(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
大理石症、および、骨粗しょう症からなる群から選択される過剰な神経の興奮に関連する疾患および／または状態を、治療するため、予防するため、および／または、予後を改善するための薬学的組成物であって、アセトアセテート、および、フェニルピルビン酸からなる群から選択される化合物またはその医薬として許容される塩を含有する、薬学的組成物。
【請求項２】
過剰な神経の興奮に関連する疾患および／または状態を、治療するため、予防するため、および／または、予後を改善するための薬学的組成物であって、アセトアセテートを含有する、薬学的組成物。
【請求項３】
過剰な神経の興奮に関連する疾患および／または状態を、治療するため、予防するため、および／または、予後を改善するための薬学的組成物であって、フェニルピルビン酸を含有する、薬学的組成物。
【請求項４】
大理石症、および、骨粗しょう症からなる群から選択される過剰な神経の興奮に関連する疾患および／または状態を、治療のため、予防のため、および／または、予後を改善するための候補化合物をスクリーニングするための方法であって、以下：
（ａ）小胞型神経伝達物質トランスポーターを含む小胞を調製する工程；
（ｂ）該小胞型神経伝達物質トランスポーターが輸送する興奮性神経伝達物質、該再構成した小胞、イオノフォア、および、生理条件のクロライド存在下で、該興奮性神経伝達物質の小胞内への輸送を検出する工程；
（ｃ）該小胞型神経伝達物質トランスポーターが輸送する興奮性神経伝達物質、該再構成した小胞、イオノフォア、生理条件のクロライド、および、試験化合物の存在下で、該興奮性神経伝達物質の輸送を検出する工程；ならびに
（ｄ）上記工程（ｂ）における輸送と、上記工程（ｃ）における輸送を比較して、該試験化合物が、輸送を阻害するか否かを指標として、該試験化合物が、過剰な神経の興奮に関連する疾患および／または状態を、治療のため、予防のため、および／または、予後を改善するための候補化合物であるか否かを決定する工程、
を包含し、ここで、該小胞型神経伝達物質トランスポーターが、グルタミン酸トランスポーター、アスパラギン酸トランスポーター、ヌクレオチドトランスポーターからなる群から選択される、方法。
【請求項５】
前記小胞型神経伝達物質トランスポーターを含む小胞が、リポソームに、単離された小胞型神経伝達物質トランスポーターを再構成することによって調製される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記イオノフォアがバリノマイシンである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
小胞型神経伝達物質トランスポーターの輸送活性について、阻害の解除もしくは活性化をする化合物をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下：
（１）小胞型神経伝達物質トランスポーターの阻害剤存在下において、該小胞型神経伝達物質トランスポーターの輸送活性を測定する工程；
（２）候補化合物、および、上記（１）の阻害剤存在下において、該小胞型神経伝達物質トランスポーターの輸送活性を測定する工程；ならびに
（３）上記（２）の活性が上記（１）の活性より高い場合に、該候補化合物を、阻害の解除能もしくは活性化能を有する化合物として同定する工程；
を包含し、該小胞型神経伝達物質トランスポーターが、グルタミン酸トランスポーター、アスパラギン酸トランスポーター、ヌクレオチドトランスポーターからなる群から選択される、方法であって、ここで、該阻害剤が、以下の式（Ｉ）の化合物：
【化１】
0005630750.tif 000005
ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、および、低級アルキル（１〜４Ｃ）、ならびに、一緒になって、Ｏからなる群から選択され、
ここで、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、および、低級アルキル（１〜４Ｃ）、ならびに、一緒になって、Ｏからなる群から選択され、
Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つは酸素原子を含み、
Ｒ５は、Ｈ、直鎖アルキル、分岐アルキル、アリール、アルキルアリールからなる群から選択される化合物またはその医薬として許容される塩である、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、ここで、前記阻害剤が、アセトアセテート、ピルビン酸、フェニルピルビン酸、３−ヒドロキシブチレート、α−ケト−β−メチル−バレリン酸、および、乳酸からなる群から選択される、方法。
【請求項９】
前記過剰な神経の興奮に関連する疾患および／または状態が大理石症である、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記過剰な神経の興奮に関連する疾患および／または状態が骨粗しょう症である、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記過剰な神経の興奮に関連する疾患および／または状態が大理石症である、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記過剰な神経の興奮に関連する疾患および／または状態が骨粗しょう症である、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記過剰な神経の興奮に関連する疾患および／または状態が大理石症である、請求項４に記載の方法。
【請求項１４】
前記過剰な神経の興奮に関連する疾患および／または状態が骨粗しょう症である、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、興奮性化学伝達調節剤およびそのスクリーニング法の分野に関する。また、本発明の興奮性化学伝達調節剤は、癲癇のような過剰なニューロンの発火に起因する障害の治療薬の分野、および、抑制されたニューロンの活性化による治療の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経伝達物質は、シナプス前の細胞（前シナプス細胞）から放出され，シナプスを横切ってシナプス後の細胞（後シナプス細胞）を刺激または阻害する特異的化学物質である。神経伝達物質は、ニューロンで生産されシナプス前終末から放出されて、シナプス後膜に直接作用する。この作用によって標的細胞で引き起こされる応答反応は、電気的興奮または抑制を生み出す。電気的興奮を生み出す神経伝達物質を興奮性伝達物質といい、電気的抑制を生み出す神経伝達物質を抑制性伝達物質という。ニューロンで生産された神経伝達物質は、前ニューロン細胞のシナプス小胞に存在する神経伝達物質トランスポーターによりシナプス小胞内に蓄積され、エキソサイトーシスによってシナプス間隙に放出され、後シナプス細胞の細胞表面に存在する特異的受容体に結合する一方で、シナプス前終末やグリア細胞の細胞膜に存在する神経伝達物質トランスポーターによって回収される。【０００３】
この一連の神経伝達物質の動態には、シナプス小胞に存在する神経伝達物質トランスポーター（小胞型神経伝達物質トランスポーターまたは小胞型トランスポーターと呼ばれる）およびシナプス前終末・グリア細胞の細胞膜に存在する神経伝達物質トランスポーター（原形質膜型トランスポーター）が関与するが、これら２種の神経伝達物質トランスポーターは構造および機能が異なる分子である。【０００４】
てんかん（癲癇）とは、過度のニューロンの放電による発作的な脳の機能障害を特徴とする慢性疾患で、通常、意識の変調を伴う疾患である。発作は行動の要素的または複合的障害に限られる場合と、全身的痙攣に発展する場合とがある。発作の臨床所見は、全身痙攣や局所痙攣を含む行動の複雑異常から、意識障害の瞬間的発作まで様々である。これらの臨床所見には種々の分類がある。発作の型を示す用語は記述的であり標準化されているが、完全に統一されたものものではない。【０００５】
上記のように、癲癇は過度のニューロンの放電による発作的な脳の機能障害を特徴とすることから、抗癲癇薬の作用としては、興奮性化学伝達を低下させる一方で、抑制性化学伝達を亢進させることが考えられる。【０００６】
例えば、公知の抗癲癇薬であるバルプロ酸の作用は、脳内における抑制性伝達物質であるＧＡＢＡ濃度を増加させることであると考えられている。バルプロ酸はほとんど全ての癲癇型に有効であると考えられるが、用量依存的な消火器および肝臓に対する副作用があり、また、催奇形性である。Ｎａチャンネル抑制による神経興奮性を阻害する薬剤としてフェニトインが公知であるが、眼振、構音障害、失調、めまい、複視、傾眠、異常行動、認知障害、過敏症、発疹、多毛、歯肉増殖、骨軟化症、および、大球性貧血などの副作用が知られている。既存の抗癲癇薬には例えば上記の副作用の問題があり、併用療法をしても副作用を増すのみであることから、通常は、単剤でＴＤＭ（治療効果や副作用に関する様々な因子をモニタリングしながらそれぞれの患者に個別化した薬物投与を行うこと）を利用して至適量まで使用するのが通常である。【０００７】
興奮性化学伝達の低下を介する抗癲癇薬の開発として、神経伝達物質トランスポーターの活性調節剤を標的とするならば、シナプス前終末・グリア細胞の細胞膜に存在する興奮性神経伝達物質に特異的な神経伝達物質トランスポーター（細胞膜型神経伝達物質トランスポーター）の活性化剤、または、シナプス小胞に存在する興奮性神経伝達物質に特異的な神経伝達物質トランスポーター（小胞型神経伝達物質トランスポーター）の阻害剤が想定できる。なぜならば、細胞膜型神経伝達物質トランスポーターを活性化すると、シナプス間隙に放出された興奮性神経伝達物質のクリアランスを促進することで興奮性化学伝達の低下が合理的に予測されるからである。また、小胞型神経伝達物質トランスポーターを阻害することで、シナプス小胞に蓄積される興奮性神経伝達物質の量の低下が可能であり、その結果、興奮性化学伝達の低下が合理的に予測されるからである。【０００８】
しかしながら、興奮性神経伝達物質は複数存在することから、癲癇においては、複数の興奮性神経伝達物質が関与すると考えられる。例えば、グリア細胞は癲癇などの疾患と関連していることが知られており、そして、グリア細胞は、ＡＴＰやグルタミン酸などの興奮性神経伝達物質を分泌することが知られ、その分泌を阻害することによって、これら疾患に対する治療効果が期待できると考えられている（非特許文献５〜１３）。そのため、抗癲癇薬の候補化合物としては、複数種類の興奮性神経伝達物質の作用を阻害する化合物が求められる。【０００９】
その一方で、神経伝達物質トランスポーターは、細胞膜型であるか小胞型であるかに拘らず、各種の興奮性神経伝達物質に対して特異的であるため、神経伝達物質トランスポーターを標的として抗癲癇薬を開発する場合には、広範な種類の神経伝達物質トランスポーターを対象としなければならないと考えられる。【００１０】
小胞型グルタミン酸トランスポーターに対する阻害剤については研究されているものの（非特許文献１）、そのいずれもが、グルタミン酸トランスポーターと類似の構造を有する化合物または、小胞型神経伝達物質トランスポータータンパク質に不可逆的に結合する色素類を中心とした化合物である。小胞型グルタミン酸トランスポーターと類似の構造を有する化合物は、複数種類の小胞型神経伝達物質トランスポーターを阻害することはできないと考えられる。また、小胞型神経伝達物質トランスポータータンパク質に不可逆的に結合する色素を中心とした化合物は、小胞型神経伝達物質トランスポーターを不可逆的に失活させ、その結果、看過できない副作用を生じることが予測される。【００１１】
小胞型グルタミン酸トランスポーターは、クロライドイオン要求性であることが知られており（非特許文献２）、２−ケト−３−メチルバレリン酸が小胞型グルタミン酸トランスポーターのクロライドイオン要求性を変化させることも知られている（非特許文献３および４）。しかしながら、２−ケト−３−メチルバレリン酸は、小胞型グルタミン酸トランスポーターに対する阻害効果が非常に小さく、そのため、小胞型グルタミン酸トランスポーターの阻害剤として実用的であるとは認識されていない。しかも２−ケト−３−メチルバレリン酸は遺伝子性酵素欠損により体内蓄積する物質であり、神経毒性が報告されている（非特許文献３および４）。またそのため、２−ケト−３−メチルバレリン酸は、癲癇などの疾患の治療薬として有用であるどころか、神経毒として作用すると考えられる。【００１２】
現時点では、神経伝達物質トランスポーター（特に、小胞型神経伝達物質トランスポーター）の構造および機能、ならびに阻害剤については、充分な知見がない。そのため、広範な神経伝達物質トランスポーターを対象とする活性調節剤の開発は多大な困難が予想される。【００１３】
そのような困難性が予測されるにも拘らず、興奮性神経伝達物質に直接関わる分子である神経伝達物質トランスポーターを標的として可逆的に結合する抗癲癇薬は、副作用が少ないことが予測されるなどの利点から魅力的であるため、広範な神経伝達物質トランスポーターを対象とする活性調節剤（例えば、興奮性化学伝達阻害剤）の開発が求められている。また、抑制されたニューロンを活性化する薬剤の開発も求められている。【００１４】
興奮性化学伝達阻害剤は、癲癇以外にも、炎症、振せん、とう痛、高血圧、虚血、パーキンソン病、アルツハイマー病、大理石症、および、骨粗相症などの疾患／状態の治療、予防、および／または予後に有用であると考えられる。【００１５】
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、次のものがある。
【非特許文献１】Thompson, C. M.ら、"Inhibitorof the glutamate vesiculartransporter (VGLUT)", Curr. Med. Chem. 12,2041-2056 (2005)
【非特許文献２】Juge N, YoshidaY, Yatsushiro S, Omote H, Moriyama Y.、"Vesicularglutamate transportercontains two independent transport machineries."、JBiol Chem. 2006 Dec22;281(51):39499-506.
【非特許文献３】Tavares RG ら、"Inhibitionof glutamate uptake into synapticvesicles of rat brain by the metabolitesaccumulating in maple syrup urinedisease."、J Neurol Sci. 2000 Dec1;181(1-2):44-9
【非特許文献４】Marcelo Reis,Mariana Farage, Herman Wolosker、"Chloride-dependentinhibition ofvesicular glutamate uptake by alpha-keto acids accumulated inmaple syrup urine
【非特許文献５】Bekar L et al.,(2008) Adenosine is crucial for deep brainstimulation-mediated attenuation oftremor. Nature Med. 14, 75-80.
【非特許文献６】Tian G-F etal., An astrocytic basis of epilepsy. Nature Med. 2005,973-981.
【非特許文献７】noue K et al.,(2007) The role of nucleotides in the neuron-gliacommunication responsible forthe brain functions. J. Neurochem. 102, 1447-1458.
【非特許文献８】INedergaard Mand Dirnagl U. (2005) Role of glical cells in cerebralischemia. Glia 50,281-286.
【非特許文献９】Fields RD andBurnstock G. (2006) Purinergic signaling in neuron-gliainteractions. NatureNeuroscience 7, 423-436.
【非特許文献１０】Tian G-F etal., An astrocytic basis of epilepsy. Nature Med. 2005,973-981.
【非特許文献１１】Walts E (2007)Epilepsy controlled by low-carb diets effect on brainchannels. Nature Med. 13,516-517.
【非特許文献１２】Freeman J etal., (2006) The ketogenic diet: from molecularmechanisms to clinical effects.Epilepsy Res. 68, 145-180.
【非特許文献１３】Hartman AL etal., (2007) The neuropharmacology of the ketogenicdiet. Pediatr Neurol 36,281-292.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
興奮性化学伝達阻害剤およびそのスクリーニング法を提供することを、本発明の課題とする。特に、興奮性神経伝達物質に対する小胞型神経伝達物質トランスポーターの少なくとも２種を、生理条件のクロライド濃度下で阻害する興奮性化学伝達阻害剤およびそのスクリーニング法を提供することを、本発明の課題とする。さらに、癲癇、炎症、振せん、とう痛、高血圧、虚血、パーキンソン病、アルツハイマー病、大理石症、および、骨粗相症などの疾患／状態の治療、予防、および／または予後に有用である薬剤およびそのスクリーニング法を提供することを、本発明の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記課題は、興奮性神経伝達物質を輸送する小胞型神経伝達物質トランスポーターの阻害剤をスクリーニングするための新規の手法を開発し、そして、そのスクリーニング法によって、興奮性神経伝達物質を輸送する小胞型神経伝達物質トランスポーターの少なくとも２種類に対して阻害効果を有する化合物を同定する一群の化合物を同定することによって、本発明者らは、本発明を完成した。【００１８】
従って、本発明は、以下を提供する。
（項目１）  興奮性神経伝達物質に対する小胞型神経伝達物質トランスポーターの少なくとも２種を、生理条件のクロライド濃度下で阻害するための、以下の式（Ｉ）の化合物：【００１９】
【化３】
0005630750.tif 000002
ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、および、低級アルキル（１〜４Ｃ）、ならびに、一緒になって、Ｏからなる群から選択され、
ここで、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、および、低級アルキル（１〜４Ｃ）、ならびに、一緒になって、Ｏからなる群から選択され、
Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つは酸素原子を含み、
Ｒ５は、Ｈ、直鎖アルキル、分岐アルキル、置換アルキル、アリール、アルキルアリールからなる群から選択される化合物またはその医薬として許容される塩を含有する、薬学的組成物。
（項目２）  項目１に記載の薬学的組成物であって、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、および、ＯＨ、ならびに、一緒になって、Ｏからなる群から選択され、
ここで、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、および、ＯＨ、ならびに、一緒になって、Ｏからなる群から選択される、薬学的組成物。
（項目３）  項目２に記載の薬学的組成物であって、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、および、一緒になって、Ｏからなる群から選択され、
ここで、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、および、一緒になって、Ｏからなる群から選択される、薬学的組成物。
（項目４）  項目１に記載の薬学的組成物であって、Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つは酸素原子を含む、薬学的組成物。
（項目５）  項目４に記載の薬学的組成物であって、
ここで、Ｒ３およびＲ４は、一緒になって、Ｏである、薬学的組成物。
（項目６）  項目１に記載の薬学的組成物であって、ここで、前記化合物が、アセトアセテート、ピルビン酸、フェニルピルビン酸、３−ヒドロキシブチレート、α−ケト−β−メチル−バレリン酸、および、乳酸からなる群から選択される、薬学的組成物。
（項目７）  項目６に記載の薬学的組成物であって、ここで、前記化合物が、アセトアセテート、および、ピルビン酸からなる群から選択される、薬学的組成物。
（項目８）  項目１に記載の薬学的組成物であって、ここで、前記興奮性神経伝達物質に対する小胞型神経伝達物質トランスポーターの少なくとも２種が、グルタミン酸トランスポーター、アスパラギン酸トランスポーター、および、ヌクレオチドトランスポーターからなる群から選択される、薬学的組成物。
（項目９）  過剰な神経の興奮に関連する疾患および／または状態を、治療するため、予防するため、および／または、予後を改善するための薬学的組成物であって、以下の式（Ｉ）の化合物：【００２０】
【化４】
0005630750.tif 000003
ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、および、低級アルキル（１〜４Ｃ）、ならびに、一緒になって、Ｏからなる群から選択され、
ここで、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、および、低級アルキル（１〜４Ｃ）、ならびに、一緒になって、Ｏからなる群から選択され、
Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つは酸素原子を含み、
Ｒ５は、Ｈ、直鎖アルキル、分岐アルキル、置換アルキル、アリール、アルキルアリールからなる群から選択される化合物またはその医薬として許容される塩を含有する、薬学的組成物。
（項目１０）  項目９に記載の薬学的組成物であって、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、および、ＯＨ、ならびに、一緒になって、Ｏからなる群から選択され、
ここで、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、および、ＯＨ、ならびに、一緒になって、Ｏからなる群から選択される、薬学的組成物。
（項目１１）  項目１０に記載の薬学的組成物であって、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、および、一緒になって、Ｏからなる群から選択され、
ここで、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、および、一緒になって、Ｏからなる群から選択される、薬学的組成物。
（項目１２）  項目９に記載の薬学的組成物であって、Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つは酸素原子を含む、薬学的組成物。
（項目１３）  項目１２に記載の薬学的組成物であって、
ここで、Ｒ３およびＲ４は、一緒になって、Ｏである、薬学的組成物。
（項目１４）  項目９に記載の薬学的組成物であって、ここで、前記化合物が、アセトアセテート、ピルビン酸、フェニルピルビン酸、３−ヒドロキシブチレート、α−ケト−β−メチル−バレリン酸、および、乳酸からなる群から選択される、薬学的組成物。
（項目１５）  項目１４に記載の薬学的組成物であって、ここで、前記化合物が、アセトアセテート、および、ピルビン酸からなる群から選択される、薬学的組成物。
（項目１６）  過剰な神経の興奮に関連する疾患および／または状態が、癲癇、炎症、振せん、とう痛、高血圧、虚血、パーキンソン病、アルツハイマー病、大理石症、および、骨粗相症からなる群から選択される、項目９に記載の薬学的組成物。
（項目１７）  過剰な神経の興奮に関連する疾患および／または状態が、項目９に記載の薬学的組成物。
（項目１８）  過剰な神経の興奮に関連する疾患および／または状態を、治療のため、予防のため、および／または、予後を改善するための候補化合物をスクリーニングするための方法であって、以下：
（ａ）小胞型神経伝達物質トランスポーターを含む小胞を調製する工程；
（ｂ）該小胞型神経伝達物質トランスポーターが輸送する興奮性神経伝達物質、該再構成した小胞、イオノフォア、および、生理条件のクロライド存在下で、該興奮性神経伝達物質の小胞内への輸送を検出する工程；
（ｃ）該小胞型神経伝達物質トランスポーターが輸送する興奮性神経伝達物質、該再構成した小胞、イオノフォア、生理条件のクロライド、および、試験化合物の存在下で、該興奮性神経伝達物質の輸送を検出する工程；ならびに
（ｄ）上記工程（ｂ）における輸送と、上記工程（ｃ）における輸送を比較して、該試験化合物が、輸送を阻害するか否かを指標として、該試験化合物が、過剰な神経の興奮に関連する疾患および／または状態を、治療のため、予防のため、および／または、予後を改善するための候補化合物であるか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
（項目１９）  前記小胞型神経伝達物質トランスポーターを含む小胞が、リポソームに、単離された小胞型神経伝達物質トランスポーターを再構成することによって調製される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）  前記イオノフォアがバリノマイシンである、項目１８に記載の方法。
（項目２１）  前記小胞型神経伝達物質トランスポーターが、グルタミン酸トランスポーター、アスパラギン酸トランスポーター、ヌクレオチドトランスポーターからなる群から選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２２）  小胞型神経伝達物質トランスポーターの輸送活性について、阻害の解除もしくは活性化をする化合物をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下：
（１）小胞型神経伝達物質トランスポーターの阻害剤存在下において、該小胞型神経伝達物質トランスポーターの輸送活性を測定する工程；
（２）候補化合物、および、上記（１）の阻害剤存在下において、該小胞型神経伝達物質トランスポーターの輸送活性を測定する工程；ならびに
（３）上記（２）の活性が上記（１）の活性より高い場合に、該候補化合物を、阻害の解除能もしくは活性化能を有する化合物として同定する工程；
を包含する、方法。
（項目２３）  項目２２に記載の方法であって、ここで、前記阻害剤が、アセトアセテート、ピルビン酸、フェニルピルビン酸、３−ヒドロキシブチレート、α−ケト−β−メチル−バレリン酸、および、乳酸からなる群から選択される、方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明に従って、興奮性化学伝達阻害剤およびそのスクリーニング法が提供される。特に、本発明に従って、興奮性神経伝達物質に対する小胞型神経伝達物質トランスポーターの少なくとも２種を、生理条件のクロライド濃度下で阻害する興奮性化学伝達阻害剤およびそのスクリーニング法が提供される。さらに、本発明に従って、癲癇、炎症、振せん、とう痛、高血圧、虚血、パーキンソン病、アルツハイマー病、大理石症、および、骨粗相症などの疾患／状態の治療、予防、および／または予後に有用である薬剤およびそのスクリーニング法が提供され、具体的な有効成分が提供される。また、本発明に従って、抑制されたニューロンを活性化する薬剤も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１（Ａ）は、Ｆ−ＡＴＰａｓｅとグルタミン酸トランスポーターとを再構成したプロテオリポソームにおけるグルタミン酸輸送活性を示すグラフである。「＋ＡＴＰ」はＡＴＰ存在下での輸送活性を、「−ＡＴＰ」はＡＴＰ非存在下での輸送活性を示す。
【００２３】
図１（Ｂ）は、Ｆ−ＡＴＰａｓｅを用いることなく、グルタミン酸トランスポーターのみを再構成したプロテオリポソームにおけるグルタミン酸輸送活性を示すグラフである。「＋バリノマイシン」はバリノマイシン存在下での輸送活性を、「−バリノマイシン」はバリノマイシン非存在下での輸送活性を示す。
【図２】図２は、５ｍＭクロライド存在下（５ｍＭ  Ｃｌ−）、および、２０ｍＭクロライド存在下（２０ｍＭ  Ｃｌ−）における、種々の候補化合物の、グルタミン酸輸送阻害活性を試験した結果である。
【図３】図３は、VGLUTによるグルタミン酸輸送の活性阻害における、アセトアセテートの濃度依存性を示す結果である。
【図４】図４は、アセトアセテートによるVGLUT活性阻害がクロライドイオン濃度を増やす事により解消することを示した結果である。黒丸「●」は、アセトアセテートを添加しなかった結果（コントロール）である。黒三角「▲」は、０．２ｍＭアセトアセテートを添加した結果である。白丸「○」は、１ｍＭアセトアセテートを添加した結果である。白三角「△」は、５ｍＭアセトアセテートを添加した結果である。
【図５】図５は、高い阻害活性を示した候補化合物の構造と、50%阻害に必要な濃度(IC50)を示す図である。
【図６】図６Ａ（ＶＭＡＴ）は、モノアミントランスポーターに対する１ｍＭ  アセトアセテートの阻害活性を示す結果である。図６Ｂ（ＶＩＡＡＴ）は、ＧＡＢトランスポーターに対する１ｍＭ  アセトアセテートの阻害活性を示す結果である。いずれの実験も１０ｍＭのクロライドイオン存在下で行った。
【図７】図７Ａは、アスパラギン酸トランスポーター（シアリン）によるアスパラギン酸輸送活性に対する、アセトアセテートの阻害活性を示す結果である。図７Ｂは、ヌクレオチドトランスポーター（ＶＮＵＴ）によるＡＴＰ輸送活性に対する、アセトアセテートの阻害活性を示す結果である。
【図８】図８は、海馬ニューロンからのＫＣｌによって誘起されるグルタミン酸のエキソサイトーシスに対するアセトアセテートの阻害効果を試験した結果である。
【図９Ａ】図９Ａは、ラット脳への４ＡＰおよびアセトアセテートの投与法および循環液採取法を模式的に示した図である。
【図９Ｂ】図９Ｂの上図は、４ＡＰ投与のタイミング（下向きの矢印）、および、サンプリングのタイミング（下向きの矢印）を模式的に示した図である。図９Ｂの下図は、各タイミングでサンプリングされた循環中のグルタミン酸（上部グラフの▼）およびドーパミン（下部グラフの▼）の測定結果である。
【図９Ｃ】図９Ｃは、種々のアセトアセテート濃度での、グルタミン酸（●）およびドーパミン（○）の分泌量を示す。１０ｍＭのアセトアセテート投与後の洗浄により、グルタミン酸分泌が回復した（「洗浄」の矢印）。
【図９Ｄ】図９Ｄは、４ＡＰによって誘起された発作に対する、アセトアセテートの影響を示した結果である（ｎ＝４、*p<0.1、**p<0.01、***p<0.001）。
【配列表フリーテキスト】
【００２４】
配列番号１は、グルタミン酸トランスポーター（ＶＧＬＵＴ１）の核酸配列である。【００２５】
配列番号２は、グルタミン酸トランスポーター（ＶＧＬＵＴ１）のアミノ酸配列である。【００２６】
配列番号３は、アスパラギン酸トランスポーター（シアリン）の核酸配列である。【００２７】
配列番号４は、アスパラギン酸トランスポーター（シアリン）のアミノ酸配列である。【００２８】
配列番号５は、ヌクレオチドトランスポーター（ＶＮＵＴ）の核酸配列である。【００２９】
配列番号６は、ヌクレオチドトランスポーター（ＶＮＵＴ）のアミノ酸配列である。【００３０】
配列番号７は、グルタミン酸トランスポーター（ＶＧＬＵＴ２）の核酸配列である。【００３１】
配列番号８は、グルタミン酸トランスポーター（ＶＧＬＵＴ２）のアミノ酸配列である。【００３２】
配列番号９は、グルタミン酸トランスポーター（ＶＧＬＵＴ３）の核酸配列である。【００３３】
配列番号１０は、グルタミン酸トランスポーター（ＶＧＬＵＴ３）のアミノ酸配列である。【００３４】
配列番号１１は、グルタミン酸トランスポーター（ＶＧＬＵＴ２）をＰＣＲクローニングするためのセンスプライマーである。【００３５】
配列番号１２は、グルタミン酸トランスポーター（ＶＧＬＵＴ２）をＰＣＲクローニングするためのアンチセンスプライマーである。【００３６】
配列番号１３は、ヒトシアリン遺伝子クローニングに使用した正方向プライマーの配列である。【００３７】
配列番号１４は、ヒトシアリン遺伝子クローニングに使用した逆方向プライマーの配列である。【００３８】
配列番号１５は、ヒトシアリン遺伝子クローニングに使用した正方向プライマーの配列である。【００３９】
配列番号１６は、ヒトシアリン遺伝子クローニングに使用した逆方向プライマーの配列である。【００４０】
配列番号１７は、マウスH183R 1st PCRセンスプライマーの配列である。【００４１】
配列番号１８は、マウスH183R 1st PCRアンチセンスプライマーの配列である。【００４２】
配列番号１９は、マウスH183R 2nd PCRセンスプライマーの配列である。【００４３】
配列番号２０は、ヒトＶＮＵＴ遺伝子のクローニングに使用したセンスプライマーの配列である。【００４４】
配列番号２１は、ヒトＶＮＵＴ遺伝子のクローニングに使用したアンチセンスプライマーの配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。【００４６】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。【００４７】
本明細書において使用する場合、用語「興奮性神経伝達物質」とは、シナプス間隙に放出された場合に興奮性作用を示す神経伝達物質をいう。興奮性神経伝達物質としては、例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸、ＡＴＰが挙げられるが、これに限定されない。【００４８】
本明細書において使用する場合、用語「小胞型神経伝達物質トランスポーター」とは、ニューロンのシナプス小胞に存在し、シナプス小胞内に興奮性神経伝達物質を能動輸送するトランスポーターをいう。【００４９】
本明細書において使用する場合、用語「生理条件のクロライド濃度」とは、哺乳動物細胞（例えば、ニューロン）の細胞質中のクロライド濃度をいう。生理条件のクロライド濃度は、５〜２０ｍＭ、例えば、１０ｍＭである。【００５０】
本明細書において使用する場合、用語「アリール」とは、「Ａｒ」と互換可能に用いられ、単環状または双環状芳香族残基あり、１種またはそれ以上のヘテロ原子を任意に含む化合物をいう。Ａｒとしては、代表的には、フェニル、ナフチル、キノリル、ピリジル、ピリミジル、ベンゾチアゾイル、ベンズイミダゾイルなどが挙げられるが、これに限定されない。【００５１】
本明細書において使用する場合、用語「アルキルアリール」とは、「（ＣＨ２）ｍ−Ａｒ」と互換可能に用いられ、ここでｍは１〜１０であり、そしてＡｒ上記に定義されるとおりである。【００５２】
本明細書において使用する場合、用語「過剰な神経の興奮に関連する疾患および／または状態」とは、神経が過剰に興奮することに起因する疾患および／または異常な状態をいう。過剰な神経の興奮に関連する疾患および／または状態としては、例えば、癲癇、炎症、振せん、とう痛、高血圧、虚血、パーキンソン病、アルツハイマー病、大理石症、および、骨粗相症が挙げられるが、これに限定されない。【００５３】
本明細書において使用する場合、用語「神経が抑制されることに起因する疾患および／または状態」としては、例えば、ボケ、知覚障害（例えば味覚障害が挙げられるが、これに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。【００５４】
本明細書において使用する場合、用語「グルタミン酸トランスポーター」とは、小胞型神経伝達物質トランスポーターの一種でグルタミン酸を小胞内に輸送するトランスポーターまたはその改変体をいう。グルタミン酸トランスポーターは、代表的には：
（ａ）配列番号１、７または９に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、グルタミン酸輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｂ）配列番号１、７または９に記載の核酸配列と少なくとも８０％相同な配列を含む核酸であって、グルタミン酸輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｃ）配列番号２、８または１０に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸；および
（ｄ）配列番号２、８または１０に記載されるアミノ酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含むアミノ酸配列を有し、かつグルタミン酸輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
からなる群から選択される、核酸によってコードされるタンパク質である。【００５５】
本明細書において使用する場合、用語「アスパラギン酸トランスポーター」とは、小胞型神経伝達物質トランスポーターの一種でアスパラギン酸を小胞内に輸送するトランスポーターまたはその改変体をいう。アスパラギン酸トランスポーターは、代表的には：
（ａ）配列番号３に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、アスパラギン酸輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｂ）配列番号３に記載の核酸配列と少なくとも８０％相同な配列を含む核酸であって、アスパラギン酸輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｃ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸；および
（ｄ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含むアミノ酸配列を有し、かつアスパラギン酸輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
からなる群から選択される、核酸によってコードされるタンパク質である。【００５６】
本明細書において使用する場合、用語「ヌクレオチドトランスポーター」とは、小胞型神経伝達物質トランスポーターの一種でヌクレオチド（例えば、ＡＴＰ、ＡＤＰおよびＧＴＰ）を小胞内に輸送するトランスポーターまたはその改変体をいう。ヌクレオチドトランスポーターは、代表的には：
（ａ）配列番号５に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、ＡＴＰ輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｂ）配列番号５に記載の核酸配列と少なくとも８０％相同な配列を含む核酸であって、ＡＴＰ輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｃ）配列番号６に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸；および
（ｄ）配列番号６に記載されるアミノ酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＴＰ輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
からなる群から選択される、核酸によってコードされるタンパク質である。【００５７】
本明細書において使用される用語「トランスポーター」とは、脂質二重膜を透過できない物質（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸、および、ヌクレオチド）を、脂質二重膜を越えて輸送する物質をいう。典型的には、トランスポーターは、脂質二重膜中に存在する膜タンパク質である。タンパク質であるトランスポーターは、本明細書において「輸送タンパク質」と互換可能に使用される。【００５８】
本明細書において使用される用語「人工膜」とは、脂質を原料として人工的に調製された膜であり、好ましくは、脂質二重膜であるがこれに限定されない。「人工膜」としては、例えば、リポソームが挙げられるが、これに限定されない。【００５９】
本明細書において使用される用語「トランスポーターの活性調節剤」とは、トランスポーターの輸送活性に影響を与える物質をいう。「トランスポーターの活性調節剤」は、輸送活性を促進する物質であっても、阻害する物質であってもよい。【００６０】
本明細書において使用される用語「興奮性神経伝達阻害剤」とは、興奮性神経伝達物質による興奮性神経伝達を阻害する物質をいう。この阻害作用は、限定されることはないが、代表的には、小胞型神経伝達物質トランスポーターの阻害によってもたらされる。【００６１】
本明細書において使用される用語「輸送活性」とは、脂質二重膜を透過できない物質（例えば、興奮性神経伝達物質）を、脂質二重膜を越えて輸送する活性をいう。【００６２】
本明細書において使用する場合、用語「イオノフォア」とは、脂質二重膜に対する特定のイオンの透過性を増加させる物質をいう。イオノフォアは、好ましくは、バリノマイシンである。【００６３】
本明細書において使用される場合、「キット」とは、複数の容器、および製造業者の指示書を含み、そして各々の容器が、本発明の核酸および／またはタンパク質を含む製品をいう。必要に応じて、本発明のキットは、（ａ）リポソームのような人工膜、あるいは、人工膜を調製するための脂質、（ｂ）興奮性神経伝達物質、および、（ｃ）イオノフォアを含む。【００６４】
「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」は、一本鎖形態、二本鎖形態、または他の形態である、リン酸エステルポリマー形態のリボヌクレオチド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、もしくはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオチド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、もしくはデオキシシチジン（ＤＮＡ分子」）、またはそれらの任意のホスホエステルアナログ（例えば、ホスホロチオエートおよびチオエステル）を指し得る。【００６５】
「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）中の一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオシド」とも呼ばれる）であり、２つの以上のヌクレオチドの任意の鎖またはその相補鎖を意味する。本発明の好ましい核酸は、配列番号１に示される核酸、ならびにその相補鎖、改変体およびフラグメントを包含する。【００６６】
「相補鎖」とは、ある核酸配列に対して塩基対を形成し得るようなヌクレオチドの鎖を意味する。例えば、二本鎖ＤＮＡの各々の鎖は互いに相補的な塩基配列を有し、一方の鎖から見て他方の鎖は相補鎖である。【００６７】
「コード配列」または発現生成物（例えば、ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、もしくは酵素）を「コードする」配列は、発現された場合にその生成物の生成をもたらすヌクレオチド配列である。【００６８】
「タンパク質」、「ペプチド」または「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の連続列を含む。本発明の好ましいペプチドは、配列番号２に示されるペプチド、ならびにその改変体およびフラグメントを包含する。【００６９】
「タンパク質配列」、「ペプチド配列」、または「ポリペプチド配列」または「アミノ酸配列」は、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド中にある一連の２つ以上のアミノ酸を指す。【００７０】
本明細書において遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。また、本明細書において配列（核酸配列、アミノ酸配列など）の同一性とは、２以上の対比可能な配列の、互いに対する同一の配列（個々の核酸、アミノ酸など）の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて相同性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、相同性と類似性とは同じ数値を示す。【００７１】
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメータを用いて算出される。【００７２】
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。【００７３】
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。【００７４】
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％  ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。【００７５】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。【００７６】
本明細書において配列（アミノ酸または核酸など）の「同一性」、「相同性」および「類似性」のパーセンテージは、比較ウィンドウで最適な状態に整列された配列２つを比較することによって求められる。ここで、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の比較ウィンドウ内の部分には、２つの配列の最適なアライメントについての基準配列（他の配列に付加が含まれていればギャップが生じることもあるが、ここでの基準配列は付加も欠失もないものとする）と比較したときに、付加または欠失（すなわちギャップ）が含まれる場合がある。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がどちらの配列にも認められる位置の数を求めることによって、マッチ位置の数を求め、マッチ位置の数を比較ウィンドウ内の総位置数で割り、得られた結果に１００を掛けて同一性のパーセンテージを算出する。検索において使用される場合、相同性については、従来技術において周知のさまざまな配列比較アルゴリズムおよびプログラムの中から、適当なものを用いて評価する。このようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡおよびＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（８）：２４４４−２４４８、  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（２）：４６７３−４６８０、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：３８３−４０２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２）があげられるが、何らこれに限定されるものではない。特に好ましい実施形態では、従来技術において周知のＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（たとえば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６７−２２６８、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２を参照のこと）を用いてタンパク質および核酸配列の相同性を評価する。特に、５つの専用ＢＬＡＳＴプログラムを用いて以下の作業を実施することによって比較または検索が達成され得る。【００７７】
（１）  ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴ３でアミノ酸のクエリー配列をタンパク質配列データベースと比較；
（２）  ＢＬＡＳＴＮでヌクレオチドのクエリー配列をヌクレオチド配列データベースと比較；
（３）  ＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリー配列（両方の鎖）を６つの読み枠で変換した概念的翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較；
（４）  ＴＢＬＡＳＴＮでタンパク質のクエリー配列を６つの読み枠（両方の鎖）すべてで変換したヌクレオチド配列データベースと比較；
（５）  ＴＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリ配列を６つの読み枠で変換したものを、６つの読み枠で変換したヌクレオチド配列データベースと比較。【００７８】
ＢＬＡＳＴプログラムは、アミノ酸のクエリ配列または核酸のクエリ配列と、好ましくはタンパク質配列データベースまたは核酸配列データベースから得られた被検配列との間で、「ハイスコアセグメント対」と呼ばれる類似のセグメントを特定することによって相同配列を同定するものである。ハイスコアセグメント対は、多くのものが従来技術において周知のスコアリングマトリックスによって同定（すなわち整列化）されると好ましい。好ましくは、スコアリングマトリックスとしてＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−１４４５、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １７：４９−６１）を使用する。このマトリックスほど好ましいものではないが、ＰＡＭまたはＰＡＭ２５０マトリックスも使用できる（たとえば、Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ａｎｄ  Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，１９７８，Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｄｉｓｔａｎｃｅ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ：  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎを参照のこと）。ＢＬＡＳＴプログラムは、同定されたすべてのハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価し、好ましくはユーザー固有の相同率などのユーザーが独自に定める有意性の閾値レベルを満たすセグメントを選択する。統計的な有意性を求めるＫａｒｌｉｎの式を用いてハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価すると好ましい（Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６７−２２６８参照のこと）。【００７９】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ホルモン、サイトカインの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。【００８０】
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔ  ＥＳ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。【００８１】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。【００８２】
（治療、予防および／または予後における用途）
本発明の化合物は、少なくとも２種類の小胞型神経伝達物質トランスポーターを調節（阻害または阻害の解除もしくは活性化）することが可能である。原理にとらわれることを望まないが、本発明の化合物による阻害メカニズムは、以下のとおりである：（ａ）小胞型神経伝達物質トランスポーター、なかでも特に興奮性神経伝達物質を輸送するトランスポーターは、その輸送活性にクロライドを必要とする；（ｂ）生理条件のクロライド濃度が存在する場合（通常、５〜２０ｍＭ、代表的には、１０ｍＭ）、小胞型神経伝達物質トランスポーターは活性である；（ｃ）本発明の化合物を添加すると、小胞型神経伝達物質トランスポーターのクロライド感受性が変化し、その結果、輸送活性を示すためには、より高濃度のクロライドを要求する一方で、生理条件のクロライド濃度では、充分な輸送活性を示さない；（ｄ）そのため、生理条件のクロライド濃度下では、本発明の化合物は、濃度依存的に、小胞型神経伝達物質トランスポーターの輸送活性を調節（阻害または阻害の解除もしくは活性化、好ましくは、阻害）する。【００８３】
また、理論に拘束されることは望まないが、小胞型神経伝達物質トランスポーターの輸送活性を阻害すると、シナプス小胞内への興奮性神経伝達物質の輸送が阻害され、その結果、興奮性神経伝達物質によって生み出される電気的興奮が阻害されることとなる。そのため、本発明の薬学的組成物は、過剰な神経の興奮に関連する疾患および／または状態（例えば、癲癇）の治療、予防および／または予後に利用することが可能である。【００８４】
また、小胞型神経伝達物質トランスポーターの輸送活性について、阻害の解除もしくは活性化をすると、シナプス小胞内への興奮性神経伝達物質の輸送について、阻害の解除もしくは活性化され、その結果、興奮性神経伝達物質によって生み出される電気的興奮が増強されることとなる。そのため、本発明の薬学的組成物は、神経の抑制に起因する疾患および／または状態の治療、予防および／または予後に利用することが可能である。本発明はまた、そのような活性を有する物質をスクリーニングする方法を提供する。【００８５】
癲癇のような過剰な神経の興奮に関連する疾患および／または状態には複数の興奮性神経伝達物質が関与すると予測され、その一方で、複数種類の薬剤を併用する弊害が予測されることから、単独の薬剤によって、複数の小胞型神経伝達物質トランスポーターを阻害する化合物が、過剰な神経の興奮に関連する疾患および／または状態の処置のために望まれていた。その一方で、小胞型神経伝達物質トランスポーターの構造、機能、および阻害剤についての知見が少ないため、そのような複数の小胞型神経伝達物質トランスポーターに対して阻害活性を有する物質の探索は非常に困難であると予測されていたが、本発明は、予想外にも、複数の小胞型神経伝達物質トランスポーターに対して阻害活性を有する化合物を提供するものである。【００８６】
その結果、複数の小胞型神経伝達物質トランスポーターに対して阻害活性を有する本発明の化合物は、過剰な神経の興奮に関連する疾患および／または状態の、治療、予防、予後の改善に有用である。過剰な神経の興奮に関連する疾患および／または状態としては、例えば、癲癇、炎症、振せん、とう痛、高血圧、虚血、パーキンソン病、アルツハイマー病、大理石症、および、骨粗相症が挙げられるが、これに限定されない。【００８７】
これら疾患の中で、癲癇とは、過度のニューロンの放電による発作的な脳の機能障害を特徴とする慢性疾患で、通常、意識の変調を伴う疾患であり、発作は行動の要素的または複合的障害に限られる場合と、全身的痙攣に発展する場合とがある。発作の臨床所見は、全身痙攣や局所痙攣を含む行動の複雑異常から、意識障害の瞬間的発作まで様々であり、これらの臨床所見には種々の分類があり、発作の型を示す用語は記述的であり標準化されているが、完全に統一されたものものではない。しかしながら、複数の小胞型神経伝達物質トランスポーターに対して阻害活性を有する本発明の化合物は、癲癇の原因の一つである過剰な神経の興奮を抑制／阻害することから、全てのタイプの癲癇に有効であると考えられる。【００８８】
（本発明の化合物）
興奮性神経伝達物質に対する小胞型神経伝達物質トランスポーターの少なくとも２種を、生理条件のクロライド濃度下で阻害する本発明の化合物は、以下の式（Ｉ）：【００８９】
【化５】
0005630750.tif 000004
ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、および、低級アルキル（１〜４Ｃ）、ならびに、一緒になって、Ｏからなる群から選択され、
ここで、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、および、低級アルキル（１〜４Ｃ）、ならびに、一緒になって、Ｏからなる群から選択され、
Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つは酸素原子を含み、
Ｒ５は、Ｈ、直鎖アルキル、分岐アルキル、置換アルキル、アリール、アルキルアリールからなる群から選択される化合物またはその医薬として許容される塩である。【００９０】
一つの局面において、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、および、ＯＨ、ならびに、一緒になって、Ｏからなる群から選択され、ここで、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、および、ＯＨ、ならびに、一緒になって、Ｏからなる群から選択される。【００９１】
別の局面において、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、および、一緒になって、Ｏからなる群から選択され、ここで、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、および、一緒になって、Ｏからなる群から選択される。【００９２】
さらなる局面において、Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つは酸素原子を含み、必要に応じて、Ｒ３およびＲ４は、一緒になって、Ｏである。【００９３】
本発明の化合物としては、例えば、アセトアセテート、ピルビン酸、フェニルピルビン酸、３−ヒドロキシブチレート、α−ケト−β−メチル−バレリン酸、および、乳酸からなる群から選択される化合物が挙げられるが、これに限定されない。好ましい化合物は、アセトアセテート、および、ピルビン酸からなる群から選択される化合物である。【００９４】
本明細書において「薬学的に受容可能なキャリア」は、医薬または動物薬のような農薬を製造するときに使用される物質であり、有効成分に有害な影響を与えないものをいう。そのような薬学的に受容可能なキャリアとしては、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない：抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、賦形剤および／または薬学的アジュバント。【００９５】
本発明の処置方法において使用される薬剤の種類および量は、本発明の方法によって得られた情報（例えば、疾患に関する情報）を元に、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、投与される被検体の部位の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明のモニタリング方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。疾患状態をモニタリングする頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）のモニタリングが挙げられる。１週間−１ヶ月に１回のモニタリングを、経過を見ながら施すことが好ましい。【００９６】
必要に応じて、本発明の治療では、２種類以上の薬剤が使用してもよい。２種類以上の薬剤を使用する場合、類似の性質または由来の物質を使用してもよく、異なる性質または由来の薬剤を使用してもよい。このような２種類以上の薬剤を投与する方法のための疾患レベルに関する情報も、本発明の方法によって入手することができる。【００９７】
本発明はまた、小胞型神経伝達物質トランスポーターの輸送活性について、阻害の解除もしくは活性化をする化合物をスクリーニングする方法を提供する。そのようなスクリーニング法は、本発明の興奮性神経伝達物質輸送の阻害剤存在下において、候補化合物の中から輸送活性を回復させる効力を有する化合物を選択することによって行われる。そのようなスクリーニング法は、例えば：
（１）興奮性神経伝達物質輸送の阻害剤存在下において、興奮性神経伝達物質輸送タンパク質の輸送活性を測定する工程；
（２）さらに、候補化合物を添加した場合の、輸送活性を測定する工程；および、
（３）上記（２）の活性が上記（１）の活性より高い場合に、候補化合物を、阻害の解除能もしくは活性化能を有する化合物として同定する工程；
を包含する。この方法において、好ましい、興奮性神経伝達物質輸送タンパク質は、ＶＧＬＵＴ２であるが、これに限定されない。興奮性神経伝達物質輸送の阻害剤は、好ましくは、アセトアセテート、ピルビン酸、フェニルピルビン酸、３−ヒドロキシブチレート、α−ケト−β−メチル−バレリン酸、または、乳酸であり、より好ましくは、アセトアセテートであるが、これらに限定されない。【００９８】
このようにして同定された化合物は、神経の抑制に起因する疾患および／または状態の治療、予防および／または予後に利用する薬剤の有効成分として利用することが可能である。【００９９】
（薬学的組成物）
本明細書において薬剤の「有効量」とは、その薬剤が目的とする薬効を発現することができる量をいう。本明細書において、そのような有効量のうち、最小の濃度を最小有効量ということがある。そのような最小有効量は、当該分野において周知であり、通常、薬剤の最小有効量は当業者によって決定されているか、または当業者は適宜決定することができる。そのような有効量の決定には、実際の投与のほか、動物モデルなどを用いることも可能である。本発明はまた、このような有効量を決定する際に有用である。【０１００】
本発明の処置方法において使用される薬剤の種類および量は、本発明の方法によって得られた情報（例えば、疾患に関する情報）を元に、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、投与される被検体の部位の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明のモニタリング方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。疾患状態をモニタリングする頻度としては、例えば、毎日〜数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回〜１ヶ月に１回）のモニタリングが挙げられる。１週間〜１ヶ月に１回のモニタリングを、経過を見ながら施すことが好ましい。【０１０１】
本発明では、いったん類似の種類（例えば、ヒトに対するマウスなど）の生物、培養細胞、組織などに関し、ある特定の糖鎖構造の分析結果と、疾患レベルとが相関付けられた場合、対応する糖鎖構造の分析結果と、疾患レベルとが相関付けることができることは、当業者は容易に理解する。そのような事項は、例えば、動物培養細胞マニュアル、瀬野ら編著、共立出版、１９９３年などに記載され支持されており、本明細書においてこのすべての記載を援用する。【０１０２】
（処方）
本発明はまた、有効量の治療剤の被験体への投与による、疾患または障害（例えば、癲癇、炎症、振せん、とう痛、高血圧、虚血、パーキンソン病、アルツハイマー病、大理石症、および、骨粗相症が挙げられるが、これに限定されない）の処置および／または予防の方法を提供する。治療剤は、薬学的に受容可能なキャリア型（例えば、滅菌キャリア）と組み合せた、本発明の組成物を意味する。【０１０３】
治療剤を、個々の患者の臨床状態（特に、治療剤単独処置の副作用）、送達部位、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮に入れ、例えば、「治療薬マニュアル２００６」医学書院  監修：高久  史麿／矢崎  義雄、編集：関  顕／北原  光夫／上野  文昭／越前  宏俊に従って処方および投薬する。従って、本明細書において目的とする「有効量」は、このような考慮を行って決定される。【０１０４】
ケト原食の場合には、１ｍＭ〜２ｍＭ程度の血中濃度が達成されることから、１ｍＭ〜２ｍＭ程度の血中濃度によって効果があると考えられる。なお、マウスの場合には、１０ｍｇ／ｋｇの血中濃度で毒性が観察されなかった。（Rhoet al., (2002) Acetoacetate, acetone, and dibenzylamine (acontaminant inL-(+)-beta-hydroxybutyrate) exhibit direct anticonvulsantactions in vivo.Epilepsia 43, 358-361.およびMa W and Yallen G. (2007) Ketogenicdiet metabolitesreduce firing in central neurons by operating KATP channels. JNeurosci 27,3618-3625.）
なお、上記のように投与量は治療的裁量に委ねられる。静脈内用バッグ溶液もまた使用し得る。変化を観察するために必要な処置期間および応答が生じる処置後の間隔は、所望の効果に応じて変化するようである。【０１０５】
治療剤を、経口的、直腸内、非経口的、槽内、膣内、腹腔内、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与し得る。本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。【０１０６】
本発明の治療剤はまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性治療剤の適切な例は、経口的、直腸内、非経口的、槽内、膣内、腹腔内、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与され得る。【０１０７】
本発明の治療剤はまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性治療剤の適切な例は、適切なポリマー物質（例えば、成形品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態の半透過性ポリマーマトリックス）、適切な疎水性物質（例えば、許容品質油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂、および貧可溶性誘導体（例えば、貧可溶性塩）を包含する。【０１０８】
徐放性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：  １６７−２７７（１９８１）、およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、同書）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。【０１０９】
徐放性治療剤はまた、リポソームに包括された本発明の治療剤を包含する（一般に、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，３１７−３２７頁および３５３−３６５（１９８９）を参照のこと）。治療剤を含有するリポソームは、それ自体が公知である方法により調製され得る：ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号ならびにＥＰ第１０２，３２４号。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００Å）ユニラメラ型であり、そこでは、脂質含有量は、約３０モル％コレステロールよりも多く、選択された割合が、最適治療剤のために調整される。【０１１０】
なおさらなる実施態様において、本発明の治療剤は、ポンプにより送達される（Ｌａｎｇｅｒ、前出；Ｓｅｆｔｏｎ、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。【０１１１】
他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））による総説において議論される。【０１１２】
非経口投与のために、１つの実施態様において、一般に、治療剤は、それを所望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア、すなわち用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、かつ処方物の他の成分と適合するものと、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で混合することにより処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化、および治療剤に対して有害であることが知られている他の化合物を含まない。【０１１３】
一般に、治療剤を液体キャリアまたは微細分割固体キャリアあるいはその両方と均一および緊密に接触させて処方物を調製する。次に、必要であれば、生成物を所望の処方物に成形する。好ましくは、キャリアは、非経口的キャリア、より好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルもまた、リポソームと同様に本明細書において有用である。【０１１４】
キャリアは、等張性および化学安定性を高める物質のような微量の添加剤を適切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、このような物質としては、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸および他の有機酸またはその塩類のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；セルロースまたはその誘導体、ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；および／またはポリソルベート、ポロキサマーもしくはＰＥＧのような非イオン性界面活性剤が挙げられる。【０１１５】
治療的投与に用いられるべき任意の薬剤は、生物・ウイルスを含まない状態、すなわち、無菌状態であり得る。滅菌濾過膜（例えば０．２ミクロンメンブラン）で濾過することにより無菌状態は容易に達成される。一般に、治療剤は、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下用注射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグまたはバイアルに配置される。【０１１６】
治療剤は、通常、単位用量または複数用量容器、例えば、密封アンプルまたはバイアルに、水溶液または再構成するための凍結乾燥処方物として貯蔵される。凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌのバイアルに、滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ）治療剤水溶液５ｍｌを充填し、そして得られる混合物を凍結乾燥する。凍結乾燥した治療剤を、注射用静菌水を用いて再構成して注入溶液を調製する。【０１１７】
本発明はまた、本発明の治療剤の１つ以上の成分を満たした一つ以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。さらに、治療剤を他の治療用化合物と組み合わせて使用し得る。【０１１８】
本発明の治療剤は、単独または他の治療剤と組合わせて投与され得る。組合わせは、例えば、混合物として同時に；同時にまたは並行してだが別々に；あるいは経時的のいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療用混合物として共に投与されるという提示、およびまた、組み合わされた薬剤が、別々にしかし同時に、例えば、同じ個体に別々の静脈ラインを通じて投与される手順を含む。「組み合わせて」の投与は、一番目、続いて二番目に与えられる化合物または薬剤のうち１つの別々の投与をさらに含む。【０１１９】
本発明の代表的な化合物である、アセトアセテート、ピルビン酸、フェニルピルビン酸、３−ヒドロキシブチレート、および、乳酸からなる群から選択される化合物はいずれも生理物質であり、体内で輸送・代謝・排泄される化合物である。従って、生体内には、これらを運搬するトランスポーターが存在する（Mullerら、"Transportof ketone bodies and lactate in the sheepruminal epithelium by monocarboxylatetransporter 1"、Am J Physiol GastrointestLiver Physiol. 2002Nov;283(5):G1139-46、および、Martin PMら、"Identity of SMCT1(SLC5A8) as aneuron-specific Na+-coupled transporter for active uptake ofL-lactate andketone bodies in the brain"、J Neurochem. 2006Jul;98(1):279-88）。生体内に存在する、このトランスポーターおよび類似のトランスポーターによって本発明の化合物を輸送すると考えられることから、本発明の化合物を経口的および非経口的に生体に投与した場合、標的部位に送達され、その結果、興奮性神経伝達物質に対する小胞型神経伝達物質トランスポーターの少なくとも２種を、生理条件のクロライド濃度下で阻害することが理解できる。【０１２０】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１２１】
（実施例１：グルタミン酸トランスポーターVGLUT2のクローニング、発現、プロテオリポソームの調製、および、活性測定）
（１．クローニングおよび発現用プラスミドの構築）
ラットVGLUT2  cDNAを以下のプライマー(センスプライマー:5’-CACCATGGAGTCGGTAAAACAAAGGATT-3’：配列番号１１、アンチセンスプライマー:5’-TTCGTTATGAATAATCATCTCGGTCCT-3’：配列番号１２)を用いてPCRにより増幅し、TOPOクローニンングシステム(インビトロジェン)を用いて、pENTER/D-TOPOベクターに組み込んだ。このプラスミドをLRリコンビネーションによりデスティネーションベクター、pDEST10に組み込んだ(pDEST10VGLUT2)。これをバクミドDNAの入った大腸菌DH10bac株に形質転換し、N末側に6×Hisのはいった、VGLUTのバクミドを完成させた。DH10bac株から単離したバクミドをリポフェクション法により、Sf9細胞に形質導入することにより、VGLUT2ウイルスを得た。【０１２２】
（２．HighFive 細胞の培養とウイルスの感染）
感染はHighFive 細胞を用いて行った。High Five 細胞を培地(GIBCO Express Five SFM、 0.2mML-Glutamine、 10μg/ml gentamaicine)をいれた蓋つきフラスコにおいて27℃で培養した。感染時、1×107細胞を１０cm2シャーレに蒔きMOI(multiplicity of infection)= 1で感染し、感染後のインキュベートは48時間行った。【０１２３】
（３．細胞の回収と膜画分の可溶化）
感染48 h後の細胞をセルスクレーバーにより回収し、700×g  10分遠心して上清を取り除いた。これを緩衝液A(20mM Tris-HCl pH 8.0、0.1 M 酢酸カリウム、10%グリセロール、5mM  DTT、1μg/ml  ペプスタチンＡ、1μg/ml  ロイペプチン)で懸濁し、もう一度700×g  10分遠心して上清を取り除いた。これを緩衝液Aで懸濁した。これをTOMYUD200tip sonifier により粉砕した後、700×g  10分遠心して上清を回収し、160,000×g  １時間で超遠心して、膜画分とした。このペレットを緩衝液B（20mMMOPS-tris pH 7.0、2%  オクチルグルコシド、10%グリセロール、１μg/ml  ペプスタチンA、１μg/ml  ロイペプチン)をいれホモジナイザーを用いて懸濁し、260,000×g  30分間の遠心操作を行い、その上清を膜の可溶化画分とした。【０１２４】
（４．アフィニティカラムを用いたVGLUT2 の精製）
QIAGENNi-NTA スーパーフローレジンをエコノカラムに充填し（１ｍＬ；50%スラリー)、蒸留水にて洗浄した後 pH 8.0 の緩衝液Bで平衡化する。ここに先ほどの可溶化画分を入れ、4℃、4時間シーソー上で揺らしながら吸着させる。これを１０ｍＬの緩衝液C（20mMMOPS-tris pH 7.0、１％  オクチルグルコシド、20%  グリセロール、5 mM  イミダゾール、1μg/ml  ペプスタチンＡ、1μg/ml  ロイペプチン)で洗浄し、イミダゾールを60mMにした同液にて溶出した。使用するまで、−８０℃に保管した。【０１２５】
（５．リポソームの調製）
ダイズレクチン20mgを20 mM MOPS-NaOH pH 7.0、1 mM DTT 2 mL に加え、バス式ソニケーターにて 110 V、10 min ソニケーションした。液が澄明で均一となったらソニケーションを終了した。使用時まで−８０℃にて保管した。【０１２６】
（６．VGLUTのリポソームへの再構成）
精製したVGLUT2  10μｇをリポソーム500μｇと混合し、−８０℃で15分間静置した。凍結後これを取り出し、迅速に解凍し、その後直ちに緩衝液Ｆ（20mMMOPS-Tris pH 7.0、150 mM  酢酸ナトリウム、5 mM  酢酸マグネシウム、0.5 mM DTT、1μg/ml  ペプスタチンＡ、1μg/ml  ロイペプチン）で60倍に希釈し、200,000×gで遠心しペレットを200μＬの緩衝液Ｆで懸濁した。これをプロテオリポソーム（再構成リポソーム）として以後の実験に用いた。【０１２７】
（７．Ｆ−ＡＴＰａｓｅとVGLUTのリポソームへの再構成）
（ＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅの精製）
Ｍｏｒｉｙａｍａ  Ｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，２２１４１−２２１４６（１９９１）に記載の手順に従って、プロトンポンプであるＦ０Ｆ１タンパク質を調製した。【０１２８】
Ｆ０Ｆ１の大量発現プラスミドｐＢＷＵ１３を含有している大腸菌ＤＫ８を、０．５％グリセロールを含むＴａｎａｋａ培地（３４ｍＭ一カリウムリン酸、６４ｍＭ二カリウムリン酸、２０ｍＭ硫酸アンモニウム、０．３ｍＭ塩化マグネシウム、１μＭ硫酸鉄、１μＭ塩化カルシウム、１μＭ塩化亜鉛、１００μｇ／ｍｌイソロイシン、１００μｇ／ｍｌバリン、２μｇ／ｍｌチアミン）で培養した後、菌体を回収した。以降の調製を全て４℃で行った。【０１２９】
菌体（ＤＫ８／ｐＢＷＵ１３）約１０ｇを、４０ｍｌの膜調製緩衝液（４℃の５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ塩化マグネシウム、０，５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１ｍＭ  ＤＴＴ）に懸濁し、フレンチプレス（１，５００ｋｇ／ｃｍ２）で細胞を破砕した。破砕液を１７，０００×ｇにて１０分間遠心分離し、得られた上清をさらに２１０，０００×ｇで１時間２０分間遠心分離した。得られた膜小胞の沈澱を、Ｆ０Ｆ１調製用緩衝液（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ硫酸マグネシウム、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．８％オクチルグルコシド）中に懸濁し、再度遠心分離した。沈澱物として調製した膜小胞６０ｍｇを、２％のオクチルグルコシドを含む３ｍｌのＦ０Ｆ１調製用緩衝液中に懸濁し、Ｆ０Ｆ１を可溶化した。可溶化溶液を、２６０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清画分からＦ０Ｆ１を回収した。回収したＦ０Ｆ１を、１０％（ｗ／ｖ）〜３０％（ｗ／ｖ）のグリセロール密度勾配遠心分離（３３０，０００×ｇで５時間）によって精製した。グリセロール密度勾配を、１％オクチルグルコシドを含むＦ０Ｆ１調製用緩衝液で作製した。密度勾配遠心後、遠心管の底から１０分画に分けて分離し、最初の４画分をＦ０Ｆ１として回収し、−８０℃で保存した。【０１３０】
（ＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅと精製ＶＧＬＵＴ２のリポソームへの再構成）
２０ｍｇの大豆レシチン（Ｓｉｇｍａ  ｔｙｐｅＩＩＳ）を緩衝液（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ／ＮａＯＨ  ｐＨ７．０、０．５ｍＭ  ＤＴＴ）に懸濁し、バスタイプ超音波装置で透明になるまで超音波処理した。調製したリポソームは分注し、−８０℃で保存した。【０１３１】
次に、上記の手法で精製したＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅ  ９０μｇとＶＧＬＵＴ２  １０μｇを上記リポソーム５００μｇに混合し、−８０℃で１５分間静置し、凍結した。ただちにこれを取り出し、迅速に解凍しＦ緩衝液（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０、１００ｍＭ  酢酸カリウム、５ｍＭ  酢酸マグネシウム）にて２０倍に希釈し、１６０，０００×ｇ  ６０分遠心した。沈澱にＦ緩衝液  ４００μｌを添加し、ホモジナイズし、再構成プロテオリポソームを得た。【０１３２】
（実施例２：再構成ＶＧＬＵＴ２の輸送活性測定）
Ｆ−ＡＴＰａｓｅとＶＧＬＵＴ２を再構成したリポソームを用いて、ＡＴＰ存在下（＋ＡＴＰ）、および非存在下（−ＡＴＰ）における、種々のクロライドイオン濃度でのグルタミン酸輸送活性測定を行った。具体的には、再構成プロテオリポソーム（５μｇ）を２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０、５ｍＭ  酢酸マグネシウム、１０４ｍＭの酢酸カリウム中に懸濁し、２７℃で３分間インキュベートした。この反応液の酢酸カリウムの一部を塩化カリウムで置換することで、必要な濃度のクロライドイオンを含むようにした。その後、終濃度２ｍＭのＡＴＰを加え、さらに３分間インキュベートした。[2,3-3H]L-グルタミン酸(0.5 MBq/μmol)を加えて反応を開始し、各時間ごとに130μＬずつサンプル液を取り、セファデックスG-50ファインに通した。760×ｇで2分間遠心し、その溶出液をクリアゾル３ｍＬに溶かし、液体シンチレーションカウンターにより計測した。結果を図１（Ａ）に示す。【０１３３】
次に、ＶＧＬＵＴ２のみを再構成したリポソームをもちいて、バリノマイシン存在下（＋バリノマイシン）、および非存在下（−バリノマイシン）における、種々のクロライドイオン濃度でのグルタミン酸輸送活性測定を行った。具体的には、試験管内に緩衝液Ｇ（20mM MOPS-Tris pH 7.0、150 mM 酢酸カリウム、5 mM 酢酸マグネシウム、10 mM KCl）、2μＭ  バリノマイシン、[2,3-3H]L-グルタミン酸(0.5 MBq/pmol)、と阻害剤を加え、27℃水浴において3分間インキュベートした。ここに作製したプロテオリポソーム0.5μｇを加え反応を開始した。各時間ごとに130μＬずつサンプル液を取り、セファデックスG-50ファインに通した。760×ｇで2分間遠心し、その溶出液をクリアゾル３ｍＬに溶かし、液体シンチレーションカウンターにより計測した。結果を図１（Ｂ）に示す。【０１３４】
Ｆ−ＡＴＰａｓｅとトランスポーターをともに再構成する従来法（Ａ）では、クロライドイオン濃度が増えるに従って、輸送活性は一過性に上昇後、急速に低下する。いわゆるオーバーシュート現象を示す。これはおそらく形成された膜電位がＦ−ＡＴＰａｓｅ経由で漏れてしまうためであると推定された。従って、この従来法の測定システムでは高濃度の塩素イオンによるVGLUTへの影響を調べることは難しい。そこで、本発明者らは膜電位をバリノマイシンにより起こすことにより精製VGLUTのみを含むリポソームでグルタミン酸輸送を測定する系を構築し、グルタミン酸輸送活性の測定に成功した（Ｂ）。これにより高濃度のクロライドイオン存在下でも安定したグルタミン酸輸送活性を示すことが判明。この測定系を用いてクロライドイオン感受性に影響を与える薬物をスクリーニングすることが初めて可能になった。【０１３５】
（実施例３：阻害剤のスクリーニング）
実施例２において構築した、クロライドイオン感受性に影響を与える薬物の改善されたスクリーニング系を用いて、グルタミン酸取り込みの阻害剤をスクリーニングした。候補化合物５ｍＭを使用し、５ｍＭクロライドイオン存在下、および、２０ｍＭクロライドイオン存在下でグルタミン酸輸送活性を測定した。結果を、図２に示す。アセトアセテート、ピルベート、フェニルピルベート、３−ヒドロキシブチレート、および、α−ケト−β−メチルバレレート（ＫＭＶ）が、生理条件のクロライドイオン濃度（２０ｍＭ）下で、高い阻害活性を示した。【０１３６】
最も高い阻害活性を示したアセトアセテートについて、種々の濃度を用いた場合の、ＶＧＬＵＴ２のグルタミン酸輸送活性を図３のグラフに示した。この結果は、アセトアセテートによる阻害活性が濃度依存性であることを示す。【０１３７】
種々の濃度のクロライドおよびアセトアセテートを用いた場合における、ＶＧＬＵＴ２のグルタミン酸輸送活性を図４のグラフに示した。この結果は、アセトアセテートによるＶＧＬＵＴ２活性阻害がクロライドイオン濃度を増やす事により解消することを示す。【０１３８】
高い阻害活性を示した、候補化合物、すなわち、アセトアセテート、ピルベート、アセトール、フェニルピルベート、３−ヒドロキシブチレート、および、α−ケト−β−メチルバレレート（ＫＭＶ）のＩＣ５０を図５に示す。なお、ラクテートのＩＣ５０は＞２０ｍＭであった。また、アセトン、メチルグリオキサール、1,2−プロパンジオール、アセチルCoA、サクシネート、イソロイシン、バリン、フェニルアセテート、および、シアル酸は、10mMで阻害活性を示さなかった（図５）。【０１３９】
アセトアセテートによる阻害効果は、グルタミン酸に対する競合的阻害ではなかった。クロライド媒介性活性化のヒル係数は、約３．３であった。このことは、グルタミン酸輸送との、強力な正の協同性を示す。アセトアセテートは、クロライドとグルタミン酸との協同性に影響しなかった。アセトアセテートの効果は、完全に可逆的であり、アセトアセテートを洗浄することによって、グルタミン酸輸送活性は完全に復活した。なお、アセトアセテートは、ＶＧＬＵＴ１およびＶＧＬＵＴ３に対しても、阻害効果を示した。また、ＶＧＬＵＴ１およびＶＧＬＵＴ３をアセトアセテートによって阻害した場合も、洗浄によってグルタミン酸輸送活性は、完全に復活した。【０１４０】
これら阻害剤は、その構造から、可逆的にトランスポータータンパク質に結合し、阻害活性を示すと考えられる。小胞型神経伝達物質トランスポータータンパク質に不可逆的に結合する色素は、小胞型神経伝達物質トランスポーターを不可逆的に失活させ、その結果、看過できない副作用を生じることが予測される。これに対して、本発明の阻害活性を示す化合物は、阻害様式が可逆的なため、小胞型興奮性神経伝達物質トランスポーターの阻害剤として、特に、過剰な神経の興奮に関連する疾患および／または状態を、治療するため、予防するため、および／または、予後を改善するために有用であると考えられる。【０１４１】
（実施例４：ＶＧＬＵＴ２阻害活性を有する物質による、抑制性伝達物質トランスポーターおよびモノアミントランスポーターに対する阻害活性）
実施例３において、小胞型グルタミン酸トランスポーターに対する阻害活性を有する物質が同定された。これら阻害剤が、抑制性神経伝達物質のトランスポーターおよび／またはモノアミントランスポーターに対して阻害活性を有するか否かを試験した。トランスポーターの輸送活性に対する阻害活性を測定するために、シナプス小胞を用いた。【０１４２】
（１．シナプス小胞の調製）
Wister 系ラット3週齢雄の全脳を採取し、これをSME緩衝液(0.3M スクロース、10 mM MOPS-Tris pH 7.0、5 mMEDTA-NaOH pH 7.0、1μg/ml  ペプスタチンＡ、1μg/ml  ロイペプチン）内で洗浄し、機械ホモジナイザー(Iuchi)900 rpmで脳をホモジナイズした。これを、900×g  10分遠心して上清を回収し、2,000×g15分遠心しペレットを回収する。ペレットをSME緩衝液に再懸濁し、2,000×g15分遠心しペレットを回収する。このペレットを2 mL SME緩衝液のはいった10mM MOPS-Tris pH 7.0 緩衝液20 mL に懸濁し、20分静置した。その後、11,000×g20分遠心して上清を回収後、160,000×g  1時間  超遠心して、ペレットを回収した。回収したペレットを5mg/mLになるようにSME緩衝液を加えて懸濁し、使用するまで−８０℃に保存した。【０１４３】
（２．RI標識した化合物を用いたシナプス小胞の活性測定）
試験管内に緩衝液(10 mM MOPS-Tris pH 7.0、5 mM  酢酸マグネシウム、10 mM KCl、0.28 M  スクロース)、阻害剤（１ｍＭ  アセトアセテート）と50μｇのシナプス小胞を加え、27℃水浴において3分間インキュベートした。その後、2mMATPを加え27℃水浴において3分間インキュベートした。100μＭ  ［２，３−３Ｈ］−ＧＡＢＡ（0.5MBq/μmol）、または10μＭ  ５−ヒドロキシ［３−３Ｈ］トリプタミン（0.5MBq/μmol）を加え、反応を開始した。各時間に100μＬずつサンプル液を取り、0.45μｍフィルター（ミリポア社）に通し、このフィルターを緩衝液１０ｍｌで洗浄後、クリアゾル３ｍｌに溶かし、液体シンチレーションカウンターにより計測した。【０１４４】
（３．結果）
モノアミントランスポーターによる輸送活性の指標として、１ｍＭのアセトアセテート存在下（＋アセトアセテート）および非存在下（−アセトアセテート）での、シナプス小胞のセロトニン輸送活性を測定した。結果を図６Ａ（ＶＭＡＴ）に示す。抑制性神経伝達物質トランスポーターによる輸送活性の指標として、１ｍＭのアセトアセテート存在下（＋アセトアセテート）および非存在下（−アセトアセテート）での、シナプス小胞のＧＡＢＡ輸送活性を測定した。結果を図６Ａ（ＶＩＡＡＴ）に示す。【０１４５】
これらの結果に示されるように、本発明の阻害剤は、モノアミントランスポーターや抑制性神経伝達物質トランスポーターの対する阻害活性を有さないことが実証された。【０１４６】
（実施例５：小胞型グルタミン酸トランスポーター以外の興奮性神経伝達物質トランスポーターに対する阻害作用）
本発明の阻害剤が、小胞型グルタミン酸トランスポーター以外の興奮性神経伝達物質トランスポーターに対する阻害作用を有するか否かを試験するために、小胞型グルタミン酸トランスポーター以外の興奮性神経伝達物質トランスポーターである小胞型アスパラギン酸トランスポーター（シアリン）および小胞型ヌクレオチドトランスポーター（ＶＮＵＴ）に対する阻害活性を測定した。【０１４７】
（Ａ：アスパラギン酸トランスポーター（シアリン）のクローニング、発現、プロテオリポソームの調製、および、活性測定）
（１．ＰＣＲによるマウスおよびヒトのシアリンcDNAのクローン化）
以下のプライマーを用いたPCRによりマウスおよびヒトシアリンcDNAを得た。【０１４８】
5’-caccatgaggcccctgcttcggg-3’（配列番号１３）マウスシアリンセンスプライマー
5’-ccacggacacagaaactga-3’（配列番号１４）マウスシアリンセンスプライマー
5’-caccatgaggtctccggttcgag-3’（配列番号１５）ヒトシアリンセンスプライマー
5’-tcagtgtctgtgtccatggt-3’（配列番号１６）ヒトシアリンアンチセンスプライマー
PCR反応は、94℃  2分の後、94℃  45秒、56℃  45秒、および、72℃  2分を３５サイクル行い、次に、72℃  5分インキュベートし、ExTaqBuffer (Takara)、0.25 mM dNTP mix、1.6 pmol/μl Primer、0.5 U Ex Taq (Takara)を加えてtotalvolume16 μlにした。【０１４９】
pENTR/D-TOPOクローニングキット(No.K2400-20, Invitrogen)を用いてエントリーベクターにPCR産物を組み込んだ。方法は付属のプロトコールに準拠して行った。【０１５０】
（部位特異的変異体の作成）
プライマーとして、以下の配列のプライマーを用いた：
5’-agctatgcgggccatgtgg-3’、（配列番号１７）マウスH183R1st PCRセンスプライマー
5’-accacagaggatcatgcataacc-3’（配列番号１８）マウスH183R1st PCR アンチセンスプライマー
5’-gtaaaacgacggccagtc-3’（配列番号１９）マウスH183R2nd PCRセンスプライマー。【０１５１】
1st PCR反応は、94℃  2分の後、94℃  45秒、55℃  45秒、72℃  1分を３５サイクル繰り返し、そして、72℃  3分保温した。反応溶液は、ExTaqBuffer (Takara)、0.15 mM dNTP mix、1.6 pmol/μl Primer、0.5 U Ex Taq (Takara)を加えてtotalvolume16 μlにした。【０１５２】
2nd PCR反応は、2ndPCRセンスプライマーと1st PCR反応産物とをプライマーとして用い、94℃  2分の加熱後、94℃  45秒、50℃  1分30秒、72℃  3分を３５サイクル繰り返し、そして、72℃  5分保温した。反応溶液は、1stPCR産物、ExTaq Buffer (Takara)、0.38 mM dNTP mix、1.3 pmol/μl Primer、0.5 U Ex Taq(Takara)を加えて総容量16μlにした。【０１５３】
（２．エントリーベクターへの連結）
ＰＣＲフラグメントをＴＯＰＯクローニングキット（Invitrogen）を用いて、エントリーベクター（pENTR、Invitrogen）に組み込んだ。反応溶液（６μｌ）は、塩溶液  １μｌ（Invitrogen）、ベクター  10fmol（Invitrogen）、およびＰＣＲ産物  20fmolを含む溶液である。室温で１０分間反応させ、シアリンをエントリーベクターに組み込んだ。これをＴＯＰＯ反応液とした。【０１５４】
（３．形質転換）
大腸菌Ｍａｃｈ−１コンピテントセル（Invitrogen）５０μｌに上記ＴＯＰＯ反応液２μｌを加えた。氷上で３０分間放置後、ＳＯＣ培地（Invitrogen）２５０μｌを添加し、３７℃で１時間反応させ、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢプレートに全量を播種した。プレートを３７℃で一晩培養し、シングルコロニーをピックアップし、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地３ｍｌで一晩培養した。培養した大腸菌からQIAprepSpinMiniprep Kit(Qiagen)を用いて、シアリンを含むベクターを得た。【０１５５】
（４．ｐＤＥＳＴ１０への組換え）
上記で調製したベクターから、ＬＲクロナーゼを用いてシアリンのｃＤＮＡをｐＤＥＳＴ１０ベクターへクローニングした。上記で調製したプラスミド１５０ｍｇにｐＤＥＳＴ１０プラスミド３００ｎｇとＬＲクロナーゼ４μｌを加え、２５℃で１時間インキュベートし、その後、プロテイナーゼＫを２μｌ加え、３７℃で３０分間インキュベートした。反応液を用いて、ＤＨ５αコンピテント大腸菌を形質転換した。形質転換したＤＨ５α細胞から、QIAprepSpin Miniprep Kit(Qiagen)を用いてプラスミドを回収し、ｐＤＥＳＴ１０／ＳＬＣ１７Ａ５とした。【０１５６】
（５．組換えバックミドの作製）
BaculovirusExpression System with Gateway Technology（Invitrogen）を用いて、ｐＤＥＳＴ１０／ＳＬＣ１７Ａ５からシアリンのｃＤＮＡをバキュロウイルスゲノム（バックミド）に組み込んだ。【０１５７】
具体的には、ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（Invitrogen）２５μｌにｐＤＥＳＴ１０／ＳＬＣ１７Ａ５  ２０ｐｇを加え、氷上で３０分間放置後、４２℃、３０秒、ＳＯＣ培地２２５μｌ加えた。３７℃で４時間インキュベートし、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、７μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むＬＢプレートの播種し、３７℃で一晩インキュベートした。そしれ、ミニプレップ法にてバックミドを回収した。【０１５８】
（６．ミニプレップ法；バックミド用）
組換えバックミドの作製に用いたミニプレップ法は、以下の手順で行った。まず、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、７μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを添加したＬＢ培地３ｍｌに組換えバックミドを有するＤＨ１０Ｂａｃを植菌し、３７℃で培養した。培養した大腸菌を溶液１（５０ｍＭ  グルコース、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）２００μｌ中に懸濁し、次に、溶液２（０．２Ｍ  ＮａＯＨ、１％  ＳＤＳ）２００μｌを加え、転倒混和した。室温で５分間放置後、溶液３（３Ｍ  ＫＯＡｃ、１１．５％（ｖ／ｖ）酢酸）を２００μｌ加え、店頭混和した。そして、４℃で１０分間放置した後、遠心（１３，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）し、上清を除いた。沈澱を、さらに、７０％エタノールで２回洗浄した。これにＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を無菌的に添加し、４℃に保存した。【０１５９】
（７．ウイルスの調製）
本実施例に用いたウイルスは、以下の手順によって調製した。まず、３５ｍｍのペトリ皿に９×１０５個のＳｆ９細胞を播種した。培地を、０．３５ｍｇ／ｍｌの炭酸水素ナトリウムを添加したGrace'sInsect Medium（GIBCO）に交換した後、シアリンを含むバックミド１μｇと、cellfectin（Invitrogen）６μｌを用い、リポフェクション法にて、Ｓｆ９に感染させた。２７℃で５時間インキュベートした後、２ｍｌのcompleteTMN-FHに交換し、感染兆候が見られるまで培養し、培地を回収した。これをＰ１ウイルスとした。そして、１００ｍｍペトリ皿に６×１０６個のＳｆ９細胞を播種し（５０％コンフルエント）、１０倍段階希釈したウイルス液１ｍｌを添加し、室温で１時間振とうした。completeTMN-FH：４％Sea Plaque Agarose＝３：１となるように、混合したペトリ皿の培地を取り除いた後、これを１０ｍｌの重層アガロースを用いて２７℃で７〜１０日密閉して培養し、形成したプラークをピックアップして、再度感染させ、７２時間後、この培地をＰ１ウイルスの場合と同様に回収し、Ｐ２ウイルスとした。【０１６０】
（８．細胞の回収と膜画分の可溶化）
HighFive細胞にＰ２ウイルスをM.O.I.＝１で感染させ、２７℃で培養した。感染６０時間後の細胞をセルスクレーパーにより回収し、７００×ｇ  １０分間遠心して上清を取り除いた。これを破壊緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１００ｍＭ  酢酸カリウム、１０％  グリセロール、５ｍＭ  ＤＴＴ、１μｇ／ｍｌ  ペプスタチンＡ（ペプチド研究所）、１μｇ／ｍｌ  ロイペプチン（ペプチド研究所））中に懸濁し、再度７００×ｇ  １０分間遠心して上清を取り除いた。これを破壊緩衝液で懸濁し、超音波処理（ＴＯＭＹultrasonicdisruptorにて、Output 4、３０秒×８回）後、７００×ｇ  １０分間遠心して上清を回収し、１００，０００×ｇ  １時間、４℃で超遠心して、得られた沈澱を膜画分とした。この分画を、可溶化緩衝液（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０、２％オクチルグルコシド（同仁化学）、１０％  グリセロール、１μｇ／ｍｌ  ペプスタチンＡ、１μｇ／ｍｌ  ロイペプチン）を添加し、ホモジナイザーを用いて懸濁し、１００，０００×ｇ  ３０分の遠心操作を行い、その上清を可溶化画分とした。【０１６１】
（９．アフィニティーカラムを用いたシアリンの精製）
QIAGENNi-NTA super flowレジンをエコノカラムに充填し（１ｍＬ；５０％  スラリー）、蒸留水にて洗浄した後、ｐＨ８．０の可溶化緩衝液で平衡化した。ここに上記の可溶化画分を入れ、４℃、４時間攪拌しながら、吸着させた。これを１５ｍｌの洗浄緩衝液（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０、１％オクチルグルコシド、２０％  グリセロール、５ｍＭ  イミダゾール、１μｇ／ｍｌ  ペプスタチンＡ、１μｇ／ｍｌ  ロイペプチン）で洗浄し、溶出緩衝液（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０、１％オクチルグルコシド、２０％  グリセロール、６０ｍＭ  イミダゾール、１μｇ／ｍｌ  ペプスタチンＡ、１μｇ／ｍｌ  ロイペプチン）を用いて、精製シアリンを溶出した。【０１６２】
（１０．精製したシアリンの再構成）
精製したアスパラギン酸トランスポーター（シアリン）40μｇと大豆由来の脂質0.5 mgを混ぜ、−８０℃で10分以上インキュベーションした。これを手で素早く解かし、20mMMOPS-Tris(pH7.0)、0.15 M 酢酸ナトリウム、5 mM 酢酸マグネシウム、0.5 mM DTTを含む緩衝液で30倍希釈した。これを200,000×g、1時間、4℃で遠心し、上清を捨て、同じ緩衝液200μＬで再懸濁した。これを再構成リポソーム（プロテオリポソーム）として、以後の実験に用いた。【０１６３】
（１１．アスパラギン酸輸送活性の測定）
再構成リポソームを20 mM MOPS-Tris(pH7.0)、0.15 M 酢酸カリウム、5 mM 酢酸マグネシウム、4 mM 塩化カリウムからなる反応液、または20mMMOPS-Tris(pH7.0)、54 mM 酢酸カリウム、5 mM 酢酸マグネシウム、100 mM 塩化カリウムからなる反応液に、2μＭ  バリノマイシン、0.1mML-[2,3-3H]アスパラギン酸(0.5 MBq/μmol)を加え、27℃で2分間インキュベーションした。再構成リポソームの添加を活性測定の開始とした。2分後に反応液120μＬをセファデックスG-50(fine)スピンカラムにて760×g、2分間、4℃で遠心した。カラムを通過した反応液に含まれる放射活性を液体シンチレーションカウンターにて測定し、アスパラギン酸の輸送活性を測定した。また、200μＭアセト酢酸は再構成リポソームを添加する前に加えた。【０１６４】
（Ｂ：ヌクレオチドトランスポーター（ＶＮＵＴ）のクローニング、発現、プロテオリポソームの調製、および、活性測定）
（１．ＰＣＲによるＳＬＣ１７Ａ９遺伝子の単離）
Ex TaqBuffer（TaKaRa）中に、0.2mM dNTP混合液、1pmol プライマー、1.5U Ex Taq (TaKaRa)を添加し５０μｌとしてＰＣＲを行った。使用したプライマーは、正方向プライマー（配列番号２０：５’−ＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＣＡＧＧＡ−３’）および逆方向プライマー（配列番号２１：５’−ＣＴＡＧＡＧＧＴＣＣＴＣＡＴＧＧＧＴＡＧＡＧＣＴＣ−３’）である。ＰＣＲ条件は、９４℃  ３分で加熱した後、９４℃  ３分、５６℃  ３０秒、７２℃  ２分のサイクルを３０サイクル行い、その後、７２℃で５分加熱を用いた。【０１６５】
（２．エントリーベクターへの連結）
ＰＣＲフラグメントをＴＯＰＯクローニングキット（Invitrogen）を用いて、エントリーベクター（pENTR、Invitrogen）に組み込んだ。反応溶液（６μｌ）は、塩溶液  １μｌ（Invitrogen）、ベクター  10fmol（Invitrogen）、およびＰＣＲ産物  20fmolを含む溶液である。室温で１０分間反応させ、ＳＬＣ１７Ａ９をエントリーベクターに組み込んだ。これをＴＯＰＯ反応液とした。【０１６６】
（３．形質転換）
大腸菌Ｍａｃｈ−１コンピテントセル（Invitrogen）５０μｌに上記ＴＯＰＯ反応液２μｌを加えた。氷上で３０分間放置後、ＳＯＣ培地（Invitrogen）２５０μｌを添加し、３７℃で１時間反応させ、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢプレートに全量を播種した。プレートを３７℃で一晩培養し、シングルコロニーをピックアップし、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地３ｍｌで一晩培養した。培養した大腸菌からQIAprepSpinMiniprep Kit(Qiagen)を用いて、ＳＬＣ１７Ａ９を含むベクター（ｐＥＮＴＲ／ＳＬＣ１７Ａ９）を得た。このベクターを用いて、ＳＬＣ１７Ａ９のｃＤＮＡの配列決定を行った。ヒトＳＬＣ１７Ａ９の核酸配列を配列番号５に、アミノ酸配列を配列番号６に示す。【０１６７】
（４．ｐＤＥＳＴ１０への組換え）
上記で調製したｐＥＮＴＲ／ＳＬＣ１７Ａ９から、ＬＲクロナーゼを用いてＳＬＣ１７Ａ９のｃＤＮＡをｐＤＥＳＴ１０ベクターへクローニングした。ｐＥＮＴＲ／ＳＬＣ１７Ａ９プラスミド１５０ｎｇにｐＤＥＳＴ１０プラスミド３００ｎｇとＬＲクロナーゼ４μｌを加え、２５℃で１時間インキュベートし、その後、プロテイナーゼＫを２μｌ加え、３７℃で３０分間インキュベートした。反応液を用いて、ＤＨ５αコンピテント大腸菌を形質転換した。形質転換したＤＨ５α細胞から、QIAprepSpin Miniprep Kit(Qiagen)を用いてプラスミドを回収し、ｐＤＥＳＴ１０／ＳＬＣ１７Ａ９とした。【０１６８】
（５．組換えバックミドの作製）
BaculovirusExpression System with Gateway Technology（Invitrogen）を用いて、ｐＤＥＳＴ１０／ＳＬＣ１７Ａ９からＳＬＣ１７Ａ９のｃＤＮＡをバキュロウイルスゲノム（バックミド）に組み込んだ。【０１６９】
具体的には、ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（Invitrogen）２５μｌにｐＤＥＳＴ１０／ＳＬＣ１７Ａ９  ２０ｎｇを加え、氷上で３０分間放置後、４２℃、３０秒、ＳＯＣ培地２２５μｌ加えた。３７℃で４時間インキュベートし、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、７μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むＬＢプレートの播種し、３７℃で一晩インキュベートした。そしれ、ミニプレップ法にてバックミドを回収した。【０１７０】
（６．ミニプレップ法；バックミド用）
組換えバックミドの作製に用いたミニプレップ法は、以下の手順で行った。まず、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、７μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを添加したＬＢ培地３ｍｌに組換えバックミドを有するＤＨ１０Ｂａｃを植菌し、３７℃で培養した。培養した大腸菌を溶液１（５０ｍＭ  グルコース、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）２００μｌ中に懸濁し、次に、溶液２（０．２Ｍ  ＮａＯＨ、１％  ＳＤＳ）２００μｌを加え、転倒混和した。室温で５分間放置後、溶液３（３Ｍ  ＫＯＡｃ、１１．５％（ｖ／ｖ）酢酸）を２００μｌ加え、転倒混和した。そして、４℃で１０分間放置した後、遠心（１３，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）し、上清を除いた。沈澱を、さらに、７０％エタノールで２回洗浄した。これにＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を無菌的に添加し、４℃に保存した。【０１７１】
（７．ウイルスの調製）
本実施例に用いたウイルスは、以下の手順によって調製した。まず、３５ｍｍのペトリ皿に９×１０５個のＳｆ９細胞を播種した。培地を、０．３５ｍｇ／ｍｌの炭酸水素ナトリウムを添加したGrace'sInsect Medium（GIBCO）に交換した後、ＳＬＣ１７Ａ９を含むバックミド１μｇと、cellfectin（Invitrogen）６μｌを用い、リポフェクション法にて、Ｓｆ９に感染させた。２７℃で５時間インキュベートした後、２ｍｌのcompleteTMN-FHに交換し、感染兆候が見られるまで培養し、培地を回収した。これをＰ１ウイルスとした。そして、１００ｍｍペトリ皿に６×１０６個のＳｆ９細胞を播種し（５０％コンフルエント）、１０倍段階希釈したウイルス液１ｍｌを添加し、室温で１時間振とうした。completeTMN-FH：４％Sea Plaque Agarose＝３：１となるように、混合したペトリ皿の培地を取り除いた後、これを１０ｍｌの重層アガロースを用いて２７℃で７〜１０日密閉して培養し、形成したプラークをピックアップして、再度感染させ、７２時間後、この培地をＰ１ウイルスの場合と同様に回収し、Ｐ２ウイルスとした。【０１７２】
（８．細胞の回収と膜画分の可溶化）
HighFive細胞にＰ２ウイルスをM.O.I.＝１で感染させ、２７℃で培養した。感染６０時間後の細胞をセルスクレーパーにより回収し、７００×ｇ  １０分間遠心して上清を取り除いた。これを破壊緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１００ｍＭ  酢酸カリウム、１０％  グリセロール、５ｍＭ  ＤＴＴ、１μｇ／ｍｌ  ペプスタチンＡ（ペプチド研究所）、１μｇ／ｍｌ  ロイペプチン（ペプチド研究所））中に懸濁し、再度７００×ｇ  １０分間遠心して上清を取り除いた。これを破壊緩衝液で懸濁し、超音波処理（ＴＯＭＹultrasonicdisruptorにて、Output 4、３０秒×８回）後、７００×ｇ  １０分間遠心して上清を回収し、１００，０００×ｇ  １時間、４℃で超遠心して、得られた沈澱を膜画分とした。この分画を、可溶化緩衝液（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０、２％オクチルグルコシド（同仁化学）、１０％  グリセロール、１μｇ／ｍｌ  ペプスタチンＡ、１μｇ／ｍｌ  ロイペプチン）を添加し、ホモジナイザーを用いて懸濁し、１００，０００×ｇ  ３０分の遠心操作を行い、その上清を可溶化画分とした。【０１７３】
（９．アフィニティーカラムを用いたＳＬＣ１７Ａ９の精製）
QIAGENNi-NTA super flowレジンをエコノカラムに充填し（１ｍＬ；５０％  スラリー）、蒸留水にて洗浄した後、ｐＨ８．０の可溶化緩衝液で平衡化した。ここに上記の可溶化画分を入れ、４℃、４時間攪拌しながら、吸着させた。これを１５ｍｌの洗浄緩衝液（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０、１％オクチルグルコシド、２０％  グリセロール、５ｍＭ  イミダゾール、１μｇ／ｍｌ  ペプスタチンＡ、１μｇ／ｍｌ  ロイペプチン）で洗浄し、溶出緩衝液（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０、１％オクチルグルコシド、２０％  グリセロール、６０ｍＭ  イミダゾール、１μｇ／ｍｌ  ペプスタチンＡ、１μｇ／ｍｌ  ロイペプチン）を用いて、精製ＳＬＣ１７Ａ９を溶出した。【０１７４】
（１０．精製したヌクレオチドトランスポーター（ＶＮＵＴ）の再構成）
精製したヌクレオチドトランスポーター（ＶＮＵＴ）40μｇと大豆由来の脂質0.5 mgを混ぜ、−８０℃で10分以上インキュベーションした。これを手で素早く解かし、20mMMOPS-Tris(pH7.0)、0.15 M 酢酸ナトリウム、5 mM 酢酸マグネシウム、0.5 mM DTTを含む緩衝液で30倍希釈した。これを200,000×g、1時間、4℃で遠心し、上清を捨て、同じ緩衝液200μＬで再懸濁した。これを再構成リポソーム（プロテオリポソーム）として、以後の実験に用いた。【０１７５】
（１１．ＡＴＰ輸送活性の測定）
再構成リポソームを20 mM MOPS-Tris(pH7.0)、0.15 M 酢酸カリウム、5 mM 酢酸マグネシウム、4 mM 塩化カリウムからなる反応液、または20mMMOPS-Tris(pH7.0)、54 mM 酢酸カリウム、5 mM 酢酸マグネシウム、100 mM 塩化カリウムからなる反応液に、２μＭ  バリノマイシン、ＡＴＰ（０．１ｍＭ  ［α３２Ｐ］ＡＴＰ  ３．７ＭＢｑ／μｍｏｌ）を加え、27℃で2分間インキュベーションした。再構成リポソームの添加を活性測定の開始とした。2分後に反応液120μＬをセファデックスG-50(fine)スピンカラムにて760×g、2分間、4℃で遠心した。カラムを通過した反応液に含まれる放射活性を液体シンチレーションカウンターにて測定し、アスパラギン酸の輸送活性を測定した。また、200μＭアセト酢酸は再構成リポソームを添加する前に加えた。【０１７６】
（Ｃ：小胞型アスパラギン酸トランスポーター（シアリン）および小胞型ヌクレオチドトランスポーター（ＶＮＵＴ）に対する阻害活性の測定）
アスパラギン酸輸送に対するアセトアセテートの阻害活性（図７Ａ）、および、ＡＴＰ輸送に対するアセトアセテートの阻害活性（図７Ｂ）を測定した。各レーンの実験条件は、以下のとおりである：
レーン１  ４ｍＭ  Ｃｌ−存在下、バリノマイシン非添加、
レーン２  ４ｍＭ  Ｃｌ−存在下、２μＭ  バリノマイシン添加、
レーン３  ４ｍＭ  Ｃｌ−存在下、２μＭ  バリノマイシン添加、２００μＭ  アセトアセテート添加、
レーン４  １００ｍＭ  Ｃｌ−存在下、バリノマイシン非添加、
レーン５  １００ｍＭ  Ｃｌ−存在下、２μＭ  バリノマイシン添加、
レーン６  １００ｍＭ  Ｃｌ−存在下、２μＭ  バリノマイシン添加、２００μＭ  アセトアセテート添加。【０１７７】
クロライド濃度が低い場合、アセトアセテートは小胞型アスパラギン酸トランスポーター（シアリン）および小胞型ヌクレオチドトランスポーター（ＶＮＵＴ）を阻害したが、その阻害は、クロライドイオン濃度を１００ｍＭまで増加することによって、減少／消失した。【０１７８】
（実施例６：小胞からのグルタミン酸放出に対する阻害作用）
本発明の化合物がグルタミン酸作動性の培養細胞からのグルタミン酸のエキソサイトーシスを阻害するか否かを検討した。【０１７９】
具体的には、培養中の海馬ニューロンからのＫＣｌによって誘起されるグルタミン酸のエキソサイトーシスに対するアセトアセテートの効果を試験した。その結果、０．５ｍＭ以上のアセトアセテートを培養培地中へ添加した場合、グルタミン酸のエキソサイトーシスが阻害された（図８）。この阻害作用は、培地からアセトアセテートを除去することによって、完全に回復した（図８）。グルタミン酸作動性の島α細胞であるαＴＣ６細胞を用いた場合においても、同様の結果が得られた。【０１８０】
（実施例７：グルタミン酸輸送阻害剤による癲癇治療効果）
本発明の化合物が癲癇治療薬として有用であるか否かを決定するために、４−アミノピリジン（４ＡＰ）によってグルタミン酸分泌と発作が誘起されたラットに対する本発明のグルタミン酸輸送阻害剤の効果を検討した。【０１８１】
４ＡＰを、マイクロピペットを用いて、ラット脳に局所投与し、グルタミン酸およびドーパミンの分泌（図９Ａ）、ならびに、発作（図９Ｄ）を測定した。【０１８２】
発作の評価は、以下のように行った：
各２０分間の行動変化を次の6段階に分け、スコア化した。
(0) 行動変化なし。てんかん様症状なし；
(1) 口や顔を動かす。身繕いをする。臭いをかぐ。体をかきむしる。首を振る。過度な行動；
(2) 頭を大きく揺らす。全身をふるわせる。全身硬直；
(3) 前足が攣縮する。後ろ足が伸展する；
(4) 後ずさりをする。よだれをだす。強直性-間代性けいれん；および、
(5) てんかん性の失神。
スコア化の方法は、MeursAら（Epilepsy Res. 2008, 78, 50-59）に従い、全タイムコースにおいてスコア化し、4APを加えてから一時間分の行動量Totalseizure severity score (TSSS)を測定値とした。【０１８３】
４ＡＰ投与（図９Ｂの下向きの矢印）の前後、循環液４０μｌを採取して、グルタミン酸量を測定した（図９Ｂの上向きの矢印）。これに並行して、サンプル中のドーパミン量も測定した（図９Ｂの上向きの矢印）。４ＡＰの投与によって、脳におけるグルタミン酸分およびドーパミン分泌、ならびに、重篤な発作が誘起された。本発明のグルタミン酸輸送阻害剤のひとつであるアセトアセテート（１０ｍＭ）の投与により、４ＡＰによって誘起されたグルタミン酸分泌は抑制されたが、ドーパミン分泌は、影響を受けなかった（図９ＢおよびＣ）。アセトアセテートを除去すると、再度、脳におけるグルタミン酸分およびドーパミン分泌、ならびに、重篤な発作が誘起された（図９Ｄ）。【０１８４】
上記の結果から、本発明のグルタミン酸輸送阻害剤は、癲癇の治療薬として有用であることが示された。さらに、この結果は、癲癇のみならず、過剰な神経の興奮に関連する疾患および／または状態（たとえば、癲癇に加えて、炎症、振せん、とう痛、高血圧、虚血、パーキンソン病、アルツハイマー病、大理石症、および、骨粗相症からなる群から選択される疾患および／または状態）の治療薬として、本発明のグルタミン酸分泌阻害剤が有用であることを示す。【０１８５】
（実施例８：グルタミン酸輸送の阻害解除剤または活性化剤のスクリーニング）
本実施例の方法を用いることによって、グルタミン酸輸送の阻害解除剤または活性化剤のスクリーニングすることができる。【０１８６】
実施例２において調製した再構成リポソームに、アセトアセテートを終濃度１ｍＭで添加する。ネガティブコントロールとして、緩衝液Ａ（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０、５ｍＭ  酢酸マグネシウム、１０４ｍＭの酢酸カリウム）を用いる。ネガティブコントロール、または、候補薬物（緩衝液Ａ中で０．０１ｍＭ〜１ｍＭ）を、アセトアセテートを添加した再構成リポソームに添加し、室温で５分間放置する。【０１８７】
次に、実施例２に記載したように、バリノマイシン存在下（＋バリノマイシン）、および非存在下（−バリノマイシン）における、５ｍＭのクロライドイオン濃度でのグルタミン酸輸送活性測定を行う。具体的には、試験管内に緩衝液Ｇ（20 mM MOPS-Tris pH 7.0、150 mM 酢酸カリウム、5 mM 酢酸マグネシウム、10 mM KCl）、2μＭ  バリノマイシン、[2,3-3H]L-グルタミン酸(0.5 MBq/pmol)、と阻害剤を加え、27℃水浴において3分間インキュベートした。ここに作製したプロテオリポソーム0.5μｇを加え反応を開始する。130μＬのサンプル液を取り、セファデックスG-50ファインに通す。760×ｇで2分間遠心し、その溶出液をクリアゾル３ｍＬに溶かし、液体シンチレーションカウンターにより計測し、輸送活性を測定する。ネガティブコントロールの場合と比較して、候補化合物を添加することにより高い輸送活性が観察された場合、その候補化合物を、阻害解除剤または活性化剤として同定する。【０１８８】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１８９】
本発明によって、興奮性化学伝達阻害剤およびそのスクリーニング法が提供される。特に、興奮性神経伝達物質に対する小胞型神経伝達物質トランスポーターの少なくとも２種を、生理条件のクロライド濃度下で阻害する興奮性化学伝達阻害剤およびそのスクリーニング法が本発明によって提供される。さらに、癲癇、炎症、振せん、とう痛、高血圧、虚血、パーキンソン病、アルツハイマー病、大理石症、および、骨粗相症などの疾患／状態の治療、予防、および／または予後に有用である薬剤およびそのスクリーニング法が本発明によって提供される。
【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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