(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能的なＨＬＡ−Ａ２トランスジーンおよび機能的なＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンを含む、内因性Ｈ２クラスＩ遺伝子およびＨ２クラスＩＩ遺伝子の両方を欠いたトランスジェニックマウスであり、前記ＨＬＡ−Ａ２トランスジーンが、ＨＬＡ−Ａ２の重鎖に共有結合したヒトβ２ミクログロブリンを含む一本鎖である、トランスジェニックマウス。
【請求項２】
ＨＬＡ−Ａ２トランスジーンがシーケンスリストにおいてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で掲載されたＨＬＡ−Ａ２の配列を含み、ＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンがシーケンスリストにおいてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で掲載されたＨＬＡ−ＤＲ１の配列を含んでいる、請求項１に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項３】
候補抗原または候補抗原群における、特異的液性免疫反応、ＴＨのＨＬＡ−ＤＲ１拘束性反応、および／またはＣＴＬのＨＬＡ−Ａ２拘束性反応を生じさせる、一つまたは複数のエピトープの存否を同時に識別する方法であり、
ａ）候補抗原または候補抗原群を請求項１または請求項２のマウスに投与すること、
ｂ）マウスにおける、抗原に対する特異的液性免疫反応を分析すること、
ｃ）マウスにおける、抗原に対するＴＨのＨＬＡ−ＤＲ１拘束性反応を分析すること、および、
ｄ）マウスにおける、抗原に対するＣＴＬのＨＬＡ−Ａ２拘束性反応を分析することを含み、
−マウスにおいて抗原に対する特異的液性免疫反応が見られることによって、抗原における液性免疫反応を生じさせるエピトープが確認され、
−マウスにおいて抗原に対するＴＨのＨＬＡ−ＤＲ１拘束性反応が見られることによって、抗原におけるＴＨのＨＬＡ−ＤＲ１拘束性反応を生じさせるエピトープが確認され、
−マウスにおいて抗原に対するＣＴＬのＨＬＡ−Ａ２拘束性反応が見られることによって、抗原におけるＣＴＬのＨＬＡ−Ａ２拘束性反応を生じさせるエピトープが確認される
方法。
【請求項４】
マウスにおける抗原に対するＴｈ１特異的反応を分析することと、マウスにおける抗原に対するＴｈ２特異的反応を分析することをさらに含む、請求項３に記載の方法であり、
−マウスにおいて抗原に対するＴｈ１特異的反応が見られることによって、マウスにおける抗原に対するＴｈ１特異的反応を生じさせるエピトープが確認され、
−マウスにおいて抗原に対するＴｈ２特異的反応が見られることによって、マウスにおける抗原に対するＴｈ２特異的反応を生じさせるエピトープが確認される
方法。
【請求項５】
候補抗原または候補抗原群においてエピトープの存否を識別する方法であり、
ａ）候補抗原または候補抗原群を請求項１または請求項２のマウスに投与すること、そして、
ｂ）マウスにおける、抗原に対するエピトープ反応を分析することを含み、
−マウスにおいてＴＨのＨＬＡ−ＤＲ１拘束性ヘルパーＴ細胞エピトープ反応が見られることによって、抗原におけるＨＬＡ−ＤＲ１拘束性ヘルパーＴ細胞エピトープが確認され、
−ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性（ＣＴＬ）Ｔ細胞エピトープ反応が見られることによって、抗原におけるＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性（ＣＴＬ）Ｔ細胞エピトープが確認される
方法。
【請求項６】
二つまたはそれ以上のワクチンによって誘発された反応の有効性を比較する方法であり、
ａ）第一の候補ワクチンを請求項１または請求項２のマウスに投与し、第一の候補ワクチンによってマウスにおいて誘発された反応を測定すること、
ｂ）第二の候補ワクチンを請求項１または請求項２のマウスに投与し、第二の候補ワクチンによってマウスにおいて誘発された反応を測定すること、
ｃ）比較すべきさらなる候補ワクチンのそれぞれを請求項１または請求項２のマウスに投与し、比較すべきそれぞれのさらなる候補ワクチンによってマウスにおいて誘発された反応を測定すること、そして、
ｄ）比較すべき各ワクチンに対する反応を互いに比較することで、反応を誘発する各候補ワクチンの有効性を判定すること
を含み、
前記反応が、ヘルパーＴ細胞反応、細胞傷害性Ｔ細胞反応、またはその両方である方法。
【請求項７】
ヘルパーＴ細胞反応がＨＬＡ−ＤＲ１拘束性反応である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細胞傷害性Ｔ細胞反応がＨＬＡ−Ａ２拘束性反応である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ヘルパーＴ細胞反応がＨＬＡ−ＤＲ１拘束性反応であり、細胞傷害性Ｔ細胞反応がＨＬＡ−Ａ２拘束性反応である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
抗原、または、一つもしくは複数の抗原を含むワクチンによる免疫付与の後に、マウスの液性免疫反応、ヘルパーＴ細胞反応および細胞傷害性Ｔ細胞反応を同時に判定する方法であり、
ａ）抗原、または、一つもしくは複数の抗原を含むワクチンを、請求項１または請求項２のマウスに投与すること、
ｂ）抗原、または、一つもしくは複数の抗原を含むワクチンに対する、マウスにおける特異的液性免疫反応を分析すること、
ｃ）抗原、または、一つもしくは複数の抗原を含むワクチンに対する、マウスにおけるヘルパーＴ細胞反応を分析すること、そして、
ｄ）抗原、または、一つもしくは複数の抗原を含むワクチンに対する、マウスにおける細胞傷害性Ｔ細胞反応を分析すること
を含む方法。
【請求項１１】
ヘルパーＴ細胞反応がＴＨのＨＬＡ−ＤＲ１拘束性反応である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
細胞傷害性Ｔ細胞反応がＣＴＬのＨＬＡ−Ａ２拘束性反応である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
事前に選択された基準に基づき、二つまたはそれ以上の候補ワクチンの組成物をヒトへ投与するために最適化する方法であり、
−請求項１０に従って、二つまたはそれ以上の候補ワクチンの組成物で免疫付与した後、マウスの液性免疫反応、ヘルパーＴ細胞反応および細胞傷害性Ｔ細胞反応を同時に判定すること、そして、
−事前に選択された基準を結果に適用することで、最適化されたワクチンを選択すること
を含む方法。
【請求項１４】
二つまたはそれ以上の候補ワクチンが、ワクチン中に存在するアジュバントに対する抗原の割合においてのみ異なっている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
二つまたはそれ以上の候補ワクチンが、ワクチン中に存在するアジュバントのタイプにおいてのみ異なっている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ヒトに投与されるとき、ワクチンが自己免疫疾患を誘発する危険性を有するか否かを判定する方法であり、
ａ）ワクチンを請求項１または請求項２のマウスに投与すること、そして、
ｂ）マウスにおける自己免疫反応を分析すること
を含んでおり、
マウスにおいて自己免疫反応が見られることによって、ワクチンがヒトに投与されたときに自己免疫疾患を誘発する危険性を有することが示される方法。
【請求項１７】
内因性Ｈ−２クラスＩ遺伝子およびＨ−２クラスＩＩ遺伝子の両方を欠き、機能的なＨＬＡ−Ａ２トランスジーンと機能的なＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンを含んでいる、単離されたトランスジェニックマウスの細胞であり、前記ＨＬＡ−Ａ２トランスジーンが、ＨＬＡ−Ａ２の重鎖に共有結合したヒトβ２ミクログロブリンを含む一本鎖である細胞。
【請求項１８】
ＨＬＡ−Ａ２トランスジーンがシーケンスリストにおいてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で掲載されたＨＬＡ−Ａ２の配列を含み、ＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンがシーケンスリストにおいてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で掲載されたＨＬＡ−ＤＲ１の配列を含んでいる、請求項１７に記載のトランスジェニックマウスの細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００３年７月３０日に出願された米国特許仮出願第６０／４９０９４５号明細書（代理人番号第０３４９５．６０９３号）の利益に基づき、また該利益を特許請求するものであり、該仮出願の開示内容全体は、すべての目的について、本出願の基礎となるものであり、また、参照することによって本出願の一部を構成するものである。
【背景技術】
【０００２】
現状では、多くのワクチンが、ヒトのガンの免疫療法のため、そして、マラリア、エイズ、Ｃ型肝炎ウイルスおよび重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）のような伝染病の治療のために開発されてきている。新たに生起する病原体が出現する早さを考えると、ワクチン戦略および様々なエピトープの防御能について素早く信頼性のある評価をするために用いることのできる動物モデルを改良することが重要である。さらに、インビボ研究は、ワクチンの免疫原性、ワクチンの製剤化、投与経路、組織分布、ならびに一次リンパ器官および二次リンパ器官の関与のような、容易に評価できない、あるいはインビトロで測定することができない、ワクチンの挙動の重大な変動を評価するために既に必要とされている。単純で融通がきくことから、マウスのような小動物は、少なくとも初期のワクチンの開発研究に対して、ヒトではない霊長類のような、より扱いにくく、よりコストの高いモデルシステムに代わる、魅力的な代替物となっている。
【０００３】
野生型動物の研究では防御的であることが発見されているワクチンが、いくつかの臨床試験で中程度の有効性を示したことは（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ、Ａ．Ｊ．＆Ｈａｎｋｅ、Ｔ．『Ｎａｔ  Ｍｅｄ』９、８７４−８８０（２００３））、動物のＭＨＣ分子とヒトのＨＬＡ分子が同一の最適なエピトープを有していないために、ヒトと動物のＭＨＣが免疫反応の結果に対して与える影響が異なるということによって、部分的に説明することができる（Ｒｏｔｚｓｃｈｋｅ、Ｏ．ｅｔ  ａｌ．『Ｎａｔｕｒｅ』３４８、２５２−２５４（１９９０））。従って、いくつかの制限にも関わらず、ヒトＨＬＡを発現するトランスジェニックマウスは、ワクチン候補を試験し、ワクチンが自己免疫疾患を誘発する潜在的なリスクを評価し、ヒトの拘束因子に基づいたより良い治療方法を開発するための前臨床モデルとして、野生型マウスに対する有用な改良となるものである。
【０００４】
細胞傷害性Ｔ細胞
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、伝染病の根絶、またある場合にはガンの根絶において重要な役割を果たす（Ｐ．Ａｉｃｈｅｌｅ、Ｈ．Ｈｅｎｇａｒｔｎｅｒ、Ｒ．Ｍ．Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ  ａｎｄ  Ｍ．Ｓｃｈｕｌｚ、『Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ』１７１（１９９０）、ｐ．１８１５；Ｌ．ＢｅｎＭｏｈａｍｅｄ、Ｈ．Ｇｒａｓ−Ｍａｓｓｅ、Ａ．Ｔａｒｔａｒ、Ｐ．Ｄａｕｂｅｒｓｉｅｓ、Ｋ．Ｂｒａｈｉｍｉ、Ｍ．Ｂｏｓｓｕｓ、Ａ．Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄｒｕｈｉｌｅ、『Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』２７（１９９７）、ｐ．１２４２；Ｄ．Ｊ．Ｄｉａｍｏｎｄ、Ｊ．Ｙｏｒｋ、Ｊ．Ｓｕｎ、Ｃ．Ｌ．Ｗｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｆｏｒｍａｎ、『Ｂｌｏｏｄ』９０（１９９７）、ｐ．１７５１）。組換えタンパク質ワクチンはＣＴＬ反応を確実には誘発しない（Ｈａｂｅｓｈａｗ  ＪＡ、Ｄａｌｇｌｅｉｓｈ  ＡＧ、Ｂｏｕｎｔｉｆｆ  Ｌ、Ｎｅｗｅｌｌ  ＡＬ、Ｗｉｌｋｓ  Ｄ、Ｗａｌｋｅｒ  ＬＣ、Ｍａｎｃａ  Ｆ．１９９０年１１月；１１（１１）：４１８−２５；Ｍｉｌｌｅｒ  ＳＢ、Ｔｓｅ  Ｈ、Ｒｏｓｅｎｓｐｉｒｅ  ＡＪ、Ｋｉｎｇ  ＳＲ．『Ｖｉｒｏｌｏｇｙ』１９９２年１２月；１９１（２）：９７３−７）。弱毒化した病原体で構成される他の免疫原性ワクチンは、いくつかの主要な疾病において、最も重要な安全上の懸念から、ヒトに用いることができない。ここ数年、エピトープに基づくアプローチが、予防および免疫療法のための新たなワクチンを開発するための、将来性がある方法として提案されてきている（Ｍｅｌｉｅｆ  ＣＪ、Ｏｆｆｒｉｎｇａ  Ｒ、Ｔｏｅｓ  ＲＥ、Ｋａｓｔ  ＷＭ．『Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．』１９９６年１０月、８（５）：６５１−７；Ｃｈｅｓｎｕｔ  ＲＷ、「Ｄｅｓｉｇｎ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂａｓｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔｏ  ｔｒｅａｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ、ｃａｎｃｅｒ」、Ｐｏｗｅｌｌ、ＭＦ、Ｎｅｗｍａｎ、ＭＪ（編）『Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ、Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ』所収、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ、１９９５年、８４７）。このアプローチはいくつかの利点を有しているのだが、該利点には、自然なプロセシングを受けたエピトープを選択して、免疫系が、高度に保存され免疫的にドミナントな病原体のエピトープに焦点を合わせるようにすること（Ｒ．Ｇ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｏｓｔ、Ａ．Ｓｅｔｔｅ、Ｃ．Ｏｓｅｒｏｆｆ、Ｊ．Ａｌｅｘａｎｄｅｒ、Ｋ．Ｍｕｒａｌｉ−Ｋｒｉｓｈｎａ、Ｌ．Ｌ．Ｌａｕ、Ｓ、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄ、Ｊ．Ｓｉｄｎｅｙ、Ｒ．Ｗ．Ｃｈｅｓｎｕｔ、Ｍ．Ｍａｔｉｏｕｂｉａｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ａｈｍｅｄ、『Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』１５７（１９９６）、ｐ．５５４３）、ならびに、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の感染において見られるような突然変異によるエスケープを防ぐ、複数のエピトープが関与する反応を誘発することが含まれる。また、該アプローチはサプレッサーＴ細胞の決定基をなくすことも可能にするものであり、このことにより、ＴＨ１の反応が望まれる���件下においてＴＨ２の反応を好適に生じさせること、またその逆も可能となる（Ｐｆｅｉｆｆｅｒ  Ｃ、Ｍｕｒｒａｙ  Ｊ、Ｍａｄｒｉ  Ｊ、Ｂｏｔｔｏｍｌｙ  Ｋ．『Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．』１９９１  Ｏｃｔ；１２３：６５−８４；Ｐ  Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ、Ｑ  Ｙｕ、Ｓ  Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄ、Ａ  Ｓｅｔｔｅ、ａｎｄ  Ｂ  Ｓｉｎｇｈ『Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』１９９６、８：７４５−７５５）。最後に、該アプローチは、望ましくない自己免疫疾患を誘発する可能性のある、抗原における自己免疫Ｔ細胞の決定基を取り除く可能性を提供する。ＣＴＬエピトープペプチドを用いる防御性の抗ウイルス免疫または防御性の抗腫瘍免疫は、いくつかの実験モデルで成功を収めている（Ｄ．Ｊ．Ｄｉａｍｏｎｄ、Ｊ．Ｙｏｒｋ、Ｊ．Ｓｕｎ、Ｃ．Ｌ．Ｗｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｆｏｒｍａｎ、『Ｂｌｏｏｄ』９０、１９９７、ｐ．１７５１；Ｊ．Ｅ．Ｊ．Ｂｌａｎｅｙ、Ｅ．Ｎｏｂｕｓａｗａ、Ｍ．Ａ．Ｂｒｅｈｍ、Ｒ．Ｈ．Ｂｏｎｎｅａｕ、Ｌ．Ｍ．Ｍｙｌｉｎ、Ｔ．Ｍ．Ｆｕ、Ｙ．Ｋａｗａｏｋａ  ａｎｄ  Ｓ．Ｓ．Ｔｅｖｅｔｈｉａ、『Ｊ  Ｖｉｒｏｌ』７２（１９９８）、ｐ．９５６７）。
【０００５】
ヒトのリンパ球の使用に基づくＣＴＬエピトープの決定は、不完全な結果へとつながる環境的、遺伝的な多様性のため、また、ＣＴＬクローンの単離における技術的困難性のために、誤りを生じる恐れがある。今までに説明されているＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩのトランスジェニックマウスは、このような動物モデルで新しいＣＴＬおよびヘルパーＴ細胞のエピトープが同定されたことによって示されているように、これらの限界を克服するための有効なツールであることが証明されている（Ｈｉｌｌ  ＡＶ．『Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．』１９９８；１６：５９３−６１７；Ｃａｒｍｏｎ  Ｌ、Ｅｌ−Ｓｈａｍｉ  ＫＭ、Ｐａｚ  Ａ、Ｐａｓｃｏｌｏ  Ｓ、Ｔｚｅｈｏｖａｌ  Ｅ、Ｔｉｒｏｓｂ  Ｂ、Ｋｏｒｅｎ  Ｒ、Ｆｅｌｄｍａｎ  Ｍ、Ｆｒｉｄｋｉｎ  Ｍ、Ｌｅｍｏｎｎｉｅｒ  ＦＡ、Ｅｉｓｅｎｂａｃｈ  Ｌ．『Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ』、２０００年２月１日；８５（３）：３９１−７）。また、これらのマウスは、ｉ）ペプチドのＨＬＡ結合親和力と免疫原性との間の良好な相互関係（Ｌｕｓｔｇａｒｔｅｎ  Ｊ、Ｔｈｅｏｂａｌｄ  Ｍ、Ｌａｂａｄｉｅ  Ｃ、ＬａＦａｃｅ  Ｄ、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  Ｐ、Ｄｉｓｉｓ  ＭＬ、Ｃｈｅａｖｅｒ  ＭＡ、Ｓｈｅｒｍａｎ  ＬＡ．『Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．』１９９７年２月；５２（２）：１０９−１８；Ｂａｋｋｅｒ  ＡＢ、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒｇ  ＳＨ、Ｈｕｉｊｂｅｎｓ  ＲＪ、ＤＲｉｊｆｈｏｕｔ  ＪＷ、Ｍｅｌｉｅｆ  ＣＪ、Ａｄｅｍａ  ＧＪ、Ｆｉｇｄｏｒ  ＣＧ．『Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ』１９９７年１月２７日；７０（３）：３０２−９）、ｉｉ）抗原プロセシングのレベルでの、マウスのＣＴＬ系とヒトのＣＴＬ系の間にある顕著な重複（同一のエピトープの生成）、および、ｉｉｉ）ＨＬＡトランスジェニックマウスとヒトにおけるＣＴＬレパートリーの、大半の抗原に対する同程度の可動性（Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ、Ｐ．Ａ．、Ａ．Ｖｉｆｉｅｌｌｏ、Ｊ．Ｓｉｄｎｅｙ、Ｅ．Ｋｅｏｇｈ、Ｐ．Ｗ．Ｃｈｅｓｎｕｔ、Ｈ．Ｇｒｅｙ、Ａ．Ｓｅｔｔｅ．１９９６．『Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．』２６：９７；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ、Ｊ．、Ｃ．Ｏｓｅｒｏｆ、Ｊ．Ｓｉｄｎｅｙ、Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ、Ｅ．Ｋｅｏｇｈ、Ｇ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｆ．Ｖ．Ｃｈｉｓａｒｉ、Ｒ．Ｔ．Ｋｕｂｏ、Ｈ．Ｍ．Ｇｒｅｙ、Ａ．Ｓｅｔｔｅ、１９９７．『Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．』１５９：４７５３）を証明するために用いられている。
【０００６】
今までに、合成ペプチドに基づくＣＴＬエピトープワクチンは、多くのヒトの疾病に対する免疫療法として開発されている［１８−２０］。しかし、いくつかの臨床試験では中程度の有効性が観察されただけである（２１）。これは、部分的には、これらのワクチンが十分に強力なＣＴＬ反応を誘発することができなかったことによって説明することができる。実際、最近の報告では、最大のＣＴＬ反応を得るために、ＣＤ４+Ｔ細胞の補助が必要であることが示唆されている（Ａ．Ｊ．Ｚａｊａｃ、Ｋ．Ｍｕｒａｌｉ−Ｋｒｉｓｈｎａ、Ｊ．Ｎ．Ｂｌａｔｔｍａｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ａｈｍｅｄ、『Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』１０（１９９８）、ｐ．４４４；Ｆｉｒａｔ  Ｈ、Ｇａｒｃｉａ−Ｐｏｎｓ  Ｆ、Ｔｏｕｒｄｏｔ  Ｓ、Ｐａｓｃｏｌｏ  Ｓ、Ｓｃａｒｄｉｎｏ  Ａ、Ｇａｒｃｉａ  Ｚ、Ｍｉｃｈｅｌ  ＭＬ、Ｊａｃｋ  ＲＷ、Ｊｕｎｇ  Ｏ、Ｋｏｓｍａｔｏｐｏｕｌｏｓ  Ｋ、Ｍａｔｅｏ  Ｌ、Ｓｕｈｒｂｉｅｒ  Ａ、Ｌｅｍｏｎｎｉｅｒ  ＦＡ、Ｌａｎｇｌａｄｅ−Ｄｅｒｎｏｙｅｎ  Ｐ『Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』２９、３１１２、１９９９）。
【０００７】
ＣＴＬはウイルス感染に対する防御免疫の重要な構成要素であるが、ＣＴＬをインビボでプライミングする必要性は十分には理解されていない。今では、Ｔｈ細胞が合成ペプチドでのＣＴＬのプライミングのためには通常不可欠であることが認められている。合成ＣＴＬエピトープペプチドに関して、いくつかの研究が、最適なＣＴＬ反応を誘発するためにはＴｈリンパ球の刺激が必須であることを指摘している（Ｃ．Ｆａｙｏｌｌｅ、Ｅ．Ｄｅｒｉａｕｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｌｅｃｌｅｒｃ、『Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』１４７（１９９１）、ｐ．４０６９；Ｃ．Ｗｉｄｍａｎｎ、Ｐ．Ｒｏｍｅｒｏ、Ｊ．Ｌ．Ｍａｒｙａｎｓｋｉ、Ｇ．Ｃｏｒｒａｄｉｎ  ａｎｄ  Ｄ．Ｖａｌｍｏｒｉ、『Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ』１５５（１９９２）、ｐ．９５；Ｍ．Ｓｈｉｒａｉ、Ｃ．Ｄ．Ｐｅｎｄｋｔｏｎ、Ｊ．Ａｈｌｅｒｓ、Ｔ．Ｔａｋｅｓｈｉｔａ、Ｍ．Ｎｅｗｍａｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ａ．Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ、『Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』１５２（１９９４）、ｐ．５４９；Ｊ．Ｐ．Ｓａｕｅｔ、Ｈ．Ｇｒａｓ−Ｍａｓｓｅ、Ｊ．Ｇ．Ｇｕｉｌｌｅｔ  ａｎｄ  Ｅ．Ｇｏｍａｒｄ、『Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』８（１９９６）．ｐ．４５７）。これらの研究のいくつかは、ＣＤ４+ヘルパーＴ細胞とＣＤ８+Ｔ細胞が、それらのコグネイトエピトープを有する一つの抗原提示細胞と同時に相互作用することが、ＣＤ８+Ｔ細胞の活性化に必要であることを示している（Ｒｉｄｇｅ  ＪＰ、Ｄｉ  Ｒｏｓａ  Ｆ、Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ  Ｐ．『Ｎａｔｕｒｅ』１９９８年６月４日；３  ９３（６６８４）：４７４−８）。
ＣＴＬのプライミングにこの三つの細胞の相互作用が関与することは、ウイルスエピトープおよび動物モデルを用いた研究によって、ＣＴＬエピトープとＴｈ細胞エピトープが結合していない混合物として投与されるときより、物理的に結合しているときに、ＣＴＬのインビボでの誘発が最も効果的であったことから検証された（Ｓｈｉｒａｉ  Ｍ、Ｐｅｎｄｌｅｔｏｎ  ＣＤ、Ａｈｌｅｒｓ  Ｊ、Ｔａｋｅｓｈｉｔａ  Ｔ、Ｎｅｗｍａｎ  Ｍ、Ｂｅｒｚｏｈｋｙ  ＪＡ．『Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』１９９４年１月１５日；１５２（２）：５４９−５６；Ｏｓｅｒｏｆｆ  Ｃ、Ｓｅｔｔｅ  Ａ、Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ  Ｐ、Ｃｅｌｉｓ  Ｅ、Ｍａｅｗａｌ  Ａ、Ｄａｈｌｂｅｒｇ  Ｃ、Ｆｉｋｅｓ  Ｊ、Ｋｕｂｏ  ＲＴ、Ｃｈｅｓｎｕｔ  ＲＷ、Ｇｒｅｙ  ＢＸ  Ａｌｅｘａｎｄｅｒ『Ｊ．Ｖａｃｃｉｎｅ』１９９８年５月；１６（８）：８２３−３３）。ＣＴＬの抗原ペプチドとＴｈ細胞の抗原ペプチドの、ＣＴＬ反応を効果的に誘発する能力は、実験モデル（Ｃ．Ｆａｙｏｌｌｅ、Ｅ．Ｄｅｒｉａｕｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｌｅｃｌｅｒｃ、『Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』１４７（１９９１）、ｐ．４０６９；Ｃ．Ｗｉｄｍａｎｎ、Ｐ．Ｒｏｍｅｒｏ、Ｊ．Ｌ．Ｍａｒｙａｎｓｋｉ、Ｇ．Ｃｏｒｒａｄｉｎ  ａｎｄ  Ｄ．Ｖａｌｍｏｒｉ、『Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ』１５５（１９９２）、ｐ．９５）でも、ヒト（Ａ．Ｖｉｔｉｅｌｌｏ、Ｇ．Ｉｓｈｉｏｋａ、Ｈ．Ｍ．Ｇｒｅｙ、Ｒ．Ｒｏｓｅ、Ｐ．Ｆａｍｅｓｓ、Ｒ．ＬａＦｏｎｄ、Ｌ．Ｙｕａｎ、Ｆ．Ｖ．Ｃｈｉｓａｒｉ、Ｊ．Ｆｕｒｚｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅｕｚ、『Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ』９５（１９９５）、ｐ．３４１；Ｂ．Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ、Ｃ．Ｃｒｉｍｉ、Ｈ．Ｇｒｅｙ、Ｇ．Ｉｓｈｉｏｋａ、Ｆ．Ｖ．Ｃｈｉｓａｒｉ、Ｊ．Ｆｉｋｅｓ、Ｈ．Ｍ．Ｇｒｅｙ、Ｒ．Ｃｈｅｓｎｕｔ  ａｎｄ  Ａ．Ｓｅｔｔｅ、『Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』１５９（１９９７）、ｐ．１３８３）においても実証されている。さらに、強力なＴｈ反応は、ＣＴＬ反応の最適な誘発だけではなく、ＣＴＬの記憶の維持のためにも重要な役割を果たす（Ｅ．Ａ．Ｗａｌｔｅｒ、Ｐ．Ｄ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ、Ｍ．Ｊ．Ｇｉｌｂｅｒｔ、Ｒ．Ｊ．Ｆｉｎｃｈ、Ｋ−Ｓ．Ｗａｔａｎａｂｅ、Ｅ．Ｄ．Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｒ．Ｒｉｄｄｅｌｌ、『Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ』３３３（１９９５）、ｐ．１０３８；Ｔｈｏｍａｓ  ＥＤ、Ｂｌｕｍｅ  ＫＧ、Ｆｏｒｍａｎ  ＳＪ（編）『Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ』第２版、Ｍａｌｄｅｎ、ＭＡ：Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、１９９９年所収、Ｒｉｄｄｅｌｌ  ＳＲ、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ＰＤ）。最後に、ＣＤ４+「ヘルパー」Ｔ細胞が外来抗原に対する細胞性免疫反応と液性免疫反応を協調させることに重要であることも、古くから実証されてきている。
【０００８】
近年では、ＨＬＡ−Ａ*０２０１クラスＩ分子とＨＬＡ−ＤＲ１クラスＩＩ分子の両方を発現するトランスジェニック（Ｔｇ）マウスが確立された（ＢｅｎＭｏｈａｍｅｄ  Ｌ、Ｋｒｉｓｈｎａｎ  Ｒ、Ｌｏｎｇｍａｔｅ  Ｊ、Ａｕｇｅ  Ｃ、Ｌｏｗ  Ｌ、Ｐｒｉｍｕｓ  Ｊ、Ｄｉａｍｏｎｄ  ＤＪ、『Ｈｕｍ、Ｉｍｍｕｎｏｌ』２０００年８月；６１（８）：７６４−７９）。著者らは、ＨＬＡ−Ａ*０２０１トランスジーンとＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンの両方がインビボで機能的であること、ＭＨＣクラスＩ分子とクラスＩＩ分子の両方が拘束因子として用いられること、そして、ＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンの生成物がＨＬＡ−Ａ*０２０１拘束性の抗原特異的なＣＴＬ反応を助長することを報告している（ＢｅｎＭｏｈａｍｅｄ  Ｌ、Ｋｒｉｓｈｎａｎ  Ｒ、Ｌｏｎｇｍａｔｅ  Ｊ、Ａｕｇｅ  Ｃ、Ｌｏｗ  Ｌ、Ｐｒｉｍｕｓ  Ｊ、Ｄｉａｍｏｎｄ  ＤＪ、『Ｈｕｍ、Ｉｍｍｕｎｏｌ』２０００年８月；６１（８）：７６４−７９）。
【０００９】
これらＨＬＡ−Ａ*０２０１／ＤＲ１のＴｇマウスがそれらに固有のＭＨＣであるＨ−２クラスＩ分子およびクラスＩＩ分子を発現したことは注目に値する。内因性のマウスＭＨＣクラスＩ遺伝子を発現するＨＬＡクラスＩトランスジェニックマウスが、優先的に、そしてしばしば独占的にＨ−２拘束性のＣＴＬ反応を示し（Ｃ  Ｂａｒｒａ、Ｈ  Ｇｏｕｒｎｉｅｒ、Ｚ  Ｇａｒｃｉａ、ＰＮ  Ｍａｒｃｈｅ、Ｅ  Ｊｏｕｖｉｎ−Ｍａｒｃｈｅ、Ｐ  Ｂｒｉａｎｄ、Ｐ  Ｆｉｌｌｉｐｉ、ａｎｄ  ＦＡ  Ｌｅｍｏｎｎｉｅｒ『Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』１９９３、１５０：３６８１−３６８９；Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｈ、Ｈａｒｄｙ  Ｆ、Ｍａｙ  ＪＳ、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＭＨ、Ｈｏｌｍｅｓ  Ｎ『Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．』１９８９年９月；１９（９）：１５７５−８３；Ｌｅ  ＡＸ；ＥＪ  Ｂｅｒｎｈａｒｄ、ＭＪ  Ｈｏｌｔｅｒｍａｎ、Ｓ  Ｓｔｒｕｂ、Ｐ  Ｐａｒｈａｍ、Ｅ  Ｌａｃｙ、ａｎｄ  ＶＨ  Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ『Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』１９８９、１４２：１３６６−１３７１；Ｖｉｔｉｅｌｌｏ  Ａ、Ｍａｒｃｈｅｓｉｎｉ  Ｄ、Ｆｕｒｚｅ  Ｊ、Ｓｈｅｒｍａｎ  ＬＡ、Ｃｈｅｓｎｕｔ  ＲＷ『Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ』１９９１年４月１日；１７３（４）：１００７１５）、内因性のマウスＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を発現するＨＬＡクラスＩＩトランスジェニックマウスが、信頼性のあるＨＬＡクラスＩＩ拘束性の抗原特異的反応を誘発することができないことから（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  Ｙ、Ｉｗａｎａｇａ  Ｔ、Ｉｎａｍｉｔｓｕ  Ｔ、Ｙａｎａｇａｗａ  Ｙ、Ｙａｓｕｎａｍｉ  Ｍ、Ｋｉｍｕｒａ  Ａ、Ｈｉｒｏｋａｗａ  Ｋ、Ｓａｓａｚｕｋｉ  Ｔ『Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』１９９０年７月１日；１４５（１）３５３−６０）、これらＨＬＡ−Ａ*０２０１／ＤＲ１のＴｇマウスは、抗原に対するヒトの特異的反応を評価するためには限られた利用性となっている。
【００１０】
しかし、ＨＬＡクラスＩを遺伝子導入されたＨ−２クラスＩノックアウトマウス、または、ＨＬＡクラスＩＩを遺伝子導入されたＨ−２クラスＩＩノックアウトマウスにおいては、ＨＬＡ拘束性のＣＴＬ免疫反応だけが生じる（Ｐａｓｃｏｌｏ  Ｓ、Ｂｅｒｖａｓ  Ｎ、Ｕｒｅ  ＪＭ、Ｓｍｉｔｈ  ＡＧ、Ｌｅｍｏｎｎｉｅｒ  ＦＡ、Ｐｅｒａｒｎａｕ、Ｂ『Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ』１９９７年６月１６日；１８５（１２）：２０４３−５１；Ｍａｄｓｅｎ  Ｌ、Ｌａｂｒｅｃｑｕｅ  Ｎ、Ｅｎｇｂｅｒｇ  Ｊ、Ｄｉｅｒｉｃｈ  Ａ、Ｓｖｅｊｇａａｒｄ  Ａ、Ｂｅｎｏｉｓｔ  Ｃ、Ｍａｔｈｉｓ  Ｄ、Ｆｕｇｇｅｒ  Ｌ『Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ』１９９９年８月３１日；９６（１８）：１０３３８−４３）。実際、ＨＬＡ−Ａ２．１を遺伝子導入されたＨ−２クラスＩノックアウト（ＫＯ）マウスは、内因性のマウスＨ−２クラスＩ分子を発現したままとなっているＨＬＡ−Ａ２．１トランスジェニックマウスと比べて、強いＨＬＡ−Ａ２．１拘束性反応を実現する能力を示す（Ｐａｓｃｏｌｏ、Ｓ．ｅｔ  ａｌ．『Ｊ  Ｅｘ  Ｍｅｄ』１８５、２０４３−２０５１（１９９７）；Ｕｒｅｔａ−Ｖｉｄａｌ、Ａ．、Ｆｉｒａｔ、Ｈ．、Ｐｅｒａｒｎａｕ、Ｂ．＆Ｌｅｍｏｎｎｉｅｒ、Ｆ．Ａ．『Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』１６３、２５５５−２５６０（１９９９）；Ｆｉｒａｔ、Ｈ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』１４、９２５−９３４（２００２）；Ｒｏｈｒｌｉｃｈ、Ｐ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』１５、７６５−７７２（２００３））。本発明者らは、Ｈ−２クラスＩＩ分子を欠いているかいないかということに応じて、ＨＬＡ−ＤＲ１トランスジェニックマウスで同様の観察を行っている（Ａ．Ｐａｊｏｔ、未公刊の結果）。さらに、マウスのＭＨＣ分子との競合がないときには、ＨＬＡ−Ａ２．１を遺伝子導入されたＨ−２クラスＩ−ＫＯマウスまたはＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入されたＨ−２クラスＩＩ−ＫＯマウスは、ＨＬＡ拘束性免疫反応だけを生じさせ（Ｐａｓｃｏｌｏ、Ｓ．ｅｔ  ａｌ．『Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ』１８５、２０４３−２０５１（１９９７））（Ａ．Ｐａｊｏｔ、未公刊の結果）、ＨＬＡ拘束性のＣＤ８+Ｔ細胞反応およびＣＤ４+Ｔ細胞反応のモニタリングが容易になる。しかし、病原体に対する防御免疫反応は、ヘルパーＴ細胞と細胞傷害性ＣＤ８+Ｔ細胞の間の協調を必要とすることが多く、一頭のマウスにおいてＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩのヒトにおける反応を同時に評価することが不可能な、ＨＬＡクラスＩのみのトランスジェニックマウスまたはＨＬＡクラスＩＩのみのトランスジェニックマウスでは研究できない。
【００１１】
従って、当該分野では、ヒトＣＴＬエピトープを含む構造からなる、またある場合には、抗ウイルス性および抗腫瘍性のＣＤ８+Ｔ細胞活性を維持するための強力なＣＤ４+Ｔｈ（ヘルパーＴリンパ球）エピトープを含む構造からなる、ヒトのワクチン候補の免疫原性を試験するための、適した動物モデル系が必要である（Ａ．Ｊ．Ｚａｊａｃ、Ｋ．Ｍｕｒａｌｉ−Ｋｒｉｓｈｎａ、Ｊ．Ｎ．Ｂｌａｔｔｍａｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ａｈｍｅｄ『Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』１０（１９９８）、ｐ．４４４；Ｆｉｒａｔ  Ｈ、Ｇａｒｃｉａ−Ｐｏｎｓ  Ｆ、Ｔｏｕｒｄｏｔ  Ｓ、Ｐａｓｃｏｌｏ  Ｓ、Ｓｃａｒｄｉｎｏ  Ａ、Ｇａｒｃｉａ  Ｚ、Ｍｉｃｈｅｌ  ＭＬ、Ｊａｃｋ  ＲＷ、Ｊｕｎｇ  Ｏ、Ｋｏｓｍａｔｏｐｏｕｌｏｓ  Ｋ、Ｍａｔｅｏ  Ｌ、Ｓｕｈｒｂｉｅｒ  Ａ、Ｌｅｍｏｎｎｉｅｒ  ＦＡ、Ｌａｎｇｌａｄｅ−Ｄｅｒｎｏｙｅｎ  Ｐ『Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』２９、３１１２、１９９９）。また、ＣＴＬ反応、ＴＨ反応（特にＴＨ1反応またはＴＨ2反応）そして場合によっては液性免疫反応の間における相互協調を同時に評価することを可能にする系も必要とされている。
【特許文献１】米国特許第６１９４３８９号明細書
【特許文献２】米国特許第６２１４８０８号明細書
【非特許文献１】ＢｅｎＭｏｈａｍｅｄ  Ｌ、Ｋｒｉｓｈｎａｎ  Ｒ、Ｌｏｎｇｍａｔｅ  Ｊ、Ａｕｇｅ  Ｃ、Ｌｏｗ  Ｌ、Ｐｒｉｍｕｓ  Ｊ、Ｄｉａｍｏｎｄ  ＤＪ『Ｈｕｍ、Ｉｍｍｕｎｏｌ』．２０００年８月；６１（８）：７６４−７９）
【非特許文献２】Ａ．Ｊ．Ｚａｊａｃ、Ｋ．Ｍｕｒａｌｉ−Ｋｒｉｓｈｎａ、Ｊ．Ｎ．Ｂｌａｔｔｍａｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ａｈｍｅｄ『Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』１０（１９９８）、ｐ．４４４
【非特許文献３】Ｆｉｒａｔ  Ｈ、Ｇａｒｃｉａ−Ｐｏｎｓ  Ｆ、Ｔｏｕｒｄｏｔ  Ｓ、Ｐａｓｃｏｌｏ  Ｓ、Ｓｃａｒｄｉｎｏ  Ａ、Ｇａｒｃｉａ  Ｚ、Ｍｉｃｈｅｌ  ＭＬ、Ｊａｃｋ  ＲＷ、Ｊｕｎｇ  Ｏ、Ｋｏｓｍａｔｏｐｏｕｌｏｓ  Ｋ、Ｍａｔｅｏ  Ｌ、Ｓｕｈｒｂｉｅｒ  Ａ、Ｌｅｍｏｎｎｉｅｒ  ＦＡ、Ｌａｎｇｌａｄｅ−Ｄｅｒｎｏｙｅｎ  Ｐ『Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』２９、３１１２、１９９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者らは、Ｈ−２クラスＩ分子およびクラスＩＩ分子の両方を欠いている遺伝的背景で、ＨＬＡ−Ａ２．１分子とＨＬＡ−ＤＲ１分子の両方を遺伝子導入したマウスを提供することで、この必要性を満たし、さらなる必要性に応えた。具体的には、本発明はマウスを提供するものであるが、該マウスは、（１）変異したＨ−２クラスＩ分子およびクラスＩＩ分子を含み、（２）遺伝子導入したＨＬＡクラスＩ分子、または、遺伝子導入したＨＬＡクラスＩＩ分子、あるいは、遺伝子導入したＨＬＡクラスＩ分子と遺伝子導入したＨＬＡクラスＩＩ分子の両方を発現するものである。これらのマウスは、ヒトに使用するための、インビボにおける最大の免疫原性を備えたワクチン構造を開発し、最適化することにおいて有用なモデルを提供する。具体的には、このようなマウスによって、動物個体における免疫適応応答の三つの構成要素（抗体、ヘルパーＴ細胞および細胞溶解）の完全な分析、ならびに、抗原の攻撃に対する、ワクチン投与によって特異的に与えられる防御を評価することが可能になる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明のマウスは、Ｈ−２クラスＩ分子とクラスＩＩ分子の両方をノックアウトし、遺伝子導入したＨＬＡクラスＩの分子および遺伝子導入したＨＬＡクラスＩＩの分子を発現するもので、完全にヒト化した実験用マウスであり、該マウスは、抗原特異的抗体、抗原特異的なＨＬＡ−ＤＲ１拘束性のＴ細胞反応、および抗原特異的なＨＬＡ−Ａ２拘束性のＴ細胞反応の存否を同時に検出するために用いることができる。これらのマウスは、ＣＴＬ反応、ＴＨ反応（特にＴＨ1またはＴＨ2反応）、そして場合によっては液性免疫反応の間でどのように相互協調が起こるのかということを研究するために有用となる。これらのマウスは、基礎的および応用的なワクチン研究のための最適なツールとなる。
【００１４】
本発明の第一の実施態様は、破壊されたＨ−２クラスＩ遺伝子、破壊されたＨ−２クラスＩＩ遺伝子、および、機能的なＨＬＡクラスＩトランスジーンまたはクラスＩＩトランスジーンを含む、トランスジェニックマウスを提供するものである。
【００１５】
本発明の第二の実施態様は、破壊されたＨ−２クラスＩ遺伝子、破壊されたＨ−２クラスＩＩ遺伝子、機能的なＨＬＡクラスＩトランスジーン、および機能的なＨＬＡクラスＩＩトランスジーンを含む、トランスジェニックマウスを提供するものである。
【００１６】
いくつかの実施態様では、ＨＬＡクラスＩトランスジーンはＨＬＡ−Ａ２トランスジーンであり、ＨＬＡクラスＩＩトランスジーンはＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンである。その他の実施態様では、ＨＬＡ−Ａ２トランスジーンはシーケンスリストに掲載されたＨＬＡ−Ａ２の配列を含み、ＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンはシーケンスリストに掲載されたＨＬＡ−ＤＲ１の配列を含んでいる。
【００１７】
本発明のさらなる実施態様は、Ｈ−２クラスＩ分子とクラスＩＩ分子の両方を欠いたトランスジェニックマウスを提供しており、該実施態様では、トランスジェニックマウスは機能的なＨＬＡクラスＩトランスジーンと、機能的なＨＬＡクラスＩＩトランスジーンを含んでいる。一つの実施態様では、マウスはＨＬＡ−Ａ２+ＨＬＡ−ＤＲ１+β２ｍ゜ＩＡβ゜という遺伝子型を有している。いくつかの実施態様では、ＨＬＡ−Ａ２トランスジーンはシーケンスリストに掲載されたＨＬＡ−Ａ２の配列を含み、ＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンはシーケンスリストに掲載されたＨＬＡ−ＤＲ１の配列を含んでいる
【００１８】
本発明のもう一つの実施態様は、一つの候補抗原または候補抗原群における一つまたは複数のエピトープの存否を同時に識別するための方法を提供しており、該実施態様では、一つまたは複数のエピトープにより、特異的な液性免疫反応、ＴＨのＨＬＡ−ＤＲ１拘束性反応、および／またはＣＴＬのＨＬＡ−Ａ２拘束性反応が生じる。該方法は、破壊されたＨ−２クラスＩ遺伝子、破壊されたＨ−２クラスＩＩ遺伝子、機能的なＨＬＡ−Ａ２トランスジーン、および機能的なＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンを含むトランスジェニックマウスに、あるいは、機能的なＨＬＡクラスＩトランスジーンと機能的なＨＬＡクラスＩＩトランスジーンを含み、ＨＬＡ−Ａ２+ＨＬＡ−ＤＲ１+β２ｍ゜ＩＡβ゜という遺伝子型を有している、Ｈ−２クラスＩ分子とクラスＩＩ分子の両方を欠いたトランスジェニックマウスに、候補抗原または候補抗原群を投与すること、マウスにおける、抗原に対する特異的液性免疫反応を分析すること、マウスにおける、抗原に対するＴＨのＨＬＡ−ＤＲ１拘束性反応を分析すること、そして、マウスにおける、抗原に対するＣＴＬのＨＬＡ−Ａ２拘束性反応を分析することを含んでいる。マウスにおいて抗原に対する特異的液性免疫反応が見られることで、抗原における液性免疫反応を生じさせるエピトープが確認される。マウスにおいて抗原に対するＴＨのＨＬＡ−ＤＲ１拘束性反応が見られることで、抗原におけるＴＨのＨＬＡ−ＤＲ１拘束性反応を生じさせるエピトープが確認される。マウスにおいて抗原に対するＣＴＬのＨＬＡ−Ａ２拘束性反応が見られることで、抗原におけるＣＴＬのＨＬＡ−Ａ２拘束性反応を生じさせるエピトープが確認される。
【００１９】
いくつかの実施態様では、この方法は、マウスにおける抗原に対するＴｈ１特異的反応を分析することと、マウスにおける抗原に対するＴｈ２特異的反応を分析することを含んでいる。この場合、マウスにおいて抗原に対するＴｈ１特異的反応が見られることで、マウスにおいて抗原に対するＴｈ１特異的反応を生じさせるエピトープが確認され、マウスにおいて抗原に対するＴｈ２特異的反応が見られることで、マウスにおける抗原に対するＴｈ２特異的反応を生じさせるエピトープが確認される。
【００２０】
また、本発明は、一つの候補抗原または候補抗原群におけるＨＬＡ−ＤＲ１拘束性ヘルパーＴ細胞エピトープの存否を識別する方法も提供するものであり、該方法は、破壊されたＨ−２クラスＩ遺伝子、破壊されたＨ−２クラスＩＩ遺伝子、機能的なＨＬＡ−Ａ２トランスジーンおよび機能的なＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンを含んでいるトランスジェニックマウスに、あるいは、機能的なＨＬＡクラスＩトランスジーンと機能的なＨＬＡクラスＩＩトランスジーンを含み、ＨＬＡ−Ａ２+ＨＬＡ−ＤＲ１+β２ｍ゜ＩＡβ゜という遺伝子型を有している、Ｈ−２クラスＩ分子およびクラスＩＩ分子の両方を欠いたトランスジェニックマウスに、候補抗原または候補抗原群を投与することと、マウスにおいて、抗原に対する、ＴＨのＨＬＡ−ＤＲ１拘束性ヘルパーＴ細胞エピトープ反応を分析することを含んでいる。マウスにおいて、抗原に対する、ＴＨのＨＬＡ−ＤＲ１拘束性ヘルパーＴ細胞エピトープ反応が見られることで、抗原における、ＴＨのＨＬＡ−ＤＲ１拘束性ヘルパーＴ細胞エピトープ反応を生じさせるエピトープが確認される。
【００２１】
さらに、本発明は、前段落の方法によって確認されたＨＬＡ−ＤＲ１拘束性ヘルパーＴ細胞のエピトープを含む、単離された抗原を提供するものである。いくつかの実施態様では、単離された抗原はさらに、液性免疫反応を生じさせるエピトープおよび／またはＣＴＬのＨＬＡ−Ａ２拘束性反応を生じさせるエピトープを含んでいる。別の実施態様では、ＨＬＡ−ＤＲ１拘束性ヘルパーＴ細胞のエピトープを含む抗原はポリペプチドを含んでいる。その他の実施態様では、ＨＬＡ−ＤＲ１拘束性ヘルパーＴ細胞のエピトープを含む抗原はポリヌクレオチドを含んでいる。さらなる実施態様では、ＨＬＡ−ＤＲ１拘束性ヘルパーＴ細胞のエピトープを含む抗原は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいはＤＮＡとＲＮＡの両方を含んでいる。
【００２２】
さらに、本発明は、一つの候補抗原または候補抗原群におけるＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープの存否を識別する方法も提供するものであり、該方法は、破壊されたＨ−２クラスＩ遺伝子、破壊されたＨ−２クラスＩＩ遺伝子、機能的なＨＬＡ−Ａ２トランスジーンおよび機能的なＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンを含んでいるトランスジェニックマウスに、または、機能的なＨＬＡクラスＩトランスジーンと機能的なＨＬＡクラスＩＩトランスジーンを含み、ＨＬＡ−Ａ２+ＨＬＡ−ＤＲ１+β２ｍ゜ＩＡβ゜という遺伝子型を有している、Ｈ−２クラスＩ分子およびクラスＩＩ分子の両方を欠いたトランスジェニックマウスに、候補抗原または候補抗原群を投与することと、マウスにおける抗原または抗原群に対するＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）反応を分析することを含んでいる。マウスにおいて抗原または抗原群に対するＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）反応が見られることで、抗原または抗原群においてＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）反応を生じさせるエピトープが確認される。
【００２３】
本発明は、前段落の方法によって確認された、ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープを含む、単離された抗原を提供するものである。いくつかの実施態様では、抗原がさらに、液性免疫反応を生じさせるエピトープおよび／またはＴＨのＨＬＡ−ＤＲ１拘束性ヘルパーＴ細胞エピトープ反応を生じさせるエピトープを含んでいる。別の実施態様では、ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープを含む抗原はポリペプチドを含んでいる。その他の実施態様では、ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープを含む抗原はポリヌクレオチドを含んでいる。さらなる実施態様では、ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープを含む抗原は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または、ＤＮＡとＲＮＡの両方を含んでいる。
【００２４】
また、本発明は二つまたはそれ以上のワクチンによって誘発されたヘルパーＴ細胞の反応の有効性を比較する方法も提供するものである。この方法は、破壊されたＨ−２クラスＩ遺伝子、破壊されたＨ−２クラスＩＩ遺伝子、機能的なＨＬＡ−Ａ２トランスジーンおよび機能的なＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンを含むトランスジェニックマウスに、あるいは、機能的なＨＬＡクラスＩトランスジーンと機能的なＨＬＡクラスＩＩトランスジーンを含み、ＨＬＡ−Ａ２+ＨＬＡ−ＤＲ１+β２ｍ゜ＩＡβ゜という遺伝子型を有する、Ｈ−２クラスＩ分子およびクラスＩＩ分子の両方を欠いたトランスジェニックマウスに、第一の候補ワクチンを投与し、第一の候補ワクチンによってマウスにおいて誘発されたヘルパーＴ細胞の反応を測定すること、破壊されたＨ−２クラスＩ遺伝子、破壊されたＨ−２クラスＩＩ遺伝子、機能的なＨＬＡ−Ａ２トランスジーンおよび機能的なＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンを含むトランスジェニックマウスに、または、機能的なＨＬＡクラスＩトランスジーンおよび機能的なＨＬＡクラスＩＩトランスジーンを含み、ＨＬＡ−Ａ２+ＨＬＡ−ＤＲ１+β２ｍ゜ＩＡβ゜という遺伝子型を有している、Ｈ−２クラスＩ分子およびクラスＩＩ分子の両方を欠いたトランスジェニックマウスに、第二の候補ワクチンを投与し、第二の候補ワクチンによってマウスにおいて誘発されたヘルパーＴ細胞の反応を測定すること、破壊されたＨ−２クラスＩ遺伝子、破壊されたＨ−２クラスＩＩ遺伝子、機能的なＨＬＡ−Ａ２トランスジーンおよび機能的なＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンを含むトランスジェニックマウスに、または、機能的なＨＬＡクラスＩトランスジーンと機能的なＨＬＡクラスＩＩトランスジーンを含み、ＨＬＡ−Ａ２+ＨＬＡ−ＤＲ１+β２ｍ゜ＩＡβ゜という遺伝子型を含んでいる、Ｈ−２クラスＩ分子およびクラスＩＩ分子の両方を欠いたトランスジェニックマウスに、比較すべきさらなる候補ワクチンのそれぞれを投与し、さらなる候補ワクチンによってマウスにおいて誘発されたヘルパーＴ細胞の反応を測定すること、そして、比較すべき各ワクチンに対するヘルパーＴ細胞の反応を相互に比較してヘルパーＴ細胞の反応を誘発する各候補ワクチンの有効性を判定することを含んでいる。いくつかの実施態様では、ヘルパーＴ細胞の反応はＨＬＡ−ＤＲ１拘束性反応である。
【００２５】
さらに、本発明は、二つまたはそれ以上のワクチンによって誘発された細胞傷害性Ｔ細胞反応の有効性を比較する方法を提供するものである。本方法は、破壊されたＨ−２クラスＩ遺伝子、破壊されたＨ−２クラスＩＩ遺伝子、機能的なＨＬＡ−Ａ２トランスジーンおよび機能的なＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンを含むトランスジェニックマウスに、または、機能的なＨＬＡクラスＩトランスジーンと機能的なＨＬＡクラスＩＩトランスジーンを含み、ＨＬＡ−Ａ２+ＨＬＡ−ＤＲ１+β２ｍ゜ＩＡβ゜という遺伝子型を有している、Ｈ−２クラスＩ分子およびクラスＩＩ分子の両方を欠いたトランスジェニックマウスに、第一の候補ワクチンを投与し、第一の候補ワクチンによってマウスにおいて誘発された細胞傷害性Ｔ細胞の反応を測定すること、破壊されたＨ−２クラスＩ遺伝子、破壊されたＨ−２クラスＩＩ遺伝子、機能的なＨＬＡ−Ａ２トランスジーンおよび機能的なＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンを含むトランスジェニックマウスに、または、機能的なＨＬＡクラスＩトランスジーンと機能的なＨＬＡクラスＩＩトランスジーンを含み、ＨＬＡ−Ａ２+ＨＬＡ−ＤＲ１+β２ｍ゜ＩＡβ゜という遺伝子型を有している、Ｈ−２クラスＩ分子およびクラスＩＩ分子の両方を欠いたトランスジェニックマウスに、第二の候補ワクチンを投与し、第二の候補ワクチンによってマウスにおいて誘発された細胞傷害性Ｔ細胞反応を測定すること、破壊されたＨ−２クラスＩ遺伝子、破壊されたＨ−２クラスＩＩ遺伝子、機能的なＨＬＡ−Ａ２トランスジーンおよび機能的なＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンを含むトランスジェニックマウスに、または、機能的なＨＬＡクラスＩトランスジーンと機能的なＨＬＡクラスＩＩトランスジーンを含み、ＨＬＡ−Ａ２+ＨＬＡ−ＤＲ１+β２ｍ゜ＩＡβ゜という遺伝子型を有している、Ｈ−２クラスＩ分子およびクラスＩＩ分子の両方を欠いたトランスジェニックマウスに、比較すべきさらなる候補ワクチンのそれぞれを投与し、さらなる候補ワクチンによってマウスにおいて誘発された細胞傷害性Ｔ細胞反応を測定すること、そして、比較すべき各ワクチンに対する細胞傷害性Ｔ細胞反応を相互に比較して細胞傷害性Ｔ細胞反応を誘発する各候補ワクチンの有効性を判定することを含んでいる。いくつかの実施態様では、細胞傷害性Ｔ細胞反応はＨＬＡ−Ａ２拘束性反応である。
【００２６】
さらに、本発明は、二つまたはそれ以上のワクチンによって誘発されたヘルパーＴ細胞の反応と細胞傷害性Ｔ細胞の反応の有効性を同時に比較する方法も提供するものである。本方法は、破壊されたＨ−２クラスＩ遺伝子、破壊されたＨ−２クラスＩＩ遺伝子、機能的なＨＬＡ−Ａ２トランスジーンおよび機能的なＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンを含むトランスジェニックマウスに、または、機能的なＨＬＡクラスＩトランスジーンと機能的なＨＬＡクラスＩＩトランスジーンを含み、ＨＬＡ−Ａ２+ＨＬＡ−ＤＲ１+β２ｍ゜ＩＡβ゜という遺伝子型を有している、Ｈ−２クラスＩ分子およびクラスＩＩ分子の両方を欠いたトランスジェニックマウスに、第一の候補ワクチンを投与し、第一の候補ワクチンによってマウスにおいて誘発されたヘルパーＴ細胞の反応と細胞傷害性Ｔ細胞の反応を測定すること、破壊されたＨ−２クラスＩ遺伝子、破壊されたＨ−２クラスＩＩ遺伝子、機能的なＨＬＡ−Ａ２トランスジーンおよび機能的なＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンを含むトランスジェニックマウスに、または、機能的なＨＬＡクラスＩトランスジーンと機能的なＨＬＡクラスＩＩトランスジーンを含み、ＨＬＡ−Ａ２+ＨＬＡ−ＤＲ１+β２ｍ゜ＩＡβ゜という遺伝子型を有している、Ｈ−２クラスＩ分子およびクラスＩＩ分子の両方を欠いたトランスジェニックマウスに、第二の候補ワクチンを投与し、第二の候補ワクチンによってマウスにおいて誘発されたヘルパーＴ細胞の反応と細胞傷害性Ｔ細胞の反応を測定すること、破壊されたＨ−２クラスＩ遺伝子、破壊されたＨ−２クラスＩＩ遺伝子、機能的なＨＬＡ−Ａ２トランスジーンおよび機能的なＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンを含むトランスジェニックマウスに、または、機能的なＨＬＡクラスＩトランスジーンと機能的なＨＬＡクラスＩＩトランスジーンを含み、ＨＬＡ−Ａ２+ＨＬＡ−ＤＲ１+β２ｍ゜ＩＡβ゜という遺伝子型を有している、Ｈ−２クラスＩ分子およびクラスＩＩ分子の両方を欠いたトランスジェニックマウスに、比較すべきさらなる候補ワクチンのそれぞれを投与し、さらなる候補ワクチンのそれぞれによってマウスにおいて誘発されたヘルパーＴ細胞の反応と細胞傷害性Ｔ細胞の反応を測定すること、そして、比較すべき各ワクチンに対するヘルパーＴ細胞の反応と細胞傷害性Ｔ細胞の反応を相互に比較してヘルパーＴ細胞の反応と細胞傷害性Ｔ細胞の反応を誘発する各候補ワクチンの有効性を判定することを含んでいる。いくつかの実施態様では、ヘルパーＴ細胞の反応はＨＬＡ−ＤＲ１拘束性反応であり、細胞傷害性Ｔ細胞の反応がＨＬＡ−Ａ２拘束性反応である。
【００２７】
また、本発明は、一つの抗原による免疫付与、あるいは、一つまたは複数の抗原を有するワクチンによる免疫付与に従った、マウスの液性免疫反応、ヘルパーＴ細胞の反応、そして細胞傷害性Ｔ細胞の反応を同時に判定する方法を提案するものでもある。本方法は、破壊されたＨ−２クラスＩ遺伝子、破壊されたＨ−２クラスＩＩ遺伝子、機能的なＨＬＡ−Ａ２トランスジーンおよび機能的なＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンを含むトランスジェニックマウスに、または、機能的なＨＬＡクラスＩトランスジーンと機能的なＨＬＡクラスＩＩトランスジーンを含み、ＨＬＡ−Ａ２+ＨＬＡ−ＤＲ１+β２ｍ゜ＩＡβ゜という遺伝子型を有している、Ｈ−２クラスＩ分子とクラスＩＩの分子の両方を欠いたトランスジェニックマウスに、抗原、もしくは、一つまたは複数の抗原を含むワクチンを投与すること、抗原、もしくは、一つまたは複数の抗原を含むワクチンに対する、マウスにおける特異的液性免疫反応を分析すること、抗原、もしくは、一つまたは複数の抗原を含むワクチンに対する、マウスにおけるヘルパーＴ細胞の反応を分析すること、そして、抗原、もしくは、一つまたは複数の抗原を含むワクチンに対する、マウスにおける細胞傷害性Ｔ細胞の反応を分析することを含んでいる。いくつかの実施態様において、ヘルパーＴ細胞の反応はＴＨのＨＬＡ−ＤＲ１拘束性反応である。いくつかの実施態様において、細胞傷害性Ｔ細胞の反応はＣＴＬのＨＬＡ−Ａ２拘束性反応である。
【００２８】
また、本発明は、事前に選択された基準に基づき、二つまたはそれ以上の候補ワクチンの組成物をヒトに投与するために最適化する方法も提供するものである。本方法は、二つまたはそれ以上の候補ワクチンの組成物による免疫付与に従った、マウスの液性免疫反応、ヘルパーＴ細胞の反応および細胞傷害性Ｔ細胞の反応を同時に判定することを含み、ここで用いる方法は、破壊されたＨ−２クラスＩ遺伝子、破壊されたＨ−２クラスＩＩ遺伝子、機能的なＨＬＡ−Ａ２トランスジーンおよび機能的なＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンを含むトランスジェニックマウスに、または、機能的なＨＬＡクラスＩトランスジーンと機能的なＨＬＡクラスＩＩトランスジーンを含み、ＨＬＡ−Ａ２+ＨＬＡ−ＤＲ１+β２ｍ゜ＩＡβ゜という遺伝子型を有している、Ｈ−２クラスＩ分子とクラスＩＩ分子の両方を欠いたトランスジェニックマウスに、抗原、もしくは、一つまたは複数の抗原を含むワクチンを投与すること、抗原、もしくは、一つまたは複数の抗原を含むワクチンに対する、マウスにおける特異的液性免疫反応を分析すること、抗原、もしくは、一つまたは複数の抗原を含むワクチンに対する、マウスにおけるヘルパーＴ細胞の反応を分析すること、抗原、もしくは、一つまたは複数の抗原を含むワクチンに対する、マウスにおける細胞傷害性Ｔ細胞の反応を分析すること、そして、事前に選択された基準を結果に適用して、最適化されたワクチンを選択することを含む。いくつかの実施態様では、二つまたはそれ以上のワクチン候補は、ワクチンに存在するアジュバントに対する抗原の割合においてのみ異なっている。いくつかの実施態様では、二つまたはそれ以上のワクチン候補は、ワクチンに存在するアジュバントのタイプにおいてのみ異なっている。
【００２９】
もう一つの特徴では、本発明は、ワクチンがヒトに投与されたときに、自己免疫疾患を誘発する危険性を有するか否かを判定する方法を提供するものである。本方法は、破壊されたＨ−２クラスＩ遺伝子、破壊されたＨ−２クラスＩＩ遺伝子、機能的なＨＬＡ−Ａ２トランスジーンおよび機能的なＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンを含むトランスジェニックマウスに、または、機能的なＨＬＡクラスＩトランスジーンと機能的なＨＬＡクラスＩＩトランスジーンを含み、ＨＬＡ−Ａ２+ＨＬＡ−ＤＲ１+β２ｍ゜ＩＡβ゜という遺伝子型を有する、Ｈ−２クラスＩ分子とクラスＩＩ分子の両方を欠いたトランスジェニックマウスにワクチンを投与すること、そして、マウスにおける自己免疫反応を分析することを含んでおり、該分析において、マウスにおいて自己免疫反応が見られるということは、ワクチンがヒトに投与されたときに自己免疫疾患を誘発する危険性を有するものであることを示す。
【００３０】
また、本発明は、破壊されたＨ−２クラスＩ遺伝子、破壊されたＨ−２クラスＩＩ遺伝子、および、機能的なＨＬＡクラスＩトランスジーンまたはクラスＩＩトランスジーンを含む、単離されたトランスジェニックマウスの細胞を提供するものでもある。
【００３１】
さらに、本発明は、破壊されたＨ−２クラスＩ遺伝子、破壊されたＨ−２クラスＩＩ遺伝子、機能的なＨＬＡクラスＩトランスジーンおよび機能的なＨＬＡクラスＩＩトランスジーンを含む、単離されたトランスジェニックマウスの細胞を提供するものでもある。
【００３２】
いくつかの実施態様では、ＨＬＡクラスＩトランスジーンはＨＬＡ−Ａ２トランスジーンであり、ＨＬＡクラスＩＩトランスジーンはＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンである。その他の実施態様では、ＨＬＡ−Ａ２トランスジーンは、シーケンスリストに掲載されたＨＬＡ−Ａ２の配列を含み、ＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンは、シーケンスリストに掲載されたＨＬＡ−ＤＲ１の配列を含んでいる。
【００３３】
さらに、本発明は、Ｈ−２クラスＩ分子およびクラスＩＩ分子の両方を欠いている、単離されたトランスジェニックマウスの細胞を提供するものであり、ここでは、トランスジェニックマウスの細胞は、機能的なＨＬＡクラスＩトランスジーンと、機能的なＨＬＡクラスＩＩトランスジーンを含んでいる。いくつかの実施態様では、トランスジェニックマウスの細胞はＨＬＡ−Ａ２+ＨＬＡ−ＤＲ１+β２ｍ゜ＩＡβ゜という遺伝子型を有している。その他の実施態様では、ＨＬＡ−Ａ２トランスジーンは、シーケンスリストに掲載されたＨＬＡ−Ａ２の配列を含み、ＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンは、シーケンスリストに掲載されたＨＬＡ−ＤＲ１の配列を含んでいる。
【００３４】
本発明は、以下の図面を参照することで、より十全に説明されるものである。
【００３５】
図１は、表示されている遺伝子導入した分子の細胞表面発現のフローサイトメトリー分析を示している。（ａ）ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩＩ−ＫＯマウスに由来する脾細胞（ＤＲ１+ＣＩＩ-、左パネル）、ＨＬＡ−Ａ２．１／ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩ／クラスＩＩ−ＫＯマウスに由来する脾細胞（Ａ２+ＤＲ１+ＣＩ-ＣＩＩ-、中央パネル）、および、ＨＬＡ−Ａ２．１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩ−ＫＯマウスに由来する脾細胞（Ａ２+ＣＩ-、右パネル）を、ＦＩＴＣ標識Ｗ６／３２（抗ＨＬＡ−ＡＢＣ、横座標）またはビオチン化した２８−８−６Ｓ（抗Ｈ−２Ｋb／Ｄb、縦座標）ｍ．Ａｂのいずれかによって染色し、後者は、ＰＥ標識抗マウスＩｇＧで可視化した。（ｂ）同一のマウス系統に由来するＢ２２０+脾臓Ｂリンパ球を、ＦＩＴＣ標識Ｌ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ１、上パネル）とＰＥ標識ＡＦ６−１２０．１（抗Ｈ−２ＩＡβb、下パネル）ｍ．Ａｂで染色した。
【００３６】
図２は、表示された遺伝子型のマウスにおける、ＣＤ８+およびＣＤ４+の脾臓Ｔ細胞の数およびＢＶセグメントの使用（ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ分析に基づく）を示している。（ａ）ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩＩ−ＫＯマウスに由来する脾細胞（ＤＲ１+ＣＩＩ-、左パネル）、ＨＬＡ−Ａ２．１／ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩ／クラスＩＩ−ＫＯマウスに由来する脾細胞（Ａ２+ＤＲ１+ＣＩ-ＣＩＩ-、中央パネル）、および、ＨＬＡ−Ａ２．１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩ−ＫＯマウスに由来する脾細胞（Ａ２+ＣＩ-、右パネル）を、ＰＥ標識ＣＴ−ＣＤ４（抗マウスＣＤ４、縦座標）およびＦＩＴＣ標識５３−６．７（抗マウスＣＤ８、横座標）ｍ．Ａｂで染色した。数字は、脾細胞全体におけるＣＤ４+Ｔ細胞（左上の四角）またはＣＤ８+Ｔ細胞（右下の四角）のパーセンテージに対応している。（ｂおよびｃ）ＢＶファミリー（１−２０）に特異的なフォワードプライマーおよびＢＣリバースプライマーを用いての、ＢＶセグメントファミリー（１−２０）の使用についての、精製した脾臓のＣＤ８+Ｔ細胞（ｂ）およびＣＤ４+Ｔ細胞（ｃ）のｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ  ＲＴ−ＰＣＲ分析である。生産的に再配列したＢＶセグメントファミリーの典型的なグラフの特徴は、ガウス分布のような分布に、３ヌクレオチドによる長さが異なる一連のピークを有している。この図は、ＨＬＡ−Ａ２．１／ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩ／クラスＩＩ−ＫＯの代表のマウスで得られた結果を示している。
【００３７】
図３はＨＢｓ特異的抗体反応、細胞溶解反応および増殖反応を示している。ＨＬＡ−Ａ２．１／ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩ／クラスＩＩ−ＫＯマウスを、ＨＢｓＡｇをコードするプラスミドＤＮＡを筋肉注射することによって免疫付与し、また免疫付与せず、それから個別に試験した。（ａ）ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡで免疫付与した代表のマウスの液性免疫反応（上パネル）、細胞溶解反応（中パネル）および増殖反応（下パネル）、ならびに特異性についての対照である。ｍｉｄｄｌｅとｓｍａｌｌのＨＢＶエンベロープタンパク質の両方を含有するＨＢｓＡｇ粒子に対する抗体（ＩｇＧ）の力価と、ｐｒｅＳ２109-134ペプチドに対する抗体の力価を、ＥＬＩＳＡ検定で判定した。様々なエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）の割合における細胞溶解活性を、関連ペプチド（ＨＢｓＡｇ348-357、ＨＬＡ−Ａ２．１拘束性◆）または対照ペプチド（ＨＢｓＡｇ371-378、Ｈ−２Ｋb拘束性Δ、およびＭＡＧＥ−３271-279、ＨＬＡ−Ａ２．１拘束性□）をパルスしたＲＭＡＳ−ＨＨＤ標的細胞を用いて評価した。増殖反応は、関連ペプチド（ＨＢｓＡｇ180-195、ＨＬＡ−ＤＲ１拘束性）または対照ペプチド（ＨＢｓＡｇ126-138、Ｈ−２ＩＡb拘束性およびＨＩＶ１Ｇａｇ263-278、ＨＬＡ−ＤＲ１拘束性）のいずれかを用いて検出した。（ｂ）ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡで免疫付与した６匹のマウス（１〜６）の抗体反応（ＩｇＧ、上パネル）、細胞溶解反応（中パネル）および増殖反応（下パネル）の同様の評価を、６匹の未処理マウス（０）の反応の平均と比較したものである。３０／１のＥ／Ｔ割合での細胞溶解活性を、免疫的にドミナントなペプチドであるＨＢｓＡｇ348-357（塗りつぶした棒）、または、サブドミナントなペプチドであるＨＢｓＡｇ335-343（グレーの棒）のいずれかをパルスしたＲＭＡＳ−ＨＨＤ標的細胞で評価した。
【００３８】
図４は防御分析の結果を示している。ＨＬＡ−Ａ２．１／ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩ／クラスＩＩ−ＫＯマウスは、ＨＢｓＡｇをコードしているプラスミドＤＮＡで二回免疫付与したものと、していないものを用意した。最後の免疫付与から１５日後、該マウスを、ＨＢｓＡｇまたはＨＢｘタンパク質のいずれかを発現している１０7ＰＦＵのｒＶＶを腹腔内接種して攻撃した。４日後、マウスを、卵巣におけるウイルス力価について個別に試験した。結果（１０を底とする対数で示したｒＶＶのＰＦＵ／卵巣）は、ｒＶＶ−ＨＢｓＡｇで攻撃したＨＢｓＡｇ−ＤＮＡで免疫付与したマウス（Ｉ、ｎ＝１０）、ｒＶＶ−ＨＢｓＡｇで攻撃した未処理マウス（Ｎ、ｎ＝６）、ｒＶＶ−ＨＢｘで攻撃したＨＢｓＡｇで免疫付与したマウス（Ｉｘ、ｎ＝６）、および、ｒＶＶ−ＨＢｘで攻撃した未処理マウス（Ｎｘ、ｎ＝６）について示されている。
【００３９】
図５は、ｐｃｍｖＳ２／Ｓによる免疫付与に従った、ＨＬＡ−Ａ２+ＤＲ１+ＣＩ-ＣＩＩ-マウスにおけるＡＣの抗ＰｒｅＳ２反応を示している。
【００４０】
図６は、ｐｃｍｖＳ２−ＳによるＨＬＡ−Ａ２+ＤＲ１+ＣＩ-ＣＩＩ-マウスの免疫付与に従った、ＨＬＡ−ＤＲ１拘束性エピトープに対するＣＤ４+Ｔ細胞の増殖反応を示している。
【００４１】
図７は、ｐｃｍｖＳ２／ＳによるＨＬＡ−Ａ２+ＤＲ１+ＣＩ-ＣＩＩ-マウスの免疫付与に従った、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＨＢＳ（３４８−３５７）ペプチドに対する、ＣＤ８+Ｔ細胞の細胞傷害性反応を示している。
【００４２】
配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は下位の部分を含んでおり、その下位の部分であるヌクレオチド１−１２０５はＨＬＡ−Ａ２プロモーターを含み、ヌクレオチド１２０６−１２６５はＨＬＡ−Ａ２リーダー配列を含み、ヌクレオチド１２６６−１５６５はヒトβ２ミクログロブリンｃＤＮＡを含み、ヌクレオチド１５６６−１６１０は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）3リンカーを含み、ヌクレオチド１６１１−２４４０は、ＨＬＡ−Ａ２のエクソン２およびイントロン３の一部を含有するセグメントを含み、そして、ヌクレオチド２４４１−４５４７は、イントロン３の一部、エクソン４から８、および、Ｈ2Ｄb遺伝子の３’非コード領域の一部を含有するセグメントを含んでいる。
【００４３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２は、ＤＲＡ*０１０１遺伝子のヌクレオチド配列である。ヌクレオチド１−１５２７９は５’からＨＬＡ−ＤＲアルファ遺伝子に位置するプロモーターであり、ヌクレオチド１５２８０−１５４２５はエクソン１であり、ヌクレオチド１５３４４−１５３４６はＡＴＧ開始コドンであり、ヌクレオチド１７８３８−１８０８３はエクソン２であり、ヌクレオチド１８５７５−１８８６６はエクソン３であり、ヌクレオチド１９１４６−１９３１１はエクソン４であり、そしてヌクレオチド２０００８−２０３４０はエクソン５である。
【００４４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３はＤＲＢ１*０１０１０１遺伝子のヌクレオチド配列である。ヌクレオチド７３９１−７５５２はエクソン１であり、ヌクレオチド７４５３−７４５５はＡＴＧ開始コドンであり、ヌクレオチド１５８０９−１６０７９はエクソン２であり、ヌクレオチド１９５３６−１９８１７はエクソン３であり、ヌクレオチド２０５１５−２０６２４はエクソン４であり、ヌクレオチド２１０９７−２１１２１はエクソン５であり、そしてヌクレオチド２１７５０−２２０８５はエクソン６である。
【００４５】
本発明の実施には、別のものが指示されていない限り、当該分野の技術に含まれる、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の慣用的技術が用いられるものとする。このような技術は先行研究で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ』第二版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；『ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ』第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；『Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ』（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；『Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４６８３１９５号明細書；『Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ』（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；『Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ』（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；『Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ』（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８７）；『Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ』（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ『Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ』（１９８４）；『Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ』（Ｊ．Ａｂｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍ．Ｓｉｍｏｎ編集主幹、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）のシリーズ、とりわけ、第１５４巻および第１５５巻（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．編）ならびに第１８５巻「Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編）；『Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ』（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；『Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ』（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７）；『Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ』第Ｉ巻〜第ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６）；そして、『Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ』（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８６）を参照すること。
【００４６】
本発明はマウスを提供するものであるが、該マウスは、（１）変異したＨ−２クラスＩ分子およびクラスＩＩ分子を含み、そして、（２）遺伝子導入したＨＬＡクラスＩ分子、または、遺伝子導入したＨＬＡクラスＩＩ分子、または、遺伝子導入したＨＬＡクラスＩ分子と遺伝子導入したＨＬＡクラスＩＩ分子の両方を発現するものである。本発明によるマウスは、Ｈ−２クラスＩ分子およびクラスＩＩ分子の両方をノックアウトしており、遺伝子導入したＨＬＡクラスＩ分子と遺伝子導入したＨＬＡクラスＩＩ分子を発現するもので、完全にヒト化した実験用マウスであり、該実験用マウスは、抗原特異的な抗体、抗原特異的なＨＬＡ−ＤＲ１拘束性Ｔ細胞反応、および抗原特異的なＨＬＡ−Ａ２拘束性Ｔ細胞反応の存否を同時に検出するために用いることができる。これらのマウスは、ＣＴＬ反応、ＴＨ反応（特にＴＨ1反応またはＴＨ2反応）、および、場合によっては液性免疫反応の間でどのように相互協調が行われているかということを研究するために有用である。これらのマウスは基礎的かつ応用的なワクチン研究のための最適なツールとなるものである。
【００４７】
本発明は、破壊されたＨ−２クラスＩ遺伝子、破壊されたＨ−２クラスＩＩ遺伝子、および、機能的なＨＬＡクラスＩトランスジーンまたはクラスＩＩトランスジーンを含む、トランスジェニックマウスを提供するものである。いくつかの実施態様では、トランスジェニックマウスは破壊されたＨ−２クラスＩ遺伝子、破壊されたＨ−２クラスＩＩ遺伝子、機能的なＨＬＡクラスＩトランスジーン、および機能的なＨＬＡクラスＩＩトランスジーンを含んでいる。このようなマウスは完全にヒト化された実験用マウスであるということができるのだが、それは、該マウスが、抗原特異的な抗体、抗原特異的なＨＬＡ−ＤＲ１拘束性Ｔ細胞反応および抗原特異的なＨＬＡ−Ａ２拘束性Ｔ細胞反応の存否を同時に検出するために用いることができるからである。
【００４８】
本発明に挙げられている実施例で部分的に示されているように、また、開示内容から当業者には一般的に明らかであるように、ＨＬＡ−Ａ２．１／ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩ／クラスＩＩ−ＫＯマウスは、ＤＮＡによる免疫付与に従って、ＨＢｓＡｇに特異的な抗体反応、ＣＤ４+ヘルパーＴ細胞反応および細胞溶解性のＣＤ８+Ｔ細胞反応を示す能力を有している。これらの反応は、試験した全てのマウス個体で見られたが、ヒトの反応と同じ免疫的にドミナントなエピトープに対して生じ、免疫付与したマウスは、ＨＢｓＡｇ組換えワクシニアウイルスに対する特異的な防御を示した。
【００４９】
ヘルパーＴ細胞は、抗体反応の完全な成熟（Ｋａｔｚ、Ｄ．Ｈ．＆Ｂｅｎａｃｅｒｒａｆ、Ｂ．、『Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』１５、１−９４（１９７２））、多くのエピトープに対するＣＴＬのプライミング（ｖｏｎ  Ｂｏｅｈｍｅｒ、Ｈ．＆Ｈａａｓ、Ｗ．、『Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ』１５０、１１３４−１１４２（１９７９）；Ｋｅｅｎｅ、Ｊ．Ａ．＆Ｆｏｒｍａｎ、Ｊ．、『Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ』１５５、７６８−７８２（１９８２））、および、ＣＴＬの長期維持（Ｍａｔｌｏｕｂｉａｎ、Ｍ．、Ｃｏｎｃｅｐｃｉｏｎ、Ｒ．Ｊ．＆Ａｈｍｅｄ、Ｒ．、『Ｊ  Ｖｉｒｏｌ』６８、８０５６−８０６３（１９９４））には不可欠である。抗体（Ｌｅｆｒａｎｃｏｉｓ、Ｌ．、『Ｊ  Ｖｉｒｏｌ』５１、２０８−２１４（１９８４））とＣＴＬ（Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ、Ｒ．Ｍ．＆Ｗｅｌｓｈ、Ｒ．Ｍ．、『Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』１１７、１４９５−１５０２（１９７６））は共に、ウイルス感染に対する防御免疫の重要な構成要素である。実際、強力なＨＢｓＡｇに特異的な抗体の反応およびＣＴＬ反応は、ＨＬＡ−Ａ２．１とＨＬＡ−ＤＲ１の両方を遺伝子導入したＨ−２クラスＩ／クラスＩＩ−ＫＯマウスでは見られるが、ＨＬＡ−Ａ２．１のみを遺伝子導入したＨ−２クラスＩ／クラスＩＩ−ＫＯマウスでは見られない。従って、ＨＢｓＡｇに特異的なＣＤ４+Ｔ細胞の助けが、効果的なＨＢｓＡｇに特異的なＣＴＬ反応と抗体反応を生じさせるために不可欠である。これらの結果は、ＨＢｓＡｇで免疫付与したマウス（Ｍｉｌｉｃｈ、Ｄ．Ｒ．、『Ｓｅｍｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ』１１、９３−１１２（１９９１））、およびＨＢｓＡｇをワクチン接種したヒト（Ｃｅｌｉｓ、Ｅ．、Ｋｕｎｇ、Ｐ．Ｃ．＆Ｃｈａｎｇ、Ｔ．Ｗ．、『Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』１３２、１５１１−１５１６（１９８４））を対象とする研究と一貫しており、このことは、抗ＨＢｓ抗体反応の発生がＣＤ４+Ｔ細胞に依存していることを示唆している。
【００５０】
ＨＬＡ−Ａ２．１クラスＩ分子およびＨＬＡ−ＤＲ１クラスＩＩ分子の両方を発現するトランスジェニックマウスは既に得られている（ＢｅｎＭｏｈａｍｅｄ、Ｌ．ｅｔ  ａｌ．『Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』６１、７６４−７７９（２０００））。著者らは、ＨＬＡ−Ａ２．１分子およびＨＬＡ−ＤＲ１分子の両方がインビボで機能的な拘束性の要素であることと、ＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンの産物が、ＨＬＡ−Ａ２．１拘束性の抗原特異的なＣＴＬ反応を強化することを報告している。しかし、これらのマウスにおける免疫反応のヒトへの関連性は、マウスが、通常優先的に、そしてしばしば独占的に抗原に対する反応における拘束要素として用いられる、自身のＨ−２クラスＩ分子およびクラスＩＩ分子を依然として発現しているため、過小評価されている（Ｕｒｅｔａ−Ｖｉｄａｌ、Ａ．、Ｆｉｒａｔ、Ｈ．、Ｐｅｒａｒｎａｕ、Ｂ．＆Ｌｅｍｏｎｎｉｅｒ、Ｆ．Ａ．、『Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』１６３、２５５５−２５６０（１９９０）；Ｒｏｈｒｌｉｃｈ、Ｐ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』１５、７６５−７７２（２００３））（Ａ．Ｐａｊｏｔ、未公刊の結果）。ここで記載されている本発明は、この限界を、ＨＬＡ−Ａ２．１／ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩ／クラスＩＩ−ＫＯマウスを提供することで克服するものである。
【００５１】
いくつかの実施態様では、β２ｍ−ＫＯの背景の、ＨＬＡ−Ａ２．１／ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩ／クラスＩＩ−ＫＯマウスは、ＨＬＡ−Ａ２．１の一本鎖を発現し、該一本鎖において、ヒトβ２ｍがペプチドのアームによってＨＬＡ−Ａ２．１の重鎖に共有結合している。該マウスではさらに、Ｈ−２ＩＡβb遺伝子の不活性化の結果として、通常のＨ−２クラスＩＩのＩＡ分子およびＩＥ分子の細胞表面発現がないのだが、それはなぜなら、Ｈ−２のＩＥαがＨ−２bハプロタイプの偽遺伝子だからである。ここで挙げられている結果は、このようなマウスがＨ−２クラスＩ分子およびクラスＩＩ分子の細胞表面発現を失っていることを示している。しかし、ある場合には、結合していないクラスＩの重鎖、特にＨ−２Ｄbがβ２ｍ−ＫＯマウスの細胞表面に存在し、アロ反応性を誘発する可能性があることが指摘されている。仮にこれが正しいとしても、このようなマウスはペプチドを有していないため、該マウスが抗原特異的な免疫反応に関わることはない（Ｂｉｘ、Ｍ．＆Ｒａｕｌｅｔ、Ｄ．、『Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ』１７６、８２９−８３４（１９９２））。これはＡｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌの報告にも記載されており（Ａｌｌｅｎ、Ｈ．、Ｆｒａｓｅｒ、Ｊ．、Ｆｌｙｅｒ、Ｄ．、Ｃａｌｖｉｎ、Ｓ．＆Ｆｌａｖｅｌｌ、Ｒ．、『Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ』８３、７４４７−７４５１（１９８６））、該報告において、Ａｌｌｅｎらは、細胞内にβ２ｍが存在しないときにもＨ−２Ｄbが細胞表面に発現すること、しかしこのようなＤb抗原がＤbアロ特異的またはＤb拘束性の細胞傷害性Ｔリンパ球のいずれによっても認識されないことを確認している。さらに、Ｄb抗原はほとんどの天然Ｄbのモノクローナル抗体には認識されない。
【００５２】
それにも関わらず、ＨＬＡ−ＤＲαのみを遺伝子導入したマウスでは、少なくともＨＬＡ−ＤＲβ鎖がないときに、特殊なＨＬＡ−ＤＲα／Ｈ−２ＩＥβb混成複合体がある程度は細胞表面に発現しうることが報告されている（Ｌａｗｒａｎｃｅ、Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｃｅｌｌ』５８、５８３−５９４（１９８９））。この観察にも関わらず、これらの特殊な分子は、血清学的には、このような混成分子と反応することが知られているｍＡｂ（１７−３−３Ｓ）によっても、ＨＬＡ−Ａ２．１／ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩ／クラスＩＩ−ＫＯマウスにおける細胞表面では検出されなかった（Ｏｚａｔｏ、Ｋ．、Ｍａｙｅｒ、Ｎ．＆Ｓａｃｈｓ、Ｄ．Ｈ．、『Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』１２４、５３３−５４０（１９８０））（図１ａおよび示していないデータ）。さらに、これらのマウスのＨＢｓＡｇに特異的なＴ細胞反応およびＨＩＶの１−Ｇａｇに特異的なＴ細胞反応を研究することで得られた結果はすべて、拘束要素としてＨＬＡ−Ａ２．１分子およびＨＬＡ−ＤＲ１分子のみを用いていることを示した。このことから、特殊なＨＬＡ−ＤＲα／Ｈ−２ＩＥβb混成体が、通常のＨＬＡ−ＤＲα／ＨＬＡ−ＤＲβ分子と比べて不安定であると思われること、そして、該混成体が、ＨＬＡ−ＤＲβ鎖がないときにだけ存在しうることが言える。すべてのＨ−２クラスＩＩ領域（Ｈ−２ＩＡβb、ＩＡαb、ＩＥβb）が削除されているマウス系統（Ｍａｄｓｅｎ、Ｌ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ』９６、１０３３８−１０３４３（１９９９））、ならびに、Ｈ−２Ｄb遺伝子が削除されているマウス系統が、この可能性を完全に排除するために分析されているところである。第一のマウスから得られた脾細胞の予備分析では、ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩＩ−ＫＯマウス（Ｉａβb゜）で見られるものに類似したＣＤ４+Ｔ細胞プールの回復が見られ、これらの新たなマウスのＨＬＡ−ＤＲ１拘束性ＣＤ４+Ｔ細胞反応が、ＨＬＡ−Ａ２．１／ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩ／クラスＩＩ−ＫＯマウスのＨＬＡ−ＤＲ１拘束性ＣＤ４+Ｔ細胞反応と同等であることを示唆している。
【００５３】
ＨＬＡ−Ａ２．１／ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩ／クラスＩＩ−ＫＯマウスの末梢ＣＤ８+Ｔリンパ球は、親であるＨＬＡ−Ａ２．１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩ−ＫＯマウスと比較して、少なくともＢＶセグメントの使用の点では量的かつ質的に類似しており、ＴＣＲレパートリーが完全に多様化している。野生型マウスと比べて、特にＣＤ８+Ｔ細胞プールの部分的な回復は、キメラ（マウス由来のα３ドメイン）ＨＬＡ−Ａ２．１分子を発現する、一つのＨＬＡを遺伝子導入したマウスで恒常的に見られている（Ｐａｓｃｏｌｏ、Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ』１８５、２０４３−２０５１（１９９７））。共結晶分析により、ヒトのＣＤ８もＨＬＡ−Ａ２．１重鎖のα２ドメインと接触を持っていることが実証されたことから、α３ドメインの置換に関係なく、マウスのＣＤ８とＨＬＡ−Ａ２．１分子の間では相互作用が不十分なままである（Ｇａｏ、Ｇ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｎａｔｕｒｅ』３８７、６３０−６３４（１９９７））。また、不十分な協調は小胞体で起こる可能性もあり、該小胞体では、多くの分子（ＴＡＰ、タパシン、ＥＲｐ５７）がＭＨＣクラスＩ分子の生合成を補助する。しかし、この段階では、これらのマウス小胞体分子とヒト小胞体分子の間における唯一の実証されている機能的な差異、つまり、マウスのＴＡＰではなくヒトのＴＡＰが、プラスの電荷を帯びた細胞質ペプチドのＣＯＯＨ末端を効果的に輸送すること（Ｍｏｍｂｕｒｇ、Ｆ．、Ｎｅｅｆｊｅｓ、Ｊ．Ｊ．＆Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ、Ｇ．Ｊ．、『Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』６、３２−３７（１９９４））は、疎水性のＣ末端を有するペプチドと結合するＨＬＡ−Ａ２．１分子にとっては問題にならず、それは、これらのペプチドがマウスおよびヒトのＴＡＰによって効果的に輸送されるからである。ＨＬＡ−Ａ２．１のみを遺伝子導入したＨ−２クラスＩ−ＫＯマウス、ＨＬＡ−Ａ２．１／ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩ／クラスＩＩ−ＫＯマウスの双方において、ＣＤ８+Ｔリンパ球の数が少なくても、該リンパ球は効果的にＨＢｓＡｇに対して反応し、そして、重要なこととして、後者のマウスは、ヒトと類似した抗体反応、ヘルパーＴ細胞反応および細胞溶解反応を示す。
【００５４】
Ｔリンパ球を標的とする、Ｔ細胞エピトープをベースとするワクチンの設計を妨げる困難の一つは、ＨＬＡクラスＩ／クラスＩＩ分子の多型性である。ＨＬＡ−Ａ２．１分子およびＨＬＡ−ＤＲ１分子は、ヒトの個体群におけるかなりの割合の個体が発現している（ＨＬＡ−Ａ２．１については３０％から５０％、ＨＬＡ−ＤＲ１については６％から１８％）。ＨＬＡクラスＩ分子を機能的にスーパーファミリーにクラスタリングすることは、提示されたペプチド34の集合の顕著な剰余量に基づいているのであるが、ＨＬＡクラスＩのアイソタイプ変異体または対立遺伝子多型のそれぞれによって生じた反応の個別分析は、それらが提示する最適なエピトープを識別するために、依然として行う必要がある。これは、免疫反応をモニターするための四量体（ＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩ）のような、新たな試薬を開発するために特に重要である。同様の理由のために、たとえペプチドのＨＬＡクラスＩＩ分子に対する結合がクラスＩ分子に対する結合より拘束性が低くても、ＨＬＡ−Ａ２．１を他のＨＬＡクラスＩＩ分子とともに共発現するマウス系統を得ることは有益となるものである。ここでの開示に基づき、さらなる、ＨＬＡクラスＩ／クラスＩＩを遺伝子導入したＨ−２クラスＩ／クラスＩＩ−ＫＯマウスを、これらの目的あるいは他の目的のために構成することができる。
【００５５】
ＨＬＡを遺伝子導入したＨ−２−ＫＯマウスによって、ヒトへ置き換えることのできる可能性に優れた抗原ペプチドの免疫原性を詳細に分析し、最適化することが可能になるのに対し（Ｒｏｈｒｌｉｃｈ、Ｐ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』１５、７６５−７７２（２００３）；Ｌｏｉｒａｔ、Ｄ．、Ｌｅｍｏｎｎｉｅｒ、Ｆ．Ａ．＆Ｍｉｃｈｅｌ、Ｍ．Ｌ．、『Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』１６５、４７４８−４７５５（２０００）；Ｓｃａｒｄｉｎｏ、Ａ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』３１、３２６１−３２７０（２００１））、これは、ワクチンアジュバントの製剤化の研究に対してはあまり明白ではない。このことは、二つの種の間にある、抗原攻撃に対する反応の初期に動員される様々なエフェクターの違いに起因する可能性がある。固有の免疫に関する基本的な知識を高めることは、将来的には、マウスの免疫系をより完全にヒト化させることをもたらしうるものである。
【００５６】
最後に、ここでの開示によって、最適化し、ヒト化したトランスジェニックマウスのモデルが説明されるのだが、該マウスのＨ−２クラスＩ遺伝子（マウスβ２ｍ）およびクラスＩＩ遺伝子（Ｈ−２ＩＡβb）は削除され、等価のヒト遺伝子のＨＨＤ（ＨＬＡ−Ａ*０２０１）、ＨＬＡ−ＤＲＡ*０１０１およびＨＬＡ−ＤＲＢ１*０１０１で置き換えられている。ＨＬＡ−Ａ２．１／ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩ／クラスＩＩ−ＫＯマウスにおける細胞性免疫は、ヒトのＨＬＡ分子によって完全に拘束され、マウスのＭＨＣ分子によって拘束された免疫反応は全くない。マウスＭＨＣの免疫反応とヒト（トランスジェニック）ＨＬＡの免疫反応の間に競合がないことによって、これらのマウスを、ヒトのワクチンにおける、ＨＬＡ拘束性ＣＤ４+ヘルパーＴ細胞とＨＬＡ拘束性ＣＤ８+細胞溶解性Ｔ細胞の間の協調を要求するエピトープを明らかにするために用いることが可能になる。
【００５７】
「ＨＬＡ」はヒトのＭＨＣ複合体であり、「Ｈ−２」はマウスのＭＨＣ複合体である。ヒトの複合体は三つのクラスＩα鎖遺伝子である、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ、ならびに、ＭＨＣクラスＩＩα鎖遺伝子とβ鎖遺伝子の三つのペアである、ＨＬＡ−ＤＲ、−ＤＰおよび−ＤＱを含んでいる。多くのハプロタイプにおいて、ＨＬＡ−ＤＲクラスターは余分のβ鎖遺伝子を含んでおり、該遺伝子の産物はＤＲα鎖と対をなすことができ、従って、遺伝子の三つのセットは、四つのタイプのＭＨＣクラスＩＩ分子を生み出すことになる。マウスにおいて、三つのクラスＩα鎖遺伝子は、Ｈ−２−Ｌ、Ｈ−２−ＤおよびＨ−２−Ｋである。マウスのＭＨＣクラスＩＩ遺伝子はＨ−２−ＡおよびＨ−２−Ｅである。
【００５８】
当該分野において、多型性ＨＬＡ抗原および異なったＨＬＡ対立遺伝子の両方の結果として、様々な個体のＨＬＡ遺伝子の間に遺伝的多様性が存在していることが知られている。従って、ここで開示されている本発明の実施態様は、一つの多型性ＨＬＡ抗原を他の一つで置き換えること、あるいは、一つのＨＬＡ対立遺伝子を他の一つで置き換えることができる。ＨＬＡ多型および対立遺伝子の例は、たとえば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｎｔｈｏｎｙｎｏｌａｎ．ｏｒｇ．ｕｋ／ＨＩＧ／ｄａｔａ．ｈｔｍｌとｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ、Ｄｏｍｉｎｉｑｕｅ  Ｃｈａｒｏｎ編『Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＨＬＡ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ』、ＥＤＫ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ、および、Ｓｔｅｖｅｎ  Ｇ．Ｅ．Ｍａｒｓｈ、Ｐｅｔｅｒ  Ｐａｒｈａｍ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄａ  Ｂａｒｂｅｒ『Ｔｈｅ  ＨＬＡ  ＦａｃｔｓＢｏｏｋ』、ＡＰ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２０００で見ることができる。
【００５９】
「破壊された」遺伝子とは、相同組換えまたは当該分野で知られたその他のアプローチを用いて変異した遺伝子である。破壊された遺伝子は、遺伝子の低形質対立遺伝子（ｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ  ａｌｌｅｌｅ）または遺伝子の無効対立遺伝子（ｎｕｌｌ  ａｌｌｅｌｅ）のどちらかとすることができる。当業者は、用いる対立遺伝子のタイプをあらゆる特別な背景に対して選択することが可能であることを理解できるものである。本発明の多くの実施態様では、無効対立遺伝子が選択されている。
【００６０】
「相同組換え」とは、細胞の、事前に選択した所望の遺伝子配列を変異させることで、トランスジェニック動物を作成するための、一般的なアプローチである（Ｍａｎｓｏｕｒ、Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｎａｔｕｒｅ』３３６：３４８−３５２（１９８８）；Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｍ．Ｒ．、『Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．』５：７０−７６（１９８９）；Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｍ．Ｒ．、『Ｓｃｉｅｎｃｅ』２４４：１２８８−１２９２（１９８９）；Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｍ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｍ．Ｒ．編『Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ』所収、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、ｐｐ．４５−５２；Ｆｒｏｈｍａｎ、Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｃｅｌｌ』５６：１４５−１４７（１９８９））。
【００６１】
こうして、マウス中のどのような遺伝子も任意に改変することが可能になる（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｍ．Ｒ．、『Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．』５：７０−７６（１９８９）；Ｆｒｏｈｍａｎ、Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｃｅｌｌ』５６：１４５−１４７（１９８９））。遺伝子ターゲッティングでは、選択した遺伝子座のクローニングしたＤＮＡ配列の中に所望の変異を導入するために、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用する。それから、その変異を、相同組換えを通して、多能性の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）のゲノムへと導入する。改変した幹細胞をマウスの胚盤胞にマイクロインジェクトし、発生中のマウスの胚に組み込み、最終的にキメラマウスに成長させる。ある場合には、キメラマウスの生殖系列細胞は、遺伝的に改変したＥＳ細胞から派生することがあり、変異した遺伝子型は生殖を通して伝達することができる。
【００６２】
遺伝子ターゲッティングは、ｎｐｔＩＩ遺伝子がβ２ミクログロブリン遺伝子座に挿入されているキメラマウスおよびトランスジェニックマウスを作成するために用いられている（Ｋｏｌｌｅｒ、Ｂ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）』８６：８９３２−８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａ、Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｎａｔｕｒｅ』３４２：４３５−４３８（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａ、Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｎａｔｕｒｅ』３４４：７４２−７４６（１９８９）；ＤｅＣｈｉａｂａ  ｅｔ  ａｌ．、『Ｎａｔｕｒｅ』３４５：７８−８０（１９９０））。同様の実験により、ｎｐｔＩＩ遺伝子の挿入によって破壊されているｃ−ａｂｌ遺伝子を有しているキメラマウスおよびトランスジェニックマウスの作成が可能になっている（Ｓｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇ、Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｓｃｉｅｎｃｅ』２４６：７９９−８０３（１９８９））。該技術は、ｅｎ−２遺伝子がｎｐｔＩＩ遺伝子の挿入によって破壊されているキメラマウスを作成するために用いられている（Ｊｏｙｎｅｒ、Ａ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｎａｔｕｒｅ』３３８：１５３−１５５（１９８９））。
【００６３】
「遺伝子ターゲッティング」法を用いるためには、対象となる遺伝子はその前にクローニングされている必要があり、また、イントロン−エクソンの境界が決定されている必要がある。該方法により、マーカー遺伝子（例えばｎｐｔＩＩ遺伝子）が、対象となる特定の遺伝子の翻訳された領域に挿入される。従って、遺伝子ターゲッティング法を用いると、対象となる遺伝子はかなり破壊される。
【００６４】
意義深いことに、細胞の遺伝子を改変するために遺伝子ターゲッティングを用いると、その遺伝子配列においてかなりの改変が生じる。遺伝子ターゲッティングの有効性は可変領域の数に左右され、構造ごとに異なる。
【００６５】
本発明のキメラマウスまたはトランスジェニックマウスの細胞は、ＥＳ細胞またはその同等物のような多能性前駆細胞とすることができる、一つまたは複数のＤＮＡ分子を細胞に導入することによって調製される（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｍ．Ｒ．編『Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ』、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）所収、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｅ．Ｊ．、ｐｐ．３９−４４）。「前駆」という用語は、多能性細胞が、目的の（トランスフェクトされた）多能性細胞に対する前駆体であることだけを意味し、該多能性細胞は本発明の教示内容に従って調製される。多能性細胞（前駆的またはトランスフェクトされているもの）は、キメラマウスまたはトランスジェニックマウスを作成するために、当該分野で知られた方法（Ｅｖａｎｓ、Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｎａｔｕｒｅ』２９２：１５４−１５６（１９８１））により、インビボで培養することができる。
【００６６】
どのようなＥＳ細胞でも本発明に従って用いることができる。しかし、ＥＳ細胞の初代分離株を用いることが好ましい。このような分離株は、Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｍ．Ｒ．編『Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ』、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）所収、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｅ．Ｊ．ｐｐ．３９−４４によって開示されているＣＣＥ細胞株のような胚から直接、または、ＣＣＥ細胞株からのＥＳ細胞のクローン単離（Ｓｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇ、Ｐ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｓｃｉｅｎｃｅ』２４６：７９９−８０３（１９８９）、この文献は参照することにより本発明の一部を構成するものである）により、得ることができる。このようなクローン単離は、Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎの方法（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編『Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ』、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８７に記載）に従って行うことができるのだが、該文献および該方法は参照することにより本発明の一部を構成するものである。このようなクローン増殖の目的は、マウスへの分化に対して大きな有効性を有しているＥＳ細胞を得ることである。クローン選択されたＥＳ細胞は、トランスジェニックマウスの作成において、始原細胞株であるＣＣＥよりもおよそ１０倍効果的である。本発明の組換え法のためには、クローン選択による利点はない。
【００６７】
胚からクローン単離によって得たＥＳ細胞株の例は、ＥＳ細胞株、ＡＢ１（ｈｐｒｔ+）またはＡＢ２．１（ｈｐｒｔ-）である。ＥＳ細胞は、Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編『Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ』、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８７所収、ｐｐ．７１−１１２）によって説明されているように、好ましくは間質細胞（ＳＴＯ細胞（特にＳＮＣ４のＳＴＯ細胞）および／または胚の初代培養線維芽細胞など）上で培養されるのだが、該文献は、参照することにより本発明の一部を構成するものである。キメラマウスの作成および分析のための方法は、Ｂｒａｄｌｅｙ、Ａ．（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編『Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ』、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８７所収、ｐｐ．１１３−１５１）によって開示されており、該文献は参照することにより、本発明の一部を構成するものである。間質細胞（および／または線維芽細胞）は、異常なＥＳ細胞の過剰なクローン増殖をなくすことに役立つ。もっとも好適には、細胞は、白血球阻害因子（「ｌｉｆ」）（Ｇｏｕｇｈ、Ｎ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．』１：２８１−２８８（１９８９）；Ｙａｍａｍｏｒｉ、Ｙ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｓｃｉｅｎｃｅ』２４６：１４１２−１４１６（１９８９）、該文献の両者は参照することで本発明の一部を構成するものである）の存在の下で培養される。ｌｉｆをコードする遺伝子がクローニングされているので（Ｇｏｕｇｈ、Ｎ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．』１：２８１−２８８（１９８９））、この遺伝子を有する間質細胞を、当該分野で知られた方法によって形質転換し、そして、ＥＳ細胞を、ｌｉｆを培地に分泌する、形質転換された間質細胞上で培養することが特に好ましい。
【００６８】
本発明で用いられているように、「トランスジーン」という用語は、部分的または全体的に異種な、つまりそれを導入するトランスジェニック動物またはトランスジェニック細胞が有さない核酸配列、あるいは、それを導入するトランスジェニック動物またはトランスジェニック細胞の内因性遺伝子に対して相同ではあるが、それを挿入する細胞のゲノムを改変するような方法で動物のゲノムに挿入されるように作られている、または挿入されている核酸配列を指すものである（たとえば、該核酸配列は、天然の遺伝子の位置とは異なる位置に挿入され、そうでなければ、その挿入はノックアウトを生じさせる）。トランスジーンは、一つまたは複数の転写制御配列と、イントロンのような、選択した核酸の最適な発現に必要となる可能性がある他のあらゆる核酸に、機能可能となるように結合させることができる。本発明の典型例となるトランスジーンは、たとえばＨ−２ポリペプチドをコードしている。他の典型例となるトランスジーンは、一つまたは複数のＨＬＡ遺伝子を、ＨＬＡ遺伝子のゲノム配列との相同組換えによって破壊するようになっている。
【００６９】
「機能的なトランスジーン」とは、ｍＲＮＡ転写産物を生成するものであり、該転写産物は、トランスジーンを含むマウスの少なくとも一つの細胞において、適切にプロセシングされたタンパク質を生成する。当業者には、既知の転写制御エレメントおよび転写後のプロセシングを指示する配列の様々な組み合わせによる一連の選択肢があり、この中から宿主マウスがトランスジーンの発現を指示するということが理解されるものである。本発明の多くの実施態様では、Ｈ−２遺伝子制御エレメントの制御下でＨＬＡトランスジーンが発現することが好ましい。
【００７０】
いくつかの実施態様では、ＨＬＡクラスＩトランスジーンはＨＬＡ−Ａ２トランスジーンであり、ＨＬＡクラスＩＩトランスジーンはＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンである。ＨＬＡ−Ａ２トランスジーンの一例は、シーケンスリストに掲載されたＨＬＡ−Ａ２の配列を含むものである。ＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンの一例は、シーケンスリストに掲載されたＨＬＡ−ＤＲ１の配列を含むものである。
【００７１】
一つの実施態様において、本発明はＨ−２クラスＩ分子とクラスＩＩ分子の両方を欠いたトランスジェニックマウスを提供しており、該実施態様では、トランスジェニックマウスは機能的なＨＬＡクラスＩトランスジーンと、機能的なＨＬＡクラスＩＩトランスジーンを含んでいる。いくつかの実施態様では、マウスはＨＬＡ−Ａ２+ＨＬＡ−ＤＲ１+β２ｍ゜ＩＡβ゜という遺伝子型を有している。他の実施態様では、ＨＬＡ−Ａ２トランスジーンは、シーケンスリストに掲載されたＨＬＡ−Ａ２の配列を含み、ＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンは、シーケンスリストに掲載されたＨＬＡ−ＤＲ１の配列を含んでいる。
【００７２】
また、本発明は単離されたトランスジェニックマウスの細胞も提供するものである。ある場合には、細胞は、破壊されたＨ−２クラスＩ遺伝子、破壊されたＨ−２クラスＩＩ遺伝子、および、機能的なＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩのトランスジーンを含んでいる。その他の場合には、細胞は、破壊されたＨ−２クラスＩ遺伝子、破壊されたＨ−２クラスＩＩ遺伝子、機能的なＨＬＡクラスＩトランスジーン、および機能的なＨＬＡクラスＩＩトランスジーンを含んでいる。ＨＬＡクラスＩトランスジーンはＨＬＡ−Ａ２トランスジーンあってよく、ＨＬＡクラスＩＩトランスジーンはＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンであってよい。ある場合には、ＨＬＡ−Ａ２トランスジーンはシーケンスリストに掲載されたＨＬＡ−Ａ２の配列を含み、ＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンは、シーケンスリストに掲載されたＨＬＡ−ＤＲ１の配列を含んでいる。
【００７３】
一つの実施態様では、本発明は、Ｈ−２クラスＩ分子とクラスＩＩ分子の両方を欠いた、単離されたトランスジェニックマウスの細胞を提供しており、該実施態様において、トランスジェニックマウスは、機能的なＨＬＡクラスＩトランスジーンと機能的なＨＬＡクラスＩＩトランスジーンを含んでいる。単離されたトランスジェニックマウスの細胞は、ＨＬＡ−Ａ２+ＨＬＡ−ＤＲ１+β２ｍ゜ＩＡβ゜という遺伝子型を有することができる。ＨＬＡ−Ａ２トランスジーンはシーケンスリストに掲載されたＨＬＡ−Ａ２の配列を含むことができ、ＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンは、シーケンスリストに掲載されたＨＬＡ−ＤＲ１の配列を含むことができる。
【００７４】
本発明の単離されたトランスジェニックマウスの細胞は、本発明のいかなるマウスの遺伝子型を有することもできる。しかし、本発明の単離されたトランスジェニックマウスの細胞の遺伝子型の集合と、本発明のマウスの遺伝子型の集合は、必ずしも完全には重なっていない。
【００７５】
本発明の単離されたマウスの細胞は、マウスまたはマウスの胚から得ることができる。一つの実施態様では、マウスまたはマウスの胚は、得るべき細胞と同一の遺伝子型を有している。もう一つの実施態様では、マウスまたはマウスの胚は、得るべき細胞とは異なった遺伝子型を有している。細胞をマウスまたはマウスの胚から得た後、細胞の遺伝子を、例えば相同組換えによって破壊することができる。さらに、機能的な遺伝子を、例えばトランスフェクションによって、細胞のゲノムの中に導入することができる。当業者であれば、当該分野で知られたいかなる適切な方法でも、細胞のゲノムを修飾するために適用することができ、それにより、所望の遺伝子型を有する、単離されたマウスの細胞が得られるということが理解されるものである。
【００７６】
本発明のもう一つの目的は、Ｈ−２クラスＩ分子とクラスＩＩ分子の両方を欠いた、単離されたトランスジェニックマウスの細胞であり、該目的において、トランスジェニックマウスの細胞は機能的なＨＬＡクラスＩトランスジーンと機能的なＨＬＡクラスＩＩトランスジーンを含んでいる。いくつかの実施態様では、トランスジェニックマウスの細胞はＨＬＡ−Ａ２+ＨＬＡ−ＤＲ１+β２ｍ゜ＩＡβ゜という遺伝子型を有している。その他の実施態様では、ＨＬＡ−Ａ２トランスジーンは、シーケンスリストに掲載されたＨＬＡ−Ａ２の配列を含み、ＨＬＡ−ＤＲ１トランスジーンは、シーケンスリストに掲載されたＨＬＡ−ＤＲ１の配列を含んでいる。
【００７７】
Ｔ細胞は、獲得した免疫の多くの側面で中心的な役割を果たし、多様な制御的機能および防御機能を遂行する。いくつかのＴ細胞は、感染した細胞またはガン化した細胞に出会うと、それらを異種のものと認識し、キラー細胞として作用することで対応し、細胞性免疫反応の一部として宿主自身の細胞を殺す。他のＴ細胞は、ヘルパーＴ細胞と呼ばれるものだが、抗体を産生するためにＢ細胞を刺激することで、あるいは、液性免疫反応または細胞性免疫反応のある側面を抑制することで、認識された異種抗原に反応する。
【００７８】
ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）は、サイトカインの生成を介して多くの免疫反応をとりまとめる。一般的にはＣＤ４細胞表面マーカーを有するものとして識別されるが、これらの細胞は、機能的には、該細胞が生成するサイトカインのプロフィールと、免疫系のその他の細胞に対するそれらの影響に応じて、Ｔｈ１またはＴｈ２という亜集団に分けられる。
【００７９】
Ｔｈ１細胞は、Ｔ細胞抗原レセプターと称される認識システムを通して、侵入しようとする病原体、またはガンである宿主細胞を検出する。細胞性免疫と呼ばれる、Ｔｈ１が関与するプロセスは、一般的にはＢ細胞以外の細胞の活性化を伴い、ＩＦＮ−γの生成を特徴とすることが多い。それにも関わらず、Ｔｈ１系がそもそも液性抗体の生成からは独立していても、Ｔｈ１サイトカインは、ＩｇＧ2aアイソタイプへの免疫グロブリンのクラススイッチを促進する。
【００８０】
異種抗原を検出するとすぐに、ほとんどの成熟したＴｈ１細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、高濃度のＴＮＦ−α、高濃度のＭＩＰ−１α、高濃度のＭＩＰ−１β、およびＲＡＮＴＥＳの放出を命令する。これらのサイトカインは、遅延型過敏性および一般的な細胞性免疫を促進する。たとえばＩＬ−２は、Ｔ細胞の成長因子であり、該成長因子は、最初に検出された特定の抗原に感受性のある、さらなるＴ細胞のクローンの生成を促進するものである。感作Ｔ細胞は、抗原を含む細胞または病原体に付着し、攻撃する。
【００８１】
対照的に、成熟したＴｈ２細胞は、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦ、および、低濃度のＴＮＦ−αの分泌を促進する傾向がある。さらに、Ｔｈ２反応は、Ｂ細胞を活性化させること、抗体の産生と分泌を刺激すること、そして、ＩｇＡ、ＩｇＧ1およびＩｇＥアイソタイプへのクラススイッチを誘発することによって液性免疫を促進する。
【００８２】
本発明で用いられるとき、「抗原」は、１）少なくとも一つのＨＴＬエピトープ、または、２）少なくとも一つのＣＴＬエピトープ、または、３）少なくとも一つのＢ細胞エピトープ、または、４）少なくとも一つのＨＴＬエピトープと少なくとも一つのＣＴＬエピトープ、または、５）少なくとも一つのＨＴＬエピトープと少なくとも一つのＢ細胞エピトープ、または、６）少なくとも一つのＣＴＬエピトープと少なくとも一つのＢ細胞エピトープ、または、７）少なくとも一つのＨＴＬエピトープと少なくとも一つのＣＴＬエピトープと少なくとも一つのＢ細胞エピトープを含んでいる。「候補抗原」とは、抗原として機能するかどうかを判定するために研究中の分子である。
【００８３】
「液性免疫反応」とは、抗体が介在する特異的免疫である。
【００８４】
「エピトープ」とは、免疫系によって認識される抗原上の部位である。抗体エピトープは、抗体によって認識される抗原上の部位である。Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣ分子に結合している抗原上の部位である。ＴＨエピトープはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合している抗原上の部位である。ＣＴＬエピトープは、ＭＨＣクラスＩ分子に結合している抗原上の部位である。
【００８５】
抗原は、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列を含むことができ、該配列は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはその両方からなることができる。一つの実施態様では、抗原は、一つまたは複数の抗原性ポリペプチドを機能的にコードしている少なくとも一つのポリヌクレオチド配列を含む。この文脈で用いられるとき、「含む」という語は、少なくとも一つの抗原性ポリペプチドが、少なくとも一つの抗原性ポリペプチドをコードしている外因性ポリヌクレオチドに作用する、宿主細胞の転写装置および／または翻訳装置によってもたらされることを意味しており、それは例えば米国特許第６１９４３８９号明細書および米国特許第６２１４８０８号明細書に記載されている。
【００８６】
本発明の抗原はどのような抗原性分子であってもよい。抗原性分子には、タンパク質、リポタンパク質、および糖タンパク質が含まれ、それらには、アルブミン、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、百日咳トキソイド、細菌の外膜タンパク質（髄膜炎菌の外膜タンパク質を含む）、ＲＳＶ−Ｆタンパク質、マラリア由来のペプチド、Ｂ−ラクトグロブリンＢ、アプロチニン、オボアルブミン、リゾチームなどの、ウイルス性、細菌性、寄生虫性、動物性および真菌性タンパク質、ならびに、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５、ＣＡ１９−９、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）および米国特許第５４７８５５６号明細書のＴＡＡ複合体のような腫瘍関連抗原が含まれ、該明細書は参照することでその全体が本発明の一部を構成するものである。抗原性分子にはまた、天然の多糖類および合成多糖類を含む炭水化物、ならびにその他のポリマーが含まれ、それらには、フィコール、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、アガロース、ポリアクリルアミドおよびその他のアクリル系樹脂、乳酸グリコール酸共重合体、ポリビニルアルコール、部分的に加水分解されたポリ酢酸ビニル、ポリビニルピロリジン、Ｂ群連鎖球菌の莢膜多糖および肺炎球菌の莢膜多糖（タイプＩＩＩを含む）、緑膿菌の細胞外ムコ多糖および莢膜多糖（フィッシャーのタイプＩを含む）、ならびにヘモフィルスインフルエンザの多糖（ＰＲＰを含む）が含まれる。抗原性分子にはまた、ＴＮＰ、糖類、オリゴ糖類、多糖類、ペプチド、毒素、薬物、化学物質およびアレルゲンのような、ハプテンおよび低分子量の分子を含むその他の成分が含まれる。そして、抗原性分子にはまた、細菌、リケッチア、菌類、ウイルス、寄生虫に由来するハプテンおよび抗原が含まれ、それらには、ジフテリア菌、百日咳菌、破傷風菌、ヘモフィルスインフルエンザウイルス、肺炎球菌、大腸菌、クレブシエラ菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、髄膜炎菌、ポリオウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、炭疽菌、リステリア菌、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩおよびＩＩ、単純ヘルペスウイルス１型および２型、ＣＭＶ、ＥＢＶ、水痘帯状疱疹ウイルス、マラリア原虫、結核菌、カンジダアルビカンス、その他のカンジダ菌、ニューモシスティスカリニ、マイコプラズマ、Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルス、アデノウイルス、Ａ群連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌、緑膿菌、ライノウイルス、リーシュマニア、パラインフルエンザウイルス１型、２型および３型、コロナウイルス、サルモネラ菌、赤痢菌、ロタウイルス、トキソプラズマ、エンテロウイルス、ならびに、クラミジアトラコマチスおよびクラミジアニューモニエが含まれる。
【００８７】
本発明で用いられるとき、薬学的組成物またはワクチンは、少なくとも一つの免疫性の組成物を含み、該免疫性組成物は、薬学的に許容されうる担体または賦形剤に溶解すること、懸濁すること、または結合することができる。薬学的に許容されうるどのような担体でも、組成物の投与のために用いることができる。適切な薬学的な担体は、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編『Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ』第１８版、１９９０、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．に記載されており、該文献は参照することによりその全体が本発明の一部を構成するものである。担体は、水、ポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ならびに石油、動物油、植物油、ピーナッツオイル、大豆油、鉱油、ごま油などを含む油類のような、減菌した液体とすることができる。担体は、霧、スプレー、パウダー、ワックス、クリーム、座薬、インプラント、軟膏、膏薬、パッチ、湿布、フィルム、または化粧品の形状とすることができる。
【００８８】
薬学的組成物またはワクチンの適切な製剤法は、選択する投与経路に左右される。たとえば、急速静注法または持続注入による静脈投与では、組成物は好ましくは水溶性であり、生理食塩水が好まれる担体である。経皮、経鼻、経口、胃内、膣内、直腸内、またはその他の経粘膜的投与のためには、浸透させるべき障壁に適した浸透剤を製剤に含めることができ、該浸透剤は当該分野では知られたものである。経口投与のためには、活性成分は、錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などに含有させることに適した担体と結合させることができる。また、時間依存の送達システムも本発明の組成物の投与に適用可能である。典型的なシステムは、乳酸グリコール酸共重合体、共重合したシュウ酸塩、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸およびポリ無水物のようなポリマーをベースとするシステムを含む。これらのポリマーおよび類似のポリマーは当該分野で知られた方法に従ってマイクロカプセルに製剤化することができるのだが、該方法はたとえば、米国特許第５０７５１０９号明細書で教示されており、該文献は参照することでその全体が本発明の一部を構成するものである。本発明の開示された免疫賦活化合物の投与に適した代替の送達システムは、米国特許第６１９４３８９号明細書、第６０２４９８３号明細書、第５８１７６３７号明細書、第６２２８６２１号明細書、第５８０４２１２号明細書、第５７０９８７９号明細書、第５７０３０５５号明細書、第５６４３６０５号明細書、第５６４３５７４号明細書、第５５８０５６３号明細書、第５２３９６６０号明細書、第５２０４２５３号明細書、第４７４８０４３号明細書、第４６６７０１４号明細書、第４４５２７７５号明細書、第３８５４４８０号明細書および第３８３２２５２号明細書（該文献のそれぞれは参照することでその全体が本発明の一部を構成するものである）で開示されているものを含んでいる。
【００８９】
また、デキストロース溶液およびグリセロール溶液も液体担体として、とりわけ注入可能な溶液または噴霧溶液のために用いることができる。噴霧による投与のためには、当業者に理解されているように、加圧されたスプレーまたは噴霧器による場合のように、適切な推進剤を加えることができる。また、免疫学的組成物は、可溶化剤、乳化剤、安定剤、分散剤、香料、アジュバント、担体、リドカインやキシロカインなどのような局所麻酔剤、抗体、および、既知のまたは可能性が想定されている、抗ウイルス性、抗菌類性、抗寄生虫性、または抗腫瘍性の化合物でも製剤することができる。
【００９０】
「アジュバント」とは、標的抗原に対する免疫反応を促進するか強める組成物である。当業者であれば、本発明をここでの開示に照らして実施するにあたり、使用するための適切なアジュバントを選択することができる。
【００９１】
本発明は、一つまたは複数の本発明の抗原を含む組成物を投与することで、免疫賦活を必要としている患者を治療する方法を含むものである。本発明で用いられるとき、治療は、あらゆる疾病、病気、異常、または症状に関連する、矯正方法、回復方法、改善方法および予防方法を含んでいる。さらに、治療は、実験動物内またはエクスビボにおいて免疫反応を生じさせること、または抑制することを含んでいる。
【００９２】
従って、治療は、本発明のあらゆる免疫賦活性組成物の免疫賦活的な量を、当業者に馴染みのある、あらゆる方法によって投与することを含んでおり、該方法は、一般的には経口経路、経皮経路、静脈注射、筋肉注射および皮下注射を含み、これ以外にも、腹腔内投与、体腔内投与、関節内投与、脳室内投与、髄腔内投与、局所投与、扁桃投与、粘膜投与、経皮投与、膣内投与および強制経口投与を含む。
【００９３】
技術を有する実施者によって認識されているように、適切な投与方法を選択することは治療の有効性に寄与する可能性があり、そして、局所投与が、ある場合の適用には好まれる可能性がある。局所投与の許容される経路には、皮下、皮内、腹腔内、硝子体内、吸入または洗浄、経口、経鼻、および、所定の組織、器官、関節、腫瘍、または細胞集団へ向けられた注入が含まれる。例えば、粘膜のリンパ節あるいはパイエル板に粘膜を塗布または注入することは、かなりのＩｇＡへのクラススイッチを伴う液性免疫反応を促進する可能性がある。あるいは、病変部位、病巣、または感染した体の部位を標的とする注入は、充実性腫瘍、局所感染、あるいはその他の免疫賦活を必要とする部位の治療に適用することができる。
【００９４】
また、免疫系細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、またはオリゴデンドロサイト）は、宿主から採取し、インビトロで処理することができる。処理された細胞をさらに、培養し、患者に（または異種宿主に）再導入することで、患者または宿主に免疫賦活をもたらすことができる。例えば、骨髄細胞は、患者から吸引し、ＨＤＲで処理することで、全体的な免疫または特異的な免疫を賦活することができる。そして、高線量放射線処理または同等の処理を、患者に残っている免疫細胞を破壊するために用いることができる。再移植すると、賦活された自己細胞は、患者において通常の免疫機能を回復するようになる。あるいは、ガンに冒されている患者から単離したＮＫ細胞および／またはＴ細胞を、患者のガンに特異的な一つまたは複数の抗原にインビトロで曝すことができる。患者に再移植すると、抗原で賦活された細胞は、ガン細胞に抗する活発な細胞性免疫反応を展開するようになる。
【００９５】
免疫賦活的な（有効な）量とは、患者における免疫反応を賦活することのできるワクチンの量を指し、病原の攻撃、アレルギー、あるいは免疫異常または免疫学的な病気を予防し、改善し、または治療するために十分な量である。免疫賦活的な量は、ワクチンによる事前の処理を受けていない患者に抗原が投与されたときに得られる反応と比べて、抗原の少なくとも一つのエピトープに対する液性免疫反応または細胞性免疫反応を測定できる程に高める量である。従って、例えば、免疫賦活的な量は、対象となる抗原エピトープに対する抗体の産生を促進すること、あるいは、病原性またはアレルギー性の攻撃に対する検出可能な防御効果を賦活すること、あるいは、対象となる抗原エピトープに対する防御的なＣＴＬ反応を促進することができる、抗原含有組成物の量を指す。
【００９６】
免疫賦活的な量の本発明の抗原含有組成物による治療は、少なくとも一つの免疫系細胞またはそれらから派生した細胞株を含む宿主での免疫反応において、直接的、間接的、または統計的に観察可能もしくは測定可能な、あらゆる増加またはその他の所望の変化を引き起こすことを含んでおり、前記宿主には特に、エクスビボで組織を培養した宿主が含まれる。宿主の細胞は、ヒトまたは動物の末梢血、リンパ節などから派生させることができる。エクスビボで組織培養した宿主は、好ましくは、新鮮分離したＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、オリゴデンドロサイト、ＮＫ細胞、および単球を含み、これらのそれぞれは標準的な技術を用いて単離または精製することができる。観察可能あるいは測定可能な反応には、Ｂ細胞またはＴ細胞の増殖または活性化、抗体の分泌の増加、アイソタイプスイッチ、サイトカインの放出の増加、特に一つまたは複数のＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βまたはＲＡＮＴＥＳの放出の増加、特異抗原に対する抗体力価または親和性の増加、病原感染に関連する罹患率または死亡率の低下、ウイルス潜伏の促進、誘発、維持または強化、悪性および非悪性腫瘍の成長、転移、影響の抑制または緩和、そして、疾病または疾病の影響からの予防的防御をもたらすことが含まれる。
【００９７】
免疫反応の抑制が望まれる場合、例えば自己免疫疾患またはアレルギーの治療では、効果的な量にはまた、治療すべき病気または病変に関連する反応を測定可能または観察可能に減少させるために十分な量が含まれる。
【００９８】
投与すべき抗原含有組成物の量および投与頻度は経験的に決定することができ、治療する患者の年齢とサイズ、扱う病気または疾病を考慮に入れることになる。適切な容量は、接種材料につき０．０１μｇから１００μｇの範囲に収まるが、より多い、またはより少ない量が指示されることもある。二次的な追加免疫による免疫付与は、一週間から数ヶ月の間隔の後に行うことができる。
【００９９】
以下の実施例は本発明のいくつかの実施態様を示している。当業者であれば、本発明の趣旨または範囲を変えることなく行うことができる、数々の変更および変形例が認識されるものである。これらの変更および変形例は、本発明の範囲に含まれていると考えられる。実施例はいかなる場合も本発明を限定するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１００】
以下の実験技術および試薬は、本発明のいくつかの非限定的な実施態様を示すために用いた。
【０１０１】
トランスジェニックマウス
【０１０２】
ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩＩ−ＫＯマウス（ＩＡβb゜）を、リールのパスツール研究所において（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ  ｏｆ  Ｌｉｌｌｅ）、ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したマウス（Ａｌｔｍａｎｎ、Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ』１８１、８６７−８７５（１９９５））とＨ−２クラスＩＩ−ＫＯマウス（ＩＡβb゜）（Ｒｏｈｒｌｉｃｈ、Ｐ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』１５、７６５−７７２（２００３））を交配して得た。キメラ一本鎖（ＨＨＤ分子：ＨＬＡ−Ａ２．１のα１−α２ドメイン、Ｈ−２Ｄbのα３から細胞内ドメインまでが、そのＮ末端において、１５のアミノ酸のペプチドリンカーによって、ヒトβ２ｍのＣ末端と結合している）を発現する、ＨＬＡ−Ａ２．１を遺伝子導入したマウスを作成した（Ｐａｓｃｏｌｏ、Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ』１８５、２０４３−２０５１（１９９７））。ＨＬＡ−Ａ２．１（ＨＨＤ）を遺伝子導入したＨ−２クラスＩ−ＫＯマウスとＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩＩ−ＫＯマウス（ＩＡβb゜）を異系交配し、後代を、ＨＬＡ−Ａ２．１+/-／ＨＬＡ−ＤＲ１+/-の二つを遺伝子導入したＨ−２クラスＩ（β２ｍ0）／クラスＩＩ（ＩＡβ0）−ＫＯマウスが得られるまで選別し、ここに記載された実験に使用した。ＨＬＡ−Ａ２．１+/-のみを遺伝子導入したＨ−２クラスＩ（β２ｍ0）／クラスＩＩ（ＩＡβ0）−ＫＯマウスを防御分析における対照として使用した。マウスは、パリのパスツール研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、Ｐａｒｉｓ）の動物施設で飼育し、全ての手順は、動物保護についてのフランスおよびヨーロッパの規制、および公衆衛生局の勧告を遵守するために、パスツール研究所の所轄局による調査を受けている。
【０１０３】
遺伝子型決定
【０１０４】
ＨＬＡ−ＤＲＢ１*０１０１、ＨＬＡ−ＤＲＡ*０１０１およびＨＬＡ−Ａ*０２０１トランスジーンをＰＣＲで検出した。１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのｐＨ７．２であるＴｒｉｓ−ＨＣＩ、１００ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＳＤＳおよび０．５ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫの中で、５６℃で一晩インキュベートし、その後、２５０μｌの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、イソプロパノール沈殿を行った後、ＤＮＡの末尾部分を抽出した。標本を７０％のエタノール中で洗浄し（×３）、１５０μｌの、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、１ｍＭのｐＨ８であるＥＤＴＡで再懸濁した。ＰＣＲ条件は以下の通りである。１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、１．２５ＵのＴａｑポリメラーゼ、緩衝液は、製造業者（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）によって提供されたものであり、１サイクル（７分、９４℃）、４０サイクル（３０秒、９４℃；３０秒、６０℃；１分、７２℃）、１サイクル（４分、７２℃）を行い、フォワードプライマーおよびリバースプライマーとして、ＨＨＤについては、５’ＣＡＴ  ＴＧＡ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＧＣＧ  ＣＴＴ  ＧＧＣ  ＡＣＡ  ＧＡＡ  ＧＣＡ  Ｇ３’および５’ＧＧＡ  ＴＧＡ  ＣＧＴ  ＧＡＧ  ＴＡＡ  ＡＣＣ  ＴＧＡ  ＡＴＣ  ＴＴＴ  ＧＧＡ  ＧＴＡ  ＣＧＣ  ３’を用い、ＨＬＡ−ＤＲＢ１*０１０１については、５’ＴＴＣ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＧＧＧ  ＡＣＧ  ＧＡＧ  ＣＧＧ  ＧＴＧ  ３’および５’ＣＴＧ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＣＴＣ  ＡＣＣ  ＡＡＣ  ３’を用い、ＨＬＡ−ＤＲＡ*０１０１については、５’ＣＴＣ  ＣＡＡ  ＧＣＣ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＣＡＧ  ＡＧ３’および５’ＡＴＧ  ＴＧＣ  ＣＴＴ  ＡＣＡ  ＧＡＧ  ＧＣＣ  ＣＣ  ３’を用いた。
【０１０５】
ＦＡＣＳ分析
【０１０６】
細胞の蛍光定量を、赤血球を除去した、Ｌｙｍｐｈｏｌｉｔｅ−Ｍ（Ｔｅｂｕ−ｂｉｏ社、Ｌｅ  Ｐｅｒｒａｙ  ｅｎ  Ｙｖｅｌｉｎｅｓ、フランス）で精製した脾細胞について、ＦＩＴＣと結合したＷ６／３２（抗ＨＬＡ−ＡＢＣ、Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス）とビオチン化した抗２８−８−６Ｓ（抗Ｈ−２Ｋb／Ｄb、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州サンディエゴ）ｍ．Ａｂを用いて行った。ＣＤ４+およびＣＤ８+のＴリンパ球を、ＰＥ標識ＣＴ−ＣＤ４抗マウスＣＤ４（ＣＡＬＴＡＧ社、カリフォルニア州南サンフランシスコ）とＦＩＴＣ標識５３−６．７抗マウスＣＤ８−ｍ．Ａｂ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて染色した。ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の分析を、ＭＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ）でポジティブセレクトしたＢ２２０+Ｂリンパ球について行った。２．４Ｇ２ｍ．ＡｂでＦｃレセプターが飽和した後、ＨＬＡ−ＤＲ１およびＨ−２ＩＡbの発現を、ＦＩＴＣ標識Ｌ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ）およびＰＥ標識ＡＦ６−１２０．１（抗Ｈ−２ＩＡβb）ｍ．Ａｂ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて分析した。パラホルムアルデヒドで固定した細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、マサチューセッツ州ベッドフォード）で分析した。
【０１０７】
Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ分析
【０１０８】
未処理マウスに由来するＣＤ４+およびＣＤ８+のＴ細胞を、Ａｕｔｏ−Ｍａｃｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）でポジティブセレクトし、ＲＮＡを、ＲＮＡ  Ｅａｓｙ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いて調製し、ｃＤＮＡ合成に使用した。ｃＤＮＡを、ＢＶセグメントファミリーのそれぞれに特異的なフォワードプライマーと、二つのＢＣセグメントに共通のリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、ＦＡＭをタグ付けした内部ＢＣプライマーを用いて、ランオフで伸長した。ランオフした産物を、３７３Ａ  ＤＮＡシーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社、カリフォルニア州フォスターシティ）で分離する（７ｈ、３５Ｗ）ために、６％アクリルアミド／８Ｍ尿素ゲルにロードした。データを、Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅソフト（Ｐａｎｎｅｔｉｅｒ、Ｃ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ』９０、４３１９−４３２３（１９９３））を用いて分析した。
【０１０９】
ペプチド
【０１１０】
ＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドのＨＢｓＡｇ348-357ＧＬＳＰＴＶＷＬＳＶおよびＨＢｓＡｇ335-343ＷＬＳＬＬＶＰＦＶ、Ｈ−２Ｋb結合ペプチドのＨＢｓＡｇ371-378ＩＬＳＰＦＬＰＬ、ＨＬＡ−ＤＲ１結合ペプチドのＨＢｓＡｇ180-195ＱＡＧＦＦＬＬＴＲＩＬＴＩＰＱＳ、Ｈ−２ＩＡb結合ペプチドのＨＢｓＡｇ126-138ＲＧＬＹＦＰＡＧＧＳＳＳＧ、ならびにｐｒｅＳ２ペプチドのＨＢｓＡｇ109-134ＭＱＷＮＳＴＴＦＨＱＴＬＱＤＰＲＶＲＧＬＹＦＰＡＧＧは、Ｎｅｏｓｙｓｔｅｍ社（ストラスブール、フランス）によって合成されたものであり、ＰＢＳ−１０％のＤＭＳＯに１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。ペプチドのアミノ酸配列のナンバリングは、ＨＢＶのａｙｗサブタイプのｐｒｅＳ１領域の最初のメチオニンから開始している。
【０１１１】
ＨＢＶのＳ２−Ｓタンパク質をコードするＤＮＡによる免疫付与
【０１１２】
ヒトＣＭＶ前初期遺伝子プロモーターの制御下で発現するＨＢＶの表面抗原ｐｒｅＳ２およびＳをコードしている、ｐＣＭＶ−Ｓ２．Ｓプラスミドベクター（Ｍｉｃｈｅｌ、Ｍ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ』９２、５３０７−５３１１（１９９５））を、エンドトキシンフリーの条件の下、Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｇｉｇａ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）のカラムで精製した。先行文献で説明されているように（Ｄａｖｉｓ、Ｈ．Ｌ．、Ｍｉｃｈｅｌ、Ｍ．Ｌ．＆Ｗｈａｌｅｎ、Ｒ．Ｇ．、『Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ』２、１８４７−１８５１（１９９３））、麻酔したマウスの再生前脛骨筋に注入した（各側に５０μｇ）。
【０１１３】
Ｔ細胞増殖分析
最後の免疫付与から１２日後、文献で説明されているように（Ｌｏｉｒａｔ、Ｄ．、Ｌｅｍｏｎｎｉｅｒ、Ｆ．Ａ．＆Ｍｉｃｈｅｌ、Ｍ．Ｌ．、『Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』１６５、４７４８−４７５５（２０００））、赤血球を除去した、Ｆｉｃｏｌｌで精製した脾細胞（５×１０6細胞／２５ｃｍ2培養フラスコ（Ｔｅｃｈｎｏ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＴＰＰ）、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ、スイス））を、ペプチドをパルスし（２０μｇ／ｍｌ）、γ線を放射（１８０Ｇｙ）した、ＬＰＳ幼若化細胞（５×１０6細胞／培養フラスコ）と、１０％のＦＣＳ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５×１０-5Ｍの２−メルカプトエタノール、１００Ｉ×Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇのストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ培地で、共培養した。７日目、増殖分析のために、細胞を、ペプチドをパルスし、放射線照射したＬＰＳ幼弱化細胞（２×１０5細胞／ウェル）と、７２時間、３％のＦＣＳを加えたＲＰＭＩ完全培地で平面培養した（平底の９６ウェルマイクロプレート（ＴＰＰ）に５×１０5細胞／ウェル）。細胞に、ＴＯＭＴＥＣコレクターを用いるｆｉｌｔｅｒｍａｔｅｓ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）で回収する前の１６時間、ウェルあたり１μＣｉの（3Ｈ）−チミジンをパルスし、取り込まれた放射活性をマイクロβカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）で測定した。結果は、賦活指数（ＳＩ）＝特異的ペプチドでのｃｐｍ／関連のないペプチドでのｃｐｍで示した。
【０１１４】
ＣＴＬ活性の測定
【０１１５】
増殖分析として、細胞毒性分析を、同一の免疫脾細胞群で行った。応答細胞（５×１０6細胞／２５ｃｍ2培養フラスコ、ＴＰＰ）と、刺激するための、ペプチドをパルスし（２０μｇ／ｍｌ）、γ線を放射した（１８０Ｇｙ）ＬＰＳ幼若化抗原細胞（５×１０6細胞／培養フラスコ）を、７日間にわたって、同様の添加ＲＰＭＩ培地の中で共培養した。細胞溶解活性を、１０μｇ／ｍｌの実験対象のペプチドまたは対照ペプチドをパルスしたＲＭＡ−Ｓ−ＨＨＤ標的細胞について、標準的な４ｈ51Ｃｒアッセイで試験した。％で示された特異的溶解は二段階で計算したのだが、該計算は、［実験対象の自然放出］／［最大の自然放出］×１００から、対照ペプチドで見られる非特異的溶解を差し引いたものである。
【０１１６】
インビボでの抗体産生の測定
【０１１７】
ＤＮＡの注入前後の様々な時間に、マウスから、ヘパリン処理したガラスピペットを用いて、血液を球後穿刺によって採取し、遠心分離によって回収した血清を、抗ＨＢｓおよび抗ｐｒｅＳ２について、特異的ＥＬＩＳＡによって分析した。ＨＢＶのｓｍａｌｌＳタンパク質（１μｇ／ｍｌ）またはｐｒｅＳ２（１２０−１４５）合成ペプチド（１μｇ／ｍｌ）を含有する、精製した組換え粒子を、固相として用いた。１０％のＦＣＳを加えたＰＢＳＴ（０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）でブロックした後、連続希釈を行った。よく洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、イギリス）で標識した抗マウスＩｇ（全ＩｇＧ）で、結合抗体を検出した。抗体力価を、連続終末点希釈法によって測定した。マウスの血清は個別に試験し、力価は、少なくとも三つの測定値の平均とした。１／１００未満まで血清を希釈した場合はネガティブであるとした。
【０１１８】
抗体力価測定
【０１１９】
免疫付与したマウスに由来する血清を個別に、ＥＬＩＳＡ（Ｍｉｃｈｅｌ、Ｍ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ』９２、５３０７−５３１１（１９９５））によって、精製したＨＢＶのｍｉｄｄｌｅタンパク質とｓｍａｌｌタンパク質またはｐｒｅＳ２合成ＨＢｓ109-134ペプチドのいずれかについて分析した。０．１％のＴｗｅｅｎ２０と１０％のＦＣＳを加えた１×ＰＢＳでブロックし、洗浄（×３）した後、結合抗体を、ホースラディッシュペルオキシダーゼで標識した抗マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、イギリス）で検出した。抗体力価（少なくとも３回の測定の平均）は連続終末点希釈法によって測定した。１／１００未満の力価はネガティブであるとした。
【０１２０】
ワクチン攻撃とプラークアッセイ
【０１２１】
ＤＮＡを注入したマウスは、ＨｂｓＡｇタンパク質（Ｓｍｉｔｈ、Ｇ．Ｌ．、Ｍａｃｋｅｔｔ、Ｍ．＆Ｍｏｓｓ、Ｂ．、『Ｎａｔｕｒｅ』３０２、４９０−４９５（１９８３））またはＨＢｘタンパク質（Ｓｃｈｅｋ、Ｎ．、Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ、Ｒ．、Ｋｕｈｎ、Ｃ．＆Ｓｃｈａｌｌｅｒ、Ｈ．、『Ｏｎｃｏｇｅｎｅ』６、１７３５−１７４４（１９９１））のいずれかを発現している、１０7ＰＦＵの組換えワクシニアウイルス（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ株）で、最後の注入から１２日後に腹腔内を攻撃したのだが、ＨＢｓＡｇタンパク質を発現しているワクシニアウイルスとＨＢｘタンパク質を発現しているワクシニアウイルスはそれぞれ、Ｂ．Ｍｏｓｓ博士とＨ．Ｓｃｈａｌｌｅｒ博士の好意によって提供されたものである。４日後、卵巣を、ｒＶＶ力価について、ＢＨＫ２１細胞（Ｂｕｌｌｅｒ、Ｒ．Ｍ．＆Ｗａｌｌａｃｅ、Ｇ．Ｄ．、『Ｌａｂ  Ａｎｉｍ  Ｓｃｉ』３５、４７３−４７６（１９８５））に対するプラークアッセイによって分析した。
【実施例１】
【０１２２】
ＭＨＣ分子の細胞表面発現
ＨＬＡ−Ａ２．１、Ｈ−２Ｋb／Ｄb、ＨＬＡ−ＤＲ１およびＨ−２ＩＡb分子の細胞表面発現を、フローサイトメトリー法によって、脾細胞で評価した。図１ａに示されているように、類似したレベルのＨＬＡ−Ａ２．１の発現が、ＨＬＡ−Ａ２．１／ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩ／クラスＩＩ−ＫＯマウスと、ＨＬＡ−Ａ２．１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩ−ＫＯマウスで見られたのに対し、ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩＩ−ＫＯマウスでは、ＨＬＡ−Ａ２．１は見られず、Ｈ−２Ｋb／Ｄbのみが発現した。ＨＬＡ−ＤＲ１およびＨ−２ＩＡbの細胞表面発現を、Ｂ２２０+に富んだＢ細胞で測定した。図１ｂに示されているように、類似したレベルのＨＬＡ−ＤＲ１の発現が、ＨＬＡ−Ａ２．１／ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩ／クラスＩＩ−ＫＯマウスと、ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩＩ−ＫＯマウスで見られたのに対し、ＨＬＡ−Ａ２．１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩ−ＫＯマウスでは全く発現が検出されなかった。しかし、遺伝子導入した分子（特にＨＬＡ−ＤＲ１）の細胞表面発現は、内因性のＨ−２クラスＩ分子およびクラスＩＩ分子の発現より低かった。
【実施例２】
【０１２３】
末梢ＣＤ４+Ｔ細胞およびＣＤ８+Ｔ細胞
ＣＤ４+およびＣＤ８+の脾臓Ｔ細胞の数を、図２ａに示されているように、免疫染色分析およびフローサイトメトリー分析によって測定した。
【０１２４】
ＣＤ４+Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２．１／ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩ／クラスＩＩ−ＫＯマウスと、ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩＩ−ＫＯマウスの両方において、脾細胞群の１３％〜１４％であった。対照的に、Ｈ−２クラスＩＩ−ＫＯマウスでは、細胞の２％〜３％だけがＣＤ４+であり（データは示されていない）、ＭＨＣクラスＩＩ分子を欠くマウスについての初期報告（Ｃｏｓｇｒｏｖｅ、Ｄ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｃｅｌｌ』６６、１０５１−１０６６（１９９１））に一致する。期待された通り、遺伝子導入したＨＬＡ−Ａ２．１分子の発現は、末梢ＣＤ８+Ｔ細胞群の割合を増加させ、β２ミクログロブリン（β２ｍ）をＫＯした、ＭＨＣクラスＩを欠いたマウスでは、０．６％〜１％であった（Ｐａｓｃｏｌｏ、Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ』１８５、２０４３−２０５１（１９９７））のに対し、ＨＬＡ−Ａ２．１／ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩ／クラスＩＩ−ＫＯマウスと、ＨＬＡ−Ａ２．１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩ−ＫＯマウスの両方においては、全脾細胞の２％〜３％に達した。
【０１２５】
実施例１および実施例２で示された結果は、
（１）ＨＬＡ−Ａ２+ＨＬＡ−ＤＲ１+β２ｍ゜ＩＡβ゜マウスでは、ＨＬＡ−Ａ２分子の発現、Ｈ−２−Ｋb分子の非発現、ＣＤ８+末梢Ｔリンパ球の数、およびＣＤ８+Ｔレパートリーの多様性が、概ねＨＬＡ−Ａ２+β２ｍ゜マウスに匹敵していること、
（２）ＨＬＡ−Ａ２+ＨＬＡ−ＤＲ１+β２ｍ゜ＩＡβ゜マウスでは、ＨＬＡ−ＤＲ１分子の発現、Ｈ−２−ＩＡb分子の非発現、ＣＤ４+Ｔリンパ球の数、およびＣＤ４+レパートリーの多様性が、概ねＨＬＡ−ＤＲ１+ＩＡβ゜マウスに匹敵していること、そして、
（３）ＨＬＡ−Ａ２+ＨＬＡ−ＤＲ１+β２ｍ゜ＩＡβ゜マウスが、ＨＬＡ−Ａ２+β２ｍ゜マウスおよびＨＬＡ−ＤＲ１+ＩＡβ゜マウスで見られる特徴的な利点の全てを有していること、
を示している。
【実施例３】
【０１２６】
ＴＣＲのＢＶセグメントの使用
一つのＭＨＣクラスＩ分子と一つのＭＨＣクラスＩＩ分子の存在により、ＴＣＲレパートリーの数と多様性を減少させることができるので、過去に記載されているように（Ｃｏｃｈｅｔ、Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』２２、２６３９−２６４７（１９９２））、様々なＢＶファミリーの発現とＣＤＲ３の長さの多様性を、ＲＴ−ＰＣＲをベースとするｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ技術によって、精製した脾細胞のＣＤ４+またはＣＤ８+のＴ細胞について研究した。ガウス分布に似た分布での大きなピークが、ほとんどのＢＶファミリー（分析した２０のうち１５）について、Ｔ細胞のＣＤ８+群（図２ｂ）およびＣＤ４+群（図２ｃ）の両方で見られた。抹消Ｔリンパ球で見られたこのようなグラフの特徴は、機能的に再配列したＢＶセグメントに典型的であり、一つ目のピークから次のピークまでに、ＣＤＲ３亜領域の３ヌクレオチド長の変化を有する（Ｃｏｃｈｅｔ、Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』２２、２６３９−２６４７（１９９２））。
【０１２７】
ＢＶ５．３および１７で見られるような、展開（または大きく変化したグラフの特徴）がないことは、予想されていたことであるが、それは、これらの二つのＢＶセグメントがＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて偽遺伝子だからである（Ｗａｄｅ、Ｔ．、Ｂｉｌｌ、Ｊ．、Ｍａｒｒａｃｋ、Ｐ．Ｃ．、Ｐａｌｍｅｒ、Ｅ．＆Ｋａｐｐｌｅｒ、Ｊ．Ｗ．、『Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』１４１、２１６５−２１６７（１９８８）；Ｃｈｏｕ、Ｈ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ』８４、１９９２−１９９６（１９８７））。しかし、ＢＶ５．１、５．２および１１のセグメントについて見られたグラフの変化は、対応するＢＶ発現Ｔ細胞亜群が小さいことに起因している（該Ｔ細胞亜群はＣ５７ＢＬ／６マウスでは５％より少なく、ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩＩ−ＫＯマウスではおよそ２％である）（データは示していない）。これらの事例以外では、ＨＬＡ−Ａ２．１／ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩ／クラスＩＩ−ＫＯマウスにおけるＣＤ４+およびＣＤ８+のＴ細胞の両方が、それぞれ、非トランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウスのパターンと類似した、ＴＣＲのＢＶ鎖の使用とＣＤＲ３の多様性のパターンを示している。
【実施例４】
【０１２８】
機能的解析
ＡｇＨＢｓ（Ｂ型肝炎ウイルスのエンベロープタンパク質）で免疫付与したＨＬＡ−Ａ２+ＨＬＡ−ＤＲ１+β２ｍ゜ＩＡβ゜マウスを分析した。図５は、ＨＢｓＳ２抗体の産生によって示される特異的液性免疫反応を示している。図６は、ＨＢｓ348-357に対する、特異的なＤＲ１拘束性ＣＤ４+Ｔ細胞の増殖反応を示している。そして図７は、ＨＢｓ348-357またはＨＢｓ335-343に対する、特異的なＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＤ８+細胞溶解性Ｔ細胞の反応を示している。
【０１２９】
これらの結果は、ＨＬＡ−Ａ２+ＨＬＡ−ＤＲ１+β２ｍ゜ＩＡβ゜マウスによって、免疫付与した個体において、特異的液性免疫反応、ＣＤ４+Ｔヘルパー細胞のＡｇ特異的ＨＬＡ−ＤＲ１拘束性反応、そして、Ａｇ特異的ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＤ８+Ｔ細胞の細胞溶解反応を同時に分析することが可能になることを示している。
【０１３０】
これらのマウスから得られた追加データを以下の表１〜表３に示した。
【０１３１】
【表１】
0005478003.tif 000002
【０１３２】
【表２】
0005478003.tif 000003
【０１３３】
【表３】
0005478003.tif 000004
【実施例５】
【０１３４】
ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡワクチンに対する免疫反応
ＨＬＡ−Ａ２．１／ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩ／クラスＩＩ−ＫＯマウスの免疫学的潜在能力を評価するため、そして、それらの液性免疫反応、ＣＤ４+Ｔ細胞反応およびＣＤ８+Ｔ細胞反応をヒトのものと比較するために、マウスを、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡプラスミドで免疫付与した。このプラスミドは二つのＢ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質（ｍｉｄｄｌｅであるｐｒｅＳ２／ＳおよびｓｍａｌｌであるＳ）をコードしており、該タンパク質は、Ｂ型肝炎表面抗原を有する粒子で自己組織化している。Ｂ型肝炎に対して現状で用いられているワクチンは、これらの二つのタンパク質を含んでいる。
【０１３５】
代表的なマウスについて図３ａで示されているように、ＨＢｓＡｇ特異的抗体は、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡワクチンの注射後１２日目に最初に検出し（図３ａ、上パネル）、これらの抗体の力価は、２４日目まで増加した（二回目のＤＮＡ免疫付与の１２日後、データは示していない）。この抗体の早期反応は、ｍｉｄｄｌｅのＨＢＶエンベロープタンパク質が有するｐｒｅＳ２−Ｂ細胞エピトープ（ＨＢｓ109-134）とＨＢｓＡｇ粒子に対して特異的であり、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡで免疫付与したマウス（Ｍｉｃｈｅｌ、Ｍ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ』９２、５３０７−５３１１（１９９５））と、ＨＢｓＡｇをワクチン投与されたヒト（Ｍｏｕｌｉａ−Ｐｅｌａｔ、Ｊ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｖａｃｃｉｎｅ』１２、４９９−５０２（１９９４））で報告された類似の反応に一致している。
【０１３６】
ＨＢｓＡｇに対するＣＤ８+ＣＴＬ反応を試験し、ＨＬＡ−Ａ２．１／ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩ／クラスＩＩ−ＫＯマウスの末梢におけるＣＤ８+Ｔ細胞が、遺伝子導入したヒトのクラスＩ分子によって機能的に拘束されるかどうか判定した。ＨＢＶに感染したＨＬＡ−Ａ２．１+のヒトでは、免疫的にドミナントなＨＬＡ−Ａ２．１拘束性ＨＢｓＡｇ特異的ＣＴＬ反応が、ＨＢｓＡｇ348-357ペプチド（Ｍａｉｎｉ、Ｍ．Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．、『Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ』１１７、１３８６−１３９６（１９９９））およびＨＢｓＡｇ335-343ペプチド（Ｎａｙｅｒｓｉｎａ、Ｒ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』１５０、４６５９−４６７１（１９９３））に対して生じた（すなわち、複数のエピトープ反応が見られた）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは、Ｈ−２Ｋb拘束性ＨＢｓＡｇ特異的ＣＴＬ反応が、ＨＢｓＡｇ371-378ペプチド（Ｓｃｈｉｒｍｂｅｃｋ、Ｒ．、Ｗｉｌｄ、Ｊ．＆Ｒｅｉｍａｎｎ、Ｊ．、『Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』２８、４１４９−４１６１（１９９８））に対して生じた。ヒト化したマウスがヒトのように反応することができるかどうかを評価するために、ここに記載したように、脾臓Ｔ細胞を７日間にわたって、関連ペプチド（ＨＢｓＡｇ348-357、ＨＬＡ−Ａ２．１拘束性）または対照ペプチド（ＨＢｓＡｇ371-378、Ｈ−２Ｋb拘束性、ＭＡＧＥ−３271-279、ＨＬＡ−Ａ２．１拘束性）のいずれかで再賦活した。図３ａ（中パネル）は、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡによる免疫付与が強いＨＢｓＡｇ348-357特異的ＣＴＬ反応を生じさせるが、ＨＢｓＡｇ371-378ペプチドまたはＭＡＧＥ−３271-279ペプチドのいずれに対する反応も生じさせなかったことを示している。
【０１３７】
このＨＬＡ−Ａ２．１／ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩ／クラスＩＩ−ＫＯマウスの末梢におけるＣＤ４+Ｔ細胞が、遺伝子導入したヒトのクラスＩＩ分子によって機能的に拘束されるかどうかを判定するため、ＨＢｓＡｇタンパク質に対するＣＤ４+Ｔ細胞反応を試験した。ＨＢｓＡｇをワクチン投与した、または、ＨＢＶに感染したＨＬＡ−ＤＲ１+のヒトでは、免疫的にドミナントなＨＬＡ−ＤＲ１拘束性ＨＢｓＡｇ特異的ＣＤ４+Ｔ細胞反応が、ＨＢｓＡｇ180-195ペプチド（Ｍｍ、Ｗ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．、『Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ』４６、９３−９９（１９９６））に対して生じる。Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは、Ｈ−２ＩＡb拘束性ＨＢｓＡｇ特異的ＣＤ４+Ｔ細胞反応が、ＨＢｓＡｇ126-138ペプチド（Ｍｉｌｉｃｈ、Ｄ．Ｒ．、『Ｓｅｍｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ』１１、９３−１１２（１９９１））に対して生じた。ヒト化したマウスをヒトおよび野生型マウスと比較するために、脾臓のＴ細胞を、関連ペプチド（ＨＢｓＡｇ180-195、ＨＬＡ−ＤＲ１拘束性）または対照ペプチド（ＨＢｓＡｇ126-138、Ｈ−２ＩＡb拘束性、ＨＩＶ１Ｇａｇ263-278、ＨＬＡ−ＤＲ１拘束性）のいずれかでインビトロで再賦活した。図３ａ（下パネル）は、期待されたように、ＨＬＡ−ＤＲ１拘束性ＨＢｓＡｇ180-195ペプチドに対する強い増殖反応を示す一方、Ｈ−２ＩＡb拘束性ペプチドは反応の賦活においては効果的ではなかった。同様に、ＨＩＶ１Ｇａｇ263-278ペプチドによっても反応は誘発されなかった。さらに、ＨＢｓＡｇ180-195ペプチドによってさらにインビトロで再現したところ、特異的増殖指数が数倍増加した（データは示していない）。
【０１３８】
第一の、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡで免疫付与した、ＨＬＡ−Ａ２．１／ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩ／クラスＩＩ−マウスにおける、ＨＢｓＡｇ特異的抗体反応、Ｔ細胞の増殖反応および細胞溶解性反応の発生と特異性については実証したが、同じ三つの反応について、さらに６頭のＨＢｓＡｇ−ＤＮＡで免疫付与したマウスと、対照である６頭の未処理のＨＬＡ−Ａ２．１／ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩ／クラスＩＩ−ＫＯマウスも、個別に試験した。図３ｂに示されているように、三つの反応は、試験した６頭の免疫付与したマウスでは同時に実証されたが、対照用の未処理マウスでは実証されなかった。興味深いことに、２頭の免疫付与したマウスは、ＨＢｓＡｇ348-357およびＨＢｓＡｇ335-343のＨＬＡ−Ａ２．１拘束性ペプチドの両方に対するＣＴＬ反応を示す能力があった（図３ｂ、中パネル）。
【実施例６】
【０１３９】
防御分析
上記の実施例は、ＨＬＡ−Ａ２．１／ＨＬＡ−ＤＲ１を遺伝子導入したＨ−２クラスＩ／クラスＩＩ−ＫＯマウスにおける、ＨＢｓＡｇ特異的液性免疫性の、ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞反応の誘発を実証しており、また、該反応が、自然感染した、または、ＨＢｓＡｇをワクチン投与したヒトの反応と同一の、免疫的にドミナントなエピトープに対して生じることを示している。本実施例では、これらの反応がワクチン投与したマウスで防御を示すかどうかを試験した。マウスはＨＢＶに対して寛容ではないため、ＨＢｓＡｇを遺伝子組換えしたワクシニアウイルス（ｒＶＶ−ＨＢｓＡｇ）をこれらの実験に用いた。マウスは、１００μｇのＨＢｓＡｇ−ＤＮＡで二回、筋肉内に免疫付与した。最後の免疫付与から１２日後、マウスは、１０7ＰＦＵのｒＶＶ−ＨＢｓＡｇで、腹腔内を攻撃した。４日後、ウイルス力価を、既知の方法に従って測定し、ｒＶＶのＰＦＵ／卵巣で記録した（Ｂｕｌｌｅｒ、Ｒ．Ｍ．＆Ｗａｌｌａｃｅ、Ｇ．Ｄ．、『Ｌａｂ  Ａｎｉｍ  Ｓｃｉ』３５、４７３−４７６（１９８５））。
【０１４０】
結果を図４に示した。ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡで免疫付与していない未処理マウスは、攻撃後にｒＶＶ−ＨＢｓＡｇが複製されていることを示した。対照的に、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡで免疫付与したマウスにおけるウイルス力価は、４桁以上小さい値であった。これらの結果は、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡでのワクチン投与が、ｒＶＶ−ＨＢｓＡｇによる感染を制御する防御性のＨＢｓＡｇ特異的免疫反応を誘発することを強く示唆している。
【０１４１】
ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡのワクチン投与によって与えられる防御の特異性は、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡで免疫付与したマウスを他のＨＢｘ遺伝子組換えＶＶ（Ｂ型肝炎のｘタンパク質をコードしている）で攻撃することで実証された。免疫付与していない対照と比べ、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡで免疫付与したマウスでは、ｒＶＶ−ＨＢｘの複製の減少は見られなかった。
【実施例７】
【０１４２】
ＨＬＡ−ＤＲ１拘束性のＣＤ４+Ｔ細胞は、抗体、ならびにウイルス感染に対するＣＴＬ反応および防御にとって重要である。
ＨＬＡ−ＤＲ１拘束性ヘルパーＴリンパ球がヒト化したマウスにおける抗体反応とＣＴＬ反応に寄与するかどうかを評価するために、免疫反応とウイルス感染効率を、一つ（ＨＬＡ−Ａ２．１）を遺伝子導入した、および二重（ＨＬＡ−Ａ２．１／ＨＬＡ−ＤＲ１）に遺伝子導入した、Ｈ−２クラスＩ／クラスＩＩ−ＫＯマウスにおいて比較した。表４に示されているように、強力なＨＢｓＡｇ348-357特異的ＣＴＬ反応は、ＨＬＡ−Ａ２．１／ＨＬＡ−ＤＲ１を二重に遺伝子導入したＨ−２クラスＩ／クラスＩＩ−ＫＯマウスでは見られたが、ＨＬＡ−Ａ２．１のみを遺伝子導入したＨ−２クラスＩ／クラスＩＩ−ＫＯマウスでは見られなかった。さらに、抗ＨＢｓ抗体は、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡをワクチン投与した、ＨＬＡ−Ａ２．１のみを遺伝子導入したＨ−２クラスＩ／クラスＩＩ−ＫＯマウスでは検出することができなかった。結果的に、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡで免疫付与した、ＨＬＡ−Ａ２．１のみを遺伝子導入したＨ−２クラスＩ／クラスＩＩ−ＫＯマウスは、ｒＶＶ−ＨＢｓＡｇの感染に対して防御されなかった。
【０１４３】
【表４】
0005478003.tif 000005
【０１４４】
本出願を通して引用されたすべての参考文献、特許文献および公開された特許出願の全内容は、参照することによってそれらの全体が本発明の一部を構成するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１ａ】表示されたトランスジェニック分子の細胞表面発現のフローサイトメトリー分析を示している。
【図１ｂ】表示されたトランスジェニック分子の細胞表面発現のフローサイトメトリー分析を示している。
【図２ａ】表示された遺伝子型のマウスにおける、ＣＤ８+およびＣＤ４+の脾臓Ｔ細胞の数およびＢＶセグメントの使用（ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ分析に基づく）を示している。
【図２ｂ】表示された遺伝子型のマウスにおける、ＣＤ８+およびＣＤ４+の脾臓Ｔ細胞の数およびＢＶセグメントの使用（ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ分析に基づく）を示している。
【図２ｃ】表示された遺伝子型のマウスにおける、ＣＤ８+およびＣＤ４+の脾臓Ｔ細胞の数およびＢＶセグメントの使用（ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ分析に基づく）を示している。
【図３ａ】ＨＢｓ特異的抗体反応、細胞溶解反応および増殖反応を示している。
【図３ｂ】ＨＢｓ特異的抗体反応、細胞溶解反応および増殖反応を示している。
【図４】防御検定の結果を示している。
【図５】ｐｃｍｖＳ２／Ｓによる免疫付与に従った、ＨＬＡ−Ａ２+ＤＲ１+ＣＩ-ＣＩＩ-マウスにおけるＡＣの抗ＰｒｅＳ２反応を示している。
【図６】ｐｃｍｖＳ２−ＳによるＨＬＡ−Ａ２+ＤＲ１+ＣＩ-ＣＩＩ-マウスの免疫付与に従った、ＨＬＡ−ＤＲ１拘束性エピトープに対するＣＤ４+Ｔ細胞の増殖反応を示している。
【図７】ｐｃｍｖＳ２／ＳによるＨＬＡ−Ａ２+ＤＲ１+ＣＩ-ＣＩＩ-マウスの免疫付与に従った、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＨＢＳ（３４８−３５７）ペプチドに対する、ＣＤ８+Ｔ細胞の細胞傷害性反応を示している。
【図１ａ】
0005478003.tif 000006
【図１ｂ】
0005478003.tif 000007
【図２】
0005478003.tif 000008
【図３ａ】
0005478003.tif 000009
【図３ｂ】
0005478003.tif 000010
【図４】
0005478003.tif 000011
【図５】
0005478003.tif 000012
【図６】
0005478003.tif 000013
【図７】
0005478003.tif 000014
【配列表】
0005478003000001.xml