(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式(I)：
【化１】
0005526339.tif 000011
(式中、
Xは窒素原子であり、
YはC-R8であり、
Zは窒素原子であり、
R1〜R8は、同一又は異なり、水素原子又は直鎖C1-10-炭化水素基である)、若しくは
次式(II)：
【化２】
0005526339.tif 000012
(式中、
X'は窒素原子であり、
Y'はC-R8であり、
Z'はN-R9であり、
R1〜R4及びR6〜R9は、同一又は異なり、水素原子又は直鎖C1-10-炭化水素基であり、
C環は、点線部分に最多二重結合を有する)
で示される化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する抗ウイルス剤であって、該ウイルスがフラビウイルス科に属するウイルスである、前記抗ウイルス剤。
【請求項２】
前記直鎖C1-10-炭化水素基が直鎖C1-10-アルキル基である、請求項１記載の抗ウイルス剤。
【請求項３】
前記直鎖C1-10-アルキル基がメチル基である、請求項２記載の抗ウイルス剤。
【請求項４】
前記ウイルスが、黄熱病ウイルス(YFV)、デング熱ウイルス(DENV)、日本脳炎ウイルス(JEV)、西ナイルウイルス(WNV)、ウシ下痢症ウイルス(BVDV)及びC型肝炎ウイルス(HCV)から成る群より選択されるフラビウイルス科に属するウイルスである、請求項１〜３のいずれか１項記載の抗ウイルス剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、フラビウイルス科（Flaviviridae）に属するウイルス等のウイルスに対する抗ウイルス剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
フラビウイルス科に属するウイルスとしては、黄熱病ウイルス(YFV)、デング熱ウイルス(DENV)、日本脳炎ウイルス(JEV)、西ナイルウイルス(WNV)等のフラビウイルス属に属するウイルス、ウシ下痢症ウイルス(BVDV)等のペスティウイルス属に属するウイルス、C型肝炎ウイルス(HCV)等のヘパシウイルス属に属するウイルスが挙げられる。これら列挙したフラビウイルス科に属するウイルスのうち、ウシ下痢症ウイルスを除くウイルスは、ヒトに深刻な感染症を引き起こすことが知られている。特に、デング熱ウイルス及びC型肝炎ウイルスがそれぞれ引き起こすデング熱又はC型肝炎を患う患者は、世界中で非常に多い。また、最近では西ナイル熱が北米を中心として流行している。西ナイル熱は、上述した西ナイルウイルスが引き起こす。【０００３】
ところで、抗ウイルス化合物としては、例えばC型肝炎ウイルスに対する処置として使用されるピラノインドール誘導体(特許文献１〜３)、C型肝炎ウイルス等のウイルスに対して抗ウイルス効果を有するユージストミン誘導体(特許文献４及び５)、C型肝炎ウイルス感染阻害剤に使用されるテトラゾロキノリン化合物(特許文献６)、及びフラビウイルス科ウイルスの感染の治療に使用される二環式イミダゾール誘導体(特許文献７)が知られている。しがしながら、このような従来の化合物の抗ウイルス活性は、十分なものではなかった。
【特許文献１】特表2005-531572号公報
【特許文献２】特表2007-526320号公報
【特許文献３】特表2005-533031号公報
【特許文献４】国際公開第2005/082373号パンフレット
【特許文献５】国際公開第2006/088191号パンフレット
【特許文献６】特表2007-506788号公報
【特許文献７】特表2007-501189号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、上述した実情に鑑み、フラビウイルス科に属するウイルスを含めたウイルスに対して抗ウイルス活性を示す化合物を含有する抗ウイルス剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上述した目的を達成するため、本発明者が鋭意検討した結果、特定の複素芳香族化合物が抗ウイルス活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００６】
本発明は、次式(I)：
【化１】
0005526339.tif 000002
【０００７】
(式中、Xは、CH、窒素原子、酸素原子又は硫黄原子であり、Y及びZは、同一又は異なり、窒素原子又はC-R8であって、少なくとも一方は窒素原子であり、R1〜R8は、同一又は異なり、水素原子、直鎖C1-10-炭化水素基、水酸基又は置換若しくは非置換のベンジル基であり、ただし、Xが酸素原子又は硫黄原子の場合には、R5は存在しない)、若しくは
次式(II)：
【化２】
0005526339.tif 000003
【０００８】
(式中、X'は、CH又は窒素原子であり、Y'及びZ'は、同一又は異なり、窒素原子、N-R9又はC-R8であって、少なくとも一方は窒素原子又はN-R9であり、R1〜R4及びR6〜R8は、前記と同一であり、R9は、水素原子、直鎖C1-10-炭化水素基、水酸基又は置換若しくは非置換のベンジル基であり、C環は、点線部分に最多二重結合を有する)で示される化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する抗ウイルス剤に関する。【０００９】
前記式(I)で示される化合物としては、Xが窒素原子であり、YがC-R8であり、Zが窒素原子であり、R1〜R8が同一又は異なり、水素原子又は直鎖C1-10-炭化水素基である化合物が挙げられる。【００１０】
前記式(II)で示される化合物としては、X'が窒素原子であり、Y'がC-R8であり、Z'がN-R9であり、R1〜R4及びR6〜R9が同一又は異なり、水素原子又は直鎖C1-10-炭化水素基である化合物が挙げられる。【００１１】
また、前記直鎖C1-10-炭化水素基としては、直鎖C1-10-アルキル基が挙げられる。さらに、直鎖C1-10-アルキル基としては、メチル基が挙げられる。【００１２】
本発明に係る抗ウイルス剤が対象とするウイルスとしては、フラビウイルス科に属するウイルスが挙げられる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、従来の抗ウイルス剤に比べて抗ウイルス活性が高い抗ウイルス剤を提供することができる。【００１４】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2007-279648号及び2008-050771号の明細書に記載される内容を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。【００１６】
前記式(I)又は式(II)においてR1〜R9で表される直鎖C1-10-炭化水素基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、へプチル基、オクチル基、ノニル基及びデシル基の直鎖C1-10-アルキル基；ビニル基、1-プロペニル基、アリル基、1-ブテニル基、2-ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基等の直鎖C2-10-アルケニル基；エチニル基、1-プロピニル基、2-プロピニル（プロパルギル）基、3-ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基等の直鎖C2-10-アルキニル基が挙げられる。【００１７】
前記式(I)又は式(II)においてR1〜R9で表されるベンジル基は、ハロゲン原子、芳香族複素環基、アシル基、水酸基、カルボキシル基、C1-12-炭化水素-O-基等から選ばれる1以上の置換基で置換されていてもよい。【００１８】
ここで、ハロゲン原子としては、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。【００１９】
芳香族複素環基としては、例えばフリル基、チエニル基、ピロリル基、オキサゾリル基、イソオキサゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、ピリジル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基、ピラジニル基、キノリル基、イソキノリル基が挙げられる。【００２０】
アシル基としては、例えばホルミル基、アセチル基、プロパノイル基、ブタノイル基、ペンタノイル基、ヘキサノイル基等のC1-6-脂肪族アシル基；ベンゾイル基、トルオイル基等のアロイル基が挙げられる。【００２１】
C1-12-炭化水素-O-基としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、sec-ブトキシ基、tert-ブトキシ基、ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、シクロプロピルオキシ基、シクロブチルオキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基等のC1-6-アルコキシ基が挙げられる。【００２２】
前記式(I)で示される化合物としては、Xが窒素原子であり、YがC-R8であり、Zが窒素原子であるγ-カルボリン(又は5-カルボリンと呼ばれる)又はその誘導体であることが好ましい。その際、前記式(I)におけるR1〜R8が同一又は異なり、水素原子又は直鎖C1-10-炭化水素基であることが好ましく、直鎖C1-10-炭化水素基としては、直鎖C1-10-アルキル基が特に好ましい。さらに好ましくは、直鎖C1-10-アルキル基はメチル基である。【００２３】
また、前記式(II)で示される化合物としては、X'が窒素原子であり、Y'がC-R8であり、Z'がN-R9である化合物(上述のγ-カルボリンの互変異性体に相当する)又はその誘導体が好ましい。その際、前記式(II)におけるR1〜R4及びR6〜R9が同一又は異なり、水素原子又は直鎖C1-10-炭化水素基であることが好ましく、直鎖C1-10-炭化水素基としては、直鎖C1-10-アルキル基が特に好ましい。さらに好ましくは、直鎖C1-10-アルキル基はメチル基である。【００２４】
前記式(I)又は式(II)で示される化合物の薬学的に許容される塩としては、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、ピロ硫酸、メタリン酸等の無機酸、又はクエン酸、安息香酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、スルホン酸(例えば、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸)等の有機酸との塩が挙げられる。また、フェノール性水酸基又はカルボキシル基を有する場合には、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩として用いることもできる。【００２５】
前記式(I)で示される化合物については、例えば、γ-カルボリンは、T. Iwakiら, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1999年, 第11号, p. 1505-1510に記載の方法により製造することができる。X及びYが窒素であり、ZがCHであり、且つR1〜R7が水素原子であるβ-カルボリンは、例えば東京化成工業(株)から市販されている。また、前記式(I)中、Xが窒素原子であり、YがC-R8であり、Zが窒素原子であり、R1〜R4及びR6〜R8のうち1つがメチル基であり、且つ当該メチル基以外のR1〜R8が水素原子である化合物は、L. K. Daltonら, Aust. J. Chem., 1969年, 第22巻, p. 185-195に記載の方法により製造することができる。さらに、前記式(I)中、Xが窒素原子であり、YがC-R8であり、Zが窒素原子であり、R5がメチル基であり、且つR1〜R4及びR6〜R8が水素原子である化合物は、H. Zhang及びR. C. Larock, J. Org. Chem., 2002年, 第67巻, p. 7048-7056に記載の方法により製造することができる。【００２６】
また、前記式(I)中、Xが窒素原子であり、YがC-R8であり、Zが窒素原子であり、R5がメチル基であり、R1、R2、R4及びR6〜R8のうちいずれか1つがメチル基であり、且つ当該メチル基以外のR1〜R4及びR6〜R8が水素原子である化合物は、X. Jiangら, Org. Proc. Res. Develop., 2001年, 第5巻, p. 604-608に記載の方法により製造することができる。さらに、前記式(I)中、Xが窒素原子であり、YがC-R8であり、Zが窒素原子であり、R3及びR5がメチル基であり、且つR1、R2、R4及びR6〜R8が水素原子である化合物は、T. Tsunodaら, Chem. Lett., 1994年, 第23巻, p. 539-542に記載の方法により製造することができる。【００２７】
一方、前記式(II)で示される化合物については、例えば、当該式中、X'が窒素原子であり、Y'がC-R8であり、Z'がN-R9であり、R9がメチル基であり、且つR1〜R4及びR6〜R8が水素原子である化合物は、N. N. Smolyarら, Pharm. Chem. J., 2001年, 第35巻, p. 514-517に記載の方法により製造することができる。【００２８】
以下、前記式(I)又は式(II)で示される化合物及びその薬学的に許容される塩(以下、「本発明に係る化合物」という)の投与量及び製剤化について説明する。【００２９】
本発明に係る化合物は、そのまま、あるいは慣用の製剤担体と共に動物及びヒトに投与することができる。投与形態としては、特に限定がなく、必要に応じ適宜選択され、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤、注射剤、坐剤等の非経口剤が挙げられる。【００３０】
経口剤として所期の効果を発揮するためには、患者の年令、体重、疾患の程度により異なるが、通常成人で本発明に係る化合物の重量として5〜1,000mg、好ましくは10〜600mgを、1日1回又は数回に分けての服用が適当である。【００３１】
経口剤は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を用いて常法に従って製造される。【００３２】
この種の製剤には、適宜前記賦形剤の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を使用することができる。【００３３】
結合剤としては、例えばデンプン、デキストリン、アラビアゴム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴールが挙げられる。【００３４】
崩壊剤としては、例えばデンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロースが挙げられる。【００３５】
界面活性剤としては、例えばラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリソルベート80が挙げられる。【００３６】
滑沢剤としては、例えばタルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコールが挙げられる。【００３７】
流動性促進剤としては、例えば軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウムが挙げられる。【００３８】
また、本発明に係る化合物は、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エリキシル剤としても投与することができ、これらの各種剤形には、矯味矯臭剤、着色剤を含有してもよい。【００３９】
非経口剤として所期の効果を発揮するためには、患者の年令、体重、疾患の程度により異なるが、通常成人で本発明に係る化合物の重量として1日5〜500mg、好ましくは10〜300mgの静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射が適当である。【００４０】
この非経口剤は常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、オリーブ油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を用いることができる。更に必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤等を加えてもよい。また、この非経口剤は安定性の点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥技術により水分を除去し、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。更に、必要に応じて適宜、等張化剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤等を加えてもよい。【００４１】
その他の非経口剤としては、パップ剤、外用液剤、軟膏等の塗布剤、直腸内投与のための坐剤等が挙げられ、常法に従って製造される。【００４２】
一方、本発明に係る化合物は、特に限定されないが、例えばフラビウイルス科、トガウイルス科（Togaviridae）、レオウイルス科（Reoviridae）、ピコルナウイルス科（Picornaviridae）、ブニヤウイルス科(Bunyaviridae)、オルソミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）、パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）、コロナウイルス科（Coronaviridae）、カリシウイルス科（Caliciviridae）、アデノウイルス科（Adenoviridae）、パポーバウイルス科（Papovaviridae）、ポックスウイルス科（Poxviridae）、ラブドウイルス科（Rhabdoviridae）、ヘルペスウイルス科(Herpesviridae)、アレナウイルス科（Arenaviridae）及びレトロウイルス科(Retroviridae)等に属するウイルスによるウイルス感染を抑制するために使用することできる。特に、フラビウイルス科に属するウイルス感染を抑制するために、本発明に係る化合物を使用することができる。フラビウイルス科に属するウイルスとしては、例えば黄熱病ウイルス(YFV)、デング熱ウイルス(DENV)、日本脳炎ウイルス(JEV)、西ナイルウイルス(WNV)等のフラビウイルス属に属するウイルス；ウシ下痢症ウイルス(BVDV)等のペスティウイルス属に属するウイルス；C型肝炎ウイルス(HCV)等のヘパシウイルス属に属するウイルスが挙げられる。【００４３】
本発明に係る化合物の抗ウイルス活性は、例えばウイルスを細胞に感染させ、感染前、感染後、又は感染と同時に、本発明に係る化合物を培地に添加した後、ウイルス複製抑制率を測定する方法によって評価することができる。具体的には、例えばLDH cytotoxicity detection kit(Takara Biochemicals社)を用いてウイルス感染細胞の培養上清中の乳酸脱水素酵素(LDH)活性を測定することで、ウイルス複製抑制率を評価することができる。LDHは細胞質内に存在する酵素であり、通常、細胞膜の存在により細胞外へ放出されることはほとんどない。一方、ウイルスが細胞に感染し、細胞内で増殖すると、感染細胞は死滅する。ウイルス感染により、細胞の細胞膜が破壊され、LDHが培養上清中に放出されることとなる。本発明に係る化合物の存在下でのウイルス感染細胞の培養において、本発明に係る化合物の効果によってウイルスの感染や増殖が抑制されると、当該細胞の細胞膜は破壊されないため、培養上清中のLDHは上昇しない。すなわち、ウイルス増殖による細胞破壊の程度と培養上清中のLDH量が極めて良好な正の相関を示す。そこで、培養上清中のLDHを定量することで、本発明に係る化合物の抗ウイルス活性(ウイルス複製抑制)を測定することができる。【００４４】
また、ウイルス非感染細胞を含む培地に本発明に係る化合物を添加した後、本発明に係る化合物の細胞増殖抑制率を測定する。例えば水溶性MTT液TetraColor One(登録商標)(Seikagaku Corporation社）等の生細胞測定用試薬を用いることで、細胞増殖抑制率を測定することができる。【００４５】
次いで、得られたウイルス複製抑制率から、50％のウイルス複製抑制率を付与することができる本発明に係る化合物の濃度(すなわち、50％有効濃度：EC50)を求める。一方、得られた細胞増殖抑制率から、50％の細胞増殖抑制率を付与する本発明に係る化合物の濃度(すなわち、50％細胞毒性濃度：CC50)を求める。さらに、選択係数(CC50/EC50)を求める。当該選択係数は、値が大きいほど、細胞を傷つけずにウイルス複製のみを抑制する効果が高いとみなすことができる。従って、当該選択係数を指標に本発明に係る化合物の抗ウイルス活性を評価することができる。また、本発明に係る化合物の抗ウイルス活性は、本発明に係る化合物を含む培地で培養したウイルス感染細胞におけるウイルス抗原量を測定するアッセイ(例えば、ウエスタンブロット分析、ELISAやフローサイトメトリー)、あるいはウイルス感染細胞におけるウイルス遺伝子(RNA)量を測定するアッセイ(例えば、ノーザンブロット分析や定量RT-PCR法)によって評価することができる。【００４６】
以上に説明したように、本発明に係る化合物を有効成分とする抗ウイルス剤をウイルス感染被験者に投与することで、ウイルスの増殖を抑制することができる。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。【００４８】
〔参考例〕フルオレン、ジベンゾフラン及びカルバゾールの抗ウイルス活性
(1)材料
フルオレン、ジベンゾフラン及びカルバゾールの抗ウイルス活性を調べるために、以下の材料を使用した。【００４９】
1) 細胞：Madin-Darby bovine kidney細胞（以下、「MDBK細胞」という）
2) ウイルス：ウシ下痢症ウイルス(Bovine viral diarrhea virus：以下、「BVDV」という)Nose株
3) 培地：100 unit/ml ペニシリンG、100μg/mlストレプトマイシン及び3％ウマ血清を添加したDulbecco's Modified Eagle Medium
4) 培養プレート：96穴平底マイクロタイタープレート
5) 測定用試薬又はキット：LDH cytotoxicity detection kit(Takara Biochemicals社）及び水溶性MTT液TetraColor One(登録商標)(Seikagaku Corporation社）
6) 化合物
試験化合物は、以下の表１に示す化合物である。
【表１】
0005526339.tif 000004
【００５０】
RibavirinはSchering-Plough社製のものを使用した。シクロスポリンAは、Sigma社製のものを使用した。また、インターフェロン-αは、PBL Biochemical Laboratories社製のものを使用した。【００５１】
一方、フルオレンは、Aldrich社製のものを使用した。また、ジベンゾフラン及びカルバゾールは、関東化学(株)製のものを使用した。【００５２】
上記化合物のうち、Ribavirinは核酸誘導体で、抗BVDV効果及び抗C型肝炎ウイルス(以下、「HCV」という)効果を有することが知られており、現在インターフェロンとともにC型肝炎の治療薬として臨床で使用されているものである。また、シクロスポリンAは、その抗HCV効果がin vitroで証明されている。さらに、インターフェロン-αは、幅広いウイルスに対して抗ウイルス効果を有しており、その抗BVDV効果及び抗HCV効果が証明されている。本参考例では、Ribavirin、シクロスポリンA及びインターフェロン-αを陽性対照として使用した。【００５３】
また、上記LDH cytotoxicity detection kitは、細胞から放出された乳酸脱水素酵素(LDH)を測定することにより細胞傷害を測定するキットである。本参考例では、当該キットをウイルス複製抑制率を求めるために使用した。さらに、水溶性MTT液TetraColor One(登録商標)は生細胞測定用試薬である。【００５４】
(2)方法
以下に示す方法により、Ribavirin、シクロスポリンA及びインターフェロン-α並びにフルオレン、ジベンゾフラン及びカルバゾールの抗ウイルス活性を測定した(Baba C.ら, Antiviral Chem. Chemother., 16: 33-39 (2005))。【００５５】
MDBK細胞（2 × 105 cells/ml）に、BVDVを感染多重度(multiplicity of infection；MOI)=0.01で感染させた。次いで、BVDV感染細胞を含む溶液を96穴平底マイクロタイタープレートの各穴に100μlずつ分注し、同時に5倍段階希釈した化合物を添加し、37℃（5％CO2）で3日間培養した。【００５６】
3日間の培養後、培養上清を50μl採取して別のマイクロタイタープレートに移し、LDH cytotoxicity detection kitの反応液を50μl添加した。室温で30分間培養した後、マイクロタイタープレートをマイクロプレートリーダー（BioRad Laboratories社）に供し、490 nm/690 nmで吸光度を測定した。【００５７】
得られた吸光度に基づいて、ウイルス複製の抑制率(％)を次の計算式で求めた。【００５８】
100 - [(ODT)V-(ODC)M] / [(ODC)V-(ODC)M] × 100 (％)
この式において、各略称は以下の意味を示す。【００５９】
(ODT)V：化合物存在下におけるウイルス感染細胞上清の吸光度（LDH活性）
(ODC)M：化合物非存在下におけるウイルス非感染細胞上清の吸光度（LDH活性）
(ODC)V：化合物非存在下におけるウイルス感染細胞上清の吸光度（LDH活性）
さらに、得られたウイルス複製抑制率から、50％のウイルス複製抑制率を付与する化合物の濃度(50％有効濃度:EC50）を求めた。【００６０】
同時に、化合物の毒性を測定するために、上述のようにウイルス非感染MDBK細胞を含むマイクロタイタープレートに化合物を添加し、3日間培養した。3日間の培養後、マイクロタイタープレートの各穴にTetraColor One(登録商標)を10μlづつ添加した。37℃で1時間インキュベーションした後、マイクロタイタープレートをマイクロプレートリーダーに供し、450 nm/690 nmで吸光度を測定した。【００６１】
得られた吸光度に基づいて、化合物による細胞増殖抑制率％を次の計算式で求めた。【００６２】
100 - [(ODT)M / (ODC)M] × 100 (％)
この式において、各略称は以下の意味を表す。【００６３】
(ODT)M：化合物存在下における非感染細胞培養液の吸光度（MTT活性）
(ODC)M：化合物非存在下における非感染細胞培養液の吸光度（MTT活性）
さらに得られた細胞増殖抑制率から、50％の細胞増殖抑制率を付与する化合物の濃度(50％細胞毒性濃度CC50）を求めた。【００６４】
(3)結果
各化合物のEC50(μM)、CC50(μM)及び選択係数(CC50/EC50)を表２に示す。なお、EC50(μM)及びCC50(μM)の数値は、少なくとも2回、別々に行われた実験からの平均値である。
【表２】
0005526339.tif 000005
【００６５】
表２から判るように、既存の薬剤であるRibavirinとシクロスポリンAは選択的な抗BVDV効果を示したが、それらの選択係数はいずれも10以下であり、それ程高いものではなかった。【００６６】
〔実施例１〕β-カルボリン及びγ-カルボリンの抗ウイルス活性
上記参考例に記載の方法に準じて、以下の表３に示すβ-カルボリン及びγ-カルボリンの抗ウイルス活性を測定した。β-カルボリンは、東京化成工業(株)製のものを使用した。γ-カルボリンは、T. Iwakiら, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1999年, 第11号, p. 1505-1510に記載の方法に準じて製造した。【００６７】
また、表３には、測定されたβ-カルボリン及びγ-カルボリンのEC50(μM)、CC50(μM)及び選択係数(CC50/EC50)も示す。
【表３】
0005526339.tif 000006
【００６８】
表３から判るように、β-カルボリン及びγ-カルボリンが選択的な抗BVDV効果を示し、とりわけγ-カルボリンが強い効果を有していた。【００６９】
〔比較例〕
上記参考例に記載の方法に準じて、以下の表４に示すα-カルボリン及びδ-カルボリンの抗ウイルス活性を測定した。これらカルボリンは、T. Iwakiら, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1999年, 第11号, p. 1505-1510に記載の方法に準じて製造した。【００７０】
また、表４には、測定されたα-カルボリン及びδ-カルボリンのEC50(μM)、CC50(μM)及び選択係数(CC50/EC50)も示す。
【表４】
0005526339.tif 000007
【００７１】
表４から判るように、β-カルボリン及びγ-カルボリン(表３)と比較して、α-カルボリン及びδ-カルボリンの抗BVDV効果は低かった。【００７２】
〔実施例２〕γ-カルボリン誘導体の抗ウイルス活性(1)
上記参考例に記載の方法に準じて、以下の表５に示すメチル-γ-カルボリンの抗ウイルス活性を測定した。表５に示す化合物1、3、4及び6〜9は、L. K. Daltonら, Aust. J. Chem., 1969年, 第22巻, p. 185-195に記載の方法に準じて製造した。また、表５に示す化合物5は、H. Zhang及びR. C. Larock, J. Org. Chem., 2002年, 第67巻, p. 7048-7056に記載の方法に準じて製造した。さらに、表５に示す化合物2は、N. N. Smolyarら, Pharm. Chem. J., 2001年, 第35巻, p. 514-517に記載の方法に準じて製造した。【００７３】
また、表５には、測定された各メチル-γ-カルボリンのEC50(μM)、CC50(μM)及び選択係数(CC50/EC50)も示す。
【表５】
0005526339.tif 000008
【００７４】
0005526339.tif 000009
【００７５】
表５から判るように、9種類全てのメチル-γ-カルボリンにおいて選択的な抗BVDV効果が認められたが、その中でも化合物5に最も強い活性と高い選択性が認められた。【００７６】
〔実施例３〕γ-カルボリン誘導体の抗ウイルス活性(2)
上記参考例に記載の方法に準じて、以下の表６に示すジメチル-γ-カルボリンの抗ウイルス活性を測定した。表６に示す化合物10〜13、15及び16は、X. Jiangら, Org. Proc. Res. Develop., 2001年, 第5巻, p. 604-608に記載の方法に準じて製造した。また、表６に示す化合物14は、T. Tsunodaら, Chem. Lett., 1994年, 第23巻, p. 539-542に記載の方法に準じて製造した。【００７７】
また、表６には、測定された各ジメチル-γ-カルボリンのEC50(μM)、CC50(μM)及び選択係数(CC50/EC50)も示す。
【表６】
0005526339.tif 000010
【００７８】
表６から判るように、7種類全てのジメチル-γ-カルボリンにおいて選択的な抗BVDV効果が認められたが、その中でも特に化合物12に最も強い活性と高い選択性が認められた。また、化合物11には、化合物12に匹敵する活性と最も高い選択性が認められた。【００７９】
本発明に係る化合物が標的とする分子は、フラビウイルス科に属するウイルスであれば、構造が同じ又は構造が極めて類似していることが容易に予測される。したがって、本発明に係る化合物は、BVDVと同様、フラビウイルス科に属する他のウイルスに対しても、強い抗ウイルス活性を示すことが期待できる。【００８０】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。