(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光測定による生体分子の検出に用いる標識色素であって、有機EL色素から成る発色部と、生体分子を結合する結合部と、発色部と結合部とを連結するスペーサー部とを有し、
上記有機ＥＬ色素が、以下の一般式（１）、（２）又は（３）で示されるアゾール誘導体、または以下の一般式（４）、（５）、（６）、（７）又は（８）で示されるイミダゾール誘導体であり、
上記スペーサー部が、アミノ末端がアミド化された、アミノ酸又は２〜２０個のアミノ酸からなるペプチドリンカー、あるいは一般式-COO-(CH2)r-COO-で表され、rが０から２０の整数である、生体分子用標識色素。
0005638734.tif 000049
（式中、R2、R3、R4は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルケ
ニル基、アルキニル基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、芳香
族炭化水素基または複素環基からなる置換基を有してもよい芳香族炭化水素基又は炭化水
素基又は複素環基を示し、R1はスペーサー部との直接結合を示し、Xは置換基を有しても
よい窒素原子又は硫黄原子又は酸素原子又はセレン原子、ボロン原子を示し、R'は芳香環
を含んでも良い脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基、An-は、ハロゲン化物イオ
ン、CF3SO3-、BF4-、PF6-を示す。）
0005638734.tif 000050
0005638734.tif 000051
（式中、R2、R3、R4、R5は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、芳香族炭化水素基、複素環基からなる置換基を有するあるいは無置換の芳香族炭化水素基又は炭化水素基又は複素環基を示し、R2、R3、R4、R5は同じでも異なっていても良く、R1はスペーサー部との直接結合を示し、R'、R''は無置換あるいは芳香環を置換基として含む脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基、An-は、ハロゲン化物イオン、CF3SO3-、
BF4-、PF6-を示す。）
【請求項２】
上記のR2とR3が、それぞれ独立に、チオフェン誘導体、フラン誘導体、ピロール誘導体、イミダゾール誘導体、オキサゾール誘導体、チアゾール誘導体、ピラゾール誘導体及びピリジン誘導体からなる群から選択された１種である請求項１記載の生体分子用標識色素。
【請求項３】
上記のR2とR3が、スルホニル基を有するアリール基である請求項１記載の生体分子用標識色素。
【請求項４】
上記結合部が、カルボン酸基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化アルキル基、トリアジン基、カルボジイミド基そして活性エステル化したカルボニル基から選択されたいずれか１種の反応性基を有する請求項１から３のいずれか一つに記載の生体分子用標識色素。
【請求項５】
上記スペーサー部がアミノ末端がアミド化されたアミノ酸であって、該アミノ末端がアミド化されたアミノ酸のアミノ酸の部分が天然アミノ酸又は合成アミノ酸である請求項１記載の生体分子用標識色素。
【請求項６】
上記アミノ酸の部分が、システイン酸、2-アミノ-3-スルホサルファニルプロパン酸、2-アミノ-3-スルホキシプロパン酸、チロシン、スレオニン、4-アミノ-2-ヒドロキシブタン酸、ホモセリン及びセリンからなる群から選択された１種である請求項５記載の生体分子用標識色素。
【請求項７】
上記スペーサー部がアミノ末端がアミド化されたペプチドリンカーであって、該アミノ末端がアミド化されたペプチドリンカーのペプチドの部分が、スルホニル基、ヒドロキシル基、４級アミン基及びカルボキシル基からなる群から選択された少なくとも１種の荷電基を有する請求項１記載の生体分子用標識色素。
【請求項８】
上記ペプチドの部分が、システイン酸、2-アミノ-3-スルホサルファニルプロパン酸、2-アミノ-3-スルホキシプロパン酸、チロシン、スレオニン、4-アミノ-2-ヒドロキシブタン酸、ホモセリン及びセリンからなる群から選択された少なくとも１種のアミノ酸を含む請求項７記載の生体分子用標識色素。
【請求項９】
蛍光測定による生体分子の検出に用いる生体分子用標識キットであって、請求項１記載の生体分子用標識色素を含む生体分子用標識キット。
【請求項１０】
さらに、カルボン酸基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化アルキル基、トリアジン基、カルボジイミド基そして活性エステル化したカルボニル基から選択されたいずれか１種の反応性基を生体分子用標識色素に導入するための反応性基導入試薬を含む請求項９記載の生体分子用標識キット。
【請求項１１】
請求項１記載の生体分子用標識色素を、生体分子試料と反応させ、該標識色素により標識された生体分子試料の蛍光を測定する生体分子の検出方法。
【請求項１２】
上記生体分子試料に、核酸、タンパク質、ペプチド類、そして糖類からなる群から選択されたいずれか１種を用いる請求項１１記載の検出方法。
【請求項１３】
請求項１記載の生体分子用標識色素で標識されたプローブと、生体分子試料とを反応させ、該生体分子試料の蛍光を測定する検出方法。
【請求項１４】
上記生体分子試料が核酸であり、上記プローブには該核酸の塩基配列に相補的なオリゴヌクレオチド又はPNAを用いる請求項１３記載の検出方法。
【請求項１５】
上記オリゴヌクレオチドがプライマー又はターミネータであり、上記核酸を増幅させて蛍光を測定する請求項１４記載の検出方法。
【請求項１６】
上記核酸の増幅に先立ってプライマーを有機EL色素で標識する請求項１５記載の検出方法。
【請求項１７】
上記オリゴヌクレオチド又はPNAがモレキュラービーコンである請求項１４記載の検出方法。
【請求項１８】
生体分子から成る被検体又は修飾物質により修飾された該被検体の検出方法であって、被検体に特異結合する結合物質又は修飾物質に特異結合する結合物質の一方を、請求項１記載の生体分子用標識色素で標識し、標識された結合物質からの蛍光を測定する生体分子の検出方法。
【請求項１９】
上記の被検体又は修飾物質と上記結合物質との組み合わせが、抗原−抗体、ハプテン−抗ハプテン抗体、ビオチン−アビジン、Tag−抗Tag抗体、レクチン−糖タンパク質又はホルモン−受容体である請求項１８記載の検出方法。
【請求項２０】
生体分子試料を電気泳動によりサイズ分離する工程を含み、該電気泳動に先立ってあるいは該電気泳動後に生体分子試料を、請求項１記載の生体分子用標識色素で標識する生体分子の検出方法。
【請求項２１】
上記生体分子試料が核酸であり、電気泳動画像に基づいて該核酸の塩基配列を決定する請求項２０記載の検出方法。
【請求項２２】
上記生体分子試料がタンパク質であり、電気泳動画像に基づいて取り出したタンパク質を質量分析する請求項２０記載の検出方法。
【請求項２３】
組織又は細胞試料中の生体分子を、請求項１記載の生体分子用標識色素で標識する組織又は細胞の染色方法。
【請求項２４】
上記生体分子が核酸又はタンパク質である請求項２３記載の染色方法。
【請求項２５】
組織又は細胞試料の染色に用いる染色色素であって、請求項１記載の生体分子用標識色素から成る染色色素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光色素から成り、核酸、タンパク質、ペプチド類、そして糖類等の生体分子の検出に用いる生体分子用標識色素及び標識キット並びに生体分子の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒトゲノムの全容が明らかにされ、遺伝子治療、遺伝子診断などを目的としたポストゲノム研究が盛んに行われている。例えば、DNA解析は、DNAマイクロアレイ基盤上に固定されたプローブDNAと、蛍光色素等で標識されたサンプルDNAとをハイブリダイズさせて二本鎖を形成させ、サンプルDNAの検出を行っている。これは蛍光色素で標識した核酸をPCR伸長し、基盤上でハイブリダイゼーションを行った後に測定する手法である。最近では、より多くのアミノ基を有するプライマーを用いた手法、DNAにアミノ基を導入する手法がとられている。【０００３】
標識には、蛍光色素が広く使用されており、高い蛍光強度を有すること、乾燥状態（固体状態）でも発光すること、そして水溶性を有することなどが要求されている。蛍光色素としては、例えば、Cy3やCy5が使用されている（例えば、非特許文献１を参照されたい）。
【非特許文献１】Science 283,1,January,1999,83-87
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来の標識色素は標識率が低いという問題がある。例えば、一カ所の反応点を有するDNAに対して２００倍モル程度の蛍光色素を用いているが、この条件下においても標識率は５０−６０％程度であった。そのため、標識色素を大量に使用する必要があるため検出費用が高コストになったり、未反応の標識色素を除去するための処理工程が必要となり検出に長時間を要するという問題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の課題を解決するため、本発明者は鋭意努力した結果、有機EL色素から成る発色部と、生体分子を結合する結合部と、発色部と結合部とを連結するスペーサー部とを有する標識色素を用いることにより、DNAに対する標識率を大幅に向上させることが可能なことを見出して本発明を完成させたものである。すなわち、本発明の生体分子用標識色素は、蛍光測定による生体分子の検出に用いる標識色素であって、有機EL色素から成る発色部と、生体分子を結合する結合部と、発色部と結合部とを連結するスペーサー部とを有することを特徴とする。【０００６】
ここで、上記有機EL色素には、１種以上のヘテロ原子、セレン原子又はボロン原子を含む５員環化合物と共役系を有する６員環化合物とから成る縮合多環化合物を用いることができる。【０００７】
また、上記縮合多環化合物には、以下の一般式（１）、（２）又は（３）のいずれか１種で示されるアゾール誘導体を用いることができる。【０００８】
【化１】
0005638734.tif 000002
【０００９】
ここで、式中、R1、R2、R3、R4は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、芳香族炭化水素基、複素環基、ヘテロ原子を環内に含む芳香族基などの置換基を有してもよい芳香族炭化水素基又は炭化水素基又は複素環基又はヘテロ原子を環内に含む芳香族基を示し、Xは置換基を有していてもよい窒素原子又は硫黄原子又は酸素原子又はセレン原子、ボロン原子を示し、R'は芳香環を含んでも良いアルキル基又はアルケニル基等の脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基、An-は、Cl-、Br-、I-等のハロゲン化物イオン、CF3SO3-、BF4-、PF6-を示す。【００１０】
また、上記のR2とR3に、チオフェン誘導体、フラン誘導体、ピロール誘導体、イミダゾール誘導体、オキサゾール誘導体、チアゾール誘導体、ピラゾール誘導体及びピリジン誘導体からなる群から選択された１種を用いることができる。【００１１】
また、上記のR2とR3に、スルホニル基を有するフェニル基を用いることができる。【００１２】
また、上記縮合多環化合物に、以下の一般式（４）、（５）、（６）、（７）又は（８）で示されるイミダゾール誘導体を用いることもできる。【００１３】
【化２】
0005638734.tif 000003
0005638734.tif 000004
【００１４】
ここで、式中、R1、R2、R3、R4、R5は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、芳香族炭化水素基、複素環基、ヘテロ原子を環内に含む芳香族基などの置換基を有しても良い芳香族炭化水素基又は炭化水素基又は複素環基又はヘテロ原子を環内に含む芳香族基を示し、R1、 R2、R3、R4、R5は同じでも異なっていても良く、R'、R''は芳香環を含んでも良いアルキル基又はアルケニル基等の脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基、An-は、Cl-、Br-、I-等のハロゲン化物イオン、CF3SO3-、BF4-、PF6-を示す。【００１５】
また、上記のR2とR3に、チオフェン誘導体、フラン誘導体、ピロール誘導体、イミダゾール誘導体、オキサゾール誘導体、チアゾール誘導体、ピラゾール誘導体及びピリジン誘導体からなる群から選択された１種を用いることができる。【００１６】
また、上記のR2とR3に、スルホニル基を有するフェニル基を用いることもできる。【００１７】
また、本発明の標識色素は、結合部に、カルボン酸基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化アルキル基、トリアジン基、カルボジイミド基そして活性エステル化したカルボニル基から選択されたいずれか１種の反応性基を用いることができる。【００１８】
また、本発明の標識色素は、スペーサー部に、-CH2-、-NHCOO-、-CONH-、-CH2NH-、-CH2NR-、-COO-、-SO2NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-（Rはアルキル基）、-(CH2-CH2-O)n-（nは１から１０の整数）、-CH=CH-、-C≡C-、-Ar-及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択される官能基を少なくとも１種含むものを用いることができる。【００１９】
ここで、上記スペーサー部には、以下の一般式(I)で表されるものを用いることができる。
-(CHR')p-X-(CHR")q-      （I）
式中、Xは直接結合又は、-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO2NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-、-CH=CH-、-C≡C-、-Ar-及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択され少なくとも１種の官能基を表し、R'とR"はそれぞれ独立に、水素原子、あるいは芳香環を含んでも良いアルキル基又はアルケニル基等の脂肪族炭化水素基、あるいは芳香族炭化水素基であって、必要によりスルホニル基、ヒドロキシル基、４級アミン基及びカルボキシル基からなる群から選択されたいずれか１種の荷電基により置換されたものを表し、Arはアリール基を表し、pとqはそれぞれ独立に０から２０の整数を表し、p+q≧1である。【００２０】
また、スペーサー部に、アミノ酸又は２〜２０個のアミノ酸からなるペプチドリンカーを用いることができる。【００２１】
また、スペーサー部にアミノ酸を用い、そのアミノ酸に天然アミノ酸又は合成アミノ酸を用いることができる。【００２２】
また、アミノ酸に、システイン酸、2-アミノ-3-スルホサルファニルプロパン酸、2-アミノ-3-スルホキシプロパン酸、チロシン、スレオニン、4-アミノ-2-ヒドロキシブタン酸、ホモセリン及びセリンからなる群から選択された１種を用いることができる。【００２３】
また、スペーサー部にペプチドリンカーを用い、そのペプチドリンカーに、スルホニル基、ヒドロキシル基、４級アミン基及びカルボキシル基からなる群から選択された少なくとも１種の荷電基を有するものを用いることもできる。【００２４】
また、ペプチドリンカーに、システイン酸、2-アミノ-3-スルホサルファニルプロパン酸、2-アミノ-3-スルホキシプロパン酸、チロシン、スレオニン、4-アミノ-2-ヒドロキシブタン酸、ホモセリン及びセリンからなる群から選択された少なくとも１種のアミノ酸を含むものを用いることもできる。【００２５】
また、本発明の第１の生体分子用標識キットは、蛍光測定による生体分子の検出に用いる生体分子用標識キットであって、有機EL色素から成る発色部と、生体分子を結合する結合部と、発色部と結合部とを連結するスペーサー部とを有する標識色素を含むことを特徴とする。【００２６】
また、本発明の第２の生体分子用標識キットは、蛍光測定による生体分子の検出に用いる生体分子用標識キットであって、少なくとも、有機EL色素から成る発色部と、該発色部に結合し、-CH2-、-NHCOO-、-CONH-、-CH2NH-、-CH2NR-、-COO-、-SO2NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-（Rはアルキル基）、-(CH2-CH2-O)n-（nは１から１０の整数）、-CH=CH-、-C≡C-、-Ar-及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択される官能基を少なくとも１種含むスペーサー部とを含むことを特徴とする。【００２７】
さらに、第２の生体分子用標識キットは、カルボン酸基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化アルキル基、トリアジン基、カルボジイミド基そして活性エステル化したカルボニル基から選択されたいずれか１種の反応性基を標識色素に導入するための反応性基導入試薬を含むことができる。【００２８】
また、本発明の第１の生体分子の検出方法は、有機EL色素から成る発色部と、生体分子を結合する結合部と、発色部と結合部とを連結するスペーサー部とを有する標識色素を、生体分子試料と反応させ、該標識色素により標識された生体分子試料の蛍光を測定することを特徴とする。ここで、上記生体分子試料には、核酸、タンパク質、ペプチド類、そして糖類からなる群から選択されたいずれか１種を用いることができる。なお、タンパク質は抗体を含む。【００２９】
また、本発明の第２の生体分子の検出方法は、有機EL色素から成る発色部と、生体分子を結合する結合部と、発色部と結合部とを連結するスペーサー部とを有する標識色素で標識されたプローブと、生体分子試料とを反応させ、該生体分子試料の蛍光を測定することを特徴とする。ここで、上記生体分子試料には核酸に用い、上記プローブには該核酸の塩基配列に相補的なオリゴヌクレオチド又はPNAを用いることができる。さらに、上記オリゴヌクレオチドにプライマー又はターミネータを用い、上記核酸を増幅させて蛍光を測定することができる。また、上記核酸の増幅に先立ってプライマーを有機EL色素で標識することができる。また、上記オリゴヌクレオチド又はPNAにモレキュラービーコンを用いることができる。【００３０】
また、本発明の第３の生体分子の検出方法は、生体分子から成る被検体又は修飾物質により修飾された該被検体の検出方法であって、被検体に特異結合する結合物質又は修飾物質に特異結合する結合物質の一方を、有機EL色素から成る発色部と、生体分子を結合する結合部と、発色部と結合部とを連結するスペーサー部とを有する標識色素で標識し、標識された結合物質からの蛍光を測定することを特徴とする。
ここで、上記の被検体又は修飾物質と上記結合物質との組み合わせには、抗原−抗体、ハプテン−抗ハプテン抗体、ビオチン−アビジン、Tag−抗Tag抗体、レクチン−糖タンパク質又はホルモン−受容体を用いることができる。【００３１】
また、本発明の第４の生体分子の検出方法は、生体分子試料を電気泳動によりサイズ分離する工程を含み、該電気泳動に先立ってあるいは該電気泳動後に生体分子試料を、有機EL色素から成る発色部と、生体分子を結合する結合部と、発色部と結合部とを連結するスペーサー部とを有する標識色素で標識することを特徴とする。ここで、上記生体分子試料に核酸を用い、電気泳動画像に基づいて核酸の塩基配列を決定することができる。また、上記生体分子試料にタンパク質を用い、電気泳動画像に基づいて取り出したタンパク質を質量分析することもできる。【００３２】
また、本発明の組織又は細胞の染色方法は、組織又は細胞試料中の生体分子を、有機EL色素から成る発色部と、生体分子を結合する結合部と、発色部と結合部とを連結するスペーサー部とを有する標識色素で標識することを特徴とする。ここで、上記生体分子に核酸又はタンパク質を用いることができる。【００３３】
また、本発明の染色色素は、組織又は細胞試料の染色に用いる染色色素であって、有機EL色素から成る発色部と、組織又は細胞中の生体分子と結合する結合部と、発色部と結合部とを連結するスペーサー部とを有する標識色素から成ることを特徴とする。
【発明の効果】
【００３４】
本発明の生体分子用標識色素は、発色部に有機EL色素を用い、結合部と発色部の間にスペーサー部を設けるようにしたので、おおむね１００％近い標識率を有し、かつ固体状態での高い蛍光強度を与える標識色素を提供することできる。
すなわち、スペーサー部を設けることにより、発色部と標識対象である生体分子との間の立体障害が抑制され、結合部と生体分子の標識部位との結合が容易になる結果、高い標識率が得られたと考えられる。これにより、本発明の標識色素によれば、スペーサー部の長さを制御することにより、生体分子の標識部位の深度に影響されることなく、高い標識率を得ることが可能となる。これにより使用する標識色素の量を大幅に低減できることから、標的分子の検出費用を大幅にコストダウンすることも可能となる
さらに、有機EL色素は固体状態（固体及び半固体を含む）で高い量子収率を有しているので、マイクロアレイなどの基盤上、もしくはビーズ上の乾燥状態でも高い蛍光強度を与える。また、有機EL色素はCy3やCy5に比べ安価であるので、より低コストで生体分子の検出を行うことができる。また、有機EL色素の置換基を変えることにより励起波長及び発光波長を変化させることができるので、蛍光波長の選択の自由度が増加し、オレンジ、イエロー、グリーン、ブルーなど多くの蛍光波長を用いることができる。これにより、ストークスシフトの大きい（励起波長と蛍光波長の差が大きい）２種以上の蛍光色素を用いることが可能となり、一つの試料中に含まれる複数の標的核酸を同時に検出することも可能となる。また、Cy3やCy5は冷凍保存する必要があるのに対し、有機EL色素は化学的に安定であり、常温での長期保存に耐えることができるので、取り扱いが容易である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明の検出方法において、プローブにモレキュラービーコンを用いた場合の発光機構を示す模式図である。
【図２】本発明の検出方法において、IgG抗体のFab'フラグメントの調製方法の一例を示す模式図である。
【図３】本発明の検出方法において、IgG抗体のFab'フラグメントへの有機EL色素の導入方法の一例を示す模式図である。
【図４Ａ】本発明の実施例１における、EL-OSuにより標識された17mer DNAのHPLCスペクトルの一例である。
【図４Ｂ】本発明の実施例１における、EL-OSu-Spにより標識された17mer DNAのHPLCスペクトルの一例である。
【図５Ａ】本発明の実施例１における、EL-OSuにより標識された20mer DNAのHPLCスペクトルの一例である。
【図５Ｂ】本発明の実施例１における、EL-OSu-Spにより標識された20mer DNAのHPLCスペクトルの一例である。
【図５Ｃ】本発明の実施例１における、Alexa594により標識された20mer DNAのHPLCスペクトルの一例である。
【図６Ａ】本発明の実施例１における、EL-OSuにより標識された40mer DNAのHPLCスペクトルの一例である。
【図６Ｂ】本発明の実施例１における、EL-OSu-Spにより標識された40mer DNAのHPLCスペクトルの一例である。
【図７】本発明の実施例１における、EL-OSu-Spの添加量と標識率の関係を示すグラフの一例である。
【図８Ａ】本発明の実施例２における、EL-OSuにより標識されたBSAのHPLCスペクトルの一例である。
【図８Ｂ】本発明の実施例２における、EL-OSu-Spにより標識されたBSAのHPLCスペクトルの一例である。
【図９Ａ】本発明の実施例２における、EL-OSuによる標識後のBSAのTOF MSスペクトルの一例である。
【図９Ｂ】本発明の実施例２における、標識前のBSAのTOF MSスペクトルの一例である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の生体分子用標識色素は、有機EL色素から成る発色部と、生体分子を結合する結合部と、発色部と結合部とを連結するスペーサー部とを有することを特徴とするものである。【００３７】
本発明の標識色素に用いる有機EL色素は、一対の陽極と陰極との間に固体状態で挟持され、陽極から注入された正孔と陰極から注入された電子とが再結合する際のエネルギーにより発光可能な色素であれば特に限定されない。例えば、テトラフェニルブタジエンやペリレン等の多環芳香族化合物、シクロペンタジエン誘導体、ジスチリルピラジン誘導体、アクリドン誘導体、キナクドリン誘導体、スチルベン誘導体、フェノチアジン誘導体、ピラジノピリジン誘導体、アゾール誘導体、イミダゾール誘導体、カルバゾール誘導体そしてテトラフェニルチオフェン誘導体等を用いることができる。さらに、分子内にカルボン酸基を有し、又はカルボン酸基を導入可能な色素であることが好ましい。以下に述べるように、生体分子と結合するための反応性基の導入を容易に行うことができるからである。【００３８】
本発明の標識色素に用いる結合部は、生体分子試料（以下、標的分子という）を結合する反応性基を有しており、その反応性基には、生体分子との間に共有結合又はイオン結合を形成する置換基あるいは求核試薬又は求電子試薬を用いることができる。【００３９】
生体分子との間に共有結合を形成する場合、反応性基は、標的分子のアミノ基、イミノ基、チオール基又はヒドロキシル基と反応可能な官能基が好ましい。有機EL色素と標的分子との間の共有結合としては、アミド結合、イミド結合、ウレタン結合、エステル結合、又はグアニジン結合を形成させることが好ましい。その官能基には、例えば、イソチオシアネート基、イソシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化スルホニル基、塩化アシル基、ハロゲン化アルキル基、グリオキザル基、アルデヒド基、トリアジン基、カルボジイミド基そして活性エステル化したカルボニル基等を用いることができる。好ましくは、イソチオシアネート基、イソシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化アルキル基、トリアジン基、カルボジイミド基そして活性エステル化したカルボニル基から選択されたいずれか１種を用いることが好ましい。より好ましくは、イソシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化アルキル基、トリアジン基、カルボジイミド基そして活性エステル化したカルボニル基から選択されたいずれか１種を用いることが好ましい。標的分子のアミノ基とアミド結合を形成することができ、また標的分子内のイミノ基に直接結合する事ができるからである。さらに好ましくはトリアジン基、カルボジイミド基又は活性エステル化したカルボニル基である。また、これらの有機EL色素がカルボン酸基を有する場合、カルボジイミド誘導体、トリアジン誘導体の存在下で、標的分子中に存在するアミノ基およびイミノ基を直接修飾する事も可能である。さらに、置換基を有しても良いトリアジン基、置換基を有しても良いカルボジイミド基を有する有機EL色素は、DNA塩基中のグアニン、チミンのイミノ基と直接反応するため、PCR法による色素の導入を行う必要が無く、ミスマッチ検出（二本鎖を形成していない塩基の検出）が可能であり、SNP（１塩基多型）解析の試薬として用いることが可能である。【００４０】
また、標的分子との間にイオン結合を形成する反応性基には、アニオン性基、例えばスルホニル基やカルボキシル基を用いることができる。これらのアニオン性基は、生体分子のカチオン性基、例えばアミノ基とイオン結合する。【００４１】
また、反応性基として、共有結合を形成する反応性基とイオン結合を形成する反応性基の両方を用いることもできる。これにより、標的分子の間にさらに強い結合を形成することができる。共有結合を形成する反応性基とイオン結合を形成する反応性基の組合せは特に限定されず、上記の官能基と上記のスルホニル基やカルボキシル基等のアニオン性基の組合せを挙げることができる。【００４２】
なお、標的分子がDNAの場合にはオリゴDNA末端に修飾されたアミノ残基と、タンパク質の場合にはアミノ残基と、ペプチド類の場合にはポリペプチドのアミノ基と、例えばポリリシン誘導体のアミノ残基と、そして糖類の場合には多糖類誘導体骨格内のアミノ基と反応性基を結合させることができる。【００４３】
本発明の標識色素に用いるスペーサー部は、発色部と反応性基とを連結する構成部分であって、共有結合又は原子鎖を含む部分であり、-CH2-、-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO2NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-（Rはアルキル基）、-(CH2-CH2-O)n-（nは１から１０の整数）、-CH=CH-、-C≡C-、-Ar-及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択される官能基を１種以上含むものを用いることができる。
すなわち、スペーサー部は、上記の群から選択された１種の官能基のみで構成しても良く、２種以上の官能基を含む構成とすることもできる。また、選択した一の官能基を２個以上含む構成とすることもできる。【００４４】
例えば、１種の官能基のみで構成する場合、-CONH-、-COO-、-CH2-O-R-、-CH2NH-等が好ましい。また、２種以上の官能基で構成する場合、以下の態様とすることができる。
（１）２種の官能基で構成する場合
-CONH-COO-、-CH2-O-、-CH2-NR- 等が好ましい。
（２）３種以上の官能基で構成する場合
（i）以下の一般式(I)で表されるものを用いることが好ましい。
-(CHR1)p-X-(CHR2)q-      （I）
式中、Xは直接結合又は、-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO2NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-、-CH=CH-、-C≡C-、-Ar-及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択された少なくとも１種の官能基を用いることができ、好ましくは-COO-、-CONH-、-O-、-CH=CH-、-C≡C-又は-Ar-、より好ましくは-COO-、-CONH-、-O-又は-Ar-を用いることができる。また、R1とR2はそれぞれ独立に、水素原子、あるいは芳香環を含んでも良いアルキル基又はアルケニル基等の脂肪族炭化水素基、あるいは芳香族炭化水素基であって、必要によりスルホニル基、ヒドロキシル基、４級アミン基及びカルボキシル基からなる群から選択されたいずれか１種の荷電基により置換されたものを用いることができる。また、Arはアリール基、好ましくは、フェニレン基又はナフチレンで基あり、必要に応じてスルホニル基で置換されたものを用いることができる。pとqはそれぞれ独立に０から２０の整数、好ましくは０から１０の整数、より好ましくは０から５の整数であり、p+q≧1である。
このスペーサー部の具体例を挙げると、-(CH2)p-CONH-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-(CH2)q-、-(CH2)p-CH(-R1-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-CH(-R1-N+H3)-(CH2)q-、-(CH2)p-CH(-R1-COOH)-(CH2)q-、-(CH2)p-CH(-R1-OH)-(CH2)q-、-(CH2)p-(O-CH-)n-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R1-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R1-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R1-N+H3)-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R1-OH)-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R1-COOH)-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-R1(-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-R1(-OH)-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-R1(-N+H3)-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-R1(-COOH)-(CH2)q-、-(CH2)p-Ar-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-COO)-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-N+H3)-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-OH)-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-COOH)-(CH2)q-、-(CH2)p-C≡C-(CH2)q-、-(CH2)p-C=C-(CH2)q-、-(CH2)p-NR-(CH2)q-、-(CH2)p-O-(CH2)q-、-(CH2)p-S-(CH2)q-、-(CH2)p-HN-C(=NH)-NH- (CH2)q-、-(CH2)p-CO-Ar-NR-(CH2)q-等を挙げることができる。より好ましくは、-(CH2)p-CONH-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-(CH2)q-  である。
(ii)以下の一般式(II)で表されるものを用いることが好ましい。
-Y-(CHR3)r-Z-      （II）
ここで、Y及びZは、それぞれ独立に、-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO2NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-CH2NH-、-CH2NR-、-O-、-S-、-NR-、-CH=CH-、-C≡C-、-Ar-及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択された１種の官能基であり、好ましくは、-CONH-と-COO-、-COO-と-COO-、-COO-と-NR- 等の組み合わせである。また、R3は、水素原子、あるいは芳香環を含んでも良いアルキル基又はアルケニル基等の脂肪族炭化水素基、あるいは芳香族炭化水素基であって、必要によりスルホニル基、ヒドロキシル基、４級アミン基及びカルボキシル基からなる群から選択されたいずれか１種の荷電基により置換されたものを用いることができる。また、Arはアリール基、好ましくは、フェニレン基又はナフチレンで基あり、必要に応じてスルホニル基で置換されたものを用いることができる。rは０から２０の整数、好ましくは０から１０の整数、より好ましくは０から５の整数である。このスペーサー部の具体例を挙げると、-CONH-(CH2)r-COO-、-CONH-CH(-R3-OH)-COO-、-CONH-CH(-R3-COOH)-COO-、-CONH-CH(R3-SO3H)-COO-、-COO-(CH2)r-COO-  等を挙げることができる。【００４５】
また、スペーサー部に、アミノ酸又は２〜２０のアミノ酸から成るペプチドリンカーを用いることもできる。アミノ酸には天然又は合成のアミノ酸を用いることができる。ここで、天然アミノ酸には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、4-アミノ-2-ヒドロキシブタン酸、ホモセリン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、リシン、ヒドロキシリシン、アルギニン、システイン、システイン酸、2-アミノ-3-スルホサルファニルプロパン酸、2-アミノ-3-スルホキシプロパン酸、シスチン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、プロリン及び4-ヒドロキシプロリン等が含まれる。【００４６】
合成アミノ酸には、上記天然アミノ酸のD体や、分子内に少なくともアミノ基とカルボキシル基とを有する修飾アミノ酸が含まれる。
修飾アミノ酸は、一般式：H-N(R1)-(R2-CO)-OHで表すことができる。ここで、R1とR2は、それぞれ独立に、エステル、エーテル、チオエステル、チオエーテル、アミド、カルバミド又はチオカルバミドを介して又は介さずに、スルホニル基、ヒドロキシル基、４級アミン基、及びカルボキシル基からなる群から選択されたいずれか１種の荷電基により置換された炭化水素基又は芳香族基又はヘテロ環基を表す。さらに炭化水素基又は芳香族基又はヘテロ環基は、それぞれ、ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基又はアルコキシ基の少なくとも１種で置換されていても良い。【００４７】
本発明のスペーサー部に用いるより好ましいアミノ酸は、スルホニル基を有するアミノ酸である、システイン酸、2-アミノ-3-スルホサルファニルプロパン酸、2-アミノ-3-スルホキシプロパン酸、そしてヒドロキシル基を有するチロシン、スレオニン、4-アミノ-2-ヒドロキシブタン酸、ホモセリン、セリンからなる群から選択されたいずれか１種である。標識色素の水溶性を向上させることができるからである。さらに好ましくは、システイン酸又はセリンである。【００４８】
ペプチドリンカーとしては、それぞれ、-C(-R1)-CONH-C(-R2)-、-C(-R1)-CONH-C(-R2)-CONH-C(-R3)-、-C(-R1)-CONH-C(-R2)-CONH-C(-R3)-CONH-C(-R4)-  で表されるジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドを用いることが好ましい。ここで、R1、R2、R3、R4は、水素原子、炭素数１から６のアルキル基、アルコール基、インドール基、ヒドロキシフェニル基、ベンジル基、グアニジン基、チオエーテル基、アルキルチオール基、イミダゾール基又はアルキルアミン基等の置換基を表す。これらペプチドは、ホモ又はヘテロペプチドであって良い。具体例を挙げると、Ala-Ser、Glu-Ala、Glu-Ala-Leu、Gly-Pro、Gly-Pro-Asn、Ile-Val、Ile-Val-Met等を用いることができる。【００４９】
また、ペプチドリンカーの一部を必要によりスルホニル基、ヒドロキシル基、４級アミン基及びカルボキシル基からなる群から選択された少なくとも１種の荷電基を有するものを用いることができる。例えば、これらのいずれか１個の荷電基を有するアミノ酸を１種以上含むペプチドリンカーを用いることができる。これにより、標識色素の水溶性を向上させることができる。例えば、スルホニル基を有するシステイン酸、2-アミノ-3-スルホサルファニルプロパン酸、2-アミノ-3-スルホキシプロパン酸、ヒドロキシル基を有するチロシン、スレオニン、4-アミノ-2-ヒドロキシブタン酸、ホモセリン、セリンを含む群から選択された少なくとも１種のアミノ酸を含むペプチドリンカーを用いることができる。【００５０】
スペーサー部の長さ及びその構造を変えることにより、発色部と生体分子の標識部位との間の距離を変えて生体分子と標識色素との間の立体障害を抑制することが可能である。すなわち、複雑な構造をとる、タンパク質、ペプチド、DNA等の生体分子の立体構造に合わせて、立体障害を抑制するように標識色素の構造設計をすることができるので、標識率を向上させることが可能となる。あるいは、スペーサー部に、剛直性を与える官能基、例えば、-CH=CH-、-C≡C-、-Ar-及び-CO-Ar-NR-を導入することで、特定の標識部位、例えば深部にある標識部位に対する立体障害を大きくすることもできる。これにより、立体障害の少ない標識部位、例えば浅部のみを選択的に標識する一方、立体障害の少ない別の標識色素で深部の標識部位を標識することにより、深部と浅部の標識部位を識別することも可能となる。【００５１】
本発明の標識色素に反応性基を導入する場合、例えば、スキーム１に示す反応を用いることができる。反応式（I）は、反応性基に活性エステル化したカルボニル基を用い、反応性基と結合するスペーサー部の官能基に-COO-を用いた例を示している。活性エステル化したカルボニル基には、N−ヒドロキシ−スクシンイミドエステルやマレイミドエステルを用いることができる。N−ヒドロキシ−スクシンイミドを用い、縮合剤としてDCCを用いることによりN−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル体を経由してアミド結合により有機EL色素と標的分子が結合する。【００５２】
また、反応式（II）は、活性エステル化したカルボニル基にトリアジン誘導体を用い、反応性基と結合するスペーサー部の官能基に-COO-を用いた例を示している。【００５３】
また、反応式（III）は、反応性基にカルボジイミド基を用い、反応性基と結合するスペーサー部の官能基に-COO-を用いた例を示している。カルボジイミド基には、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）や1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリノエチル）カルボジイミド等のカルボジイミド試薬を用いることができる。カルボジイミド体を経由してアミド結合により有機EL色素と標的分子を結合させることができる。【００５４】
また、反応式（IV）は、スペーサー部に予めカルボジイミド基、トリアジン基を導入した例、すなわち、反応性基と結合するスペーサー部の官能基が反応性基を兼ねる例を示している。これにより、標識色素に別途、反応性基を導入しなくても、標的分子内のアミノ基、イミノ基に対して標識色素を直接結合させる事ができる。【００５５】
【化３】
0005638734.tif 000005
スキーム１．【００５６】
本発明の標識色素に用いる好ましい有機EL色素は、共役系を有する５員環化合物を含む化合物であって、その５員環化合物が１種以上のヘテロ原子、セレン原子又はボロン原子を含むものを挙げることができる。さらに、詳しくは共役系を有する５員環化合物から成る単環化合物と、その５員環化合物と共役系を有する６員環化合物から成る縮合多環化合物を挙げることができる。固体状態であっても、量子収率が大きく、強い蛍光を示すからである。５員環化合物には、アゾール誘導体あるいはイミダゾール誘導体が好ましい。さらに、アゾール誘導体あるいはイミダゾール誘導体は１以上の４級アンモニウム基を有することが好ましい。水溶性を向上させことができるからである。
以下に、縮合多環化合物の具体例について説明する。【００５７】
（モノアゾール誘導体１）
【化４】
0005638734.tif 000006
【００５８】
ここで、R1、R2、R3、R4、R5は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、芳香族炭化水素基、複素環基などの置換基を有しても良い芳香族炭化水素基又は炭化水素基又は複素環基を示し、R1、R2、R3、R4、R5は同じでも異なっていても良い。上記のアルキル基は、好ましくは炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキル基である。また、上記のアルケニル基は、好ましくはビニル基、アリル基、クロチル基、チグリル基又はプレニル基である。また、上記のアルキニル基は、好ましくはエチニル基又はプロパルギル基である。また、上記のアルコキシ基は、好ましくはメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチロキシ基又はフェノキシ基である。また、上記の芳香族炭化水素基は単環又は多環を含み、好ましくはフェニル基、トリル基、キシリル基又はナフチル基であり、より好ましくはフェニル基である。また、上記の複素環基は、好ましくはピロール基、フラン基、チオフェン基、イミダゾール基、オキサゾール基、チアゾール基、ピラゾール基、ピリジン基又はキノリン基であり、より好ましくはフラン基、イミダゾール基又はチオフェン基である。また、上記の炭化水素基は、好ましくは炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキル基である。
また、R'は芳香環を含んでも良いアルキル基又はアルケニル基等の脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基を示す。ここで、アルキル基、アルケニル基芳香族炭化水素基には、上記と同様のものを用いることができる。
また、An-は、Cl-、Br-、I-等のハロゲン化物イオン、CF3SO3-、BF4-、PF6-を示す。なお、以下の一般式においても、特に断らない限り同様である。【００５９】
（モノアゾール誘導体２）
【化５】
0005638734.tif 000007
【００６０】
ここで、式中、R8、R9は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、芳香族炭化水素基、複素環基などの置換基を有しても良い芳香族炭化水素基又は炭化水素基又は複素環基を示し、R8、R9は同じでも異なっていても良い。上記のアルキル基は、好ましくは炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキル基である。また、上記のアルケニル基は、好ましくはビニル基、アリル基、クロチル基、チグリル基又はプレニル基である。また、上記のアルキニル基は、好ましくはエチニル基又はプロパルギル基である。また、上記のアルコキシ基は、好ましくはメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチロキシ基又はフェノキシ基である。また、上記の芳香族炭化水素基は単環又は多環を含み、好ましくはフェニル基、トリル基、キシリル基又はナフチル基であり、より好ましくはフェニル基である。また、上記の複素環基は、好ましくはピロール基、フラン基、チオフェン基、イミダゾール基、オキサゾール基、チアゾール基、ピラゾール基、ピリジン基又はキノリン基であり、より好ましくはフラン基、イミダゾール基又はチオフェン基である。また、上記の炭化水素基は、好ましくは炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキル基である。
なお、以下の一般式においても、特に断らない限り同様である。また、nは１以上の整数、好ましくは１〜５であり、以下の一般式中でも同様である。【００６１】
（ジアゾール誘導体１）
【化６】
0005638734.tif 000008
【００６２】
（ジアゾール誘導体２）
【化７】
0005638734.tif 000009
【００６３】
（ジアゾール誘導体３）
【化８】
0005638734.tif 000010
【００６４】
ここで、式中、R1、R2、R3、R4は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、芳香族炭化水素基、複素環基などの置換基を有しても良い芳香族炭化水素基又は炭化水素基又は複素環基を示し、R1、R2、R3、R4、R6、R7は同じでも異なっていてもよい。R2、R3は、置換基を有しても良い芳香族炭化水素基、好ましくはフェニル基を用いることができ、その置換基には炭素数１から４のアルキル基やアルコキシ基、又は臭素原子を用いることが好ましい。さらに、アルキル基にはメチル基、アルコキシ基にはメトキシ基を用いることが好ましい。また、Xは、置換基を有しても良い窒素原子、硫黄原子、酸素原子、セレン原子又はボロン原子であり、特に断らない限り以下の一般式中でも同様である。【００６５】
（ジアゾール誘導体４）
【化９】
0005638734.tif 000011
【００６６】
（ジアゾール誘導体５）
【化１０】
0005638734.tif 000012
ここで、N→Oは、窒素原子が酸素原子に配位結合している状態を示す。【００６７】
（ジアゾール誘導体６）
【化１１】
0005638734.tif 000013
【００６８】
（ジアゾール誘導体７）
【化１２】
0005638734.tif 000014
【００６９】
（ジアゾール誘導体８）
【化１３−１】
0005638734.tif 000015
【００７０】
【化１３−２】
0005638734.tif 000016
【００７１】
ここで、式中、R10、R11は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、芳香族炭化水素基、複素環基などの置換基を有しても良い芳香族炭化水素基又は炭化水素基又は複素環基を示し、R10、 R11は同じでも異なっていてもよい。上記のアルキル基は、好ましくは炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキル基である。また、上記のアルケニル基は、好ましくはビニル基、アリル基、クロチル基、チグリル基又はプレニル基である。また、上記のアルキニル基は、好ましくはエチニル基又はプロパルギル基である。また、上記のアルコキシ基は、好ましくはメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチロキシ基又はフェノキシ基である。また、上記の芳香族炭化水素基は単環又は多環を含み、好ましくはフェニル基、トリル基、キシリル基又はナフチル基であり、より好ましくはフェニル基である。また、上記の複素環基は、好ましくはピロール基、フラン基、チオフェン基、イミダゾール基、オキサゾール基、チアゾール基、ピラゾール基、ピリジン基又はキノリン基であり、より好ましくはフラン基、イミダゾール基又はチオフェン基である。また、上記の炭化水素基は、好ましくは炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキル基である。また、R12は、置換基を有してもよいオレフィン基又はパラフィン基であり、nは１から３の整数、好ましくは１である。なお、以下の一般式においても、特に断らない限り同様である。【００７２】
（ジアゾール誘導体９）
【化１４−１】
0005638734.tif 000017
【００７３】
【化１４−２】
0005638734.tif 000018
【００７４】
（トリアゾール誘導体１）
【化１５】
0005638734.tif 000019
【００７５】
（トリアゾール誘導体２）
【化１６】
0005638734.tif 000020
【００７６】
５員環化合物として、チオフェン基を含む以下の誘導体を用いることもできる。
（チオフェン誘導体１）
【化１７】
0005638734.tif 000021
【００７７】
（チオフェン誘導体２）
【化１８】
0005638734.tif 000022
【００７８】
（チオフェン誘導体３）
また、チオフェン誘導体の場合、非縮合系の化合物であり、以下の一般式で示される2,3,4,5-テトラフェニルチオフェン誘導体を用いることもできる。【００７９】
【化１９】
0005638734.tif 000023
【００８０】
ここで、式中、R13,R14,R15は、それぞれ独立に、水素原子あるいは直鎖、分岐又は環状の炭素数１から６のアルキル基、置換又は未置換のアリール基、好ましくはフェニル基、トリル基、キシリル基又はナフチル基を表し、あるいは置換又は未置換のアラルキル基、好ましくはベンジル基又はフェネチル基を表し、Ar1およびAr2は置換又は未置換のアリール基、好ましくはフェニル基、トリル基、キシリル基又はナフチル基を表し、さらに、Ar1とAr2は結合している窒素原子と共に含窒素複素環を形成してもよい。また、Y1およびY2は水素原子、ハロゲン原子、あるいは直鎖、分岐又は環状の炭素数１から６のアルキル基、あるいは直鎖、分岐又は環状のアルコキシ基、好ましくはメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチロキシ基又はフェノキシ基、あるいは置換又は未置換のアリール基、好ましくはフェニル基、トリル基、キシリル基又はナフチル基、あるいは置換又は未置換のアラルキル基、好ましくはベンジル基又はフェネチル基、あるいは置換又は未置換のアミノ基を表す。【００８１】
（チオフェン誘導体４）
また、以下の一般式で示される2,3,4,5-テトラフェニルチオフェン誘導体を用いることもできる。【００８２】
【化２０】
0005638734.tif 000024
【００８３】
ここで、式中、Ar1〜Ar6はそれぞれ独立に、置換または未置換のアリール基、好ましくはフェニル基、トリル基、キシリル基又はナフチル基を表し、さらに、Ar1とAr2、Ar3とAr4およびAr5とAr6は結合している窒素原子と共に含窒素複素環を形成していても良い。【００８４】
また、５員環化合物にイミダゾールを用い、以下の一般式で示すイミダゾール誘導体を用いることもできる。ここで、イミダゾール誘導体を構成するイミダゾール基は４級アンモニウム基を有することが好ましい。水溶性を向上させることができるからである。さらに、ピリジノ基を含む場合、より水溶性を向上させるために、ピリジノ基も４級アンモニウム基を有していても良い。なお、以下の一般式中、R''は芳香環を含んでも良いアルキル基又はアルケニル基等の脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基を示す。【００８５】
（イミダゾール誘導体１）
【化２１】
0005638734.tif 000025
【００８６】
（イミダゾール誘導体１）
【化２２】
0005638734.tif 000026
【００８７】
（イミダゾール誘導体２）
【化２３】
0005638734.tif 000027
【００８８】
（イミダゾール誘導体３）
【化２４】
0005638734.tif 000028
【００８９】
【化２５】
0005638734.tif 000029
【００９０】
ここで、イミダゾール骨格は中央のベンゼン環R8, R9, R10, R11 の任意の位置に複数ユニットが結合していても良い。また、R12は、置換基を有してもよいオレフィン基又はパラフィン基であり、nは１から３の整数、好ましくは１である。【００９１】
（カルバゾール誘導体）
また、以下の一般式で示されるカルバゾール誘導体を用いることもできる。
【化２６】
0005638734.tif 000030
【００９２】
また、共役系を有する５員環化合物であって、１種以上のヘテロ原子、セレン原子又はボロン原子を含む単環化合物を用いることもできる。特に限定されないが、例えば、以下の一般式で表されるアゾール誘導体を用いることができる。【００９３】
【化２７】
0005638734.tif 000031
【００９４】
ここで、式中、R1、 R4、 R5は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、芳香族炭化水素基、複素環基などの置換基を有しても良い芳香族炭化水素基又は炭化水素基又は複素環基を示し、R1、R4、R５は同じでも異なっていてもよい。上記のアルキル基は、好ましくは炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキル基である。また、上記のアルケニル基は、好ましくはビニル基、アリル基、クロチル基、チグリル基又はプレニル基である。また、上記のアルキニル基は、好ましくはエチニル基又はプロパルギル基である。また、上記のアルコキシ基は、好ましくはメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチロキシ基又はフェノキシ基である。また、上記の芳香族炭化水素基は単環又は多環を含み、好ましくはビフェニル基、フェニル基、トリル基、キシリル基又はナフチル基であり、より好ましくはビフェニル基、フェニル基である。また、上記の複素環基は、好ましくはピロール基、フラン基、チオフェン基、イミダゾール基、オキサゾール基、チアゾール基、ピラゾール基、ピリジン基又はキノリン基であり、より好ましくはフラン基、イミダゾール基又はチオフェン基である。また、上記の炭化水素基は、好ましくは炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキル基である。【００９５】
本発明の標識色素に用いる有機EL色素には、以上、説明した縮合多環化合物及び単環化合物であれば特に限定されないが、以下の一般式で表されるジアゾール誘導体又はイミダゾール誘導体を好適に用いることができる。【００９６】
【化２８】
0005638734.tif 000032
【００９７】
【化２９】
0005638734.tif 000033
【００９８】
さらに、上記のジアゾール誘導体及びイミダゾール誘導体の中で、ジアゾロピリジン誘導体又はイミダゾロピリジン誘導体を好適に用いることができる。【００９９】
本発明の特に好ましい標識色素は、上記のジアゾロピリジン誘導体又はイミダゾロピリジン誘導体を発色部に含むものであり、以下の一般式で表すことができる。【０１００】
【化３０】
0005638734.tif 000034
【０１０１】
【化３１】
0005638734.tif 000035
【０１０２】
-(CHR')p-X-(CHR")q-は前述のスペーサー部を表す。また、Zは前述の反応性基を表す。
ここで、上記のR2とR3に、置換基を有しても良い芳香族炭化水素基又は炭化水素基を用いることが好ましい。Cy3に対応する緑色蛍光色素を得ることができる。芳香族炭化水素基としてはフェニル基、トリル基、キシリル基又はナフチル基、より好ましくはフェニル基又はトリル基である。さらに、置換基としてはスルホニウム基が好ましい。水溶性を高めることができるからである。【０１０３】
あるいは、上記のR2とR3に、置換基を有しても良いチオフェン基、フラン基、ピロール基、イミダゾール基、オキサゾール基、チアゾール基、ピラゾール基及びピリジン基からなる群から選択された１種、より好ましくはチオフェン基、イミダゾール基又はフラン基を用いることもできる。Cy5に対応する赤色蛍光色素を得ることができる。【０１０４】
標識色素は、反応性基とスペーサー部の組み合わせにより種々の方法により合成することができる。例えば、反応性基に活性エステル化したカルボニル基を用いる場合、予めジアゾロピリジン誘導体又はイミダゾロピリジン誘導体の活性エステル体を合成しておき、この活性エステル体にスペーサー用化合物（例えば、グリシン、アラニン、4−アミノブタン酸、システイン酸、セリン等のアミノ酸）を反応させてカルボン酸体を得、このカルボン酸体を、N−ヒドロキシ−スクシンイミドと反応させることにより、スペーサーを導入した活性エステル体を得ることができる。例えば、スペーサー用化合物にグリシンを用いた場合、-CONH-と-(CH2)-を有するスペーサー部を得ることができる。また、β-アラニンを用いた場合、-CONH-と-(CH2)2-を有するスペーサー部を得ることができる。また、4-アミノブタン酸を用いた場合、-CONH-と-(CH2)3-を有するスペーサー部を得ることができる。また、システイン酸を用いた場合、-CONH-と-SO3-を有するスペーサー部を得ることができる。また、セリンを用いた場合、-CONH-と-OHを有するスペーサー部を得ることができる。システイン酸とセリンを用いることにより、スペーサー部にそれぞれ、スルホニウム基と水酸基を導入することができ、標識色素の水溶性を向上させることができる。【０１０５】
本発明の標識色素は、標識された固体あるいは半固体状態の生体分子の蛍光を測定する検出方法であれば、あらゆる生体分子の検出方法に用いることができる。従来の蛍光色素に代えて有機EL色素を用いることにより、高感度で、化学的に安定で操作性に優れ、さらに低コストの検出方法を提供することができる。本発明においては、前述のように生体分子試料に有機EL色素を直接反応させて、生体分子試料を有機EL色素で標識しても良く、あるいは生体分子試料と、有機EL色素で標識されたプローブとを反応させて生体分子試料を有機EL色素で標識する方法を用いることもできる。また、特異結合を利用した生体分子の検出方法を用いることもできる。さらに、有機EL色素で標識した生体分子試料を電気泳動によりサイズ分離する方法を用いることもできる。【０１０６】
例えば、核酸を検出対象とするDNAマイクロアレイ法では、以下の手順で行うことができる。
（DNAマイクロアレイ法）
本検出方法は、検出すべき標的核酸に有機EL色素を反応させて有機EL色素で標識する一方、標的核酸に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖のプローブ核酸を用意し、一本鎖に変成させた標的核酸とプローブ核酸とを基盤上でハイブリダイズさせ、標的核酸の蛍光を測定する。本検出方法では、基盤に固定するプローブ核酸には、遺伝子の発現を調べる場合、cDNA等をcDNAのライブラリー、ゲノムのライブラリー又は全ゲノムをテンプレートとしてPCR法により増幅して調製したものを用いることができる。また、遺伝子の変異等を調べる場合、標準となる既知の配列をもとにして、変異等に対応する種々のオリゴヌクレオチドを合成したものを用いることができる。【０１０７】
プローブ核酸の基盤上への固定は、核酸の種類や基盤の種類に応じて適当な方法を選択することができる。例えば、DNAの荷電を利用し、ポリリシン等の陽イオンで表面処理した基盤に静電結合させる方法を用いることもできる。一方、一本鎖に変性させた標的核酸と有機EL色素とを混合して反応させることにより、有機EL色素により標識された標的核酸を調製する。反応温度は室温〜60℃、反応時間は2〜48時間で行うことが好ましい。【０１０８】
次いで、標識された標的核酸を基盤上にスポットし、ハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションは、室温〜70℃、そして2〜48時間の範囲で行うことが好ましい。ハイブリダイゼーションにより、プローブ核酸と相補的な塩基配列を有する標的核酸が選択的にプローブ核酸と結合する。その後、基盤を洗浄して、室温で乾燥する。次いで、乾燥した基盤の表面の蛍光強度を蛍光レーザスキャナ法により測定する。蛍光強度により、遺伝子発現のレベルをモニタリングすることができる。なお、上記のハイブリダイゼーションは、プローブ核酸を基盤に固定する方法について説明したが、予め有機EL色素で標識した標的核酸を基盤に固定し、プローブ核酸を基盤上にスポットする方法を用いることもできる。【０１０９】
また、同様に核酸を検出対象とし、プライマーやターミネータを用いるPCR法では、以下の手順で行うことができる。
（PCR法）
（PCR法）
本検出方法は、検出すべき標的核酸の塩基配列に相補的なプローブを有機EL色素で標識し、標的核酸の増幅に先立って、あるいは増幅させた後、標的核酸とプローブとを反応させ、標的核酸の蛍光を測定する。具体的には、標的核酸の伸長反応は酵素（DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ）によって行われ、このとき標的核酸とオリゴヌクレオチドからなるプライマーとが形成した２本鎖核酸配列を酵素が認識し、その認識した位置から伸長反応が行われ、目的とする遺伝子領域だけを増幅させる。酵素が合成を行う際ヌクレオチド(dNTP、NTP)を原料として合成反応が行われる。このとき通常のヌクレオチド(dNTP、NTP)に、例えば、図２７に示すような、色素を有するヌクレオチドを任意の割合で混合すると、その割合の色素が導入された核酸を合成することができる。または、PCRにより、任意の割合でアミノ基を有するヌクレオチドを導入した後に有機EL色素を結合させ、有機EL色素が導入された核酸を合成することも可能である。【０１１０】
【化３２】
0005638734.tif 000036
【０１１１】
酵素が合成を行う際ヌクレオチドを原料に合成反応が行われるが、このときのヌクレオチドの3'のOHをHに変えたものを使用した場合、それ以上核酸の伸長反応が行われず、その時点で反応が終了する。このヌクレオチド、dideoxynucleotide triphospate（ddNTP）はターミネータと呼ばれる。通常のヌクレオチドにターミネータを混ぜて核酸の合成反応を行うと、一定確率でターミネータが導入され、反応が終了するため様々な長さの核酸が合成される。これをゲル電気泳動によりサイズ分離を行うと長さの順番ごとにDNAが並ぶことになる。ここで、ターミネータの各塩基の種類ごとに異なる有機EL色素で標識しておくと、合成反応の終点（3'端）には各塩基に依存した傾向が観察され、ターミネータに標識した有機EL色素を基点に蛍光情報を読み取っていくことで、その標的核酸の塩基配列情報を得ることが出来る。また、ターミネータに代えて、予め有機EL色素で標識したプライマーを用いて標的核酸とハイブリダイズすることもできる。【０１１２】
また、プローブとしてPNA（ペプチド核酸）を用いることもできる。PNAは、核酸の基本骨格構造である五単糖・リン酸骨格を、グリシンを単位とするポリアミド骨格に置換したもので、核酸によく似た三次元構造を有し、相補的な塩基配列を持つ核酸に対し、非常に特異的かつ強力に結合する。そのため、特定核酸検出のためのプローブとして有効である。そのため、in-situ hybridization 法など既存のDNA解析手法のみならず、テロメアPNAプローブに応用することで、テロメア研究の試薬として用いることも可能である。【０１１３】
検出には、例えば、二本鎖DNAを、DNAの塩基配列の全部又は一部に相補的な塩基配列を有し、有機EL色素で標識されたPNAと接触させてハイブリダイズさせ、その混合物を加熱して一本鎖DNAを生成させ、混合物をゆっくりと室温まで冷却させてPNA-DNA複合体を調製し、その蛍光を測定することにより行うことができる。【０１１４】
上記の例では、標的核酸をPCR法により増幅させて、生成物の蛍光を測定する方法について説明したが、この方法では、電気泳動で生成物のサイズを確認して、その後蛍光強度を測定することにより増幅生成物の量を調べる必要がある。これに対し、蛍光色素のエネルギートランスファーを利用して、PCR法の生成物にハイブリダイズさせることで蛍光が生じるように工夫されたプローブを用い、リアルタイムで生成物の量を測定することもできる。これには、例えば、ドナーとアクセプターを標識したDNAを用いることができる。具体的な検出方法としては、特定配列の核酸の存在を確認するモレキュラービーコン法やTaqMan-PCR法やサイクリングプローブ法等を挙げることができる。【０１１５】
例えば、モレキュラービーコン法の発光機構について図１を用い、基盤上にモレキュラービーコンを固定し、目的遺伝子とのハイブリダイゼーションを行う例について説明する。特定のDNA配列を有するDNA（プローブ）の一端に有機EL色素F、他端にクエンチャーQを標識する。クエンチャーQは基盤に固定されており、目的遺伝子導入前では、クエンチャーQと有機EL色素Fとが近接しており蛍光色素は消光される。ここに、標識したDNAと相補的な配列を有する目的遺伝子を導入すると、標識したDNAと目的遺伝子とはハイブリダイゼーションを行うが、これにより有機EL色素FとクエンチャーQの距離が離れ、有機EL色素Fの蛍光を観察することができる。これにより、DNAのハイブリダイゼーションの観察ならびにハイブリダイゼーションの量を測定することが可能となる。【０１１６】
また、タンパク質を検出対象とする場合、電気泳動後のタンパク質の検出には染色色素が用いられている。通常、泳動後のゲル中に、染色色素、例えばクーマシーブリリアントブルー（CBB）を浸透させてタンパク質を染色し、UVを照射して発光させる方法が用いられる。しかしながら、従来の染色色素を用いる方法は簡便であるが、感度が100ng程度と低く微量のタンパク質の検出には適さない。また、ゲルを介して染色色素を浸透させるため、染色に長時間を要するという問題もある。【０１１７】
これに対し、本発明では、タンパク質を電気泳動によりサイズ分離した後、分離したタンパク質に有機EL色素を結合させることによりタンパク質を標識する。本発明の有機EL色素は反応性基を有しており、タンパク質と速やかに定量的に反応し、さらに高感度であり、微量タンパク質の検出には好適である。さらに、サイズ分離したタンパク質を質量分析して同定することもできる。【０１１８】
ここで、タンパク質には、アルブミン、グロブリン、グルテリン、ヒストン、プロタミン、そしてコラーゲン等の単純タンパク質、核タンパク質、糖タンパク質、リボタンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質等の複合タンパク質のいずれも検出対象とすることができる。例えば、リンタンパク質、糖タンパク質、総タンパク質の染色色素に対応させて３種の有機EL色素を用い、二次元電気泳動で分離したタンパク質試料において、リンタンパク質、糖タンパク質及び総タンパク質を染色することができる。また、TOF-Mass等の質量分析を行うことにより、タンパク質を同定できるので、特殊なタンパク質を生成させる、ガンやウィルスによる感染症などの疾病の診断や治療に応用することが可能である。また、コラーゲンは、動物の結合組織を構成するタンパク質であり、独特の繊維状構造をとる。すなわち、３本のポリペプチド鎖からなり、そのペプチド鎖が寄り集まって三重鎖を形成する。コラーゲンは、一般に極めて免疫原性が低いタンパク質であり、食品、化粧品、医薬品等の分野で広く利用されている。しかし、コラーゲンのペプチド鎖に蛍光色素を導入しても、従来の蛍光色素ではその安定性が十分とは言えず、より安定な蛍光色素が必要とされている。そこで、コラーゲンを標識する蛍光色素に有機EL色素を用いることにより、安定かつ高感度な検出を行うことが可能となる。【０１１９】
また、プローブにアプタマーを用いることもできる。アプタマーはオリゴ核酸からなり、塩基配列に依存して種々の特徴ある立体構造をとることができるので、その立体構造を介してタンパク質を含むあらゆる生体分子に結合することができる。この性質を利用し、有機EL色素で標識したアプタマーを特定のタンパク質に結合させ、被検体との結合によるそのタンパク質の構造変化に伴う蛍光変化から間接的に被検体を検出することができる。例えば、蛍光色素で標識したアプタマーを用い、エネルギートランスファーを利用したコカイン検出用バイオセンサが提案されている（J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 4928-4931）。この蛍光色素に代えて、有機EL色素を用いることにより、高感度で取り扱いの容易なバイオセンサを提供することが可能となる。【０１２０】
また、本発明の標識色素を、特異結合を利用した生体分子の検出方法にも用いることができる。すなわち、生体分子から成る被検体又は修飾物質により修飾された該被検体の検出に際し、被検体に特異結合する結合物質又は修飾物質に特異結合する結合物質の一方を、有機EL色素から成る発色部と、生体分子を結合する結合部と、発色部と結合部とを連結するスペーサー部とを有する標識色素で標識し、標識された結合物質からの蛍光を測定することができる。
ここで、上記の被検体又は修飾物質と上記結合物質との組み合わせには、抗原−抗体、ハプテン−抗ハプテン抗体、ビオチン−アビジン、Tag−抗Tag抗体、レクチン−糖タンパク質又はホルモン−受容体を用いることができる。【０１２１】
具体的には、基盤上、溶液中、ビーズ上、抗体上に存在する、抗原又はハプテンに対し、有機EL色素で標識した抗体等の結合物質を作用させ、その抗体の抗原又はハプテン特異的結合能を利用して、特定の抗原又はハプテンを検出する。抗原としては、タンパク質、多糖類、核酸、ペプチドなどが挙げられ、ハプテンとしてはFITCやジニトロフェニル基などの低分子量分子を挙げることができる。抗原又はハプテンと抗体の組み合わせとしては、GFPと抗GFP抗体、FITCと抗FITC抗体などを挙げることができる。
具体例として、以下の方法を用いることができる。
（１）基盤や溶液中に存在する生体分子（抗原：タンパク質、多糖類、核酸、ペプチド）に蛍光標識した抗体を結合させ検出を行う方法。
（２）基盤や溶液中にハプテンを修飾した生体分子（タンパク質、多糖類、核酸、ペプチド）に、蛍光標識した抗ハプテン抗体を結合させ検出を行う方法。
（３）基盤や溶液中にビオチンを修飾した生体分子（タンパク質、多糖類、核酸、ペプチド）に、蛍光標識したアビジンを結合させ検出を行う方法。
（４）基盤や溶液中に存在する生体分子（タンパク質、多糖類、核酸、ペプチド）に抗体を結合させ、さらにその抗体と特異的に結合する蛍光色素を標識した抗体を結合させ検出を行う方法。
（５）基盤や溶液中に存在する生体分子（タンパク質、多糖類、核酸）にハプテンを修飾した抗体を結合させ、さらにそのハプテンと特異的に結合する蛍光色素を標識した抗体を結合させ検出を行う方法。
（６）基盤や溶液中に存在する生体分子（タンパク質、多糖類、核酸）にビオチンを修飾した抗体を結合させ、さらにそのビオチンと特異的に結合する蛍光色素を標識したアビジンを結合させ検出を行う方法。
（７）基盤や溶液中に存在する生体分子（タンパク質、多糖類、核酸）にTag（ヒスチジンなど）を導入し、蛍光色素で標識した抗Tag抗体で検出を行う方法。
これらの標識物は、免疫染色、ELISA、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー等の各種の測定手法に使用することができる。
さらに、具体例を説明すると、例えば、図２に示すように、IgG抗体をペプシンで処理するとF(ab')2と呼ばれるフラグメントが得られる。このフラグメントをジチオスレイトール等で還元するとFab'と呼ばれるフラグメントが得られる。Fab'フラグメントは1つもしくは2つのチオール基（-SH）を有している。このチオール基に対してマレイミド基を作用させて特異的な反応を行うことができる。すなわち、図３に示すように、マレイミド基を導入した有機EL色素をフラグメントのチオール基と反応させることにより、有機EL色素で抗体を標識することができる。この場合、抗体の生理活性（抗原捕捉能）を失うことがない。【０１２２】
また、本発明の標識色素を用いて、金属イオンの検出を行うこともできる。体内のDNAやタンパク質などの安定性や高次構造の維持、機能発現、そして生体内のすべての化学反応を司る酵素の活性化など、生体内で起こるあらゆる生命現象に金属イオンは関与している。そのため、生体内での金属イオンの動きをリアルタイムで観察できる金属イオンセンサは医療分野を初めとしてその重要性が叫ばれている。従来、生体分子に蛍光色素を導入した金属イオンセンサが知られている。例えば、K+イオン存在化において、K+イオン取り込んで特殊な構造をとる配列を有する核酸を利用する金属イオンセンサが提案されている（J. AM. CHEM. SOC. 2002, 124, 14286-14287）。エネルギートランスファーを起こす蛍光色素を核酸の両端に導入する。通常は色素間距離があるためエネルギートランスファーは起きない。しかし、K+イオン存在下では核酸が特殊な形をとる結果、蛍光色素がエネルギートランスファーを起こす距離に近接することで、蛍光を観察することができる。また、ペプチドに蛍光色素を導入した亜鉛イオンセンサも提案されている（J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 3053-3054）。これらの従来の蛍光色素に代えて本発明の有機EL色素から成る標識色素を用いることにより、従来に比べ高感度で取り扱いが容易な金属イオンセンサを提供することが可能となる。なお、生体内に存在する金属イオンであれば、すべての金属イオンを検出することが可能である。【０１２３】
また、本発明の標識色素を用いて、細胞内のシグナル観察を行うこともできる。内部シグナルや環境情報に対する細胞の応答には、イオンから酵素へと多大な分子が関与している。シグナル伝達過程では特殊なプロテインキナーゼが活性化し、特殊な細胞タンパク質のリン酸化を導くことで様々な細胞応答の初期応答を担っていることが知られている。ヌクレオチドの結合と加水分解はこれらの活性に重大な役割を果たしており、ヌクレオチド誘導体を用いることで、シグナル伝達挙動を素早く観察することが出来る。例えば、プロテインキナーゼC（PKC）は細胞膜におけるシグナル伝達において重要な役割を果たしている。このCa2+依存セリン／スレオニンプロテインキナーゼはジアシルグリセロールやフォスファティジルセリンの様な膜構成脂質上で活性化され、イオンチャネルや細胞骨格タンパク質に存在するセリンやスレオニンをリン酸化することで膜表面電化を変えシグナル伝達を行っている。これらを生細胞において動的に観察することで細胞のシグナル伝達の観察を行うことができる。【０１２４】
ここで、ヌクレオチド誘導体は酵素の基質や阻害剤として供給され、孤立性タンパク質の構造と力学の探査、膜結合タンパク酵素の再構成、ミトコンドリアのようなオルガネラ、除膜筋線維のような組織のヌクレオチド結合タンパク質部分に、結合してその調節を行っている。また、最近ではG-タンパク質の阻害剤や活性体のようなシグナル伝達に影響を与える化合物の存在も解ってきている。このヌクレオチド誘導体に本発明の有機EL色素からなる標識色素を導入することで、これらの細胞内シグナル伝達の動的観察を高感度で、かつ取り扱い容易に行うことが可能となる。【０１２５】
また、本発明の標識色素をRNA 干渉作用（RNAi）を利用した遺伝子発現状況の観察に用いることもできる。RNAiは、RNAを細胞に導入した時、それと同じ配列を持った遺伝子の発現がノックダウンされる現象である。RNAiは二本鎖RNA（dsRNA）を細胞に導入することにより、標的遺伝子のmRNA を分解し、発現を抑制する。このプロセスでは、はじめに長鎖のdsRNA(double stranded RNA)がリボヌクレアーゼ活性を有するDicerによって21〜23 merの短いsiRNAに切断される。生成したsiRNAは、中間複合体（RNA-induced silencing complex (RISC)）によって取り込まれ、この複合体が取り込んだsiRNA のアンチセンス鎖と相補的な配列を持つmRNA の切断を行うことが知られている。この分野でも遺伝子発現状況などを観察するために蛍光色素が用いられている。標識する蛍光色素に有機EL色素を用いることにより、安定かつ高感度な検出を行うことが可能となる。【０１２６】
本発明の標識色素は、組織又は細胞試料中の標的核酸や標的タンパク質の発現レベルの検討に用いる組織又は細胞の染色色素としても用いることができる。組織又は細胞の染色は、前述のように反応性基を介して標的核酸あるいは標的タンパク質に有機EL色素を結合させることにより行うことができる。【０１２７】
すなわち、本発明の染色色素は、例えば、有機EL色素を真核細胞の染色に用いると、乾燥状態でも蛍光を発することから標識後の保存などの点で従来の色素よりも優れた性能を示す。また、真核細胞のみならず、細胞骨格用色素としても十分に用いることが可能である。この他、ミトコンドリア、ゴルジ体、小胞体、リソゾーム、脂質二重膜などの標識に用いることが可能である。これら、標識された細胞等は、湿潤及び乾燥のあらゆる条件下で観測が可能であるため、汎用性が大きい。観測に際しては、蛍光顕微鏡などを用いることができる。【０１２８】
また、臨床段階で人体より採取された組織は、ミクロトームなどの機器を用いて薄膜にスライスした後、染色されている。ここでは、Cy色素及びAlexa色素が用いられている。しかしながら、既存の色素は安定性が非常に悪く、再診断の際には、再びサンプルを作製する必要がある。また、作製されたサンプルは標本として保存することが不可能である。しかし、上記の従来の色素に比べ有機EL色素は、非常に安定な色素であるので、染色した組織を標本として保存することが可能である。【０１２９】
本発明の標識キットは、有機EL色素から成る発色部と、生体分子を結合する結合部と、発色部と結合部とを連結するスペーサー部とを有する標識色素を含むが、必要により色素を対象とする生体分子と反応させるための、試薬、酵素、溶媒等を含むことができる。対象とする生体分子は、核酸、タンパク質、ペプチド類、又は糖類である。【０１３０】
また、本発明の別の標識キットは、少なくとも、有機EL色素から成る発色部と該発色部に結合し前述の一般式（I）で表されるスペーサー部とを有する標識色素前駆体を含み、必要により、カルボン酸基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化アルキル基、トリアジン基、カルボジイミド基そして活性エステル化したカルボニル基から選択されたいずれか１種の反応性基を標識色素に導入するための反応性基導入試薬を含むものである。
【実施例】
【０１３１】
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例により限定されるものではない。
合成例１．
有機EL色素として、1, 2, 5,-オキサジアゾロ-[3, 4-c]ピリジン誘導体を用いた。
以下に、スペーサー部として-COO-を導入したオキサジアゾロ-[3, 4-c]ピリジンの活性エステル体の反応例（スキーム２と３）を示す。なお、スペーサー部を有しない活性エステル体をEL-OSu、スペーサー部を導入した活性エステル体をEL-OSu-Spと略す。【０１３２】
【化３３】
0005638734.tif 000037
スキーム２．【０１３３】
次いで、オキサジアゾロピリジン活性エステル体(6)をDMF中、アラニンと反応させ、スペーサー部を導入したカルボン酸体(7)を合成した。その後、カルボン酸体(7)をジオキサン中、N−ヒドロキシスクシンイミドと反応させ、スペーサー部を導入したオキサジアゾロピリジン活性エステル体(8)を合成した。以下に反応例を示す。【０１３４】
【化３４】
0005638734.tif 000038
スキーム３．【０１３５】
各ステップとも反応は穏やかに進行し、カルボン酸体(7)を経由して目的とする活性エステル体(8)を高収率で得た。
（合成手順）
（１）ジケトン誘導体(2)の合成
500mL三口フラスコに4-メトキシアセトフェノン(1)37.5 g (0.25 mol)、亜硝酸ナトリウム0.15 gを酢酸100 mLに溶解した。水浴中、HNO3 100 mLを酢酸100 mLに溶解したものを2時間かけて滴下した。その後、室温で2日間撹拌した。反応混合物を500mLの水にゆっくりと入れ、沈殿を生成させた。沈殿物は濾過し、クロロホルムに溶解した。クロロホルム相を飽和重曹水で洗浄し、10% NaCl 水溶液で2回洗浄した。MgSO4で脱水した後、減圧下、クロロホルムを留去し、オキサジアゾール-N-オキサイド(2)を34.5 g (収率78%)で得た。【０１３６】
（２）ジケトン誘導体(3)の合成
500mL三口フラスコにオキサジアゾール-N-オキサイド(2)17.7 g (0.05 mol)をアセトニトリル400 mLに溶解した。それにZn 12.0 g、AcOH 7 mL、Ac2O 20mLを添加した。水浴中で反応温度が30℃を超えないように冷却した。12時間撹拌して反応終点とした。反応混合物を濾過し、不溶分を除去した。アセトニトリルを減圧下留去して残渣を得た。残渣をクロロホルムで再結晶し、オキサジアゾール-N-オキサイド(3)を10.2 g (収率60%)で得た。【０１３７】
（３）オキサジアゾロピリジンエチルエステル(4)の合成
500mL三口フラスコでオキサジアゾール-N-オキサイド(3)15.6 g (0.046 mol)をブタノール300 mLに溶解した。そこへグリシンエチルエステル塩酸塩 32.0 g (0.23 mol)を添加した。24時間加熱還流を行った。ブタノールを減圧下留去し、残渣を得た。残渣を200mLのクロロホルムに溶解し、10% HCl、飽和NaHCO3、10%NaClで洗浄した。MgSO4で乾燥し、溶媒を留去した。得られた残渣をクロロホルムで再結晶し、オキサジアゾロピリジンエチルエステル(4)を13.0 g (収率 70%)で得た。【０１３８】
（４）オキサジアゾロピリジンエチルエステル(4)の加水分解
500mL三口フラスコでオキサジアゾロピリジンエチルエステル(4)3.0 g (0.007 mol)を200 mLのエタノールに溶解した。そこへKOH 0.62 g (0.01 mol)を添加した。5時間加熱環流を行った後、反応混合物を200 mLの水へ添加した。この水溶液に濃塩酸を滴下してpH 1に調整したところ沈殿が生じた。沈殿物を濾過し、クロロホルムに溶解した。クロロホルム相を10% NaHCO3水溶液、水で洗浄した。クロロホルムを留去して残渣を得た。残渣を水-エタノール (1:1)で再結晶し、2.1 g (収率 81%)のオキサジアゾロピリジンカルボン酸(5)を得た。【０１３９】
（５）活性エステル体(6)の合成
50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジンカルボン酸(5)1.0 g (0.0026 mol)とN-ヒドロキシスクシンイミド0.30 g (0.0026 mol)をDMF 20mLに溶解した。これにN, N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド 0.54 g (0.0026 mol)を30分かけて滴下した。滴下後、室温で30時間撹拌した。減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム）で単離精製し、オキサジアゾロピリジン活性エステル体(6)を0.76 g (収率62%)得た。【０１４０】
（６）カルボン酸体(7)の合成
50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジン活性エステル体（6)  100 mg (0.21 mmol)とアラニン18.8 mg (0.21 mmol)をDMF 20mLに溶解した。その後、室温で12時間撹拌した。反応終了後、減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム−メタノール＝7：3）で単離精製し、カルボン酸体(7)を83 mg (収率88%)得た。【０１４１】
（７）活性エステル体(8)の合成
次いで、50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジンカルボン酸体(7)70 mg (0.16 mmol)とN-ヒドロキシスクシンイミド18.0 mg (0.16 mmol)をDMF 20mLに溶解した。これにDMF 5 mLに溶解したN, N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド 32.2 mg (0.16 mmol)を30分かけて滴下した。滴下後、室温で30時間撹拌した。減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム）で単離精製し、活性エステル体(8)を75.8 mg (収率89%)得た。【０１４２】
合成例２．
有機EL色素としてイミダゾロピリジンエチルエステル誘導体を用いた。以下に、スペーサー部として-COO-を導入したイミダゾロピリジンエチルエステルの活性エステル体の反応例（スキーム４と５）を示す。【０１４３】
【化３５】
0005638734.tif 000039
スキーム４．【０１４４】
次いで、合成例１の場合と同様に、イミダゾロピリジン活性エステル体(3)をアラニンと反応させ、スペーサー部を導入したカルボン酸体(4)を合成し、そのカルボン酸体(4)をジオキサン中、N−ヒドロキシスクシンイミドと反応させ、スペーサー部を導入したイミダゾロピリジン活性エステル体(5)を合成した。以下に反応例を示す。【０１４５】
【化３６】
0005638734.tif 000040
スキーム５．【０１４６】
（１）イミダゾロピリジンエチルエステル(1)の加水分解
500mL三口フラスコでエステル体(1)0.5 g (1.5 mmol)を50 mLのエタノールに溶解した。そこへKOH 0.12 g (2.1 mol)を添加した。5時間加熱環流を行った後、反応混合物を50 mLの水へ添加した。この水溶液に濃塩酸を滴下してpH 1に調整したところ沈殿が生じた。沈殿物を濾過し、クロロホルムに溶解した。クロロホルム相を10% NaHCO3水溶液、水で洗浄した。クロロホルムを留去して残渣を得た。残渣を水で再結晶し、0.3 g (収率 63%)のカルボン酸体(2) を得た。【０１４７】
（２）活性エステル体(3)の合成
50 mL 三口フラスコでカルボン酸誘導体(2)0.2 g (0.6 mmol)とN-ヒドロキシスクシンイミド0.07 g (0.6 mmol)をDMF 10mLに溶解した。これにN, N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド 0.12 g (0.6 mmol)を30分かけて滴下した。滴下後、室温で30時間撹拌した。減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム）で単離精製し、活性エステル体(3)を0.14 g (収率55%)得た。【０１４８】
（３）カルボン酸体(4)の合成
50 mL 三口フラスコでイミダゾロピリジン活性エステル体（3)  80 mg (0.19 mmol)とアラニン17.3 mg (0.19 mmol)をDMF 20mLに溶解した。その後、室温で10時間撹拌した。反応終了後、減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム−メタノール＝7：3）で単離精製し、カルボン酸体(4)を 58 mg (収率 78%)得た。【０１４９】
（４）活性エステル体(5)の合成
次いで、50 mL 三口フラスコでイミダゾロピリジンカルボン酸体(4)54 mg (0.14 mmol)とN-ヒドロキシスクシンイミド16.1 mg (0.14 mmol)をDMF 20mLに溶解した。これにDMF 5 mLに溶解したN, N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド 28.8 mg (0.14 mmol)を30分かけて滴下した。滴下後、室温で30時間撹拌した。減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム）で単離精製し、活性エステル体(5)を62.2 mg (収率 92%)得た。【０１５０】
合成例３．
有機EL色素として合成例１で用いたオキサジアゾロピリジン誘導体を用い、スペーサー部にシステイン酸を用い、反応性基には活性エステル化したカルボニル基とアニオン性基であるスルホニウム基の両方を導入した。オキサジアゾロピリジン活性エステル体(6)をシステイン酸と反応させ、スペーサー部を導入したカルボン酸体(9)を合成した。その後、カルボン酸体(9)をジオキサン中、N-ヒドロキシスクシンイミドと反応させ、スペーサー部を導入したオキサジアゾロピリジン活性エステル体(10)を合成した。以下に反応例を示す。【０１５１】
【化３７】
0005638734.tif 000041
スキーム６．【０１５２】
以下に、合成例１と異なる部分のみの合成手順を示す。
（１）カルボン酸体(9)の合成
50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジン活性エステル体（6)  100 mg (0.21 mmol)とシステイン酸 39 mg (0.23 mmol)をDMF 20mLに溶解した。その後、室温で12時間撹拌した。反応終了後、減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム−メタノール＝7：3）で単離精製し、カルボン酸体(9)を98 mg (収率88%)得た。【０１５３】
（２）活性エステル体(10)の合成
次いで、50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジンカルボン酸体(9) 80 mg (0.15 mmol)とN-ヒドロキシスクシンイミド 19 mg (0.17 mmol)をDMF 20mLに溶解した。これにDMF 5 mLに溶解したN, N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド 35 mg (0.17 mmol)を30分かけて滴下した。滴下後、室温で30時間撹拌した。減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝10：1）で単離精製し、活性エステル体(10)を73 mg (収率 78%)得た。【０１５４】
合成例４．
有機EL色素として合成例１で用いたオキサジアゾロピリジン誘導体を用い、スペーサー部にセリンを用いた。オキサジアゾロピリジン活性エステル体(6)をセリンと反応させ、スペーサー部を導入したカルボン酸体(11)を合成した。その後、カルボン酸体(11)をジオキサン中、N-ヒドロキシスクシンイミドと反応させ、スペーサー部を導入したオキサジアゾロピリジン活性エステル体(12)を合成した。以下に反応例を示す。【０１５５】
【化３８】
0005638734.tif 000042
スキーム７．【０１５６】
以下に、合成例１と異なる部分のみの合成手順を示す。
（１）カルボン酸体(11)の合成
50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジン活性エステル体（6)  100 mg (0.21 mmol)とセリン26 mg (0.25 mmol)をDMF 20mLに溶解した。その後、室温で12時間撹拌した。反応終了後、減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム−メタノール＝7：3）で単離精製し、カルボン酸体(12)を 79 mg (収率 81%)得た。【０１５７】
（２）活性エステル体(12)の合成
次いで、50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジンカルボン酸体(11) 70 mg (0.15mmol)とN-ヒドロキシスクシンイミド 19 mg (0.17 mmol)をDMF 20mLに溶解した。これにDMF 5 mLに溶解したN, N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド 35 mg (0.17 mmol)を30分かけて滴下した。滴下後、室温で30時間撹拌した。減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝10：1）で単離精製し、活性エステル体(12)を 61 mg (収率 72%)得た。【０１５８】
合成例５．
有機EL色素として合成例１で用いたオキサジアゾロピリジン誘導体を用い、スペーサー部にペプチドリンカーとしてアラニルセリン（Ala-Ser）を用いた。オキサジアゾロピリジン活性エステル体(6)をアラニルセリンと反応させ、スペーサー部を導入したカルボン酸体(13)を合成した。その後、カルボン酸体(13)をジオキサン中、N-ヒドロキシスクシンイミドと反応させ、スペーサー部を導入したオキサジアゾロピリジン活性エステル体(14)を合成した。以下に反応例を示す。【０１５９】
【化３９】
0005638734.tif 000043
スキーム８．【０１６０】
以下に、合成例１と異なる部分のみの合成手順を示す。
（１）カルボン酸体(13)の合成
50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジン活性エステル体（6)  100 mg (0.21 mmol)とアラニルセリン 45 mg (0.25 mmol)をDMF 20mLに溶解した。その後、室温で10時間撹拌した。反応終了後、減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム−メタノール＝6：4）で単離精製し、カルボン酸体(13)を72 mg (収率64%)得た。【０１６１】
（２）活性エステル体(14)の合成
次いで、50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジンカルボン酸体(13) 60 mg (0.11 mmol)とN-ヒドロキシスクシンイミド 14 mg (0.12 mmol)をDMF 15mLに溶解した。これにDMF 5 mLに溶解したN, N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド 25 mg (0.12 mmol)を30分かけて滴下した。滴下後、室温で15時間撹拌した。減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝8：2）で単離精製し、活性エステル体(14)を60 mg (収率 86%)得た。【０１６２】
合成例６．
有機EL色素として合成例１で用いたオキサジアゾロピリジン誘導体を用い、スペーサー部にはエチレングリコール酸を用いた。以下に反応式を示す。
【化４０】
0005638734.tif 000044
スキーム９．【０１６３】
（１）酸クロライド体(15)の合成
50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジンカルボン酸体(5) 100 mg (0.27 mmol)をSOCl2 20mLに混合し、２時間加熱環流を行った。室温まで冷却しSOCl2を留去し、酸クロライド体15を94 mg (Y. 90%)で得た。【０１６４】
（２）カルボン酸体（16）の合成
100 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジン酸クロライド体(15) 90 mg (0.22 mmol)をTHF 40mLに混合した。そこへ5mLのTHFに溶解したエチレングリコール酸 20 mg (0.22 mmol)を投入し、１時間攪拌した。その後、THFを留去した。残渣をメタノールで再結晶し、カルボン酸体16を61 mg (Y. 62%)で得た。【０１６５】
（３）活性エステル体（17）の合成
次いで、50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジンカルボン酸体(16) 100 mg (0.22 mmol)とN-ヒドロキシスクシンイミド 29 mg (0.24 mmol)をDMF 25mLに溶解した。これにDMF 10 mLに溶解したN, N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド 50 mg (0.24 mmol)を30分かけて滴下した。滴下後、室温で15時間撹拌した。減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝7：3）で単離精製し、活性エステル体(17)を107 mg (収率 89%)得た。【０１６６】
合成例７．
有機EL色素として合成例１で用いたオキサジアゾロピリジン誘導体を用い、スペーサー部にタウリンを用いて、合成例３のオキサジアゾロピリジン活性エステル体（10）を合成した。【０１６７】
オキサジアゾロピリジン活性エステル体（6） 0.48 g [1.08 mmol] とDCC等の不純物 0.52 g、Taurine (M.W.：125.15) 0.43 g [3.44  mmol]を100 mLのナス型フラスコに入れ、さらに無水DMF 50mLを添加した。次にトリエチルアミン(TEA、M.W.：101.19、1 L≒0.73 kg) 715 μl [514 mmol]加え、4時間攪拌した。このとき、TLC [CHCl3：MeOH = 6：4、原料Rf＝0.89、目的物Rf＝0.69]、TLC [CHCl3：MeOH = 7：3、原料Rf＝0.89、目的物Rf＝0.49]にて確認したところ、反応は2時間でほぼ終了した。
DMFを減圧留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー （CHCl3：MeOH=3:1）で精製し目的物を分取したところ、分取した溶液に結晶が生じたのでそれを濾過した。得られた結晶をHPLC(Figure 3)、TLCにて確認したところ目的物であった。収量は283 mg（収率 58%）であった。【０１６８】
実施例１．
〈オリゴDNAの色素標識及び検出（１）〉
（オリゴDNA）
用いたオリゴDNAは以下の通りである。
17mer DNA    H2N-(C6) - 5'-ACT CCA GTG GTA ATC TA -3'
20mer DNA    H2N-(C6) - 5'-ACT CCA GTG GTA ATC TAC TG-3'
40mer DNA    H2N-(C6) - 5'-ACT CCA GTG GTA ATC TAC TGG GAC GGA ACA GCT TTG AGG T-3'【０１６９】
（標識手順）
標識色素には、合成例１で合成したオキサジアゾロピリジンの活性エステル体8（EL-OSu-Sp)を用いた。オリゴDNAに20mer DNAを用いた例について説明する。
H2N-(C6) - 5'-ACT CCA GTG GTA ATC TAC TG-3' (10 nmol)を含むホウ酸buffer (pH 8.5) 20 μlに、活性エステル体（EL-OSu-Sp）12 nmol (5.7 μg)(1.2当量)を含むDMSO溶液80 μlを加えて室温で6時間振とうした。振とう後、全量が1 mlになるように0.1 M TEAA (triethylamine acetate) buffer (pH7.0)を加え、NAP-10カラム(GE healthcare Sephadex G-25)を用いてオリゴヌクレオチドに由来する成分を分取した。その際、NAP-10カラムはあらかじめ0.1M TEAA buffer 15 mlで平衡化させた後使用した。全量が1 mlになるようにメスアップした試料をカラムに充填し、1 mlの溶液が溶出した後、0.1 M TEAA bufferを1.5 mlチャージした。この直後からの溶出液1.5 mlを分取した。得られた溶液100 μlを逆相HPLCにより分析した。
なお、比較のため、スペーサー部を含まないオキサジアゾロピリジンの活性エステル体（EL-OSu)を用いてオリゴDNAの標識を行った。また、Molecular Probe社製のAlexa594の活性エステル体も一部比較に用いた。
なお、標識率は、HPLCスペクトルのピーク面積を対比することによって算出した。【０１７０】
（HPLC測定条件）
HPLC装置には、日本分光（株）製の LC-2000plus シリーズを用いた。
カラム：GL Science              Inertsil ODS-3 Column              5μm、4.6 mm×250 mm
DNAグラジエント条件
Eluting solvent A: 0.1M TEAA水溶液(pH7.0)
Eluting solvent B: 90% CH3CN/0.1M TEAA水溶液 (pH7.0)
Gradient (B%) 0 min（10%）→30 min（45%）→40 min（100%）→50 min（100%）→60 min（10%）
流速    1ml/min
温度    40℃【０１７１】
（結果）
EL-OSu又はEL-OSu-Spを用いて標識したオリゴDNAのHPLCの結果を、17mer DNA、20mer DNA、40mer DNAについて、図４Ａ〜４Ｂ、図５Ａ〜５Ｃ、図６Ａ〜６Ｂに示す。また、標識率の値を表１から３に示す。【０１７２】
【表１】
0005638734.tif 000045
【表２】
0005638734.tif 000046
【表３】
0005638734.tif 000047
【０１７３】
次に、17mer DNAを用い、EL-OSu-Spとの比率を以下の範囲で変化させた場合の、標識率の変化を調べた。結果を図７に示す【０１７４】
スペーサー部を導入した標識色素EL-OSu-Spを用いることにより、スペーサー部を有しないEL-OSuやAlexa594に比べ標識率を向上させることができた。特に、20mer程度の長さのオリゴDNAであれば、1.2倍モルの添加量で、EL-OSuの約12％、Alexaのtrace量（1％以下）に対し、概ね100％の標識率を得ることができた。また、17merや40mer  DNAは、Alexaでは標識が困難であったが、これらのオリゴDNAについても飛躍的に標識率を向上させることができた。モル比1.2程度でも概ね100％の標識率が得られることから、スペーサー部を導入した標識色素EL-OSu-Spは、オリゴDNAに対して定量的な標識が可能である。Alexa等の従来の標識色素を用いる場合、200倍モル程度添加しても50％前後の標識率しか得られないことを考えると、20mer程度の長さのオリゴDNAであれば、スペーサー部を導入した標識色素EL-OSu-Spは約1/200の添加量で100％の標識率を得ることができるという顕著な効果を有する。【０１７５】
実施例２．
〈オリゴDNAの色素標識及び検出（２）〉
有機EL色素にスペーサー部を有するイミダゾロピリジンの活性エステル体5(im-EL-OSu-Sp)を用いた以外は、実施例１と同様の方法により20mer DNAへの色素標識を行った。【０１７６】
（結果）
オキサジアゾロピリジンの活性エステル体(EL-OSu-Sp)を用いた場合と同様、モル比1.2程度でも概ね100％の標識率が得られた。【０１７７】
実施例３．
〈オリゴDNAの色素標識及び検出（３）〉
有機EL色素に合成例３で合成したスペーサー部を有するオキサジアゾロピリジンの活性エステル体10を用い、DMSOを10μlとして試料液全体の10vol%とした以外は、実施例１と同様の方法により20mer DNAへの色素標識を行った。【０１７８】
（結果）
オキサジアゾロピリジンの活性エステル体8を用いた場合と同様、モル比1.2程度でも概ね100％の標識率が得られた。なお、実施例１では、有機EL色素を溶解させるためDMSOを試料液全体の80vol%としたが、本実施例では10vol%でも有機EL色素が溶解し、優れた水溶性を示した。【０１７９】
実施例４．
〈オリゴDNAの色素標識及び検出（４）〉
有機EL色素に合成例４で合成したスペーサー部を有するオキサジアゾロピリジンの活性エステル体12を用い、DMSOを10μlとして試料液全体の10vol%とした以外は、実施例１と同様の方法により20mer DNAへの色素標識を行った。【０１８０】
（結果）
オキサジアゾロピリジンの活性エステル体8を用いた場合と同様、モル比1.2程度でも概ね100％の標識率が得られた。また、実施例３の場合と同様、優れた水溶性を示した。【０１８１】
実施例５．
〈オリゴDNAの色素標識及び検出（５）〉
有機EL色素に合成例５で合成したスペーサー部を有するオキサジアゾロピリジンの活性エステル体14を用い、DMSOを10μlとして試料液全体の10vol%とした以外は、実施例１と同様の方法により20mer DNAへの色素標識を行った。【０１８２】
（結果）
オキサジアゾロピリジンの活性エステル体8を用いた場合と同様、モル比1.2程度でも概ね100％の標識率が得られた。なお、実施例１では、有機EL色素を溶解させるためDMSOを試料液全体の80vol%としたが、本実施例では10vol%でも有機EL色素が溶解し、優れた水溶性を示した。【０１８３】
実施例６．
〈タンパク質の色素標識及び検出（１）〉
（標識手順）
BSA（Bovine Serium Albumin）のリシン残基のアミノ基とスペーサー部を含むオキサジアゾロピリジンの活性エステル体8（EL-OSu-Sp)）を反応させてアミド結合を形成させて、BSAへの色素標識を行った。具体的には、BSA 1.0 mg (15.05 nmol)を含む炭酸buffer(pH9.0) 100 μlに、活性エステル体35.82 μg(75.25 nmol)を含むDMSO溶液400μl加えて室温で24時間振盪した。その後全量が1 mlになるように0.1 M TEAA buffer(pH7.0)を加え、NAP-10カラム(GE healthcare Sephadex G-25)を用いてBSAに由来する成分を1.5 ml分取した。得られた溶液100μlを逆相HPLCにより分析した。【０１８４】
なお、MALDI TOF MSにより、EL-OSuで標識したBSAの同定を行った。標識したBSA（図９Ａ）は原料（図９Ｂ）に比べ、分子量が2200程増加しており、有機EL色素が約5分子結合していることがわかった。【０１８５】
（HPLC測定条件）
HPLC装置には、日本分光（株）製の LC-2000plus シリーズを用いた。
カラム：GL Science    Inertsil ODS-3 Column    5μm、4.6 mm×250 mm
DNAグラジエント条件
Eluting solvent A: 0.1M TFA水溶液(pH7.0)
Eluting solvent B: 90% CH3CN/0.1M TFA水溶液 (pH7.0)
Gradient (B%) 0 min（5%）→20 min（50%）→60 min（70%）→70 min（100%）→80 min（100%）→90 min（5%）
流速    0 min→20 min, 60 min→90 min ：1 mL/min、20 min→60 min ：0.5 mL/min
温度    40℃【０１８６】
（結果）
スペーサー部を有しないEL-OSuとスペーサー部を有するEL-OSu-Spを用いて標識したBSAのHPLCの結果を、それぞれ図８Ａと８Ｂに示す。標識率を表４に示す。【０１８７】
【表４】
0005638734.tif 000048
【０１８８】
BSAを対象とした場合も、スペーサー部を有するEL-OSu-Spを用いることにより、スペーサー部を有しないEL-OSuを用いた場合よりも飛躍的に標識率を向上させることができた。反応性基である活性エステルと色素分子との間にスペーサー部を導入することにより、BSAの標識部位と色素分子の立体障害がより小さくなったため標識率が向上したと考えられる。また、TOF-MASSの測定結果より、EL-OSuで標識したBSAには５分子の有機EL色素が導入されていることを確認した。EL-OSu-Spの場合、５分子を導入するため5倍モル用いたところ、ほぼ定量的に標識することができた。【０１８９】
実施例７．
〈タンパク質の色素標識及び検出（２）〉
有機EL色素に合成例３で合成したスペーサー部を有するオキサジアゾロピリジンの活性エステル体10を用い、DMSOを10μlとして試料液全体の10vol%とした以外は、実施例５と同様の方法によりBSAへの色素標識を行った。【０１９０】
（結果）
実施例５の場合と同様の標識率で得られた。なお、実施例５では、有機EL色素を溶解させるためDMSOを試料液全体の80vol%としたが、本実施例では10vol%でも有機EL色素が溶解し、優れた水溶性を示した。【０１９１】
実施例８．
〈タンパク質の色素標識及び検出（４）〉
有機EL色素に合成例４で合成したスペーサー部を有するオキサジアゾロピリジンの活性エステル体12を用い、DMSOを10μlとして試料液全体の10vol%とした以外は、実施例５と同様の方法によりBSAへの色素標識を行った。【０１９２】
（結果）
実施例５の場合と同様の標識率が得られた。また、実施例５の場合と同様、優れた水溶性を示した。【０１９３】
実施例９．
〈タンパク質の色素標識及び検出（５）〉
有機EL色素に合成例５で合成したスペーサー部を有するオキサジアゾロピリジンの活性エステル体14を用い、DMSOを10μlとして試料液全体の10vol%とした以外は、実施例５と同様の方法によりBSAへの色素標識を行った。【０１９４】
（結果）
実施例５の場合と同様の標識率が得られた。なお、実施例５では、有機EL色素を溶解させるためDMSOを試料液全体の80vol%としたが、本実施例では10vol%でも有機EL色素が溶解し、優れた水溶性を示した。【０１９５】
実施例１０．
〈タンパク質の色素標識及び検出（６）〉
有機EL色素に合成例６で合成したスペーサー部を有するオキサジアゾロピリジンの活性エステル体17を用い、DMSOを10μlとして試料液全体の10vol%とした以外は、実施例５と同様の方法によりBSAへの色素標識を行った。【０１９６】
（結果）
実施例５の場合と同様の標識率が得られた。なお、本実施例でも優れた水溶性を示した。【０１９７】
以上、説明したように、本発明の標識色素によれば、固体状態でも高い蛍光強度を有するのみならず、標的分子に対して用いる色素量を大幅に低減することが可能である。例えば、従来の標識色素の場合、200倍モル程度が常識とされていたが、これを1/200程度まで低減することが可能となる。これにより使用する標識色素の量を大幅に低減できることから、標的分子の検出費用を大幅にコストダウンすることも可能となる。また、標識反応後、未反応の大量の色素を除去する工程が不要とすることも可能となり、検出方法をより短時間で行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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