(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
発現プロモーター、およびC型肝炎ウイルスゲノムのcDNAを含む組換えワクシニアウイルスであって、前記cDNAが以下の(A)または(B)のDNAである、前記組換えワクシニアウイルス。
(A) 配列番号2に示す塩基配列からなるDNA
(B) 配列番号2に示す塩基配列からなるDNAと90％以上の相同性を有する塩基配列からなるDNAであって、かつ、C型肝炎ウイルスの構造タンパク質および非構造タンパク質をコードするDNA
【請求項２】
発現プロモーターがハイブリッドプロモーターである請求項１に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項３】
ハイブリッドプロモーターの塩基配列が、以下の(a)または(b)のDNAである請求項２に記載の組換えワクシニアウイルス。
(a) 配列番号4に示す塩基配列からなるDNA
(b) 配列番号4に示す塩基配列からなるDNAと90％以上の相同性を有する塩基配列からなるDNAであって、かつ、プロモーター活性を有するDNA
【請求項４】
ワクシニアウイルスがLC16m8株である請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えワクシニアウイルスを含む医薬組成物。
【請求項６】
C型肝炎の予防薬である請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
C型肝炎の治療薬である請求項５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、C型肝炎の予防薬および治療薬に関する。詳しくは、C型肝炎ウイルス遺伝子を発現することができる組換えワクシニアウイルス、ならびに当該組換えワクシニアウイルスを含むC型肝炎用の予防薬および治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）の日本での感染者は200万人以上存在し、そのうち毎年３万６千人もの人々が肝細胞癌を発症し、そのがん患者の多くが死に至る。現在唯一かつ有効な抗HCV薬としてインターフェロン(IFN)が用いられているが、その効果は限られており、副作用も重篤であることから、より安全で効果的な薬剤の開発が求められている。さらには感染者が高齢化し、それに伴う発がんのリスクも高まっていることから、早急な対策が必要とされている。
【０００３】
現状においては、HCVのウイルス複製を抑制する核酸アナログやプロテアーゼ阻害剤等の薬剤が開発され治療に用いられている。しかしながら、このこれらの薬剤を用いた治療を行う場合、薬剤耐性ウイルスが出現し易く、またその作用機序からみてもウイルスの完全排除は困難であり、したがって終生投薬治療が必要となる。このような現状から、終生にわたる投薬治療から離脱・解放されるための根治療法の確立が強く望まれている。
【０００４】
本発明者らは、感染性を有するHCV のcDNAクローン作製、HCV感染可能なトランスジェニックマウスおよびヒト肝臓キメラマウスなどの感染動物の樹立などによりHCV研究に関わる研究資源を確立し、様々なモデル実験系の確立を行なってきた（例えば、非特許文献１参照）。HCV感染の大きな特徴として挙げられるのは、高率な持続感染成立と慢性肝炎発症への移行である。本発明者らは長い年月にわたり、この機序を免疫寛容の獲得とその破綻という観点から上述のモデル実験系などを用いて鋭意解析・検討を行なってきた（例えば、非特許文献2参照）。
【０００５】
これまでにもHCVに対する感染を予防するワクチンの開発が多く試みられて来たが、完全に感染を防御できる結果は得られていない（例えば、非特許文献３，４，５、６参照）。
【０００６】
【非特許文献１】Wakita T., et al., J. Biol. Chem., 1998, vol.273, p9001-9006
【非特許文献２】Inoue K., et al., Hepatology, 2007, vol.45, p921-928
【非特許文献３】Choo QL., et al., Pros. Natl. Acad. Sci. 1994, vol.91, 1294-1298
【非特許文献４】Puig M., et. al., Vaccine 2004, vol.22, 991-1000
【非特許文献５】Abraham JD., Vaccine 2004, vol.22, 3917-3928
【非特許文献６】Elmowalid GA., et. al., Pros. Natl. Acad. Sci. 2007, vol.104, 8427-8432
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、C型肝炎の感染発症を阻止するのに有効な組換えワクシニアウイルスを含む治療薬または予防薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記HCV感染に関する解析および検討結果をもとに、さらに鋭意研究を行った結果、組換えワクシニアワクチンを用いて免疫の強力な活性化をもたらすことが、有力なC型肝炎感染予防法につながるものと考えた。さらに、組換えワクシニアワクチンなどを用いて免疫による排除系の強力な活性化をもたらすことがひとつの有力なC型肝炎根治療法につながるものと考えられ、根治困難なウイルス疾患の完全な病態制御を目指すことができるものと考えた。そして、本発明者らは、これまで長年携わってきたウイルス感染症に関する研究から得た知見を基礎とし、上記課題を解決するべく鋭意検討を行なった。その結果、C型肝炎の感染発症を阻止するのに有効な組換えワクシニアウイルスを作製することに成功し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）発現プロモーター、およびC型肝炎ウイルスゲノムのcDNAの全部または一部を含む組換えワクシニアウイルス。
ワクシニアウイルスとしては、例えばLC16m8株が挙げられる。また、C型肝炎ウイルスゲノムのcDNAは、C型肝炎ウイルスの構造タンパク質またはC型肝炎ウイルスの非構造タンパク質をコードするものが挙げられ、また、C型肝炎ウイルスの構造タンパク質およびC型肝炎ウイルスの非構造タンパク質の両者をコードするものであってもよい。
具体的には、C型肝炎ウイルスゲノムのcDNAは、以下の(a)〜(f)のDNAを例示することができる。
(a) 配列番号１に示す塩基配列からなるDNA
(b) 配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、C型肝炎ウイルスの構造タンパク質をコードするDNA 
(c) 配列番号2に示す塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号2に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、C型肝炎ウイルスの非構造タンパク質をコードするDNA
(e) 配列番号3に示す塩基配列からなるDNA
(f) 配列番号3に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、C型肝炎ウイルスの構造タンパク質および非構造タンパク質をコードするDNA
【００１０】
さらに、本発明の組換えワクシニアウイルスに含まれる発現プロモーターとしては、例えばハイブリッドプロモーターが挙げられる。具体的には、ハイブリッドプロモーターの塩基配列は、以下の(a)または(b)のDNAを例示することができる。
(a)配列番号4に示す塩基配列からなるDNA
(b) 配列番号4に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロモーター活性を有するDNA
（２）上記（１）の組換えワクシニアウイルスを含む医薬組成物。
上記医薬組成物は、C型肝炎の予防薬又は治療薬として使用することができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、C型肝炎の予防または治療に有効であり、かつ安全性の高い新規な組換えワクシニアウイルス、およびこれを含むC型肝炎用予防薬または治療薬（C型肝炎の予防または治療用ワクチン）を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明にかかる組換えワクシニアウイルスおよびその用途について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
【００１３】
１．概要
各種ワクチンの中でも、生ワクチンは特に有効なものの一つであるが、一般に、新興ウイルスの弱毒性ワクチンを開発するには非常に長い期間が必要となることが知られており、このことはHCVに関しても同様であると考えられる。
このような場合に採られる手法の一つとして、生ワクチンとして組換えワクシニアウイルス (RVV)を作製するという遺伝子工学的手法が知られている。例えば、本発明者らが開発した、狂犬病ウイルス用、あるいはリンダペスト用の組換えワクシニアウイルスは、野外試験等において、優れた感染発症予防効果を発揮することが実証されている（例えば、Tsukiyama K. , et al., Arch. Virol., 1989, vol.107, p.225-235参照）。
また本発明者らは、新型肺炎SARSに関して、その病原体として知られるSARS-CoVのcDNAを有する組換えワクシニアウイルスの作製に成功しており（WO2006/038742）、優れた予防効果と再投与可能な製剤であることが確認されている（例えば、Kitabatake M. , et al., Vaccine, 2007, vol.25, p.630-637参照）。
【００１４】
RVVの作製に用いる組換え母体となるワクシニアウイルスとしては、安全性の確立されているワクチン株である必要があるが、そのようなワクチン株としてはワクシニアウイルスLC16m8株（例えば、臨床とウイルス vol.3, No.3, 269, 1975参照）が知られている。LC16m8株はリスター株から分離されたものであって、実際に予防ワクチンとしての投与実績があり、かつ安全性および有効性が確認されており、現在製造されている唯一のワクチン株である。
【００１５】
また、本発明者らは、リンダペスト、HIV、SARS-CoV等に対する組換えワクシニアウイルスの開発検討の過程で、抗体産生能および細胞性免疫の誘導能を非常に高めることのできる遺伝子発現プロモーターを用いることが、本発明のワクシニアウイルスに有効であることを見出した。具体的にはプラスミドベクターとしてpSFJ1-10やpSFJ2-16を用いることが好ましいことを見出した（例えば、Jin N-Y, et al., Arch. Virol. 1994, vol.138, p.315-330、Elmowalid GA., et. al., Pros. Natl. Acad. Sci. 2007, vol.104, 8427-8432; Arch. Virol. 138, 315-330, 1994;特開平6-237773号報などを参照）。
その結果、本発明者は、HCVの非構造タンパク質をコードする遺伝子および/または構造タンパク質をコードする遺伝子を、プロモーターとともにワクシニアウイルスに組み込むことにより、HCV組換えワクシニアウイルスを作製することに成功したものである。
本発明にかかる組換えワクシニアウイルスの母体となるウイルスは、上記のとおりワクシニアウイルスである。そのゲノム中にHCVのｃDNAが組み込まれたものが、本発明の組換えワクシニアウイルスである。HCVの蛋白質をコードしているすべての遺伝子領域、外殻蛋白質領域、及び複製に関与している非構造タンパク質領域の遺伝子をそれぞれクローニングしたものを発現ユニットとし、それぞれワクシニアウイルスベクターに導入した。この発現ユニットをワクシニアウイルスのHA遺伝領域に導入した。HA遺伝領域に外来遺伝子を導入してもワクシニアウイルスの増殖活性には影響を与えないので増殖能の弱い安全なワクチン株を組換え母胎ウイルスとして使用することができることはすでに知られている（Vaccine 12, 675-681, 1994）。
組換えワクシニア生ワクチンは、狂犬病ウイルスやリンダペストウイルスに対するものが野外試験されており、その感染発症予防効果の優秀性が証明されている。
【００１６】
本発明者は、ハイブリットプロモーターの下流にC型肝炎ウイルス(HCV)のタンパク質をコードしているすべての遺伝子、外殻蛋白質領域をコードする遺伝子、及び複製に関与している非構造タンパク質領域をコードする遺伝子を挿入し、これらの遺伝子を弱毒ワクシニアウイルス株のヘマグルチニン(HA)遺伝子領域に組み込むことで組換えワクシニアウイルス(RVV)を作製した。
ハイブリッドプロモーターは、ポックスウイルスA型封入体(ATI)プロモーター及び複数反復するワクシニアウイルス7.5 kDaタンパク質(p7.5)前期発現プロモーターにより構成される（Jin N-Y, et al.,  Arch. Virol. 1994, vol.138, p.315-330参照）。このプロモーターは、北海道大学の志田壽利博士により開発され、同博士から提供を受けることも可能である。
作製したRVVは、動物細胞に感染させることにより、HCV蛋白質を大量に発現することが確認され、また動物個体に接種することでHCVに対する高力価の抗体が早期に産生することが併せて確認された。また、動物個体に接種した場合に細胞性免疫も活性化されていることがELISPOTアッセイにより確認され、本発明を完成した。
【００１７】
２．HCV組換えワクシニアウイルスの作製
C型肝炎ウイルス(HCV)の蛋白質をコードしているすべての遺伝子、外殻蛋白質領域をコードする遺伝子、及び複製に関与している非構造タンパク質領域をコードする遺伝子は、すでにクローニングされ、プラスミドに挿入されている。したがって、本発明の組換えウイルスに含まれる遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、遺伝子工学的手法として一般的に用いられているDNA合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となる遺伝子配列を単離又は合成した後に、それぞれの遺伝子に特異的なプライマーを設計し、PCR装置を用いてその遺伝子配列を増幅するPCR法、又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を用いることができる。上記方法は、Moleculer cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等に従い、当業者ならば容易に行うことができる。得られたPCR産物の精製には公知の方法を用いることができる。
【００１８】
本発明の好ましい態様においては、上記プラスミドに挿入されているHCV遺伝子(遺伝子型 1b; 核酸番号 1-9611; DDBJ/EMBL/GenBank accession number; AY045702)を鋳型に用いることができる。そして、HCV遺伝子cDNAを鋳型とし、HCV遺伝子特異的なプライマーを用いてPCRを行うことにより、HCVの各遺伝子領域を調製することができる。本発明においては、HCVのすべての遺伝子領域を「CN5」、外殻蛋白質の構造タンパク質領域をコードする遺伝子を「CN2」、複製に関与している非構造タンパク質領域をコードする遺伝子を「N25」という。
CN2、N25およびCN5の塩基配列を、それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３に示す。但し、配列番号１〜３に示される塩基配列からなるDNAのほか、以下のDNAも、本発明において使用することができる。
配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、C型肝炎ウイルスの構造タンパク質をコードするDNA（CN2の変異型DNA）。
配列番号2に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、C型肝炎ウイルスの非構造タンパク質をコードするDNA（N25の変異型DNA）。
配列番号3に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、C型肝炎ウイルスの構造タンパク質および非構造タンパク質をコードするDNA（CN5の変異型DNA）。
【００１９】
ここで、「C型肝炎ウイルスの構造タンパク質をコードする」とは、ウイルスの外殻を構成するタンパク質をコードすることを意味し、具体的には、少なくともコア領域、E1領域、E2領域をコードする（図１A）。また、「C型肝炎ウイルスの非構造タンパク質をコードする」とは、ウイルスが増殖するときに細胞中に産生されるタンパク質をコードすることを意味し、具体的には、少なくともNS2領域、NS3領域、NS4a領域、NS4b領域、NS5a領域、NS5b領域をコードする（図１B）。
また、上記構造タンパク質をコードする遺伝子及び非構造タンパク質をコードする遺伝子には、全長配列のほか、その一部の配列も含まれる。CN2の場合は、コア領域、E1領域及びE2領域の全部又はいずれかの領域を含む限り、全長である必要はなくその一部でもよい。例えば、配列番号１に示す塩基配列のE1領域（589〜1164番）、E2の領域（1165〜2253番）を使用することができる。N25の場合は、NS2領域、NS3領域、NS4a領域、NS4b領域、NS5a領域及びNS5b領域の全部又はいずれかの領域を含む限り、全長である必要はなくその一部でもよい。例えば、配列番号2に示す塩基配列のNS2領域（805〜1455番）、NS3領域（1456〜3348番）を使用することができる。CN5の場合は、コア領域、E1領域、E2領域、NS2領域、NS3領域、NS4a領域、NS4b領域、NS5a領域及びNS5b領域の全部又はいずれかの領域を含む限り、全長である必要はなくその一部でもよい。例えば、配列番号3に示す塩基配列のE1領域（589〜1164番）、E2領域（1165〜2253番）、NS2領域（2443〜3093番）、NS3領域（3094〜4986番）を使用することができる。
【００２０】
上記変異型DNAは、化学合成により得ることができ、あるいは、配列番号１〜３で表される塩基配列からなるDNA、又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、cDNAライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。上記ハイブリダイゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、たとえば、0.1×SSC〜10×SSC、0.1％〜1.0％SDS及び20℃〜80℃の条件が挙げられ、より詳細には、37℃〜56℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、0.1×SSC、0.1％SDS中、室温で10〜20分の洗浄を1〜3回行う条件が挙げられる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」（Cold Spring Harbor Press (1989)）等を参照することができる。
また、配列番号１に示す塩基配列と50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ、C型肝炎ウイルスの構造タンパク質をコードするDNA（CN2の変異型DNA）、配列番号2に示す塩基配列と50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ、C型肝炎ウイルスの非構造タンパク質をコードするDNA（N25の変異型DNA）、配列番号3に示す塩基配列と50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ、C型肝炎ウイルスの非構造タンパク質および構造タンパク質をコードするDNA（CN5の変異型DNA）用いることができる。
【００２１】
本発明の組換えワクシニアウイルスに含まれるプロモーターは、ワクシニアウイルスのヘマグルチニン(HA)遺伝子領域内にポックスウイルスA型封入体(ATI)プロモーター及び複数反復するワクシニアウイルス7.5 kDaタンパク質(p7.5)前期発現プロモーターにより構成されるハイブリットプロモーターである。このプロモーターは、適当なプラスミドに連結することができ、例えばpBMSF7Cが知られている (Arch. Virol. 138, 315-330, 1994;特開平6-237773号報)。
本発明において使用可能なハイブリッドプロモーターの塩基配列を配列番号4に示す。但し、配列番号4に示す塩基配列からなるDNAのほか、配列番号4に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロモーター活性を有するDNAも、本発明において使用することができる。「ストリンジェントな条件」は前記と同様である。「プロモーター活性を有する」とは、構造タンパク質または非構造タンパク質をコードする遺伝子の転写活性を有することを意味する。
このハイブリットプロモーターにより発現されるタンパク質は、ワクシニアウイルス感染前期から後期まで完全な糖修飾を受けた形で大量に発現することができる。本発明においては、pBMSF7Cのプロモーター下流にHCV遺伝子（CN5)を挿入したプラスミドベクターをpBMSF7C-CN5という。また、本発明において、pBMSF7Cのプロモーター下流に外殻タンパク質領域遺伝子（CN2)を挿入したプラスミドベクターをpBMSF7C-CN２という。さらに、pBMSF7Cのプロモーター下流に非構造タンパク質遺伝子（N25）を挿入したプラスミドベクターをpBMSF7C-N25という。
これらのプラスミドベクターを、宿主であるワクシニアウイルスに導入することで、組換えワクシニアウイルスを作製することができる。プラスミドベクターの宿主への導入は、公知の任意の手法を採用することができ、例えば弱毒ワクシニアウイルスLC16m8株を感染した動物細胞中にプラスミドベクターpBMSF7C-CN5、pBMSF7C-CN２、pBMSF7C-N25をそれぞれ導入することにより、ワクシニアウイルスのヘマグルチニン(HA)遺伝子領域で相同組換えを引き起こし、HCVの各蛋白質をそれぞれ発現する組換えワクシニアウイルス(RVV-CN5, RVV-CN2及びRVV-N25)を作製することができる。
【００２２】
なお、RVVの作製に用いたワクシニアウイルスLC16m8株は、動物個体で増殖可能であるが、神経細胞における増殖性は極めて低い弱毒株である。日本では痘瘡ワクチンとして認可されており、約5万人の小児に接種の結果、重篤な副作用は発生していない（厚生省種痘研究班研究報告、臨床とウイルス vol.3, No.3, 269, 1975）。一方、免疫誘導能に関しては親株であるLister株と同等であることが報告されており、LC16m8株は安全で効果的なワクチンである。
【００２３】
作製したRVV-CN5, RVV-CN2, RVV-N25は、ワクシニアウイルスのHA遺伝子領域にHCVの蛋白質遺伝子が挿入されるため、HAタンパク質の発現が欠如し、赤血球凝集反応を起こさない。したがって、RVV-CN5、RVV-CN2およびRVV-N25を動物細胞に感染させ、これにより形成するプラークへのニワトリ赤血球の凝集反応を指標にして、RVVのスクリーニングを行う。目的のRVVは、赤血球凝集が認められないホワイトプラークを選別すればよい。
ホワイトプラークより得られたウイルスは、ウイルスゲノムを鋳型としてHCV遺伝子特異的なプライマーによりPCRを行い、HCVの遺伝子導入を確認することができる。
HCV蛋白質の発現は、RVV-CN5, RVV-CN2及びRVV-N25を感染させた後の動物細胞をサンプルとして、ウエスタンブロット法により確認することができる。なお、抗体は、HCVポリペプチドを免疫して作製した抗血清から（J. Biol.Chem. 279:14531-14541, 2004）Protein GによりIgGを精製した物を用いることができる。
RVVの作製において目的遺伝子の挿入部位として、HA遺伝子領域以外として、一般にはチミジンキナーゼ(TK)遺伝子領域が用いられるが、TK遺伝子領域に目的遺伝子を挿入することにより、TKの発現欠損によりRVVの増殖性が低下することが知られている。一方、HAタンパク質発現欠損によるRVVの増殖性はほとんど影響がないことが報告されている（Vaccine 12, 675-681, 1994）。したがって、本発明においては、目的遺伝子の挿入部位としてHA遺伝子領域が好ましい。
【００２４】
３．C型肝炎予防または治療用医薬組成物
本発明は、上記組換えワクシニアウイルスを含む、C型肝炎予防薬およびC型肝炎治療薬（医薬組成物）を提供する。
本発明の医薬組成物は、あらゆる公知の方法、例えば、筋肉、腹腔内、皮内又は皮下等の注射、あるいは鼻腔、口腔又は肺からの吸入、経口投与により生体に導入することができる。さらに、本発明の医薬組成物に含まれる組換えウイルスと、既存の抗ウイルス薬（例えばインターフェロン）を併用することも可能である。併用の態様は特に限定されるものではなく、本発明の組換えウイルスと既存の抗ウイルス薬とを同時に投与することもできるし、一方を投与後、一定時間経過後に他方を投与する方法により生体に導入することもできる。
また、本発明の医薬組成物は、賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤等公知の薬学的に許容される担体、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等と混合することができる。
本発明の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、シロップ剤等の経口投与剤、注射剤、外用剤、坐剤、点眼剤等の非経口投与剤などの形態に応じて、経口投与又は非経口投与することができる。好ましくは、皮内、筋肉、腹腔等への局部注射等が例示される。
投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象、患者の年齢、体重、性別、症状その他の条件により適宜選択されるが、ウイルスの一日投与量としては、経口の場合は1000〜1000000000PFU（plaque forming units）程度、好ましくは100000〜100000000PFU程度であり、非経口の場合は100〜1000000000PFU（plaque forming units）程度、好ましくは1000〜100000000PFU程度である。ウイルスは、1日1回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。
【００２５】
本発明の組換えウイルスは、C型肝炎予防用または治療用ワクチンとして使用される。また、これまでにHCVに対するワクチンの開発ではHCVに対する抗体と細胞障害性T細胞(CTL)に着目した研究が行われている。したがって、予めワクチンとしての抗体価または細胞性免疫活性を測定しておくことが好ましい。
例えば、作製したRVV-CN5, RVV-CN2, RVV-N25または親株であるLC16m8株に対する抗体価は、これらのウイルス株をウサギに接種後、経時的に血清を回収し、血清のHCVに対するELISA価を測定することで得ることができる。RVV-CN5, RVV-CN2を接種したウサギの血清は、接種４週間後からHCVに対する抗体価の上昇が認められる。
また、細胞性免疫活性は、RVV-CN5, RVV-CN2, RVV-N25または親株であるLC16m8株をマウスに接種後、免疫したマウスから脾臓細胞を分離し、HCV特異的CTLが誘導されている否かを、ELISPOT assayにより測定することができる。本発明においては、RVV-CN5免疫BALB/cマウス由来の脾臓細胞を、H-2d拘束性のE1特異的なCTLエピトープ配列の合成ペプチドで刺激すると、コントロールの10倍近いINF-γ産生細胞が検出された。このことから、RVV-CN5免疫はBALB/cマウスにおいて、E1特異的なCTLを誘導することが分かった。
以上、本発明者らが作製したHCV-RVVsは、HCVに対する液性および細胞性免疫を誘導することが確認された。
本発明を以下の実施例により具体的に説明する。これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００２６】
組換えワクシニアウイルスの作製
pBMSF7Cプラスミド(特開平６−２３７７７３)のSbfIとSgfI SiteにC型肝炎ウイルスのすべての遺伝子領域(CN5)、外殻蛋白質領域(CN2)及び複製に関与している非構造タンパク質領域(N25)の遺伝子領域(DDBJ/EMBL/GenBank accession number; AY045702)を組み込むことにより、ヘマグルチニン(HA)遺伝子領域内のATI・p7.5ハイブリットプロモーター下流にHCV遺伝子が挿入されたプラスミドベクターpBMSF7C-CN5、pBMSF7C-CN２、pBMSF7C-N25を作製した。(図1)
初代腎培養細胞をT175フラスコに播種し、コンフルエントに達したところで、ワクシニアウイルス弱毒株LC16m8株をmoi=10で30℃、2時間感染させた。なお、moi(multiplicity of infection）とは、細胞１個あたりのPFUをいう。感染後、ウイルス溶液を吸引除去し、細胞をPBS(-)で洗浄した。次いで、0.05%トリプシン/0.5mM EDTA/PBS(-)により処理し、10%FCS/MEM培地、PBS(-)、HeBS bufferで洗浄後、細胞をHeBS buffer 600μlに懸濁した。プラスミドベクターpBMSF7C-CN5、pBMSF7C-CN２およびpBMSF7C-N25 の各40 μgを、それぞれ全量200μl になるようにHeBS bufferを用いて希釈し、細胞懸濁液に加えて混和し、氷上で10分間静置した。プラスミドベクターを加えた細胞懸濁液を0.4 cmキュベットに移し、エレクトロポレーター（Bio-Rad社製）を用いてエレクトロポレーション（0.2 kV、960 μF）を行った。エレクトロポレーション後、直ちに10%FCS/MEM培地1 mlを細胞懸濁液に加えて希釈した。この細胞懸濁液をあらかじめT175フラスコに播種しておいたRK13細胞または初代腎培養細胞に添加し、30℃で24時間培養した。
【００２７】
24時間培養後、培養上清を吸引除去し、PBS(-)により細胞を洗浄した。次いで、0.05%トリプシン/0.5mM EDTA/PBS(-)処理を行った後、細胞を10%FCS/MEM培地に懸濁した。細胞懸濁液を回収し、冷水中において超音波処理（30 sec × 4回）を行った後、遠心分離（2000 rpm、10 min）した。その上清をウイルス溶液として使用した。ウイルス溶液を10%FCS/MEM培地に希釈し、100 mm ディッシュに播種しておいた初代腎培養細胞に30℃、1時間感染させた。ウイルス溶液を吸引除去した後、PBS(-)で細胞を洗浄した。10%FCS/0.5%メチルセルロース/MEM培地を添加して、30℃で72時間培養した。72時間培養後、上清を吸引除去し、PBS(-)で洗浄した。PBS(+)で希釈したニワトリ赤血球溶液を100 mm ディッシュに添加し、37℃で30 min培養した。赤血球溶液を吸引除去した後、細胞をPBS(-)で2回洗浄した。ニワトリ赤血球が吸着しないプラークを、ピペットマンを用いて回収した。回収したプラークはＰＣＲならびに遺伝子配列の決定によりHCV遺伝子の導入を確認した。遺伝子導入が確認されたプラークについてはプラーク精製を3回繰り返した。
3回プラーク精製したウイルスについて、小スケール培養を行った。3回目に得たコロニーを700 μlの10%FCS/MEM培地に懸濁し、冷水中で超音波処理を行った。遠心分離（2000 rpm、10 min）を行った後、上清500 μlをT25に播種しておいた初代腎培養細胞に添加し、30℃、2時間感染させた。感染後、ウイルス溶液を吸引除去し、2.5 mlの10%FCS/MEM培地で細胞を洗浄した。培地を吸引除去し、新たに2.5 ml の10%FCS/MEM培地を添加し、30℃、72時間培養した。72時間後にスクレーパーを用いて細胞をフラスコからはがし、細胞懸濁液を回収した。回収した細胞懸濁液を冷水中で超音波処理（30 sec、4回）した後、遠心分離し、その上清をウイルス溶液として回収した。回収したウイルス溶液は、段階希釈して6 ウェルプレートに播種しておいたRK13細胞または初代腎培養細胞に添加し、30 ℃、1時間感染させた。ウイルス溶液を吸引除去した後、PBS(-)で細胞を2回洗浄した後、10%FCS/0.5%メチルセルロース/MEM培地を添加して、30℃で72時間培養した。72時間後に、ウェル中に形成されるプラーク数をカウントすることによりtiterを算出した。
【００２８】
この算出したtiterをもとに大スケール培養を行った。T175フラスコ10枚にRK13細胞または初代腎培養細胞を播種し、コンフルエントに達したところで、組換えワクシニアウイルス溶液をmoi=0.1で30℃、2時間感染させた。感染後、ウイルス溶液を吸引除去し、20 mlの10%FCS/MEM培地で細胞を洗浄した。培地を吸引除去し、新たに20 ml の10%FCS/MEM培地を添加し、30℃、72時間培養した。72時間後にスクレーパーを用いて細胞をフラスコからはがし、細胞懸濁液を回収し、-80℃で凍結保存した。この細胞懸濁液は凍結融解を三回行った後、冷水中で超音波処理（30 sec、4回）、遠心分離をし、その上清をウイルス溶液として回収した。回収したウイルス溶液を高速遠心用チューブに移しいれ、18000 rpmで45分間遠心分離を行い、ウイルスを沈殿させた。上清を吸引除去した後、ペレットを少量の10%FCS/MEM培地で再懸濁させた。この操作によりT175フラスコでの培養時に比べて10倍濃縮のウイルス溶液を調製する。この濃縮ウイルス溶液を段階希釈して、6ウェルプレートに播種しておいたRK13細胞または初代腎培養細胞に感染させて、上記と同様な方法により溶液中のウイルスtiterを算出した。Titerを算出したこの濃縮ウイルス溶液を以下の実施例に示す種々の実験に使用した。
【実施例２】
【００２９】
PCRによるHCV遺伝子導入の確認
HCV遺伝子に特異的な以下のプライマーを用い、得られた組み換えワクシニアウイルスゲノムを鋳型として、PCRを行うことにより、当該ウイルスゲノム中にHCV遺伝子が導入されているか確認した（図２、図３）。
【００３０】
(1) クローニング用プライマー塩基配列
Fw: HCV-CL-Fw （配列番号５）
5-GGGCGGCCCTGCAGGTAATACGACTCACTATAGGGCGTAGACCGTGCATCATGAGCACAAATCCTAAACCCCAAAGAAAAACCAAACG-3
Rv: HCV-CL-MRv（配列番号６）
5-GGGCGGCGCGATCGCCTATCATTAAAGGAGCCGCCACCCCTGCCCTTCAAGACTATC-3
Fw: HCV-CL-MFw（配列番号７）
5-GGGCGGCCCTGCAGGTAATACGACTCACTATAGGGCGTAGACCGTGCATCATGACGCGGCCGCCGCAAGGCAACTGGTTCGGC-3
Rv: HCV-CL-Rv（配列番号８）
5-GGGCGGCGCGATCGCCTATCATTATCGGTTGGGGAGCAGGTAGATGCCTAC-3
【００３１】
(2) インサート確認PCR用プライマー塩基配列
＜HA＞
Fw: HA-1-S（配列番号９）
5-GGTCTTATATACACCGAGTAAGG-3
Rv: PBSF-110-350-R20（配列番号10）
5-TCAGGAAAGACAGCCATAGC-3
＜前半領域＞
Fw: PBSF-110-1204-S22（配列番号11）
5-CATCACATTGAAACATTGGGAC-3
Rv: 6-354-R20（配列番号12）
5-GATTTGTGCTCATGATGCAC-3
Rv: 6-2139-R23（配列番号13）
5-CCGAACCACATTTTGTGTAAGTG-3
＜後半領域＞
Fw: 6-3251-18S（配列番号14）
5-AGTAGAGCCCGTTGTCTT-3
Fw: 6-9168-S20（配列番号15）
5-TACCTCTTCAACTGGGCAGT-3
Rv: HA-6-R（配列番号16）
5-CTAGTTCTGAGAAACCAGAGG-3
【００３２】
具体的には、反応液組成は、市販のポリメラーゼに添付の緩衝液50μLに対しDNAポリメラーゼ1U、dNTP0.3mM、Fプライマー１μM、Rプライマー１μMとし、サイクル条件は、融解を95℃で0.5分、アニーリングを58℃で0.5分、伸長を72℃で2分とするサイクルを25サイクルとした。得られたPCR産物を、アガロースゲルを用いて電気泳動して、バンドを確認した。その結果、プライマー設計により予め想定した長さの単一のバンドが認められれば、組み換えウイルスゲノム中にHCV遺伝子が導入されていることが分かり、一方、当該バンドが認められなければ、HCV遺伝子は導入されていないことが分かることになる。
【００３３】
図３に示すように、PCR産物（増幅断片）の2wt％アガロースゲル電気泳動の結果、組み換えウイルスゲノム中にHCV遺伝子が導入されていることが分かった。
【実施例３】
【００３４】
ウエスタンブロット法によるHCVタンパク質の発現確認
組換えワクシニアウイルスを、予め6ウェルプレートに播種しておいたRK13細胞にmoi=30のRVV-Sを30℃、2時間感染させた。感染後、ウイルス溶液を吸引除去し、PBS(-)により細胞を2回洗浄した。各ウェルに2 mlの10%FCS/MEM培地を添加し、30℃、24時間培養した。24時間後、培地を吸引除去し、100 μlの溶解 buffer（1% SDS、0.5% NP-40、0.15 M NaCl、10 mM Tris-HCl(pH 7.4)）を添加して細胞を溶解させ、その溶液を1.5mlのエッペンドルフチューブに移しいれた。回収した溶液は粘性がなくなるまで冷水中で超音波処理を行った。調製した溶液中のタンパク質量は、Lowry法により定量した。
電気泳動は、10%アクリルアミドゲルを用い、50 μgのタンパク質に対して行った。電気泳動終了後、ゲルを取り出し、Semi-dry blotterを用いて5.5 mA/cm2、60分間通電し、ゲル中のタンパク質をPVDFメンブレンにトランスファーした。メンブレンをTBS-T溶液で洗浄した後、5%スキムミルク-TBS-T溶液につけてブロッキングを行った。ブロッキング終了後、メンブレンをTBS-T溶液で3回洗浄した。一次抗体はマウスモノクローナル抗体で、Core-31-2、E1-384、E2-544、NS3-10-1、NS4B-52-1、NS5B-14-5クローンIgGを精製したものを使用した。精製した抗体のタンパク質量はLowry法により定量し、10 μg/mlに調製して使用した。一次抗体との反応終了後、メンブレンをTBS-T溶液で3回洗浄した。二次抗体には抗ウサギIgG-linked HRPO（from Donkey、Amersham社製）を使用した。二次抗体との反応終了後、再度TBS-T溶液でメンブレンを3回洗浄し、ECL溶液をメンブレンに添加し、フィルムに現像した。
その結果、図4に示すように、RVV-CN2、RVV-N25および RVV-CN5の組み換えウイルスゲノム中においてHCV蛋白質を発現していることが分かった。
【実施例４】
【００３５】
ウサギおよびマウスへの組換えワクシニアウイルス接種実験（図５）
図5は、HCV-RVVの液性・細胞性免疫誘導能の確認方法を示す図である。
実施例１で得た組換えワクシニアウイルスまたは親株であるLC16m8株をニュージーランドホワイトウサギのメスに1×108 pfuで経内皮接種後、1、2、3、４、6週間耳静脈より採血を行った。また、初回ウイルス接種より6週間後に再度RVV-S を1×108 pfuで接種した。再接種後も同様に1、2、3、4、6週間後に耳静脈より採血を行った。採取した血液は、すべて真空採血管（TERUMO社製、製品名：ベノジェクトII真空採血管（滅菌品）、9ｍL）にとり、遠心分離(3000rpm、20分間)して血清を分離回収した。血清は、後述するELISA試験を行うまで、−20℃に凍結保存した。
【実施例５】
【００３６】
HCV-RVVで免疫したウサギ血清中のHCV蛋白質に対するELISA法による抗体価測定
96ウェルプレートにCore蛋白質およびE2蛋白質をコートしておき、凍結しておいた血清サンプルを100倍に希釈して添加した。室温で１時間静置後、96ウェルプレートをTBS-T溶液で洗浄した後、96ウェルプレートに抗ウサギIgG-linked HRPO（from Donkey、Amersham社製）を二次抗体として添加した。室温で１時間の二次抗体との反応終了後、再度TBS-T溶液で96ウェルプレートを3回洗浄し、発色液を100 μl/wellで添加した。室温で10-20分間静置後、マイクロプレートリーダーで450 nmの吸光度を測定した。
その結果、図６に示すように、RVV-CN2および RVV-CN5を接種したウサギ血清中にCoreおよびE2に対して高い抗体価の誘導が認められた。
【実施例６】
【００３７】
ELISPOTアッセイによるHCV-RVVのワクチンとしての細胞性免疫誘導能効果の確認
（1日目）
96 wellニトロセルロースプレートに精製抗マウスIFN-γ抗体 (R4-6A2) (1μg/ml) (Pharmingen)を最終濃度8μg/mlに調整（sterile PBSにて125倍希釈）し、75〜100 μl/wellでまき、４度で一晩静置した。
【００３８】
（2日目）
マウスより脾臓細胞を取り出し、洗浄用RPMIで適量に浮遊させた。洗浄用RPMIは2.5% FCSを添加したものを使用した。1200 rpm, 4度で５分間遠心し細胞を集めた。ACK処理し、洗浄用RPMIで適量に浮遊し、再度1200 rpm, 4度で５分間遠心し細胞を集めた。フィルターに500 μlの洗浄用RPMIを通した後に細胞浮遊液を通し、完全に通った後洗浄用RPMI 1.5mlで洗った。10% FCS添加RPMIで1回洗浄し、H-h培地に浮遊後、1×107/mlに調整した。
１）H-h 培地: 10% FCS添加RPMIと10% FCS 添加CLICK'S mediumを等量混合したもの。
２）10% FCS添加RPMI：RPMI-1640(SIGMA R8758), FCS (final 10%), 2-メルカプトエタノール (終濃度5μM), ペニシリン-ストレプトマイシン (終濃度PCs:100u/ml, SM:0.1mg/ml), 7.5% NaHCO3 4ml
３）10% FCS添加CLICK'S 培地：CLICK'S 培地 (SIGMA C5572), FCS (終濃度10%), 2-メルカプトエタノール (終濃度5μM), ペニシリン-ストレプトマイシン (終濃度PCs:100u/ml, SM:0.1mg/ml), 7.5% NaHCO3 4ml
【００３９】
培養の開始
96 well ニトロセルロースプレートをPBS（100μl/well）で3回洗浄後、10% FCS添加RPMIを100μl/wellで加え、37度 で１時間 CO2 インキュベーター中に入れブロッキングを行った。培地を捨て、エフェクター細胞を1×106/100μl /wellから0.125×106/100μl /wellまで２倍階段希釈でまいた。
ペプチド溶液（200μg/ml）を100μl/well（終濃度 100μg/ml）にて加え、37度 で24時間 CO2 インキュベーター中で培養した。
【００４０】
（3日目）
培地を捨て、PBS, 0.05% Tween 20（200μl/well）で10回洗浄した。Biotinated 抗-マウス IFN-γ(XMG1.2) (0.5mg/ml) (Pharmingen) を最終濃度2μg/mlに調整（PBSにて250倍希釈）し、100μl/wellで添加した。４度で１晩静置した。
【００４１】
（4日目）
96 well ニトロセルロースプレートをPBS, 0.05% Tween 20（200μl/well）で10回洗浄した。ストレプトアビジン-アルカリフォスファターゼ(1mg/ml) (MABTECH AB)を最終濃度1μg/mlに調整（PBSにて1000倍希釈）し、100μl/wellで添加した。
得られた溶液を室温で1.5時間静置した。25× AP color development buffer（BIO-RAD）をDWで25倍希釈し、1/100量のAP color reagent A and B（BIO-RAD）をそれぞれ加えて反応混合物を調製した。96 well ニトロセルロースプレートをPBS, 0.05% Tween 20（200μl/well）で10回洗浄した。反応混合物を100μl/wellで加え、室温で10〜20 分静置した。発色しdark spotが出現したら反応混合物を捨て、水中でよく洗った。96 well ニトロセルロースプレートの底を剥がし乾燥させ、ELISPOT Readerでスポットの数を計数した。
計数した結果を図７に示したが、強い細胞性免疫を誘導していることが認められた。
【実施例７】
【００４２】
HCV-RVVのC型肝炎に対する治療効果の検討
Cre/loxPシステムでHCV遺伝子を導入したトランスジェニック（Cre/loxP/HCV-Tg）マウス（図８中「loxP-HCV」）と、IFN誘導性のCreを発現するトランスジェニックマウス（図８中「MxCre」）とを交配させ、任意の時期にHCV遺伝子をスイッチング発現するTgマウス（Cre/loxP/HCV-MxCre Tg）を作製し（図８）、その病態解析を行った。病態解析においては、インターフェロンによりCre組換え酵素を遺伝子発現するため、インターフェロン誘導剤であるpoly ICを用いた。
なお、図８において、パネルAはCre/loxPスイッチングシステムによるHCV遺伝子発現を示す図であり、パネルBはloxP-HCVトランスジェニックマウスとMxCre遺伝子発現トランスジェニックマウスとの交配を示す図である。
HCV-RVVとしては、HCVの構造蛋白質を主に発現するRVV-CN2、複製に関与している非構造蛋白質を発現するRVV-N25、全蛋白質を発現するRVV-CN5を用いた（図１）。これらHCV-RVVの治療効果を評価するために、HCV蛋白を３ヶ月間持続的に発現させたCre/loxP/HCV-MxCre TgマウスにHCV-RVV（1×107 pfu）を単回皮内接種し、接種から４週間後に、マウス肝臓をサンプリングした（図９）。そして、マウス肝臓におけるHCV蛋白の発現量と形態学的検索を行った。
結果を図１０に示す。図１０において、パネルＡはHCVコア蛋白質量（「HCV Core」）とALT（アラニンアミノトランスフェラーゼ）の推移を示す図であり、HCVコア蛋白質量（「HCV Core」）は棒グラフで、ALTは線グラフで示されている。なお、ALTは肝臓の障害の程度を示す指標である。パネルBにおいて「d0」、「d90」、「d180」、「d480」は、それぞれ、HCV遺伝子発現前、HCV遺伝子発現から90日後、180日後、480日後の肝臓における組織変化を示す。
Cre/loxP/HCV-MxCre Tgマウスの肝臓におけるHCV蛋白（図１０中「HCV Core」）は完全に排除されることなく、１年以上の持続的な発現が確認され、肝臓における炎症や脂肪変性、線維化等の慢性肝炎の病態を示した（図１０）。
また、HCV-RVV接種から４週間後のCre/loxP/HCV-MxCre Tgマウス肝臓ではRVV-N25接種群のコア蛋白質発現量が減少していた（図１１）。さらに、RVV-N25接種群では、肝臓における形態学的な異常（肝臓の索状構造や肝細胞の状態など）の正常化が認められた（図１１）。
図１１において、「m8」、「CN2」、「CN5」、「N25」は、それぞれLC16m8株、RVV-CN2、RVV-CN5、 RVV-N25を示す。パネルAは肝臓中のHCVコア蛋白質量を示し、パネルBはHCV-RVV接種から４週間後の肝臓組織像を示す。パネルBにおいて、aはHCV遺伝子発現前の肝臓組織像を示し、bはHCV-RVV接種から４週間後の肝臓組織像を示す。図11より、RVV-N25を投与したマウスの肝臓が正常化していることが分かる。従って、本発明のワクシニアウイルスは、Ｃ型肝炎の治療効果を有することが示された。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】HCV組換えワクシニアウイルス作製のためのプラスミドの遺伝子構造を示す図である。
【図２】PCRによるHCV遺伝子導入確認に用いたプライマーの位置と名称を示す図である。
【図３】PCRによるHCV遺伝子導入確認の結果を示す、アガロースゲル電気泳動の写真である。
【図４】ウエスタンブロット法によるHCVタンパク質発現確認の結果を示す、PVDFメンブレンの写真である。
【図５】HCV-RVVの液性・細胞性免疫誘導能の確認方法を示す図である。
【図６】HCV-RVVのワクチンとしての液性免疫誘導能効果を、ELISA法により測定下結果を示す図である。
【図７】HCV-RVVのワクチンとしての細胞性免疫誘導能効果を、ELISPOTアッセイにより測定した結果を示す図である。
【図８】C型肝炎ウイルス遺伝子発現トランスジェニックマウスのCre/loxPスイッチング遺伝子発現を示す図である。
【図９】HCV遺伝子発現後のトランスジェニックマウス肝臓内HCVコア蛋白質量の経日的変化（パネルA）及びトランスジェニックマウス肝臓の肝炎発症による組織変化（パネルB）を示す図である。
【図１０】HCVトランスジェニックマウスへのHCV組換えワクシニアウイルス投与スケジュールを示した図である。
【図１１】HCVトランスジェニックマウスへのHCV組換えワクシニアウイルス投与後の治療効果を示した図である。
【配列表フリーテキスト】
【００４４】
配列番号５：合成DNA
配列番号６：合成DNA
配列番号７：合成DNA
配列番号８：合成DNA
配列番号９：合成DNA
配列番号１０：合成DNA
配列番号１１：合成DNA
配列番号１２：合成DNA
配列番号１３：合成DNA
配列番号１４：合成DNA
配列番号１５：合成DNA
配列番号１６：合成DNA
配列番号１７：合成ペプチド
配列番号１８：合成ペプチド
配列番号１９：合成ペプチド
配列番号２０：合成ペプチド
【図１】
0005584407.tif 000002
【図２】
0005584407.tif 000003
【図３】
0005584407.tif 000004
【図４】
0005584407.tif 000005
【図５】
0005584407.tif 000006
【図６】
0005584407.tif 000007
【図７】
0005584407.tif 000008
【図８】
0005584407.tif 000009
【図９】
0005584407.tif 000010
【図１０】
0005584407.tif 000011
【図１１】
0005584407.tif 000012
【配列表】
0005584407000001.app