(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（３）で示されるスフィンゴ糖脂質誘導体の一以上を含有するスフィンゴ糖脂質誘導体の混合物を有効成分として含有する医薬用組成物。
【化１】
0005392451.tif 000013
ここで、Ｒ３はＨ又はＯＨを表し、Ｒ４は下記（ａ）又は（ｂ）で定義される。
（ａ）Ｒ３がＨの場合、Ｒ４は（ＣＨ２）１３ＣＨ３、又は（ＣＨ２）６ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）４ＣＨ３である。
（ｂ）Ｒ３がＯＨの場合、Ｒ４は（ＣＨ２）ＹＣＨ３（ここで、Ｙは１４〜２１の整数である。）、又は（ＣＨ２）Ｚ１ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）Ｚ２ＣＨ３（ここで、Ｚ１、及びＺ２は０又は自然数であって、Ｚ１＋Ｚ２＝１９である。）である。
【請求項２】
前記（ｂ）は以下で定義される請求項１に記載の医薬用組成物。
（ｂ）Ｒ３がＯＨの場合、Ｒ４は（ＣＨ２）ＹＣＨ３（ここで、Ｙは１４〜２１の整数である。）、又は（ＣＨ２）１２ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３である。
【請求項３】
炭素数の異なる数種のスフィンゴ糖脂質誘導体混合物を有効成分として含有する請求項  １又は２に記載の医薬用組成物。
【請求項４】
前記スフィンゴ糖脂質誘導体は天然のスフィンゴ糖脂質誘導体である請求項１から３のいずれか一に記載の医薬用組成物。
【請求項５】
前記スフィンゴ糖脂質誘導体はビール等の製造工程で得られるビール粕より抽出されるスフィンゴ糖脂質誘導体である請求項１から４のいずれか一に記載の医薬用組成物。
【請求項６】
前記スフィンゴ糖脂質誘導体は、
麦芽を熱風で乾燥させて乾燥麦芽を得る乾燥麦芽製造工程と、
前記乾燥麦芽を粉砕し副原料を混入させ酵素によりデンプン糖化処理を行う糖化工程と、
前記糖化工程で得られた糖化液をろ過するろ過工程と、
前記ろ過工程で得られたろ液を乾燥させて得られたビール糟を極性溶媒に浸漬する浸漬工程と、
前記浸漬工程の極性溶媒からビール糟を除去して抽出液を得る抽出工程と、
前記抽出工程で得られた抽出液を濃縮する濃縮工程と、
前記濃縮工程で得られた脂質成分粗精製物をアルカリ溶液によって加水分解する加水分解工程と、
前記加水分解後、疎水性溶媒と親水性溶媒の混合物を加えて層分離させて分解産物を除去する分解産物除去工程と、
から抽出されるスフィンゴ糖脂質誘導体である請求項１から５のいずれか一に記載の医薬用組成物。
【請求項７】
前記抽出工程で得られる抽出液を、前記浸漬工程で用いる極性溶媒として再度用いることを所定回数繰り返すサイクル工程をさらに有する請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記医薬用組成物は抗腫瘍剤として用いるための医薬用組成物である請求項１から７のいずれか一に記載の医薬用組成物。
【請求項９】
下記の式（２）で示されるスフィンゴ糖脂質誘導体の一以上を含有するスフィンゴ糖脂質誘導体の混合物を有効成分として、白血病細胞に対して細胞傷害性を有する請求項８に記載の医薬用組成物。
【化３】
0005392451.tif 000014
ここで、Ｒ１はモノカルボン酸がカルボキシル基で酸アミド結合した残基を表す。
【請求項１０】
下記の式（３）で示されるスフィンゴ糖脂質誘導体の一以上を含有するスフィンゴ糖脂質誘導体の混合物を有効成分として、白血病細胞に対して細胞傷害性を有する請求項８に記載の医薬用組成物。
【化４】
0005392451.tif 000015
ここで、Ｒ３はＨ又はＯＨを表し、Ｒ４は下記（ａ）又は（ｂ）で定義される。
（ａ）Ｒ３がＨの場合、Ｒ４は（ＣＨ２）１３ＣＨ３、又は（ＣＨ２）６ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）４ＣＨ３である。
（ｂ）Ｒ３がＯＨの場合、Ｒ４は（ＣＨ２）ＹＣＨ３（ここで、Ｙは１４〜２１の整数である。）、又は（ＣＨ２）Ｚ１ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）Ｚ２ＣＨ３（ここで、Ｚ１、及びＺ２は０又は自然数であって、Ｚ１＋Ｚ２＝１９である。）である。
【請求項１１】
前記医薬用組成物は免疫賦活剤として用いるための医薬用組成物である請求項１から７のいずれか一に記載の医薬用組成物。
【請求項１２】
下記の式（３）のＲ３、及びＲ４が下記の表で示す構造を有するスフィンゴ糖脂質誘導体を一度に１００μＭ以上投与する肝臓癌抗腫瘍剤。
【化５】
0005392451.tif 000016
【表１】
0005392451.tif 000017
【請求項１３】
下記の式（３）のＲ３、及びＲ４が下記の表で示す構造を有するスフィンゴ糖脂質誘導体を一度に５０μＭ以上投与する皮膚癌抗腫瘍剤。
【化６】
0005392451.tif 000018
【表２】
0005392451.tif 000019
【請求項１４】
下記の式（３）のＲ３、及びＲ４が下記の表で示す構造を有するスフィンゴ糖脂質誘導体を一度に７５μＭ以上投与する肺腺癌抗腫瘍剤。
【化７】
0005392451.tif 000020
【表３】
0005392451.tif 000021
【請求項１５】
下記の式（３）のＲ３、及びＲ４が下記の表で示す構造を有するスフィンゴ糖脂質誘導体を一度に５０μＭ以上投与する白血病抗腫瘍剤。
【化８】
0005392451.tif 000022
【表４】
0005392451.tif 000023
【請求項１６】
下記の式（３）のＲ３、及びＲ４が下記の表で示す構造を有するスフィンゴ糖脂質誘導体を一度に７５μＭ以上投与する大腸癌抗腫瘍剤。
【化９】
0005392451.tif 000024
【表５】
0005392451.tif 000025
【請求項１７】
前記免疫賦活剤はＮＫＴ細胞を活性化することによる請求項１１に記載の医薬用組成物。
【請求項１８】
請求項５から７のいずれか一の方法によりビール糟から抽出されるスフィンゴ糖脂質誘導体を含有するスフィンゴ糖脂質誘導体の混合物を主成分とし、ＮＫＴ細胞活性化状態での血中ＩＮＦ−γレベルをＮＫＴ細胞活性度が相対的に低い状態の血中ＩＮＦ−γレベルと同等に維持しながらＮＫＴ細胞を活性化するＮＫＴ細胞活性化剤。
【請求項１９】
請求項５から７のいずれか一の方法によりビール糟から抽出されるスフィンゴ糖脂質誘導体を含有するスフィンゴ糖脂質誘導体の混合物を主成分とし、ＮＫＴ細胞活性化状態での血中ＧＴＰをＮＫＴ細胞活性度が相対的に低い状態の血中ＧＴＰレベルと同等に維持しながらＮＫＴ細胞を活性化するＮＫＴ細胞活性化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフィンゴ糖脂質誘導体を有効成分として含む副作用の少ない医薬用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、我が国の死亡原因の第一位を占める生活習慣病の一つであり、平成１７年現在では約３人に１人が当該疾患によって命を失っている。がん治療法を確立し、がんを克服することは今や我が国の健康対策における最重要課題となっている。
【０００３】
がん治療法の一つである化学療法には抗腫瘍剤（抗がん剤、制がん剤）を体内に投与し、腫瘍細胞を破壊する方法がある。現在、多数の抗腫瘍剤が開発されており、臨床医薬として使用され一定の効果が見られている。
【０００４】
抗腫瘍剤の有効成分として、近年セラミド（Ｎ−アシルスフィンゴシン）やその関連物質が注目されている。「セラミド」は生体内に存在する脂質の一種で、スフィンゴシンと脂肪酸とが酸アミド結合をした構造を有する物質である。また、「セラミド関連物質」とは当該セラミドを基本骨格とするスフィンゴ脂質であって、セラミドに糖が結合したスフィンゴ糖脂質とリン酸と塩基が結合したスフィンゴリン脂質が知られている。最近の研究からセラミドやセラミド関連物質は、生体内に導入することで腫瘍細胞にアポトーシス（細胞死）を誘導させるセカンドメッセンジャーとして機能することが明らかになってきている。
【０００５】
そのような背景から現在までに様々なセラミド関連物質の同定が行われ、それらを医薬用組成物として用いる技術が多数報告されている。例えば、特許文献１は海面動物等から得られた新規スフィンゴ糖脂質を含有する抗腫瘍剤、若しくは免疫賦活剤の製造法とその使用の発明である。また、特許文献２は腫瘍細胞や病原体感染細胞の免疫原性を増強するα−グリコシルセラミド構造を有する化合物等の発明である。
【０００６】
このようにセラミド関連物質は抗腫瘍剤や免疫賦活剤としてその有効性が期待されているが、一方で既知のセラミド関連物質のほとんどが正常細胞に対しても毒性（細胞傷害活性）を示すという副作用の問題を有していた（非特許文献１）。このような副作用は現在使用されている他の多くの抗腫瘍剤にも共通する不可避的な問題である。したがって、標的である腫瘍細胞の増殖を的確に抑制しながらも正常細胞に対しては少しでも副作用の少ない抗腫瘍剤が望まれていた。
【０００７】
さらに、セラミドやセラミド関連物質を抗腫瘍剤として使用する場合には原料の安全性という別の問題もあった。セラミド関連物質は動植物の組織に広く存在するが、特に動物の脳や脊髄等の神経組織に比較的多く見られる。そのため従来のセラミド関連物質は牛等の家畜の脳から抽出されてきた。しかし、ＢＳＥ（牛海綿状脳症）のヒトへの感染が国際問題化したことに伴い、牛の脳から得たセラミド関連物質に対する安全性が問題となってきた。さらに、動物愛護の観点からも牛の脳等に代わる人体に安全なセラミド関連物質の新たな天然原料、若しくは代替品が求められていた。
【０００８】
上記原料に関する問題の解決策の一つとしてセラミド関連物質の化学合成がある。セラミド関連物質の多くはその分子構造が解明されており、それに基づいた合成方法も開発されている。したがって、近年では人工的に化学合成されたセラミド関連物質が天然物の代替品として使用され始めている。確かに化学合成されたセラミド関連物質であれば、ＢＳＥや動物愛護の問題は解決できる。しかし、そのような化学合成されたセラミド関連物質は、化学合成の際に使用された人体に有害な薬剤の残存、あるいは合成過程で発生する有害な副産物の混入等の新たな問題が発生し、人体に対する安全面で十分とは言い難かった。
【０００９】
そこで、現在では人体に対して安全性の高いセラミド関連物質の原料として植物が注目されている。植物由来のセラミド関連物質を利用した発明としては保湿剤や皮膚炎治療剤等の有効成分として利用したものが既に知られている。例えば、特許文献３は、こんにゃくトビ粉等の植物から有機溶剤によって抽出された植物由来のスフィンゴ糖脂質を有効成分としたアトピー性皮膚炎治療剤の発明である。このような食用植物を原料として得られたセラミド関連物質であれば、ＢＳＥや動物愛護の問題、さらには合成過程で発生する有害な副産物の混入等の問題は解決できる。しかし、一般に植物細胞はグリセロ糖脂質を多量に含有しており、スフィンゴ糖脂質をはじめとするセラミド関連物質の存在量は動物に比べると僅かしかない。したがって、十分量のセラミド関連物質を得るには大量の原料が必要となり、製造コストの面で割高になるという新たな問題を生じていた。
【特許文献１】特許第３０６８９１０号
【特許文献２】国際公開番号 Ｗ０９９／１５６２７
【特許文献３】特開２００３−２３１６４０
【特許文献４】特願２００５−２７２６３９
【特許文献５】特開平１１−１９３２３８
【特許文献６】特願２００４−１３５０５３
【非特許文献１】Ｏｓｍａｎ Ｔ，Ｋａｗａｍｕｒａ Ｔ，Ｎａｉｔｏ Ｔ，Ｔａｋｅｄａ Ｋ，Ｋａｅｒ， ＬＶ，Ｏｋｕｍｕｒａ Ｋ，Ａｂｏ Ｔ（２０００）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，３０，１９１９−１９２８．
【非特許文献２】Ｆｕｊｉｉ Ｈ，Ｓｅｋｉ Ｓ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｓ，Ｋｉｔａｄａ Ｔ，Ｋａｗａｋｉｔａ Ｎ，Ａｄａｃｈｉ Ｋ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ，４４６，６６３−６７３．
【非特許文献３】Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｅ，Ｍｏｔｏｋｉ Ｋ，Ｕｃｈｉｄａ Ｔ，Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ Ｈ，Ｋｏｅｚｕｋａ Ｙ（１９９５）Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｓ，７，５２９−５３４．
【非特許文献４】Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ Ｍ（２００５）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２６，８７７−９００．
【非特許文献５】Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ Ｍ，Ｈａｒａｄａ Ｍ,Ｋｏｊｏ Ｓ，Ｎａｋａｙａｍａ Ｔ，Ｗａｋａｏ Ｈ（２００３）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２１，４８３−５１３．
【非特許文献６】Ｏｓｍａｎ Ｙ，Ｋａｗａｍｕｒａ Ｔ，Ｎａｉｔｏ Ｔ，Ｔａｋｅｄａ Ｋ，Ｋａｅｒ ＬＶ， Ｏｋｕｍｕｒａ K，Ａｂｏ Ｔ（２００１）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，３１，１７２０−１７２７．
【非特許文献７】Ｗａｔａｎａｂｅ Ｈ，Ｍｉｙａｊｉ Ｃ，Ｓｅｋｉ Ｓ，Ａｂｏ T（１９９６）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１８４，６８７−６９３．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、人体に対して安全性が高く、かつ低コストの原料を用いて、副作用の少ないセラミド関連物質を有効成分として含有する抗腫瘍剤、又は免疫賦活剤としての医薬用組成物を開発し、提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
係る課題を解決するために本発明者らは、まず人体に対して安全性が高い原料として植物由来のセラミド関連物質を利用する事にした。当該原料コストに関する問題は、特許文献４を参考にしてビール粕からセラミド関連物質（スフィンゴ糖脂質誘導体）を得ることで解決した。
【００１２】
特許文献４は目的の植物性セラミド関連物質を効率よく、かつ低コストで抽出するためにビール粕を十分に乾燥させる方法を提供している。これにより、抽出用の極性溶媒をビール粕へ効率よく浸透させ、さらにビール粕の含有する水分が極性溶媒中へ混入することを抑えることができる。また、特許文献４は得られた抽出液を再度抽出用の極性溶媒として用いるサイクルを繰り返す方法を提供している。これにより、抽出に必要な極性溶媒量を従来の約１／１０にまで抑えることができる。ビール粕からセラミド関連物質を得る公知技術としては、他にも特許文献５や特許文献６が知られているが、製造コストを軽減する点においては特許文献４の方法を参考にすることが好ましいと考えられた。
【００１３】
本発明者らは上記ビール粕より得られたスフィンゴ糖脂質誘導体を用いて鋭意研究を重ねた結果、当該スフィンゴ糖脂質誘導体が特定の腫瘍細胞に対してのみ強い細胞傷害活性を示し、正常細胞に対してはほとんど不活性であるという事実を見出した。これまでに知られるセラミド関連物質はα−ガラクトシルセラミド（以下、αＧａｌＣｅｒとする。）のように全腫瘍細胞標的型で、かつ正常細胞に対しても強い細胞傷害活性を示すものがほとんどであった（非特許文献２）。本発明のような細胞選択的な細胞傷害活性を示すスフィンゴ糖脂質は、本発明者らが知る限りこれまでに報告はない。
【００１４】
さらに、本発明者らは上記ビール粕より得られたスフィンゴ糖脂質誘導体が高濃度投与下でも肝傷害の誘導を伴わずにＮａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｔ細胞（以下、ＮＫＴ細胞とする。）を活性化する免疫賦活作用を有する事実を見出した。これまでにもαＧａｌＣｅｒが同様の免疫賦活作用やアポトーシス誘導作用を有することは報告されていた（非特許文献３）が、αＧａｌＣｅｒの投与では、その強い細胞傷害活性から肝傷害等の副作用が大きな問題となっていた。したがって、本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体は当該副作用が少ない免疫賦活剤として、より有効であると考えられる。
【００１５】
本発明は係る発見に基づいて完成されるに至ったものであり、以下（Ａ）から（Ｋ）を提供するものである。
【００１６】
（Ａ）本発明は、下記の式（３）で示されるスフィンゴ糖脂質誘導体の一以上を含有するスフィンゴ糖脂質誘導体の混合物を提供する。
【化１】
0005392451.tif 000002
ここで、Ｒ３はＨ又はＯＨを表し、Ｒ４は下記（ａ）又は（ｂ）で定義される。
（ａ）Ｒ３がＨの場合、Ｒ４は（ＣＨ２）１３ＣＨ３、又は（ＣＨ２）６ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）４ＣＨ３である。
（ｂ）Ｒ３がＯＨの場合、Ｒ４は（ＣＨ２）ＹＣＨ３（ここで、Ｙは１３〜２１の整数である。）、又は（ＣＨ２）Ｚ１ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）Ｚ２ＣＨ３（ここで、Ｚ１、及びＺ２は０又は自然数であって、Ｚ１＋Ｚ２＝１９である。）である。
【００１７】
（Ｂ）本発明は、前記（ｂ）が以下で定義される医薬用組成物を提供する。
（ｂ）Ｒ３がＯＨの場合、Ｒ４は（ＣＨ２）ＹＣＨ３（ここで、Ｙは１３〜２１の整数である。）、又は（ＣＨ２）１２ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３である。
【００１８】
（Ｃ）本発明は、前記（ａ）及び（ｂ）で定義されることを特徴とする炭素数の異なる数種のスフィンゴ糖脂質誘導体混合物を有効成分として含有することを特徴とする医薬用組成物を提供する。
【００１９】
（Ｄ）本発明は、前記スフィンゴ糖脂質誘導体が天然のスフィンゴ糖脂質誘導体であることを特徴とする医薬用組成物を提供する。
【００２０】
（Ｅ）本発明は、前記スフィンゴ糖脂質誘導体がビール等の製造工程で得られるビール粕より抽出されるスフィンゴ糖脂質誘導体であることを特徴とする医薬用組成物を提供する。
【００２１】
（Ｆ）本発明は、前記スフィンゴ糖脂質誘導体は、麦芽を熱風で乾燥させて乾燥麦芽を得る乾燥麦芽製造工程と、前記乾燥麦芽を粉砕し副原料を混入させ酵素によりデンプン糖化処理を行う糖化工程と、前記糖化工程で得られた糖化液をろ過するろ過工程と、前記ろ過工程で得られたろ液を乾燥させて得られたビール糟を極性溶媒に浸漬する浸漬工程と、前記浸漬工程の極性溶媒からビール糟を除去して抽出液を得る抽出工程と、前記抽出工程で得られた抽出液を濃縮する濃縮工程と、前記濃縮工程で得られた脂質成分粗精製物をアルカリ溶液によって加水分解する加水分解工程と、前記加水分解後、疎水性溶媒と親水性溶媒の混合物を加えて層分離させて分解産物を除去する分解産物除去工程と、から抽出されるスフィンゴ糖脂質誘導体であることを特徴とする医薬用組成物を提供する。
【００２２】
（Ｇ）本発明は、前記抽出工程で得られる抽出液を、前記浸漬工程で用いる極性溶媒として再度用いることを所定回数繰り返すサイクル工程をさらに有することを特徴とする医薬組成物を提供する。
【００２３】
（Ｈ）本発明は、前記医薬用組成物が抗腫瘍剤として用いるための医薬用組成物であることを特徴とする医薬用組成物を提供する。
【００２４】
（Ｉ）本発明は、下記の式（１）で示されるスフィンゴ糖脂質誘導体の一以上を含有するスフィンゴ糖脂質誘導体の混合物を有効成分として、白血病細胞に対して細胞傷害性を有する医薬用組成物を提供する。
【化２】
0005392451.tif 000003
（１）
ここで、Ｒ１はモノカルボン酸がカルボキシル基で酸アミド結合した残基を表し、またＲ２は（ＣＨ２）Ｘ１ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）Ｘ２ＣＨ３（ここで、Ｘ１、及びＸ２は０又は自然数であって、Ｘ１＋Ｘ２＝１０である。）である。
【００２５】
（Ｊ）本発明は、下記の式（２）で示されるスフィンゴ糖脂質誘導体の一以上を含有するスフィンゴ糖脂質誘導体の混合物を有効成分として、白血病細胞に対して細胞傷害性を有する医薬用組成物を提供する。
【化３】
0005392451.tif 000004
ここで、Ｒ１はモノカルボン酸がカルボキシル基で酸アミド結合した残基を表す。
【００２６】
（Ｋ）本発明は、前式（３）で示されるスフィンゴ糖脂質誘導体の一以上を含有するスフィンゴ糖脂質誘導体の混合物を有効成分として、白血病細胞に対して細胞傷害性を有する医薬用組成物を提供する。
【００２７】
（Ｌ）本発明は、前記医薬用組成物が免疫賦活剤として用いるための医薬用組成物であることを特徴とする医薬用組成物を提供する。
【００２８】
（Ｍ）本発明は、下記の表２で示されるスフィンゴ糖脂質誘導体を一度に１００μＭ以上投与する肝臓癌抗腫瘍剤を提供する。
【表１】
0005392451.tif 000005
【００２９】
（Ｎ）本発明は、前記表１で示されるスフィンゴ糖脂質誘導体を一度に５０μＭ以上投与することを特徴とする皮膚癌抗腫瘍剤を提供する。
【００３０】
（Ｏ）本発明は、前記表１で示されるスフィンゴ糖脂質誘導体を一度に７５μＭ以上投与することを特徴とする肺腺癌抗腫瘍剤を提供する。
【００３１】
（Ｐ）本発明は、前記表１で示されるスフィンゴ糖脂質誘導体を一度に５０μＭ以上投与することを特徴とする白血病抗腫瘍剤を提供する。
【００３２】
（Ｑ）本発明は、前記表１で示されるスフィンゴ糖脂質誘導体を一度に７５μＭ以上投与することを特徴とする大腸癌抗腫瘍剤を提供する。
【００３３】
（Ｒ）本発明は、前記免疫賦活剤はＮＫＴ細胞を活性化することによることを特徴とする医薬用組成物を提供する。
【００３４】
（Ｓ）本発明は、ビール糟から抽出されるスフィンゴ糖脂質誘導体を含有するスフィンゴ糖脂質誘導体の混合物を主成分とし、ＮＫＴ細胞活性化状態での血中ＩＮＦ−γレベルをＮＫＴ細胞活性度が相対的に低い状態の血中ＩＮＦ−γレベルと同等に維持しながらＮＫＴ細胞を活性化することを特徴とするＮＫＴ細胞活性化剤を提供する。
【００３５】
（Ｔ）本発明は、ビール糟から抽出されるスフィンゴ糖脂質誘導体を含有するスフィンゴ糖脂質誘導体の混合物を主成分とし、ＮＫＴ細胞活性化状態での血中ＧＴＰをＮＫＴ細胞活性度が相対的に低い状態の血中ＧＴＰレベルと同等に維持しながらＮＫＴ細胞を活性化することを特徴とするＮＫＴ細胞活性化剤を提供する。
【発明の効果】
【００３６】
本発明の化合物によれば、特定の腫瘍細胞のみを標的とした強い細胞傷害活性を有し、かつ正常細胞に対する毒性は極めて弱い、すなわち副作用の少ない抗腫瘍剤としての医薬用組成物質を提供できる。
【００３７】
また、本発明の化合物によれば、肝傷害等の細胞誘導を伴わない副作用の少ない免疫賦活剤としての医薬用組成物質を提供できる。
【００３８】
さらに、本発明の化合物によれば低コストで、かつ人体に対して安全性が高い原料から製造される医薬用組成物質を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
以下に、各発明を実施するための最良の形態を説明する。なお、本発明はこれらの実施の形態に何ら限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において、種々なる様態で実施しうる。
【００４０】
本発明の「スフィンゴ糖脂質誘導体」とは、スフィンゴ糖脂質であるグリコシルセラミドを基本構造とする化合物であって、脂肪酸炭素数、二重結合の位置、水酸基等の付加等のような当該スフィンゴ糖脂質の分子内の一部構造が変化した一群の物質を言う。すなわち、前記式（１）、式（２）、又は式（３）のいずれかで表される化合物である。
【００４１】
ここで、式（１）のＲ１はモノカルボン酸がカルボキシル基で酸アミド結合した残基であって、当該モノカルボン酸残基の炭素鎖数は２〜３０の整数のいずれかである。好ましくは炭素鎖数が１６〜２４の整数のいずれかである。また、Ｒ１の炭素鎖数が４〜３０の整数の範囲内にある場合には、当該炭素鎖中に二重結合を一つ有していても良い。当該二重結合を有する場合、その位置は前記炭素鎖の範囲内にあれば特に限定しない。また、Ｒ２は炭素鎖数が１３であって、当該炭素鎖中に二重結合を一つ有する。当該二重結合の位置は、（ＣＨ２）Ｘ１ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）Ｘ２ＣＨ３（ここで、Ｘ１、及びＸ２は０又は自然数であって、Ｘ１＋Ｘ２＝１０である。）で表される範囲内にあれば、いずれであってもよい。好ましくは、式（２）、式（３）で示す位置、即ち（ＣＨ２）５ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）５ＣＨ３で表される位置である。
【００４２】
さらに、式（３）のＲ３は水素Ｈ若しくはヒドロキシル基ＯＨを表し、それぞれの場合に応じてＲ４の構造が異なる。すなわち、Ｒ３が水素の場合にはパルミチン酸、又はリノール酸のカルボキシル基が酸アミド結合した残基となり、下記の式（４）、又は式（５）で表される。
【化４】
0005392451.tif 000006
【化５】
0005392451.tif 000007
【００４３】
Ｒ３がヒドロキシル基の場合、モノカルボン酸残基は炭素鎖数１７〜２４のいずれかの飽和脂肪酸の残基であるか、又は炭素鎖数２４で二重結合をその炭素鎖中に一つ有する不飽和脂肪酸の残基である。
【００４４】
すなわち、前者の場合は下記の式（６）で表される。
0005392451.tif 000008
ここで、ｎは１５〜２２の整数である。
【００４５】
また後者の場合は下記の式（７）で表される。
0005392451.tif 000009
ここでｎ１、及びｎ２は０又は自然数であって、ｎ１＋ｎ２＝２０である。式（７）における二重結合の位置の中で、より好ましくは下記の式（８）で表されるＣ１５−にシス配置で二重結合を有する構造である。
0005392451.tif 000010
（８）
【００４６】
本発明の「医薬用組成物」とは、抗腫瘍剤、免疫賦活剤、アポトーシス誘導剤等、広く医薬品、若しくはその原料として使用されるものを言う。特に、本発明においては後述する抗腫瘍活性と免疫賦活作用という二つの効果を有することから抗腫瘍剤、及び免疫賦活剤としての医薬用組成物であることが好ましい。
【００４７】
<スフィンゴ糖脂質誘導体の抽出>
【００４８】
本発明の前記式（１）、式（２）、又は式（３）で示されるスフィンゴ糖脂質誘導体は、化学合成によって製造されたものであってもよい。しかし、本発明の趣旨の一つが人体に安全な原料より製造するということを考慮すると、現時点での化学合成による製造は安全面で十分とは言い難い。したがって、好ましくは天然の原料から抽出されるスフィンゴ糖脂質誘導体、さらに好ましくは植物組織から抽出されるスフィンゴ糖脂質誘導体である。植物組織の中でもビール等の製造工程で得られるビール粕から抽出されるものは特に好ましい。これは、後述の実施例１で示すようにビール粕には本発明のスフィンゴ糖脂質が多量に含まれているからである。
【００４９】
「ビール等」とは、ビール、若しくはビール類似酒を意味する。ここで「ビール類似酒」とは、ビールに類似した外見や風味を有するアルコール飲料を言う。例えば、発泡酒が該当する。
【００５０】
図１を用いて「ビール等の製造工程」について例を挙げて説明する。この図で示すように、一般的なビール製造工程における最初の工程は、麦芽製造工程（０１０１）である。当該工程では大麦を発芽させた後に熱風等で乾燥させて成長を止め、乾燥麦芽を得る。次は仕込み工程（０１０２）である。当該工程では前記乾燥麦芽を粉砕し、温水と副原料であるコーンスターチ等を加えて麦芽酵素の働きによってデンプンの糖化処理を行う。当該処理後、麦汁を濾過する。この濾過で残った残渣がビール粕（０１０７）である。続いて煮沸工程（０１０３）を行う。当該工程では前記麦汁を煮沸して苦味成分であるホップを加える。煮沸によって生じるタンパク質やホップ粕（０１０８）を澱（オリ）として沈殿させて除去する。次は発酵工程（０１０４）である。当該工程では、前記煮沸後の麦汁を冷却し、酵母を加えて１週間から２週間程度（発酵温度により異なる）発酵させる。続いて熟成工程（０１０５）に入る。当該工程では、発酵工程後の麦汁を０℃近くまで冷却して発酵を抑える。ここで、炭酸ガスが蓄積されるとともに、味がまろやかになる。最後が濾過工程（０１０６）である。当該工程では、前記熟成工程後の液から酵母（０１０９）を濾過して生ビールを得る。濾過後、加熱殺菌したビールが通常のビールである。以上の工程を経て一般的なビールは製造されている。なお、ビール類似酒は酒税法で定めるビールとは原材料面で相違が見られるが、製造工程の基本は上記ビールの製造工程とほぼ同様である。
【００５１】
「ビール粕」（０１０７）とは、前記ビール等の製造工程において仕込み工程後に得られる残渣を言う。したがって、通常は麦芽の他、副原料として用いられる米、コーンスターチ、ジャガイモ等のでんぷん、若しくは糖を含有する穀物、又は芋類等の搾り粕から構成されている。もちろん、麦芽１００％から成る残渣であっても構わない。また、煮沸工程（０１０３）後に得られるタンパク質やホップ粕（０１０８）や濾過工程（０１０６）後に得られる酵母（０１０９）等を当該ビール粕の一部として加えてもよい。ホップ粕や酵母等にはビール粕内で回収しきれず搾汁液や発酵工程へ移行したスフィンゴ糖脂質誘導体が混在している可能性があるからである。
【００５２】
動物組織や植物組織等の天然の原料からスフィンゴ糖脂質誘導体を抽出する方法は、公知のいずれの技術を用いてもよい。特に、ビール粕からスフィンゴ糖脂質誘導体を抽出する方法は、特許文献４、又は６の技術に準じて行うと便利である。
【００５３】
図２に天然の原料からスフィンゴ糖脂質誘導体を抽出する最も一般的な方法について図示して説明する。
【００５４】
まず、原料を極性溶媒に浸漬して脂質成分を抽出（Ｓ０２０１ 抽出工程）し、抽出液を濃縮する（Ｓ０２０２ 濃縮工程）。これらの操作によって、原料中に含有する脂質成分の粗精製物が得られる。
【００５５】
ここで「極性溶媒」とは、電荷の偏りを持つ極性分子からなる溶媒を言う。例えば、低級アルコール、ベンゼン、若しくはトルエン等の極性有機溶媒、水、又はそれらの組み合わせによる混合液が該当する。極性溶媒の種類や組み合わせは特に限定しないが、本発明において得られるスフィンゴ糖脂質誘導体をヒトや他の動物に使用する場合には、毒性が非常に低いエタノール、若しくはエタノールと水の混合液であることが好ましい。また、抽出効率を考慮した場合、エタノールのみの使用がより好ましい。
【００５６】
次に、前記方法で得られた脂質成分からなる脂質成分粗精製物にアルカリ溶液を加え、当該脂質成分の粗精製物中に含まれるグリセロ糖脂質をアルカリ溶液によって加水分解する（Ｓ０２０３ 加水分解工程）。その後、分解産物を除去（Ｓ０２０４ 分解産物除去工程）する。これらの操作によってスフィンゴ糖脂質誘導体の粗精製物が得られる。
【００５７】
「アルカリ溶液」は、アルカリ性物質を極性溶媒で溶解した溶液である。本発明におけるアルカリ溶液は、例えば水酸化ナトリウム溶液又は水酸化カリウム溶液等を用いることができる。また極性溶媒としては、例えば、水、若しくはメタノールやエタノール等の低級アルコールを用いることができる。アルカリ溶液のアルカリ濃度、及び添加する容量は溶液中のアルカリの量が前記脂質成分の粗精製物中に含まれるグリセロ糖脂質を加水分解できるケン化価を有していればよい。
【００５８】
加水分解反応を促進するために、脂質成分の粗精製物とアルカリ溶液の混合液を加熱してもよい。加熱温度は３０℃から５０℃の範囲が好ましい。加水分解反応の時間は温度に依存する。すなわち、低温ほど長くする。例えば、３７℃であれば２時間、５０℃であれば１時間のように適宜調整すればよい。
【００５９】
加水分解処理後、クロロホルム等の疎水性溶媒と水若しくはメタノール等の親水性溶媒からなる混合液を加えて混合した後、静置するなどして２層に分離する。疎水性溶媒としてクロロホルムを用いた場合には目的のスフィンゴ糖脂質を含有する下層のクロロホルム層を回収することにより、水（親水性溶媒）層に移行したグリセロ糖脂質の分解産物である脂肪酸とグリセリンは除去される。クロロホルム層の溶液からクロロホルムを風乾等により除去することでスフィンゴ糖脂質誘導体の粗精製物を得ることができる。
【００６０】
必要に応じて前記スフィンゴ糖脂質誘導体の粗精製物をさらに精製してもよい。その場合は、得られたスフィンゴ糖脂質誘導体の粗精製物を分画することで達成できる（Ｓ０２０５ 分画工程）。
【００６１】
分画方法は公知技術に準ずればよい。例えば、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の方法で分画し、溶出する方法がある。クロマトグラフィーの具体例としては、カラムクロマトグラフィー等が該当する。当該カラムクロマトグラフィーは、スフィンゴ糖脂質誘導体の粗精製物をシリカゲル等の固定相に流載後、クロロホルム等の疎水性溶媒とメタノール等の親水性溶媒、及びそれらの複数種の溶媒を適当な容量比で混合した溶出液によって溶出する。
【００６２】
溶出の際には、溶出液の組成、溶出時間等を適宜調整する。スフィンゴ糖脂質誘導体の溶媒に対する溶解度差やイオン結合力の差異によって、さらには必要に応じて同様の操作を数回繰り返すことによって目的とするスフィンゴ糖脂質誘導体を分離精製することができる。なお、本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体の調製方法については実施例１で詳述する。
【００６３】
この他に、特許文献４に記載された「浸漬工程」に先立ちビール粕に含まれる水分を除去する「乾燥工程」や、「浸漬工程」後にビール粕を除去して得られる抽出液を浸漬工程の極性溶媒として再度用いることを所定回数繰り返す「サイクル工程」を有していてもよい。これらの工程を有することで、原料コストの軽減を図れ、本発明の目的に資する。乾燥方法やサイクル方法については特許文献４に記載された技術に準ずればよい。
【００６４】
上述の方法により得られたスフィンゴ糖脂質誘導体は、必ずしも単一物質にまで精製する必要はない。例えば、ビール粕を原料とする場合であれば極性溶媒抽出後にアルカリ分解処理を行っただけのスフィンゴ糖脂質誘導体の粗精製物として用いてもよい。また、当該粗精製物をさらに精製した場合であっても、通常炭素数の異なる数種の誘導体が混合した混合物として得られる場合が多い。このような炭素数の異なる誘導体をそれぞれ分離精製する必要もない。なぜなら、当該混合物には本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体が含有されおり、実際に実施例２から６に示すように、本発明の効果を十分に果たし得ているからである。
【００６５】
<スフィンゴ糖脂質誘導体の抗腫瘍活性>
【００６６】
本発明の式（１）から（３）で示されるスフィンゴ糖脂質誘導体は、実施例２で示すようにαＧａｌＣｅｒ等と同様に腫瘍細胞由来の培養細胞に対して強い細胞傷害活性を有する。ここで興味深いのは、当該スフィンゴ糖脂質誘導体は所定の投与量範囲内においては特定の腫瘍細胞に対してのみ細胞傷害活性を示し、他の腫瘍細胞に対してはほとんど活性を示さないという選択的な細胞傷害活性を有している点である。さらに、重要な点は所定の投与量範囲内では正常細胞に対してほとんど細胞傷害活性を示さないことである。これは当該スフィンゴ糖脂質誘導体の副作用が少ないことを示している。このように特定の腫瘍細胞に対してのみ選択的に細胞傷害活性を示すスフィンゴ糖脂質誘導体は、本発明者の調べた限りでは報告がない。したがって、当該スフィンゴ糖脂質誘導体は正常細胞に対する副作用が少なく、かつ標的である特定の腫瘍のみを攻撃する上で医薬用組成物、特には抗腫瘍剤として有用である。
【００６７】
ここで「特定の腫瘍細胞」とは、例えば、大腸癌細胞、肝臓癌細胞、皮膚癌細胞、肺腺癌細胞、白血病細胞等が該当する。これに対して、スフィンゴ糖脂質誘導体が細胞傷害活性を示さない、すなわち抗腫瘍活性を示さない腫瘍細胞としては、例えばリンパ腫細胞、胃癌細胞、膵臓癌細胞、肺扁平上皮癌が挙げられる。また、前記「所定の投与量」は標的とする腫瘍細胞の種類や後述する患者等の状況によって勘案される。なお、本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体の抗腫瘍活性等については、実施例２で詳述する。
【００６８】
<スフィンゴ糖脂質誘導体の免疫賦活作用>
【００６９】
αＧａｌＣｅｒ等のスフィンゴ糖脂質は、ＮＫＴ細胞をアポトーシス誘導に伴って活性化することが知られている（非特許文献４〜６）。本発明の式（１）から（３）で示されるスフィンゴ糖脂質誘導体も、実施例３、及び６で示すようにαＧａｌＣｅｒと同様にアポトーシス誘導に伴いＮＫＴ細胞を活性化する免疫賦活作用を有する。しかし、当該スフィンゴ糖脂質誘導体の免疫賦活作用がαＧａｌＣｅｒのそれと異なる点として、実施例３で示すように免疫賦活作用を有しながら、実施例５で示すように血中のＩＮＦ−γレベルの上昇がほとんど認められないこと、さらに実施例４で示すような高濃度の投与であっても肝傷害等の副作用をほとんど示さないこと等が挙げられる。つまり、本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体は、従来から知られるαＧａｌＣｅｒ等と同属のスフィンゴ糖脂質ではあるが、生体への作用機序や効果は異なると考えられる。以上のように本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体は肝細胞への副作用が少なく、かつＮＫＴ細胞等を活性化することから医薬用組成物、特には免疫賦活剤として有用であると言える。
【００７０】
<医薬用組成物としての使用法>
【００７１】
本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体を有効成分とする医薬用組成物は、当該スフィンゴ糖脂質誘導体をそのまま、又は適当な担体と共に製剤化した医薬製剤とすることでヒト、又は動物に投与することができる。
【００７２】
投与方法は、合目的的な投与経路であれば特に制限はしない。例えば、ヒトの場合であれば注射等による局所投与、静脈または動脈への血管内投与、腹腔内投与、胸腔内投与、筋肉内投与、直腸投与、皮下投与、経皮吸収、経口投与、又は舌下投与等の方法によって投与することができる。また、動物の場合であれば注射等による局所投与、静脈または動脈への血管内投与、腹腔内投与、皮下投下等の方法によって投与することができる。
【００７３】
医薬製剤の剤型は、投与方法や投与目的等に応じて適宜選択すればよい。例えば、経口剤であれば錠剤、カプセル剤、細粒剤、散剤、口中剤、ドライシロップ等が、また非経口剤であれば注射剤、懸濁剤、乳化剤、軟膏剤、座剤、貼布剤等が挙げられる。医薬製剤への製剤化に用いる担体は、製薬上許容される添加剤を投与方法や投与目的等に応じて適宜選択すればよい。添加剤としては、例えば、溶剤や可溶化剤等の希釈剤、ｐＨ調整剤、粘稠化剤、等張化剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、安定剤、保存剤、抗酸化剤、界面活性剤等が該当する。
【００７４】
本発明の有効成分であるスフィンゴ糖脂質誘導体の投与量は、動物実験の結果及び個々の状況を勘案し、連続的又は間欠的に投与した際に一定量を超えないように定めればよい。具体的な投与量は投与方法、患者等の状況等によって異なる。ここで「状況」とは、例えば、年令、性別、体重、食餌、投与時間、併用する薬剤、薬剤感受性、疾患の程度等が該当する。適量と投与量と投与回数は、前記指針に基づいて専門家の適量決定試験によって決定されなければならない。
【００７５】
以下の実施例をもって本発明をより具体的に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００７６】
<本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体の調製方法>
【００７７】
前記ビール粕由来の「スフィンゴ糖脂質誘導体の抽出」に関する実施例を以下で説明する。
【００７８】
ビール粕を原料として、本発明の化合物であるスフィンゴ糖脂質誘導体を調製した。まず、ビール粕からセラミド関連物質であるスフィンゴ糖脂質誘導体を粗精製する方法は、特許文献４に記載された濃縮工程を含む実施例１の方法に従った。前記方法で得られた粗スフィンゴ糖脂質誘導体残渣２ｇを４ｍｌのクロロホルムで溶解した。次に、メタノールを溶媒とする０．６Ｎ水酸化ナトリウム溶液を４ｍｌ加えて混合後、５０℃で３０分保温した。当該操作によって前記粗スフィンゴ糖脂質誘導体中に混在するグリセロ糖脂質はアルカリ加水分解される。続いて、１Ｎ塩酸２．６ｍｌと水１ｍｌを加えて溶液を中和させた後、室温に３時間放置することで層分離を行った。分離層のうちアルカリ分解したグリセロ糖脂質が含まれるメタノール層を除去し、スフィンゴ糖脂質誘導体が含まれるクロロホルム層を得た。
【００７９】
次に、前記工程で得たクロロホルム層の溶液をオープンシリカゲルカラム（メルク社 １．５ｃｍ×３０ｃｍＩＤ）に流載した後、クロロホルム：メタノール：水（容量比６５：１５：２）の混合液で３時間溶出し、溶出時間６０分後の主として脂肪酸、脂肪アルコール、ステロールからなる非極性脂質画分、及び溶出時間１１０分後のステロールエーテル画分を分離・除去し、溶出時間１２０分後のスフィンゴ糖脂質誘導体の画分を得た。この工程でスフィンゴ糖脂質誘導体の粗精製がなされている。
【００８０】
続いて、前記工程で得られたスフィンゴ糖脂質誘導体画分を、高速液体クロマトグラフィーシリカ充填カラム（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ社 Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ６０−３， ８ｍｍ×２５０ｎｍＩＤ）に流載した。カラムからの溶出はクロロホルム：メタノール（容量比８７：３）の混合液を４０℃の下で流速率２．５ｍｌ／分で流して行い、２０分の溶出時間で精製されたスフィンゴ糖脂質誘導体を得た。なお、以上の実験において特に指定していない手順に関しては、全て室温（約２８℃）で行っている。
【００８１】
<精製スフィンゴ糖脂質誘導体分析方法>
前記最終精製物として得られたスフィンゴ糖脂質誘導体のスペクトルデータを以下に示す。
【００８２】
（１Ｈ）
ＮＭＲ：５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、２３．９℃
δ（ｐｐｍ） ５．３５（ｍ）、５．３５（ｍ）、５．３５（ｍ）、５．３５（ｍ）、４．２７（ｄ、Ｊ＝７．９）、４．２４（ｄ、Ｊ＝７．４）、４．０８（ｍ）、４．０２、３．９６（ｍ）、３．８０（ｄｄ、Ｊ＝１０．５、３．８）、３．７９（ｄｄ、Ｊ＝３．８、１０．０）、３．６６（ｍ）、３．３５（ｍ）、３．３０（ｍ）、３．２９（ｍ）、３．２８（ｍ）、２．０６−２．００、１．２８−１．４０１．２８（ｍ）、１．２８（ｍ）、１．２８（ｍ）、１．２８（ｍ）、１．２８（ｍ）、１．２８（ｍ）、１．２４−１．２４、１．２４−１．２４、０．８９（ｔ）、０．８９（ｔ）。
【００８３】
（１３Ｃ）
ＮＭＲ：５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、２３．９℃
δ（ｐｐｍ） １７７．１、１３０．８ ｏｒ １３０．７、１３０．８ ｏｒ １３０．７、１３０．１ ｏｒ １３０．８、１３０．１ ｏｒ １３０．８、１０４．７、７７．９、７７．９、７５．５、７２．９、７１．６、７１．６、６９．１、６２．６、５４．６、３５．９、３３．７、３２．９、３１．０−３０．３、３１．０−３０．３、３１．０−３０．１、２６．１、２３．８、２３．８、１４．５。
【００８４】
当該スペクトルデータの結果、最終精製物として得られたスフィンゴ糖脂質誘導体は、式（３）のＲ３、及びＲ４が表１で示す構造を有するスフィンゴ糖脂質誘導体であることが明らかとなった。
【表１】
0005392451.tif 000011
【実施例２】
【００８５】
<本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体の細胞選択的抗腫瘍活性>
【００８６】
（目的）
本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体が各種培養細胞に及ぼす細胞傷害活性について検証する。
【００８７】
（実験方法）
実験方法について以下で説明する。なお、本実施例では細胞培養に用いる器具や試薬、水等は特に断りのない限りは原則として全て滅菌処理済みのものを使用し、操作はクリーンベンチ、又は無菌室にて行うことを前提とする。
【００８８】
培養細胞株の種類：
本実施例においては、以下のヒト腫瘍細胞由来の培養細胞株、及び入手可能な範囲の各腫瘍細胞と同組織由来の正常培養細胞株を用いた。
Ｈｅｐ−Ｇ２（肝臓癌細胞）、ＣＳ−ＨＣ（正常肝細胞）、Ａ４３１（扁平上皮癌細胞）、ＴＩＧ（正常皮膚細胞）、Ａ５４９（肺腺癌細胞）、ＷＩ３８（正常肺細胞）、ＷＩ３８ ＶＢＡ ｓｕｂ２ＲＡ（正常肺細胞）、ＯＵＭＳ３６（正常繊維芽細胞）、ＭＯＬＴ−４（Ｔ細胞性白血病細胞）、ＣＯＬＯ２０１（大腸癌細胞）、Ｒａｊｉ（リンパ腫細胞）、ＭＩＡ Ｐａｃａ（膵臓癌細胞）、ＶＭＲＣ−ＬＣＰ（肺扁平上皮癌細胞）、ＫＡＴＯ−３（胃癌細胞）。
【００８９】
培養試薬：
上記各細胞を培養するために、以下の培地を用いた。
・Ｈｅｐ−Ｇ２、Ａ４３１、Ａ５４９、ＯＵＭＳ３６用：ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ：ナカライテスク社）／１０％ 牛胎児血清（ＦＣＳ：Ｆｅｔａｌ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ：Ｓｉｇｍａ社）
・ＭＯＬＴ−４、ＣＯＬＯ２０１、Ｒａｊｉ、ＭＩＡ Ｐａｃａ用：ＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ社）／１０％ 牛胎児血清（ＦＢＳ：Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ：Ｓｉｇｍａ社）
・ＴＩＧ、ＷＩ３８、ＶＭＲＣ−ＬＣＰ用：イーグル最少必須培地（Ｅ−ＭＥＭ：Ｇｉｂｃｏ社）／１０％ ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ社）
・ＫＡＴＯIII用：ＭｃＣｏｙ'ｓ ５ａ（Ｓｉｇｍａ社）／１０％ ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ社）
・ＷＩ３８ ＶＢＡ ｓｕｂ２ＲＡ用：Ｅ−ＭＥＭ＋ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸：Ｇｉｂｃｏ社）＋ピルビン酸（Ｇｉｂｃｏ社）／１０％ ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ社）
・ＣＳ−ＨＣ用：ＣＳ−Ｃ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉｕｍ（大日本製薬）／１０％ ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ社）
【００９０】
培養方法とスフィンゴ糖脂質誘導体の添加：
培養細胞の培養条件、及びスフィンゴ糖脂質誘導体の添加条件について説明する。９６ウェルプレートを用いて、株化された上記の各培養細胞３．０×１０５ ｃｅｌｌｓをそれぞれの株に適した培地１００μｌ／ウェル×５ウェルに播いた。当該プレートを３７℃、５％ＣＯ２濃度下で２４時間培養した後、実施例１で精製した表１で表されるスフィンゴ糖脂質誘導体の混合物を異なる濃度でそれぞれのウェルに添加した。添加したスフィンゴ糖脂質誘導体の濃度は、無添加、５０μＭ、１００μＭ、１５０μＭ、２００μＭの５点、又は２５μＭ、５０μＭ、７５μＭ、１００μＭの５点のいずれかである。濃度調製は０．８％Ｔｗｅｅｎ８０を含むリン酸緩衝液によって行った。いずれのサンプルも添加前に０．２２μｍフィルターで濾過滅菌されたものを使用した。添加後、再び３７℃、５％ＣＯ２濃度下で２４時間インキュベートした。なお、前記培養の間にウェル内の培地の交換は行っていない。
【００９１】
生細胞数の測定（ＭＴＳアッセイ）：
前記インキュベート後、各ウェルにアポトーシス検出試薬であるＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（Ｒ） ＡＱｕｅｏｕｓ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（プロメガ社）を添付のプロトコルに従って添加し、３７℃、５％ＣＯ２濃度下で１時間から４時間インキュベートした。生細胞は当該キット試薬中のテトラゾリウム塩ＭＴＳを還元し、４９０ｎｍで検出できる発色性のフォルマザン産物を生じさせる。したがって、インキュベート後に４９０ｎｍにおける吸光度を測定することで本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体によりアポトーシスが誘導された細胞の率を知ることができる。測定には予め無処理のコントロールを平行して培養しておき、スフィンゴ糖脂質誘導体で処理されたウェルから得られる吸光度値とコントロールの値と比較することで各ウェルの細胞の細胞生存率（％）を得ることができる。無処理のコントロールは前記スフィンゴ糖脂質誘導体無添加のサンプルでもよいし、それとは別に用意しておいたものでもよい。数点のスフィンゴ糖脂質誘導体濃度で行う事で添加した濃度に対する生存曲線の変化を見た。なお、本実施例では一の培養細胞に関して細胞生存率を同一濃度で５回以上とり、それらの平均値をその濃度における細胞生存率とした。
【００９２】
（結果）
図３〜１２に前記実験における各培養細胞の細胞生存率の測定結果とそれに基づいた生存曲線を示す。いずれの図のグラフも横軸に添加したスフィンゴ糖脂質誘導体の濃度（μＭ）、縦軸に細胞生存率（％）を示している。各図で示す細胞は以下の通りである。
図３：Ｈｅｐ−Ｇ２（０３０１）、ＣＳ−ＨＣ（０３０２）
図４：Ａ４３１（０４０１）、ＴＩＧ（０４０２）
図５：Ａ５４９（０５０１）、ＷＩ３８（０５０２）、ＷＩ３８ ＶＢＡ ｓｕｂＲ Ａ２（０５０３）
図６：ＭＯＬＴ−４
図７：ＣＯＬＯ２０１
図８：ＯＵＭＳ−３６
図９：Ｒａｊｉ
図１０：ＭＩＡ Ｐａｃａ
図１１：ＶＭＲＣ−ＬＣＰ
図１２：ＫＡＴＯ−３
【００９３】
生存曲線の結果から、本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体は肝臓癌細胞Ｈｅｐ−Ｇ２（図３：０３０１）、皮膚癌細胞Ａ４３１（図４：０４０１）、肺腺癌細胞Ａ５４９（図５：０５０１）、白血病細胞ＭＯＬＴ−４（図６）、大腸癌細胞ＣＯＬＯ２０１（図７）に対しては１００μＭ、若しくは２００μＭの濃度下で顕著な細胞細胞傷害活性を示すことが明らかとなった。ところが、同組織の正常細胞に対しては同一条件下でほとんど不活性であった。具体的に説明すると、例えば、図３のＣＳ−ＨＣ（０３０２）は当該スフィンゴ糖脂質誘導体の２００μＭまでの投与では細胞生存率の変化はほとんどない。一方、Ｈｅｐ−Ｇ２（０３０１）は１００μＭ以上の投与で急速に細胞生存率が減少し、２００μＭでは３０％弱にまで下がる。また、図４では１００μＭ以上の投与では正常皮膚細胞のＴＩＧ（０４０２）にも細胞傷害活性が見られるが、１５０μＭの濃度ではＴＩＧが８０％強の細胞生存率を示すのに対して皮膚癌細胞のＡ４３１（０４０１）では３０％強と、両者の差は約５０％もあった。このように本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体は、所定の範囲内で前述の腫瘍細胞に対して濃度依存的な強い抗腫瘍活性を示すと共に正常細胞に対してはほとんどその活性を示さないか、又は活性が見られるものであっても腫瘍細胞に対する活性と大きな差異が見られた。したがって、本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体は少なくともこれらの腫瘍細胞に対しては副作用が少ない抗腫瘍剤としての利用が可能であることが明らかとなった。
【００９４】
一方、本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体は、正常繊維芽細胞（図８）やリンパ腫細胞（図９）、膵臓癌細胞（図１０）、肺扁平上皮癌細胞（図１１）、そして胃癌細胞（図１２）に対しては本実施例の条件下では細胞傷害活性は不活性であった。つまり、本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体では、これらの腫瘍に対しては抗腫瘍剤としての効果は期待できないと考えられる。しかし、当該性質は抗腫瘍剤としての効果を何ら減じるものではない。本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体が特定の特定の腫瘍細胞に対してのみ強い細胞傷害活性を示すという事実は、標的を的確に攻撃しながら正常細胞や他の細胞に対しては副作用が少ないことを意味している。したがって、本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体はむしろ全腫瘍に対して細胞傷害活性を示すことが多かった従来のスフィンゴ糖脂質誘導体よりも有用であることを示唆している
【実施例３】
【００９５】
<本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体の投与による免疫賦活作用>
【００９６】
（目的）
本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体がαＧａｌＣｅｒと同様に、生体内においてＮＫＴ細胞を活性化する機能を有するかについて検証した。
【００９７】
（実験方法）
マウスは８週目のＣ５７ＢＬ／６系統を使用した。実施例１で精製したスフィンゴ糖脂質誘導体を上記マウスの腹腔内に２０μｇ、１００μｇ、及び２００μｇ／ｍｏｕｓｅでそれぞれ投与した。また、αＧａｌＣｅｒを２μｇ／ｍｏｕｓｅで投与した個体を陽性コントロールとした。投与後、各マウスの肝臓よりリンパ球を経時的に分離し、ＮＫＴ細胞(ＣＤ３＋ＮＫ１．１＋)の検出用としてＦＩＴＣ標識−抗ＣＤ３抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）及びＰＥ標識−抗ＮＫ１．１抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）の二種類の蛍光標識されたモノクローナル抗体で二重免疫染色を行った後、ＮＫＴ細胞の動態をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）によって解析した。なお、肝臓からのリンパ球分離法と免疫染色法は非特許文献７の方法に従った。
【００９８】
（結果）
図１３に上記フローサイトメトリーによる解析結果のサイトグラムを示す。この図においてＡ、Ｂは陽性コントロールであるαＧａｌＣｅｒを、Ｃ、Ｄは１００μｇのスフィンゴ糖脂質誘導体を、そしてＥ、Ｆは２００μｇのスフィンゴ糖脂質誘導体を、それぞれ投与したマウスのリンパ球のサイトグラムを示す。また、Ａ、Ｃ、Ｅは未投与対照マウス、Ｂは投与後１２時間、そしてＤ、Ｆは投与後２４時間の結果である。各サイトグラムは、いずれも横軸がＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体の、また縦軸がＰＥ標識抗ＮＫ１．１抗体の蛍光強度をそれぞれログスケールで示している。ＦＩＴＣの蛍光強度が大きいほど測定した細胞表面のＣＤ３分子数が多いことを意味し、またＰＥの蛍光強度が大きいほど測定した細胞表面のＮＫ１．１分子数が多いことを意味する。各サイトグラムにおける４つの分画は、２種類の蛍光強度に基づいてａをＮＫ細胞のフラクション(ＣＤ３−ＮＫ１．１＋)、ｂ（ドットと重なるため一部のサイトグラムでは示さず。）をＢ細胞やマクロファージ等のフラクション(ＣＤ３−ＮＫ１．１−)、ｃをＮＫＴ細胞のフラクション(ＣＤ３＋ＮＫ１．１＋)（図中矢印で示した。）、ｄをＴ細胞のフラクション(ＣＤ３＋ＮＫ１．１−)としてそれぞれ区分けしている。また、各分画内の数値は測定した全細胞における当該分画に含まれる細胞の割合（％）を表す。
【００９９】
まず、陽性コントロールであるαＧａｌＣｅｒを投与したマウスでは、投与後１２時間（Ｂ）で肝臓のＮＫＴ細胞のほとんどが消失した。図示していないが投与後２４時間でもこの傾向に変化はない。ＮＫＴ細胞は、ＮＫ細胞と同様に標的細胞を直接攻撃する細胞傷害活性と、活性化により誘導された細胞内のサイトカインを放出する二つの機能を有する（非特許文献１）。即ち、肝臓のＮＫＴ細胞の消失はαＧａｌＣｅｒにより活性化したＮＫＴ細胞がアポトーシスを起こし、消失したことを示している。
【０１００】
一方、本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体は、２０μｇ／ｍｏｕｓｅの投与（図示せず）では２４時間後でもαＧａｌＣｅｒのような効果は見られなかった。また、１００μｇ／ｍｏｕｓｅ、及び２００μｇ／ｍｏｕｓｅの投与も、１２時間後（図示せず）では顕著な効果は見られなかった。しかしながら、２４時間後ではこれらはＤ、Ｆに示すように肝臓のＮＫＴ細胞の消失が観察された。このように本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体は高濃度下において緩やかにＮＫＴ細胞を活性化する機能を有することが明らかとなった。なお、ＮＫＴ細胞の活性化に伴うアポトーシスに関しては実施例６で詳述する。
【実施例４】
【０１０１】
<本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体の投与による血中ＩＮＦ−γレベルの検証>
【０１０２】
（目的）
ＮＫＴ細胞はαＧａｌＣｅｒによる活性化でＩＮＦ−γを産生することが知られている（非特許文献４及び５）。つまり、αＧａｌＣｅｒの投与により血中のＩＮＦ−γは増大する。そこで本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体においても、その投与により血中のＩＮＦ−γレベルに変化が生じるかについて検証した。
【０１０３】
（実験方法）
実施例３で調製したマウスを用いた。経時的に各マウスより約１ｍｌの血液を採取した後、血清を分離し、当該血清中のＩＮＦ−γレベルをＥＬＩＳＡ法により測定した。ＥＬＩＳＡ測定にはＢＤ ＯｐｔＥＩＡ ｓｅｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を用い、方法は添付のプロトコルに従った。
【０１０４】
（結果）
図１４に結果を示す。αＧａｌＣｅｒの投与によって血中ＩＮＦ−γレベルは、コントロールである正常マウスの値約４０ｐｇ／ｍｌから約３０００ｐｇ／ｍｌへと増大した。これに対して、本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体の投与では正常マウスとほぼ同様の値を示した。すなわち、実施例３で示したように本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体はＮＫＴ細胞の活性化を有するにもかかわらず、血中ＩＮＦ−γレベルは上昇しないことが明らかとなった。これは、おそらく本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体とαＧａｌＣｅｒではＮＫＴ細胞に対する活性化の作用機序が異なっていることに起因するものと考えられる。
【実施例５】
【０１０５】
<本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体の投与による肝傷害の検証>
【０１０６】
（目的）
αＧａｌＣｅｒはその細胞傷害活性により生体内投与では強い抗腫瘍活性を示すが、同時に肝臓に対しても細胞傷害性を引き起こす問題を有することが知られている（非特許文献１）。実施例３で示したように本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体は、ＮＫＴ細胞の活性化のためにαＧａｌＣｅｒよりも遥かに高濃度で投与する必要がある。ゆえにαＧａｌＣｅｒと同様、あるいはそれ以上の肝傷害を誘導する可能性が考えられる。そこで、本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体の生体内投与による肝傷害誘導について検証した。
【０１０７】
（実験方法）
実施例３で調製したマウスを用いた。経時的に各マウスより約１ｍｌの血液を採取した後、血清を分離し、各血清中のトランスアミナーゼ（ＧＰＴ）値を体外用診断キットであるトランスアミナーゼＣＩＩ―テストワコー（和光純薬）を用いて測定した。測定方法はキット添付のプロトコルに従った。なお、マウスは一般に赤血球が溶血しやすい。そのためＧＯＴ値は測定結果にエラーが発生しやすいため、ここでは示していない。
【０１０８】
（結果）
図１５にＧＰＴ値の測定結果を示す。ここで、まず血清中のＧＰＴについて簡単に説明をする。ＧＰＴは通常肝細胞中で機能しているが、肝炎等の肝傷害により幹細胞が破壊されることで血液中に漏出する。そのため血液中のＧＰＴ値の上昇は肝傷害の指標となる。一般に１００ＩＵ（国際単位）／Ｌ（リットル）以上では肝炎等の肝傷害を引き起こしていると解される。
【０１０９】
図１５で示すように、正常マウスのＧＰＴ値は約１１ＩＵ／Ｌであった。αＧａｌＣｅｒの投与によるＧＰＴ値は、１２時間後で１１６ＩＵ／Ｌ、２４時間後には約１８３ＩＵ／Ｌと１００を越える高い値を示し、これまでの報告通り肝傷害を引き起こしていることが認められた。一方、本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体の投与によるＧＰＴ値は、驚くべきことに２００μｇという極めて高濃度な投与であっても、２０ＩＵ／Ｌ以下という正常マウスのそれを僅かに上回る程度の低い値であった。これは、本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体が肝細胞に対する細胞傷害性がほとんどない、即ち副作用が極めて少ないことを示唆している。
【実施例６】
【０１１０】
<本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体によるＮＫＴ細胞のアポトーシス誘導の検証>
【０１１１】
（目的）
ＮＫＴ細胞は、αＧａｌＣｅｒによる活性化に伴い、自らアポトーシスを生じることが知られている（非特許文献１）。そこで、本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体による活性化においてもＮＫＴ細胞のアポトーシス誘導が生じているかについて検証した。
【０１１２】
（実験方法）
基本的な実験方法は実施例３と同様である。マウスは８週目のＣ５７ＢＬ／６系統を使用し、実施例１で精製したスフィンゴ糖脂質誘導体を当該マウスの腹腔内に２００μｇ／ｍｏｕｓｅまた、αＧａｌＣｅｒを２μｇ／ｍｏｕｓｅで投与した。投与後２４時間で各マウスの肝臓よりリンパ球を分離し、ＮＫＴ細胞(ＣＤ３＋ＮＫ１．１＋)の検出用としてＰｅｒＣＰ標識−抗ＣＤ３抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）及びＰＥ標識−抗ＮＫ１．１抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）の二種類の蛍光標識されたモノクローナル抗体とアポトーシス細胞検出用としてＦＩＴＣ標識−アネキシンＶ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）により三重免疫染色を行った。免疫染色法は非特許文献１の方法に従った。次に、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）によりＰｅｒＣＰ及びＰＥを検出し、それらの蛍光強度に基づいてＮＫＴ細胞のフラクション（図１３のｃで示されるエリア）を得た。ここまでは検出する蛍光物質の種類以外は実施例３と同様である。本実施例では、さらに当該フラクションに対してＦＩＴＣの蛍光強度を測定することでフラクション内でアポトーシスを生じた細胞を検出した。なお、コントロールとしてＴ細胞のフラクション（図１３のｄで示されるエリア）についても同様の操作を行った。
【０１１３】
（結果）
図１６にその結果を示す。Ａ、Ｄは未操作正常マウス細胞の、Ｂ、Ｅは２μｇ／ｍｏｕｓｅのαＧａｌＣｅｒを投与したマウス細胞の、Ｃ、Ｆは２００μｇ／ｍｏｕｓｅの本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体を投与したマウスＮＫＴ細胞分画とＴ細胞分画のヒストグラムを示している。また、Ａ、Ｂ、ＣはＮＫＴ細胞のフラクションを、Ｄ、Ｅ、ＦはＴ細胞のフラクションを示す。各プロファイルの横軸は蛍光物質Ｃの蛍光強度を、縦軸は細胞数（単位：個）を表す。アネキシンＶは初期のアポトーシスに陥っている細胞を検出する。したがって、ＦＩＴＣ蛍光強度の強い細胞が多い場合、つまりアネキシンＶ陽性の場合にはアポトーシスが陽性であることを意味する。アネキシンＶ陽性の細胞は、やがてネクローシスに陥り、完全な死（ＰＩ陽性）に至る。
【０１１４】
Ａの正常マウスでは、ＮＫＴ細胞は弱い蛍光強度１０付近でピーク（１６０１）を有するのに対して、ＢのαＧａｌＣｅｒを投与したマウスでは、このピークが完全に消失し、比較的強い蛍光強度２００付近の位置にわずかなピーク（１６０２）が見られるのみである。コントロールであるＴ細胞ではＤとＥのヒストグラムのパターンにほとんど違いが見られず、アポトーシスの誘導は認められない。したがって、これはαＧａｌＣｅｒの投与によりＮＫＴ細胞が活性化され、さらにアポトーシスの進行によって細胞膜が崩壊したことを示している。一方、本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体では、やはりＡに見られる弱い蛍光強度のピークは消失し、代わって６００付近の強い蛍光強度の位置にピーク（１６０３）を生じている。コントロールであるＴ細胞のＤとＦにおいてヒストグラムのパターンにほとんど違いが見られず、アポトーシスの誘導は認められない。したがって、当該スフィンゴ糖脂質誘導体においてもαＧａｌＣｅｒと同様に、その投与によってＮＫＴ細胞が活性化され、ＮＫＴ細胞のアポトーシスが誘導されていることが明らかとなった。しかし、当該スフィンゴ糖脂質誘導体によるＮＫＴ細胞のアポトーシス誘導は、強い蛍光強度の位置にピークが残っていることからαＧａｌＣｅｒのそれと比較して比較的穏やかに進行すると考えられる。
【実施例７】
【０１１５】
<本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体よる癌細胞への抗腫瘍活性およびそれに伴う肝障害の検証>
【０１１６】
（目的）
本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体が生体内において癌細胞の増殖を抑制する機能を有するかについて検証した。
【０１１７】
（実験方法）
マウスは４週目のＣ３Ｈ／ＨｅＪＪｃｌ系統を使用した。当該マウスの皮内にマウス肝臓癌細胞（ＭＨ１３４−ＴＣ）を約１×１０４個移植した。その２週間後にマウスを２群に分け、一群についてのみ実施例１で精製したスフィンゴ糖脂質誘導体０．２ｍｇをマウスの腹腔内に毎日投与した。癌細胞の増殖率は、皮内の癌組織面積増加率として求めた。副作用の指標として血清中のＧＰＴ値を計測した。なお、コントロールとしてスフィンゴ糖脂質誘導体を投与しない一群についても同様の計測をした。
【０１１８】
（結果）
図１７にスフィンゴ糖脂質誘導体の投与による癌細胞の増殖抑制効果の結果を示す。横軸はスフィンゴ糖脂質誘導体の投与後の経過日数を、また縦軸はスフィンゴ糖脂質誘導体投与開始時の癌組織面積に対する相対値を示している。Ａはスフィンゴ糖脂質誘導体を投与した一群のマウスの結果であり、Ｂはコントロールとしての一群のマウスの結果である。また、表２にＧＰＴ値の測定結果を示す。
【表２】
0005392451.tif 000012
【０１１９】
図１７よりスフィンゴ糖脂質誘導体の投与後2日目から癌組織面積の増加率にわずかながらも差異が見られた。６日目にはコントロールの一群（Ｂ）が約６．８倍に増加したのに対して、スフィンゴ糖脂質誘導体を投与した一群（Ａ）は約４．９倍の増加であった（ｐ<０．０１）。これにより、スフィンゴ糖脂質誘導体が生体内においても癌細胞の増殖を有意に抑制することが示された。
【０１２０】
また表２より、スフィンゴ糖脂質誘導体を投与した一群とコントロールの一群において、ＧＰＴ値に大きな差は見られなかった。これは、本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体が肝細胞に対して細胞傷害性をほとんど有さない、つまり副作用の少ないことを示している。
【０１２１】
即ち、本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体は正常な細胞に対してはほとんど作用せず、腫瘍細胞である癌細胞に対して選択的に細胞傷害性を有していることが示された。
【実施例８】
【０１２２】
<本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体による生体内での癌細胞の転移抑制、及び個体生存率の検証>
【０１２３】
（目的）
本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体の投与による生体内での癌細胞の転移抑制、及び生存率の変化について検証した。
【０１２４】
（実験方法）
マウスは８週目のＣ５７ＢＬ／６系統を使用した。実施例１で精製したスフィンゴ糖脂質誘導体を当該マウスの腹腔内に０．２ｍｇ／ｍｏｕｓｅで投与し、その３日後に再び腹腔内に２００μｇ／ｍｏｕｓｅで投与すると同時にマウスリンパ腫細胞ＥＬ４を尾静脈から約１×１０５個を移入して、生存率を計測した。また、これと同条件で処理したマウスにおいて、ＥＬ４細胞約５×１０５個を注入後２１日目に肝臓を摘出し、当該肝臓へ転移したＥＬ４細胞塊の個数を目視にて計測した。なお、コントロールとしてスフィンゴ糖脂質誘導体を投与しないマウスについても同様の計測をした。
【０１２５】
（結果）
図１８にスフィンゴ糖脂質誘導体投与マウスと未投与マウスのそれぞれにおける生存率を示す。横軸はＥＬ４細胞を注入した日からの経過日数を示し、縦軸はマウスの生存率（％）（ｎ＝６）を示す。また、図１９はＥＬ４細胞移入後２１日目のスフィンゴ糖脂質誘導体投与マウスと未投与マウスのそれぞれの肝臓に転移した当該細胞塊数の結果を示す。縦軸はＥＬ４細胞の転移細胞塊数（個）を示す。また、図２０は、ＥＬ４細胞注入後２１日目のスフィンゴ糖脂質誘導体未投与マウス（Ａ）、スフィンゴ糖脂質誘導体投与マウス（Ｂ）のそれぞれから摘出した肝臓を示している。破線円内の斑状痕が転移したＥＬ４細胞塊である。
【０１２６】
図１８において、スフィンゴ糖脂質誘導体を投与されたマウス（Ａ）はＥＬ４細胞を移入した日から２０日経過後から生存率が下がり始めてはいるが、３５日を経過しても約３０％（ｐ<０．０５）が生存している。これに対してコントロール（Ｂ）はＥＬ４細胞移入２０日目に急激に生存率が低下し、２５日目には全てのマウスが死亡した。これにより、スフィンゴ糖脂質誘導体が浸潤性の癌細胞を有する個体の生存率を有意に上昇させることが示された。
【０１２７】
図１９において、スフィンゴ糖脂質誘導体を投与されたマウスにおけるＥＬ４細胞の肝臓への転移細胞塊数は約１５個であった。これに対してコントロールでは約６５個の転移細胞塊を示した（ｐ<０．０５）。また図２０により、投与マウス（Ｂ）においてはＥＬ４細胞の肝臓への転移はほとんど見られなかった。これにより、スフィンゴ糖脂質誘導体が当該細胞の転移を有意に抑制していることが示された。
【０１２８】
即ち、本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体は、生体内においても免疫賦活性剤としてＮＫＴ細胞を活性化し、腫瘍細胞の転移を抑制し、生存率を上昇させると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】ビールの抽出工程を説明するための概念図
【図２】天然の原料からスフィンゴ糖脂質誘導体等を抽出する方法の流れ図の一例
【図３】本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体を投与した肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＣＳ−ＨＣ）の生存曲線
【図４】本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体を投与した皮膚細胞（Ａ４３１、ＴＩＧ）の生存曲線
【図５】本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体を投与した肺細胞（Ａ５４９、Ｗ３８、ＷＩ３８ Ｓｕｂ）の生存曲線
【図６】本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体を投与した白血病細胞Ｍｏｌｔ−４の生存曲線
【図７】本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体を投与した大腸癌細胞ＣＯＬＯ２０１の生存曲線
【図８】本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体を投与した正常繊維芽細胞ＯＵＭＳ３６の生存曲線
【図９】本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体を投与したリンパ腫細胞Ｒａｊｉの生存曲線
【図１０】本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体を投与した膵臓癌細胞ＭＩＡ Ｐａｃａの生存曲線
【図１１】本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体を投与した肺扁平上皮癌細胞ＶＭＲＣ−ＬＣＰの生存曲線
【図１２】本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体を投与した胃癌細胞ＫＡＴＯ−３の生存曲線
【図１３】本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体又はαＧａｌＣｅｒの投与による肝臓ＮＫＴ細胞の経時的動態を示すサイトグラム
【図１４】本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体又はαＧａｌＣｅｒを投与したマウスの血中ＩＮＦ−γレベル
【図１５】本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体又はαＧａｌＣｅｒを投与したマウスの血中ＧＰＴ値
【図１６】本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体又はαＧａｌＣｅｒの投与による肝臓ＮＫＴ細胞及びＴ細胞に対するアポトーシス誘導を示すヒストグラム
【図１７】本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体を投与したマウスの癌組織面積の増加曲線
【図１８】本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体を投与したマウスと未投与マウスのマウスリンパ腫による生存率を示すグラフ
【図１９】本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体を投与したマウスと未投与マウスの癌細胞転移細胞塊数を示すグラフ
【図２０】本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体を投与したマウスと未投与マウスの癌細胞の肝臓への転移を表す図
【符号の説明】
【０１３０】
０３０１：Ｈｅｐ Ｇ２の生存曲線
０３０２：ＣＳ−ＨＣの生存曲線
【図１】
0005392451.tif 000026
【図２】
0005392451.tif 000027
【図３】
0005392451.tif 000028
【図４】
0005392451.tif 000029
【図５】
0005392451.tif 000030
【図６】
0005392451.tif 000031
【図７】
0005392451.tif 000032
【図８】
0005392451.tif 000033
【図９】
0005392451.tif 000034
【図１０】
0005392451.tif 000035
【図１１】
0005392451.tif 000036
【図１２】
0005392451.tif 000037
【図１３】
0005392451.tif 000038
【図１４】
0005392451.tif 000039
【図１５】
0005392451.tif 000040
【図１６】
0005392451.tif 000041
【図１７】
0005392451.tif 000042
【図１８】
0005392451.tif 000043
【図１９】
0005392451.tif 000044
【図２０】
0005392451.tif 000045