(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３つ以上のｓｉＲＮＡが各々の一末端で、リンカーなしで互いに接合されている多重ｓｉＲＮＡに陽イオン性細胞伝達体が結合されている、細胞内の伝達能が増加したｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項２】
前記３つ以上のｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’方向末端と、隣接するｓｉＲＮＡのセンス鎖の５’末端とで互いに接合されていることを特徴とする請求項１に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項３】
前記ｓｉＲＮＡは化学的修飾を含むことを特徴とする請求項１または２に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項４】
前記化学的修飾は、前記ｓｉＲＮＡに含まれる少なくとも１つのヌクレオチドのリボースの２’位置のヒドロキシル基が水素原子、フッ素原子、−Ｏ−アルキル基、−Ｏ−アシル基、及びアミノ基のいずれか一つに置換されることを特徴とする請求項３に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項５】
前記多重ｓｉＲＮＡは異なるｓｉＲＮＡより構成されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項６】
前記陽イオン性細胞伝達体は電荷相互作用により結合されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項７】
前記陽イオン性細胞伝達体は、陽イオン性ポリマーまたは陽イオン性脂質であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項８】
前記陽イオン性細胞伝達体は、ポリエチレンイミンまたはリポソームであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の複合体を細胞内に導入することを含むｓｉＲＮＡの細胞内の伝達方法（伝達される細胞がヒトの体にある細胞を除く）。
【請求項１０】
３つ以上の官能基を有する化合物にｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンタゴｍｉＲ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、及びアプタマーからなる群から選択される３つ以上の核酸オリゴヌクレオチドの各々の一末端が連結している多機能性核酸構造体であって、前記３つ以上の官能基を有する化合物はホスホアミダイト化合物、ヨードアセチル化合物、マレイミド化合物、エポキシド化合物、チオール−ジスルフィド化合物、チオール化されたエルマン試薬、ＮＨＳまたはｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ化合物及びイソシアネート化合物からなる群から選択されることを特徴とする多機能性核酸構造体。
【請求項１１】
前記３つ以上の官能基を有する化合物の各官能基に核酸断片が連結しており、そして前記ｓｉＲＮＡのセンスまたはアンチセンスの一つの鎖、ｍｉＲＮＡ、アンタゴｍｉＲ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム及びアプタマーから選択される一つに、前記核酸断片と相補的に結合できる配列を導入することによって、前記核酸オリゴヌクレオチドのそれぞれが、前記核酸断片に、相補的結合により連結されることを特徴とする請求項１０に記載の多機能性核酸構造体。
【請求項１２】
前記多機能性核酸構造体は１以上のｓｉＲＮＡを含むことを特徴とする請求項１０または１１に記載の多機能性核酸構造体。
【請求項１３】
前記多機能性核酸構造体は３つ以上のｓｉＲＮＡより構成されることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の多機能性核酸構造体。
【請求項１４】
前記多機能性核酸構造体は互いに異なる三つのｓｉＲＮＡより構成されることを特徴とする請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の多機能性核酸構造体。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドは化学的修飾を含むことを特徴とする請求項１０に記載の多機能性核酸構造体。
【請求項１６】
前記化学的修飾は、前記オリゴヌクレオチドに含まれる少なくとも１つのヌクレオチドのリボースの２’位置のヒドロキシル基が水素原子、フッ素原子、−Ｏ−アルキル基、−Ｏ−アシル基、及びアミノ基のいずれか一つに置換されることを特徴とする請求項１５に記載の多機能性核酸構造体。
【請求項１７】
請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の多機能性核酸構造体に陽イオン性細胞伝達体が結合されている、細胞内の伝達能が増加した多機能性核酸構造複合体。
【請求項１８】
前記陽イオン性伝達体は電荷相互作用により結合されることを特徴とする請求項１７に記載の多機能性核酸構造複合体。
【請求項１９】
前記陽イオン性細胞伝達体は、陽イオン性ポリマーまたは陽イオン性脂質であることを特徴とする請求項１７または１８に記載の多機能性核酸構造複合体。
【請求項２０】
前記陽イオン性伝達体は、ポリエチレンイミンまたはリポソームであることを特徴とする請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の多機能性核酸構造複合体。
【請求項２１】
請求項１７から２０のいずれか一項に記載の多機能性核酸構造複合体を細胞内に導入することを含む多機能性核酸構造体の細胞内の伝達方法（伝達される細胞がヒトの体にある細胞を除く）。
【請求項２２】
３つ以上の官能基を有する化合物にｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンタゴｍｉＲ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム及びアプタマーからなる群から選択される核酸オリゴヌクレオチドの一末端を連結させることを特徴とする多機能性核酸構造体の製造方法であって、前記３つ以上の官能基を有する化合物はホスホアミダイト化合物、ヨードアセチル化合物、マレイミド化合物、エポキシド化合物、チオール−ジスルフィド化合物、チオール化されたエルマン試薬、ＮＨＳまたはｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ化合物及びイソシアネート化合物からなる群から選択される多機能性核酸構造体の製造方法。
【請求項２３】
前記３つ以上の官能基を有する化合物の各官能基に核酸断片が連結すること、そして前記オリゴヌクレオチドに前記核酸断片と相補的に結合できる配列を導入し、前記核酸断片に相補的に連結されることを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
次の工程を含む、細胞内の伝達能が増加した多機能性核酸構造複合体の製造方法：
（ａ）ホスホアミダイト化合物、ヨードアセチル化合物、マレイミド化合物、エポキシド化合物、チオール−ジスルフィド化合物、チオール化されたエルマン試薬、ＮＨＳまたはｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ化合物及びイソシアネート化合物からなる群から選択される３つ以上の官能基を有する化合物にｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンタゴｍｉＲ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム及びアプタマーからなる群から選択される核酸オリゴヌクレオチドの一末端を連結して、多機能性核酸構造体を製造する工程；及び
（ｂ）前記多機能性ＲＮＡ構造に陽イオン性細胞伝達体を電荷相互作用によって結合させる工程。
【請求項２５】
前記（ａ）工程は３つ以上の官能基を有する化合物の各官能基に核酸断片が連結し、そして前記オリゴヌクレオチドに前記核酸断片と相補的に結合できる配列を導入し、前記核酸断片との相補的に連結される工程を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸断片は配列番号４２の塩基配列を含むことを特徴とする請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記オリゴヌクレオチドは化学的修飾を含むことを特徴とする請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記陽イオン性細胞伝達体は、陽イオン性ポリマーまたは陽イオン性脂質であることを特徴とする請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ複合体を含有する遺伝子発現抑制用組成物。
【請求項３０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ複合体を含有する抗癌組成物。
【請求項３１】
請求項１０〜２０のいずれか一項に記載の多機能性核酸構造複合体を含有する遺伝子発現抑制用組成物。
【請求項３２】
請求項１０〜２０のいずれか一項に記載の多機能性核酸構造複合体を含有する抗癌組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞内の伝達能が増加したｓｉＲＮＡ複合体及び多機能性核酸構造複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉（RNA interference：ＲＮＡｉ）は非常に特異的で、効率的に遺伝子発現を抑制できるメカニズムであり、これは目的遺伝子のｍＲＮＡと相同の配列を有するセンスと、これと相補的な配列を有するアンチセンスで構成される２本鎖ＲＮＡ（以下、「ｄｓＲＮＡ」と称する）を細胞等に導入して、目的遺伝子ｍＲＮＡの分解を誘導することによって目的遺伝子の発現を抑制する。
【０００３】
このようなＲＮＡｉ手法に対し今まで活性及び／または細胞内の伝達効率を上げるための修飾等に対する研究が進められ、将来、癌やウィルス性感染を含んだ多くの病気の治療のための効果的な治療剤になると期待された。多くの研究者は、低分子干渉ＲＮＡ（small interfering RNA：ｓｉＲＮＡ）及び低分子ヘアピン型ＲＮＡ（short hairpin RNA：ｓｈＲＮＡ）のような多様なＲＮＡｉ手法を用いて、成功裡にウィルスの複製を抑制した（Jacque J.M. et al., Nature,418:435, 2002; Novina C.D. et al., Nat. Med., 8:681, 2002; Nishitsuji H. et al., Microbes Infect., 6:76, 2004）。しかし、ＲＮＡｉ機構によって、一つの目的遺伝子だけを発現抑制させる場合、ウイルスゲノム内部の目的遺伝子の一つのヌクレオチドの置換乃至欠失によって、ウィルスがＲＮＡｉ媒介遺伝子発現抑制機構から外れる場合があると報告された（Westerhout E.M. et al., Nucleic Acids Res., 33:796, 2005）。これと共にウィルスが遺伝子発現抑制機構から逃れることを最小にするための１つの方案はウイルスゲノム内の多様な部分をターゲッティングする多重ＲＮＡｉ機構を誘導することである。
【０００４】
一方、ウィルス複製抑制だけでなく、ＲＮＡｉ機構は癌治療のための薬としても開発されてきた。ＲＮＡｉは細胞サイクル停止を誘導して、腫瘍生存に本質的な遺伝子をターゲッティングして、癌細胞にアポトーシス（apoptosis）を誘導することができる。ここで、多数の遺伝子に対する同時多発的な遺伝子発現の抑制は、癌細胞に強いアポトーシスを誘導するようになると報告されている（Menendez J.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 101:10715, 2004）。そこで、ＲＮＡｉ機構を利用して、複数の目的遺伝子を発現抑制させるための効率的な戦略の開発が求められる。
【０００５】
しかし、現在までは、多重標的ＲＮＡｉ機構は主にｓｈＲＮＡ発現システムを基盤として開発されてきた（Konstantinova P. et al., Gene Ther., 13:1403, 2006; ter Brake O. et al., Mol. Ther., 14:883, 2006; Watanabe T. et al., Gene Ther., 13:883, 2006）。また、Ｋｈａｌｅｄ等は、非ウィルス性ｓｉＲＮＡ伝達のために、ｐｈｉ２９  ＲＮＡ骨格に基づいた多重ｓｉＲＮＡを含むＲＮＡナノ構造を作製したが（Khaled A. et al., Nano Lett., 5:1797, 2005）、このようなＲＮＡ骨格構造は、その長さが長すぎて、化学的に合成できず、その実際の使用には制限があった。従って、多重ｓｉＲＮＡに適用可能であると共に、化学的に合成することのできる新しい構造のｓｉＲＮＡ構造体開発が求められている。
【０００６】
一方、ｓｉＲＮＡ手法において、さらなる障害はｓｉＲＮＡを細胞内に効率的に伝達することであり、従来知らされたｓｉＲＮＡ構造の２１塩基対のｓｉＲＮＡはプラスミドＤＮＡと比較すると、ＰＥＩのような陽イオンポリマーと結合するには適しないことが報告された（Balcato-Bellemin A.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 104:16050, 2007）。
【０００７】
そこで、本発明者は複数の遺伝子を発現抑制でき、かつ向上した細胞内の伝達能を有する新しいｓｉＲＮＡ複合体を提供しようと鋭意努力した結果、特定構造で多重ｓｉＲＮＡと多機能性核酸構造体を作製して、これらを各々陽イオン性細胞伝達体と共に複合体を形成させた後、効果的に複数の遺伝子を発現抑制させかつ顕著に向上した細胞伝達能を有することを確認して、本発明の完成に至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、複数の遺伝子を発現抑制でき、同時に向上した細胞内の伝達能を有する新しいｓｉＲＮＡ複合体を提供することである。
本発明の他の目的は、向上した細胞内の伝達能を有する新しい構造の多機能性核酸構造複合体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明は、３つ以上のｓｉＲＮＡが各々の一末端で互いに接合されている多重ｓｉＲＮＡに陽イオン性細胞伝達体が結合されている、細胞内の伝達能が増加したｓｉＲＮＡ複合体を提供する。
本発明はまた、前記ｓｉＲＮＡ複合体を細胞内に導入することを含むｓｉＲＮＡの細胞内の伝達方法を提供する。
本発明はまた、３つ以上の官能基を有する化合物にｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンタゴｍｉＲ（ａｎｔａｇｏｍｉＲ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム（ribozyme）及びアプタマーからなる群から選択される３つ以上の核酸オリゴヌクレオチドの各々の一末端が連結している多機能性核酸構造体を提供する。
本発明はまた、前記多機能性核酸構造体に陽イオン性細胞伝達体が結合されている、細胞内の伝達能が増加した多機能性核酸構造複合体を提供する。
本発明はまた、前記多機能性核酸構造複合体を細胞内に導入することを含む多機能性核酸構造の細胞内の伝達方法を提供する。
本発明はまた、３つ以上の官能基を有する化合物にｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンタゴｍｉＲ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム及びアプタマーからなる群から選択される核酸オリゴヌクレオチドの一末端を連結させることを特徴とする多機能性核酸構造体の製造方法を提供する。
【００１０】
本発明はまた、次の工程を含む、細胞内の伝達能が増加した多機能性核酸構造複合体の製造方法を提供する：
（ａ）３つ以上の官能基を有する化合物にｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンタゴｍｉＲ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム及びアプタマーからなる群から選択される核酸オリゴヌクレオチドの一末端を連結して、多機能性核酸構造体を製造する工程；及び
（ｂ）前記多機能性ＲＮＡ構造に陽イオン性細胞伝達体を電荷相互作用によって結合させる工程。
本発明はまた、前記ｓｉＲＮＡ複合体を含有する遺伝子発現抑制用組成物を提供する。
本発明はまた、前記ｓｉＲＮＡ複合体の遺伝子発現抑制用用途を提供する。
本発明はまた、前記ｓｉＲＮＡ複合体を細胞内に導入することを特徴とする遺伝子発現抑制方法を提供する。
本発明はまた、前記ｓｉＲＮＡ複合体を含有する抗癌組成物を提供する。
本発明はまた、前記ｓｉＲＮＡ複合体の抗癌用途を提供する。
本発明はまた、前記ｓｉＲＮＡ複合体を細胞内に導入することを特徴とする癌の抑制または治療方法を提供する。
本発明はまた、前記多機能性核酸構造複合体を含有する遺伝子発現抑制用組成物を提供する。
本発明はまた、前記多機能性核酸構造複合体の遺伝子発現抑制用用途を提供する。
本発明はまた、前記多機能性核酸構造複合体を細胞内に導入することを特徴とする遺伝子発現抑制方法を提供する。
本発明はまた、前記多機能性核酸構造複合体を含有する抗癌組成物を提供する。
本発明はまた、前記多機能性核酸構造複合体の抗癌用途を提供する。
本発明はまた、前記多機能性核酸構造複合体を細胞内に導入することを特徴とする癌の抑制または治療方法を提供する。
本発明はまた、前記遺伝子発現用抑制用組成物を含む遺伝子発現抑制用キットを提供する。
本発明はまた、前記ｓｉＲＮＡ複合体または多機能性核酸構造複合体のウィルス治療剤としての用途を提供する。
本発明の他の特徴及び実施態様は下記の詳細な説明及び特許請求の範囲からより一層明白になる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明に係る多重ｓｉＲＮＡ複合体の多重ｓｉＲＮＡのtｓｉＲＮＡの構造（ａ）及び本発明に係るｓｉＲＮＡ複合体の遺伝子抑制活性を示すグラフ（ｂ）〜（ｄ）である。
【図２】本発明に係る多重ｓｉＲＮＡをＰＥＩと結合させた場合（ａ）と、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００と結合させた場合（ｂ）の遺伝子抑制活性を示したグラフである。
【図３】ＦＩＴＣラベルしたｓｉＲＮＡ混合物（ｓｉＬａｍｉｎ、ｓｉＤＢＰ、ＦＩＴＣ−ｓｉＴＩＧ３）とＦＩＴＣラベルしたｔｓｉＲＮＡ（ＦＩＴＣ−ｔｓｉＲＮＡ）をＰＥＩと結合させてＨｅＬａ細胞に導入した後、蛍光顕微鏡で観察した写真である。
【図４】ＣＶＡ２４ゲノムの互いに異なる部位をターゲットにする本発明に係る多重ｓｉＲＮＡ（tｓｉＲＮＡ−ＣＶＡ）構造（ａ）及びこれと各々前記部位をターゲットにする三つのｓｉＲＮＡ混合物をＰＥＩを利用して、三つの互いに異なるウィルス塩基配列を含む各々のルシフェラーゼベクターと共に細胞内に導入した後、相対的なルシフェラーゼ活性を測定して、比較したグラフ（ｂ）である。
【図５】本発明に係るｓｉＲＮＡ構造が従来の１９＋２  ｓｉＲＮＡと同様なＲＮＡｉ機構によって、遺伝子発現を抑制させるか確認するために、５’ＲＡＣＥ分析を行った結果である。
【図６】本発明に係るｓｉＲＮＡ構造が非特異的な抗ウィルス性反応を起こすか確認するために、ｓｉＲＮＡ混合物とtｓｉＲＮＡをＰＥＩと結合して、導入させた後、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）の誘導レベルをＲＴ−ＰＣＲ方法によって、測定した比較グラフである。
【図７】本発明において使用されたＴｒｅｂｌｅｒ  ｔｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎ（Ｔ−ｔｉＳｕｒｖｉｖｉｎ）の構造である。
【図８】Ｔｒｅｂｌｅｒ  ｔｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎの対照群として使用されたｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎとｌｏｎｇ  ｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎの塩基配列である。
【図９】Ｔ−ｔｉＳｕｒｖｉｖｉｎ−ＰＥＩ伝達体の遺伝子発現効率を示したグラフである。
【図１０】ｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎ、ｓｉインテグリン及びｓｉβ−カテニンをＴｒｅｂｌｅｒホスホアミダイトに結合させて、製造したＴ−ｔｉＲＮＡ構造（ａ）及び遺伝子発現抑制効率を示したグラフ（ｂ）である。
【図１１】Ａｎｔｉ−ｍｉＲ２１、ｓｉインテグリン及びｓｉβ−カテニンをＴｒｅｂｌｅｒホスホアミダイトに結合させて、製造したＭＴ−ｔｉＲＮＡ構造（ａ）及び遺伝子発現抑制効率を示したグラフ（ｂ）である。
【図１２】Ｔ−ｔｉＡｎｔｉ−ｍｉＲ２１の導入時、ルシフェラーゼ活性を比較したグラフである。
【図１３】Ｔ−ｔｉＳｕｒｖｉｖｉｎ複合体のＨＳによる分離率を確認するための電気泳動結果（ａ）と、ＦＩＴＣを利用して、細胞内の伝達能を測定した写真（ｂ）及びフローサイトメトリーを利用して、蛍光強度を測定した結果（ｃ）及び（ｄ）である。
【図１４】Ｔ−ｔｉＳｕｒｖｉｖｉｎ複合体の遺伝子発現抑制効率を確認したグラフ（ａ）と、Ｔ−ｔｉＳｕｒｖｉｖｉｎ複合体導入後ＨｅｐＧ２細胞成長抑制効能を示したグラフ（ｂ）及び顕微鏡イメージ（ｃ）である。
【図１５】ｔｉＲＮＡ複合体でトランスフェクションされたＴ９８Ｇ細胞でのＩＦＩＴＩ  ｍＲＮＡ（ａ）、ＩＦＮ−βｍＲＮＡ（ｂ）及びＯＡＳ２  ｍＲＮＡ（ｃ）の発現程度を示したグラフである。
【図１６】Ｄｉｃｅｒ処理前後の２７ｂｐのｄｓＲＮＡ、ｓｉＬａｍｉｎ、ｔｓｉＲＮＡ、ｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎ及びＴ−ｔｉＳｕｒｖｉｖｉｎを電気泳動した結果である。
【図１７】ｔｓｉＲＮＡの一部ヌクレオチドを化学的に修飾させた構造である。
【図１８】Ｔ−ｔｉＳｕｒｖｉｖｉｎの一部ヌクレオチドを化学的修飾させた構造である。
【図１９】化学的修飾を有するｔｓｉＲＮＡ（ＯＭｅ）（ａ）及びＴ−ｔｉＳｕｒｖｉｖｉｎ（ＯＭｅ）（ｂ）のＤｉｃｅｒ処理後電気泳動した結果である。
【図２０】化学的修飾を有するｔｓｉＲＮＡ（ＯＭｅ）（ａ）及びＴ−ｔｉＳｕｒｖｉｖｉｎ（ＯＭｅ）（ｂ）の遺伝子発現抑制効率を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
本発明の詳細な説明などにおいて使用される主な用語の定義は、下記の通りである。
【００１３】
本願において「ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）」とは、配列特異的に効率的な遺伝子発現抑制（gene silencing）を媒介する短い２本鎖のＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を意味する。
【００１４】
本願において「遺伝子」とは、最広義の意味と見なされるべきであり、構造蛋白質または調節蛋白質をコードすることができる。ここで、調節蛋白質は転写因子、熱ショック蛋白質またはＤＮＡ／ＲＮＡ複製、転写及び／または翻訳に係る蛋白質を含む。また、本発明において、発現抑制の対象になる目的遺伝子は、ウイルスゲノムに内在するもので、動物遺伝子にインテグレートされたり、染色体外の構成要素として存在することができる。例えば、目的遺伝子はＨＩＶゲノム上の遺伝子であってもよい。この場合、ｓｉＲＮＡ分子は、ほ乳動物細胞内ＨＩＶ遺伝子の翻訳を不活性化させるのに有用である。
【００１５】
本願において、前記多重ｓｉＲＮＡまたは多機能性核酸構造体と陽イオン性細胞伝達体の「複合体」は、多重ｓｉＲＮＡの骨格の陰電荷と、陽イオン性細胞伝達体の陽電荷の強い相互作用で形成され、電荷相互作用による結合体である。
【００１６】
本発明は一観点において、３つ以上のｓｉＲＮＡが各々の一末端で互いに接合されている多重ｓｉＲＮＡに陽イオン性細胞伝達体が結合されている、細胞内の伝達能が増加したｓｉＲＮＡ複合体に関する。
本発明はまた、前記ｓｉＲＮＡ複合体を細胞内に導入することを含むｓｉＲＮＡの細胞内の伝達方法を提供する。
【００１７】
本発明において、多重ｓｉＲＮＡとは、３つ以上のｓｉＲＮＡが各々の一末端で互いに接合されるように構造化されたｓｉＲＮＡ構造体をいい、互いに異なるｓｉＲＮＡを、例えば４つ等、多数のｓｉＲＮＡを接合して使用できるが、複数の目的遺伝子の発現を抑制させながらも、細胞内の伝達能を顕著に高めるためには、三つの互いに異なるｓｉＲＮＡを利用することが好ましい。また、前記多重ｓｉＲＮＡは、アンチセンスの５'方向末端は外部に向かうようにして、他方の末端であるアンチセンスの３'方向末端で互いに接合される構造を有することを特徴とする。図１（ａ）は三つの互いに異なる目的遺伝子をターゲットにするｓｉＲＮＡを本発明の多重ｓｉＲＮＡ構造で接合したものである。
【００１８】
ここで、前記ｓｉＲＮＡは化学的修飾を含むこと含むことができるが、化学的修飾は、例えば、前記ｓｉＲＮＡに含まれる少なくとも１つのヌクレオチドのリボースの２’位置のヒドロキシル基が水素原子、フッ素原子、−Ｏ−アルキル基、−Ｏ−アシル基、及びアミノ基のいずれか一つに置換されることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明において陽イオン性細胞伝達体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏのいずれの状態においても、核酸、即ちｓｉＲＮＡを細胞内伝達するために使用し、陽性に電荷された、伝達のための試薬である。陽イオン性細胞伝達体は、本発明の多重ｓｉＲＮＡと強く相互作用をして、複合体を形成することによってｓｉＲＮＡが効果的に細胞内に導入されるようにする。陽イオン性細胞伝達体としては、陽イオン性ポリマーまたは陽イオン性脂質が使える。例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）といったリポソームが使えるが、これに制限されずに陽性に電荷された伝達のための試薬の場合、本発明に係る複合体を提供するために使用できることは本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者には自明である。
【００２０】
本発明は、また他の観点において、３つ以上の官能基を有する化合物にｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンタゴｍｉＲ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム及びアプタマーからなる群から選択される３つ以上の核酸オリゴヌクレオチドの各々の一末端が連結している多機能性核酸構造体に関する。
【００２１】
本発明において、多機能性核酸構造体とは、３つ以上の官能基を有する化合物の各官能基にｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンタゴｍｉＲ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム及びアプタマーのような機能性核酸オリゴヌクレオチドを結合させた核酸構造体をいい、前記において「３つ以上の核酸オリゴヌクレオチド」は互いに同じ種類の３つ以上の核酸オリゴヌクレオチドであるか、２または３つの同じ種類の核酸オリゴヌクレオチドと一つ以上の異なる核酸オリゴヌクレオチドで構成されたり、または全て異なる種類の核酸オリゴヌクレオチドで構成されると解釈される。即ち、図７及び図１０（ａ）のように３つ以上のｓｉＲＮＡだけ構成されたり、図１１（ａ）のように二つのｓｉＲＮＡと一つのアンタゴｍｉＲで構成される。
【００２２】
このような核酸オリゴヌクレオチドは、化学的修飾を含んで製造されるが、化学的修飾は、例えば、前記核酸オリゴヌクレオチドに含まれる少なくとも１つのヌクレオチドのリボースの２'位置のヒドロキシル基が水素原子、フッ素原子、−Ｏ−アルキル基、−Ｏ−アシル基、及びアミノ基のいずれか一つに置換されることを特徴とする。
【００２３】
このような多機能性核酸構造体は、３つ以上の官能基を有する化合物にｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンタゴｍｉＲ、アンチセンス、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム及びアプタマーからなる群から選択される核酸オリゴヌクレオチドの一末端を連結させることで製造されるが、これは３つ以上の官能基を有する化合物の各官能基に核酸断片を連結した後、前記核酸オリゴヌクレオチドに前記核酸断片と相補的に結合できる配列を導入し、前記核酸断片と相補的に結合させるようにすることで連結することを特徴とする。
【００２４】
本発明において、前記３つ以上の官能基を有する化合物は、例えば、ホスホアミダイト化合物（phosphoramidite compounds）、ヨードアセチル（Iodoacetyl）化合物、マレイミド（maleimide）化合物、エポキシド化合物、チオール−ジスルフィド（thiol-disulfide）化合物、チオール化されたエルマン試薬、ＮＨＳまたはｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ化合物、イソシアネート（Isocyanate）化合物等が使えるが、これに限定されずに３つ以上の官能基を有する化合物で３つ以上のｓｉＲＮＡまたは他機能性ヘキサンオリゴヌクロチドを結合できる任意の化合物が、制限されずに使用できることは本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者には自明である。ここで、前記使用される３つ以上の官能基を有する化合物は、適切に、アミンまたはチオール等で末端が置換されたオリゴヌクレオチドと連結できる。
【００２５】
例えば、リンカーとしてホスホアミダイト化合物を使う場合、望ましくはＴｒｅｂｌｅｒホスホアミダイト（Ｔｒｉｌｉｎｋ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のような三つのアームを有するホスホアミダイト化合物に三つの核酸断片を連結して、センスまたはアンチセンスの一つの鎖に前記核酸断片と相補的に結合できる配列を含むｓｉＲＮＡを作製して、前記核酸断片に相補的結合によって連結させることで、新しい構造の多機能性核酸構造体を作製することができる。ここで、「相補的に結合」とは、前記核酸断片の配列とｓｉＲＮＡのセンスまたはアンチセンス鎖に含まれる一部断片が約７０〜８０％以上、望ましくは約８０〜９０％以上、より望ましくは約９０〜９５％以上、より一層望ましくは約９５〜９９％以上配列が互いに相補的であるか完全に相補的に混成化される可能性があることを意味する。但し、アニーリング可能なレベルで連結のための部分にミスマッチが計画的に導入される。
【００２６】
本発明に係る多機能性核酸構造体に陽イオン性細胞伝達体を電荷相互作用によって結合させることで、多機能性核酸構造複合体を提供することができる。従って、本発明は他の観点において、陽イオン性細胞伝達体が結合されている、細胞内の伝達能が増加した多機能性核酸構造複合体に関する。
【００２７】
陽イオン性細胞伝達体としては、陽イオン性ポリマーまたは陽イオン性脂質が使える。例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のようなリポソームが使えるが、これに制限されずに、陽性に電荷された伝達のための試薬が、本発明に係る複合体を提供するために使用できることは本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者に自明である。
【００２８】
本発明の一実施例においては本発明に係るｓｉＲＮＡ複合体と、従来のｓｉＲＮＡ構造に係るｓｉＲＮＡ−陽イオン性脂質複合体を細胞内に導入して、遺伝子発現抑制効率を測定した結果、本発明に係るｓｉＲＮＡ複合体が、従来のｓｉＲＮＡ構造体に比べて、さらに効率的にすべての目的遺伝子の発現レベルを抑制することを確認した。
【００２９】
さらに、従来、ウィルス性感染に対するＲＮＡｉ機構のための治療の場合、ウィルスのゲノム内のヌクレオチドの置換乃至欠失による回避が問題になってきたが、本発明の他の実施例においては、ウイルスゲノムの互いに異なる三部位をターゲッティングする多重ｓｉＲＮＡを、ＰＥＩを利用して導入することによって、該当ウイルスゲノム部位を含むｍＲＮＡの発現を顕著に低くすることが確認され、ウィルス性感染の治療のためにも本発明が有用であることが示された。
【００３０】
また、本発明の他の実施例においては蛍光顕微鏡を利用して、本発明に係るｓｉＲＮＡ複合体と従来のｓｉＲＮＡの細胞内の透過率を比較した結果、本発明に係るｓｉＲＮＡ複合体が従来のｓｉＲＮＡ構造にＰＥＩを結合させたもとと比べて、細胞内の伝達活性が非常に優秀であることを確認した。即ち、従来のｓｉＲＮＡの場合、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）のような陽イオン性脂質と結合するには適さないと報告し、細胞内の透過率が低いと確認されたが（図３）、本発明の多重ｓｉＲＮＡはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）のような陽イオン性細胞伝達体と結合して、非常に高い細胞内の伝達活性を示すことが確認された。
【００３１】
従って、本発明に係るｓｉＲＮＡ複合体は、効果的にｓｉＲＮＡを細胞内に伝達する方法に関し、前記方法は本発明に係るｓｉＲＮＡ複合体を細胞内に導入させる工程を含むことを特徴とする。
【００３２】
さらに、本発明の他の実施例では本発明に係るｓｉＲＮＡ複合体を一般的なＲＮＡｉ機構の用途と同じ範疇で使われるか確認するために、従来のｓｉＲＮＡ構造と対比して機構分析実験を行って、本発明に係るｓｉＲＮＡ複合体の多重ｓｉＲＮＡ構造が従来の１９＋２  ｓｉＲＮＡ構造と同じＲＮＡｉ機構によって、遺伝子発現を抑制することを確認した。これは本発明に係るｓｉＲＮＡ複合体を従来ＲＮＡｉの用途と同一範疇で使う可能性があることを意味する。
【００３３】
従って、前記ｓｉＲＮＡ複合体を細胞内伝達することによって、効率的に目的遺伝子の発現が抑制できるが、本発明は他の観点において、３つ以上のｓｉＲＮＡが各々の一末端で互いに接合されている多重ｓｉＲＮＡに陽イオン性細胞伝達体が結合されている複合体を含有する遺伝子発現抑制用組成物に関する。また、本発明は３つ以上のｓｉＲＮＡが各々の一末端で３つ以上の官能基を有する化合物を利用して連結している多機能性核酸構造体に陽イオン性細胞伝達体を結合させた多機能性核酸構造複合体の形態としても遺伝子発現抑制用組成物を提供することができる。
【００３４】
本発明に係る多機能性核酸構造複合体は、多重ｓｉＲＮＡ複合体のように顕著な遺伝子発現抑制効果を有するだけでなく、ｓｉＲＮＡ以外にｍｉＲＮＡ、アンタゴｍｉＲ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー及びリボザイムのような機能性核酸オリゴヌクレオチドを結合して、多機能性を有する核酸構造体を提供できる長所がある。多重ｓｉＲＮＡの場合、特定の構造を要しｓｉＲＮＡのような二重螺旋のＲＮＡの接合を要することとは異なり、３つ以上の官能基を有する化合物を利用して短いオリゴヌクレオチドを有する基本骨格を構成することによって、いかなる核酸オリゴヌクレオチドであっても構造体内に導入されるように考案した。従って、アンタゴｍｉＲのような単一鎖核酸オリゴヌクレオチドの結合も可能にする。また、３つ以上の官能基を有する化合物に結合させることによって、多重ｔｓｉＲＮＡより比較的短い長さの核酸断片製造で構造体の提供が可能になって、製造単価も低下し製造工程も容易になる。
【００３５】
さらに、本発明の一実施態様においては、本発明に係る多機能性核酸構造複合体と多重ｓｉＲＮＡ複合体の免疫反応誘導の有無を実験した。その結果、多重ｓｉＲＮＡ複合体がｄｓＲＮＡ処理に対し非常に高い免疫感受性を有すると報告されたＴ９８Ｇ細胞で非特異的な免疫反応を一部起こすのとは異なり、多機能性核酸構造複合体はこのような免疫反応を起こさないことを確認した。
【００３６】
また、本発明の他の実施態様においては、Ｄｉｃｅｒに対する抵抗性を実験して、多機能性核酸構造複合体がより高い抵抗性を示すことを確認した。
【００３７】
一方、前記遺伝子発現抑制用組成物は遺伝子発現抑制用キット（kit）の形態で提供できる。遺伝子発現抑制用キットは瓶、筒（tub）、小袋（sachet）、封筒（envelope）、チューブ、アンプル（ampoule）等のような形態であってもよく、これらは部分的にまたは全体的にプラスチック、ガラス、紙、ホイール、ワックスなどから形成される。容器は、最初は容器の一部であるか、または機械的、接着性、またはその他の手段によって、容器に付着できる、完全にまたは部分的に分離可能な栓を取り付けることができる。容器はまた注射針によって内容物に接近できる、ストッパーが取り付けられる。前記キットは外部パッケージを有することができ、外部パッケージは構成要素の使用に関する使用説明書を含んでもよい。
【００３８】
また、前記遺伝子発現抑制用組成物を利用することによって、効果的に同時に２つ以上の遺伝子の発現を抑制できるが、これに本発明はさらに他の観点において、前記遺伝子発現抑制用組成物を利用した遺伝子発現抑制方法に関する。
【００３９】
また、本発明の他の実施態様においては、本発明に係る複合体が癌細胞の増殖を抑制する効果があることを確認したが、本発明はさらに他の観点において前記多重ｓｉＲＮＡ複合体または多機能性核酸構造複合体を含有する抗癌組成物に関する。
【００４０】
本発明に係る抗癌組成物は、前記複合体を単独で含んだり一つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含んで医薬組成物で提供でき、前記複合体は疾患及びこれの重症程度、患者の年令、体重、健康状態、性別、投与経路及び治療期間等により適切な薬学的に有効な量で医薬組成物に含まれる。
【００４１】
前記「薬学的に許される」とは、生理学的に許容されてヒトに投与される際に、通常、胃腸障害、めまいのようなアレルギー反応またはこれと類似する反応を起こさない組成物をいう。前記担体、賦形剤及び希釈剤としは、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油が挙げられる。
【００４２】
前記医薬組成物は、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤等をさらに含んでもよい。また、本発明の医薬組成物は、ほ乳動物に投与された後、活性成分の迅速、持続または遅延放出を提供できるように当業界に公知の方法を使って、剤形化される。剤形は滅菌注射溶液などの形態でありうる。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業界において通常の知識を持った者にとって自明である。
【００４４】
特に、下記実施例においては目的遺伝子として、ラミンＡ／Ｃ（Lamin A/C）、ＤＢＰ、ＴＩＧ３、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ遺伝子及びＣＶＡ２４ウイルスゲノムだけを例示したが、その他の異なる目的遺伝子をターゲットとして本発明に係る複合体及び組成物を提供した場合においても同様の結果が得られ、下記実施例において使われたＡｎｔｉｍｉＲ−２１以外の他の機能性核酸オリゴヌクレオチドを利用しても本発明に係る多機能性核酸構造体を提供できることは本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者には自明な事項である。
【００４５】
［実施例１］本発明に係るｓｉＲＮＡ複合体の製造
本実施例において使われた多重ｓｉＲＮＡ、及び実験に使うｓｉＲＮＡはＢｉｏｎｅｅｒ社から化学的に合成されたＲＮＡを購入した後、製造者のプロトコールに従ってアニーリングすることによって提供された。
まず、ラミンＡ／Ｃ、ＤＢＰ及びＴＩＧ３  ｍＲＮＡをターゲットとする三重目的遺伝子発現抑制ＲＮＡ（triple-target gene silencing siRNA：ｔｓｉＲＮＡ）は図１（ａ）のように製造した。
前記ｔｓｉＲＮＡを提供するための３本鎖は下記の通りである。
１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ：５’−ＵＧＵＵＣＵＵＣＵＧＧＡＡＧＵＣＣＡＧＵＣＧＡＡＧＡＣＡＵＣＧＣＵＵＣＵＣＡ−３’（配列番号１）
２ｎｄ  ｓｔｒａｎｄ：５’−ＵＧＡＧＡＡＧＣＧＡＵＧＵＣＵＵＣＧＡＣＵＧＵＣＵＣＡＧＧＣＧＵＵＣＵＣＵＡ−３’（配列番号２）
３ｒｄ  ｓｔｒａｎｄ：５’−ＵＡＧＡＧＡＡＣＧＣＣＵＧＡＧＡＣＡＧＣＵＧＧＡＣＵＵＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＡ−３’（配列番号３）
一方、対照群として使った前記三つの各部位に対するｓｉＲＮＡは下記の通りである。
Ｌａｍｉｎ  ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＬａｍｉｎ）
センス（sense）：５’−ＣＵＧＧＡＣＵＵＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＡ（ｄＴｄＴ）−３’（配列番号４）
アンチセンス（antisense）：５’−ＵＧＵＵＣＵＵＣＵＧＧＡＡＧＵＣＣＡＧ（ｄＴｄＴ）−３’（配列番号５）
ＤＢＰ  ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＤＢＰ）
センス（sense）：５’−ＵＣＧＡＡＧＡＣＡＵＣＧＣＵＵＣＵＣＡ（ｄＴｄＴ）−３’（配列番号６）
アンチセンス（antisense）：５’−ＵＧＡＧＡＡＧＣＧＡＵＧＵＣＵＵＣＧＡ（ｄＴｄＴ）−３’（配列番号７）
ＴＩＧ３  ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＴＩＧ３）
センス（sense）：５’−ＣＵＧＵＣＵＣＡＧＧＣＧＵＵＣＵＣＵＡ（ｄＴｄＴ）−３’（配列番号８）
アンチセンス（antisense）：５’−ＵＡＧＡＧＡＡＣＧＣＣＵＧＡＧＡＣＡＧ（ｄＴｄＴ）−３’（配列番号９）
前記のように取得したｔｓｉＲＮＡにポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社）を製造者のプロトコールにより加えて、本発明に係るｓｉＲＮＡ複合体を製造した。
【００４６】
［実施例２］本発明に係るｓｉＲＮＡ複合体と従来のｓｉＲＮＡの遺伝子抑制活性測定
実施例１で製造したラミンＡ／Ｃ、ＤＢＰ及びＴＩＧ３  ｍＲＮＡをターゲットとする三重目的遺伝子発現抑制ＲＮＡ（ｔｓｉＲＮＡ）とＰＥＩの複合体と、実施例１の従来ｓｉＲＮＡ構造体のｓｉＬａｍｉｎ、ｓｉＤＢＰ及びｓｉＴＩＧ３を各々ＰＥＩと複合体を形成したものをＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）へ導入した。ＨｅＬａ細胞は、１０％ＦＢＳ（fetal bovine serum）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ改質Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）で培養し、細胞は１２ウェルプレートで平板培養し、導入前には抗生剤がない完全培地でコンフルエンシー（confluency）が８０％になるまで２４時間培養した。ｓｉＲＮＡ混合物は、各１００ｎＭ使い、ｔｓｉＲＮＡも１００ｎＭ使い、使ったＰＥＩ（Ｎ／Ｐ＝５）はＰｏｌｙｐｌｕｓ社から購入し、導入は製造者のプロトコールに従った。
導入してから３時間後に培地を交換し、ラミン、ＤＢＰ、及びＴＩＧ３  ｍＲＮＡのレベルは定量的なリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定した。即ち、全ＲＮＡをＴｉｒ−ｒｅａｇｅｎｔキット（Ａｍｂｉｏｎ社）を利用して、細胞溶解物から抽出した後、取得された全ＲＮＡは、ＩｍＰｒｏ−ＩＩ（商品名）逆転写システム（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を利用してｃＤＮＡ合成をするための鋳型として使った。前記ｃＤＮＡの合成は、前記製造会社のプロトコールに従った。それから、ステップワンリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して、製造会社のプロトコールに従って各目的遺伝子の発現レベルを測定し、測定されたラミン、ＤＢＰ、ＴＩＧ３のｍＲＮＡレベルは、ＧＡＰＰＤＨ（対照群）ｍＲＮＡレベルで分けて比較した。使った各遺伝子に対するプライマーは下記の通りである。
ＤＢＰのＲＴ−ＰＣＲ用プライマー対
ＤＢＰ−ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＣＣＴ  ＣＧＡ  ＡＧＡ  ＣＡＴ  ＣＧＣ  ＴＴＣ  ＴＣ−３’（配列番号１０）
ＤＢＰ−ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＧＣＡ  ＣＣＧ  ＡＴＡ  ＴＣＴ  ＧＧＴ  ＴＣＴ  ＣＣ−３’（配列番号１１）
ＧＡＰＤＨのＲＴ−ＰＣＲ用プライマー対
ＧＡＰＤＨ−ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＧＡＧ  ＴＣＡ  ＡＣＧ  ＧＡＴ  ＴＴＧ  ＧＴＣ  ＧＴ−３’（配列番号１２）
ＧＡＰＤＨ−ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＧＡＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＣＣ  ＧＴＴ  ＣＴＣ  ＡＧ−３’（配列番号１３）
ＬａｍｉｎのＲＴ−ＰＣＲ用プライマー対
Ｌａｍｉｎ−ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＣＣＧ  ＡＧＴ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＡＧＧ  ＴＧＧ  ＴＣ−３’（配列番号１４）
Ｌａｍｉｎ−ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＡＧＧ  ＴＣＡ  ＣＣＣ  ＴＣＣ  ＴＴＣ  ＴＴＧ  ＧＴ−３’（配列番号１５）
ＴＩＧ３のＲＴ−ＰＣＲ用プライマー対
ＴＩＧ３−ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＡＧＡ  ＴＴＴ  ＴＣＣ  ＧＣＣ  ＴＴＧ  ＧＣＴ  ＡＴ−３’（配列番号１６）
ＴＩＧ３−ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＴＴＴ  ＣＡＣ  ＣＴＣ  ＴＧＣ  ＡＣＴ  ＧＴＴ  ＧＣ−３’（配列番号１７）
導入した後、導入してから３０分後、１時間及び３時間後にＲＴ−ＰＣＲでｍＲＮＡレベルを各々ラミン、ＤＢＰ及びＴＩＧ３のｍＲＮＡレベルを測定した結果、図１（ｂ）乃至１（ｄ）に示したように、各時間帯毎に本発明に係るｓｉＲＮＡ複合体（ｔｓｉＲＮＡ）がより優秀な遺伝子抑制活性を示すことが分かる。
一方、実施例１で取得したｓｉＲＮＡ複合体（ＴｓｉＲＮＡ）及び実施例１で取得したｔｓｉＲＮＡに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を製造会社のプロトコールに従って加えて製造したｓｉＲＮＡ複合体（ＴｓｉＲＮＡ−１）を、各々前記と同様の方法でＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）へ導入した後、２４時間後ＲＴ−ＰＣＲでｍＲＮＡレベルを測定した。
その結果、図２に示したように、従来の報告と同様で（Bolcato-Bellemin A.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 104:16050, 2007）、各々のｓｉＲＮＡとＰＥＩとの混合物は、非常に限定的な遺伝子発現抑制活性を見せたが、ＴｓｉＲＮＡを陽イオン性ポリマーのＰＥＩを結合させた場合と、陽イオン性脂質であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を結合させた場合とは、共に三つ全ての遺伝子ｍＲＮＡの発現レベルがずっと低いことが分かる。
このような結果は本発明に係るｓｉＲＮＡ複合体が、従来のｓｉＲＮＡ構造にＰＥＩやＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００のような陽イオン性細胞伝達体を結合して処理した場合と比べて、三つの互いに異なる遺伝子発現を抑制するのにさらに効果的であることを示す。
【００４７】
［実施例３］本発明に係るｓｉＲＮＡ複合体の細胞内の伝達能測定
本発明に係るｓｉＲＮＡ複合体と、従来のｓｉＲＮＡ（ｓｉＴＩＧ３）の細胞内の伝達能を比較するために、次のような実験を行った。
ｓｉＴＩＧ３のセンス鎖の３'末端と、ｔｓｉＲＮＡのＴＩＧ３センスの３'末端にＦＩＴＣをラベルした。そして、ＦＩＴＣラベルしたｓｉＲＮＡ混合物（ｓｉＬａｍｉｎ、ｓｉＤＢＰ、ＦＩＴＣ−ｓｉＴＩＧ３）とＦＩＴＣラベルしたｔｓｉＲＮＡ（ＦＩＴＣ−ｔｓｉＲＮＡ）をＰＥＩと結合させてＨｅＬａ細胞に導入した。導入後、ＨｅＬａ細胞は時間帯毎に蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）で観察した。
１０分、３０分、１時間及び３時間間隔で観察した結果、図３に示したように、図３（ａ）のｓｉＲＮＡ混合物を、ＰＥＩを利用して導入させた場合、テストした全ての培養時間帯においてほとんど蛍光が観察されないことが明らかになった。これに対して、ＦＩＴＣラベルしたｔｓｉＲＮＡを、ＰＥＩを利用して導入した場合（図３（ｂ））、細胞内の部位で散在された緑色のスポットが見られ、これは培養時間の増加に従って順次その強度も増加することが明らかになった。
このような結果は、本発明に係るｓｉＲＮＡ複合体が、従来のｓｉＲＮＡ構造にＰＥＩを結合させたものに比べて、細胞内の伝達活性が非常に優れていることを示す。
【００４８】
［実施例４］ウイルスゲノムに対するターゲット
従来のＲＮＡｉ機構を利用したウィルス複製抑制の場合、高いウィルスの回避率による問題点があった。そこで、このような問題点を克服できるか、及び本発明に係るｓｉＲＮＡ構造が一般にｓｉＲＮＡ機構のために適用される機構であるかを確認するために、以下の実験を行った。まず、本発明に係るｓｉＲＮＡ複合体をウイルスゲノム（coxsackievirus A24：ＣＶＡ２４）の３つの互いに異なる部位（ＣＲＥ、３Ｄ１、３Ｄ２）をターゲットとするように図４（ａ）（ｔｓｉＲＮＡ−ＣＶＡ）のように製造した。
前記ｔｓｉＲＮＡ−ＣＶＡを提供するための３本鎖は下記の通りである。
ｔｓｉＲＮＡ−ＣＶＡ：
１ｓｔｓｔｒａｎｄ：５’−ＵＣＡＡＵＡＣＧＧＵＧＵＵＵＧＣＵＣＵＵＧＧＵＧＡＵＧＡＵＧＵＡＡＵＵＧＣＵ−３’（配列番号１８）
２ｎｄｓｔｒａｎｄ：５’−ＡＧＣＡＡＵＵＡＣＡＵＣＡＵＣＡＣＣＡＣＣＡＵＧＡＣＵＣＣＡＧＣＵＧＡＣＡＡ−３’（配列番号１９）
３ｒｄｓｔｒａｎｄ：５’−ＵＵＧＵＣＡＧＣＵＧＧＡＧＵＣＡＵＧＧＡＧＡＧＣＡＡＡＣＡＣＣＧＵＡＵＵＧＡ−３’（配列番号２０）
一方、対照群として使った前記３つの各部位に対するｓｉＲＮＡは下記の通りである。
ＣＶＡ−ＣＲＥ  ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＶＡ−ＣＲＥ）
センス（sense）：５’−ＡＧＡＧＣＡＡＡＣＡＣＣＧＵＡＵＵＧＡ（ｄＴｄＴ）−３’（配列番号２１）
アンチセンス（antisense）：５’−ＵＣＡＡＵＡＣＧＧＵＧＵＵＵＧＣＵＣＵ（ｄＴｄＴ）−３’（配列番号２２）
ＣＶＡ−３Ｄ１  ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＶＡ−３Ｄ１）
センス（sense）：５’−ＵＧＧＵＧＡＵＧＡＵＧＵＡＡＵＵＧＣＵ（ｄＴｄＴ）−３’（配列番号２３）
アンチセンス（antisense）：５’−ＡＧＣＡＡＵＵＡＣＡＵＣＡＵＣＡＣＣＡ（ｄＴｄＴ）−３’（配列番号２４）
ＣＶＡ−３Ｄ２  ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＶＡ−３Ｄ２）
センス（sense）：５’−ＣＣＡＵＧＡＣＵＣＣＡＧＣＵＧＡＣＡＡ（ｄＴｄＴ）−３’（配列番号２５）
アンチセンス（antisense）：５’−ＵＵＧＵＣＡＧＣＵＧＧＡＧＵＣＡＵＧＧ（ｄＴｄＴ）−３’（配列番号２６）
次に、ｓｉＣＶＡ−ＣＲＥに対するターゲット配列、ｓｉＣＶＡ−３Ｄ１に対するターゲット配列、ｓｉＣＶＡ−３Ｄ２に対するターゲット配列を、各々ｐＭＩＲ  Ｒｅｐｏｒｔ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｖｅｃｔｏｒ（Ａｍｂｉｏｎ社）のルシフェラーゼｍＲＮＡコーディング遺伝子の３'非番駅部位のＳｐｅＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ位置に挿入したベクターｐＭＩＲ−ＣＲＥ、ｐＭＩＲ−３Ｄ１、及びｐＭＩＲ−３Ｄ２を構築した。前記挿入された各ターゲット配列は下記の通りである。
ＣＲＥ  ＡＳ−ｔａｒｇｅｔ
Ｈｉｎｄ  ５’−ＡＧＣＴＴ  Ｔ  ＣＡＡ  ＴＡＣ  ＧＧＴ  ＧＴＴ  ＴＧＣ  ＴＣＴ  Ａ  −３’（配列番号２７）
Ｓｐｅ  ３’−  Ａ  Ａ  ＧＴＴ  ＡＴＧ  ＣＣＡ  ＣＡＡ  ＡＣＧ  ＡＧＡ  ＴＧＡＴＣ−５’（配列番号２８）
３Ｄ１  ＡＳ−ｔａｒｇｅｔ
Ｈｉｎｄ  ５’−ＡＧＣＴＴ  Ａ  ＧＣＡ  ＡＴＴ  ＡＣＡ  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＣＣＡ  Ａ  −３’（配列番号２９）
Ｓｐｅ  ３’−  Ａ  Ｔ  ＣＧＴ  ＴＡＡ  ＴＧＴ  ＡＧＴ  ＡＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＡＴＣ−５’（配列番号３０）
３Ｄ２  ＡＳ−ｔａｒｇｅｔ
Ｈｉｎｄ  ５’−ＡＧＣＴＴ  Ｔ  ＴＧＴ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  Ａ  −３’（配列番号３１）
Ｓｐｅ  ３’−  Ａ  Ａ  ＡＣＡ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＣＴＣ  ＡＧＴ  ＡＣＣ  ＴＧＡＴＣ−５’（配列番号３２）
各々の前記ベクターをｓｉＲＮＡ混合物（ｓｉＣＶＡ−ＣＲＥ、ｓｉＣＶＡ−３Ｄ１、ｓｉＣＶＡ−３Ｄ２）とＰＥＩとの複合体、またはｔｓｉＲＮＡ−ＣＶＡとＰＥＩとの複合体として、ＨｅＬａ細胞に導入した後、ルシフェラーゼ活性を下記の通り測定した。即ち、導入してから２４時間後に、細胞をＤｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のＰａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓバッファーで溶解させた。ルシフェラーゼ活性はショウジョウバエ及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼのためのＶｉｃｔｏｒ３プレートリーダー（Victor3 plate reader、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を利用して測定した。
その結果、図４（ｂ）に示したように、実施例２の結果と同様に、従来のｓｉＲＮＡ構造にＰＥＩを結合させて導入したものと比べて、本発明に係るｓｉＲＮＡ複合体がずっと低いルシフェラーゼ活性を示すことが確認された。
前記の実験結果は、本発明に係るｓｉＲＮＡ複合体は、既存のＲＮＡｉ機構に対し高い回避率を示すウィルスの複製抑制のためにも有用に利用できることを提示している。これは本発明に係るｓｉＲＮＡ複合体の構造が、実施例２の目的遺伝子の発現抑制にだけ限定されるものではなく、細胞伝達能及び抑制効率が改善された一般的なｓｉＲＮＡ機構として提供できることを意味する。
但し、追加的に本発明に係るｓｉＲＮＡ複合体が従来のＲＮＡｉ機構の用途と同じ範疇で使われるかを確認するために、次の機構分析実験を行った。
【００４９】
［実施例５］遺伝子発現抑制機構の分析
本発明に係るｓｉＲＮＡ構造が、従来の１９＋２  ｓｉＲＮＡと同じＲＮＡｉ機構によって、遺伝子発現を抑制させるかを確認するために次のような実験を行った。即ち、各目的ｍＲＮＡに対する切断部位を分析するために５’ＲＡＣＥ（Rapid amplification of cDNA ends）分析を行った。
まず、ｓｉＲＮＡ（ｓｉＬａｍｉｎ、ｓｉＤＢＰ、ｓｉＴＩＧ３）または実施例１で作製したｔｓｉＲＮＡをＰＥＩを利用してＨｅＬａ細胞に導入してから、１８時間後にＴｒｉ−ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）で全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡ（３μｇ）は前処理を行わずに０．２５μｇのＧｅｎｅＲａｃｅｒ  ＲＮＡ  ｏｌｉｇｏを接合（ligation）させてから、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ  ＲＮＡ  ｏｌｉｇｏ−接合された全ＲＮＡをＧｅｎｅＲａｃｅｒ  ｏｌｉｇｏ  ｄＴ及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商品名）III  ＲＴ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用して逆転写させた。ＲＮＡオリゴ接合されたｍＲＮＡは、遺伝子特異的なプライマーを利用して増幅した。次にＰＣＲ産物はＴ＆Ａ  ｖｅｃｔｏｒ（ＲＢＣ）でクローンした後、Ｍ１３フォワードプライマーでシーケンシングした。
ＴＩＧ３  Ｇｅｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ３’ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＧＧＧＧＣＡＧＡＴＧＧＣＴＧＴＴＴＡＴＴＧＡＴＣＣ−３’（配列番号３３）
ＴＩＧ３  Ｇｅｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ３’ｎｅｓｔｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＧＣＧＡＧＡＧＡＧＧＧＡＡＡＣ−３’（配列番号３４）
Ｌａｍｉｎ  Ｇｅｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ３’ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＣＣＡＧＴＧＡＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＴＣＧＡＡＧ−３’（配列番号３５）
Ｌａｍｉｎ  Ｇｅｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ３’ｎｅｓｔｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＣＣＴＧＧＣＡＴＴＧＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＣＡＧＡ−３’（配列番号３６）
ＤＢＰ  ｇｅｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ
５’−ＣＧＧＧＡＣＡＧＣＡＣＧＧＣＧＣＧＧＴＡＧＴ−３’（配列番号３７）
ＤＢＰ  ｇｅｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ３’  ｎｅｓｔｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ
５’−ＣＴＣＣＴＧＧＣＧＣＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＣＴＴ−３’（配列番号３８）
Ｍ１３フォワードプライマー
５’−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’（配列番号３９）
その結果、図５に示したように、ｓｉＲＮＡ−ＰＥＩ複合体を処理した場合及びｔｓｉＲＮＡ−ＰＥＩ複合体を処理した場合共に、Ｌａｍｉｎ、ＤＢＰ及びＴＩＧ３  ｍＲＮＡの同じ地点を切断することが明らかになった。
前記実験結果は、本発明に係るｓｉＲＮＡ複合体の多重ｓｉＲＮＡ構造が、従来の１９＋２  ｓｉＲＮＡ構造と同じＲＮＡｉ機構によって、遺伝子発現を抑制することを意味する。
【００５０】
［実施例６］非特異的な抗ウィルス反応発生有無測定
３０ｂｐ以上のＲＮＡ２本鎖は、非特異的な抗ウィルス反応をＨｅＬａ細胞で起こして、特異的な遺伝子発現抑制を起こさなかったと報告されている（Manche L. et al., Mol. Cell Biol., 12:5238, 1992; Elbashir S.M. et al., Nature, 411:494, 2001）。本発明に係るｓｉＲＮＡ複合体が従来のｓｉＲＮＡ構造と比較すると、特異的かつ効率的な遺伝子発現抑制効率を示すか実験した。
抗ウィルス性反応が起こるか否かを確認するために、実施例２のｓｉＲＮＡ混合物とｔｓｉＲＮＡをＰＥＩと結合して導入させた後、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）の誘導レベルを実施例２と同様の方法でＲＴ−ＰＣＲ方法によって測定した。使われたプライマー対は下記の通りであり、抗ウィルス性反応を起こす陽性対照群ではポリ（Ｉ：Ｃ）導入された細胞を使った。
ＩＦＮ−βＲＴ−ＰＣＲ用プライマー対
ＩＦＮ−βｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＡＧＡ  ＡＧＴ  ＣＴＧ  ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＡＡＡ  ＡＧＡ  ＴＡＴ  Ｔ−３’（配列番号４０）
ＩＦＮ−βｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＧＴ  ＡＣＴ  ＣＣＴ  ＴＧＧ  ＣＣＴ  ＴＣＡ  ＧＧＴ  ＡＡ−３’（配列番号４１）
その結果、図６に示したように、本発明に係るｓｉＲＮＡ複合体も従来のｓｉＲＮＡ構造を有するｓｉＲＮＡ混合物をＰＥＩと結合させて導入した場合と同様にポリＩ：Ｃの陽性対照群によって誘導されるＩＦＮ−βｍＲＮＡレベルの１％未満に過ぎなかった。
前記実験結果は、本発明に係るｓｉＲＮＡ複合体の多重ｓｉＲＮＡが、３０ｂｐ以上の長さにもかかわらず従来ｓｉＲＮＡ構造と同様に非特異的な抗ウィルス反応を示さないことを意味する。
【００５１】
［実施例７］リンカーを利用した三重ｓｉＲＮＡ伝達複合体の製造及び遺伝子抑制活性測定
７−１：Ｔ−ｔｉＳｕｒｖｉｖｉｎの製造及び遺伝子抑制活性測定
図７に示したような三重ホスホアミダイト化合物（Trebler phosphoramidite，Ｔｒｉｌｉｎｋ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）を利用して、三重ｓｉＲＮＡ伝達複合体を作製した。
まず、前記Ｔｒｅｂｌｅｒホスホアミダイトを購入した後、ゲノテック社に依頼してＴｒｅｂｌｅｒホスホアミダイトに配列番号４２のＤＮＡオリゴヌクレオチドを三本連結した（赤色表示、Ｔｒｅｂｌｅｒから５'−＞３'方向）。次に、配列番号４２のＤＮＡオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有する部分とｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎのアンチセンス配列を同時に有するＲＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号４３）、そしてｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎセンス配列（配列番号４４）を同時にアニーリングして、図７に示したＴ−ｔｉＳｕｒｖｉｖｉｎを得た。それから、対照群として図８のｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎ、ｌｏｎｇ  ｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎ、そして図７のＴ−ｔｉＳｕｒｖｉｖｉｎを各々ＰＥＩと結合させてＨｅＬａ細胞内部に伝達してから、２４時間後にＳｕｒｖｉｖｉｎ  ｍＲＮＡの発現程度を実施例２と同様の方法でリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使って測定した。使われたプライマー対は下記の通りである。
Ｓｕｒｖｉｖｉｎ−ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＣＡ  ＣＣＡ  ＣＴＴ  ＣＣＡ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＡＴ−３’（配列番号４８）
Ｓｕｒｖｉｖｉｎ−ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＴＣ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＣＡＣ  ＴＴＴ  ＣＡＡ  ＧＡ−３’（配列番号４９）
その結果、図９（ａ）に示したように、Ｔ−ｔｉＳｕｒｖｉｖｉｎの遺伝子発現抑制効果が既存のｓｉＲＮＡや長い（long）ｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎに比べて、顕著に増加したことを確認することができた。また、ＩＣ５０値を測定した結果、図９（ｂ）に示したように、従来の構造のｓｉＲＮＡに比べて、約１１倍低い値を示すと確認された。これは既存のｓｉＲＮＡ構造に比べて、本発明のリンカーを利用した三重構造のｓｉＲＮＡがより優秀な遺伝子抑制効率を示すことを意味する。
【００５２】
７−２：Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、カテニン、インテグリンの発現を抑制するＴ−ｔｉＲＮＡの製造及び遺伝子抑制活性測定
実施例７−１と同様の方法で、ｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎ、ｓｉインテグリン及びｓｉβ−カテニンをＴｒｅｂｌｅｒホスホアミダイトに結合させて図１０（ａ）のように三重ｓｉＲＮＡ伝達複合体を作製した。それから、図１０（ａ）のＴ−ｔｉＲＮＡ及び対照群として図８のｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎとｓｉインテグリン、ｓｉβ−カテニンの混合物をＰＥＩと結合させてＨｅＬａ細胞内部に伝達してから、２４時間後にＳｕｒｖｉｖｉｎ  ｍＲＮＡ、インテグリンｍＲＮＡ、β−カテニンｍＲＮＡの発現程度を実施例２と同様の方法でリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使って測定した。使われたプライマー対は下記の通りである。この時、Ｓｕｒｖｉｖｉｎに対するプライマー対は実施例７−１で使ったプライマー対を利用した。
Ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＣＧＴ  ＡＴＣ  ＴＧＣ  ＧＧＧ  ＡＴＧ  ＡＡＴ  ＣＴ−３’（配列番号５４）
Ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＧＧＧ  ＴＴＧ  ＣＡＡ  ＧＣＣ  ＴＧＴ  ＴＧＴ  ＡＴ−３’（配列番号５５）
β−ｃａｔｅｎｉｎ−ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＡＴＧ  ＴＣＣ  ＡＧＣ  ＧＴＴ  ＴＧＧ  ＣＴＧ  ＡＡ−３’（配列番号５６）
β−ｃａｔｅｎｉｎ−ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＴＧＧ  ＴＣＣ  ＴＣＧ  ＴＣＡ  ＴＴＴ  ＡＧＣ  ＡＧ−３’（配列番号５７）
ｓｉＩｎｔｅｇｒｉｎ  ｓｅｎｓｅ：５’−ＵＧＡＡＣＵＧＣＡＣＵＵＣＡＧＡＵＡＵ（ｄＴｄＴ）−３’（配列番号５８）
ｓｉＩｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：５’−ＡＵＡＵＣＵＧＡＡＧＵＧＣＡＧＵＵＣＡ（ｄＴｄＴ）−３'（配列番号５９）
ｓｉβ−ｃａｔｅｎｉｎ  ｓｅｎｓｅ：５’−ＧＵＡＧＣＵＧＡＵＡＵＵＧＡＵＧＧＡＣＵＵ−３’（配列番号６０）
ｓｉβ−ｃａｔｅｎｉｎ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：５’−ＧＵＣＣＡＵＣＡＡＵＡＵＣＡＧＣＵＡＣＵＵ−３’（配列番号６１）
その結果、図１０（ｂ）に示したように、Ｔ−ｔｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果がｓｉＲＮＡ混合物に比べて、顕著に増加したことを確認することができた。これもまた既存のｓｉＲＮＡ構造に比べて、本発明のリンカーを利用した三重構造のｓｉＲＮＡがより優秀な遺伝子抑制効率を示すことを意味する。
【００５３】
７−３：ｍｉＲ−２１を抑制して、カテニン及びインテグリンの発現を抑制する多機能性ＭＴ−ｔｉＲＮＡの製造及び遺伝子抑制活性測定
実施例７−１と同様の方法で、Ａｎｔｉ−ｍｉＲ２１、ｓｉＩｎｔｅｇｒｉｎ及びｓｉβ−カテニンをＴｒｅｂｌｅｒホスホアミダイトに結合させて図１１（ａ）のように三重ＲＮＡ構造体を作製した。それから、ｍｉＲ−２１に対するターゲット配列をｐＭＩＲ  Ｒｅｐｏｒｔ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｖｅｃｔｏｒ（Ａｍｂｉｏｎ社）のルシフェラーゼｍＲＮＡコーディング遺伝子の３'非翻訳部位のＳｐｅＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ位置に挿入したベクターを構築した。前記挿入される各ターゲット配列は下記の通りである。
ｍｉＲ−２１  ｔａｒｇｅｔ
ｍｉＲ−２１  ｓｅｎｓｅ：
５’−ＡＡＴＧＣＡＣＴＡＧＴＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧＣＴＡＧＣＴＣＡＧＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＧＣ−３’（配列番号６３）
ｍｉＲ−２１  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：
５’−ＧＣＡＴＴＡＡＧＣＴＴＧＣＴＧＡＧＣＴＡＧＣＴＴＡＴＣＡＧＡＣＴＧＡＴＧＴＴＧＡＡＣＴＡＧＴＧＣＡＴＴ−３’（配列番号６４）
前記ベクターを図１１（ａ）のＭＴ−ｔｉＲＮＡ、及び対照群としてＡｎｔｉ−ｍｉＲ２１及びｓｉインテグリン、ｓｉβ−カテニンの混合物をＰＥＩと結合させてＨｅＬａ細胞内部に伝達した後、実施例４同様にルシフェラーゼ活性を測定した。
Ａｎｔｉ−ｍｉＲ２１：５’−ＵＣＡＡＣＡＵＣＡＧＵＣＵＧＡＵＡＡＧＣＵＡ−３’（配列番号６５）
また、図１１（ａ）のＭＴ−ｔｉＲＮＡと、対照群としてＡｎｔｉ−ｍｉＲ２１及びｓｉインテグリン、ｓｉβ−カテニンの混合物をＰＥＩと結合させてＨｅＬａ細胞内部に伝達してから、２４時間後にインテグリン  ｍＲＮＡ、β−カテニンｍＲＮＡの発現程度を実施例２と同様の方法でリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使って測定した。使われたプライマー対としては実施例７−２で使ったプライマー対を利用した。
その結果、図１１（ｂ）に示したように、本発明に係るＭＴ−ｔｉＲＮＡ複合体が、ｍｉＲ−２１を抑制してルシフェラーゼ活性が顕著に増加したことを確認することができた。即ち、本発明に係る核酸構造複合体は、ｍｉＲＮＡを抑制する機能も示すことができる多機能性を示すことを確認することができた。
また、図１１（ｃ）に示したように、Ｔ−ｔｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果が、ｓｉＲＮＡ混合物に比べて、顕著に増加したことを確認することができた。これもまた既存のｓｉＲＮＡ構造に比べて、本発明のリンカーを利用した三重構造のｓｉＲＮＡがより優秀な遺伝子抑制効率を示すことを意味する。
【００５４】
７−４：ｍｉＲ−２１を抑制するＴ−ｔｉＡｎｔｉ−ｍｉＲ２１の製造及びｍｉＲ−２１抑制活性測定
追加的に、実施例７−１と同様の方法で、三つのＡｎｔｉ−ｍｉＲ２１を、各々Ｔｒｅｂｌｅｒホスホアミダイトに連結させて、三重ＲＮＡ構造体を作製した。次に、実施例７−３と同様の方法でルシフェラーゼ活性を測定した。対照群としてはＡｎｔｉ−ｍｉＲ２１を使った。
その結果、図１２に示したように、アンタゴｍｉＲのＡｎｔｉ−ｍｉＲ２１を導入した場合とは異なり、Ｔ−ｔｉＡｎｔｉ−ｍｉＲ２１を導入した場合、ｍｉＲ−２１を抑制してルシフェラーゼ活性が顕著に増加したことを確認することができた。即ち、本発明に係る核酸構造複合体は、既存のアンタゴｍｉＲに比べて、より高い効率でｍｉＲＮＡの活性を抑制することを確認することができた。
【００５５】
［実施例８］陽イオン性細胞伝達体との結合力及び細胞伝達力測定
８−１：ＨＳによる分離率比較
細胞内に核酸を導入する過程で核酸と陽イオン性細胞伝達体幹相互作用が細胞表面の陰電荷を帯びるプロテオグリカン（proteoglycan）によって阻害されるため、本発明に係る多重ｓｉＲＮＡ複合体の細胞表面に発現する陽イオン性ロテオグリカンであるＨＳ（heparan sulfate）による分離率を次のように実験した。まず、図８の１９ｂｐ  ｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎ及び図７のＴ−ｔｉＳｕｒｖｉｖｉｎを各々ＰＥＩ（Ｎ／Ｐ＝５）と結合させた後、各複合体とＨＳ（Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ）をＨＳの量を順次増加させながら３０分の間培養した。次に、１％アガロースゲルで電気泳動を利用して、各複合体から放出されるｓｉＲＮＡの量を測定した。この時、ＥｔＢｒで染色してＵＶ  ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎで可視化させて確認した。
その結果、図１３（ａ）に示したように、ｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎは同量（１  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ（ｗｔ／ｗｔ））のＨＳによってＰＥＩから分離されたが、本発明に係る複合体は４倍増加したＨＳと共に培養した場合に限って分離されることを確認することができた。このような実験結果は、本発明に係る多機能性ＲＮＡ構造複合体は、細胞内への導入前に、陽イオン性細胞表面物質による影響に抵抗性を有することを示す。
【００５６】
８−２：ＦＩＴＣを利用した細胞内の伝達能測定
本発明に係る多機能性ＲＮＡ構造体（Ｔ−ｔｉＳｕｒｖｉｖｉｎ）及び従来ｓｉＲＮＡ（ｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎ（図８））に対する細胞内の伝達程度を比較するために、実施例３と同様の方法でＦＩＴＣで各々ラベルした後、蛍光顕微鏡で観察した。
その結果、図１３（ｂ）に示したように、ｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎの場合、細胞内に殆ど導入されないことが明らかになったが、本発明に係るＴ−ｔｉＳｕｒｖｉｖｉｎの場合、細胞内の部位で散在された緑色のスポットを確認することができた。
また、フローサイトメトリーを利用してＦＩＴＣ−ラベルされたＲＮＡが導入された細胞の蛍光強度を測定した。測定は、ＦＩＴＣ−ラベルされたＴ−ｔｉＳｕｒｖｉｖｉｎ及びｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎを各々ＰＥＩに結合させてＨｅＬａ細胞にトランスフェクションさせてから、３時間後に細胞を収集してＰＢＳで二回洗浄した後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を利用して行われた。
その結果、図１３（ｃ）に示したように、従来のｓｉＲＮＡ構造に比べて、本発明に係る多機能性核酸構造体は蛍光強度が増加したことが明らかになり、これを定量化した結果、図１３（ｄ）のように、平均強度で約１０倍の差があることを確認することができた。
このような結果は、本発明に係る多機能性核酸構造体が、従来のｓｉＲＮＡにＰＥＩを結合させたものに比べて、細胞内の伝達活性が非常に優秀であることを示す。
【００５７】
［実施例９］癌細胞成長抑制効果確認
本発明に係る複合体が抗癌組成物として使用可能であるかを確認するために、まず実施例７−１と同様の方法でＳｕｒｖｉｖｉｎ  ｍＲＮＡ発現程度を測定した結果、本発明に係るＴ−ｔｉＳｕｒｖｉｖｉｎが従来のｓｉＲＮＡ構造のｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎに比べて顕著にＳｕｒｖｉｖｉｎ発現を抑制することを確認（図１４（ａ））した。その後、図７のＴ−ｔｉＳｕｒｖｉｖｉｎと図８のｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎを各々肝臓ガン細胞株であるＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ−８０６５）に導入して、癌細胞成長抑制程度を測定した。
その結果、図１４（ｂ）及び図１４（ｃ）に示したように、本発明に係る多機能性ＲＮＡ構造体であるＴ−ｔｉＳｕｒｖｉｖｉｎをＰＥＩと結合させて導入した場合、ｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎを導入した場合と何も処理しない対照群とは異なって、癌細胞増殖を抑制してアポトーシス化する効果があることが確認できた。
即ち、本発明に係る複合体が癌細胞の増殖を抑制する効果があり、癌の治療及び増殖抑制用抗癌組成物として提供できることを確認した。
【００５８】
［実施例１０］免疫反応誘導の可否確認
本発明に係る多重ｓｉＲＮＡ及び核酸構造体が、従来のｓｉＲＮＡと比較して、ｄｓＲＮＡによって媒介される先天性免疫反応を引き起こすかを確認するために、３つの抗ウィルス性免疫反応遺伝子の発現の有無を確認した。
まず、ｄｓＲＮＡ処理に対し非常に高い免疫感受性を有すると報告されたＴ９８Ｇ細胞に、図７のＴ−ｔｉＳｕｒｖｉｖｉｎ、図８のｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎと、実施例２のｓｉＲＮＡ混合物及びｔｓｉＲＮＡを、各々Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００と結合して導入させた後、ＩＦＩＴ１、ＩＦＮ−β、ＯＡＳ２の誘導レベルを実施例２と同様の方法でＲＴ−ＰＣＲ方法によって測定した。使われたプライマー対は下記の通りであり、抗ウィルス性反応を起こす陽性対照群としてはポリ（Ｉ：Ｃ）導入された細胞を使った。
ＩＦＩＴ１  ＲＴ−ＰＣＲ用プライマー対
ＩＦＩＴ１−Ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＧＣＣ  ＡＣＡ  ＡＡＡ  ＡＡＴ  ＣＡＣ  ＡＡＧ  ＣＣＡ−３’（配列番号６６）
ＩＦＩＴ１−ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＣＣＡ  ＴＴＧ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＴＴＴ  ＡＡＧ  ＣＧＧ−３’（配列番号６７）
ＩＦＮ−β  ＲＴ−ＰＣＲ用プライマー対
ＩＦＮ−β  ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＡＧＡ  ＡＧＴ  ＣＴＧ  ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＡＡＡ  ＡＧＡ  ＴＡＴ  Ｔ−３’（配列番号４０）
ＩＦＮ−β  ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＧＴ  ＡＣＴ  ＣＣＴ  ＴＧＧ  ＣＣＴ  ＴＣＡ  ＧＧＴ  ＡＡ−３’（配列番号４１）
ＯＡＳ２  ＲＴ−ＰＣＲ用プライマー対
ＯＡＳ２−ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＴＣＡ  ＧＡＡ  ＧＡＧ  ＡＡＧ  ＣＣＡ  ＡＣＧ  ＴＧＡ−３’（配列番号６８）
ＯＡＳ２−ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＧＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＣＧＡ  ＧＧＧ  ＴＡＡ  ＡＴ−３’（配列番号６９）
その結果、図１５に示したように、本発明に係る多機能性核酸構造複合体とは異なり、ｄｓＲＮＡ処理に対し非常に高い免疫感受性を有すると報告されたＴ９８Ｇ細胞において本発明による多重ｓｉＲＮＡ複合体の場合、ウィルスによる免疫反応遺伝子と知られたＩＦＩＴ１及びＯＡＳ２の発現を誘導することを確認することができた。即ち、非特異的な免疫反応を誘導することを確認することができた。但し、ＩＦＮ−βの場合、ＨＥＬＡ細胞に導入した実施例２と同様に、ポリＩ：Ｃの陽性対照群によって誘導されるＩＦＮ−βｍＲＮＡレベルの１％未満に過ぎなかった。
前記実験結果は、非特異的な免疫反応を誘導しないためには、３つ以上の官能基を有する化合物をリンカーとして利用した多機能性核酸構造複合体がより効果的であることを示す。
【００５９】
［実施例１１］化学的修飾を有する多重ｓｉＲＮＡ複合体及び多機能性核酸構造複合体の作製及びＤｉｃｅｒに対する基質であるか否かの確認
長いｄｓＲＮＡが細胞内導入される場合、Ｄｉｃｅｒによって切断されて２１〜２３ｂｐのｓｉＲＮＡが生成されると知られている。そこで、本発明に係る多重ｓｉＲＮＡ及び多機能性核酸構造体が従来のｄｓＲＮＡらと異なる機構に従うのかを確認するために次のような実験を行った。
【００６０】
１１−１：ｔｓｉＲＮＡ及びＴ−ｔｉＳｕｒｖｉｖｉｎがＤｉｃｅｒ基質として作用するか否かの確認
２７ｂｐのｄｓＲＮＡ、実施例２のｓｉＬａｍｉｎとｔｓｉＲＮＡ、図８のｓｉＳｕｒｖｉｖｉｎ、及び図７のＴ−ｔｉＳｕｒｖｉｖｉｎを各々３０ｐｍｏｌずつＴｕｒｂｏ  Ｄｉｃｅｒ  ｓｉＲＮＡ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）を利用して、製造者のプロトコールに従って、１２時間反応させた後、各反応物の２μＬ分画を取って、１０％ｎｏｎ−ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌで展開させた。この時、ＥｔＢｒで染色し、ＵＶ  ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎで確認した。
２７ｂｐ  ｄｓＲＮＡ
Ｓｕｒｖｉｖｉｎ２７  Ｓｅｎｓｅ：５’−ＵＣＵ  ＵＡＧ  ＧＡＡ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＵＣＡ  ＡＣＡ  ＵＵＵ  ＵＣＡ−３’（配列番号７０）
Ｓｕｒｖｉｖｉｎ２７  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：５’−ＵＧＡ  ＡＡＡ  ＵＧＵ  ＵＧＡ  ＵＣＵ  ＣＣＵ  ＵＵＣ  ＣＵＡ  ＡＧＡ−３’（配列番号７１）
その結果、図１６に示したように、２７ｂｐのｄｓＲＮＡが完全に切断されることとは異なり、本発明に係る多重ｓｉＲＮＡや多機能性核酸構造体は、良いＤｉｃｅｒ基質ではないと確認された。但し、ｔｓｉＲＮＡの場合、部分的にＤｉｃｅｒによって切断されたことが確認された。そこで、以下化学的修飾を有する多重ｓｉＲＮＡ及び多機能性核酸構造体を作製して、次のような実験を行った。
【００６１】
１１−２：化学的修飾を有する多重ｓｉＲＮＡ複合体及び多機能性核酸構造複合体の製造及びこれらがＤｉｃｅｒの基質として作用するのか否かの確認
実施例２のｔｓｉＲＮＡ及び図７のＴ−ｔｉＳｕｒｖｉｖｉｎの接合される部分の一末端を図１７及び図１８のように灰色でアンダーラインの部分のヌクレオチドのリボースの２'位置のヒドロキシル基を−Ｏ−メチル基で置き換えた化学的修飾を有する多重ｓｉＲＮＡ（ｔｓｉＲＮＡ（ＯＭｅ））及び多機能性核酸構造体（Ｔ−ｔｉＳｕｒｖｉｖｉｎ（ＯＭｅ））を製造した後、実施例１１−１と同様の方法で実験を行った。
その結果、図１９に示したように、ｔｓｉＲＮＡ（ＯＭｅ）及びＴ−ｔｉＳｕｒｖｉｖｉｎ（ＯＭｅ）は共にＤｉｃｅｒの基質として作用しないことを確認することができた。
【００６２】
１１−３：化学的修飾を有する多重ｓｉＲＮＡ複合体及び多機能性核酸構造複合体の遺伝子発現抑制効果確認
実施例１１−２のようにＤｉｃｅｒの基質として作用しない化学的修飾を有する多重ｓｉＲＮＡ複合体及び多機能性核酸構造複合体が遺伝子発現抑制効果を有するのか否かを確認するために、実施例２及び実施例７−１と同様の方法でＲＴ−ＰＣＲを行った。
その結果、図２０に示したように、化学的修飾を有する多重ｓｉＲＮＡ複合体及び多機能性核酸構造複合体共に優秀な遺伝子発現抑制効果を有することを確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
以上説明した通り、本発明に係るｓｉＲＮＡ複合体及び多機能性核酸構造複合体は、従来複数の目的遺伝子発現を抑制するためのｓｈＲＮＡシステムに比べて容易に化学的合成される新しい構造を有し、従来のｓｉＲＮＡより向上した効率で複数の遺伝子を同時に発現抑制させられる長所がある。また、高い細胞内の伝達能を有するだけでなく、非特異的な抗ウィルス性反応を起こすことなく、特異的に目的遺伝子を発現抑制させられるため、癌やウィルス性感染等を治療するためのｓｉＲＮＡ機構媒介治療剤として非常に有用である。それと共に、本発明に係る多機能性核酸構造複合体は、ｓｉＲＮＡ以外にｍｉＲＮＡ、アンタゴｍｉＲ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー及びリボザイムのような機能性核酸オリゴヌクレオチドを結合して、同時に多様な機能を提供することができる。
【図１】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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