(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハンチントン病の治療又はアルツハイマー病の治療のための、薬学的に許容できる担体、並びに、コポリマー１及びコポリマー１で活性化されたＴ細胞から選択される活性薬剤を含有する薬剤組成物であって；該活性薬剤が、４週間隔で投与される、薬剤組成物。
【請求項２】
ハンチントン病の治療のための、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項３】
アルツハイマー病の治療のための、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項４】
前記ハンチントン病又はアルツハイマー病に罹患している患者において、疾患進行を低減し、且つ／又は神経変性から保護し、且つ／又はグルタミン酸毒性から保護するための、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項５】
ハンチントン病の治療又はアルツハイマー病の治療のための医薬品を製造するための、コポリマー１及びコポリマー１で活性化されたＴ細胞から選択される活性薬の使用であって；該活性薬が、４週間隔で投与される、上記使用。
【請求項６】
ハンチントン病の治療のための、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
アルツハイマー病の治療のための、請求項５に記載の使用。
【請求項８】
前記ハンチントン病又はアルツハイマー病に罹患している患者において、疾患進行を低減し、且つ／又は神経変性から保護し、且つ／又はグルタミン酸毒性から保護するための、請求項５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プリオン疾患を除く、ミスフォールディング及び／又は凝集タンパク質の蓄積が存在する神経変性疾患を治療するための組成物、例えばワクチン及び方法に関する。特に、本発明は、コポリマー１、コポリマー１関連ペプチド若しくはポリペプチド及びこれらで活性化されたＴ細胞からなる群から選択される薬剤を投与することにより、神経変性疾患であるハンチントン病（ＨＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）又はパーキンソン病（ＰＤ）を治療することに関する。
【０００２】
略語：Ａβ１〜４０、β−アミロイドペプチド１〜４０；ＡＤ、アルツハイマー病；ＡＰＣ、抗原提示細胞；ＣＮＳ、中枢神経系；Ｃｏｐ−１、コポリマー１；ＤＡＴ、ドーパミン輸送体；ＨＤ、ハンチントン病；ＩＲＰＢ、光受容体内レチノイド結合タンパク質；ＭＰＴＰ、１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン；ＯＨＳＣ、器官型海馬切片培養；ＰＤ、パーキンソン病；ＰＩ、ヨウ化プロピジウム；ＲＧＣ、網膜神経節細胞；Ｔｒｅｇ、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞；ＴＵＮＥＬ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼビオチン−ｄＵＴＰニックエンド標識；ＷＲＨ、全網膜ホモジネート。
【背景技術】
【０００３】
ミスフォールディング及び／又は凝集タンパク質の蓄積を伴うＣＮＳの病理学的障害
数十年間にわたって、臨床医は、特定の疾患での不溶性タンパク質凝集物の形成に注目してきた。アルツハイマー病（Ｓｅｌｋｏｅ、１９９７、２００２）では、ＣＮＳでのβ−アミロイド含有プラークの存在が、神経変性及び認知症に関係している。同様に、他の神経変性疾患も、脳内にタンパク質凝集を伴うことが最近になって発見された。例えば、クールー、クロイツフェルト・ヤコブ病及びウシ海綿状脳障害などのプリオン疾患は、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）のアミロイド沈着と関連している。ハンチントン病などのポリグルタミンリピート疾患も、ニューロンサイトゾル及び核内封入体と関連している（ＤｉＦｉｇｌｉａら、１９９７）。これらの封入体は、アミロイドと同様に着色する原線維からなる（Ｓｃｈｅｒｚｉｎｇｅｒら、１９９７）。最後に、パーキンソン病では、基底核の細胞の細胞質中に存在するレビ小体として知られている封入体は、タンパク質α−シヌクレインのアミロイド様凝集体を含有する。（Ｃｏｎｗａｙら、２０００；Ｓｅｒｐｅｌｌら、２０００）
【０００４】
ジョージ・ハンチントン医師により１８００年代後半に同定されたハンチントン病（ＨＤ）は、常染色体優性神経変性疾患であり、その症状は、脳の基底核内の細胞が失われることにより誘発される。細胞に対するこの損傷は、認知能力（思考、判断、記憶）、運動及び感情制御に影響を及ぼす。ＨＤは、制御不可能な舞踏様運動及び人格変化を特徴とする。ＨＤ患者は、不明瞭な発語、不規則な歩行及び嚥下困難を発症する。ＨＤには、有効な治療がない。ＨＤを有する個人は、長期の疾病の後に窒息又は感染などの合併症により死亡する。
【０００５】
１９９３年に、ＨＤを誘発する突然変異は、未知の機能を有するタンパク質であるハンチンチンをコードするＩＴ１５遺伝子でのＣＡＧリピート数の不安定な増加であることが同定された（Ｍｅｎａｌｌｅｄ及びＣｈｅｓｓｅｌｅｔ，２００２）。ＣＡＧリピート数の増加は、脳及び末梢組織で広く発現されるタンパク質のＮ末端部でのグルタミン鎖伸長をもたらす（Ｇｕｔｅｋｕｎｓｔら、１９９５）。ハンチントン病での神経死の正確なメカニズムは、まだわかっていない。提示されているメカニズムとしては、カスパーゼ又は他のアポトーシストリガーの活性化、ミトコンドリア又は代謝毒性並びに遺伝子転写での干渉がある。通常の神経変性疾患、特にハンチントン病の病態生理学の理解における最近の進歩は、神経変性疾患の進行を遅らせるか、発症を遅延させることを目的とする新たな治療戦略を示唆している。
【０００６】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、不可逆的な進行性の脳障害であり、これは、徐々に発症し、記憶の消失、行動及び人格の変化並びに精神能力の低下をもたらす。これらの消失は、脳細胞の死及び細胞間の結合の破壊に関連している。この疾患の経過は、ヒトによって異なり、低下の速度も異なる。ＡＤ患者は、平均的には診断されてから８から１０年間生存するが、疾患は、２０年まで続くことがある。
【０００７】
ＡＤは段階によって、初期の軽い物忘れから、精神機能の重度の消失まで進行する。始めに、ＡＤは、記憶を制御する脳の部分、特に、海馬及び関連構造にあるニューロンを破壊する。海馬の神経細胞が適切な機能を停止すると、短期記憶が損なわれる。さらにＡＤは、大脳皮質、特に言語及び理性を任う領域を攻撃する。最終的には、脳の多くの他の部分も巻き込まれる。
【０００８】
パーキンソン病（ＰＤ）は、遅く、衰えた運動、筋硬直、静止振戦及び姿勢の不安定性を特徴とする特発性で、進行の遅い変性ＣＮＳ障害である。広範な研究にもかかわらず、ＰＤの原因は未知なままである。尾状核及び被殻へと突出する黒質ニューロンの消失は、これらの部分での神経伝達物質ドーパミンの枯渇をもたらす。ヒト、非ヒト霊長類及びマウスを含む他の哺乳動物種においてＰＤの神経病理学的特徴の大部分を再現する神経毒である１−メチル−４−フェニル−１，２，４，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）を使用することにより、ＰＤ発病への重大なヒントが得られた。ＭＰＴＰマウスモデルは、いくつかの重要な点において、ヒトのＰＤとは異なるが、これは、中脳ドーパミン作動性ニューロンの消滅の基礎となる分子事象をｉｎ  ｖｉｖｏで研究するための独特な手段を提供する（Ｄａｕｅｒ及びＰｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉ，２００３）。
【０００９】
成熟神経細胞の増殖し、失われたニューロンを補償する能力が非常に乏しいことにより、成人ＣＮＳでの急性及び／又は慢性ニューロン消失は、機能の不可逆的消失をもたらす。したがって、ニューロン消失を低減することは、機能を保存するために必須である。アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及びハンチントン病などの神経変性疾患の多くでは、病因が明らかでなく、したがって、これらは治癒不能である。しかしながら、いくつかの一次的又は二次的な危険因子が存在し、これらは、ニューロン消失の進行を阻止又は低減することを目的とする、総じて、神経保護治療と称される治療的介入のためのターゲットである。いくつかの危険因子は、疾患特異的であるが、興奮性アミノ酸、遊離ラジカル及び酸化窒素などの他の因子は、全ての神経変性障害で共通である。これらの因子は、健常なＣＮＳにおいて必須の自己成分であるが、これらが変性組織に過剰量で蓄積すると、細胞毒性になり、ニューロン死の初期原因を上回る広範な損傷をもたらす。
【００１０】
グルタミン酸は、発作重積状態、脳虚血、外傷性脳損傷、ＡＬＳ、ハンチントン病、ラチリスム及びアルツハイマー病などの急性及び慢性変性障害において、最も一般的な毒性仲介物質の１つである。グルタミン酸は、ヒトＣＮＳにおける一次興奮性神経伝達物質である。Ｌ−グルタミン酸は、大部分のシナプスに存在し、二重活性を示しうる、即ち、正常な機能では、必須の神経伝達物質として重要な役割を果たすが、その生理学的レベルを超えると、毒性になる。
【００１１】
ニューロンの消失を最小とするために（神経保護）、いくつかの手法が試みられており、その場合、最も一般的なことは、その作用を中和又は阻害する試みとして、危険因子をターゲットとすることである。残念ながら、これらの治療戦略は、ヒト患者では、僅かな効果しか示さず重度の副作用が随伴する。別々の単一の作用メカニズムを有する薬剤の失敗により、多面的な手法が論じられている。
【００１２】
防御的自己免疫
壊滅的な慢性神経変性障害を有する患者でのニューロンの消失は、多数の因子に起因し、その大部分（例えば、酸化ストレス、イオンのアンバランス、代謝の欠損、神経伝達物質のアンバランス、神経毒性）はこのような疾患の全てに共通する（Ｄｏｂｌｅ，１９９９）。明らかに特定の疾患に独特な因子でも、構造変化及び他の変化をもたらす自己化合物（ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）の細胞外沈着、さらにしばしばプラーク形成に達する凝集の点での変化を含む一定の共通する特徴を共有する（Ｈａｒｄｙ及びＳｅｌｋｏｅ，２００２）。
【００１３】
ＣＮＳ損傷に対する局所免疫応答は往々にして、損傷の後に生じる進行性神経変性をもたらす（Ｈａｕｂｅｎ及びＳｃｈｗａｒｔｚ，２００３）。しかしながら、本発明者らの研究室での研究は、活性化された小膠細胞又は血中の活性化されたマクロファージは、進行中の病理に寄与するとの長い間支持されてきた考えに挑み、代わりに、これらの免疫細胞は、回復を助けるために利用されるが、必要な表現型（活性）を得ることができないか、その干渉が十分には強くないか、タイミングが不適切であることに起因して、著しいプラスの効果を示すことはできないことを示唆している。この示唆は、ラットにおいて、末梢神経（Ｒａｐａｌｉｎｏら、１９９８）又は皮膚（Ｂｏｍｓｔｅｉｎら、２００３）により活性化されたマクロファージは、脊髄損傷からの回復を促進するのに役立ち得るとの証明により支持された。このようなマクロファージの機能活性は、ＡＰＣの活性と類似していることが最近になって判明した（Ｂｏｍｓｔｅｉｎら、２００３）。
【００１４】
本発明者らによるその後の研究によって、ＣＮＳへの機械的又は生化学的損傷の後に、損傷部位に存在する自己抗原に対するＴ細胞（即ち、自己免疫Ｔ細胞）を介した局所免疫応答が、損傷に由来する異常（ｕｎｆｒｉｅｎｄｌｙ）な細胞外状態に抵抗する神経組織の能力を決定することが示唆された。したがって、損傷部位に存在する抗原に特異的なＴ細胞の形態で末梢適応免疫応答を利用することにより、体は、ＣＮＳ中の毒性の自己化合物に対して自身を防御するようである（Ｈａｕｂｅｎら、２０００ａ；Ｍｏａｌｅｍら、１９９９ａ；Ｙｏｌｅｓら、２００１；Ｓｃｈｏｒｉら、２００１ａ；Ｓｃｈｏｒｉら、２００１ｂ）。防御を仲介するＴ細胞は、特定の脅威となる自己化合物を対象とするのではなく、損傷部位に存在する優性な自己抗原を対象とする（Ｍｉｚｒａｈｉら、２００２；Ｓｃｈｗａｒｔｚら、２００３；Ｂａｋａｌａｓｈら、２００２）。
【００１５】
本発明者らによるさらなる研究により、その部位に到着したＴ細胞の内、その特異的な又は交叉反応性の抗原（ＡＰＣとして作用する局所小膠細胞によりそれらに提示される）と遭遇したものが、確実に活性化されるためには、Ｔ細胞特異性が必要であることが示唆された。次いで、活性化されたＴ細胞は、局所小膠細胞の活性及び細胞外環境の適性（ｆｒｉｅｎｄｌｉｎｅｓｓ）を制御するために必要なサイトカイン又は成長因子をもたらしうる（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、２００３；Ｍｏａｌｅｍら、２０００；Ｋｉｐｎｉｓら、２０００）。
【００１６】
Ｔ細胞依存性「保護自己免疫」の概念は、発明者らであるＭｉｃｈａｌ  Ｓｃｈｗａｒｔｚ教授らのグループによってまとめられた（Ｋｉｐｎｉｓら、２００２ａ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ及びＫｉｐｎｉｓ，２００２ａ）。この概念では、ＣＮＳへの急性又は慢性損傷は、損傷部位に存在するタンパク質に対する自己免疫応答を誘発する。損傷部位へのＴ細胞のホーミングは、細胞が関連抗原を提示することにより活性化される。いったん活性化されると、局所の免疫細胞を増大させ、制御して、毒性化合物及び組織崩壊物の効率的な除去を可能にし、さらなる変性から損傷神経を保護する。この悪い状態を軽減する免疫系の潜在能力は、正常な免疫応答を増強することにより増大される。この仮定に基づくと、適切な抗原での免疫系の増強は、神経保護をもたらすはずである。本発明者らが同定した適切な抗原は、コポリマー１である。
【００１７】
コポリマー１
Ｃｏｐ１とも称されるコポリマー１は、非病原性の合成ランダムコポリマーであり、４種のアミノ酸：Ｌ−グルタミン酸（Ｅ）、Ｌ−アラニン（Ａ）、Ｌ−チロシン（Ｙ）及びＬ−リシン（Ｋ）をおよそ１．５：４．８：１：３．６の比で、不規則な順序で含有するポリペプチドの不均一な混合物である。その作用様式は論争の的のままであるが、Ｃｏｐ１は明らかに、ヒト多発性硬化症（ＭＳ）、マウスで研究された関連自己免疫状態の実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）の進行を遅らせる。酢酸グラチラマーとしても知られているＣｏｐ１の一形態は、いくつかの国で、Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）（Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．，Ｐｅｔａｃｈ  Ｔｉｋｖａ，Ｉｓｒａｅｌ）の商品名で多発性硬化症の治療に関して承認されている。
【００１８】
本発明者らにより、Ｃｏｐ１又はＣｏｐ１活性化Ｔ細胞のワクチン接種は、外傷性ＣＮＳ損傷の後に防御的自己免疫を増強して、さらなる外傷誘発損傷を低減し、さらに、グルタミン酸毒性からＣＮＳ細胞を保護しうることが判明している。Ｃｏｐ１、Ｃｏｐ１関連ペプチド及びポリペプチド並びにこれらで活性化されたＴ細胞は、ニューロン変性を予防又は阻害し、ＣＮＳ又は末梢神経系（ＰＮＳ）での神経再生を促進し、ＣＮＳ細胞をグルタミン酸毒性から保護することを開示している、出願人の先行する米国特許出願第０９／７６５３０１号明細書及び同第０９／７６５６４４号明細書及び対応する国際公開第０１／５２８７８号パンフレット及び国際公開第０１／９３８９３号パンフレットが参照される。
【００１９】
Ｓｃｈｗａｒｔｚ教授らは、Ｃｏｐ１は、幅広い自己反応性Ｔ細胞を活性化して、ＣＮＳ白質及び灰白質変性の両方に対して有効な神経保護自己免疫をもたらす低親和性抗原として作用することを示した（Ｋｉｐｎｉｓら、２００２ａ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ及びＫｉｐｎｉｓ，２００２ａ）。本発明者らによって、Ｃｏｐ１ワクチン接種の神経保護作用が、視神経外傷（Ｋｉｐｎｉｓら、２０００）、頭部外傷（Ｋｉｐｎｉｓら、２００３）、緑内障（Ｓｃｈｏｒｉら、２００１ｂ）、筋萎縮性側索硬化症（Ａｎｇｅｌｏｖら、２００３）などの急性及び慢性神経障害の動物モデルで、出願人の国際公開第０１／５２８７８号パンフレット、国際公開第０１／９３８９３号パンフレット及び国際公開第０３／０４７５００号パンフレットにおいて証明された。
【００２０】
プリオン関連疾患を治療するためのコポリマーの使用は、国際公開第０１／９７７８５号パンフレットに開示されている。Ｇｅｎｄｅｌｍａｎらは、Ｃｏｐ１で免疫されたマウスの脾細胞を用いての受動免疫は、ＭＰＴＰ治療マウスにおいてドーパミン作動性神経保護をもたらすことを開示している（Ｂｅｎｎｅｒら、２００４）。
【００２１】
本明細書に挙げられている特許及び特許出願は全て、本明細書で完全に開示されているようにその全体を参照により援用する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、一態様において、プリオン関連疾患を除く、ミスフォールディング及び／又は凝集タンパク質の蓄積が存在する神経変性障害又は疾患を治療する方法に関し、この方法は、（ｉ）コポリマー１、（ｉｉ）コポリマー１関連ペプチド、（ｉｉｉ）コポリマー１関連ポリペプチド及び（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）で活性化されたＴ細胞からなる群から選択される薬剤を、その必要のある個人に投与することを含む。
【００２３】
一実施形態において、本発明は、プリオン関連疾患を除く、ミスフォールディング及び／又は凝集タンパク質の蓄積が存在する神経変性障害又は疾患に罹患している患者において、疾患の進行を低減し、及び／又は神経変性から保護し、及び／又はグルタミン酸毒性から保護する方法に関し、この方法は、（ｉ）コポリマー１、（ｉｉ）コポリマー１関連ペプチド、（ｉｉｉ）コポリマー１関連ポリペプチド及び（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）で活性化されたＴ細胞からなる群から選択される薬剤を治療的に活性な量で、前記患者に投与することを含む。
【００２４】
他の実施形態において、本発明は、プリオン関連疾患を除く、ミスフォールディング及び／又は凝集タンパク質の蓄積が存在する神経変性障害又は疾患に罹患している患者において、疾患の進行を低減し、及び／又は神経変性から保護し、及び／又はグルタミン酸毒性から保護する方法に関し、この方法は、（ｉ）コポリマー１、（ｉｉ）コポリマー１関連ペプチド、（ｉｉｉ）コポリマー１関連ポリペプチド及び（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）で活性化されたＴ細胞からなる群から選択される薬剤で前記患者を免疫することを含む。
【００２５】
他の態様では、本発明は、プリオン関連疾患を除く、ミスフォールディング及び／又は凝集タンパク質の蓄積が存在する神経変性障害又は疾患を治療するための薬剤組成物であって、薬学的に許容できる担体並びに（ｉ）コポリマー１、（ｉｉ）コポリマー１関連ペプチド、（ｉｉｉ）コポリマー１関連ポリペプチド及び（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）で活性化されたＴ細胞からなる群から選択される活性薬剤を含有する、薬剤組成物を提供する。一実施形態において、前記薬剤組成物はワクチンである。
【００２６】
さらなる態様では、本発明は、プリオン関連疾患を除く、ミスフォールディング及び／又は凝集タンパク質の蓄積が存在する神経変性障害又は疾患を治療するための薬剤組成物を製造するための、（ｉ）コポリマー１、（ｉｉ）コポリマー１関連ペプチド、（ｉｉｉ）コポリマー１関連ポリペプチド及び（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）で活性化されたＴ細胞からなる群から選択される活性薬剤の使用に関する。一実施形態において、前記薬剤組成物はワクチンである。
【００２７】
一実施形態において、前記神経変性疾患又は障害はハンチントン病である。他の実施形態において、前記神経変性疾患又は障害はアルツハイマー病である。他の実施形態において、前記神経変性疾患又は障害はパーキンソン病である。
【００２８】
さらに他の態様では、本発明は、包装材料並びに前記包装材料内に含まれる薬剤組成物を含有する製品であって、前記薬剤組成物は、コポリマー１、コポリマー１関連ペプチド及びコポリマー１関連ポリペプチドからなる群から選択される薬剤を含有し；前記包装材料は、前記薬剤が、ハンチントン病、アルツハイマー病又はパーキンソン病から選択される神経変性疾患又は障害を治療するために治療上有効であることを示すラベルを含む、製品を提供する。
【００２９】
本発明の最も好ましい実施形態において、活性薬剤はコポリマー１である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明の方法は、プリオン関連疾患を除く、ミスフォールディング及び／又は凝集タンパク質の蓄積が存在する神経変性障害又は疾患を治療するために、（ｉ）コポリマー１、（ｉｉ）コポリマー１関連ペプチド、（ｉｉｉ）コポリマー１関連ポリペプチド及び（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）で活性化されたＴ細胞からなる群から選択される薬剤を、その必要のある個人に投与することを含む。好ましい一実施形態では、神経変性疾患又は障害はハンチントン病である。他の好ましい実施形態では、神経変性疾患又は障害はアルツハイマー病である。さらに好ましい実施形態では、神経変性疾患又は障害はパーキンソン病である。
【００３１】
コポリマー１、Ｃｏｐ１関連ペプチド若しくはポリペプチド又はそれらで活性化されたＴ細胞での治療は、ハンチントン病、アルツハイマー病又はパーキンソン病に罹患している患者において疾患進行を低下させ、神経変性から保護し、及び／又はグルタミン酸毒性から保護することを目的としている。一実施形態では、免疫により治療を行う。他の実施形態では、治療的有効量の選択薬剤を患者に投与する。これら２種の治療の用量及びレジメンは、異なってよい。
【００３２】
さらに本発明により、ハンチントン病、アルツハイマー病又はパーキンソン病に伴う神経変性並びに認知低下及び障害を治療又は予防する方法が提供され、この方法は、ｉ）コポリマー１、（ｉｉ）コポリマー１関連ペプチド、（ｉｉｉ）コポリマー１関連ポリペプチド及び（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）で活性化されたＴ細胞からなる群から選択される薬剤をその必要のある個人に投与することを含む。
【００３３】
本出願で使用する場合、「Ｃｏｐ１」及び「コポリマー１」の用語は、交換可能に使用されている。
【００３４】
本発明の目的では、「Ｃｏｐ１又はＣｏｐ１関連ペプチド若しくはポリペプチド」は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）と機能的に交叉反応し、抗原提示においてＭＨＣクラスＩＩ上のＭＢＰと競合しうる、ランダムコポリマーを含むペプチド又はポリペプチドを含むこととする。
【００３５】
本発明の組成物又はワクチンは、適切な比で、グルタミン酸又はアスパラギン酸などの負に荷電されているアミノ酸（好ましくは、より低い量で）と組み合わせて、場合によっては、充填物質として役立つアラニン又はグリシンなどの非荷電中性アミノ酸と組み合わせて、場合によっては、チロシン又はトリプトファンのような芳香族アミノ酸などのコポリマーに免疫原性特性をもたらすようなアミノ酸を伴って、リシン又はアルギニンなどの正に荷電しているアミノ酸からなるランダムコポリマーにより表示されるＣｏｐ１又はＣｏｐ１関連ペプチド若しくはポリペプチドを、活性薬剤として含有してもよい。このような組成物は、その内容が全て、参照により本明細書に援用される国際公開第００／０５２５０号パンフレットに開示されているコポリマーのいずれかを含んでもよい。
【００３６】
さらに具体的には、本発明で使用される組成物は、次の群のうちの少なくとも３群から選択されるそれぞれ１種のアミノ酸を含有するランダムコポリマーを含む群から選択される少なくとも１種のコポリマーを含有する：リシン及びアルギニン；（ｂ）グルタミン酸及びアスパラギン酸；（ｃ）アラニン及びグリシン；（ｄ）チロシン及びトリプトファン。
【００３７】
本発明で使用するためのコポリマーは、Ｌ−若しくはＤ−アミノ酸又はこれらの混合物から構成されてよい。当業者には知られているように、Ｌ−アミノ酸は大抵の天然タンパク質中に存在する。しかしながら、Ｄ−アミノ酸は、市販されており、本発明で使用されるコポリマーを製造するために使用されるアミノ酸の一部又は全部と交換することができる。本発明は、Ｄ−及びＬ−アミノ酸の両方を含有するコポリマー、さらに主にＬ−又はＤ−アミノ酸を含有するコポリマーを使用することを意図する。
【００３８】
本発明の一実施形態では、コポリマーは、それぞれ群（ａ）から（ｄ）の異なる群からの４種の異なるアミノ酸を含有する。
【００３９】
さらに好ましい実施形態では、本発明の薬剤組成物又はワクチンは、正味で全体として正電荷を有し、約２ＫＤａから約４０ＫＤａの分子量を有し、主にアミノ酸Ｌ−グルタミン酸（Ｅ）、Ｌ−アラニン（Ａ）、Ｌ−チロシン（Ｙ）及びＬ−リシン（Ｋ）を１．５：４．８：１：３．６の近似比で含有するランダムポリペプチドの混合物であるコポリマー１を含有する。好ましい一実施形態では、Ｃｏｐ１は、約２ＫＤａから約２０ＫＤａ、さらに好ましくは約４．７ＫＤａから約１３ＫＤａ、いっそう好ましくは約４ＫＤａから約８．６ＫＤａ、約５ＫＤａから約９ＫＤａ、約６．２５ＫＤａから８．４ＫＤａの平均分子量を有する。他の好ましい実施形態では、Ｃｏｐ１は、約１３ＫＤａから約２０ＫＤａ、さらに好ましくは約１３ＫＤａから約１６ＫＤａ、又は約１５ＫＤａから約１６ＫＤａの平均分子量を有する。Ｃｏｐ１では、４０ＫＤａ未満の他の平均分子量も、本発明に包含される。当技術分野で知られている方法により、例えば、その内容の全てが、参照によりそのまま本明細書に援用される米国特許第５８００８０８号明細書に記載されている方法により、前記分子量範囲のコポリマー１を調製することができる。コポリマー１は、その長さに約１５から約１００個、好ましくは約４０個から約８０個のアミノ酸を含有するポリペプチドであってよい。好ましい一実施形態では、Ｃｏｐ１は、一般名酢酸グラチラマーで知られているその酢酸塩の形態であり、これは、いくつかの国で、Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）（Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｌｔｄ．，Ｐｅｔａｃｈ  Ｔｉｋｖａ，Ｉｓｒａｅｌ）の商品名で多発性硬化症（ＭＳ）の治療に関して承認されている。本明細書に開示されているワクチンでのコポリマー１の活性は、次の置換、グルタミン酸をアスパラギン酸にする置換、アラニンをグリシンにする置換、リシンをアルギニンにする置換チロシンをトリプトファンにする置換の１つ又は複数が行われても、存続されると予期される。
【００４０】
本発明の他の実施形態では、Ｃｏｐ１関連ペプチド又はポリペプチドは、群（ａ）から（ｄ）のうちの３つの群からそれぞれ１種の異なる３種のアミノ酸を含有するコポリマーである。これらのコポリマーは、本明細書では、ターポリマーと称される。
【００４１】
一実施形態では、Ｃｏｐ１関連ペプチド又はポリペプチドは、チロシン、アラニン及びリシンを含有するターポリマーであり（以後、ＹＡＫと称する）、このターポリマーでは、アミノ酸の平均モル分率は変動してよく、チロシンは、０．０５〜０．２５０のモル分率で、アラニンは約０．３〜０．６のモル分率で、リシンは約０．１〜０．５のモル分率で存在してよい。さらに好ましくは、チロシン、アラニン及びリシンのモル比は、それぞれ約０．１０：０．５４：０．３５である。リシンがアルギニンに、アラニンがグリシンに、及び／又はチロシンがトリプトファンに置換されていてもよい。
【００４２】
他の実施形態では、Ｃｏｐ１関連ペプチド又はポリペプチドは、チロシン、グルタミン酸及びリシンを含有するターポリマーであり（以後、ＹＥＫと称する）、このターポリマーでは、アミノ酸の平均モル分率は変動してよく、グルタミン酸は、約０．００５〜０．３００のモル分率で存在してよく、チロシンは、約０．００５〜０．２５０のモル分率で存在してよく、リシンは、約０．３〜０．７のモル分率で存在してよい。さらに好ましくは、グルタミン酸、チロシン及びリシンのモル比は、それぞれ約０．２６：０．１６：０．５８である。グルタミン酸をアスパラギン酸に、リシンをアルギニンに、及び／又はチロシンをトリプトファンに置換することもできる。
【００４３】
他の好ましい実施形態では、Ｃｏｐ−１関連ペプチド又はポリペプチドは、リシン、グルタミン酸及びアラニン含有するターポリマーであり（以後、ＫＥＡと称する）、このターポリマーでは、アミノ酸の平均モル分率は変動してよく、グルタミン酸は、約０．００５〜０．３００のモル分率で存在してよく、アラニンは、約０．００５〜０．６００のモル分率で存在してよく、リシンは、約０．２〜０．７のモル分率で存在してよい。さらに好ましくは、グルタミン酸、アラニン及びリシンのモル比は、それぞれ約０．１５：０．４８：０．３６である。グルタミン酸をアスパラギン酸に、アラニンをグリシンに、及び／又はリシンをアルギニンに置換することもできる。
【００４４】
好ましい実施形態では、ＣＯＰ１関連ペプチド又はポリペプチドは、チロシン、グルタミン酸及びアラニンを含有するターポリマーであり（以後、ＹＥＡと称する）、このターポリマーでは、アミノ酸の平均モル分率は変動してよく、チロシンは、約０．００５〜０．２５０のモル分率で、グルタミン酸は、約０．００５〜０．３００のモル分率で、アラニンは、約０．００５〜０．８００のモル分率で存在してよい。さらに好ましくは、グルタミン酸、アラニン及びチロシンのモル比は、それぞれ約０．２１：０．６５：０．１４である。チロシンをトリプトファンに、グルタミン酸をアスパラギン酸に、及び／又はアラニンをグリシンに置換することもできる。
【００４５】
ターポリマーＹＡＫ、ＹＥＫ、ＫＥＡ及びＹＥＡの平均分子量は、約２ＫＤａから４０ＫＤａ、好ましくは約３ＫＤａから３５ＫＤａ、さらに好ましくは約５ＫＤａから２５ＫＤａの間で変動してよい。
【００４６】
当技術分野で知られている方法により、例えば、所望のモル比のアミノ酸を溶液の形態で使用する縮合条件下で、又は固相合成手順により、コポリマー１並びに関連ペプチド及びポリペプチドを調製することができる。縮合条件には、１種のアミノ酸のカルボキシル基と他のアミノ酸のアミノ基とを縮合させて、ペプチド結合を生じさせるために適した温度、ｐＨ及び溶剤条件が含まれる。縮合剤、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミドを使用して、ペプチド結合の形成を促進することができる。ブロック基を使用して、側鎖部分並びにいくつかのアミノ又はカルボキシル基などの官能基を望ましくない副反応に対して保護することもできる。
【００４７】
例えば、米国特許第３８４９５５０号明細書に開示されているプロセスにより、コポリマーを調製することができ、この際、周囲温度（２０℃〜２６℃）で、無水ジオキサン中で、開始剤としてジエチルアミンを用いて、チロシンのＮ−カルボキシ無水物、アラニン、グルタミン酸γ−ベンジル及びＮε−トリフルオロアセチル−リシンを重合させる。氷酢酸中の臭化水素により、グルタミン酸のγ−カルボキシル基を脱ブロックすることができる。１Ｍのピペリジンにより、トリフルオロアセチル基をリシンから除去する。当業者であれば、このプロセスを調節して、グルタミン酸、アラニン、チロシン又はリシンのうちのいずれか１種に関する反応を選択的に除外することにより、所望のアミノ酸、即ち、コポリマー１中の４種のアミノ酸のうちの３種を含有するペプチド及びポリペプチドを製造することができることを容易に理解するであろう。
【００４８】
ポリペプチド合成の間に、又はコポリマーを製造した後に、コポリマーの分子量を調節することができる。ポリペプチド合成の間に分子量を調節するためには、合成条件又はアミノ酸量を調節して、ポリペプチドが望ましいほぼ正確な長さに達したら合成が止まるようにする。合成の後に、分子量サイジングカラム又はゲルでのポリペプチドのクロマトグラフィー及び望ましい分子量範囲の収集などの利用可能なサイズ選択手順のいずれかにより、所望の分子量を有するポリペプチドを得ることができる。例えば酸又は酵素加水分解により、コポリマーを部分的に加水分解して、高分子量種を除去し、次いで精製して、酸又は酵素を除去することができる。
【００４９】
一実施形態では、保護ポリペプチドと臭化水素酸とを反応させて、所望の分子量プロファイルを有するトリフルオロアセチル−ポリペプチドを生じさせることを含むプロセスにより、所望の分子量を有するコポリマーを調製することができる。１回又は複数回の試験反応により予め決定された時間及び温度で、反応を行う。試験反応では、時間及び温度を変動させて、試験ポリペプチドの所定バッチの分子量範囲を決定する。最適な分子量範囲をポリペプチドバッチにもたらした試験条件を、そのバッチのために使用する。したがって、試験反応により予め決定された時間及び温度で、保護ポリペプチドと臭化水素酸とを反応させることを含むプロセスにより、所望の分子量プロファイルを有するトリフルオロアセチル−ポリペプチドを生じさせることができる。次いで、所望の分子量プロファイルを有するトリフルオロアセチル−ポリペプチドをさらに、ピペリジン水溶液で処理して、所望の分子量を有する低毒性ポリペプチドを生じさせる。
【００５０】
好ましい実施形態では、所定のバッチからの保護ポリペプチドの試験試料を臭化水素酸と、約２０〜２８℃の温度で約１０〜５０時間反応させる。いくつかの試験反応を実施することにより、このバッチでの最良の条件を決定する。例えば、一実施形態では、保護ポリペプチドを臭化水素酸と約２６℃の温度で約１７時間反応させる。
【００５１】
Ｃｏｐ１とＭＳ随伴ＨＬＡ−ＤＲ分子との結合モチーフは知られているので（Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、１９９９）、規定の配列を有するＣｏｐ１に由来するポリペプチドは、Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）刊行物に記載されているように、容易に調製し、ＨＬＡ−ＤＲ分子のペプチド結合グルーブへの結合に関して試験することができる。このようなペプチドの例は、その全内容が参照により本明細書に援用される国際公開第００／０５２４９号パンフレット及び国際公開第００／０５２５０号パンフレットに開示されているものであり、下記の配列番号１〜３２のペプチドが含まれる。
【化１】
0005456235.tif 000002
【００５２】
Ｃｏｐ１から誘導されるこのようなペプチド及び他の同様のペプチドは、Ｃｏｐ１と同様の活性を有すると考えられる。このようなペプチド及び他の同様のペプチドはさらに、Ｃｏｐ１関連ペプチド又はポリペプチドの定義内と見なされ、その使用は、本発明の一部と見なされる。
【００５３】
本発明による「Ｃｏｐ１関連ペプチド又はポリペプチド」との定義は、Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、２００２により記載されたランダム４−アミノ酸コポリマーなどの他の合成アミノ酸コポリマー（多発性硬化症を治療するための候補物質）、即ち、アミノ酸のフェニルアラニン、グルタミン酸、アラニン及びリシン（ポリＦＥＡＫ）を、又はチロシン、フェニルアラニン、アラニン及びリシン（ポリＹＦＡＫ）を含有するコポリマー（１４、３５及び５０マー）並びにＣｏｐ１に類似の万能抗原と考えられることが判明している他の同様のコポリマーを包含することを意味している。
【００５４】
他の実施形態では、本発明は、ハンチントン病、アルツハイマー病又はパーキンソン病から選択される神経変性疾患又は障害を治療することに関し、これは、好ましくはＣｏｐ１の存在下に、又はＣｏｐ１関連ペプチド若しくはポリペプチドにより活性化されたＴ細胞をその必要のある患者に投与することを含む。このようなＴ細胞は好ましくは、自己由来、さらに好ましくは、ＣＤ４及び／又はＣＤ８表現型であるが、これらはさらに、血縁関連ドナー（例えば、兄弟、親、子供）又はＨＬＡ−適合又は部分適合の半同種若しくは完全同種ドナーに由来する、同種Ｔ細胞であってもよい。この目的のためのＴ細胞は、いずれも、本明細書に完全に開示されているかのように、その全体を参照により本明細書に援用される国際公開第０１／９３８９３号パンフレットに対応するＵＳＳＮ０９／７５６３０１及びＵＳＳＮ０９／７６５６４４に記載されている。
【００５５】
投与されるＣｏｐ１の用量は、患者の年齢及び疾患段階に応じて医師によって決定され、１〜８０ｍｇの範囲、好ましくは２０ｍｇから選択することができるが、他の適切な用量も、本発明に包含される。好ましくは治療を、適切な時間間隔で、好ましくは１、４又は６週間ごとの繰り返し投与により実施すべきであるが、治療される神経変性疾患、患者の年齢及び状態に応じて、他の適切な免疫の間隔も本発明では考えられる。
【００５６】
本発明で使用するための薬剤組成物は、１種又は複数の生理学的に許容できる担体又は付形剤を使用する慣用の方法で処方することができる。担体は、組成物の他の成分と相容性であり、そのレシピエントに有害でないという意味において、「許容でき」なければならない。
【００５７】
本発明では、コポリマー１又はコポリマー１関連ペプチド若しくはポリペプチドを含有する組成物は、防御的自己免疫をもたらすレジメンで投与され、場合によっては、神経保護ワクチン接種のためのワクチンである。このようなワクチンは、望ましい場合には、ヒト臨床使用に適したアジュバントで乳化されたコポリマー１を含有してもよい。
【００５８】
したがって、本薬剤では、活性薬剤はアジュバントを用いずに投与することもできるし、ヒト臨床使用に適したアジュバント中で乳化することもできる。アジュバントは、水酸化アルミニウム、水酸化アルミニウムゲル及びヒドロキシリン酸アルミニウム若しくはヒト臨床使用に適していることが判明している他のアジュバントから選択する。好ましい実施形態では、ワクチンアジュバントは、酸性等電点及び１：１のＡｌ：Ｐ比を有する非晶質ヒドロキシリン酸アルミニウム（後記ではＡｌｕｍ−ｐｈｏｓ）である。これは、例として挙げられているにすぎず、このワクチンは、構成成分及び構成成分の相対割合の両方に関して変動しうることは、明らかである。
【００５９】
投与方法には、これらに限られないが、例えば非経口、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、粘膜（例えば、口、鼻腔内、頬、膣、直腸、眼内）、くも膜下、局所及び真皮内経路が含まれる。投与は、全身又は局所であってよい。
【００６０】
本発明では、Ｃｏｐ１又はＣｏｐ１関連ペプチド若しくはポリペプチドは、単独治療として、又はアルツハイマー、ハンチントン又はパーキンソン病を治療するための１種又は複数の薬剤と組み合わせて使用することができる。アルツハイマー、ハンチントン又はパーキンソン病を治療するために適した１種又は複数の他の薬物と一緒に投与する場合、１種又は複数の付加的な薬物を、製造者の指示に従い、ワクチンレジメンとは無関係に、ワクチン接種と同日に、その後に連日、又は間隔を空けて投与することができる。
【００６１】
本発明を、次の非限定的実施例により詳述する。
【実施例】
【００６２】
セクションＩ：ハンチントン病を治療するためのＣｏｐ１によるワクチン接種
ＣＡＧ突然変異により生じる初期の病理学的、分子及び細胞異常の研究を可能にする、ハンチントン病の様々なマウスモデルが確立されている。ＨＤ  Ｒ６／２トランスジェニックマウスモデルを、本発明でのｉｎ  ｖｉｖｏ試験系として選択した。これらのマウスは、ハンチンチンをコードするＣＡＧリピート長の長いヒトハンチントン病遺伝子のエキソン１を過剰発現する（Ｍａｎｇｉａｒｉｎｉら、１９９６）。ＨＤ  Ｒ６／２トランスジェニックマウスは、５〜６週齢という早期に行動運動欠失（ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ−ｍｏｔｏｒ  ｄｅｆｉｃｉｔｓ）を示す。行動異常は、８週齢までは現れず、その後、低体重、握り締め（ｃｌａｓｐｉｎｇ）、振戦及び痙攣を伴う進行性の重度な神経表現型、さらに１０〜１４週齢での早期の死亡が生じる（Ｃａｒｔｅｒら、１９９９）。
【００６３】
グルタミン酸毒性モデルに基づくと、４週間間隔でのＣｏｐ１  ７５μｇの反復注射のレジメンにより、マウスでの最適な神経保護作用が確立された。同じレジメンの治療が、ＨＤ  Ｒ６／２トランスジェニックマウスにも有利であることが判明し、ロータロッド（ｒｏｔａｒｏｄ）パフォーマンスの著しい維持及び動物の寿命の延長により示されるように、運動機能低下速度を低減した。
【００６４】
材料及び方法−セクションＩ
（ｉ）動物
８〜１３週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ系のマウスは、Ａｎｉｍａｌ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）により供給された。実験で使用する前に、ケタミン８０ｍｇ／ｋｇ及びキシラジン１６ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与することによりマウスに麻酔をかけた。ハンチンチンをコードするヒト遺伝子を過剰発現するトランスジェニックＲ６／２マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た。Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ及びＵｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）により確立された規則に従い全ての動物を取り扱った。
【００６５】
（ｉｉ）試薬
コポリマー１（中央ＭＷ：７２００ダルトン）は、Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．（Ｐｅｔａｃｈ  Ｔｉｋｖａ，Ｉｓｒａｅｌ）により供給された。
【００６６】
（ｉｉｉ）免疫
免疫のために、マウスの側腹部の１カ所に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：１００μｌ）に溶かしたＣｏｐ１を皮下注射した。対照マウスには、ビヒクルのみを注射した。
【００６７】
（ｉｖ）グルタミン酸注射
麻酔をかけたＣ５７Ｂ  ＢＬ／６Ｊマウスの右眼に、強膜の上部で２７ゲージ針で穴を開け、３０ゲージ針を有する１０μｌハミルトンシリンジを硝子体からなるべく遠くに挿入した。マウスに、生理食塩水に溶かしたＬ−グルタミン酸塩を全体積で１μｌ（２００ｎｍｏｌ）眼内注射した。
【００６８】
（ｖ）マウスの網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の標識
実験の終了７２時間前に、ＲＧＣを標識した。マウスに麻酔をかけ、定位装置に置いた。頭蓋を暴露し、乾燥及び清浄に保った。ブレグマを同定し、マーキングした。注射の所定の点は、脳表面から２ｍｍの深さ、前後軸においてブレグマの２．９２ｍｍ後、正中線に対して０．５ｍｍ側方であった。左右の半球の所定の座標上の頭皮を開口した。次いで、ハミルトンシリンジを使用して、神経トレーサー（ｎｅｕｒｏｔｒａｃｅｒ）染料ＦｌｕｏｒｏＧｏｌｄ（生理食塩水中５％の溶液；Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ，Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ）を適用し（１μｌ、各半球で０．５μｌ／分の速度）、創傷の上の皮膚を縫合した。染料の逆行取り込みは、生存細胞のマーカーを提供する。
【００６９】
（ｖｉ）マウスでの生存ＲＧＣの評価
マウスに致死用量のペントバルビトン（１７０ｍｇ／ｋｇ）を与えた。その眼を摘出し、網膜を切り離し、パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中４％）中の平坦な全体マウントとして調製した。同一のサイズ（０．５ｍｍ２）の４〜６個の選択領域からの標識細胞数を測定した。選択した領域は、視神経円板からほぼ同じ距離（０．３ｍｍ）に位置させて、視神経円板からの距離の関数としてのＲＧＣ密度における変動を克服した。マウスに与えられた治療を知らない観察者が、蛍光顕微鏡（倍率×９００）で、領域を計測した。各網膜での１領域当たりのＲＧＣの平均数を算出した。ニューロンを保護する際の様々なワクチン製剤の有効性を、生存ＲＧＣを計測することにより測定する。
【００７０】
（実施例１）
グルタミン酸毒性  Ｃｏｐ１ワクチン接種の用量及びレジメンを選択するためのｉｎ  ｖｉｖｏモデル
グルタミン酸は、ＣＮＳ中に低濃度で通常は存在するアミノ酸であり、主要な興奮性神経伝達物質として役立っている。しかしながら、多くの神経変性疾患では、グルタミン酸レベルが毒性レベルまで上昇して、細胞損傷をもたらしている。したがって、このモデルを選択し、Ｃｏｐ１神経保護ワクチン接種を確立し、治療レジメンを最適化した。グルタミン酸毒性を、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスの眼にグルタミン酸を眼内注射し、次いで、視覚信号を脳に伝達するニューロンであるＲＧＣのその後の死を測定することにより、評価する。
【００７１】
１ａ．Ｃｏｐ１の用量決定
グルタミン酸誘発ＲＧＣ死に対するＣｏｐ１ワクチン接種の用量の影響を研究するために、完全フロイントアジュバント中で乳化されたＣｏｐ１（ＣＦＡ；Ｃｏｐ１  ２５、７５又は２２５μｇ、全体積１００μｌ）をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの側腹部の１カ所に皮下注射し、７日後に、グルタミン酸（２００ｎｍｏｌ）をマウスの硝子体に注射した。７日後に、生存ＲＧＣを計測した。予め免疫しなかった場合のグルタミン酸毒性後のＲＧＣ死の量を保護可能な細胞に１００％と見なした。図１に示されている結果により、Ｃｏｐ１を２５μｇ又は７５μｇ投与することにより、有効なワクチン接種が得られた。
【００７２】
グルタミン酸注射の７、１４及び２８日前に、Ｃｏｐ１  ７５μｇをワクチン接種することにより、神経保護作用の潜時を決定した。図２に示されているように、Ｃｏｐ１の１回注射の神経保護作用は、免疫７日後に最適である（ＲＧＣ死の≧４０％の低減）。神経保護作用は、ワクチン接種後１４日目及び２８日目に低減した。
【００７３】
１ｂ．反復Ｃｏｐ１注射の最適なレジメン
Ｃｏｐ１免疫の神経保護作用を維持するために、Ｃｏｐ１の反復注射を評価した。この目的は、長期ＲＧＣ生存効果を最適化しうる反復Ｃｏｐ１注射の最適なレジメンを決定することであった。
【００７４】
Ｃｏｐ１は元々、ＣＮＳの自己ペプチドに対する非制御Ｔ細胞活性を特徴とする自己免疫疾患である多発性硬化症（ＭＳ）のための治療として開発された。Ｃｏｐ１は、ＭＳ患者には、患者１人当たり２０ｍｇの用量で１日１回皮下注射により投与されている。Ｃｏｐ１の連日注射を数日間繰り返すと、ＲＧＣに対する神経保護作用が維持されるかどうかを試験した。マウスをＣｏｐ１で２又は３日間連日免疫した（Ｃｏｐ１、２５μｇ／マウス及び７５μｇ／マウス）。図３に示されている結果は、Ｃｏｐ１の連日注射を２日間繰り返すと、ＲＧＣに対して神経保護をもたらし、Ｃｏｐ１  ７５μｇでより良好な保護が達成されるが、連続３日間の免疫すると、ＲＧＣに対する神経保護作用は失われることを示している。
【００７５】
最適な程度の神経保護をもたらすワクチン接種レジメン（最適な時間間隔）を決定するために、３回反復Ｃｏｐ１注射を、連日から１カ月ごとの範囲の異なる時間間隔で、マウスに投与した。１つの実験では、マウスに１、２、３、４、６及び８週間の間隔でＣｏｐ１  ７５μｇ注射を２回投与した。他の実験では、マウスに連日又は１、２及び４週間間隔でＣｏｐ１  ７５μｇを３回繰り返して投与した。結果をそれぞれ、図４及び５に示す。処置の神経保護作用は、グルタミン酸毒性が誘発される７日前に注射したＣｏｐ１（７５μｇ／マウス）の１回注射に対する％として表されている。この１回注射は、陽性対照として決定されており、各実験で行われた。図４及び５で分かるように、４週間間隔のＣｏｐ１注射（７５μｇ／マウス）が、最も高い神経保護作用を示した。多発性硬化症の治療として使用されているレジメンであるＣｏｐ１の連日投与は、低い神経保護しかもたらさないことは、印象深い。
【００７６】
グルタミン酸毒性モデルを使用する結果は、Ｃｏｐ１の反復注射のレジメンは、持続性の神経保護作用をもたらしうることを示している。これらの結果に基づき、マウスでの最適な神経保護作用は、４週間間隔でＣｏｐ１を７５μｇで反復注射することであることが判明した。
【００７７】
（実施例２）
Ｃｏｐ１ワクチン接種に対する細胞免疫応答と神経保護作用との相間関係
２種のｅｘ  ｖｉｖｏマーカー、Ｔ細胞刺激指数及びインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）は、効果と相関している。刺激指数は、Ｃｏｐ１応答性Ｔ細胞がリンパ球集団内に存在する程度を示している。ＩＦＮ−γ分泌は、「Ｔｈ１」サブタイプのＴ細胞に特徴的である。したがって、これらのマーカーは、細胞免疫応答をプロファイリングする手段をもたらす。
【００７８】
したがって、Ｔ細胞増殖及びサイトカイン分泌のレベルプロファイルをｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価することにより、神経保護作用とＣｏｐ１に対する細胞免疫応答との相間関係を決定した。
【００７９】
様々な用量のＣｏｐ１（２５、７５及び２２５μｇ／マウス）で免疫したマウスから、免疫の７、１４、２１及び２８日後に脾臓リンパ球を単離し、［３Ｈ］チミジン導入によりＣｏｐ１に対する脾細胞の増殖応答を、さらにＥＬＩＳＡアッセイによりサイトカイン産生（ＩＦＮ−γ）の誘発を測定することにより、Ｃｏｐ１ワクチン接種の効果を試験した。
【００８０】
脾細胞による標識チミジンの取り込みは、Ｃｏｐ１ワクチン接種後の、Ｃｏｐ１に特異的なＴ細胞の増殖を示している。図６の結果は、刺激指数（ＳＩ）として示されており、ここで、ＳＩは、抗原（Ｃｏｐ１）なしにｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベーションされた細胞の平均ｃｐｍで割った、抗原（Ｃｏｐ１）と共にｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベーションした細胞の平均ｃｐｍである。陽性応答は、ＳＩ＞２と定義した。Ｃｏｐ１の１回注射は、この３つの用量で７日後に高いＳＩをもたらした。１４日後に、Ｃｏｐ１の２５及び２２５μｇの注射では、Ｔ細胞の僅かな増殖のみが観察され、Ｃｏｐ１の７５μｇの注射ではより低い増殖が観察された。ＳＩは、２１及び２８日後には低下し、このことは、Ｃｏｐ１に応答しての脾細胞増殖が衰えたことを意味している。これらの結果は、時間と共に神経保護効果が低下することを示したグルタミン酸毒性の結果を実証している。
【００８１】
刺激された脾細胞によるＩＮＦ−γの分泌を、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により測定した。図７に示されているように、脾増細胞からの最も高いレベルのＩＮＦ−γ分泌は、Ｃｏｐ１免疫（２５及び７５μｇ／マウス）の７日後に観察された。ＩＮＦ−γレベルは、１４、２１及び２８日後には低下した。これらの結果は、神経保護効果及びＴ細胞増殖について得られた結果と一致する。
【００８２】
神経保護効果は、図１に示されている効果と同様に、ＩＦＮ−γ分泌と相関した。対照的に、Ｔ細胞増殖は、Ｃｏｐ１を連日注射しても、高いままであった。この結果は、Ｃｏｐ１応答Ｔ細胞は未だ存在するが、ＩＦＮ−γ分泌の消失は、細胞の主要な表現型のシフトを表すことを示している。このことは、神経保護効果の消失を伴う。したがって、神経保護は、ＩＦＮ−γ分泌と関係しているようである。
【００８３】
前記動物での結果は、ＭＳ患者へのＣｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）の連日投与はＴｈ２型応答をもたらすという観察と一致する（Ｖｉｅｉｒａら、２００３）。したがって、Ｃｏｐ１の連日レジメンは、神経保護をもたらすと考えるべきでなく、ハンチントン病のために選択されるレジメンではない。比較的広い間隔を開けたワクチン接種が有効なようである。
【００８４】
（実施例３）
ハンチントン病のｉｎ  ｖｉｖｏ動物実験系
Ｃｏｐ１ワクチン接種の有益な効果を、ＨＤ  Ｒ６／２トランスジェニックマウス試験系を使用して、神経保護効果に関して実験した。Ｒ６／２トランスジェニックマウスは、複数のＣＡＧリピートの挿入を含む突然変異ヒトハンチンチン遺伝子を過剰発現する（Ｍａｎｇｉａｒｉｎｉら、１９９６）。これらのマウスは、５〜６週齢の早期から始まる進行性の行動−運動欠損を示し、これは、１０〜１３週目で早発死をもたらした。症状には、低体重、抱擁、振戦及び痙攣が含まれた（Ｃａｒｔｅｒら、１９９９）。
【００８５】
２種の異なる用量、Ｃｏｐ１  ７５μｇ／マウス（ｎ＝１３）及びＣｏｐ１  １５０μｇ／マウス（ｎ＝１１）のＣｏｐ１ワクチン接種を試験し、４５日齢時とその後４週ごとに注射した。第３群（ｎ＝１２）には、Ｃｏｐ１  ７５μｇを６０日齢時とその後４週ごとにワクチン接種した。対照群（ｎ＝１７）には、ＰＢＳを４５日齢時とその後４週ごとに注射した。回転棒に留まるマウスの能力を評価するロータロッドパフォーマンス試験を使用して、運動神経機能を評価した。この試験では、マウスを２ｒｐｍで回転する棒上に置き、マウスが回転棒から落ちるまでの時間（３回の試みのうちの最良のもの、各試験ごとに１８０秒まで）を動物の運動機能の尺度として使用する。各マウスを週２回試験し、その２回のスコアを平均した。
【００８６】
結果を図８に示す。グラフ上の各点は、各週での平均の群スコアを示している（誤差棒によりＳＥＭを示す）。ｘ軸上の矢印は、Ｃｏｐ１（又はＰＢＳ）注射の時期を示している。結果は、４５日齢で開始したそれぞれ７５μｇ／マウス又は１５０μｇ／マウスのＣｏｐ１のワクチン接種は、８から１４週の追跡期間の間、運動パフォーマンスに著しい改善をもたらすことを示している。しかしながら、６０日齢で開始したＣｏｐ１  ７５μｇ／マウスのワクチン接種は、著しい効果を示さなかった（データは示さない）。
【００８７】
対照及びＣｏｐ１ワクチン接種されたＨＤ  Ｒ６／２トランスジェニックマウス（１５０μｇ／マウス）を、４５日目に、４種の異なる速度、２、５、１５及び２５ｒｐｍを使用して、ロータロッドパフォーマンス試験にかけた。図９により、Ｃｏｐ１ワクチン接種後のロータロッドパフォーマンスの改善は、回転速度に依存していることが分かる。非処置ＨＤ  Ｒ６／２対照マウスと比較して、１２週齢ワクチン接種されたＨＤ  Ｒ６／２マウスの著しく改善されたパフォーマンスは、５ｒｐｍロータロッド速度を使用すると、最も明白である。
【００８８】
ＨＤ  Ｒ６／２トランスジェニックマウスの体重低下に対するＣｏｐ１ワクチン接種の効果を、３つの群で試験した。１日のうちの同じ時間に、マウスを週に２回秤量した。それぞれＣｏｐ１  ７５μｇ／マウス又は１５０μｇ／マウスを使用して４５日又は６０日目にワクチン接種した後、体重については、対照群と比較して効果は観察されなかった。
【００８９】
さらに、Ｃｏｐ１ワクチン接種は、ＨＤ  Ｒ６／２マウスの死亡及び疾患発症をかなり遅くすることを観察することができた。ＨＤトランスジェニックマウスの生存率に対するＣｏｐ１ワクチン接種の効果を、表１に示す。生存率の統計的比較を、ＡＮＯＶＡ、続いてＦｉｓｈｅｒ最小有意差試験により行った。
【表１】
0005456235.tif 000003
【００９０】
結論として、実施例１及び２の結果は、Ｃｏｐ１ワクチン接種は、高レベルの興奮毒性（ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃ）神経伝達物質グルタミン酸に暴露されることにより誘発されるニューロン細胞死を減じ、神経保護作用は、ＩＮＦ−γ（Ｔｈ１）を分泌するＣｏｐ１特異的Ｔ細胞の活性化及び増殖に依存していることを示している。増強レジメンにより維持されない限り、神経保護作用は、短命であり、この作用は、免疫の７日目まで増大し、その後応答を終わらせる調節細胞の活性化によって低減される。動物モデルで最も活性であると判明したＣｏｐ１の用量は、Ｃｏｐ１  ７５μｇ／マウスであり、これは、ｍｇ／ｍ２ベースで、ヒト成人用量２０ｍｇに換算される。実施例３に示されているように、マウスでの神経保護に最適なレジメンは、グルタミン酸毒性モデルでも、運動機能欠損の速度を低下させ、ＨＤ  Ｒ６／２トランスジェニックマウスの平均余命を改善するためにも、月１回の注射であった。したがって、ヒトへの使用では、神経保護用のＣｏｐ１ワクチン接種は、少なくとも１カ月空けて、好ましくは４〜６週間空けて、さらに好ましくは５又は６週ごとの用量で投与すべきである。
【００９１】
（実施例４）
ハンチントン病でのヒト臨床試験
ヒト試験の第１の目的は、ハンチントン病患者での、プラセボに対するＣｏｐ１（Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）又は他のＣｏｐ１製剤）２０ｍｇ又は２×２０ｍｇ用量の連続投与の忍容性、安全性及び免疫学的応答を評価することである。この試験の第２の目的は、次の神経学的臨床パラメータ、統一ハンチントン病評定スケール（Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ（ＵＨＤＲＳ））及び全運動スケール（Ｔｏｔａｌ  Ｍｏｔｏｒ  Ｓｃａｌｅ（ＴＭＳ））を測定することによる、Ｃｏｐ１投与後のＨＤ疾患患者の神経学的経過を評価することである。
【００９２】
適格患者（女性及び男性、１８〜７０才、臨床診断されたＨＤ及びＨＤの確認された家族歴を有する症状のある患者）に、プラセボ（マンニトール４０ｍｇ／注射）の１回投与及びＣｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）の３回投与（皮下２０ｍｇ／ｍｌ又は皮下２×２０ｍｇ／ｍｌ、それぞれの腕に１回）を６週の投与間隔で投与する。免疫学的プロファイル分析のための血液試料を、スクリーニングの際と、最初の注射の前に採取する。コポリマー１の各投与の後に、一連の血液採取を続けて、７、１４、２８日目と、次の注射の直前と終了時での免疫学的プロファイルを決定する。
【００９３】
ＵＨＤＲＳは、ハンチントン研究グループ（ＨＳＧ）により開発された研究ツールである。スケールの目的は、研究者が、ＨＤの症状に等級をつけて、個々の患者の間で正確に比較し、患者における疾患の経過をより良好にチャート化することができるようにすることである。スケールを、全運動スコア４（ＴＭＳ−４）を含むいくつかの異なるサブスケールに分ける。ヒト試験では、主要評価項目は、ＨＤの試験での標準的な等級付けスケールであるＵＨＤＲＳのＴＭＳ−４サブスケールでの、ある期間、例えば１年間にわたる変化である。試験（ＵＨＤＲＳスコアなど）の予め決定されていた評価項目を、Ｃｏｐａｘｏｎｅ投与中の患者で比較すると、その薬物が、ハンチントン病にある種の影響を与えたといえる可能性を想定することができる。
【００９４】
セクションＩＩ：自己抗原又はＣＯＰ１のワクチン接種は、β−アミロイド及びグルタミン酸毒性に対して保護する
神経変性疾患は、原因は異なるが、同様に広がる。このセクションでの実験では、凝集β−アミロイドの眼内注射により生じたニューロン消失は、正常なマウスより、免疫欠損マウスにおいて著しく多かったことを示す。天然のＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を除去又は添加することにより、神経変性は減弱又は増大した。β−アミロイドを伴わない網膜由来抗原又はコポリマー１のワクチン接種は、眼ニューロン消失を低減させた。マウス海馬切片では、活性化Ｔ細胞に遭遇した小膠細胞は、凝集β−アミロイドの細胞毒性を克服した。これらの知見により、「防御的自己免疫」の概念は支持され、所与のＴ細胞ベースのワクチン接種は、毒性の種類に関わりなく、特定の部位で防御的であることを示しており、局所で活性化されたＴ細胞は、ニューロンの損傷への抵抗に役立つ小膠細胞表現型を誘発することを示唆している。Ｃｏｐ１又は関連化合物のワクチン接種により、又はＴｒｅｇ抑制を低減する化合物での処置により、アルツハイマー及び他の神経変性疾患を阻止するか、遅らせることができる。
【００９５】
下記の実験では、β−アミロイドペプチド１〜４０の老化（凝集）形態（Ａβ１〜４０）の眼内注射は、毒性濃度のグルタミン酸の作用と同様に、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の消失をもたらすことが示された。さらに、いずれの場合にも、天然のＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を除去するか、組織自体の構成的に発現されたタンパク質に由来する抗原に対する（脅威性化合物自体に対するのではなく）免疫応答を喚起することにより、その破壊作用を弱めることができる。同じ自己抗原に対するＴ細胞の受身移入により、治療効果を再現することができた。
【００９６】
材料及び方法  セクションＩＩ
（ｖｉｉ）動物
Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｖｉｓｉｏｎ及びＯｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ（ＡＲＶＯ）の研究における動物使用に関する決議に従い、マウスを処理した。全て特定病原不在の、８から１３週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型、ＢＡＬＢ／ｃ／ＯＬＡ野生型及びヌードマウスが無菌条件下に、Ａｎｉｍａｌ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）により供給された。マウスを光及び温度調節室で飼育し、各実験で年齢を合わせた。マウスに、ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ；Ｋｅｔａｓｅｔ，Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ，ＩＡ）及びキシラジン（１６ｍｇ／ｋｇ；Ｖｉｔａｍｅｄ，Ｒａｍａｔ−Ｇａｎ，Ｉｓｒａｅｌ）のｉ．ｐ．投与により麻酔をかけた。組織を切除する前に、マウスを致死量のペントバルビトン（１７０ｍｇ／ｋｇ；Ｃ．Ｔ．Ｓ．，Ｋｉｒｙａｔ  Ｍａｌａｃｈｉ，Ｉｓｒａｅｌ）で殺した。
【００９７】
（ｖｉｉｉ）抗原
記載されているように（Ｐｅｐｐｅｒｂｅｒｇら、１９９１）、Ｃｏｎ  Ａで親和性クロマトグラフィー処理することにより、ウシ光受容体内レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）を網膜抽出物から精製した。Ｐｕｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）により改変された、Ｂｕｃｚｙｌｋｏ及びＰａｌｃｚｅｗｓｋｉ（Ｐａｌｃｚｅｗｓｋｉら、１９９４）の方法で、Ｃｏｎ  Ａカラム流のフロースルーから、ウシＳ抗原（アレスチン）を調製した。ＰＢＳ中にホモジェナイズした同系網膜から、全網膜ホモジネート（ＷＲＨ）を調製した。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．から、オボアルブミン（ＯＶＡ）、Ｃｏｎ  Ａ及びβ−アミロイドペプチド１〜４０（Ａβ１〜４０）を購入した。Ａβ（１〜４０）ペプチドを内毒素不含の水に溶かし、記載されているように（Ｉｓｈｉｉら、２０００）、Ａβ（１〜４０）をインキュベーションすることにより、β−アミロイド凝集物を形成させた。酢酸グラチラマー（Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）；Ｃｏｐ−１）はＴｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ．（Ｐｅｔａｃｈ  Ｔｉｋｖａ，Ｉｓｒａｅｌ）から購入した。
【００９８】
（ｉｘ）免疫
マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（５ｍｇ／ｍｌ；Ｄｉｆｃｏ）を含有する等体積のＣＦＡ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）中でそれぞれ乳化されているＩＲＢＰ（５０μｇ）、Ｓ−抗原（５０μｇ）、Ａβ１〜４０（５０μｇ）、ＷＲＨ（６００μｇ）又はＣｏｐ−１（７５μｇ）で、成体マウスを免疫した。エマルション（全体積０．１５ｍｌ）を側腹部の１カ所に皮下注射した。対照マウスには、ＣＦＡ中のＰＢＳ、又はＰＢＳのみを注射した。
【００９９】
（ｘ）マウスでのＲＧＣの標識
材料及び方法、セクションＩ（ｖ）に記載されているように標識を実施した。
【０１００】
（ｘｉ）グルタミン酸又は凝集Ａβ１〜４０の注射による毒性の誘発
麻酔をかけたＣ５７ＢＬ／６Ｊ又はＢＡＬＢ／ｃ／ＯＬＡマウスの右眼に、強膜の上部で２７ゲージ針で穴を開け、３０ゲージ針を有するハミルトンシリンジを硝子体からなるべく遠くで挿入した。各マウスに、Ｌ−グルタミン酸塩（４００ｎｍｏｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）又は凝集Ａβ１〜４０（５０μＭ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳを全体積１μｌで注射した。
【０１０１】
（ｘｉｉ）生存網膜神経節細胞の評価
実験期間の終了時に、マウスに、致死用量のペントバルビトン（１７０ｍｇ／ｋｇ）を与えた。その眼を摘出し、網膜を切り離し、ＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒド中の平坦な全体マウントとして調製し、同一のサイズ（０．０７６ｍｍ２）の４〜６個の領域からの標識細胞を計測した（Ｓｃｈｏｒｉら、２００１ｂ）。各網膜で、１領域当たりのＲＧＣの平均数を算出した。対側（損傷なし）眼でのＲＧＣの数も計測して、内部対照として役立てた。
【０１０２】
（ｘｉｉｉ）末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼＤＮＡ（ＴＵＮＥＬ）による細胞死のその場検出
眼内グルタミン酸注射の４８時間後に、マウスを屠殺し、その眼を除去し、凍結切片化（ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ）のために処理した。凍結切片を３．７％ホルマリン中、室温で１０分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄した。切片を１００％メタノールに−２０℃で１５分間移し、エタノール１００％、９５％及び７０％中で２回、５分間順次洗浄し、次いで、ＰＢＳと共に１０分間インキュベーションした。浸透化のために、プロテイナーゼＫを用いて、プロテアーゼを室温で２０分間消化した。製造者指示に従い、その場でのアポトーシス検出キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＳ）を使用して、ＤＮＡ断片の開放端を標識した。ストレプトアビジン−フルオレセイン結合体と共に供給されたフルオレセイン検出キットを使用して、標識された末端を検出した。蛍光顕微鏡を使用して、フルオレセイン染色された細胞を可視化した。
【０１０３】
（ｘｉｖ）ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞を欠失した脾細胞の調製
慣用の手順により調製された脾細胞をラット抗マウスフィコエリトリン（ＰＥ）結合ＣＤ２５抗体と共にインキュベーションし、これに、抗ＰＥビーズ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂａｃｔｌａｂ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，Ｈａｉｆａ，イスラエル）とのインキュベーションを続けた。洗浄した後に、脾臓細胞を「欠失感受性」プログラムを伴うＡｕｔｏＭａｃｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，ドイツ）にかけた。回収された集団を、ＦＡＣＳｓｏｒｔ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）（Ｋｉｐｎｉｓら、２００２ａ）により分析した。
【０１０４】
（ｘｖ）活性化されたナイーブＴ細胞の調製
リンパ節（腋下、鼠径部、表在、頚部、下顎及び腸間膜）及び脾臓を採取し、すりつぶした。Ｔ細胞をＴ細胞カラム（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で精製した（負の選択により富化）。富化されたＴ細胞を抗ＣＤ８マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）と共にインキュベーションし、負に選択されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＰＢＳ／２％ウシ胎児血清中のＰＥ−結合抗ＣＤ２５抗体（３０μｇ／１０８細胞）と共にインキュベーションした。次いで、これらを洗浄し、抗−ＰＥマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）と共にインキュベーションし、ＡｕｔｏＭＡＣＳを用いて磁気分離にかけた。残った細胞をカラムから精製ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞（Ｔｒｅｇ）として溶離した。５×１０５細胞／ｍｌを脾臓由来ＡＰＣ（３０００ｒａｄで照射）及び抗ＣＤ３抗体０．５μｇ／ｍｌと共に含有し、マウス組換えＩＬ−２  １００単位（ｍｒＩＬ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補足した培地中で、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞からなる負の画分（エフェクターＴ細胞、Ｔｅｆｆ）をさらに４日間活性化させた。
【０１０５】
（ｘｖｉ）免疫マウスからの抗原特異的活性化リンパ球の調製
免疫の１０日後に、マウスを殺し、その流入領域リンパ節を切除し、微細な金網に通した。Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５Ｍ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ＩＵ／ｍｌ）及び自系マウス血清１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を補足したＲＰＭＩを含有する刺激培地中で、洗浄したリンパ球（２×１０６細胞／ｍｌ）を関連抗原（ＩＲＢＰ１〜２０又は凝集Ａβ１〜４０、それぞれ１０μｇ／ｍｌで）で活性化した。３７℃、相対湿度９０％、ＣＯ２７％で４８時間のインキュベーションした後、リンパ球をＰＢＳで洗浄し、計測し、毒性用量（５０μＭ）の凝集Ａβ１〜４０を硝子体内注射した後１時間以内に、自系マウスに腹腔内注射した。
【０１０６】
（ｘｖｉｉ）小膠細胞培養
記載されているように（Ｂｕｔｏｖｓｋｙら、２００１）、新生（０日齢）ＢＡＬＢ／ｃ／ＯＬＡマウスの大脳皮質から、小膠細胞を精製した。ＩＦＮ−γ（２０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、β−アミロイド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；凝集Ａβ１〜４０２５μＭ）又は活性化Ｔ細胞（１ウェル１．５×１０５）を培地に１２時間加えた。処理の後に、小膠細胞をＰＢＳで３回洗浄し、海馬切片で適用するために調製した。
【０１０７】
（ｘｖｉｉｉ）海馬切片のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル
８〜１０日齢のＢＡＬＢ／ｃ／ＯＬＡマウスを断頭し、その脳を迅速に無菌条件下に取り出し、１％のＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を補足した最小必須培地（ＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からなる氷冷調製培地にｐＨ７．３５で入れた。大脳前頭極を取り出し、ビブラトーム（Ｐｅｌｃｏ，Ｒｅｄｄｉｎｇ，ドイツ）の上で、前方から開始して、脳を３５０μｍ水平切片に切断した。海馬を含む切片を、６ウェルプレート中、空孔サイズ０．４μｍのＦａｌｃｏｎ細胞培養インサート上で培養した。培地は、５０％のＭＥＭ、２５％のハンクス平衡塩類溶液（Ｇｉｂｃｏ）、２５％の正常ウマ血清、２％のグルタミン、インスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム補足１０μｇ／ｍｌ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）、グルコース２．６４ｍｇ／ｍｌ（Ｂｒａｕｎ，Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ、ドイツ）、ストレプトマイシン０．１ｍｇ／ｍｌ、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ及びビタミンＣ０．８μｇ／ｍｌ（全て、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから）を含有していた。器官型海馬切片培養物（ＯＨＳＣ）を３５℃、５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気下で、２４時間インキュベーションしたが、その間、切片を未処置で放置するか、１ウェル当たり４×１０５小膠細胞で処置した。インキュベーション期間終了時に、培地にヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（５μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）を３０分間加えることにより、組織損失を評価した。次いで、過剰のＰＩを培地と共に洗い流し、切片を顕微鏡のために調製し、可視化した。ＯＨＳＣ中での神経細胞死を定量するために、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、各切片でのＰＩ強度を評価した。両側スチューデントのＴ検定を使用して、特定の処置でのＰＩ染色強度を未処置の対照の強度と比較した。
【０１０８】
（実施例５）
網膜タンパク質は、グルタミン酸中毒に対する保護的なＴ細胞ベースの応答を誘発しうる
我々は、異なる遺伝的背景を有するマウスは、有害な条件に抵抗するその能力において異なることを以前に示した（Ｓｃｈｏｒｉら、２００１ｂ；Ｋｉｐｎｉｓら、２００１；Ｓｃｈｏｒｉら、２００２）。この違いによって、少なくとも一部では、Ｔ細胞依存性保護的応答を示す能力において、系統に関連する変化が生じる（Ｋｉｐｎｉｓら、２００１）。ミエリンタンパク質は眼でのグルタミン酸毒性に対してマウスを保護することができないことが観察されたこと及び網膜タンパク質によってラットでのグルタミン酸毒性に対する保護が成功したことを考慮して（Ｓｃｈｏｒｉら、２００１ｂ；Ｍｉｚｒａｈｉら、２００２）、我々は、網膜タンパク質でのマウスの免疫は、グルタミン酸毒性に暴露した後のそのニューロン生存率を改善しうるのではないか、もしそうであるならば、そのワクチンが、同じ部位に注射された他の脅威的化合物（凝集β−アミロイド）に対しても有効であろうということに興味を持った。グルタミン酸（４００ｎｍｏｌ）をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの右眼に注射し、４８時間後に、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼビオチン−ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）した網膜凍結断片を調べた。アポトーシス細胞死が、ＲＧＣ層では観察された（図１０Ａ）。毒性用量の眼内グルタミン酸（４００ｎｍｏｌ）を注射する６日前に、この系統のマウスに、ＣＦＡ中の全網膜タンパク質のホモジネートをワクチン接種すると、１週間後の検査により、ＣＦＡ中に乳化したＰＢＳを注射した年齢及び系統が適合する対照マウスで観察された生存率よりも高いＲＧＣの生存率が明らかになった（それぞれ２２３９．７±１５３．３及び１４８０．６±１７６．２、Ｐ＜０．０００１；両側スチューデントのｔ検定）。この発見は、網膜成分のワクチン接種は、免疫マウスのグルタミン酸毒性に抵抗する能力を高めることを示している。図１０Ｂは、ワクチン接種が、正常対照での数に対するパーセンテージとして表されるＲＧＣ損失を著しく低下させたことを示している（平均±ＳＥＭ；図１０Ｂ）。
【０１０９】
前記結果を考慮し、さらに、グルタミン酸毒性に対して誘発された保護は、網膜自己抗原に対するＴ細胞仲介応答の結果であるという我々の仮説を調べるために、網膜ホモジネートではなく、特異的に眼に存在する抗原である光受容体内レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）又はＳ−抗原（網膜アルセニン（ａｒｓｅｎｉｎ））での免疫は、ＲＧＣをグルタミン酸毒性に対して保護するかどうかを試験した。グルタミン酸注射の１０日前の、ＣＦＡ中に乳化したＩＲＢＰでのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの免疫は、ＰＢＳ／ＣＦＡで免疫したグルタミン酸注射したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいてよりも、かなり高いＲＧＣ生存率をもたらした（それぞれ１９９６±４９．５３及び１６４９±４３、Ｐ＜０．０００８；両側スチューデントのｔ検定；図１０Ｃ）。ＣＦＡ中の網膜自己抗原Ｓ抗原による免疫は、ＰＢＳ／ＣＦＡによる免疫に対してニューロン生存率に同様の上昇をもたらした（それぞれ２１６０±３８及び１６４８±３７、Ｐ＜０．０００１；両側スチューデントのｔ検定；図１０Ｄ）。比較を容易にするために、図の結果は、系統の適合する正常網膜でのＲＧＣの数に対するパーセンテージとして表されているニューロン消失として示されている。
【０１１０】
いずれも感受性マウスにおいてブドウ膜炎をもたらしうるが（Ｃａｐｓｉら、１９９０ａ；Ｃａｐｓｉら、１９９０ｂ）、ここでは保護の目的のために使用された網膜自己タンパク質ＩＲＢＰ及びＳ抗原は、治療用ワクチン接種として開発されたものではない。このことは、純粋に、概念を証明するために使用された実験例であり、これは、同じＴ細胞が保護的にも破壊的にもなりうるとの我々の先行する主張を支持し、その実際の効果は、組織内容、Ｔ細胞の量及び組織でのその活性化のタイミングを反映する（Ｍｉｚｒａｈｉら、２００２；Ｈａｕｂｅｎら、２００１；Ｆｉｓｈｅｒら、２００１）ことは強調されるべきである。
【０１１１】
（実施例６）
β−アミロイドの毒性に抵抗する能力は、Ｔ細胞に依存する
神経毒性に対してする保護のための生理学的に適した抗原は、それ自体毒性の化合物（グルタミン酸）ではなく、損傷部位に位置する自己抗原であることが判明したが、次いで、我々は、毒性が同じ部位に限られる場合、同じワクチン接種が、別の毒性自己化合物に対して有益であるかどうかを試験した。この仮定を、凝集β−アミロイドの毒性に対するワクチン接種の効果を試験することにより調べた。凝集β−アミロイド（Ａβ）１〜４０（５又は５０μＭ）をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの右眼に注射した。推定されているこの化合物とアルツハイマー病での眼神経障害との関連のためではなく（Ｂａｋａｌａｓｈら、２００２；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，２００４）、βアミロイドがＲＧＣ死をもたらしうるので（Ｊｅｎら、１９９８）、このモデル（β−アミロイドの眼内注射）を選択し、したがって、その使用により、抗原特異性の概念をさらに調べることができた。凝集β−アミロイドの眼注射の１又は２週間後に、生存ＲＧＣを計測した。１週間後には、生存可能なＲＧＣは２２５７±７７（５μＭ注射）及び２０７１±３０（５０μＭ注射）であり、２週間後には、これらは、２０６２±４１（５μＭ）及び１９５２±２１（５０μＭ）であった。非免疫マウスでは、全部で３４４５±５７個のニューロンが計測された。同じ実験条件で、ビヒクルのみの注射により生じた毒性は、正常な網膜ではＲＧＣの５％より多くには影響を与えなかった。図１１Ａは、β−アミロイド誘発ニューロン消失を、正常野生型網膜でのＲＧＣの平均数に対するパーセンテージとして示している。図１１Ｂ及び１１Ｃは、それぞれＰＢＳ及び凝集Ａβ１〜４０を眼内注射された後にマウスから切除された全マウント網膜の代表顕微鏡写真を示している。
【０１１２】
凝集Ａβ１〜４０の毒性に耐える非免疫マウスの能力は、Ｔ細胞依存性であるかどうかを決定するために、我々は、凝集Ａβ１〜４０（５０μＭ）を眼内注射した２週間後に、野生型とヌード（ｎｕ／ｎｕ）ＢＡＬＢ／ｃ／ＯＬＡマウスでのＲＧＣ生存率を比較した。注射された野生型マウス（２３１６±５３）においては、そのＴ細胞欠失対照（１７７９±１４７；Ｐ＜０．０１）においてよりもかなり多いニューロンが生存した。この実験のためのＢＡＬＢ／ｃ／ＯＬＡマウスの選択は、ＣＮＳ損傷の結果に抵抗するこの系統のＴ細胞依存パフォーマンス力は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの能力よりもかなり良好であり（Ｓｃｈｏｒｉら、２００１ｂ；Ｋｉｐｎｉｓら、２００１；Ｋｉｐｎｉｓら、２００４）、Ｔ細胞がないことによる差異は、ＢＡＬＢ／ｃ／ＯＬＡマウスにおいて、より簡単に検出可能であるとの先行する観察に基づく。図１１Ｄは、ニューロン消失を正常網膜でのニューロンの数に対するパーセンテージとして示している。図１１Ｅ及び１１Ｆは、それぞれ凝集Ａβ１〜４０の眼内注射の後の、野生型及びヌードマウスからの網膜の代表顕微鏡写真を示している。これらの結果は、この系統が、眼毒性に抵抗する神経組織の能力における因子であるという主張を支持し、さらに、これらに関する系統による差は、損傷のタイプに関しているのではなく、良好に制御されているＴ細胞依存性免疫応答を利用する能力に関していることを示している。
【０１１３】
神経保護に特異的に必要なＴ細胞は、脅威性化合物を対象とするのではなく、損傷部位に存在する自己抗原を対象とするという我々の作業仮定をさらに調べるために、我々は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、凝集Ａβ１〜４０の眼内毒性にかけ、次いで、これらを、ＩＲＢＰ由来ペプチド（グルタミン酸毒性（図１０Ｃ）の場合と同様に、凝集Ａβ１〜４０の眼内毒性に対して保護性がある）で免疫した。ワクチン接種の後に、凝集Ａβ１〜４０により誘発されたＲＧＣの損失は、ＰＢＳ／ＣＦＡで免疫されたマウスで観察されたよりもかなり小さかった（生存ＲＧＣは、ＩＲＢＰ／ＣＦＡでは２３０７±６２、ＰＢＳ／ＣＦＡでは１８４０±５６であった；図１２Ａ）。さらに、Ａβ１〜４０を眼内注射する前に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、β−アミロイドペプチドの非凝集（非毒性）形態で免疫した。β−アミロイド／ＣＦＡをワクチン接種した後に、凝集Ａβ１〜４０により誘発されたＲＧＣの消失は、ＰＢＳ／ＣＦＡで免疫されたマウスで観察された消失と著しくは異ならなかった（生存ＲＧＣは、それぞれ１７４３±５５及び１８３１±４５；図１２Ｂ）。
【０１１４】
観察されたワクチン接種誘発保護がＴ細胞依存性であることを確認するために、我々は、ＩＲＢＰ及びＳ抗原を対象とするか、ＩＲＢＰのみを対象とする一次Ｔ細胞を調製した。ｅｘ  ｖｉｖｏでこれらを活性化させた後に、リンパ球（１．２×１０７細胞）を、グルタミン酸又は凝集Ａβ１〜４０の毒性に新たに暴露された非免疫Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに移した。非ＣＮＳ抗原ＯＶＡにより活性化されたリンパ球で免疫されたマウスにおいてよりも、ＩＲＢＰ＋Ｓ抗原で活性化されたリンパ球を与えたマウスでは、かなり多いＲＧＣが生存した（１６５２±５６に対して２２２０±３８、Ｐ＜０．００１；両側スチューデントのｔ検定；図１３Ａ）。ＯＶＡ活性化Ｔ細胞を与えられたマウスでの生存ＲＧＣは、グルタミン酸を注射された非免疫マウスにおいてと著しくは異ならなかった（それぞれ１６５２．６±５６及び１５３５．６±７４；図示せず）。結果を、対照マウスにおいての生存率と比較してのニューロン生存率の上昇パーセンテージとして示す（図１３Ａ）。
【０１１５】
同様に、免疫マウスから得られたＩＲＢＰ又は非凝集Ａβ１〜４０に特異的なＴ細胞を調製し、ｅｘ  ｖｉｖｏで活性化させ、次いで、凝集Ａβ１〜４０の毒性に暴露されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに受身移入した。ＩＲＢＰ由来ペプチドで活性化させたＴ細胞の受身移入が、凝集Ａβ１〜４０を眼内注射されたマウスでは有利であったが、このことは、正常な対照マウスにおいてよりも、これらのマウスでの著しく低いＲＧＣ損失により示されている（図１３Ｂ）。これに対して、非凝集Ａβ１〜４０に特異的なＴ細胞の受身移入を受けたマウスでは、毒性用量の凝集Ａβ１〜４０を眼内注射された後のＲＧＣの損失は、ＰＢＳで治療されたマウスにおいてとほとんど変わりなかった。
【０１１６】
これらの知見により、ＩＲＢＰ（図１２Ａ）の活性ワクチン接種により達成される凝集Ａβ１〜４０の毒性に対する保護は、Ｔ細胞で仲介されることが確認された。凝集Ａβ１〜４０自体を対象とするＴ細胞が保護をもたらすことができないということは、凝集Ａβ１〜４０に出会った小膠細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣ−ＩＩ）を発現することができないという、我々の研究室での観察に一致する。その結果、このような小膠細胞は、Ｔ細胞にβ−アミロイドを発現することができず、β−アミロイド特異的Ｔ細胞がＣＮＳにホーミングしても、局所的に活性化されない（Ｂｕｔｏｖｓｋｙら、未発表の観察）。したがって、βアミロイド毒性と戦うために、より適切な選択は、その部位に存在し、Ｔ細胞のホーミングに提示されうる抗原であろう。
【０１１７】
前記でまとめられた結果は、β−アミロイド毒性と戦うために適したワクチン接種の選択は、変性の部位に存在し、ホーミングＴ細胞に提示されうる抗原であることを示唆している。ヒト組織適合性複合体の多様性によって、自己抗原のワクチン接種は、治療目的のために安全であると見なすことはできない。安全なワクチンを探索するために、我々は、自己免疫疾患を引き起こすことなく、自己反応性Ｔ細胞の幅広い効果を模倣する部分アゴニスト又は修飾ペプチドリガンドとして作用することが以前に示された（Ｓｃｈｏｒｉら、２００１ｂ）合成抗原酢酸グラチラマー（Ｃｏｐ−１）（Ｓｃｈｏｒｉら、２００１ｂ；Ｋｉｐｎｉｓら、２０００）でのワクチン接種の効力を調べた。毒性用量の凝集Ａβ１〜４０を眼内注射する７日前に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにコポリマー１をワクチン接種することにより、凝集β−アミロイドの毒性に対するかなりの保護が観察された（図１４）。Ｃｏｐ−１処置及びＰＢＳ処置マウスでのＲＧＣ生存は、それぞれ１９３９±８０及び１６１７±４３であった；Ｐ＜０．０１；両側スチューデントのｔ検定。
【０１１８】
（実施例７）
天然の調節ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、網膜でのβ−アミロイド毒性に対抗する体の能力を制限する
介入の不在下では、凝集Ａβ１〜４０の毒性に抵抗するマウスの能力はＴ細胞に依存するという前記観察（図１１）によって我々は、凝集β−アミロイドの毒性に自発的に抵抗する神経組織の能力は、他のＣＮＳ損傷の場合において記載されたように（Ｋｉｐｎｉｓら、２００２ａ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ及びＫｉｐｎｉｓ，２００２ａ）、天然に生じる調節ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞によって抑制されるかどうかを調べることを思いついた。もしそうであれば、このような制御の除去又は脆弱化は、β−アミロイド関連神経変性状態に対する保護に必要な自己免疫Ｔ細胞を利用する付加的な方法として役立つはずである。
【０１１９】
したがって我々は、マウス神経組織が凝集Ａβ１〜４０の毒性に抵抗する能力を、Ｔｒｅｇの除去により増強することができるかを調べた。生後３日目に胸腺摘出（Ｔｒｅｇ欠失をもたらす手順［Ｓａｋａｇｕｃｈｉら、２００１；Ｓｅｄｄｏｎ，２０００］）をした成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスでは、非胸腺摘出適合対照においてよりもかなり多いＲＧＣが凝集Ａβ１〜４０暴露で生存した（それぞれ、２２５１±５３及び１９１８±９４；Ｐ＜０．０１；両側スチューデントのｔ検定；図１５Ａ）。相補的実験で、ＢＡＬＢ／ｃ／ＯＬＡ系統のヌードマウスに、Ｔｒｅｇ集団をｅｘｖｉｖｏで除去した４．５×１０７野生型脾細胞を補充した。対照として、野生型マウスの全脾臓から得られ、したがって、ＴｒｅｇとエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の両方が含まれる同じ数の脾細胞を補充したヌードマウスを使用した。補充の３日後に、受容マウスに、毒性用量の凝集Ａβ１〜４０を注射し、生存ＲＧＣを２週間後に計測した。Ｔｒｅｇを欠失した脾細胞を補充したマウスでは、正常脾細胞集団を補充されたマウスにおいてよりも、著しく少ないＲＧＣが死亡した；しかしながら、いずれの群でも、凝集Ａβ１〜４０を注射された非処置ｎｕ／ｎｕマウスの群においてよりも少ないＲＧＣが死亡した（それぞれ、生存ＲＧＣは、２４１２±６１、２２４６±１０１及び２０８０±５６であった；図１５Ｂ）。これらの知見は、Ｔｒｅｇは通常、凝集Ａβ１〜４０毒性に自発的に抵抗する神経組織の能力をダウンレギュレーションすることを示唆している。Ｔｒｅｇと関連することが判明している（Ｋｈａｔｔｒｉら、２００３）Ｆｏｘｐ３発現に関するＰＣＲ試験により、Ｔｒｅｇは、Ｆｏｘｐ３陽性であり、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞はＦｏｘｐ３陰性であることが確認された（図１５Ｃ）。
【０１２０】
（実施例８）
Ｔ細胞は、小膠細胞が炎症性細胞毒性表現型を展開することを防ぐ
自己免疫Ｔ細胞が自己化合物を克服するために役立つ方法の１つは、小膠細胞の活性の制御による（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、２００３）ことを、我々は以前に提案していた。我々のグループは、器官型海馬切片培養（ＯＨＳＣ）を使用して、ラット小膠細胞を凝集Ａβ１〜４０で予備処置すると、神経組織に対して細胞毒性になり、ＭＨＣ−ＩＩを発現するその能力が抑制される（Ｂｕｔｏｖｓｋｙら、未刊行の観察）ことを示した。したがって、我々は、凝集Ａβ１〜４０に暴露されたネズミ小膠細胞は、細胞毒性になるかどうか、もしそうであるとしたら、活性化Ｔ細胞は、毒性を克服しうるかどうかを決定するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験を実施した。マウス小膠細胞を凝集Ａβ１〜４０に暴露した後、マウスＯＨＳＣに加えると、非処置か、非免疫小膠細胞で処置されたＯＨＳＣで観察されたよりもかなり多い神経死が生じた（図１６）。しかしながら、凝集Ａβ１〜４０に暴露する時点で、加える小膠細胞を活性化エフェクター（ＣＤ４＋ＣＤ２５−）Ｔ細胞にも暴露すると、この消失は著しく低下した（図１６Ａ）。様々に処置されたＯＨＳＣ及び非処置対照の代表顕微鏡写真を図１６Ｂ（１〜４）に示す。これらの知見は、適切に制御された量の活性化Ｔ細胞への小膠細胞の暴露は、小膠細胞が細胞毒性になることを妨げるだけでなく、それらを神経保護性にするという主張を支持する。このバイオアッセイは、抗原提示を必要としないので、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイされた小膠細胞毒性は、ＭＨＣ−ＩＩ発現の欠失を反映しないことを特記する。
【０１２１】
（実施例９）
アルツハイマー病に関するｉｎ  ｖｉｖｏ動物実験系
Ｃｏｐ１ワクチン接種の有利な作用は、トランスジェニックマウス試験系を使用して、神経保護作用の発揮に関して調べることができる。
【０１２２】
実験モデルとして使用することができるほど十分にＡＤに対して類似性を有する自発的動物突然変異は存在しない。アルツハイマー病に可能な治療を試験するための様々なトランスジェニック動物モデルが知られている。米国特許第６７１７０３１号明細書及びＪｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）に記載されているように、ヒトβ−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１及びＡＰＰ７７０又はこれらのサブ断片、さらに、アミノ酸７１７での家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）突然変異などの天然に生じる突然変異をベースとする様々な点突然変異並びにＡＰＰ遺伝子での予測突然変異の３種の主な形態のうちの１種又は複数の発現を制御する能力に基づくモデルが知られている。適切なモデルは例えば、トランスジェニックｈＡＰＰ７７０／ＦＡＤ７１７マウスモデルである。
【０１２３】
Ｃｏｐ１の効果を試験するために、Ｃｏｐ１を含有する適切な製剤を、トランスジェニックマウスの子孫又はそれに由来する細胞に投与し、トランスジェニックマウス又はトランスジェニックマウスに由来する細胞でのアルツハイマー病マーカーを検出又は測定する。好ましい一実施形態では、アルツハイマー病マーカーは、行動であり、観察される差は、化合物が投与されたトランスジェニックマウスで観察された行動の変化である。この行動は、作業記憶を使用する行動、参照記憶を使用する行動、歩行活動、新規の環境又は新規の対象に対する情緒反応並びに対象認知であってよい。例えば、記載されているように（Ｐｏｓｔｉｎａら、２００４）、Ｍｏｒｒｉｓ水迷路（ｗａｔｅｒ  ｍａｚｅ）を使用して、Ｃｏｐ１治療されたアルツハイマートランスジェニックマウスモデルの行動を試験することができる。治療された動物は、その行動に改善を示すと予測される。
【０１２４】
考察
前記セクションＩＩに記載の本発明の結果は、凝集Ａβ１〜４０及びグルタミン酸などの他の毒性物質により誘発される毒性を中和する治療用ワクチンを開発する際には、毒性物質が、よくあるように、同じ部位に全て位置している場合、同じワクチンを使用することができることを示唆している。前記セクションＩＩで使用されたマウスモデルでは、２種の神経毒性自己化合物を眼に注射し、同じ抗原、即ち、眼に存在するタンパク質に由来するペプチドをワクチン接種することにより、いずれに対しても保護が達成された。我々は、この知見を、損傷部位に構成的に存在する優性自己抗原は、この部位での脅威的条件に対する自己保護的抗原であるという原理の証拠として解釈する。さらに我々は、天然に生じるＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の欠失は、このような抗原に対する自発応答を、したがって、凝集β−アミロイドの毒性作用に抵抗する能力を高めうることを示している。しかしながら、治療戦略として、我々は、部位特異的自己タンパク質自体を用いてではなく、コポリマー１、自己抗原の合成弱アゴニストを用いてのワクチン接種を提案する（Ｓｃｈｏｒｉら、２００１ｂ；Ｋｉｐｎｉｓら、２０００；Ａｎｇｅｌｏｖら、２００３；Ｚｉｅｍｓｓｅｎら、２００２）。それというのも、後者は、自己免疫疾患、自己免疫の本質的に不十分な制御を伴って起こりうる危険を誘発するリスクなしに、保護的ワクチンとして使用することができるためである（Ｓｃｈｗａｒｔｚ及びＫｉｐｎｉｓ，２００２）。別の戦略として、我々は、Ｔｒｅｇの活性を弱める何らかの操作を使用することを提案する（Ｋｉｐｎｉｓら、２００３）。
【０１２５】
パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、プリオン、運動ニューロン疾患及び他の破壊性慢性神経変性症候群などの神経変性障害は、凝集したか、構造変化を受けた自己タンパク質の蓄積を含む共通するいくつかの形態を有する（Ｐｅｒｌｍｕｔｔｅｒ、２００２）。アルツハイマー病では、凝集Ａβ１〜４０の蓄積が、ニューロン毒性の主な原因と考えられる（Ｈａｒｄｙ及びＳｅｌｋｏｅ，２００２）。この結果は、ニューロンに対して直接的に毒性であるためだけでなく（Ｊｅｎら、１９９８；Ｃａｒｔｅｒ及びＬｉｐｐａ，２００１）、細胞毒性表現型を取り入れるように小膠細胞を誘発するようであることからも、凝集した形態のβ−アミロイドペプチド（老人斑に見られる）は、ＣＮＳに毒性作用を有するとの主張を支持する。加えて、β−アミロイドワクチン接種が、眼でのβ−アミロイド誘発ストレスに対して保護することができないことは、細胞表面ＭＨＣ−ＩＩ発現が、凝集β−アミロイドと遭遇した小膠細胞では損なわれるという我々の研究室からの観察と一致する（Ｂｕｔｏｖｓｋｙら、未刊行の観察）。
【０１２６】
以前には、活性化小膠細胞は、神経変性疾患の内容物に見られるので、これらの細胞が、進行している変性の原因であると一般に考えられていた（Ｑｉｎら、２００２）。したがって、かなりの研究努力が、その抑制を達成することに費やされた。
【０１２７】
前記セクションＩＩの結果は、この問題に対する別の手法は、小膠細胞を変性させ、それにより、機能不全の小膠細胞によりもたらされる危険性を模倣するだけではなく、凝集Ａβ１〜４０並びにグルタミン酸及び酸化ストレスなどの進行性変性に関連する他の毒性物質の破壊作用に抵抗する際に小膠細胞の助力を利用することを必要とすることを示している。炎症関連酵素をもたらしたり、レドックスアンバランスを促進したりしない限り、活性化Ｔ細胞に暴露された小膠細胞が必要とする表現型は、破壊的ではない（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、２００３）。したがって、局所的に活性化しうるＴ細胞は、損傷部位に存在する抗原のアイデンティティにかかわらず、敵からの隣接小膠細胞集団を味方に変えることができる。
【０１２８】
前記セクションＩＩに記載の実験で、凝集Ａβ１〜４０の毒性に抵抗するマウスの能力において、系統に関連する差異が観察された。この結果はさらに、天然に生じるＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞が、神経変性状態に抵抗する能力を主に制御するとの我々の主張と一致する。これらの細胞は、自己免疫疾患に対する保護の際に鍵となる関係物質であるが（Ｋｏｈｍら、２００２）、これらは、ＣＮＳでの変性と戦う能力を限定する（Ｋｉｐｎｉｓら、２００２ａ）。我々は以前に、免疫応答の不適切な制御の故に、これらの細胞の存在は、自己免疫防御の必要性と自己免疫疾患の発症リスクとの進化的妥協を反映しており（Ｋｉｐｎｉｓら、２００２ａ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ及びＣｏｈｅｎ，２０００）、この際、後者は、Ｔｒｅｇが最適な抑制活性を示すことができないことの結果である（Ｋｏｈｍら、２００２）と仮定した。Ｔｒｅｇ欠失ラット又はマウスでは、有害な条件に対する保護において有利であるにもかかわらず、自己免疫疾患の発症に対する罹病性が高まる。したがって、神経保護治療の目的の１つは、Ｔｒｅｇを弱体化することである。Ｔｒｅｇの生理学的弱体化（ブロックではない）を模倣する化合物での薬理学的介入は、Ｔ細胞ベースの自己防御を増強する方法をもたらすであろう。
【０１２９】
同じ自己免疫Ｔ細胞が、支持的にも破壊的にもなりうることが我々のグループによって判明した（Ｋｉｐｎｉｓら、２００２ｂ）。したがって、自己免疫疾患に先天的に罹患しやすい動物では、Ｔ細胞応答をもたらすために使用されるプロトコルが、結果に決定的な影響を及ぼす。強いアジュバントは、その持久性又は強度によってその利点が相殺される自己免疫応答をもたらしうる（Ｈａｕｂｅｎら、２００１）。しかしながら、このような感受性系統では、ＣＮＳに対する自己免疫応答は、治療ウィンドウ内で調節されるのに十分に初期に発現されえないか、タイムリーな遮断などの他の必要性をかなえることができない（Ｓｈａｋｅｄら、２００４ａ）。さらに、免疫細胞（ＳＣＩＤ）を欠失しているか、Ｔ細胞ベースの調節メカニズムを欠いた罹病性系統では、脳炎誘発性Ｔ細胞の受身移入は、ＥＡＥをもたらすが、神経保護に寄与するには不十分である（Ｋｉｐｎｉｓら、２００２ｂ）。これに対して、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞をＳＣＩＤマウスに受身移入すると（Ｋｉｐｎｉｓら、２００４ｂ）、これらは、野生型に受身移入された脳炎誘発性Ｔ細胞と同様の保護作用を示しうる（Ｈａｕｂｅｎら、２０００ａ，２０００ｂ；Ｍｏａｌｅｍら、１９９９ａ）。自己免疫疾患に対して先天的に抵抗性のある動物では、ＣＮＳ損傷に対して自発的に誘発された応答が破壊的である可能性は非常に低い；他方では、有利であるには弱体化されすぎていて、増強を必要とする。したがって、自己免疫が、感受性系統での深刻な状況で有利であるかどうかは、調節と内容の両方によって決定される。
【０１３０】
マイナスの副作用を生じさせること無く、耐性系統と感受性系統の両方を満たしうる治療では、Ｃｏｐ１又は他の関連化合物などの弱い合成抗原の使用が考慮される。β−アミロイドなどの毒性抗原由来のペプチドでのワクチン接種とは異なり、このような戦略は、リスクがない利点をもたらしうる。さらに、同様の安全な抗原を、変性の様々な部位、患者が往々にして必要とする状況を保護するために使用することができる。
【０１３１】
さらに本明細書の結果は、神経変性条件に対する保護のために体が免疫系を利用する方法は、Ｔ細胞依存性経路によるとの主張を支持する。加えて、これらは、タンパク質沈着を特徴とする神経変性疾患に対する治療アプローチを取り入れる際に、ワクチン接種のために選択される抗原は、アルツハイマー病での凝集Ａβ１〜４０、パーキンソン病でのレビ小体又はプリオン疾患でのプリオンタンパク質（ＰｒＰ）などの疾患特異的タンパク質であってはならず（Ｄｏｄａｒｔら、２００３；Ｗｈｉｔｅら、２００３）、ＣＮＳ損傷の部位に存在する免疫優性自己タンパク質に由来するペプチド、潜在自己ペプチド又は変性自己ペプチド、好ましくは、コポリマー１並びにコポリマー１関連ペプチド及びポリペプチドなどの自己と僅かに交叉反応する非自己ペプチドでなければならないとの見解を支援する。
【０１３２】
前記セクションＩＩに記載のＴ細胞ベースのワクチン接種は、存在する凝集Ａβ１〜４０の神経変性作用からマウスを保護する。提示されている戦略は、ワクチン接種のために使用されるペプチドが脳炎誘発性でないかぎり、Ａβ−アミロイドに特異的な抗体のあり得る利点に対して反対の議論をしているのではない（Ｄｏｄａｒｔら、２００３；Ｆｕｒｌａｎら、２００３；Ｍｏｈａｊｅｒｉら、２００２）。これら２つのアプローチは、相互に拮抗しないので、相互に補足することができる。
【０１３３】
セクションＩＩＩ：パーキンソン病を治療するためのＣｏｐ１のワクチン接種
パーキンソン病（ＰＤ）は、黒質でのドーパミン作動性ニューロンの進行性損失及び線条体での神経伝達物質ドーパミンの欠失を特徴とする神経変性運動障害である。現在、ＰＤの最適なモデルは、１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）動物モデルである。ＭＰＴＰは、ヒト及び非ヒト霊長類の両方でパーキソニズムを誘発することが判明している。ドーパミン作動性ニューロンへと細胞内輸送される、ＭＰＴＰの代謝産物である１−メチル−４−フェニルピリジニウムイオン（ＭＰＰ＋）により生じる神経毒性は、ヒトＰＤを模倣すると考えられ、ＰＤにおける神経保護を研究するための良好なモデルをもたらす。ＭＰＴＰマウス試験系又はパーキンソン病のための他の適切なモデルを使用して、神経保護作用の行使に関して、Ｃｏｐ１免疫の有利な効果を試験する。Ｃｏｐ１でのＰＤのための神経保護治療は、神経変性作用及び疾患進行の速度を減衰させることができる。
【０１３４】
材料及び方法  セクションＩＩＩ
（ｘｉｘ）動物
Ａｎｉｍａｌ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）から供給された８〜１３週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ系統のオスのマウスを、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ及びＵｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）により作成された規則に従い取り扱う。
【０１３５】
（ｘｘ）試薬
Ｃｏｐ１（中央ＭＷ：７２００ダルトン）は、Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．（Ｐｅｔａｃｈ  Ｔｉｋｖａ，Ｉｓｒａｅｌ）に由来する。ＭＰＴＰ．ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ）を０．９％のＮａＣｌに溶かした。
【０１３６】
（ｘｘｉ）免疫
免疫のために、ＰＢＳ（１００μｌ）に溶かしたＣｏｐ１をマウスの側腹部の１カ所で、皮下注射した。対照マウスにはビヒクルのみを注射した。
【０１３７】
（ｘｘｉｉ）ＭＰＴＰ治療
異なる群のオスのＳＪＬマウスを、例えば１日に２時間間隔で４回、ＰＢＳ中のＭＰＴＰ．ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ）１８〜２０ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射で、又は１日２回２日間にわたってＭＰＴＰ２０ｍｇ／ｋｇを皮下注射することにより様々なスケジュールのＭＰＴＰで処置して、強度及び時間経過において異なる変性プロセスを誘発させる。対照マウスには、対応する用量のビヒクルのみを投与する。
【０１３８】
（実施例１０）
パーキンソンＭＰＴＰ齧歯類モデルでのＣｏｐ１の効果
オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、２時間間隔で４回、ＰＢＳ中のＭＰＴＰ．ＨＣｌ２０ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射する。最後のＭＰＴＰ投与の１２時間後に、Ｃｏｐ１（ＰＢＳ中のＣｏｐ１  ７５μｇ又は１５０μｇ／マウス）又はＰＢＳ（対照群）をＭＰＴＰ処置された動物に投与する。
【０１３９】
ＰＤでの運動機能不全は、線条内のドーパミン作動性神経線維の消失により誘発される線条体ドーパミン内容の深在性減少による。Ｃｏｐ１で免疫されたか、ＰＢＳを注射されたＭＰＴＰ処置マウスの運動パフォーマンスを、前記ようにロータロッドで測定する（Ｈｕｎｏｔら、２００４）。ロータロッドパフォーマンス試験により、回転棒の上に留まるマウスの能力を評価する。Ｃｏｐ１での免疫は、対照マウスに対して、ロータロッドでの運動機能の改善（長いロータロッド時間）を示すと予測することができる。
【０１４０】
ドーパミンニューロン数の立体解析定量並びにドーパミン輸送体（ＤＡＴ）及びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）での免疫染色を使用するドーパミン線維消失の光学密度測定などの、神経保護に関する他のＰＤパラメータを免疫の１週間又は複数週間後に実施することができる。
（参考文献）
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】ＲＧＣをグルタミン酸毒性に暴露する７日前に注射される様々な用量のＣｏｐ１（２５、７５ｇ又は２２５μｇ／マウス）を注射して免疫することによる、マウスの網膜神経節細胞（ＲＧＣ）に対する神経保護作用を示すグラフである。結果は、非処置群での全ＲＧＣ死に対する、Ｃｏｐ１ワクチン接種により保護されたＲＧＣの平均±ＳＥＭパーセンテージとして示す。＊は、非処置群に対する統計的に有意な差異（ｔ−検定、ｐ＜０．０５）を表す。
【図２】ＲＧＣをグルタミン酸毒性に暴露する７、１４及び２８日前に注射したＣｏｐ１  ７５μｇでワクチン接種することによる、マウスのＲＧＣに対する神経保護作用の潜時を示すグラフである。
【図３】用量２５μｇ及び７５μｇで３日間にわたって繰り返したＣｏｐ１の連日注射は、ＲＧｃに対する神経保護作用の消失をもたらすことを示すグラフである（２５μｇでは、２及び３日後にそれぞれ２３％及び１．５％の保護；７５μｇでは、２及び３日後にそれぞれ４７％及び１３．５％の保護）。
【図４】様々な時間間隔（１、２、３、４、６、８週）で注射したＣｏｐ１（７５μｇ／マウス）の２回の反復注射の効果を示すグラフである。ＲＧＣに対する治療の神経保護作用を、グルタミン酸毒性を誘発する７日前に注射したＣｏｐ１（７５μｇ／マウス）の１回注射に対する％として表す。この１回注射を陽性対照と決定し、各実験で行った。＊は、非処置群に対する統計的に有意な差異（ｔ−検定、ｐ＜０．０５）を表す。
【図５】様々な時間間隔（１、２、４週）で注射したＣｏｐ１（７５μｇ／マウス）の３回の反復注射の効果を示すグラフである。ＲＧＣに対する治療の神経保護作用を、グルタミン酸毒性を誘発する７日前に注射したＣｏｐ１（７５μｇ／マウス）の１回注射に対するパーセンテージとして表す。この１回注射を陽性対照と決定し、各実験で行った。
【図６】様々な用量のＣｏｐ１（２５μｇ、７５μｇ、２２５μｇ）で免疫した後のマウスからの脾細胞の増殖を示すグラフである。７、１４、２１及び２８日後の結果を、刺激指数（ＳＩ）として表したが、この際、ＳＩは、Ｃｏｐ１なしにｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベーションされた細胞の平均ｃｐｍで割った、Ｃｏｐ１と共にｉｎ  ｖｉｔｒｏインキュベーションした細胞の平均ｃｐｍである。
【図７】Ｃｏｐ１  ２５μｇ又は７５μｇで免疫した７、１４、２１又は２８日後に刺激された脾細胞からのＩＮＦ−γ分泌を示すグラフである。
【図８】Ｃｏｐ１  ７５μｇ又は１５０μｇをワクチン接種した後のＨＤ  Ｒ６／２トランスジェニックマウスのロータロッドパフォーマンスを示すグラフである。
【図９】様々な回転速度（２、５、１５及び２５ｒｐｍ）での、Ｃｏｐ１  １５０μｇをワクチン接種した後のＨＤ  Ｒ６／２トランスジェニックマウスのロータロッドパフォーマンスを示すグラフである。
【図１０Ａ】網膜タンパク質でのマウスの免疫は、グルタミン酸毒性に対して網膜神経節細胞を保護することを示す。（Ａ）毒性用量のグルタミン酸を硝子体内注射した４８時間後の、Ｃ５７／Ｂ１／６ＪマウスのＲＧＣ層でのＴＵＮＥＬ陽性細胞。切片（２０μｍ厚）を、ＴＵＮＥＬ染色にかけ、ヨウ化プロピジウムで対比染色し、共焦点顕微鏡検査法により観察して、ＴＵＮＥＬ陽性細胞を検出した。代表網膜の共焦点画像を示す。矢印は、ＲＧＣ層中のＴＵＮＥＬ陽性細胞を示している。尺度線＝２００μｍ。
【図１０Ｂ】網膜タンパク質でのマウスの免疫は、グルタミン酸毒性に対して網膜神経節細胞を保護することを示す。（Ｂ）Ｃ５７／Ｂ１／６Ｊマウスを側腹部で、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）５ｍｇ／ｍｌを補足したＣＦＡ中に乳化された全網膜ホモジネート（ＷＲＨ）６００μｇを用いて免疫した。６日後に、マウスにグルタミン酸（４００ｎｍｏｌ）を硝子体内注射した。１週間後に生存していたＲＧＣを計測した。重大なことに、ＰＢＳ／ＣＦＡで免疫したマウスよりも、ＷＲＨ／ＣＦＡで免疫されたマウスにおいて、より多くのＲＧＣが生存した。図は、成長網膜のＲＧＣ集団に対するニューロン消失として表されている、２つの独立した実験から１つの代表実験の結果を示している（各群の１実験当たりｎ＝６〜８マウス；Ｐ＜０．０００１、両側スチューデントのｔ検定）。
【図１０Ｃ−Ｄ】網膜タンパク質でのマウスの免疫は、グルタミン酸毒性に対して網膜神経節細胞を保護することを示す。（Ｃ、Ｄ）他の実験セットでは、マウスを側腹部で、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）５ｍｇ／ｍｌを補足したＣＦＡ中に乳化された光受容体内結合タンパク質（ＩＲＢＰ；５０μｇ）又はＳ−抗原（５０μｇ）を用いて免疫した。対照マウスを、ＣＦＡ中のＰＢＳで免疫した。重大なことに、ＩＲＢＰ／ＣＦＡ免疫群（Ｐ＜０．０００１；両側スチューデントのｔ検定；ｎ＝各群６〜８マウス）、又はＳ−抗原免疫群（Ｐ＜０．０００１；ｎ＝各群６〜８マウス）よりも、ＰＢＳ／ＣＦＡ免疫群において、より多くのニューロンが消失した。
【図１１Ａ】Ａβ１〜４０毒性に対する網膜神経節細胞の感受性は、Ｔ細胞依存性であることを示している。（Ａ）Ｃ５７  ＢＬ／６／Ｊマウスに５又は５０μＭのＡβ１〜４０を硝子体内注射するか、注射せずに（対照）、１又は２週間後に、網膜を切除し、生存ＲＧＣを計測した。対照に対して、高用量のＡβ１〜４０を与えられたマウスでは、かなり多いニューロンが失われた（１週及び２週でそれぞれＰ＜０．００１及びＰ＜０．０００１、両側スチューデントのｔ検定）。示されている値は、同様の結果を伴う３つの独立した実験のうちの１つからである（各群ｎ＝６〜８マウス）。ビヒクルの注射は、対照に対して少ないＲＧＣの消失をもたらした。
【図１１Ｂ】Ａβ１〜４０毒性に対する網膜神経節細胞の感受性は、Ｔ細胞依存性であることを示している。（Ｂ）Ａβ１〜４０を注射した網膜の代表顕微鏡写真である。
【図１１Ｃ】Ａβ１〜４０毒性に対する網膜神経節細胞の感受性は、Ｔ細胞依存性であることを示している。（Ｃ）Ａβ１〜４０を注射しなかった網膜の代表顕微鏡写真である。
【図１１Ｄ】Ａβ１〜４０毒性に対する網膜神経節細胞の感受性は、Ｔ細胞依存性であることを示している。（Ｄ）ＢＡＬＢ／ｃ／ＯＬＡマウス［野生型又はｎｕ／ｎｕ（成熟Ｔ細胞欠失）］にＡβ１〜４０（５０μＭ）を硝子体内注射した。野生型に比べて、ｎｕ／ｎｕマウスでは、かなり多いＲＧＣが失われた（Ｐ＜０．００１、両側スチューデントのｔ検定）。示されている値は、同様の結果を伴う３つの独立した実験のうちの１つからのものである（各群ｎ＝５〜７マウス）。
【図１１Ｅ】Ａβ１〜４０毒性に対する網膜神経節細胞の感受性は、Ｔ細胞依存性であることを示している。（Ｅ）Ａβ１〜４０を注射された野生型ＢＡＬＢ／ｃ／ＯＬＡマウスからの網膜の代表顕微鏡写真を示す。
【図１１Ｆ】Ａβ１〜４０毒性に対する網膜神経節細胞の感受性は、Ｔ細胞依存性であることを示している。（Ｆ）Ａβ１〜４０を注射されたｎｕ／ｎｕＢＡＬＢ／ｃ／ＯＬＡマウスからの網膜の代表顕微鏡写真を示す。
【図１２Ａ】毒性薬剤自体ではなく毒性部位に存在する抗原での免疫は、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスでの凝集Ａβ１〜４０毒性に対して保護することを示すグラフ。Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスを側腹部で、ＣＦＡ中の光受容体内結合タンパク質（ＩＲＢＰ；５０μｇ）、ＣＦＡ中のβ−アミロイドペプチド（１〜４０、非凝集）（５０μｇ）又はＣＦＡ中のＰＢＳで免疫した。いずれの場合も、ＣＦＡに、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）５ｍｇ／ｍｌを補足した。１０日後に、マウスに、毒性用量の凝集Ａβ１〜４０（５０μＭ）を硝子体内注射し、１０日後に、その網膜を切除し、生存ＲＧＣを計測した。（Ａ）ＰＢＳ／ＣＦＡで治療された適合対照においてよりも、ＩＲＢＰ／ＣＦＡで免疫されたＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスでは、かなり少ないＲＧＣが失われた（Ｐ＜０．０００８、両側スチューデントのｔ検定）。
【図１２Ｂ】（Ｂ）ＣＦＡ中の天然β−アミロイドペプチドで免疫したマウスでの生存ＲＧＣの平均数は、ＰＢＳ／ＣＦＡを注射したマウスと有意には異ならなかった。
【図１３Ａ】優性網膜抗原で免疫されたマウスからの活性化脾細胞の非免疫マウスへの受身移入は、保護をもたらすことを示すグラフである。（Ａ）野生型Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスを、後ろ足の足裏で、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）５ｍｇ／ｍｌを補足したＣＦＡ中で乳化されている光受容体内結合タンパク質（ＩＲＢＰ）とＳ抗原との組み合わせ（それぞれ５０μｇ）又はＯＶＡ５０μｇで免疫した。１０日後に、排出性リンパ節を切除し、貯留し、細胞懸濁液を調製し、細胞を計測した。細胞を、その特異的抗原で４８時間刺激することによりｅｘ  ｖｉｖｏ活性化し、次いで、活性化されたＴ細胞を、非免疫Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスに腹膜内注射した。ＩＲＢＰ＋Ｓ抗原に特異的なＴ細胞を、ＰＢＳ中にＴ細胞１．２×１０７個の用量で注射した。被動性Ｔ細胞転嫁の１時間の間、マウスに、グルタミン酸塩の硝子体内注射（４００ｎｍｏｌ）を与え、生存網膜神経節細胞（ＲＧＣ）を１週間後に計測した。ＩＲＢＰ＋Ｓ抗原に特異的なＴ細胞を与えられたマウスにおいてよりも、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞を与えられたマウスでは、かなり少ないＲＧＣが生存した（Ｐ＜０．００１；両側スチューデントのｔ検定）。ＯＶＡ特異的Ｔ細胞を与えられたマウスと非免疫マウスとの間に、グルタミン酸注射を生き延びたＲＧＣの数において差異はなかった（各群ｎ＝４〜６マウス）。
【図１３Ｂ】（Ｂ）マウスに、ＩＲＢＰ又はβ−アミロイドペプチド（１〜４０、非凝集）を対象とする活性化Ｔ細胞８×１０６を静脈内注射した。このＴ細胞の受身移入の１時間後に、マウスに、毒性用量の凝集Ａβ１〜４０を注射した。２週間後に、その網膜を切除し、生存ＲＧＣを計測した。これらのマウスでのニューロン消失は、ＩＲＢＰに反応性を有するＴ細胞の稼働により著しく低下した（Ｐ＜０．００５、両側スチューデントのｔ検定）が、非凝集β−アミロイドに反応性を有するＴ細胞の移入によっては著しい影響を受けなかった。
【図１４】Ｃｏｐ−１での活性免疫は、Ａβ１〜４０毒性に対して保護することを示すグラフである。凝集Ａβ１〜４０を硝子体内注射する６日前に、Ｃ５７Ｂｌ／６ＪマウスをＣｏｐ−１で免疫した。２週間後に、網膜を切除し、生存細胞を計測した。ＰＢＳで処置した適合対照においてよりも、Ｃｏｐ−１で免疫したマウスでは、失われたＲＣＧはかなり少なかった（Ｐ＜０．００１、両側スチューデントのｔ検定）。
【図１５Ａ】非免疫マウスより、天然に生じる調節ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を欠失しているマウスでは、より多くのニューロンが、凝集Ａβ１〜４０中毒を生き延びた。（Ａ）誕生後３日目での胸腺摘出の結果としてＴｒｅｇを欠失しているＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウス（ＴＸＤ３マウス）に、毒性用量のＡβ１〜４０を１２週齢で硝子体内注射した。年齢適合正常対照においてよりも、ＴＸＤ３マウスでは、失われたＲＧＣはかなり僅かであった（Ｐ＜０．００１；両側スチューデントのｔ検定）；各群ｎ＝６〜８マウス）。
【図１５Ｂ】（Ｂ）ＢＡＬＢ／ｃ／ＯＬＡｎｕ／ｎｕマウスに、Ｔｒｅｇを欠失している脾臓からか、ＢＡＬＢ／ｃ／ＯＬＡマウスの全脾臓からの脾細胞４．５×１０７個を補充した。凝集Ａβ１〜４０を注射した後には、適合野生型対照においてよりも、Ｔｒｅｇを欠失している脾細胞を補充されたｎｕ／ｎｕマウスでは、欠失したＲＧＣはかなり少なかった（Ｐ＜０．０５；両側スチューデントのｔ検定）。いずれの群でも、凝集Ａβ１〜４０を注射された非治療ｎｕ／ｎｕマウスにおいてよりも、失われたＲＧＣはかなり少ない（Ｐ＜０．００１；両側スチューデントのｔ検定）。各実験では、凝集Ａβ１〜４０に暴露された眼で計測されたＲＧＣの数を、正常基線値と見なした。２つの実験からの１つの実験の結果を示す。
【図１５Ｃ】（Ｃ）Ｆｏｘｐ３発現の半定量ＲＴ−ＰＣＲ分析。ｍＲＮＡを新たに単離されたＴｅｆｆ及びＴｒｅｇから抽出した。ハウスキーピング遺伝子β−アクチンを定量分析のために使用した。示されている結果は、５つ実験からの代表１実験である。
【図１６Ａ】凝集Ａβ１〜４０と共に、活性化Ｔ細胞と共に、又は伴わずにインキュベーションした小膠細胞での処置２４時間後での、ラット器官型海馬切片培養中の神経細胞の死を示す。ＯＨＳＣをＢＡＬＢ／ｃ／ＯＬＡマウスから得た。切断した後に直ちに、切片を、凝集Ａβ１〜４０のみと、又は凝集Ａβ１〜４０と活性化Ｔｅｆｆとの組み合わせと共に予備インキュベーション（１２時間）しておいた小膠細胞と共に２４時間同時培養した（Ａ）。対照切片を、非免疫小膠細胞で治療するか、非治療のままにした。小膠細胞及び脳切片の同時培養の２４時間後に、切片をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（死細胞のみを染色する蛍光染料）で染色し、蛍光顕微鏡法により分析した。（Ａ）非治療対照ＯＨＳＣで測定された強度に対するパーセンテージとして算出されたＰＩ強度の定量化（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；両側スチューデントのｔ検定；各群でｎ＝６〜８切片）。
【図１６Ｂ】（Ｂ）非治療対照切片の選択顕微鏡写真（１）、非治療小膠細胞と共にインキュベーションされた切片（２）、凝集Ａβ１〜４０で予備インキュベーションされた小膠細胞で治療された切片（３）及び活性化Ｔ細胞と共に凝集Ａβ１〜４０に暴露された小膠細胞で治療された切片（４）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【配列表】
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