(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１３】
0005506386.tif 000017
［式中、
Ｒ1は、アミノ、モルホリノ、およびハロから選択される置換基で末端の炭素原子が置換された直鎖アルキルであり；
Ｙは、−Ｃ（Ｏ）−、または−ＳＯ2−であり；
Ａｒはフェニレンであり；および、
Ａｒ’は１以上の可能な位置に、分枝状または非分枝状の、置換または無置換Ｃ2−Ｃ10アルキルで置換されたフェニルである］
で示される化合物、または、その生理的に許容可能な塩、およびその製薬学的に許容可能な担体を共に含む、医薬組成物。
【請求項２】
Ｒ1は、ジメチルアミノで末端の炭素原子が置換された直鎖アルキルである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
Ｒ1は、アミノまたはモルホリノで末端の炭素原子が置換された直鎖Ｃ３−６アルキルである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
Ｒ1の置換基が、アミノまたはモルホリノであり、前記アミノまたはモルホリノがプロトン化された窒素原子を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
Ｙが−Ｃ（Ｏ）−である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記化合物が、式（ＩＩ）
【化１４】
0005506386.tif 000018
［式中、Ｒ2は分枝状または非分枝状の、置換または無置換のＣ2−Ｃ10アルキルである］
で示される請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
Ｒ1ＹＮＨ基、および／またはＲ２は、それらが結合する各フェニル基のパラ位にある請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記組成物が５−ジメチルアミノ−ペンタン酸｛４−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−チオウレイド］−フェニル｝−アミドおよび５−モルホリノ−ペンタン酸｛４−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−チオウレイド］−フェニル｝−アミド、またはその生理的に許容可能な塩、およびその製薬学的に許容可能な担体を共に含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
式（Ｉ）
【化１５】
0005506386.tif 000019
［式中、
Ｒ1は、アミノ、モルホリノおよびハロから選択される置換基で末端の炭素原子が置換された直鎖Ｃ３−６アルキルであり；
Ｙは−Ｃ（Ｏ）−または−ＳＯ2−であり；
Ａｒはフェニレンであり；および、
Ａｒ’は１以上の可能な位置に、分枝状または非分枝状の、置換または無置換Ｃ2−Ｃ10アルキルで置換されたフェニルである］
で示される化合物、またはその生理的に許容可能な塩を含む医薬。
【請求項１０】
Ｒ1は、ジメチルアミノで末端の炭素原子が置換された直鎖アルキルである、請求項９に記載の医薬。
【請求項１１】
Ｒ1は、アミノまたはモルホリノで末端の炭素原子が置換された直鎖Ｃ３−６アルキルである、請求項９に記載の医薬。
【請求項１２】
Ｒ1の置換基が、アミノまたはモルホリノであり、前記アミノまたはモルホリノがプロトン化された窒素原子を含む、請求項９に記載の医薬。
【請求項１３】
Ｙが−Ｃ（Ｏ）−である、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１４】
前記化合物が、式（ＩＩ）
【化１６】
0005506386.tif 000020
［式中、Ｒ2は分枝状または非分枝状の、置換または無置換のＣ2−Ｃ10アルキルである］
で示される請求項９〜１３のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１５】
前記組成物が５−ジメチルアミノ−ペンタン酸｛４−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−チオウレイド］−フェニル｝−アミドおよび５−モルホリノ−ペンタン酸｛４−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−チオウレイド］−フェニル｝−アミド、またはその生理的に許容可能な塩を含む、請求項９に記載の医薬。
【請求項１６】
式（Ｉ）
【化１７】
0005506386.tif 000021
［式中、
Ｒ1は、アミノ、モルホリノおよびハロから選択される置換基で末端の炭素原子が置換された直鎖Ｃ３−６アルキルであり；
Ｙは−Ｃ（Ｏ）−または−ＳＯ2−であり；
Ａｒはフェニレンであり；および、
Ａｒ’は１以上の可能な位置に、分枝状または非分枝状の、置換または無置換Ｃ2−Ｃ10アルキルで置換されたフェニルである］
で示される化合物、またはその生理的に許容可能な塩。
【請求項１７】
Ｒ1は、ジメチルアミノで末端の炭素原子が置換された直鎖アルキルである、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒ1は、アミノまたはモルホリノで末端の炭素原子が置換された直鎖Ｃ３−６アルキルである、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｒ1の置換基が、アミノまたはモルホリノであり、前記アミノまたはモルホリノがプロトン化された窒素原子を含む、請求項１６に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｙが−Ｃ（Ｏ）−である、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２１】
前記化合物が、式（ＩＩ）
【化１８】
0005506386.tif 000022
［式中、Ｒ2は分枝状または非分枝状の、置換または無置換のＣ2−Ｃ10アルキルである］
で示される請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２２】
前記化合物が５−ジメチルアミノ−ペンタン酸｛４−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−チオウレイド］−フェニル｝−アミドおよび５−モルホリノ−ペンタン酸｛４−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−チオウレイド］−フェニル｝−アミド、またはその生理的に許容可能な塩から選択される、請求項１６に記載の化合物。
【請求項２３】
細胞増殖に関連する疾患、または糖尿病、筋分化、炎症、異常なまたは望ましくない免疫反応、肥満、心不全、神経変性、老化、ＨＩＶ感染およびマラリアから選択されるサーチュイン発現および／または機能に関連する疾患／状態の治療または予防剤である請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記細胞増殖に関連する疾患の治療または予防剤が、癌の治療または予防剤である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｐ５３応答を活性化する化合物に関し、および、例えば、癌の治療および潜在的な他の疾患／状態（サーチュイン機能を含む）などの過増殖性疾患において見出された使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｐ５３腫瘍抑制タンパク質は、細胞ストレス応答の中心的なメディエーターである。Ｐ５３は、腫瘍の発生を抑制する中心的な役割を担う。保護的なメカニズム、特に細胞周期の停止やアポトーシスを活性化させることにより、潜在的に発癌性ストレスの範囲に応答する。腫瘍抑制剤としての重要性は、５０％を超える成人ヒト腫瘍で、ＴＰ５３遺伝子における変異や欠失を不活性化する、ヒト癌における高頻度の変異に反映される。ｐ５３が野生型である多くの癌では、他の発癌性イベントによりｐ５３系が変化しうる。これは、おそらくｐ５３応答が、殆どの癌において欠損していることを意味する。
【０００３】
成人の固形腫瘍における知見に反し、ウイルス関連性の悪性腫瘍（例えば、子宮頸癌）、血液の悪性疾患および小児癌におけるｐ５３変異の発生は、非常に低い。これは、成人と比較し小児の癌の予後がより良好であることへの手がかりになりうる。しかし、若年患者の長期間の療法や治療を考慮した場合、現在の多くの療法の変異原性作用を知ることが重要である。さらに、文献には、ＤＮＡ障害性アルキル化物質によるＢ−ＣＬＬ患者の治療が、ｐ５３の変異の発生に関連し、著しい不良転帰および薬剤抵抗性を伴うことが示されている。変異によってｐ５３機能が消失していない癌の治療の向上は、新規な、非遺伝毒性的なｐ５３応答活性剤の発見によるだろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
多くの現在の抗癌療法は、ＤＮＡ傷害によりｐ５３応答を活性化する。ｐ５３系の非遺伝毒性的活性化は、癌の予防的な治療も含め、長期化へ通じる。この要件に合う分子は、変異によるｐ５３機能を消失していない過増殖性状態を伴う患者に適用する治療物質として有用となりうる。
【０００５】
本発明の目的は、過増殖性状態や、癌などの異常なＰ５３機能、および関連する状態を含む状態および疾患の治療および／または予防のための分子、およびそれらの分子の使用を提供することである。
【０００６】
本発明の更なる目的は、癌、糖尿病、筋分化、心不全、神経変性、老化、ＨＩＶ感染およびマラリアなどの、サーチュイン発現および／または機能を伴う状態および疾患の治療および／または予防のための分子、およびそれらの分子の使用を提供することである。
【０００７】
本発明の第１の局面によれば、式（Ｉ）の化合物の医薬としての使用が提供される。
【０００８】
【化１】
0005506386.tif 000002
【０００９】
［式中、
【００１０】
Ｒ1は独立してＨであるか；分枝状または非分枝状の、モノ、ジ、もしくはトリ置換または無置換の、アルキル、アルケニルもしくはアルキニルであるか；または、アリールであるか；または、Ｚ−アルキル、Ｚ−アルケニル、Ｚ−アルキニルもしくはＺ−アリール（ここでＺはＯ、ＮＨ、Ｎ、またはＳであるか、ラベル、プローブもしくは基を可溶化する溶媒に結合する基を含む）であり；
Ｙは存在しないか、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ＝Ｓ−、または−ＳＯ2−であり；
Ａｒ、Ａｒ’はアリールであり；
ＸはＯまたはＳであり；
Ｒ3およびＲ4は、独立して、非存在であるか存在し、存在するときは、独立してＨ、または分枝状または非分枝状の、モノ、ジもしくはトリ置換または無置換の、アルキルもしくはＺ−アルキル（ここで、ＺがＯ、ＮＨ、ＮもしくはＳ）であるか、またはＲ3およびＲ4は、共に結合して、分枝状または非分枝状の、置換または無置換の、アルキレンもしくはＺ−アルケン（ここで、ＺはＯ、ＮＨ、ＮまたはＳである）を形成し；
Ｒ5およびＲ6は、独立して、非存在であるか存在し、存在するときは、独立して分枝状または非分枝状の、置換または無置換のアルキルであり；ここで、
Ｒ3が存在するときは、破線ｂは単結合であり、Ｒ3が非存在のときは、破線ｂは二重結合であり；
Ｒ4が存在するときは、破線ｃおよびｄは単結合であり、Ｒ4が非存在のときは、破線ｃまたはｄの一方は二重結合であり、他方は単結合であり；そして、
Ｒ5およびＲ6が非存在のとき、破線ａおよびｅはそれぞれ二重結合であり、Ｒ5およびＲ6が存在するときは、破線ａおよびｅは、それぞれ単結合である］
で示される、医薬としての使用に供される化合物、または、その生理的に許容可能な塩、溶媒和物、エステルもしくは他の生理的機能性誘導体。
【００１１】
このように、破線ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅの単結合または二重結合の要件は、付随する炭素原子の四価、および窒素原子の三価を確保し、維持するために選択される。しかし、窒素原子は、四価となり、例えば、アルキル基などの他の部分の窒素原子への結合を通じて、正電荷を有しうることに留意する。
【００１２】
誤解を避けるために、式（Ｉ）の種々の化合物は、以下の化合物式（ＩＡ−Ｄ）により示される。
【００１３】
【化２】
0005506386.tif 000003
【００１４】
理論により拘束されることを意図することなしに、構造活性相関の研究から、式（Ｉ）におけるＲ1−Ｙ−ＮＨ−の一群は、例えば、ＮＨ残基により規定されるように、水素結合供与体基を備えることにより活性を有するように思われる。また、Ｒ2は、立体的に嵩高い基が好ましいようである。
【００１５】
Ｙは、存在または非存在となり得るが、好ましくは存在する。Ｙは、好ましくは−Ｃ（Ｏ）−基である。
Ｒ1は、好ましくは独立してＨ、または置換または無置換のアルキルまたはアリール基である。
アリール基、Ａｒは、置換または無置換の、単環または多環系アリールもしくはヘテロアリール部分であってもよい。
好ましくは、Ａｒはフェニルである。
Ａｒがフェニルのとき、フェニルにパラ位で結合する基、すなわち、−ＮＨ−が−ＮＲ3−基に対しパラ位であるのが好ましい。
好ましくはＡｒ’は、１以上の可能な位置に、分枝状または非分枝状の、置換また
は無置換Ｃ2−Ｃ10アルキルで置換されたフェニルである。好ましくは、Ｒ2は二級または三級アルキル基などの、分枝状のアルキル基である。
【００１６】
最も好ましくは、Ｒ2はｉｓｏ−プロピルまたは三級のブチル基（すなわち、ｔｅｒｔ−ブチル）である。
Ｒ2基は、結合するフェニル環のパラ位で結合するのが好ましい。
好ましくは、破線ａおよびｅが二重結合となるようにＲ5およびＲ6は非存在である。
好ましくは、Ｒ3およびＲ4は存在し、好ましくは水素、または、例えば、メチルなどのＣ1−Ｃ4アルキルである。
【００１７】
アルキル、アルケニルおよびアルキニルという語は、ここでは、これらの基の分枝状または非分枝状で、置換され、または無置換の、線状または環状のものを含む。
アリールという語は、置換または無置換の単環もしくは多環系のアリールまたはヘテロアリールを含む。
【００１８】
Ｒ1がＨでないとき、各存在で、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはヘテロアリール、カルボキシ、アルキルオキシカルボニル  ヒドロキシル、アミノ、モルホリノ、ニトロ、アルキルオキシ、アルキルチオ、ホルミル、シアノ、カルバモイル、ハロ（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード）、ケトン、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ7Ｒ8または−Ｓ（Ｏ）Ｒ9（ここで、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は、それぞれ独立してアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはヘテロアリールから選択される）からなる群から、独立して選択される基で１回以上置換されうる。
【００１９】
通常、Ｒ1はアルキル基であり、好ましくは直鎖のＣ3−Ｃ6アルキル、例えば、ｎ−ブチルなどのＣ4アルキルである。
通常、アルキル基は、遊離末端で、フェニル、ヒドロキシル、アミノ、モルホリノ、ニトロ、アルキルオキシ、アルキルチオ、ホルミル、シアノ、カルバモイル、ハロ（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード）、ケトン、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ7Ｒ8または−Ｓ（Ｏ）Ｒ9（ここで、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は、それぞれ独立してアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはヘテロアリールから選択される）から選択される置換基で置換される。
【００２０】
末端置換基がモルホリノ基のとき、好ましくは、その窒素原子によりＲ1の末端に結合する。
末端置換基は、ハロゲンであってもよく、例えば、ブロモの場合は、式Ｂｒ（ＣＨ2）4−を有するＲ1基を与える。
末端置換基が、アミノまたはモルホリノ基のとき、その窒素原子は、プロトン化（例えば、酸反応により）して、正電荷されたものとなってもよい。
【００２１】
末端Ｒ1は、ラベル、親和性樹脂または基質プローブおよび／または水溶性基に結合するリンカー基として有利に考慮されても良い。例えば、リンカーは、活性メカニズムの研究に有用な分子を提供するために、式（Ｉ）の化合物（すなわち、活性化合物）の残存部分と、生物化学実験で用いられるラベルまたはプローブに結合してもよい。リンカーは、アルキル鎖、エチレングリコールのポリマー類（すなわち、（ＯＣＨ2ＣＨ2）n1）および６−アミノヘキサン酸のペプチド類（すなわち、（ＮＨ（ＣＨ2）5ＣＯ）n2）r；ここで、ｎ１およびｎ２は、分子がポリマーであることを示し、通常、１から６または８ぐらいの範囲の整数である）などの本目的に適するどのような部分であってもよい。ラベルやプローブは、ビオチン、ストレプロアバジン（ｓｔｒｅｐｔａｖａｄｉｎ）、フルオロフォア類（例えば、ｂｏｄｉｐｙ、フルオレセインおよびローダミン）、放射活性ラベル類および固相マトリックス、例えば、ポリマービーズなどのポリマー類（例えばポリスチレン）などの、その目的において知られる物を含む。水溶性化する基は、その目的において適する糖類、アミン類、アミノ酸類、リン酸類等およびそれらの塩を含む。
【００２２】
水溶性化する基は、例えば、特に医薬として使用されるとき、化合物の生物学的利用性および／または薬物動態を最適化するために、活性化合物の水溶性を変化させるための修飾に用いられうる。
【００２３】
アミノという語は、ここでは、サイクリックアミノ基、すなわち、アミンの窒素原子が環の構成員である基を含む。
アミノという語は、ここでは、プロトン化された種々のアミン類およびその塩についても含む。例えば、アミンは、プロトン化されてもよく、塩酸、硫酸の酸など、カルボン酸類を含む多くの酸類との塩を形成してもよい。例えば、アミンの塩酸塩は、水や水溶性溶媒中で高い水溶性を示す。
【００２４】
式（Ｉ）において、アリール残基は、例えば、５または６員の単環アリールもしくはヘテロアリール環構造、または他の多環系アリールもしくはヘテロアリール残基となりうる。
フェニルは、６員アリール基の具体例である。
【００２５】
通常、ヘテロアリール構造中のヘテロ原子は、酸素または窒素から選択される。
フリルおよびピロリルは、それぞれ酸素および窒素ヘテロ原子を含む５員ヘテロアリール基の具体例である。
ピリジニルおよびピリミジニルは、それぞれ１つの窒素原子、および２つの窒素原子を含む６員ヘテロアリール基の具体例である。
ナフチルは、縮合６員環を形成する１０個の炭素原子の骨格を有するアリール基の具体例である。
【００２６】
アリール基は、示されるように、１以上の位置で置換されてもよく、適する置換基は、それぞれの置換位置において、Ｒ1またはＲ2で定義された置換基から独立して選択されうる
【００２７】
置換基は、アリール基に直接的に、または、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ−または−（ＣＲ10Ｒ11）n−（ここで、ｎは１〜２５の整数であり、例えば、１〜１０、１〜４などであり、Ｒ10およびＲ11は、独立してアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはヘテロアリール、カルボキシ、アルキルオキシカルボニル  ヒドロキシル、アミノ、モルホリノ、ニトロ、アルキルオキシ、アルキルチオ、ホルミル、シアノ、カルバモイル、ハロ（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード）、ケトン、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ7Ｒ8または−Ｓ（Ｏ）Ｒ9（ここで、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は前記の定義の通り））から独立して選択される基を介して結合してもよい。
【００２８】
医薬としての使用に関し、式（Ｉ）の好ましい化合物は、以下の式（ＩＩ）
【００２９】
【化３】
0005506386.tif 000004
［式中、Ｒ1、Ｒ2およびＹは前記定義の通りである］
または、その生理的に許容可能な塩、溶媒和物、エステルまたは他の生理的機能性誘導体、を有する。
【００３０】
好ましくは、Ｒ1ＹＮＨ−および／またはＲ2−基が、それらが結合するそれぞれのフェニル環上のパラ位にある。
好ましくは、Ｙは−Ｃ（Ｏ）−基であり、このため、好ましくは、Ｒ1ＹＮＨ−基はＲ1Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である。
【００３１】
好ましい化合物、その薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、エステルまたは他の生理的機能性誘導体は、実施例の項においても示される。
本発明は、さらに以下に詳細を説明するように、その薬学的に許容可能な担体と共に式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物を含む医薬製剤にも及ぶ。
本発明は、さらに以下により詳細に記載するように、ここに記載された１以上の式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物を、それを必要とする患者に投与することを含む治療または予防方法にも及ぶ。
本発明は、式（Ｉ）および（ＩＩ）の範囲に含まれる新規な化合物にも及ぶ。
【００３２】
このように、更なる局面において、本発明は、下記化合物
【化４】
0005506386.tif 000005
を除く、ここに示される式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物を提供する。
【００３３】
ここに記載された化合物式において、アルキル基は、独立してＣ1−Ｃ22アルキル、好ましくはＣ1−Ｃ10アルキル、好ましくはＣ1−Ｃ4アルキル、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチルであってもよい。
アルケニル基は、独立してＣ2−Ｃ22アルケニル、好ましくはＣ2−Ｃ10アルケニル、好ましくはＣ2−Ｃ4アルケニルであってもよい。
アルキニル基は、独立してＣ2−Ｃ22アルキニル、好ましくはＣ2−Ｃ10アルキニル、好ましくはＣ2−Ｃ4アルキニルであってもよい。
アルキル、アルケニルまたはアルキニル基は、分枝状または非分枝状、置換または無置換であってもよい。例えば典型的な分枝状のアルキル基は、ｉｓｏ−プロピル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、３−メチルブチル、３，３−ジメチルブチルおよびそれらの異性体を含む変形体を含む。
【００３４】
ここに記載されたように、アルキル、アルケニルまたはアルキニル基は、置換されてもよく、置換基は、ヒドロキシル、置換または無置換のアミン、置換または無置換のアミド、ハライド（フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨードなど）、アルコキシ、チオ、ニトロ、カルボキシ、エステル、シアノ、またはアリール（フェニル、ナフチルおよびピリジルなど）などのあらゆる化学分子であってよい。
【００３５】
ここに記載された化合物、例えば、アルケニル基、における二重結合の幾何学的配置はｃｉｓまたはｔｒａｎｓの幾何学的配置であってよい。
【００３６】
本発明の化合物の生理的に許容可能な塩の例には、有機カルボン酸類（酢酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、ピルビン酸、シュウ酸、フマル酸、オキザロ酢酸、イセチオン酸、ラクトビオン酸および琥珀酸など）；有機スルホン酸類（メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸およびｐ−トルエンスルホン酸など）および無機酸類（塩酸、硫酸、リン酸およびスルファミン酸等）と形成される酸付加塩を含む。
【００３７】
本発明化合物の生理的機能性誘導体は、体内で親化合物に変換される誘導体である。そのような生理的機能性誘導体は、「プロドラッグ」や「バイオプレカーサー」とも言われる。本発明化合物の生理的機能性誘導体は、生体内で加水分解性のエステル類を含む。
【００３８】
記載された使用／方法のいずれか１において使用されうる、ここに記載された化合物に対応する溶媒和物を、調製、精製、および／または処理することが、簡便であるか、好ましい。溶媒和物という語は、ここでは、化合物またはその化合物の塩などの溶質と溶媒との複合体を言うのに用いられる。溶媒が水のとき、その溶媒和物を、例えば基質１分子当たりの水分子の数により、一水和物、二水和物、三水和物など、水和物と称してもよい。
【００３９】
当然のことながら、本発明の化合物は、種々の立体異性体が存在し得、上記に定義された本発明の化合物は、エナンチオマーおよびラセミ混合物を含む、全ての立体異性体およびその混合物を含む。本発明は、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物の個々のエナンチオマーやそのようなエナンチオマーの全または部分ラセミ混合物を含む、そのような全ての立体異性体や立体異性体の混合物の使用を、その範囲に含む。
【００４０】
本発明の化合物は、後述するように、技術的に容易に利用可能な試薬と技術を用いて調製されうる。本発明の化合物の調製のための合成経路において新規な中間体化合物は、本発明の分子の調製についての一般適用に関し、重要な分子となりうる。従って、本発明はこれらの新規な中間体化合物を含む範囲にまで及ぶ。
【００４１】
具体例として、化合物は、公報番号ＥＰ  ０  １３６  ７４５  Ｂ１の欧州特許、および公開番号ＥＰ  ０  １９３  ２４９  Ａ２の欧州特許出願に記載された方法を用いて合成されうる。
【００４２】
式（ＩＩ）に記載の化合物の調製に有用な合成方法には、以下の手法において示されるように、溶媒（例えば、アセトン）中、種々の塩化ベンゾイル類を金属チオシアン酸塩（例えば、チオシアン酸ナトリウム）で処理し、ベンゾイルイソチオシアネート類を得、次いでアニリン類と反応（好ましくはｉｎ  ｓｉｔｕで）させ、以下の式（ＩＩ）の化合物を得る。
【００４３】
【化５】
0005506386.tif 000006
【００４４】
上記の手法において、フェニル基は、あらゆるアリール基を表す。更なる機能付与は、アシル化やアルキル化により達成されうる。塩基性水溶性条件下で、化合物は加水分解され、Ｎ−アリールチオ尿素類が得られる。
【００４５】
上記に示した通り、本発明は、ここに示される化合物を、それを必要とする患者に投与することを含む、ここに挙げられる疾患、病態もしくは状態の治療または予防を提供する。
【００４６】
本発明に関する疾患は、Ｐ５３タンパク質、その機能および／またはＰ５３経路の異常を伴う異常な細胞死に関与するものを含む。
【００４７】
特に、異常な細胞増殖が関与する疾患は、ここに挙げられた化合物で治療可能である。そのような疾患の例には、癌、過剰増殖性疾病（疣贅類、乾癬、炎症性腸疾患を含む）、リウマチ／自己免疫状態、鎌状赤血球性貧血、サラセミア等が含まれる。
【００４８】
本活性化合物により治療されうる癌の例には、これらに限定されないが、例えば、膀胱癌、乳房癌、大腸癌（例えば、大腸腺癌や大腸腺腫などの結腸直腸の癌）、腎臓癌、表皮性癌、肝癌、肺癌（例えば腺癌、小細胞肺癌や非小細胞肺癌）、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌（例えば、膵外分泌部の癌）、胃癌、頚部癌、甲状腺癌、前立腺癌または皮膚癌（例えば扁平上皮癌）；リンパ系の造血性腫瘍（例えば白血病、急性リンパ性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、毛様細胞リンパ腫、またはバーキットリンパ腫）；骨髄疾患系の造血性腫瘍（例えば急性および慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、または前骨髄球性白血病）；濾胞性甲状腺癌；間葉系起源の腫瘍（例えば線維肉腫または横紋筋肉腫）；中枢または末梢神経系の腫瘍（例えば星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫またはシュワン細胞腫）；メラノーマ；精上皮腫；奇形癌腫；骨肉腫；色素性乾皮症；角化棘細胞腫；濾胞性甲状腺癌；またはカポジ肉腫が含まれる。
【００４９】
本発明者らは、ここに示されるＪＨ１６４などの本発明の化合物が、ＳｉｒＴ１活性の抑制に特に有効であることに注目している。このため、ＪＨ１６４などの本発明の化合物は、ＳｉｒＴ１発現／機能に関連する疾患／状態の治療に使用されうる。
【００５０】
ＳｉｒＴ１または関連するタンパク質は、癌、炎症、免疫反応、肥満、老化、糖尿病、筋分化、心不全、神経変性、ＨＩＶ感染およびマラリアを含む非常に多くの疾患／状態において標的であると確認されており（例えば、Ｂｏｒｄｏｎｅ  ＬおよびＧｕａｒｅｎｔｅ  Ｌ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６６（８）：４３６８−７７（２００６年４月１５日）；Ｈｅｌｔｗｅｇら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ．，２６（２）：９４−１０３、２００５年２月；Ｐａｇａｎｓら、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００５  Ｖｏｌ．３，  Ｎｏ．２，ｅ４１；Ｄｅｉｔｓｃｈ  ＫＷ，Ｃｅｌｌ．，１２１（１）：１−２（２００５年４月８日）；Ｆｒｅｉｔａｓ−Ｊｕｎｉｏｒ  ＬＨら、Ｃｅｌｌ．，１２１（１）：２５−３６（２００５年４月８日）；Ｎａｙａｇａｍ  ＶＭ、Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ．（２００６年１１月１２日）を参照のこと）、従って本発明の化合物は、前記のあらゆる疾患／状態の治療／予防において有用性が見出されうる。
【００５１】
式（Ｉ）の化合物と、（同時に、または異なる時間間隔を問わず）一緒に投与されうる他の治療物質の例には、これらに限定されないが、シスプラチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、イリノテカン、フルダラビン、５ＦＵ、タキサン類、マイトマイシンＣなどの、トポイソメラーゼ阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗薬、ＤＮＡ結合剤および微小管阻害薬（チューブリン標的剤）、または放射線療法などが含まれる。活性化合物を他の療法と組み合わせる場合、２以上の治療剤が、異なる経路により種々の個別の投薬計画で投与されうる。
【００５２】
本発明の化合物と上記に挙げられた物質との組み合わせは、通常の一般的な知見と熟練した施術者に公知の投薬計画を用い、投与量を選択する医師の裁量でなされる。
【００５３】
式（Ｉ）の化合物が、１、２、３、４またはそれ以上、好ましくは１または２、好ましくは１以上の治療剤との組み合わせ療法で投与される場合、化合物を同時にまたは連続して投与できる。連続して投与する場合、狭い間隔（例えば、５〜１０分間隔以上）または、より長い間隔（例えば１、２、３、４時間またはそれ以上開けて、または必要な場合はより長い間隔）で、治療の作用と治療剤に見合った的確な投薬計画で投与されうる。
【００５４】
本発明の化合物はまた、放射線療法、光力学療法、遺伝子療法；外科手術および栄養制限食などの非化学療法と組み合わせて投与されうる。
患者は、通常、動物であり、例えば、哺乳動物、特にヒトである。
【００５５】
本発明による使用に関し、ここに記載された化合物またはその生理的に許容可能な塩、溶媒和物、エステルもしくは他の生理的機能性誘導体は、該化合物またはその生理的に許容可能な塩、エステルもしくは生理的機能性誘導体と共に、１以上の薬学的に許容可能な担体および任意に他の治療的および／または予防的成分を含む医薬製剤でありうる。担体は、製剤の他の成分に適合するという意味で許容可能でなくてはならず、服用者に有害であってはならない。
【００５６】
医薬製剤は、経口、局所（経皮、バッカルおよび舌下を含む）、直腸、または非経口的（皮下、内皮内、筋肉内および静脈内を含む）、経鼻的および肺内投与（例えば、吸入による）に適するものを含む。製剤は、必要に応じて、別個の投与量単位として好都合に存在し得、薬学の当該技術において周知のあらゆる方法により調製されうる。全ての方法には、活性化合物を液体担体や細かく分割された固体担体あるいはその両方と組み合わせる状態にする工程を含み、次いで、所望により、生成物を所望の剤型に形成する。
【００５７】
経口投与に適する医薬製剤は、担体が固体であり、最も好ましくは、巨丸剤（ボーラス）、カプセルや錠剤などの、それぞれに活性化合物の所定量を含む単位用量製剤である。錠剤は、場合により、１以上の副成分とともに、圧縮や成型によって製造されてもよい。圧縮錠剤は、粉末や顆粒などの自由流動形態の活性化合物を、場合により、結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、潤滑剤、表面活性化物質または分散剤と混合し、適する機器で圧縮することにより調製されうる。成型錠剤は、活性化合物を不活性な液体希釈剤で成型することにより製造されうる。錠剤は、場合により被覆されてもよく、被覆されていない場合には、場合により割線を入れても良い。カプセル剤は、活性化合物を、単独あるいは１以上の副成分との混合剤として、カプセル殻に充填し、次いで常法により封止することにより調製しうる。サッシェ剤は、カプセル剤に類似し、活性化合物を副成分とともにライスペーパー製の封筒に入れ封止する。活性化合物は、分散可能な顆粒として製剤化してもよく、例えば、投与前に水に懸濁してもよく、食品に散布してもよい。顆粒剤は、例えば、サッシェに包装してもよい。担体が液体である経口投与に適する製剤は、水溶性もしくは非水溶性の溶液または懸濁液として、あるいは水中油型液体エマルジョンとして存在しうる。
【００５８】
放出制御投与形態を含む経口投与製剤は、例えば、活性化合物が適した放出制御マトリックスで製剤化され、あるいは、適する放出制御フィルムで被覆された錠剤を含む。そのような製剤は、特に予防的使用に好都合となりうる。
【００５９】
直腸投与に適する担体が固体である医薬製剤は、最も好ましくは、単位用量の坐薬である。適する担体は、カカオ脂や技術的に通常用いられる他の物質を含む。坐薬は、活性化合物を柔らかい、あるいは溶けた担体と混合し、次いで冷却し、成型することにより簡便に形成しうる。
【００６０】
非経口的投与に適する医薬製剤は、無菌の溶液、または、水溶性もしくは油性の担体中の活性化合物の懸濁液を含む。
【００６１】
注射用製剤は、急速注入や連続的な注入に用いられる。そのような製剤は、使用に必要とされるまで製剤を導入後封止した、単位用量または多用量の容器で好都合に存在する。あるいは、活性化合物は、使用前に、無菌の発熱性物質の存在しない水などの適する担体と構成される粉末形態であってもよい。
【００６２】
活性化合物は、長時間作用性デポ製剤として製剤化されてもよく、例えば、皮下投与や筋肉内投与などの、筋肉内注射や埋め込みにより投与されうる。デポ製剤は、例えば、適する重合性や疎水性の物質、またはイオン交換樹脂を含んでもよい。そのような長時間作用性の製剤は、特に予防的使用に好都合となりうる。
【００６３】
口腔を介した肺内投与に適する製剤は、活性化合物を含み、好ましくは０．５〜７ミクロンの範囲の直径を有し、服用者の気管支樹に到達するような粒子である。
そのような製剤の１つの可能性としては、吸入器で使用される穴の開けられるカプセル（好ましくは、例えば、ゼラチン）で、あるいは、活性化合物と、適する液体または気体噴射剤、および、場合により界面活性剤および／または固体希釈剤などの他の成分を含む自己噴射性製剤として用いられる、細かく粉砕した粉末の形態である。適する液体噴射剤は、プロパンおよびクロロフルオロカーボン類を含み、適する気体噴射剤は、二酸化炭素を含む。活性化合物が、溶液または懸濁液の溶滴の形態で分散している自己噴射性製剤も、使用されうる。
【００６４】
そのような自己噴射性製剤は、当該技術において公知のものの類似物であり、確立された手順により調製しうる。好ましくは、所望のスプレー特性を有する手動で操作可能な機能性バルブ、または、有利には、各操作において、例えば、２５〜１００マイクロリットルの固定容量を送達する計量型のバルブ、を備える容器を用いる。
【００６５】
更なる可能性として、吸入の微滴霧を作り出すのに、加速気流や超音波撹拌が用いられる噴霧器やネブライザーでの使用に、活性化合物を溶液や懸濁液の状態で用いることができる。
【００６６】
経鼻投与に適する製剤は、一般的に上記に記載された肺内投与と類似の調製法を含む。分散する場合、そのような製剤は、鼻腔中に保持可能に、好ましくは、１０〜２００ミクロンの範囲の粒子直径を有するべきであり、必要に応じて、適する粒径の粉末の使用や適切なバルブの選択により、達成されうる。他の適する製剤は、鼻および鼻腔に近づけ保持された容器から、鼻腔を通じて、水溶性もしくは油性溶液または懸濁液中に０．２〜５％ｗ／ｖの活性化合物を含む滴を、高速吸入により投与するために、２０〜５００ミクロンの範囲の粒子径を有する粗粉末である。
【００６７】
前述の担体成分に加え、上記に記載された医薬製剤は、希釈剤、緩衝剤、香味剤、結合剤、界面活性剤、増粘剤、滑沢剤、保存料（抗酸化剤を含む）等の、適当な１以上の追加的な担体成分、および製剤を対象とする服用者の血液と等張にする目的で加えられる物質を含んでもよい。
【００６８】
薬学的に許容可能な担体は、当業者に周知であり、これらに限定されないが、０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍリン酸バッファまたは０．８％生理食塩水を含む。また、そのような薬学的に許容可能な担体は、水溶性もしくは非水溶性溶液、懸濁液、およびエマルジョンであってもよい。非水溶性溶媒の例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびエチルオレイン酸塩などの注射可能な有機エステル類がある。水溶性担体は、水、アルコール／水溶性溶液、生理食塩水や緩衝培地を含むエマルジョンまたは懸濁液を含む。非経口的担体は、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース液、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化されたリンゲル液または固定油を含む。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、不活性ガスなどの、保存料および他の添加物も存在してもよい。
【００６９】
局所製剤に適する製剤は、例えば、ゲル、クリームまたは軟膏として供されうる。そのような製剤は、例えば、創傷や潰瘍に適用でき、創傷や潰瘍の表面上に直接塗布したり、治療する箇所および部分一面に適用可能な、包帯、ガーゼ、メッシュなどの適するサポートに保持してもよい。
例えば、創傷や潰瘍に、治療する箇所に直接スプレーや散布しうる液体や粉末製剤も提供されうる。また、製剤を包帯、ガーゼ、メッシュなどの担体にスプレーでき、あるいは散布し、治療する箇所に適用することもできる。
【００７０】
動物用の治療用製剤は、粉末や液体の濃縮形態が好都合であろう。動物用製剤の手技標準により、ラクトースやスクロースなどの従来の水溶性添加剤は、その物性を向上させるために加えられうる。このように、特に適する本発明の粉末は、活性成分を５０〜１００％ｗ／ｗ、好ましくは６０〜８０％ｗ／ｗ含み、従来の動物用添加剤を０〜５０％ｗ／ｗ、好ましくは２０〜４０％ｗ／ｗ含む。これらの粉末は、例えば、予め混ぜた中間体を経由し、動物用飼料に加えたり、動物用飲料水で希釈してもよい。
【００７１】
本発明の液体濃縮物は、化合物や誘導体またはその塩を好適に含み、場合により、獣医学的に許容可能な水相溶性溶媒、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、グリセロールホルマールや３０％ｖ／ｖまでのエタノールと混合したような溶媒などを含んでも良い。液体濃縮物は、動物用飲料水に投与してもよい。
【００７２】
本発明を、以下の図面、限定されない実施例を参照して詳細に説明する。
以下の図面を参照して本発明を詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】化合物ＪＪ９１を種々の量で処理したＴ２２  ＲＧＣ−Ｆｏｓ−ｌａｃＺ細胞におけるｐ５３−依存性転写誘導の量を示すグラフである。
【図２】ウェスタンブロット画像を示す。
【図３】ＦＡＣＳ分析グラフである。
【図４】（Ａ）および（Ｂ）は、ウェスタンブロット画像を示す。
【図５】マウスへの化合物投与の結果を示すグラフである。
【図６】ＢＬ２バーキットリンパ腫細胞の生存に対する種々の濃度のＪＪ９１の効果を示すグラフである。
【図７】ＳＣＩＤマウスにおけるＢＬ２バーキットリンパ腫異種移植腫瘍に対するＪＪ９１の効果を示すグラフである。
【図８】ＳｉｒＴ１活性に対するＪＨ１６４の抑制効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
詳細な説明
化合物合成
ここに記載された化合物は、手法１および２を参照し、以下の方法に従って準備された。
【００７５】
手法１を参照し、本発明に記載されたＮ−ベンゾイルチオ尿素類は、種々のベンゾイルクロライド類をアセトン溶媒中、チオシアン酸ナトリウムで処理し、そして所望の化合物を得るためのアニリン類とｉｎ  ｓｉｔｕで反応させ、ベンゾイルイソチオシアネート類を得ることにより、合成した。
【００７６】
【化６】
0005506386.tif 000007
【００７７】
さらに、アシル化またはアルキル化によって機能付与を行った。
【００７８】
具体例として、化合物（ＪＨ１２９）の合成を以下のように行った。
アセトン（２０ｍＬ）中４−ｔｅｒｔ−ブチルベンゾイルクロライド（１０ｍｍｏｌ、１．９７ｇ）の撹拌溶液に、アルゴン雰囲気下で、チオシアン酸ナトリウム（１０ｍｏｌ、０．８１ｇ）を加えた。２時間後、この混合物を、０℃に冷却されたアルゴン下で、アセトン（５０ｍＬ）中１，４−フェニレンジアミン（２０ｍｍｏｌ、２．１６ｇ）溶液に滴下した。周囲温度まで加温後、反応混合物を３６時間攪拌した。混合物を減圧下濃縮し、残渣をジクロロメタン中にとり、濾過し、濾液を濃縮し、シリカゲルカラムでクロマトグラフィにかけ、酢酸エチル−石油エーテル混液で溶出した。生じた固体をジエチルエーテルで粉砕し、分析的に純粋な物質２．４５ｇ（７５％）を得た。分析により以下のデータを得た：ｍｐｔ  １８９−１９１℃；1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１．３６（ｓ，９Ｈ），６．８１（ｍ，２Ｈ），７．４７（ｍ，２Ｈ），７．５４（ｍ，２Ｈ），７．８１（ｍ，２Ｈ），９．０５（ｓ，１Ｈ），１２．４１（ｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ３５０［Ｍ＋Ｎａ］+；Ｃ18Ｈ21Ｎ3ＯＮａＳの計算値３５０．１３００，実測値３５０．１３０３．
【００７９】
さらなる具体例として、以下のようにアシル化によって、化合物ＪＨ１２９をさらに機能付与した。
ジクロロメタン（１ｍＬ）中、ＪＨ１２９（０．２ｍｍｏｌ、６５ｍｇ）の撹拌溶液に、アルゴン雰囲気下で、５−ブロモプロパノイルクロライド（ジクロロメタン０．２ｍＬ中０．２ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。生じた懸濁液に、トリエチルアミン（０．２ｍｍｏｌ、２７μＬ）を加えた。反応混合物を９０分間攪拌し、ジクロロメタン（５ｍＬ）で希釈し、１ＭのＨＣｌ、２ＭのＮａＯＨおよび飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄した。有機層を乾燥（ＭｇＳＯ4）し、灰白色固体になるまで濃縮した。酢酸エチルから再結晶し、分析的に純粋な物質６４ｍｇ（６５％）を得た。分析により以下のデータを得た：ｍｐｔ  １５２−１５３℃；1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１．３６（ｓ，９Ｈ），１．９２（ｍ，４Ｈ），２．４２（ｔ，２Ｈ），３．４６（ｔ，２Ｈ），７．２２（ｓ，１Ｈ），７．５７（ｍ，４Ｈ），７．６８（ｍ，２Ｈ），７．８２（ｍ，２Ｈ），９．０４（ｓ，１Ｈ），１２．６０（ｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ５１２，５１４［Ｍ＋Ｎａ］+；Ｃ23Ｈ2879ＢｒＮ3Ｏ2ＮａＳの計算値５１２．０９８３，実測値５１２．０９９５．
【００８０】
更なる具体例として、化合物ＪＨ１６４ＨＣｌは、式（Ｉ）において、Ｒ1基が、水溶性基に活性化合物を結合するためのリンカー基であると考えられ得る具体的化合物である。ＪＨ１６４の合成およびその塩酸塩の形成は、次のようになされた。
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中、ＪＨ１４０（０．１ｍｍｏｌ、５０ｍｇ）の溶液に、ジメチルアミン水溶液（４０重量％の２ｍＬ）を加えた。二相性の混合物を２０時間攪拌した。有機層を分離し、乾燥（ＭｇＳＯ4）し、エバポレートして、乾固するまで濃縮した。残渣をアセトンに溶解し、この溶液をＨＣｌ蒸気に曝した。生じたＨＣｌ塩を濾過し、純白色固体、３３ｍｇ（６７％）を単離した。分析により以下のデータを得た：ｍｐｔ  ２０５−２０６℃；1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ6−ＤＭＳＯ）δ１．３２（ｓ，９Ｈ），１．６４（ｂｒｓ，４Ｈ），２．３９（ｔ，２Ｈ），２．７５（ｓ，６Ｈ），３．０６（ｔ，２Ｈ），７．６０（ｍ，６Ｈ），７．９４（ｍ，２Ｈ），９．６４（ｂｒｓ，＜１Ｈ），１０．１１（ｓ，１Ｈ），１１．４５（ｓ，１Ｈ），１２．６０（ｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ  ４５５［Ｍ−Ｃｌ］+；Ｃ25Ｈ35Ｎ4Ｏ2Ｓの計算値４５５．２４８１，実測値４５５．２４７７；分析  Ｃ25Ｈ35ＣｌＮ4Ｏ2Ｓの計算値：Ｃ，６１．１４；Ｈ，７．１８；Ｎ，１１．４１％．実測値：Ｃ，６０．７５；Ｈ，７．４６；Ｎ，１１．３０％．
【００８１】
生物学的評価
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験：
材料と方法：
ケムブリッジケミカルス（ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、１６９８１  Ｖｉａ  Ｔａｚｏｎ、Ｓｕｉｔｅ  Ｇ、サンディエゴ、ＣＡ  ９２１２７）から得た３０，０００個の化合物ライブラリー（ＤＩＶＥＲＳｅｔTM）を、ｐ５３腫瘍抑制剤機能の活性化剤についてスクリーニングした。
１次および２次スクリーニングを、以下の細胞ベースのアッセイを用いて行った。
【００８２】
１．１次スクリーニング
Ｌｕ  Ｘ、Ｂｕｒｂｉｄｇｅ  ＳＡ、Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＳおよびＳｍｉｔｈ  ＨＭによりＯｎｃｏｇｅｎｅ．，１３（２）：４１３−８（１９９６年７月１８日）に記載された、ｐ５３−依存性プロモーター支配下でベータ−ガラクトシダーゼを発現するＴ２２  ＲＧＣ−ΔＦｏｓ−ｌａｃＺ細胞を用いた。
・セレクションなしのＤＭＥＭ９０μｌ、１０％ＦＣＳおよびゲンタマイシン１ｍｇ／ｍｌを有する９６ウェル組織培養プレートに１ウェル当たり、１ｘ１０4個の低継代Ｔ２２細胞を播種する。
・細胞播種４８時間後に化合物を加える。ＤＭＳＯは、培地中最終濃度１：１００を超えない。非処理の対照と、アクチノマイシンＤ５ｎｇ／ｍｌで処理したポジティブコントロールを使用する。総量＝１００μｌ
・１８時間後、９６ウェルプレートから培地を除き、１ウェルあたり５０μｌの１倍溶解バッファ（プロメガ）を加える。
・室温で１時間振盪する（すぐに使えるようになるまでプレートを−８０℃で冷凍できる）
・１ウェルあたり１５０μｌのＣＰＲＧ反応混合物を加える。
ＣＰＲＧ反応混合物１５ｍｌの調製
［１５ｍｌの０．１Ｍのリン酸バッファ、ｐＨ７．５
３００μｌのＣＰＲＧ  ４ｍｇ／ｍｌ（ベーリンガー・マンハイム）
８０μｌ（０．１ＭのＭｇＣｌ2／０．１Ｍ  β−メルカプトエタノール）］
・３７℃で４時間湿室中でインキュベートする。色が黄色から桃色に変わると、ｐ５３活性を示す。
・各ウェルから新たな９６ウェルプレートに１００μｌを移す。これは、細胞壊死組織片が、吸光度の読み取りに干渉するのを防止する。プレートリーダーを用いて５７０ｎＭでの吸光度を測定する。
・可溶化液を一晩４℃で放置し、次いで、再び吸光度を測定する。
【００８３】
２．ＦＡＣＳ分析
Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．，１８（５１）：７３７８−８６（１９９９年１２月２日）に、Ｓｍａｒｔ  Ｐ，Ｌａｎｅ  ＥＢ，Ｌａｎｅ  ＤＰ，Ｍｉｄｇｌｅｙ  Ｃ，Ｖｏｊｔｅｓｅｋ  Ｂ，Ｌａｉｎ  Ｓにより開示されている神経芽細胞腫細胞株ＳＫＮＳＨ−ＣＭＶＮｅｏ（ｐ５３機能あり）およびＳＫＮＳＨ−ＤＤｐ５３（不活化ｐ５３）を用いた。
１日目
・６ウェルプレートの１ウェルあたり５０，０００個の細胞をＤＭＥＭ−１０％  ＦＣＳで播種する。
２日目
・薬剤を細胞に加える。
４日目
・ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を３０μＭになるまで加え、２０分間細胞をインキュベートする。
・細胞から培地を除去し、１３ｍｌのファルコンチューブに移す。ＰＢＳで細胞をすすぎ、これも移す。細胞をトリプシン処理し、チューブに移し、次いで最後にＰＢＳで再度すすぐ。一旦チューブに全てを移し、１５００ｒｐｍで５分、細胞をペレット化する。
・１ｍｌのＰＢＳに細胞を再懸濁し、ボルテックスする間、３ｍｌのエタノールに流滴を加える。４℃で最短１〜２時間（上限なし）インキュベートする。
５日目
・２，５００ｒｐｍで５分間の遠心分離によりペレット化し、上澄みを捨てる。
３０ｍＭのＨＣｌ（ｐＨ１．５）中１ｍｇ／ｍｌの濃度で、１チューブあたりペプシン溶液２ｍｌを新たに調製し、３７℃に予め温める。
・予熱したペプシン溶液２ｍｌを各チューブに加え、３７℃で３０分間混合する。
・２，５００ｒｐｍで５分間の遠心分離によりペレット化し、上澄みを捨てる（ペレットは、透明になろう）。
・室温で１５−２０分間１ｍｌの２Ｍ  ＨＣｌを加える（貯蔵瓶は、１１．６Ｍ）。タイミングが重要であり、長時間のインキュベートは、ブロードなＤＮＡピークとなる。ＰＢＳを追加し、前記と同様にペレット化する。
・ＰＢＳで再度次いで抗体緩衝液で一度洗浄し、毎回細胞をペレット化する。
抗体緩衝剤：ＰＢＳ、０．５％のＢＳＡ、０．５％のＴｗｅｅｎ−２０
・抗体緩衝剤中１：５０に希釈されたベクトン・ディッキンソン抗ＢｒｄＵ抗体の２００μＬ中にペレットを再懸濁する。室温で１時間インキュベートする。
・ＰＢＳで洗浄し、細胞をペレット化する。
・抗体緩衝剤中１：６４に希釈されたシグマＦＩＴＣ抗体（＃３００８）の２００μＬ中にペレットを再懸濁する。抗体の消失を予防するために暗所下、室温で３０分間インキュベートする。
・ＰＢＳで洗浄し、細胞をペレット化する。
・２５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム対比染色液を含む５００μＬのＰＢＳ中に最終的なペレットを再懸濁する。ＦＡＣＳｃａｎで分析にかけるまで暗所下氷冷する。
・ＦＡＣＳｃａｎによるＤＮＡ含量の測定（ヨウ化プロピジウム蛍光）およびＤＮＡ合成（ＢｒｄＵ取り込み）
【００８４】
３．ウエスタンブロット法
・６ウェルプレートの１ウェルあたり、２ｘ１０5個のＭＣＦ−７細胞を播種する。
・２４〜３６時間インキュベーション後、細胞に薬剤を加え、必要な時間インキュベートする。
・プレートの培地を捨て、ＰＢＳで洗浄する。ＰＢＳの残りを吸引し１００μｌの１倍ＬＤＳ添加緩衝剤（インビトロジェン）をプレートに直接加える。プレートの表面を片隅へかき取り、細胞／ＬＤＳをピペットでチューブに取る。
・試料を９０℃まで５分間加熱し、次いで各１５秒間を２回超音波処理する。最大速で５分間遠心分離し、必要時まで氷冷する。全ての試料のタンパク質濃度を測定（ピアスＢＣＡキット）し、濃度を均等化する。各試料に１：１０ＤＴＴを加える。
・試料を４〜１２％ノベックス・ゲルに添加し、ＭＯＰＳバッファで１度流し、メーカーの使用説明書（インビトロジェン）に従い、ＰＶＤＦ膜に移す。
・膜をブロックし、標準手順を用い１次、次いで２次抗体でインキュベートし、検出にアマシャムＥＣＬを用いた。
・関連する１次抗体は、抗ｐ５３ＤＯ１マウスモノクローナル抗体、抗ｐ５３ホスホセリン−１５（サンタクルズ）、抗ｐ２１  １１８マウスモノクローナル抗体を含む。負荷対照としてアクチン検出を用いた。
【００８５】
水溶性分析の一般手順
化合物の相対的水溶性は、ＵＶスペクトルに基づく方法を使用して求めた。各化合物の吸光係数の生成は、分光学的グレードのアセトニトリル（１００ｍＬ）中に１ｍｇの化合物（一部の化合物は、最初に最小量のＤＭＳＯに溶解することを要する）を溶解することにより行われる。次いで６ｘ２倍の連続希釈を行い、合計７溶液を得る。これらの溶液をＵＶスペクトルで分析し、適当な波長における吸光度をモル濃度に対しプロットした。吸光係数を最適な線勾配から算出した。次いで吸光係数を、４０ｍＭのＤＭＳＯストックと１００μＭの化合物の水溶液の実際の濃度を計算するのに用いた。
４０ｍＭのＤＭＳＯストックと１００μＭの化合物の水溶液の実際の濃度は、次のように計算した。１ｍｇの化合物を必要量のＤＭＳＯに溶解し、４０ｍＭストックを得た。次いで、不溶の化合物を遠心分離でペレット化した。上澄み（２μＬ）をアセトニトリルで４ｍＬに希釈し、理論上２ｘ１０-5Ｍの溶液を作った。次いで溶液をＵＶスペクトルで分析した。
１００μＭ水溶液の実際の濃度は、４０ｍＭＤＭＳＯ溶液のアリコート（４．２μＬ）を１ｍＬになるまで水で希釈することにより求めた。この溶液のアリコート（６０μＬ）を水（４０μＬ）に加え、不溶の化合物を遠心分離によりペレット化した。上澄み（８０μＬ）をアセトニトリルで４ｍＬになるまで希釈し、理論上２ｘ１０-6Ｍの溶液を作った。次いでこの溶液をＵＶスペクトルで分析した。
次いで水における実験的に測定した水溶性を、理論値（パーセンテージとして）と比較し、テノビン１に対する相対的水溶性値を得た。
【００８６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ脱アセチル化アッセイ
酵素的ＳｉｒＴｌアッセイを、Ｆｌｕｏｒ  ｄｅ  Ｌｙｓ蛍光アッセイシステム（バイオモルキットＡＫ５５５）で精製成分を用い、以下のメーカーの使用説明書に従い行った。ＦｄＬ基質を７＊ＭおよびＮＡＤ＋１ｍＭで用いた。化合物をＤＭＳＯ中、反応において０．２５％より小さい最終ＤＳＭＯ濃度で可溶化した。１反応あたり酵素１単位を用いた。反応は、３７℃で１時間行った。
【００８７】
結果
図１に示される結果は、ＪＪ９１はｐ５３転写因子機能を活性化することを示す。Ｔ２２  ＲＧＣ−ΔＦｏｓ−ｌａｃＺ細胞をＪＪ９１の指示量で１６時間処理した。ｐ５３−依存性転写の誘導率を測定した
図２に示される結果は、ＪＪ９１がｐ５３を活性化して、選択的に神経芽細胞腫細胞を死滅させることを示す。ＳＫＮＳＨ−ＣＭＶＮｅｏおよびＳＫＮＳＨ−ＤＤｐ５３細胞は、非処理にしたまま、あるいは１０μＭのＪＪ９１で４８時間処理した。細胞をＦＡＣＳ分析で分析した。ＪＪ９１は、明らかにＤＮＡ合成と細胞死例を低下させた（ｓｕｂ−Ｇ１／Ｇ０細胞の数を増加）。これらの効果は、非活性化ｐ５３を伴うＳＫＮＳＨ細胞においては、見られない。
図３に示される結果は、ＪＪ９１がｐ５３レベルを増加させることを示す。ＭＣＦ−７細胞を、ＤＮＡ傷害物質であるマイトマイシン  Ｃ（１０μＭ）、非遺伝毒性物質ｎｕｔｌｉｎ−３（６μＭ）やＪＪ９１（１０μＭ）で指示時間処理した。ＪＪ９１は、ｎｕｔｌｉｎ−３と同様の効果を有する。Ｐ５３レベルは、急速に増加する。ｐ５３ホスホセリン−１５のレベルは、遺伝毒性物質であるマイトマイシンＣで見られたほど高くはない。アクチンを増加させるｐ５３の下流の標的ｐ２１のレベルは、負荷対照で分析された。
図４Ａおよび４Ｂに示される結果は、ｐ５３レベルにおけるＪＪ９１類縁物質の効果を示す。
図４Ａ：ＭＣＦ−７細胞を４時間（レーン２から９）または６時間（レーン１１から１５）、１０μＭのマイトマイシンＣ（レーン２）、ＪＪ９１（レーン３および１１）、ＪＨ１１８（レーン４）、ＪＨ１２９（レーン５）、ＪＨ１３２（レーン６）、ＪＨ１４０（レーン７および１２）、ＪＨ１４１（レーン８）および４−アミノアセトアニリド（レーン９）、ＪＨ１５１（レーン１３）、ＪＨ１５６（レーン１４）および５４０６０８５（レーン１５）で処理した。レーン２とレーン１０において、細胞を非処理とした。細胞抽出液をｐ５３、ホスホセリン−１５  ｐ５３、ｐ２１およびアクチンに対する抗体で、ウエスタンブロット法により分析した。
図４Ｂ：ＭＣＦ−７細胞を、４時間（レーン２から６）６μＭのｎｕｔｌｉｎ−３（レーン２）、１０μＭのＪＪ９１（レーン３）、１０μＭの７３２２３６６（レーン４）、４０ｎＭのレプトマイシンＢ（レーン５）および２０μＭのＭＧ１３２  ＪＨ１２９で処理した。細胞抽出液を、ｐ５３、アクチン、ｐ２１、病原性毒素およびｍｄｍ２に対する抗体でウエスタンブロット法により分析した。
【００８８】
表１は、活性化合物の構造、および化合物ＪＪ９１活性を１００％とし、示された化合物によるＴ２２  ＲＧＣ−ΔＦｏｓ−ｌａｃＺ細胞におけるｐ５３−依存性転写に関する活性レベルを示す。
【００８９】
【表１】
0005506386.tif 000008
【００９０】
【表２】
0005506386.tif 000009
【００９１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ実験
図５に関し、ＪＪ９１をマウスに５ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。◆と□は、それぞれｉ．ｐ．とｐ．ｏ．の投与ルートに対応する（挿入図は、データの対数プロットを示す。）。血中濃度は、上記のＬＣ−ＭＳ／ＭＳで示される時点において測定し、示される値は、３つの測定値の±ＳＤを意味する。結果は、化合物の腹膜内注射が、血中でマイクロモル濃度に達し、顕著な体重や行動変化を起こさず、約１．３時間の半減期を有することを示す。
図６に関し、ＢＬ２バーキットリンパ腫細胞を、１μＭ〜１０μＭの範囲の指示濃度のＪＪ９１（７０％シクロデキストリンに溶解）で２時間処理した。このとき、生存細胞の数をカウントした。この短い暴露のあと、細胞を洗浄し、化合物を除去した。この処理は、６日間毎日繰り返した。実験を三回実施し、標準偏差を示した。図６に示されるように化合物への６回の短い暴露のあと、ＢＬ２細胞の生存は、大きく減少した。
図７に関し、ＳＣＩＤマウスにおけるＢＬ２バーキットリンパ腫異種移植腫瘍を腫瘍が触知できるまで７日間樹立した。このとき、ビヒクル（７０％シクロデキストリン）（上段パネル）およびＪＪ９１（９２ｍｇ／ｋｇ）（下段パネル）を毎日腹膜内注射で投与した。腫瘍サイズを、注射した日（１日目）および注射後４、８および１１日目で測定した。示されるように、ＪＪ９１は、ＳＣＩＤマウスにおけるＢＬ２異種移植腫瘍の成長を低下させる。
ＳｉｒＴ１活性を、メーカーにより特定されるバイオモルのＦｌｕｏｒ  ｄｅ  Ｌｙｓ  ＳｉｒＴ１蛍光活性アッセイ（カタログ番号ＡＫ−５５５）を用いて評価した。反応は、１ミリモルのＮＡＤ＋、７マイクロモルのＦｌｕｏｒ  ｄｅ  Ｌｙｓ基質および過量のＪＨ１６４を含んだ。脱アセチル化と展開液反応を３７℃で１時間行った。ＪＨ１６４のＩＣ50は、２３．５マイクロモルである。図８はＳｉｒＴ１に対するＪＨ１６４の抑制効果を示す。
上記態様は、本発明の代表的なものであり、請求の範囲に定義された発明の範囲を制限すると解釈されるものではない。
【００９２】
更なる化合物は、初期の化合物ＪＪ９１（以後、テノビン１と称する）に基づき、合成される。
【００９３】
【化７】
0005506386.tif 000010
【００９４】
調製された追加の化合物は、４つのカテゴリーに分類される。
カテゴリー１：水溶性類縁物質
ａ）テノビン６（ＪＨ１６４）：中間体ＪＨｌ４０から調製
ＪＨ１４０は、可逆的にｐ５３を活性化するこれまでに調製された他の化合物全てとは異なり、非可逆的ｐ５３活性化を示すことから、潜在的に興味深い。その合成は、テノビン６の手順中、以下に説明される。
化合物１  上記
化合物５〜８  上記
【００９５】
下記手法１で示されるこれらの化合物の実験的合成
【化８】
0005506386.tif 000011
【００９６】
b
手法１：a テノビン６および類縁物質１、５〜７の合成
試薬と条件：（ｉ）ＳＯＣｌ2、ＣＨ2Ｃｌ2、室温１６時間（９６％）。（ｉｉ）ＮａＳＣＮ、アセトン、室温、８時間、次いで１，４−フェニレンジアミン、１６時間（５８％）。（ｉｉｉ）酸塩化物、ＮＥｔ3、ＤＣＭ、室温。（ｉｖ）４０％  ＨＮＭｅ2水溶液、ＤＣＭ／Ｈ2Ｏ、室温、２４時間。（ｖ）２Ｍ  ＨＣｌ（ジエチルエーテル中）。
【００９７】
テノビン１（ＪＪ９１）：Ｎ−｛４−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−チオウレイド］−フェニル｝−アセトアミドの合成
アセトン（５０ｍＬ）中、３（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８５、２０７、８９８に記載の２から調製）の溶液（６．５３ｇ、３３ｍｍｏｌ、１当量）に、チオシアン酸ナトリウム（２．６９ｇ、３３ｍｍｏｌ、１当量）を加えた。クリーム色の懸濁液を室温で１６時間攪拌し、次いで、アセトン（５０ｍＬ）中、ｐ−アミノアセトアニリドの溶液（４．９５ｇ、３３ｍｍｏｌ、１当量）を加えた。黄色懸濁液を室温で１６時間攪拌し、溶媒を減圧下濃縮し、淡橙色残渣を得、それをＣＨ2Ｃｌ2中に再懸濁し、不溶性固体を濾過した。濾液を減圧下濃縮し、淡橙色固体を得、それを酢酸エチルから再結晶することにより精製し、テノビン１（７．４９ｇ、６１％）を淡黄色固体として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（アセトン−ｄ6，３００ＭＨｚ）δ１．３６（ｓ，９Ｈ，（ＣＨ3）3），２．０９（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3），７．６３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，ＡｒＨ），７．７１（ｓ，６Ｈ，ＡｒＨ），８．０３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，ＡｒＨ），９．２６（ｓ（ｂｒ），１Ｈ，ＮＨ），１０．１２（ｓ（ｂｒ），１Ｈ，ＮＨ），１２．８０（ｓ（ｂｒ），１Ｈ，ＮＨ）．
13Ｃ−ＮＭＲ（アセトン−ｄ6，１００ＭＨｚ）δ２３．３６，２９．７０，３０．４０，３４．８３，１１８．９５，１２４．１４，１２５．７１，１２８．１５，１２９．３６，１３３．３１，１３７．８２，１５７．００，１６７．９７，１７８．７３．
【００９８】
中間体化合物１：（４−アミノ−フェニル）−３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−チオ尿素（４）の合成
アセトン（３０ｍＬ）中、３（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８５、２０７、８９８に記載の２から調製）の溶液（４ｇ、２０．４ｍｍｏｌ、１当量）に、チオシアン酸ナトリウム（１．６８ｇ、２０．８ｍｍｏｌ、１．０２当量）を加えた。生じた淡黄色懸濁液を室温で８時間攪拌し、次いで、０℃でアセトン（３０ｍＬ）中１,４−フェニレンジアミン溶液（４．４１ｇ、４０．８ｍｍｏｌ、２当量）を加えた。
褐色懸濁液を室温まで加温し、１６時間撹拌した。溶媒を減圧下濃縮し、残った残渣をＣＨ2Ｃｌ2に再懸濁し、不溶性固体を濾過した。濾液を減圧下濃縮し、褐色固体を得、シリカのカラムクロマトグラフィにより精製（５０％酢酸エチル／石油エーテル）し、続いて酢酸エチルから再結晶により４（４．４２ｇ、５８％）を淡黄色固体として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，３００ＭＨｚ）δ１．３６（ｓ，９Ｈ，（ＣＨ3）3，３．７５（ｓ（ｂｒ），２Ｈ，ＮＨ2），６．７１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，ＡｒＨ），７．４９（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６，３３．４Ｈｚ，ＡｒＨ），７．８１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，ＡｒＨ），７．６８（ｄｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．６，８１．３Ｈｚ，ＡｒＨ），９．０２（ｓ（ｂｒ），１Ｈ，ＮＨ），１２．３７（ｓ（ｂｒ），１Ｈ，ＮＨ）．
13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１００ＭＨｚ）δ３１．１，３５．０，１１５．１，１２５．８，１２６．２，１２７．４，１２８．７，１２８．８，１４５．４，１５７．７，１６６．８，１７８．５．
【００９９】
中間体ＪＨｌ４０からのテノビン６（ＪＨｌ６４）：５−ジメチルアミノ−ペンタン酸｛４−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−チオウレイド］−フェニル｝−アミド塩酸塩の合成
ＣＨ2Ｃｌ2（１１０ｍＬ）中、チオ尿素４（６ｇ、１８．３ｍｍｏｌ、１当量）をＮ2雰囲気下で攪拌した。５−ブロムワレリルクロライド（３．６５ｇ、１８．３ｍｍｏｌ、１当量）、続いてトリエチルアミン（２．５１ｍＬ、１８．３ｍｍｏｌ、１当量）を加えた。ベージュ色の懸濁液を室温で４時間攪拌し、ＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍＬ）で希釈した。有機溶液を１Ｍの塩酸水溶液（１ｘ５０ｍＬ）、１０％水酸化ナトリウム水溶液（１ｘ５０ｍＬ）、および飽和塩水（１ｘ５０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ4で乾燥し、減圧下濃縮した。生じた褐色泡をシリカのフラッシュクロマトグラフィで精製（５０％酢酸エチル／石油エーテル）し、５−ブロモ−ペンタン酸｛４−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−チオウレイド］−フェニル｝−アミド（中間体ＪＨ１４０）（６．７６ｇ、７７％）を黄色粉末として得た。
【０１００】
【化９】
0005506386.tif 000012
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，３００ＭＨｚ）δ１．３６（ｓ，９Ｈ，（ＣＨ3）3），１．９３（ｍ，４Ｈ，（ＣＨ2）2），２．４２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，ＣＯＣＨ2），1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ）ｐｐｍ  ３．４５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，ＣＨ2Ｂｒ），７．２２（ｓ（ｂｒ），１Ｈ，ＮＨ），７．５７（ｍ，４Ｈ，ＡｒＨ），７．６８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），７．８２（ｍ，２Ｈ，ＡｒＨ），９．０５（ｓ（ｂｒ），１Ｈ，ＮＨ），１２．６０（ｓ（ｂｒ），１Ｈ，ＮＨ）．
13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１００ＭＨｚ）δ２４．６，２７．７，３１．１，３２．５，３３．６，３７．４，１１９．９，１２４．９，１２６．３，１２７．４，１２８．６，１３３．６，１５７．９，１６６．９，１７０．９，１７８．４．
【０１０１】
上記ブロモ化合物（中間体ＪＨ１４０）（２．３６ｇ、４．８０ｍｍｏｌ）のＨ2Ｏ（７５ｍＬ）中のジメチルアミン（３０ｍＬ）との処理により、５−ジメチルアミノ−ペンタン酸｛４−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−チオウレイド］−フェニル｝−アミドを含む粗混合物を得た。この混合物を最小量のアセトンに溶解し、黄色沈殿が生じるまで、エーテル溶液中、２Ｍ塩酸を滴下した。固体を濾過し、粗混合物を得、エタノールから再結晶することにより精製し、テノビン６（１．４ｇ、５９％）を黄色固体として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6，３００ＭＨｚ）δ１．３３（ｓ，９Ｈ，（ＣＨ3）3），１．６６（ｍ，４Ｈ，（ＣＨ2）2），２．４０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，ＣＯＣＨ2），２．７５（ｓ，６Ｈ，Ｎ（ＣＨ3）2），３．０６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2ＮＨ（ＣＨ3）2），７．５９（ｍ，６Ｈ，ＡｒＨ），７．９５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，ＡｒＨ），９．７７（ｓ（ｂｒ），１Ｈ，ＮＨ（ＣＨ3）2），１０．１３（ｓ（ｂｒ），１Ｈ，ＮＨ），１１．４３（ｓ（ｂｒ），１Ｈ，ＮＨ），１２．６１（ｓ（ｂｒ），１Ｈ，ＮＨ）．
13Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6，７５ＭＨｚ）δ２２．４，２３．８，３１．３，３５．３，３５．９，４２．５，５６．７，１１９．５，１２５．３，１２５．８，１２９．１，１２９．７，１３３．３，１３７．９，１５６．８，１６８．５，１７１．２，１７９．４．
ＨＲＭＳ実測値４５５．２４７７（Ｃ17Ｈ39Ｎ6Ｏ4Ｓ2の計算値４５５．２４７４）．
【０１０２】
化合物１：５−モルホリン−４−イル−ペンタン酸  ｛４−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−チオウレイド］−フェニル｝−アミド塩酸塩（１）の合成
アセトニトリル（４ｍＬ）中、５−ブロモ−ペンタン酸｛４−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−チオウレイド］−フェニル｝−アミド（中間体ＪＨ１４０、テノビン６に記載の通り調製）（８０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）の溶液に、モルホリン（０．４ｍＬ）およびヨウ化カリウム（触媒量）を加えた。反応混合物を４０分間加熱還流し、室温まで冷却し、減圧下濃縮した。残った残渣を、７５％飽和炭酸水素ナトリウム水溶液とＣＨ2Ｃｌ2間で分配した。有機層をＭｇＳＯ4で乾燥し、減圧下濃縮し、ベージュ色の粗固体を得た。ＥｔＯＡｃから再結晶により精製し、５−モルホリン−４−イル−ペンタン酸｛４−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−チオウレイド］−フェニル｝−アミドを得、蒸気拡散により塩酸塩に変換した。２５％ＣＤＣｌ3／ジエチルエーテル中ジメチルアミンの溶液を、塩化水素に曝し、１を白色沈殿として得、濾過により集めた。
ＨＲＭＳ実測値４９７．２５８５（Ｃ27Ｈ37Ｎ4Ｏ3Ｓの計算値．４９７．２５８６）．
【０１０３】
化合物５：Ｎ−｛４−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−チオウレイド］−フェニル｝−４−ジメチルアミノ−ブチルアミド塩酸塩（５）の合成
チオ尿素４（２００ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ、１当量）をＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍＬ）中、Ｎ2雰囲気下で攪拌した。４−ブロモブチリルクロライド（１６９ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ、１．５当量）、続いてトリエチルアミン（８５μＬ、０．６１ｍｍｏｌ、１当量）を加えた。橙色溶液を室温で１．５時間攪拌し、ＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍＬ）で希釈した。有機溶液を１Ｍ塩酸水溶液（１ｘ１０ｍＬ）、１０％水酸化ナトリウム水溶液（１ｘ５０ｍＬ）、および飽和塩水（１ｘ１０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ4で乾燥し、減圧下濃縮した。生じた淡黄色泡をシリカ（５０％酢酸エチル／石油エーテル）のフラッシュクロマトグラフィにより精製し、４−ブロモ−Ｎ−｛４−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−チオウレイド］−フェニル｝−ブチルアミド（１３８ｍｇ、４８％）を黄色オイルとして得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，３００ＭＨｚ）δ１．３５（ｓ，９Ｈ，（ＣＨ3）3），２．２６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＨ2Ｂｒ），２．５７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，ＣＨ2），３．５２（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，ＣＨ2），７．６０（ｍ，６Ｈ，ＡｒＨ），７．８２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，ＡｒＨ），９．０８（ｓ（ｂｒ），１Ｈ，ＮＨ），１２．５９（ｓ（ｂｒ），１Ｈ，ＮＨ）．
【０１０４】
前記ブロモ化合物（１３８ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を、Ｈ2Ｏ（７．５ｍＬ）中、ジメチルアミン（３ｍＬ）で処理し、Ｎ−｛４−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−チオウレイド］−フェニル｝−４−ジメチルアミノ−ブチルアミドを含有する粗混合物を得た。この混合物を最小量のアセトンに溶解し、エーテル溶液中、２Ｍ塩酸を沈殿が生じるまで滴下した。固体を濾過し、濾液を減圧下濃縮した。生じた黄色オイルをヘキサンで研和し、黄色固体を得、イソプロパノールから再結晶し、５（７５ｍｇ、５５％）を粘性黄色固体として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6，３００ＭＨｚ）δ１．３２（ｓ，９Ｈ，（ＣＨ3）3），１．９５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），２．４４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，ＣＨ2），２．７９（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，Ｎ（ＣＨ3）2），３．０９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），７．６２（ｍ，６Ｈ，ＡｒＨ），７．９５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，ＡｒＨ），９．６４（ｓ（ｂｒ），１Ｈ，ＮＨ（ＣＨ3）2），１０．１７（ｓ（ｂｒ），１Ｈ，ＮＨ），１１．４４（ｓ（ｂｒ），１Ｈ，ＮＨ），１２．６１（ｓ（ｂｒ），１Ｈ，ＮＨ）．
【０１０５】
化合物６：６−ジメチルアミノ−ヘキサン酸｛４−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−チオウレイド］−フェニル｝−アミド塩酸塩（６）の合成
チオ尿素４（２００ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ、１当量）をＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍＬ）中、Ｎ2雰囲気下で攪拌した。６−ブロモヘキサノイルクロリド（１９５．８ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ、１．５当量）、続いてトリエチルアミン（８５μＬ、０．６１ｍｍｏｌ、１当量）を加えた。
ベージュ色の懸濁液を室温で１．５時間攪拌し、ＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍＬ）で希釈した。有機溶液を１Ｍ塩酸水溶液（１ｘ１０ｍＬ）、１０％水酸化ナトリウム水溶液（１ｘ５０ｍＬ）、および飽和塩水（１ｘ１０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ4で乾燥し、減圧下濃縮した。生じた褐色の泡をシリカ（５０％酢酸エチル／石油エーテル）のフラッシュクロマトグラフィにより精製し、６−ブロモ−ヘキサン酸｛４−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−チオウレイド］−フェニル｝−アミド（１６６ｍｇ、５５％）を黄色オイルとして得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，３００ＭＨｚ）δ１．３５（ｓ，９Ｈ，（ＣＨ3）3），１．５１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），１．７３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），１．８９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），２．３６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，ＣＯＣＨ2），３．４０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，ＣＨ2Ｂｒ），７．５７（ｍ，７Ｈ，ＡｒＨ，ＮＨ），９．１０（ｓ（ｂｒ），１Ｈ，ＮＨ），１２．５８（ｓ（ｂｒ），１Ｈ，ＮＨ）．
【０１０６】
前記ブロモ化合物（１３６ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）をＨ2Ｏ（６．２５ｍＬ）中、ジメチルアミン（２．５ｍＬ）で処理することにより、６−ジメチルアミノ−ヘキサン酸｛４−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−チオウレイド］−フェニル｝−アミドを含有する粗混合物を得た。この混合物を最小量のＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、エーテル溶液中、２Ｍ塩酸を、クリーム色の沈殿が生じるまで滴下した。固体を濾過し、濾液を減圧下濃縮した。生じた黄色オイルをヘキサンで研和し、黄色固体を得、イソプロパノールから再結晶し、６（８０ｍｇ、５９％）を粘性黄色固体として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6，３００ＭＨｚ）δ１．３２（ｓ，９Ｈ，（ＣＨ3）3），１．６４（ｍ，４Ｈ，（ＣＨ2）2），２．３５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，ＣＨ2），２．７３（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，Ｎ（ＣＨ3）2），３．０１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），７．５９（ｍ，６Ｈ，ＡｒＨ），７．９４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，ＡｒＨ），９．８３（ｓ（ｂｒ），１Ｈ，ＮＨ（ＣＨ3）2），１０．０８（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１１．４２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．５９（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）．
【０１０７】
化合物７：８−ジメチルアミノ−オクタン酸｛４−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−チオウレイド］−フェニル｝−アミド塩酸塩（７）の合成
８−ブロモオクタン酸（２ｇ、８．９０ｍｍｏｌ、１当量）をＣＨ2Ｃｌ2（１５ｍＬ）中、Ｎ2雰囲気で攪拌し、塩化チオニル（７８４μＬ、１０．６８ｍｍｏｌ、１．２当量）、続いて、ＤＭＦ（数滴）を加えた。溶液を１６時間攪拌し、減圧下濃縮して８−ブロモオクタノイルクロライド（２．０４ｇ、９５％）を黄色オイルとして得、さらなる精製をせずに用いた。チオ尿素４（６００ｍｇ、１．８４ｍｍｏｌ、１当量）を、ＣＨ2Ｃｌ2（１５ｍＬ）中、Ｎ2雰囲気下で攪拌した。８−ブロモオクタノイルクロライド（５３２ｍｇ、２．０２ｍｍｏｌ、１．２当量）、続いてトリエチルアミン（２５６μＬ、１．８４ｍｍｏｌ、１当量）を加えた。ベージュ色の懸濁液を室温で１６時間攪拌し、ＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍＬ）で希釈した。有機溶液を１Ｍ塩酸水溶液（１ｘ２０ｍＬ）、１０％水酸化ナトリウム水溶液（１ｘ２０ｍＬ）、および飽和塩水（１ｘ２０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ4で乾燥し、減圧下濃縮した。生じた黄色の泡をシリカ（５０％酢酸エチル／石油エーテル）のフラッシュクロマトグラフィで精製し、８−ブロモ−オクタン酸｛４−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−チオウレイド］−フェニル｝−アミド（５７９ｍｇ、５９％）を黄色オイルとして得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，４００ＭＨｚ）δ１．３６（ｓ，９Ｈ，（ＣＨ3）3），１．４４（ｍ，６Ｈ，（ＣＨ2）3），１．７４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），１．８６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），２．３７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，ＣＯＣＨ2），３．４１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，ＣＨ2Ｂｒ），７．１８（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．５６（ｍ，６Ｈ，ＡｒＨ），７．６３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ＡｒＨ），７．８２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，ＡｒＨ），９．０４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．５９（１Ｈ，ＮＨ）．
13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，７５ＭＨｚ）δ２５．５，２８．０，２８．６，２９．１，３１．１，３２．７，３４．０，３７．６，１２０．１，１２４．８，１２６．２，１２７．５，１２８．６，１３３．４，１３６．８，１５７．８，１６７．０，１７１．６，１７８．５．
【０１０８】
前記ブロモ化合物（４８７ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ）をＨ2Ｏ（２５ｍＬ）中、ジメチルアミン（１０ｍＬ）で処理することにより、８−ジメチルアミノ−オクタン酸｛４−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−チオウレイド］−フェニル｝−アミドを含有する粗混合物を得た。この混合物を最小量のＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、エーテル溶液中、２Ｍ塩酸をクリーム色の沈殿が生じるまで滴下した。固体を濾過し、濾液を減圧下濃縮した。生じた黄色オイルをヘキサンで研和し、黄色固体を得、イソプロパノールから再結晶し、７（３０１ｍｇ、６２％）を粘性黄色固体として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6，４００ＭＨｚ）δ１．３２（ｓ，９Ｈ，（ＣＨ3）3），１．３２（ｍ，６Ｈ，ＣＨ2）3），１．６２（ｍ，４Ｈ，（ＣＨ2）2），２．３３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），２．７２（ｓ（ｂｒ），６Ｈ，Ｎ（ＣＨ3）2），２．９９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），７．６２（ｍ，６Ｈ，ＡｒＨ），７．９７（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．５，１６．５Ｈｚ，ＡｒＨ），９．９５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１０．０８（ｓ（ｂｒ），１Ｈ，ＮＨ），１１．４４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．６０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）．
【０１０９】
化合物８：Ｎ−｛４−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−チオウレイド］−フェニル｝−２−［２−（２−｛２−［２−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−アセトアミド塩酸塩（８）の合成
【０１１０】
【化１０】
0005506386.tif 000013
【０１１１】
類縁物質８の合成
試薬と条件：（ｉ）ＪＯＣ  ２００４、６９、６３９に記載された文献反応により調製。（８７％）（ｉｉ）ＣｒＯ3／Ｈ2ＳＯ4、アセトン、０℃から室温、１６時間（６５％）。（ｉｉｉ）ＳＯＣｌ2、ＣＨ2Ｃｌ2、室温、１６時間。（ｉｖ）４、ＮＥｔ3、ＣＨ2Ｃｌ2、室温、１６時間、（４６％）。（ｖ）ＬｉＢｒ、アセトン、還流、２４時間（８１％）。（ｖｉ）４０％ＨＮＭｅ2水溶液、ＣＨ2Ｃｌ2／Ｈ2Ｏ、室温、２４時間（９１％）。（ｖｉｉ）ジエチルエーテル中２ＭのＨＣｌ、ＣＨ2Ｃｌ2、（７３％）。
【０１１２】
ベンゼンスルホン酸  ２−［２−（２−｛２−［２−（２−ヒドロキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エチルエステル（１２）
ヘキサエチレングリコール（１１）（２．８２ｇ、１０ｍｍｏｌ、１当量）を、Ｎ2雰囲気下、ＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬ）に溶解し、酸化銀（３．４８ｇ、１５ｍｍｏｌ、１．５当量）、続いて塩化トシル（２．１０ｇ、１１ｍｍｏｌ、１．１当量）およびヨウ化カリウム（３３２ｍｇ、２ｍｍｏｌ、０．２ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を室温で１時間攪拌し、次いで、濃縮し、セライトを通じて濾過し、酢酸エチルで溶出した。濾液を減圧下濃縮し、淡黄色オイルを得、シリカ（酢酸エチル）のカラムクロマトグラフィで精製し、１２（３．７９ｇ、８７％）を淡黄色オイルとして得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6，３００ＭＨｚ）δ１．８０（ｓ（ｂｒ），１Ｈ，ＯＨ），２．４４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3），３．６４（ｍ，２２Ｈ，（ＣＨ2）11），４．１５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），７．３３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，ＡｒＨ），７．７９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，ＡｒＨ）．
【０１１３】
［２−（２−｛２−［２−（２−ベンゼンスルホニルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−酢酸（１３）
１．５Ｍ硫酸水溶液（１０ｍＬ）を０℃に調製し、三酸化クロムを加えて撹拌し、橙色溶液を得た。アルコール１２（１ｇ、２．２９ｍｍｏｌ）をアセトン（１５ｍＬ）に溶解し、その溶液を硫酸に０℃で滴下した。混合物を室温まで温め、１６時間撹拌した。生じた緑色の溶液をセライトで濾過し、減圧下濃縮した。生じた水溶性の残渣をＨ2Ｏで希釈し、ＣＨ2Ｃｌ2（３ｘ５０ｍＬ）で抽出した。有機相をＭｇＳＯ4で乾燥し、減圧下濃縮し、１３（６７２ｍｇ、６５％）を淡黄色オイルとして得、更なる精製は行わなかった。
1Ｈ−ＮＭＲ（アセトン−ｄ6，３００ＭＨｚ）δ２．４６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3），３．５９（ｍ，１８Ｈ，（ＣＨ2）9），４．１３（ｍ，４Ｈ，（ＣＨ2）2），７．４９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，ＡｒＨ），７．８２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）．
13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１００ＭＨｚ）δ２１．６，６８．５，６８．６，６８．８，６９．１，６９．３，７０．３，７０．４，７０．４，７０．５，７０．６，７０．６，７０．７，７０．８，７１．２，７１．３，７６．８，７７．１，７７．４，１２７．９，１２９．９，１３２．９，１４４．９，１７２．７．
ＬＲＭＳ（Ｍ＋Ｎａ）実測値４７３．１６．
【０１１４】
Ｎ−｛４−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−チオウレイド］−フェニル｝−２−［２−（２−｛２−［２−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−アセトアミド塩酸塩（８）
酸１３（１１７ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を、触媒量のＤＭＦを含有する塩化オキサリル中で攪拌した。溶液を１時間加熱還流し、次いで、室温に冷却し、溶媒を減圧下濃縮し、対応する酸塩化物を得、更なる精製を行わずに用いた。酸塩化物（１３８ｍｇ、０．２９、１．３当量）を乾燥ＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍＬ）中、Ｎ2雰囲気下で攪拌し、チオ尿素４（７４ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ、１当量）を加え、明黄色溶液を得た。トリエチルアミン（４１μＬ、０．２３ｍｍｏｌ、１当量）を加え、混合物を室温で１６時間撹拌した。溶液をＣＨ2Ｃｌ2（１ｘ１０ｍＬ）で希釈し、１Ｍ塩酸水溶液（１ｘ１０ｍＬ）、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、続いて飽和塩水（１ｘ１０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ4で乾燥し、溶媒を減圧下濃縮した。生じた黄色の泡をシリカ（５０％酢酸エチル／石油エーテル）のフラッシュクロマトグラフィで精製し、トルエン−４−スルホン酸  ２−［２−（２−｛２−［２−（｛４−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−チオウレイド］−フェニルカルバモイル｝−メトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エチルエステル（７９ｍｇ、４６％）を黄色オイルとして得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，３００ＭＨｚ）δ１．３４（ｓ，９Ｈ，（ＣＨ3）3），２．４１（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3），３．６３（ｍ，１８Ｈ，（ＣＨ2）9），４．１０（ｍ，４Ｈ，（ＣＨ2）2），７．３１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，ＡｒＨ），７．５３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，ＡｒＨ），７．６７（ｍ，４Ｈ，ＡｒＨ），７．７９（ｍ，ｍ，４Ｈ，ＡｒＨ），８．９９（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），９．１５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．６１（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）．
13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１００ＭＨｚ）δ２１．７，３１．１，３５．３，６８．７，６９．３，７０．１，７０．４，７０．５，７０．６，７０．７，７１．２，１２０．２，１２４．６，１２６．１，１２６．２，１２７．５，１２７．９，１２８．６，１２９．８，１３３．７，１３６．１，１４４．８，１５７．８，１６６．８９，１６８．４，１７８．３．
ＨＲＭＳ（Ｍ＋Ｎａ）実測値７８２．２７５６（Ｃ37Ｈ49Ｎ3Ｏ10ＮａＳ2の計算値７８２．２７５７）．
【０１１５】
上記に記載されたトシレート（７６ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、１当量）をアセトン（３ｍＬ）中で攪拌し、臭化リチウム（４４ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ、５当量）を加えた。混合物を５０℃で２４時間加熱した。溶媒を減圧下濃縮し、生じた残渣を酢酸エチルに再懸濁し、固体を濾過した。濾液を減圧下濃縮し、２−［２−（２−｛２−［２−（２−ブロモ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−Ｎ−｛４−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−チオウレイド］−フェニル｝−アセトアミド（５４ｍｇ、８１％）を淡黄色オイルとして得、更なる精製を行わずに用いた。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，３００ＭＨｚ）δ１．３６（ｓ，９Ｈ，（ＣＨ3）3），３．４５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，ＣＨ2Ｂｒ），３．７１（ｍ，１６Ｈ，（ＣＨ2）8），４．１８（ｓ，２Ｈ，ＮＨＣＯＣＨ2），７．５５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，ＡｒＨ），７．７０（ｑ，４Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，ＡｒＨ），７．８２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，ＡｒＨ），９．０６（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），９．１６（ｓ（ｂｒ），１Ｈ，ＮＨ），１２．６１（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）．
【０１１６】
続いてこの臭化物（３０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を、４０％ジメチルアミン水溶液（０．７５ｍＬ）、Ｈ2Ｏ（１．８ｍＬ）およびＣＨ2Ｃｌ2（２ｍＬ）中、室温で２４時間撹拌することによりジメチルアミン誘導体に変換した。反応混合物をＣＨ2Ｃｌ2  （２０ｍＬ）で希釈し、有機相をＨ2Ｏ（１ｘ１０ｍＬ）、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１ｘ１０ｍＬ）および飽和塩水（１ｘ１０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ4で乾燥し、溶媒を減圧下濃縮し、ジメチルアミン体を得た。淡黄色オイルを最少量のＣＨ2Ｃｌ2にとり、ジエチルエーテル中２Ｍ塩酸溶液を、わずかな沈殿が生じるまで滴下した。混合物を減圧下濃縮し、８（２０ｍｇ、７３％）を黄色の泡として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，３００ＭＨｚ）δ１．３２（ｓ，９Ｈ，（ＣＨ3）3），２．７７（ｄ（ｂｒ），６Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，ＮＨ（ＣＨ3）2），３．６１（ｍ，１８Ｈ，（ＣＨ2）9），４．１０（ｍ，４Ｈ，（ＣＨ2）2），７．６３（ｍ，６Ｈ，ＡｒＨ），７．９５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，ＡｒＨ），９．５５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），９．７７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１１．４５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．６２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）．
【０１１７】
カテゴリー２：オキソ−テノビン類縁体、化合物２４
以下の手法に従い２４を調製した。
【０１１８】
【化１１】
0005506386.tif 000014
【０１１９】
｛４−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−ウレイド］−フェニル｝−カルバミン酸  ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２８）
上記に記載されたとおり、ベンズアミド２６（１ｇ、５．６４ｍｍｏｌ、１当量）を塩化オキサリル（８３４μＬ、９．５９ｍｍｏｌ、１．７当量）と反応させた。生じたイソシアネート（２７）を、アニリン１８と共に乾燥アセトニトリル中で素早く撹拌し、３時間加熱還流した。生じたベージュ色の懸濁液を室温まで冷却し、沈殿を濾過により集め、２８（４００ｍｇ、１７％）をベージュ色の固体として得、さらに精製しなかった。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6，３００ＭＨｚ）δ１．３１（ｓ，９Ｈ，（ＣＨ3）3），１．４７（ｓ，９Ｈ，ＯＣ（ＣＨ3）3），７．４３（ｍ，４Ｈ，ＡｒＨ），７．５５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，ＡｒＨ），７．９７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，ＡｒＨ），９．３１（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１０．７７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１０．９１（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）．
【０１２０】
５−ブロモ−ペンタン酸  ｛４−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−ウレイド］−フェニル｝−アミド（２９）
Ｎ−アシル尿素２８（３００ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（１．２ｍＬ）中、４０分間攪拌し、減圧下濃縮し、１−（４−アミノ−フェニル）−３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−ウレア（トリフルオロ酢酸塩として）（３８３ｍｇ、定量的）を褐色な綿状の固体として得、更なる精製をしなかった。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6，３００ＭＨｚ）δ１．３０（ｓ，９Ｈ，（ＣＨ3）3），７．３２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，ＡｒＨ），７．５５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，ＡｒＨ），７．７０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ＡｒＨ），７．９８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，ＡｒＨ），１０．９６（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１１．０２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）．
【０１２１】
脱保護したアミン（３６８ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ）を乾燥ＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍＬ）中、Ｎ2雰囲気下で攪拌し、ＮＥｔ3（９８μＬ、０．７０ｍｍｏｌ）を加え、清明な褐色溶液を得た。５−ブロムワレリルクロライド（１４０μＬ、１．０５ｍｍｏｌ、１．５．当量）、続いてトリエチルアミン（９８μＬ、０．７０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１６時間攪拌し、次いでＣＨ2Ｃｌ2（１ｘ２０ｍＬ）で希釈し、１Ｍ塩酸水溶液（１ｘ２０ｍＬ）、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１ｘ２０ｍＬ）および飽和塩水（１ｘ２０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ4で乾燥し、減圧下濃縮し、粗黄色チョーク質の固体を得、シリカ（５０％酢酸エチル／石油エーテル）のカラムクロマトグラフィで精製し、２９（１５３ｍｇ、４８％）を黄色固体として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6，３００ＭＨｚ）δ１．３１（ｓ，９Ｈ，（ＣＨ3）3），１．８０（ｍ，４Ｈ，（ＣＨ2）2），２．３３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＯＣＨ2），３．５７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，ＣＨ2Ｂｒ），７．５４（ｍ，６Ｈ，ＡｒＨ），７．９８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，ＡｒＨ），９．９０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１０．８２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１０．９３（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）．
【０１２２】
５−ジメチルアミノ−ペンタン酸  ｛４−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−ウレイド］−フェニル｝−アミド塩酸塩（２４）
ブロモ化合物２９（１２３ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍＬ）、４０％ＨＮＭｅ2水溶液（３ｍＬ）およびＨ2Ｏ（７．５ｍＬ）中、室温で２０時間攪拌した。反応混合物をＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍＬ）で希釈し、Ｈ2Ｏ（１ｘ１０ｍＬ）、１０％ＮａＯＨ水溶液（１ｘ１０ｍＬ）、および飽和塩水（１ｘ１０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ4で乾燥し、減圧下濃縮し、クリーム色の固体を得、アセトンに溶解し、ジエチルエーテル中２Ｍ塩酸で処理した。白色沈殿を得、濾過により単離し、２４（４４ｍｇ、３６％）をクリーム色の粉末として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6，４００ＭＨｚ）δ１．３１（ｓ，９Ｈ，（ＣＨ3）3），１．６４（ｍ，４Ｈ，（ＣＨ2）2），２．３６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，ＣＯＣＨ2），２．７５（ｓ，６Ｈ，ＮＨ（ＣＨ3）2），３．０５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2Ｂｒ），７．５３（ｍ，６Ｈ，ＡｒＨ），７．９８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，ＡｒＨ），９．６３（ｓ（ｂｒ），１Ｈ，ＮＨ），９．９８（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１０．８２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１０．９３（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）．
【０１２３】
カテゴリー３：Ｂｏｃ−テノビン類縁体、化合物２１
この類縁物質は、以下に示すｐ５３活性化アッセイにおいて、非常に良好な活性を示したので、重要な化合物である。
【０１２４】
｛４−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−チオウレイド］−フェニル｝−カルバミン酸  ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２１）
アセトン（１５ｍＬ）中３（８６９μＬ、４．７９ｍｍｏｌ、１当量）の撹拌溶液に、Ｎ2雰囲気下、チオシアン酸ナトリウム（３８９ｍｇ、４．７９ｍｍｏｌ、１当量）を加え、反応混合物を室温で４時間撹拌した。アニリン１８（１ｇ、４．７９ｍｍｏｌ、１当量）をアセトン（１０ｍＬ）中に溶液として加えた。生じたベージュ色の懸濁液を室温で１６時間攪拌し、溶媒を減圧下濃縮した。残った残渣を、ＣＨ2Ｃｌ2に再懸濁し、不溶の固体を濾過した。濾液を減圧下濃縮し、クリーム色の粗固体を得、５０％酢酸エチル／石油エーテルから再結晶することにより精製し、｛４−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−チオウレイド］−フェニル｝−カルバミン酸  ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１．４ｇ、６６％）を金色微粉末として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，３００ＭＨｚ）δ１．３６（ｓ，９Ｈ，（ＣＨ3）3），１．６３（ｓ，９Ｈ，ＯＣ（ＣＨ3）3），６．５２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．４２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，ＡｒＨ），７．５５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，ＡｒＨ），７．６４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，ＡｒＨ），８．８２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，ＡｒＨ），９．０３（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．５６（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）．
【０１２５】
カテゴリー４：テノビン類に基づく親和性マトリックス
このタイプの試薬として、テノビン類に基づく親和性マトリックスの調製が含まれ、テノビン類の可能性のあるタンパク質標的や、サーチュインタンパク質ファミリーやその他の範囲の抑制剤の選択性のアッセイにおいて、可能性のある関連物質（例えばＭｅｉｊｅｒ，Ｌａｕｒｅｎｔ；Ｓｋａｌｔｓｏｕｎｉｓ，Ａｌｅｘｉｏｓ−Ｌｅａｎｄｒｏｓ；Ｍａｇｉａｔｉｓ，Ｐｒｏｋｏｐｉｏｓ；Ｐｏｌｙｃｈｒｏｎｏｐｏｕｌｏｓ，Ｐａｎａｇｉｏｔｉｓ；Ｋｎｏｃｋａｅｒｔ，Ｍａｒｉｅ；Ｌｅｏｓｔ，Ｍａｒｙｓｅ；Ｒｙａｎ，Ｘｉａｏｚｈｏｕ  Ｐ．；Ｖｏｎｉｃａ，Ｃｌａｕｄｉａ  Ａｌｉｎ；Ｂｒｉｖａｎｌｏｕ，Ａｌｉ；Ｄａｊａｎｉ，Ｒａｎａ；Ｃｒｏｖａｃｅ，Ｃｌａｕｄｉａ；Ｔａｒｒｉｃｏｎｅ，Ｃａｔａｌｄｏ；Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ，Ａｎｄｒｅａ；Ｒｏｅ，Ｓ．Ｍａｒｋ；Ｐｅａｒｌ，Ｌａｕｒｅｎｃｅ；Ｇｒｅｅｎｇａｒｄ，Ｐａｕｌ．「古代紫インディルビン類から誘導されるＧＳＫ−３−選択的な抑制剤」Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００３），１０（１２），１２５５−１２６６により報告される以下の類縁物質プロトコール）を同定するのに重要である。親和性マトリックスを調製する手順は次のとおりである。
【０１２６】
親和性樹脂の使用
【０１２７】
【化１２】
0005506386.tif 000015
【０１２８】
６−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−ヘキサン酸（３１）
６−アミノヘキサン酸（３．１ｇ、２３．６３ｍｍｏｌ、１当量）を、ジオキサン／Ｈ2０（１：１、７５ｍＬ）中、０℃で水酸化ナトリウム（１．０５ｇ、２３．６３ｍｍｏｌ）と共に攪拌した。この溶液に、Ｂｏｃ無水物（５．２ｇ、２１．２７ｍｍｏｌ、０．９当量）を加え、反応を１６時間室温まで温めた。反応混合物を１Ｍ塩酸水溶液でｐＨ５まで酸性にした。混合物をＣＨ2Ｃｌ2（３ｘ５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機相をＭｇＳＯ4で乾燥し、減圧下濃縮し、３１を無色のオイル（４．５ｇ、８９％）として得、更なる精製を行わなかった。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，３００ＭＨｚ）δ１．４２（ｍ，４Ｈ，（ＣＨ2）2），１．４４（ｓ，９Ｈ，（ＣＨ3）3），１．６５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），２．３５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，ＣＨ2），３．１０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），４．５５（ｓ，（ｂｒ），１Ｈ，ＮＨ）．
【０１２９】
（５−｛４−［３−（４−tｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−チオウレイド］−フェニルカルバモイル｝−ペンチル）−カルバミン酸  ｔｅｒｔ−ブチルエステル（３２）
チオ尿素４（１００ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ、１当量）を乾燥ＣＨ2Ｃｌ2（５ｍＬ）中、Ｎ2雰囲気下で攪拌し、酸３１（１０６ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ、１．５当量）、続いてブロモ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（２１４ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ、１．５当量）、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５３μＬ、０．３１ｍｍｏｌ、１当量）を加えた。反応混合物を室温で１６時間攪拌し、次いで、ＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍＬ）で希釈し、１Ｍ塩酸水溶液（１ｘ１０ｍＬ）、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１ｘ１０ｍＬ）、および飽和塩水（１ｘ１０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ4で乾燥し、減圧下濃縮し、粗黄色オイルを得、シリカ（２５〜５０％酢酸エチル／石油エーテル）のカラムクロマトグラフィで精製し、３２（８６ｍｇ、５４％）を無色のオイルとして得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，３００ＭＨｚ）δ１．３６（ｓ，９Ｈ，（ＣＨ3）3），１．４０（ｓ，９Ｈ，ＯＣ（ＣＨ3）3），１．４０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），１．５２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），１．７５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），２．３６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，ＣＨ2），３．１２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），４．６１（ｓ（ｂｒ），１Ｈ，ＮＨＢｏｃ），７．５４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，ＡｒＨ），７．６２（ｍ，４Ｈ，ＡｒＨ），７．８２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，ＡｒＨ），９．０９（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．５９（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）．
ＬＲＭＳ（Ｍ＋Ｎａ）実測値５６３．１５．
【０１３０】
６−アミノ−ヘキサン酸｛４−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾイル）−チオウレイド］−フェニル｝−アミドトリフルオロ酢酸塩（３３）
Ｂｏｃ保護されたアミン３２（２０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（１ｍＬ）およびトリフルオロ酢酸（１６６μＬ）中、室温で３０分間攪拌した。減圧下濃縮し、３３を淡黄色オイルとして得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，３００ＭＨｚ）δ１．２９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2）１．３０（ｓ，９Ｈ，（ＣＨ3）3），１.５９（ｍ，４Ｈ，（ＣＨ2）2），２．２８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），２．９０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），７．６０（ｍ，６Ｈ，ＡｒＨ），７．７５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，ＡｒＨ），８．７５（ｓ（ｂｒ），１Ｈ，ＮＨ），９．２１（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．５０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）．
【０１３１】
親和性樹脂（Ａｆｆｉｇｅｌ−１５）への３３の固定化
Ａｆｆｉｇｅｌ−１５（ＢｉｏＲａｄ）（１ｍＬ）を冷イソプロパノールで洗浄し、濾過した。Ａｆｆｉｇｅｌ（２１０ｍｇ）に、ジオキサン（１ｍＬ）、３３（２ｍｇ）および過剰のトリエチルアミンを加えた。さらにジオキサンを加え、総量を１．５ｍＬに調節した。混合物を４℃で２４時間撹拌し、次いで３０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。母液をデカントし、新鮮なジオキサンを加え、混合物を振盪した。遠心分離し、２回デカントした。
【０１３２】
上記に記載された化合物の活性および水溶性を試験し、結果を表２に示す。
【０１３３】
【表３】
0005506386.tif 000016
表２活性データ：a細胞ベースのアッセイにおいて類縁物質がｐ５３を活性化する活性化能の順序．この形式は、定量化が困難なｐ５３活性化アッセイに選択的に用いられている。ｎ．ｄ．＝測定せず
【図１】
0005506386.tif 000023
【図２】
0005506386.tif 000024
【図３】
0005506386.tif 000025
【図４】
0005506386.tif 000026
【図５】
0005506386.tif 000027
【図６】
0005506386.tif 000028
【図７】
0005506386.tif 000029