(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは哺乳動物の腫瘍細胞の耐性を逆転させるための医薬の製造におけるアデノウイルスの使用であって、前記アデノウイルスが、核内にＹＢ−１を欠く細胞内においては複製欠損であるが、ＹＢ−１を核内に有するか調節解除されたＹＢ−１を含むかするヒトまたは哺乳動物の腫瘍細胞内においては複製し、前記耐性が、医薬的に活性な１つ以上の薬剤および／または放射線に対する耐性であり、前記医薬的に活性な１つ以上の薬剤に対する耐性が、ＡＢＣトランスポーターによって媒介され、前記放射線に対する耐性が、腫瘍疾患の照射において使用される放射線に対する耐性であり、
ここで、前記アデノウイルスが、少なくとも一つのアデノウイルス性遺伝子をトランス活性化させる癌遺伝子タンパク質をコードしており、前記アデノウイルス性遺伝子が、Ｅ１Ｂ５５ｋＤａ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３およびＥ３ＡＤＰからなる群より選択され、前記癌遺伝子タンパク質が、Ｅ１Ａであり、前記アデノウイルスが、ｄｌ５２０、ＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ｄｌ１１１９／１１３１およびＣＢ０１６からなる群より選択されるか、または
前記アデノウイルスが、Ｅ１Ａタンパク質からなる群より選択される第二タンパク質より前に、Ｅ１Ｂ５５ｋＤａタンパク質およびＥ４ｏｒｆ６タンパク質の組み合わせである第一タンパク質を発現しており、前記アデノウイルスが、Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質をコードする少なくとも一つの核酸を含み、前記Ｅ１Ａタンパク質の発現が、Ｅ１Ａプロモーターとは異なるプロモーターの制御下にある、使用。
【請求項２】
ヒトまたは哺乳動物の腫瘍細胞の耐性を逆転させるための医薬の製造におけるアデノウイルスの使用であって、前記アデノウイルスが、核内にＹＢ−１を欠く細胞内においては複製欠損であるが、ＹＢ−１を核内に有するか調節解除されたＹＢ−１を含むかするヒトまたは哺乳動物の腫瘍細胞内においては複製し、前記耐性が、医薬的に活性な１つ以上の薬剤に対する耐性であり、前記医薬的に活性な１つ以上の薬剤に対する耐性が、ＡＢＣトランスポーターによって媒介され、
ここで、前記アデノウイルスが、少なくとも一つのアデノウイルス性遺伝子をトランス活性化させる癌遺伝子タンパク質をコードしており、前記アデノウイルス性遺伝子が、Ｅ１Ｂ５５ｋＤａ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３およびＥ３ＡＤＰからなる群より選択され、前記癌遺伝子タンパク質が、Ｅ１Ａであり、前記アデノウイルスが、ｄｌ５２０、ＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ｄｌ１１１９／１１３１およびＣＢ０１６からなる群より選択されるか、または
前記アデノウイルスが、Ｅ１Ａタンパク質からなる群より選択される第二タンパク質より前に、Ｅ１Ｂ５５ｋＤａタンパク質およびＥ４ｏｒｆ６タンパク質の組み合わせである第一タンパク質を発現しており、前記アデノウイルスが、Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質をコードする少なくとも一つの核酸を含み、前記Ｅ１Ａタンパク質の発現が、Ｅ１Ａプロモーターとは異なるプロモーターの制御下にある、使用。
【請求項３】
ヒトまたは哺乳動物の腫瘍細胞の薬剤感受性を回復させるための医薬の製造におけるアデノウイルスの使用であって、前記アデノウイルスが、核内にＹＢ−１を欠く細胞内においては複製欠損であるが、ＹＢ−１を核内に有するか調節解除されたＹＢ−１を含むかするヒトまたは哺乳動物の腫瘍細胞内においては複製し、前記感受性が、医薬的に活性な１つ以上の薬剤および／または放射線に対する感受性であり、前記医薬的に活性な１つ以上の薬剤に対する感受性が、ＡＢＣトランスポーターによって媒介され、前記放射線に対する感受性が、腫瘍疾患の照射において使用される放射線に対する感受性であり、
ここで、前記アデノウイルスが、少なくとも一つのアデノウイルス性遺伝子をトランス活性化させる癌遺伝子タンパク質をコードしており、前記アデノウイルス性遺伝子が、Ｅ１Ｂ５５ｋＤａ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３およびＥ３ＡＤＰからなる群より選択され、前記癌遺伝子タンパク質が、Ｅ１Ａであり、前記アデノウイルスが、ｄｌ５２０、ＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ｄｌ１１１９／１１３１およびＣＢ０１６からなる群より選択されるか、または
前記アデノウイルスが、Ｅ１Ａタンパク質からなる群より選択される第二タンパク質より前に、Ｅ１Ｂ５５ｋＤａタンパク質およびＥ４ｏｒｆ６タンパク質の組み合わせである第一タンパク質を発現しており、前記アデノウイルスが、Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質をコードする少なくとも一つの核酸を含み、前記Ｅ１Ａタンパク質の発現が、Ｅ１Ａプロモーターとは異なるプロモーターの制御下にある、使用。
【請求項４】
ヒトまたは哺乳動物の腫瘍細胞の薬剤感受性を回復させるための医薬の製造におけるアデノウイルスの使用であって、前記アデノウイルスが、核内にＹＢ−１を欠く細胞内においては複製欠損であるが、ＹＢ−１を核内に有するか調節解除されたＹＢ−１を含むかするヒトまたは哺乳動物の腫瘍細胞内において複製し、前記感受性が、医薬的に活性な１つ以上の薬剤に対する感受性であり、前記医薬的に活性な１つ以上の薬剤に対する感受性が、ＡＢＣトランスポーターによって媒介され、
ここで、前記アデノウイルスが、少なくとも一つのアデノウイルス性遺伝子をトランス活性化させる癌遺伝子タンパク質をコードしており、前記アデノウイルス性遺伝子が、Ｅ１Ｂ５５ｋＤａ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３およびＥ３ＡＤＰからなる群より選択され、前記癌遺伝子タンパク質が、Ｅ１Ａであり、前記アデノウイルスが、ｄｌ５２０、ＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ｄｌ１１１９／１１３１およびＣＢ０１６からなる群より選択されるか、または
前記アデノウイルスが、Ｅ１Ａタンパク質からなる群より選択される第二タンパク質より前に、Ｅ１Ｂ５５ｋＤａタンパク質およびＥ４ｏｒｆ６タンパク質の組み合わせである第一タンパク質を発現しており、前記アデノウイルスが、Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質をコードする少なくとも一つの核酸を含み、前記Ｅ１Ａタンパク質の発現が、Ｅ１Ａプロモーターとは異なるプロモーターの制御下にある、使用。
【請求項５】
前記医薬的に活性な薬剤が細胞増殖抑制剤である、請求項１〜４のいずれか一項記載の使用。
【請求項６】
前記耐性が多剤耐性またはポリ耐性、および／または放射線に対する耐性であることを特徴とする、請求項１〜２のいずれか一項記載の使用。
【請求項７】
前記耐性が細胞増殖抑制剤に対して多剤耐性またはポリ耐性であることを特徴とする、請求項１〜２のいずれか一項記載の使用。
【請求項８】
前記ＡＢＣトランスポーターが、ＭＲＰ、ＭＤＲ、およびＭＤＲ−１からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項記載の使用。
【請求項９】
前記アデノウイルスが、ｄｌ５２０、ＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ｄｌ１１１９／１１３１およびＣＢ０１６からなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか一項記載の使用。
【請求項１０】
前記アデノウイルスが、ｄｌ５２０およびｄｌ１１１９／１１３１からなる群より選択される、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
前記アデノウイルスが、ｄｌ５２０である、請求項１〜９のいずれか一項記載の使用。
【請求項１２】
ｄｌ５２０、ＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ｄｌ１１１９／１１３１およびＣＢ０１６からなる群より選択された前記アデノウイルスが、さらにＥ１Ｂ１９ｋＤａ欠損を有する、請求項１〜１１のいずれか一項記載の使用。
【請求項１３】
前記アデノウイルスが、さらにＥ１Ｂ１９ｋＤａ欠損を有するｄｌ５２０である、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
前記Ｅ１Ａが、Ｅ１Ａ１２Ｓである、請求項１〜１３のいずれか一項記載の使用。
【請求項１５】
前記細胞が、細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を有する、請求項１〜１４のいずれか一項記載の使用。
【請求項１６】
前記アデノウイルス性癌遺伝子タンパク質Ｅ１Ａが、ＹＢ−１の核局在化を誘導しないことを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか一項記載の使用。
【請求項１７】
前記細胞が、Ｒｂ陰性であり、前記細胞が、ＹＢ−１核陽性であることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか一項記載の使用。
【請求項１８】
前記細胞が、Ｒｂ陰性であり、前記細胞が、細胞周期とは無関係にＹＢ−１核陽性であることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか一項記載の使用。
【請求項１９】
前記アデノウイルス性癌遺伝子タンパク質が、組織および／または腫瘍特異的プロモーターの制御下にあることを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか一項記載の使用。
【請求項２０】
前記アデノウイルスが、ＹＢ−１をコードし、前記ＹＢ−１が、組織および／または腫瘍特異的プロモーターの制御下にあることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか一項記載の使用。
【請求項２１】
前記アデノウイルスが、少なくとも一つのタンパク質をコードし、タンパク質が、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３、Ｅ１Ｂ５５ｋＤａおよびアデノウイルス性Ｅ３ＡＤＰタンパク質からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１〜２０のいずれか一項記載の使用。
【請求項２２】
前記アデノウイルスが、Ｅ１Ａタンパク質からなる群より選択される第二タンパク質より前に、Ｅ１Ｂ５５ｋＤａタンパク質およびＥ４ｏｒｆ６タンパク質の組み合わせである第一タンパク質を発現しており、前記アデノウイルスが、Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質をコードする少なくとも一つの核酸を含み、前記Ｅ１Ａタンパク質の発現が、Ｅ１Ａプロモーターとは異なるプロモーターの制御下にある、請求項１〜８のいずれか一項記載の使用。
【請求項２３】
前記Ｅ１Ａタンパク質が、Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質であることを特徴とする、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記アデノウイルスが、野生型アデノウイルス内において前記タンパク質発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターの制御下にあるＥ１Ｂ５５ｋＤａタンパク質をコードする核酸を含むことを特徴とする、請求項２２〜２３のいずれか一項記載の使用。
【請求項２５】
前記アデノウイルスが、野生型アデノウイルス内において前記タンパク質発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターの制御下にあるＥ４ｏｒｆ６タンパク質をコードする核酸を含むことを特徴とする、請求項２２〜２４のいずれか一項記載の使用。
【請求項２６】
前記アデノウイルスが、野生型アデノウイルス内において前記タンパク質発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターの制御下にあるＥ１Ｂ５５ｋＤａタンパク質およびＥ４ｏｒｆ６タンパク質の組み合わせをコードする核酸を含むことを特徴とする、請求項２２〜２４のいずれか一項記載の使用。
【請求項２７】
前記Ｅ１Ｂ５５ｋＤａタンパク質の発現が、プロモーターによって制御されており、前記プロモーターが腫瘍特異的プロモーター、器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、異種プロモーター、およびアデノウイルスプロモーターからなる群より選択され、前記アデノウイルスプロモーターが、Ｅ１Ｂプロモーターとは異なることを特徴とする、請求項２２〜２６のいずれか一項記載の使用。
【請求項２８】
前記Ｅ４ｏｒｆ６タンパク質の発現が、プロモーターによって制御されており、前記プロモーターが腫瘍特異的プロモーター、器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、異種プロモーター、およびアデノウイルスプロモーターからなる群より選択され、前記アデノウイルスプロモーターが、Ｅ４プロモーターとは異なることを特徴とする、請求項２２〜２７のいずれか一項記載の使用。
【請求項２９】
前記アデノウイルスプロモーターが、Ｅ１Ａプロモーターである、請求項２７または２８記載の使用。
【請求項３０】
前記Ｅ１Ａタンパク質の発現が、腫瘍特異的プロモーター、器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、異種プロモーター、およびアデノウイルスプロモーターからなる群より選択されるプロモーターによって制御されていることを特徴とする、請求項２２〜２９のいずれか一項記載の使用。
【請求項３１】
前記Ｅ１Ａタンパク質の発現を制御するプロモーターが、ＹＢ−１で制御されているか、またはＹＢ−１で調節可能であることを特徴とする、請求項２７〜３０のいずれか一項記載の使用。
【請求項３２】
前記Ｅ１Ａタンパク質の発現を制御するプロモーターが、アデノウイルスのＥ２後期プロモーターであることを特徴とする、請求項２７〜３１のいずれか一項記載の使用。
【請求項３３】
前記Ｅ４ｏｒｆ６タンパク質、および前記Ｅ１Ｂ５５ｋＤａタンパク質が、同一または共通のプロモーターの制御下にあることを特徴とする、請求項２２〜３２のいずれか一項記載の使用。
【請求項３４】
前記アデノウイルスが、少なくとも１つのアデノウイルスのタンパク質を介して核内にＹＢ−１を供給するか、または少なくとも１つのアデノウイルスのタンパク質を介して核内へのＹＢ−１の供給を媒介しており、前記アデノウイルスのタンパク質が、Ｅ１Ａとは異なることを特徴とする、請求項２２〜３３のいずれか一項記載の使用。
【請求項３５】
前記アデノウイルスが、少なくとも１つのアデノウイルスのタンパク質を介してアデノウイルスの複製のためのＹＢ−１を供給するか、または少なくとも１つのアデノウイルスのタンパク質を介してアデノウイルスの複製のためのＹＢ−１の供給を媒介しており、前記アデノウイルスのタンパク質が、Ｅ１Ａとは異なることを特徴とする、請求項２２〜３４のいずれか一項記載の使用。
【請求項３６】
前記アデノウイルスのタンパク質が、Ｅ４ｏｒｆ６およびＥ１Ｂ５５ｋＤａの複合体であることを特徴とする、請求項３４または３５記載の使用。
【請求項３７】
前記アデノウイルスの核酸が、少なくとも１つの機能的に不活性なアデノウイルス領域を含み、前記領域が、Ｅ１領域、Ｅ３領域、Ｅ４領域、そしてこれらの組み合わせからなる群より選択されることを特徴とする、請求項２２〜３６のいずれか一項記載の使用。
【請求項３８】
前記少なくとも１つの機能的に不活性なアデノウイルス領域が、Ｅ１領域であることを特徴とする、請求項３７記載の使用。
【請求項３９】
前記少なくとも１つの機能的に不活性なアデノウイルス領域が、Ｅ３領域であることを特徴とする、請求項３７または３８記載の使用。
【請求項４０】
前記少なくとも１つの機能的に不活性なアデノウイルス領域が、Ｅ４領域であることを特徴とする、請求項３７〜３９のいずれか一項記載の使用。
【請求項４１】
前記少なくとも１つの機能的に不活性なアデノウイルス領域が、Ｅ１領域、Ｅ３領域およびＥ４領域を含むことを特徴とする、請求項３７〜４０のいずれか一項記載の使用。
【請求項４２】
前記アデノウイルスが、核酸を含み、前記核酸がＹＢ−１をコード化することを特徴とする、請求項２２〜４１のいずれか一項記載の使用。
【請求項４３】
ＹＢ−１をコードする前記核酸が、プロモーターの制御下にあり、該プロモーターがＥ２後期プロモーターであることを特徴とする、請求項４２記載の使用。
【請求項４４】
ＹＢ−１をコード化する前記核酸が、プロモーターの制御下にあり、該プロモーターがそれぞれＹＢ−１依存性であり、そしてＹＢ−１の制御下にあることを特徴とする、請求項４２または４３記載の使用。
【請求項４５】
前記アデノウイルスが、プロモーターおよび核酸配列を含む発現カセットを含み、前記核酸配列がアプタマー、リボザイム、アプタザイム、アンチセンス分子およびｓｉＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする、請求項２２〜４４のいずれか一項記載の使用。
【請求項４６】
前記アデノウイルスが、プロモーターおよび核酸配列を含む発現カセットを含み、前記核酸配列がコード化核酸であり、前記核酸がペプチド、ポリペプチド、タンパク質、アンチカリン、抗体および抗体断片からなる群から選択される分子をコード化することを特徴とする、請求項２２〜４４のいずれか一項記載の使用。
【請求項４７】
前記アデノウイルスが、発現カセットを含み、前記発現カセットがプロモーターおよび核酸配列を含み、前記核酸配列がアポトーシス誘導遺伝子、プロドラッグ遺伝子、プロテアーゼインヒビターをコードする核酸、腫瘍抑制遺伝子、サイトカインをコード化する核酸および血管形成抑制剤をコード化する核酸からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２２〜４４のいずれか一項記載の使用。
【請求項４８】
前記アデノウイルスが、アデノウイルス突然変異体であることを特徴とする、請求項２２〜４７のいずれか一項記載の使用。
【請求項４９】
前記ＡＢＣトランスポーターの発現が、ＹＢ−１によって制御されている、請求項１〜４８のいずれか一項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物細胞における多剤耐性を逆転させる方法に関するものである。
【０００２】
ドイツ連邦共和国では、毎年約３５０，０００人が悪性腫瘍を患っている。これらの患者で根治治療を望めるのは５０％未満である。外科切除および放射線療法を除けば、細胞増殖抑制剤を使用する化学療法が、当面は最も一般的な癌の治療形態である。これと関連して使用される抗腫瘍活性物質は、原理上、生物の全ての細胞に対して効果的ではあるが、細胞増殖速度が高まることに起因して腫瘍細胞は、化学療法感受性をさらに受けやすくなる傾向がある。若年性リンパ性白血病、一部のリンパ腫、睾丸癌などの様々な腫瘍に対して良好な治療結果を得ることができる。しかし、これら腫瘍は全ての悪性疾患のわずか１０％を占めるに過ぎない。固形腫瘍の大半は、様々な細胞増殖抑制剤を使用する治療に対して、反応しないか、もしくは弱くしか反応しない。このことは、黒色腫や脳腫瘍の他、腎臓、結腸、膵臓、肝臓に由来する癌腫について特に当てはまる。また、例えば乳癌、卵巣癌、前立腺癌は、細胞増殖抑制剤での治療に対して最初は十分に反応するが、治療サイクルの途中で使用される細胞増殖抑制剤に対して反応しにくくなる。これと一致して、P糖タンパク質の発現と転移の発生との間に強い相関関係が存在することが、研究によって示される。化学療法や放射線療法などの既存の治療概念の発展は、長年にわたって大幅な進歩を遂げたが、特に固形腫瘍の治療は、全般的に依然として不十分である。
【０００３】
特定の腫瘍を除けば、腫瘍細胞の異質性および腫瘍の血管形成、腫瘍細胞自体における遺伝的かつ遺伝子外の変化が、細胞増殖抑制剤や放射線に対する耐性の形成に関与している。これらは以下の６群に大別できる：１．排出活性の上昇、２．標的タンパク質の調節、３．修復の増大、４．アポトーシスの調節、５．細胞周期、６．流入の減少。
【０００４】
悪性腫瘍の臨床治療中、再発性腫瘍は、最初に使用される細胞増殖抑制剤に対してだけでなく、異なる化合物群の他の抗悪性腫瘍薬に対しても耐性があることが観察される場合が多い。この現象は、ポリドラッグ耐性、もしくは英語でＭｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（ＭＤＲ：多剤耐性）と呼ばれる。非典型的な多剤耐性を除けば、古典的なＭＤＲ現象は、膜結合型の１７０ｋＤａＡＴＰ依存性の膜貫通型糖タンパク質の過剰発現に基づいており、これは主に脂溶性化合物を細胞外に出す。ＭＤＲ１タンパク質は、別名Ｐｇｐ、Ｐ糖タンパク質で、ＡＢＣトランスポーターのグループの１員であり、特にＭＲＰ（多剤耐性関連タンパク質）およびＢＣＲＰ（乳癌耐性タンパク質）もこのグループに属する。小胞性ＬＲＰタンパク質（肺耐性関連タンパク質）は典型的なＡＢＣトランスポーターには属さない。しかし、この関連で言及されることも非常に多く、腫瘍細胞における細胞殖抑制剤に対する耐性の形成と関係する輸送プロセスにも関与しているためである（Sugawara I ら, CANCER LETTERS 112, 23-31, 1997; Gottesman ら, Nat Rev Cancer. 2002,2: 48-58）。ＬＲＰプロモーターは、逆方向ＣＡＡＴボックス（Ｙボックス）を含むことが知られている（Scheider ら, Breast Cancer Res., 2001, 3, 183-191）。
【０００５】
このように本発明の基礎をなす課題は、このような疾患の処置法、特に上記の耐性疾患、即ち細胞が細胞増殖抑制剤および／または放射線に対して耐性を有する腫瘍や腫瘍疾患の処置法を提供することである。また、本発明の基礎をなす課題は、上記および本明細書記載の他の耐性を逆転させるか、または取り除くことである。さらなる態様では、本発明の基礎をなす課題は、薬剤感受性、特に腫瘍および腫瘍疾患を形成する、もしくはこれらに関与する細胞の薬剤感受性を回復させる方法を提供することであり、該細胞は細胞増殖抑制剤および／または放射線に対して非感受性であるか、もしくはもはや感受性はない。
【０００６】
本発明によると、これらの課題は、ＹＢ−１依存的に複製するウイルス、特にアデノウイルスの使用によって解決される。また、これらの課題は、本発明に従って、添付の独立クレームの発明の要旨によって解決される。好適な実施態様は添付の従属請求項に由来する。
【０００７】
本発明の基礎をなす課題は、このように第１の態様において、細胞の耐性を逆転させるためのウイルス、好ましくはアデノウイルスの使用によっても解決される。
【０００８】
本発明の基礎をなす課題は、このように第２の態様において、細胞の耐性を逆転させるための薬剤製造用のウイルス、好ましくはアデノウイルスの使用によっても解決される。
【０００９】
本発明の基礎をなす課題は、このように第３の態様において、細胞の薬剤感受性を回復させるためのウイルス、好ましくはアデノウイルスの使用によっても解決される。
【００１０】
本発明の基礎をなす課題は、このように第４の態様において、細胞の薬剤感受性を回復させるための薬剤製造のためのウイルス、好ましくはアデノウイルスの使用によっても解決される。
【００１１】
本発明の第１から第４の態様に従った一実施態様では、細胞は、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞である。
【００１２】
好適な一実施態様では、細胞は、腫瘍細胞である。
【００１３】
好適な一実施態様では、細胞は、１つ以上の医薬的に活性な薬剤および／または放射線に対して耐性があるか、または非感受性である。
【００１４】
好適な一実施態様では、医薬的に活性な薬剤は、細胞増殖抑制剤である。
【００１５】
本発明の基礎をなす課題は、このように第５の態様において、ＡＢＣトランスポーター、特にＡＢＣトランスポーターの発現を抑制するためのウイルス、好ましくはアデノウイルスの使用によっても解決される。
【００１６】
第１、２、３、４の態様の一実施態様では、耐性は、ＡＢＣトランスポーターによって媒介される。
【００１７】
第１、２、３、４、５の態様の一実施態様では、耐性は、多剤耐性またはポリ耐性、特に細胞増殖抑制剤および／または放射線に対する多剤耐性またはポリ耐性である。
【００１８】
本発明の基礎をなす課題は、このように第６の態様において、疾患またはその一部に関与する細胞は、耐性を有する、特にＡＢＣトランスポーターを介した耐性および／または多剤耐性またはポリ耐性、好ましくは細胞増殖抑制剤および／または放射線に対して多剤耐性またはポリ耐性を有する疾患、特に腫瘍疾患の治療用薬剤の製造におけるウイルス、好ましくはアデノウイルスの使用によっても解決される。
【００１９】
第６の態様の別の好適な一実施態様では、治療は、アデノウイルスおよびさらなる医薬的に活性な薬剤の投与、またはアデノウイルスの投与および処置される細胞または生物に対する放射線からなり、アデノウイルスの投与は、さらなる医薬的に活性な薬剤および／または放射線の有効性を生じさせる、もしくは増大させる。
【００２０】
第６の態様の好適な一実施態様では、治療は、アデノウイルスおよびさらなる医薬的に活性な薬剤の投与、またはアデノウイルスの投与および処置される細胞または生物に対する放射線からなり、さらなる医薬的に活性な薬剤の投与および／または放射線は、アデノウイルスの有効性を生じさせる、もしくは増大させる。
【００２１】
第５、６の態様の一実施態様では、ＡＢＣトランスポーターは、ＭＲＰおよびＭＤＲ、特にＭＤＲ−１を含むグループから選択される。
【００２２】
第５、６の態様の一実施態様では、アデノウイルスは、さらなる医薬的に活性な薬剤の投与前、少なくとも治療の開始時に投与される。
【００２３】
第５、６の態様の一実施態様では、アデノウイルスは、治療の開始時、少なくとも放射線照射前に投与される。
【００２４】
第５、６の態様の一実施態様では、アデノウイルスは、さらなる医薬的に活性な薬剤の投与または放射線より約１〜３日、好ましくは約１〜２日前に投与される。
【００２５】
第１、２、３、４、５、６の態様の一実施態様では、耐性は、細胞増殖抑制剤および／または放射線に対する耐性である。
【００２６】
第６の態様の一実施態様では、さらなる医薬的に活性な薬剤は、細胞増殖抑制剤を含むグループから選択される。
【００２７】
第６の態様の一実施態様では、放射線は、腫瘍疾患の放射線療法において使用される放射線である。
【００２８】
第６の態様の一実施態様では、放射線療法は、任意の線量で放射線療法の計画を利用して実施され、および／または任意の用量で、もしくは患者の治療計画に従って、さらなる医薬的に活性な薬剤が投与され、患者は、免疫抑制状態の患者、血液像が不良または病的である患者、腎臓の数値が不良または病的な患者を含むグループから選択される。
【００２９】
第６の態様の一実施態様では、放射線療法は、任意の線量で、もしくは放射線療法の計画に従って実施され、および／または任意の用量で、もしくは疾患を患っている患者の治療計画に従って、さらなる医薬的に活性な薬剤が投与され、ここで該疾患またはその一部に関与する細胞は耐性はない。
【００３０】
第６の態様の一実施態様では、アデノウイルスの投与は、さらなる医薬的に活性な薬剤の投与、もしくは放射線療法の必要条件となる。
【００３１】
第１、２、３、４、５、６の態様の一実施態様では、アデノウイルスは、ウイルス、核酸、ベクター、複製系、薬剤、医薬的組成物として存在する。
【００３２】
第１、２、３、４、５、６の態様の一実施態様では、アデノウイルスは、ＹＢ−１依存的に複製する。
【００３３】
第１、２、３、４、５、６の態様の一実施態様では、アデノウイルスは、Ｅ１Ａマイナスである。
【００３４】
第１、２、３、４、５、６の態様の一実施態様では、アデノウイルスは、腫瘍退縮アデノウイルスである。
【００３５】
第１、２、３、４、５、６の態様の一実施態様では、ウイルス、好ましくはアデノウイルスは、核内にＹＢ−１を欠く細胞内において複製能を欠損しており、該ウイルスは、癌遺伝子または癌遺伝子産物、特に癌遺伝子タンパク質をコード化しており、これは少なくとも1つのウイルス遺伝子、好ましくはアデノウイルス遺伝子をトランス活性化させ、該遺伝子はＥ１Ｂ５５ｋＤａ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３、およびＥ３ＡＤＰを含むグループから選択される。
【００３６】
第１、２、３、４、５、６の態様の好適な一実施態様では、ウイルス、特にアデノウイルスは、核内にＹＢ−１を有する細胞内において複製する。
【００３７】
第１、２、３、４、５、６の態様のより好適な一実施態様では、ウイルスの癌遺伝子タンパク質はＥ１Ａであり、および／または該癌遺伝子はＥ１Ａおよび／または癌遺伝子タンパク質Ｅ１Ａをコード化する遺伝子である。
【００３８】
第１、２、３、４、５、６の態様の一実施態様では、ウイルスの癌遺伝子タンパク質Ｅ１Ａは機能的Ｒｂ腫瘍抑制遺伝子産物に結合できる。
【００３９】
第１、２、３、４、５、６の態様の一実施態様では、ウイルスの癌遺伝子タンパク質Ｅ１Ａは機能的Ｒｂ腫瘍抑制遺伝子産物に結合できない。
【００４０】
第１、２、３、４、５、６の態様の一実施態様では、ウイルスの癌タンパク質Ｅ１Ａは、ＹＢ−１の核への局在化を誘導しない。
【００４１】
第１、２、３、４、５、６の態様の一実施態様では、薬剤は、Ｒｂ陽性またはＲｂ陰性の細胞を有する患者用である。
【００４２】
第１、２、３、４、５、６の態様の一実施態様では、細胞は、Ｒｂ陰性であり、細胞核はＹＢ−１陽性、好ましくは細胞周期とは無関係に核内においてＹＢ−１陽性である。
【００４３】
第１、２、３、４、５、６の態様の一実施態様では、細胞は、ｐ５３陽性またはｐ５３陰性である。
【００４４】
第１、２、３、４、５、６の態様の一実施態様では、癌遺伝子タンパク質は、野生型癌遺伝子タンパク質Ｅ１Ａと比較して１つ以上の突然変異または欠失を示し、該欠失は好ましくはＣＲ３ストレッチの欠失、Ｎ末端の欠失、そしてＣ末端の欠失を含むグループから選択される欠失である。
【００４５】
第１、２、３、４、５、６の態様の一実施態様では、Ｅ１Ａ癌遺伝子タンパク質は、Ｒｂに結合できる。
【００４６】
第１、２、３、４、５、６の態様の一実施態様では、癌遺伝子タンパク質は、野生型癌遺伝子タンパク質と比較して１つ以上の突然変異または欠失からなり、該欠失は、好ましくはＣＲ１領域および／またはＣＲ２領域の欠失である。
【００４７】
第１、２、３、４、５、６の態様の一実施態様では、癌遺伝子タンパク質Ｅ１ＡがＲｂに結合できない。
【００４８】
第１、２、３、４、５、６の態様の一実施態様では、ウイルスの癌遺伝子タンパク質、好ましくはＥ１Ａは、組織および／または腫瘍特異的プロモーターの制御下にある。
【００４９】
第１、２、３、４、５、６の態様の一実施態様では、ウイルス、特にアデノウイルスは、ＹＢ−１をコードする。
【００５０】
第１、２、３、４、５、６の態様の一実施態様では、ＹＢ−１が組織特異的プロモーターおよび／または腫瘍特異的プロモーターの制御下にある。
【００５１】
第１、２、３、４、５、６の態様の一実施態様では、ウイルス、好ましくはアデノウイルスは、少なくとも１つのタンパク質をコード化し、該タンパク質は、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３、Ｅ１Ｂ５５ｋ、およびアデノウイルスＥ３ＡＤＰタンパク質を含むグループから選択される。
【００５２】
第１、２、３、４、５、６の態様の一実施態様では、細胞は、核内にＹＢ−１を含む、好ましくは腫瘍または腫瘍の一部を形成する細胞は、核内にＹＢ−１を有する。
【００５３】
第１、２、３、４、５、６の態様の一実施態様では、ＹＢ−１の核内への輸送を誘導後に腫瘍は、核内にＹＢ−１を含む。
【００５４】
第１、２、３、４、５、６の態様の一実施態様では、ＹＢ−１の核内への輸送は、放射線照射、細胞増殖抑制剤の投与、および温熱療法を含むグループから選択される少なくとも１つの処置によって誘導される。
【００５５】
第１、２、３、４、５、６の態様の一実施態様では、処置は、細胞、器官、生物、好ましくは処置を必要とする生物、より好ましくは該疾患を伴う生物に対して施される。
【００５６】
第１、２、３、４、５、６の態様の一実施態様では、ウイルス、好ましくはアデノウイルスは、ＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ｄｌ１１１９／１１３１、ＣＢ０１６、ｄｌ５２０および機能的Ｒｂ腫瘍抑制遺伝子産物に結合できるウイルス癌遺伝子の発現を欠くウイルスを含むグループから選択される。
【００５７】
第１、２、３、４、５、６の態様の一実施態様では、ウイルス、好ましくはアデノウイルスは、複製がＥ２後期プロモーターの活性化を通じてＹＢ−１によって制御されるように、好ましくは活性化がＥ２後期プロモーターの活性化を通じて主に制御されるように設計される。
【００５８】
第１、２、３、４、５、６の態様の一実施態様では、ウイルスは、トランス遺伝子をコード化する核酸を含む。
【００５９】
第１、２、３、４、５、６の態様の一実施態様では、ウイルスは、トランス遺伝子の翻訳産物および（または）転写産物を含む。
【００６０】
第１、２、３、４、５、６の態様の一実施態様では、核酸は、トランス遺伝子またはトランス遺伝子をコード化する核酸を含む。
【００６１】
第１、２、３、４、５、６の態様の一実施態様では、トランス遺伝子は、プロドラッグ遺伝子、サイトカインおよびサイトカイン遺伝子、アポトーシス誘導遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、メタロプロテイナーゼインヒビター遺伝子、および血管形成抑制遺伝子を含むグループから選択される。
【００６２】
第１、２、３、４、５、６の態様の一実施態様では、トランス遺伝子は、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、アンチセンス分子、リボザイムの核酸を含むグループから選択され、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、アンチセンス分子、および／またはリボザイムは標的分子をターゲットにする。
【００６３】
第１、２、３、４、５、６の態様の一実施態様では、標的分子は、耐性関連因子、抗アポトーシス因子、癌遺伝子、血管形成因子、ＤＮＡ合成酵素、ＤＮＡ修復酵素、増殖因子、増殖因子の受容体、転写因子、メタロプロテイナーゼ、好ましくはマトリクスメタロプロテイナーゼキナーゼ、およびウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子を含むグループから選択される。
【００６４】
第１、２、３、４、５、６のいずれか一態様の一実施態様では、薬剤は、少なくとも１つの医薬的に活性な薬剤をさらに含む。
【００６５】
第１、２、３、４、５、６の態様の好適な一実施態様では、医薬的に活性な薬剤は、サイトカイン、メタロプロテイナーゼ阻害剤、血管形成抑制剤、細胞増殖抑制剤、細胞周期阻害剤、プロテアソーム阻害剤、組換え抗体、シグナル伝達系の阻害剤、およびタンパク質キナーゼの阻害剤を含むグループから選択される。
【００６６】
第１、２、３、４、５、６のいずれか一態様の一実施態様では、薬剤は、少なくとも２つの薬剤の組み合わせからなり、該薬剤のそれぞれは細胞増殖抑制剤を含むグループから個別かつ無関係に選択される。
【００６７】
好適な一実施態様では、少なくとも２つの薬剤は、異なる標的分子をターゲットにする。
【００６８】
好適な一実施態様では、少なくとも２つの薬剤は、異なる作用機序を介して活性である。
【００６９】
一実施態様では、少なくとも１つの薬剤は、ウイルスが複製する細胞の感染性を増大させる。
【００７０】
一実施態様では、少なくとも１つの薬剤は、細胞成分の有効性に影響を及ぼす、好ましくは成分の有効性を増大させ、該成分がウイルスの取り込みを媒介する。
【００７１】
一実施態様では、少なくとも１つの薬剤は、ＹＢ−１の核内への輸送を媒介する、好ましくはＹＢ−１の核内への輸送を増大させる。
【００７２】
一実施態様では、少なくとも１つの薬剤は、ヒストンデアセチラーゼ抑制剤である。
【００７３】
好適な一実施態様では、ヒストンデアセチラーゼ抑制剤は、トリコスタチンＡ、ＦＲ９０１２２８、ＭＳ−２７−２７５、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ＰＸＤ１０１、アピシジン、およびスクリプタイドを含むグループから選択される。
【００７４】
一実施態様では、少なくとも１つの薬剤は、トリコスタチンＡ、ＦＲ９０１２２８、ＭＳ−２７−２７５、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ＰＸＤ１０１、アピシジン、およびスクリプタイドを含むグループから選択される。
【００７５】
一実施態様では、少なくとも１つの薬剤は、トポイソメラーゼ抑制剤である。
【００７６】
好適な一実施態様では、トポイソメラーゼ抑制剤は、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、ＤＸ−８９５Ｉｆ、ＳＮ−３８、９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン、ダウノルビシン、およびエトポシドを含むグループから選択される。
【００７７】
第１、２、３、４、５、６のいずれか一態様の一実施態様では、薬剤は、トリコスタチンＡおよびイリノテカンを含む。
【００７８】
第１、２、３、４、５、６のいずれか一態様の一実施態様では、ウイルス、特に第１、２、３、４、５、６のいずれか一態様と関連して記載されるウイルスは、該薬剤中の少なくとも２つの薬剤から分離される。
【００７９】
好適な一実施態様では、少なくとも１単位用量のウイルスは、少なくとも１単位用量の１つまたは少なくとも２つの薬剤から分離される。
【００８０】
第１、２、３、４、５、６のいずれか一態様の一実施態様では、ウイルス、好ましくはアデノウイルスは、Ｅ１Ａタンパク質を含むグループから選択される第二タンパク質より前に、Ｅ１Ｂタンパク質およびＥ４タンパク質を含むグループから選択される第一タンパク質を発現する。
【００８１】
好適な一実施態様では、第一タンパク質は、Ｅ１Ｂタンパク質、好ましくはＥ１Ｂ５５ｋｄタンパク質である。
【００８２】
より好適な一実施態様では、第一タンパク質は、Ｅ４タンパク質、好ましくはＥ４ｏｒｆ６タンパク質である。
【００８３】
一実施態様では、第一タンパク質は、Ｅ１Ｂタンパク質およびＥ４タンパク質の組み合わせ、好ましくはＥ１Ｂ５５ｋＤタンパク質およびＥ４ｏｒｆ６タンパク質の組み合わせである。
【００８４】
一実施態様では、Ｅ１Ａタンパク質は、Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質である。
【００８５】
第１、２、３、４、５、６のいずれか一態様の一実施態様では、ウイルスが、Ｅ１Ｂタンパク質、Ｅ４タンパク質、Ｅ１Ａタンパク質を含むグループから選択されるタンパク質をコード化する少なくとも１つの核酸を含み、少なくとも１つのタンパク質は、野生型アデノウイルス内においてタンパク質の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターの制御下にある。
【００８６】
好適な一実施態様では、少なくとも１つのタンパク質は、Ｅ１Ｂタンパク質、好ましくはＥ１Ｂ５５ｋＤタンパク質である。
【００８７】
好適な一実施態様では、少なくとも１つのタンパク質は、Ｅ４タンパク質、好ましくはＥ４ｏｒｆ６タンパク質である。
【００８８】
一実施態様では、少なくとも１つのタンパク質は、Ｅ１Ａタンパク質、好ましくはＥ１Ａ１２Ｓタンパク質である。
【００８９】
一実施態様では、少なくとも１つのタンパク質は、Ｅ１Ｂタンパク質およびＥ４タンパク質の組み合わせ、好ましくはＥ１Ｂ５５ｋＤタンパク質およびＥ４ｏｒｆ６タンパク質の組み合わせである。
【００９０】
一実施態様では、少なくとも１つのタンパク質は、Ｅ１Ｂタンパク質およびＥ１Ａタンパク質の組み合わせ、好ましくはＥ１Ｂ５５ｋＤタンパク質およびＥ１Ａ１２Ｓタンパク質の組み合わせである。
【００９１】
一実施態様では、少なくとも１つのタンパク質は、Ｅ４タンパク質およびＥ１Ａタンパク質の組み合わせ、好ましくはＥ４ｏｒｆ６タンパク質およびＥ１Ａ１２Ｓタンパク質の組み合わせである。
【００９２】
一実施態様では、少なくとも１つのタンパク質は、Ｅ１Ｂタンパク質、Ｅ４タンパク質、Ｅ１Ａタンパク質の組み合わせ、好ましくはＥ１Ｂ５５ｋＤタンパク質、Ｅ４ｏｒｆ６タンパク質、Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質の組み合わせである。
【００９３】
一実施態様では、Ｅ１Ｂタンパク質の発現が、プロモーターによって制御されており、該プロモーターは、腫瘍特異的プロモーター、器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、異種プロモーター、およびアデノウイルスプロモーターを含むグループから選択され、該アデノウイルスプロモーターは、Ｅ１Ｂプロモーターとは異なる。
【００９４】
一実施態様では、Ｅ４タンパク質の発現が、プロモーターによって制御されており、該プロモーターは、腫瘍特異的プロモーター、器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、異種プロモーター、およびアデノウイルスプロモーターを含むグループから選択され、該アデノウイルスプロモーターは、Ｅ４プロモーターとは異なる。
【００９５】
一実施態様では、アデノウイルスプロモーターが、Ｅ１Ａプロモーターである。
【００９６】
一実施態様では、Ｅ１Ａタンパク質の発現が、プロモーターによって制御されており、該プロモーターは、腫瘍特異的プロモーター、器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、異種プロモーター、およびアデノウイルスプロモーターを含むグループから選択され、該アデノウイルスプロモーターは、Ｅ１Ａプロモーターとは異なる。
【００９７】
一実施態様では、Ｅ１Ａタンパク質の発現が、ＹＢ−１で制御されている、もしくはＹＢ−１で制御可能である。
【００９８】
一実施態様では、Ｅ１Ａタンパク質の発現を制御するプロモーターは、アデノウイルスのＥ２後期プロモーターである。
【００９９】
一実施態様では、Ｅ４タンパク質、好ましくはＥ４ｏｒｆ６タンパク質、およびＥ１Ｂタンパク質、好ましくはＥ１Ｂ５５ｋｄタンパク質が、同一または共通のプロモーターの制御下にある。
【０１００】
第１、２、３、４、５、６のいずれか一態様の一実施態様では、ウイルスが少なくとも１つのアデノウイルスのタンパク質を介して核内にＹＢ−１を供給する、もしくは少なくとも１つのアデノウイルスのタンパク質を介して核内へのＹＢ−１の供給を媒介しており、好ましくは該アデノウイルスタンパク質は、Ｅ１Ａとは異なる。
【０１０１】
第１、２、３、４、５、６のいずれか一態様の一実施態様では、ウイルスが、少なくとも１つのアデノウイルスのタンパク質を介してアデノウイルスの複製のためにＹＢ−１を供給する、もしくは少なくとも１つのアデノウイルスのタンパク質を介してアデノウイルスの複製のためのＹＢ−１の供給を媒介しており、好ましくは該アデノウイルスタンパク質は、Ｅ１Ａとは異なる。
【０１０２】
一実施態様では、アデノウイルスのタンパク質が、Ｅ４ｏｒｆ６およびＥ１Ｂ５５ｋｄの複合体である。
【０１０３】
第１、２、３、４、５、６のいずれか一態様の一実施態様では、アデノウイルスの核酸が少なくとも１つの機能的に不活性なアデノウイルスの領域からなり、該領域がＥ１領域、Ｅ３領域、Ｅ４領域、そしてこれらの組み合わせを含むグループから選択される。
【０１０４】
好適な一実施態様では、該領域がＥ１領域である。
【０１０５】
一実施態様では、該領域が、Ｅ３領域である。
【０１０６】
一実施態様では、該領域が、Ｅ４領域である。
【０１０７】
一実施態様では、該領域が、Ｅ１領域、Ｅ３領域、Ｅ４領域を含む。
【０１０８】
第１、２、３、４、５、６のいずれか一態様の一実施態様では、ウイルスが、少なくとも１つの発現カセットからなり、該発現カセットは、少なくとも１つのプロモーターおよびアデノウイルスのタンパク質をコードする核酸を含み、該アデノウイルスタンパク質が、Ｅ１Ｂタンパク質、好ましくはＥ１Ｂ５５ｋＤタンパク質である。
【０１０９】
好適な一実施態様では、該プロモーターが、Ｅ１Ｂプロモーターとは異なる。
【０１１０】
好適な一実施態様では、プロモーターが、腫瘍特異的プロモーター、器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、異種プロモーター、およびアデノウイルスプロモーターを含むグループから選択され、該プロモーターがＥ１Ｂプロモーターとは異なる。
【０１１１】
第１、２、３、４、５、６のいずれか一態様の一実施態様では、ウイルスが少なくとも１つの発現カセットを含み、該発現カセットが、少なくとも１つのプロモーターおよびアデノウイルスのタンパク質をコード化する核酸からなり、該アデノウイルスのタンパク質が、Ｅ４タンパク質、好ましくはＥ４ｏｒｆ６タンパク質である。
【０１１２】
好適な一実施態様では、該プロモーターが、Ｅ４プロモーターとは異なる。
【０１１３】
好適な一実施態様では、プロモーターが、腫瘍特異的プロモーター、器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、異種プロモーター、およびアデノウイルスプロモーターを含むグループから選択され、該アデノウイルスプロモーターがＥ４プロモーターとは異なる。
【０１１４】
一実施態様では、該プロモーターは、Ｅ１Ａプロモーターである。
【０１１５】
第１、２、３、４、５、６のいずれか一態様の一実施態様では、ウイルスが少なくとも１つの発現カセットからなり、該発現カセットは、少なくとも１つのプロモーターおよびアデノウイルスのタンパク質をコード化する核酸からなり、該アデノウイルスタンパク質が、Ｅ１Ａタンパク質、好ましくはＥ１Ａ１２Ｓタンパク質である。
【０１１６】
好適な一実施態様では、該プロモーターは、Ｅ１Ａプロモーターとは異なる。
【０１１７】
好適な一実施態様では、プロモーターが、腫瘍特異的プロモーター、器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、異種プロモーター、およびアデノウイルスプロモーターを含むグループから選択される。
【０１１８】
一実施態様では、アデノウイルスが、核酸を含み、該核酸がＹＢ−１をコード化する。
【０１１９】
好適な一実施態様では、ＹＢ−１をコード化する核酸が、プロモーターの制御下にあり、好ましくは該プロモーターがＥ２後期プロモーターである。
【０１２０】
一実施態様では、ＹＢ−１をコード化する核酸が、プロモーターの制御下にあり、該プロモーターがＹＢ−１依存性で、ＹＢ−１制御下にある。
【０１２１】
一実施態様では、ＹＢ−１をコード化する核酸が、Ｅ１Ａタンパク質をコード化する核酸、好ましくはＥ１Ａ１２Ｓタンパク質をコード化する核酸を含む発現カセットの一部である。
【０１２２】
好適な一実施態様では、Ｅ１Ａタンパク質をコード化する核酸が、ＩＲＥＳ配列を介して、ＹＢ−１をコード化する核酸から分離される。
【０１２３】
一実施態様では、Ｅ４タンパク質、好ましくはＥ４ｏｒｆ６タンパク質をコード化する核酸、およびＥ１Ｂタンパク質、好ましくはＥ１Ｂ５５ｋＤタンパク質をコード化する核酸が、発現カセットに含まれ、好ましくは２つのコード配列がＩＲＥＳ配列によって分離される。
【０１２４】
好適な一実施態様では、発現カセットのプロモーターが、腫瘍特異的プロモーター、器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、異種プロモーター、およびアデノウイルスプロモーターを含むグループから選択され、該アデノウイルスプロモーターが、Ｅ４プロモーターおよびＥ１Ｂプロモーターとは異なり、好ましくは野生型Ｅ４プロモーターおよび野生型Ｅ１Ｂプロモーターとは異なる。
【０１２５】
一実施態様では、ウイルスが、プロモーターおよび核酸配列を含む発現カセットを含み、該核酸配列が、アプタマー、リボザイム、アプタザイム、アンチセンス分子、およびｓｉＲＮＡを含むグループから選択される。
【０１２６】
一実施態様では、ウイルスが、プロモーターおよび核酸配列を含む発現カセットを含み、該核酸配列が、コード化核酸であり、該核酸が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、アンチカリン、抗体、および抗体断片を含むグループから選択される分子をコードする。
【０１２７】
一実施態様では、ウイルスが、発現カセットを含み、該発現カセットが、プロモーターおよび核酸配列からなり、該核酸配列が、アポトーシス誘導遺伝子、プロドラッグ遺伝子、プロテアーゼ・インヒビター、腫瘍抑制遺伝子、サイトカイン、および血管形成抑制剤を含むグループから選択される。
【０１２８】
一実施態様では、該ウイルスが、組換えアデノウイルスである。
【０１２９】
一実施態様では、該ウイルスが、アデノウイルス突然変異体である。
【０１３０】
一実施態様では、該ウイルスが、複製能を欠損している。
【０１３１】
好適な一実施態様では、ウイルスが、脱調節ＹＢ−１を含む細胞内、もしくは核内にＹＢ−１を有する細胞内において複製可能である。
【０１３２】
好適な一実施態様では、細胞が、細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を含む。
【０１３３】
一実施態様では、薬剤が、少なくとも１つのさらなる医薬的に活性な薬剤を含む。
【０１３４】
一実施態様では、薬剤が、さらなる医薬的に活性な薬剤と同時投与される、もしくは同時投与が意図されている。
【０１３５】
一実施態様では、さらなる医薬的に活性な薬剤が、サイトカイン、メタロプロテイナーゼ阻害剤、血管形成抑制剤、細胞増殖抑制剤、チロシンキナーゼ阻害剤、細胞周期阻害剤、プロテアソーム阻害剤、シグナル伝達系の阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、および組換え抗体を含むグループから選択される。
【０１３６】
一実施態様では、薬剤が、少なくとも２つの薬剤の組み合わせを含み、各薬剤が細胞増殖抑制剤を含むグループから個別かつ無関係に選択される。
【０１３７】
好適な一実施態様では、少なくとも２つの薬剤が、異なる標的分子をターゲットにする。
【０１３８】
より好適な一実施態様では、少なくとも２つの薬剤が、異なる作用機序を介して活性である。
【０１３９】
一実施態様では、少なくとも１つの薬剤が、ウイルスが複製する細胞の感染性を増大させる。
【０１４０】
一実施態様では、薬剤が、細胞成分の有効性に影響を及ぼし、好ましくは成分の有効性を増大させ、該成分がウイルスの取り込みを媒介する。
【０１４１】
一実施態様では、薬剤が、ＹＢ−１の核内への輸送を媒介する、好ましくはＹＢ−１の核内への輸送を増大させる。
【０１４２】
一実施態様では、薬剤が、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤である。
【０１４３】
好適な一実施態様では、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、トリコスタチンＡ、ＦＲ９０１２２８、ＭＳ−２７−２７５、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ＰＸＤ１０１、アピシジン、およびスクリプタイドを含むグループから選択される。
【０１４４】
一実施態様では、少なくとも１つの薬剤が、トリコスタチンＡ、ＦＲ９０１２２８、ＭＳ−２７−２７５、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ＰＸＤ１０１、アピシジン、およびスクリプタイドを含むグループから選択される。
【０１４５】
一実施態様では、少なくとも１つの薬剤が、トポイソメラーゼ阻害剤である。
【０１４６】
好適な一実施態様では、トポイソメラーゼ阻害剤が、カンプトテシン、ＳＮ−３８、トポテカン、ＤＸ−８９５Ｉｆ、イリノテカン、９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン、エトポシド、およびダウノルビシンを含むグループから選択される。
【０１４７】
一実施態様では、薬剤が、トリコスタチンＡおよびイリノテカンを含む。
【０１４８】
第１、２、３、４、５、６のいずれか一態様の一実施態様では、ウイルスが、以下を含む：
−機能的な野生型Ｅ１領域の欠損
−ウイルス感染させた細胞におけるＹＢ−１核内輸送用トランスポーター。
【０１４９】
一実施態様では、ウイルスが、タンパク質ＩＸをコード化する核酸を発現しており、またタンパク質ＩＸを発現する。
【０１５０】
一実施態様では、機能的な野生型Ｅ１Ａ領域の欠損が、Ｅ１Ａマイナスである。
【０１５１】
一実施態様では、機能的な野生型Ｅ１領域の欠損が、Ｅ１Ｂマイナスである。
【０１５２】
好適な一実施態様では、野生型Ｅ１領域の欠損がＥ１Ｂ５５ｋマイナスおよび（または）Ｅ１Ｂ１９ｋマイナスおよび（または）タンパク質ＩＸマイナスである。
【０１５３】
一実施態様では、トランスポーターが、ウイルスによって供給されるトランスポーター、好ましくは異種トランスポーターである。
【０１５４】
好適な一実施態様では、トランスポーターが、ウイルスのトランスポーターである。
【０１５５】
一実施態様では、トランスポーターがＥ４ｏｒｆ６タンパク質を含む。
【０１５６】
一実施態様では、トランスポーターが、Ｅ１Ｂ５５ｋタンパク質を含む。
【０１５７】
一実施態様では、トランスポーターが、Ｅ４ｏｒｆ４およびＥ１Ｂ５５ｋからなる複合体を含む。
【０１５８】
一実施態様では、トランスポーターが、核酸によってコード化されており、該核酸がプロモーターの制御下にある。
【０１５９】
好適な一実施態様では、トランスポーターが、少なくとも２つの因子からなる複合体であり、各因子が核酸によってコード化されており、両方の核酸が共通のプロモーターによって制御される。
【０１６０】
好適な一実施態様では、２つのコード化核酸が、発現レベルの調節エレメントを介して連結しており、該エレメントは好ましくはＩＲＥＳを含むグループから選択される。
【０１６１】
一実施態様では、トランスポーターが少なくとも２つの因子からなる複合体であり、各因子が、核酸によってコード化されており、両方の核酸が、それぞれ自己のプロモーターによって制御されている。
【０１６２】
一実施態様では、プロモーターが、Ｅ４プロモーター、特にアデノウイルスのＥ４プロモーターとは異なり、またＥ１Ｂプロモーター、特にアデノウイルスＥ１Ｂプロモーターとは異なる。
【０１６３】
一実施態様では、プロモーターが、Ｅ４プロモーター、Ｅ１Ｂプロモーターとは異なり、そして好ましくはＥ２後期プロモーターとも異なり、組織特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター、ウイルスプロモーター、ＣＭＶプロモーター、特にアデノウイルスプロモーターを含むグループから選択される。
【０１６４】
一実施態様では、トランスポーターをコード化する核酸が、Ｅ１Ｂ５５ｋの３′においてＥ１Ｂ５５ｋの３′−ＵＴＲを含む。
【０１６５】
一実施態様では、野生型Ｅ１領域の欠損が、Ｅ１Ｂ５５ｋ陽性である場合、トランスポーターをコード化する核酸が、Ｅ１Ｂ５５ｋをコード化する核酸を含まない。
【０１６６】
一実施態様では、トランスポーターをコード化する核酸が、Ｅ１Ｂ５５ｋおよびＥ１Ｂ１９ｋをコードする。
【０１６７】
好適な一実施態様では、トランスポーターをコード化する核酸が、タンパク質ＩＸもコード化する。
【０１６８】
一実施態様では、Ｅ１Ｂ５５ｋおよびＥ１Ｂ１９ｋをコード化する核酸が、プロモーターの制御下にある。
【０１６９】
一実施態様では、Ｅ１Ｂ５５ｋおよび／またはＥ１Ｂ１９ｋおよび／またはタンパク質ＩＸをコード化する核酸が、プロモーターの制御下にあり、該プロモーターは好ましくはＥ１Ａ依存的プロモーターとは異なり、より好ましくは該核酸が、Ｅ１Ｂ５５ｋ、Ｅ１Ｂ１９ｋ、タンパク質ＩＸをコード化する。
【０１７０】
一実施態様では、機能的な野生型Ｅ１領域の欠損が、Ｅ１Ａ１３Ｓマイナスおよび／またはＥ１Ａ１２Ｓマイナスである。
【０１７１】
一実施態様では、機能的な野生型Ｅ１領域の欠損が、Ｅ１Ａ１３Ｓマイナスである。
【０１７２】
一実施態様では、好ましくは野生型Ｅ１領域の欠損が、Ｅ１Ａ１３ＳマイナスおよびＥ１Ａ１２Ｓマイナスであり、ウイルスがＥ１Ａ１２Ｓタンパク質をコード化する核酸を含み、該核酸が、好ましくは異種核酸である。
【０１７３】
好適な一実施態様では、Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質をコード化する核酸が、プロモーターの制御下にあり、該プロモーターが好ましくはＹＢ−１依存的プロモーターであり、より好ましくはＥ２後期プロモーター、腫瘍特異的プロモーター、および組織特異的プロモーターを含むグループから選択される。
【０１７４】
好適な一実施態様では、トランスポーターをコード化する核酸が、Ｅ４ｏｒｆ６およびＥ１Ｂ５５ｋをコードする。
【０１７５】
一実施態様では、Ｅ１Ａ１２Ｓをコード化する核酸およびタンパク質ＩＸをコード化する核酸が、共通のプロモーターの制御下にあり、好ましくは両方の核酸が、発現調節エレメントを介して互いに連結しており、該エレメントはより好ましくはＩＲＥＳを含むグループから選択される。
【０１７６】
一実施態様では、Ｅ１Ａ１２Ｓ領域をコード化する核酸およびタンパク質ＩＸをコード化する核酸が、それぞれ任意のプロモーターの制御下にあり、該プロモーターは好ましくは同一のプロモーターである。
【０１７７】
一実施態様では、プロモーターが、ＹＢ−１依存的プロモーターであり、好ましくはＥ２後期プロモーター、ＭＤＲプロモーター、およびＤＮＡポリメラーゼαプロモーターを含むグループから選択される。
【０１７８】
一実施態様では、ウイルスが、ＹＢ−１をコード化する核酸を含む。
【０１７９】
好適な一実施態様では、Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質をコード化する核酸およびＹＢ−１をコード化する核酸が、共通のプロモーターの制御下にあり、両方のコード化核酸が、発現調節エレメントによって互いに連結されており、該エレメントは好ましくはＩＲＥＳを含むグループから選択される。
【０１８０】
より好適な一実施態様では、ＹＢ−１をコード化する核酸およびＥ１Ａ１２Ｓタンパク質をコード化する核酸が、それぞれ任意のプロモーターの制御下にあり、該プロモーターは好ましくは同一のプロモーターである。
【０１８１】
一実施態様では、プロモーターが、ＹＢ−１依存的プロモーターであり、好ましくはＥ２後期プロモーター、ＭＤＲプロモーター、ＤＮＡポリメラーゼαプロモーターを含むグループから選択される。
【０１８２】
一実施態様では、Ｅ１Ａ１２Ｓをコード化する核酸が、Ｅ３領域またはＥ４領域内にクローニングされる。
【０１８３】
一実施態様では、Ｅ１Ａ１２Ｓをコード化核酸およびタンパク質ＩＸをコード化する核酸またはＹＢ−１をコード化する核酸が、Ｅ３領域またはＥ４領域内にクローニングされる。
【０１８４】
一実施態様では、タンパク質ＩＸをコード化する核酸の発現が、Ｅ１Ｂとは異なるプロモーター、Ｅ１Ｂ１９ｋまたはＥ１Ａ１２Ｓによって制御される。
【０１８５】
一実施態様では、ウイルスが、好ましくはＥ３領域内にクローニングされた少なくとも１つのトランス遺伝子を含む。
【０１８６】
好適な一実施態様では、ウイルスが、好ましくはＥ４領域内にクローニングされた少なくとも１つのトランス遺伝子を含む。
【０１８７】
第１、２、３、４、５、６のいずれか一態様の好適な一実施態様では、ウイルスは、以下を含む：
−機能的な野生型Ｅ１領域の欠損
−ウイルス感染させた細胞におけるＹＢ−１核内輸送用トランスポーター。
【０１８８】
ウイルスは、ＲＧＤモチーフをコードする核酸を含む。
【０１８９】
第１、２、３、４、５、６のいずれか一態様の好適な一実施態様では、ウイルスは、以下を含む：
−機能的な野生型Ｅ１領域の欠損
−ウイルス感染させた細胞におけるＹＢ−１核内輸送用トランスポーター。
【０１９０】
ウイルスは、ＭＬＰ遺伝子および（または）Ｅ２Ａ遺伝子およびＥ１Ｂ遺伝子および（または）Ｅ３遺伝子および（または）Ｅ４遺伝子を含む。
【０１９１】
一実施態様では、ウイルスは、核内にＹＢ−１を含まない細胞内において複製能を欠損している。
【０１９２】
一実施態様では、ウイルスは、核内にＹＢ−１を含む細胞内、特に細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を含む細胞内において複製可能である。
【０１９３】
一実施態様では、ウイルスは、調節解除されたＹＢ−１が存在する細胞内において複製可能である。
【０１９４】
一実施態様では、薬剤は、少なくとも１つの医薬的に活性な薬剤をさらに含む。
【０１９５】
好適な一実施態様では、医薬的に活性な薬剤が、サイトカイン、メタロプロテイナーゼ阻害剤、血管形成抑制剤、細胞増殖抑制剤、細胞周期阻害剤、プロテアソーム阻害剤、組換え抗体、シグナル伝達系およびタンパク質キナーゼに対する阻害剤を含むグループから選択される。
【０１９６】
一実施態様では、薬剤が、少なくとも２つの薬剤の組み合わせからなり、各薬剤は、細胞増殖抑制剤を含むグループから個別かつ無関係に選択される。
【０１９７】
好適な一実施態様では、少なくとも２つの薬剤が、異なる標的分子をターゲットにする。
【０１９８】
好適な一実施態様では、少なくとも２つの薬剤が、異なる作用機序を介して活性である。
【０１９９】
一実施態様では、少なくとも１つの薬剤が、ウイルスが複製する細胞の感染性を増大させる。
【０２００】
一実施態様では、少なくとも１つの薬剤が、細胞成分の有効性に影響を及ぼし、好ましくは成分の有効性を増大させ、該成分がウイルスの取り込みを媒介する。
【０２０１】
一実施態様では、薬剤が、ＹＢ−１の核内への輸送を媒介する、好ましくはＹＢ−１の核内輸送を増大させる。
【０２０２】
一実施態様では、少なくとも１つの薬剤が、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤である。
【０２０３】
一実施態様では、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、トリコスタチンＡ、ＦＲ９０１２２８、ＭＳ−２７−２７５、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ＰＸＤ１０１、アピシジン、およびスクリプタイドを含むグループから選択される。
【０２０４】
一実施態様では、薬剤が、トリコスタチンＡ、ＦＲ９０１２２８、ＭＳ−２７−２７５、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ＰＸＤ１０１、アピシジン、およびスクリプタイドを含むグループから選択される。
【０２０５】
一実施態様では、少なくとも１つの薬剤が、トポイソメラーゼ阻害剤である。
【０２０６】
好適な一実施態様では、トポイソメラーゼ阻害剤が、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、ＤＸ−８９５Ｉｆ、ＳＮ−３８、９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン、ダウノルビシン、およびエトポシドを含むグループから選択される。
【０２０７】
一実施態様では、薬剤が、トリコスタチンＡおよびイリノテカンを含む。
【０２０８】
一実施態様では、ウイルス、特に前項のいずれか一項記載のウイルスが、少なくとも２つの該薬剤から分離される。
【０２０９】
一実施態様では、少なくとも１単位用量のウイルスが、少なくとも１単位用量の１つまたは少なくとも２つの薬剤から分離される。
【０２１０】
第七の態様では、本発明の基礎をなす課題は、本発明と関連するウイルスの使用によって定義される薬剤によって解決される。
【０２１１】
第八の態様では、本発明の基礎をなす課題は、治療を必要とする患者における処置法によって解決され、本明細書においてそれぞれ定義、開示さる薬剤が該患者に投与される。
【０２１２】
本発明者は、驚くべきことに、複製にＹＢ−１を必要とするアデノウイルス、即ち、ＹＢ−１依存的に複製するアデノウイルスが、細胞、特に動物細胞の耐性をそれぞれ取り除く、逆転するのに適していることを見出した。これに拘束されることを望まないが、ＹＢ−１依存的ウイルスの複製におけるＹＢ−１の使用のため、ＹＢ−１は耐性成立において重要因子としてもはや利用できないように思われる。特に、このウイルス、特にアデノウイルスの複製におけるＹＢ−１の関与のため、ＹＢ−１による耐性媒介遺伝子群の転写制御などＹＢ−１によって制御される他のプロセスがもはや進行しない、もしくは少なくとも大幅に減速して進行する、もしくはもはや利用できない程度にまでＹＢ−１は除去されると思われる。
【０２１３】
したがって、本発明と関連して、また本明細書に記載の使用のために、概して任意のウイルスが使用可能であり、該ウイルスはＹＢ−１をその複製に利用し、好ましくは複製が一過性の複製のみならず、感染細胞の溶解を招く［別名ＣＰＥ：細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）］ことは本発明の範囲内である。
【０２１４】
低減または逆転される耐性の種類は、基本的にそれらの耐性にのみ限定され、即ち、ＹＢ−１によって制御される、好ましくはＹＢ−１によって活性化される、転写、翻訳および／または活性である。特に、これらは逆方向ＣＡＡＴボックス（Ｙボックス）を含む耐性媒介因子である。該耐性は特に以下の耐性である。古典的かつ非定型の多剤耐性（ＭＤＲ）であり、非定型の多剤耐性は別として、古典的なＭＤＲの表現型は、主に脂溶性化合物を細胞外に出す、膜結合型の１７０ｋＤａＡＴＰ依存性の膜貫通型糖タンパク質の過剰発現に基づいている。ＭＤＲ１タンパク質（別名Ｐｇｐ、Ｐ糖タンパク質）は、ＡＢＣトランスポーターのグループの１員であり、特にＭＲＰ（多剤耐性関連タンパク質）およびＢＣＲＰ（乳癌耐性タンパク質）が属する。したがって、本発明の意味における別の耐性は、ＡＢＣトランスポーター、ＭＤＲ−１、Ｐｇｐ、Ｐ糖タンパク質、ＭＲＰおよび（または）ＢＣＲＰによって媒介される。小胞性ＬＲＰタンパク質（肺耐性関連タンパク質）は古典的なＡＢＣトランスポーターには属さない。しかし、これに関連して言及されることが多く、腫瘍細胞における細胞殖抑制剤に対する耐性成立と関連する輸送プロセスにも関与するためである（Sugawara I ら, CANCER LETTERS 112, 23-31, 1997; Gottesman ら, Nat Rev Cancer. 2002,2: 48-58）。ＬＲＰプロモーターは逆方向ＣＡＡＴボックス（Ｙボックス）を含むことが知られている（Scheider ら, Breast Cancer Res., 2001, 3, 183-191）。この範囲において、小胞性ＬＲＰタンパク質によって媒介される耐性も本発明の意味において耐性である。別の耐性は、治療される様々な腫瘍と関連して一般に、そしてより具体的に本明細書に記載されている耐性であり、ＭＤＲ、ＭＲＰ、トポイソメラーゼ、ＢＣＬ２、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、およびタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。細胞増殖抑制剤の作用は特にアポトーシス誘導に基づいているため、アポトーシス関連遺伝子の発現が耐性成立において重要な役割を果たしており、したがって以下の因子、即ち、Ｆａｓ、ＢＣＬ−２ファミリー、ＨＳＰ７０、ＥＧＦＲ［Kim ら, Cancer Chemther. Pharmacol. 2002, 50, 343-352］もその限りにおいて関連しており、ひいては本発明の意味において耐性を定義する。
【０２１５】
本発明に従って使用されるウイルス、特にアデノウイルスは、ＹＢ−１依存性、即ち、複製にＹＢ−１を要求するウイルスである。これと関連して、該ウイルスは先行技術において既知であり、本発明に従って使用できること、または該ウイルスが本発明書の開示に基づいて設計できることは、本発明の範囲内である。本発明のウイルスやアデノウイルスという用語、もしくは本発明に従って使用されるウイルス、アデノウイルスは、それらが複製にＹＢ−１を利用するという条件で本発明書に記載のウイルスが本発明に従って使用可能であるという、本発明の目的での同義語として理解する必要のあることを指摘すべきである。複製に使用されるＹＢ−１は、以下に詳細が概説されているように、調節解除されたされている、または核内に局在化しているＹＢ−１、特に細胞周期とは無関係に核内に局在化しているＹＢ−１でありうる。
【０２１６】
調節解除された形態のＹＢ−１を含む細胞は、以下の特性の少なくとも１つを含む細胞および／またはＹＢ−１を含む細胞であり、該ＹＢ−１が少なくとも以下の特性の１つを示す：（１）ＹＢ−１が細胞内において、好ましくは細胞周期とは無関係に過剰発現されており、それによって、好ましくは、発現の手段として、正常細胞、即ち以下のような腫瘍細胞または細胞（繊維芽細胞株ＷＩ３８およびＣＣＤ３２−Ｌｕの他、肝細胞）、細胞株とは異なる細胞内におけるＹＢ−１の発現が利用される。好ましくは、ファクター２−１０、好ましくは５−１０の範囲で発現が増加した場合、過剰発現が認められる。発現、特に過剰発現の測定方法は、当業者には既知であり、特にタンパク質濃度の測定、特にＹＢ−１のタンパク質濃度、ＲＮＡ測定、特にＹＢ−１のＲＮＡ測定、好ましくはそれぞれがＹＢ−１と関連するウェスタンブロッティング、ノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲを含む。ＹＢ−１ではなく、代理マーカーも本明細書に記載の通り使用可能である。ＹＢ−１の過剰発現を示す細胞株の例は、以下の通りである：結腸癌細胞株２５７ＲＤＢ、膵臓癌細胞株１８１ＲＤＢ、乳癌細胞株ＭＣＦ−７Ａｄｒ、前立腺癌細胞株ＤＵ１４５、前立腺癌細胞株ＰＣ３、神経膠腫細胞株Ｕ３７３、神経膠腫細胞株Ｕ８７、肺癌細胞株Ａ５４９、肝臓癌細胞株Ｈｅｐ３ＢおよびＨｅｐＧ２。（２）細胞内に存在するＹＢ−１は、本発明のウイルスの複製を可能にする。本発明と関連して、上記の条件下での複製効率が、有意に低下した複製とは異なる場合が好ましい。
【０２１７】
一実施態様では、有意に低下した複製は、特に、野生型と比較して、ファクター２、好ましくはファクター５、より好ましくはファクター１０、最も好ましくはファクター１００だけ低下した複製である。好適な一実施態様の場合、同様または同一の細胞株、同様または同一のウイルス感染力価（感染の多重度：ＭＯＩまたはプラーク形成単位ｐｆｕ）および／または同一または同様の全般的な実験条件を利用して複製比較が実施される。特に複製という用語は粒子形成を示す。さらなる実施態様の場合、ウイルス核酸の合成の程度は、複製の測定法として理解できる。粒子形成の測定方法の他、ウイルスの核酸合成の測定方法は、当業者には既知である。
【０２１８】
本明細書で示される調節解除されたＹＢ−１の別の形態は、リン酸化ＹＢ−１である。この理論的根拠は以下の通りである。ＹＢ−１は多くの腫瘍において高発現しており、正常細胞においてはほとんど検出できない。また、ＹＢ−１が、ＵＶ照射や化学療法薬などのストレス刺激によって核内移行することが証明されている（Okamoto T ら, Oncogene, 19, 6194-6202, 2000: Koike K ら, FEBS Letters, 417, 390-394, 1997）。セリン／スレオニン・キナーゼであるＡｋｔは、転写因子および細胞周期タンパク質をリン酸化することで腫瘍細胞の増殖を促進させる（Nicholson KM and Anderson NG, Cell. Signal., 14, 381-395, 2002）。また、活性化Ａｋｔ（リン酸化Ａｋｔ）およびＹＢ−１のタンパク質発現に正の相関関係にあり、ＡｋｔがＹＢ−１のＳｅｒ１０２のコールドショックドメインに結合して、リン酸化させることが見出された（Sutherland BW ら, Oncogene, 24, 4282-4292, 2005）。これらのデータは、ＹＢ−１の細胞内局在を変化させて、その機能を導くシグナル伝達系の存在を示唆している。また、このリン酸化は、ＭＤＲ１およびＭＲＰなどのタンパク質の産生を増加させ、これらはストレス反応、細胞増殖、癌形質転換に関与する（Evdokimova V ら, Molecular and Cellular Biology, 26, 277-292, 2006）。しかし、ＡｋｔによるＹＢ−１のリン酸化は、キャップ結合能も弱め、これによってサイレンシングされたｍＲＮＡ種の翻訳の活性化を促す（Evdokimova V ら, Molecular and Cellular Biology, 26, 277-292, 2006）。Ａｋｔは正常細胞内において活性化していないため、ＹＢ−１はリン酸化状態では存在しないが、腫瘍細胞内においてＹＢ−１は、リン酸化および（または）過剰発現など、「調節解除」状態で存在する。
【０２１９】
本明細書に記載のウイルスおよび／または本明細書に記載の薬剤を使用して治療される様々な疾患および患者は、本明細書に記載される疾患および患者である。本発明のウイルスの投与、放射線療法、細胞増殖抑制剤の投与の間のタイミングについて、ウイルスの複製効率および腫瘍の種類および大きさによって主に判断することを指摘すべきである。ウイルスの投与時、複製までそれがある程度の時間、通常約１−３日間続いて、これによってＹＢ−１の複合体形成、それに伴う他の因子、特に耐性を生じる各因子の転写において利用できなくなることは、当業者には理解されるであろう。この範囲において、特に耐性疾患の治療開始時、別の任意の治療、特に医薬的に活性な薬剤などの医薬的に活性な化合物の投与および／または放射線療法前におけるウイルス投与は有益である。
【０２２０】
医薬的に活性な化合物の投与は、好ましくは本明細書に実施例として開示される抗腫瘍薬や抗癌剤の投与を含む。別の各薬剤は、当業者には既知である。特に好ましいのは細胞増殖抑制剤である。例示的な細胞増殖抑制剤は、ウイルスと同時投与される医薬的組成物および（医薬）製剤と関連して本明細書に記載の細胞増殖抑制剤である。
【０２２１】
腫瘍疾患の治療における通常の用量および処置法は、本発明と関連して適用可能であることは本発明の範囲内であるが、これに限定されるわけではない。例えば、細胞増殖抑制剤の投与量は、好ましくは体表面積（ｍ２）に基づいて算出される。実施例を用いて、ドキソルビシンは約５０ｍｇ／ｍ２である。治療計画は異なって作成され、細胞増殖抑制剤および放射線それぞれ数日間、数種間、さらには数ヶ月間の投与の他、１日投与を含むことができる。追加的な投与および放射線療法を周期的に施すことができる。放射線療法および／または細胞増殖抑制剤の投与は単独療法または併用療法の順で可能であり、本発明に従ってさらにウイルス投与で補う。
【０２２２】
本発明をさらに理解するために、ウイルス複製の基本を簡単に概説する。アデノウイルスの複製は非常に複雑な過程であり、通常、ヒトの転写因子Ｅ２Ｆに基づいている。ウイルス感染中、まず「初期遺伝子」Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４が発現される。「後期遺伝子」群はウイルスの構造タンパク質の合成に関与している。異なるＥ１Ａ、Ｅ１Ｂタンパク質をコード化する２つの転写単位Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂを含むＥ１領域は、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４遺伝子の転写を誘導するため、初期・後期遺伝子いずれの活性化においても重要な役割を果たす（Nevins, J. R., Cell 26, 213-220, 1981）。また、Ｅ１Ａタンパク質は休止中の細胞においてＤＮＡ合成を開始させて、Ｓ期への移行を引き起こすことができる（Boulanger and Blair, 1991参照）。また、それらはＲｂクラスの腫瘍抑制因子と相互作用する（Whyte, P. ら, Nature 334, 124-127, 1988）。この過程で、細胞の転写因子Ｅ２Ｆが放出される。次に、Ｅ２Ｆ因子が細胞およびウイルスの両遺伝子の対応するプロモーター領域（特にアデノウイルスのＥ２初期プロモーター）に結合して、転写、ひいては複製を開始させる（Nevins, J. R., Science 258, 424-429, 1992）。ｐＲｂおよびＥ２Ｆの活性はリン酸化によって制御される。低リン酸化型ｐＲｂは特にＧ１、Ｍ期に存在する。これとは対照的に、過リン酸化型ｐＲｂはＳ、Ｇ２期に存在する。ｐＲｂのリン酸化によって、Ｅ２Ｆおよび低リン酸化型ｐＲｂを含む複合体を含むＥ２Ｆが放出される。Ｅ２Ｆおよび低リン酸化型ｐＲｂの複合体からのＥ２Ｆの放出によって、Ｅ２Ｆ依存的遺伝子の転写がもたらされる。Ｅ１Ａタンパク質は低リン酸化型ｐＲｂにのみ結合して、これによってＥ１Ａタンパク質のＣＲ２領域を介してＥ１ＡとｐＲｂへの結合が主に生じる。また、これはＣＲ１領域にも結合するが、親和性は低い（Ben-Israel and Kleiberger, Frontiers in Bioscience, 7, 1369-1395, 2002; Helt and Galloway, Carcinogenesis, 24, 159-169, 2003）。
【０２２３】
Ｅ２領域の遺伝子産物は、それらが３つの必須タンパク質をコードするため、複製の開始および完了において特に必要とされる。Ｅ２タンパク質の転写は、「Ｅ２初期Ｅ２Ｆ依存的プロモーター」という２つのプロモーターによって制御されており、本明細書ではＥ２初期プロモーターまたは初期Ｅ２プロモーター、および「Ｅ２後期プロモーター」とも呼ばれる（Swaminathan and Thimmapaya, The Molecular Repertoire of Adenoviruses III: Current Topics in Microbiology and Immunology, vol 199, 177-194, Springer Verlag 1995）。また、Ｅ４領域の産物は、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ−５５ｋＤａタンパク質とともに、Ｅ２Ｆの活性およびｐ５３の安定性において重要な役割を果たす。例えば、Ｅ２プロモーターは、Ｅ２ＦおよびＤＰ１を含むヘテロ二量体と、Ｅ４領域によってコード化されるＥ４ｏｒｆ６／７との直接の相互作用によってさらにトランス活性化される（Swaminathan and Thimmapaya, JBC 258, 736-746, 1996）。さらに、感染の溶菌サイクルを成功裏に完了させるために、Ｅ１Ｂ−５５ｋＤａおよびＥ４ｏｒｆ６を含む複合体はｐ５３によって不活化される（Steegenga, W. T. ら, Oncogene 16, 349-357, 1998）。また、Ｅ１Ｂ−５５ｋＤａは、Ｅ４ｏｒｆ６タンパク質と相互作用する際に、ウイルスＲＮＡの核外への輸送を促進させるが、細胞のＲＮＡは核内に保持されるため、この意味でさらに重要な機能を有する（Bridge and Ketner, Virology 174, 345-353, 1990）。さらに重要な知見は、Ｅ１Ｂ−５５ｋＤａ／Ｅ４ｏｒｆ６を含むタンパク質複合体が、いわゆる「ウイルス封入体（viral inclusion body）」内に局在することである。これらの構造は複製および転写の場と考えられる（Ornelles and Shenk, J. Virology 65, 424-429、1991）。
【０２２４】
Ｅ３領域は、複製、特にアデノウイルスの放出において重要なもう１つの領域である。Ｅ３領域は、インビトロ（即ち、細胞培養）においてアデノウイルスの感染サイクルに必須ではない比較的小さな様々なタンパク質の遺伝情報をより正確に含んでいる。しかし、それらは、特に免疫調節機能およびアポトーシス機能を有するため、インビボでの急性および／または潜伏感染中のウイルスの生存において重要な役割を果たす（Marshall S. Horwitz, Virologie, 279, 1-8, 2001; Russell, 前記）。約１１．６ｋＤａの大きさを持つタンパク質が細胞死を誘導することが示されている。このタンパク質は、その機能のため、ＡＤＰ（adenovirus death protein：アデノウイルス死タンパク質）と名付けられている（Tollefson, J. Virology, 70, 2296-2306, 1996）。該タンパク質は主に感染サイクルの後期に形成される。さらに、該タンパク質の過剰発現によって、感染細胞のより良好な溶解がもたらされる（Doronin ら, J. Virology, 74, 6147-6155, 2000）。これと一致して、各遺伝子およびタンパク質は本発明のウイルス内にそれぞれ含まれる。
【０２２５】
以下には、様々なアデノウイルスの一部が記載されており、これらは本発明のウイルスとして使用可能である。これと関連して、明示のためだけに、それらはグループに分類されて、ウイルスグループ§１、ウイルスグループ§２、ウイルスグループ§３と称される。該ウイルスは、明示のため、そして本出願者が共同所有され、引用によってその全体が本明細書の一部とされる、以下の出願で開示される使用可能性のためである。より具体的には、ウイルスグループ§１は、２００３年５月２７日に出願され、２００２年５月２７日付のＤＥ  １０２  ２３  ５３４．１、２００２年６月７日付のＤＥ  １０２  ２５  ４００．１、２００２年１０月１５日付のＤＥ  １０２  ４８  ０３９．７、２００３年５月１９日付のＤＥ  １０３  ２２  ５３０．７の優先権を主張する、国際公開広報第０３／０９９８５９号で公表されている国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ  ０５５８３に記載されている。ウイルスグループ§２は、２００３年１０月１５日に出願され、２００２年１０月１５日付のＤＥ  １０２  ４８  ０３９．７、２００３年５月１９日付のＤＥ  １０３  ２２  ５３０．９、２００３年５月２７日付のＤＥ  １０３  ２４  ０８５．３、２００３年５月２７日付のＰＣＴ／ＥＰ  ０３／０５５８３の優先権を主張する、国際公開広報第２００４／０３５６１６号で公表されている国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ  ０３／１１４２７に記載されている。ウイルスグループ§３は、２００６年１月２日に出願され、２００４年１２月３１日に出願されたＤＥ  １０  ２００４  ０６３６６２．１の優先権を主張する、「E1-minus Adenovirusen und deren Verwendung」という表題の付けられた国際特許出願に記載されている。
【０２２６】
個々のグループに関して与えられた解説は、これが明確に除外されないという条件で、他のグループにも適用可能であることは本発明の範囲内である。このことは、特に具体的な態様において与えられた定義に適用される。また、一態様と関連して列挙される任意の特徴、実施態様、利点などが、本明細書に記載の本発明の各態様および任意の他の態様にも適用されることは本発明の範囲内である。本発明による任意のウイルスおよびアデノウイルスと関連して列挙される任意の特徴、実施態様、利点などが、本明細書に記載のウイルスまたはアデノウイルスに従った使用にも適用されること、そしてその逆も本発明の範囲内である。
【０２２７】
一実施態様において本明細書で使用されている通り、機能的な野生型Ｅ１領域という用語は、特に野生型のアデノウイルスＡｄ５に含まれるＥ１領域を示す。一実施態様では、機能的な野生型Ｅ１領域の欠損とは、野生型アデノウイルスに存在するＥ１領域の１つ以上の機能または機能性を含まない、もしくは同様のものを完全には含まないＥ１領域を示す。機能性または機能は、以下において一般に機能と呼ばれ、核酸またはタンパク質によって媒介され、好ましくはタンパク質によって示される、または媒介される。
【０２２８】
本発明と関連して、機能の欠損は、翻訳レベルで活性ではない機能によって生じる可能性があり、即ち、コード化する核酸は依然としてウイルスゲノム中に存在するが、機能を媒介するタンパク質が存在しない。このことは、例えば、特にｍＲＮＡの安定性をもたらすｍＲＮＡの３′ＵＴＲなどの翻訳が存在しないように制御する調節エレメントによって生じる。好ましくは、これらの調節エレメントは、各機能のために野生型ウイルスに存在するような調節・制御コンテクストにおいてもはや存在しない。
【０２２９】
本発明と関連して、機能の欠損は、代わりに、もしくは付加的に転写レベルで活性ではない機能によって生じる可能性があり、即ち、機能を媒介するタンパク質が存在せず、コード化する核酸は従って依然としてウイルスゲノム中に含まれないか、もしくはウイルスゲノム中に完全には含まれない。コード化核酸が、機能の喪失をもたらすような１つ以上の突然変異を含むことは本態様の範囲内である。該突然変異は好ましくは数塩基を含む点突然変異および／または欠失、および／または該タンパク質をコード化するオープンリーディングフレームまたは核酸の完全な欠失である。
【０２３０】
タンパク質が対応する野生型タンパク質が示す全ての機能または活性を含まない場合、上記の実施態様の意味において機能は欠損している。一実施態様では、該条件下で得ることのできる活性の測定値として複製の程度が利用され、好ましくは野生型のタンパク質、遺伝子型および／または表現型を利用した複製とは有意に異なる。
【０２３１】
本発明の好適な一実施態様では、野生型ウイルスと比較して、機能が異なる調節コンテクストで含まれる場合にも機能の欠損が存在する。好適な一実施態様では、異なる調節コンテクストは、他の機能と比較して、どの機能が異なる時間点および／または異なる転写および／または翻訳の制御または影響エレメントの制御下にあるのかと関連するコンテクストである。特定の実施態様の場合、該エレメントはプロモーターである。
【０２３２】
一実施態様では、特に本明細書において強く低減した複製は、野生型と比較して、ファクター２、好ましくはファクター５、より好ましくはファクター１０、最も好ましくはファクター１００だけ低減した複製を意味する。好適な一実施態様では、同一または同様の細胞株、同一または同様のウイルスの感染力価（感染の多重度：ＭＯＩまたはプラーク形成単位、ｐｆｕ）および／または同一または同様の全般的な実験条件を利用して、複製の比較が実施される。特に複製という用語は粒子形成を示す。さらなる実施態様では、複製の測定値は、ウイルスの核酸合成の程度として理解できる。ウイルスの核酸合成の程度の測定方法および粒子形成の測定方法はいずれも当業者には既知である。
【０２３３】
上記の意味における機能の欠損は、本明細書では「マイナス」で示される各機能によっても示される。例えば、Ｅ１Ａ１３Ｓの欠損はＥ１Ａ１３Ｓマイナスと示される。
【０２３４】
ウイルスグループ§１
このウイルスグループは、ＹＢ−１核陽性の腫瘍細胞においてＥ１Ａ改変アデノウイルスのＤＮＡ複製がＥ２後期プロモーターの活性化に基づいているとの驚くべき知見に基づいている。本明細書で使用されるＥ１Ａ改変アデノウイルスは、（ａ）ＹＢ−１核陰性の細胞内では複製しないアデノウイルスであり、各野生株と比較して、ＹＢ−１核陰性の細胞内において低下した、好ましくは強く低下した複製を示し、（ｂ）少なくとも１つのウイルスの遺伝子をトランス活性化させ、該遺伝子は特にＥ１Ｂ−５５ｋＤａ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３、Ｅ３ＡＤＰを含むグループから選択され、および／または（ｃ）アデノウイルスを介して細胞のＹＢ−１を核内移行させないアデノウイルスである。場合により、本発明に従って使用されるアデノウイルスは、アデノウイルスがコード化するＥ１Ａタンパク質の結合がＥ２ＦのＲｂへの結合を妨げ、Ｅ２ＦおよびＲｂを含む各複合体を分解可能であるという特性をさらに持つことができる。上記の特徴ａ）からｃ）の少なくとも１つ以上、好ましくはａ）からｃ）の全ての特徴を有するアデノウイルスは、核内にＹＢ−１を持たない細胞内では複製能を欠く。
【０２３５】
以下において、これに拘束されることを望まないが、本発明者は、Ｅ２初期プロモーター、即ち、Ｅ２Ｆ転写因子によって制御される初期Ｅ２プロモーターが、本発明に従って本明細書において使用されるウイルスの複製には決定的に重要ではないと推測している。複製のスイッチオンは、細胞のＲｂの状態とは無関係であり、即ち、本明細書において開示されているウイルスを使用して感染され、好ましくはその後に溶菌された腫瘍細胞が不活性なＲｂタンパク質の他、機能的なＲｂタンパク質からなりうることを意味する。また、アデノウイルスの複製には、本明細書で開示されるアデノウイルスまたは本明細書で開示される条件を利用する場合、機能的なｐ５３タンパク質およびその存在によって影響を受ける必要もない。この範囲において、技術指導は、ＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ＣＢ０１６型の腫瘍退縮（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃまたはｔｕｍｏｒｌｙｔｉｃ）アデノウイルス、もしくは例えば欧州特許ＥＰ  ０  ９３１  ８３０に記載のアデノウイルスの使用を基礎とする原理から出発しており、完全な機能的Ｒｂタンパク質がインビボでの効率的な複製の障害になり、ひいてはインビボでＲｂ陰性およびＲｂ変異細胞内においてのみアデノウイルスは複製するという仮定の下に、これらにはＥ１Ａタンパク質内に１つ以上の欠失が導入されている。初期Ｅ２プロモーター（Ｅ２初期プロモーター）および「遊離型Ｅ２Ｆ」によるアデノウイルスのインビボでの複製を制御するために、先行技術のこれらのアデノウイルスのシステムはＥ１Ａに基づいている。それにもかかわらず、先行技術のこれらのウイルスは、本発明に従って、即ち、細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を含む細胞内における複製のために使用できる。
【０２３６】
該欧州特許ＥＰ  ０  ９３１  ８３０に記載のウイルスおよび特にアデノウイルスは、本発明に従って使用できる。より具体的には、該特許に記載のウイルスは複製能を欠損しており、機能的なＲｂ腫瘍抑制遺伝子の産物に結合可能なウイルスの癌タンパク質の発現を欠いている。特にアデノウイルスは、機能的な腫瘍抑制遺伝子の産物、特にＲｂに結合可能なウイルスのＥ１Ａ癌タンパク質の発現を欠くアデノウイルスでありうる。ウイルスのＥ１Ａ癌タンパク質は不活性化変異、例えばＡｄ５内の３０−８５位のアミノ酸のＣＲ１ドメイン、Ａｄ５内の６９７−７９０位のヌクレオチドおよび（または）１２０−１３９位のアミノ酸のＣＲ２ドメイン、ｐ１０５Ｒｂタンパク質、ｐ１３０、ｐ１０７タンパク質への結合に関与する９２０−９６７位のヌクレオチドを含むことができる。アデノウイルスを２型ｄｌ３１２または５型ＮＴｄｌ０１０にすることも計画できる。
【０２３７】
本発明に従って使用されるアデノウイルスのさらなる特徴は、これらが本明細書において癌遺伝子とも呼ばれるウイルスの癌タンパク質をコード化しており、該癌遺伝子タンパク質が好ましくはＥ１Ａであり、該癌遺伝子タンパク質がウイルスの複製および／またはウイルスに感染した細胞の細胞溶解に影響を及ぼしうる少なくとも１つのウイルス遺伝子を活性化できることである。複製に及ぼす影響が、各ウイルスの癌遺伝子タンパク質を欠く状況と比較して、癌遺伝子タンパク質の存在下においてウイルス複製を良好にするようであれば好ましい。このプロセスは、本明細書において、トランス活性化、特にトランス活性化がＥ１Ａによって媒介される場合、Ｅ１Ａトランス活性化とも呼ばれる。「トランス活性化させる」または「トランス活性化」という用語は、好ましくは、各ウイルス癌タンパク質が、遺伝子自体をコード化するウイルス癌タンパク質とは異なる１つ以上の他の遺伝子の発現および／または転写に影響を及ぼす、即ち、好ましくはその発現および／または翻訳を制御しており、特にこれ／これらを活性化させるプロセスを述べている。該ウイルス遺伝子は、上記の遺伝子および遺伝子産物の任意の組み合わせの他、好ましくはＥ１Ｂ５５ｋＤａ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３、Ｅ３ＡＤＰである。
【０２３８】
好ましくは、任意であるが、本発明に従って利用されるアデノウイルスの別の特徴は、腫瘍抑制Ｒｂへの結合、および腫瘍抑制Ｒｂの結合である。原理上、本発明に従って使用されるアデノウイルスがＲｂに結合する、もしくはＲｂに結合しないことは本発明の範囲内である。アデノウイルスの他の態様はいずれも処理される細胞のＲｂの状態とは無関係に利用可能である。
【０２３９】
Ｒｂに結合しない能力を与えるために、例えば、Ｅ１Ａ癌タンパク質の以下の欠失が可能である：ＣＲ１領域（Ａｄ５内の３０−８５位のアミノ酸）およびＣＲ２領域（ＡＤ５内の１２０−１３９位のアミノ酸）の欠失。この過程で、ＣＲ３領域は保持されて、他の初期ウイルス遺伝子に対するトランス活性化の機能を有することが可能である。
【０２４０】
これとは対照的に、Ｅ１ＡにＲｂ結合能を付与するために、Ｅ１Ａ癌タンパク質に対する以下の欠失が原理上可能である：ＣＲ３領域の欠失（１４０−１８５位のアミノ酸）、Ｎ末端の欠失（１−２９位のアミノ酸）、８５−１１９位のアミノ酸の欠失、およびＣ末端の欠失（１８６−２８９位のアミノ酸）。本明細書に列挙される領域は、Ｅ２ＦのＲｂへの結合を妨げない。しかし、トランス活性化の機能は残るが、野生型Ａｄ５と比較して低下する。
【０２４１】
本発明と関連して、本発明に従って使用される様々なアデノウイルスの改変Ｅ１Ａ癌タンパク質は、ＹＢ−１核陽性の細胞において、例えばＥ１Ｂ５５Ｋ、Ｅ４ｏｒｆ３、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ３ＡＤＰなどの初期ウイルス遺伝子をトランス活性化する。これと関連して、好ましくは、その他の点でウイルスゲノムに別の変化はなく、各アデノウイルスは野生型またはその任意の誘導体と一致する。
【０２４２】
本発明の意味においてトランス活性化癌遺伝子タンパク質をコード化する、もしくは例えばＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ＣＢ１０６および／または欧州特許ＥＰ  ０  ９３１  ３８０に記載のアデノウイルスを含むウイルスであり、これらはそれぞれＥ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３および／またはＥ４などの初期遺伝子をトランス活性化でき、野生型アデノウイルス、特に野生型Ａｄ５と同等である。Ｅ１Ａタンパク質の特定領域はこれらの場合でのトランス活性化に関与する。アデノウイルスの様々な血清型の中で、Ｅ１Ａタンパク質内に高度に保存された３つの領域が存在する。４１−８０位のアミノ酸のＣＲ１領域、１２０−１３９位のアミノ酸からのＣＲ２領域、１４０−１８８位のアミノ酸のＣＲ３領域である。トランス活性化の機能は主にＥ１Ａタンパク質のＣＲ３領域の存在に基づいている。ＣＲ３のアミノ酸配列は上記のアデノウイルスにおいて不変である。このことは、核または細胞質内におけるＹＢ−１の存在とは無関係に初期遺伝子Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４のトランス活性化をもたらす。
【０２４３】
しかし、組換えアデノウイルスｄｌ５２０においてはＣＲ３領域が欠失している。したがって、ｄｌ５２０は、ＣＲ３領域のアミノ酸配列を含まない、いわゆるＥ１Ａ１２Ｓタンパク質を発現する。結果的に、ｄｌ５２０は特にＥ２領域に対して非常に弱いトランス活性化の機能しか発揮できず、ひいてはＹＢ−１核陰性の細胞内においては複製しない。ＹＢ−１核陽性の細胞内では、ＹＢ−１はＥ２領域をトランス活性化させて、ひいてはｄｌ５２０の効率的な複製を可能にする。これは本明細書に開示されている目的のためのｄｌ５２０などの使用およびｄｌ５２０に基づくシステムの使用の基礎である。前述のアデノウイルスの両グループ間［即ち、Δ２４残基（本明細書では別名ＡｄΔ２４）およびｄｌ５２０残基］における別の重要な違いは、ｄｌ５２０によって、ＹＢ−１核陰性の細胞と比較して、ＹＢ−１核陽性の細胞内において初期遺伝子Ｅ１Ｂ、Ｅ３、Ｅ４がより強力にトランス活性化されるという事実にある。逆に、Δ２４との違いはないか、もしくはごくわずかである。しかし、ｄｌ５２０、より具体的にはＥ１Ａ１２Ｓタンパク質のトランス活性化の作用は、野生型のアデノウイルスと比較して、有意に低下している。しかし、このトランス活性化は、実施例１０に示されるように、ＹＢ−１核陽性の細胞において効率的な複製を可能にするために十分である。Ｅ１Ａタンパク質および本明細書に記載のＥ１Ａタンパク質をコード化する核酸の設計、そして特にＥ１Ａタンパク質が、野生型の癌遺伝子タンパク質Ｅ１Ａと比較して、１つ以上の欠失および／または突然変異を有するようなコンテクストにおいて、該欠失は好ましくはｄｌ５２０またはＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ＣＢ１０６および／または欧州特許ＥＰ  ０  ９３１  ８３０に記載のアデノウイルスと関連して記載されているＥ１Ａタンパク質の特に好適な態様を含むウイルス、特にアデノウイルスの態様であり、ＣＲ３領域の欠失、Ｎ末端の欠失、Ｃ末端の欠失を含むグループから選択される欠失であり、その複製はＥ２後期プロモーターの活性化、好ましくは主にＥ２後期プロモーターの活性化を通じてＹＢ−１によって制御される。アデノウイルスのこの様式の複製を可能にするＥ１Ａタンパク質の別の態様は、本明細書の開示に基づいて、当業者によって作成可能である。
【０２４４】
新たに作成される別のアデノウイルスは、本明細書では誘導体と呼ばれ、本発明に従って使用可能であり、通常、Ｅ１欠失、Ｅ１／Ｅ３欠失および／またはＥ４欠失を伴い、即ち、対応するアデノウイルスが機能的に活性なＥ１および／またはＥ３および／またはＥ４の発現産物および各産物を産生できず、換言すると、これらのアデノウイルスは機能的に不活性なＥ１、Ｅ３および／またはＥ４の発現産物を産生できるだけであり、転写レベルおよび／または翻訳レベルを問わず、発現産物として全く存在しないような機能的に不活性なＥ１、Ｅ２、Ｅ４の発現産物、もしくは野生型アデノウイルスが有する機能の１つを少なくとも欠くような形で存在する。野生型アデノウイルスの発現産物の機能は、当業者には既知であり、Russel, W. C., Journal of Virology, 81、2573-2604, 2000に記載されている。Ｒｕｓｓｅｌ（前記）は、本明細書において引用として援用されているアデノウイルスおよびアデノウイルスベクターの構築の原理も記載している。改変Ｅ１Ａ癌タンパク質Ｅ１Ｂ−５５Ｋ、Ｅ４ｏｒｆ６および／またはＥ３ＡＤＰ［アデノウイルス死タンパク質（ADP:adenoviral death protein）］（Tollefson, A. ら, J. Virology, 70, 2296-2306, 1996）が該ベクターに個別または組み合わせて発現されることも本発明の範囲内である。これと関連して、本明細書に開示されているトランス遺伝子の他、個別に命名された遺伝子をＥ１および／またはＥ３および／またはＥ４領域にクローニングして、適当なプロモーターにより、もしくは適当なプロモーターの制御下で個別に発現させることができる。基本的には、Ｅ１、Ｅ３、Ｅ４領域は、アデノウイルス核酸内のクローニングサイトとして同様に適しており、クローニングに使用されない領域は個別または共に存在するか、部分的に欠失および／または完全に欠失させることができる。これらの領域が存在する場合、特に完全に存在する場合、それらが完全であり、好ましくは翻訳産物および／または転写産物を供給する、および／または完全ではなく、好ましくは翻訳産物および／または転写産物を供給しないことは本発明の範囲内である。適当なプロモーターは、例えば、Ｅ１Ａ、特に改変Ｅ１Ａのそれぞれ制御および発現と関連して本明細書に開示されているプロモーターである。
【０２４５】
最後に、一実施態様では、本発明と関連して使用されるアデノウイルスはＥ１Ｂ、特にＥ１Ｂ１９ｋＤａが欠損している。本明細書において使用されている通り、欠損という用語は概して、Ｅ１Ｂが野生型に固有の特性を全て有しているわけではなく、少なくともこれらの特性の１つが存在しない状態を意味する。アデノウイルスのＢＣＬ２ホモログであるＥ１Ｂ１９ｋは、Ｅ１Ａがプロアポトーシスタンパク質であるＢａｋおよびＢａｘとの相互作用によってアポトーシスを誘導することを示している。このために、感染細胞において最高の複製および（または）粒子形成が可能となる（Ramya Sundararajan und Eileen White, Journal of Virology 2001, 75, 7506-7516）。Ｅ１Ｂ１９ｋの欠損は、アデノウイルス死タンパク質が存在する場合にはその機能を最小限にするため、より良好なウイルスの放出をもたらす。ウイルスが誘導する細胞変性作用は該欠失によって増大され（Ta-Chiang Liu ら, Molecular Therapy, 2004）、ひいては感染された腫瘍細胞のより強い溶解をもたらす。また、Ｅ１Ｂ１９ｋの欠損は、腫瘍細胞における該組換えアデノウイルスの複製には影響を及ぼさないＴＮＦ−αをもたらすが、正常細胞においては、処置は複製低下および感染性ウイルスの放出をもたらす。このように、選択性および特異性が増大する（Ta-Chiang Liu ら, Molecular Therapy 2004, 9, 786-803）。
【０２４６】
本明細書に開示されている本発明に従って使用されるアデノウイルスでの一部の実施態様は、基本的に先行技術において既知である。
【０２４７】
本発明に従って使用されるアデノウイルスは、特に野生型と比較して本明細書に記載の技術指導に従って改変されている場合にも、好ましくは組換えアデノウイルスである。本発明に必須ではないこれらのアデノウイルスの核酸を欠失させる、または突然変異を起こさせることは、当業者の技術の範囲内である。該欠失は、例えば、本明細書にも記載のＥ３、Ｅ４をコードする核酸の一部と関連しうる。Ｅ４の欠失は、該欠失がタンパク質Ｅ４ｏｒｆ６にまで伸びない、換言すると、本発明に従って使用されるアデノウイルスがＥ４ｏｒｆ６をコードする場合に特に好ましい。好適な実施態様では、これらのアデノウイルスの核酸はウイルスのカプシド内に依然として封入され、ひいては感染粒子を形成可能である。同じことは本発明の核酸の使用に当てはまる。概してアデノウイルスの系には１つ以上の発現産物が欠損しうることを指摘する必要がある。これと関連して、該発現産物をコードする核酸が完全に突然変異を起こしている、または欠失している、もしくは発現産物が本質的にはもはや産生されない程度にまで突然変異を起こしている、または欠失しているという事実、あるいは発現を制御するプロモーターまたは転写因子の欠損、もしくはそれらが核酸レベル（プロモーターの欠如；シス作用エレメント）または翻訳系および転写系（トランス作用エレメント）にいずれかで、野生型とは異なる様式で活性化しているという事実に基づきうることを考慮に入れる必要がある。特に、後者の態様は細胞の背景に左右されうる。
【０２４８】
既知である、本発明のアデノウイルスの使用とは別に、本明細書に記載の他のアデノウイルスについて既に開示されているのと同程度に新しいアデノウイルスも使用可能である。本発明の新しいアデノウイルスは、本明細書に記載の技術指導に由来する。特に好適な代表例には、例えば図１６、１７に描かれているウイルスＸｖｉｒ０３およびＸｖｉｒ０３／０１であり、これらの設計原理は実施例１１、１２にもさらに図解されている。
【０２４９】
ベクターＸｖｉｒ０３の場合、ＩＲＥＳ配列で隔てられた、Ｅ１Ｂ５５ＫおよびＥ４ＯＲＦ６の核酸をコードするＥ１領域内にＣＭＶプロモーターがクローニングされる。これと関連して、Ｅ３領域を部分的または完全に欠失させる、あるいは完全なまま存在させることが可能である。これら２つの遺伝子の導入およびそこから産生される遺伝子産物に起因して、野生型ウイルスの１つにほぼ対応する複製効率が生じ、複製の選択性が細胞、特に腫瘍細胞において保持され、この範囲において特にＹＢ−１核陽性細胞、特にＹＢ−１が調節解除されたされた細胞において複製が起こる。ＹＢ−１が調節解除されたされた細胞は、正常細胞または非腫瘍細胞と比較して、好ましくはＹＢ−１発現の増大を示し、好ましくはコンパートメント非依存的である。クローニングによるＥ１Ｂ５５ｋおよびＥ４ｏｒｆ６のＥ４領域内への導入も実施可能であり、これによってＥ３領域は完全であるか、または／および部分的ないし完全に欠失可能である。
【０２５０】
ウイルスＸｖｉｒ０３のさらなる開発物がＸｖｉｒ０３／０１であり、好適な一態様の場合、この中に治療用遺伝子またはトランス遺伝子が特異的プロモーター、特に腫瘍特異的または組織特異的なプロモーターの制御下にクローニングされる。Ｅ４領域が機能的に不活性である、好ましくは欠失されていることも該ウイルスの範囲内である。本明細書に記載のトランス遺伝子もＥ４領域内にクローニング可能であり、これはＥ３領域内へのトランス遺伝子のクローニングへの追加または代用として生じることが可能であり、該Ｅ３領域は部分的または全体が完全なままである。本明細書で使用されるトランス遺伝子は、治療用遺伝子またはウイルス遺伝子が可能であり、好ましくはアデノウイルス遺伝子であり、好ましくは、これらはそれぞれ野生型アデノウイルスのゲノム中または現在それらが特定ウイルス内に存在するゲノム中の位置には存在しない。
【０２５１】
好適な一実施態様では、本発明のアデノウイルスおよび本発明のアデノウイルスの複製系および本発明に従ったこれらの使用のそれぞれに関して、アデノウイルスの核酸には癌遺伝子タンパク質、特にＥ１Ａタンパク質の発現が欠如しており、このことは、本明細書で定義されている通り、それが１２ＳＥ１Ａタンパク質または１３ＳＥ１Ａタンパク質をコード化していない、もしくは１２ＳＥ１Ａタンパク質および１３ＳＥ１Ａタンパク質のいずれもコード化していない、もしくは改変されており、またアデノウイルスの複製系がさらにヘルパーウイルスの核酸を含んでおり、該ヘルパーウイルス核酸が癌遺伝子タンパク質、特にＥ１Ａタンパク質をコード化する核酸配列を含み、これは以下の特性を有しており、以下の特性をアデノウイルスに付与する：好ましくはＹＢ−１核陰性の細胞内では複製しないが、細胞周期と無関係な細胞（ＹＢ−１核陽性）内では、少なくとも１つのウイルスゲノム、特にＥ１Ｂ５５ｋＤａ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３および／またはＥ３ＡＤＰをトランス活性化させ、および／またはＹＢ−１核陽性の細胞内では、細胞のＹＢ−１を核内移行させないことを意味する。本明細書に記載のトランス遺伝子がヘルパーウイルスによって個別または共にコード化される、および／またはそこから発現されることは本発明の範囲内である。
【０２５２】
ウイルスグループ§２
これらのウイルスは、やはり明示のために、グループＩおよびグループＩＩに分類される。ウイルスグループ§２と関連する請求項において最初に定義されたウイルスは、本明細書においてグループＩのアデノウイルスとも呼ばれ、Ｅ１Ａなどのトランス活性化させる癌遺伝子タンパク質を含むアデノウイルス、および／または本明細書において言及され、特に上記において本発明に従って使用されるアデノウイルスは、本明細書においてグループＩＩのアデノウイルスとも呼ばれる。グループＩおよびグループＩＩのアデノウイルスは全てまとめてアデノウイルスまたは本発明のアデノウイルスまたは本発明のウイルスとも呼ばれる。ここでも好ましくはグループＩと関連して本明細書に記載の任意の特徴、態様および／または使用がグループＩＩにも適用可能であり、逆もまた同様であることは本明細書の範囲内である。
【０２５３】
これらのウイルスは、アデノウイルス遺伝子の発現配列を逆転させることで効率的な複製、また場合によってはアデノウイルスに感染した細胞の溶解をもたらすという驚くべき知見に基づいている。好ましくは、該逆転は野生型ウイルス、好ましくは野生型アデノウイルスの各遺伝子の発現および／または有効性の順序と比較して、それぞれ遺伝子および遺伝子産物の発現および／または有効性の経時的な逆転である。経時的に変化したアデノウイルス遺伝子の発現に関して、第二タンパク質の前に発現される第一タンパク質として、本明細書でも言及されているＥ１Ｂタンパク質およびＥ４タンパク質が個別または集合的に特に強調される。第二タンパク質は、Ｅ１Ａタンパク質を含むグループから選択される。まずＥ１Ａタンパク質、次に初めてＥ１Ｂタンパク質およびＥ４タンパク質が発現される、野生型アデノウイルスと比較して逆転しているこの発現配列によって、転写因子が活性化され、例えば感染細胞での核内への輸送、そしてさらなる複製活性への影響またはその制御が保証される。野生型アデノウイルス内のアデノウイルスの転写産物の反応速度論は、例えばGlenn G. M. and Ricciardi R. P. Virus Research 1988, 9, 73-91に記載されており、彼らは、野生型においては、Ｅ１Ａ転写産物、即ちＥ１Ａ１２Ｓ転写産物およびＥ１Ａ１３Ｓ転写産物が、それぞれ転写産物および翻訳産物であるＥ４ｏｒｆ６およびＥ１Ｂ５５ｋよりも前に通常検出可能であることを報告している。本発明の場合、Ｅ１Ｂタンパク質であり、異論がない場合には本明細書においても概して、好ましくはＥ１Ｂ−５５ｋＤタンパク質である。本発明の場合、Ｅ４タンパク質であり、異論がない場合には本明細書においても概して、好ましくはＥ４ｏｒｆ６タンパク質である。本発明の場合、Ｅ１Ａタンパク質であり、異論がない場合には本明細書においても概して、好ましくはＥ１Ａ１２Ｓタンパク質またはＥ１Ａ改変アデノウイルスと関連して本明細書に記載のＥ１Ａタンパク質である。
【０２５４】
Ｅ１Ａタンパク質、特にＥ１Ａ１２Ｓタンパク質も原理上、置き換えできるのはこれらのウイルス内である。置き換えられた該Ｅ１Ａタンパク質、Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質はそれぞれ本明細書においてＥ１Ａタンパク質、Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質と呼ばれ、異論がない場合、この用語によって含まれると考えられる。Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質の代わりに、例えばDickopp A、Esche H、Swart G、Seeber S、Kirch HC、Opalka B.Cancer Gene Ther. 2000, Jul; 7(7): 1043-50.に記載のように、腫瘍抑制機能を有する１Ａタンパク質も使用できる。Ｅ１Ａタンパク質、特にＥ１Ａ１２Ｓタンパク質の別の誘導体は、本明細書で使用されている、および／または言及されているように、概してＲｂ／Ｅ２Ｆ複合体からＥ２Ｆ因子を放出可能なタンパク質でもある。これらは特にChellappan S. ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 4549-4533に記載のシミアンウイルス４０腫瘍抗原（ＳＶ４０ラージＴ抗原）、パピローマウイルスＥ７タンパク質（ＨＰＶ  Ｅ７）である。
【０２５５】
Ｅ４ｏｒｆ６およびＥ１Ｂ５５ｋの誘導体も使用可能であることはこれらのウイルスの範囲内であり、本明細書で使用されているＥ４ｏｒｆ６およびＥ１Ｂ５５ｋには該誘導体を含む。該誘導体は、例えばShen Y ら, J. of Virology 2001, 75, 4297-4307、Querido E. ら, J. of Virology 2001, 75, 699-709.に記載されている。
【０２５６】
それぞれ上記の通り、Ｅ１Ｂタンパク質がＥ１Ａタンパク質の前に発現されること、もしくはＥ４タンパク質がＥ１Ａタンパク質の前に発現されること、もしくはＥ１Ｂタンパク質およびＥ４タンパク質がＥ１Ａタンパク質の前に発現されることはこれらのウイルスの範囲内である。
【０２５７】
このように設計されたアデノウイルスは、核内にＹＢ−１を発現する、好ましくは細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を発現する細胞、もしくは調節解除されたＹＢ−１を含む、好ましくは細胞質内に調節解除されたＹＢ−１を含む細胞の感染時に、特に高レベルでの複製が可能である。以下ではこのことへの拘泥を望まないが、Ｅ１Ｂタンパク質および／またはＥ４タンパク質を含む複合体、そしてこれら２つの各タンパク質のそれぞれが細胞の核内へ調節解除されたＹＢ−１を輸送可能である、もしくはＥ１Ａタンパク質の前に発現されるＥ１Ｂタンパク質および／またはＥ４タンパク質の影響下においてアデノウイルスの複製をそこで開始可能であると本発明者は予測している。一度、細胞核内に存在する、または細胞核内において活性型で存在すると、本明細書で記載の通り、ＹＢ−１は、特にＥ２後期プロモーターを使用して、効率的に複製可能である。Ｅ１Ｂタンパク質および／またはＥ４タンパク質の経時的な初期発現はこのようにして野生型において観察される、Ｅ１Ａタンパク質の発現開始とともに進行するカスケードを回避する。好適な一実施態様では、Ｅ１Ａタンパク質は、特にＥ１Ｂタンパク質および／またはＥ４タンパク質をもはやトランス活性化しない、もしくは非常に限られた程度しかトランス活性化できないＥ１Ａタンパク質である。好ましくは、このトランス活性化は、効率的な複製を保証するには不十分であり、核内にＹＢ−１を持たない細胞内での複製を保証するには不十分である。細胞周期とは無関係にＹＢ−１を持たない細胞または調節解除されたＹＢ−１を持たない細胞内ではトランス活性化が生じないことが好ましい。
【０２５８】
さらに、これらのウイルスは、アデノウイルスが少なくとも任意のタンパク質をコードする核酸を含む場合に特に効率的に複製可能であるとの驚くべき知見に基づいており、該タンパク質は、Ｅ１Ｂタンパク質、Ｅ４タンパク質、Ｅ１Ａタンパク質を含むグループから選択され、その少なくとも１つのタンパク質は野生型アデノウイルス内において各タンパク質の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターの制御下にある。核内にＹＢ−１を伴う、好ましくは細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を伴う細胞、もしくは細胞が調節解除されたＹＢ−１を含む、好ましくは細胞質内に調節解除されたＹＢ−１を含む細胞の場合、該複製は特に効率的であり、通常、腫瘍溶解を招く。Ｅ１Ｂタンパク質、Ｅ４タンパク質、Ｅ１Ａタンパク質に関する上記は本明細書にも適用する。野生型アデノウイルスにおいて、Ｅ１Ｂタンパク質はＥ１Ｂプロモーターによって制御され、Ｅ４タンパク質はＥ４プロモーターによって制御され、Ｅ１Ａタンパク質はＥ１Ａプロモーターによって制御されている。野生型アデノウイルスにおいて上記のタンパク質の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターを選択することで、前述のタンパク質の発現、ひいては個々のアデノウイルスの核酸およびタンパク質の調節相互作用が変化する。プロモーターを選択することで、経時的に異なる発現パターンを作り出すことが可能であり、以下ではこれに拘泥することを望まないが、細胞内で観察された複製をもたらし、そのメカニズムはアデノウイルスのタンパク質Ｅ１Ｂ、Ｅ４、Ｅ１Ａの経時的に異なる発現に関して既に記述されているメカニズムが可能である。野生型アデノウイルスにおいて各タンパク質の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターを介した該タンパク質の制御のための特定の設計の一例が、下部クレームおよび実施例から引用可能であり、特にそこでＸＶｉｒＰＳＪＬ１およびＸＶｉｒＰＳＪＬ２と呼ばれるウイルスがその典型例である。好ましくは、Ｅ１Ｂタンパク質はＥ１Ｂ５５ｋＤ、Ｅ４タンパク質はＥ４ｏｒｆ６タンパク質、Ｅ１Ａタンパク質はＥ１Ａ１２Ｓタンパク質である。
【０２５９】
アデノウイルスプロモーターが使用される場合、Ｅ１Ｂタンパク質の発現制御においてそれらはＥ１Ｂプロモーターとは異なり、Ｅ４タンパク質の発現制御においてＥ４プロモーターとは異なるという条件で、腫瘍特異的プロモーター、器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、異種プロモーター、アデノウイルスプロモーターを含むグループから、好ましくはＥ４タンパク質の他にＥ１Ｂタンパク質を制御するプロモーターが選択される。Ｅ１Ｂタンパク質および／またはＥ４タンパク質の発現制御のためのＥ１Ａプロモーターの使用は特に好ましい。Ｅ１Ａプロモーターは、例えばBoulanger P. A. and Blair, G. E. Biochem. J. 1991, 275, 281-299.に記載されている。また、他の任意の各異種プロモーター、即ち、野生型アデノウイルス内において各タンパク質の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターの使用も可能である。典型例はＣＭＶプロモーターであり、他のプロモーターは当業者には周知である。
【０２６０】
Ｅ１Ａタンパク質の制御に使用されるプロモーターは、アデノウイルスプロモーターがＥ１Ａプロモーターとは異なるという条件下で、腫瘍特異的プロモーター、器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、異種プロモーター、アデノウイルスプロモーターを含むグループから選択可能である。１つ以上の上記のタンパク質、即ち、Ｅ１Ｂタンパク質、Ｅ４タンパク質、Ｅ１Ａタンパク質が同じプロモーターの制御下にあることは本発明の範囲内であるが、それにもかかわらず特にＥ１Ｂタンパク質およびＥ４タンパク質が同じプロモーターの制御下にあることが好ましい。Ｅ１Ａタンパク質の発現がＹＢ−１制御プロモーターまたはＹＢ−１によって制御可能なプロモーターによって制御されることが特に好ましい。該プロモーターは、本発明の他の態様と関連して本明細書において開示されている。第一にＹＢ−１によって制御可能であり、第二にＥ２後期プロモーターの制御下にある核酸の非常に良好な制御が保証されるように、ＹＢ−１の非在下においてわずかの転写しか示さず、事実上無視できるため、アデノウイルスＥ２後期プロモーターの使用はＥ１Ａプロモーターの発現制御に特に好ましい。この範囲においてＹＢ−１依存性またはＹＢ−１によって制御される他のプロモーターが使用可能であることを認める必要があり、これらは当業者には既知であるか、もしくは本明細書に記載されている。これは、特に医学分野での適用の場合に生物学的安全性を大幅に向上させる。
【０２６１】
さらに、複製のために特に細胞核内に直接的または間接的にＹＢ−１が供給される、もしくはＹＢ−１の供給が直接的または間接的にアデノウイルスタンパク質を媒介しており、該アデノウイルスタンパク質がＥ１Ａとは異なる場合、核内にＹＢ−１を有する、特に細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を有する細胞内において、そして／または調節解除されたＹＢ−１を有する細胞内、好ましくは細胞質内に調節解除されたＹＢ−１を有する細胞内において、アデノウイルスが特に良好に複製することを本発明者は見出している。本発明のこの態様は、本明細書で開示されている態様とは異なり、即ち、トランス活性化Ｅ１Ａ改変アデノウイルス、好ましくはグループＩＩアデノウイルスの使用によって、ＹＢ−１核陽性の腫瘍細胞内、特に細胞周期とは無関係にＹＢ−１陽性であるＹＢ−１核陽性の細胞内、そして調節解除されたＹＢ−１を有する細胞内、特に細胞質内にＹＢ−１を含む細胞内でのこれらのウイルスの複製を可能にして、この範囲においてＥ１Ａタンパク質、特にＥ１Ａ１３Ｓタンパク質のトランス活性化特性がここで利用されない、即ち、グループＩのアデノウイルスと関連するが、好適な一実施態様では、Ｅ１Ａ１３Ｓタンパク質は機能的に不活性であるため、ＹＢ−１の核内への直接的または間接的な輸送および供給に関与しているＥ４ｏｒｆ６およびＥ１Ｂ５５ｋをもはやトランス活性化できない。結果として、本発明のこの態様によると、アデノウイルスの効果的な複製は不可能である。この範囲において、ＹＢ−１の核内供給およびアデノウイルス複製のためのＹＢ−１供給はそれぞれＥ１Ａタンパク質の直接的または間接的な関与の制御下にはもはやなく、Ｅ１Ｂタンパク質、特にＥ１Ｂ５５ｋＤおよび／またはＥ４タンパク質、特にＥ１Ａでは制御されないＥ４ｏｒｆ６タンパク質の発現を通じて生じる。
【０２６２】
アデノウイルスの本態様も上記の手段の１つによって提供可能であり、例えばｒｅａｌｉｚｉｎｅにより、即ち、Ｅ１Ａタンパク質の発現と比較して、Ｅ１Ｂタンパク質および／またはＥ４タンパク質のより早期の経時的発現をもたらすか、またはＥ１Ｂタンパク質、Ｅ４タンパク質、Ｅ１Ａタンパク質の１つ以上を野生型アデノウイルスにおいて各タンパク質の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターの制御下に置くことによる。
【０２６３】
最後に、Ｅ１Ｂタンパク質、Ｅ４タンパク質、Ｅ１Ａタンパク質の少なくとも１つ、特にその好適なフォームが、プロモーターの制御下で発現カセットにおいて発現される場合、核内にＹＢ−１を伴う、好ましくは細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を伴う細胞、もしくは細胞が調節解除されたＹＢ−１を含む、好ましくは細胞質内に調節解除されたＹＢ−１を含む細胞の場合に効果的な複製が起こりうるとの驚くべき知見から発明者は着手している。本発明の一実施態様では、基本的に、それぞれ該タンパク質の１つを含む３つの発現カセットが与えられる。別の実施態様の場合、特にＥ１Ａ１２Ｓの場合、発現カセットはそれぞれタンパク質Ｅ１Ｂ、Ｅ４、Ｅ１Ａ、そしてこれらの誘導体および可能な置換体の２つ以上からもなりうる。アデノウイルスがタンパク質Ｅ１Ｂ、Ｅ４、Ｅ１Ａと関連する核酸を含む態様と関連する過去の記述は、様々なタンパク質およびそれぞれに使用されるプロモーターの設計にも適用可能である。該発現カセットを使用する場合、発現カセットの各タンパク質に対応するタンパク質、そして野生型アデノウイルスのゲノム内においてこれらをコードする核酸を完全または部分的に欠失させて、少なくともより高い程度で、ウイルスを安定化させて、組換えを避けることが好ましい。
【０２６４】
原理上、発現カセットをアデノウイルスの各領域および各部位にそれぞれクローニング可能であり、好ましくはウイルスのＥ１領域、Ｅ３領域および／またはＥ４領域内に個別ないし互いに同時に１つ以上のカセットが挿入される。Ｅ１、Ｅ３、Ｅ４領域の核酸を完全に欠失、部分的に欠失、全く欠失させないことが可能であるが、本発明によるアデノウイルスに関しては、ウイルスによってＥ１Ａタンパク質をトランス活性化させないために、Ｅ１Ａ１３Ｓ遺伝子をコードする核酸を不活化または欠失させることが好ましい。領域Ｅ１、Ｅ３、Ｅ４の１つ以上における該欠失の範囲は、使用される発現カセット、任意で、導入された外来遺伝子またはトランス遺伝子またはさらにそれらを含む発現カセット、即ち、アデノウイルスの遺伝子とは異なる遺伝子、つまり野生型アデノウイルス内に広がるようなアデノウイルス核酸の調節コンテクスト内に与えられない、もしくは該部位に野生型アデノウイルスのアデノウイルス核酸の配列内に与えられないという意味で少なくとも異なる遺伝子によって決定される。Ｅ１Ｂタンパク質、Ｅ４タンパク質および／またはＥ１Ａタンパク質をコードする１つ以上の発現カセットに含まれる核酸が、アデノウイルスゲノム内において部分的または完全に欠失されることは本発明の範囲内である。一態様の場合、例えば本発明のアデノウイルスなどにおいて、Ｅ４ｏｒｆ６をコードするアデノウイルスの核酸であるＸｖｉｒＰＳＪＬ１、２は、部分的または完全に欠失されるが、これをコードする完全な核酸は発現カセットに含まれる。好ましくは、このことはＥ１Ｂ５５ｋ（別名Ｅ１５５Ｋｄ）タンパク質および／またはＥ１Ａ１２Ｓタンパク質でも実現される。欠失の範囲は、野生型アデノウイルスの最高充填率である約１０３%に達するような好適な実施態様において選択されるが、この上限は好適な上限に過ぎない。アデノウイルスゲノム内に作成可能な欠失は、依然として感染性である充填粒子を製造可能とする好適な態様における限界の対象に過ぎない。正確な欠失の範囲は、標準試験によって本明細書で与えられる開示に基づいて当業者によって決定できる。
【０２６５】
本明細書に記載のアデノウイルスの構築における開始点として、任意の野生型アデノウイルスを使用できるが、本発明の技術指導に従って構築されているという条件で、他のアデノウイルスも使用できる。サブグループＣのアデノウイルスへの遡及（ｒｅｃｏｕｒｓｅ）およびこのグループ内において順にアデノウイルス２およびアデノウイルス５への遡及が特に好ましい。
【０２６６】
Ｅ１Ａタンパク質およびＥ１Ａタンパク質群の他、Ｅ１Ｂタンパク質およびＥ１Ｂタンパク質群、Ｅ４タンパク質およびＥ４タンパク質群という用語は、異論がない場合、本明細書において同義語として使用されている。
【０２６７】
本明細書で使用される、「調節解除された」ＹＢ−１という用語は、細胞内、好ましくは非腫瘍細胞内に正常に存在するＹＢ−１とは定量的および／または定性的に異なる形で存在する本明細書に記載のＹＢ−１分子またはＹＢ−１タンパク質を示す。調節解除されたＹＢ−１は、該ＹＢ−１を含む細胞バックグラウンドにおいて調節解除されたＹＢ−１の存在下で複製可能な特定ウイルスの存在などによって特性付け、同定可能である。これと関連する特定ウイルスは、そのＥ１Ａタンパク質が突然変異を起こしており、トランス活性化の機能を示すウイルスである。これらの特定ウイルスの例は、ＡＤΔ２４、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ＣＢ０１６および／または［Howe, J. A ら, Molecular Therapy 2, 485-495, 2000; Fueyo J. ら, Oncogene 19, 2-12, 2000; Heise C. ら, Nature Medicine 6, 1134-1139, 2001; Balague, C ら, J. Virol. 75. 7602-7611, 2001; Bautista, D.S. ら, Virology 1991, 182, 578-596; Jelsma T.N. ら, Virology 1988, 163, 494-502; Wong, H. K. and Ziff E.B., J. of Virology 1994, 68, 4910-4920］に記載のウイルスである。該バックグラウンドを有する該細胞は、グループＩアデノウイルスおよび（または）グループＩＩアデノウイルスの複製に使用可能である。また、該細胞を含む腫瘍を本発明のアデノウイルスによって溶解できる。
【０２６８】
さらに、本発明は、ＹＢ−１核陽性の腫瘍細胞内におけるＥ１Ａ改変アデノウイルスのＤＮＡ複製がＥ２後期プロモーターの活性化に基づいているとの驚くべき知見に基づいている。Ｅ１Ａ改変アデノウイルスは、（ａ）ＹＢ−１核陰性の細胞内において、野生型と比較して複製が低下しているか、全く複製しないアデノウイルス、（ｂ）Ｅ１Ｂ−５５ｋＤａ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３、Ｅ３ＡＤＰを含むグループから特に選択される少なくとも１つのウイルス遺伝子に対してトランス活性化能を有するアデノウイルス、（ｃ）アデノウイルスによって細胞内ＹＢ−１の核内移行がなされないアデノウイルスと理解される。任意に、本発明により使用されるアデノウイルスは、アデノウイルスによりコードされるＥ１Ａタンパク質の結合がＥ２ＦのＲＢへの結合を阻害しており、Ｅ２ＦおよびＲｂを含む各複合体を分解可能であるというさらなる特性を有する。上記の特徴ａ）〜ｃ）の１つ以上、好ましくはａ）〜ｃ）全ての特徴を有するアデノウイルスは、核内にＹＢ−１を持たない細胞内において複製能を欠く。
【０２６９】
これに拘泥することを望まないが、アデノウイルスのＥ２発現は、Ｅ２初期プロモーター、即ち、本発明により使用されるウイルスの複製と関連する、そして本明細書に開示されているアデノウイルスの本発明による使用と関連するヒト細胞Ｅ２Ｆ転写因子を介した初期Ｅ２プロモーターによって十分にスイッチオンされないと本発明者は推測している。該状況下では、複製開始は細胞、即ち、本明細書で開示されているウイルスを使用して感染され、好ましくはそれに続いて溶解された腫瘍細胞内のＲｂの状態とは無関係であり、不活性なＲｂタンパク質の他、機能的なＲｂタンパク質も含みうる。また、本発明書に開示されているアデノウイルスを利用する、もしくは本発明書に開示されている条件を利用するアデノウイルスの複製には機能的なｐ５３は必要なく、その存在によって負の影響を受けることもない。完全な機能的Ｒｂタンパク質が効率的なインビボでの複製を妨げるため、Ｒｂ陰性細胞およびＲｂ変異細胞においてのみアデノウイルスのインビボでの複製をもたらしうるとの仮定の下にＥ１Ａタンパク質内に１つ以上の欠失を起こさせたＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ＣＢ０１６という腫瘍退縮または腫瘍溶解性のアデノウイルス、もしくは例えば欧州特許ＥＰ  ０  ９３１  ８３０に記載のアデノウイルスの使用の基礎となる原理から技術的教示「は離れている。初期Ｅ２プロモーター（Ｅ２初期プロモーター）および「遊離Ｅ２Ｆ」によるアデノウイルスのインビボでの複製を制御するために、先行技術におけるこれらのアデノウイルスの系はＥ１Ａに基づいている。それにもかかわらず、先行技術において既知のこれらのウイルスは、細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を含む細胞内、もしくは調節解除されたＹＢ−１を含む細胞内における複製のために本発明に従って使用可能である。
【０２７０】
ウイルス、特に該欧州特許ＥＰ  ０  ９３１  ８３０に記載のアデノウイルスは、本発明に従って使用できる。より具体的には、該特許に記載のウイルスは、複製能を欠いており、機能的なＲｂ腫瘍抑制遺伝子の産物に結合可能なウイルスの癌タンパク質の発現を欠いているウイルスである。アデノウイルスは特に機能的な腫瘍抑制遺伝子の産物、より具体的にはＲｂに結合可能なウイルスのＥ１Ａ癌タンパク質の発現を欠いている任意のアデノウイルスである。ウイルスのＥ１Ａ癌タンパク質は、例えば、本明細書でもＡｄ５と呼ばれる、アデノウイルスＡｄ５内の３０−８５位にアミノ酸のＣＲ１ドメイン、Ａｄ５内の６９７−７９０位のヌクレオチドおよび／または１２０−１３０位のアミノ酸のＣＲ２ドメイン、ｐ１０５Ｒｂタンパク質、ｐ１３０およびｐ１０７タンパク質の結合に関与する９２０−９６７位にヌクレオチドなどの不活化変異を示しうる。しかし、アデノウイルスがタイプ２ｄｌ３１２またはタイプ５ＮＴｄｌ１０１０であることは本発明の範囲内である。
【０２７１】
本発明の他のアデノウイルスとは異なる、本発明に従って使用される一部のアデノウイルスの別の特徴は、それらが本明細書において癌遺伝子タンパク質とも呼ばれるウイルスの癌遺伝子をコード化していることであり、該癌遺伝子は好ましくはＥ１Ａであり、該癌遺伝子タンパク質は該ウイルスの感染した細胞におけるウイルス複製および／または細胞溶解に影響を及ぼす少なくとも１つのウイルス遺伝子を活性化できる。好ましくは、複製に及ぼす影響は、各ウイルスの癌遺伝子タンパク質が存在しない場合と比較して、癌遺伝子タンパク質の存在下でウイルスがより良好に複製する。このプロセスは、本明細書ではトランス活性化、特にトランス活性化がＥ１Ａにより媒介される場合にはＥ１Ａトランス活性化とも呼ばれる。「トランス活性化させる」または「トランス活性化」という用語は好ましくは、各ウイルス癌タンパク質が、ウイルスの癌遺伝子タンパク質自体をコードする遺伝子とは異なる、１つ以上の他の遺伝子の発現および／または転写に影響を及ぼす、即ち、それ／それらの発現および／または翻訳を制御する、特にそれ／それらを活性化させるプロセスを述べている。該ウイルス遺伝子は、好ましくはＥ１Ｂ５５ｋＤａ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３、Ｅ３ＡＤＰ、そして前記の遺伝子および遺伝子産物の組み合わせである。
【０２７２】
任意に過ぎないが、本発明のアデノウイルスの他、本発明に従って使用されるアデノウイルスの別の特徴は、腫瘍抑制Ｒｂに対する結合特性、それらによってコードされる特定タンパク質の結合特性である。基本的に、本発明に従って使用されるアデノウイルスがＲｂに結合するか否かは本発明の範囲内である。アデノウイルスの２つの他の実施態様のいずれを利用しても、処理された細胞または処理される細胞のＲｂの状態とは無関係である。
【０２７３】
Ｅ１ＡをＲｂに結合不可能にするために、Ｅ１Ａ癌タンパク質に以下の欠失を作成することができる：ＣＲ１領域の欠失（Ａｄ５内の３０−８５位のアミノ酸）およびＣＲ２領域の欠失（Ａｄ５内の１２０−１３９位のアミノ酸）。この過程において、ＣＲ３領域は保存され、他の初期ウイルス遺伝子に対してトランス活性化機能を発揮する。
【０２７４】
Ｅ１ＡをＲｂに結合可能にするには、基本的にＥ１Ａ癌タンパク質に以下の欠失を作成可能である：ＣＲ３領域の欠失（１４０〜１８５位のアミノ酸）およびＮ末端の欠失（１〜２９位のアミノ酸）、８５〜１１９位のアミノ酸およびＣ末端の欠失（１８６〜２８９位のアミノ酸）。上記の領域はＥ２ＦのＲｂへの結合を妨げない。トランス活性化機能は依然として完全であるが、野生型Ａｄ５と比較して低下している。
【０２７５】
特に本発明のアデノウイルスと関連して、Ｅ１Ａタンパク質、特にＥ１Ａ１２Ｓタンパク質が、一実施態様では、Ｒｂと結合可能であり、別の実施態様では、Ｒｂとは結合できないように設計することも本発明の範囲内であるが、本発明の意味において、Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質はＥ１Ａタンパク質、特にＥ１Ａ１２Ｓタンパク質であるが、それにもかかわらず先行技術においては改変Ｅ１Ａ１２Ｓと呼ばれることがある。Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質の各設計は当業者の技術の範囲内であり、特にＥ１Ａタンパク質の前述の欠失に関して、本明細書では単にＥ１Ａとも呼ばれる。
【０２７６】
基本的に先行技術において既知であり、トランス活性化を示さない該アデノウイルスは概して複製能を欠損していると見なされる。一方で、それにもかかわらず適当なバックグラウンド、特に適当な細胞バックグラウンドにおいて該ウイルスが複製可能であることを認めたことは、本発明者にとって利点である。このような適当な細胞バックグラウンドは、核内でのＹＢ−１の存在、好ましくは細胞周期とは無関係なＹＢ−１の核内での存在または調節解除されたＹＢ−１によって生じる、もしくはもたらされる。本発明の各態様および任意の他の態様と関連して本明細書で使用される細胞または細胞系という用語には、インビトロ、インビボ、インサイチューで存在する細胞の他、細胞抽出物の小部分または分画が含まれる。この範囲において、細胞系または細胞という用語は、グループとしてまたは組織、器官、生物の一部として分離されたが、好ましくは生きた生物内にも存在しうる、細胞培養、組織培養、器官培養、もしくはインビボ、インサイチューでそれぞれ任意の組織または器官に存在する細胞も含む。該生物は好ましくは任意の脊椎動物であり、より好ましくは哺乳動物である。より好ましくは、該生物は人体である。他の好適な生物は、本発明の様々な態様と関連して開示される生物である。
【０２７７】
本発明と関連して、本発明に従って使用される様々なアデノウイルスの改変Ｅ１Ａ癌タンパク質は、ＹＢ−１核陽性の細胞または調節解除されたＹＢ−１を含む細胞内においてＥ１Ｂ５５Ｋ、Ｅ４ｏｒｆ３、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ３ＡＤＰなどの初期ウイルス遺伝子をトランス活性化させることができる。好ましくは、ウイルスゲノムに他の変化を加えず、この範囲において、各アデノウイルスはその他の点で野生型アデノウイルスまたはその誘導体と一致する。
【０２７８】
本発明の意味においてトランス活性化癌遺伝子タンパク質をコード化するか、または含んでいる、本明細書で開示されるウイルス、例えば、それぞれＥ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３および／またはＥ４などの初期遺伝子をトランス活性化することができ、野生型アデノウイルス、特に野生型Ａｄ５と同等である、アデノウイルスＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ＣＢ１０６および／または欧州特許ＥＰ  ０  ０９３１  ８３０に記載のアデノウイルスを含む。これらの場合、Ｅ１Ａタンパク質の異なる領域がトランス活性化に関与する。様々なアデノウイルスの血清型内には、Ｅ１Ａタンパク質内に高度に保存された３つの領域が存在する。４１−８０位のアミノ酸のＣＲ１領域、１２０−１３９位のアミノ酸のＣＲ２領域、１４０−１８８位のアミノ酸のＣＲ３領域である。トランス活性化機能は、主にＥ１Ａタンパク質内のＣＲ３領域の存在に基づいている。ＣＲ３のアミノ酸配列は、上記のアデノウイルス内において未変化で存在する。これは、ＹＢ−１が核内または細胞質内のいずれに存在するかにかかわらず、初期遺伝子群Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４のトランス活性化をもたらす。
【０２７９】
これとは反対に、ＣＲ３領域は組換えアデノウイルスｄｌ５２０において欠失されてきた。したがって、ｄｌ５２０はいわゆるＥ１Ａ１２Ｓタンパク質を発現し、これはＣＲ３領域のアミノ酸配列を含まない。結果として、ｄｌ５２０は特にＥ２領域に対して非常に弱いトランス活性化機能しか発揮しないため、ＹＢ−１核陰性の細胞内では複製しない。ＹＢ−１核陽性の細胞内では、ＹＢ−１がＥ２領域のトランス活性化に関与しているため、ｄｌ５２０の効率的な複製を可能にする。本明細書で開示されている目的でのｄｌ５２０などのシステムまたはｄｌ５２０に由来するシステムの使用はこれに基づいている。例えばデルタ２４（本明細書ではＡｄΔ２４とも呼ばれる）と例えばｄｌ５２０などの前述の２つのアデノウイルスグループ間でのさらに重要な違いは、初期遺伝子Ｅ１Ｂ、Ｅ３、Ｅ４が、ＹＢ−１核陰性の細胞または調節解除されたＹＢ−１を含まない細胞と比較して、細胞周期とは無関係にＹＢ−１核陽性の細胞内または調節解除されたＹＢ−１を含む細胞内においてより包括的にトランス活性化されているという事実にある。これとは反対に、デルタ２４における違いはないか、ほんのわずかである。一方、ｄｌ５２０、より具体的にはＥ１Ａ１２Ｓタンパク質のトランス活性化は、野生型アデノウイルスと比較して有意に低下している。しかし、このトランス活性化は、実施例１０にも示されるように、ＹＢ−１核陽性の細胞において効率的な複製をもたらすには十分である。本明細書に記載されている、特にこれと関連して記載されている、野生型の癌遺伝子タンパク質Ｅ１Ａと比較して、特に好ましくはｄｌ５２０またはＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ＣＢ１０６および／または欧州特許ＥＰ  ０  ０９３１  ８３０に記載のアデノウイルスと関連して記載されているＥ１Ａタンパク質の設計を含めた、１つ以上の欠失および／または突然変異をＥ１Ａタンパク質が有するような、Ｅ１Ａタンパク質の設計およびこれをコードする核酸の設計は、ウイルス、特にアデノウイルスの実施態様であり、その複製は好ましくは主にＥ２後期プロモーターの活性化によって制御される。好ましくは、欠失は、ＣＲ３領域の欠失およびＮ末端の欠失およびＣ末端の欠失を含むグループから選択される欠失である。アデノウイルスのこの種の複製を可能にするＥ１Ａタンパク質のさらなる実施態様は、本明細書に記載の開示に基づいて当業者によって作成可能である。前述のＥ１Ａタンパク質の実施態様は、本発明のアデノウイルスまたはグループＩのアデノウイルスとして本明細書にも記載されている本発明のアデノウイルスとの関連でも使用可能な態様である。
【０２８０】
本発明のアデノウイルス、特にグループＩのアデノウイルスは、本明細書において誘導体とも呼ばれ、本発明に従って使用可能であり、通常、Ｅ１欠失、Ｅ１／Ｅ３欠失、および／またはＥ４欠失を含み、即ち、対応するアデノウイルスはそれぞれ機能的に活性なＥ１および／またはＥ３および／またはＥ４発現産物および対応する産物を産生できない。換言すると、これらのアデノウイルスは機能的に不活性なＥ１、Ｅ３および／またはＥ４発現産物の産生のみ可能であり、機能的に不活性なＥ１、Ｅ３および／またはＥ４発現産物は、転写レベルおよび／または翻訳レベルで発現産物として全く存在しないか、野生型アデノウイルスにおいてそれに起因する機能の１つを少なくとも有さない形で存在する。野生型アデノウイルス内の発現産物に固有のこの／これらの機能は当業者には既知であり、例えば、Russell, W. C., Journal of Virology, 81, 2573-2604, 2000に記載されている。Ｒｕｓｓｅｌ（前記）はアデノウイルスおよびアデノウイルスベクターの設計原理についても記載しており、これらは引用として本明細書の一部となっている。改変アデノウイルス、即ち、もはやトランス活性しないＥ１Ａタンパク質およびＥ１Ａ１２Ｓ、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ、Ｅ４ｏｒｆ６および（または）Ｅ３ＡＤＰ（アデノウイルス死タンパク質（ＡＤＰ））（Tollefson, A. ら, J. Virology, 70, 2296-2306, 1996）などの他のタンパク質が単独または併用で該ベクター内において発現されないことも本発明の範囲内である。本明細書で開示されているトランス遺伝子の他、個別に言及されている遺伝子は、互いに無関係にＥ１および／またはＥ３および／またはＥ４領域内にクローニングして、適当なプロモーターを使用し、もしくは適当なプロモーターの制御下で発現させることができる。基本的に、Ｅ１、Ｅ３、Ｅ４領域のそれぞれは、アデノウイルスの核酸内のクローニング部位として適しており、クローニングに使用されない領域が存在する、もしくは部分的および／または完全に欠失させることができる。これらの領域が存在する、特に完全に存在する場合、これらが完全であるか、好ましくは翻訳産物および／または転写産物を提供し、および／または完全ではなく好ましくは翻訳産物および／または転写産物を提供しないことは本発明の範囲内である。態様では、適当なプロモーターはＥ１Ａ、特に改変Ｅ１Ａの制御および発現とそれぞれ関連して本明細書で開示されているプロモーターである。
【０２８１】
最後に、一実施態様では、本発明に従って使用されるグループＩＩのアデノウイルスはＥ１Ｂ欠損、特にＥ１Ｂ１９ｋＤａ欠損である。本明細書において一般に使用される欠損と言う用語は条件を示し、そこではＥ１Ｂは野生型Ｅ１Ｂの特性の全てを示すわけではなく、これらの特性の少なくとも１つを欠いている。
【０２８２】
アデノウイルスのＢＣＬ２ホモログＥ１Ｂ１９ｋは、プロアポトーシスタンパク質であるＢａｋおよびＢａｘとの相互作用によってＥ１Ａ誘導性アポトーシスを回避させる。このために感染細胞内において最高の複製および／または粒子形成が可能である（Ramya Sundararajan and Eileen White, Journal of Virology 2001, 75, 7506-7516）。Ｅ１Ｂ１９ｋの不在はウイルスのより良好な放出をもたらし、存在する場合には、アデノウイルス死タンパク質の機能を最小限にすると推測される。ウイルス誘導性の細胞変性作用はこのような欠失によって増大され（Ta-Chiang Liu ら, Molecular Therapy, 2004）、これによって感染された腫瘍細胞の溶解がより顕著になる。また、Ｅ１Ｂ１９ｋの不在は、ＴＮＦ−αが腫瘍細胞内の該アデノウイルスの複製に対しては何の作用も持たないが、正常細胞においては、治療が感染性ウイルスの複製および放出の低下をもたらす。この範囲において、選択性と特異性いずれも増大する（Ta-Chiang Liu ら, Molecular Therapy, 2004, 9, 786-803）。
【０２８３】
本明細書で開示される発明に従って使用されるグループＩＩのアデノウイルスの少なくとも一部の実施態様は、技術分野において既知のものである。特に野生型と比較して、本明細書に記載の技術指導の意味において変化が加えられている場合も、本発明に従って使用されるアデノウイルスは好ましくは組換えアデノウイルスである。本発明とは無関係のアデノウイルスの核酸配列をそれぞれ欠失させ、突然変異を加えることは当業者の技術の範囲内である。該欠失は、例えば本明細書にも記載のＥ３およびＥ４をコード化する核酸の一部と関連しうる。Ｅ４の欠失がＥ４ｏｒｆ６タンパク質に及ばない、換言すると、本発明に従って使用されるアデノウイルスがＥ４ｏｒｆ６をコード化するという条件で、該欠失は特に好ましい。好適な実施態様では、これらのアデノウイルス核酸は依然としてウイルスカプシド内に充填され、感染性粒子を形成しうる。これは、本発明に従った核酸の使用にも当てはまる。一般に、１つまたは複数の発現産物に関してアデノウイルスの系が欠損しうることも認められる。このことと関連して、グループＩのアデノウイルスおよびグループＩＩのアデノウイルスの両方と関して、発現産物をコードする核酸の突然変異または欠失、この場合、該突然変異および欠失はそれぞれインタクトであるか、あるいは発現産物が形成されない程度に施されていることによる、あるいは核酸レベル（プロモーター、シス作用エレメントの欠如）、翻訳・転写レベル（トランス作用エレメント）のいずれかで、それぞれ調節エレメントおよびプロモーターや転写因子などの発現を制御するエレメントが失われている、あるいは野生型とは異なる様式で活性化していることにより、これが生じうることを考慮に入れる必要がある。特に、後者の態様はそれぞれの細胞バックグラウンドに左右される。
【０２８４】
既知のアデノウイルスの使用は別として、本発明に従って、本明細書に記載の他のアデノウイルスについて既に開示されている目的のために、グループＩＩアデノウイルスなどの新しいアデノウイルスも使用できる。本発明の新しいアデノウイルスは、本明細書に記載の技術指導に由来する。特に好適な代表例は、例えば図１６、１７に描かれているＸｖｉｒ０３およびＸｖｉｒ０３／０１ウイルスであり、これらの設計原理は実施例１１、１２においてさらに説明されている。
【０２８５】
ベクターＸｖｉｒ０３の場合、ＩＲＥＳ配列によって隔てられたＥ１Ｂ５５ｋおよびＥ４ｏｒｆ６の核酸を制御するＥ１領域内にＣＭＶプロモーターをクローニングした。これと関連して、Ｅ３領域およびＥ４領域を欠失および／またはインタクトなまま存在させることができる。これら２つの遺伝子のウイルス内へのクローニングおよびそこから産生される遺伝子産物のため、野生型ウイルスの１つと事実上相当する高い複製効率がもたらされ、本開示の意味において特にＹＢ−１核陽性の細胞および特に調節解除されたＹＢ−１を含む細胞内において複製が生じる限りにおいて、細胞、好ましくは腫瘍細胞内での選択的複製が維持される。調節解除されたＹＢ−１が存在する細胞は、一態様の場合、正常または非腫瘍細胞と比較して、ＹＢ−１の発現の増大、好ましくは分画とは無関係のＹＢ−１発現を示す細胞である。一方、クローニングによってもＥ１Ｂ５５ｋおよびＥ４ｏｒｆ６をＥ４領域内へ導入可能であり、Ｅ３領域はインタクトであるか、もしくは欠失させることができる。
【０２８６】
Ｘｖｉｒ０３ウイルスの別の開発物は、好適な実施態様の場合、この中に治療用遺伝子またはトランス遺伝子を特異的プロモーター、特に腫瘍特異的または組織特異的プロモーターの制御下にクローニングされたＸｖｉｒ０３／０１ウイルスである。これと関連して、Ｅ３、Ｅ４領域を欠失させるか、および／または完全なまま存在させることができる。該ウイルスと関連して、Ｅ４領域も機能的に不活性であるか、好ましくは欠失させることができる。本明細書に記載のトランス遺伝子もＥ４領域内にクローニング可能であり、これはＥ３領域内へのトランス遺伝子のクローニングの代わりに、もしくはこれに加えて実施できる。
【０２８７】
本明細書に記載され、特に以下に記載されているトランス遺伝子も本発明のアデノウイルスと関連して、もしくはこれによって発現可能であり、即ち、それぞれグループＩのアデノウイルスおよびその核酸、または本発明の複製系をこのようにプロモーターおよび核酸配列を含む発現カセットと関連して含め、該核酸配列は１つ以上の該トランス遺伝子をコード化する。Ｅ１、Ｅ３および／またはＥ４領域はアデノウイルスゲノム内の特に適したクローニング部位であるが、クローニング部位はこれらに限定されるわけではない。本明細書で使用されるトランス遺伝子は、治療用遺伝子またはウイルス遺伝子、好ましくはアデノウイルスの遺伝子であり、好ましくは野生型アデノウイルスのゲノムには含まれず、特定ウイルス中に現在存在するゲノム内の部位には存在しない。
【０２８８】
本発明に従って使用されるアデノウイルス、特にグループＩＩのアデノウイルスの一態様の場合でのアデノウイルスの一部であるが、本発明のアデノウイルス、即ち、グループＩのアデノウイルスの一部でもあるＹＢ−１をコードする核酸は、ＹＢ−１の核内輸送を媒介する核酸配列からなりうる。例えば、Ｏｎｙｘ−１５、ＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ＣＢ０１６、ｄｌ５２０および特許ＥＰ  ０  ９３１  ８３０に記載のアデノウイルスなどの先行技術において既知のアデノウイルスの他、本発明による核酸、アデノウイルス、アデノウイルスの系を、本発明に従ったこれらの核酸と共にそれぞれアデノウイルスおよびアデノウイルスの系として使用できる。核輸送を媒介する適当な核酸配列は当業者には既知であり、例えば、Whittaker, G.R. ら, Virology, 246, 1-23, 1998; Friedberg, E.C., TIBS 17, 347, 1992; Jans, D.A. ら, Bioassays 2000 Jun; 22(6): 532-44; Yoneda, Y., J. Biochem. (Tokyo) 1997 May; 121(5): 811-7; Boulikas, T., Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 1993; 3(3): 193-227; Lyons RH, Mol. Cell Biol., 7 2451-2456, 1987に記載されている。核輸送を媒介する核酸配列は異なる原理を実現可能である。該原理は、ＹＢ−１型がシグナルペプチドと融合タンパク質を形成する、もしくは該ペプチドシグナルを供給され、シグナルペプチドに起因して細胞核内に移行され、そこで本発明のアデノウイルスの複製が起こる。
【０２８９】
本発明に従って使用されるアデノウイルス、特にグループＩＩのアデノウイルス、本発明のアデノウイルス、即ち、グループＩのアデノウイルスの設計において使用されうる別の原理は、好ましくは細胞質内での合成開始からＹＢ−１の核内への移行または転位をもたらし、そこでウイルス複製を促す輸送配列を有するＹＢ−１の供給である。核内輸送を媒介する特に有効な核酸の例は、ＨＩＶのＴＡＴ配列であり、これは例えば、Efthymiadis, A., Briggs, LJ, Jans, DA., JBC 273, 1623-1628, 1998においてこの種の他の適当な核酸配列と共に記載されている。本発明に従って使用されるアデノウイルス、特にグループＩＩのアデノウイルス、本発明のアデノウイルス、即ち、グループＩのアデノウイルスが、核輸送を媒介するペプチドをコードする核酸配列を含むことは本発明の範囲内である。
【０２９０】
ＹＢ−１が全長で存在すること、特に野生型ＹＢ−１と一致する形で存在することは本発明の範囲内である。さらに、ＹＢ−１が、誘導体、例えば短縮または切断した形で使用される、または存在することは発明の範囲内である。本発明と関連して使用される、または存在しうるＹＢ−１の誘導体は、好ましくはＥ２後期プロモーターと連結可能であり、アデノウイルスのＥ２領域の遺伝子発現を活性化させるＹＢ−１である。該誘導体は、本明細書に開示されているＹＢ−１の誘導体を特に含む。別の誘導体は、Ｎ末端、Ｃ末端、またはアミノ酸配列内の１つ以上のアミノ酸の欠失によって作成可能である。本発明の意味においてＹＢ−１断片もＹＢ−１タンパク質として使用されることは本発明の範囲内である。Jurchott et al. [JBC 2003, 278, 27988-27996］の論文において、Ｃ末端およびＮ末端の欠失を特徴とする様々なＹＢ−１断片が開示されている。様々なＹＢ−１断片の分布によって、Ｃ末端の他、コールドショックドメイン（ＣＳＤ）も細胞周期によって制御される細胞核内へのＹＢ−１の輸送に関係することが示されている。したがって、本発明のＥ１Ｂ５５ｋおよびＥ４ｏｒｆ６の発現と関連した短縮ＹＢ−１（本明細書ではＹＢ−１タンパク質とも呼ばれる）がより良好に核内に移動して、ひいては野生型ＹＢ−１と比較して、Ｅ２後期プロモーターに必ずしも良好に結合することなくより強力なＣＰＥを誘導することは本明細書の範囲内であり、ここで短縮ＹＢ−１もより良好に核内に移動して、両方の作用、即ち、ＣＰＥの誘導およびＥ２後期プロモーターへの結合を生じることを除外できない。最後に、短縮ＹＢ−１断片も核内に良好に移動して、より良好なＣＰＥを誘導することなく、より効率的にＥ２後期プロモーターに結合する。短縮ＹＢ−１タンパク質およびＹＢ−１断片はそれぞれ特定細胞の核局在配列（ＮＬＳ）などにおいて全長のＹＢ−１と関連して本明細書で開示されている別の配列を含むことも本発明の範囲内である。
【０２９１】
本発明と関連して、本発明に従って使用されるアデノウイルス、特にグループＩＩのアデノウイルス、およびグループＩのアデノウイルスおよびこれをコード化する核酸は、任意の各アデノウイルス核酸であり、これはそれ自体または別の核酸配列との併用によって複製をもたらすことができる。本明細書において説明の通り、複製に必要な配列および／または遺伝子産物がヘルパーウイルスによって供給可能である。言及の範囲内で、コード化核酸配列および該核酸配列は既知の配列であり、同一配列だけでなくそれから派生する配列も使用可能であることは本発明の範囲内である。本明細書では、派生する配列は、派生しない配列の機能と一致する機能を有する核酸またはポリペプチドを問わず、特に遺伝子産物をもたらす任意の配列を意味する。これは当業者には既知の通常の試験によって調べることができる。派生する該核酸配列の例は、同じ遺伝子産物、特に同じアミノ酸配列をコード化するが、遺伝暗号の縮重のために異なる塩基配列を有する核酸配列である。
【０２９２】
本発明のアデノウイルスおよび／または本発明の対応するアデノウイルスの複製系および本発明に従ったそれらの使用に関して、本明細書で定義されるとおり、異論がない場合、それぞれ一実施態様において、アデノウイルス核酸は癌遺伝子タンパク質の発現を欠いており、特にＥ１Ａタンパク質を欠いており、即ち、１２Ｓ  Ｅ１Ａタンパク質（本明細書ではＥ１Ａ１２Ｓタンパク質とも呼ばれる）または１３Ｓ  Ｅ１Ａタンパク質（本明細書ではＥ１Ａ１３Ｓタンパク質とも呼ばれる）をコード化しないか、もしくは１２Ｓ  Ｅ１Ａタンパク質および１３Ｓ  Ｅ１Ａタンパク質の両方をコード化しない、もしくは改変されており、そしてアデノウイルスの複製系がさらにヘルパーウイルスの核酸を含み、ヘルパーウイルスの核酸は癌遺伝子タンパク質、特にＥ１Ａタンパク質をコード化する核酸配列を含み、これは以下の特性を有しており、以下の特性をアデノウイルスに与える。好ましくはＹＢ−１核陰性の細胞内においては複製しないが、細胞周期とは無関係にＹＢ−１核陽性の細胞または調節解除されたＹＢ−１を示す細胞内においては複製しており、ＹＢ−１核陽性の細胞内において少なくとも１つのウイルス遺伝子、特にＥ１Ｂ５５ｋＤａ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３および／またはＥ３ＡＤＰをトランス活性化しており、および（または）細胞のＹＢ−１を核内移動させない。本明細書に記載のトランス遺伝子は個別または集合的にコードされている、および／またはヘルパーウイルスによって発現されていることは本発明の範囲内である。これはグループＩのアデノウイルスおよびグループＩＩのアデノウイルスの両方に適用される。
【０２９３】
グループＩのアデノウイルスおよび／またはグループＩＩのアデノウイルス、またウイルスグループ§１および§３は、本明細書に記載の様々な核酸および遺伝子産物によりそれぞれ特性付けされており、その他の点では当業者に既知であり、野生型アデノウイルス固有の全てのエレメントを含みうる（Shenk, T.: Adenoviridae: The virus and their replication. Fields Virology, vol. 3, editions Fields, B.N., Knipe, D.M., Howley, P.M. ら, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996, chapter 67）。
【０２９４】
既に言及されているように、グループＩおよび（または）グループＩＩのアデノウイルスは、ＹＢ−１を核内に有する該細胞および細胞系において複製可能である。本発明に従って使用されるこれらのアデノウイルスも複製可能であるため、腫瘍溶解が可能であるか否かについては、Ｒｂ、つまり網膜芽細胞腫の腫瘍抑制遺伝子の有無に関する細胞の状態は無関係である。さらに、本発明に従った該アデノウイルスの使用に関して、ＹＢ−１核陽性の細胞、即ち、細胞の状態とは無関係に核内にＹＢ−１を有する細胞に関して本明細書で開示されているアデノウイルスの系を使用する場合、Ｒｂの状態の他、ｐ５３の状態が、本明細書で開示される技術指導を実践する際にアデノウイルスの複製に及ぼす影響がないため、感染細胞、感染される細胞または処理される細胞のｐ５３の状態を考慮に入れる必要はない。
【０２９５】
癌遺伝子および癌遺伝子タンパク質、特にＥ１Ａ、好ましくはグループＩＩのアデノウイルスのトランス活性化は、独自の天然型アデノウイルスプロモーターの制御下および（または）腫瘍特異的または組織特異的プロモーターを介して制御可能である。適当な非アデノウイルスプロモーターは、サイトメガロウイルスプロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、アデノウイルスベースのプロモーターＶａＩおよび非ウイルスＹＢ−１プロモーター（Makino Y. ら, Nucleic Acids Res. 1996, 15, 1873-1878）を含むグループから選択可能である。本明細書で開示されている本発明の任意の態様と関連して使用されうる別のプロモーターは、テロメラーゼプロモーター、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター、癌胎児性抗原プロモーター（ＣＥＡ）（Cao, G., Kuriyama, S., Gao, J., Mitoro, A., Cui, L., Nakatani, T., Zhang, X., Kikukawa, M., Pan, X., Fukui, H., Qi, Z. Int. J. Cancer, 78, 242-247, 1998）、Ｌプラスチンプロモーター（Chung, I., Schwartz, PE., Crystal, RC., Pizzorno, G, Leavitt, J., Deisseroth, AB. Cancer Gene Therapy, 6, 99-106, 1999）、アルギニンバソプレシンプロモーター（Coulson, JM, Staley, J., Woll, PJ. British J. Cancer, 80, 1935-1944, 1999）、Ｅ２ｆプロモーター（Tsukada ら, Cancer Res., 62, 3428-3477, 2002）、ウロプラキンＩＩプロモーター（Zhang ら, Cancer Res., 62, 3743-3750, 2002）、ＰＳＡプロモーター（Hallenbeck PL, Chang, YN, Hay, C, Golightly, D., Stewart, D., Lin, J., Phipps, S., Chiang, YL. Human Gene Therapy, 10, 1721-1733, 1999）、チロシナーゼプロモーター（Nettelbeck, DM. Anticancer Drugs, 14, 577-584, 2003）、シクロオキシゲナーゼ２プロモーター（Nettelbeck, DM., Rivera, AA, Davydova, J., Dieckmann, D., Yamamoto, M., Curiel, DT. Melanoma Res., 13, 287-292, 2003）、テトラサイクリンなどの誘導系（Xu, XL., Mizuguchi, H., Mayumi, T., Hayakawa, T. Gene, 309, 145-151, 2003）である。さらに、ドイツ特許出願ＤＥ  １０１  ５０  ９８４．７に記載のアデノウイルスのＹＢ−１依存的Ｅ２後期プロモーターは、本発明と関連して使用可能なプロモーターである。
【０２９６】
特に野生型アデノウイルスにおいて各タンパク質の発現または発現産物を制御するプロモーターとは異なるプロモーターが使用される場合、上記の様々なプロモーターは本発明のアデノウイルス、好ましくはグループＩのアデノウイルスの様々な態様と関連して、またウイルスグループ§１およびウイルスグループ§２と関連しても使用されることは本発明の範囲内である。該プロモーターはこのように本発明の意味において適当な異種プロモーターである。本発明のアデノウイルス、特にグループＩのアデノウイルスの好適な態様では、本明細書に定義されるように、細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を有する、もしくは細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を有さないが調節解除されたＹＢ−１を含む細胞と関連するアデノウイルスを直接的または間接的に適用する場合、これは、該異種プロモーターからＥ１Ｂタンパク質および／またはＥ４タンパク質の発現が開始するように起こり、好ましくは（しかしこれに限定されないが）Ｅ１Ａタンパク質の発現がＹＢ−１によって制御されることが検討される。Ｅ１Ａタンパク質の発現は、本実施態様および他の実施態様の場合、例えばＥ２後期プロモーターなどのＹＢ−１制御可能プロモーターの制御下にある。これは、Ｅ１Ｂタンパク質および／またはＥ４タンパク質が発現カセットにおいて発現される場合にも当てはまる。
【０２９７】
本発明のアデノウイルス、特にグループＩのアデノウイルスの好適な実施態様では、特に細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を含まない細胞、および調節解除されたＹＢ−１を含まない細胞と関連してアデノウイルスを適用する場合、プロモーターがそれぞれ無関係に腫瘍特異的、器官特異的、組織特異的プロモーターであることが検討される。これと関連して、Ｅ１Ｂタンパク質、Ｅ４タンパク質および／またはＥ１Ａタンパク質を制御するプロモーターの少なくとも１つがこのような特異的プロモーターの場合に十分である。この腫瘍、器官、組織の特異性によって、本発明のアデノウイルスの複製が各腫瘍、器官、組織の細胞内でのみ起こることが保証され、これとは別に、アデノウイルスの複製によって（例えば溶解によって）組織がさらに傷害を受けることはない。好ましくは、さらに２番目およびより好ましくは３つ全てのタンパク質が該腫瘍特異的、器官特異的、または組織特異的なプロモーターによって制御される。該アデノウイルスを使用して、腫瘍を形成しない、もしくは該腫瘍に進行できない細胞も溶解可能であるが、これらは医薬品上の理由など他の理由、例えば、不都合な因子を生じる、または該因子を高過ぎるレベルで生じるために破壊される、もしくは生物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは人体から除去される。
【０２９８】
ウイルスグループ§３
このウイルスグループは、本発明のウイルス、即ち、野生型アデノウイルスに存在する機能的なＥ１領域を欠き、同時にトランスポーターを含み、そして特にＹＢ−１を輸送または転位可能な該トランスポーターをコード化するウイルスが、細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を含む、もしくは調節解除されたＹＢ−１を有する、または含む細胞内において複製可能であるという驚くべき知見に基づいている。
【０２９９】
さらに本発明者は、特に複製がＹＢ−１によって媒介される場合、本発明のウイルスもＥ１Ａ１３Ａとは無関係に複製しうることを見出している。特に上記の細胞において該条件下で複製が起こる。本明細書で使用されているように、ＹＢ−１を核内に含む、好ましくは細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を含む細胞も、本発明のウイルスの使用に起因して、特にこれらの細胞への感染に起因して、核内にＹＢ−１を含む細胞である。
【０３００】
最後に、タンパク質ＩＸが特に細胞崩壊性ウイルスとして使用された場合、特に本発明のウイルスの有効性にとって重要因子であること、そして本明細書で開示されるコンストラクトがこの因子の発現をもたらし、これはＹＢ−１媒介性のＥ１Ａ１３Ｓ非依存的ウイルス複製においても高レベルな粒子形成をもたらすことを本発明者は認識している。この範囲において、このグループのウイルスがＹＢ−１依存的に複製するウイルスも含んでおり、該ウイルスはタンパク質ＩＸを含んでいるか、またはコード化している。
【０３０１】
本発明のウイルスは、ＹＢ−１の核内への輸送のためのトランスポーターを含んでいる。好適な一実施態様の場合、該トランスポーターはタンパク質、好ましくはウイルスのタンパク質である。トランスポーターによって細胞の核内に輸送されたＹＢ−１は、好ましくは特に本明細書で定義される調節解除されたＹＢ−１である。一方、ＹＢ−１は、本発明のウイルスによって調節解除されたＹＢ−１の代わりに、もしくは追加でコードされるＹＢ−１であり、ウイルス感染した細胞内で発現されることも本発明の範囲内である。この範囲において、本明細書のウイルスグループ§２に関して概説された各特徴はウイルスグループ§３にも適用可能である。
【０３０２】
本発明のウイルスのトランスポーターがＹＢ−１の核内への輸送を行っている細胞は、好ましくは調節解除されたＹＢ−１を含む細胞である。
【０３０３】
ウイルスが該トランスポーターを含んでいるか、もしくはそれをコードしているかを評価することは当業者の技術の範囲内である。これと関連して、一実施態様では、細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を含む細胞、例えば子宮頸癌細胞株ＨｅＬａまたは骨肉腫細胞株Ｕ２ＯＳを使用して、次にウイルスの感染およびそれに続く複製に起因して、対応する感染細胞が核内にＹＢ−１を含むか否かを判断できる。別の実施態様では、細胞は調節解除されたＹＢ−１を含む細胞として使用可能である。当業者が実施可能な本明細書に記載の方法、特に抗ＹＢ−１抗体を利用して、該実験条件下でＴＢ−１を核内において検出可能である。ウイルスの影響下にある場合、ＹＢ−１は細胞核内で検出され、試験されたウイルスはトランスポーターを含む。
【０３０４】
上記の実施態様の意味において、Ｅ１領域によってコードされるタンパク質グループの一方または両方に関してＥ１Ａ領域が「マイナス」であることは本発明の範囲内である。２つの該タンパク質グループは、Ｅ１Ａタンパク質のグループ、特にＥ１Ａ１３Ｓタンパク質（本明細書ではＥ１Ａ１３Ｓとも呼ばれる）、Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質（本明細書ではＥ１Ａ１２Ｓとも呼ばれる）、そしてＥ１Ｂタンパク質のグループ、特にＥ１Ｂ５５ｋタンパク質（本明細書ではＥ１Ｂ５５ｋとも呼ばれる）、Ｅ１Ｂ１９ｋタンパク質（本明細書ではＥ１Ｂ１９ｋとも呼ばれる）、タンパク質ＩＸである。
【０３０５】
Ｅ１Ａ１３Ｓが、Ｅ１Ａプロモーターとは異なるプロモーター、好ましくはアデノウイルスのＥ１Ａプロモーター、より好ましくはアデノウイルスの野生型Ｅ１Ａプロモーターの制御下にある場合、ウイルスはＥ１Ａ１３Ｓマイナスであり、Ｅ１Ａ１２Ｓが、Ｅ１Ａプロモーターとは異なるプロモーター、好ましくはアデノウイルスのＥ１Ａプロモーター、より好ましくはアデノウイルスの野生型Ｅ１Ａプロモーターの制御下にある場合、ウイルスはＥ１Ａ１２Ｓマイナスであることは本発明の一実施態様の範囲内である。Ｅ１Ｂ５５ｋが、Ｅ１Ｂプロモーターとは異なるプロモーター、好ましくはアデノウイルスのＥ１Ｂプロモーター、より好ましくはアデノウイルスの野生型Ｅ１Ｂプロモーターの制御下にある場合、ウイルスはＥ１Ｂ５５ｋマイナスであり、Ｅ１Ｂ１９ｋが、Ｅ１Ｂプロモーターとは異なるプロモーター、好ましくはアデノウイルスのＥ１Ｂプロモーター、より好ましくはアデノウイルスの野生型Ｅ１Ｂプロモーターの制御下にある場合、ウイルスはＥ１Ｂ１９ｋマイナスであり、タンパク質ＩＸが、Ｅ１Ｂ  ＩＸプロモーターとは異なるプロモーター、好ましくはアデノウイルスのＥ１Ｂ  ＩＸプロモーター、より好ましくはアデノウイルスの野生型Ｅ１Ｂ  ＩＸプロモーターの制御下にある場合、もしくはＥ１Ｂ  ＩＸプロモーターの制御下にあるが、該プロモーターがＥ１Ｂ  ＩＸプロモーターの活性化を導く特定のウイルス因子の欠乏に起因して不活性である場合、ウイルスはタンパク質ＩＸマイナスであり、後者は調節コンテクストが変化した例であり、より具体的には調節コンテクストが間接的に変化した、もしくはより高い統合または調節レベルで変化している。概して、このように「変化した調節コンテクスト」という用語は、間接的またはより高い統合または調節レベルでの変化も含んでいるが、いずれの場合にも野生型の特殊性、特に野生型アデノウイルスとは異なっている。タンパク質またはタンパク質の機能およびこれら「マイナス」をコード化する各核酸に関して、該タンパク質、タンパク質の機能、これらをコード化する核酸がいずれにしてもウイルスの好適な態様に含まれうるが、野生型ウイルスの各コンテクストとは異なるコンテクストに含まれることを認める必要がある。該タンパク質、タンパク質の機能、各核酸は、該条件化において本明細書で異種（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ）とも呼ばれる。
【０３０６】
本発明の実施態様では、ウイルスはＥ１Ａ１３Ｓマイナスである。さらなる実施態様では、ウイルスはＥ１Ａ１２マイナスでもある。これと関連して、ウイルスのＥ１Ａ１２Ｓは、その活性がＹＢ−１によって制御されるプロモーターの制御下にある、特にＹＢ−１によって活性化される場合に特に好ましい。これらのプロモーターは本明細書ではＹＢ−１依存的プロモーターと呼ばれる。特に好適なＹＢ−１依存的プロモーターはアデノウイルスＥ２後期プロモーターである。この構築によって、ＹＢ−１が核酸内に存在する場合にのみウイルス複製中でのＥ１Ａ１２Ｓの活性化が保証される。これは、調節解除されたＹＢ−１を感染細胞の核内に転位させる本発明のウイルストランスポーターを介した調節解除されたＹＢ−１を有する細胞の場合に成立する。野生型における発現と比較して、ウイルストランスポーターおよびＥ１Ａ１２Ｓの経時的に逆転した発現に起因して、Ｅ１Ａ１２Ｓは調節解除されたＹＢ−１を含む細胞において特異的に発現されるため、ウイルス複製がこれらの細胞に限られ、結果的に溶解がこれらの細胞に限定され、このことは特に安全性という点でこのウイルスの顕著な利点を示す。
【０３０７】
これらの状況下では、ＹＢ−１依存的な複製と関連して粒子数が増加するはずであった。タンパク質ＩＸがＹＢ−１依存的な複製においても重要な役割を果たし、本明細書で開示される設計を実現する際に、その発現は好ましくはＥ１Ｂ領域のタンパク質によってもたらされるトランスポーターおよびＥ１Ａ１２Ｓの発現における上記の経時的な変化の影響を受けないことを本発明者は認識していた。先行技術において記載されているＹＢ−１複製のためのアデノウイルスの設計は、顕著な腫瘍崩壊活性にもかかわらず、一部の適用では低い粒子形成を示し、これは例えば腫瘍退縮ウイルスの別の適用を必要とした。ウイルスのこのような別の適用は原理上可能であるが、大半の場合に望ましくない。本明細書に記載のコンストラクト、特にウイルスグループ§３と関連して記載されるコンストラクトによって粒子形成を改善可能である。
【０３０８】
アデノウイルスのタンパク質ＩＸはカプシド構造を強固にして、ビリオン内におけるウイルスＤＮＡのパッケージングに重要である（Boulanger ら, Journal of Virology, 44, 783-800, 1979; Jones und Shenk, Cell, 17, 683-689, 1979）。遺伝子はウイルスゲノム内の３５８１−４０７１位に位置するが（Colby und Shenk T, Journal of Virology, 1981, 39、977-980）、タンパク質ＩＸの遺伝子は複製中のＤＮＡ分子からのみ発現される（Matusi T ら., Molecular and Cellular Biology, 1986, 6, 4149-4154）。
【０３０９】
先行技術に記載されており、ＹＢ−１依存的な複製を行うウイルスＸｖｉｒ０３−３′ＵＴＲは、３′ＵＴＲ配列は同じものを含んでいるため、本発明と関連して一時的に実施された分析で示されたように、タンパク質ＩＸの他、プロモーターを含んでいる。一方、該タンパク質は腫瘍細胞内では弱くしか発現しておらず、野生型ウイルスと比較して、粒子形成は比較的低い。ウイルスＸｖｉｒ０３−３′ＵＴＲは、Ｘｖｉｒ０３−３′ＵＴＲ内に導入された異種ＣＭＶプロモーター（Clontech: Plasmid pShuttle）によって媒介されるように、ウイルスタンパク質Ｅ１Ｂ５５ｋおよびＥ４ｏｒｆ６を発現する。ＣＭＶプロモーターよりも、Ｅ１Ａ発現と関連して本明細書で開示されている全てのプロモーターも使用可能である。両遺伝子のオープンリーディングフレームは、いわゆるＩＲＥＳ配列（内部リボソーム侵入部位、英語：internal ribosomal entry site）によって互いに結合されている（Pelletier, J. and Sonenberg, N. Nature, 1988, 334, 320-325）。このエレメント（Ｎｏｖａｇｅｎ：ｐＣＩＴＥ）は１つのｍＲＮＡから２つのタンパク質の発現を可能にする。１つのＲＮＡから２つのタンパク質の発現のための別の選択肢は短鎖ペプチド（２Ａ）の使用であり、これは口蹄疫ウイルスに由来する（Pablo de Felipe, Genetic Vaccines and Therapy, 2004, 2, 13）。原理上、このエレメントは本明細書に記載の様々な態様において調節ＩＲＥＳ配列の代用として使用可能である。
【０３１０】
本出願以前には未知であった、ＹＢ−１依存的に複製するウイルス、特にアデノウイルスにおけるタンパク質ＩＸの発現調節バックグラウンドから、ＹＢ−１依存的な複製と関連した、ＹＢ−１依存的に複製するウイルスの場合に、基本的に以下の異なる戦略によってタンパク質ＩＸを発現可能であることを本発明者は認識した：
１．好ましくはタンパク質Ｅ１Ａ１２Ｓおよびタンパク質Ｅ１Ｂ１９の発現を制御する非依存的プロモーターによる。
非依存的プロモーターは好ましくはＥ１Ｂ  ＩＸプロモーターとは異なるプロモーターである。好ましくは、非依存的プロモーターは組織特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター、ＹＢ−１依存的ウイルスプロモーターを含むグループから選択される。
２．Ｅ１Ａ１２Ｓによるタンパク質ＩＸの発現制御。感染細胞におけるＳ期誘導は、Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質の発現によって起こり、これは天然型プロモーターによるタンパク質ＩＸの活性化をもたらす。
原理上、該プロモーターはトランスポーターの発現のために使用され、野生型ウイルスにおけるトランスポーターの発現を制御するプロモーターとは異なることは本発明の範囲内である。好適な実施態様では、このことはＥ１５５ｋがＥ１Ｂとは異なるプロモーターによって制御され、Ｅ４ｏｒｆ６はＥ４プロモーターとは異なるプロモーターによって制御されることを意味する。別の実施態様では、プロモーターはＥ１Ａ非依存的、即ち、その活性がＥ１Ａの影響を受けないプロモーターである。好適なプロモーターはこのように、特に本明細書に記載されているプロモーターである、組織特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター、ウイルスプロモーターである。
【０３１１】
特にその任意の態様と関連して、本発明の範囲内において使用可能なＹＢ−１依存的プロモーターは、アデノウイルスＥ２後期プロモーター、ＭＤＲプロモーター［Stein et al., J. Biol. Chem, 2001, 276, 28562-28569］、ＤＮＡポリメラーゼαプロモーターの他［En-Nia et al., J. Biol. Chem., 2004, Epub ahead of print］であるが、これらに限定されるわけではない。
【０３１２】
本発明の範囲内において有用な適当な非アデノウイルスプロモーターは、サイトメガロウイルスプロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、アデノウイルスベースのプロモーターＶａＩおよび非ウイルスＹＢ−１プロモーター（Makino Y. ら, Nucleic Acids Res. 1996, 15, 1873-1878）を含むグループから選択可能である。本明細書で開示されている発明の任意の態様と関連して使用可能な別のプロモーターは、テロメラーゼプロモーター、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター、癌胎児性抗原プロモーター（ＣＥＡ）（Cao, G., Kuriyama, S., Gao, J., Mitoro, A., Cui, L., Nakatani, T., Zhang, X., Kikukawa, M., Pan, X., Fukui, H., Qi, Z. Int. J. Cancer, 78, 242-247, 1998）、Ｌプラスチンプロモーター（Chung, I., Schwartz, PE., Crystal, RC., Pizzorno, G, Leavitt, J., Deisseroth, AB. Cancer Gene Therapy, 6, 99-106, 1999）、アルギニンバソプレシンプロモーター（Coulson, JM, Staley, J., Woll, PJ. British J. Cancer, 80, 1935-1944, 1999）、Ｅ２ｆプロモーター（Tsukada ら, Cancer Res., 62, 3428-3477, 2002）、ウロプラキンＩＩプロモーター（Zhang ら, Cancer Res., 62, 3743-3750, 2002）、ＰＳＡプロモーター（Hallenbeck PL, Chang, YN, Hay, C, Golightly, D., Stewart, D., Lin, J., Phipps, S., Chiang, YL. Human Gene Therapy, 10, 1721-1733, 1999）である。さらにドイツ特許出願ＤＥ  １０１  ５０  ９８４．７で開示されているアデノウイルスのＹＢ−１依存的Ｅ２後期プロモーターは、本発明の範囲内で使用できるプロモーターである。
【０３１３】
本発明のウイルスは、先行技術のＹＢ−１依存的ウイルスと比較して、粒子形成の有意な増加を可能にする。好ましくは、粒子形成はファクター２−５０、より好ましくはファクター１０−５０だけ増加する。
【０３１４】
最後に、好適な一実施態様では、本発明に従って使用されるアデノウイルスはＥ１Ｂ、特にＥ１Ｂ１９ｋが欠損している。本明細書において一般に使用されている通り、欠損という用語は、Ｅ１Ｂが野生型に固有の特性を全て示すわけではなく、少なくともこれらの特性の１つを欠いている状態を意味する。アデノウイルスのＢＣＬ２ホモログであるＥ１Ｂ１９ｋは、プロアポトーシスタンパク質であるＢａｋおよびＢａｘの相互作用によってＥ１Ａ誘導性アポトーシスを阻害する。このように、感染細胞において最高の複製および／または粒子形成が可能となる（Ramya Sundararajan und Eileen White, Journal of Virology 2001, 75, 7506-7516）。Ｅ１Ｂ１９ｋの存在はアデノウイルス死タンパク質の機能を最小限にするため、Ｅ１Ｂ１９ｋの不在はより良好なウイルスの放出をもたらす。ウイルスが誘導する細胞変性作用は該欠失によって増大され（Ta-Chiang Liu ら, Molecular Therapy, 2004）、これによって感染された腫瘍細胞のより強い溶解をもたらす。また、Ｅ１Ｂ１９ｋの不在は、腫瘍細胞内の該組換えアデノウイルスの複製には影響を及ぼさないＴＮＦ−αをもたらすが、正常細胞では、処理により複製の低下および感染性ウイルスの放出がもたらされる。このように、選択性および特異性が増大する（Ta-Chiang Liu ら, Molecular Therapy 2004, 9, 786-803）。
【０３１５】
以下の態様、特徴、実施態様は、本発明に従って使用される、また使用予定の全てのウイルス、特にアデノウイルスに適用可能である。
【０３１６】
本明細書で使用されているように、トランス遺伝子という用語は、一実施態様では、ウイルス、特に野生型アデノウイルス、より好ましくはアデノウイルスＡｄ５野生型に含まれない全ての遺伝子、もしくは本明細書で定義される異なる調節コンテクストに含まれる全ての遺伝子を含む。本明細書に記載の１つ以上のトランス遺伝子は、１つ以上のヘルパーウイルスによってコードおよび／または発現されることは本発明の一実施態様の範囲内である。
【０３１７】
本明細書に記載の知見および方法、使用、または核酸、タンパク質、複製系などはそれぞれ必ずしもアデノウイルスに限定されるわけではない。原理上、該システムは本明細書にも含まれる、そして開示される他のウイルスにも存在する。
【０３１８】
本発明のウイルスを使用する場合、または本発明に従って使用する場合、記載のウイルスは野生型ウイルス、好ましくは野生型アデノウイルスと同程度にまで複製し、該程度は、先行技術に従った１０−１００ｐｆｕ／細胞と比較して、１−１０ｐｆｕ／細胞の感染数で既に実現可能である。
【０３１９】
本発明のウイルスは、先行技術のＹＢ−１依存的ウイルスと比較して、粒子形成の顕著な増大をもたらす。好ましくは、粒子形成はファクター２〜５０、より好ましくはファクター１０〜５０だけ増加する。
【０３２０】
本発明とは無関係のアデノウイルスの核酸配列をそれぞれ欠失させ、突然変異を加えることは当業者の技術の範囲内である。該欠失は、例えば本明細書にも記載のＥ３およびＥ４をコード化する核酸の一部と関連しうる。Ｅ４の欠失の場合、それがＥ４ｏｒｆ６タンパク質に及ばないことが特に好ましく、これは本発明に従って使用されるアデノウイルスがＥ４ｏｒｆ６をコード化することを意味する。好適な実施態様では、これらのアデノウイルス核酸は依然としてウイルスカプシド内に充填されるため、感染性粒子を形成しうる。これは、本発明に従った核酸の使用にも当てはまる。一般に、１つ以上の発現産物に関してアデノウイルスの系が欠損可能であることが認められる。これと関連して、グループＩのアデノウイルスおよびグループＩＩのアデノウイルスの両方に関して、発現産物をコード化する核酸の突然変異または欠失、この場合、該突然変異および欠失はそれぞれ完全であるか、あるいは発現産物が形成されない程度に施されていることによる、あるいは核酸レベル（プロモーター、シス作用エレメントの欠如）、翻訳・転写レベル（トランス作用エレメント）のいずれかで、それぞれ調節エレメントおよびプロモーターや転写因子などの発現を制御するエレメントが失われている、若しくは野生型とは異なる様式で活性化していることにより、これが生じうることを考慮に入れる必要がある。特に、後者の態様はそれぞれの細胞バックグラウンドに左右される。
【０３２１】
本発明のさらなる態様では、ウイルス、ウイルス系、同じもののコードまたは含む複製系、これをコード化する核酸、同じものを含むベクターが、薬剤の製造に使用される。好ましい薬剤は本明細書に記載される、特に本明細書に記載の様々なウイルスの本発明に従った使用と関連して記載される疾患の治療用である。
【０３２２】
本発明に従った、特に全身投与と関連するアデノウイルスの薬剤としての使用は、アデノウイルスの適当なターゲティングによって向上できる。腫瘍細胞のアデノウイルス感染は、特にコクサッキーウイルスアデノウイルス受容体ＣＡＲおよび特定のインテグリンの存在にある程度左右される。これらが細胞内、特に腫瘍細胞内において強く発現される場合、既に非常に低い力価（ｐｆｕ／細胞）で感染可能である。組換えアデノウイルスのいわゆる再ターゲティングを実現するために、例えば、タンパク質ＩＸのファイバーノブ（ｆｉｂｅｒ  ｋｎｏｂ）領域およびＣ末端への異種配列の挿入、二重特異性抗体の使用、アデノウイルスのポリマーコーティング、Ａｄ−ｆｉｂｅｒ内へのリガンドの導入、それぞれ血清型５ｋｎｏｐおよび血清型５ファイバーシャフト（ｆｉｂｅｒ  ｓｈａｆｔ）の置換、血清型３ｋｎｏｐおよびＡｄ３５ファイバーシャフト、ペントン基のｋｎｏｐおよび修飾による異なる戦略が今までに取られてきた（Nicklin S. A. ら, Molecular Therapy 2001, 4, 534-542; Magnusson, M. K. ら, J. of Virology 2001, 75, 7280-7289; Barnett B. G. ら, Biochimica et Biophysica Acta 2002, 1575, 1-14; Dimitrev IP ら, Journal of Virology, 2002, 76, 6893-6899; Mizuguchi und Hayakawa, Human Gene Therapy, 2004, 15, 1034-1044）。本発明のアデノウイルスおよび本発明に従って使用されるアデノウイルスと関連する別の設計および特性を実現することは、本発明の様々な実施態様において、本発明の範囲内である。
【０３２３】
本明細書に記載のウイルスの一部は、本明細書に記載の１つ以上のトランス遺伝子を含んでいることが認められる。該トランス遺伝子は、作用機序、より正確にはウイルスの複製機序、もしくは一部の実施態様において、トランス遺伝子が治療用遺伝子である場合での薬剤としての使用に関して重要または有用である。
【０３２４】
Ｅ１Ｂ５５ｋＤ、Ｅ４ｏｒｆ６、ＡＤＰなどを含む様々なトランス遺伝子は、特にそれらがウイルス遺伝子の場合、原理上、各ウイルス、好ましくはアデノウイルス、さらに好ましくはアデノウイルスＡｄ５からクローニングできる。様々なプラスミドが先行技術において追加的に記載されており、これらは各遺伝子を含み、これらから該遺伝子を適時回収可能であり、これらを本発明に従って使用されるウイルスの他、本発明に従った両方のアデノウイルスに導入できる。Ｅ１Ｂ５５ｋＤを発現するプラスミドの例は、例えば、Dobbelstein, M. ら, EMBO Journal, 16, 4276-4284, 1997に記載されている。Ｅ１Ｂ５５Ｋ遺伝子のコーディング領域は、例えば、ｐＤＣＲＥ１ＢプラスミドからＢａｍＨＩによってこの遺伝子の３′非コード領域（３′ＵＴＲ領域は好ましくはアデノウイルスの野生型ゲノムの約３５０７〜４１０７位にある）と共に切り出すことができる。３′非コード領域の他、Ｅ１Ｂ５５ｋＤを含む各断片は、アデノウイルス５型の２０１９〜４１０７位のヌクレオチドに対応する。しかし、Ｅ１Ｂ５５ｋＤ遺伝子がそれぞれＢａｍＨＩ、ＢｆｒＩ、ＸｂａＩ制限酵素でプラスミドから切り出され、それに続いてアデノウイルスにクローニングされることも本発明の範囲内である。この遺伝子の類似物質、特に３′領域の類似物質を本発明において使用できることも本発明の範囲内である。３′ＵＴＲ領域の類似物質は、３′ＵＴＲ領域と同じ作用、特に遺伝子、好ましくはＥ１Ｂ５５ｋＤ遺伝子の発現に関して同じ作用を有する任意の配列である。該類似物質は、当業者が実施する通常の実験（例、３′ＵＴＲ領域の１つ以上のヌクレオチドの伸長または短縮、そして次にこのようにして得られた類似物質が過去に記載された３′ＵＴＲ領域と同じ作用を依然として有しているか否かを試験する）によって判定できる。一実施態様では、３′ＵＴＲ領域はこのように遺伝子の各類似物質および任意の類似物質を含む。
【０３２５】
治療用遺伝子またはトランス遺伝子が、好適な実施態様において、好ましくは特異的プロモーター、特に腫瘍特異的プロモーターまたは組織特異的プロモーターの制御下にクローニングされたウイルスは、本発明に従ったウイルスをさらに発展させたものである。Ｅ４領域が機能的に不活性である、または好ましくは欠失されていることも該ウイルスの範囲内である。本明細書に記載のトランス遺伝子もＥ４領域内にクローニング可能であり、これはＥ３領域内へのトランス遺伝子のクローニングの代わり、もしくは追加的に実施可能であり、Ｅ３領域は部分的または完全に無傷でありうる。本明細書で使用されるトランス遺伝子は、治療用遺伝子またはウイルス遺伝子、好ましくはアデノウイルス遺伝子であり、好ましくは野生型アデノウイルスのゲノム中には存在せず、現在特定のウイルス中に位置するゲノム部位には存在しない。
【０３２６】
治療用遺伝子はプロドラッグ遺伝子、サイトカイン遺伝子、アポトーシス誘導遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、メタロプロテイナーゼインヒビター遺伝子、および／または血管形成抑制剤、チロシンキナーゼインヒビター遺伝子でありうる。また、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、アンチセンス分子、リボザイムは好ましくは癌関連標的分子に対して発現可能である。好ましくは、個別の、もしくはいくつかの標的分子を、耐性関連因子、抗アポトーシス因子、癌遺伝子、血管形成因子、ＤＮＡ合成酵素、ＤＮＡ修復酵素、増殖因子およびその受容体、転写因子、メタロプロテイナーゼ、特にマトリクスメタロプロテイナーゼ、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子から選択される。これらの好ましい実施態様は本明細書において既に開示されている。
【０３２７】
一実施態様では、耐性関連因子は好ましくはＰ糖タンパク質、ＭＲＰ、ＧＳＴを含むグループから選択され、これらをコードする核酸も含む。
【０３２８】
好適な実施態様において使用可能なプロドラッグ遺伝子は、例えば、シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼ、カルボキシペプチダーゼ、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、プリンヌクレオチドホスフォリラーゼ（ＰＮＰ）である（Kirn ら, Trends in Molecular Medicine, volume 8, no. 4 (suppl), 2002; Wybranietz W.A. ら, Gene Therapy, 8, 1654-1664, 2001; Niculescu-Duvaz ら, Curr. Opin. Mol. Therapy, 1, 480.486, 1999; Koyama ら, Cancer Gene Therapy, 7, 1015-1022, 2000; Rogers ら, Human Gene Therapy, 7, 2235-2245, 1996; Lockett ら, Clinical Cancer Res., 3, 2075-2080, 1997; Vijayakrishna ら, J. Pharmacol. And Exp. Therapeutics, 304, 1280-1284, 2003）。
【０３２９】
好適な実施態様において使用可能なサイトカインは、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＣＳＦまたはインターフェロンγである（Gene Therapy, Adavnces in Pharmacology, volume 40, editor; J. Thomas August, Academic Press; Zhang and Degroot, Endocrinology, 144, 1393-1398, 2003; Descamps ら, J. Mol. Med., 74, 183-189, 1996; Majumdar ら, Cancer Gene Therapy, 7, 1086-1099, 2000）。
【０３３０】
一実施態様では、抗アポトーシス因子はＢＣＬ２を含むグループから選択され、これらをコード化する核酸も含む。一態様の場合、癌遺伝子はＲａｓ、特に変異Ｒａｓ、Ｒｂ、Ｍｙｃを含むグループから選択され、これらをコード化する核酸も含む。一実施態様では、血管新生因子はＶＥＧＦおよびＨＭＧタンパク質を含むグループから選択され、これらをコード化する核酸も含む。一態様の場合、ＤＮＡ合成酵素はテロメラーゼを含むグループから選択され、これらをコード化する核酸も含む。一実施態様では、ＤＮＡ修復酵素はＫｕ−８０を含むグループから選択され、これらをコード化する核酸も含む。一実施態様では、増殖因子はＰＤＧＦ、ＥＧＦ、Ｍ−ＣＳＦを含むグループから選択され、これらをコード化する核酸も含む。さらなる実施態様では、受容体は特に増殖因子の受容体であり、好ましくは、増殖因子はＰＤＧＦ、ＥＧＦ、Ｍ−ＣＳＦを含むグループから選択され、これらをコード化する核酸も含む。一実施態様では、転写因子はＹＢ−１を含むグループから選択され、これらをコード化する核酸も含む。一実施態様では、メタロプロテイナーゼは特にマトリクスメタロプロテイナーゼである。好適な態様の場合、マトリクスメタロプロテイナーゼはＭＭＰ−１およびＭＭＰ−２を含むグループから選択され、これらをコード化する核酸も含む。一実施態様では、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子はｕＰａ−Ｒを含むグループから選択され、これらをコード化する核酸も含む。
【０３３１】
好適な実施態様において使用可能なアポトーシス誘導遺伝子は、例えば、デコリン（Tralhao ら, FASEB J, 17, 464-466, 2003）、網膜芽細胞腫（Zhang ら, Cancer Res., 63, 760-765, 2003)、BaxおよびBad(Zhang ら, Hum. Gene Ther., 20, 2051-2064, 2002)、アポプチン(Noteborn and Pietersen, Adv. Exp. Med. Biol., 465, 153-161, 2000)、ADP(Toth ら, Cancer Gene Therapy, 10, 193-200, 2003)、bcl-xs(Sumantran ら, Cancer Res, 55, 2507-2512, 1995)E4orf4(Braithwaite and Russell, Apoptosis, 6, 359-370, 2001)、FasL、Apo-1、Trail(Boehringer Manheim, Guide to Apoptotic Pathways, Arai ら, PNAC, 94, 13862-13867, 1997)、Bims(Yamaguchi ら, Gene Therapy, 10, 375-385, 2003)、GNR163(Oncology News, 17 June, 2000）である。
【０３３２】
好適な実施態様において使用可能な腫瘍抑制遺伝子は、例えば、Ｅ１Ａ、ｐ５３、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ＭＤＡ−７である（Opalka ら, Cell Tissues Organs, 172, 126-132, 2002, Ji ら, Cancer Res., 59, 3333-3339, 1999, Su ら, Oncogene, 22, 1164-1180, 2003)。
【０３３３】
好適な実施態様において使用可能な血管新生インヒビターは、例えば、エンドスタチンまたはアンジオスタチン（Hajitou ら, FASEB J., 16, 1802-1804, 2002)および抗VEGF抗体(Ferrara, N., Semin Oncol 2002 Dec; 29 (6 suppl 16): 10-4）である。
【０３３４】
好適な実施態様において使用可能なメタロプロテイナーゼインヒビターは、例えば、Ｔｉｍｐ−３（Ahonen ら, Mol Therapy, 5, 705-715, 2002)、PAI-1(Soff ら, J. Clin. Invest., 96, 2593-2600, 1995)、Timp-1(Brandt K. Curr. Gene Therapy, 2, 255-271, 2002）である。
【０３３５】
本発明のグループＩアデノウイルスおよびグループＩＩアデノウイルスによって発現可能な本発明の意味での別のトランス遺伝子もチロシンキナーゼインヒビターである。例示的なチロシンキナーゼはＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）である［Onkologie, Entstehung und Progression maligner Tumoren; 著者:Christoph Wagner, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1999］。好適なチロシンキナーゼインヒビターはハーセプチンである［Zhang H ら, Cancer Biol Ther. 2003, Jul-Aug; 2(4suppl1): S122-6］。
【０３３６】
本明細書で使用される、ｓｉＲＮＡ（短鎖干渉ＲＮＡ）は、塩基の相同性に起因して互いにハイブリダイズする２本の、好ましくは別々のＲＮＡ鎖からなり、これらが本質的に塩基対を作って存在し、好ましくは、鎖長は最高５０ヌクレオチド、好ましくは１８−３０ヌクレオチド、より好ましくは２５ヌクレオチド未満、最も好ましくは２１、２２、２３ヌクレオチドであり、これらの数字はｓｉＲＮＡの一本鎖、特により正確には第二の一本鎖とハイブリダイズする、もしくは塩基対を作る一本鎖の鎖長を示す。このために必要な特異性は、ｓｉＲＮＡの配列、そしてその結合部位によって媒介される。分解の標的配列は、第一または第二のｓｉＲＮＡ形成鎖と本質的に相同である。厳密な作用機序は依然として不明であるが、ｓｉＲＮＡは進化の途中で別の対立遺伝子を阻害して、ウイルスから自身を守るための細胞の生物学的戦略と予測される。ｓｉＲＮＡ媒介性ＲＮＡ干渉は、遺伝子特異的な二本鎖ＲＮＡの導入によってタンパク質の発現の特異的抑制または完全な除外の方法として使用される。高等動物では、１９−２３ヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡが、インターロイキン反応などの非特異的な防衛反応を活性化させないため、この範囲で特に適している。対称な２ヌクレオチドの３′突出を有する２１ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡの直接的トランスフェクションは、哺乳動物細胞においてＲＮＡ干渉を媒介するのに適しており、リボザイムやアンチセンス分子などの他の技術と比較して非常に効率的であった（Elbashir, S. Harborth J. Lendeckel W. Yalvcin, A. Weber K, Tuschl T: Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 2001, 411: 494-498）。標的遺伝子の発現を抑制するために数本のｓｉＲＮＡ分子だけで十分である。特に干渉現象の一過性およびｓｉＲＮＡ分子の特異的デリバリーにおける外来ｓｉＲＮＡの限界を回避するために、内因性ｓｉＲＮＡ発現を可能にする先行技術のベクターを使用する。該目的のために、例えば、９ヌクレオチドのスペーサー配列によって隔てられた、センスおよびアンチセンス両方向の１９ヌクレオチド長の標的配列を含むベクターに６４ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを導入する。結果として得られる転写産物は、例えば１９塩基対のステム構造（ステム）を有するヘアピン構造に折りたたまれる。ループは細胞内において急速に分解され、機能的なｓｉＲＮＡ分子が産生される（Brummelkamp ら, Science, 296, 550-553, 2002）。
【０３３７】
さらに別の一実施態様では、薬剤はさらに１つの薬学的に活性な化合物または薬学的に活性な薬剤からなり、明確な異論がない場合、化合物および薬剤という用語は互換性を持って使用される。
【０３３８】
好適な一実施態様では、薬学的に活性な化合物は、サイトカイン、メタロプロテイナーゼ阻害剤、血管新生阻害剤、結腸癌に対するイリノテカンやＣＰＴ−１１および白血病に対するダウノルビシン、ＣＤＫ２／サイクリンＥキナーゼ活性を阻害して結腸癌に対して使用可能なＣＹＣ２０２などの細胞周期阻害剤（McClue SJ, Int. J. Cancer 2002, 102, 463-468）Ｒａｆ−１を阻害して、例えば、乳癌に効果的なＢＡＹ４３−９００６（Wilhelm SM ら, Cancer Res.2004, 64, 7099-7109）、２６Ｓプロテアソーム活性を阻害して扁平上皮癌に対して使用されるＰＳ−３４１などのプロテアソーム阻害剤（Fribley A ら, Mol Cell Biol 2004 Nov; 24(22): 9695-704）、ＥＧＦ受容体に対する組換え抗体（Herceptin for breast carcinoma and prostate tumor; H.G. van der Poel, European Urology 2004, 1-17; Erbitux against head and neck tumors; Bauman M ら, Radiother. Oncol., 2004, 72, 257-266）、特にｃ−ｋｉｔを抑制して胃腸腫瘍に対して使用可能なＳＴＩ５７１などのシグナル伝達系の阻害剤（H.G. van der Poel, European Urology 2004, 45, 1-17）、特に前立腺癌に対して使用可能なエンドセリン阻害剤であるＡＢＴ−６２７（H.G. van der Poel, European Urology 2004, 45, 1-17）、ＶＥＧＦチロシンキナーゼ受容体のリン酸化を阻害して膠芽細胞腫や前立腺癌に対して使用可能なＳＵ５４１６（Bischof M らInt. J Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2004; 60(4): 1220-32）、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性を阻害して、特に前立腺癌に対して使用可能なＺＤ１８３９（H.G. van der Poel, European Urology 2004, 45, 1-17）、ｍＴＯＲを阻害して前立腺癌に対して使用可能なＣＣＩ−７７９やＲＡＤ００１などのラパマイシン誘導体である。本明細書に記載の様々なアデノウイルスや本発明に従って使用されるアデノウイルスが原理上これと関連して記載される各適用および任意の適応に対する上記の各化合物および任意の化合物と共に使用可能であることは本発明の範囲内である。特に好適な一実施態様では、適応は過去に記載された薬学的に活性な化合物または薬剤に対して記載された適応である。
【０３３９】
本発明者はさらに驚くべきことに、少なくとも２つの化合物の併用によって本明細書に記載のウイルスおよび特に本発明に従って使用されるウイルスの有効性を高めることが可能であることを見出しており、少なくとも２つの化合物のそれぞれは細胞増殖抑制剤を含むグループから個別および無関係に選択される。
【０３４０】
本明細書の好適な一実施態様において使用されているように、細胞増殖抑制剤は特に化学的化合物または生物学的化合物であり、これらは細胞または該細胞を含む生物への投与中または投与後に、細胞分裂および（または）細胞増殖を停止させる、および（または）細胞分裂および（または）細胞増殖を停止または減速させる。細胞増殖抑制剤は、細胞または該細胞を含む生物においてのみ上記の意味で細胞増殖抑制性となる化合物または薬剤も含む。この範囲において、細胞増殖抑制剤という用語は、細胞増殖抑制前も含む。
【０３４１】
細胞増殖抑制剤は作用機序に従ってグループ分けされる。原理上、全てが本発明の範囲内で使用可能な以下のグループは区別される：
−アルキル化剤、即ち、タンパク質の他、核酸のリン酸基、アミノ基、スルフヒドリル基、カルボキシ基、ヒドロキシ基のアルキル化によって細胞毒性作用を生じる化合物。該化合物はそれ自体が発癌性を有する場合が多い。細胞増殖抑制剤のこのグループの典型例は、シスプラチンおよびプラチン誘導体であるシクロホスファミド、ダカルバジン、マイトマイシン、プロカルバジンである。
−代謝拮抗産物、即ち、構造的類似性または結合能に起因して、代謝過程を遮断する、またはそれに影響を与える化合物。代謝拮抗産物のグループ内では、構造的に類似した代謝拮抗産物、構造を変化させる代謝拮抗産物、間接的に作用する代謝拮抗産物間で区別される。構造的に類似している代謝拮抗産物は、化学的類似性に起因して、その機能を発揮することなく競合する。構造を変化させる代謝産物は、機能または吸収を妨げる、もしくは代謝産物を化学的に修飾する代謝産物に結合する。間接的に作用する代謝拮抗産物は、例えば、イオンの結合によって代謝産物の機能を妨げる。このグループの典型例は、メトトレキセートなどの葉酸拮抗剤、フルオロウラシルなどのピリミジン類似物質、アザチオプリンやメルカプトプリンなどのプリン類似物質である。
−有糸分裂阻害剤、即ち、細胞分裂を阻害する化合物。有糸分裂阻害剤のグループ内では、細胞分裂毒、紡錘体毒、染色体毒間で区別される。このグループの典型例はタキサンおよびビンカアルカロイドである。タキサンは次にタキソールとタキソテールの2つの主なグループに分けることができ、特に好ましいタキソールはパクリタキセルであり、特に好ましいタキソテールはドセタキセルである。
−ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対する抑制効果を有する抗生物質。典型例は、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、マイトマイシンなどのアントラサイクリンである。
−トポイソメラーゼ阻害剤、特にトポイソメラーゼＩ阻害剤。トポイソメラーゼ阻害剤は、３段階の過程でＤＮＡのねじれ数の変化を触媒することでＤＮＡの三次構造を決定する化合物である。本質的に、２つの型のトポイソメラーゼが区別される。Ｉ型トポイソメラーゼは、ＤＮＡ鎖のみを切断して、ＡＴＰ非依存性であるが、ＩＩ型トポイソメラーゼはＤＮＡの両方の鎖を切断し、ＡＴＰ依存性である。トポイソメラーゼＩ阻害剤の典型例はイリノテカンおよびトポテカンであり、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤の典型例はエトポシドおよびダウノルビシンである。
【０３４２】
本発明の範囲内で、少なくとも１つおよび好ましくは２つの薬剤が上記のグループから選択される。一方、特に３、４、５つの異なる薬剤が選択されることも本発明の範囲内である。１つだけ、好ましくは２つの薬剤をウイルスと併用する、本発明の実施態様と関して以下のコメントがなされた。これらの考察は基本的に１つ以上の薬剤が使用される実施態様にも適用可能である。
【０３４３】
好ましくは、薬剤は、それらが異なる標的分子を対象とする、もしくは異なる分子を標的とする、と文献中に記載されているように互いに異なる。薬剤が、同じ標的分子に結合する２つ以上の異なる薬剤を含むことは本発明の範囲内である。該薬剤が標的分子の第一部位に結合して、次に該薬剤が標的分子の第二部位に結合することも本発明の範囲内である。
【０３４４】
少なくとも２つの薬剤が異なる作用機序で活性であることも本発明の範囲内である。「活性である」とは、好適な一実施態様では、化合物の作用を阻害する、もしくは遅らせる細胞増殖および／または細胞分裂が異なる作用機序により媒介されることを意味する。特に好適な一態様の場合、「活性である」という用語は、１つおよび／または両方の薬剤が使用されない場合と比較して、ウイルス、特に本発明のウイルス、本明細書に記載のウイルスおよび本発明に従って使用されるウイルスの複製効率が増大することを意味する。ウイルス複製の効率測定値として、好ましくは細胞溶解に必要なウイルス数を使用し、好ましくはｐｆｕ／細胞で表す。
【０３４５】
特に好適な実施態様では、少なくとも２つの薬剤の内、少なくとも１つが、ウイルス複製を生じる、好ましくは選択的に生じる、好ましくは本明細書に記載のウイルスおよび／または本明細書に従って使用されるウイルスによる細胞の感染性を増大させる薬剤である。これは、例えば、細胞によるウイルスの取り込みによって実施可能である。ウイルス、特にアデノウイルスの取り込みは、例えば、コクサッキーウイルスアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）によって媒介される（Mizuguchi und Hayakawa, GENE 285, 69-77, 2002）。ＣＡＲの発現上昇は、例えば、トリコスタチンＡによって生じる（Vigushin ら, Clinical Cancer Research, 7, 971-976, 2001）。
【０３４６】
別の一実施態様では、少なくとも２つの薬剤の内、１つは細胞内成分の有効性を増大させ、該成分は、ウイルス、本明細書に記載のウイルスおよび／または本発明に従って使用されるウイルスの複製を増大させる薬剤である。
【０３４７】
別の一実施態様では、少なくとも２つの薬剤の内１つはＹＢ−１の核内への輸送を媒介する薬剤である。該薬剤は、トポイソメラーゼ阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、有糸分裂阻害剤を含むグループから選択される。好ましいトポイソメラーゼ阻害剤は、カンプトテシン、イリノテカン、エトポシド、そしてこれらの類似物質である。好ましい有糸分裂阻害剤は、ダウノルビシン、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセルである。好ましいアルキル化剤はシスプラチンおよびその類似物質である。好ましい代謝拮抗剤はフルオロウラシルおよびメトトレキサートである。
【０３４８】
特に好適な一実施態様では、少なくとも２つの薬剤の内１つは、細胞の感染性、特にＣＡＲの発現を増大させる薬剤であり、少なくとも２つの薬剤の２番目はＹＢ−１の核内輸送を増大させる薬剤であり、好ましくは化合物として、好ましくは上記の必要な各特性を示す化合物が使用される。
【０３４９】
別の一実施態様では、少なくとも２つの薬剤の内１つはヒストンデアセチラーゼ阻害剤である。好ましいヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、トリコスタチンＡ、ＦＲ９０１２２８、ＭＳ−２７−２７５、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ＰＸＤ１０１を含むグループから選択される。トリコスタチンＡは、例えば、Vigushin ら, Clinical Cancer Research, 7, 971-976, 2001に記載されている。ＦＲ９０１２２８は、例えば、Kitazono ら, Cancer Res., 61, 6328-6330, 2001に記載されている。ＭＳ−２７−２７５は、Jaboin ら, Cancer Res., 62, 6108-6115, 2002に記載されている。ＰＸＤ１０１は、Plumb ら, Mol. Cancer Ther., 8, 721-728, 2003に記載されている。ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４は、Atadja ら, Cancer Res., 64, 689-695, 2004に記載されている。
【０３５０】
一実施態様では、少なくとも１つの薬剤は、トリコスタチンＡ（膠芽細胞腫に対する；Kim JH ら, Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 2004, 59, 1174-1180）、ＦＲ９０１２２８（膵臓腫瘍に対する：Sato N ら, Int. J. Oncol. 2004, 24, 679-685）、ＭＳ−２７−２７５（前立腺癌に対する；Camphausen K ら, Clinical Cancer Research 2004, 10, 6066-6071）、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４（白血病に対する；Nimmanapalli R ら, Cancer Res. 2003, 63, 5126-5135）、ＰＸＤ１０１（卵巣癌に対する；Plumb JA ら, Mol. Cancer Ther. 2003, 2, 721-728）、スクリプタイド（乳癌に対する；Keen JC ら, Breast Cancer Res. Treat. 2003, 81, 177-186）、アピシジン（黒色腫に対する；Kim SH ら, Biochm. Biophys. Res. Commun. 2004, 315, 964-970）、ＣＩ−９９４（多様な腫瘍に対する；Nemunaitis JJ ら, Cancer J. 2003, 9, 58-66）を含むグループから選択される。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の作用機序は特に、Lindemann RK ら, Cell Cycle 2004, 3, 77-86に記載されている。これらと関連する、本明細書に記載の各適応および任意の適応に対して、原理上、本明細書に記載の様々なアデノウイルスおよび本発明に従って使用されるアデノウイルスを上記の化合物と併用できることは本発明の範囲内である。特に好適な一実施態様では、適応は、上記の薬学的に活性な各化合物および任意の化合物に関して記載されている適応である。
【０３５１】
さらに別の一実施態様では、少なくとも２つの薬剤の内１つはトポイソメラーゼ阻害剤、好ましくはトポイソメラーゼＩ阻害剤である。好ましいトポイソメラーゼ阻害剤は、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、ＳＮ−３８、９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン、ＤＸ−８９５Ｉｆ、ダウノルビシンを含むグループから選択される阻害剤である。イリノテカンおよびＳＮ−３８は、例えば、Gilbert ら, Clinical Cancer Res., 9, 2940-2949, 2003に記載されている。ＤＸ−８９５ＩＦは、van Hattum ら, British Journal of Cancer, 87, 665-672, 2002に記載されている。カンプトテシンは、Avemann ら, Mol. Cell. Biol., 8, 3026-3034, 1988に記載されている。９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシンは、Rajendra ら, Cancer Res., 63, 3228-3233, 2003に記載されている。ダウノルビシンは、M. Binaschi ら, Mol. Pharmacol., 51, 1053-1059に記載されている。
【０３５２】
好適な一実施態様では、トポイソメラーゼ阻害剤は、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、ＤＸ−８９５Ｉｆ、ＳＮ−３８、９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン、エトポシド、ダウノルビシンを含むグループから選択される。これらは様々な腫瘍、例えば、結腸腫瘍、膵臓腫瘍、卵巣癌、前立腺癌に対して使用可能である。適用の範囲は、特に、Recchia F ら, British J. Cancer 2004, 91, 1442-1446、Cantore M ら, Oncology 2004, 67, 93-97、Maurel J. et al., Gynecol. Oncol 2004, 95, 114-119、Amin A.ら, Urol. Oncol. 2004, 22, 398-403、Kindler HL ら, Invest. New Drugs 2004, 22, 323-327、Ahmad T.ら, Expert Opin. Pharmacother. 2004, 5, 2333-2340、Azzariti A. ら, Biochem Pharmacol. 2004, 68, 135-144、Le QT ら, Clinical Cancer Res. 2004, 10, 5418-5424に記載されている。これらと関連する、本明細書に記載の各適応および任意の適応に対して、原理上、本明細書に記載の様々なアデノウイルスおよび本発明に従って使用されるアデノウイルスを上記の化合物と併用できることは本発明の範囲内である。特に好適な一実施態様では、適応は、上記の薬学的に活性な各化合物および任意の化合物に関して記載されている適応である。
【０３５３】
一実施態様では、少なくとも１つの薬剤は、トリコスタチンＡ、ＦＲ９０１２２８（膵臓腫瘍に対する：Sato N ら, Int. J. Oncol. 2004, 24, 679-685）、ＭＳ−２７−２７５（前立腺癌に対する；Camphausen K ら, Clinical Cancer Research 2004, 10, 6066-6071）、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４（白血病に対する；Nimmanapalli R ら, Cancer Res. 2003, 63, 5126-5135）、ＰＸＤ１０１（卵巣癌に対する；Plumb JA ら, Mol. Cancer Ther. 2003, 2, 721-728）、スクリプタイド（乳癌に対する；Keen JC ら, Breast Cancer Res. Treat. 2003, 81, 177-186）、アピシジン（黒色腫に対する；Kim SH ら, Biochm. Biophys. Res. Commun. 2004, 315, 964-970）、ＣＩ−９９４（多様な腫瘍に対する；Nemunaitis JJ ら, Cancer J. 2003, 9, 58-66）を含むグループから選択される。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の作用機序は、特に、Lindemann RK et al., Cell Cycle 2004, 3, 77-86に記載されている。これらと関連する、本明細書に記載の各適応および任意の適応に対して、原理上、本明細書に記載の様々なアデノウイルスおよび本発明に従って使用されるアデノウイルスを上記の化合物と併用できることは本発明の範囲内である。特に好適な一実施態様では、適応は、上記の薬学的に活性な各化合物および任意の化合物に関して記載されている適応である。
【０３５４】
好適な一実施態様では、トポイソメラーゼ阻害剤は、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、ＤＸ−８９５Ｉｆ、ＳＮ−３８、９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン、ダウノルビシン、エトポシドを含むグループから選択される。これらは様々な腫瘍、例えば、結腸腫瘍、膵臓腫瘍、卵巣癌、前立腺癌に対して使用可能である。適用の範囲は、特に、Recchia F et al., British J. Cancer 2004, 91, 1442-1446、Cantore M ら, Oncology 2004, 67, 93-97、Maurel J. ら, Gynecol. Oncol 2004, 95, 114-119、Amin A.et al., Urol. Oncol. 2004, 22, 398-403、Kindler HL ら, Invest. New Drugs 2004, 22, 323-327、Ahmad T.ら., Expert Opin. Pharmacother. 2004, 5, 2333-2340、Azzariti A. ら, Biochem Pharmacol. 2004, 68, 135-144、Le QT ら, Clinical Cancer Res. 2004, 10, 5418-5424に記載されている。これらと関連する、本明細書に記載の各適応および任意の適応に対して、原理上、本明細書に記載の様々なアデノウイルスおよび本発明に従って使用されるアデノウイルスを上記の化合物と併用できることは本発明の範囲内である。特に好適な一実施態様では、適応は、上記の薬学的に活性な各化合物および任意の化合物に関して記載されている適応である。
【０３５５】
特に好適な一実施態様では、少なくとも２つの薬剤の１つはヒストンデアセチラーゼ阻害剤であり、少なくとも２つの薬剤の他方はトポイソメラーゼ阻害剤である。
【０３５６】
本発明の各態様および任意の態様の好適な実施態様では、さらに薬学的に活性な化合物が、サイトカイン、メタロプロテイナーゼ阻害剤、血管形成抑制剤、結腸癌に対するイリノテカンやＣＰＴ−１１および白血病に対するダウノルビシン、ＣＤＫ２／サイクリンＥキナーゼ活性を阻害して結腸癌に対して使用可能なＣＹＣ２０２などの細胞周期阻害剤（McClue SJ, Int. J. Cancer 2002, 102, 463-468）Ｒａｆ−１を阻害して、例えば、乳癌に効果的なＢＡＹ４３−９００６（Wilhelm SM ら, Cancer Res.2004, 64, 7099-7109）、２６Ｓプロテアソーム活性を阻害して脳腫瘍に対して使用されるＰＳ−３４１などのプロテアソーム阻害剤（Yin D. ら, Oncogene 2004）、ＥＧＦ受容体に対する組換え抗体（Herceptin for breast carcinoma and prostate tumor; H.G. van der Poel, European Urology 2004, 1-17; Erbitux against head and neck tumors; Bauman M ら., Radiother. Oncol., 2004, 72, 257-266）、特にｃ−ｋｉｔを抑制して胃腸腫瘍に対して使用可能なＳＴＩ５７１などのシグナル伝達系の阻害剤（H.G. van der Poel, European Urology 2004, 45, 1-17）、特に前立腺癌に対して使用可能なエンドセリン阻害剤であるＡＢＴ−６２７（H.G. van der Poel, European Urology 2004, 45, 1-17）、ＶＥＧＦチロシンキナーゼ受容体のリン酸化を阻害して頭頸部腫瘍に対して使用可能なＳＵ５４１６（Cooney ら, Cancer Chemother. Pharmacol 2004）、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性を阻害して、特に前立腺腫瘍に対して使用可能なＺＤ１８３９（H.G. van der Poel, European Urology 2004, 45, 1-17）、ｍＴＯＲを阻害して前立腺腫瘍に対して使用可能なＣＣＩ−７７９やＲＡＤ００１（H.G. van der Poel, European Urology 2004, 45, 1-17）などのラパマイシン誘導体である。本明細書に記載の様々なアデノウイルスおよび本発明に従って使用されるアデノウイルスが、原理上これらと関連して記載される各適用および任意の適応に対する上記の各化合物および任意の化合物と共に使用可能であることは本発明の範囲内である。特に好適な一実施態様では、適応は過去に記載された薬学的に活性な化合物または薬剤に対して記載された適応である。
【０３５７】
一実施態様では、本発明に従った方法および／または本発明に従って調製された方法は、本発明のウイルスと併用または同時投与される少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つの薬剤の１つ以上から分離されたウイルスを含んでいる。ウイルスが、ウイルスと併用される任意の薬剤から分離されることが好ましい。好ましくは、分離は空間的分離である。空間的分離は、ウイルスが薬剤とは異なるパッケージに存在させることができる。好ましくは、パッケージは１単位用量、即ち、ウイルスおよび薬剤は１用量としてパックされている。次に１単位用量を合わせて、パッケージを形成できる。一方、ウイルス１用量を１つ以上の薬剤の１以上の単位用量と合わせる、もしくはパックすることも本発明の範囲内である。
【０３５８】
パッケージの種類は、当業者には既知の投与方法に左右される。好ましくは、ウイルスは凍結乾燥状態または適当な液相に存在する。好ましくは、薬剤は固形状、例えば、錠剤またはカプセルで存在するが、これらに限定されるわけではない。代わりに、薬剤は液状でも存在できる。
【０３５９】
ウイルスを全身または局所投与することは本発明の範囲内である。ウイルスと併用される薬剤は、個別に、また互いに別々に、もしくは共に全身または局所投与されることも本発明の範囲内である。他の投与方法は当業者には既知である。
【０３６０】
ウイルスおよびウイルスと併用される薬剤は、経時的に異なる方法または同時に投与されることは本発明の範囲内である。経時的な方法と関連して、ウイルス投与前に薬剤を投与することが好ましい。ウイルスより前にどのくらいの期間、薬剤が投与されるかは、使用される薬剤の種類に左右され、使用される薬剤の作用機序から当業者には明らかである。また、少なくとも２つの薬剤の投与は、同じ、または異なる時間点で起こることが可能である。経時的に異なる投与と関連して、時間点はここでも薬剤の作用機序に起因しており、これに基づいて、当業者が判断できる。
【０３６１】
本明細書において薬学的組成物とも呼ばれる、本発明に従った薬剤と関連する上記の考察は、概して、ウイルス複製、好ましくは本発明に従ったインビトロでのウイルス複製で使用可能な組成物を含む任意の組成物にも適用可能である。上記の考察は、本発明に従ったキットおよび本発明に従って使用されるキットのそれぞれにも適用可能であり、キットは本明細書に記載のウイルスおよび本明細書に従って使用されるウイルスとは別に、本明細書に記載の薬剤または薬剤の併用も含みうる。該キットは、ウイルスおよび／または使える状態の１つ以上の薬剤、そして好ましくは使用説明書を含む。さらに、上記の考察は、本明細書で開示される核酸、本明細書に従って使用される核酸、本発明に従った複製系およびこれをコード化する核酸、本発明に従って使用される複製系および本発明に従って使用されるこれをコード化する核酸にも適用される。
【０３６２】
本明細書で開示されるアデノウイルスが本発明に従って使用される製品と関連する、もしくは製品用である薬剤は、通常、全身投与を目的としているが、局所投与またはデリバリーも本発明の範囲内である。適用では、特にこれらの細胞にアデノウイルスを感染させることを目的としているが、ここでは特にアデノウイルスの複製が起こることを目的としており、好ましくは因果関係において状態、通常は疾患に関与しており、発明の薬剤はその診断および／または予防および／または治療に使用される。
【０３６３】
該薬剤は、好ましくは腫瘍疾患の治療用である。これらの腫瘍は、腫瘍疾患の発症機序、特に病理学的機序に起因して、ＹＢ−１が核内に既に位置するか、もしくは細胞核内のＹＢ−１の存在が外因的処置によって生じており、該外因的処置はＹＢ−１の核内移行に適しているか、もしくは核内でＹＢ−１を誘導または発現させる場合に特に好ましい。腫瘍または腫瘍疾患という用語は、本明細書においては良性腫瘍の他に悪性腫瘍、そして各疾患を含める。一実施態様では、薬剤は少なくとも1つの医薬的にさらに活性な化合物を含む。医薬的にさらに活性な化合物または薬剤の性質または量は、薬剤が使用される適応の種類に左右される。薬剤が腫瘍疾患の治療および／または予防に使用される場合、通常、シスプラチンおよびタキソールなどの細胞増殖抑制剤、ダウノブラスチン、ダウノルビシン、アドリアマイシンおよび／またはミトキサントロンまたは他の細胞増殖抑制剤、または本明細書に記載の細胞増殖抑制剤群が使用される。
【０３６４】
本発明に従った薬剤は、様々な剤形、好ましくは液状で存在できる。さらに、薬剤は、剤形の技術分野における当業者には既知の安定剤、緩衝剤、保存剤などのアジュバントを含む。
【０３６５】
本明細書で開示されるアデノウイルスが本発明に従って使用される製品と関連する、もしくは製品用である薬剤は、通常、全身投与されることが予想されるが、局所投与または局所へのデリバリーも本発明の範囲内である。適用では、特にこれらの細胞にアデノウイルスを感染させ、そこでアデノウイルスの複製が起こることを目的としており、好ましくは因果関係において状態、通常は疾患に関与しており、発明の薬剤はその診断および／または予防および／または治療に使用される。
【０３６６】
該薬剤は、好ましくは腫瘍疾患の治療用である。これらの腫瘍は、腫瘍疾患の発症機序、特に病理学的機序に起因して、ＹＢ−１が核内に既に位置するか、もしくは細胞核内のＹＢ−１の存在が外因的処置によって生じており、該外因的処置はＹＢ−１の核内移行に適しているか、もしくは核内でＹＢ−１を誘導または発現させる場合に特に好ましい。腫瘍または腫瘍疾患という用語は、本明細書においては良性腫瘍の他に悪性腫瘍、そして各疾患を含める。一実施態様では、薬剤は、少なくとも1つの医薬的にさらに活性な化合物を含む。医薬的にさらに活性な化合物または薬剤の性質または量は、薬剤が使用される適応の種類に左右される。薬剤が腫瘍疾患の治療および／または予防に使用される場合、通常、シスプラチンおよびタキソールなどの細胞増殖抑制剤、ダウノブラスチン、ダウノルビシン、アドリアマイシンおよび／またはミトキサントロンまたは他の細胞増殖抑制剤、または本明細書に記載の細胞増殖抑制剤群が使用される。
【０３６７】
本発明に従った薬剤は様々な剤形、好ましくは液状で存在できる。さらに、薬剤は、剤形の技術分野における当業者には既知の安定剤、緩衝剤、保存剤などのアジュバントを含む。
【０３６８】
本発明者は、驚くべきことに本発明のウイルスを細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を含むこれらの腫瘍および調節解除されたＹＢ−１を含む該腫瘍に対して高い成功率で使用可能であることを見出している。通常、ＹＢ−１は細胞質、特に核周囲の細胞質にも存在している。ＹＢ−１は細胞周期のＳ期において腫瘍細胞の他、正常細胞の核内にも存在している。しかし、これは該改変アデノウイルスの使用時にウイルス性の腫瘍崩壊をもたらすには不十分である。先行技術において報告される該弱毒化アデノウイルスの比較的低い効率は、最終的にはその誤った適用に基づいている。換言すると、該アデノウイルス系は、本明細書に記載の弱毒化アデノウイルスまたは改変アデノウイルスを使用したウイルス性の腫瘍崩壊での分子生物学的な必要条件が満たされる条件下において特に高い有効性で使用可能である。該必要条件は、その細胞が細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を含む、もしくは調節解除されたＹＢ−１を含む腫瘍疾患において与えられる。この形式の核局在化は、腫瘍自体の性質によって起こるか、もしくは本明細書に記載の本発明に従った薬剤または本明細書に記載の方法の適用によって起こりうる。したがって、本発明はそれぞれ腫瘍および腫瘍疾患の新しいグループ、ひいては本発明のウイルス、特に選考技術において既に記載されている弱毒化または改変アデノウイルスを使用して治療可能な患者も定義している。
【０３６９】
本発明のウイルスを使用して治療可能な患者の別のグループは、本発明のウイルスの使用を含め、特定の条件を適用または実現させた際にＹＢ−１が核内へ移動する、核内へ誘導される、もしくは核内へ輸送されることの確かな患者である。この患者グループと関連する本発明のウイルスの使用は、この範囲においてウイルス複製の誘導がＹＢ−１の核局在化およびそれに続くＹＢ−１のＥ２後期プロモーターへの結合に基づくとの知見に基づいている。このことは、ＹＢ−１核陽性細胞および／またはＹＢ−１が本適用の意味において調節解除されたの状態で存在する細胞にも適用される。この範囲において、本発明のアデノウイルスは、これらの特性を有する細胞を含む、特にこれらの細胞が治療される各疾患の成立に関与する場合、疾患および患者グループの治療において本発明に従って使用可能である。本発明のウイルス、特にアデノウイルスを使用して治療可能な別の患者グループは、後述の処理の結果としてＹＢ−１核陽性である患者および／または好ましくは治療の意味で、本明細書に記載の処置の１つを施された患者、本発明のウイルス投与を経験した患者、もしくは本発明のウイルス投与と共にこれらを経験した患者である。ＹＢ−１核陽性の患者とは細胞周期とは無関係にＹＢ−１を核内、特に多数の腫瘍形成細胞内に有する患者であることは本明細書の範囲内である。これらの処置は、本明細書に大まかに記載されている、および／または腫瘍の治療と関連して使用される該細胞増殖抑制剤の投与を含む。さらにこの処置グループは、放射線照射、特に腫瘍の治療と関連する使用される放射線照射を含む。放射線照射は、特に高エネルギー放射線照射、好ましくは放射能による放射線照射、好ましくは腫瘍の治療と関連して使用される放射線照射を意味する。別の処置は、温熱療法および温熱療法の適用、好ましくは腫瘍の治療と関連して使用される温熱療法である。特に好適な態様の場合、温熱療法は局所的に適用される。
【０３７０】
最後に、別の処置はホルモン療法、特に腫瘍の治療と関連して使用されるホルモン療法である。該ホルモン療法と関連して、抗エストロゲンおよび（または）抗アンドロゲンが使用される。これと関連して、タモキシフェンなどの抗エストロゲンが、特に乳癌の治療において使用され、抗アンドロゲン、例えばフルタミドおよび酢酸シプロテロンは、前立腺癌の治療に使用される。
【０３７１】
本発明の開示の意味で、核内に内在的にＹＢ−１を含む、または誘導および核内への能動的な導入後に核内にＹＢ−１を含む、もしくは調節解除されたＹＢ−１を含む腫瘍形成細胞の一部は本発明の範囲内である。好ましくは、腫瘍形成細胞の約５％またはそれ以上（即ち、６％、７％、８％など）がＹＢ−１核陽性の細胞または調節解除されたＹＢ−１の存在する細胞である。乳癌、骨肉腫、卵巣癌、滑膜癌、肺癌などの他の腫瘍の場合、調節解除されたＹＢ−１を含む腫瘍細胞または細胞周期とは無関係に核局在を示す腫瘍細胞の割合は、約３０−５０％でありうる［Kohno K.ら, BioAssays 2003, 25, 691-698］。該腫瘍は、好ましくは、本発明のアデノウイルスを使用して処置可能である。ＹＢ−１の核局在化は、外部ストレスおよび局所的に加えられたストレスのそれぞれによって誘導できる。この誘導は照射、特にＵＶ照射、特に本明細書で開示される細胞増殖抑制剤の投与、温熱療法によって起こりうる。温熱療法と関連して、非常に特異的な方法、特に局所的な方法で実現可能であり、ひいてはＹＢ−１の特異的な核内輸送も起こり、このためにアデノウイルスの複製のための必要条件ひいては細胞および腫瘍の溶解のための必要条件が与えられ、これは好ましくは局所に限定されることが重要である（Stein U, Jurchott K, Walther W, Bergmann, S, Schlag PM, Royer HD. J Biol Chem. 2001, 276(30): 28562-9; Hu Z, Jin S, Scotto KW. J Biol Chem. 2000 Jan 28; 275(4): 2979-85; Ohga T, Uchiumi T, Makino Y, Koike K, Wada M, Kuwano M, Kohno K. J Biol Chem. 1998, 273(11): 5997-6000）。
【０３７２】
したがって、発明の薬剤は患者および患者グループにも投与され、または患者および患者グループ向けに設計されており、適切な前治療または併用療法によって、特に各腫瘍細胞内においてＹＢ−１の輸送が起こり、そして調節解除されたＹＢ−１が細胞内に生じる。
【０３７３】
本明細書に記載のアデノウイルスが本発明に従って使用される溶解用の細胞の特性に関して、一実施態様では、これらが耐性、好ましくは多剤耐性またはポリ耐性であることが予想される。本明細書で使用される耐性とは、本明細書に記載の細胞増殖抑制剤および（または）放射線照射に対する耐性を示す。この多剤耐性は、好ましくは、同じおよび対応する患者グループが示す、各細胞ひいては腫瘍の判定マーカーである膜結合型輸送タンパク質である、Ｐ糖タンパク質の発現、好ましくは過剰発現と同時に起こる。本明細書で使用される耐性という用語は、非典型的な耐性も示しているＭＲＰなどのＰ糖タンパク質以外が媒介する耐性の他、典型的な耐性も示しているＰ糖タンパク質が媒介する耐性を含む。本明細書で言及され、腫瘍および患者それぞれに特徴的な、治療すべき別の耐性は、以下の遺伝子によって媒介されるが、これらに限定されるわけではない：ＭＤＲ、ＭＲＰ、トポイソメラーゼ、ＢＣＬ２、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）。細胞増殖抑制剤の作用は特にアポトーシス誘導に基づいているため、アポトーシス関連遺伝子の発現は耐性成立に重要な役割を果たしており、この範囲において、以下の因子も関連する：Ｆａｓ、ＢＣＬ２ファミリー、ＨＳＰ７０、ＥＧＦＲ［Kim et al., Cancer Chemther. Pharmacol. 2002, 50, 343-352］。ＹＢ−１発現と相関関係のある別のマーカーはトポイソメラーゼＩＩαである。この範囲において、核内のＹＢ−１の測定ではなく、もしくは測定に加えて、トポイソメラーゼＩＩαの発現または本明細書に記載の他のマーカーいずれかを、成功を期待して、本発明のアデノウイルスで患者の治療が可能であるか否かを判断するためのスクリーニング方法において使用可能である。原理上、Ｐ糖タンパク質と同様に使用可能な別のマーカーはＭＲＰである。少なくとも結腸癌細胞または結腸癌患者が侵される程度の別のマーカーはＰＣＮ（増殖性細胞核抗原）（Hasan S. et al., Nature, 15, 387-391, 2001）であり、例えばＳｈｉｂａｏによって記載されている（Shibao K et al., Int. Cancer, 83, 732-737, 1999）。最後に、少なくとも乳癌および骨肉腫の細胞において、ＭＤＲ（英語：多剤耐性）の発現は、上記の意味でマーカーである（Oda Y et al., Clin. Cancer Res., 4, 2273-2277）。本発明に従って使用可能な別のマーカーはｐ７３である（Kamiya, M., Nakazato, Y., J Neurooncology 59, 143-149 (2002); Stiewe ら, J. Biol. Chem., 278, 14230-14236, 2003）。
【０３７４】
医薬・臨床の意味において本来ならもはや治療できず、そのため成功を期待しての先行技術の方法を利用した腫瘍疾患のさらなる治療はもはや不可能であり、特に細胞増殖抑制剤および放射線照射がもはやまず不可能であり、腫瘍に影響を及ぼす、または縮小させるという意味においてもはや成功裏に実施することは不可能な場合、これらの患者も本明細書に記載のアデノウイルスを本発明に従って使用する処置法の対象にできることは本発明の特に有利な点である。本明細書において、腫瘍という用語は、内因性に、好ましくは細胞周期とは無関係に、もしくは本明細書で開示される外的処置によって細胞核内にＹＢ−１を含む、および／または調節解除されたＹＢ−１を含む腫瘍または癌疾患も一般に示す。
【０３７５】
さらに、本明細書に記載のウイルスは原理上、腫瘍の治療のために使用可能である。
【０３７６】
本明細書に記載のウイルスによって特に治療可能な腫瘍は、好ましくは神経系腫瘍、眼腫瘍、皮膚腫瘍、軟組織腫瘍、胃腸腫瘍、呼吸器系腫瘍、骨格腫瘍、内分泌系腫瘍、女性生殖器系腫瘍、乳線腫瘍、男性生殖器系腫瘍、尿排泄系腫瘍、混合腫瘍および胚芽腫を含む造血系腫瘍を含むグループから選択される腫瘍である。これらの腫瘍は、特に本明細書で定義される特に耐性な腫瘍である。
【０３７７】
神経系の腫瘍グループは好ましくは以下を含む：
１．脳（頭蓋内）腫瘍の他、頭部腫瘍、好ましくは星膠腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、節神経腫、脳室上衣腫、神経鞘腫、神経線維腫、血管芽細胞腫、脂肪腫、頭蓋咽頭腫、奇形腫および軟骨腫
２．脊髄腫瘍および脊柱管腫瘍、好ましくは膠芽腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、神経線維腫、骨肉腫、軟骨肉腫、血管肉腫、線維肉腫および多発性骨髄腫
３．末梢神経腫瘍、好ましくは神経鞘腫、神経線維腫、神経線維肉腫および神経周囲の線維芽細胞腫
【０３７８】
眼腫瘍のグループは、好ましくは以下を含む：
１．眼瞼腫瘍および眼瞼腺腫瘍、好ましくは腺腫、腺癌、乳頭腫、組織球腫、肥満細胞腫、基底細胞腫、黒色腫、扁平上皮癌、線維腫および線維肉腫
２．結膜腫瘍および瞬膜腫瘍、好ましくは扁平上皮癌、血管腫、血管肉腫、腺腫、腺癌、線維肉腫、黒色腫および乳頭腫
３．眼窩腫瘍、視神経腫瘍、眼球腫瘍、好ましくは網膜芽細胞腫、骨肉腫、肥満細胞腫、髄膜腫、細網細胞腫、膠腫、神経鞘腫、軟骨腫、腺癌、扁平上皮癌、形質細胞腫、リンパ腫、横紋筋肉腫および黒色腫
【０３７９】
皮膚腫瘍のグループは好ましくは以下を含む：
組織球腫、脂肪腫、線維肉腫、線維腫の腫瘍、肥満細胞腫、悪性黒色腫、乳頭腫 、基底細胞腫、角化性棘細胞腫、血管周囲細胞腫、毛包腫、汗腺腫瘍、脂腺腺腫、血管腫、血管肉腫、脂肪腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、形質細胞腫およびリンパ管腫
【０３８０】
軟部組織腫瘍のグループは、好ましくは以下を含む：
胞巣状軟組織肉腫、類上皮細胞肉腫、軟組織の軟骨肉腫、軟組織の骨肉腫、軟組織のユーイング肉腫、原始神経外胚葉腫瘍（ＰＮＥＴ）、線維肉腫、線維腫、平滑筋肉腫、平滑筋腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、悪性血管外皮細胞腫、血管腫、血管肉腫、悪性間葉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ 、悪性神経鞘腫、悪性メラニン細胞神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫、リンパ管腫およびリンパ管肉腫
【０３８１】
胃腸腫瘍のグループは、好ましくは以下を含む：
１．口腔腫瘍および舌腫瘍、好ましくは扁平上皮癌、線維肉腫、メルケル細胞腫瘍、誘導性の繊維性エナメル上皮腫 、線維腫、線維肉腫、ウイルス性乳頭腫、特発性乳頭腫、鼻咽頭ポリープ、平滑筋肉腫、筋原細胞腫およびマスト細胞腫瘍
２．唾液腺腫瘍、好ましくは腺癌
３．食道腫瘍、好ましくは扁平上皮癌、平滑筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、バレット癌および食道周囲腫瘍
４．外分泌膵臓腫瘍、好ましくは腺癌
５．胃腫瘍、好ましくは腺癌、平滑筋腫、平滑筋肉腫および線維肉腫
【０３８２】
呼吸器系腫瘍のグループは、好ましくは以下を含む：
１．鼻および鼻腔の腫瘍、咽頭および気管の腫瘍、好ましくは扁平上皮癌、線維肉腫、線維腫、リンパ肉腫、リンパ腫、血管腫、血管肉腫、黒色腫、肥満細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、膨大細胞腫（横紋筋肉腫）、腺癌および筋原細胞腫
２．肺腫瘍、好ましくは扁平上皮癌、線維肉腫、線維腫、リンパ肉腫、リンパ腫、血管腫、血管肉腫、黒色腫、肥満細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、膨大細胞腫（横紋筋肉腫）、腺癌、筋原細胞腫、小細胞癌、非小細胞癌、気管支腺癌、気管支肺胞腺癌および胞巣状腺癌
【０３８３】
骨格腫瘍のグループは、好ましくは以下を含む：
骨肉腫、軟骨肉腫、傍骨性骨肉腫、血管肉腫、滑膜細胞肉腫、血管肉腫、線維肉腫、悪性間葉腫、巨大細胞腫、骨腫および多小葉骨腫
【０３８４】
内分泌系腫瘍のグループは、好ましくは以下を含む：
１．甲状腺/副甲状腺、好ましくは腺腫および腺癌
２．副腎、好ましくは腺腫、腺癌および褐色細胞腫（副腎髄質腫）
３．視床下部/脳下垂体腫瘍、好ましくは腺腫および腺癌
４．内分泌膵臓腫瘍、好ましくは膵島細胞腫（β細胞腫、ＡＰＵＤｏｍ）およびゾリンジャー・エリソン症候群（膵δ細胞のガストリン分泌腫瘍）
５．多発性内分泌腫瘍（ＭＥＮ）と非クロム親和性傍神経節腫
【０３８５】
女性生殖器系腫瘍のグループは、好ましくは以下を含む：
１．卵巣腫瘍、好ましくは腺腫、腺癌、嚢胞腺腫および未分化癌
２．子宮腫瘍、好ましくは平滑筋腫、平滑筋肉腫、腺腫、腺癌、線維腫、線維肉腫および脂肪腫
３．頚管腫瘍、好ましくは腺癌、腺腫、 平滑筋肉腫および平滑筋腫
４．腟および外陰の腫瘍、好ましくは平滑筋腫、平滑筋肉腫、線維平滑筋腫、線維腫、線維肉腫、ポリープおよび扁平上皮癌
【０３８６】
乳腺腫瘍のグループは、好ましくは以下を含む：
線維腺腫、腺腫、腺癌、間葉系腫瘍、癌腫、癌肉腫
【０３８７】
男性生殖器系腫瘍のグループは、好ましくは以下を含む：
１．睾丸腫瘍、好ましくは精上皮腫、間質細胞腫瘍およびセルトリ細胞腫
２．前立腺腫瘍、好ましくは腺癌、未分化癌、扁平上皮癌、平滑筋肉腫および移行上皮癌
３．陰茎および外性器の腫瘍、好ましくは肥満細胞腫および扁平上皮癌
【０３８８】
尿排泄系腫瘍のグループは、好ましくは以下を含む：
１．腎腫瘍、好ましくは腺癌、移行上皮癌（上皮性腫瘍）、線維肉腫、軟骨肉腫（間葉系腫瘍）、ウィルムス腫瘍、腎芽細胞腫および腺肉腫（胎児性多能性芽腫）
２．輸尿管腫瘍、好ましくは平滑筋腫、平滑筋肉腫、線維乳頭腫、移行上皮癌
３．膀胱腫瘍、好ましくは移行上皮癌、扁平上皮癌、腺癌、ぶどう状（胎児性横紋筋肉腫）、線維腫、線維肉腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、乳頭腫および血管肉腫
４．尿道腫瘍、好ましくは移行上皮癌、扁平上皮癌および平滑筋肉腫
【０３８９】
造血系腫瘍のグループは、好ましくは以下を含む：
１．リンパ腫、リンパ性白血病、非リンパ性白血病、骨髄増殖性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫
【０３９０】
混合腫瘍および胎児性腫瘍のグループは、好ましくは以下を含む：
血管肉腫、胸腺腫および中皮腫
【０３９１】
特に好適な実施態様では、これらの腫瘍は乳癌、卵巣癌、前立腺癌、骨肉腫、膠芽腫、黒色腫、小細胞肺癌および大腸癌を含むグループから選択される。さらなる腫瘍は、本明細書に記載される耐性の腫瘍、好ましくは多剤耐性の腫瘍、また特に上記のグループの腫瘍である。特に好ましい腫瘍は、乳房腫瘍、骨腫瘍、胃腫瘍、腸腫瘍、胆嚢腫瘍、膵臓腫瘍、肝臓腫瘍、腎臓腫瘍、脳腫瘍、卵巣腫瘍、皮膚および皮膚付属器の腫瘍、頭頸部腫瘍、子宮腫瘍、滑膜腫瘍、咽頭腫瘍、食道腫瘍、舌腫瘍と前立腺腫瘍を含むグループから選択される腫瘍である。腫瘍は、それらの徴候に関して本明細書で開示される腫瘍であることが好ましい。
【０３９２】
本発明のウイルスを使用して治療可能な別の腫瘍は、白血病腫瘍および転移性腫瘍、特に前述の腫瘍の 転移性腫瘍である。本発明に従って治療可能なさらなる腫瘍は、原発腫瘍、二次性腫瘍、三次性腫瘍、転移性腫瘍を含むグループから選択される。以下の特徴、即ち、理由を問わず、腫瘍が細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を有する、および／または腫瘍が調節解除されたＹＢ−１を含む、少なくとも１つを腫瘍が有することが好ましい。本発明のウイルスを使用して治療可能なさらなる腫瘍グループは、本明細書で開示される耐性の1つ以上を有するという条件で、上記の腫瘍および本発明のウイルスを使用して治療可能であると記載されている腫瘍の全てである。
【０３９３】
好ましくは細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を含まない、または調節解除されたＹＢ−１を含まない、該腫瘍が本発明のウイルスを使用して治療可能であることもさらに本発明の範囲内である。これは特にウイルス自体がＹＢ−１をコード化する場合に実現される。ＹＢ−１の特異的発現、ひいては特異的ウイルス複製の理由で、好適な実施態様では、ウイルスの発現は好ましくは高度に調節されたプロモーターの制御下に置かれる。該プロモーターは、ウイルスが目的細胞内でのみ複製可能なように、特異的な活性化が可能な任意のプロモーターでありうる。特に好適なプロモーターは、特に当業者には既知の腫瘍特異的プロモーターおよび組織特異的プロモーターである。
【０３９４】
ＹＢ−１は、逆方向ＣＡＡＴ配列、いわゆるＹボックスに結合する高度に保存されたグループに属する。これらは転写および翻訳の両レベルで調節的に活性化できる（Wolffe, A.P. Trends in Cell Biology 8, 318-323, 1998）。
【０３９５】
本発明に従って使用されるウイルスの一実施態様では、ウイルスの一部となるＹＢ−１をコードする核酸は、ＹＢ−１の核内輸送を媒介する核酸配列も含むことができる。例えばＯｎｙｘ−０１５，ＡｄΔ２４，ｄｌ９２２−９４７，ＥｌＡｄ／０１／０７，ＣＢ０１６，ｄｌ  ５２０などの先行技術において既知のアデノウイルスおよび特許ＥＰ  ０  ９３１  ８３０に記載のアデノウイルスの他、本発明に従った核酸、ウイルス、ウイルス系は、単独使用、もしくはアデノウイルスおよびアデノウイルス系、ひいては対応する核酸として、これと関連して本発明に従ったこれらの核酸との併用が可能である。核酸輸送に適した核酸配列は当業者には既知であり、例えば（Whittaker, G.R. ら, Virology, 246, 1-23, 1998; Friedberg, E.C., TIBS 17, 347,1992; Jans, D.A. et al., Bioessays 2000 Jun; 22(6): 532-44; Yoneda, Y., J. Biocehm. (Tokyo)1997 May; 121(5): 811-7; Boulikas, T., Crit. Rev. Eukaryot Gene Expr. 1993; 3(3): 193-227;Lyons RH, Mol. Cell Biol., 7, 2451-2456, 1987）に記載されている。核輸送を媒介する核酸配列と関連して、異なる原理を利用できる。該原理は、例えば、ＹＢ−１がシグナルペプチドとの融合タンパク質として形成され、そして核内に導入されて、これによって本発明のアデノウイルス複製が起こりうる。
【０３９６】
本発明に従って使用されるアデノウイルスの設計において実現可能な別の原理は、好ましくは細胞質内での合成から始まり、細胞核内にＹＢ−１を導入する、もしくは細胞核内にＹＢ−１を転位させ、そこでウイルス複製を促進させるトランスポーター配列によってもらすことが可能である。核輸送を媒介する特に効果的な核酸配列の一例は、ＨＩＶのＴＡＴ配列であり、これはEfthymiadis,A., Briggs, LJ, Jans, DA., JBC 273, 1623-1628, 1998に記載されている種類の他の適当な核酸配列の１つである。本発明に従って使用されるアデノウイルスが、核輸送をコード化しているペプチドをコード化する核酸配列を含むことは本発明の範囲内である。
【０３９７】
ＹＢ−１が全長で、特に野生型ＹＢ−１と一致する形で存在することは本発明の範囲内である。ＹＢ−１が、例えば短縮化または切断された誘導体として使用される、もしくは存在することは本発明の範囲内である。本発明において使用される、もしくは存在するＹＢ−１の誘導体は、Ｅ２後期プロモーターに結合可能であり、ひいてはアデノウイルスのＥ２領域の遺伝子発現を活性化するＹＢ−１である。該誘導体は特に本明細書で開示されるＹＢ−１を含む。別の誘導体は、Ｎ末端、Ｃ末端、またはアミノ酸配列の範囲内の１つ以上のアミノ酸の欠失によって作成可能である。ＹＢ−１断片が、本発明の意味において、ＹＢ−１タンパク質として使用される、およびＹＢ−１タンパク質を示すことも本発明の範囲内である。様々なＹＢ−１断片が、Jurchott K ら［JBC 2003, 278, 27988-27996］の論文において開示されており、これらはＣ末端およびＮ末端の欠失を特徴とする。様々なＹＢ−１断片の分布は、Ｃ末端の他、コールドショックドメイン（ＣＳＤ）が細胞周期によって制御されるＹＢ−１の核内輸送において重要であることを示した。このため切断ＹＢ−１（本明細書においてはＹＢ−１タンパク質とも呼ばれる）が、本発明に従ったＥ１Ｂ５５ｋおよびＥ４ｏｒｆ６の発現との組み合わせで、より良好に核内に移動して、ひいては野生型ＹＢ−１と比較して必ずしもＥ２後期プロモーターにより良好に結合することなくＣＰＥをより強力に誘導することも本発明の範囲内であり、ここでは切断ＹＢ−１もより良好に核内に移動して、両活性、つまりＣＰＥの誘導およびＥ２後期プロモーターへの結合を示すことは除外できない。最後に、該切断ＹＢ−１断片もより良好に核内に移動して、より良好にＣＰＥを誘導することなくＥ２後期プロモーターにより良好に結合可能である。切断ＹＢ−１タンパク質または断片が、完全長ＹＢ−１と関連して本明細書に記載の別の配列、特に核局在化シグナル配列（ＮＬＳ）などを含むことも本発明の範囲内である。
【０３９８】
ウイルスが本発明に従って使用される製造用の薬剤が、その様々な実施態様において本発明自体の別の態様を表すことは本発明の範囲内である。
【０３９９】
本発明は、別の態様において、好ましくは腫瘍または腫瘍疾患を患う、もしくは腫瘍または腫瘍疾患を患うことが疑われる患者、および本発明のウイルスを使用して治療可能な患者のスクリーニング方法と関連しており、方法は以下の段階を含む：
−  患者の検体、好ましくは腫瘍組織の検体の分析。
−  ＹＢ−１が細胞周期とは無関係に核内に局在するか否か、または細胞が、検体の１つ以上の細胞において調節解除された／過剰発現ＹＢ−１を含むか否かの判定。
【０４００】
ＹＢ−１の代わりに、もしくはＹＢ−１に加えて、好ましくは代理マーカーとして機能する、もしくは機能することが知られている上記のマーカーの存在も評価可能である。
【０４０１】
代わりに、検体に含まれる細胞が本発明の意味において耐性であるか否かについて検体を試験可能である。
【０４０２】
好ましくは、腫瘍組織またはその一部がＹＢ−１を核内に含む、もしくは調節解除されたＹＢ−１を含む場合、もしくは本発明の意味において細胞が耐性である場合、本発明で開示されるウイルスは本発明に従って使用可能である。
【０４０３】
本発明に従った方法の一実施態様では、ＹＢ−１に対するアンチカリンの他、抗ＹＢ−１抗体、ＹＢ−１特異的に結合するペプチド、ＹＢ−１に対するアプタマー、ＹＢ−１に対するＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒを含むグループから選択される薬剤による腫瘍組織の分析が検討される。原理上、各マーカーに対して同じ種類の薬剤も製造・使用できる。抗体、特にモノクローナル抗体の製造は、当業者には既知である。ＹＢ−１またはマーカーの特異的検出用の別の薬剤は、高い親和性で標的構造に結合するペプチドであり、本発明の場合にはＹＢ−１または該マーカーである。先行技術において、該ペプチドを作成するための方法は、例えばファージディスプレイなどが知られている。該目的のために、個々のペプチドの長さが約８−２０アミノ酸であり、ライブラリーサイズが約１０２−１０１８、好ましくは１０８−１０１５の異なるペプチドである、ペプチドライブラリーから始める。ポリペプチドに結合する標的分子の特定構造はいわゆるアンチカリンとよばれ、これは例えばドイツ特許出願ＤＥ１９７  ４２  ７０６に記載されている。
【０４０４】
ＹＢ−１または本明細書で開示される対応する代替マーカーへの特異的結合、ひいては細胞周期とは無関係なＹＢ−１の核局在化の検出のための別の薬剤は、いわゆるアプタマー、即ち、ＲＮＡまたはＤＮＡに基づき、一本鎖または二本鎖のいずれかで存在して、標的分子に特異的に結合するＤ核酸である。アプタマーの作成は、例えば欧州特許ＥＰ  ０  ５３３  ８３８に記載されている。アプタマーの特別な実施態様は、いわゆるアプタザイムであり、例えば、Piganeau, N. et al. (2000), Angew. Chem. Int. Ed., 39, no. 29, pp 4369-4373に記載されている。これらがアプタマーの構成成分とは別にリボザイムの構成成分からなり、結合またはアプタマー構成成分へ結合する標的分子の放出時にリボザイムが触媒活性を有し、シグナル発生に伴って核酸基質を切断する限りにおいて、これらはアプタマーの特別な実施態様である。
【０４０５】
アプタマーの別の形態は、いわゆるスピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）、即ち、Ｌ−核酸を含む標的分子に結合する核酸である。該ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒの作成方法は、例えば、ＷＯ９８／０８８５６に記載されている。
【０４０６】
腫瘍組織の検体は、穿刺または外科手術によって採取される。細胞周期とは無関係にＹＢ−１が核内に位置するか否かに関しては、顕微鏡技術および（または）通常抗体または上記の別の薬剤のいずれかを使用した免疫組織解析の利用によって評価される場合が多い。核内のＹＢ−１およびその核局在化が細胞周期と無関係であること別の検出方法は、当業者には既知である。例えば、ＹＢ−１の局在化は、ＹＢ−１染色された組織切片のスキャニング時に容易に検出可能である。ＹＢ−１が核内に存在する頻度は、核局在化が細胞周期とは無関係であることを既に示唆している。核内における細胞周期非依存的なＹＢ−１の検出のさらなる可能性は、ＹＢ−１染色、ＹＢ−１が核内に局在するか否かの評価、そして細胞分裂の相の判定である。一方、上記およびＹＢ−１の検出はそれぞれＹＢ−１に対する前述の薬剤を使用しても実施可能である。薬剤は当業者には既知の方法によって検出される。該薬剤はＹＢ−１に特異的であり、この範囲において分析される検体中の他の構造、特に細胞の他の構造には結合しないため、薬剤の適当な標識およびそれらのＹＢ−１に対する特異的結合に起因する該薬剤の局在化およびＹＢ−１の局在化はいずれも適宜に検出・評価できる。薬剤の標識方法は当業者には既知である。
【０４０７】
本明細書に記載のウイルスは、本発明のウイルスか否か、もしくは本発明に従って使用されるか否かを問わず、疾患、特に腫瘍疾患、より好ましくは腫瘍細胞の少なくとも一部が多剤耐性、特に多剤耐性を示す腫瘍疾患と関連して使用可能であることも本発明の範囲内であり、ここでＹＢ−１は調節解除された型として存在する。これは、細胞および疾患が、ＹＢ−１が核内に、好ましくは細胞周期とは無関係に存在する場合での細胞および疾患を示しているという条件で、細胞および腫瘍と関連して本明細書に記載の他の各態様および任意の態様にも適用される。
【０４０８】
本発明に従った、および本明細書で開示されるウイルスは、好ましくはアデノウイルスであるが、洞察、方法および使用、核酸、タンパク質、複製系などはアデノウイルスに限定されず、他のウイルスおよびウイルス系に適用される。
【０４０９】
アデノウイルスおよびアデノウイルス系の作成の他、任意の使用を含む、当該考察は、これをコード化する核酸、ひいてはその逆の場合にも適用される。
【０４１０】
本発明と関連して、本発明に従って使用されるアデノウイルスおよびこれをコード化する核酸は、それぞれそれ自体で、もしくは別の核酸配列との組み合わせで複製を起こす、対応する任意のアデノウイルス核酸とすることが可能である。本明細書で説明されているように、ヘルパーウイルスによって、複製に必要な配列および（または）遺伝子産物を供給可能である。コード核酸配列が言及される範囲、およびそれらが既知の核酸である範囲において、同一の配列だけでなく、それに派生する配列も使用されることは本発明の範囲内である。派生する配列は、特に、派生ではない配列の機能の１つに対応する機能を有する核酸またはポリペプチドを問わず、依然として遺伝子産物をもたらす配列である。これは、当業者には既知の簡単な通常の試験によって判定可能である。派生する核酸配列の一例は、同じ遺伝子産物、特に同じアミノ酸配列をコード化するが、遺伝暗号の縮重に起因して異なる塩基配列を示す核酸配列である。
【０４１１】
ヘルパーウイルスの有無を問わず、本発明のウイルスが複製系として存在することは、本発明の範囲内である。
【０４１２】
本発明に従った該アデノウイルス複製系の場合、アデノウイルス核酸および／または核酸が、複製可能なベクターとして存在することは、さらに本発明の範囲内である。
【０４１３】
本発明に従って使用されるアデノウイルスをコード化する核酸が、発現ベクター内に存在すること、および該発現ベクターが本発明に従って使用されることは、さらに本発明の範囲内である。
【０４１４】
さらなる態様では、本発明は少なくとも２つのベクターを含むベクターグループとも関連しており、該ベクターグループはその全体で本明細書に記載のアデノウイルス複製系を構成しており、該ベクターグループは本発明に従って使用される。アデノウイルス複製系の各成分が、別のベクター、好ましくは発現ベクターに存在することは本発明の範囲内である。
【０４１５】
最後に、本発明は、さらなる態様において、本発明に従って使用されるウイルスをコードする１つ以上の核酸を含む細胞の使用と関連しており、該細胞は、様々なアデノウイルスに関して本明細書に記載される全く同じ目的のために、本発明に従った対応するウイルス複製系および／または対応するベクターおよび／またはベクターグループに関する本発明に従って使用される。
【０４１６】
上記のウイルスの構築、特にこれらの核酸およびこれらをコード化する核酸は、細胞内、好ましくは腫瘍細胞内に複数で導入することも可能であり、これによって様々な個々の成分の存在に起因して、個々の成分が１つの核酸および１つ以上のウイルスからそれぞれ派生したかのように共に行動する。
【０４１７】
本発明に従って使用され、ウイルス、ウイルス系、これらの部分をコードする核酸は、ベクターとしても存在できる。好ましくは、これらのベクターはウイルスベクターである。核酸がウイルスの核酸を含む場合、好ましくは、ウイルス粒子はベクターである。一方、該核酸がプラスミドベクター内に存在することも本発明の範囲内である。いずれの場合にも、ベクターは、挿入された核酸の増殖、即ち、挿入された核酸の複製および選択的発現を可能にするエレメントを含む。適当なベクター、好ましくは発現ベクター、および各エレメントは、当業者には既知であり、例えばGrunhaus, A., Horwitz, M.S., 1994に記載されており、クローニングベクターとしてのアデノウイルスは、Rice, C., editor, Seminars in Virology, London: Saunders,Scientific Publicationsに記載されている。
【０４１８】
ベクターグループと関連する態様では、該核酸の様々なエレメントが必ずしも１つのベクターのみに含まれないという前述の実施態様を考慮に入れている。これに応じて、ベクターグループは少なくとも２つのベクターを含む。これとは別に、ベクターに関する記載は、ベクターおよびベクターグループにもそれぞれ適用可能である。
【０４１９】
本発明に従って使用されるウイルス、特にアデノウイルスは、本明細書において開示される様々な核酸および遺伝子産物によって特徴付けられ、その他の点では、好ましくは当業者には既知であり、野生型アデノウイルスに固有の全てのエレメントを含むことができる（Shenk, T.: Adenoviridae: The virus and their replication. Fields Virology, vol. 3, editors Fields, B.N., Knipe, D.M., Howley, P.M. et al., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996, chapter 67）。
【０４２０】
別の態様では、本発明は、本発明のウイルス投与、該核酸、ベクター、複製系、薬剤、薬学的組成物を含む腫瘍疾患の処置法と関連している。腫瘍疾患は本明細書に記載の腫瘍疾患である。患者には該治療が必要であり、好ましくは本明細書で開示される患者のグループから選択される患者である。
【０４２１】
異論がない場合、各ウイルス、核酸、ベクター、複製系、薬剤、薬学的組成物に関して開示される特徴および実施態様は、それぞれ本発明に従って、本発明の各態様および他の態様にも適用可能であることは本発明の範囲内である。様々なトランス遺伝子が、ウイルスゲノム内の適当な部位にクローニング可能であることは本発明の範囲内である。特に好ましいのはＥ１、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４領域である。Ｅ１領域内へのトランスポーターのクローニングは特に好ましい。ウイルスゲノムの各部位へのトランス遺伝子のクローニングは、これらの部位によってコード化される遺伝子を部分的または完全に不活化または欠失させることが当業者によって認められる。一方、特定部位にコード化される遺伝子を部分的または完全に活性なままにできることは本発明の範囲内である。
【０４２２】
本発明のウイルスは、好ましくはアデノウイルスである。
【０４２３】
疾患または障害の治療という用語は、好適な一態様の場合、該疾患または障害の予防も含める。
【０４２４】
実施例１
本発明に従って使用されるアデノウイルスが含むことのできるＥ１Ａ改変の種類
図1は、アデノウイルスベクターＡｄＥ１／Ｅ３マイナス、即ち、Ｅ１／Ｅ３欠失アデノウイルス、野生型アデノウイルス、アデノウイルスｄｌ５２０の構造設計を示している。
【０４２５】
アデノウイルスＡｄＥ１／Ｅ３マイナスは、機能的Ｅ１Ａまたは機能的Ｅ１ＢまたはＥ３をコードする領域を持たず、本実験においては、毒性の対照として使用されている。
【０４２６】
野生型Ｅ１Ａ遺伝子は、Ｅ１Ａ  ＲＮＡの選択的スプライシングによって作られる計５つのタンパク質をコード化する。これらのうち、２つの異なるタンパク質、つまり２８９アミノ酸タンパク質および２４３アミノ酸タンパク質が作られる。ｄｌ５２０はＥ１Ａ遺伝子のＣＲ３ストレッチ内に欠失を持ち、これは１３Ｓ遺伝子産物を欠如させるため、ｄｌ５２０は２８９アミノ酸タンパク質をコード化しない。本発明に従って使用可能なアデノウイルスｄｌ５２０は、当業者によって１２Ｓ−Ｅ１Ａと呼ばれる。先行技術において既知のアデノウイルスｄｌ３４７（Wong und Ziff, J. Virol., 68, 4910-4920, 1994）は、本発明に従って使用可能な１２Ｓ−Ｅ１Ａウイルスでもある。
【０４２７】
１３Ｓ−Ｅ１ＡｍＲＮＡによってコードされる２８９アミノ酸タンパク質内には、様々なアデノウイルスのサブタイプ間で保存されている３つの領域が存在する。これらはＣＲ１、ＣＲ２、ＣＲ３と呼ばれる。ＣＲ１およびＣＲ２は両方のＥ１Ａタンパク質（Ｅ１Ａ  １２ＳおよびＥ１Ａ  １３Ｓ）、即ち、２８９アミノ酸タンパク質および２４３アミノ酸タンパク質の両方に存在するが、ＣＲ３領域は２つの該タンパク質の大きい方にのみ存在する。
【０４２８】
ＣＲ３領域はウイルス遺伝子、特にＥ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の活性化に必要とされる。小さい方、即ち、２４３アミノ酸タンパク質だけを含むウイルスは、ウイルスの遺伝子を非常に弱くトランス活性化するだけで、核内にＹＢ−１を持たない細胞内においてはアデノウイルスの複製を促進しない。ＹＢ−１は腫瘍細胞の核内にのみ存在し、腫瘍細胞の核内においてのみ検出可能であるため、このベクターは腫瘍特異的な複製を誘導させるのに適している。
【０４２９】
ｄｌ５２０内のＣＲ３の欠失に起因して、このアデノウイルスは細胞のＹＢ−１を細胞核内に転位（本明細書では転位とも呼ばれる）できず、このためＹＢ−１核陰性の細胞内において複製する位置にはなく、したがって本発明に従って使用可能なウイルスであり、該ウイルスは本発明に従って必要となるトランス活性化を含んでいる。
【０４３０】
実施例２：細胞のＲｂの状態に応じたアデノウイルスの作用機序
図２は、ｐ３００、ｐ１０７、ｐ１０５の結合に関して、Ｅ１Ａタンパク質の結合ドメインを示している。ｐ１０７の他、ｐ３００は細胞の結合タンパク質である。腫瘍抑制タンパク質である網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）の結合は、ＣＲ１およびＣＲ２によって媒介される。研究では、ｐＲｂおよびｐ１０７／ｐ３００が細胞の転写因子Ｅ２Ｆと結合して転写調節に有効であることが示されている。野生型Ｅ１Ａタンパク質は、Ｅ２ＦのＲｂへの結合を妨げる。このようにして放出されたＥ２ＦはＥ２初期プロモーターに結合して、これによってアデノウイルスの複製を誘導させる。
【０４３１】
Ｅ１Ａ癌タンパク質における特定の欠失によって、以下で言及されるような組換えアデノウイルスベクターをもたらすことが可能であり、これらは主にＲｂ陰性の細胞内において複製可能であり、本発明に従って使用可能であることが先行技術から知られている。例えば、アデノウイルスベクターｄｌ９２２−９４７は、ＣＲ２領域内（アミノ酸１２２〜１２９位）に欠失を含んでおり、ベクターＣＢ０１６はＣＲ１領域内（アミノ酸２７〜８０位）およびＣＲ２領域内（アミノ酸１２２〜１２９位）に欠失を有する。ベクターＥ１Ａｄｌ０１／０７は、ＣＲ２領域内（アミノ酸１１１〜１２３位）に欠失を含んでいる。また、Ｎ末端（アミノ酸４−２５位）の追加的な欠失のため、タンパク質ｐ３００への結合は認められない。アデノウイルスベクターＡｄΔ２４は、ＣＲ２領域内（アミノ酸１２０〜１２７位）に欠失を含んでいる。特許ＥＰ  ０  ９３１  ８３０に記載のアデノウイルスベクターは、ＣＲ１領域およびＣＲ２領域に欠失を含んでいる。
【０４３２】
Ｅ２Ｆ／ＲＢの結合機序およびＥ１Ａにより媒介されるＥ２Ｆの放出は、本発明の基礎となる機序とは根本的に異なる。先行技術における推測とは異なり、ウイルス複製に重大とまでは言わないが必須であるのは、Ｒｂタンパク質からＥ２Ｆの放出ではなく、ヒトの転写因子ＹＢ−１の核局在である。この転写因子は、正常細胞内においては、細胞周期の大半で細胞質にのみ存在する。アデノウイルスの感染後、ＹＢ−１は特定の状況下において核内に誘導されるか、もしくは異なる細胞系、例えば乳癌、卵巣癌、前立腺癌、骨肉腫、膠芽腫、黒色腫、小細胞肺癌および結腸癌を含む異なる腫瘍疾患（これらに限定されるわけではない）においては核内に既に存在している。
【０４３３】
実施例３：Ｕ２ＯＳ細胞の感染
１ウェル当たり１００，０００個のＵ２ＯＳ細胞を播種した。翌日、図３に示される様々なアデノウイルスを細胞に感染させた。感染は５００μＬ無血清ＤＭＥＭ培地中で３７℃１時間実施された。次に、感染用培地を取り除いて、２ｍＬの完全培地（１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ）と交換した。３日後にクリスタルバイオレット染色法を使用して分析を実施した。
【０４３４】
図３から読み取れるように、２つの異なるアデノウイルス、すなわちＥ１／Ｅ３マイナスと呼ばれるＥ１／Ｅ３欠失アデノウイルス、および本発明に従って使用可能なアデノウイルスｄｌ５２０での感染後のクリスタルバイオレット染色法で表されるように、核内にＹＢ−１を伴わないＵ２ＯＳ細胞は溶解を示さなかった。これと関連して、まず培地を除いた。次に、細胞にクリスタルバイオレット（５０％ＥＴＯＨ，３％ホルムアルデヒド，５％酢酸，１％クリスタルバイオレット）を重層して、室温で５−１０分間培養した。次に、６ウェルプレートを水で十分に洗い流して、室温で乾燥させた。
【０４３５】
これによって、本発明に従って使用されるウイルスを誘導して、感染細胞を溶解させるために、ＹＢ−１の存在が必要とされるという、本発明の基礎となる知見が確認される。
【０４３６】
実施例４：２５７ＲＤＢ細胞の感染
１ウェル当たり１００，０００個の２５７ＲＤＢ細胞を播種した。翌日、図４に示される様々なアデノウイルスを細胞に感染させた。感染は５００μＬ無血清ＤＭＥＭ培地中で３７℃１時間実施された。次に、感染用培地を取り除いて、２ｍＬの完全培地（１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ）と交換した。３日後にクリスタルバイオレット染色法を使用して分析を実施した。
【０４３７】
この実験の結果は図４に示されている。Ｅ１／Ｅ３を欠失させた、Ｅ１／Ｅ３マイナスＡｄ５と示されたアデノウイルスは、核内にＹＢ−１を有する２５７ＲＤＢ細胞の感染時に低ＭＯＩｓ（ｐｆｕ／細胞）では溶解を示さなかった。これとは対照的に、実施例３に示されるように、ｄｌ５２０は、ＹＢ−１核陰性の細胞内では複製せず、同時に本発明のトランス活性化癌遺伝子タンパク質のＥ１Ａをコード化しており、４０ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで実際の完全な溶解を、１０ｐｆｕ／細胞のＭＯＩ（感染の多重度）で依然として主な溶解をもたらす。このことからｄｌ５２０および本明細書に記載の同様のウイルス、ｄｌ１１１９／１１３１またはＡｄＸｖｉｒ０３が、Ｅ１欠失またはＥ１／Ｅ３欠失アデノウイルスと比較して、約１マグニチュード（ファクター１０）だけ下げたＭＯＩを必要とし、このことはそれらの臨床用途を裏付けると結論付けることができる。
【０４３８】
図７に示されるように、ｄｌ５２０のタンパク質Ｅ１Ａは、そのＣＲ３領域が欠失していることを特徴としており、これは本発明での用途に必要なトランス活性化およびＹＢ−１核陽性の細胞内における複製をもたらす。
【０４３９】
実施例５：ｄｌ１１１９／１１３１による２５７ＲＤＢおよびＵ２ＯＳ細胞の感染
図５に示されるように、Ｅ１Ａタンパク質のアミノ酸４〜１３８位およびそれをコードする核酸の欠失を示し、さらにアミノ酸２１８位に停止コドンを含め、発現された切断Ｅ１Ａタンパク質が完全なＥ１Ａタンパク質のＣＲ３領域を含んでいる、ｄｌ１１１９／１１３１によるＹＢ−１核陰性のＵ２ＯＳ細胞の感染時には、２０ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで溶解は認められなかった。ネガティブコントロールとして未感染細胞層を使用した。
【０４４０】
これとは対照的に、核内にＹＢ−１を含む（つまり、ＹＢ−１核陽性の）２５７ＲＤＢなどの細胞系において、アデノウイルスｄｌ１１１９／１１３１の影響下において２０ｐｆｕ／細胞のＭＯＩでは実際に完全な細胞層の溶解が認められた。この範囲において、この実施例は、図７に示される改変Ｅ１Ａ癌遺伝子タンパク質が、例えばＣＲ１領域およびＣＲ２領域を欠いたＣＲ３領域のみを含んでおり、本発明のアデノウイルスの複製に必要なＹＢ−１核陽性の細胞において必要なトランス活性化をもたらし、これはウイルス複製をもたらすというもう１つの証拠である。したがって、アデノウイルスｄｌ１１１９／１１３１は、本発明に従って使用可能なさらに別のアデノウイルスである。ＣＲ３領域に関してはｄｌ１１１９／１１３１と同様に設計されているが、これとは対照的にＣＲ１領域および（または）ＣＲ２領域を有するウイルスも使用可能であることは本発明の範囲内である。
【０４４１】
実施例６：多剤耐性細胞における核ＹＢ−１の検出
実施例は、核ＹＢ−１が転写因子としてｍｄｒ１プロモーター（英語：multiple drug resistance promoter）内のＹ−ボックス（ＣＡＡＴ配列）に結合するとの考察に基づいている。これを検出するために、いわゆるＥＭＳＡ分析（電気泳動移動度シフトアッセイ）を実施した。これと関連して、核タンパク質を単離して、次に１−１０μｇのタンパク質を短鎖ＤＮＡ断片（オリゴ）と共に３７℃でインキュベートした。核ＹＢ−１を判定するために、以下のオリゴヌクレオチドを使用した：Ｕ２Ｏ３とは対照的なｍｄｒ１プロモーター（−８６〜−６７位）：
【表１】
0005584393.tif 000002
（Ｘボックスに下線を引いている）。
【０４４２】
その前に、このＤＮＡ断片の５′末端を３２Ｐで放射線標識する。次に、天然ポリアクリルアミドゲル内で分離する。タンパク質ＹＢ−１がオリゴヌクレオチド内の配列に結合する場合、未結合オリゴヌクレオチドが結合オリゴヌクレオチドよりも速くゲル内を移動するため、これは検出可能である（Holm, P.S.ら, JBC 277, 10427-10434, 2002; Bargou, R. C. et al., Nature Medicine 3, 447-450, 1997）。
【０４４３】
図６に示されるように、細胞株Ｕ２ＯＳおよびＨｅＬａ細胞とは対照的に、多剤耐性細胞２５７ＲＤＢ、１８１ＲＤＢ、ＭＣＦ−７Ａｄの核内にはＹＢ−１が存在することをＥＭＳＡ分析によって示すことが可能であった。
【０４４４】
実施例４、５に示される結果によって、アデノウイルスｄｌ５２０およびｄｌ１１１９／１１３１がＹＢ−１核陽性の細胞内（例、Ｕ２０５とは対照的な２５７ＲＤＢ）において複製して、これらの溶解を誘導させることが確認される。このことは、本発明のアデノウイルスの使用に関する知見を確認している。また、結果によって、野生型アデノウイルスと比較して、改変または欠失Ｅ１Ａ遺伝子産物を介したＹＢ−１核陽性の細胞内でのウイルス遺伝子の弱いトランス活性化が、例えば多剤耐性細胞を含め、核内にＹＢ−１が存在する細胞の複製および溶解の成功をもたらし、ひいては本明細書に記載のアデノウイルスを該腫瘍の溶解に使用可能であることが既に確認される。
【０４４５】
実施例７：Ｅ１マイナスアデノウイルスの複製効率の向上
この実施例では、プラスミドｐＥ４ｏｒｆ６のトランスフェクションおよびＥ１／Ｅ３欠失アデノウイルスＡｄ−５５Ｋの感染を通じて、初期ウイルス遺伝子Ｅ１Ｂ−５５ＫおよびＥｏｒｆ６が、置換可能であることを示している。Ａｄ−５５ＫはＥ１／Ｅ３欠失ウイルスであり、Ｅ１Ｂ−５５ＫはＥ１内にクローニングされており、ＣＭＶの制御下にある（Dobbelstein, M. et al., EMBO Journal, 16, 4276-4284, 1997）。ＡｄＹＢ−１、即ち、ＹＢ−１を発現するアデノウイルスがこれらの初期遺伝子を発現せず、核内にＹＢ−１を含む複製系におけるこれらの初期遺伝子の置換によって複製効率および粒子形成をそれぞれＡｄ５型の野生型アデノウイルスのものと同程度にまで増大可能であることを本発明者が認識していることに関して、この置換は必要である。
【０４４６】
以下が実施された：
ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用したｐＥ４ｏｒｆ６プラスミドの各１０５個のＵ２ＯＳ細胞へのトランスフェクション。プラスミドｐＥ４ｏｒｆ６はＣＭＶの制御下に初期ウイルス遺伝子Ｅ４ｏｒｆ６をコード化するＤＮＡ配列を有する。
【０４４７】
ｐＥ４ｏｒｆ６プラスミドのトランスフェクションから２４時間後、細胞にＹＢ−１発現Ｅ１／Ｅ３欠失アデノウイルスＡｄＹＢ−１（５０ｐｆｕ／細胞）およびＥ１／Ｅ３欠失Ｅ１Ｂ−５５ＫアデノウイルスＡｄ−５５Ｋ（５０ｐｆｕ／細胞）を感染させた。Ａｄ−５５Ｋは、トランス遺伝子としてＣＭＶ制御下のウイルス遺伝子Ｅ１Ｂ−５５Ｋを有するＥ１／Ｅ３欠失ウイルスである。
【０４４８】
続いて、感染から５日後（感染後）に培地（２ｍＬ）から細胞を取り出した。単離された細胞からのウイルス粒子の放出は、凍結および融解（融解／凍結）を３回繰り返すことで行った。次に、作成された感染性粒子の測定のために２９３個の細胞についてプラークアッセイを実施した（ｐｆｕ／ｍＬ：１ｍＬ当たりのプラーク形成単位）。結果を図８、９に示した。図８は、絶対値で表したプラークアッセイでの結果を示している。ＡｄＹＢ−１単独感染と比較して最も顕著な差は、ｐＥ４ｏｒｆ６プラスミドとのトランスフェクションおよび２つのウイルスＡｄＹＢ−１およびＡｄ−５５Ｋと同時感染によって示される。図９は図８の結果を示しており、複製効率の上昇は、ＡｄＹＢ−１に関して測定された複数回の複製として表される。ｐＥ４ｏｒｆ６プラスミド、次にＡｄＹＢ−１およびＥ１Ｂ−５５Ｋ（Ａｄ−５５Ｋ）を感染させた細胞は、最高２５倍のｐｆｕ／ｍＬをもたらす。
【０４４９】
これらの結果に基づいて、Ｅ１Ｂ−５５ＫおよびｐＥ４ｏｒｆ６の置換によって、最高ファクター２５だけＥ１／Ｅ３欠失アデノウイルスＡｄＹＢ−１感染後に形成されたウイルス数（ｐｆｕ／ｍＬ）が増加したと結論付けることができる。プラーク形成単位（ｐｆｕ）の提示におよぼすＥ１Ｂ−５５ＫおよびＥ４ｏｒｆ６の相加効果は、２つの各遺伝子産物の効果と比較して、有意に高かった。
【０４５０】
ＥＧＦＰを発現するプラスミドによるコントロール実験では、選択された実験方法において、細胞のわずか１０％がｐＥ４ｏｒｆ６プラスミドでのトランスフェクションに成功することが示された。Ｅ１Ｂ−５５ＫおよびＥ４ｏｒｆ６の両方を発現する細胞内に形成された粒子の数は、ヒトアデノウイルス５型（野生型）のものと同程度である。これによって、Ｅ４ｏｒｆ６およびＥ１Ｂ−５５Ｋが、ＹＢ−１の核局在化との組み合わせで、特にＥ１Ａ欠失アデノウイルスにおいて野生型Ａｄ５と同程度のアデノウイルス複製および粒子形成をもたらすことが可能であるとの本発明の基礎となる知見が確認される。
【０４５１】
実施例８：細胞増殖抑制剤の投与時にＹＢ−１核陰性の細胞、ＹＢ−１核陽性の細胞において複製しないアデノウイルスの複製の増大
様々な細胞増殖抑制剤の添加がヒト転写因子ＹＢ−１の核局在化を誘導することは先行技術において既知である。本発明者が見出したように、核内に局在したＹＢ−１は、アデノウイルスＥ２後期プロモーターの活性化によってアデノウイルスの複製を制御する。特異的な腫瘍溶解をもたらすために、両方の作用の組み合わせを利用可能である。
【０４５２】
腫瘍崩壊アッセイの実施の際、以下の方法に従う：２００，０００個の細胞（ＨｅＬａおよびＵ２ＯＳ）を６ウェルプレートの各ウェルに播種した。翌日、４０ｎｇ／ｍＬ（最終濃度）のダウノルビシンを添加した。３時間の培養後、１０、３０ｐｆｕ  ｄｌ５２０／細胞でそれぞれ細胞を感染させた。次に、細胞増殖抑制剤を含まない培地中で細胞を培養した。３−５日後、細胞をクリスタルバイオレットで染色した。
【０４５３】
図１０、１１から読み取れるように、ダウノルビシンの添加は、ＹＢ−１の核局在化を介してｄｌ５２０の複製を誘導する。このように、ｄｌ５２０は、細胞増殖抑制剤ダウノルビシン単剤と比較して、ダウノルビシンとの併用でより大きな腫瘍溶解作用を生む。
【０４５４】
実施例９：ｄｌ５２０によるインビボでの腫瘍溶解
このインビボ試験において使用されたＨｅＬａ（ＹＢ−１核陰性）および２５７ＲＤＢ（ＹＢ−１核陽性）細胞を無菌的培養条件下において増殖させた。皮下腫瘍を形成するためにマウス（ＣＤ１ＮｕＮｕ系）に細胞を注入する前に、細胞をトリプシン処理によって回収して、ＤＭＥＭ培地（１０％ＦＣＳ）中に取り、計数して、ＰＢＳで１回洗った。次に細胞を遠心分離して、吸入したＰＢＳおよび細胞を目的の細胞数で新しいＰＢＳ中に分注した。この試験で皮下注射された細胞数は、両細胞株についてそれぞれ５ｘ１０６個であった。動物の脇腹に皮下注射して、より良く区別するためにＨｅＬａ細胞は右側に、２５７ＲＤＢ細胞は左側に注射した。腫瘍の増殖は週２回調節され、ノギスを使用して腫瘍の長さと幅を測定した。これに基づいて、以下の数式に従って腫瘍容積を計算した：
３／４π＊ａ／２＊（ｂ／２）２ａ＝長さｂ＝幅
腫瘍容積が２００〜５２０ｍｍ３に達したら、ネガティブコントロールとしてウイルスおよびＰＢＳを腫瘍内に投与した。注入量は毎回同じ５０μＬであった。これは３日間連続して繰り返した。投与したウイルスの全用量は５ｘ１０８ｐｆｕであった。次に、腫瘍の増殖を継続させて、週２回記録して、容積を計算した。試験終了時にマウスを犠牲にして、別の解析用に腫瘍を除去した。
【０４５５】
図１２、１３に結果を示している。
【０４５６】
図１２には、時間と様々な治療計画との関数として腫瘍容積を表している図を示している。腫瘍が、ＲＤＢ２５７によって形成された場合、ＰＢＳ注射時に約４３８−１，４６６ｍｍ３への腫瘍の有意な増殖が認められた。本発明にしたがって使用されたベクターｄｌ５２０の影響下では、腫瘍の増殖を有意に低下できた。平均腫瘍サイズ３４４ｍｍ３から始まり、腫瘍サイズは２１％だけ増大して、全体で５４３ｍｍ３になった。
【０４５７】
本実施例において、ＨｅＬａ細胞を含む腫瘍を対照として使用しており、この腫瘍はＰＢＳ投与時に、ＰＢＳ投与時のＲＤＢ２５７を含む腫瘍と同様の行動をとった。一方、ＨｅＬａ細胞からなり、ｄｌ５２０処理を施された腫瘍は、依然として３１１ｍｍ３から始まり、１，９５４ｍｍ３まで増大する、腫瘍増殖における有意な増大を示した。
【０４５８】
図１３は、ＲＤＢ２５７を使用して増殖腫瘍をもっていて犠牲なったヌードマウスの写真を示している。本発明のアデノウイルスｄｌ５２０の投与後、腫瘍が有意に減少したことが明確に見ることができる。この場合、さらに腫瘍容積の減少が認められた（ｄｌ５２０ウイルス投与後１日目：５１５ｍｍ３；ｄｌ５２０ウイルス投与後３０日目：３５０ｍｍ３）。
【０４５９】
実施例１０：腫瘍のＤＮＡによるサザンブロット
実施例９で発生させた腫瘍の中央から採取された腫瘍検体からＤＮＡを抽出した。単離において、Ｑｉａｇｅｎ社のＤｎｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔを使用する。使用説明書に従ってＤＮＡを単離する。これに従って、アルカリ溶解によって細胞からＤＮＡを放出させた。次に単離したＤＮＡをカラムで精製する。次に、単離したＤＮＡの濃度を２６０ｎｍの測光によって測定する。１０ユニットの制限酵素ＫｐｎＩで消化した２μｇのＤＮＡサンプルを使用して解析を行った。次に、０．８％アガロースゲル中でサンプルを電気泳動分離させた。次にＤＮＡをナイロンメンブレンにブロッティングした（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌの系に従って実施）。メンブレンにブロッティングされたＤＮＡに１，５０１ｂｐの特異的ＤＮＡプローブをハイブリダイズさせた。１，５０１ｂｐのＤＮＡプローブは、Ａｄ５配列をコードするＥ２Ａ内の３，３６９ｂｐのＫｐｎＩ断片に特異的に結合する。事前に、ＰＣＲ
【表２】
0005584393.tif 000003
および放射線標識３２Ｐによってプローブを調製した。
【０４６０】
腫瘍ＤＮＡでのサザンブロットの結果を図１４に示している。解析によって、レーン３、４、５に示されるように、ｄｌ５２０だけが耐性細胞ＲＤＢ２５７においてインビトロで複製することが確認された。レーン１はポジティブコントロールとしてＡｄ−５ｄを示しており、レーン６、７、８はｄｌ５２０を感染させたＨｅＬａ細胞からのＤＮＡを示している。ＨｅＬａ細胞はＹＢ−１核陽性ではないため、ｄｌ５２０ウイルスは複製せず、このためＥ２Ａ配列は検出できなかった。
【０４６１】
ｄｌ５２０でのさらなる結果を図１５に示している。プラークアッセイに基づいて、ｄｌ５２０およびアデノウイルスでの感染後に粒子形成（ｐｆｕ／ｍＬ）を検証した。様々なＹＢ−１核陽性（２５７ＲＤＢおよび１８１ＲＤＢ）腫瘍細胞およびＹＢ−１核陰性腫瘍細胞をｄｌ５２０および野生型アデノウイルスに感染させた。
【０４６２】
以下の方法を実施した：
１００，０００−２００，０００個の細胞をいわゆる６つのウェルのプレート（英語：６ウェルプレート）内の１０％ＦＣＳを含むＬ１５培地（耐性細胞）およびＤＭＥＭ（非耐性細胞）にそれぞれ播種した。２４時間後にｄｌ５２０および野生型アデノウイルス（１０ｐｆｕ／細胞）を感染させた。感染から３日後（感染後）に、３回の凍結融解によって細胞浮遊液（３ｍＬ）からウイルス粒子を放出させた。次に、形成した感染性粒子を測定するために、２９３個の細胞についてプラークアッセイを実施した（１ｍＬ当たりのプラーク形成単位（ｐｆｕ／ｍＬ））。結果を図１５に示している。プラークアッセイの結果は、野生型アデノウイルスと同様に、ｄｌ５２０がＹＢ−１核陽性の細胞（２５７ＲＤＢおよび１８１ＲＤＢ）内において複製していることが示された。この範囲において、本発明に従って本明細書に記載のアデノウイルスを使用した場合、野生型アデノウイルスの１つと同様の複製効率を認めることができた。
【０４６３】
実施例１１：アデノウイルスベクターＸｖｉｒ０３の構造設計
図１６は、アデノウイルスベクターＸｖｉｒ０３の構造設計を示している。アデノウイルスＸｖｉｒ０３はいわゆるＥ１／Ｅ３欠失アデノウイルスである。これは、アデノウイルス複製において機能的なＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ（Ｅ１Ｂ５５ｋ、Ｅ１Ｂ１９Ｋタンパク質）、Ｅ３が作られないことを意味する。Ｅ１領域の欠失は３４２−３，５２８に及び、Ｅ３領域の欠失は２７，８６５−３０，９９５位の塩基に及ぶ。本明細書で使用されているように、「Ｅ１欠失ウイルス」という用語は、Ｅ１がもはや機能的に活性ではないウイルスを意味する。これは、これは、その他の点ではほぼ完全な核酸およびアミノ酸配列の不活化によって得られるが、様々な大きさのタンパク質をコードするＥ１領域の欠失も意味する。Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂタンパク質およびこれらをコードする核酸の欠損のため、Ｅ４ｏｒｆ６などのＥ４領域は弱くしか発現されないか（野生型と比較して約１−５％）、もしくは全く発現されない。ウイルス遺伝子Ｅ１Ｂ５５ｋおよびＥ４ｏｒｆ６は、Ｘｖｉｒ０３内に導入された異種ＣＭＶプロモーター（Clontech: Plasmid pShuttle）によってＥ１領域内において発現される。ＣＭＶプロモーターの代わりに、Ｅ１Ａの発現と関連して本明細書で開示される各プロモーターおよび任意のプロモーターを使用可能である。両遺伝子のオープンリーディングフレームをいわゆるＩＲＥＳ（英語：内部リボソーム侵入部位）配列を用いて互いに連結させる（Pelletier, J. and Sonenberg, N. Nature, 1988, 334, 320-325）。このエレメント（Novagen: pCITE）は１つのｍＲＮＡから２つのタンパク質の発現をもたらす。
【０４６４】
ベクターは以下のように作成された：Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製Ｓｙｓｔｅｍ  Ａｄｅｎｏ−Ｘ
Ｍ．Ｄｏｂｅｌｓｔｅｉｎ氏（マールブルク大学）から供与されたｐＣＧＮＥ１Ｂ由来のＥ１Ｂ５５ｋのオープンリーディングフレーム（ＸｂａＩおよびＢｆｒＩで切断）をｐＳｈｕｔｔｌｅ内（ＢａｍＨＩのみで切断）にクローニングすることでＥｌＢ５５ｋ−ｐＳｈｕｔｔｌｅプラスミドを作成したが、この場合には末端を平滑末端にして、平滑末端にしたｐＳｈｕｔｔｌｅ内にクローニングした。次に、ｐＳｈｕｔｔｌｅ内のＥ１Ｂ５５ｋはＡｐａＩで線状化させて、末端は平滑末端にして、ＮｈｅＩで切断した。
【０４６５】
第二のベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロｇｅｎ）では、互いの後に、ＴＡクローニングを利用して、ＰＣＲ産物としてのＩＲＥＳエレメントを鋳型であるＮｏｖａｇｅｎ社製ｐＣＩＴＥ−４ａ（＋）のＥｃｏＲＶ切断部位にクローニングし、ＢａｍＨＩを用いて、ｐＣＭＶ−Ｅ４ｏｒｆ６プラスミド（マールブルク大学Ｍ．Ｄｏｂｅｌｓｔｅｉｎ氏）由来のＥ４ｏｒｆ６をＩＲＥＳ−Ｅ４ｏｒｆ６−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）にクローニングした。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）内のＩＲＥＳ−Ｅ４ｏｒｆ６をＮｏｔ  Ｉで線状化させて、末端を平滑末端にして、次にＩＲＥＳ−Ｅ４ｏｒｆ６断片をＮｈｅＩで切り出した。ＩＲＥＳ−Ｅ４ｏｒｆ６断片を開環ベクターＥｌＢ５５ｋ−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（平滑、ＮｈｅＩ）に連結させた。次にカセットをＣＭＶプロモーターおよびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）−ＰｏｌｙＡと共にＥｌＢ５５ｋ−ＩＲＥＳ−Ｅ４ｏｒｆ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅからΔＥ１，ΔＥ３Ａｄｅｎｏ−Ｘ−Ｐｌａｓｍｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｉ−ＣｅｕＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩ）にクローニングして、ＡｄｃｍｖＥ１Ｂ／ＩＲＥＳ／Ｅ４ｏｒｆ６と称した。次に、メーカーの使用説明書（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に従ってアデノウイルスを作成した。ＰａｃＩで線状化され、発現エレメントＣＭＶ−Ｅ１Ｂ５５ｋ−ＩＲＥＳ−Ｅ４ｏｒｆ６−ＢＧＨ  ｐｏｌｙＡを有するアデノプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションして、凍結融解サイクルの繰り返しによってアデノウイルスを放出させるために、トランスフェクション後１１日目に剥離した細胞を培地と共に取り除いた。
【０４６６】
ＱＢＩＯＧＥＮＥおよびＭｉｃｒｏｂｉｘのシステムＡｄＥａｓｙなどの他のシステムを本発明のアデノウイルス、好ましくは組換えアデノウイルス、特にカセットＥ４ｏｒｆ６−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂ５５ｋおよびＹＢ−１−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ａ１２Ｓを個々に、および（または）共に含む組換えアデノウイルスの製造のために使用可能であることは本発明の範囲内であり、本明細書に記載の技術指導に関する当業者にとって実施可能である。また、カセット間で個々のトランス遺伝子を交換可能である。該アデノウイルスが本発明に従って製造・使用可能であり、カセットが以下の設計（Ｅ１Ｂ５５ｋ−ＩＲＥＳ−Ｅ４ｏｒｆ６およびＥ１Ａ１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ１）を有することも本発明の範囲内である。
【０４６７】
本発明と関連して、カセットＥ４ｏｒｆ６−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂ５５ｋを含むいわゆるＥ１／Ｅ３欠失組換えアデノウイルスを使用した。一方、ウイルスがＥ１欠失だけを含み、これがＥ３領域は完全なままであることを意味することは一実施態様の範囲内である。任意に、Ｅ４領域を部分的および（または）完全に欠失可能である。
【０４６８】
異なるシステムを使用したベクターの作成において、以下のように開始した：
【０４６９】
Ｇｒａｈａｍ（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）に従ったベクターシステムを伴う、完全なＥ３領域を有するアデノウイルスＡｄ−Ｘｖｉｒ３′ＵＴＲの製造
【０４７０】
ｐＤｅｌｔａＥ１ｓｐ１Ａ内のＣＭＶ−Ｅ４ＯＲＦ６−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂ５５ｋ３′ＵＴＲ−ｐｏｌｙＡベクターのクローニング
Ｅ１Ｂ５５ｋ３′ＵＴＲ−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）プラスミド用に、３′−ＵＴＲを有するオープンリーディングフレームをアデノウイルス５型のＤＮＡ
【表３】
0005584393.tif 000004
から増幅によって調製し、平滑末端にしたＮｈｅＩ制限酵素部位に導入し、これにはＴ末端（ＴＡクローニング）が与えられ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のｐＳｈｕｔｔｌｅプラスミドにクローニングした。このように、トランス遺伝子の５′末端にはｈＣＭＶプロモーター、３′末端にはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルが与えられた。一方、ＢａｍＨＩおよびＴＡクローニングのそれぞれを用いて、Ｄｏｂｂｅｌｓｔｅｉｎ氏から供与されたｐＣＧＮＥ１Ｂプラスミド（Dobbelstein, M. et al., EMBO Journal, 16, 4276-4284, 1997）由来のＥ１Ｂ５５ｋを使用することも本発明の範囲内である。クローニングされたＥ１Ｂ５５ｋ−３′ＵＴＲは特に図２３、２４により詳細に記載されている。
【０４７１】
Ｅ４ＯＲＦ６−ＩＲＥＳ−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターのクローニング
次に、鋳型としてアデノウイルス５型ＤＮＡ
【表４】
0005584393.tif 000005
を使用し、ＢａｍＨＩで切断したｐＣＭＶＥ４−３４ｋＤプラスミド（Dobbelstein, M. et al., EMBO, 16, 4276-4284, 1997）由来の増幅産物Ｅ４ｏｒｆ６、および鋳型としてＮｏｖａｇｅｎ社のｐＣＩＴＥ−４ａ（＋）を有するＩＲＥＳエレメント
【表５】
0005584393.tif 000006
（Ｔａｂｌｅ  ５）をｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターのマルチクローニングサイトにクローニングした。この目的のために、オープンリーディングフレームの５′末端にＢａｍＨＩ切断部位、３′末端にＥｃｏＲＩ切断部位を作成したＥ４ｏｒｆ６トランス遺伝子用のプライマーを使用した。増幅産物を各制限酵素で切断して、その末端はＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを使用して開環されたベクターへの直接クローニングに適合するようにした。次に、ｐＤＮＡ３．１（＋）内のＥ４ｏｒｆ６プラスミドをＥｃｏＲＶで線状化して、Ｔ末端を付加して、増幅産物をＩＲＥＳエレメント内にクローニングした。ＩＲＥＳの正確な方向を確認後、別のクローニング用にベクターを使用した。
【０４７２】
ＩＲＥＳエレメントを有する両方のトランス遺伝子の連結は、過去に作成されたＣＭＶ−Ｅ１Ｂ５５ｋ３′ＵＴＲ−ｐｏｌｙＡ−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；ＮｏｔＩで線状化して、平滑末端にし、次にＸｂａＩで切断）へのＥ４ｏｒｆ６−ＩＲＥＳカセットのクローニングによって得られた。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）内のＥ４ｏｒｆ６−ＩＲＥＳをＮｏｔＩで線状化させて、末端を平滑化させ、ＮｈｅＩでさらに消化した。Ｅ４ｏｒｆ６−ＩＲＥＳインサートをＣＭＶ−Ｅ１Ｂ５５ｋ３′ＵＴＲ−ｐｏｌｙＡ−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ＸＶＩＲ−３′ＵＴＲと連結することでｐＳｈｕｔｔｌｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を作成した。
【０４７３】
使用するアデノウイルスシャトルベクターの作成
Ｍｉｃｒｏｂｉｘ社のアデノウイルス作成システム用に現在使用されているシャトルベクターｐΔＥ１ｓｐ１Ａは、ＣＭＶプロモーター、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルのいずれも含まなかったため、これらのエレメントをｐΔＥ１ｓｐ１Ａにクローニングした。この目的のために、ｐΔＥ１ｓｐ１ＡをＣｌａＩで線状化させて、平滑末端にして、ＥｃｏＲＩで切断した。ｐＳｈｕｔｔｌｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からエレメントＣＭＶ−ＭＣＳ（マルチクローニングサイト）−ポリＡをＭｆｅＩで線状化させて、末端を平滑にして、ＥｃｏＲＩでさらに切断した。次に、ＰｍｅＩによりカセット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＸｖｉｒ−３′ＵＴＲ）を、やはりＰｍｅＩで切断してジホスホリル化させたＣＭＶ−ＭＣＳ−ポリＡｐΔＥ１ｓｐ１Ａベクターにクローニングした。クローニング産物であるＸｖｉｒ−３′ＵＴＲ−ｐΔＥ１ｓｐ１Ａはウイルス作成に使用された。
【０４７４】
ウイルス作成
Ｘｖｉｒ−３′ＵＴＲ−ｐΔＥ１ｓｐ１ＡおよびｐＢＨＧＥ３（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ社製；野生型アデノウイルス５型に対応するＥ３領域を含む）をＨＥＫ２９３細胞内に同時移入させて、この時、二つのベクターの相同配列の組換えに起因してウイルスＡｄ−Ｘｖｉｒ−３′ＵＴＲＥ３が作成された。
【０４７５】
ＡｄＥＡＳＹシステム（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社）を使用したアデノウイルスＡｄ−Ｘｖｉｒ３′ＵＴＲ−ＡｄＥＡＳＹＥ３の作成
使用するアデノウイルスシャトルベクターの作成
今回使用するシステムにおいて、ベクターｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＡｄＥＡＳＹはＣＭＶプロモーター、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルのいずれも含まなかったため、これらのエレメントをｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＡｄＥＡＳＹにクローニングした。この目的のために、プラスミドをＥｃｏＲＩで切断して、Ｔ４ポリメラーゼおよびｄＮＴＰｓを用いたフィリングによって末端を平滑化させ、骨格を脱リン酸化させて、生成した両方の消化産物を再連結させた。これによって制限酵素認識部位ＥｃｏＲＩを消去した。このようにして得られたプラスミドをｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＥｃｏＲＩ）−ＡｄＥＡＳＹと呼んだ。
【０４７６】
次に、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のｐＳｈｕｔｔｌｅ由来のＣＭＶ−ＭＣＳ−ポリＡカセットをＭｆｅＩおよびＥｃｏＲＩで切断して、末端を平滑化させ、この目的のためにＸｂａＩで線状化して、平滑末端にし、脱リン酸化させたｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＥｃｏＲＩ）−ＡｄＥＡＳＹベクターにクローニングした。このようにしてＣＭＶ−ＭＣＳ−ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＡｄＥＡＳＹプラスミドを作成した。ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩを使用して、Ｅ４Ｏｒｆ６−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂ５５ｋ−３′ＵＴＲカセットをこのプラスミドにクローニングした。これによってｐＳｈｕｔｔｌｅＡｄＥＡＳＹ内のＸｖｉｒ−３′ＵＴＲプラスミドを作成した。これをＢｓｔ１１０７ＩおよびＭｒｏＩで線状化させて、エレクトロポレーションによって、レスキュープラスミドｐＡｄＥＡＳＹとともにＢＪ５１８３（ＥＣ）細菌内に導入した。相同組換えによって、アデノウイルスプラスミドＡｄ−Ｘｖｉｒ−３′ＵＴＲ−ｐＡｄＥＡＳＹを作成して、これはＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクション後にウイルス産生をもたらした。
【０４７７】
ｐＡｄＥＡＳＹへのｗｔＥ３領域の導入
ｐＡｄＥＡＳＹプラスミドにおいてＥ３領域は大幅に欠失されているため、再構築のためにＳｐｅＩおよびＰａｃＩによってｐＡｄＥＡＳＹプラスミドからＥ３領域をＣＭＶ−ＭＣＳ−ポリＡｐＳｈｕｔｔｌｅ（ＡｄＥＡＳＹ）にクローニングして、これによりＥ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＡｄＥＡＳＹプラスミドを作成した。
【０４７８】
ＮｄｅＩによる切断および再連結によって、２つのＮｄｅＩ制限酵素部位のうち１つを欠失させ、またプラスミドからマルチクローニングサイトも欠失させた。この方法によって、Ｅ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹプラスミドを作成した。
【０４７９】
次に、野生型アデノウイルス５型から４００７ｂｐのｗｔＥ３領域をＳｐｅＩおよびＮｄｅＩによって切り出して、ＳｐｅＩおよびＮｄｅＩによって開環されたＥ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹにクローニングした。このようにして作成されたベクターをｗｔＥ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹと呼んだ。
【０４８０】
次に、Ｅ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹから野生型Ｅ３Ｅ４領域をＳｐｅＩおよびＰａｃＩで切り出して、ＳｐｅＩおよびＰａｃＩで切断したｐＡｄＥＡＳＹにクローニングし、ｐＡｄＥＡＳＹプラスミド内にＥ３領域を再構築した（ｐＡｄＥＡＳＹ−Ｅ３）。ｐＳｈｕｔｔｌｅＡｄＥＡＳＹおよびｐＡｄＥＡＳＹ−Ｅ３内におけるＸｖｉｒ−３′ＵＴＲプラスミドでのＢＪ５１８３（ＥＣ）細菌の形質転換時における相同組換えによってＸＶｉｒ−３′ＵＴＲ−ｐＡｄＥＡＳＹ−Ｅ３を作成した。
【０４８１】
記載された全システムにおけるＥ４の操作
治療用トランス遺伝子に空間を与え、目的以外の相同組換えを避けるために、Ｅ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹプラスミドのＥ４領域を特異的に欠失できる。この目的のために、ＰｓｔＩによる切り出しおよび再連結によって、Ｅ４ｏｒｆ６領域を約０．６ｋＢ、好ましくは６２９または６３４ｂｐだけ短縮させる。これは、図１７に記載のとおり、Ｘｖｉｒ０３／０１に関して実施可能である。組換えアデノウイルスの作成のための異なるシステムでの各欠失も当業者には実施可能である。
【０４８２】
特にＡｄ−Ｘｖｉｒ３′ＵＴＲ−ＡｄＥＡＳＹＥ３内のＲＧＤモチーフのクローニング（別のシステムにも適用可能）
感染性を高めるために、ｆｉｂｒｅ  ｋｎｏｂドメインのＨＩループを以下のDmitriev et al. 1998（An Adenovirus Vector with Genetically Modified Fibers Demonstrates Expanded Tropism via Utilization of a Coxsachievirus and Adenovirus Receptor-Independet Cell Entry Mechanism）に従って改変させた。プライマー
【表６】
0005584393.tif 000007
を使用して各領域を増幅させて、これによってＥｃｏＲＶ制限酵素部位を作成した。この制限酵素部位内に、
【表７】
0005584393.tif 000008
をコード化する一対のオリゴヌクレオチドをクローニングした。これによって、ｆｉｂｒｅ  ｋｎｏｂドメインのＨＩループ内にＲＧＤモチーフが存在する。
【０４８３】
上述される該ベクターは原理上、本明細書に従って使用される本明細書に記載の他のウイルスと同様に適している。特に、該ベクターは、ＹＢ−１が調節解除されたされた（即ち、正常細胞および腫瘍細胞それぞれと比較してＹＢ−１が過剰発現している）細胞の他、ＹＢ−１核陽性の細胞において、この範囲において複製および溶解の誘導に適している。該ベクターの使用は特に、本明細書に従って使用される本明細書に記載の他のアデノウイルスおよび本明細書で開示される他のアデノウイルスに関して開示される疾患、患者群、患者集団に適用される。
【０４８４】
実施例１２：アデノウイルスベクターＸｖｉｒ０３／０１の構造設計
図１７から読み取れるように、Ｘｖｉｒ０３／０１はＸｖｉｒ０３をさらに発展させたものである。例えば、本明細書に記載の遺伝子などの治療用遺伝子およびトランス遺伝子をＥ３領域内にクローニングできる。また、Ｘｖｉｒ０３の発現カセット由来のＥ４ｏｒｆ６との相同組換えを避けるために、Ｅ４領域内に欠失を導入した。これによって、より大きなトランス遺伝子をこのコンストラクトの中にクローニングできる。欠失させたＥ３領域にはカセットを導入するためのＳａｃＩ、ＮｄｅＩ、ＮｈｅＩ制限酵素部位が含まれ、カセットには例えば治療用のトランス遺伝子をクローニングできる。一方、Ｅ３は完全なままで、治療用の遺伝子をＥ４領域内にクローニングすることもできる。これによってアデノウイルス死タンパク質の発現がもたらされる。
【０４８５】
Ｅ４領域名への欠失の作成の他、Ｅ３領域内への治療用遺伝子のクローニングのためのプラスミド調製
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のｐＡｄｅｎｏＸ−Ｐｌａｓｍｉｄは３′ＩＴＲ領域の後ろにＳｆｕＩ制限酵素部位を有しており、これは野生型アデノウイルスには存在しない。ＳｐｅＩ（２３６４４位）およびＳｆｕＩによってｐＡｄｅｎｏＸ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＥ３−Ｅ４領域を取り出し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロｇｅｎ）内に移入させた（＝ｐｃＤＮＡ３．１−Ｅ３Δ２７８６５−３０９９５−Ｅ４）。Ｅ４ＯＲＦ６の大部分、即ち、３３２４１−３３８７５をＰｓｔＩによって取り除いた（＝ｐｃＤＮＡ３．１−Ｅ３Δ２７８６５−３０９９５，Ｅ４Δ３３２４１−３３８７５）。Ｘｖｉｒ０３をさらに発展させたものでは、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｅ３Δ２７８６５−３０９９５，Ｅ４Δ３３２４１−３３８７５由来の欠失Ｅ３／Ｅ４領域をＳｆｕＩおよびＳｐｅＩによってｐＡｄｅｎｏＸプラスミドにクローニングした（ｐＡｄｅｎｏＸＥ３Δ２７８６５−３０９９５，Ｅ４Δ３３２４１−３３８７５）。
【０４８６】
次に、Ｅ１Ｂ５５ｋ−ＩＲＥＳ−Ｅ４ｏｒｆ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅからＩ−ＣｅｕＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩによって、Ｘｖｉｒ０３と記載される発現カセットをＣＭＶプロモーターおよびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡと共にｐＡｄｅｎｏＸＥ３Δ２７８６５−３０９９５，Ｅ４Δ３３２４１−３３８７５にクローニングして、ＡｄｃｍｖＥ１Ｂ／ＩＲＥＳ／Ｅ４ｏｒｆ６−ΔＥ４と称した。次に、メーカーの使用説明書（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に従ってアデノウイルスを作成した。
【０４８７】
本発明のアデノウイルス、特にＱＢＩＯＧＥＮＥ社およびＭｉｃｒｏｂｉｘ社のシステムなどの組換えアデノウイルスの製造に他のシステムを使用可能であることは、本開示の観点から、本発明の範囲内であり、当業者が実施可能である。
【０４８８】
上記のベクターは、本発明に従って使用される本明細書に記載の他のウイルスと同様に原理上、有用である。特に、上記のベクターは、ＹＢ−１が調節解除されたされた（即ち、正常細胞および腫瘍細胞と比較して過剰発現している）細胞の他、ＹＢ−１核陽性の細胞において複製して、この範囲において溶解を起こすのに適している。このベクターは、本明細書に従って使用される他のアデノウイルスおよび本明細書に従ったアデノウイルスに関して開示される疾患、患者群、患者集団にも使用可能である。
【０４８９】
実施例１３：２５７ＲＤＢ細胞および１８１ＲＤＢ細胞内におけるＸｖｉｒ０３の腫瘍崩壊作用
６つのウェルを有するプレート（英語：６ウェルプレート）の１ウェル当たり１００，０００個の細胞（２５７ＲＤＢおよび１８１ＲＤＢ）を播種した。翌日、図１８に示されるように、Ａｄ３１２（２０ｐｆｕ／細胞）およびＸｖｉｒ０３（５ｐｆｕ／細胞）を細胞に感染させた。感染は５００μＬ無血清ＤＭＥＭ培地中で３７℃１時間実施された。次に、感染用培地を取り除いて、２ｍＬの完全培地（１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ）と交換した。５日後にクリスタルバイオレット染色法を使用して分析を実施した。結果は図１８Ａおよび１８Ｂに示している。
【０４９０】
図１８Ａおよび１８Ｂから読み取れるように、核内にＹＢ−１を有する多剤耐性細胞は、細胞のクリスタルバイオレット染色法で表されるように、Ｘｖｉｒ０３の場合にのみＡｄ３１２およびＸｖｉｒ０３感染後の溶解を示す。これと関連して、まず培地を除いた。次に、細胞にクリスタルバイオレット（５０％ＥＴＯＨ，３％ホルムアルデヒド，５％酢酸，１％クリスタルバイオレット）を重層して、室温で５−１０分間培養した。次に、６ウェルプレートを水で十分に洗い流して、室温で乾燥させた。
【０４９１】
本発明の意味においてアデノウイルスをトランス活性化しないＥ１Ａ欠失ウイルス（例、Ａｄ３１２）は高ＭＯＩで非常に効率的に複製可能であることを本発明者は知っているが（Nevins J.R., Cell 26, 213-220, 1981）、しかし、臨床用途においては実現不可能である。この現象は文献中において「Ｅ１様活性」と呼ばれる。本明細書で使用されるアデノウイルスＡｄ３１２は、Ｅ１Ａ欠失ウイルスである。依然として臨床上望ましい力価を上回る使用力価（２０ｐｆｕ／細胞）では、Ｅ１Ｂ５５ｋおよびＥ４ｏｒｆ６などの初期アデノウイルス遺伝子は発現されないか、もしくは非常に低い程度しか発現されない（Nevins J.R., Cell 26, 213-220, 1981）。本明細書に既に記載の通り、これらの遺伝子およびタンパク質はウイルス複製において重要な役割を果たす。これとは対照的に、これらの遺伝子およびタンパク質はそれぞれアデノウイルスＸｖｉｒ０３によって発現される（図１６）。図１８Ａおよび１８Ｂから読み取れるように、Ｅ１Ｂ５５ｋおよびＥ４ｏｒｆ６遺伝子の発現は、同時により低い必要力価（ｐｆｕ／細胞で表される）で効率的なウイルス複製および細胞溶解をもたらす。これによって本発明の基礎となる知見、即ち、ＹＢ−１の核局在と共にＥ４ｏｒｆ６およびＥ１Ｂ５５Ｋの発現（Ｅ１Ａの不在）が非常に効率なアデノウイルスの複製を誘導可能であることが確認される。わずか１−５ｐｆｕ／細胞という、これに対する必要力価によって、現在臨床応用が可能になっている。
【０４９２】
このことは本発明の基礎となる知見、即ち、本発明に従って使用されるウイルスによって感染細胞を溶解させるためには、核内のＹＢ−１の存在、特に細胞周期とは無関係なＹＢ−１の存在が必要であることを確認している。
【０４９３】
実施例１４：イリノテカン添加後の細胞内におけるアデノウイルスの複製
アデノウイルス複製に及ぼすイリノテカンの影響を判定するために、１０６個のＵ３７３腫瘍細胞を１０ｃｍ２のシャーレに播種した。第一反応において、２４時間後に５μＭイリノテカンを添加した。さらに２４時間後、１０ｐｆｕ／細胞のｄｌ５２０を細胞に感染させた。イリノテカン不含での３日間の培養後、実施例１０に記載の方法に従ってＤＮＡを単離した。
【０４９４】
並行反応において、上記のとおりに調製したＵ３７３細胞はイリノテカンと前培養しなかった。イリノテカンなしで細胞を４８時間培養後、１０ｐｆｕ／細胞のｄｌ５２０を細胞に感染させて、その後、イリノテカンなしでさらに３日間培養させた。上記のとおりにＤＮＡを単離した。
【０４９５】
次に、２μｇのＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩで消化して、サザンブロット解析を実施した。ＰＣＲ法を用いて作成されたアデノウイルスゲノムの一部（２２７３４−２４２３５位）をプローブとして用いた。
【０４９６】
結果を図１９に示している。図１９は、イリノテカンと共に培養後、イリノテカンと共に培養を実施しなかった未処理コントロール（レーン１）と比較して、イリノテカン処理後のＵ３７３細胞（レーン２）においてアデノウイルスの複製が有意に増大することを示している。このことは、イリノテカンの影響下でアデノウイルスの複製が増大することを意味する。
【０４９７】
実施例１５：トリコスタチンＡ添加後の細胞内におけるアデノウイルスの複製
アデノウイルスの複製に及ぼすトリコスタチンＡの作用を調べるために、１０６個のＵ３７３腫瘍細胞を１０ｃｍ２のシャーレに播種した。２４時間後に０．２５、０．５、０．７５μＭトリコスタチンＡを添加した。さらに２４時間後、１０ｐｆｕ／細胞のｄｌ５２０を細胞に感染させた。
【０４９８】
トリコスタチンＡ不含培地での３日間の培養後、ＤＮＡを単離した。次に、２μｇのＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩで消化して、サザンブロット解析を実施した。ＰＣＲ法を用いて作成されたアデノウイルスゲノムの一部（２２７３４−２４２３５位）をプローブとして用いた。
【０４９９】
結果を図２０に示している。図２０は、トリコスタチンＡと共に培養しなかった未処理コントロール（レーン１）と比較して、より高濃度のトリコスタチンＡと共に培養したＵ３７３細胞（レーン２、３、４）においてウイルス複製が有意に増大することを示している。このことはトリコスタチンＡの影響下でウイルス複製が増大することを意味する。
【０５００】
実施例１６：トリコスタチンＡ添加に反応したＵ３７３細胞上のコクサッキーウイルスアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）発現に及ぼす影響
２００，０００個のＵ３７３細胞を６ウェルプレートへ播種した。２４時間後、細胞を１μＭのトリコスタチンと共に２４時間培養した。さらに２４時間後、細胞を単離した。次に、ＦＡＣＳ分析、一次抗体であるＵｐｓｔａｔｅ社の抗ＣＡＲクローンＲｍｃＢ、二次抗体としてウサギ抗マウスＦＩＴＣ（ＤＡＫＯ社）を使用して、標準プロトコルに従ってＣＡＲ発現を解析した。
【０５０１】
結果を図２１に示している。トリコスタチン処理なしでは、細胞の１１．３％がＣＡＲ陽性であったが、細胞を１μＭトリコスタチンと共に培養後は、細胞の５６．２％がＣＡＲ陽性であった。数字は試験に使用された全細胞における割合である。
【０５０２】
図２１から、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤であるトリコスタチンＡの影響下では、アデノウイルスの結合における重要因子ＣＡＲが高レベルで発現され、より多く利用可能であり、これによって上記のとおりに処理された細胞のトランスフェクション効率が高められることが読み取れる。
【０５０３】
実施例１７：イリノテカンおよびトリコスタチンＡでの細胞の併用処理後のアデノウイルスによるＵ３７３細胞の腫瘍崩壊
２００，０００個のＵ３７３細胞を６ウェルプレートに播種した。２４時間後、２μＭイリノテカンまたは１μＭトリコスタチンＡのみまたは１μＭイリノテカン＋０．５μＭトリコスタチンを培地に添加した。２４時間の培養後、１０、２０、３０ｐｆｕ／細胞のｄｌ５２０を細胞に感染させた。３−５日後、クリスタルバイオレット染色を利用して分析を実施した。アッセイはデュプリケートで行った。
【０５０４】
結果を図２２に示している。パネル１に示される６枚のプレートは、クリスタルバイオレット染色によって示されるように、イリノテカンおよびトリコスタチンＡの併用での培養による影響を受けなかった完全な細胞層を示している。パネル１の次の２つのウェルはそれぞれ１０、２０ｐｆｕ／細胞のｄｌ５２０による感染後の細胞層を示している。該条件下でも、ｄｌ５２０の複製の欠如に起因する細胞溶解は認められない。このように１０または２０ｐｆｕ／細胞のｄｌ５２０、１μＭイリノテカン＋０．５μＭトリコスタチンＡのみのいずれも細胞溶解の誘導には適さないことが示される。
【０５０５】
図２２に示される、別の６ウェルプレート２、３、４（本明細書ではパネル２、３、４とも呼ばれる）は、基本的にこの計画に従って処理した。先述のとおりに、個々のウェルにＵ３７３細胞を接種して、この中で細胞を培養した。ウェルには１０、２０、３０ｐｆｕ／細胞のｄｌ５２０を２回接種し、ここで３枚の６ウェルプレート間の違いは使用された細胞増殖抑制剤の種類にあった。パネル２には２μＭイリノテカン、パネル３には１μＭトリコスタチンＡ、パネル４には１μＭイリノテカンおよび０．５μＭトリコスタチンＡを個々のプレートに添加した。
【０５０６】
２μＭイリノテカンの入った６ウェルプレート２（パネル２）では、３０ｐｆｕ／細胞のｄｌ５２で細胞を溶解させた。１μＭトリコスタチンＡの入った６ウェルプレート３（パネル３）では、２０、３０ｐｆｕ／細胞のｄｌ５２で細胞を溶解させた。これらとは対照的に、１μＭイリノテカン＋０．５μＭトリコスタチンＡの入った６ウェルプレート４（パネル４）では、１０ｐｆｕ／細胞のｄｌ５２で細胞は既に溶解させていた。
【０５０７】
図１９−２３に結果が示されている試験では、イリノテカン＋トリコスタチンＡ＋ｄｌ５２０を含む併用によって、いずれの化合物単独よりも腫瘍細胞のより効果的な細胞溶解を誘導させることが示されている。これは他方で、トリコスタチンＡによるＣＡＲ発現の増大に起因しており、ひいては細胞の感染性を有意に向上させる。他方で、イリノテカンはＹＢ−１を細胞核内に転位させ、ひいてはアデノウイルスの複製の向上を促す。また、細胞のＹＢ−１はｄｌ５２０感染後のアデノウイルスの複製を助け、ＤＮＡ修復プロセスにはもはや利用できない。この観点から、これはｄｌ５２０の有効性を向上させ、他方では細胞増殖抑制剤の有効性を増大させる。
【０５０８】
実施例１８：アデノウイルスＡｄ３１２のＥ２遺伝子発現に関するノーザンブロット解析
各ケースで、１００万個のＡ５４９細胞およびＵ２ＯＳ細胞を１０ｃｍシャーレに播種した。翌日、Ａｄ３１２（５０ｐｆｕ／細胞）およびＡｄｗｔ（対照として使用される；５ｐｆｕ／細胞）を細胞に感染させた。使用された高ウイルス力価のＡｄ３１２は、腫瘍細胞においてＥ１非依存的な複製をもたらした。１〜２ｍＬの無血清ＤＭＥＭ中で３７℃１時間、感染させた。次に、感染用培地を取り除いて、１０ｍＬの完全培地（１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ）と交換した。３日後にＲＮＡを単離した。次に、単離したＲＮＡの濃度を２６０ｎｍの測光器で測定した。そしてＲＮＡサンプルを０．８％ホルムアルデヒドアガロースゲル中で電気泳動的に分離させた。次に、ＲＮＡをナイロンメンブレン上にブロッティングした（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌのシステムに従って実施）。メンブレン上にブロッティングされたＲＮＡは、「初期プローブ」Ｅ２および「後期プローブ」Ｅ２とハイブリダイズさせた。１５０１ｂｐの「後期プローブ」は、Ｅ２後期プロモーターの後方に特異的に結合する。プローブは事前にＰＣＲ
【表８】
0005584393.tif 000009
によって調製して、３２Ｐで放射線標識した。一方、初期プローブはＥ２初期プロモーターとＥ２後期プロモーターの間（２２６７９１−２２７００２位）に結合して、やはりＰＣＲ
【表９】
0005584393.tif 000010
によって作成した。次に、メンブレンを洗って、フィルムに暴露させた。
【０５０９】
結果を図２５に示している。後期プローブは無論、初期プローブも野生型アデノウイルスによるコントロール感染において特異的シグナルをもたらしたが、Ａｄ３１２感染した腫瘍細胞は、後期プローブを使用した場合にのみ特異的シグナルをもたらした。このことにより、本発明の基礎となる知見、即ち、Ｅ４ｏｒｆ６およびＥ１Ｂ５５Ｋの発現およびＥ１Ａの欠如はそれぞれ過剰発現した調節解除されたＹＢ−１を核内に輸送して、ひいては効率的なアデノウイルス複製の必要条件としてＥ２遺伝子発現を誘導することが確認される。
【０５１０】
実施例１９：アデノウイルスＡｄｄｅｌｔａ２４のＥ２遺伝子発現に関するノーザンブロット解析
各ケースで、１００万個のＵ２ＯＳ細胞を１０ｃｍシャーレに播種した。翌日、アデノウイルスデルタ２４（Ａｄｄｅｌｔａ２４）（１０ｐｆｕ／細胞）および野生型アデノウイルス（Ａｄｗｔ）（対照として使用；１０ｐｆｕ／細胞）を細胞に感染させた。使用した組換えアデノウイルスＡｄｄｅｌｔａ２４（Fueyo, J. et al., Oncogene 19, 2-12, 2000）はＥ１Ａタンパク質のＣＲ２領域内に特定の欠失を有しており、これによってＲｂ陰性の腫瘍においてのみ複製可能である。また、ウイルスは、野生型アデノウイルスと同様に、Ｅ１Ｂ５５ｋおよびＥ４ｏｒｆ６遺伝子を発現している。１〜の無血清ＤＭＥＭ中で３７℃１時間、感染させた。次に、感染用培地を取り除いて、１０ｍＬの完全培地（１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ）と交換した。１２、２４時間後にＲＮＡを単離した。次に、単離したＲＮＡの濃度を２６０ｎｍの測光器で測定した。そしてＲＮＡサンプルを０．８％ホルムアルデヒドアガロースゲル中で電気泳動的に分離させた。次に、ＲＮＡをナイロンメンブレン上にブロッティングした（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌのシステムに従って実施）。メンブレン上にブロッティングされたＲＮＡは、「初期プローブ」および「後期プローブ」とハイブリダイズさせた。１５０１ｂｐを含む「後期プローブ」は、Ｅ２後期プロモーターの後方に特異的に結合する。プローブは事前にＰＣＲ
【表１０】
0005584393.tif 000011
によって調製して、３２Ｐで放射線標識した。一方、初期プローブはＥ２初期プロモーターとＥ２後期プロモーターの間に結合して、やはりＰＣＲ
【表１１】
0005584393.tif 000012
によって作成した。次に、メンブレンを洗って、フィルムに暴露させた。
【０５１１】
結果を図２６に示している。
【０５１２】
１２時間後、後期プローブのみが特異的シグナルをもたらした。２４時間後に初めて、初期プローブもＡｄｄｅｌｔａ２４感染細胞においてシグナルをもたらした。しかし、シグナルは、野生型アデノウイルスと比較して、有意に弱かった。このことからも、本発明の基礎となる知見、即ち、Ｅ４ｏｒｆ６およびＥ１Ｂ５５Ｋの発現がそれぞれ過剰発現した調節解除されたＹＢ−１を核内に輸送して、その後これはＥ２後期プロモーターに結合してＥ２遺伝子発現を誘導することが確認される。
【０５１３】
実施例２０：アデノウイルスベクターＸｖｉｒＰＳＪＬ１およびＸｖｉｒＰＳＪＬ２の構造設計
ベクターの説明：本明細書においてグループＩアデノウイルスと呼ばれるウイルスの実施態様であり、ベクターおよびアデノウイルスによって例示されるＸｖｉｒＰＳＪＬグループのベクター、ＸｖｉｒＰＳＪＬ１およびＸｖｉｒＰＳＪＬ２は、アデノウイルスのようにＹＢ−１核陽性の細胞、特に腫瘍細胞だけでなく、ＹＢ−１が過剰発現しており、調節解除されたされている腫瘍細胞においても複製可能である。ウイルス遺伝子、Ｅ１Ｂ５５ｋおよびＥ４ｏｒｆ６は、Ｅ１ＢプロモーターおよびＥ４プロモーターの影響下においてｄｌ５２０感染ＹＢ−１核陽性の細胞においてのみ発現し、ＸｖｉｒＰＳＪＬにおけるＥ１Ｂ５５ｋおよびＥ４ｏｒｆ６の発現はサイトメガロウイルス（ｃｍｗ）プロモーターによって起こる。一方で、ｃｍｗプロモーターの代わりに、他のプロモーター、特に腫瘍特異的、組織特異的、器官特異的プロモーターおよび天然型Ｅ１Ａプロモーター、即ち、特に野生型アデノウイルスに存在するＥ１Ａプロモーター、特にＡｄ５を使用可能である。Ｅ１Ｂ５５ｋおよびＥ４ｏｒｆ６の発現のために、過剰発現したＹＢ−１および調節解除されたＹＢ−１はそれぞれ核内に輸送され、アデノウイルスの複製が開始する。本明細書で開示されるＸｖｉｒＰＳＪＬグループのアデノウイルスベクターは、このように様々なエレメント、ひいては単一のベクター内のアデノウイルスベクターｄｌ５２０、Ｘｖｉｒ０３、ＡｄＹＢ−１の機能を組み合わせる。ｄｌ５２０ベクターと同様に、ＸｖｉｒＰＳＪＬウイルスはＥ１Ａ１２Ｓ遺伝子を含む。該遺伝子および対応する遺伝子産物はそれぞれ感染細胞のＳ期の誘導に関与しており、ウイルス複製および化学療法薬および放射照射の作用を促進させる。Ｘｖｉｒ０３と同様に、ＸｖｉｒＰＳＪＬウイルスは発現カセットＣＭＶ−Ｅ４ｏｒｆ６／ＩＲＥＳ／Ｅ１Ｂ５５ｋを含んでおり、これは効率的な複製、および好ましくは腫瘍細胞内に含まれる調節解除されたＹＢ−１の間接的または直接的な核内輸送に必要となる。このように、複製はＹＢ−１が過剰発現している、もしくは調節解除されたされている細胞、特に腫瘍細胞内において可能である。また、ｐ５３はＥ１Ｂ５５ｋ／Ｅ４ｏｒｆ６複合体による分解の対象となる。ヒト転写因子ＹＢ−１をコード化する配列をＡｄＹＢ−１ウイルスから取る。内因性、即ち、細胞内に既に存在するＹＢ−１がウイルス複製を増幅させる。Ｅ１Ａ１２ＳおよびＹＢ−１いずれの発現もＹＢ−１依存性アデノウイルスＥ２後期プロモーターによって制御される。また、これと関連して、一実施態様の場合、特異的プロモーター、特に腫瘍特異的、組織特異的、器官特異的プロモーターを使用可能である0。これらのウイルスの別の特徴は、Ｅ４領域が欠失していることである。ベクターはここに制限酵素認識部位を含んでおり、これによって、リボザイム、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、アポトーシス誘導遺伝子、サイトカイン、プロドラッグ遺伝子など、本明細書で開示される様々なトランス遺伝子が発現可能となる。これらの発現も本明細書で開示される腫瘍特異的、組織特異的、器官特異的プロモーターによって制御可能である。発現カセットの局在は、特にＥ１、Ｅ３、Ｅ４領域と関連して、もしくはＥ１、Ｅ��、Ｅ４領域内において固定されていないが、任意の方法で配置可能である。ベクターはｐ５３またはＲｂとは無関係に腫瘍細胞内において複製する。
【０５１４】
組換えアデノウイルス、ＸｖｉｒＰＳＪＬ１およびＸｖｉｒＰＳＪＬ２の構造設計は図２７、２８に示されている。
【０５１５】
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のシステムに従ったＸｖｉｒＰＳＪＬベクターの作成
Ｅ２後期ＹＢ１ＩＲＥＳ／１２Ｓカセットの作成
本明細書における出発材料として使用される、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ／ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のｐＡｄｅｎｏＸプラスミドは、アデノウイルスＡｄ５のゲノム核酸を含み、野生型アデノウイルスにはない３′ＩＴＲ領域の後方にＳｆｕＩ制限酵素切断部位を有する。ＳｐｅＩ（２３６４４位）およびＳｆｕＩによってｐＡｄｅｎｏＸ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＥ３−Ｅ４領域をｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロｇｅｎ）に移入して、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｅ３Δ２７８６５−３０９９５−Ｅ４と呼んだ。Ｅ４ＯＲＦ６の大部分、即ち、３３２４１−３３８７５塩基をＰｓｔＩで除去した。得られた該断片は、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｅ３Δ２７８６５−３０９９５、Ｅ４Δ３３２４１−３３８７５と呼んだ。
【０５１６】
Ｅ２後期プロモーターはｐＧＬ３−ＥＧＦＰからＳａｃＩおよびＮｈｅＩで切り出して、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｅ３Δ２７８６５−３０９９５、Ｅ４Δ３３２４１−３３８７５にクローニングした。この過程で、Δ２７５９３−３１５０９塩基の領域のＥ３領域をさらに欠失させた。このようにして得られた断片は、Ｅ２後期ｐｃＤＮＡ３．１−Ｅ３Δ２７５９３−３１５０９、Ｅ４Δ３３２４１−３３８７５と呼んだ。
【０５１７】
ＲＴ−ＰＣＲを用いてＥ１Ａ−２４３ＡＡ産物のｃＤＮＡを作成して、単離して、配列を確認して、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを使用してｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（インビトロｇｅｎ）にクローニングした。Ｅ１Ａ−１２Ｓ−ｐｃＤＮＡ３．１＋をＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩで線状化して、Ｔ４ポリメラーゼで平滑末端にして、ＴａｑポリメラーゼおよびｄＮＴＰｓによってＴ突出を作った。ＰＣＲ産物（鋳型＝ｐＣＩＴＥ、Ｎｏｖａｇｅｎ）としてＩＲＥＳエレメントをＥ１Ａ−１２Ｓ−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターにクローニングした（ＴＡクローニング法）。
【０５１８】
ｐＨＶａｄ２ｃベクター（Holm et al., JBC 2002, 277, 10427-10434）からＹＢ−１−ＥｃｏＲＩ断片を単離して、平滑末端にした。ｐＳｈｕｔｔｌｅベクター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから市販）をＸｂａＩで線状化して、末端を平滑末端にして、脱リン酸化させて、以前に作成したＹＢ−１をコード化する核酸と連結させた。このようにして得られたベクターはＹＢ−１ｐＳｈｕｔｔｌｅと呼ばれる。ｐＳｈｕｔｔｌｅベクターへのクローニングによって、インフレームで停止コドンを伴うＹＢ−１断片をコードする核酸をもたらした。ＹＢ−１をコード化する核酸をＮｈｅＩおよびＢｆｒＩを用いてＹｂ−１ｐＳｈｕｔｔｌｅからｐｃＤＮＡ３．１内のＩＲＥＳ−Ｅ１Ａ−１２Ｓベクターにクローニングした。このようにして得られた断片をＹＢ−１（ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ  ｗｉｔｈ  ＳＴＯＰ  ｃｏｄｏｎ）−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ａ−１２Ｓ−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）と呼んだ。
【０５１９】
次に、ＹＢ−１−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ａ１２ＳをＰｍｅＩで切り出して、ＮｈｅＩで線状化して、平滑末端にし、脱リン酸化したＥ２ｌａｔｅ−ｐｃＤＮＡ３．１Ｅ３Δ２７５９３−３１５０９、Ｅ４Δ３３２４１−３３８７５ベクターにクローニングした。このように、第二のカセットはＥ３領域内の欠失領域内にある。
【０５２０】
核酸コンストラクトＥ２ｌａｔｅ−ＹＢ−１−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ａ１２Ｓを含むトランス遺伝子をＳｆｕＩおよびＳｐｅＩを用いて残りのアデノウイルス配列Ｅ３Δ２７５９３−３１５０９、Ｅ４Δ３３２４１−３３８７５と共にＣｌｏｎｔｅｃｈ社のｐＡｄｅｎｏＸベクターにクローニングした（＝ＡｄｅｎｏＸ／Ｅ２ｌａｔｅ−ＹＢ−１−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ａ１２Ｓ／Ｅ３Δ２７５９３−３１５０９、Ｅ４Δ３３２４１−３３８７５）。
【０５２１】
ＣＭＶ−Ｅ１Ｂ５５ｋ／ＩＲＥＳ／Ｅ４ｏｒｆ６カセットをＩ−ＣｅｕＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩを用いてＸｖｉｒ０３と関連する上記のｐＳｈｕｔｔｌｅから切り出して、ＡｄｅｎｏＸ／Ｅ２ｌａｔｅ−ＹＢ−１−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ａ１２Ｓ／Ｅ３Δ２７５９３−３１５０９、Ｅ４Δ３３２４１−３３８７５に挿入した。
【０５２２】
次に、ベクターをＰａｃＩで線状化して、２９３細胞内にトランスフェクションさせて、使用説明書に従って、図中に示されるトランス遺伝子を持たない組換えアデノウイルスＸｖｉｒＰＳＪＬ１およびＸｖｉｒＰＳＪＬ２を単離した。
【０５２３】
本発明のアデノウイルス、好ましくは組換えアデノウイルス、特にＥ４ｏｒｆ６−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂ５５ｋおよびＥ１Ａ１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１カセットをそれぞれ別々および／または共に含むアデノウイルスの作成のためにＱＢＩＯＧＥＮＥおよびＭＩＣＲＯＢＩＸ社のシステムなど他のシステムを使用可能であることは本開示の観点から、本発明の範囲内であり、当業者に実施可能である。また、個々のトランス遺伝子は個々のカセット、特に各カセット間で交換可能である。また、Ｅ１Ａ１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１カセットはＥ１Ａ１２Ｓのみからなり、および／またはＥ１Ａ１２Ｓは、他の関連遺伝子とＩＲＥＳを介して連結可能である。
【０５２４】
ＡｄＥＡＳＹシステムによる欠失Ｅ３領域内のＥ１Ａ１２Ｓを伴うアデノウイルスＡｄＰＳＪＬ−Ｅ２−ｌａｔｅプロモーター１２Ｓ−ＡｄＥＡＳＹの作成（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ社）
ＰＳＪＬ１２Ｓのクローニング
まず、Ｅ２後期プロモーターを対合オリゴヌクレオチド
【表１２】
0005584393.tif 000013
としてのｐＧＬ３エンハンサープラスミド（ｐＧＬ３−Ｅ２−ｌａｔｅ）のＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌＩＩ切断部位にクローニングした。
【０５２５】
次に、ＮｃｏＩおよびＸｂａＩを使用してルシフェラーゼ遺伝子を切り出して、平滑末端にして、Ｔ末端を付加した。Ｅ１Ａ１２Ｓフォワードプライマー
【表１３】
0005584393.tif 000014
およびＥ１Ａ１２Ｓバックワードプライマー
【表１４】
0005584393.tif 000015
によって増幅させたトランス遺伝子Ｅ１Ａ１２Ｓを上記のとおりに開環させた部位にＴＡクローニングによって導入した。
【０５２６】
ＰｖｕＩおよびＣｌａＩを使用してこのカセットを切り出して、末端を平滑にして、Ｅ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹのＥ３領域内の平滑末端にした脱リン酸化ＮｈｅＩ切断部位にクローニングした。したがって、該カセットはＥ２後期プロモーター、オープンリーディングフレームＥ１ａ−１２Ｓ、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルを含む。結果として得られたコンストラクトは、Ｅ２−ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２Ｓ−Ｅ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹである。
【０５２７】
次に、ＳｐｅＩおよびＰａｃＩを使用してＥ２−ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２Ｓ−Ｅ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹからＥ２−ｌａｔｅ−Ｅ１ａ１２Ｓ−Ｅ３Ｅ４を切り出し、ＳｐｅＩおよびＰａｃＩで切断したｐＡｄＥＡＳＹにクローニングした。このようにして得られたコンストラクトをＥ２−ｌａｔｅ−Ｅ１ａ１２Ｓ−Ｅ３−Ｅ４−ｐＡｄＥＡＳＹと呼んだ。
【０５２８】
ｐＳｈｕｔｔｌｅＡｄＥＡＳＹおよびＥ２−ｌａｔｅ−Ｅ１ａ１２Ｓ−Ｅ３Ｅ４−ｐＡｄＥＡＳＹ内のＸｖｉｒ−３′ＵＴＲプラスミドでのＢＪ５１８３（ＥＣ）細菌の形質転換時の相同組換えによってＡｄＰＳＪＬ−１２Ｓ−ＡｄＥＡＳＹを作成した。
【０５２９】
ＡｄＥＡＳＹシステムを使用した、欠失Ｅ３領域内のＥ１Ａ１２ＳおよびＹＢ−１を伴うアデノウイルスＡｄＰＳＪＬ−Ｅ２ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ１２Ｓ−ＹＢ−１−ＡｄＥＡＳＹの作成（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ社）
【０５３０】
Ｅ４ＯＲＦ６−ＩＲＥＳ−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）のクローニング
次に、増幅産物Ｅ１ａ１２Ｓ（上記）およびＩＲＥＳエレメント（上記）をｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターのマルチクローニングサイトにクローニングした。この目的のために、Ｅ１ａ−１２Ｓ増幅産物をＴＡクローニングによって平滑末端にしたＢａｍＨＩ切断部位に導入した。次に、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）内のＥ１ａ−１２ＳプラスミドをＥｃｏＲＶで線状化して、Ｔ末端を付加し、増幅産物をＩＲＥＳエレメント内にクローニングした。次に、このようにして得られたプラスミドをＸｈｏＩで線状化させて、末端を平滑化させ、停止コドンを持たないＹＢ−１のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ切断産物。
【０５３１】
このようにして作成されたコンストラクトＥ１Ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）を、ＮｏｔＩを使用して線状化させて、末端を平滑化させた。また、ＹＢ−１ＥｃｏＲＩ切断産物を平滑末端にして、脱リン酸化ベクターＥ１Ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）に導入した。ＰｍｅＩを使用してＥ１Ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１カセットを取り除き、Ｎｃｏ１およびＸｂａＩでルシフェラーゼ遺伝子を除去して、平滑末端にし、脱リン酸化後、上記のｐＧＬ３−Ｅ２−ｌａｔｅにクローニングした。
【０５３２】
ＰｖｕＩおよびＣｌａＩを使用してＥ２−ｌａｔｅ−Ｅ１Ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１カセットを切り出し、末端を平滑化して、Ｅ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹのＥ３領域内の平滑末端にした脱リン酸化ＮｈｅＩ切断部位にクローニングした。このようにして得られたコンストラクトがＥ１−ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｅ１Ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１−Ｅ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹである。
【０５３３】
次に、ＳｐｅＩおよびＰａｃＩによってＥ２ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｅ１Ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１−Ｅ３Ｅ４カセットをＥ２−ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｅ１Ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１−Ｅ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹから切り出した。結果として得られるコンストラクトをＥ１ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１−Ｅ３Ｅ４−ｐＡｄＥＡＳＹと呼んだ。
【０５３４】
ｐＳｈｕｔｔｌｅＡｄＥＡＳＹおよびＥ１ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１−Ｅ３Ｅ４−ｐＡｄＥＡＳＹ内のＸｖｉｒ−３′ＵＴＲプラスミドでのＢＪ５１８３（ＥＣ）細菌の形質転換時の相同組換えによってＡｄＰＳＪＬ−１２Ｓ−Ｙｂ−１−ＡｄＥＡＳＹを作成した。
【０５３５】
Ｅ４領域内のＥ２ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｅ１Ａ−１２Ｓおよび（または）Ｅ２−ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｅ１Ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１カセットのクローニング
ＰｓｔＩを使用したＥ４領域の操作および欠失後、６３４ｂｐを取り除いた。Ｅ２ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｅ１Ａ−１２Ｓおよび（または）Ｅ２−ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｅ１Ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１カセットをＥ４領域内に導入可能である。代わりに、Ｅ４領域を該条件下で完全なままにすることもできる。
【０５３６】
ＲＧＤモチーフのクローニング
感染性を向上させるために、ｆｉｂｒｅ  ｋｎｏｂドメインのＨＩループを以下のDmitriev et al. 1998（An Adenovirus Vector with Genetically Modified Fibers Demonstrates Expanded Tropism via Utilization of a Coxsachievirus and Adenovirus Receptor-Independet Cell Entry Mechanism）に従って改変させた。プライマー
【表１５】
0005584393.tif 000016
を使用して各領域を増幅させて、これによってＥｃｏＲＶ切断部位を作成した。この切断部位内に、
【表１６】
0005584393.tif 000017
をコードする対合オリゴヌクレオチドをクローニングした。これによって、ｆｉｂｒｅ  ｋｎｏｂドメインのＨＩループ内にＲＧＤモチーフが含まれる。
【０５３７】
実施例２１：アデノウイルスｄｌ５２０によるＨｅＬａ細胞の感染
シャーレ１枚当たり１００，０００個のＨｅＬａ細胞を播種した。翌日、様々な力価（ｐｆｕ／ｍＬ）のアデノウイルスｄｌ５２０を細胞に感染させた。感染は５００μＬ無血清ＤＭＥＭ培地中で３７℃１時間実施された。次に、感染用培地を取り除いて、２ｍＬの完全培地（１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ）と交換した。３−５日後にクリスタルバイオレット染色法を使用して分析を実施した。
【０５３８】
この実験の結果は、図２３に示されている。アデノウイルスｄｌ５２０は、核内にＹＢ−１を持たないＨｅＬａ細胞の感染時に低ＭＯＩｓ（５−１０ｐｆｕ／細胞）では溶解を示さなかった。これとは対照的に、ｄｌ５２０は、ＹＢ−１核陰性の細胞内では複製せず、同時に本発明に従ったトランス活性化癌遺伝子タンパク質のＥ１Ａをコードし、１００−２００ｐｆｕ／細胞のＭＯＩ（感染の多重度）で実際に完全な溶解を示し、５０ｐｆｕ／細胞のＭＯＩでも依然として顕著な溶解を示した。このことからより高いＭＯＩでアデノウイルス遺伝子Ｅ１Ｂ５５ｋおよびＥ４ｏｒｆ６のスイッチを入れることの可能なｄｌ５２０および同様のウイルスが、過剰発現した、もしくは調節解除されたＹＢ−１の直接的または間接的な核内輸送ひいては細胞溶解の誘導に適していると結論付けることができる。
【０５３９】
実施例２２：Ｅ２後期プロモーター活性の測定のためのルシフェラーゼアッセイ
ＹＢ−１は核内のアデノウイルスＥ２後期プロモーターに結合して（Holm et al., JBC 2002, 277, 10427-20434）、このプロモーターも核酸の発現に適していることが知られている。アデノウイルスＥ２後期プロモーターの使用は、特にこれがＹＢ−１によって制御可能であるとの事実が理由となっており、ＹＢ−１は正のエフェクタ−として作用する、即ち、プロモーターはＹＢ−１の存在下でのみ活性である。この範囲において、該アデノウイルスＥ２後期プロモーターはより高い選択性をもって制御可能であり、ひいてはＹＢ−１が核内に存在して、ＹＢ−１がエフェクタ−および調節因子として存在しない場合、アデノウイルスの制御下にある核酸のいかなる発現も実際に回避させるシステムにおいて使用可能である。Ｅ２後期プロモーターは、Ｅ２遺伝子の活性化と関連する３Ｙボックス（ＣＡＡＴ）を含む。異なるＥ２後期プロモーターの構築を比較して、それらの特異性および活性を調べた。以下のとおりに分析を実施した。
【０５４０】
ＹＢ−１を核内に有するＥＰＧ−２５７ＲＤＢ（上皮性胃癌）、ＨｅＬａ（上皮性子宮頸癌）、Ｕ２ＯＳ（骨肉腫）細胞株を３つの異なる細胞濃度で６ウェルプレートに播種した。翌日に７０％コンフルエンスを示したウェルをトランスフェクションに使用した。各ウェルについて、ルシフェラーゼベクター内（Ｐｒｏｍｅｇａから市販；出発プラスミド：ｐＧＬ３エンハンサー）の異なるＥ２後期プロモーターコンストラクトのＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した５００ｎｇのプラスミドＤＮＡを、１．５ｍＬロッキングキャップ反応容器内の５００μＬのＯｐｔｉＭＥＭおよび別のロッキングキャップ反応容器内の５μＬのＤＯＴＡＰに加えた。両方の溶液を合わせて、混和した。混和液を３０分間室温でインキュベーションさせて、複合体を形成させた。細胞をＰＢＳで３回洗い、トランスフェクション混合液の層で覆った。プレートを３７℃で５時間培養させて、再度ＰＢＳで３回洗い、完全培地を加えた。
【０５４１】
感染後、細胞をＰｒｏｍｅｇａ社のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋｉｔ（カタログＮｏ．Ｅ１５００）で４８時間処理した。各ウェルに５００μＬの溶解バッファーの層を加えて、室温で１０分後に１ｍＬピペットで細胞をウェルプレートから洗い落とし、１．５ｍＬのロッキングキャップ反応容器に移した。次に細胞の溶解液を４℃、１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。各５０μＬの上精に、１００μＬのルシフェラーゼ基質を加えて、９６ウェルのブラックプレート内でＴｏｐＣｏｕｎｔ（Canberra-Packard GmbH, 63303 Dreieich）Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ＆Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅカウンターを用いて波長９４５ｎｍで測定した。
【０５４２】
ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（カタログＮｏ．２３２２７；ＰＩＥＲＣＥ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，  ＵＳＡ）を用いてＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社のＢｉｏｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（ＢｉｏｌｕｍｉｎＴＭ９６０）Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ／Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅプレートリーダー内において５７０ｎｍでタンパク質を測定した。サンプルの相対的光シグナルをタンパク質量（ＲＬＵ／μｇタンパク質）に変換した。
【０５４３】
以下のプラスミドを使用した：ＢａｍＨＩ（２２５０ｂｐ）およびＢｓａＢＩ（２００３ｂｐ）を用いてエンハンサーを取り除いたｐＧＬ３−ｅｎｈａｎｃｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をブランクリーディングに使用した。制限酵素切断部位ＡｐａＩおよびＳａｃＩを用いて、エンハンサーを欠くｐＧＬ３ベクターのＭＣＳに様々なＥ２プロモーターコンストラクトをクローニングした。ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いてｐＧＬ３エンハンサー内にｈＣＭＶプロモーターをクローニングして、ポジティブコントロールとして使用した。ポジティブコントロールによってトランスフェクション効率の推定が可能となり、ルシフェラーゼ活性の参照値としての役割も果たした。各細胞株について、ＣＭＶコントロールを１００％に設定して、Ｅ２プロモーターコンストラクトがもたらす酵素活性をこれとの関係において、図２４の棒グラフで示した。
【０５４４】
様々なコンストラクトを以下のとおり参照した：
１．２５９３２−２６１７９ｂｐの塩基に対応するＹボックスＩ、ＩＩ、ＩＩＩを含む（野生型アデノウイルスの配列を参照。次に与えられるアデノウイルスＥ２領域の一部も参照）。
２．２５９３２−２６１２７ｂｐの塩基に対応するＹボックスＩＩ、ＩＩＩを含む（野生型アデノウイルスの配列を参照。次に与えられるアデノウイルスＥ２領域の一部も参照）。
３．２５９３２−２６００４ｂｐの塩基に対応するＹボックスＩＩＩを含む（野生型アデノウイルスの配列を参照。次に与えられるアデノウイルスＥ２領域の一部も参照）。
４．ブランクリーディングとして機能するＹボックスを含まない。
【０５４５】
アデノウイルスＥ２領域の一部（Virology 1992, 186, 280-285）（ＹＢ−１結合部分を太字で印刷している）
【表１７】
0005584393.tif 000018
【０５４６】
図３０に示される結果は、異なるＥ２後期／Ｙボックスを含む個々のプロモーター断片が、ＹＢ−１核陽性の腫瘍細胞内において治療用トランス遺伝子の発現に適しており、ひいては本発明の意味においてプロモーターとして使用可能であることを見事に確認している。
【０５４７】
実施例２３：粒子の放出時にアデノウイルスによって発現されるＹＢ−１の作用
Ｅ１／Ｅ３の欠失したＡｄＹＢ−１およびＥ１Ａのみが欠失したＡｄ３１２アデノウイルスベクターを５０ｐｆｕ／細胞のＭＯＩでヒト骨肉種細胞（Ｕ２ＯＳ）に感染させた。ＡｄＹＢ−１はそのゲノム中に細胞の転写因子ＹＢ−１をコードする配列を含み、ひいてはＹボックス結合タンパク質１（ＹＢ−１）を発現する。感染後に「プラーク形成単位（ｐｆｕ）」としてウイルス粒子の放出を評価するために、感染後２、５日目に培地の上精または残りの細胞層を単離した。３サイクルの凍結融解によって細胞内粒子を放出させた。プラークアッセイを利用して２９３個の細胞に関する粒子数を分析した。
【０５４８】
結果を図３１に示しており、黒棒は細胞内に残るウイルス粒子を示しており、縞模様の棒は放出された細胞外ウイルス粒子を示している。
【０５４９】
図３１に示される結果は、ＡｄＹＢ−１が全体としてＡｄ３１２よりも高いｐｆｕをもたらし、より多くの粒子を放出することを確認している。５日後、Ａｄ３１２感染細胞とは対照的に、ＡｄＹＢ−１感染細胞は細胞変性作用（ＣＰＥ）を明確に示している。
【０５５０】
図３２は、Ｅ２ＦおよびＹＢ−１を介したＥ２後期プロモーターおよびＥ２初期プロモーターによるアデノウイルスのＥ２領域の制御の略図を示している。図１には、関与するプロモーター、Ｅ２初期プロモーターおよびＥ２後期プロモーターを、Ｅ２ＦおよびＹＢ−１による結合および活性化に関してそれぞれ表している。野生型Ｅ１Ａタンパク質はＥ２Ｆの網膜芽細胞腫タンパク質Ｒｂへの結合を阻害する。このようにして放出されたＥ２ＦはＥ２初期プロモーターに結合して、これによってアデノウイルスの複製を誘導する。８−１２時間後、Ｅ２後期プロモーターへのいわゆるスイッチが生じる。これは、ＹＢ−１の細胞質から核内への転位時にのみ可能となる。核局在後、Ｅ２後期プロモーターへの結合によってＹＢ−１はＥ２遺伝子発現を活性化させる。
【０５５１】
Ｅ２Ｆ／ＲＢとＥ１Ａとの結合機序が媒介するＥ２Ｆの放出は、本発明の基礎となる機序とは根本的に異なる。先行技術において推測されるＲｂタンパク質からＥ２Ｆの放出は、アデノウイルスの複製に重大ではないプロセスとまでは言わないが、重要ではなく、しかしヒトの転写因子ＹＢ−１の核局在はアデノウイルスの複製にとって重大な要素である。この転写因子は細胞周期の大部分において正常細胞の細胞質にのみ存在する。アデノウイルスの感染後、この転写因子は異なる条件下で核内に誘導されるか、もしくは異なる腫瘍疾患（例、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、骨肉腫、膠芽腫、黒色腫、小細胞肺癌、結腸直腸癌など、しかしこれらに限定されるわけではない）などの特定の細胞系と関連して核内に既に存在している。
【０５５２】
実施例２４：アデノウイルスを発現する異なるタンパク質ＩＸの構築
図３３に示される野生型アデノウイルスのウイルス核酸の設計から始めて、本明細書で開示される様々な設計原理が、ＹＢ−１依存的に複製するアデノウイルス内のタンパク質ＩＸの発現のために実現されており、図３４、３５、３６、３７に示されている。全ての設計は、これらが天然型および野生型のそれぞれに存在するＥ１Ａプロモーターによって制御されるという意味でＥ１Ａ１３ＳマイナスおよびＥ１Ａ１２Ｓマイナスである点が共通している。
【０５５３】
図３４に示されるアデノウイルスＸｖｉｒ０５／プロモーターと関連して、タンパク質ＩＸが野生型に存在する調節コンテクストに含まれず、タンパク質ＩＸが発現しないという意味で、プロモーターはさらにＥ１Ｂ１９Ｋマイナス、タンパク質ＩＸマイナスである。むしろ、発現はＥ２後期プロモーターによって制御される。タンパク質ＩＸをＥ３領域内にクローニングしているが、原理上、Ｅ４領域にもクローニングできる。Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ４、ＭＬＰ遺伝子は依然として存在しており、発現も可能である。Ｅ４ｏｒｆ６およびＥ１Ｂ５５Ｋを含むトランスポーターは、ＣＭＶプロモーターの制御下にあるＥ４ｏｒｆ６−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂ５５Ｋカセットによって形成される。各カセットをＥ１領域にクローニングしているが、例えばＥ３、Ｅ４領域などの他の領域にもクローニングできる。
【０５５４】
図３５に示されるアデノウイルスＸｖｉｒ０５／Ｅ１Ａ１２Ｓでは、タンパク質ＩＸが野生型に存在する調節コンテクストに含まれず、タンパク質ＩＸが発現しないという意味で、アデノウイルスはさらにＥ１Ｂ１９Ｋマイナス、タンパク質ＩＸマイナスである。むしろ、発現はＥ２後期プロモーターによって制御されるＥ１Ａ１２Ｓによって生じ、これはＥ１Ｂ５５Ｋをコードする領域内に存在するタンパク質ＩＸのオープンリーディングフレームの活性化をもたらす。Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質はＥ３領域内にクローニングしているが、原理上、Ｅ４領域にもクローニングできる。Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ４、ＭＬＰ遺伝子は依然として存在しており、発現も可能である。Ｅ４ｏｒｆ６およびＥ１Ｂ５５Ｋを含むトランスポーターは、ＣＭＶプロモーターの制御下にあるＥ４ｏｒｆ６−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂ５５Ｋカセットによって形成される。各カセットをＥ１領域にクローニングしているが、例えばＥ３、Ｅ４領域などの異なる領域にもクローニングできる。
【０５５５】
図３６に示されるアデノウイルスＸｖｉｒ０５／Ｅ１Ｂ１９Ｋでは、タンパク質ＩＸが野生型に存在する調節コンテクストに存在しないという意味で、アデノウイルスはさらにＥ１Ｂ１９Ｋマイナス、タンパク質ＩＸマイナスである。むしろ、発現は、ＣＭＶプロモーターの影響下で発現するＥ１Ｂ１９Ｋタンパク質によって制御され、Ｅ１Ｂ５５Ｋリーディングフレームに含まれるタンパク質ＩＸのリーディングフレームの発現を可能にする。Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、ＭＬＰ遺伝子は依然として存在しており、発現も可能である。Ｅ４ｏｒｆ６およびＥ１Ｂ５５Ｋを含むトランスポーターは、ＣＭＶプロモーターの制御下にあるＥ１Ｂ領域のＥ４ｏｒｆ６−ＲＳＶプロモーターカセットによって形成される。各カセットをＥ１領域にクローニングしているが、例えばＥ３、Ｅ４領域などの異なる領域にもクローニングできる。
【０５５６】
図３７に示されるアデノウイルスＸｖｉｒ０５／Ｅ３−ＩＸでは、Ｅ１Ｂ１９Ｋタンパク質が野生型アデノウイルスに存在する調節コンテクストに存在せず、タンパク質ＩＸが発現しないという意味で、アデノウイルスはさらにＥ１Ｂ１９Ｋマイナス、タンパク質ＩＸマイナスである。むしろ、発現は天然型Ｅ３プロモーターによって制御される。Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ４、ＭＬＰ遺伝子は依然として存在しており、発現も可能である。Ｅ４ｏｒｆ６およびＥ１Ｂ５５Ｋを含むトランスポーターは、ＣＭＶプロモーターの制御下にあるＥ４ｏｒｆ６−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂ５５Ｋカセットによって形成される。各カセットをＥ１領域にクローニングしているが、例えばＥ３、Ｅ４領域などの異なる領域にもクローニングできる。
【０５５７】
図３８−４１は、本発明のアデノウイルスのさらなる実施態様を示している。
【０５５８】
図３８に示されるウイルスは、図３６に示されるＸｖｉｒ０５／Ｅ１Ｂ１９Ｋアデノウイルスの別の開発物である。Ｘｖｉｒ０５／Ｅ１Ｂ１９Ｋに加えて、このウイルスは、Ｅ１Ａ１２Ｓ、ＹＢ−１、そしてこれらをコードする核酸を含むＥ２後期プロモーターの制御下にあるカセットを示し、ここでは両方のリーディングフレームはＩＲＥＳによって隔てられている。一実施態様では、ＹＢ−１をコードする核酸がカセットに含まれないことが予想される。ウイルスによって発現されるＹＢ−１の核酸は、調節解除されたＹＢ−１を有する細胞内においてさらに顕著な複製をもたらす。
【０５５９】
図４０に示されるアデノウイルスは、図３５に示されるアデノウイルスをさらに発展させたものであり、Ｅ２後期プロモーターの制御下にあるカセットは、Ｅ１Ａ１２Ｓ、ＹＢ−１、そしてこれらをコードする核酸からなり、Ｅ４領域にクローニングされ、いくつかのトランス遺伝子（例、アポトーシス誘導遺伝子、プロドラッグ遺伝子、ｓｉＲＮＡ、腫瘍抑制遺伝子、サイトカインなど）はＥ３プロモーターの制御下にあるＥ３領域にクローニングされる。代わりに、本明細書で開示される様々なトランス遺伝子をこの領域にクローニングできる。
【０５６０】
図４１に示される本発明のアデノウイルスは、図４０に示されるアデノウイルスを最終的にさらに発展させたものであり、これと関連して、ＲＧＤモチーフがクローニングによって導入されており、これはウイルスのターゲティングに有利である。それは、およそ３２５７６−３２６８５位の範囲内にある繊維タンパク質内のアデノウイルスゲノム内に存在する。正確な位置づけに関するこのバラツキは、野生型アデノウイルスの配列が様々なデータバンクおよびデータバンク入力において異なり、様々な長さを有するという事実に起因する。
【０５６１】
図３９に示される本発明のアデノウイルスは、図３６に示されるアデノウイルスに基づいている。しかし、対照的に、このアデノウイルスはＥ４ｏｒｆ６およびＥ１Ｂ５５Ｋを含むカセットを含まず、両者は異なるプロモーター、即ち、ＣＭＶプロモーターおよびＲＳＶプロモーターによって制御される。クローニングはＥ１領域内に施されている。また、アデノウイルスは、Ｅ２後期プロモーターの制御下にあるＥ１Ａ１２Ｓをコード化する核酸とは別に、依然としてタンパク質ＩＸをコードする別の核酸を含み、これはＩＲＥＳによりＥ１Ａ１２Ｓをコードする核酸とは隔てられている。また、このカセットも原理上タンパク質ＩＸをコード化する核酸を欠くことができる。可能な別の一態様では、カセットをＥ４領域にクローニングできる。最後に、このウイルスは依然としてＥ３またはＥ４領域内に図８に示されるウイルスと関連して記載されているトランス遺伝子を含むことができる。これらのウイルスの別の一態様では、ＲＧＤモチーフが含まれる。
【０５６２】
実施例２５：タンパク質ＩＸ発現の検出
ＹＢ−１が媒介する複製における効果的な粒子形成におけるタンパク質ＩＸの発現の重要性を確認するために、この実験を実施した。したがって、先行技術において記載され、図５０に示される、腫瘍退縮ＹＢ−１依存的に複製中のアデノウイルスＸｖｉｒ０３−３′ＵＴＲを使用している。
【０５６３】
実験は以下のとおりに実施した：１０ｃｍの各シャーレに、１０６個の２９３、２５７ＲＤＢ細胞を播種した。翌日、図１０に示すとおり、細胞は未感染（Ｋ）、野生型アデノウイルス感染、またはＸｖｉｒ０３感染のいずれかであった。１．５ｍＬの無血清ＤＭＥＭ培地中で３７℃１時間、感染させた。次に、感染用培地を取り除いて、１０ｍＬの完全培地（１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ）と交換した。２４−４８時間後にＲＮＡを単離した。次に、ノーザンブロット解析を実施した。この目的のために、各１０μｇのＲＮＡサンプルを３％ホルムアルデヒドアガロースゲル中で電気泳動的に分離させ、ナイロンメンブレン上にブロッティングし、特異的な３８６ｂｐのプローブとハイブリダイズさせた。プローブとして、ＰＣＲを利用して作成された、タンパク質ＩＸに対する３２Ｐ標識プローブを使用した。以下のプライマーをＰＣＲに使用した：
【表１８】
0005584393.tif 000019
野生型アデノウイルスゲノム内のプローブの位置は３６４８−４０３３位である。使用したウイルスは、タンパク質ＩＸを発現しないＸｖｉｒ０３である。
【０５６４】
実験結果を図４２に示している。
【０５６５】
図４２から読み取れるように、ウイルスＸｖｉｒ０３−３′ＵＴＲは、野生型アデノウイルスと比較して、腫瘍細胞２５７ＲＤＢ内において発現の低下を示した。Ｅ１Ａタンパク質およびＥ１Ｂタンパク質、特にＥ１Ｂ１９Ｋタンパク質も発現する２９３細胞内では、十分なタンパク質ＩＸが発現している。
【０５６６】
実施例２６：Ｘｖｉｒ０３−３′ＵＴＲベクターの組換え分析
１０ｃｍの各シャーレに、１０６個の２９３細胞を播種した。翌日、図４３に示すとおり、様々なアデノウイルスを細胞に感染させた。１．５ｍＬの無血清ＤＭＥＭ培地中で３７℃１時間、感染させた。次に、感染用培地を取り除いて、１０ｍＬの完全培地（１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ）と交換した。４８時間後にアルカリ溶解によってＤＮＡを放出させて、カラムで精製した。次に、２μｇのＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで切断した。サンプルを１−２％アガロースゲル中で電気泳動的に分離させ、ナイロンメンブレン上にブロッティングした。メンブレン上にブロッティングさせたＤＮＡを特異的な３８６ｂｐのプローブとハイブリダイズさせた。プローブとして、ＰＣＲを利用して作成されたタンパク質ＩＸに対する３２Ｐ標識プローブを使用した。以下のプライマーをＰＣＲに使用した：
【表１９】
0005584393.tif 000020
野生型アデノウイルスゲノム内でのプローブの位置は、３４６８−４０３３位の間である。結果は、アデノウイルスＸｖｉｒ０３が２９３細胞の感染後に組換えを起こさないことを示している。切断産物の大きさを図中に表している。
【０５６７】
実施例２７：２７５ＲＤＢ細胞内でのＭＲＰ発現解析 
１０ｃｍの各シャーレに、１０６個の２５７ＲＤＢ細胞を播種した。翌日、図４４に示される様々なアデノウイルスを細胞に感染させた。１．５ｍＬの無血清ＤＭＥＭ培地中で３７℃１時間、感染させた。次に、感染用培地を取り除いて、１０ｍＬの完全培地（１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ）と交換した。３−４日後にＲＮＡを単離した。次に、ノーザンブロット解析を実施した。この目的のために、各１０μｇのＲＮＡを３％ホルムアルデヒドアガロースゲル中で電気泳動的に分離させ、ナイロンメンブレン上にブロッティングし、特異的な３２Ｐ標識ＭＲＰプローブとハイブリダイズさせた。プローブは、ｐＣＲＩＩ−ＭＲＰプラスミドから制限酵素ＥｃｏＲＩによって作成した。結果は、アデノウイルスＸｖｉｒ０３がＡＢＣトランスポーターＭＲＰの発現を阻害可能であることを示している。
【０５６８】
実施例２８：２７５ＲＤＢ細胞内でのＭＤＲ発現解析
１０ｃｍのシャーレ１枚当たり１０６個の２５７ＲＤＢ細胞を播種した。翌日、図４５に示される様々なアデノウイルスを細胞に感染させた。１．５ｍＬの無血清ＤＭＥＭ培地中で３７℃１時間、感染させた。次に、感染用培地を取り除いて、１０ｍＬの完全培地（１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ）と交換した。３−４日後にＲＮＡを単離した。次に、ノーザンブロット解析を実施した。この目的のために、各１０μｇのＲＮＡを３％ホルムアルデヒドアガロースゲル中で電気泳動的に分離させ、ナイロンメンブレン上にブロッティングし、特異的な３２Ｐ標識ＭＤＲプローブ（Holm et al., British J. Cancer, 1994, 70, 239-243）とハイブリダイズさせた。結果は、アデノウイルスＸｖｉｒ０３がＡＢＣトランスポーターＭＤＲ１の発現を阻害可能であることを示している。
【０５６９】
実施例２９：ＤＵ１４５細胞内でのＭＲＰ発現解析
１０ｃｍのシャーレ１枚当たり１０６個のＤＵ１４５細胞を播種した。翌日、図４６に示される様々なアデノウイルスを細胞に感染させた。１．５ｍＬの無血清ＤＭＥＭ培地中で３７℃１時間、感染させた。次に、感染用培地を取り除いて、１０ｍＬの完全培地（１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ）と交換した。３−４日後にＲＮＡを単離した。次に、ノーザンブロット解析を実施した。この目的のために、各１０μｇのＲＮＡを３％ホルムアルデヒドアガロースゲル中で電気泳動的に分離させ、ナイロンメンブレン上にブロッティングし、特異的な３２Ｐ標識ＭＲＰプローブとハイブリダイズさせた。結果は、アデノウイルスＸｖｉｒ０３がＡＢＣトランスポーターＭＲＰの発現を阻害可能であることを示している。
【０５７０】
提示された実施例から、組換えアデノウイルスＸｖｉｒ０３が耐性関連遺伝子であるＭＲＰおよびＭＤＲ１の発現を抑制可能であることが読み取れる。これは、アデノウイルスの複製のためにヒト細胞の転写因子ＹＢ−１を集めるＥ４ｏｒｆ６およびＥ１Ｂ５５ｋを含む複合体によって完成する。したがって、本来ならＭＤＲ１遺伝子およびＭＲＰ遺伝子の発現に関与するこの転写因子は、もはやこれらの発現には利用できない。結果として、Ｘｖｉｒ０３感染後、ＭＲＰおよびＭＤＲ１タンパク質の発現が減少する。これは、例えばダウノルビシンなどの様々な細胞増殖抑制剤に対する腫瘍細胞の感作をもたらす（図９）。
【０５７１】
実施例３０：前立腺癌細胞ＤＵ１４５細胞およびＰＣ３細胞におけるＸｖｉｒ０３の溶解作用の説明
シャーレ１枚当たり１００，０００個のＤＵ１４５細胞およびＰＣ３細胞を播種した。翌日、図４７、４８に示される異なる濃度のＸｖｉｒ０３（ＰＦＵ／細胞）を細胞に感染させた。５００μＬの無血清ＤＭＥＭ培地中で３７℃１時間、感染させた。次に、感染用培地を取り除いて、２ｍＬの完全培地（１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ）と交換した。５−７日後、クリスタルバイオレット染色によって評価を実施した。この目的のために、まず培地を取り除いた。細胞にクリスタルバイオレット（５０％ＥＴＯＨ、３％ホルムアルデヒド、５％酢酸、１％クリスタルバイオレット）を重層して、室温で５−１５分間培養した。次に、プレートを水で十分に洗い、室温で乾燥させた。
【０５７２】
実験結果を図４７、４８に示している。アデノウイルスＸｖｉｒ０３は約３０−５０のＭＯＩで腫瘍細胞を溶解可能である。
【０５７３】
実施例３１：Ｘｖｉｒ０３感染による細胞増殖抑制剤ダウノルビシンの作用の増強
様々な細胞増殖抑制剤の添加によってヒト転写因子ＹＢ−１の核局在を誘導されることが先行技術において知られている。ＹＢ−１がＭＤＲ１およびＭＲＰ発現の活性化および調節に関与することも知られている。本発明者が見出しているように、Ｅ４ｏｒｆ６／Ｅ１Ｂ５５ｋ複合体を介したＹＢ−１の集合によって、ＡＢＣトランスポーターであるＭＲＰおよびＭＤＲ１の発現が抑制される。これによって細胞増殖抑制剤の有効性が増大される。
【０５７４】
腫瘍崩壊アッセイを実施するために、以下のように進めた：６ウェルプレートの各ウェルに１００，０００個の細胞（ＤＵ１４５）を播種した。翌日、１５ＰＦＵ／細胞を細胞に感染させた。２４時間後、示されたとおりにダウノルビシンを添加した。１５−２５時間の培養後、ダウノルビシンを含む培地を、細胞増殖抑制剤を含まない培地と交換した。さらに４−６日後、細胞をクリスタルバイオレット染色した。
【０５７５】
図４９から読み取れるように、腫瘍細胞のＸｖｉｒ０３感染は、ダウノルビシン単剤と比較して、ダウノルビシンとＸｖｉｒ０３との併用において、腫瘍細胞の増殖に対してより顕著な抑制作用をもたらした。
【０５７６】
実施例３２：組換えアデノウイルスＸｖｉｒ０５、Ｘｖｉｒ０５／タンパク質ＩＸ、Ｘｖｉｒ０５／０１、Ｘｖｉｒ０５／０２の構造
特にウイルスタンパク質Ｅ４ｏｒｆ６およびＥ１Ｂ５５ｋの発現は、ＣＭＶ−Ｅ４ｏｒｆ６発現カセットおよびＲＳＶ−Ｅ１Ｂ領域によってＸｖｉｒ０５ベクター内において保証されている。これは、ＹＢ−１の核転位をもたらす。Ｅ２後期プロモーターによって制御されるＹＢ−１遺伝子産物の他、Ｅ１Ａ１２Ｓ遺伝子産物はさらにウイルス複製を促進させる。また、ウイルスはＡＢＣトランスポーターであるＭＲＰおよびＭＤＲ１の発現を抑制可能である。また、タンパク質Ｅ１Ｂ１９Ｋおよびタンパク質ＩＸは、カセットＲＳＶ−Ｅ１Ｂ領域の構成要素として発現される。
【０５７７】
ベクターＸｖｉｒ０５のタンパク質ＩＸは、該ベクターの別の開発物である。ここでは、アデノウイルスのタンパク質ＩＸの発現が、発現カセットＥ２ｌａｔｅ−Ｅ１Ａ１２Ｓ−ＩＲＥＳ−タンパク質ＩＸによって保証される。該ベクターは完全なＥ１Ｂ領域を含まず、Ｅ１Ｂ５５ｋのオープンリーディングフレームのみを含む。
【０５７８】
ベクターＸｖｉｒ０５／０１内では、完全なＥ１Ｂ領域、即ち、Ｅ１Ｂ１９ｋ、Ｅ１Ｂ５５ｋ、タンパク質ＩＸが、例えばＲＳＶプロモーターなどのアデノウイルス以外のウイルスのプロモーターによって制御される。発現カセットＥ２ｌａｔｅ−Ｅ１Ａ１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１はＥ４領域内に存在する。したがって、特異的な治療用トランス遺伝子をＥ３領域内にクローニングできる。Ｅ３の欠失は、アデノウイルスのＡＤＰタンパク質（「アデノウイルス死タンパク質」）が依然として発現されるようになっている。また、Ｅ１Ａ１２ＳおよびＥ１Ｂ１９ｋの発現はタンパク質ＩＸの発現に影響を及ぼす。
【０５７９】
Ｘｖｉｒ０５／０２ベクターは、感染率を高めるために、さらにｆｉｂｒｅ  ｋｎｏｂのＨループ内にＲＧＤモチーフを含む。
【０５８０】
ウイルス作成は、以下のとおりに実施された：
レスキュープラスミドｐＡｄＥＡＳＹの改変（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社）
ΔＥ３Ｅ４シャトルベクターの作成のためのｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＡｄＥＡＳＹシャトルベクターの使用
最初にＣＭＶプロモーターおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルをこのｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＡｄＥＡＳＹベクターにクローニングした。この目的のために、プラスミドをＥｃｏＲＩで切断して、Ｔ４ポリメラーゼおよびｄＮＴＰｓを用いたフィリングによって末端を平滑化させ、骨格を脱リン酸化させて、生成した両方の消化産物を再連結させた。これによって制限酵素認識部位ＥｃｏＲＩを破壊した。このようにして得られたプラスミドをｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＥｃｏＲＩ）−ＡｄＥＡＳＹと呼んだ。
【０５８１】
次に、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のｐＳｈｕｔｔｌｅからＣＭＶ−ＭＣＳ−ポリＡカセットをＭｆｅＩおよびＥｃｏＲＩで切断して、末端を平滑化させ、この目的のためにＸｂａＩで線状化して、平滑末端にし、脱リン酸化させたｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＥｃｏＲＩ）−ＡｄＥＡＳＹベクターにクローニングした。このようにしてＣＭＶ−ＭＣＳ−ＰｏｌｙＡ−ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＡｄＥＡＳＹプラスミドを作成した。
【０５８２】
Ｅ３領域およびＥ４領域を操作するために、ＳｐｅＩおよびＰａｃＩを用いてｐＡｄＥＡＳＹプラスミドのΔＥ３Ｅ４領域をＣＭＶ−ＭＣＳ−ＰｏｌｙＡ−ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＡｄＥＡＳＹプラスミドにクローニングし、このようにしてΔＥ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＡｄＥＡＳＹプラスミドを作成した。ＮｄｅＩによる切断そして再連結によって、２つのＮｄｅＩ制限酵素認識部位の１つを消去して、ひいてはプラスミドからマルチクローニングサイトも消去した。この手順で、ΔＥ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹプラスミドを作成した。
【０５８３】
Ｅ４の操作
潜在的な治療用トランス遺伝子に空間を与え、目的以外の相同組換えを避けるために、ΔＥ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹプラスミドのＥ４領域を特異的に欠失した。この過程で、ＰｓｔＩによる切り出しおよび再連結によって、Ｅ４ｏｒｆ６領域を約６３４ｂｐだけ短縮させる（ΔＥ３Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹ）。組換えアデノウイルスの作成のための異なるシステムにおいて、各欠失は当業者によって実施可能である。
【０５８４】
ΔＥ３Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹ内のＲＧＤモチーフのクローニング
感染性を高めるために、ｆｉｂｒｅ  ｋｎｏｂドメインのＨＩループを以下のDmitriev et al. 1998（An Adenovirus Vector with Genetically Modified Fibers Demonstrates Expanded Tropism via Utilization of a Coxsachievirus and Adenovirus Receptor-Independet Cell Entry Mechanism）に従って改変させた。プライマー
【表２０】
0005584393.tif 000021
を使用して各領域を増幅させて、これによってＥｃｏＲＶ制限酵素部位を作成した。この制限酵素部位内に、
【表２１】
0005584393.tif 000022
をコードする対合オリゴヌクレオチドをクローニングした。ΔＥ３Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹ内のＨｐａＩおよびＢｆｒＩ切断部位を利用したクローニングによって、ΔＥ３−ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹを作成した。ｆｉｂｒｅ  ｋｎｏｂドメインのＨＩループ内にＲＧＤモチーフが存在する。
【０５８５】
ΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹのΔＥ３領域内のＥ３ａ領域のクローニング
この目的のために、インビトロｇｅｎ社のｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターをＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩで切断して、ＣＭＶプロモーターを取り除き、ベクターを再連結した（ＣＭＶを持たないｐｃＤＮＡ３．１（＋）＝ｏＣＭＶ）。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｏＣＭＶベクターのこれらのＳｐｅＩおよびＸｈｏＩ制限酵素部位を利用して、野生型ウイルスＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｏＣＭＶ／Ｅ３ａＸｈｏＩ）からＳｐｅＩ（２７０８３ｂｐ）およびＸｈｏＩ（２９７９２ｂｐ）で切り出した２７０９ｂｐの断片をクローニングした。代わりに、３′末端のＸｈｏＩではなくＨｐａＩ（３０５７０ｂｐ）で切断可能である。この目的のために、次にｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｏＣＭＶベクターをＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＶで切断して、これにアデノウイルスＳｐｅＩ−ＨｐａＩ断片をクローニングした（ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｏＣＭＶ／Ｅ３ａＨｐａＩ）。別の選択肢は、アデノウイルスの野生型ＤＮＡの２７１８ｂｐのＥｃｏＲＩ断片（２７３３２ｂｐ−３００５０ｂｐ）であり、これはＥｃｏＲＩを使用して開環したｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｏＣＭＶ内にクローニングされる（ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｏＣＭＶ／Ｅ３ａＥｃｏＲＩ）。
【０５８６】
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｏＣＭＶ／Ｅ３ａを使用して、Ｅ３ａ領域をΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹベクターにクローニングできた。この目的のために、シャトルベクターΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹをＮｈｅＩで切断して、平滑末端にして、ＳｐｅＩでさらに切断した。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｏＣＭＶ／Ｅ３ａＸｈｏＩ由来のインサートをこの部位にクローニングした。この目的のために、プラスミドをＸｈｏＩで切断して、末端を平滑化して、さらにＳｐｅＩで切断した。このようにして切り出された断片を事前に切断したΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹプラスミドにクローニングした。
【０５８７】
ＳｐｅＩ−ＨｐａＩ断片（２７０８３ｂｐ−３０５７０ｂｐ）およびＥｃｏＲＩ断片（２７３３２ｂｐ−３００５０ｂｐ）を各ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｏＣＭＶ／Ｅ３ａから同じ方法で切り出して、クローニングによって転移可能である。
【０５８８】
代わりに、アデノウイルス５型の野生型ＤＮＡを鋳型に用いて、プライマー
【表２２】
0005584393.tif 000023
を使用したＰＣＲによってＥ３ａ領域を増幅可能である。Ｅ３ａリバースプライマーを使用して、ＮｈｅＩ切断部位を作成した。増幅産物をＳｐｅＩおよびＮｈｅＩで切断して、同様にＳｐｅＩおよびＮｈｅＩで切断したΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹにクローニングする。
【０５８９】
ＳｐｅＩ−ＨｐａＩ断片について
代わりに、アデノウイルス５型の野生型ＤＮＡを鋳型に用いて、プライマー
【表２３】
0005584393.tif 000024
を使用してＥ３ａ領域を増幅可能である。Ｅ３ａリバースプライマーを使用して、ＮｈｅＩ切断部位を作成した。増幅産物をＳｐｅＩおよびＮｈｅＩで切断して、やはりＳｐｅＩおよびＮｈｅＩで切断したΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹベクターにクローニングする。
【０５９０】
ＥｃｏＲＩ断片について
代わりに、アデノウイルス５型の野生型ＤＮＡを鋳型に用いて、プライマー
【表２４】
0005584393.tif 000025
を使用したＰＣＲによってＥ３ａ領域を増幅可能である。Ｅ３ａリバースプライマーを使用して、ＮｈｅＩ切断部位を作成した。増幅産物をＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩで切断して、やはりＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩで切断したΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹベクターにクローニングする。
【０５９１】
ΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹ内のｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｏＣＭＶ／Ｅ３ａからクローニングによってＥ３ａ領域を移転させることで、Ｅ３ａΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹを作成した。
【０５９２】
このようにしてクローニングされた領域は、Ｅ３ＡＤＰのオープンリーディングフレームまでのＥ３領域（２９７７２ｂｐ）、ひいてはＥ３プロモーター、ポリアデニル化シグナルを伴う完全なＥ３Ａ領域、１２．５Ｋ、Ｅ３６．７Ｋ、Ｅ３ｇｐ１９Ｋ、Ｅ３ＡＤＰの転写開始およびオープンリーディングフレームを含む。
【０５９３】
ＳｐｅＩ−ＸｈｏＩクローニングの場合、アデノウイルス５型のＤＮＡ配列と比較して、Ｅ３領域は２９７９６−３１５０９ｂｐ（＝１７１３ｂｐ）を欠失させた。
【０５９４】
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｏＣＭＶ／Ｅ３ａプラスミド内のＥ３プロモーターとＡＤＰのオープンリーディングフレームの間をさらに欠失させることができる。例えば、ＥｃｏＲＩＩ、ＢｓｉＷＩ、ＤｒａＩ、ＭｕｎＩによる２７５９６ｂｐと２９３５５ｂｐの間のさらなる切断によって、この間に位置する６．７Ｋおよびｇｐ１９Ｋのオープンリーディングフレームを取り除いて、ひいては別のトランス遺伝子を取り込むためのさらに１．８ｋｂのスペースをもたらすことができる。上記のＥ３ａ増幅産物は、対応する制限酵素によっても切断可能であり、先述のとおりにクローニングによって転移可能である。
【０５９５】
Ｅ２後期プロモーターの制御下にある第二の発現カセットＥ１ａ１２Ｓのクローニング
まず、Ｅ２後期プロモーターを対合オリゴヌクレオチド
【表２５】
0005584393.tif 000026
としてＰｒｏｍｅｇａ社のｐＧＬ３エンハンサープラスミド（ｐＧＬ３−Ｅ２Ｌａｔｅ）のＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌＩＩ切断部位にクローニングした。
【０５９６】
次に、ＮｃｏＩおよびＸｂａＩでルシフェラーゼ遺伝子を切り出して、末端を平滑化して、Ｔ末端を付加した。上記のとおりに開環させた部位に、プライマー
【表２６】
0005584393.tif 000027
を使用したＲＴ−ＰＣＲによって増幅させたトランス遺伝子Ｅ１Ａ１２ＳをＴＡクローニングによって導入した。
【０５９７】
したがって、該カセットはｐＧＬ３ベクターのＥ２後期プロモーター、オープンリーディングフレームＥ１ａ−１２Ｓ、ＳＶ−４０後期ポリアデニル化シグナルを含む。
【０５９８】
ＰｖｕＩおよびＣｌａＩを使用してこのカセットを切り出して、末端を平滑化して、任意でＥｃｏＲＩＩ、ＢｓｉＷＩ、ＤｒａＩ、ＭｕｎＩを欠失させたＥ３ａ領域内（Ｅ３６．７Ｋおよびｇｐ１９Ｋのオープンリーディングフレームの除去後、上記を参照）またはクローニングしたＥ４ＯＲＦ６の欠失内、例えば平滑末端にして脱リン酸化させたＢｆｒＩ切断部位にクローニング可能である。
【０５９９】
結果として得られたコンストラクトは、Ｅ３ａ／Ｅ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２Ｓ／ΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹまたはＥ３ａΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６／Ｅ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹである。
【０６００】
Ｅ２後期プロモーターの制御下にＹＢ−１を伴う第二の発現カセットＥ１ａ１２Ｓのクローニング
次に増幅産物Ｅ１ａ１２Ｓ（上記を参照）およびＩＲＥＳエレメント（Ｎｏｖａｇｅｎ社のｐＣＩＴＥ−４ａ（＋）を鋳型に、ＩＲＥＳフォワード＝
【表２７】
0005584393.tif 000028
およびＩＲＥＳリバース＝
【表２８】
0005584393.tif 000029
をｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（インビトロｇｅｎ）のマルチクローニングサイトにクローニングした。この目的のために、Ｅ１ａ−１２Ｓ増幅産物をＴＡクローニングによって平滑末端にしたＢａｍＨＩ制限酵素切断部位にクローニングした。次に、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）内のＥ１ａ−１２ＳプラスミドをＥｃｏＲＶで線状化して、Ｔ末端を付加し、ＩＲＥＳエレメントの増幅産物をクローニングした。このようにして作成されたコンストラクト、Ｅ１ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）をＮｏｔＩで線状化させて、平滑末端にし、やはり平滑末端にしたｐＨＶａｄ２ｃＣＭＶ／Ｓ４０＋Ｙｂ−１（Ｓｔｅｐｈａｎ  Ｂｅｒｇｍａｎｎ）のＹＢ−１ＥｃｏＲＩ切断産物も脱リン酸化ベクターＥ１Ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）に導入した。代わりに、タンパク質ＩＸのオープンリーディングフレームのＰＣＲ増幅産物、具体的にはプライマーＩＸ
【表２９】
0005584393.tif 000030
をＴ末端の付加後のＥ１ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターの平滑末端化させたＮｏｔＩ切断部位に導入可能である。
【０６０１】
カセットＥ１Ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１またはＥ１Ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳタンパク質ＩＸをＰｍｅＩで切り出して、ルシフェラーゼ遺伝子をＮｃｏＩおよびＸｂａＩで除去して、平滑末端化させ、脱リン酸化した後の上記ｐＧＬ３−Ｅ２Ｌａｔｅプラスミドにクローニングした。
【０６０２】
ＰｖｕＩおよびＣｌａＩを使用してこのカセットＥ２ｌａｔｅ−Ｅ１Ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１を切り出して、末端を平滑化して、任意でＥｃｏＲＩＩ、ＢｓｉＷＩ、ＤｒａＩ、ＭｕｎＩを欠失させたＥ３ａ領域内（Ｅ３６．７Ｋおよびｇｐ１９Ｋのオープンリーディングフレームの除去後、上記を参照）またはＥ４ＯＲＦ６の欠失内、例えば平滑末端にして脱リン酸化させたＢｆｒＩ切断部位にクローニング可能である。
【０６０３】
結果として得られたコンストラクトは、Ｅ３ａ／Ｅ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１／ΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹまたはＥ３ａΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６／Ｅ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹである。
【０６０４】
レスキュープラスミドＥ３ａ／Ｅ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２Ｓ／ΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＡｄＥＡＳＹまたはＥ３ａΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６／Ｅ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２Ｓ−ｐＡｄＥＡＳＹ、および、Ｅ３ａ／Ｅ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１／ΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＡｄＥＡＳＹまたはＥ３ａΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６／Ｅ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１−ｐＡｄＥＡＳＹの作成
Ｅ３ａまたはＥ４ΔＯＲＦ６内に第二発現カセットＥ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２ＳまたはＥ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１を伴うＥ３ａΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６領域を、対応するｐＳｈｕｔｔｌｅプラスミドＥ３ａΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹからＳｐｅＩおよびＰａｃＩで切り出して、対応する開環ベクターｐＡｄＥＡＳＹにクローニングして、これによって新しいレスキュープラスミドＥ３ａ／Ｅ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２Ｓ／ΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＡｄＥＡＳＹまたはＥ３ａΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６／Ｅ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２Ｓ−ｐＡｄＥＡＳＹ、および、Ｅ３ａ／Ｅ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１／ΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＡｄＥＡＳＹまたはＥ３ａΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６／Ｅ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１−ｐＡｄＥＡＳＹを作成した。
【０６０５】
第二発現カセットは、Ｅ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２ＳまたはＥ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１のいずれもＥ３ａまたはＥ４ΔＯＲＦ６内に存在するため、Ｅ３ａΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＡｄＥＡＳＹはＥ３ａ領域、ＲＧＤモチーフ、欠失したＥ４ＯＲＦ６を含む。このコンストラクトは、シャトルプラスミドを介してＥ１領域内に別のトランス遺伝子を導入するためのレスキュープラスミドである。
【０６０６】
Ｅ１領域用のトランス遺伝子カセットの作成
Ｅ１Ｂ領域のクローニング
Ｅ１Ｂ領域を得るためにアデノゲノムをＸｂａＩ（１３４０ｂｐ位）およびＭｕｎＩ（３９２５ｂｐ位）で切断して、ＡｄＥＡＳＹのｐＳｈｕｔｔｌｅのＸｂａＩおよびＭｕｎＩ切断部位に該２５８５ｂｐ断片をクローニングして、このためこれは完全なＥ１Ｂ（ｐＳｈｕｔｔｌｅ／Ｅ１Ｂ）を含む。
【０６０７】
代わりに、アデノウイルス５型の野生型ＤＮＡを鋳型に使用して、プライマー
【表３０】
0005584393.tif 000031
を使用したＰＣＲによってＥ１Ｂ領域を増幅させ、ＸｂａＩおよびＭｕｎＩで切断して、ＡｄＥＡＳＹのｐＳｈｕｔｔｌｅのＸｂａＩおよびＭｕｎＩ制限酵素切断部位にクローニングできる。
【０６０８】
したがって、ｐＳｈｕｔｔｌｅ／Ｅ１Ｂは、Ｅ１Ｂプロモーター、Ｅ１Ｂ１９Ｋ、Ｅ１Ｂ５５Ｋ、タンパク質ＩＸのオープンリーディングフレーム、そして天然型のポリＡ部分を含む。ＸｂａＩおよびＨｐａＩを使用してＥ１Ｂプロモーターを取り除き、１ベクターの末端を平滑化させて、インビトロｇｅｎ社のｐｃＤＮＡ３．１（＋）由来のＣＭＶプロモーターと置換して、これをＭｌｕＩおよびＸｈｏＩで切断して、その末端も平滑化させた。別の方法として、例えば本特許において列挙されるプロモーター、ＣＭＶプロモーターまたは腫瘍特異的なウイルスプロモーターの代わりに、ＲＳＶプロモーターによってＥ１Ｂ領域の発現を制御できる。
【０６０９】
ＲＳＶ−Ｅ４ＯＲＦ６−ｐｏｌｙＡカセットを調製するためのＲＳＶプラスミドの調製
Ｉｎｖｉｒｏｇｅｎ社のｐＲｃ／ＲＳＶプラスミドをＸｈｏＩ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩで切断した。このようにして作成した２８１０ｂｐおよび２７８ｂｐの断片を再連結させて、Ｆ１複製起点およびネオマイシン耐性遺伝子（ｏＮｅｏ）を取り除いた。
【０６１０】
このようにして作成したｐＲｃ／ＲＳＶ（ｏＮｅｏ）ベクターは、ＢａｍＨＩ切断部位を含んでおり、この中にだけＤｏｂｂｅｌｓｔｅｉｎから供与されたＣＧＮプラスミド由来のＥ４ＯＲＦ６のオープンリーディングフレームをクローニングした。代わりに、プライマー
【表３１】
0005584393.tif 000032
を使用したＰＣＲの増幅産物を、Ｔ末端付加後（ＴＡクローニング）のｐＲｃ／ＲＳＶ（ｏＮｅｏ）ベクターのＥｃｏＲＶ切断部位に導入可能である。別の方法として、例えば本特許において列挙されるプロモーター、ＲＳＶプロモーター（ＭｌｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで取り出す）または腫瘍特異的なウイルスプロモーターの代わりに、ＣＭＶプロモーター（ＭｌｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによりｐｃＤＮＡ３．１（＋）から入手）がＥ４ｏｒｆ６の発現を導く。
【０６１１】
ＲＳＶ−Ｅ４ＯＲＦ６−ｐｏｌｙＡカセット（ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルはｐＲＣ／ＲＳＶプラスミド由来である）をＭｌｕＩで切断して、末端を平滑化させて、プラスミドからＸｈｏＩで回収した。次にＮｏｔＩで切断して、平滑末端にし、ＸｈｏＩで切断したｐＳｈｕｔｔｌｅ／Ｅ１Ｂベクター内に発現カセットをクローニングした。これによって、ＲＳＶ−Ｅ４ＯＲＦ６−ｐｏｌｙＡ／Ｅ１Ｂ−ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＡｄＥＡＳＹベクターを作成した。
【０６１２】
レスキューベクター内へのトランス遺伝子カセットの導入
Ｅ１領域用のＲＳＶ−Ｅ４ＯＲＦ６−ｐｏｌｙＡ／Ｅ１Ｂ−ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＡｄＥＡＳＹベクターをＢｓｔ１０７ＩおよびＭｒｏＩを使用して線状化させて、エレクトロポレーションによってレスキュープラスミド（上記）と共にＢＪ５１８３（ＥＣ）細菌内に導入した。相同組換えによってアデノウイルスプラスミドＲＳＶ−Ｅ４ＯＲＦ６−ｐｏｌｙＡ／Ｅ１Ｂ−Ｅ３ａ／Ｅ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２Ｓ／ΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＡｄＥＡＳＹ（または上記のレスキューベクター変異体に応じて）を作成し、これはＨＥＫ２９３細胞内へのトランスフェクション後にウイルスの産生をもたらした。
【０６１３】
本発明の前記アデノウイルス、特に組換えアデノウイルス、特に上記の発現カセットを個別に、および／または一緒に含むアデノウイルスの作成には、他のシステム（例、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ／ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のｐＡｄｅｎｏＸシステムまたはＭｉｃｒｏｂｉｘ社のシステム）が使用可能であることは、本開示の観点から、本発明の範囲内であり、当業者が実施可能である。
【０６１４】
前記の明細書において開示されている発明の特徴、請求項、図は、組み合わせでは無論、個別にも本発明の実施およびその様々な実施態様と関連しうる。
【０６１５】
以下では、新しい特徴、態様、利点を読み取ることができる図および実施例を参照することで本発明をさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【０６１６】
【図１】本明細書においてＡｄＥ１／Ｅ３マイナスと呼ばれるアデノウイルスベクターの構造設計を示しており、これは野生型アデノウイルスおよびアデノウイルスｄｌ５２０のＥ１／Ｅ３欠失アデノウイルスである。
【図２】ｐ３００、ｐ１０７、ｐ１０５の結合に関して、Ｅ１Ａタンパク質の結合ドメインを示している。
【図３】Ｅ１／Ｅ３欠失アデノウイルスＡｄ５感染後、核内にＹＢ−１を持たないＵ２ＯＳ細胞を示しており、Ｅ１／Ｅ３マイナスＡｄ５、ｄｌ５２０と呼ぶ。
【図４】Ｅ１／Ｅ３欠失アデノウイルスＡｄ５感染後、核内にＹＢ−１を持つ２５７ＲＤＢ細胞を示しており、Ｅ１／Ｅ３マイナスＡｄ５、アデノウイルスｄｌ５２０と呼ぶ。
【図５】アデノウイルスｄｌ１１１９／１１３１感染後の２５７ＲＤＢ細胞およびＵ２ＯＳ細胞を示している。
【図６】ＥＭＳＡ解析の結果を示しており、ＹＢ−１は多剤耐性細胞および細胞株２５７ＲＤＢ、１８１ＲＤＢ、ＭＣＦ−７Ａｄには存在しているが、ＹＢ−１はＵ２ＯＳおよびＨｅＬａ細胞には存在しない。
【図７】野生型アデノウイルス、アデノウイルスｄｌ５２０、アデノウイルスｄｌ１１９／１１３１のＥ１Ａタンパク質の構造設計を示している。
【図８】追加的に発現されたウイルスタンパク質の存在下におけるアデノウイルスの複製効率を絶対値で示す柱状図表である。
【図９】追加的に発現されたウイルスタンパク質の存在下におけるアデノウイルスの複製効率の上昇を示す柱状図表である。
【図１０】それぞれクリスタルバイオレット染色および１０、３０ｐｆｕ／細胞のｄｌ５２０感染後のＵ２ＯＳ細胞、およびそれぞれダウノルビシン未投与の対照（Ｋ）および４０ｎｇ／ｍＬダウノルビシン投与後のＵ２ＯＳ細胞を増殖させたウェルを示している。
【図１１】それぞれクリスタルバイオレット染色および１０、３０ｐｆｕ／細胞のｄｌ５２０感染後、そしてそれぞれダウノルビシン投与なしの対照（Ｋ）および４０ｎｇ／ｍＬダウノルビシン投与後のＨｅＬａ細胞を増殖させたウェルを示している。
【図１２】それぞれＰＢＳ、ｄｌ５２０処理後の時間の関数として、由来の異なる腫瘍（ＲＤＢ２５７、ＨｅＬａ）の腫瘍容積の図式である。
【図１３】それぞれＰＢＳおよび５ ｘ １０８ｐｆｕのｄｌ５２０処理後のＲＤＢ２５７細胞から腫瘍を発生した犠牲になったマウスの写真を示している。
【図１４】ｄｌ５２０感染後のＲＤＢ２５７細胞およびＨｅＬａ細胞の（皮下増殖された腫瘍の）細胞抽出物のサザンブロット解析の結果である。
【図１５】ＹＢ−１核陽性の腫瘍細胞（２５７ＲＤＢ、１８１ＲＤＢ）およびＹＢ−１核陰性の腫瘍細胞（ＨｅＬａ、Ｕ２ＯＳ）におけるｄｌ５２０および野生型アデノウイルスの複製効率および粒子形成をそれぞれ示す柱状図表である。
【図１６】野生型アデノウイルスおよびアデノウイルスベクターＡｄＸｖｉｒＯ３の構造設計を示している。
【図１７】アデノウイルスベクターＡｄＸｖｉｒ０３／０１の構造設計を示している。
【図１８Ａ】クリスタルバイオレット染色およびＡｄ３１２（２０ｐｆｕ／細胞）、Ｘｖｉｒ０３（５ｐｆｕ／細胞）感染後および対照（未感染）の１８１ＲＤＢ細胞を増殖させたウェルを示しており、クリスタルバイオレット染色は感染から５日後に実施された。
【図１８Ｂ】クリスタルバイオレット染色およびＡｄ３１２（２０ｐｆｕ／細胞）、Ｘｖｉｒ０３（５ｐｆｕ／細胞）感染後および対照（未感染）の２７２ＲＤＢ細胞を増殖させたウェルを示しており、クリスタルバイオレット染色は感染から５日後に実施された。
【図１９】イリノテカン処理済みおよび未処理のＵ３７３細胞におけるアデノウイルスｄｌ５２０の複製挙動に関するサザンブロット解析での結果である。
【図２０】トリコスタチンＡ処理済みおよび未処理のＵ３７３細胞におけるアデノウイルスｄｌ５２０の複製挙動に関するサザンブロット解析での結果である。
【図２１】ＣＡＲ陽性細胞の割合で表した、コクサッキーウイルスアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）発現に関する、トリコスタチン処理済みＵ３７３細胞のＦＡＣＳ分析での結果である。
【図２２】複製中のアデノウイルスｄｌ５２０、イリノテカン、トリコスタチンの作用を異なる組み合わせで描写するために異なる４つのパネルの細胞層を示している。
【図２３】３′ＵＴＲ断片および３５３２位の制限酵素切断部位ＢｆｒＩを伴うＥ１Ｂ５５ＫのＯＲＦの略図を示している。
【図２４】野生型Ａｄ５の３５０７位から４１７４位の配列に対応する ＥｌＢ５５ｋ−３′ＵＴＲ領域の配列を示している。
【図２５】野生型アデノウイルスＡｄ５およびアデノウイルスＡｄ３１２感染後のＡ５４９細胞およびＵ２ＯＳ細胞におけるＥ２遺伝子発現のノーザンブロット解析での結果を示している。
【図２６】野生型アデノウイルスおよびアデノウイルスΔ２４感染から１２時間および２４時間後でのＵ２ＯＳ細胞におけるＥ２遺伝子発現のノーザンブロット解析での結果を示している。
【図２７】アデノウイルスベクターＸｖｉｒＰＳＪＬｌの構造設計を示している。
【図２８】アデノウイルスベクターＸｖｉｒＰＳＪＬ２の構造設計を示している。
【図２９】クリスタルバイオレット染色および異なるｐｆｕ／細胞を利用したアデノウイルスｄｌ５２０感染後のＨｅＬａ細胞を増殖させたウェルを示している。
【図３０】アデノウイルスＥ２後期プロモーターの異なるプロモーター断片の使用時におけるＵ２ＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、２５７ＲＤＢ細胞におけるルシフェラーゼ活性を示す棒グラフを示している。
【図３１】ＹＢ−１発現アデノウイルスおよびＡｄ３１２ウイルスによるＵ２ＯＳ細胞の感染から２、５日後でのウイルス粒子数を示す棒グラフを示しており、細胞内に残るウイルス粒子（黒で示す）と細胞外に放出されたウイルス粒子（横縞）を区別している。
【図３２】Ｅ２ＦおよびＹＢ−１によるＥ２後期、Ｅ２初期プロモーターによるアデノウイルスのＥ２領域の制御の略図を示している。
【図３３】野生型アデノウイルスの概略設計を示している。
【図３４】Ｅ２後期プロモーターの制御下でタンパク質ＩＸを発現する、本発明のアデノウイルスＸｖｉｒ０５／プロモーターの略図を示している。
【図３５】Ｅ１Ａ１２Ｓの制御下でＥ１Ｂ５５Ｋリーディングフレームの一部としてタンパク質ＩＸを発現する、本発明のアデノウイルスＸｖｉｒ０５／Ｅ１Ａ１２Ｓの略図を示している。
【図３６】Ｅ１Ｂ１９Ｋの制御下でタンパク質ＩＸを発現する、本発明のアデノウイルスＸｖｉｒ０５Ｅ１Ｂ１９Ｋの略図を示している。
【図３７】Ｅ３プロモーターの制御下でタンパク質ＩＸを発現する、本発明のアデノウイルスＸｖｉｒ０５／Ｅ３−ＩＸプロモーターの略図を示している。
【図３８】野生型アデノウイルス、およびウイルスＸｖｉｒ０５／Ｅ１Ｂ１９Ｋの一実施態様である本発明のアデノウイルスＸｖｉｒ０５の略図である。
【図３９】野生型アデノウイルス、およびウイルスＸｖｉｒ０５／Ｅ１Ａ１２Ｓの一実施態様である本発明のアデノウイルスＸｖｉｒ０５／タンパク質ＩＸの略図である。
【図４０】野生型アデノウイルス、およびウイルスＸｖｉｒ０５／タンパク質ＩＸの一実施態様である本発明のアデノウイルスＸｖｉｒ０５／０１の略図である。
【図４１】野生型アデノウイルス、およびウイルスＸｖｉｒ０５／タンパク質ＩＸの一実施態様である本発明のアデノウイルスＸｖｉｒ０５／０２の略図である。
【図４２】タンパク質ＩＸの検出に関するノーザンブロット解析の結果を示している。
【図４３】Ｘｖｉｒ０３−３′ＵＴＲのサザンブロット解析の結果を示している。
【図４４】Ｘｖｉｒ０３−３′ＵＴＲ感染後のノーザンブロット解析を利用したＭＲＰ発現の結果を示している。
【図４５】Ｘｖｉｒ０３−３′ＵＴＲ感染後のノーザンブロット解析を利用したＭＤＲ発現の結果を示している。
【図４６】Ｘｖｉｒ０３−３′ＵＴＲ感染後のノーザンブロット解析を利用したＭＲＰ発現の結果を示している。
【図４７】クリスタルバイオレット染色および異なるｐｆｕ／細胞のアデノウイルスＸｖｉｒ０３感染後のＤＵ１４５細胞を増殖させたウェルを示している。
【図４８】クリスタルバイオレット染色および異なるｐｆｕ／細胞を利用したアデノウイルスＸｖｉｒ０３感染後のＰＣ−３細胞を増殖させたウェルを示している。
【図４９】複製中のアデノウイルスＸｖｉｒ０３およびダウノルビシンの作用を説明する異なる４つのパネルの細胞層を示している。
【図５０】アデノウイルスベクターＸｖｉｒ０３およびＸｖｉｒ０３−３′ＵＴＲの構造設計をそれぞれ示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【配列表】
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