(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1個のプロリンまたはヒドロキシプロリンを構成成分として含む、直鎖ジペプチドおよび直鎖トリペプチドの少なくとも１種を含有する水溶液を0.5MPa以下の圧力で加熱して、少なくとも1個のプロリンまたはヒドロキシプロリンを構成成分として含む環状ジペプチドを得ることを含む、環状ジペプチドの製造方法であって、
前記直鎖ジペプチドが、X-Pro、X-Hyp、Pro-Y、またはHyp-Yで表されるジペプチドであり、かつ前記環状ジペプチドが、それぞれシクロ(X-Pro)、シクロ(X-Hyp)、シクロ(Pro-Y)、またはシクロ(Hyp-Y)であり、前記Xは、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシンおよびグリシンから成る群から選ばれる1種のアミノ酸であり、
Yはアルギニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、グリシン、プロリン、およびヒドロキシプロリンから成る群から選ばれる1種のアミノ酸であり、
前記直鎖トリペプチドが、X-Y-Zで表されるトリペプチドであり、かつ前記環状ジペプチドが、シクロ(X-Y)であり、前記Xはグリシンであり、Yはプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、Zは、アラニン、プロリンおよびヒドロキシプロリンから成る群から選ばれる1種のアミノ酸である、環状ジペプチドの製造方法。
【請求項２】
前記加熱の温度が70℃以上、100℃以下の温度である請求項1に記載の製造方法。
【請求項３】
前記直鎖ジペプチドまたは直鎖トリペプチドを含有する水溶液は、pHが2以上、10未満の範囲である請求項1〜2のいずれか1項に記載の製造方法。
【請求項４】
前記直鎖ジペプチドが、X-Pro、またはPro-Yで表されるジペプチドであり、かつ前記環状ジペプチドが、それぞれシクロ(X-Pro)、またはシクロ(Pro-Y)である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記直鎖トリペプチドが、X-Pro-Zで表されるトリペプチドであり、かつ前記環状ジペプチドが、シクロ(X-Pro)である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記直鎖ジペプチドおよび直鎖トリペプチドの少なくとも１種を含有する水溶液が、タンパク質の加水分解物の一部の成分として、前記直鎖ジペプチドまたは直鎖トリペプチドを含有する水溶液である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記直鎖ジペプチドおよび直鎖トリペプチドの少なくとも１種を含有する水溶液は、有機溶媒を含有しない、請求項1〜6のいずれか1項に記載の製造方法。
【請求項８】
グリシンおよび少なくとも1個のプロリンまたはヒドロキシプロリンを構成成分として含む、直鎖ジペプチドおよび直鎖トリペプチドの少なくとも１種を固相で加熱して、環状ジペプチドを得ることを含み、
前記直鎖ジペプチドは、Gly-ProまたはGly-Hypであり、かつ前記環状ジペプチドは、それぞれシクロ(Gly-Pro)、またはシクロ(Gly-Hyp)であり、
前記直鎖トリペプチドは、Gly-Pro-Z、またはGly-Hyp-Zで表されるトリペプチドであり、かつ前記環状ジペプチドが、それぞれシクロ(Gly-Pro)またはシクロ(Gly-Hyp)であり、前記Zがアラニン、プロリン、およびヒドロキシプロリンから成る群から選ばれる1種のアミノ酸である、
環状ジペプチドの製造方法。
【請求項９】
前記加熱の温度が120℃以上の温度である請求項8に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記加熱の温度が140℃超、200℃以下の温度である請求項8に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記直鎖ジペプチドは、Gly-Proであり、かつ前記環状ジペプチドは、シクロ(Gly-Pro)である、請求項8〜10のいずれか1項に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記直鎖トリペプチドは、Gly-Pro-Zで表されるトリペプチドであり、かつ前記環状ジペプチドが、シクロ(Gly-Pro)である、請求項8〜10のいずれか1項に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記直鎖ジペプチドまたは直鎖トリペプチドが、タンパク質の加水分解物の一部の成分として、前記直鎖ジペプチドまたは直鎖トリペプチドを含有する混合物である、請求項8〜12のいずれか1項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のアミノ酸配列を有する直鎖ジペプチドまたは直鎖トリペプチドから環状ジペプチドを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
環状ペプチド群は、抗腫瘍活性や抗ウイルス活性、抗菌活性等、多様な生理活性を示すことが報告されており、今後、医療、農業、食品等への応用が期待される(非特許文献1、2)。
【０００３】
従来、環状ペプチドは、まず前駆体となる直鎖ペプチドを適当な方法で合成し、次いでその直鎖ペプチドを環化させることにより合成されていた。一般にペプチドの環化反応は、まず、末端アミノ基を保護した直鎖ペプチドの活性エステルを合成し、次いで末端アミノ基の保護基を除去し、得られた直鎖ペプチドの活性エステルを大量の溶媒中に加えることにより行われてきた。
【０００４】
また別の方法として、ジペプチドを水と低沸点共沸混合物を形成する有機溶剤中で、水を共沸により留去することにより、環状ジペプチドを製造する方法が記載されている(特許文献1)
【０００５】
一方、近年、超臨界領域または亜臨界領域にある水(所謂、超臨界水または亜臨界水)を用いて環状ペプチドを合成する方法が提供されている。この方法は、溶媒として水を用いるために環境負荷がかからないことが利点である(特許文献2)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表2003-531197
【特許文献２】特開2003-252896
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】J. Pharm Pharmacol, 2000, 52(1), 75-82
【非特許文献２】Pharmazie 1999, 54(10), 772-775
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、特許文献1に記載の有機溶媒を用いる手法は、工業的に生産する場合、爆発等の危険があり、安全面に対応するための設備投資のためのコストや環境への負荷の大きさが課題となる。
【０００９】
特許文献2に記載の方法は、超臨界水または亜臨界水を用いての製造であるため、超臨界水または亜臨界水を生成し得る耐熱・耐圧性を有する高額で特別な設備を必要とし、更に工業的規模で生産する場合の設備投資は膨大なものとなる。
【００１０】
そこで本発明は、特許文献1に記載の方法のように有機溶媒を用いることなく、かつ特許文献2に記載の方法のように超臨界水または亜臨界水を用いることなく、比較的容易に環状ジペプチドを製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成する本発明の第一の態様は、少なくとも1個のプロリンまたはヒドロキシプロリンを構成成分として含む、直鎖ジペプチドおよび直鎖トリペプチドの少なくとも１種を含有する水溶液を加熱して、少なくとも1個のプロリンまたはヒドロキシプロリンを構成成分として含む環状ジペプチドを得ることを含む、環状ジペプチドの製造方法に関する。
【００１２】
本発明の第二の態様は、グリシンおよび少なくとも1個のプロリンまたはヒドロキシプロリンを構成成分として含む、直鎖ジペプチドおよび直鎖トリペプチドの少なくとも１種を固相で加熱して、環状ジペプチドを得ることを含む、環状ジペプチドの製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、特殊な製造設備を必要とせず、かつ有機溶媒やジペプチドを構成する一方のアミノ酸および多量のアルカリ金属塩を用いることなく、特定のアミノ酸を有する環状ジペプチドを製造できる。そのため、工業化が容易であり、より安価に環状ジペプチドの供給が期待できる。さらに、環境に負荷をかけずに、低コストで、且つ安全に環状ジペプチドを製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例2の逆相クロマトグラムを示す。
【図２】実施例4の逆相クロマトグラムを示す。
【図３】実施例5の逆相クロマトグラムを示す。
【図４】実施例6の逆相クロマトグラムを示す。
【図５】実施例8のサイズ排除クロマトグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
<本発明の第一の態様>
本発明の第一の態様では、原料として、少なくとも1個のプロリンまたはヒドロキシプロリンを構成成分として含む、直鎖ジペプチドおよび直鎖トリペプチドの少なくとも１種を用いる。
【００１６】
前記直鎖ジペプチドは、X-Pro、X-Hyp、Pro-Y、またはHyp-Yで表されるジペプチドであることができる。前記XおよびYは、アルギニン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、アラニン、グリシン、プロリン、グルタミン酸、グルタミン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、トリプトファン、システイン、ヒドロキシプロリンおよびヒドロキシリシンから成る群から選ばれる1種のアミノ酸である。XおよびYは、好ましくはグリシン、フェニルアラニン、ロイシン、ヒスチジン、プロリン、アラニン、ヒドロキシプロリン、またはアルギニンである。直鎖ジペプチドは、より具体的には、例えば、Gly-Pro、Phe-Pro、Leu-Pro、His-Pro、Pro-Gly、Pro-Hyp、Pro-Ala、Pro-Arg、Pro-Leu、またはHyp-Glyであることができる。
【００１７】
前記X-Pro、X-Hyp、Pro-Y、またはHyp-Yで表される直鎖ジペプチドから製造される環状ジペプチドは、それぞれシクロ(X-Pro)、シクロ(X-Hyp)、シクロ(Pro-Y)、またはシクロ(Hyp-Y)である。XおよびYは、直鎖ジペプチドにおけるXおよびYと同一である。環状ジペプチドは、例えば、シクロ(Gly-Pro)、シクロ(Phe-Pro)、シクロ(Leu-Pro)、シクロ(His-Pro)、シクロ(Pro-Hyp)、シクロ(Pro-Ala)、シクロ(Pro-Arg)、またはシクロ(Hyp-Gly)であることができる。
【００１８】
前記直鎖トリペプチドは、X-Y-Pro、X-Pro-Z、Pro-Y-Z、X-Y-Hyp、X-Hyp-ZまたはHyp-Y-Zで表されるトリペプチドであることができる。前記X、YおよびZは、独立に、アルギニン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、アラニン、グリシン、プロリン、グルタミン酸、グルタミン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、トリプトファン、システイン、ヒドロキシプロリンおよびヒドロキシリシンから成る群から選ばれる1種のアミノ酸である。XおよびYは、好ましくは独立にグリシン、プロリン、ヒドロキシプロリンである。直鎖トリペプチドは、より具体的には、例えば、Gly-Pro-Z、Gly-Hyp-Z、Pro-Pro-Z、Pro-Hyp-Z、Hyp-Pro-Z、Hyp-Hyp-Zであることができる。
【００１９】
X-Y-Pro、X-Pro-Z、Pro-Y-Z、X-Y-Hyp、X-Hyp-ZまたはHyp-Y-Zで表されるトリペプチドから製造される環状ジペプチドは、それぞれシクロ(X-Pro)、シクロ(Pro-Y)、シクロ(X-Y)、シクロ(X-Hyp)、またはシクロ(Hyp-X)である。環状ジペプチドは、好ましくはシクロ(Gly-Pro)、シクロ(Gly-Hyp)、シクロ(Pro-Pro)、シクロ(Pro-Hyp)、シクロ(Hyp-Hyp)であることができる。
【００２０】
本発明の第一の態様においては、上記直鎖ジペプチドおよび直鎖トリペプチドの少なくとも１種を含有する水溶液を加熱して、少なくとも1個のプロリンまたはヒドロキシプロリンを構成成分として含む環状ジペプチドを得る。
【００２１】
直鎖ジペプチドおよび直鎖トリペプチドの少なくとも１種を含有する水溶液は、直鎖ジペプチドおよび直鎖トリペプチドのいずれか1種を含有する水溶液であることができる他、直鎖ジペプチドの2種以上の混合物を含有する水溶液、直鎖トリペプチドの2種以上の混合物を含有する水溶液、1種以上の直鎖ジペプチドおよび1種以上の直鎖トリペプチドを含む水溶液であることもできる。さらに、直鎖ジペプチドおよび直鎖トリペプチドの少なくとも１種を含有する水溶液は、タンパク質の加水分解物の一部の成分として直鎖ジペプチドおよび直鎖トリペプチドの少なくとも１種、好ましくは2種以上を含有する水溶液であることもできる。タンパク質の加水分解物の一部の成分として直鎖ジペプチドおよび直鎖トリペプチドの少なくとも１種を含有する水溶液を用いることで、環状ジペプチドをより簡易に製造することができる。
【００２２】
直鎖ジペプチドおよび直鎖トリペプチドは任意の配列をペプチド合成するか、微生物または酵素を用いて合成するか、若しくはタンパク質を酵素により分解することで得ることができる。
【００２３】
前記加熱の温度は、直鎖ジペプチドまたは直鎖トリペプチドが脱水・環化反応を生じる温度であればよく、例えば、50℃以上の温度であることができる。加熱温度は高いほど、短い時間で脱水・環化反応を完了できるため、60℃以上であることが好ましく、70℃以上であることがより好ましい。一方、加熱温度が100℃を超える条件では、加圧下での加熱が必要となり、加圧の圧力が高くなればなるほど、耐圧性の高い装置が必要となることから、加熱の上限温度は150℃以下であり、好ましくは140℃以下である。より好ましい加熱温度は80℃〜100℃である。
【００２４】
加熱時の圧力は0.5 MPa以下であることが好ましく、より好ましくは、0.1 MPa〜0.2MPaの範囲である。
【００２５】
直鎖ジペプチドおよび直鎖トリペプチドの少なくとも１種を含有する水溶液は、pHを事前に調整しておくことが高い収率を得るという観点から好ましい。上記水溶液のpHは、2以上、10未満の範囲であることが好ましく、2〜9の範囲にあることがより好ましく、6〜8がより好ましい。水溶液のpH調整は、例えば、適当なpH緩衝剤を併用することで調整することができる。また、直鎖ジペプチドおよび直鎖トリペプチド自体が水溶液中で示すpHが上記範囲であれば、特にpH緩衝剤を併用することなくそのままのpHで反応させることもできる。あるいは、直鎖ジペプチドおよび直鎖トリペプチド並びに共存する他のアミノ酸等(例えば、タンパク質の加水分解物の場合)が、全体として示すpHが上記範囲である場合にも、特にpH緩衝剤を併用することなくそのままのpHで反応させることもできる。
【００２６】
加熱時間は、環状ジペプチドの収率等を考慮して適宜決定でき、例えば、2時間〜72時間の範囲であることができる。一般的傾向として、反応温度が高いほど、より短時間で高い収率を得ることができる。例えば、加熱温度は80℃〜100℃である場合、時間は、12〜36時間の範囲とすることができる。但し、これに限定される意図ではない。
【００２７】
上記条件下で直鎖ペプチドを含む水溶液を反応させると、直鎖ペプチドがジペプチドの場合、ジペプチドのN末端アミノ酸のアミノ基とC末端アミノ酸のカルボキシ基が脱水縮合し環状ジペプチドを生成する。また直鎖ペプチドがトリペプチドである場合、トリペプチドのN末端アミノ酸のアミノ基と2番目のアミノ酸のカルボキシ基とが環化し、さらに3番目のアミノ酸が脱離することで、環状ジペプチドを生成する。この方法で得られた生成物は、一般的な方法で精製、濃縮、乾燥し粉末として回収することができる。また、生成した環状ジペプチドの構造は、LC-MS/MS法やNMR法によって同定することができる。
【００２８】
<本発明の第二の態様>
本発明の第二の態様では、グリシンおよび少なくとも1個のプロリンまたはヒドロキシプロリンを構成成分として含む、直鎖ジペプチドおよび直鎖トリペプチドの少なくとも１種を原料として用いる。
【００２９】
より具体的には、前記直鎖ジペプチドは、グリシルプロリン(Gly-Pro)、プロリルグリシル(Pro-Gly)、グリシルヒドロキシプロリン(Gly-Hyp)またはヒドロキシプロリルグリシン(Hyp-Gly)の配列を含む物であることができる。直鎖ジペプチドは、例えば、Gly-Pro、Pro-Gly、Gly-HypまたはHyp-Glyであり、これらの直鎖ジペプチドから得られる環状ジペプチドは、それぞれシクロ(Gly-Pro)、またはシクロ(Gly-Hyp)である。
【００３０】
直鎖トリペプチドは、例えば、Gly-Pro-Z、Pro-Gly-Z、Gly-Hyp-ZまたはHyp-Gly-Zで表されるトリペプチドである。Zはアルギニン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、アラニン、グリシン、プロリン、グルタミン酸、グルタミン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、トリプトファン、システイン、ヒドロキシプロリンおよびヒドロキシリシンから成る群から選ばれる1種のアミノ酸である。Gly-Pro-ZまたはGly-Hyp-Zで表されるトリペプチドから得られる環状ジペプチドは、それぞれシクロ（Gly-Pro）またはシクロ（Gly-Hyp）である。
【００３１】
直鎖ジペプチドおよび直鎖トリペプチドの少なくとも１種は、直鎖ジペプチドおよび直鎖トリペプチドのいずれか1種であることができる他、直鎖ジペプチドの2種以上の混合物、直鎖トリペプチドの2種以上の混合物、直鎖ジペプチドおよび1種以上の直鎖トリペプチドを含む混合物であることもできる。さらに、直鎖ジペプチドおよび直鎖トリペプチドの少なくとも１種は、タンパク質の加水分解物の一部の成分として直鎖ジペプチドおよび直鎖トリペプチドの少なくとも１種、好ましくは2種以上を含有する水溶液であることもできる。タンパク質の加水分解物の一部の成分として直鎖ジペプチドおよび直鎖トリペプチドの少なくとも１種を含有する混合物であることもできる。この場合、環状ジペプチドをより簡易に製造することができる。
【００３２】
本発明の第二の態様では、上記直鎖ジペプチドおよび直鎖トリペプチドの少なくとも１種を固相で加熱して、環状ジペプチドを得る。固相での加熱は、ペプチドが局所的に過剰に加熱されることを防ぎながら、極力均一に加熱することが好ましい。そのためには、直鎖ジペプチドおよび直鎖トリペプチドの少なくとも１種は粉末であることが好ましく、かつ種々の粉末の加熱方法を適用することができる。直鎖ジペプチドおよび直鎖トリペプチドの少なくとも１種の粉末は、例えば、バッチ式で加熱することもできるが、例えば、噴霧乾燥機等を用いて連続的に加熱することもできる。
【００３３】
加熱の温度は、直鎖ジペプチドまたは直鎖トリペプチドが固相にて脱水・環化反応を生じる温度であればよく、例えば、120℃以上の温度であることができる。加熱温度は高いほど、短い時間で脱水・環化反応を完了できるため、140℃超であることが好ましく、150℃以上であることがより好ましい。一方、加熱温度が220℃を超える条件では、生成物である環状ジペプチドの分解のおそれもあるので、加熱の上限温度は220℃以下であり、好ましくは180℃以下である。より好ましい加熱温度は150℃〜200℃である。
【００３４】
上記加熱は固相反応であるので、大気圧下において行うことができる。
【００３５】
加熱時間は、加熱温度および環状ジペプチドの収率を考慮して数分〜1時間の範囲で適宜選択することができる。加熱温度が高いほど、より短時間で反応が進行し、完了する。
【００３６】
本発明の第一の態様および第二の態様のいずれの方法によっても、環状ジペプチドを製造することができる。製造された環状ジペプチドを含む生成物は、そのまま利用することもできるが、環状ジペプチドを精製することもできる。環状ジペプチドの精製は、共存物の種類や量に応じて適宜選択することができる。
【００３７】
以上のように、本発明の第一の態様および第二の態様の方法を用いることで、特殊な設備を必要とせず、安価で安全に環状ペプチドを製造することができる。また、使用する溶媒は水であるため、有機溶媒の使用による環境負荷をなくすことができる。
【実施例】
【００３８】
以下に、本発明を実施例によりより具体的に詳細に説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。
【００３９】
実施例において、生成した環状ジペプチドの収率は高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて行った。
HPLCの分析条件を以下に示す。
【００４０】
逆相クロマトグラフィーの分析条件
Colum : TSKgel ODS-80Ts (4.6 mm×150 mm)
Eluent : A) H2O/TFA (100/0.1)、B) Acetonitrile/ H2O/TFA(50/50/0.1)
Temperature : 40℃
Flow rate : 1 mL/min
Gradient Conditions : 0-15 mins 0% B、15 to 30 mins 90% B、30 to 33 mins 100% B、33 to 35 mins 0% B、35 to 50 mins 0% B
Detection : UV at 214 nm
【００４１】
サイズ排除クロマトグラフィーの分析条件
Colum : Superdex peptide (10 mm×300 mm)
Eluent : 100 mM Tris/HCl (pH 7.4)
Temperature : 30℃
Flow rate : 1 mL/min
Detection : UV at 214 nm
【００４２】
生成物の収率は、クロマトグラムの全面積あたりの生成物の面積比から算出した。
【００４３】
<実施例1>
直鎖ジペプチド、4-ヒドロキシ-プロリルグリシン(Hyp-Gly)(Bachem社製) 1.88 mgを、0.1 Mリン酸緩衝液(pH 8)100μlに溶解し、90℃で24時間インキュベートした。得られた生成物を逆相クロマトグラフィーにより分析した。分析の結果、Hyp-Glyを含む溶液からシクロ-4-ヒドロキシ-プロリルグリシンが生成し、収率は約60%であった。
【００４４】
<実施例2>
直鎖ジペプチド、プロリル-4-ヒドロキシ-プロリン(Pro-Hyp)(Bachem社製) 1.88 mgを、0.1 Mリン酸緩衝液(pH 8)100μlに溶解し、80℃で48時間インキュベートした。得られた生成物を逆相クロマトグラフィーにより分析した。逆相クロマトグラフィーの結果、Pro-Hypを含む溶液からシクロプロリル-4-ヒドロキシ-プロリンがほぼ定量的に生成した。
【００４５】
<実施例3>
直鎖ジペプチド、フェニルアラニルプロリン(Phe-Pro)(Bachem社製)2.62 mgを、0.1 Mリン酸緩衝液(pH 8)100μlに溶解し、90℃で24時間インキュベートした。得られた生成物を逆相クロマトグラフィーにより分析した。分析の結果、Phe-Proを含む溶液からシクロフェニルアラニルプロリンが生成し、収率は95%以上であった。
【００４６】
<実施例4>
直鎖ジペプチド、グリシルプロリン(Gly-Pro)(Bachem社製) 1.72 mgを、0.1 Mリン酸緩衝液(pH 8)100μlに溶解し、80℃で48時間インキュベートした。得られた生成物を逆相クロマトグラフィーにより分析した。分析の結果、Gly-Proを含む溶液からシクログリシルプロリンが生成し、収率は約80%であった。
【００４７】
<実施例5>
直鎖トリペプチド、グリシルプロリルアラニン(Gly-Pro-Ala) (SIGMA社製) 2.43 mgを、0.1 Mリン酸緩衝液(pH 8)100μlに溶解し、95℃で18時間インキュベートした。得られた生成物を逆相クロマトグラフィーにより分析した。分析の結果、Gly-Pro-Alaを含む溶液からシクログリシルプロリンが生成し、収率は90%以上であった。
【００４８】
<実施例6>
直鎖トリペプチド、グリシルプロリル-4-ヒドロキシ-プロリン(Gly-Pro-Hyp) (Bachem社製) 2.85 mgを、0.1 Mリン酸緩衝液(pH 8)100μlに溶解し、80℃で48 時間インキュベートした。得られた生成物を逆相クロマトグラフィーにより分析した。分析の結果、Gly-Pro-Hypを含む溶液からシクログリシルプロリンが生成し、収率は80%以上であった。
【００４９】
<実施例7>
直鎖ペプチド原料として、コラーゲン分解物である直鎖トリペプチドを15%以上含有する、HACP(ゼライス社製)を用いた。HACP 100 mgを純水900μlに溶解し、を60℃で72時間インキュベートした。得られた生成物をサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。分析の結果、HACPの18%含まれていたトリペプチドのうち12%が環化・脱離し、環状ジペプチドシクロ(Gly-Pro)が生成した。
【００５０】
<実施例8>
直鎖ペプチド原料として、コラーゲン分解物である直鎖トリペプチドを25%以上含有する、CTP M-30(ゼライス社製)を用いた。CTP M-30はトリペプチドを25%以上含む製品である。CTP M-30 100 mgを純水900μlに溶解し、95℃で18時間インキュベートした。得られた生成物をサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。分析の結果、CTP M-30の31%含まれていたトリペプチドのうち16%が環化・脱離し、環状ジペプチドシクロ(Gly-Pro)が生成した。
【００５１】
<実施例9>
直鎖ペプチド原料として、コラーゲン分解物である直鎖トリペプチドを55%以上含有する、CTP-F60(ゼライス社製)を用いた。CTP-F60はトリペプチドを55%以上含む製品である。CTP-F60 100 mgを純水900μlに溶解し、80℃で48時間インキュベートした。得られた生成物をサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。分析の結果、CTP-F60の58%含まれていたトリペプチドのうち28%が環化・脱離し、環状ジペプチドシクロ(Gly-Pro)が生成した。
【００５２】
<実施例10>
直鎖ペプチド原料として、コラーゲン分解物である直鎖トリペプチドを85%以上含有する、CTP M-90(ゼライス社製) を用いた。CTP M-90はトリペプチドを85%以上含む製品である。CTP M-90 100 mgを純水900μに溶解し、90℃で24時間インキュベートした。得られた生成物をサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。分析の結果、CTP M-90の89%含まれていたトリペプチドのうち65%が環化・脱離し、環状ジペプチドシクロ(Gly-Pro)が生成した。
【００５３】
<実施例11>
直鎖ジペプチド、グリシルプロリン(Gly-Pro)(Bachem社製)を、160℃で30分間インキュベートした。得られた生成物を逆相クロマトグラフィーにより分析した。分析の結果、Gly-Proからシクロ(Gly-Pro)がほぼ定量的に生成した。
【００５４】
<実施例12>
(1-1)ジペプチド試料X-Yを濃度0.1mol/Lとなるようにリン酸緩衝液(pH8) 0.1mol/Lに溶解し、得られた水溶液を90℃で24hrインキュベートした。環状ジペプチド収率を実施例1と同様に求めて、「水溶液中収率」として表１に示す。
(2-1)固相加熱：ジペプチド試料X-Y粉末を180℃で15分間加熱した。環状ジペプチド収率を実施例11と同様に求めて「固相加熱収率」として表１に示す。
【００５５】
【表１】
0005456876.tif 000002
【００５６】
(1-2)トリペプチド試料X-Y-Zを濃度0.1mol/Lとなるようにリン酸緩衝液(pH8) 0.1mol/Lに溶解し、得られた水溶液を90℃で24hrインキュベートした。環状ジペプチド収率を実施例1と同様に求めて、「水溶液中収率」として表2に示す。
(2-2)固相加熱：トリペプチド試料X-Y-Z粉末を180℃で15分間加熱した。環状ジペプチド収率を実施例11と同様に求めて「固相加熱収率」として表2に示す。
【００５７】
【表２】
0005456876.tif 000003
【００５８】
<実施例13>
加熱温度の影響試験
ジペプチド試料Gly-Proを試料濃度0.1mol/Lとなるようにリン酸緩衝液(pH8) 0.1mol/Lに溶解し、表３に示す条件(温度および時間)でインキュベートした。インキュベート後の環状ジペプチド収率をHPLCで測定した。結果を表3に示す。
【００５９】
【表３】
0005456876.tif 000004
【００６０】
<実施例14>
pH影響試験
ジペプチド試料Gly-Proを試料濃度0.1mol/Lとなるようにリン酸緩衝液またはクエン酸緩衝液0.1mol/Lに溶解し、表4に示すpHに調整した後に、90℃で24hrインキュベート後、HPLCで環状ジペプチド収率を測定した。結果を表4に示す。
【００６１】
【表４】
0005456876.tif 000005
【００６２】
<実施例15>
固相加熱における加熱温度の影響試験
ジペプチド試料Gly-Pro粉末を表5に示す条件(温度および時間)で加熱後、粉末を溶離液で溶解し、HPLCで環状ジペプチド収率を測定した。結果を表5に示す。
【００６３】
【表５】
0005456876.tif 000006
【要約】
【課題】有機溶媒を用いることなく、かつ超臨界水または亜臨界水を用いることなく、比較的容易に環状ジペプチドを製造する方法を提供すること。
【解決手段】少なくとも1個のプロリンまたはヒドロキシプロリンを構成成分として含む、直鎖ジペプチドおよび直鎖トリペプチドの少なくとも１種を含有する水溶液を加熱して、少なくとも1個のプロリンまたはヒドロキシプロリンを構成成分として含む環状ジペプチドを得ることを含む、環状ジペプチドの製造方法。グリシンおよび少なくとも1個のプロリンまたはヒドロキシプロリンを構成成分として含む、直鎖ジペプチドおよび直鎖トリペプチドの少なくとも１種を固相で加熱して、環状ジペプチドを得ることを含む、環状ジペプチドの製造方法。
【選択図】なし【図１】
0005456876.tif 000007
【図２】
0005456876.tif 000008
【図３】
0005456876.tif 000009
【図４】
0005456876.tif 000010
【図５】
0005456876.tif 000011