(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式(I)：
【化１】
0005477749.tif 000004
〔式中、R1は置換基を有していてもよいアリール基を示し、R2は置換基を有していてもよい2-カルボキシフェニル基を示し、R3及びR4はそれぞれ独立に-(CH2)p-N(R5)(R6)(式中、pは1ないし4の整数を示し、R5及びR6はそれぞれ独立に-(CH2)n-COOH（式中、nは1ないし4の整数を示す）で表される基を示す）を示す〕で表される化合物、その塩、又はそのエステル（ただし、エステルを構成する基は以下の群から選択される：メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、t-ブチル基、ベンジル基、アセトキシメチル基、1-(アセトキシ)エチル基、プロピオニルオキシメチル基、1-(プロピオニルオキシ)エチル基、ブチリルオキシメチル基、1-(ブチリルオキシ)エチル基、イソブチリルオキシメチル基、1-(イソブチリルオキシ)エチル基、バレリルオキシメチル基、1-(バレリルオキシ)エチル基、イソバレリルオキシメチル基、1-(イソバレリルオキシ)エチル基、ピバロイルオキシメチル基、1-(ピバロイルオキシ)エチル基、メトキシカルボニルオキシメチル基、1-(メトキシカルボニルオキシ)エチル基、エトキシカルボニルオキシメチル基、1-(エトキシカルボニルオキシ)エチル基、プロポキシカルボニルオキシメチル基、1-(プロポキシカルボニルオキシ)エチル基、イソプロポキシカルボニルオキシメチル基、1-(イソプロポキシカルボニルオキシ)エチル基、ブトキシカルボニルオキシメチル基、1-(ブトキシカルボニルオキシ)エチル基、イソブトキシカルボニルオキシメチル基、1-(イソブトキシカルボニルオキシ)エチル基、t-ブトキシカルボニルオキシメチル基、1-(t-ブトキシカルボニルオキシ)エチル基、シクロペンタンカルボニルオキシメチル基、1-(シクロペンタンカルボニルオキシ)エチル基、シクロヘキサンカルボニルオキシメチル基、1-(シクロヘキサンカルボニルオキシ)エチル基、シクロペンチルオキシカルボニルオキシメチル基、1-(シクロペンチルオキシカルボニルオキシ)エチル基、シクロヘキシルオキシカルボニルオキシメチル基、1-(シクロヘキシルオキシカルボニルオキシ)エチル基、ベンゾイルオキシメチル基、1-(ベンゾイルオキシ)エチル基、フェノキシカルボニルオキシメチル基、1-(フェノキシカルボニルオキシ)エチル基、(5-メチル-2-オキソ-1，3-ジオキソレン-4-イル)メチル基、及び2-トリメチルシリルエチル基）。
【請求項２】
R1がp-アミノフェニル基又はp-ヒドロキシフェニル基である請求項１に記載の化合物、その塩、又はそのエステル。
【請求項３】
R2が2-カルボキシフェニル基である請求項１又は２に記載の化合物、その塩、又はそのエステル。
【請求項４】
R3及びR4が-(CH2)-N[(CH2)-COOH]2である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の化合物、その塩、又はそのエステル。
【請求項５】
エステルがR3及びR4におけるテトラアセトキシメチルエステルである請求項１ないし４のいずれか１項に記載の化合物のエステル。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の化合物、その塩、又はそのエステルを含む活性酸素測定用試薬。
【請求項７】
活性酸素種がヒドロキシルラジカル、パーオキシナイトライト、又は次亜塩素酸である請求項６に記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性酸素測定用試薬として有用な化合物又はその塩に関するものである。また、本発明は上記化合物又はその塩を含む活性酸素測定用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体および生命現象において一酸化窒素などのフリーラジカル種が情報伝達のセカンドメッセンジャーとして作用しており、循環器系において血圧の制御を行うなど多様な生理作用を発揮していることが知られている。フリーラジカル種の一つである活性酸素としてはスーパーオキサイドアニオン、過酸化水素、ヒドロキシルラジカル、一重項酸素などが挙げられるが、これらのうち、ヒドロキシルラジカルは、血管障害や虚血後の脳障害、あるいは紫外線によるDNA修飾に関わる知見が多数報告され、病因・病態との関係で特に障害性が高い活性酸素種と考えられている。【０００３】
このように活性酸素種の生体内での役割の解明の重要性が高まっているが、その測定方法については課題が多い。ヒドロキシルラジカルを測定する方法については、電子スピン共鳴（ESR）法で測定した多数の報告があるが、ESR法では生細胞を測定試料として使用すること自体が困難であり、個々の細胞レベルでの測定評価は実際上不可能である。一方、活性酸素種を広く測定可能なDCFH-DA (2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、モレキュラー・プローブス社、カタログ番号D-399)を他の活性酸素種生成の阻害剤と共に使用して顕微鏡下でヒドロキシルラジカルを検出する方法も知られているが、阻害剤共存下の成績は生体内での反応とは異なる要素を含んだものになる。またDCFH-DAは、極めて自動酸化をうけやすいため、同一視野を何度も観察する必要がある場合に、自動酸化によるバックグラウンド蛍光が検出を妨害してしまう。さらに、暗所での操作を必要とするなど操作性、保存性の点で極めて不便な方法であった。【０００４】
活性酸素種を簡便かつ高感度に測定できる試薬として、一重項酸素に対して特異的な検出試薬（国際公開WO99/51586号）、及びヒドロキシルラジカル、パーオキシナイトライト、次亜塩素酸などを特異的かつ高感度に測定できる試薬（化合物として、ヒドロキシフェニルフルオレセイン(HPF)、アミノフェニルフルオレセイン(APF)など）、（国際公開WO01/64664号、HPF及びAPFは積水メディカル株式会社により販売されている）が提供されている。しかしながら、後者の試薬では活性酸素種との反応により生じるフルオレセインの細胞内滞留性が悪く細胞から漏出することがあるため、細胞内の微量の活性酸素の測定が困難になる場合があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開WO99/51586号
【特許文献２】国際公開WO01/64664号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、ヒドロキシルラジカルなどの活性酸素の測定用試薬として有用な化合物を提供することにある。また、本発明の別な課題は、上記化合物を含む活性酸素測定用試薬及び上記化合物を用いた活性酸素の測定方法を提供することにある。特に、生体や組織中に微量に存在する活性酸素、より具体的には細胞内に微量に存在する活性酸素をバイオイメージングの手法によって長時間にわたって高感度に測定するための試薬を提供することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、下記の一般式(I)で表される実質的に非蛍光性の化合物がヒドロキシルラジカルなどの活性酸素と生理的条件下で効率的に反応して脱アリール化された蛍光性の化合物を与えること、並びに一般式(I)で表される化合物から生じる脱アリール化された蛍光性物質の細胞内滞留性が極めて高く、細胞内に存在する微量の活性酸素を高感度に測定するための試薬として優れて有用であることを見出した。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。【０００８】
すなわち本発明は、下記の一般式(I)：
【化１】
0005477749.tif 000002
〔式中、R1は置換基を有していてもよいアリール基を示し、R2は置換基を有していてもよい2-カルボキシフェニル基を示し、R3及びR4はそれぞれ独立に-(CH2)p-N(R5)(R6)(式中、pは1ないし4の整数を示し、R5及びR6はそれぞれ独立に-(CH2)n-COOH（式中、nは1ないし4の整数を示す）で表される基を示す）を示す〕で表される化合物、その塩、又はそのエステルを提供するものである。【０００９】
本発明の好ましい態様によれば、R1がアミノ基又は水酸基で置換されたフェニル基である上記の化合物、その塩、又はそのエステル；R1がp-アミノフェニル基又はp-ヒドロキシフェニル基である上記の化合物、その塩、又はそのエステル；R2が2-カルボキシフェニル基である上記の化合物、その塩、又はそのエステル；R3及びR4が-(CH2)-N[(CH2)-COOH]2である上記の化合物、その塩、又はそのエステル；R1がp-アミノフェニル基又はp-ヒドロキシフェニル基であり、R2が2-カルボキシフェニル基であり、R3及びR4が-(CH2)-N[(CH2)-COOH]2である上記の化合物、その塩、又はそのエステル；エステルがR3及びR4におけるテトラアセトキシメチルエステルである上記の化合物のエステルが提供される。【００１０】
別の観点からは、上記の一般式(I)で表される化合物、その塩、又はそのエステルを含む活性酸素測定用試薬が本発明により提供される。
この発明の好ましい態様によれば、反応性の高い活性酸素種の測定用試薬である上記の試薬；活性酸素種がヒドロキシルラジカル、パーオキシナイトライト、又は次亜塩素酸である上記の試薬が提供される。【００１１】
さらに、本発明により、活性酸素の測定方法であって、下記の工程：(A)上記一般式(I)で表される化合物又はその塩と活性酸素とを反応させる工程、及び(B)上記工程(A)で生成した脱アリール化合物（上記一般式(I)においてR1が水素原子である化合物）又はその塩の蛍光を測定する工程を含む方法が提供される。
この発明の好ましい態様によれば、反応性の高い活性酸素種の測定用試薬である上記の方法；活性酸素種がヒドロキシルラジカル、パーオキシナイトライト、又は次亜塩素酸である上記の方法が提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の化合物は活性酸素種、好ましくは反応性の高い活性酸素種（例えばヒドロキシルラジカル、パーオキシナイトライト、又は次亜塩素酸など）の測定用試薬として有用であり、活性酸素種との反応により生じる蛍光性物質が高い細胞内滞留性を有していることから、細胞内に存在する微量の活性酸素種を極めて高感度に長時間にわたって測定できるという優れた特徴を有している。本発明の化合物を含む活性酸素測定用試薬及び上記化合物を用いた活性酸素の測定方法は、特に生体内の特定の細胞や組織中に局在する活性酸素をバイオイメージングの手法によって高感度に測定するための試薬及び測定方法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】HL-60を用いてカルセイン(棒グラフ左)及びフルオレセイン(棒グラフ右)の細胞内滞留性を比較した結果（上図）、及びpKaの比較結果（下図、右側のプロットがフルオレセイン）を示した図である。
【図２】APCと活性酸素種又は窒素種との反応性を示した図である。(A)ヒドロキシルラジカル、(B)パーオキシナイトライト、(C)次亜塩素酸、(D)一重項酸素、(E)スーパーオキシド、(F)過酸化水素、及び(G)一酸化窒素の結果を示す。
【図３】APCと次亜塩素酸との反応をHPLCにより分析した結果を示した図である。（A）APC；（B）APCに次亜塩素酸-を反応させたもの；（C）カルセインの結果を示す。
【図４】HeLa細胞にAPC-AMを適用した結果を示した図である。(A)次亜塩素酸ナトリウム刺激前、(B)次亜塩素酸ナトリウム刺激後の結果を示す。
【図５】HL-60を用いて活性酸素種の検出を行った結果を示した図である。(A)過酸化水素刺激前、(B)過酸化水素刺激なし、(C)過酸化水素刺激ありの結果を示す。
【図６】APF及びAPC-AMを用いて活性酸素種との反応性及び細胞内滞留性を調べた結果を示した図である。図中、(A)〜(C)はAPF、(D)〜(F)はAPC-AMの結果を示す。(A)及び(D)過酸化水素刺激直後、(B)及び(E)30分後、(C)及び(F)60分後の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
R1が示すアリール基としては、例えば、環構成原子数が6個から14個の単環性、二環性、又は三環性アリール基を用いることができる。好ましくはフェニル基又はナフチル基、より好ましくはフェニル基を用いることができる。上記アリール基は環上に1個又は2個以上の置換基を有していてもよい。2個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。置換基の種類及び置換位置は特に限定されないが、例えば、C1-6アルキル基（アルキル基は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせのいずれでもよい。アルキル部分を有する他の置換基のアルキル部分についても同様である。）、C1-6ハロアルキル基、C1-6アルケニル基、C1-6アルコキシ基、ハロゲン原子（ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよい）、シアノ基、ニトロ基、置換基を有することもあるアミノ基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、C1-6アルカノイル基、C1-6ハロアルカノイル基、アロイル基、水酸基、アルキレンジオキシ基などを置換基として用いることができる。
【００１５】
R1としては置換フェニル基が好ましく、モノ置換フェニル基がより好ましい。モノ置換フェニル基としては、無置換のアミノ基又は水酸基を有するフェニル基が特に好適である。置換基の置換位置としては、オルト位又はパラ位が好ましい。R1としてはp-アミノフェニル基又はp-ヒドロキシフェニル基が特に好ましい。
【００１６】
R2が示す2-カルボキシフェニル基のベンゼン環は1個又は2個以上の置換基を有していてもよい。2個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。ベンゼン環上の置換基としては上記のアリール基について説明した基を用いることができ、R2としては無置換の2-カルボキシフェニル基が好ましい。
【００１７】
R3及びR4が示す-(CH2)p-N(R5)(R6)においてpは1ないし4の整数を示すが、好ましくは1ないし3の整数、より好ましくは1又は2、特に好ましくは1を示す。R5及びR6はそれぞれ独立に-(CH2)n-COOHを示し、nは1ないし4の整数を示すが、好ましくは1ないし3の整数、より好ましくは1又は2、特に好ましくは1を示す。
【００１８】
上記一般式(I)で表される化合物は塩として存在する場合がある。塩としては、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などを挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩を挙げることができ、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。アミノ酸塩としてはグリシン塩などを例示することができる。もっとも、本発明の化合物の塩はこれらに限定されることはない。これらのうち、生理学的に許容される水溶性の塩は、本発明の試薬及び測定方法に好適に使用できる。
【００１９】
一般式(I)で表される化合物のエステルとしては、R2が示す2-カルボキシフェニル基のカルボキシ基及びR3及びR4にそれぞれ2個ずつ存在するカルボキシ基からなる群から選ばれる1又は2以上のカルボキシ基のエステルを用いることができ、好ましくはR3及びR4にそれぞれ2個ずつ存在する合計4個のカルボキシ基からなる群から選ばれる1又は2以上のカルボキシ基のエステルを用いることができる。より好ましくはR3及びR4にそれぞれ2個ずつ存在する合計4個のカルボキシ基からなる群から選ばれる3個以上のカルボキシ基のエステルであり、特に好ましいのはR3及びR4にそれぞれ2個ずつ存在する合計4個のカルボキシ基のエステルである。2個以上のエステルが存在する場合には、エステルの残基は同一でも異なっていてもよい。
【００２０】
エステルとしては生理学的に許容されるエステルが好ましい。好適なエステル残基の具体例としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、t-ブチル基、ベンジル基、アセトキシメチル基、1-(アセトキシ)エチル基、プロピオニルオキシメチル基、1-(プロピオニルオキシ)エチル基、ブチリルオキシメチル基、1-(ブチリルオキシ)エチル基、イソブチリルオキシメチル基、1-(イソブチリルオキシ)エチル基、バレリルオキシメチル基、1-(バレリルオキシ)エチル基、イソバレリルオキシメチル基、1-(イソバレリルオキシ)エチル基、ピバロイルオキシメチル基、1-(ピバロイルオキシ)エチル基、メトキシカルボニルオキシメチル基、1-(メトキシカルボニルオキシ)エチル基、エトキシカルボニルオキシメチル基、1-(エトキシカルボニルオキシ)エチル基、プロポキシカルボニルオキシメチル基、1-(プロポキシカルボニルオキシ)エチル基、イソプロポキシカルボニルオキシメチル基、1-(イソプロポキシカルボニルオキシ)エチル基、ブトキシカルボニルオキシメチル基、1-(ブトキシカルボニルオキシ)エチル基、イソブトキシカルボニルオキシメチル基、1-(イソブトキシカルボニルオキシ)エチル基、t-ブトキシカルボニルオキシメチル基、1-(t-ブトキシカルボニルオキシ)エチル基、シクロペンタンカルボニルオキシメチル基、1-(シクロペンタンカルボニルオキシ)エチル基、シクロヘキサンカルボニルオキシメチル基、1-(シクロヘキサンカルボニルオキシ)エチル基、シクロペンチルオキシカルボニルオキシメチル基、1-(シクロペンチルオキシカルボニルオキシ)エチル基、シクロヘキシルオキシカルボニルオキシメチル基、1-(シクロヘキシルオキシカルボニルオキシ)エチル基、ベンゾイルオキシメチル基、1-(ベンゾイルオキシ)エチル基、フェノキシカルボニルオキシメチル基、1-(フェノキシカルボニルオキシ)エチル基、(5-メチル-2-オキソ-1，3-ジオキソレン-4-イル)メチル基、又は2-トリメチルシリルエチル基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００２１】
遊離形態の一般式(I)で表される化合物、その塩、又はそのエステルは、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を例示することができる。
【００２２】
一般式(I)で表される化合物は、置換基の種類に応じて1個または2個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。なお、一般式(I)で表される化合物における2-カルボキシフェニル基のカルボキシ基は分子内でラクトン環を形成することがあるが、ラクトン環を形成した化合物も本発明の範囲に包含されることは言うまでもない。また、上記ラクトン形成に基づく光学活性体も本発明の範囲に包含される。
【００２３】
一般式(I)で表される本発明の化合物は、一般的には、対応のフルオレセイン化合物にR3及びR4を導入してR1が水素原子である化合物を製造した後、この化合物をアリール化することにより製造することができる。アリール化の手段については国際公開WO01/64664号などに具体的に示されているが、例えば、フルオレセイン化合物のアルカリ金属塩を調製しておき、適当な溶媒中でヨウ化アリール化合物と反応させればよい。本発明の一般式(I)で表される化合物の代表的化合物の製造方法が本明細書の実施例に具体的に示されているので、当業者は実施例の具体的説明を基にして、出発原料及び反応試薬を適宜選択し、必要に応じて反応条件や工程を適宜変更ないし修飾することにより、本発明の化合物を容易に製造することが可能である。
【００２４】
なお、反応工程において特定の官能基を必要に応じて保護して反応を行うことにより、目的物を効率的に製造することができる場合があるが、保護基については、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス (Protective Groups in Organic Synthesis, T.W.Greene, John Wiley & Sons, Inc., 1981)などに詳しく説明されており、当業者は適宜の保護基を選択することが可能である。
【００２５】
また、上記製造法における生成物の単離、精製は通常の有機合成で用いられる方法、例えば濾過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、結晶化、各種クロマトグラフィー等を適宜組み合わせ行うことができる。また、上記工程における製造中間体は、特に精製することなく次の反応に供することも可能である。本発明の化合物の塩を製造する場合には、上記製造法においてそれぞれの化合物の塩が得られる場合はそのまま精製すればよればよく、遊離形態の化合物が得られる場合には、遊離形態の化合物を適当な溶媒に溶解又は懸濁した後、塩基を加えて塩を形成させ、必要に応じて精製を行えばよい。
【００２６】
上記一般式(I)で表される本発明の化合物又はその塩は、緩和な条件下、例えば生理的条件下で活性酸素と反応して、脱アリール体であるフルオレセイン化合物（一般式(I)においてR1が水素原子である化合物に相当する）又はそれらの塩を与える性質を有している。一般式(I)の化合物又はその塩は実質的に非蛍光性であり、一方、脱アリール化されたフルオレセイン化合物又はそれらの塩は高強度の蛍光を発する性質を有している。従って、上記式(I)で表される化合物又はその塩を活性酸素と反応させた後、脱アリール化された化合物又はその塩の蛍光を測定することによって、活性酸素を選択的かつ高感度に測定することが可能である。この反応様式は国際公開WO01/64664号に具体的に説明されている。
【００２７】
また、一般式(I)で表される化合物のエステルは、それ自体は活性酸素と反応して蛍光性物質を与える性質を有しない場合があるが、例えば細胞膜を通過して細胞内に移行した後に加水分解酵素によりエステルの開裂を受けて一般式(I)で表される化合物に変換され、生成した一般式(I)で表される化合物が活性酸素と反応して蛍光性物質を与える。従って、一般式(I)で表される化合物のエステルは細胞膜透過性の活性酸素測定用試薬として利用可能である。
【００２８】
本発明の試薬により測定可能な活性酸素の種類は特に限定されず、スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシルラジカル、一重項酸素、過酸化水素などのいずれも測定可能であるが、反応性の高い活性酸素種（例えばヒドロキシルラジカル、パーオキシナイトライト、又は次亜塩素酸など）を高感度かつ選択的に測定することができる。例えば、一般式(I)の化合物又はその塩を活性酸素測定用試薬として用いると、個々の細胞や特定の組織中に局在する活性酸素を正確にかつ簡便に測定できる。
【００２９】
本明細書において用いられる「測定」という用語は、定量、定性、又は診断などの目的で行われる測定、検査、検出などを含めて、最も広義に解釈しなければならない。本発明の活性酸素の測定方法は、一般的には、(A)上記一般式(I)で表される化合物又はその塩と活性酸素とを反応させる工程、及び(B) 上記工程(A)で生成した脱アリール化合物（上記一般式(I)においてR1が水素原子である化合物に相当する）又はその塩の蛍光を測定する工程を含んでいる。上記一般式(I)で表される化合物のエステルを用いる場合には、細胞膜を透過したエステル化合物が加水分解されて生成する一般式(I)で表される化合物又はその塩により上記工程(A)の反応が進行する。
【００３０】
脱アリール化された化合物又はその塩の蛍光の測定は通常の方法で行うことができ、インビトロで蛍光スペクトルを測定する方法や、バイオイメージングの手法を用いてインビボで蛍光スペクトルを測定する方法などを採用することができる。例えば、定量を行う場合には、常法に従って予め検量線を作成しておくことが望ましいが、定量的なヒドロキシルラジカルの発生系として、例えば、ガンマーラジオリシス法などを利用することができ、一重項酸素の発生系として、例えば、ナフタレンエンドパーオキシド系（Saito, I,. et al., J. Am. Chem. Soc., 107, pp.6329-6334, 1985）などを利用することができる。本発明の一般式(I)で表される化合物のエステルは細胞膜を透過して細胞内に取り込まれる性質を有しており、個々の細胞内に局在する活性酸素をバイオイメージング手法により高感度に測定できる。
【００３１】
本発明の活性酸素測定用試薬としては、上記式(I)で表される化合物、その塩、又はそのエステルをそのまま用いてもよいが、必要に応じて、試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、pH調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供される。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１
以下のスキームにより本発明の化合物を製造した。
【化２】
0005477749.tif 000003
【００３３】
3,6-ジヒドロキシ-4,5-ビス-[N,N'-ジ(カルボキシメチル)-アミノメチル]フルオレセイン テトラエチルエステル(2)
フルオレセイン 1 (1.01 g, 3.04 mmol) とジエチルイミノジアセテート(1.6 mg, 9.1 mmol)及びパラホルムアルデヒド(0.31 g, 10.3 mmol) をアセトニトリル(35 ml) と水(15 ml) の混合溶液に懸濁させ、24時間加熱還流した。室温まで放冷後、溶媒を減圧除去してシリカゲルカラムクロマトグラフィー (展開溶媒；1,2-ジクロルエタン) により精製し、淡黄色粉末の化合物2 (2.078 g, 収率：93.1%) を得た。【００３４】
3-ヒドロキシ-4,5-ビス-[N,N'-ジ-(カルボキシメチル)-アミノメチル]-6-(4'-ニトロ)-フェノキシフルオレセイン テトラエチルエステル(3)
化合物2 (1.345 g, 1.83 mmol)と4-フルオロニトロベンゼン (0.29 g, 2.06 mmol)及び炭酸ナトリウム（0.58 g, 5.5 mmol）をジメチルスルホキシド(DMSO, 5 ml) に溶解して8時間加熱還流した。室温まで放冷後、2N 塩酸で中和し1,2-ジクロルエタン/飽和食塩水で抽出した。有機層を集めて硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後に溶媒を留去して未精製の化合物3を得た。これをNHシリカゲルカラムクロマトグラフィー (展開溶媒；n-ヘキサン/1,2-ジクロルエタン) で精製して黄色固体の化合物3 (251.6 mg, 収率：19.4%) を得た。【００３５】
6-(4'-アミノ)-フェノキシ-3-ヒドロキシ-4,5-ビス-[N,N'-ジ-(カルボキシメチル)-アミノメチル]フルオレセイン テトラエチルエステル(4)
化合物3 (363.1 mg, 0.424 mmol) と10% Pd-C (23.6 mg) をメタノール/1,2-ジクロルエタン=1:9 (10 ml) に加えて水素ガス置換して1時間接触還元した。触媒を濾去し、溶媒を留去した後の残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (展開溶媒：1,2-ジクロルエタン/メタノール) で粗精製した後、HPLCにより精製して淡黄色粉末の化合物4 (252.6 mg, 収率：72.1%) を得た。【００３６】
3-ヒドロキシ-4,5-ビス-[N,N'-ジ-(カルボキシメチル)-アミノメチル]-6-(4'-ニトロ)-フェノキシフルオレセイン(化合物5：APC)
化合物4 (42.2 mg, 0.05 mmol) を1N 水酸化カリウム メタノール溶液(40 ml) に溶解して12時間攪拌した。2N HCl 水溶液で中和した後に溶媒を留去し、HPLCにより精製して淡黄色粉末の化合物5 (24.5 mg, 収率：67.2%) を得た。【００３７】
3-ヒドロキシ-4,5-ビス-[N,N'-ジ-(カルボキシメチル)-アミノメチル]-6-(4'-ニトロ)-フェノキシフルオレセイン テトラアセトキシメチルエステル(化合物6：APC-AM)
化合物5 (23.1 mg, 0.03 mmol) とジイソプロピルエチルアミン(DIEA, 167.5 mg, 1.3 mmol) およびブロモメチルアセテート(198.9 mg, 1.3 mmol) をジメチルホルムアミド(5 ml) に溶解し、アルゴン置換して12時間攪拌した。酢酸エチルとpH 7.4のリン酸ナトリウムバッファー（Na-Pi buffer）を用いて抽出し、有機層を集めて硫酸ナトリウムで乾燥して濾過した後、溶媒を留去して残渣をHPCLにより精製して白色粉末の化合物6 (6.8 mg, 21.0%) を得た。【００３８】
化合物5（APC）
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6)
δ 8.00 ( d, 1H, J=7.6 ), 7.83-7.71 ( m, 2H ), 7.32 ( d, 2H, J=7.2 ), 7.15 ( d, 2H, J=7.2 ), 7.03 ( d, 2H, J=8.8 ), 6.74 ( d, 1H, J=8.8 ), 6.66 ( d, 1H, J=8.8 ), 6.63 ( d, 1H, J=8.8 ), 6.54 ( d, 1H, J=8.8 ), 4.44-4.32 ( m, 4H ), 3.75 ( s, 4H ), 3.71 ( s, 4H )
13C-NMR (400MHz, DMSO-d6)
δ 171.7, 171.6, 168.7, 159.3, 158.5, 158.2, 157.4, 152.5, 150.8, 149.9, 135.8, 130.3, 128.9, 128.6, 125.7, 124.9, 124.1, 122.1, 120.3, 118.1, 115.2, 113.9, 113.0, 112.8, 109.3, 82.6, 54.1, 53.8, 47.4, 46.3
HRMS ( ESI+ ): m/z calcd for ( M+H )+, 714.19351; found, 714.19434【００３９】
化合物6 (APC-AM)
1H-NMR (300MHz, DMSO-d6)
δ 8.49 ( d, 1H, J=7.3 ), 7.71-7.59 ( m, 2H ), 7.24 ( d, 2H, J=7.7 ), 6.8 ( d, 2H, J=8.2 ), 6.65 ( d, 2H, J=8.6 ), 6.61 ( s, 2H ), 6.56 ( d, 1H, J=9.0 ), 6.36 ( d, 1H, J=9.0 ), 5.83-5.80 ( m, 4H ), 5.65 ( s, 4H ), 4.62 ( d, 1H, J=8.8 ), 4.42 ( d, 1H, J=14.1 ), 4.32 ( d, 1H, J=12.6 ), 4.32 ( d, 1H, J=9.5 ), 4.30 ( d, 1H, J=11.0), 3.88 ( s, 4H ), 3.73 ( d, 4H, J=4.8 ), 2.08 ( s, 6H ), 2.03 ( s, 6H )
HRMS (ESI-): m/z calcd for ( M-H )-, 1000.26238; found, 1000.26361【００４０】
例２
化合物5（APC）は活性酸素種と特異的に反応する部位を分子内に有するほぼ無蛍光性（Φf=0.007）の物質である。この物質は活性酸素種と特異的に反応してカルセイン(calcein)となって蛍光を発する。このカルセインのテトラアセトキシメチルエステルとフルオレセインのジアセチルエステルをHL-60細胞に取り込ませ、カルセインとフルオレセインの細胞内滞留性を評価した。結果を図1（上図）に示す。カルセイン(棒グラフ左)は60分後でもほとんどHL-60細胞内の蛍光強度が下がらないのに対し、フルオレセイン(棒グラフ右)は15分後であってもHL-60細胞内の蛍光強度が10分の1以下に低下していることが分かる。フルオレセインの蛍光強度低下はフルオレセインの細胞外への漏出が原因であり、カルセインが極めて優れた細胞内滞留性を有していることが示された。また、従来の活性酸素測定用蛍光プローブであるHPF及びAPF（積水メディカル株式会社）は活性酸素種と反応してフルオレセインとなり蛍光を発するが、このフルオレセインのpKaは6.4であり生理的条件下における蛍光強度の安定性に乏しいという問題がある。一方、APCから生成するカルセインのpKaはおよそ5.4であり（図1、下図）、生理的pHにおける蛍光強度が安定しており、かつ非常に大きい（Φf=0.793）。従って、APCを用いることで従来の活性酸素測定用プローブでは達成しえなかった長時間にわたる高感度の観察が可能となることが示された。【００４１】
例３
化合物5（APC）と様々な活性酸素種又は窒素種とを反応させて蛍光スペクトル変化を測定した。測定は以下のように行った。
(1)ヒドロキシルラジカル
10μMのAPCのリン酸緩衝液溶液(0.1 M、pH 7.4、共溶媒として0.02% DMFを含む)を室温下、フラスコ内で激しく攪拌しながら1 M 過酸化水素水溶液を終濃度1 mMとなるように加え、次いで過塩素酸鉄(II)水溶液を終濃度0μM、50μM、100μM、200μM、300μM、500μM、1000μM、2000μMとなるように滴下した。滴下後直ちに蛍光光度計で494nmの励起光にて蛍光スペクトルを測定した。【００４２】
(2)パーオキシナイトライト
10μMのAPCのリン酸緩衝液溶液(0.1 M、pH 7.4、共溶媒として0.02% DMFを含む)を37℃で、キュベット中で攪拌しながら、パーオキシナイトライトの0.1N水酸化ナトリウム水溶液を終濃度0μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、10μMとなるように滴下した。30分後に蛍光光度計で494nmの励起光にて蛍光スペクトルを測定した。【００４３】
(3)次亜塩素酸
10μMのAPCのリン酸緩衝液溶液(0.1 M、pH 7.4、共溶媒として0.02% DMFを含む)を37℃で、キュベット中で攪拌しながら、次亜塩素酸ナトリウムの0.1N水酸化ナトリウム水溶液を終濃度0μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、10μMとなるように滴下した。30分後に蛍光光度計で494nmの励起光にて蛍光スペクトルを測定した。【００４４】
(4)一重項酸素
10μMのAPCのリン酸緩衝液溶液(0.1 M、pH 7.4、共溶媒として0.02% DMFを含む)を37℃、キュベット中で攪拌しながら、熱依存的に一重項酸素を放出することが知られている一重項酸素放出剤EP-1（3-(1,4-ジヒドロ-1,4-エピジオキシ-1-ナフチル)プロピオン酸）のDMF溶液を終濃度100μMになるように添加し、30分後に蛍光光度計で494nmの励起光にて蛍光スペクトルを測定した。【００４５】
(5)スーパーオキシド
10μMのAPCのリン酸緩衝液溶液(0.1 M、pH 7.4、共溶媒として0.02% DMFを含む) を37℃、キュベット中で攪拌しながら、終濃度10μMとなるようキサンチンオキシダーゼ水溶液を加え、続いて終濃度10μMとなるようにキサンチン-DMF溶液を添加した。30分後に蛍光光度計で494nmの励起光にて蛍光スペクトルを測定した。【００４６】
(6)過酸化水素
10μMのAPCのリン酸緩衝液溶液(0.1 M、pH 7.4、共溶媒として0.02% DMFを含む) を37℃、キュベット中で攪拌しながら過酸化水素水溶液を終濃度100μMとなるように添加し、30分後に蛍光光度計で494nmの励起光にて蛍光スペクトルを測定した。【００４７】
(7)一酸化窒素
10μMのAPCのリン酸緩衝液溶液(0.1 M、pH 7.4、共溶媒として0.02% DMFを含む) を37℃、キュベット中で攪拌しながらNOC-13（1-ヒドロキシ-2-オキソ-3-(3-アミノプロピル)-3-エチル-1-トリアゼン:一酸化窒素放出剤）を終濃度10μmol/Lとなるよう添加し、30分後に蛍光光度計で494nmの励起光にて蛍光スペクトルを測定した。【００４８】
結果を図2に示す。図2中、 (A)はヒドロキシルラジカル、(B)はパーオキシナイトライト、(C)は次亜塩素酸、(D)は一重項酸素、(E)はスーパーオキシド、(F)は過酸化水素、及び(G)は一酸化窒素の結果を示している。APCは特にヒドロキシルラジカル、パーオキシナイトライト、又は次亜塩素酸などの反応性の高い活性酸素種(hROS)と速やかに反応して濃度依存的に蛍光強度が上昇することが確認された。一方、一重項酸素、スーパーオキシド、過酸化水素、及び一酸化窒素と反応せず、全く蛍光強度が上昇しないことが確認された。また、これらの蛍光上昇がAPCと活性酸素種との反応により生成したカルセインに由来するものであることを確認するため、APC、APCと次亜塩素酸との反応液、及びカルセインのHPLC分析を下記の条件で行った。【００４９】
分析条件
溶出溶媒 : A = H2O / 0.1 % トリフルオロ酢酸：B = 80 % アセトニトリル / 20 % 水 / 0.1 % トリフルオロ酢酸：A / B = 95 / 5 で分析を開始し、5分後から30分のリニアグラジェントでA / B =20 / 80 とする。
検出 : 蛍光 (ex./em.=470 nm/525nm)
カラム : ODS-3, 4.6 x 250 mm
流速 : 1 mL / min【００５０】
この結果を図3に示す。APCは約19.8分に溶出ピークが確認され(図3中、A)）、カルセインは約21.5分に溶出ピークが確認された（図3中、C））。APCと次亜塩素酸との反応液では未反応のAPCが約19.8分に確認できると共に、次亜塩素酸と反応して生成したカルセインの溶出ピークも約21.5分に確認された（図3中、B））。よって、蛍光上昇が活性酸素種との反応により生成したカルセインによるものであることが確認された。カルセインは水中においてフルオレセインに匹敵する強い蛍光を発し、かつフルオレセインをはるかに凌ぐ極めて高い細胞内滞留性を有している。従って、本発明の化合物は細胞内の微量活性酸素種を長時間にわたって高感度に測定することができる。【００５１】
例４
化合物5（APC）を用いて生細胞内活性酸素種のイメージングを行った。APCの細胞膜透過性を高めたエステル型の化合物6(APC-AM、1.0μM; 0.1% ジメチルホルムアミド(共溶媒))を培地に加えHeLa細胞に15分間負荷した後、500μMの次亜塩素酸ナトリウム刺激を行った。（A）が次亜塩素酸ナトリウム刺激前、(B)が次亜塩素酸ナトリウム刺激後の結果を示す。次亜塩素酸ナトリウム刺激後に非常に強い蛍光が観察されたことから、APC-AMが非侵襲的に細胞内に導入された後に加水分解を受けてAPCが細胞内で生成し、このAPCが次亜塩素酸と反応して非常に強い蛍光を発することが確認された（図4）。この結果から本発明の化合物は次亜塩素酸等の生細胞内の活性酸素種の蛍光イメージングにおいても有用であることが示された。【００５２】
例５
本発明の化合物5（APC）と従来の蛍光プローブであるアミノフェニルフルオレセイン(APF)をHL-60細胞に適用して、活性酸素種との反応性及び反応生成物の細胞内滞留性の比較を行った。HL-60細胞は、血球系の浮遊細胞でありミエロペルオキシダーゼを有しているため、細胞内で過酸化水素と塩素イオンが反応して次亜塩素酸が生成することが知られている。APCの細胞内導入形であるAPC-AM (10μM; 1.0% ジメチルホルムアミド(共溶媒)) を培地に加えHL-60細胞に60分間負荷した後、30分間プレインキュベートし、100μMの過酸化水素刺激を15分行った後、FACS (fluorescence activated cell sorting)により蛍光強度を測定した。結果を図5に示す。(A)は過酸化水素刺激前のHL-60細胞、(B)は過酸化水素刺激を行わずに15分間経過したHL-60細胞、(C)は酸化水素刺激後15分間経過したHL-60細胞の測定結果を示している。(A)と(B)には有意な差は無く、過酸化水素刺激を行った（C）のみ蛍光強度が20倍以上上昇した。よって、HL-60細胞が産生した活性酸素種はAPCと反応させることによりFACSで測定可能なことが示された。【００５３】
同様の手法でAPF及びAPCから生じる活性酸素種との反応生成物について細胞内滞留性の比較を行った。APFおよびAPC-AM (ともに10μM; 1.0% ジメチルホルムアミド(共溶媒)) を培地に加えHL-60細胞に60分間負荷した後、100μMの過酸化水素刺激を15分行った。その後、定期的（0分、30分、60分）に蛍光強度をFACSにより測定した。結果を図6に示す。図6中、(A)〜(C)はAPF、(D)〜(F)はAPC-AMの結果を示し、(A)及び(D)過酸化水素刺激直後、(B)及び(E)30分後、(C)及び(F)60分後の結果を示す。APFと活性酸素種との反応により生成したフルオレセインは刺激直後では蛍光強度の上昇が観察されるため細胞内に留まっていることが確認されるが（A）、反応後に速やかに細胞内から漏出し、30分後には検出が困難となった（B、C）。一方、細胞内でAPC-AMが加水分解されることにより生成したAPCと活性酸素種とが反応して生成するカルセインは刺激直後から蛍光強度に変化が無く、長時間にわたり細胞内に保持されていることが確認された。よって、APCにより微量の活性酸素種（特に細胞内の微量の活性酸素種）を長時間にわたって高感度に検出できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明の化合物を含む活性酸素測定用試薬及び上記化合物を用いた活性酸素の測定方法は、特に生体内の特定の細胞や組織中に局在する活性酸素をバイオイメージングの手法によって高感度に測定するための試薬及び測定方法として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図４】
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