(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造式Ｉに示すラパマイシン炭酸エステル化合物又はその薬学的に受容可能な塩において、
【化１】
0005394493.tif 000046
Ｉ
式中、Ｒ１とＲ２は、各々独立に、Ｈ又は、
【化２】
0005394493.tif 000047
であり、且つＲ１、Ｒ２同時にＨではなく、
その中、ｎは１〜６の整数であり、Ｒ３は、
【化３】
0005394493.tif 000048
又は
【化４】
0005394493.tif 000049
であり、Ｒ４、Ｒ５とＲ６は、各々独立に、Ｈ、炭素数１〜６のヒドロキシアルキル基、炭素数１〜６のアルキル基又は炭素数２〜６のアルケニル基であり、Ｒ７とＲ８は、各々独立に、Ｈ又は炭素数１〜６のアルキル基である、
ラパマイシン炭酸エステル化合物又はその薬学的に受容可能な塩。
【請求項２】
請求項１に記載の構造式Ｉに示すラパマイシン炭酸エステル化合物又はその薬学的に受容可能な塩において、
ｎは１〜４の整数であり、Ｒ３は、
【化５】
0005394493.tif 000050
又は
【化６】
0005394493.tif 000051
であり、
その中、Ｒ４、Ｒ５とＲ６が、各々独立に、Ｈ又は炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基であり、Ｒ７とＲ８が、各々独立に、炭素数１〜４のアルキル基である、
ことを特徴とするラパマイシン炭酸エステル化合物又はその薬学的に受容可能な塩。
【請求項３】
請求項２に記載の構造式Ｉに示すラパマイシン炭酸エステル化合物又はその薬学的に受容可能な塩において、
ｎは１〜２の整数であり、Ｒ３は、
【化７】
0005394493.tif 000052
又は
【化８】
0005394493.tif 000053
であり、
その中、Ｒ７とＲ８は、各々独立に、炭素数１〜４のアルキル基である、
ことを特徴とするラパマイシン炭酸エステル化合物又はその薬学的に受容可能な塩。
【請求項４】
請求項３に記載の構造式Ｉに示すラパマイシン炭酸エステル化合物又はその薬学的に受容可能な塩において、
前記化合物が以下のいずれかである、
【化９】
0005394493.tif 000054
【化１０】
0005394493.tif 000055
【化１１】
0005394493.tif 000056
【化１２】
0005394493.tif 000057
ことを特徴とするラパマイシン炭酸エステル化合物又はその薬学的に受容可能な塩。
【請求項５】
請求項１に記載の構造式Ｉに示すラパマイシン炭酸エステル化合物又はその薬学的に受容可能な塩において、
前記Ｒ３の中にキラル中心を有する場合、前記ラパマイシン炭酸エステル化合物又はその薬学的に受容可能な塩が光学異性体又は光学異性体の混合物である、
ことを特徴とするラパマイシン炭酸エステル化合物又はその薬学的に受容可能な塩。
【請求項６】
請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の構造式Ｉに示すラパマイシン炭酸エステル化合物の製造方法であって、
Ｒ１、Ｒ２が同じく、
【化１３】
0005394493.tif 000058
で、Ｒ３が、
【化１４】
0005394493.tif 000059
又は
【化１５】
0005394493.tif 000060
である場合、以下の方法により製造する：
構造式１に示すアルコールが、p−トルエンスルホン酸の触媒作用で、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の溶媒中において、カルボニル化合物Ｒ７ＣＯＲ８又はそのアセタール化合物と反応し、構造式２に示すアルコールを得て、
アルカリにより、トリホスゲンが構造式２に示したアルコールと反応し、アシルクロリド３を形成し、
更に、アルカリにより該アシルクロリド３がラパマイシンと反応し、Ｒ３が、
【化１６】
0005394493.tif 000061
である３１位、４２位の二置換ラパマイシン炭酸エステル化合物を得て、
更に、該ラパマイシン炭酸エステル化合物を加水分解することにより、Ｒ３が、
【化１７】
0005394493.tif 000062
であるラパマイシン炭酸エステル化合物を得て、
その反応式が以下であり、
【化１８】
0005394493.tif 000063
式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８の定義が引用した請求項の記載と同様であり、
或いは、
Ｒ１とＲ２が異なり、それぞれＨ又は、
【化１９】
0005394493.tif 000064
であり、Ｒ３が、
【化２０】
0005394493.tif 000065
又は
【化２１】
0005394493.tif 000066
である場合、以下の方法で製造する：
適切な比例のイミダゾールとクロロトリメチルシラン（ＴＭＳＣｌ）の存在下で、ジクロロメタン、ジクロロエタン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトニトリル又はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を溶媒として、ラパマイシンとクロロトリメチルシランとを反応させ、３１位のみ保護する生成物Ｒａｐａｍｙｃｉｎ−３１−ＯＴＭＳ（トリメチルシリルオキシ）を得て、
Ｒａｐａｍｙｃｉｎ−３１−ＯＴＭＳの４２位のヒドロキシ基をｔｅｒｔ−ブチルジメチルクロロシラン（ＴＢＳＣｌ）により保護してから、安定性の悪い３１位での保護基を脱離させることにより、４２位のみ保護するＲａｐａｍｙｃｉｎ−４２−ＯＴＢＳ（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）を得て、
その反応式は以下であり、
【化２２】
0005394493.tif 000067
Ｒａｐａｍｙｃｉｎ−３１−ＯＴＭＳが直接にアシルクロリド（式３）
【化２３】
0005394493.tif 000068
と反応し、４２位をエステル化する生成物を得て、更に３１位のシリル系保護基を脱離させた後、対応する４２位をモノエステル化したラパマイシン炭酸エステル化合物を得て、又は、４２位のみ保護する生成物Ｒａｐａｍｙｃｉｎ−４２−ＯＴＢＳとアシルクロリド
（式３）
【化２４】
0005394493.tif 000069
とを反応させ、３１位をエステルした化生成物が得られ、更に４２位のシリル系保護基を脱離させ、対応する３１位のみモノエステル化したラパマイシン炭酸エステル化合物を得る、
ことを特徴とするラパマイシン炭酸エステル化合物の製造方法。
【請求項７】
抗腫瘍活性及び抗癌活性又は免疫抑制活性を有する薬剤組成物であって、
活性成分として治療有効量の一種又は数種の請求項１に記載の構造式Ｉに示すラパマイシン炭酸エステル化合物又はその薬学的に受容可能な塩と、一種又は数種の薬学的に受容可能なキャリアとを含む、
ことを特徴とする薬剤組成物。
【請求項８】
請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の構造式Ｉに示すラパマイシン炭酸エステル化合物又はその薬学的に受容可能な塩の、抗腫瘍薬及び／又は抗癌薬或いは免疫抑制薬の製造における使用。
【請求項９】
請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の構造式Ｉに示すラパマイシン炭酸エステル化合物又はその薬学的に受容可能な塩の、ヒト横紋筋肉腫、前立腺癌、非小細胞肺癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肺腺癌、子宮頸癌又は白血病の治療薬の製造における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物化学領域に属し、具体的に、新規な構造を有するラパマイシン炭酸エステル類似体（Rapalogs）又はその薬学的に受容可能な塩、及び該化合物を含む薬剤組成物に関する。また、本発明は、該化合物の製造方法、該化合物の抗腫瘍薬及び／又は抗癌薬或いは免疫抑制薬の研究における用途にも関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、細胞の異常増殖及び転移を特徴とする一種の疾病であり、すでに人間の健康を脅かす疾病の一つとなっている。世界保健機関（WHO）の統計によれば、世界において癌の新規患者が毎年六百万人に達している。中国において、癌はすでに脳血管疾患に次ぐ致死性病因となっている。
【０００３】
現在、臨床に良く使用されている抗腫瘍薬が主に細胞毒性薬剤であり、選択性が悪く、毒性副作用が強く、耐薬性を生じやすいなどの欠点が存在する。近年のゲノム工学技術、分子腫瘍学及び分子薬理学に関する研究の著しい発展に伴い、細胞癌化の本質が細胞シグナル伝達の失調にあり、大部分の腫瘍のシグナル伝達経路の活性が高すぎて、細胞が無限に増殖することが認知されてきている。細胞シグナル伝達分子は、新型抗腫瘍薬を探すための重要な切り口であり、一部の腫瘍細胞の分化増殖に相関する細胞シグナル伝達経路の重要な酵素を薬品に作用させて標的のスクリーニングを行い、選択的に標的に作用する効果的、且つ毒性の低く、特異性の強い新型抗腫瘍薬を発見することがすでに現在の抗腫瘍薬の研究開発の新しい方向とされている。
【０００４】
ＰＩ３Ｋ−ｍＴＯＲシグナル経路は、最も重要なチロシンキナーゼシグナル伝達の手段の一つである。ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）がリン酸化によりプロティンキナーゼＢ（PKB）を活性化させ、後者が哺乳類動物のラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）をリン酸化させて活性化させる。ｍＴＯＲは、直接的又は間接的に多数の細胞増殖及び成長に相関するプロセスの調節に関与し、細胞増殖の中心的な役割を果たすと認識されている。多くの研究結果によると、腫瘍細胞において、ＰＩ３Ｋ− ｍＴＯＲシグナル経路が異常な伝達を示し、腫瘍の発生及び発展において重要な役割を果たしている。従って、該経路を遮断し、特にｍＴＯＲの活性を抑制することにより、特異的に腫瘍細胞の成長を抑制できる。ＰＩ３Ｋ− ｍＴＯＲシグナル伝達経路は、すでに有望な抗腫瘍治療の標的となっている。
【０００５】
ラパマイシン（Ｒａｐａｍｙｃｉｎ）は、一種のトリエンマクロライド抗生物質であり、シロリムス（Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ）とも呼ばれる。１９７５年にＷｙｅｔｈ  Ａｙｅｒｓｔ実験室によりRapanui島で分離したストレプトマイセス・ハイグロスコピカスを発酵させて初めて得られ、抗菌活性を有するとともに、効果的な免疫抑制薬としてすでに臨床治療に用いられている。最近の研究により、ラパマイシンがｍＴＯＲの特異性抑制剤として明らかな抗腫瘍活性を有することが証明された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、約１ｎｇ／ｍｌのラパマイシンだけで、明らかに横紋筋肉腫細胞の成長を抑制できる。世界中の多数の研究室による研究においても、Ｒａｐａｍｙｃｉｎが良い腫瘍治療候補薬品であると支持されている。横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、膠芽腫、髄芽腫、小細胞肺癌などの腫瘍細胞に対して、強い抑制作用を有し、また腫瘍細胞の成長に対する抑制がｍＴＯＲと結合する結果であることが確認されている。ラパマイシンが前臨床段階において良い抗癌活性を示しているが、そのマクロライドの低水溶性と化学安定性の理由で、臨床開発が制限されている。
【０００６】
近年、各大企業により数種のｍＴＯＲの腫瘍標的治療に用いるラパマイシン類似体を開発されている。その中、代表的なものとして、Ｗｙｅｔｈ社により開発されたＣＣＩ−７７９（ＴｅｍＲａｐａｍｙｃｉｎ）、Ｎｏｖａｒｔｉ社により開発されたＲＡＤ−００１（Ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ）、及びＡｒｉａｄ社のＡＰ２３５７６である。これらの類似物はラパマイシンと類似な抗腫瘍作用を有し、かつ薬理学的な性質が改善され、明らかな毒性副作用も有しない。ＣＣＩ−７７９が静脈注射に適用でき、すでに末期腎臓癌患者の臨床治療に用いられている。ＲＡＤ−００１は経口用として、小細胞肺癌などに対する治療が第二相臨床試験段階まできている。現在ＡＰ２３５７６の血液癌及び固形癌に対する治療は第三相臨床試験段階であり、良い製薬の可能性を示している。従って、ラパマイシンを母体として構造の改造を行うことで、高い応用価値を有し、効果的、低毒性、且つ特異性の強い抗腫瘍薬を発見することが期待されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ラパマイシンの３１位と４２位のヒドロキシ基に対して構造修飾又は改造を行うことにより、一連の体内外の抗腫瘍及び／又は抗癌活性或いは免疫抑制活性を有し、かつ新規な構造を備えるラパマイシン炭酸エステル類似体を合成した。水溶性、体内外の薬剤効果、経口バイオアベイラビリティ、薬物代謝などの方面の考察によると、更に研究を進める価値があり、抗腫瘍薬に用いられ、又は免疫抑制薬の候補薬として研究開発する価値があることが判明された。従って、本発明の一つの目的は、一種の新規構造を有するラパマイシン炭酸エステル類似物又は薬学的に受容可能な塩を提供することである。
【０００８】
本発明のもう一つの目的は、前述ラパマイシン炭酸エステル類似体又はその薬学的に受容可能な塩を活性成分とする薬剤組成物を提供することである。
【０００９】
本発明のもう一つの目的は、抗腫瘍及び／又は抗癌薬或いは免疫抑制薬の製造における前述ラパマイシン炭酸エステル類似体又はその薬学的に受容可能な塩の用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明で提供されたラパマイシン炭酸エステル類似体は構造式Ｉに示す構造を有しており、
【化１】
0005394493.tif 000002
ここで、Ｒ１とＲ２は、各々独立に、Ｈ又は、
【化２】
0005394493.tif 000003
であり、且つＲ１、Ｒ２同時にＨではなく、その中ｎは１〜６の整数であり、Ｒ３は、
【化３】
0005394493.tif 000004
又は
【化４】
0005394493.tif 000005
であり、Ｒ４、Ｒ５とＲ６は、各々独立にＨ、炭素数１〜６のヒドロキシアルキル基、炭素数１〜６のアルキル基又は炭素数２〜６のアルケニル基であり、Ｒ７とＲ８が、各々独立にＨ又は炭素数１〜６のアルキル基である。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態において、前述Ｒ１とＲ２は、各々独立に、Ｈ又は、
【化５】
0005394493.tif 000006
であり、且つＲ１、Ｒ２は同時にＨではなく、その中、ｎは１〜４の整数であり、Ｒ３は、
【化６】
0005394493.tif 000007
又は
【化７】
0005394493.tif 000008
であり、Ｒ４、Ｒ５とＲ６が、各々独立に、Ｈ、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基であり、Ｒ７とＲ８が、各々独立に、炭素数１〜４のアルキル基である。
【００１２】
本発明の好ましい実施形態において、前述Ｒ１とＲ２は、各々独立に、Ｈ又は、
【化８】
0005394493.tif 000009
であり、且つＲ１、Ｒ２は同時にＨではなく、その中、ｎは１〜２の整数であり、宜しくはＲ３が、
【化９】
0005394493.tif 000010
又は
【化１０】
0005394493.tif 000011
であり、Ｒ７とＲ８が炭素数１〜４のアルキル基である。
【００１３】
更に、本発明の代表的な化合物が以下の化合物の何れかである：
【化１１】
0005394493.tif 000012
【化１２】
0005394493.tif 000013
【化１３】
0005394493.tif 000014
【化１４】
0005394493.tif 000015
【００１４】
本発明のラパマイシン炭酸エステル類似体又はその薬学的に受容可能な塩において、前述Ｒ３の中にキラル中心を含有する場合、前述ラパマイシン炭酸エステル類似体又はその薬学的に受容可能な塩は、各種の光学異性体又は光学異性体の混合物であっても良い。
【００１５】
本発明は、構造式Ｉに示すラパマイシン炭酸エステル類似体の製造方法を提供する。即ち、Ｒ１、Ｒ２が同じく
【化１５】
0005394493.tif 000016
であり、Ｒ３が
【化１６】
0005394493.tif 000017
又は
【化１７】
0005394493.tif 000018
である場合、以下の方法により製造できる。
【００１６】
構造式１に示すアルコールは、ｐ−トルエンスルホン酸の触媒作用で、ＤＭＳＯ、ＤＭＦなどの溶媒中において、カルボニル化合物Ｒ７ＣＯＲ８又はそのアセタール化合物（アセトン、２，２−ジメトキシプロパンなど）と反応し、構造式２に示すアルコールが得られる。アルカリにより、トリホスゲンが構造式２に示したアルコールと反応し、アシルクロリド３を形成する。また、アルカリにより、該アシルクロリド３がラパマイシンと反応し、Ｒ３が
【化１８】
0005394493.tif 000019
である、３１位、４２位の二置換ラパマイシン炭酸エステル類似体を得る。更に、該ラパマイシン炭酸エステル類似体を加水分解することにより、Ｒ３が
【化１９】
0005394493.tif 000020
であるラパマイシン炭酸エステル類似体が得られる。
【００１７】
反応式は以下のようである：
【化２０】
0005394493.tif 000021
式中、化合物１は市販で入手でき、例えば、国薬集団化学試材有限公司（Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd．）、Aldrich社等から購入できる。
【００１８】
更に具体的に、アルコール１はオルト位の二つのヒドロキシ基の保護により、アルコール２を得る。ＤＭＡ、ＤＭＦ、アセトニトリル、ジクロロメタン又はテトラヒドロフラン溶媒において、ピリジン、トリエチルアミン又はジイソプロピルアミンなどのアルカリ性条件で、アルコール２がトリホスゲンと反応し、アシルクロリド３を得る。次に、ＤＭＡ、ＤＭＦ、アセトニトリル、ジクロロメタン又はテトラヒドロフラン溶媒において、ピリジン、トリエチルアミン、ＤＭＡＰ又はジイソプロピルアミンなどのアルカリ性条件で、ラパマイシンがアシルクロリド３と反応し、３１位及び４２位をエステル化された、ラパマイシン炭酸エステル類似体を得る。その中、ラパマイシンは福建科瑞薬業公司（Fujian Kerui Pharmaceutical Co., Ltd．）から購入できる。
【００１９】
一方、本発明のラパマイシン炭酸エステル類似体において、Ｒ１とＲ２が異なり、各々独立に、Ｈ又は、
【化２１】
0005394493.tif 000022
であり、Ｒ３が
【化２２】
0005394493.tif 000023
又は
【化２３】
0005394493.tif 000024
である場合、ラパマイシンの３１位、４２位のヒドロキシ基の選択的保護により、異なる一置換又は二置換の炭酸エステル類似体が得られても良い。しかし、ラパマイシンが３１位及び４２位において二つの第２級アルコール基を有するため、選択的にラパマイシンの４２位又は３１位でのモノエステル化を実現することが以前から困難であった。米国特許第６，２７７，９８３号に二段階で４２位のモノエステル化合物の製造方法を記載したが、実際の操作性が悪く、且つ長時間及び低温条件が必要である。本発明者は、米国特許第６，２７７，９８３号の方法を実施したとき、反応過程においてラパマイシンがすぐラパマイシンの３１位、４２位の二置換生成物に変化することを発見した。また、本発明者は、時間の延長とともに、前述二置換生成物が反応条件で、更にラパマイシン３１位の一置換生成物及び一部のラパマイシン生成物と変化することを発見した。ＴＬＣにより反応過程を追跡し、反応時間を制御することにより、ラパマイシンの３１位のみ置換された生成物の製造が可能となる。
【００２０】
本発明者は、適切な比例のイミダゾールとクロロトリメチルシランを用い、ジクロロメタン、ジクロロエタン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、アセトニトリル又はＤＭＦなどを溶媒として使用し、ラパマイシンにより室温条件で高速的、且つ効率的に３１位のみ保護された生成物Ｒａｐａｍｙｃｉｎ−３１−ＯＴＭＳを得た。それに基づき、４２位のヒドロキシ基をＴＢＳにより保護してから、安定性の悪い３１位でのシリル系保護基を脱離させる方法により、４２位のみ保護するＲａｐａｍｙｃｉｎ−４２−ＯＴＢＳを得ることが可能である。
【００２１】
反応式が以下のようである。
【化２４】
0005394493.tif 000025
【００２２】
式中、Ｒａｐａｍｙｃｉｎ−３１−ＯＴＭＳの製造において、該反応の溶媒がジクロロメタン、ジクロロエタン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドであり、反応温度が０℃〜４０℃であり、反応時間は２〜４８時間である。反応中のラパマイシン：イミダゾール：クロロトリメチルシランの適切な当量比は１：５〜３０：２〜６であり、最も宜しい当量比は、１：１０〜１５：２〜４である。
【００２３】
続いて、Ｒａｐａｍｙｃｉｎ−３１−ＯＴＭＳが直接アシルクロリド３、
【化２５】
0005394493.tif 000026
と反応し、４２位をエステル化する生成物が得られ、３１位の保護基を脱離させた後、対応する４２位をモノエステル化したラパマイシン炭酸エステル類似体が得られる。
【００２４】
４２位のみ保護する生成物Ｒａｐａｍｙｃｉｎ−４２−ＯＴＢＳとアシルクロリド３、
【化２６】
0005394493.tif 000027
と反応させ、３１位をエステルした生成物を得て、４２位の保護基を脱離させた後、対応する３１位のみモノエステル化したラパマイシン炭酸エステル類似体を得る。
【００２５】
本発明のラパマイシン炭酸エステル類似体の薬学的に受容可能な塩は、本発明のラパマイシン炭酸エステル類似体から通常の方法により製造できる。
【００２６】
本発明の薬剤組成物は、治療的有効量の活性成分としての一種又は数種の本発明に記載のラパマイシン炭酸エステル類似体又はその薬学的に受容可能な塩と、一種又は数種の薬学的に受容可能なキャリアとを含む。
【発明の効果】
【００２７】
一方、本発明者は実験により、本発明のラパマイシン炭酸エステル類似体又はその薬学的に受容可能な塩が、ラパマイシンより明らかに高い抗腫瘍又は抗癌活性を有し、薬理学及び薬物代謝学の性質が良く、ヒト横紋筋肉腫、前立腺癌、非小細胞肺癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肺腺癌、子宮頸癌又は白血病を治療するための薬剤の製造に応用できることを発見した。また、本発明のラパマイシン炭酸エステル類似体又はその薬学的に受容可能な塩は、ラパマイシンの水溶性を改善したほか、ラパマイシンに相当又はそれより優れた免疫抑制活性を維持している。
【００２８】
本発明で提供された抗腫瘍化合物は、各種の腫瘍細胞及び／又は癌細胞に有効に対抗でき、且つラパマイシンに比べ、ヒドロキシ基などの水溶性、極性基を導入することにより、水溶性が増強され、薬学的な性質が改善されている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験中に、異なる腫瘍株における実験により、抗腫瘍活性が明らかにラパマイシンより優れていることを示された（表４−８及び図３−９を参照）。細胞レベルの研究により、Ｙ５０がＲｈ３０、ＰＣ−３、ＭＣＦ−７、ＣＡＫＩ−１及びＨＬ−６０腫瘍細胞の成長に対して、ラパマイシンに相当する抑制作用を有しており（図１に示す）、Ｙ５０が濃度依存的にＲｈ３０、ＰＣ−３、ＭＣＦ−７及びＣＡＫＩ−１細胞中のｍＴＯＲの下流因子のリン酸化促進能力を抑制でき、同濃度でその抑制能力がラパマイシンに相当している（図２に示す）ことが判明された。ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）の結果によると（表４及び図９に示す） 、１）ラパマイシン、ＣＣＩ−７７９、Ｙ５０及びＹ３１はいずれも濃度依存的にＦＫＢＰ１２と結合できる。ラパマイシンと比べると、同濃度でＹ５０及びＹ３１がラパマイシンより高いＲＵ（Response Unit）を有し、同濃度のＹ５０及びＹ３１とＦＫＢＰ−１２の結合がラパマイシンより強い、  ２）Ｙ５０及びＹ３１とＦＫＢＰ１２の結合が飽和に達するまで必要な濃度がラパマイシンより低い、３）Ｙ５０とＹ３１のＦＫＢＰ１２との解離速度がラパマイシンより低く、同様にＣＣＩ−７７９よりも低く、Ｙ５０及びＹ３１の解離係数がラパマイシン及びＣＣＩ−７７９より低い。動物実験の研究により、Ｙ５０の経口投与がヒト横紋筋肉腫ＲＨ−３０異種移植マウスの移植腫に対して、明らかにラパマイシンより優れた成長抑制作用を有する（表５及び図３から図４）。Ｙ５０の経口投与によりヒト前立腺癌ＰＣ−３異種移植マウスの移植腫に対する成長抑制作用も、明らかにラパマイシンより優れる（表６及び図５から図６に示す）。そのＴ／Ｃがそれぞれ１０．０％と４０．２％であり、陽性対照としてのラパマイシンの同用量群に対応するＴ／Ｃがそれぞれ３０．９％と４６．５％であった。Ｙ３１の経口投与は、ヒト骨肉腫Ｕ２ＳＯ異種移植マウスの移植腫の成長に対して、明らかな成長抑制作用を有する。低用量群（２．５ｍｇ／ｋｇ）の場合、ＣＣＩ−７７９及びラパマイシンは、ヒト骨肉癌Ｕ２ＳＯ異種移植マウスの移植腫の成長に対して、明らかな抑制作用を有さず、そのＴ／Ｃ値がそれぞれ６９．０％、６０．０％であった。なお、低用量（２．５ｍｇ／ｋｇ）の場合、化合物Ｙ３１が該腫瘍の成長に対する抑制作用が明らかにラパマイシン及びＣＣＩ−７７９より優れている（表８及び図８に示す）。
【００２９】
本発明で提供された化合物を更に研究するための抗腫瘍実験中に、該化合物及びラパマイシンは、市販しているラパマイシン類似体ＣＣＩ−７７９と比べると、Ｙ３１がより良い薬物動態パラメータを示している（表９〜１２及び図１０〜１２に示す）。これは、ヒドロキシ基などの水溶性、極性基を導入することと関係する可能性がある。特に、Ｙ３１を投与した後、薬物が腫瘍組織での選択的吸収が一番良かった（表１２及び図１２に示す）。実験によると、マウスにＹ３１を投与した後、体内で迅速に代謝物ラパマイシン（Ｒａｐａｍｙｃｉｎ）と変化し、血漿及び組織中のプロトタイプ薬の濃度が低く、最大濃度が２０ｎｇ／ｍｌ（又はｎｇ／ｇ）未満で、薬剤を投与してから５時間でプロトタイプ薬を検出できなかった。Ｙ３１を投与した後、血漿、肝臓、及び腫瘍中に、Ｒａｐａｍｙｃｉｎの暴露量とＲａｐａｍｙｃｉｎ投与群の比率がそれぞれ１．２２、１．３２、１．９３であった。
【００３０】
本発明のラパマイシン炭酸エステル類似体の薬学的に受容可能な塩は、前述の抗腫瘍活性及び優れた薬物動態パラメータを示すだけではなく、ラパマイシンに相当する又はそれより優れた免疫抑制活性も保持している。ラパマイシンを対照として、化合物Ｙ３１ を例として系統的免疫抑制活性実験を行った（結果を表１３〜１５及び図１３〜１６に示す）。
【００３１】
（１）マイトジェン／同種異体抗原で誘導された正常マウス脾臓リンパ細胞の増殖活性に対するＲａｐａｍｙｃｉｎ及びＹ３１の影響：
結果に示すように、Ｒａｐａｍｙｃｉｎ及びその誘導体Ｙ３１がマイトジェン／同種異体抗原で誘導されたリンパ細胞の増殖反応を明かに抑制し、強いｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫抑制活性を有する（表１４及び図１３に示す）。
【００３２】
（２）マウス遅延型過敏反応に対するＲａｐａｍｙｃｉｎ及びＹ３１の影響：
ＤＮＦＢで誘導されたＤＴＨ反応は、Ｔｈ１細胞を介した、Ｔ細胞の活性化及び数種の細胞因子の発現を含むアレルギー反応である。我々は、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＤＴＨ応答中での化合物の役割を測定し、実験結果を図１４に示した。ＤＮＦＢで誘導されて遅延型過敏反応を生じたマウスを対照群として使用し、その両耳の耳の腫脹の平均増加が０．１７５ｍｍである。陽性対照薬Ｄｅｘ ２ｍｇ／ｋｇ投与群のマウスの耳の腫脹の平均増加が０．１３ｍｍであり、対照群と比較すると、明らかな差異を有する。Ｒａｐａｍｙｃｉｎ投与群のマウスの耳の腫脹の平均増加が０．０７６ｍｍであり、対照群と比較すると、差異が明らかである。Ｙ３１投与群のマウスの耳の腫脹の平均増加が０．１２９ｍｍであり、対照群と比較すると、差異が明らかである。
実験結果によれば、Ｒａｐａｍｙｃｉｎ及びＹ３１が明かにＤＮＦＢで誘導されたマウス遅延型過敏反応を抑制できる（図１４に示す）。
【００３３】
（３）ＳＲＢＣで誘導されたマウス脾臓リンパ細胞中の特異的抗体産生細胞に対するＲａｐａｍｙｃｉｎ及びＹ３１の影響：
Ｒａｐａｍｙｃｉｎ（１．５ｍｇ／ｋｇ）及びその誘導体Ｙ３１（１．５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与すると、マウス脾臓中の特異的な抗ＳＲＢＣ抗体産生細胞の生成量を明かに抑制でき、その抑制作用が陽性対照薬ＣｓＡより強く、マウスの体液性免疫機能に対して、明らかな抑制作用を有していた（表１５に示す）。
【００３４】
（４）マウス急性移植片対宿主病（ａＧＶＨＤ）に対するＲａｐａｍｙｃｉｎ及びＹ３１の薬効学研究：
本実験の結果により、急性移植片対宿主病（ａＧＶＨＤ）の動物モデルに対して、Ｒａｐａｍｙｃｉｎ及び誘導体Ｙ３１が良い治療効果を有することが証明された（図１５に示す）。
【００３５】
（５）ＤＢＡ／１マウスでの牛ＩＩ型コラーゲン誘導関節炎に対するＹ３１の治療効果
牛ＩＩ型コラーゲンを用いて皮下注射を二回行うことで、ＤＢＡ／１マウス関節炎を誘導できる。刺激してから四日後関節腫脹が現れ、一週間後１００％のマウスが関節炎を発症した。且つ、関節腫脹が進行的に悪化し、第１４日から薬を投与開始した。Ｙ３１を投与してから、明かにＣＩＡの発症程度が低減し、マウスの四肢（足、爪）の腫脹が明らかに減少された。Ｙ３１の経口投与は、ＤＢＡ／１マウスでのコラーゲン誘導関節炎の発病を抑制できる（図１６に示す）。
【００３６】
本発明で提供されたラパマイシン炭酸エステル類似体は、優れた腫瘍抑制活性及び免疫抑制活性、比較的に良い薬物動態パラメータを有し、製造方法が簡単で、操作性に優れたほか、高い生産率、及び良好な薬剤開発可能性を有している。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】異なる濃度の化合物Ｙ５０のＲｈ３０（ヒト横紋筋肉腫、Ａ）、ＰＣ−３（ヒト前立腺癌、Ｂ）、ＭＣＦ（ヒト乳癌、Ｃ）、ＣＡＫ−１（ヒト腎臓細胞癌、Ｄ）及びＨＬ−６０（ヒト白血病、Ｅ）細胞の成長に対する抑制を示す図である。
【図２】Ｙ５０のＲｈ３０、ＰＣ−３、ＭＣＦ−７．ＣＡＫ−１細胞中のｐ７０Ｓ６Ｋ及び４Ｅ−ＢＰ１に対するリン酸化レベルの評価を示す図である。
【図３】化合物Ｙ５０のヒト横紋筋肉腫Ｒｈ３０異種移植マウスの移植腫の成長に対す抑制曲線を示す図である。
【図４】化合物Ｙ５０のヒト横紋筋肉腫Ｒｈ３０異種移植マウスの移植腫の成長に対する抑制を示す図である。
【図５】化合物Ｙ５０のヒト前立腺癌ＰＣ−３異種移植マウスの移植腫の成長に対する抑制曲線を示す図である。
【図６】化合物Ｙ５０のヒト前立腺癌ＰＣ−３異種移植マウスの移植腫の成長に対する抑制を示す図である。
【図７】化合物Ｙ５０、Ｙ３１、Ｙ３１−１、Ｒａｐａｍｙｃｉｎ（ラパマイシン）のヒト横紋筋肉腫Ｒｈ３０異種移植マウスの移植腫の成長に対する抑制曲線を示す図である。
【図８】化合物Ｙ３１、ＣＣＩ−７７９、 Ｒａｐａｍｙｃｉｎ（ラパマイシン）のヒト骨肉癌Ｕ２ＳＯ異種移植マウスの移植腫に対する実験治療効果を示す図である。
【図９】ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）の方法により測定した小分子化合物とタンパク質ＦＫＢＰ−１２との結合活性を示す図である。
【図１０】マウスにそれぞれＹ３１、ＣＣＩ−７７９及びＲａｐａｍｙｃｉｎ（ラパマイシン）を投与した後、血漿中のＲａｐａｍｙｃｉｎ（ラパマイシン）の濃度−時間曲線を示す図である。
【図１１】マウスにそれぞれＹ３１、ＣＣＩ−７７９及びＲａｐａｍｙｃｉｎ（ラパマイシン）を投与した後、肝臓中のＲａｐａｍｙｃｉｎ（ラパマイシン）の濃度−時間曲線を示す図である。
【図１２】マウスにそれぞれＹ３１、ＣＣＩ−７７９及びＲａｐａｍｙｃｉｎ（ラパマイシン）を投与した後、腫瘍中のＲａｐａｍｙｃｉｎ（ラパマイシン）の濃度−時間曲線を示す図である。
【図１３】マイトジェン／同種異体抗原で誘導された正常マウス脾臓リンパ細胞の増殖活性に関するＲａｐａｍｙｃｉｎ（ラパマイシン）及びＹ３１の影響を示す図である。
【図１４】マウス遅延型過敏反応に関するＲａｐａｍｙｃｉｎ（ラパマイシン）及びＹ３１の影響を示す図である。
【図１５】マウス急性移植片対宿主病（ａＧＶＨＤ）に関するＲａｐａｍｙｃｉｎ（ラパマイシン）及びＹ３１の薬効学研究を示す図である。
【図１６】ＤＢＡ／１マウスでの牛ＩＩ型コラーゲン誘導関節炎に関するＹ３１の治療効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
具体的な実施例に基づき、更に詳しく本発明を説明する。しかし、本発明は実施例に限定されない。
【００３９】
＜ラパマイシン炭酸エステル類似体の製造に関する実施例＞
後述実施例中に、通常の後処理方法は、反応を終えた後、反応液に適量の水を加え、有機相と水相に分離し、水相が有機溶媒により充分に抽出された後、有機相を合併する。必要に応じて、順次に５％ＨＣｌ溶液及び／又は飽和ＮａＨＣＯ３溶液、水及び飽和食塩水を用いて洗浄する。無水Ｎａ２ＳＯ４又は無水ＭｇＳＯ４により有機相を乾燥させ、濾過してから減圧スピン乾燥を行い、粗生成物を得て、更にカラムクロマトグラフィーにより純化した後、最終生成物を得た。
【００４０】
後述製造の実施例中に、Ｖａｒｉａｎにより製造されたＭｅｒｃｕｒｙ−Ｖｘ６００Ｍ装置を用い、ＮＭＲを測定した。δＨ／Ｃ  ７．２６／７７．０ｐｐｍ（ＣＤＣｌ３）をＮＭＲキャリブレーションに使用した。試薬が主に上海化学試剤公司（Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd．）により提供され、生成物の純化が主にカラムクロマトグラフィーを使用した。シリカゲル（２００−３００目）について、カラムクロマトグラフィーに用いたシリカゲルのタイプはMacro−pored silica Gel （ＺＬＸ−ＩＩ）であり、青島海洋化工場分場（Qingdao Haiyang Chemical Co., Ltd．）により製造されたものである。
【００４１】
＜製造の実施例１：化合物Ｙ２３０、Ｙ７２及びＹ５０の製造＞
【化２７】
0005394493.tif 000028
２７６ｍｇ（３ｍｍｏｌ）のグリセロールを取り、２ｍｌのＤＭＳＯ中に溶解させ、窒素雰囲気で、０．４４ｍｌの２，２−ジメトキシプロパンを注入し、触媒量のｐ−トルエンスルホン酸を加えた。室温で数時間攪拌し、ＴＬＣにより反応終了まで追跡し、通常の後処理を経て合計１７３ｍｇの液状の生成物２ｉを得た。
【００４２】
５０ｍｌのナスフラスコに１７３ｍｇ（１．３１ｍｍｏｌ）の化合物２ｉ、１３０ｍｇ（０．４４ｍｍｏｌ）のトリホスゲンを加え、窒素雰囲気で２５ｍｌの二重蒸留ＣＨ２Ｃｌ２溶液を注入し、氷水浴で１７０μｌ（１．３１ｍｍｏｌ）の乾燥ピリジンを一滴ずつ滴加し、滴加を終えたら、自然に室温まで昇温して２時間反応させ、２００ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ）のラパマイシンを加え、更に０．２ｍｌのピリジンを追加し、ＴＬＣにより反応終了まで追跡した。次に、ナスフラスコに１ＮのＨＣｌを加え弱酸性に中和させ、ジクロロメタンで抽出し、ジクロロメタンの抽出液を水洗い、飽和食塩水により洗浄し、無水硫酸マグネシウムにより乾燥して濃縮し、石油エーテル／アセトン（体積比５／１）を展開液としてカラムクロマトグラフィーにより分離させて２４０ｍｇの化合物Ｙ２３０を得て、副生成物として２０ｍｇのＹ７２を得た。
【００４３】
２４０ｍｇの化合物Ｙ２３０を取り、３ｍｌのＴＨＦに溶解させ、０〜５℃で１．７ｍｌの２ＮのＨ２ＳＯ４を滴加し、ＴＬＣにより反応終了まで追跡した。５％ＮａＨＣＯ３を加え弱アルカリ性まで中和させ、酢酸エチルで抽出し、酢酸エチルの抽出液を飽和食塩水により洗浄し、無水硫酸マグネシウムにより乾燥し、減圧濃縮し、石油エーテル／アセトン（体積比１／１）を展開液としてフラッシュカラムクロマトグラフィーにより分離させて１２０ｍｇの化合物Ｙ５０を得た（全収率：３８％）。
【００４４】
【表１】
0005394493.tif 000029
【００４５】
＜製造の実施例２：化合物Ｙ３１の製造＞
【化２８】
0005394493.tif 000030
【００４６】
４００ｍｇ（０．４４ｍｍｏｌ）のラパマイシン、４４９ｍｇ（６．６ｍｍｏｌ）のピリジンを２０ｍｌの二重蒸留ＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ、０．２２ｍｌ（１．７６ｍｍｏｌ） のクロロトリメチルシラン（ＴＭＳＣＩ）を滴加した。滴加を終えた後、ＴＬＣにより追跡し、６時間ほど反応させ、減圧濃縮し、石油エーテル／アセトン（体積比４／１） を展開液としてカラムクロマトグラフィーにより合計２７７ｍｇの化合物Ｒａｐａｍｙｃｉｎ−３１−ＯＴＭＳを得た。
【００４７】
５０ｍｌのナスフラスコに５７３ｍｇ（４．３４ｍｍｏｌ）の化合物３ｉ、４５３ｍｇ（１．５３ｍｍｏｌ）のトリホスゲンを加え、窒素雰囲気で３０ｍｌの二重蒸留ＣＨ２Ｃｌ２溶液を注入し、氷水浴で３７７μｌ（４．６７ｍｍｏｌ）の乾燥ピリジンを滴加し、滴加を終えてから、自然に室温まで昇温して２時間反応させ、２７７ｍｇ（０．２８ｍｍｏｌ） のＲａｐａｍｙｃｉｎ−３１−ＯＴＭＳを加えた。４時間後ＴＬＣにより反応終了を追跡したら、弱酸性になるように１ＮのＨＣｌを加え、ジクロロメタンで抽出し、水洗い、飽和食塩水により洗浄し、無水硫酸マグネシウムにより乾燥し、濃縮し、石油エーテル／アセトン（体積比４／１） を展開液としてカラムクロマトグラフィーにより分離させて合計２４０ｍｇの化合物Ｙ４４を得た。
【００４８】
２４０ｍｇの化合物Ｙ４０を４ｍｌのＴＨＦに溶解させ、０〜５℃で１．７ｍｌの２ＮのＨ２ＳＯ４を滴加し、ＴＬＣにより反応終了まで追跡した。弱アルカリ性になるように、５％のＮａＨＣＯ３を加え、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水により洗浄し、無水硫酸マグネシウムにより乾燥し、減圧濃縮し、石油エーテル／アセトン（体積比１．５／１） を展開液としてカラムクロマトグラフィーにより分離させて合計１２０ｍｇの化合物Ｙ３１を得た。
【００４９】
【表２】
0005394493.tif 000031
【００５０】
＜製造の実施例３：化合物Ｙ３１−１の製造＞
化合物Ｒａｐａｍｙｃｉｎ−３１−ＯＴＭＳの製造に関して、製造の実施例２を参照する。
【００５１】
２５ｍｌのナスフラスコに２００ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ） の化合物Ｒａｐａｍｙｃｉｎ−３１−ＯＴＭＳ、２０６ｍｇ（３ｍｍｏｌ） のピリジンを加え、７ｍｌのＤＭＦを注入し、更に１８４ｍｇ（１．２２ｍｍｏｌ） のtert−ブチルジメチルクロロシラン（ＴＢＳＣＩ）を滴加した。ＴＬＣにより追跡し、室温で４８時間反応させてから水を加えて希釈し、酢酸エチルで抽出し、水洗い、飽和食塩水により洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥させ、石油エーテル／アセトン（体積比３／１） を展開液としてカラムクロマトグラフィーにより分離し、合計１２０ｍｇの生成物Ｙ０２８を得た。
【００５２】
５０ｍｌのナスフラスコに１７３ｍｇ（１．３１ｍｍｏｌ）の化合物３ｉ、１３０ｍｇ（０．４４ｍｍｏｌ）のトリホスゲンを加え、窒素雰囲気で２５ｍｌの二重蒸留ＣＨ２Ｃｌ２溶液を注入し、氷水浴で１７０μｌ（１．３１ｍｍｏｌ）の乾燥ピリジンを滴加し、滴加を終えてから、自然に室温まで昇温して２時間反応させ、１２０ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ） のＹ０２８を加え、更に０．２ｍｌのピリジンを追加し、ＴＬＣにより反応終了まで追跡した。次に、弱酸性になるように、ナスフラスコに１ＮのＨＣｌを加え、ジクロロメタンで抽出し、水洗い、飽和食塩水により洗浄し、無水硫酸マグネシウムにより乾燥し、濃縮し、石油エーテル／アセトン（体積比３／１） を展開液としてカラムクロマトグラフィーにより分離させて合計１００ｍｇの化合物Ｙ８６を得た。
【００５３】
１００ｍｇの化合物Ｙ８６を１．５ｍｌのＴＨＦに溶解させ、０〜５℃で０．８ｍｌの２ＮのＨ２ＳＯ４を滴加し、ＴＬＣにより反応終了まで追跡した。弱アルカリ性になるように５％のＮａＨＣＯ３を加え、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水により洗浄し、無水硫酸マグネシウムにより乾燥し、減圧濃縮させ、石油エーテル／アセトン（体積比１／１） を展開液としてフラッシュカラムクロマトグラフィーにより分離させて合計８０ｍｇの化合物Ｙ３１−１を得た。
【００５４】
【化２９】
0005394493.tif 000032
【００５５】
【表３】
0005394493.tif 000033
【００５６】
＜生物実験の実施例＞
＜実施例１：細胞レベルの抗腫瘍活性測定実験＞
Ｉ．Ｙ５０のＲｈ３０、ＰＣ−３、ＭＣＦ−７、ＣＡＫＩ−１及びＨＬ−６０細胞の成長に対する抑制。
【００５７】
異なる濃度の化合物により、Ｒｈ３０細胞を７２時間処理し、ＳＲＢ（Sulforhodamine B）法により細胞の生存率を測定した。
【００５８】
指数増殖期に属する前記の各種の腫瘍細胞を９０μｌ／穴で９６穴プレートに接種し、２４時間接着培養し、更に１０μｌ／穴で薬を加えた。各濃度に関して、同条件の穴を三つ設けた。また、相応な濃度の溶媒対照（生理食塩水）及アポトーシスを発生しない穴を設けた。３７℃、５％ＣＯ２の条件で腫瘍細胞を７２時間培養した後、培養液を取り除き、１０％冷ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）を用いて細胞を固定させ、４℃で１時間放置してから、蒸留水により５回洗浄し、空気中で自然乾燥させた。１％氷酢酸から調製した４ｍｇ／ｍｌのＳＲＢ（Ｓｉｇｍａ）溶液を１００μｌ／穴で加え、室温で１５分間染色し、上澄みを取り除き、１％酢酸により５回洗浄し、空気中で乾燥させた。最後に１５０μｌ／穴でＴｒｉｓ溶液を加え、ＥＬＩＳＡにより波長５２０ｎｍでＡ値を測定した。以下の公式により、腫瘍細胞成長に対する抑制率を計算した。
【００５９】
抑制率＝（Ａ５２０対照群−Ａ５２０投与群）／ Ａ５２０対照群×１００％
【００６０】
結果から図１に示すように、前記の各種の腫瘍細胞成長に対して、Ｙ５０がラパマイシンに相当する抑制作用を有することが証明された。
【００６１】
ＩＩ．Ｙ５０のＲｈ３０、ＰＣ−３、ＭＣＦ−７及びＣＡＫＩ−１細胞中のｐ７０Ｓ６Ｋ及び４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化レベルに対する抑制。
【００６２】
一定の密度で細胞を１２穴プレートに接種し、細胞が壁と接着する状態で一晩放置し、新鮮な無血清培養液に変え、飢餓状態で２４時間保持した後、相応な濃度の薬を加えて１時間反応させ、ＩＧＦにより１０分間刺激させ、サンプルを採取し、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔにより細胞中のｐ７０Ｓ６Ｋ及び４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化レベルを測定した。結果を図２に示し、実験結果からＹ５０が濃度依存的に各種の腫瘍細胞中のｍＴＯＲの下流因子のリン酸化促進能力を抑制できることが示された。同濃度で、その抑制能力がラパマイシンと相当する。
【００６３】
ＩＩＩ．化合物Ｙ５０、Ｙ３１と標的タンパク質ＦＫＢＰ−１２の結合活性の測定実験。
【００６４】
１．材料と装置：
（１）ＦＫＢＰ−１２タンパク質はＳｉｇｍａ社から購入した。
（２）ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．００５％（ｖ／ｖ） Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０，ｐＨ７．４）。
（３）活性化試薬のＥＤＣ、ＮＨＳ及びブロッキング試薬（Blocking reagent）のＥｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅなどは、ＢＬＡＣＯＲＥ  ＡＢ社（Uppsala，Sweden）から購入した。
（４）Ｂｉａｃｏｒｅ３０００、ＣＭ５チップは、ＢＬＡＣＯＲＥ  ＡＢ社（Uppsala，Sweden）から購入した。
【００６５】
２．実験方法：
（１）ＦＫＢＰ−１２タンパク質のカップリング：
Ｂｉａｃｏｒｅ３０００プログラム中のアミンカップリングのWizardを用いてTubulinタンパク質を、ＣＭ５チップのＦＣ２通路にカップリングさせた。ｐＨ４．６、１０ｍＭ  ＮａＡＣで、３．３ｇ／ＬのＦＫＢＰ−１２タンパク質を最終濃度の６６μｇ／ｍｌまで希釈した。０．１Ｍの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDCI）と０．１ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を１：１混合させて、チップ表面において２０μＬ／ｍｉｎの流速で７分間試料を導入し、タンパク質溶液を注射し、活性化チップの表面をブロッキングさせるように、ｐＨ８．５、１Ｍのエタノールアミンを７分間導入した。
【００６６】
化合物の初期スクリーニング（Preliminary screeninｇ）及びダイナミクス測定：
ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）の方法を用いて小分子化合物とＦＫＢＰ−１２タンパク質の結合活性を測定した。化合物の原液濃度が１０ｍＭであり、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を一定の比例で希釈し、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００プログラム中のダイナミクス解析Wizardによりダイナミクス実験（Dynamic experiment）を行った。得られた実験データに関して、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００解析ソフト中の１：１ Lanｇmuir結合モデル又は定常状態モデルに基づき近似を行い、確実な動的定数及び熱力学定数を得た。
【００６７】
ＳＰＲ実験結果（表４及び図８に示す）：
１．Ｒａｐａｍｙｃｉｎ（ラパマイシン）、ＣＣＩ−７７９、Ｙ５０及びＹ３１の何れもが濃度依存的にＦＫＢＰ１２と結合できる。Ｙ５０及びＹ３１は、Ｒａｐａｍｙｃｉｎと比較すると、同濃度でのＲＵ（Response Unit）がＲａｐａｍｙｃｉｎより高く、同濃度のＹ５０及びＹ３１とＦＫＢＰ−１２の結合がＲａｐａｍｙｃｉｎより強いことを意味する。
２．Ｙ５０及びＹ３１とＦＫＢＰ１２の結合の飽和に達するまでに必要な濃度がＲａｐａｍｙｃｉｎより低い。
３．Ｙ５０及びＹ３１とＦＫＢＰ１２の解離速度がＲａｐａｍｙｃｉｎより低く、かつＣＣＩ−７７９よりも低い。Ｙ５０及びＹ３１の解離定数がＲａｐａｍｙｃｉｎ及びＣＣＩ−７７９より低い。
【００６８】
【表４】
0005394493.tif 000034
【００６９】
＜実施例２：動物レベルの抗腫瘍活性測定実験＞
実験目的：ヒト横紋筋肉腫ＲＨ−３０異種移植マウスの移植腫の成長に対する抑制作用を観察する。
【００７０】
実験物：５％ツイン（Ｔｗｅｅｎ）８０、５％ＰＥＧ４００及びＤＤＷを溶媒として適用し、Ｙ５０を経口投与製剤に調製した。
【００７１】
陽性対照薬：５％ツイン８０、５％ＰＥＧ４００及びＤＤＷを溶媒として適用し、ラパマイシンを経口投与製剤に調製した。
【００７２】
投与量の設置：Ｙ５０の経口投与量を５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇの二つの用量群と設け、毎日一回の経口投与を行った。ラパマイシンについて、同様な投与量で経口投与を行った。
【００７３】
動物：ＢＡＬＢ／ｃＡマウス、オス、４０〜４５日齢、体重２１±２ｇ、中国科学院上海薬物研究所により提供された。生産ライセンス：SCXK（濾） ２００４−０００２。各群の動物数：陰性対照群６匹、投与群６匹。
【００７４】
移植腫：ヒト横紋筋肉腫ＲＨ−３０異種移植マウスの移植腫。ヒト横紋筋肉腫ＲＨ−３０細胞株をマウスの皮下に接種して作成した。５×１０６の細胞接種量で接種して移植腫を形成した後、マウス体内に遺伝して３世代目以降を使用した。
【００７５】
実験方法：成長増殖の活発な時期の腫瘍組織を約１．５ｍｍ３にカットし、無菌条件で、マウスの右側の脇の下の皮下に接種した。マウスの移植腫に対して、ノギスにより移植腫の直径を測定し、腫瘍が１００〜２００ｍｍ３まで成長してから、ランダムに動物を組み分けした。実験群に経口投与し、毎日一回投与を行い、三週間連続行った。陽性対照薬のラパマイシンについても、同様な方法で、同用量を投与し、合計三週間行った。陰性対照群に対して、０．２ｍｌ／匹で溶媒を経口投与した。毎週腫瘍の直径を二回測定し、同時にマウスの体重も測定した。腫瘍体積（Tumor volume， ＴＶ）の計算式は、ＴＶ ＝ １／２×ａ×ｂ２であり、その中、ａ、ｂがそれぞれ長さ、厚さを示す。測定した結果により、相対腫瘍体積（Relative tumor volume，ＲＴＶ）を計算した。その計算式は、ＲＴＶ ＝ Ｖｔ／Ｖ０であり、その中、Ｖ０は投与開始のとき（すなわち、ｄ０のとき）の測定した腫瘍体積で、Ｖｔが毎回測定するときの腫瘍体積である。抗腫瘍活性の評価指標は、相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）である。
【００７６】
計算式：Ｔ／Ｃ（％）＝（ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ）×１００。その中、ＴＲＴＶは治療群ＲＴＶで、ＣＲＴＶは陰性対照群ＲＴＶである。
【００７７】
治療の評価指標：Ｔ／Ｃ（％）＞６０％であれば、無効である。Ｔ／Ｃ（％）≦６０％、且つ統計学処理によりｐ＜０．０５であれば、有効である。
【００７８】
結果：Ｙ５０のヒト横紋筋肉腫ＲＨ−３０異種移植マウスの移植腫の成長に対する抑制作用を表５及び図３、図４に示す。実験結果により、三週間連続毎日一回５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ のＹ５０を経口投与した、二つの用量群がヒト横紋筋肉腫ＲＨ−３０異種移植マウスの移植腫の成長に対して明らかな抑制作用を有し、そのＴ／Ｃがそれぞれ３２．５％、３２．９％であり、陽性対照群のラパマイシンの高用量群（１０ｍｇ／ｋｇ）に相当した。一方、ラパマイシンの低用量群（５ｍｇ／ｋｇ）が、ヒト横紋筋肉腫ＲＨ−３０異種移植マウスの移植腫の成長に対して、明らかな抑制作用がなく、そのＴ／Ｃ値が６１．８％であった。実験群のマウスの死亡例が見られなかった。
【００７９】
結論：ヒト横紋筋肉腫ＲＨ−３０異種移植マウスの移植腫に対して、Ｙ５０経口投与がラパマイシンより明らかに優れた成長抑制作用を有する。下の表５、図３及び図４に示す。
【００８０】
【表５】
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【００８１】
同様な実験により、Ｙ５０のヒト前立腺癌ＰＣ−３異種移植マウスの移植癌の成長に対する抑制作用を観察した。結果に示すように、異なる用量群において、ヒト前立腺癌ＰＣ−３異種移植マウスの移植癌に対する成長抑制作用について、Ｙ５０経口投与がラパマイシンより明らかに優れる。そのＴ／Ｃがそれぞれ１０．０％、４０．２％であった。一方、陽性対照のラパマイシンの同用量群に対応するＴ／Ｃがそれぞれ３０．９％、４６．５％であった。下の表６、図５及び図６に示す。
【００８２】
【表６】
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【００８３】
【表７】
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【００８４】
前記と同様の実験により、Ｙ５０、Ｙ３１、Ｙ３１−１、Ｒａｐａｍｙｃｉｎのヒト横紋筋肉腫ＲＨ−３０異種移植マウスの移植腫の成長に対する抑制作用を観察した。ヒト横紋筋肉腫ＲＨ−３０異種移植マウスの移植腫の成長に対して、Ｙ３１、Ｙ５０、Ｙ３１−１の経口投与が明らかな成長抑制作用を有した。Ｙ３１、Ｙ５０の該腫瘍の成長に対する抑制作用がラパマイシンより優れ、その中、ラパマイシンが低用量群（２．５ｍｇ／ｋｇ）のとき、ヒト横紋筋肉腫ＲＨ−３０異種移植マウスの移植腫に対して、明らかな抑制作用を有していない。そのＴ／Ｃ値が６３．７％であった。一方、Ｙ３１は低使用量（２．５ｍｇ／ｋｇ）のときでも、比較的に高い抑制作用を達成でき、Ｙ５０及びラパマイシンの高用量群（５ｍｇ／ｋｇ）より明かに優れる。表７及び図７に示す。
【００８５】
【表８】
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【００８６】
同実験により、Ｙ３１、ＣＣＩ−７７９、Ｒａｐａｍｙｃｉｎのヒト骨肉癌Ｕ２ＳＯ異種移植マウスの移植腫の成長に対する抑制作用を観察した。結果により、ヒト骨肉癌Ｕ２ＳＯ異種移植マウスの移植腫の成長に対して、Ｙ３１経口投与が明らかな成長抑制作用を有することが示された。低用量群（２．５ｍｇ／ｋｇ）のとき、ヒト骨肉癌Ｕ２ＳＯ異種移植マウスの移植腫に対して、ＣＣＩ−７７９及びラパマイシンが明らかな抑制作用を有しない。そのＴ／Ｃ値はそれぞれ６９．０％、６０．０％であった。一方、低用量（２．５ｍｇ／ｋｇ）のとき、化合物Ｙ３１の該腫瘍の成長に対する抑制作用がラパマイシン及びＣＣＩ−７７９より明かに優れる。
【００８７】
＜実施例３：Ｙ３１、Ｒａｐａｍｙｃｉｎ及びＣＣＩ−７７９を投与した後のマウス体内におけるＲａｐａｍｙｃｉｎの分布に関する研究実験＞
本実験において、マウスにＹ３１、Ｒａｐａｍｙｃｉｎ及びＣＣＩ−７７９を投与した後のマウス体内におけるＲａｐａｍｙｃｉｎの分布特徴に関して、検討を行った。マウスに薬剤を投与した後、異なる時間での血漿、肝臓及び腫瘍組織を採集し、液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により血漿及び組織中のプロトンタイプ薬物及びＲａｐａｍｙｃｉｎの濃度を測定した。マウスにＹ３１、Ｒａｐａｍｙｃｉｎ及びＣＣＩ−７７９を投与した後、血漿及び組織中のプロトンタイプ薬物及びＲａｐａｍｙｃｉｎの濃度を表９〜１１に示し、主な薬物動態パラメータを表１２に示す。
【００８８】
【表９】
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【００８９】
【表１０】
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【００９０】
【表１１】
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【００９１】
【表１２】
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【００９２】
結果によると、ヒト横紋筋肉腫ＲＨ−３０異種移植マウスの移植腫を移植した動物にＹ３１、Ｒａｐａｍｙｃｉｎ及びＣＣＩ−７７９をそれぞれ投与してからマウスにＹ３１を投与した後、体内に迅速に代謝物Ｒａｐａｍｙｃｉｎと変化し、血漿及び組織中のプロトンタイプ薬の濃度が低く、最大濃度が２０ｎｇ／ｍｌ又はｎｇ／ｇより低かった。投薬してから５時間でプロトンタイプ薬を検出できなくなった。Ｙ３１を投与した後、血漿、肝臓及び腫瘍中のＲａｐａｍｙｃｉｎの暴露量とＲａｐａｍｙｃｉｎ投与群の比例がそれぞれ１．２２、１．３２、１．９３であった。
【００９３】
マウスにＣＣＩ−７７９を投与した後、血漿及び組織中にプロトンタイプ薬ＣＣＩ−７７９及び代謝物Ｒａｐａｍｙｃｉｎを同時に検出でき、血漿、肝臓及び腫瘍組織中の代謝物Ｒａｐａｍｙｃｉｎとプロトンタイプ薬の暴露量の比例がそれぞれ１０．４、０．９４と１．８９であった。ＣＣＩ−７７９を投与した後、血漿、肝臓及び腫瘍中のＲａｐａｍｙｃｉｎの暴露量とＲａｐａｍｙｃｉｎ投与群の比例がそれぞれ０．７５、０．５４と０．６３であった。
【００９４】
マウスにＲａｐａｍｙｃｉｎを投与した後、血漿中にＲａｐａｍｙｃｉｎが迅速に吸収され、ピークに達する時間が０．５〜２時間であった。肝臓中にピークに達する時間が０．５時間であり、血漿中の場合に近かった。腫瘍中にピークに達する時間が比較的に遅く、２〜５時間であった。Ｒａｐａｍｙｃｉｎは血漿及び肝臓でより速く除去される。
【００９５】
三つの投与群において、投薬してから４８時間、血漿及び肝臓中の濃度が、ピーク濃度の１．９６％〜６．４２％となった。Ｒａｐａｍｙｃｉｎは腫瘍中で比較的に遅く除去され、投与してから４８時間、腫瘍中の濃度がピーク濃度の４０％〜５１％となった。三つの投薬群において、肝臓中のＲａｐａｍｙｃｉｎの暴露量がそれぞれ血漿中の暴露量の２．２６、２．０１、１．５１倍であり、腫瘍中のＲａｐａｍｙｃｉｎの暴露量がそれぞれ血漿中の暴露量の１．６６、１．０５と０．８７倍であった。
【００９６】
Ｙ３１を陽性対照薬Ｒａｐａｍｙｃｉｎ及びＣＣＩ−７７９と比較すると、共有の有効成分Ｒａｐａｍｙｃｉｎの肝臓中の暴露量がそれぞれ血漿中の暴露量の２．２６、２．０１と１．５１倍であった。腫瘍中の暴露量がそれぞれ血漿中の暴露量の１．６６、１．０５と０．８７倍であった。Ｙ３１が明らかな腫瘍組織特異性を有することが示された。
【００９７】
＜実施例４：細胞レベルの免疫抑制活性測定実験＞
【００９８】
【表１３】
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【００９９】
化合物Ｙ５０、Ｙ３１、Ｙ２３０の免疫抑制活性実験の結果により、化合物Ｙ３１のＩＣ５０値が５０ｎＭに達し、親化合物のラパマイシン及び化合物Ｙ５０より明かに優れ、化合物Ｙ３１が比較的に高い安全指数を有し、化合物Ｙ５０、Ｙ２３０の免疫抑制活性がラパマイシンに相当することが示された。
【０１００】
＜実施例５：Ｙ３１の免疫抑制活性測定の系統的実験＞
Ｉ．マイトジェン／同種異体抗原で誘導された正常マウス脾臓リンパ細胞の増殖活性に関するＲａｐａｍｙｃｉｎ及びＹ３１の影響：
実験目的：
３Ｈ−チミジン（３H−thymidine）取り込みにより、マイトジェン／同種異型マウス脾臓リンパ細胞の混合培養による正常マウス脾臓リンパ細胞の増殖機能に対する、化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ投与の影響を測定し、そのｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫抑制活性を評価する。
３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド （ＭＴＴ）法により、正常マウス脾臓リンパ細胞活性に対して、化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ投与の影響を測定し、その細胞毒性効果を評価した。
【０１０１】
測定薬物：
名称：Ｒａｐａｍｙｃｉｎ、Ｙ３１。性状、含有量：白い粉末。
【０１０２】
調製方法：使用する前４℃で保存した。実験前にＤＭＳＯに溶解させ、原液を調製した。使用時、培養液で必要な濃度まで希釈した。細胞を培養するとき、ＤＭＳＯ中の最終濃度が＜０．０２％であった。該濃度のＤＭＳＯが細胞成長に影響しない。
【０１０３】
実験動物：由来、品種、系統：ＢＡＬＢ／ｃ純系マウス、メス、１８〜２０ｇ、中国科学院上海実験動物中心から購入。動物生産ライセンス：SCXK（濾）２００２−００１０号。動物は上海薬物研究所ＳＰＦ動物飼育施設で飼育。実験動物使用ライセンス：SYXK（濾）２００３−００２９号、少なくとも一週間飼育してから使用した。温度が２２±１℃であり、湿度が５５±５％であり、１２時間交代の明暗サイクルで飼育した。餌と水が全部消毒してから動物が自由に摂取した。全部の実験について、完全に実験動物に関する条例に基づいて行った。
【０１０４】
実験方法及び評価：
ＭＴＴ法によりマウス脾臓リンパ細胞の活性に対する化合物の影響を測定した。
１００μｌ（４×１０５／孔）のマウス脾臓リンパ細胞の懸濁液を９６穴プレートに接種するとともに、異なる濃度の化合物を加え、相応な溶媒対照及び培養液のバックグランド対照を設け、全体積が２００μｌであった。３７℃で５％のＣＯ２のインキュベータで４８時間培養した。培養を終了する６−７時間前に、２０μｌ（５ｍｇ／ｍｌ）のＭＴＴ溶液を加えた。各孔から１００μｌの上澄みを取り出し、更に１００μｌのＭＴＴ溶解液を加え、インキュベータで６〜７時間放置してから、ＥＬＩＳＡにより５７０ｎＭでＯＤ値を測定した。
【０１０５】
３Ｈ−ＴｄＲ取り込みにより、マイトジェンで誘導された正常マウス脾臓リンパ細胞の増殖機能に対する化合物の影響を測定した。１００μｌ（４×１０５／孔）のマウス脾臓リンパ細胞の懸濁液を９６穴プレートに接種し、５０μｌのＣｏｎＡ（最終濃度５μｇ／ｍｌ）又は５０μｌのＬＰＳ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）を加え、異なる濃度の化合物５０μｌを注入し、全体積が２００μｌとなった。各濃度に関して、三つの穴を設け、相応なＣｏｎＡ／ＬＰＳ非投与対照穴及び薬物非投与対照穴を設けた。３７℃で５％のＣＯ２のインキュベータで４８時間培養した。培養を終了する８時間前に、各孔に２５μｌ（１０μＣｉ／ｍｌ）の３Ｈ−チミジンを加えた。実験終了まで、培養を継続した。細胞収集器（Cell harvester）により細胞をガラス繊維膜に収集し、シンチレーション液を加えてからＢｅｔａカウンタ（MicroBeta Trilux， PerkinElmer）により細胞ＤＮＡに取り込まれた３Ｈ−ＴｄＲ量を測定し、ｃｐｍ値を用いて細胞増殖の状況を示す。
【０１０６】
３H−ＴｄＲ取り込みにより、同種異体抗原で誘導された正常マウス脾臓リンパ細胞の増殖機能に対する化合物の影響を測定した。
刺激細胞の準備：ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓リンパ細胞の懸濁液、Ｇａｍｍａ線照射装置（Gammacell ３０００）を用いてセシウム１３７放射線照射（３０００Rads）を行ってその増殖能力を無くしてから、ＲＰＭＩ１６４０で２回洗浄し、細胞濃度を５×１０６／ｍｌまで調節した。
【０１０７】
反応細胞の準備：Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓リンパ細胞を反応細胞として使用し、細胞濃度は５×１０６／ｍｌであった。
【０１０８】
リンパ細胞混合培養：５０μｌ のＣ５７ＢＬ／６マウス脾臓リンパ細胞の懸濁液を９６穴プレートに接種し、５０μｌ のセシウム１３７放射線で処理した後のＢＡＬＢ／Ｃマウス脾臓リンパ細胞の懸濁液を加え、全体積を２００μｌになるように異なる濃度の化合物５０μｌを加えた。全体積が２００μｌより少ない場合、ＲＭＰＩ−１６４０培養液で補足した。実験において、ＢＡＬＢ／ｃマウス群、Ｃ５７ＢＬ／６マウス群、及びＢＡＬＢ／ＣとＣ５７ＢＬ／６の混合培養群の合計３群を設けた。各濃度に対して、三つの穴を設け、又は相応な非投与対照穴、刺激細胞対照穴及び反応細胞対照穴を設けた。３７℃で５％のＣＯ２のインキュベータで３〜５日培養した。培養を終了する８時間前に、各孔に２５μｌ（１０μＣｉ／ｍｌ）の３Ｈ−チミジンを加えた。実験終了まで、培養を継続した。細胞収集器により細胞をガラス繊維膜に収集し、シンチレーション液を加えてからＢｅｔａカウンタ（MicroBeta Trilux， PerkinElmer）により細胞ＤＮＡに取り込まれた３Ｈ−ＴｄＲ量を測定し、ｃｐｍ値を用いて細胞増殖の状況を示した。
【０１０９】
結果処理及び統計方法：全データを平均値±標準偏差で示し、各指標の検査結果をExcel ２０００及びSPSS １１．０統計ソフトで処理を行った。
【０１１０】
実験結果により用量反応曲線（Dose−response curve）を描き、ＣＣ５０値（５０％ cytotoxic concentration）、すなわち５０％細胞の致死濃度を計算した。また、ＩＣ５０（５０％ inhibitory concentration）、すなわち５０％抑制効果を有するときの化合物濃度を計算した。
【０１１１】
実験結果：実験結果を図１３及び表１４に示す。
【０１１２】
正常マウス脾臓リンパ細胞に対するＲａｐａｍｙｃｉｎの細胞毒性は、ＣＣ５０＝４５．５１μＭであった。濃度依存的にＣｏｎＡ／ＬＰＳで誘導された正常マウス脾臓Ｔ／Ｂリンパ細胞増殖反応を抑制し、その中、ＩＣ５０がそれぞれ１９６．４ｎＭと４８．８ｎＭであった。正常マウス脾臓リンパ細胞に対するＹ３１の細胞毒性は、ＣＣ５０＝３６．９μＭであった。濃度依存的にＣｏｎＡ／ＬＰＳで誘導された正常マウス脾臓Ｔ／Ｂリンパ細胞の増殖反応を抑制し、そのＩＣ５０がそれぞれ３３０．７ｎＭと９７．８ｎＭであった。Ｒａｐａｍｙｃｉｎ及びＹ３１が、同種異体抗原で誘導された正常マウス脾臓リンパ細胞の増殖反応に対して、抑制活性を示しており、Ｙ３１の免疫抑制活性がより強かった。
【０１１３】
【表１４】
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【０１１４】
結果により、Ｒａｐａｍｙｃｉｎ及びその誘導体Ｙ３１がマイトジェン／同種異体抗原で誘導されたリンパ細胞の増殖反応を明かに抑制し、強いｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫抑制活性を有することが示された。
【０１１５】
ＩＩ．マウス遅延型過敏反応に対するＲａｐａｍｙｃｉｎ及びＹ３１の影響：
実験目的：ＤＮＦＢで誘導されたマウス遅延型過敏反応（ＤＴＨ）を用い、ＤＴＨに対する化合物ｉｎ  ｖｉｖｏ作用の抑制作用を観察した。誘導によりマウスが遅延型過敏反応を生じ、すなわち、マウスがＤＮＦＢ感作後にＤＮＦＢで攻撃されると、マウスが耳介腫脹反応を生じる。マウスの耳介腫脹反応の進行状況に対する化合物の影響を観察することで、マウスＤＴＨに対する影響を評価し、生体細胞の免疫反応に対する影響を検討した。
【０１１６】
実験薬剤：
名称：Ｒａｐａｍｙｃｉｎ、Ｙ３１。
性状、含有量：白い粉末。
調製方法：無水アルコールに溶解させ、５０ｍｇ／ｍｌの保存液を調製した。使用時、５％ＰＥＧ４００＋５％Ｔｗｅｅｎ−８０無菌水を溶媒として必要な濃度まで保存液を希釈した。
【０１１７】
実験動物：
由来、品種、系統：ＢＡＬＢ／ｃ純系マウス、メス、１８〜２０ｇ、中国科学院上海実験動物中心から購入された。動物生産ライセンス：SCXK（濾）２００２−００１０号。動物が上海薬物研究所ＳＰＦ動物飼育施設で飼育された。実験動物使用ライセンス：SYXK（濾）２００３−００２９号、少なくとも一週間飼育してから使用した。温度が２２±１℃であり、湿度が５５±５％であり、１２時間交代の明暗サイクルで飼育した。餌と水を全部消毒してから動物が自由に摂取した。全部の実験に関して、完全に実験動物に関する条例に基づいて行った。
【０１１８】
実験方法：
２，４−ジニトロフルオロベンゼン （ＤＮＦＢ）は一種のハプテン（Incomplete antigen）であり、ＤＮＦＢでマウスの足部を敏感にさせた後、皮膚タンパク質と結合して完全抗原となり、更に一週間後ＤＮＦＢでマウスの耳を攻撃し、部分的に遅延型アレルギー反応を生じさせ、耳の腫脹の遅延型過敏反応を起こさせた。一方、攻撃されなかった耳の方では耳の腫脹の遅延型過敏反応を生じなかった。耳の腫脹の増加により、ジニトロフルオロベンゼンで誘導されたマウスの遅延型過敏反応に対する進行状況を表した。
（１）２０μｌの、アセトン：オリーブオイル（４：１）を溶媒とした０．５％ＤＮＦＢ溶液をマウスの各後足に塗布し、敏感にさせた。
（２）第１回敏感にしてから５日、０．２％ＤＮＦＢ溶液を用いてマウスの左耳の両側を塗布して免疫攻撃を行った。対照として、アセトン：オリーブオイル（４：１）溶媒だけで右耳を塗布した。
（３）マウスをモデル群、Ｄｅｘ群（２ｍｇ／ｋｇ／ｄ、経口投与）、Ｒａｐａｍｙｃｉｎ群（１．５ｍｇ／ｋｇ／ｄ、腹腔内注射投与）、Ｙ３１群（１．５ｍｇ／ｋｇ／ｄ、腹腔内注射投与）と、ランダムに４群と分けた。
（４）スパイラルマイクロメータ（Spiral micrometer）で各マウスの左、右耳の厚さをそれぞれ測定し、右耳の厚さから左耳の厚さを引き、その差を腫脹の増加として記録した。
【０１１９】
実験結果を図１４に示す。
【０１２０】
ＤＮＦＢで誘導されたＤＴＨ反応は、Ｔｈ１細胞を介した、Ｔ細胞の活性化及び多種の細胞因子の生成を含むアレルギー反応である。我々はＢＡＬＢ／ｃマウスＤＴＨ応答中における化合物の効果を測定し、その結果を以下の図に示した。ＤＮＦＢで誘導されて遅延型過敏反応を生じたマウスをモデル対照群として用い、その両耳の耳の腫脹の平均増加は０．１７５ｍｍであった。陽性対照薬Ｄｅｘ  ２ｍｇ／ｋｇ群のマウスの耳の腫脹の平均増加は０．１３ｍｍであり、モデル群と比較すると、明らかな差異を有していた。Ｒａｐａｍｙｃｉｎ群のマウスの耳の腫脹の平均増加が０．０７６ｍｍであり、モデル群と比較すると、明らかな差異を有した。Ｙ３１群のマウスの耳の腫脹の平均増加が０．１２９ｍｍであり、モデル群と比較すると、明らかな差異を有していた。
【０１２１】
実験結果により、Ｒａｐａｍｙｃｉｎ及びＹ３１がＤＮＦＢで誘導されたマウス遅延型過敏反応に対して、明らかに抑制できることが示された。
【０１２２】
ＩＩＩ．ＳＲＢＣで誘導されたマウス脾臓リンパ細胞中の特異的抗体産生細胞に対するＲａｐａｍｙｃｉｎ及びＹ３１の影響：
実験目的：
マウスがヒツジ赤血細胞で免疫されると、マウスの脾臓リンパ細胞中に特異的抗体産生細胞が現れる。Ｒａｐａｍｙｃｉｎ及びその誘導体を投与した後のマウスの脾臓リンパ細胞の特性的抗体産生細胞の生成量の変化を測定することで、Ｒａｐａｍｙｃｉｎ及びその誘導体のマウスの体液性免疫への影響を観察した。
【０１２３】
実験薬剤：
名称：Ｒａｐａｍｙｃｉｎ、Ｙ３１。
性状、含有量：白い粉末。
調製方法：無水アルコールに溶解させ、５０ｍｇ／ｍｌの保存液を調製した。使用時、５％ＰＥＧ４００＋５％Ｔｗｅｅｎ−８０無菌水を溶媒として必要な濃度まで保存液を希釈した。
【０１２４】
実験動物：
由来、品種、系統：ＢＡＬＢ／ｃ純系マウス、メス、１８〜２０ｇ、中国科学院上海実験動物中心から購入された。動物生産ライセンス：SCXK（濾）２００２−００１０号。動物が上海薬物研究所ＳＰＦ動物飼育施設で飼育された。実験動物使用ライセンス：SYXK（濾）２００３−００２９号、少なくとも一週間飼育してから使用した。温度が２２±１℃であり、湿度が５５±５％であり、１２時間交代の明暗サイクルで飼育した。餌と水を全部消毒してから動物が自由に摂取した。全部の実験に関して、完全に実験動物に関する条例に基づいて行った。
【０１２５】
マウスは中国科学院上海実験動物中心から購入され、血清（補体）を取るために使用した。
【０１２６】
その他の実験材料：ヒツジ赤血細胞（ＳＲＢＣ）は上海江南生物技術工程有限公司から購入した。
【０１２７】
実験原理：
ＳＲＢＣで誘導されたマウス体液性免疫反応のモデルの中に、ＳＲＢＣの溶血反応で抗原特性的抗体の生産状況を測定することは、典型的な実験方法である。ヒツジ赤血細胞定量溶血反応検定（Quantitative hemolysis of sheep red blood cells， ＱＨＳ）は、Ｂリンパ細胞（プラズマ細胞）で特異的な抗ＳＲＢＣ抗体を生じてヒツジ赤血細胞を破砕し、ヘモグロビンを解放して抗体の生成状況を表す一種の実験方法である。ヒツジ赤血細胞（ＳＲＢＣ）でマウスを敏感にさせた後、マウス脾臓リンパ細胞中に特異的抗体産生細胞が現れる。この細胞の産生する抗体とＳＲＢＣが補体の協同作用で溶血反応を生じ、分光光度法により溶血程度を測定し、特異性抗体産生細胞数の生成量を表した。
【０１２８】
実験方法：
１．ＢＡＬＢ／ｃマウスをランダムに正常対照群、モデル対照群、陽性対照群（ＣｓＡ１０ｍｇ／ｋｇ）、Ｒａｐａｍｙｃｉｎ群（１．５ｍｇ／ｋｇ／ｄ、腹腔内注射投与）、Ｙ３１群（１．５ｍｇ／ｋｇ／ｄ、腹腔内注射投与）の５群と分け、各群に６匹のマウスを設けた。
免疫にする場合、各群のマウスに腹腔内投与し始め、免疫後の５日まで毎日一回投与した。モデル対照群に対して、毎日溶媒対照を行った。
【０１２９】
２．ＰＢＳで新鮮なヒツジ赤血細胞（ＳＲＢＣ）を３回洗浄した後、１：５（ｖ／ｖ）に希釈し、各マウスに０．２ｍｌ希釈されたＳＲＢＣを腹腔内注射して、敏感にさせた。
【０１３０】
３．免疫後の５日でＱＨＳ測定を行い、マウス脾臓を取り、脾臓リンパ細胞を調製し。
分光光度法により溶血程度の測定：リンパ細胞５×１０６、０．２％ＳＲＢＣ、最適希釈比率のマウスの血清補体を均一に混合させ、３７℃で１時間定温放置してから、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、上澄みを取り出した。５４０ｎｍの所でＯＤ値を測定し、特異的抗体産生細胞の生成量を表した。
【０１３１】
実験結果（表１５に示す）：
ヒツジ赤血細胞定量溶血反応検定（ＱＨＳ）で、体内におけるＢ細胞の分泌した抗体でヒツジ赤血細胞を破砕して解放されたヘモグロビン（ＯＤ値）を用いて表した。その結果で、生体の体液性免疫機能を表す。
【０１３２】
特異的抗体産生細胞抑制％＝（モデル対照群ＯＤ−投与群ＯＤ）／（モデル対照群ＯＤ−正常対照群ＯＤ）
【０１３３】
【表１５】
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【０１３４】
実験結論：
Ｒａｐａｍｙｃｉｎ（１．５ｍｇ／ｋｇ）及びその誘導物Ｙ３１（１．５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与が、マウス脾臓中の特異的な抗ＳＲＢＣ抗体産生細胞の生成量を明らかに抑制でき、その抑制作用が陽性対照薬ＣｓＡより強く、マウスの体液性免疫機能に対して、明らかな抑制作用を有した。
【０１３５】
ＩＶ．マウス急性移植片対宿主病（ａＧＶＨＤ）に対するＲａｐａｍｙｃｉｎ及びＹ３１の薬効学研究：
実験目的：
ＢＡＢＬ／Ｃマウスをドナーとして、Ｃ５７Ｂ６／６マウスを受容体として用い、ＢＡＢＬ／Ｃマウス骨髄細胞及びリンパ細胞を致死量γ射線で照射したＣ５７Ｂ／６マウス体内に移植し、急性移植片対宿主病（ａＧＶＨＤ）モデルを作成し、マウスのａＧＶＨＤに対するＲａｐａｍｙｃｉｎ及び誘導体の薬効学効果を考察した。
【０１３６】
実験薬剤：
名称：Ｒａｐａｍｙｃｉｎ、Ｙ３１。
性状、含有量：白い粉末。
調製方法：無水アルコールに溶解させ、５０ｍｇ／ｍｌの保存液を調製した。使用時、５％ＰＥＧ４００＋５％Ｔｗｅｅｎ−８０無菌水を溶媒として必要な濃度まで保存液を希釈した。
【０１３７】
実験動物：
由来、品種、系統：ＢＡＬＢ／ｃ純系マウス、メス、４週齢、Ｃ５７Ｂ／６マウス、メス、７〜８週齢、中国科学院上海実験動物中心から購入された。動物生産ライセンス：SCXK（濾）２００２−００１０号。動物が上海薬物研究所ＳＰＦ動物飼育施設で飼育された。実験動物使用ライセンス：SYXK（濾）２００３−００２９号、少なくとも一週間飼育してから使用した。温度が２２±１℃であり、湿度が５５±５％であり、１２時間交代の明暗サイクルで飼育した。餌と水を全部消毒してから動物が自由に摂取した。全部の実験に関して、完全に実験動物に関する条例に基づいて行った。
【０１３８】
実験方法：
１．全身照射（ＴＢＩ）：
Ｃ５７Ｂ／６（Ｈ−２ｂ）、メス、７週齢のマウスを受容体マウスとして使用した。
Gammacellで８．５Ｇｙ全身照射した。
【０１３９】
２．骨髄移植：
受容体マウスに４〜６時間照射した後、異種骨髄移植を行った。
ＢＡＢＬ／Ｃ（Ｈ−２ｄ）、メス、４週齢のマウスをドナーマウスとして使用した。マウスの四肢長骨骨髄細胞及び脾臓リンパ細胞を採取した。二種類の細胞濃度を１×１０８まで調製し、ＰＢＳ緩衝液中に懸濁させた。
等比例で二種類の細胞を混合させ、各受容体マウスに混合細胞の懸濁液を０．５ｍｌずつ静脈注射した。
【０１４０】
３．群分け及び投与：
ランダムにモデル群（溶媒対照）、Ｒａｐａｍｙｃｉｎ群（１．５ｍｇ／ｋｇ／ｄ、腹腔内注射投与）、Ｙ−３１群（１．５ｍｇ／ｋｇ／ｄ、腹腔内注射投与）と３群に分け、各群のサンプル数はｎ＝１０であり、骨髄移植の当日から投与開始し、毎日１回行った。
【０１４１】
４．測定指標：
（１）体重：毎日１回計測した。
（２）ＢＭＴ後のマウスの生存時間を記録した。
【０１４２】
実験結果：
本実験において、急性移植片対宿主病（ａＧＶＨＤ）のマウスモデルを作成し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスが半数致死量（Sub−fatal dose）８．５Ｇｙの全身照射を受けた後、ＢＡＬＢ／Ｃマウス骨髄細胞及び脾臓細胞を注入し、ａＧＶＨＤモデルを複製し、ａＧＶＨＤマウスの生存及び体重変化に対する化合物の影響を観察した。
実験結果を図１５示した。骨髄移植した後、ａＧＶＨＤモデルマウスの体重が明らかに低減し、且つ死亡例が見られた。ａＧＶＨＤ異体移植によるマウス体重の低減に対して、Ｒａｐａｍｙｃｉｎ及び誘導体Ｙ３１が明らかな緩衝作用を有し、ａＧＶＨＤマウスの生存率を上昇させ、治療効果が明らかであった。
実験結果により、急性移植片対宿主病（ａＧＶＨＤ）動物モデルに対して、Ｒａｐａｍｙｃｉｎ及び誘導体Ｙ３１が良好な治療効果を有することが証明された。
【０１４３】
Ｖ．ＤＢＡ／１マウスでの牛ＩＩ型コラーゲン誘導関節炎に関するＹ３１の治療効果：
実験目的：本実験において牛型コラーゲンでＤＢＡ／１マウス関節炎を誘導し、Ｙ３１を体内へ投与し、マウス関節炎の発病指数（Disease index）の変化を観察することで、マウス関節炎に対するＹ３１の治療効果を観察・評価した。
【０１４４】
実験薬剤：
名称：Ｙ３１。
性状、含有量：白い粉末。
調製方法：無水アルコールに溶解させ、５０ｍｇ／ｍｌの保存液を調製した。使用時、５％ＰＥＧ４００＋５％Ｔｗｅｅｎ−８０無菌水を溶媒として必要な濃度まで保存液を希釈した。
【０１４５】
実験動物及び材料：
ＤＢＡ／１マウス、７〜８週齢、体重２０〜２２ｇ、日本大阪大学医学部Hiromi Fujiwara教授より提供された。動物は上海薬物研究所ＳＰＦ動物飼育施設で飼育され、少なくとも一週間飼育してから使用した。温度が２２±１℃であり、湿度が５５±５％であり、１２時間交代の明暗サイクルで飼育した。餌と水を全部消毒してから動物が自由に摂取した。全部の実験に関して、完全に実験動物に関する条例に基づいて行った。
Mycobacterium tuberculosisstrain H37Rvを含むフロイント完全アジュバント（Freund’s complete adjuvant）がWako Pure Chemical Industries Ltd（Osaka， Japan）から購入。
【０１４６】
実験方法：
関節炎モデル：牛ＩＩ型コラーゲンに０．１Ｍの酢酸を加え、濃度を２０ｍｇ／ｍｌに調製し、４℃の冷蔵庫で一晩放置して溶解させた。コラーゲンが同体積のフロイント完全アジュバント（結核菌を含むＨ３７Ｒｖ株）と充分乳化し、オスのＤＢＡ／１マウスを麻酔した後、２５μｌ／匹（すなわち、２５０μｇ／匹）でその尾部を敏感にさせた。３週間後、同用量で攻撃した。肉眼でマウスの四肢を観察し、関節炎の程度に関して、０〜４段階評価を行った：０＝正常、１＝１個又は数個の趾関節が発赤又は腫脹、２＝膝関節以下が中等度発赤腫脹、３＝膝関節を含む部分が重度発赤腫脹、４＝膝関節を含む部分が完全に発赤腫脹、関節変形、硬直、機能障害。各マウスの最高評価点数が、１６点であった。
【０１４７】
薬物治療：
ランダムにマウスをモデル対照群、Ｙ３１（１ｍｇ／ｋｇ）投与群（攻撃した後１４日から投与開始し、三週連続投与した）と、二群に分けた。
【０１４８】
実験結果：
牛ＩＩ型コラーゲンを皮下に二回注射することでＤＢＡ／１マウス関節炎を誘導できた。関節腫脹が攻撃された後の４日から現れ、一週間後１００％のマウスが関節炎を発症し、且つ関節腫脹が進行性に悪化し、１４日から投与開始した。Ｙ３１を投与した後、ＣＩＡの発症程度が明らかに低減され、マウスの四肢（足、爪）の腫脹が明らかに軽減された（図１６、ｐ＜０．０５）。Ｙ３１経口投与がコラーゲンで誘導されたＤＢＡ／１マウス関節炎の発症を抑制できることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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