(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一のポリペプチドをコードする第一の核酸分子と第二のポリペプチドをコードする第二の核酸分子とを少なくとも含んでなる高度弱毒化改変アンカラ（ＭＶＡ）ベクターであって、
該第一および第二の核酸分子がそれぞれ、４０以上の連続するヌクレオチドの部分にわたっておよそ８０％または８０％を超える相同性パーセンテージを示す第一および第二の天然核酸配列から得られ、かつ
ベクターに含まれる該第一の核酸分子および／または該第二の核酸分子が、該相同性パーセンテージを７５％未満に低下させるよう改変され、かつ
該第一の核酸分子と該第二の核酸分子が少なくとも、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３３およびＨＰＶ−５２から選択される異なるＨＰＶ血清型から得られる同じポリペプチドをコードし、
前記ポリペプチドが、Ｅ１、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１若しくはＬ２またはこれらの組み合わせから選択され、
第一および第二の核酸分子間の同一部分が８未満の連続したヌクレオチドに限定されるように、コドン使用パターンが改変された、
ＭＶＡベクター。
【請求項２】
相同性パーセンテージを７５％未満に低下させるために、第一の核酸分子または第二の核酸分子または第一および第二の核酸分子の双方のコドン使用パターンが、４０以上の連続するヌクレオチドの該相同部分で少なくとも改変される、請求項１に記載のＭＶＡベクター。
【請求項３】
コドン使用パターンがヌクレオチドレベルで改変され、該改変がアミノ酸レベルではサイレントである、請求項２に記載のＭＶＡベクター。
【請求項４】
第一の核酸分子と第二の核酸分子との間の相同部分が、５未満の連続するヌクレオチドに限定されるように、コドン使用パターンが改変される、請求項２または３に記載のＭＶＡベクター。
【請求項５】
前記の第一および第二の核酸分子が、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３０、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３５、ＨＰＶ−３９、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−５１、ＨＰＶ−５２、ＨＰＶ−５６、ＨＰＶ−５８、ＨＰＶ−５９、ＨＰＶ−６６、ＨＰＶ−６８、ＨＰＶ−７０およびＨＰＶ−８５からなる群から選択される高リスク乳頭腫ウイルスから独立に得られる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＭＶＡベクター。
【請求項６】
前記の第一および第二の核酸分子が、Ｅ１、Ｅ６およびＥ７からなる群から選択される初期乳頭腫ウイルスポリペプチドをコードする、請求項５に記載のＭＶＡベクター。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、Ｅ６ポリペプチド、Ｅ７ポリペプチドまたはＥ６およびＥ７ポリペプチドの双方である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＭＶＡベクター。
【請求項８】
第一の核酸分子がＨＰＶ−１６  Ｅ６ポリペプチドをコードし、第二の核酸分子がＨＰＶ−１８  Ｅ６ポリペプチドをコードし、第二の核酸分子が配列番号１４で示されるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項７に記載のＭＶＡベクター。
【請求項９】
第一の核酸分子がＨＰＶ−１６  Ｅ７ポリペプチドをコードし、第二の核酸分子がＨＰＶ−１８  Ｅ７ポリペプチドをコードし、第二の核酸分子が配列番号１５で示されるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項７に記載のＭＶＡベクター。
【請求項１０】
第一の核酸分子がワクシニア７．５Ｋプロモーターの制御下に置かれ、第二の核酸分子がワクシニアＨ５Ｒプロモーターの制御下に置かれ、第一および第二の核酸分子が双方ともＭＶＡベクターの欠失ＩＩＩに挿入される、請求項８または９に記載のＭＶＡベクター。
【請求項１１】
ＨＰＶ−１６  Ｅ６ポリペプチドをコードする第一の核酸分子、ＨＰＶ−１８  Ｅ６ポリペプチドをコードする第二の核酸分子、ＨＰＶ−１６  Ｅ７ポリペプチドをコードする第三の核酸分子およびＨＰＶ−１８  Ｅ７ポリペプチドをコードする第四の核酸分子を含んでなり、該第一、第二、第三および第四の核酸分子が７５％または７５％を超える相同性パーセンテージを示す４０以上の連続するヌクレオチドの部分を含まない、請求項７に記載のＭＶＡベクター。
【請求項１２】
配列番号９、１０、１１、１４または１５で示されるヌクレオチド配列を含んでなる、実質的に単離された核酸分子。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸分子または請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＭＶＡベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項１４】
治療上有効な量の、請求項１２に記載の核酸分子、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項１３に記載の宿主細胞と、薬学上許容されるビヒクルとを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１５】
前記組成物が、ヒトにおける全身投与または粘膜投与に好適な１以上のアジュバントを含んでなる、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記アジュバントが、イミダゾキノリン化合物である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
感染性疾患、癌または免疫不全疾患の治療または予防に用いるための、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
持続的感染、前悪性および悪性病変などの、乳頭腫ウイルスによる感染に関連した症状の予防的または治療的処置のための、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記の治療または予防が、プライムブースト療法に従って行われ、前記のベクターまたは組成物を用い、被験体において初回免疫反応または追加免疫反応のいずれかまたは初回免疫反応と追加免疫反応の両方が行われる、請求項１７または１８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、同じ生物または近縁の生物から得られる目的の複数のヌクレオチド配列を独立に発現するように操作された組換えベクターに関する。本発明は、種々の原核生物ならびに真核生物in vitro系または治療もしくは予防目的の動物もしくはヒト被験体で、互いに相同性を示す複数のヌクレオチド配列を発現させるための組換え核酸技術の分野に関する。本発明は、特に、免疫療法の分野で、特に、乳頭腫（パピローマ）ウイルスおよび肝炎ウイルスなどの感染性生物によって引き起こされる病状を治療または予防するために有用である。
【０００２】
組換えＤＮＡ技術は、培養宿主細胞または生体生物でヌクレオチド配列を発現することを可能とした。いくつかのプラスミドＤＮＡおよびウイルスベクターが作製され、ワクチン接種、遺伝子療法、免疫療法および培養細胞での発現を含む種々の目的のために用いられてきた。アデノウイルスおよびポックスウイルスベクターなどのベクターは、広範囲の宿主細胞で複数のヌクレオチド配列を発現する能力を持った大きなクローニング能を提供するという利点を持つ。複数のヌクレオチド配列の発現はコードされるポリペプチドによって提供される治療効力を改良するために有利である（例えば、体液性免疫と細胞性免疫の組合せ）。所望のヌクレオチド配列の各々を発現するように個々に操作された複数の組換えベクターを作製するよりもむしろ、少なくとも生産工程および規制認可を容易にするためには単一の組換えベクターを作製するほうが有利であろう。
【０００３】
例えば、乳頭腫ウイルス感染に関しては、特に重複感染（例えば、ＨＰＶ−１６とＨＰＶ−１８）のリスクのある被験体において宿主の免疫応答を拡大または増強するために、いくつかの乳頭腫ウイルス遺伝子型に由来する免疫原性ポリペプチドを発現させることに注目される。しかしながら、このような免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は関連のあるＨＰＶ遺伝子型間では相同性が高い。例えば、ヌクレオチドレベルで６３％の全体的相同性を示すＨＰＶ−１６  Ｅ６配列とＨＰＶ−１８  Ｅ６配列は、やはり、７５％を超える極めて相同性の高い特定の領域を含み、単一のベクターからのＨＰＶ−１６遺伝子およびＨＰＶ−１８遺伝子の発現を危うくする。
【０００４】
さらに、ウイルス起源のポリペプチドを発現させる場合、ウイルスゲノムの全体構成からも相同なヌクレオチド配列が生じ得る。むしろ、ウイルスは、内部翻訳開始またはリーディングフレームシフティング（すなわち、同じ配列のＤＮＡが２つ以上のリーディングフレームで翻訳される）などの生体機構を通じ、同じヌクレオチド配列を用いて２つの異なるタンパク質をコードすることがしばしばある。例えば、ＨＰＶ−１６ゲノムでは、隣接するＥ１遺伝子とＥ２遺伝子は、異なるリーディングフレームで翻訳される５９のヌクレオチドで重なっている。言い換えれば、Ｅ１遺伝子の少なくとも５９のヌクレオチドがＥ２遺伝子の最初の５９のヌクレオチドと重なっている。
【０００５】
しかしながら、ベクターに相同な配列が存在すると、特にベクターの作製中のその安定性に負の影響を及ぼし、相同な配列間で起こる組換え事象によって遺伝子配列の欠損をもたらすと考えられる。従って、単一のベクターにおけるＨＰＶ−１６  Ｅ１およびＥ２遺伝子の発現は、潜在的に相同組換え事象を、ついにはＥ１とＥ２相同配列の間に含まれる配列の欠損をもたらし得る５９のヌクレオチドの共通部分の存在を含む。このような望まれない相同組換え事象は、同じベクターでＨＰＶ−１６遺伝子配列とＨＰＶ−１８遺伝子配列を発現させる場合にも起こり得る。この不安定性の問題は、ベクター原株を特にヒト臨床試験に使用不能とし得る。
【０００６】
これに関し、ＷＯ９２／１６６３６は、組換えベクターにおいて相同なヌクレオチド配列を組換え事象の可能性を下げるように、互いに対して逆向きに挿入することを提案している。しかしながら、この戦略はワクシニアウイルスベクターに関して記載されており、アデノウイルスなどの他の組換えベクターに関しては記載されていない。さらに、この逆向きの配向は潜在的なプロモーター干渉および構築の制約ために常に可能とは限らない。
【０００７】
当技術分野では、宿主細胞または被験体において、本来的に、相同性の高い部分を含む、同じ生物または近縁の生物から得られるヌクレオチド配列を発現し得る組換えベクターを作製する必要がある。本発明は、遺伝コードの縮重を用いて相同なヌクレオチド配列の一方または両方を変化させて、コードされているアミノ酸配列を変化させることなく、または有意に変化させることなく、それらを改変前よりも低い相同性にすることにより、組換え事象の可能性を最小限とするように設計された新規な戦略を提供することでこの必要に取り組んだ。本発明は、特にベクター作製工程中に、相同な配列間で起こり、その間に含まれるヌクレオチド配列の欠損をもたらし得る相同組換えの悪影響を回避することを可能とする。本発明のベクターは、本来の文脈において５９ヌクレオチドの１００％相同部分を共有するＥ１およびＥ２乳頭腫ウイルス遺伝子を発現させるのに驚くほど有効であり、ベクター作製工程中に驚くべき安定性であることが見出された。また、本発明のベクターは、近縁のＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８遺伝子型から得られるＥ６およびＥ７遺伝子を発現させるのに驚くほど有効であることも見出された。
【０００８】
この技術的問題は特許請求の範囲で定義された具体例の提案により解決される。
【０００９】
本発明のその他の、またさらなる態様、特徴および利点は、以下の本発明の、現在のところ好ましい実施形態の記載から明らかになろう。これらの実施形態は開示を目的に示されるものである。
【００１０】
よって、第一の態様において、本発明は少なくとも、第一のポリペプチドをコードする第一の核酸分子と第二のポリペプチドをコードする第二の核酸分子とを含んでなり、
該第一および第二の核酸分子がそれぞれ、４０以上の連続するヌクレオチドの部分にわたっておよそ８０％または８０％を超える相同性パーセンテージを示す第一および第二の天然核酸配列から得られ、かつ、
ベクターに含まれる該第一の核酸分子および／または該第二の核酸分子が該相同性パーセンテージを７５％未満に低下させるように改変されている、
ベクターを提供する。
【００１１】
本明細書において全出願を通じ「a」および「an」は、特に断りのない限り、示されている化合物または工程の「少なくとも１つ」、「少なくとも第一」、「１以上」または「複数」を意味するという意味において用いられる。例えば、「a cell」は、その混合物を含め、複数の細胞を含む。
【００１２】
本明細書において「および／または」とは、「および」、「または」および「この用語によって接続された要素の全て、または他のいずれかの組合せ」の意味を含む。例えば、「第一の核酸分子および／または第二の核酸分子」とは、第一の核酸分子、または第二の核酸分子、または第一および第二の核酸分子の双方を意味する。
【００１３】
本明細書において「約」または「およそ」とは、示された値または範囲の５％以内、好ましくは４％以内、より好ましくは２％以内を意味する。
【００１４】
本明細書において、定義された生成物、組成物および方法に対して用いる場合、「含んでなる」とは、それらの生成物、組成物および方法は示されている成分または工程を含むが、他を排除しないことを意味するものとする。「〜から本質的になる」とは、本質的意味の他の成分または工程を排除することを意味する。従って、示された成分から本質的になる組成物は微量の夾雑物および薬学上許容される担体を排除しない。「〜からなる」とは、微量要素を超える他の成分または工程を排除することを意味する。例えば、ポリペプチドが示されたアミノ酸配列以外のアミノ酸を含まない場合、そのポリペプチドはそのアミノ酸配列「からなる」。アミノ酸配列がわずかな付加的アミノ酸残基、一般には約１から約５０などの付加的残基のみを伴って存在する場合、そのポリペプチドはそのアミノ酸配列から「本質的になる」。アミノ酸配列がポリペプチドの最後のアミノ酸配列の少なくとも一部である場合、そのポリペプチドはそのアミノ酸を「含んでなる」。このようなポリペプチドは数個から数百までの付加的アミノ酸残基を持ち得る。このような付加的アミノ酸残基はとりわけ、ポリペプチド輸送に役割を果たしたり、ポリペプチド生産を助けたり、あるいは半減期を延長したりすることができる。同じことがヌクレオチド配列についても当てはまる。
【００１５】
本明細書において「ベクター」とは、宿主細胞または被験体において少なくとも第一および第二の核酸分子を送達および発現し得る因子である。ベクターは染色体外型（例えば、エピソーム）であっても組込み型（宿主染色体に組み込むためのもの）であっても、自律複製型であってもなくても、多重コピーであっても低コピーであっても、二本鎖であっても一本鎖であっても、裸(naked)であっても他の分子との複合体（例えば、脂質またはポリマーと複合化して、リポソーム、リポプレックスまたはナノ粒子などの粒状構造を形成したベクター、ウイルスキャプシッドにパッケージングされたベクター、および固相粒子上に固定されたベクターなど）であってもよい。「ベクター」の定義には、特定の宿主細胞を優先的に標的とすることができるように改変されたベクターも包含する。標的化ベクターの特徴は、それらの表面に、細胞特異的マーカー（例えば、ＨＰＶ感染細胞）、組織特異的マーカーまたは腫瘍特異的マーカーなどの細胞および表面露出成分を認識し、それと結合し得るリガンドが存在することである。このリガンドは一般に、ベクターの表面に存在するポリペプチド（例えば、アデノウイルス繊維、ペントン、ＷＯ９４／１０３２３およびＷＯ０２／９６９３９に記載のｐＩＸまたはＥＰ１１４６１２５に記載のワクシニアｐ１４遺伝子産物）に挿入することができる。
【００１６】
本発明に関する範囲内で、「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」および「ヌクレオチド配列」は互換的に用いられ、長さによらず、ポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）分子のいずれかの、またはそれらの組合せのポリマーを定義する。この定義には、一本鎖または二本鎖、直鎖または環状、天然または合成ポリヌクレオチドを包含する。さらに、このようなポリヌクレオチドは非天然ヌクレオチド（例えば、米国特許第５，５２５，７１１号、同第４，７１１，９５５号またはＥＰＡ３０２１７５に記載されているものなどのメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体）ならびに核酸のin vivo安定性を高めるため、その送達を高めるため、または宿主対象からのクリアランス速度を低減するための化学修飾（例えば、ＷＯ９２／０３５６８、米国特許第５，１１８，６７２号参照）を含み得る。存在する場合、修飾は重合前に行っても重合後に行ってもよい。
【００１７】
本明細書において「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、ペプチド結合を介して結合した９以上のアミノ酸を含むアミノ酸残基のポリマーを指して互換的に用いられる。ポリマーは直鎖であっても分枝型であっても環状であってもよい。本発明に関して、「ポリペプチド」とは、Ｌ立体異性体（天然型）またはＤ立体異性体のアミノ酸を含んでよく、β−アラニン、オルニチンもしくはメチオニンスルホキシド、または、１以上のα−アミノ、α−カルボキシルもしくは側鎖（例えばメチル、ホルミル、アセチル、グリコシル、ホスホリルなどの付加による）で修飾されたアミノ酸など、２０種の一般天然アミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。一般的な指標として、アミノ酸ポリマーが長い場合（例えば、５０を超えるアミノ酸残基）、好ましくはポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。結局、「ペプチド」とは、アミノ酸約９〜約５０個の長さのフラグメントを指す。本発明の文脈において、ペプチドは好ましくは、天然タンパク質の選択された領域、例えば、エピトープを含むその免疫原性フラグメントを含む。
【００１８】
本明細書で定義される「ポリペプチド」とは、天然ならびに改変ポリペプチドを包含する。本明細書において「天然」とは、天然源から採取された材料を指し、実験室でヒトによって人工的に改変または変更された材料とは異なる。例えば、天然ポリペプチドは、野生型生物または細胞のゲノムに存在している遺伝子によりコードされている。これに対し、改変ポリペプチドは、例えば、１以上のアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換、またはこれらの可能性の任意の組合せによって天然ポリペプチドとは異なるように実験室で改変された核酸分子によりコードされている。いくつかの改変が意図される場合、それらは連続残基に関するものであっても、かつ／または非連続残基に関するものであってもよい。本発明が意図する改変の例は、天然ポリペプチドが示す生物活性の変更をもたらすものであり得る。ある生物活性に重要なアミノ酸は、構造および機能分析によるなど、常法によって同定することができ、当業者ならば、そのような生物活性を低減または排除し得る突然変異のタイプを容易に決定することができる。このような改変は、部位特異的突然変異誘発などの常法によって行うことができる。あるいは、自動化法で化学合成により改変ポリペプチドをコードする合成核酸分子を作出することもできる（例えば、付属の実施例の節に記載されているようなオーバーラッピング合成オリゴヌクレオチドから組み立て）。
【００１９】
本明細書において「得られる」とは、天然源に見られる、天然源から単離される、天然源から精製される、または天然源から誘導される材料を指す。「単離される」とは、その天然環境から取り出されることを意味する。「精製される」とは、それが自然状態で会合している少なくとも１つの他の成分を実質的に含まないことを表す。「誘導される」とは、天然材料に対しての１以上の改変（特に、置換、欠失および／または挿入などの突然変異）を表す。単離、精製および改変の技術は当技術分野の慣例であり、得られる材料によって異なる（例えば、核酸分子のクローニングは天然源から、制限酵素の使用、ＰＣＲまたは化学合成によって行うことができる）。
【００２０】
本明細書において「相同性」とは、一般にパーセンテージとして表し、少なくとも４０の連続するヌクレオチド（例えば、およそ４０、４５、５０、５５、５７、５８、５９、６０、７０、さらにはそれを超える連続するヌクレオチド）の部分にわたって、所定の同一性の程度を互いに保持するヌクレオチド配列を表す。「少なくとも８０％」とは、およそ８０％または８０％を超える（例えば、８０％を超える任意の値、有利には少なくとも８５％、望ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、いっそうより好ましくは少なくとも９７％、１００％までの配列相同性）を指す。「７５％未満」とは、７５より小さい任意の値、例えば、およそ７４、７２、７０、６８、６５、６２、６０％、さらにはそれより小さいことを表す。２つのヌクレオチド配列間の相同性％は、それらの配列に共通する同一の位置の数の関数であり、最適なアライメントのために導入する必要のあるギャップの数と各ギャップの長さが考慮されている。当技術分野では、ヌクレオチド配列間の同一性パーセンテージを決定するために、ＧＣＧウィスコンシンパッケージおよびNational Center for Biotechnology Information (NCBI)で公的に利用可能であり、印刷刊行物（例えば、Altschul et al, 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410）に記載されているthe Basic Local aliment Search Tool (BLAST)プログラムなどの種々のコンピュータープログラムおよび数学的アルゴリズムが利用可能である。
【００２１】
最初の時点で、８０％または８０％を超える相同性パーセンテージを共有する４０以上の連続するヌクレオチドの１以上の部分（すなわち、「相同」部分）を明らかにするために、改変前の第一の核酸分子と第二の核酸分子の間の配列アライメントを用いることができる。特定の実施形態においては、相同性パーセンテージを７５％未満（例えば、およそ７４、７２、７０、６８、６５、６２、６０％またはさらにはそれより低い）に低下させるために、第一の核酸分子または第二の核酸分子または第一および第二の核酸分子の双方のコドン使用パターン（codon usage pattern）が、４０以上の（例えば、およそ４０、４５、５０、５５、５７、５８、５９、６０、７０、またはさらにそれを超える）連続するヌクレオチドの該相同部分で少なくとも改変される（例えば、コドン使用パターンの縮重による）。
【００２２】
メチオニン残基およびトリプトファン残基はそれぞれ独自の核酸トリプレット（すなわち、コドン）によりコードされているが、他の１８のアミノ酸をコードするには種々のコドンが使用可能である（遺伝コードの縮重）。例えば、アミノ酸は次のようなコドンによってコードされる：アラニン（ＡｌａまたはＡ）はコドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵにより；システイン（ＣまたはＣｙｓ）はコドンＵＧＣおよびＵＧＵにより；アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）はコドンＧＡＣおよびＧＡＵにより；グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）はコドンＧＡＡおよびＧＡＧにより；フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）はコドンＵＵＣおよびＵＵＵにより；グリシン（ＧまたはＧＩｙ）はコドンＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧおよびＧＧＵにより；ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）はコドンＣＡＣおよびＣＡＵにより；イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）はコドンＡＵＡ、ＡＵＣおよびＡＵＵにより；リシン（ＫまたはＬｙｓ）はコドンＡＡＡおよびＡＡＧにより；ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）はコドンＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧおよびＣＵＵにより；メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）はコドンＡＵＧにより；アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）はコドンＡＡＣおよびＡＡＵにより；プロリン（ＰまたはＰｒｏ）はコドンＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧおよびＣＣＵにより；グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）はコドンＣＡＡおよびＣＡＧにより；アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）はコドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧおよびＣＧＵにより；セリン（ＳまたはＳｅｒ）はコドンＡＧＣ、ＡＧＵ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧおよびＵＣＵにより；トレオニン（ＴまたはＴｈｒ）はコドンＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧおよびＡＣＵにより；バリン（ＶまたはＶａｌ）はコドンＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧおよびＧＵＵにより；トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）はコドンＵＧＧによりおよびチロシン（ＹまたはＴｙｒ）はコドンＵＡＣおよびＵＡＵによりコードされる。
【００２３】
該第一および第二の核酸分子に存在する１以上の相同部分における相同性パーセンテージの低下は、遺伝コードの縮重（degeneracy）を利用し、第一の核酸分子および／または第二の核酸分子のコドン使用パターンを改変することによって達成することができる。コドン使用パターンの改変は、一般に、１以上の「天然」コドンを別のコドンに置き換えることで行われる。例えば、ＡｒｇをコードするＡＧＡコドンをＡｒｇをコードするＣＧＣコドンで置き換えると、コドンの３つの位置のうち２つの相同性が無くなる。相同性は部分的置換で十分低下し得るので、全ての天然コドンを変更する(degenerate)必要はない。さらに、コドン使用パターンの改変は核酸分子全体にわたって行うこともできるし、あるいは改変前に存在する相同部分に限定することもできる。望ましくは、本明細書において、変更（degenerescence）は第一の核酸分子で行い、相同部分に限定される。好ましくは、コドン使用パターンはヌクレオチドレベルで改変され、これらの改変はアミノ酸レベルではサイレントであり、すなわち、可能であれば、各「天然」コドンは、同じアミノ酸をコードするコドンで置き換えられ、その結果、このような改変はコードされるポリペプチドに翻訳されない。より好ましくは、可能であれば、第一の核酸分子と第二の核酸分子の間の相同部分が９または８未満の連続するヌクレオチド、有利には７未満の連続するヌクレオチド、好ましくは６未満の連続するヌクレオチド、より好ましくは５未満の連続するヌクレオチドに限定されるように、コドン使用パターンが改変される。コドン使用パターンの改変は、部位特異的突然変異誘発（例えば、Amersham, Les Ullis, FranceのSculptor（商標）in vitro突然変異誘発系を使用）、ＰＣＲ突然変異誘発、ＤＮＡシャッフリングおよび化学合成技術（例えば、合成核酸分子を生じる）など、当業者に公知のいくつかの方法によって作製することができる。
【００２４】
本発明のベクターが２つを超える核酸分子を含む場合、ベクターに含まれ、別の核酸分子が得られる少なくとも１つの他の天然核酸配列と、４０以上の連続するヌクレオチドの部分にわたっておよそ８０％または８０％を超える相同性パーセンテージを示す天然核酸配列から得られる核酸分子はいずれも、相同性パーセンテージを７５％未満に低下させるように、すなわち、ベクターに含まれる核酸分子対には、７５％を超える同一性パーセンテージを示す４０以上の連続するヌクレオチドの部分を含むものが無いように改変することができる。
【００２５】
８０％または８０％を超える相同性パーセンテージを示す１以上の部分を明らかにするためには、それらの核酸分子が得られる各天然配列間（対）の配列アラインメントを用いればよい。次に、少なくとも相同部分の相同性パーセンテージを７５％未満に低下させるように、特にコドン使用の縮重によって、１以上の天然配列の配列が改変される。最後に、ベクターに含まれる核酸分子には、該ベクターに含まれる他の核酸分子と７５％を超える同一性パーセンテージを示す４０以上の（例えば、４５、５０、５５、５７、５８、５９、６０、７０またはさらにはそれを超える）連続するヌクレオチドの部分を含むものが無くなる。
【００２６】
上述のように、ベクターの含まれる核酸分子によりコードされるポリペプチドは、天然ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有してもよいし、有さなくてもよい。特に、ベクターに含まれる核酸分子の少なくとも相同部分における相同性を低減させるためのコドン使用の縮重に関する突然変異の他、ベクターに含まれる該核酸分子はまた、コードされているポリペプチドのアミノ酸配列の改変をもたらす付加的突然変異を含んでもよいし、改変をもたらさない付加的突然変異を含んでもよい。
【００２７】
本発明のベクターはウイルスならびに非ウイルス（例えば、プラスミドＤＮＡ）ベクターを包含する。好適な非ウイルスベクターとしては、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４(Invitrogene)、ｐＣＩ(Promega)、ｐＣＤＭ８(Seed, 1987, Nature 329, 840)、ｐＶＡＸおよびｐｇＷｉｚ(Gene Therapy System Inc; Himoudi et al, 2002, J. Virol. 76, 12735-12746)などのプラスミドが含まれる。本明細書において「ウイルスベクター」は、その分野で認識されている意味に従って用いられる。ウイルスベクターは、完全なウイルスゲノム、その一部、または下記のような改変ウイルスゲノムならびに生産されたそのウイルス粒子（例えば、感染性ウイルス粒子を生産するためにウイルスキャプシッドにパッケージングされたウイルスベクター）を含む、ウイルス起源の少なくとも１つの要素を含むいずれのベクターも指す。本発明のウイルスベクターは複製能があってもよく、あるいは遺伝的に不能にし、複製欠陥型または複製障害型とすることもできる。本明細書において「複製能」とは、特定の宿主細胞（例えば、腫瘍細胞）において良好または選択的に複製するように操作された複製選択および条件的複製ウイルスベクターを包含する。ウイルスベクターは種々の異なるウイルスから、特には、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルスおよび泡沫状ウイルスからなる群から選択されるウイルスから得ることができる。
【００２８】
一実施形態では、本発明のベクターはアデノウイルスベクターである（総説としては、"Adenoviral vectors for gene therapy", 2002, Ed D. Curiel and J. Douglas,Academic Press参照）。それはヒトまたは動物アデノウイルスのいずれから誘導することもできる。本発明において、いずれの血清型およびサブグループも使用可能である。より詳しくは、サブグループＡ（例えば、血清型１２、１８および３１）、サブグループＢ（例えば、血清型３、７、１１、１４、１６、２１、３４および３５）、サブグループＣ（例えば、血清型１、２、５および６）、サブグループＤ（例えば、血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２〜３０、３２、３３、３６〜３９および４２〜４７）、サブグループＥ（血清型４）およびサブグループＦ（血清型４０および４１）が挙げられる。特に好ましいのはヒトアデノウイルス２（Ａｄ２）、５（Ａｄ５）、６（Ａｄ６）、１１（Ａｄ１１）、２４（Ａｄ２４）および３５（Ａｄ３５）である。このようなアデノウイルスは、the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Md.)から入手可能であり、それらの配列、構成および生産方法を記載した多くの刊行物の対象となっており、当業者ならばそれらを適用することができる（例えば、米国特許第６，１３３，０２８号、同第６，１１０，７３５号、ＷＯ０２／４０６６５、ＷＯ００／５０５７３、ＥＰ１０１６７１１、Vogels et al, 2003, J. Virol. 77, 8263-8271参照）。
【００２９】
本発明のアデノウイルスベクターは複製能を持ち得る。当業者ならば、複製能があるアデノウイルスベクターの多くの例を容易に入手することができる（例えば、Hernandez- Alcoceba et al., 2000, Human Gene Ther. 11, 2009-2024; Nemunaitis et al., 2001, Gene Ther. 8, 746-759; Alemany et al., 2000, Nature Biotechnology 18, 723-727；ＷＯ００／２４４０８;米国特許第５，９９８，２０５号、ＷＯ９９／２５８６０、米国特許第５，６９８，４４３号、ＷＯ００／４６３５５、ＷＯ００／１５８２０およびＷＯ０１／３６６５０参照）。
【００３０】
あるいは、本発明のアデノウイルスベクターは、複製欠陥型であってもよい（例えば、ＷＯ９４／２８１５２参照）。好ましい複製欠陥型アデノウイルスベクターはＥ１欠陥型（例えば、米国特許第６，１３６，５９４号および同第６，０１３，６３８号）であり、Ｅ１の欠失はおよそ４５９番〜３３２８番またはおよそ４５９番〜３５１０番に及ぶ（受託番号Ｍ７３２６０としてＧｅｎｅＢａｎｋに、また、Chroboczek et al, 1992, Virol. 186, 280-285に開示されているヒト５型アデノウイルスの配列を参照）。クローニング能および安全性は、（例えば、Lusky et al., 1998, J. Virol 72, 2022-2032に記載されているような非必須Ｅ３領域または他の必須Ｅ２、Ｅ４領域において）アデノウイルスゲノムのさらなる部分を欠失させることにより、さらに改良することができる。
【００３１】
第一および第二の核酸分子は、Chartier et al. (1996, J. Virol. 70, 4805-4810)に記載されているように、本発明のアデノウイルスベクターのいずれの位置にでも独立に挿入することができ、挿入領域の本来の転写方向に対してセンス配向および／またはアンチセンス配向に独立に配置することができる。例えば、それらは双方ともＥ１領域の代わりに挿入することもできるし、あるいは一方がＥ１領域の代わりに、もう一方がＥ３領域の代わりに挿入される。
【００３２】
別の実施形態では、本発明のベクターはポックスウイルスベクターである（例えば、Cox et al. in "Viruses in Human Gene Therapy" Ed J. M. Hos, Carolina Academic Press参照）。それはポックスウイルス科のいずれのメンバーから得られるものでもよく、特に、カナリヤ痘ウイルス（例えば、ＷＯ９５／２７７８０に記載されているようなＡＬＶＡＣ）、鶏痘ウイルス（例えば、Paoletti et al., 1995, Dev. Biol. Stand. 84, 159-163に記載されているようなＴＲＯＶＡＣ）またはワクシニアウイルスから得られるものであり、ワクシニアウイルスが好ましい。好適なワクシニアウイルスは、コペンハーゲン株(Goebel et al., 1990, Virol. 179, 247-266および517-563; Johnson et al., 1993, Virol. 196, 381-401)、ワイス株、ＮＹＶＡＣ（ＷＯ９２／１５６７２およびTartaglia et al., 1992, Virology 188, 217-232参照）および高弱毒改変アンカラ（ＭＶＡ）株(Mayr et al., 1975, Infection 3, 6-16)からなる群から選択することができる。このようなベクターおよび作製方法は当業者に入手可能な多くの文献に記載されている（例えば、Paul et al., 2002, Cancer gene Ther. 9, 470-477; Piccini et al., 1987, Methods of Enzymology 153, 545-563；米国特許第４，７６９，３３０号；同第４，７７２，８４８号；同第４，６０３，１１２号；同第５，１００，５８７号および同第５，１７９，９９３号）。本発明で用いられる第一および第二の核酸分子は好ましくは、その組換えポックスウイルスが活性および感染性を維持するように、ポックスウイルスゲノムの非必須遺伝子座に挿入される。非必須領域は非コード遺伝子間領域またはその不活性化または欠失がウイルスの増殖、複製または感染を有意に損なわないいずれかの遺伝子である。また、例えば、そのポックスウイルスゲノムで欠失しているものに相当する相補配列を有するヘルパー細胞株を用いることにより、ウイルス粒子の生産の際に欠損している機能がトランスで供給される限り、必須ウイルス遺伝子座における挿入も考えられる。
【００３３】
コペンハーゲンワクシニアウイルスを用いる場合、少なくとも第一および第二の核酸分子は好ましくはチミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）に挿入される(Hruby et al, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci USA 80, 3411-3415; Weir et al., 1983, J. Virol. 46, 530-537)。しかしながら、例えば、血球凝集素遺伝子(Guo et al., 1989, J. Virol. 63, 4189-4198)、Ｋ１Ｌ遺伝子座、ｕ遺伝子(Zhou et al., 1990, J. Gen. Virol. 71, 2185-2190)または種々の自然欠失または操作欠失が文献(Altenburger et al., 1989, Archives Virol. 105, 15-27; Moss et al. 1981, J. Virol. 40, 387-395; Panicali et al., 1981, J. Virol. 37, 1000-1010; Perkus et al, 1989, J. Virol. 63, 3829-3836; Perkus et al, 1990, Virol. 179, 276-286; Perkus et al, 1991, Virol. 180, 406-410)に報告されているワクシニアウイルスゲノムの左末端などの他の挿入部位も適当である。
【００３４】
ＭＶＡを用いる場合、少なくとも第一および第二の核酸分子は、ＭＶＡゲノム(Antoine et al., 1998, Virology 244, 365-396)ならびにＤ４Ｒ遺伝子座に存在する、同定された欠失Ｉ〜ＶＩＩのいずれに独立に挿入してもよいが、欠失ＩＩおよび／またはＩＩＩにおける挿入が好ましい(Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038; Sutter et al., 1994, Vaccine 12, 1032-1040)。
【００３５】
鶏痘ウイルスを用いる場合、チミジンキナーゼ遺伝子内への挿入が考えられるが、少なくとも第一および第二の核酸分子は好ましくはＯＲＦ７と９の間に位置する遺伝子間領域、に導入される（例えば、ＥＰ３１４５６９および米国特許第５，１８０，６７５号参照）。
【００３６】
本発明の別の実施形態では、少なくとも第一および第二の核酸分子は、病状を示す、または示すおそれのある被験体において治療または予防活性を提供し得るポリペプチドを独立にコードする。本明細書において「被験体」とは、脊椎動物、特に哺乳類種のメンバー、特には家庭動物、農場動物、競技動物、およびヒトを含む霊長類を指す。このようなポリペプチドは好ましくは免疫原性ポリペプチドおよび抗腫瘍ポリペプチドからなる群から選択される。
【００３７】
「免疫原性」ポリペプチドとは、それが発現される被験体において免疫系を誘導、刺激、発達または追加免疫（boost）し得るポリペプチドを指す。このような免疫応答は体液性または細胞性または体液性と細胞性の双方であり得る。体液性応答は対象ポリペプチドに対する抗体生産を惹起し、細胞性応答はＴヘルパー細胞および／またはＣＴＬ応答および／またはサイトカイン生産の刺激を惹起する。一般に、ポリペプチドの免疫原性は、当技術分野で標準的な種々のアッセイによって、in vitroまたはin vivoのいずれかで評価することができる（免疫応答の誘発および活性化を評価するために利用可能な技術の概説としては、例えば、Coligan et al, Current Protocols in Immunology; ed J Wiley & Sons Inc, National Institute of Healthの最新版を参照）。例えば、検出は比色定量、蛍光測定または放射性であってよく、好適な技術としては、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイおよび免疫沈降アッセイが挙げられる。細胞性免疫の測定は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞から誘導されたものを含む、活性化されたエフェクター細胞によって分泌されたサイトカインプロフィールの測定（例えば、ＥＬＩｓｐｏｔによるＩＦＮｇ産生細胞の定量）により、免疫エフェクター細胞の活性化状態の判定（例えば、従来の［３Ｈ］チミジン取り込みによるＴ細胞増殖アッセイ）により、増感被験体における抗原特異的Ｔリンパ球のアッセイ（例えば、細胞傷害性アッセイにおけるペプチド特異的溶解）により、行うことができる。ポリペプチドの免疫原性はまた、ＥＬＩｓｐｏｔ、四量体に基づく分析技術またはＴ細胞性免疫の分析のための他の標準的な技術により、好適な動物モデルにおいて評価することもできる。好適な免疫原性ポリペプチドはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）から得られるもの（例えば、ＥＰ４１４３７４；ＥＰ３０４５７８またはＥＰ１９８４７４に記載されているようなＳ、ｐｒｅＳ２またはｐｒｅＳ１−ポリペプチド）；Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）から得られるもの（例えば、Ｃｏｒｅ（Ｃ）、エンベロープ糖タンパク質Ｅ１、Ｅ２、非構造ポリペプチドＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４もしくはＮＳ５またはその任意の組合せ）；ヒト免疫
不全ウイルス（ＨＩＶ）から得られるもの（例えば、ｇｐ１２０またはｇｐ１６０）および乳頭腫ウイルス（以下に記載される）から得られるものであり得る。
【００３８】
「抗腫瘍」ポリペプチドとは、腫瘍細胞の拡大に抑制または正味の減少を与え得るポリペプチドを指す。ポリペプチドの抗腫瘍特性は、適当な動物モデルで、または処置された被験体において、一定期間にわたる実際の腫瘍サイズの低下によって測定することができる。腫瘍サイズを評価するには、放射線学的方法（例えば、単光子および陽電子放射型コンピューター断層撮影法；一般に、"Nuclear Medicine in Clinical Oncology," Winkler, C. (ed.) Springer-Verlag, New York, 1986参照）、従来の画像試薬（例えば、クエン酸ガリウム−６７）を用いる方法、免疫学的方法（例えば、特異的腫瘍マーカーに向けられた放射性標識モノクローナル抗体）ならびに超音波法（"Ultrasonic Differential Diagnosis of Tumors", Kossoff and Fukuda, (eds.), Igaku-Shoin, New York, 1984参照）を含む種々の方法が使用可能である。あるいは、ポリペプチドの抗腫瘍特性は、腫瘍マーカーの存在の低下に基づいて測定することができる。例としては、前立腺癌の検出のためのＰＳＡ、ならびに結腸直腸癌およびある種の乳癌の検出のためのＣＥＡが挙げられる。さらに、ポリペプチドの抗腫瘍特性は、例えば代表的なヒト癌細胞系統を注射したマウスを使用するなど、好適な動物モデルで測定することもできる。触知可能な腫瘍が発達した後、マウスに本発明のベクターを注射し、その後、腫瘍増殖速度の低下および生存率の増加をモニタリングする。さらに、種々のin vitro法を用いて、in vivoにおける腫瘍阻害を推定することができる。好適な抗腫瘍ポリペプチドとしては、ＭＵＣ−Ｉ（ＷＯ９２／０７０００；Acres et al, 2005, Exp. Rev. Vaccines 4(4)）、ＢＲＣＡ−Ｉ、ＢＲＣＡ−２(Palma et al., 2006, Critical Reviews in Oncology/haematology 27, 1-23)、癌胎児性抗原ＣＥＡ(Conroy et al., 1995, Gene Ther; 2, 59-65)、ＭＡＧＥ（ＷＯ９９／４０１８８；De Plaen et al., 1994, Immunogenetics 40, 360-369）、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ  １００(Bakker et al., 1994, J. Exp. Med. 179, 1005-9)、ＰＲＡＭＥ、ＢＡＧＥ、Ｌａｇｅ（ＮＹ  Ｅｏｓ  １としても知られる）ＳＡＧＥ、ＨＡＧＥ（ＷＯ９９／５３０６１）、ＧＡＧＥ(Robbins and Kawakami, 1996. Current Opinions in Immunol. 8, 628-36)および前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）(Ferguson, et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 3114-9；ＷＯ９８／１２３０２、ＷＯ９８／２０１１７およびＷＯ００／０４１４９）ならびに腫瘍誘発能を有するウイルス（例えば、乳頭腫ウイルス）由来のウイルスポリペプチドなどの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が挙げられる。
【００３９】
本発明の別の実施形態では、少なくとも第一および第二の核酸分子は同じ生物または近縁の生物から得られる。
【００４０】
本明細書において「生物」とは、微生物、好ましくは、病原性を有する微生物、ならびに高等真核生物を包含する。「微生物」とは、真菌、細菌、原虫およびウイルスを表す。ウイルスの代表例としては、限定されるものではないが、ＨＩＶ（ＨＩＶ−ＩまたはＨＩＶ−２）、ヒトヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ１またはＨＳＶ２）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、ＨＢＶ、ＨＣＶおよびＥ型肝炎ウイルス）、フラビウイルス（例えば、黄熱ウイルス）、水痘−帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、パラミクソウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルスおよび乳頭腫ウイルス（上記で定義された通り）が挙げられる。好適な細菌の代表例としては、限定されるものではないが、ナイセリア属(Neisseria)（例えば、淋菌)(N. gonorrhea)および髄膜炎菌(N. meningitidis)）；ボルデテラ属(Bordetella)（例えば、百日咳菌(B. pertussis)、パラ百日咳菌(B. paraperussis)および気管支敗血症菌(B. bronchiseptica)、マイコバクテリア属(Mycobacteria)（例えば、結核菌(M. tuberculosis)、ウシ結核菌(M. bovis)、らい菌(M. leprae)、鳥結核菌(M. avium)、パラ結核菌(M. paratuberculosis)、スメグマ菌(M. smegmatis)）；レジオネラ属(Legionella)（例えば、Ｌ．ニューモフィラ(L. pneumophila)）；エシェリキア属(Escherichia)（例えば、内毒素大腸菌(E. coli)、腸管出血性(enterohemorragic)大腸菌、腸病原性大腸菌）；赤痢菌属(Shigella)（例えば、ソンネ赤痢菌（S. sonnei）、志賀赤痢菌(S. dysenteriae)、フレクスナー赤痢菌(S. flexnerii)）；サルモネラ菌属(Salmonella)（例えば、チフス菌(S. typhi)、パラチフス菌(S. paratyphi)、豚コレラ菌(S. choleraesuis)、腸炎菌(S. enteritidis)）；リステリア属(Listeria)（例えば、リステリア菌(L. monocytogenes)）；ヘリコバクター(Helicobacter)（例えば、ピロリ菌(H. pylori)）；シュードモナス属(Pseudomonas)（例えば、緑膿菌(P. aeruginosa)）；ブドウ球菌属(Staphylococcus)（例えば、黄色ブドウ球菌(S. aureus)、表皮ブドウ球菌(S. epidermidis)）；腸球菌属(Enterococcus)（例えば、フェカリス菌(E. faecalis)、フェシウム菌(E. faecium)）；バチルス属（例えば、炭疽菌(B. anthracis)）；コリネバクテリア属(Corynebacterium)（例えば、ジフテリア菌(C. diphtheriae)）およびクラミジア属(Chlamydia)（例えば、トラコーマクラミジア(C. trachomatis)、肺炎クラミジア(C. pneumoniae)、オウム病クラミジア(C. psittaci)）が挙げられる。寄生虫の代表例としては、限定されるものではないが、プラスモジウム属(Plasmodium)（例えば、熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)）；トキソプラズマ属(Toxoplasma（例えば、トキソプラズマ(T. gondii)）；リーシュマニア(Leshmania)（例えば、森林型熱帯リーシュマニア(L. major)）；ニューモシスティス(Pneumocystis)（例えば、Ｐ．カリニ(P. carinii)）；およびシソストーマ属(Schisostoma)(例えば、マンソン住血吸虫(S. mansoni)）が挙げられる。真菌の代表例としては、限定されるものではないが、カンジダ(Candida)（例えば、Ｃ．アルビカンス(C. albicans)）およびアスペルギルスが挙げられる。高等真核生物は好ましくは、ヒトを含む哺乳類である。
【００４１】
「同じ生物（same organism）」とは、共通の祖先に起源し、同じ進化経路をたどった生物を定義する。代表例としては、同じ血清型または遺伝子型を有するウイルスの種々の単離物が挙げられる。例えば、ＨＰＶ−１６の２つの単離物はこのカテゴリーに分類される。「近縁の生物（closely related organism）」とは、共通の祖先に起源し、進化中に分岐した生物を定義する。代表例としては、異なる血清型または遺伝子型を有するウイルスが挙げられる。例えば、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８はこのカテゴリーに分類される。
【００４２】
好ましい実施形態では、少なくとも第一および第二の核酸分子を得るための生物は乳頭腫ウイルスであり、それぞれ乳頭腫ウイルスポリペプチドをコードしている。「乳頭腫ウイルス」とは、乳頭腫ウイルス亜科に属すウイルスとして定義することができ、この用語には、限定されるものではないが、ウシ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、イヌ、非ヒト霊長類および齧歯類を含む非ヒト種起源の動物乳頭腫ウイルスならびにヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）が包含される。現在のところ１００を超えるＨＰＶ遺伝子型が同定されており(Van Ranst et al., 1992, J. Gen. Virol. 73, 2653; De Villiers et al., 2004, Virology 324, 17-27)、それらの発癌性によって「低リスク」（ＬＲ）および「高リスク」（ＨＲ）血清型に分類されている。ＬＲ  ＨＰＶは感染体に良性腫瘍を引き起こし、ＨＲは悪性進行に関して高いリスクを有する。
【００４３】
一般的な指針としては、乳頭腫ウイルスは、タンパク質キャプシッドに取り囲まれた約７９００塩基対の二本鎖環状ＤＮＡを有する（例えば、Pfister, 1987, in The papovaviridae: The Papillomaviruses, Salzman and Howley edition, Plenum Press, New York, p 1-38参照）。それらのゲノムは３つの機能的領域、すなわち、初期（Ｅ）、後期（Ｌ）および長い制御（ＬＣＲ）領域からなる。ＬＣＲは、エンハンサーおよびプロモーターなどの転写調節配列を含む。後期領域は、それぞれ主要およびマイナーキャプシッドタンパク質であるＬ１およびＬ２構造タンパク質をコードし、初期領域は、ウイルスの複製、転写および細胞形質転換を制御する核内に主要に見られる調節タンパク質（Ｅ１〜Ｅ７）をコードしている。より具体的には、Ｅ１タンパク質は、ＡＴＰ依存性ヘリカーゼ活性を有するＤＮＡ結合リンタンパク質である(Desaintes and Demeret, 1996, Semin. Cancer Biol. 7, 339-347; Wilson et al, 2002, Virus Gene 24, 275-290)。Ｅ２タンパク質は、ウイルス遺伝子の転写を調節し、ＤＮＡ複製を制御する多機能型ＤＮＡ結合リンタンパク質である(Bechtold et al., 2003, J. Virol. 77, 2021-8)。Ｅ４によりコードされるタンパク質は細胞質のケラチンネットワークと結合してこれを分断し、ウイルス成熟に役割を果たす。Ｅ５タンパク質の機能はなお議論の余地があり、その発現は宿主染色体にウイルスが組み込まれる際にはしばしば消失する。ＨＲ  ＨＰＶ遺伝子型の、Ｅ６およびＥ７によりコードされる遺伝子産物は、感染細胞の発癌性転換に関与しており(Kanda et al., 1988, J. Virol. 62, 610-3; Vousden et al., 1988, Oncogene Res. 3, 1-9; Bedell et al., 1987, J. Virol. 61, 3635-40)、それはおそらくそれぞれ細胞腫瘍抑制遺伝子産物ｐ５３および網膜芽細胞腫（Ｒｂ）へのこれらのウイルスタンパク質の結合を介したものである（Howley, 1996, Papillomaviruses and their replication, p 2045-2076. In B.N. Fields, D. M. Knipe and P.M. Howley (ed), Virology, 3rd ed. Lippincott-Raven Press, New York, N.Y.に総説）。ｐ５３に対する天然ＨＰＶ−１６  Ｅ６ポリペプチドの結合に関与するアミノ酸残基は残基１１８〜１２２（＋１は最初のＭｅｔ残基、または好ましく用いられる２番目のＭｅｔ残基から始まって残基１１１〜１１５）で明らかに定義されており(Crook et al., 1991, Cell 67, 547-556)、天然ＨＰＶ−１６  Ｅ７ポリペプチドとＲｂの結合に関与するものは残基２１〜２６に位置している(Munger et al., 1989, EMBO J. 8, 4099-4105; Heck et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4442-4446)。
【００４４】
好ましくは、少なくとも第一および第二の核酸分子は、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３０、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３５、ＨＰＶ−３９、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−５１、ＨＰＶ−５２、ＨＰＶ−５６、ＨＰＶ−５８、ＨＰＶ−５９、ＨＰＶ−６６、ＨＰＶ−６８、ＨＰＶ−７０およびＨＰＶ−８５からなる群から選択される高リスク乳頭腫ウイルスから独立に得られる。
【００４５】
本明細書において「乳頭腫ウイルスポリペプチド」とは、乳頭腫ウイルスゲノム／供給源から得られる核酸分子によりコードされている、当技術分野で認識されているポリペプチドを指す。「ポリペプチド」という用語に関して上記で定義されているように、「乳頭腫ウイルスポリペプチド」とは、天然型、改変型乳頭腫ウイルスポリペプチドおよびそのペプチドを包含する。乳頭腫ウイルスの供給源としては、限定されるものではないが、生体サンプル（例えば、乳頭腫ウイルスに曝された被験体から採取した生体サンプル、組織切片、生検および組織培養）、培養細胞（例えば、ＡＴＣＣから入手可能なＣａＳｋｉ細胞）、ならびに寄託機関、商用カタログで入手可能な、または文献に記載されている組換え材料が含まれる。いくつかの乳頭腫ウイルスゲノムのヌクレオチド配列およびコードされているポリペプチドのアミノ酸配列は専門のデータバンク、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋで入手可能である。概略の情報としては、ＨＰＶ−１６ゲノムは受託番号ＮＣ＿０１５２６およびＫ０２７１８として；ＨＰＶ−１８はＮＣ＿００１３５７およびＸ０５０１５；ＨＰＶ−３１はＪ０４３５３として；ＨＰＶ−３３はＭ１２７３２として；ＨＰＶ−３５はＮＣ＿００１５２９として；ＨＰＶ−３９はＮＣ＿００１５３５として；ＨＰＶ−４５はＸ７４４７９として；ＨＰＶ−５１はＮＣ＿００１５３３として；ＨＰＶ−５２はＮＣ＿００１５９２として；ＨＰＶ−５６はＸ７４４８３として；ＨＰＶ−５８はＤ９０４００として；ＨＰＶ−５９はＮＣ＿００１６３５として；ＨＰＶ−６８はＸ６７１６０およびＭ７３２５８として；ＨＰＶ−７０はＵ２１９４１として；また、ＨＰＶ−８５はＡＦ１３１９５０としてＧｅｎｂａｎｋに記載されている。
【００４６】
第一および／または第二の核酸分子によりコードされている乳頭腫ウイルスポリペプチドは、初期、後期またはそのいずれかの組合せである。初期乳頭腫ウイルスポリペプチドとしては、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６およびＥ７が含まれ、後期ポリペプチドはＬ１またはＬ２であり得る。膨大な数の乳頭腫ウイルス血清型の初期および後期ポリペプチドヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が当業者に入手可能な文献に記載されている。
【００４７】
望ましくは、少なくとも第一および第二の核酸分子は、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ６およびＥ７からなる群から選択される初期ポリペプチドを独立にコードしている。例示として、天然ＨＰＶ−１６  Ｅ１、Ｅ２、Ｅ６およびＥ７ポリペプチドのアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１〜４で示されている。しかしながら、本発明はこれらの例示的配列に限定されない。実際に、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は異なる乳頭腫ウイルス単離物では異なる場合があり、この自然の遺伝子変動、ならびに以下に記載されるものなどの非自然的改変も本発明の範囲内に含まれる。好適な改変された乳頭腫ウイルスポリペプチドの例は以下に示されるが（例えば、配列番号５〜８および６４〜６５）、（例えば、配列比較により、他の乳頭腫ウイルス遺伝子型から起源するポリペプチドに対して）本明細書に記載される改変を適合させることは、当業者の裁量の範囲内である。
【００４８】
本発明で用いるのに好適な乳頭腫ウイルスＥ１ポリペプチドは、ウイルス複製刺激に欠陥がある、すなわち、それらのウイルス複製刺激能が、相当する天然Ｅ１ポリペプチドよりも統計学的に有意に低い（例えば、７５％未満、有利には５０％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満）突然変異体を包含する。一般的な指針としては、ウイルス複製刺激を担うドメインはＥ１の中央部に位置する（例えば、Hugues and Romanos, 1993, Nucleic Acids Res.21, 5817-23）。複製欠陥Ｅ１ポリペプチドの代表例は、例えばYasugi et al. (1997, J. Virol 71, 5942-51)など、当業者に入手可能な文献に記載されている。本発明に関して好ましい改変としては、ＨＰＶ−１６  Ｅ１ポリペプチドの４８２番のＧｌｙ残基の、別の残基（好ましくは、Ａｓｐ残基）での置換（例えば、配列番号５参照）またはＨＰＶ−１８  Ｅ１ポリペプチドの４８９番のＧｌｙ残基の、別の残基（好ましくはＡｓｐ残基）での置換（例えば、配列番号６参照）が含まれる。
【００４９】
本発明で用いるのに好適なＥ２ポリペプチドは、天然Ｅ２ポリペプチドに比べて転写活性化および／または複製活性に欠陥がある（例えば、７５％未満、有利には５０％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満）突然変異体を包含する。一般的な指針としては、転写の活性化および複製の刺激を担うドメインは、Ｅ２のＮ末端部分に位置し(Seedorf et al., 1985, Virology, 145,181-185; Kennedy et al., 1991, J. Virol. 65, 2093-2097; Cole et al., 1987, J. Mol.Biol. 193, 599-608; McBride et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 510-514)、複製および転写Ｅ２活性の低下または欠如は、標準的な方法を用いて容易に判定することができる（例えば、Sakai et al., 1996, J. Virol. 70, 1602-1611参照）。本発明で用いるのに好適な欠陥型Ｅ２突然変異体は、例えば、Demeret et al. (1995, Nucleic Acids Res. 23, 4777-4784)、Sakai et al. (1996, J. Virol. 70, 1602-1611)、Brokaw et al. (1996, J. Virology 70, 23-29)およびFerguson et al. (1996, J. Virology 70, 4193-4199)など、当業者が入手可能な文献に記載されている。本発明に関して好ましい改変としては、ＨＰＶ−１６  Ｅ２の３９番のＧｌｕ残基の、好ましくはＡｌａ残基での置換（Ｅ３９Ａ）および／または７３番のＩｌｅ残基の、好ましくはＡｌａ残基での置換（Ｉ７３Ａ）が含まれる（例えば、配列番号７参照）。例示として、ＨＰＶ−１６  Ｅ２の３９番および７３番のＧｌｕおよびＩｌｅ残基はそれぞれ、ＨＰＶ−１８  Ｅ２の４３番および７７番のＧｌｕおよびＩｌｅ残基に相当する（例えば、配列番号８参照）。
【００５０】
本発明で用いるのに好適なＥ６ポリペプチドは、細胞腫瘍抑制遺伝子産物ｐ５３との結合に欠陥がある非発癌性突然変異体を包含する。非発癌性Ｅ６ポリペプチドの代表例は、例えば、Pim et al. (1994, Oncogene 9, 1869-1876)およびCrook et al. (1991, Cell 67, 547-556)に記載されている。この場合に好ましい改変としては、ＨＰＶ−１６  Ｅ６における残基１１８〜１２２（ＣＰＥＥＫ）の欠失（例えば、配列番号６４参照）またはＨＰＶ−１８  Ｅ６における残基１１３〜１１７（ＮＰＡＥＫ）の欠失が含まれる。
【００５１】
本発明で用いるのに好適なＥ７ポリペプチドは、細胞腫瘍抑制遺伝子産物Ｒｂとの結合に欠陥がある非発癌性突然変異体を包含する。非発癌性Ｅ７ポリペプチドの代表例は、例えば、Munger et al. (1989, EMBO J. 8, 4099-4105)、Heck et al. (1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4442-4446)およびPhelps et al. (1992, J. Virol. 66, 2148-2427)などの記載されている。この場合に好ましい改変としては、ＨＰＶ−１６  Ｅ７における残基２１〜２６（ＤＬＹＣＹＥ）の欠失（例えば、配列番号６５参照）またはＨＰＶ−１８  Ｅ７における残基２４〜２８（ＤＬＬＣＨ）の欠失が含まれる。
【００５２】
さらに、少なくとも第一および／または第二の核酸分子によりコードされているポリペプチド（例えば、乳頭腫ウイルスポリペプチド）は、例えば、潜在的切断部位の抑制、潜在的グリコシル化部位の抑制および／または発現細胞の表面における提示など、コードされているポリペプチドのプロセシング、安定性および／または溶解度に有益な付加的開眼をさらに含んでもよい。例えば、コードされているポリペプチドは、発現細胞の原形質膜内に固定されるの好適なシグナルを含み得る。実際、これまでに、膜提示がＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩの提示を向上させ、宿主の免疫系による認識の増強をもたらし得る（例えば、ＷＯ９９／０３８８参照）。天然初期乳頭腫ウイルスポリペプチド（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ６およびＥ７）は核タンパク質であるので（典型的な核局在シグナルは明らかに同定することはできなかったが）、宿主対象においてそれらの免疫原性、従ってそれらの治療効力を高めるために、それらを原形質膜で取り扱うことが有益であり得る。
【００５３】
発現宿主細胞の表面でのポリペプチドの効率的な膜提示は、このポリペプチドをシグナルペプチドおよび膜固定ペプチドと融合させることより、達成することができる。このようなペプチドは当技術分野で公知である。要するに、シグナルペプチドは一般に、膜に提示された、または分泌されたポリペプチドのＮ末端に存在し、それらの小胞体（ＥＲ）への経路を誘発する。それらは１５〜３５の本質的に疎水性のアミノ酸を含み、その後、これが特異的ＥＲ局在エンドペプチダーゼによって除去されて成熟ポリペプチドとなる。膜固定ペプチドは通常、本来疎水性が高く、これらのポリペプチドを細胞膜に固定するのに役立つ（例えば、Branden and Tooze, 1991, in Introduction to Protein Structure p. 202- 214, NY Garland参照）。本発明に関して使用可能なシグナルペプチドおよび膜固定ペプチドの選択肢は膨大である。それらは狂犬病糖タンパク質、ＨＩＶウイルスエンベロープ糖タンパク質または麻疹ウイルスＦタンパク質などの分泌型または膜固定ポリペプチド（例えば、細胞ポリペプチドまたはウイルスポリペプチド）から独立に得ることができるか、あるいは合成することができる。シグナルペプチドの好ましい挿入部位は、転写開始コドンのＮ末端下流であり、膜固定ペプチドの好ましい挿入部位は、例えば、停止コドンのすぐ上流のＣ末端である。必要に応じて、シグナルペプチドおよび／または膜固定ペプチドとコードされているポリペプチドを接続するためにリンカーペプチドを使用することができる。
【００５４】
本発明で用いるのに好適な膜固定型かつ欠陥型のＥ１ポリペプチドの代表例は配列番号５（実施例の節に示されているＨＰＶ−１６  ＳＳ−Ｅ１＊−ＴＭＲポリペプチドを定義する）および配列番号６（実施例の節に示されているＨＰＶ−１８  ＳＳ−Ｅ１＊−ＴＭＦポリペプチドを定義する）で示される。本発明で用いるのに好適な膜固定型かつ欠陥型Ｅ２ポリペプチドの代表例は、配列番号７（実施例の節に示されているＨＰＶ−１６  ＳＳ−Ｅ２＊−ＴＭＲポリペプチドを定義する）および配列番号８（実施例の節に示されているＨＰＶ−１８  ＳＳ−Ｅ２＊−ＴＭＲポリペプチドを定義する）で示される。本発明で用いるのに好適な膜固定型かつ非発癌性Ｅ６およびＥ７ポリペプチドの代表例は、それぞれ配列番号６４（実施例の節に示されているＨＰＶ−１６  ＳＳ−Ｅ６＊−ＴＭＦポリペプチドを定義する）および配列番号６５（実施例の節に示されているＨＰＶ−１６  ＳＳ−Ｅ７＊−ＴＭＲポリペプチドを定義する）で示される。
【００５５】
特に好ましい実施形態では、少なくとも第一の核酸分子および第二の核酸分子は、同じＨＰＶ血清型から得られる２つの異なる乳頭腫ウイルスポリペプチドをコードしている。
【００５６】
本実施形態の好ましい一態様では、第一の核酸分子はＥ１ポリペプチドをコードし、第二の核酸分子はＥ２ポリペプチドをコードするか、またはその逆である。望ましくは、これらのＥ１およびＥ２をコードする核酸分子はＨＰＶ−１６またはＨＰＶ−１８から得られる。好ましくは、第一の核酸分子は配列番号５で示されるアミノ酸配列を含んでなる、またはそれから本質的になる、またはそれからなるポリペプチドをコードし、第二の核酸分子は配列番号７で示されるアミノ酸配列を含んでなる、またはそれから本質的になる、またはそれからなるポリペプチドをコードする。あるいは、第一の核酸分子は配列番号６で示されるアミノ酸配列を含んでなる、またはそれから本質的になる、またはそれからなるポリペプチドをコードし、第二の核酸分子は配列番号８で示されるアミノ酸配列を含んでなる、またはそれから本質的になる、またはそれからなるポリペプチドをコードする。
【００５７】
本来の文脈において（例えば、ＨＰＶ−１６またはＨＰＶ−１８ゲノム）、Ｅ１をコードする配列の３’部分はＥ２をコードする配列の５’部分と５９のヌクレオチドにわたって重複する。これらの１００％相同な５９のヌクレオチドの存在は、Ｅ１をコードする核酸分子とＥ２をコードする核酸分子の双方を発現するベクターの安定性に悪影響を及ぼすと予想される。これらの共通部分間で相同組換えが起こり、それらの間に含まれるヌクレオチド配列の欠失がもたらされることがある。
【００５８】
本発明によれば、Ｅ１をコードする核酸分子およびＥ２をコードする核酸分子の改変前に存在する５９ヌクレオチドの重複部分間のこの１００％の相同性は、これらの核酸分子の一方のコドン使用パターンを変更することにより、７５％未満に低下させることができる。変更された配列の代表例は配列番号９で示され、この場合、Ｅ１／Ｅ２で重複する５９のヌクレオチドの相同性は６９％に低下し（図１に示されている）、ＨＰＶ−１６  Ｅ１およびＥ２ポリペプチドをコードする本発明の好ましいベクターは配列番号９で示されるヌクレオチド配列を含む。同じ戦略がＨＰＶ−１８のＥ１とＥ２をコードする配列に存在する重複部分にも適用可能である。このように変更された配列を、Ｅ１をコードする第一の核酸分子に、天然の重複する５９のヌクレオチドの代わりに導入することができる（例えば、それぞれ配列番号１０および１１）。
【００５９】
よって、本発明の好ましいベクターは、配列番号１０で示されるヌクレオチド配列（配列番号５のＨＰＶ−１６  Ｅ１ポリペプチドをコードする）を含んでなる、またはそれから本質的になる、またはそれからなる第一の核酸分子と、配列番号１２で示されるヌクレオチド配列（配列番号７のＨＰＶ−１６  Ｅ２ポリペプチドをコードする）を含んでなる、またはそれから本質的になる、またはそれからなる第二の核酸分子とを含んでなる。本発明の別の好ましいベクターは、配列番号１１で示されるヌクレオチド配列（配列番号６のＨＰＶ−１８  Ｅ１ポリペプチドをコードする）を含んでなる、またはそれから本質的になる、またはそれからなる第一の核酸分子と、配列番号１３で示されるヌクレオチド配列（配列番号８のＨＰＶ−１８  Ｅ２ポリペプチをコードする）を含んでなる、またはそれから本質的になる、またはそれからなる第二の核酸分子とを含んでなる。より好ましくは、本発明のベクターはＭＶＡベクターであり、第一の（Ｅ１をコードする）核酸分子はワクシニア７．５Ｋプロモーターの制御下に置かれ、第二の（Ｅ２をコードする）核酸分子はワクシニアＨ５Ｒプロモーターの制御下に置かれ、第一および第二の核酸分子は双方とも前記ＭＶＡベクターの欠失ＩＩＩに挿入される。
【００６０】
本発明はまた、ＨＰＶ−１６  Ｅ１ポリペプチドをコードする第一の核酸分子、ＨＰＶ−１６  Ｅ２ポリペプチドをコードする第二の核酸分子、ＨＰＶ−１８  Ｅ１ポリペプチドをコードする第三の核酸分子、およびＨＰＶ−１８  Ｅ２ポリペプチドをコードする第四の核酸分子を含み、該第一、第二、第三および第四の核酸分子は、７５％または７５％を超える相同性パーセンテージを示す４０以上の連続するヌクレオチドの部分を含まないベクターに関する。好ましくは、該ＨＰＶ−１６  Ｅ１ポリペプチドは配列番号５で示されるアミノ酸配列を含んでなり、該ＨＰＶ−１６  Ｅ２ポリペプチドは配列番号７で示されるアミノ酸配列を含んでなり、該ＨＰＶ−１８  Ｅ１ポリペプチドは配列番号６で示されるアミノ酸配列を含んでなり、かつ／または該ＨＰＶ−１８  Ｅ２ポリペプチドは配列番号８で示されるアミノ酸配列を含んでなる。
【００６１】
本来的に、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８  Ｅ１をコードする配列は、８０％または８０％を超える相同性パーセンテージを示す４０以上の連続するヌクレオチドの部分をいくつか含む。同じことがＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８  Ｅ２をコードする配列についても言える。さらに、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８ゲノムにおいて、隣接するＥ１をコードする配列とＥ２をコードする配列は、およそ５９のヌクレオチドの部分にわたって重複する。これに関しては、特に両血清型に共通している相同部分において、それらのＨＰＶ−１６対応物との相同性を７５％未満に低下させるようにＨＰＶ−１８  Ｅ１をコードする核酸分子配列とＥ２をコードする核酸分子配列を改変することが提案される。この目的で、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８  Ｅ１およびＥ２遺伝子のヌクレオチド配列をアラインし、相同性を８、７、６または好ましくは５未満の連続するヌクレオチドに低下させるようにヌクレオチドレベルで改変を設計することができる。さらに、ＨＰＶ−１８  Ｅ１配列を、ＨＰＶ−１８  Ｅ２配列の５’末端で重複する５９のヌクレオチドの部分との相同性が７５％未満に低下させるようにさらに改変することができる。コドン使用が改変されることが好ましいが、例えば酵素機能の欠損をもたらす、本明細書で定義された改変を作出する場合以外は、改変はアミノ酸レベルで翻訳しない。第三および第四の核酸分子として好適に使用可能な、「変更された（degenerated）」ＨＰＶ−１８  Ｅ１−およびＨＰＶ−１８  Ｅ２をコードするヌクレオチド配列の代表例は、それぞれ配列番号１１および配列番号１３で示される。本発明の好ましいベクターは、配列番号１０で示されるヌクレオチド配列（配列番号５で示されるＨＰＶ−１６  Ｅ１ポリペプチドをコードする）を含んでなる、またはそれから本質的になる、またはそれからなる第一の核酸分子、配列番号１２で示されるヌクレオチド配列（配列番号７で示されるＨＰＶ−１６  Ｅ２ポリペプチドをコードする）を含んでなる、またはそれから本質的になる、またはそれからなる第二の核酸分子、配列番号１１で示されるヌクレオチド配列（配列番号６で示されるＨＰＶ−１８  Ｅ１ポリペプチドをコードする）を含んでなる、またはそれから本質的になる、またはそれからなる第三の核酸分子、および配列番号１３で示されるヌクレオチド配列（配列番号８で示されるＨＰＶ−１８  Ｅ２ポリペプチドをコードする）を含んでなる、またはそれから本質的になる、またはそれからなる第四の核酸分子を含んでなる。好ましくは、このベクターはＭＶＡベクターであり、該第一、第二、第三および第四の核酸分子はＭＶＡベクターの欠失ＩＩＩに導入され、該第一および第三の（Ｅ１をコードする）核酸分子は、それぞれワクシニアｐ７．５Ｋプロモーターの制御下に逆向きに配置され、第二および第四の（Ｅ２をコードする）核酸分子は、それぞれワクシニアｐＨ５Ｒプロモーターの制御下に逆向きに配置される。
【００６２】
別の特に好ましい実施形態では、少なくとも第一の核酸分子および第二の核酸分子は、近縁の生物、例えば、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３３および／またはＨＰＶ−５２などの近縁のＨＰＶ血清型から得られる同じポリペプチドをコードしている。
【００６３】
本実施形態の第一の態様において、近縁の生物から得られる同じポリペプチドは好ましくはＥ２ポリペプチドである。コードされているＥ２ポリペプチドは好ましくは、本明細書で定義されているように、膜固定型かつウイルス複製欠陥型となるように改変される。本来的に、種々の遺伝子型のＥ２をコードする配列は、特に最も保存性の高い部分において、ヌクレオチドレベルで高い程度の相同性を示す。これらの相同な配列の存在は、２以上（例えば、３、４またはさらにはそれを超える）Ｅ２遺伝子、例えば、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３３およびＨＰＶ−５２などのＨＲ  ＨＰＶに由来するＥ２遺伝子を同時発現するベクターの安定性に悪影響を及ぼすと予想される。これらの相同な遺伝子配列間で相同組換えが起こり、それらの間に含まれるヌクレオチド配列の欠失がもたらされ、遺伝子サイレンシングが起こることがある。
【００６４】
本発明によれば、本発明のベクターに含まれるＥ２ポリペプチドをコードする核酸分子は、特に相同性の高い部分において相同性を７５％未満に低下させるようにコドン使用パターンを変更することによって改変することができる。変更されたＥ２ポリペプチドをコードする核酸分子の代表例は、配列番号１３、６６、６７、６８および６９で示される。より具体的には、配列番号１３は、ヌクレオチド配列が、そのＥ２をコードする対応物との相同性を８または７未満の連続ヌクレオチドにまで低下させるように設計されている、膜提示型かつ複製欠陥型ＨＰＶ−１８  Ｅ２ポリペプチドをコードする。配列番号６６および６７は双方とも、ヌクレオチド配列が、Ｅ２をコードする他の対応物との相同性が８または７未満の連続ヌクレオチドにまで低下させるように設計された、複製欠陥ＨＰＶ−３３  Ｅ２ポリペプチド（配列番号６７ではそれはさらに膜提示型である）をコードする。配列番号６８および６９は双方とも、ヌクレオチド配列が、Ｅ２をコードする他の対応物との相同性が８または７未満の連続ヌクレオチドにまで低下させるように設計された、複製欠陥ＨＰＶ−５２  Ｅ２ポリペプチド（配列番号６９ではそれはさらに膜提示型である）をコードする。しかしながら、本発明はこれらの例示的配列に限定されず、上記で定義されたような変更されたＥ２乳頭腫ウイルスポリペプチドをコードする核酸分子の別の変型もこの原理で設計することができる。
【００６５】
本発明の好ましいベクターは、本明細書に定義されているようなＨＰＶ−１６  Ｅ２ポリペプチド（例えば、配列番号７で示されるアミノ酸配列を含んでなる膜提示型かつ複製欠陥Ｅ２ポリペプチド）をコードする第一の核酸分子、本明細書で定義されているようなＨＰＶ−１８  Ｅ２ポリペプチド（例えば、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含んでなる膜提示型かつ複製欠陥Ｅ２ポリペプチド）をコードする第二の核酸分子、本明細書で定義されているようなＨＰＶ−３３  Ｅ２ポリペプチド（例えば、配列番号７０で示されるアミノ酸配列を含んでなる膜提示型かつおよび複製欠陥型Ｅ２ポリペプチド）をコードする第三の核酸分子、および本明細書で定義されているようなＨＰＶ−５２  Ｅ２ポリペプチド（例えば、配列番号７１で示されるアミノ酸配列を含んでなる膜提示型かつ複製欠陥型Ｅ２ポリペプチド）をコードする第四の核酸分子を含んでなる。より好ましくは、第一の核酸分子は配列番号１２で示されるヌクレオチド配列含んでなる、またはそれから本質的になる、またはそれからなり；第二の核酸分子は配列番号１３で示されるヌクレオチド配列含んでなる、またはそれから本質的になる、またはそれからなり；第三の核酸分子は配列番号６７で示されるヌクレオチド配列含んでなる、またはそれから本質的になる、またはそれからなり；かつ／または第四の核酸分子は配列番号６９で示されるヌクレオチド配列含んでなる、またはそれから本質的になる、またはそれからなる。より好ましくは、本発明のベクターはＭＶＡベクターであり、Ｅ２をコードする４つの核酸分子は欠失ＩＩＩに挿入される。いっそうより好ましくは、第一および第二の核酸分子はワクシニアＨ５Ｒプロモーターの制御下にあり、互いに逆向きに配置され、第三および第四の核酸分子はワクシニアｐ７．５Ｋプロモーターの制御下にあり、互いに逆向きに配置される。
【００６６】
本実施形態の別の態様において、近縁の生物から得られる同じポリペプチドは好ましくはＥ６ポリペプチド、Ｅ７ポリペプチドまたはＥ６およびＥ７ポリペプチドの双方である。Ｅ６およびＥ７は独立に発現させることもできるし、あるいは融合ポリペプチドとして発現させることもできる。コードされているＥ６および／またはＥ７ポリペプチドは好ましくは、本明細書で定義されているように膜固定型かつ非発癌性となるように改変されている。
【００６７】
本来の文脈において、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８天然Ｅ６配列はヌクレオチドレベルで６３％の相同性を有し、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８天然Ｅ７配列は互いに５７％相同である。しかしながら、両場合とも、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８天然配列は、８０％または８０％を超える相同性を示す４０ヌクレオチド以上の部分をいくつか共有する（図２参照）。これらの相同部分の存在は、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８  Ｅ６および／またはＥ７遺伝子を同時発現するベクターの安定性に悪影響を及ぼすと予想される。これらの相同部分間で相同組換えが起こり、それらの間に含まれるヌクレオチド配列の欠失がもたらされ、遺伝子サイレンシングが起こることがある。
【００６８】
本発明によれば、ＨＰＶ−１６および／またはＨＰＶ−１８  Ｅ６およびＥ７ポリペプチドをコードする核酸分子は、特に相同部分において、相同性が７５％未満に低下させるようにコドン使用パターンを変更することにより改変することができる。変更されたＨＰＶ−１８  Ｅ６ポリペプチドをコードする核酸分子の代表例は配列番号１４で示され、変更されたＨＰＶ−１８  Ｅ７ポリペプチドをコードする改変核酸分子の代表例は配列番号１５で示される。より具体的には、、配列番号１４および配列番号１５は、ＨＰＶ−１８膜固定型かつ非発癌性Ｅ６およびＥ７ポリペプチドをコードしつつ、ＨＰＶ−１６対応物との相同性を８、７、６または好ましくは５未満の連続ヌクレオチドにまで低下させるように設計されている。しかしながら、上記で定義されたような変更されたＥ６および／またはＥ７乳頭腫ウイルスポリペプチドをコードする核酸分子の別の変型もこの原理で設計することができる。
【００６９】
本発明の好ましいベクターは、本明細書で定義されているようなＨＰＶ−１６  Ｅ６ポリペプチド（例えば、膜固定型かつ非発癌性）をコードする第一の核酸分子と、本明細書で定義されているようなＨＰＶ−１８  Ｅ６ポリペプチド（例えば、膜固定型かつ非発癌性）をコードする第二の核酸分子を含んでなり、該第二の核酸分子は、配列番号１４で示されるヌクレオチド配列を含んでなり、またはそれから本質的になる。本発明の別の好ましいベクターは、本明細書で定義されているようなＨＰＶ−１６  Ｅ７ポリペプチド（例えば、膜固定型かつ非発癌性）をコードする第一の核酸分子と、本明細書で定義されているようなＨＰＶ−１８  Ｅ７ポリペプチド（例えば、膜固定型および非発癌性）をコードする第二の核酸分子を含んでなり、該第二の核酸分子は配列番号１５で示されるヌクレオチド配列を含んでなり、またはそれから本質的になる。より好ましくは、本発明のベクターはＭＶＡベクターであり、第一の核酸分子はワクシニア７．５Ｋプロモーターの制御下に置かれ、第二の核酸分子はワクシニアＨ５Ｒプロモーターの制御下に置かれ、第一および第二の核酸分子は双方ともＭＶＡベクターの欠失ＩＩＩに挿入される。
【００７０】
本発明はまた、ＨＰＶ−１６  Ｅ６ポリペプチドとＨＰＶ−１６  Ｅ７ポリペプチドの融合物をコードする第一の核酸分子と、ＨＰＶ−１８  Ｅ６ポリペプチドとＨＰＶ−１８  Ｅ７ポリペプチドの融合物をコードする第二の核酸分子を含んでなり、該第一および第二の核酸分子が、およそ７５％または７５％を超える相同性パーセンテージを示す４０以上の連続するヌクレオチドの部分を含まない、ベクターに関する。
【００７１】
本発明はまた、ＨＰＶ−１６  Ｅ６ポリペプチドをコードする第一の核酸分子、ＨＰＶ−１８  Ｅ６ポリペプチドをコードする第二の核酸分子、ＨＰＶ−１６  Ｅ７ポリペプチドをコードする第三の核酸分子、およびＨＰＶ−１８  Ｅ７ポリペプチドをコードする第四の核酸分子を含んでなり、該第一、第二、第三および第四の核酸分子が、７５％または７５％を超える相同性パーセンテージを示す４０以上の連続するヌクレオチドの部分を含まない、ベクターに関する。好ましくは、第二の核酸分子は配列番号１４を含んでなる、またはそれから本質的になる、またはそれからなり、かつ／または第四の核酸分子は配列番号１５を含んでなる、またはそれから本質的になる、またはそれからなる。より好ましくは、本発明のベクターはＭＶＡベクターであり、第一および第二の核酸分子はそれぞれワクシニア７．５Ｋプロモーターの制御下に逆向きに配置され、第三および第四の核酸分子はそれぞれワクシニアＨ５Ｒプロモーターの制御下に逆向きに配置され、第一、第二、第三および第四の核酸分子はＭＶＡベクターの欠失ＩＩＩに挿入される。
【００７２】
別の態様において、本発明はまた、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、６６、６７、６８または６９で示されるヌクレオチド配列を含んでなる、またはそれから本質的になる、またはそれからなる実質的に単離された核酸分子を提供する。
【００７３】
本発明の別の実施形態では、本発明のベクターに含まれる第一および第二、および存在する場合には第三および第四の核酸分子は、宿主細胞または被験体における、コードされているポリペプチドの発現に好適な形態であり、これはそれらが発現に必要な調節配列の制御下に置かれていることを意味する。
【００７４】
本明細書において「調節配列」とは、複製、倍加、転写、スプライシング、翻訳、安定性および／または宿主細胞への核酸またはその誘導体の１つ（すなわち、ｍＲＮＡ）の輸送を含む、所定の宿主細胞における核酸分子の発現を可能とする、またはそれに寄与する、またはそれを調節するいずれの配列も指す。本発明の文脈で、調節配列は発現される核酸分子に「作動可能なように連結」され、すなわち、それらは宿主細胞または被験体における発現を可能とする機能的関係に置かれる。このような調節配列は当技術分野でよく知られている（例えば、Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego参照）。当業者ならば、ベクターのタイプ、宿主細胞、所望の発現レベルなどの要因に基づいて調節配列を選択できることが分かるであろう。
【００７５】
プロモーターは特に重要であり、本発明は、多くのタイプの宿主細胞において核酸分子の発現を命令する構成的プロモーター、およびある種の宿主細胞でのみ（例えば、組織特異的調節配列）または特定の事象もしくは外因性の因子に応答して（例えば、温度、栄養添加物、ホルモンまたは他のリガンドによる）発現を命令するものの使用を包含する。真核生物系での構成的発現に好適なプロモーターとしては、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーターまたはエンハンサー(Boshart et al, 1985, Cell 41, 521-530)、アデノウイルス初期および後期プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）−１のチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターおよびレトロウイルスの長い末端反復配列（例えば、ＭｏＭｕＬＶおよびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ）などのウイルスプロモーター、ならびにホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター(Hitzeman et al., 1983, Science 219, 620-625 ; Adra et al., 1987, Gene 60, 65-74)などの細胞プロモーターが挙げられる。ポックスウイルスベクターにおいて核酸分子の発現を駆動するのに有用な好適なプロモーターとしては、ワクシニアウイルスの７．５Ｋ、Ｈ５Ｒ、ＴＫ、ｐ２８、ｐ１１またはＫ１Ｌプロモーターが挙げられる。あるいは、Chakrabarti et al. (1997, Biotechniques 23, 1094-1097)、Hammond et al. (1997, J. Virological Methods 66, 135-138)およびKumar and Boyle (1990, Virology 179, 151-158)に記載されているものなどの合成プロモーター、ならびに初期および後期ポックスウイルスプロモーターの間のキメラプロモーターが挙げられる。
【００７６】
誘導プロモーターは外因的に供給される化合物によって調節され、限定されるものではないが、亜鉛誘導メタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター(Mc Ivor et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7, 838-848)、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（ＷＯ９８／１００８８）、エクジソン昆虫プロモーター(No et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 3346-3351)、テトラサイクリン抑制プロモーター(Gossen et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547-5551)、テトラサイクリン誘導プロモーター(Kim et al., 1995, J. Virol. 69, 2565-2573)、ＲＵ４８６誘導プロモーター(Wang et al., 1997, Nat. Biotech. 15, 239-243およびWang et al., 1997, Gene Ther. 4, 432-441)、ラパマイシン誘導プロモーター(Magari et al., 1997, J. Clin. Invest. 100, 2865-2872)ならびに大腸菌のｌａｃ、ＴＲＰおよびＴＡＣプロモーターが含まれる。
【００７７】
本発明に関する使用において調節配列は、治療利益が望まれる特定の組織において核酸分子の発現を駆動するように組織特異的とすることもできる。好適なプロモーターは腫瘍細胞で優先的に発現される遺伝子から取得することができる。このような遺伝子は、例えばディスプレーおよび比較ゲノムハイブリダイゼーション（例えば、米国特許第５，７５９，７７６号および同第５，７７６，６８３号参照）によって同定することができる。
【００７８】
当業者ならば、本発明のベクターに含まれる核酸分子の発現を制御する調節エレメントはさらに、転写の誘導、調節および終結（例えば、ポリＡ転写終結配列）、ｍＲＮＡ輸送（例えば、核局在シグナル配列）、プロセシング（例えば、スプライシングシグナル）、安定性（例えば、イントロンおよび非コード５’および３’配列）および翻訳（例えば、三分割リーダー配列、リボソーム結合部位、Shine-Dalgamo配列など）に好適な付加的エレメントを宿主細胞または被験体に含んでもよいことが分かるであろう。
【００７９】
別の態様において、本発明は、上記のベクターを含む感染性ウイルス粒子を提供する。ここでは、感染性ウイルス粒子の生産に関して知られている種々の方法を詳しくは記載することはしない。一般に、このようなウイルス粒子は、（ａ）適当な細胞系統にウイルスベクターを導入すること、（ｂ）該細胞系統を該感染性ウイルス粒子の生産を可能とするのに好適な条件下で培養し、生産された感染性ウイルス粒子を該細胞系統の培養物から回収し、所望により、回収された感染性ウイルス粒子を精製するステップを含む方法によって生産される。
【００８０】
ウイルスベクターが欠陥型である場合、感染性粒子は通常、補足的細胞系統で、または非機能的ウイルス遺伝子をトランスで供給するヘルパーウイルスの使用を介して生産される。例えば、Ｅ１欠損アデノウイルスベクターを補足するのに好適な細胞系統としては、２９３細胞(Graham et al, 1997, J. Gen. Virol. 36, 59-72)、ＰＥＲ−Ｃ６細胞(Fallaux et al., 1998, Human Gene Ther. 9, 1909-1917)およびＨＥＲ９６細胞が挙げられる。ポックスウイルスベクターを増幅させるのに適当な細胞は鳥類細胞であり、最も好ましくは、受精卵から得られたニワトリ胚から調製された一次ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）である。これらの生産細胞は、適当な温度、ｐＨおよび酸素含量条件下で従来の発酵反応槽、フラスコおよびペトリプレートで培養することができる。
【００８１】
感染性ウイルス粒子は培養上清または溶解後の細胞から回収することができる。それらは、標準的な技術（例えば、ＷＯ９６／２７６７７、ＷＯ９８／００５２４、ＷＯ９８／２２５８８、ＷＯ９８／２６０４８、ＷＯ００／４０７０２、ＥＰ１０１６７００およびＷＯ００／５０５７３に記載されているようなクロマトグラフィー、超遠心分離）に従ってさらに精製することができる。
【００８２】
別の態様において、本発明は、上記の核酸分子、ベクターまたは感染性ウイルス粒子を含む宿主細胞を提供する。本明細書において「宿主細胞」とは、本発明のベクターまたは感染性ウイルス粒子のレシピエントとなり得る、またはレシピエントとなった任意の細胞およびそのような細胞の後代を定義する。この用語は広く、単離された細胞、細胞群、ならびに細胞の特定の構成物、例えば組織または器官を包含するものと理解すべきである。このような細胞は一次型、形質転換型または培養細胞であり得る。
【００８３】
本発明に関して宿主細胞としては、原核細胞（例えば、大腸菌(Escherichia coli)、バチルス属、リステリア属）、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス・ポンベ(Saccharomyces pombe)またはピキア・パストリス(Pichia pastoris)）などの下等真核細胞、ならびに昆虫細胞、植物細胞および高等真核細胞などの他の真核細胞が挙げられ、哺乳類細胞（例えば、ヒトまたは非ヒト細胞）が特に好ましい。好適な宿主細胞の代表例としては、限定されるものではないが、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）細胞、ＭＤＣＫ細胞（Madin-Darbyイヌ腎臓細胞系統）、ＣＲＦＫ細胞（Crandellネコ腎臓細胞系統）、ＣＶ−Ｉ細胞（アフリカサル腎臓細胞系統）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞およびＶｅｒｏ細胞が挙げられる。「宿主細胞」という用語はまた、上記に引用されているものなどの本発明の複製欠陥ベクター（例えば、アデノウイルスベクター）の少なくとも１つの欠損機能を補足することができる補足細胞も包含する。
【００８４】
宿主細胞は、本発明のベクターまたは感染性粒子に含まれる核酸分子によりコードされているポリペプチドを組換え的手段によって生産するために使用可能である。このような技術は当技術分野でよく知られている（例えば、Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, 1987-2002;およびSambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressの最新刊を参照)。
【００８５】
別の態様において、本発明は、上記の核酸分子、ベクター、感染性ウイルス粒子または宿主細胞（ここでは、有効剤ということもある）またはそのいずれかの組合せを含んでなる組成物を提供する。有利には、該組成物は、治療上有効な量の有効剤と薬学上許容されるビヒクルとを含んでなる医薬組成物である。
【００８６】
本明細書において「薬学上許容されるビヒクル」とは、医薬投与に適合した担体、溶媒、希釈剤、賦形剤、アジュバント、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤および吸収遅延剤などのいずれか、また総てを含むものとする。本明細書において「治療上有効な量」とは、被験体において治療または予防されることが望まれる病状と通常関連する１以上の症状の緩和に十分な用量である。予防的使用に関しては、この用語は被験体における病状の確立を回避する、または遅延させるのに十分な用量を意味する。例えば、治療上有効な量は、処置された対象において免疫応答を誘導または増強するのに十分な量、または病状を軽減、改善、安定化、逆転、進行を緩慢化または遅延する（例えば、対象における病巣または腫瘍の大きさの減少または退縮、感染対象におけるウイルス感染の復帰）のに十分な量であり得る。
【００８７】
望ましくは、本発明の組成物は、用いる用量および濃度では無毒な１以上の担体および／または希釈剤を含む。このような担体および／または希釈剤は好ましくは、全身投与または粘膜投与用の単位投与形または多用量形のいずれかに組成物を処方するために通常用いられるものから選択される。好適な担体は、溶媒、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）を含有する分散媒、植物油またはそれらの好適な混合物であり得る。希釈剤は好ましくは、等張性、低張性または弱高張性であり、比較的低いイオン強度を有する。好適な希釈剤の代表例としては、無菌水、生理食塩水（例えば、塩化ナトリウム）、リンゲル溶液、グルコース、トレハロースまたはサッカロース溶液、ハンクス溶液および他の生理学的平衡塩溶液（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams&Wilkinsの最新刊を参照）が挙げられる。本発明の組成物のｐＨは適宜調整し、ヒトまたは動物での使用に適切となるように、好ましくは、生理学的ｐＨまたはやや塩基性のｐＨ（およそｐＨ７．５〜およそｐＨ９、ｐＨおよそ８または８．５が特に好ましい）に緩衝させる。好適なバッファーとしては、リン酸バッファー（例えば、ＰＢＳ）、重炭酸バッファーおよび／またはＴｒｉｓバッファーが挙げられる。
【００８８】
本発明の組成物は、例えば、凍結、固体（例えば、乾燥粉末形態または凍結乾燥形態）、または液体（例えば、水溶液）など、種々の形態であり得る。有効剤と任意の付加的な所望の成分の固体組成物は、予め濾過除菌したその溶液から、真空乾燥および凍結乾燥させて得ることができる。それを所望により、使用前に好適なビヒクルを加えることで再構成するだけの無菌アンプルで保存することができる。
【００８９】
特に好ましい組成物（特に、有効剤がアデノウイルスベクターである場合）は、１Ｍサッカロース、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５４ｍｇ／ｌ  Ｔｗｅｅｎ  ８０、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５中に処方される。別の好ましい組成物は、１０ｍｇ／ｍｌマンニトール、１ｍｇ／ｍｌ  ＨＳＡ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．２および１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中に処方される。このような処方物は、冷凍温度（例えば、−７０℃、−４０℃、−２０℃）または冷蔵温度（例えば、４℃）のいずれかで少なくとも２か月間、本発明の組成物の安定性を保つのに特に好適である。
【００９０】
該組成物はまた、例えば、ｐＨ、浸透圧、粘度、明澄度、色、無菌性、安定性、ヒトまたは動物被験体中への放出または吸収の改変または維持を含む、所望の薬学的または薬物動態的特性を提供するために１以上の薬学上許容される賦形剤を含み得る。安定化成分の代表例としては、溶解度、安定性および半減期の所望の特性を得るために用い得るポリソルベート８０、Ｌ−アルギニン、ポリビニルピロリドン、トレハロース、およびポリエチレングリコールなどのポリマーが挙げられる(Davis et al, 1978, Enzyme Eng. 4, 169-173; Burnham et al., 1994, Am. J. Hosp. Pharm. 51, 210-218)。増粘剤としては、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよびデキストランが挙げられる。該組成物はまた、粘膜関門を通過する、または特定の臓器における浸透または輸送を促進することが当技術分野で知られている物質を含み得る。例えば、膣投与に好適な組成物は結局、粘膜の孔径を増すのに有用な１以上の吸収促進剤を含み得る。
【００９１】
さらに、本発明の組成物は、ヒトにおける全身投与または粘膜投与に好適な１以上のアジュバントを含み得る。「アジュバント」とは、特定の抗原に対する免疫応答を増強する能力を有する化合物を表す。アジュバントは、抗原部位付近に送達することができる。体液性免疫の増強は一般に、その抗原に対して生成した抗体の力価の有意な増加（通常は１０倍を超える）によって現れる。細胞性免疫の増強は、例えば、陽性皮膚試験、細胞傷害性Ｔ細胞アッセイ、ＩＦＮｇまたはＩＬ−２に関するＥＬＩｓｐｏｔアッセイによって測定することができる。好ましくは、本発明での使用におけるアジュバントは、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８およびＴＬＲ−９などの、特にトル様受容体（ＴＬＲ）を介して有効剤に対する免疫を刺激することができる。有用なアジュバントの代表例としては、限定されるものではないが、ミョウバン、フロイントの完全および不完全アジュバント（ＩＦＡ）などの鉱油エマルション、リポ多糖類またはその誘導体(Ribi et al., 1986, Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407-19)；ＱＳ２１(Sumino et al., 1998, J.Virol. 72, 4931-9；ＷＯ９８／５６４１５)などのサポニン；イミキモド(Suader, 2000, J. Am Acad Dermatol. 43, S6-S11)、１Ｈ−イミダゾ（４，５−ｃ）キノロン−４−アミン誘導体(Aldara（商標））および関連化合物(Smorlesi, 2005, Gene Ther. 12, 1324-32)などのイミダゾキノリン化合物；ＣｐＧ(Chu et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 1623; Tritel et al., 2003, J. Immunol. 171: 2358-2547)などのシトシンリン酸グアノシンオリゴデオキシヌクレオチド；およびＩＣ−３１(Kritsch et al., 2005, J. Chromatogr Anal. Technol Biomed Life Sci 822, 263-70)などの陽イオンペプチドが挙げられる。
【００９２】
本発明の核酸分子、ベクター、感染性粒子または組成物は、全身投与、局所投与および粘膜投与を含む種々の投与様式によって投与することができる。全身投与は、例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、腹腔内、血管内、動脈内注射など、いずれの手段によって行ってもよい。注射は通常のシリンジと針、または当技術分野で利用可能な他のいずれかの適当なデバイスで行うことができる。粘膜投与は、経口、鼻腔、気管内、肺内、腟内または直腸内経路によって行うことができる。局所投与は、経皮的手段（例えば、パッチなど）を用いて行うことができる。筋肉内または皮下投与は、有効剤としてウイルスベクターおよび感染性粒子を用いる場合に特に好ましい。
【００９３】
適当な用量は、特定の有効剤の薬物動態特性、被験体の齢、健康錠剤および体重、処置する病状、症状の性質および程度、同時処置の種類、処置の頻度、予防または治療の必要性および／または望まれる効果などの既知の因子によって異なる。用量はまた、選択された特定の経路に応じて算出することができる。処置に適当な用量を決定するために必要な計算のさらなる精密化は、通常、医師が関連の状況に照らして行う。一般的な指針としては、アデノウイルス粒子の好適な用量は、約１０５〜約１０１３ｉｕ（感染単位）、望ましくは約１０７〜約１０１２ｉｕ、好ましくは約１０８〜約１０１１ｉｕと様々である。ワクシニアウイルス粒子の好適な用量は、約１０４〜約１０１０ｐｆｕ（プラーク形成粒子）、望ましくは約１０５〜約１０９ｐｆｕ、好ましくは約１０６〜約５×１０８ｐｆｕと様々である。ベクタープラスミドは、１０μｇ〜２０ｍｇの間、好ましくは１００μｇ〜２ｍｇの間の用量で投与することができる。
【００９４】
さらに、投与は、単回投与、あるいはまた標準的プロトコール、投与法および数時間、数日および／または数週間にわたる投与計画に従って複数用量で行うことができる。また、投与は、ボーラス注射または連続注入によって行うこともできる。例えば、上記の核酸分子、ベクター、感染性粒子または組成物の少なくとも２回（例えば、２〜１０回）の投与で被験体を処置することができる。好ましくは、数日から４週間まで様々な期間内で第一投与シリーズを順次行い、その後、第一シリーズの最後の投与の後、１〜６か月以内に第二投与シリーズ（例えば、１回または２回の投与）を行う。第二シリーズの各投与間の期間は数日から４週間であり得る。好ましい実施形態では、第一投与シリーズは、１週間おきの３回の連続投与を含み、第二シリーズは第一シリーズの後４〜６か月以内に１回の投与を含む。一般的な指針としては、ＭＶＡベクターを用いる場合、好ましい投与経路は、１０６〜５×１０８ｐｆｕの間で含まれる１用量のＭＶＡ粒子による皮下投与である。
【００９５】
本発明の核酸分子、ベクター、感染性粒子、宿主細胞または組成物は、遺伝病、先天性疾患および獲得疾患を含む種々の病状の治療または予防のために被験体に導入することができる。本発明はまた、このような病状を治療または予防することを意図した薬剤の製造のための本発明の核酸分子、ベクター、感染性粒子、宿主細胞または組成物の使用に関する。それは感染性疾患（例えば、ウイルスおよび／または細菌感染）、癌および免疫不全疾患を治療または予防するのに特に適切である。本明細書において「癌」とは、び慢性または局在性腫瘍、転移、癌性ポリープおよび前腫瘍性病変（例えば、新生物）を含む、望まれない細胞増殖によって起こるいずれの癌症状も包含する。
【００９６】
本発明に関して意図される感染性疾患は、上記のような病原微生物による感染に関連したいずれの症状も包含する。本発明に関して意図される癌としては、限定されるものではないが、膠芽腫、肉腫、黒色腫、肥満細胞腫、癌腫ならびに乳癌、前立腺癌、精巣癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌（特に、乳頭腫ウイルス感染に関するもの）、肺癌（例えば、大細胞癌、小細胞癌、扁平上皮癌および腺癌）、腎臓癌、膀胱癌、肝臓癌、結腸癌、肛門癌、膵臓癌、胃癌、胃腸癌、口腔癌、喉頭癌、脳およびＣＮＳ癌、皮膚癌（例えば、黒色腫および非黒色腫）、血液癌（特にそれらが充実塊で発達した場合は、リンパ腫、白血病）、骨癌、網膜芽細胞腫および甲状腺癌が挙げられる。
【００９７】
好ましい実施形態では、本発明は、持続的感染、前悪性および悪性病変などの、乳頭腫ウイルス（特に、ＨＲ  ＨＰＶ）による感染に関連した症状の予防的または治療的処置に用いられる。「持続的感染」とは、ウイルスの根絶が果たせなかった感染対象における無症候相の乳頭腫ウイルス感染を指す。一般に、臨床的徴候は見られない。前悪性病変の例としては、限定されるものではないが、ＣＩＮ（子宮頸上皮内新生物）、陰門上皮内新生物（ＶＩＮ）、肛門上皮内新生物（ＡＩＮ）、陰茎上皮内新生物（ＰＩＮ）および膣上皮内新生物（ＶａＩＮ）などの種々の組織に検出可能な低悪性度、中悪性度または高悪性度の上皮内新生物が挙げられる。悪性病変の例としては、限定されるものではないが、子宮頸癌、肛門癌、膣癌、陰茎癌および口腔癌が挙げられる。乳頭腫ウイルスポリペプチドをコードする本発明の核酸分子、ベクター、感染性粒子、宿主細胞または組成物は、前悪性病変、特にＣＩＮ２／３病変または悪性病変、特に子宮頸癌の処置に特に向けられる。別の実施形態では、本発明はまた、持続的感染、慢性または劇症肝炎(fulgurant hepatitis)および肝臓癌など、肝炎ウイルス（例えば、ＨＢＶまたはＨＣＶ）による感染に関連した症状の予防的または治癒的処置にも使用可能である。
【００９８】
有効剤は単独で使用することもできるし、あるいは所望により慣例の療法（例えば、放射線療法、化学療法および／または外科手術）と併用することもできる。慣例の療法は、標準的な薬剤、投与法および投与計画を用いた標準的なプロトコールに従って動物またはヒト被験体に送達され、このような療法は、本発明の有効剤の投与前、投与中および／または投与後に行うことができる。例えば、ＨＣＶ感染に関連した症状を処置するためには、本発明の方法または使用は、好ましくは、例えば、プロテアーゼ阻害剤（例えば、VertexのＶＸ９５０などのセリンプロテアーゼ阻害剤）、ポリメラーゼ阻害剤、ヘリカーゼ阻害剤、抗繊維症薬、ヌクレオシド類似体、ＴＬＲアゴニスト、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗ＨＣＶ抗体、免疫調節薬、治療用ワクチンおよびＨＣＶ関連肝臓癌の処置に慣例的に用いられる抗腫瘍薬（例えば、アドリアマイシン、またはアドリアマイシリピオドールと、肝動脈における薬物塞栓療法(chimioembolisation)により通常投与されるスポンゲルの混合物）を伴う。特に好適な組合せとしては、好ましくは本発明の有効剤の投与前２４〜４８週間の間、ペグ化ＩＦＮ−α（ＩＦＮ−α２ａまたはＩＦＮ−α２ｂ）および／またはリバビリンで処置することを含む。乳頭腫ウイルス感染に関連する症状を処置するためには、本発明の方法または使用は、ループ電気外科切除術などの切除法を伴い得る。本発明に従う方法または使用はまた、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＦＮｇ）などの免疫刺激剤または自殺遺伝子産物（例えば、Caruso et al, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7024-28に記載されているＨＳＶ−Ｉのチミジンキナーゼ；ＷＯ９９／５４４８１に記載されているＦＣＵ−Ｉ）またはこのようなポリペプチドを発現するベクターを併用して行うことができる。
【００９９】
別の実施形態では、本発明の方法または使用は、初回免疫組成物と追加免疫組成物の逐次投与を含むプライムブースト療法に従って行われる。一般に、初回免疫組成物と追加免疫組成物は、少なくとも１つの共通の抗原ドメインを含む、またはコードする、異なるビヒクルを用いる。本発明の方法または使用は、初回免疫組成物を１〜１０回投与した後に、追加免疫組成物を１〜１０回投与することを含むことができる。望ましくは、注射間隔はおよそ１日〜１２か月である。好ましい療法は、３〜１０日（例えば、１週間）まで様々な期間をそれぞれあけて初回免疫の投与を３回または４回連続的に行い、その後、最後の初回免疫の１〜数週間後に追加免疫の投与を１回または２回行う。さらに、この初回免疫組成物と追加免疫組成物は同じ部位に投与することもできるし、あるいは同じ投与経路または異なる投与経路で違う部位に投与することもできる。例えば、ポリペプチドに基づく組成物は粘膜経路によって投与することができるが、ベクターに基づく組成物は注射するのが好ましく、例えば、ＭＶＡベクターでは皮下注射し、ＤＮＡプラスミドおよびアデノウイルスベクターでは筋肉内注射する。本発明のベクター、感染性粒子または組成物は、処置対象において免疫応答を誘発もしくは追加刺激するため、または初回刺激と追加刺激の双方を行うために使用可能である。一実施形態では、初回免疫は本発明のプラスミドベクターで行い、追加免疫は本発明のワクシニアウイルス感染性粒子で行う。別の実施形態では、初回免疫は本発明のアデノウイルス感染性粒子で行い、追加免疫は本発明のワクシニアウイルス感染性粒子で行う。さらに別の実施形態では、初回免疫は本発明のワクシニアウイルス感染性粒子で行い、追加免疫は本発明のアデノウイルス感染性粒子で行う。
【０１００】
本発明を例示として記載してきたが、用いられている用語は限定ではなく、本質的に記載の言葉の範疇に入るということを意図するものであると理解される。上記の教示に照らして本発明の多くの改変および変形が可能であることは明らかである。従って、添付の特許請求の範囲内で、本発明を本明細書に明示されているものとは異なる方法で実施可能であると理解される。
【０１０１】
上記に引用されている特許、刊行物およびデータベース登録の開示は総て、このような個々の特許、刊行物および登録がそれぞれ引用することにより本明細書の一部とされることが具体的かつ個々に示されている場合と同程度に、その全開示内容が具体的に引用することにより本明細書の一部とされる。
【０１０２】
以下の実施例は本発明を例示するものである。
【実施例】
【０１０３】
下記の構築を、Maniatis et al. (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY)に詳しく述べられている一般的な遺伝子操作技術および分子クローニング技術に従い、または市販のキットを用いる場合には、製造者の推奨に従って行う。ＰＣＲ増幅技術は当業者に公知である（例えば、Innis, Gelfand, Sninsky and White, Academic Pressにより発行されているPCR protocols -A guide to methods and applications, 1990参照）。アンピシリン耐性遺伝子を有する組換えプラスミドを、１００μｇ／ｍｌの抗生物質を添加した寒天または液体培地で、大腸菌Ｃ６００(Stratagene)、ＢＪ５１８３(Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580)およびＮＭ５２２内で複製させる。組換えワクシニアウイルスの構築は、上に引用した文献、また、Mackett et al. (1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7415-7419)およびMackett et al. (1984, J. Virol. 49, 857-864)中の当技術分野における常法に従って行う。この組換えワクシニアウイルスの選択を容易にするため、大腸菌の選択遺伝子ｇｐｔ（キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）(Falkner and Moss, 1988, J. Virol. 62, 1849-1854)を用いる。
【０１０４】
実施例１：ＨＰＶ−１６  Ｅ１およびＥ２遺伝子を発現するＭＶＡベクター（ＭＶＡＴＧ１７４１０）の構築
ａ）ＨＰＶ−１６  Ｅ２遺伝子をコードする組換えＭＶＡベクター（ＭＶＡＴＧ１７４０８）の構築
ＨＰＶ１６  Ｅ２遺伝子のクローニング
ＨＰＶ−１６  Ｅ２をコードするヌクレオチド配列を、ＣａＳｋｉ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５５０）から単離されたゲノムからクローニングした。プライマーＯＴＧ１６８０９（配列番号１６）とＯＴＧ１６８１０（配列番号１７）を用いてＥ２遺伝子を増幅した。得られたフラグメントをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲ１で消化し、同じ酵素で制限処理したｐＧＥＸ２Ｔ(Amersham Biosciences)に挿入し、ｐＴＧ１７２３９を得た。クローニングされたＥ２遺伝子を配列決定したところ、ＨＰＶ１６  Ｅ２始原配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＣ−０１５２６に記載）と比べた場合に５つの突然変異が示された。２つの突然変異がサイレントであり、３つの非サイレント突然変異（Ｔ２１０Ｉ、Ｓ２１９Ｐ、Ｋ３１０Ｔ）を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene)を用いて修正し、ｐＴＧ１７２６８を得た。
【０１０５】
ＨＰＶ−１６  Ｅ２ポリペプチドの改変
Ｅ２＊と呼ばれるＨＰＶ−１６  Ｅ２変異体（Ｅ３９ＡおよびＩ７３Ａ）を作出するため、ｐＴＧ１７２６８に組み込まれたＥ２ヌクレオチド配列を部位特異的突然変異誘発により改変した。より具体的には、３９番のＧｌｕ残基をＡｌａで置換することによりＥ２複製機能を、また、７３番のＩｌｅ残基をＡｌａで置換することによりトランス活性化機能を無効にした。得られたプラスミドｐＴＧ１７３１８は、ＨＰＶ−１６  Ｅ２＊をコードする改変配列を含む。
【０１０６】
ＨＰＶ−１６  Ｅ２＊を、そのＮ末端においてペプチドシグナルと、また、そのＣ末端において狂犬病ウイルス（ＰＧ株；Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｙ００９０９７）の糖タンパク質に由来する膜固定配列と融合させることにより、原形質膜表面で発現宿主細胞中のＨＰＶ−１６  Ｅ２＊の提示を命令するように改変した。ＳＳ−Ｅ２＊−ＴＭＲと呼ばれる膜提示型Ｅ２欠陥変異体をコードするヌクレオチド配列（配列番号１２）を、次のプライマー：ＯＴＧ１７５００（配列番号１８）、ＯＴＧ１７５０１（配列番号１９）、ＯＴＧ１７５０２（配列番号２０）、ＯＴＧ１７５０３（配列番号２１）、ＯＴＧ１７５０４（配列番号２２）およびＯＴＧ１７５０５（配列番号２３）を用いた３回のＰＣＲにより再組み立てした。この再組み立てした配列をｐＢＳ由来ベクター(Stratagene)に挿入してｐＴＧ１７３６０を得、次に、ワクシニアトランスファープラスミドの、ｐＨ５Ｒプロモーターの下流にクローニングし(Rosel et al, 1986, J Virol. 60, 436-449)、ｐＴＧ１７４０８を得た。
【０１０７】
このトランスファープラスミドは、移入されるヌクレオチド配列が相同組換えによりＭＶＡゲノムの欠失ＩＩＩに挿入されるように設計されている。これはプラスミドｐＴＧ１Ｅ（Braun et al., 2000, Gene Ther. 7, 1447-57に記載）に起源し、ＭＶＡ欠失ＩＩＩ周辺のフランキング配列（ＢＲＧ３およびＢＲＤ３）（これらの配列は、ＭＶＡＴＧＮ３３．１  ＤＮＡからＰＣＲにより得られた配列である(Sutter and Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-51)）をクローニングしたものである。このトランスファープラスミドはまた、オワンクラゲ(Aequorea victoria)増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ遺伝子、ｐＥＧＰ−Ｃｌから単離、Clontech）と大腸菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ遺伝子）との融合物を初期後期ワクシニアウイルス合成プロモーターｐ１１Ｋ７．５の制御下に含む（R. Wittek, University of Lausanneから厚意により提供）。キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼの合成により、ＧＰＴ＋組換えＭＶＡは、ミコフェノール酸、キサンチンおよびヒポキサンチンを含有する選択培地でプラークを形成することができ(Falkner et al, 1988, J. Virol. 62, 1849-54)、ｅＧＦＰにより組換えＭＶＡプラークの可視化が可能となる。選択マーカーｅＧＰＰ−ＧＰＴは、２つの相同配列間に同じ向きに配置される。クローン選択が達成されると、選択マーカーは数回の無選択継代培養によって容易に排除され、ｅＧＰＰ−ＧＰＴ組換えＭＶＡの増殖が可能となる。
【０１０８】
ＨＰＶ−１６  ＳＳ−Ｅ２＊−ＴＭＲ遺伝子を発現する組換えＭＶＡの構築
ＭＶＡＴＧ  １７４０８ウイルスの作出は、ＭＶＡＴＧＮ３３．１に感染させ（ＭＯＩ  ０．１ｐｆｕ／細胞）、ｐＴＧ１７４０８でトランスフェクトした（標準的なリン酸カルシウムＤＮＡ沈殿法に従う）一次ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）において相同組換えによって行った。ウイルスの選択は、ミコフェノール酸、キサンチンおよびヒポキサンチンを含有する選択培地の存在下での３回のプラーク精製によって行った。上述のように、選択マーカーはその後、非選択培地での継代培養によって排除された。親ＭＶＡの混入が無いことをＰＣＲにより確認した。
【０１０９】
Ｅ２発現の分析は、ウエスタンブロットによって行った。ＣＥＦにＭＶＡＴＧ１７４０８をＭＯＩ０．２で感染させ、２４時間後、細胞を採取した。ウエスタンブロット分析は、市販のモノクローナル抗Ｅ２抗体ＴＶＧ２７１(Abeam)を用いて行った。Ｅ２＊−ＴＭＲの理論分子量は４８．９ｋＤａであるが、見掛けの分子量が５５ｋＤＡのタンパク質の発現が検出された。細胞抽出物をエンドグリコシダーゼＦで処理した後に、この組換えタンパク質の大きさの減少が見られたが、このことは、ＭＶＡＴＧ１７４０８から発現されたＥ２＊  ＴＭＲポリペプチドがＮ−グルコシル型であることを示唆する。
【０１１０】
ｂ）ＨＰＶ−１６  Ｅ２遺伝子と重複する部分において変更されたＨＰＶ−１６  Ｅ１遺伝子をコードする組換えＭＶＡ（ＭＶＡＴＧ１７４０９）の構築
ＨＰＶ−１６  Ｅ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をＣａＳｋｉ細胞ＤＮＡ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５５０）からクローニングした。より具体的には、Ｅ１遺伝子を２つの部分Ｅ１ａ（ｎｔ  １〜１１０２）およびＥ１ｂ（ｎｔ  １００１〜１９５０）として増幅した。プライマーＯＴＧ１６８１１（配列番号２４）とＯＴＧ１６８１４（配列番号２５）を用いてＥ１ａフラグメントを増幅し、これをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、同じ酵素で制限処理したｐＧＥＸ２Ｔに挿入し、ｐＴＧ１７２４０を得た。Ｅ１ｂフラグメントはＯＴＧ１６８１３（配列番号２６）とＯＴＧ１６８１２（配列番号２７）を用いて作製し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化した後、ｐＧＥＸ２Ｔに挿入し、ｐＴＧ１７２４１を得た。配列決定を行ったところ、ＨＰＶ−１６  Ｅ１始原配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＣ−０１５２６に記載）と比較した場合に４つの突然変異が示された。１つの突然変異がサイレントであり、Ｅ１ａに存在する３つの非サイレント突然変異（Ｋ１３０Ｑ、Ｎ１８５ＴおよびＴ２２０Ｓ）を特異的突然変異誘発により修正した。次に、修正されたＥ１ａフラグメントを、ＢｓｒＧＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＴＧ１７２４１にクローニングすることにより、完全なＥ１遺伝子を再組み立てした。得られたプラスミドをｐＴＧ１７２８９と呼んだ。
【０１１１】
ＨＰＶ−１６ゲノムにおいて、Ｅ１遺伝子の最後の５９のヌクレオチドは、Ｅ２遺伝子の最初の５９のヌクレオチドと同一である。Ｅ１およびＥ２をコードするＭＶＡベクターの生産工程中の不安定性の問題を避けるため、Ｅ１コード配列のこの部分を、Ｅ２コード配列との配列相同性を低下させるようにコドン使用の改変により改変した。変更されたプライマーＯＴＧ１７４０８（配列番号２８）とＯＴＧ１７４０９（配列番号２９）を用い、Ｅ１遺伝子の３’末端の増幅により、変更された配列（配列番号９）を得た。この増幅フラグメントをＮｓｉＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、同じ酵素で制限処理したｐＴＧ１７２８９に挿入し、ｐＴＧ１７３４０を得た。
【０１１２】
ＨＰＶ−１６変更型Ｅ１配列はまた、ＨＰＶ−１６  Ｅ１の４８２番のＧｌｙ残基をＡｓｐ残基で置換（Ｇ４８２Ｄ；本明細書ではＥ１＊とも呼ぶ）することにより、コードされているＥ１ポリペプチドの複製機能を無効にするための部位特異的突然変異誘発によっても変異させ、ｐＴＧ１７３７３を得た。
【０１１３】
ＨＰＶ−１６  Ｅ１ｄｅｇ＊配列はまた、狂犬病ウイルス（ＥＲＡ単離物；Ｇｅｎｂａｎｋ番号  Ｍ３８４５２に記載）の糖タンパク質に由来するシグナルペプチドおよび膜固定ペプチドと融合させることにより、形質細胞表面での、コードされているポリペプチドの発現を命令するように改変した。ＳＳ−Ｅ１ｄｅｇ＊−ＴＭＲ配列（配列番号１０）は、次のプライマーＯＴＧ１７５６０（配列番号３０）、ＯＴＧ１７５６１（配列番号３１）、ＯＴＧ１７５６２（配列番号３２）、ＯＴＧ１７５６３（配列番号３３）、ＯＴＧ１７５６４（配列番号３４）およびＯＴＧ１７５６５（配列番号３５）を用いた３回のＰＣＲにより再構築した。得られたフラグメントをｐＢＳ由来ベクター(Stratagene)に挿入し、ｐＴＧ１７４０４を得た。次に、ＳＳ−Ｅ１ｄｅｇ＊−ＴＭＲ配列をワクシニアトランスファープラスミドの、ｐ７．５Ｋプロモーターの下流にクローニングし(Cochran et al, 1985, J. Virol. 54, 30-7)、ｐＴＧ１７４０９を得た。
【０１１４】
ＭＶＡＴＧ１７４０９ウイルスの生成は、上記のように相同組換えによりＣＥＦで行った。
【０１１５】
ｃ）ＨＰＶ−１６  Ｅ１およびＥ２遺伝子をコードする組換えＭＶＡ（ＭＶＡＴＧ１７４１０）の構築
配列決定され、ｐ７．５Ｋプロモーターにより制御されるＳＳ−Ｅ１ｄｅｇ＊−ＴＭＲをｐＴＧ１７４０９から単離し、ｐＴＧ１７４０８に挿入し、ｐＴＧ１７４１０を得た。
ＭＶＡＴＧ１７４１０ウイルスの生成は、上記のように相同組換えによりＣＥＦで行った。
【０１１６】
実施例２：ＨＰＶ−１８  Ｅ１およびＥ２遺伝子をコードするＭＶＡベクター（ＭＶＡＴＧ１７５８２）の構築
ＨＰＶ−１８  Ｅ１およびＥ２遺伝子を合成遺伝子として再構成し、（ｉ）天然ＨＰＶ−１６配列とＨＰＶ−１８配列が共有する相同部分の間の相同性パーセンテージを７５％未満に低下させるように（ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８  Ｅ１およびＥ２遺伝子の配列をアラインし、相同性を５未満の連続ヌクレオチドにまで低下させるようにオリゴヌクレオチドを設計した）、（ｉｉ）天然ＨＰＶ−１８  Ｅ１配列の３’末端と、ＨＰＶ−１８  Ｅ２配列の５’末端の双方に存在する５９のヌクレオチドの部分間の相同性を７５％未満に低下させるように、また、（ｉｉ）ＨＰＶ−１８  Ｅ１およびＥ２遺伝子産物の酵素機能を無効にする突然変異（Ｅ１：Ｇ４８９Ｄ、Ｅ２：Ｅ４３ＡおよびＩ７７Ａ）を導入するように、オリゴヌクレオチドを設計した。
【０１１７】
５０のオリゴヌクレオチドを組み立てることでＨＰＶ−１８  ｄｅｇＥ１＊配列を再構築し、ｐＢＳベクターにクローニングし、ｐＴＧ１７４７３を得た。次に、プライマーＯＴＧ１５３１５（配列番号３６）、ＯＴＧ１７８８１（配列番号３７）、ＯＴＧ１７８８２（配列番号３８）、ＯＴＧ１７８８３（配列番号３９）、ＯＴＧ１７８８４（配列番号４０）およびＯＴＧ１７８８５（配列番号４１）を用いた３回のＰＣＲにより、Ｅ１配列を、麻疹ウイルスＦタンパク質に由来するシグナル伝達配列クローンと融合させた（ＳＳ−１８Ｅ１ｄｅｇ＊−ＴＭＦ）。得られたフラグメント（配列番号１１）をＭＶＡトランスファーベクターの、ｐ７．５Ｋプロモーターの制御下にクローニングし、ｐＴＧ１７５２１を得た。
【０１１８】
２６オリゴヌクレオチドを組み立てることでＨＰＶ−１８  ｄｅｇＥ２＊配列を再構築し、ｐＢＳベクターにクローニングし、ｐＴＧ１７４９８を得た。プライマーＯＴＧ１７８７５（配列番号４２）、ＯＴＧ１７８７６（配列番号４３）、ＯＴＧ１７８７７（配列番号４４）、ＯＴＧ１７８７８（配列番号４５）、ＯＴＧ１７８７９（配列番号４６）およびＯＴＧ１７８８０（配列番号４７）を用いた３回のＰＣＲにより、狂犬病ウイルス（ＥＲＡ株；Ｇｅｎｂａｎｋ番号  Ｍ３８４５２）の糖タンパク質のシグナルおよび膜固定ペプチドとの融合を行った。このＳＳ−１８Ｅ２＊−ＴＭＲカセットをＭＶＡトランスファープラスミドの、ｐＨ５Ｒプロモーターの下流に挿入し、ｐＴＧ１７５５２を得た。最後に、このｐ７．５Ｋ−ＳＳ−Ｅ１ｄｅｇ＊−ＴＭＦカセットをｐＴＧ１７５２１から単離し、ｐＴＧ１７５５２に挿入し、ｐＴＧ１７５８２を得た。
【０１１９】
上記のように組換えＭＶＡＴＧ１７５２１、ＭＶＡＴＧ１７５５２およびＭＶＡＴＧ１７５８２の作製を行った。
【０１２０】
実施例３：ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８  Ｅ１およびＥ２遺伝子を発現する多価ＭＶＡベクター（ＭＶＡＴＧ１７５８３）の構築
ｐ７．５Ｋ−ＳＳ−１８Ｅ１ｄｅｇ＊−ＴＭＦカセットおよびｐＨ５Ｒ−ＳＳ−１８Ｅ２＊−ＴＭＲカセットをｐＴＧ１７４１０（ｐ７．５Ｋ−ＳＳ−１６Ｅ１ｄｅｇ＊−ＴＭＲカセットおよびｐＨ５Ｒ−ＳＳ−１６Ｅ２＊−ＴＭＲを含む）に導入し、得られたトランスファープラスミドをｐＴＧ１７５８３と呼んだ。ＭＶＡＴＧ１７５８３の作製も上記のように行った。
【０１２１】
実施例４：ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８  Ｅ６およびＥ７遺伝子を発現する多価組換えウイルスの構築
ＭＶＡＴＧ１６３２７は、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８  Ｅ６およびＥ７ポリペプチドの膜固定型、非発癌性変異体を発現する組換えＭＶＡウイルスである。それらの発癌特性を排除するために、Ｅ６およびＥ７ヌクレオチド配列を変異させ（Ｅ６＊およびＥ７＊）、適当な適当なシグナルおよび膜固定ペプチドをコードする配列と融合させた（Ｅ６＊ｔｍ、Ｅ７＊ｔｍ）。より具体的には、、ＨＰＶ−１８  Ｅ７＊をそれぞれそのＮ末端およびＣ末端において麻疹ウイルスのＦ糖タンパク質のシグナルペプチドおよび膜固定ペプチドと融合させ、ＨＰＶ−１６  Ｅ６＊、ＨＰＶ−１６  Ｅ７＊およびＨＰＶ−１８  Ｅ６＊を、狂犬病ウイルス糖タンパク質のそれに由来するシグナルペプチドおよび膜固定ペプチドと融合させた。さらに、ＨＰＶ−１８  Ｅ６およびＥ７ヌクレオチド配列を、それらのＨＰＶ１６対応物との相同性を低下させるように、コドン使用の改変により改変した。この目的で、天然ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８遺伝子の配列をアラインし、相同性が５未満の連続ヌクレオチドにまで低下させるようコドンの変更を行った。このベクターでは、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８  Ｅ６配列は、双方ともｐ７．５Ｋプロモーターの制御下に、互いに逆向きに配置され、一方、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８  Ｅ７配列はＨ５Ｒプロモーターにより駆動し、総ての発現カセットをＭＶＡゲノムの切除領域ＩＩＩに挿入した。
【０１２２】
ａ）ＨＰＶ−１６  Ｅ７＊ｔｍ発現カセットの構築
ＨＰＶ−１６  Ｅ７遺伝子をＣａｓｋｉ細胞から単離し、ＷＯ９９／０３８８５に記載されているように、非発癌性および膜提示型Ｅ７ポリペプチド（１６Ｅ７＊ｔｍＲ）をコードするように改変した。非発癌性突然変異は、アミノ酸残基２１〜２６の欠失（ΔＤＬＹＣＹＥ）によって行い、膜提示は、Ｅ７＊変異配列をその５’末端および３’末端においてそれぞれ、狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＥＲＡ株；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ３８４５２）からクローニングしたシグナルペプチドおよび膜固定ペプチドをコードする配列と融合させることによって行った。得られた配列を初期−後期ｐＨ５Ｒプロモーターの制御下にクローニングし(Rosel et al, 1986. J. Virol. 60, 436-9)、このカセットをｐＢＳ由来ベクターに導入し、ｐＴＧ１６１６１を得た。
【０１２３】
ｂ）ＨＰＶ−１６  Ｅ６＊ｔｍおよびＨＰＶ−１８  Ｅ６＊ｔｍ発現カセットのクローニング
ＨＰＶ−１６  Ｅ６遺伝子を単離し、ＷＯ９９／０３８８５に記載されているように、非発癌性、膜提示型Ｅ６ポリペプチドをコードするように改変した。非発癌性突然変異は、アミノ酸残基１１８〜１２２の欠失（ΔＣＰＥＥＫ）によって行い、膜提示は、Ｅ６＊変異配列をその５’末端および３’末端においてそれぞれ、狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＰＧ株；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ａｙ００９０９７）に由来するシグナルペプチドおよび膜固定ペプチドをコードする配列と融合させることによって行った。これは、ＢａｍＨＩ部位により分離されたシグナルペプチドおよび膜固定ペプチド配列を含むベクターにＥ６＊変異配列を挿入することによって行い、ｐＴＧ１６０９７を得た。
【０１２４】
オリゴヌクレオチドＯＴＧ１５１７４（配列番号４８）、ＯＴＧ１５１７５（配列番号４９）、ＯＴＧ１５１７６（配列番号５０）、ＯＴＧ１５１７７（配列番号５１）、ＯＴＧ１５１７８（配列番号５２）、ＯＴＧ１５１７９（配列番号５３）、ＯＴＧ１５１８０（配列番号５４）およびＯＴＧ１５１８１（配列番号５５）を組み立てることにより、合成ＨＰＶ−１８  Ｅ６配列を作製した。これらのオリゴヌクレオチドは、アミノ酸残基１１３〜１１７をコードするコドン欠失（非発癌性突然変異ΔＮＰＡＥＫ）を導入するよう、また、ＨＰＶ−１６  Ｅ６遺伝子との相同性を低減するためにコドン使用を変更（変更配列）するように設計された。次に、得られた合成配列をその５’末端および３’末端においてそれぞれ、狂犬病ウイルス糖タンパク質遺伝子に由来するシグナルペプチドおよび膜固定ペプチドをコードする配列と融合させて、配列番号１４で示される配列を得、ｐＴＧ１６１６０とした。このＨＰＶ−１６  Ｅ６＊ｔｍＲおよびＨＰＶ−１８  ｄｅｇＥ６＊ｔｍＲ配列をそれぞれｐ７．５Ｋプロモーターの制御下に逆向きに挿入した。その後、これらのカセットをｐＴＧ１６１６１に導入し、ｐＴＧ１６２１５を得た。
【０１２５】
ｃ）ＨＰＶ−１８  Ｅ７＊ｔｍＦ発現カセットのクローニング
オリゴヌクレオチドＯＴＧ１４７７３（配列番号５６）、ＯＴＧ１４７７４（配列番号５７）、ＯＴＧ１４７７５（配列番号５８）、ＯＴＧ１４７７６（配列番号５９）、ＯＴＧ１４７７７（配列番号６０）およびＯＴＧ１４７７８（配列番号６１）を組み立てることにより、合成ＨＰＶ−１８  Ｅ７配列を作製した。アミノ酸残基２４〜２８をコードするコドンの欠失を導入するよう（非発癌性突然変異ΔＤＬＬＣＨ）、また、ＨＰＶ−１６  Ｅ７遺伝子との相同性を低減するためにコドン使用を変更するよう（変更された配列）、オリゴヌクレオチドを設計した。次に、得られた合成配列をその５’末端および３’末端において、それぞれ麻疹ウイルスＦタンパク質遺伝子（ＥＰ０３０５２２９に記載）からクローニングしたシグナルおよび膜固定ペプチドのコード配列と融合させた。得られた配列（配列番号１５）をｐＨ５Ｒプロモーターの制御下にクローニングし、このカセットをｐＢＳ由来ベクターに導入し、ｐＴＧ１６０１５を作製した。
【０１２６】
ｄ）トランスファープラスミドｐＴＧ１６３２７の構築
トランスファープラスミドｐＴＧ６０１９（ＷＯ９９／０３８８５の実施例２に記載）は、ＭＶＡ欠失ＩＩＩをフランキングする相同配列を含む。これを次のように改変した。プライマーＯＴＧ１５０４０（配列番号６２）およびＯＴＧ１５０４１（配列番号６３）のハイブリダイゼーションによって得られた合成ポリリンカーを、ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで消化したｐＴＧ６０１９に導入し、ｐＴＧ１６００７を得た。初期−後期ｐＨ５Ｒプロモーターの制御下に置かれた大腸菌ｇｐｔをコードする発現カセットを含むＳａｃＩ−ＳａｃＩフラグメントをｐＴＧ１４０３３から単離し（ＥＰ１１４６１２５の実施例２に記載）、ＳａｃＩで消化したｐＴＧ１６００７に導入し、ｐＴＧ１６０９３を得た。キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼの合成により、ＧＰＴ＋組換えＭＶＡは、ミコフェノール酸、キサンチンおよびヒポキサンチンを含有する選択培地でプラークを形成することができる(Falkner et al, 1988, J. Virol. 62, 1849-54)。選択マーカーＧＰＴは、２つの相同配列間に同じ向きに配置される。クローン選択が達成されると、選択マーカーは数回の無選択継代培養によって容易に排除され、ＧＰＴ組換えＭＶＡの増殖が可能となる。
【０１２７】
ＨＰＶ−１８  ｄｅｇＥ７＊ＴＭＦ発現カセットを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩフラグメントをｐＴＧ１６０１５から単離し、同じ酵素で消化したｐＴＧ１６０９３に導入し、ｐＴＧ１６１０５を得た。他方、ｐＴＧ１６２１５をＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、Ｔ４  ＤＮａポリメラーゼで処理し、得られたＨＰＶ−１６  Ｅ７＊ｔｍＲ、ＨＰＶ−１６  Ｅ６＊ｔｍＲおよびＨＰＶ−１８  ｄｅｇＥ６＊ＴＭＲ発現カセットを含むフラグメントを、  ＳｍａＩで消化したｐＴＧ１６１０５に導入し、ｐＴＧ１６３２７を得た（図２）。
【０１２８】
ｅ）ＭＶＡＴＧ１６３２７の作製
ＭＶＡＴＧ１６３２７の作製は、一次ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）における相同組換えによって行った。この目的で、ｐＴＧ１６３２７を、標準的なリン酸カルシウムＤＮＡ沈殿法に従い、予めＭＶＡＴＧＮ３３．１にＭＯＩ  ０．１ｐｆｕ／細胞で感染させたＣＥＦにトランスフェクトした。ウイルスの選択は、ミコフェノール酸、キサンチンおよびヒポキサンチンを含有する選択培地の存在下、ＣＥＦ上での３回のプラーク精製によって行った。次に、選択マーカーを非選択培地での形態培養により排除した。親ＭＶＡの混入が無いことをＰＣＲにより確認した。
【０１２９】
遺伝子発現の分析は、ウエスタンブロットによって行った。ＣＥＦにＭＶＡＴＧ１６３２をＭＯＩ０．２で感染させ、２４時間後、細胞を採取した。ウエスタンブロット分析は、それぞれＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８  Ｅ６およびＥ７タンパク質に対するウサギポリクローナル抗体を用いて行った。結果は、ＨＰＶポリペプチドがＭＶＡＴＧ１６３２７から適切に発現されたことを示す。
【０１３０】
ｆ）ＭＶＡＴＧ１６３２７の遺伝的安定性の検討
ＭＯＩ  １０−２ｐｆｕ／細胞および１０ー４ｐｆｕ／細胞で感染させたＣＥＦに対してＭＶＡＴＧ１６３２７の５回の継代培養を行った。継代培養５回の被験原株から単離した１００のウイルスクローンに対して遺伝的安定性を評価した。発現カセットの構造を決定するためのＰＣＲ増幅と、ウエスタンブロットによる抗原検出の２つの方法を用いた。ＰＣＲ分析の結果は、これらクローンの９９％が目的の発現カセットを含んでいることを示した。免疫検出は、これらクローンの９７％が、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８  Ｅ６＊ｔｍおよびＥ７＊ｔｍポリペプチドの４種類の抗原を発現することを示した。
【０１３１】
これらの分析は、５回の継代培養後にＭＶＡＴＧ１６３２７に由来するクローンの９７％が確認されたことを示し、この構築物の良好な遺伝的安定性を示唆する。
【０１３２】
実施例５：ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３３およびＨＰＶ−５２  Ｅ２遺伝子を発現する多価ＭＶＡベクターの構築
ＨＰＶ−３３  Ｅ２ポリペプチドをコードする合成遺伝子はGeneart (Regensburg, Germany)によって合成されたものである。この合成配列は、（ｉ）ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８およびＨＰＶ−５２に由来するＥ２遺伝子との相同性パーセンテージを７５％未満に低減するよう（可能であれば、相同部分が６未満の連続ヌクレオチドまで低減される）、また、（ｉｉ）ＨＰＶ−３３遺伝子産物の酵素機能を無効にする突然変異（Ｅ３９ＡおよびＩ７３Ａ）を導入するように設計された。
【０１３３】
次に、ＨＰＶ−３３  ｄｅｇＥ２＊配列を狂犬病ウイルス（ＥＲＡ株、Ｇｅｎｂａｎｋ番号  Ｍ３８４５２）の糖タンパク質のシグナルペプチドおよび膜固定ペプチドをコードするヌクレオチド配列と融合させた。これは、プライマーＯＴＧ１８９６２（配列番号７２）、ＯＴＧ１８９６３（配列番号７３）、ＯＴＧ１８９６４（配列番号７４）、ＯＴＧ１８９６５（配列番号７５）、ＯＴＧ１８９６６（配列番号７６）およびＯＴＧ１８９６７（配列番号７７）を用いた３回のＰＣＲによって行った。得られたＳＳ−３３ｄｅｇＥ２＊−ＴＭＲポリペプチドをコードするフラグメント（配列番号６７）をＭＶＡトランスファーベクターのｐ７．５Ｋプロモーターの制御下にクローニングし、上記のようにウイルス粒子を生成した。
【０１３４】
ＨＰＶ−５２  Ｅ２ポリペプチドをコードする合成遺伝子はGeneart (Regensburg, Germany)によって合成されたものである。この合成配列が、（ｉ）ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８およびＨＰＶ−３３に由来するＥ２遺伝子との相同性パーセンテージが７５％未満に低減するよう（相同部分は好ましくは６未満の連続ヌクレオチドまで低減される）、また、（ｉｉ）ＨＰＶ−５２遺伝子産物の酵素機能を無効にする突然変異（Ｅ３９ＡおよびＩ７３Ａ）を導入するように設計された。
【０１３５】
次に、プライマーＯＴＧ１８９６８（配列番号７８）、ＯＴＧ１８９６９（配列番号７９）、ＯＴＧ１８９７０（配列番号８０）、ＯＴＧ１８９７１（配列番号８１）、ＯＴＧ１８９７２（配列番号８２）およびＯＴＧ１８９７３（配列番号８３）を用いた３回のＰＣＲにより、合成ＨＰＶ−５２  Ｅ２＊ｄｅｇ配列を麻疹ウイルスＦタンパク質のシグナルペプチドおよび膜固定ペプチドをコードするヌクレオチド配列と融合させた（ＳＳ−５２Ｅ２＊ｄｅｇ−ＴＭＦを得る）。
【０１３６】
得られたＳＳ−５２Ｅ２＊ｄｅｇ−ＴＭＦポリペプチドをコードするフラグメント（配列番号６９）をＭＶＡトランスファープラスミドの、ｐ７．５Ｋプロモーターの下流に挿入し、上記のようにウイルス粒子を生成した。
【０１３７】
膜提示型、酵素欠損型ＨＰＶ−１８  Ｅ２ポリペプチドをコードするｐＨ５Ｒ−ＳＳ−１８Ｅ２＊−ＴＭＲカセット（ｐＴＧ１７５５２から単離）、膜提示型、酵素欠損型ＨＰＶ−３３  Ｅ２ポリペプチドをコードするｐ７．５Ｋ−ＳＳ−３３ｄｅｇＥ２＊−ＴＭＲカセットおよび膜提示型、酵素欠損型ＨＰＶ−５２  Ｅ２ポリペプチドをコードするｐ７．５Ｋ−ＳＳ−５２ｄｅｇＥ２＊−ＴＭＦカセットをｐＴＧ１７４０８（ｐＨ５Ｒ−ＳＳ−１６Ｅ２＊−ＴＭＲカセットを含む）に導入し、上記のようにウイルス粒子を生成した。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】（Ａ）（ａ）天然ＨＰＶ−１６  Ｅ１配列の終了部と（ｂ）天然ＨＰＶ−１６  Ｅ２配列の開始部とに存在する５９のヌクレオチドの間、および（Ｂ）（ａ）天然ＨＰＶ−１６  Ｅ１配列の終了部または天然ＨＰＶ−１６  Ｅ２配列の開始部と（ｂ）配列番号９とに存在する５９のヌクレオチドの間の配列アラインメントを示す。
【図２】（Ａ）ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８  Ｅ６をコードする配列の間、および（Ｂ）ＨＰＶ−１６  Ｅ６をコードする配列と配列番号１４の間の配列アラインメントを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【配列表】
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