(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグナン水酸化活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号：２６のアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号：２６のアミノ酸配列において、１〜１５個のアミノ酸が欠失、挿入、置換および／または付加されたアミノ酸配列
を含有するポリペプチド。
【請求項２】
下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかであることを特徴とするポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号２７の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：２６のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；または
（ｃ）配列番号：２６のアミノ酸配列において、１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたポリペプチドであって、かつリグナン水酸化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
リグナン水酸化活性を有するポリペプチドをコードし、かつ下記の（ｆ）〜（ｈ）のいずれかである請求項２に記載のポリヌクレオチド：
（ｆ）配列番号：２７の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号２７の塩基配列と少なくとも９０％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｈ）配列番号：２７の塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、挿入、置換および／または付加されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２に記載のポリヌクレオチドであって、配列番号２７の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記リグナン水酸化活性がリグナンの９位に対する水酸化である、請求項２〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項２〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの、少なくとも20ntの長さのフラグメントまたはその相補配列からなることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１に記載のポリペプチドの発現を抑制することを特徴とする請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項２〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターを用いることを特徴とするポリペプチドの製造方法。
【請求項１０】
請求項２〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドが導入されていることを特徴とする形質転換体。
【請求項１１】
リグナンおよび請求項２〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを導入することによって水酸化リグナンの含有比が改変されることを特徴とする請求項１０に記載の形質転換体。
【請求項１２】
生物もしくはその子孫、またはこれら由来の組織であることを特徴とする請求項１０または１１に記載の形質転換体。
【請求項１３】
上記生物が植物であることを特徴とする請求項１２に記載の形質転換体。
【請求項１４】
上記植物がゴマ、レンギョウまたはアマであることを特徴とする請求項１３に記載の形質転換体。
【請求項１５】
請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の形質転換体を用いることを特徴とするポリペプチドを製造するための方法。
【請求項１６】
請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の形質転換体を用いることを特徴とする水酸化リグナンの製造方法。
【請求項１７】
上記水酸化リグナンの基質が、ピペリトール、またはピノレジノールであることを特徴とする請求項１６に記載の水酸化リグナンの製造方法。
【請求項１８】
請求項８に記載のベクターを含有することを特徴とする細胞。
【請求項１９】
ゴマ、レンギョウまたはアマ由来の細胞であることを特徴とする請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載の細胞を用いることを特徴とするポリペプチドを製造するための方法。
【請求項２１】
請求項１８または１９に記載の細胞を用いることを特徴とする水酸化リグナンの製造方法。
【請求項２２】
上記水酸化リグナンの基質が、ピペリトール、ピノレジノールであることを特徴とする請求項２１に記載の水酸化リグナンの製造方法。
【請求項２３】
請求項１に記載のポリペプチドを用いることを特徴とする水酸化リグナンの製造方法。
【請求項２４】
上記水酸化リグナンの基質が、ピペリトール、またはピノレジノールであることを特徴とする請求項２３に記載の水酸化リグナンの製造方法。
【請求項２５】
請求項１６、２１または２３のいずれか１項に記載の製造方法により得られた水酸化リグナンを含有することを特徴とする食品または工業製品。
【請求項２６】
上記水酸化リグナンの基質が、ピペリトール、またはピノレジノールであることを特徴とする請求項２５に記載の食品または工業製品。
【請求項２７】
請求項２〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを、リグナンを産生する生物に導入する工程を包含することを特徴とする生物中の水酸化リグナンの含有量を増加させる方法。
【請求項２８】
上記リグナンを産生する生物がゴマ、レンギョウまたはアマであることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
上記リグナンがピペリトール、またはピノレジノールであることを特徴とする請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項７に記載のオリゴヌクレオチドを、リグナンを産生する生物に導入する工程を包含することを特徴とする生物中の水酸化リグナンの含有量を減少させる方法。
【請求項３１】
上記リグナンを産生する生物がゴマ、レンギョウまたはアマであることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
上記リグナンがピペリトール、またはピノレジノールであることを特徴とする請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
下記式： 
【化１】
0005638807.tif 000003
を有する化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リグナンに対して水酸基を転移する活性を有する酵素、および当該酵素の利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リグナンは、維管束植物の二次代謝物（例えば、セサミンおよびセサモリンなど）であり、植物に広く分布している。これまでにリグナンは、植物の種子、果実、切穂、塊茎、および／または塊根等に含まれている事が報告されており、主として植物における生体防御機構に寄与していると考えられている。このリグナンは、その強力な抗酸化性などのため、植物以外においても広範囲にわたる生理学的および薬理学的機能を有することが注目されている。リグナンは、Ｃ６−Ｃ３骨格を有するフェニルプロパノイド化合物が２分子重合した構造を有し、８，８’結合型が最も一般的である（Ｌｉｇｎａｎｓ，Ｄ．Ｃ．Ａｙｒｅｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｌｏｉｋｅ（１９９０）参照）。【０００３】
代表的なリグナンとしては、ゴマ（Ｓｅｓａｍｕｍ  ｉｎｄｉｃｕｍ）に含まれる（＋）−ピノレジノール、（＋）−セサミン、（＋）−セサミノール、（＋）−セサモリンおよび（＋）−セサモリノール；レンギョウ（Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）に含まれる（＋）−ピノレジノール、（−）−アルクチゲニンおよび（−）−マタイレジノール；ソシマ（Ｄａｐｈｎｅ  ｔａｎｇｕｔｉｃａ）に含まれる（−）−ピノレジノールおよび（−）−ラリシレジノール；アマ（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）に含まれる（＋）−セコイソラリシレジノールなどが挙げられる（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅｖ．  （２００３）２：２５７−２８８参照）。これらのリグナンの分子構造は多様であり、骨格構造から8種のサブクラスに分類される（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅｖ．  （２００３）２：３７１−３９０参照）。【０００４】
リグナンの生合成経路はゴマ科ゴマ、モクセイ科レンギョウ、アマ科アマを中心として進められており、代謝経路を触媒する酵素および遺伝子がいくつか報告されている。この中で、ピノレジノールが、コニフェリルアルコールの重合により合成される生合成上の最初のリグナンであること、また（＋）−ピノレジノールから個々の植物種において特有な生合成経路を経由して多様なリグナンが合成されることが報告されている（Ｊ．Ｗｏｏｄ．Ｓｃｉ．５３，２７３−２８４（２００７）、Ｌｉｇｎａｎｓ：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（１９９９）１：６４０−７１３参照）。また、（＋）−ピノレジノールにピペリトール合成酵素が作用することによってピペリトールは合成される。ピノレジノールは、リグナン生合成経路において、最初期に合成されるリグナンであるため、多くの植物に分布しているメジャーなリグナンであり、例えば、キク科、モクセイ科、キョウチクトウ科、セリ科、ジンチョウゲ科、モクレン科、ユリ科、マツ科植物中に含まれている。【０００５】
リグナンの生合成に関与する酵素としては、レンギョウ（Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）などにおいてピノレジノールの合成に寄与するディリジェントタンパク質が報告されている（非特許文献６：Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，（２０００）１２３：４５３および特許文献１：特表２００１−５０７９３１公報など参照）。また、リグナンの生合成に関与する酵素の遺伝子およびその利用として、レンギョウのピノレジノール−ラリシレジノール還元酵素遺伝子（非特許文献７：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９９６）２７１：２９４７３および特許文献１参照）、Ｔｈｕｊａ  ｐｌｉｃａｔａのピノレジノール−ラリシレジノール還元酵素遺伝子（非特許文献８を参照のこと）ならびに組換えセコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼおよびその使用方法（非特許文献９：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（２００１）２７６：１２６１４および特許文献２：特表２００２−５１２７９０公報など参照）が報告されている。さらにゴマからはピペリトール-セサミン合成活性を有するチトクロームＰ４５０酵素遺伝子とならびに使用方法が報告されている（非特許文献１０：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（２００６）１０３：１０１１６および特許文献３：特表２００７−５０７２０１公報参照）。【０００６】
リグナンは骨格形成後に配糖化、水酸化、メチル化、プレニル化など多種多様な修飾を受けることが知られており、ゴマリグナンであるセサミノールなどのフロフラン型リグナンに対して配糖体化活性を有する配糖化酵素遺伝子が単離され、その使用方法が報告されている（特許文献１：特開２００６−１２９７２８公報参照）。【０００７】
中国原産のキク科メタカラコウ属のLigularia kanaitizensisやキョウチクトウ科アラマンダ属のAllamanda neriifoliaにはピノレジノールに代表されるフロフラン型リグナンの９位の水酸化派生体が存在することが知られている（非特許文献１：Ｌｉｇｎａｎｓ，Ｄ．Ｃ．Ａｙｒｅｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｌｏｉｋｅ（１９９０）； 非特許文献２：Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（１９８８）２７，５７５、非特許文献３：Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．，（１９９５）３４Ｂ，９７５など参照）。９位水酸化派生体である９−ヒドロキシピノレジノールは、in vivo試験による抗酸化活性やブチリルコリンエステラーゼ阻害活性、さらに最近になって脳における酸化的障害に対するニューロン保護作用が報告されている。また、水酸基が更に修飾され、エステル基となった２−メチル−２−ブテノイック−ピノレジノールには、抗ＨＩＶ−１逆転写酵素（ＲＴ）活性が認められた事が報告されており、その生合成経路の解明が待たれている（非特許文献４：Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，（２００５）５７，２３３．；非特許文献５：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐａｋｉｓｔａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（２００５）４２，１６７； 非特許文献６： Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，（２００７）５９：５２１など参照）。【０００８】
このように、水酸基を有するリグナンの有用性が報告されているにも関わらず、リグナンの水酸化酵素としては、これまでにハマビシ科チャパラルから単離されている（+）−ラレアトリシン水酸化酵素のみが知られている（非特許文献７：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（２００６）１００：１０６４１参照）。この酵素は植物の酸化酵素の一種であるポリフェノール酸化酵素（PPO）ファミリーに属している（非特許文献８：Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２００７）１２，２９参照)。また、本酵素ファミリーの他にもチトクロームP450酵素や2-オキソグルタレート依存型オキシゲナーゼなどの酸化酵素ファミリーも、リグナンの水酸化反応を触媒することが知られている（非特許文献９：Ｄｅ  Ｍｏｎｔｅｌｌａｎｏ，Ｐ．Ｒ．Ｏ．，Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｍｅｃｈａｎｉｓｕｍ， ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ． Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ．（２００５）および非特許文献１０：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  （２００４）２７９，１２０６参照）。しかしながら、（+）−ラレアトリシン水酸化酵素はフラン環の9(9’)位に酸素を有しないリグナンの水酸化酵素であり、依然としてピノレジノールに代表されるフロフラン型リグナンの9位水酸化を触媒する酵素については不明である。従って、さらなるリグナン酸化酵素遺伝子の取得と機能解析が望まれている。
【特許文献１】特開２００６−１２９７２８公報参照）
【非特許文献１】Ｌｉｇｎａｎｓ，Ｄ．Ｃ．Ａｙｒｅｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｌｏｉｋｅ（１９９０）
【非特許文献２】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（１９８８）２７，５７５、
【非特許文献３】Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．，（１９９５）３４Ｂ，９７５
【非特許文献４】Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，（２００５）５７，２３３．
【非特許文献５】Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐａｋｉｓｔａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（２００５）４２，１６７；
【非特許文献６】Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，（２００７）５９：５２１
【非特許文献７】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（２００６）１００：１０６４１
【非特許文献８】Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２００７）１２，２９
【非特許文献９】Ｄｅ  Ｍｏｎｔｅｌｌａｎｏ，Ｐ．Ｒ．Ｏ．，Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｍｅｃｈａｎｉｓｕｍ， ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ． Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ．（２００５）および
【非特許文献１０】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  （２００４）２７９，１２０６.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、以上の事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、リグナン水酸化活性を有する酵素、特に、リグナン類に水酸基を転移する反応を触媒する酵素、好ましくはピペリトールから９−ヒドロキシピペリトール、ピノレジノールから９−ヒドロキシピノレジノールへの水酸化反応を触媒する酵素を提供することである。換言すれば、本発明の目的は、リグナンに対して（好ましくは９位に）水酸基を転移する活性を有する酵素を用いて、代謝工学的に水酸化リグナン（好ましくは、９位が水酸化されたリグナン；以下９−水酸化リグナン）を供給することである。【００１０】
さらに本発明の目的は、リグナンまたは水酸化リグナンを効率よく生成するために、リグナンと水酸化リグナンとの含量比を増加または減少させた植物を代謝工学的に作製する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、次に示す、リグナン水酸化活性を有するポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを含有するベクターまたは形質転換体、この形質転換体を用いてリグナン水酸化活性を有するポリペプチドを製造する方法などに関する。【００１２】
（１）  リグナン水酸化活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号：２６のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号：２６のアミノ酸配列において、１〜１５個のアミノ酸が欠失、挿入、置換および／または付加されたアミノ酸配列；または
（ｃ）配列番号：２６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、
を含有するポリペプチド。
（２）  上記（１）に記載のリグナン水酸化活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号：２６のアミノ酸配列；または
（ｂ’）配列番号：２６のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換および／または付加されたアミノ酸配列； 
を含有するポリペプチド。
（３）  下記の（ａ）〜（ｅ）のいずれかであることを特徴とするポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号２７の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：２６のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：２６のアミノ酸配列において、１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたポリペプチドであって、かつリグナン水酸化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号：２６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドであって、かつリグナン水酸化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｅ）配列番号：２７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリグナン水酸化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（４）  リグナン水酸化活性を有するポリペプチドをコードし、かつ下記の（ｆ）〜（ｉ）のいずれかである上記（３）に記載のポリヌクレオチド：
（ｆ）配列番号：２７の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号：２７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号２７の塩基配列と少なくとも９０％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｉ）配列番号：２７の塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、挿入、置換および／または付加されたポリヌクレオチド。
（５）  上記（３）に記載のポリヌクレオチドであって、配列番号２７の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（６）  前記リグナン水酸化活性がリグナンの９位に対する水酸化である、上記（３）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（７）  上記（３）〜（６）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドのフラグメントまたはその相補配列からなることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
（８）  上記（１）または（２）に記載のポリペプチドの発現を抑制することを特徴とする上記（７）に記載のオリゴヌクレオチド。
（９）  上記（３）〜（６）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。
（１０）  上記（９）に記載のベクターを用いることを特徴とするポリペプチドの製造方法。
（１１）  上記（３）〜（６）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドが導入されていることを特徴とする形質転換体。
（１２）  リグナンおよび上記（３）〜（６）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを導入することによって水酸化リグナンの含有比が改変されることを特徴とする上記（１１）に記載の形質転換体。
（１３）  生物もしくはその子孫、またはこれら由来の組織であることを特徴とする上記（１１）または（１２）に記載の形質転換体。
（１４）  上記生物が植物であることを特徴とする上記（１３）に記載の形質転換体。
（１５）  上記植物がゴマ、レンギョウまたはアマであることを特徴とする上記（１４）に記載の形質転換体。
（１６）  上記（１１）〜（１５）のいずれか１項に記載の形質転換体を用いることを特徴とするポリペプチドを製造するための方法。
（１７）  上記（１１）〜（１５）のいずれか１項に記載の形質転換体を用いることを特徴とする水酸化リグナンの製造方法。
（１８）  上記水酸化リグナンの基質が、ピペリトール、またはピノレジノールであることを特徴とする上記（１７）に記載の水酸化リグナンの製造方法。
（１９）  上記（９）に記載のベクターを含有することを特徴とする細胞。
（２０）  ゴマ、レンギョウまたはアマ由来の細胞であることを特徴とする上記（１９）に記載の細胞。
（２１）  上記（１９）または（２０）に記載の細胞を用いることを特徴とするポリペプチドを製造するための方法。
（２２）  上記（１９）または（２０）に記載の細胞を用いることを特徴とする水酸化リグナンの製造方法。
（２３）  上記水酸化リグナンの基質が、ピペリトール、ピノレジノールであることを特徴とする上記（２２）に記載の水酸化リグナンの製造方法。
（２４）  上記（１）または（２）に記載のポリペプチドを用いることを特徴とする水酸化リグナンの製造方法。
（２５）  上記水酸化リグナンの基質が、ピペリトール、またはピノレジノールであることを特徴とする上記（２４）に記載の水酸化リグナンの製造方法。
（２６）  上記（１７）、（２２）または（２４）のいずれか１項に記載の製造方法により得られた水酸化リグナンを含有することを特徴とする食品または工業製品。
（２７）  上記水酸化リグナンの基質が、ピペリトール、またはピノレジノールであることを特徴とする上記（２６）に記載の食品または工業製品。
（２８）  上記（３）〜（６）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを、リグナンを産生する生物に導入する工程を包含することを特徴とする生物中の水酸化リグナンの含有量を増加させる方法。
（２９）  上記リグナンを産生する生物がゴマ、レンギョウまたはアマであることを特徴とする上記（２８に記載の方法。
（３０）  上記リグナンがピペリトール、またはピノレジノールであることを特徴とする上記（２８または２９に記載の方法。
（３１）  上記（８）に記載のオリゴヌクレオチドを、リグナンを産生する生物に導入する工程を包含することを特徴とする生物中の水酸化リグナンの含有量を減少させる方法。
（３２）  上記リグナンを産生する生物がゴマ、レンギョウまたはアマであることを特徴とする上記（３１）に記載の方法。
（３３）  上記リグナンがピペリトール、またはピノレジノールであることを特徴とする上記（３１）または（３２）に記載の方法。
（３４）  下記式： 
【化２】
0005638807.tif 000002
を有する化合物（９−ヒドロキシピペリトール）。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係るポリペプチド（リグナン水酸化酵素）を利用すれば、生物（特に、植物）においてリグナンおよび水酸化リグナンの量を人為的に調節することができるという効果を奏する。また、本発明に係るリグナン水酸化酵素を使用してリグナンに新たな水酸基を導入することにより、その水酸基に更なる修飾をすることが可能となり、例えば配糖化やエステル化することが可能になる。これらの効果に基づいて、本発明は、新しい生理機能物質を開発することができる。【００１４】
本発明に係るリグナン水酸化酵素を遺伝子組換え技術を用いて所望の生物に発現させることによって、ピペリトールから９−ヒドロキシピペリトールを、および／またはピノレジノールから９−ヒドロキシピノレジノールを人工的に生産できるという効果を奏する。また、本発明に係るリグナン水酸化酵素を遺伝子組換え技術を用いて所望の生物に発現させることによって、リグナンと水酸化リグナンとの量を人為的に制御した植物および／または微生物を作出することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】RT-PCRによるSiD遺伝子の発現解析を示す。
【図２】SiD6の生成物のHPLC分析を示す。
【図３】SDS-PAGEによるSiD6組換えタンパク質の検出結果を示す。
【図４】Ｐ３（９−ヒドロキシピペリトール）のＮＭＲ解析によるシグナルのアサインを示す。
【図５】Ｐ３（９−ヒドロキシピペリトール）の構造を示す。
【図６】SiD6が触媒するリグナン水酸化反応概略図を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明者らは、これまで知られているリグナン水酸化酵素であるポリフェノール酸化酵素とは異なる酸化酵素ファミリーに属する２−オキソグルタル酸（以下2-OGと称す。)依存的ジオキシゲナーゼ遺伝子をプローブとして用いて、ゴマ種子ｃＤＮＡライブラリーからゴマ2-OG依存的ジオキシゲナーゼ様遺伝子群（以下、SiD遺伝子と称する）を網羅的に取得した。取得した各SiD遺伝子を大腸菌において発現させた。これらの組換えタンパク質をピノレジノールまたはピペリトールと反応させた後、ＨＰＬＣ分析、ＬＣ−ＭＳ分析、およびNMR分析を用いて、ヒドロキシピノレジノールまたはヒドロキシピペリトールの生成を触媒する酵素を選択した。その結果、SiD6が、ピノレジノールから9−ヒドロキシピノレジノールを生成する反応を触媒することが明らかとなった。さらに、Sid6はピペリトールから9−ヒドロキシピペリトールを生成する反応を触媒することが明らかとなった。このリグナンは現在までに報告のない新規なヒドロキシリグナンであった。【００１７】
以下、本発明に係るリグナン水酸化活性を有するポリペプチド、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびこれらの利用について詳述する。【００１８】
（１）ポリペプチド
本発明者らは、リグナン、特に、ピペリトールおよび／またはピノレジノールを主な基質にする新規水酸化酵素を見出し、本発明を完成するに至った。さらに本発明者らは、上記新規水酸化酵素がピペリトールを水酸化することを見出した。これまでに、ヒドロキシピペリトールは見出されていない。【００１９】
まず、本発明は、リグナン水酸化活性を有するポリペプチドであって、（ａ）配列番号：２６のアミノ酸配列；（ｂ）配列番号：２６のアミノ酸配列において、１〜１５個のアミノ酸が欠失、挿入、置換および／または付加されたアミノ酸配列；または（ｃ）配列番号：２６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、を含有するポリペプチドを提供する。【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明に係るポリペプチドはまた、天然供給源より単離されたポリペプチドでも、化学合成されたものでもよい。【００２１】
用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。【００２２】
本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明に係るポリペプチドは、水酸化され得るか、または非水酸化され得る。さらに、本発明に係るポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。【００２３】
本明細書中で使用される場合、「リグナン水酸化活性」は、リグナンを水酸化する活性（好ましくは、９−水酸化リグナンを生成する活性）、すなわち、リグナンに水酸基を転移する活性が意図される。すなわち、本明細書中で使用される場合、水酸化酵素と水酸基転移酵素とは、相互交換可能に使用される。【００２４】
一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、配列番号２６のアミノ酸配列からなるポリペプチドが好ましい。【００２５】
別の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、上記したような、配列番号２６のアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体でありかつリグナン水酸化活性を有するポリペプチドが好ましい。【００２６】
このような変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性の残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が挙げられる。特に、ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しない。【００２７】
ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。【００２８】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望の活性を有するか否かを容易に決定し得る。【００２９】
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係るポリペプチド活性を変化させない。【００３０】
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。【００３１】
上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントでありそうか（すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか）に関するさらなるガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ， Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ： Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０ （１９９０）（本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。【００３２】
本発明における好ましいポリペプチドは、リグナン水酸化活性を有するポリペプチドであって、（ａ）配列番号：２６のアミノ酸配列；または（ｂ’）配列番号：２６のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換および／または付加されたアミノ酸配列を含有する。このような変異ポリペプチドは、上述したように、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するポリペプチドを単離精製したものであってもよい。【００３３】
本発明に係るポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖やイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されない。【００３４】
また、本発明に係るポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓタグやｃ−Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。【００３５】
また、本発明に係るポリペプチドは、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入して、そのポリペプチドを細胞内発現させた状態であってもよいし、細胞、組織などから単離精製されてもよい。また、本発明に係るポリペプチドは、化学合成されてもよい。【００３６】
他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、本発明に係るポリペプチドの付加的なアミノ酸（タグ）、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間または引き続く操作および保存の間の安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に付加され得る。ポリペプチドは複数のタグを有してもよく、それぞれのタグの位置は離れていても連続していてもよい。【００３７】
本実施形態に係るポリペプチドは、例えば、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列であるタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）にＮ末端またはＣ末端へ付加され得る。このような配列は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、タグアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）において提供されるタグ）であり、他の中では、それらの多くは公的および／または商業的に入手可能である。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）（本明細書中に参考として援用される）において記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質由来のエピトープに対応する精製のために有用な別のペプチドであり、それは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４）（本明細書中に参考として援用される）によって記載されている。他のそのような融合タンパク質は、ＮまたはＣ末端にてＦｃに融合される本実施形態に係るポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。【００３８】
本発明に係るポリペプチドは、下記で詳述されるように組換え生成されても、化学合成されてもよい。【００３９】
組換え生成は、当該分野において周知の方法を使用して行なうことができ、例えば、以下に詳述されるようなベクターおよび細胞を用いて行なうことができる。【００４０】
合成ペプチドは、化学合成の公知の方法を使用して合成され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、４週間未満で調製されそして特徴付けられたＨＡ１ポリペプチドセグメントの単一アミノ酸改変体を示す１０〜２０ｍｇの２４８の異なる１３残基ペプチドのような多数のペプチドの合成のための簡単な方法を記載している。Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）。この「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＰＳ）」プロセスは、さらにＨｏｕｇｈｔｅｎら（１９８６）の米国特許第４，６３１，２１１号に記載される。この手順において、種々のペプチドの固相合成のための個々の樹脂は、別々の溶媒透過性パケットに含まれ、固相法に関連する多くの同一の反復工程の最適な使用を可能にする。完全なマニュアル手順は、５００〜１０００以上の合成が同時に行われるのを可能にする（Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、前出、５１３４）。これらの文献は、本明細書中に参考として援用される。【００４１】
下記に詳細に記載するように、本発明に係るポリペプチドは、リグナンを水酸化して水酸化リグナンを得るための方法およびキットにおいて有用である。【００４２】
本発明に係るポリペプチドは、リグナン（特に、ピペリトール、またはピノレジノール）の水酸化反応を触媒することができる。【００４３】
このように、本発明に係るポリペプチドは、少なくとも、配列番号２６のアミノ酸配列を含んでいればよいといえる。すなわち、配列番号２６のアミノ酸配列と特定の機能（例えば、タグ）を有する任意のアミノ酸配列とからなるポリペプチドも本発明に含まれることに留意すべきである。また、配列番号２６のアミノ酸配列および当該任意のアミノ酸配列は、それぞれの機能を阻害しないように適切なリンカーペプチドで連結されていてもよい。【００４４】
また、本発明に係るポリペプチドは、当該ポリペプチドがピノレジノールを水酸化する活性以外にピペリトールを水酸化する活性を有しているので、当該ポリペプチドの用途としてはピノレジノールを水酸化してこれらの水酸化体を生成することのみに限定されるべきではない。【００４５】
つまり、本発明の目的は、リグナンを水酸化する活性を有するポリペプチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリペプチド作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得されるリグナンを水酸化する活性を有するポリペプチドも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。【００４６】
（２）ポリヌクレオチド
また、本発明は、リグナン水酸化活性を有する本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。具体的には、本発明は、下記の（ａ）〜（ｅ）のいずれかであることを特徴とするポリヌクレオチドを提供する。
（ａ）配列番号２７の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：２６のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：２６のアミノ酸配列において、１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたポリペプチドであって、かつリグナン水酸化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号：２６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドであって、かつリグナン水酸化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｅ）配列番号：２７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリグナン水酸化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。【００４７】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、「配列番号１の塩基配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。【００４８】
本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、またはそれは、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化合合成されてもよい。【００５０】
本発明に係るポリヌクレオチドのフラグメントは、少なくとも１２ｎｔ（ヌクレオチド）、好ましくは約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも約４０ｎｔの長さのフラグメントが意図される。少なくとも２０ｎｔの長さのフラグメントによって、例えば、配列番号１の塩基配列からの２０以上の連続した塩基を含むフラグメントが意図される。本明細書を参照すれば配列番号１の塩基配列が提供されるので、当業者は，配列番号１に基づくＤＮＡフラグメントを容易に作製することができる。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。適切なフラグメント（オリゴヌクレオチド）が、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ＡＢＩ，８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄｒ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ ９４４０４）３９２型シンセサイザーなどによって合成される。【００５１】
また本発明に係るポリヌクレオチドは、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。【００５２】
本発明に係るポリヌクレオチドは、リグナン水酸化活性を有するポリペプチドまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。【００５３】
本発明は、リグナン水酸化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの変異体を提供する。「変異体」は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の１つが意図される。天然に存在しない変異体は、例えば当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る。【００５４】
一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、リグナン水酸化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列において１〜数個の塩基が欠失、挿入、置換、または付加された変異体が好ましい。変異体は、コードもしくは非コード領域、またはその両方において変異され得る。コード領域における変異は、保存的または非保存的なアミノ酸の欠失、挿入、置換および／または付加を生成し得る。【００５５】
本発明における好ましいポリヌクレオチドは、リグナン水酸化活性を有するポリペプチドをコードし、かつ下記の（ｆ）〜（ｉ）のいずれかであるポリヌクレオチドである。
（ｆ）配列番号：２７の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号：２７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号：２７の塩基配列と少なくとも９０％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｉ）配列番号：２７の塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、挿入、置換および／または付加されたポリヌクレオチド。【００５６】
他の実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、リグナン水酸化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単離したポリヌクレオチドが好ましい。【００５７】
本発明において最も好ましいポリヌクレオチドは、配列番号：２７の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。【００５８】
ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。【００５９】
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、配列番号：２７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又は配列番号：２６のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）をいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばMolecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などに記載されている方法を利用することができる。【００６０】
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。【００６１】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたポリヌクレオチド（例えば、DNA）を検出することができる。【００６２】
これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号：２６をコードするポリヌクレオチドと80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。【００６３】
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al： J. Mol. Biol. 215： 403, 1990）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。【００６４】
さらに、本発明は、上記ポリヌクレオチドのフラグメントまたはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを提供する。【００６５】
本発明に係るオリゴヌクレオチドがリグナン水酸化ポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者は、本発明に係るポリヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして本発明に係るポリペプチドを作製するために使用され得ることを容易に理解する。リグナン水酸化ポリペプチドをコードしない本発明に係るオリゴヌクレオチドの他の用途としては、以下が挙げられる：（１）ｃＤＮＡライブラリー中のリグナン水酸化酵素遺伝子またはその対立遺伝子もしくはスプライシング改変体の単離；（２）リグナン水酸化酵素遺伝子の正確な染色体位置を提供するための、分裂中期染色体スプレッドへのインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）（Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載される）；および（３）特定の組織におけるリグナン水酸化酵素ｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析。【００６６】
本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡメカニズムによる遺伝子発現操作のためのツールとして使用することができる。アンチセンスＲＮＡ技術によって、内因性遺伝子に由来する遺伝子産物の減少が観察される。本発明に係るオリゴヌクレオチドを導入することによって、リグナン水酸化活性を有するポリペプチドの含量を低下させ得、その結果、植物中の水酸化リグナン含量または含量比を制御（増加または減少）させることができる。本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。【００６７】
本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得する方法としては、本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離する種々の公知の方法が挙げられる。例えば、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製して、ゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすれば、本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得することができる。このようなプローブとしては、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）であればよい。【００６８】
このようなハイブリダイゼーションによって選択されるポリヌクレオチドとしては、天然のポリヌクレオチド（例えば、ゴマ科植物やコケ科植物などの植物由来のポリヌクレオチド）が挙げられるが、植物以外に由来するポリヌクレオチドであってもよい。【００６９】
本発明に係るポリヌクレオチドを取得する別の方法として、ＰＣＲを用いる方法が挙げられる。このＰＣＲ増幅方法は、例えば、本発明に係るポリヌクレオチドのｃＤＮＡの５’側および／または３’側の配列（またはその相補配列）を利用してプライマーを調製する工程、これらのプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等をテンプレートにしてＰＣＲ増幅する工程を包含することを特徴としており、本方法を使用すれば、本発明に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得することができる。【００７０】
本発明に係るポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、ピペリトール、またはピノレジノールを含む生物材料であることが好ましい。本明細書中で使用される場合、用語「生物材料」は、生物学的サンプル（生物体から得られた組織サンプルまたは細胞サンプル）が意図される。下述する実施例においては、ゴマを用いているが、これに限定されない。【００７１】
本発明に係るポリヌクレオチドを使用すれば、形質転換体または細胞においてリグナン水酸化活性を有するポリペプチドを合成することができる。【００７２】
本発明に係るポリヌクレオチドを用いれば、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを検出することによって、リグナン水酸化活性を有するポリペプチドを発現する生物を容易に検出することができる。【００７３】
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、リグナン水酸化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するハイブリダイゼーションプローブまたは当該ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして利用することによって、リグナン水酸化活性を有するポリペプチドを発現する生物または組織を容易に検出することができる。なおさらに、上記オリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用して、上記生物体またはその組織もしくは細胞におけるリグナン水酸化活性を有するポリペプチドの発現を抑制することができる。【００７４】
本発明に係るポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドがピノレジノールを水酸化する活性以外にピペリトールを水酸化する活性もまた有している。したがって、本発明に係るポリヌクレオチドの用途としては、基質としてピノレジノールのみを水酸化してこれらの水酸化体（例えば９位の水酸化体）を生成することに限定されるべきではない。【００７５】
つまり、本発明の目的は、ピペリトール、またはピノレジノールを水酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得されるピペリトール、またはピノレジノールを水酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。【００７６】
（３）本発明に係るポリペプチドまたはポリヌクレオチドの利用
本発明はさらに、本発明に係るポリペプチドまたはポリヌクレオチドを用いることによって生物（好ましくは、植物）中のリグナンおよび水酸化リグナンの量を制御（増加または減少）するための方法および当該制御された生物（好ましくは、植物）の利用を提供する。【００７７】
（Ａ）ベクター
本発明は、リグナン水酸化活性を有するポリペプチドを生成するために使用されるベクターを提供する。本発明に係るベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであっても組換え発現に用いるベクターであってもよい。【００７８】
本発明に係るベクターは、上述した本発明に係るポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されない。例えば、リグナン水酸化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターなどが挙げられる。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。【００７９】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明に係るポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係るポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。【００８０】
本発明に係る発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター、および／または複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。発現ベクターの作製は、制限酵素および／またはリガーゼ等を用いる慣用的な手法に従って行うことができる。発現ベクターによる宿主の形質転換もまた、慣用的な手法に従って行うことができる。【００８１】
上記発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、培養、栽培または飼育した後、培養物等から慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等）に従えば、目的タンパク質を回収、精製することができる。【００８２】
発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性遺伝子、およびＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。【００８３】
上記選択マーカーを用いれば、本発明に係るポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。あるいは、本発明に係るポリペプチドを融合ポリペプチドとして発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光ポリペプチドＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明に係るポリペプチドをＧＦＰ融合ポリペプチドとして発現させてもよい。【００８４】
上記の宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞等を挙げることができるが、特に限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。【００８５】
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明に係るポリペプチドを昆虫で転移発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いてもよい。【００８６】
本発明に係るベクターを使用すれば、上記ポリヌクレオチドを生物または細胞に導入すれば、当該生物または細胞中にリグナン水酸化活性を有するポリペプチドを発現させることができる。さらに、本発明に係るベクターを無細胞タンパク質合成系に用いれば、リグナン水酸化活性を有するポリペプチドを合成することができる。【００８７】
このように、本発明に係るベクターは、少なくとも、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含めばよいといえる。すなわち、発現ベクター以外のベクターも、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。【００８８】
つまり、本発明の目的は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法に存するのではない。したがって、上記以外のベクター種およびベクター作製方法を用いて取得したベクターも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。【００８９】
（Ｂ）形質転換体または細胞
本発明は、上述したリグナン水酸化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体または細胞を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換体」は、組織または器官だけでなく、生物個体を含むことが意図される。【００９０】
形質転換体または細胞の作製方法（生産方法）は特に限定されないが、例えば、上述した組換えベクターを宿主に導入して形質転換する方法が挙げられる。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物、植物または動物が挙げられる。【００９１】
本発明に係る形質転換体または細胞は、これらの形質転換体または細胞が天然に有するリグナンおよび／または水酸化リグナンの組成が改変されていることを特徴とする。本発明に係る形質転換体または細胞は、植物もしくはその子孫、またはこれら由来の組織であることが好ましく、ゴマ、レンギョウまたはアマであることが特に好ましい。このような形質転換体または細胞は、本発明に係る水酸化リグナン含有量を制御する方法を用いることによって、リグナンを産生する生物中の水酸化リグナンの含有量を増加または減少させることができる。【００９２】
一実施形態において、本発明に係る形質転換体は、植物形質転換体であり得る。本実施形態に係る植物形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現され得るように植物中に導入することによって取得される。【００９３】
組換え発現ベクターを用いる場合、植物体の形質転換に用いられる組換え発現ベクターは、当該植物内で本発明に係るポリヌクレオチドを発現させることが可能なベクターであれば特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクター、または外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）を有するベクターが挙げられる。【００９４】
本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）または植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、特に限定されず、単子葉植物綱または双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。【００９５】
植物への遺伝子の導入には、当業者に公知の形質転換方法（例えば、アグロバクテリウム法、遺伝子銃、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法など）が用いられる。例えば、アグロバクテリウムを介する方法と直接植物細胞に導入する方法が周知である。アグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適当なアグロバクテリウム（例えば、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））に導入し、この株をリーフディスク法（内宮博文著、植物遺伝子操作マニュアル（１９９０）２７〜３１頁、講談社サイエンティフィック、東京）などに従って無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることができる。また、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、６７、３２５（１９９０））が用いられ得る。この方法は、まず、例えば発現ベクターをアグロバクテリウムに導入し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓ．Ｂ．Ｇｅｌｖｉｎら、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載の方法で植物細胞または植物組織に導入する方法である。ここで、「植物組織」とは、植物細胞の培養によって得られるカルスを含む。アグロバクテリウム法を用いて形質転換を行う場合には、バイナリーベクター（ｐＢＩ１２１またはｐＰＺＰ２０２など）を使用することができる。【００９６】
また、遺伝子を直接植物細胞または植物組織に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法が知られている。遺伝子銃を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＰＤＳ−１０００（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）など）を用いて処理することができる。処理条件は植物または試料によって異なるが、通常は４５０〜２０００ｐｓｉ程度の圧力、４〜１２ｃｍ程度の距離で行う。【００９７】
遺伝子が導入された細胞または植物組織は、まずハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性で選択され、次いで定法によって植物体に再生される。形質転換細胞から植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。【００９８】
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、組換えベクターを遺伝子銃、エレクトロポレーション法などで培養細胞に導入する。形質転換の結果得られるカルスやシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養または器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライドなど）の投与などによって植物体に再生させることができる。【００９９】
遺伝子が植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液などによって染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応などによって増幅産物を確認する方法も採用することができる。【０１００】
本発明に係るポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転換植物体が一旦取得されれば、当該植物体の有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体またはその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。したがって、本発明には、本発明に係るポリヌクレオチドが発現可能に導入された植物体、もしくは、当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫、またはこれら由来の組織も含まれる。【０１０１】
また、種々の植物に対する形質転換方法が既に報告されている。本発明に係る形質転換体植物としては、例えば、ゴマ、イネ、タバコ、オオムギ、コムギ、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマイモ、タイズ、アルファルファ、ルーピン、トウモロコシ、カリフラワー、バラ、キク、カーネーション、キンギョソウ、シクラメン、ラン、トルコギキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、ペチュニア、トレニア、チューリップ、レンギョウ、シロイヌナズナ、およびミヤコグサなどが挙げられるがこれらに限定されない。【０１０２】
好ましい実施形態において、ゴマを使用して、本発明に係る形質転換体を作製することができる。ゴマの形質転換体の作製方法としては、例えば、Ｔ．Ａｓａｍｉｚｕ：Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｓａｍｅ ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ＭＡＴ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ：ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ ｇｅｎｅｓ．Ｓｅｓａｍｅ Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ １６：２２〜２５（２００２）に記載されるような公知の方法が挙げられる。レンギョウの形質転換に関してはＣａｒｌｏ  Ｒｏｓａｔｉ，ｅｔ  ａｌ．：Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｕｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｏｒｓｙｔｉａ×ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ  “Ｓｐｒｉｎｇ  Ｇｌｏｒｙ”に記載されるような公知の方法が挙げられる。【０１０３】
このようにして得た形質転換ゴマおよびレンギョウを用いれば、当該ゴマ内で水酸化リグナンを生産するため、低コストかつ環境に低負荷な生産プロセスで水酸化リグナン（ヒドロキシピペリトール、および／またはヒドロキシピノレジノール）を生産することができる。【０１０４】
他の好ましい実施形態において、本発明に係る形質転換体として、タバコを好適に用いることができる。タバコは、ペチュニアなどとともに、形質転換が容易な代表的植物であり、細胞壁を取り除いた細胞の１個（プロトプラスト）から、植物１個体への再生が可能である。この再生された植物１個体は、多細胞に由来する１個体とは異なりキメラ状に陥らないため、形質転換体の作製を効率よく行うことができる。【０１０５】
タバコの形質転換に好ましい方法としては、リーフディスク法が挙げられる。この方法は、操作が容易であり、かつ１枚の葉切片からいくつもの独立した形質転換体を得ることができる方法である。形質転換の方法はたとえば「新生物化学実験の手引き３ 核酸の分離・分析と遺伝子実験法 化学同人 １９９６年」に記載されている。【０１０６】
具体的には、無菌的に育てたタバコの葉から、無菌シャーレ上でリーフディスクを切り出し、切り出したリーフディスクをＮＢ培地にて前培養する。次に、前培養したリーフディスクをアグロバクテリウムの感染菌液に浸して共存培養し、リーフディスクをカルベニシリンとカナマイシンとを補充したＮＢ培地に埋め込み、リーフディスクからカルスが形成されてシュートができるまで継代した後、シュートを得る。シュートが生長して茎葉部の区別が明確になった時点で、茎から切り取って抗生物質およびホルモンを含まないＭＳ培地に移す。切り取ったシュートから根が生じた後に、これを温室で育てる。シュートをホルモン含有培地に移して発根を促すと同時に、このシュートから葉を一部切り出してきてカルベニシリンおよびカナマイシンを補充した検定培地に移植する。移植の約１０日後に、葉がカルス化しているものはカナマイシン耐性個体とみなして回収し、褐変化してしまったものはカナマイシン感受性個体とみなして破棄する。【０１０７】
このようにして得た形質転換タバコを用いれば、当該タバコ内で水酸化リグナンを生産するため、低コストかつ環境に低負荷な生産プロセスで水酸化リグナン（ヒドロキシピペリトール、および／またはヒドロキシピノレジノール）を生産することができる。【０１０８】
別の好ましい実施形態において、本発明に係る形質転換体として、イネを好適に用いることができる。イネ形質転換体を作製する一実施形態を以下に記載する。【０１０９】
本発明に係るポリヌクレオチドをハイグロマイシン耐性遺伝子を含有するバイナリーベクターｐＰＺＰ２０２に導入し、形質転換ベクターを構築する。本発明に係るポリヌクレオチドは、プロモーターＣａＭＶ３５Ｓとインフレームで作動可能に連結される。【０１１０】
得られた形質転換ベクターを用いて、エレクトロポーレーションにより、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンおよびハイグロマイシンの選択下でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＥＨＡ１０１株を形質転換する。得られたアグロバクテリウム株は、使用するまで凍結保存する。【０１１１】
野生型の種子から穎を除き玄米とし、これを７０％エタノールで３分間殺菌し、殺菌蒸留水で３回洗浄した後、さらに５０％の次亜塩酸ナトリウム溶液で３０分間殺菌し、そして殺菌蒸留水で５回洗浄する。この玄米を、３０ｇ／ｌスクロース、０．３ｇ／ｌカザミノ酸、２．８ｇ／ｌのプロリン、２．０ｍｇ／ｌの２，４−Ｄを添加し、４．０ｇ／ｌのゲルライトで固化させたＮ６培地（Ｃｈｕら、１９７５、Ｓｃｉ．Ｓｉｎｉｃａ、１８、６５９−６６８）を含むカルス誘導培地上に置く。なお、培地ｐＨはオートクレーブ前にｐＨ５．８に調整する。玄米を、２８℃で４週間明所で生育させ、約５ｍｍの大きさのカルスを得る。このカルスをアグロバクテリウム感染に用いる。【０１１２】
グリセロール中で凍結保存した上記のアグロバクテリウムを、２０ｍｇ／ｌのカナマシイン、５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシン、１００ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンを含みｐＨ７．２に調整し、１５ｇ／ｌの寒天で固化したＡＢ培地（Ｃｈｉｌｔｏｎら、１９７４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７１、３６７２−３６７６）上で暗所で２８℃３日間の培養を行う。アグロバクテリウム菌体を集め、１０ｍｇ／ｌのアセトンシリンゴン（Ｈｉｅｉら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、６、２７１−２８２）を含む液体ＡＡＭ培地（Ｈｉｅｉら、１９９４）に懸濁する。得られた懸濁液の中に上記のカルスを２分間浸漬した後、殺菌したペーパータオルで余分の水分を除き、これを１０ｍｇ／ｌアセトンシリンゴンを含む上記のカルス誘導培地に置き、暗所で２８℃、３日間の共存培養を行い、アグロバクテリウムを感染させる。得られた感染カルスを殺菌蒸留水で１０回洗浄し、最後に５００ｍｇ／ｌのカルベニシリンを含む殺菌蒸留水で１回洗浄した後、殺菌したペーパータオルで余分の水分を除く。このカルスを１０ｍｇ／ｌアセトシリンゴン、５０ｍｇ／ｌハイグロマイシン、３００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含む上記のカルス誘導培地で２８℃、２週間の培養を行い、さらに５０ｍｇ／ｌハイグロマイシン、１００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含むカルス誘導培地で４週間の培養を行う。ハイグロマイシン耐性カルスを選択し、３０ｇ／ｌのスクロース、３０ｇ／ｌのソルビトール、２ｇ／ｌのカザミノ酸、２．２ｍｇ／ｌのカイネチン、１．０ｍｇ／ｌのＮＡＡ、１００ｍｇ／ｌのカルベニシリン、５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンおよび４ｇ／ｌのゲルライトを含むｐＨ５．８のＭＳ基礎培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ、１９６２、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．、１５、４７３−４９７）を含む再生培地に移す。【０１１３】
このようにして得られる形質転換体は、ハイグロマイシンを含む再生培地で容易に再生し、土壌に移して栽培することができる。【０１１４】
このようにして得た形質転換イネを用いれば、当該イネ内で水酸化リグナンを生産するため、低コストかつ環境に低負荷な生産プロセスで水酸化リグナン（ヒドロキシピペリトール、および／またはヒドロキシピノレジノール）を生産することができる。【０１１５】
本発明に係る形質転換体は、リグナン（特に、ピノレジノール、またはピペリトール）を含む生物であれば、生物種を問わず、上記ポリヌクレオチドを導入することで当該リグナンの水酸化体を生産することができる。【０１１６】
本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターが導入された形質転換体を用いれば、植物などの生物に内在するリグナンを水酸化する反応を触媒することができるので、低コストかつ環境に対して低負荷な生産プロセスで水酸化リグナンの大量調製が可能になる。さらに本発明は、水酸化リグナンを大量調製することによって安価な食品または工業製品を提供することができる。【０１１７】
本発明に係る形質転換体を用いれば、リグナン水酸化反応を触媒するポリペプチドを低コストでありかつ環境に低負荷な条件下で提供することができる。【０１１８】
一実施形態において、本発明に係る細胞は、種々の細菌宿主であり得る。本実施形態に係る細胞は、本発明に係るポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現され得るように細胞中に導入することによって取得される。【０１１９】
宿主としては、原核生物または真核生物を用いることができる。原核生物宿主としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する細菌（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）など）、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓなどを用いることができる。真核生物宿主としては、下等真核生物（例えば、酵母または糸状菌などの真核生物微生物）を用いることができる。酵母としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属微生物（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなど）が挙げられ、糸状菌としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属微生物（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒなど）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属微生物が挙げられる。また、動物細胞または植物細胞が宿主として使用され得る。動物細胞としては、マウス、ハムスター、サル、ヒト等の細胞が挙げられる。さらに、昆虫細胞（例えば、カイコ細胞、またはカイコの成虫）もまた宿主として使用され得る。【０１２０】
当業者は、本明細書中の記載に従えば、リグナン水酸化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターが導入されれば、細菌から高等植物までの広範な生物にリグナン水酸化能を付与することができるということを容易に理解する。【０１２１】
本発明に係る細胞は、リグナン（特に、ピノレジノール、またはピペリトール）を含む生物であれば、生物種を問わず、上記ポリヌクレオチドを導入することで当該ヒドロキシリグナンを生産することができる。【０１２２】
本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターが導入された細胞を用いれば、当該細胞内でリグナン水酸化反応を触媒することができるので、低コストかつ環境に対して低負荷な生産プロセスで水酸化されたリグナンの大量調製が可能になる。さらに本発明は、水酸化リグナンを大量調製することによって安価な食品または工業製品を提供することができる。【０１２３】
本発明に係る細胞を用いれば、リグナン水酸化反応を触媒するポリペプチドを低コストでありかつ環境に低負荷な条件下で提供することができる。【０１２４】
このように、本発明に係る形質転換体または細胞は、少なくとも、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されていればよいといえる。すなわち、組換え発現ベクター以外の手段によって生成された形質転換体または細胞も、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。【０１２５】
また上述したように、本発明に係るポリペプチドは、当該ポリペプチドがピノレジノールを水酸化する活性以外にピペリトールを水酸化する活性を有しているので、本発明に係る形質転換体または細胞の用途として、ピノレジノールを水酸化してこれらの水酸化体を生成することのみに限定されるべきではない。【０１２６】
つまり、本発明の目的は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されていることを特徴とする形質転換体または細胞を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々のベクター種および導入方法に存するのではない。したがって、上記以外のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法を用いて取得した形質転換体または細胞も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。【０１２７】
（Ｃ）ポリペプチドの生産方法
本発明は、本発明に係るポリペプチドを生産する方法を提供する。本発明に係るポリペプチドの生産方法を用いれば、リグナン水酸化反応を触媒するポリペプチドを低コストでありかつ環境に低負荷な条件下で提供することが可能となる。また、本発明に係るポリペプチドの生産方法を用いれば、リグナン水酸化反応を触媒するポリペプチドを容易に生産することが可能となる。【０１２８】
本発明の一実施形態に係るポリペプチドの生産方法においては、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いる。【０１２９】
本発明の一実施形態に係るポリペプチドの生産方法においては、上記ベクターを無細胞タンパク質合成系に用いることが好ましい。無細胞タンパク質合成系を用いる場合、種々の市販のキットを用いればよい。好ましくは、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターと無細胞タンパク質合成液とをインキュベートする工程を包含する。【０１３０】
本発明の他の実施形態に係るポリペプチドの生産方法では、組換え発現系を用いることが好ましい。組換え発現系を用いる場合、本発明に係るポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能に宿主に導入し、宿主内で翻訳されて得られる上記ポリペプチドを精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、宿主に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。好ましくは、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターを宿主に導入する工程を包含する。【０１３１】
このように宿主に外来ポリヌクレオチドを導入する場合、発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドを発現するように宿主内で機能するプロモーターを組み込んであることが好ましい。組換え的に産生されたポリペプチドを精製する方法は、用いた宿主、ポリペプチドの性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のポリペプチドを精製することが可能である。【０１３２】
本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るポリペプチドを含む細胞または組織の抽出液から当該ポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。ポリペプチドを精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。【０１３３】
本発明の他の実施形態に係るポリペプチドの生産方法においては、本発明に係るポリペプチドを天然に発現する細胞または組織から当該ポリペプチドを精製する。本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上述したオリゴヌクレオチドを用いて本発明に係るポリペプチドを天然に発現する細胞または組織を同定する工程を包含することが好ましい。また、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上述したポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。【０１３４】
さらに他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るポリペプチドを化学合成することを特徴とする。当業者は、本明細書中に記載される本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて周知の化学合成技術を適用すれば、本発明に係るポリペプチドを化学合成できることを、容易に理解する。【０１３５】
以上のように、本発明に係るポリペプチドを生産する方法によって取得されるポリペプチドは、天然に存在する変異ポリペプチドであっても、人為的に作製された変異ポリペプチドであってもよい。【０１３６】
変異ポリペプチドを作製する方法についても、特に限定されない。例えば、部位特異的変異誘発法（例えば、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｇｅｎｅ １５２，２７１−２７５（１９９５）参照）、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異ポリペプチドを作製する方法、またはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異ポリペプチド作製法を用いることによって、変異ポリペプチドを作製することができる。変異ポリペプチドの作製には市販のキットを利用してもよい。【０１３７】
このように、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、少なくとも、リグナン水酸化活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列、またはリグナン水酸化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて公知慣用技術を用いればよいといえる。【０１３８】
つまり、本発明の目的は、リグナン水酸化活性を有するポリペプチドの生産方法を提供することにあるのであって、上述した種々の工程以外の工程を包含する生産方法も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。【０１３９】
（Ｄ）水酸化リグナン生産方法
これまで、リグナンおよび水酸化リグナンの生産は植物からの抽出により行われているので、大量生産ができない等の問題点を有していたが、本発明に従えば、リグナンおよび水酸化リグナンを低コストで大量生産できる。【０１４０】
本発明は、本発明に係るポリペプチドを発現する生物体または細胞を用いて水酸化リグナンを生産する方法を提供する。上記生物体は、天然の未改変生物体であっても組換え発現系を用いた形質転換体であってもよい。本発明に係る水酸化リグナン生産方法は、リグナン（特に、ピノレジノール、またはピペリトール）を効率よく生産することができる。【０１４１】
本発明の一実施形態に係る水酸化リグナン生産方法は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された生物体またはその組織を用いて水酸化リグナンを生産することを特徴とする。好ましくは、上記生物体は、上述した形質転換体植物または細菌であり、特に好ましくは、大腸菌、ゴマ、レンギョウまたはアマである。【０１４２】
本発明の好ましい実施形態に係る水酸化リグナン生産方法は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを上記生物体に導入する工程を包含する。ポリヌクレオチドを上記生物体に導入する工程としては、上述した種々の遺伝子導入方法を用いればよい。本実施形態のこの局面において、上記生物体は形質転換される前に産生した水酸化リグナンと形質転換後に産生する水酸化リグナンとの間でその組成が異なる。具体的には、上記生物体から得られるリグナンおよびその水酸化体は、その含有率が増加する。本実施形態のこの局面に係る水酸化リグナン生産方法は、上記生物体から水酸化リグナンを抽出する工程をさらに包含することが好ましい。【０１４３】
他の実施形態において、本発明に係る水酸化リグナン生産方法は、本発明に係るポリペプチドを天然に発現する生物体に、本発明に係るオリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドとして導入する工程を包含する。オリゴヌクレオチドを上記生物体に導入する工程としては、上述したアンチセンスＲＮＡ技術を用いればよい。本実施形態に係る水酸化リグナン生産方法は、上述したオリゴヌクレオチドを用いて本発明に係るポリペプチドを天然に発現する生物体を同定する工程をさらに包含することが好ましい。本実施形態のこの局面に係る水酸化リグナン生産方法は、上記生物体から水酸化リグナンを抽出する工程をさらに包含することが好ましい。【０１４４】
本実施形態において、上記生物体は上記オリゴヌクレオチドを導入される前に産生した水酸化リグナンと導入後に産生する水酸化リグナンとの間でその組成が異なる。具体的には、上記生物体から得られるリグナンおよびその水酸化体は、その含有率が減少する。【０１４５】
このように、本発明に係る水酸化リグナンの生産方法は、少なくとも、本発明に係るポリペプチドを発現する生物体を用いればよいといえる。【０１４６】
つまり、本発明の目的は、本発明に係るポリペプチドによって水酸化リグナンの組成が改変された生物体に基づく水酸化リグナン生産方法を提供することにあるのであって、上記生物体として動物、植物または種々の細胞を用いる生産方法も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。【０１４７】
（Ｅ）食品および工業製品
本発明は、上述の水酸化リグナン生産方法により得られた水酸化リグナンを用いて製造される食品および工業製品を提供する。本項で記載する食品は、上述した形質転換植物体の種子、果実、切穂、塊茎、および／または塊根であっても、上述した形質転換植物体から抽出された水酸化リグナンを用いて製造された食品（例えば、ゴマ、レンギョウまたはアマ、あるいはこれらの加工食品）であってもよい。本発明に係る食品または工業製品は、所望する量のリグナン（特に、ピノレジノール、またはピペリトール）を含有することができる。【０１４８】
例えば、上述のように水酸化リグナンの含量が増加した本発明に係る形質転換植物から抽出された水酸化リグナン抽出液は、水酸化リグナンの含量が高い食品として提供される。また、抽出した水酸化リグナンに限らず、上記形質転換植物体の種子、果実、切穂、塊茎、および／または塊根等もまた、水酸化リグナンを多く含む食品として提供される。水酸化リグナン組成を改変する対象は特に限定されるものではなく、植物以外にも動物、細菌、または酵母等のあらゆる生物を対象とすることが可能である。【０１４９】
また、リグナンおよび水酸化リグナンの独特な物性に基づいて、本発明に係るポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、工業製品（例えば、実験用試薬、フィルム、生分解性プラスティック、機能性繊維、潤滑油、または洗剤のような工業製品）の原料に利用され得る。【０１５０】
本発明は、リグナン水酸化活性を有する全てのポリペプチド、およびその利用に関するものであることが、当業者には明白である。リグナン水酸化酵素は、植物、動物または微生物のいずれ由来でもよく、リグナン水酸化酵素活性を有していればリグナン量を制御することができる。さらに本発明は、リグナン水酸化酵素をコードするポリヌクレオチドを導入することによって作製されたリグナン量が調節された植物、その子孫またはこれらの組織に関し、その形態は切り花であってもよい。本発明に係るリグナン水酸化ポリペプチドを用いれば、水酸化リグナンの生成を促進または抑制することができる。また、慣用的な手法を用いれば、植物に上記ポリヌクレオチドを導入して当該ポリヌクレオチドを構成的あるいは組織特異的に発現させて、目的のポリペプチドの発現を増加させること、ならびに、アンチセンス法、同時サプレッション法およびＲＮＡｉ法などを用いることによって目的のポリペプチドの発現を抑制することができるということを、当業者は容易に理解する。
【実施例】
【０１５１】
以下の実施例に基づき本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。また、実施例において用いる分子生物学的手法は、他で詳述しない限り、Molecular Cloning (Sambrookら, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989) に記載の方法に従った。【０１５２】
（実施例１：ゴマcDNAライブラリーの作製）
RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) を製造業者が推奨する方法に従って使用して、ゴマの種子から総RNAを抽出した。続いて、オリゴテックス−MAG mRNA精製キット（TaKaRa）を使用して、ポリA（＋）RNA 5μgを得た。ZAP Express cDNA Synthesis Kit and Zap Express cDNA Gigapack 3 Gold Cloning Kit（Stratagene）を製造業者の推奨する方法に従って使用して、このポリＡ（＋）RNAからcDNAライブラリーを作製した。作製したライブラリーは１×107pfu／mlであった（参考文献：Ono et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 10116-10121. 2006）。【０１５３】
（実施例２：ハイブリダイゼーションプローブの作製）
RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN）を使用して、アブラナ科シロイヌナズナから総RNAを抽出した後、SuperScriptＴＭ  Firtst−Strand Synthesis System for RT-PCR（Invitrogen）を製造業者が推奨する条件に従って使用して、総RNA  1μgからcDNAを合成した。シロイヌナズナの２−オキソグルタレート依存型ジオキシゲナーゼ（以下2OG−ジオキシゲナーゼ）様遺伝子であるAt3g13610をAt3g13610-Fw （配列番号1）およびAt3g13610-Rvプライマー（配列番号2）を用いて増幅した断片をスクリーニングプローブとした。
配列番号1：At3g13610-Fw: 5’-ATG GCT CCA ACA CTC TTG ACA ACC CAA-3’
配列番号2：At3g13610-Rv: 5’-TCA GAT CTT GGC GTA ATC GAC GGT TTT-3’
非ラジオアイソトープDIG−核酸検出システム（ロシュ社）を、製造者が推奨するPCR条件に従って使用して、RT−PCRによって得られたフラグメントにDIG標識を導入した。具体的にはPCR反応液（50μl）は、各cDNA  １μl、１×Taqバッファー（TaKaRa）、0.2nM  dNTPs、プライマー（配列番号１および２）各0.4pmol／μl、rTaq ポリメラーゼ2.5Uからなる。PCR反応は94℃で5分間反応させた後、94℃で1分間、53℃で1分間、72℃で2分間の反応を30サイクルの増幅を行った。このDIG標識化フラグメントを、ハイブリダイゼーション用プローブとして以下の実験に用いた。【０１５４】
（実施例３：ゴマ2ＯＧ-ジオキシゲナーゼ遺伝子のスクリーニング）
非ラジオアイソトープDIG−核酸検出システム（ロシュ・ダイアグノスティックス）を製造者の推奨する方法に従って使用して、実施例１で得たcDNAライブラリーを、実施例２で得たプローブを用いてスクリーニングした。【０１５５】
ハイブリダイゼーション緩衝液（5×SSC、30％ホルムアミド、50ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）、1％SDS、2％ブロッキング試薬（ロシュ社）、0.1％ラウロイルサルコシン、80g／mlサケ精子DNA）を用いて37℃で2時間プレハイブリダイゼーションを行った後、実施例２で得たプローブを添加して、さらに一晩インキュベートした。メンブレンを、1％ＳＤＳを含む5×SSC洗浄液中にて55℃で30分間洗浄した。約1×106 pfuのプラークをスクリーニングして、約200個の陽性クローンを得た。【０１５６】
cDNAライブラリー合成キットを製造業者が推奨する方法に従って使用して、上記500個のクローンをpBK−CMVプラスミド（Stratagene）に挿入した。M13RVおよびM13M4（−20）のプライマー対を用いて、挿入物の部分DNA配列を決定した。得られたＤＮＡ配列に基づいて得た推定のアミノ酸配列を用いてBlast xによるデータベース検索を行い、ゴマ由来2OG-ジオキシゲナーゼ（以下、SiD）の部分配列を得た。DNA Sequencer model 3100（Appllied Biosystems）を使用して、合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いるプライマーウォーキング法によって塩基配列を決定した。Clustal−W解析によって最終的に7種類のSiD様遺伝子（SiD 1〜7）を得た。SiD4およびSiD 7以外のSiD遺伝子はライブラリーのスクリーニングによって得られたクローンが推定ＯＲＦの５’あるいは3’領域を含んでいなかったため、Gene Racer kit（Invitorogen）を製造業者の推奨する方法に従ってRapid Amplification of cDNA  Ｅｎｄ（以下、ＲＡＣＥ）を行い、それぞれのＳｉｄ遺伝子の5’および3‘領域を増幅した。ＲＡＣＥには以下に示す各SiD遺伝子特異的なプライマーセットを用いた（配列番号3〜15および46）。各増幅産物を、合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いるプライマーウォーキング法によって塩基配列を決定し、完全長ORFを含むSiDシークエンスを得た。【０１５７】
配列番号3：GR-SiD1-Fw3: 5’-GGG GAA CGG GCG CAG CTT GCG GGA  AGA TT
配列番号4：GR-SiD1-Rv3: 5’-GGC ATC ACC ATC GGT TCC CCC ACC GTG AAA
配列番号5：SiD1-nest-Fw2: 5’-TGA TCT CGT GCT GGG GTT GAA
配列番号6：SiD1-nest-Rv: 5’-TGC TCA TAA TCT CCA TTT GGT
配列番号7：GR-SiD2-Fw: 5’-GGT CGA CAC AAG GAC GGC GGG GCG TTA
配列番号8：GR-SiD2-Rv: 5’-ACG CCC CGC CGT CCT TGT GTC GAC CTA
配列番号9：SiD2-nest-Fw: 5’-ACT GAT GGC GAA TGG ATT CTT
配列番号10：SiD2-nest -Rv2: 5’-TTC CTT CCA GTC CCT GAC ATT 
配列番号11：GR-SiD3-Rv: 5’-GGG GTT CGG ACA CTT GGG GTA GTA GA 
配列番号12：SiD3-nest-Rv: 5’-CAA GGC GGA TTC TTT GAC CTT
配列番号13：GR-SiD5-Rv: 5’-TGA TCC ACT TCT CGC CCC GCC GGA CTT
配列番号14：SiD5-nest-Rv: 5’-TGA GGG CAT TTT GGG TAA TAG
配列番号15：GR-SiD6-Rv: 5’-TGC GGG TCA GGT GGA TGA GGG GCC ATT
配列番号46：SiD6-nest-Rv: 5’-CAT TAC ACA AGT GAT AGT AT【０１５８】
得られた完全長ORFを含む各SiD遺伝子のアミノ酸配列とDNA配列を以下に示す（配列番号16〜19）。【０１５９】
配列番号16：Sid1タンパク質
MAGVASPPAEVLLSKRVQELVITGEDPSGPYVCRNDDDNGELDATTENSPIPVVNIGHFLSGKWSDDESVQELKKLHSALSTWGCFQGIGHGIPSCFLDEVRRVGREFFEQPMEEKNKYGKTVTEFQGYGADPVPEEGQSLDWSDRLFLELVPEDQRNYRFWPQNPSSFKGTLEEYSEKMKTVTEIISKSMARSLHLEETCFLKQFGERAQLAGRFNYYSPCRRPDLVLGLKPHADGSGYTVILQDEPGLQVLNHGKWYTVPKNPDALLVLMGDQMEIMSNGVFRSPVHRVLSNGERDRISVAVFYTPEVGKEIGPEEGLISAEAPRVFKMVKDYADIHVGYYQRGMRSLHTVRV【０１６０】
配列番号17：Sid1 DNA
ATGGCTGGAGTTGCATCCCCACCCGCTGAAGTATTGCTGTCCAAAAGAGTCCAAGAATTGGTCATCACCGGTGAGGACCCGTCGGGGCCATACGTGTGTAGAAACGACGACGACAACGGGGAATTAGACGCGACAACTGAGAATTCTCCGATTCCAGTTGTGAACATTGGACACTTCTTGTCGGGAAAATGGTCCGATGATGAAAGTGTACAAGAGCTGAAGAAACTCCACTCGGCTCTCTCCACATGGGGATGCTTTCAGGGCATAGGTCATGGGATCCCGAGTTGTTTCCTGGACGAGGTACGAAGAGTTGGGAGGGAGTTCTTCGAGCAGCCAATGGAGGAGAAGAACAAGTATGGGAAAACGGTGACGGAGTTTCAAGGGTATGGAGCTGATCCCGTCCCGGAAGAAGGGCAGTCGCTCGACTGGTCGGATCGTCTTTTCCTAGAGTTAGTCCCTGAAGATCAAAGAAATTACAGATTCTGGCCTCAGAACCCATCCTCTTTCAAAGGAACACTGGAAGAGTACTCGGAGAAGATGAAAACAGTGACTGAGATAATATCCAAATCCATGGCAAGATCACTTCATCTTGAGGAGACCTGCTTCTTGAAACAGTTCGGGGAACGGGCGCAGCTTGCGGGAAGATTCAACTACTATTCGCCTTGCAGGAGGCCTGATCTCGTGCTGGGGTTGAAGCCTCACGCCGACGGATCAGGCTACACCGTTATACTGCAGGATGAACCCGGCCTTCAAGTACTCAACCATGGCAAATGGTATACTGTCCCCAAGAACCCTGATGCCCTTCTAGTCCTCATGGGGGACCAAATGGAGATTATGAGCAACGGGGTGTTCAGAAGTCCGGTGCACAGGGTGCTGAGCAATGGGGAGAGGGACAGGATCTCTGTGGCTGTATTTTACACGCCGGAGGTGGGGAAGGAGATCGGGCCGGAAGAGGGGTTGATCAGTGCGGAGGCACCGAGAGTGTTCAAGATGGTGAAAGATTATGCTGACATTCACGTGGGGTACTATCAGAGGGGAATGAGATCGCTTCATACTGTCAGAGTTTGATGCTCTATATATATAGGGAAAGTTTAGTCCATCTCGAGTTTGGTCAGATCTAAATCAATTATATGTCAAGTCAATACATTTGTCGTGATTAGTGTATAATTTAAAAAATGACTAATCATGTGACAAATGTATCACACTTGCTCTATAATTGATTTAGTTCAATGAAAGCTGATATAGATAAAAATTTTGCATGTANATATGGNGTGTGTTGGATGCCTTTCCAATGTTTAAATAACCATATTGCTGCTTGGGATTTCTTTTG【０１６１】
配列番号18：Sid2 タンパク質
MGEVDPAFIQALEHRPKPHSVEAQGIPLIDLSPANSPDPDPGSLSALAAEIGDACEKWGFFQVINHGVPLHVREKIDLVSRKFFALPKEEKKKVSRDEVNPSGYYDTEHTKNVRDWKEVFDFTVGEPMVMPASHEPDDRELKEVINQWPENPSEMREVCEEYGAEMQKLGHKLLELIALSLGLARDRFNGFFKDQTTFIRLNYYAPCPIPDLALGVGRHKDGGALTILAQDDVGGLEVKRKTDGEWILVKPTPDAYIINVGDIIQVWSNDKYESVEHRVKVNSERERFSIPFFLNPAHYTMVEPLEELVNKQNPANYNPYNWGKFFSTRKRSNYKKLDVENIQIHHFKNY*【０１６２】
配列番号19：Sid2 DNA
ATGGGAGAAGTCGACCCTGCATTCATCCAAGCGCTCGAACACAGGCCTAAACCCCACAGCGTCGAGGCCCAAGGCATCCCGTTAATCGATCTCTCCCCCGCCAACTCCCCGGACCCCGATCCGGGTTCCCTGTCAGCTCTCGCCGCCGAAATTGGTGATGCGTGCGAGAAATGGGGATTTTTCCAGGTGATCAACCACGGGGTGCCGTTGCATGTTCGGGAGAAAATTGACCTGGTTTCCAGGAAATTTTTTGCTCTGCCGAAAGAGGAGAAGAAGAAGGTTTCCAGGGATGAGGTGAACCCGTCGGGGTATTACGACACTGAGCACACTAAGAATGTCAGGGACTGGAAGGAAGTGTTTGATTTCACGGTGGGGGAACCGATGGTGATGCCGGCTTCGCATGAGCCTGATGACAGGGAGCTGAAAGAAGTGATCAATCAGTGGCCTGAGAATCCTTCAGAAATGAGGGAAGTGTGTGAAGAATACGGTGCAGAAATGCAAAAATTGGGACACAAGTTGCTGGAACTCATAGCCCTGAGCCTAGGCTTGGCGAGAGATCGATTCAATGGGTTTTTCAAGGATCAAACCACCTTCATTCGGCTGAATTACTATGCGCCATGCCCGATCCCTGATCTAGCTCTTGGCGTAGGTCGACACAAGGACGGCGGGGCGTTAACAATTCTTGCTCAAGACGATGTAGGGGGGCTGGAGGTGAAGAGGAAAACTGATGGCGAATGGATTCTTGTGAAACCTACTCCTGATGCCTATATAATCAATGTTGGTGACATTATACAGGTTTGGAGCAACGATAAGTACGAGAGTGTGGAACACAGAGTGAAAGTGAATTCAGAGAGAGAGAGATTTTCGATTCCCTTCTTCCTCAACCCTGCACATTATACTATGGTAGAACCGCTGGAGGAGCTGGTGAACAAGCAGAATCCTGCCAACTACAATCCTTACAACTGGGGAAAGTTCTTCTCCACCCGAAAACGCAGTAACTACAAGAAGCTTGATGTGGAGAACATTCAAATACATCACTTCAAGAACTACTGAAGGTTGCCCTTTTGGGCCTAAGTGTTCACATTCTCAATGATTATGCTTACAGACTGATGGATTTGGCTCTCTTGACTGTGCATGTATTATGAATAAATAATTACTTTAGATATATTATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA【０１６３】
配列番号20：Sid3 タンパク質
MSELLSEPDNLIDFMLNKGNGVKGLSQINLKQIPDRFIQPPEERLDHIQIATQESVPVIDVSRWDDPGIAESICEAAAKWGFFQIINHGIPDEVLENVKRAAHDFFELPVEERRRYLKENSPTHTVMLKTSFSPLAEKILEWKDYLMHYCDGQENEHSKFWPPLSRDQVLDYVNWIKPIIRKLLTVLLNGIKVEQIDKVKESALMGSPVVTLLYYPKCPNPNVAAGAGRHSDVSSITILLQDDVGGLYVRATEGDQWIHIAPTKGALVVNIGDVLQIMSNDRYKSIEHRVFVNGSKNRVSVPVFVNPSSDAIIGPLPEVLKAGEKPIYKHVVFSDYFNYFFSKGHDGKRSLDYAKI*【０１６４】
配列番号21：Sid3 DNA
ATGTCTGAACTACTCTCGGAACCCGACAACCTCATAGATTTTATGCTGAACAAAGGAAATGGAGTGAAGGGTCTCTCTCAGATAAACCTTAAACAAATCCCAGATCGATTCATCCAGCCCCCTGAAGAAAGATTGGACCATATCCAAATTGCGACCCAAGAATCCGTACCCGTTATCGATGTGTCCAGATGGGATGACCCGGGAATTGCAGAATCAATCTGCGAGGCAGCAGCCAAGTGGGGTTTCTTTCAGATCATCAATCATGGAATCCCAGATGAGGTTCTTGAAAATGTGAAGAGGGCTGCTCATGATTTCTTTGAGTTGCCTGTTGAGGAGAGGAGGAGGTATTTGAAGGAGAATTCTCCCACTCACACTGTGATGTTGAAGACTAGCTTTAGTCCTCTTGCTGAGAAGATTTTGGAGTGGAAAGACTATCTTATGCACTACTGTGATGGCCAAGAAAATGAGCATTCCAAGTTCTGGCCACCTTTGTCTAGAGATCAAGTTTTGGACTACGTAAACTGGATAAAGCCCATTATCAGAAAGCTACTGACAGTGTTGCTCAATGGTATTAAGGTGGAACAAATTGACAAGGTCAAAGAATCCGCCTTGATGGGCTCACCAGTTGTCACCCTTCTCTACTACCCCAAGTGTCCGAACCCCAATGTTGCAGCTGGAGCTGGCCGTCACTCTGATGTGTCATCAATCACCATCCTCCTACAAGACGACGTAGGTGGACTCTACGTACGAGCAACTGAAGGCGACCAGTGGATCCATATAGCACCAACCAAAGGAGCTCTTGTTGTAAACATCGGAGATGTGCTGCAGATCATGAGCAACGACAGGTACAAAAGCATCGAGCATCGTGTATTTGTGAATGGGAGCAAGAACAGGGTTTCCGTGCCCGTCTTTGTCAACCCTTCAAGTGACGCCATCATTGGCCCTCTGCCGGAAGTGCTGAAGGCCGGAGAGAAACCAATCTATAAACATGTTGTCTTCTCGGATTACTTCAATTACTTCTTTAGTAAAGGTCATGATGGCAAACGATCGCTGGATTATGCGAAAATATGACGTGTTTGTGTTTTGTAGGATAGCTTATCTTCACAAGTCTTTGCTGTCTTCTTGCATAGGCTGTGTCATATACTCACAGATTTATCTCCG【０１６５】
配列番号22：Sid4 タンパク質
MEPKLTKLGSSLPVPIVQELAKEKLATVPPRYVRPDQHQHTILSALNSSFPQIPVIDMQKFSDIYIMDSELQALHNACQEWGFFQLINHGVDSAVMEKMKIEIQEFFNLPIEEKKKFKHEEGDIQGYGQAFVVSEDQKLDWGDVFAIVTSPIYLRKPHLIAKLPATFRDATEVYASELKVLAMKILKLMAKALDMKAEEMETLFAEGMHSMRMNYYPPCPQPELVTGLCPHSDADGLTILLQVNEMDGLQIKKDGVWIPVSPLPNAFTINIGDNLEILTNGAYRSIEHRATVNKEKERISIATFLGANLDGDMGPSPSLVTPQTPAKFKRIGVTQYLKELFSRELMGKSYLDLMRI*【０１６６】
配列番号23：Sid4 DNA
ATGGAACCAAAATTAACAAAGCTAGGCAGCTCTCTTCCGGTGCCTATCGTACAAGAATTGGCCAAGGAGAAATTAGCAACGGTTCCTCCAAGATACGTGCGCCCAGATCAACATCAACACACGATTCTCTCTGCTCTTAATTCTTCCTTCCCTCAAATTCCTGTCATCGATATGCAGAAGTTTTCAGACATCTATATAATGGATTCTGAGCTTCAGGCCCTACATAATGCATGCCAAGAATGGGGTTTCTTTCAGTTGATCAACCATGGGGTGGACTCTGCTGTAATGGAGAAAATGAAGATAGAAATTCAAGAATTCTTTAATCTCCCAATAGAGGAGAAGAAGAAATTTAAGCATGAGGAAGGGGACATACAGGGTTATGGGCAAGCCTTTGTTGTATCAGAAGATCAAAAGCTCGACTGGGGAGACGTGTTTGCCATTGTTACCTCACCAATTTACCTCAGAAAGCCTCACTTAATCGCCAAGCTTCCTGCTACCTTCAGGGACGCCACAGAAGTGTATGCATCGGAACTCAAAGTTCTCGCCATGAAGATTCTAAAGCTAATGGCAAAAGCCTTAGACATGAAAGCTGAAGAAATGGAAACGCTATTCGCAGAAGGGATGCATTCCATGAGGATGAACTACTATCCTCCGTGTCCCCAGCCCGAGCTCGTCACGGGCCTCTGCCCTCACTCCGATGCAGATGGGCTCACCATTCTCCTCCAAGTGAATGAAATGGATGGCCTCCAGATCAAGAAAGATGGAGTCTGGATTCCCGTTTCTCCACTCCCTAATGCCTTCACCATCAATATTGGAGATAACTTGGAGATTCTGACAAACGGTGCTTATAGGAGCATTGAGCATAGAGCAACTGTCAACAAGGAGAAAGAAAGAATCTCCATTGCCACATTTCTGGGCGCGAATCTAGATGGTGATATGGGTCCGTCGCCAAGCCTCGTCACTCCTCAGACTCCGGCAAAATTCAAGAGGATCGGGGTGACTCAATATTTGAAGGAACTATTCTCGCGGGAACTCATGGGGAAATCATATCTAGACCTTATGAGGATTTAGGGTGTAGTACTGGGGTATGGTAATAACACCAACATGAGTTTGTACCTAATAAGTTATCAACCATTAGATTACAAATAATACTATGATCATGTGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA【０１６７】
配列番号24：Sid5タンパク質
MMSCLQSWPEPVVRVQHLSDSGIRVIPERYVKKLSDRPSFCDSLSGEVNIPVIDMKGLYSDDASVRKKTAGMISGACREWGFFQVVNHGVRQEVMGRAREAWREFFKLPLEEKQKYANSPSTYEGYGSRLGVEKGISLDWSDYFFLNYLPLALRDQNKWPALPLSCREMVGEYCREVVELGGRLMKILSSNLGLEEEYLQEAFGGEEFGACMRVNYYPKCPQPDLTLGLSPHSDPGGMTLLFPDENVSGLQVRRGEKWITVDPVPNAFIVNIGDQLEVLSNGNYKSVEHRVIVNSEKERVSIALFYNPRGDMLIKPADELVTEDRPPLYPPTVYDEYRLYMRTRGPRGKSQVHSLKSLQ*【０１６８】
配列番号25：Sid5 DNA
ATGATGAGCTGCTTGCAGAGCTGGCCCGAACCCGTTGTCAGGGTCCAACACCTCTCCGACAGCGGGATTCGGGTAATCCCCGAACGCTACGTGAAGAAACTCTCAGACAGGCCGAGCTTTTGCGACTCCCTCTCCGGCGAAGTTAACATTCCAGTCATCGACATGAAGGGGTTGTACTCGGACGACGCCTCAGTCCGGAAGAAGACGGCCGGGATGATCAGCGGGGCATGCCGCGAGTGGGGGTTCTTCCAGGTGGTGAACCACGGGGTGAGACAGGAGGTGATGGGGCGGGCCAGGGAGGCGTGGCGCGAGTTTTTTAAGCTGCCGCTGGAGGAGAAGCAGAAGTACGCGAATTCGCCGAGCACGTATGAGGGGTACGGCAGCCGCCTGGGTGTGGAGAAGGGAATATCACTGGATTGGAGTGACTACTTTTTCCTGAATTACCTTCCTCTCGCACTCAGAGACCAGAATAAGTGGCCTGCACTTCCTCTTTCATGCAGGGAAATGGTGGGAGAGTACTGTAGAGAAGTGGTTGAACTTGGTGGAAGATTGATGAAGATTCTGTCGAGCAATCTTGGGCTGGAAGAAGAGTATCTTCAAGAAGCATTTGGAGGAGAGGAGTTTGGGGCATGCATGAGGGTTAACTATTACCCAAAATGCCCTCAACCGGACCTCACACTCGGCCTTTCTCCTCATTCCGACCCGGGTGGGATGACCCTTCTCTTCCCCGACGAGAACGTATCGGGTCTCCAAGTCCGGCGGGGCGAGAAGTGGATCACCGTCGACCCAGTCCCCAATGCGTTTATCGTCAATATAGGAGATCAACTTGAGGTGTTAAGCAATGGGAATTACAAGAGTGTGGAGCATAGGGTGATTGTGAATTCAGAGAAAGAGAGAGTGTCAATCGCATTGTTCTACAATCCAAGGGGTGATATGCTGATAAAGCCGGCGGATGAGCTGGTGACGGAGGACCGCCCACCGCTCTACCCGCCCACCGTTTACGACGAGTATAGGCTGTACATGAGGACAAGGGGCCCTCGTGGCAAGTCCCAAGTCCATTCACTTAAATCACTTCAATAACTTAATTAATATTATATTTAAATAATAATTTTAGGTAGTATTGTTCCATGAATTGTAGTGTTGTTTGTTAATTAATTTCCGCATTTTATGTAATTTGGATTGTACTACACATATATATCATGACTACTACTCATCATGGGTTAATTAAAAAAAAAAAAAAAA【０１６９】
配列番号26：Sid6 タンパク質
MEVQTMKVHAYDRLSELKAFDDSKSGVKGLVDAGVTKIPRFFINDNDMPGSEPCNFNSEAIFPVIDLSGMHHAANRAGIVSRVKEACEKWGFFQIINHEMPLRVMDEMIAGVRRFHEQDAEVKKKYYGRDVTKKFQYNSNFDLYKTRAAMWRDTITCVMAPHPPDPQELPDVCRDIMFEYSKHVMRVGHTVYELLSEALGLNPSYLRDIGCIESNFIVGHYSPACPEPELTFGIRSHVDFGLLTILLQDQIGGLQVLHQNQWVDVSPLPGSLIINVGDFIQLISNDKFKSVKHRALSKRVGPRISVGVFIKPYYADGDNLRVYGPIKELLTEEEPAIYRETTYKDYERFYFANCDDGTTKLPYFRLGT*【０１７０】
配列番号27：Sid6 DNA
ATGGAAGTTCAGACAATGAAAGTTCATGCATACGATCGACTAAGTGAACTAAAAGCATTCGATGATTCAAAATCAGGCGTGAAGGGACTTGTTGATGCTGGTGTTACGAAGATCCCACGCTTCTTCATTAATGATAATGATATGCCTGGATCCGAACCGTGCAACTTCAACTCAGAAGCCATCTTTCCAGTCATAGATTTATCAGGCATGCACCATGCTGCAAACCGTGCTGGAATTGTCAGCAGAGTGAAAGAGGCATGTGAGAAGTGGGGATTCTTTCAGATAATCAATCATGAGATGCCGCTGCGAGTGATGGATGAAATGATTGCAGGGGTTCGAAGATTTCACGAGCAAGATGCTGAGGTTAAGAAGAAATACTACGGTCGTGATGTCACGAAAAAGTTTCAGTACAATAGCAATTTCGATCTTTACAAAACACGGGCGGCCATGTGGAGGGATACTATCACTTGTGTAATGGCCCCTCATCCACCTGACCCGCAGGAATTGCCAGATGTATGCAGAGACATCATGTTTGAATACTCTAAGCATGTCATGAGAGTGGGGCATACCGTGTATGAATTGCTGTCGGAGGCTTTGGGCCTCAATCCCAGCTACCTGAGAGACATTGGCTGTATTGAGTCGAATTTCATCGTGGGCCATTATTCTCCGGCTTGCCCAGAACCAGAACTGACCTTTGGCATCAGAAGCCACGTCGACTTCGGCTTGCTCACAATACTCTTGCAGGACCAGATTGGCGGTCTCCAGGTGCTTCACCAGAATCAGTGGGTCGACGTTTCTCCCTTGCCTGGAAGTCTAATAATAAATGTTGGGGACTTTATACAGCTGATCAGTAACGACAAATTCAAAAGCGTGAAACACAGAGCACTATCAAAAAGGGTAGGGCCAAGAATTTCAGTTGGTGTTTTCATTAAACCCTACTACGCTGATGGAGATAATTTGCGGGTGTACGGACCTATCAAGGAGCTGTTAACTGAAGAAGAGCCGGCTATCTACAGGGAAACAACTTATAAAGACTATGAAAGATTCTACTTCGCCAATTGTGATGACGGAACCACCAAGCTGCCGTATTTCAGGCTGGGCACCTGATCAATGGTCCTGCAGTGGCAGCTTGTCAAGTACTGGATAGTTGTGAACTGACCTTCTTCACCA【０１７１】
配列番号28：Sid7 タンパク質
MAWRSQTEANYDRASELKAFDDTKTGVKGLVDSGITQVPRIFITPRNDSDKNLKPSDSQLKFPIIDLENIDEDPIRFKKVVDEVRDASGTWGFFQVINHGIPGSVLEEMLDGVRKFYEQDPEERKKWYTRDRKRSVVYNSNFDLYSAPAANWRDTFFCKMAPHPPSPEELPAVCRDIMFEYTKQVLKLGTSLFKLLSEALGLDANHLGDMKCADGLALLCHYYPFCPQPELTMGASQHADSDFLTVLLNDNVTGLQVLYQNQWFDVPSVPGSLVVNVGDLLQLISNDRLISSEHRVLANNVRSRVSVACFFRSDIDKSDELYGPIQELLSEDNPPKYRATTMKEYVNYYNAKGLDGTSALLHFRV*【０１７２】
配列番号29：Sid7 DNA
ATGGCCTGGAGATCTCAGACAGAAGCAAACTACGACAGAGCAAGCGAACTAAAAGCTTTTGATGACACCAAAACTGGTGTCAAAGGCTTAGTTGACAGTGGTATAACCCAAGTCCCGAGAATCTTCATCACCCCACGAAATGATTCAGACAAGAACCTTAAACCTTCCGATTCACAACTCAAATTCCCAATAATTGACCTCGAAAACATCGATGAAGATCCAATCAGGTTTAAGAAGGTCGTGGACGAGGTTCGAGATGCTTCAGGGACATGGGGTTTCTTCCAGGTGATCAATCATGGGATTCCGGGTTCTGTTTTGGAGGAGATGCTAGATGGGGTCCGGAAATTCTATGAACAAGATCCTGAGGAGAGGAAAAAGTGGTACACAAGGGATAGAAAAAGAAGTGTTGTTTACAATAGCAACTTTGATTTGTATAGTGCACCAGCAGCTAATTGGAGGGACACTTTCTTCTGTAAAATGGCTCCTCATCCTCCAAGCCCTGAGGAGTTGCCCGCTGTGTGCAGAGATATAATGTTTGAGTACACAAAGCAAGTTTTGAAACTGGGAACAAGTTTGTTTAAATTGTTGTCCGAGGCCCTTGGTCTGGATGCCAACCACCTTGGGGACATGAAATGTGCTGACGGGCTTGCTCTCCTGTGCCATTACTACCCCTTCTGCCCTCAGCCGGAGTTAACTATGGGCGCCAGCCAGCACGCGGACAGTGACTTCCTGACGGTGCTCCTAAATGACAATGTAACCGGCCTGCAAGTTCTTTACCAAAACCAGTGGTTTGATGTTCCCTCAGTGCCCGGATCTCTGGTGGTAAATGTTGGAGATCTTCTACAGCTTATATCAAATGATAGGTTGATTAGTTCGGAGCATAGAGTACTAGCAAACAACGTTCGTTCAAGGGTATCAGTCGCATGTTTCTTTAGAAGCGACATAGATAAGTCGGACGAGCTCTACGGACCAATCCAGGAACTCTTGTCTGAAGATAATCCACCAAAATACAGGGCAACCACCATGAAAGAGTATGTGAACTACTACAACGCCAAGGGGTTGGACGGAACTTCTGCTTTGTTACATTTCCGCGTTTGAATTGAAATGATATGATGGGAAGATGTTACTTTCCATATTAATATAATCCGGGAAAACGGAACATTCGAAATGTAGTATGAAAGAAAAATGTGCGGTCTATTTCTATTTTATTAGTAAAACCATAACGAATGTTGATTAACTATGATTAAAATTAAGCTTTCACTTTAAAAAAAAAAAAAAAAA【０１７３】
（実施例４：ゴマ2OG-ジオキシゲナーゼ(ＳｉＤ)の大腸菌発現ベクターの構築）
各SiDのcDNAの開始メチオニンコドン（ATG）の上流にBamHIまたはBglII部位を、終始コドンの下流にXhoI部位を有するプライマーを設計し（配列番号30〜配列番号43）、各SiD遺伝子ORFを含むフラグメントをPCRにより増幅した。【０１７４】
配列番号30：Bgl2NcoI-SiD1-Fw: 5’-TTT AGA TCT TCC ATG GCT GGA GTT GCA TCC CCA
配列番号31：Sid1-endXhoI-Rv: 5’-TTG ACA TAT AAT TGA TTT AGA TCT
配列番号32：BamNco-SiD2-Fw: 5’-AAA GGA TCC ATG GGA GAA GTC GAC CCT GCA TT
配列番号33：SiD2-KpnXho- Rv: 5’-AAA CTC GAG GTA CCC AAC CTT CAG TAG TTC TTG AAG T
配列番号34：Bgl2-SiD3-Fw: 5’-TTT AGA TCT ATG TCT GAA CTA CTC TCG GAA 
配列番号35：SiD3-KpnXho-Rv: 5’-AAA CTC GAG GTA CCA ACA CGT CAT ATT TTC GCA TA
配列番号36：BamNco-SiD4-Fw: 5’-AAA GGA TCC ATG GAA CCA AAA TTA ACA AAG CTA
配列番号37：SiD4-KpnXho-Rv: 5’-AAA CTC GAG GTA CCT ACT ACA CCC TAA ATC CTC ATA A
配列番号38：BamHI-SiD5-Fw: 5’-AAA GGA TCC ATG AGC TGC TTG CAG AGC T
配列番号39：SiD5-KpnXho-Rv: 5’-AAA CTC GAG GTA CCT TAA TTA AGT TAT TGA AGT GAT TT
配列番号40：Bgl2Nco-SiD6-Fw: 5’- AAA GAT CTT CCA TGG AAG TTC AGA CAA TGA AA
配列番号41：SiD6-KpnXho-Rv: 5’-AAA CTC GAG GTA CCT GAT CAG GTG CCC AGC CTG AAA TA
配列番号42：BamNco-SiD7-Fw: 5’-AAA GGA TCC ATG GCC TGG AGA TCT CAG ACA GAA
配列番号43：SiD7-KpnXho-Rv: 5’-AAA CTC GAG GTA CCT TCA ATT CAA ACG CGG AAA TGT AA【０１７５】
PCR反応液（25μl）は、テンプレートとしてのゴマ種子cDNA、各プライマー0.2 pmol／μl、1×KOD  plus緩衝液（TOYOBO）、0.2ｍＭ  dNTPs、1mM  MgSO4、1U  KODplusポリメラーゼからなる。94℃で５分間反応させた後、94℃１分間、55℃１分間、72℃2分間の反応を30サイクル行ってPCR増幅した後、72℃で3分間保持した。得られた各PCR産物を、製造者が推奨する方法に従ってpCR4  Blunt-TOPO vector（Invitrogen）のマルチクローニング部位に挿入した。シークエンス解析により挿入されたＰＣＲ産物にエラーがないことを確認した。【０１７６】
上記7種のSiDがサブクローニングされたプラスミドをBamHIまたはBglIIおよびXhoIまたはKpnIで消化して得た完全長SiDを含む約1.1kbのDNA断片を、大腸菌発現ベクターであるｐＥＴ-30aベクター（Novagen）のBamHIとXhoIまたはKpnIサイトに挿入し、7種のSiD大腸菌発現ベクターを得た。【０１７７】
（実施例５：ゴマにおけるSiD遺伝子の発現解析）
7種のＳｉＤ遺伝子のゴマ植物体における遺伝子発現パターンをRT-PCR法によって解析した。先行文献（Ono et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 10116-10121 (2006)）に従ってゴマを成熟葉、花弁、茎、さく果、種子（ステージ1〜6）、芽生え（発芽誘導後1日と7日）に分けた。分離した器官から1ｇからRNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN）を用いてRNAを抽出した。得られたRNA  1μgを鋳型として逆転写反応を行い、cDNAを得た。cDNA合成にはSuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(GIBCO BRL)を利用し、合成条件は本システム製造業者が推奨する条件に従った。得られたステージ別のcDNAを鋳型に、実施例4に記載のＳｉＤ遺伝子特異的なプライマー（配列番号30〜43）を用いてPCR反応を行った。また、ＳｉＤ遺伝子と内在遺伝子発現量とを比較するために、内部標準遺伝子としてゴマの18ＳリボソームRNAを用い、本遺伝子増幅のためにＳｉ18Ｓ-Fｗ（配列番号44）およびＳｉ18Ｓ-Rｖプライマ−（配列番号45）を合成した。【０１７８】
配列番号44：Si18S-Fw: 5’-TAT GCT TGT CTC AAA GAT TAA
配列番号45：Si18D-Rv: 5’- AAC ATC TAA GGG CAT CAC AGA【０１７９】
cDNA  1μｌ、1×Ex−Taq緩衝液（TaKaRa）、0.2nM  dNTPs、プライマー各0.2pmol／μl、Ex−Taqポリメラーゼ  1.25Uからなる。94℃で5分間の後、94℃で1分間、55℃で1分間、72℃で2分間の反応を30サイクル行ってＰＣＲ増幅した後、72℃で7分間保持した。ＰＣＲ産物を1.0％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色により増幅断片を検出した。その結果、7種のＳｉＤ遺伝子は異なる発現パターンを示すものの、全てリグナンが蓄積するゴマ種子内において発現していることが示された（図1）。【０１８０】
（実施例６：大腸菌によるSiD組換えタンパク質の発現）
実施例４で構築したSiD遺伝子の大腸菌発現ベクターを大腸菌BL21（DE3）株に定法により形質転換した。これらの組換え大腸菌を最終濃度20μg／mlのアンピシリンを含むＬＢ培地中にて37℃で一晩前培養した。前培養液の一部をアンピシリン50μg／ml、カザミノ酸0.5%を含むM9培地（10ml）に添加して、A600＝0.6〜1.0に達するまで振盪培養した。次いで、培養液に最終濃度0.5mMのIPTG（イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド）を加え、さらに30℃で一晩振盪培養した後、3000rpmにて4℃で10分間遠心分離を行って集菌した。菌体を10mlの緩衝液（30mM  Tris-HCl(pH7.5)、30mM NaCl）に懸濁した後に超音波処理を行って大腸菌を破砕し、次いで、15,000rpmにて4℃で10分間遠心分離を行い、得られた上清を粗酵素液として以下の活性測定に用いた。【０１８１】
（実施例７：SiD組換えタンパク質の酵素解析）
ピノレジノールなどのリグナンは、例えば、公知の方法（日本農芸化学会誌  ６７：１６９３（１９９３））に従ってゴマから抽出および精製して得ることができる。基質は少量のＤＭＳＯに溶解した後に70％エタノールに溶解して基質溶液（1mg／ml）とした。この基質溶液5μｌ、大腸菌で発現させた各ＳｉDの上記粗酵素液145μｌ、0.1M  アスコルビン酸ナトリウムを10μｌ、0.1M  2-オキソグルタル酸（2ＯＧ）を10μｌ、および10ｍＭ  FeSO4を10μｌを反応チューブ中で混合した後、30℃で1時間反応させた。【０１８２】
100％アセトニトリル（150μｌ）を反応チューブに添加することによって、酵素反応を停止させた。反応チューブをボルテックスミキサーで激しく攪拌した後、15,000ｒｐｍにて4℃で5分間遠心分離し、得られた上清をフィルター（ポアサイズ0.45mm、4mm Millex-LH, Millipore）を用いて清浄化した後、液体高速クロマトグラフィー（以下HPLC）を用いてこの上清を分析した。リグナンおよびその水酸化体の分析条件は以下の通りである。【０１８３】
C-30カラム（野村化学C30-UG-5、4.6ｍｍ×150ｍｍ）を用いて液体クロマトグラフィー（Lc−2010C（島津製作所））を行った。移動相には、Ａ液として、0.1％TFA、Ｂ液として、0.1％ＴＦＡを含む90％アセトニトリルを用いた。Ａ液65％：Ｂ液35％の混合液を用いてカラムを平衡化した（20分間）後、直線濃度勾配（Ａ液65％：Ｂ液35％→Ａ液0％：Ｂ液100％）を用いて20分間にわたって溶出（流速0.6ｍｌ／分）し、Ｂ液100％を用いて7分間溶出した。287ｎｍの吸収を測定して、サンプル中に含有される化合物を検出した。化合物の各ピークを、SPD−10AV（島津製作所）を用いて190ｎｍ〜400ｎｍのスペクトルを測定し、リグナンに特徴的な２つの吸収極大（230nmおよび280ｎｍ）を有する物質を探索した。この条件下で、ピノレジノール標準品は約8.7分、ピペリトール標準品は約12.8分、シリンガレジノール標準品は保持時間約7.9分、およびセコイソラリシレジノール標準品は約6.2分に検出される（図２）。【０１８４】
酵素反応液のHPLC分析の結果、Sid6組換えタンパク質とピノレジノールとの反応液中においてのみ、リグナンのスペクトルを有する生成物Ｐ1（保持時間約6.2分）および生成物Ｐ2（保持時間約4.3分）が得られた（図２）。また、Sid6組換えタンパク質とピペリトールとの反応液中において、リグナンのスペクトル（保持時間約9.7分）を有する生成物P３が新たに得られた（図２）。また、SiD６とシリンガレジノールとの反応液中においてリグナンのスペクトルを有する生成物Ｐ４（保持時間約5.8分）および生成物Ｐ５（保持時間約4.2分）が新たに得られた（図２）。一方、セコイソラリシレジノールとの反応液中には新しい生成物は認められなかった（図2）。さらに、セサミン、セサミノールおよびセサモリンに加え、フラボノイドの一種であるナリンゲニンに対しても生成物は認められなかった。以上の結果からＳｉＤ6はフラン環を有し、且つベンゼン環に少なくとも隣り合う水酸基とメトキシ基を有するリグナンと反応することが示された。（図2）。【０１８５】
SiD6を発現する大腸菌由来の粗抽出液10μlをSDS-PAGEに供し、CBB染色した結果、pET-30aベクターを形質転換した大腸菌由来の粗抽出液においては認められない約45kDa付近に顕著なバンドが認められた（図3）。このサイズはSiD6の推定分子量39.1kDaとpET−30aベクター由来のHis-Tag,トロンビン認識サイト、エンテロキナーゼ認識サイトおよびS-Tagを加えたサイズと一致するため、発現した45kDaのバンドは組み換えSiD6タンパク質と結論づけた。酵素反応液中から2ＯＧを除いた場合、新しい生成物は認められなかったことから（図2）、反応液中に認めらた生成物はSiD6によって生成したリグナンであることが強く支持された。【０１８６】
Blastxプログラムによるホモロジー検索の結果、SiD6はニチニチソウのインドールアルカロイドの水酸化酵素であるDesacetoxyvindoline 4-hydroxylaseと最も高い47％の配列同一性を示すが、これまでにゴマにおいて本アルカロイドの報告はなく、また2OGジオキシゲナーゼのファミリーの酵素でリグナンを水酸化する活性は新規なものである。【０１８７】
（実施例８： SiD6による生成物のLC-MS解析）
ＬＣ−ＭＳ分析によって、実施例7におけるSiD6による生成物P1およびP3の分子量の解析を行った。【０１８８】
ダイアイオンSEPABEADS HP20樹脂（三菱化学）を1ｍｌ充填したカラムを10ｍｌの50％アセトンで洗浄した後、10ｍｌの蒸留水で平衡化した。引き続き、実施例7のSiD6による生成物を含む酵素反応液200μlを蒸留水で1ｍｌにそれぞれメスアップしたものをカラムに負荷し、5ｍｌの蒸留水で洗浄し、タンパク質および塩類を除去した。その後、2ｍｌの80％アセトンでリグナンを溶出したものをエバポレーターで乾燥させた。【０１８９】
ダイアイオンＨＰ−２０樹脂（三菱化学）を１ｍｌ充填したカラムを５０％アセトン５ｍｌで洗浄した後、水１０ｍｌを用いて平衡化した。実施例7のピノレジノール生成物Ｐ1を含む酵素反応液をカラムに負荷し、５ｍｌの水で不純物を洗浄後、８０％アセトン２ｍｌを用いて反応生成物を溶出した。エバポレーターで溶出液を乾固させた後、１％ギ酸を含む５０％アセトニトリル（１００μｌ）中に溶解させてＬＣ−ＭＳ分析試料とした。ＬＣ条件を以下に示す。【０１９０】
Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０−ＵＧ−３カラム（野村化学(株)、３．０ｍｍ×１５０ｍｍ）を用い、移動相は、Ａ液として10mM酢酸アンモニウムを含む水を、Ｂ液として１００％アセトニトリルを用いた。１０分間の直線濃度勾配（Ａ液70％：Ｂ液３０％→Ａ液30％：Ｂ液７０％）を用いて溶出し、その後、Ａ液30％：Ｂ液70％で5分間のアイソクラティック溶出を行った。（流速：０．２ｍｌ／分）。【０１９１】
検出はフォトダイオードアレイ検出器（SPD-M10A、(株)島津製作所）で230-500nmのデータを収集し、A280nmのクロマトグラムを測定した。またPDA検出器の後にTOF-MS検出器（LCMS-IT-TOF(株)島津製作所）を接続し、分子量の測定を行った。MSの測定条件はネガティブおよびポジティブの両モードで、測定分子量範囲は100-1000Da、インターフェンス電圧はそれぞれ４．５KVおよびー３．５KVで行った。【０１９２】
この条件下で、ピノレジノールおよびピノレジノール反応生成物Ｐ1は10.1分、7.9分にそれぞれ溶出された。またピペリトールおよびピペリトール生成物Ｐ3は13.3分、10.9分にそれぞれ溶出された。ＬＣ−ＭＳ分析の結果、P1はポジティブモードでm/z 375.13  [M+H]+、ネガティブモードでm/z 373.13 [M+H]-の分子イオンを与え、ピノレジノールに水酸基が付加したものと推察された。またP3はポジティブモードでm/z 373.12  [M+H]+、ネガティブモードでm/z 371.11 [M+H]-の分子イオンを与え、ピペリトールに水酸基が付加したものと推察された。【０１９３】
以上の結果から、ゴマ由来ＳｉD6遺伝子はピノレジノールおよびピペリトールに対して水酸化する活性を有するリグナン水酸化酵素をコードしていることが示された。【０１９４】
（実施例9： SiD6による生成物の精製およびNMR解析）
ピノレジノールの水酸化生成物であるＰ1およびＰ２、ピペリトールの水酸化生成物であるＰ３の水酸化部位を同定する為に各々の精製およびNMR分析を行った。ピノレジノール反応液については、ダイアイオンSEPABEADS HP20樹脂（三菱化学）を100ｍｌ充填したカラムを200ｍｌの50％アセトンで洗浄した後、500ｍｌの蒸留水で平衡化した。引き続き、実施例7のSiD6による生成物Ｐ１およびＰ２を含む酵素反応液100ｍｌをカラムに負荷し、さらに200ｍｌの蒸留水で洗浄し、タンパク質を除去した。最後に200ｍｌの50％アセトンでＰ１、Ｐ２を溶出したものをエバポレーターで減圧濃縮した後、凍結乾燥させた。ピペリトール水酸化生成物であるＰ３についても同様に精製した。ついで、これをカラム:Develosil C30-UG-5（20×250 mm, 野村化学）、A液:  蒸留水, B液: 90% アセトニトリル, 溶出条件：ピノレジノール水酸化物（Ｐ１・Ｐ２）：20%−70％B液（60min）、ピペリトール水酸化物（Ｐ３）：60−100%Ｂ液（60min）、流速：6 ml/min、検出波長：280 nmで分画精製を行った。生成した主ピーク画分を回収して凍結乾燥標品を調製した。これをＮＭＲ（BRUKER社、750MHz）にて解析した結果、以下の通り同定できた。【０１９５】
Ｐ１：9−ヒドロキシピノレジノール（溶出時間31.0min画分）：NMR ：δppm (DMSO-d6)；2.47 (1H, dd), 3.08 (1H, t), 3.62 (1H, ddd), 3.66 (1H, t), 3.76 (6H, s), 4.40 (1H, d), 5.30 (1H, d), 5.45 (1H, s), 6.74 (2H, brs), 6.75 (2H, brs), 6.89 (2H, brs)。
Ｐ２：9, 9’−ジヒドロキシピノレジノール（溶出時間22.9min画分）：NMR：δppm (DMSO-d6)；2.77 (2H, d), 3.76 (6H, s), 4.75 (2H, d), 5.39 (2H, d), 6.60 (2H, d), 6.73 (2H, d), 6.85 (2H, dd), 7.13 (2H, d)。【０１９６】
Ｐ３については、各シグナルのアサイン（図４）を行った結果、９-ヒドロキシピペリトール（図５）であることを確認した。９−ヒドロキシピペリトールは新規化合物である。セサミン代謝物解析から、本新規リグナンについても生体内で代謝されカテコール型のリグナンに変換され、抗酸化性を発揮するものと考えられる(先行文献：Nakai, M., et al. J. Agric. Food. Chem. 51, 1666-1670.(2003))。【０１９７】
以上の結果より、本酵素がフロフラン型リグナンの９位水酸化活性を有する酵素であることが示された（図６）。ピノレジノールおよびピペリトールの水酸化位置から、シリンガレジノールとの反応物P4およびP5も同様に9位または9,9’位が水酸化されていると類推される。【０１９８】
本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１９９】
以上のように、本発明に係るポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、リグナンを水酸化する為に有用である。また、本発明に係るポリヌクレオチドを発現可能に導入した形質転換体または細胞は、食品分野、各種工業分野において、リグナン水酸化、またはこれを用いる製品を生産する上で、極めて有用である。上記形質転換体が植物体である場合、植物体自体を食品として用いることができるので農業分野等において非常に有用である。【０２００】
さらに、本発明に係るポリペプチドおよびポリヌクレオチドを、本発明者らが見出した他の酵素（ピペリトールおよびセサミンを合成する酵素であるＳｉＰ１８９）と組合わせることによって、特定のリグナン分子種の生産系の確立が可能となり、その結果、特定のリグナン分子種の生産量を拡大することができる。従って、本発明は、農業、食品産業、医薬品産業およびこれらの関連産業にわたる広範な利用が可能である。
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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