(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラニュリン又はグラニュリン様化合物が、プログラニュリン、グラニュリン１、グラニュリン２、グラニュリン３、グラニュリン４、グラニュリン５、グラニュリン６、グラニュリン７、及びパラグラニュリンからなる群から選択される少なくとも１つの分子であって、前記グラニュリン又はグラニュリン様化合物を有効成分として含む、神経障害性疼痛のための予防治療剤。
【請求項２】
前記グラニュリン又はグラニュリン様化合物が前記分子のうちの１つをコードする核酸である、請求項１記載の予防治療剤。
【請求項３】
前記核酸が配列番号１〜１０のうちの１つによる核酸又はこれらの配列のうちの１つと少なくとも９０％同一である核酸である、請求項２記載の予防治療剤。
【請求項４】
前記グラニュリン又はグラニュリン様化合物がタンパク質又はペプチドである、請求項１記載の予防治療剤。
【請求項５】
前記グラニュリン又はグラニュリン様化合物が配列番号１１〜２０のうちの１つによるタンパク質若しくはペプチド、又はこれらの配列のうちの１つと少なくとも９０％同一であるタンパク質若しくはペプチドである、請求項４記載の予防治療剤。
【請求項６】
ヒトを含む哺乳類における神経障害性疼痛の治療又は予防のための薬学的組成物を製造するための請求項１〜５のいずれか一項に記載の予防治療剤の使用。
【請求項７】
神経障害性疼痛の低減のための薬学的組成物を製造するための請求項１〜５のいずれか一項に記載の予防治療剤の使用。
【請求項８】
ヒトを含む哺乳類における神経障害性疼痛の治療又は予防のための請求項１〜５のいずれか一項に記載の予防治療剤を含む、薬学的組成物。
【請求項９】
錠剤、糖衣錠、ピル、顆粒、エアロゾル、注入溶液、乳濁液、懸濁液又は溶液の形態である、請求項８に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性疼痛の治療又は予防のための薬学的組成物の製造のための、特に慢性疼痛の治療又は予防のための複数の薬学的組成物の製造のための、グラニュリン又はグラニュリン様化合物の使用に関する。さらに、本発明は、それぞれの薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニューロン損傷に罹患した患者において、外傷性、炎症性、感染性、腫瘍関連性、虚血性、変性、代謝性又は毒性のいずれであっても、多くの場合、続発性のニューロン損傷、例えば細胞死及び慢性疼痛、特に神経障害性疼痛が、これらのニューロン損傷の一因として起こる。
【０００３】
神経障害性疼痛は、末梢及び中枢ニューロン細胞の多種多様な損傷から発生し得る。疼痛は、特に、糖尿病性又は毒性（例えば化学療法的治療による）多発性神経障害、切断後の幻肢痛、帯状疱疹後神経痛、三叉神経痛、圧迫症候群、例えば手根管症候群及び脊髄脱における坐骨神経痛、多発性硬化症における疼痛、並びに虚血後神経痛において共通である。当該技術水準から既知である非侵襲性の医薬的可能性は、異なる抗癲癇薬（例えばガバペンチン、プレガバリン）、抗うつ薬（例えばアミトリチリン（amitrytilin））、及びオピオイドの使用に限定され、これらは、それでも患者の約３０％だけに耐容可能な副作用を同時的に伴う十分な鎮痛作用を達成し得るのみであり、ニューロン損傷に影響を及ぼさない。
【０００４】
慢性の、特に神経障害性の疼痛の発生に関与するメカニズムは、多様である。近年の実験的試験は、抑制性ニューロンの経シナプス的破壊と、これに本質的に付加される神経膠細胞の活性化を示す。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、特に、部分的末梢ニューロン病変における再生を助けるために、そして続発性細胞死を防止するために、ニューロン損傷の治療又は予防のために用いられ得るそれぞれ方法又は手段を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の本質は、神経保護化合物の治療的使用による抑制性ニューロンの損失の低減並びに神経膠媒介性炎症反応の遮断、したがって連続的過剰興奮による進行性損傷を回避することにある。これは、慢性の、特に神経障害性の疼痛を低減し、再生過程を支持する。
【０００７】
本発明の基礎を成す目的は、慢性疼痛の治療及び／又は予防のための薬学的組成物を製造するためのグラニュリン又はグラニュリン様化合物の使用により解決される。その点で、「慢性疼痛」という用語は、特に、神経障害性疼痛並びに炎症性及び腫瘍関連性疼痛を含む。
【０００８】
急性又は慢性のニューロン損傷における慢性の、特に神経障害性の疼痛の治療又は予防のためのグラニュリン又はグラニュリン様化合物の使用は、利用可能な医薬的可能性（抗癲癇薬、抗うつ薬、オピオイド及びカンナビノイド）と対照して、病態生理学的基礎を成すメカニズムに正の影響を及ぼす新規の治療原理を表す。
【０００９】
本発明によれば、抑制性介在ニューロンの破壊を回避することが可能である。そうする場合、興奮インパルスの不十分な遮断、したがって疼痛伝達路の過剰活性が回避される。したがって神経障害性疼痛の慢性化は、抑制性ニューロンのアポトーシスのために起こるリモデリング過程及び誤結合の結果的に生じる制限により低減される。これと対照して、今まで利用可能な薬剤は、ニューロン活性の全身性制動をもたらし、末梢又は中枢ニューロン損傷に起因する神経障害性疼痛における病態生理学的メカニズムに影響を及ぼさない。
【００１０】
本発明の好ましい一実施の形態において神経障害性疼痛の治療又は予防のためのグラニュリン又はグラニュリン様化合物は、プログラニュリン、グラニュリン１、グラニュリン２、グラニュリン３、グラニュリン４、グラニュリン５、グラニュリン６、グラニュリン７、パラグラニュリン、プログラニュリンシグナル伝達分子、及びこれらの分子と機能的に等価であるこれらの分子の断片、並びにこれらの分子と機能的に等価であるアゴニストを含有する群から選択される少なくとも１つの分子である。下記でさらに説明されるように、アゴニストは特にペプチド模倣体であり得る。
【００１１】
さらに、上記の群からのさまざまな分子の組合せの使用が、本発明に包含される。
【００１２】
基本的に、本発明は、それぞれタンパク質又はペプチドの両方に、及び核酸、例えばＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡ、並びにそれらの誘導体に関する。
【００１３】
したがって、本発明の一実施の形態において、グラニュリン又はグラニュリン様化合物は、上記の分子のうちの１つをコードする核酸であり得る。特に、核酸は、配列番号１〜１０のうちの１つによる核酸、又はこれらの配列のうちの１つと少なくとも５０％、好ましくは６０％、７０％、若しくは８０％、特に好ましくは８５％若しくは９０％、最も好ましくは９５％若しくは９８％同一である核酸であり得る。それにより、核酸によりコードされるペプチド又はタンパク質は、有益には、配列番号１１〜２０によるグラニュリン又はグラニュリン様化合物と機能的に等価である。
【００１４】
核酸の断片は、グラニュリン又はグラニュリン様化合物をコードする核酸において見出されるグラニュリン又はグラニュリン様化合物の配列からの、少なくとも５０、好ましくは少なくとも１５０、特に好ましくは少なくとも１８０連続ヌクレオチドの任意の配列を意味するものとする。
【００１５】
機能的に等価な断片をコードする核酸は、配列番号１１〜２０からの上記断片をコードする核酸に関して少なくとも５０％、好ましくは６０％、７０％又は８０％、特に８５％又は９０％、最も好ましくは９５％又は９８％同一である。
【００１６】
「機能的に等価」とは、配列番号１１〜２０によるグラニュリン又はグラニュリン様化合物と同一の定性的作用をニューロン及び神経膠細胞に及ぼす断片を意味するものとするが、この場合、定量的作用は異なり得る。
【００１７】
これに代わるものとして、本発明の別の実施の形態では、グラニュリン又はグラニュリン様化合物はタンパク質又はペプチドであり得る。特に、すでに上記したようなペプチド模倣体は、ここで言及されるべきである。
【００１８】
特に好ましい一実施の形態では、グラニュリン又はグラニュリン様化合物は、配列番号１１〜２０の１つによるタンパク質又はペプチド、あるいはこれらの配列のうちの１つと少なくとも５０％、好ましくは６０％、７０％、又は８０％、特に好ましくは８５％又は９０％、最も好ましくは９５％又は９８％同一であるペプチド又はタンパク質である。
【００１９】
タンパク質又はペプチドの断片とは、グラニュリン又はグラニュリン様化合物の配列からの、少なくとも５、好ましくは少なくとも１０又は少なくとも２０、特に好ましくは少なくとも３０、４０、最も好ましくは少なくとも５０連続アミノ酸のグラニュリン又はグラニュリン様化合物中に存在する任意の配列を意味するものとする。
【００２０】
上記の化合物は、哺乳類における、特にヒトにおけるだけでなく、ペット及び家畜における、慢性の、特に神経障害性の疼痛の治療又は予防のための薬学的組成物の製造に適している。本発明は、ヒト核酸及びタンパク質／ペプチド配列に関して記載される。それにもかかわらず、ヒト配列に基づいて、既知の方法を用いて、公的に利用可能なデータベースに含有されない限り、他の種の配列も当業者は検出し得る。
【００２１】
上記のような使用は、神経障害性疼痛の低減のための、損傷ニューロンの細胞死の回避のための、及び／又はニューロン再生の促進のための薬学的組成物の製造にも適している。
【００２２】
本発明の根本的問題は、グラニュリン若しくは機能的に等価のグラニュリン断片、又はグラニュリン・アゴニストを含み且つ／又は含有する薬学的組成物によっても解決される。
【００２３】
したがって、グラニュリン又はグラニュリン様化合物は、プログラニュリン、グラニュリン１、グラニュリン２、グラニュリン３、グラニュリン４、グラニュリン５、グラニュリン６、グラニュリン７、パラグラニュリン、プログラニュリンシグナル伝達分子、及び機能的に等価である上記分子の断片、並びに機能的に等価であるこれらの分子のアゴニスト（例えば上記断片のうちの１つではないペプチド模倣体）を含有する群から選択される少なくとも１つの分子である。
【００２４】
上記の記載と同様に、薬学的組成物のグラニュリン又はグラニュリン様化合物は、上記の分子のうちの１つをコードする核酸、特に、配列番号１〜１０のうちの１つによる核酸、又はこれらの配列のうちの１つと少なくとも５０％、好ましくは６０％、７０％、若しくは８０％、特に好ましくは８５％若しくは９０％、最も好ましくは９５％若しくは９８％同一である核酸であり得る。したがって、コードされるペプチド又はタンパク質は、上記規定の意味で、効果において等価である。
【００２５】
上記の核酸は、少なくとも１つの細胞中への、上記配列を含む構築物、例えばウイルス又はプラスミドの移入により、患者に投与され得る。構築物のトランスフェクションは、既知の方法により、例えばリポフェクション、バリスティック移入（「遺伝子銃」）などにより起こり得る。
【００２６】
代替的な一実施の形態では、薬学的組成物のグラニュリン又はグラニュリン様化合物がタンパク質又はペプチドである請求項１記載の使用。したがって、グラニュリン又はグラニュリン様化合物が配列番号１１〜２０のうちの１つによるタンパク質若しくはペプチド、又はこれらの配列のうちの１つと少なくとも５０％、好ましくは６０％、７０％、若しくは８０％、特に好ましくは８５％若しくは９０％、最も好ましくは９５％若しくは９８％同一であるタンパク質若しくはペプチドである。
【００２７】
上記の薬学的組成物は、好ましくは、哺乳類における、特にペット及び家畜における、そしてヒトにおける、慢性の、特に神経障害性の疼痛の治療又は予防のための薬学的組成物を製造するために用いられ得る。ここで示されるような配列はすべてヒトに由来するが、しかし、ここで示されるような配列に基づいて、当業者は他の生物体における対応する分子を同定し、単離し得る。
【００２８】
本発明によれば、薬学的組成物は、慢性の、特に神経障害性の疼痛の低減、損傷ニューロンの細胞死の回避、及び／又はニューロン再生の促進のための薬学的組成物を製造するためにも役立ち得る。
【００２９】
本発明による薬学的組成物は、錠剤、糖衣錠、ピル、顆粒、エアロゾル、注入溶液、乳濁液、懸濁液又は溶液の形態で存在し得る。
【００３０】
本発明による作用物質又は薬学的組成物の使用はそれぞれ、適切な既知の処方物を用いて行われ得る。
【００３１】
本発明による作用物質の使用は、不活性の、非毒性の、製薬上許容可能な担体又は溶媒を用いて、既知の方法で、一般的処方物、例えば錠剤、糖衣錠、ピル、顆粒、エアロゾル、乳濁液、懸濁液及び溶液に変えられ得る。これによって、グラニュリン又はグラニュリン様化合物に関する治療的有効濃度の作用物質は、それぞれ約０．１重量％〜９５重量％、好ましくは約０．５重量％〜９０重量％の濃度で、すなわち、標的化された場合に組織中に必要とされるような作用物質の濃度を達成するために十分である量で、全体的混合物中に存在する。
【００３２】
処方物は、例えば、任意に乳化剤及び／又は分散剤を用いて、溶媒及び／又は担体で作用物質を薄めることにより製造されるが、ここで、例えば希釈剤として水を用いる場合、任意に有機溶媒が補助剤として用いられ得る。
【００３３】
補助剤として言及されるものは、例えば水、非毒性溶媒、例えばパラフィン（例えば、粗油留分）、植物油（例えば、落花生油，ゴマ油）、アルコール（例えば、エチルアルコール、グリセロール）、担体、例えば天然石粉（例えば、カオリン、アルミナ、タルカム、チョーク）、合成石粉（例えば、高分散シリカ、ケイ酸塩）、糖（例えば、ショ糖、乳糖及びブドウ糖）、乳化剤（例えば、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エーテル）、分散剤（例えば、リグニン、亜硫酸パルプ廃液、メチルセルロース、デンプン及びポリビニルピロリドン）、並びに滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルカム、ステアリン酸及び硫酸ナトリウム）である。
【００３４】
適用は、一般的方法で、好ましくは経口的に又は非経口的に、特に経舌的に又は静脈内で行われる。本発明による薬剤の経口使用の場合、錠剤は、言及されたような担体のほかに、当然、添加剤、例えばクエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム及びリン酸二カルシウムも、いくつかの添加剤、例えばデンプン、好ましくはジャガイモデンプン、ゼラチン等と一緒に含有し得る。さらに、滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルカムが、錠剤成形のために含まれ得る。水性懸濁液の場合、上記の補助剤のほかに、いくつかの呈味改良剤又は着色剤が活性作用物質に付加され得る。非経口投与の場合、適切な液体担体物質を使用する活性作用物質の溶液が用いられ得る。
【００３５】
本発明は、神経障害性疼痛の治療又は予防のための本明細書に記載されるようなグラニュリン若しくはグラニュリン様化合物の使用、又は本明細書に記載したようなグラニュリン若しくはグラニュリン様化合物及び神経障害性疼痛の治療又は予防のためのその使用にも関する。
【００３６】
本発明は、グラニュリン若しくはグラニュリン様化合物、又は上記による薬学的組成物を用いた、個体の、特に患者の治療又は予防のための方法にも関する。
【００３７】
実施例に基づいて本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されない。実施例に記載されるような実験の結果は、図に示されている。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】プログラニュリンは高システインタンパク質であって、これは、なお未知のプロテアーゼにより、分泌される７つの異なるグラニュリンに切断され（図１）、そして出発物質のように、増殖因子及びサイトカイン様作用を示し、創傷治癒を促し、腫瘍増殖及びニューロン発達を調節する。今まで、細胞外及び細胞内「受容体」は分かっていない。ヒトにおいて、プログラニュリン遺伝子の「機能損失」突然変異は、前頭側頭認知症を引き起こす。プログラニュリンに関するヒト遺伝子Ｇｒｎのイントロン−エキソン構造において、エキソンはボックスとして描かれる。プログラニュリン−タンパク質は、プロテアーゼにより、７つの異なるグラニュリン（黒色ボックス）及びＮ末端「シグナル伝達ペプチド」に切断される。グラニュリンはすべて、グラニュリンＡ（Ｃｘ−Ｃｘ−ＣＣｘ−ＣＣｘ−ＣＣｘ−ＣＣｘ−Ｃｘ−Ｃ）と同様の構造を有する。Ｃ＝システイン、Ｘ＝他のアミノ酸の可変数。
【図２】坐骨神経（N. ischiadicus）の末梢病変後の脊髄及びＤＲＧにおけるプログラニュリン発現の調節。    Ａ  神経障害性モデル、坐骨神経部分損傷（ＳＮＩ、Decosterd & Woolf）、絞振性神経損傷（ChronicConstriction Injury）（ＣＣＩ、Bennett）、脊髄神経結紮（ＳＮＬ、Chung）。    Ｂ  上に示したモデルにおける後角及びＤＲＧにおけるプログラニュリンｍＲＮＡのマイクロアレイ分析。    Ｃ  ＳＮＩモデルにおけるプログラニュリンｍＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲ。    Ｄ  ＳＮＩモデルにおける脊髄におけるプログラニュリンタンパク質発現のウエスタンブロット分析。    Ｅ  ＳＮＩ後のＤＲＧにおけるプログラニュリン−タンパク質。    Ｆ  糖尿病誘導の３ヵ月後のＳＴＺ誘導性糖尿病多発性神経障害モデルにおけるＤＲＧにおけるプログラニュリン−タンパク質発現。
【図３】神経膠原繊維酸性タンパク質ＧＦＡＰ及び転写因子ＡＴＦ−３に関するプログラニュリンｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び後ｉｎ  ｓｉｔｕ免疫蛍光法。    Ａ  脊髄の後角におけるＳＮＩ後の星状細胞を例示するためのｉｎ  ｓｉｔｕでのＧｒｎ（黒色）及びＧＦＡＰ免疫蛍光（赤色）。    Ｂ  Ａの拡大図。プログラニュリンは星状細胞中で発現されない。    Ｃ  ＳＮＩ後の脊髄の前角中の小神経膠細胞（小細胞）及び運動ニューロン（矢印）におけるｉｎ  ｓｉｔｕでのＧｒｎ。    Ｄ  ＡＴＦ−３免疫蛍光法による損傷運動ニューロン（赤色）を示すＣと同様の前角。ＡＴＦ−３は、損傷軸索を有するニューロンに関するマーカーである。
【図４】ＳＮＩ後の脊髄における小神経膠細胞反応の全体像。補体因子３（ＣＤ１１ｂ）の受容体に関する免疫蛍光法による小神経膠細胞の実証。
【図５】ＳＮＩ後の前角における小神経膠細胞反応。    Ａ  ＳＮＩ後の脊髄の前角中の活性小神経膠細胞の実証のためのＣＤ１１ｂ免疫蛍光。    Ｂ  運動ニューロン（赤色、ペリフェリン−免疫蛍光）の直ぐ近くの活性化小神経膠細胞（矢印）中のプログラニュリンｍＲＮＡ（ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、灰色）。
【図６】ＳＮＩ後のプログラニュリンｍＲＮＡ（ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、灰色）の発現を伴う後根神経節のニューロン（ペリフェリンＩＲ、赤色）。
【図７】ＳＮＩ後のプログラニュリンｓｉＲＮＡの連続脊髄注入時のプログラニュリンｍＲＮＡ発現及びマウスの行動。    Ａ  Ｇｒｎ  ｓｉＲＮＡ及び対照オリゴヌクレオチドによる処置時の脊髄におけるＳＮＩ後のＧｒｎ  ｍＲＮＡ。処置は、Ｌ３のレベルで終わる脊髄カテーテルを介して皮下埋め込み型浸透圧アルゼットポンプを用いて行われた。注入はＳＮＩ直後に始まり、ＳＮＩの４週間後に終了する。    Ｂ  異なる侵害試験における、並びに運動遂行を測定するロータロッド試験における、Ｇｒｎ  ｓｉＲＮＡ又は対照オリゴヌクレオチドによる処置時のＳＮＩ後のマウス（Ｃ５７Ｂｌａｃｋ６）の行動。動的フォン・フレイ触覚計で「退避」潜時を測定することにより、機械的異痛を測定したが、潜伏時間が短いほど、異痛（上左）は強かった。アセトン検定（上右）で、並びに１０℃の冷プレートを用いて（下右）、寒冷異痛を記録した。アセトン検定では、足裏に１滴のアセトンを適用後の足の反応（舐める、振り動かす、持ち上げる）の持続時間を測定したが、反応が長いほど、異痛は強かった。寒冷に対する露出後の反応潜伏時間は冷プレートを用いて測定されるが、短いほど、異痛は強い。マウスがどれだけ長く倒れずに回転する円筒体上を走るかを、ロータロッド試験で測定する。運動協調性及び消耗並びにニューロン病変後の補償のための能力を測定する。行動実験は、Ｇｒｎ  ｓｉＲＮＡでの処置時の異痛の増大及び減損運動回復を示す。プログラニュリンｓｉＲＮＡの脊髄注入によるマウスの処置は、ＳＮＩ後に生じるプログラニュリンの上向き調節を遮断し、マウスにおける疼痛様行動の増大をもたらす。さらに、ロータロッド試験における運動機能のその回復は、対照オリゴヌクレオチドで処置された対照動物におけるものよりわずかに遅い。
【図８】細胞及びマウス組織におけるプログラニュリン／グラニュリンタンパク質発現。プログラニュリン、グラニュリン１、２及び７に指向性があるＮ１９抗体（SantaCruz Biotechnology）を用いたウエスタンブロット。グリコシル化プログラニュリンの分子量：８８ｋＤａ、個々のグラニュリンの分子量：６ｋＤａ。小ペプチドを分離するために、トリシンゲルを用いた。略号：ＭＦ、マクロファージ；ＬＰＳ、リポ多糖；ＳＣ、脊髄；ＤＲＧ、後根神経節；ＨＥＫ２９３、ヒト胚性腎細胞；ＭＣＦ−７、乳癌細胞；ＰＣ１２、クロム親和性細胞腫細胞（ニューロン様）；ＰＡＧＥ、ポリアクリルアミド・ゲル・電気泳動。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００３９】
以下において、図に示したような結果を参照しながら、ここに記載する実験により本発明を説明する。
【００４０】
方法  プログラニュリン
神経障害モデル及びＲＮＡｉ処置
成体Ｃ５７Ｂ１６マウスを用いた。坐骨神経部分損傷（ＳＮＩ）モデルにおいて、坐骨神経の２つの枝、すなわち、腓骨神経及び脛骨神経を結紮し、遠位で切断した。腓腹神経は無傷のままである。浸透圧ポンプ（アルゼット浸透圧ポンプ２００４；０．２５μｌ／時）を用いて、アクログラニンに関するサイレンサーＲＮＡ（ステルスＲＮＡｉ、Invitrogen）を、脊髄カテーテル（ＰＴＦＥ  ｓｕｂ−ｌｉｔｅ  ｗａｌｌチューブ；ＯＤ／ＩＤ  ０．１５ｍｍ／０．０５ｍｍ）により連続的にクモ膜下腔内注入した。カテーテルの先端を腰髄のレベルにおいて、浸透圧ポンプを皮下組織中に固定した。ＳＮＩ手術直後に注入を開始し、４週間継続した。３つの異なるアクログラニンＲＮＡｉの混合物（４週間の期間中、１ｎｍｏｌ／各マウス）又は対照ＲＮＡｉをそれぞれ用いた。さらに、ＦＩＴＣ標識ダミーＲＮＡｉ（２０ｎｍｏｌ）を、その後の免疫組織学的位置確認のために注入した。注入溶液は、１：４０希釈リポフェクタミンを有するリンガー溶液で構成された（１９５μｌ  リンガー＋５μｌ  リポフェクタミン／ポンプ）。
【００４１】
侵害受容性行動
動物を、３×３０分間、試験ケージに馴れさせた。処置について知ることなしに、行動の測定を実施した。後肢の機械的刺激に関する反応潜伏時間を、動的フォン・フレイ触覚計（Ｄｙｎａｍｉｃ  ａｅｓｔｈｅｓｉｏｍｅｔｅｒ, UgoBasile, Italien）を用いて測定した。「冷プレート」（４℃）を用いて、寒冷に対する疼痛感受性を、９０秒の期間の間の悪反応（舐める、跳び上がる、足を持ち上げる）を計数することにより測定した。５２℃「温熱プレート」を用いて、熱に対する疼痛感受性を、最初の反応までの潜伏時間を測定することにより確定した。問題損傷を回避するため、カットオフ潜伏時間は３０秒であった。ロータロッド試験において、ニューロン病変後の運動協調性又は運動回復をそれぞれ測定した（９０秒カットオフ）。
【００４２】
マイクロアレイ
QiagenＲＮＡ抽出キットにより均質化脊髄又はＤＲＧ組織から全ＲＮＡを抽出し、ＤＮＡに転写した。ｃＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅し、ｐＣＲ４ベクター（ＴＡクローニングキット、Invitrogen）に結紮した。ビオチニル化ｃＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により産生して、AffymetrixのＲＧＵ３４Ａチップのハイブリダイゼーションのために用いた。
【００４３】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
QiagenＲＮＡ抽出キットにより均質化脊髄又はＤＲＧ組織から全ＲＮＡを抽出し、ＤＮＡに転写した。プロバイダー（Applied Biosystems）のマニュアルに従ってSybr-Green検出系を用いて、定量的実時間ｒｔ−ＰＣＲを実施した。プライマー組を、Primer Expressで選択した。アガロースゲル電気泳動により、特定ＰＣＲ産物の増幅を検証した。
【００４４】
ウエスタンブロット
脊髄又はＤＲＧ組織をＰｈｏｓｐｈｏＳａｆｅ抽出緩衝液（Novagen）中で均質化し、ホモジネートを遠心分離（４０，０００ｇ、２０分）して、上清中のタンパク質をそれぞれポリアクリルアミド又はトリシンゲル電気泳動により分離した。タンパク質を湿式ブロットによりニトロセルロース膜上に移し、ＰＢＳＴ−５％ミルク（５％低脂肪乳粉末を有する１ｍｏｌ／ｌ  ＰＢＳ中０．０５％トゥイーン２０）中で遮断し、アクログラニンに対する抗体（ＰＢＳＴ中１：１０００）と共に一晩インキュベートして、洗浄し、二次抗体と共に室温で２時間インキュベートして、Odysseeウエスタンブロットスキャナーを用いて評価した。
【００４５】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
マウスをＣＯ２及び放血により屠殺して、Ｌ４／５ＤＲＧ及び脊髄を迅速に取り出し、ＯＣＴ中に包埋して、ドライアイス上で凍結させ、クリオトームで１４μｍ切片に切断した。切片を４％パラホルムアルデヒド中で後固定し、アセチル化した。ＤＩＧ標識リボ試料をｃＤＮＡ断片のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写及びジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰの組入れにより生成した（Ｄｉｇ標識キット、Roche）。切片を、室温で２時間、プレハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、２×デンハード、５００μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ、２５０μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ）中で前ハイブリダイズして、その後、オーブン中で７２℃で１６時間、プレハイブリダイゼーション溶液中で２５０ｎｇ／ｍｌのリボプローブ（アンチセンス及びセンス）とハイブリダイズした。切片を０．２×ＳＳＣ中で６８℃で２時間洗浄し、抗ｓｉｇ−ＡＰ抗体（０．１ｍｏｌ／ｌマレイン酸緩衝液中の１％遮断試薬（Roche）中で１：１０００）と共に４℃で一晩インキュベートして、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ／レバミゾール（Boehringer Mannheim）で発色させた。切片をグリセロール／ゼラチン中に包埋し、又は、それぞれの抗体を用いて後ｉｎ  ｓｉｔｕ免疫蛍光法によりさらに発色させた。
【００４６】
免疫蛍光法
固定のために、動物を１×ＰＢＳで、その後、４％パラホルムアルデヒドで心臓内還流した。組織を調製し、４％ＰＦＡ中で２時間、後固定し、１×ＰＢＳ中の２０％スクロース中で一晩、冷凍人工物に対して保護し、ＯＣＴ中に包埋して、それぞれ１２μｍ又は１４μｍ切片をクリオトームで切断した。切片を、０．０３％トリトンＸ−１００及び１％遮断試薬（Roche）を有する１×ＰＢＳ中で室温で２時間遮断し、４℃の遮断溶液（上記参照）中の一次抗体と共に一晩インキュベートして、洗浄し、次に、室温で２時間、遮断溶液中で種特異的Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ−４８８又はＦＩＴＣ標識二次抗体と共にインキュベートして、再び洗浄し、自己蛍光の低減のために０．０２％スーダンブラックで処理し、Vectashieldで包埋した。それぞれ蛍光（Nikon）又はレーザー走査顕微鏡（Zeiss）で、分析を行なった。
【００４７】
以下の一次抗体を用いた：マウスＮＦ２００、１：４０００（Sigma）；マウスＣＧＲＰ、１：１０００（Sigma）；ウサギＡＴＦ−３、１：３００（SantaCruz）；ＦＩＴＣ標識グリフォニア・シンプリシフォリア（griffoniasimplicifolia）イソレクチンＢ４（Sigma）、１：５００；ウサギＧＦＡＰ（１：１０００、Chemicon）；ウサギ抗ペリフェリン（１：１０００、Chemicon）；ウサギＩｂａ−１（１：５００、DAKO）。
【００４８】
末梢ニューロン損傷後、小神経膠活性化が同側脊髄で起こり、これは神経障害性疼痛の発生のために重要である。これらの活性化小神経膠細胞は、マイクロアレイ（図２）、ＱＲＴ−ＰＣＲ（図２）、ウエスタンブロット（図２）、及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（図３）により示されるように、プログラニュリンの強い発現を示す。ニューロン病変により直接損傷されるＤＲＧニューロン及び運動ニューロンは、より弱い発現を示す（図３〜４）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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