵＣＢ−ＭＳＣと、Ｕ−８７ ＭＧ、ＬＮ１８、Ｕ１３８、またはＵ２５１などのヒト脳腫瘍細胞株；ＬＳ−１７４Ｔなどのヒト直腸がん細胞株；ＮＣ３７などのヒトＢリンパ球；マウスの線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）；ＫＡＴＯ ＩＩＩなどの胃がん細胞株；Ａ５４９などの肺がん細胞株；およびＰＬＣ／ＰＲＦ５などの肝臓がん細胞株を共培養し、ＵＣＢ−ＭＳＣの移動性を測定した結果、UCB-MSCが、脳腫瘍細胞であるＵ−８７ ＭＧ、ＬＮ１８、Ｕ１３８、Ｕ２５１に対して強力な遊走性を有するということが見出された（図３および図４）。ＵＣＢ−ＭＳＣは、Ｕ−８７ ＭＧ細胞を含まない、Ｕ−８７ ＭＧを培養して得た馴化培地に対しても、遊走性を示した（図４）。
【００２２】
また、ＵＣＢ−ＭＳＣの脳腫瘍細胞株に対する遊走性を、現在幹細胞の供給源として使用されているＢＭ−ＭＳＣと比較分析した結果、脳腫瘍細胞株に対して、ＵＣＢ−ＭＳＣがＢＭ−ＭＳＣよりも強い遊走性を有することが見出された（図５）。また、ＵＣＢ−ＭＳＣの走化性インデックスは、各種がん細胞株のうちで脳腫瘍細胞株で最も高かった（図６）。ＢＭ−ＭＳＣよりＵＣＢ−ＭＳＣがより容易に入手でき、より高い免疫安定性を有するという事実に加えて、脳腫瘍細胞株に対するこのような高い走化性インデックスは、ＵＣＢ−ＭＳＣのさらなる長所であり、ＵＣＢ−ＭＳＣが、脳腫瘍内部または脳腫瘍付近に治療遺伝子を効果的に伝達するために、脳腫瘍の遺伝子治療に極めて適した媒体であることを立証するものである。
【００２３】
前記トランスウェル・チャンバ内でのＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性は、２種類の細胞の共培養において分泌が誘導されるサイトカインによって誘導されうる。従って、トランスウェル・チャンバ中で２種類の細胞を共培養して培地を調製し、続いてサイトカインアレイを利用してその培地を分析した。その結果、ＵＣＢ−ＭＳＣとＵ８７ ＭＧとを共培養した培地で、ＩＬ−８またはＧＲＯ−αのようなサイトカインが高レベルで分泌されるということが確認された（図７）。従って、これらのサイトカインが、ＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性を誘導した可能性が高い。
【００２４】
本発明の発明者らは、ＵＣＢ−ＭＳＣ単独培養、Ｕ−８７ ＭＧ細胞単独培養、前記ＵＣＢ−ＭＳＣとＵ−８７ ＭＧの共培養後、これらの細胞のＩＬ−８ ｍＲＮＡレベルをＲＴ−ＰＣＲで分析した。その結果、ＵＣＢ−ＭＳＣは、Ｕ−８７ ＭＧ細胞が存在しても存在しなくても、ＩＬ−８を発現しなかったが、Ｕ−８７ ＭＧは、 ＵＣＢ−ＭＳＣが存在しても存在しなくてもＩＬ−８を構成的に発現した（図８）。ＵＣＢ−ＭＳＣをＩＬ−８で処理すると、処理していない場合と比較し、移動が顕著に多くなった（図９Ａ）。しかし、ＵＣＢ−ＭＳＣをＩＬ−８受容体に対する抗体である抗ＣＸＣＲ１抗体とプレインキュベートした後、組換えＩＬ−８をＵＣＢ−ＭＳＣに適用したところ、ＩＬ−８によるＵＣＢ−ＭＳＣの移動が抗ＣＸＣＲ１抗体により用量依存的に減少した（図９Ｂ）。抗ＣＸＣＲ２処理もまた、同じ効果を示した。ＧＲＯ−α処理もまた、処理していないＵＣＢ−ＭＳＣと比較して、ＵＣＢ−ＭＳＣの移動を増加させた（図９Ｃ）。一方、ＭＣＰ−１で処理された培養物では、ＵＣＢ−ＭＳＣの移動において、有意な差を観察できなかった（図９Ｄ）。このデータは、ＵＣＢ−ＭＳＣのＵ−８７ ＭＧ細胞への移動に、ＩＬ−８およびＧＲＯ−αが関与するということを示している。
【００２５】
各がん細胞から分泌されたＩＬ−８の濃度とＵＣＢ−ＭＳＣの移動性との相関関係を測定した結果、ＵＣＢ−ＭＳＣを最も多く移動させたＵ−８７ ＭＧが、ＩＬ−８を最も多く生産した（図１０Ａ）。本発明者はまた、多様な神経膠腫細胞でIL-8分泌レベルを測定した。ＵＣＢ−ＭＳＣ移動性の標的細胞であった試験されたあらゆる神経膠腫細胞株はまた、高いIL-8分泌レベルを示した(図１０Ｂ)。このデータは、ＵＣＢ−ＭＳＣがＩＬ−８を分泌する細胞に対して強い移動誘引力を有するということを示している。これを確認するために、ＩＬ−８の発現度が低いヒト肺がん細胞であるＡ５４９において人為的にＩＬ−８を過剰発現させて、ＩＬ−８を過剰発現しているＡ５４９とＵＣＢ−ＭＳＣとを共培養した。その結果、Ａ５４９細胞への移動性が低かったＵＣＢ−ＭＳＣが、ＩＬ−８を過剰発現しているＡ５４９細胞には、高い移動性を示すことが見出された。従って、ＩＬ−８がＵＣＢ−ＭＳＣの強い誘導因子でありうる（図１０Ｃ）。
【００２６】
本発明の発明者らは、Ｕ−８７ ＭＧ細胞またはＩＬ−８に関してＢＭ−ＭＳＣとＵＣＢ−ＭＳＣの移動特性を比較した。その結果、ＵＣＢ−ＭＳＣはＢＭ−ＭＳＣに比べてＵ−８７ ＭＧ細胞またはＩＬ−８に対してより強力に移動した。ＵＣＢ−ＭＳＣ移動性は、ＩＬ−８処理に対応して劇的に増加したが、ＢＭ−ＭＳＣの場合は、ＩＬ−８処理に対応して弱かった（図１１）。
【００２７】
ＵＣＢ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣにおける、ＣＸＣケモカイン受容体１（ＣＸＣＲ１）およびＣＸＣケモカイン受容体２（ＣＸＣＲ２）の発現レベルを、ｍＲＮＡとタンパク質とを測定することで比較した（図１２）。ＵＣＢ−ＭＳＣおよびＢＭ−ＭＳＣから単離した総ＲＮＡを使用してＲＴ−ＰＣＲ分析した結果、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２両方のＰＣＲ産物は、ＢＭ−ＭＳＣに比べてＵＣＢ−ＭＳＣでより高い強度を有した。ＣＸＣＲ１とＣＸＣＲ２とのタンパク質発現に関して、ＵＣＢ−ＭＳＣおよびＢＭ−ＭＳＣの両方で、ＣＸＣＲ１とＣＸＣＲ２が高く発現された。ＩＬ−８はＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２に対して高い親和性を有するので、ＵＣＢ−ＭＳＣのＵ−８７ ＭＧに対する上昇した移動性は、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２の上方制御された発現に起因していると考えられる。
【００２８】
本発明者らは、ＵＣＢ−ＭＳＣに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子を導入する試験を行った。その結果、ＧＦＰがうまく導入され発現されることが見出された（図１３）。また、ＧＦＰをコードする遺伝子を過剰発現しているＵＣＢ−ＭＳＣも、Ｕ８７ ＭＧに対する遊走性を有するということも見出された（図１４）。このような結果は、遺伝子またはその産物を導入されたＵＣＢ−ＭＳＣが、ＩＬ−８またはＧＲＯ−αを分泌する細胞に伝達されうるということを示している。
【００２９】
前記結果に基づき、本発明は、ＵＣＢ−ＭＳＣを利用して、ＩＬ−８またはＧＲＯ−αを発現する細胞に遺伝子またはその産物を伝達する方法に関する。また本発明は、ＩＬ−８またはＧＲＯ−αを発現し、かつＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性を誘導する細胞に、治療的遺伝子またはマーカー遺伝子、あるいはその産物を伝達する、ＵＣＢ−ＭＳＣを含む治療的組成物にも関する。また本発明は、ＵＣＢ−ＭＳＣを利用する、治療用の薬学的組成物、キット、脳腫瘍を予防または治療するための使用、および脳腫瘍の治療方法に関する。本発明は、ＵＣＢ−ＭＳＣを利用する、組成物、脳腫瘍の診断用または治療経過モニタリング用のキット、および脳腫瘍の診断方法または脳腫瘍治療経過のモニタリング方法に関する。
【００３０】
具体的には本発明の概念は、以下に関する。
［１］ＵＣＢ−ＭＳＣを含む、脳腫瘍の予防または治療用の薬学的組成物。
［２］ＵＣＢ−ＭＳＣを含む、脳腫瘍の予防または治療用の薬学的組成物であって、ＵＣＢ−ＭＳＣが脳腫瘍の遺伝子治療のためのキャリアとして機能する、薬学的組成物。
［３］ＵＣＢ−ＭＳＣを含む、脳腫瘍の予防または治療用の薬学的組成物であって、抗腫瘍遺伝子がＵＣＢ−ＭＳＣに導入された、薬学的組成物。
［４］ＵＣＢ−ＭＳＣを含む、脳腫瘍の予防または治療用の薬学的組成物であって、抗腫瘍遺伝子がＵＣＢ−ＭＳＣに導入され、抗腫瘍遺伝子が腫瘍抑制遺伝子、アポトーシス誘導因子遺伝子、細胞周期調節遺伝子および血管新生抑制遺伝子から選択される、薬学的組成物。
［５］ＵＣＢ−ＭＳＣを含む、脳腫瘍の予防または治療用の薬学的組成物であって、抗腫瘍遺伝子がＵＣＢ−ＭＳＣに導入され、抗腫瘍遺伝子が腫瘍抑制遺伝子、アポトーシス誘導因子遺伝子、細胞周期調節遺伝子および血管新生抑制遺伝子から選択され、腫瘍抑制遺伝子がホスファターゼおよびテンシンホモログ（PTEN）の遺伝子、Maspinの遺伝子、ＲＵＮＸ３の遺伝子、Caveolin−１の遺伝子、ｎｍ２３の遺伝子、Ｒｂタンパク質の遺伝子、Brush−１の遺伝子、腫瘍増殖の阻害因子（ＩＮＧ−４）の遺伝子、Survivinの遺伝子、X染色体連鎖性アポトーシス阻害タンパク質（ＸＩＡＰ）の遺伝子、神経アポトーシス阻害タンパク質（ＮＡＩＰ）の遺伝子、およびそれらの遺伝子を調節するタンパク質の遺伝子からなる群から選択されてもよい、薬学的組成物。
［６］ＵＣＢ−ＭＳＣを含む、脳腫瘍の予防または治療用の薬学的組成物であって、抗腫瘍遺伝子がＵＣＢ−ＭＳＣに導入され、抗腫瘍遺伝子が腫瘍抑制遺伝子、アポトーシス誘導因子遺伝子、細胞周期調節遺伝子および血管新生抑制遺伝子から選択され、アポトーシス誘導因子遺伝子が、サイトカインの遺伝子、インターロイキンの遺伝子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の遺伝子、インターフェロン（ＩＮＦ−α、ＩＮＦ−β、ＩＮＦ−γ）の遺伝子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）の遺伝子、ｐ５３の遺伝子、Ａｐａｆ−１の遺伝子、ＴＲＡＩＬの遺伝子、カスパーゼの遺伝子、Ｂａｘの遺伝子、Ｂａｄの遺伝子、ＦＡＤＤの遺伝子、ＪＮＫの遺伝子、ｐ３８キナーゼの遺伝子、およびそれら遺伝子を調節するタンパク質の遺伝子からなる群から選択されてもよい、薬学的組成物。
［７］ＵＣＢ−ＭＳＣを含む、脳腫瘍の予防または治療用の薬学的組成物であって、抗腫瘍遺伝子がＵＣＢ−ＭＳＣに導入され、抗腫瘍遺伝子が腫瘍抑制遺伝子、アポトーシス誘導因子遺伝子、細胞周期調節遺伝子および血管新生抑制遺伝子から選択され、細胞周期調節遺伝子が、ｃｄｃ２の遺伝子、サイクリン（サイクリンＡ、サイクリンＤ、サイクリンＥ）の遺伝子、ｃｄｃ２５Ｃの遺伝子、ｐ２１ＷＡＦの遺伝子、ｐ１６ＩＮＫ４の遺伝子、ＣＤＫ（ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６）の遺伝子、Ｒｂタンパク質の遺伝子、Ｅ２Ｆの遺伝子、それらのアンチセンスまたはＳｉＲＮＡおよびそれらの遺伝子を調節するタンパク質の遺伝子からなる群から選択されてもよい、薬学的組成物。
［８］ＵＣＢ−ＭＳＣを含む、脳腫瘍の予防または治療用の薬学的組成物であって、抗腫瘍遺伝子がＵＣＢ−ＭＳＣに導入され、抗腫瘍遺伝子が腫瘍抑制遺伝子、アポトーシス誘導因子遺伝子、細胞周期調節遺伝子および血管新生抑制遺伝子から選択され、血管新生抑制遺伝子が、トロンボスポンジン−１の遺伝子、エンドスタチンの遺伝子、タムスタチンの遺伝子、カンスタチン（canstatin）の遺伝子、バスタチン（vastatin）の遺伝子、レスチン（restin）の遺伝子、血管内皮増殖抑制因子の遺伝子、マスピン（maspin）の遺伝子、アンジオポエチンの遺伝子、プロラクチン１６−ｋｄ断片の遺伝子、およびエンドレペリン（endorepellin）の遺伝子からなる群から選択されてもよい、薬学的組成物。
［９］ＵＣＢ−ＭＳＣを含む、脳腫瘍の予防または治療用の薬学的組成物であって、プロドラッグ転換酵素遺伝子がＵＣＢ−ＭＳＣに導入された、薬学的組成物。
［１０］ＵＣＢ−ＭＳＣを含む、脳腫瘍の予防または治療用の薬学的組成物であって、プロドラッグ転換酵素遺伝子が、ＵＣＢ−ＭＳＣに導入され、前記プロドラッグ転換酵素遺伝子が、シトシンデアミナーゼ遺伝子およびＣＹＰ２Ｂ１遺伝子から選択される、薬学的組成物。
［１１］ＵＣＢ−ＭＳＣを含む、脳腫瘍の予防または治療用の薬学的組成物であって、脳腫瘍と関連する遺伝子のアンチセンスまたはＳｉＲＮＡがＵＣＢ−ＭＳＣに導入された、薬学的組成物。
［１２］ＵＣＢ−ＭＳＣを含む、脳腫瘍の予防または治療用の薬学的組成物であって、脳腫瘍と関連する遺伝子のアンチセンスまたはＳｉＲＮＡが、ＵＣＢ−ＭＳＣに導入され、脳腫瘍と関連する遺伝子が、Ｒａｓファミリーの遺伝子、ｃ−ｍｙｃの遺伝子、ａｂｌの遺伝子、ｅｒｂＢ−１の遺伝子、ＥＧＦ−Ｒの遺伝子、Ｂａｘの遺伝子、Ａｐａｆ−１相互作用タンパク質（ＡＰＩＰ）の遺伝子、Ｗｎｔ−１誘導性分泌タンパク質１（ＷＩＳＰ−１）の遺伝子、Ｗｎｔの遺伝子、Ｒａｆ−１の遺伝子、Ｓｒｃの遺伝子、Ａｋｔの遺伝子、Ｅｒｋ−１、２の遺伝子、およびＢｃＬ−２の遺伝子からなる群から選択されてもよい、薬学的組成物。
［１３］ＵＣＢ−ＭＳＣを含む、脳腫瘍の予防または治療用の薬学的組成物であって、腫瘍崩壊ウイルスがＵＣＢ−ＭＳＣに導入された、薬学的組成物。
［１４］ＵＣＢ−ＭＳＣを含む、脳腫瘍の予防または治療用の薬学的組成物であって、腫瘍崩壊ウイルスがＵＣＢ−ＭＳＣに導入され、該腫瘍崩壊ウイルスが単純ヘルペスウイルスおよびレオウイルス３型から選択される、薬学的組成物。
［１５］脳腫瘍の予防または治療用の薬学的組成物のいずれか一つであって、前記脳腫瘍が、星状細胞腫、毛様細胞性星状細胞腫、低悪性度星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形性膠芽腫、脳幹神経膠腫、上衣細胞腫、上衣下細胞腫、神経節細胞腫、混合性神経膠腫、乏突起細胞腫、視神経膠腫、聴神経腫、脊索腫、CNSリンパ腫、頭蓋咽頭腫、血管芽細胞腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体腫瘍、下垂体腫瘍、未分化神経外胚葉性腫瘍、ラブドイド腫瘍、神経鞘腫、嚢胞、神経線維腫症、偽脳腫瘍、および結節硬化症からなる群から選択される、薬学的組成物。
［１６］ＵＣＢ−ＭＳＣを含む、脳腫瘍を診断するまたは脳腫瘍の治療経過をモニタリングするための組成物。
［１７］ＵＣＢ−ＭＳＣを含む、脳腫瘍を診断するまたは脳腫瘍の治療経過をモニタリングするための組成物であって、前記ＵＣＢ−ＭＳＣが検出可能なマーカーで標識される、組成物。
［１８］ＵＣＢ−ＭＳＣを含む、脳腫瘍を診断するまたは脳腫瘍の治療経過をモニタリングするための組成物であって、前記ＵＣＢ−ＭＳＣが検出可能なマーカーで標識され、前記検出可能なマーカーが、ルシフェラーゼを含む酵素に基づく蛍光検出剤およびTatペプチド誘導体化磁性ナノ粒子から選択される、組成物。
［１９］脳腫瘍を診断するまたは脳腫瘍の治療経過をモニタリングするための組成物のいずれか一つであって、前記脳腫瘍が、星状細胞腫、毛様細胞性星状細胞腫、低悪性度星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形性膠芽腫、脳幹神経膠腫、上衣細胞腫、上衣下細胞腫、神経節細胞腫、混合性神経膠腫、乏突起細胞腫、視神経膠腫、聴神経腫、脊索腫、CNSリンパ腫、頭蓋咽頭腫、血管芽細胞腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体腫瘍、下垂体腫瘍、未分化神経外胚葉性腫瘍、ラブドイド腫瘍、神経鞘腫、嚢胞、神経線維腫症、偽脳腫瘍、および結節硬化症からなる群から選択される、組成物。
［２０］プロドラッグ転換酵素遺伝子を有する発現ベクター、ＵＣＢ−ＭＳＣ、および抗がん剤のプロドラッグを含む、脳腫瘍を治療するためのキット。
［２１］プロドラッグ転換酵素遺伝子を有する発現ベクター、ＵＣＢ−ＭＳＣ、および抗がん剤のプロドラッグを含む、脳腫瘍を治療するためのキットであって、前記プロドラッグ転換酵素遺伝子が、シトシンデアミナーゼ遺伝子およびＣＹＰ２Ｂ１遺伝子から選択される、キット。
［２２］プロドラッグ転換酵素遺伝子を有する発現ベクター、ＵＣＢ−ＭＳＣ、および抗がん剤のプロドラッグを含む、脳腫瘍を治療するためのキットであって、プロドラッグ転換酵素遺伝子が、シトシンデアミナーゼ遺伝子およびＣＹＰ２Ｂ１遺伝子から選択され、ＵＣＢ−ＭＳＣが、プロドラッグ転換酵素遺伝子を有する発現ベクターでトランスフェクトされる、キット。
［２３］脳腫瘍が星状細胞腫、毛様細胞性星状細胞腫、低悪性度星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形性膠芽腫、脳幹神経膠腫、上衣細胞腫、上衣下細胞腫、神経節細胞腫、混合性神経膠腫、乏突起細胞腫、視神経膠腫、聴神経腫、脊索腫、CNSリンパ腫、頭蓋咽頭腫、血管芽細胞腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体腫瘍、下垂体腫瘍、未分化神経外胚葉性腫瘍、ラブドイド腫瘍、神経鞘腫、嚢胞、神経線維腫症、偽脳腫瘍、および結節硬化症からなる群から選択される、上記のキットのいずれか一つ。
［２４］細胞に治療的遺伝子またはその産物を伝達するための遺伝子治療用の組成物であって、該遺伝子治療用組成物がＵＣＢ−ＭＳＣを含み、前記細胞が、ＩＬ−８またはＧＲＯ−αを発現し、かつＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性を誘導する、遺伝子治療用の組成物。
［２５］細胞に治療的遺伝子またはその産物を伝達するための遺伝子治療用の組成物であって、該遺伝子治療用組成物がＵＣＢ−ＭＳＣを含み、前記細胞が、ＩＬ−８またはＧＲＯ−αを発現し、かつＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性を誘導し、ＵＣＢ−ＭＳＣが遺伝子治療のためのキャリアとして機能する、遺伝子治療用の組成物。
［２６］細胞に治療的遺伝子またはその産物を伝達するための遺伝子治療用の組成物であって、該遺伝子治療用組成物がＵＣＢ−ＭＳＣを含み、前記細胞が、ＩＬ−８またはＧＲＯ−αを発現し、かつＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性を誘導し、抗腫瘍遺伝子が、ＵＣＢ−ＭＳＣに導入された、遺伝子治療用の組成物。
［２７］細胞に治療的遺伝子またはその産物を伝達するための遺伝子治療用の組成物であって、該遺伝子治療用組成物がＵＣＢ−ＭＳＣを含み、前記細胞が、ＩＬ−８またはＧＲＯ−αを発現し、かつＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性を誘導し、抗腫瘍遺伝子が、ＵＣＢ−ＭＳＣに導入され、抗腫瘍遺伝子が腫瘍抑制遺伝子、アポトーシス誘導因子遺伝子、細胞周期調節遺伝子および血管新生抑制遺伝子からなる群から選択される、遺伝子治療用の組成物。
［２８］細胞に治療的遺伝子またはその産物を伝達するための遺伝子治療用の組成物であって、該遺伝子治療用組成物がＵＣＢ−ＭＳＣを含み、前記細胞が、ＩＬ−８またはＧＲＯ−αを発現し、かつＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性を誘導し、抗腫瘍遺伝子が、ＵＣＢ−ＭＳＣに導入され、抗腫瘍遺伝子が腫瘍抑制遺伝子、アポトーシス誘導因子遺伝子、細胞周期調節遺伝子および血管新生抑制遺伝子からなる群から選択され、腫瘍抑制遺伝子がホスファターゼおよびテンシンホモログ（PTEN）の遺伝子、Maspinの遺伝子、ＲＵＮＸ３の遺伝子、Caveolin−１の遺伝子、ｎｍ２３の遺伝子、Ｒｂタンパク質の遺伝子、Brush−１の遺伝子、腫瘍増殖の阻害因子（ＩＮＧ−４）の遺伝子、Survivinの遺伝子、X染色体連鎖性アポトーシス阻害タンパク質（ＸＩＡＰ）の遺伝子、神経アポトーシス阻害タンパク質（ＮＡＩＰ）の遺伝子、およびそれらの遺伝子を調節するタンパク質の遺伝子からなる群から選択されてもよい、遺伝子治療用の組成物。
［２９］細胞に治療的遺伝子またはその産物を伝達するための遺伝子治療用の組成物であって、該遺伝子治療用組成物がＵＣＢ−ＭＳＣを含み、前記細胞が、ＩＬ−８またはＧＲＯ−αを発現し、かつＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性を誘導し、抗腫瘍遺伝子が、ＵＣＢ−ＭＳＣに導入され、抗腫瘍遺伝子が腫瘍抑制遺伝子、アポトーシス誘導因子遺伝子、細胞周期調節遺伝子および血管新生抑制遺伝子からなる群から選択され、アポトーシス誘導因子遺伝子がサイトカインの遺伝子、インターロイキンの遺伝子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の遺伝子、インターフェロン（ＩＮＦ−α、ＩＮＦ−β、ＩＮＦ−γ）の遺伝子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）の遺伝子、ｐ５３の遺伝子、Ａｐａｆ−１の遺伝子、ＴＲＡＩＬの遺伝子、カスパーゼの遺伝子、Ｂａｘの遺伝子、Ｂａｄの遺伝子、ＦＡＤＤの遺伝子、ＪＮＫの遺伝子、ｐ３８キナーゼの遺伝子、およびそれらの遺伝子を調節するタンパク質の遺伝子からなる群から選択されてもよい、遺伝子治療用の組成物。
［３０］細胞に治療的遺伝子またはその産物を伝達するための遺伝子治療用の組成物であって、該遺伝子治療用組成物がＵＣＢ−ＭＳＣを含み、前記細胞が、ＩＬ−８またはＧＲＯ−αを発現し、かつＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性を誘導し、抗腫瘍遺伝子が、ＵＣＢ−ＭＳＣに導入され、抗腫瘍遺伝子が腫瘍抑制遺伝子、アポトーシス誘導因子遺伝子、細胞周期調節遺伝子および血管新生抑制遺伝子からなる群から選択され、細胞周期調節遺伝子がｃｄｃ２の遺伝子、サイクリン（サイクリンＡ、サイクリンＤ、サイクリンＥ）の遺伝子、ｃｄｃ２５Ｃの遺伝子、ｐ２１ＷＡＦの遺伝子、ｐ１６ＩＮＫ４の遺伝子、ＣＤＫ（ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６）の遺伝子、Ｒｂタンパク質の遺伝子、Ｅ２Ｆの遺伝子、それらのアンチセンスまたはＳｉＲＮＡおよびそれらの遺伝子を調節するタンパク質の遺伝子からなる群から選択されてもよい、遺伝子治療用の組成物。
［３１］細胞に治療的遺伝子またはその産物を伝達するための遺伝子治療用の組成物であって、該遺伝子治療用組成物がＵＣＢ−ＭＳＣを含み、前記細胞が、ＩＬ−８またはＧＲＯ−αを発現し、かつＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性を誘導し、抗腫瘍遺伝子が、ＵＣＢ−ＭＳＣに導入され、抗腫瘍遺伝子が腫瘍抑制遺伝子、アポトーシス誘導因子遺伝子、細胞周期調節遺伝子および血管新生抑制遺伝子からなる群から選択され、血管新生抑制遺伝子が、トロンボスポンジン−１の遺伝子、エンドスタチンの遺伝子、タムスタチンの遺伝子、カンスタチン（canstatin）の遺伝子、バスタチン（vastatin）の遺伝子、レスチン（restin）の遺伝子、血管内皮増殖抑制因子の遺伝子、マスピン（maspin）の遺伝子、アンジオポエチンの遺伝子、プロラクチン１６−ｋｄ断片の遺伝子、およびエンドレペリン（endorepellin）の遺伝子からなる群から選択されてもよい、遺伝子治療用の組成物。
［３２］細胞に治療的遺伝子またはその産物を伝達するための遺伝子治療用の組成物であって、該遺伝子治療用組成物がＵＣＢ−ＭＳＣを含み、前記細胞が、ＩＬ−８またはＧＲＯ−αを発現し、かつＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性を誘導し、プロドラッグ転換酵素遺伝子が、ＵＣＢ−ＭＳＣに導入された、遺伝子治療用の組成物。
［３３］細胞に治療的遺伝子またはその産物を伝達するための遺伝子治療用の組成物であって、該遺伝子治療用組成物がＵＣＢ−ＭＳＣを含み、前記細胞が、ＩＬ−８またはＧＲＯ−αを発現し、かつＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性を誘導し、プロドラッグ転換酵素遺伝子が、ＵＣＢ−ＭＳＣに導入され、前記プロドラッグ転換酵素遺伝子がシトシンデアミナーゼ遺伝子およびＣＹＰ２Ｂ１遺伝子からなる群から選択される、遺伝子治療用の組成物。
［３４］細胞に治療的遺伝子またはその産物を伝達するための遺伝子治療用の組成物であって、該遺伝子治療用組成物がＵＣＢ−ＭＳＣを含み、前記細胞が、ＩＬ−８またはＧＲＯ−αを発現し、かつＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性を誘導し、腫瘍と関連する遺伝子に対するアンチセンスまたはＳｉＲＮＡが、ＵＣＢ−ＭＳＣに導入された、遺伝子治療用の組成物。
［３５］細胞に治療的遺伝子またはその産物を伝達するための遺伝子治療用の組成物であって、該遺伝子治療用組成物がＵＣＢ−ＭＳＣを含み、前記細胞が、ＩＬ−８またはＧＲＯ−αを発現し、かつＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性を誘導し、腫瘍と関連する遺伝子に対するアンチセンスまたはＳｉＲＮＡが、ＵＣＢ−ＭＳＣに導入され、腫瘍と関連する遺伝子がＲａｓファミリーの遺伝子、ｃ−ｍｙｃの遺伝子、ａｂｌの遺伝子、ｅｒｂＢ−１の遺伝子、ＥＧＦ−Ｒの遺伝子、Ｂａｘの遺伝子、Ａｐａｆ−１相互作用タンパク質（ＡＰＩＰ）の遺伝子、Ｗｎｔ−１誘導性分泌タンパク質１（ＷＩＳＰ−１）の遺伝子、Ｗｎｔの遺伝子、Ｒａｆ−１の遺伝子、Ｓｒｃの遺伝子、Ａｋｔの遺伝子、Ｅｒｋ−１、２の遺伝子、およびＢｃＬ−２の遺伝子からなる群から選択されてもよい、遺伝子治療用の組成物。
［３６］細胞に治療的遺伝子またはその産物を伝達するための遺伝子治療用の組成物であって、該遺伝子治療用組成物がＵＣＢ−ＭＳＣを含み、前記細胞が、ＩＬ−８またはＧＲＯ−αを発現し、かつＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性を誘導し、腫瘍崩壊ウイルスが、ＵＣＢ−ＭＳＣに導入された、遺伝子治療用の組成物。
［３７］細胞に治療的遺伝子またはその産物を伝達するための遺伝子治療用の組成物であって、該遺伝子治療用組成物がＵＣＢ−ＭＳＣを含み、前記細胞が、ＩＬ−８またはＧＲＯ−αを発現し、かつＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性を誘導し、腫瘍崩壊ウイルスが、ＵＣＢ−ＭＳＣに導入され、腫瘍崩壊ウイルスが単純ヘルペスウイルスおよびレオウイルス３型からなる群から選択される、遺伝子治療用の組成物。
［３８］細胞を含む部位に発生した疾患の診断または該疾患の治療経過モニタリング用の組成物であって、該組成物がＵＣＢ−ＭＳＣを含み、前記細胞がＩＬ−８またはＧＲＯ−αを発現し、かつＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性を誘導する、組成物。
［３９］細胞を含む部位に発生した疾患の診断または該疾患の治療経過モニタリング用の組成物であって、該組成物がＵＣＢ−ＭＳＣを含み、前記細胞がＩＬ−８またはＧＲＯ−αを発現し、かつＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性を誘導し、前記ＵＣＢ−ＭＳＣが検出可能なマーカーで標識される、組成物。
［４０］細胞を含む部位に発生した疾患の診断または該疾患の治療経過モニタリング用の組成物であって、該組成物がＵＣＢ−ＭＳＣを含み、前記細胞がＩＬ−８またはＧＲＯ−αを発現し、かつＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性を誘導し、前記ＵＣＢ−ＭＳＣが検出可能なマーカーで標識され、前記検出可能なマーカーが、ルシフェラーゼを含む酵素に基づく蛍光検出剤およびTatペプチド誘導体化磁性ナノ粒子からなる群から選択されてもよい、組成物。
【００３１】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００３２】
本明細書において、用語「臍帯血（umbilical blood）」は、ヒトを含むあらゆる哺乳動物で、胎盤と胎児とを連結する臍静脈から採取された血液を意味する。
【００３３】
本明細書において、用語「臍帯血由来の間葉系幹細胞（ＵＣＢ−ＭＳＣ）」は、哺乳動物、望ましくは、ヒトの臍帯血から分離および培養されたＭＳＣを意味する。
【００３４】
本明細書において、用語「治療」は、まだ疾患を保有していると診断されていないが、疾患に罹りやすい動物、望ましくは、哺乳動物、より望ましくは、ヒトで、疾患または障害の発症に対する予防、疾患の進行の抑制および疾患の軽減を意味する。
【００３５】
本明細書において、用語「脳腫瘍」は、脳および脊髄に発生する悪性腫瘍および良性腫瘍、ならびにグリア細胞および非グリア細胞に発生するあらゆる腫瘍を意味する。かような意味において、前記脳腫瘍は、一次性脳腫瘍または二次性脳腫瘍でありうる。
【００３６】
一方、本明細書で、定義されていない用語は、本発明が属する技術分野で一般的に使われる意味を有しうる。
【００３７】
臍帯血由来の間葉系幹細胞を含む単球を分離するためには、本出願人によって出願されて登録された韓国登録特許第４８９２４８号に記載された方法のようなあらゆる公知の方法が使用されうる。例えば、前記分離方法は、フィコールハイパック密度勾配分離法（Ficoll-Hypaque density gradient method）でありうるが、これに制限されるものではない。具体的に、分娩後に胎盤が剥離される前に臍静脈（umbilical vein）から採取した臍帯血を、フィコールハイパック勾配（Ficoll-Hypaque gradient）で遠心分離して単球を得た後、その単球を数回洗浄して不純物を除去する。このように得られた単球は、間葉系幹細胞の分離もしくは培養に直ちに利用することができ、または長期間低温保存されうる。
【００３８】
間葉系幹細胞は、大韓民国公開特許第２００３−００６９１１５号公報の方法のような、公知の任意の方法（Pittinger ＭＦら，Science，２８４：１４３−７，１９９９、およびLazarus ＨＭら，Bone Marrow Transplant，１６：５５７−６４，１９９５）を使用して、臍帯血から分離および培養することができる。
【００３９】
まず、前記分離された臍帯血を、例えば、フィコールハイパック濃度勾配を利用して遠心分離することによって、造血細胞および間葉系幹細胞を含む単球を分離した後、その単球を何回か洗浄して不純物を除去する。洗浄後、適切な濃度で単球を培養ディッシュに播種し、単一層の形態で細胞を増殖させる。これらの細胞を位相差顕微鏡で確認した。前記位相差顕微鏡イメージで、均一でかつ紡錘形の細胞のコロニーが間葉系幹細胞である。その後細胞が培養されて成長すれば、所望の細胞数になるまで継代培養により増殖させる。
【００４０】
本発明の組成物に含まれるUCB-MSCは、公知の方法を使用して低温保存されうる（Camposら，Cryobiology ３５：９２１−９２４，１９９５）。低温保存過程のための培地は、１０〜２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、および１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むことができる。前記培地１ｍＬに約１×１０６〜５×１０６個の細胞の濃度になるまで、前記培地に前記細胞を懸濁させる。
【００４１】
前記細胞懸濁液を低温保存用のガラスまたはプラスチック材質のアンプルに分配し、サンプルを密封し、温度制御されプログラムされた冷凍機に入れる。冷凍された細胞が解凍されるときの細胞損傷を低減するように、細胞は、−１℃／分の温度変化を提供する冷凍プログラムを利用して冷凍される。サンプルの温度が−９０℃以下に達すれば、−１５０℃以下の温度を有する液体窒素保存タンクに移動させる。
【００４２】
低温保存された細胞を解凍させるときは、サンプルを液体窒素保存タンクから速かに３７℃に調節された水槽に移動させる。アンプル中で解凍された内容物は、安定した条件で培養培地を含んだ培養ディッシュに移される。
【００４３】
本発明で、間葉系幹細胞の分離および培養のための培養培地は、１０％〜３０％ＦＢＳを含む細胞培養培地でありうる。前記細胞培養培地は、当業界で一般的に使われる細胞培養培地のいずれでもよい。前記細胞培養培地の例としては、ＤＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、α−ＭＥＭ培地、ＭｃＣｏｙｓ ５Ａ培地、イーグルズ基本培地、ＣＭＲＬ培地、グラスゴー（Glasgow）最小必須培地、（Ｈａｍ’ｓ）Ｆ−１２培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、（Liebovitz’）Ｌ−１５培地、及びＲＰＭＩ １６４０培地を含む。例えば、前記細胞培養培地は、ＤＭＥＭ培地でありうる。培養時には、細胞は、細胞の濃度が、前記培地１ｍＬに約５×１０３〜２×１０４個の細胞であるように懸濁されうる。
【００４４】
また、前記細胞培養培地には、必要によって一種以上の添加物を含めてもよい。かような添加物としては、ウシ胎仔、ウマまたはヒトの血清、微生物の汚染を防止するためペニシリンＧ、硫酸ストレプトマイシンまたはゲンタマイシンなどの抗生剤、アンフォテリシンＢまたはニスタチンなどの抗真菌剤およびそれらから選択された少なくとも2つの物質の混合物からなる群から選択された少なくとも一つの物質を含むことができる。
【００４５】
本発明のＵＣＢ−ＭＳＣは、脳腫瘍細胞の成長を実質的に阻害するための治療剤を伝達できるように、遺伝子操作してもよい。また本発明のＵＣＢ−ＭＳＣは、ＩＬ−８またはＧＲＯ−αを分泌する細胞に治療的遺伝子またはその産物を伝達できるように、遺伝子操作してもよい。ここで使われた「阻害」とは、細胞増殖および成長を阻害するだけでなく、壊死やアポトーシスも含まれる。治療的遺伝子は、例えば、抗腫瘍遺伝子、プロドラッグを薬物に転換する酵素の遺伝子、腫瘍と関連する遺伝子に対するアンチセンスまたはＳｉＲＮＡ、または腫瘍崩壊ウイルスでありうる（Yip Sら，The Cancer Ｊ．９（３），１８９−２０４，２００３）。前記抗腫瘍遺伝子は、腫瘍抑制遺伝子、アポトーシス誘導因子遺伝子、細胞周期調節遺伝子または血管新生抑制遺伝子でありうる。具体的に、前記腫瘍抑制遺伝子は、ホスファターゼおよびテンシンホモログ（PTEN）の遺伝子、Maspinの遺伝子、ＲＵＮＸ３の遺伝子、Caveolin−１の遺伝子、ｎｍ２３の遺伝子、Ｒｂタンパク質の遺伝子、Brush−１の遺伝子、腫瘍増殖の阻害因子（ＩＮＧ−４）の遺伝子、Survivinの遺伝子、X染色体連鎖性アポトーシス阻害タンパク質（ＸＩＡＰ）の遺伝子、神経アポトーシス阻害タンパク質（ＮＡＩＰ）の遺伝子、およびそれらの遺伝子を調節するタンパク質の遺伝子からなる群から選択されうる。前記腫瘍抑制遺伝子は、上記のこれらの遺伝子に制限されるものではない。前記アポトーシス誘導因子遺伝子は、サイトカインの遺伝子、インターロイキンの遺伝子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の遺伝子、インターフェロン（ＩＮＦ−α、ＩＮＦ−β、ＩＮＦ−γ）の遺伝子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）の遺伝子、ｐ５３の遺伝子、Ａｐａｆ−１の遺伝子、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）の遺伝子、カスパーゼの遺伝子、Ｂａｘの遺伝子、Ｂａｄの遺伝子、ＦＡＤＤの遺伝子、ＪＮＫの遺伝子、ｐ３８キナーゼの遺伝子、およびそれらの遺伝子を調節するタンパク質の遺伝子からなる群から選択されうる。前記アポトーシス誘導因子遺伝子は、上記のこれらの遺伝子に制限されるものではない。前記細胞周期調節遺伝子は、ｃｄｃ２の遺伝子、サイクリン（サイクリンＡ、サイクリンＤ、サイクリンＥ）の遺伝子、ｃｄｃ２５Ｃの遺伝子、ｐ２１ＷＡＦの遺伝子、ｐ１６ＩＮＫ４の遺伝子、ＣＤＫ（ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６）の遺伝子、Ｒｂタンパク質の遺伝子、Ｅ２Ｆの遺伝子からなる群から選択されうる。前記細胞周期調節遺伝子は、上記のこれらの遺伝子に制限されるものではない。前記血管新生抑制遺伝子は、トロンボスポンジン−１の遺伝子、エンドスタチンの遺伝子、タムスタチンの遺伝子、カンスタチン（canstatin）の遺伝子、バスタチン（vastatin）の遺伝子、レスチン（restin）の遺伝子、血管内皮増殖抑制因子の遺伝子、マスピン（maspin）の遺伝子、アンジオポエチンの遺伝子、プロラクチン１６−ｋｄ断片の遺伝子、及びエンドレペリン（endorepellin）の遺伝子からなる群から選択されうる。前記血管新生抑制遺伝子は、上記のこれらの遺伝子に制限されるものではない。前記プロドラッグを薬物に転換する酵素の遺伝子は、抗がん剤である５−ＦＵのプロドラッグである５−ＦＣを５−ＦＵに転換するシトシン��アミナーゼ、または抗がん剤であるシクロフォスファミドおよびイフォスファミドを生物活性化させるのに関与するＣＹＰ２Ｂ１遺伝子でありうる。プロドラッグを薬物に転換する酵素の遺伝子は、上記のこれらの物質に制限されるものではない。前記腫瘍と関連した遺伝子に対するアンチセンスまたはＳｉＲＮＡは、Ｒａｓファミリーの遺伝子、ｃ−ｍｙｃの遺伝子、ａｂｌの遺伝子、ｅｒｂＢ−１の遺伝子、ＥＧＦ−Ｒの遺伝子、Ｂａｘの遺伝子、Ａｐａｆ−１相互作用タンパク質（ＡＰＩＰ）の遺伝子、Ｗｎｔ−１誘導性分泌タンパク質１（ＷＩＳＰ−１）の遺伝子、Ｗｎｔの遺伝子、Ｒａｆ−１の遺伝子、Ｓｒｃの遺伝子、Ａｋｔの遺伝子、Ｅｒｋ−１、２の遺伝子、およびＢｃＬ−２の遺伝子に対するアンチセンスまたはＳｉＲＮＡでありうるが、これらに制限されるものではない。
【００４６】
ＵＣＢ−ＭＳＣが保持できる前記腫瘍崩壊ウイルスとしては、単純ヘルペスウイルス、またはレオウイルス３型でありうるが、これらに制限されるものではない。
【００４７】
望ましい遺伝子を発現可能な状態で導入させたＵＣＢ−ＭＳＣは、当技術分野で公知の技術を利用して適切に作製することが可能である。例えば、導入しようとする遺伝子を含むベクターを調製し（Dehari Ｈら，Cancer Gene Ther．，１０，７５−８５，２００３、ＷＯ０７／０３７６５３）、その後、そのベクターを、初代培養間葉系幹細胞に体外（ex vivo）で形質導入することができる。ここで、前記ベクターの例としては、アデノウイルス・ベクター、レトロウイルス・ベクター、アデノ随伴ウイルス・ベクター、単純ヘルペスウイルス・ベクター、ＳＶ４０ベクター、ポリオーマウイルス・ベクター、パピローマウイルス・ベクター、ピコルナウイルス・ベクター、ワクシニアウイルス・ベクター、及びレンチウイルスベクターを含む。例として、Tsuda Ｈらによって開発された方法（Mol Ther ２００３，７，３５４−３６５）を使用しうる。具体的には、アデノウイルス遺伝子を感染させる１日前に、間葉系幹細胞（５×１０５細胞）を培養ディッシュに播種してもよい。次いで、間葉系幹細胞と、アデノウイルス遺伝子が導入されたアデノウイルス・ベクターを含む溶液とを、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で１時間インキュベートし、前記間葉系幹細胞にアデノウイルス遺伝子を感染させる。感染させた間葉系幹細胞を、リン酸バッファ溶液で洗浄して、一般的な培地を加える。または、ウイルス・ベクターを使用せずに、裸のＤＮＡを使用し、リン酸カルシウム法、カチオン性リポゾーム法、及び電気穿孔法から選択された方法によって、望ましい遺伝子をＵＣＢ−ＭＳＣに導入することができる。または、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）と抗腫瘍タンパク質との融合タンパク質遺伝子を含むベクターを使用し、前記融合タンパク質遺伝子を臍帯血間葉系幹細胞に導入できる（Wu ＳＰら，Biochem Biophys Res Commun．３４６（１），１−６，２００６）。
【００４８】
前記ベクターは、さらなる組織学的検査のための遺伝子マーカーをさらに含んでもよい。この遺伝子マーカーは、例えば、ｌａｃＺまたは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような発色または蛍光性タンパク質をコードする遺伝子であってよいが、これらに限定されるものではない（Yip Ｓら，The Cancer Ｊ．９（３），１８９−２０４，２００３）。
【００４９】
本発明の薬学的組成物を使用し、診断、予防、及び治療が可能な脳腫瘍は、原発性脳腫瘍または続発性脳腫瘍でありうる。また本発明の組成物を使用し、診断、予防、及び治療が可能な脳腫瘍の例としては、星状細胞腫、毛様細胞性星状細胞腫、低悪性度星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形性膠芽腫、脳幹神経膠腫、上衣細胞腫、上衣下細胞腫、神経節細胞腫、混合性神経膠腫、乏突起細胞腫、視神経膠腫、聴神経腫、脊索腫、CNSリンパ腫、頭蓋咽頭腫、血管芽細胞腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体腫瘍、下垂体腫瘍、未分化神経外胚葉性腫瘍、ラブドイド腫瘍、神経鞘腫、嚢胞、神経線維腫症、偽脳腫瘍、および結節硬化症を挙げることができる。本発明の組成物を使用し、診断、予防、及び治療が可能な脳腫瘍は、上記のこれらの腫瘍に限定されるものではない。
【００５０】
本発明の薬学的組成物は、公知の任意の抗がん剤と共に投与してもよい。
【００５１】
ＵＣＢ−ＭＳＣは、組織または臓器を移植した場合の免疫学的拒絶反応の主要な原因であるＨＬＡ−ＤＲ（主要組織適合複合体クラスＩＩ）を発現しないことから（Le Blanc ＫＣ，Exp Hematol，３１：８９０−８９６，２００３、およびTse ＷＴら，Transplantation，７５：３８９−３９７，２００３）、移植の主要な問題である拒絶反応などの免疫反応を生じないか、または最小化できる。従って、本発明の薬学的組成物に含まれるＵＣＢ−ＭＳＣは、自己由来臍帯血に加えて、他の対象由来の臍帯血から採取することができる。本発明によれば、ＵＣＢ−ＭＳＣは、低温保存された後で使用することができる。
【００５２】
本発明による遺伝子治療用または疾患の予防または治療用のＵＣＢ−ＭＳＣを含む薬学的組成物は、有効成分に加えて薬学的に許容される添加剤をさらに含みうる。前記ＵＣＢ−ＭＳＣを含む薬学的組成物は、身体に投与できる適した製剤に剤形化してもよい。適した製剤は、注射可能製剤または局所的に投与できる製剤など、非経口投与製剤であってよい。例えば、水または薬学的に許容可能である溶媒を含む滅菌された溶液または懸濁液が、注射可能な形態で非経口的に投与されうる。具体的に、水または前記薬学的に許容可能な溶媒は、薬学的に許容可能な担体または媒体と適切に組み合わされ、それによって一般的に許容可能な単位投与形態で注射可能な製剤を形成する。前記薬学的に許容される担体あるいは媒体の例は、滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、賦形剤、ビヒクル（vehicle）、防腐剤、結合剤などを含むことができる。
【００５３】
上記の注射可能な製剤は、一般的な方法によって非経口的に、疾患の部位に特異的に直接投与されうる。または、前記注射可能な製剤は、脳脊髄液、静脈または疾患の部位に血流を供給する動脈を介して投与でき、望ましくは、脳または脊髄における疾患部位の周辺部分、またはその反対側部分に直接投与されうる。例えば、前記注射可能な製剤は、Douglas Kondziolka（Pittsburgh，１９９８）が開発した臨床方法を利用して投与されうる。すなわち、まず、投与される対象の頭蓋骨を約１ｃｍ径ほどのエンドウ豆サイズに切開した後、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）と混合した間葉系幹細胞溶液が注入される。このとき、ＭＳＣ溶液の注入は、長針を備えた注射器と、脳内部にＭＳＣ溶液を正確に注入するための定位固定フレームとを利用してなされる。
【００５４】
前記ＵＣＢ−ＭＳＣの１日投与量は、１×１０４〜１×１０７細胞／ｋｇ体重、望ましくは、５×１０５〜５×１０６細胞／ｋｇ体重でありうる。前記１日投与量は１回または数回に分けて投与できる。しかし、本発明のＵＣＢ−ＭＳＣの投与量は、治療しようとする疾患の種類、治療しようとする疾患の重症度、投与経路、ならびに患者の体重、年齢および性別によって変わりうる。従って、前記投与量は、本発明の範囲を限定するものではない。
【００５５】
さらに本発明は、ＩＬ−８またはＧＲＯ−αを産生しかつＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性を誘導する細胞に関連した疾患、または脳腫瘍の治療方法を提供し、本方法は、患者に本発明の治療に有効な量の薬学的組成物を投与することを含む。ここで、前記薬学的組成物に含まれるＵＣＢ−ＭＳＣは、患者本人の臍帯血、または他のヒトもしくは医療用に用いられる動物から採取されてもよい。ここで、前記ＵＣＢ−ＭＳＣは、低温保存した後で利用されうる。ＵＣＢ−ＭＳＣを利用する前記方法は、ヒトに限定されるものではなく、他の哺乳動物にも適用されうる。
【００５６】
本発明はまた、ＵＣＢ−ＭＳＣを使用して、ＩＬ−８またはＧＲＯ−αを生産しかつＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性を誘導する細胞に関連する疾患または脳腫瘍を診断する方法、およびこの方法を実施するために使用するキットを提供する。この方法で、ＵＣＢ−ＭＳＣは、検出可能なマーカーで標識してもよい。検出可能なマーカーで標識されたＵＣＢ−ＭＳＣは、最先端の技術によって視覚化され、生きている動物の生体内でリアルタイムで追跡が可能である。前記検出可能なマーカーは、ルシフェラーゼを含む酵素に基づく蛍光検出剤、またはTatペプチド誘導体化磁性ナノ粒子でありうる（Yip Ｓら，The CancerＪ．９（３），１８９−２０４，２００３）。ルシフェラーゼを発現する幹細胞を使用する場合、リアルタイムで生物発光を特定することによって、投与された幹細胞が疾患部位に移動することを追跡でき、疾患の診断および疾患位置の特定が可能である（Weissleder Ｒら，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２３−１２８，２００３）。Tatペプチド誘導体化磁性ナノ粒子を、Lewinらが開発した方法（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ １８，４１０−４１４，２０００）によってＵＣＢ−ＭＳＣに連結させて、その後生体内に投与する。投与したＵＣＢ−ＭＳＣは、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ：magnetic resonance imaging）を使用して追跡が可能である。従って、マーカーで標識されたＵＣＢ−ＭＳＣを生体に投与し、次いでＵＣＢ−ＭＳＣが集まる部位を確認することによって、腫瘍及び腫瘍の部位を特定することができる。さらに、前記マーカーで標識されたＵＣＢ−ＭＳＣを脳腫瘍治療中または脳腫瘍治療後に投与し、投与されたＵＣＢ−ＭＳＣの分布の位置および大きさを特定することが可能である。すなわち、脳腫瘍治療の進行がモニタリングされうる。よって、本発明は、ＵＣＢ−ＭＳＣを使用して、脳腫瘍治療の進行をモニタリングする方法、および本方法を実施するために使用されるキットを提供する。本モニタリング方法および本方法を実施するために使用されるキットは、ＩＬ−８またはＧＲＯ−αを産生しかつＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性を誘導する細胞に関連する疾患にも適用できる。
【００５７】
本明細書で引用されたあらゆる先行技術文献は、参照としてその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５８】
本発明について以下の実施例を参照してさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を例示するだけであり、本発明の概念の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００５９】
本実験に使われたＵ−８７ ＭＧ、Ａ５４９、ＫＡＴＯ ＩＩＩ、ＰＬＣ／ＰＲＦ５、ＬＮ１８、Ｕ１３８およびＵ２５１の細胞株は、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）から購入した。Ａ５４９、ＫＡＴＯ ＩＩＩおよびＰＬＣ／ＰＲＦ５細胞は、１０〜２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（HyClone，Logan ＵＴ、米国）およびゲンタマイシンを含むＲＰＭＩで、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養した。Ｕ８７ ＭＧ、ＬＮ１８、Ｕ１３８およびＵ２５１の細胞は、１０〜２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むイーグルズ最小必須培地（ＭＥＭ）で増殖させた。骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）は、ＬＯＮＺＡから購入した。ＢＭ−ＭＳＣおよび確立されたＵＣＢ−ＭＳＣは、１０〜２０％ＦＢＳを含有するα−ＭＥＭ中で培養した。
【００６０】
＜実施例１＞臍帯血由来間葉系幹細胞（ＵＣＢ−ＭＳＣ）の調製
臍帯血サンプルは、産婦の同意を得て、出産時に臍静脈から収集した。具体的に、４４ｍＬのＣＰＤＡ−１抗凝固剤（緑十字、龍仁、京畿道、大韓民国）を含むＵＣＢ収集バッグの１６ゲージの注射針を臍静脈に挿入し、重力によってＵＣＢを収集した。全ての場合において、臍帯血収集物は、採取後４８時間内に処理し、生存率は９０％以上であった。
【００６１】
＜実施例２＞臍帯血由来間葉系幹細胞の分離および増幅
実施例１で調製したＵＣＢ−ＭＳＣをフィコールハイパック勾配（密度：１．０７７ｇ／ｍＬ、Sigma社製）で遠心分離し、数回洗浄して不純物を除去した。１０〜２０％ＦＢＳ（HyClone社）を含有した基本培地（α−ＭＥＭ，GibcoＢＲＬ社）を得られた生成物に添加し、ＵＣＢ−ＭＳＣを懸濁させた。ＵＣＢ−ＭＳＣを、適した濃度で、１０〜２０％ＦＢＳを含有した基本培地に分けた後、５％ＣＯ２インキュベータ内３７℃で、一週間に二回培地を交換しながら培養した（図１）。培養された細胞が単一層を形成すれば、位相差顕微鏡を利用し、紡錘状に増幅された間葉系幹細胞を確認した。その後、前記間葉系幹細胞が十分に増幅されるまで継代培養を反復した。
【００６２】
＜実施例３＞ＰＫＨ−２６で標識されたＵＣＢ−ＭＳＣの調製
実施例２で培養したＵＣＢ−ＭＳＣを、文献［Barreda ＤＡら，Developmental and Comparative Immunology，２４：３９５−４０６，２０００］に開示された方法によって、ＰＫＨ−２６（Sigma社）で染色した。まず、ＵＣＢ−ＭＳＣを、トリプシンを利用して細胞培養用ディッシュから分離した後、２×１０７個の細胞をＦＢＳを含まない培地で洗浄した。洗浄した細胞を遠心分離機を利用して集め、これを製造業者が提供するキットにおいて１ｍＬのDiluent Ｃ中に懸濁した。その後、得られた細胞懸濁溶液（２×）を、ＰＫＨ蛍光色素（２×）１ｍＬと混合し、混合物を２５℃で５分間反応させた。標識反応を停止させるために、等量のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が含まれた培地を反応産物に添加した後、１分間静置させた。ＰＫＨ−２６で標識された細胞を遠心分離によって集めた後、１０〜２０％ＦＢＳが含まれた培地で三回洗浄し、実験に使用した。
【００６３】
＜実施例４＞トランスウェル・チャンバ内での間葉系幹細胞と他の細胞株との共培養
ヒトＵＣＢ−ＭＳＣ（ｈＵＣＢ−ＭＳＣ）をＰＫＨ−２６（Sigma）で染色した。前記染色されたＵＣＢ−ＭＳＣと他の腫瘍細胞株とを、トランスウェル・チャンバ（ＦＡＬＣＯＮ）で培養条件下で、共培養した（間葉系幹細胞：がん細胞株＝１：５）。対照群として、がん細胞のない間葉系幹細胞を同じ条件で培養した。培養に使用したトランスウェル・チャンバは、図２に図示するように、下の区画（lower compartment）と上の区画（upper compartment）を含み、微細孔膜（microporous membrane）（８μｍサイズ）によって、下の区画が上の区画から分離している。上の区画でＰＫＨ−２６で標識したｈＵＣＢ−ＭＳＣを培養し、下の区画では、ヒト脳腫瘍細胞株Ｕ８７−ＭＧ、ヒト直腸がん細胞株ＬＳ１７４−Ｔ、ヒトＢリンパ球ＮＣ−３７、およびマウスの線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３の各々を培養した。１日、２日、および３日間それぞれ培養した後、位相差顕微鏡（×１００）を利用してＰＫＨ−２６で標識されたＵＣＢ−ＭＳＣの移動を同定し、移動したＰＫＨ２６で標識されたＵＣＢ−ＭＳＣを計数した（図３）。また、ＫＡＴＯ ＩＩＩ、Ａ５４９、ＰＬＣ／ＰＲＦ５、ＬＮ１８、Ｕ１３８、およびＵ２５１のような腫瘍細胞株に対しても同じ実験を行い、ＰＫＨ−２６で標識されたＵＣＢ−ＭＳＣの移動を同定した。Ｕ−８７ ＭＧ細胞によって調節された培地を、トランスウェル・チャンバの下の区画に置いた条件下で、同じ実験を行った（図４）。
【００６４】
すなわち、ＰＫＨ−２６で標識されたＵＣＢ−ＭＳＣを、トランスウェル・チャンバで様々な腫瘍細胞株と共培養した後、下の区画に移動したＰＫＨで標識された間葉系幹細胞を計数した。その結果、ＵＣＢ−ＭＳＣは、脳腫瘍細胞株であるＵ８７−ＭＧ、ＬＮ１８、Ｕ１３８、およびＵ２５１に対しては強力な遊走性を示したが、他の腫瘍細胞に対しては、遊走性が微弱であった（図３及び図４）。図３のＢにおいて、左側のイメージは、腫瘍細胞の代わりに、ヒト細胞株を含まない培地が添加された対照群の場合を示し、右側のイメージは、ＵＣＢ−ＭＳＣをＵ８７−ＭＧ細胞と共培養した場合を示す。図３を参照すると、多くのＰＫＨ２６標識ＵＣＢ−ＭＳＣの移動が確認された。腫瘍細胞の代わりに、ヒト細胞株を含まない培地を使用して培養する場合、ＰＫＨ２６標識ＵＣＢ−ＭＳＣの移動はごくわずかであった（図３Ｂ左側のイメージ）。しかし、ＰＫＨ２６標識ＵＣＢ−ＭＳＣは、Ｕ−８７ ＭＧ細胞を含まないが、Ｕ−８７ ＭＧ細胞を培養して得た馴化培地に対して遊走性を示した（図４Ｄ）。この結果は、馴化培地内に、ＵＣＢ−ＭＳＣをＵ−８７ ＭＧ細胞に引き寄せるように機能する可溶性因子が含まれていることを示す。
【００６５】
＜実施例５＞Ｕ８７−ＭＧに対するＢＭ−ＭＳＣの遊走性とＵ８７−ＭＧに対するＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性の比較
トランスウェル・チャンバを利用して、Ｕ８７−ＭＧに対するＢＭ−ＭＳＣの遊走性とＵ８７−ＭＧに対するＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性を比較した。下の区画には、Ｕ８７−ＭＧがん細胞または培地を入れ、上の区画には、それぞれＢＭ−ＭＳＣおよびＵＣＢ−ＭＳＣを入れた。すべての場合において、２日間培養した。結果として、ＵＣＢ−ＭＳＣがＢＭ−ＭＳＣよりＵ８７−ＭＧに対して強い遊走性を示すことが見出された（図５）。
【００６６】
＜実施例６＞ＭＳＣの移動比較
４人のドナーから供与されたＵＣＢ−ＭＳＣを上の区画で、Ａ５４９（肺がん細胞）、ＨｅＬａ（子宮頸部がん細胞）、およびＵ８７−ＭＧ（脳腫瘍神経膠腫細胞）をそれぞれ下の区画で、トランスウェル・チャンバ内で共培養した。その後、各場合におけるＵＣＢ−ＭＳＣの走化性インデックスを比較した（図６）。
【００６７】
Ａ５４９、ＨｅＬａ及びＵ８７−ＭＧ細胞は、American type culture collection（ＡＴＣＣ）社から購入した。Ａ５４９およびＵ８７−ＭＧ細胞はそれぞれ、１０〜２０％ウシ血清が含まれたＲＰＭＩ１６４０中で培養し、ＨｅＬａは、ＤＭＥＭ中で培養した。各場合において、走化性インデックスは、対照実験において移動したＵＣＢ−ＭＳＣ数で、Ｕ８７ ＭＧに移動したＵＣＢ−ＭＳＣの数を割って算出した。これらのがん細胞に対するＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性を分析した結果、ＵＣＢ−ＭＳＣは、脳腫瘍細胞株であるＵ８７ ＭＧに最も強力な遊走性を示すことを観察できた。
【００６８】
＜実施例７＞サイトカイン・アレイ
間葉系幹細胞とＵ８７−ＭＧ腫瘍細胞を含む３種のヒト細胞それぞれとを共培養して、培養培地を収集した。前記培養培地由来のサイトカインプロファイルを、サイトカイン抗体アレイを利用して検討した。
【００６９】
Ｒ＆Ｄ system社から購入したサイトカイン・アレイ用キットから、各種サイトカインの抗体が付着したフィルムを取り出し、ブロッキング溶液と１時間反応させた。それとは別に、ＵＣＢ−ＭＳＣとＵ８７−ＭＧ腫瘍細胞を含む３種のヒト細胞のそれぞれとを共培養して調製した培地の量を最大１．５ｍＬ以下に合わせ、各培地を、キットに含まれるサイトカインに対する混合抗体と混ぜ、１時間抗原抗体反応を誘導した。供給されたサイトカイン抗体と分泌されたサイトカインとが結合した状態の培地を、ブロッキングに供したフィルムと４℃で１２時間反応させた。反応後、フィルムを洗浄溶液に入れて洗浄した後、三次蒸溜水で洗浄し、次いで室温でフィルムを乾燥させた。前記洗浄及び乾燥の過程を2回または3回反復した後、ストレプトマイシン−ＨＲＰを含んだ溶液中で前記フィルムを３０分間反応させた。次いで、フィルムを洗浄溶液で三回洗浄し、発色試薬と反応させ、暗室でＸ線フィルムに感光させた。
【００７０】
UCB-MSCの強力な遊走性を誘導したＵ８７−ＭＧは、成長関連がん遺伝子（ＧＲＯ−α）、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＤＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、遊走阻止因子（ＭＩＦ）、及びSerpin Ｅ１を分泌した。具体的には、ＧＲＯ−αおよびＩＬ−８の量が、ＭＣＰ−１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＤＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＭＩＦ、及びSerpin Ｅ１よりもさらに多かった。図７は、細胞の溶解物及び細胞培養上清液をサイトカイン・アレイで分析した結果を示している。対照群と比較したアレイ結果及び変化するスポットについての情報は、図１に示されている。表１で、括弧内に表示したサイトカインが、腫瘍細胞との共培養によって誘導されたサイトカインである。これらサイトカインは、UCB-MSCの遊走性を誘導する可能性が高い。
【００７１】
【表１】
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【００７２】
ＵＣＢ−ＭＳＣの単独培養、Ｕ−８７ ＭＧ細胞の単独培養、および両方の細胞の共培養から収集した馴化培地を調製した。各馴化培地をアレイ膜上で培養し、ＥＣＬ試薬によって可視化させた。次いで、可視化した馴化培地を、互いに比較した（図８）。図８Ａは、ＵＣＢ−ＭＳＣを単独で培養して調製した培地、及び対照培地からのサイトカイン抗体アレイの分析結果を示し、図８Ｂは、Ｕ−８７ ＭＧを単独で培養して調製した培地、およびＵＣＢ−ＭＳＣとＵ−８７ ＭＧを共培養して調製した培地からのサイトカイン抗体アレイの分析結果である。
【００７３】
図８Ｃは、Ｕ−８７ ＭＧが存在する場合および存在しない場合に培養されたＵＣＢ−ＭＳＣ（左側）またはＵＣＢ−ＭＳＣが存在する場合および存在しない場合に培養されたＵ−８７ ＭＧ（右側）からｍＲＮＡを分離して確認した結果である。ＩＬ−８特異的プライマーを用いてＲT−ＰＣＴを行い、ＧＡＰＤＨを対照として使用した。ＩＬ−８ ｍＲＮＡレベルをＲＴ−ＰＣＲで分析した結果、Ｕ−８７ ＭＧは、ＵＣＢ−ＭＳＣと共に培養する場合およびＵＣＢ−ＭＳＣを伴わずに培養する場合の両方で、ＩＬ−８を発現するということが確認された。
【００７４】
＜実施例８＞ＵＣＢ−ＭＳＣの移動に対するサイトカインの影響
ＵＣＢ−ＭＳＣの移動に対するＩＬ−８、ＧＲＯ−α、ＭＣＰ−１（ＲＮＤ Systems，ＭＮ，米国）の効果を、トランスウェル移動分析を利用して測定した。ＰＨＫ−２６で標識されたＵＣＢ−ＭＳＣを上の区画に置き、下の区画には、いかなる細胞も入れなかった。ＵＣＢ−ＭＳＣを、ＩＬ−８を含まない培地または異なる濃度の組換えヒトＩＬ−８を含む培地で２４時間培養した。その結果、ＩＬ−８で処理した場合、ＩＬ−８で処理しなかった場合と比較して、ＵＣＢ−ＭＳＣがより移動したことを見ることができる（図９Ａ）。
【００７５】
ＵＣＢ−ＭＳＣ上のＩＬ−８受容体は、抗ヒトＣＸＣケモカイン受容体１（ＣＸＣＲ１）抗体によって効果的に遮断されうる。ＵＣＢ−ＭＳＣを抗ＣＸＣＲ１抗体とあらかじめインキュベートした後、組換えＩＬ−８をＵＣＢ−ＭＳＣに再度添加した。ＩＬ−８によるＵＣＢ−ＭＳＣの移動が、抗ＣＸＣＲ１処理により、用量依存的に減少した（図９Ｂ）。抗ＣＸＣＲ２処理もやはり、同じ効果を示した。
【００７６】
ＧＲＯ−α処理も同様に、処理していない細胞と比較した場合、ＵＣＢ−ＭＳＣの移動を増大させた（図９Ｃ）。ＧＲＯ−αも、ＣＣサブファミリーに属し、ＣＸＣＲ２受容体と相互作用しうる［WuytsＡ．ら，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２５５，６７−７３（１９９８）］。
【００７７】
一方、ＭＣＰ−１で処理した培養では、ＵＣＢ−ＭＳＣの移動において、有意差は見られなかった（図９Ｄ）。これらのデータは、ＵＣＢ−ＭＳＣのＵ−８７ ＭＧ細胞への移動に、ＩＬ−８およびＧＲＯ−αが関与するということを強く示している。
【００７８】
＜実施例９＞ＩＬ−８を過剰発現するＡ５４９へのＵＣＢ−ＭＳＣの移動
さまざまながん細胞から分泌されたＩＬ−８の濃度と、それぞれのがん細胞に対するＵＣＢ−ＭＳＣの移動性との相関関係を調べた。図１０Ａは、Ｕ８７ ＭＧ（脳腫瘍）、ＫＡＴＯ ＩＩＩ（胃がん）、Ａ５４９（肺がん）、およびＰＬＣ／ＰＲＦ５（肝臓がん）の細胞を培養した培地で、分泌されたＩＬ−８の濃度を示すＥＬＩＳＡ結果である。１×１０５細胞当たりＩＬ−８の濃度で測定した。分析したがん細胞株のうち、Ｕ８７−ＭＧがＩＬ−８を最も多く産生した。このデータは、ＵＣＢ−ＭＳＣがＩＬ−８を産生する細胞に対して強い移動性向を有することを示唆した。さらに、他のヒト脳腫瘍細胞であるＬＮ１８，Ｕ１３８，Ｕ２５１細胞もやはり、Ｕ−８７ ＭＧと類似したＩＬ−８濃度レベルを示した（図１０Ｂ）。したがって、脳腫瘍細胞が分泌するＩＬ−８に対してＵＣＢ−ＭＳＣが遊走性を有するということを示している。
【００７９】
ＩＬ−８を低レベルに発現する細胞にＩＬ−８を添加した場合、ＵＣＢ−ＭＳＣの移動が誘導されるかを知るために、ヒト肺がん細胞であるＡ５４９でＩＬ−８を過剰発現させた。図１０Ｃは、Lipofectamine試薬を利用してＩＬ−８を低レベルに分泌するＡ５４９細胞にＩＬ−８遺伝子を導入して、ＩＬ−８を過剰発現させた後、ＵＣＢ−ＭＳＣの移動性を測定した結果を示す。図１０Ｃを参照すれば、Ａ５４９細胞よりＩＬ−８を過剰発現するＡ５４９細胞に移動したＵＣＢ−ＭＳＣの数がはるかに多かった。これは、ＩＬ−８がＵＣＢ−ＭＳＣ移動の強力な誘導因子であるということを示している。図１０Ｄは、Ｃの条件で、培地に分泌されたＩＬ−８の濃度をＥＬＩＳＡで測定した結果である。
【００８０】
＜実施例１０＞ＩＬ−８に対するＢＭ−ＭＳＣとＵＣＢ−ＭＳＣとの反応比較
ＢＭ−ＭＳＣがインビトロおよびインビボでＵ−８７ ＭＧ細胞に向かって移動するということは知られているので、ＢＭ−ＭＳＣとＵＣＢ−ＭＳＣとのＵ−８７ ＭＧ細胞に対する移動性と、ＩＬ−８に対する移動性とを比較した（図１１）。図１１Ａは、下の区画Ｂ、すなわちＵ８７ ＭＧに向かって移動したＢＭ−ＭＳＣとＵＣＢ−ＭＳＣとの遊走性を示したものであり、図１１Ｂは、ＩＬ−８で１４時間処理した場合、下の区画Ｂに移動したＢＭ−ＭＳＣとＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性を示したものである。図１１を参照すれば、ＵＣＢ−ＭＳＣがＢＭ−ＭＳＣよりも多く移動した。従って、ＵＣＢ−ＭＳＣは、ＩＬ−８に強く反応してさらに多く移動するが、ＢＭ−ＭＳＣの場合は、ＩＬ−８に比較的弱く反応したことが分かる。
【００８１】
＜実施例１１＞ＵＣＢ−ＭＳＣでのＩＬ−８の受容体であるＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２の発現レベル
ＵＣＢ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣとで、ＩＬ−８の受容体であるＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２の発現レベルを、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２各々においてｍＲＮＡとタンパク質とを測定して比較した。図１２Ａは、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２においてｍＲＮＡを分離した後、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２プライマーを使用して実施したＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。分離されたＲＮＡを定量するために、各試料にＧＡＰＤＨを含めた。図１２Ｂは、図１２Ａで得られたゲルの各ｍＲＮＡバンド強度を濃度計で測定することによってＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２の発現レベルを示した結果である（＊および＊＊、ｐ＜０．００１，ｎ＝４）。ＵＣＢ−ＭＳＣおよびＢＭ−ＭＳＣから分離したＲＮＡをすべてＲＴ−ＰＣＲ分析した結果、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２のＰＣＲ産物によるバンド密度が、ＢＭ−ＭＳＣに比べ、ＵＣＢ−ＭＳＣでさらに高かった。図１２Ｃは、抗ＣＸＣＲ１およびＣＸＲ２抗体を用いてＵＣＢ−ＭＳＣおよびＢＭ−ＭＳＣを免疫染色し、ＣＸＣＲ１とＣＸＣＲ２の発現レベルを特定することによって得た分析結果を示す（×４００）。図１２を参照すれば、ＵＣＢ−ＭＳＣおよびＢＭ−ＭＳＣは、ＣＸＣＲ１とＣＸＣＲ２の高い発現レベルを示した。ＩＬ−８がＣＸＣＲ１とＣＸＣＲ２とに対する親和度が高いので、ＵＣＢ−ＭＳＣのＵ−８７ ＭＧに対する上昇した移動性は、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２の上方制御された発現に起因したものであると見える。図１２Ｄは、抗ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２抗体で処理せずに二次抗体だけで処理したＵＣＢ−ＭＳＣおよびＢＭ−ＭＳＣを免疫染色して、抗ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２抗体の抗原特異性を特定することによって得た分析結果を示す。
【００８２】
＜実施例１２＞ＵＣＢ−ＭＳＣへの遺伝子導入
ＵＣＢ−ＭＳＣに遺伝子を導入する実験の例として、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を、amaxa biosystem社のヒトＭＳＣ neucleofectorを用いた電気穿孔法により過剰発現させた。４×１０５のＵＣＢ−ＭＳＣを二日間培養した後、ＧＦＰをコードする遺伝子５ｍｇとヒトＭＳＣ nucelofector１００ｍｌとの混合液中に１５分間静置し、エレクトロポレーターで遺伝子を導入した。得られたＵＣＢ−ＭＳＣをプレートに移し、２４時間後にＧＦＰの発現レベルを蛍光顕微鏡下で観察した。各間葉系幹細胞の細胞質で、ＧＦＰを観察できた（図１３）。
【００８３】
ＧＦＰをコードする遺伝子が導入されたＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性をテストするために、ＧＦＰをコードする遺伝子と空の遺伝子とをＵＣＢ−ＭＳＣでそれぞれ過剰発現させた後、Ｕ−８７ ＭＧに対する得られたＵＣＢ−ＭＳＣの遊走性を検証した。前記の通りに遺伝子を導入した後、トランスウェル・チャンバの上の区画にＧＦＰを発現するＵＣＢ−ＭＳＣを、トランスウェル・チャンバの下の区画にはＵ−８７ ＭＧを入れて、ＧＦＰを発現するＵＣＢ−ＭＳＣとＵ−８７ ＭＧを２４時間共培養した。下の区画に移動した細胞のうち、ＧＦＰ陽性細胞を確認した。その結果、ＧＦＰ遺伝子導入でＧＦＰが過剰発現されたＵＣＢ−ＭＳＣが、Ｕ８７ ＭＧ細胞に対して強い遊走性を示すことを確認することができた（図１４）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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