(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己集合化によってウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成することができるバクテリオファージの組み換えキャプシドタンパク質の発現方法であって、前記バクテリオファージがＲＮＡバクテリオファージＱβであり、前記組み換えキャプシドタンパク質が配列番号５のアミノ酸配列を有し、前記方法は、
a) 発現プラスミドを細菌宿主に導入する工程であって、前記発現プラスミドは(i)配列番号３の位置１から１６に記載の塩基配列：taaggaggaa aaaaaa、（ii)発現コンストラクト、および(iii) ラクトースによって誘導可能なプロモーターを含んでなり、前記発現コンストラクトは配列番号６のヌクレオチド配列を含んでなるか、あるいは配列番号６のヌクレオチド配列からなる工程、
b) グリセロールである主要な炭素源を含んでなる培地中で該細菌宿主を培養する工程であって、前記培養がバッチ式培養で、該プロモーターがｌａｃＩによって抑制される条件下で行われ、該ｌａｃＩが該細菌宿主によって過剰発現されるものである工程、
c) 該バッチ培養物に該主要な炭素源を与える工程、そして、
d) 誘導因子により該プロモーターを誘導する工程であって、前記プロモーターの前記誘導が、前記バッチ培養物に前記誘導因子と前記主要な炭素源が一定流速又は漸増流速でともに供給されることによって行われ、前記誘導因子がラクトースであり、前記誘導因子がラクトースであって、前記ラクトースと前記主要な炭素源がおよそ２：１から１：４(w/w)の比率で前記バッチ培養物にともに供給され、前記バッチ培養物の培養及び供給と前記プロモーターの誘導が、前記細菌宿主の最適増殖温度より低い温度で行われ、前記温度が２７．５と３５℃の間である工程
を含んでなる方法。
【請求項２】
前記発現プラスミドが配列番号１のヌクレオチド配列を含んでなるか、あるいは配列番号１のヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロモーターは、
a) ｔａｃプロモーター、
b) ｔｒｃプロモーター、
c) ｔｉｃプロモーター、
d) ｌａｃプロモーター、
e) ｌａｃＵＶ５プロモーター、
f) Ｐｓｙｎプロモーター、
g) ｌｐｐａプロモーター、
h) ｌｐｐ-ｌａｃプロモーター、
i) Ｔ７-ｌａｃプロモーター、
j) Ｔ３-ｌａｃプロモーター及び
k) Ｔ５-ｌａｃプロモーター
からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記プロモーターは配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ｌａｃＩが前記細菌宿主によって過剰発現され、該過剰発現がｌａｃＩｑ又はｌａｃＱ１によって起こる、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記過剰発現がｌａｃＩｑによって起こる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細菌宿主がβ-ガラクトシダーゼ活性を含んでなる、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記温度が２８と３１℃の間である、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記温度が３０℃である、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
a) 前記発現プラスミドが配列番号１のヌクレオチド配列を含んでなるか、あるいは配列番号１のヌクレオチド配列からなる、
b) 前記細菌宿主が大腸菌ＲＢ７９１である、そして、
c) 前記バッチ培養物の培養及び供給と前記プロモーターの誘導がおよそ３０℃の温度で実施される、
請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ラクトースと前記主要な炭素源が１：１から１：３(w/w)の比率で前記バッチ培養物にともに供給される、請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ラクトースと前記主要な炭素源が１：３(w/w)の比率で前記バッチ培養物にともに供給される、請求項１から１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
自己集合化によってウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成することができるバクテリオファージの組み換えキャプシドタンパク質の発現方法であって、前記バクテリオファージがＲＮＡバクテリオファージＡＰ２０５であり、
a) 発現プラスミドを細菌宿主大腸菌ＲＢ７９１に導入する工程であって、前記発現プラスミドは発現コンストラクトを含んでなり、前記発現コンストラクトは(i)配列番号３０のヌクレオチド配列を含むか、あるいは配列番号３０のヌクレオチド配列からなり、更に(ii) ラクトースによって誘導可能なプロモーターを含んでなるものである工程、
b) グリセロールである主要な炭素源を含んでなる培地中で前記細菌宿主を培養する工程であって、前記培養がバッチ式培養で、前記プロモーターがｌａｃＩによって抑制される条件下で行われ、前記ｌａｃＩが前記細菌宿主によって過剰発現されるものである工程、
c) 前記バッチ培養物にグリセロールを与える工程であって、前記バッチ培養物への前記グリセロールの供給は続けられるものである工程、そして、
d) 誘導因子により前記プロモーターを誘導する工程であって、前記プロモーターの前記誘導は、前記バッチ培養物に前記誘導因子と前記グリセロールを一定流速又は漸増流速でともに供給することによって行われ、前記誘導因子はラクトースであり、前記ラクトースと前記グリセロールが２：１から１：４(w/w)の比率で前記バッチ培養物にともに供給され、前記バッチ培養物の培養及び供給と前記プロモーターの前記誘導がおよそ３０℃の温度で実施される工程
を含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
(発明の分野)
この発明は、タンパク質発現及び発酵技術の分野に関連がある。細菌宿主における組み換えバクテリオファージキャプシドタンパク質の効率的な発現のための方法を記載する。本方法により、自己集合化(セルフアセンブリ、self-assembly)によってウイルス様粒子(ＶＬＰ)を形成することができる組み換えキャプシドタンパク質の高収率が可能である。さらに、本方法は、実験室規模から、５０リットルより大きな発酵槽容量まで拡張可能である。
【０００２】
(発明の背景)
近年のワクチン接種計画は、抗原に対する免疫応答を亢進するためにウイルス又はウイルス様粒子(ＶＬＰ)を使用する。例えば、国際公開第０２／０５６９０５号は、高度に配列した反復配列に担体と結合した抗原を配位するための、ＶＬＰの担体としての利用を示す。このような抗原アレイによって結合した抗原に対して、特定の抗体応答に強力な免疫応答が生じ得、さらに自己抗原に対する免疫系の固有の耐性を弱めることが可能である。したがって、このような抗原アレイは、感染症及びアレルギーの治療のため、並びに自己特異的な免疫応答の効率的な誘導、例えば癌、関節リウマチ及び様々な他の疾患の治療のための、ワクチンの産生に有用である。
国際公開第０２／０５６９０５号に示されるように、バクテリオファージのキャプシドタンパク質は抗原担体として特に適している。細菌宿主における発現の際にＶＬＰに効率的に自己集合化することが示されている(Kastelein等 1983, Gene 23:245-254；Kozlovskaya等 1986, Dokl. Akad. Nauk SSSR 287:452-455)。さらに、バクテリオファージのキャプシドタンパク質、例えばｆｒ(Pushko等 1993, Protein Engineering 6(8)883-891)、Ｑβ(Kozlovska等 1993, Gene 137:133-137；Ciliens等 2000, FEBS Letters 24171:1-4；Vasiljeva等 1998, FEBS Letters 431:7-11)、及びＭＳ-２(国際公開第９２／１３０８１；Mastico等 1993, Journal of General Virology 74:541-548；Heal等 2000, Vaccine 18:251-258)由来のものは、誘導性プロモーター、例えばｔｒｐプロモーター又はｔｒｐ-Ｔ７融合体(ｆｒ及びＱβの場合)又はｔａｃプロモーターを用いて誘導因子物質としてＩＰＴＧを用いて(ＭＳ-２の場合)、細菌宿主内で生産されている。組み換えキャプシドタンパク質の起こりうる毒作用及び細菌性発現宿主の成長、ひいては発現タンパク質の収率を低減しうるタンパク質発現の代謝負担を回避するために、誘導性プロモーターの使用は有益である。
【０００３】
しかしながら、今までのバクテリオファージのキャプシドタンパク質の発現のために用いられる発現系は、小規模発酵、すなわち一般的に明らかに１リットル未満の容量を有する実験室規模及び小さいバッチ式培養に応用されている。５０リットル以上の容量を含むこれらのシステムのスケールアップは、プロモーターの漏出及び／又はプラスミド保持率の低下により個々のキャプシドタンパク質回収率を大幅に減少させると思われる。
バクテリオファージの組み換えキャプシドタンパク質の商業的に望ましい高水準発現及び迅速な蓄積に関する更なる課題は、不正確に折りたたまれたタンパク質種(folded protein species)の形成と、いわゆる封入体、すなわちタンパク質集合体の形成であり、これらは不溶性で、さらに後に続く工程を妨げうる。ゆえに、バクテリオファージＭＳ-２のコートタンパク質については、ＶＬＰへの自己集合体化能を失わせるタンパク質凝集塊とタンパク質種の形成は、タンパク質がｐＥＴ発現系を用いたＩＰＴＧ誘導後に強力なＴ７プロモーターの制御下で発現されたときに報告されている(Peabody & Al-Bitar 2001, Nucleic Acid Research 29(22): e113)。
【０００４】
したがって、組み換えキャプシドタンパク質の高発現速度は、正確に集合化(アセンブリ)されたＶＬＰの収率にネガティブな影響を及ぼしうる。したがって、商業的な規模のＶＬＰベースのワクチンの産生は、ＶＬＰに自己集合化力を有する恒常的な品質及び純度の産物を生じるバクテリオファージの組み換えキャプシドタンパク質の発現のために、効率性、特に拡張可能な発酵方法の確立を必要とする。これによって、キャプシドタンパク質の不溶性分画の形成は最小限化されるか又は回避される。
したがって、不利益又は従来の方法の不利な点を回避するか又は最小限化するバクテリオファージの組み換えキャプシドタンパク質の発現のための方法、特に、商業的な規模に拡張可能でありながら、ＶＬＰへの自己集合化能及び恒常的な品質ないし純度の産物を生じ、キャプシドタンパク質の不溶性分画の形成が最小限化されるか又は回避される方法を提供することが本発明の目的である。
【０００５】
(発明の概要)
本発明は、自己集合化によってＶＬＰを形成することができるバクテリオファージの組み換えキャプシド又はその変異体ないしはその断片の発現のための方法であって、a) 発現プラスミドを細菌宿主に導入する、このとき、該発現プラスミドは発現コンストラクトを含んでなり、該発現コンストラクトは(i) 該組み換えキャプシドタンパク質又はその変異体ないしはその断片をコードする第一ヌクレオチド配列、と(ii) ラクトースによって誘導可能なプロモーターを含んでなるものであり；b) 主要な炭素源を含んでなる培地中で該細菌宿主を培養する；このとき、該培養がバッチ式培養で、該プロモーターがｌａｃＩによって抑制される条件下で行われ、該ｌａｃＩが該細菌宿主によって過剰発現されるものであり；c) 該バッチ培養物に該主要な炭素源を与える；そして、d) 誘導因子により該プロモーターを誘導する、このとき好ましくは該バッチ培養物への該主要な炭素源の供給を続けるという工程を含んでなる方法。
本発明は、自己集合化によりＶＬＰを形成しているバクテリオファージのキャプシドタンパク質の発現のための強力な発酵方法であって、該方法が商業的な生産規模に拡張可能であり、該キャプシドタンパク質の発現速度により可溶性キャプシドタンパク質の収率が改善される方法を提供する。これは、特に、本方法の全体にわたる増殖期の間のプロモーターの抑制及び高いプラスミド保持率を改善することによって達成される。発現系はさらに、生産期の間に生じる最大発現速度を制限することによって不溶性タンパク質凝集塊の形成を回避する。
【０００６】
好適な実施態様では、前記バクテリオファージはＲＮＡバクテリオファージである。より好ましくは、前記ＲＮＡバクテリオファージは、ａ) バクテリオファージＱβ；ｂ) バクテリオファージＡＰ２０５；ｃ) バクテリオファージｆｒ；ｄ) バクテリオファージＧＡ；ｅ) バクテリオファージＳＰ；ｆ) バクテリオファージＭＳ２；ｇ) バクテリオファージＭ１１；ｈ) バクテリオファージＭＸ１；ｉ) バクテリオファージＮＬ９５；ｊ) バクテリオファージｆ２；ｋ) バクテリオファージＰＰ７及びｌ) バクテリオファージＲ１７からなる群から選択される。好ましくは、前記ＲＮＡバクテリオファージはＱβである。より好ましくは、前記組み換えキャプシドタンパク質は、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０及び配列番号：１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるか、あるいはこれらからなる。さらにより好ましくは、前記組み換えキャプシドタンパク質は配列番号：５を含んでなり、最も好ましくは、前記組み換えキャプシドタンパク質は配列番号：５からなる。
更なる好適な実施態様では、前記組み換えキャプシドタンパク質は、配列番号：１２、配列番号：１３及び配列番号：１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるか、あるいはこれらからなる。より好ましくは、前記組み換えキャプシドタンパク質は配列番号：１２を含んでなり、最も好ましくは、前記組み換えキャプシドタンパク質は配列番号：１２からなる。
【０００７】
本発明の他の実施態様では、前記発現コンストラクトは第一停止コドンを含み、該第一停止コドンがＴＡＡであり、好ましくは該ＴＡＡが前記第一ヌクレオチド配列の３'に直接位置する。
更なる実施態様では、前記発現コンストラクトが第一停止コドンと第二停止コドンを含み、該第一停止コドンが前記第一ヌクレオチド配列の３'に直接位置し、該第二停止コドンが該第一停止コドンの３'に直接位置し、該第一又は第二の停止コドンの少なくとも１つがＴＡＡである。
更なる実施態様では、前記発現コンストラクトは第一ヌクレオチド配列と第二ヌクレオチド配列を含んでなり、該第一ヌクレオチド配列が、組み換えキャプシドタンパク質、好ましくはＱβ ＣＰ又はその変異体ないしはその断片をコードしており、該第二ヌクレオチド配列が、任意の他のタンパク質、好ましくはＱβ Ａ１タンパク質又はその変異体ないしはその断片をコードしており、該第一及び該第二のヌクレオチド配列は少なくとも１つのＴＡＡ停止コドンを含んでなるまさに１つの配列範囲によって切り離されている。好適な実施態様では、前記発現コンストラクトは、配列番号：６のヌクレオチド配列を含んでなるか又はこれからなる。
更なる実施態様では、前記発現プラスミドは配列番号：１のヌクレオチド配列を含んでなるか、より好ましくはこれからなる。
【０００８】
本発明の一実施態様では、前記プロモーターは、a) ｔａｃプロモーター；ｂ)  ｔｒｃプロモーター；ｃ) ｔｉｃプロモーター；ｄ) ｌａｃプロモーター；ｅ) ｌａｃＵＶ５プロモーター；ｆ)  Ｐｓｙｎプロモーター；ｇ) ｌｐｐａプロモーター；ｈ)  ｌｐｐ-ｌａｃプロモーター；ｉ) Ｔ７-ｌａｃプロモーター；ｊ)  Ｔ３-ｌａｃプロモーター；ｋ)  Ｔ５-ｌａｃプロモーター；そして、ｌ) 配列番号：２に少なくとも５０％の配列相同性を有するプロモーターからなる群から選択される。好適な実施態様では、前記プロモーターは、配列番号：２に少なくとも５０％、６０％、７０％、８０、９０又は９５％、好ましくは９８〜１００％、最も好ましくは９９％の配列相同性を有する。更なる好適な実施態様では、前記プロモーターは、ｔｉｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター及びｔａｃプロモーターからなる群から選択される。さらにより好ましくは、前記プロモーターはｔａｃプロモーターである。最も好ましくは、前記プロモーターは、配列番号：２のヌクレオチド配列を含んでなるかあるいはこれからなる。
一実施態様では、前記主要な炭素源はグルコース又はグリセロールであり、好ましくはグリセロールである。 
一実施態様では、前記のバッチ培養物への供給はある流速で行われ、該流速は指数係数μで増加し、好ましくは該指数係数μはμｍａｘより小さいものである。
【０００９】
更なる実施態様では、前記プロモーターの誘導は、前記バッチ培養物に前記誘導因子、好ましくはラクトースと、前記主要な炭素源、好ましくはグリセロールが一定流速でともに供給されることによって行われる。
更なる実施態様では、前記プロモーターの誘導は、前記バッチ培養物に前記誘導因子、好ましくはラクトースと、前記主要な炭素源、好ましくはグリセロールが漸増流速でともに供給されることによって行われる。
更なる実施態様では、前記誘導因子はラクトースであって、好ましくは該ラクトースと前記主要な炭素源はおよそ２：１から１：４(w/w)の比率で前記バッチ培養物にともに供給される。
更なる実施態様では、前記誘導因子はＩＰＴＧであり、好ましくは前記培地中の該ＩＰＴＧの濃度は０．００１〜５ｍＭ、好ましくは０．００１〜１ｍＭ、より好ましくは０．００５〜１ｍＭ、より好ましくは０．００５〜０．５ｍＭである。とても好適な実施態様では、前記ＩＰＴＧの濃度はおよそ０．０１ｍＭ、最も好ましくは０．０１ｍＭである。
【００１０】
一実施態様では、前記ｌａｃＩは前記細菌宿主によって過剰発現され、該過剰発現はｌａｃＩｑ又はｌａｃＱ１、好ましくはｌａｃＩｑによって起こる。一実施態様では、前記細菌宿主はその染色体上に前記ｌａｃＩｑ遺伝子又は前記ｌａｃＱ１遺伝子、好ましくは前記ｌａｃＩｑ遺伝子を含んでなる。さらに好適な実施態様では、前記細菌宿主はプラスミド、好ましくはハイコピー数プラスミドに、前記ｌａｃＩｑ遺伝子又は前記ｌａｃＱ１遺伝子、好ましくは前記ｌａｃＩｑ遺伝子を含んでなる。さらに好適な実施態様では、前記細菌宿主は前記発現プラスミドに、前記ｌａｃＩｑ遺伝子又は前記ｌａｃＱ１遺伝子、好ましくは前記ｌａｃＩｑ遺伝子を含んでなる。
一実施態様では、前記細菌宿主は、大腸菌株ＲＢ７９１、大腸菌株ＤＨ２０及び大腸菌株Ｙ１０８８からなる群から選択される。好ましくは前記細菌宿主は大腸菌ＲＢ７９１である。
一実施態様では、前記細菌宿主はβ-ガラクトシダーゼ活性を含む。
【００１１】
一実施態様では、前記バッチ培養物の培養及び供給と前記プロモーターの誘導は、前記細菌宿主の最適増殖温度より低い温度で行われる。好ましくは前記温度は２３℃と３５℃の間、より好ましくは２５と３３℃の間、さらにより好ましくは２７と３２℃の間、より好ましくは２８と３１℃の間である。さらにより好ましくは、前記温度はおよそ３０℃であり、最も好ましくは、前記温度は３０℃である。
一実施態様では、前記バッチ培養物の培養及び供給は、前記細菌宿主の最適増殖温度よりも低い温度で行われ、より好ましくは該温度は２３℃と３５℃の間、より好ましくは２５と３３℃の間、さらにより好ましくは２７と３２℃の間、なおより好ましくは２８と３１℃の間であり、さらにより好ましくは前記温度はおよそ３０℃であり、最も好ましくは前記温度は３０℃であり、前記プロモータの誘導は、細菌宿主の最適増殖温度、好ましくはおよそ３７℃で行われる。
一実施態様では、前記バッチ培養物の培養及び供給と前記プロモーターの誘導は抗生物質の非存在下で行われる。
【００１２】
特定の実施態様では、前記発現プラスミドは配列番号：１のヌクレオチド配列を含んでなるか、好ましくは配列番号：１のヌクレオチド配列からなり、前記主要な炭素源はグリセロールであり、前記のバッチ培養物への供給はある流速で行われ、該流速は指数係数μで増加し、好ましくは指数係数μはμｍａｘより小さいものであり、前記バッチ培養物にともに供給されることによる前記プロモーターの誘導は一定流速で行われ、ラクトース及びグリセロールはおよそ２：１からおよそ１：４(w/w)、好ましくはおよそ１：１からおよそ１：４(w/w)、最も好ましくはおよそ１：３(w/w)の比率で前記バッチ培養物にともに供給され、そして前記バッチ培養物の培養及び供給と前記プロモーターの誘導は２７と３２℃の間、好ましくはおよそ３０℃、最も好ましくは３０℃の温度で行われる。
更なる特定の実施態様では、前記発現プラスミドは配列番号：３０のヌクレオチド配列を含んでなるか、好ましくは配列番号：３０のヌクレオチド配列からなり、前記主要な炭素源はグリセロールであり、前記のバッチ培養物への供給はある流速で行われ、該流速は指数係数μで増加し、該指数係数μはμｍａｘより小さいものであり、前記バッチ培養物にともに供給されることによる前記プロモーターの誘導は一定流速で行われ、ラクトース及び前記の主要な炭素源はおよそ２：１からおよそ１：４(w/w)、好ましくはおよそ１：１からおよそ１：４(w/w)、最も好ましくはおよそ１：３(w/w)の比率で前記バッチ培養物にともに供給され、そして前記バッチ培養物の培養及び供給と前記プロモーターの誘導は２７と３２℃の間、好ましくはおよそ３０℃、最も好ましくは３０℃の温度で行われる。
【００１３】
(発明の詳細な説明)
特に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語はすべて本発明が属する分野の通常の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。
「およそ」：本出願の意味の範囲内でおよそなる表現は±１０％の意味を有するであろう。例えば、およそ１００は９０〜１１０を意味する。
本明細書中で用いる「ラクトースによって誘導可能であるプロモーター」はｌａｃオペロンの調節エレメントを含んでなるプロモーターを指す。このようなプロモーターは、ｌａｃＩによって抑制され、ラクトース又は合成誘導因子ＩＰＴＧによって誘導されうる。熟練した人は、ラクトースによるプロモーターの誘導が細菌宿主内でβ-ガラクトシダーゼ活性を必要とすることを知っている。
「３'に直接位置する」：他のヌクレオチド配列Ｎ１の３'に直接位置するヌクレオチド配列Ｎ２は、Ｎ１及びＮ２が直接連結されて、更なる配列エレメントによって分離されない高次構造５'-Ｎ１-Ｎ２-３'を有する連続的な配列を指す。
【００１４】
「配列範囲」：本明細書中で用いられる「配列範囲」なる用語は、５０未満、好ましくは２０未満、より好ましくは１０未満、さらにより好ましくは５未満のヌクレオチドから成る連続的なヌクレオチド配列を指す。更なる好適な実施態様では、配列範囲は、少なくとも１、好ましくは１つのＴＡＡ停止コドンを含んでなるか、あるいはこれからなる。他の実施態様では、配列範囲は、少なくとも１、好ましくは１つのＴＡＡ、少なくとも１、好ましくは１つのＴＧＡ停止コドンを含んでなるか、あるいはこれからなる。更なる好適な実施態様では、配列範囲は、配列番号：３２を含んでなるか、あるいはこれからなる。
「細菌宿主」：本明細書中で用いられる「細菌宿主」なる用語は、宿主である又は本発明の発現プラスミドの宿主となることができる細菌性生物を指し、「宿主である」ことは、発現プラスミドの複製と細胞分割の間の発現プラスミドの維持を必要とする。
【００１５】
「培養物」：本発明の前後関係で、「培養物」は培地に細菌宿主を含んでなり(「細菌培養物」)、一般的に、該培地は前記細菌宿主の増殖を支持している。
本明細書中で用いられる「バッチ培養物(バッチ式培養物)」は、培養物、すなわち培地中の細菌宿主を指し、該培養物は閉鎖系を構成する、すなわち一般的及び好ましくは、培養時間の間に培地の添加又は除去ないものである。したがって、連続培養とは異なり、一般的及び好ましくは、バッチ培養物中の細菌宿主の密度は培養時間の進行につれて連続的に増加する。バッチ培養物は、本方法の制御に必要な化合物、例えば誘導因子、酸素、及びｐＨを調節するためのアルカリ又は酸の添加を除外しない。
「バッチ培養物への供給」：本明細書中で用いられるように、基質、好ましくは細菌宿主の主要な炭素源を含有する更なる培地が供給される培養物である(流加培地又は共流加培地)。本出願において、本方法は、「前記バッチ培養物への供給」(培地は主要な炭素源を含んでなる)及び「前記バッチ培養物への同時供給」(培地は主要な炭素源及び誘導因子、好ましくはラクトースを含んでなる)なる用語によって称される。一般的及び好ましくは、分析的目的以外の培地の除去は、流加培養法(fed batch culture)の培養時間の間に行わない。
【００１６】
「前培養」：より大きな容量の培養、例えば組み換えキャプシドタンパク質が産生される培養(産生培養)のための種菌を産生するために用いられる培養、好ましくはバッチ培養。前培養は２以上の工程で行われ、第二の前培養は第一の前培養などを播種して、産生培養のために十分に大きな種菌を生産する。第一及び／又は続く前培養は、プラスミド安定性を向上させるために抗生物質を含んでもよい。
「基質」：本明細書中で用いられるように、細菌宿主の炭素及びエネルギーの供給に関与する培養液中の化合物を指す。したがって、「基質」なる用語は、細菌宿主の炭素供給に貢献する培地中に含有される任意の化合物を包含する。細菌のための代表的な基質は、細菌によって代謝されることができる糖質、澱粉、グリセロール、アセテート及び他の任意の有機化合物である。したがって、「基質」なる用語は主要な炭素源だけでなく例えばラクトースも含む。
本明細書中で用いられる「主要な炭素源」は、増殖期の間に細菌宿主の炭素及びエネルギーの供給に最も関与する培養液中の化合物を指す。したがって、主要な炭素源は細菌宿主の主要な基質である。主要な炭素源は一般的に、糖質、例えばスクロース又はグルコース、又はグリセロール、好ましくはグルコース又はグリセロールである。ラクトースが細菌宿主の主要な炭素源として第一に作用するが、本発明においては「主要な炭素源」なる用語は、一般的及び好ましくはラクトースを含まない。
【００１７】
本発明の方法の段階：本発明の方法は、その増殖及び発現コンストラクトの抑制／誘導状態に関して細菌宿主の異なる生理学的状態を指す異なる段階に特徴付けられる。
「増殖期」：増殖期は、培地中での前記細菌宿主の培養によって始まる。増殖期は、組み換えキャプシドタンパク質の発現を促すプロモーターが抑制され、増殖期が誘導因子による前記プロモーターの誘導によって終了される状態によって特徴付けられるのが好ましい。さらに増殖期は「バッチ期」と「流加期(feed phase)」に分けることができる。前記バッチ期は、培地中で前記細菌宿主を培養することによって始まる。バッチ期は、細菌宿主がまだ増殖していないか又は非指数関数的な速度、典型的及び好ましくは線形的な速度で増殖する「誘導期」を含む。増殖期はさらに、誘導期に直接続く「指数増殖期」を含む。前記培養物への供給はバッチ期の間行わないので、指数増殖期は細菌宿主による基質の消費によって終了する。増殖期はさらに、バッチ期の直後であり、前記バッチ培養物への前記主要な炭素源の供給によって始まる「流加期」を含む。流加期は、主要な炭素源を含有する流加培地の流速に直接依存する細菌宿主の増殖速度によって特徴付けられる。
「生産期」：増殖期の後に、誘導因子による前記プロモーターの誘導によって始まる生産期が続き、典型的及び好ましくは前記バッチ培養物への前記主要な炭素源の供給が続けられる。
【００１８】
「プロモーターが抑制される状態」：プロモーターの抑制はリプレッサー-オペレーター複合体の形成と解離の平衡であり、さらに強く抑制されたプロモーターはそれらの誘導因子の非存在下でもある発現速度を示しうることが理解される。したがって、本出願において用いられるように、「プロモーターが抑制される状態」なる用語は、増殖期終了後、すなわち培養物に誘導因子を添加する直前に、組み換えキャプシドタンパク質が、実施例１７のＨＬＰＣ方法によって測定するところの２００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１５０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは、１００ｍｇ／Ｌの培地中の濃度を超えないレベルで発現される状態を指す。最も好ましくは、組み換えタンパク質の濃度は前記方法の検出レベル未満である。
「誘導因子」：本明細書中の意味の範囲内での「誘導因子」なる用語は、直接又は間接的に誘導性プロモーターと相互作用することにより、該プロモーターからの発現を容易にする任意の物質を指す。例えば、「ラクトースによって誘導可能なプロモーター」、例えばｌａｃ又はｔａｃプロモーターの誘導因子は、ＩＰＴＧ、ラクトース及びアロラクトースである。
【００１９】
「コートタンパク質」／「キャプシドタンパク質」：「コートタンパク質」なる用語及び本出願の範囲内で交換可能に用いられる「キャプシドタンパク質」なる用語は、ウイルスタンパク質、好ましくはウイルス、好ましくはＲＮＡバクテリオファージの天然のキャプシドのサブユニットを指し、ウイルスキャプシド又はＶＬＰに組み込まれることが可能であるものである。例えば、ＲＮＡバクテリオファージＱβのコートタンパク質遺伝子の特定の遺伝子産物は「Ｑβ ＣＰ」と称され、一方、バクテリオファージＱβの「コートタンパク質」又は「キャプシドタンパク質」は「Ｑβ ＣＰ」並びにＡ１タンパク質を含んでなる。
「組み換えキャプシドタンパク質」：組み換え宿主細胞によって合成されるキャプシドタンパク質。
「ポリペプチド」：本明細書中で用いられる「ポリペプチド」なる用語は、アミノ酸残基から成るポリマー、一般にペプチド結合によりともに結合された天然のアミノ酸残基を指す。ポリペプチドは大きさで限定する必要はないが、ポリペプチドなる用語はおよそ１０〜およそ５０のアミノ酸の大きさのペプチドとともに用いられることが多い。
【００２０】
「タンパク質」：本明細書中で用いられるように、タンパク質なる用語は、一般的に２０より多い、より好ましくは５０より多いアミノ酸残基の大きさのポリペプチドを指す。必ずしも必要ではないが、タンパク質は一般に、定義された三次元構造を有しており、折りたたまれた(folded)と称されることが多く、それに対して、定義された三次元構造を有していないが、多数の異なる高次構造を取り入れることができるペプチド及びポリペプチドは折りたたまれていない(unfolded)と称される。 
「組み換え宿主細胞」：本明細書中で用いられるように「組み換え宿主細胞」なる用語は、本発明の一又は複数の核酸分子が導入されている宿主細胞を指す。
「組み換えＶＬＰ」：本明細書中で用いる「組み換えＶＬＰ」なる用語は、組み換えＤＮＡ技術の少なくとも一工程を含んでなる方法によって得られるＶＬＰを指す。本明細書中で用いる「組み換えて生産されるＶＬＰ」なる用語は、組み換えＤＮＡ技術の少なくとも一工程を含んでなる方法によって得られるＶＬＰを指す。ゆえに、「組換えＶＬＰ」及び「組み換えて生産されるＶＬＰ」なる用語は本願明細書において交換可能に用いられ、同一の意味を有する。
【００２１】
「ＲＮＡ-バクテリオファージ」：本明細書中で用いられるように、「ＲＮＡ-バクテリオファージ」なる用語はＲＮＡウィルス感染細菌、好ましくは一本鎖陽性センスＲＮＡウィルス感染細菌を指す。
「ウイルス様粒子(ＶＬＰ)」：本明細書中で用いられるように、「ウイルス様粒子」なる用語は構造類似ウイルス粒子を指すか、又は非複製性又は非感染性、好ましくは非複製性かつ非感染性のウイルス粒子を指すか、又は非複製性又は非感染性、好ましくは非複製性かつ非感染性の構造類似ウイルス粒子、好ましくはウイルスのキャプシドを指す。本明細書中で用いられる「非複製性」なる用語は、ＶＬＰに包含されるゲノムを複製できなことを意味する。本明細書中で用いられる「非感染性」なる用語は、宿主細胞に侵入することができないことを意味する。好ましくは、本発明のウイルス様粒子は、ウイルスゲノムないしはウイルスゲノム機能の全て又は一部を欠いているため、非複製性及び／又は非感染性である。典型的には、ウイルス様粒子はウイルスゲノムの複製性及び感染性の構成成分のすべて又は一部を欠いている。本発明のウイルス様粒子は、それらのゲノムと異なる核酸を含みうる。本発明のウイルス様粒子の典型的かつ好ましい実施態様では、対応するウイルス、バクテリオファージ、好ましくはＲＮＡファージのウイルスキャプシド等の、ウイルスキャプシドである。「ウイルスキャプシド」又は「キャプシド」なる用語は、ウイルスタンパク質のサブユニットから構成される巨大分子の集合体を指す。典型的には、６０、１２０、１８０、２４０、３００、３６０及び３６０以上のウイルスタンパク質サブユニットである。典型的かつ好ましくは、これらのサブユニットの相互作用により、固有の反復して組織化される、ウイルスキャプシド又はウイルスキャプシド様構造が形成される。前記構造は典型的には球状又は管状である。例えば、ＲＮＡバクテリオファージのキャプシド又はＨＢｃＡｇは、正二十面体対称の球状形である。
【００２２】
「ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子」：本明細書中で用いる「ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子」なる用語は、ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体ないしは断片を含んでなる、好ましくは基本的にこれからなる、あるいはこれからなるウイルス様粒子を指す。さらに、ＲＮＡバクテリオファージの構造に類似するＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子は非複製性及び／又は非感染性であり、ＲＮＡバクテリオファージの複製機構をコードする少なくとも一の遺伝子、好ましくは複数の遺伝子を欠損しており、及び典型的には、宿主にウイルスが接着するか侵入するためのタンパク質又はそれに関与するタンパク質をコードする一又は複数の遺伝子も欠損する。ＲＮＡバクテリオファージ由来の好適なＶＬＰは、正二十面体対称を表し、１８０のサブユニットから成る。ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子を非複製性及び／又は非感染性にする好適な方法は、遺伝子操作によるものである。
Ｏｎｅ、ａ、又はａｎ：用語「ｏｎｅ」、「ａ」、又は「ａｎ」を本開示中で使用するとき、それらは、特に示さない限りは、「少なくとも一」又は「一又は複数」を意味する。
【００２３】
「配列同一性」：ポリペプチドのアミノ酸配列同一性は、公知のコンピュータープログラム、例えばＢｅｓｔｆｉｔプログラムを使用して慣習的に決定することができる。ある配列が例えば参照アミノ酸配列に対して９５％の同一性があるかどうかを決定するためにＢｅｓｔｆｉｔ又は他の配列アライメントプログラム、好ましくはＢｅｓｔｆｉｔを用いる場合、同一性の割合が参照アミノ酸配列の完全長に対して算出され、ホモロジー内のギャップが参照配列のアミノ酸残基の総数の５％以下になるように、パラメーターを設定する。ポリペプチド間の同一性の割合を決定する際の上述の方法は、この発明で開示されるすべてのタンパク質、ポリペプチド又はその断片に適用できる。
「配列相同性」：ヌクレオチド配列の相同性は、例えば、好ましくはソフトウェアのデフォルト設定を用いたＢＬＡＳＴアルゴリズムの実施であるプログラムｂｌａｓｔｎによって決定することができる。
【００２４】
本明細書中で用いられるように、「タンパク質の断片」、特に組み換えタンパク質又は組み換えコートタンパク質の断片は、野生型組み換えタンパク質又はコートタンパク質それぞれの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％の長さであり、好ましくはＶＬＰ形成能を有するポリペプチドとして定義される。好ましくは、前記断片は、少なくとも１つの内部欠損、少なくとも１つの切断又は少なくとも１つのその組合せによって得られる。さらに好ましくは、前記断片は、多くても１０、多くても９、多くても８、多くても７、多くても６、多くても５、多くても４、多くても３又は多くても２の内部欠損によって；多くても１０、多くても９、多くても８、多くても７、多くても６、多くても５、多くても４、多くても３又は多くても２つの切断によって；又は、多くても３、好ましくは多くても２、最も好ましくはまさしくその１つの組み合わせによって得られる。最も好ましくは、前記断片は、まさしく１つの内部欠損、まさしく１つの切断又はまさしくその組み合わせによって得られる。
【００２５】
「組み換えタンパク質の断片」なる用語又は「コートタンパク質の断片」なる用語は、さらに「組み換えタンパク質の断片」又は「コートタンパク質の断片」それぞれに少なくとも８０％、好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％のアミノ酸配列同一性を有し、上記に定義されるように、好ましくはウイルス様粒子に集合化することができるポリペプチドを包含する。
「変異組み換えタンパク質」なる用語又は本明細書中で交換可能に用いられる「組み換えタンパク質の変異体」、又は「変異コートタンパク質」なる用語又は本明細書中で交換可能に用いられる「コートタンパク質の変異体」なる用語は、野生型組み換えタンパク質又はコートタンパク質それぞれに由来するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指し、該アミノ酸配列は野生型配列に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の同一性があり、好ましくはＶＬＰを集合体化する能力を保持する。
【００２６】
本発明は、バクテリオファージのＶＬＰの産生のための効率的な発酵方法に関連がある。前記方法は、ＶＬＰの収率に関して向上しており、商業的な生産規模に拡張することができる。前記方法は、キャプシドタンパク質を自然発生的にＶＬＰに自己集合体化させる条件下での細菌宿主におけるバクテリオファージの組み換えキャプシドタンパク質の発現を包含する。
本発明の方法によって生産されうるＶＬＰのある例は、バクテリオファージ、好ましくはＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰである。本発明の一実施態様では、本発明のウイルス様粒子は、ＲＮＡファージの組み換えコートタンパク質、その変異体ないしは断片を含んでなるか、あるいは基本的にこれからなるか、あるいはこれからなる。好ましくは、ＲＮＡ-ファージは、ａ) バクテリオファージＱβ；ｂ) バクテリオファージＲ１７；ｃ) バクテリオファージｆｒ；ｄ) バクテリオファージＧＡ；ｅ) バクテリオファージＳＰ；ｆ) バクテリオファージＭＳ２；ｇ) バクテリオファージＭ１１；ｈ) バクテリオファージＭＸ１；ｉ) バクテリオファージＮＬ９５；ｋ) バクテリオファージｆ２；ｌ) バクテリオファージＰＰ７及びｍ) バクテリオファージＡＰ２０５からなる群から選択される。
【００２７】
本発明の一実施態様では、ＶＬＰは、ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体ないしはその断片を含んで産生され、該コートタンパク質は：(ａ) Ｑβ ＣＰと称する配列番号：５；(ｂ) 配列番号：５及び配列番号：１５の混合物(Ｑβ Ａ１タンパク質)；(ｃ) 配列番号：１６(Ｒ１７キャプシドタンパク質)；(ｄ) 配列番号：１７(ｆｒキャプシドタンパク質)；(ｅ) 配列番号：１８(ＧＡキャプシドタンパク質)；(ｆ) 配列番号：１９(ＳＰキャプシドタンパク質)；(ｇ) 配列番号：１９及び配列番号：２０の混合物；(ｈ) 配列番号：２１(ＭＳ２キャプシドタンパク質)；(ｉ) 配列番号：２２(Ｍ１１キャプシドタンパク質)；(ｊ) 配列番号：２３(ＭＸ1キャプシドタンパク質)；(ｋ) 配列番号：２４(ＮＬ９５キャプシドタンパク質)；(ｌ) 配列番号：２５(ｆ２キャプシドタンパク質)；(ｍ) 配列番号：２６(ＰＰ７キャプシドタンパク質)；及び、(ｎ) 配列番号：１２(ＡＰ２０５キャプシドタンパク質)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
大腸菌内での発現の際には、通常Ｑβコートタンパク質のＮ末端メチオニンが取り除かれる(Stoll, E.等, J. Biol. Chem. 252:990-993 (1977))。Ｎ末端メチオニンが取り除かれていないＱβコートタンパク質から成るＶＬＰ、又はＮ末端メチオニンが切断されているか存在しているＱβコートタンパク質の混合物を含んでなるＶＬＰもまた、本発明の範囲内である。
【００２８】
本発明のある好適な実施態様では、ＶＬＰは、ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体ないしはその断片の複数のアミノ酸配列、好ましくは２つのアミノ酸配列を含んでなるかあるいはこれからなるモザイクＶＬＰである。 
あるとても好適な実施態様では、ＶＬＰは、ＲＮＡバクテリオファージの２つの異なるコートタンパク質を含んでなるかあるいはこれらからなり、該２つのコートタンパク質は、配列番号：５と配列番号：１５、又は配列番号：１９と配列番号：２０のアミノ酸配列を有する。
本発明の好適な実施態様では、生産されたＶＬＰは、ＲＮＡ-バクテリオファージＱβ、ｆｒ、ＡＰ２０５又はＧＡのの組み換えコートタンパク質、その変異体ないしはその断片を含んでなるか、あるいは基本的にこれらからなるか、あるいはこれらからなる。
ある好適な実施態様では、ＶＬＰはＲＮＡ-ファージＱβのＶＬＰである。Ｑβのキャプシド又はウイルス様粒子は、２５ｎｍの直径とＴ＝３準対称性を有する二十面体のファージ様キャプシド構造を示す。キャプシドはコートタンパク質の１８０のコピーを含有し、ジスルフィド架橋によって共有結合性五量体及び六量体に連結される(Golmohammadi, R.等, Structure 4:543-5554 (1996))。
【００２９】
ＲＮＡバクテリオファージ、特に本発明のＱβ及びｆｒの好適なウイルス様粒子は、国際公開第０２／０５６９０５号に開示されており、その開示内容は出典明記によって本明細書中に援用される。国際公開第０２／０５６９０５号の特定の実施例１８は、ＱβのＶＬＰ粒子の調製を詳細に説明している。
他の好適な実施態様では、ＶＬＰはＲＮＡバクテリオファージＡＰ２０５のＶＬＰである。アミノ酸５のプロリンがスレオニンに置換しているＡＰ２０５コートタンパク質を含むＡＰ２０５ ＶＬＰの集合体化能を有する変異形も本発明の実施に用いられ、本発明の他の好適な実施態様となる。国際公開第２００４／００７５３８号は、特に実施例１及び実施例２において、ＡＰ２０５コートタンパク質を含んでなるＶＬＰの入手方法、及びこれによって特にその発現及び精製を記述する。国際公開第２００４／００７５３８号は出典明記によって本明細書中に援用される。
【００３０】
ある好適な実施態様では、ＶＬＰはウイルス、好ましくはＲＮＡバクテリオファージの変異コートタンパク質を含んでなるか、あるいはこれからなり、該変異コートタンパク質は置換及び／又は欠失による少なくとも１つのリジン残基の除去によって修飾されている。他の好適な実施態様では、本発明のＶＬＰはウイルス、好ましくはＲＮＡバクテリオファージの変異コートタンパク質を含んでなるか、あるいはこれからなり、該変異コートタンパク質は置換及び／又は挿入による少なくとも１つのリジン残基の付加によって修飾されている。少なくとも１つのリジン残基の欠失、置換又は付加は、抗原とのカップリングの程度を変化させる。
Ｑβコートタンパク質のＶＬＰ又はキャプシドは、それらの表面上に一定数のリジン残基を表出しており、キャプシドの内部へ向かい、ＲＮＡと相互作用する３つのリジン残基と、キャプシドの外側に曝される４つの他のリジン残基により定められた形態を有する。
【００３１】
露出したリジン残基がアルギニンによって置換されているＱβ変異体もまた本発明によって包含される。好ましくは、これらの変異コートタンパク質は、ａ) Ｑβ-２４０(配列番号：７、Ｌｙｓ１３→Ａｒｇ)；ｂ) Ｑβ-２４３(配列番号：８、Ａｓｎ１０→Ｌｙｓ)；ｃ) Ｑβ-２５０(配列番号：９、Ｌｙｓ２→Ａｒｇ)；ｄ) Ｑβ-２５１(配列番号：１０、Ｌｙｓ１６→Ａｒｇ)；及び、ｅ) Ｑβ-２５９(配列番号：１１、Ｌｙｓ２→Ａｒｇ、Ｌｙｓ１６→Ａｒｇ)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるか、あるいはこれからなる。上記の示されたＱβ変異コートタンパク質、すなわち変異Ｑβコートタンパク質ＶＬＰ及びキャプシドの構築、発現及び精製は、それぞれ、国際公開第０２／０５６９０５号に記述される。特に、上述した出願の実施例１８に示される。
更なる好適な実施態様では、組み換えキャプシドタンパク質は、配列番号：１２に表されるアミノ酸配列を有するバクテリオファージＡＰ２０５のキャプシドタンパク質ないしはその変異体であり、ＶＬＰ、例えばタンパク質ＡＰ２０５Ｐ５Ｔ(配列番号：１３)又はＡＰ２０５ Ｎ１４Ｄ(配列番号：１４)を形成することができる。
【００３２】
とても好適な実施態様では、前記組み換えキャプシドタンパク質は、配列番号：５に示すアミノ酸配列を含むか好ましくはこれからなる大腸菌ＲＮＡバクテリオファージＱβの１３３のアミノ酸コートタンパク質Ｃからなり、好ましくは該組み換えキャプシドタンパク質は自己集合体化によってＶＬＰを形成することができる。
一実施態様では、発現コンストラクトは第一停止コドンと第二停止コドンを含み、該第一停止コドンが前記第一ヌクレオチド配列の３'に直接位置し、該第二停止コドンが該第一停止コドンの３'に直接位置し、該第一又は第二の停止コドンの少なくとも１つがＴＡＡである。例えば、プラスミドｐＴａｃ-ｎＳＤＡＰ２０５(配列番号：３０)は、第一停止コドンとして天然に生じるＴＡＡ停止コドンを、及び第一停止コドンの３'直接に更なるＴＧＡ停止コドンを含んでなる。
【００３３】
好適な実施態様では、発現コンストラクトは、第一ヌクレオチド配列と第二ヌクレオチド配列を含んでなり、該第一ヌクレオチド配列が組み換えキャプシドタンパク質、好ましくはＱβ ＣＰ又はその変異体ないしはその断片、最も好ましくは配列番号：５をコードしており、該第二ヌクレオチド配列が任意の他のタンパク質、好ましくはＱβ Ａ１タンパク質又はその変異体ないしはその断片、最も好ましくは配列番号：１５をコードしており、該第一及び該第二のヌクレオチド配列が少なくとも１つのＴＡＡ停止コドンを含んでなるまさに１つの配列範囲によって切り離されている。一実施態様では、前記ＴＡＡ停止コドンは、天然に生じる停止コドン、好ましくはＴＧＡを配列ＴＡＡに置換することによって生成される。あるいは、より好ましくは、前記ＴＡＡ停止コドンは、天然に生じる停止コドン、好ましくはＴＧＡを配列TAATGA(配列番号：３２)に置換することによって生成される。
【００３４】
例えば、Ｑβ遺伝子Ｃの領域は、NCBI GenBank Acc. No. M99039(ヌクレオチド４６−１０６２)に対応する。遺伝子Ｃは、１３３-アミノ酸Ｑβコートタンパク質(配列番号：５)をコードする第一ヌクレオチド配列と、３２９-アミノ酸リードスルータンパク質Ａ１(配列番号：１５)をコードする第二ヌクレオチド配列を含有する。配列番号：６のヌクレオチド１−３９９(NCBI GenBank Acc. No. M99039のヌクレオチド４６−４４４)は、１３３-アミノ酸Ｑβ ＣＰをコードする前記第一ヌクレオチド配列に対応し、配列番号：６のヌクレオチド４００−４０２は強力なＴＡＡ停止コドンに、配列番号：６のヌクレオチド４０３−４０５はリーキーＴＧＡ停止コドンに対応し、前記第二ヌクレオチド配列(Ｑβ Ａ１)が続く。驚くべきことに、発現コンストラクトのＡ１に関するヌクレオチド配列の存在によりＲＮＡ安定性が高くなり、したがって、Ａ１配列が欠失しているコンストラクトと比較してＱβ ＣＰ及びＶＬＰの収率が向上することが明らかとなった。
【００３５】
組み換えタンパク質の発現は、蓄積しているタンパク質の毒作用及びタンパク質合成によって生じる代謝負荷によって細菌宿主の増殖速度が有意に減少しうる。特に、細胞溶解及び低プラスミド保持率が生じうる。誘導性プロモーターは、発酵方法の生産期から増殖期を切り離しうる。誘導性プロモーターは、細菌宿主の増殖期の間、抑制因子分子によって抑制され、生産期の間、細菌宿主を誘導条件に曝すことによって誘導される。したがって、誘導性プロモーターは増殖期の間、細菌宿主を早く、好ましくは指数関数的に増殖させ、高い細胞密度に達する。ゆえに、誘導性プロモーターは、生産期終了時の発現産物の高収率を提供する。したがって、組み換えタンパク質の発現のための誘導性プロモーターの使用は好ましい。
【００３６】
誘導性プロモーターの周知の例は、ｌａｃオペロンの一部を形成し、細菌宿主の増殖培地へのラクトース又は強力な合成誘導因子イソプロピルチオ-β-Ｄ-ガラクトシド(ＩＰＴＧ)の添加によって誘導することができるｌａｃプロモーターである。Donavan等 2000 (Can. J. Microbiol 46:532-541)は、ｌａｃプロモーターの制御下でのモノクローナル抗体断片の発現のための改良方法について報告する。さらに、誘導性プロモーターの例は、Makrides 1996 (Microbiological Reviews, p. 512-538)の表１において提供される。
誘導性プロモーターをベースとした発現系の代表的な欠点はプロモーターの「漏れやすさ(リーキー)」であり、これはプロモーターが不十分にしか抑制されておらず、増殖期の間に組み換えタンパク質のある一定の発現速度が生じることを意味する。典型的には、これにより細胞密度の減少又はプラスミド不安定性が生じ、結果として、組み換えタンパク質の収率が減少するMakrides 1996 (Microbiological Reviews, p. 512-538)。不十分な抑制傾向があるプロモーターの例は、高酸素条件下で抑制されて、酸素低下により誘導されるＶＨｂプロモーターである。
【００３７】
本発明の目的のためには、厳密に抑制されるプロモーターが好ましい。一実施態様では、プロモーターは抑制因子ｌａｃＩによって抑制される。このようなプロモーターの例は、Makrides 1996 (Microbiol. Rev. 60: 512-538)、Goldstein & Doi 1995 (Biotechnology Annual Review 1:105-128)、Hannig & Makrides 1998 (TIBTECH 16:54-60)及びStevens 2000 (Structures 8, R177-R185)において開示される。好適な実施態様では、プロモーターはラクトースによって誘導可能であり、より好ましくは、それはｌａｃ、ｌａｃＵＶ５、ｔａｃ、ｔｒｃ、Ｐｓｙｎ  ｌｐｐａ、ｌｐｐ-ｌａｃ、Ｔ７-ｌａｃ、Ｔ３-ｌａｃ及びＴ５-ｌａｃからなる群から選択される。本発明の目的のために特に好適なのはｔａｃプロモーター(配列番号：２)又はその突然変異体ないしは変異体である。本発明の範囲内では、配列番号：２と配列相同性を有するｔａｃプロモーターの変異体又は切断型又は欠失した変異体であり、その相同性は少なくとも５０％、６０％、７０％、８０、９０又は９５％、好ましくは９８〜１００％、最も好ましくは９９％である。このとき、このような変異した切断型又は欠失した変異体のプロモーター強度は、配列番号：２のプロモーターと同等である。熟練した人は、標準的な方法を用いた比較発現実験により所望の配列のプロモーター強度を決定することができるであろう。本発明の特定の実施態様では、組み換えキャプシドタンパク質の発現を促すプロモーターは、配列番号：２を含んでなるか、あるいはこれからなる。ｔａｃプロモーターは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの−１０の領域及びｔｒｐプロモーターの−３５の領域の融合生成物であって、ｔｒｐの高い転写効率をｌａｃプロモーターの調節エレメントと組み合わせる(de Boer等 1983, PNAS 80:21-25；Amann等 1983 Gene 25:167-178)。より強力なプロモーター、例えばＴ７プロモーターによって起こりうる不溶性又は不正確に折りたたまれた組み換えタンパク質の形成を回避する一方で、十分に高い発現速度と高いタンパク質収率が提供される。ｔｒｃ及びｔｉｃプロモーターは、ｔａｃプロモーターの変異したバージョンである(Brosius等 1985, The Journal of Biological Chemistry 260(6): 3539-3541)。更なる好適な実施態様では、プロモーターは、ｔｉｃ、ｔｒｃ及びｔａｃからなる群から選択される。
【００３８】
本発明の目的のための発現コンストラクトの構築のために、プロモーターは、リボソーム結合部位(シャイン‐ダルガーノ配列、ＳＤ)、典型的にはその３'末端にＡＴＧ開始コドンを含むものを介して、組み換えキャプシドタンパク質をコードする前記第一ヌクレオチド配列に作用可能に結合する。本発明の目的のために好適なシャイン‐ダルガーノ配列は公知技術である(Dalboge等 1988, DNA 7(6): 399-405；Ringquist等 1992, Mol. Micr. 6:1219-1229)。本発明の一実施態様では、発現コンストラクトは、配列番号：４に示すDalboge等 1988 (DNA 7(6): 399-405)のＳＤ配列を含んでなる。他の好適な実施態様では、発現コンストラクトはRingquist等 1992のシャイン‐ダルガーノ配列を含んでなる(Mol. Micr. 6:1219-1229、配列番号：３、ｎＳＤ)。驚くべきことに、発現レベルが向上し、組み換えキャプシドタンパク質の収率が向上したので、本発明の目的のためには配列番号：３が特に好適であることが明らかとなった。配列番号：３は、ＡＰ２０５キャプシドタンパク質の発現を亢進するために特に適している。本発明の好適な実施態様では、発現コンストラクトは、配列番号：３及び配列番号：４からなる群から選択されたシャイン‐ダルガーノ配列を含んでなり、好ましくは該シャイン‐ダルガーノ配列は配列番号：３である。
【００３９】
転写終結区は、発現コンストラクトの機能的な成分である。熟練した人は、広範囲のソースから適切な転写終結区配列を選択することができるであろう。本発明の好適な実施態様では、前記発現コンストラクトは転写終結区配列を含んでなり、好ましくは該転写終結区配列は前記第一ヌクレオチド配列に作用可能に連結され、さらに好ましくは該転写終結区配列は、ｒＲＮＢ転写終結区配列、最も好ましくは配列番号：２８である。
プラスミド選別のために、熟練した人は、一般的に抗生物質抵抗性マーカー遺伝子を使用するであろう。従来技術において広く使われており、本発明のために適切である抗生物質耐性遺伝子の例は、抗生物質アンピシリン、テトラサイクリン及びカナマイシンに対する耐性遺伝子である。代替抗生物質と比較してカナマイシンのアレルギー誘発能が低いため、また、ワクチンとしてのＶＬＰの使用のために生じる安全性問題が低いために、ＶＬＰの産生のための方法への選択薬剤としてのカナマイシンの使用は、通常好ましい。さらに、カナマイシンは、代替抗生物質、例えばアンピシリンと比較して、プラスミド保持率がより良好である。したがって、トランスポゾンＴｎ９０３から得られるカナマイシン３'-リン酸転移酵素遺伝子(配列番号：２９)は、特に有用な選択マーカー遺伝子である。
【００４０】
通常、培地への抗生物質の添加は、コスト及び安全理由のため、商業的な生産方法では望ましくない。本発明の関係において、一般的及び好ましくは、抗生物質、好ましくはカナマイシンが発現株の選別のために用いられる。生産方法に用いられる培地は基本的に抗生物質、特にカナマイシンを含まない。しかしながら、生産培養のための種菌を生産するために用いられる前培養への抗生物質の添加は、本方法(実施例１０)の全体にわたってプラスミド保持率を向上しうる。
熟練した人は、分子生物学の標準分析法を利用する上記の遺伝的因子を組み合わせることによってバクテリオファージのＶＬＰの産生のために有用である発現コンストラクトを含んでなる発現プラスミドを作成するであろう。本発明のために特に有用な発現プラスミドは、Ｑβ ＶＬＰの産生のためのｐＴａｃ-ｎＳＤＱβ-ｍｕｔ(配列番号：１)及びＡＰ２０５ ＶＬＰの産生のためのｐＴａｃ-ｎＳＤＡＰ２０５(配列番号：３０)である。これらの特定の発現プラスミドの構築は実施例の項目において詳述する。
【００４１】
発現プラスミドは、公知技術の任意の方法、好ましくはエレクトロポレーションによって細菌性発現宿主に形質転換される。発現プラスミドを含んでなる宿主の個々のクローンは、細胞溶解後のＳＤＳ-ＰＡＧＥによって組み換えキャプシドタンパク質の最大の発現について選択される。発現プラスミドを含んでなる発現宿主の選択クローンは、凍結グリセロール培養物として保存することができる。
前記細菌宿主は、複製して、細胞分裂の間に前記発現プラスミドを維持することができる任意の細菌株から選択することができる。好適な細菌宿主は、以下の項目に記述される特定の特徴を有する大腸菌株である。
プロモーターの抑制は、細菌宿主による抑制因子の過剰発現によって向上する。一実施態様では、前記細菌宿主の培養は、バッチ式培養で、前記プロモーターがｌａｃＩによって抑制される条件下で実施される。好適な実施態様では、前記細菌宿主の前記ｌａｃＩの過剰発現を引き起こす遺伝子は、プラスミド、好ましくは前記発現プラスミドに配置される。これに対して、前記遺伝子は、前記細菌宿主に含有される個々のプラスミドに配置され、該個々のプラスミドは好ましくはハイコピー数プラスミドである。あるいは及び最も好ましくは、前記遺伝子は前記細菌宿主の染色体上に配置される。
【００４２】
ｌａｃＩの過剰発現を引き起こす遺伝子の一例は、ｌａｃＩのプロモーター領域の−３５での単一のＣＧからＴＡへの変化により、ＬａｃＩ発現の１０倍の増加を引き起こすｌａｃＩｑ (Menzella等 2003, Biotechnology and Bioengineering 82(7)809-817)である。更なる例は、ｌａｃＩＱ１(Glascock & Weickert 1998, Gene 223(1-2): 221-231)である。増殖期の間でのプロモーターの抑制の改善により、プラスミド保持率が改善し、細胞密度が高まり、最終的にタンパク質収率が向上する。例えば、ｌａｃＩｑ遺伝子を含む細菌株は、ｌａｃＩ抑制因子分子を過剰発現させ、よって、野生型遺伝子を含む株より効率的に、増殖期間の組み換えタンパク質の形成を阻害する。好適な実施態様では、前記ｌａｃＩの過剰発現を引き起こす遺伝子は、ｌａｃＩＱ１又はｌａｃＩｑ、好ましくはｌａｃＩｑである。特定の好適な実施態様では、前記細菌宿主はその染色体上にｌａｃＩｑ遺伝子を含んでなる。
一実施態様では、前記プロモーターの誘導は誘導因子により行われ、好ましくは該誘導因子はＩＰＴＧ及びラクトースから選択され、最も好ましくは前記誘導因子はラクトースである。誘導因子への細菌宿主の曝露の際に、抑制因子は不活性化され、プロモーターは活性化される。ＩＰＴＧは拡散によって直接細胞に入り、活性な抑制因子ｌａｃＩを結合して不活性化するので、培養液への強力な誘導因子ＩＰＴＧの添加により組み換えタンパク質の発現速度が高レベルへ即時に増加する。不活性化ｌａｃＩ抑制因子分子はオペレーターから分離して、プロモーターからの高レベルな転写を可能にする。ＩＰＴＧは細胞によって代謝されず、他の代謝パラメーターが限界になるまで、高速で転写が続く。
【００４３】
前記したように、高い発現速度により、自己集合体化によるＶＬＰの形成ができない不溶性組み換えタンパク質が形成されうる。特に、高濃度のＩＰＴＧによるタンパク質発現の誘導は、不溶性タンパク質が形成される傾向にある。したがって、プロモーターの誘導は、発現を最大速度にする濃度よりも低い濃度でＩＰＴＧを添加することによって達成されるのが好ましい(Kopetzki等 1989, Mol Gen Genet 216:149-155)。
好適な実施態様では、前記プロモーターの誘導はＩＰＴＧによって行われ、前記培地中の前記ＩＰＴＧの濃度は、およそ０．００１〜５ｍＭ、好ましくは０．００１〜１ｍＭ、より好ましくは０．００５〜１ｍＭ、より好ましくは０．００５〜０．５ｍＭである。特定の好適な実施態様では、前記ＩＰＴＧの濃度はおよそ０．０１ｍＭ、最も好ましくは０．０１ｍＭである。
【００４４】
これに対して、プロモーターの誘導はラクトースの添加によって達成される。ラクトースによる組み換えタンパク質発現の誘導は、細菌宿主が例えばＬａｃ透過酵素によって培地からラクトースを取り込むこと、及びβ-ガラクトシダーゼ活性を含むことが必要である。ラクトースの細胞へのＬａｃ透過酵素依存的な取り込みは拡散によるＩＰＴＧの取り込みより動態学的に遅く起こる。さらに、ラクトースは、ｌａｃオペロンと直接相互作用しないが、β-ガラクトシダーゼによって、プロモーターの実際の誘導因子であるアロラクトース(１-６-Ｏ-β-ガラクトピラノジル-Ｄ-グルコース)に変換される。ラクトースの添加による組み換えタンパク質発現の誘導は、誘導因子の添加の際に発現速度が最大レベルに即時に増加することが回避され、ゆえに不溶性タンパク質形成のリスクが低減するので、有益である。
アロラクトースは、生産期の間に細菌宿主によって代謝され、炭素及び代謝エネルギーを細菌の代謝に寄与する。これはさらに、ＩＰＴＧによる誘導と比較してタンパク質収率の向上に寄与しうる。さらに、ラクトースによる誘導は、培地中のラクトース濃度による生産期の間の組み換えタンパク質の発現速度の制御をある程度可能にする。さらに、ＩＰＴＧが高価で、毒性があると考えられているので、ラクトースによる誘導は製薬的生産方法において好ましい。その除去は生産方法の終わりに示される必要がある。
【００４５】
好適な実施態様では、前記プロモーターの誘導は、前記バッチ培養物へのラクトースの添加によって行われ、好ましくは前記細菌宿主は培地からラクトースを取り込むことが可能であり、さらに好ましくは前記細菌宿主はβ-ガラクトシダーゼ活性を含む。このような細菌株は、例えば、株コレクション、例えばＡＴＴＣ (http://www.atcc.org)から入手することができる。好適な実施態様では、前記細菌宿主は大腸菌株、好ましくはＲＢ７９１、ＤＨ２０、Ｙ１０８８、Ｗ３１１０及びＭＧ１６５５からなる群から選択される大腸菌株である。最も好ましくは、前記細菌宿主は大腸菌ＲＢ７９１である。さらにより好適な実施態様では、前記プロモーターはｔａｃプロモーター又はその突然変異体ないしは変異体であり、前記細菌宿主は更にｔａｃプロモーターの抑制因子の過剰発現を引き起こす遺伝子を含む大腸菌株であり、該遺伝子は好ましくはｌａｃＩｑである。細菌宿主の培養液のｐＨは、発酵方法の間に制御され、当分野で周知の方法を用いて酸性又はアルカリ性の溶液を添加することによって調節されてもよい。一実施態様では、前記細菌宿主の培養及び、前記バッチ培養物への供給は、培地のｐＨが制御される条件下で行われる。好適な実施態様では、前記ｐＨは５．５と８．０の間、さらに好ましくは６．５と７．５の間、さらにより好ましくは６．７と７．０の間であり、最も好ましくは前記培地の前記ｐＨは６．８である。前記培地のｐＨは本方法の間、一定に保たれてもよく、又は、上記に特定したｐＨ範囲内で本方法の異なる段階の間、特定の性質を伴ってもよい。好適な実施態様では、前記ｐＨは６．７〜７．０の値で一定に保たれ、好ましくは前記ｐＨは６．８で一定に保たれる。
【００４６】
本発明の方法は増殖期を含んでなり、該増殖期はバッチ期及び流加期を含んでなり、該増殖期及び同時に該バッチ期は前記細菌宿主を培養することによって開始され、該流加期は該バッチ培養物に前記主要な炭素源を供給することによって開始される。
細菌細胞の酸化能は制限され、高濃度の基質によってアセテートのような産物の形成が減少し、これによって望ましくない培地の酸性化と、細菌の増殖減少が起こりうる。したがって、細菌宿主は、限られた量の基質を有する最少栄養培地での流加回分培養において増殖する。一実施態様では、前記細菌宿主の培養は、前記の主要な炭素源を含んでなる培地中で行われ、好ましくは前記培地が最少培地、好ましくは化学的に定められた最少培地である。最も好ましくは、前記培地は実施例５に記載のＲ２７培地である。
バッチ期の終わりに、培地に含有される基質がほぼ無くなった場合、主要な炭素源を含有する培地(流加培地)は細菌宿主の所望の増殖速度と同じ速度で前記バッチ培養物に供給される。すなわち、細菌宿主の増殖速度は基質の流加速度によって制限される。重要なパラメーターは基質、好ましくは主要な炭素源と増殖を維持するために必要な他の栄養分の実際のマスフローであることは、熟練した人に理解されるであろう。実際には流加培地の一定の組成を想定することができるので、流速は培地の容量流量に関係する。同じことが共流加培地にもいえる(下記参照)。
【００４７】
したがって、一実施態様では、前記の主要な炭素による前記バッチ培養物の供給は流速により行われ、前記流速は前記細菌宿主の増殖速度を制限している。
流加期の間、阻害が起こらない場合には、増殖速度は最大増殖速度(μｍａｘ)に近い広範囲で選択してもよい。μｍａｘの実際の値は、細菌株、発現コンストラクト及び増殖条件に非常に依存している。熟練した人は、μｍａｘの測定はプロモーターが抑制される条件下で行われることを理解するであろう。
一定の実験的設定のために、μは、培養時間に対するＯＤ６００又は細胞生重量(ＣＷＷ)によって定まるバイオマス濃度(ｘ)をプロットして、方程式ｘ＝ｘ０ ｅμｔに基づいて指数増殖係数μを決定することによって、培養物の増殖曲線から決定することができる。基質の制限が起こらない、すなわち供給による更なる培地の添加が無い場合、μｍａｘの実際の値は、バッチ期の開始の際の指数関数的な増殖バッチ培養物の増殖速度μとして決定する。増殖速度μは、時差に対する時間ｔ１で測定される総バイオマスＸ１の自然対数と時間ｔ２で測定される総バイオマスＸ２の自然対数との間の相違の比を計算することによって決定することができる。(ｔ２−ｔ１)：μ＝(ｌｎＸ２−ｌｎＸ１)／(ｔ２−ｔ１)
【００４８】
流加回分培養は一定の増殖速度(μ)を維持する。好適な実施態様では、基質、好ましくは主要な炭素源は、バイオマス(ｘ)の指数関数的増加に従って流加期間に供給される。流加期の間、基質が消耗するのと同じ速度で供給される場合、培養物は疑定常状態にあり、連続培養の培養に類似している。バイオマス形成及び基質消費が基質-帰因収率係数Ｙｘ／ｓ(バイオマス[ｇ]／基質[ｇ])に相関するので、供給される時間単位(ｔ)当たりの基質量(ｓ)は、式ｄｓ／ｄｔ＝μ／Ｙｘ／ｓｘ０ｔ０ｔｅμｔ(このときｘ０ｔ０ｔは供給開始時の総バイオマスである)に従って算出される。 
したがって、好適な実施態様では、前記のバッチ培養物への前記主要な炭素供給源の供給はある流速で行われ、該流速は指数係数μで増加し、好ましくは該指数係数μはμｍａｘより小さい。ゆえに、流加期の間の前記細菌宿主の増殖速度はμｍａｘより小さい値に設定される。好適な実施態様では、前記指数係数μは、μｍａｘのおよそ３０％〜７０％、最も好ましくはμｍａｘのおよそ５０％である。本発明の特定の実施態様では、μは０．１５〜０．４５ｈ−１、より好ましくは０．２５〜０．３５ｈ−１の絶対値に設定され、最も好ましくはμは０．３ｈ−１であり、本方法の設定をこれらの値がμｍａｘより小さくなるようにする。
【００４９】
細菌は様々な異なる基質を利用することができる。本発明のために、好適な主要な炭素源はグルコース及びグリセロール、好ましくはグリセロールである。達成されうる発現宿主の最大比増殖速度(μｍａｘ)がグリセロールよりグルコースによるものの方が高いが、グリセロールはアセテート形成を少なくし、基質当たりのバイオマス収率(Ｙｘ／ｓ)を高くし、最終的に、組み換えタンパク質の収率を高くする。さらに、液体基質グリセロールの取扱いは、異なる生産工程において溶解する必要があるグルコースのような固形炭素源の取扱いより容易である。
前記したように、プラスミド保持率、すなわち発酵過程の間の細菌宿主中の発現プラスミドの維持は、組み換えタンパク質の最適収量のために必須である。プラスミド保持率は、固形培地上に細菌細胞を播いて単一コロニーを形成させ、それらの抗生物質耐性について試験することによって評価することができる。例えば、１００％のプラスミド保持率は、１００個の試験したコロニーのうちの１００個が発現プラスミドによって与えられた特定の抗生物質耐性を含むことを意味する。本発明のために、発酵過程の終わりのプラスミド保持率は、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上及び最も好ましくは１００％である。
【００５０】
細菌株の最適増殖温度は、その最も高い最大増殖速度(μｍａｘ)に達する温度である。特段の条件が課されない場合には、ほとんどの大腸菌株に対するこの温度はおよそ３７℃である。しかしながら、最適増殖温度及び、選択抗生物質の非存在下における発現コンストラクトを含む細菌株の増殖は、発現プラスミドの欠如を表し得、一方、発現株がより低い温度で増殖する場合にプラスミド保持率は通常改善される。その最適増殖温度より低い温度で細菌株が増殖する場合、その発現株の最大増殖速度は最適増殖温度での増殖と比較して低いが、組み換えタンパク質の収率は、プラスミド保持率が改善されているために、低い温度でも同じか、むしろよいかもしれない。 
したがって、本発明の一実施形態では、前記細菌宿主の培養及び／又は前記主要な炭素源の前記バッチ培養物への供給及び／又は誘導因子による前記プロモーターの誘導は、前記細菌宿主の最適増殖温度より低い温度で行われる。好適な実施態様では、前記温度は、２０と３７℃の間、好ましくは２３と３５℃の間、より好ましくは２５と３３℃の間、さらにより好ましくは２７と３２℃の間、さらにより好ましくは２８と３１℃の間である。さらにより好ましくは、前記温度はおよそ３０℃であり、最も好ましくは前記温度は３０℃である。
【００５１】
本発明の方法は生産期を含んでなり、前記生産期は誘導因子による前記プロモーターの誘導によって開始される。前記生産期の開始のための時間点は、培養時間及び／又は増殖パラメーターに基づいて決定することができる。
発酵方法の間の細菌宿主の増殖は、６００ｎｍの光学濃度(ＯＤ６００)、細胞生重量(ＣＷＷ[ｇ／Ｌ])及び細胞乾燥重量(ＣＤＷ[ｇ／Ｌ])を決定することによって評価することができる。これらのパラメータは、培地に誘導因子、好ましくはラクトースを添加することによって生産期の始まりの最適時間点を定めるために用いることができる。生産期の初めのＣＷＷをより高くすることは延長した流加期によって達成することができ、組み換えタンパク質の収率が改善されうる反面、他方では、過剰経過培養物はタンパク質発現が不十分かもしれないことは、当業者に明らかであろう。したがって、誘導因子による前記プロモーターの誘導によって開始される生産期を開始するための最適の時間点は、特定の生産条件を決定することが必要である。例えば、総容積２Ｌの大腸菌ＲＢ７９１におけるＱβ ＣＰの発現について、誘導は、ＯＤ６００がおよそ４０〜６０に達するおよそ１４時間後に始まる。驚くべきことに、５０Ｌのスケールの同じ方法についても類似のパラメーターが明らかとなり、誘導開始は、ＯＤ６００がおよそ５０に達するおよそ１４時間後である。
【００５２】
したがって、本発明の一実施態様では、前記誘導因子による前記プロモーターの誘導は、前記増殖期の開始後、好ましくは１２〜１５時間後、より好ましくは１３〜１５時間後、最も好ましくはおよそ１４時間後の１０〜１６時間に行われ、好ましくは前記誘導因子による前記プロモーターの誘導は、ＯＤ６００がおよそ４０〜６０、好ましくはおよそ５０に達したときに行われる。
更なる実施態様では、前記誘導因子による前記プロモーターの誘導は延長した流加期の後に行われ、好ましくは前記誘導因子による前記プロモーターの誘導は、培地中での前記細菌宿主の培養の開始後、好ましくは１５時間〜１８時間後、より好ましくは１６時間〜１７時間後、最も好ましくはおよそ１６．５時間後の１４時間〜２０時間に行われ、好ましくは前記誘導因子による前記プロモーターの誘導はＯＤ６００がおよそ８０〜９０、好ましくはおよそ８５に達したときに行われる。
【００５３】
本発明の一実施態様では、前記誘導因子による前記プロモーターの誘導はＯＤ６００が２５〜６０、好ましくは２５〜５５、より好ましくは３０〜５０、最も好ましくは３０〜４０の値に達したときに行われる。特定の好適な実施態様では、前記誘導因子による前記プロモーターの誘導は、ＯＤ６００が３５であるときに行われる。
本発明の他の実施態様では、前記誘導因子による前記プロモーターの誘導は延長した流加期後に行われ、そのときＯＤ６００は６０〜１２０、好ましくは７０〜１１０、より好ましくは８０〜１００、最も好ましくは８０〜９０の値に達する。特定の好適な実施態様では、ＯＤ６００がおよそ８５、好ましくは８５である延長した流加期の後に誘導が開始される。
【００５４】
ＩＰＴＧによる誘導：本発明の一実施態様では、誘導因子による前記プロモーターの誘導はＩＰＴＧの添加によって達成され、好ましくは培養物への主要な炭素源の供給は続けられる。ＩＰＴＧは細菌宿主によって代謝されないので、誘導は、所望の濃度に対するＩＰＴＧの単回の添加によって達成することができる。これに対して、誘導は、培養物へのＩＰＴＧの連続流動によって達成されてもよい。好適な実施態様では、誘導は、単回の添加又は連続流動でのＩＰＴＧの添加によって達成され、前記バッチ培養物への主要な炭素源の供給は、主要な炭素源の流速を一定にするか、漸増するか又は指数関数的に増やして続ける。
【００５５】
ラクトースによる誘導：上述の通り、タンパク質発現の誘導は、培養液へのラクトースの添加によって達成することができる。本発明の一実施態様では、生産期の初めに、基質を指数関数的に与えるのを中断し、培養物に１００〜３００ｇ／Ｌ、好ましくは１００ｇ／Ｌのラクトースを唯一の炭素源(ラクトース流加培地)として含有する一定流量の誘導培地を供給する。好ましくは、ラクトースの一定流速は流加期の終わりの基質の流速におよそ等しい。
本発明の好適な実施態様では、誘導因子による前記プロモーターの誘導はラクトースの添加によって達成され、好ましくは前記ラクトースは前記バッチ培養物に連続流量で供給され、好ましくは前記主要な炭素源のバッチ培養物への供給は続けられない。
培養物へのラクトースの添加により、β-ガラクトシダーゼ活性は増加し、ラクトースはｔａｃプロモーターを誘導するアロラクトースに変換され、組み換えキャプシドの発現が開始される。同時に、アロラクトースはさらに代謝され、細菌宿主のエネルギーの供給に寄与する。したがって、誘導培地の供給速度と細胞によるラクトース消費の平衡は発現速度を決定する。本カスケードに関与する酵素反応により、封入体の形成が最小になる方法で本方法を制御することができる。誘導方法の経過は、例えばβ-Ｇａｌアッセイキット(Invitrogen、K1455-01)によって、培養物中のβ-ガラクトシダーゼ活性を決定することによってモニターすることができる。 
本発明のより好適な実施態様では、誘導因子による前記プロモーターの誘導はラクトースの添加によって達成され、好ましくは該ラクトースは、前記バッチ培養物に連続流量で供給され、そして好ましくは前記バッチ培養物への主要な炭素源の供給が続けられる。
【００５６】
誘導因子の非連続的な添加：前記誘導因子は、生産期の初めに単回添加する、又は、生産期の間に２、３回続けて添加することによって非連続的に培養物に加えられてもよい。ＩＰＴＧは細菌宿主によって代謝されないので、誘導因子がＩＰＴＧである場合に、誘導因子の非連続的な添加、特に単回添加が特に適している。したがって、典型的及び好ましくは、代謝されるＩＰＴＧの置換は、生産期の間、必要でない。一実施態様では、誘導因子による前記プロモーターの誘導は、前記誘導因子、好ましくはＩＰＴＧ又はラクトース、最も好ましくはＩＰＴＧの前記培地への添加によって行われ、前記誘導因子は生産期の初めに単回添加されることによってすぐにおよそその終濃度にまで添加され、好ましくは前記主要な炭素源の前記バッチ培養物への供給が続けられる。好適な実施態様では、誘導因子による前記プロモーターの誘導は前記培地へのＩＰＴＧの添加によって行われ、該ＩＰＴＧは単回添加されることによってすぐにおよそその終濃度にまで添加され、好ましくは前記主要な炭素源の前記バッチ培養物への供給が続けられる。別法として、誘導因子による前記プロモーターの誘導は、前記誘導因子、好ましくはＩＰＴＧ又はラクトース、最も好ましくはラクトースの前記培地への添加によって行われ、この添加は生産期の間に数回、好ましくは１〜５、より好ましくは２〜４、最も好ましくは３回行われ、好ましくは前記主要な炭素源の前記バッチ培養物への供給が続けられる。
【００５７】
誘導因子の連続的な添加(供給)：好ましくは、前記誘導因子は、連続流量で、好ましくは生産期の全体にわたって培地に添加される。ラクトースは細菌宿主によって代謝され、ゆえに生産期の間のラクトースの連続的な添加によりプロモーターの十分な誘導が起こる培地中のラクトース濃度を維持することができるので、誘導因子の連続的な添加はラクトースに特に適している。好適な実施態様では、誘導因子による前記プロモーターの誘導は該誘導因子による前記バッチ培養物への供給により行われ、好ましくは前記誘導因子はＩＰＴＧ又はラクトース、最も好ましくはラクトースであり、該供給は連続的な流量で行われ、さらに好ましくは該供給は生産期の全体にわたって実施される。
【００５８】
誘導因子及び主要な炭素源の共供給(Co-feeding)：組み換えタンパク質の発現はエネルギー需要工程である。細菌による誘導因子の過剰な消費とその結果から生じる発現速度の低下によって引き起こされうる収率損失を防ぐために、培養物に、生産期の間、基質、好ましくは主要な炭素源を更に添加することができ、誘導因子及び／又は主要な炭素源の流速は一定又は漸増、好ましくは一定である。生産期の間、培養物に漸増流速で基質を添加する場合、その流速は指数関数的速度で増加することが好ましい。
【００５９】
一定流速による共供給：好適な実施態様では、誘導因子による前記プロモーターの誘導は前記誘導因子及び前記主要な炭素源の前記バッチ培養物への共供給により行われ、前記誘導因子は好ましくはＩＰＴＧ又はラクトース、最も好ましくはラクトースであり、前記主要な炭素源はグルコース又はグリセロール、好ましくはグリセロールであり、前記誘導因子、好ましくはラクトースと前記主要な炭素源、好ましくはグリセロールはある流速で前記バッチ培養物に共供給され、該流速は好ましくはおよそ一定である。更なる好適な実施態様では、前記流速は、増殖期の終了時とおよそ同じ速度で前記バッチ培養物へ前記主要な炭素源が供給されるように選択する。なお更なる好適な実施態様では、前記誘導因子、好ましくはラクトースと前記主要な炭素源、好ましくはグリセロールは、同じ培地に含有される(共同流加培地)。更なる好適な実施態様では、共同流加培地はある流速で前記バッチ培養物へ供給され、該流速は好ましくはおよそ一定であり、さらに好ましくは該流速は、増殖期の終了時とおよそ同じ速度で前記バッチ培養物へ前記主要な炭素源が供給されるように選択する。とても好適な実施態様では、前記誘導因子はラクトースであり、前記主要な炭素源はグリセロールであり、該ラクトース及び該グリセロールは、前記バッチ培養物におよそ２:１から１:４(w/w)の比率で共供給される。
本発明の更なる好適な実施態様では、ラクトース及び前記主要な炭素源、好ましくはグリセロールは、前記バッチ培養物に０:１から１:０(w/w)、好ましくはおよそ２：１からおよそ１:４(w/w)、より好ましくはおよそ１：１から１:３(w/w)、最も好ましくはおよそ１:３(w/w)の比で共供給される。好適な実施態様では、ラクトースと主要な炭素源、好ましくはグリセロールの比率は１:１(w/w)である。他の好適な実施態様では、ラクトース及び主要な炭素源、好ましくはグリセロールの比率は１:３(w/w)である。より好適な実施態様では、前記の共同流加培地はおよそ２００ｇ／Ｌのラクトースとおよそ２００ｇ／Ｌのグリセロールを含んでなる。さらにより好適な実施態様では、共同流加培地は、およそ１００ｇ／Ｌのラクトースとおよそ３００ｇ／Ｌのグリセロールを含んでなる。
【００６０】
漸増流速による共供給：別法として、誘導因子による前記プロモーターの誘導は、該誘導因子と前記主要な炭素源を前記バッチ培養物へ共供給することによって行われ、該誘導因子は好ましくはＩＰＴＧ又はラクトース、最も好ましくはラクトースであり、前記主要な炭素源はグルコース又はグリセロール、好ましくはグリセロールであり、該誘導因子、好ましくはラクトースと該主要な炭素源、好ましくはグリセロールがある流速で前記バッチ培養物に共供給され、この流速が増加しており、該流速は直線的又は指数関数的な特徴で増加してもよく、好ましくは開始流速は、増殖期の終了時とおよそ同じ速度で前記バッチ培養物へ該主要な炭素源が供給されるように選択する。
さらにこれに対して、誘導因子による前記プロモーターの誘導は、該誘導因子及び前記主要な炭素源を前記バッチ培養物に共供給することによって行われ、該誘導因子は好ましくはＩＰＴＧ又はラクトース、最も好ましくはラクトースであり、前記主要な炭素源はグルコース又はグリセロール、好ましくはグリセロールであり、該誘導因子、好ましくはラクトースが、第一の流速で前記バッチ培養物に供給され、該主要な炭素源、好ましくはグリセロールが、第二流速で前記バッチ培養物に供給され、該第一流速は一定又は漸増、好ましくは一定であり、該第二流速は一定又は漸増、好ましくは漸増であり、好ましくは該第二流速の開始値は、増殖期の終了時とおよそ同じ速度で前記バッチ培養物へ該主要な炭素源が供給されるように選択する。とても好適な実施態様では、前記誘導因子はラクトースであり、前記主要な炭素源はグリセロールであり、該ラクトース及び該グリセロールは、前記バッチ培養物におよそ２:１から１:４(w/w)の比率で共供給される。
【００６１】
ＣＤＷ、ＣＷＷ又はＯＤ６００によって定まる細菌宿主の増殖は、増殖期の間に低く、経過時間につれて減少する増殖速度で、生産期の間、続く。本発明の更なる実施態様では、誘導因子による前記プロモーターの誘導は、前記誘導因子、好ましくはラクトースと前記主要な炭素源、好ましくはグリセロールを、漸増流速、好ましくは流速の成長性増加が培養物の実際の増殖速度に適合する流速で、前記バッチ培養物に共供給することによって行われる。更なる好適な実施態様では、前記誘導因子、好ましくはラクトースと前記主要な炭素源、好ましくはグリセロールは同じ培地中に含有され(共同流加培地)、好ましくは該培地(共同流加培地)中でのラクトースとグリセロールとの比率はおよそ０:１から１:０(w/w)、好ましくはおよそ２：１からおよそ１:４(w/w)、より好ましくはおよそ１：１から１:３(w/w)の範囲であり、最も好ましくはその比はおよそ１:３(w/w)である。好適な実施態様では、ラクトースと主要な炭素源、好ましくはグリセロールの比率は１:１(w/w)である。他の好適な実施態様では、ラクトース及び主要な炭素源、好ましくはグリセロールの比率は１:３(w/w)である。より好適な実施態様では、前記培地(共同流加培地)はおよそ２００ｇ／Ｌのラクトースとおよそ２００ｇ／Ｌのグリセロールを含んでなる。さらにより好適な実施態様では、誘導培地は、およそ１００ｇ／Ｌのラクトースとおよそ３００ｇ／Ｌのグリセロールを含んでなる。
【００６２】
本発明の一実施態様では、誘導因子による前記プロモーターの誘導は、前記誘導因子、好ましくはラクトースと前記主要な炭素源、好ましくはグリセロールを前記バッチ培養物に共供給することによって行われ、該誘導因子、好ましくはラクトースと該主要な炭素源、好ましくはグリセロールは、前記培養物に別々に供給される個々の培地に含まれる。
生産期終了時に、細胞は遠心によって回収される。一般的に、細胞は誘導開始後のおよそ５時間に回収され、そのとき最終的なＯＤ６００は９０〜１３０に達する。さらに、生産期の延長によりＯＤ６００とＣＷＷ値がより高くなり、したがって、発現コンストラクトの収率がさらに向上する。
回収された細胞は貯蔵バッファに再懸濁して、更なる処理のために−８０℃で保存されてもよい。
【００６３】
細胞の総タンパク質含有量は、ＳＤＳ ＰＡＧＥ又はＬＤＳ ＰＡＧＥによる細胞溶解とタンパク質標準物質との比較の後に決定される。可溶性タンパク質の含有量はＨＰＬＣで測定される。発現されたキャプシドタンパク質の同定はウェスタンブロッティングで測定される。集合体化ＶＬＰの濃度は、サイズ排除クロマトグラフィによって分析することができる(実施例１８)。ＶＬＰは、クロマトグラフィ法による溶解した細胞から調整して精製することができる。
大容量への本発明の方法のスケールアップはわずかに変更するのみで可能である。本発明は、１００ｍＬから６０００Ｌの範囲の培養物容量を包含する。好適な培養物容量は、４０〜１００Ｌ、最も好ましくはおよそ５０Ｌである。特により大きな培養物容量には播種に用いられる前培養物の容量がより多く必要であることは、当業者に明らかである。例えば、前培養は、前培養容量を増やしながら２又はそれ以上の工程で行ってもよい。大きな培養物容量中のプラスミド保持率を確認するために、種菌として用いる前培養に抗生物質を含ませ、選択負荷を維持してもよい。さらに、所望の最終細胞密度に達するために必要である世代数を減らすことによってプラスミド保持率を改善することができることは、当業者に周知である。したがって、高い細胞密度を有するバッチ培養物及び前培養物を播種することは有益である。好適な実施態様では、前培養の最初のＯＤ６００は０．１〜０．４、好ましくはおよそ０．３である。
【００６４】
一実施態様では、前記方法はさらに、前記培養工程の前に、前記細菌宿主を培地に導入する工程を含んでなり、該導入は播種によって行われ、該播種は抗生物質、好ましくはカナマイシンを含んでなる培地中で前記細菌宿主を増殖させる工程を含んでなる前培養工程において産生される。より好ましくは、前記前培養方法は、抗生物質、好ましくはカナマイシンを含んでなる第一培地中で前記細菌宿主を増殖させ、細菌宿主を含んでなる該第一培地を第二培地により０．１〜０．４、好ましくはおよそ０．３のＯＤ６００にまで希釈し、このとき該第二培地は、基本的に抗生物質を含まず、さらに該細菌宿主を培養する工程を含んでなる。
さらに、本発明の発酵方法は、培養物中の細菌に十分な酸素を供給することを必要とする好気性工程であることは、当業者に明らかである。細菌宿主の酸素需要は、とりわけ、細胞密度の増加と増殖速度の増加につれて増える。細菌宿主の総容積及び酸素需要に従い、酸素は、例えば、撹拌すること及び／又は空気で通気することによって供給することができる。あるいはまた、酸素は、純酸素又は任意の他のガス、好ましくは空気と純酸素との混合物による通気によって供給することができ、このときの純酸素は技術的な目的に共通して有用な技術的に純粋なガスを指す。さらに、発酵槽の圧力を増やすことによって培地中の酸素分圧を増やすと、細菌宿主に酸素を供給することができるかもしれない。
【００６５】
本発明の好適な実施態様では、前記細菌宿主の培養及び／又は前記バッチ培養への供給及び／又は誘導因子による前記プロモーターの誘導は、該細菌宿主に、好ましくは空気による通気、最も好ましくは一定流量での空気による通気によって酸素が供給され、好ましくは該酸素が方法全体を通して、最も好ましくは誘導期、増殖期及び生産期を通して供給され、さらに好ましくは酸素分圧が培養培地中でモニターされ、細菌宿主はあるいは又はさらに純酸素による通気によって酸素が供給され、好ましくは培地中の酸素分圧(ｐＯ２)が一定の閾値以下である、条件下にて行われる。特異的に好適な実施態様では、ｐＯ２の前記閾値は、０％〜６０％、好ましくは１０％〜５０％、より好ましくは２０％〜４５％の範囲であり、最も好ましくは前記閾値はおよそ４０％である。
上記の酸素供給、好ましくは空気及び／又は純酸素にて通気して好適なｐＯ２を維持することは、本発明の方法において好ましくは２Ｌ以上の培養物容量に通常応用される。記載の様式での酸素による通気は、スケールアップ過程、最も好ましくは４０〜１００Ｌ以上に特に好適である。
【００６６】
したがって、本発明の一実施態様は、自己集合化によってＶＬＰを形成することができるバクテリオファージの組み換えキャプシドタンパク質又はその変異体ないしはその断片の発現方法であって、a) 発現プラスミドを細菌宿主に導入する、このとき、該発現プラスミドは発現コンストラクトを含んでなり、該発現コンストラクトは(i) 該組み換えキャプシドタンパク質又はその変異体ないしはその断片をコードする第一ヌクレオチド配列、と(ii) ラクトースによって誘導可能なプロモーターを含んでなるものであり；b) 主要な炭素源を含んでなる培地中で該細菌宿主を培養する；このとき、該培養がバッチ式培養で、該プロモーターがｌａｃＩによって抑制される条件下で行われ、該ｌａｃＩが該細菌宿主によって過剰発現されるものであり；c) 該バッチ培養物に該主要な炭素源を与える；そして、d) 誘導因子により該プロモーターを誘導する、このとき該バッチ培養物への該主要な炭素源の供給を続ける；ここで、本方法のb)からd)の工程を通して、酸素が少なくともおよそ１０％〜５０％、好ましくはおよそ４０％の培地にｐＯ２によって該細菌宿主に供給され、さらに好ましくは該酸素が、空気、純酸素又はその両方、好ましくは空気と純酸素の混合物によって供給される、という工程を含んでなる方法である。
【実施例】
【００６７】
実施例１  発現プラスミドｐＴａｃ-ｎＳＤ-Ｑβ-ｍｕｔ(配列番号：１)のクローニング法
大腸菌ＲＮＡバクテリオファージＱβのコートタンパク質コード化遺伝子(Ｃ)を、プラスミドｐＳＤＱβ-ｍｕｔ(配列番号：３３)から増幅する。プラスミドは、１３３ａａのＱβコートタンパク質(ＣＰ)及び３２９ａａのリードスルータンパク質(Ａ１をコードする遺伝子Ｃの配列を含有する。リードスルーを予防するために、NCBI GenBank Acc. No. M99030 TGAACA(配列番号：３１)に記載のヌクレオチド４４５−４５０を、配列TAATGA(配列番号：３２)に置換する。
プラスミドｐＳＤＱβ-ｍｕｔからのコートタンパク質コード化遺伝子ＣをＰＣＲによって増幅する。内部のＥｃｏＲI部位及び合成シャイン-ダルガーノ(ＳＤ、配列番号：４)配列を有するオリゴヌクレオチドQβ-FOR3/2(配列番号：３４)をＱβ ＣＰ遺伝子の５'末端にアニールさせる。オリゴヌクレオチドQblang-REV2/2(配列番号：３５)は内部のＨｉｎｄIII部位を含有し、遺伝子Ｃの非翻訳領域の３'末端に結合する。１０５４ｂｐの増幅されたＰＣＲ断片は、NCBI GenBank Acc. No. M99039のヌクレオチド４６−１０６２(上記のヌクレオチド変化を除く)及び合成ＳＤ配列を含む。ＰＣＲ断片を制限酵素ＨｉｎｄIII／ＥｃｏＲIにて消化して、結果として生じた１０３６ｂｐ断片を修飾ｐＫＫ２２３-３ベクター(Pharmacia, NCBI GenBank Acc. No.: M77749、配列番号：２７)のＨｉｎｄIII／ＥｃｏＲI制限酵素部位に挿入する。この修飾ｐＫＫ２２３-３ベクターにおいて、アンピシリン耐性遺伝子はベクターｐＵＣ４Ｋ(Pharmacia, NCBI GenBank Acc. No.: X06404、配列番号：３７)のカナマイシン耐性遺伝子によって置換されている。
【００６８】
ベクターｐＴａｃ-ｎＳＤＱβ-ｍｕｔ(配列番号：３３)は、ベクターｐＴａｃＱβ-ｍｕｔとシャイン‐ダルガーノ配列が異なる。このシャイン‐ダルガーノ配列(ｎＳＤ、配列番号：３)は、プラスミドｐＴａｃＱβ-ｍｕｔからのＰＣＲによってＱβコートタンパク質-コード化遺伝子Ｃを増幅することによって導入される。内部のＥｃｏＲI部位及び対応する合成シャイン-ダルガーノ(ｎＳＤ)配列を有するオリゴヌクレオチドｎＳＤＱβ-ｍｕｔＥｃｏＲＩｆｏｒ(配列番号：３６)をＱβ ＣＰ遺伝子の５'末端にアニールさせる。オリゴヌクレオチドQblang-REV2/2(配列番号：３５)は内部のＨｉｎｄIII部位を含有し、遺伝子Ｃの非翻訳領域の３'末端に結合する。１０５４ｂｐの増幅されたＰＣＲ断片は、NCBI GenBank Acc. No. M99039のヌクレオチド４６−１０６２(上記のヌクレオチド変化を除く)及び合成ｎＳＤ配列を含む。ＰＣＲ断片を制限酵素ＨｉｎｄIII／ＥｃｏＲIにて消化し、結果として生じる１０３６ｂｐ断片を、修飾ｐＫＫ２２３-３ベクター(Pharmacia, NCBI GenBank Acc. No.: M77749、配列番号：２７)のＨｉｎｄIII／ＥｃｏＲI制限酵素部位に挿入する。この修飾ｐＫＫ２２３-３ベクターにおいて、アンピシリン耐性遺伝子はベクターｐＵＣ４Ｋ(Pharmacia, NCBI GenBank Acc. No.: X06404、配列番号：３７)のカナマイシン耐性遺伝子によって置換されている。
【００６９】
実施例２  発現プラスミドｐＴａｃ-ｎＳＤ-ＡＰ２０５(配列番号：３０)のクローニング法
アシネトバクター属バクテリオファージＡＰ２０５のコートタンパク質コード化遺伝子をプラスミドｐＡＰ２０５-５８から増幅する。このプラスミドは、バクテリオファージＡＰ２０５の１３１-アミノ酸キャプシドタンパク質をコードしているコートタンパク質遺伝子の配列を含有する(NCBI GenBank Acc. No. AF334111のヌクレオチド１９０８−２３０３に対応する)。
コートタンパク質コード化遺伝子はＰＣＲによって増幅する。内部のＥｃｏＲI部位及び合成シャイン-ダルガーノ(ｎＳＤ)配列を有するオリゴヌクレオチドｎＳＤＡＰ２３８-ＥｃｏＲＩｆｏｒ(配列番号：３８)をコートタンパク質遺伝子の５'末端にアニールさせる。オリゴヌクレオチドＡＰ２３８ＨｉｎｄIIIｒｅｖ(配列番号：３９)は内部のＨｉｎｄIII部位を含有し、コートタンパク質遺伝子の３'末端に結合する。このオリゴヌクレオチドは、コートタンパク質の天然に生じる停止コドンの後に第二停止コドンを導入する。４３８ｂｐの増幅されたＰＣＲ断片は、NCBI GenBank Acc. No. AF334111のヌクレオチド１９０８−２３０３及び合成ｎＳＤ配列を含む。ＰＣＲ断片を制限酵素ＨｉｎｄIII／ＥｃｏＲIにて消化して、結果として生じた４２０ｂｐ断片を修飾ｐＫＫ２２３-３ベクター(Pharmacia, NCBI GenBank Acc. No.: M77749、配列番号：２７)のＨｉｎｄIII／ＥｃｏＲI制限酵素部位に挿入する。この修飾ｐＫＫ２２３-３ベクターにおいて、アンピシリン耐性遺伝子はベクターｐＵＣ４Ｋ(Pharmacia, NCBI GenBank Acc. No.: X06404、配列番号：３７)のカナマイシン耐性遺伝子によって置換されている。
【００７０】
実施例３  ｔａｃプロモーター及びｎＳＤの制御下におけるＱβ ＣＰの発現
大腸菌株ＲＢ７９１にプラスミドｐＴａｃ-ｎＳＤ-Ｑβ-ｍｕｔ(配列番号：１)を形質転換した。クローンを振とうフラスコ中で増殖させた。各々のフラスコは、カナマイシン(２５μｇ／ｍＬ)を有する１００ｍＬのＲ４０培地(主要な培養液、Ｈｙｐｅｐ７４５５、グリセロール、実施例５を参照)を含有し、０．３の開始ＯＤ６００の終夜培養物を播種した。振とうフラスコを、３０℃で４時間、２２０回転数／分で撹拌しながら培養した(４から５のＯＤ６００)。誘導は０．５％のラクトースによって４時間かけて行った。タンパク質産生はＳＤＳ-ＰＡＧＥにて測定した。ゲルは、Ｑβ ＣＰとみられる強力なタンパク質のバンドを示した。
【００７１】
実施例４  ｔａｃプロモーター及びＳＤ対ｎＳＤの制御下におけるＡＰ２０５ ＣＰの発現
９クローンのｐＴａｃ-ｎＳＤ ＡＰ２０５(配列番号：３０)及び６クローンのｐＴａｃ-ＳＤ ＡＰ２０５を振とうフラスコにてスクリーニングした。ｐＴａｃ-ＳＤ ＡＰ２０５(配列番号：４０)はｐＴａｃ-ｎＳＤ ＡＰ２０５と同一であるが、配列番号：３のシャイン‐ダルガーノ配列の代わりに配列番号：４のシャイン‐ダルガーノ配列を含んでなる。各々のフラスコは、カナマイシン(２５μｇ／ｍＬ)を有する５０ｍＬのＲ４０培地(主要な培養液、Ｈｙｐｅｐ７４５５、グリセロール、実施例５を参照)を含有し、０．３(ｐＴａｃ-ｎＳＤＡＰ２０５の場合)又は０．４(ｐＴａｃ-ＳＤＡＰ２０５の場合)の開始ＯＤ６００の終夜培養物を播種した。振とうフラスコを、３０℃で４時間、２２０回転数／分で撹拌しながら培養した。誘導は０．５％のラクトースによって４時間かけて行った。タンパク質産生はＳＤＳ-ＰＡＧＥにて測定した。すべての試験したクローンについて、ＡＰ２０５ ＣＰの発現は、ｐＴａｃ-ＳＤＡＰ２０５よりｐＴａｃ-ｎＳＤＡＰ２０５によるものが有意に強かった。
【００７２】
実施例５  培養物の組成物
培養液は、表１に示すように構成した。
表１：培養培地の組成物。
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【００７３】
実施例６  流加培養(２Ｌスケール)過程におけるＱβ ＣＰの発現
発酵過程は、２ディスク撹拌器(Φ６ｃｍ)、整流装置(３×１６ｃｍ)、ｐＨ−、ｐＯ２−及び温度調節を備えたバイオリアクター(Applikon ５Ｌ皿状底) 、及び発酵槽ソフトウェアBioXpert バージョン２．２２にて行った。
プラスミドｐＴａｃ-ｎＳＤ-Ｑβ-ｍｕｔを形質転換した５μＬのＲＢ７９１のクリオ培養物を、５０ｍＬの培地Ｒ４０(２５μｇ／ｍＬカナマイシン)を含有する１００ｍＬのエーレンマイヤーフラスコに播種し、３０℃で１４時間、２２０回転数／分で振とうしながら終夜培養した。１４時間後、６．０のＯＤ６００値に達した。回分発酵のために、２Ｌの培地(Ｒ４０)をバイオリアクターにポンプで送りこんだ。表２に培養パラメーターを列記する。
表２：バッチ期の間のパラメーター設定ポイント。
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【００７４】
バイオリアクターに１００ｍＬの種菌を播種した。２ｍＬの試料を採取し、ＯＤ６００を測定して、１４０００回転数／分で遠心分離した。ペレット及び上清を分離して、更なる分析のために冷凍した。バイオマス濃度[ｇ／Ｌ]は、以下の方程式を用いて算出した：
ＯＤ６００×０．４５[ｇ×Ｌ−１×ＯＤ６００−１]＝バイオマス[ｇ／Ｌ]。 
総タンパク質含有量中のＱβ含有量の割合は以下の通りに算出し、大腸菌バイオマスの５０％がタンパク質であると仮定した：
バイオマス[ｇ×Ｌ−１]／２＝総タンパク質[ｇ×Ｌ−１] 
Ｑβ[ｇ×Ｌ−１]／総タンパク質[ｇ×Ｌ−１]×１００＝Ｑβ／総タンパク質[％]。
【００７５】
バッチモードに続く流加モードには流加期が加えられる。流加期では、基質は、一定の特徴に従って反応器内の細胞に供給される。流加(供給)特徴は、選択された増殖速度μ、グリセロールに対する収率係数バイオマス(Ｙｘ／グリセロール)、容量(Ｖｆ)、及び流加基質濃度中の基質の濃度(ｃｆ)に依存する。供給は以下の方程式を使用して算出した：
供給方程式
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【００７６】
較正パラメーターａ及びｂの測定のために、ポンプ較正を行った。さらに、供給ボトルを有する供給チューブを供給ポンプに固定して、ポンプを７、１４及び２１％のポンプパフォーマンスにて作動させた。時間当たりの汲み出された流加(供給)容量を記録した。汲み出された供給溶液[ｍＬ／時]に対するポンプパフォーマンス[％]の関係の結果として生じる線図において、傾斜(ａ)及びＹ軸切片(ｂ)を決定した。バイオリアクターでは、表３のパラメーターを流加培養のために設定した。
表３：バイオリアクターにおける流加培養のためのパラメーター。
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およそ７時間の経過時間に達した後(バッチの終わり)に、供給ポンプを自動的に作動させた。更に７時間の培養の後、ＯＤ６００が５５〜６０に達したときに、流加培地(バイオマス増殖のために)を誘導培地Ｒ４２(バイオマス増殖及び誘導のために)に交換した。５時間の後、Ｒ４２の流加を中止し、培養物を遠心にて回収した。
【００７７】
経過パラメーターの分析：
通常、以下の経過パラメーターを分析した。ｐＯ２、ｐＨ、温度及び撹拌器速度は、経過時間の全体にわたってオンラインで計量した。６００ｎｍの光学濃度はオフラインで測定した。β-ガラクトシダーゼ活性の測定は、β-Ｇａｌアッセイキット(Invitrogen, cat. no. K1455-01)を用いて行った。活性は、ｍＬ  ＯＤ６００＝１．０当たりの単位として明記した。ｍＬの細菌懸濁液(ＯＤ６００＝１．０)及び毎分当たりに加水分解されるオルソ-ニトロフェニル-β-Ｄ-ガラクトピラノシド(ＯＮＰＧ)の量をｎｍｏｌとして定める。蓄積した産物をＳＤＳ-ＰＡＧＥにて分析し、総タンパク質含有量(可溶性及び不溶性タンパク質)を決定して、ＨＰＬＣ分析法を用いて、可溶性分画を測定した。大腸菌の破壊は、超音波ホモジナイザー(Bandlin Sonoplus, HD2070)を用いて、溶解バッファ(５０ｍＭ グルコース、２５ｍＭ トリス／ＨＣｌ(ｐＨ８)、１５ｍＭ ＥＤＴＡ(ｐＨ８．０))において行った。５０のＯＤ６００を有する２５０μＬの細菌懸濁液を１４０００回転数／分にて１０分間遠心分離した。ペレットを、２５０μＬの溶解バッファに再懸濁して(ボルテックス)、室温に５分間置いた。その後、細胞を、１０％のデバイスパフォーマンスの超音波にて２０秒間破壊し(細胞は氷上に置く)、次いで細胞懸濁液を１４０００回転数／分で１０分間遠心分離した。次いで、上清(可溶性タンパク質)をＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣにて分析した。
【００７８】
誘導前及び生産期の終了時(５時間の誘導後)の試料をバイオリアクターから採取し、ＯＤ５．０に正規化したＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分析されるＱβ形成を分析した。培養終了後、１．９Ｌの培養物を回収した。遠心分離後、３つの別々の反応実験において以下の細胞ペレットを得た：１) 最終ＯＤ６００  ８４：１９４ｇのＣＷＷ；２) 最終ＯＤ６００  ８８：２００ｇのＣＷＷ；３) 最終ＯＤ６００  ８６：２０１ｇのＣＷＷ。
実験１及び２のプラスミド保持率は、誘導開始時に１００％及び回収時１００％であった。ＳＤＳ-ＰＡＧＥによるＱβ ＣＰ標準物質との比較に基づいて、収率はおよそ５ｇ／ＬのＱβ ＣＰであることがおおよそ推定された。ＨＰＬＣ分析はおよそ６ｇ／ＬのＱβ ＶＬＰの濃度に達した。
【００７９】
実施例７  炭素源及び細菌株の選択
炭素源としてのグルコース及びグリセロールを比較した。これらの炭素源に対する細菌株ＤＨ２０及びＲＢ７９１の各々の増殖動向を試験するために、振とうフラスコ実験を、グルコース(Ｒ２７)含有培地及びグリセロール(Ｒ４０)含有培地にて行った。両培地に２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した。各々の培養は０．３の開始ＯＤ６００で始めた。０．５％のラクトースを加えることによって誘導を行った。最大比増殖速度(μｍａｘ)及び収率係数(Ｙｘ／ｓ)を決定して、表４に列挙した。グルコース及びグリセロールの両方に対してＲＢ７９１の方が増殖が速かった。さらに、結果として生じる収率係数も高かった。グルコースは最大比増殖速度(μｍａｘ)をより高くするが、収率係数(Ｙｘ／ｓ)はグリセロールの方が高かった。
表４：グルコース及びグリセロールに対するＲＢ７９１及びＤＨ２０による培養実験の最大比増殖速度及び収率係数。
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【００８０】
実施例８  至適温度の決定
生成物形成に対する温度の影響を調査した。２つの振とうフラスコ培養物を播種して、３０℃で２２０回転数／分にてインキュベートした。５のＯＤ６００に達した後、培養物をラクトースにて誘導した。その後、１つの培養物は、３７℃で培養し続け、他方の培養物は２３℃で培養を続けた。ＳＤＳ-ＰＡＧＥの結果から、誘導後４時間及び５時間後の発現レベルは３７℃で誘導した培養物の方が高いことが明らかとなった。１９時間の培養物の誘導は、２３℃で誘導した培養物においてより高いＱβレベルを示した。
【００８１】
実施例９  ラクトース及びグリセロールの共供給(Co-Feed)による誘導
２０％のグリセロール及び２０％のラクトースの供給溶液を構成し(Ｒ４２)、誘導開始時に実施例６に記載のように発酵に用いた。図１は、経過時間の全体にわたって関連する経過パラメーターの概要を示す。発現は、およそ５５のＯＤ６００の１３．５時間目に誘導した。誘導の際に、供給ポンプ速度は一定に設定した。グリセロールは流加により蓄積しなかった。ラクトースは４ｇ／Ｌまで蓄積し、その後減少しはじめた。β-ガラクトシダーゼ活性は１０Ｕ／ｍＬまで上昇して、その後減少した。以前の発酵実験ａ) 誘導開始時、供給(流加)なしの単回ラクトースパルスとして投与するラクトース；ｂ) グリセロールなしの連続ラクトース供給と比較して、実験ａ)及びｂ)の４時間後と比較して、活性は７Ｕ／ｍＬ高く、２時間後にすでに最大活性に達成した。
【００８２】
実施例１０  プラスミド保持率
プラスミド保持率に対する以下の操作条件の効果は、実施例６に記述される方法で試験した：１) 前培養開始容量、２) 前培養中のカナマイシン、３) ３７℃対３０℃の増殖及び／又は誘導。結果を表５に要約する。前培養は細胞貯蔵バイアルのうちの５μＬ容量にて開始した。少しの容量を播種して終夜前培養の増殖を行った。QT0103_F8の前培養は２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有するのに対して、QT0103_F7の前培養は全くカナマイシンを含有しない。両発酵は３０℃で行い、５時間誘導した。５時間の誘導の前後のプラスミド保持率から判断して、カナマイシンを有する前培養を添加するとプラスミド保持率に陽性の影響を及ぼす。プラスミド保持率は５時間の誘導の前後で９８％のままであった。それに対して、カナマイシンが前培養から排除されている場合、プラスミド保持率は８０％の値にしか達さなかった。その後の実験QT0203_F7のために、また前培養を５μＬで開始し、カナマイシン含有培地において増殖させた。その後のバイオリアクター中の発酵は、初めから３７℃で操作した。３７℃の操作によりプラスミド安定性に対して有害効果が生じた。プラスミド保持率が誘導の前には９９％であったが、５時間の誘導後に０％に低下した。前培養が短ければ、すなわち世代数が少なければ５時間の誘導後のプラスミド保持率が改善されるかどうかを試験するために、一連の前培養を解凍した細胞貯蔵バイアルからの３００μＬで開始し、カナマイシンを含まない培地で増殖させた。すべての実験に対して２つの発酵槽は３０℃で操作した。さらに２つの発酵糟を、細胞増殖のために初めは３０℃で操作して、その後生産期のために３７℃に切り替えた。結果として生じるプラスミド安定性は、誘導の前及び５時間後にすべて１００％であった。
【００８３】
表５：前培養中の世代数、前培養中のカナマイシンの有無及び３７℃での増殖及び／又は誘導に関して異なる操作条件下で得られた誘導前及び誘導の５時間後でのプラスミド保持率の概要。
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【００８４】
実施例１１  誘導時点における変化
基本的に実施例６に記載の方法において、指数関数的な供給特徴をバイオリアクターの播種の７時間後に始まるように設定した。標準的な条件下において、予定される誘導の時間は１４時間経過時であった。最終細胞密度に対する誘導時点の変化の効果を試験するために、１つの培養物は１３．５時間目(指数関数的な供給の６．５時間目となる)に、他方の培養物は１４．５時間目(指数関数的な供給の７．５時間目となる)に誘導した。一定の１４時間の時点に誘導された１つの培養物をコントロールとした(指数関数的供給の７時間目)。結果を表６に要約する。細胞密度は流加が長くなるにつれて増加した。最終的なＣＷＷに利用できるデータポイントの線形回帰分析から判断して、比例関係があるようである(ｒ２＝０．９２)。
表６：誘導時点における変化：ＯＤ６００及びＣＷＷに関する最終細胞密度に対する効果。
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【００８５】
実施例１２  回収時点における変化
基本的に実施例６に記載の方法における培養物の回収を手作業で行った。標準的な条件下において、予定される回収時間は１９時間経過時であった。「回収」なる操作は、バイオリアクター操作の手動破壊(manual ending)を伴う。最終細胞密度に対する回収時点の変化の効果を試験するために、１つの培養物を１８．８時間目(誘導の４．８時間目になる)に回収し、他方の培養物を１９．５時間目(誘導の５．５時間目になる)に回収した。一定の１９時間の時点に回収された１つの培養物をコントロールとした(誘導の５時間目)。結果を表７にまとめる。細胞は誘導されながらも増殖するので、細胞密度は誘導の長さが長くなるにつれて増加した。
表７：回収時点における変化：ＯＤ６００及びＣＷＷに関する最終細胞密度に対する効果。
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【００８６】
実施例１３  温度の効果
基本的に実施例６に記載の方法における発酵温度の効果を、５つの異なる温度設定ポイントで６つの発酵を行うことによって調査した。結果を表８にまとめる。最終細胞密度は、３０℃で最適となる発酵温度に影響を受けた。
表８：ＯＤ６００及びＣＷＷに関する最終細胞密度に対する異なる温度設定ポイントの結果の概要。
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【００８７】
実施例１４  スケールアップ発酵(５０Ｌ)
実施例６に記載の方法を５０Ｌの容量にまでスケールアップして、２Ｌの反応容量バイオリアクターシステムからより大きな容量のスケールアップ能を評価した。スケールアップした方法に関する重要な経過パラメーターを表９にまとめる。
表９：５０Ｌのバイオリアクターの経過パラメーター。
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＊バイオリアクター播種の時間との相対
【００８８】
２つの前培養拡張工程が必要であった。第一段階において、２Ｌの方法のために定着するように細胞を増殖させた(実施例６)。この処置の後、細胞を、各々７５０ｍＬの培地を含む２つの５０００ｍＬの振とうフラスコ培養に分けた。さらに５時間の増殖を行った。５０Ｌのバイオリアクターの培養は、２Ｌのシステムと同じ時間プロファイルで行った(実施例６)。誘導開始時のＯＤ６００は４６であり、最終ＯＤ６００は１２８であった。プラスミド保持率は誘導前に１００％であり、培養終了時には９８％であった。培養終了時の培地中のＱβ ＣＰタンパク質の濃度は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥを用いて８ｇ／Ｌとおよそ推定された。Ｑβの総量はこのリアクター実験ではおよそ３００ｇと推定された。
【００８９】
実施例１５  延長した指数関数的供給の効果
実施例６又は１４に従って行われた発酵のための指数関数的流加期は７時間であった。この時間以後、細胞は誘導のための密度に達し、誘導の間、最終細胞密度として目標とされるおよそ１００〜１３０の最大ＯＤ６００にまで増加した。最終ＯＤ６００、最終ＣＷＷ、最終ＣＤＷ、誘導開始時及び回収時のプラスミド保持率並びに培養終了時のＱβ濃度を、実施例６及び１４、好ましくは実施例１４に記載のように行ったリアクター実験について決定し、このときの指数関数的な流加期を１１時間まで、好ましくは１０時間まで延長した。
【００９０】
実施例１６  生産の間の供給増加の効果
実施例９によりグリセロールが生産期の間に蓄積しないことが示された。このことから、生産が誘導培地の供給速度によって制限されるかもしれないことが示唆される。最終ＯＤ６００、最終ＣＷＷ、最終ＣＤＷ、誘導開始時及び回収時のプラスミド保持率並びに培養終了時のＱβ濃度に対する誘導培地の延長した供給速度の効果を、実施例６及び１４、好ましくは実施例１４に記載のように行ったリアクター実験において決定し、このときの産生の間の供給速度を増加した。あるいは又は加えて、流加培地中のラクトース及びグリセロールの比率は、高グリセロール及び低ラクトース濃度へ移行した。
【００９１】
実施例１７  Ｑβ ＣＰのＨＰＬＣ分析
Ｑβ ＣＰを以下の通りにＨＰＬＣシステムによって評価した：Ｑβ ＣＰを含有する試料を、１０ｍＭ １,４-ジチオ-ＤＬ-トレイトールを含有する１×反応バッファ(５０ｍＭ トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンバッファｐＨ８．０)にて適切に希釈し、サーモミキサー中で５０℃で１５分インキュベートした。インキュベーションの後、試料を遠心分離し、上清をＨＰＬＣ分析まで２℃〜１０℃で保存した。１０〜１００μＬの試料を注入した。
Ｑβは、５０℃で熱平衡したＣ４逆相カラム、３００Å、５μｍ、４．６×１５０ｍｍ、Vydac Inc., Hesperia, USA (Cat. No. 214TP5415)から溶出した後に２１５ｎｍにて検出したＨＰＬＣピークに回帰させた公知のＱβ標準物質の回帰曲線によって定量化した。システム全体の流速は、移動相Ｂの以下の勾配を有する移動相Ａ(０．１２％トリフルオロ酢酸を含む水)及び移動相Ｂ(０．１２％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル)からなる１ｍＬ／分であった：０〜２分 ４０％で一定、２〜８分 ５０％への線形増加、８〜１０分 ５０％で一定、１０〜１０．１分 ４０％への線形減少及び１０．１〜１２分 ４０％で一定。
【００９２】
実施例１８  分析的サイズ排除クロマトグラフィによるＱβ ＶＬＰの決定
分析的サイズ排除クロマトグラフィによるＱβ粒子の分析は、リン酸緩衝食塩水(２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２)で平衡化したTskgelG5000 PWXL-カラム(１０μｍ、７．８×３００ｍｍ、TosoH Biosep；Cat.-No. 08023)を用いて行った。溶出は、リン酸緩衝食塩水にて０．８ｍＬ／分で２０分間のアイソクラチック勾配によって行った。Ｑβ濃度は、２６０ｎｍで検出されるＨＰＬＣピーク領域に回帰した公知のＱβ標準物質の回帰曲線から決定した。
【００９３】
実施例１９  延長した指数関数的供給の効果
実施例６又は１４に従って行われた発酵のための指数関数的流加期は７時間であった。この時間以後、細胞は誘導のための密度に達し、誘導の間、最終細胞密度として目標とされるおよそ１００〜１３０の最大ＯＤ６００にまで増加した。最終ＯＤ６００、最終ＣＷＷ、誘導前及び回収時のプラスミド保持率並びに培養終了時のＱβ濃度を、実施例６及び１４、好ましくは実施例１４に記載のように行ったリアクター実験について決定し、このときの指数関数的な流加期を１２時間まで延長した。さらに、誘導供給におけるグリセロールとラクトースの濃度はそれぞれ３００ｇ／Ｌと１００ｇ／Ｌに変更した。結果を表１０にまとめる。
【００９４】
表１０：培養終了時のＯＤ６００及びＣＷＷ、誘導前及び培養終了時のプラスミド保持率、並びにピーク酸素マスフロー。培養は、異なる継続時間の指数関数的な供給で行った。
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ＬＤＳ-ＰＡＧＥ分析によると、１２時間の指数関数的供給による培養を除くすべての培養物中の特定のＱβ濃度は同じであった。絶対的なＱβ収率及び酸素消費に関する最適条件は、９．５時間の指数関数的供給であることが明らかとなった。したがって、方法は、９．５時間の指数関数的流加期で行うことが好ましい。
【００９５】
実施例２０  スケールアップした発酵(５０Ｌ)
実施例６に記載の方法であって、実施例１９に記載のように３００ｇ／Ｌ グリセロールと１００ｇ／Ｌ ラクトースによる９．５時間の指数関数的流加期を有する方法を、５０Ｌの容量にまでスケールアップして、２Ｌの反応容量バイオリアクターシステムからより大きな容量のスケールアップ能を評価した。スケールアップした方法に関する重要な経過パラメーターを表１１にまとめる。
表１１：５０Ｌのスケールに対する経過パラメーター
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＊バイオリアクター播種の時間との相対
【００９６】
およそ同じ細胞密度をより大きなリアクターに播種するために前培養手順を変更する必要があった。５０Ｌのバイオリアクターの培養は、実施例１９に記載のように、２Ｌのスケールに適した時間プロファイルで行った。６つの培養物の最終細胞生重量は１８８ｇ／Ｌ±９であった。プラスミド保持率は、培養終了時に９７．３％±１．４であった。培養終了時の培地中のＱβ ＣＰタンパク質の濃度はＣ４逆相ＨＰＬＣによって測定すると(実施例１７)、１０．８ｇ／Ｌ±０．３であった。Ｑβ ＣＰの総量は１つの５０Ｌ実験では５４０ｇであった。およそ２回濃縮したバイオマスの粗抽出物を、Ｑβ ＣＰ及びＱβ ＶＬＰについて分析した(実施例１８)。Ｑβ ＣＰの濃度は１９．１ｇ／Ｌ±０．４(Ｃ４逆相ＨＰＬＣ)であり、Ｑβ ＶＬＰの濃度は１８．８ｇ／Ｌ±１．１であった。したがって、発酵方法のＶＬＰ-収率は、回収時におよそ９〜１１ｇ／Ｌの発酵ブロスであることが推定される。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】２Ｌの培養物におけるＲＢ７９１中のｐＴａｃ-ｎＳＤ-Ｑβ-ｍｕｔ(配列番号：１)による発酵性質。生産期中の同時供給は２０％のグリセロール及び２０％のラクトースを含有する培地にて行った。グリセロール濃度[ｇ／Ｌ](●)；ラクトース濃度[ｇ／Ｌ](▲)；β-Ｇａｌ活性[Ｕ／ｍＬ＊ＯＤ＝１](■)を示し、ＯＤ６００(◆)を経過時間[時間]に対してプロットした。
【図１】
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【配列表】
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