(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アリールマロン酸エステルを原料にして、α-アリールプロピオン酸である光学活性カルボン酸を製造する方法であって、アリールマロン酸エステルにSulfolobus tokodaii strain7由来エステラーゼを作用させ、１段階のドミノ反応により、α-アリールプロピオン酸である光学活性カルボン酸を製造する方法。
【請求項２】
Sulfolobus tokodaii strain7由来エステラーゼが以下の(a)又は(b)のエステラーゼである、請求項１記載の１段階のドミノ反応により、α-アリールプロピオン酸である光学活性カルボン酸を製造する方法：
(a) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるエステラーゼ
(b) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるエステラーゼ。
【請求項３】
原料となるアリールマロン酸エステルが、2-メチル-2-フェニルマロン酸ジエステル又は2-メチル-2-ベンジルマロン酸ジエステルであり、得られるα-アリールプロピオン酸である光学活性カルボン酸が、2-フェニルプロピオン酸又は2-ベンジルプロピオン酸である、請求項１又は２に記載のα-アリールプロピオン酸である光学活性カルボン酸を製造する方法。
【請求項４】
アリールマロン酸エステルとSulfolobus tokodaii strain 7由来エステラーゼの反応が室温〜80℃で行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のα-アリールプロピオン酸である光学活性カルボン酸を製造する方法。
【請求項５】
Sulfolobus tokodaii strain 7由来エステラーゼを有効成分として含む、エナンチオ選択性をもったドミノ型反応を触媒し、原料基質であるアリールマロン酸エステルから１段階で、α-アリールプロピオン酸である光学活性カルボン酸を生成する、光学活性カルボン酸製造用触媒組成物。
【請求項６】
Sulfolobus tokodaii strain7由来エステラーゼが以下の(a)又は(b)のエステラーゼである、請求項５記載の光学活性カルボン酸製造用触媒組成物：
(a) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるエステラーゼ
(b) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるエステラーゼ。
【請求項７】
アリールマロン酸エステルにSulfolobus tokodaii strain 7由来エステラーゼを作用させることを含む、アリールマロン酸エステルを原料にして立体選択性加水分解により、下記化学式IIで示される光学活性なマロン酸ハーフエステルを製造する方法であって、得られるマロン酸ハーフエステルの絶対立体配置がブタ肝臓エステラーゼ（PLE）を用いて得られるマロン酸ハーフエステルと逆である、光学活性なマロン酸ハーフエステルを製造する方法。
【化１】
0005506658.tif 000045
[R1及びR2はそれぞれ相互に異なり、フェニル基で置換された又は無置換のアルキル基、炭素数１〜５のアルキル基で置換された又は無置換のアリール基を表し、R3及びR4は独立にH又は炭素数１〜５のアルキル基を表す。]
【請求項８】
Sulfolobus tokodaii strain7由来エステラーゼが以下の(a)又は(b)のエステラーゼである、請求項７記載の光学活性なマロン酸ハーフエステルを製造する方法：
(a) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるエステラーゼ
(b) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるエステラーゼ。
【請求項９】
アリールマロン酸エステルとSulfolobus tokodaii strain 7由来エステラーゼの反応が室温で行われる、請求項７又は８に記載の光学活性なマロン酸ハーフエステルを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬、農薬等の中間原料として用いられる光学活性なカルボン酸の製造方法に関し、詳細には、好熱性古細菌由来エステラーゼにより触媒されるドミノ反応を利用して、１段階で光学活性なカルボン酸を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
加水分解を触媒する酵素は、多くの種類がある。その中でもエステル結合に作用するリパーゼとエステラーゼ、アミド結合に作用するプロテアーゼやアミダーゼなどが最も多く研究されている。加水分解酵素を用いた物質変換に関する研究は、４０年ほど前から始まり、ステロイド系化合物の加水分解反応を触媒するエステラーゼの研究等がなされてきた。また現在では、加水分解酵素は洗剤や食品加工など工業的に多く利用されている。そのなかでも熱安定性が高い酵素は、高温条件下や有機溶媒中でも高い安定性を示すため、工業的に利用されやすい。
このような熱安定酵素の格好のスクリーニング対象として、近年、古細菌（ａｒｃｈａｅａ）が注目されている。古細菌は、真正細菌（ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ）、真核生物（ｅｕｋａｒｙｏｔｅ）と並んで第３の生物群であり、高温、高圧、低ｐＨや高塩濃度のような極限環境下で生育することが知られている。このように古細菌は、熱安定性という特徴を活かしたバイオテクノロジーへの応用等の視点から、重要性が高まってきている。
生体触媒を用いた研究では、光学活性体の合成が主流となってきている。これは酵素自体が、光学活性アミノ酸からなる不斉環境をもつためである。光学活性体の合成研究のなかでも、基質にプロキラルな化合物を用いる場合が多い。プロキラルな化合物とは、一段階の反応をさせると不斉炭素をもつキラル化合物になることのできる化合物のことを指す（図１）。すなわち、収率１００％で光学的に純粋な化合物を得ることができるため、効率の良い反応といえる。
例えば、図１に示す化合物１のような化合物を用いた反応の研究は、多く報告されており、例えばブタ肝臓エステラーゼ（以下ＰＬＥ）を用いたジカルボン酸エステルの不斉加水分解が報告されている（非特許文献１を参照）。
基質がプロキラルなジカルボン酸エステルの場合、等価なエステルのうち一方が選択的に加水分解されることで光学活性体を得ることができる。さらにプロキラルな基質を用いた反応は光学分割法とは異なり、理論上では１００％の収率で１００％の鏡像体過剰率で光学活性体を得ることができるため、非常に効率の良い反応である。
例えば、二置換マロン酸エステルの立体選択的加水分解は、理論的には収率１００％で光学的に純粋なマロン酸ハーフエステルを得ることができる有用な反応である。上記のＰＬＥ（豚肝臓エステラーゼ）を用いた例は、多く報告されているがそのほかの酵素については報告例がなく、得られる立体配置も１種類に限定されていた。また、ＰＬＥは熱的にはあまり安定ではなく、反応速度の向上が期待できる高温では用いることができなかった。
化合物によっては、そのエナンチオマーによって異なる生理活性を示すことが分かったため、光学活性体が重要視されるようになった。単一エナンチオマーを製造する技術の重要性は増すとともに、一方のエナンチオマーのみを医薬品とする割合は飛躍的に伸びている。また医薬品に限らず、農薬、食品や香料、最近では生理活性とは関係ない液晶など幅広い分野で光学活性体が用いられている。
医薬品としても光学活性体として、例えば図２に示す、フルルビプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン等が知られている。これらの光学活性α−アリールプロピオン酸は、非ステロイド性抗炎症薬であり、Ｓ体のエナンチオマーに有用な生理活性があることが知られている。したがって、光学活性なα−アリールプロピオン酸の一方のエナンチオマーのみを効率良く合成することが求められている。
ドミノ型反応とは、１つの反応溶液内で複数の反応が連続して起こる反応をいう。ドミノ型反応の特徴は、素反応の収率が高い場合には反応の中間体の抽出や精製の手間が省けるため効率よく生成物が得られるということである。また、この手法は有機合成等でシンプルな化合物から複雑な化合物を合成する際に利用されている（非特許文献２を参照）。
以上より、このようなドミノ型反応を生体触媒によって行うことは、合成方法がより単純に効率よくなり、かつ環境に低負荷で行える利点がある。しかし、現在までに１種類の酵素を用いたドミノ型反応は報告例がない。
【非特許文献１】Ｃ．Ｊ．Ｓｉｈ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９７５，９７，４１４４
【非特許文献２】Ｄ．Ｅｎｄｅｒｓ，Ｃ．Ｇｒｏｎｄａｌ，Ｍ．Ｒ．Ｍ．Ｈｕｔｔｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２００７，４６，１５７０−１５８１
【発明の開示】
【０００３】
本研究はエステラーゼＳＴ００７１を触媒として加水分解反応と脱炭酸反応の新規ドミノ型反応を実現させ、光学活性なα−アリールアルカン酸等のカルボン酸の生成を目的とする。
本発明者らは、好熱好酸性古細菌Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ  ｓｔｒａｉｎ  ７のゲノム配列から、既知のエステラーゼと相同性の高いエステラーゼＳＴ００７１のクローニングを行い、発現した酵素が目的通りエステラーゼ活性を持つことを明らかにした（Ｙ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｈ．Ｏｈｔａ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２００４，２３６，９７−１０２）。エステラーゼＳＴ００７１は、至適反応温度が７０℃及び至適ｐＨが７．５〜８．０という高い熱安定性を有することが分かった。さらに相同性検索からエステラーゼＳＴ００７１は、Ｘ線結晶構造が解かれている熱安定エステラーゼと近縁であることが確認された。しかし、まだ本酵素のＸ線構造解析及び詳細な特徴は分かっていない。
そこで、本発明者らは、高い熱安定性を持ったエステラーゼＳＴ００７１を用いることで、本酵素の詳細な特性を明らかにするとともに、好熱性という性質を生かした物質生産プロセスの構築を目的とし鋭意検討を行った。
本発明者らは、単離精製した好熱性古細菌由来エステラーゼＳＴ００７１を触媒とした化学式１に示す新規ドミノ型反応をデザインした。
【化１】
0005506658.tif 000002
0005506658.tif 000003
すなわち基質には、プロキラルであり立体障害の大きいアリールマロン酸ジエチルエステルを選択した。この基質からエステラーゼＳＴ００７１を触媒として、まず加水分解反応によりハーフエステルを得た。このハーフエステルは、室温では安定であることが分かった。そこで、高温条件又は脱炭酸しやすい基質を用いることで、酵素の活性中心内で脱炭酸を行い、光学活性アリールプロピオン酸が得られることを見出した。
本発明の方法により、二置換マロン酸エステルの立体選択的加水分解を高い光学純度で行えることができ、さらに、得られる化合物の絶対立体配置は、ＰＬＥで得られるものと逆であった。さらに、反応を高温で行うことにより、加水分解に引き続き脱炭酸反応が進行した生成物を得ることにも成功し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］  ジカルボン酸エステルを原料にして光学活性カルボン酸を製造する方法であって、ジカルボン酸エステルにＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属微生物由来エステラーゼを作用させ、１段階のドミノ反応により、光学活性カルボン酸を製造する方法。
［２］  Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属微生物由来エステラーゼがＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ由来エステラーゼである、［１］の光学活性カルボン酸を製造する方法。
［４］  ジカルボン酸エステルを原料にして光学活性カルボン酸を製造する方法であって、ジカルボン酸エステルに以下の（ａ）又は（ｂ）のエステラーゼを作用させ、１段階のドミノ反応により、光学活性カルボン酸を製造する方法：
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるエステラーゼ
（ｂ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるエステラーゼ。
［４］  原料となるジカルボン酸エステルが下記化学式Ｉで示される化合物であり、
【化１】
0005506658.tif 000004
［式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ相互に異なり、置換された又は無置換のアルキル基；置換された又は無置換のアリール基若しくはアラルキル基；置換された又は無置換のシクロアルキル基、置換された又は無置換のアルケニル基、置換された又は無置換のアルキニル基、置換された又は無置換のアルコキシ基を表し、Ｒ３及びＲ４は独立にＨ又はアルキル基を表す。］
得られる光学活性カルボン酸が下記化学式ＩＩＩで示される化合物である、［１］〜［３］のいずれかの光学活性カルボン酸を製造する方法。
【化２】
0005506658.tif 000005
［式中Ｒ１及びＲ２は、上記化学式Ｉで表される化合物と同じである。］
［５］  原料となるジカルボン酸エステルが下記化学式Ｉで示される化合物であり、
【化３】
0005506658.tif 000006
［式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ相互に異なり、フェニル基で置換された又は無置換のアルキル基、炭素数１〜５のアルキル基で置換された又は無置換のアリール基を表し、Ｒ３及びＲ４は独立にＨ又は炭素数１〜５のアルキル基を表す。］
得られる光学活性カルボン酸が下記化学式ＩＩＩで示される化合物である、［５］の光学活性カルボン酸を製造する方法。
【化４】
0005506658.tif 000007
［式中Ｒ１及びＲ２は、上記化学式Ｉで表される化合物と同じである。］
［６］  原料となるジカルボン酸エステルがアリールカルボン酸エステルであり、得られる光学活性カルボン酸が、α−アリールアルカン酸である、［４］の光学活性カルボン酸を製造する方法。
［７］  原料となるジカルボン酸エステルがアリールマロン酸エステルであり、得られる光学活性カルボン酸が、α−アリールプロピオン酸である、［４］の光学活性カルボン酸を製造する方法。
［８］  原料となるジカルボン酸エステルが、２−メチル−２−フェニルマロン酸ジエステル又は２−メチル−２−ベンジルマロン酸ジエステルであり、得られる光学活性カルボン酸が、２−フェニルプロピオン酸又は２−ベンジルプロピオン酸である、［４］の光学活性カルボン酸を製造する方法。
［９］  ジカルボン酸エステルとＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属微生物由来エステラーゼの反応が室温〜８０℃で行われる、［１］〜［８］のいずれかの光学活性カルボン酸を製造する方法。
［１０］  Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属微生物由来エステラーゼを有効成分として含む、エナンチオ選択性をもったドミノ型反応を触媒し、原料基質であるジカルボン酸エステルから１段階で光学活性カルボン酸を生成する、光学活性カルボン酸製造用触媒組成物。
［１１］  Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属微生物由来エステラーゼがＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ由来エステラーゼである、［１０］の光学活性カルボン酸製造用組成物。
［１２］  以下の（ａ）又は（ｂ）のエステラーゼを有効成分として含む、エナンチオ選択性をもったドミノ型反応を触媒し、原料基質であるジカルボン酸エステルから１段階で光学活性カルボン酸を生成する、光学活性カルボン酸製造用触媒組成物：
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるエステラーゼ
（ｂ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるエステラーゼ。
［１３］  ジカルボン酸エステルにＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属微生物由来エステラーゼを作用させることを含む、ジカルボン酸エステルを原料にして立体選択性加水分解により、光学活性なマロン酸ハーフエステルを製造する方法であって、得られるマロン酸ハーフエステの絶対立体配置がブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）を用いて得られるマロン酸ハーフエステルと逆である、光学活性なマロン酸ハーフエステルを製造する方法。
［１４］  Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属微生物由来エステラーゼがＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ由来エステラーゼである、［１３］の光学活性なマロン酸ハーフエステルを製造する方法。
［１５］  ジカルボン酸エステルに以下の（ａ）又は（ｂ）のエステラーゼを作用させることを含む、ジカルボン酸エステルを原料にして立体選択性加水分解により、光学活性なマロン酸ハーフエステルを製造する方法であって、得られるマロン酸ハーフエステの絶対立体配置がブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）を用いて得られるマロン酸ハーフエステルと逆である、光学活性なマロン酸ハーフエステルを製造する方法：
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるエステラーゼ
（ｂ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるエステラーゼ。
［１６］  原料となるジカルボン酸エステルが下記化学式Ｉで示される化合物であり、
【化５】
0005506658.tif 000008
0005506658.tif 000009
［式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ相互に異なり、置換された又は無置換のアルキル基；置換された又は無置換のアリール基若しくはアラルキル基；置換された又は無置換のシクロアルキル基、置換された又は無置換のアルケニル基、置換された又は無置換のアルキニル基、置換された又は無置換のアルコキシ基を表し、Ｒ３及びＲ４は独立にＨ又はアルキル基を表す。］
得られる光学的に純粋なマロン酸ハーフエステルが下記化学式ＩＩで示される化合物である、［１３］〜［１５］のいずれかの光学活性なマロン酸ハーフエステルを製造する方法。
【化６】
0005506658.tif 000010
［式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、上記化学式Ｉで表される化合物と同じである。］
［１７］  ジカルボン酸エステルとＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属微生物由来エステラーゼの反応が室温で行われる、［１３］〜［１６］のいずれかの光学活性なマロン酸ハーフエステルを製造する方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００８−０４５０５５号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、プロキラルな化合物の例を示す図である。
図２は、光学活性な医薬品の例を示す図である。
図３は、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ  ｓｔｒａｉｎ  ７由来エステラーゼＳＴ００７１の基質の例を示す図である。
図４は、図３に示す基質よりＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ  ｓｔｒａｉｎ  ７由来エステラーゼＳＴ００７１による加水分解により生成するハーフエステルを示す図である。
図５は、酵素反応の手順を示す図である。
図６は、ブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）による生成物の絶対立体配置を示す図である。
図７は、２−メチル−２−フェニルマロン酸物エチルエステルのＨＰＬＣの分析結果を示す図である。
図８は、図３に示す基質よりＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ  ｓｔｒａｉｎ  ７由来エステラーゼＳＴ００７１による加水分解により生成したハーフエステルの収率、鏡像体過剰率を示す図である。
図９は、基質として２−メチル−２−（ｐ−ニトロフェニル）マロン酸ジエチルエステルを用いた反応のＴＬＣ分析結果を示す図である。
図１０は、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ  ｓｔｒａｉｎ  ７由来エステラーゼＳＴ００７１の基質の基本骨格を示す図である。
図１１は、加水分解反応に影響する置換基の電子効果を示す図である。
図１２は、２−メチル−２−フェニルマロン酸ジエチルエステルの構造を示す図である。
図１３は、２−メチル−２−ベンジルマロン酸ジエチルエステルの構造を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いられるエステラーゼは、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属微生物由来エステラーゼであり、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ由来エステラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ  ｓｔｒａｉｎ  ７由来エステラーゼが含まれる。Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ  ｓｔｒａｉｎ  ７由来エステラーゼＳＴ００７１は、好熱好酸性古細菌Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ  ｓｔｒａｉｎ  ７からＹ  Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２３６（２００４）９７−１０２の記載に従って得ることができる。該エステラーゼＳＴ００７１はＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ  ｓｔｒａｉｎ  ７を培養し、培養物から精製することができる。また、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ  ｓｔｒａｉｎ  ７より該酵素をコードする遺伝子を単離し、遺伝子工学的手法により製造することができる。Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ  ｓｔｒａｉｎ  ７はＪＣＭ（Ｊａｐａｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）より入手することができる（登録番号ＪＣＭ１０５４５）。該エステラーゼＳＴ００７１の塩基配列及びアミノ酸配列はＤＤＢＪ（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）に登録番号ＢＡＢ６５０２８．１で登録されている。その塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。
本発明のエステラーゼは、配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質がエステラーゼ活性を有する限り、当該アミノ酸配列において少なくとも１個、好ましくは１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。ここで、１若しくは数個とは、１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個をいう。
このような配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列として、配列番号２のアミノ酸配列と、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の同一性を有しているものが挙げられる。
このような配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質は配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同一である。
また、配列番号１に表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡと下記のストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであってエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡにコードされるエステラーゼも本発明のエステラーゼに含まれる。すなわち、ＤＮＡを固定したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣとは１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムからなる）を用い、６８℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。あるいは、サザンブロッティング法によりニトロセルロース膜上にＤＮＡを転写、固定後、ハイブリダイゼーション緩衝液〔５０％  フォルムアミド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１０×デンハルツ（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）溶液、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ〕中で４２℃で一晩反応させることによりハイブリッドを形成することができるＤＮＡである。Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ  ｓｔｒａｉｎ  ７由来エステラーゼＳＴ００７１等のＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属微生物由来エステラーゼは、プロキラルなジカルボン酸エステル（二置換マロン酸エステル）を基質とし、ジエステル部分のうちの一方のエステルを優先的に加水分解し、マロン酸ハーフエステル（モノエステル体）を生成する。該ハーフエステルは光学的に純粋で、高い収率で得ることができる。この反応により、光学活性体を得ることができる。
生成した光学活性なハーフエステルにさらにＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ  ｓｔｒａｉｎ  ７由来エステラーゼＳＴ００７１等のＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属微生物由来エステラーゼを作用させると、加水分解反応及び脱炭酸反応が生じ、光学活性であり、不斉炭素原子を有するキラルなモノカルボン酸が生成する。
すなわち、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ  ｓｔｒａｉｎ  ７由来エステラーゼＳＴ００７１等のＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属微生物由来エステラーゼは、エナンチオ選択性をもったドミノ型反応を触媒する。
上記反応の原料となる基質は以下の化学式Ｉで表されるジカルボン酸エステルである。
【化８】
0005506658.tif 000011
式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ相互に異なり、置換された又は無置換のアルキル基；置換された又は無置換のアリール基若しくはアラルキル基；置換された又は無置換のシクロアルキル基、置換された又は無置換のアルケニル基、置換された又は無置換のアルキニル基、置換された又は無置換のアルコキシ基を表す。
アルキル基としては、直鎖又は分子鎖のアルキル基が挙げられ、例えば炭素数１〜２０、好ましくは炭素数１〜１０、さらに好ましくは炭素数１〜５の直鎖又は分子鎖のアルキル基が挙げられ、メチル、エチル、プロピル、メチルエチル、ブチル、メチルプロピル、ペンチル、メチルブチル、エチルプロピル等が含まれる。アルケニル基としては、直鎖又は分枝鎖のアルケニル基が挙げられ、例えば炭素数２〜２０、好ましくは炭素数２〜１０、さらに好ましくは炭素数２〜５の直鎖又は分枝鎖のアルケニル基が挙げられ、ビニル、プロペニル等が含まれる。アルキニル基としては、直鎖又は分枝鎖のアルキニル基が挙げられ、例えば炭素数２〜２０、好ましくは炭素数２〜１０、さらに好ましくは炭素数２〜５の直鎖又は分枝鎖のアルキニル基が挙げられ、エチニル、プロピニル等が含まれる。アルコキシ基としては、直鎖又は分枝鎖のアルコキシ基が挙げられ、例えば炭素数１〜２０、好ましくは炭素数１〜１０、さらに好ましくは炭素数１〜６の直鎖又は分枝鎖のアルコキシ基が挙げられ、メトキシ、エトキシ、プロポキシ等が含まれる。アリール基としては、例えば炭素数６〜２０、好ましくは炭素数６〜１０のアリール基が挙げられ、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル等が含まれる。置換されたアルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アリール基の置換基には、例えば、アリール基、シクロアルキル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アミノ基、ニトロ基、水酸基、ハロゲン原子等が挙げられる。これらの置換基は、さらに置換されていてもよい。
好ましくは、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ相互に異なり、フェニル基、炭素数１〜２０、好ましくは１〜１０、さらに好ましくは１〜５のアルキル基、炭素数１〜２０、好ましくは１〜１０、さらに好ましくは１〜５のアルコキシ基若しくはカルボキシル基で置換された又は無置換のアルキル基；炭素数１〜２０、好ましくは１〜１０、さらに好ましくは１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基、ヒドロキシル基若しくはハロゲンで置換された又は無置換のアリール基又はアラルキル基を表す。好ましくは、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ相互に異なり、置換された又は無置換のアルキル基、置換された又は無置換のアリール基を表す。特に好ましくは、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ相互に異なり、フェニル基で置換された又は無置換のアルキル基、炭素数１〜２０、好ましくは１〜１０、さらに好ましくは１〜５のアルキル基で置換された又は無置換のアリール基を表す。Ｒ１及びＲ２の一方は、好ましくは炭素数１〜２のアルキル基、さらに好ましくはメチル基であり、もう一方が、フェニル基で置換されたアルキル基又は炭素数１〜５のアルキル基で置換された又は無置換のアリール基である。Ｒ３及びＲ４は独立にＨ又は炭素数１〜２０、好ましくは１〜１０、さらに好ましくは１〜５のアルキル基を表す。化合物Ｉとしては、例えば、アリールマロン酸エステル等のアリールカルボン酸エステルが挙げられ、具体的には、２−メチル−２−フェニルマロン酸ジエステル、特に２−メチル−２−フェニルマロン酸ジエチルエステル又は２−メチル−２−ベンジルマロン酸ジエステル、特に２−メチル−２−ベンジルマロン酸ジエチルエステルが挙げられる。
最初の立体選択的加水分解反応により、以下の化学式ＩＩで表されるハーフエステルが生成する。
【化９】
0005506658.tif 000012
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は上記化学式Ｉで表される化合物と同じである。
本発明は、化学式ＩＩで表されるハーフエステルを製造する方法をも包含する。該ハーフエステルは、医薬品や農薬の製造のための中間体として利用することができる。
上記反応により、以下の化学式ＩＩＩで表される光学活性なカルボン酸が生成する。
【化１０】
0005506658.tif 000013
式中Ｒ１及びＲ２は、上記化学式Ｉで表される化合物と同じである。原料である化合物Ｉが、アリールマロン酸エステル等アリールカルボン酸エステルである場合、得られる化合物はα−アリールプロピオン酸等のα−アリールアルカン酸であり、化合物Ｉが、２−メチル−２−フェニルマロン酸ジエステル又は２−メチル−２−ベンジルマロン酸ジエステルである場合、得られる化合物はそれぞれ、２−フェニルプロピオン酸又は２−ベンジルプロピオン酸である。また、本発明の方法で得られるその他のα−アリールプロピオン酸の例として、光学活性なフルルビプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン等が挙げられる。
最初の加水分解反応で生成するハーフエステルの鏡像体過剰率は、２０ｅｅ（％）以上、好ましくは８０ｅｅ（％）以上であり、収率は、５０％以上、好ましくは９０％以上である。
本発明において、光学活性なカルボン酸とは、一方の光学異性体が他方の光学異性体より多く含有されることをいい、最終的に得られるカルボン酸の鏡像体過剰率は、２０ｅｅ（％）以上、好ましくは８０ｅｅ（％）以上であり、収率は、２０％以上、好ましくは５０％以上である。
反応は、０〜１００℃、好ましくは室温〜８０℃、例えば、２５℃〜８０℃、さらに好ましくは５０〜８０℃で行う。上記化学式ＩのＲ１又はＲ２の種類によっては、室温以下の低い温度では、ドミノ型反応が起こりにくく、ハーフエステルを生成する反応のみが進行する。この場合、好ましくは５０〜８０℃で行う。
反応時のエステラーゼ濃度、基質濃度は基質の種類に応じて適宜決定することができるが、例えば、基質濃度１０ｍＭ、酵素５００Ｕ、反応液量２０ｍＬの条件で行なえばよい。ここで、エステラーゼの単位のＵ（Ｕｎｉｔ）は、ｐＨ８．０、２５℃において、１μＭのｐ−ニトロフェニルブタン酸エステルを加水分解し１μＭのｐ−ニトロフェノールを１分間に生成する酵素活性をいう。反応時のｐＨは、５〜１０、好ましくは６〜９．５である。反応は、緩衝液中で行なえばよい。
反応時間は、１〜３００時間である。
本発明のＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ  ｓｔｒａｉｎ  ７由来エステラーゼＳＴ００７１等のＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属微生物由来エステラーゼを用いた反応で得られる光学活性カルボン酸の絶対立体配置は、Ｃ．Ｊ．Ｓｉｈ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９７５，９７，４１４４に記載のブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）とは逆になる。従来は、酵素反応により、ブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）とは逆の絶対立体配置を有するものは得られなかった。
また、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ  ｓｔｒａｉｎ  ７由来エステラーゼＳＴ００７１を、不溶性担体に固定化して用いてもよい。Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ  ｓｔｒａｉｎ  ７由来エステラーゼＳＴ００７１は、好熱好酸性であり、熱や酸に対して安定である。従って、繰り返し利用することができる。
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ  ｓｔｒａｉｎ  ７由来エステラーゼＳＴ００７１等のＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属微生物由来エステラーゼを用いることにより、上記化学式１で表される化合物を原料として、抗炎症剤等の医薬品や農薬の中間原料となる化学式２で表される光学活性なカルボン酸を１段階で短時間で生成することができる。
本発明は、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ  ｓｔｒａｉｎ  ７由来エステラーゼＳＴ００７１等のＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属微生物由来エステラーゼを有効成分として含む、エナンチオ選択性をもったドミノ型反応を触媒する、原料基質であるジカルボン酸エステルから１段階で光学活性カルボン酸を生成する、光学活性カルボン酸製造用触媒組成物を包含する。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
エステラーゼＳＴ００７１の粗酵素液を用いた光学活性カルボン酸の製造
本実施例で用いたエステラーゼＳＴ００７１は以下の方法で簡易精製し、粗酵素液として用いた。
（ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）をプラスミドｐＥＴｓｔＥｓｔで形質転換し、１０ｍｌのＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）中、３７℃で一昼夜培養した。それを１０００ｍｌのＬＢ培地に植え継ぎ、さらに３０℃で５時間培養した。酵素の発現誘導のため０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加え、さらに３時間培養した。
（ｂ）培養液を遠心した（８５００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）。
（ｃ）菌体を１００ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．２）５０ｍｌに懸濁した。
（ｄ）菌体を超音波破砕し（１５ｍｉｎ，０℃）、遠心した（１２０００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ，４℃）。
（ｅ）上清を６０℃で２５分間インキュベートし、遠心した（１２０００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ，４℃）。
（ｆ）上清を回収し、粗酵素液を得た。
また、本実施例において、核磁気共鳴スペクトルの測定には日本電子ＪＥＯＬ  ＪＮＭ  ＥＸ−２７０（２７０ＭＨｚ）フーリエ変換核磁気共鳴スペクトル測定装置と日本電子ＪＥＯＬ  ＪＮＭ  ＡＬ−３００（３００ＭＨｚ）フーリエ変換核磁気共鳴スペクトル測定装置を用いた。赤外線吸収スペクトルの測定には日本分光ＪＡＳＣＯ  ＦＴ／ＩＲ−４１０を用いた。高速液体クロマトグラフィーは、センシュー科学ＳＳＣ−３４６１を用いた。分析用シリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にはＭＥＲＣＫ１．０５７１５．を用いた。分取用シリカゲル薄層クロマトグラフィー（ｐＴＬＣ）にはＭＥＲＣＫ１．０５７４４．を用いた。
また、本実施例において、以下の方法で酵素反応と生成物の分析を行った。
５０ｍＬナスフラスコに基質濃度が１０ｍＭとなるよう基質と粗酵素液を加え、室温または６０℃で１〜１０日間撹拌させ、反応を行った。２Ｍ塩酸を加え反応を終了させた後、セライト濾過をし、定法により酢酸エチルで抽出をした。減圧下溶媒を留去し、残留物を分取用薄層カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル／酢酸＝２／１／０．１）により精製し、生成物を得た。
生成物は核磁気共鳴スペクトル及び赤外線吸収スペクトルによって決定した。
生成物の核磁気共鳴スペクトル及び赤外線吸収スペクトルは以下のとおりであった。
（Ｓ）−Ｍｏｎｏｅｔｈｙｌ  ２−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｐｈｅｎｙｌ−ｍａｌｏｎａｔｅ（６）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．２６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．９０（３Ｈ，ｓ），４．２６（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），７．２４−７．３８（５Ｈ，ｍ）
ＩＲ（ＮａＣｌ）ｖｍａｘ：３０６３，２９８９，２６４１，１９５５，１７１１，１６００，１５８５，１４９８，１４４７，１３７９，１２５１，１１１７，１０７４，１０２９，１０１７，９３０，８５７，７２７，６９８ｃｍ−１
（Ｓ）−２−Ｐｈｅｎｙｌ−ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（７）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．５２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），３．７５（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），７．２４−７．３８（５Ｈ，ｍ）
ＩＲ（ＮａＣｌ）ｖｍａｘ：３０３０，２９８２，２９３８，２７２８，２６３４，１９４９，１８７７，１７０６，１６０１，１５８５，１４９７，１４５４，１４１３，１３７８，１２６２，１２３２，１１８５，１０６４，１０３０，９３７，８６１，７２７，６９８ｃｍ−１
（Ｓ）−Ｍｏｎｏｅｔｈｙｌ  ２−ｅｔｈｙｌ−２−ｐｈｅｎｙｌ−ｍｌｏｎａｔｅ（１２）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０．９８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．２５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），２．４５（２Ｈ，ｑｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），４．２８（２Ｈ，ｑｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），７．２４−７．３８（５Ｈ，ｍ）
ＩＲ（ＮａＣｌ）ｖｍａｘ：３０６３，３０３０，２９８１，２９３９，２６４５，１９５３，１７１０，１６０１，１４９８，１４４７，１４０８，１２３４，１１２８，１０９５，１０２４，９３５，８５７，７２３，６９８ｃｍ−１
（Ｒ）−Ｍｏｎｏｅｔｈｙｌ  ２−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｂｅｎｚｙｌ−ｍａｌｏｎａｔｅ（１３）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．２８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．４７（３Ｈ，ｓ），３．２５（２Ｈ，ｓ），４．２３（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），７．１２−７．２７（５Ｈ，ｍ）
ＩＲ（ＫＢｒ）ｖｍａｘ：３０３１，２９８６，２９３９，１７１２，１６０５，１４９６，１４５５，１３７９，１２１５，１１１３，１０２０，９３６，８６１，７３８，７０１，６６６ｃｍ−１
２−（ｐ−Ｎｉｔｒｏ−ｐｈｅｎｙｌ）−ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（１４）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．５８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），３．８９（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），７．４９−８．２２（４Ｈ，ｍ）
Ｍｏｎｏｅｔｈｙｌ  ２−（ｐ−ｍｅｔｈｙｌ−ｐｈｅｎｙｌ）−ｍａｌｏｎａｔｅ（１５）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．２８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．８９（３Ｈ，ｓ），２．３４（３Ｈ，ｓ），４．２８（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），７．１５−７．２７（４Ｈ，ｍ）
ＩＲ（ＮａＣｌ）ｖｍａｘ：２９８７，２６３９，１７１２，１５５７，１５１４，１４５９，１３７７，１２４９，１０９８，１０６９，１０２０，８５７，７４４，７２２，６６６ｃｍ−１
さらに、鏡像体過剰率は高速液体クロマトグラフィーによって決定した。ここに、各化合物のＲ体とＳ体のリテンションタイムとその時の条件を示す。検出はＭｏｎｏｅｔｈｙｌ  ２−ｅｔｈｙｌ−２−ｐｈｅｎｙｌ−ｍｌｏｎａｔｅ（１２）のみ２１４ｎｍ、他はすべて２５４ｎｍで行った。
高速液体クロマトグラフィーにおける分離データは以下のとおりであった。
Ｍｏｎｏｅｔｈｙｌ  ２−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｐｈｅｎｙｌ−ｍａｌｏｎａｔｅ（６）
カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ  ＯＤ−Ｈ（ダイセル化学）
展開系：ヘキサン／イソプロパノール／トリフルオロ酢酸＝９８／２／０．５％
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ    Ｒ体：３４．７ｍｉｎ，Ｓ体：３０．８ｍｉｎ
２−Ｐｈｅｎｙｌ−ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（７）
カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ  ＯＤ−Ｈ（ダイセル化学）
展開系：ヘキサン／イソプロパノール／トリフルオロ酢酸＝９３／７／１．５％
流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ    Ｒ体：１９．１ｍｉｎ，Ｓ体：２０．６ｍｉｎ
Ｍｏｎｏｅｔｈｙｌ  ２−ｅｔｈｙｌ−２−ｐｈｅｎｙｌ−ｍｌｏｎａｔｅ（１２）
カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ  ＯＤ（ダイセル化学）
展開系：ヘキサン／イソプロパノール／トリフルオロ酢酸＝９９／１／０．１％
流速：０．４ｍｌ／ｍｉｎ    Ｒ体：１０９ｍｉｎ，Ｓ体：９２．６ｍｉｎ
Ｍｏｎｏｅｔｈｙｌ  ２−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｂｅｎｚｙｌ−ｍａｌｏｎａｔｅ（１３）
カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ  ＯＪ−Ｈ（ダイセル化学）
展開系：ヘキサン／イソプロパノール／トリフルオロ酢酸＝９８／２／１．０％
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ    Ｒ体：１８．２ｍｉｎ，Ｓ体：１３．０ｍｉｎ
２−（ｐ−Ｎｉｔｒｏ−ｐｈｅｎｙｌ）−ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（１４）
カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ  ＡＤ−ＲＨ（ダイセル化学）
展開系：水／アセトニトリル／リン酸＝５／１／０．１％
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ    ７０．６ｍｉｎ，８３．５ｍｉｎ
プロキラルかつ立体障害が大きく加水分解されにくい化合物として２−メチル−２−フェニルマロン酸ジエチルエステル（以下の化学式中の５の化合物）を選択し、本酵素がドミノ型反応を触媒するかどうか検討した。そして、種々な温度にて加水分解生成物（以下の化学式中の６の化合物）やドミノ型反応による生成物（以下の化学式中の７の化合物）が得られるかどうか検討した。
【化１１】
0005506658.tif 000014
また本酵素の基質特異性の検討に用いた化合物は、図３に示す通りである。
１．化合物の合成
（１）基質の合成
酵素反応の基質として用いた２−メチル−２−フェニルマロン酸ジエチルエステル（５）、２−エチル−２−フェニルマロン酸ジエチルエステル（８）、２−メチル−２−ベンジルマロン酸ジエチルエステル（９）、２−メチル−２−（ｐ−ニトロフェニル）マロン酸ジエチルエステル（１０）および２−メチル−２−（ｐ−メチルフェニル）マロン酸ジエチルエステル（１１）は、化学式２〜６に示す方法で合成した。
【化１２】
0005506658.tif 000015
【化１３】
0005506658.tif 000016
【化１４】
0005506658.tif 000017
【化１５】
0005506658.tif 000018
【化１６】
0005506658.tif 000019
0005506658.tif 000020
２−メチル−２−フェニルマロン酸ジエチルエステル（５）はナトリウムエトキシドを塩基として用い、２−フェニルマロン酸ジエチルエステルをよう化メチルによってメチル化することにより合成した（化学式２）。２−エチル−２−フェニルマロン酸ジエチルエステル（８）および２−メチル−２−ベンジルマロン酸ジエチルエステル（９）は、水素化ナトリウムを塩基として用い、２−置換マロン酸ジエチルエステルをよう化アルキルによってアルキル化することにより合成した（化学式３及び４）。２−メチル−２−（ｐ−ニトロフェニル）マロン酸ジエチルエステル（１０）は、メチルマロン酸ジエチルエステルを、水素化ナトリウムを塩基としｐ−ニトロクロロベンゼンを用いてアリール化することにより合成した（化学式５）。２−メチル−２−（ｐ−メチルフェニル）マロン酸ジエチルエステル（１１）は、２−（ｐ−メチルフェニル）プロピオン酸をエステル化し、リチウムジイソプロピルアミン（ＬＤＡ）を塩基としてクロロギ酸エチルを用いてエトキシカルボニル化することにより合成した（化学式６）。
具体的な合成方法は以下のとおりであった。
（ｉ）Ｄｉｅｔｈｙｌ  ２−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｐｈｅｎｙｌ−ｍａｌｏｎａｔｅ（５）の合成
ナトリウムエトキシド（０．８１７ｇ，１２ｍｍｏｌ）／無水エタノール（８ｍｌ）にフェニルマロン酸ジエチルエステル（２．３６ｇ，１０ｍｍｏｌ）／無水エタノール（１０ｍｌ）を滴下した。滴下終了後、０℃で３０分間攪拌した。次に、よう化メチル（０．９３４ｍＬ、１５ｍｍｏｌ）を加え、温度を室温（約２２℃）へと自然昇温させ、さらに３時間撹拌した。２Ｍ塩酸を加えて酸性にした後、定法により抽出し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝７／１）で精製して目的物（１．８９ｇ，７６％）を無色液体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．２５（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．８６（３Ｈ，ｓ），４．２２（４Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），７．２５−７．３８（５Ｈ，ｍ）
（ｉｉ）Ｄｉｅｔｈｙｌ  ２−ｅｔｈｙｌ−２−ｐｈｅｎｙｌ−ｍａｌｏｎａｔｅ（８）の合成
水素化ナトリウム（０．３６５ｇ、１５．２ｍｍｏｌ）に無水ヘキサン１０ｍＬにて計３回洗浄した。ヘキサンを取り除き無水エタノール１０ｍＬを加え、温度を０℃に保ちながら、フェニルマロン酸ジエチルエステル（３．０２ｇ、１２．７ｍｍｏｌ）の無水エタノール溶液（５ｍＬ）を加えた。３０分間攪拌した後、よう化エチル（３．１０ｇ、１９．１ｍｍｏｌ）の無水エタノール溶液（５ｍＬ）を加え室温で一昼夜攪拌した。２Ｍ塩酸を加えて酸性にした後、定法により抽出し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝３０／１）で精製して目的物（１．２２ｇ、１９％）を無色液体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０．８８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．２４（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），２．３５（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），４．１７（４Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），７．２５−７．４１（５Ｈ，ｍ）
ＩＲ（ＮａＣｌ）ｖｍａｘ：３０６２，３０３０，２９８１，２９３９，１７３２，１６０２，１４９７，１４４７，１２３９，１０２７，８５９，７４４，７２７，６９８，６６６ｃｍ−１
（ｉｉｉ）Ｄｉｅｔｈｙｌ  ２−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｂｅｎｚｙｌ−ｍａｌｏｎａｔｅ（９）の合成
水素化ナトリウム（０．５７５ｇ、１４．４ｍｍｏｌ）に無水ヘキサン１０ｍＬにて計３回洗浄した。ヘキサンを取り除きＴＨＦ１５ｍＬを加え、温度を０℃に保ちながら、ベンジルマロン酸ジエチルエステル（３．００ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１０ｍＬ）を加えた。３０分間攪拌した後、よう化メチル（２．０４ｇ、１４．４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１０ｍＬ）を加え８０℃で６時間加熱還流した。２Ｍ塩酸を加えて酸性にした後、定法により抽出し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝５／１）で精製して目的物（２．５４ｇ、８０％）を無色液体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．２５（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．３３（３Ｈ，ｓ），３．２２（２Ｈ，ｓ），４．１９（４Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），７．１１−７．２６（５Ｈ，ｍ）
ＩＲ（ＮａＣｌ）ｖｍａｘ：３０８６，３０６３，３０３０，２９８３，２９３８，１９５６，１８８２，１７３３，１６０５，１４９６，１４５４，１２４１，１１０８，１０２３，８６２，７８７，７４３，７０２，６６６ｃｍ−１
（ｉｖ）Ｄｉｅｔｈｙｌ  ２−ｍｅｔｈｙｌ−２−（ｐ−ｎｉｔｒｏ−ｐｈｅｎｙｌ）−ｍａｌｏｎａｔｅ（１０）の合成
水素化ナトリウム（１．１２ｇ、２８．１ｍｍｏｌ）に無水ヘキサン１０ｍＬにて計３回洗浄した。ヘキサンを取り除きＤＭＦ１０ｍＬを加え、温度を０℃に保ちながら、メチルマロン酸ジエチルエステル（３．００ｇ、１８．７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１５ｍＬ）を加えた。３０分間攪拌した後、ｐ−ニトロクロロベンゼン（４．４３ｇ、２８．１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１５ｍＬ）を加え１００℃で４時間加熱還流した。２Ｍ塩酸を加えて酸性にした後、定法により抽出し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝５／１）で精製して目的物（２．４２ｇ、４４％）を無色液体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．２６（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．９１（３Ｈ，ｓ），４．２５（４Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），７．５５−８．２１（４Ｈ，ｍ）
ＩＲ（ＮａＣｌ）ｖｍａｘ：３０８４，２９８５，２９４１，２９０７，２８７４，１９３０，１７３６，１６０６，１５２４，１４９７，１３５０，１２５８，１１０７，９２５，８５７，７５２，７３６，６６５ｃｍ−１
（ｖ）Ｅｔｈｙｌ  ２−（ｐ−ｍｅｔｈｙｌ−ｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅの合成
２−（ｐ−メチルフェニル）プロピオン酸（５．００ｇ、３０．５ｍｍｏｌ）にｐ−トルエンスルホン酸一水和物（９０ｍｇ）とエタノール（５０ｍＬ）を加え、９０℃で一昼夜加熱還流した。減圧下エタノールを留去し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて、定法により抽出した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝２／１）で精製し、目的物（５．６０ｇ、９６％）を無色液体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．２０（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．４７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），２．３３（３Ｈ，ｓ），３．６７（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），４．１９（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），７．１１−７．２６（５Ｈ，ｍ）
ＩＲ（ＮａＣｌ）ｖｍａｘ：３０９４，２９８０，２９３６，２８７５，１９０１，１７３２，１６１７，１５１４，１４５３，１３７４，１３３０，１２０２，１１７３，１０７１，１０２５，８６０，８２１，７８３，７２６，６６５ｃｍ−１
（ｖｉ）Ｄｉｅｔｈｙｌ  ２−ｍｅｔｈｙｌ−２−（ｐ−ｍｅｔｈｙｌ−ｐｈｅｎｙｌ）ｍａｌｏｎａｔｅ（１１）の合成
ジイソプロピルアミン（０．７９５ｇ、７．８０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（５ｍｌ）に１．５８Ｍｎ−ＢｕＬｉヘキサン溶液（４．６１ｍｌ、７．２８ｍｍｏｌ）を加えて０℃で３０分間攪拌した。温度を０℃に保ちながら２−（ｐ−メチルフェニル）プロピオン酸エチルエステル（１．０ｇ、５．２０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１０ｍＬ）を加えて３０分攪拌した。その後、反応系の温度を０℃から−７８℃に冷却し、クロロギ酸エチル（０．６７７ｇ、６．２４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（５ｍＬ）を加えた。３０分間撹拌させた後、反応系の温度を室温に昇温させ、さらに一昼夜撹拌させた。２Ｍ塩酸を加えて酸性にした後、定法により抽出し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝９／１）で精製して目的物（０．３９１ｇ、２８％）を無色液体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．２５（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．８５（３Ｈ，ｓ），２．３３（３Ｈ，ｓ），４．２２（４Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），７．１３−７．２６（５Ｈ，ｍ）
ＩＲ（ＮａＣｌ）ｖｍａｘ：２９８３，２９３９，１７３０，１６１７，１５１５，１４６３，１３７５，１２５３，１１０５，１０７０，１０２１，９２１，８６１，７６３，７４２，６８８，６６６ｃｍ−１
（２）生成物の合成
高速液体クロマトグラフィーの保持時間を知るために、酵素反応の生成物であるハーフエステルを合成した（図４及び化学式７）。
【化１７】
0005506658.tif 000021
図４より２−メチル−２−フェニルマロン酸モノエチルエステル（６）、２−エチル−２−フェニルマロン酸モノエチルエステル（１２）、２−メチル−２−ベンジルマロン酸モノエチルエステル（１３）および２−メチル−２−（ｐ−メチルフェニル）マロン酸モノエチルエステル（１５）は、水酸化カリウムを用いて、片方のエステルのみ加水分解させて合成した。同様の方法で、ニトロ化合物（１０）を加水分解したところ、ハーフエステルは得られず脱炭酸反応も進行した２−（ｐ−ニトロフェニル）プロピオン酸（１４）が得られた。
また、基質５の高温における反応の生成物２−フェニルプロピオン酸（７）の分析には、市販されているものを用いた。
ハーフエステルの具体的な合成方法は以下のとおりであった。
（ｉ）Ｍｏｎｏｅｔｈｙｌ  ２−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｐｈｅｎｙｌ−ｍａｌｏｎａｔｅ（６）の合成
２−メチル−２−フェニルマロン酸ジエチルエステル（１．８１ｇ、１０．９ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（６ｍＬ）に水酸化カリウム（０．６０９ｇ、７．２３ｍｍｏｌ）水溶液（６ｍＬ）を加え、室温で攪拌した。６時間後、塩酸と水酸化ナトリウム水溶液を用いて中性に合わせた後、減圧下溶媒を留去し、残留物と等量の水を加えた。その後、ジエチルエーテルを用いて水層を抽出し、塩酸で塩基性にした。さらにジエチルエーテルを用いて抽出し、飽和食塩水で有機層を洗浄した。無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後減圧下溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝５／１）で精製して目的物（０．２５０ｇ、１１％）を無色液体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．２５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．９０（３Ｈ，ｓ），４．２５（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），７．２４−７．３８（５Ｈ，ｍ）
ＩＲ（ＮａＣｌ）ｖｍａｘ：３０６３，２９８９，２６４７，１９５４，１７１０，１６０１，１５８５，１４９８，１４４７，１３７９，１２５１，１０７４，１０２９，１０１７，９３０，８５７，７５１，６９８ｃｍ−１
（ｉｉ）Ｍｏｎｏｅｔｈｙｌ  ２−ｅｔｈｙｌ−２−ｐｈｅｎｙｌ−ｍｌｏｎａｔｅ（１２）の合成
２−エチル−２−フェニルマロン酸ジエチルエステル（０．５００ｇ、１．８９ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（３ｍＬ）に水酸化カリウム（０．１５９ｇ、２．８３ｍｍｏｌ）水溶液（３ｍＬ）を加え、室温で攪拌した。６時間後、塩酸と水酸化ナトリウム水溶液を用いて中性に合わせた後、減圧下溶媒を留去し、残留物と等量の水を加えた。その後、ジエチルエーテルを用いて水層を抽出し、塩酸で塩基性にした。さらにジエチルエーテルを用いて抽出し、飽和食塩水で有機層を洗浄した。無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後減圧下溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝５／１）で精製して目的物（０．１０２ｇ、２３％）を無色液体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０．９８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．２５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），２．４５（２Ｈ，ｑｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），４．２８（２Ｈ，ｑｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），７．２４−７．３８（５Ｈ，ｍ）
ＩＲ（ＮａＣｌ）ｖｍａｘ：２９８１，２６３６，１９５５，１８７７，１７０８，１６０１，１５８４，１４９８，１４４７，１３８８，１２３２，１１２７，１０９５，１０２４，８５７，７６０，７２７，６９８ｃｍ−１
（ｉｉｉ）Ｍｏｎｏｅｔｈｙｌ  ２−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｂｅｎｚｙｌ−ｍａｌｏｎａｔｅ（１３）の合成
２−メチル−２−ベンジルマロン酸ジエチルエステル（１．００ｇ、３．７８ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（３ｍＬ）に水酸化カリウム（０．３２３ｇ、５．７６ｍｍｏｌ）水溶液（３ｍＬ）を加え、室温で攪拌した。３時間後、塩酸と水酸化ナトリウム水溶液を用いて中性に合わせた後、減圧下溶媒を留去し、残留物と等量の水を加えた。その後、ジエチルエーテルを用いて水層を抽出し、塩酸で塩基性にした。さらにジエチルエーテルを用いて抽出し、飽和食塩水で有機層を洗浄した。無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後減圧下溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）で精製して目的物（０．４０９ｇ、４６％）を無色液体として得た
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．２８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．４７（３Ｈ，ｓ），３．２５（２Ｈ，ｓ），４．２３（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），７．１２−７．２７（５Ｈ，ｍ）
ＩＲ（ＮａＣｌ）ｖｍａｘ：３０７６，２９９１，１９３６，１７０７，１５９８，１５１８，１４５８，１３８２，１３４６，１２２０，１０９２，９２５，８５５，７５４，７４１，６９８，６６６ｃｍ−１
（ｉｖ）２−（ｐ−Ｎｉｔｒｏ−ｐｈｅｎｙｌ）−ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（１４）の合成
２−メチル−２−（ｐ−ニトロフェニル）マロン酸ジエチルエステル（１．００ｇ、３．３９ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（３ｍＬ）に水酸化カリウム（０．２９９ｇ、５．３３ｍｍｏｌ）水溶液（３ｍＬ）を加え、室温で攪拌した。８時間後、塩酸と水酸化ナトリウム水溶液を用いて中性に合わせた後、減圧下溶媒を留去し、残留物と等量の水を加えた。その後、ジエチルエーテルを用いて水層を抽出し、塩酸で塩基性にした。さらにジエチルエーテルを用いて抽出し、飽和食塩水で有機層を洗浄した。無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後減圧下溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）で精製して目的物（０．１４６ｇ、２２％）を無色液体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．５８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），３．８９（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），７．４９−８．２２（４Ｈ，ｍ）
（ｖ）Ｍｏｎｏｅｔｈｙｌ  ２−（ｐ−ｍｅｔｈｙｌ−ｐｈｅｎｙｌ）−ｍａｌｏｎａｔｅ（１５）の合成
２−メチル−２−（ｐ−メチルフェニル）マロン酸ジエチルエステル（３２０ｍｇ、１．２１ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（２ｍＬ）に水酸化カリウム（１０２ｍｇ、１．８２ｍｍｏｌ）水溶液（３ｍＬ）を加え、室温で攪拌した。６時間後、塩酸と水酸化ナトリウム水溶液を用いて中性に合わせた後、減圧下溶媒を留去し、残留物と等量の水を加えた。その後、ジエチルエーテルを用いて水層を抽出し、塩酸で塩基性にした。さらにジエチルエーテルを用いて抽出し、飽和食塩水で有機層を洗浄した。無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後減圧下溶媒を留去し、分取用薄層カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル／酢酸＝２／１／０．１）で精製して目的物（８８．９ｍｇ、３１％）を無色液体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．２７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．８９（３Ｈ，ｓ），２．３４（３Ｈ，ｓ），４．２７（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），７．１５−７．２７（４Ｈ，ｍ）
（３）酵素反応の手順
まず酵素溶液は、ＳＴ００７１をコードする遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌を大量培養し、菌体を１００ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ９．２に懸濁した後、超音波破砕および熱処理後の上清を用いた。そして酵素溶液２０ｍＬに濃度が１０ｍＭとなるように基質を加え、撹拌した。反応の進行は薄層クロマトグラフィーで確認した。基質が全て消失したことが確認できたら、反応溶液に２Ｍ  ＨＣｌを加え酸性にし、生成物を定法により抽出した。分取用薄層クロマトグラフィーにより精製し、得られた生成物を１Ｈ−ＮＭＲおよびＩＲで同定した（図５）。
（４）生成物の絶対立体配置の決定方法
生成物であるハーフエステルの光学活性体は市販されておらず、また高速液体クロマトグラフィーの保持時間および旋光度の文献値も知られていない。しかし、図６に示したブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）による反応が報告されている（Ｃ．Ｊ．Ｓｉｈ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９７５，９７，４１４４；Ｊ．Ｂｏｕｔｅｌｊｅ，Ｓ．Ｇａｔｅｎｂｅｃｋ，Ｐ．Ｓｚｍｕｌｉｋ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９８５，４１，１３４７−１３５２；Ｊ．Ｂｏｕｔｅｌｊｅ，Ｓ．Ｇａｔｅｎｂｅｃｋ，Ｐ．Ｓｚｍｕｌｉｋ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍ．，１９８６，１４，１７６−１８６；Ｅ．Ｊ．Ｔｏｏｎｅ，Ｊ．Ｂ．Ｊｏｎｅ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，１９９１，２，１０４１−１０５２；Ｂ．Ｋｌｏｔｚ−Ｂｅｒｅｎｄｅｓ，Ｓ．Ｋｏｔｉｌａ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，１９９７，８，１８２１−１８２３；Ｂ．Ｋｏｓｓｍａｎｎ，Ｏ．Ｍａｙ，Ｈ．Ｇｒｏｇｅｒ，ＳＹＮＬＥＴＴ，２００５，１１，１７４６−１７４８）。
そこでＰＬＥによる反応の生成物と本酵素による反応の生成物を、高速液体クロマトグラフィーで比較することにより絶対立体配置を決定した。
２．結果および考察
（１）ドミノ型反応の検討
エステラーゼＳＴ００７１がドミノ型反応を触媒するかどうかということを調べるために、まず２−メチル−２−フェニルマロン酸ジエチルエステル（５）を基質として、酵素反応を行った。このとき、反応温度を室温および６０℃で検討した。
薄層クロマトグラフィーの分析の結果、両温度の反応溶液で、基質５とは異なるＲｆ値のスポットを確認でき、両温度において加水分解反応が進行していることが確認できた。また６０℃における反応では、時間が経つと加水分解生成物と推測されるスポットが１つから２つへと増加した。つまり何らかの多段階反応が進行し、新たな生成物が生成していることが分かった。
そこで、基質５が全て反応し終わることを薄層クロマトグラフィーで確認したあと生成物を抽出および精製し、得られた生成物を１Ｈ−ＮＭＲおよびＩＲで同定した。
分析の結果、室温における反応の生成物は２−メチル−２−フェニルマロン酸モノエチルエステル（６）であることが分かった。つまり、２−メチル−２−フェニルマロン酸ジエチルエステル（５）のジエステル部分のうち片方のエステルのみが加水分解されていることが分かった（化学式８）。
【化１８】
0005506658.tif 000022
一方６０℃における反応の生成物は、２−メチル−２−フェニルマロン酸モノエチルエステル（６）と２−フェニルプロピオン酸（７）であることが分かった。つまり６０℃における反応では、まず加水分解反応が起こり化合物６を生成した後、脱炭酸反応が起こり化合物７を生成したと考えられる（化学式９）。
【化１９】
0005506658.tif 000023
化学式９及び１０より、室温条件では、６０℃の条件時より反応時間が長いにも関わらず、化合物７の生成は検出されなかった。これは、化合物６から化合物７への脱炭酸反応に、室温では超えることのできない活性化エネルギーを要することが分かる。
また６０℃の反応において、化合物７の収率が化合物６のそれより高いことから、反応時間を長くすれば、全て化合物７に変換されることが推測される。
以上より本酵素は、２−メチル−２−フェニルマロン酸ジエチルエステル（５）を加水分解することができるとともに、高温条件ではドミノ型反応を触媒することが分かった。
（２）ドミノ型反応における生成物の詳細な分析
酵素反応に用いた２−メチル−２−フェニルマロン酸ジエチルエステル（５）はプロキラルであり、生成した２−メチル−２−フェニルマロン酸モノエチルエステル（６）及び２−フェニルプロピオン酸（７）は不斉炭素をもつ。したがって、これらの反応が酵素の活性部位内で起これば、生成物は光学活性体であることが期待できる。
生成物６の絶対立体配置は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の保持時間が既知では無く、また旋光度の文献値も無いため決定することができない。そこで、ブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）による生成物の絶対立体配置と比較し、決定した。
ＨＰＬＣで分析した結果、ＳＴ００７１による生成物６とＰＬＥによる生成物６の各ピークが重ならなかったため（図７）、両酵素による生成物６は絶対立体配置が異なることが分かった。したがってＰＬＥによってＲ体の生成物６が得られることが既知であるので（Ｂ．Ｋｌｏｔｚ−Ｂｅｒｅｎｄｅｓ，Ｓ．Ｋｏｔｉｌａ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，１９９７，８，１８２１−１８２３）、ＳＴ００７１による生成物６はＳ体と決定できた。また、２−フェニルプロピオン酸（７）の絶対配置は、ＨＰＬＣの保持時間が既知であるので、ＨＰＬＣによって決定した。
以上よりＨＰＬＣを用いてＳＴ００７１による各生成物の絶対配置および鏡像体過剰率を分析した（表１）。
【表１】
0005506658.tif 000024
0005506658.tif 000025
表１より両温度における生成物６は、９６−９９％ｅｅという高い鏡像体過剰率をもちＳ体であることが分かった。さらに、６０℃の反応におけるもう一方の生成物７もＳ体の光学活性体であることが分かった。このように光学活性な２つの生成物が得られたことから、この反応には酵素が関与していることを確認できた。
以上の結果および考察より２−メチル−２−フェニルマロン酸モノエチルエステル（６）から２−フェニルプロピオン酸（７）への反応経路を予測した（化学式１０）。
【化２０】
0005506658.tif 000026
化学式１０より予測する１つ目の経路は、脱炭酸反応が起こり２−フェニルプロピオン酸エチルエステル（１６）が生成し、さらにエステルの加水分解反応が起こるというものである。２つ目は、先にエステルの加水分解反応が起こり２−メチル−２−フェニルマロン酸（１７）が生成し、脱炭酸反応が起こるというものである。この２つの予測経路の中間体（１６，１７）の検出はされていない。しかし本酵素がＡＭＤａｓｅ活性を持たないことから、中間体１６を経由する経路ではないかと推定している。これらの反応経路は、各中間体１６、１７を用いて酵素反応を行い、反応の進行を検討することで決定できる。
どちらの経路でも脱炭酸反応した後エノール中間体となるため、このときに活性部位にてエナンチオ面選択的にプロトンを供与された場合、光学活性な２−フェニルプロピオン酸（７）を生成すると考える（化学式１１）。
【化２１】
0005506658.tif 000027
以上の結果より６０℃においてエナンチオ選択性をもった新規ドミノ型反応の構築に成功した。さらに室温においても高い鏡像体過剰率でＳ体のハーフエステル（６）を生成できた。
そこで本酵素の基質特異性を検討し、他の基質でもドミノ型反応が進行するか検討することとした。
（３）  基質特異性の検討
前項までに本酵素がプロキラルかつ立体障害が大きい２−メチル−２−フェニルマロン酸ジエチルエステル（５）を強く認識することが分かったので、図３に示す基質８〜１１を酵素反応に用いた。このとき反応温度は室温で検討を行った。
薄層クロマトグラフィーを用いて反応の進行を確認しながら、各基質が全て反応し終わった時点で反応を止め、生成物を抽出および精製をした。得られた生成物は、１Ｈ−ＮＭＲ、ＩＲおよびＨＰＬＣを用いて分析した（表２）。また絶対立体配置は前項と同様にＰＬＥによる生成物と比較して決定した。
【表２】
0005506658.tif 000028
表２より全ての基質に対して反応の進行を確認することができ、高収率で生成物を得ることができた。
（４）各基質における反応経路の推測
表２より各生成物は、基質１０に対する反応を除き、全てハーフエステルであることが分かった。つまり基質５、８、９、１１を用いた場合、基質のジエステルのうち片方のエステルのみ加水分解される反応が進行していた（図８）。
一方、基質１０に対する反応の生成物は、ハーフエステルでは無くカルボン酸１４であった。そこでＴＬＣによって反応を追ってみると次の結果が得られた（図９）。
図９より基質１０が全て反応し終えた時点（１４４時間後）では、生成物はカルボン酸１４のみであったが、反応開始から１２時間後のときには、ＴＬＣ分析で２ハーフエステル１８を確認することが出来た。よって化学式１２の反応経路が推測できた。
【化２２】
0005506658.tif 000029
つまり、基質１０を用いた場合、室温条件で加水分解反応および脱炭酸反応のドミノ型反応に成功した。
しかし基質５を用いた場合、熱をかけないと脱炭酸反応は進行しなかった。基質１０に対してのみ、室温条件でドミノ型反応が起こったことは、ニトロ基の電子効果によって説明ができる。フェニル基のｐ位に付加しているニトロ基は電子求引性を有している。この電子求引性により、基質１０のα炭素とエステルの炭素間の電子密度は低下する。したがってハーフエステル１８は非常に脱炭酸しやすく、すみやかにα位のＣ−Ｃ結合が切れカルボン酸１４を生成すると考える。
以上より、熱をかけるのみではなく室温条件においても基質をたくみにデザインすることによって、ドミノ型反応を実現することに成功した。
（５）各基質における反応性の推測
上記の結果より、基質によって反応時間に大きな差が出ることが分かった。この最大の要因もエステルのカルボニル炭素の電子密度によるものと考えられる。カルボニル炭素の電子密度は、アルキル基とアリール基の電子的な効果によって変動する。基質の基本骨格を図１０に示す。置換基の電子効果は表３に示すとおりである。
【表３】
0005506658.tif 000030
これらの電子効果は図１１に示すように加水分解反応に影響すると考える。
図１１（ａ）より、電子供与性置換基はカルボニル炭素の電子密度を増大させる。これによって、カルボニル炭素は酵素の触媒残基の求核攻撃を受けにくくなるため、反応速度が低下する。それに対し、電子求引性置換基の場合（図１１（ｂ））、カルボニル炭素は電子密度が低下し、求核攻撃を受けやすくなる。したがって反応速度は上がる。
２−エチル−２−フェニルマロン酸ジエチルエステル（８）および２−メチル−２−ベンジルマロン酸ジエチルエステル（９）は、２−メチル−２−フェニルマロン酸ジエチルエステル（５）に比べて反応時間が長くなった。
図１２に構造を示す基質８は、基質５のメチル基をエチル基に置換している。このことから、反応時間が長くなった要因に、アルキル基の電子供与性がメチル基のときに比べて高くなったことが挙げられる。その他の要因として考えられるのは、エチル基の立体障害である。エチル基はメチル基より立体障害が大きいため、加水分解をより受けにくくなったと推測される。
したがって反応時間の影響は、エチル基の高い電子供与性と立体障害が大きくなったことが要因であると示唆される。
図１３に構造を示す基質９は、基質５のフェニル基をベンジル基に置換している。ベンジル基になることで、フェニル基とα炭素の間にメチレン基が挿入された。これによってカルボニル炭素に対する影響は、フェニル基よりも挿入されたメチレン基の電子供与性の方が大きくなる（図１３）。したがって、この反応時間もフェニル基の隣に挿入されたメチレン基の電子供与性が要因であると示唆される。
次に２−メチル−２−（ｐ−ニトロフェニル）マロン酸ジエチルエステル（１０）について考察する。基質１０は、基質５のフェニル基のｐ位にニトロ基を付加した基質である。ニトロ基およびフェニル基は電子求引性であるため、この基質のカルボニル炭素の電子密度はかなり低下する。よって反応時間は短くなるはずである。しかし、基質５より反応時間が長くなった。これは前述したように基質１０はドミノ型反応であるため、反応時間より加水分解の反応性を比較することはできない。そこで、基質５の６０℃における反応と比較する。
反応時間は基質が全て反応し終えるまでの時間であることを注意する。すると化学式１３ではハーフエステル６を得られたのに対して、化学式１４ではハーフエステル１８を得ることが出来なかった。このことから脱炭酸反応では、ニトロ基の電子求引性によって、ハーフエステル６より１８の方が反応性が高くなったと推測できる。
【化２３】
0005506658.tif 000031
【化２４】
0005506658.tif 000032
0005506658.tif 000033
最後に２−メチル−２−（ｐ−メチルフェニル）マロン酸ジエチルエステル（１１）について考察する。基質１１は、基質５のフェニル基のｐ位にメチル基を付加した基質である。このｐ位のメチル基は電子供与性であるため、この基質のカルボニル炭素の電子密度は基質５より高くなる。よって基質８，９のように反応時間が長くなることが予測されたが、反応時間は短くなった（化学式１５）。
【化２５】
0005506658.tif 000034
以上より、置換基の電子的な効果は加水分解反応の進行に大きく影響し、そのなかでも電子求引基は脱炭酸反応を進行させることが推測できた。
（６）各生成物の鏡像体過剰率および絶対立体配置
【表４】
0005506658.tif 000035
0005506658.tif 000036
まず基質８の生成物である２−エチル−２−フェニルマロン酸モノエチルエステル（１２）について考察する。表４より鏡像体過剰率は２５％ｅｅと、光学活性体ではあるものの低い値である。それに対して生成物６の鏡像体過剰率は９６％ｅｅと高いことから、前項で述べたようにアルキル基の立体障害の大きさが本酵素のエナンチオ選択性に影響していると推測する。また、生成物１２の絶対立体配置は生成物６と同じＳ体であったことから、アルキル基の立体障害の大きさは本酵素の立体選択性には関係ないと考える。
次に基質９の生成物である２−メチル−２−ベンジルマロン酸ジエチルエステル（１３）について考察する。この基質９を用いた反応は、基質８を用いたときと同様に反応時間が長かった。しかし生成物１２とは異なり、生成物１３の鏡像体過剰率は８３％ｅｅと高い値である。このことから、アリール基の立体障害の大きさはエナンチオ選択性に関係せず、ゆっくりと反応が進むことで高い鏡像体過剰率の生成物１３を得られたと推測できる。また、この絶対立体配置はＲ体であり、他の生成物の絶対立体配置とは逆であった。これは、基質９に対してのみが本酵素の立体選択性が反転したと推測する。
次に基質１０の生成物である２−（ｐ−ニトロフェニル）プロピオン酸（１４）について考察する。表４より、生成物１４の鏡像体過剰率は２．２％ｅｅとほぼラセミ体であった。これに対して、基質５の６０℃の反応における生成物２−フェニルプロピオン酸（７）の鏡像体過剰率は１６％ｅｅと低いながらも光学活性体であった。よって、生成物１４を生成する脱炭酸反応は酵素によるものではなく電子効果による影響が強いと考える。
上記の検討において、基質１０の反応条件はアルカリ性で行っており、これは脱炭酸反応を促進させる条件である。酸性条件下で反応を緩やかに進行させることで、ニトロ基の電子効果＜基質に対する酵素の認識力となり、鏡像体過剰率の上昇が期待できる。
ここで、本酵素による生成物とＰＬＥによる生成物の絶対立体配置（Ｃ．Ｊ．Ｓｉｈ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９７５，９７，４１４４；Ｊ．Ｂｏｕｔｅｌｊｅ，Ｓ．Ｇａｔｅｎｂｅｃｋ，Ｐ．Ｓｚｍｕｌｉｋ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９８５，４１，１３４７−１３５２；Ｊ．Ｂｏｕｔｅｌｊｅ，Ｓ．Ｇａｔｅｎｂｅｃｋ，Ｐ．Ｓｚｍｕｌｉｋ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍ．，１９８６，１４，１７６−１８６；Ｅ．Ｊ．Ｔｏｏｎｅ，Ｊ．Ｂ．Ｊｏｎｅ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，１９９１，２，１０４１−１０５２；Ｂ．Ｋｌｏｔｚ−Ｂｅｒｅｎｄｅｓ，Ｓ．Ｋｏｔｉｌａ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，１９９７，８，１８２１−１８２３；Ｂ．Ｋｏｓｓｍａｎｎ，Ｏ．Ｍａｙ，Ｈ．Ｇｒｏｇｅｒ，ＳＹＮＬＥＴＴ，２００５，１１，１７４６−１７４８）を比較する（表５）。
【表５】
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表５より両酵素による生成物の絶対立体配置は、異なることが分かる。つまりエステラーゼＳＴ００７１とＰＬＥの立体選択性は逆であることが示唆される。したがって、２−メチル−２−（ｐ−メチルフェニル）マロン酸モノエチルエステル（１５）の絶対立体配置は、Ｓ体と推測できる。
以上より、本実施例で用いた全基質に対してエステラーゼＳＴ００７１は同じ立体選択性を示し、またＰＬＥとは立体選択性が反転していることが分かった。そしてアルキル基の立体障害の大きさは、鏡像体過剰率に影響することが分かった。
エステラーゼＳＴ００７１は、立体障害が大きく加水分解されにくいα−アリールマロン酸ジエチルエステルを、高い立体選択性で加水分解してハーフエステルを生成することを見出した。さらに、酵素反応を高温で行うことにより、加水分解ついで脱炭酸反応が進行したと考えられるカルボン酸の生成を確認した。つまり高温条件でドミノ型反応の構築に成功した（化学式１６）。
【化２６】
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またドミノ型反応は、ニトロ基のような電子求引性置換基を有する基質をデザインすることによっても実現することが分かった。
室温条件では、アルキル基の立体障害の大きさが反応の進行および立体選択性に影響することが示唆された。同様に、カルボニル炭素の電子密度が反応の進行に影響することが示唆された。
エステラーゼＳＴ００７１の立体選択性は、ＰＬＥのそれと反転していることが分かった。
【実施例２】
【０００７】
精製エステラーゼＳＴ００７１を用いた光学活性カルボン酸の製造
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）をプラスミドｐＥＴｓｔＥｓｔで形質転換し、１０ｍｌのＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）中、３７℃で一昼夜培養した。それを１０００ｍｌのＬＢ培地に植え継ぎ、さらに３０℃で５時間培養した。酵素の発現誘導のため０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加え、さらに５時間培養した。培養液を遠心分離（８５００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）し、菌体を集めた。得られた菌体を２０ｍＭ，ｐＨ７．４リン酸緩衝溶液４０ｍｌ（０．５Ｍ  ＮａＣｌと２０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅを含む）に懸濁した。菌体を超音波破砕し（１５ｍｉｎ，０℃）、遠心分離（１２０００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ，４℃）することにより無細胞抽出液を得た。上清を６０℃で２５分間滅処理を行い、遠心分離（１２０００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ，４℃）により変成したタンパク質を除いた。得られた粗酵素液をＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）Ｎｉ２＋  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｏｌｕｍｎに吸着させた後、０．５Ｍ  ＮａＣｌと２０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅを含むリン酸緩衝溶液で洗浄した。次いで、０．５Ｍ  ＮａＣｌと０．５Ｍ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅを含む２０ｍＭリン酸緩衝溶液で溶出した。エステラーゼ活性を含む画分を集めて、透析することで均一な酵素を得た。
５０ｍＬナスフラスコに基質濃度が２ｍＭとなるよう基質（フェニルメチルマロン酸時エステル）と酵素（１８Ｕ）を加え、７０℃で２日間撹拌させ、反応を行った。２Ｍ塩酸を加え反応を終了させた後、定法により酢酸エチルで抽出をした。減圧下溶媒を留去し、残留物を分取用薄層カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル／酢酸＝２／１／０．１）により精製し、生成物（α−フェニルプロピオン酸）を得た。
収率９５％、光学純度４８％ｅ．ｅ．、絶対立体配置Ｓ体
【産業上の利用可能性】
【０００８】
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ  ｓｔｒａｉｎ  ７由来エステラーゼを用いることによって、ＰＬＥで得られるものと逆の立体配置のハーフエステルが得られた。さらに、好熱性の酵素を用いることにより、ドミノ型反応を行うことに成功した。この様に一つの反応容器内で起こる連続した反応をドミノ型反応と言うが、このような例はこれが始めてである。
本発明の方法又は触媒組成物を用いることにより、ジカルボン酸エステルより医薬品や農薬の中間体となる光学活性カルボン酸を製造することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図９】
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