(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマシグナル伝達経路を刺激し、それによりＮＫおよび／またはＴ細胞などのＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞の活性化および／または増殖を誘導および／または刺激することを目的とした化合物であって、
該化合物は、ＩＬ−１５Ｒアルファの細胞外領域のスシドメインを含む少なくとも１つのポリペプチドに柔軟なペプチドリンカーにより間接的に共有結合している少なくとも１つのＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素を含むことを特徴とし、ここで：
−前記少なくとも１つのＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素はＩＬ−１５であり、そして
−ＩＬ−１５Ｒアルファの細胞外領域のスシドメインを含む前記少なくとも１つのポリペプチドのアミノ酸配列は：
○  ＩＬ−１５Ｒアルファの細胞外領域のアミノ酸配列であるか、あるいは
○  ＩＬ−１５Ｒアルファの細胞外領域のフラグメントのアミノ酸配列であり、前記フラグメントは前記ＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域のスシドメインを保持し、前記スシドメインは最初のエクソン２にコードされたシステイン残基（Ｃ１）で開始し、第４のエクソン２にコードされたシステイン残基（Ｃ４）で終了し、残基Ｃ１およびＣ４は共に前記スシドメインに含まれていると定義されるアミノ酸配列である、
ここで、前記ペプチドリンカーは、少なくとも１つの、しかし３０個未満のアミノ酸を含む、
化合物。
【請求項２】
前記ＩＬ−１５Ｒアルファが、ヒトＩＬ−１５Ｒアルファ、またはサルＩＬ−１５Ｒアルファ、またはネズミＩＬ−１５Ｒアルファ、またはウサギＩＬ−１５Ｒアルファ、またはブタＩＬ−１５Ｒアルファであることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記ＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域のアミノ酸配列が、配列番号４０のヒトＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域、配列番号８０のチンパンジーＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域、配列番号７４のハツカネズミＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域、または配列番号８６のＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域、の配列であることを特徴とする、請求項１〜２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４】
前記スシドメインのアミノ酸配列が、配列番号１４のヒトＩＬ−１５Ｒアルファスシドメイン、配列番号８１のチンパンジーＩＬ−１５Ｒアルファスシドメイン、配列番号７５のハツカネズミＩＬ−１５Ｒアルファスシドメイン、または配列番号８７のＩＬ−１５Ｒアルファスシドメイン、の配列であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
ＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域の前記フラグメントが：
−前記ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン２および３にコードされたＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域の一部、または
−前記スシドメインを保持している、該エクソン２〜３にコードされた部分のフラグメント
を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
前記エクソン２にコードされた配列が：
−配列番号２４の配列であるヒト細胞外ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン２にコードされた部分、
−配列番号９８の配列であるチンパンジー細胞外ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン２にコードされた部分、
−配列番号９７の配列であるハツカネズミ細胞外ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン２にコードされた部分、
−配列番号９９の配列であるドブネズミ細胞外ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン２にコードされた部分
であることを特徴とする、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
前記エクソン３にコードされた配列が：
−配列番号９３の配列であるヒト細胞外ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン３にコードされた部分、
−配列番号９５の配列であるチンパンジー細胞外ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン３にコードされた部分、
−配列番号９４の配列であるハツカネズミ細胞外ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン３にコードされた部分、
−配列番号９６の配列であるドブネズミ細胞外ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン３にコードされた部分
であることを特徴とする、請求項５〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
ＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域の前記フラグメントが：
−前記ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン２にコードされたＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域の一部、または
−前記スシドメインを保持している、該エクソン２にコードされた部分のフラグメント
から成ることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
ＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域の前記フラグメントが、前記ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン２にコードされたＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域の一部を含み、さらに前記ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン３にコードされた配列由来の少なくとも１つのアミノ酸を含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
ＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域の前記フラグメントが：
−前記ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン２および３にコードされたＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域の一部、または
−前記ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン２にコードされたＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域の一部および前記ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン３にコードされたＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域の一部のフラグメント
から成ることを特徴とする、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
ＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域の前記フラグメントが：
−前記ＩＬ−１５Ｒアルファのヒンジ領域、または
−該ヒンジ領域のフラグメントであって、
ここで、前記ＩＬ−１５Ｒアルファヒンジ領域のアミノ酸配列は：
−配列番号２０のヒトＩＬ−１５Ｒアルファヒンジ配列、
−配列番号８２のチンパンジーＩＬ−１５Ｒアルファヒンジ配列、
−配列番号７６のハツカネズミＩＬ−１５Ｒアルファヒンジ配列、または
−配列番号８８のドブネズミＩＬ−１５Ｒアルファヒンジ配列であるフラグメント
をさらに含むＩＬ−１５Ｒアルファのフラグメントであることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのスシ含有ポリペプチドが、配列番号３０のポリペプチドであることを特徴とする、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
ヒトＩＬ−１５Ｒアルファヒンジ領域の前記フラグメントのアミノ酸配列が、アミノ酸Ｉ、ＩＲまたはＩＲＤを含むことを特徴とする、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのスシ含有ポリペプチドが、配列番号２２、２４、２６、２８のポリペプチドであることを特徴とする、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
ヒトＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域の前記フラグメントが、さらに：
−ヒトＩＬ−１５Ｒアルファのグリコシル化部位を多く含む領域のエクソン３にコードされた部分、配列番号３４の配列である前記エクソン３にコードされた部分、または
−配列番号３４のフラグメント
を含むことを特徴とする、請求項１〜７、９〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのスシ含有ポリペプチドが、配列番号３６のポリペプチドであることを特徴とする、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
ＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域の前記フラグメントが、さらに：
−エクソン１、２、３以外の１つまたはいくつかのＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外エクソンにコードされた細胞外ＩＬ−１５Ｒアルファの一部、または
−該部分のフラグメント
を含むことを特徴とする、請求項５〜７、９〜１１、１３、１５に記載の化合物。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのスシ含有ポリペプチドまたは前記少なくとも１つのＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素に直接または間接的に結合したシグナルペプチドを含むことを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９】
前記ＩＬ−１５が、ヒトＩＬ−１５であることを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２０】
前記ヒトＩＬ−１５のアミノ酸配列が、配列番号４８の配列であることを特徴とする、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
前記少なくとも１つのＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素が、ＩＬ−２Ｒアルファに結合しないことを特徴とする、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２２】
前記少なくとも１つのスシ含有ポリペプチドが、前記少なくとも１つのＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素に、１０〜３０個のアミノ酸長を有するペプチドリンカーを介して結合することを特徴とする、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２３】
前記ペプチドリンカーのアミノ酸配列が、配列番号５０または５２の配列であることを特徴とする、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２４】
前記少なくとも１つのスシ含有ポリペプチドが、前記少なくとも１つのＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素に関連してＮ末端位置にあることを特徴とする、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２５】
前記少なくとも１つのスシ含有ポリペプチドが、前記少なくとも１つのＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素に関連してＣ末端位置にあることを特徴とする、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２６】
そのアミノ酸配列が、配列番号６０の配列であることを特徴とする、請求項１〜７、９〜１２、１８〜２４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２７】
そのアミノ酸配列が、配列番号６２の配列であることを特徴とする、請求項１〜７、９〜１２、１８〜２３、２５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２８】
ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマシグナル伝達経路を刺激し、それによりＮＫおよび／またはＴ細胞などのＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞の活性化および／または増殖を誘導および／または刺激することを目的とした化合物をコードする核酸であって、普遍的遺伝子コードにしたがってその縮重を十分考慮して、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の化合物をコードすることを特徴とする、核酸。
【請求項２９】
請求項２８に記載の少なくとも１つの核酸を含むことを特徴とする、ベクター。
【請求項３０】
請求項２８に記載の核酸、および／または請求項２９に記載のベクターによって形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞。
【請求項３１】
哺乳動物細胞であることを特徴とする、請求項２９記載の宿主細胞。
【請求項３２】
以下の要素：
−請求項１〜２７のいずれか一項に記載の化合物、
−請求項２８に記載の核酸、
−請求項２９に記載のベクター、
−請求項３０〜３１のいずれか一項に記載の宿主細胞
のうち少なくとも１つの要素を含むことを特徴とする、免疫治療組成物のためのアジュバント。
【請求項３３】
ＣＤ８メモリー応答を向上させることを特徴とする、請求項３２記載のアジュバント。
【請求項３４】
以下の要素：
−請求項１〜２７のいずれか一項に記載の化合物、
−請求項２８に記載の核酸、
−請求項２９に記載のベクター、
−請求項３０〜３１のいずれか一項に記載の宿主細胞
のうち少なくとも１つの要素を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項３５】
以下の要素：
−請求項１〜２７のいずれか一項に記載の化合物、
−請求項２８に記載の核酸、
−請求項２９に記載のベクター、
−請求項３０〜３１のいずれか一項に記載の宿主細胞
のうち少なくとも１つの要素を含むことを特徴とする、薬剤。
【請求項３６】
予防および／または緩和および／または治療ワクチン組成物であることを特徴とする、請求項３５記載の薬剤。
【請求項３７】
腫瘍の成長または存在の予防および／または緩和および／または治療を目的とすることを特徴とする、請求項３５または３６に記載の薬剤。
【請求項３８】
少なくとも１つの腫瘍抗原をさらに含むことを特徴とする、請求項３７に記載の薬剤。
【請求項３９】
感染疾患の予防および／または緩和および／または治療を目的とすることを特徴とする、請求項３５または３６に記載の薬剤。
【請求項４０】
免疫不全の予防および／または緩和および／または治療を目的とすることを特徴とする、請求項３５または３６に記載の薬剤。
【請求項４１】
ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞の増殖および／または活性化を誘導および／または刺激するインビトロでの方法であって：
−ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞を含む細胞試料を提供する工程、
−前記試料を以下の要素：
−請求項１〜２７のいずれか一項に記載の化合物、
−請求項２８に記載の核酸、
−請求項２９に記載のベクター、
−請求項３０〜３１のいずれか一項に記載の宿主細胞
の少なくとも１つと接触させる工程を含み、前記接触は、前記ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞の増殖および／または活性化を誘導および／または刺激することを可能とする期間および環境条件下であることを特徴とする方法。
【請求項４２】
活性化ＮＫおよび／またはＴ細胞を生成するインビトロでの方法であって：
−静止ＮＫおよび／またはＴ細胞を含む細胞試料を提供する工程、
−前記試料を以下の要素：
−請求項１〜２７のいずれか一項に記載の化合物、
−請求項２８に記載の核酸、
−請求項２９に記載のベクター、
−請求項３０〜３１のいずれか一項に記載の宿主細胞
の少なくとも１つと接触させる工程を含み、該接触は、該試料に含まれる静止ＮＫおよび／またはＴ細胞の活性化を誘導することを可能とする期間および環境条件下であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイトカイン誘導および／またはサイトカイン刺激性生物学的応答の分野に、もっと詳しく言えばＩＬ−１５誘導および／またはＩＬ−１５刺激性生物学的応答の分野に、特にＩＬ１５Ｒβ／γシグナル伝達経路が関与するこれらの生物学的応答の分野に関する。
【０００２】
背景技術
ＩＬ−１５は、ＩＬ−２のように、元来Ｔ細胞成長因子として記述されてきたサイトカインである（１）。４つのα−ヘリックス束ファミリーに属する２つのサイトカインおよびそれらの膜受容体は、シグナル変換を起こす２つのサブユニット（ＩＬ−２Ｒ／ＩＬ−１５Ｒβおよびγ鎖）を共有する（２）。ＩＬ−２Ｒβ／γ複合体は両サイトカインの中等度親和性受容体である。主にそれはほとんどのＮＫ細胞で発現し、ナノモル濃度のＩＬ−２またはＩＬ−１５によりインビトロで活性化し得る。
例えば活性化Ｔ細胞上で発現し、ピコモル濃度の、いずれのサイトカインでも活性化し得る高親和性ＩＬ−２およびＩＬ−１５受容体はまた、サイトカイン特異性を引き起こし、サイトカイン結合親和性を促進する自身専用のα鎖（ＩＬ−２ＲαおよびＩＬ−１５Ｒα）を含有する（３）。
両サイトカインは先天性免疫および適応免疫において中心的な役割を担っている。ところが初期のインビトロ実験では大量の機能的重複が見られ（活性化リンパ球およびＮＫ細胞の増殖および細胞毒性の誘導、Ｂ細胞増殖の共刺激ならびにＴ細胞の免疫グロブリン合成、化学誘引）（１，４〜６）、より最近の実験では、２つのサイトカインはインビボの相補的で、対照的ですらある作用を示すことが分かってきた。ところがマウスのＩＬ−２またはＩＬ−２Ｒαノックアウトは活性化ＴおよびＢ細胞、ＩＬ−１５ならびにＩＬ−１５Ｒαノックアウト集団の増加を伴う自己免疫性表現型と関連しており、ＮＫ、ＮＫ−Ｔ、上皮内リンパ球および記憶ＣＤ８Ｔ細胞の特定の欠損をまねいた（７，８）。さらに、ＩＬ−２は、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）を誘導することで末梢寛容を促進するが、ＩＬ−１５はＩＬ−２媒介ＡＩＣＤを阻害し（９）、ＩＬ−２と異なりＩＬ−１５はＣＤ８記憶Ｔ細胞の生存因子である（１０）。
これらの観察と一致して、ＩＬ−２の主要な役割は活性化Ｔ細胞の絶え間ない増加を制限することであるが、ＩＬ−１５はＴ細胞分裂の開始と記憶Ｔ細胞の生存に重要であることが示唆されている（１１）。
ＩＬ−１５トランス提示の新規なメカニズムとして、ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒαは抗原提示細胞（単球、樹状細胞）により協調的に発現し、ＩＬ−１５Ｒαに結合したＩＬ−１５は、ＩＬ−１５Ｒβ／γ受容体のみを発現する隣接のＮＫまたはＣＤ８Ｔ細胞にトランス型で提示されるということが記述されてきた（１２）。免疫学的シナプスで生じる共刺激事象として、ＩＬ−１５トランス提示は現在、インビボでのＩＬ−１５作用にとっての主力のメカニズムであることが分かっている（１３、１４）。それは腫瘍の免疫監視において主要な役割を担うことが示唆されている（１５）。
【０００３】
ＩＬ−１５ＲαおよびＩＬ−２Ｒαサブユニットは、サイトカイン受容体のサブファミリーを形成し、そこでそれらはＮ末端細胞外部分で相補体または接着分子にも見られるいわゆる「スシ」構造ドメイン（ＩＬ−１５Ｒαに１つ、ＩＬ−２Ｒαに２つ）を有している（１６）。両ケースで、これらのスシドメインがサイトカイン結合を起こす構造的要素の大部分を担っていることが示されている。
しかしＩＬ−２Ｒα単独はＩＬ−２の低親和性（Ｋｄ＝１０ｎＭ）受容体であり、ＩＬ−１５Ｒαは高親和性（Ｋｄ＝１００ｐＭ）のＩＬ−１５に結合する。タンパク質分解によるＩＬ−２Ｒαの分断は、リンパ球活性化のダウンレギュレーションに関与している自然のメカニズムである。ＩＬ−２Ｒαは、Ｔｈ１細胞を阻害しアレルギー環境を好む主要なダニアレルゲンであるＤｅｒ  ｐ１により（１７）、また、癌に遭遇するＴ細胞の増殖を抑制する腫瘍誘導メタロプロテイナーゼにより（１８）切断される。このように生成された可溶ＩＬ−２Ｒαは、インビトロでのＩＬ−２作用の競合的阻害剤である。しかしながら、それは依然として低親和性ＩＬ−２結合剤であり、インビボでのＩＬ−２活性のダウンレギュレーションに効率的には関与しない傾向にある。
ヒトＩＬ−１５Ｒαの可溶形態は、ＭＭＰを含む分断過程によりＩＬ−１５Ｒα陽性細胞から自然に放出されることも可能であることが近年明らかになっている（１９）。可溶ＩＬ−２Ｒαと対照的に、この可溶ＩＬ−１５Ｒα受容体は高親和性でＩＬ−１５に結合し、高親和性ＩＬ−１５Ｒα／β／γシグナリング複合体を経て駆動される増殖を効率的にブロックすることができた。この結果はｓＩＬ−１５Ｒαが相同体ｓＩＬ−２Ｒαのようにアンタゴニストとして挙動するという考え、およびインビトロまたはインビボでのマウスｓＩＬ−１５Ｒαの阻害効果と一致した（２０、２１）。
【０００４】
ここで、本発明者らは、本質的にＩＬ−１５Ｒアルファ（＝ＩＬ−１５Ｒα）のスシドメインからなるフラグメントが相反作用を有することを示す。
該フラグメントは、ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ（＝ＩＬ−１５Ｒβ／γ）中等度親和性受容体を介して、高親和性受容体によりこれらに影響を及ぼすこともなく、ＩＬ−１５の生物活性のみならず結合を促進することが可能である。また、本発明者らはＩＬ−１５Ｒβ／γ複合体の強力なスーパーアゴニストとして挙動する融合タンパク質について記述する。該融合タンパク質は、共有原子価、例えば柔軟なリンカーにより、ＩＬ−１５ＲαまたはＩＬ−１５Ｒアルファのスシドメインを保持するＩＬ−１５Ｒアルファフラグメントに融合するＩＬ−１５（または保存的フラグメント、アゴニスト、その模倣体）などのＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素を有している。
【０００５】
本発明者らが知る限りでは、ＩＬ−１５Ｒアルファ関連要素、すなわち可溶ＩＬ−１５Ｒアルファの市販されている形態を含む化合物に対する刺激効果を報告している先行技術はただ１つしかない。
それはGiron-Michelらの「Membrane-bound and soluble IL-15/IL-15Ralpha complexes display differential signaling and functions on human haematopoietic progenitors」（Blood, 1 October 2005, Vol. 106, No. 7, pp. 2302-2310; ２００５年６月にオンラインで先行公表）という題名の刊行物である。
Giron-Michelらの刊行物は以下のことを開示した（Giron-Michelらの図７を参照）：
−  組換えＩＬ−１５（ｒＩＬ−１５）は、１０ng/mlの用量で使用される場合、有意な抗アポトーシス効果を誘導し、また
−  ｒＩＬ−１５は０．１ng/mLの用量では有意な抗アポトーシス効果は誘導しないが、
−  可溶ＩＬ−１５Ｒアルファの市販されている形態で使用された場合は、０．１ng/mL用量でｒＩＬ−１５は有意な抗アポトーシス効果を誘導する。
Giron-Michelらが使用した可溶ＩＬ−１５ＲアルファはＩＬ−１５Ｒアルファの市販されている形態（R＆D Systemsから入手、１４７−ＩＲ参照下）である。この可溶ＩＬ−１５Ｒアルファはエクソン３が欠損した可溶ＩＬ−１５Ｒアルファを修飾した形態である。故に、Giron-Michelらが使用した可溶ＩＬ−１５Ｒアルファの形態は、ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン４コード部分に直接結合しているＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン２コード部分を有し、ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン３コード部分は有していない。したがってGiron-Michelらが使用した可溶ＩＬ−１５Ｒアルファの形態は、ＩＬ−１５Ｒアルファのフラグメントと対応しないが、その修飾形態には対応する。
さらに、Giron-Michelらが使用した可溶ＩＬ−１５Ｒアルファの形態は、共有原子価によりそれに結合したＦｃフラグメント（ヒトＩｇＧ）を含む。ＦｃフラグメントはＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマに結合しない。したがって、Giron-Michelらの刊行物は、可溶ＩＬ−１５Ｒアルファ形態が共有原子価によって、ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素に結合するような化合物については全く開示していない。
さらにGiron-Michelらの刊行物は、抗アポトーシス効果を開示しているが、ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞の増殖および／または活性化への影響は全く開示していない。さらに、開示された抗アポトーシス効果アッセイは、（ｉ）ｒＩＬ−１５非存在下での可溶ＩＬ−１５Ｒアルファ−Ｆｃフラグメントまたは（ｉｉ）いずれのＦｃフラグメントも有しない可溶ＩＬ−１５Ｒアルファを含有する対照試料を全く有していないことに注目し得る。したがって開示された抗アポトーシス効果は、使用の化合物のＩＬ−１５Ｒアルファ部分に直接寄与することは不可能である。
【０００６】
さらにGiron-Michelらの刊行物はＩＬ−１５Ｒアルファのスシドメインに対する（または、この先行技術で使用している可溶ＩＬ−１５Ｒアルファ形態に不在であるヒンジ領域に対する）どのような手掛かりも含んでおらず、ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマシグナル伝達経路に対する手掛かりも含んでいない。
【０００７】
本発明は初めて、ＩＬ−１５生物学的作用の誘導および／または刺激、ＩＬ−１５ベータ／ガンマシグナル伝達経路の特定の誘起、ならびにＮＫおよび／またはＴ細胞の増殖の誘導および／または刺激に必要な、特にそれらに有利な構造単位を記述している。それにより本発明は、これまで達成不可能であった生物学的および医学的応用を可能にする、先行技術を超える技術的貢献を果たしている。
【０００８】
したがって、演繹的に分析した場合、Giron-Michelらの刊行物は請求範囲に記載されている発明を当業者に教示することもなく、当業者を請求範囲に記載されている発明へと導いていないと信じる。
【０００９】
発明の概要
本発明はＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマシグナル伝達経路に、ならびにＮＫおよび／またはＴ細胞などの、ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞の活性化および／または増殖および／またはアポトーシスの阻止を誘導および／または刺激することに関する。
【００１０】
本発明は、ＩＬ−１５Ｒアルファの細胞外領域がＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマシグナル伝達経路を介してＩＬ−１５の生物学的作用のアゴニストとして働き得ることを説明している。ＮＫおよび／またはＴ細胞などの、ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞の増殖および／または活性化および／もしくはアポトーシスの阻止を刺激および／または誘導し得ることが特に説明されている。
本発明は、該アゴニスト作用を発揮するのに必要な、このＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域に含有されている最小限の構造単位がＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域のスシドメインであることを説明している。
本発明はさらに、このＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域のヒンジ領域および尾部がこのアゴニスト作用の効率を有意に高めていることも説明している。
本発明はさらに、野生型ＩＬ−１５と比較して３０から１５０倍の生物活性の増大を有し、ＩＬ−１５と可溶ＩＬ−１５Ｒアルファスシドメインの単純な会合より強力でさえある化合物を提供する。
【００１１】
本発明は詳細な明細書の項目に記述した対象に、もっと詳しく言えば、添付の請求項で定義した対象に関する。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、ＩＬ−１５Ｒアルファ、および少なくとも１つのＩＬ−１５Ｒアルファスシドメインを含むＩＬ−１５Ｒアルファフラグメントに関する。
【００１３】
本発明は、ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマシグナル伝達経路を刺激し、それによってＮＫおよび／またはＴ細胞などのＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞のアポトーシスの活性化および／または増殖および／または阻止を誘導および／または刺激することを目的とし得る生成物に関する。
【００１４】
本発明は、ＩＬ−１５Ｒアルファの細胞外領域に含まれるスシドメインを含有する単離したスシ含有ポリペプチドに関し、すなわちＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域から成る単離フラグメントおよびスシドメインを保持したそのサブフラグメントに関する。
【００１５】
本発明のスシ含有ポリペプチドは、少なくとも１つのＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素に、共有原子価で結合可能である場合、または結合不可能である場合がある。
【００１６】
もっと詳しく言えば、本発明は、少なくとも１つのＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素に直接または間接的に共有原子価で結合した、少なくとも該スシ含有ポリペプチドを含む共有結合化合物に関する。
該化合物は、野生型ＩＬ−１５と比較して３０から１５０倍の生物活性の増大を有することが可能であり、ＩＬ−１５と可溶ＩＬ−１５Ｒアルファスシドメインの自由会合より強力であり得る。
【００１７】
ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素：
前記少なくとも１つのスシ含有ポリペプチド以外に、本発明の前記共有結合化合物は、少なくとも１つのＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素を含む。
【００１８】
前記ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素はＩＬ−１５もしくはＩＬ−１５フラグメント、模倣体またはアゴニストであることが好ましく、前記ＩＬ−１５フラグメント、模倣体またはアゴニストは、天然ＩＬ−１５のものより有意に低くはないＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマへの結合親和性を有する。
【００１９】
前記ＩＬ−１５は任意のＩＬ−１５、例えばヒトＩＬ−１５、または非ヒト哺乳動物ＩＬ−１５、または非哺乳動物ＩＬ−１５であり得る。
例示した非ヒト哺乳動物ＩＬ−１５はサルＩＬ−１５、またはネズミＩＬ−１５（例えばアクセッション番号ＮＭ＿００８３５７のマウスＩＬ−１５；アクセッション番号ＮＭ＿０１３１２９のラットＩＬ−１５）、またはウサギＩＬ−１５（例えばアクセッション番号ＤＱ１５７１５２）、ヒツジＩＬ−１５（例えばアクセッション番号ＮＭ＿００１００９７３４）、またはブタＩＬ−１５（例えばアクセッション番号ＮＭ＿２１１３９０）である。例示した非哺乳動物ＩＬ−１５はニワトリ（例えばアクセッション番号ＮＭ＿２０４５７１）である。
【００２０】
さらに好ましくは、前記ＩＬ−１５はヒトＩＬ−１５である。最も好ましくは、前記ヒトＩＬ−１５のアミノ酸配列は配列番号４８の配列である。
【００２１】
ＩＬ−１５はＩＬ−２Ｒアルファに結合しない。本発明が意図した生物学的および医学的応用を考慮して、前記ＩＬ−１５フラグメント、模倣体またはアゴニストはＩＬ−２Ｒアルファに結合しないことが好ましい。
【００２２】
用語「アゴニスト」および「模倣体」は本明細書では、当技術分野における通常の意味である。
化合物は、天然ＩＬ−１５で誘導されたものと同レベル以上の生物学的応答を誘導する場合にＩＬ−１５アゴニストと称される。いっそう高いレベルの生物学的応答を誘導するアゴニスト（スーパーアゴニスト）が好ましい。
ＩＬ−１５アゴニストは通常は、ＩＬ−１５Ｒアルファおよび／またはＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマへの結合親和性を有し、この親和性は天然ＩＬ−１５のものと少なくとも有意差があるとは言えず、天然ＩＬ−１５のものより有意に高いことが好ましい。
【００２３】
ＩＬ−１５の模倣体（またはミメトープ）はＩＬ−１５の生物学的作用を模倣できる任意の化合物を意味する。
【００２４】
本発明では、ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマシグナル伝達経路を介してＩＬ−１５の生物学的作用を模倣できるＩＬ−１５模倣体またはアゴニストが好ましい。したがって該好ましいＩＬ−１５模倣体はＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ複合体に結合する能力を有し、それにより前記ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ複合体を介した生物学的シグナルの変換を誘導および／または刺激する。本発明の好ましいＩＬ−１５模倣体またはアゴニストは、天然ＩＬ−１５のものと少なくとも有意差があるとは言えず、天然ＩＬ−１５のものより有意に高いことが好ましいＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマへの結合親和性を有する。適切なアゴニストまたは模倣体は、例えば国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００２３６７に記載され、ＩＮＳＥＲＭと称して２００５年２月１０日に出願されている。
【００２５】
スシ含有ポリペプチド：
前記少なくとも１つのスシ含有ポリペプチドのアミノ酸配列は：
○  ＩＬ−１５Ｒアルファ（ＩＬ−１５Ｒアルファスシドメインを有するＩＬ−１５Ｒアルファの前記細胞外領域）の細胞外領域のアミノ酸配列であるか、または、
○  ＩＬ−１５Ｒアルファの細胞外領域のフラグメントのアミノ酸配列であり、前記フラグメントはＩＬ−１５Ｒアルファの前記細胞外領域のスシドメインを保持し、前記スシドメインは最初のエクソン２にコードされたシステイン残基（Ｃ１）で開始し、第４のエクソン２にコードされたシステイン残基（Ｃ４）で終了し、残基Ｃ１およびＣ４は共にスシドメインに含まれていると定義されており、または
○  前記スシドメインの４つの各システイン残基（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３およびＣ４）を保持する変異アミノ酸配列である。
【００２６】
その定義付けの代替的定義付けは、それがシグナルペプチドの後方の最初のシステイン残基（Ｃ１）で開始し、シグナルペプチドの後方の第４のシステイン残基（Ｃ４）で終了するというものである。
【００２７】
前記変異アミノ酸配列は、ＩＬ−１５Ｒアルファスシドメインの保存的変異配列を有している可能性がある。
該ＩＬ−１５Ｒアルファスシドメインの保存的変異配列は親スシドメインの配列から、アミノ酸の少なくとも１つの欠失および／または少なくとも１つの置換および／または少なくとも１つの付加により得られるが、以下の特徴：
ｉ．ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマに対するＩＬ−１５の親和性を増加させる能力、
ｉｉ．ベータ／ガンマ陽性細胞、もっと詳しく言えばナイーブなＮＫおよび／またはＴ細胞などのベータ／ガンマ陽性アルファ陰性細胞に対する抗アポトーシス効果を誘導および／または刺激する能力、
ｉｉｉ．ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマシグナル伝達経路を経たＩＬ−１５生物学的作用の効率を促進、すなわちベータ／ガンマ陽性細胞、もっと詳しく言えばナイーブまたは静止ＮＫおよび／またはＴ細胞などのベータ／ガンマ陽性アルファ陰性細胞の増殖および／または活性化を誘導および／または刺激する能力
の少なくとも１つの能力を保持している。
好ましくは、前記保存的変異体は、上記のｉｉｉ．に記述された特徴を保持している。
上述の特徴をアッセイする適切な細胞系はＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ陽性ＩＬ−１５Ｒアルファ陰性細胞である。該細胞系の例は、ベータおよびガンマ鎖（例えばヒトベータおよびヒトガンマ鎖）でトランスフェクション可能な細胞系３２Ｄである。
あるいは、ナイーブまたは静止ＮＫおよび／またはＴ細胞は、血液試料などの生物学的試料から精製可能である。
【００２８】
前記変異アミノ酸配列は、該ＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域または該ＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域のフラグメントのアミノ酸配列に、ＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域のこの配列の全長にわたって、またはＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域のフラグメントの全長にわたって、少なくとも８５%同一であることが好ましい。
さらに好ましくは配列同一性の割合は少なくとも９０%、いっそうさらに好ましくは少なくとも９２%、最も好ましくは少なくとも９５%、例えば少なくとも９６%、少なくとも９７%、少なくとも９８%、少なくとも９９%または１００%である。
【００２９】
該変異アミノ酸配列は、動物種内で天然に存在するＩＬ−１５Ｒアルファの多型、ならびに当業者が製造できる保存的変異体を特に包含する。
【００３０】
ＩＬ−１５Ｒアルファ：
ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン１は、ＩＬ−１５Ｒアルファのシグナルペプチドをコードする。
ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン２は、ＩＬ−１５Ｒアルファのスシドメインをコードする。
エクソン３の５’末端部分は、ＩＬ−１５Ｒアルファのヒンジ領域として公知の領域をコードする。
エクソン３の残りの部分ならびに他の細胞外エクソン（すなわちヒトＩＬ−１５ｒアルファならびにほとんどの種のエクソン４、エクソン５およびエクソン６の５’部分）は、ＩＬ−１５Ｒアルファの尾部としても公知のグリコシル化部位に富んだ領域をコードする。
残りのＩＬ−１５Ｒアルファエクソン（すなわちヒトＩＬ−１５ｒアルファならびにほとんどの種のエクソン６の３’部分ならびにエクソン７）は、ＩＬ−１５Ｒアルファの膜透過領域および細胞質内領域をコードする。
【００３１】
有利には、本発明の医学的な応用を考慮して、前記ＩＬ−１５ＲアルファはヒトＩＬ−１５Ｒアルファであることが好ましい。
前記ヒトＩＬ−１５Ｒアルファのアミノ酸配列は、配列番号３（２６７個のアミノ酸）のヒトＩＬ−１５Ｒアルファ配列の配列であることが最も好ましい。配列番号３のヒトＩＬ−１５Ｒアルファの細胞外領域は、配列番号４０（配列番号３の１．．２０９）のアミノ酸配列を含む。配列番号４０のシグナルペプチド欠失形態は配列番号４４（配列番号３の３１．．２０９）として一覧に示してある。
ＩＬ−１５Ｒアルファのいくつかのヒト対立遺伝子は、配列番号３の位置１８２で、Ａｓｎアミノ酸（ａａｔまたはａａｃにコードされるアミノ酸ｎ）の代わりに、Ｔｈｒアミノ酸（ａｃｔ、ａｃｃ、ａｃａまたはａｃｇにコードされるアミノ酸ｔ）を含んでよい。該変異体は天然に存在し機能的である。
本出願では、該ヒトＩＬ−１５Ｒアルファの対立遺伝子天然変異体は、配列番号３（アミノ酸配列）および配列番号１または２（ｃＤＮＡおよびＣＤＳ配列）の参照ヒトＩＬ−１５Ｒアルファ配列と、ならびに、そこから直接得た参照ヒトＩＬ−１５Ｒアルファ配列、すなわち配列番号４０または４４（アミノ酸配列）および配列番号３９および４３（ＣＤＳ配列）の細胞外領域配列と同等であることを意味する。
配列番号３のヒトＩＬ−１５Ｒアルファの７つのエクソンの位置は以下の表１に記載してある。
これに関して、下記表１に記載されているとおりエクソン１の位置は１．．１７０であり、エクソン２では１７１．．３６５であり、それらはそれぞれ１．．１７１ならびに１７２．．３６５ではなく、アクセッション番号Ｕ３１６２８で入手可能な配列で公表されていることを留意されたい。
【００３２】
【表１】
0005394742.tif 000002
【００３３】
配列番号３のヒトＩＬ−１５Ｒアルファの様々な領域および部分の位置を下記表２に示す。
【００３４】
【表２】
0005394742.tif 000003
【００３５】
本願では、最初の番号と次の番号の間にある２重点記号（《．．》）は、位置「最初の番号」から位置「次の番号」の範囲の配列と一致する分離した配列を表している。
本出願では、配列が「開始」および「終了」位置により定義されている場合、これらの開始および終止位置は記載の配列内に含まれていることを意味する。
【００３６】
予備的な試験、調査、開発、化合物または細胞スクリーニング、臨床前および臨床研究（薬理学的、毒物学的、薬物動態学的または生物学的品質ならびに「リスク便益評価」に関連する試験および安全関連性試験を含む）などの生物学的応用のため、非ヒト哺乳動物ＩＬ−１５Ｒアルファはいずれにせよ使用可能である。
好ましい非ヒト哺乳動物ＩＬ−１５ＲアルファはサルＩＬ−１５Ｒアルファ（例えばチンパンジーＩＬ−１５Ｒアルファ）、またはネズミＩＬ−１５Ｒアルファ（例えばマウスＩＬ−１５Ｒアルファ、ラットＩＬ−１５Ｒアルファ）、またはウサギＩＬ−１５Ｒアルファ、またはブタＩＬ−１５Ｒアルファを特に含む。
【００３７】
該非ヒト哺乳動物ＩＬ−１５ＲアルファのＩＬ−１５Ｒアルファアミノ酸配列の例としては、アクセッション番号ＮＭ＿００８３５８（ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＩＬ−１５Ｒアルファ：配列番号７２の核酸配列、配列番号７３のアミノ配列）、アクセッション番号ＸＭ＿５２１６８４（チンパンジー（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）ＩＬ−１５Ｒアルファ：配列番号７８の核酸配列、配列番号７９のアミノ配列）またはアクセッション番号ＸＭ＿５７７５９８（ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）：ＩＬ−１５Ｒアルファ：配列番号８４の核酸配列、配列番号８５のアミノ配列）として入手可能な核酸配列によりコードされたものが挙げられる。ヒトＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン２およびエクソン３の位置および配列の例として、図４０、４１、４２を参照されたい。
【００３８】
ＩＬ−１５Ｒアルファの細胞外領域
ＩＬ−１５Ｒアルファの細胞外領域は通常、最初のＮ末端アミノ酸から、尾部である最後のアミノ酸（またはグリコシル化部位に富んだ領域）の範囲のＩＬ−１５Ｒアルファ配列の領域として定義される。以下に詳述するとおり、ＩＬ−１５Ｒアルファ配列の尾部は、当業者が、例えばソフトウェアの助けを借りて判定できる。
【００３９】
ＩＬ−１５Ｒアルファの前記細胞外領域は、ヒトＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域または非ヒト哺乳動物ＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域である。
【００４０】
ヒト細胞外ＩＬ−１５Ｒアルファ領域のアミノ酸配列の中では、配列番号４０の細胞外ＩＬ−１５Ｒアルファ領域のアミノ酸配列が好ましい。
配列番号４０のヒトＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域のアミノ酸配列は、ヒトＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン１〜５およびエクソン６の小規模の５’部分にコードされている。
ヒトＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン１（配列番号８）は、ＩＬ−１５Ｒアルファシグナルペプチド（配列番号４の核酸配列；配列番号５のアミノ酸配列）をコードする。
エクソン２（配列番号９）は、ヒトＩＬ−１５Ｒアルファのスシドメインをコードする配列を含む。
エクソン２の最後の３’コドンは、ヒンジ領域の最初のアミノ酸をコードする。
【００４１】
エクソン３（配列番号１０のエクソン３）の５’部分は、ヒトＩＬ−１５Ｒアルファのヒンジ領域をコードする。
エクソン４（配列番号１１）、エクソン５（配列番号１２）を加えたエクソン３の残りの３’部分およびエクソン６の５’部分（配列番号１の６９９．．７０９）は、グリコシル化部位に富んだ領域（尾部としても公知である）をコードする。
配列番号４４の配列は、配列番号４０のＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域の、シグナルペプチド欠失形態である。本発明ではシグナルペプチドを使用してよいが、場合による。該シグナルペプチドはＩＬ−１５Ｒアルファシグナルペプチドまたは他のタンパク質のシグナルペプチドであり得る。したがってＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域のシグナルペプチド欠失形態（配列番号４４など）は、完全なＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外配列（配列番号４０など）と直接に同等である。
【００４２】
非ヒト哺乳動物ＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域の例として、配列番号７４（ハツカネズミＩＬ−１５Ｒアルファの１．．２０４）、配列番号８０（チンパンジーＩＬ−１５Ｒアルファの１．．２８６）、配列番号８６（ドブネズミＩＬ−１５Ｒアルファの１．．１８２）の配列を有するものが挙げられる。
【００４３】
スシドメイン：
前記少なくとも１つのスシ含有ポリペプチドを定義するＩＬ−１５Ｒアルファまたはそのフラグメントの細胞外領域は、ＩＬ−１５Ｒアルファスシドメインを含有する。
【００４４】
ＩＬ−１５Ｒアルファの細胞外領域はスシドメインとして公知のドメインを含有する（Weiら、2001, J. Immunol. 167: 277-282）。
ＩＬ−１５Ｒアルファのスシドメインはベータシート構造を有する。
それはＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン２にコードされている。それは最初のエクソン２にコードされたシステイン残基（Ｃ１）で開始し、第４のエクソン２にコードされたシステイン残基（Ｃ４）で終了する。
標準的なＮ末端からＣ末端への配向におけるＩＬ−１５Ｒアルファタンパク質配列を考える場合、ＩＬ−１５Ｒアルファのスシドメインは、シグナルペプチドの後方の最初のシステイン残基（Ｃ１）で開始し、シグナルペプチドの後方の第４のシステイン残基（Ｃ４）で終了すると定義することができる。
残基Ｃ１およびＣ４は、両方ともスシ配列に含まれる。
【００４５】
したがって、スシドメインが、そのシグナルペプチド配列から欠失したＩＬ−１５Ｒアルファ配列（例えば配列番号４４の配列など）で同定される場合、スシドメインはその後、最初のシステイン残基で開始し（タンパク質のＮ末端から開始し）、このＩＬ−１５Ｒアルファ配列の第４のシステイン残基で終了すると定義される。
ＩＬ−１５Ｒアルファスシドメインは、Prosite（http://us.expasy.org/prosite/）、InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/）、SMART（http://elm.eu.org/）などの適切なソフトウエアを使ったＩＬ−１５Ｒアルファのアミノ酸配列の分析によっても判定可能である。
【００４６】
前記スシドメインのアミノ酸配列は、ヒトＩＬ−１５Ｒアルファスシドメインまたは非ヒト哺乳動物スシドメインのアミノ酸配列であり得る。
【００４７】
ヒトＩＬ−１５Ｒアルファスシドメインのアミノ酸配列の中では、配列番号１４のヒトＩＬ−１５Ｒアルファスシドメインのアミノ酸配列が好ましい。
例えば、ヒトＩＬ−１５Ｒアルファの細胞外領域の前記フラグメントのアミノ酸配列は、配列番号１６（ｉｔ＋ヒトＩＬ−１５Ｒアルファスシ）または１８（ｔ＋ヒトＩＬ−１５Ｒアルファスシ）の配列であり得る。
【００４８】
非ヒト哺乳動物ＩＬ−１５Ｒアルファスシドメインの例として、配列番号７５（ハツカネズミＩＬ−１５Ｒアルファの３６．．〜９６）、配列番号８１（チンパンジーＩＬ−１５Ｒアルファの１３．．７３）または配列番号８７（ドブネズミＩＬ−１５Ｒアルファの２４．．８４）のアミノ酸配列が挙げられる。
【００４９】
シグナルペプチド：
シグナルペプチドはタンパク質の翻訳後輸送を目的とした短い（１５〜６０アミノ酸長）ペプチド鎖である。タンパク質の輸送後、シグナルペプチダーゼによりタンパク質から切断されるシグナルペプチドもある。シグナルペプチドは標的シグナルまたはシグナル配列と称してもよい。シグナルペプチドのアミノ酸配列はサイトゾルで合成されたタンパク質を、核、ミトコンドリア基質、小胞体、葉緑体およびペルオキシソームなどの特定の細胞小器官へと導く。
【００５０】
ＩＬ−１５Ｒアルファのシグナルペプチドは約２９〜３３個のアミノ酸、例えば３０〜３２個のアミノ酸のＮ末端配列である。それはＩＬ−１５Ｒアルファの最初のＮ末端アミノ酸残基で開始する。それは、SIGCLEAVE（http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/sigcleave.html）、InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/）、SMART（http://elm.eu.org/）などの適切なソフトウエアを使ったＩＬ−１５ＲアルファのN末端アミノ酸配列の分析によって判定する。
【００５１】
ハツカネズミＩＬ−１５Ｒアルファのシグナルペプチドは、３２個のアミノ酸のＮ末端アミノ酸配列である（アクセッション番号ＮＰ＿０３２３８４；ｓｉｇ＿ペプチド１．．３２を参照）。
配列番号５に示すとおりヒトＩＬ−１５Ｒアルファのシグナルペプチドは、１つのシステイン残基を含有する３０個のアミノ酸のＮ末端アミノ酸配列である。
【００５２】
エクソン２にコードされた部分のフラグメント：
ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン２は、スシドメイン、すなわち本発明に必要な最小構造単位を含有する。
【００５３】
ＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域の前記フラグメントは、以下：
−前記ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン２にコードされたＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域の一部、または
−該エクソン２にコードされた部分のフラグメント
を含むことが可能である（または本質的に成る）。
【００５４】
本発明にしたがって、ＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域の前記フラグメントは、少なくとも１つのＩＬ−１５Ｒアルファドメインを含む必要がある。したがって、エクソン２にコードされた部分のフラグメントは、スシドメイン（残基Ｃ１から残基Ｃ４）を依然として含むのであれば、その任意のフラグメントであり得る。
例えば、配列番号４０のヒト細胞外領域のエクソン２にコードされた部分は位置３１から位置９４までの範囲の配列（すなわち配列番号２４）であり、すなわちそれはｉｔ＋スシ＋ｉである。
このエクソン２にコードされた部分のフラグメントは、ｔ＋スシ；ｉｔ＋スシ；ｔ＋スシ＋ｉである。
例えば、前記エクソン２にコードされた配列は以下：
−配列番号２４の配列であるヒト細胞外ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン２にコードされた部分、
−配列番号９８の配列であるチンパンジー細胞外ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン２にコードされた部分、
−配列番号９７の配列であるハツカネズミ細胞外ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン２にコードされた部分、
−配列番号９９の配列であるドブネズミ細胞外ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン２にコードされた部分
であり得る。
【００５５】  該ＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域フラグメントの変異体が、本発明の範囲内に包含されている。  該変異体には、その配列に保存的アミノの欠失および／または置換および／または付加を有するものが特に含まれる。  ＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域フラグメントの保存的変異体配列は、親ＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域フラグメントの配列から、アミノ酸の少なくとも１つの欠失および／または少なくとも１つの置換および／または少なくとも１つの付加により得られ、以下の特徴：ｉ．ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマに対するＩＬ−１５の親和性を増加させる能力、ｉｉ．ベータ／ガンマ陽性細胞、もっと詳しく言えばナイーブなＮＫおよび／またはＴ細胞などのベータ／ガンマ陽性アルファ陰性細胞に対する抗アポトーシス効果を誘導および／または刺激する能力、ｉｉｉ．ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマシグナル伝達経路を経たＩＬ−１５生物学的作用の効率を促進、すなわちベータ／ガンマ陽性細胞、もっと詳しく言えばナイーブなまたは静止ＮＫおよび／またはＴ細胞などのベータ／ガンマ陽性アルファ陰性細胞の増殖および／または活性化を誘導および／または刺激する能力の少なくとも１つの能力を保持している。【００５６】
好ましくは、前記保存的変異体は、上記のｉｉｉ．に記述した特徴を保持している。
保存的変異体は、親配列に、この親配列の全長にわたって、少なくとも８５%同一であるアミノ酸配列を持つものを特に含む。好ましくは同一性の前記割合は少なくとも９０%、いっそうさらに好ましくは少なくとも９２%、最も好ましくは少なくとも９５%、例えば少なくとも９６%、少なくとも９７%、少なくとも９８%、少なくとも９９%または１００%である。
【００５７】
例えば、配列番号４０の上述のエクソン２にコードされた部分から始まって、ｉ＋スシ、ｉ＋スシ＋ｔ、ｉ＋スシ＋ｉ、ｉｔ＋スシ＋ｔが親フラグメントと技術的に同等の保存的変異体であることは当業者に明らかであろう。
【００５８】
エクソン２〜３にコードされた部分のフラグメント：
本発明の非常に有利な一実施態様にしたがって、ＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域の前記フラグメントは、前記ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン３にコードされた配列由来の少なくとも１つのアミノ酸をさらに含んでよい。
【００５９】
したがってＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域の前記フラグメントは以下：
−前記ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン２および３にコードされたＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域の一部、または
−前記スシドメインを保持している該エクソン２〜３にコードされた部分のフラグメント
を含むか、あるいは成ってよい。
【００６０】
配列番号３のヒトＩＬ−１５Ｒアルファ（すなわち配列番号４０のヒト細胞外領域）のエクソン３は配列番号１０の核酸配列である。配列番号３のエクソン３にコードされた部分は配列番号９３、すなわち配列番号３または配列番号４０の９５．．１２７配列部分（すなわち配列番号３または４０のヒトＩＬ−１５Ｒアルファの位置９５から位置１２７の範囲のアミノ酸配列であり、位置９５および１２７は共に含まれている）である。
【００６１】
例えば、前記エクソン３にコードされた配列は以下：
−配列番号９３の配列であるヒト細胞外ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン３にコードされた部分、
−配列番号９５の配列であるチンパンジー細胞外ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン３にコードされた部分、
−配列番号９４の配列であるハツカネズミ細胞外ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン３にコードされた部分、
−配列番号９６の配列であるドブネズミ細胞外ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン３にコードされた部分
であり得る。
【００６２】
エクソン３にコードされた部分のフラグメントは、１つのみのアミノ酸、好ましくは少なくとも２つのアミノ酸、より好ましくは少なくとも３つのアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも４つのアミノ酸、最も好ましくは少なくとも５つのアミノ酸のフラグメントであり得る。
【００６３】
本発明者らは、ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマシグナル変換ならびにＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞増殖および活性化に関して、ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン３にコードされた部分またはそのフラグメントが、得られた化合物の親和性および効率を有利に増加させることを明らかにしている。
【００６４】
スシ含有ポリペプチドが融合タンパク質の生成を目的とする場合、当業者はエクソン３のアミノ酸数を、最適な数、すなわち、一方での親和性および効率の増加と、他方での分子サイズおよび構造の難しさの増加との間の均衡のとれたバランスを示すアミノ酸数に限定することを好む場合がある。
したがって当業者は、前記ＩＬ−１５Ｒアルファスシドメインに付加したエクソン３にコードされたアミノ酸数を、３０に、好ましくは２５、より好ましくは２０、さらにより好ましくは１８、最も好ましくは１７、例えば１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６に限定することに利点を見出すこともある。
したがってエクソン３にコードされたアミノ酸の最も好ましい数は、上述の各下限から上述の各上限の組み合わせに起因する区間の数である。
エクソン３にコードされた部分の好ましいフラグメントの例として、配列番号３（または配列番号４０）のヒトＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン３にコードされた部分、すなわち、位置９５および１２７を共に含む位置９５から位置１２７の範囲の部分（すなわち：配列番号３または４０の配列９５．．１２７）から得るフラグメントすべてが挙げられる。
したがって本発明の好ましい化合物は、前記スシドメイン以外に、配列番号３の位置９５から１２７の範囲の配列（位置９５および１２７も共に含む）より得られる少なくとも１つのアミノ酸を含む、少なくとも１つのスシ含有ポリペプチドを含む。それは：
−好ましい数の該アミノ酸（すなわち、「少なくとも２つのアミノ酸、より好ましくは少なくとも３つのアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも４つのアミノ酸、最も好ましくは少なくとも５つのアミノ酸」）、または
−最も好ましい数の該アミノ酸（すなわち「少なくとも２つのアミノ酸、より好ましくは少なくとも３つのアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも４つのアミノ酸、最も好ましくは少なくとも５つのアミノ酸」と「最大３０、好ましくは最大２５、より好ましくは最大２０、さらにより好ましくは最大１８、最も好ましくは最大１７、例えば１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６」とに起因する任意の組み合わせ）
を含むことが最も好ましい。
【００６５】
したがってＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域の前記フラグメントは、前記ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン２にコードされるＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域の部分または上記で定義したその保存的変異体を有利にも含み、さらに、前記ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン３にコードされた配列由来の少なくとも１つのアミノ酸も含む。
【００６６】
もっと詳しく言えば、ＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域の前記フラグメントは以下：
−前記ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン２および３にコードされるＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域の一部またはその保存的変異体、あるいは
−前記ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン２にコードされるＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域の一部、および前記ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン３にコードされるＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域の一部のフラグメント
を含むことができる（または本質的になることができる）。
【００６７】
さらにもっと詳しく言えば、ＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域の前記フラグメントは以下：
−前記ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン２および３にコードされたＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域の一部またはその保存的変異体、あるいは
−該エクソン２〜３にコードされた部分または該エクソン２〜３にコードされた変異体のフラグメント、但し、該フラグメントはスシドメインを保持している
を含むことができる（または本質的に成ることができる）。
【００６８】  保存的変異体の上記の定義は、エクソン２〜３にコードされた部分の保存的変異体について準用し、すなわちそれは親エクソン２〜３にコードされた配列から、アミノ酸の少なくとも１つの欠失および／または少なくとも１つの置換および／または少なくとも１つの付加により得られる配列であり、以下の特徴：ｉ．ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマに対するＩＬ−１５の親和性を増加させる能力、ｉｉ．ベータ／ガンマ陽性細胞、もっと詳しく言えばナイーブなＮＫおよび／またはＴ細胞などのベータ／ガンマ陽性アルファ陰性細胞に対する抗アポトーシス効果を誘導および／または刺激する能力、ｉｉｉ．ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマシグナル伝達経路を経たＩＬ−１５生物学的作用の効率を促進、すなわちベータ／ガンマ陽性細胞、もっと詳しく言えばナイーブなまたは静止ＮＫおよび／またはＴ細胞などのベータ／ガンマ陽性アルファ陰性細胞の増殖および／または活性化を誘導および／または刺激する能力の少なくとも１つの能力を保持している。  好ましくは、前記保存的変異体は、上記のｉｉｉ．に記述した特徴を保持している。  保存的変異体には、親配列に、この親配列の全長にわたって、少なくとも８５%同一であるアミノ酸配列を有するものが特に含まれる。好ましくは同一性の前記割合は少なくとも９０%、いっそうさらに好ましくは少なくとも９２%、もっとも好ましくは少なくとも９５%、例えば少なくとも９６%、少なくとも９７%、少なくとも９８%、少なくとも９９%または１００%である。【００６９】
ヒンジ領域（エクソン２の３’部およびエクソン３の５’部により、またはエクソン３の５’部によりコードされたスシドメインの後方に位置する）：
本発明者らは、ＩＬ−１５Ｒアルファのヒンジ領域がシグナル変換効率のこの上昇に、およびＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞増殖および活性のこの上昇にさらにとりわけ関与していることを明らかにしている。
【００７０】
それゆえ、本発明の非常に有利な実施態様にしたがって、ＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域の前記フラグメントは、前記ＩＬ−１５Ｒアルファスシドメイン以外に、ＩＬ−１５Ｒアルファヒンジ領域またはＩＬ−１５Ｒアルファヒンジ領域のフラグメントをさらに含むことができる。
【００７１】
ＩＬ−１５Ｒアルファヒンジ領域は、（標準的なＮ末端からＣ末端への配向におけるＩＬ−１５Ｒアルファ配列を考える場合）スシドメインの後方の最初のアミノ残基で開始し、グリコシル化の最初の潜在的部位の前方の最後のアミノ酸残基で終了するアミノ酸配列と定義される。
潜在的グリコシル化部位の位置は、潜在的Ｏ−グリコシル化部位の同定ではソフトウエアNetOGlyc（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc-3.1/）を、潜在的Ｎ−グリコシル化部位の同定ではソフトウエアNetNGlyc（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）を使用して判定する。
【００７２】
ヒトＩＬ−１５Ｒアルファにおいて、ヒンジ領域のアミノ酸配列は、前記スシドメインと比べてＣ末端位置におけるこのＩＬ−１５Ｒアルファのスシドメインの後方にある１４個のアミノ酸からなり、すなわち前記ＩＬ−１５Ｒアルファヒンジ領域は、前記（Ｃ４）システイン残基の後方の最初のアミノ酸で開始し、１４番目のアミノ酸（標準的「Ｎ末端からＣ末端」の配向でカウント）で終了する。
【００７３】
配列番号３のヒトＩＬ−１５Ｒアルファ（配列番号４０の配列である細胞外領域）では、前記ヒトＩＬ−１５Ｒアルファヒンジ領域のアミノ酸配列は配列番号２０の配列である。それはエクソン２にコードされた１つのアミノ酸（アミノ酸ｉ）およびエクソン３にコードされた１３個のアミノ酸を含有する。
【００７４】
配列番号７３のハツカネズミＩＬ−１５Ｒアルファにおいて、ヒンジ領域は配列番号７６の配列を有する。
配列番号７９のチンパンジーＩＬ−１５Ｒアルファにおいて、ヒンジ領域は配列番号８２の配列を有する。
【００７５】
配列番号８５のドブネズミＩＬ−１５Ｒアルファにおいて、ヒンジ領域は配列番号８８の配列を有する。
【００７６】
したがって、前記少なくとも１つのスシ含有ポリペプチドは、配列番号７５のスシドメインおよび配列番号７６のヒンジ領域（ハツカネズミ）、配列番号８１のスシドメインおよび配列番号８２のヒンジ領域（チンパンジー）または配列番号８７のスシドメインおよび配列番号８８のヒンジ領域（ドブネズミ）を含んでよい。
【００７７】
好都合にも、前記少なくとも１つのスシ含有ポリペプチドは配列番号１４のヒトスシドメインおよび配列番号２０のヒトヒンジ領域（例えば、配列番号１６または１８、この後に配列番号２０のヒンジ領域が続く）を含むことが好ましい。好ましくは、前記少なくとも１つのスシ含有ポリペプチドは配列番号３０のポリペプチド（ｉｔ＋スシ＋ヒンジ）を含むか、あるいはそれ自体であり、場合によってそのＮ末端ｉおよび／またはｔから欠失している。
【００７８】  ＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域の前記フラグメントは、スシドメイン以外に、ヒンジ領域のフラグメントを代替的に含むことが可能である。ヒンジ領域のフラグメントにより、本明細書ではそれは、前記ヒンジ領域のわずか１つのアミノ酸にいたるまでのその任意のフラグメントを意味する。好ましくは、ヒンジ領域のフラグメントは少なくとも２つのアミノ酸を、より好ましくは少なくとも３つのアミノ酸を含む。  したがってＩＬ−１５Ｒアルファヒンジ領域のフラグメントは、１（例えばアミノ酸ｉ）、２（例えばアミノ酸ｉｒ）、３（例えばアミノ酸ｉｒｄ）、４（例えばアミノ酸ｉｒｄｐ）、５（例えばアミノ酸ｉｒｄｐａ）、６（例えばアミノ酸ｉｒｄｐａｌ）、７（例えばアミノ酸ｉｒｄｐａｌｖ）、８（例えばアミノ酸ｉｒｄｐａｌｖｈ）、９、１０、１１、１２、１３または１４アミノ酸のフラグメントであり得る。  好都合にも、前記少なくとも１つのスシ含有ポリペプチドは、配列番号１４のヒトスシドメインおよび配列番号２０のヒンジ領域のフラグメントを含むことが好ましい。  ＩＬ−１５Ｒアルファヒンジ領域の前記フラグメントのアミノ酸配列は、ｉまたはｉｒまたはｉｒｄを含むか、あるいはそれ自体である。  配列番号２２、２４および２６のスシ含有ポリペプチドは、配列番号１４のスシドメインおよび配列番号２０のヒンジ領域の「ｉ」フラグメントを含む。【００７９】
配列番号２８のスシ含有ポリペプチドは、配列番号１４のスシドメインおよび配列番号２０のヒンジ領域の「ｉｒｄ」フラグメントを含む。
【００８０】
ヒトＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域のフラグメントの前記アミノ酸配列は、もっと詳しく言えば、前記スシドメインおよびヒンジ領域アミノ酸配列以外に以下：
−グリコシル化部位に富んだ領域または尾部として公知の細胞外ＩＬ−１５Ｒアルファの領域のアミノ酸配列、もしくは
−そのフラグメント
を含んでよい。
【００８１】
尾部としても公知であるグリコシル化部位に富んだ領域（エクソン３の３’部、他の細胞外エクソンによりコードされる）：
ＩＬ−１５Ｒアルファのグリコシル化部位に富んだ領域は潜在的グリコシル化部位をいくつか含む領域である。それはＩＬ−１５Ｒアルファの「尾」部を意味することもある。それは（標準的な「Ｎ末端からＣ末端への」配向における配列を考える場合）ヒンジ領域の後方の最初のアミノ酸残基で開始し、ＩＬ−１５Ｒアルファの膜透過領域の前方の最後のアミノ酸残基で終了する。それはいくつかの潜在的グリコシル化部位を含む。
膜透過ドメインは、TopPred (http://biowed.pasteur.fr/seqanal/interfaces/topred.html)、TMpred (http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)などの適切なソフトウエアを使用してＩＬ−１５Ｒアルファのアミノ酸配列を分析することで判定する。
【００８２】
ヒトＩＬ−１５Ｒアルファの尾部は、いくつかのＯ−グリコシル化部位および１つのＮ−グリコシル化部位を含む。
配列番号３２のヒトＩＬ−１５Ｒアルファ尾部は、前記ヒトＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン３の３’部、ならびにエクソン４、エクソン５およびエクソン６の５’部にコードされている。
【００８３】
非ヒト哺乳動物ＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域の尾の例として、配列番号７７（ハツカネズミ）、配列番号８３（チンパンジー）または配列番号８９（ドブネズミ）のアミノ酸配列が挙げられる。
【００８４】
グリコシル化部位に富んだ領域のフラグメントまたはサブフラグメント（あるいは尾部のフラグメントまたはサブフラグメント）により、本明細書ではそれは、前記領域のわずか１つのアミノ酸にいたるまでの前記領域の任意のフラグメントまたはサブフラグメントを意味する。好ましくは前記フラグメントまたはサブフラグメントは、少なくとも２つのアミノ酸、より好ましくは少なくとも３つのアミノ酸を含む。
【００８５】
ゆえにＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域のフラグメントの前記アミノ酸配列は：
−ＩＬ−１５Ｒアルファのグリコシル化部位に富んだ領域の、エクソン３にコードされた部分、または
−該エクソン３にコードされた部分のフラグメント
を含んでよい。
【００８６】
ヒトＩＬ−１５Ｒアルファのグリコシル化部位に富んだ領域の、エクソン３にコードされた部分に好適なアミノ酸配列は、配列番号３４のアミノ酸配列である。本発明のスシ含有ポリペプチドは、有利には配列番号３６のポリペプチドである（場合により、最初のＣ末端ｉおよび／またはｔアミノ酸から欠失している）。
前述したとおり、当業者が適当であると判断したエクソン３にコードされた部分の任意のフラグメントが使用可能であり、例えば任意のフラグメントは少なくとも１つのアミノ酸、好ましくは少なくとも２つのアミノ酸、より好ましくは少なくとも３つのアミノ酸のフラグメントである。
【００８７】
エクソン１、２、３以外の細胞外エクソン：
エクソン１、２、３以外の細胞外ＩＬ−１５Ｒアルファエクソンは、尾部のＣ末端フラグメントをコードする。
該部分、またはそのフラグメントは本発明の化合物の効率をさらに促進する可能性がある。
【００８８】
したがってＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域のフラグメントの前記アミノ酸配列は、エクソン４および／またはエクソン５および／またはエクソン６にコードされた細胞外ＩＬ−１５Ｒアルファの部分、もしくは該部分の任意のフラグメントをさらに含む。
【００８９】
配列番号３のヒトＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン位置は、本明細書では上記の表１に示す。
該スシ含有ポリペプチドのアミノ酸配列の例として、配列番号３８、シグナルペプチド欠失配列番号４２、またはシグナルペプチド欠失配列番号４４の配列が挙げられる。
【００９０】
スシ含有ポリペプチドの例として、ＩＬ−１５Ｒアルファのスシドメイン、ヒンジ領域および完全な尾部（例えば配列番号３２のヒトＩＬ−１５Ｒアルファ尾部；配列番号８３のチンパンジーＩＬ−１５Ｒアルファ尾部；配列番号７７のハツカネズミＩＬ−１５Ｒアルファ尾部；配列番号８９のドブネズミＩＬ−１５Ｒアルファ尾部）、そして場合によりシグナルペプチドを含むものも挙げられる。
【００９１】
ＩＬ−１５生物学的作用：
生物レベルまたは細胞レベルでは、本発明の生成物はＩＬ−１５生物学的作用を誘導および／または刺激するという特徴を含む。それは、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５模倣体および／またはＩＬ−１５アゴニストにより発揮され、誘導され、または刺激されるそれらの生物学的作用を刺激する。
よって本発明の生成物（すなわち単離した形態での本明細書に記述したスシ含有ポリペプチド、もっと詳しく言えば本発明の化合物）は、ＩＬ−１５生物学的作用のアゴニストと見なしてもよい。
【００９２】
本発明の生成物の、特別かつ有利な一特徴的性質は、ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマシグナル伝達経路を誘導および／刺激できること、もっと詳しく言えばＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマシグナル伝達経路を介してＩＬ１５生物学的作用を刺激できることである。
【００９３】
分子レベルでは、従って本発明の生成物はもっと詳しく言えば、ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマシグナル伝達経路の効率を増加させるという特徴を有する。それはＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ複合体を発現する該細胞をＩＬ−１５の作用に対して感受性を持たせる。さらにもっと詳しく言えばそれは、ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ複合体を発現するがＩＬ−１５Ｒアルファは発現しないそれらの細胞（ＩＬ−１５Ｒβ／γ＋ＩＬ−１５Ｒα−細胞）をＩＬ−１５の作用に対して感受性を持たせる。
【００９４】
ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマシグナル伝達経路の効率を促進しないという意味では、本発明の生成物にはＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ特異的のものがある。それは本発明のＩＬＲ融合タンパク質のケースで顕著である（配列番号６２のアミノ酸配列；配列番号６１の核酸配列）。
本発明の他の生成物にはＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマおよびＩＬ−１５Ｒアルファ／ベータ／ガンマシグナル伝達経路の両方の効率を促進可能であるものがある。それは本発明のＲＬＩ融合タンパク質のケースで顕著である（配列番号６０のアミノ酸配列；配列番号５９の核酸配列）。
【００９５】
また、本発明はＩＬ−１５Ｒαのスシドメインがトランス提示に重要であることを示している。よってそれは、例えば少なくとも１つのＩＬ−１５Ｒアルファスシドメインを含含む少なくとも１つの化合物を含む組成物の投与などのワクチン投与により、癌治療および／または緩和および／または予防の分野の、特に有用で特に必要な医学的応用に近づける。
【００９６】
ＩＬ−１５は、リンパ球（Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞など）の増殖および／または生存ならびに／もしくは腫瘍細胞に対するその活性を刺激するサイトカインである。
ＩＬ−１５は補助細胞とリンパ系細胞間のクロストークに関与している。
それは末梢組織においてＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞およびＣＤ８＋記憶Ｔ細胞の成長に必須である。
それはＣＤ３４＋造血細胞の分化を誘導できる最も強力な生理学的因子である。
【００９７】
前記ＩＬ−１５生物学的作用は、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−１５模倣体および／またはＩＬ−１５アゴニストにより発揮され、誘導され、あるいは刺激される生物学的作用である。
当業者は、評価または監視に適当であると、あるいは利便性が高いと判断する任意のＩＬ−１５生物学的応答を選択できる。
前記ＩＬ−１５生物学的作用は、ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ＋ＩＬ−１５Ｒアルファ−細胞に対して、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−１５模倣体および／またはＩＬ−１５アゴニストにより発揮され、誘導され、あるいは刺激される生物学的作用であることが好ましい。
【００９８】
典型的なＩＬ−１５生物学的応答は、ＩＬ−１５感受性細胞の増殖および／または活性化である。
【００９９】
ＩＬ−１５感受性細胞の例としては、その増殖がＩＬ−１５および／もしくはＩＬ−１５模倣体および／もしくはＩＬ−１５アゴニストの添加で誘導および／もしくは刺激され、ならびに／またはその活性化がＩＬ−１５および／もしくはＩＬ−１５模倣体および／もしくはＩＬ−１５アゴニストの添加で誘導および／もしくは刺激される（例えば抗腫瘍活性の誘導）Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞が挙げられる。
該細胞は例えば、哺乳動物生体から採取可能である。
【０１００】
ＩＬ−１５感受性細胞の他の例として、ＣＴＬ−Ｌ２マウス細胞毒性Ｔリンパ腫細胞系（ＡＴＣＣアクセッション番号ＴＩＢ−２１４）またはTF1−ベータ細胞などの公知の細胞系が挙げられる。
TF−1ベータ細胞は、ベータ鎖でTF−1細胞をトランスフェクトすることで利用できる。
TF−1細胞は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−２００３でAmerican Type Culture Collection ATCC; P. O. Box 1549; Manassas, VA 20108; U.S.A.; cf. http://www.lgcpromochem.com/atcc/から入手できる。
その後ＩＬ−２Ｒベータ組換えレトロウイルスを使用してTF−1細胞を感染させ、Ｇ４１８を含有する培地中での選択後、TF−1βを生成することが可能である。
【０１０１】
前記ＩＬ−１５感受性細胞はＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ＋ＩＬ−１５Ｒアルファ−細胞であることが好ましい。ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ＋ＩＬ−１５Ｒアルファ−細胞の例として、ヒトＭｏ−７細胞系もしくは静止ＮＫおよび／またはＴ細胞が挙げられる。
静止ＮＫおよび／またはＴ細胞は当業者で入手できる。それらは例えば、血液試料などの細胞試料を精製することで得られる。
静止ＮＫおよびＴ細胞は以下のとおり健常成体ドナーの血液から単離可能である：全血は高速遠心分離し、淡黄色の膜を得る。この淡黄色の膜は密度勾配遠心分離（Histopaque, Sigma）し、末梢血液リンパ球を得る。その後静止ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞陰性単離キット（Dynal, Biotech ASA, Oslo, Norway）を使用し、末梢血液リンパ球から単離する。あるいは、静止Ｔ細胞は、Ｔ細胞陰性単離キット（Dynal, Biotech ASA, Oslo, Norway）を使用し、末梢血液リンパ球から単離する。
【０１０２】
ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ＋ＩＬ−１５Ｒアルファ−細胞の他の例として、ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ、好ましくはヒトＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマにより形質転換またはトランスフェクトされるＩＬ−１５Ｒアルファ−細胞が挙げられる。
例えば、ネズミ３２Ｄ細胞系（ＡＴＣＣ  ＣＲＴ−１１３４６）はベータおよびガンマ鎖、好ましくはヒトおよびガンマ鎖によりトランスフェクトできる。
【０１０３】
ベータ鎖（すなわちＩＬ−１５Ｒベータ鎖、ＩＬ−２Ｒベータ鎖とも称される）は当業者に公知であり、利用可能である。ベータ鎖の中では、ヒトベータ鎖が好ましい。
ベータ鎖テンプレートは、ヒトＩＬ−２Ｒベータ配列（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｋ０３１２２）にしたがって、プルーフリーディングポリメラーゼＰｆｕ（Stratagene no 600390）およびセンスプライマー（配列番号７０）として
【表３】
0005394742.tif 000004
ならびにアンチセンスプライマー（配列番号７１）として
【表４】
0005394742.tif 000005
を使用し、ＲＴ−ＰＣＲによりＨｕＴ１０２（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１６２）のＲＮＡから利用可能である。ＰＣＲ生成物は、Zero Blunt PCR Cloning Kit（In Vitrogen cat no K2700-20）またはTOPO XL PCRクローニングキット（In Vitrogen cat no K4750-10）を使用し効率よくクローン化する。その後ＩＬ−２Ｒベータ遺伝子のｃＤＮＡを、キットの記述どおりに、Pantropic Retroviral Expression System（BD Biosciences Clontech no 631512）のｐＬＸＲＮレトロウイルス発現ベクターのマルチクローニングサイト中にサブクローン化し、ＧＰ２−２９３細胞へトランスフェクトし、組換えレトロウイルスを生成する。
【０１０４】
ガンマ鎖（すなわちＩＬ−１５Ｒガンマ鎖、ＩＬ−２Ｒガンマ鎖とも称される）は当業者に公知であり、利用可能である。ガンマ鎖の中では、ヒトガンマ鎖が好ましい。
ガンマ鎖テンプレートは、ヒトインターロイキン−２受容体ガンマ配列（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｄ１１０８６）にしたがって、プルーフリーディングポリメラーゼＰｆｕ、およびセンスプライマーとして
【表５】
0005394742.tif 000006
（配列番号１００）、およびアンチセンスプライマーとして
【表６】
0005394742.tif 000007
（配列番号１０１）を使用し、ＲＴ−ＰＣＲによりTF1（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ２００３）またはＨｕＴ１０２（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１６２）のＲＮＡから利用できる。ＰＣＲ生成物は、Zero Blunt PCRクローニングキットまたはTOPO XL PCRクローニングキットを使用し効率よくクローン化する。その後ＩＬ−２Ｒγ遺伝子のｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ  3.1/HYGRO（In Vitrogen）中にサブクローン化し、ｐｃＤＮＡ  ＩＬ−２Ｒγ／ＨＹＧＲＯプラスミドを生成する。
【０１０５】
ＩＬ−２Ｒベータ組換えレトロウイルスを用いて３２Ｄ細胞を感染させ、Ｇ４１８を含有する培地中での選択後に、３２Ｄβを生成することができる。その後ｐｃＤＮＡ  ＩＬ−２Ｒγ／ＨＹＧＲＯプラスミドはエレクトロポレーションにより３２Ｄβ細胞にトランスフェクトし、ハイグロマイシンを含有する培地中での選択後に、３２Ｄβγを生成することができる。
【０１０６】
当業者は、チロシンキナーゼ（例えばＪａｋ−１／Ｊａｋ−３；Ｌｃｋ；Ｓｙｋ）の活性化、ＭＡＰキナーゼの活性化または核転座事象（例えばリン酸化Ｓｔａｔ−３および／またはＳｔａｔ−５の転座）などの、シグナル伝達経路のより下流でのＩＬ−１５生物学的応答を評価または監視することを代替的に選択してよい。そのとき前記ＩＬ１５生物学的応答は無細胞応答である可能性がある。
【０１０７】
付加的な要素（シグナルペプチド、分子タグ、タンパク分解部位等）：
本発明の化合物はシグナルペプチドを含んでよい。このシグナルペプチドは前記少なくとも１つのスシ含有ポリペプチド、または前記少なくとも１つのＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素に直接または間接的に結合可能である。前記シグナルペプチドは、共有原子価により前記化合物に結合可能である。
シグナルペプチドは細胞からのタンパク質分泌を容易にする。
このシグナルペプチドは例えば、前記フラグメントに直接または間接的に結合するヒトＩＬ−１５Ｒアルファ（配列番号５の配列であるヒトＩＬ−１５Ｒアルファのシグナルペプチドなど）、または前記フラグメントに直接または間接的に結合する他のタンパク質のシグナルペプチド（配列番号５８のウシプレプロラクチンのシグナルペプチドなど）などのＩＬ−１５Ｒアルファのシグナルペプチドであってよい。
シグナルペプチドの例としては以下が挙げられる：
−ヒト野生型ＩＬ−１５Ｒアルファのリーダー配列にコードされたペプチド（配列番号４）、すなわちヒト野生型ＩＬ−１５Ｒアルファの最初の３０個のＮ末端アミノ酸（配列番号５）、または
−ウシプレプロラクチンのリーダー配列にコードされたペプチド（配列番号５７）、すなわちウシプレプロラクチンの最初の３１個のＮ末端アミノ酸（配列番号５８）。
当業者が適当であると判断する他のシグナルペプチドも使用してよい。さらに、アミノ酸配列を変化させずに、ＩＬ−１５リーダー配列の特定のヌクレオチドを変化させることが可能である。また、シグナルペプチドとして作用する配列の能力に影響を及ぼさないアミノ酸変化が起こり得る。
【０１０８】
本発明のスシ含有ポリペプチドは、それが得られるＩＬ−１５Ｒアルファのシグナルペプチドに直接結合してよい。にもかかわらず、該スシ含有ポリペプチドは：
−該「天然」シグナルペプチドに間接的に結合してもよいし、または
−前記スシ含有ポリペプチドが得られるＩＬ−１５Ｒアルファ由来ではないシグナルペプチドに直接または間接的に結合してよい。
【０１０９】
本発明の化合物はさらに少なくとも１つの分子タグおよび／または少なくとも１つのタンパク分解部位を含んでよい。
例えば、分子タグおよび／またはタンパク分解部位は、シグナルペプチドとスシドメイン間、またはシグナルペプチドとＩＬ−５Ｒベータ／ガンマ結合要素間に位置することが可能である。前記分子タグおよび／またはタンパク分解部位は前記少なくとも１つのスシ含有ポリペプチドまたは前記ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素に直接または間接的に結合してよい。
分子タグの例として、特にＦＬＡＧ（登録商標）タグが挙げられる。
タンパク分解部位の例として、特にＸａ結合部位が挙げられる。
ＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチド（Hoppら、Bio/Technology 6: 1204, 1988）は融合タンパク質の生物学的活性を変化させず、抗原性が高く、特異性モノクローナル抗体により可逆的に結合したエピトープをもたらし、発現した融合タンパク質の検出を速め、精製を容易にする。ＦＬＡＧ（登録商標）配列はまた、ＡｓｐＬｙｓ対合の直後に、ウシ粘膜エンテロキナーゼによって、その残基で特異的に切断される。このペプチドで覆われた融合タンパク質はまた、大腸菌の細胞内分解に耐性を示す場合がある。ＦＬＡＧ（登録商標）配列に結合するネズミモノクローナル抗体は、アクセッション番号ＨＢ９２５９でＡＴＣＣに寄託されている。ＦＬＡＧ（登録商標）配列を有している融合タンパク質の精製における抗体の使用法は米国特許第５，０１１，９１２号に記載されている。
Ｆｌａｇエピトープおよび因子Ｘａ結合部位をコードする配列の例として、配列番号５３および５５（それぞれ配列番号５４および５６のアミノ酸配列）が挙げられる。
【０１１０】
アミノ酸：
本発明との関連で、「アミノ酸残基」は当業者に既知の任意のアミノ酸残基を意味する（例えばSewaldら、2002 (42)を参照; http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/AminoAcid/でIUPACと命名）。
これは天然のアミノ酸（例えば３文字のコード、Ａｌａ、ｂＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌの使用など）ならびに未加工および／または合成アミノ酸およびその誘導体（例えばＡａｄ、Ａｂｕ、Ａｃｐ、Ａｈｅ、Ａｉｂ、Ａｐｍ、Ｄｂｕ、Ｄｅｓ、Ｄｐｍ、Ｈｙｌ、ＭｅＬｙｓ、ＭｅＶａｌ、Ｎｖａ、ＨＡＯ、ＮＣａｐ、Ａｂｕ、Ａｉｂ、ＭｅＸａａ等を包含する（例えば（Mullerら、1993; Auroraら、1998; Obrechtら、1999; Maisonら、2001; Formaggioら、2003; Nowickら、2003; (43-48)を参照。
前記アミノ酸残基またはその誘導体は、任意のその異性体、特に、任意のキラル異性体、例えばＬ−またはＤ−イソ型であり得る。
アミノ酸誘導体によって、本発明者らは当技術分野では既知の任意のアミノ酸誘導体を言っている（例えばSewaldら、2002 (42) を参照; http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/AminoAcid/でIUPACと命名）。
例えば、アミノ酸誘導体には、側鎖、例えばアルキル側鎖の付加および／またはヘテロ原子置換を担う天然アミノ酸から誘導可能な残基が挙げられる。アミノ酸誘導体のさらなる例として、化学的修飾を担うアミノ酸が挙げられ、該修飾は、天然親ペプチドの生物学的作用（単数または複数）を模倣またはそれに拮抗することが可能な非ペプチド構造要素を含有している化合物である模倣ペプチドまたはペプチド模倣体に見られる。ペプチド模倣体は通常、酵素的に切断可能なペプチド結合などの古典的なペプチドの性質はもはや有していない。
【０１１１】
前記アミノ酸は非必須アミノ酸の群に属することが好ましい。好ましい非必須アミノ酸はグリシン、アラニン、プロリン、セリン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジンである。
薬剤を投与すべき患者に、より少量のこれらアミノ酸を選択することで、適切なアミノ酸を正確に選択し得る。用量および投与計画は、患者の前記アミノ酸におけるレベルに応じて決めることができる。用量および投与計画は、患者のアミノ酸量を正常な標準レベルまで増やすことを目的とするものであることが好ましい。
【０１１２】
前記少なくとも１つのスシ含有ポリペプチドの、前記少なくとも１つのＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素への結合：
本発明の前記少なくとも１つのスシ含有ポリペプチドは、前記少なくとも１つのＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素へ直接結合してよい。
【０１１３】
あるいは、本発明の前記少なくとも１つのスシ含有ポリペプチドおよび前記少なくとも１つのＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素タンパク質は、タンパク質が適切な２次および３次構造を形成することを確実にするのに十分な長さの「リンカー」アミノ酸配列により分離してもよい。好ましくは、前記リンカーは、少なくとも１つではあるが３０個未満のアミノ酸を含むペプチドリンカー、例えば２〜３０個のアミノ酸、好ましくは１０〜３０個のアミノ酸、より好ましくは１５〜３０個のアミノ酸、さらにより好ましくは１９〜２７個のアミノ酸、最も好ましくは２０〜２６個のアミノ酸のペプチドリンカーである。リンカーは、化合物が適切な立体配座（すなわちＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマシグナル伝達経路を経た適切なシグナル変換活性を可能にする立体配座）を選択することを可能ならしめるものが好ましい。リンカーの例としては、柔軟なリンカーが好ましい。
最も好適なリンカー配列は（１）柔軟で拡張された立体配座を選択し、（２）融合タンパク質の機能的ドメインと相互に作用し得る規則的な２次構造を生成する傾向を示さず、（３）機能的タンパク質ドメインとの相互作用を促進し得る最低限の疎水性または荷電特性を有するとされている。柔軟なタンパク質領域の典型的表面アミノ酸としてはＧｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒ（すなわちＧ、ＮまたはＳ）が挙げられる。事実上、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒを含有しているアミノ酸配列の任意の順列は、リンカー配列の上記の基準を満たすことが予想される。Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ（すなわちＴ、Ａ、Ｌ、Ｑ）などの他の中性に近いアミノ酸もリンカー配列中で使用してよい。リンカー配列の長さは融合タンパク質の生物学的活性に多大な影響を及ぼすことなく変化してよい。
リンカー配列の例は米国特許第５，０７３，６２７号および５，１０８，９１０号に記載されている。
本発明にさらにとりわけ好適な柔軟リンカーの例として、配列番号４９または５１の配列にコードされるものが挙げられる（それぞれリンカー２０とも称される配列番号５０およびリンカー２６とも称される配列番号５２のアミノ酸配列）。
【０１１４】
本発明の化合物において、前記少なくとも１つのＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素の配列に対して、前記少なくとも１つのスシ含有ポリペプチドの配列はＮ末端側に位置し得る。
あるいは、前記少なくとも１つのＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素の配列に対して、前記少なくとも１つのスシ含有ポリペプチドの配列はＣ末端側に位置し得る。
【０１１５】
本発明の化合物は融合タンパク質であり得る。
融合タンパク質は、異なる、または異種のタンパク質またはペプチド由来の２つ以上の領域を含むポリペプチドである。融合タンパク質は、目的の配列からフラグメントを酵素切断およびライゲーションする通常の技術を使用し調製する。合成オリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲ技術は目的のフラグメントを調製および／または増幅させるために使用してよい。目的の配列を表す重複合成オリゴヌクレオチドもまた、融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物を調製するために使用可能である。融合タンパク質は数個の、リーダー（またはシグナルペプチド）配列、リンカー配列、ロイシンジッパー配列または他のオリゴマー形成配列を含む配列、および融合タンパク質の簡易な精製または迅速な検出の手段を提供する高抗原性部分をコードする配列を含むことができる。
【０１１６】
本発明の化合物の例として、任意にリンカーを介して互いに結合している配列番号３０のスシ含有ポリペプチド（ｉｔ＋スシ＋ヒンジ）および配列番号４８のヒト野生型ＩＬ−１５を含む融合タンパク質が挙げられる。
本発明の化合物のさらなる例として、以下を含む融合タンパク質が挙げられる：
−配列番号５のシグナルペプチド、
−配列番号５４のＦｌａｇタグおよびＸａ結合部位配列、
−配列番号３０のスシ含有ポリペプチド（ｉｔ＋スシ＋ヒンジ）、
−配列番号５０のリンカー、および
−配列番号４８のヒト野生型ＩＬ−１５、
すなわち配列番号６０にコードされたＲＬＩ融合タンパク質。
本発明の化合物のさらなる例として、以下を含む融合タンパク質が挙げられる：
−配列番号５８のシグナルペプチド、
−配列番号５６のＦｌａｇタグおよびＸａ結合部位配列、
−配列番号４８のヒト野生型ＩＬ−１５、
−配列番号５２のリンカー、
−配列番号３０のスシ含有ポリペプチド（ｉｔ＋スシ＋ヒンジ）、
すなわち配列番号６２のＩＬＲ融合タンパク質。
【０１１７】
本発明の化合物は、当業者が適当であると判断し得る任意の手段、例えば化学的ポリペプチド合成またはポリペプチド生合成などにより生産可能である。
【０１１８】
化学的ポリペプチド合成は現在日常で行われており（Anderssonら、2000, Biopolymers (Peptide Science) 55: 227-250）、該合成を多くの企業が専門化している。
好ましくは、本発明の化合物は、標準的ＦＭＯＣプロトコールを使用して固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）技術により合成する（例えばCarpinoら、1970, J. Am. Chem. Soc. 92 (19): 5748-5749; Carpinoら、1972, J. Org. Chem. 37 (22): 3404-3409を参照）。
【０１１９】
あるいは、当業者は、該化合物をコードする核酸のインビトロまたはインビボ翻訳により生物学的に化合物を生成することを選択してもよい。
【０１２０】
核酸、ベクター、宿主細胞：
よって本発明は、ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマシグナル伝達経路を刺激し、それによってＮＫおよび／またはＴ細胞などのＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞の活性化および／または増殖を誘導および／または刺激することを目的とする生成物をコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）にも関する。
もっと詳しく言えば、本発明の核酸は、本明細書で定義した本発明の単離スシ含有ポリペプチド、または本明細書で定義した本発明の共有結合した（すなわち少なくとも１つのＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素に直接または間接的に共有原子価で結合した少なくとも１つのスシ含有ポリペプチドを有している）化合物をコードしている。その縮重を十分に考慮しながら、前記コーディングは普遍的遺伝子コードにしたがっている。
本発明の核酸は、トランスフェクションベクターまたは発現ベクターなどのベクター内に任意に含有させることが可能である。
本発明の核酸は、転写プロモーターまたはエンハンサーなどの好適な転写または翻訳調節配列、転写を制御する任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳開始および終結を制御する適切な配列に操作可能に結合してよい。
該ベクターの例として、ｐＥＦ１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（In Vitrogen, V921-20）、ｐｃＤＮＡ３．１（In Vitrogen, V800-20）が挙げられる。
本発明の核酸はまた、翻訳したポリペプチドの細胞外分泌を改善することを可能にするリーダー配列に結合してよい。該リーダー配列の例として、ラットプレプロラクチン（配列番号５７）由来の、またはヒトＩＬ−１５ＲアルファシグナルペプチドなどのＩＬ−１５Ｒアルファ（配列番号４のＣＤＳ）由来のリーダー配列が挙げられる。
これらの核酸配列は、それらの３’末端の終止コドン（ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡ）も含んでよい。
【０１２１】
本発明は、本発明の記述した化合物の１つをコードしているすべての核酸に関する。請求項の前に位置する表４はこれらの核酸の各配列番号を示している。
【０１２２】
例えば：
−前記ヒトＩＬ−１５Ｒアルファの核コーディングは、配列番号２の配列を含むことができる；
−前記ヒト細胞外ＩＬ−１５Ｒアルファの核コーディングは、配列番号３９の配列を含むことが可能である；
−前記ヒトスシドメインの核コーディングは、配列番号１３の配列を含むことができる；
−前記ヒト尾部の核コーディングは、配列番号３１の配列を含むことができる；
−前記ヒト尾部の前記エクソン３にコードされた部分の核コーディングは、配列番号３３の配列を含むことができる；
−前記ヒトＩＬ−１５の核コーディングは、配列番号４７の配列を含むことができる；
−本発明の共有結合した化合物の核コーディングは、配列番号５９（ＲＬＩ融合タンパク質）または配列番号６１（ＩＬＲ融合タンパク質）の配列を含むことができる。
【０１２３】
本発明の核酸は、５’末端のコザック配列、例えばｇｃｃ  ｇｃｃなどのヒト野生型ＩＬ−１５Ｒ由来のコザック配列；またはｇｃｃ  ａｃｃなどのウシプレプロラクチン由来のコザック配列を含むことが可能である。
本発明の核酸は、その３’末端に終止コドン（例えばｔａｇ、ｔｇａまたはｔａａ）を含むことが可能である。
【０１２４】
本発明はまた、本発明の核酸を有する任意のベクターに関する。好ましくは、該ベクターはバキュロウイルスベクターである。
前記ベクターは、例えばトランスフェクション、または発現ベクターであり得る。
【０１２５】
本発明はまた、本発明の核酸および／またはベクターに形質転換またはトランスフェクションされた任意の宿主細胞に関する。
本明細書で使用する「トランスフェクションされた」または「トランスフェクション」は１つ以上の外因性核酸の真核細胞への導入を意味する。トランスフェクションは、リン酸カルシウム沈殿、硫酸デキストラン沈殿、エレクトロポレーション、リポソーム媒介核酸輸送、粒子衝突などの弾道的な方法等を含む標準的な物理的および化学的トランスフェクション技術によるプラスミドなどの裸核酸の導入を含んでいる。トランスフェクションは、ウイルス変換または感染（受容体媒介および非受容体媒介）を含む生物学的方法による核酸の細胞への導入も含んでいる。
本明細書で使用するとおり、「形質転換された」または「形質転換」は、１つ以上の外因性核酸の原核細胞への導入を意味する。形質転換は、裸核酸ならびにファージなどの核酸ベクターの導入を含んでいる。
【０１２６】
好適な宿主細胞には、適切なプロモーターの制御下の原核生物、酵母または高等真核細胞が含まれる。
原核生物には、グラム陽性およびグラム陰性生物、例えば大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）ならびにバチルス属、シュードモナス属、ストレプトマイセス属、ブドウ球菌族内の他の様々な種が含まれる。
好適な宿主細胞の例として、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）などの酵母および哺乳動物または昆虫起源の樹立細胞系などの高等真核細胞も挙げられる。好適な高等真核細胞の例として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えばチャイニーズ卵巣ハムスター細胞系ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−（ＣＨＯ  ｄｕｋ−）（ＡＴＣＣｎｏＣＲＬ−９０９６）または上皮細胞系、例えばサル上皮細胞系ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣｎｏＣＲＬ１６５１）またはヒト細胞系、例えば２９３ｃ１８ヒト腎細胞系（ＡＴＣＣｎｏＣＲＬ−１０８５２）またはＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３−Ｆヒト腎細胞系（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｎｏＲ７９０−０７）などの哺乳動物細胞系が挙げられる。
前記宿主細胞は、真核細胞、哺乳動物細胞（ヒトまたはＣＨＯ細胞などの非ヒト）、酵母細胞または原核細胞（大腸菌など）であってよい。
前記宿主細胞は、該細胞がより効率的（グリコシル化のいかなる問題とも無関係に）である本発明のとおり、哺乳動物細胞であることが最も好ましい。
【０１２７】
生物学的および医学的応用：
本発明の生成物は、本明細書で定義した単離形態およびその共有結合形態で前記スシ含有ポリペプチドを特に含み、本明細書では本発明の共有結合化合物と称される（すなわち、少なくとも１つのＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素に共有原子価で直接または間接的に結合した少なくとも１つのスシ含有ポリペプチドを含む化合物）。
【０１２８】
本発明の生成物は、該ポリペプチドおよび化合物をコードする核酸、該核酸を有するベクター、ならびに該核酸または該ベクターに形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞をも含む。
本発明の生成物は特定のＴ／ＮＫサブセットなどのリンパ球サブセットの拡張に有用である。したがって本発明は、ＮＫ細胞、ＮＫ−Ｔ細胞、ＣＤ８＋記憶細胞などの１つまたは数種のリンパ球集団を拡張するための薬剤としての本発明の生成物の使用、ならびに該使用を目的とした、少なくとも１つの本発明の生成物を含む医薬組成物および薬剤を含めたアジュバント、組成物およびキットに関する。
前記少なくとも１つのスシ含有ポリペプチドおよび前記少なくとも１つのＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素は、例えば本発明の共有結合化合物の形態などの結合形態で、または分離形態で使用可能である。
よって本発明は：同時の、別々の、または連続的な使用のための、すなわちキット・オブ・パーツ（kit-of-parts）形態での組み合わせの製剤として：
−本明細書で定義した前記少なくとも１つのＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素、および
−本明細書で定義した前記少なくとも１つのスシ含有ポリペプチド、
またはそれらの各核酸、ベクター、宿主細胞
に関する。
したがって本発明は、医薬組成物および薬剤を含むアジュバント、組成物またはキットである該製剤に関する。
【０１２９】
したがって本出願は、ＩＬ−１５活性の増大が望まれる疾患または病気、特に癌または免疫不全などの予防および／または緩和および／または治療に関する。該予防および／または緩和および／または治療は、リンパ球（Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞など）の増殖および／もしくは生存ならびに／または腫瘍細胞に対するそれらの活性、を刺激することで作用する可能性がある。
【０１３０】
本発明の予防および／または緩和および／または治療の方法は、本発明の生成物を、それを必要とする患者に投与することを含む。
【０１３１】
本発明はまた、該予防および／または緩和および／または治療用に意図したアジュバント、組成物、医薬組成物、薬剤およびワクチンに関する。
本発明の医薬組成物、薬剤およびワクチンには本発明の少なくとも１つの生成物を、場合によって医薬的に許容され得るビヒクルおよび／または担体および／または希釈剤および／またはアジュバントが含まれる。
【０１３２】
本発明はもっと詳しく言えばアジュバントに関する。該アジュバントは免疫応答の誘導および／または刺激に特に適合し、単離したＩＬ−１５Ｒアルファスシドメインまたはその保存的変異体を含む。該アジュバントは抗生物（抗ウイルス、抗細菌、抗真菌）ワクチンまたは抗腫瘍ワクチン用のアジュバントであってよい。
【０１３３】
本発明はまた：
−単離したＩＬ−１５Ｒアルファスシドメイン、またはその保存的変異体を含む、ＩＬ−１５の生物学的作用を誘導および／または刺激することを特に意図した組成物、
−免疫治療組成物のアジュバントを製造するための、単離したＩＬ−１５Ｒアルファスシドメイン、またはその保存的変異体の使用、
−ＩＬ−１５の生物学的作用を誘導および／または刺激することを特に意図した組成物を製造するための、単離したＩＬ−１５Ｒアルファスシドメイン、またはその保存的変異体の使用、
に関する。
【０１３４】
したがって本願は、本明細書で定義した少なくとも１つのスシ含有ポリペプチド、ならびに場合によって医薬的に許容され得るビヒクルおよび／または担体および／または希釈剤および／またはアジュバントを含む薬剤またはワクチンに関する。
該薬剤またはワクチンは、ＩＬ−１５活性の増大が望まれる疾患または病気、特に癌または免疫不全などを予防および／または治療および／または緩和することを目的としている。該薬剤またはワクチンは、リンパ球（Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞など）の増殖および／もしくは生存ならびに／または腫瘍細胞に対するそれらの活性を刺激することで作用する可能性がある。
【０１３５】
本発明はもっと詳しく言えば、ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマを発現するが、ＩＬ−１５Ｒアルファは発現しないＮＫおよびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の刺激を介したその予防効果および／または緩和効果および／または治療効果を発揮する抗腫瘍薬またはワクチンに関する。
したがって該抗腫瘍薬またはワクチンは、効率的な抗腫瘍サーベイランスまたは抗腫瘍除去をするにはＮＫおよび／またはＣＤ８＋Ｔ細胞集団の活性が不十分である患者を対象としている。
該抗腫瘍薬またはワクチンはもっと詳しく言えば、ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマを発現するが、ＩＬ−１５Ｒアルファは発現しないＮＫおよび／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の集団が不十分である、またはその活性的集団が不十分である患者を対象としている。
【０１３６】
本発明の抗腫瘍薬またはワクチンは、単離したＩＬ−１５Ｒアルファスシドメインまたはその保存的変異体を含んでよい。
【０１３７】
本発明の好ましい抗腫瘍薬またはワクチンは：
−ＩＬ−１５などの、本明細書で定義した少なくとも１つのＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素、および
−単離したＩｌ−１５Ｒアルファスシドメインまたはその保存的変異体などの、本明細書で定義した少なくとも１つのスシ含有ポリペプチド
を含む。
好ましくは、ＩＬ−１５などの少なくとも１つのＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素、および単離したＩｌ−１５Ｒアルファスシドメインまたはその保存的変異体などの前記少なくとも１つのスシ含有ポリペプチドは融合タンパク質内で結合しており、それによって本発明の共有結合した化合物が形成される。
【０１３８】
本発明はまた、免疫不全に関する病気または疾患の予防および／または緩和および／または治療に関する。
本発明はもっと詳しく言えば、ＨＩＶ関連免疫不全に関する病気または疾患の予防および／または緩和および／または治療に関する。
この予防および／または緩和および／または治療には、本発明の生成物を必要とする患者に投与することが挙げられる。
本発明は、該予防および／または緩和および／または治療用の薬剤および／または組成物に関する。
【０１３９】
よって本発明は免疫治療組成物用のアジュバントに関しており、それは以下の要素：
−本発明の化合物、
−本発明の核酸、
−本発明のベクター、
−本発明の宿主細胞
の中で少なくとも１つの要素を含むことを特徴としている。
好都合にも、前記アジュバントはＣＤ８メモリー応答を改善する。
【０１４０】
本願では、『免疫療法』は、免疫応答の誘導および／または刺激による治療、緩和および／または予防を包含している。したがって用語『免疫治療組成物』は、予防的ワクチンならびに緩和および／または治療の「ワクチン」を包含する。
用語『アジュバント』は、組成物に添加して免疫応答（先天性免疫応答および／または適応免疫応答）を改善し得る物質を定義することを意図している。本発明において、それはさらに、組成物に添加してこの組成物の経時的な効率、すなわち免疫応答の持続時間を改善し得る物質（記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞）を包含する。
【０１４１】
本発明の化合物はアジュバント化合物として組成物に使用してよいが、有効成分としてそれ自体で作用することも可能である。
それはまさに、ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞の増殖および活性化、もっと詳しく言えばナイーブなＮＫおよび／またはＴ細胞由来のＮＫおよび／またはＴ細胞の分化を誘導および／または刺激することが自然に自力で可能である。
用語『有効成分』は、免疫応答を誘起し得る物質を定義することを意図している。
【０１４２】
免疫治療組成物のアジュバントとして、本発明の化合物は免疫応答（先天性免疫応答；適応免疫応答）の強さを改善、および／または免疫応答の持続時間を改善する（Ｔ  ＣＤ８メモリー応答を改善する）。
【０１４３】
免疫治療組成物の活性薬剤として、本発明の化合物は、他のＮＫ／Ｔ細胞刺激に誘導される免疫応答よりも強く、および／または持続時間が長い免疫応答を誘導する。
それゆえに、誘導された他の免疫応答に関連するアジュバントとして用いようと、または免疫応答を自然に自力で誘導する有効成分として用いようと、本発明の化合物は免疫応答の強さおよび／または持続時間を改善する。それは好都合には：
−先天性免疫応答の改善を誘導し、
−適応免疫応答の改善、もっと詳しく言えばＣＤ８メモリー応答の改善を誘導する。
【０１４４】
本出願はまた、以下の要素：
−本明細書で定義した本発明の化合物、
−本発明の核酸、
−本発明のベクター、
−本発明の宿主細胞
の中で少なくとも１つの要素を含むアジュバント組成物に関する。
【０１４５】
本出願はまた免疫治療組成物のアジュバントの製造方法に関し、特徴的に以下の工程：
そのスシドメインを保持した可溶ＩＬ−１５Ｒアルファ分子またはそのフラグメントを提供する工程、
それを、天然ＩＬ−１５の結合親和性よりも有意に低くはないＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合親和性を有し（ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマに結合するため、天然ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２と競合可能である）、また、好適にＩＬ−２Ｒアルファに結合しないＩＬ−１５、ＩＬ−１５フラグメント、アゴニストまたは模倣体から選択されたＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素に共有原子価で結合させる工程、
を含み、
これらによって、これらに起因する化合物は免疫治療組成物のアジュバントである。
【０１４６】
本発明はまた、本明細書で定義したＩＬ−１５Ｒアルファのスシドメインを含有する少なくとも１つのポリペプチドを含む組成物、医薬組成物または薬剤に関しており、すなわち、ここでは前記少なくとも１つのスシ含有ポリペプチドのアミノ酸配列は：
○  ＩＬ−１５Ｒアルファのスシドメインが、最初のエクソン２にコードされたシステイン残基（Ｃ１）で開始し、第４のエクソン２にコードされたシステイン残基（Ｃ４）で終了し、残基Ｃ１およびＣ４は共にスシ配列に含まれていると定義されている、前記ＩＬ−１５Ｒアルファのスシドメインを保持しているヒトＩＬ−１５Ｒアルファまたはそのフラグメントの細胞外領域のアミノ酸配列であるか、あるいは
○  前記スシドメインの４つのシステイン残基（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３およびＣ４）がそれぞれ保持されていれば、該ＩＬ−１５ＲアルファまたはＩＬ−１５Ｒアルファフラグメント配列に少なくとも８５%同一である。
好ましくは同一性の前記割合は少なくとも９０%、いっそうさらに好ましくは少なくとも９２%、最も好ましくは少なくとも９５%、例えば少なくとも９６%、少なくとも９７%、少なくとも９８%、少なくとも９９%または１００%である。
本発明はもっと詳しく言えば、本明細書に定義したＩＬ−１５Ｒアルファのスシドメインを含有する少なくとも１つのポリペプチドを含む組成物、医薬組成物または薬剤に関しており、ここで前記少なくとも１つのスシ含有ポリペプチドは、スシドメインを保持しているエクソン２および３にコードされた細胞外ＩＬ−１５Ｒアルファの一部または該部分のフラグメントを含むか、あるいはそれから成る。
好ましくは、本発明は：
−そのアミノ酸配列が配列番号３の位置１から位置１２７まで拡張しているアミノ酸であるヒトＩＬ−１５Ｒアルファフラグメント、または
−前記フラグメントのスシドメインを保持しているそのサブフラグメント
を含む組成物、医薬組成物または薬剤に関しており、ここでは：
−前記スシドメインは、最初のエクソン２にコードされたシステイン残基（Ｃ１）で開始し、第４のエクソン２にコードされたシステイン残基（Ｃ４）で終了し、残基Ｃ１およびＣ４は共にスシドメインに含まれていると定義され、
−前記シグナルペプチドのアミノ酸配列は、前記配列番号３の位置１から位置３０まで拡張している配列であり、
−前記フラグメントまたはサブフラグメントの変異体は、前記フラグメントまたはサブフラグメントの全長にわたって少なくとも８５%のアミノ酸配列同一性を有する。
好ましくは同一性の前記割合は少なくとも９０%、いっそうさらに好ましくは少なくとも９２%、最も好ましくは少なくとも９５%、例えば少なくとも９６%、少なくとも９７%、少なくとも９８%、少なくとも９９%または１００%である。
該組成物、医薬組成物または薬剤はさらに、本明細書で定義したＩＬ−１５またはＩＬ−１５フラグメントまたは変異体などの、少なくとも１つのＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素を含んでよい。
前記少なくとも１つのＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素は前記少なくとも１つのスシ含有ポリペプチドに共有原子価で結合することができず、すなわち遊離形態で前記組成物に位置し、および／または前記少なくとも１つのスシ含有ポリペプチドに共有原子価で結合することが可能である。後者では、本発明の組成物、医薬組成物または薬剤は実際、本明細書で定義した本発明の化合物を含む。
【０１４７】
該医薬組成物または薬剤はＩＬ−１５生物学的作用を活性化する（agonizing）、もっと詳しく言えばＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞の増殖および／または活性化を誘導および／または刺激することを目的とし得る。
該医薬組成物または薬剤は、ＮＫおよび／またはＴ免疫応答の増加および／または活性化を誘導および／または刺激することを目的とし得る。
該医薬組成物または薬剤は、予防および／または緩和および／または治療のワクチン組成物を目的とし得る。
該医薬組成物または薬剤は、感染病の予防および／もしくは緩和および／もしくは治療、ならびに／または免疫不全（ＨＩＶ誘導免疫不全など）の予防および／もしくは緩和および／もしくは治療、ならびに／または腫瘍の成長または存在の予防および／もしくは緩和および／もしくは治療（および少なくとも１つの腫瘍抗原を含有してよい）、ならびに／またはＸ−ＳＣＩＤの予防および／もしくは緩和および／もしくは治療を目的とし得る。
【０１４８】
本発明の有利な実施態様にしたがって、前記少なくとも１つのスシ含有ポリペプチドはＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素に共有結合する。このＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素はＩＬ−２Ｒアルファに結合しないことが最も好ましい。
本発明の好ましい一実施態様にしたがって、前記少なくとも１つのスシ含有ポリペプチドは、天然ＩＬ−１５の結合親和性よりも有意に低くはないＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合親和性を有する、ＩＬ−１５、またはＩＬ−１５フラグメント、模倣体もしくはアゴニスト（すなわちＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマに結合するため、天然ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２と競合可能であるフラグメント、模倣体またはアゴニスト）であるＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ結合要素に共有結合する。
【０１４９】
従って本発明はもっと詳しく言えば、ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマシグナル伝達経路を刺激し、それによりＮＫおよび／またはＴ細胞などのＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞の活性化および／または増殖を誘導および／または刺激することを目的とする医薬組成物に関しており、それは以下の要素：
−本発明の化合物、
−本発明の核酸、
−本発明のベクター、
−本発明の宿主細胞
の中で少なくとも１つの要素を含むことを特徴としている。
該医薬組成物はさらに、医薬的に適切なビヒクル（担体、希釈剤、賦形剤、添加剤、ｐＨ調整剤、乳化剤または分散剤、保存剤、界面活性剤、ゲル化剤ならびに緩衝剤、他の安定剤および可溶化剤等）を含んでよい。
【０１５０】
本発明はまた、ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマシグナル伝達経路を刺激し、それによってＮＫおよび／またはＴ細胞などのＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞の活性化および／または増殖を誘導および／または刺激することを目的とする薬剤に関しており、それは以下の要素：
−本発明の化合物、
−本発明の核酸、
−本発明のベクター、
−本発明の宿主細胞
の中で少なくとも１つの要素を含むことを特徴としている。
前記薬剤は免疫治療組成物であることが好ましい。
該薬剤は、予防および／または緩和および／または治療用ワクチン組成物であることが最も好ましい。
前記薬剤はさらに、生理学的に適切なビヒクル（担体、希釈剤、賦形剤、添加剤、ｐＨ調整剤、乳化剤または分散剤、保存剤、界面活性剤、ゲル化剤ならびに緩衝剤、他の安定剤および可溶化剤等）を含んでよい。
【０１５１】
適切な医薬的に許容できるビヒクルおよび製剤は、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」、第２０版、Mack Publishing Co.；および「Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems」、Ansel, PopovichおよびAllen Jr., Lippincott WilliamsおよびWilkinsに記載しているような公知の医薬的に許容できるビヒクルおよび製剤すべてを含む。
【０１５２】
概して、担体の性質は採用された特定の投与形式に依存するとされている。例えば、非経口製剤には通常、１つ以上の造影剤以外に、ビヒクルとしての水、生理食塩水、平衡塩類溶液、バッファー、水溶性デキストラン、グリセロール、エタノール、ゴマ油、それらの組み合わせ等などの医薬的および生理学的に許容できる液体を含む注射用液が挙げられる。媒質はまた、例えば医薬的に許容できる浸透圧調整用の塩、バッファー、保存料等の従来の医薬補助剤も含有してもよい。担体および組成物は滅菌可能であり、製剤は投与形式に適している。
【０１５３】
固形組成物（例えば粉末、錠剤、タブレットまたはカプセル形態）では、通常の非毒性固形担体は、例えば医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムまたはステアリン酸マグネシウムを含むことが可能である。生物学的に中性の担体以外に、投与される医薬組成物は、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートといった湿潤剤、乳化剤、保存剤およびｐＨ緩衝剤等の補助剤を少量含有することが可能である。
【０１５４】
組成物は液体溶液、懸濁液、乳液、タブレット、錠剤、カプセル、徐放製剤または粉末であり得る。組成物は、トリグリセリドなどの従来の結合剤および担体で製剤化できる。
【０１５５】
本発明の組成物または薬剤は、ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマシグナル伝達経路を介したＩＬ−１５生物学的作用の誘導および／または刺激に有用である。もっと詳しく言えば、それは先天性免疫応答（ＮＫ細胞）および／または適応免疫（Ｔ細胞、もっと詳しく言えばＴ  ＣＤ８＋記憶細胞）の誘導および／または刺激に有用である。
【０１５６】
本発明の非常に有利な一実施態様にしたがって、前記薬剤は腫瘍の成長または存在の予防および／または緩和および／または治療を目的とし得る。
前記腫瘍は、例えばメラノーマ、リンパ球、癌腫（例えば子宮頸癌）、乳癌、卵巣癌、膵臓腫瘍であり得る。
好都合にも、前記抗腫瘍薬は、トランス提示を解して作用する抗腫瘍ワクチンである。
本発明の抗腫瘍薬はさらに、少なくとも１つの腫瘍抗原を含むことができる。前記少なくとも１つの腫瘍抗原は可溶形態であるか、あるいは本発明の化合物に（共有原子価または他の結合形態によって）結合することが可能である。前記少なくとも１つの腫瘍抗原は好都合にも、該抗原のある樹状細胞、例えば前記少なくとも１つの腫瘍抗原を発現する遺伝子改変樹状細胞の形態で提供される。
【０１５７】
腫瘍抗原は、腫瘍細胞の表面上のＭＨＣ  Ｉ分子により提示される抗原である。腫瘍抗原はまた、例えば、Ｂ細胞に認識される場合に変異型受容体の形態で腫瘍の表面上に存在し得る。
腫瘍抗原は腫瘍細胞のみに提示され、正常細胞に提示され得ないことがある。この場合、それらは腫瘍特異性抗原（ＴＳＡ）または腫瘍特異性移植抗原（ＴＳＴＡ）または腫瘍拒絶抗原（ＴＲＡ）と称され、典型的に腫瘍特異的突然変異に起因している。感染ウイルスが細胞を不死にし、ウイルス抗原を発現するようにさせると、通常ＴＳＡが現れる。ウイルスに誘導されないＴＳＡは、Ｂ細胞リンパ腫のＢＣＲまたはＴ細胞リンパ腫のＴＣＲのイディオタイプである。
【０１５８】
腫瘍細胞および正常細胞によって提示される抗原が、より一般的であり、それらは腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と称される。ＴＡＡは腫瘍細胞上で見られ、また、選択された器官または多くの細胞で出生後胎児期（腫瘍胎児抗原）の正常細胞上でも見られるが、腫瘍細胞上の場合より濃度はかなり低い。
癌遺伝子は発癌性ウイルス内で発現する場合がある。ほとんどの癌遺伝子は実際宿主細胞に存在し、ここでそれらは細胞成長の調節に機能している。ウイルスに誘導され、ウイルスプロモーターの制御下で発現された場合、宿主細胞遺伝子の生成物、すなわち癌原遺伝子の生成物は、腫瘍細胞の成長を無制限にする。癌原遺伝子にコードされたタンパク質は通常、正常細胞に発現することから、腫瘍細胞上で過剰発現すればそれらは腫瘍関連抗原と見なされる。
これらの抗原を認識した細胞毒性Ｔリンパ球は、増殖または転移する前に腫瘍細胞を破壊し得る可能性がある。しかしながら腫瘍細胞はＭＨＣクラスＩ発現を下方制御する場合がある。それらは、Ｔ  ＣＤ８＋細胞と相互作用するのに必要なＢ７のような共刺激分子または接着分子を欠いていることが多い。細胞免疫を阻害するＴＧＦベータなどの抑制サイトカインを生成することで免疫応答を活性的に抑制する腫瘍細胞もある。
【０１５９】
腫瘍抗原の例として、特に以下が挙げられる：
−サイクリン依存キナーゼ４などの細胞サイクル制御因子（メラノーマ）、
−ベータ−カテニンなどのシグナル変換器（メラノーマ）、
−カスパーゼ−８などのアポトーシス調節因子（扁平上皮癌）、
−ＭＡＧＥ抗原などの精巣タンパク質（メラノーマ、乳房腫瘍、グリオーマ腫瘍）、例えばＭＡＧＥ−１（アクセッション番号Ｐ４３３５５）、ＭＡＧＥ−２（アクセッション番号Ｐ４３３５６）、ＭＡＧＥ−３（アクセッション番号Ｐ４３３５７）、ＭＡＧＥ−４（アクセッション番号Ｐ４３３５８）、ＭＡＧＥ−６（アクセッション番号Ｐ４３３６０）、ＭＡＧＥ−８（アクセッション番号Ｐ４３３６１）、ＭＡＧＥ−９（アクセッション番号Ｐ４３３６２）、ＭＡＧＥ−１０（アクセッション番号Ｐ４３３６３）、ＭＡＧＥ−１１（アクセッション番号Ｐ４３３６４）、ＭＡＧＥ−１２（アクセッション番号Ｐ４３３６５）、
−チロシナーゼ（アクセッション番号Ｐ１４６７９）などのメラニン合成に関与する化合物（メラノーマ）、
−表面ＩｇイディオタイプなどのＢＣＲイディオタイプ（リンパ腫）、
−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ＭＵＣ−１などのチロシンキナーゼ受容体（乳癌および卵巣癌）
−ＭＵＣ−１などのグリコシル化不十分のムチン（乳房腫瘍、膵臓腫瘍）、
−ＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７などのウイルス遺伝子生成物（子宮頸癌）。
【０１６０】
本発明の組成物または薬剤は、感染病（ウイルス、細菌、酵母、真菌等の生物による感染）の予防および／または緩和および／または治療を目的とし得る。
【０１６１】
本発明の組成物または薬剤は、免疫不全（例えば、抗腫瘍治療または移植前治療などの特定の治療による副作用として誘発された、またはＨＩＶなどのウイルスに誘発された免疫不全）の予防および／または緩和および／または治療を目的とし得る。
【０１６２】
本発明の組成物または薬剤は、ＳＣＩＤ−Ｘ（ＩＬ−１５Ｒガンマ機能障害と関連した、Ｘ関連性重度併発免疫不全）の予防および／または緩和および／または治療を目的とし得る。
【０１６３】
本発明の生成物の少なくとも１つを有する医薬組成物の製剤は、良好に当技術分野の範囲内にある。同様のことが前記組成物の投与に関する細部にも当てはまる。患者を治療する医師は、他のパラメータの中で年齢、全身状態および症状を考慮しなければならないとされている。
本発明の方法にしたがって同定された治療に有用な化合物は、特定の化合物に適した任意の方法で患者に、例えば経口、静脈内、非経口、経皮、経粘膜的に、もしくは化合物の効果を必要とする部位に、あるいはその近傍に（例えば、固形または半固形の生物学的に適合可能かつ吸収性のマトリックスの形態での化合物で）手術または移植で投与してよい。治療量は当業者により適宜判断され、体重の関数である。
【０１６４】
本発明はまた、治療および／または緩和および／または予防により、それを必要とする患者または非ヒト動物を化合物で治療する方法に関する。
【０１６５】
本発明はまた、それ（治療および／または緩和および／または予防による療法）を必要とする患者を、本発明の生成物、組成物または薬剤の投与によって治療する方法に関する。
【０１６６】
本発明はまた、ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞の増殖および／または活性化を誘導および／または刺激する方法に関しており、該方法は：
−ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞を以下の要素：
−本発明の化合物、
−本発明の核酸、
−本発明のベクター、
−本発明の宿主細胞
の少なくとも１つと接触させる工程を含み、このことによって、前記ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞の増殖および／または活性化が誘導および／または刺激される。
前記接触は、前記ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞の増殖および／または活性化を可能にする条件下で行われる。該条件には、期間および環境条件（温度、大気、培地）が特に挙げられる。該条件の調整は、当業者の適性に従う。
本発明はまた、ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞の増殖および／または活性化を誘導および／または刺激するインビトロでの方法に関するものであり、該方法は：
−ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞を含む細胞試料を提供する工程、
−前記試料を以下の要素：
−本発明の化合物、
−本発明の核酸、
−本発明のベクター、
−本発明の宿主細胞
の少なくとも１つと接触させる工程を含み、該接触は、前記ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞の増殖および／または活性化を誘導および／または刺激することを可能とする期間および環境条件下であることを特徴とする。
【０１６７】
本発明はまた、活性化ＮＫおよび／またはＴ細胞を生成する方法に関するものであり、該方法は：
−静止ＮＫおよび／またはＴ細胞を以下の要素：
−本発明の化合物、
−本発明の核酸、
−本発明のベクター、
−本発明の宿主細胞
の少なくとも１つと接触させる工程を含み、該接触は、前記試料に含まれる前記静止ＮＫおよび／またはＴ細胞の活性化を誘導することを可能とする期間および環境条件下であることを特徴とする。
本発明はまた、活性化ＮＫおよび／またはＴ細胞を生成するインビトロでの方法に関するものであり、該方法は：
−静止ＮＫおよび／またはＴ細胞を含む細胞試料を提供する工程、
−前記試料を以下の要素：
−本発明の化合物、
−本発明の核酸、
−本発明のベクター、
−本発明の宿主細胞
の少なくとも１つと接触させる工程を含み、該接触は、前記試料に含まれる前記静止ＮＫおよび／またはＴ細胞の活性化を誘導することを可能とする期間および環境条件下であることを特徴とする。
【０１６８】
ＩＬ−１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞の増殖および／または活性化を誘導および／または刺激する方法、および活性化ＮＫおよび／またはＴ細胞を生成する方法では、接触した細胞は細胞系であってよい。それらは代替的に、生体（例えばヒト患者）から採取されたエクスビボ細胞であり、インビトロでの治療後、この生体または他の生体（例えば同じ患者）に戻すことを目的にし得る。
【０１６９】
よって、本発明は、治療および／または緩和および／または予防の治療過程での前記方法およびその実施のエクスビボの実施態様を包含する。
【０１７０】
本出願では、「終止」コドン（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）は通常、ＣＤＳ内に含まれているとして言明されていない。
【０１７１】
「含んでいる(including)」または「含有している(containing)」の同義語である用語「含んでいる（comprising）」は制約のないものであり、付加的でかつ引用されたものではない要素、成分または方法の工程を排除しているわけではない。それに反して、用語「から成っている」は用語を限定しており、明確に引用されていないあらゆる付加的な要素、工程または成分を排除している。用語「本質的に〜から成っている」は部分的に非限定的用語であり、付加的でかつ引用されたものではない要素、工程または成分が本発明の基本的な性質および新規の性質に著しく影響を及ぼさない限り、これらの付加的な要素、工程または成分を排除するものではない。
したがって用語「含んでいる」（または「含む」）は、用語「から成っている」（「から成る」）ならびに用語「本質的に〜から成っている」（「本質的に〜から成る」）を含む。したがって、用語「含んでいる」（または「含む」）は本出願では、もっと詳しく言えば、用語「から成っている」（「から成る」）および用語「本質的に〜から成っている」（「本質的に〜から成る」）を包含していることを意味する。
【０１７２】
用語「有意に」は本明細書では、統計学分野（例えばＴ検定、Ｚ検定、カイ二乗値またはＦ率等）での通常の意味で使用されており、すなわち互いに値を比較し、これらの値が互いに異なっているかを判定するために使用する。したがって用語「有意に」は、度数分布におけるデータのばらつきの量を測定する標準偏差を（いくらかでも）当業者が考慮に入れる事実を包含している。望ましいｐ値は通常、５%のアルファレベル、より厳密に１%のアルファレベルに設定する。
【０１７３】
本明細書に引用したすべての参考文献の関連した各開示は、参照によって明確に援用される。以下の実施例は実例を用いて、非限定的に提供されている。
【０１７４】
実施例
実験手順
細胞培養およびサイトカイン−
組換えヒトＩＬ−１５（ｒＩＬ−１５）をPeprotech Inc（Rocky Hill, NJ）から購入した。Ｍｏ−７骨髄性白血病細胞系（ＩＬ−１５Ｒβ／γは発現するがＩＬ−１５Ｒαは発現しないヒト細胞系）およびTF−1赤白血病ヒト細胞系（ＩＬ−１５ＲαおよびＩＬ−１５Ｒγは発現するがＩＬ−１５Ｒβは発現しない細胞系；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２００３）を１０%の熱不活性ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２mMのグルタミンおよび１ng/mlのＧＭ−ＣＳＦ（R&D Systems; Abington, UK）を含有しているＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。TF−1−β細胞（２２）は、２５０μg/mlのジェネテシン（geneticin）を補充した同じ培地中で培養した。Ｋｉｔ２２５ヒトＴリンパ腫細胞系（ＩＬ−２依存細胞系）を６%のＦＣＳ、２mMのグルタミン、１０ng/mlのｒＩＬ−２（Chiron; Emeryville, CA）を含有しているＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。
内因性マウスＩＬ−１５Ｒγ鎖およびトランスフェクションされたヒトＩＬ−１５Ｒβ鎖（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１３４６から入手可能な３２Ｄ細胞系）を発現するマウス３２Ｄβ細胞系をＲＰＭＩ、１０%ＦＣＳ、０．４ng/mlのｍ−ＩＬ−３、１０μg/mlのｂ−メルカプトエタノール、２５０μg/mlのジェネテシン中で培養した。
【０１７５】
ｓＩＬ−１５Ｒα−ＩＬ２、ｓＩＬ−１５Ｒα−スシ−ＩＬ−２およびｓＩＬ−１５Ｒα−スシ−
ｓＩＬ−１５Ｒα−ＩＬ−２をＣＨＯ細胞で発現させ、（２３）に記載のとおりに調製した。ＩＬ−１５Ｒα（成熟コーディング配列のアミノ酸１〜６６）のスシドメインをヒトＩＬ−２（ｓＩＬ−１５Ｒα−スシ−ＩＬ−２）の分子に結合した同様の構造を作成した。
ＩＬ１５Ｒαのスシ−ドメインをＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ生成物を精製し、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（Fermentas, Vilnius, Lithuania）で消化し、ｐＱＥ３０発現ベクターにライゲーションした。ＩＰＴＧ誘導下、大腸菌ＳＧ１３００９細胞中で発現を行った。細胞溶解後、封入体を洗浄し、６mMのグアニジンＨＣｌ、２０mMのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、２０mMのイミダゾール、１５０mMの塩化ナトリウムおよび１mMのＤＴＴ中で可溶化した。ＩＬ−１５Ｒα−スシは、１mMの還元グルタチオンおよび０．２mMの酸化グルタチオンを加えた可溶化バッファーで平衡化したＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（Qiagen）に捉えた。それを、カラムバッファー（２４）中、６から０MのグアニジンＨＣｌの勾配を介してリフォールディングし、２５０mMのイミダゾールで溶出した。
【０１７６】
ＲＬＩおよびＩＬＲ融合タンパク質−
融合タンパク質の構造を図２Ｅに示す。ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン（ａａ１−７７）およびヒトＩＬ−１５を、ＲＬＩではリンカー２０
【表７】
0005394742.tif 000008
、またはＩＬＲではリンカー２６
【表８】
0005394742.tif 000009
によって分離した。
ＦｌａｇエピトープおよびＦａｃｔｏｒ  Ｘａ結合部位
【表９】
0005394742.tif 000010
をコードする配列はシグナルペプチド（ｓｐ）とコーディング配列間に付加した。ＲＬＩにはヒトＩＬ−１５Ｒα（配列番号５）の内因性ｓｐを、ＩＬＲにはウシプレプロラクチン（配列番号５８）のｓｐを使用した。
これらの構造を、ｐＦａｓｔＢａｃ１（InVitrogen）発現ベクターのＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ間に挿入して２つの発現ベクターを生成し、それをBac-Bac発現システム（InVitrogen）を使用したバキュロウイルスＤＮＡ中で組換えた。組換えバキュロウイルスを使用してＳＦ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７１１）を感染させ、融合タンパク質をＳＦ９００ＩＩ培地（GibcoTM Invitrogen Corp.）で発現させ、感染から４日後に回収した。融合タンパク質の濃度は、捕捉抗体として抗ＩＬ−１５ｍＡｂ２４７（R&D Systems）および露出抗体として抗ＦｌａｇＭ２ペルオキシダーゼ接合体（Sigma; St Louis, MO）を用いてＥＬＩＳＡで測定した。
【０１７７】
表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)試験−
これらの実験はBIACore2000バイオセンサー（BIACore, Uppsala, Sweden）を用いて行った。ｒIL−１５をＣＭ５センサーチップに共有結合させ、上昇濃度のｓＩＬ−１５Ｒα−ＩＬ２、ｓＩＬ−１５Ｒα−スシ−ＩＬ−２またはｓＩＬ−１５Ｒα−スシの結合を監視した。BIAlogue動力学評価ソフトウエアを用いてセンサーグラムの分析を行った。
【０１７８】
増殖アッセイ−
無サイトカイン培地での４８時間の培養および１６時間の［３Ｈ］−チミジンとの培養の４時間後、（１９）の記載どおりに、Ｍｏ−７、TF−1βおよびＫｉｔ２２５細胞のｒＩＬ−１５、ｒＩＬ−２、ＲＬＩまたはＩＬＲに対する増殖応答を［３Ｈ］−チミジン取り込みにより測定した。
【０１７９】
アポトーシス−
アネキシンＶアッセイを、FACScanフローサイトメーターおよびAnnexin V-FITC Apoptosis検出キット（BD Biosciences Pharmingen、フランス）を使用して行った。サイトカイン欠乏後、細胞を、１ml中５．１０５細胞個／ウェルでマルチウェルプレートに播種し、様々な反応物（ｒＩＬ−１５、ｓＩＬ−１５Ｒα−スシおよびＲＬＩ融合タンパク質を補充した培地で培養した。CellQuestソフトウエアを使用してデータを得、分析した。
【０１８０】
結合アッセイおよび内部移行−
ヒトｒＩＬ−１５、ｓＩＬ−１５Ｒα−スシおよびＲＬＩ融合タンパク質を［１２５Ｉ］−ヨウ素で標識化し、次いで結合実験を前述の（１９）のとおりに行った。内部移行には、４℃で標識ｓＩＬ−１５Ｒα−スシまたはＲＬＩを用いて細胞を平衡化し、温度を３７℃に変更した。異なる時間間隔で、２つの試料を洗浄し、遠心分離した。細胞ペレットの１つを０．２Mのグリシン−ＨＣｌバッファー、ｐＨ２．５で処理し、他方をＰＢＳ、ｐＨ７．４で４℃で５分間処理した。遠心分離後、総リガンド結合を、ＰＢＳで処理した細胞ペレットから測定し、一方、膜結合画分および内部移行画分をそれぞれ、酸ｐＨで処理した上清および細胞ペレットから測定した。
【０１８１】
ｓＩＬ−１５Ｒａ−スシ＋：Ｆｌａｇ−Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａでタグを付けたｓＩＬ−１５Ｒα−スシ＋を昆虫ＳＦ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７１１）培地、ＳＦ９００ＩＩ（In Vitrogen, Cergy-Pontoise、フランス）中で、融合タンパク質ＲＬＩおよびＩＬＲで記述されたとおりに発現させた。上清を９０%飽和硫酸アンモニウム沈殿で濃縮し、抗Ｆｌａｇアガロース免疫親和性カラム（Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier、フランス）に負荷した。前述のとおりクロラミン−Ｔ法でのヨウ化後ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価したところ、ｓＩＬ−１５Ｒａ−スシ＋の純度は１００%であり、見かけ上分子量は１２ｋＤａであった（Lehoursら、Eur. Cytokine Netw. 11 (2000), 207-5）。その濃度を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）ベースのタンパク質アッセイ（Pierce, Perbio Science, Brebieres、フランス）で測定した。
【０１８２】
結果
ＩＬ−１５に結合しているＩＬ−１５Ｒαは主にスシドメインに起因する−
前述の研究（２５）では、ＩＬ−１５Ｒのエクソン２にコードされた「スシ」ドメインを除去するとＩＬ−１５の膜固定ＩＬ−１５Ｒαへの結合が完全に抑止されたことが示され、このことからスシドメインが結合に必須であることが分かる。ＩＬ−１５結合におけるスシドメインの寄与を直接測定するため、細胞外ドメイン全体またはＮ末端スシドメインのみを含有しているＩＬ−１５Ｒαの可溶形態が調製され、ＩＬ−１５結合について競合アッセイおよび表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術で検定された。
図１Ａに示すとおり、ＣＨＯ細胞で生成され、ヒトＩＬ−２の分子（精製用タグとして使用）に結合した全ＩＬ−１５Ｒα細胞外ドメインを有するｓＩＬ−１５Ｒα−ＩＬ−２融合タンパク質は、高親和性（ｋｏｎ＝３．７  １０５Ｍ−１ｓ−１；ｋｏｆｆ＝１．４  １０−５ｓ−１；Ｋｄ＝３８ｐＭ）でＩＬ−１５に結合した。ＩＬ−１５ＲαのスシドメインをヒトＩＬ−２に結合させている同様の構造もＩＬ−１５に結合したが（図１Ｂ）、親和性は１０倍低く、これは主に反応速度が速かったためである（ｋｏｎ＝３．１  １０５Ｍ−１ｓ−１；ｋｏｆｆ＝１．３  １０−４ｓ−１；Ｋｄ＝４２０ｐＭ）。
可溶スシドメインは大腸菌でも生成した。このｓＩＬ−１５Ｒα−スシも低親和性（ｋｏｎ＝２．５  １０５Ｍ−１ｓ−１；ｋｏｆｆ＝３．８  １０−４ｓ−１；Ｋｄ＝１．５ｎＭ）でＩＬ−１５に結合した（図１Ｃ）。
これらの結果から、スシドメインはＩＬ−１５の結合親和性の大部分に関与しているが、全長細胞外ドメインに提示された高親和性結合を完全には再構成しないということが示される。
図１Ｅに示すとおり、ヒンジ領域と呼ばれる、エクソン３にコードされた最初の１３個のアミノ酸まで拡張している可溶スシドメインの結合親和性は、ｓＩＬ−１５Ｒα−スシ−ＩＬ−２と比較して４倍増加しており、これは非拡張スシドメインも含有しており、また、全長可溶ＩＬ−１５Ｒαよりわずか３倍低い親和性を示し、この時３つの構築物はすべて、類似の折りたたみ能を有する真核系で生成した。これらの結果から、ヒンジ領域まで拡張したスシドメインは全長細胞外ドメインに提示された高親和性結合をほとんど完全に再構成するということが分かる。
様々な可溶ＩＬ−１５Ｒαタンパク質に対して算出されたＩＬ−１５（ＫＤ）の親和定数および統計的試験定数（Ｃｈｉ２）を与えるセンサーグラムの分析結果を以下の表３に示す。
【０１８３】
【表１０】
0005394742.tif 000011
【０１８４】
可溶ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は、膜固定ＩＬ−１５Ｒαに結合しているＩＬ−１５を阻害する−
放射性ヨウ化ＩＬ−１５と結合せずに、ＩＬ−１５Ｒγ鎖も発現するがＩＬ−１５Ｒβ鎖は発現しないヒト細胞系TF−1に発現されたＩＬ−１５Ｒαと競合する能力について、３つの可溶形態のＩＬ−１５Ｒαを試験した（図１Ｄ）。３つのタンパク質は、ＳＰＲ技術で測定されたＫｄに類似したそれぞれのＩＣ５０：１００pM（ｓＩＬ−１５R（−ＩＬ−２）、２７０pM（ｓＩＬ−１５Ｒα−スシ−ＩＬ−２）および１．３nM（ｓＩＬ−１５Ｒα−スシ）で、TF−1細胞に結合しているＩＬ−１５を阻害した。
【０１８５】
ｓＩＬ−１５Ｒα−スシはＩＬ−１５Ｒβ／γ複合体を介したＩＬ−１５駆動型細胞増殖を促進する−
可溶スシドメインは容易に、高収率にて大腸菌内で生成したために、さらなる研究のすべてに対して選択した。最初の例では、ＩＬ−１５Ｒβ／γ複合体を発現するだけの細胞系で試験した（内因性マウスＩＬ−１５Ｒγ鎖およびトランスフェクションされたヒトＩＬ−１５Ｒβ鎖を発現するヒトＭｏ−７細胞系およびマウス３２Ｄβ細胞系）。予想どおり、Ｍｏ−７細胞系は、ナノモル濃度のｒＩＬ−１５またはｒＩＬ−２に応答して増殖した（図２Ａおよび２Ｂ）。予想外に、固定濃度のｓＩＬ−１５Ｒα−スシ（１０nM）をアッセイに加えると、低濃度のｒＩＬ−１５に対して増殖反応が約４倍増加した。ｓＩＬ−１５Ｒα−スシは増殖反応を自力では誘導しなかった。３２Ｄβでは、約１０倍の推移で、同様の結果が得られた。ｓＩＬ−１５Ｒα−スシはＭｏ−７細胞のｒＩＬ−２駆動型増殖に影響を及ぼさないという事実により特異性を評価した（図２Ｂ）。ｓＩＬ−１５Ｒα−スシが、増殖効果を単独ではわずかしか誘導しない固定濃度（１nM）のｒＩＬ−１５の効果を、用量依存的に、ＩＬ−１５のそのＫｄに類似したＩＣ５０（３．５nM）で高めることが、図２Ｃに示されている。
【０１８６】
ＲＬＩおよびＩＬＲ融合タンパク質は、ＩＬ−１５Ｒβ／γ複合体を介した細胞増殖の強力な誘導物質である−
スシのＩＬ−１５生物活性に対する相乗効果が単一分子へ移行することが可能かを評価するために、ＩＬ−１５とスシドメインを結合する融合タンパク質をコードする分子構築物を合成した。該２つの構造には、柔軟なリンカーを、ＩＬ−１５のＣ末端とスシドメイン（ＩＬＲ）またはその逆（ＲＬＩ）のＮ末端間に誘導した（図２Ｅ）。これらのタンパク質の構造を説明する分子モデルを図２Ｆに示す。これらの２つの融合タンパク質をＭｏ−７細胞の増殖について試験した。
図２Ｄに示すとおり、両タンパク質は、類似の（約２５pM）ＥＣ５０およびｒＩＬ−１５単独（３nM）またはｒＩＬ−１５とｓＩＬ−１５Ｒα−スシの等モル混合物（０．９nM）のＥＣ５０よりはるかに低いＥＣ５０で、Ｍｏ−７細胞の増殖の用量依存的誘導を誘発した。これらの結果はさらに、ＩＬ−１５作用に対するｓＩＬ−１５Ｒα−スシの相乗効果を支持し、ＩＬ−１５：ｓＩＬ−１５Ｒα−スシ複合体を共有結合リンカーで安定させると、この相乗作用が顕著に高められるということを示唆している。
【０１８７】
ｓＩＬ−１５Ｒα−スシはＩＬ−１５に誘導されるアポトーシスの阻止を促進し、ＲＬＩは細胞アポトーシスを効率的に阻止する−
サイトカイン離脱に続き、アポトーシス性Ｍｏ−７細胞の画分は４８時間後に１０%から８０%まで増加した（図３Ａ、グラフａおよびｂ）。時点０で添加した場合、ｒＩＬ−１５（５nM）はこのアポトーシスを７０%まで低下させた（図３Ａ、グラフｃ）。単独では、ｓＩＬ−１５Ｒα−スシ（１０nM）は効果を示さなかった（図３Ａｂ）。しかし、それはｒＩＬ−１５の抗アポトーシス効果を著しく高めた（４８時間で３５%のアポトーシス）（図３Ａ、グラフｃ）。ＩＬ−１５のアポトーシス阻止に対するｓＩＬ−１５Ｒα−スシの相乗効果は動態解析（図３Ｂ）および用量反応曲線（図３Ｃ）によって支持される。ｒＩＬ−１５は、約１．５nMのＩＣ５０、ＩＬ−１５β／γ受容体の飽和度に一致する値で挙動した。１０nMのｓＩＬ−１５Ｒα−スシ存在下で、このＩＣ５０は約１０倍低かった（１７０pM）。ＲＬＩ融合タンパク質はアポトーシスを著しく阻止した（図３Ｂ）。モルベースではそれは、約４０pMのＩＣ５０でＩＬ−１５：ｓＩＬ−１５Ｒα−スシ会合体より活性的でさえあった（図３Ｃ）。
【０１８８】
ｓＩＬ−１５Ｒα−スシはＭｏ−７細胞へのＩＬ−１５結合を増加させ、ＲＬＩ融合タンパク質はＭｏ−７細胞に結合し、Ｍｏ−７細胞により内部移行する−
予想どおり、Ｍｏ−７細胞は、中等度親和性（Ｋｄ＝１３．５nM）、８００部位／細胞の最大結合能でＩＬ−１５に結合した（図４Ａ）。ｓＩＬ−１５Ｒα−スシ（１０nM）を添加すると、最大結合能（１１８０部位／細胞）にさほど影響を及ぼすこともなくＩＬ−１５結合の親和性（Ｋｄ＝７nM）が増加した。放射性ヨウ化ＲＬＩ融合タンパク質を使用した場合（図４Ｂ）、それは同様の同数の受容体部位（７３０部位／細胞）に結合し、結合の親和性（Ｋｄ＝７８０pM）がＩＬ−１５のものより著しく高まっていることを本発明者らは見出した。図４Ｃから、ＲＬＩが効率的に素早く内部移行し得ることが分かる。細胞画分の結合放射活性は約２０分で減少し、続いて同時に細胞内放射活性が上昇した。
【０１８９】
ｓＩＬ−１５Ｒα−スシは、ＩＬ−１５駆動型細胞増殖にも高親和性ＩＬ−１５Ｒα／β／γ複合体を介したアポトーシス阻害にも影響を及ぼさない−
ヒトリンパ腫細胞系Ｋｉｔ２２５は内因性ＩＬ−１５Ｒα、βおよびγ鎖を発現し、ヒトTF−1β細胞系は内因性ＩＬ−１５Ｒαおよびγ鎖、その上トランスフェクションされたヒトＩＬ−１５Ｒβ鎖を発現する。したがって、図５Ａおよび５Ｂ（それぞれＥＣ５０＝１９pMおよび２１pM）に示すとおり、低い、ピコモル濃度のＩＬ−１５に応答して、これらの細胞系は増殖する。Ｍｏ−７または３２Dβ細胞に見られるものと対照的に、等モルのｓＩＬ−１５Ｒα−スシをＩＬ−１５に添加しても、どの細胞型のＩＬ−１５用量反応曲線にもさほど影響はなかった。ＩＬＲ融合タンパク質は、２つの細胞系に対してｒＩＬ−１５と同等に活性であった。ＲＬＩもまた、Ｋｉｔ２２５細胞に対してｒＩＬ−１５と同等に活性であったが、TF−1β細胞に対してはｒＩＬ−１５より約１６倍効率的（ＥＣ５０＝１．２ｐＭ）あった。
ｓＩＬ−１５Ｒα−スシおよびＲＬＩの効果をさらに、サイトカイン欠乏により誘導したTF−1β細胞アポトーシスについて分析した。ヒストグラムを図５Ｃ（グラフａ、ｂ、ｃおよびｄ）に示す。一方、反応速度および用量反応曲線を図５Ｄおよび５Ｅにそれぞれ示す。ｒＩＬ−１５は、用量および時間に依存的に、TF−1βアポトーシスを阻害した。ｓＩＬ−１５Ｒα−スシは単独では効果がなく、ＩＬ−１５の効果を変化させることはなかった。ＩＬＲ融合タンパク質はｒＩＬ−１５と同等に活性であり、一方、ＲＬＩは、ｒＩＬ−１５のものより約３倍高い保護効果を有していた（ｒＩＬ−１５またはｓＩＬ−１５Ｒα−スシおよびｒＩＬ−１５に対する６．５pMの代わりに、ＲＬＩにはＩＣ５０＝２．５pM）。
【０１９０】
TF−1β細胞に結合しているＩＬ−１５、ｓＩＬ−１５Ｒα−スシおよびＲＬＩ−
ＩＬ−１５Ｒα−スシがTF−1βのＩＬ−１５増殖に影響を及ぼさない範囲で、本発明者らは、広範な濃度で分析したＩＬ−１５結合に対するその効果を試験した（図６Ａ）。飽和結合曲線のスキャッチャード分析から、少数の高親和性結合部位（ＩＬ−１５Ｒα／β／γ複合体、Ｋｄ＝２２pM、Ｂｍａｘ＝１００部位／細胞）ならびに多量の中等度親和性結合部位（ＩＬ−１５Ｒβ／γ複合体、Ｋｄ＝３０nM、２８００部位／細胞）の存在と適合するＩＬ−１５結合部位に２つのクラスがあることが示された。ｓＩＬ−１５Ｒα−スシはＩＬ−１５結合の増加を誘導し、この結合はスキャッチャード分析で主に中等度親和性成分に対するＩＬ−１５結合の親和性（Ｋｄ＝３．５ｎＭ）の増加に起因しているとされた。高親和性成分に対するｓＩＬ−１５Ｒαの効果をさらに具体的に試験するために、低濃度の放射性標識したＩＬ−１５でその効果を分析した。図６Ｂに示すように、ｓＩＬ−１５Ｒα−スシは２５nMの濃度まで、高親和性受容体を主に標的にする低濃度ＩＬ−１５（２００pM）のＩＬ−１５結合に影響を及ぼさなかった（図６Ｂ）。
放射性標識したｓＩＬ−１５Ｒα−スシのTF−1β細胞への結合（図６Ｃ）は、ｒＩＬ−１５の存在に完全に依存している特異的結合成分を示した。１nMのｒＩＬ−１５の存在下で、ｓＩＬ−１５Ｒα−スシ結合を反映するＫｄは、ＩＬ−１５に対するその親和性と適合する値３．５nMであり、最大結合能（３３００部位／細胞）は多数のＩＬ−１５中等度結合部位と適合していた。さらに図６Ｄに示すように、放射性標識したｓＩＬ−１５Ｒα−スシは効率的に内部移行した。放射性標識したＲＬＩ融合タンパク質はまた、TF−1β細胞に結合した（図６Ｅ）。単一特異的結合成分は２５０pMのＫｄで見られ、最大能力（４０００部位／細胞）は再度、多量のＩＬ−１５中等度親和性結合部位に適合可能であった。いったん結合すると、ＲＬＩもまた効率的に内部移行した（図６Ｆ）。
【０１９１】
考察
ヒトＩＬ−１５Ｒαのエクソン２の欠失はＩＬ−１５結合を完全に抑止し、サイトカイン認識においてスシドメインの不必要な機能を示すことが以前に示された（２５）。ＩＬ−１５Ｒα（ｓＩＬ−１５Ｒα−ＩＬ−２融合タンパク質の文脈において）の細胞外部分のＣ末端尾部（エクソン３から５）を除去すると、ＳＰＲではＩＬ−１５に対する結合親和性が１０倍減少し、競合アッセイではその親和性は３．５倍減少することが、本発明で示されている。
熱力学に関しては、親和性の１０倍の減少が算出され、ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒαとの相互作用の自由エネルギーの１０%損失に対応していた。したがって、エクソン２（スシドメイン）にコードされたＮ末端構造ドメインは、大部分（９０%）ではあるがすべてではないＩＬ−１５結合能を有している。本発明者らの研究室の近年のデータから、エクソン３にコードされたドメインもＩＬ−１５結合に寄与することが示されている。
大腸菌で生成されたｓＩＬ−１５Ｒα−スシの親和性は、ＣＨＯ細胞で生成されたｓＩＬ−１５Ｒα−スシ−ＩＬ−２のものより３から４倍低かった。スシドメインがＮまたはＯ結合グリコシル化の可能性がある任意の部位を含有していない限り、この差異は２つのタンパク質のグリコシル化状態の違いでは説明できない（２）。したがって、それは２つのタンパク質の構造的折りたたみの違いに起因している可能性がある。
膜ＩＬ−１５Ｒαに結合しているＩＬ−１５と競合している一方で、ｓＩＬ−１５Ｒα−スシはＩＬ−１５β／γ複合体を介したＩＬ−１５作用を促進することでアゴニスト効果を発揮することが見出された。中等度親和性ＩＬ−１５受容体（Ｍｏ−７、３２Ｄβ）単独か、あるいは高親和性および中等度親和性ＩＬ−１５受容体（TF−1β、Ｋｉｔ２２５）の両方を発現する細胞の研究から、ｓＩＬ−１５Ｒα−スシのアゴニスト作用はＩＬ−１５Ｒβ／γ複合体に特異的に向けられたものであることが示された：（ｉ）それはＩＬ−１５の非存在下では効果がなく、（ｉｉ）それはＩＬ−１５の存在下で、中等度ＩＬ−１５結合部位のものと匹敵する密度である結合部位の単一親和性クラスで、TF−1β細胞と結合し、（ｉｉｉ）Ｍｏ−７細胞およびTF−1β細胞では、それは、ＩＬ−１５Ｒβ／γ複合体に対するＩＬ−１５の親和性を増加したが、TF−1β細胞での高親和性複合体へのＩＬ−１５の結合に影響を及ぼさず、（ｉｖ）Ｍｏ−７細胞のＩＬ−１５β／γを介してそれはＩＬ−１５生物学的作用（増殖、アポトーシスの阻止）の効率を促進したが、TF−1β細胞の高親和性受容体を媒介した同様の生物学的効果に影響を及ぼすことはなかった。
このアゴニスト作用の機能性は、ｓＩＬ−１５Ｒα−スシがいったんＩＬ−１５と結合してＭｏ−７細胞のＩＬ−１５Ｒβ／γに結合すれば、高効率に細胞内部移行するという事実によってさらに支持された。その可能性はＩＬＲおよびＲＬＩ融合タンパク質を考慮すると、高まった：（ｉ）ＲＬＩは、ＩＬ−１５自体よりほとんど２０倍の親和性でＩＬ−１５Ｒβ／γに結合した。（ｉｉ）ＲＬＩの結合に次いで、融合タンパク質が迅速に内部移行した。（ｉｉｉ）ＲＬＩまたはＩＬＲ融合タンパク質は、機能アッセイにおいてＩＬ−１５より極めて強力であった。Ｍｏ−７細胞の２つの融合タンパク質の用量反応曲線はＫｉｔ２２５またはTF−1β細胞の高親和性受容体を介したＩＬ−１５の曲線に匹敵しており、これらの融合タンパク質が中等度親和性受容体のみを発現する細胞の高親和性応答をほとんど完全に再構成することが示された。
したがって、結果として、ｓＩＬ−１５Ｒα−スシおよびＩＬ−１５は複合体を形成し、共同でＩＬ−１５Ｒβ／γ受容体への結合親和性を増加させるということが分かった。対照的に、いったん後者が膜高親和性受容体複合体と会合していれば、ｓＩＬ−１５Ｒα−スシはＩＬ−１５結合および生物活性に影響を及ぼすことができない。しかし、ｓＩＬ−１５Ｒα−スシがこの高親和性複合体にすでに関与しているＩＬ−１５にまだ結合可能であるかを考慮しないわけにはいかず、主に高親和性受容体を発現する細胞、すなわち類似したレベルの３つの受容体サブユニットを発現する細胞の有用性で試験することが可能であった。
本発明者らの研究室では以前、ＣＯＳ細胞で発現した、またはＩＬ−１５Ｒα陽性細胞により自然生成されたｓＩＬ−１５Ｒαが、高親和性（Ｋｄ＝１６６ｐＭ）でＩＬ−１５を結合し、低濃度（３から１０pMのＩＣ５０）でＫｉｔ２２５細胞のＩＬ−１５誘発性増殖を阻害することで強力なアンタゴニストとして挙動することを示している（１９）。本発明と対照的に、これらの結果は、ｓＩＬ−１５Ｒα−スシはＫｉｔ２２５細胞またはTF−1β細胞の増殖には影響を及ぼさず、Ｍｏ−７細胞に対するアゴニストであることを示している。
他の対照的な結果として、組換えヒトｓＩＬ−１５Ｒα（エクソン３欠損）−Ｆｃホモ二量体キメラとのｒＩＬ−１５の混合物はＭｏ−７細胞への抗アポトーシス効果を誘導することが可能であるが、同用量のｒＩＬ−１５単独では効果がないという近年の報告がある（２６）。
これらの作用の違いを説明しようと、あるモデルが本特許出願の図７に提案されている。高親和性ＩＬ−１５応答を考慮すると、ｓＩＬ−１５Ｒαは、ＩＬ−１５の補充に対する膜ＩＬ−１５Ｒαの競合者として作用する（図７Ａ）。反して、ｓＩＬ−１５Ｒα−スシとＩＬ−１５との複合体は膜ＩＬ−１５Ｒβ／γと会合し、ＩＬ−１５の生物学的効果を高め得る（図７Ｂ）。高親和性受容体を考慮するとｓＩＬ−１５Ｒα−スシに阻害効果がないことを明らかにするために、２つの代案が挙げられる（図７Ｃ）。第１の代案によれば、ｓＩＬ−１５Ｒα−スシのＩＬ−１５に対する親和性（本書ではＫｄ＝１．５nM）はｓＩＬ−１５Ｒα（Ｋｄ＝１６０pM）より低く（１９）、したがってＫｉｔ２２５またはTF−1β細胞の膜ＩＬ−１５Ｒαと効率的に競合することができない。第２の代案によれば、ｓＩＬ−１５Ｒα−スシはＩＬ−１５への結合において膜ＩＬ−１５Ｒαと競合し、Ｍｏ−７細胞で形成されるものと類似したＩＬ−１５Ｒβ／γとの複合体を形成することが可能である。ＩＬ−１５が活性化されるより高い濃度（高親和性受容体の２０pMの代わりにＩＣ５０＝７５０pM、図２および５）を必要とすることから、該複合体は効率的ではない。しかし、ＩＬ−１５Ｒβ／γがＫｉｔ２２５またはTF−1β細胞のＩＬ−１５Ｒαに対して過剰に存在していることを踏まえると、該複合体の低い効率はその高密度（TF−1β細胞の１００個の高親和性受容体の代わりに約３０００個の中等度親和性受容体、図６を参照）により補償することが可能であった。この結果、生物学的効果に関して変化は見られなくなる。しかしながら、ｓＩＬ−１５Ｒα−スシはTF−1β細胞のＩＬ−１５高親和性結合に影響を及ぼさないという本発明者らの見解（図６Ｂ）は第１の代案を支持する。
ｓＩＬ−１５ＲαおよびｓＩＬ−１５Ｒα−スシ間の機能的差異から、ｓＩＬ−１５ＲαのＣ末端尾部が膜ＩＬ−１５Ｒαとの競合、ひいてはｓＩＬ−１５Ｒαのアンタゴニスト作用に重要な役割を担っていることが分かる。この尾部は、ＩＬ−１５Ｒβ／γとの可溶ＩＬ−１５Ｒαの会合を妨げるか、あるいは該会合を可能にするものであるが、機能するためにＩＬ−１５Ｒβ／γが不適切な立体配座になる。可溶性の一般的なγ鎖の場合では類似したメカニズムが提案されている（２７）。この（γ鎖の全細胞外部分に対応する）可溶γ鎖の阻害活性は、Ｃ末端部分の除去またはＷＳＸＷＳモチーフの突然変異によって破壊された。この２つの領域はサイトカイン結合に関与していない。
スシのアゴニスト効果は、拡大したサイトカインのＩＬ−６ファミリー（すなわちｓＩＬ−６Ｒ、ｓＩＬ−１１Ｒ、ｓＣＮＴＦＲおよびＩＬ−１２ｐ４０サブユニット）内で可溶受容体について記述したアゴニスト効果を想起させる（２８）。しかし、これまでγｃファミリー（ｓＩＬ−２Ｒα、ｓＩＬ−２Ｒβ、ｓＩＬ−４Ｒ）内で記述していた可溶受容体すべて、およびｓＩＬ−１５Ｒα自体がサイトカインアンタゴニストとして挙動する限り、該アゴニスト作用は、ＩＬ−１５Ｒの場合、予測不可能である（１９、２９）。したがって本結果により、ＩＬ−１５Ｒαの可溶スシドメインがこのファミリー内の予想外かつ高効率のアゴニストであることが確認された。
サイトカイン移行シグナル伝達の概念は、ＩＬ−６の場合に最初に使用され、この概念では可溶ＩＬ−６Ｒは、ＩＬ−６反応性細胞のＩＬ−６の作用に対する感受性を高め、細胞を、ｇｐ１３０は発現するがＩＬ−６に対して反応する膜ＩＬ−６Ｒは発現しないようにするということが分かった（３０）。この概念はｇｐ１３０サイトカインファミリー（ＩＬ−１１Ｒ、ＣＮＴＦＲ、ＣＬＣ）の他のメンバーにまで拡大されている（３１〜３４）。ＩＬ−１５の場合、サイトカインのトランス提示のメカニズムが示されており（１２）、ここでは単球／樹状細胞に生成されたＩＬ−１５は同様の細胞によって発現された膜ＩＬ−１５Ｒαに会合し、ＩＬ−１５Ｒβ／γ＋ＩＬ−１５Ｒα−バイスタンダー細胞の増殖を刺激し得る。近年の報告では、トランス提示は、同様の細胞によるＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒαの発現を必要とするインビボにおける主力のメカニズムであることが示唆されている（１３、１４、３５、３６）。それは移行シグナル伝達の概念にやや似通っており、この概念では、トランス提示されたＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα複合体はＩＬ−１５Ｒβ／γ＋ＩＬ−１５Ｒα−細胞をＩＬ−１５の生理学的濃度に対して感受性を持たせるようにすることが可能である。この点では、膜ＩＬ−１５Ｒαは、そのＩＬ−１５Ｒβ／γ複合体への結合活性およびシグナル伝達の効率を高めることでＩＬ−１５作用のアゴニストとして作用する（１２）。本発明者らのデータから、ｓＩＬ−１５Ｒα−スシは同様に挙動し、ＩＬ−１５Ｒβ／γ＋ＩＬ−１５Ｒα−細胞をＩＬ−１５の作用に対して感受性を持たせるようにすることが分かる。このことから、膜ＩＬ−１５Ｒαのスシドメインがトランス提示に不可欠なものであることが示唆される。本発明者らはＩＬ−１５Ｒα発現細胞に生成され、ＩＬ−１５Ｒαの全細胞外部分を包含するｓＩＬ−１５ＲαがＩＬ−１５作用に抑制的であることを示している（１９）。それは、ＩＬ−１５の生物学的効果を限定する負のフィードバック機構を構成する傾向にある。対照的に、本研究で記述されたｓＩＬ−１５Ｒα−スシは、アゴニスト効果を示す。該可溶スシがＩＬ−１５Ｒα発現細胞によって生成されれば、ＩＬ−１５トランス提示機構に関与することが可能であろう。該自然に生成される可溶スシドメインの存在は未だ記述されていないが、（ｉ）スシドメインを膜透過ドメインへ結合させる（エクソン３から５にコードされた）尾部が欠損しているものも含む膜ＩＬ−１５Ｒαの様々なイソ型が記述されている事実（３、２５、３７）、および（ｉｉ）それらのいくつかの可溶対応物の、分断による生成が解明されてきた事実（１９）により支持されている。したがって、ｓＩＬ−１５ＲαおよびｓＩＬ−１５Ｒα−スシは相反する調節作用を有し、そのようなものとして両者はＩＬ−１５生物学的作用の規模および持続時間を調整することに関与することが可能であった。
本発明はまた、ＩＬＲまたはＲＬＩなどの融合タンパク質を生成する柔軟なリンカーを使用することはＩＬ−１５の場合、有効な手段であることを示している。スシドメインを有するＩＬ−１５の分子モデルが生成され（図２）、ＩＬ−１５のＣ末端をスシのＮ末端（ＩＬＲ融合タンパク質）またはその逆（ＲＬＩ融合タンパク質）に結合させる柔軟なリンカーを設計する上での支援となった。そのモデルはまた、ＩＬ−１５Ｒβおよびγ鎖への結合に関与していると考えられているＩＬ−１５の領域をリンカーがマスキングしていないことを予期させた。上述のとおり、２つの融合タンパク質は、Ｍｏ−７細胞のＩＬ−１５Ｒβ／γ複合体を活性化する場合、ＩＬ−１５ならびにＩＬ−１５にｓＩＬ−１５Ｒα−スシを加えた複合体より極めて活性的であることが判明した。TF−1β細胞で、また高親和性受容体の活性化を考慮すると、ＩＬＲ融合タンパク質はＩＬ−１５と同等に活性であり、ＲＬＩ融合タンパク質ではさらに１０倍活性であり、細胞増殖の誘導の際、ＥＣ５０は１．２pMと低かった。高活性のため、これらのハイパーＩＬ−１５融合タンパク質は、リンパ球サブセット、特にＩＬ−１５のトランス提示が生理学的活性化工程であると示唆されているリンパ球（ＮＫ、ＣＤ８記憶Ｔ細胞）の拡張用の貴重なツールを構成することが分かっている（１３）。したがってそれらは、癌、免疫不全または感染疾患の患者の治療に的をしぼった治療戦略における非常に効率的なアジュバント分子である。
【０１９２】
【表１１】
0005394742.tif 000012
0005394742.tif 000013
0005394742.tif 000014
【０１９３】
表４：配列番号表：
ｈＩＬ−１５Ｒアルファ＝ヒトＩＬ−１５Ｒアルファ
ｈＩＬ−２＝ヒトＩＬ−２
【表１２】
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【図面の簡単な説明】
【０１９４】
【図１】ＩＬ−１５に対する様々な可溶ＩＬ−１５Ｒαタンパク質の結合親和性。漸増濃度のｒＩＬ−１５（３．１、６．２、１２．５、２５、５０および１００nM）の固定化（Ａ）ｓＩＬ−１５Ｒα−ＩＬ−２、（Ｂ）ｓＩＬ−１５Ｒα−スシ−ＩＬ−２または（Ｃ）ＩＬ−１５Ｒα−スシへの結合（会合相および解離相）のＳＰＲセンサーグラム。（Ｄ）：ｓＩＬ−１５Ｒα−スシ（◇）、ｓＩＬ−１５Ｒα−ＩＬ−２（◆）またはｓＩＬ−１５Ｒα−スシ−ＩＬ−２（△）と、TF−1細胞に結合した放射性ヨウ化ｒＩＬ−１５（２００pM）との競合試験。漸増濃度のｒＩＬ−１５（１、２．５、５、１０、２５、５０、１００nM）の固定化（Ｅ）ｓＩＬ−１５Ｒα−スシ＋への結合（会合相および解離相）のＳＰＲセンサーグラム。
【図２】ＩＬ−１５Ｒβ／γを介したＩＬ−１５誘導増殖への効果。Ｍｏ−７細胞の増殖を［３Ｈ］−チミジンの取り込みにより評価した。細胞を、漸増濃度のヒトｒＩＬ−１５（Ａ）またはヒトｒＩＬ−２（Ｂ）と共に、固定濃度（１０nM）のｓＩＬ−１５Ｒα−スシの非存在（●）または存在（◇）下で培養した。（Ｃ）：細胞を、１nMのｓＩＬ−１５の存在下、漸増濃度のｓＩＬ−１５Ｒα−スシの非存在（●）または存在下（◇）で培養した。（Ｄ）：細胞を、漸増濃度の、ｒＩＬ−１５（●）、ＩＬ−１５とｓＩＬ−１５Ｒα−スシとの等モル混合物（◇）、ＲＬＩ（▲）またはＩＬＲ融合タンパク質（△）と共に培養した。（Ｅ）：ＲＬＩおよびＩＬＲ融合タンパク質を発現するために使用される分子構造。ＩＬ−１５Ｒα  ｓｐ：ヒトＩＬ−１５Ｒαシグナルペプチド、ｐｐｌ  ｓｐ：ウシプレプロラクチンシグナルペプチド。（Ｆ）：融合タンパク質の３次元モデル構造。
【図３】ＩＬ−１５Ｒβ／γを介したアポトーシスのＩＬ−１５誘導阻害への効果。アポトーシスを、フローサイトメトリーによりアネキシンＶ細胞表面発現で評価した。完全ヒストグラム（Ａａ）は、実験開始時のＭｏ−７へのアネキシンＶ染色を表す。細胞は、ヒトｒＩＬ−１５非存在下（Ａｂ）または固定濃度のヒトｒＩＬ−１５（５００pM）存在下（Ａｃ）で、ｓＩＬ−１５Ｒα−スシ非存在下（完全ヒストグラム）または存在下（１０nM）（実線）で、４８時間培養した。（Ｂ）：外因性サイトカインの非存在（●）またはｒＩＬ−１５（５００pM）（○）、ｓＩＬ−１５Ｒα−スシ（１０nM）（□）、ｓＩＬ−１５Ｒα−スシ（１０nM）とｒＩＬ−１５（５００pM）（◇）もしくはＲＬＩ（５００pM）（▲）の存在下でのＭｏ−７細胞上のアネキシンＶ発現の反応速度。（Ｃ）：Ｍｏ−７細胞は、漸増濃度のｒＩＬ−１５と共に、固定濃度（１０nM）のｓＩＬ−１５Ｒα−スシの非存在（○）もしくは存在（◇）下で、または漸増濃度のＲＬＩ（▲）と共に培養した。
【図４】ＩＬ−１５Ｒβ／γに結合したＩＬ−１５へのｓＩＬ−１５Ｒα−スシのアゴニスト効果。ＲＬＩの結合および内部移行。（Ａ）：ｓＩＬ−１５Ｒα−スシの非存在（■）または１０ｎＭのｓＩＬ−１５Ｒα−スシの存在下（□）でのＭｏ７細胞への１２５Ｉ標識ｒＩＬ−１５の結合。（Ｂ）：１２５Ｉ標識ＲＬＩ融合タンパク質の結合。挿入図をスキャッチャードプロットで示す。（Ｃ）：１２５Ｉ標識ＲＬＩ融合タンパク質（５００ｐＭ）の内部移行。
【図５】ＩＬ−１５Ｒα／β／γ受容体を介したＩＬ−１５誘導細胞増殖およびアポトーシスへの効果。漸増濃度の、ｒＩＬ−１５（●）、ｒＩＬ−１５とｓＩＬ−１５Ｒα−スシとの等モル混合物（◇）、ＲＬＩ（▲）またはＩＬＲ融合タンパク質（△）と共に培養したＫｉｔ２２５（Ａ）およびTF−1β（Ｂ）細胞による［３Ｈ］−チミジンの取り込み。（Ｃ）：実験開始時（Ｃａ）の、培養の４８時間後のヒトｒＩＬ−１５の非存在下（Ｃｂ）もしくは固定濃度のヒトｒＩＬ−１５（５００pM）の存在下（Ｃｃ）、ｓＩＬ−１５Ｒα−スシタンパク質非存在下（完全ヒストグラム）もしくは存在下（１０nM）（実線）、または１０pMのＲＬＩの存在下（Ｃｄ）でのTF−1βのアネキシンＶ染色。（Ｄ）：外因性サイトカインの非存在下（○）、またはｒＩＬ−１５（１０pM）（●）、ｓＩＬ−１５Ｒα−スシ（１０nM）（□）、ｓＩＬ−１５Ｒα−スシ（１０nM）とｒＩＬ−１５（１０pM）（◇）またはＲＬＩ融合タンパク質（１０pM）（▲）の存在下での染色の反応速度。（Ｅ）漸増用量のｒＩＬ−１５を用いた、ｓＩＬ−１５Ｒα−スシの非存在もしくは固定濃度（１０nM）のｓＩＬ−１５Ｒα−スシ存在下、または漸増濃度のＲＬＩ融合タンパク質（▲）の存在下での培養の４８時間後の染色。
【図６】TF−1β細胞上のｓＩＬ−１５Ｒα−スシおよびＲＬＩの結合および内部移行。ＩＬ−１５結合へのｓＩＬ−１５Ｒα−スシの効果。（Ａ）：ｓＩＬ−１５Ｒα−スシの非存在（■）または１０nMのｓＩＬ−１５Ｒα−スシ存在下（□）での１２５Ｉ標識ｒＩＬ−１５の飽和結合曲線。（Ｂ）：固定濃度の放射性ヨウ化ｒＩＬ−１５（２００pM）の結合への漸増濃度のｓＩＬ−１５Ｒα−スシの効果。（Ｃ）：１nMのｒＩＬ−１５の存在下での１２５Ｉ標識ｓＩＬ−１５Ｒα−スシの飽和結合曲線および（Ｄ）その後の内部移行。（Ｅ）：１２５Ｉ標識ＲＬＩの飽和結合曲線および（Ｆ）その後の内部移行。
【図７】ｓＩＬ−１５ＲαおよびｓＩＬ−１５Ｒα−スシの差動効果に対する提案モデル。（Ａ）ＩＬ−１５Ｒα／β／γ受容体において、ｓＩＬ−１５Ｒαは、ＩＬ−１５と結合するために膜ＩＬ−１５Ｒαと競合する。（Ｂ）ＩＬ−１５Ｒβ／γ受容体について、ｓＩＬ−１５Ｒα−スシはＩＬ−１５との複合体を形成し、これはＩＬ−１５単独の場合よりもより効果的にＩＬ−１５Ｒβ／γ複合体を活性化する。ＲＬＩまたはＩＬＲ融合タンパク質はこのアゴニスト効果を増幅する。（Ｃ）ＩＬ−１５Ｒα／β／γ受容体について、ｓＩＬ−１５Ｒα−スシは膜ＩＬ−１５Ｒαとの競合に有効ではないか、そうでなければ膜ＩＬ−１５Ｒαと競合し、ｓＩＬ−１５Ｒα−スシのＩＬ−１５との複合体は過剰ＩＬ−１５Ｒβ／γ複合体を（Ｂ）の場合と同様に活性化する。
【図８】図８から４２は、アミノ酸配列および核酸配列を示しており、それらの配列番号は表４に一覧にしている（表４は書誌参照の後ろ、請求項の前に記載）。ヒト野生型ＩＬ−１５ＲアルファｃＤＮＡ（配列番号１）。
【図９】ヒト野生型ＩＬ−１５ＲアルファのＣＤＳ（配列番号２）およびヒト野生型ＩＬ−１５Ｒアルファタンパク質（配列番号３）。
【図１０】ヒト野生型ＩＬ−１５Ｒアルファのシグナルペプチド（配列番号４および５）および成熟ペプチド（配列番号６および７）のＣＤＳおよびアミノ酸配列。
【図１１】ヒト野生型ＩＬ−１５Ｒアルファのエクソン１から５の核酸配列（配列番号８〜１２）。
【図１２】ヒト野生型ＩＬ−１５Ｒアルファのスシドメイン（配列番号１３〜１４）ならびにスシドメインを含むヒト野生型ＩＬ−１５Ｒアルファのフラグメント（配列番号１５および１６）の核酸配列およびアミノ酸配列。
【図１３】スシドメインを含むヒト野生型ＩＬ−１５Ｒアルファのフラグメントの核酸配列およびアミノ酸配列（配列番号１７および１８）。
【図１４】ヒト野生型ＩＬ−１５Ｒアルファのヒンジ（配列番号１９および２０）ならびにこのヒンジ領域のフラグメントの核酸配列およびアミノ酸配列。
【図１５】スシドメインおよびヒンジ領域のフラグメントを含むヒト野生型ＩＬ−１５Ｒアルファのフラグメントの核酸配列およびアミノ酸配列（配列番号２１〜２４）。
【図１６】スシドメインおよびヒンジ領域のフラグメントを含むヒト野生型ＩＬ−１５Ｒアルファのフラグメントの核酸およびアミノ酸配列（配列番号２５〜２８）。
【図１７】スシドメインおよびヒンジ領域を含むヒト野生型ＩＬ−１５Ｒアルファのフラグメントの核酸配列およびアミノ酸配列（配列番号２９〜３０）。
【図１８】ヒト野生型ＩＬ−１５Ｒアルファのグリコシル化部位に富んだ領域の核酸配列およびアミノ酸配列（配列番号３１〜３２）。
【図１９】ヒト野生型ＩＬ−１５Ｒアルファのグリコシル化部位に富んだエクソン３にコードされた部分（配列番号３３〜３４）ならびにスシドメイン、ヒンジ領域およびグリコシル化部位に富んだ領域のエクソン３にコードされた部分を含むＩＬ−１５Ｒアルファのフラグメント（配列番号３５〜３６）の核酸配列およびアミノ酸配列。
【図２０】ヒト野生型ＩＬ−１５Ｒアルファの可溶細胞外領域の核酸配列およびアミノ酸配列（配列番号３７〜３８）。
【図２１】ヒト野生型ＩＬ−１５Ｒアルファの可溶細胞外領域の核酸配列およびアミノ酸配列（配列番号３９〜４０）。
【図２２】ヒトＩＬ−１５Ｒアルファの可溶、シグナルペプチド欠失細胞外ドメインのフラグメントの核酸配列およびアミノ酸配列（配列番号４１〜４２）。
【図２３】ヒトＩＬ−１５Ｒアルファの可溶、シグナルペプチド欠失細胞外ドメインの核酸配列およびアミノ酸配列（配列番号４３〜４４）。
【図２４】ヒト野生型ＩＬ−１５の核酸配列（配列番号４５）
【図２５】ヒト野生型ＩＬ−１５前駆タンパク質のアミノ酸配列（配列番号４６）、ヒト野生型成熟ＩＬ−１５の核酸配列およびアミノ酸配列（配列番号４７〜４８）。
【図２６】２つの柔軟なリンカーの核酸配列およびアミノ酸配列（リンカー２０  配列番号４９〜５０；リンカー２６  配列番号５１〜５２）。
【図２７】ＦｌａｇタグおよびＸａ結合部位（配列番号５３〜５６）、ウシプレプロラクチンシグナルペプチド（配列番号５７〜５８）の核酸およびアミノ酸配列、ならびにＩＬ−１５Ｒの核酸配列およびプレプロラクチンコザック配列
【図２８】ＲＬＩ（本発明の融合タンパク質；配列番号５９〜６０）の核酸配列およびアミノ酸配列。ＲＬＩ融合タンパク質＝ＩＬ−１５Ｒアルファのシグナルペプチド＋ＦｌａｇタグおよびＸａ結合部位＋ｉｔ＋スシ＋ｉ＋ｒｄ＋１１個のエクソン３にコードされたａａ＋リンカー２０＋ヒト野生型成熟ＩＬ−１５。
【図２９】ＩＬＲの核酸配列およびアミノ酸配列（本発明の融合タンパク質；配列番号６１〜６２）。ＩＬＲ融合タンパク質＝ウシプレプロラクチンのシグナルペプチド＋ＦｌａｇタグおよびＸａ結合部位＋ヒト野生型成熟ＩＬ−１５＋リンカー２６＋ｉｔ＋スシ＋ｉ＋ｒｄ＋１１個のエクソン３にコードされたアミノ酸。
【図３０】ヒト野生型ＩＬ−２の核酸配列（配列番号６３）。
【図３１】ヒト野生型成熟ＩＬ−２（配列番号６４〜６５）およびＩＬ−２でＩＬ−１５Ｒアルファのスシ含有フラグメントにタグを付けるために使用するリンカーの核酸配列およびアミノ酸配列。
【図３２】ＩＬ−２でタグを付けたＩＬ−１５Ｒアルファのスシ含有フラグメントの核酸およびアミノ酸配列（配列番号６６〜６７）。
【図３３】ＩＬ−２でタグを付けたＩＬ−１５Ｒアルファのスシ含有フラグメント（細胞外ＩＬ−１５Ｒアルファのフラグメント）の核酸配列およびアミノ酸配列（配列番号６８〜６９）。
【図３４】ハツカネズミＩＬ−１５Ｒアルファの核酸配列およびアミノ酸配列（配列番号７２〜７３）。
【図３５】ハツカネズミＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域（配列番号７４）、スシドメイン（配列番号７５）、ヒンジ領域（配列番号７６）および尾部（配列番号７７）のアミノ酸配列。
【図３６】チンパンジーＩＬ−１５Ｒアルファの核酸およびアミノ酸配列（配列番号７８〜７９）
【図３７】チンパンジーＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域（配列番号８０）、スシドメイン（配列番号８１）、ヒンジ領域（配列番号８２）および尾部（配列番号８３）のアミノ酸配列。
【図３８】ドブネズミＩＬ−１５Ｒアルファの核酸およびアミノ酸配列（配列番号８４〜８５）
【図３９】ドブネズミＩＬ−１５Ｒアルファ細胞外領域（配列番号８６）、スシドメイン（配列番号８７）、ヒンジ領域（配列番号８８）および尾部（配列番号８９）のアミノ酸配列。
【図４０】ハツカネズミＩＬ−１５Ｒアルファ（配列番号９０）、チンパンジーＩＬ−１５Ｒアルファ（配列番号９１）およびドブネズミＩＬ−１５Ｒアルファ（配列番号９２）のエクソン３の核酸配列。
【図４１】ヒトＩＬ−１５Ｒアルファ（配列番号９３）、ハツカネズミＩＬ−１５Ｒアルファ（配列番号９４）、チンパンジーＩＬ−１５Ｒアルファ（配列番号９５）およびドブネズミＩＬ−１５Ｒアルファ（配列番号９６）のエクソン３にコードされた部分のアミノ酸配列。
【図４２】ヒトＩＬ−１５Ｒアルファ（配列番号２４）、ハツカネズミＩＬ−１５Ｒアルファ（配列番号９７）、チンパンジーＩＬ−１５Ｒアルファ（配列番号９８）およびドブネズミＩＬ−１５Ｒアルファ（配列番号９９）のエクソン２にコードされた部分のアミノ酸配列。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【配列表】
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