(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタシルコウイルス2型感染の発生率を低下させるか、又はブタシルコウイルス2型感染の重篤度を緩和するために有効な、ブタシルコウイルス2型抗原、及びブタ生殖器及び呼吸器症候群（PRRS）ウイルスに対して有効な免疫原性活性成分を含む、シングル用量多価混合ワクチンであって、前記ブタシルコウイルス2型抗原は単離されたウイルス性又は組み換えにより発現されたブタシルコウイルス2型のORF2タンパク質であり、かつ、前記PRRSウイルスに対して有効な免疫原性活性成分が、PRRS改変生ウイルス（PRRS MLV）である、シングル用量多価混合ワクチン。
【請求項２】
ブタに1用量を投与することによりブタシルコウイルス2型感染に付随する臨床症状を軽減し又はその重篤度を緩和するために有効な、請求項1に記載のシングル用量多価混合ワクチン。
【請求項３】
前記ブタシルコウイルス2型抗原が、ブタシルコウイルス2型のORF2と少なくとも90%の配列同一性を有するDNA配列によってコードされるタンパク質である、請求項1又は2に記載のシングル用量多価混合ワクチン。
【請求項４】
前記ブタシルコウイルス2型のORF2タンパク質が以下のいずれかである、請求項1から3のいずれかの請求項に記載のシングル用量多価混合ワクチン：
i）配列番号:5、配列番号:6、配列番号:9、配列番号:10又は配列番号:11の配列を含むポリペプチド；
ii）項目i）のポリペプチドと少なくとも80%相同なポリペプチド；
iii）配列番号:3又は配列番号:4の配列を含むDNAによってコードされるポリペプチド；  iv）項目iii）のポリヌクレオチドと少なくとも80%相同なポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
【請求項５】
前記ブタシルコウイルス2型抗原が、ブタシルコウイルス2型のORF2のDNAを含む組換えバキュロウイルスベクターに感染してブタシルコウイルス2型のORF2タンパク質を発現している細胞培養の上清から回収されたブタシルコウイルス2型のORF2タンパク質である、請求項1から4のいずれかの請求項に記載のシングル用量多価混合ワクチン。
【請求項６】
前記PRRS改変生ウイルスが、Ingelvac(登録商標)PRRS MLVに含まれるウイルスである、請求項1から5のいずれかの請求項に記載のシングル用量多価混合ワクチン。
【請求項７】
マイコプラズマ・ヒオプニューモニエ（M hyo）の抗原をさらに含む、請求項1から6のいずれかの請求項に記載のシングル用量多価混合ワクチン。
【請求項８】
前記マイコプラズマ・ヒオプニューモニエの抗原が、Ingelvac(登録商標)M.hyoに含まれる抗原である、請求項7に記載の多価混合ワクチン。
【請求項９】
前記ワクチンの1用量が2μgから150μgのORF2タンパク質を含む、請求項1から8のいずれかの請求項に記載の多価混合ワクチン。
【請求項１０】
前記ワクチンの1用量が4μgから16μgのORF2タンパク質を含む、請求項1から8のいずれかの請求項に記載の多価混合ワクチン。
【請求項１１】
ブタに1用量を投与することによりブタシルコウイルス2型感染に付随する臨床症状を軽減し又はその重篤度を緩和するためのシングル用量多価混合ワクチンを製造するための、単離されたウイルス性又は組み換えにより発現されたブタシルコウイルス2型のORF2タンパク質及びPRRS改変生ウイルス（PRRS MLV）の使用。
【請求項１２】
前記ブタシルコウイルス2型のORF2タンパク質が以下のいずれかである、請求項11に記載の使用：
i）配列番号:5、配列番号:6、配列番号:9、配列番号:10又は配列番号:11の配列を含むポリペプチド；
ii）項目i）のポリペプチドと少なくとも80%相同なポリペプチド；
iii）配列番号:3又は配列番号:4の配列を含むDNAによってコードされるポリペプチド；  iv）項目iii）のポリヌクレオチドと少なくとも80%相同なポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
【請求項１３】
前記PRRS改変生ウイルスが、Ingelvac(登録商標)PRRS MLVに含まれるウイルスである、請求項11又は12に記載の使用。
【請求項１４】
前記多価混合ワクチンが、マイコプラズマ・ヒオプニューモニエ（M hyo）の抗原をさらに含む、請求項11又は12に記載の使用。
【請求項１５】
前記ワクチンの1用量が2μgから150μgのORF2タンパク質を含む、請求項11から14のいずれかの請求項に記載の使用。
【請求項１６】
前記ワクチンの1用量が4μgから16μgのORF2タンパク質を含む、請求項11から14のいずれかの請求項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明のある特徴は、ブタシルコウイルス2型（PCV2）のオープンリーディングフレーム2（ORF2）によって発現されるタンパク質の回収に関する。より具体的には、前記タンパク質は、ブタシルコウイルス2型の組換えコード配列、オープンリーディングフレーム2を含むトランスフェクトされたウイルスによって発現される組換えタンパク質である。さらに具体的には、前記トランスフェクトされたウイルスは増殖培養液中で細胞に感染することができ、オープンリーディングフレーム2によって発現されたタンパク質は、細胞質内からではなく上清から回収される。さらに具体的には、前記方法は、ブタシルコウイルス2型由来のオープンリーディングフレーム2遺伝子を増幅し、この増幅部分を第一のベクターにおいてクローニングし、この第一のベクターからオープンリーディングフレーム2部分を切り出し、前記をトランスファーベクターにおいてクローニングし、このトランスファーベクターを増殖培養液中でウイルスベクターとともにコトランスフェクトして細胞を前記ウイルスベクターに感染させ、それによってオープンリーディングフレーム2を発現させ、さらにオープンリーディングフレーム2によってコードされた、上清中に発現された組換えタンパク質を回収する工程を含む。
【０００２】
別の特徴では、本発明は、PCV2に対する免疫応答を誘発するために有効な免疫原性組成物、及びこれら免疫原性組成物を製造する方法に関する。より具体的には、本発明は、前記組成物を投与された動物を防御し、さらにPCV2感染に付随する臨床症状を軽減し又はその重篤度を緩和する免疫応答を提供するために有効な免疫学的組成物に関する。さらに具体的には、本発明は、PCV2による感染に対して有効な防御を付与するタンパク質系免疫学的組成物に関する。さらに具体的には、本発明はPCV2のORF2を含む免疫学的組成物に関し、この場合、PCV2-ORF2の投与はPCV2による感染に対する防御をもたらす。きわめて具体的には、本発明は、前記免疫学的組成物を投与されたブタに効果的な免疫を付与するために有効な免疫学的組成物に関し、この場合、前記組成物はPCV2のORF2によって発現されるタンパク質を含む。
本発明のまた別の特徴では、混合ワクチン又は多価ワクチンが提供される。より具体的には、本発明は、PCV2及びブタに疾患を引き起こす少なくとも1つの他の生物による感染に対する免疫応答の誘発に有効な免疫学的組成物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
ブタシルコウイルス2型（PCV2）は、小さな（直径17−22nm）正二十面体のエンベロープをもたないDNAウイルスであり、一本鎖の環状ゲノムを含む。PCV2は、ブタシルコウイルス1型（PCV1）と約80%の配列同一性を共有する。しかしながら、PCV1（一般的に非病毒性である）とは対照的に、PCV2に感染したブタは、一般的に離乳後多臓器消耗症候群（PMWS）と称される症状を示す。PMWSは、臨床的には、るい痩、皮膚の蒼白、活力減退（unthriftiness）、呼吸窮迫、下痢、黄疸（icterus及びjaundice）を特徴とする。いくらかの罹患ブタでは、全ての症状の合併が明白であるが、一方、他のブタはこれら症状の1つ又は2つを有するのみである。剖検時に、顕微鏡的及び肉眼的病巣がまた多数の組織及び器官に出現し、類リンパ器官が病巣の好発部位である。PCV2核酸又は抗原の量と顕微鏡的類リンパ病巣の重篤度との間で、強い相関性が観察された。PCV2感染ブタの死亡率は80%に達することがある。PMWSに加えて、PCV2は、仮性狂犬病、ブタ生殖器系及び呼吸器系症候群（PRRS）、グラッサー病（Glasser's disease）、ストレプトコッカス性髄膜炎、サルモネラ症、離乳後大腸菌症、食餌性肝症、及び化膿性気管支肺炎を含む他のいくつかの感染を併発する。
【０００４】
PCV2のオープンリーディングフレーム2（ORF2）タンパク質（SDS-PAGEゲルで泳動したときほぼ30kDaの分子量を有する）は、PCV2用ワクチンで抗原性成分として過去に用いられた。そのようなワクチンで使用されるORF2を入手する典型的な方法は、ORF2をコー用量るPCV2 DNAを増幅し、前記ORF2 DNAをウイルスベクターにトランスフェクトし、前記ORF2 DNAを含むウイルスベクターを細胞に感染させ、細胞内でこのウイルスにORF2タンパク質を発現させ、さらに細胞溶解により細胞からORF2タンパク質を抽出することから成る。これらの方法は一般的にはウイルスベクターによる細胞の感染後約4日を要する。しかしながら、これらの方法は、抽出方法が多くの経費及び時間を要するという点で欠点をもつ。さらにまた、細胞から回収されるORF2の量は非常に高いというわけではない。結果として、ワクチンなどで使用するために十分な量の組換え発現タンパク質を得るために大量のウイルスベクターで多数の細胞を感染させる必要がある。
PCV2免疫のための従来のアプローチにはDNA系ワクチン（例えば米国特許6,703,023号に記載されたもの）が含まれる。しかしながら、そのようなワクチンは、PCV2感染及び前記に関連する臨床症状に対する防御免疫の付与に有効ではなかった。
【０００５】
ブタ生殖器系及び呼吸器系症候群（PRRS）は、最近1991年にはじめて単離されアーテリウイルス（arterivirus）に分類されたウイルスによって引き起こされる。この症候群は最初USAで1980年代の半ばに認識され、“ブタのミステリー病”と呼ばれた。前記はまた青耳病とも呼ばれた。ブタアーテリーウイルスという名称は最近提唱された。PRRSのウイルスは、マクロファージ（特に肺で見出されるもの）に特に親和性を有する。マクロファージは身体の防衛の一部分である。肺に存在するものは肺胞マクロファージと呼ばれる。それらは、侵入した細菌及びウイルスを摂取し除去するが、PRRSウイルスの場合はその限りではなく、ウイルスはそれらの中で増殖し、より多くのウイルスを産生してマクロファージを死滅する。いったん前記ウイルスが家畜の群れに侵入するや、ウイルスは居座り無限に活動を続ける。40%ものマクロファージが破壊され、それによって身体の防御メカニズムの主要部分が失われ、細菌及び他のウイルスが増殖し損傷をもたらすことを可能にする。前記事象の一般的な例は、家畜がPRRSウイルスに感染したとき、生育／仕上げ肥育（finishing）ユニットにおける動物地方病性肺炎の重篤度が顕著に増加することである。ウイルスは群れの中で急速に広がるように見えるけれども、全飼育家畜（特に大きな群れ）が最初に感染するには1年もの期間を要し、雌ブタの少なくとも90%が血清陽性になるには4−5ヶ月かそこらを要することがある。いくらかの雌ブタは未感染を維持する。さらにまた、感染後1−2年の雌ブタの群れが20%未満の血清学的陽性動物を含むということは珍しいことではない。しかしながら、このことは、前記家畜群がなお免疫を持たないということを必ずしも意味せず、またそれらが子孫に免疫を伝達しなくなったということも意味しない。成獣は、発育中の仔豚に比べてはるかに短い期間（14日）ウイルスを放出する（仔豚は1−2ヶ月間ウイルスを排出することができる）。臨床像は群れ間で極めて大きく変動する。見本として示せば、初めてPRRSに暴露された3つの群れ毎に、1つの群れは認識しえる症状を示さず、第二の群れは軽度の症状を示し、第三は中等度から重篤な症状を示す。その理由は明確には理解されていない。しかしながら、群れの健康状態が良好であればあるほど、症状の重篤度は低い。ウイルスは増殖につれ変異し、高度に病毒性であるいくらかの株、さらに病毒性でないいくらかの株を生み出しえる。PRRSは、サイズにかかわりなく全タイプの家畜群（良好な健康状態及び通常の健康状態並びに屋内及び屋外ユニットを含む）に感染する。
【０００６】
マイコプラズマ・ヒオプニューモニエ（Mycoplasma hyopneumoniae（M hyo））は、マイコプラズマ科に分類される小さな細菌（400−1200nm）である。M hyoは、動物の地方病性肺炎（生育豚及び仕上げ肥育豚で一般的に見られるブタの呼吸器疾患）に付随する。M hyoは、気管及び肺の上皮細胞の線毛を攻撃してビート運動を停止させ（線毛静止）、最終的には肺領域を崩壊させる。症状の程度に応じて、感染豚の1日当たりの体重増加は17%まで減少することがある。動物地方病性肺炎はブタの集団に蔓延しており、ほぼ全てのブタの群れに存在する。M hyoは、PRRSV及び他の呼吸器病原体の肺への侵入を容易にする一次病原体であると考えられる。3つの別個の株、232、J及び7448でゲノム配列が決定された（Minion et al. J Bacteriol, 2004, 186:7123-33；Vasconcelos et al. J Bacteriol 2005, 187:5568-77）。
【０００７】
ブタ増殖性腸炎は、回腸及び結腸の過形成及び炎症を特徴とする、成育-仕上げ肥育豚及び若い繁殖豚の一般的な下痢性疾患である。前記はしばしば軽度で個体限定的であるが、ときに持続的な下痢、重篤な壊死性腸炎、又は高い死亡率の出血性腸炎を起こす。前記の病因は、最近分類された細胞内細菌、ロウソニア・イントラセルラリス（Lawsonia intracellularis）である。前記生物は細胞培養でのみ培養され、無細胞培地系で前記を増殖させる試みは失敗に終わった。コッホの仮説は、L.イントラセルラリスの純培養を通常飼育豚に接種し、この疾患の典型的な病変がもたらされ、この病巣からL.イントラセルラリスが再度単離されたことによって満たされた。この疾患のより一般的な非出血型は、しばしば18から36kgのブタが罹患し、突然下痢が始まることが特徴である。糞便は水様からペースト状で、褐色であるか又はわずかに血液が混じる。約2日後、回腸で形成された黄色の線維素性壊死性円柱が排泄されることがある。ほとんどの罹患豚は偶発的に回復するが、有意の数のブタが慢性壊死性腸炎を発し、衰弱が進行する。出血型は、皮膚蒼白、脆弱、及び血液性又は黒色タール様糞便の排泄を特徴とする。未経産妊娠若豚は流産することがある。病巣は、小腸の下半分、盲腸、結腸の任意の場所に出現しえるが、回腸の病巣がもっとも頻繁で明白である。腸壁は肥厚し、腸間膜は浮腫を示すことがある。腸間膜リンパ節は肥大する。腸粘膜は肥厚してしわが寄ったように見え、褐色又は黄色の線維素性壊死性膜で覆われることがあり、時に点状出血を有する。黄色の壊死性円柱が回腸内に見出されるか、又は結腸を通過して排泄されることがある。慢性症例ではびまん性の完全な粘膜壊死が、庭用ホースに類似する腸の硬化を引き起こす。増殖性の粘膜病巣はしばしば結腸で見出されるが、剖検時に注意深く精査することによってのみ検出される。過度の出血型では、赤色又は黒色のタール様糞便が結腸に存在し、凝固血液が回腸に存在する。
ウシウイルス性下痢ウイルス（BVD）及びボーダー病（Border's disease）は2種のウイルスであり、これらはブタ熱ウイルス（豚コレラ）と同じペプチウイルス群であるが、前記は主としてそれぞれウシ及びヒツジに感染する。前記はブタの繁殖群に侵入し、生殖系の問題を引き起こしえる。前記疾患は雌豚の不妊の一般的原因ではなく、診断観点からは可能性は低いと考えられよう。
【０００８】
レプトスピラ症は、ヒトを含む動物の接触伝染病であり、種々の免疫学的に別個のレプトスピラ血液型亜型（その大半はレプトスピラ・インテルロガンス（Leptospira interrogans）の亜群とみなされる）によって引き起こされる。ブタで重要な5つの以下の血液型亜型及びグループが存在する：ポモナ（pomona）、アウストラリス（australis）、タラッソヴィ（tarassovi）、カニコラ（canicola）、イクテロヘモラジカエ（icterohaemorrhagicae）及びグリッポチフォサ（grippotyphosa）。感染は無症状であるか、又は種々の症状を引き起こしえる。前記症状には、食欲不振、発熱、横臥嗜好、黄疸、流産、死産及び他のあいまいな生殖系の問題、並びに死亡。急性感染の後、レプトスピラはしばしば腎臓又は生殖器官に局在し（病巣は巣状間質性腎炎の小さな灰色の分散病巣から成る）、尿中に時には何ヶ月又は何年にもわたって放出される。生物は長期にわたって表面水に生存するので、前記疾患はしばしば水によって媒介される。米国では、前記疾患は主として以下の血液型亜型による：レプトスピラ・ハルジョ（Leptospira hardjo）、レプトスピラ・ポモナ（Leptospira pomona）、及びレプトスピラ・グリッポチフォサ（Leptospira grippotyphosa）。抗体力価は一時的であり1ヶ月未満しか持続しないので、診断は困難な可能性がある。さらにまた、レプトスピラは健康な動物にも見出される可能性がある。L.アウストラリスの血液型亜型ブラチスラヴァ（bratislava）は生殖系の問題にもっとも通常的に付随する。慢性感染家畜群は流産、死産及び脆弱な仔豚を生じる。
【０００９】
ブルセラ症はブルセラ（Brucella）属の細菌によって引き起こされ、流産、停留胎盤、不妊、雄豚の精巣炎、及び雌豚の重篤な子宮炎を特徴とする。仔豚では、この疾患は後方麻痺及び跛行（lameness）を特徴とする。ブタではこの疾患はほぼ例外なくブルセラ・スイス（Brucella suis）1、2及び3によって引き起こされる。他の多くの哺乳動物がブルセラ・スイスを保有し、これをブタに伝播することがある。感染は急速に広がり、ワクチン未接種家畜群で多くの流産を引き起こす。伝播は主として別のブタとの接触によって発生するが、ただし性交感染も可能である。血清学的診断は、比較的一般的な生物イェルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）O:9（前記はブルセラと共通抗原を共有し、しばしば偽陽性結果を生じる）のために困難である。死後病巣には通常子宮炎及び精巣炎が含まれ、さらに膿瘍、ときに肝臓の壊死巣を含むことがある。
【００１０】
クロストリジウム（Clostridium）は、クロストリジウム科の普遍的なグラム陽性菌であり、通常土壌で見出されるが、自然界ではまたほとんどの動物の消化管内に存在する。ブタのC.ジフィシル（difficile）感染は、重篤な結腸間膜浮腫、下痢及び他の組織の浮腫（例えば水胸症）を特徴とする。ブタのクロストリジウム腸炎は、C.パーフリンゲンス（perfringens）によって引き起こされ、慢性腸炎（下痢、体重減少及び発熱を伴う）を特徴とする。C.パーフリンゲンスA、B及びC型による感染は、重篤な腸炎、赤痢、毒血症、及び若年牛での高い死亡率をもたらす。B型及びC型はともに、重篤な腸損傷の原因である、重度に壊死性で致死的なβ毒素を産生する。この毒素はタンパク質分解酵素に感受性であり、症状は腸におけるタンパク質分解阻害を伴う。雌豚の初乳（トリプシン阻害物質を含む）は仔豚の感受性因子と提唱された。前記疾患は、1週齢未満の仔豚の突然死を引き起こし、出生3日以内がもっとも一般的であるえる。より週齢の進んだ仔豚では、クロストリジウム腸炎は小腸の肥厚をもたらし、食餌及び栄養の吸収を困難にする。仔豚は通常、感染と栄養不足の合併の結果として死亡する。死亡は数時間で発生することがあるが、重篤度が低い場合は数日間生存し、数日に及ぶ回復が可能である。粘膜の潰瘍をもつ出血性腸炎は全ての種で主要な病変である。肉眼的には、腸の罹患部分は濃い青紫色で、腸間膜のねじれに付随する梗塞形成があることは一見して明らかである。腸内容物の塗抹を多数のグラム陽性杆状 細菌について調査し、さらに、ろ液を毒素検出及びその後の特異的抗体を用いた中和による同定のために作成することができる。
【００１１】
クロストリジウム・ノーヴィ（Clostridium novyi）は、高レベル穀物性飼料を与えられたウシ及びブタの突然死の原因として疑われているが未だ確認に至らず、肝の以前に存在する病巣も検出されなかった。致死的な壊死性毒素（主としてα毒素）は肝実質に損傷を与え、それによって細菌が増殖し、致死量の毒素産生を可能にする。通常は、死は明瞭に規定される徴候がなく突然出現する。罹患動物は群れから遅れる傾向があり、胸骨横臥の姿勢をとり、数時間以内に死亡する。ほとんどの症例が夏及び初秋に発生し、この時期には肝吸虫感染が最も多い。この疾患は、1年から4年のヒツジでもっとも流行し、肝吸虫感染動物に限定される。急性肝蛭症との区別は困難かもしれないが、剖検時に典型的な病巣を示す動物の超急性の死亡は伝染性壊死性肝炎の疑いを起こさせるはずである。もっとも特徴的な病巣は、しばしば若い吸虫の遊走路に続く肝臓の灰黄色壊死巣である。他の一般的な所見は、麦わら色の液体で満たされた拡張した心膜嚢、並びに腹腔及び胸腔の過剰な液体である。通常、皮下組織内の毛細血管に広範囲の破壊があり、前記は隣接する皮膚を黒色に変化させる（したがって一般的名称は黒色病（black disease））。
クロストリジウム・セプチクム（Clostridium septicum）は、世界中の土壌及び動物（ヒトを含む）の腸内容物で見出される。感染は通常、疲弊組織、土壌又は他の何らかの組織疲弊物質を含む創傷の汚染から発生する。事故、去勢、ドッキング、不衛生なワクチン接種、分娩によって生じた創傷は感染を起こしえる。一般的な徴候、例えば食欲不振、中毒及び高熱は局所病巣と同様に、損傷を受けやすい状態になった後数時間から数日で発生する。局所病巣はやわらかい腫脹で、前記は圧を受けて窪み、罹患領域の皮下及び筋肉内の結合組織に浸潤する大量の滲出物の形成のために急速に広がる。ガスの蓄積は一般的ではない。裂傷に付随する悪性の浮腫は、顕著な浮腫、重篤な毒血症、及び24−48時間での死亡を特徴とする。
破傷風毒血症は、破傷風菌（Clostridium tetani）によって壊死組織で産生される特異的な神経毒によって生じる。ほとんど全ての哺乳動物（ブタを含む）がこの疾患に感受性を示す。破傷風は世界中に分布するが、土壌にこの生物がほとんど見いだされず、さらに破傷風がほとんど知られていないいくつかの領域（例えば米国の北部ロッキー山区）が存在する。一般的には、土壌での破傷風菌の出現及びヒトでの破傷風の発生は種々の大陸のより温暖な部分で多い。破傷風菌（末端性球状芽胞を有する嫌気性菌）は、土壌及び腸管で見出される。ほとんどの症例で、菌は、適切な嫌気性環境を提供する創傷（特に深い刺し傷）を介して組織に導入される。
【００１２】
サルモネラspp（Salmonela spp）による感染は、全ての年齢の動物で、特にストレス下にあるか、密集状態で飼育されているか、又は重度に汚染された飼料若しくは飲水に暴露されている動物で下痢を起こす。サルモネラ症は、サルモネラ科の多くの種によって引き起こされ、臨床的には3つの主要な症状、敗血症、急性腸炎及び慢性腸炎の1つ以上を特徴とする。発病率は家畜生産の増大とともに増加している。種々の型のサルモネラがブタで感染を引き起こしえるが、ブタで見出される古典的なサルモネラは豚コレラ菌（S. choleraesuis）及びネズミチフス菌（S.typhimurium）である。ほとんどのサルモネラがもたらす臨床パターンは明確には区別されないが、異なる種のサルモネラは異なる疫学的態様を示す傾向がある。プラスミドプロフィル及び薬剤耐性パターンは、時には疫学的調査のための有用なマーカーである。敗血症性サルモネラ症にはしばしば豚コレラ菌が付随する。感染した仔豚は移動を好まず、食欲不振、40.5℃から41.6℃の高熱を示し、さらに空咳を有することがある。仔豚はまた四肢のチアノーゼを示し死亡しているのが発見されることがある。豚コレラ菌は、肺炎及び下痢の両方を起こしえる稀な疾患の１つであり、感染した仔豚の死亡率はしばしば高い。概して、腸炎にはより一般的なネズミチフス菌が付随する。感染は黄色で水様下痢を特徴とし、感染が進行するにつれ血液又は粘液を含むことがある。死亡率は低く、しばしば下痢による脱水及びカリウム欠乏を伴う。感染動物の糞便が、飼料及び水、屠場の生肉および加工肉、肥料又は飼料として用いられる植物及び動物製品、牧草及び放牧地、並びに多くの自動力をもたない物質を汚染しえる。ただし豚コレラ菌は飼料で見出されることは稀である。前記菌はまた感染動物と接触することによって直接伝播されえる。サルモネラ菌は、何ヶ月も湿った温かい領域、例えば飼育豚舎又は貯水槽で生存しえる。げっ歯類及び野鳥もまた感染源である。感染の蔓延性は種及び国毎に様々であるが、臨床症状の発生率よりも高く、一般的にストレスを与える状況（例えば餌を突然失う、輸送、干ばつ、密集、分娩、及びいくつかの薬剤の投与）によって促進される。
【００１３】
大腸菌（Escherichia coli）は、腸内細菌科の菌であり、全ての哺乳動物の小腸に自然状態で存在する主要な細菌タイプである。通常では無害であるが、いくつかの大腸菌株は、感染及び疾患を引き起こす多数の外毒素及び内毒素を産生しえる。易熱性（LT）及び耐熱性（ST）外毒素がいくつかの株によって活発に産生され、下痢発生の原因である。赤痢菌様毒素II型変種（SLT-IIe）、Stx2e及びヴェロトキシン浮腫病は小動脈の壁に作用し、浮腫を引き起こす。内毒素、例えば脂質Aは、乳房炎及び尿道感染で役割を果たす。大腸菌感染は、関与する個々の株に応じて様々な多くの症状を特徴とし、前記には、下痢、落ち窪んだ眼、発育不全、目に見える体重減少、発育停止、抑うつ、腸浮腫、乳房炎、膀胱炎、腎盂腎炎及び死亡が含まれる。大腸菌は、その細胞壁（O抗原）及び線毛（F抗原）によって分類され、コードされる。例えば、下痢はしばしば大腸菌Abbotstown:O147、F4、F5に付随し、一方、腸浮腫はF18線毛に付随する。前記コードを正確に同定することが正しいワクチンの選択に必須である。大腸菌感染はブタの免疫系を損ない、死亡はしばしば二次感染及び二次疾患の結果である。
【００１４】
ブタ天然痘は、皮膚病変、パウル（paule）、膿疱及び痂皮を生じる疾患である。
エペリスロゾーン症は、エペリスロゾーン・スイス（Eperythrozoon suis）（ブタの赤血球膜に付着する細胞外細菌生物）によって引き起こされる、赤血球の変形及び損傷を誘発するリケッチア（血液栄養性）病である。この疾患は貧血及び黄疸（粘膜、強膜、目の内部の黄色の変色）を特徴とする。前記は妊娠率低下、他の未確認の繁殖に関する問題及びときに死亡を引き起こすことがある。
古典的ブタ熱（CSF）又はアフリカブタ熱（ASF）としてもまた知られているブタのコレラ）は、フラビウイルス科のウイルス（前記はエンベロープをもつRNAウイルスである）によって、又はASFの場合はポックスウイルスに関連するエンベロープをもつDNAウイルスによって引き起こされる疾患である。臨床的には、CSFとASFとは区別できない。最初の症状は、活動低下及びある程度の食欲低下を伴う嗜眠状態であり、当該ブタは悪寒を有するように見えることがある。数日以内に、ブタは顕著な発熱を示し（41−42℃）、発熱とともにときに皮膚が赤くなる。次に当該ブタは結膜炎及び便秘を発し、便秘から黄色の下痢に至る。群れの中では、当該ブタは悪寒を有するようであり、しばしばまとまって身を寄せ合う。いくらかのブタは死亡前に痙攣を示すことがある。ブタは皮膚の紫色の変色の広がりを示すとともに死亡が始まり、しばしば感染後10−20日後に死亡し始める。生存ブタは重篤な発育遅延及び背骨の湾曲を示す。定着した群れでは、妊娠中の母獣から感染した仔豚は、流産、ミイラ化、奇形、死産、及び脆弱仔豚をもたらしえる。CSF感染母獣から生まれた仔豚は健常であるが、生涯にわたって病気を蔓延させ続けることがある。
【００１５】
肺炎型パスツレラ症及びストレプトコッカス症は、パスツレラ・ムルトシーダ（Pasteurella multocida）及び多様なストレプトコッカス種（典型的にはS. suis）によって引き起こされる。前記原因因子による感染は、一般的には離乳後呼吸器症候群の最終段階を表す。臨床徴候は以下の3つの形態で出現する。急性型はもっとも一般的にはP.ムルトシーダB血清型に付随する。動物は、呼吸困難、呼吸困難、痙攣性呼吸、高熱（42.2℃）、虚脱を示し、最終的には死亡する。いくつかの症例では、腹部は変色により紫色になる。第二の形態は亜急性型であり、胸膜炎、咳、及び呼吸困難を特徴とする。ブタは顕著な体重減少を示し、さらに生長不良又は成長停止を示しブタの流れに重大な結果を及ぼす。この形態は一般的には10−16週齢のブタが罹患する。
ストレプトコッカス髄膜炎は、脳を覆う膜である髄膜の炎症を引き起こす。哺乳仔豚では、前記は通常ストレプトコッカス・スイス、ヘモフィルス・パラスイス（Haemophilus parasuis）又は、時には大腸菌及び他のストレプトコッカスのような細菌によって引き起こされる。S.スイスは多くの血清型を有する。ほとんどの国では、S.スイス1型は哺乳仔豚では主要な血清型であるが、他の国においてはそうではない。例えば、デンマークでは主要な血清型は7型である。S.スイス、特に1型および4型はまた、関節の問題を引き起こす。S.スイスは、長期間にわたって扁桃腺で保持され、雌ブタから又は他の仔豚から哺乳仔豚に伝播されえる。雌ブタはまた様々なレベルの免疫を初乳で提供する。ストレプトコッカス髄膜炎は、前記微生物が群れに始めて導入されたとき、又はPRRS感染に対して前記が二次的であった場合、哺乳仔豚ではさらに悪化する。
【００１６】
仮性狂犬病（ブタ狂犬病ウイルスとしてもまた知られている）は、エンベロープを有するヘルペスDNAウイルスが原因因子である。未感作群では、哺乳仔豚はひきつけから重度の協調不良まで一連の中枢神経症状を示す。後方麻痺が哺乳仔豚で生じることがあり、イヌ様座位を示す。さらに死亡率も高い。離乳豚では、中枢神経症状は軽減することがあるが、呼吸器症状の増加を伴うことがある。しばしば、呼吸器疾患は二次感染に付随する。離乳豚はるい痩を示し、発育は悪化し、しばしば停止する。成育豚では、中枢神経症状は軽減し続けるが、一方呼吸器症状は増加する。呼吸器症状の程度は二次感染の有無及び重篤度に依存する。成獣では、生殖器症状が主流である。雌ブタは流産し、出産予定日近くで感染した動物は死産又は脆弱な仔豚を出産しやすい。定着した群れでは、臨床症状はわずかでありえる。
ブタインフルエンザウイルスは、ブタのインフルエンザを引き起こし、インフルエンザウイルスA型ウイルス群に属する。未感作の群れでは、臨床症状は爆発的流行として出現し、全て又は多くの動物が同時に発病する。動物は、不活発、抑うつ、一箇所に身を寄せ合い（huddling/pilling）、食欲低下を示す。動物はしばしば口で呼吸し、呼吸困難を示す。体を動かしたときに続いて咳を発する。他の臨床症状には鼻汁分泌、はれぼったい眼（puffy eye）及び40.5℃から41.5℃の直腸温度が含まれる。繁殖ストック内での高温は流産、不妊、小さな脆弱仔豚の産出、及び死産の増加をもたらすことがある。定着した群れでは、毎年再感染が発生する。
【００１７】
スピロヘータ性腸炎は細菌ブラキスピラ・ピロシコリ（Brachyspira pilosicoli）によって起きる。この感染は一般的には10−20週齢の成育豚／仕上げ肥育豚で生じる。前記は、成育豚の非致死的な衰弱をもたらす下痢を特徴とし、肥育に必要な日数を増加させる。下痢はまた飼料効率の低下をもたらし、水様下痢又は軟便を生じる。約半分のブタが、一過性から持続的な水様から粘液様の緑色から褐色の下痢（血液を含まない）を示すことがある。臨床症状は、より一般的には飼料の混合及び変更後10−14日である。
ブタ赤痢は、細菌ブラキスピラ・ヒオディセンテリエ（Brachyspira hyodysenteriae）によって引き起こされる。12の公知の血清型が現時点で存在する。定着した群れの臨床症状には下痢、いくらかのブタでは良好な健康状態の急速な消失、毛深い外観、脱水、腹部の痛み、及び他のブタが何らかの症状を示す前に1、2頭のブタの死亡が含まれる。未感作の群れにおける主要な大流行では、哺乳仔豚から成獣の全週齢群が影響を示しえる。
伝染性胃腸炎はコロナウイルスによって引き起こされる腸の疾患である。前記は、ブタ呼吸器コロナウイルス、流行性下痢ウイルス、及び血球凝集性脳脊髄炎ウイルスと同じ科である。最初の臨床症状は、水様下痢、嘔吐及び食欲不振である。21日齢未満の仔豚は一般的には死亡し、離乳豚は発育が低下し、一方、成育豚、仕上げ肥育豚及び成獣は一般には軽度の影響を示し、適切な水を提供されるならば生存するであろう。
パルボウイルスは、ブタの生殖系の問題を特徴とする疾患を引き起こす。原因因子は小型の、エンベロープをもたないDNAウイルスである。胎児が唯一の影響を受けるグループであり、胎児に対する影響は、感染時の日齢に左右される。10−30日齢では、感染は胎児の死亡及び再吸収をもたらす。30−70日齢では、感染は死亡及びミイラ化をもたらす。70日から出産まで、感染は脆弱な仔豚の出産及びミイラ化をもたらす。この病気は胎盤を通過することができ、子宮で各胎児に移動しえる。雌豚では、臨床症状は死産、ミイラ化仔豚、胎児期死亡、不妊、及び生存仔豚の出産数の激減である。流産はパルボウイルス感染の特徴ではない。
【００１８】
アクチノバシルス・プリューロプニューモニア（Actinobacillus pleuropneumonia）（APP又はヘモフィルス・プリューロプニューモニア（Haemophilus pleuropneumonia）としても知られている）は、細菌アクチノミセス・プリューロプニューモニアによって起こる。現在のところ、15の血清型が記載されており、臨床症状の重篤度は種々の血清ウイルス及び他の因子の存在で異なる。血清ウイルス1、5、9、10、及び11は病毒性が高いと考えられる。さらにまた、血清ウイルス1、9及び11；2、6及び8；4及び7は交差反応することができる。全週齢のブタが感受性を有する。臨床症状は突然の健康悪化で、動物は横臥し41.5℃の高い直腸温度を示す。動物は一般的には食欲が低下し、水を飲まなくなり、先端部分はチアノーゼを呈し触れると冷たい。チアノーゼは全身に広がり、重度の呼吸困難が死亡前に出現する（しばしば口による呼吸を示す）。血液の混じった分泌液が口及び鼻孔で認められ、死は一般的には24−48時間以内に発生する。急性臨床症状は、群内の高い割合の動物の抑うつ及び横臥、40.5℃から41℃の高い直腸温度、食欲不振、飲水の停止、重度の呼吸困難、咳、口呼吸、チアノーゼ、嘔吐、及び流産である。亜急性臨床症状には、豚の群れ内の間歇的な咳、全般的な食欲低下、生長低下が含まれる。Cyrovar3型は、関節炎、心内膜炎及び膿瘍を示す。慢性的に侵された群れでは、1日当たりの体重増加は影響を受けないかもしれないが、間歇的な咳を認識しえる。
【００１９】
グラッサー（Glassers）病は、細菌ヘモフィルス・パラスイス（Haemophilus parasuis）（Hps）で引き起こされる。前記には少なくとも15の異なる型が存在する。前記細菌は世界中で見出され、極めて良好な健康状態の群れにおいても存在する。そのような群れをSPF又はMEW技術を用いて立ち上げ、Hpsが存在しない場合、それらの群れが初めて汚染されたとき、前記細菌によって完全に破壊され、雌豚で高い死亡率を有する炭疽様疾患を生じることがある。前記細菌が流行した大半の群れでは、雌豚は強い母体免疫を生じ、前記免疫はそれらの仔豚で通常8−12週齢まで存続する。結果として、離乳動物では感染の影響は通常全く存在しないか又は最小限である。疾患はしかしながら哺乳仔豚で認めることができる。母体抗体によってなお防御されているときは通常、ブタは臨床的に感染を示さず、それら自身の免疫応答を刺激する。しかしながら、仔豚が感染する前に母体免疫が取り除かれる場合、仔豚は重篤な症状を発することがある。前記は通常離乳後しばらくしてから生じる。前記細菌はまた他の主要な疾患（特に動物地方病性肺炎（EP）（Mycoplasma hyopneumoniae））に対する二次病原体とし作用することがある。疾患の流行は、哺乳仔豚（特に若い雌豚の群れに存在する）でときに発生する。Hpsは、関節の平滑な表面、腸、肺、心臓及び脳の被覆層を攻撃し、肺炎、心膜感染、腹膜炎、胸膜炎を引き起こす。Hpsによって生じる疾患は、非授乳雌豚が未感作でない限り雌豚では稀である。跛行又は硬直、関節及び腱のかすかな腫脹、及び稀には髄膜炎が場合によって若い雌豚で認められる。仔豚では、体温上昇、食欲不振を示し起き上がるのを嫌い、急激に抑うつ状態になったブタで急性症状が示される。特徴的な1つの症状は2−3のエピソードを含む短い咳である。良好な哺乳状態の仔豚の突然死は一般的ではない。Hpsはまた、発熱及び食欲不振とともに関節炎及び跛行を示す個々の症例を引き起こすことが知られている。慢性症状の特徴は蒼白で発育不良のブタである。突然死もまた生じることがある。離乳豚及び成育豚の場合、グラッサー病のブタは急激に抑うつ状態となるか、又は死んでいるのを見つけることがある。他の症状には、体温上昇、食欲不振、起き上がるのを嫌うこと、神経症状（例えばひきつけ及び痙攣（髄膜炎を含む））が含まれ、さらに貧弱なブタ（るい痩及び毛深さが目立つ）がしばしば生じる。若い生育中のブタでは、以下の症状がもっとも一般的である：発熱、軽度の髄膜炎、関節炎、跛行、肺炎、心膜感染、腹膜炎、胸膜炎。さらにまた特徴的な症状はほんの2−3のエピソードを含む短い咳である。
【００２０】
滲出性表皮炎は、通常は症状を生じることなく皮膚に生息する細菌スタフィロコッカス・ヒイクス（Staphylococcus hyicus）によって起こる。なぜ前記細菌が時に激しく増殖し、脂肪分の多い液体が滲出する皮膚炎を引き起こすのかは不明である。前記細菌は、全身に吸収され肝臓及び腎臓を損傷する毒素を産生する。哺乳仔豚では、症状は通常各動物に限定されるが、若い雌ブタの新しい群れ及び離乳ブタでは大きな問題となることがある。分娩の直前の数日間に細菌は雌ブタの膣で大いに増殖し、その結果、仔豚は分娩中又はその直後に感染する。雌ブタの症状には、特に顔面及び眼の後ろに認められる、稀であるが限局した病巣が含まれる。重篤な感染仔豚は死亡するであろう。仔豚では、症状には大腿外側部及び耳の後ろの限局病巣が含まれる。病巣は通常、小さな黒い限局した、顔面周囲又は脚の感染領域から始まる。大腿外側、臀部及び脚の間の皮膚が褐色に変化し、徐々に全身を含むようになる。皮膚にはしわがより、広い領域が剥がれ落ち、脂ぎった感触を呈する。重篤な症例では、皮膚は壊死のために黒くなり、仔豚は死亡する。雌ブタがある程度の免疫を仔豚に伝えた場合、より限局化した像が観察され、直径が約5−10mmの小さな限定された病巣が存在し、前記は拡大しない。離乳仔豚及び成育豚の場合、症状は通常、離乳後約3日で限局した褐色の感染領域、又は顔面周囲若しくは脚の皮膚炎から始まる（前記部分では皮膚は損傷を受ける）。前記は潰瘍となることがある。大腿外側、臀部及び脚の間の皮膚は、徐々に全身を巻き込みながら褐色に変化する。皮膚にはしわがより、広い領域が剥がれ落ち、暗色の脂ぎった手触りへと進行し、重症例では黒くなる。そのような症例では、スタフィロコッカス菌によって産生された毒素のために死亡する。飼育場では、集団の15%までが巻き込まれ、脱水は一般的である。
【００２１】
豚丹毒は、細菌エリシペロスリクス・リュシオパシエ（Erysipelothrix rhusiopathiae）により引き起こされる。前記菌は、全ての豚飼育場でないとしても大半の飼育場で見出される。動物の50%までがその扁桃腺にこの菌を保持している可能性がある。前記は唾液、糞便又は尿を介して排出されるので、常にブタ又は環境のどちらかに存在する。前記はまた多くの他の種（トリ及びヒツジを含む）で見出され、ブタの体外で数週間さらに軽い土壌ではさらに長く生存することができる。したがって、菌を群れから排除することは不可能であり、感染糞便が特に生育場及び仕上げ肥育場におけるおそらく主要な感染源である。前記細菌は単独で疾患を引き起こしえるが、ウイルス（例えばPRRS又はインフルエンザ）の同時感染が流行の引き金となることがある。8−12週齢未満のブタでは、初乳を介して雌ブタの母体移行抗体によって提供される防御のためにこの疾患は比較的珍しい。もっとも感受性の高い動物は成育豚、ワクチン未接種の若い雌ブタ、及び4回までの経産雌ブタである。この菌は体内で増殖し血流に侵入して敗血症をもたらす。増殖の迅速性及びブタの免疫レベルが臨床症状を決定する。
エペリスロゾーン症（Epe）は、赤血球表面に付着し、ときにそれらを破壊するエペリスロズーノーシス・スイスと呼ばれる細菌によって起こる。続いてブタは貧血になり、血球の破壊後に残された生成物は黄疸を引き起こすことがある。臨床症状は、若いブタでより一般的である。しかしながら前記は繁殖群で生殖系の問題もまた起こしえる。雌ブタはEpeを保持し、しかも極めて健康であり続けるが、菌は胎盤を通過し、脆弱で血色の悪いブタを出産する。Epeは全部ではないとしてもほとんどの群れに存在し、前記が病原性を獲得しある集団で症状を起こし他の集団では症状を示さないメカニズムは不明である。
脳心筋炎又はEMCは、広範囲の脊椎動物に感染し病気をもたらすが、ブタはもっとも感受性が高い家畜動物種であるように思われる。前記ウイルスは世界中に分布するが、病原性及び病毒性は種々の国及び地域で異なる。ヨーロッパの大半の国、特にEUでは、前記は比較的温和又は非病原性であり、ブタの症状も稀にしか報告されていない。オーストラリアでは、その株はニュージーランドのものよりもはるかにブタに対して病毒性が高いように思われる。フロリダ、カリブ諸国、及びおそらく中央アメリカの病毒株は心臓に損傷を与え死亡させるが、一方、アメリカ中西部の株は生殖系の問題を引き起こす傾向がある。ブタの臨床症状は、ラットの数が異常レベルに増加するときに発生する傾向がある。ブタはラットから又はラット汚染飼料若しくは自ら感染しえる。ブタの間では前記はそれほど急速に拡大するように思われない。罹患した群れで、離乳豚及び成育豚には通常臨床徴候は認められない。
アウエスキー病又はADはヘルペスウイルスによって起こるブタの重要な疾患である。このウイルスはブタの神経にキャリアー状態で長期間にわたって潜み続け、再活性化されえる。いったん群れに導入されると、通常このウイルスはそこにとどまり、様々なレベルで繁殖行動に影響を与え続けることができる。このウイルスはブタの体外で3週間まで生存することができる。疾患の急性期流行は、このウイルスの病毒株がワクチン未接種の感受性の高い群れに最初に感染したときに発生する。ウイルスは子宮及び胎盤を通過し胎児に感染する。ブタが主要な宿主であるが、イヌ及びウシもまた感染し、神経症状を示して死亡する。
【００２２】
ブタサイトメガロウイルス感染（PCMV）はヘルペスウイルスによって引き起こされ、このウイルスは生まれたばかりの仔豚の鼻（ここで前記ウイルスは炎症（鼻炎）を起こす）を含む全身の組織で見出される。PCMVは世界中に存在し、全部ではないとしても大半のブタの集団に存在するが、ほとんどの感染は臨床症状を示さず、臨床症状は稀である。例えばイギリスで実施された血清学的調査は、90%を超える群れが既に感染に暴露されていることを示している。このウイルスによって生じる鼻炎は珍しく、主として生まれたばかりのブタで発生し、毒素産生細菌パスツレラ・ムルトシーダによって起こる萎縮性鼻炎とは無関係である。大半の群れでは、したがって感染は重大ではなく、ときに軽度のくしゃみを起こすこと以外はブタの健康に大きな影響を与えない。
ブルーアイ病（Blue eye disease）はウイルス疾患であり、神経症状、生殖不全及び角膜の混濁又は青色化を起こす。前記は主としてメキシコで認められるが、他の国々でも報告されている。前記はヨーロッパでは観察されていない。症状には、食欲不振、角膜混濁−結膜炎、神経症状、例えばひきつけ及び痙攣、犬様座位の傾向、発熱、再発増加、離乳から交尾までの間隔の延長、死産、ミイラ化仔豚、仔豚の高い死亡率、腫脹精巣及び性欲低下が含まれる。
日本脳炎ウイルスB型（JE）は、蚊によって媒介されるウイルスであり、前記昆虫が多い国で重要である。大半の家畜が感染する。前記はヒトに脳炎を起こす。ブタは重要な感染源である。症状には仔豚のミイラ化又は死産、仔豚の神経症状（例えばひきつけ及び痙攣）、及び仔豚の浮腫が含まれる。前記はまた不妊及び雄ブタで精巣の腫脹を起こしえる。
【００２３】
ブタ流行性下痢（PED）は、TGEを起こすウイルスにいくぶん類似するコロナウイルスによって引き起こされる。このウイルスはヨーロッパで広がっている。前記ウイルスは腸管の絨毛に損傷を与え、したがって吸収面積を低下させ、液体の損失及び脱水をもたらす。このウイルスが感受性を有する繁殖家畜群に導入された後、強い免疫が2、3週間にわたって発達する。続いて初乳免疫が仔豚を保護する。通常、ウイルスは繁殖群（特に小さい繁殖群（300頭未満）から偶発的に消失する。下痢の急性型流行は、ウイルスが感受性集団に初めて導入されたときに生じる。そのような事例では、雌ブタの100%が罹患し、軽度から非常に水様の下痢を示す。2つの臨床像が認識されている：I型PEDは成育豚のみが罹患し、一方、II型PEDは哺乳豚及び成熟雌ブタを含む全週齢が罹患する。インキュベーション期間は約2日で、下痢は7から14日続く。哺乳豚では、この病気は軽度から重度で、40%の死亡率を示す。大きな繁殖群では（特に広い範囲で維持されている場合）、全ての雌が最初に感染するわけではなく、再発が起こりえる。これは母体抗体をもたない雌ブタから哺乳する仔豚で発生し、したがって散発的である。
ブタ呼吸器コロナウイルス感染（PRCV）は、ヨーロッパで数十年又はそれ以前にブタで最初に出現した。前記はTGEウイルスと関係があるが別個のウイルスである（TGEはまた別のコロナウイルスである）。前記は農場間で風によって拡散され、したがって前記に汚染されていない群れを維持することは極めて困難である。感染はしばしば2−3週齢の哺乳ブタで発生するが、重大なものではない。前記は他の呼吸器病原体が存在するときに慢性呼吸器合併症として肺組織に影響を与える。雌ブタは通常症状を示さないが、他の呼吸器性因子が存在しているときには咳が起こりえる。仔豚では、一過性の咳が存在することがある。初めて暴露された群れの離乳豚及び成育豚では、もし有るとしてもわずかな症状を示す。もっとも一般的な症状はほんの数時間続く一過性の咳である。
【００２４】
ロタウイルス感染は、ブタの集団で広範囲に広まっているウイルス感染である。前記は全てではないとしてもほとんどのブタの群れに存在し、成獣ストックでは実質的に100%の血清変換を示す。さらに別の疫学的特徴はブタの体外でのその存続性であり、前記は環境変化及び多くの消毒剤に耐性を示す。母体抗体は、ブタが感染に感受性になった後3−6週間持続するが、暴露は必ずしも症状をもたらさない。ブタの下痢の10−15%のみが最初のロタウイルス感染によって始まると概算されている。成熟した群れでは、仔豚が7−10日齢になった後で出現する。前記は齢が進むにつれて重要ではなくなる。しかしながら、大腸菌の病原性株が存在する場合は、重篤な症状が高い死亡率とともに発生しえる。
狂犬病はウイルスによって起こされ、ブタでは稀な病気と考えられる。前記はヒトを含む全ての種で例外なく致死的であり、したがって重要である。狂犬病はイギリスでは存在しないが、世界中の他の国々で存在しえる。仔豚及び雌ブタの感染は稀である。雌ブタ、離乳豚及び成育豚では、症状は、顔面筋の神経性引きつり、ひきつけ及び痙攣、めまぐるしい咀嚼、唾液過多、痙攣しやすい筋肉、及び後方麻痺を含む症状で突然始まる。死亡は通常3日以内に起こる。
ブタ水疱病（SVD）は、口蹄疫（FMD）を起こすウイルスとは異なるウイルスである。しかしながら、前記は、臨床的にはFMDとは区別できない症状をブタで生じる。この疾患は、突然の跛行が、ブタの鼻、舌及びつま先の小疱又は水ぶくれとともに広く出現したら常に考慮されるべきである。
【００２５】
結核は、ヒトを含む哺乳動物、トリ及びブタが罹患する。原因菌、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）は、さらにヒト型、ウシ型及びトリ型に分類される。トリ型はM.アヴィウム（M. avium）又は往々にしてアヴィウム/イントラセルラーレ群と称され、これはトリ型が均一な種ではないためである。M.アヴィウムそれ自体は主として鳥に感染するが、環境中ではM.イントラセルラーレ（M. intracellulare）とともに見出される（M.イントラセルラーレはもっぱら死物寄生植物として又は独立して生存している）。アヴィウム/イントラセルラーレ群はまた準臨床的、非進行性感染を健常な人々にもたらす。主要な懸念は、前記は免疫抑制者及びエイズ（AIDS）感染者でより重篤な症状を引き起こしえるということである。大半の国々では、屠場で頸部に病巣が見出されたら頭部全体が廃棄され、さらに腸間膜リンパ節（腸から液体を排出する）に病巣が発見されたら屑肉が廃棄される。病巣がさらに広範に体内に広がっている場合（稀であるが）、全屠殺体が廃棄されるか、又は加熱される。小さな病巣が食肉検査官に見逃された場合、通常の加熱料理によって菌は死滅する。全てのブタで、感染は、頸部のリンパ節及び小腸から排液するリンパ節に小結節を生じる。症例の大半で病巣は非進行性であり、病巣は体中には広がらず、前記はブタに病気を起こさず排出されることはない。臨床症状は存在せず、感染豚と非感染豚で行動に差は存在しない。
ブタ水疱性発疹ウイルス（VES）は、口蹄疫（FMD）及びブタ水疱病（SVD）を起こすウイルスとは異なるが、前記は、臨床的にはFMD及びSVDと区別できない症状をブタで生じる。FMDと異なり、前記はブタにのみ影響を及ぼす。症状は低い死亡率を含むが、哺乳仔豚ではある程度死亡することがある。他の症状には唾液過多、食欲不振、並びに口、鼻、舌及び足の周囲の水疱が含まれる。
【００２６】
水疱性口内炎（VS）は、南アメリカ及び中央アメリカ、場合によって米国で主として発生する疾患を引き起こすが、稀にカナダのような極北及びアルゼンチンのような南の端にも広がる流行病である。VSウイルスは、ブタでFMD、SVD及びVESと臨床的に区別できない症状を生じる。しかしながら、もっとも頻繁にはブタの感染は準臨床的である。全てのブタで、感染は、流涎、足の病巣及び跛行、成長速度の鈍化、40−41℃（華氏106−107度）への体温の上昇、鼻、舌、乳首及び脚の蹄冠部周囲（前記がブタを跛行させる）に直径30mmまでの水疱（水ぶくれ）の出現を特徴とする。死亡率は通常は低く、ほとんどのブタは1−2週間で回復する。
萎縮性鼻炎（進行性及び非進行性疾患）は鼻の炎症を生じ、種々の細菌及び刺激物質によって引き起こされる。感染過程で、鼻の繊細な構造物又は鼻甲介は損傷を受け、萎縮又は消失する。進行性萎縮性鼻炎は、鼻の組織が永久的に萎縮する特定の疾患を示す。前記は、パスツレラ・ムルトシーダ（PMt）の毒素産生株によって引き起こされる。A型及びB型の2つがある。哺乳仔豚では、くしゃみ、鼻性呼吸及び鼻汁排出が最初の症状であるが、急性流行（母体抗体はほとんど存在しない）では鼻炎は非常に重篤で鼻から出血する。3週−4週齢までに、及び離乳の開始から、涙の染み並びに捩れ及び短縮を伴う鼻の形成不全が明白である。重篤な罹患ブタは摂食障害を有することがある。1日当たりの体重増加は極めて低下する。重篤な流行では、ブタは取引重量まで生育しえない。
【００２７】
東部ウマ脳炎ウイルス（EEEV）はトガウイルス科アルファウイルス属のメンバーである。EEEVは感染した蚊に刺されているときウマ及びヒトに伝達されえる。ウマ及びヒトの他に、EEBVは一般的な家畜種（例えばブタ及びウシ）に重篤な症状をもたらしえる。EEEV又はウイルス特異的抗体がトリ、例えばとりわけシチメンチョウ、ハト、ウズラ、ダチョウ、およびエミューから回収されている。
マイコプラズマ関節炎は、マイコプラズマ・ヒオシノヴィエ（Mycoplasma hyosynoviae）によって起きる。この関節炎は、1つ以上の関節の炎症を特徴とし、全ての哺乳豚及び成育豚及び雌ブタで一般的である。しかしながら前記は仔豚では稀である。
ブタでの感染はまたアデノウイルス及び血球凝集性脳脊髄炎ウイルスによってもまた起きる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２８】
したがって当技術分野で必要とされるものは、感染細胞からORF2タンパク質を抽出することを必要としない、ORF2タンパク質を入手する方法である。さらに必要とされるものは、効率的にワクチン組成物を製造するために十分な量で組換えORF2タンパク質を入手する方法である。さらにまた必要とされるものは、従来のORF2タンパク質抽出プロトコルによって要求される複雑で労働集約型の方法を必要としない、ORF2タンパク質を入手する方法である。最後に組成物に関して、当技術分野で必要とされるものは、PCV2感染に対する防御免疫を確かに付与し、前記に付随する臨床症状の重篤度を緩和するか、又は前記臨床症状を予防する免疫原性組成物である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
発明の要旨
本発明は、従来技術に固有の問題を克服し、当分野の現状に対し明瞭な進歩を提供する。特に、本発明のある特徴は、以下によってPCV2 ORF2タンパク質の製造及び／又は回収方法の改善を提供する：i）培養下の感受性細胞をPCV2 ORF2 DNAコード配列を含む組換えウイルスベクターに感染させ（この場合ORF2タンパク質は前記組換えウイルスベクターによって発現される）、さらにii）その後で上清のORF2を回収する。感染及びその後の感染細胞のインキュベーションを従来の典型的なPCV2 ORF2回収プロセス（細胞内のPCV2 ORF2を抽出する）を越えて進行させた場合、大量のORF2が上清に放出されることが予想に反して発見された。さらにまた驚くべきことには、PCV ORF2は、産生細胞外でプロトタイプ分解に対して抵抗することも見出された。両発見を総合すれば、PCV2 ORF2 DNAを含む組換えウイルスベクターに感染してPCV2 ORF2タンパク質を発現している細胞培養の上清から大量のPCV2 ORF2タンパク質の回収が可能になる。大量のPCV2 ORF2タンパク質とは、上清1mLにつき約20μgを超える、好ましくは約25μgを超える、より好ましくは約30μgを超える、さらに好ましくは約60μgを超える、なお好ましくは約80μgを超える、さらに好ましくは約100μgを超える、さらに好ましくは焼く150μgを超える、もっとも好ましくは190μgを超えるものを意味する。このような発現速度はまた、例えば実施例1から3に記載した方法によって達成されえる。
好ましい細胞培養は、約0.3−2.0ｘ106細胞/mL、より好ましくは約0.35−1.9ｘ106細胞/mL、さらに好ましくは約0.4−1.8ｘ106細胞/mL、より好ましくは約0.45−1.7ｘ106細胞/mL、もっとも好ましくは約0.5−1.5ｘ106細胞/mLの間の細胞数を有する。当業者は好ましい細胞を決定することができる。好ましい細胞は、適切な組換えウイルスベクター（PCV2 ORF2 DNAを含み、PCV2 ORF2タンパク質を発現する）による感染に感受性を有するものである。好ましくは前記細胞は昆虫細胞であり、より好ましくは、それらにはSf+昆虫細胞（Protein Sciences Corporation, Meriden, CT）の登録商標で販売されている昆虫細胞が含まれる。
【００３０】
適切な増殖培地もまた当業者が決定できるが、好ましい増殖培地は血清を含まない昆虫細胞培養液、例えばExcell420（JRH Biosciences, Inc., Lenexa, KS）などである。好ましいウイルスベクターには、特に産生細胞が昆虫細胞である場合は、バキュロウイルス、例えばBaculoGold（BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA）が含まれる。バキュロウイルス発現系が好ましいが、他の発現系も、本発明の目的のために、すなわちPCV2 ORF2の細胞培養上清への発現のために機能するであろうということは当業者には理解されよう。そのような他の発現系は、培養液中へORF2を発現させるためにシグナル配列の使用を必要としえる。驚くべきことに、ORF2がバキュロウイルス発現系によって産生されるときには、前記発現系は、ORF2を培養液中に発現させるためにシグナル配列又は更なる改変を全く要求しない。このタンパク質は独立してウイルス様粒子を形成し（J General Virology, 2000, 81:2281-2287）、培養上清に分泌されえると考えられる。PCV2 ORF2 DNAを含む組換えウイルスベクターは、感受性細胞の感染に用いられるときは、好ましくは約0.03−1.5、より好ましくは約0.05−1.3、さらに好ましくは約0.09−1.1、もっとも好ましくは約0.1−1.0の感染多重度（MOI）を有する。上記に記載のMOIは、細胞培養液1mLに対してである。本明細書に記載の方法は、PCV2 ORF2 DNAを含み、PCV2 ORF2タンパク質を発現する組換えウイルスベクターで、0.35−1.9ｘ106細胞/mL、より好ましくは約0.4−1.8ｘ106細胞/mL、さらに好ましくは約0.45−1.7ｘ106細胞/mL、もっとも好ましくは約0.5−1.5ｘ106細胞/mLを、約0.03−1.5、より好ましくは約0.05−1.3、さらに好ましくは約0.09−1.1、もっとも好ましくは約0.1−1.0のMOIで感染させることを含む。
【００３１】
続いて感染細胞を10日まで、より好ましくは約2日から約10日、さらに好ましくは約4日から約9日、もっとも好ましくは約5日から約8日にわたってインキュベートする。好ましいインキュベーション条件は、約22−32℃、より好ましくは約24−28℃、もっとも好ましくは約27℃を含む。好ましくは、Sf+細胞は、特徴的なバキュロウイルス誘発変化のために接種後観察される。そのような観察には、細胞密度の変化及び感染後の生存率の低下の追跡が含まれえる。ウイルス力価のピークは感染後3−5日後に観察され、細胞から上清へのORF2放出ピークは5日目から8日目、及び／又は細胞生存率が10%未満に減少したとき得られることが分かった。
したがって、本発明のある特徴は、組換えPCV2 ORF2タンパク質を、好ましくは上記に記載した量で以下によって製造及び／又は回収する改良方法を提供する：i）上記に規定したMOIで、多数の感受性細胞（上記参照）を組換えウイルスベクターに感染させ、ii）前記組換えウイルスベクターによりPCV2 ORF2タンパク質を発現させ、さらにiii）その後、感染後5から8日で得られる細胞、及び／又は細胞生存率が10%未満に低下した細胞の上清においてPCV2 ORF2を回収する。好ましくは、前記組換えウイルスベクターはPCV2 ORF2 DNAコード配列を含む組換えバキュロウイルスであり、細胞はSf+細胞である。さらにまた、感染後の期間に前記培養を汚染又は非典型的な細胞形態変化の肉眼的及び顕微鏡的証拠について周期的に調べることは好ましい。何らかの汚染を示すいずれの培養も廃棄されるべきである。好ましくは、発現された組換えORF2タンパク質は、前記細胞によって、細胞の生存活性を維持する周囲の増殖培養液中に分泌される。
【００３２】
回収プロセスは、好ましくは、分離工程を介して、培養液中に発現されたORF2から細胞屑を分離することから開始する。好ましい分離工程には、ろ過、約20,000ｘｇまでの速度での遠心、連続流による遠心、イオン交換又はゲルろ過を用いるクロマトグラフィー分離、及び通常のイムノアフィニティーによる方法が含まれる。これらの方法は、例えば以下の文献によって当業者に知られている：Harris and Angel (eds), Protein purification methods - a practical approach, IRL press Oxford 1995。もっとも好ましい分離方法には、約20,000ｘｇまでの速度での遠心及びろ過が含まれる。好ましいろ過方法には、デッドエンド型微粒子ろ過及び接線方向流（又は交差流）ろ過が含まれ、前記は中空線維デッドエンド型微粒子ろ過を含む。もちろん、デッドエンド型微粒子ろ過が好ましい。デッドエンド型微粒子ろ過のための好ましいポアサイズは約0.30−1.35μm、より好ましくは約0.35−1.25μm、さらに好ましくは約0.40−1.10μm、もっとも好ましくは約0.45−1.0μmである。通常のいずれのろ過膜も本発明の方法のために機能するが、ポリエーテルスルホン膜が好ましい。ろ過工程で一切の低重量核酸種が除去される。
したがって、本発明のさらに別のある特徴は、PCV2 ORF2タンパク質を、好ましくは上記に記載した量で以下によって製造及び／又は回収する改良方法を提供する：i）上記に規定したMOIで、多数の感受性細胞（上記参照）を組換えウイルスベクターに感染させ、ii）前記組換えウイルスベクターによりPCV2 ORF2タンパク質を発現させ、iii）感染後5から8日で得られる細胞、及び／又は細胞生存率が10%未満に低下した細胞の上清でPCV2 ORF2を回収し、さらにiv）発現されたPCV2 ORF2から分離工程を介して細胞屑を分離する。好ましくは、前記組換えウイルスベクターはORF2 DNAコード配列を含むバキュロウイルスであり、細胞はSF+細胞である。好ましい分離工程は上記に記載した工程である。もっとも好ましいものは、約0.30−1.35μm、より好ましくは約0.35−1.25μm、さらに好ましくは約0.40−1.10μm、もっとも好ましくは約0.45−1.0μmのポアサイズを有する膜を用いるデッドエンド型微粒子ろ過である。
【００３３】
免疫原性又は免疫学的組成物（例えばワクチン）で用いられるPCV2 ORF2の回収のために、不活化工程を取り入れてウイルスベクターを不活化することが好ましい。“免疫原性又は免疫学的組成物”とは、問題の組成物又はワクチンに対する細胞性免疫応答及び／又は抗体介在免疫応答の免疫学的応答を宿主で誘引する少なくとも1つの抗原を含む物質の組成物を指す。通常は、“免疫学的応答”には1つ以上の以下の作用（ただしこれらに限定されない）が含まれる：抗体、B細胞、ヘルパーT細胞、サプレッサーT細胞、及び／又は細胞傷害性T細胞及び／又はyd T細胞（問題の組成物又はワクチンに含まれる抗原に対して特異的に誘導される）の産生又は活性化。好ましくは、新しい感染に対する抵抗性が強化されるか、及び／又は症状の臨床的重篤度が緩和されるように、宿主は治療的な又は予防的な免疫学的応答のどちらかを示すであろう。そのような予防は、通常は感染宿主によって示される症状の緩和又は欠如、より迅速な回復期間又は感染宿主におけるウイルス力価の減少によって示されるであろう。したがって、本発明はまた、組換えPCV2 ORF2タンパク質を、好ましくは上記に記載した量で以下によって製造及び／又は回収する方法に関する：i）上記に規定したMOIで、多数の感受性細胞（上記参照）を組換えウイルスベクターに感染させ、ii）前記組換えウイルスベクターによりPCV2 ORF2タンパク質を発現させ、iii）感染後5から8日で得られる細胞、及び／又は細胞生存率が10%未満に低下した細胞の上清でPCV2 ORF2を回収し、iv）発現されたPCV2 ORF2から分離工程を介して細胞屑を分離し、さらにv）前記組換えウイルスベクターを不活化する。
【００３４】
好ましくは、この不活化はろ過工程の直前又は直後に実施され、ろ過工程後が不活化の好ましい時期である。いずれの通常的な不活化方法も本発明の目的に用いることができる。したがって、不活化は、化学的及び／又は物理的処理によって実施することができる。好ましい形態では、採集液の体積を測定し、温度を約32−42℃にし、より好ましくは約34−40℃、もっとも好ましくは約35−39℃にする。好ましい不活化方法には、環化二元エチレンイミン（BEI）の、好ましくは約1から約20mM、より好ましくは約2から約10mM、さらに好ましくは約2から約8mM、さらに好ましくは約3から約7mM、もっとも好ましくは約5mMの濃度での添加が含まれる。例えば、不活化には、好ましくは約0.4Mの2-ブロモエチレンアミンヒドロブロミドの溶液（0.3NのNaOH中で0.2Mの二元エチレンイミン（BEI）に対して環化されてある）を約5mMのBEIの最終濃度が得られるように液に添加することが含まれる。好ましくは、続いてこの液を持続的に72−96時間攪拌し、不活化された採集液は-40℃で、又はそれより低い温度で、又は約1−7℃の間で保存することができる。不活化が完了した後、チオ硫酸ナトリウム溶液（好ましくは1.0M）を添加して残留する一切のBEIを中和する。好ましくは、チオ硫酸ナトリウムは、不活化のためにその前に添加したBEIと比較して等価の量で添加される。例えば、BEIが最終濃度5mMに添加された場合には、1.0Mのチオ硫酸ナトリウム溶液は最終濃度5mMを生じるように添加され一切の残留BEIが中和される。
【００３５】
したがって、本発明のさらに別の特徴は、組換えPCV2 ORF2タンパク質を、好ましくは上記に記載した量で以下によって製造する方法に関する：i）上記に規定したMOIで、多数の感受性細胞（上記参照）を組換えウイルスベクターに感染させ、ii）前記組換えウイルスベクターによりPCV2 ORF2タンパク質を発現させ、iii）感染後5から8日で得られる細胞、及び／又は細胞生存率が10%未満に低下した細胞の上清でPCV2 ORF2を回収し、iv）発現されたPCV2 ORF2から分離工程を介して細胞屑を分離し、さらにv）前記組換えウイルスベクターを不活化する。好ましくは、前記組換えウイルスベクターは、ORF2 DNAコード配列を含むバキュロウイルスであり、細胞はSf+細胞である。好ましい分離工程は上記で述べたものであり、もっとも好ましくはろ過工程である。好ましい不活化工程は上記で述べたものである。好ましくは、不活化は、約35−39℃で、さらに2から8mMのBEIの存在下で、より好ましくは約5mMのBEIの存在下で実施される。驚くべきことには、より高い濃度のBEIはPCV2 ORF2タンパク質に悪影響を及ぼすことが見出された。
【００３６】
本発明のさらに別の特徴にしたがえば、上記に記載の方法はまた工程v）の後に中和工程を含む。この工程vi）は、溶液内の不活化薬剤を中和する、等価量の作用物質を添加することを含む。好ましくは、前記不活化剤がBEIである場合には、等価量のチオ硫酸ナトリウムの添加が好ましい。したがってさらに別の特徴にしたがえば、工程vi）は、不活化薬剤がBEIであるときは、約1から約20mM、好ましくは約2から約10mM、さらに好ましくは約2から約8mM、さらに好ましくは約3から約7mM、もっとも好ましくは約5mMの最終濃度にチオ硫酸ナトリウムを添加することを含む。
好ましい形態、特に免疫原性組成物（例えばワクチン）でPCV2 ORF2タンパク質を用いる形態では、採集ORF2の各ロットは、固定依存性でバキュロウイルス感受性のSf+細胞での継代によって不活化について検査されるであろう。この検査の好ましい形態では、150cm2の適切な細胞培養単層に1.0mLの不活化PCV2液を接種し、25−29℃で14日間少なくとも2回継代しながら維持する。維持期間の最後に、PCV2 ORF2バキュロウイルスに典型的な細胞病原性作用（CPE）について細胞単層を調べる。好ましくは、陽性ウイルスコントロールもまた用いられる。そのようなコントロールは、非不活化参照PCV2 ORF2バキュロウイルスを接種したSf+細胞の1つの培養及び接種していないSf+細胞のフラスコから成る。インキュベーション及び継代後にBEI処理ウイルス液中でウイルス感染細胞が存在しなければ、不活化検査は充足されたことを示す。参照ウイルスを接種したコントロール細胞はPCV2 ORF2バキュロウイルスに典型的なCPEを示すはずであり、未接種フラスコはPCV2 ORF2バキュロウイルスCPEの証拠を全く示さないはずである。また別には、維持期間の最後に、上清サンプルを採集して、既にSf+細胞がロードされてあるにSf+ 96ウェルプレートに接種し、25−29℃で5−6日間維持することができよう。続いて、プレートを固定し、FITC結合抗PCV2 ORF2抗体で染色する。IFA顕微鏡検査によって検出したとき、BEI処理ウイルス液中ではCPE及びORF2発現が存在しなければ、不活化検査は充足されたことを示す。参照ウイルスを接種したコントロール細胞はCPE及びIFA活性を示すはずであり、未接種フラスコはPCV2 ORF2バキュロウイルスのCPEの証拠を全く示さず、IFA活性も含まないはずである。
【００３７】
したがって、本発明のさらに別の特徴は、組換えウイルスベクターの不活化の有効性を決定するための検査に関連し、前記検査は以下の工程を含む：i）組換えウイルスベクターを含む培養液の少なくとも一部分を、好ましくは上記に記載した不活化薬剤と接触させる工程、ii）前記不活化薬剤を中和するために、好ましくは上記に記載した中和薬剤を添加する工程、及びiii）上記に記載したアッセイによって残留感染性を決定する工程。
本発明のさらに別の特徴は、PCV2 ORF2 DNAを含み、感受性細胞に感染させたとき大量にPCV2 ORF2タンパク質を発現する組換えウイルスベクターを構築する方法に関する。驚くべきことに、本明細書で提供する組換えウイルスベクターは、感受性細胞に感染後、上記に規定したように大量のPCV2 ORF2を発現することが見出された。したがって、本発明はまた、好ましくは、PCV2 ORF2 DNAを含みPCV2 ORF2タンパク質を発現する組換えウイルスベクターを構築する工程を含む、PCV2 ORF2タンパク質を製造及び／又は回収するための改良方法に関する。好ましくは、前記ウイルスベクターは組換えバキュロウイルスである。本明細書で提供する、PCV2 ORF2 DNAを含みPCV2 ORF2タンパク質を発現する組換えウイルスベクターを構築する方法の詳細は以下に記載される。好ましい形態では、細胞を感染させるために用いられるPCV2 ORF2 DNAを含みPCV2 ORF2タンパク質を発現する組換えウイルスベクターは、その中でORF2遺伝子がクローン化されてあるトランスファーベクターをウイルスベクターにトランスフェクトすることによって生成される。好ましくは、トランスファーベクターの部分のみ（ORF2 DNAを含む）が、ウイルスベクターにトランスフェクトされる。“ウイルスベクターにトランスフェクトされる”という用語は、異種DNAをウイルスベクター（例えばバキュロウイルスベクター）に“導入する”又はウイルスベクター（例えばバキュロウイルスベクター）において“クローニングする”ということを意味し、さらに前記の同義語として用いられる。
【００３８】
したがって、本発明のさらに別の特徴にしたがえば、前記組換えウイルスベクターは、異種PCV2 ORF2 DNAを含むトランスファーベクターとウイルスベクター、好ましくはバキュロウイルス、より好ましくは直鎖化複製欠損バキュロウイルス（例えばBaculoGold DNA）との間の組換えによって生成される。“トランスファーベクター”は、少なくとも1つの複製起点、異種遺伝子（本発明の例ではPCV2 ORF2）、及び前記異種遺伝子をウイルスベクターにおいてクローニングすることを可能にするDNA配列を含むDNA分子を指す。好ましくは、異種遺伝子をウイルスベクターにおいてクローニングすることを可能にする配列は異種遺伝子にフランキングしている。さらに好ましくは、これらフランキング配列は、ウイルスベクターの配列と少なくとも部分的に相同である。この配列相同性が両分子（ウイルスベクター及びトランスファーベクター）の組換えを可能にして、異種遺伝子を含む組換えウイルスベクターを生成する。ある好ましいトランスファーベクターはpVL1392ベクター（BD Biosciences Pharminngen）であり、これは好ましくはSf+細胞株へBaculoGold DNAと一緒にコトランスフェクトするために設計されている。好ましくは、前記トランスファーベクターはPCV2 ORF2 DNAを含む。コトランスフェクトされる構築物は長さがほぼ10,387塩基対である。
【００３９】
より好ましい形態では、本発明の方法は、PCV2 ORF2 DNAの単離で始まるであろう。ORF2 DNAは高度に保存され種々の単離株間で少なくとも約95%の配列同一性を有するので、一般的には、前記DNAは公知の株由来でも未知の株由来でもよい。当分野で公知の任意のPCV2 ORF2遺伝子を、それらは上清に発現されるであろうから本発明の目的に用いることができる。PCV ORF2 DNAは好ましくはPCR法を用いて増幅されるが、より好ましくは5'フランキングコザックコンセンサス配列（CCGCCAUG）（配列番号:1）及び／又は3'フランキングEcoRI部位（GAATTC）（配列番号:2）と一緒に増幅される。5'コザックコンセンサスのそのような導入は、PCV2 ORF2の天然に存在する開始コドンAUGを除去する。3'のEcoRI部位は好ましくはPCV2 ORF2の停止コドンの下流に導入される。より好ましくは、前記は、ポリA転写終了配列（それ自体はPCV2 ORF2停止コドンの下流に位置する）の下流に導入される。コザックコンセンサス配列の使用、特に上記で述べた使用は、その後に続くPCV2 ORF2タンパク質の発現レベルを増加させる。増幅させたPCV2 ORF2 DNAは前記追加の配列とともにベクターにおいてクローニングされる。この最初のクローニング工程のために好ましいベクターはpGEM-T-Easyベクター（Promega, Madison, WI）である。いくらかのpGEMベクター配列を含むPCV2 ORF2 DNA（配列番号:7）は、好ましくはNotI制限部位でベクターから切り出される。続いて、得られたDNAをトランスファーベクターにおいてクローニングする。
したがって、本発明のある特徴では、PCV2 ORF2 DNAを含む組換えウイルスベクターを構築する方法が提供される。前記方法は以下の工程を含む：i）組換えPCV2 ORF2をトランスファーベクターにおいてクローニングする工程、及びii）組換えPCV2 ORF2を含むトランスファーベクターの部分をウイルスベクターにトランスフェクトして組換えウイルスベクターを生成する工程。好ましくは、前記トランスファーベクターは上記に記載したものであるか、又は上記に記載したように若しくは図1に例示的に示したように構築される。したがってさらに別の特徴にしたがえば、本明細書に記載の組換えウイルスベクターの構築に用いられるトランスファーベクターは配列番号:7の配列を含む。
【００４０】
さらに別の特徴にしたがえば、この方法は、さらに工程i）の前にin vitroでPCV2 ORF2 DNAを増幅する工程を含み、この場合、PCV2 ORF2 DNAのフランキング配列は上記に記載したように改変される。PCV2 ORF2 DNAを増幅しフランキング配列を改変するin vitroの方法、増幅PCV2 ORF2 DNAのトランスファーベクターでのクローニング、及び適切なトランスファーベクターは、上記に記載されているか、図1に例示的に示されているか、又は当業者に公知である。したがってさらに別の特徴にしたがえば、本発明は、PCV2 ORF2 DNAを含みPCV2 ORF2タンパク質を発現する組換えウイルスベクターを構築する方法に関し、前記方法は以下の工程を含む：i）PCV2 ORF2 DNAをin vitroで増幅する工程（ここで前記PCV2 ORF2 DNAのフランキング配列は改変される）； ii）増幅させたPCV2 ORF2 DNAをトランスファーベクターにおいてクローニングする工程；及びiii）組換えPCV2 ORF2 DNAを含むトランスファーベクター又はその部分をウイルスベクターにトランスフェクトして組換えウイルスベクターを生成する工程。好ましくは、PCV2 ORF2 DNAのフランキング配列の改変は、上記に記載したように、例えば5'のコザック配列及び／又はEcoRI部位を、好ましくは上記に記載したように導入することによって実施される。
さらに別の特徴にしたがえば、PCV2のオープンリーディングフレーム2によって発現される組換えタンパク質を製造及び／又は回収する方法が提供される。前記方法は一般的には以下の工程を含む：i）組換えPCV2 ORF2をトランスファーベクターにおいてクローニングする工程；ii）組換えPCV2 ORF2を含むトランスファーベクターの部分をウイルスにトランスフェクトする工程；iii）前記トランスフェクトウイルスを細胞に感染させる工程；iv）前記トランスフェクトウイルスにPCV2 ORF2から組換えタンパク質を発現させる工程；v）上清から細胞を分離する工程；及びvi）発現されたPCV2 ORF2タンパク質を上清から回収する工程。
【００４１】
組換えPCV2 ORF2 DNAをトランスファーベクターにおいてクローニングする方法は上記に記載されている。好ましくは、トランスファーベクターは、配列番号:3、配列番号:4又は配列番号:7を含む。しかしながらトランスファーベクターは、組換えウイルスベクターにトランスフェクトされたときPCV2 ORF2 DNAが細胞培養で発現される限り、任意のPCV2 ORF2 DNA（改変されたものであれ未改変であれ）を含むことができる。好ましくは、組換えウイルスベクターは配列番号:8の配列を含む。さらにまた、細胞を感染させる方法、好ましくは、昆虫細胞をPCV2 ORF2 DNAを含みPCV2 ORF2タンパク質を発現する組換えバキュロウイルスの規定された数で感染させる方法は上記で詳細に記載されている。さらにまた、細胞を上清から分離する工程もまた、発現されたPCV2 ORF2タンパク質を回収する工程と同様に上記で詳細に記載されている。本明細書に記載したこれらの具体的な工程はいずれも、上記に記載されているPCV2のオープンリーディングフレーム2によって発現される組換えタンパク質の製造及び／又は回収方法の部分である。好ましくは、細胞はSF+細胞である。より好ましくは、細胞培養は、約0.3−2.0ｘ106細胞/mL、より好ましくは約0.35−1.9ｘ106細胞/mL、さらに好ましくは約0.4−1.8ｘ106細胞/mL、さらに好ましくは約0.45−1.7ｘ106細胞/mL、もっとも好ましくは約0.5−1.5ｘ106細胞/mLの細胞数を有する。好ましくは、PCV2 ORF2 DNAを含む組換えウイルスベクターは、感受性細胞の感染に用いられるときは、約0.03−1.5、より好ましくは約0.05−1.3、さらに好ましくは約0.09−1.1、さらに好ましくは約0.1−1.0、もっとも好ましくは約0.5の好ましい感染多重度（MOI）を有する。好ましくは、PCV2 ORF2の回収は、感染後5から8日で得られる細胞、及び／又は細胞生存率が10%未満に低下した細胞の上清で得られる。好ましくは、PCV2 ORF2タンパク質の製造のために、細胞は25から29℃で培養される。好ましくは、分離工程は遠心又はろ過工程である。
【００４２】
場合によって、本方法は、PCV2 ORF2 DNAのトランスファーベクターでのクローニング前にPCV2の株からPCV2 ORF DNAを増幅する工程を含むことができる。好ましい形態では、5'のコザック配列、3'のEcoRI部位、及びその組合せもまた前記増幅される配列に、好ましくは増幅前又は増幅中に付加することができる。好ましい5'のコザック配列は配列番号:1を含む。好ましい3'のEcoRI部位は配列番号:2を含む。好ましいPCV2 ORF2 DNAは、ヌクレオチド配列Genbankアクセッション番号AF086834（配列番号:3）及び配列番号:４を含む。好ましい組換えPCV2 ORF2タンパク質は、配列番号:5のアミノ酸配列（配列番号:3（Genbankアクセッション番号AF086834）によってコードされるタンパク質）及び配列番号:6（配列番号:4によってコードされるタンパク質）を含む。好ましい培養液は、血清を含まない昆虫細胞培養液、より好ましくはExcell420培養液を含む。オプションの増幅工程を実施するときは、増幅されるオープンリーディングフレーム2を最初に第一のベクターにおいてクローニングし、前記第一のベクターからオープンリーディングフレーム2を切り出し、さらに前記切り出したオープンリーディングフレームをトランスファーベクターにおけるクローニングに使用するのが好ましい。同時トランスフェクションのために好ましい細胞株はSF+細胞株である。同時トランスフェクションのために好ましいウイルスはバキュロウイルスである。本方法の好ましい形態では、トランスファーベクターのトランスフェクトされる部分は配列番号:8を含む。最後に本方法の場合、細胞をウイルスで感染させた後少なくとも5日で細胞培養上清中のPCV2オープンリーディングフレーム2（ORF2）タンパク質を回収することが好ましい。
【００４３】
したがって、本発明のさらに別の特徴は、PCV2オープンリーディングフレーム2を製造及び／又は回収する方法に関し、前記方法は以下の工程を含む：i）PCV2 ORF2 DNAをin vitroで、好ましくは5'コザック配列を添加することによって、及び／又は3' EcoRI制限部位を添加することによって増幅する工程；ii）増幅させたPCV2 ORF2をトランスファーベクターにおいてクローニングする工程；iii）組換えPCV2 ORF2を含むトランスファーベクターの部分をウイルスにトランスフェクトする工程；iv）トランスフェクトしたウイルスで培養液中の細胞を感染させる工程；v）前記トランスフェクトしたウイルスにPCV2 ORF2から組換えタンパク質を発現させる工程；vi）上清から細胞を分離する工程；及びvii）発現されたPCV2 ORF2タンパク質を上清から回収する工程。
本発明のさらに別の特徴は、PCV2 ORF2タンパク質及び不活化されたウイルスベクターを含む組成物を製造する方法に関する。本方法は以下の工程を含む：i）増幅させたPCV2 ORF2をトランスファーベクターにおいてクローニングする工程；ii）組換えPCV2 ORF2を含むトランスフェーベクターの部分をウイルスにトランスフェクトする工程；iii）前記トランスフェクトしたウイルスベクターに培養液中で細胞を感染させる工程；iv）前記トランスフェクトしたウイルスベクターにPCV2 ORF2から組換えタンパク質を発現させる工程；v）上清から細胞を分離する工程；vi）発現されたPCV2 ORF2タンパク質を上清から回収する工程；及びvii）組換えウイルスベクターを不活化する工程。好ましくは、前記組換えウイルスベクターはORF2 DNAコード配列を含むバキュロウイルスであり、細胞はSF+細胞である。好ましい分離工程は上記に記載したものであり、もっとも好ましいものはろ過工程である。好ましい不活化工程は上記に記載したものである。好ましくは、不活化は、約35−39℃で2−8mMのBEIの存在下において、より好ましくは約5mMのBEIの存在下において実施される。驚くべきことに、より高い濃度のBEIはPCV2 ORF2タンパク質に悪影響を与え、より低い濃度は、24から72時間の不活化ではウイルスベクターの不活化に有効ではないことが見出された。好ましくは、不活化は、少なくとも24時間、より好ましくは24から72時間実施される。
【００４４】
さらに別の特徴にしたがえば、PCV2 ORF2タンパク質及び不活化されたウイルスベクターを含む組成物を製造する方法はまた、上記に記載したように、工程vii）の後に中和工程を含む。この工程viii）は、溶液内の不活化剤を中和する等価量の薬剤を添加することを含む。好ましくは、不活化剤がBEIである場合は、等価量のチオ硫酸ナトリウムの添加が好ましい。したがって、さらに別の特徴にしたがえば、工程viii）は、不活化剤がBEIであるとき、チオ硫酸ナトリウム溶液を約1から約20mMの最終濃度、好ましくは約2から約10mM、さらに好ましくは約2から約8mM、さらに好ましくは約3から約7mM、もっとも好ましくは約5mMの最終濃度に添加することを含む。
さらに別の特徴にしたがえば、PCV2 ORF2タンパク質及び不活化されたウイルスベクターを含む組成物を製造する方法は、上記に記載したように工程i）の前に以下の工程を含む：i）in vitroでPCV2 ORF2 DNAを増幅する工程、この場合、PCV2 ORF2 DNAのフランキング配列は上記に記載したように改変されている。PCV2 ORF2 DNAを増幅しフランキング配列を改変するin vitroの方法、増幅PCV2 ORF2 DNAのトランスファーベクターにおけるクローニング、及び適切なトランスファーベクターは上記に記載されているか、図1に例示的に示されているか、又は当業者にとって公知である。したがってさらに別の特徴によれば、本方法は以下の工程を含む：i）in vitroでPCV2 ORF2 DNAを増幅する工程（この場合、前記PCV2 ORF2 DNAのフランキング配列は改変されている）；ii）増幅させたPCV2 ORF2 DNAをトランスファーベクターにおいてクローニングする工程；iii）組換えPCV2 ORF2 DNAを含むトランスフェーベクター又はその部分をウイルスベクターにおいてトランスフェクトして組換えウイルスベクターを生成する工程；iv）前記トランスフェクトしたウイルスに培養液中で細胞を感染させる工程；v）前記トランスフェクトしたウイルスにPCV2 ORF2から組換えタンパク質を発現させる工程；vi）上清から細胞を分離する工程；vii）発現されたPCV2 ORF2タンパク質を上清から回収する工程；viii）組換えウイルスベクターを、好ましくは約1から約20mMのBEIの存在下で、もっとも好ましくは約5mMのBEIの存在下で不活化する工程；及びix）溶液中の不活化剤を中和する等価量の薬剤を添加する工程であって、不活化剤がBEIであるときは、好ましくはチオ硫酸ナトリウムを、約1から約20mM、好ましくは約5mMの最終濃度に添加する工程。
【００４５】
本発明の別の特徴では、PCV2に対する免疫応答を引き起こすための組成物、好ましくは抗原性組成物（例えばワクチン）を製造する方法が提供される。一般的には、本方法は、構築物をウイルスにトランスフェクトする工程を含み（前記構築物はi）PCV2のORF2由来の組換えDNAを含む）、ii）増殖培養液中で細胞をトランスフェクトしたウイルスに感染させ、iii）前記ウイルスにPCV2 ORF2から組換えタンパク質を発現させ、iv）上清から発現されたORF2タンパク質を回収し、さらにv）前記回収されたタンパク質を適切なアジュバント及び／又は他の医薬的に許容できる担体と一体化することによって組成物を製造する。
本明細書で用いられる“アジュバント”には水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サポニン、例えばQuil A、QS-21（Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA）、GPI−0100（Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL）、油中水エマルジョン、水中油エマルジョン、水中油中水エマルジョンが含まれえる。前記エマルジョンは、軽液体パラフィン油系（European Pharmacopeaタイプ）；イソプレノイド油、例えばアルケン、特にイソブテン又はデセンのオリゴマー化から生じたスクァラン又はスクァレン；直鎖アルキル基を含む酸又はアルコールのエステル、より好ましくは植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ-(カプリレート/カプレート)、グリセリル-(カプリレート/カプレート)、又はウロピレングリコールジオレエート；分枝脂肪酸又はアルコールのエステル、特にイソステアリン酸エステルであってもよい。油を乳化剤と一緒に用いてエマルジョンを生成する。乳化剤は、好ましくは非イオン性界面活性剤、特にソルビタンのエステル、マンニドのエステル（例えばアンヒドロマンニトールオレエート）、グリセロールのエステル、ポリグリセロールのエステル、プロピレングリコールのエステル、及びオレイン酸、イソステアリン酸、リシノレン酸又はヒドロキシステアリン酸のエステル（前記は場合によってエトキシル化される）、並びにポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンコポリマーブロック、特にプルロニック社（Pluronic）の製品、特にL121でありえる（以下を参照されたい：Hunter et al. The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed. D.E.S. Stewart-Tull), John Wiley and Sons, NY, pp51-94 (1995)；及びTodd et al. 1997, Vaccine 15:564-570）。
【００４６】
例えば、以下の文献（”Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach”, Ed. By M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995）の147ページに記載されたSPTエマルジョン、及び同書の183ページに記載されたエマルジョンMF59を用いることができる。
アジュバントのさらに別の例は、アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー、並びに無水マレイン酸のコポリマー及びそのアルケニル誘導体から選択される化合物である。有利なアジュバント化合物はアクリル酸又はメタクリル酸のポリマーであり、それらは特に糖又はポリアルコールのポリアルケニルエーテルで架橋される。これらの化合物はカルボマーという名で知られている（Pharmeuropa Vol.8, No.2, 1996年6月）。当業者はまた米国特許2,909,462号を参照することができる。前記特許は、少なくとも3つ（好ましくは8つを超えない）のヒドロキシル基を有するポリヒドロキシル化化合物（少なくとも3つのヒドロキシルの水素原子は、少なくとも2つの炭素原子を有する不飽和脂肪族ラジカルによって置換されている）で架橋されたそのようなアクリル系ポリマーについて記載している。前記の好ましいラジカルは2から4つの炭素原子を含むもの、例えばビニル、アリル、及び他のエチレン系不飽和基である。前記不飽和ラジカルはそれ自体他の置換基、例えばメチルを含んでいてもよい。Carbopol（BF Goodrich, Ohio, USA）の名称で販売されている製品が特に適切である。それらはアルキルシュクロース又はアリルペンタエリトリトールで架橋される。とりわけ、Carbopol 974P、934P及び971Pと称されるものがある。もっとも好ましいものはCarbopol 971Pの使用である。無水マレイン酸のコポリマー及びアルケニル誘導体の中で、無水マレイン酸とエチレンのコポリマーであるコポリマーEMA（Monsanto）がある。水へのこれらポリマーの溶解は酸性溶液を生じ、前記は好ましくは生理学的pHに中和されて、免疫原性、免疫学的又はワクチン組成物そのものに取り込まれるアジュバント溶液を生じるであろう。
【００４７】
さらに適切なアジュバントには以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：RIBIアジュバント系（RIBI Inc.）。ブロックコポリマー（CytRx, Atlanta GA）、SAF-M（Chiron, Emeryville CA）、モノホスホリル脂質A、Avridine脂質-アミンアジュバント、大腸菌の易熱性内毒素（組換え型又は他のもの）、コレラ毒素、IMS 1314ムラミルジペプチド及びその他多くのもの。
好ましくは、アジュバントは、約100μgから約10mg/用量の量で添加される。より好ましくは、アジュバントは、約100μgから約10mg/用量の量で添加される。より好ましくは、アジュバントは、約500μgから約5mg/用量の量で添加される。より好ましくは、アジュバントは、約750μgから約2.5mg/用量の量で添加される。もっとも好ましくは、アジュバントは、約1mg/用量の量で添加される。
したがって、さらに別の特徴によれば、PCV2に対する免疫応答を引き起こすことを目的とする抗原性組成物（例えばワクチン）を製造する方法は以下の工程を含む：i）PCV2 ORF2タンパク質を製造し回収する工程、及びii）前記を適切なアジュバントと混合する工程。好ましくは、アジュバントはCarbopol 971Pである。より好ましくはCarbopol 971Pは、約500μgから約5mg/用量の量で、より好ましくは約750μgから約2.5mg/用量の量で、もっとも好ましくは約1mg/用量の量で添加される。好ましくは、プロセス工程i）は、PCV2 ORF2の製造及び回収について記載されたプロセス工程を含む。本方法の好ましい形態では、PCV2 ORF2 DNAを含む構築物はトランスファーベクター中で得られる。適切なトランスファーベクター及び製造方法は上記に記載されている。場合によって、本方法は、ORF2をトランスファーベクターにおいてクローニングする前に、PCRによりPCV2のある株からORF2を増幅する工程を含む。好ましいオープンリーディングフレーム配列、コザック配列、3'のEcoRI部位配列、組換えタンパク質配列、トランスフェクトされた構築物配列培養液、細胞及びウイルスは以前の方法の中で記載されている。本方法のまた別のオプション工程は、増幅したPCV2 ORF2 DNAを第一のベクターにおいてクローニングする工程、この第一のベクターからORF2 DNAを切り出す工程、及びこの切り出したPCV2 ORF2 DNAを用いてトランスファーベクターにおいてクローニングする工程を含む。他の方法に関しては、組換えORF2タンパク質を上清から回収する前に、トランスフェクトしたバキュロウイルスにより細胞を感染させた後で少なくとも5日間待つのが好ましい。好ましくは、本方法の回収工程はまた、細胞及び細胞屑から培養液を分離する工程を含む。前記は多様な態様で実施できるが、簡便のために、約0.45μmから約1.0μmの範囲のポアサイズを有するフィルターから細胞、細胞屑及び増殖培養液をろ過することが好ましい。最後に本方法では、回収した組換えPCV2 ORF2タンパク質を組成物中で混合する前にウイルス不活化工程を含むことが好ましい。前記は多様な態様で実施できるが、本発明ではBEIを使用することが好ましい。
【００４８】
したがってさらに別の特徴によれば、本方法は以下の工程を含む：i）in vitroでPCV2 ORF2 DNAを増幅する工程（この場合、前記PCV2 ORF2 DNAのフランキング配列は改変される）；ii）増幅させたPCV2 ORF2 DNAをトランスファーベクターにおいてクローニングする工程；iii）組換えPCV2 ORF2 DNAを含むトランスフェーベクター又はその部分をウイルスベクターにトランスフェクトして組換えウイルスベクターを生成する工程；iv）前記トランスフェクトしたウイルスに培養液中で細胞を感染させる工程；v）前記トランスフェクトしたウイルスにPCV2 ORF2から組換えタンパク質を発現させる工程；vi）上清から細胞を分離する工程；vii）発現されたPCV2 ORF2タンパク質を上清から回収する工程；viii）組換えウイルスベクターを、好ましくは約1から約20mMのBEIの存在下で、もっとも好ましくは約5mMのBEIの存在下で不活化する工程；ix）溶液中の不活化剤を中和する等価量の薬剤を添加する工程であって、不活化剤がBEIであるときは、好ましくはチオ硫酸ナトリウムを、約1から約20mM、好ましくは約5mMの最終濃度に添加する工程；及びx）適切な量のアジュバントを添加する工程、好ましくはCarbopol、より好ましくはCarbopol 971Pを、さらに好ましくは上記に記載の量で添加する工程（例えば約500μgから約5mg/用量の量で、より好ましくは約750μgから約2.5mg/用量の量で、もっとも好ましくは約1mg/用量の量で添加される）。
さらにまた、前記組成物は1つ以上の許容できる医薬担体を含むことができる。本明細書で用いられる、“許容できる医薬担体”には任意の全ての溶媒、分散媒体、コーティング、安定化剤、稀釈剤、保存料、抗菌及び抗カビ剤、等張剤、吸着延長剤などが含まれる。もっとも好ましくは、本明細書で提供される組成物は、in vitro培養細胞の上清から回収されたPCV2 ORF2タンパク質を含み、この場合、前記細胞は、PCV2 ORF2 DNAを含みPCV2 ORF2タンパク質を発現する組換えウイルスベクターで感染されてあり、さらにこの場合、前記細胞培養は約2から約8mMのBEIで、好ましくは約5mMのBEIで処理されてウイルスベクターが不活化され、さらに等価濃度の中和剤、好ましくは最終濃度約2から約8mMのチオ硫酸ナトリウム溶液、好ましくは約5mMのCarbopol、より好ましくはCarbopol 971Pを、好ましくは約500μgから約5mg/用量の量で、より好ましくは約750μgから約2.5mg/用量の量で、もっとも好ましくは約1mg/用量の量で含み、さらに生理学的食塩水を、好ましくは約50から約90％（v/v）、より好ましくは約60から約80％（v/v）、さらに好ましくは約70％（v/v）の量で含む。
【００４９】
したがってさらに別の特徴は、以下の工程を含む、PCV2に対して免疫応答を引き起こすことを目的とする抗原性組成物、例えばワクチンを製造する方法に関する：i）in vitroでPCV2 ORF2 DNAを増幅する工程（この場合、前記PCV2 ORF2 DNAのフランキング配列は改変される）；ii）増幅させたPCV2 ORF2 DNAをトランスファーベクターにおいてクローニングする工程；iii）組換えPCV2 ORF2 DNAを含むトランスフェーベクター又はその部分をウイルスベクターにトランスフェクトして組換えウイルスベクターを生成する工程；iv）前記トランスフェクトしたウイルスに培養液中で細胞を感染させる工程；v）前記トランスフェクトしたウイルスにPCV2 ORF2から組換えタンパク質を発現させる工程；vi）上清から細胞を分離する工程；vii）発現されたPCV2 ORF2タンパク質を上清から回収する工程；viii）組換えウイルスベクターを、好ましくは約2から約20mMのBEIの存在下で、もっとも好ましくは約5mMのBEIの存在下で不活化する工程；ix）溶液中の不活化剤を中和する等価量の薬剤を添加する工程であって、不活化剤がBEIであるときは、好ましくはチオ硫酸ナトリウムを、約0.5から約20mM、好ましくは約5mMの最終濃度に添加する工程；x）適切な量のアジュバントを添加する工程、好ましくはCarbopol、より好ましくはCarbopol 971Pを、さらに好ましくは上記に記載の量で添加する工程（例えば約500μgから約5mg/用量の量で、より好ましくは約750μgから約2.5mg/用量の量で、もっとも好ましくは約1mg/用量の量で添加される）；及びxi）生理学的食塩水を約50から約90％（v/v）、より好ましくは約60から約80％（v/v）、さらに好ましくは約70％（v/v）の量で添加する工程。場合によって本方法はまた防御物質の添加を含むことができる。本明細書で用いられる防御物質は抗微生物学的活性を有する薬剤、例えばゲンタマイシン、マーチオレートなどを指す。特に防御物質の添加は、マルチ用量組成物の製造のためにもっとも好ましい。これらの抗微生物学的活性を有する薬剤は、問題の組成物を一切の微生物学的汚染から保護するために、又は問題の組成物中の一切の微生物学的増殖を阻害するために有効な濃度で添加される。
【００５０】
さらにまた、本方法はまた、製品の保存期間を延長及び／又は維持するために、任意の安定化剤（例えば糖類、トレハロース、マンニトール、サッカロースなど）の添加を含むことができる。しかしながら、驚くべきことに、生成された処方物は少なくとも24ヶ月の期間にわたって、さらに別の安定化剤を全く添加することなく免疫学的に有効であることが判明した。
本発明のさらに別の特徴は、上記に記載の方法から生成される製品に関する。特に、本発明は、組換えにより発現されたPCV2 ORF2タンパク質を含む成分の組成物に関する。さらにまた、本発明はまた、組換えにより発現され、昆虫細胞培養の上清から回収されたPCV2 ORF2タンパク質を含む成分の組成物に関する。さらにまた、本発明はまた、組換えによって発現され、昆虫細胞培養の上清から回収されたPCV2 ORF2タンパク質を含む成分の組成物に関する。好ましくはこの成分の組成物はまた、ウイルスベクターの不活化に適切な薬剤を含む。好ましくは、前記不活化薬剤はBEIである。さらにまた、本発明はまた、組換えによって発現され、昆虫細胞培養の上清から回収されたPCV2 ORF2タンパク質を含み、さらにウイルスベクターの不活化に適切な薬剤、好ましくはBEI、及び前記不活化薬剤の中和のための中和薬剤を含む成分の組成物に関する。前記中和薬剤は、不活化薬剤としてBEIが用いられるときは、好ましくはチオ硫酸ナトリウムである。
本発明のさらに別の特徴では、免疫応答を誘発する、より具体的にはPCV2感染の臨床症状に対して防御免疫を付与する免疫原性組成物が提供される。本組成物は一般的には、PCV2のオープンリーディングフレーム2（ORF2）によって発現されるポリペプチド又はそのフラグメントを前記組成物の抗原性成分として含む。
【００５１】
前記組成物の製造のために本明細書で用いられ、さらにまた本明細書で提供する方法の中で用いられるPCV2 ORF2 DNA及びタンパク質は、PCV2単離株内で高度に保存されたドメインであり、そのためいずれのPCV2 ORF2も、本明細書で用いられるPCV ORF2 DNA及び／又はポリペプチドの供給源として有効であろう。好ましいPCV2 ORF2タンパク質は配列番号:11のタンパク質である。好ましいPCV ORF2ポリペプチドは配列番号:5として本明細書で提供されるが、この配列は6−10%も配列相同性が変動しえるがそれでもなお、免疫原性組成物においてこのポリペプチドを有用ならしめる抗原的特徴を維持することは当業者には理解されよう。免疫学的組成物の抗原的特徴は、例えば実施例4によって提供されるチャレンジ実験により概算することができる。さらにまた、配列番号:3又は配列番号:4のポリヌクレオチド配列によってコードされるPCV2 ORF2タンパク質と比較して、改変された抗原が、防御免疫の少なくとも70%、好ましくは80%、より好ましくは90%を付与するとき、前記改変された抗原の抗原的特徴はなお維持されている。本明細書で用いられる“免疫原性組成物”とは、PCV2 ORF2タンパク質に対する細胞性免疫及び／又は抗体介在免疫応答の“免疫学的応答”を宿主で誘引するPCV2 ORF2タンパク質を指す。好ましくは、本免疫原性組成物は、PCV2感染及び前記に付随する臨床症状に対する防御免疫を付与することができる。いくつかの形態では、PCV2 ORF2タンパク質の免疫原性部分が、組成物の抗原性成分として用いられる。本明細書で用いられる“免疫原性部分”という用語は、PCV2 ORFタンパク質若しくはポリヌクレオチドのそれぞれの切端及び／又は置換形又はフラグメントを指す。好ましくは、そのような切端及び／又は置換形又はフラグメントは、完全長のORF2ポリペプチドの少なくとも6つの連続するアミノ酸を含む。より好ましくは、切端若しくは置換形又はフラグメントは、完全長ORF2ポリペプチドの少なくとも10、より好ましくは少なくとも15、さらに好ましくは少なくとも19の連続するアミノ酸を有するであろう。これに関する2つの好ましい配列は、配列番号:9及び10として本明細書で提供される。そのような配列は、より大きなフラグメント又は切端形の部分であってもよいこともまた理解されよう。本明細書で提供されるさらに別の好ましいPCV2 ORF2ポリペプチドは、配列番号:3又は配列番号:4のヌクレオチド配列によってコードされる。しかしながら、この配列は配列相同性が6−20%も変動することが可能であり、免疫原性組成物でこの配列を有用ならしめる抗原的特徴をなお保持しえることは当業者には理解されよう。いくつかの形態では、ORF2の切端若しくは置換形又はフラグメントは、前記組成物の抗原性成分として用いられる。好ましくは、そのような切端若しくは置換形又はフラグメントは、完全長ORF2ヌクレオチド配列（例えば配列番号:3又は配列番号:4）の少なくとも18の連続するヌクレオチドを含むであろう。より好ましくは、前記切端若しくは置換形又はフラグメントは、完全長ORF2ヌクレオチド配列（たとえば配列番号:3又は配列番号:4）の少なくとも30、より好ましくは少なくとも45、さらに好ましくは少なくとも57の連続するヌクレオチドを有するであろう。
【００５２】
当分野で知られているとおり、“配列同一性”は、2つ以上のポリペプチド配列又は2つ以上のポリヌクレオチド配列、すなわち参照配列と前記参照配列と比較するために与えられる配列との間の関係を指す。配列同一性は、もっとも高度の配列類似性（そのような配列の鎖間のマッチによって決定される）を提供するために最適なアラインメントを配列で実施した後、与えられた配列を参照配列と比較することによって決定される。そのようなアラインメントに際して、配列同一性は各位置毎に確認される。例えば配列は、個々の位置において、ヌクレオチド又はアミノ酸残基が当該位置において同一であるならば“同一”である。続いてそのような位置同一の総数を参照配列中のヌクレオチド又は残基の総数で割って％配列同一性が得られる。配列同一性は、以下（ただしこれらに限定されない）に記載されている方法を含む公知の方法によって容易に算出することができる：Computational Molecular Biology, A.N. Lask ed., Oxford University Press, New York (1988)；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, D.W. Smith ed., Academic Press, New York (1993)；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, A.M. Griffin and H.G. Griffin eds., Humana Press, New Jersey (1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology, von G. Heinge, Academic Press (1987)；Sequence Analysis Primer, M. Gribskov and J. Devereux eds., M. Stockton Press, New York (1991)；及びH. Carillo and D. Lipman, SIAM J Applied Math, 48:1073, 1988（前記の教示内容は参照により本明細書に含まれる）。配列同一性を決定する好ましい方法は、調査される配列間で最高のマッチが得られるように設計される。配列同一性を決定する方法は、与えられた配列間の配列同一性を決定する公開コンピュータープログラムで集大成されている。そのようなプログラムの例には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：GCGプログラムパッケージ（J. Devereux et al. Nucleic Acids Research, 1984, 12(1):387）、BLASTP、BLASTN及びFASTA（S.F. Altschul et al., J Molec Biol 1990, 215:403-410）。BLASTXプログラムはNCBI及び他のソースから公開されている：BLAST Manual, S. Altschul et al. NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894；S.F. Altschul et al. J Molec Biol 1990, 215:403-410（前記文献の教示内容は参照により本明細書に含まれる）。これらのプログラムは、与えられた配列と参照配列間で最高レベルの配列同一性を提供するために、場合によってデフォルトギャップ荷重値を用いて配列のアラインメントを実施する。例示すれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも例えば85%、好ましくは90%、さらに好ましくは95%の“配列同一性”を有するヌクレオチド配列をもつポリヌクレオチドとは、与えられたポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列の100ヌクレオチド毎に15箇所まで、好ましくは10箇所まで、より好ましくは5箇所まで変異を含みえるという点を除いて、前記与えられたポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は参照配列と同一であることを意味する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に対して、少なくとも85%、好ましくは90%、より好ましくは95%の同一性を有するポリヌクレオチドでは、参照配列中の15%まで、好ましくは10%まで、より好ましくは5%までが欠失しているか若しくは別のヌクレオチドで置き換えられえるか、又は参照配列中の全ヌクレオチドの15%まで、好ましくは10%まで、より好ましくは5%までの数のヌクレオチドが参照配列に挿入されえる。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の5'若しくは3'末端の位置に又はそれら末端位置の間の任意の位置に、参照配列中のヌクレオチド中に個々に分散して又は参照配列内の1つ以上の連続群として存在しえる。同様に、参照アミノ酸配列に対して例えば少なくとも85%、好ましくは90%、より好ましくは95%の同一性を有する或るアミノ酸配列を持つポリペプチドとは、与えられたポリペプチド配列は、参照アミノ酸配列の100アミノ酸配列毎に15まで、好ましくは10まで、より好ましくは5つまでのアミノ酸変異を含みえるという点を除いて、前記与えられたポリペプチドのアミノ酸配列は参照配列と同一であることを意味する。換言すれば、参照アミノ酸配列と少なくとも85%、好ましくは90%、より好ましくは95%の配列同一性を有するあるポリペプチドを得るために、参照配列中のアミノ酸残基の15%まで、好ましくは10%まで、より好ましくは5%までを欠失若しくは別のヌクレオチドで置換するか、又は参照配列中のアミノ酸残基総数の15%まで、好ましくは10%まで、より好ましくは5%までの数のアミノ酸を参照配列中に挿入することができる。参照配列のこれらの変異は、参照アミノ酸配列のアミノ若しくはカルボキシ末端の位置に又はそれら末端位置の間の任意の位置に、参照配列中の残基中に個々に分散して又は参照配列内の1つ以上の連続群として存在しえる。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸残基によって相違する。しかしながら、保存的置換は、配列同一性を決定するときにはマッチとして含まれない。
【００５３】
本明細書で用いられる“配列相同性”は、2つの配列の関連性を決定する方法についていう。配列相同性を決定するために、2つ以上の配列で最適なアラインメントが実施され、必要な場合にはギャップが導入される。しかしながら、“配列同一性”とは対照的に、保存的アミノ酸置換は、配列相同性を決定するときにはマッチとして数えられる。換言すれば、参照配列と95%の配列相同性を有するポリペプチド又はポリヌクレオチドを得るために、参照配列中のアミノ酸残基又はヌクレオチドの85%、好ましくは90%、より好ましくは95%がマッチするか、又は別のアミノ酸若しくはヌクレオチドによる保存的置換を含む必要があり、又は、参照配列中の全アミノ酸残基若しくはヌクレオチドの15%まで、好ましくは10%まで、より好ましくは5%までの数のアミノ酸若しくはヌクレオチド（保存的置換は含まれない）が参照配列に挿入されえる。好ましくは、相同な配列は、少なくとも50、好ましくは100、より好ましくは250、さらに好ましくは500ヌクレオチドの一続きを含む。
“保存的置換”は、全体的な機能性が著名には変化しないように、類似の特徴又は特性（サイズ、疎水性などを含む）を有する別のアミノ酸残基又はヌクレオチドによるアミノ酸残基又はヌクレオチドの置換を指す。
“単離された”とは、“人工的に”その天然の状態から変更されることを意味する。すなわちそれが天然に存在する場合には、前記はその本来の環境から変更されてあるか、又は移動されてあること又はその両方を意味する。例えば生きている生物内に自然の状態で存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは“単離されて”いないが、その天然の状態で一緒に存在する物質から分離された同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは、この用語が本明細書で用いられるとおり“単離されて”いる。
【００５４】
したがって、本発明のさらに別の特徴は、PCV2感染に付随する臨床症状の重篤度を緩和するために有効な、PCV2 ORFタンパク質を含む免疫原性組成物に関する。好ましくは、PCV2 ORF2タンパク質は上記に記載したもののいずれかである。好ましくは、前記PCV2 ORF2タンパク質は以下のものである：
i）配列番号:5、配列番号:6、配列番号:9、配列番号:10又は配列番号:11の配列を含むポリペプチド；
ii）項目i）のポリペプチドと少なくとも80%相同な任意のポリペプチド；
iii）項目i）及び／又は項目ii)のポリペプチドの任意の免疫原性部分；
iv）配列番号:5、配列番号:6、配列番号:9、配列番号:10又は配列番号:11の配列に含まれる少なくとも10の連続するアミノ酸を含む、項目iii）の免疫原性部分；
v）配列番号:3又は配列番号:4の配列を含むDNAによってコードされるポリペプチド；
vi）項目v）のポリヌクレオチドと少なくとも80%相同なポリヌクレオチドによってコードされる任意のポリペプチド；
vii）項目v）及び／又は項目vi)のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの任意の免疫原性部分；
viii）項目vii）の免疫原性部分、ここで前記免疫原性部分をコー用量るポリヌクレオチドは、配列番号:3又は配列番号:4の配列に含まれる少なくとも30の連続するヌクレオチドを含む。
好ましくは、これら免疫原性部分のいずれも、配列番号:3又は配列番号:4の配列によってコードされるPCV2 ORF2タンパク質の免疫原性についての特徴を有するであろう。
【００５５】
さらに別の特徴にしたがえば、PCV2 ORF2タンパク質は、所望の免疫応答の誘発（すなわちPCV2感染から生じる臨床症状の発生頻度の軽減又は前記症状の緩和）に有効な抗原含有レベルにある免疫原性組成物において提供される。好ましくは、PCV2 ORF2タンパク質の含有レベルは、最終免疫原性組成物の単位mL当たり少なくとも0.2μg抗原（μg/mL）、より好ましくは約0.2から約400μg/mL、さらに好ましくは約0.3から約200μg/mL、さらに好ましくは約0.35から約100μg/mL、さらに好ましくは約0.4から約50μg/mL、さらに好ましくは約0.45から約30μg/mL、さらに好ましくは約0.6から約15μg/mL、さらに好ましくは約0.75から約8μg/mL、さらに好ましくは約1.0から約6μg/mL、さらに好ましくは約1.3から約3.0μg/mL、さらに好ましくは約1.4から約2.5μg/mL、さらに好ましくは約1.5から約2.0μg/mL、及びもっとも好ましくは約1.6μg/mLである。
さらに別の特徴にしたがえば、ORF2抗原含有レベルは、最終抗原組成物の単位用量当たり少なくとも0.2μgの上記に記載のPCV2 ORF2タンパク質（μg/用量）、より好ましくは約0.2から約400μg/用量、より好ましくは約0.3から約200μg/用量、より好ましくは約0.35から約100μg/用量、より好ましくは約0.4から約50μg/用量、より好ましくは約0.45から約30μg/用量、より好ましくは約0.6から約15μg/用量、より好ましくは約0.75から約8μg/用量、より好ましくは約1.0から約6μg/用量、より好ましくは約1.3から約3.0μg/用量、より好ましくは約1.4から約2.5g/用量、より好ましくは約1.5から約2.0μg/用量、及びもっとも好ましくは約1.6μg/用量である。
【００５６】
本発明にしたがって免疫原性組成物で用いられるPCV2 ORF2ポリペプチドは、PCV2 ORF2の単離及び精製の方法論、標準的タンパク質合成の方法論、及び組換え方法論を含む任意の態様で誘導することができる。PCV2 ORF2ポリペプチドを入手する好ましい方法は上記に記載されてあり、さらにまた米国特許出願11/034,797号においても提供されている（前記文献の教示内容は参照により本明細書に含まれる）。略記すれば、感受性細胞をPCV2 ORF2 DNAコード配列を含む組換えウイルスベクターに感染させ、PCV2 ORF2ポリペプチドを前記組換えウイルスによって発現させ、前記発現されたPCV2 ORFポリペプチドをろ過によって上清から回収し、通常の方法によって、好ましくは二元エチレンイミンを用いて不活化する（続いてエチレンイミンを中和して不活化プロセスを停止させる）。
したがって、さらに別の特徴によれば、免疫原性組成物は、i）好ましくは上記に記載の濃度にある、上記記載のPCV2 ORF2タンパク質のいずれか、及びii）前記PCV2 ORFタンパク質を発現する、好ましくは組換えバキュロウイルスのウイルスベクターの少なくとも一部分を含む。さらにまた別の特徴にしたがえば、免疫原性組成物は、i）好ましくは上記に記載の濃度にある、上記記載のPCV2 ORF2タンパク質のいずれか、ii）前記PCV2 ORFタンパク質を発現する、好ましくは組換えバキュロウイルスのウイルスベクターの少なくとも一部分、及びiii）細胞培養上清の一部分を含む。
PCV2 ORF2タンパク質の製造及び回収プロセスのある特別な実施態様にしたがえば、細胞培養上清は、好ましくは約0.45から1μmのポアサイズを有する膜からろ過される。したがって、さらに別の特徴は、以下を含む免疫原性組成物に関する：i）好ましくは上記に記載の濃度にある、上記記載のPCV2 ORF2タンパク質のいずれか、ii）前記PCV2 ORFタンパク質を発現する、好ましくは組換えバキュロウイルスのウイルスベクターの少なくとも一部分、及びiii）細胞培養の一部分（ここで前記成分の約90%は1μmより小さいサイズを有する）。
【００５７】
さらに別の特徴にしたがえば、本発明は以下を含む免疫原性組成物に関する：i）好ましくは上記に記載の濃度にある、上記記載のPCV2 ORF2タンパク質のいずれか、ii）前記PCV2 ORFタンパク質を発現するウイルスベクターの少なくとも一部分、iii）細胞培養の一部分、及びiv）組換えウイルスベクターを不活化する不活化薬剤、好ましくはBEI（ここでi）からiii）の成分の約90%は1μmより小さいサイズを有する）。好ましくは、BEIはバキュロウイルスの不活化に有効な濃度で存在する。有効な濃度は上記に記載されている。
さらに別の特徴にしたがえば、本発明は以下を含む免疫原性組成物に関する：i）好ましくは上記に記載の濃度にある、上記記載のPCV2 ORF2タンパク質のいずれか、ii）前記PCV2 ORFタンパク質を発現するウイルスベクターの少なくとも一部分、iii）細胞培養の一部分、iv）組換えウイルスベクターを不活化する不活化薬剤、好ましくはBEI、及びv）前記不活化薬剤によって仲介された不活化を停止させる中和剤（ここでi）からiii）の成分の約90%は1μmより小さいサイズを有する）。好ましくは、前記不活化薬剤がBEIならば、前記組成物は、BEIに対して等価の量のチオ硫酸ナトリウムを含む。
ポリペプチドは、PCV2感染に感受性を有する動物に投与することができる組成物に取り込まれる。好ましい形態では、組成物はまた、当業者に公知の追加成分を含むことができる（以下の文献もまた参照されたい:Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed. Mack Publ. Easton）。さらにまた、前記組成物は獣医分野で許容できる1つ以上の担体を含むことができる。本明細書で用いられる、“獣医分野で許容できる担体”には任意の全ての溶媒、分散媒体、コーティング、アジュバント、安定化剤、稀釈剤、保存料、抗菌及び抗カビ剤、等張剤、吸着延長剤などが含まれる。
好ましい実施態様では、免疫原性組成物は、本明細書で提供されるPCV2 ORF2タンパク質を、好ましくは抗原性成分として上記に記載の濃度で含み、前記はアジュバント（好ましくはCarbopol）及び生理学的食塩水とともに混合される。
【００５８】
本明細書の組成物は、公知の注射可能な生理学的に許容できる無菌的溶液を含むことができることは当業者には理解されよう。非経口注射又は輸液用即席溶液の製造のためには、等張水溶液（例えば食塩水又は対応する血漿タンパク質溶液）が容易に入手できる。さらにまた、本発明の免疫原性及びワクチン組成物は、稀釈剤、等張剤、安定化剤又はアジュバントを含むことができる。稀釈剤には水、食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどが含まれえる。等張剤には、とりわけ塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースが含まれえる。安定化剤には、とりわけアルブミン及びエチレンジアミン四酢酸のアルカリ塩が含まれる。適切なアジュバントは上記に記載のものである。もっとも好ましいものはCarbopolの使用、特にCarbopol 971Pの好ましくは上記記載の量（例えば単位用量当たり約500μgから約5mg、より好ましくは単位用量当たり約750μgから約2.5mg、もっとも好ましくは単位用量当たり約1mgの量）での使用である。
したがって、本発明はまた以下を含む免疫原性組成物に関する：i）好ましくは上記に記載の濃度にある、上記記載のPCV2 ORF2タンパク質のいずれか、ii）前記PCV2 ORFタンパク質を発現するウイルスベクターの少なくとも一部分、iii）細胞培養の一部分、iv）組換えウイルスベクターを不活化する不活化薬剤、好ましくはBEI、及びv）前記不活化薬剤によって仲介された不活化を停止させる中和剤、好ましくはBEIに対し等価量のチオ硫酸ナトリウム、及びvi）上記記載の量の適切なアジュバント、好ましくはCarbopol 971（ここでi）からiii）の成分の約90%は1μmより小さいサイズを有する）。さらに別の特徴にしたがえば、本免疫原性組成物は、さらに医薬として許容できる塩（好ましくはリン酸塩）を生理学的に許容できる濃度で含む。好ましくは前記免疫原性組成物のpHは、生理学的pH（約6.5から7.5の間を意味する）に調節される。
【００５９】
したがって、本発明はまた1mL当たり以下を含む免疫原性組成物に関する：i）少なくとも1.6μgの上記記載のPCV2 ORF2タンパク質、ii）前記PCV2 ORFタンパク質を発現するバキュロウイルスの少なくとも一部分、iii）細胞培養の一部分、iv）約2から8mMのBEI、v）BEIと等価量のチオ硫酸ナトリウム、及びvi）約1mgのCarbopol 971、及びvii）生理学的に許容できる濃度のリン酸塩（ここでi）からiii）の成分の約90%は1μmより小さいサイズを有し、さらに前記免疫原性組成物のpHは約6.5から7.5に調節される）。
免疫原性組成物はさらに1つ以上の他の免疫調節薬剤、例えばインターロイキン、インターフェロン又は他のサイトカインを含むことができる。免疫原性組成物はまたゲンタマイシン及びマーチオレートを含むことができる。本発明の関係で有用なアジュバント及び添加物の量及び濃度は当業者には容易に決定することができるが、本発明は、本ワクチン組成物の単位mL用量当たり約50μgから約2000μg、及び好ましくは約250μgのアジュバントを含む組成物を意図する。別の好ましい実施態様では、本発明は、約1μg/mLから約60μg/mLの抗生物質、より好ましくは約30μg/mL未満の抗生物質を含むワクチン組成物を意図する。
したがって、本発明はまた以下を含む免疫原性組成物に関する：i）好ましくは上記に記載の濃度にある、上記記載のPCV2 ORF2タンパク質のいずれか、ii）前記PCV2 ORFタンパク質を発現するウイルスベクターの少なくとも一部分、iii）細胞培養の一部分、iv）組換えウイルスベクターを不活化する不活化薬剤、好ましくはBEI、及びv）前記不活化薬剤によって仲介された不活化を停止させる中和剤、好ましくはBEIに対し等価量のチオ硫酸ナトリウム、vi）上記記載の量の適切なアジュバント、好ましくはCarbopol 971、vii）医薬として許容できる濃度の緩衝食塩水、好ましくはリン酸塩の緩衝食塩水、及びviii）抗微生物学的な活性を有する薬剤（ここでi）からiii）の成分の約90%は1μmより小さいサイズを有する）。
【００６０】
驚くべきことに、本明細書で提供される免疫原性組成物は24ヶ月にわたって極めて安定であることが判明した。さらにまた、本明細書で提供される免疫原性組成物（本明細書で提供される組換えバキュロウイルス発現PCV2 ORF2タンパク質を含む）は、PCV2感染に付随する臨床症状の緩和に非常に有効であることが見出された。驚くべきことに、本明細書で提供される組換えバキュロウイルス発現PCV2 ORF2タンパク質を含む免疫原性組成物は、不活化形の全PCV2ウイルス又は単離されたPCV2 ORF2抗原を含む免疫原性組成物よりも有効であることが見出された。特に、驚くべきことに、組換えバキュロウイルス発現PCV2 ORF2タンパク質は非常に低い濃度（0.25μg/用量までの濃度のものを意味する）で有効であることが見出された。PCV2 ORF2タンパク質のこの予期せぬ高い免疫原性潜在能力はCarbopolの追加によってさらに増強されえる。
さらに別の特徴は、本明細書で提供されるPCV2 ORF2タンパク質の免疫原性組成物の少なくとも1用量を含む容器に関し、この場合、1用量は少なくとも2μgのPCV2 ORF2タンパク質、好ましくは2−16μgのPCV2 ORF2タンパク質を含む。前記容器は1から250用量の免疫原性組成物を含むことができる。好ましくは、前記容器は1、10、25、50、100、150、200又は250用量のPCV2 ORF2タンパク質の免疫原性組成物を含む。好ましくは、1用量を超えるPCV2 ORF2タンパク質の免疫原性組成物を含む各容器は、さらに抗微生物学的活性を有する薬剤を含む。それらの薬剤は、例えばゲンタマイシン及びマーチオレートなどを含む抗生物質である。したがって、本発明のある特徴は、PCV2 ORF2タンパク質の免疫原性組成物の1から250用量（この場合1用量は少なくとも2μgのPCV2 ORF2タンパク質を含む）、及びゲンタマイシン及び／又はマーチオレート（好ましくは約1μg/mLから約60μg/mL、より好ましくは約30μg/mL未満の抗生物質）を含む容器に関する。
【００６１】
さらに別の特徴は、上記に記載の容器のいずれか及び取扱い説明書を含むキットに関し、前記説明書は、PCV2感染に付随する臨床症状の重篤度を緩和するために、PCV2 ORF2タンパク質の免疫原性組成物の少なくとも1用量を仔豚の筋肉内に適用するための情報を含む。さらにまた、さらに別の特徴にしたがえば、前記取扱い説明書は、PCV2 ORF2の免疫原性組成物の少なくとも1用量の第二回目の又は更なる投与に関する情報を含む。この場合、前記第二の投与又は任意の更なる投与は、最初の投与又はいずれかその前の投与から少なくとも14日後である。好ましくは、前記取扱い説明書はまた、免疫刺激物質を投与するための情報を含む。好ましくは、前記免疫刺激物質は少なくとも2回投与されるであろう。好ましくは、免疫刺激物質の第一回目と第二回目、又は任意の更なる投与の間隔は、少なくとも3日、より好ましくは少なくとも5日、さらに好ましくは少なくとも7日である。好ましくは、前記免疫刺激物質は、PCV2 ORF2タンパク質の免疫原性組成物の最初の投与から少なくとも10日、好ましくは15日、より好ましくは20日、さらに好ましくは少なくとも22日先である。好ましい免疫刺激物質は、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、好ましくは不完全フロイントのアジュバントで乳化されたもの（KLH/ICFA）である。しかしながら、当業者に公知のいずれの他の免疫刺激物質もまた使用することができることは理解されよう。本明細書で用いられる、“免疫刺激物質”とは、好ましくは特定の免疫応答（例えば特定の病原体に対する免疫応答）を開始又は増強することなく、一般的な免疫応答の引き金となりえる任意の薬剤又は組成物を意味する。さらに、適切な用量で免疫刺激物質を投与することもまた指示される。さらにまた、前記キットはまた、少なくとも1用量の免疫刺激物質、好ましくは1用量のKLH又はKLH/ICFAを含む容器を含む。
【００６２】
さらにまた、驚くべきことに、組換えバキュロウイルス発現PCV2 ORF2タンパク質（好ましくはCarbopolと併用されてある）を含む免疫原性組成物の免疫原性潜在能力は、IngelVac PRRS MLVワクチン（実施例5参照）の投与によってさらに増強されえることが見出された。PCV2の臨床症状及び病状は、PRRS感染が存在するときは極めて重篤化する。しかしながら、本明細書で提供される本免疫原性組成物及びワクチン接種法は、予想を超えて前記の影響を軽減した。換言すれば、予想に反する相乗作用が、動物（好ましくはブタ）を本明細書で提供される任意のPCV2 ORF2免疫原性組成物及びIngelvac PRRS MLVワクチン（Boehringer Ingelheim）で処置したときに観察された。
したがって、本発明のさらに別の特徴は、本明細書で提供されるPCV2 ORF2の免疫原性組成物及び取扱い説明書を含む上記に記載のキットに関し、この場合、前記取扱説明書は、PRRS抗原、好ましくはアジュバント添加PRRS抗原を含む免疫原性組成物と一緒に又はほぼ同じ頃にPCV2 ORF2免疫原性組成物を投与するための情報をさらに含む。好ましくは、前記PRRS抗原はIngelVac(登録商標)PRRS MLV（Boehringer Ingelheim）である。
本発明のさらに別の特徴はまた以下を含むキットに関する：i）本明細書で提供される少なくとも1用量のPCV2 ORF2の免疫原性組成物を含む容器、及びii）PRRS抗原、好ましくはアジュバント添加PRRS抗原を含む免疫原性組成物を含む容器。好ましくは、前記PRRS抗原はIngelVac(登録商標)RPPS MLV（Boehringer Ingelheim）である。より好ましくは、前記キットはさらに、両方の医薬組成物を投与するための情報を含む取扱説明書を含む。好ましくは、前記は、PCV2 ORF2含有組成物はPRRS含有組成物の前に一時的に投与されるという情報を含む。
さらに別の特徴は、本明細書で提供される組成物のいずれかの医薬としての、好ましくは獣医薬としての、より好ましくはワクチンとしての使用に関する。さらにまた、本発明はまた、PCV2感染に付随する臨床症状の重篤度を緩和するための医薬の製造を目的とする、本明細書に記載の組成物のいずれかの使用に関する。好ましくは、前記医薬はPCV2感染の予防、より好ましくはブタにおける予防を目的とする。
【００６３】
さらに別の特徴は、i）PCV2による感染又は再感染の予防、又はii）対象動物でPCV2により引き起こされる臨床症状の緩和又は排除を目的とする方法に関し、前記方法は、本明細書で提供される免疫原性組成物のいずれかをその必要がある対象動物に投与することを含む。好ましくは、対象動物はブタである。好ましくは、免疫原性組成物は筋肉内に投与される。好ましくは、免疫原性組成物の1用量又は2用量が投与され、この場合、1用量は、好ましくは少なくとも2μgのPCV2 ORF2タンパク質、より好ましくは約2から約16μg、及び少なくとも約0.1から約5mgのCarbopol、好ましくは約1mgのCarbopolを含む。さらに別の特徴は、免疫原性組成物の2回目の適用が実施される、上記に記載の処置方法に関する。好ましくは、この2回目の投与は、同じ免疫原性組成物、好ましくは同じ量のPCV2 ORF2タンパク質を有する組成物を用いて実施される。好ましくは、第2回目の投与もまた筋肉内に実施される。好ましくは、第2回目の投与は、最初の投与から少なくとも14日後に、より好ましくは最初の投与から少なくとも4週間後である。
さらに別の特徴にしたがえば、前記処置方法はまた免疫刺激物質の投与を含む。好ましくは、前記免疫刺激物質は少なくとも2回投与される。好ましくは、免疫刺激物質の1回目と2回目の投与の間隔は少なくとも3日、より好ましくは少なくとも5日、さらに好ましくは7日である。好ましくは、免疫刺激物質は、PCV2 ORF2免疫原性組成物の最初の投与後少なくとも10日、好ましくは15日、より好ましくは20日、さらに好ましくは少なくとも22日で投与される。好ましい免疫刺激物質は、例えばキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、なお好ましくは不完全フロイントアジュバントで乳化されたもの（KLH/ICFA）である。しかしながら、当業者に公知の他のいずれの免疫刺激物質も用いることができることは理解されよう。免疫刺激物質を適切な用量で投与することは当業者の一般的な知識の範囲内である。
更なる特徴にしたがえば、上記に記載の処置方法はまたPRRS抗原の投与を含む。好ましくは、PRRS抗原はIngelVac(登録商標) PRRS MLV（Boehringer Ingelheim）である。好ましくは、前記PRRS抗原は、PCV2 ORF2タンパク質の免疫原性組成物の投与後に一時的に投与される。
さらに別の特徴にしたがえば、本発明は多価混合ワクチンを提供する。前記ワクチンは、PCV2感染の発生率の減少又は前記の重篤度の緩和に有効な免疫学的作用物質、及びブタで別の疾患を起こす生物に対して免疫原性活性を有する少なくとも1つの成分を含む。
特に、PCV2感染の発生率の減少又は前記の重篤度の緩和に有効な免疫学的作用物質はPCV2抗原である。好ましくは、前記PCV2抗原は、本明細書で提供されるPCV2 ORF2タンパク質、又はPCV2 ORF2タンパク質を含む上記記載の任意の免疫原性組成物である。
【００６４】
しかしながら、PCV2抗原はまた、ブタに投与したとき、PCV2感染に対して免疫応答を誘発、刺激又は強化することができる少なくとも1つの抗原を含む物質の任意の組成物もまた指すことは本明細書により理解されよう。好ましくは、前記PCV2抗原は、全PCV2ウイルス（好ましくは不活化型の全PCV2ウイルス）、改変若しくは弱毒PCV2ウイルス、PCV2の少なくとも免疫原性アミノ酸配列を含むキメラウイルス、PCV2の少なくとも免疫原性アミノ酸配列を含む任意の他のポリペプチド若しくは成分である。本明細書で用いられる“免疫原性タンパク質”、“免疫原性ポリペプチド”又は“免疫原性アミノ酸配列”は、前記免疫原性タンパク質、免疫原性ポリペプチド又は免疫原性アミノ酸配列を含む病原体に対して宿主で免疫応答を誘引する任意のアミノ酸配列を指す。本明細書で用いられる“免疫原性タンパク質”、“免疫原性ポリペプチド”又は“免疫原性アミノ酸配列”には、任意のタンパク質の完全長の配列、その類似体又はその免疫原性フラグメントが含まれる。“免疫原性フラグメント”とは、1つ以上のエピトープを含み、したがって関連する病原体に対して免疫学的応答を誘引するフラグメントを指す。そのようなフラグメントは、当分野で周知の任意のエピトープマッピング技術を用いて特定することができる。例えば以下の文献を参照されたい：Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, vol.66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey。例えば、直鎖状エピトープは、固相上で多数のペプチド（タンパク質分子の部分に一致する）を同時に合成し、前記ペプチドが前記固相になお結合している間に抗体と反応させることによって決定することができる。そのような技術は当分野で公知であり、さらに例えば以下の文献に記載されている：米国特許4,708,871号；Geysen et al. (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:3998-4002；Geysen et al. (1986) Molec Immunol 23:709-715。同様に、形状的エピトープも、アミノ酸の空間的配座を例えばX-線結晶解析及び二次元核磁気共鳴により決定することによって特定される。例えば上掲書（Epitope Mapping Protocol）を参照されたい。合成抗原、例えばポリエピトープ、フランキングエピトープ及び他の組換え体又は合成により誘導された抗原もまた本定義内に含まれる。例えば以下を参照されたい:Bergmann et al. (1983) Eur J Immunol 23:2777-2781；Bergmann et al. (1996) J Immunol 157:3242-3249；A. Suhrbier (1997) Immunol and Cell Biol 75:402-408；Gardner et al. (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28-July 3, 1998。
【００６５】
さらに別の実施態様にしたがえば、前記PCV2抗原は、Ingelvac(登録商標) CircoFLEXTM（Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc. St Joseph, MO, USA）、CircoVac(登録商標)（Merial SAS, Lyon, France）、CircoVent（Intervet Inc. Millsboro, DE, USA）又はSuvaxyn PCV-2 One Dose(登録商標)（Fort Dodhe Animal Health, Kansas City, KA, USA）である。
組成物又はワクチンに対する“免疫学的又は免疫応答”は、問題の組成物又はワクチンに対する細胞性及び／又は抗体介在免疫応答の宿主での発生である。通常は、“免疫応答”には1つ以上の以下の作用が含まれる（ただしこれらに限定されない）：抗体、B細胞、ヘルパーT細胞、サプレッサーT細胞、及び／又は細胞傷害性T細胞及び／又はyd T細胞（問題の組成物又はワクチンに含まれる抗原に対して特異的に誘導される）の産生又は活性化。好ましくは、宿主は、新規感染に対する抵抗性が強化されるか、及び／又は当該症状の臨床的重篤度が緩和されるように、治療的又は予防的な免疫学的応答を示すであろう。そのような予防は、上記に記載したように宿主の感染に付随する症状の緩和又は欠如によって示されるであろう。
【００６６】
好ましくはブタで他の疾患を引き起こす生物が以下から成る群から選択される：アクチノバシルス・プリューロプニューモニア（Actinobacillus pleuropneumonia）（1）；アデノウイルス（2）；アルファウイルス、例えば東部ウマ脳炎ウイルス（3）；ボルデテーラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bronchiseptica）（4）；ブランキスピラ（Branchyspira）spp.（5）、好ましくはB.ヒオディエンテリエ（B. hyodyentheriae）；B.ピオシコリ（B. piosicoli）（7）；ブルセラ・スイス（Brucella suis）、好ましくはbiovars 1、2及び3（8）；古典的ブタ熱ウイルス（9）；クロストリジウム（Clostridium）spp.（10）、好ましくはCl.ディフィシル（Cl. difficile）（11）、Cl.パーフリンゲンス（perfringens）A、B及びC型（12）、Cl.ノーヴィ（novyi）（13）、Cl.セプチクム（septicum）（14）、破傷風菌（Cl. tetani）（15）；コロナウイルス（16）、好ましくはブタ呼吸器コロナウイルス（17）；エペリスロズーノーシス・スイス（Eperythrozoonosis suis）（18）；エリシペロトリクス・リシオパシエ（Erysipelothrix rhsiopathiae）（19）；大腸菌（Escherichia coli）（20）；ヘモフィルス・パラスイス（Haemophilus parasuis）、好ましくは1、7及び14亜型（21）；血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（22）；日本脳炎ウイルス（23）；ローソニア・イントラセルラーリス（Lawsonia intracellularis）（24）；レプトスピラ（Leptospira）spp.（25）、好ましくはレプトスピラ・アウストラリス（26）；レプトスピラ・カニコラ（L. canicola）（27）；レプトスピラ・グリッポチフォサ（L. grippotyphosa）（28）；L.イクテロヘモラジカエ（L. icterohaemorrhagicae）（29）；L.インテルロガンス（L. interrogans）（30）；L.ポモナ（L. Pomona）（31）；L.タラッソヴィー（L. tarassovi）（32）；マイコバクテリウムspp.（33）、好ましくはM.アヴィウム（M. avium）（34）、M.イントラセルラーレ（M. intracellulare）（35）及びM.ボビス（M. bovis）（36）；マイコプラズマ・ヒオプニューモニエ（M. hyo）（37）；パスツレラ・ムルトシーダ（Pasteurella multocida）（38）；ブタサイトメガロウイルス（39）；ブタパルボウイルス（40）；ブタ生殖器呼吸器症候群（PRRS）ウイルス（41）；仮性狂犬病ウイルス（42）；ロタウイルス（43）；サルモネラ（Salmonella）spp.（44）、好ましくはネズミチフス菌（S. thyhimurium）（45）及び豚コレラ菌（S. choleraesuis）（46）；スタフィロコッカス・ヒイクス（Staph. Hyicus）（47）；スタフィロコッカスspp.（48）、好ましくはストレプトコッカスspp.（49）、好ましくはStrep.スイス（50）；ブタヘルペスウイルス（51）；ブタインフルエンザウイルス（52）；ブタ天然痘ウイルス（53）；ブタ天然痘ウイルス（54）；水泡性口内炎ウイルス（55）ブタの水疱性発疹ウイルス（56）；レプトスピラ・ハルジョー（Leptospira Hardjo）（57）；及び／又はマイコプラズマ・ヒオシノヴィエ（58）。
以下におけるブタの病原体に関連する全ての言及は、病原体、例えばM. hyoの名を挙げるか、又は上記で見出される病原体の後ろの（）内の数字を挙げることによって行われる。例えばM. hyoについての言及はM. hyoによるか、又は（37）によって行われる。
【００６７】
したがって、本発明はブタの治療及び／又は予防のための混合ワクチンに関し、前記は、PCV2感染の発生率の減少又は前記の重篤度の緩和に有効な免疫学的作用物質（好ましくはPCV2抗原）、及び以下のブタの病原体［（1）、（2）、（3）、（4）、（5）、（6）、（7）、（8）、（9）、（10）、（11）、（12）、（13）、（14）、（15）、（16）、（17）、（18）、（19）、（20）、（21）、（22）、（23）、（24）、（25）、（26）、（27）、（28）、（29）、（30）、（31）、（32）、（33）、（34）、（35）、（36）、（37）、（38）、（39）、（40）、（41）、（42）、（43）、（44）、（45）、（46）、（47）、（48）、（49）、（50）、（51）、（52）、（53）、（54）、（55）、（56）、（57）及び／又は（58）］のいずれかによって起こる感染の治療及び／又は予防に有効なさらに別の免疫学的活性成分若しくは前記ブタ病原体の免疫学的活性成分を含む。［combo1］。
本明細書で用いられる、“免疫学的活性成分”は、前記成分が投与された動物で免疫応答を誘発又は刺激する成分を意味する。好ましい実施態様にしたがえば、前記免疫応答は、前記成分に対し又は前記成分を含む微生物に対して行われる。さらに好ましい実施態様にしたがえば、前記免疫学的活性成分は、弱毒微生物（改変生ウイルス（MLV）を含む）、死滅微生物又は微生物の少なくとも免疫学的活性部分である。
本明細書で用いられる、“微生物の免疫学的活性部分”は、当該成分が投与された動物で免疫応答を誘発又は刺激する少なくとも1つの抗原を含む、微生物のタンパク質-、糖-及び／又は糖タンパク質含有部分を意味する。好ましい実施態様にしたがえば、前記免疫応答は、微生物の前記免疫学的活性部分に対して、又は前記免疫学的活性部分を含む微生物に対して行われる。
好ましくは、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（41）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（41）の免疫学的活性成分である。
【００６８】
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（37）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（37）の免疫学的活性成分である。
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（1）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（1）の免疫学的活性成分である。
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（7）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（7）の免疫学的活性成分である。
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（24）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（24）の免疫学的活性成分である。
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（38）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（38）の免疫学的活性成分である。
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（21）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（21）の免疫学的活性成分である。
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（40）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（40）の免疫学的活性成分である。
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（2）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（2）の免疫学的活性成分である。
【００６９】
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（44）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（44）の免疫学的活性成分である。
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（50）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（50）の免疫学的活性成分である。
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（19）、好ましくは（20）及び／又は（21）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（19）、好ましくは（20）及び／又は（21）の免疫学的活性成分である。
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（22）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（22）の免疫学的活性成分である。
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（41）及び（37）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（41）及び（37）の免疫学的活性成分である。
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（1）及び（41）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（1）及び（41）の免疫学的活性成分である。
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（1）及び（37）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（1）及び（37）の免疫学的活性成分である。
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（1）、（41）及び（37）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（1）、（41）及び（37）の免疫学的活性成分である。好ましい形態では、本混合物はアジュバントとしてCarbopolが添加される。
【００７０】
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（1）及び（21）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（1）及び（21）の免疫学的活性成分である。
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（21）及び（41）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（1）及び（41）の免疫学的活性成分である。
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（21）及び（37）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（21）及び（37）の免疫学的活性成分である。
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（21）及び（38）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（21）及び（38）の免疫学的活性成分である。
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（7）及び（19）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（7）及び（19）の免疫学的活性成分である。
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（38）及び（33）、好ましくは（34）、（35）及び／又は（36）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（38）及び（33）、好ましくは（34）、（35）及び／又は（36）の免疫学的活性成分である。
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（49）好ましくは（50）、及び（21）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（49）好ましくは（50）及び、（21）の免疫学的活性成分である。
【００７１】
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（49）好ましくは（50）、（20）及び（21）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（49）好ましくは（50）、（20）及び（21）の免疫学的活性成分である。
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（49）好ましくは（50）、（20）及び（21）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（49）好ましくは（50）、（20）及び（21）の免疫学的活性成分である。
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（49）好ましくは（50）、（20）、（38）及び（21）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（49）好ましくは（50）、（20）、（38）及び（21）の免疫学的活性成分である。
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（49）好ましくは（50）、（20）、（33）及び（21）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（49）好ましくは（50）、（20）、（33）及び（21）の免疫学的活性成分である。
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（49）好ましくは（50）、（20）、（38）、（33）及び（21）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（49）好ましくは（50）、（20）、（38）、（33）及び（21）の免疫学的活性成分である。
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（41）、（40）及び（19）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（41）、（40）及び（19）の免疫学的活性成分である。
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（38）、（4）及び（19）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（38）、（4）及び（19）の免疫学的活性成分である。
【００７２】
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（38）、（4）、（21）及び（19）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（38）、（4）、（21）及び（19）の免疫学的活性成分である。
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（20）、好ましくは（20）、（31）及び（38）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（20）、（31）、（38）の免疫学的活性成分である。
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（5）、好ましくは（5）及び（24）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（5）及び（24）の免疫学的活性成分である。
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（1）、好ましくは（1）及び（5）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（1）及び（5）の免疫学的活性成分である。
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（41）、好ましくは（40）、（27）、（28）、（29）、（31）、（19）及び（57）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（41）、（40）、（27）、（28）、（29）、（31）、（19）及び（57）の免疫学的活性成分である。
別の特徴にしたがえば、［combo1］のさらに別の免疫学的活性成分は、ブタ病原体（6）、好ましくは（6）、（19）、（38）及び（58）によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効であるか、又はブタ病原体（1）及び（5）の免疫学的活性成分である。
【００７３】
さらに別の特徴にしたがえば、混合ワクチンのさらに別の免疫学的活性成分は、Enterisol(登録商標)Ileitis、Enterisol(登録商標)Ileitis FF、Enterisol(登録商標)SC-54、Enterisol(登録商標)SC-54 FF、Enterisol(登録商標)ERY-ALC、Ingelvac(登録商標)APP ALC、Ingelvac(登録商標)AR4、Ingelvac(登録商標)HP-1、Ingelvac(登録商標)HPE-1、Ingelvac(登録商標)M.hyo、Ingelvac(登録商標)PRRS MLV、Ingelvac(登録商標)PRRS ATP、Ingelvac(登録商標)PRV-G1、Reprocyc(登録商標)PRRS PLE、Reprocyc(登録商標)PLE、TetguardTM、Toxivac(登録商標)AD+E、Toxvac(登録商標)PLUS Parsuis（いずれもBoehringer Ingelheim（St. Joseph, MO, USA））；Circovent、Porcilis Coli、Porcilis ERY+PARVO、Porcilis Ery、Porcilis Glasser、Porcilis Parvo、Porcilis Porcoli DF、Porcilis APP、Porcilis AR-T、Porcilis AR-T DF、Porcilis Porcoli、Porcilis Porcoli Diluvac forte、Porcilis PRRS、Porcilis Porcol 5、Porcilis Aujeszky、Porcilis Begonia Diluvac、Porcilis Begonia I.D.A.L.、Porcilis Begonia Unisole、Porcilis M. hyo、Porcilis Atrinord、Myco Silencer(登録商標)BPM、Myco Silencer(登録商標)BPME、Myco Silencer(登録商標)ME、Myco Silencer(登録商標)M、Myco Silencer(登録商標)Once、Myco Silencer(登録商標)MEH、Rhinogen(登録商標)BPE、Rhinogen(登録商標)CTE 5000、Rhinogen(登録商標)CTSE、Score、Sow Bac(登録商標)E II、Sow Bac(登録商標)CE II、Sow Bac(登録商標)TREC、ProSystem(登録商標)CE、ProSystem(登録商標)RCE、ProSystem(登録商標)TREC、ProSystem(登録商標)Pillmune、ProSystem(登録商標)Rotamune(登録商標)にImugan(登録商標)II併用、ProSystem(登録商標)Rota、ProSystem(登録商標)Rotamune KV、ProSystem(登録商標)TG-Emune(登録商標)RotaにImugan(登録商標)II併用、ProSystem(登録商標)TGE/Rota、ProSystem(登録商標)TG-Emune(登録商標)にImugen(登録商標)併用、ProSystem(登録商標)TGE、MaGESTIC 7、MaGESTIC 8、MaGESTicTMにSpur(登録商標)併用、MaGESTic 7にSpur(登録商標)併用、MaGESTic 8にSpur(登録商標)併用、End-FLUence(登録商標)にImugen(登録商標)II併用、End-FLUence(登録商標)2、PRRomiSE(登録商標)、PRV-BegoniaにDiluvac Forte(登録商標)、Argus(登録商標)SC/ST、Strep Bac、Strep Bac(登録商標)にImugen(登録商標)II、Colisorb、Heptavac、Lambivac、Porcovac plus、Erysorb Parvo（いずれもIntervet Inc.（Millsboro, DE, USA））；Hyoresp、Circovac、Neocolipor、Parvoruvac、Parvosuin、Progressis、Viraflu、Akipor 6.3、Jespur gl-、Jesful gl-（いずれもMerial LTD（Duluth, GA））；ER BAC(登録商標)PLUS、ER BAC(登録商標)、ER BAC(登録商標)PLUS/LEPTOFERM-5(登録商標)、ER BAC(登録商標)Lptoferm-5(登録商標)、Farrowsure(登録商標)、Farrowsure(登録商標)B、FARROWSURE(登録商標)PLUS B、FARROWSURE(登録商標)PLUS、FARROWSURE(登録商標)PRV、FARROWSURE(登録商標)B-PRV、FLUSURETM、FLUSURETM RTU、FLUSURETM/ER BAC(登録商標)PLUS、FLUSURETM/ER BAC Plus(登録商標)、FLUSURETM/RESPISURE(登録商標)、FLUSURETM/RESPISURE(登録商標)RTU、FLUSURETM/RESPISURE-ONE(登録商標)/ER BAC(登録商標)PLUS、FLUSURETM/RespiSure 1 ONE(登録商標)/ER BAC Plus(登録商標)、FLUSURETM/RESPISURE ONE(登録商標)、FLUSURETM/RESPISURE 1 ONE(登録商標)、FLUSURE/Farrowsure Plus、FLUSURE/Farrowsure Plus B、LITTERGURD(登録商標)LT-C、LITTERGURD(登録商標)LT、PleuroGuard(登録商標)4、Pneumosuis III、Stellamune One、Stellamune Uno、Stellamune Once、Stellamune Mono、Stellamune Mycoplasma、Respisure One、Respisure(登録商標)、Respisure 1 ONE(登録商標)、Respisure 1 One(登録商標)/ER Bac Plus(登録商標)、Enduracell T、Zylexis（以前にはBaypamuneとして知られていた）、Atrobac(登録商標)3、BratiVac(登録商標)、BratiVac(登録商標)-B、Leptoferm-5TM、Parvo-Vac(登録商標)/Leptoferm-5(登録商標)、PR-Vac(登録商標)-Killed、PR-Vac(登録商標)、PR-Vac PlusTM（いずれもPfizer Inc.（New York, NY, USA））；Suvaxyn MH One、Suvaxyn RespiFend(登録商標)MH、Suvaxyn Mycoplasma、Suvaxyn Aujeszky Bartha+Diluent、Suvaxyn Aujeszky Bartha+o/w、Suvaxyn Aujeszky-Flu、Suvaxyn Aujeszky 783+o/w、Suvaxyn Ery、Suvaxyn Flu、Suvaxyn M.hyo、Suvaxyn MH-One、Suvaxyn Parvo ST、Suvaxyn Parvo/E、Suvaxyn RespiFend(登録商標)APP、Suvaxyn RespiFend(登録商標)HPS、Suvaxyn RespiFend(登録商標)MH/HPS、Suvaxyn RespiFend(登録商標)MH、Suvaxyn(登録商標)AR/T/E、Suvaxyn(登録商標)EC-4、Suvaxyn(登録商標)E、Suvaxyn(登録商標)-E、Suvaxyn(登録商標)E-oral、Suvaxyn(登録商標)PLE、Suvaxyn(登録商標)PLE/PrV gpl-、Suvaxyn(登録商標)LE+B、Suvaxyn(登録商標)PLE+B、Suvaxyn(登録商標)PLE+B/PrV gpl-、Suvaxyn(登録商標)SIV、Suvaxyn(登録商標)SIV/Mh-one、Suvaxyn(登録商標)P、Suvaxyn(登録商標)PrV gpl-、Suvaxyn(登録商標)PCV-2 One Shot（いずれもFort Dodge Animal Health（Overland Park, KS, USA, Wyeth））；SCOURMUNE(登録商標)、SCOURMUNE(登録商標)-C、SCOURMUNE(登録商標)-CR、AP-PAC(登録商標)-PD+ER、AP-PARAPAC(登録商標)+ER、M+Rhusigen(登録商標)、M+PAC(登録商標)、MaxiVac Excell(登録商標)3、MaxiVac(登録商標)H1N1、MaxiVac(登録商標)H3N2、MaxiVac(登録商標)-FLU、MaxiVac(登録商標)-M+、MaxiVac Excell(登録商標)、MaxiVac Excell 3、PARAPAC(登録商標)、PNEU PAC(登録商標)、PNEU PAC(登録商標)-ER、PNEU PAC(登録商標)+ER、PRV/Marker Gold(登録商標)、PRV/Marker Gold(登録商標)、PRV/Marker Gold(登録商標)-MaxiVac(登録商標)FLU、RhusigenTM、Gletvax 6、Covexin 8、M+PAC、Gletvax plus、M-ParapacTMSS PAC(登録商標)（いずれもSchering-Plough Animal Health Corporation（Kenilworth, NJ, USA））；AMERVAC-PRRS、AUSKIPRA-BK、AUSKIPRA-GN、COLISUIN-CL、COLISUIN-TP、ERYSIPRAVAC、GRIPORK、HIPRASUIS-GLASSER、MYPRAVAC SUIS、NEUMOSUIN、PARVOSUIN、PARVOSUIN-MR、PARVOSUIN-MR/AD、RINIPRAVAC-DT、SUIPRAVAC-PRRS、SUIPRAVAC-RC、TOXIPRA PLUS（いずれもLaboratorios Hipra S.A. Amer.（Girona, Spain））；Clostricol、Coliporc Plus、Haeppovac、Per-C-Porc、Porciparvac、RESPIPORC ART+EP、RESPIRORC FLU、Respiporc M. HYO 1 SHOT、Rhusiovac、Rotlauf-Lebendimpfstoff、Salmoporc、Suisaloral、AK-vac MK35（いずれもIDT Impfstoffwerk DessaTornau（Tornau, Germany））；Mypravac Suis（Albrecht GmbH, Germany）；Haemo Shield(登録商標)P、Parapleuro Shield(登録商標)P、Parapleuro Shield(登録商標)P+BE、Rhinicell(登録商標)FD、Rhini ShieldTM TX4、Prefarrow Shield(登録商標)9、Prefarrow Strep Shield(登録商標)、Clostratox(登録商標)BCD、Clostratox(登録商標)C、Clostratox(登録商標)Ultra C 1300、Porcine Ecolizer(登録商標)3+C、Porcine Pili ShieldTM＋C、Porcine Pili ShieldTM Porcine Ecolizer(登録商標)3、Ery SerumTM Ery ShieldTMEry Vac Oral、Ery ShieldTM ＋L5、PanSTARTM Ery、ErycellTMParvo Shield(登録商標)E、Parvo Shield(登録商標)L5E、Parvo Shield(登録商標)L5、Parvo Shield(登録商標)、Para Shield(登録商標)、PneumoSTAR SIV、PneumoSTARTM Myco、Lepto ShieldTM 5、Myco ShieldTMSalmo Shield(登録商標)2、Salmo Shield(登録商標)Live、Amitox TetTMC. Perfringens Type A Toxoid（いずれもNovartis Animal Health（Basel, Switzerland））；Nitro-Sal（Akro）、又は上記記載の組成物に含まれる任意の抗原から成る群から選択される。また別には、PCV2抗原がこれらワクチンのいずれかに既に存在するときは、（i）本明細書に記載のPCV2抗原がこれら組成物／抗原のいずれかに添加されるか、又は（ii）これらワクチンのいずれかに存在するPCV2抗原は、本明細書に記載のPCV2抗原で置き換えられる。
【００７４】
さらに別の特徴にしたがえば、本混合ワクチンのさらに別の免疫学的活性成分は、Enterisol(登録商標)Ileitis、Enterisol(登録商標)Ileitis FF、Enterisol(登録商標)SC-54、Enterisol(登録商標)SC-54 FF、Enterisol(登録商標)ERY-ALC、Ingelvac(登録商標)APP ALC、Ingelvac(登録商標)AR4、Ingelvac(登録商標)HP-1、Ingelvac(登録商標)HPE-1、Ingelvac(登録商標)M.hyo、Ingelvac(登録商標)PRRS MLV、Ingelvac(登録商標)PRRS ATP、Ingelvac(登録商標)PRV-G1、Reprocyc(登録商標)PRRS PLE、Reprocyc(登録商標)PLE、TetguardTM、Toxivac(登録商標)AD+E、Toxivac(登録商標)PLUS Parsuis（いずれもBoehringer Ingelheim（St. Joseph, MO, USA））；Circovent、Porcilis Coli、Porcilis ERY+PARVO、Porcilis Ery、Porcilis Glasser、Porcilis Parvo、Porcilis Porcoli DF、Porcilis APP、Porcilis AR-T、Porcilis AR-T DF、Porcilis Porcoli、Porcilis Porcoli Diluvac forte、Porcilis PRRS、Porcilis Porcol 5、Porcilis Aujeszky、Porcilis Begonia Diluvac、Porcilis Begonia I.D.A.L.、Porcilis Begonia Unisole、Porcilis M. hyo、Porcilis Atrinord、Myco Silencer(登録商標)BPM、Myco Silencer(登録商標)BPME、Myco Silencer(登録商標)ME、Myco Silencer(登録商標)M、Myco Silencer(登録商標)Once、Myco Silencer(登録商標)MEH、Rhinogen(登録商標)BPE、Rhinogen(登録商標)CTE 5000、Rhinogen(登録商標)CTSE、Score、Sow Bac(登録商標)E II、Sow Bac(登録商標)CE II、Sow Bac(登録商標)TREC、ProSystem(登録商標)CE、ProSystem(登録商標)RCE、ProSystem(登録商標)TREC、ProSystem(登録商標)Pillmune、ProSystem(登録商標)Rotamune(登録商標)にImugan(登録商標)II併用、ProSystem(登録商標)Rota、ProSystem(登録商標)Rotamune KV、ProSystem(登録商標)TG-Emune(登録商標)RotaにImugan(登録商標)II併用、ProSystem(登録商標)TGE/Rota、ProSystem(登録商標)TG-Emune(登録商標)にImugen(登録商標)併用、ProSystem(登録商標)TGE、MaGESTIC 7、MaGESTIC 8、MaGESTicTMにSpur(登録商標)併用、MaGESTic 7にSpur(登録商標)併用、MaGESTic 8にSpur(登録商標)併用、End-FLUence(登録商標)にImugen(登録商標)II併用、End-FLUence(登録商標)2、PRRomiSE(登録商標)、PRV-BegoniaにDiluvac Forte(登録商標)、Argus(登録商標)SC/ST、Strep Bac、Strep Bac(登録商標)にImugen(登録商標)II、Colisorb、Heptavac、Lambivac、Porcovac plus、Erysorb Parvo（いずれもIntervet Inc.（Millsboro, DE, USA））；Hyoresp、Circovac、Neocolipor、Parvoruvac、Parvosuin、Progressis、Viraflu、Akipor 6.3、Jespur gl-、Jesful gl-（いずれもMerial LTD（Duluth, GA））；ER BAC(登録商標)PLUS、ER BAC(登録商標)、ER BAC(登録商標)PLUS/LEPTOFERM-5(登録商標)、ER BAC(登録商標)Lptoferm-5(登録商標)、Farrowsure(登録商標)、Farrowsure(登録商標)B、FARROWSURE(登録商標)PLUS B、FARROWSURE(登録商標)PLUS、FARROWSURE(登録商標)PRV、FARROWSURE(登録商標)B-PRV、FLUSURETM、FLUSURETM RTU、FLUSURETM/ER BAC(登録商標)PLUS、FLUSURETM/ER BAC Plus(登録商標)、FLUSURETM/RESPISURE(登録商標)、FLUSURETM/RESPISURE(登録商標)RTU、FLUSURETM/RESPISURE-ONE(登録商標)/ER BAC(登録商標)PLUS、FLUSURETM/RespiSure 1 ONE(登録商標)/ER BAC Plus(登録商標)、FLUSURETM/RESPISURE ONE(登録商標)、FLUSURETM/RESPISURE 1 ONE(登録商標)、FLUSURE/Farrowsure Plus、FLUSURE/Farrowsure Plus B、LITTERGURD(登録商標)LT-C、LITTERGURD(登録商標)LT、PleuroGuard(登録商標)4、Pneumosuis III、Stellamune One、Stellamune Uno、Stellamune Once、Stellamune Mono、Stellamune Mycoplasma、Respisure One、Respisure(登録商標)、Respisure 1 ONE(登録商標)、Respisure 1 One(登録商標)/ER Bac Plus(登録商標)、Enduracell T、Zylexis（以前にはBaypamuneとして知られていた）、Atrobac(登録商標)3、BratiVac(登録商標)、BratiVac(登録商標)-B、Leptoferm-5TM、Parvo-Vac(登録商標)/Leptoferm-5(登録商標)、PR-Vac(登録商標)-Killed、PR-Vac(登録商標)、PR-Vac PlusTM（いずれもPfizer Inc.（New York, NY, USA））；Suvaxyn MH One、Suvaxyn RespiFend(登録商標)MH、Suvaxyn Mycoplasma、Suvaxyn Aujeszky Bartha+Diluent、Suvaxyn Aujeszky Bartha+o/w、Suvaxyn Aujeszky-Flu、Suvaxyn Aujeszky 783+o/w、Suvaxyn Ery、Suvaxyn Flu、Suvaxyn M.hyo、Suvaxyn MH-One、Suvaxyn Parvo ST、Suvaxyn Parvo/E、Suvaxyn RespiFend(登録商標)APP、Suvaxyn RespiFend(登録商標)HPS、Suvaxyn RespiFend(登録商標)MH/HPS、Suvaxyn RespiFend(登録商標)MH、Suvaxyn(登録商標)AR/T/E、Suvaxyn(登録商標)EC-4、Suvaxyn(登録商標)E、Suvaxyn(登録商標)-E、Suvaxyn(登録商標)E-oral、Suvaxyn(登録商標)PLE、Suvaxyn(登録商標)PLE/PrV gpl-、Suvaxyn(登録商標)LE+B、Suvaxyn(登録商標)PLE+B、Suvaxyn(登録商標)PLE+B/PrV gpl-、Suvaxyn(登録商標)SIV、Suvaxyn(登録商標)SIV/Mh-one、Suvaxyn(登録商標)P、Suvaxyn(登録商標)PrV gpl-、Suvaxyn(登録商標)PCV-2 One Shot（いずれもFort Dodge Animal Health（Overland Park, KS, USA, Wyeth））；SCOURMUNE(登録商標)、SCOURMUNE(登録商標)-C、SCOURMUNE(登録商標)-CR、AP-PAC(登録商標)-PD+ER、AP-PARAPAC(登録商標)+ER、M+Rhusigen(登録商標)、M+PAC(登録商標)、MaxiVac Excell(登録商標)3、MaxiVac(登録商標)H1N1、MaxiVac(登録商標)H3N2、MaxiVac(登録商標)-FLU、MaxiVac(登録商標)-M+、MaxiVac Excell(登録商標)、MaxiVac Excell 3、PARAPAC(登録商標)、PNEU PAC(登録商標)、PNEU PAC(登録商標)-ER、PNEU PAC(登録商標)+ER、PRV/Marker Gold(登録商標)、PRV/Marker Gold(登録商標)、PRV/Marker Gold(登録商標)-MaxiVac(登録商標)FLU、RhusigenTM、Gletvax 6、Covexin 8、M+PAC、Gletvax plus、M-ParapacTMSS PAC(登録商標)（いずれもSchering-Plough Animal Health Corporation（Kenilworth, NJ, USA））；AMERVAC-PRRS、AUSKIPRA-BK、AUSKIPRA-GN、COLISUIN-CL、COLISUIN-TP、ERYSIPRAVAC、GRIPORK、HIPRASUIS-GLASSER、MYPRAVAC SUIS、NEUMOSUIN、PARVOSUIN、PARVOSUIN-MR、PARVOSUIN-MR/AD、RINIPRAVAC-DT、SUIPRAVAC-PRRS、SUIPRAVAC-RC、TOXIPRA PLUS（いずれもLaboratorios Hipra S.A. Amer.（Girona, Spain））；Clostricol、Coliporc Plus、Haeppovac、Per-C-Porc、Porciparvac、RESPIPORC ART+EP、RESPIRORC FLU、Respiporc M. HYO 1 SHOT、Rhusiovac、Rotlauf-Lebendimpfstoff、Salmoporc、Suisaloral、AK-vac MK35（いずれもIDT Impfstoffwerk DessaTornau（Tornau, Germany））；Mypravac Suis（Albrecht GmbH, Germany）；Haemo Shield(登録商標)P、Parapleuro Shield(登録商標)P、Parapleuro Shield(登録商標)P+BE、Rhinicell(登録商標)FD、Rhini ShieldTM TX4、Prefarrow Shield(登録商標)9、Prefarrow Strep Shield(登録商標)、Clostratox(登録商標)BCD、Clostratox(登録商標)C、Clostratox(登録商標)Ultra C 1300、Porcine Ecolizer(登録商標)3+C、Porcine Pili ShieldTM＋C、Porcine Pili ShieldTM Porcine Ecolizer(登録商標)3、Ery SerumTM Ery ShieldTMEry Vac Oral、Ery ShieldTM ＋L5、PanSTARTM Ery、ErycellTMParvo Shield(登録商標)E、Parvo Shield(登録商標)L5E、Parvo Shield(登録商標)L5、Parvo Shield(登録商標)、Para Shield(登録商標)、PneumoSTAR SIV、PneumoSTARTM Myco、Lepto ShieldTM 5、Myco ShieldTMSalmo Shield(登録商標)2、Salmo Shield(登録商標)Live、Amitox TetTMC. Perfringens Type A Toxoid（いずれもNovartis Animal Health（Basel, Switzerland））；Nitro-Sal（Akro）、又は上記記載の組成物に含まれる任意の抗原から成る群から選択される。また別には、PCV2抗原がこれらワクチンのいずれかに既に存在するときは、（i）本明細書に記載のPCV2抗原がこれら組成物／抗原のいずれかに添加されるか、又は（ii）これらワクチンのいずれかに存在するPCV2抗原は、本明細書に記載のPCV2抗原で置き換えられる。
【００７５】
処方物
本発明の重要な特徴は混合ワクチンの製造である。前記組成物に混合することができるさらに別の成分を当業者は理解していよう（さらにまた以下の文献を参照されたい:Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed. Mack Publ. Easton）。熟練者は、公知の注射可能で生理学的に許容しえる無菌的溶液を使用することができる。非経口注射又は輸液用の即席溶液を調製するために、等張水溶液（例えば食塩水又は対応する血漿タンパク質溶液）を容易に入手することができる。医薬組成物は凍結乾燥調製物又は乾燥調製物として提供しえる。前記調製物は、例えば複数の部分を含むキットとして、無菌的条件下で使用直前に公知の注射可能な溶液を用いて再構成することができる。
さらにまた、本発明の免疫原性組成物及びワクチン組成物は獣医分野で許容できる1つ以上の担体を含むことができる。本明細書で用いられる、“獣医分野で許容できる担体”には任意の及び全ての溶媒、分散剤、媒体、コーティング、アジュバント、安定化剤、稀釈剤、保存料、抗菌及び抗カビ剤、等張剤、吸着延長剤などが含まれる。
稀釈剤には水、食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどが含まれえる。等張剤には、とりわけ塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースが含まれえる。安定化剤には、とりわけアルブミン及びエチレンジアミン四酢酸のアルカリ塩が含まれる。
好ましいアジュバントは上記に記載のものである。免疫原性組成物はさらに1つ以上の他の免疫調節薬剤、例えばインターロイキン、インターフェロン又は他のサイトカインを含むことができる。免疫原性組成物はまたゲンタマイシン及びマーチオレートを含むことができる。本発明の関係で有用なアジュバント及び添加物の量及び濃度は当業者には容易に決定することができるが、本発明は、本ワクチン組成物の単位mL用量当たり約50μgから約2000μg、及び好ましくは約250μgのアジュバントを含む組成物を意図する。別の好ましい実施態様では、本発明は、約1μg/mLから約60μg/mLの抗生物質、より好ましくは約30μg/mL未満の抗生物質を含むワクチン組成物を意図する。
さらに別の実施態様にしたがえば、本混合ワクチンは最初に脱水される。したがってワクチン接種前に組成物が他の方法によって凍結乾燥又は脱水される場合には、前記組成物は、水性（例えば食塩水、PBS（リン酸緩衝食塩水））又は非水性溶液（例えばオイルエマルジョン（鉱物油又は植物／代謝性油系／単一又は二重エマルジョン系）、アルミニウム系、カルボマー系アジュバント）中で再水和される。
【００７６】
用量及び投与
本発明にしたがえば、ブタに投与される有効量の混合ワクチンは、PCV2及び上記に挙げた少なくとも1つのさらに別の病原体によって引き起こされる微生物学的感染に対して有効な免疫を提供する。ブタの微生物学的疾患の治療及び予防について好ましい抗原の組合せは上記に列挙されている。
さらに別の実施態様にしたがえば、混合ワクチンは約2から4週間の間隔で1回以上ブタに投与される。例えば、最初の投与は、動物が約2−3週齢から約8週齢のときに実施される。第2回目の投与は、最初のワクチン接種の第1回目の投与から約１週間から4週間後に実施される。さらに別の実施態様にしたがえば、再ワクチン接種は、第2回目の投与後3から12ヶ月の間隔で実施される。その後のワクチン投与は好ましくは6ヶ月から1年毎に実施される。別の好ましい実施態様では、約2から3週齢前にワクチン接種された動物は再ワクチン接種される。その後のワクチン接種は好ましくは１年毎に実施される。
有効な混合ワクチンの量は、ワクチンの成分及び投与スケジュールに左右される。典型的には、不活化ウイルス又は改変生ウイルス調製物が混合ワクチンで用いられるときは、約102から約109 TCID50/用量、好ましくは約103から約108 TCID50/用量、より好ましくは約104から約108 TCID50/用量を含むワクチンの量が用いられる。一般的には、不活化抗原は、通常は生改変ウイルスよりも大量で用いられる。典型的には混合ワクチンで細菌抗原が用いられるときは、約103から約109 コロニー形成単位(CFU)/用量、好ましくは約104から約108 (CFU)/用量、より好ましくは約105から約106 (CFU)/用量の量を含むワクチンが用いられる。サブユニットワクチンは、通常は、少なくとも0.2μg抗原/用量、好ましくは約0.2から約400μg/用量、より好ましくは約0.3から約200μg/用量、さらに好ましくは約0.35から約100μg/用量、さらに好ましくは約0.4から約50μg/用量、さらに好ましくは約0.45から約30μg/用量、さらに好ましくは約0.6から約15μg/用量、さらに好ましくは約0.75から約8μg/用量、さらに好ましくは約1.0から約6μg/用量、さらに好ましくは約1.3から約3.0μg/用量の抗原含有レベルで投与される。例えば、PCV ORF2抗原、好ましくは本明細書で提供されるPCV2 ORF2タンパク質の抗原含有レベルは、約2μgから約150μg、好ましくは約2μgから約60μg、さらに好ましくは約2μgから約50μg、さらに好ましくは約2μgから約40μg、さらに好ましくは約2μgから約30μg、さらに好ましくは約2μgから約25μg、さらに好ましくは約2μgから約20μg、さらに好ましくは約4μgから約20μg、さらに好ましくは約4μgから約16μgである。（37）を含む混合ワクチンの場合には、少なくとも1から10 log、より好ましくは5−10 log、もっとも好ましくは6−8 logを用いることが好ましい。（41）を含む混合ワクチンの場合には、少なくとも1から10 log、より好ましくは3−10 log、もっとも好ましくは5−6 logを用いることが好ましい。
本発明の組成物は、皮内、気管内、又は膣内に適用することができる。好ましくは、本組成物は筋肉内又は鼻内に適用することができる。動物体においては、上記に記載の医薬組成物を静脈内注射によって、又は標的組織に直接注射することによって適用することが有利であることが証明することができる。全身投与のためには、静脈内、血管内、筋肉内、鼻内、銅若内、腹腔内、経口、又は気管内ルートが好ましい。より局所的な適用は、皮下、表皮内、皮内、心内、肺葉内、骨髄内、肺内に、又は治療するべき組織（結合組織、骨組織、筋肉組織、神経組織、上皮組織）に直接若しくはその近くに実施することができる。所望される治療期間及び効果に応じて、本発明の組成物は1回又は数回、さらにまた間歇的に、例えば1日1回数日間、数週間又は数ヶ月、及び種々の用量で投与することができる。
【００７７】
治療方法
本発明のさらに別の重要な実施態様は、PCV2及び1つ以上のブタの病原性微生物によって起きる疾患の予防又は治療方法である。前記方法では、PCV2抗原、好ましくは本明細書で提供されるPCV2 ORF2タンパク質、及び前記のさらに別のブタの病原性微生物によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効なさらに別の免疫学的活性成分が、その必要がある動物に適切な用量で投与される。さらに別の特徴にしたがえば、前記PCV2 ORF2タンパク質は上記に記載の抗原性組成物の部分である。したがって、本発明のさらに別の特徴は、本明細書で提供される抗原性組成物のいずれかを含み、さらにPCV2 ORF2タンパク質及び前記さらに別のブタの病原性微生物によって引き起こされる感染の治療及び／又は予防に有効な別の免疫学的活性成分を含む混合ワクチンに関する。
以下の実施例は、本発明にしたがって好ましい材料及び方法を説明する。しかしながら、これらの実施例は例示としてのみ提供され、それらのいずれも本発明の全体的範囲を制限するものと解釈してはならない。
【実施例】
【００７８】
実施例１
この実施例では、本発明の方法を用いるORF2の相対的収量が従来技術で知られている方法と比較される。4000mLのスピンナーフラスコの各々に300mLの無血清昆虫培養液Excell 420（JRH Biosciences, Inc., Lenexa, KS）中のSf+細胞（約1.0ｘ106/mL）を播種した。マスター細胞培養は、SF+（Spodoptera frugiperda）マスター細胞ストック（19継代、Lot#N112−095W）と確認する。SF+マスター細胞ストックを作成するために用いられる細胞は業者から入手した（Protein Sciences Corporation, Inc., Meriden, CT）。本実施例のためのSF+細胞株は、19継代から59継代に限った。前記以外の継代も本発明の目的のために機能するであろうが、大規模製造用プロセスにスケールアップするために、少なくとも19継代がおそらく必要であり、59継代を超える継代は発現に影響を有するかもしれない（ただしこれは精査したわけではない）。より詳細に述べれば、液体窒素保存の最初のSF+細胞培養をExcell420培養液にて懸濁状態で、無菌的スピンナーフラスコで定常的に攪拌しながら増殖させた。培養を100mLから250mLのスピンナーフラスコで25から150mLのExcell420無血清培養液で増殖させた。前記細胞が1.0−8.0ｘ106細胞/mLの細胞密度に増殖したとき、それらを0.5−1.5ｘ106細胞/mLの播種密度で新しい容器に分割した。その後の拡大培養は、36リットルまでスピンナーフラスコで、又は300リットルまでステンレススチールバイオリアクターで2−7日間、25−29℃で増殖させた。
播種後、フラスコを4時間27℃でインキュベートした。続いて、PCV2 ORF2遺伝子（配列番号:4）を含む組換えバキュロウイルスを各フラスコに接種した。PCV2 ORF2遺伝子を含む組換えバキュロウイルスは以下のように作成した：PCV2の北アメリカ株のPCV2 ORF2遺伝子を増幅させて、5'コザック配列（配列番号:1）及び3'EcoRI部位（配列番号:2）を含むようにし、pGEM-T-Easyベクター（Promega, Madison, WI）においてクローニングした。続いて前記を切り出し、トランスファーベクターpVL1392（BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA）においてサブクローニングした。PCV2 ORF2遺伝子を含むpVL1392プラスミドをN47-064Yと呼び、続いてBaculoGold(登録商標)（BD Biosciences Pharmingen）バキュロウイルスDNAとともにSf+昆虫細胞（Protein Sciences, Meriden, CT）にコトランスフェクトして、PCV2 ORF2遺伝子を含む組換えバキュロウイルスを作成した。この新規構築物は、本明細書では配列番号:8として提供される。PCV2 ORF2遺伝子を含む組換えバキュロウイルスをプラーク-精製し、マスター種ウイルス（MSV）をSF+細胞株で増殖させ、小分けにして-70℃で保存した。MSVは、バキュロウイルス特異的プライマーを用いPCR-RFLPによってPCV2 ORF2バキュロウイルスであると確信した。MSV又は作業用種ウイルスを生成するためにPCV2 ORF2バキュロウイルスを感染させた昆虫細胞は、ポリクローナル血清又はモノクローナル抗体によって関節蛍光抗体アッセイで検出されるPCV2 ORF2抗原を発現する。さらにまた、PCV2 ORF2バキュロウイルスの実体はN-末端アミノ酸配列決定によって確認された。PCV2 ORF2バキュロウイルスMSVはまた、9C.F.R.113.27(c)、113.28及び113.55にしたがい純度について検査した。回転フラスコに接種した各組換えバキュロウイルスは種々の感染多重度（MOI）を有していた。フラスコ1には0.88MOIで7.52mLの種を接種し、フラスコ2には0.36MOIで3.01mLの種を接種し、フラスコ3には0.18MOIで1.5mLの種を接種し、さらにフラスコ4には0.09MOIで0.75mLの種を接種した。PCV2 ORF2組換えバキュロウイルスの構築に用いた基本的工程を示す工程模式図が本明細書に図1として提供されている。バキュロウイルスを接種した後、続いてフラスコを27±2℃で7日間インキュベートし、さらにその間100rpmで攪拌した。フラスコには通気キャップを用い空気の流通を可能にした。次の7日間、各フラスコから24時間毎にサンプルを採取した。採取後、各サンプルを遠心し、ペレットと上清の両方を分離し続いて0.45−1.0μmのポアサイズの膜でろ過した。
【００７９】
続いて、得られたサンプルでその中に存在するORF2の量をELISAアッセイにより定量した。ELISAアッセイは、0.05Mの炭酸緩衝液（pH9.6）で1：6000に稀釈した捕捉抗体、ブタ抗PCV2 Pab IgGプロテインG精製（PBSにて1：250に稀釈）を用いて実施した。100μLの抗体をマイクロタイタープレートのウェルに入れ、密封して37℃で一晩インキュベートした。続いてプレートを洗浄溶液（0.5mLのトゥイーン20（Sigma, St. Louis, MO）、100mLの10ｘD-PBS（Gibco Invitrogen, Carlsbad, CA）及び899.5mLの蒸留水を含む）で3回洗浄した。続いて、250μLのブロッキング溶液（10mLのD-PBS QS中の5gのカーネーション無脂肪ドライミルク（Nestle, Glendale, CA）を100mLの蒸留水に添加）を各ウェルに添加した。次の工程は検査プレートの洗浄及び前稀釈抗原の添加であった。前稀釈抗原は、200μLの稀釈溶液（999.5mLのD-PBSに0.5mLのトゥイーン20）を稀釈プレートの各ウェルに添加することにより作成した。続いてサンプルを1：240比及び1：480比に稀釈し、これら稀釈サンプルの各々100μLを前記稀釈プレートの最上段のウェルの1つに添加した（すなわち、最上段の1つのウェルは1：240希釈の100μLを受けとり、他のものは1：480希釈の100μLを受けとった）。続いて、連続する各ウェルから100μLを取り出し、プレートの次のウェルに移すことによって、前記プレートの残りについて連続稀釈を作成した。検査プレートの洗浄は洗浄緩衝液による3回のプレート洗浄を含んでいた。続いてプレートを密封し、37℃で1時間インキュベートした後、さらに3回洗浄緩衝液で洗浄した。使用した検出抗体はPCV ORF2に対するモノクローナル抗体であった。前記を稀釈溶液で1：300に稀釈し、前記稀釈した検出抗体の100μLをウェルに添加した。続いてプレートを密封し、37℃で1時間インキュベートした後、洗浄緩衝液で3回洗浄した。正常ウサギ血清（Jackson Immunoresearch, West Grove, PA）を稀釈溶液に1%の濃度で添加することによって、コンジュゲート希釈液を調製した。コンジュゲート抗体、ヤギ抗マウス(H+1)-HRP（Jackson Immunoresearch）を前記コンジュゲート希釈液で1：10,000に稀釈した。続いて、稀釈したコンジュゲート抗体の100μLを各ウェルに添加した。続いてプレートを密封し37℃で45分間インキュベートしてから洗浄緩衝液で3回洗浄した。等体積のペルオキシダーゼ基質B（KPL）と混合した基質（TMB Peroxidase Substrate, Kirkgaard and Perry Laboratories (KPL), Gaithersberg, MD）の100μLを各ウェルに添加した。このプレートを室温で15分間インキュベートした。続いて1NのHCl溶液100μLを全てのウェルに添加して反応を停止させた。プレートをELISAリーダーで読み取った。このアッセイの結果は下記の表1に提供される。
【００８０】
表1
0005394750.tif 000002
【００８１】
これらの結果は、インキュベーション時間が長くなるとき、遠心細胞及び媒体の上清中へのORF2の発現は遠心細胞及び媒体のペレットでの発現よりも大きくなることを示している。したがって、発現を5日未満進行させて細胞からORF2を回収するのではなくて、ORF2発現を少なくとも5日間進行させ上清でORF2を回収する方が、ORF2収量の大きな増加及び従来技術を超える顕著な改良を提供する。
【００８２】
実施例２
この実施例は、本明細書で主張する本発明の有効性に関するデータを提供する。1000mLのスピンナーフラスコに300mLのExcell420培養液中のSF+細胞（ほぼ1.0ｘ106細胞/mL）を播種した。続いてこのフラスコを100rpmで攪拌し27℃でインキュベートした。その後、前記フラスコに10mLのPCV2 ORF2/Bac p+6（Sf9昆虫細胞でさらに6回継代したPCV2 ORF2遺伝子を含む組換えバキュロウイルス）を接種した。
続いてフラスコを合計6日間インキュベートした。インキュベーション後に、フラスコを遠心し得られた上清から3つのサンプルを採集して不活化した。上清は温度を37±2℃にすることによって不活化した。第一のサンプルには、0.4Mの2-ブロモエチレンアミンヒドロブロミドの溶液（0.3NのNaOH中で0.2Mの二元エチレンイミン（BEI）に対して環化されてある）を上清に添加し、BEIの最終濃度を5mMにした。第二のサンプルには、10mMのBEIを上清に添加した。第三のサンプルには、上清にBEIを添加しなかった。続いてこれらサンプルを48時間持続的に攪拌した。最終最低濃度が5mMになるように1.0Mのチオ硫酸ナトリウム溶液を添加して、一切の残留BEIを中和した。続いて、各サンプルのORF2の量を実施例1で述べたようにELISAアッセイ方法を用いて定量した。前記の結果は下記の表2に示すことができる。
【００８３】
表2
0005394750.tif 000003
【００８４】
本実施例は、BEIによる中和は、有意量の組換えPCV2 ORF2タンパク質生成物の除去又は分解を生じないことを示している。このことは、BEI又は上昇温度により上清から大量のORF2が失われないという事実によって証明される。回収ORF2は適切なタンパク質生成物であることは、当業者には理解されよう。
【００８５】
実施例３
この実施例は、本発明が組換えPCV2 ORF2の小規模生産からPCV2 ORF2の大規模生産へ変更しえることを示す。7000mLのExcell420培養液中のSF+細胞（5.0ｘ106細胞/mL）を20000mLのApplikonバイオリアクターに導入した。続いてこの培養液及び細胞を27℃でインキュベートし68時間100RPMで攪拌した。68時間で、41.3mLのPCV2 ORF2バキュロウイルスMSV+3を7000mLのExcell420培養液に添加した。得られた混合物を続いて前記バイオリアクターに添加した。さらに7日間、前記混合物を27℃でインキュベートし100RPMで攪拌した。4日目よりバイオリアクターからサンプルを24時間毎に取り出し、各サンプルを遠心した。サンプルの上清を保存し、ORF2の量はSDS-PAGEデンシトメトリーを用いて定量した。前記の結果は下記表3で知ることができる。
【００８６】
表3
0005394750.tif 000004
【００８７】
実施例４
本実施例は、７つのPCV2ワクチン候補物の有効性を調べ、さらにPCV2の病毒株への暴露後の有効性パラメーターを明らかにする。108匹の帝王切開により分娩させた初乳断ち（CDCD）仔豚（9−14日齢）を同じサイズの9群に任意に分けた。表4は本実施例のための一般的実験設計を示す。
【００８８】
表4：一般的実験設計
0005394750.tif 000005
vORF2＝単離したウイルスORF2；rORF2＝組換えバキュロウイルス発現ORF2；死滅全細胞ウイルス＝適切な細胞培養で増殖させたPCV2ウイルス
【００８９】
7つの群（群1−7）はPCV2 ORF2ポリペプチドの投与を受けたが、群のうち1つはチャレンジコントロールとして機能してPCV ORF2を投与されず、もう1つ別の群は完全陰性コントロールとして同様にPCV2 ORF2は投与されなかった。0日目に、割り当てたワクチンで群1から7を処置した。群7の仔豚は14日目にブースター処置を与えられた。ワクチン接種後副作用及び注射部位反応について仔豚を観察し、19日目に仔豚を第二の実験場所に移動させた。第二の実験場所では、群1−8は1つの建物の中で群ごとに収容したが、群9は別の建物に収容した。全てのブタにキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）／不完全フロイントアジュバント（ICFA）を21日目及び27日目に投与し、さらに24日目に群1−8を病毒性PCV2でチャレンジした。
PCV2血清学検査のためにチャレンジ前及びチャレンジ後の血液サンプルを採取した。チャレンジ後、平均一日体重増加（ADWG）を決定するための体重データ及び臨床症状とともに、鼻のPCV2排出を決定するための鼻内スワブ標本を採取した。49日目に、全ての生存ブタの剖検を実施し、肺病巣を採点し、選択した組織を後日の免疫組織化学検査（IHC）のためにホルマリン中で保存した。
【００９０】
材料と方法
これは、0日目に9−14日齢のCDCD豚で実施した部分的盲検のワクチン接種-チャレンジフィージビリティー実験であった。本実験に含むためには、雌豚のPCV2 IFA力価は≦1：1000であった。さらにまた、雌豚の血清学的状況は、PRRSが陰性であることが判明している群れ出身であった。28頭の雌豚をPCV2血清学的状況について調査した。14頭の雌豚はPCV2力価が≦1000で、第一の実験場所に移された。110匹の仔豚を帝王切開術で娩出させ、この実験の4日前に入手できた。実験3日前に、第一の実験場所の108匹のCDCD豚の体重を測定し、耳標識で特定し、体重によっておおまかに分け（blocked）、上記表4に示したように第１から第9群に任意に振り分けた。包含基準に適合する全ての被検動物を本実験に登録し、後に何らかの理由で排除した場合には、研究者及び測定者は、前記動物から採集したデータを最終分析で使用するか否かを決定するために協議した。登録した豚が排除された日付及び排除の理由が記載された。最初いずれの雌豚も排除されなかった。実験3日前に、利用可能な110匹のブタのうち合計108匹を任意に第１から第9群に振り分けた。2匹のもっとも小さいブタ（No.17及び19）は１つの群に振り分け、必要な場合にエキストラとして利用可能であった。実験中に幾匹かの動物が除去された。1日目にブタNo.82（群9）、3日目にブタNo.56（群6）、4日目にブタNo.53（群9）、8日目にブラNo.28（群8）、7日目にブタNo.69（群8）及び9日目にブタNo.93（群4）はそれぞれチャレンジ前に死亡しているのが発見された。これらの6匹のブタは最終的な実験結果には含まなかった。ブタNo.17（エキストラ豚の1匹）を群9に割り当てた。残りのエキストラ豚No.19は実験から排除した。
各群に投与した処方物は以下のとおりであった：群1は、16μg ORF2/mLを含むウイルスORF2（vORF2）の1mLを投与するために設計した。これは、10.24mLのウイルスORF2（265μg/25μg/mL＝10.24mLのvORF2）を3.2mLの0.5%Carbopol及び2.56mLのリン酸緩衝食塩水（pH7.4）と混合することによって実施した。前記によって群1用の処方物16mLが得られた。群2は8μg vORF2/mLを含むvORF2の1mLを投与するために設計した。これは、5.12mLのvORF2（128μg/25μg/mL＝5.12mLのvORF2）を3.2mLの0.5%Carbopol及び7.68mLのリン酸緩衝食塩水（pH7.4）と混合することによって実施した。前記によって群2用の処方物16mLが得られた。群3は4μg vORF2/mLを含むvORF2の1mLを投与するために設計した。これは、2.56mLのvORF2（64μg/25μg/mL＝2.56mLのvORF2）を3.2mLの0.5%Carbopol及び10.24mLのリン酸緩衝食塩水（pH7.4）と混合することによって実施した。前記によって群3用の処方物16mLが得られた。群4は16μg rORF2/mLを含む組換えORF2（rORF2）の1mLを投与するために設計した。これは、2.23mLのrORF2（512μg/230μg/mL＝2.23mLのrORF2）を6.4mLの0.5%Carbopol及び23.37mLのリン酸緩衝食塩水（pH7.4）と混合することによって実施した。前記によって群4用の処方物32mLが得られた。群5は8μg rORF2/mLを含むrORF2の1mLを投与するために設計した。これは、1.11mLのrORF2（256μg/230μg/mL＝1.11mLのrORF2）を6.4mLの0.5%Carbopol及び24.49mLのリン酸緩衝食塩水（pH7.4）と混合することによって実施した。前記によって群5用の処方物32mLが得られた。群6は8μg rORF2/mLを含むrORF2の1mLを投与するために設計した。これは、0.56mLのrORF2（128μg/230μg/mL＝0.56mLのrORF2）を6.4mLの0.5%Carbopol及び25.04mLのリン酸緩衝食塩水（pH7.4）と混合することによって実施した。前記によって群6用の処方物32mLが得られた。群7はMAX PCV2 KVを含むPCV2死滅全細胞ワクチン（PCV2 KV）の2mLを投与するために設計した。これは、56mLのPCV2 KVを14mLの0.5%Carbopolと混合することによって実施した。前記によって群7用の処方物70mLが得られた。最後に群8は、2mL用量につき0.5μg/mL又は1.0μg/mLのKLHを投与するために設計した。これは、40.71mLのKLH（0.5μg/mLの7.0μgタンパク質/mL＝570mL（7.0μg/mL）（ｘ）＝（0.5）（570mL））、244.29mLのリン酸緩衝食塩水（pH7.4）及び285mLのフロイントのアジュバントを混合することによって実施した。表5は本実施例の主要な調査活動についてのタイムフレームを示している。
【００９１】
表5：調査活動
0005394750.tif 000006
【００９２】
本実験の生存期の終了後、ホルマリン固定組織を病理学者によるPCV2抗原の検出のために免疫組織化学検査によって調べ、血液サンプルはPCV2血清学的検査によって判定し、鼻のスワブサンプルはPCV2排出について判定し、平均1日当たり体重増加（ADWG）は24日目から49日目まで測定した。
動物は、誕生からほぼ11日齢（実験のほぼ0日目）まで、第一の実験場所で5つの部屋の個々のケージに収容した。それぞれの部屋はレイアウトが同一であり、加温されフィルターに通した空気が各単離ユニットに供給されている、積み重ねた個々のステンレススチールのケージから成っていた。それぞれの部屋は別々の加温換気を有し、したがって部屋間の空気の相互汚染は防止されている。第二の実験場所では、動物は2つの異なる建物に収容された。群9（完全陰性コントロール群）は改造した仕上げ肥育棟に離して収容し、群1−8は改造した哺育棟に収容した。各群は別々の囲いに収容し（11−12匹／囲い）、各囲いはブタ1匹当たり約3.0平方フィートを提供した。各囲いは、プラスチック製羽根板の床をもつ一段高いデッキ上にあった。囲い下のくぼみは排泄物及び廃液のための保持用タンクとして機能した。各棟はそれ自身の別個の加温及び換気システムを有し、建物間の空気の相互汚染の確率ははきわめて低かった。
第一の実験場所では、仔豚は特別処方比ミルクを誕生からほぼ3週齢まで与えられた。全てのブタは実験19日目（ほぼ４ 1/2週齢）までは一定の特別混合比を消費した。第二の実験場所では、全ての仔豚は、それらの齢及び体重に適した通常の医薬品無添加の市販混合比を随意に与えられた。両実験場所では水もまた随意に利用可能であった。
全ての被検ブタは以下により処置された：実験2日前にビタミンE、実験1日前には鉄の注射、並びに実験16日目、17日目、18日目及び19日目にNAXCEL(登録商標)（交互のももの後部に1.0mL、筋肉内）。さらにまた、種々の健康上の理由のために、ブタNo.52（群9）には実験3日目に鉄の注射を処置し、ブタNo.45（群6）には実験11日目に鉄の注射を処置し、ブタNo.69（群8）には実験6日目にNAXCEL(登録商標)を処置し、ブタNo.74（群3）には実験14日目にデキサメタゾン及びペニシリンを処置し、さらにブタNo.51（群1）には実験1３日目にデキサメタゾン及びペニシリン、並びに14日目にNAXCEL(登録商標)を処置した。
【００９３】
両実験場所にいる間、ブタは獣医師の管理下にあった。動物の健康診断は0日目に実施され、健康診断書記録用紙に記録された。全ての動物は、0日目の観察によりワクチン接種前に良好な健康状態及び栄養状態にあった。全ての被検動物は、チャレンジ前に良好な健康状態及び栄養状態にあることが観察された。死骸及び組織は料金を支払って廃棄した。最終的な実験動物の処分は動物処分記録に記録された。
0日目に、群1−6に割り振られたブタは、無菌的な3.0mLのルアロック（Luer-lock）注射筒及び無菌的な20gｘ1/2インチ注射針を用い、それぞれ1.0mLのPCV2ワクチン1−6を左の首の領域の筋肉内に接種された。群7に割り振られたブタは、無菌的な3.0mLのルアロック注射筒及び無菌的な20gｘ1/2インチ注射針を用い、2.0mLのPCV2ワクチンNo.7を左の首の領域の筋肉内に接種された。14日目に、群7に割り振られたブタは、無菌的な3.0mLのルアロック注射筒及び無菌的な20gｘ1/2インチ注射針を用い、2.0mLのPCV2ワクチンNo.7を右の首の領域の筋肉内に接種された。
21日目に、全ての被検ブタは、無菌的な3.0mLのルアロック注射筒及び無菌的な20gｘ1/2インチ注射針を用い、2.0mLのKLH/ICFAを右のももの後部領域の筋肉内に接種された。27日目に、全ての被検ブタは、無菌的な3.0mLのルアロック注射筒及び無菌的な20gｘ1/2インチ注射針を用い、2.0mLのKLH/ICFAを左のももの後部領域の筋肉内に接種された。
24日目に、群1−8に割り振られたブタは、無菌的な3.0mLのルアロック注射筒及び無菌的な20gｘ1/2インチ注射針を用い、1.0mLのPCV2 ISUVDLチャレンジ材料（5.11 log10 TCID50/mL）を左の首の領域の筋肉内に接種された。同じ材料のさらに1.0mLが、無菌的な3.0mLのルアロック注射筒及び鼻用カニューレを用いて各ブタの鼻内に投与された（鼻孔当たり0.5mL）。
被検ブタは、全体的な健康状態及び副作用症状について実験4日前及び実験0日目から19日目まで毎日観察された。観察は臨床観察記録に記録された。全ての被検ブタは、注射部位反応について0日目から7日目まで観察され、群7はさらに14日目から21日目まで観察された。平均1日体重増加は、実験3日前、実験24日目及び49日目に、又はブタが死んでいるのを発見した日に、各ブタを目盛りつき天秤で測定することによって決定した。体重は、体重用紙に記録した。実験3日前の体重は、任意抽出前にブタを大まかに割り振る（block）ために利用した。24日目と49日目の体重データは、各ブタについてこれらの時点の間の平均1日体重増加（ADWG）の決定に利用した。チャレンジ後又は49日目の前に死亡したブタについては、ADWGは24日目から死亡日までのADWGを表すように調整した。
【００９４】
PCV2の血清学を決定するために、実験3日前及び実験14日目に静脈性全血を各ブタの眼窩静脈洞から採集した。各ブタについて、血液は、無菌的キャピラリーチューブを一方の目のめがしらに挿入し、約3.0mLの全血を血清分離チューブ（SST）に引き入れることによって眼窩静脈洞から採集した。24日目、31日目及び49日目に、18gｘ1 1/2インチのヴァキュテイナー（Vacutainer）針（Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, New Jersey）、ヴァキュテイナー針ホルダー及び13mLのSSTを用いて、後大静脈から各ブタの静脈性全血を採集した。各時点の血液採集はサンプル採集記録に記録した。各SST内の血液を凝血させ、続いて各SSTを遠心して血清を採集した。採集血清は、無菌的な蓋付きチューブに移し、後日の検査まで-70±10℃で保存した。血清は、BIVI-R&Dの職員によってPCV2抗体の存在について試験された。
ブタは、20日目から49日目まで臨床症状について1日1回観察され、臨床観察は臨床観察記録に記録された。
PCV2の鼻内排出を試験するために、24日目、25日目及びその後49日目まで1日おきの奇数実験日に、無菌的ダクロンスワブを各ブタの左又は右の鼻孔にできるだけ無菌的に鼻内挿入し、数秒間ぐるりと回してから取り出した。続いて、各スワブを1.0mLのEMEM培養液（500ユニット/mLのペニシリン、500μg/mLのストレプトマイシン及び2.5μg/mLのファンギゾンを含む）を入れた1本の無菌的な蓋付きチューブに入れた。スワブをチューブ内で折り、前記蓋付きチューブを密閉し、動物番号、実験番号、採集日、実験日及び“鼻スワブ”と適切な付箋を付けた。密閉した蓋付きチューブを-40±10℃でBIVI-St. Josephへ輸送するまで一晩氷上で保存した。鼻スワブ収集物は、鼻スワブサンプル収集物用紙に記録した。BIVI-R&Dが鼻スワブサンプルによる定量的ウイルス単離（VI）試験を実施した。結果はlog 10値で表された。1.3 log以下の値は陰性とみなし、1.3 logより大きな値は陽性とみなした。
第一の実験場所で死亡したブタ（No.28、52、56、69、82及び93）は診断の確定に必要なレベルで剖検を実施した。肉眼病巣を記録し、これらのブタの組織は保存しなかった。第二の実験場所では、実験49日目までに死亡したブタ（No.45、23、58、35）、実験49日目に安楽死前に死亡が発見されたブタ（No.2、43）及び49日目に安楽死させたブタは剖検を実施した。全ての肉眼病巣を記録し、病巣をもつ肺葉を剖検記録用紙に記録した。
第二の実験場所で剖検を実施した103頭の各ブタから、扁桃、肺、心、肝、腸間膜リンパ節、腎及び鼠径部リンパ節の組織サンプルを、10%ホルマリン緩衝液を入れた1本の容器に入れ、一方、前述の同じ器官のまた別の組織サンプルをホァールパック（Whirl-pak）（M-Tech Diagnostics Ltd., Thelwall, UK）に入れ、各ホァールパックを氷上に置いた。各容器に適切な付箋を付けた。サンプル収集物は剖検記録用紙に記録した。その後、ホルマリン固定組織サンプル及び診断請求用紙をIHC検査のために提出した。IHC検査は、サンプルの受け取り、サンプルとスライドの調製、及び染色技術について標準的なISU実験室手順にしたがって実施された。ホァールパック中の新鮮組織は、保存（-70℃±10℃）及び将来の使用可能性のためにアイスパックとともに実験モニターに輸送した。ホルマリン固定組織は、IHCによるPCV2の検出のために病理専門家が精査し、以下のスコア系を用いて採点した：0＝無し；1＝わずかな部位に淡い陽性染色；2＝多数の部位に中等度の陽性染色；3＝組織全体に拡散した十分な陽性染色。病理専門家は鼠径部リンパ節と腸間膜リンパ節とを明確に識別することができなかったので、これらの組織についての結果は単にリンパ節として標識され、各動物のこれら2つの組織の各々に対する最高スコアをスコアとして標識した。
【００９５】
結果
本実施例の結果は以下に提供される。群9の1匹のブタは0日前に死亡し、さらに5匹のブタ（群４から1匹、群6から1匹、群8から2匹、及び群9から1匹）がワクチン接種後に死亡したと記録されている。死後検査によって、6匹のいずれもワクチン接種又はPMWSには関連しない潜在的感染症のために死亡したことが示された。さらにまた、副作用又は注射部位反応はいずれの群でも記録されていない。
平均1日体重増加（ADWG）の結果は下記の表6に提供されている。群9（完全陰性コントロール群）は最高のADWG（1.06±0.17 lbs/日）を有し、群5（0.94±0.22 lbs/日）がこれに続いた（群5は8μgのrORF2の1用量を投与された）。群3（4μgのvORF2の1用量を投与された）はもっとも低いADWG（0.49±0.21 lbs/日）を示し、群7（0.50±0.15 lbs/日）がこれに続いた（群7は死滅ワクチンの2用量を投与された）。
【００９６】
表6：群の平均1日体重増加のまとめ
0005394750.tif 000007
vORF2＝単離したウイルスORF2；rORF2＝組換えバキュロウイルスにより発現されたORF2；死滅全細胞ウイルス＝適切な細胞培養で増殖させたPCV2ウイルス
【００９７】
PCV2血清学の結果は下記の表7に提供されている。9群の全てが実験3日前にはPCV2について血清陰性であった。実験14日目に、vORF2ワクチンを投与された群は最高の力価を示し、前記は187.5から529.2の範囲であった。死滅ウイルスワクチンを投与されたブタは次に高い力価を示し、rORF2ワクチンを投与された群がその後に続いた。群8及び9は、この時点では血清陰性のままであった。24日目及び31日目に、vORF2ワクチンを投与されたブタは、強力な血清学的応答を示し続け、死滅ウイルスワクチンの2用量を投与された群が接近して続いた。rORF2ワクチンを投与されたブタはよりゆっくりと血清学的に応答し、群8及び9は血清陰性を維持し続けた。49日目に、vORF2ワクチン、2用量の死滅ウイルスワクチン及び最低用量のrORF2を投与されたブタは、もっとも強い血清学的応答を示した。16μg及び8μgのrORF2ワクチンを投与されたブタは、チャレンジコントロールよりもわずかに高いIFA力価を示した。49日目の群9はもっとも強い血清学的応答を示した。
【００９８】
表7：群におけるPCV2 IFA力価のまとめ
平均IFA力価
0005394750.tif 000008
vORF2＝単離したウイルスORF2；rORF2＝組換えバキュロウイルスにより発現されたORF2；死滅全細胞ウイルス＝適切な細胞培養で増殖させたPCV2ウイルス
*計算のために、≦100IFA力価を力価“50”と称し、≧6400IFA力価を力価“12,800”と称した。
**チャレンジの日
***剖検の日
【００９９】
チャレンジ後の臨床観察の結果は下記の表8に提供されている。この結果の要旨には、異常行動、異常呼吸、咳及び下痢についての観察が含まれている。表9は群の全体的な臨床症状の発生率の要旨を含み、表10はチャレンジ後の群の死亡率の要旨から得られた結果を含む。本実験で観察されたもっとも一般的な臨床症状は異常行動であった。前記は軽度から重度の無気力として採点された。vORF2の低いほうの2種の用量を投与されたブタ、16μgのrORF2を投与されたブタ、及び2用量のKVワクチンを投与されたブタは27.3%以上の発生率を示した。8μgのrORF2を投与されたブタ及び完全な陰性コントロール群は異常行動を示さなかった。この実験のいずれのブタも異常呼吸を全く示さなかった。咳は全ての群でしばしばに認められ（0から25%）、下痢も同様であった（0−20%）。観察された臨床症状はいずれもPMWSに特有の症候ではなかった。
臨床症状の全体的な発生率は群間で変動した。いずれかのvORF2ワクチンを投与された群、16μgのrORF2を投与された群、2用量のKVワクチンを投与された群及びチャレンジコントロール群は最高の全体的臨床症状の発生率を示した（≧36.4%）。完全陰性コントロール群、8μgのrORF2を投与された群及び4μgのrORF2を投与された群は、それぞれ0%、8.3%及び9.1%の臨床症状発生率を示した。
全体的死亡率も同様に群間で変動した。2用量のKVワクチンを投与された群は最高の死亡率（16.7%）を示したが、4μgのvORF2、16μgのrORF2又は8μgのrORF2、及び完全陰性コントロール群はいずれも0%の死亡率を示した。
【０１００】
表8：異常行動、異常呼吸、咳及び下痢についての群における観察のまとめ
0005394750.tif 000009
vORF2＝単離したウイルスORF2；rORF2＝組換えバキュロウイルスにより発現されたORF2；死滅全細胞ウイルス＝適切な細胞培養で増殖させたPCV2ウイルス
1少なくとも1日の間何らかの異常行動を示した、各群のブタの総数
2少なくとも1日の間何らかの異常呼吸を示した、各群のブタの総数
3少なくとも1日の間咳を示した、各群のブタの総数
4少なくとも1日の間下痢を示した、各群のブタの総数
【０１０１】
表9：臨床症状の群における全体的発生率のまとめ
0005394750.tif 000010
vORF2＝単離したウイルスORF2；rORF2＝組換えバキュロウイルスにより発現されたORF2；死滅全細胞ウイルス＝適切な細胞培養で増殖させたPCV2ウイルス
1少なくとも1日の間何らかの臨床症状を示した、各群のブタの総数
【０１０２】
表10：群におけるチャレンジ後の死亡率のまとめ
0005394750.tif 000011
vORF2＝単離したウイルスORF2；rORF2＝組換えバキュロウイルスにより発現されたORF2；死滅全細胞ウイルス＝適切な細胞培養で増殖させたPCV2ウイルス
【０１０３】
PCV2の鼻内排出の結果は下記表11に提供されている。24日目のチャレンジ後に、群7の1匹のブタが27日目にPCV2を排出し始めた。他の群のいずれも33日目まで排出を示さなかった。鼻内排出塊は35日目から45日目まで観察された。3種のvORF2ワクチンのいずれかを投与された群及び4μg又は8μgのORF2のどちらかを投与された群は、PCV2の鼻内排出の最も低い発生率（≦9.1%）を示した。チャレンジコントロール群（群8）は最高の排出率（80%）を示し、完全陰性コントロール（群9）がこれに続いた（群9の発生率は63.6%であった）。
【０１０４】
表11：群におけるPCV2の鼻内排出発生率のまとめ
0005394750.tif 000012
vORF2＝単離したウイルスORF2；rORF2＝組換えバキュロウイルスにより発現されたORF2；死滅全細胞ウイルス＝適切な細胞培養で増殖させたPCV2ウイルス
【０１０５】
群における黄疸発生率、群における胃の潰瘍の発生率、群における平均肺病巣スコア、及び群における肺病巣の発生率の要旨は下記表12に示されている。6匹のブタがワクチン接種後の実験期に第一の実験場所で死亡した（群4、N=1；群6、N=1；群8、N=2；群9、N=1）。6匹のブタのうち4匹が1つ以上の体腔に線維性病巣を有し、1匹のブタ（群6）はクロストリジウム症に一致する病巣を有し、さらに1匹のブタ（群9）には肉眼病巣はなかった。ワクチン接種後の実験期に死亡したブタのいずれにもPMWSと一致する病巣はなかった。
チャレンジ後に死亡したブタ及び実験49日目に安楽死させたブタで剖検を実施した。剖検では、いずれの群にも黄疸及び胃の潰瘍は存在しなかった。肺病巣の平均%に関しては、群9は最も低い肺病巣平均%（0%）を有し、群1（0.40±0.50%）及び群5（0.68±1.15%）がこれに続いた。群2、3、7及び8は最も高い肺病巣平均％を有した（≧7.27%）。これら4群の各々は、％肺病巣が71.5%以上の1匹のブタを含み、前記がこれら4群の結果を歪めてより高くした。観察された肺病巣が0%の群9を例外として、残りの8つの群は36%以下の肺病巣を有していた。観察されたほとんど全ての肺病巣が赤色/紫色で硬化性であると記載されていた。
【０１０６】
表12：群における黄疸発生率、群における胃の潰瘍の発生率、群における平均％肺病巣スコア、及び群における顕著な肺病巣の発生率のまとめ
0005394750.tif 000013
vORF2＝単離したウイルスORF2；rORF2＝組換えバキュロウイルスにより発現されたORF2；死滅全細胞ウイルス＝適切な細胞培養で増殖させたPCV2ウイルス
【０１０７】
群におけるIHC陽性発生率の結果の要旨は表13に示されている。群1（vORF2−16μg）及び群5（rORF2−8μg）は、最も低いIHC陽性率の結果を示した（16.7%）。群8（チャレンジコントロール）及び群9（完全陰性コントロール）は、それぞれ90%及び90.9%の最高IHC陽性率の結果を示した。
【０１０８】
表13：群におけるIHC陽性発生率のまとめ
0005394750.tif 000014
vORF2＝単離したウイルスORF2；rORF2＝組換えバキュロウイルスにより発現されたORF2；死滅全細胞ウイルス＝適切な細胞培養で増殖させたPCV2ウイルス
【０１０９】
チャレンジ後、群5（8μgのrORF2抗原1用量を投与された）は他の6ワクチン群よりも優れていた。群5は、最高のADWG（0.94±0.22 lbs/日）、もっとも低い異常行動発生率（0%）、2番目に低い咳発生率（8.3%）、最も低い全体的臨床症状発生率（8.3%）、最も低い死亡率（0%）、最も低いPCV2鼻内排出率（8.3%）、2番目に低い平均%肺病巣（0.68±1.15%）及び最も低い陽性組織発生率（16.7%）を示した。種々のレベルのrORF2抗原を投与された群は、種々のレベルのvORF2を投与された群よりも全体的に優れ、さらに死滅全細胞PCV2ワクチンの2用量を投与された群の性能は最も低かった。表14及び15は、チャレンジ後の群のデータの要旨を含む。
【０１１０】
表14：チャレンジ後の群のデータのまとめ、その1
0005394750.tif 000015
vORF2＝単離したウイルスORF2；rORF2＝組換えバキュロウイルスにより発現されたORF2；死滅全細胞ウイルス＝適切な細胞培養で増殖させたPCV2ウイルス
【０１１１】
表15：チャレンジ後の群のデータのまとめ、その2
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vORF2＝単離したウイルスORF2；rORF2＝組換えバキュロウイルスにより発現されたORF2；死滅全細胞ウイルス＝適切な細胞培養で増殖させたPCV2ウイルス
【０１１２】
本実験の結果は、ワクチンに対する今後のあらゆる努力がrORF2ワクチンに注がれるべきであることを示している。全体的に、PCV2の鼻内排出はチャレンジ後に検出され、PCV2ワクチンによるワクチン接種は排出の減少をもたらした。選択した類リンパ組織の免疫化学検査もまたワクチンの有効性について良好なパラメーターとして機能したが、一方、ADWG、臨床症状及び肉眼病巣では大きな相違は群間で検出されなかった。この実験の間のいくつかの時点で外部からPCV2が導入されたという事実（群9（完全陰性コントロール群）におけるPCV2の排出、PCV2血清変換及び陽性IHC組織によって立証された）よって本実験は複雑になった。
【０１１３】
考察
この実験では7種のPCV2ワクチンを評価した（前記ワクチンには0日目に1回投与された3つの異なる用量レベルのvORF2抗原、0日目に1回投与された3つの異なる用量レベルのrORF2抗原、並びに0日目及び14日目に投与された1つの用量レベルの死滅全細胞PCV2ワクチンが含まれる）。全体的に、群5（8μgのrORF2抗原を含む1用量のワクチンが投与された）が最良の結果を示した。群5は、最も高いADWG、最も低い異常行動発生、もっとも低い異常呼吸発生、2番目に低い咳発生、最も低い全体的臨床症状発生、最も低い死亡率、最も低いPCV2鼻内排出率、2番目に低い平均%肺病巣率及び最も低い陽性IHC組織発生率を示した。
興味深いことに、群4（群5よりも高い用量のrORF2抗原が投与された）は群5と同様又は群5よりも良好な性能を示したわけではなかった。群4は、群5よりもわずかに低いADWG、より高い異常行動発生、より高い全体的臨床症状発生、より高いPCV2鼻内排出率、より高い平均%肺病巣、及びより高い陽性IHC組織率を示した。統計分析はこれらのデータについて実施されなかったが（これら2つの群間の相違は統計的には有意ではないことを示す可能性があった）、群4は群5と同様に良好な性能を示さない傾向が観察された。
ワクチン接種後、6匹のブタは第一の実験場所で死亡した。この6匹のブタうち4匹は、群8又は群9由来であった（前記群はワクチンが投与されなかった）。6匹のブタのいずれもPMWSに一致する病巣を示さず、副作用も報告されず、全体的に7種全てのワクチンが、ほぼ11日齢のブタに投与するときは安全であるようであった。本実験のワクチン接種後の期間中、3つの用量レベルのvORF2ワクチン又は死滅全細胞ワクチンのいずれかを投与されたブタは最高のIFATレベルを示したが、一方、群5は、チャレンジ直前にワクチン群で最低のIFATレベルを示した。
正式に証明したわけではないが、離乳後間もない若い雌ブタへのPCV2のもっとも支配的な伝播経路は口及び鼻の直接接触によると考えられており、PCV2の鼻内排出を減少させる効果的なワクチンは感染の拡大の制御に役立つであろう。3種のvORF2抗原レベルの1つを投与された群、及び8μgのrORF2を投与された群は、最も低いPCV2鼻内排出発生率（8.3%）を示した。予想したとおり、チャレンジコントロール群は最高の鼻内排出発生率（80%）を示した。
PCV2感染に対し二次性のPMWSを示すブタの肉眼病巣は、典型的には、以下の1つ又は複数の症状が合併する全身性リンパ節腫脹症から成る：（1）小葉間浮腫を伴なう間質性肺炎、（2）皮膚蒼白又は黄疸、（3）斑状萎縮肝（mottled atrophic liver）、（4）胃の潰瘍、及び（5）腎炎。剖検では、いずれの群においても黄疸、肝炎、腎炎及び胃の潰瘍は認められず、リンパ節腫脹は特に調べたわけではなかった。平均%肺病巣スコアは群間で変動した。16μgのvORF2抗原を投与された群は、最も低い平均%肺病巣スコア（0.40±0.50%）を示し、8μgのrORF2を投与された群がこれに続いた（0.68±1.15%）。予想したように、チャレンジコントロール群は最高の平均%肺病巣スコア（9.88±29.2%）を示した。4群全てで、平均%肺病巣スコアは、これらの群の各々において非常に高い肺病巣スコアを有する1匹のブタのために上昇した。肺病巣のほとんどが赤色/紫色で硬化性であると記載された。典型的には、PMWSに付随する肺病巣は、小葉間浮腫を伴う褐色で非崩壊性であると記される。この実験で認められた肺病巣はPCV2感染に関連しないか、又は二次的な肺感染因子が存在していた。この実験の関係では、おそらく%肺病巣スコアは、PCV2による肺感染量の真の測定値を反映していない。
【０１１４】
他の研究者らは、IHCによるPCV2抗原の存在と組織病理学との間の正の相関性を示した。選択した組織の組織病理学はこの実験では実施されなかった。群1（16μgのvORF2）及び群5（8μgのrORF2）では、PCV2抗原陽性のブタの発生率はもっとも低く（8.3%）、一方、群9（完全陰性コントロール群−90.9%）及び群8（チャレンジコントロール群−90.0%）では、PCV2抗原陽性ブタの発生率はもっとも高かった。この検査の非主観的性質のために、IHCの結果は、おそらくワクチンの有効性判定のための最良のパラメーターの１つであろう。
したがって、本発明のある特徴では、CDCDブタモデルにおけるPCV2チャレンジ時の抽出PCV2 ORF2を含む1mＬ/１用量組換え生成物（rORF2）の最小防御用量（MPD）が決定された。種々のレベルのrORF2抗原を投与された3群のうち、群5（8μgのrORF2抗原）は明確に最高レベルの防御を示した。群5は最良の結果を示すか、又は調べたパラメーターの全てに関して好ましい結果と結びついていた。群5を他の6つのワクチン群のチャレンジ後と比較したとき、群5は、最高のADWG（0.94±0.22 lbs/日）、もっとも低い異常行動の発生（0%）、2番目に低い咳の発生（8.3%）、最も低い全体的臨床症状発生（8.3%）、最も低い死亡率（0%）、最も低いPCV2鼻内排出率（8.3%）、2番目に低い平均%肺病巣（0.68±1.15%）及び最も低い陽性IHC組織発生率（16.7%）を示した。
本発明のまた別の特徴では、部分精製PCV2 ORF2（vORF2）抗原である1mL/1用量の通常の生成物のCDCDブタモデルにおけるPCV2チャレンジ時のMPDが決定された。種々のレベルのvORF2抗原を投与された3群のうち、群1（16μgのvORF2）が最高レベルの防御を示した。群1は、ADWG、平均%肺病巣及びIHCに関して群2及び3よりも優れていた。群1及び2（8μgのvORF2抗原）は、全体的臨床症状発生に関しては等価の性能を有し、群3（4μgのvORF2抗原）は最も低い死亡率を示し、さらに鼻内ウイルス排出に関して3群はいずれも等価の性能を示した。全体的に、vORFワクチンは、rORFワクチンのような良好な性能を示さなかった。
さらに別の特徴では、CDCDブタモデルにおけるPCV2チャレンジに対して、2mL/2用量の通常の死滅PCV2ワクチンの最大用量の有効性が決定された。この実験で評価された7つのワクチンのうち、死滅全細胞PCV2ワクチンはもっとも性能が低かった。死滅全細胞PCV2ワクチンの2用量を投与された仔豚は、最も低いADWG、2番目に高い異常行動の割合（58.3%）、2番目に高い全体的臨床症状の発生（58.3%）、最も高い死亡率（16.7%）、2番目に高い鼻内排出率（41.7%）、最高の平均%肺病巣（9.88±29.2%）、認識された肺病巣の高発生（75%）及び中等度のIHC組織発生率（41.7%）を示した。しかしながら、前記はなお免疫応答の喚起に有効であった。
本発明のさらに別の特徴では、有効性のパラメーターとしてPCV2の鼻内排出が査定され、さらに以前の実験から得られた以前のPCV2有効性パラメーターが確認された。本実験から得られた結果は、PCV2の鼻内排出は鼻内チャレンジに続いて生じ、PCV2ワクチンはチャレンジ後のPCV2の鼻内排出を減少させることを示した。さらにまた、本実験の結果及び文献上の報告は、IHCの査定は将来のPCV2ワクチンの試験でも同様に続けられるべきであることを示している。
本実験から得られたいくつかの付加的結論は、リンパ節腫脹症はPMWSの特徴の1つであるということである。PMWSのまた別の特徴は、類リンパ球枯渇及び多核性/巨大組織球である。さらにまた、7つのPCV2ワクチンのいずれについても副作用又は注射部位反応は観察されず、さらに7つのPCV2ワクチンのいずれも若いブタへ投与したとき安全であるように思われた。
【０１１５】
実施例５
本実施例は8つのPCV2候補ワクチンの有効性を試験し、先のチャレンジ実験で得られた、病毒性PCV2株への暴露後のPCV2チャレンジパラメーターを再確認する。150匹の帝王切開由来初乳断ち（CDCD）仔豚（6−16日齢）を体重でおおまかに分け、同じサイズの10群に任意に分割した。表16は本実施例の一般的実験設計を示す。
【０１１６】
表16：一般的実験設計
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vORF2＝単離したウイルスORF2；rORF2＝組換えバキュロウイルスにより発現されたORF2；KV又は死滅全細胞ウイルス＝適切な細胞培養で増殖させたPCV2ウイルス
【０１１７】
各群に投与されたワクチン処方物は以下のとおりであった：PCV2ワクチンNo.1（群１に1ｘ2mL用量で投与）は、アジュバントとしてIMS1314が添加された、高用量（16μg/2mL用量）の不活化組換えORF2抗原であった（16μg rORF2−IMS1314）。PCV2ワクチンNo.2（群2に1ｘ2mL用量で投与）は、アジュバントとしてCarbopolが添加された、高用量（16μg/2mL用量）の部分精製されたVIDO R-1生成PCV2 ORF2抗原であった（16μg vORF2−Carbopol）。PCV2ワクチンNo.3（群3に1ｘ2mL用量で投与）は、アジュバントとしてCarbopolが添加された、高用量（16μg/2mL用量）の不活化組換えORF2抗原であった（16μg rORF2−Carbopol）。PCV2ワクチンNo.4（群4に1ｘ1mL用量で投与）は、アジュバントとしてCarbopolが添加された、高用量（16μg/1mL用量）の部分精製されたVIDO R-1生成PCV2 ORF2抗原であった（16μg vORF2−Carbopol）。ワクチンNo.5（群5に1ｘ2mL用量で投与）は、アジュバントとしてCarbopolが添加された、4μg/2mL用量の不活化組換えORF2抗原であった（4μg rORF2−Carbopol）。PCV2ワクチンNo.6（群6に1ｘ2mL用量で投与）は、アジュバントとしてCarbopolが添加された、1μg/2mL用量の不活化組換えORF2抗原であった（1μg rORF2−Carbopol）。PCV2ワクチンNo.7（群7に1ｘ2mL用量で投与）は、アジュバントとしてCarbopolが添加された、低用量（0.25μg/2mL用量）の不活化組換えORF2抗原であった（0.25μg rORF2−Carbopol）。PCV2ワクチンNo.8（群8に1ｘ2mL用量で投与）は、アジュバントとしてCarbopolが添加された、高用量（不活化前力価＞8.0 log/2mL用量）の不活化通常死滅VIDOR-1生成PCV2 Struve抗原であった（＞8.0 log KV−Carbopol）。0日目に、群1−8は割り振られたそれらのワクチンで処置された。群1−3及び5−8はそれぞれのワクチンで14日目にブースターを受けた。16μgのvORF2−Carbopolのシングル用量の有効性は群4で試験された（群4は14日目にブースターを受けなかった）。仔豚は、両ワクチン接種の後、副作用及び注射部位反応について観察された。21日目に、仔豚を第二の実験場所に移し、この場所では群1−9は1つの建物に群ごとに収容され、群10は別の建物に収容された。全てのブタは、フロイントの不完全アジュバントで乳化したキーホールリンペットヘモシアニンを22日目及び28日目に投与された。25日目に、群1−9を約4 logの病毒性PCV2ウイルスでチャレンジした。46日目までに、チャレンジコントロール群で極めてわずかの死亡が発生した。ブタの免疫刺激及びPCV2チャレンジ材料の病毒性強化のために、全ての群をINGELVAC(登録商標)PRRS MLV（ブタ生殖器系及び呼吸器系ワクチン、改変生ウイルス）で46日目に処置した。
チャレンジ前及びチャレンジ後の血液サンプルをPCV2血清学のために採集した。平均1日体重増加（ADWG）の決定のためのチャレンジ後体重データ及び臨床症状観察を実施した。50日目に、全ての生存ブタで剖検を実施し、肉眼病巣を記録し、肺の病変を採点し、さらに、後日のPCV2抗原検出のために免疫組織化学（IHC）による調査用選択組織をホルマリン中で保存した。
【０１１８】
材料及び方法
これは、0日目に6−16日齢のCDCD豚で実施した部分的盲検ワクチン接種-チャレンジフィージビリティー実験であった。本実験に含まれるためには、雌豚のPCV2 IFA力価は≦1：1000であった。さらにまた、雌豚の血清学的状況は、PRRSが陰性であることが判明している群れ出身であった。16頭の雌豚をPCV2血清学的状況について調査し、16頭全てが1000以下のPCV2力価を有し、第一の実験場所に移された。150匹の仔豚が帝王切開術で娩出され、この実験の3日前に入手できた。実験3日前に、第一の実験場所の150匹のCDCD豚の体重を測定し、耳標識で特定し、体重によっておおまかに分け、さらに上記表16に示したように10群の1つに任意に振り分けた。血液サンプルを全てのブタから採集した。包含基準に適合する全ての被検動物を本実験に登録し、後に何らかの理由で排除した場合には、研究者及び測定者は、前記動物から採集したデータを最終分析で使用するか否かを決定するために協議した。登録した豚が排除された日付及び排除の理由が記載された。この包含基準に適合し、本実験のために選択され、第一の実験場所に移されたいずれの雌豚も排除されなかった。いずれの仔豚も本実験から排除されず、いずれの被検動物も終了前に本実験から取り除かれることはなかった。表17は、本実施例の主要な調査活動についてのタイムフレームを示している。
【０１１９】
表17：調査活動
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【０１２０】
本実験の生存期の終了後、ホルマリン固定組織は、病理学専門家によるPCV2抗原の検出のために免疫組織化学検査によって調べ、血液サンプルはPCV2血清学について査定し、平均1日体重増加（ADWG）は25日目から50日目まで測定した。
動物は、誕生からほぼ11日齢（実験のほぼ0日目）まで、第一の実験場所で7つの部屋の個々のケージに収容した。それぞれの部屋はレイアウトが同一であり、加温されフィルターに通した空気が各単離ユニットに供給されている、積み重ねた個々のステンレススチールのケージから成っていた。それぞれの部屋は別々の加温換気を有し、したがって部屋間の空気の相互汚染は防止されている。第二の実験場所では、動物は2つの異なる建物に収容された。群10（完全陰性コントロール群）は改造した保育棟に離して収容し、群1−9は改造した分娩棟に収容した。各群は別々の囲いに収容し（14−15匹／囲い）、各囲いはブタ1匹当たり約2.3平方フィートを提供した。群2、4及び8は通路の一方の側にある隣り合う3つの囲いに入れ、さらに群1、3、5、6、7及び9は通路のもう一方の側にある隣り合う6つの囲いに入れた。群を分離したのは、群2、4及び8に投与されるワクチンが完全には不活化されていないという実験測定者の懸念のためであった。各囲いは、プラスチック製羽根板の床をもつ一段高いデッキ上にあった。囲い下のくぼみは排泄物及び廃液のための保持用タンクとして機能した。各棟はそれ自身の別個の加温及び換気システムを有し、建物間での空気の相互汚染の確率ははきわめて低かった。
第一の実験場所では、仔豚は特別処方比ミルクを誕生からほぼ3週齢まで与えられた。全てのブタは実験29日目（ほぼ４ 1/2週齢）までは固定した特別混合比を消費した。第二の実験場所では、全ての仔豚は、それらの齢及び体重に適した通常の医薬品無添加の市販混合比を随意に与えられた。両実験場所では水もまた随意に利用可能であった。
全ての被検ブタは、19、20及び21日目に1.0mLのNAXCEL(登録商標)を交互のももの後部のIMに処置された。さらにまた、種々の健康上の理由のために、ブタNo.11（群1）には10日目にNAXCEL(登録商標)を筋肉内に処置し、ブタNo.13（群10）には10日目に1mLのペニシリン及び1mLのPREDEF(登録商標)2Xを処置し、ブタNo.4（群9）には11日目に1.0mLのNAXCEL(登録商標)を筋肉内に処置し、さらにブタNo.1（群1）、4及び11にはそれぞれ14日目に1.0mLのNAXCEL(登録商標)を処置した。
両実験場所にいる間、ブタは獣医師の管理下にあった。動物の健康診断は実験3日前に実施され、健康診断書記録用紙に記録された。全ての動物は、0日目の観察により決定したときワクチン接種前に良好な健康状態及び栄養状態にあった。全ての被検動物は、チャレンジ前に良好な健康状態及び栄養状態にあることが観察された。死骸及び組織は料金を支払って廃棄した。最終的な実験動物の処分は動物処分記録に記録された。
0日目及び14日目に、群1−3に割り振られたブタは、無菌的な3.0mLのルアロック注射筒及び無菌的な20gｘ1/2インチ注射針を用い、それぞれ2.0mLの割り振られたPCV2ワクチン1−4をそれぞれ右及び左の首の領域の筋肉内に投与された。群4に割り振られたブタは、0日目にのみ、無菌的な3.0mLのルアロック注射筒及び無菌的な20gｘ1/2インチ注射針を用い、1.0mLのPCV2ワクチンNo.2を右の首の領域の筋肉内に投与された。
22日目に、全ての被検ブタは、無菌的な3.0mLのルアロック注射筒及び無菌的な20gｘ1/2インチ注射針を用い、2.0mLのKLH/ICFAを左の首領域の筋肉内に投与された。28日目に、全ての被検ブタは、無菌的な3.0mLのルアロック注射筒及び無菌的な20gｘ1/2インチ注射針を用い、2.0mLのKLH/ICFAを右のももの後部領域に投与された。
25日目に、群1−9に割り振られたブタは、無菌的な3.0mLのルアロック注射筒及び無菌的な20gｘ1/2インチ注射針を用い、1.0mLのPCV2 ISUVDLチャレンジ材料（3.98 log10 TCID50/mL）を右の首の領域の筋肉内に接種された。同じ材料のさらに1.0mLが、無菌的な3.0mLのルアロック注射筒及び鼻用カニューレを用いて各ブタの鼻内に投与された（鼻孔当たり0.5mL）。
46日目に、全ての被検ブタは、無菌的な3.0mLのルアロック注射筒及び無菌的な20gｘ1/2インチ注射針を用い、2.0mLのINGELVAC(登録商標)PRRS MLVを右の首の領域の筋肉内に接種された。PRRSV MLVは、PCV2チャレンジ材料の病毒性を高めるために投与された。
被検ブタは、全体的な健康状態及び副作用について実験3日前及び実験0日目から21日目まで毎日観察された。各ブタは正常若しくは異常行動、呼吸又は咳について採点された。観察は臨床観察記録に記録された。全ての被検ブタは注射部位反応について0日目から7日目まで観察され、群7はさらに14日目から21日目まで観察された。平均1日体重増加は、実験3日前、実験25日目及び50日目に、又はチャレンジ後にブタが死んでいるのを発見した日に、各ブタを目盛りつき天秤で測定することによって決定した。体重は、体重用紙に記録した。実験3日前の体重は、任意抽出前にブタを大まかに振り分けるために利用した。25日目と50日目の体重データは、各ブタについてこれらの時点の間の平均1日体重増加（ADWG）の決定に利用した。チャレンジ後又は50日目の前に死亡したブタについては、ADWGは25日目から死亡日までのADWGを表すように調整した。
【０１２１】
PCV2の血清学を決定するために、実験3日前及び実験14日目に静脈性全血を各ブタの眼窩静脈洞から採集した。各ブタについて、血液は、無菌的キャピラリーチューブを一方の目のめがしらに挿入し、約3.0mLの全血を血清分離チューブ（SST）に引き入れることによって眼窩静脈洞から採集した。25日目、32日目及び50日目に、20gｘ1 1/2インチのヴァキュテイナー針（Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, New Jersey）、ヴァキュテイナー針ホルダー及び13mLのSSTを用いて、後大静脈から各ブタの静脈性全血を採集した。各時点の血液採集はサンプル採集記録に記録した。各SST内の血液を凝血させ、続いて各SSTを遠心して血清を採集した。採集血清は、無菌的な蓋付きチューブに移し、後日の検査まで-70±10℃で保存した。血清は、BIVI-R&Dの職員によってPCV2抗体の存在について試験された。
ブタは、22日目から50日目まで臨床症状について1日1回観察され、さらに正常若しくは異常行動、呼吸又は咳について採点された。臨床観察は臨床観察記録に記録された。
ブタNo.46（群1）及び98（群9）は第一の実験場所で死亡した。これら両方の死亡は出血死と分類され、これら2匹のブタについては剖検を実施しなかった。第二の実験場所では、チャレンジ後及び実験50日目前に死亡したブタ、及び実験50日目に安楽死させたブタでは剖検が実施された。全ての肉眼病巣を記録し、病巣をもつ肺葉のパーセンテージを剖検記録用紙に記録した。
第二の実験場所で剖検を実施した各ブタから、扁桃、肺、心、及び腸間膜リンパ節の組織サンプルを、10%ホルマリン緩衝液を入れた1本の容器に入れ、一方、前述の同じ器官のまた別の組織サンプルをホァールパック（Whirl-pak(登録商標)）（M-Tech Diagnostics Ltd., Thelwall, UK）に入れ、各ホァールパック(登録商標)を氷上に置いた。各容器に適切な付箋を付けた。サンプル収集は剖検記録用紙に記録した。その後、ホルマリン固定組織サンプル及び診断請求用紙をIHC検査のために提出した。IHC検査は、サンプルの受け取り、サンプルとスライドの調製、及び染色技術について標準的な実験室手順にしたがって実施された。ホァールパック(登録商標)中の新鮮組織は、保存（-70℃±10℃）及び将来の使用可能性のためにアイスパックとともに実験モニターに輸送した。ホルマリン固定組織は、IHCによるPCV2の検出のために病理専門家が精査し、以下のスコア系を用いて採点された：0＝無し；1＝わずかな部位に淡い陽性染色；2＝多数の部位に中等度の陽性染色；3＝組織全体に拡散した豊富な陽性染色。分析のために、スコア0は“陰性”とみなし、0を超えるスコアは“陽性”とみなした。
【０１２２】
結果
本実施例の結果は以下に提供される。ブタNo.46及び98は14日目及び25日目にそれぞれ死亡した。これらの死亡は出血死と分類された。ブタNo.11（群1）は15日目に浅速呼吸を行いあえいでいた。それ以外は、本観察期間中、全てのブタは行動、呼吸及び咳について正常であり、全身的な副作用はいずれの群でも観察されなかった。0日目のワクチン接種後、注射部位反応は全く認められなかった。14日目のワクチン接種後、14匹の群1のブタのうち7匹（50.0%）が15日目にスコア“2”の腫脹を示した。群1の14匹のうち4匹（28.6%）が16日目になおスコア“2”の腫脹を示した。他の群のいずれもいずれのワクチン接種後にも注射部位反応を示さなかった。
平均1日体重増加（ADWG）の結果は下記の表18に提供されている。出血のために死亡したNo.46及び98は群の結果から除外された。群4（16μg vORF2-Carbopolの1用量を投与）は最も高いADWG（1.16±0.26 lbs/日）を示し、群1、2、3、5、6及び10がこれに続いた（前記は1.07±0.23 lbs/日から1.11±0.26 lbs/日の範囲のADWGを示した）。群9は最も低いADWG（0.88±0.29 lbs/日）を示し、群8及び7がこれに続いた（前記はそれぞれ0.93±0.33 lbs/日及び0.99±0.44 lbs/日を示した）。
【０１２３】
表18：群の平均1日体重増加（ADWG）のまとめ
0005394750.tif 000019
vORF2＝単離したウイルスORF2；rORF2＝組換えバキュロウイルスにより発現されたORF2；KV又は死滅全細胞ウイルス＝適切な細胞培養で増殖させたPCV2ウイルス
【０１２４】
PCV2の血清学は下記の表19に提示されている。実験3日前には10群全てがPCV2について血清陰性であった。14日目には、PCV2力価は10群全てについて低いままであった（50−113の範囲）。25日目に、群8（死滅全細胞ウイルスワクチンを投与）は、最高のPCV2力価（4617）を有し、群2（16μgのvORF2−Carbopolを投与）、群4（16μgのvORF2−Carbopolのシングル用量を投与）、及び群3（16μgのrORF2−Carbopolを投与）がこれに続き、前記はそれぞれ2507、1920及び1503の力価を有していた。32日目（チャレンジ後1週間）に、群1−6及び群8の力価は2360から7619の範囲であったが、一方、群7（0.25μgのrORF2−Carbopol）、群9（チャレンジコントロール）及び群10（完全陰性コントロール）は、それぞれ382、129及び78の力価を示した。50日目（剖検の日）に、10群全てが高いPCV2力価を示した（≧1257）。
25日目、32日目及び50日目に、群3（16μgのrORF2−Carbopolの2用量を投与）は群1（16μgのrORF2−IM1314の2用量を投与）よりも高い抗体力価を示した。25日目、32日目及び50日目に、群2（16μgのvORF2の2用量を投与）は群4（同じワクチンの1用量だけを投与）よりも高い力価を示した。25日目及び32日目に、群3、5、6、7（低レベルのrORF2−Carbopol、それぞれ16、4、1及び0.25μgを投与）は対応する低レベルの抗体力価を示した。
【０１２５】
表19：群におけるPCV2 IFA力価のまとめ
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vORF2＝単離したウイルスORF2；rORF2＝組換えバキュロウイルスにより発現されたORF2；KV又は死滅全細胞ウイルス＝適切な細胞培養で増殖させたPCV2ウイルス
*計算のために、≦100のIFA力価を力価“50”と称し、≧6400のIFA力価を力価“12,800”と称した。
**チャレンジの日
***剖検の日
【０１２６】
チャレンジ後の臨床観察から得られた結果は下記に提示されている。表20は、異常行動、異常呼吸、咳及び下痢についての観察を含む。表21は、群の全体的な臨床症状の発生のまとめから得られた結果を含み、表22はチャレンジ後の群の死亡率のまとめから得られた結果を含む。チャレンジ後の異常行動、異常呼吸及び咳の発生は、16μgのrORF2-IMS1314（群1）、16μgのrORF2-Carbopol（群3）、1μgのrORF2-Carbopol（群6）、0.25μgのrORF2-Carbopol（群7）を投与されたブタ、及びチャレンジコントロール群（群9）のブタで低かった。チャレンジ後の異常行動、異常呼吸及び咳の発生率は、16μgのvORF2-Carbopol（群2）、16μgのvORF2-Carbopolのシングル用量（群4）、4μgのrORF2-Carbopol（群5）、＞8 logのKV-Carbopol（群8）を投与されたブタ、及び完全陰性コントロール群（群10）のブタでゼロであった。
臨床症状の全体的な発生率は群間で変動した。16μgのvORF2-Carbopol（群2）、16μgのvORF2-Carbopolのシングル用量（群4）を投与されたブタ、及び完全陰性コントロール群（群10）のブタは0%の発生率を有し、16μgのrORF2-Carbopol（群3）及び1μgのrORF2-Carbopol（群6）を投与されたブタは6.7%の発生率を有し、16μgのrORF2-IMS1314を投与されたブタ（群1）は7.1%の全体的発生率を有し、4μgのrORF2-Carbopol（群5）、0.25μgのrORF2-Carbopol（群7）及び＞8 logのKVワクチン（群8）を投与されたブタは13.3%の発生率を有し、チャレンジコントロール群（群9）のブタは14.3%の発生率を示した。
全体的死亡率は同様に群間で変動した。群8（2用量のKVワクチンを投与）は最高の死亡率（20.0%）を有し、群9（チャレンジコントロール）及び群7（0.25μgのrORF2-Carbopolを投与）がこれに続き、それぞれ14.3%及び13.3%の死亡率を示した。群4（16μgのvORF2-Carbopolのシングル用量を投与）は6.7%の死亡率を示した。他の1、2、3、5、6及び10は0%の死亡率を示した。
【０１２７】
表20：チャレンジ後の群における異常行動、異常呼吸、及び咳についての観察のまとめ
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1少なくとも1日の間何らかの異常行動を示した、各群のブタの総数
2少なくとも1日の間何らかの異常呼吸を示した、各群のブタの総数
3少なくとも1日の間咳を示した、各群のブタの総数
【０１２８】
表21：チャレンジ後の群における臨床症状の全体的発生率のまとめ
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vORF2＝単離したウイルスORF2；rORF2＝組換えバキュロウイルスにより発現されたORF2；KV又は死滅全細胞ウイルス＝適切な細胞培養で増殖させたPCV2ウイルス
1少なくとも1日の間何らかの臨床症状を示した、各群のブタの総数
【０１２９】
表22：チャレンジ後の群における死亡率のまとめ
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vORF2＝単離したウイルスORF2；rORF2＝組換えバキュロウイルスにより発現されたORF2；KV又は死滅全細胞ウイルス＝適切な細胞培養で増殖させたPCV2ウイルス
【０１３０】
群の平均パーセント肺病巣及び一時的診断の要旨は下記の表23に提供されている。群9（チャレンジコントロール群）は、平均が10.81±23.27%の最高のパーセント肺病巣を示し、群7（0.25μgのrORF2−Carbopolを投与）（平均が6.57±24.74%）、群5（4μgのrORF2−Carbopolを投与）（平均が2.88±8.88%）及び群8（KVワクチンを投与）（平均が2.01±4.98%）がこれに続いた。残りの6群はより低い平均%肺病巣を示し、前記は0.11±0.38%から0.90±0.15%の範囲であった。
肺炎の一時的診断は群間で変動した。群3（16μgのrORF2−Carbopolの2用量を投与）は、最も低い肺炎の一時的診断を受け13.3%であった。群9（チャレンジコントロール群）は群の50%が肺炎と一時的に診断され、群10（完全陰性コントロール群）及び群2（16μgのvORF2-Carbopolの2用量を投与）がこれに続き、それぞれ46.7%及び40%が一時的に肺炎と診断された。
群1、2、3、5、9及び10では群の0%がPCV2感染と一時的に診断されたが、一方、群8（KVワクチンの2用量を投与）では一時的にPCV2感染と診断された割合がもっとも高く（20%）、群7（0.25μgのrORF2−Carbopolの2用量を投与）及び群4（16μgのvORF2-Carbopolの1用量を投与）では、各群のそれぞれ13.3%及び6.7%が一時的にPCV2感染と診断された。
胃の潰瘍は群7の1匹のブタ（6.7%）で診断されただけであったが、他の9つの群では胃の潰瘍は存在しなかった。
【０１３１】
表23：群における平均%肺病巣及び一時的診断のまとめ
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vORF2＝単離したウイルスORF2；rORF2＝組換えバキュロウイルスにより発現されたORF2；KV又は死滅全細胞ウイルス＝適切な細胞培養で増殖させたPCV2ウイルス
【０１３２】
群におけるIHC陽性発生結果の要旨は下記表24に示されている。群1（16μgのrORF2−IMS1314）は最も低い群内IHC陽性結果を示し（PCV2陽性ブタは0%）、群2（16μgのvORF2−Carbopol）及び群4（16μgのvORF2−Carbopolのシングル用量）がこれに続き、それぞれ6.7%及び13.3%の群内IHC率を示した。群9（チャレンジコントロール群）はもっとも高いIHC陽性発生率を示し（100%のPCV2陽性ブタ）、群10（完全陰性コントロール群）及び群8（KVワクチン）がこれに続き、PCV2陽性ブタはそれぞれ93.3%及び80%であった。
【０１３３】
表24：群におけるIHC陽性発生率のまとめ
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vORF2＝単離したウイルスORF2；rORF2＝組換えバキュロウイルスにより発現されたORF2；KV又は死滅全細胞ウイルス＝適切な細胞培養で増殖させたPCV2ウイルス
【０１３４】
考察
この実施例では7種のPCV2ワクチンを評価した（前記ワクチンには、2回投与されるIMS1314アジュバント添加高用量（16μg）rORF2抗原、1つの群のブタに1回及び第二の群のブタに2回投与されるCarbopolアジュバント添加高用量（16μg）vORF2抗原、2回投与されるCarbopolアジュバント添加高用量（16μg）rORF2抗原、2回投与されるCarbopolアジュバント添加4μg用量のrORF2抗原、2回投与されるCarbopolアジュバント添加1μg用量のrORF2抗原、2回投与されるCarbopolアジュバント添加低用量（0.25μg）のrORF2抗原、及びCarbopolアジュバント添加高用量（＞8 log）の死滅全細胞PCV2ワクチンが含まれる）。全体的には、群1（16μgのrORF2−IMS1314の2用量が投与された）は、群2から群7（Carbopolアジュバントを添加され種々のレベルのvORF2又はrORF2抗原を含む）よりもわずかに良好な性能を示し、群8（死滅全細胞PCV2ワクチンの2用量が投与された）よりもはるかに良好な性能を示した。群1は3番目に高いADWG（1.80±0.30 lbs/日）、最も低い異常行動の発生（0%）、最も低い異常呼吸（0%）、低い咳の発生（7.1%）、低い全体的臨床症状の発生（7.1%）を示し、もっとも低い死亡率（0%）、2番目に低率の平均%肺病巣（0.15±0.34%）、2番目に低率の肺炎（21.4%）及び最も低い陽性IHC組織の発生率（0%）については他の3群と連携していた。しかしながら、群1は、注射部位反応が認められた唯一の群で、第二のワクチン接種の1日後には50%のワクチン接種動物が含まれた。群2から群7に投与された他のワクチンは死滅全細胞ワクチンよりも良好な性能を示し、さらに群1に投与されたワクチンとはほぼ同様の性能を示した。
群8（Carbopolアジュバント添加死滅PCV2ワクチンの2用量が投与された）は、いずれのワクチン群よりも劣る結果を示した。群8は、もっとも低いADWG（0.93±0.33 lbs/日）、2番目に高率の異常行動（6.7%）、最も高率の異常呼吸（6.7%）を示し、最も高い全体的臨床症状の発生率（13.3%）については他の3つの群と同様であり、死亡率については全ての群でもっとも高く（20%）、さらにいずれのワクチンよりも高いIHC陽性率（80%）を示した。死滅全細胞PCV2ワクチンは群8への投与前に完全には不活化されてなかったという懸念が存在し、このことはこの群の不良な結果を説明しえる。残念ながら、この懸念を確認するための明確なデータは利用可能ではなかった。全体として、この実施例の状況では、通常の死滅PCV2ワクチンはPCV2関連症状の緩和を促進しなかった。
以前に述べたように、IMS1314アジュバント添加ワクチンを除いて本被検ワクチンは副作用を伴わなかった。注射部位反応は、IMS1314で処方されたワクチンによる第二のワクチン接種の1日後には50%のブタで観察され、第二のワクチン接種の2日後には28.6%のブタで観察された。Carbopolアジュバント添加を投与されたいずれのブタでも反応は観察されなかった。IMS1314アジュバント添加ワクチンを接種されたブタを含むさらに別の実験を継続して、注射部位反応についてブタを厳密にモニターする必要がある。
【０１３５】
全てのブタが実験3日前にPCV2について血清陰性であり、さらに群2のみが実験14日目に100を越える力価を示した。25日目（チャレンジの日）に、群8はもっとも高いPCV2抗体力価を有し（4619）、群2（2507）がこれに続いた。群7、9及び10を例外として、全ての群が32日目までに強い抗体応答を示した。50日目までに、群7、9及び10を含む全ての群が強い抗体応答を示した。
後期PCV2感染およびそれに続くPMWSの発症の特徴の1つは、離乳豚の発育遅延であり、重篤な症例では体重減少が認められる。群における平均1日体重増加は発育遅延又は体重減少を示す定量的な方法である。本実施例では、群間でADWGの大きな相違はなかった。群8はもっとも低いADWG（0.88±0.29 lbs/日）を示し、一方、群4は最高のADWG（1.16±0.26 lbs/日）を示した。本実験の状況では、ADWGにワクチンの更なる有効性の根拠を置くために十分な相違は群間には存在しなかった。
体重の減少に加えて、呼吸困難、嗜眠、皮膚蒼白及び時には黄疸がPMWSに付随する臨床症状である。本実施例では、異常行動及び異常呼吸並びに咳が各群でときに認められた。本実験で立証されたように、このチャレンジモデル及びチャレンジ株は過剰な臨床症状をもたらさず、前記はワクチンの有効性の根拠とするための強力なパラメーターではない。
本実施例では死亡率は全体的に高くなく、チャレンジコントロール群で高死亡率を欠くということは、ワクチンの有効性の根拠となるこのパラメーターの限界を示す。46日目前に、群4及び群7ではそれぞれ15匹のブタのうち1匹が死亡し、群9では14匹のブタのうち2匹が死亡し、群8では15匹のブタのうち3匹が死亡した。群9（チャレンジコントロール群）はPCV2の臨床症状を示さず、46日目までにこの群では2匹が死亡しただけであるという事実のために、ブタの呼吸器及び生殖器症候群ウイルス（PRRSV）MLVワクチンを46日目に全てのブタに投与した。以前の実験は、INGELVAC(登録商標)PRRS MLVを免疫刺激剤として利用し、PCV2関連PMWSの症状を悪化させ、これらの以前の実験では死亡率が高められた。2匹の死亡は46日目にPRRSワクチンを投与した後まもなく発生した：群4では46日目に1匹が死亡し、群7では47日目に1匹が死亡した（これらは。おそらくPRRSワクチンの投与とは関連しない）。50日までに、群8（死滅ワクチンの2用量を投与）は最高の死亡率を示し、群9（チャレンジコントロール）及び群7（0.25μgのrORF2−Carbopol）がこれに続き、それぞれ14.3%及び13.3%の死亡率を示した。全体的には、本実施例のチャレンジ後観察期後期におけるチャレンジモデルへのPRRSワクチンの投与は、死亡率を顕著には高めなかった。
PCV2感染に対し二次性PMWSを有するブタの肉眼病巣は、典型的には以下の1つ以上と合併した全身性リンパ節腫脹症から成る：（1）小葉間浮腫を伴う間質性肺炎、（2）皮膚蒼白又は黄疸、（3）斑状萎縮肝（mottled atrophic liver）、（4）胃の潰瘍、及び（5）腎炎。剖検（50日目）では、いずれの群においても黄疸、肝炎、及び腎炎は認められなかった。胃の潰瘍は群7の1匹のブタで観察されたが、リンパ節腫脹症については特に調査されなかった。PCV2感染に一致する病巣の存在を基準にしたとき、３つの群が、一時的にPCV2（PMWS）と診断されるブタを1匹含んでいた。群8（死滅ワクチンの2用量を投与）は20%が一時的にPCV2と診断され、一方、群7及び群4はそれぞれ13.3%及び6.7%が一時的にPCV2と診断された。平均%肺病巣スコアは剖検時に群間で変動した。群1、2、3、4、6及び10は、0.11±0.38%から0.90±0.15%の範囲の低い%肺病巣スコアを有した。予想したとおり、群9（チャレンジコントロール）は、最高の平均%肺病巣スコア（10.81±23.27%）を示した。4つの群では、平均%肺病巣スコアは、これらの群の各々において非常に高い肺病巣スコアを有する1匹から3匹のブタのために上昇した。肺病巣は赤色/紫色で硬化していた。典型的には、PMWSに付随する肺病巣は、小葉間浮腫を伴う褐色で非崩壊性であると記される。この実験で認められた肺病巣はPCV2感染に付随しないか、又は二次的な肺感染因子が存在する可能性があった。この実験の関係では、おそらく%肺病巣スコアは、PCV2による肺感染量の真の測定値を反映しない。同様に、一時的な肺炎の診断もまた過剰に利用されていたかもしれない。肺病巣を有する全てのブタ（あるものはわずかに0.10%である）が一時的な肺炎の診断とともに列挙された。本実施例では、肉眼病巣と％肺病巣に関してはワクチンの有効性の根拠とするために十分な相違は群間に存在しなかった。
IHCの結果はもっとも大きな群間の相違を示した。群1（16μgのrORF2−IMS1314）は、PCV2抗原に対し最も低い陽性IHCの結果を示し（0%）、一方、群9及び群10は最も高い陽性IHCの結果を示し、発生率はそれぞれ100%及び93.3%であった。群3、5、6及び7（Carbopolアジュバントを添加されたそれぞれ16、4、1又は0.25μgのrORF2抗原を投与された）は、それぞれ20%、20%、40%及び46.7%のIHC陽性率を示した。群2（Carbopolアジュバントを添加された16μgのvORF2の2用量を投与された）は6.7%のIHC陽性率を示し、一方、群4（同じワクチンの1用量が投与されただけであった）は13.3%のIHC陽性率を示した。この検査の客観的な性質及びIHCの結果が予想される結果と相関性を示したという事実により、IHC検査はおそらくワクチンの有効性の根拠とするための最良のパラメーターの１つであろう。
したがって、本発明のある特徴では、PCV2チャレンジに対する、Carbopolアジュバント添加PCV2 rORF2抗原のCDCDブタモデルにおける最小防御用量（MPD）が決定される。群3、5、6及び7は、それぞれCarbopolアジュバントを添加されたrORF2抗原の2用量を投与されたが、rORF2抗原のレベルは各群について異なっていた。群3、5、6及び7は各々、それぞれ16、4、1又は0.25μgのrORF2抗原を投与された。一般的には、rORF2抗原レベルの減少はPCV2抗体力価を低下させ、さらに死亡率、平均％肺病巣及びIHC陽性組織の発生を増加させた。種々のレベルのrORF2−Carbopolを投与された4つの群のうち、群3及び5（それぞれ16又は4μgのrORF2抗原の2用量が投与された）は各々、わずかに20%のIHC陽性率を有し、さらにそれぞれ類似の抗体力価を示した。全体的に、IHC陽性結果を基準に、2回投与されるrORF2抗原の最小防御用量はほぼ4μgである。
本発明の別の特徴では、組換え体（rORF2）及びVIDO R-1（vORF2）PCV2抗原の抗原性が査定された。群2は16μgのvORF2の2用量を投与され、群3は16μgのrORF2の2用量を投与された。両ワクチンはCarbopolアジュバントを添加された。両ワクチンは安全であることが判明し、両方とも死亡率が0%であった。群2は25日目に2507のPCV2抗体力価を示し、一方、群3は1503のPCV2抗体力価を示した。群3は、群2よりも低い平均%肺病巣を示したが（0.11±0.38%対0.90±0.15%）、群2は、群3よりも低いIHC陽性発生率を示した（6.7%対20%）。全体的に、両ワクチンは類似の抗原性を有するが、vORF2はわずかに良好なIHC結果を伴った。
本発明のさらに別の特徴では、2つの異なるアジュバント（Carbopol及びIMS1314）の適切性が決定された。群1及び3はともに16μgのrORF2抗原を含むワクチンの2用量を投与されたが、群1はIMS1314アジュバントを添加された抗原を投与され、一方、群3はCarbopolアジュバントを添加された抗原を投与された。両群は、本質的に同じADWG、本質的に同じチャレンジ後臨床徴候の発生、同じ死亡率、及び本質的に同じ平均%肺病巣を示したが、群1は0%のIHC陽性率を示し、一方、群3は20%のIHC陽性率を示した。しかしながら群3（Carbopolアジュバント添加ワクチンを投与された）は、25日目、32日目及び50日目に、群1（IMS1314アジュバントを添加したワクチンを投与された）よりも高いIFAT PCV2力価を示した。全体的に、IMS1314アジュバントを添加されたPCV2ワクチンは確かにより良好なIHCの結果を提供したが、前記はPCV2感染に対して相当に良好な防御を提供したわけではなく、さらに注射部位反応も誘発した。一方、Carbopolアジュバント添加PCV2ワクチンはIMS1314アジュバント添加ワクチンとほぼ同様な性能を示したが、いかなる副作用も伴わなかった。
本発明のさらに別の特徴では、PCV2 ORF2の1mL、１用量製品としてのフィージビリティーが決定された。群2及び4はともに、Carbopolアジュバントが添加された16μgのvORF2ワクチンを0日目に投与されたが、群2は14日目に第二の用量を14日目に投与された。群4は、群2よりもわずかに高いADWG及び低い平均%肺病巣を示したが、群2は、25日目、32日目及び50日目により高いIFAT PCV2力価を示し、さらにわずかに低いIHC陽性組織発生率を示した。これら2つの群についての他の全ての結果は類似していた。全体的に、Carbopolアジュバント添加vORF2の1用量は、同じワクチンの2用量と類似の性能を有した。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】PCV2 ORF2組換えバキュロウイルスの好ましい構成を示す工程図である。
【図２】2a及び2bはそれぞれ本発明の組成物の製造の仕方を示す工程図である。
【図１】
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【図２（ａ）】
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【図２（ｂ）】
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【配列表】
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