(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）；
【化１】
0005474280.tif 000012
（式中、Ｒ１は直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表す。Ｒ２はアミノ基の保護基を表す。）で表される含窒素環状β−ケトエステルもしくはその塩のカルボニル基を立体選択的に還元する能力を有する酵素源を作用させることによる、一般式（２）；
【化２】
0005474280.tif 000013
（式中、Ｒ１、Ｒ２は前記と同じ。）で表される光学活性なｔｒａｎｓ体含窒素環状β−ヒドロキシエステルの製造方法であって、前記酵素源が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）；ＦＥＲＭ  ＢＰ‐６８９８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＧＧ１）；ＦＥＲＭ  ＢＰ‐７８５８、リポマイセス・スターケイー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉ）ＩＦＯ ０６７８、スフィンゴバクテリウム・スピリチボラム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｉｒｉｔｉｖｏｒｕｍ）ＩＦＯ １４９４８、もしくはトリコスポロン・キュタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｃｕｔａｎｅｕｍ）ＩＦＯ １１９８の菌体、培養液、及び、それらの処理物のいずれかであることを特徴とする、光学活性なｔｒａｎｓ体含窒素環状β−ヒドロキシエステルの製造方法。
【請求項２】
一般式（１）；
【化３】
0005474280.tif 000014
（式中、Ｒ１は直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表す。Ｒ２はアミノ基の保護基を表す。）で表される含窒素環状β−ケトエステルもしくはその塩のカルボニル基を立体選択的に還元する能力を有する酵素源を作用させることによる、一般式（３）；
【化４】
0005474280.tif 000015
（式中、Ｒ１、Ｒ２は前記と同じ。）で表される光学活性なｔｒａｎｓ体含窒素環状β−ヒドロキシエステルの製造方法であって、前記酵素源が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＳＢＧ１）；ＦＥＲＭ  ＢＰ‐７１１９、ブレブンディモナス・ディミヌータ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）ＩＦＯ ３１４０、クルイベロマイセス・ポリスポラス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｓ）ＩＦＯ ０９９６、サッカロマイセス・バヤナス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）ＩＦＯ０２５１、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＩＦＯ０２０９、又は、トリコスポロン・アステロイドス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＩＦＯ ０１７３の菌体、培養液、及び、それらの処理物のいずれかであることを特徴とする、光学活性なｔｒａｎｓ体含窒素環状β−ヒドロキシエステルの製造方法。
【請求項３】
一般式（４）；
【化５】
0005474280.tif 000016
（式中、Ｒ１は直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表す。Ｒ２はアミノ基の保護基を表す。）で表される含窒素環状β−ケトエステルもしくはその塩のカルボニル基を立体選択的に還元する能力を有する酵素源を作用させることによる、一般式（５）；
【化６】
0005474280.tif 000017
（式中、Ｒ１、Ｒ２は前記と同じ。）で表される光学活性なｔｒａｎｓ体含窒素環状β−ヒドロキシエステルの製造方法であって、前記酵素源が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＳＣＳ）；ＦＥＲＭ  ＢＰ‐１００２４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）；ＦＥＲＭ  ＢＰ‐８４５８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＳＧＧ１）；ＦＥＲＭ  Ｐ‐１８４４９の菌体、培養液、及び、それらの処理物のいずれかであることを特徴とする、光学活性なｔｒａｎｓ体含窒素環状β−ヒドロキシエステルの製造方法。
【請求項４】
一般式（４）；
【化７】
0005474280.tif 000018
（式中、Ｒ１は直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表す。Ｒ２はアミノ基の保護基を表す。）で表される含窒素環状β−ケトエステルもしくはその塩のカルボニル基を立体選択的に還元する能力を有する酵素源を作用させることによる、一般式（６）；
【化８】
0005474280.tif 000019
（式中、Ｒ１、Ｒ２は前記と同じ。）で表される光学活性なｔｒａｎｓ体含窒素環状β−ヒドロキシエステルの製造方法であって、前記酵素源が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｇ）；ＦＥＲＭ  ＢＰ‐５８３５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＦＰＧ）；ＦＥＲＭ  ＢＰ‐７１１７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＧＧ１）；ＦＥＲＭ  ＢＰ‐７８５８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＳＢＧ１）；ＦＥＲＭ  ＢＰ‐７１１９の菌体、培養液、及び、それらの処理物のいずれかであることを特徴とする、光学活性なｔｒａｎｓ体含窒素環状β−ヒドロキシエステルの製造方法。
【請求項５】
Ｒ１が直鎖もしくは分岐鎖状の炭素数１〜１０のアルキル基である、請求項１から４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
Ｒ１がメチル基、エチル基のいずれかである請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド、及び／または、酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチドリン酸をそれぞれの還元型へ還元する酵素と、該還元のための基質を、共存させることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド、及び／または、酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチドリン酸をそれぞれの還元型へ還元する酵素がグルコース脱水素酵素もしくはギ酸脱水素酵素である、請求項７に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
光学活性なｔｒａｎｓ体含窒素環状β−ヒドロキシエステルの製造法に関する。光学活性なｔｒａｎｓ体含窒素環状β−ヒドロキシエステルは、医薬品、農薬等の合成原料及び中間体として有用な化合物である。
【背景技術】
【０００２】
本発明の化合物に類似する物質の製造法としては、従来、以下の様な方法が知られている。
【０００３】
例えば、１−置換−４−ヒドロキシピロリジン−３−カルボン酸エステルの製造法としては、
（１）水素化ホウ素リチウムによって１−ベンジル−４−ピロリジノン−３−カルボン酸エチルエステルを１−ベンジル−４−ヒドロキシピロリジン−３−カルボン酸エチルエステルに還元する方法（非特許文献１）、
（２）ラセミ体のｔｒａｎｓ−１−ベンジル−４−ヒドロキシピロリジン−３−カルボン酸エチルエステルをＮｏｖｏｚｙｍｅ４３５リパーゼによって光学分割し、光学活性なｔｒａｎｓ−１−ベンジル−４−ヒドロキシピロリジン−３−カルボン酸エチルエステルを得る方法（特許文献１）、
がある。しかしながら、（１）の方法では生成物がｃｉｓ体とｔｒａｎｓ体の混合物であり、しかも得られるｔｒａｎｓ体はラセミ体である。また、（２）の方法では、原料であるラセミ体ｔｒａｎｓ−１−置換−４−ヒドロキシピロリジン−３−カルボン酸エステルを煩雑な操作により合成する必要があり、かつリパーゼを用いた光学分割反応であるため、収率は最高でも５０％である。
【０００４】
また、１−置換−４−ヒドロキシピペリジン−３−カルボン酸エステルの製造法としては、
（３）パン酵母の作用によって１−置換−４−ピペリジノン−３−カルボン酸エステルを光学活性なｃｉｓ−１−置換−４−ヒドロキシピペリジン−３−カルボン酸エステルへ立体選択的に還元する方法（非特許文献２、３、４）、
（４）豚肝臓リパーゼの作用によってラセミ体のｔｒａｎｓ−Ｎ−置換−４−ベンゾイロキシピペリジン−３−カルボン酸メチルエステルを光学分割し、光学活性なｔｒａｎｓ−Ｎ−置換−４−ヒドロキシピペリジン−３−カルボン酸メチルエステルを得る方法（非特許文献５）、
（５）リパーゼの作用によってラセミ体のｔｒａｎｓ−１−Ｂｏｃ−４−ヒドロキシピペリジン−３−カルボン酸エチルエステルを光学分割し、光学活性なｔｒａｎｓ−１−Ｂｏｃ−４−ヒドロキシピペリジン−３−カルボン酸エチルエステルを得る方法（非特許文献６）、
が知られている。
【０００５】
しかしながら、（３）の方法で得られる含窒素環状β−ヒドロキシエステルの９５％以上はｃｉｓ体である。また、（４）及び（５）の方法では、原料であるラセミ体ｔｒａｎｓ−１−置換−４−ピペリジノン−３−カルボン酸エステルを煩雑な操作により合成する必要があり、かつリパーゼを用いた光学分割反応であるため、収率は最高でも５０％である。
【０００６】
このように、不斉触媒を用いた還元反応による光学活性なｔｒａｎｓ−１−置換−４−ヒドロキシピロリジン−３−カルボン酸エステル及びｔｒａｎｓ−１−置換−４−ヒドロキシピペリジン−３−カルボン酸エステルの製造法は報告されていない。
【特許文献１】国際公報  第２００５／０３３０７６号  パンフレット
【非特許文献１】Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ，３０，７４０（１９６５）
【非特許文献２】Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ．Ｃｈｉｍｉｃａ．Ａｃｔａ，７０，１６０５（１９８７）
【非特許文献３】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，４，６２５（１９９３）
【非特許文献４】Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ．Ｔｒａｎｓ1，３６７３（１９９８）
【非特許文献５】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，１１，４３９７（２０００）
【非特許文献６】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，１５，３２８１（２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、医薬品の中間体として有用な光学活性なｔｒａｎｓ体含窒素環状β−ヒドロキシエステルを安価で入手容易な原料から簡便に製造できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、光学活性なｔｒａｎｓ体含窒素環状β−ヒドロキシエステルの効率的な製造法を開発すべく検討を重ねた結果、光学活性なｔｒａｎｓ体含窒素環状β−ケトエステルのカルボニル基のみを立体選択的に還元して、光学活性なｔｒａｎｓ体含窒素環状β−ヒドロキシエステル類に変換する方法を発見し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明は、以下の１又は複数の特徴を有する。
【００１０】
即ち、本発明は、一般式（１）；
【００１１】
【化４】
0005474280.tif 000002
【００１２】
（式中、Ｒ１は直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表す。Ｒ２はアミノ基の保護基を表す。ｍは１もしくは２を表す。）で表される含窒素環状β−ケトエステルもしくはその塩を不斉還元反応により、一般式（２）；
【００１３】
【化５】
0005474280.tif 000003
【００１４】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びｍは前記と同じ。）もしくは、一般式（３）；
【００１５】
【化６】
0005474280.tif 000004
【００１６】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びｍは前記と同じ。）で表される光学活性なｔｒａｎｓ体含窒素環状β−ヒドロキシエステルのいずれかに変換することを特徴とする、前記式（２）及び（３）で表される光学活性なｔｒａｎｓ体含窒素環状β−ヒドロキシエステルの製造方法である。
【００１７】
好ましくは、前記触媒としてカルボニル基を立体選択的に還元する能力を有する酵素源を作用させることを特徴とする上記製造方法である。
【００１８】
更に好ましくは、前記化合物が１−置換−４−ヒドロキシピロリジン−３−カルボン酸エステルもしくは１−置換−４−ヒドロキシピペリジン−３−カルボン酸エステルであり、前記酵素源が、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、リポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属、ロドトルーラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ブレブンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ属）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、スフィンゴバクテリウム属（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属からなる群より選ばれた微生物由来のものである製造方法である。
【００１９】
別の好ましい実施態様としては、酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド（以降ＮＡＤ＋と省略する）及び／または酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチドりん酸（以降ＮＡＤＰ＋と省略する）をそれぞれの還元型へ還元する酵素と、該還元のための基質を、共存させることを特徴とする上記製造方法である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によって、医薬品及び農薬等の合成原料及び中間体として有用な光学活性なｔｒａｎｓ体含窒素環状β−ヒドロキシエステルの効率的かつ工業的な製造方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明について詳述する。
【００２２】
本発明の不斉還元反応の基質となる含窒素環状β−ケトエステル類は一般式（１）；
【００２３】
【化７】
0005474280.tif 000005
【００２４】
（式中、Ｒ１は直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表す。Ｒ２はアミノ基の保護基を表す。ｍは１もしくは２を表す。）で表される含窒素環状β−ケトエステルもしくはその塩である。前記一般式（１）の環状部分はｍ＝１の５員環もしくはｍ＝２の６員環である。
【００２５】
前記一般式（１）のＲ１は、直鎖もしくは分岐鎖状の炭素数１〜１０のアルキル基が好ましい。
【００２６】
さらに好ましくは前記一般式（１）のＲ１がメチル基もしくはエチル基である。
【００２７】
また、前記一般式（１）のＲ２は一般的なアミノ基の保護基であることが好ましい。例えば、「ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ」（ＪＯＨＮ  ＷＩＬＥＹ  ＆  ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．）に記載の保護基がある。すなわちｔ−ブトキシカルボニル基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、パラメトキシベンジルオキシカルボニル基、パラニトロベンジルオキシカルボニル基、ホルミル基、アセチル基、プロパノイル基、ｔ−ブチロイル基、メトキシアセチル基、フルオロアセチル基、ジフルオロアセチル基、トリフルオロアセチル基、クロロアセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、ベンジル基、α−メチルベンジル基、トリチル基、ベンズヒドリル基、パラニトロベンジル基およびパラメトキシベンジル基からなる群より選ばれた保護基である。
【００２８】
さらに好ましくは前記一般式（１）のＲ２がベンジル基である。
【００２９】
前記式（１）で表される化合物の一例としては、１−ベンジル−４−ピロリジノン−３−カルボン酸メチルエステルや１−ベンジル−４−ピペリジノン−３―カルボン酸エチルエステルなどが挙げられる。
【００３０】
本発明においては、触媒を用いて、上記一般式（１）で表される化合物のカルボニル基を不斉還元し、一般式（２）：
【００３１】
【化８】
0005474280.tif 000006
【００３２】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びｍは前記と同じ。）もしくは、一般式（３）；
【００３３】
【化９】
0005474280.tif 000007
【００３４】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びｍは前記と同じ。）で表される光学活性なｔｒａｎｓ体含窒素環状β−ヒドロキシエステルに変換する。
【００３５】
前記触媒としてはカルボニル基を立体選択的に還元する酵素であることが好ましい。
【００３６】
また、上記一般式（２）及び（３）は具体的には、ｔｒａｎｓ−１−ベンジル−４−ヒドロキシピロリジン−３−カルボン酸メチルエステルやｔｒａｎｓ−１−ベンジル−４−ヒドロキシピペリジン−３―カルボン酸エチルエステルに相当する。
【００３７】
なお、ここでいう「光学活性」とは、考えられる各種光学異性体のうち、ひとつの光学異性体の光学純度が高いことをいう。
【００３８】
本発明において前記一般式（２）あるいは（３）で表される光学活性なｔｒａｎｓ体含窒素環状β−ヒドロキシエステルにおいては、光学純度は５０％ｅ．ｅ．以上が好ましく、より好ましくは９０％ｅ．ｅ．以上、さらに好ましくは９９％ｅ．ｅ．以上である。
【００３９】
また、不斉還元によって生成する含窒素環状β−ヒドロキシエステルのｔｒａｎｓ体比は２０％以上が好ましく、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは９０％以上である。
【００４０】
なお、ｔｒａｎｓ体比は高速液体クロマトグラフィーなどで含窒素環状β−ヒドロキシエステルを分析し、「ｔｒａｎｓ体のピーク面積÷（ｔｒａｎｓ体のピーク面積＋ｃｉｓ体のピーク面積）×１００」で求めることができる。
【００４１】
また、光学純度は下記式より求めた。
ｔｒａｎｓ体の内、一般式（２）で示される光学異性体が主生成物である場合：
（一般式（２）で示される光学異性体の光学純度（％ｅ．ｅ．）＝｛（一般式（２）のピーク面積）−（一般式（３）のピーク面積）｝÷｛（一般式（２）のピーク面積）＋（一般式（３）のピーク面積）｝×１００
ｔｒａｎｓ体の内、一般式（３）で示される光学異性体が主生成物である場合：
（一般式（３）で示される光学異性体の光学純度（％ｅ．ｅ．）＝｛（一般式（３）のピーク面積）−（一般式（２）のピーク面積）｝÷｛（一般式（２）のピーク面積）＋（一般式（３）のピーク面積）｝×１００
本発明で使用される酵素源は、上記含窒素環状β−ケトエステル類を光学活性なｔｒａｎｓ体含窒素環状β−ヒドロキシエステル類に不斉還元する能力を有する微生物由来のものを用いることが出来る。
【００４２】
ここでいう「微生物由来のもの」としては、該微生物の菌体そのもの、微生物の培養液、あるいは菌体処理物、または該微生物から得られる酵素であってもよいし、さらには該微生物由来の上記還元活性を有する酵素をコードするＤＮＡが導入された形質転換体も含む。
【００４３】
上記微生物の菌体処理物としては特に限定されず、例えば、アセトンや五酸化二リンによる脱水処理またはデシケーターや扇風機を利用した乾燥によって得られる乾燥菌体、界面活性剤処理物、溶菌酵素処理物、固定化菌体または菌体を破砕した無細胞抽出標品などをあげることができる。更に、培養物より不斉還元反応を触媒する酵素を精製し、これを使用してもよい。
【００４４】
これらを単独で用いても、２種以上組み合わせて用いても良い。また、これら酵素源は周知の方法で固定化して用いても構わない。
【００４５】
含窒素環状β−ケトエステル類を光学活性なｔｒａｎｓ体含窒素環状β−ヒドロキシエステル類に不斉還元する能力を有する微生物は、以下に説明する方法によって見いだすことができる。
【００４６】
例えば、以下のようにして行う。グルコース４０ｇ、酵母エキス３ｇ、リン酸水素二アンモニウム６．５ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．８ｇ、硫酸亜鉛七水和物６０ｍｇ、硫酸鉄七水和物９０ｍｇ、硫酸銅五水和物５ｍｇ、硫酸マンガン四水和物１０ｍｇ、塩化ナトリウム１００ｍｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）５ｍｌを試験管に入れて殺菌後、無菌的に微生物を接種し、３０℃で２〜３日間振とう培養する。
【００４７】
その後、菌体を遠心分離により集め、グルコース２〜１０％を含んだリン酸緩衝液１〜５ｍｌに懸濁し、あらかじめ１−ベンジル−４−ピロリジノン−３−カルボン酸メチルエステルを２．５〜２５ｍｇいれた試験管に加えて、２〜３日間３０℃で振とうする。この際、遠心分離により得た菌体をデシケーター中またはアセトンにより乾燥したものを用いることもできる。更に、これら微生物もしくはその処理物と含窒素環状β−ケトエステル類を反応させる際に、ＮＡＤ＋及び／またはＮＡＤＰ＋と、グルコース脱水素酵素及びグルコース、もしくはギ酸脱水素酵素及びギ酸、を添加してもよい。また、反応系に有機溶媒を共存させてもかまわない。
【００４８】
変換反応ののち適当な有機溶媒で抽出を行ない、生成する１−ベンジル−４−ヒドロキシピロリジン−３−カルボン酸メチルエステルを高速液体クロマトグラフィーなどにより分析する。
【００４９】
本発明に使用しうる微生物としては、含窒素環状β−ケトエステル類をｔｒａｎｓ体含窒素環状β−ヒドロキシエステル類に不斉還元する能力を有する微生物であればいずれも使用しうるが、例えば、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、リポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属、ロドトルーラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ブレブンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ属）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、スフィンゴバクテリウム属（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物等が挙げられる。
【００５０】
特に、絶対立体配置が一般式（２）であるｔｒａｎｓ体含窒素環状β−ヒドロキシエステル類に変換しようとする場合には、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、リポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属、ロドトルーラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ブレブンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ属）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、スフィンゴバクテリウム属（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物が好ましい。更に好ましくは、キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）、キャンディダ・パラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、リポマイセス・スターケイー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙｉ）、ロドトルーラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、トリコスポロン・アステロイドス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ブレブンディモナス・ディミヌータ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）、セルロモナス・エスピー（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａ ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、スフィンゴバクテリウム・スピリチボラム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｉｒｉｔｉｖｏｒｕｍ）などがあげられる。
【００５１】
特に、絶対立体配置が一般式（３）であるｔｒａｎｓ体含窒素環状β−ヒドロキシエステル類に変換しようとする場合には、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ブレブンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ属）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物が好ましい。
【００５２】
更に好ましくは、キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）、キャンディダ・マリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｒｉｓ）、キャンディダ・パラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、クルイベロマイセス・ポリスポラス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｓ）、サッカロマイセス・バヤナス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｌａｅ）、トリコスポロン・キュタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ）、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、ブレブンディモナス・ディミヌータ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）、デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａ ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓ）などがあげられる。
【００５３】
これら微生物は一般に、入手または購入が容易な保存株から得ることができるが、自然界から分離することもできる。なお、これらの微生物に変異を生じさせて、より本反応に有利な性質を有する菌株を得ることもできる。
【００５４】
これらの微生物の培養には、通常これらの微生物が資化しうる栄養源を含む培地であれば何でも使用しうる。例えば、グルコース、シュークロース、マルトース等の糖類、乳酸、酢酸、クエン酸、プロピオン酸等の有機酸類、エタノール、グリセリン等のアルコール類、パラフィン等の炭化水素類、大豆油、菜種油等の油脂類、またはこれらの混合物等の炭素源；硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、コーンスチープリカー等の窒素源；更に、その他の無機塩、ビタミン類等の栄養源；を適宜混合・配合した通常の培地を用いることが出来る。これら培地は用いる微生物の種類によって適宜選択すればよい。
【００５５】
微生物の培養は通常一般の条件により行なうことができ、例えば、ｐＨ４．０〜９．５、温度範囲２０℃〜４５℃の範囲で、好気的に１０〜９６時間培養するのが好ましい。含窒素環状−β−ケトエステル類に微生物を反応させる場合においては、通常、上記微生物の菌体を含んだ培養液をそのまま反応に使用することもできるが、培養液の濃縮物も用いることができる。また、培養液中の成分が反応に悪影響を与える場合には、培養液を遠心分離等により処理して得られる菌体または菌体処理物を使用することもできる。
【００５６】
上記微生物の菌体処理物としては特に限定されず、例えば、アセトンや五酸化二リンによる脱水処理またはデシケーターや扇風機を利用した乾燥によって得られる乾燥菌体、界面活性剤処理物、溶菌酵素処理物、固定化菌体または菌体を破砕した無細胞抽出標品などをあげることができる。更に、培養物より不斉還元反応を触媒する酵素を精製し、これを使用してもよい。
【００５７】
還元反応の際には、基質である含窒素環状−β−ケトエステルを反応の初期に一括して添加してもよく、反応の進行にあわせて分割して添加してもよい。反応時の温度は通常１０〜６０℃、好ましくは、２０〜４０℃であり、反応時のｐＨは２．５〜９、好ましくは、５〜９の範囲である。反応液中の酵素源の量はこれらの基質を還元する能力に応じ適宜決定すればよい。また、反応液中の基質濃度は０．０１〜５０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、より好ましくは、０．１〜３０％（Ｗ／Ｖ）である。反応は通常、振とうまたは通気攪拌しながら行なう。反応時間は基質濃度、酵素源の量及びその他の反応条件により適宜決定される。通常、２〜１６８時間で反応が終了するように各条件を設定することが好ましい。
【００５８】
還元反応を促進させるために、反応液にグルコース、エタノール、イソプロパノールなどのエネルギー源を０．５〜３０％の割合で加えると優れた結果が得られるので好ましい。一般に生物学的方法による還元反応に必要とされている還元型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド（以降ＮＡＤＨと省略する）、還元型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチドりん酸（以降ＮＡＤＰＨと省略する）等の補酵素を添加することにより、反応を促進させることもできる。この場合、具体的には、反応液に直接これらを添加する。
【００５９】
また、還元反応を促進させるために、ＮＡＤ＋及び／またはＮＡＤＰ＋をそれぞれの還元型へ還元する酵素と、該還元のための基質を共存させて反応を行うと優れた結果が得られるので好ましい。例えば、還元型へ還元する酵素としてグルコース脱水素酵素、還元のための基質としてグルコースをそれぞれ共存させるか、または、還元型へ還元する酵素としてギ酸脱水素酵素、還元のための基質としてギ酸をそれぞれ共存させる。
【００６０】
本発明の還元反応を触媒する酵素のかわりに、該酵素をコードするＤＮＡを含む形質転換体を使用しても、同様にｔｒａｎｓ体含窒素環状β−ヒドロキシエステル類を製造することができる。また、該酵素をコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体を使用しても、同様に光学活性なｔｒａｎｓ体含窒素環状β−ヒドロキシエステル類を製造することができる。とりわけ、該酵素をコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体を使用した場合には、補酵素を再生するための酵素を別途調製・添加する必要がなく、ｔｒａｎｓ体含窒素環状β−ヒドロキシエステル類の製造をより効率良く行うことができる。
【００６１】
なお、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む形質転換体、若しくは、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡおよび補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体は、培養菌体は言うまでもなく、その処理物としてもｔｒａｎｓ体含窒素環状β−ヒドロキシエステル類の製造に使用することができる。ここで言う形質転換体の処理物とは、例えば、界面活性剤や有機溶媒で処理した細胞、乾燥細胞、破砕処理した細胞、細胞の粗抽出液等のほか、公知の手段でそれらを固定化したものを意味する。
【００６２】
該酵素をコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体は、該酵素をコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を、同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られるほか、これら２種のＤＮＡを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それら２種のベクターを同一の宿主細胞に導入することによっても得られる。
【００６３】
該酵素をコードするＤＮＡ及び補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者が組込まれたベクターの例としては、ＷＯ０１／０４０４５０公報に記載のキャンディダ・マグノリエ由来の酸化還元酵素遺伝子を含む発現ベクターｐＮＴＣＲに、バシラス・メガテリウム由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を導入した、ｐＮＴＣＲＧが挙げられる。また、該酵素をコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体の例としては、当該ベクターでＥ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１を形質転換して得られる、Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）が挙げられる。本形質転換微生物は受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８９８として、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【００６４】
該酵素をコードするＤＮＡを含む形質転換体の培養、および、該酵素をコードするＤＮＡと補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体の培養は、それらが増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いて実施できる。
【００６５】
また更に、トリトン（ナカライテスク株式会社製）、スパン（関東化学株式会社製）、ツイーン（ナカライテスク株式会社製）などの界面活性剤を反応液に添加することも効果的である。更に、基質及び／または還元反応の生成物であるアルコール体による反応の阻害を回避する目的で、酢酸エチル、酢酸ブチル、イソプロピルエーテル、トルエン、ヘキサンなどの水に不溶な有機溶媒を反応液に添加してもよい。更に、基質の溶解度を高める目的で、メタノール、エタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドなどの水に可溶な有機溶媒を添加することもできる。
【００６６】
還元反応により生成したｔｒａｎｓ体含窒素環状β−ヒドロキシエステル類の採取は、特に限定されないが、反応液から直接、あるいは菌体等を分離後、酢酸エチル、トルエン、ｔ−ブチルメチルエーテル、ヘキサン等の溶剤で抽出し、脱水後、蒸留やシリカゲルカラムクロマトグラフィー等により精製すれば高純度のｔｒａｎｓ体含窒素環状β−ヒドロキシエステル類を容易に得ることができる。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。なお、以下の記載において、「％」は特に断らない限り「重量％」を意味する。
（参考例１）１−ベンジル−４−ピロリジノン−３―カルボン酸メチルエステルナトリウム塩の調製法
１−ベンジル−４−ピロリジノン−３―カルボン酸メチルエステルナトリウム塩は、特開昭５４−１６４６６号公報に開示されている方法を参考に合成した。
【００６８】
まず、ベンジルアミン１５．０ｇをメタノール１３．８ｇに溶解し、アクリル酸メチル１２．７ｇを少しずつ滴下し、３５℃で攪拌しながら５時間反応した。生成物を９０℃で濃縮した後、トルエン２４．７ｇ、炭酸カリウム１７．７ｇを加え、９０℃に加熱した。加熱後、モノクロロ酢酸メチル２０．８ｇを滴下し、１７時間反応した。反応後、室温まで冷却し、４９．５ｇの水を加えクエンチした。有機層を分離後、エバポレーターで濃縮した。この濃縮溶液４０．５ｇにトルエン４６．３ｇ、２８％ナトリウムメトキサイド３６．５ｇを加え、２５℃で反応した。生成した結晶をろ過により分離後、真空乾燥し、１−ベンジル−４−ピロリジノン−３−カルボン酸メチルエステルナトリウム塩２３．６ｇを得た。
（参考例２）１−ベンジル−４−ピロリジノン−３−カルボン酸メチルエステルの調製法
１−ベンジル−４−ピロリジノン−３−カルボン酸メチルエステルナトリウム塩１０ｇを５０ｍｌの水に溶解し、６Ｎ  ＨＣｌを用いて、ｐＨ７に調整した。この溶液にｔ−ブチルメチルエーテル１００ｍｌを加えて抽出し、有機層を減圧下で留去し、オイル状の１−ベンジル−４−ピロリジノン−３−カルボン酸メチルエステルを得た。
【００６９】
（参考例３）１−ベンジル−４−ピロリジノン−３−カルボン酸エチルエステルの調製法
Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３０，７４０（１９６４）に記載の方法を参考に調製した。
【００７０】
まず、ベンジルアミン２０．０ｇをエタノール１８．４ｇに溶解し、アクリル酸エチル１９．６ｇを少しずつ滴下し、３５℃で攪拌しながら５時間反応した。生成物を９０℃で濃縮した後、トルエン３８．７ｇ、炭酸カリウム１８．７ｇを加え、９０℃に加熱した。加熱後、モノクロロ酢酸メチル３８．７ｇを滴下し、１７時間反応した。反応後、室温まで冷却し、７７．４ｇの水を加えクエンチした。有機層を分離後、エバポレーターで濃縮した。この濃縮溶液２０ｇにトルエン１００ｇ、ｔ−ブトキシカリウム８ｇを加え、攪拌しながら５℃で反応した。反応液に５０ｇの水を加え、水層を分離した。次に、水層から塩酸で飽和したジエチルエーテル５０ｇで生成物を抽出した。有機層をエバポレーターで濃縮し、１−ベンジル−４−ピロリジノン−３−カルボン酸エチルエステル１１ｇを得た。
【００７１】
（参考例４）ブレブンディモナス・ディミヌータ由来の還元酵素の精製
本発明者らは、Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エチルをＮ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルに還元するブレブンディモナス・ディミヌータ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）由来の還元酵素ＲＢＤが１−ベンジル−４−ピロリジノン−３−カルボン酸メチルエステルを（３Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシピロリジン−３−カルボン酸メチルエステルに変換することを発見した。実施例６で用いた還元酵素ＲＢＤの精製方法について以下に示す。
【００７２】
まず、ブレブンディモナス・ディミヌータ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）ＮＢＲＣ１２６９７株より、還元酵素活性を有するポリペプチドを分離し、単一に精製した。特に断りのない限り、精製操作は４℃で行った。
【００７３】
還元酵素活性は以下のように算出した。まず、試験管に適量の粗酵素液と１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を加えて、総量で０．５ｍｌにする。さらにＮＡＤＨ１ｍｇ、基質としてＮ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−オキソプロピオン酸エチル０．２５ｍｇを加えて、振とうしながら３０℃で２時間反応させた。反応後、酢酸エチル１ｍｌを加えて抽出を行った。
【００７４】
生成したＮ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルの定量は、キャピラリーガスクロマトグラフィー（カラム：ＧＬサイエンス株式会社製ＩｎｅｒｔＣＡＰ５（ＩＤ０．２５ｍｍ×３０ｍ）、カラム温度：２００℃、キャリアガス：ヘリウム（７０ｋＰａ）、検出：ＦＩＤ）を用いて行った。
【００７５】
生成したＮ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルの量から酵素活性を算出した。なお、本反応条件において１分間に１μｍｏｌのＮ−Ｂｏｃ−２−アミノ−３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシプロピオン酸エチルを生成する活性を、１ｕｎｉｔと定義した。
【００７６】
（微生物の培養）
５Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製）に、肉エキス１０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、アデカノールＬＧ−１０９（日本油脂製）０．１ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）３Ｌを調製し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌をおこなった。この培地に、予め同培地にて前培養しておいたブレブンディモナス・ディミヌータ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）ＮＢＲＣ１２６９７株の培養液を１５ｍｌ接種し、攪拌回転数４５０ｒｐｍ、通気量０．９ＮＬ／ｍｉｎ、３０℃で１６時間培養を行った。
【００７７】
（無細胞抽出液の調製）
上記の培養液から遠心分離により菌体を集め、０．８％塩化ナトリウム水溶液を用いて菌体を洗浄した。この菌体を、５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、ＳＯＮＩＦＩＥＲ２５０型超音波破砕機（ＢＲＡＮＳＯＮ社製）を用いて破砕した後、遠心分離にて菌体残渣を除き、無細胞抽出液を得た。
【００７８】
（ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィー）
上記の無細胞抽出液を、５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（４００ｍｌ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、ＮａＣｌのリニアグラジエント（０Ｍから０．３Ｍまで）により活性画分を溶出させた。
【００７９】
（Ｐｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィー）
ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分に終濃度１.０Ｍとなるよう硫酸アンモニウム及び終濃度１０％となるようにグリセリンを溶解し、１.０Ｍの硫酸アンモニウム及び５ｍＭのβ−メルカプトエタノール及び１０％のグリセリンを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＰｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（５０ｍｌ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウムのリニアグラジエント（１.０Ｍから０Ｍまで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール及び１０％グリセリンを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて一晩透析した。
【００８０】
（５’−ＡＭＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムクロマトグラフィー）
Ｐｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分を、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール及び１０％グリセリンを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化した５’−ＡＭＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６  ４Ｂ（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）カラム（１４ｍｌ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、ＮａＣｌのリニアグラジエント（０Ｍから２Ｍまで）により活性画分を溶出させ、電気泳動的に単一なポリペプチドの精製標品を得た。
（実施例１）（３Ｓ，４Ｒ）又は（３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシピロリジン−３−カルボン酸メチルエステルの製造
グルコース４０ｇ、酵母エキス３ｇ、リン酸水素二アンモニウム６．５ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．８ｇ、硫酸亜鉛七水和物６０ｍｇ、硫酸鉄七水和物９０ｍｇ、硫酸銅五水和物５ｍｇ、硫酸マンガン四水和物１０ｍｇ、塩化ナトリウム１００ｍｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）５ｍｌを大型試験管に分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。
【００８１】
これらの液体培地に表１に示す微生物を無菌的に一白金耳接種して、３０℃で７２時間振とう培養した。培養後、各培養液を遠心分離にかけて菌体を集め、グルコース１％を含んだ１００ｍＭリン酸緩衝液０．６ｍｌ（ｐＨ６．５）に菌体を懸濁した。この菌体懸濁液を、あらかじめ１−ベンジル−４−ピロリジノン−３−カルボン酸メチルエステル６ｍｇをいれた試験管に加えて、３０℃で２４時間反応させた。反応後、各反応液に０．６ｍｌのｔ−ブチルメチルエーテルを加えてよく混合した。
【００８２】
２−プロパノールで希釈した有機層を下記分析条件で分析して、４−ヒドロキシピロリジン−３−カルボン酸メチルエステルへの変換率及びｔｒａｎｓ体比、光学純度を求めた。なお、下記分析条件１におけるｃｉｓ体及びｔｒａｎｓ体のピーク面積の和を１００％としたときのｔｒａｎｓ体の割合をｔｒａｎｓ体比と定義した。
［高速液体クロマトグラフィー分析条件１（変換率、ｔｒａｎｓ体比算出用）］
カラム：野村化学株式会社製Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ  ＨＧ−３（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ）
溶離液：１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液／メタノール＝６／４
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
検出：２１０ｎｍ
リテンションタイム：ｃｉｓ体  １８ｍｉｎ、ｔｒａｎｓ体  ２４ｍｉｎ
［高速液体クロマトグラフィー分析条件２（光学純度算出用）］
カラム：ダイセル化学工業株式会社製Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＯＢ−Ｈ（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）
溶離液：ｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝９５／５
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：２１０ｎｍ
リテンションタイム：ｃｉｓ体  ２４ｍｉｎ及び３４ｍｉｎ、（３Ｓ，４Ｒ）体  ２６ｍｉｎ、（３Ｒ，４Ｓ）体  ４０ｍｉｎ
結果を表１にまとめた。
【００８３】
【表１】
0005474280.tif 000008
【００８４】
（実施例２）（３Ｓ，４Ｒ）又は（３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシピロリジン−３−カルボン酸メチルエステルの製造
肉エキス１０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム３ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）７ｍｌを大型試験管に分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。これらの液体培地に表２に示す微生物を無菌的に一白金耳接種して、３０℃で７２時間振とう培養した。
【００８５】
培養後、各培養液を遠心分離にかけて菌体を集め、グルコース１％を含んだ１００ｍＭリン酸緩衝液０．６ｍｌ（ｐＨ６．５）に菌体を懸濁した。この菌体懸濁液を、あらかじめ１−ベンジル−４−ピロリジノン―３―カルボン酸メチルエステル６ｍｇをいれた試験管に加えて、３０℃で２４時間反応させた。
【００８６】
反応終了後、実施例１と同様に分析し、変換率とｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシピロリジン−３−カルボン酸メチルエステルの光学純度を分析した。
【００８７】
結果を表２にまとめた。
【００８８】
【表２】
0005474280.tif 000009
【００８９】
（実施例３）（３Ｓ，４Ｒ）又は（３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシピロリジン−３−カルボン酸メチルエステルの製造
トリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ＝７）５０ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。これらの液体培地に表３に示す各種組み換え大腸菌を無菌的に一白金耳接種して、３７℃で７２時間振とう培養した。
【００９０】
培養後、各培養液０．９ｍｌ、１−ベンジル−４−ピロリジノン−３−カルボン酸メチルエステルナトリウム塩１０ｍｇ、ＮＡＤ（またはＮＡＤＰ） １ｍｇ、グルコース１０ｍｇ、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）０．１ｍｌを試験管に加えて、３０℃で２４時間反応させた。
【００９１】
反応終了後、実施例１と同様に分析し、変換率と生成物の光学純度を分析した。
【００９２】
結果を表３にまとめた。受託番号が示してある組換え菌は日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【００９３】
【表３】
0005474280.tif 000010
【００９４】
（実施例４）（３Ｓ，４Ｓ）又は（３Ｒ，４Ｒ）−４−ヒドロキシピペリジン−３−カルボン酸エチルエステルの製造
トリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ 、ＮａＣｌ  ５ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ＝７）５０ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。これらの液体培地に表３に示す各種組み換え大腸菌を無菌的に一白金耳接種して、３０℃で７２時間振とう培養した。
【００９５】
培養後、各培養液０．９ｍｌをあらかじめ１−ベンジル−４−ピペリジノン−３―カルボン酸エチルエステル１０ｍｇをいれた試験管に加えて、ＮＡＤ（またはＮＡＤＰ）１ｍｇ、グルコース１０ｍｇ、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）０．１ｍｌを添加し、３０℃で２４時間反応させた。
【００９６】
反応後、各反応液に０．６ｍｌのｔ−ブチルメチルエーテルを加えてよく混合した。２−プロパノールで希釈した有機層を下記分析条件で分析して、変換率とｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシピペリジン−３−カルボン酸エチルエステルのｔｒａｎｓ体比及び光学純度を求めた。
［高速液体クロマトグラフィー分析条件３（変換率）］
カラム：野村化学株式会社製Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ  ＨＧ−３（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ）
溶離液：１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液／アセトニトリル＝６／４
流速：０．７ｍｉｎ／ｍｌ
検出：２１０ｎｍ
リテンションタイム：１−ベンジル−４−ヒドロキシピペリジン−３―カルボン酸エチルエステル体  ８ｍｉｎ
［高速液体クロマトグラフィー分析条件４（ｔｒａｎｓ体比、光学純度算出用）］
カラム：ダイセル化学工業株式会社製Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＪ（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ×２本）
溶離液：ｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝９／１
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出：２１０ｎｍ
リテンションタイム：ｃｉｓ体  ３９ｍｉｎ、ｃｉｓ体  ４０ｍｉｎ、（３Ｓ，４Ｓ）体  ３０ｍｉｎ、（３Ｒ，４Ｒ）体  ３６ｍｉｎ
結果を表４にまとめた。受託番号が示してある組換え菌は日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【００９７】
【表４】
0005474280.tif 000011
【００９８】
（実施例５）（３Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシピロリジン−３−カルボン酸エチルエステルの製造
トリプトン１６ｇ 、酵母エキス１０ｇ 、ＮａＣｌ  ５ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ＝７）５０ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。これらの液体培地にこの液体培地に国際公開公報ＷＯ０１／０４０４５０号パンフレット記載のエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）を接種し、３７℃で７２時間振とう培養した。
【００９９】
培養後、各培養液０．９ｍｌ、１−ベンジル−４−ピロリジノン−３−カルボン酸エチルエステル１０ｍｇ、ＮＡＤＰ＋１ｍｇ、グルコース１０ｍｇ、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）０．１ｍｌを試験管に加えて、３０℃で２４時間反応させた。
【０１００】
反応終了後、実施例１と同様に分析し、生成物である（３Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシピロリジン−３−カルボン酸エチルエステルの生成量とその光学純度を定量したところ、５ｍｇ、ｔｒａｎｓ体比７９％、光学純度９９％ｅ．ｅ．以上であった。
（実施例６）（３Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシピロリジン−３−カルボン酸メチルエステルの製造
５０ｍｌの１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、グルコース３．５ｇ、ブレブンディモナス・ディミヌータ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）ＮＢＲＣ１２６９７株から参考例４に示した方法で調製した酸化還元酵素ＲＢＤ  １０００Ｕ、グルコース脱水素酵素「ＧＬＵＣＤＨ“Ａｍａｎｏ２”」（天野エンザイム株式会社製）５０ｍｇ、ＮＡＤ＋５ｍｇを加え、３０℃で攪拌しながら１−ベンジル−４−ピロリジノン−３−カルボン酸メチルエステルナトリウム塩を２時間毎に１ｇずつ４回添加した。その間、反応液は５Ｎ  ＮａＯＨ及び５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４によってｐＨ６．５に維持した。
【０１０１】
２４時間の反応ののち、反応液にｔ−ブチルメチルエーテル２００ｍｌを加えて抽出し、有機層を減圧下で留去し、オイル状の（３Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシピロリジン−３−カルボン酸メチルエステルを２．３ｇ得た。化学純度は７１．５％、ｔｒａｎｓ体比は８６．１％、光学純度は９９．９％ｅ．ｅ．以上であった。
（実施例７）（３Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシピロリジン−３−カルボン酸メチルエステルの製造
トリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ＝７）５０ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。この液体培地に国際公開公報ＷＯ０１／０４０４５０号パンフレット記載のエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）を接種し、３７℃で１８時間振とう培養した。
【０１０２】
得られた培養液５０ｍｌにＮＡＤＰ＋３ｍｇ、グルコース３．５ｇを加え、３０℃で攪拌しながら１−ベンジル−４−ピロリジノン−３−カルボン酸メチルエステルナトリウム塩を２時間毎に１ｇずつ４回添加した。反応中は５Ｎ  ＮａＯＨ及び５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４によって反応液のｐＨを６．５に維持した。
【０１０３】
反応終了後、反応液にｔ−ブチルメチルエーテル２００ｍｌを加えて抽出し、有機層を減圧下で留去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、オイル状の（３Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシピロリジン−３−カルボン酸メチルエステルを０．９４ｇ得た。ｔｒａｎｓ体比は９９．３％、光学純度は９９．９％ｅ．ｅ．以上であった。