(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質含有組成物全体中ホスファチジルセリンを１０重量％以上含有し、且つ構成脂肪酸全体中高度不飽和脂肪酸の含有量が１０〜４０重量％であるリン脂質含有組成物の製造方法であって、以下の工程（１）、（２）及び工程（３）、（４）を含むリン脂質含有組成物の製造方法。
工程（１）：ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）により、リゾリン脂質と高度不飽和脂肪酸とのエステル化反応を行い、リン脂質を得る。
工程（２）：工程（１）の後、リン脂質に、無機塩のグリセリン溶液、炭素数４以下のアルコール、及び、グリセリンと混和せずリン脂質を溶解する有機溶剤を添加し、撹拌した後静置して、リン脂質を含む有機溶剤層と、ＰＬＡ２を含むグリセリン溶液層とを形成させ、該有機溶剤層を該グリセリン溶液層から分離することで、リン脂質からＰＬＡ２を除去し、リン脂質中のＰＬＡ２活性を１０Ｕ／ｇ（リン脂質）以下にする。
工程（３）：ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）の存在下、リン脂質とセリンの混合物における塩基交換反応を行い、ホスファチジルセリンを含むリン脂質含有組成物を形成する。
工程（４）：ホスファチジルセリンを含むリン脂質含有組成物を分離する。
【請求項２】
高度不飽和脂肪酸がＤＨＡである、請求項１に記載のリン脂質含有組成物の製造方法。
【請求項３】
リゾリン脂質が植物または卵黄由来のリゾレシチンである、請求項１または２に記載のリン脂質含有組成物の製造方法。
【請求項４】
リゾリン脂質が大豆由来のリゾレシチンである、請求項３に記載のリン脂質含有組成物の製造方法。
【請求項５】
無機塩のグリセリン溶液中の水分量が１０重量％以下である、請求項１に記載のリン脂質含有組成物の製造方法。
【請求項６】
グリセリンと混和せずリン脂質を溶解する有機溶剤が、炭素数が５〜８の炭化水素溶剤、及び／又は、エーテルである、請求項１に記載のリン脂質含有組成物の製造方法。
【請求項７】
グリセリン溶液中の無機塩濃度が、０．２〜４０重量％である、請求項１に記載のリン脂質含有組成物の製造方法。
【請求項８】
無機塩が、硫酸亜鉛、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム及び塩化カルシウムからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載のリン脂質含有組成物の製造方法。
【請求項９】
有機溶剤がヘキサンである、請求項１に記載のリン脂質含有組成物の製造方法。
【請求項１０】
炭素数４以下のアルコールがエタノールである、請求項１に記載のリン脂質含有組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスファチジルセリンを含むリン脂質含有組成物の製造方法、及び、リン脂質含有組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホスファチジルセリンは、認知機能障害、記憶力、集中力の改善など、脳機能の向上に有効であると言われており、ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）が結合することでそれらの効果がさらに高まることが知られている。ＤＨＡ結合ホスファチジルセリンは牛脳から抽出することにより生産できるが、狂牛病の影響から近年行われていない。また、ＤＨＡ結合ホスファチジルセリンは、ＤＨＡ結合ホスファチジルコリンやＤＨＡ結合ホスファチジルエタノールアミンなどにセリンの存在下でホスホリパーゼＤを作用させることにより合成できることが知られている（特許文献１）。また、ＤＨＡ結合ホスファチジルセリンの原料となるＤＨＡ結合ホスファチジルコリンは、多価不飽和脂肪酸を多く含む、まぐろや鰹、鯖、鰯、さんま、アジなどの魚類の組織や、多価不飽和脂肪酸を含む飼料で飼養されたニワトリより得られる鶏卵から抽出する方法がある（特許文献１）。さらに、大豆由来のホスファチジルセリンと海洋性のＤＨＡ結合ホスファチジルセリン（セリングリセロリン脂質接合体）を混合して用いる方法も知られている（特許文献２）。しかし、これらの方法では原料が高価であり、供給が安定していない。【０００３】
一方、リン脂質にＤＨＡを結合させてＤＨＡ結合リン脂質を作製する方法としては、ホスホリパーゼＡ２を用いてリン脂質の２位の脂肪酸を加水分解して得たリゾリン脂質、または市販のリゾリン脂質にＤＨＡを導入する方法がある（特許文献３）。【０００４】
しかし、特許文献３記載の方法では、リン脂質の２位の脂肪酸を加水分解する際に用いたホスホリパーゼＡ２の除去や失活操作を行っていないことから、ホスホリパーゼＡ２が相当量残留しているため、リゾリン脂質に結合したＤＨＡが保管中経時的に離脱する場合がある。また、該ＤＨＡ結合リン脂質を、特許文献１記載の方法に従ってセリン化しようとすると、セリンとホスホリパーゼＤによるセリン化には水が必要で、そのため反応中に２位で加水分解するという問題があり、ＤＨＡ結合ホスファチジルセリンの合成が効率的に行えなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平９−１２１８７９号公報
【特許文献２】特表２０１１−５２５５２５公報
【特許文献３】特開２０１０−０６８７９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
高度不飽和脂肪酸が多く結合したホスファチジルセリン、とりわけＤＨＡ結合ホスファチジルセリンを、安全な原料を用いて安価かつ安定的に供給する方法は知られていない。【０００７】
そこで、本発明の目的は、２位に高度不飽和脂肪酸が多く結合したホスファチジルセリンを含むリン脂質含有組成物を安価且つ安定的に供給することが可能な製造方法、及び、高度不飽和脂肪酸が多く結合したホスファチジルセリンを含むリン脂質含有組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、リン脂質と高度不飽和脂肪酸を原料に、特定の工程を含む製造方法を実施すると、高度不飽和脂肪酸が高効率で導入されたリン脂質含有組成物が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
即ち、本発明の第一は、リン脂質含有組成物全体中ホスファチジルセリンを１０重量％以上含有し、且つ構成脂肪酸全体中高度不飽和脂肪酸の含有量が１０〜４０重量％であるリン脂質含有組成物の製造方法であって、以下の工程（１）、（２）及び工程（３）、（４）を含むリン脂質含有組成物の製造方法に関する。
工程（１）：ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）により、リゾリン脂質と高度不飽和脂肪酸とのエステル化反応を行い、リン脂質を得る。
工程（２）：工程（１）の後、リン脂質に、無機塩のグリセリン溶液、炭素数４以下のアルコール、及び、グリセリンと混和せずリン脂質を溶解する有機溶剤を添加し、撹拌した後静置して、リン脂質を含む有機溶剤層と、ＰＬＡ２を含むグリセリン溶液層とを形成させ、該有機溶剤層を該グリセリン溶液層から分離することで、リン脂質からＰＬＡ２を除去し、リン脂質中のＰＬＡ２活性を１０Ｕ／ｇ（リン脂質）以下にする。
工程（３）：ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）の存在下、リン脂質とセリンの混合物における塩基交換反応を行い、ホスファチジルセリンを含むリン脂質含有組成物を形成する。
工程（４）：ホスファチジルセリンを含むリン脂質含有組成物を分離する。
【００１２】
ここで、無機塩のグリセリン溶液中の水分量が１０重量％以下であることが好ましい。【００１３】
好ましくは、グリセリンと混和せずリン脂質を溶解する有機溶剤が、炭素数が５〜８の炭化水素溶剤、及び／又は、エーテルである。【００１４】
好ましくは、グリセリン溶液中の無機塩濃度が、０．２〜４０重量％である。【００１５】
好ましくは、無機塩が、硫酸亜鉛、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム及び塩化カルシウムからなる群より選ばれる少なくとも１種である。【００１６】
好ましくは、有機溶剤がヘキサンである。【００１７】
好ましくは、炭素数４以下のアルコールがエタノールである。【００１９】
本発明では、例えば、高度不飽和脂肪酸がＤＨＡである。また、リゾリン脂質が植物または卵黄由来のリゾレシチンである。さらに、リゾリン脂質が大豆由来のリゾレシチンである。
【発明の効果】
【００２１】
本発明に従うと、２位に高度不飽和脂肪酸が結合したホスファチジルセリン、とりわけＤＨＡ結合ホスファチジルセリンを含むリン脂質含有組成物を、安価且つ安定的に供給することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明につき、さらに詳細に説明する。本発明のリン脂質含有組成物の製造方法は、特定の工程を含むことを特徴とする。また、本発明のリン脂質含有組成物は、植物や卵黄由来のリン脂質などを原料として合成されたリン脂質含有組成物であり、ホスファチジルセリンを特定量含有し、リン脂質の構成脂肪酸として高度不飽和脂肪酸を特定量含むことが特徴である。
【００２３】
本発明のホスファチジルセリンとは、リン脂質の一種であり、神経細胞に集中して存在し、脳内での情報伝達や血流に重要な働きをしている。
【００２４】
本発明の高度不飽和脂肪酸とは、炭素−炭素間の二重結合が４つ以上の不飽和脂肪酸、および、共役リノール酸のことである。高度不飽和脂肪酸は、学習機能向上、動脈硬化予防、脂質代謝改善などの機能を持っている。これらの高度不飽和脂肪酸は、トリグリセリドに結合した形態よりもリン脂質に結合した形態の方が抗酸化性が強く、安定性が高まり、摂取した際の吸収性も良いとされている。具体的な高度不飽和脂肪酸としては、ＤＨＡ、ＥＰＡ、アラキドン酸などが挙げられ、入手のし易さや機能の強さの観点から、ＤＨＡが好ましい。
【００２５】
本発明のリン脂質含有組成物は、ホスファチジルセリンを組成物全体中１０重量％以上含有することが好ましく、より好ましくは１０〜８０重量％、さらに好ましくは３０〜８０重量％、特に好ましくは４０〜８０重量％である。含有量が１０重量％より少ないと、本発明の効果が得られない場合がある。また、リン脂質含有組成物中の高度不飽和脂肪酸の含有量は、構成脂肪酸全体中１０〜４０重量％であることが好ましい。１０重量％より少ないと、高度不飽和脂肪酸による効果が低い場合があり、４０重量％より多いものは製造にコストがかかりすぎる場合がある。
【００２６】
＜ホスファチジルセリンの定量方法＞
リン脂質またはリン脂質含有組成物中のホスファチジルセリンの定量は、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１３（１９９０），ｐｐ１２６−１２９に記載の方法に沿って、ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ装置により分析する。ホスファチジルセリンの定量には、あらかじめ標準的な方法で大豆レシチンからホスホリパーゼＤを用いて合成し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製したホスファチジルセリン標品を用いて検量線を作成し、それを基に定量する。
【００２７】
本発明のリン脂質含有組成物の製造方法は、基本的には、以下の工程（１）、（２）をこの順序で、且つ工程（３）、（４）をこの順序で含む。
【００２８】
＜工程（１）＞
ホスホリパーゼＡ２（以下、ＰＬＡ２ともいう）を用いて、リゾリン脂質と高度不飽和脂肪酸とのエステル化反応を行い、高度不飽和脂肪酸が結合したリン脂質を得る。前記エステル化反応は、常法に従えばよいが、酵素の至適温度や脂肪酸の酸化等を考慮し、３０〜８０℃の温度範囲で行うのが好ましく、４０〜７０℃の範囲で行うことがより好ましい。３０℃未満であると酵素活性が低い場合があり、８０℃を超えると酵素が失活したり、脂肪酸が酸化したりする場合がある。また反応時間は、３〜７２時間が好ましい。ＰＬＡ２の添加量は、リゾリン脂質１００重量部あたり１〜１００重量部が好ましい。反応はリン脂質の脂肪酸組成を分析し、高度不飽和脂肪酸が構成脂肪酸中少なくとも１０重量％以上になったことを確認した後、終了させることが好ましい。
【００２９】
ここで用いるホスホリパーゼＡ２は、リン脂質の２位を加水分解、或いはリゾリン脂質の２位に脂肪酸を導入するための酵素である。特にその由来は問わないが、一般に食用に用いることができるものが好ましく、ブタ膵臓由来のものや微生物由来のものが挙げられる。
【００３０】
本発明のリゾリン脂質は、工業的にはホスホリパーゼＡ２によりリン脂質の２位に結合した脂肪酸を加水分解して得られる。その中でも、入手のし易さから、植物または卵黄に由来するレシチンから得られるリゾレシチンが好ましく、大豆や卵黄に含有されるレシチンから得られるリゾレシチンがより好ましく、コスト面を考慮すると、大豆由来のリゾレシチンがさらに好ましい。大豆由来のリン脂質の２位に結合した脂肪酸を常法に従ってホスホリパーゼＡ２により加水分解して得られるペーストや粉末状の大豆由来リゾレシチンでは、リゾホスファチジルコリンの含有量が１８〜３０重量％程度であり、濃縮したものでは６０〜７５重量％である。また、卵黄由来のリン脂質の２位に結合した脂肪酸を常法に従って加水分解して得られるペーストや粉末状の卵黄由来リゾレシチンでは、リゾホスファチジルコリンの含有量が５０〜８０重量％程度である。
【００３１】
上記のように、リゾリン脂質として大豆由来のリゾレシチンを用いた場合は、最終的に工程（２）又は（４）で得られるリン脂質含有組成物に、構成脂肪酸としてリノール酸を多く含むことになる。この時、構成脂肪酸全体中のリノール酸の含量は概ね１５〜４０重量％の範囲内であり、好ましくは２０〜４０重量％の範囲内である。
【００３２】
＜工程（２）＞
工程（１）の後、工程（１）で得られたリン脂質中のＰＬＡ２活性を１０Ｕ／ｇ（リン脂質）以下にする。この工程は、具体的には、以下で説明するようなリン脂質からＰＬＡ２を除去する工程（２）−１、または、リン脂質中のＰＬＡ２を失活させる工程（２）−２で実現される。工程（２）−１と工程（２）−２の両方を併用してもよい。
【００３３】
＜工程（２）−１＞
工程（１）の後、リン脂質（工程（１）でエステル化反応して得られたリン脂質含有反応溶液からリン脂質を有機溶剤に抽出した抽出溶液、この抽出溶液から有機溶剤を留去したリン脂質含有組成物、又はさらにアセトンなどにより脂肪酸が除去されたリン脂質含有組成物）に対して、無機塩のグリセリン溶液、炭素数４以下のアルコール、及び、グリセリンと混和せずリン脂質を溶解する有機溶剤を添加し、混合する。それらの添加量は、ＰＬＡ２の除去効果を考慮して適宜決定すればよく、前記反応溶液や抽出溶液が当該溶剤をあらかじめ含んでいる場合は適宜調整することができる。
【００３４】
そして混合後、２０〜６０℃に温調し、リン脂質が溶解した有機溶剤とグリセリンとが分離しないように強く攪拌する。好ましくは、４０〜６０℃に温調する。その後充分に撹拌した後静置して、ＰＬＡ２を含むグリセリン溶液層と、リン脂質を含む有機溶剤層とを形成させ、該有機溶剤層を分離（分取）する。即ち、リン脂質に残存していたＰＬＡ２をグリセリン溶液層側に移行させて除去することで、リン脂質中のホスホリパーゼＡ２活性を下げる。上記のような所定溶剤の添加および分取操作は、純度の向上と作業効率を考慮し、適宜繰り返しても良い。
【００３５】
前記有機溶剤層を分離した後は、有機溶剤を留去してリン脂質を回収できる。有機溶剤を留去した後、リン脂質を溶解せず脂肪酸や水を溶解する溶剤で洗浄処理を行い、沈澱したリン脂質を回収する方法が好ましい。
【００３６】
ここで前記炭素数４以下のアルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール及びブタノールが挙げられ、それらの群より選ばれる少なくとも１種を用いることができる。それらの内、毒性が低く食品添加物として利用できることから、エタノールが好ましい。
【００３７】
無機塩としては、グリセリンへの溶解性があるものなら特に限定は無いが、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、塩化カリウム、塩化ナトリウム及び塩化カルシウムからなる群より選ばれる少なくとも１種を使用することが好ましい。無機塩は、グリセリン溶液全体中０．２重量％以上となるように混合して用いることが好ましい。０．２重量％より少ないとＰＬＡ２の除去が十分でない場合がある。無機塩の濃度は濃いほどＰＬＡ２の除去効率は高くなるが、グリセリン溶液全体中４０重量％以下とすることが好ましい。４０重量％を超えると、グリセリン溶液の粘度が上昇し、もしくは無機塩が析出して扱いにくくなる場合がある。
【００３８】
前記無機塩のグリセリン溶液の調製は、グリセリンへの無機塩の分散性を考慮して、無機塩を水溶液にしてからグリセリンと混合することが好ましい。さらに、無機塩のグリセリン溶液全体中の水分量は少ないほど好ましいが、３０重量％以下であることが好ましく、１０重量％以下であることがより好ましく、さらに好ましくは１重量％以下である。グリセリン溶液中の水分量が３０重量％を超えると、ＰＬＡ２の除去が十分に行えない場合がある。また、無機塩を水溶液にしてからグリセリン溶液を調製した場合は、グリセリン溶液中の水を留去してから用いることが好ましい。
【００３９】
グリセリンと混和せずリン脂質を溶解する有機溶剤としては、炭素数が５〜８の炭化水素溶剤、及び／又は、エーテルが好ましい。具体的にはヘプタン、ヘキサン、ペンタン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等が挙げられ、食品用途への利用の観点からヘキサンがより好ましい。
【００４０】
リン脂質を溶解せず脂肪酸や水を溶解する溶剤としてはアセトンなどが挙げられる。
【００４１】
工程（２）−１の後、リン脂質中のホスホリパーゼＡ２活性は、低ければ低いほど良いが、１０Ｕ／ｇ（リン脂質）以下が好ましく、１Ｕ／ｇ以下がより好ましい。１０Ｕ／ｇよりも高いと、工程（１）でリン脂質に結合した高度不飽和脂肪酸が脱離し過ぎる場合がある。
【００４２】
なお、工程（２）としては、工程（２）−１を実施しても良いが、次の工程（２）−２を実施しても良い。
【００４３】
＜工程（２）−２＞
工程（１）の後、酸性プロテアーゼをリン脂質に添加することで、リン脂質中のＰＬＡ２を失活させてリン脂質中のホスホリパーゼＡ２活性を下げる。該プロテアーゼは、たんぱく質中のペプチド結合を切断する酵素であり、動物・植物・微生物に広く存在する。
【００４４】
具体的には、工程（１）でエステル化反応して得られたリン脂質含有反応溶液からリン脂質を有機溶剤により抽出し、抽出溶剤から溶剤を留去し、好ましくはアセトンなどの溶剤により脂肪酸が除去されたリン脂質含有組成物を水に分散させたリン脂質含有水溶液（酸性の水溶液）に酸性プロテアーゼを添加し、所定温度に保持して０．５〜４８時間攪拌して酵素反応することが好ましい。反応時間が０．５時間より短いと、ホスホリパーゼＡ２活性低減効果が小さい場合があり、４８時間より長いと、リン脂質が劣化する、もしくはリン脂質が凝集したり、プロテアーゼが失活するなどしてホスホリパーゼＡ２活性低減効果が頭を打ってしまう場合がある。前記所定温度は、酵素の至適温度でよいが、リン脂質の劣化を防ぐため６０℃を上回らない温度が好ましい。酸性プロテアーゼとしては、例えば、動物由来のペプシン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来の酸性プロテアーゼ等が挙げられる。酸性プロテアーゼの添加量は、リン脂質含有溶液１００重量部あたり０．１〜１０重量部が好ましい。
【００４５】
工程（２）−２は酸性プロテアーゼを用いた処理で完了してもよいが、好ましくは、酸性プロテアーゼを用いた処理後、続けて、リン脂質含有溶液のｐＨを４．０〜８．０に中和し、ここに中性プロテアーゼを添加する。より好ましくは、リン脂質含有溶液のｐＨを５．０〜７．０に中和し、ここに中性プロテアーゼを添加する。中性プロテアーゼを添加した後は、所定温度に保持して０．５〜４８時間撹拌して酵素反応することが好ましい。反応時間が０．５時間より短いと、ホスホリパーゼＡ２活性低減効果が小さい場合があり、４８時間より長いと、リン脂質が劣化する、もしくはリン脂質が凝集したり、プロテアーゼが失活するなどしてホスホリパーゼＡ２活性低減効果が頭を打ってしまう場合がある。前記所定温度は、酵素の至適温度でよいが、リン脂質の劣化を防ぐため６０℃を上回らない温度が好ましい。中性プロテアーゼとしてはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｏｒｙｚａｅ由来、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来等が挙げられる。中性プロテアーゼの添加量は、リン脂質含有溶液１００重量部あたり０．１〜１０重量部が好ましい。
【００４６】
酸性プロテアーゼによる酵素反応、或いは酸性プロテアーゼ及び中性プロテアーゼによる酵素反応終了後は、リン脂質を溶解し、水と混和しない溶剤（例えばヘキサン等）をリン脂質含有水溶液１００重量部に対して１０〜２００重量部添加・撹拌し、上層（溶剤層）を分取し、当該層から溶剤を除去してリン脂質を抽出することができる。リン脂質含有水溶液の粘度が高くなるなどして、前記溶剤だけではリン脂質を抽出しにくい場合は、さらに、エタノールなどの、水と混和するアルコール溶剤を加えることで抽出効率が向上する場合がある。アルコール溶剤を加える場合は、リン脂質含有水溶液１００重量部に対して１０〜１００重量部加えるのが好ましい。以上の処理により得られるリン脂質中のホスホリパーゼＡ２活性は、大幅に低減されている。
【００４７】
前記において、上層から溶剤を除去した後、リン脂質をアセトンで洗浄する方が好ましい。アセトン洗浄により、残留している水分や、加水分解で遊離した脂肪酸などを除去することができる。
【００４８】
工程（２）−２の後、リン脂質中のホスホリパーゼＡ２活性は、低ければ低いほど良いが、１０Ｕ／ｇ（リン脂質）以下が好ましく、１Ｕ／ｇ以下がより好ましい。１０Ｕ／ｇよりも高いと、工程（１）でリン脂質に結合した高度不飽和脂肪酸が脱離し過ぎる場合がある。
【００４９】
＜ホスホリパーゼＡ２活性の測定方法＞
本発明におけるリン脂質中のホスホリパーゼＡ２活性の測定方法は以下の通りである。まず、脱脂大豆レシチン６ｇに蒸留水４００ｍＬを加えて室温で３０分間攪拌する。その脱脂大豆レシチン溶液に、デオキシコール酸ナトリウム０．７ｇ及び塩化カルシウム２水和物０．５ｇを水１１０ｍＬに溶かした溶液を加え、氷冷しながら８０００ｒｐｍで１５分間ホモジナイズする。得られた溶液を活性測定溶液とする。活性測定溶液２０ｍＬを５０ｍＬのサンプル瓶に計り取り、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨを８．０に調整する。測定対象であるリン脂質サンプル２０ｍｇを１ｍＬの蒸留水に分散させ、その溶液をｐＨ８．０に調整した活性測定溶液に加えて、再度ｐＨを８．０に調整し、ｐＨを８．０に維持するために必要な２０ｍＭ水酸化ナトリウム溶液の１分当たりの滴定量を測定する。あらかじめ酵素標準溶液で作成した検量線を用いて、リン脂質中のＰＬＡ２活性を算出する。
【００５０】
＜工程（３）＞
工程（２）で得られたリン脂質又は市販のリン脂質をセリンと混合して、ホスホリパーゼＤ（以下、ＰＬＤともいう）の存在下、塩基交換反応を行い、リン酸基にセリンを結合させる。これにより、ホスファチジルセリンを含むリン脂質含有組成物を形成する。前記塩基交換反応としては、リン脂質を溶解する有機溶剤と、セリンやホスホリパーゼＤを溶解する水との二層系で実施する方法、もしくは水のみで実施する方法などがあり、何れの方法でも構わないが、リン脂質の溶解性の観点から二層系で実施する方法が好ましい。
【００５１】
具体的には、二層系で実施する方法を示す。まず、工程（２）で得られたリン脂質又は市販のリン脂質を溶解させた有機溶剤溶液を調製する。それとは別に、セリン及びホスホリパーゼＤを溶解させた水を調製しておく。そしてこれらを混合し、好ましくは２０〜５５℃の温度で０．５〜４８時間、層分離しないよう強く攪拌して反応させる。２０℃より低い温度で反応させると反応効率が悪い場合があり、５５℃より高い温度で反応させるとホスホリパーゼＤが失活する場合がある。また反応時間が０．５時間未満になると反応効率が悪い場合があり、４８時間を超えると加水分解などの副反応が進行する場合がある。
【００５２】
工程（３）で使用する有機溶剤は特に種類を問わないが、例えばヘキサン、アセトン、酢酸エチルなどが用いられる。ヘキサンとアセトンを併用する場合には、ヘキサン／アセトン（容積比）を２０／１〜１／１にすることが好ましい。ヘキサン／アセトン（容積比）が２０より大きいと水との混合性が悪くなり反応効率が悪くなる場合があり、１より小さいとリン脂質の溶解が悪くなり反応効率が悪くなる場合がある。
【００５３】
有機溶剤の量は、リン脂質が十分に溶解する量であれば問題ないが、リン脂質１００重量部に対して、５００〜２００００重量部用いることが好ましい。５００重量部より少ないとリン脂質の溶解が十分でなく反応効率が悪くなる場合があり、２００００重量部より多いと溶剤の使用量が多く回収などのコストが増加し過ぎる場合がある。
【００５４】
水の量については、溶剤と混合して効率的に攪拌できる量であれば構わないが、溶剤１００重量部に対して１０〜１０００重量部用いることが好ましい。１０重量部より少ないとセリンや酵素の溶解が十分でないため反応効率が低下する場合があり、１０００重量部より多いとホスホリパーゼＤによる加水分解が優勢となり反応効率が低下する場合がある。
【００５５】
セリンの量については、使用する水の量などにもよるが、リン脂質１００重量部に対して５０〜５０００重量部用いることが好ましい。５０重量部より少ないと反応効率が低下する場合があり、５０００重量部より多いとコストが増加し過ぎる場合がある。
【００５６】
本発明のホスホリパーゼＤは、リン脂質におけるリン酸基に結合したアミノ基を交換するための酵素であり、キャベツ等の植物由来のものや、植物の中でもピーナッツ等の豆類由来のもの、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ属やＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属などの微生物由来のものが挙げられる。そしてホスホリパーゼＤの量については、リン脂質１ｇあたり２０〜１０００Ｕ程度となるように用いることが好ましく、２０Ｕより少ないと反応効率が低下する場合があり、１０００Ｕを超えるとコストが増加し過ぎる場合がある。
【００５７】
＜工程（４）＞
工程（３）で形成されたホスファチジルセリンを含むリン脂質含有組成物を分離する。
【００５８】
工程（３）を二層系で実施する場合は、反応終了後撹拌を止めると、ホスファチジルセリンを含有するリン脂質含有組成物は有機溶剤層に移行しているので、有機溶剤層を回収した後、水洗により酵素を除去し、その後濃縮する。その後、好ましくはアセトンで洗浄してから、乾燥することで、ホスファチジルセリンを含む精製されたリン脂質含有組成物を得ることができる。
【００５９】
また、工程（３）を水のみで実施する場合は、反応終了後、例えば（１）水１００重量部に対して、ヘキサン等の有機溶剤を２５〜２００重量部添加し、充分撹拌してから、ホスファチジルセリンを含有するリン脂質含有組成物を有機溶剤層に移行し、有機溶剤層を回収した後、水洗により酵素を除去し、その後濃縮するか、（２）水層から析出するホスファチジルセリンを含有するリン脂質含有組成物を濾過することで当該組成物を回収する。回収後、好ましくはアセトンで洗浄してから、乾燥することで、ホスファチジルセリンを含有する精製されたリン脂質含有組成物を得ることができる。
【００６０】
以上では、本発明の製造方法を、工程（１）、工程（２）、工程（３）、及び工程（４）の順序で行う場合について説明した。しかし、本発明はこの順序に限定されず、別の態様によると、本発明は、工程（３）、工程（４）、工程（１）、工程（２）の順序で実施することもできる。この場合、工程（４）の後、工程（４）で得たリン脂質に対してＰＬＡ２を作用させることで、リン脂質の２位に結合した脂肪酸を加水分解してリゾリン脂質を得ればよい。当該リゾリン脂質を用いて工程（１）を実施する。そして、工程（２）でＰＬＡ２活性を低減して得られたリン脂質が、目的生成物であるホスファチジルセリンと高度不飽和脂肪酸を多く含むリン脂質含有組成物に該当する。さらに、前記のように工程（３）において、リン脂質含有組成物が移行した有機溶剤層を回収した後、水洗により酵素を除去できることから、コスト増を考慮しなければ、工程（３）、（１）、（２）、（４）の順序によっても、本発明の製造方法は実施可能である。
【００６１】
工程（３）、工程（４）、工程（１）、工程（２）の順序で実施する態様では、工程（１）で加水分解反応が進行するのを抑制するために、エステル化反応の反応速度を過度に抑制しない範囲で、工程（１）のエステル化反応の系中に含まれる水分量を低減することが好ましい。このために、工程（１）でのエステル化反応を減圧下で実施することや、原料に含まれる水分量をあらかじめ低減しておくことが好ましい。
【００６２】
本発明のリン脂質含有組成物の製造方法は、食用や飼料用のリン脂質含有組成物の製造に好適に用いることができる。その為には製造過程で食用に適さない原料やトルエン、ホルムアミドなどの溶剤などを使用さえしなければよい。また、本発明のリン脂質含有組成物は、高機能の食用或いは飼料用リン脂質として好適に用いることができる。その際、食品に添加しても良いし、そのまま摂取しても良い。
【実施例】
【００６３】
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。なお、実施例において「部」や「％」は重量基準である。【００６４】
＜リン脂質含有組成物の脂肪酸組成の分析＞
実施例・比較例で得られたリン脂質含有組成物１０ｍｇをイソオクタン２ｍＬに溶かし、０．２Ｍナトリウムメチラートのメタノール溶液１ｍＬを加えて６０℃で攪拌しながら１０分間加熱した。酢酸で中和し、水を加えて上層のイソオクタン層を回収してガスクロマトグラフで分析した。その際、ガスクロマトグラフとしては、アジレント社製「５８９０ｓｅｒｉｅｓＩＩ」を使用した。カラムとしては、アジレント社製「ＤＢ−２３」（長さ３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、膜厚０．２５μｍ）を用いて、注入口温度：２６０℃、検出温度：２６０℃、オーブン温度：２００℃一定で分析を行った。【００６５】
（実施例１）
以下の工程（１）〜（４）を行い、リン脂質含有組成物を得た。【００６６】
（工程（１））  高度不飽和脂肪酸が結合したリン脂質の作製
１Ｌのガラス製反応容器にグリセリン（阪本薬品社製）：２００ｇを注入し、そこに、リゾリン脂質（辻製油社製「ＳＬＰ−ホワイトリゾ」、リゾホスファチジルコリン含量規格：１８〜３０重量％）：１５ｇ、ホスホリパーゼＡ２（サンヨーファイン社製「リゾナーゼ」、活性：５万Ｕ／ｇ）：６ｇ、ＤＨＡ含有トリグリセリド（クローダジャパン「インクロメガＤＨＡ−Ｊ４６」、ＤＨＡ含有量：４９．７重量％）、定法によりアルカリ加水分解した脂肪酸：６ｇ、グリシン：６ｇ、アラニン：６ｇ、および２Ｍ塩化カルシウム水溶液：２ｍＬを加えて攪拌しながら、３００Ｐａの減圧下、５０℃で２４時間反応させた。【００６７】
（工程（２））  ホスホリパーゼＡ２活性を下げたリン脂質の回収
工程（１）の反応終了後、エタノール：１００ｍＬ、ヘキサン：１００ｍＬを加えてグリセリン溶液層と有機溶剤層の二層を形成した。ここから上層である有機溶剤層を回収し、溶剤を留去してリン脂質含有回収物を１５ｇ得た。該回収物にアセトン：５０ｍＬを加えてよくかき混ぜ、０℃で１時間冷却して得られた沈澱を回収し、リン脂質含有組成物を１０ｇ得た。このリン脂質含有組成物中に残存するＰＬＡ２の活性は、７５Ｕ／ｇであった。また、リン脂質中の脂肪酸組成の内、ＤＨＡの含量は１６．５重量％であった。【００６８】
グリセリン：５０ｇに、２Ｍ塩化カルシウム水溶液：１０ｍＬ、飽和塩化ナトリウム水溶液：１０ｍＬを加え、３００Ｐａの減圧下、６０℃で３０分間水分を除去して、グリセリン溶液を調製した。このグリセリン溶液に、上記で得たリン脂質含有回収物：１０ｇ、ヘキサン：５０ｍＬ及びエタノール：５０ｍＬを加え、５０℃で１時間攪拌した。攪拌終了後、静置してから上層（有機溶剤層）を回収し、当該層から溶剤を留去した後、アセトン：５０ｍＬを加えて０℃で１時間静置し、リン脂質含有組成物の沈澱を回収した。回収したリン脂質含有組成物中のＰＬＡ２残存活性を表１に示した。【００６９】
【表１】
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【００７０】
（工程（３））  回収したリン脂質のセリン化
１Ｌのガラス製反応容器に、工程（２）で得られたリン脂質含有組成物：８ｇを入れ、そこにヘキサン：３３６ｍＬ／アセトン：８４ｍＬの混合溶媒を混合・攪拌して溶解し、さらに緩衝液（０．０５Ｎ酢酸ナトリウム：０．０５Ｎ酢酸＝６：１（容積比））：１００ｍＬ、塩化カルシウム：０．８４ｇ、Ｌ−セリン：６０ｇを混合し、最後にホスホリパーゼＤ（ＴＨ−２株：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｐｔａｔｕｓ由来、岡山県）：３２４ｍｇを水：８ｍＬに溶解してから加え、４２℃で１２時間反応させ、セリン化した。【００７１】
（工程（４））  ホスファチジルセリンを含むリン脂質含有組成物の回収及び精製
工程（３）を終えた反応溶液を分液ロートに移し、静置して層分離させた後、下層を廃棄して上層（溶剤層）を回収した。回収した上層に水：５０ｍＬを加えて静置し、層分離させた後で下層を廃棄して上層（溶剤層）を回収することを２回繰り返した。回収した上層に無水硫酸ナトリウムを加えて水分を溶剤層から除去し、ろ紙で固形物を除いた。ロータリーエバポレーターで溶剤を留去し、リン脂質含有組成物を６．４ｇ回収した。該組成物全体中のホスファチジルセリンの含有量は２８重量％だった。また回収したリン脂質含有組成物の構成脂肪酸中のＤＨＡ含量は１６．２重量％、リノール酸の含量は３０重量％であった。【００７２】
（実施例２）
以下の工程（１）〜（４）を行い、リン脂質含有組成物を得た。【００７３】
（工程（１））  高度不飽和脂肪酸が結合したリン脂質の作製
リゾリン脂質として「ＳＬＰ−ＬＰＣ７０」（辻製油社製、リゾホスファチジルコリン含量規格：６５〜７５重量％）を用いた以外は実施例１と同様にして反応を行った。【００７４】
（工程（２））  ホスホリパーゼＡ２活性を下げたリン脂質の回収
工程（１）の反応終了後、実施例１と同様にしてＤＨＡ結合リン脂質含有組成物：９ｇを得た。このリン脂質含有組成物中に残存するＰＬＡ２の活性は、８６Ｕ／ｇであった。また、リン脂質中の構成脂肪酸組成全体中、ＤＨＡの含量は１６．４重量％であった。【００７５】
グリセリン：４５ｇに、２Ｍ塩化カルシウム水溶液：９ｍＬ、飽和塩化ナトリウム水溶液：９ｍＬ加えて、３００Ｐａの減圧下、６０℃で３０分間水分を除去してグリセリン溶液を調製した。このグリセリン溶液に、上記で得たリン脂質含有回収物：９ｇ、ヘキサン：４５ｍＬとエタノール：４５ｍＬを加えて５０℃で１時間攪拌した。攪拌終了後、静置してから上層（有機溶剤層）を回収し、当該層から溶剤を留去後、アセトン：４５ｍＬにクエン酸：４００ｍｇを溶解させたものを加えて０℃で１時間静置し、リン脂質含有組成物の沈澱を回収した。回収したリン脂質含有組成物中のＰＬＡ２残存活性を表１に示した。【００７６】
（工程（３））  回収したリン脂質のセリン化
１Ｌのガラス製反応容器に、工程（２）で得られたリン脂質含有組成物：６ｇを入れ、そこにヘキサン：２４０ｍＬ／アセトン：６０ｍＬの混合溶媒を混合・攪拌して溶解し、緩衝液（０．０５Ｎ酢酸ナトリウム：０．０５Ｎ酢酸＝６：１（容積比））：７０ｍＬ、塩化カルシウム：０．６ｇ、Ｌ−セリン：４５ｇを混合し、最後にホスホリパーゼＤ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｐｔａｔｕｓ由来ＴＨ−２株：岡山県）：２５０ｍｇを水：６ｍｌに溶解してから加え、４２℃で１２時間反応させ、セリン化した。【００７７】
（工程（４））  ホスファチジルセリンを含むリン脂質含有組成物の回収及び精製
工程（３）を終えた反応溶液を分液ロートに移し、静置して層分離させた後、下層を廃棄して上層（溶剤層）を回収した。回収した上層に水：５０ｍＬを加えて静置し、層分離させた後で下層を廃棄して上層（溶剤層）を回収することを２回繰り返した。回収した上層に無水硫酸ナトリウムを加えて水分を溶剤層から除去し、ろ紙で固形物を除いた。ロータリーエバポレーターで溶剤を留去し、リン脂質含有組成物を５ｇ回収した。該組成物全体中のホスファチジルセリンの含有量は４８重量％であった。また回収したリン脂質含有組成物の構成脂肪酸中のＤＨＡ含量は１６．９重量％、リノール酸の含量は３１重量％であった。【００７８】
（実施例３）
以下の工程（１）〜（４）を行い、リン脂質含有組成物を得た。【００７９】
（工程（１））  高度不飽和脂肪酸が結合したリン脂質の作製
１００ｍＬのガラス製反応容器にグリセリン（阪本薬品社製）：２０ｇを注入し、そこにリゾホスファチジルコリン（辻製油社製「ＳＬＰ−ＬＰＣ７０」）：１．５ｇ、ホスホリパーゼＡ２（サンヨーファイン社製「リゾナーゼ」、活性：５万Ｕ／ｇ）：０．６ｇ、試薬ＤＨＡ（シグマアルドリッチ社製、純度９８％以上）：０．６ｇ、グリシン：０．６ｇ、アラニン：０．６ｇ、２Ｍ塩化カルシウム水溶液：０．１ｍＬを加えて攪拌しながら、３００Ｐａの減圧下、５０℃で２４時間反応させた。【００８０】
（工程（２））  ホスホリパーゼＡ２活性を下げたリン脂質の回収
工程（１）の反応終了後、エタノール：１０ｍＬ、ヘキサン：１０ｍＬを加えてグリセリン溶液層と有機溶剤層の二層を形成した。ここから上層である有機溶剤層を回収し、溶剤を留去してリン脂質含有回収物を１．７ｇ得た。このリン脂質含有回収物中に残存するＰＬＡ２の活性は、９１Ｕ／ｇであった。また、リン脂質中の脂肪酸組成の内、ＤＨＡの含量は３３．２重量％であった。【００８１】
グリセリン：６ｇに、２Ｍ塩化カルシウム水溶液：１．２ｍＬ、飽和塩化ナトリウム水溶液：１．２ｍＬを加え、３００Ｐａの減圧下、６０℃で３０分間水分を除去して、グリセリン溶液を調製した。このグリセリン溶液に、ヘキサン：６ｍＬとエタノール：６ｍＬ及び上記リン脂質含有回収物を加えて５０℃で１時間攪拌した。攪拌終了後、静置してから上層を回収し、溶剤を留去した後、アセトン：６ｍＬにクエン酸：５４ｍｇを溶解させたものを加えて０℃で１時間静置し、リン脂質含有組成物の沈澱を回収した。回収したリン脂質含有組成物中のＰＬＡ２残存活性を表１に示した。【００８２】
（工程（３））  ホスホリパーゼＤによる回収したリン脂質のセリン化
１Ｌのガラス製反応容器に、工程（２）で得られたリン脂質含有組成物：１ｇを入れ、ヘキサン：３０ｍＬ、アセトン：８ｍＬの混合溶媒を混合・攪拌して溶解し、緩衝液（０．０５Ｎ酢酸ナトリウム：０．０５Ｎ酢酸＝６：１（容積比））：１０ｍＬ、塩化カルシウム：８４ｍｇ、Ｌ−セリン：６ｇを混合し、最後にホスホリパーゼＤ（ＴＨ−２株、岡山県）：３２ｍｇを水：０．８ｍＬに溶解してから加え、４２℃で１２時間反応させ、セリン化した。【００８３】
（工程（４））  ホスファチジルセリンを含むリン脂質含有組成物の回収及び精製
工程（３）を終えた反応溶液を分液ロートに移し、静置して層分離させた後、下層を廃棄して上層（溶剤層）を回収した。回収した上層に水：１０ｍＬを加えて静置し、層分離させた後で下層を廃棄して上層（溶剤層）を回収することを２回繰り返した。回収した上層に無水硫酸ナトリウムを加えて水分を溶剤層から除去し、ろ紙で固形物を除いた。ロータリーエバポレーターで溶剤を留去し、リン脂質含有組成物を０．８ｇ回収した。該組成物全体中のホスファチジルセリンの含有量は４６重量％だった。また回収したリン脂質含有組成物の構成脂肪酸中のＤＨＡ含量は３４．５重量％、リノール酸含量は３１重量％であった。【００８４】
（実施例４）
工程（１）における試薬ＤＨＡの代わりに、試薬アラキドン酸（シグマアルドリッチ社製、純度９９％以上）を用いた以外は、実施例３と同様にして工程（１）〜（４）に従ってリン脂質含有組成物を得た。【００８５】
工程（２）において回収したリン脂質含有回収物中に残存するＰＬＡ２の活性は、８７Ｕ／ｇであった。また、リン脂質中の脂肪酸組成の内、アラキドン酸の含量は３６．４重量％であった。【００８６】
また、工程（４）において回収したリン脂質含有組成物量は、０．８ｇだった。該組成物全体中のホスファチジルセリンの含有量は４８重量％だった。また回収したリン脂質含有組成物の構成脂肪酸中のアラキドン酸含量は３７．７重量％、リノール酸含量は３１重量％であった。【００８７】
（実施例５）
（工程（１））  高度不飽和脂肪酸が結合したリン脂質の作製
実施例１の工程（１）と同様に反応を行った。【００８８】
（工程（２））  ホスホリパーゼＡ２活性を下げたリン脂質の回収
工程（１）の反応終了後、エタノール：１００ｍＬ、ヘキサン：１００ｍＬを加えてグリセリン溶液層と有機溶剤層の二層を形成した。ここから上層である有機溶剤層を回収し、溶剤を留去してリン脂質含有回収物を１５ｇ得た。該回収物にアセトン：５０ｍＬを加えてよくかき混ぜ、０℃で１時間冷却して得られた沈澱を回収し、リン脂質含有組成物を１０ｇ得た。このリン脂質含有組成物中に残存するＰＬＡ２の活性は、７５Ｕ／ｇであった。また、リン脂質中の脂肪酸組成の内、ＤＨＡの含量は１６．５重量％だった。【００８９】
このリン脂質含有組成物：１０ｇを０．２Ｍクエン酸水溶液：１００ｍＬに分散させ、この水溶液に酸性プロテアーゼ（エイチビイアイ社製「オリエンターゼ２０Ａ」）：１ｇを加えて４５℃で５時間攪拌した。攪拌終了後、反応液に１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を添加してｐＨ７．０に調整し、中性プロテアーゼ（アマノエンザイム社製「ペプチダーゼＲ」）：１ｇを加えて４５℃で３時間攪拌した。攪拌終了後、反応液にエタノール：５０ｍＬとヘキサン：５０ｍＬを加えて攪拌してから静置分離した後上層を回収した。回収した上層の溶剤を留去し、残渣にアセトン：５０ｍＬを加えて０℃で１時間静置し、リン脂質含有組成物の沈澱を回収した。回収したリン脂質中のＰＬＡ２残存活性を表１に示した。【００９０】
（工程（３））  ホスホリパーゼＤによる回収したリン脂質のセリン化
１Ｌのガラス製反応容器に、工程（２）で得られたリン脂質含有組成物：７ｇ、ヘキサン：２８０ｍＬ、アセトン：７０ｍＬの混合溶媒を混合・攪拌して溶解し、緩衝液（０．０５Ｎ酢酸ナトリウム：０．０５Ｎ酢酸＝６：１（容積比））：８０ｍＬ、塩化カルシウム：０．６ｇ、Ｌ−セリン：５０ｇを混合し、最後にホスホリパーゼＤ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｐｔａｔｕｓ由来「ＴＨ−２株」、岡山県）：２４０ｍｇを水：６ｍＬに溶解してから加え、４２℃で１２時間反応させた。【００９１】
（工程（４））  ホスファチジルセリンを含むリン脂質含有組成物の回収及び精製
工程（３）を終えた反応溶液を分液ロートに移し、静置して層分離させた後、下層を廃棄して上層（溶剤層）を回収した。回収した上層に水：４０ｍＬを加えて静置し、層分離させた後で下層を廃棄して上層（溶剤層）を回収することを２回繰り返した。回収した上層に無水硫酸ナトリウムを加えて水分を溶剤層から除去し、ろ紙で固形物を除いた。ロータリーエバポレーターで溶剤を留去し、リン脂質含有組成物を６．１ｇ回収した。該組成物全体中のホスファチジルセリンの含有量は２９重量％であった。また該組成物の構成脂肪酸中のＤＨＡ含量は１６．９重量％、リノール酸量は３０重量％であった。【００９２】
（実施例６）
（工程（３））  ホスホリパーゼＤによるリン脂質のセリン化
１Ｌのガラス製反応容器に、リン脂質（辻製油社製「ＳＬＰ−ＰＣ７０」）：１０ｇを入れ、そこへヘキサン：３６０ｍＬ、アセトン：９０ｍＬの混合溶媒を混合・攪拌して溶解し、さらに緩衝液（０．０５Ｎ酢酸ナトリウム：０．０５Ｎ酢酸＝６：１（容積比））：１００ｍＬ、塩化カルシウム：１ｇ、Ｌ−セリン：７０ｇを混合し、最後にホスホリパーゼＤ（ＴＨ−２株：岡山県）：３５０ｍｇを水：９ｍＬに溶解してから加え、４２℃で１２時間反応させた。【００９３】
（工程（４））  ホスファチジルセリンを含むリン脂質含有組成物の回収及び精製
工程（３）を終えた反応溶液を分液ロートに移し、静置して層分離させた後、下層を廃棄して上層（溶剤層）を回収した。回収した上層に水：１００ｍＬを加えて静置し、層分離させた後で下層を廃棄して上層（溶剤層）を回収することを２回繰り返した。回収した上層に無水硫酸ナトリウムを加えて水分を溶剤層から除去し、ろ紙で固形物を除いた。ロータリーエバポレーターで溶剤を留去し、リン脂質含有組成物を８ｇ回収した。該組成物全体中のホスファチジルセリンの含有量は５２重量％だった。【００９４】
（工程（１））  高度不飽和脂肪酸が結合したリン脂質の作製
工程（３）で得たリン脂質含有組成物：９ｇを水：５０ｍＬに分散させ、１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ８．０に調整した。塩化カルシウム２水和物：１５０ｍｇを加え、さらにホスホリパーゼＡ２（サンヨーファイン社製「リゾナーゼ」、活性：５万Ｕ／ｇ）：１００ｍｇを加えて５０℃で３時間反応させ、該リン脂質含有組成物中の２位の脂肪酸を切断してリゾ化した。反応液にアセトン：３００ｍＬを加えて０℃で３０分間冷却し、沈澱したリゾホスファチジルセリンを含むリン脂質含有組成物を回収して得た。【００９５】
５００ｍＬのガラス製反応容器に、グリセリン（阪本薬品社製）：７０ｇを注入し、そこに上記リゾホスファチジルセリンを含むリン脂質含有組成物：５ｇ、ホスホリパーゼＡ２（サンヨーファイン社製「リゾナーゼ」、活性：５万Ｕ／ｇ）：２ｇ、ＤＨＡ含有トリグリセリド（クローダジャパン社製「インクロメガＤＨＡ−Ｊ４６」、ＤＨＡ含有量：４９．７重量％）を定法によりアルカリ加水分解した脂肪酸：２ｇ、グリシン：２ｇ、アラニン：２ｇ、２Ｍ塩化カルシウム水溶液：１ｍＬを加えて攪拌しながら、３００Ｐａの減圧下、５０℃で２４時間反応させた。【００９６】
（工程（２））  ホスホリパーゼＡ２活性を下げたリン脂質の回収
工程（１）の反応終了後、エタノール：３５ｍＬ、ヘキサン：３５ｍＬを加えてグリセリン溶液層と有機溶剤層の二層を形成した。ここから上層である有機溶剤層を回収し、溶剤を留去してリン脂質含有回収物を５．２ｇ得た。この回収物中のリン脂質含有組成物中に残存するＰＬＡ２の活性は、５６Ｕ／ｇであった。また、該リン脂質含有組成物中の脂肪酸組成の内、ＤＨＡの含量は１４．６重量％、リノール酸の含量は３２重量％であった。該組成物全体中のホスファチジルセリンの含有量は４０重量％であった。【００９７】
グリセリン：３０ｇに２Ｍ塩化カルシウム水溶液：１２ｍＬを加え、３００Ｐａの減圧下、６０℃で３０分間減圧して水分を除去して、グリセリン溶液を調製した。ヘキサン：３０ｍＬとエタノール：３０ｍＬ及び上記リン脂質含有組成物を加えて室温で１時間攪拌した。攪拌終了後、静置してから上層を回収し、溶剤を留去した後、アセトン３０ｍＬにクエン酸：２７０ｍｇを溶解させたものを加えて０℃で１時間静置し、リン脂質含有組成物の沈澱を回収した。回収したリン脂質含有組成物中のＰＬＡ２残存活性を表１に示した。【００９８】
（比較例１）  ＰＬＡ２失活なし
実施例１と全く同様にして工程（１）の反応を行った。工程（１）の反応終了後、エタノール：１００ｍＬ、ヘキサン：１００ｍＬを加えてグリセリン溶液層と有機溶剤層の二層を形成した。ここから上層である有機溶剤層を回収し、溶剤を留去してリン脂質含有回収物を１５ｇ得た。該回収物にアセトン：５０ｍＬを加えてよくかき混ぜ、０℃で１時間冷却して得られた沈澱を回収し、リン脂質含有組成物を１０ｇ得た。このリン脂質含有組成物中に残存するＰＬＡ２の活性は、７５Ｕ／ｇであった。また、該組成物中の脂肪酸組成のうち、ＤＨＡの含量は１６．５重量％だった。【００９９】
工程（２）を行うことなく、得られたリン脂質含有組成物を用いて実施例１と同様に工程（３）、工程（４）を行うと、残存したＰＬＡ２による分解を受け、回収物からホスファチジルセリンを含めリン脂質は検出されなかった。【０１００】
（比較例２）高度不飽和脂肪酸を結合せず、セリン化
市販の脱脂大豆レシチンを原料として、工程（１）、工程（２）を行うことなく、実施例１と同様に工程（３）、工程（４）を行った。その結果、最終的に得られたリン脂質含有組成物中のホスファチジルセリンの含有量は３０重量％であった。また該リン脂質含有組成物からＤＨＡは検出されなかった。
【要約】
リン脂質含有組成物全体中ホスファチジルセリンを１０重量％以上含有し、且つ構成脂肪酸全体中高度不飽和脂肪酸の含有量が１０〜４０重量％であるリン脂質含有組成物の製造方法であって、以下の工程（１）、（２）及び工程（３）、（４）を含む方法により、２位に高度不飽和脂肪酸が多く結合したホスファチジルセリンを含むリン脂質含有組成物を安価且つ安定的に供給する。工程（１）：ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）により、リゾリン脂質と高度不飽和脂肪酸とのエステル化反応を行い、リン脂質を得る、工程（２）：工程（１）の後、リン脂質中のＰＬＡ２活性を１０Ｕ／ｇ（リン脂質）以下にする、工程（３）：ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）の存在下、リン脂質とセリンの混合物における塩基交換反応を行い、ホスファチジルセリンを含むリン脂質含有組成物を形成する、工程（４）：当該組成物を分離する。