(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＢＣＡ１の１０５１Ｇ→Ａ（ｒｓ２２３０８０６）、ＡＢＣＣ８の３８５７Ｇ→Ａ（ｒｓ１７９９８５９）、ＡＧＴの−６Ｇ→Ａ（ｒｓ５０５１）、ＡＰＯＡ５の−１１３１Ｔ→Ｃ（ｒｓ６６２７９９）、ＡＰＯＢのＴ→Ｃ（Ｖａｌ５９１Ａｌａ）（ｒｓ６７９８９９）、ＡＰＯＥの４０７０Ｃ→Ｔ（ｒｓ７４１２）、３９３２Ｔ→Ｃ（ｒｓ４２９３５８）、ＣＤ１４の−２６０Ｃ→Ｔ（ｒｓ２５６９１９０）、ＣＥＴＰのＣ→Ｔ（ｉｎｔｒｏｎ  １）（ｒｓ７０８２７２）、ＥＮＰＰ１の９７Ａ→Ｃ（ｒｓ１０４４４９８）、ＥＰＨＸ２のＧ→Ａ（Ａｒｇ２８７Ｇｌｎ）（ｒｓ７５１１４１）、ＧＪＡ４の１０１９Ｃ→Ｔ（ｒｓ１７６４３９１）、ＬＩＰＣの−２５０Ｇ→Ａ（ｒｓ２０７０８９５）、ＬＴＡの８０４Ｃ→Ａ（ｒｓ１０４１９８１）、ＰＤＥ４ＤのＴＡＡＡ→−（３’−ＵＴＲ）（ｒｓ３８３９２１９）、ＳＥＲＰＩＮＥ１の６６８４Ｇ→５Ｇ（ｒｓ１７９９７６８）及びＶＡＭＰ８のＡ→Ｇ（ｒｓ１０１０）の全ての遺伝子多型を検出することを特徴とする日本人における高コレステロール血症のリスク検出法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質代謝異常の遺伝的リスク検出法等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
脂質代謝異常は、遺伝的要因および環境的要因の相互作用によって起こる多因子性疾患である。環境的要因としては、高脂肪および高カロリーの食事、運動不足などがある（非特許文献１）。遺伝子連鎖解析（非特許文献２−４）および候補遺伝子解析（非特許文献５−８）によって、脂質代謝異常との連鎖が示唆されるいくつかの染色体領域および候補遺伝子が特定されている。しかしながら、脂質代謝異常の遺伝要因については、未だ十分に解明されていない。更に、ライフスタイルおよび環境要因における集団間の相違と、遺伝的要因を考慮し、各集団において、脂質代謝異常に関連する遺伝子多型を精査することが重要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、上記の事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、脂質代謝異常について、遺伝的リスクを判断するための一材料を得るための遺伝子検出法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、脂質代謝異常に関し、５,４２１人の日本人について、１９５遺伝子中の２５８カ所の遺伝子多型に関する大規模研究である。
脂質代謝異常は、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、低ＨＤＬコレステロール血症、高ＬＤＬコレステロール血症の状態を含むが、いずれの症状もアテローム性動脈硬化の重要なリスク因子である。我々は、これらの各状態のそれぞれと遺伝的変異との関係を調査した。本研究の目的は、脂質代謝異常に関与する遺伝子多型を同定し、この知見に基づいて、ある者に対して脂質代謝異常を予防するための有用な情報を与えることである。
【０００５】
上記課題を解決するための第１の発明に係る脂質代謝異常のリスク検出法は、ＡＢＣＡ１の１０５１Ｇ→Ａ、ＡＢＣＢ１のＴ→Ｇ、ＡＢＣＣ６の３８２６Ｇ→Ａ、ＡＢＣＣ８の３８５７Ｇ→Ａ、ＡＣＡＴ２の４１Ａ→Ｇ、ＡＤＩＰＯＱの６２Ｇ→Ｔ、ＡＤＩＰＯＲ１のＣ→Ｇ、ＡＧＴの−６Ｇ→Ａ、ＡＧＴＲ２の３１２３Ｃ→Ａ、ＡＫＡＰ１０の２０７３Ａ→Ｇ、ＡＰＯＡ５の−１１３１Ｔ→Ｃ、−３Ａ→Ｇ、５５３Ｇ→Ｔ、ＡＰＯＢのＣ→Ｔ、Ｔ→Ｃ、ＡＰＯＣ３の１１００Ｃ→Ｔ、ＡＰＯＥの４０７０Ｃ→Ｔ、−２１９Ｇ→Ｔ、３９３２Ｔ→Ｃ、ＣＤ１４の−２６０Ｃ→Ｔ、ＣＥＴＰの−６２９Ｃ→Ａ、Ｃ→Ｔ、ＣＰＢ２のＴ→Ｃ、ＣＹＰ３Ａ５の６９８６Ａ→Ｇ、ＣＹＰ７Ａ１の−２０４Ａ→Ｃ、ＥＮＰＰ１の９７Ａ→Ｃ、ＥＰＨＸ２のＧ→Ａ、ＦＡＢＰ２の２４４５Ｇ→Ａ、ＧＪＡ４の１０１９Ｃ→Ｔ、ＩＴＧＢ２の１３２３Ｃ→Ｔ、ＬＩＰＣの−２５０Ｇ→Ａ、ＬＰＬの１５９５Ｃ→Ｇ、ＬＴＡの８０４Ｃ→Ａ、ＭＭＰ１の−５１９Ａ→Ｇ、ＭＴＰの−４９３Ｇ→Ｔ、Ｐ２ＲＹ１２の７４４Ｔ→Ｃ、ＰＣＳＫ９のＡ→Ｇ、ＰＤＥ４ＤのＴＡＡＡ→−、Ｃ→Ｔ、ＰＳＭＡ６の−８Ｃ→Ｇ、ＳＥＲＰＩＮＥ１の６６８ ４Ｇ→５Ｇ、ＴＨＢＤの２１３６Ｃ→Ｔ、ＴＨＢＳ２の３９４９Ｔ→Ｇ、ＴＮＦの−２３８Ｇ→Ａ、−８５０Ｃ→Ｔ、ＵＴＳ２の３４７Ｇ→Ａ、ＶＡＭＰ８のＡ→Ｇのうちの少なくとも１個または２個以上の遺伝子多型と、性別、ＢＭＩとを評価因子とし、各評価因子のオッズ比を乗じた発症リスクを計算し、この発症リスクを平均と分散またはパーセント区分に応じて３つ以上の複数の群を作成し、各群に応じて発症のリスクを検出することを特徴とする。
このとき、群を形成するときに使用する分散については、統計上の分散値、或いは標準偏差値（ＳＤ）、パーセントによる区分などを用いることができる。なお、遺伝子多型については、必ずしも上記４６個には限られず、これら４６個の多型のうちの任意の１個−４５個、或いは本明細書中で示される上記４６個の他の多型を含む４７個以上で実施することもできる。
【０００６】
本明細書中において、多型の記載方法は、次の通りである。原則として、各遺伝子について、「多型が生じている位置、データベースに登録されている塩基（Ａ：アデニン、Ｇ：グアニン、Ｃ：シトシン、Ｔ：チミン）→多型塩基」の順で記載する。例えば、「ＡＢＣＡ１の１０５１Ｇ→Ａ」は、ＡＢＣＡ１の遺伝子について、１０５１位のＧがＡとなっている多型を意味している。また、場所の指定がない多型（例えば、ＡＤＩＰＯＲ１のＣ→Ｇ）については、表１−表６に記載のｄｂＳＮＰのアクセス番号から、その内容を容易に理解することができる。
なお、ＡＢＣＡ１の１０５１Ｇ→Ａについては、ｄｂＳＮＰのｒｓ番号（ｒｓ２２３０８０６）を見ると、順方向（forward strand）に読んでＧ／Ａ多型として記録されているが、逆方向（reverse strand）で読むとＣ／Ｔ多型となる。多くの文献について、このＳＮＰは「１０５１Ｇ／Ａ」多型として記載されているので、本明細書においても上記の通りに記載する。
【０００７】
一般に多型は、集団（例えば、日本人集団、西洋人集団など）が異なると、その種類・頻度が異なることが知られている。このため、日本人以外の集団において、脂質代謝異常との関係が指摘されている多型であっても、必ずしも日本人集団においてそのような関連が認められるわけではない。このため、従来の報告については、国または疾患が異なる場合には、必ずしも日本人における多型および脂質代謝異常との関連が裏付けられるわけではない。
【０００８】
また、上記発明において、脂質代謝異常が高コレステロール血症の場合には、ＡＢＣＡ１の１０５１Ｇ→Ａ、ＡＢＣＣ８の３８５７Ｇ→Ａ、ＡＧＴの−６Ｇ→Ａ、ＡＰＯＡ５の−１１３１Ｔ→Ｃ、ＡＰＯＢのＴ→Ｃ、ＡＰＯＥの４０７０Ｃ→Ｔ、３９３２Ｔ→Ｃ、ＣＤ１４の−２６０Ｃ→Ｔ、ＣＥＴＰのＣ→Ｔ、ＥＮＰＰ１の９７Ａ→Ｃ、ＥＰＨＸ２のＧ→Ａ、ＧＪＡ４の１０１９Ｃ→Ｔ、ＬＩＰＣの−２５０Ｇ→Ａ、ＬＴＡの８０４Ｃ→Ａ、ＰＤＥ４ＤのＴＡＡＡ→−、ＳＥＲＰＩＮＥ１の６６８ ４Ｇ→５Ｇ、ＶＡＭＰ８のＡ→Ｇのうちの少なくとも１個または２個以上の遺伝子多型を検出することが好ましい。
【０００９】
また、脂質代謝異常が高トリグリセリド血症の場合には、ＡＣＡＴ２の４１Ａ→Ｇ、ＡＰＯＡ５の−１１３１Ｔ→Ｃ、５５３Ｇ→Ｔ、ＡＰＯＣ３の１１００Ｃ→Ｔ、ＡＰＯＥの３９３２Ｔ→Ｃ、ＣＹＰ３Ａ５の６９８６Ａ→Ｇ、ＣＹＰ７Ａ１の−２０４Ａ→Ｃ、ＩＴＧＢ２の１３２３Ｃ→Ｔ、ＬＰＬの１５９５Ｃ→Ｇ、ＭＭＰ１の−５１９Ａ→Ｇ、ＭＴＰの−４９３Ｇ→Ｔ、ＰＣＳＫ９のＡ→Ｇ、ＰＤＥ４ＤのＣ→Ｔ、ＳＥＲＰＩＮＥ１の６６８４Ｇ→５Ｇ、ＴＨＢＤの２１３６Ｃ→Ｔのうちの少なくとも１個または２個以上の遺伝子多型を検出することが好ましい。
【００１０】
また、脂質代謝異常が低ＨＤＬコレステロール血症の場合には、ＡＢＣＢ１のＴ→Ｇ、ＡＤＩＰＯＱの６２Ｇ→Ｔ、ＡＧＴの−６Ｇ→Ａ、ＡＧＴＲ２の３１２３Ｃ→Ａ、ＡＰＯＡ５の−３Ａ→Ｇ、−１１３１Ｔ→Ｃ、５５３Ｇ→Ｔ、ＡＰＯＢのＣ→Ｔ、ＡＰＯＥの−２１９Ｇ→Ｔ、３９３２Ｔ→Ｃ、ＣＤ１４の−２６０Ｃ→Ｔ、ＣＥＴＰの−６２９Ｃ→Ａ、ＬＩＰＣの−２５０Ｇ→Ａ、ＬＰＬの１５９５Ｃ→Ｇ、ＰＳＭＡ６の−８Ｃ→Ｇ、ＳＥＲＰＩＮＥ１の６６８ ４Ｇ→５Ｇ、ＴＮＦの−８５０Ｃ→Ｔ、ＵＴＳ２の３４７Ｇ→Ａのうちの少なくとも１個または２個以上の遺伝子多型を検出することが好ましい。
【００１１】
また、脂質代謝異常が高ＬＤＬコレステロール血症の場合には、ＡＢＣＣ８の３８５７Ｇ→Ａ、ＡＤＩＰＯＲ１のＣ→Ｇ、ＡＧＴの−６Ｇ→Ａ、ＡＧＴＲ２の３１２３Ｃ→Ａ、ＡＫＡＰ１０の２０７３Ａ→Ｇ、ＡＰＯＢのＴ→Ｃ、ＡＰＯＥの４０７０Ｃ→Ｔ、３９３２Ｔ→Ｃ、ＣＰＢ２のＴ→Ｃ、ＦＡＢＰ２の２４４５Ｇ→Ａ、ＬＰＬの１５９５Ｃ→Ｇ、Ｐ２ＲＹ１２の７４４Ｔ→Ｃ、ＴＨＢＳ２の３９４９Ｔ→Ｇ、ＴＮＦの−２３８Ｇ→Ａのうちの少なくとも１個または２個以上の遺伝子多型を検出することが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、脂質代謝異常について、遺伝的リスクおよび発症リスクを判断するための検出法等が提供される。この発明を用いることにより、脂質代謝異常に対する予防が可能となり、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・寝たきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
次に、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
【００１４】
＜試験方法＞
研究対象
研究対象は、２つの独立な母集団からなる５,４２１名であった。集団Ａは４,００２名から構成され、研究参加施設（岐阜県立岐阜病院、岐阜県立多治見病院、岐阜県立下呂温泉病院、弘前大学病院、黎明郷リハビリテーション病院）に、２００２年１０月から２００７年３月までに、様々な症状または毎年の健康診断のために来院した者であった。集団Ｂは１,４１９名から構成され、群馬県における人口に基づく将来の老化および加齢障害の研究のため地域社会に暮らす高齢者であった。
研究プロトコールはヘルシンキ宣言に従い、三重大学医学部、弘前大学医学部、岐阜県国際バイオ研究所、東京都老人総合研究、および参加病院の倫理委員会によって承認された。各参加者に対しては書面によるインフォームドコンセントを得た。
【００１５】
血中脂質濃度の測定
静脈血の採取は、早朝において各患者が一晩に渡って絶食し、脂質濃度低下のための適当な治療を受ける前に行った。血液サンプルは、４℃にて、１６００×ｇ、５分間遠心し、血清を分離した。血清は、脂質濃度を測定するまで−３０℃にて保存した。血清中の全コレステロール（非特許文献３６）、トリグリセリド（非特許文献３７）、ＨＤＬコレステロール（非特許文献３８）の濃度を周知方法によって測定した。ＬＤＬコレステロール濃度についても周知の方法（非特許文献３９）、すなわちフリーデワルドの公式（Friedewald formula）に基づき、「血中ＬＤＬコレステロール濃度＝血中全コレステロール濃度−血中ＨＤＬコレステロール濃度−（０.２×血中トリグリセリド濃度）。但し、血中トリグリセリド濃度が４.４ｍｍｏｌ／Ｌ以下の場合」として求めた（非特許文献４０、４１）。
【００１６】
多型の選択
公開データベースの使用、および本発明者の鋭意検討により、１９５個の候補遺伝子を選択した。本発明者は、従来の知見およびデータベースに基づき、これら１９５個の遺伝子について、２５８個の多型を選択した。これらの多型の多くは、プロモーター領域、エクソン、イントロンのスプライシングの供与部位或いは受容部位に多く位置しており、多型の結果として、コードされたタンパク質の機能または発現に変化を与える可能性があるものであった。これら２５８個の多型は、下記表１−表６に示した。なお、表中においては、左欄から順に、座位（Locus）、遺伝子名（Gene）、簡易記載（Symbol）、多型（Polymorphism）、多型データベース登録番号（dbSNP）を示している。なお、多型データベース登録番号が無い場合には、ＮＣＢＩ遺伝子バンクに登録されている番号を示した。各多型の野生型および変異型対立遺伝子は、情報源のものを用いた。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
【表２】
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【００１９】
【表３】
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【００２０】
【表４】
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【００２１】
【表５】
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【００２２】
【表６】
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【００２３】
遺伝子多型の検出方法
７ｍＬの静脈血を５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ(ジナトリウム塩)を含むチューブに採取し、ゲノムＤＮＡをキット(ゲノミックス社製)によって分離した。２５８個の多型の遺伝子型は、ＰＣＲと配列特異的オリゴヌクレオチドプローブをサスペンジョン・アレイ・テクノロジー（ＳＡＴ：Ｌｕｍｉｎｅｘ  １００）と組み合わせて使用する方法によって決定した（Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社）。プライマー、プローブ、その他の条件は、下表７に示した。表７は左から順に、遺伝子記（Gene Symbol）、多型（Polymorphism）、センスプライマー（Sense primer）、アンチセンスプライマー（Antisense primer）、プローブ１（Probe 1）、プローブ２（Probe 2）、アニーリング温度（Annealing）、およびサイクル数（Cycles）を示した。また、詳細な方法については、既報のもの（非特許文献４２）を基本として、適宜に増幅条件を変えて行った。なお、脂質代謝異常との関連が認められなかった多型を検出するための条件については記載を省略した。
【００２４】
【表７】
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【００２５】
ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法
方法の詳細については、非特許文献４２に記載の通りである。以下には、この方法の概要について説明する。
図１には、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００フローサイトメトリーで検出するマイクロビーズの微細構造と特徴を示した。マイクロビーズ（図中の符号（Ａ））は、直径が約５.５μｍ程度であり、ポリスチレン製である。ビーズ表面には、特異的な塩基配列を認識するプローブが結合されている。各ビーズには、一種類のプローブが結合されている。このマイクロビーズには、赤色色素と赤外色素との割合を変化させることにより、図中の符号（Ｂ）に示すように、最大で１００種類のものを混合した状態で、各ビーズの同定が行えるようになっている。複数種類のプローブを備えたマイクロビーズ（但し、各マイクロビーズには一種類のプローブのみ）を適当な割合で混合し、１００ビーズ／μＬとなるようにしたビーズミックスを調製した（図中の符号（Ｃ））。
【００２６】
図２には、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法の手順の概要を示した。
＜増幅反応（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）＞
目的とするＤＮＡを増幅するＰＣＲ反応には、５’末端をビオチンでラベルしたプライマーを用いた。１.５ｍＭ塩化マグネシウムを含む１ｘＰＣＲ溶液（５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.３）、２％ＤＭＳＯ、０.２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、及び０.１μＭ−１０μＭプライマーセットを混合し、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（５０Ｕ／ｍＬ）と５０ｎｇ−１００ｎｇのゲノムＤＮＡを加えて２５μＬとした。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分間処理の後、９４℃で２０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３０秒間の伸長を１サイクルとし、これを５０サイクル繰り返した。機器としてＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いた。
【００２７】
＜ハイブリダイゼーション（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）＞
増幅したＤＮＡを変性した後、ビーズミックスとハイブリダイズさせた。９６ウエルプレートの各ウエルに、５μＬの増幅反応後のＰＣＲ増幅液、５μＬのビーズミックス、及び４０μＬのハイブリダイズ用緩衝液（３.７５Ｍ  ＴＭＡＣ、６２.５ｍＭ  ＴＢ（ｐＨ８.０）、０.５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０.１２５％  Ｎ−ラウロイルザルコシン）を添加し、全量５０μＬとした。この混合液を添加した９６ウエルプレートについて、９５℃で２分間の変性、及び５２℃で３０分間のハイブリダイゼーションを行った（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラーを用いた。）。
図２中には、増幅したＤＮＡを認識するプローブを有するビーズ（１）のみが、ＤＮＡと結合する様子が示されている。
【００２８】
＜ストレプトアビジン−フィコエリスリン反応（ＳＡ−ＰＥ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）＞
次に、上記ビーズミックス−ＤＮＡをＳＡ−ＰＥと反応させた。ハイブリダイゼーション反応の後、各ウエルに１００μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（１ｘＰＢＳ（ｐＨ７.５）、０.０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を添加し、１０００ｘｇで５分間の遠心を行い、上清を取り去ることで、マイクロビーズを洗浄した。各ウエルに残ったマイクロビーズに、それぞれ７０μＬのＳＡ−ＰＥ溶液（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにより、市販品（Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社製）を１００倍希釈したもの）を添加し混合した後、５２℃で１５分間の反応を行った（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラーを用いた。）。
図２中には、ビーズ（１）のプローブにのみビオチン化ＤＮＡが結合しているので、そのビオチンにＳＡ−ＰＥが結合する様子が示されている。
【００２９】
＜測定（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）＞
次に、反応後のサンプルはＬｕｍｉｎｅｘ１００を用いて、ビーズ種類の同定と、そのビーズにＰＥが結合しているか否かを判定した。測定は２種類のレーザを使用して行い、ビーズの種類は６３５ｎｍレーザにより同定し、ＰＥ蛍光は５３２ｎｍレーザを用いて定量した。オリゴビーズに結合したＤＮＡは１測定あたり各々のビーズを最低５０個ずつ測定し、定量されたＰＥの蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を使用した。
図２中には、各ビーズ（１）−（３）が同定され、かつビーズ（１）にのみＰＥが測定されたことから、ビーズ（１）に結合させたプローブが認識するＤＮＡが増幅された様子が示されている。
【００３０】
統計解析
臨床データは、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、低ＨＤＬコレステロール血症、高ＬＤＬコレステロール血症の患者群とコントロール群との間で、対応のないスチューデントt検定により比較した。質的データは、カイ二乗検定によって比較した。対立遺伝子頻度は遺伝子カウント法によって概算し、ハーディ・ワインベルク平衡にあてはまるかどうかを判断するためにカイ二乗検定を使った。遺伝子型分布は、２つの群から構成される遺伝モデルと高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、低ＨＤＬコレステロール血症、高ＬＤＬコレステロール血症の患者群とコントロール群との間でカイ二乗検定(２ｘ２)によって比較した。遺伝モデルは、優性モデルは「変異型のホモ接合体とヘテロ接合体の結合群」対「野生型のホモ接合体」（ＢＢ＋ＡＢ対ＡＡ）、劣性モデルは「変異型のホモ接合体」対「野生型のホモ接合体とヘテロ接合体の結合群」（ＢＢ対ＡＡ＋ＡＢ）である。
【００３１】
危険率（ｐ値）が５％未満（ｐ＜０.０５）で脂質代謝異常の各疾患と関連した多型の遺伝モデルは、疾患の発症に関係があると思われる要因（交絡因子）として、他の背景因子（年齢（age：連続値）、性別（sex：女性＝０、男性＝１））とともに、強制投入法による多項ロジスティック回帰分析により解析した。このとき、背景因子および各遺伝子型を独立変数とし、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、低ＨＤＬコレステロール血症、高ＬＤＬコレステロール血症を従属変数とした。各遺伝子型は、優性、劣性遺伝モデルに従って評価し、ｐ値、オッズ比、および９５％信頼区間を計算した。
【００３２】
上記多項ロジスティック回帰分析により、危険率（ｐ値）が５％未満（ｐ＜０.０５）で脂質代謝異常の各疾患と関連した多型の遺伝モデルまたは他の背景因子の効果を確認するために、ステップワイズ変数増加法により解析を行った。このとき、背景因子に関しては、さらに肥満指数(body mass index：BMI：連続値)、喫煙状態(smoking：非喫煙者＝０、喫煙者＝１)を独立変数として追加し、解析を行った。対象の選択基準は組み入れ規準（inclusion criteria）を０.２５とし、除外規準（external validity）を０.１とした。
【００３３】
上記解析の結果、危険率（ｐ値）が３％未満（ｐ＜０.０３）であった背景因子および多型の遺伝モデルを脂質代謝異常の各疾患と有意に関連する因子として選択した。同じ多型で優性モデル（ＢＢ＋ＡＢ対ＡＡ）と劣性モデル（ＢＢ対ＡＡ＋ＡＢ）の両者のｐ値が３％未満であった場合は、優性モデルを採用した。
【００３４】
脂質代謝異常と遺伝モデルまたは他の背景因子の多重比較の結果を得る際は、危険率５％未満（ｐ＜０.０５）は統計的に有意であると見なし、ステップワイズ変数増加法による解析では危険率３％未満（ｐ＜０.０３）を統計的に有意であると見なした。統計的有意性は、両側検定によって試験した。統計解析は、ＳＰＳＳ  １３.０（エス・ピー・エス・エス株式会社製）によって実行した。
【００３５】
＜試験結果＞
５,４２１名の研究対象、集団Ａおよび集団Ｂに関する背景データを表８に示した。表には、左欄より順に、特徴（Characteristic）、被験者集団Ａ（Subject panel A）、および被験者集団Ｂ（Subject panel B）を示している。また、特徴欄は、上より順に、者数（No. of subjects）、年齢（Age）、性別（男性／女性）（Sex(male/female)）、肥満指数（Body mass index）、血中総コレステロール（Serum total cholesterol）、高コレステロール者率（Hypercholesterolemia）血中トリグリセリド（Serum triglycerides）、高トリグリセリド者率（Hypertriglyceridemia）、血中ＨＤＬ−コレステロール（Serum HDL-cholesterol）、低ＨＤＬコレステロール者率（Low HDL-cholesterol）、血中ＬＤＬ−コレステロール（Serum LDL-cholesterol）、及び高ＬＤＬコレステロール者率（High LDL-cholesterol）を示している。
【００３６】
【表８】
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【００３７】
年齢、ＢＭＩ、および血中脂質濃度に関するデータは、平均±ＳＤで示した。喫煙率については、一日あたり１０本以上を吸った場合を喫煙とした。高コレステロール血症については、血中総コレステロール濃度が５.６９ｍｍｏｌ（２２０ｍｇ／ｄＬ）以上の者とした。高トリグリセリド血症については、血清トリグリセリド値が１.６５ｍｍｏｌ／Ｌ（１５０ｍｇ／ｄＬ）以上の者とした。低ＨＤＬコレステロール血症については、血清ＨＤＬコレステロール値が１.０４ｍｍｏｌ／Ｌ（４０ｍｇ／ｄＬ）未満の者とした。高ＬＤＬコレステロール血症については、血清ＬＤＬコレステロール値が３.６４ｍｍｏｌ／Ｌ（１４０ｍｇ／ｄＬ）以上の者７した。
【００３８】
高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、高ＬＤＬコレステロール血症、Ｌコレステロール血症のリスク診断を行うために必要な因子を抽出するため、前記対象集団において検査した遺伝子多型結果を優性、劣性モデルとしてカイ二乗宇検定により評価し、さらに年齢、性別、ＢＭＩ、喫煙状態を含む多項ロジスティック回帰分析を行った（詳細については後述する）。その結果、次に説明するように、脂質代謝異常に関するリスク診断を行えることが分かった。
【００３９】
＜脂質代謝異常のリスク診断システム＞
表９−表１２には、ステップワイズ変数増加法で各疾患の発生に有意（に関連した遺伝子多型群および他の背景因子（年齢、性別、ＢＭＩ）に関する詳細を示した。これらの因子は独立したものであり、オッズ比の積（かけ算）により総合的な高血圧発症リスクを予測することができる。表には、左欄より順に、因子（Variable）、ｐ値（P value）、オッズ比（９５％信頼区間）（OR(95%CI)）を示した。また、最下段には、従来の危険因子（Conventional risk factors）と、今回の研究で見出された遺伝因子（Genetic risk factors）のオッズ比を乗じた総合リスク（Total risk）を示した。
【００４０】
【表９】
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【００４１】
【表１０】
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【００４２】
【表１１】
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【００４３】
【表１２】
0005478835.tif 000013
【００４４】
＜高コレステロール血症＞
多項ロジスティック回帰分析の結果、従来の危険因子としては性別とＢＭＩが、遺伝因子としては、ＡＢＣＡ、ＡＢＣＣ８、ＡＧＴ、ＡＰＯＡ５、ＡＰＯＢ、ＡＰＯＥ、ＣＤ１４、ＣＥＴＰ、ＥＮＰＰ１、ＥＰＨＸ２、ＧＪＡ４、ＬＩＰＣ、ＬＴＡ、ＰＤＥ４Ｄ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＶＡＭＰ８の各遺伝子多型が高コレステロール血症に関連した。従来の危険因子では最小オッズ比が０.４７２で最大オッズ比が１.０６２、遺伝因子では最小オッズ比が０.１６８で最大オッズ比が９７.９３５であった。したがって、従来の危険因子と遺伝因子を総合すると、最小オッズ比が０.０７９で最大オッズ比が１０４.００７であり、１３１６倍の差が認められた。
【００４５】
＜高トリグリセリド血症＞
多項ロジスティック回帰分析の結果、従来の危険因子としては性別とＢＭＩが、遺伝因子としては、ＡＣＡＴ２、ＡＰＯＡ５、ＡＰＯＣ３、ＡＰＯＥ、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ７Ａ１、ＩＴＧＢ２、ＬＰＬ、ＭＭＰ１、ＭＴＰ、ＰＣＳＫ９、ＰＤＥ４Ｄ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＴＨＢＤの各遺伝子多型が高トリグリセリド血症に関連した。従来の危険因子では最小オッズ比が０.９８１で最大オッズ比が１.０６１、遺伝因子では最小オッズ比が０.３９５で最大オッズ比が４.０２３であった。したがって、従来の危険因子と遺伝因子を総合すると、最小オッズ比が０.３８７で最大オッズ比が４.２６８であり、１１倍の差が認められた。
【００４６】
＜低ＨＤＬコレステロール血症＞
多項ロジスティック回帰分析の結果、従来の危険因子としては性別とＢＭＩが、遺伝因子としては、ＡＢＣＢ１、ＡＤＩＰＯＱ、ＡＧＴ、ＡＧＴＲ２、ＡＰＯＡ５、ＡＰＯＢ、ＡＰＯＥ、ＣＤ１４、ＣＥＴＰ、ＬＩＰＣ、ＬＰＬ、ＰＳＭＡ６、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＴＮＦ、ＵＴＳ２の各遺伝子多型が高トリグリセリド血症に関連した。従来の危険因子では最小オッズ比が０.９７８で最大オッズ比が４.０８９、遺伝因子では最小オッズ比が０.２３０で最大オッズ比が４.８８７であった。したがって、従来の危険因子と遺伝因子を総合すると、最小オッズ比が０.２２５で最大オッズ比が１９.９８３であり、８８倍の差が認められた。
【００４７】
＜高ＬＤＬコレステロール血症＞
多項ロジスティック回帰分析の結果、従来の危険因子としては性別が、遺伝因子としては、ＡＢＣＣ８、ＡＤＩＰＯＲ１、ＡＧＴ、ＡＧＴＲ２、ＡＫＡＰ１０、ＡＰＯＢ、ＡＰＯＥ、ＣＰＢ２、ＦＡＢＰ２、ＬＰＬ、Ｐ２ＲＹ１２、ＴＨＢＳ２、ＴＮＦの各遺伝子多型が高ＬＤＬコレステロール血症に関連した。従来の危険因子では最小オッズ比が０.６３２で最大オッズ比が１.０４４、遺伝因子では最小オッズ比が０.２３５で最大オッズ比が１０８.８６２であった。したがって、従来の危険因子と遺伝因子を総合すると、最小オッズ比が０.１４９で最大オッズ比が１１３.６５２であり、７６２倍の差が認められた。
【００４８】
ステップワイズ変数増加法で各疾患の発生に有意に関連した遺伝子多型群および性別、ＢＭＩに関しては、再度強制投入法による多項ロジスティック回帰分析を行い、リスク診断を行うために必要な因子を抽出した（後の表２５−表２８に示す）。
【００４９】
本研究成果の臨床的な意義について以下に述べる。病院、クリニックまたは健診センターにおいて希望者に対して従来の危険因子と今回の遺伝因子に関する検査を行い、脂質代謝異常の発症リスクの予測を行う。多項ロジスティック回帰分析により疾患の発症に関連が認められた遺伝因子および他の交絡因子（性別、ＢＭＩ）についての検査結果から、受診者の発症確率のロジットを推定し、その分布からリスクの程度を３段階以上（例えば、５段階）に分ける。コントロール群のリスク値の大きい順に全体を５％、２０％、５０％、２０％、５％に区分し、リスク値の最も大きい５％の群をリスクが高い群、次の２０％の群をリスクがやや高い群、次の５０％の群を平均的リスクの群、次の２０％の群をリスクがやや低い群、リスク値が最も小さい５％の群をリスクが低い群とする。
実際に本研究における高コレステロール血症の分布は、リスクが高い群は１１.８％（コントロール群は４.９％）、リスクがやや高い群は３１.２％（コントロール群は２１.３％）、平均的リスクの群は４４.２％（コントロール群は４９.２％）、リスクがやや低い群は１０.８％（コントロール群は１９.３％）、リスクが低い群は１.１％（コントロール群は５.３％）であった。高トリグリセリド血症の分布は、リスクが高い群は１１.９％（コントロール群は４.７％）、リスクがやや高い群は４６.５％（コントロール群は２０.６％）、平均的リスクの群は４４.３％（コントロール群は５２.２％）、リスクがやや低い群は１０.０％（コントロール群は１８.５％）、リスクが低い群は１.４％（コントロール群は５.０％）であった。低ＨＤＬコレステロール血症の分布は、リスクが高い群は２０.１％（コントロール群は５.０％）、リスクがやや高い群は３９.２％（コントロール群は２０.０％）、平均的リスクの群は３４.８％（コントロール群は５０.０％）、リスクがやや低い群は５.５％（コントロール群は１９.９％）、リスクが低い群は０.５％（コントロール群は５.０％）であった。高ＬＤＬコレステロール血症の分布は、リスクが高い群は４.３％（コントロール群は４.３％）、リスクがやや高い群は２３.２％（コントロール群は２０.７％）、平均的リスクの群は４９.５％（コントロール群は５０.５％）、リスクがやや低い群は１８.２％（コントロール群は１９.７％）、リスクが低い群は４.８％（コントロール群は４.９％）であった。
【００５０】
結果については、医師等の有資格者の判断を含めてカウンセリングを行い、とりわけ高リスク群またはやや高リスク群に属する場合には生活習慣の改善（禁煙・飲酒の減量・食事療法即ちカロリー制限・運動療法・ストレス解消・睡眠不足解消など）を行うことにより脂質代謝異常群の一次・二次予防を積極的に推進する。特に多量の飲酒、高カロリー・高脂肪食、運動不足などの生活習慣は、一般的に脂質代謝異常群の原因と考えられているため、遺伝的に脂質代謝異常のリスクが平均より高いと予測された場合は、生活習慣の改善により脂質代謝異常のリスクを減少させるようにクライアントに説明する。特に脂質代謝異常の家族歴のある人への適用が有効である。本システムにより脂質代謝異常のオーダーメイド予防が可能になり、脂質代謝異常に起因する種々の疾患、即ち心筋梗塞、脳梗塞、腎臓病、閉塞性動脈硬化症などの予防につながる。ひいては、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止や今後の医療費削減などにつながり、医学的・社会的に大きく貢献できる。
【００５１】
＜リスク判断システム＞
次に、上記リスク判断システムを開発するに至った統計解析の結果について説明する。
カイ二乗検定により、高コレステロール血症で４７個、高トリグリセリド血症で３８個、低ＨＤＬコレステロール血症で６１個、高ＬＤＬコレステロール血症で２９個の遺伝モデルが疾患との関連を示した（ｐ＜０.０５）。詳細を表１３−表１６に示した。表においては、左欄より順に、遺伝子表記（Gene symbol）、遺伝モデル（Dominant/Recessive）、および危険率（p）を示している。
【００５２】
【表１３】
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【００５３】
【表１４】
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【００５４】
【表１５】
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【００５５】
【表１６】
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【００５６】
これらの遺伝モデルについては、各疾患との関連について更に詳細に分析した。年齢、性別を補正した多項ロジスティック回帰分析を行ったところ、次の多型において、各疾患の発生に有意に関連した（ｐ＜０.０５）。詳細を表１７−表２０に示した。表においては、左欄より順に、遺伝子表記（Gene symbol）、多型（Polymorphism）、遺伝モデル（Dominant/Recessive）、危険率（p）、オッズ比（OR）、９５％信頼区間（95% CI）をそれぞれ示している。
【００５７】
【表１７】
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【００５８】
【表１８】
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【００５９】
【表１９】
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【００６０】
【表２０】
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【００６１】
次に、各疾患に対する遺伝子型、年齢、性別に加え、背景因子としてさらにＢＭＩ、喫煙状況の影響について、ステップワイズ変数増加法により解析した。
対象の選択基準は組み入れ規準（inclusion criteria）を０.２５とし、除外規準（external validity）を０.１とした。結果を表２１−表２４に示す。表中には、左欄より順に、因子（Variable）、多型（Polymorphism）、遺伝モデル（Dominant/Recessive）、ｐ値（p value）、オッズ比（OR）、９５％信頼区間（95% CI）をそれぞれ示している。
【００６２】
【表２１】
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【００６３】
【表２２】
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【００６４】
【表２３】
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【００６５】
【表２４】
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【００６６】
上記ステップワイズ変数増加法によるロジスティック回帰分析により、危険率３％（ｐ＜０.０３）で各疾患と有意に関連した因子をリスク判断のための最終的な因子として採用した。ただし、高トリグリセリド血症におけるＡＰＯＣ３の１１００Ｃ→Ｔ多型（優性モデル：ｐ＝０.０４８）、低ＨＤＬコレステロール血症におけるＡＰＯＡ５の−３Ａ→Ｇ多型（劣性モデル：ｐ＝０.０４０）、高ＬＤＬコレステロール血症におけるＦＡＢＰ２の２４４５Ｇ→Ａ多型（優性モデル：ｐ＝０.０３１）、ＬＰＬの１５９５Ｃ→Ｇ多型（劣性モデル：ｐ＝０.０４４）に関しては、ｐ値が０.０３を超えるものの０.０５以下であり、かつ脂質代謝異常との関連が示唆されているため、解析に使用した。また、優性モデル、劣性モデルの両者がｐ＜０.０３で有意に関連した多型に関しては、変異型ホモＢＢ、ヘテロ接合体ＡＢの両者を含む優性モデルを採用した。これらの因子に関しては、強制投入法によるロジスティック回帰分析を行い、リスク判断システムに必要な数値を決定した。このとき、優性モデル、劣性モデルの両者がｐ＜０.０３で有意に関連した多型に関しては、対象者の遺伝子型が変異型ホモＢＢである場合の疾患発症リスクをより正確に判断するために、変異型ホモＢＢの（０,１）情報をダミー変数として投入した。これにより、この多型が優性モデルである対象者の場合、ＢＢの多型を持つか、ＡＢの多型を持つかにより疾患発症の確率にどの程度違いがあるかを確認することが可能となる。結果を表２５−表２８に示す。表中には、左欄より順に、因子（Variable）、多型（Polymorphism）、偏回帰係数（β）、ｐ値（p value）、オッズ比（OR）、９５％信頼区間（95% CI）をそれぞれ示している。
【００６７】
【表２５】
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【００６８】
【表２６】
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【００６９】
【表２７】
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【００７０】
【表２８】
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【００７１】
高コレステロール血症の罹患率に対し、統計的有意性が高い順に、性別（Sex）、ＡＰＯＥの４０７０Ｃ→Ｔ多型（優性モデル）、ＡＧＴの−６Ｇ→Ａ多型（優性モデル）、ＢＭＩ、ＡＰＯＥの３９３２Ｔ→Ｃ多型（優性モデル）、ＣＥＴＰのＣ→Ｔ多型（劣性モデル）、ＡＰＯＡ５の−１１３１Ｔ→Ｃ多型（劣性モデル）が有意であり（ｐ＜０.００１）、各要因が独立して高コレステロール血症に影響を与えることが分かった。同様に、高トリグリセリド血症の罹患率に対し、ＢＭＩ、性別、ＬＰＬの１５９５Ｃ→Ｇ多型（優性モデル）、ＡＰＯＡ５の−１１３１Ｔ→Ｃ多型（優性モデル）ＡＰＯＡ５の５５３Ｇ→Ｔ多型（優性モデル）、ＡＣＡＴ２の４１Ａ→Ｇ多型（劣性モデル）が、低ＨＤＬコレステロール血症の罹患率に対し、性別、ＢＭＩ、ＡＧＴの−６Ｇ→Ａ多型（優性モデル）、ＬＰＬの１５９５Ｃ→Ｇ多型（優性モデル）、ＡＰＯＡ５の５５３Ｇ→Ｔ多型（優性モデル）、ＣＥＴＰの−６２９Ｃ→Ｔ多型（劣性モデル）、ＬＩＰＣの−２５０Ｇ→Ａ多型（優性モデル）、ＡＰＯＥの−２１９Ｇ→Ｔ多型（劣性モデル）が、高ＬＤＬコレステロール血症の罹患率に対し、ＡＰＯＥの４０７０Ｃ→Ｔ多型（優性モデル）、性別、ＡＧＴＲの３１３２Ｃ→Ａ多型（優性モデル）、ＡＰＯＥの３９３２Ｔ→Ｃ多型（優性モデル）、ＡＧＴの−６Ｇ→Ａ多型（優性モデル）が有意であり（ｐ＜０.００１）、各要因が独立して疾患に影響を与えることが分かった。
【００７２】
各因子の偏回帰係数により得られるロジスティック回帰モデルより、対象集団における疾患発症確率のロジットの推定が可能となる。受診者ごとに予測されたロジットの値を低い順に並べた場合、値が大きいほど対象集団における発症リスクは高くなる。したがって、疾患との関連が示された遺伝因子およびその他の因子の検査結果から本モデルにおける順位を解析することで、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、低ＨＤＬコレステロール血症、高ＬＤＬコレステロール血症の発症リスクを推定することが可能となる。
【００７３】
＜考察＞
本発明者は、５,４２１名の日本人からなる２つの独立した集団において、１９５個の候補遺伝子中の２５８個の多型と、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、低ＨＤＬコレステロール血症、および高ＬＤＬコレステロール血症との関連を調べた。今回の大規模研究によって、（１）ＡＢＣＡ１の１０５１Ｇ→Ａ多型、ＡＢＣＣ８の３８５７Ｇ→Ａ多型、ＡＧＴの−６Ｇ→Ａ多型、ＡＰＯＡ５の−１１３１Ｔ→Ｃ多型、５５３Ｇ→Ｔ多型、ＡＰＯＢのＴ→Ｃ多型、ＡＰＯＥの４０７０Ｃ→Ｔ多型、３９３２Ｔ→Ｃ多型、ＣＤ１４の−２６０Ｃ→Ｔ多型、ＣＥＴＰの−６２９Ｃ→Ａ多型、ＥＮＰＰ１の９７Ａ→Ｃ多型、ＥＰＨＸ２のＧ→Ａ多型、ＧＪＡ４の１０１９Ｃ→Ｔ多型、ＬＩＰＣの−２５０Ｇ→Ａ多型、ＬＴＡの８０４Ｃ→Ａ多型、ＰＤＥ４ＤのＴＡＡＡ→−多型、ＳＥＲＰＩＮＥ１の６６８ ４Ｇ→５Ｇ多型、ＶＡＭＰ８のＡ→Ｇ多型が高コレステロール血症と有意に関連すること、（２）ＡＣＡＴ２の４１Ａ→Ｇ多型、ＡＰＯＡ５の−１１３１Ｔ→Ｃ多型、５５３Ｇ→Ｔ多型、ＡＰＯＣ３の１１００Ｃ→Ｔ多型、ＡＰＯＥの３９３２Ｔ→Ｃ多型、ＣＹＰ３Ａ５の６９８６Ａ→Ｇ多型、ＣＹＰ７Ａ１の−２０４Ａ→Ｃ多型、ＩＴＧＢ２の１３２３Ｃ→Ｔ多型、ＬＰＬの１５９５Ｃ→Ｇ多型、ＭＭＰ１の−５１９Ａ→Ｇ多型、ＭＴＰの−４９３Ｇ→Ｔ多型、ＰＣＳＫ９のＡ→Ｇ多型、ＰＤＥ４ＤのＣ→Ｔ多型、ＳＥＲＰＩＮＥ１の６６８４Ｇ→５Ｇ多型、ＴＨＢＤの２１３６Ｃ→Ｔ多型が高トリグリセリド血症と有意に関連すること、（３）ＡＢＣＢ１のＴ→Ｇ多型、ＡＤＩＰＯＱの６２Ｇ→Ｔ多型、ＡＧＴの−６Ｇ→Ａ多型、ＡＧＴＲ２の３１２３Ｃ→Ａ多型、ＡＰＯＡ５の−３Ａ→Ｇ多型、−１１３１Ｔ→Ｃ多型、ＡＰＯＢのＣ→Ｔ多型、ＡＰＯＥの−２１９Ｇ→Ｔ多型、３９３２Ｔ→Ｃ多型、ＣＤ１４の−２６０Ｃ→Ｔ多型、ＣＥＴＰの−６２９Ｃ→Ａ多型、ＬＩＰＣの−２５０Ｇ→Ａ多型、ＬＰＬの１５９５Ｃ→Ｇ多型、ＰＳＭＡ６の−８Ｃ→Ｇ多型、ＳＥＲＰＩＮＥ１の６６８ ４Ｇ→５Ｇ多型、ＴＮＦの−８５０Ｃ→Ｔ多型、ＵＴＳ２の３４７Ｇ→Ａ多型が、低ＨＤＬコレステロール血症と有意に関連すること、および（４）ＡＢＣＣ８の３８５７Ｇ→Ａ多型、ＡＤＩＰＯＲ１のＣ→Ｇ多型、ＡＧＴの−６Ｇ→Ａ多型、ＡＧＴＲ２の３１２３Ｃ→Ａ多型、ＡＫＡＰ１０の２０７３Ａ→Ｇ多型、ＡＰＯＢのＴ→Ｃ多型、ＡＰＯＥの４０７０Ｃ→Ｔ多型、３９３２Ｔ→Ｃ多型、ＣＰＢ２のＴ→Ｃ多型、ＦＡＢＰ２の２４４５Ｇ→Ａ多型、ＬＰＬの１５９５Ｃ→Ｇ多型、Ｐ２ＲＹ１２の７４４Ｔ→Ｃ多型、ＴＨＢＳ２の３９４９Ｔ→Ｇ多型、ＴＮＦの−２３８Ｇ→Ａ多型が高ＬＤＬコレステロール血症と有意に関連することがわかった。
【００７４】
最後に、高コレステロール血症では上記１７個の多型と性別、ＢＭＩ、高トリグリセリド血症では上記１５個の多型と性別、ＢＭＩ、低ＨＤＬコレステロール血症では上記１８個の多型と性別、ＢＭＩ、高ＬＤＬコレステロール血症では上記１４個の多型と性別の情報をロジスティック回帰式に投入し、これらの遺伝子型の組み合わせによる遺伝的リスクをＡ−Ｅの５段階で評価した。結果を表２９−表３２に示す。表中においては、左より順に、各多型の遺伝子名、遺伝子型、年齢、性別、ロジット、５段階評価を示す。５段階評価は、受診者の発症確率のロジットを推定し、その分布からリスクの程度を５段階に分ける。コントロール群のリスク値の大きい順に全体を５％、２０％、５０％、２０％、５％に区分し、リスク値の最も大きい５％の群をリスクが高い群、次の２０％の群をリスクがやや高い群、次の５０％の群を平均的リスクの群、次の２０％の群をリスクがやや低い群、リスク値が最も小さい５％の群をリスクが低い群とする。本発明においては、遺伝的リスクを５段階評価で提示することにより、発症リスクが容易に推定可能となる。
【００７５】
【表２９】
0005478835.tif 000030
【００７６】
【表３０】
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【００７７】
【表３１】
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【００７８】
【表３２】
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【００７９】
ＡＰＯＡ５、ＡＰＯＡ１、およびＡＰＯＣ３について
染色体１１ｑ２３上のアポリポプロテイン遺伝子クラスター（ＡＰＯＡ５−ＡＰＯＡ１−ＡＰＯＣ３−ＡＰＯＡ４）は、血中脂質濃度と定量的に相関する遺伝子領域である。ＡＰＯＡ５は、良く知られているＡＰＯＡ１−ＡＰＯＣ３−ＡＰＯＡ４遺伝子クラスター（非特許文献９）の約２７ｋｂ上流に位置しており、血中トリグリセリド濃度と強く相関することが知られている（非特許文献１０）。ヒトＡＰＯＡ５は、４個のエクソンによって構成されており、３６９個のアミノ酸からなるタンパク質である（非特許文献１０）。マウスを用いた実験によれば、ＡＰＯＡ５の発現量は、血中トリグリセリド濃度に大きな影響を与えることが知られている。ヒトＡＰＯＡ５を発現するトランスジェニックマウスの血中トリグリセリド濃度は、コントロール動物の血中トリグリセリド濃度の１／３であるのに対し、ＡＰＯＡ５をノックアウトしたマウスでは、血中トリグリセリド濃度はコントロールの４倍であった（非特許文献１０）。
【００８０】
ヒトＡＰＯＡ５のプロモータ領域にある−１１３１Ｔ→Ｃ多型は、多くの民族において、血中トリグリセリド濃度と独立して相関しており、このとき変異型のＣアレルは、トリグリセリド濃度を上昇させる危険因子である（非特許文献７、１０−１４）。この多型は、アジア人および白人において、トリグリセリド濃度およびＨＤＬコレステロール濃度とも関連しており、Ｃアレルを持つとＨＤＬコレステロール濃度が減少することが知られている（非特許文献７、１２−１４）。ＡＰＯＡ５の−３Ａ→Ｇ多型（非特許文献７、１５）と５５３Ｇ→Ｔ（Ｇｌｙ１８５Ｃｙｓ）多型（非特許文献１６）は、−１１３１Ｔ→Ｃ多型と連鎖不平衡の関係にあり、トリグリセリド濃度の変化と関係している。これらの知見によれば、ＡＰＯＡ５は、ヒトにおいて、トリグリセリドおよびＨＤＬコレステロールの調節に重要な役割を果たしていることがわかる。我々の研究によれば、ＡＰＯＡ５の−１１３１Ｔ→Ｃ多型、−３Ａ→Ｇ多型、および５５３Ｇ→Ｔ（Ｇｌｙ１８５Ｃｙｓ）多型が高トリグリセリド血症と低ＨＤＬコレステロール血症に関連しており、このとき変異型のＣ、Ｇ、およびＴアレルは、リスク因子であることが示された。これらのデータは、従来の知見と矛盾するものではない（非特許文献７、１２−１６）。
【００８１】
トリグリセリド代謝において、アポリポプロテインＡ−Ｖが果たす役割については、未だにわかっていない。アポリポプロテインＡ−Ｖは、疎水的表面では、高活性、低弾性、および遅結合活性を示し（非特許文献１７）、トリグリセリドが多い粒子の集合を妨害する活性を示す。ＡＰＯＡ５トランスジェニックマウスでは、ＶＬＤＬ−トリグリセリド濃度が顕著に減少するという知見（非特許文献１０）に加え、インビトロ実験の結果では、組換えアポリポプロテインＡ−Ｖがリポプロテインリパーゼの活性に関与し、これを増加することが知られている（非特許文献１８）。アポリポプロテインＡ−Ｖは、肝ＶＬＤＬ合成を減少させ、ＶＬＤＬ除去を増加することにより、ＶＬＤＬ−トリグリセリド濃度を減少させるのかも知れない。
【００８２】
７９個のアミノ酸から構成される糖タンパクのアポリポプロテインＣ−IIIは、肝臓と小腸で合成され、トリグリセリドに富むリポプロテインとＨＤＬの主要な要素である。このタンパク質は、血中トリグリセリド濃度の調節に重要である（非特許文献１９）。すなわち、リポプロテインリパーゼの阻害、肝トリグリセリドリパーゼ活性の阻害、および細胞膜のグリコサミノグリカンとリポプロテインの結合を阻害することにより、ＶＬＤＬの脂質分解を阻害する（非特許文献２０）。ＡＰＯＣ３中の多型、またはＡＰＯＣ３の近傍のいくつかの多型が、高トリグリセリド血症と関連している。ＡＰＯＣ３の３’非翻訳領域の多様型ＳｓｔＩ部位（３２３８Ｃ→Ｇ）は、様々な民族において高トリグリセリド血症に関連していることが知られている（非特許文献６、９）。ＡＰＯＣ３の１１００Ｃ→Ｔ多型は、血中トリグリセリド濃度と関連していることが知られている（非特許文献２１）。今回の研究では、ＡＰＯＣ３の１１００Ｃ→Ｔ多型が高トリグリセリド血症に関連し、Ｔアリルが危険因子であることがわかった。
【００８３】
アポリポプロテインＡ−Ｉは、肝臓と、小腸で合成され、ＨＤＬの主要構成要素である（非特許文献９）。このタンパク質は、細胞のコレステロールの恒常性に重要な役割を果たしている。また、このタンパク質は、酵素レシチン（コレステロールアシルトランスフェラーゼ）の共同因子であり、末梢組織から肝臓にコレステロールを運搬する際に主要な役割を果たす（非特許文献９）。この経路は、アテローム性動脈硬化に対向するものであると考えられている。実際に、ヒトＡＰＯＡ１を発現するトランスジェニックマウスでは、食餌由来のアテローム性動脈硬化の発達を阻害することが知られている（非特許文献２２）。ＡＰＯＡ１の８４Ｔ→Ｃ多型は、血中トリグリセリドおよびＨＤＬコレステロール濃度に関連することが知られている（非特許文献２３）。今回の研究では、ＡＰＯＡ１の８４Ｔ→Ｃ多型が、高トリグリセリド血症に関連し、Ｃアレルが保護因子であることが明らかとなった。
【００８４】
ＬＰＬ
リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）は、血中のトリグリセリドに富むリポタンパク質の脂質分解を行う律速酵素である。このタンパク質は、脂肪組織の実質細胞、骨格筋、および心筋で合成され、血管内皮のヘパラン硫酸結合部位に運ばれる（非特許文献２４）。ＬＰＬの加水分解機能は、トリグリセリドに富むカイロミクロンやＶＬＤＬをレムナント粒子にするための処理、およびリン脂質とアポリポプロテインをＨＤＬに運搬するために重要である。また、ＬＰＬは、血中のリポプロテインを受容体を介して除去するために重要な働きを果たしている（非特許文献２５）。ＬＰＬは多様型であり、アミノ酸の置換によって、トリグリセリドおよびＨＤＬコレステロール濃度に影響を与える。これらの濃度は、アテローム性動脈硬化の発生について影響を与えている（非特許文献２６）。
【００８５】
ＬＰＬの１５９５Ｃ→Ｇ（Ｓｅｒ４４７Ｓｔｏｐ）多型は、ＬＰＬのＣ末端の２個のアミノ酸を除去する。この変化は、このタンパク質と受容体との結合活性を上昇または促進させるか、ダイマーの形成に影響を与えると考えられている（非特許文献２６）。１５９５Ｃ→Ｇ（Ｓｅｒ４４７Ｓｔｏｐ）多型のＧアレルは、血中トリグリセリド濃度を減少させるか、ＨＤＬコレステロール濃度を上昇させる（或いは、両方の作用）と言われている（非特許文献５、２５、２６）。過去の知見によれば、２個のアミノ酸が除去されたＬＰＬ変異体の酵素活性と安定性とは、ほとんど野生型と同じであるが、血中のＬＰＬ濃度が上昇することにより、ＬＰＬ活性が増加するようである（非特許文献２５、２７）。今回の研究では、ＬＰＬの１５９５Ｃ→Ｇ（Ｓｅｒ４４７Ｓｔｏｐ）多型が高トリグリセリド血症に関連しており、このときＧ（Ｓｔｏｐ）アレルが保護因子であることがわかった。この知見は、従来の知見と矛盾しない（非特許文献５、２５、２６）。
【００８６】
ＡＰＯＥ
アポリポプロテインＥは、脂質運搬と脂質代謝に重要な役割を果たしている。ＡＰＯＥの３つの一般的なアレル（ε２、ε３、ε４）は、三つの主要なアイソフォーム（Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４）をコードしている。これらのアイソフォームは、１１２位と１５８位のアミノ酸が異なっている。ε４ではＬＤＬコレステロール濃度が高く、ε２では低いというデータに基づき、ＡＰＯＥのアレル変異によって、総コレステロール濃度およびＬＤＬコレステロール濃度の個体差が説明される（非特許文献２８−３０）。各種のアポリポプロテインＥアイソフォームは、特異的なリポプロテイン受容体と異なった相互作用を示し、最終的に血中コレステロール濃度に影響を与える（非特許文献３１）。
【００８７】
ＶＬＤＬ、カイロミクロン、およびカイロミクロンレムナントのアポリポプロテインＥは、肝臓において、特異的な受容体と結合する。ε２アレルを持つ者は、ＡｐｏＥ２アイソフォームの結合特性の結果として、ＶＬＤＬとカイロミクロンの合成能力、およびそれらを血中から肝臓に運搬する能力に劣る。これに対し、ε３とε４アレルを持つ者では、これらの処理能力は優れている。このため、ε３とε４アレルを持つ者と比べると、ε２アレルを持つ者では、血中から食事に含まれる脂質を代謝するまでの時間が遅い（非特許文献３２）。食後のリポプロテイン粒子の取り込みの相違は、肝ＬＤＬ受容体の制御の相違に基づくが、これは、血中全コレステロール濃度およびＬＤＬコレステロール濃度が、遺伝子型の相違によるものであることに依る（非特許文献３３−３５）。
今回の研究においては、我々は、ＡＰＯＥの４０７０Ｃ→Ｔ（Ａｒｇ１５８Ｃｙｓ）と３９３２Ｔ→Ｃ（Ｃｙｓ１１２Ａｒｇ）が高ＬＤＬコレステロール血症に関連し、４０７０ＴアレルとＥ２アイソフォームをコードするハプロタイプが保護因子であること、および３９３２ＣアレルとＥ４アイソフォームをコードするハプロタイプがリスク因子であることを明らかとした。この結果は、従来の知見と矛盾しない（非特許文献８、２８−３０、３３−３５）。
【００８８】
脂肪酸結合タンパク質２（ＦＡＢＰ２）は、小腸の円柱状の吸収上皮細胞においてのみ発現される細胞内タンパク質である。このタンパク質は、飽和および不飽和脂肪酸に対して高い親和性を持つ単一の結合部位を持っており、長鎖脂肪酸の吸収および細胞内輸送に寄与している。ＦＡＢＰ２の２４４５Ｇ→Ａ（Ａｌａ５４Ｔｈｒ）多型においてＡ対立遺伝子産物は、Ｇ対立遺伝子産物に比べると、インビトロ試験系で長鎖脂肪酸に対して大きな親和性を示した（非特許文献４４）。また、Ａ対立遺伝子は、血漿中ＬＤＬコレステロール濃度がより高く（非特許文献１７）、メタボリック症候群と脂質代謝異常に関連することが認められている（非特許文献４５）。
＜結論＞
我々の研究によれば、日本人においては、ＡＰＯＡ５、ＡＰＯＣ３、ＡＰＯＡ１、およびＬＰＬは高トリグリセリド血症に関連し、ＡＰＯＡ５とＡＰＯＥは低ＨＤＬコレステロール血症と高ＬＤＬコレステロール血症に、ＦＡＢＰ２は高ＬＤＬコレステロール血症に関連していた。この結果に基づき、遺伝子多型を調べることにより、脂質代謝異常の危険性を知ることができる。
このように本実施形態によれば、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、低ＨＤＬコレステロール血症、高ＬＤＬコレステロール血症を含む脂質代謝異常について、遺伝的リスクを判断するための検出法を提供することができる。この実施形態を用いることにより、脂質代謝異常の予防が可能となり、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。
【００８９】
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【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】Ｌｕｍｉｎｅｘ１００で検出するマイクロビーズの微細構造と特徴を示す図である。
【図２】ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法の手順の概要を示す図である。
【図１】
0005478835.tif 000034
【図２】
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【配列表】
0005478835000001.app