(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵島β細胞をインビトロで骨髄細胞と少なくとも３０日の持続期間で培養することを含有してなる、膵島β細胞を培養する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法により膵島β細胞を培養することを含有してなる、インビトロで膵島β細胞を増殖する方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法により膵島β細胞を培養することを含有してなる、膵島β細胞の生存能力を増大し、膵島β細胞の機能を改善し、及び／又は膵島β細胞の形態を改善する方法。
【請求項４】
持続期間が少なくとも６０日、少なくとも９０日又は少なくとも１２０日である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
膵島β細胞を骨髄細胞と培養することが、骨髄細胞の非存在下で培養された膵島β細胞と比較すると、膵島β細胞の生存能力を増大し、膵島β細胞の機能を改善し、及び／又は膵島β細胞の形態を改善する、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
膵島β細胞の機能を基礎インスリン分泌試験又はグルコース誘導インスリン分泌試験で測定する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
膵島β細胞の生存能力の増大、機能の改善、及び／又は形態の改善が持続期間の間に達成される、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
膵島β細胞を骨髄細胞と培養することが、骨髄細胞の非存在下で培養された膵島β細胞と比較すると、膵島β細胞のアポトーシスを減少させる、請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
膵島β細胞を骨髄細胞と培養することが、骨髄細胞の非存在下で培養された膵島β細胞と比較すると、膵島β細胞からのサイトカインの放出を減少させる、請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
サイトカインがＩＬ−１βである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
膵島β細胞を骨髄細胞と培養することが、少なくとも１つの内分泌細胞に特異的な遺伝子の発現を増大する、請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
内分泌細胞に特異的な遺伝子が、ＧＣＧ（グルカゴン、α細胞遺伝子）、ＩＮＳ（インスリン、β細胞遺伝子）、ＳＳＴ（ソマトスタチン、γ細胞遺伝子）、β細胞膵臓及び十二指腸ホメオボックス１（ＰＤＸ１又はＩＰＦ１）、ニューロジェニン３（ＮＧＮ３）、ペアードボックス遺伝子６（ＰＡＸ６）、膵島−１（ＩＳＬ−１）、ｖ−ｍａｆ筋腱肉腫癌遺伝子ホモログＡ（ＭＡＦａ）、及びＭｉｓｔ１に対する転写因子よりなる群から選ばれる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
骨髄細胞とインビトロで少なくとも３０日の持続期間で培養された膵島β細胞を含有してなる、医薬組成物。
【請求項１４】
骨髄細胞とインビトロで少なくとも３０日の持続期間で培養された膵島β細胞及び骨髄細胞を含有してなる、医薬組成物。
【請求項１５】
糖尿病を治療するための、請求項１３又は１４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００６年１１月２１日出願の、米国仮特許出願第６０／８６０，６３７号の優先権を主張し、この全てを参照として本明細書に組み入れる。
【０００２】
（連邦政府支援研究に関する陳述）
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）認可番号第Ｐ２０ＲＰ０１８７５７号を受けて米国政府の支援によってなされた。従って、米国政府は本発明に対して幾らかの権利を有している。
【０００３】
（技術分野）
本発明は概して膵島細胞培養の分野に関している。より詳細には、本発明は移植前の膵島細胞の長期培養及び可能性のある増殖のための骨髄細胞の使用に関する。本発明は、対象におけるインビボのヒト膵島機能と置き換えるための、骨髄細胞の存在下で生育している膵島細胞の使用も包含している。
【背景技術】
【０００４】
糖尿病は、主要で高まりつつある世界的な健康問題である[非特許文献１]。血糖値を管理しながらの、標準的なインスリンによる治療方法は、治癒をもたらさず、そして患者は未だこの疾患の多くの長期的な合併症にさらされている［非特許文献２，３］。膵臓移植はこの疾患を治癒できるが、組織適合性及び免疫抑制療法に対する反応性によって制限されている［非特許文献４］。膵島細胞の生存能力を保持するために、比較的速いドナーからの膵臓の採取が必要である。標準的な移植免疫抑制療法は膵臓移植に必ずしも有効とは限らない。更に、免疫抑制療法は、膵臓移植が必要な患者において、腎臓に、しばしば機能低下を呈する更なる損傷をもたらす。これに代わって、膵島β細胞の移植は効果が得られ、そして必要としている免疫抑制療法はそれ程極端でないが、膵島細胞は膵臓よりも入手しにくい［非特許文献５］。功を奏する膵島細胞移植はしばしば、二人又は三人のドナーから採取した細胞を必要とし、更にこの方法で治療できる患者の数を限定する。移植するための膵島β細胞の単離も簡単ではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Yamada, S. and I. Kojima, Regenarative medicine of the Pancreatic beta cells. J Hepatobiliary Pancreat Surg, 2005. 12(3): p. 218-26。
【非特許文献２】Das, S.R., et al., Increased cardiovascular risk associated with diabetes in Dallas County. Am Heart J, 2006. 151(5): p. 1087-93。
【非特許文献３】Borrero Pachon, M.P., [Diabetic foot]. Rev Enferm, 2006, 29(3): p. 8-14。
【非特許文献４】Balamurugan, A.N., et al., Prospective and Challenges of islet transplantaion for the therapy of autoimmunne diates. Pancreas, 2006. 32(3): p. 231-43。
【非特許文献５】Shapiro, A.M., et al., International Trial of the Edmonton Protocol for Islet Transplantation. N Engl J Med, 2006. 355(13): p. 1318-1330。
【非特許文献６】Lakey, J.R., M. Mirbolooki, and A.M. Shapiro, Current status of clinical islet cell transplantation. Methods Mol Biol, 2006. 333: p. 47-104。
【非特許文献７】Kayed, H., et al., Hedgehog signaling in the normal and diseased pancreas. Pancreas, 2006, 32(2): p. 119-29。
【非特許文献８】Lingohr, M.K., et al., Specific regulation of IRS-2 expression by glucose in rat primary pancreatic islet beta-cells. J Biol Chem, 2006. 281(23): p. 15884-92。
【非特許文献９】McCabe, C., A. Samali, and T. O'Brien, Cytoprotection of beta cells: rational gene transfer strategies. Diabetes Metab Res Rev, 2006. 22(3): p. 241-52。
【非特許文献１０】Truong, W., et al., Coinhibitory T-cell sinaling in islet allograft rejection and tolerance. Cell Transplant, 2006. 15(2): p. 105-19。
【非特許文献１１】Matsuda, T., et al., Inhibition of p38 pathway suppresses human islet production of pro-inflammatory cytokines and improves islet graft function. Am J Transplant, 2005. 5(3): p. 484-93。
【非特許文献１２】Chae, H.Y., et al., Effective glycemic control achieved by transplanting non-viral cationic liposome-mediated VEGF-transfected islets in streptozotocin-induced diabetic mice. Exp Mol Med, 2005. 37(6): p. 513-23。
【非特許文献１３】Mattsson, G., et al., Endothelial cells in endogenous and transplanted pancreatic islets: differences in the expression of angiogenic peptides and receptors. Pancreatology, 2006. 6(1-2): p.86-95。
【非特許文献１４】Olsson, R., A. Maxhuni, and P.O. Carlsson, Revascularization of transplanted pancreatic islets following culture with stimulators of angiogenesis. Transplantation, 2006. 82(3): p. 340-7。
【非特許文献１５】Oh, S.H., et al., Adult bone marrow-derived cells trans-differentiating into insulin-producing cells for the treatment of type I diabetes. Lab Invest, 2004, 84(5): p. 607-17。
【非特許文献１６】Hess, D., et al., Bone marrow-derived stem cells initiate pancreatic regeneration. Nat Biotechnol, 2003. 21(7): p. 763-70。
【非特許文献１７】Lechner, A., et al., No evidence for significant transdifferentiation of bone marrow into pancreatic beta-cells in vivo. Diabetes, 2004. 53(3): p. 616-23。
【非特許文献１８】Mathews, V., et al., Recruitment of bone marrow-derived endothelial cells to sites of pancreatic beta-cell injury. Diabetes, 2004. 53(1): p. 91-8。
【非特許文献１９】Dawn, B. and R. Bolli, Adult bone marrow-derived cells: Regenerative potential, plasticity, and tissue commitment. Basic Res Cardiol, 2005. 100(6): p. 494-503。
【非特許文献２０】Luo, L., N. Yano, and J.Z. Luo, The molecular mechanism of EGF receptor activation in pancreatic beta-cells by thyrotropin-releasing hormone. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2006. 290(5): p. E889-99。
【非特許文献２１】Luo, L.G., et al., Effect of prepro TRH antisense on thyrotropin-releasing hormone synthesis and viability of cultured rat diencephalic neurons. Endocrine, 2001. 15(1): p. 79-85。
【非特許文献２２】Luo, L.Z. and L. Luo, American Ginseng Stimulates Insulin Production and Prevents Apoptosis through Regulation of Uncoupling Protein-2 in Cultured beta Cells. Evid Based Complement Alternat Med, 2006. 3(3): p. 365-72。
【非特許文献２３】Cabrera, O., et al., The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006. 103(7): p. 2334-9。
【非特許文献２４】Brissova, M., et al., Assessment of human pancreatic islet architecture and cmposition by laser scanning confocal microscopy. J Histochem Cytochem, 2005. 53(9): p. 1087-97。
【非特許文献２５】Welsh, N., et al., Is there a role for locally produced interleukin-I in the deleterious effects of high glucose or the type 2 diabetes milieu to human pancreatic islets? Diabetes, 2005, 54(11): p. 3238-44。
【非特許文献２６】Storling, J., et al., Nitric oxide contributes to cytokine-induced apoptosis in pancreatic beta cells via potentiation of JNK activity and inhibition of Akt. Diabetologia, 2005. 48(10): p. 2039-50。
【非特許文献２７】Paraskevas, S., et al., Cell loss in isolated human islets occurs by apoptosis. Pancreas, 2000, 20(3): p. 270-6。
【非特許文献２８】Amrani, A., et al., IL-1alpha, IL-1beta, and IFN-gamma mark beta cells for Fas-dependent destruction by diabetogenic CD4(+)T lymphocytes. J Clin Invest, 2000. 105(4): p. 459-68。
【非特許文献２９】Eizirik, D.L. and M.I. Draville, beta-cell apoptosis and defense mechanisms: lessons from type 1 diabetes. Diabetes, 2001. 50 suppl 1: p. S64-9。
【非特許文献３０】Gurol, A.O., et al., Peritrasnplant and long-term secretion of interleukin-1beta in cyclosporine treated syngeneic rats allografted with islets of langerhans. Transplant Proc, 2005. 37(5): p. 2375-8。
【非特許文献３１】Raida, M., et al., Role of bone morphogenetic protein 2 in the crosstalk between endothelial progenitor cell and mesenchymal stem cells. Int J Mol Med, 2006. 18(4): p. 735-9。
【非特許文献３２】Ruscetti, F.W., S. Akel, and S.H. Bartelmez, Autocrine transforming growth factor-beta regulation of hematopoiesis: many outcomes that depend on the context. Oncogene, 2005. 24(37): p.5751-63。
【非特許文献３３】Ozturk, M.A., G.S. Guven, and I.C. Haznedaroglu, How hematopoietic stem cells know and act in cardiac microenvironment for stem cell plasticity? Impact of local renin-angiotensin systems. Med Hypotheses, 2004. 63(5): p. 866-74。
【非特許文献３４】Zhang, N., et al., Blood-borne stem cells differentiate into vascular and cardiac lineages during normal development. Stem Cells Dev, 2006. 15(1): p. 17-28。
【非特許文献３５】Thatava, T., et al., Chromatin-remodeling factors allow differentiation of bone marrow cells into insulin-producing cells. Stem Cells, 2006。
【非特許文献３６】Taneera, J., et al., Failure of transplanted bone marrow cells to adopt a pancreatic beta-cell fate. Diabetes, 2006. 55(2): p. 290-6。
【非特許文献３７】Kang, E.M., et al., Hematopoietic stem cell transplantation prevents diabetes in NOD mice but does not contribute to significant islet cell regeneration once diseaes is established. Exp Hematol, 2005. 33(6): p. 699-705。
【非特許文献３８】Moriscot, C., et al., Human bone marrow mesenchymal stem cells can express insulin and key transcription factors of endocrine pancreas developmental pathway upon genetic and/or microenvironmental manipulation in vitro. Stem Cells, 2005. 23(4): p. 594-603。
【非特許文献３９】Steele, A. and P. Steele, Stem cells for repair of the heart. Curr Opin Pediatr, 2006. 18(5): p. 518-523。
【非特許文献４０】Le Blanc, K. and O. Ringden, Mesenchymal stem cells: properties and role in clinical bone marrow transplantation. Curr Opin Immunol, 2006. 18(5): p. 586-91。
【非特許文献４１】Fazel, S., et al., Cardioprotective c-kit+ cells are from the bone marrow and regulate the myocardial balance of angiogenic cytokines. J Clin Invest, 2006. 116(7): p. 1865-77。
【非特許文献４２】Dell'Agnola, C., et al., Hematopoietic stem cell transplantation does not restore dystrophin expression in Duchenne muscular dystrophy dogs. Blood, 2004. 104(13): p. 4311-8。
【非特許文献４３】Chien, K.R., Lost and found: cardiac stem cell therapy revisited. J Clin Invest, 2006. 116(7): p. 1838-40。
【非特許文献４４】Wollert, K.C. and H. Drexler, Cell-based therapy for heart failure. Curr Opin Cardiol, 2006. 21(3): p. 234-9。
【非特許文献４５】Tang, Y.L., et al., Autologous mesenchymal stem cell transplantation induce VEGF and neovascularization in ischemic myocardium. Regul Pept, 2004. 117(1): p. 3-10。
【非特許文献４６】Carvalho, K.A., et al., Proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells, skeletal muscle cells and co-culture of both for cell myocardium therapy in Wistar rats. Transplant Proc, 2006. 38(6): p. 1955-6。
【非特許文献４７】Bin, F., et al., Construction of tissue-engineered homograft bioprosthetic heart valves in vitro. Asaio J, 2006. 52(3): p. 303-9。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
膵島の単離、保存及び移植の間に受ける事象は、膵島機能の損失及び糖尿病患者への膵島移植の治療可能性の限定をもたらす細胞死に関するものである。膵島β細胞移植方法についての重大な問題は、インビトロ又はインビボにおいて生存している膵島を保持することの困難さ、及びインビトロ培養における膵島組織の増殖不良に関している。ドナーからの膵臓の採取後できるだけ早く実施するように、膵臓から採取する間に細胞を培養しないと、移植が最も成功するということを研究が立証している。当然のことながら、移植は最も多くの移植を行うセンターにおいても最も成功する。このロバストな培養条件が欠如しているという理由で、膵島細胞移植のドナーは、組織の採取時に主要な移植センターの近くにいなければならず、そして移植者は、しばしばある持続期間にわたり、一人以上のドナーを待ちながら、主要な移植センターの近くに住んでいなければならない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、持続期間培養下で、膵島β細胞の生存能力、構造及び／又は機能を維持する方法を含んでいる。この方法は、骨髄細胞と膵島β細胞を培養することを含んでいる。骨髄細胞が、炎症性サイトカインの放出及びアポトーシスを減少させながら、膵島β細胞の生育及び生存能力を促進し、そしてβ膵島細胞の機能及び形態を強化することを見出した。膵島細胞が、基礎的な及び誘導的なインスリン放出によって示されたように、膵島細胞の機能を保持することを示した。臍帯血細胞及び単離した末梢ＣＤ３４＋血液細胞はβ膵島細胞の生育を保持し又は生存能力を増大することができなかった。
【０００８】
本発明は、膵島β細胞を複数の骨髄細胞と共に培養することによって、共培養におけるアポトーシスを減少させる方法を包含している、培養下の膵島β細胞を増殖する方法を含んでいる。骨髄細胞が、部分的であってもアポトーシスを減少させることによって、しかしながら膵島β細胞の数を増加することによっても、膵島β細胞の生育を促進することを見出した。膵島細胞を増殖する能力は、単独の移植者に対して複数のドナーの必要性を減少させるのに必須であり、膵島β細胞移植の広範な利用を潜在的に可能にする。
【０００９】
本発明は、膵島β細胞を複数の骨髄細胞と培養することによって、培養下で膵島凝集を促進する方法を含んでいる。骨髄細胞は膵島凝集の過程を刺激する。
【００１０】
本発明は更に、培養下の膵島β細胞からのサイトカイン及び他の炎症性調節因子の放出を減少する方法を含んでいる。この方法は、膵島β細胞を骨髄細胞と共に培養することを含んでいる。膵島β細胞の骨髄細胞との共培養は、骨髄細胞なしでの膵島β細胞の生育と比べると、インターロイキン（ＩＬ）−１βのような炎症性サイトカインの放出を減少させた。このことは膵島β細胞移植に応答する患者における炎症応答の減少をもたらすことができる。
【００１１】
本発明は、膵島β細胞を複数の骨髄細胞と培養することによって、膵臓に特異的な転写因子を含む内分泌細胞に特異的な遺伝子の発現を増大する方法を含んでいる。この因子は、ＧＣＣ（グルカゴン、α細胞遺伝子）、ＩＮＳ（インスリン、β細胞遺伝子）、及びＳＳＴ（ソマトスタチン、γ細胞遺伝子）の内分泌細胞に特異的な遺伝子；及びβ細胞膵臓及び十二指腸ホメオボックス１（ＰＤＸ１又はＩＰＦ１）、ニューロジェニン３（ＮＧＮ３）、ペアードボックス遺伝子６（ＰＡＸ６）、膵島−１（ＩＳＬ１）、ｖ−ｍａｆ筋腱肉腫癌遺伝子ホモログＡ（ＭＡＦａ）、及びＭｉｓｔ１に対する転写因子を含んでいる。この方法は、膵島β細胞を骨髄細胞と培養することを含む。この方法は更に、β細胞の再生を増加させるためにＮＧＮ３の発現を増大することを含んでいる。この方法は更に、ＰＤＸ１、ＩＰＦ１、ＮＧＮ３、ＰＡＸ６、ＩＳＬ１、及びＭＡＦａのうちの少なくとも１つの発現を増大することによって、β細胞の長期生存を促進することを含んでいる。この方法は、Ｍｉｓｔ１の発現を増大することによる新しい膵臓組織の構築を促進することも含んでいる。
【００１２】
本発明は、膵島β細胞を得ること、膵島細胞を骨髄細胞の存在下で培養すること、及び結合した膵島β細胞と骨髄細胞を治療が必要な対象に移植することを含有してなる、膵島細胞の移植を必要とする個人を治療する方法を含んでいる。この方法は、治療を必要とする対象の減少した又は失われた膵臓細胞の機能を改善するために、骨髄、好ましくは自家の骨随の存在下で培養している膵島細胞の直接移植によってインビボの膵臓細胞の機能を改善及び／又は置き換えるための骨髄の移植を含んでいる。膵島β細胞の移植を必要とする対象は、Ｉ型又はＩＩ型の糖尿病を患っている個人でよい。糖尿病は、病気による、又は膵臓癌におけるような膵臓の少なくとも一部の除去による、膵臓損傷によるものであってよい。本発明は更に、膵島細胞移植、改善された又は置き換わった膵島細胞の機能が必要な対象を選択又は同定することを含むことができる。本発明は、改善された膵臓活性について対象を監視することも含むことができる。
【００１３】
本発明は更に、本発明の方法を実施するためのキットを含んでいる。このキットは、例えば骨髄細胞又は骨髄を如何に採取するかについての説明書を、本発明の方法によって如何に膵臓細胞を培養するかについての説明書と共に含むことができる。キットは更に、骨髄細胞の存在下で膵島細胞を培養するための試薬、又は骨髄細胞と共に培養して生育する膵島細胞の生存能力、機能、及び／又は特性を測定するための試薬を包含している。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、骨髄細胞を加えて又は加えないで６日間又は１５６日間培養した膵島細胞の位相差顕微鏡画像である。（画像の倍率は２０倍）。図１ａは、６日間単独で培養した膵島β細胞を示す。図１ｂは、６日間骨髄細胞と培養した膵島β細胞を示す。図１ｃは、１５６日間単独で培養した膵島β細胞を示す。図１ｄは、１５６日間骨髄細胞と培養した膵島β細胞を示す。
【図２ａ−ｂ】図２は、細胞型特異的マーカーを用いる、膵島β細胞及び骨髄細胞の免疫蛍光及び免疫組織化学分析である。図２ａは、プロインスリンの抗体で染色した（矢印で示してある）、ＣＤ４５（骨髄細胞、細い矢印で示してある）（下図）で染色した、及びＤＡＰＩで核染色した、蛍光免疫組織化学染色を示す。図２ｂは、プロインスリン（太い矢印で示してある）及びＣＤ４５（細い矢印で示してある）のための免疫組織化学染色を示す。（画像の倍率は２０倍）。図２ｃは、２８日における骨髄−膵島の共培養と比較した膵島単独培養におけるプロインスリン陽性細胞の数を示す棒グラフである。（＊＝ｐ＜０．０１、ｎ＝６）
【図２ｃ】図２は、細胞型特異的マーカーを用いる、膵島β細胞及び骨髄細胞の免疫蛍光及び免疫組織化学分析である。図２ａは、プロインスリンの抗体で染色した（矢印で示してある）、ＣＤ４５（骨髄細胞、細い矢印で示してある）（下図）で染色した、及びＤＡＰＩで核染色した、蛍光免疫組織化学染色を示す。図２ｂは、プロインスリン（太い矢印で示してある）及びＣＤ４５（細い矢印で示してある）のための免疫組織化学染色を示す。（画像の倍率は２０倍）。図２ｃは、２８日における骨髄−膵島の共培養と比較した膵島単独培養におけるプロインスリン陽性細胞の数を示す棒グラフである。（＊＝ｐ＜０．０１、ｎ＝６）
【図３】図３は、１５３日間培養した、膵島α及びβ細胞の細胞型特異的マーカーを用いる免疫蛍光分析である。画像は位相差顕微鏡図（左図）、及び膵島表面（中央図）及び中間部（右図）の共焦点顕微鏡図である。アルファー細胞はグルカゴンに対する抗体で染色し（明るい矢印で示してある）、そしてβ細胞はプロインスリンに対する抗体で染色した（暗い矢印で示してある）。
【図４】図４は、骨髄細胞を加えて又は加えないで生育した膵島β細胞の機能分析である。図４ａは、一連の時点の間の基礎インスリン分泌のグラフである。図４ｂは、２０４日目までの一連の時点の間の高グルコースに応答するインスリン放出のグラフである。（＊＝ｐ＜０．０１、ｎ＝６）
【図５ａ−ｃ】図５は、培養中の膵島の生育である。図５ａは試験の概略図である。図５ｂは、骨髄細胞の非存在下（上図）又は存在下（下図）でのグリッド上の膵島の生育を示す。図５ｃは、培養中の膵島の生育を定量した棒グラフである（＊＝ｐ＜０．０５、ｎ＝６）。図５ｄは、新生期間中（左図）及び再添加後（右図、１３ヶ月以上）（倍率は５倍）におけるグリッド上で骨髄細胞と生育した膵島を示す。図５ｅは、図５ｄの右図に示されている膵島からの３２２日目〜４０６日目のインスリン放出のグラフである。図５ｆは、３６０、３６９、及び３９９日目の高グルコース投与に応答するインスリン分泌のグラフである。膵島単独培養は同じ時点で検出可能なインスリン分泌を有していない。
【図５ｄ−ｆ】図５は、培養中の膵島の生育である。図５ａは試験の概略図である。図５ｂは、骨髄細胞の非存在下（上図）又は存在下（下図）でのグリッド上の膵島の生育を示す。図５ｃは、培養中の膵島の生育を定量した棒グラフである（＊＝ｐ＜０．０５、ｎ＝６）。図５ｄは、新生期間中（左図）及び再添加後（右図、１３ヶ月以上）（倍率は５倍）におけるグリッド上で骨髄細胞と生育した膵島を示す。図５ｅは、図５ｄの右図に示されている膵島からの３２２日目〜４０６日目のインスリン放出のグラフである。図５ｆは、３６０、３６９、及び３９９日目の高グルコース投与に応答するインスリン分泌のグラフである。膵島単独培養は同じ時点で検出可能なインスリン分泌を有していない。
【図６】図６は、１５３日目に細胞型特異的マーカーを使用して行った、骨髄細胞を加えて又は加えないで培養した膵島β細胞の形態学的及び免疫蛍光分析である。左の画像は、骨髄細胞を加えて(上図）又は加えないで（下図）生育した膵島β細胞の位相差顕微鏡図である。右の画像は、Ｋｉ６７及びプロインスリン（矢印で示してある）に対する抗体を用いる蛍光免疫組織化学図である。（画像の倍率は２０倍）
【図７ａ−ｃ】図７は、１９０日目に細胞型特異的マーカーを使用して行った、骨髄細胞と培養した膵島β細胞の形態学的、免疫蛍光、及び機能分析である。図７ａは、骨髄細胞と１９０日間培養した膵島から生成した組織の画像であって、棒線は１ｃｍを示す。組織は長さが約１．８ｃｍで、明確な３次元構造を有している。図７ｂ及びｃは、図７ａで示されているものに相当する凍結組織からの５μｍの切断面である。図７ｂは、組織構造を明らかにするためのヘマトキシリン及びエオシンによる組織化学的染色を示す。矢印は、多孔性足場状組織で囲まれている部分に現れている膵島状構造を示している。図７ｃは、抗−ヒトプロインスリン抗体による免疫蛍光染色（矢印ｂで示してある）、抗−ヒトグルカゴン抗体で染色した細胞（矢印ａで示してある）、及び核染色ＤＡＰＩである。図７ｄは、骨髄細胞を加えないで（Ｉ）又は加えて（Ｂ＋Ｉ）培養した１９０日目の膵島β細胞からの基礎インスリン放出を示す棒グラフである。図７ｅは、骨髄細胞を加えないで（Ｉ）又は加えて（Ｂ＋Ｉ）培養した１９０日目の膵島β細胞からのグルコース投与に応答するインスリン放出を示す棒グラフである。（ｐ＜０．０５対膵島単独培養。画像の倍率は２０倍）
【図７ｄ−ｅ】図７は、１９０日目に細胞型特異的マーカーを使用して行った、骨髄細胞と培養した膵島β細胞の形態学的、免疫蛍光、及び機能分析である。図７ａは、骨髄細胞と１９０日間培養した膵島から生成した組織の画像であって、棒線は１ｃｍを示す。組織は長さが約１．８ｃｍで、明確な３次元構造を有している。図７ｂ及びｃは、図７ａで示されているものに相当する凍結組織からの５μｍの切断面である。図７ｂは、組織構造を明らかにするためのヘマトキシリン及びエオシンによる組織化学的染色を示す。矢印は、多孔性足場状組織で囲まれている部分に現れている膵島状構造を示している。図７ｃは、抗−ヒトプロインスリン抗体による免疫蛍光染色（矢印ｂで示してある）、抗−ヒトグルカゴン抗体で染色した細胞（矢印ａで示してある）、及び核染色ＤＡＰＩである。図７ｄは、骨髄細胞を加えないで（Ｉ）又は加えて（Ｂ＋Ｉ）培養した１９０日目の膵島β細胞からの基礎インスリン放出を示す棒グラフである。図７ｅは、骨髄細胞を加えないで（Ｉ）又は加えて（Ｂ＋Ｉ）培養した１９０日目の膵島β細胞からのグルコース投与に応答するインスリン放出を示す棒グラフである。（ｐ＜０．０５対膵島単独培養。画像の倍率は２０倍）
【図８】図８は、生細胞膜染色色素を用いて行った、共培養して最初の４８時間の膵島β細胞及び骨髄細胞の免疫蛍光分析である。ＰＫＩ−２６ＧＬで標識したヒト骨髄細胞を、ＰＫ−２ＧＬで染色した膵島と共培養して、培養中の骨髄細胞と膵島β細胞との相互作用を検討するために、特異的抗−プロインスリン抗体及び核染色用のＤＡＰＩで免疫組織化学染色を実施した。図８ａは７時間後の細胞を示す。図８ｂは２４時間後の細胞を示す。図８ｃは４８時間後の細胞を示す。図８ｄは９６時間後の細胞を示す。（画像の倍率は２０倍、矢印は骨髄及びβ細胞と共局在化している骨髄を示している）
【図９】図９は、骨髄細胞及び膵島β細胞を共培養液に導入後２０分間隔で記録した経時的顕微鏡検査の画像である。骨髄細胞及び膵島細胞をそれぞれＰＫＨ２６及びＰＫＨ２で個別に標識し、次いで共に培養した。画像ａ〜ｊは９６時間培養の１回分の画像である。太い矢印は骨髄を示し、細い矢印は、膵島中に放出された骨髄物質を示している。（画像の倍率は２０倍）
【図１０】図１０は、互いに向かって移動して（図１０ａ〜ｄ）、最終的に融合する（図１０ｅ）グリッド上の３つの膵島細胞を記録した経時的顕微鏡検査の画像である。図１０ｆは、骨髄細胞の結合した膵島内への移動を示す、骨髄細胞が標識されている別の実験からの画像である。
【図１１】図１１は、各時点で細胞型特異的マーカーを用いて測定した、膵島β細胞の骨髄細胞との培養液中の、ＩＬ−１βの濃度である。図１１ａは、培養液中へのＩＬ−１βの放出を示すグラフである。図１１ｂは、高グルコース（２０ｍＭ）刺激後の培養液中へのＩＬ−１βの放出を示すグラフである。（ｎ＝６、＊＝ｐ＜０．００１）
【図１２】図１２は、特定時点で細胞型特異的マーカーを用いて行った、骨髄細胞と培養する膵島β細胞のアポトーシスの免疫蛍光分析である。図１２ａは、ＴＵＮＥＬアッセイで評価した、骨髄細胞を加えないで(Ｉ）又は加えて（Ｂ＋Ｉ）培養した膵島β細胞中のアポトーシスの免疫蛍光分析を示す。膵島β細胞が、培養期間の７時間時点（７Ｈ）、４８時間時点（４８Ｈ）及び３週間時点（３Ｗ）にプロインスリン抗体で蛍光免疫組織化学染色されて示されている。図１２ｂは、示された時点における総β細胞に対するアポトーシス細胞の量を百分率で示すグラフである。（ｎ＝２４、＊＝ｐ＜０．０１）
【図１３】図１３は、培養下の膵島β細胞の機能を保護する非骨髄細胞型の分析である。図１３は、３１日間にわたって単独培養、又は臍帯血、末梢血、又は末梢血ＣＤ３４＋細胞と共培養した膵島β細胞からのインスリン放出のグラフである。
【図１４】図１４は、糖尿病のマウスモデルにおける膵島β細胞と骨髄細胞との共培養のインビボ評価である。図１４は、単独で培養した膵島β細胞又は骨髄細胞と共培養した膵島β細胞を移植したマウスにおける血糖値のグラフである。
【図１５】図１５は、膵島β細胞の移動を骨髄細胞が促進することのインビトロでの証明である。膵島凝集の形成の経時的顕微鏡検査の画像である。図１５ａ〜ｅは、倍率が５倍である。図１５ｆの膵島表面の濃い色は、膵島への骨髄細胞の移動を示している。（倍率は２０倍）
【図１６】図１６ａは、骨髄細胞の有り無しで生育した膵島β細胞におけるＧＣＧ及びＩＮＳの発現レベルについての倍数変化のグラフである。図１６ｂは、骨髄細胞の有り無しで生育した膵島β細胞におけるＳＳＴ及びＮＧＮ３の発現レベルについての倍数変化のグラフである。図１６ｃは、骨髄細胞の有り無しで生育した膵島β細胞におけるＩＰＦ１、ＩＳＬ１、ＰＡＸ６、ＭＩＳＴ１、及びＭＡＦＡの発現レベルについての倍数変化のグラフである。
【００１５】
（定義）
「持続期間」は、細胞のインスリンを放出する機能が、好ましくは膵島組織の生育を伴って、維持されるように膵島β細胞を維持するのに十分な期間であると解釈される。ある態様では、この期間は少なくとも約３０日、好ましくは少なくとも約６０日、より好ましくは少なくとも９０日、更により好ましくは少なくとも１２０日である。
【００１６】
「膵島β細胞の機能」は、これに限定されないが、形態学的、免疫組織化学的及び機能試験を含む多くの試験の何れかによって定義することができる。好ましい態様では、膵島β細胞の機能は、静止細胞又はグルコースに対する応答の何れかにおける、インスリン放出試験の活性によって定義される。より好ましい態様では、膵島β細胞は、約２０〜１００膵島（ＩＥＱ）において、（２０μＭのグルコース処理に応答して）３０分間にわたって少なくとも約１５０ユニットのインスリンを放出する機能を有していると定義される。膵島細胞機能を測定する正確な方法は本発明の限りではない。
【００１７】
「増大した膵島β細胞の生存能力」は、好ましくは膵島β細胞を骨髄細胞なしで生育させる対照培養と比較して、単時点で又は時間をかけて観察される細胞死のより低い比率として解釈される。生細胞の数は、生存細胞を確認するためのトリパンブルー色素排除、及び特定領域又は容量中の生細胞の数を測定するための血球計数機を用いる細胞計数のような、当業者に公知の方法で測定される。細胞の生存能力は、多くの市販アポトーシスアッセイの何れかを用いて、又は当業者に公知の方法によって測定することもできる。対照試料に比較して試料中アポトーシスのより低い割合は膵島β細胞の生存能力の増大を示唆している。アポトーシスのアッセイを、膵島β細胞であることを確認するための免疫組織化学染色と組み合わせることができる。膵島β細胞を測定する特定の方法は本発明の限定ではない。
【００１８】
本明細書で解釈されているような「膵島」は、インスリン及びその他のホルモンを分泌して器官の内分泌部分を形成する、膵臓に存在する細胞の集団であり、ランゲルハンス島としても知られている。膵島は膵臓の質量のおよそ１〜２％を構成している。健常成人の膵臓に約１００万の膵島があり、これは臓器中に散らばっていて、これらの総重量は１〜１．５ｇである。各膵島はおおよそ１０００個の細胞を含有していて、直径が５０〜５００μｍである。インスリン−産生β細胞が膵島細胞の約６５〜８０％を構成していて、グルカゴン−放出アルファ細胞が膵島細胞の約１５〜２０％を構成している。膵島細胞はソマトスタチン−産生デルタ細胞（約３〜１０％）及び膵臓ポリペプチド−含有ＰＰ細胞（１％）も含有している。
【００１９】
「細胞を得ること」は、作成すること、購入すること、又はそれ以外で細胞を入手することであると、本明細書では解釈される。
【００２０】
「膵島β細胞の増殖」にあるような用語「増殖」及び「増殖する」は、時間をかけて、培養中の膵島β細胞の生存細胞数及び機能が増大することであると解釈されている。増殖は、存在している膵島β細胞の細胞分裂又は骨髄細胞の膵島細胞への変換又はその両方を促進することによって起こり得る。
【００２１】
用語「培養中」は、例えば、温度、ＣＯ２、及び栄養の適切な条件下でのペトリ皿における、細胞の生育を包含すると解釈することができる。細胞は、例えば、動物、植物、又は海藻由来の天然又は人工のタンパク質基質のような、基質の存在下で培養できる。適切な状況下では、培養中は、例えば細胞の非天然の条件下での生育と解釈することができる。例えば、細胞を、動物の特定臓器中を含む、マウスのような動物に移植した培地中で、又は動物に移植する前にエクスビボの臓器培地中で培養することができる。
【００２２】
「膵島β細胞機能を維持する又は維持すること」にあるような「維持する」及び「維持すること」は、骨髄細胞の非存在下で培養されている膵島β細胞と比較して、膵島β細胞の生存能力の増大、及び／又は膵島β細胞の機能の改善、及び／又は膵島β細胞の形態の改善を含んでいると解釈される。
【００２３】
用語「対象」は生体を示す。ある態様では、生体は動物である。ある好ましい態様では、対象は哺乳動物である。ある態様では、対象は家畜である。ある態様では、対象はヒトである。対象は、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギ、及びヒツジを包含する。対象は糖尿病であると診断されていてもよい。別の態様では、対象はある別の膵臓疾患であると診断されている。
【００２４】
用語「対象の選択」又は「対象の同定」は、これに限定されないが、身体症状、診断方法で確認された臨床的特徴を包含する特有な特徴に基づいて、混合個人集団から１人又はそれ以上を選択することであると解釈される。
【００２５】
用語「対象の観察」は、膵島細胞の移植後に、好ましくは膵島細胞の移植前後の両方において、変化した膵島細胞の機能、好ましくは改善された膵島細胞の機能について、対象を観察すことであると解釈することができる。
【００２６】
本明細書中で述べられている範囲は、範囲内の全ての値についての略号であると解釈できる。例えば、１〜５０秒の時間は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８，２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０秒を含んでいると解釈される。
【００２７】
特定な記述がないか又は文脈から明瞭である限り、本明細書で用いられている用語「又は」は、包括的であると解釈することができる。
【００２８】
特定な記述がないか又は文脈から明瞭である限り、本明細書で用いられている用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は単数又は複数であると解釈することができる。
【００２９】
（詳細な説明及び好ましい態様）
本検討において、インビトロにおけるドナーヒト膵島の内分泌機能を保持する、同種骨髄の能力を検討した。ヒト膵島β細胞の同種骨髄との共培養は、膵島の生存及び機能の増大を示し、最終的に膵島構造及びβ細胞の機能を保持する微小環境を維持可能な新規な膵臓内分泌組織を形成した。
【００３０】
骨髄細胞は、膵臓内分泌組織の生育を刺激する一方で、膵島細胞から、ＩＬ−１βのような炎症性サイトカインの放出を減少できることを示した。骨髄細胞との共培養は膵島細胞のアポトーシスも減少させた。骨髄細胞は最終的に、長期間にわたる培養において（１３ヶ月以上）ヒト膵島細胞を機能的な膵臓内分泌膵島組織に回復させることを示した。このような効果は骨髄細胞に特異的であることが見出された。臍帯血細胞及び／又は単離した末梢血ＣＤ３４＋細胞は、インビトロにおいて膵島の機能又は生存を保持するのに有用ではなかった。このことは骨髄が、インスリン非依存性確立の成功を有意に改善することができる、ヒト内分泌膵臓組織の保持において独特な利点を提供することを立証している。
【００３１】
本発明は膵島β細胞の骨髄細胞との共培養を含んでいる。しかしながら、好ましい態様では、約１〜５×１０６個の骨髄細胞に対して約２５〜１００個の膵島の比率である。骨髄細胞に対する膵島のその他の比率も可能であること、そして培養が、骨髄幹細胞、葉様細胞、及び膵臓アルファー細胞のような追加の細胞型を含んでいてもよいことを理解されたい。
【００３２】
作用メカニズムに結びつけようとは思わないが、このデータは、骨髄細胞が膵島細胞からＩＬ−１βを含むサイトカインの放出を減少することによって、膵島細胞の形態、生存能力、及び／又は機能を増大することを示唆している。このことは、炎症性因子放出の減少、及びアポトーシス又は細胞死の減少をもたらすことが提示される。共培養は、膵臓特異的遺伝子及び再生に係わる成長因子の発現を増大することも明らかにした。本明細書に開示されているデータは、幾つかの骨髄細胞がβ細胞の表現型を呈してはいるが、恐らく明らかにされた生存及び生育効果の些細な要素に過ぎないことを示唆する。明らかにされた本発明の共培養方法の抗−アポトーシス効果は、恐らく傍分泌効果（その一つが炎症性サイトカイン、インターロイキン−１βの抑制であろう）に基づくものだろう［非特許文献２５、２８〜３０］。骨髄傍分泌生育因子によって刺激された膵島細胞の増殖及び生育が、膵島組織の再構築に寄与する主要な因子であると思われる［非特許文献２０、３１〜３３］。
【００３３】
本発明は、膵島β細胞と完全な骨髄との共培養に限定されない。勾配による細胞選別方法、細胞表面マーカー、及びその他の方法は当業者に周知である。骨髄細胞の１つ又はそれ以上の亜集団が、ある持続期間にわたり培養中の膵島β細胞の生存能力、形態、及び機能を促進するのに有効であることが期待される。本発明は細胞の起源によっても限定されない。同種の膵島β細胞と骨髄細胞を共培養する方法の使用は、何れかの哺乳動物の膵島β細胞と骨髄細胞の培養のために利用できることを理解されたい。用語「哺乳動物」は、齧歯動物、ウサギ、又は霊長類及び特にヒト患者のような、温血動物を示すように本明細書で用いる。意図する特定の齧歯動物及び霊長類は、ブタ、チンパンジー、ヒツジ、ヤギ、ウマ、マウス、ラット、ウサギ、及びサルを含む、認証されているヒト疾患のモデルを示すような動物を包含する。意図する特定のヒト患者は、膵臓細胞機能の低下若しくは喪失があるか、それが疑われるか、又はその危険性があるヒトを包含する。更に、免疫系が欠如しているヌードマウス又はその他の動物の骨髄中で、ヒト膵島細胞を培養することを含んでいる方法は本発明の範囲内である。
【００３４】
本明細書中に開示されているデータは、同種のヒト骨髄と膵島β細胞との共培養が、インビトロにおいて１３週間以上を含む、長期間にわたる膵島組織の生育を伴う膵島数及びインスリン放出機能の維持を可能にすることを示唆している。先行の検討では、培養したヒト膵島は一般に機能及び生存能力を３〜４週間後に失った［非特許文献２７］。これらの検討における、膵島中の細胞は基礎のインスリン産生及びグルコース投与への応答を維持しているα及びβ細胞を含有している。これらの観察は同種の骨髄細胞との共培養を用いる膵島細胞の移植に対して即時の対応を示唆している。しかしながら、本発明の方法は培養で生育させた後の膵島細胞の使用に限定されない。
【００３５】
本発明を以下の実施例を用いて更に説明する。これらの実施例は、発明の理解を助けるために提供されていて、それらを限定するように意図されていない。本願全体にわたって引用されている引例、特許及び公開特許出願は、更に図面も、その全てが参照として本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００３６】
（実施例１）
細胞染色方法。
蛍光及び化学染色色素を用いる細胞の染色及び免疫蛍光測定の方法は当業者に周知である。多数の実施例がこのような染色方法を含んでいる。細胞染色の典型的な方法を提供する。チャンバースライド上で生育している細胞を３％のパラホルムアルデヒドで固定し、次いで１０％の正常ヤギ血清へ暴露した。スライドを洗浄せずにブロットして、一次抗体の混合物を適用し、次いでスライドを湿性チャンバー中、４℃で１晩培養した。スライドを３回洗浄した後、二次抗体に室温で４５分間暴露した。洗浄後、希釈した二次抗体を適用して、スライドを１５分間培養した。引き続きスライドをＰＢＳで十分に洗浄して、必要により、二次蛍光色素（例えば、ＤＡＰＩ）及び／又は三次抗原−検出抗体を用いて、上記の工程を繰り返した。工程が終了したときに、スライドを蛍光封入剤及びカバースライドで覆った。次いで、試料を観察して、共焦点蛍光顕微鏡を用いて撮影した［非特許文献２２］。
【００３７】
（実施例２）
ヒト骨髄とヒト膵島β細胞の共培養。
正常ドナー由来の、ヒト膵島組織を、Islet Resource Centers(ICRs) in the ICR Basic Islet Distribution Program、Human Islet Laboratory、University of Pennsylvania (Philadelphia, PA)、Joslin Diabetes Center (Boston, MA) 及び City of Hope National Medical Center (Duarte, CA) から入手した。これらの細胞の使用は、IRB at Roger William Hospital 及び  ICRs Committes から認証を受けた。
【００３８】
正常ドナー由来のヒト骨髄は、Roger Williams Hospital Institutional Review Committee (IRB) によって認証された適切な同意書に署名した後に入手した。骨髄単核細胞を、Ficoll-Paque（登録商標）Plus (Amersham Biosciences; Amersham, UK)を用いて製造会社の説明書に従って単離した。次いで細胞を５％のＦＣＳ／ＰＢＳで２回洗浄して、培養培地（下記を参照されたい）に再懸濁した。細胞の生存能力を評価するために、トリパンブルー染色を用いた。
【００３９】
ヒト膵島を、ボランティアドナーの死後４８時間以内に Islet Cell Resource Centers (ICRs) から受領した（純度＞９０％、生存率＞９５％で）。１ｍｌ当たり５０膵島当量（ＩＥＱｓ）を１×１０６個／ｍｌの同種全骨髄細胞と、１０％の加熱不活性化ウシ胎仔血清（ＨｉＦＢＳ）、５．５ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、及び１％のＰ／Ｓで補完した、ＲＰＭＩ１６４０（製造会社）中で、加湿した３７℃のインキュベータ中、５％のＣＯ２下で、培養した。
【００４０】
図１ａ〜ｄは、骨髄細胞の非存在下（ａ及びｃ）及び存在下（ｂ及びｄ）で６日（ａ及びｂ）又は１５６日（ｃ及びｄ）の何れかの間生育させた膵島β細胞を示している。形態の相違がたった６日後に明瞭である。骨髄細胞の非存在下で生育した細胞は単層の形成を開始した（図１ａ）のに対して、骨髄細胞の存在下で生育した細胞は同様な形態上の損失を示さなかった。骨髄細胞は膵島細胞を包囲して、膵島細胞膜を保護し、そして細胞が拡散するのを阻害する（図１ｂ）。形態における相違は１５６日目でなおさら目立った。骨髄細胞の非存在下で生育した細胞は単層を形成した（図１ｃ）のに対して、骨髄細胞の存在下で生育したものは、円形の膵島を形成した（図１ｄ）。
【００４１】
図２ａ〜ｂは、骨髄細胞の非存在下（左図）又は存在下（右図）で生育した２８日目の膵島β細胞を示す。膵島を０．０５％のトリプシン（Promega, Madison, WI) で５分間消化した。ＰＢＳで１回洗浄した後、細胞のサイトスピンスライドを作成した。図２ａの上図の細胞は核を可視化するためにＤＡＰＩで染色した。下図の細胞は、プロインスリン及び骨髄細胞のマーカーであるＣＤ４５を標的とする抗体で染色して、画像化すると異なった色で見える二次抗体を用いて可視化した。
【００４２】
膵島細胞単独培養（左図）における細胞数は、骨髄共培養（右図）と比較して、実質的に少なかった。更に、膵島細胞単独培養において、多くの細胞がプロインスリンを発現していないように見えた（すなわち、これらはＤＡＰＩで染色されるが、抗−ＣＤ４５抗体では染色されない）。
【００４３】
右側の図において、太い下の矢印で示されている比較的大きな細胞の集団が、集団中に幾つかの骨髄細胞が存在していることを示唆する、いくらかの斑点ＣＤ４５染色を伴い、プロインスリン染色されていた。細い上の矢印は、ＣＤ４５抗体で染色されている細胞を示している。共培養中のプロインスリン染色されていない大部分の細胞は、ＣＤ４５に染まり、これらが骨髄細胞であることを示唆した。
【００４４】
免疫蛍光分析による観察を確認するために、免疫組織化学法を用いて細胞を染色した。プロインスリン発現細胞及びＣＤ４５発現細胞を異なった発色団で染色した。また、膵島細胞単独培養中の多くの膵島細胞がプロインスリン発現していなかったのに対して、共培養中の殆ど全ての非骨髄細胞がインスリンを発現していた。プロインスリン染色は左図において矢印で示されていて、矢印は右図でも更に右に示されている。ＣＤ４５染色は左図において更に図の左に矢印で示されている。また、より生存能力がある細胞及びより多くのプロインスリン染色が共培養中で観察された。
【００４５】
プロインスリン陽性膵島の百分率の定量分析が図２ｃに示されている。膵島細胞単独培養と比較して、共培養において有意に多数の（２．７倍多い）膵島細胞がプロインスリンを発現することが見出された（ｐ＜０．０１、ｎ＝６）。
【００４６】
図３は、１５３日目の培地に形成された膵島を示す。左図は膵島の位相差画像である。中央図及び右図は、それぞれ膵島の先端部及び中心部の共焦点画像である。α細胞をグルカゴンに対する抗体で染色して、細胞塊の中心に向かう矢印で示し、そしてβ細胞をプロインスリンを標的とする抗体で染色して細胞集団の外に向かう矢印で示した。α細胞は低血糖に応答してグルカゴンを放出する。共焦点画像から明らかのように、β細胞がα細胞を取り囲んだ。この分析は、β細胞が細胞集団の大多数を占め、そしてα細胞が膵島の中心部に局在することを明らかにしていて、これらの培養中で再構成が起こっていることを示唆している［非特許文献２３、２４］。
【００４７】
これらの結果は、骨髄細胞が、インビトロで長期にわたって、膵島の形態を保持し、そして膵島細胞に特異的なマーカーの発現を保持するのに役立つことを明確に示唆している。
【００４８】
（実施例３）
インスリン放出試験における膵島機能の評価
グルコースを投与するか又は投与しないときのインスリンの放出を測定して膵島細胞の機能を評価した。培養培地を１週間に２回採取して、ＥＬＩＳＡによる基礎インスリン放出を試験するまで、−８０℃で保管した。
【００４９】
高グルコース投与試験を以下のようにして１週間に１回実施した。培養液を採取して、培養細胞をＲＰＭＩ培養液で１回洗浄した。次いで培養液を高グルコース（２０ｍＭ）ＲＰＭＩ１６４０に１５分間及び３０分間置き換えた。培養液を最終的に採取して、ＥＬＩＳＡによるインスリン試験まで−８０℃で保管した。
【００５０】
標本（細胞培養培養液又は組織抽出物）中のインスリン濃度を、Human Insulin ELISA Kit（Linco Research, St. Charles, MO）を用い、製造会社の使用説明書に従って測定した。すなわち、インスリン標準品及び適切に希釈した（１：５０〜１：５００）サンプルをインスリン抗体で被覆した９６ウェルのマイクロプレートに加えて４℃で２時間培養した。洗浄後、抗−ヒトインスリン酵素複合体をそれぞれのウェルに加えて室温で３０分間培養した。洗浄後、酵素基質溶液を加えてから、暗所で室温にて、４５分間培養した。１Ｎの硫酸を加えて反応を停止した。４５０ｎｍにおける吸光を、μQuant（登録商標）マイクロプレートリーダー（Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT）で読み取って、KC Junior（登録商標）マイクロプレートリーダーソフトウェア（Bio-Tek Instruments, Inc.）で濃度を計算した［非特許文献２０］。
【００５１】
細胞の機能的統合性を、基礎インスリン放出試験及び高グルコース投与に応答するインスリン分泌試験を用いて測定した。これらの試験は、骨髄細胞と共培養された膵島が培養２０４日にわたって安定した形でインスリンを放出することを明らかにした（図４ａ）。インスリン放出レベルは、開始時の約８０００μＵ／ｍｌから培養１９５日目の約１０，０００μＵ／ｍｌでほぼ安定していた。経時的なヒトインスリン放出の増大は、経時的な膵島細胞の再生及び／又は増殖を示唆している。
【００５２】
単独で培養した膵島は不安定なインスリン放出を示した（図４ａ）。すなわち、平均約９，５００μＵ／ｍｌで始まって、培養の２８日目の約１７，５００の高さから約４，９００μＵ／ｍｌへ急激に下落する著しい変化を伴い、５週間目までに機能を失った。形態学的研究と関連付けると、これら１５日目と２８日目における急な山形の所見は、膵島単独培養中の死にかけているβ細胞からのインスリンの漏出の結果が原因である可能性が高かった。同様に、共培養の最初の２１日間における比較的低い基礎インスリン放出は、機能安定化を達成する前の死にかけたβ細胞の不足に起因していたのであろう。
【００５３】
グルコース投与（２０ｍＭ）に応答するインスリン分泌の評価は、膵島細胞の単独培養が、高グルコース投与に対する応答能力を殆ど４２日目までに、完全に７０日目までに失うのに対して、骨髄細胞と培養した膵島細胞が培養中の２０４日にわたってグルコースに応答可能であることを明らかにした（図４ｂ）。インスリン放出及びグルコース投与に応答するインスリン分泌に関する、膵島単独培養とＢＭとの膵島培養との間の差は、統計的に有意であった（ｐ＜０．０１、ｎ＝６）。
【００５４】
（実施例４）
膵島β細胞の骨髄細胞との共培養は細胞の生育及び膵島細胞塊の形成を促進する。
細胞の生育及び膵島細胞の形成を、グリッド（格子）上で膵島β細胞を骨髄細胞有り又は無しで生育させて観察した。グリッドの上にある膵島細胞の概略図を図５ａに示してある。グリッドを用いて、１つの膵島を生育について経時的に観察することができる。膵島細胞を追跡して、形態学的変化を顕微鏡写真として記録した。ＮＩＨの画像分析ソフトウェアを用いて膵島の表面積（ピクセル値）を定量した。３つの膵島の表面積値の平均を１つのサンプルとみなして、１群当たり６つのサンプルを集めた。
【００５５】
培養の始めの３週間においては、機能的に有意な差があるにも係わらず、骨髄細胞有り及び無しで培養した膵島の間に形態学的な相違が殆ど観察されなかった（図示せず）。しかしながら、３週間後に骨髄細胞の存在下で培養した膵島が増殖し続けたのに対して、骨髄細胞の非存在下で培養した膵島は、減少して最終的に消失した（図５ｃ）。膵島及び細胞の大きさの変化を、画像分析ソフトウェアを用いて定量した。その結果は、骨髄の膵島との共培養では、１７日間（５４日目〜７１日目）でその表面積を１．８倍増大したことを明らかにした。これは、大きさの増大及び膵島の形成を実質的に示さない膵島単独培養と比較すると優位な差であった（図５ｃ、ｐ＜０．０５、ｎ＝６）。
【００５６】
図５ｄは、１３ヶ月にわたる共培養（右図）における新生初期（左図）のグリッドスライド上の膵島細胞の生育を示す。長時間にわたる共培養における大きさの実質的な増大がグリッドスライド上で容易に観察される。増大した膵島の大きさは、骨髄細胞が膵島の増殖を刺激した結果であると思われ、このことはそのＫｉ６７の有意な発現によって確認できる（図６）。
【００５７】
図５ｅ及びｆは、膵島細胞が培養１３ヶ月後に機能を保持していたことを明らかにしている。機能試験を上記のように実施した。インスリンの放出を、観察期間４０６日間の終わりまで観察した（図５ｅ）。高グルコースに応答するインスリン分泌を、図５ｆに示すように、３６０日目、３６９日目、及び３９９日目に観察した。これらのデータは、少なくとも１３ヶ月にわたって骨髄の存在下で生育した膵島β細胞の持続した機能を明らかにしている。
【００５８】
（実施例５）
膵島β細胞の骨髄細胞との共培養は増殖を促進する。
図６は、培養液中で骨髄細胞有りで（上図）又は無しで（下図）生育した１５３日後の膵島β細胞培養物を示す。左側の図は位相差画像である。右側の図では、細胞がプロインスリン及び細胞増殖のマーカーであるＫｉ６７で染色されている。核はＤＡＰＩで可視化してある。上図は、細胞がプロインスリンで染色された細胞の大きな集団によって膵島形態を進展して、実質的なプロインスリン染色によって明らかにされたように増殖していることを示す。矢印で示されている細胞を含む、Ｋｉ６７染色の多数のスポットも観察される。下図は殆どプロインスリン又はＫｉ６７染色されていない比較的均質な単層を示す。膵島培養物では、細胞は基本的にＤＡＰＩ染色だけで可視化されている。これらの画像は、骨髄細胞の存在下で培養された膵島β細胞が、ある持続期間にわたって培養液中に、プロインスリンを発現し、膵島を形成し、そして増殖することを明らかにしている。反対に、膵島β細胞単独培養においては、特異的な膵島の形態が観察されなかった。同様に、膵島β細胞単独培養においては、プロインスリン又はＫｉ６７染色が殆ど観察されなかった。
【００５９】
（実施例６）
膵島β細胞の骨髄細胞との共培養は肉眼的な膵島の形成を促進する。
膵島β細胞の骨髄細胞との長期培養後に、肉眼的な組織が形成された。図７ａは、骨髄細胞と１９０日間培養した膵島細胞から生成された組織を表示している。バーは１ｃｍを示している。組織は明確な３次元構造で長さが約１．８ｃｍである。５ミクロンの凍結切片を同程度の組織サンプルから調整し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色して組織の形態を明らかにした（図７ｂ）。組織学的染色は、切片に現れている、有孔骨格状組織で囲まれている膵島様構造（矢印で示してある）を組織が有していることを示した。組織のインスリン含量は、タンパク質１ｍｇ当たり５６３０７μＵであることが見出された（ＥＬＩＳＡアッセイ）。この膵島様組織は、蛍光免疫組織化学で示されるように、主にβ細胞及びほんの少しのα細胞を含有していた（図７ｃ）。膵島β細胞をプロインスリンに対する抗体で（矢印ａで示してある）、α細胞をグルカゴンに対する抗体（矢印ｂで示してある）で染色して、核をＤＡＰＩで染色した。
【００６０】
この組織を、上記の方法を用いて、基礎インスリン放出及び高グルコースに応答する誘導インスリン分泌について分析した。予想通り、膵島β細胞−骨髄共培養で形成された組織は基礎インスリン放出（図７ｄ）及び高グルコースに応答する誘導インスリン分泌（図７ｅ）の両方を示した。同世代の膵島β細胞単独培養中の細胞からは実質的にインスリン分泌が観察されなかった。このデータは膵島β細胞の骨髄細胞との共培養が、膵島様構造及び機能を有する、高次の三次元構造の形成を可能にすることを明らかにしている。
【００６１】
（実施例７）
骨髄細胞の膵島細胞共培養との相互作用。
培養中の膵島β細胞を保護する骨髄細胞の能力を、組織化学及び免疫蛍光分析を用いて、更に明らかにした。細胞型間の相互作用を観察するために、ＰＫＨ細胞標識キット（Sigma, St. Louis, MO）を骨髄及び膵島β細胞の標識用に使用した。ＰＫＨ染色色素を、細胞の形態及び機能に影響を及ぼさずに生体を標識するために用いることができる。この染色色素は膜に組み込む長い脂溶性末端と結合する蛍光標識で、蛍光部位を細胞の表面付近に露出したままにする。この染色色素は集団中の２つの型の生細胞の追跡を可能にする。製造会社の説明書に従い、４μＭのＰＫＨ２６（ＰＫＨ２６ＧＬ）及びＰＫＨ２（ＰＫＨ２ＧＬ）を、１×１０６個の骨髄細胞及び５０個の膵島と共にそれぞれ３分間培養した。細胞を別々にＰＢＳ中で洗浄した。冷却したＢＳＡの１％ＰＢＳ溶液を１ｍＬ加えて染色を停止した。細胞を５回ゆっくりペレット化してＰＢＳ中に再懸濁して結合していない何れの染色色素も除去した。標識化が完了した後、骨髄細胞と膵島を上記の条件下で共培養した。
【００６２】
培養の７、２４、４８及び９６時間後に細胞を採取した。細胞をプロインスリンを標的とする抗体で染色した。７時間目に骨髄細胞（太い矢印）が膵島に密接に接近して（図８ａ）、２４時間目までに膵島中に盛んに移動した（図８ｂ）ことが観察された。４８時間後に、骨髄細胞は膵島のβ細胞に接着したように見えた（図８ｃ、挿入図は高倍率）。高倍率画像は膵島β細胞と接触している骨髄細胞を示した。更に、左上隅の高倍率画像（図８ｄ、挿入図は高倍率）で示されているように、培養９６時間目に、骨髄細胞はβ細胞と凝集して完全な膵島の形成を助長したとように見えた。骨髄細胞が膵島β細胞と両側で結合していることに気付かれたい。
【００６３】
骨髄細胞の膵島β細胞との相互作用も、リアルタイムの経時的顕微鏡検査法及び生体染色色素を用いて６４時間培養した培養中の骨髄細胞及びヒト膵島を観察し、２０分毎に記録した画像（図９）で分析した。骨髄細胞（太い矢印）は、図９ａ、ｂ、及びｃに見られるように、徐々に膵島に接近した。次いで、ｄ、ｅ、及びｆに見られるように、膵島集団中への骨髄細胞の浸入があった。ｇ、ｈ、ｉ、及びｊに見られるように、骨髄細胞は次第に膵島の外に移動した（細い矢印）。この画像は、ＢＭ細胞は膵島細胞に接触して、膵島細胞の近傍に物質を放出することを明らかに示唆している。
【００６４】
骨髄が膵島の再生にどのように関与しているかの知見をもたらすために、膵島β細胞と培養している骨髄細胞の移動も長期にわたって観察した。図１０では、生体染色色素ＰＫＨ−２６で標識したヒト骨髄細胞（矢印で示してある）が、３時間の共培養でヒト膵島（大きな集団）から分離し（図１０ａ）、３０日間の培養後に膵島内へ移動して（図１０ｂ）、６０日間の培養で膵島の周囲にカプセル状の組織を形成した（図１０ｃ）。膵島の単独培養は、３時間で何ら赤色を示さず（図１０ｄ）、そして膵島は３０日目に培養中で単層となって（図１０ｅ）、６０日目にそれを維持した（１０ｆ）。（倍率は２０倍）。
【００６５】
（実施例９）
膵島β細胞の骨髄細胞との共培養はサイトカインの放出を阻害する。
ヒト膵島で産生されて放出される、ＩＬ−１βは膵島の生存及び機能に重要な役割を果たしていることが知られている［非特許文献２５、２６］。膵島培養物の生存におけるＩＬ−１βの役割を評価するために、骨髄細胞の存在下及び非存在下における膵島β細胞培養液中のＩＬ−１βレベルを測定した。ヒトＩＬ−１βに特異的なＥＬＩＳＡキットを用いて、膵島を単独で培養したときの膵島からのＩＬ−１β放出の穏やかな増大を明らかにした。サイトカイン産生のレベルは、培養物の蒔種時における検出不能なレベルから培養６３日後の２５倍増まで増大した。これは、ＩＬ−１β濃度が非常に低い、骨髄細胞と培養した膵島（図１１ａ）と対照的である。高グルコースの存在下でのＩＬ−１β放出の更なる評価は、膵島単独培養ににおいてＩＬ−１β放出のレベルが１５００倍に増大したのに対して、膵島を骨髄と培養するとＩＬ−１βのレベルが非常に低く保持される（図１１ｂ）ことを示した。
【００６６】
（実施例１０）
膵島β細胞の骨髄細胞との共培養は細胞の生存を促進する。
膵島β細胞のアポトーシスが、インビボ及びインビトロにおけるβ細胞死の主因であることが認識されている。ヒト膵島の生存及び機能の骨髄による調節が培養膵島のアポトーシス過程に関与しているか否かについて分析した。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴＤＴ)が介在するｄＵＴＰジゴキシゲニンニックエンド標識（ＴＵＮＥＬ）方法（Clone ApoAlert(登録商標) DNA Fragmentation assay kit BD Clontech) をアポトーシス核を検出するために、製造会社の説明書に従って用いた。すなわち、ヒト膵島調製物を３％のパラホルムアルデヒド中に固定して、Ｈ２Ｏ２の０．３％メタノール液中で５分間培養して、内因性のペルオキシダーゼを阻害した。スライドをＴｄＴ培養緩衝液と３７℃で２時間培養して、２倍のＳＳＣで反応を終結した。細胞も抗−ヒトプロインスリン抗体で染色した。アポトーシス細胞を、処理手順の予備知識なしで、アポトーシス細胞の総数をインスリン陽性細胞の総数で割って計算して分析した。結果は、それぞれのスライドから無作為に抽出した１０個以上の膵島の測定値から計算し、それぞれの試料から合計４つのスライドを測定した［非特許文献２１］。
【００６７】
培養開始からの時間を関数としたアポトーシスの試験は、早ければ７時間で、骨髄細胞が膵島をアポトーシスから保護すること、及びこの効果が骨髄の非存在下で生育した膵島と比較したときに有意であったことを明らかにした（図１２ａ及びｂ）。図１２ａは、膵島単独（Ｉ）培養における７時間目に始まった実質的なＴＵＮＥＬ染色を示す（上列）。骨髄細胞による膵島細胞アポトーシスの保護は培養時間の増大に伴って、例えば４８時間目と３週間目の細胞を比較すると、より明瞭となる。膵島単独培養画像において、８時間目に幾らかの非アポトーシス細胞が観察されるが、３週間目には殆ど確認できない。このことは、全ての観察時点において細胞が実質的に非アポトーシスであることが明らかな膵島＋骨髄（Ｉ＋Ｂ）培養（下列）とは明確に異なっていた。この実験の結果を定量して、培養液中のアポトーシス細胞の百分率を図１２ｂに示す。これは骨髄細胞の膵島に対するほぼ即時の保護効果を明らかにしている画像に示されることを反映している。
【００６８】
（実施例１１）
臍帯血細胞又はＣＤ３４＋末梢血細胞の存在下での膵島β細胞の共培養。
ＢＭ以外の細胞の膵島機能に対する効果を評価するために、全臍帯血細胞、動員末梢血細胞、及び動員末梢ＣＤ３４＋細胞を上記のＢＭ培養と同じ条件下で膵島と培養して、これらが膵島β細胞の生育をサポートして膵島の形成を促進するか否かについて確認した。指定の日数の培養後に、インスリン放出を分析した（図１３）。膵島のインスリン放出測定から得た値は、これらの細胞と、膵島単独培養との間で、有意な差を示さず、このことはＢＭ細胞が膵島細胞の生存に独特な利点を提供することを示唆している。
【００６９】
（実施例１２）
骨髄細胞と共培養した膵島細胞を用いる糖尿病のマウスモデルにおける膵臓機能の再構築。
骨髄細胞と共培養した膵島細胞が、糖尿病のマウスモデルの膵島細胞移植方法において機能するかを評価するために、単独又は骨髄と共培養の何れか一方で３週間培養して保持した膵島細胞を膵島細胞の移植に用いた。マウス（８週齢、雄、Ｂａｌｂ／ｃ  ＳＣＩＤマウス）に体重１ｋｇ当たり２００ｍｇのＳＴＺを注射（ｉ．ｐ．）して、３日間連続して４００ｍｇ／ｄＬを越える血糖値を有すると定義されている、糖尿病を誘発した。骨髄なしで培養したヒト膵島細胞（Ｉ３Ｗ＝１５００膵島（ＩＥＱ））又は骨髄と培養した細胞（Ｉ３Ｗ＝１５００膵島（ＩＥＱ）及び１×１０６個の骨髄細胞）を左、腎臓下の莢膜に移植した。血糖値を観察した（図１４）。
【００７０】
４ヶ月後に、骨髄と共培養した膵島細胞を移植した動物は正常な血糖値を有していて、血液は検出可能なヒトインスリン値（１５７ｕＵ／ｍｌ）を有していた。単独培養で生育した膵島細胞を移植した動物は高血糖を維持していた。これらのデータは膵臓のインスリン応答が骨髄共培養で生育した移植された膵島によって置き換わったが、膵島単独培養で生育した膵島によっては置き換わらなかったことを強く示唆している。
【００７１】
血糖コントロールが移植細胞によって誘発されたことを確実にするために、移植細胞を含有している腎臓を除去した。これに応答して、動物は高血糖になった。これらのデータは骨髄細胞と共培養した膵島細胞の、膵島細胞移植における使用に対する及び糖尿病の治療及び／又は改善に対する有用性を明らかにしている。
【００７２】
（実施例１３）
膵島細胞の骨髄細胞との共培養は膵島の凝集を促進する。
骨髄は膵島の凝集を促進する。先のデータは培養中の実質的な膵臓組織の形成を示しており、これは膵島の凝集を骨髄が刺激した結果であり得る。一連の経時的顕微鏡画像（図１５）からのデータは、骨髄が膵島細胞の凝集及びまとまった膵臓組織の形成の過程を刺激することを示唆している。培養下でのグリッドの使用は、週に１回撮ったライブ顕微鏡画像中の個々の膵島移動の確認及び観察を可能にした。
【００７３】
図１５ａでは、グリッドの幾つかの領域に３つの膵島が目に見える。図１５ｂ、ｃ、及びｄでは、３つの大きな膵島のうちの２つが互いの方向に移動して、図１５ｅでは、最終的に結合してより大きな膵島を形成する（倍率＝５倍）。生体染色色素ＰＫＨ−２６で骨髄を標識した後（別の実験で）、骨髄が結合した膵島の中に移動して、被包性の再構築された膵島を形成したことが見出された（図１５ｆ）。（倍率＝２０倍）
【００７４】
（実施例１４）
骨髄の非存在下及び存在下で培養している膵島細胞における遺伝子発現の分析。
膵島単独（ｉｓｌｅｔ）又は膵島と骨髄の共培養（ｉｓｌｅｔ＋Ｂ）で生育したヒト膵島β細胞における遺伝子発現を分析した。内分泌細胞に特異的な遺伝子及び再生転写因子遺伝子の発現レベルを、遺伝子特異的プライマーによるＲＴ−ＰＣＲを用いて分析した。細胞を２０９日間培養し、総ＲＮＡを単離して逆転写し、そして得られたｃＤＮＡを通常の方法を用いてＰＣＲで増幅した。
【００７５】
内分泌特異的遺伝子ＧＣＧ、ＩＮＳ、及びＳＳＴの発現が、再生関連遺伝子ＮＧＮ３の発現と同じように、共培養下の細胞において有意に増大したが、膵島単独培養下では増大しなかった（図１６ａ及びｂ）。これらの結果は、インビトロで骨髄細胞がヒト膵島細胞の再生を刺激することを示唆している。同様に、膵臓に特異的な転写因子ＰＤＸ１又はＩＰＦ１、ＰＡＸ６、ＩＳＬ１及びＭＡＦａの発現における増大も共培養において見られたが、膵島単独培養では見られなかった（図１６ｃ）。これらの転写因子は、共培養下で観察される長期生存及び機能の増強をもたらすことができる、培養下の移動、分化、及び増殖を調節する。
【００７６】
Ｍｉｓｔ１は、外分泌細胞で特異的に発現されて、膵臓腺房細胞の構成及び機能に必要である、ベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス型転写因子である。検討により、Ｍｉｓｔ−１の発現が膵島の進展及び機能を保持する微小環境をもたらすことが示唆されている。Ｍｉｓｔ１の発現は、膵島細胞を高次構造に構成することを可能にするだろう。
【００７７】
（統計学的評価）
全てのデータを平均＋／−ＳＥＭで表して、特に指示しない限り、スチューデントｔ−検定の後に分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって分析した。図表を作るために Sigma Plot (SPSS Inc. Chicago, IL)を用いた。全てのデータは３回の結果を示している。
【００７８】
（参照としての取り込み）
本明細書で挙げられているか又は引用されている、全ての文献、特許、特許出願、ペプチド及び核酸の受入番号は参照して本明細書中に組み込まれている。
【００７９】
（均等物）
当業者は、本明細書に記載されている発明の特定な態様に対する多種均等物を、通常の実験のみを用いて、確認できるか、又は解明できるであろう。このような均等物は以下の特許請求の範囲に包含されるように意図されている。
【図１】
0005474559.tif 000002
【図２ａ−ｂ】
0005474559.tif 000003
【図２ｃ】
0005474559.tif 000004
【図３】
0005474559.tif 000005
【図４】
0005474559.tif 000006
【図５ａ−ｃ】
0005474559.tif 000007
【図５ｄ−ｆ】
0005474559.tif 000008
【図６】
0005474559.tif 000009
【図７ａ−ｃ】
0005474559.tif 000010
【図７ｄ−ｅ】
0005474559.tif 000011
【図８】
0005474559.tif 000012
【図９】
0005474559.tif 000013
【図１０】
0005474559.tif 000014
【図１１】
0005474559.tif 000015
【図１２】
0005474559.tif 000016
【図１３】
0005474559.tif 000017
【図１４】
0005474559.tif 000018
【図１５】
0005474559.tif 000019
【図１６】
0005474559.tif 000020