(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、又は配列番号１のアミノ酸配列に対して９０％以上の一致度を有するアミノ酸配列を有し、アセチルCoAとマロニルCoAとをアセトアセチルCoAに変換する反応を触媒する酵素をコードするアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子と、アセトアセチルCoA転移酵素遺伝子であるClostridium acetobutylicum由来のctfA遺伝子及びctfB遺伝子と、アセト酢酸脱炭酸酵素遺伝子であるClostridium acetobutylicum由来のadc遺伝子と、イソプロパノール脱水素酵素遺伝子であるClostridium beijerinckii由来のpdh遺伝子とをサッカロマイセス属酵母に導入した組換え酵母を培養し、培養物からイソプロパノールを取得することを特徴とするイソプロパノールの製造方法。
【請求項２】
上記アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子、上記アセトアセチルCoA転移酵素遺伝子、上記アセト酢酸脱炭酸酵素遺伝子及び上記イソプロパノール脱水素酵素遺伝子は、宿主となるサッカロマイセス属酵母のゲノム内に導入されていることを特徴とする請求項１記載のイソプロパノールの製造方法。
【請求項３】
配列番号１記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、又は配列番号１のアミノ酸配列に対して９０％以上の一致度を有するアミノ酸配列を有し、アセチルCoAとマロニルCoAとをアセトアセチルCoAに変換する反応を触媒する酵素をコードするアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子と、アセトアセチルCoA転移酵素遺伝子であるClostridium acetobutylicum由来のctfA遺伝子及びctfB遺伝子と、アセト酢酸脱炭酸酵素遺伝子であるClostridium acetobutylicum由来のadc遺伝子と、イソプロパノール脱水素酵素遺伝子であるClostridium beijerinckii由来のpdh遺伝子とをサッカロマイセス属酵母に導入した組換え酵母。
【請求項４】
上記アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子、上記アセトアセチルCoA転移酵素遺伝子、上記アセト酢酸脱炭酸酵素遺伝子及び上記イソプロパノール脱水素酵素遺伝子は、宿主となるサッカロマイセス属酵母のゲノム内に導入されていることを特徴とする請求項３記載の組換え酵母。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イソプロパノール生合成に関連する遺伝子群が組み込まれたイソプロパノール生産能を有する組換え酵母を利用したイソプロパノール製造方法及び当該組換え酵母に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、石油資源の枯渇、地球レベルの炭酸ガス発生量の削減が叫ばれており、今後、石油価格の高騰が予想され、石油代替材料の開発が求められている。例えば、太陽エネルギーにより水と炭酸ガスから植物が作り出したバイオマス、糖、澱粉、油脂、タンパク等をバイオコンバージョンし、石油代替材料として利用する試みが実用化されている。一例として、石油を使用するプラスチックの代替物質として、植物由来のポリ乳酸やポリブチレンサクシネートを生産する技術開発が取り組まれている。また、米国・ブラジル等では糖、澱粉などからエタノールを発酵生産し、石油から精製される自動車燃料にブレンドして用いることも行われている。【０００３】
また、塗料・インキ等の工業用溶剤樹脂原料として重要な化成品としてアセトンやイソプロパノール（2-プロパノールと同義）がある。イソプロパノールは、従来、石油を原料として合成されていたが、石油枯渇、大気中のCO2削減の問題から発酵プロセスを用いてバイオマスから合成することが望まれている。従来、Clostridium acetobutylicumがブタノールと共にアセトンとイソプロパノールを発酵生産することが知られている（非特許文献１：Biotechnology, 2nd Edn., vol1, p285-323, 1993）。Clostridium acetobutylicum由来のアセトン合成遺伝子を大腸菌に導入しアセトンが合成されることも公知である（非特許文献２：Appl. Environ. Microbiol., 73, 1079-1085, 1998、特許文献１：US2008/293125、特許文献２：WO 2009/008377、特許文献３：WO 2009/028582）。【０００４】
さらに、Clostridium acetobutylicum由来のアセトン合成遺伝子に加え、イソプロパノール脱水素酵素遺伝子を導入した大腸菌を用いてイソプロパノールを合成する例が報告されている（非特許文献３：Appl. Environ. Microbiol., 64, 7814-7818, 2007）。しかしながら、大腸菌を始めとする細菌類は有機溶媒耐性が低いことが問題視されており、それを解決するためのいくつかの方法が知られているがまだ工業的に有機溶剤を生産するには耐性が不十分である（特許文献４：WO 2007/146377、特許文献５：WO 2007/130560、特許文献６：WO 2008/073406、特許文献７：US 6,156,532）。大腸菌等の細菌類では、細胞膜が有機溶媒に対して弱いことが問題であり、細菌類は有機溶媒生産に不向きであると考えられる。一方、酵母類は有機溶媒耐性能が高いが、酵母に遺伝子を導入してイソプロパノールやアセトンといった有機溶媒を生産する例は報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】US 2008/293125
【特許文献２】WO 2009/008377
【特許文献３】WO 2009/028582
【特許文献４】WO 2007/146377
【特許文献５】WO 2007/130560
【特許文献６】WO 2008/073406
【特許文献７】US 6,156,532
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Biotechnology, 2nd Edn., vol1, p285-323, 1993
【非特許文献２】Appl. Environ. Microbiol., 73, 1079-1085, 1998
【非特許文献３】Appl. Environ. Microbiol., 64, 7814-7818, 2007
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、上述したような実情に鑑み、酵母を利用して、発酵プロセスにより優れた生産性でイソプロパノールを製造する方法を提供するとともに、イソプロパノール生産能に優れた組換え酵母を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子と、アセトアセチルCoAからイソプロパノールを合成する一群の酵素をコードする遺伝子群（イソプロパノール合成関連遺伝子群）とを導入した組換え酵母を培養したところ、イソプロパノールを高生産することを見いだし、本発明を完成するに至った。本発明は以下を包含する。【０００９】
（１）アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子、及びアセトアセチルCoAからイソプロパノールを合成する代謝経路に関連するイソプロパノール生合成関連遺伝子群が導入された組換え酵母を培養し、培養物からイソプロパノールを取得することを特徴とするイソプロパノールの製造方法。【００１０】
（２）上記アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子は、アセチルCoAとマロニルCoAとをアセトアセチルCoAに変換する反応を触媒する酵素をコードすることを特徴とする（１）記載のイソプロパノールの製造方法。【００１１】
（３）上記アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子は、Streptomyces属の微生物由来の遺伝子（ORFn遺伝子）であることを特徴とする（２）記載のイソプロパノールの製造方法。【００１２】
（４）上記アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子は、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、又は配列番号１のアミノ酸配列に対して８０％以上の一致度を有するアミノ酸配列を有し、マロニルCoAとアセチルCoAとからアセトアセチルCoAを合成する機能を有するタンパク質をコードするものであることを特徴とする（２）記載のイソプロパノールの製造方法。【００１３】
（５）イソプロパノール生合成関連遺伝子群は、アセトアセチルCoA転移酵素遺伝子、アセト酢酸脱炭酸酵素遺伝子及びイソプロパノール脱水素酵素遺伝子からなる群のなかから選ばれる遺伝子であることを特徴とする（１）記載のイソプロパノールの製造方法。【００１４】
（６）上記組換え酵母は、イソプロパノール生合成関連遺伝子群として、アセトアセチルCoA転移酵素遺伝子、アセト酢酸脱炭酸酵素遺伝子及びイソプロパノール脱水素酵素遺伝子のうち内在しない遺伝子が導入されたものであることを特徴とする（１）記載のイソプロパノールの製造方法。【００１５】
（７）アセトアセチルCoA転移酵素遺伝子は、Clostridium acetobutylicum由来のctfA遺伝子及びctfB遺伝子であることを特徴とする（５）又は（６）記載のイソプロパノールの製造方法。【００１６】
（８）アセト酢酸脱炭酸酵素遺伝子は、Clostridium acetobutylicum由来のadc遺伝子であることを特徴とする（５）又は（６）記載のイソプロパノールの製造方法。【００１７】
（９）イソプロパノール脱水素酵素遺伝子は、Clostridium beijerinckii由来のpdh遺伝子であることを特徴とする（５）又は（６）記載のイソプロパノールの製造方法。【００１８】
（１０）上記アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子、上記イソプロパノール生合成関連遺伝子群は、宿主となる酵母のゲノム内に導入されていることを特徴とする（１）記載のイソプロパノールの製造方法。【００１９】
（１１）アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子、及びアセトアセチルCoAからイソプロパノールを合成する代謝経路に関連するイソプロパノール生合成関連遺伝子群が導入された組換え酵母。【００２０】
（１２）上記アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子は、アセチルCoAとマロニルCoAとをアセトアセチルCoAに変換する反応を触媒する酵素をコードすることを特徴とする（１１）記載の組換え酵母。【００２１】
（１３）上記アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子は、Streptomyces属の微生物由来のアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子（ORFn遺伝子）であることを特徴とする（１２）記載の組換え酵母。【００２２】
（１４）上記アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子は、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、又は配列番号１のアミノ酸配列に対して８０％以上の一致度を有するアミノ酸配列を有し、マロニルCoAとアセチルCoAとからアセトアセチルCoAを合成する機能を有するタンパク質をコードするものであることを特徴とする（１２）記載の組換え酵母。【００２３】
（１５）イソプロパノール生合成関連遺伝子群は、アセトアセチルCoA転移酵素遺伝子、アセト酢酸脱炭酸酵素遺伝子及びイソプロパノール脱水素酵素遺伝子からなる群のなかから選ばれる遺伝子であることを特徴とする（１１）記載の組換え酵母。【００２４】
（１６）イソプロパノール生合成関連遺伝子群として、アセトアセチルCoA転移酵素遺伝子、アセト酢酸脱炭酸酵素遺伝子及びイソプロパノール脱水素酵素遺伝子のうち内在しない遺伝子が導入されたものであることを特徴とする（１１）記載の組換え酵母。【００２５】
（１７）アセトアセチルCoA転移酵素遺伝子は、Clostridium acetobutylicum由来のctfA遺伝子及びctfB遺伝子であることを特徴とする（１５）又は（１６）記載の組換え酵母。【００２６】
（１８）アセト酢酸脱炭酸酵素遺伝子は、Clostridium acetobutylicum由来のadc遺伝子であることを特徴とする（１５）又は（１６）記載の組換え酵母。【００２７】
（１９）イソプロパノール脱水素酵素遺伝子は、Clostridium beijerinckii由来のpdh遺伝子であることを特徴とする（１５）又は（１６）記載の組換え酵母。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子と、イソプロパノール生合成関連遺伝子群とを導入することで、優れたイソプロパノール生産能を有する組換え酵母を作製することができる。本発明においては、イソプロパノール生産能を有する組換え酵母を利用することで生産性に優れたイソプロパノールの製造方法を提供できる。すなわち、本発明に係るイソプロパノールの製造方法によれば、燃料や樹脂原料として使用されるイソプロパノールを製造する際の生産性を向上させることができ、イソプロパノール生産コストを低減させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】＃15-10株、ERG10/＃15-10株及びORFn/＃15-10株について、イソプロパノール生産量を経時的に測定した結果を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３１】
本発明に係るイソプロパノールの製造方法は、アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子、及びアセトアセチルCoAからイソプロパノールを合成する代謝経路に関連するイソプロパノール生合成関連遺伝子群が導入された組換え酵母を培養し、培養物からイソプロパノールを取得するものである。
【００３２】
アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子
アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子とは、マロニルCoAとアセチルCoAとからアセトアセチルCoAを合成する活性、又は二分子のアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する活性を有する酵素をコードする遺伝子である。なお、二分子のアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する活性を有する酵素をチオラーゼと称する場合もある。
【００３３】
特に本発明においては、マロニルCoAとアセチルCoAとからアセトアセチルCoAを合成する活性を有する酵素をコードするアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子を使用することが好ましい。マロニルCoAとアセチルCoAとからアセトアセチルCoAを合成する活性を有する酵素をコードするアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子を使用した場合には、二分子のアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する活性を有する酵素をコードするアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子を使用した場合と比較して、非常に優れたイソプロパノール生産能を有する組換え酵母を作製することができる。
【００３４】
マロニルCoAとアセチルCoAとからアセトアセチルCoAを合成する活性を有するタイプのアセトアセチルCoA合成酵素をコードする遺伝子は、例えば、Streptomyces属の放線菌において見いだされており（特開2008-61506号公報）、例えばStreptomyces属の放線菌由来の遺伝子を使用することができる。
【００３５】
このアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子としては、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質は、放線菌Streptomyces sp. CL190株において見いだされたマロニルCoAとアセチルCoAとからアセトアセチルCoAを合成する活性を有し、二分子のアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する活性を有しないアセトアセチルCoA合成酵素である（特開2008-61506号公報）。
【００３６】
配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子は、特開2008-61506号公報を参照して設計した一対のプライマーを用い、放線菌Streptomyces sp. CL190株から得たゲノムDNAを鋳型とした核酸増幅法（例えばPCR）により取得することができる。
【００３７】
一方、二分子のアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する活性を有するタイプのアセトアセチルCoA合成酵素（チオラーゼ）をコードする遺伝子は、従来公知の遺伝子、すなわち各種の生物において同定された本タイプのアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子を使用することができる。なお、アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子は、多くの生物種に存在するメバロン酸経路に含まれる遺伝子である。
【００３８】
一例としては、Clostridium acetobutylicum（ATCC824として寄託されている）由来チオラーゼ遺伝子を挙げることができる。Clostridium acetobutylicum由来のチオラーゼ遺伝子は、thlA遺伝子と表記され、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしている。また、チオラーゼ遺伝子としては、例えばSchizosaccharomyces pombe、Saccharomyces cerevisiae、Escherichia coli、Macaca mulatta、Bos taurus、Drosophila melanogaster、Oryza sativa、Aspergillus oryzae、Bacillus amyloliquefaciens及びClostridium kluyveri由来の遺伝子を使用することができる。
【００３９】
ところで、本発明において、アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子としては、放線菌Streptomyces sp. CL190株由来の配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子に限定されず、配列番号１のアミノ酸配列に対して高い類似性を有するアミノ酸配列を有し、マロニルCoAとアセチルCoAとからアセトアセチルCoAを合成する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。また、本発明において、アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子としては、Clostridium acetobutylicum由来の配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするチオラーゼ遺伝子に限定されず、配列番号２のアミノ酸配列に対して高い類似性を有するアミノ酸配列を有し、二分子のアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。ここで、高い類似性とは、例えば８０％以上の一致度を意味し、好ましくは９０％以上の一致度、より好ましくは９５％以上の一致度、最も好ましくは９７％以上の一致度を意味する。なお、一致度の値は、配列類似性を検索するプログラム（相同性検索プログラムと称される場合もある）を用いて、配列番号１又は２のアミノ酸配列と他のアミノ酸配列とをアライメントした際に、当該他のアミノ酸配列における、配列番号１又は２のアミノ酸配列に対して一致したアミノ酸残基の割合として算出される値である。
【００４０】
また、本発明において、アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子としては、配列番号１のアミノ酸配列における１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、マロニルCoAとアセチルCoAとからアセトアセチルCoAを合成する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。また、本発明において、アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子としては、配列番号２のアミノ酸配列における１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、二分子のアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。ここで、複数個のアミノ酸とは、例えば２〜３０個のアミノ酸を意味し、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、最も好ましくは２〜５個のアミノ酸を意味する。
【００４１】
さらに、本発明において、アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子としては、配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドの一部又は全部に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、マロニルCoAとアセチルCoAとからアセトアセチルCoAを合成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよい。また、本発明において、アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子としては、配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドの一部又は全部に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、二分子のアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとは、６０℃で２×ＳＳＣ洗浄条件下で結合を維持することを意味する。ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。
【００４２】
上述したような、配列番号１のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するアセトアセチルCoA合成酵素をコードする遺伝子は、例えば、Streptomyces sp. CL190株以外の放線菌から単離することができる。また、配列番号２のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するアセトアセチルCoA合成酵素をコードする遺伝子は、例えば、Clostridium acetobutylicum（ATCC824）以外のClostridium属細菌から単離することができる。また、配列番号１又は２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。塩基配列に変異を導入するには、Kunkel法またはGapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-KやMutant-G（何れも商品名、TAKARA社製））等を用いて、あるいはLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキット（商品名、TAKARA社製）を用いて変異が導入される。
【００４３】
配列番号１のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するアセトアセチルCoA合成酵素の活性は以下のように評価することができる。すなわち、先ず、評価対象のタンパク質をコードする遺伝子を発現可能なように宿主細胞に導入し、クロマトグラフィー等の手法によってタンパク質を精製する。得られた評価対象のタンパク質を含む緩衝液中に、基質としてマロニルCoAとアセチルCoAとを添加する。その後、例えば所望の温度（例えば10〜60℃）でインキュベートする。そして、反応終了後、基質の減少量及び/又は生成物（アセトアセチルCoA）の生成量を測定することで、評価対象のタンパク質について、マロニルCoAとアセチルCoAとからアセトアセチルCoAを合成する機能の有無及びその程度を評価することができる。このとき、得られた評価対象のタンパク質を含む緩衝液中に、基質としてアセチルCoAのみを添加し、同様に、基質の減少量及び/又は生成物生成量を測定することで、二分子のアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する活性の有無について検討することができる。
【００４４】
配列番号２のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するアセトアセチルCoA合成酵素の活性は以下のように評価することができる。すなわち、先ず、評価対象のタンパク質をコードする遺伝子を発現可能なように宿主細胞に導入し、クロマトグラフィー等の手法によってタンパク質を精製する。得られた評価対象のタンパク質を含む緩衝液中に、基質としてアセチルCoAとを添加する。その後、例えば所望の温度（例えば10〜60℃）でインキュベートする。そして、反応終了後、基質の減少量及び/又は生成物（アセトアセチルCoA）の生成量を測定することで、評価対象のタンパク質について、二分子のアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する機能の有無及びその程度を評価することができる。
【００４５】
イソプロパノール生合成関連遺伝子群
イソプロパノール生合成関連遺伝子群とは、アセトアセチルCoAを出発化合物として最終生産物であるイソプロパノールを生合成する代謝経路に関与する酵素をコードする複数の遺伝子からなる群を意味する。イソプロパノール生合成代謝経路に関与する酵素としては、アセトアセチルCoAを基質としてアセチル酢酸を合成するアセトアセチルCoA転移酵素、アセチル酢酸を基質としてアセトンを合成するアセト酢酸脱炭酸酵素及び、アセトンを基質としてイソプロパノールを合成するイソプロパノール脱水素酵素を挙げることができる。
【００４６】
これら酵素をコードする各遺伝子は、イソプロパノールの生合成能を有する微生物から単離することができる。イソプロパノール生合成能を有する微生物としては、特に限定されないが、細菌を挙げることができる。イソプロパノール生合成能を有する微生物としては、Clostridium属の微生物、特に限定されないが、Clostridium acetobutylicum、Clostridium beijerinckii、Clostridium saccharoperbutylacetonicum、Clostridium saccharoacetobutylicum、Clostridium aurantibutyricum、Clostridium pasteurianum、Clostridium sporogenes、Clostridium cadaveris及びClostridium tetanomorphumを挙げることができる。なかでも、全ゲノム配列が解析されているClostridium acetobutylicum及びClostridium beijerinckii由来のイソプロパノール生合成関連遺伝子群を使用することが好ましい。
【００４７】
特に、アセトアセチルCoA転移酵素遺伝子としては、Clostridium acetobutylicum由来のctfA遺伝子及びctfB遺伝子を使用することができる。ctfA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３に示し、ctfB遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４に示す。また、アセト酢酸脱炭酸酵素遺伝子としては、Clostridium acetobutylicum由来のadc遺伝子を使用することができる。adc遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号５に示す。さらに、イソプロパノール脱水素酵素遺伝子は、Clostridium beijerinckii由来のpdh遺伝子を使用することができる。pdh遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６に示す。
【００４８】
上述したctfA遺伝子以外にもアセトアセチルCoA転移酵素（αサブユニット）遺伝子としては、例えば、Escherichia coli、Shigella sonnei、Pectobacterium carotovorum、Photorhabdus asymbiotica、Bacillus cereus、Citrobacter koseri、Streptococcus pyogenes、Clostridium difficile及びClostridium beijerinckii由来の遺伝子を使用することができる。また、上述したctfB遺伝子以外にもアセトアセチルCoA転移酵素（βサブユニット）遺伝子としては、Escherichia coli、Citrobacter koseri、Haemophilus influenzae、Nitrobacter hamburgensis、Streptococcus pyogenes、Clostridium difficile及びBacillus weihenstephanensis由来の遺伝子を使用することができる。さらに、adc遺伝子以外にもアセト酢酸脱炭酸酵素遺伝子としては、Saccharopolyspora erythraea、Streptomyces avermitilis、Bradyrhizobium sp.、Rhizobium leguminosarum、Burkholderia mallei、Ralstonia solanacearum、Francisella tularensis、Clostridium botulinum及びClostridium beijerinckii由来の遺伝子を使用することができる。さらにまた、pdh遺伝子以外にもイソプロパノール脱水素酵素遺伝子としては、Rhodococcus ruber由来の遺伝子を使用することができる。
【００４９】
また、イソプロパノール生合成関連遺伝子群としては、上述した遺伝子に限定されず、Clostridium acetobutylicum由来のctfA遺伝子、ctfB遺伝子及びadc遺伝子、並びにClostridium beijerinckii由来のpdh遺伝子に対する相同遺伝子であってもよい。相同遺伝子は、遺伝子の塩基配列やタンパク質のアミノ酸配列が格納されたデータベースに対して、BlastやFasta等の公知のアルゴリズムを用いた相同性検索によって特定することができる。データベースを用いて特定した相同遺伝子は、公知の手法によって微生物から単離して使用することができる。すなわち、微生物から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、特定した相同遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いた核酸増幅法によって相同遺伝子を含む核酸断片を得ることができる。
【００５０】
また、上述したようなイソプロパノール生合成能を有するClostridium属微生物について公知の手法によってcDNAライブラリーを作製し、Clostridium acetobutylicum由来のctfA遺伝子、ctfB遺伝子及びadc遺伝子、並びにClostridium beijerinckii由来のpdh遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプローブと特異的にハイブリダイズするcDNAを特定することで、上述したようなイソプロパノール生合成能を有するClostridium属微生物由来の相同遺伝子を得ることもできる。
【００５１】
なお、Clostridium acetobutylicum由来のctfA遺伝子、ctfB遺伝子及びadc遺伝子、並びにClostridium beijerinckii由来のpdh遺伝子に対する相同遺伝子の取得方法は、上述した手法に限定されず、如何なる手法を適用しても良い。
【００５２】
宿主酵母への形質転換
上述した「アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子」及び「イソプロパノール生合成関連遺伝子群」は、適当な発現ベクターに組み込まれ、宿主酵母に導入される。ここで、宿主酵母としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などの酵母が挙げられる。
【００５３】
また、宿主酵母としては、マロニルCoAとアセチルCoAとからアセトアセチルCoAを合成する活性を有するアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子を使用する場合、特に、油脂生産能が高い酵母を使用することが好ましい。脂質代謝経路においてマロニルCoAは基質の一部となっているため、油脂生産能の高い酵母では、マロニルCoAの合成速度及び/又は合成量が高い。よって、マロニルCoAとアセチルCoAとからアセトアセチルCoAを合成する活性を有するアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子を使用する場合、油脂生産能が高い酵母を使用することで、イソプロパノール生産性の向上が期待される。このような油脂生産能の高い酵母としては、例えば、Rhodotorula glutinis、Rhodotorula gracilis、Mortierella alpina、Lipomyces starkeyi、Trichosporon sp.、Saccharomycopsis lipolytica、Endomyces magnusii、Cryptococcus albidus、Rhodosporidium toruloides及びHansenula polymorphaを挙げることができる。
【００５４】
酵母を宿主とする場合、発現ベクターは、宿主酵母中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、上述した遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、発現ベクターには、プロモーター活性を制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００５５】
また、上述した「アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子」及び「イソプロパノール生合成関連遺伝子群」は、宿主酵母の染色体上に導入されることが好ましい。これら遺伝子を染色体上に導入した組換え酵母では、これら遺伝子が安定的に高発現でき、優れたイソプロパノール生産能を達成できる。なお、これら遺伝子を染色体上に導入するには、特に限定されず、従来公知の手法を適宜使用することができる。一例としては、宿主酵母の染色体との相同組換えを利用する方法を使用することができる。
【００５６】
また、上述した「アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子」及び「イソプロパノール生合成関連遺伝子群」は、宿主酵母における染色体上に多コピーで導入されることが好ましい。これら遺伝子を染色体上に多コピーで導入した組換え酵母では、これら遺伝子が高発現することとなり優れたイソプロパノール生産能を達成できる。なお、これら遺伝子を染色体上に多コピーで導入するには、特に限定されず、従来公知の手法を適宜使用することができる。一例としては、多コピー導入型のベクターを使用する方法を挙げることができる。
【００５７】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、ピキア・パストリスなどが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現誘導できるものであれば特に限定されず、例えばgal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーターなどが挙げられる。
【００５８】
酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法[Becker, D.M.,et al.: Methods. Enzymol., 194:182-187 (1990)]、スフェロプラスト法[Hinnen, A. et al.:Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75:1929-1933(1978)]、酢酸リチウム法[Itoh, H.：J. Bacteriol.,153:163-168 (1983)]などが挙げられる。
【００５９】
また、宿主酵母には、上述した「イソプロパノール生合成関連遺伝子」のうち少なくとも１以上の内在遺伝子を有するものであっても良い。この場合、上述した「イソプロパノール生合成関連遺伝子」のうち、内在遺伝子以外を導入すればよい。
【００６０】
イソプロパノールの製造
上述した「アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子」及び「イソプロパノール生合成関連遺伝子群」が導入された組換え酵母を、グルコース等の炭素源を含む培地で培養することによって、イソプロパノールの生合成が進行する。一般に、目的物質の生産能を付与する又は増強する目的で、酵母に所定の遺伝子を導入しても所期の目的を達成できない場合が少なくない。理由としては、外来生物種由来の遺伝子を安定的に且つ十分な量で発現させることが困難であることが挙げられる。また、イソプロパノールを生合成するのに十分な量のアセトアセチルCoAが細胞内に存在していない可能性も挙げられる。例えば、２分子のアセチルCoAがチオラーゼによって結合してアセトアセチルCoAが合成される場合、この反応の平衡はアセトアセチルCoAからアセチルCoAが合成される方向に向いている。よって、合成されたアセトアセチルCoAを次の物質に変換する強い反応が無ければ、アセトアセチルCoA合成方向に進めることが難しいと考えられる。
【００６１】
なお、上述した「アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子」及び「イソプロパノール生合成関連遺伝子群」が導入された酵母を培養する際の培養条件としては、特に限定されず、宿主酵母の栄養要求性や薬剤耐性に合致した培地を使用し、通常の条件で培養すればよい。
【００６２】
また、合成されたイソプロパノールは培地中に存在するため、遠心分離等の手段によって培地から菌体を分離した後の上清画分からイソプロパノールを取得することができる。上清画分からイソプロパノールを単離するには、例えば、上清画分に酢酸エチル及びメタノール等の有機溶媒を添加し、十分に撹拌する。水層と溶媒層とに分離し、溶媒層からイソプロパノールを抽出することができる。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。【００６４】
〔実施例１〕
本実施例では、アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子としてStreptomyces sp. CL190株由来のORFn遺伝子又はSaccharomyces cerevisiae由来のERG10遺伝子と、アセトアセチルCoA転移酵素遺伝子としてClostridium acetobutylicum由来のctfA遺伝子及びctfB遺伝子と、アセト酢酸脱炭酸酵素としてClostridium acetobutylicum由来のadc遺伝子と、イソプロパノール脱水素酵素遺伝子としてClostridium beijerinckii由来のpdh遺伝子とを導入した組み換え酵母を作製し、イソプロパノール生産能を検討した。【００６５】
なお、ORFn遺伝子は、マロニルCoAとアセチルCoAとからアセトアセチルCoAを合成する活性を有するアセトアセチルCoA合成酵素をコードしている。ERG10遺伝子は、二分子のアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する活性を有するアセトアセチルCoA合成酵素をコードしている。【００６６】
本実施例では、先ず、ctfA遺伝子、ctfB遺伝子及びadc遺伝子を有する発現ベクター（pEXP(Ura)-ADC-CTFA-CTFB）を用いてこれら遺伝子を染色体に導入し、アセトン生産能に優れた組換え酵母を選抜した。その後、選抜された組換え酵母に、pdh遺伝子を有する発現ベクター（pDI626PGK-T-iPDH）を用いて当該遺伝子を染色体に更に導入し、イソプロパノール生産能に優れた組換え酵母を選抜した。次に、選抜された組換え酵母に、ORFn遺伝子を有する発現ベクター（pESCpgkgap-HIS-ORFn）又はERG10遺伝子を有する発現ベクター（pESCpgkgap-HIS-ERG10）を用いていずれかの遺伝子を染色体に更に導入し、イソプロパノール生産能を評価した。【００６７】
なお、本実施例では、酵母として、Saccharomyces cerevisiae YPH499(Stratagene社製)を使用した。YPH499の培養には以下の培地を使用した。【００６８】
YPD培地
2％  Bacto Peptone （DIFCO社製） 
1％  Bacto Yeast extract （DIFCO社製） 
2％  D-Glucose （和光純薬社製）
SD（-URA-TRP-HIS）
SD培地はBIO101社製のものを用いた。SD（-URA-TRP-HIS）培地はSD培地のウラシル、トリプトファン、ヒスチジンを除いたものを使用した。【００６９】
また、酵母YPH499のゲノムDNAの調製は以下の方法に従った。先ず、Saccharomyces cerevisiae YPH499(Stratagene社製)を３mlのYPD培地で30℃、1日間培養した。培養液1.5mlをQIAGEN社製ゲノムDNA調製キット（Gentra Puregene Yeast/Bact.kit）に供しゲノムDNAを調製した。【００７０】
＜pESCpgkgap-HIS-ORFnの作製＞
pDI626PGKproの作製
以下の条件でPCRを行った。【００７１】
プライマー（50 pmol）：
SacI-Ppgk1 FW；5’TAG GGA GCT CCA AGA ATT ACT CGT GAG TAA GG 3’（配列番号７）
SacII-Ppgk1 RV；5’ATA ACC GCG GTG TTT TAT ATT TGT TGT AAA AAG TAG 3’ （配列番号８）
鋳型：酵母YPH499のゲノムDNA（0.4μg）
反応液：1x Pfu Ultra II reaction buffer(Stratagene)；10 nmol dNTP；1μl Pfu Ultra II fusion HS DNA polymerase (Stratagene)；を含む50μl溶液
反応：95℃ 5分-(95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 2分)×25サイクル-72℃ 3分-4℃ストック
PCRの反応終了後、反応液をQIAGEN社製MinElute PCR purification kitを用いて精製した。得られた増幅断片を制限酵素SacIとSacIIで消化した。アガロースゲル電気泳動を行ない、712bpの断片を切り出してQIAGEN社製MinElute Gel extraction kitを用いて精製した。同様に制限酵素SacIとSacIIで消化したpDI626GAP（(APP. Env. Micro., 2009, 5536-5543)）ベクターにライゲーションした。得られた配列をシークエンスし、目的とするプラスミドが作製されていることを確認した。こうして得られたプラスミドをpDI626PGKproと命名した。【００７２】
pDI626PGKの作製
以下の条件でPCRを行った。【００７３】
プライマー（50 pmol）：
SalI-Tpgk1 FW；5’TTA AGT CGA CAT TGA ATT GAA TTG AAA TCG ATA GAT C 3’ （配列番号９）
KpnI-Tpgk1 RV2；5’TTA AGG TAC CGC TTC AAG CTT ACA CAA CAC 3’ （配列番号１０）
鋳型：酵母YPH499のゲノムDNA（0.4μg）
反応液：1x Pfu Ultra II reaction buffer(Stratagene)；10 nmol dNTP；1μl Pfu Ultra II fusion HS DNA polymerase (Stratagene)；を含む50μl溶液
反応：95℃ 5分-(95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 2分)×25サイクル-72℃ 3分-4℃ストック
PCRの反応終了後、反応液をQIAGEN社製MinElute PCR purification kitを用いて精製後、制限酵素SalIとKpnIで消化した。アガロースゲル電気泳動を行ない、330bpの断片を切り出してQIAGEN社製MinElute Gel extraction kitを用いて精製した。制限酵素SalIとKpnIで消化した上記pDI626PGKproベクターにライゲーションした。得られた配列をシークエンスし、目的とするプラスミドが作製されていることを確認した。こうして得られたプラスミドをpDI626PGKと命名した。【００７４】
pDI626PGK-Tの作製
上記pDI626PGKを制限酵素SbfIで消化し、反応液をQIAGEN社製MinElute PCR purification kitを用いて精製した。その後、TaKaRaBIO社製Blunting kitを用いて末端を平滑化し、さらに制限酵素KpnIで消化した。アガロースゲル電気泳動を行ない、3650bpの断片を切り出してQIAGEN社製MinElute Gel extraction kitを用いて精製した。これをライゲーションするためのベクターとした。次にpRS524GAP(APP. Env. Micro., 2009, 5536-5543)を制限酵素PmaCIとKpnIで消化した。アガロースゲル電気泳動を行ない、765bpの断片を切り出してQIAGEN社製MinElute Gel extraction kitを用いて精製しインサートとした。これらのライゲーションを行ない、得られた配列のつなぎ目をシークエンスし、目的とするプラスミドが作製されていることを確認した。こうして得られたプラスミドをpDI626PGK-Tと命名した。【００７５】
pESCgap-HISの作製
以下の条件でPCRを行った。【００７６】
プライマー（50 pmol）：
EcoRI-Pgap-F；5’CAC GGA ATT CCA GTT CGA GTT TAT CAT TAT CAA 3’ （配列番号１１）
BamHI-Pgap-R；5’CTC TGG ATC CTT TGT TTG TTT ATG TGT GTT TAT TC 3’ （配列番号１２）
鋳型：pDI626GAPプラスミド（1ng）
反応液：1x Pfu Ultra II reaction buffer(Stratagene)；10 nmol dNTP；1μl Pfu Ultra II fusion HS DNA polymerase (Stratagene)；を含む50μl溶液
反応：95℃ 2分-(95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 2分)×25サイクル-72℃ 3分-4℃ストック
PCRの反応終了後、反応液をQIAGEN社製MinElute PCR purification kitを用いて精製後、制限酵素BamHIとEcoRIで消化した。アガロースゲル電気泳動を行ない、686bpの断片を切り出してQIAGEN社製MinElute Gel extraction kitを用いて精製した。制限酵素BamHIとEcoRIで消化したpESC-HIS(STRATAGENE社より購入)ベクターにライゲーションした。得られた配列をシークエンスし、目的とするプラスミドが作製されていることを確認した。こうして得られたプラスミドをpESCgap-HISと命名した。 
pESCpgkgap-HISの作製
以下の条件でPCRを行った。【００７７】
プライマー（50 pmol）：
MunI-Ppgk1-F；5’TAG GCA ATT GCA AGA ATT ACT CGT GAG TAA GG 3’ （配列番号１３）
EcoRI-Ppgk1-R；5’ATA AGA ATT CTG TTT TAT ATT TGT TGT AAA AAG TAG 3’ （配列番号１４）
鋳型：pDI626PGKプラスミド（1ng）
反応液：1x Pfu Ultra II reaction buffer(Stratagene)；10 nmol dNTP；1μl Pfu Ultra II fusion HS DNA polymerase (Stratagene)；を含む50μl溶液
反応：95℃ 2分-(95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 2分)×25サイクル-72℃3分-4℃ストック
PCRの反応終了後、反応液をQIAGEN社製MinElute PCR purification kitを用いて精製後、制限酵素MunIとEcoRIで消化した。アガロースゲル電気泳動を行ない、718bpの断片を切り出してQIAGEN社製MinElute Gel extraction kitを用いて精製した。制限酵素EcoRIで消化し、BAP処理した上記pESCgap-HISベクターにライゲーションした。インサートが正しい方向にライゲーションされていることをコロニーPCRで確認し、プラスミドを調製した。配列をシークエンスし、目的とするプラスミドが作製されていることを確認した。こうして得られたプラスミドをpESCpgkgap-HISと命名した。【００７８】
pCR2.1-ORFnの作製
Streptomyces sp. CL190株由来のORFn遺伝子の塩基配列を元にし、この塩基配列に含まれているSaccharomyces cerevisiaeにおけるレアコドンを出現頻度が高いコドンとするように設計した。設計した塩基配列を配列番号１５に示す。また、本実施例では設計した塩基配列からなる核酸断片を合成した。また、合成したORFn遺伝子の上流非翻訳領域にggatccgccacc（配列番号１６）、下流非翻訳領域にctcgagの合成DNA配列を付与した。この合成遺伝子をプラスミドpCR2.1（Invitrogen社製）に導入し、得られたプラスミドをpCR2.1-ORFnと命名した。【００７９】
pESCpgkgap-HIS-ORFnの作製
上記pCR2.1-ORFnを制限酵素BamHIとXhoIで消化後、1002bpの断片を切り出し、同様に制限酵素BamHIとXhoIで消化した上記pESCpgkgap-HISベクターにライゲーションした。得られた配列を制限酵素で解析し、目的とするプラスミドが作製されていることを確認した。こうして得られたプラスミドをpESCpgkgap-HIS-ORFnと命名した。pESCpgkgap-HIS-ORFnは、Saccharomyces cerevisiae YPH499において最適に発現するようにコドンが設計された、Streptomyces sp. CL190株由来のORFn遺伝子をSaccharomyces cerevisiae YPH499の染色体上に導入するベクターである。なお、このORFn遺伝子は、PGKプロモーターにより発現制御され、恒常的に発現する。【００８０】
＜pESCpgkgap-HIS-ERG10の作製＞
以下の条件でPCRを行った。【００８１】
プライマー（50 pmol）：
ERG10-F；5’GGG GGG ATC CGC CAC CAT GTC TCA GAA CGT TTA CAT TGT ATC 3’ （配列番号１７）
ERG10-R；5’GGG GCT CGA GTC ATA TCT TTT CAA TGA CAA TAG AGG 3’ （配列番号１８）
鋳型：YPH499のゲノムDNA（0.3μg）
反応液：1x Pfu Ultra II reaction buffer(Stratagene)；10 nmol dNTP；1μl Pfu Ultra II fusion HS DNA polymerase (Stratagene)；を含む50μl溶液
反応：95℃ 5分-(95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 2分)×30サイクル-72℃ 3分-4℃ストック
PCRの反応終了後、反応液をQIAGEN社製MinElute PCR purification kitを用いて精製した後、制限酵素BamHIとXhoIで消化した。アガロースゲル電気泳動を行なった後、1209bpの断片を切り出し、QIAGEN社製MinElute Gel extraction kitを用いて精製した。得られたDNA断片を制限酵素BamHIとXhoIで消化した上記pESCpgkgap-HISベクターにライゲーションした。配列をシークエンスし、目的とするプラスミドが作製されていることを確認した。こうして得られたプラスミドをpESCpgkgap-HIS-ERG10と命名した。pESCpgkgap-HIS-ERG10は、Saccharomyces cerevisiae YPH499由来のチオラーゼ遺伝子をSaccharomyces cerevisiae YPH499の染色体上に導入するベクターである。なお、このORFn遺伝子は、PGKプロモーターにより発現制御され、恒常的に発現する。【００８２】
＜pEXP(Ura)-ADC-CTFA-CTFBの作製＞
Clostridium acetobutylicum ATCC824株由来のadc遺伝子、ctfA遺伝子及びctfB遺伝子をそれぞれpT7Blueベクターにクローニングした。得られたベクターをpDI626にクローニングした後、Gatewayドナーベクター(Invitrogen社)を用いてエントリークローン（pENT-ADC、pENT-CTFA及びpENT-CTFB）を作製した。そして、得られたエントリークローンを発現ベクター（pDEST626(2008)）に組み込むことで、pEXP(Ura)-ADC-CTFA-CTFBを作製した。詳細は以下の通りである。【００８３】
pENT-ADCの作製
adc遺伝子のエントリークローン（pENT-ADC）を以下のように作製した。【００８４】
先ず、以下の条件でPCRを行った。【００８５】
プライマー（50 pmol）：
adc-F；5’ATG TTA AAG GAT GAA GTA ATT AAA CAA ATT AG 3’ （配列番号１９）
adc-R；5’TTA CTT AAG ATA ATC ATA TAT AAC TTC AGC TC 3’ （配列番号２０）
鋳型：上記ATCC824株のゲノムDNA（0.4μg）
反応液：1x Pfu Ultra II reaction buffer(Stratagene)；10 nmol dNTP；1μl Pfu Ultra II fusion HS DNA polymerase (Stratagene)；を含む50μl溶液
反応：95℃ 5分-(95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 2分)×30サイクル-72℃ 3分-4℃ストック
PCRで増幅した735bpの断片をNovagen社製Perfectly Blunt Cloning Kitを用いてpT7Blueベクター（タカラバイオ社）にブラントエンドクローニングした。クローニングした配列をシークエンスしClostridium acetobutylicum ATCC824株のadc遺伝子の塩基配列（CA-P0165）であることを確認した。こうして得られたプラスミドをpT7Blue-ADCと命名した。【００８６】
次に、pT7Blue-ADCを制限酵素BamHIとSalIで消化し、771bpの断片を切り出して、同様に制限酵素BamHIとSalIで消化したpDI626ベクターにライゲーションした。得られた配列をシークエンスし、目的とするプラスミドが作製されていることを確認した。こうして得られたプラスミドをpDI626-ADCと命名した。【００８７】
次に、得られたpDI626-ADCを鋳型にして、以下のプライマーでPCRを行った。【００８８】
プライマー：
08-189-adc-attB1-Fw；5’GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTC AGT TCG AGT TTA TCA TTA TC 3’ （配列番号２１）
08-189-adc-attB4-Rv；5’GGG GAC AAC TTT GTA TAG AAA AGT TGG GTG GGC CGC AAA TTA AAG CCT TC 3’ （配列番号２２）
得られた1809bpのPCR産物をgateway BP反応によりドナーベクターpDONR221 P1-P4に導入した。得られたクローンのシーケンスを行ない、インサートの全塩基配列に変異個所が無いことを確認した。こうして得られたプラスミドをpENT-ADCと命名した。【００８９】
pENT-CTFAの作製
ctfA遺伝子のエントリークローン（pENT-CTFA）を以下のように作製した。【００９０】
先ず、以下の条件でPCRを行った。【００９１】
プライマー（50 pmol）：
ctfA-F；5’ATG AAC TCT AAA ATA ATT AGA TTT GAA AAT TTA AGG 3’ （配列番号２３）
ctfA-R；5’TTA TGC AGG CTC CTT TAC TAT ATA ATT TA 3’ （配列番号２４）
鋳型：上記ATCC824株のゲノムDNA（0.4μg）
反応液：1x Pfu Ultra II reaction buffer(Stratagene)；10 nmol dNTP；1μl Pfu Ultra II fusion HS DNA polymerase (Stratagene)；を含む50μl溶液
反応：95℃ 5分-(95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 2分)×30サイクル-72℃ 3分-4℃ストック
PCRで増幅した657bpの断片をNovagen社製Perfectly Blunt Cloning Kitを用いて同様にクローニングした。クローニングした配列をシークエンスしClostridium acetobutylicum ATCC824株のctfA遺伝子の塩基配列（CA-P0163）であることを確認した。こうして得られたプラスミドをpT7Blue-CTFAと命名した。【００９２】
次に、pT7Blue-CTFAを制限酵素BamHIとSalIで消化し、693bpの断片を切り出して、同様に制限酵素BamHIとSalIで消化したpDI626PGKベクターにライゲーションした。得られた配列をシークエンスし、目的とするプラスミドが作製されていることを確認した。こうして得られたプラスミドをpDI626PGK-CTFAと命名した。【００９３】
次に、得られたpDI626PGK-CTFAを鋳型にして、以下のプライマーを用いてPCRを行った。【００９４】
プライマー：
08-189-ctfA-attB4r-Fw；5’GGG GAC AAC TTT TCT ATA CAA AGT TGG CTT CAA GCT TAC ACA ACA CGG 3’ （配列番号２５）
08-189-ctfA-attB3r-Rv；5’GGG GAC AAC TTT ATT ATA CAA AGT TGT CAA GAA TTA CTC GTG AGT AAG G 3’ （配列番号２６）
得られた1823bpのPCR産物をgateway BP反応によりドナーベクターpDONR221 P4r-P3rに導入した。得られたクローンのシーケンスを行ない、インサートの全塩基配列に変異個所が無いことを確認した。こうして得られたプラスミドをpENT-CTFAと命名した。【００９５】
pENT-CTFBの作製
ctfB遺伝子のエントリークローン（pENT-CTFB）を以下のように作製した。【００９６】
先ず、以下の条件でPCRを行った。【００９７】
プライマー（50 pmol）：
ctfB-F；5’ATG ATT AAT GAT AAA AAC CTA GCG AAA G 3’ （配列番号２７）
ctfB-R；5’CTA AAC AGC CAT GGG TCT AAG TTC 3’ （配列番号２８）
鋳型：上記ATCC824株のゲノムDNA（0.4μg）
反応液：1x Pfu Ultra II reaction buffer(Stratagene)；10 nmol dNTP；1μl Pfu Ultra II fusion HS DNA polymerase (Stratagene)；を含む50μl溶液
反応：95℃ 5分-(95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 2分)×30サイクル-72℃ 3分-4℃ストック
PCRで増幅した666bpの断片をNovagen社製Perfectly Blunt Cloning Kitを用いてクローニングした。クローニングした配列をシークエンスし、Clostridium acetobutylicum ATCC824株のctfB遺伝子の塩基配列（CA-P0164）であることを確認した。こうして得られたプラスミドをpT7Blue-CTFBと命名した。【００９８】
次に、pT7Blue-CTFBを制限酵素BamHIとSalIで消化し、771bpの断片を切り出して、同様に制限酵素BamHIとSalIで消化したpDI626ベクターにライゲーションした。得られた配列をシークエンスし、目的とするプラスミドが作製されていることを確認した。こうして得られたプラスミドをpDI626-CTFB(+A)と命名した。【００９９】
次に、プライマー中の変異個所を修正するために以下のプライマーを用いて以下の条件でPCRを行った。【０１００】
プライマー（50 pmol）：
BamHI-ctfB-F；5’TAG TGG ATC CGA TGA TTA ATG ATA AAA ACC 3’ （配列番号２９）
pDI626MCS-seqF；5’CCT AGA CTT CAG GTT GTC TAA C 3’ （配列番号３０）
鋳型：pDI626-CTFB(+A)（1 ng）
反応液：1x Pfu Ultra II reaction buffer(Stratagene)；10 nmol dNTP；1μl Pfu Ultra II fusion HS DNA polymerase (Stratagene)；を含む50μl溶液
反応：95℃ 2分-(95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分)×20サイクル-72℃ 3分-4℃ストック
PCRの反応終了後、反応液をQIAGEN社製MinElute PCR purification kitを用いて精製後、制限酵素BamHIとSalIで消化した。アガロースゲル電気泳動を行ない、702bpの断片を切り出してQIAGEN社製MinElute Gel extraction kitを用いて精製した。制限酵素BamHIとSalIで消化したpDI626ベクターにライゲーションした。得られた配列をシークエンスし、変異個所が修正されていることを確認した。こうして得られたプラスミドをpDI626-CTFBと命名した。【０１０１】
次に、pDI626-CTFBを鋳型にして、以下のプライマーを用いてPCRを行った。【０１０２】
プライマー：
08-189-ctfB-attB3-Fw；5’GGG GAC AAC TTT GTA TAA TAA AGT TGG GCC GCA AAT TAA AGC CTT C 3’ （配列番号３１）
08-189-ctfB-attB2-Rv；5’GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTA CAG TTC GAG TTT ATC ATT ATC 3’ （配列番号３２）
得られた1737bpのPCR産物をgateway BP反応によりドナーベクターpDONR221 P3-P2に導入した。得られたクローンのシーケンスを行ない、インサートの全塩基配列に変異個所が無いことを確認した。こうして得られたプラスミドをpENT-CTFBと命名した。【０１０３】
pDEST626(2008)の作製
以下の条件でPCRを行った。【０１０４】
プライマー：
SacI-convA-F；5’TAG GGA GCT CAT CAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC TG 3’ （配列番号３３）
KpnI-convA-R；5’TTA AGG TAC CAT CAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC 3’ （配列番号３４）
鋳型：RfA（Invitrogen社製 Gateway Vector Conversion System）（0.5 ng）
プライマー（50 pmol）：
反応液：1x Pfu Ultra II reaction buffer(Stratagene)；10 nmol dNTP；1μl Pfu Ultra II fusion HS DNA polymerase (Stratagene)；を含む50μl溶液
反応：95℃ 2分-(95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分30秒)×20サイクル-72℃ 3分-4℃ストック
なお、鋳型としたRfAは、Gateway Vector Conversion SystemのReading Frame CassetteAである。PCRの反応終了後、反応液をQIAGEN社製MinElute PCR purification kitを用いて精製後、制限酵素SacIとKpnIで消化した。アガロースゲル電気泳動を行ない、1717bpの断片を切り出してQIAGEN社製MinElute Gel extraction kitを用いて精製後、制限酵素SacIとKpnIで消化したpDI626GAPベクター(APP. Env. Micro., 2009, 5536)にライゲーションした。得られた配列をシークエンスし、目的とするプラスミドが作製されていることを確認した。こうして得られたプラスミドをpDEST626(2008)と命名した。【０１０５】
pEXP(Ura)-ADC-CTFA-CTFBの作製 
上述のように得られた3つのエントリークローン（pENT-ADC、pENT-CTFA及びpENT-CTFB）をGateway LR反応により発現ベクターpDEST626(2008)に組み込んだ。得られたクローンについて、PCRでインサートサイズの確認を行ない、正しく組換えが行なわれたことを確認した。シークエンスを行ない、配列にエラーの無いことを確認した。こうして得られたプラスミドをpEXP(Ura)-ADC-CTFA-CTFBと命名した。【０１０６】
＜pDI626PGK-T-iPDHの作製＞
pCR2.1-iPDHの作製
先ず、GenBankに登録されているClostridium beijerinckii NRRL B593由来のpdh遺伝子の塩基配列を元にし、この塩基配列に含まれているSaccharomyces cerevisiaeにおけるレアコドンを出現頻度が高いコドンとするように設計した。また、本実施例では設計した塩基配列からなる核酸断片を合成した（配列番号３５）。また、合成したpdh遺伝子の上流非翻訳領域にGGGGTTTCCGCGGTCTAGAGCCACC（配列番号３６）、下流非翻訳領域にGGATCCGTCGACGGGG（配列番号３７）の合成DNA配列を付与した。このプラスミドをpCR2.1-iPDHと命名した。【０１０７】
pDI626PGK-T-iPDHの作製
次に、pCR2.1-iPDHを制限酵素SacIIとSalIで消化し、1080bpの断片を切り出して、同様に制限酵素SacIIとSalIで消化した上記pDI626PGK-Tベクターにライゲーションした。得られた配列をシークエンスし、目的とするプラスミドが作製されていることを確認した。こうして得られたプラスミドをpDI626PGK-T-iPDHと命名した。pDI626PGK-T-iPDHは、Saccharomyces cerevisiae YPH499において最適に発現するようにコドンが設計された、Clostridium beijerinckii NRRL B593株由来のpdh遺伝子をSaccharomyces cerevisiae YPH499の染色体上に導入するベクターである。なお、このpdh遺伝子は、PGKプロモーターにより発現制御され、恒常的に発現する。【０１０８】
＜形質転換１＞
本実施例では、先ず、上述のように構築されたpEXP(Ura)-ADC-CTFA-CTFBを制限酵素  AatII及びBssHIIで切断して線状化し、エタノール沈殿後、0.1×TE Bufferに溶解し、Frozen EZ yeast transformation kit（Zymoresearch社製）を用いてSaccharomyces cerevisiae YPH499（Stratagene社製）を形質転換した。得られたクローンをコロニーPCRし、25クローンでadc遺伝子、ctfA遺伝子及びctfB遺伝子が導入されていることを確認した。また、得られたクローンにおけるアセトン生産量を測定し、アセトン生産量が最も多い株を＃3-17と命名した。【０１０９】
＜形質転換２＞
本実施例では、次に、上述のように構築されたpDI626PGK-T-iPDHを制限酵素AatII及びBssHIIで切断して線状化し、エタノール沈殿後、0.1×TE Buffer に溶解、Frozen EZ yeast transformation kit (Zymoresearch社製)を用いてアセトン高生産酵母＃3-17を形質転換した。得られた14クローンをコロニーPCRし、13クローンでpdh遺伝子が導入されていることを確認した。得られたクローンにおけるイソプロパノール生産量を測定し、イソプロパノール生産量が最も多い株を＃15-10と命名した。【０１１０】
＜形質転換３＞
本実施例では、次に、上述のように構築されたpESCpgkgap-HIS-ERG10（0.5μg）を用いて、＃15-10を形質転換した。形質転換法は、上記と同様に、Frozen EZ yeast transformation kit（Zymoresearch社製）の方法に従った。形質転換処理の後にSD（-URA-TRP-HIS）培地に塗布し、5日間30℃で培養した後、現れたコロニーを継代した。PCRでERG10遺伝子が導入されていることを確認後、得られた株をERG10/＃15-10株と命名した。 
また、同様に、上述のように構築されたpESCpgkgap-HIS-ORFn（0.5μg）を用いて、＃15-10を形質転換した。PCRでORFn遺伝子が導入されていることを確認後、得られた株をORFn/＃15-10株と命名した。【０１１１】
＜イソプロパノール生産性試験＞
上述した形質転換３において作製した組換え酵母（ERG10/＃15-10株及びORFn/＃15-10株）について、イソプロパノールの生産性を評価した。具体的には、先ず、3ｍｌの培地の入ったガラス製ディスポーザブル試験管（16×100mm、ASAHI TECHNO GLASS社製）にグリセロールストックより解凍した組換え酵母溶液30μｌを植菌した。30℃、130ストローク/min（高崎２段振盪培養機TXY-16R-2FL型）で66時間試験管を振盪し、前培養液を作製した。次に、100ｍｌの培地を含む300ｍｌの三角フラスコに1ｍｌの前培養液を植菌し、オリエンタル技研二段式培養機（IFM-I I-S型）で、30℃、130rpmで240時間回転培養した。本培養開始後、24H、48H、72H、96H、168H、240Hで、O.D.600nmを測定し、サンプリングを行なった。【０１１２】
培養液3ｍｌを、スクリューキャップ付試験管（TST SCR 16-100；16×100mm ASAHI TECHNO GLASS社製）に入れ、室温で5分、1000ｇで遠心分離(TOMY LC-230型)した。上澄液2ｍlを、20ｍl容量のHSSバイアルに入れ、締結した後、60℃、15分熱処理をおこなった。その後HSS-GC/MS分析によりアセトン、イソプロパノールを分析した。予め濃度既知の標準液を調製し検量線を引くことで、サンプルの濃度を定量した。HSS-GC/MSの分析条件を以下に示す。【０１１３】
ヘッドスペースサンプラー分析条件
ヘッドスペースサンプラー：HP7694(Hewlett-Packard)
Zone Temp.
Oven；60℃
Loop；150℃
TR.LINE；200℃
Event Time：
GC CYCLE TIME；35min
Vial EQ TIME；15min
PRESSURIZ. TIME；0.50min
Loop Fill TIME；0.2min
Loop EQ TIME；0.2min
INJECT TIME；1.00min
Vial Prameter
SHAKE；HIGH
その他
バイアル加圧；15psi
ループサイズ；3ml
GC-MS分析条件
GC/MS：HP6890/5973 GC/MSシステム(Hewlett-Packard)
使用カラム：J&W DB-624 (0.32mm x 60m、フィルム厚1.8μm)
インレット温度：260℃
検出器温度：260℃
インジェクションパラメーター：
スプリット比；1/20
キャリヤーガス；ヘリウム 1.0ml/分
オーブン加熱条件；40℃で5分→5℃/分で75℃まで加熱→100℃/分で260℃まで加熱→260℃で16 分
＜測定結果＞
上述した形質転換２で作製した＃15-10株、上述した形質転換３で作製したERG10/＃15-10株及びORFn/＃15-10株について、イソプロパノール生産量を経時的に測定した結果を図１に示す。図１において、下向きの三角は＃15-10株、上向きの三角はERG10/＃15-10株、黒丸はORFn/＃15-10株を示す。また、本培養開始後、96時間におけるイソプロパノール生産量を比較した結果を表１に示す。
【表１】
0005630501.tif 000002
【０１１４】
図１及び表１から判るように、アセトアセチルCoAからイソプロパノールを合成する代謝経路に関連するイソプロパノール生合成関連遺伝子群が導入された組換え酵母に対して、更にアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子を導入した組換え酵母によれば、イソプロパノールの生産性を大幅に向上できることが明らかとなった。特に、マロニルCoAとアセチルCoAとからアセトアセチルCoAを合成する活性を有する酵素をコードするアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子を導入した場合には、二分子のアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する活性を有する酵素をコードするアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子（チオラーゼ）を導入した場合と比較すると、イソプロパノールの生産性が飛躍的に向上していた。これは、宿主として使用した酵母が、本来的に脂質合成能を有しており、この脂質合成経路に利用するマロニルCoAを本来的に十分有しているためと考えられた。したがって、この結果から、特に脂質合成能に優れた酵母に対して、マロニルCoAとアセチルCoAとからアセトアセチルCoAを合成する活性を有する酵素をコードするアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子とアセトアセチルCoAからイソプロパノールを合成する代謝経路に関連するイソプロパノール生合成関連遺伝子群とを導入することで、より優れたイソプロパノール生産性を有する組換え酵母を作製できることがわかった。【０１１５】
〔参考例１〕
本参考例では、宿主として大腸菌を使用し、アセトアセチルCoAからイソプロパノールを合成する代謝経路に関連するイソプロパノール生合成関連遺伝子群が導入された組換え大腸菌に対して、更にアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子を導入した組換え大腸菌を作製し、イソプロパノール生産性を評価した。【０１１６】
＜Clostridium acetobutylicum のゲノムDNAの調製＞
Clostridium acetobutylicum ATCC(824)株を常法に従い３mlのDifco社製クロストリジウム強化培地で30℃、２日間嫌気培養した。QIAGEN社製ゲノムDNA調製キット（Gentra Puregene Yeast/Bact.kit）を用いて培養液１.５mlからゲノムDNAを調製した。【０１１７】
＜pT7Blue-CAC2873の作製＞
Clostridium acetobutylicum由来のチオラーゼ遺伝子であるthiA遺伝子を以下のようにクローニングした。先ず、以下のプライマーを用いてPCRを行った。【０１１８】
CAC2873-F：5’-ATG AAA GAA GTT GTA ATA GCT AGT GCA G-3’（配列番号３８）
CAC2873-R：5’-CTA GCA CTT TTC TAG CAA TAT TGC TG-3’（配列番号３９）
PCRにおいて鋳型としては上記で調製したClostridium acetobutylicum ATCC(824)株のゲノムDNAを0.1μg使用した。また、上記一対のプライマーは50pmolとした。反応液組成は1x Pfu Ultra II reaction buffer(Stratagene)中に10nmolのdNTP及び1μlのPfu Ultra II fusion HS DNA polymerase (Stratagene)を含む50μl溶液とした。PCRのサーマルサイクルは、95℃で5分の後、95℃で30秒、60℃で30秒及び72℃で3分を1サイクルとして30サイクル行い、その後72℃で3分とした。また反応終了後は4℃でストックした。【０１１９】
PCRで増幅した約1.2kbの断片をNovagen社製Perfectly Blunt Cloning Kitを用いてpT7-Blueベクターにブラントエンドクローニングした。クローニングした配列をシークエンスし、Clostridium acetobutylicum ATCC(824)株のthiA遺伝子であることを確認した。こうして得られたプラスミドをpT7Blue-CAC2873と命名した。【０１２０】
＜pCDFDuet-thiAの作製＞
大腸菌において上記thiA遺伝子を発現するための発現ベクターを以下のように構築した。先ず、以下のプライマーを用いてPCRを行った。【０１２１】
acat-NdeI-F：5’-AAA CAT ATG AAA GAA GTT GTA ATA GC-3’（配列番号４０）
acat-XhoI-R：5’-AAA CTC GAG CTA GCA CTT TTC TAG CAA T-3’（配列番号４１）
PCRにおいて鋳型としては上記で調製したpT7Blue-CAC2873を使用した。また、上記一対のプライマーは10pmolとした。反応液組成は1xPfu UltraTMII reaction buffer (Stratagene)中に12.5 nmolのdNTP及び1μlのPfu UltraTMII fusion HS DNA polymerase (Stratagene)を含む50μl溶液とした。PCRのサーマルサイクルは、95℃で2分の後、95℃で20秒、43℃で20秒及び72℃で40秒を1サイクルといして5サイクル行い、その後、95℃で20秒、50℃で20秒及び72℃で40秒を1サイクルとして30サイクル行い、その後72℃で3分とした。また反応終了後は4℃でストックした。【０１２２】
PCRで増幅した約1.2bpのDNA断片をMinElute PCR Purification Kitで精製し、Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kitキットを用い、pCR-Blunt II-Topoベクターにクローニングした。得られたベクターをpCR-Blunt II-TOPO-thiAと命名した。pCR-Blunt II-TOPO-thiAをNdeIとXhoIで切断し、アガロースゲル電気泳動で約1.2KbpのDNA断片を精製し、pCDF-Duet（Novagen社製）のNdeI-XhoI部位に挿入した。得られたプラスミドをpCDFDuet-thiAとした。【０１２３】
＜pCDFDuet-orfNの作製＞
Clostridium acetobutylicum由来であり、マロニルCoAとアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成するアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子を以下のようにクローニングした。先ず、以下のプライマーを用いてPCRを行った。【０１２４】
OrfN-NdeI-F：5’-AAA CAT ATG ACC GAC GTC CGA TTC CGC AT 3’（配列番号４２）
OrfN-XhoI-R：5’-AAA CTC GAG TTA CCA CTC GAT CAG GGC GA 3’（配列番号４３）
PCRにおいて鋳型としてはpHISORFnを20ng使用した。pHISORFnは、特開2008-61506号公報に記載のものを使用した。また、上記一対のプライマーは15 pmolとした。反応液組成は1x PrimeSTAR GC Buffer(Mg2+plus) (タカラバイオ社製)中に10nmolのdNTP及び0.5μlのPrimeSTAR HS DNA Polymerase (タカラバイオ社製)を含む50μl溶液とした。PCRのサーマルサイクルは、94℃で1分の後、98℃で10秒、53℃で5秒及び72℃で1分を1サイクルとして5サイクル行い、その後、98℃で10秒、60℃で5秒、72℃で1分を1サイクルとして30サイクル行い、その後72℃で5分とした。また反応終了後は4℃でストックした。【０１２５】
PCRで増幅した約1KbpのDNA断片をMinElute PCR Purification Kitで精製し、Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kitキットを用い、pCR-Blunt II-Topoベクターにクローニングした。得られたベクターをpCR-Blunt II-TOPO-orfNと命名した。pCR-Blunt II-TOPO-orfNをNdeIとXhoIで切断し、アガロースゲル電気泳動で約1KbpのDNA断片を精製し、pCDF-Duet（Novagen社製）のNdeI-XhoI部位に挿入した。得られたプラスミドをpCDFDuet-orfNとした。【０１２６】
＜pETDuet-ctfABの構築＞
Clostridium acetobutylicum由来のアセトアセチルCoA転移酵素遺伝子であるctfA遺伝子及びctfB遺伝子をクローニングした。先ず、上述のように調整したゲノムDNAをテンプレートにして以下に示すPCRを行った。PCRではPfuUltra II fusion HS DNA polymerase（STRATAGEN社製）及び以下のプライマー（下線部は制限酵素サイト）を使用した。【０１２７】
ctfAB-NdeI-F：5’-ATT CAT ATG AAC TCT AAA ATA ATT AGA TTT GAA AAT TTA AGG TC-3’ （配列番号４４）
ctfAB-NdeI-R：5’-AGA CTC GAG CTA AAC AGC CAT GGG TCT AAG-3’ （配列番号４５）
PCRにおける反応液の組成は、下記の通りとした。
【表２】
0005630501.tif 000003
【０１２８】
PCRのサーマルサイクルは、95℃で2分の後、95℃で30秒、54.8℃で30秒及び72℃で2分を1サイクルとして30サイクル行い、その後72℃で7分とした。また反応終了後は4℃でストックした。【０１２９】
上記の条件でPCR（eppendruf社製）を行い、0.8％アガロースゲル電気泳動で1324bpの断片を切り出した。QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)を用いて切り出した断片を精製し、NdeI及びXhoIで消化した。さらにQIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN社製)で精製した後、pETDuet-1(メルク社製)のNdeI、XhoIサイトに挿入した。得られた配列をシークエンスし、目的とされるプラスミドが作製されていることを確認した。こうして得られたプラスミドをpETDuet-ctfABと命名した。【０１３０】
＜pETDuet-ADCの構築＞
Clostridium acetobutylicum由来のアセト酢酸脱炭酸酵素遺伝子であるadc遺伝子をクローニングした。先ず、上述のように調整したゲノムDNAをテンプレートにして以下に示すPCRを行った。PCRではPfuUltra II fusion HS DNA polymerase（STRATAGEN社製）及び以下のプライマー（下線部は制限酵素サイト）を使用した。【０１３１】
adc-SalI-F：5’-CAC GTC GAC AAG GAG ATA TAA TGT TAA AGG ATG AAG TAA TTA AAC A-3’（配列番号４６）
adc-NotI-R：5’-CAC GCG GCC GCT TAC TTA AGA TAA TCA TAT ATA ACT TCA GC-3’（配列番号４７）
PCRにおける反応液の組成は、下記の通りとした。
【表３】
0005630501.tif 000004
【０１３２】
PCRのサーマルサイクルは、95℃で2分の後、95℃で20秒、54.8℃で20秒及び72℃で3分を1サイクルとして30サイクル行い、その後72℃で3分とした。また反応終了後は13℃でストックした。【０１３３】
上記の条件でPCR（eppendruf社製）を行い、1％アガロースゲル電気泳動で735bpの断片を切り出した。QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)を用いて切り出した断片を精製し、SalI及びNotIで消化した。さらに、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN社製)で精製した後、pETDuet-1(メルク社製)のSalI、NotIサイトに挿入した。得られた配列をシークエンスし、目的とされるプラスミドが作製されていることを確認した。こうして得られたプラスミドをpETDuet-ADCと命名した。【０１３４】
＜pETDuet-ADC-ctfABの構築＞
大腸菌において上記ctfA遺伝子、ctfB遺伝子及びadc遺伝子を発現するための発現ベクターを以下のように構築した。先ず、上記で作製したpETDuet-ADCをSalI及びNotIで消化し、0.8％アガロースゲル電気泳動でadc遺伝子を含む753bpの断片を切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)を用いて精製した。また、上記で作製したpETDuet-ctfABをSalI及びNotIで消化し、得られた6677bpと上記断片をライゲーションした。得られたベクターをpETDuet-ADC-ctfABと命名した。【０１３５】
＜pCOLADuet-PDHの構築＞
Clostridium beijerinckii由来のイソプロパノール脱水素酵素遺伝子であるpdh遺伝子をクローニングした。先ず、上述の実施例１で作製したpCR2.1-iPDHを鋳型に用いて以下に示すPCRを行った。PCRではPfuUltra II fusion HS DNA polymerase（STRATAGEN社製）及び以下のプライマー（下線部は制限酵素サイト）を使用した。【０１３６】
PDH-EcoRI-F：5’- GGA ATT CCA TGA AAG GTT TCG CAA TGT T-3’ （配列番号４８）
PDH-PstI-R：5’- AAC TGC AGA ACC AAT GCA TTG GTT ACA AAA TGA CTA CGG -3’ （配列番号４９）
PCRにおける反応液の組成は、下記の通りとした。
【表４】
0005630501.tif 000005
【０１３７】
PCRのサーマルサイクルは、95℃で2分の後、95℃で30秒、50℃で30秒及び72℃で2分を1サイクルとして30サイクル行い、その後72℃で7分とした。また反応終了後は4℃でストックした。【０１３８】
上記の条件でPCR（eppendruf社製）を行い、0.8％アガロースゲル電気泳動で1056bpの断片を切り出した。MiniElute Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)を用いて切り出した断片を精製し、EcoRI及びPstIで消化した。QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN社製)で精製した後、pCOLADuet-1(メルク社製)のEcoRI、PstIサイトに挿入した。得られた配列をシークエンスし目的とされるプラスミドが作製されていることを確認した。こうして得られたプラスミドをpCOLADuet-PDHと命名した。【０１３９】
＜組換え大腸菌作製＞
上記で作製したpCDFDuet-thiA、pCDFDuet-orfN、pETDuet-ADC-ctfAB、pCOLADuet-PDHを下記表５に示すA〜Fの組み合わせで、タカラバイオ社製大腸菌BL21（DE3）大腸菌K株に分類される大腸菌NovaBlue（DE3)を形質転換した。Ａ〜Ｆの発現ベクターの組み合わせを大腸菌BL21（DE3）に形質転換した組み換え大腸菌を、それぞれＡ/BL21、Ｂ/BL21、Ｃ/BL21、Ｄ/BL21、Ｅ/BL21、Ｆ/BL21と命名した。Ａ〜Ｆの発現ベクターの組み合わせを大腸菌NovaBlue（DE3）に形質転換した組み換え大腸菌を、それぞれＡ/NB、Ｂ/NB、Ｃ/NB、Ｄ/NB、Ｅ/NB、Ｆ/NBと命名した。
【表５】
0005630501.tif 000006
【０１４０】
得られた組み換え大腸菌を培養するに際して、先ず下記組成のトレースエレメントを調整した。
【表６】
0005630501.tif 000007
【０１４１】
また、培地としてSD-7培地を以下のように調整した。NH4Cl7.0g、KH2PO41.5g、Na2HPO41.5g、K2SO40.35g、MgSO4・7H2O0.17g、Difco社製酵母エキス5.0g、トレースエレメント0.8mlを0.8Lの脱イオン水に溶解した後、5M NH4OHでpH7.0に調整した。脱イオン水で全量を1Lにしオートクレーブ滅菌した。【０１４２】
さらに、培地としてSD-8培地を以下のように調整した。NH4Cl7.0g、KH2PO47.5g、Na2HPO47.5g、K2SO40.85g、MgSO4・7H2O0.17g、Difco社製酵母エキス10.0g、トレースエレメント0.8mlを1Lの脱イオン水に溶解した後、オートクレーブ滅菌した。【０１４３】
さらに、上述した各組み換え大腸菌をSD-7培地或いはSD-8培地で培養する際には、必要に応じて下記表に示す抗生物質を添加した。なお、表中、Amp：アンピシリン、Km：カナマイシン（SIGMA社製）、Str：ストレプトマイシン及びTet：テトラサイクリンを意味する。
【表７】
0005630501.tif 000008
【０１４４】
得られた組み換え大腸菌それぞれについて、最終濃度2％のグルコース（和光純薬社製）を含む5ｍｌのSD-7培地に単一コロニーを植菌し、37℃で一晩培養した。次に、最終濃度2％のグルコースを含む50ｍｌのSD-8培地を500ｍｌのバッフル付三角フラスコに入れ、一晩培養した培養液500μｌを植菌し、37℃、130rpmで培養を行った。O.D600が1.0以下のところで、最終濃度0.1ｍＭのIPTGを添加し、さらに培養を続けた。IPTG添加後、0、3、6、9、24、30時間後に培養液5ｍｌをスクリューキャップ付試験管に分注し、-30℃で保存した（一部、48時間後も実施）。なお、IPTG添加後24時間目に最終濃度が2％になるようにGlucoseを追添加した。【０１４５】
その後、-30℃で凍結保存した培養液を室温で解凍した。Vortexでよく攪拌した後、予め重量を測定しておいたエッペンドルフチューブに培養液１mlを入れ、冷却小型遠心機（TOMY社製）を用いて、13000rpm、10分、4℃で遠心分離した。上清を除去したエッペンドルフチューブをSpeed Vac（SAVANT社製）を用いて、温度：Lowで約4時間乾燥させた。その後、エッペンドルフチューブの重量を測定し、あらかじめ測定しておいた重量を引いた値を、乾燥菌体重量とした。【０１４６】
残りの培養液（4ml）が入ったスクリューキャップ付試験管を、卓上多本架遠心機LC-230（TOMY社製）を用いて、1000g、5分、室温にて遠心分離し、上清と菌体に分離した。上清2mlを20ｍｌヘッドスペース用クリンプバイアルビンに入れ、キャップをして、60℃の温浴中に15分入れた。その後、GC-MS/HSSにて、イソプロパノール等について成分分析を行った。【０１４７】
GC-MS/HSSは、HP6890/5973/7694 GC-MS/HSSシステム(Hewlett-Packard社製)を用いた。使用カラムはJ&W DB-624 (0.32mm×60m、フィルム厚1.8μm)であり、分析条件は以下の通りとした。【０１４８】
＜GC-MS分析条件＞
[インレットパラメーター] 
インレット温度：260℃
スプリット比：1/20
キャリヤーガス：ヘリウム 1.0ml/分
[オーブン加熱条件] 
40℃で5分加熱
5℃/分で75℃まで加熱
100℃/分で260℃まで加熱
[ディテクター条件]
検出器温度：260℃
＜ヘッドスペースサンプラー条件＞
[Zoom Temp] 
Oven：60℃
Loop：150℃
Transfer Line：200℃
[Event Time]
GC Cycle Time：35分
Vial EQ Time：15分
Pressuriz. Time：0.5分
Loop Fill Time：0.2分
Loop EQ Time：0.2分
Inject Time：1.0分
[Vial Parameter]
Shake：HIGH
[その他]
バイアル加圧：15psi
＜標準物質＞
エタノール（比重：0.789）
アセトン（比重：0.789）
イソプロパノール（比重：0.784）
酢酸（比重：1.05）
上記標準物質を適当な濃度に調整し、検量線から％濃度（V/V)を算出し、さらに比重を考慮して重量濃度を計算した。本参考例で作製した組換え大腸菌のアセトン及びイソプロパノールの生産量を下記表にまとめた。
【表８】
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【０１４９】
この結果から、ctfAB遺伝子及びadc遺伝子に加えて、pdh遺伝子を導入した組換え大腸菌では、アセトンの生産量が低下するとともにイソプロパノール生産量が向上している事が判る。また、ctfAB遺伝子、adc遺伝子及びpdh遺伝子を導入した組換え大腸菌に対して、アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子を更に導入した組換え大腸菌では、イソプロパノール生産量が飛躍的に向上していることが判る。しかしながら、アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子のなかでも、マロニルCoA及びアセチルCoAを基質とする酵素をコードする遺伝子は、二分子のアセチルCoA合成を基質とする酵素をコードする遺伝子と比較すると、イソプロパノール生産性を向上させる効果が低いことが判った。一方、実施例１では、マロニルCoA及びアセチルCoAを基質とする酵素をコードするアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子を利用した方がイソプロパノールの生産性をより顕著に向上できることを示した。すなわち、実施例１で示したこの結果は、アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子とイソプロパノール生合成関連遺伝子群とを導入した組換え大腸菌から得られた知見から予測できない結果であると言える。
【図１】
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【配列表】
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