(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＤＮＡとヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＤＮＡとの共同増幅方法であって、
(A) ＨＣＶ  ＤＮＡ，ＨＩＶ  ＤＮＡまたはＨＣＶ  ＤＮＡとＨＩＶ  ＤＮＡの組合せを含む疑いのあるＤＮＡ試料において、ＨＣＶの５′非コード領域に特異的な１または複数のオリゴヌクレオチドプライマー対とＨＩＶに特異的な１または複数のオリゴヌクレオチドプライマー対とを使ってポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、(a) ＨＣＶ特異的増幅生成物、(b) ＨＩＶ特異的増幅生成物または(c) (a) と(b) の組合せを含んで成る増幅生成物を生成させ；
ここでＨＣＶに特異的なオリゴヌクレオイドプライマー対の各々が
(i) 正プライマー 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25)〔配列番号１〕と
(ii)逆プライマー  5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25) 〔配列番号２〕とを含んで成り、
ＨＩＶ−１に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー対の各々が配列
5'-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3' (JBLTR4) 〔配列番号３〕
を有する正プライマーと、配列：
(1) 5'-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT-3' (JBLTR6)〔配列番号４〕および
(2) 5'-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3' (JBLTR8)〔配列番号５〕
から成る群より選ばれたＨＩＶ−１に特異的な逆プライマー
とを含んで成り、そして
ＨＩＶ−２に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー対の各々が配列
5'-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3' (2LTRe)〔配列番号６〕
を有する正プライマーと、配列
5'-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3' (2LTR-R1)〔配列番号７〕
を有するＨＩＶ−２に特異的な逆プライマー
とを含んで成ることを特徴とする方法。
【請求項２】
(B) 前記増幅生成物を検出する
という段階を更に含み、
ここでＨＣＶ特異的増幅生成物の検出が前記試料中のＨＣＶ  ＤＮＡの存在を示し、ＨＩＶ特異的増幅生成物の検出が前記試料中のＨＩＶ  ＤＮＡの存在を示し、そしてＨＣＶ特異的増幅生成物とＨＩＶ特異的増幅生成物の検出が前記試料中のＨＣＶ  ＤＮＡとＨＩＶ  ＤＮＡの存在を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記検出がゲル電気泳動により前記増幅生成物を視覚化することを含んで成る、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記検出が、(a) １または複数のＨＣＶ特異的オリゴヌクレオチドプローブ、(b) １または複数のＨＩＶ特異的オリゴヌクレオチドプローブ、または(c) (a) と(b) の組合せを含有する固体支持体上に前記増幅生成物を捕捉し、そして前記捕捉された生成物を比色アッセイを使って定量することを含んで成る、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＨＣＶ特異的プローブが5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' (C252-27-PRB) 〔配列番号12〕から成り、そして前記ＨＩＶ特異的プローブが
(a) 5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3' (JBLTRpr3) 〔配列番号13〕；
(b) 5'-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3' (JBLTRpr4) 〔配列番号16〕；および
(c) 5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3' (2LTRpr1) 〔配列番号14〕
から成る群より選ばれる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記共同増幅が同時である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
内部陽性対照（ＩＰＣ）ＤＮＡ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＤＮＡおよびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＤＮＡの共同増幅方法であって、
(A) ＩＰＣ  ＤＮＡを含有しており且つＨＣＶ  ＤＮＡ，ＨＩＶ  ＤＮＡまたは前記のいずれかの組合せを含む疑いのあるＤＮＡ試料において、ＩＰＣに特異的な１または複数のオリゴヌクレオチドプライマー対、ＨＣＶの５′非コード領域に特異的な１または複数のオリゴヌクレオチドプライマー対、およびＨＩＶに特異的な１または複数のオリゴヌクレオチドプライマー対を使って、ポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、(a) ＩＰＣ増幅生成物、(b) ＩＰＣ増幅生成物とＨＣＶ特異的増幅生成物、(c) ＩＰＣ増幅生成物とＨＩＶ特異的増幅生成物または(d) (a), (b)および(c) の任意組合せを含んで成る増幅生成物を生成せしめ、
ここで前記ＩＰＣに特異的なオリゴヌクレオチドプライマー対の各々が
(i) 正プライマー  5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3' (IPCF1)〔配列番号８〕と
(ii)逆プライマー  5'-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3' (IPCR1)〔配列番号９〕
とを含んで成り、
前記ＨＣＶに特異的なオリゴヌクレオチドプライマー対の各々が
(i) 正プライマー  5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25) 〔配列番号10〕と
(ii)逆プライマー  5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25) 〔配列番号11〕とを含んで成り、
ＨＩＶ−１に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー対の各々が配列
5'-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3' (JBLTR4) 〔配列番号３〕
を有する正プライマーと、配列
(1) 5'-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT-3' (JBLTR6)〔配列番号４〕および
(2) 5'-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3' (JBLTR8)〔配列番号５〕
から成る群より選ばれたＨＩＶ−１に特異的な逆プライマー
とを含んで成り、
ＨＩＶ−２に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー対の各々が配列：
5'-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3' (2LTRe)〔配列番号６〕
を有する正プライマーと、配列：
5'-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3' (2LTR-R1)〔配列番号７〕
を有するＨＩＶ−２に特異的な逆プライマー
とを含んで成ることを特徴とする方法。
【請求項８】
(B) 前記増幅生成物を検出する
という段階を更に含み、
ここでＩＰＣ特異的増幅生成物の検出が前記試料中のＩＰＣ  ＤＮＡの存在を示し、ＨＣＶ特異的増幅生成物の検出が前記試料中のＨＣＶ  ＤＮＡの存在を示し、ＨＩＶ特異的増幅生成物の検出が前記試料中のＨＩＶ  ＤＮＡの存在を示し、そしてＨＣＶ特異的増幅生成物とＨＩＶ特異的増幅生成物の検出が前記試料中のＨＣＶ  ＤＮＡとＨＩＶ  ＤＮＡの存在を示す、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記検出がゲル電気泳動により前記増幅生成物を視覚化することを含んで成る、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記検出が、(a) １または複数のＩＰＣ特異的オリゴヌクレオチドプローブ、(b) １または複数のＨＣＶ特異的オリゴヌクレオチドプローブ、(c) １または複数のＨＩＶ特異的オリゴヌクレオチドプローブ、または(c)
前記のいずれかの任意組合せを含有する固体支持体上に前記増幅生成物を捕捉し、そして前記捕捉された生成物を比色アッセイを使って定量することを含んで成る、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＩＰＣ特異的プローブが5'-CTGCGTTAGACCGAGAACTGTGGATAAAGG-3'〔配列番号17〕から成り、前記ＨＣＶ特異的プローブが5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' (C252-27-PRB) 〔配列番号12〕から成り、そして前記ＨＩＶ特異的プローブが
(a) 5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3' (JBLTRpr3) 〔配列番号13〕；
(b) 5'-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3' (JBLTRpr4) 〔配列番号16〕；および
(c) 5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3' (2LTRpr1) 〔配列番号14〕
から成る群より選ばれる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記共同検出が同時である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
生物学的試料中のＨＣＶ  ＲＮＡとＨＩＶ  ＲＮＡの共同検出のためのキットであって、
(a) (i) 正プライマー  5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25) 〔配列番号10〕と
(ii)逆プライマー  5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25) 〔配列番号11〕
とを含んで成るＨＣＶの５′非コード領域に特異的な一対のオリゴヌクレオチドプライマー；
(b) 配列  5'-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3' (JBLTR4) 〔配列番号３〕を有する正プライマーと
(1)  5'-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT-3' (JBLTR6)〔配列番号４〕および
(2) 5'-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3' (JBLTR8) 〔配列番号５〕
から成る群より選ばれたＨＩＶ−１に特異的な逆プライマー
とを含んで成るＨＩＶ−１に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー；並びに
(c) 配列  5'-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3' (2LTRe)〔配列番号６〕を有する正プライマーと配列  5'-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3' (2LTR-R1)〔配列番号７〕を有するＨＩＶ−２に特異的な逆プライマー
とを含んで成るＨＩＶ−２に特異的な一対のオリヌクレオチドプライマー
を含んで成ることを特徴とするキット。
【請求項１４】
ＩＰＣに特異的な一対のオリゴヌクレオチドプライマーを更に含んで成り、前記ＩＰＣに特異的なオリゴヌクレオチドプライマー対が、正プライマー 5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3' (IPCF1) 〔配列番号８〕と逆プライマー 5'-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3' (IPCR1) 〔配列番号９〕を含んで成る、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
１または複数のプローブを更に含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１６】
１または複数のプローブを更に含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１７】
前記プローブが
5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' (C252-27-PRB) 〔配列番号12〕、
5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3' (JBLTRpr3) 〔配列番号13〕、
5'-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3' (JBLTRpr4) 〔配列番号16〕および
5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3' (2LTRpr1) 〔配列番号14〕
から成る群より選ばれる、請求項１５に記載のキット。
【請求項１８】
前記ＩＰＣ特異的プローブが5'-CTGCGTTAGACCGAGAACTGTGGATAAAGG-3' (IPC1P)〔配列番号17〕から成り、前記ＨＣＶ特異的プローブが5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' (C252-27-PRB) 〔配列番号12〕から成り、そして前記ＨＩＶ特異的プローブが
(a) 5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3' (JBLTRpr3) 〔配列番号13〕；
(b) 5'-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3' (JBLTRpr4) 〔配列番号16〕；および
(c) 5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3' (2LTRpr1) 〔配列番号14〕
から成る群より選ばれる、請求項１６に記載のキット。
【請求項１９】
ＤＮＡ試料中のＨＣＶ  ＤＮＡとＨＩＶ  ＤＮＡの共同増幅のためのキットであって、
(a) (i) 正プライマー  5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25) 〔配列番号10〕と
(ii)逆プライマー  5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25) 〔配列番号11〕
とを含んで成るＨＣＶの５′非コード領域に特異的な一対のオリゴヌクレオチドプライマー；
(b) 配列  5'-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3' (JBLTR4) 〔配列番号３〕
を有する正プライマーと配列：
(1) 5'-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT-3' (JBLTR6)〔配列番号４〕および
(2) 5'-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3' (JBLTR8)〔配列番号５〕
から成る群より選ばれたＨＩＶ−１に特異的な逆プライマー
とを含んで成るＨＩＶ−１に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー；および
配列 5'-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3' (2LTRe) 〔配列番号６〕を有する正プライマーと
配列 5'-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3' (2LTR-R1) 〔配列番号７〕を有するＨＩＶ−２に特異的な逆プライマー
とを含んで成るＨＩＶ−２に特異的な一対のオリゴヌクレオチドプライマー
を含んで成るキット。
【請求項２０】
ＩＰＣに特異的な一対のオリゴヌクレオチドプライマーを更に含んで成り、前記ＩＰＣに特異的なオリゴヌクレオチドプライマー対が、正プライマー 5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3' (IPCF1) 〔配列番号８〕と逆プライマー 5'-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3' (IPCR1) 〔配列番号９〕を含んで成る、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
１または複数のプローブを更に含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項２２】
１または複数のプローブを更に含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項２３】
前記プローブが
5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' (C252-27-PRB) 〔配列番号12〕、
5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3' (JBLTRpr3) 〔配列番号13〕、
5'-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3' (JBLTRpr4) 〔配列番号16〕および
5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3' (2LTRpr1) 〔配列番号14〕
から成る群より選ばれる、請求項２１に記載のキット。
【請求項２４】
前記ＩＰＣ特異的プローブが5'-CTGCGTTAGACCGAGAACTGTGGATAAAGG-3' (IPC1P)〔配列番号17〕から成り、前記ＨＣＶ特異的プローブが5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' (C252-27-PRB) 〔配列番号12〕から成り、そして前記ＨＩＶ特異的プローブが
(a) 5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3' (JBLTRpr3) 〔配列番号13〕；
(b) 5'-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3' (JBLTRpr4) 〔配列番号16〕；および
(c) 5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3' (2LTRpr1) 〔配列番号14〕
から成る群より選ばれる、請求項２２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明が属する技術分野】
【０００１】  本発明は、生物学的試料中の核酸配列、特に感染性微生物に由来する配列の改良検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は世界中の何百万という人々に感染しており、従って深刻な社会的健康問題の代表である。汚染された血液製剤を介したＨＩＶ感染の伝播は、患者試料中の少量のＨＩＶ  ＲＮＡを検出することができるスクリーニング法が必要であることを意味する。更に、ＨＩＶ感染の改善療法の入手可能性が増大してきていることは、適当な療法介入を開始するために患者における乾癬の早期検出がきわめて重大であることを意味する。【０００３】  Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、大部分の輸血後肝炎の症例とかなりの部分の世界的散在性（または地域社会獲得性）肝炎の症例の原因である非経口的に伝染するウイルスである。世界人口の１％超がＨＣＶに感染していると見積もられている。ＨＣＶ感染は急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変および後の肝細胞癌に関係がある。【０００４】  ＨＣＶは現在フラビウイルス科（Flaviviridae）の中の独自のヘパチウイルス属（Hepacivirus ）として分類されている。そのゲノムは、約3,000 アミノ酸のポリタンパク質前駆体をコードする単一の大きな転写解読枠（ＯＲＦ）を有する約9,500 ヌクレオチドの正鎖ＲＮＡ分子から成る。この大きなＯＲＦの上流には、ゲノムの最も高度に保存された領域である約340 ヌクレオチドの５′非コード（ＮＣ）領域がある。このＯＲＦの５′領域は（５′→３′方向で）キャプシドタンパク質、２つのエンベロープ糖タンパク質（Ｅ１とＥ２）および未知の機能を有する小さなタンパク質（Ｐ７）をコードする。このＯＲＦの３′領域は、プロテアーゼ、プロテアーゼ／ヘリカーゼ二機能性タンパク質、ＲＮＡポリメラーゼおよび調節タンパク質を包含する非構造タンパク質をコードする。【０００５】  世界中からのＨＣＶコード配列の分析により、個々のウイルス分離株間で相当な配列変異が明らかになった。更に、個々の患者からのＨＣＶ配列の分析により、関連するが同一でない配列を含むいわゆる「準種 "quasi-species"」としてウイルスは流布することが示された。分離株間と個々の患者間で存在する変異は、ウイルスによりコードされるＲＮＡに依存するＲＮＡポリメラーゼが低い信頼度を有することの結果であると考えられる。ＨＣＶの遺伝的変異の程度は、感染の予防、診断および制御にとって重要な意味を持つ。
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  ＨＣＶ感染の血清学的診断は、典型的には組換えＨＣＶタンパク質またはペプチドを結合する抗体を検出する市販のエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）により測定される。陽性ＥＩＡ結果は組換え免疫ブロットアッセイ（ＲＩＢＡ）により確かめることができるが、ＥＩＡもＲＩＢＡアッセイも現在の感染と過去の感染を区別することはできない。循環しているウイルスは典型的には低いウイルス価であるために、ウイルスタンパク質についての直接アッセイの開発は成功していない。更に、抗体に依存するアッセイは、一般に暴露後２〜３カ月間はＨＣＶ感染を検出することができない。
【０００７】  従って、ＨＩＶとＨＣＶの両方についての患者試料の同時スクリーニングを考慮に入れた改良アッセイが当該技術分野で必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  本発明は、多重アッセイを使った、生物学的試料におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡとヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＮＡの存在の同時検出方法を提供する。
【０００９】  一観点では、本発明は、生物学的試料中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡとヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＮＡの共同検出方法に向けられる。この方法は
(A) 前記試料から誘導したＲＮＡを鋳型として使用し、そしてＨＣＶ  ＲＮＡからＤＮＡへの逆転写を開始させるであろう少なくとも１つの逆転写プライマーおよびＨＩＶ  ＲＮＡからＤＮＡへの逆転写を開始させるであろう少なくとも１つの逆転写プライマーを使用して逆転写反応を実施することにより、(a) ＨＣＶ特異的逆転写生成物、(b) ＨＩＶ特異的逆転写生成物または(c) (a) と(b) の組合せを含んで成る逆転写生成物を生成させ；
(B) ＨＣＶの５′非コード領域に特異的な１または複数のオリゴヌクレオチドプライマー対とＨＩＶに特異的な１または複数のオリゴヌクレオチドプライマー対とを使って前記逆転写生成物を増幅させることにより、(a) ＨＣＶ特異的増幅生成物、(b) ＨＩＶ特異的増幅生成物または(c) (a) と(b) の組合せを含んで成る増幅生成物を生成させ、
ここで前記ＨＣＶに特異的なオリゴヌクレオチドプライマー対の各々が
(i) 正プライマー  5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25) 〔配列番号１〕と
(ii)逆プライマー  5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25) 〔配列番号２〕とを含んで成り、
ＨＩＶ−１に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー対の各々が配列
5'-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3' (JBLTR4) 〔配列番号３〕
を有する正プライマーと、配列
(1) 5'-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT-3' (JBLTR6)〔配列番号４〕および
(2) 5'-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3' (JBLTR8)〔配列番号５〕
から成る群より選ばれたＨＩＶ−１に特異的な逆プライマー
とを含んで成り、
ＨＩＶ−２に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー対の各々が配列：
5'-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3' (2LTRe)〔配列番号６〕
を有する正プライマーと、配列：
5'-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3' (2LTR-R1)〔配列番号７〕
を有するＨＩＶ−２に特異的な逆プライマー
とを含んで成り；そして
(C) 前記増幅生成物を検出する
という各段階を含んで成り、
ここでＨＣＶ特異的増幅生成物の検出が前記試料中のＨＣＶ  ＲＮＡの存在を示し、ＨＩＶ特異的増幅生成物の検出が前記試料中のＨＩＶ  ＲＮＡの存在を示し、そしてＨＣＶ特異的増幅生成物とＨＩＶ特異的増幅生成物の検出が前記試料中のＨＣＶ  ＲＮＡとＨＩＶ  ＲＮＡの存在を示すことを特徴とする。
【００１０】  第二の面では、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＤＮＡとヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＤＮＡとの共同増幅方法に向けられる。この方法は、
(A) ＨＣＶ  ＤＮＡ，ＨＩＶ  ＤＮＡまたはＨＣＶ  ＤＮＡとＨＩＶ  ＤＮＡの組合せを含む疑いのあるＤＮＡ試料において、ＨＣＶの５′非コード領域に特異的な１または複数のオリゴヌクレオチドプライマー対とＨＩＶに特異的な１または複数のオリゴヌクレオチドプライマー対とを使ってポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、(a) ＨＣＶ特異的増幅生成物、(b) ＨＩＶ特異的増幅生成物または(c) (a) と(b) の組合せを含んで成る増幅生成物を生成させ；
ここでＨＣＶに特異的なオリゴヌクレオイドプライマー対の各々が
(i) 正プライマー 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25)〔配列番号１〕と
（ｉｉ）逆プライマー  5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25) 〔配列番号２〕とを含んで成り、
ＨＩＶ−１に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー対の各々が配列
5'-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3' (JBLTR4) 〔配列番号３〕
を有する正プライマーと、配列：
(1) 5'-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT-3' (JBLTR6)〔配列番号４〕および
(2) 5'-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3' (JBLTR8)〔配列番号５〕
から成る群より選ばれたＨＩＶ−１に特異的な逆プライマー
とを含んで成り、そして
ＨＩＶ−２に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー対の各々が次の配列
5'-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3' (2LTRe)〔配列番号６〕
を有する正プライマーと、次の配列
5'-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3' (2LTR-R1)〔配列番号７〕
を有するＨＩＶ−２に特異的な逆プライマー
とを含んで成ることを特徴とする。
【００１１】  第三の面では、本発明は、生物学的試料中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡとヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＮＡの共同検出方法に向けられる。この方法は、
(A) 鋳型試料としての前記試料から誘導したＲＮＡと内部陽性対照（ＩＰＣ）、ＩＰＣ  ＲＮＡからＤＮＡへの逆転写を開始させるであろう少なくとも１つの逆転写プライマー、ＨＣＶ  ＲＮＡからＤＮＡへの逆転写を開始させるであろう少なくとも１つの逆転写プライマー、およびＨＩＶ  ＲＮＡからＤＮＡへの逆転写を開始させるであろう少なくとも１つの逆転写プライマーを使用して、逆転写反応を実施することにより、(a) ＩＰＣ特異的逆転写生成物、(b) ＨＣＶ特異的逆転写生成物、(c) ＨＩＶ特異的逆転写生成物または(c) 前記のいずれかの任意組合せを含んで成る逆転写生成物を生成させ；
(B) ＩＰＣに特異的な１または複数のオリゴヌクレオチドプライマー対、ＨＣＶの５′非コード領域に特異的な１または複数のオリゴヌクレオチドプライマー対、およびＨＩＶに特異的な１または複数のオリゴヌクレオチドプライマー対を使って、前記逆転写生成物を増幅させることにより、(a) ＩＰＣ特異的増幅生成物、(b) ＩＰＣ特異的増幅生成物とＨＣＶ特異的増幅生成物、(c) ＩＰＣ特異的生成物とＨＩＶ特異的増幅生成物または(d) 前記のいずれかの任意組合せを含んで成る増幅生成物を生成させ、
ここで前記ＩＰＣに特異的なオリゴヌクレオチドプライマー対の各々が
(1) 正プライマー  5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3' (IPCF1)〔配列番号８〕と
(2) 逆プライマー  5'-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3' (IPCR1)〔配列番号９〕
とを含んで成り、
前記ＨＣＶに特異的なオリゴヌクレオチドプライマー対の各々が
(i) 正プライマー  5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25) 〔配列番号10〕と
(ii)逆プライマー  5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25) 〔配列番号11〕とを含んで成り、
ＨＩＶ−１に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー対の各々が配列
5'-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3' (JBLTR4) 〔配列番号３〕
を有する正プライマーと、配列
(1) 5'-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT-3' (JBLTR6)〔配列番号４〕および
(2) 5'-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3' (JBLTR8)〔配列番号５〕
から成る群より選ばれたＨＩＶ−１に特異的な逆プライマー
とを含んで成り、
ＨＩＶ−２に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー対の各々が配列：
5'-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3' (2LTRe)〔配列番号６〕
を有する正プライマーと、配列：
5'-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3' (2LTR-R1)〔配列番号７〕
を有するＨＩＶ−２に特異的な逆プライマー
とを含んで成り；そして
(C) 前記増幅生成物を検出する
という各段階を含んで成り、
ここでＩＰＣ特異的増幅生成物の検出が前記試料中のＩＰＣ  ＲＮＡの存在を示し、ＨＣＶ特異的増幅生成物の検出が前記試料中のＨＣＶ  ＲＮＡの存在を示し、ＨＩＶ特異的増幅生成物の検出が前記試料中のＨＩＶ  ＲＮＡの存在を示し、そしてＨＣＶ特異的増幅生成物とＨＩＶ特異的増幅生成物の検出が前記試料中のＨＣＶ  ＲＮＡとＨＩＶ  ＲＮＡの存在を示すことを特徴とする。
【００１２】  第四の面では、本発明は、内部陽性対照（ＩＰＣ）ＤＮＡ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＤＮＡおよびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＤＮＡの共同増幅方法に向けられる。この方法は、
(A) ＩＰＣ  ＤＮＡを含有しており且つＨＣＶ  ＤＮＡ，ＨＩＶ  ＤＮＡまたは前記のいずれかの組合せを含む疑いのあるＤＮＡ試料において、ＩＰＣに特異的な１または複数のオリゴヌクレオチドプライマー対、ＨＣＶの５′非コード領域に特異的な１または複数のオリゴヌクレオチドプライマー対、およびＨＩＶに特異的な１または複数のオリゴヌクレオチドプライマー対を使って、ポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、(a) ＩＰＣ増幅生成物、(b) ＩＰＣ増幅生成物とＨＣＶ特異的増幅生成物、(c) ＩＰＣ増幅生成物とＨＩＶ特異的増幅生成物または(d) (a)，(b)および(c) の任意組合せを含んで成る増幅生成物を生成させ、
ここで前記ＩＰＣに特異的なオリゴヌクレオチドプライマー対の各々が
(i) 正プライマー  5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3' (IPCF1)〔配列番号８〕と
(ii)逆プライマー  5'-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3 '(IPCR1)〔配列番号９〕
とを含んで成り、
前記ＨＣＶに特異的なオリゴヌクレオチドプライマー対の各々が
(i) 正プライマー  5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25) 〔配列番号10〕と
(ii)逆プライマー  5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25) 〔配列番号11）とを含んで成り、
ＨＩＶ−１に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー対の各々が配列
5'-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3' (JBLTR4) 〔配列番号３〕
を有する正プライマーと、配列
(1) 5'-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT-3' (JBLTR6) 〔配列番号４〕および
(2) 5'-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3' (JBLTR8)〔配列番号５〕
から成る群より選ばれたＨＩＶ−１に特異的な逆プライマー
とを含んで成り、
ＨＩＶ−２に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー対の各々が配列：
5'-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3' (2LTRe)〔配列番号６〕
を有する正プライマーと、配列：
5'-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3' (2LTR-R1)〔配列番号７〕
を有するＨＩＶ−２に特異的な逆プライマー
とを含んで成ることを特徴とする。
【００１３】  本発明の別の面では、逆転写反応がランダムオリゴヌクレオチドプライマーを使って行われ；あるいは、１または複数のＨＣＶ特異的逆転写プライマーと１または複数のＨＩＶ特異的逆転写プライマー、即ち、ＨＣＶまたはＨＩＶ  ＲＮＡ中の配列に相当する配列を有するオリゴヌクレオチド、を使ってもよい。
【００１４】  増幅の検出方法としては、非限定的に、(a) 電気泳動および(b) ＩＰＣ−，ＨＣＶ−またはＨＩＶ−特異的プローブが取り付けられた固体支持体上への増幅生成物の捕捉に続き、比色アッセイを使った結合した生成物の定量、が挙げられる。有用なＩＰＣ特異的捕捉プローブとしては、非限定的に、5'-CTGCGTTAGACCGAGAACTGTGGATAAAGG-3'〔配列番号17〕が挙げられる。有用なＨＣＶ特異的５′捕捉プローブとしては、非限定的に、5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' 〔配列番号12〕が挙げられる。有用なＨＩＶ−１特異的捕捉プローブとしては、非限定的に、5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3'〔配列番号13〕が挙げられ、そして有用なＨＩＶ−２特異的捕捉プローブとしては、非限定的に、5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3' 〔配列番号14〕が挙げられる。
【００１５】  別の面では、本発明は、生物学的試料中のＨＣＶ  ＲＮＡとＨＩＶ  ＲＮＡの共同検出のためのキットに向けられる。このキットは、
(a) (i) 正プライマー  5 '-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25) 〔配列番号10〕と
(ii)逆プライマー  5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C29R25) 〔配列番号11〕
とを含んで成るＨＣＶの５’非コード領域に特異的な一対のオリゴヌクレオチドプライマー；
(b) 配列  5'-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3' (JBLTR4) 〔配列番号３〕を有する正プライマーと
(1)  5'-GGGTGTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT-3' (JBLTR6)〔配列番号４〕および
(2) 5'-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3' (JBLTR8) 〔配列番号５〕
から成る群より選ばれたＨＩＶ−１に特異的な逆プライマー
とを含んで成るＨＩＶ−１に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー；並びに
(c) 配列  5'-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3' (2LTRe)〔配列番号６〕を有する正プライマーと配列  5'-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3' (2LTR-R1)〔配列番号７〕を有するＨＩＶ−２に特異的な逆プライマー
とを含んで成るＨＩＶ−２に特異的な一対のオリヌクレオチドプライマー
を含んで成る。
【００１６】  更に別の面では、本発明は、ＤＮＡ試料中のＨＣＶ  ＤＮＡとＨＩＶ  ＤＮＡの共同増幅のためのキットに向けられる。このキットは、
(a) (i) 正プライマー  5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25) 〔配列番号10〕と
(ii)逆プライマー  5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25) 〔配列番号11〕
とを含んで成るＨＣＶの５′非コード領域に特異的な一対のオリゴヌクレオチドプライマー；
(b) 配列  5'-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3' (JBLTR4) 〔配列番号３〕
を有する正プライマーと配列：
(1) 5'-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT-3' (JBLTR6) 〔配列番号４〕および
(2) 5'-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3' (JBLTR8)〔配列番号５〕
から成る群より選ばれたＨＩＶ−１に特異的な逆プライマー
とを含んで成るＨＩＶ−１に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー；および
配列 5'-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3' (2LTRe) 〔配列番号６〕を有する正プライマーと
配列 5'-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3' (2LTR-R1) 〔配列番号７〕を有するＨＩＶ−２に特異的な逆プライマー
とを含んで成るＨＩＶ−２に特異的な一対のオリゴヌクレオチドプライマー
を含んで成る。
【発明の実施態様】
【００１７】  本発明者らは、多重アッセイにおいて、生物学的試料中の低レベルのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡとヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＮＡの同時検出が、(i) 前記試料から誘導されたＲＮＡに対して逆転写反応を行い、そして(ii)ＨＣＶ  ＲＮＡとＨＩＶ  ＲＮＡ中に存在する一定の配列に相補的な配列を有する特定のオリゴヌクレオチド対を使って、逆転写生成物を増幅せしめることにより達成できることを発見した。従って、本発明は、同一試料において低コピーレベルのＨＣＶ  ＲＮＡとＨＩＶ  ＲＮＡを検出する、改善された、１回の、逆転写／増幅多重アッセイを提供する。
【００１８】  オリゴヌクレオチドプライマーは、配列保存、分子内または分子間相互作用、およびアンプリコンと周囲配列の推定二次構造に基づいて選択される。更に、プライマーとアッセイ方法は、ＨＣＶゲノムとＨＩＶゲノムの多領域、多ウイルス種、および内部陽性対照（ＩＰＣ）ＲＮＡ（またはＤＮＡ）の共同増幅を可能にするようにデザインされる。ウイルスゲノムの多領域の同時増幅／検出はアッセイ感度を増加させ、そしてＩＰＣの同時増幅はＰＣＲの阻害による偽陽性結果の可能性を減少させる。
【００１９】  分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよびタンパク質生化学の多数の技術、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, 第Ｉ，IIおよびIII 巻, 1997（F.M. Ausubel編）；Sambrook他, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York ; DNA Cloning: A Practical Approach,第ＩおよびII巻, 1985 (D.N. Glover 編) ; Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M.L. Gait編) ; Transcription and Translation, 1984 (Hames & Higgins編) ; A Practical Guide to Molecular Cloning; 双書, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.) ; Protein Purification: Principles and Practice, 第２版（Springer-Verlag, N.Y. ）中に説明された技術を、本発明を実施する際に使用する。
【００２０】  本明細書中で用いる「核酸」または「ポリヌクレオチド」とは、ポリリボヌクレオチドかポリデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのプリンおよびピリミジン含有ポリマーを言う。これには一本鎖および二本鎖分子、例えばＤＮＡ−ＤＮＡ，ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、並びにアミノ酸主鎖に塩基を結合することにより形成された「タンパク質核酸」（ＰＮＡ）が含まれる。これには修飾塩基を含有する核酸も含まれる。
【００２１】  本明細書中で用いる核酸配列の「相補体」とは、元の配列と共にワトソン−クリック塩基対合に参加するアンチセンス配列を言う。
【００２２】  本明細書中で用いる「プライマー」は、着目の一本鎖核酸配列と共に二本鎖を形成しそして例えば逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼを使って相補鎖の重合を可能にする、長さ約５〜約50ヌクレオチド、好ましくは長さ約６〜約25ヌクレオチド、最も好ましくは約６〜約18ヌクレオチドの単離されたオリゴヌクレオチドである。
【００２３】  本明細書中で用いる「単離された」核酸とは、それの元の環境（例えば、それが天然に存在する混合物であるならそれの天然の環境、それが合成物であるなら反応混合物）から分離されている成分を言う。単離された核酸は、典型的には、最初にそれと関連していた成分の約50％未満、好ましくは約75％未満、そして最も好ましくは約90％未満を含有する。
【００２４】  指摘した配列「から誘導された」核酸配列とは、その指摘した配列の一領域に相当する配列を言う。これには、その配列に相同であるかまたは相補的である配列も含まれる。
【００２５】  内部陽性対照（＝ＩＰＣ）標的核酸とは、典型的には制限エンドヌクレアーゼの作用により後で直鎖状にされるプラスミドベクター中にクローニングされた合成核酸配列を指して言う。ＩＰＣは、典型的には一般的なプローブ結合領域を取り囲む複数のプライマー結合配列を有し、そして核酸増幅反応において偽陽性結果に対する包括的な対照として働く。
【００２６】  好ましい内部陽性対照標的ＤＮＡの配列は下記のものである：
5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAATGAACGCACGGACGAGGACATCATAGAGATTACACCTTTATCCACAGTTCTCGGTCTAACGCAGCAGTCAGTGTATCAGCACCAGCATCCGTAGTGAGTCTTCAGTGTCTGCTCCAGGATCGTG-3'〔配列番号15〕。
【００２７】  本明細書中に開示するいずれかの配列またはそれの部分配列を含んで成る核酸は、常法により調製することができる。例えば、Matteucci 他, 1981, J. Am. Chem. Soc. 103:3185のホスホロアミダイト固体支持体法、Yoo 他, 1989, J. Biol. Chem. 764:17078の方法、または他の周知の方法を使って、ＤＮＡを化学合成することができる。当該技術分野で既知である多数の手段により核酸を修飾することもできる。そのような修飾の非限定例としては、メチル化、「キャップ付加」、類似体による１もしくは複数の天然ヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間修飾、例えば無電荷結合（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）もしくは荷電結合（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）が挙げられる。核酸は１または複数の追加の共有結合した成分、例えば、タンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）、挿入剤（例えばアクリジン、ソラレンなど）、キレート化剤（例えば金属、放射性金属、鉄、酸化的金属など）およびアルキル化剤を含んでもよい。「核酸」なる用語にはＰＮＡも含まれる。核酸は、メチルもしくはエチルホスホトリエステルまたはアルキルホスホロアミデート結合の形成により誘導体にすることができる。更に、本発明の核酸配列は、直接または間接的に検出可能なシグナルを提供することができる標識により修飾されてもよい。典型的な標識としては、放射性同位体、蛍光分子、ビオチンなどが挙げられる。
【００２８】  本明細書中で用いる「増幅」とは、非限定的に、核酸がコピーされる相互作用工程を言う。適当な増幅方法としては、非限定的に、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、核酸一塩基増幅、および転写媒介増幅が挙げられる。
【００２９】  本発明は、生物学的試料中のＨＣＶとＨＩＶの検出方法を提供する。この方法は、
(i) 試料中に含まれるかまたは試料から誘導されるＲＮＡを鋳型として使って逆転写反応を行い；
(ii)もしあるなら、ＨＣＶのゲノム内の配列（好ましくはＨＣＶの５′非コード領域）に相当する配列を有する少なくとも１つの増幅プライマー対、およびＨＩＶのゲノム内の配列に相当する配列を有する少なくとも１つの増幅プライマー対を使って、逆転写生成物を増幅させることにより、ＨＣＶ特異的増幅生成物とＨＩＶ特異的増幅生成物を生成させ；そして
(iii) 前記ＨＣＶ特異的増幅生成物と前記ＨＩＶ特異的増幅生成物を検出することにより実施される。ＨＣＶ特異的またはＨＩＶ特異的増幅生成物の検出が、試料中のＨＣＶ  ＲＮＡおよびＨＩＶ  ＲＮＡそれぞれの存在を示す。
【００３０】  本発明によれば、任意の常法により患者から生物学的試料が得られる。適当な生物学的試料としては、非限定的に、血液、血清、血漿、尿、母乳および脳脊髄液が挙げられる。好ましくは、血漿がウイルスＲＮＡの入手源として使われる。
【００３１】  生物学的試料は、試料中に含まれるＲＮＡ、特にウイルスＲＮＡに対する逆転写試薬の接近を与えるようなやり方で処理する。生物学的試料に「から誘導された」ＲＮＡは、最初は試料中に存在していたもので且つ試料を処理することによってそのＲＮＡへの接近が増大された任意のＲＮＡである。好ましくは、当該技術分野で周知の方法、例えばチオシアン酸グアニジウムを使用する方法、またはGentra Systems, Inc. (Minneapolis MN) からのPureScriptのような市販の試薬と方法を使う方法を角いて、試料からＲＮＡを抽出する。ＲＮアーゼからのＲＮＡ、別のタンパク質、および／または逆転写反応を妨害する可能性のある他の成分からの分離をもたらすいずれの抽出方法を使ってもよい。
【００３２】  次いで、試料を(a) ランダムプライマー、例えばPharmacia Biotech, Piscataway, NJ から得られるランダムヘキサマープライマー、および／または(b) ＨＣＶ  ＲＮＡゲノム配列の５′もしくは３′非コード領域から誘導されたプライマーを使って逆転写反応にかける。逆転写は、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, 第Ｉ, IIおよびIII 巻, 1997 (F.M. Ausubel編) ; 米国特許第5,322,770 号明細書 ; Young他, J. Clin. Microbiol. 31(4):882 (1993) ; Myers他, Biochemistry 30(3):7661 (1991)または同時係属米国特許出願第 号，代理人書類番号2094/OE287中に記載されたような、常用手段を使って実施される。
【００３３】  逆転写反応の後、生成物を増幅させる。任意の増幅方法を使ってもよく、増幅方法の非限定例としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、鎖置換反応、転写媒介増幅または核酸一塩基増幅が挙げられる。好ましくはＰＣＲが使われる。典型的には、ＰＣＲに必要な全ての成分を含む反応混合物に直接逆転写反応混合物を添加する。次いで、使用するプライマー対により特定される条件を使って増幅反応を実施する。
【００３４】  本発明者らは、特定のＨＣＶ特異的およびＨＩＶ特異的増幅プライマー対を使って、患者試料中の低レベルのＨＣＶ  ＲＮＡとＨＩＶ  ＲＮＡの両方を同時に検出することができることを発見した。本発明を実施する上で使用できるプライマーの非限定例として、下の第１表に列挙されたプライマーが挙げられる。
【００３５】
【表１】
0005442917.tif 000002
【００３６】  増幅後、増幅生成物は、当該技術分野で周知の任意方法、例えば非限定的に、アガロースまたはアクリルアミドゲル中でのゲル電気泳動法；非同位体比色検出法、例えばOrtho-Clinical Diagnostics, Rochester, NY から入手可能なSureCell系（例えば下記の実施例１を参照のこと）；ＥＣｉ検出法；化学発光法；および蛍光検出法を使って検出することができる。
【００３７】  ウイルス特異的増幅生成物の検出は、試料中にウイルスＲＮＡが存在することを示す。ゲル電気泳動を用いた場合、ウイルス特異的増幅生成物は、反応に用いた増幅プライマーに相当する配列を有する各ウイルスＲＮＡの位置により推定されるような、それらのサイズにより確認される。
【００３８】  本発明は、患者におけるＨＩＶおよびＨＣＶ感染の診断において；抗ウイルス療法処置の効能についての試験において；並びにＨＣＶ感染およびＨＩＶ感染試料についての血液製剤のスクリーニングにおいて、利用するとができる。
【実施例】
【００３９】  下記の実施例は非限定的に本発明を例証する。
実施例１：生物学的試料中のＨＣＶとＨＩＶの多重検出
下記の実験は、本発明の方法に従ってＨＣＶおよびＨＩＶの多重検出の感度を測定するために行った。【００４０】Ａ．方法
１．患者試料：
製造業者の指示に従ってRoche Amplicor Assayを使って、ＨＩＶ陽性患者の血漿とＨＣＶ陽性患者の血漿のウイルス価を定量した。まず、ＨＩＶ含有血漿試料とＨＣＶ含有血漿試料をそれぞれ1,000 コピー数／mlと10,000コピー数／mlに希釈した。次いでそれらを次のようにして混合した：ＰＣＲ反応あたり25コピーのウイルスゲノムＲＮＡを提供するために、50  ＬのＨＣＶ血漿と500 ＬのＨＩＶ血漿を450 Ｌの陰性血漿に添加した。ＰＣＲ反応あたり５コピーを提供するために、10  ＬのＨＣＶ血漿と100 LのＨＩＶ血漿を890 Ｌの陰性血漿に添加した。【００４１】  ２．試料調製：
血漿試料から、PureScriptTMＲＮＡ単離試薬（Gentra Systems, Minneapolis MN）を使ってＲＮＡを調製した。体液についての製造業者のプロトコルへの変更として、20 gではなく40 gのグリコーゲンをウイルスＲＮＡの沈澱に役立つ担体として使用することを含んだ。更に、大部分において、ＲＮＡのイソプロピルアルコール沈澱とエタノールによるＲＮＡペレットの洗浄の後に、製造業者により与えられたＲＮＡハイブリダイゼーション溶液ではなく、ＲＴ緩衝液混合物中にＲＮＡペレットを再懸濁した。【００４２】  ３．逆転写：
ジエチルピロカルボネート（DEPC）で処理した水の中に50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0.4 mM 各dNTP (Pharmacia Biotech), 4 M のランダムヘキサマー (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)または特異的逆転写プライマーおよび20単位のRNasin（Promega, Madison, Wisoconsin）を含有する溶液 50 Ｌ中の100 Ｕの組換えモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素（ＲＴ）（Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland ）を添加することにより、ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成を触媒した。42℃で30分間のインキュベーション後、ＲＴ反応液を100 ℃に５分間維持してＲＴ活性を破壊した。各反応液を１分間冷却した後、16000 ×ｇで４秒間超遠心した。【００４３】  ４．ＰＣＲ増幅：
ＰＣＲは、25 mM Tris-HCl, 3 mM MgCl2, 0.725 mM EDTA, 54 mM KCl, 3.72 mM NaCl, 40 M DTT, 108 g/mlのゼラチン（IV型）, 9.5 ％グリセロール, 0.02％Tween 20, 0.02％NP40, 子ウシ胸腺ＤＮＡ(2 g), 1.2 mM の各dNTP, 0.4 M の各プライマー, 10コピーの線状化した内部陽性対照（ＩＰＣ）プラスミドＤＮＡおよび16ＵのTaq ポリメラーゼを含む溶液 100  Ｌ中でPE9600サーモサイクラー（Perkin-Elmer）中で行った。Taq に対するモノクローナル抗体 TP1-12 とTP4-9（それらの調製は米国特許第5,338,671 号明細書に開示されている）をそれぞれ50：１と５：１のモル比で反応液に添加して、Taq ポリメラーゼに対する抗体のモル比55：１を提供した。96℃で３分間の最初の変性の後、96℃で５秒と68℃で40秒から成る40サイクルの増幅を行った。サイクルの終了後、103 ℃で５分間の最終加熱段階を行ってTaq ポリメラーゼを失活させた。【００４４】  ５．ＰＣＲ生成物の検出：
ＰＣＲ生成物は、４％アガロースゲル中での電気泳動に続いて臭化エチジウム染色により検出した。あるいは、増幅中に５′−ビオチン標識プライマー（センス鎖）を使用してＰＣＲ生成物をビオチン化した。フロースルー膜の表面上に付着させたラテックス粒子に共有結合せしめたオリゴヌクレオチドプローブへのハイブリダイセーションにより、生成物を捕捉した（SureCellTM試験）。ＨＩＶ−１プローブは5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3' (JBLTRpr)〔配列番号13〕および5'-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3' (JBLTRpr4) 〔配列番号14〕であり；ＨＩＶ−２プローブは5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3' (2LTRpr1) 〔配列番号14〕であり；そしてＨＣＶプローブは5'-CCT TTC GCG ACC CAA CAC TAC TCG GCT-3' (C252-27P)〔配列番号12〕であった。生じたプローブ／生成物複合体を、色素前駆体から色素（青色）への酸化的変換を触媒するストレプトアビジン（ＳＡ）−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合体で処理した。色の強度を色標準に比較することにより、青色の強度を目視により採点した（０〜10）。目に見える色の得点＞３は、全て陽性結果であると見なした。【００４５】Ｂ．結果
ゲル電気泳動は次の増幅生成物を明らかにした：188 nt（ＨＣＶ），160 nt（ＩＰＣ）および150 nt（ＨＩＶ  ＬＴＲ長鎖生成物）。ＨＩＶとＨＣＶの組合せアッセイは、ＰＣＲ試験あたり25コピー（500 個のウイルス粒子／ml血漿）のレベルでＨＩＶとＨＣＶの混合試料を全て検出することができた。加えて、混合陽性試料の50％〜90％を、ＰＣＲ試験あたり５コピー（100 個のウイルス粒子／ml血漿）のレベルで検出することができた。これらの結果を下記第２表に要約する。【００４６】
【表２】
0005442917.tif 000003