(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鰹、鰹荒節、鰹枯節、宗田鰹、宗田鰹節、鰯、鰯節、鯵、鯵節、鯖、鯖節、煮干、または、その他の雑節の魚肉性タンパク質の熱水抽出後に残留する水不溶性タンパク質を、ｐＨ５．０〜７．０の至適条件下に酵素プロチンＮＹ−１００（商標）を用いて加水分解し、得られた加水分解物を、疎水性樹脂及びその後の分子量１０００の限外濾過に負荷することにより得られる、アンジオテンシン変換酵素阻害活性を有するジペプチドを含有する組成物であって、前記組成物中、  バリン−トリプトファンの配列から成るジペプチドを少なくとも０．０５８質量％、  トリプトファン−チロシンの配列から成るジペプチドを少なくとも０．０１３質量％、  トリプトファン−メチオニンの配列から成るジペプチドを少なくとも０．０２０質量％、  メチオニン−トリプトファンの配列から成るジペプチドを少なくとも０．０１３質量％及び  イソロイシン−トリプトファンの配列から成るジペプチドを少なくとも０．０３９質量％及び／又は  それらの酸付加塩を含有する組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物を含有する医薬組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物を含有する加工食品又は特定保健用食品。
【請求項４】
前記医薬組成物は、降圧剤組成物である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
バリン−トリプトファンの配列から成るジペプチドを少なくとも０．０５８質量％、トリプトファン−チロシンの配列から成るジペプチドを少なくとも０．０１３質量％、トリプトファン−メチオニンの配列から成るジペプチドを少なくとも０．０２０質量％、メチオニン−トリプトファンの配列から成るジペプチドを少なくとも０．０１３質量％及びイソロイシン−トリプトファンの配列から成るジペプチドを少なくとも０．０３９質量％、及び／又はこれらの酸付加塩を含有する組成物の製造方法であって、  １）鰹、鰹荒節、鰹枯節、宗田鰹、宗田鰹節、鰯、鰯節、鯵、鯵節、鯖、鯖節、煮干、または、その他の雑節の魚肉性タンパク質を熱水で抽出し、  ２）その熱水抽出後に残留する水不溶性タンパク質を粉砕し、得られた粉砕物を水分に分散して得られた該水不溶性タンパク質の粒子に、プロチンＮＹ−１００（商標）をｐＨ５．０〜７．０の至適条件下に４０〜６０℃の温度で反応させ、これにより該水不溶性タンパク質の酵素的加水分解を行い、その後、酵素反応を停止させ、そして得られた含水の加水分解反応混合物から水不溶性の粒子を除去し、これにより、疎水性・親水性高分子・低分子ペプチドおよび水溶性アミノ酸を含む水溶液を収得し、  ３）該水溶液から疎水性樹脂カラム法により得られた吸着画分をさらに分子量１０００の限外ろ過に負荷し透過画分の組成物を分離し、さらにその後、前記透過画分の組成物をスプレードライすることからなる、前記製造方法。
【請求項６】
請求項５に記載の製造方法により得られた、組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の組成物を含有する、医薬組成物。
【請求項８】
請求項６に記載の組成物を含有する、加工食品又は特定保健用食品。
【請求項９】
前記医薬組成物は、降圧剤組成物である、請求項７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）を阻害する活性をもち、このことにより、血圧降下作用を示す有用な５種類のジペプチドおよびそれを含有するペプチド組成物に関するものである。本発明のジペプチド、およびペプチド組成物が得られる製法は、魚肉性タンパク質、特に鰹節を熱水抽出した時の残渣として残る不溶性タンパク質をプロチンＮＹ１００（天野エンザイム）酵素により加水分解して得られるジペプチドを疎水性樹脂に吸着させた後、含水アルコールにより脱着、さらに限外ろ過膜(分子量１０００)に透過させること、その強いＡＣＥ阻害活性画分は、アンジオテンシン変換酵素阻害剤及び血圧降下剤の有効成分として利用できる。本発明のＡＣＥ阻害活性の高いジペプチドおよび含有するペプチド組成物は高血圧症の治療または予防に有用であると期待される。
【背景技術】
【０００２】
高血圧症は代表的な生活習慣病であり、我が国においてもその患者数は予備軍を含め、５４９０万人といわれている（厚生労働省：平成１８年国民健康・栄養調査結果）。また、２０１２年のＷＨＯの調査によると世界人口の４分の一が高血圧症あるいはその予備軍であると報告されている。高血圧症は自覚症状が少なく、サイレントキラーともいわれ、脳出血、クモ膜下出血、脳梗塞、心筋梗塞、狭心症、腎硬化症等種々の合併症を引き起こすことが知れており、高血圧症の発症メカニズムについて様々な研究が行われてきている。
【０００３】
血圧の調節系として、昇圧に関与するレニン・アンジオテンシン系と降圧に関与するカリクレイン・キニン系が重要な役割を果たしている。レニン・アンジオテンシン系では肝臓から分泌されるアンジオシノーゲンが腎臓で生産されるレニンによってアンジオテンシンＩとなり、更にアンジオテンシン変換酵素(ＡＣＥ)によってアンジオテンシンＩＩに変換される。このアンジオテンシンＩＩは血管平滑筋を収縮させ、血圧を上昇させる。一方、降圧系のカリクレインはキニノーゲンに作用してブラジキニンを産生する。このブラジキニンには血管を拡張して血圧を下げる効果があるが、ＡＣＥにはこのブラジキニンを分解してしまう作用がある。このように、ＡＣＥは昇圧ペプチドであるアンジオテンシンＩＩの産生と降圧ペプチドであるブラジキニンの不活化という二つの作用によって血圧の上昇に関与していることが知られている。
従って、このＡＣＥの酵素活性を抑制することにより血圧の上昇を抑制することが可能となる。このＡＣＥ阻害活性物質として開発されたプロリン誘導体であるカプトプリル(Ｄ−２−メチル−３−メルカプトプロパノイル−Ｌ−プロリン)やエナラプリル等は高血圧症の治療に広く用いられている。しかし、製薬の場合は、服用により副作用である空咳が認められ、ＱＯＬの面から問題があるのも事実である。また、休薬するとリバウンドすることも知られている。
【０００４】
よって、天然物から降圧作用を有する成分を調査し、あるいは天然物から精製して、活用しようとする動向はある。その中で最近では食品素材タンパク質の酵素分解物であるペプチドにＡＣＥ阻害活性のあることが報告されている。例えば、ゼラチンのコラーギナーゼ分解物(特許文献１)、カゼインのトリプシン分解物(特許文献２、特許文献３および特許文献４)、イワシ筋肉のペプシン分解物(特許文献５)、かつお節のサーモライシン分解物(特許文献６)、ゴマ蛋白のサーモライシン分解物(特許文献７)、κ−カゼインのペプシン等の分解物(特許文献８)等多数の報告がなされている。これらのペプチドは天然物由来のアンギオテンシン変換酵素阻害剤は食品あるいは食品原料から得られるので低毒性で安全性の高い降圧剤となることが期待されるからである。
微生物あるいは種々の食品中にもＡＣＥ阻害物質が見出され、降圧剤としての実用化が検討されている（非特許文献１）。
そしてＡＣＥ阻害活性を有するペプチドの製造法についても、幾つかの報告が為されている（特許文献９、１０、１１、１２、１３、１４、１５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭５２−１４８６３１号公報
【特許文献２】特開昭５８−１０９４２５号公報
【特許文献３】特開昭６１−３６２２６号公報
【特許文献４】特開昭６１−３６２２７号公報
【特許文献５】特開平３−１１０９７号公報
【特許文献６】特開平４−１４４６９６号公報
【特許文献７】特開平８−２３１５８８号公報
【特許文献８】特開平８−２６９０８８号公報
【特許文献９】特開平６−７１８８号公報
【特許文献１０】特許第２７９４０９４号公報
【特許文献１１】特許第２８７３３１８号公報
【特許文献１２】特開２００６−３４７９３７号公報
【特許文献１３】特開２００１−２４０６００号公報
【特許文献１４】特開平６−２９８７９４号公報
【特許文献１５】特開２０１０−１５５７８８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】末網邦男、発酵と工業、４６巻(Ｎｏ．３)、１７９〜１８２頁(１９８８)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
食品素材由来のＡＣＥ阻害活性を有するペプチドは副作用、毒性等の安全性の点でも問題が少なく、通常の食品として摂取することが可能であることが大きな利点となっている。
しかし、上記の報告のペプチドの多くのものは、それの構成アミノ酸数が５以上のものである（特許文献１、２、３、４、５、８）。これらアミノ酸残基数の多いペプチドは摂取後にペプシン、トリプシン、キモトリプシン等の消化酵素により分解され易く、それらのＡＣＥ阻害活性が生体中で消失したり、また、分解されない場合でもその分子構造が大きいために吸収され難いといわれている。
さらに、ＡＣＥ阻害ペプチド組成物やその製法については、特許文献９では限外ろ過膜（分子量３０００−１００００）透過液から低分子成分の逆浸透膜により除去した画分の血圧降下作用を有するＡＣＥ阻害ペプチド混合物を得ているが、塩、遊離アミノ酸の除去による阻害活性の上昇を目的としており、分画には至っておらず、逆浸透膜での具体的な成分ペプチドの追跡を明確にしていない。特許文献１０ではいちじく由来の分子量１００００以下の物質からカラムクロマトグラフィーにより分離精製、目的とするオリゴペプチドを得ることができるとしているが、合成で製造できること、その単離方法に終始しており、具体的に天然物から産業上有効な工業生産できるには至っておらず、限外ろ過膜１００００の精製までしか示されていない。特許文献１１ではゼインまたはグルテンミールのサーモライシン加水分解物であって、分子量が１００００以下の画分の含有量が固形分基準で３０％以上であるゲルろ過や限外ろ過により得る方法があるが、分子量１００００透過液に含まれる分子量１０００以下の含有量が９５％であることの根拠が示されていない。特許文献１２では畜肉タンパク質由来の血圧降下ペプチドであって、ミオシン、アクチンをアマノＳ等の酵素で加水分解したペプチド含有組成物を得ているが、精製については、ラボスケールに止まっており、単離ペプチドの合成が記載されている。その工業的大量生産は一般的な酵素調製方法を述べているに過ぎない。また、阻害ペプチドの精製に、樹脂を用いているが、構造決定をその目的としている。特許文献１３ではタンパク質のACE阻害酵素分解物を平均細孔直径３ｎｍ以下の活性炭を用いて処理する方法が記載されており、ＡＣＥ阻害活性を低下させることなく、苦みや臭いを除去することができたとしている。阻害活性の上昇を目的とはしていない。特許文献１４では合成樹脂に接触させて非吸着画分に苦みペプチドを除去する方法を提案しており、非吸着画分に阻害活性が残存することと記載されている。一方、本発明では吸着画分に高ＡＣＥ阻害活性が認められ、非吸着画分にはＡＣＥ不阻害活性が示され、さらに限外ろ過の透過液に、より消化耐性に優れた低分子のＡＣＥ阻害活性ペプチドを得ることができる。
さらに得られたＡＣＥ阻害活性ペプチドは、ＨＰＬＣに負荷することにより、一回のＨＰＬＣ操作で、高阻害活性ジペプチドを精製、単離、同定することができる。一般に、酵素分解物からのペプチドの単離には、複数、５回程度のカラム操作が必要なことから煩雑であることが指摘されており、このことは、本発明のＡＣＥ阻害ペプチドが精度良く分画されていることを裏付け、不要なペプチドの存在が少ないことが示唆される。さらに、本発明のＡＣＥ阻害ペプチドはＡＣＥ阻害活性の高いペプチドの集合体であり、それゆえに、降圧効果の力価の高さを示す。
【０００８】
したがって、本発明の課題は、経口摂取したとき消化酵素により分解されにくく、体内でのＡＣＥ阻害活性が失われにくい、そのままで小腸粘膜吸収可能な、ＡＣＥ阻害高活性を有すジペプチドとその含有するペプチド組成物を提供すること。
さらに、本発明は上記のジペプチドを一種以上含有してなるアンジオテンシン変換酵素阻害剤あるいは血圧降下剤あるいは飲食用組成物（飲食料又は特定保健用食品）を提供する。
【０００９】
上記のように、天然有機物および食品由来のアンジオテンシン変換酵素阻害物質は、人体に対する安全性をもつことから重要性が高く、生活習慣病予防のためにも大きな研究課題である。
【００１０】
本発明は、この課題を解決するためになされたものであって、アンジオテンシン変換酵素を有効に阻害することにより、血圧上昇を抑制する新規で安全な物質を、食品素材から見出し、その阻害物質の構造を明らかにするとともに、品質および価格面から適度な濃縮法を開発し、アンジオテンシン変換酵素阻害物質を含む食品素材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
鰹節を熱水抽出した後に残渣として残る水不溶性タンパク質を、プロテアーゼであるプロチンＮＹ１００（天野エンザイム）で加水分解して得られた生成分解物中に、上記問題を解決するペプチドが存在するのではないかと考え、該生成分解物の中にアミノ酸数が２以下でＡＣＥ阻害活性を有するペプチドが含有されるか、探索を行った。
その結果、下記のアミノ酸配列をもち且つＡＣＥ阻害活性を有する５種のジペプチドを、鰹節熱水抽出残渣である水不溶性タンパク質のプロチンＮＹ１００（天野エンザイム）による加水分解生成物から中に見出し、それらジペプチドを単離することに成功して本発明を完成するに至った。
【００１２】
バリン−トリプトファンの配列から成るジペプチド、トリプトファン−チロシンの配列から成るジペプチド、トリプトファン−メチオニンの配列から成るジペプチド、メチオニン−トリプトファンの配列から成るジペプチド若しくはイソロイシン−トリプトファンの配列から成るジペプチドであって、しかもアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有するジペプチドを提供する。また、本発明は上記ジペプチドを一種以上含有してなる飲食用組成物、アンジオテンシン変換酵素阻害剤および血圧降下剤を提供する。
【００１３】
本発明者らが種々研究を行い、その結果として、鰹タンパク質の中に、アンジオテンシン変換酵素阻害物質の存在が推測され、そして、この鰹節タンパク質中のアンジオテンシン変換酵素阻害物質が、逆相分配系樹脂に吸着される性質のものであることが判ってきた。さらに、限外ろ過（分子量１０００）膜透過液に消化耐性な高活性画分が得られることも分かった。この阻害物質が、鰹節を原料とし熱水抽出により得られた不溶性タンパク質残渣を、プロテアーゼ、好ましくは、食品工業用のプロテアーゼ、特に、プロチンＮＹ１００（天野エンザイム）で分解して、疎水性吸着樹脂に吸着させ、含水有機溶媒により溶出させ、さらに、限外ろ過膜（分子量１０００）処理によりＡＣＥ阻害透過画分が高収量で得られ、かつ簡単に濃縮できること、そして、得られた阻害物質中の各成分について、ＵＰＬＣクロマトグラフィーを用いて、ＡＣＥ阻害活性の強い成分を単離し、その成分の阻害活性値(ＩＣ５０値)の測定および構造解析を行ったところ、この成分で表されるアミノ酸配列をもち且つアンジオテンシン変換酵素阻害活性をもつジペプチドであることが判ってきたことによるものである。
【００１４】
上述の目的を達成するための手段として、バリン−トリプトファンの配列から成るジペプチド、トリプトファン−チロシンの配列から成るジペプチド、トリプトファン−メチオニンの配列から成るジペプチド、メチオニン−トリプトファンの配列から成るジペプチド若しくはイソロイシン−トリプトファンの配列から成るジペプチドよりなるアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドを主とするアンジオテンシン変換酵素阻害物質を提供し、また、鰹節熱水抽出残渣タンパク質を、プロテアーゼ、例えば、プロチンＮＹ−１００（天野エンザイム）で分解後、直ちに疎水性吸着樹脂に吸着させ、含水有機溶媒で溶出し、限外ろ過膜（分子量１０００）透過液に高いＡＣＥ阻害活性を有することを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害物質を提供するものである。一般に、限外ろ過膜処理は、数日間を要することから、その使用に関しては、腐敗の問題が解決されておらず、現在も食品での使用は例を見ない。課題として、温度を下げる、ｐＨを下げることは、設備費用、ランニングコストの問題、塩酸の使用による品質の問題から明確な解決法は見あたらない。また、限外ろ過膜（分子量１００００）と、逆浸透膜の併用があるが、本発明の様に正確な分子量分画はなされていない。この点を改良し、疎水性樹脂処理の脱着を５０％エタノール溶液で行うことにより、阻害活性のない画分と遊離アミノ酸を除去して精製１段階目のＡＣＥ阻害活性を上昇させること、さらに、次にアルコール存在下による限外ろ過膜（分子量１０００）処理工程による透過液に高活性成分が認められ、腐敗のない安定した製造工程から得られるＡＣＥ阻害ペプチドを提供する。
【００１５】
疎水性吸着樹脂すなわち芳香族系修飾型樹脂（例えば、三菱化学製：セパビーズＳＰ２０７）は、芳香環に臭素を化学的に導入した芳香族系（スチレン−ジビニルベンゼン系）合成吸着剤で、細孔表面の疎水吸着性が強いことから親水性の高い有機物（疎水性が低い物質）に対しても優れた吸着性能を発揮すると思われ、アミノ酸分離精製、タンパク質除去、天然抽出物精製、発酵液前処理等に用いられてよい。
【００１６】
本発明で用いるジペプチドは鰹節熱水抽出残渣タンパク質の酵素分解法、有機化学的な合成方法によりアミノ酸を段階的に導入する方法、加水分解酵素の逆反応を利用したペプチド合成法、遺伝子工学的方法等によって製造することができる。
【００１７】
鰹節熱水抽出残渣である水不溶性タンパク質の酵素分解法により前記のジペプチドを製造する方法について説明する。原料の鰹節タンパク質として、それをさらに精製した熱水抽出不溶性画分を用いる場合について説明する。
【００１８】
作用酵素としては、好ましくは、食品工業用途のプロテアーゼを挙げることができる。例えば、プロチンＮＹ１００（天野エンザイム）を挙げることができる。ここで、プロチンＮＹ１００（天野エンザイム）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来のもので、至適ｐＨは７．０、至適温度は５５℃である。一方、基質濃度は反応時に攪拌混合ができる範囲内であればいずれでもよいが、攪拌が容易なタンパク質濃度２〜３０％(ｗ／ｖ)の範囲で行うのが好ましい。添加量は力価により異なるが通常はタンパク質あたり０．０１重量％以上、好ましくは０．１ 〜１０重量％が適当である。反応のｐＨ、温度は至適ｐＨ、至適温度付近を用いればよく、ｐＨ５．０〜９．０、好ましくは６．０〜７．５、温度４０〜６０℃好ましくは４５〜５５℃が適当である。反応中のｐＨの調整は必要に応じ水酸化ナトリウム水溶液、塩酸等により行う。
【００１９】
酵素反応時間は酵素の添加量、反応温度、反応ｐＨによって異なるため一定ではないが、通常は１〜５０時間程度である。
【００２０】
酵素分解反応の停止は、加水分解物の加熱、ｐＨの変化による酵素の失活など公知の方法に従って行うことができる。ついで加水分解液を固液分離（例えば遠心分離、濾過等） し、分離液を限外濾過、ゲル濾過等により分別して例えば分子量が １００００以下の画分を含有する液を得る。この液中には本発明のジペプチドが含有されており、以下この液またはその濃縮物（例えばスプレードライ） をさらに分別して目的のジペプチドを得ることが出来る。
【００２１】
本ジペプチドの酸付加塩は常法により製造することができる。例えば本ジペプチド（塩基性アミノ酸残基を含むもの）とそれに対し１当量の適当な酸とを水中で反応させて凍結乾燥することにより得ることができる。
【００２２】
本ジペプチドおよびその酸付加塩はＡＣＥ阻害作用ひいては血圧降下作用を有しヒトをはじめとする哺乳動物の高血圧症の治療、予防に有効であると期待される。
【００２３】
本ジペプチドおよびその酸付加塩はそのまま、または通常少なくとも１つの製薬補助剤と製薬組成物にして使用する。
【００２４】
本ジペプチドおよびその酸付加塩は非経口的（すなわち、静脈注射、直腸投与等）または経口的に投与し、各投与方法に適した形態に製剤することができる。
【００２５】
注射剤としての製剤形態は、通常滅菌水溶液を包含する。上記形態の製剤はまた緩衝剤ｐＨ調節剤（リン酸水素ナトリウム、クエン酸等）、等張化剤（塩化ナトリウム、グルコース等）、保存剤（パラオキシ安息香酸メチル、ｐ-ヒドロキシ安息香酸プロピル等）等の水以外の他の製薬補助剤を含有することができる。該製剤は細菌保持フィルターを通す濾過、組成物への殺菌剤の混入、組成物の照射や加熱によって滅菌することができる。該製剤はまた殺菌固体組成物として製造し、用時滅菌水等に溶解して使用することもできる。
【００２６】
経口投与剤は胃腸器官による吸収に適した形に製剤する。錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、粉末剤は常用の製薬補助剤、例えば結合剤（シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビット、トラガカント、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース等）、賦形剤（ラクトース、シュガー、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビット、グリシン等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ等）、崩壊剤（ポテトスターチ、カルボキシメチルセルロース等）、湿潤剤（ラウリル硫酸ナトリウム等）を包含することができる。錠剤は常法によりコーティングすることができる。経口液剤は水溶液等に、ドライプロダクトにすることができる。そのような経口液剤は常用の添加剤例えば保存剤（ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル、ソルビン酸等）を包含していてもよい。
【００２７】
本ＡＣＥ阻害剤あるいは血圧降下剤中の本ジペプチドまたはその酸付加塩の量は種々かえることができるが、通常５〜１０％(ｗ／ｗ) 、特に１０〜６０％(ｗ／ｗ)が適当である。本ＡＣＥ阻害剤あるいは血圧降下剤の投与量はヒトに対して投与する場合、有効成分として０．０１〜５０ｍｇ/ｋｇ/日が適当である。
【００２８】
また、本ジペプチドは多量に摂取しても生体に悪影響を与えない利点を有することから、そのまま、または種々の栄養分等を加えて、もしくは飲食品中に含有させて血圧降下作用、高血圧予防の機能をもたせた機能性食品、健康食品として食してもよい。すなわち、例えば各種ビタミン類、ミネラル類等の栄養分を加えて、例えば栄養ドリンク、豆乳、スープ等の液状の食品や各種形状の固形食品、さらには粉末状としてそのままあるいは各種食品へ添加して用いることもできる。機能性食品、健康食品としての本ＡＣＥ阻害剤あるいは血圧降下剤中の有効成分の含有量、摂取量はそれぞれ上記製薬における含有量、投与量と同様でよい。
前記のジペプチドの有機化学的合成法としては液相法、固相法の２種があり、いずれも常法、例えば泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦及び脇道典著、「ペプチド合成の基礎と実験」、丸善株式会社、１９８５、に従って行うことができる。液相法では、例えば、本ジペプチドのＣ末端に位置すべきアミノ酸であってそのカルボキシル基をベンジル基（Ｂｚｌ ）、ｔ−ブチル基(ｔ−Ｂｕ )等で保護したアミノ酸と、該Ｃ末端アミノ酸の隣に位置すべきアミノ酸であってそのα−アミノ基をｔ−ブチルオキシカルボニル基 ( Ｂｏｃ )、ベンジルオキシカルボニル基（Ｚ）等で保護したアミノ酸をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド等に溶解し、それらをジシクロヘキシルカルボジイミド ( ＤＣＣ )及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール( ＨＯＢＴ )の存在下通常室温で一夜反応させる。ついで生成物のアミノ保護基を常法によって除去した後のジペプチド誘導体を必要に応じ、アミノ基を保護した第３のアミノ酸と同様に反応させ、アミノ保護基を除去し、必要に応じ同じ手順を繰り返して本ジペプチド誘導体を得る。反応させるアミノ酸がヒドロキシル基、グアニジノ基またはイミダゾリル基を有する場合には、これらの基は一般に上記反応に先立って保護すべきである。アルコール性ヒドロキシル基の保護基はＢｚｌ、ｔ−Ｂｕ等、フェノール性ヒドロキシル基の保護基はＢｚｌ等、グアニジノ基の保護基はトシル基 ( Ｔｏｓ)等、イミダゾリル基の保護基は Ｔｏｓ等を包含する。最終反応の終了後、すべての保護基を除去して本ジペプチドを得る。これらの保護基の導入及び除去は常法により行うことができる。
【００２９】
他方、固相法に関してはペプチドシンセサイザーを用いる方法が近年広く用いられており、例えばアプライドバイオシステムズ社製の４３０Ａ型ペプチドシンセサイザーを用いて本トリペプチドを製造することができる。すなわち、基本的には、本ジペプチドのＣ末端に位置するアミノ酸が結合したフェニルアセトアミドメチル（ＰＡＭ ）樹脂 Ｌ−Ｘａａ−Ｏ−ＣＨ２−ＰＡＭ (Ｘａａ) はアミノ酸残基) ( アプライドバイオシステムズ社から入手し得る) のＮ側から、Ｂｏｃでアミノ基を保護したα−アミノ酸（Ｂｏｃ−アミノ酸） をペプチド結合と Ｂｏｃの除去の繰り返しによって段階的に延長する。Ｂｏｃ−アミノ酸は ＤＣＣの使用によるその対称的無水物を中間体として経由する延長反応に付す。上記 Ｂｏｃ−アミノ酸またはＬ−Ｘａａ−Ｏ−ＣＨ２−ＰＡＭにおいて、反応に関与すべきでない反応性官能基がある場合には一般に適当な保護基によって保護すべきである。４３０Ａ型ペプチドシンセサイザーを用いる合成系においてはアミノ酸原料に加え以下の試薬及び溶媒を用いる：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン( ＴＦＡ中和剤 )、ＴＦＡ ( Ｂｏｃ切断 )、ＭｅＯＨ(生成尿素系化合物の溶解及び除去) 、ＨＯＢＴ (０．５Ｍ  ＨＯＢＴ／ＤＭＦ)、ＤＣＣ( ０．５Ｍ  ＤＣＣ/ジクロロメタン( ＤＣＭ) 、ＤＣＭ 及びＤＭＦ(溶媒) 、中和剤( ７０％エタノールアミン、２９．５％ メタノール) ( 廃液の中和) 。アミノ酸原料及びこれらの試薬及び溶媒は所定の場所に装填する。これらの使用はペプチドシンセサイザーが自動的に行う。反応温度及び時間の調整も自動的に行われるが、反応温度は通常室温である。上記手順によってジペプチド中の反応性基が保護されたジペプチド−Ｏ−ＣＨ２−ＰＡＭが得られる。上記固相ペプチド合成の実際の操作はアプライドバイオシステムズ社による４３０Ａ型ペプチドシンセサイザーユーザーズマニュアルによって行う。
【００３０】
得られた、反応性官能基が保護されたジペプチド−Ｏ−ＣＨ２−ＰＡＭを常法、例えば前記「ペプチド合成の基礎と実験」または４３０Ａ型ペプチドシンセサイザーユーザーズマニュアルに記載された方法、例えば、保護基の切断によって生成するカチオンを捕獲するスカベンジャーとしてチオアニソール及び／またはエタンジチオールの存在下ＴＦＡと共のトリフルオロメタンスルホン酸(ＴＦＭＳＡ)(ＴＦＡはＴＦＭＳＡの希釈剤) によって処理して、樹脂及び保護基を切断し、それによって目的とするジペプチドを得る。
【００３１】
本発明ジペプチドは、上記のとおり有機合成によって製造してもよい。けれども、経口摂取する飲食品または医薬品に添加してＡＣＥ阻害活性を発揮させる目的のためには、鰹節等に由来するタンパク質をプロチンＮＹ１００（天野エンザイム）で分解し、さらには、単離精製して得られるところの、上記５種のジペプチドの少なくとも一種を含む経口摂取可能な組成物として製造することが好ましい。
【００３２】
原料としては、鰹、鰹荒節、鰹枯節、宗田鰹、宗田鰹節、鰯、鰯節、鯵、鯵節、鯖、鯖節、煮干他雑節等の魚肉、およびそれらの熱水抽出物残渣が使用できる。
【００３３】
プロチンＮＹ１００（天野エンザイム）による分解で、本発明のジペプチドを得る場合、原料となる鰹節タンパク質を、まず前処理として、加熱処理によるアミノ酸、水溶性タンパク質の除去を行うことが好ましい。また、プロチンＮＹ１００（天野エンザイム）酵素分解を効率よくするために、原料となる素材は細かく粉砕してから水に攪拌・懸濁することが好ましい。また、得られたタンパク質は難溶性であるが、酵素反応の為に最適なｐＨになるように仮性ソーダを加え、均一に分散・懸濁・溶解させる。これにタンパク質１００ｇあたり、０．１〜１０重量％のプロチンＮＹ１００（天野エンザイム）を加え、ｐＨ５．０〜９．０、温度４０〜５５℃で０．５〜３０時間、攪拌操作を加えながらタンパク質分解を行った後、加熱処理（９８℃、１５分間）によって、酵素の活性を失活させる。分解液はバイブスクリーンで未分解タンパク質を除去後、デカンタ、デラバル、超高速遠心分離機(１５０００回転/分)や濾過処理（セライト濾過：Ｈｙｆｌｏ  Ｓｕｐｅｒ  Ｃｅｌｉｔｅなど）等で未分解物、沈殿物を除き、得られた濾液を苛性ソーダもしくは塩酸を用いて中和後、濃縮する。このようにして得られた鰹節ペプチドにはバリン−トリプトファン、トリプトファン−チロシン、トリプトファン−メチオニン、メチオニン−トリプトファン、イソロイシン−トリプトファンがそれぞれ０．０００５重量％から０．５重量％含まれる。
【００３４】
本発明のジペプチドとして、上記の得られたプロチンＮＹ１００（天野エンザイム）酵素分解物やこれをさらにハイポーラスポリマー樹脂（疎水性吸着樹脂）やイオン交換樹脂等で処理して高分子のタンパク質や、モノマーなアミノ酸、さらに塩類を除去し、限外ろ過に通して高分子ペプチドを除くことが出来、本発明のジペプチドを豊富に含有する粗精製品を得、これをそのまま用いることが出来る。以下、このような分解物および粗精製物を総称して、ジペプチドを豊富に含有する組成物と呼ぶ。
【００３５】
精製によって本発明のペプチドを得る場合には、上記濃縮物をゲル濾過カラムクロマトグラフィー、イオン交換樹脂やハイポーラスポリマー樹脂を用いたクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等で、ＡＣＥ阻害活性を有する本発明のペプチド分画を集め、さらに、この活性画分をＯＤＳカラム等の逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等を用いた通常のペプチド精製法で、ほぼ純粋な各ペプチドに精製することができる。なお、本発明のジペプチドは鰹節および鰹節熱水抽出残渣物に限らず、鰹、鰹熱水抽出残渣物、宗田鰹、宗田鰹節、宗田、宗田熱水抽出残渣物他、魚肉タンパク質からも上記に示した方法で得ることができる。ジペプチドまたはそれを豊富に含む組成物のＡＣＥ阻害活性は、例えば試験例１に記載した方法で測定できる。
【００３６】
化学合成によって本発明のペプチドを得る場合には、通常のペプチド合成に用いられる固相法あるいは液相法のいずれの方法でも合成ができる。合成によって得られた本発明のペプチドは逆相高速液体クロマトグラフィー、イオン交換樹脂やハイポーラスポリマー樹脂を用いたクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を用いた通常の精製法で精製することができる。さらに限外ろ過により高分子ペプチドを除去し、ＡＣＥ阻害活性の上昇と消化耐性を有するペプチドを得ることが出来る。
【００３７】
このようにして得られたジペプチドまたはそれを豊富に含む組成物のＡＣＥ阻害作用の比活性は強いことから極めて有用なACE阻害剤として用いることができる。さらに胃腸管からの吸収もよく熱に対しても比較的安定であることから、各種飲食物の形態および医薬品製剤のいずれに応用することも可能である。
【００３８】
したがって、本発明では上記ジペプチドを一種以上添加配合してなるところの、アンジオテンシン変換酵素阻害作用の発揮を期待しうる飲食用組成物（飲食料）が提供される。また、および上記ジペプチドを一種以上含有してなるアンジオテンシン変換酵素阻害剤と血圧降下剤とを提供するものである。
【００３９】
本発明のジペプチドを飲食品、医薬品等に使用、配合する場合、鰹節熱水抽出残渣タンパク質のプロチンＮＹ１００（天野エンザイム）酵素による分解物からジペプチドを十分に精製したものを用いても良く、あるいは化学合成により得られた合成品を用いても良い。しかし、本発明のペプチドは安定且つＡＣＥ阻害活性が強いので、上記のとおり粗精製品あるいはプロチンＮＹ１００（天野エンザイム）酵素分解物をそのままジペプチドを豊富に含む組成物として用いて十分なＡＣＥ阻害活性を得ることが出来る。
【００４０】
本発明の飲食用組成物（飲食料）は、上記ジペプチドの一種以上を、１回の摂取量として０．００１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．０１ｍｇ〜２０ｍｇ添加して製造される。本発明のペプチド組成物は、取り扱いが容易で安定な固体ないし粉末であり、水への溶解性もよい。また、胃腸管からの吸収もよい。したがって、食品への添加の時期、及び方法に特別の制限はなく、粉末状、溶液状、懸濁液状等として、食品製造の原料段階、中間工程、最終工程に、食品分野で慣用の方法で添加することが可能である。本発明のジペプチドを含有する飲食用組成物を、一時的、断続的、継続的または日常的に摂取することにより、アンジオテンシン変換酵素を阻害し、例えば血圧降下作用が可能である。飲食品の形態としては、固形状、半流動状、流動状などを挙げることができる。固形状食品としては、シート状、タブレットやカプセルなどの錠剤、顆粒粉末などの形態の一般食品および健康食品が挙げられる。半流動状食品としては、ペースト状、ゼリー状、ゲル状などの、また、流動状食品としては、ジュース、清涼飲料、茶飲料、ドリンク剤などの形態の一般食品および健康食品が挙げられる。飲食物を栄養ドリンクや調味料として、本発明のジペプチドを継続して摂取することにより、血圧の上昇を抑制することも可能である。
【００４１】
本発明によるＡＣＥ阻害剤または降圧剤である形の医薬組成物は、本発明のジペプチドを、上記飲食用組成物と同様の量で含有する。本発明の医薬組成物は、患者のアンジオテンシン変換酵素を阻害し、例えば血圧降下作用を発揮させるために、高血圧症状の患者に一時的に投与してもよく、あるいは本発明の医薬組成物の有効成分は天然物由来であることから、継続して安全に使用することもできる。本発明の医薬組成物により高血圧を治療または予防することができる。医薬組成物の形態は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ等の経口投与剤が好ましい。非経口投与用の製剤としては、静脈、動脈、皮下、筋肉を通して投与するため、あるいは鼻腔から吸入するための、無菌の液剤が挙げられる。液剤は、用時溶解できる乾燥固体であってもよい。注射用製剤は有効成分のジペプチドを生理食塩水に溶解し、通常の無菌操作により注射用製剤に製造することができる。
【００４２】
本発明手段においては、原料として鰹節を用い、その熱水抽出処理により、アミノ酸および水溶性タンパク質を除き、不溶性タンパク質残渣を得る。この鰹節熱水抽出残渣タンパク質をプロチンＮＹ１００（天野エンザイム）酵素により酵素分解処理する。
【００４３】
次いで、この酵素分解後の液を、吸着能力を効率的にする上において有効である、バイブスクリーン、デラバル、シャープレス、セライトろ過処理を行った後に、疎水性吸着樹脂を充填したカラムに負荷し、そのカラム内を流過させることで吸着を行なう。
【００４４】
疎水性吸着樹脂に吸着したアンジオテンシン変換酵素阻害物質は、含水エタノール等の含水有機溶媒を用いて溶出させる。
【００４５】
この溶媒により溶出を行なう際も、吸着させた前述の阻害物質の前記溶媒による溶出を効果的に行わせるために、その溶媒を供給する前に、水の供給により、水に溶解する物質を溶出させる処理を行なうことが有効である。すなわち、酵素分解物水溶液は、カラムの約２〜１０倍容量が望ましく、カラムに負荷した後に、次に、水をカラムの約２〜１０倍量を通過させる。非吸着画分を全て、溶出させる。さらに、エタノール５０％濃度で脱着を行い、目的の吸着画分を得る。
【００４６】
エタノール溶液により溶出したアンジオテンシン変換酵素阻害物質を含む画分は、その溶出液を、限外ろ過（分子量１０００）に負荷し、高阻害活性透過液画分を減圧濃縮し、噴霧乾燥(スプレードライ)することで、粉剤の、アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドを主体とする食品素材の製品が粉末の形態で得られる。
【００４７】
このアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドを主とする食品素材は、前述の溶出液を、高速液体クロマトグラフィーを用いて成分の単離を行ない、アセトニトリル・トリフルオロ酢酸でイソクラティック溶出することにより、アンジオテンシン変換酵素阻害活性の強い成分に精製・単離された形態のものが得られる。
【発明の効果】
【００４８】
本発明によれば、長い食経験から安全性が立証されている食材である鰹節を原料として、プロチンＮＹ１００（天野エンザイム）との反応により、アンジオテンシン変換酵素阻害活性をもつ５種類のジペプチドを得ることが出来た。また、酵素分解物を疎水性吸着樹脂に吸着させ、含水有機溶媒で溶出することにより高活性なペプチド画分を生産できることも判った。さらに、限外ろ過（分子量１０００膜）に通液循環させ、消化耐性な高ＡＣＥ阻害ペプチドを得ることも分かった。さらに、動物実験においても少量で降圧作用が発現することも分かった。本製法により得られるジペプチドを含む鰹節ペプチドは日常摂取する食品として安全で有効性の高い素材であることが明らかであり、今後の高齢化社会にとって非常に意義の有る食品素材であり、特定保健用食品、機能性食品等への利用が期待される。本製法は工業規模での機能性素材の生産に幅広く活用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】実施例７の鰹節ペプチドのＳＨＲに対する血圧降下作用を示すグラフである。
【図２】実施例７の鰹節ペプチドのＳＨＲに対する血圧降下作用を、心拍数で示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
試験例１
ＡＣＥ阻害活性測定は次のように行った。すなわち、以上のようにして得た本ジペプチドのＡＣＥ阻害活性は、Ｃｈｅｕｎｇ  ａｎｄ  Ｃｕｓｈｍａｎの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒａｍａｃｏｌｏｇｙ，２０，１６３７（１９７１））の緩衝液をリン酸緩衝液からホウ酸緩衝液に変えた方法に準じて測定した。
すなわち、ラビットラングアセトンパウダー５ｇを０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ ８．３ ) ５０ｍｌに溶かし、４００００Ｇ 、４０分の条件で遠心分離し、その上清液をさらにハイドロキシアパタイトで精製し、１ｕｎｉｔ／ｍｇタンパク質のアンジオテンシン変換酵素液を得た。あるいは、ラビットラング由来精製ＡＣＥ（Ｓｉｇｍａ社、０．２５ユニット）を用いた。
【００５１】
本ジペプチドの各濃度の溶液をそれぞれ試験管に０．０３０ｍｌ入れ、次に上記アンジオテンシン変換酵素液 ０．１ｍｌを加え、３７℃、５分間反応させる。次に、基質として、ヒプリルヒスチジルロイシン（ペプチド研究所、Ｂｚ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ・Ｈ２Ｏ、最終濃度５ｍＭ、ＮａＣｌ３００ｍＭ を含む）０．２５ｍｌを添加し、３７℃で３０分間反応させた。その後、１Ｎ塩酸０．２５ｍｌを添加して反応を停止させた後、１．５ ｍｌの酢酸エチルを加え、ボルテックスミキサーで２０秒攪拌した後、遠心分離（３０００回転、５分間）を行い、酢酸エチル層１ｍｌを分取した。加熱１０５℃、３０分間（アルミブロック）後、蒸留水３ｍｌに溶解して、酢酸エチル中に抽出された馬尿酸の２２８ｎｍでの吸収値を測定し、これを酵素活性とした。
阻害率を次の式より算出した。Ａ：阻害剤を含まない場合の２２８ｎｍ吸収値 Ｂ：阻害剤添加の場合の２２８ｎｍ吸収値 また阻害率５０％のときの本ジペプチドの濃度をＩＣ５０値とした。阻害率＝［１−（Ａ−ａ）／（Ｂ−ｂ）］×１００
Ａ：試料添加
ａ：試料添加、酵素のかわりに緩衝液添加
Ｂ：試料のかわりに蒸留水添加
ｂ：試料のかわりに蒸留水添加、酵素のかわりに緩衝液添加
【００５２】
実施例１
（a）ＡＣＥ阻害活性を有するペプチド組成物の工業生産
鰹節タンパク質１０００ｋｇに水１００００Ｌを加え、加熱処理（９５℃、３５分間）後、アミノ酸、水溶性タンパク質を除き、得られた熱水抽出残渣１１５３ｋｇ（タンパク質５７６ｋｇ）に水２８８４Ｌを加え、６Ｎ苛性ソーダでｐＨ７に調整後、プロチンＮＹ１００（天野エンザイム）酵素１．０ｗｔ％(酵素量：タンパク質当り)を添加して、攪拌を行いながら、５０℃、１７時間反応させた。反応後に苛性ソーダを加えてｐＨを６．８に調整し、９８℃、１５分間加熱して酵素を失活させた。その後、未分解タンパク質をバイブスクリーン、デラバル、遠心分離機により除去し、上清をセライトでろ過し、分解液（タンパク質２００ｋｇ）を得た。ＡＣＥ阻害活性ＩＣ50値は、０．１３６ｍｇ／ｍｌ（タンパク質）であった。
【００５３】
このペプチド２００ｋｇを疎水性クロマトグラフィーに負荷した。
以下に疎水性クロマトグラフィーの実施条件を記す。
カラム負荷量：５０ｋｇｂ
カラム：ＳＰ-２０７(１０００Ｌ容量カラム；日本練水)
溶出液：０,５０％濃度のエタノール溶液
流速：２０００Ｌ/時間
サイクル：４サイクル
【００５４】
疎水性吸着樹脂を充填したカラムからの溶出は、アルコール濃度により２分画し、８０００Ｌずつの２つの画分を分取した。各画分はＡＣＥ阻害活性を試験例1の方法で測定した結果、０％または５０％エタノール溶出画分のＡＣＥ阻害活性値ＩＣ５０はそれぞれ、検出せず、０．０４７ ｍｇ／ｍｌであった。４サイクル繰り返し分取し、タンパク質量７４．９ｋｇを得た。
【００５５】
次に疎水性クロマトグラフィーで得られたＡＣＥ阻害活性画分（５０%エタノール溶出画分）を限外ろ過膜（GE社製モジュール７．９インチ×４０インチ×２本、ろ過面積４８．４ｍ２；分子量１０００、圧１．８ＭＰａ；型番ＧＥ８０４０Ｆ１００２）に通液し、非透過液に２０倍濃縮液を得た。非透過液と透過液のＡＣＥ阻害活性を測定し、透過液に０．０３４ｍｇ／ｍｌ、非透過液に０．１１０ｍｇ／ｍｌの値が得られた。
【００５６】
透過液を減圧濃縮し、噴霧乾燥して、タンパク質量４７．６ｋｇの粉末を大量生産した。収支を表１に表した。
【表１】
0005456100.tif 000002
【００５７】
また、経口摂取した場合の生体内での消化酵素による分解の程度を確認するため、ペプシン、トリプシン、及びキモトリプシンにて、透過液及び非透過液について人工消化を行った（ペプシン、トリプシン、キモトリプシン４時間分解）。結果を表２に示した。
【表２】
0005456100.tif 000003
透過液のＡＣＥ阻害活性に高い値が示されたことより、消化酵素耐性の可能性が推定された。非透過液のＡＣＥ阻害活性（ＩＣ50）に１．６倍の強い値が示されたが、透過液の値には及ばなかった。
【００５８】
ＨＰＬＣ法による分子量の分析を下記の条件（表３）で行い、その結果を表４に示した。
【表３】
0005456100.tif 000004
【表４】
0005456100.tif 000005
その結果、分解液と樹脂脱着非透過液の最大分子量はともに５０００であった。
目的とする樹脂脱着透過液の最大分子量は１５００で、うち分子量１０００以下の割合は７９．７５％であった。
【００５９】
ジペプチドの精製における回収率を下表５に示した。
【表５】
0005456100.tif 000006
酵素ろ過液の樹脂処理により、タンパク質３９．９８％の収率で、バリン−トリプトファン１００％の回収率であった。
さらに、限外ろ過膜処理により、タンパク質６７．６６％の収率、濃縮液側１/２０倍の液量で、バリン−トリプトファンのロス率は１０％であった。よって、精製タンパク質収率は２７．０５％、バリン−トリプトファンの回収率は９０％であった。
【００６０】
鰹節ペプチドの大量生産の製造スケールを表６に示した。
【表６】
0005456100.tif 000007
その結果、スケール１、２、３のいずれにおいても工業生産できることが分かった。
【００６１】
（ｂ）５つのジペプチドの単離
鰹節のプロチンＮＹ１００酵素分解液のカラム吸着後アルコール脱着画分の限外ろ過膜透過液（鰹節ペプチド）中のジペプチドの単離を行った。
カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８
（２．１ｍｍＩＤ ×１００ｍｍＬ、１．７μｍ）
移動層：１５％ＣＨ3ＣＮ ｉｎ ０．１％ＴＦＡ
流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ
温度：４０℃
検出：ＵＶ ２００−３００ｎｍ
【００６２】
上記条件で、３０秒毎に１フラクションずつ分取した。各フラクションから、減圧下蒸発乾固後、ＡＣＥ阻害活性測定用試料とし、上記の方法に従い、ＡＣＥ阻害活性を測定した。その結果、ペプチドのフラクションに強いＡＣＥ阻害活性が認められた。フラクションはそれぞれ凍結乾燥を行い、微量のペプチドが得られた。フラクションについて、アミノ酸分析およびＴＯＦ ＭＳ解析を行い、各フラクションのペプチドは、バリン−トリプトファン、トリプトファン−チロシン、トリプトファン−メチオニン、メチオニン−トリプトファン、イソロイシン−トリプトファンであることが判明した。
【００６３】
上記で得られた画分のさらなる単離の確認を移動相の濃度を変化させ、ピークを分取した。
カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８
（２．１ｍｍＩＤ ×１００ｍｍＬ、１．７μｍ）
移動層：１０％ＣＨ3ＣＮ ｉｎ ０．１％ＴＦＡ
流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ
温度：４０℃
検出：ＵＶ ２００−３００ｎｍ
ＨＰＬＣ分析の結果、９５％以上の純度であることが分かった。
【００６４】
鰹節熱水抽出残渣のプロチンＮＹ１００（天野エンザイム）酵素分解物中の単離した５ジペプチドのＡＣＥ阻害活性値を表７に示す。
【表７】
0005456100.tif 000008
【００６５】
例
（ａ）ＡＣＥ阻害活性を有するペプチド組成物の工業生産
鰹節タンパク質１０００ｋｇに水１００００Ｌを加え、加熱処理（９５℃、３５分間）後、アミノ酸、水溶性タンパク質を除き、得られた熱水抽出残渣１７７４ｋｇ（タンパク質８８６ｋｇ）に水４４３６Ｌを加え、６Ｎ苛性ソーダでｐＨ ７に調整後、サモアーゼＰＣ１０Ｆ（大和化成）酵素１．０ｗｔ％（酵素量：タンパク質当り）を添加して、攪拌を行いながら、５０℃、１７時間反応させた。反応後に苛性ソーダを加えてｐＨを６．８に調整し、９８℃、１５分間加熱して酵素を失活させた。その後、未分解タンパク質をバイブスクリーン、デラバル、遠心分離機により除去し、上清をセライトでろ過し、酵素分解液（タンパク質２００ｋｇ）を得た。ＡＣＥ阻害活性ＩＣ５０値は、０．２０４ｍｇ／ｍｌ（タンパク質）であった。
【００６６】
このペプチド２００ｋｇを疎水性クロマトグラフィーに負荷した。
以下に疎水性クロマトグラフィーの実施条件を記す。
カラム負荷量：５０ｋｇ
カラム：ＳＰ−２０７(１０００Ｌ容量カラム；日本練水)
溶出液：０,５０％濃度のエタノール溶液
流速：２０００Ｌ／時間
サイクル：４サイクル
【００６７】
疎水性吸着樹脂を充填したカラムからの溶出は、アルコール濃度により２分画し、８０００Ｌずつの２つの画分を分取した。各画分はＡＣＥ阻害活性を試験例１の方法で測定した結果、０％または５０％エタノール溶出画分のＡＣＥ阻害活性値ＩＣ５０はそれぞれ、検出せず、０．０７１ｍｇ／ｍｌであった。４サイクル繰り返し分取し、タンパク質量７４．０ｋｇを得た。
【００６８】
次に疎水性クロマトグラフィーで得られたＡＣＥ阻害活性画分（５０％エタノール溶出画分）を限外ろ過膜（ＧＥ社製モジュール７．９インチ×４０インチ×２本、ろ過面積４８．４ｍ２；分子量１０００、圧１．８ＭＰａ；型番ＧＥ８０４０Ｆ１００２）に通液し、非透過液に２０倍濃縮液を得た。非透過液と透過液のＡＣＥ阻害活性を測定し、透過液に０．０５０ｍｇ／ｍｌ、非透過液に０．１６５ｍｇ／ｍｌの値が得られた。
【００６９】
透過液を減圧濃縮し、噴霧乾燥して、タンパク質量７１．４ｋｇの粉末を大量生産した。収支を表８に表した。
【表８】
0005456100.tif 000009
【００７０】
また、経口摂取した場合の生体内での消化酵素による分解の程度を確認するため、ペプシン、トリプシン、及びキモトリプシンにて、透過液及び非透過液について人工消化を行った（ペプシン、トリプシン、キモトリプシン４時間分解）。結果を表９に示した。
【表９】
0005456100.tif 000010
透過液のＡＣＥ阻害活性に高い値が示されたことより、消化酵素耐性の可能性が推定された。非透過液のＡＣＥ阻害活性（ＩＣ50）に１．５倍の強い値が示されたが、透過液の値には及ばなかった。
【００７１】
ＨＰＬＣ法による分子量の分析を下記の条件（表１０）で行い、その結果を表１１に示した。
【表１０】
0005456100.tif 000011
【表１１】
0005456100.tif 000012
その結果、酵素分解液と樹脂脱着非透過液の最大分子量はともに５０００であった。
目的とする樹脂脱着透過液の最大分子量は１５００で、うち分子量１０００以下の割合は７９．８％であった。
【００７２】
鰹節ペプチドの大量生産の製造スケールを表１２に示した。
【表１２】
0005456100.tif 000013
その結果、スケール１，２，３のいずれにおいても工業生産できることが分かった。
【００７３】
（b）５つのジペプチドの単離
鰹節のサモアーゼＰＣ１０Ｆ（大和化成）酵素分解液のカラム吸着後アルコール脱着画分の限外ろ過膜透過液（鰹節ペプチド）中のジペプチドの単離を行った。
カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８
（２．１ｍｍＩＤ ×１００ｍｍＬ、１．７μｍ）
移動層：１５％ＣＨ3ＣＮ ｉｎ ０．１％ＴＦＡ
流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ
温度：４０℃
検出：ＵＶ ２００−３００ｎｍ
【００７４】
上記条件で、３０秒毎に１フラクションずつ分取した。各フラクションから、減圧下蒸発乾固後、ＡＣＥ阻害活性測定用試料とし、上記の方法に従い、ＡＣＥ阻害活性を測定した。その結果、ペプチドのフラクションに強いＡＣＥ阻害活性が認められた。フラクションはそれぞれ凍結乾燥を行い、微量のペプチドが得られた。フラクションについて、アミノ酸分析およびＴＯＦ  ＭＳ解析を行い、各フラクションのペプチドは、バリン−トリプトファン、トリプトファン−チロシン、トリプトファン−メチオニン、メチオニン−トリプトファン、イソロイシン−トリプトファンの配列から成るジペプチドであることが判明した。
【００７５】
実施例３
合成法によるペプチドの合成：
アプライドバイオシステムズ社のペプチド自動合成機（ＡＢＩ ４３０モデル）を使用し、プログラムに従ってＣ端より逐次ＢＯＣ法によりペプチド鎖を延長し目的の保護ペプチド樹脂の合成を行った。
樹脂上へのペプチドの構築が終了した後、保護ペプチド樹脂を乾燥した。得られた保護ペプチドの脱保護基とペプチドの樹脂担体からの切り離しは無水フッ化水素処理(ＨＦ／ｐ−Ｃｒｅｓｏ１８：２ ｖ／ｖ、６０分)によって行った。得られた粗ペプチドは９０％酢酸によって抽出し、凍結乾燥により粉末固体として得た。さらに得られた粗ペプチドをＯＤＳカラムを用いた高速液体クロマトグラフに負荷し精製を行い、目的のペプチドを得た。
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ（３０ｍｍＩＤ × ２５０ｍｍＬ、ワイエムシィ）
移動層：Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ：５％ＣＨ3ＣＮ、０．１％ＴＦＡ
Ｂｕｆｅｒ  Ｂ ：４０％ＣＨ3ＣＮ、０．１％ＴＦＡ
勾配：０〜１０ｍｉｎ：０％  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ   
１０〜９０ｍｉｎ：０〜１００ ％  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ
流速：２０ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２２０ｎｍ 
【００７６】
精製ペプチドの純度はＯＤＳカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで検定した。
カラム：Ｚｏｒｂａｘ  ３００ＳＢ−Ｃ１８（４．６ｍｍＩＤ × １５０ｍｍＬ、    
Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
移動層：Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ：１％ＣＨ3ＣＮ、０．１％ＴＦＡ
Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ：６０％ＣＨ3ＣＮ、０．１％ＴＦＡ
勾配： ０〜２５ｍｉｎ：０〜１００％Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２２０ｎｍ
【００７７】
（ａ）バリン−トリプトファンのジペプチドの合成：
出発アミノ酸樹脂担体はＢｏｃ−トリプトファン (ＢｒＺ)樹脂(０．５ｍｍｏｌ)を使用し、アミノ酸誘導体Ｂｏｃ−バリン２ｍＭを用いてペプチド鎖を伸長した。上記の方法で精製を行い、バリン−トリプトファンの精製物を得た。
【００７８】
（ｂ）トリプトファン−チロシンのジペプチドの合成：
出発アミノ酸樹脂担体はＢｏｃ−チロシン(ＢｒＺ)樹脂（０．５ｍｍｏｌ）を使用し、アミノ酸誘導体Ｂｏｃ−トリプトファン２ｍＭを用いてペプチド鎖を伸長した。上記の方法で精製を行い、トリプトファン−チロシンの精製物を得た。
【００７９】
（ｃ）トリプトファン−メチオニンのジペプチドの合成：
出発アミノ酸樹脂担体はＢｏｃ−トリプトファン(ＢｒＺ)樹脂(０．５ｍｍｏｌ)を使用し、アミノ酸誘導体Ｂｏｃ−メチオニン２ｍＭを用いてペプチド鎖を伸長した。上記の方法で精製を行い、メチオニン−トリプトファンの精製物を得た。上記の方法で精製物の純度を測定した結果、９５．００％であった。
【００８０】
（ｄ）メチオニン−トリプトファンのジペプチドの合成：
出発アミノ酸樹脂担体はＢｏｃ−トリプトファン(ＢｒＺ)樹脂(０．５ｍｍｏｌ)を使用し、アミノ酸誘導体Ｂｏｃ−メチオニン２ｍＭを用いてペプチド鎖を伸長した。上記の方法で精製を行い、トリプトファン−メチオニンの精製物を得た。
【００８１】
（ｅ）イソロイシン−トリプトファンのジペプチドの合成：
出発アミノ酸樹脂担体はＢｏｃ−トリプトファン(ＢｒＺ)樹脂(０．５ｍｍｏｌ)を使用し、アミノ酸誘導体Ｂｏｃ−イソロイシン２ｍＭを用いてペプチド鎖を伸長した。上記の方法で精製を行い、イソロイシン−トリプトファンの精製物を得た。
【００８２】
実施例４
実施例１で得たジペプチドの単離体を用いて、下記の組成のだし飲料を製造した。
（ａ）  素材および配合量：
鰹節熱水抽出液（めんつゆ）５００ｍｌと、実施例１で単離した５種類のジペプチドの混合品（バリン−トリプトファンのジペプチド５８．８９ｍｇ、トリプトファン−チロシンのジペプチドの１３．４０ｍｇ、トリプトファン−メチオニンの２０．００ｍｇ、メチオニン−トリプトファンのジペプチド１３．１６ｍｇ、イソロイシン−トリプトファンのジペプチド３９．２０ｍｇ）。
【００８３】
（ｂ）  製造方法：
鰹節の熱水抽出（９５℃、３５分開）後、セライト濾過を行い、その分解液を常温に冷却した。得られた冷却後の、抽出液に、上記５種のジペプチドの混合物を加えて攪拌、溶解させた。これによりだし飲料を製造した。
【００８４】
実施例５
（ａ）  鰹節タンパク質熱水抽出残渣をプロチンＮＹ１００酵素で分解した反応混合物からのジペプチドの定量
鰹節タンパク質１６０ｇに水２０００ｍｌを加え、熱水抽出（９５℃、３５分間）を行った。得られた残渣（不溶性タンパク質）に１０倍量加水後、ｐＨ７に調整、プロチンＮＹ１００（天野エンザイム）酵素分解後、ｐＨ6.8に調整し、加熱（９８℃、１５分間）後、バイブスクリーン、デカンタ、デラバル、シャープレス処理、セライトろ過を行い、減圧濃縮、スプレードライを行った。
【００８５】
上記の粉末を疎水性クロマトグラフに負荷し、水２５０ｍｌ溶出後、５０％エタノール２５０ｍｌ溶出に高活性な画分を得る。さらに限外ろ過（分子量１０００膜）の透過画分の減圧濃縮（固形４０％）液後、スプレードライ（入口温度１５０〜２００℃、出口温度５０〜９０℃）に掛けて、高活性な粉末品を５００ｍｇ得る。
【００８６】
上記粉末品（鰹節ペプチド）を原料として用い、これの５００ｍｇを配合した機能性食品を得る。加工食品として飲料、錠剤、スープ等にも用いられる。鰹節ペプチドを配合した食品素材の配合割合を表１３に示した。
【表１３】
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鰹節ペプチドの錠果・錠剤・カプセル製造については、鰹節ペプチド、食品素材計量後、混合・造粒・打錠・コート工程後、ＡＣＥ阻害活性、ジペプチド量を測定して規格品を製品化する。
【００８７】
実施例６
バリン−トリプトファン、トリプトファン−チロシン、トリプトファン−メチオニン、メチオニン−トリプトファン、イソロイシン−トリプトファンの定量を次のように行った。すなわち、粉末品あるいは、その加工品から、本ジペプチドの定量を、以下のように実施した。
【００８８】
Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８前処理：
鰹節抽出残渣酵素分解物、およびその加工食品を、それぞれ、２５mg、加工食品５ｇ秤量し、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジに負荷し、水溶性画分を除去後、吸着画分を５０％エタノール溶液で溶出した液を試料とする。
【００８９】
Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８処理して上記のように得られた試料から回収されたＡＣＥ阻害精製ペプチド８０００μgを、１００μLの精製水に溶解し、Ｃ−１８カラムを用いた高速液体クロマトグラフに２０００μｇ／２５μL負荷し、ペプチドを分画した。以下に条件を記す。
カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８
（２．１ｍｍＩＤ×１００ｍｍＬ、１．７μｍ）
移動層：１５％ＣＨ3ＣＮ ｉｎ ０．１％ＴＦＡ
流速：０．２ｍｌ/ｍｉｎ
温度：４０℃
検出：ＵＶ ２００−３００ｎｍ
合成品のバリン−トリプトファン、トリプトファン−チロシン、トリプトファン−メチオニン、メチオニン−トリプトファン、イソロイシン−トリプトファンを標品として１μｇ／μL負荷した。バリン−トリプトファン、トリプトファン−チロシン、トリプトファン−メチオニン、メチオニン−トリプトファン、イソロイシン−トリプトファンの溶出時間は、それぞれ、１０．５２，１１．２１，１３．８４、１５．５７、１６．８２分であった。
【００９０】
定量した結果は下表１４の通りである。
【表１４】
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【００９１】
実施例７
ＡＣＥ阻害ペプチドのプラント製造：
鰹節タンパク質２１．９ｋｇを９５℃、３５分間熱水抽出して、可溶性タンパク質５．５ｋｇを出汁（めんつゆ）に使用する。副産物として得た鰹節熱水抽出残渣としての水不溶性タンパク質１６．４ｋｇを原料として用い、これをプロチンＮＹ１００（天野エンザイム）酵素により分解した。酵素分解反応混合物を、スクリーン（１００メッシュ）、デラバル（３層連続排出遠心分離機）、シャープレス（超遠心分離機１５０００回転/分）、セライトろ過（ハイフロスーパーセライト：Ｈｙｆｌｏ  Ｓｕｐｅｒ  Ｃｅｌｉｔｅ ０．４％）後、ろ過液を得た。このろ過液をスプレードライ（噴霧乾燥機、入口温度１５０〜２００℃、出口温度９０℃以下）することにより、粉末品（１０ｋｇ）を得ることが出来た。また、この粉末品について、アンジオテンシン変換酵素阻害活性のＩＣ５０は１３６．２５μｇ／ｍｌであった。
【００９２】
上記のろ過液(タンパク質１０ｋg) を６００リットルの水に溶解し、疎水性吸着樹脂（セパビーズＳＰ−２０７、三菱化学）を充填して予め水で平衡化したカラム（φ４５ｃｍ×１５０ｃｍ）に負荷し、吸着を行なわせ、次に６００Ｌの水で溶出した後、５０％エタノール液６００Ｌにて溶出を行った。
ここで用いた疎水性吸着樹脂は、スチレン−ジビニルベンゼン系樹脂を用いたが、逆相分配系樹脂は、オクタデシルシリカ（株式会社ワイエムシー）他、何れの逆相分配系樹脂、疎水性吸着樹脂も使用できる。また、溶出にエタノールを用いたがこれにかぎるものではない。
更に、上記で得られた５０％エタノール溶出画分を限外ろ過膜（ＧＥ社製モジュール２．４インチ×４０インチ×２本、ろ過面積５ｍ２；分子量１０００膜；型番２５４０F１０７２）に通液し、透過液を減圧濃縮（固形量４０％）、スプレードライ(噴霧乾燥機)して、鰹節ペプチドを得た。
【００９３】
５０％エタノール溶出画分に高活性が認められたこと、このことからアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドは、疎水性吸着樹脂に吸着する性質を有していると思われる。また、限外ろ過分子量１０００膜透過液に高い活性が認められたこと、非透過画分の人工消化液に活性の上昇が示されたことから、例分子ペプチドに活性の強いペプチドが存在することが推定された。上記のことを踏まえて、精製を行うことより、本発明において、効率的に、カラムクロマトと限外ろ過処理によりアンジオテンシン変換酵素阻害活性の高い物質を工業生産規模で高収量、得ることができた。
【００９４】
実施例８
鰹節ペプチドの動物実験経口投与試験
動物            ：ＳＨＲ／Ｉｚｍ
例数            ：２４匹
測定項目        ：血圧 (収縮期血圧) および心拍数
測定時間        ：投与前、投与後２、４、６、８および２４時間に測定する。
測定方法：テイルカフ法 (ラット・マウス用血圧計、ＭＫ−２０００、室町機械株式会社) により、非観血的に測定する。３回の平均値を採用する。心拍数は採用された血圧測定時の心拍数の平均値を採用する。各群の構成および投与量は表１５の通りである。
【表１５】
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【００９５】
結果、実施例７の鰹節ペプチド０．３，１ｍｇ／ｋｇの投与で、降圧作用が認められた（下表１６、１７及び１８、並びに、対応する図１及び図２）。
【表１６】
0005456100.tif 000017
【表１７】
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【表１８】
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【００９６】
比較例
限外濾過を行わなかった他は実施例１と同様にして、酵素分解物を得、これを比較例とした。
【００９７】
試験例２  比較例との対比における本発明の組成物の優位性
本発明に係る組成物である、実施例１における限外濾過により得られた透過液と、比較例との間で、ＡＣＥ阻害活性、及び、ＳＨＲに対する単回投与試験による血圧の降圧度についての対比試験を行った。結果を下記表１９に示す。
【表１９】
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【００９８】
本発明の鰹節ペプチド中に存在するジペプチドの阻害活性値とその他のジペプチドの阻害活性値の比較例を下表２０に示した。
【表２０】
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本発明の鰹節ペプチドのＡＣＥ阻害活性のうち、バリン-トリプトファン、イソロイシン-トリプトファン、メチオニン-トリプトファンは、他ペプチドと比較して高い値を示した。
【００９９】
本発明のペプチドの鰹節ペプチド中の寄与率を分析し、下表２１の結果が示された。
【表２１】
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鰹節ペプチド中の寄与率は、バリン-トリプトファン、イソロイシン-トリプトファンで高い値を示した。よって、ＡＣＥ阻害活性に関して、鰹節ペプチド中の主要なジペプチド（バリン-トリプトファン、イソロイシン-トリプトファン）であることが示され、かつ鰹節ペプチドは精製されていることも裏付けられた。
【図１】
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【図２】
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