(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における高血圧症、浮腫、急性腎不全、うっ血性心不全、慢性腎不全、腹水、眼内圧上昇、ネフローゼ症候群、または水分／ナトリウムバランスの異常に関連するその他の疾病状態の治療または予防のための医薬組成物であって、
治療上有効な量の式Ｉの化合物
【化１】
0005456975.tif 000005
（前記式中、Ｒ２はＣＯＯＨであり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、Ｈであり、
Ｘ１−Ｒ４は（＝Ｏ）であり、Ｘ２は、−ＯＳ（Ｏ）ｙ−、−Ｓ（Ｏ）ｙ−、−Ｏ−、であり；ここで、ｙは０〜３の整数であり、
Ｒ８は、Ｈ、アルドヘキソピラノース、アルドペントピラノース、アルドペントフラノース、またはケトース、またはＤ−グルコースである）、または、
その医薬として許容される塩と、
医薬として許容される担体と
を含む医薬組成物。
【請求項２】
式Ｉの化合物はキサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドである、請求項１に記載の
医薬組成物。
【請求項３】
式Ｉの化合物はキサンツレン酸８−Ｏ−サルフェートである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
哺乳動物における高血圧症、浮腫、急性腎不全、うっ血性心不全、慢性腎不全、腹水、眼内圧上昇、ネフローゼ症候群、または水分／ナトリウムバランスの異常に関連するその他の疾病状態の治療または予防のための医薬組成物であって、
（１）治療上有効な量の式Ｉの化合物
【化２】
0005456975.tif 000006
（前記式中、Ｒ２はＣＯＯＨであり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７はＨであり、
Ｘ１−Ｒ４は（＝Ｏ）であり、Ｘ２は、−ＯＳ（Ｏ）ｙ−、−Ｓ（Ｏ）ｙ−、−Ｏ−、であり；ここで、ｙは０〜３の整数であり、
Ｒ８は、Ｈ、アルドヘキソピラノース、アルドペントピラノース、アルドペントフラノース、またはケトース、またはＤ−グルコースである）、または、
その医薬として許容される塩と、
（２）１つ以上の追加の利尿剤化合物または心血管作動薬と、
医薬として許容される担体と
を含む医薬組成物。
【請求項５】
追加の利尿剤化合物は、ループ利尿薬、チアジド系利尿薬、カリウム保持性利尿薬、炭酸脱水酵素阻害薬および浸透圧性利尿薬のうちから選択される、請求項４の医薬組成物。
【請求項６】
追加の利尿剤化合物は、フロセミド、ブメタニド、トルセミド、エタクリン酸、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、スピロノラクトン、アミロライド、トリアムテレン、アセタゾラミド、メタゾラミド、ジクロルフェナミド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、インダパミド、メトラゾン、ポリチアジド、クロルサリドン、ドルゾラミド、ブリンゾラミド、グリセリン、マンノースおよび尿素のうちから選択される、請求項５の医薬組成物。
【請求項７】
追加の利尿剤化合物はフロセミドである、請求項５の医薬組成物。
【請求項８】
追加の心血管作動薬は、アンジオテンシン変換酵素阻害薬、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストおよびβ−アドレナリン遮断薬のうちから選択される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項９】
追加の心血管作動薬は、リシノプリル、モエキシプリル、エナラプリル、イルベサルタ
ン、バルサルタン、ロサルタン、ナドロール、プロプラノロール、アテノロール、チモロールまたはビソプロロールである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
哺乳動物における高血圧症、浮腫、急性腎不全、うっ血性心不全、慢性腎不全、腹水、眼内圧上昇、ネフローゼ症候群、または水分／ナトリウムバランスの異常に関連するその他の疾病状態を治療または予防するための薬の製造のための請求項１に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１１】
哺乳動物における高血圧症、浮腫、急性腎不全、うっ血性心不全、慢性腎不全、腹水、眼内圧上昇、ネフローゼ症候群、または水分／ナトリウムバランスの異常に関連するその他の疾病状態を治療または予防するための薬の製造のための請求項４に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１２】
利尿の必要がある患者に利尿をもたらすための薬の製造のための請求項１に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１３】
前記患者は、高血圧症、浮腫、急性腎不全、うっ血性心不全、慢性腎不全、腹水、眼内圧上昇またはネフローゼ症候群のうちの１つ以上の状態を有する、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
利尿の必要がある患者に利尿をもたらすための薬の製造のための請求項４に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１５】
前記患者は、高血圧症、浮腫、急性腎不全、うっ血性心不全、慢性腎不全、腹水、眼内圧上昇またはネフローゼ症候群のうちの１つ以上の状態を有する、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
異常なレベルのキサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドに関連する疾病を治療するための薬の製造のための請求項１に記載の医薬組成物の使用であって、前記疾病は、高血圧症、浮腫、急性腎不全、うっ血性心不全、慢性腎不全、腹水、眼内圧上昇、ネフローゼ症候群または水分／ナトリウムバランスの異常を伴うその他の疾病状態のうちから選択される使用。
【請求項１７】
ナトリウム再吸収の低下に関連する疾病または状態の治療薬の製造のためのキサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドアンタゴニストの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キサンツレン酸誘導体医薬組成物およびそれに関連する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連出願）
本出願は、２００４年１２月２９日に出願された米国特許出願第１１／０２７，１３１号の一部継続出願であり、前記出願は参照によりその全容を本願に援用される。
【０００３】
（発明の背景）
利尿剤は、うっ血性心不全、高血圧症、ある種の肝臓および腎臓病、ならびに眼内圧上昇を含む様々な病状を治療するために用いられる医薬品群である。利尿剤は、腎臓のネフロンによるナトリウム（Ｎａ＋）の輸送に対して、身体からのＮａ＋（また関連するイオン）および水の腎排泄を増加させ、それにより細胞外液（ＥＣＦ）量を減少させるように作用する。通常、Ｎａ＋は食事によってＥＣＦ内に入り、摂取量と同一の量で尿中に排泄される。健常な成人においては、（糸球体の濾過を介して）２つの腎臓のネフロンに入るナトリウムの９９％以上は、尿細管流体からエネルギー依存的プロセスを経て輸送され、ＥＣＦへと戻される。摂取と排泄とのこのバランスが乱されると（排泄量が摂取量よりも低下すると）、塩類貯留が生じることになる。この異常状態を治療する主要な機構は、腎臓によるＮａ＋および水の再吸収を減少させることにより、それらの尿中への排泄を増大させる１つ以上の薬剤の投与を伴う。これらの薬剤はまとめて、利尿剤として知られている。最適には、強力な利尿剤は、ナトリウム排泄増加性である（ナトリウムイオンの再吸収を抑制する）が、カリウムの損失は望ましくない副作用であるので、カリウム排泄増加性である（カリウムイオンの再吸収を抑制する）べきではない。「利尿剤」の範疇に含まれる主な医薬品は、ネフロンの特定部位の尿細管上皮細胞における特定の「担体」に作用することによって、尿細管流体からのＮａ＋（および水）の輸送を抑制することにより作用する。前記担体は使用される利尿剤に応じて変わる。
【０００４】
ループ利尿薬、チアジド系利尿剤およびカリウム保持性利尿剤を含む、いくつかの主要なクラスの利尿剤が存在する。高天井（high-ceiling）利尿剤としても知られているループ利尿薬は、腎臓内の太いヘンレ上行脚に作用する。例としては、フロセミド、ブメタニドおよびトレセミド（toresemide）が挙げられる。ループ利尿薬は、他のクラスの利尿剤よりはるかに大きな最大利尿効果を有する。このクラスの利尿剤は電解質の再吸収を抑制するように作用して、ナトリウムだけでなくカリウム、カルシウムおよびマグネシウムの排泄をもたらす。ループ利尿薬は「カリウム消耗性」であると考えられる。例えば、フロセミドは、一般に、心不全、肺水腫、高血圧症および中毒症を治療するために用いられる。残念ながら、食事のカリウムが十分でない場合、低カリウム血症が生じ、心臓不整脈を引き起こし得る（非特許文献１）。
【０００５】
チアジド系利尿剤は、腎臓の遠位尿細管および接合部分（connecting segment）において作用する。例としては、クロロチアジド、クロルサリドン、ヒドロクロロチアジド、インダパミドおよびメトラゾンが挙げられる。チアジド類は、他のクラスの利尿剤よりも、細胞外液の電解質組成をあまり歪めないが、これらの医薬品によって生じる利尿の強度も低い。このクラスの利尿剤は多数のスルホンアミド化学成分を含んでおり、よってサルファ剤アレルギーを有する人においてアレルギー反応を引き起こす可能性がある。チアジド類は、カルシウム排泄は生じないが、急性投与によってカリウム排泄を増大させる。チアジド類はまた、高血糖を誘発し、先在する糖尿病を悪化させる場合がある。チアジド系利尿薬はさらに血清コレステロール、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）およびトリグリセリ
ドの濃度の上昇をもたらすことがある。チアジド類も「カリウム消耗性」利尿剤と考えられる。
【０００６】
カリウム保持性利尿剤はいくつかの機構のいずれかを経て作用し得る。あるものは構造的にステロイド系であり、腎臓の皮質部接合尿細管（cortical connecting tubule）内のアルドステロン感受性細胞において作用する。このクラスの薬剤に属するものは、ナトリウムの吸収およびカリウムの排泄を高めるように作用するアルドステロンのような、内因性鉱質コルチコイドステロイドの競合的拮抗薬である。アルドステロン受容体は、唾液腺、結腸、腎臓のネフロン部分を含むいくつかの組織に見られる可溶性の細胞質タンパク質である。この薬剤クラスに属する代表的なものであるスピロノラクトンは、アルドステロン受容体に結合し、該受容体が活性立体配座をとるのを阻止する。スピロノラクトンはさらにカルシウム排泄を増加させる。一般的な副作用としては、悪心、胃痙攣および下痢が挙げられる。他の副作用としては、内分泌のバランス異常、女性化乳房（男性における片方または両方の乳房の異常な増大）、性的衝動の変化、性的不能または多毛症（過度の体毛）を伴う。トリアムテレンおよびアミロライドは、腎ネフロンの後半部（late segments of the kidney nephron ）におけるナトリウムの起電性の進入を抑制する、非ステロイド性カリウム保持性利尿薬である。トリアムテレンおよびアミロライドは、ナトリウムおよび塩素の排泄を増大させるが、カリウム排泄にはほとんど作用しない。トリアムテレンの副作用としては、高カリウム血症（血清カリウム濃度の上昇）、悪心、嘔吐、下肢痙攣およびめまいが挙げられる。また、アミロライドの副作用としても、高カリウム血症、悪心、嘔吐、下痢および頭痛が挙げられる。
【０００７】
他のクラスの利尿剤としては、浸透圧性利尿薬および炭酸脱水酵素阻害薬が挙げられる。マンニトールのような浸透圧性利尿薬は、尿細管によって再吸収され難い。この薬剤クラスは、ナトリウム塩の正味の再吸収を低下させる。その上、マンニトールは胃腸管によって吸収され難く、よって静脈内に投与しなければならない。他の浸透圧性利尿薬としては、グリセリン、尿素およびイソソルビドが挙げられる。
【０００８】
アセタゾラミドのような炭酸脱水酵素阻害薬は、ナトリウム再吸収の緩やかな減少をもたらし、その作用機構によりカリウム喪失および代謝性アシドーシスも引き起こし得る。
【非特許文献１】ハードマン（Hardman ）、リンバード（Limbird ）、及びギルマン（Gilman）編「Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis for Therapeutics   第１０版」、マグロウヒル（MacGraw-Hill）、第７７２頁、２００１年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
利尿剤は、単独でまたは他の医薬品と組み合わせて、高血圧（高血圧症）を治療するために用いられる。高血圧は、心臓および動脈の仕事量を増大させる。その状態が長期間にわたって継続すれば、心臓および動脈の機能が損なわれ得る。これは、脳、心臓および腎臓の血管に損傷を与えて、脳卒中、心不全または腎不全を引き起こし得る。高血圧はまた、さらに心臓発作の危険性を増大し得る。血圧を適切に制御すれば、これらの危険性を減少させることができる。米国国立心臓・肺・血液研究所（ＮＨＬＢＩ）の高血圧ガイドライン（ＪＡＭＡ、２００３年５月２１日；www.nhlbi.nih.gov ）は、前述の利尿性薬物類の副作用を有さない新規な利尿薬剤を開発する必要性を強調している。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
医薬組成物は、治療上有効な量の式Ｉの化合物
【００１１】
【化１】
0005456975.tif 000002
（前記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、独立してＸ３Ｒであり、ここで、Ｒは、Ｈ、ハロ；任意に置換された糖類、脂肪族、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリール；−Ｐ（Ｏ）（ＯＲａ）（ＯＲｂ）および−ＮＲａＲｂのうちから選択され、前記式中、ＲａおよびＲｂは、独立して、Ｈ、任意に置換された脂肪族、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）ｙ−、−Ｓ（Ｏ）ｙ−、−Ｏ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ−であるか、結合であるか、または不在であり；ここで、ｙは０〜３の整数であり；
Ｒ４およびＲ８は、独立して、Ｈ、（＝Ｏ）；ヒドロキシ；または任意に置換された、糖類、脂肪族、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、もしくはヘテロアリール；または−Ｐ（Ｏ）（ＯＲａ）（ＯＲｂ）もしくは−ＮＲａＲｂであり、前記式中、ＲａおよびＲｂは、独立して、Ｈ、または任意に置換された脂肪族、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、もしくはヘテロアリールである）、または、
そのプロドラッグもしくは医薬として許容される塩と、
医薬として許容される担体とを含む。
【００１２】
本発明はまた、式Ｉの化合物を含む医薬組成物を用いて、高血圧症、浮腫、急性腎不全、うっ血性心不全、慢性腎不全、腹水、眼内圧上昇、またはネフローゼ症候群、および他の関連する疾病および状態を、治療、制御、および予防する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本明細書において用いられる場合、別途示されていないかぎり、以下の定義が適用されるものとする。
【００１４】
「任意に置換された」という語句は、「置換されているか、または未置換である」という語句と置き換え可能であるように用いられる。別途示されていない限り、任意に置換された基とは、その基の置換可能な各位置において置換基を有し得るとともに、各置換は他の置換とは独立している。また、置換基または変数の組み合わせは、そのような組み合わせが安定した化合物を生じる場合のみ、許容可能である。さらに、別途記載のない限り、官能基ラジカルは、独立して選択される。「任意に置換された」が句読点で区切られた一連の基を修飾する場合（例えば、「任意に置換されたＡ、ＢまたはＣ」または「〜によって任意に置換されたＡ、ＢまたはＣ」）、各々の基（例えば、Ａ、ＢおよびＣ）が任意に置換されることが意図される。
【００１５】
本明細書に用いられる「脂肪族」または「脂肪族基」という用語は、完全に飽和しているかもしくは１単位以上の不飽和を含む直鎖もしくは分岐Ｃ１−１２炭化水素鎖、または完全に飽和しているかもしくは１単位以上の不飽和を含む単環式Ｃ３−８炭化水素もしくは二環式Ｃ８−１２炭化水素であって芳香族ではなく（本明細書においては「炭素環」または「シクロアルキル」とも称される）、分子の残部に対して単一の付着点を有し、前記二環式環系の個々の環は、３〜７員環であることを意味する。例えば、適切なアルキル基としては、直鎖または分岐のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびそれらの混成物、例えば（シクロアルキル）アルキル、（シクロアルケニル）アルキル、または（シクロアルキル）アルケニルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１６】
単独またはより大きな部分の一部として用いられる「アルコキシ」、「ヒドロキシアルキル」、「アルコキシアルキル」および「アルコキシカルボニル」という用語は、１〜１２個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖の双方を含む。単独またはより大きな部分の一部として用いられる「アルケニル」および「アルキニル」という用語は、２〜１２個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖の双方を含むものとする。
【００１７】
「ハロアルキル」、「ハロアルケニル」および「ハロアルコキシ」という用語は、場合に応じて１つ以上のハロゲン原子で置換された、アルキル、アルケニルまたはアルコキシを意味する。「ハロゲン」または「ハロ」という用語は、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを意味する。
【００１８】
「ヘテロ原子」という用語は、窒素、酸素または硫黄を意味し、窒素および硫黄のあらゆる酸化型、並びにあらゆる塩基性窒素の四級化型を含む。単独で、あるいは他の用語と組み合わせて用いられる「アリール」という用語は、合計５〜１４個の環員を有する単環式、二環式、または三環式の炭素環系である。前記系内の少なくとも１つの環は芳香族性であり、かつ前記系内の各環は３〜８個の環員を含む。「アリール」という用語は、「アリール環」という用語と互換的に用いられ得る。「アラルキル」という用語は、アリールによって置換されたアルキル基を指す。「アラルコキシ」という用語は、アリールによって置換されたアルコキシ基を指す。
【００１９】
本明細書において用いられる「ヘテロシクロアルキル」、「複素環」、「ヘテロシクリル」、または「複素環式」という用語は、１つ以上の環員がヘテロ原子である、５〜１４個の環員を有する単環式、二環式、または三環式の環系であって、前記系内の各環が、３〜７個の環員を含み、かつ非芳香族である環系を意味する。
【００２０】
単独で、あるいは他の用語と組み合わせて用いられる「ヘテロアリール」という用語は、合計５〜１４個の環員を有する単環式、二環式、および三環式の環系であって、１）前記系内の少なくとも１つの環は芳香族であり、２）前記系内の少なくとも１つの環は１つ以上のヘテロ原子を含み、３）前記系内の各環は３〜７個の環員を含む、環系を指す。用語「ヘテロアリール」は、「ヘテロアリール環」という用語または「複素芳香族」という用語と互換的に用いられ得る。ヘテロアリール環の例としては、２−フラニル、３−フラニル、Ｎ−イミダゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、５−イミダゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−オキサジアゾリル、５−オキサジアゾリル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、１−ピラゾリル、３−ピラゾリル、４−ピラゾリル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ピリミジル、３−ピリダジニル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、５−テトラゾリル、２−トリアゾリル、５−トリアゾリル、２−チエニル、３−チエニル、カルバゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、インドリル、キノリニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル（benzooxa
zolyl)、ベンゾイミダゾリル、イソキノリニル、インダゾリル、イソインドリル、アクリジニル、またベンゾイソキサゾリルが挙げられる。「ヘテロアラルキル」という用語は、ヘテロアリールによって置換されたアルキル基を指す。「ヘテロアリールアルコキシ」という用語は、ヘテロアリールによって置換されたアルコキシ基を指す。
【００２１】
アリール基（アラルキル、アラルコキシ、アリールオキシアルキルなどを含む）または、ヘテロアリール基（ヘテロアラルキル、ヘテロアリールアルコキシなどを含む）は、１つ以上の置換基を含んでいてもよい。アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキル基の不飽和炭素原子における適切な置換基は、ハロゲン；ハロアルキル；−ＣＦ３；−Ｒ９；−ＯＲ９；−ＳＲ９；１，２−メチレンジオキシ；１，２−エチレンジオキシ；保護されたＯＨ（アシルオキシなど）；フェニル（Ｐｈ）；Ｒ９で置換されたＰｈ；−Ｏ（Ｐｈ）；Ｒ９で置換された−Ｏ−（Ｐｈ）；−ＣＨ２（Ｐｈ）；−Ｒ９で置換されたＣＨ２（Ｐｈ）；−ＣＨ２ＣＨ２（Ｐｈ）；−Ｒ９で置換された−ＣＨ２ＣＨ２（Ｐｈ）；−ＮＯ２；−ＣＮ；−ＮＲ９Ｒ１０；−ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒ１０；−ＮＲ９Ｃ（Ｏ）ＮＲ１０Ｒ１１；−ＮＲ９ＣＯ２Ｒ１０；−ＮＲ９ＮＲ１０Ｃ（Ｏ）Ｒ１１；−ＮＲ９−ＮＲ１０Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２；−ＮＲ９ＮＲ１０ＣＯ２Ｒ１１；−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ９；−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ９；−ＣＯ２Ｒ９；−Ｃ（Ｏ）Ｒ９；−Ｃ（Ｏ）ＮＲ９Ｒ１０；−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ９Ｒ１０；−Ｓ（Ｏ）２Ｒ９；−ＳＯ２ＮＲ９Ｒ１０；−Ｓ（Ｏ）Ｒ９；−ＮＲ９ＳＯ２ＮＲ１０Ｒ１１；−ＮＲ９ＳＯ２Ｒ１０；−Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ９Ｒ１０；−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＲ９Ｒ１０；−（ＣＨ２）ｙＮＨＣ（Ｏ）Ｒ９；−（ＣＨ２）ｙＲ９；−（ＣＨ２）ｙＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ９；−（ＣＨ２）ｙＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ９；−（ＣＨ２）ｙＮＨＳ（Ｏ）Ｒ９；−（ＣＨ２）ｙＮＨＳＯ２Ｒ９または−（ＣＨ２）ｙＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ（Ｖ）ｚ−Ｒ９）（Ｒ１０）のうちから選択される。前記式中、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２は、水素、任意に置換されたＣ１−６脂肪族、未置換の５〜６員ヘテロアリールまたは複素環、フェニル（Ｐｈ）、−Ｏ（Ｐｈ）または−ＣＨ２（Ｐｈ）−ＣＨ２（Ｐｈ）から独立して選択され、ここで、ｙは０〜６であり；ｚは０〜１であり；かつ、Ｖはリンカー基である。Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１またはＲ１２がＣ１−６脂肪族である場合、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１またはＲ１２は、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−４脂肪族）、−Ｎ（Ｃ１−４脂肪族）２、−Ｓ（Ｏ）（Ｃ１−４脂肪族）、−ＳＯ２（Ｃ１−４脂肪族）、ハロゲン、（Ｃ１−４脂肪族）、−ＯＨ、−Ｏ−（Ｃ１−４脂肪族）、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２（Ｃ１−４脂肪族）、−Ｏ（ハロＣ１−４脂肪族）、または−ハロ（Ｃ１−４脂肪族）のうちから選択された１つ以上の置換基で置換されていてもよく、前記式中、各Ｃ１−４脂肪族は未置換である。
【００２２】
脂肪族基または非芳香族複素環は１つ以上の置換基を含んでいてもよい。アルキル基の飽和炭素または非芳香族複素環の飽和炭素における適切な置換基は、アリール基またはヘテロアリール基の不飽和の炭素について上記に列記した置換基および以下の、＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＮＨＲ１３、＝ＮＮＲ１３Ｒ１４、＝Ｎ−、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）Ｒ１３、＝ＮＮＨＣＯ２（アルキル）、＝ＮＮＨＳＯ２（アルキル）、または＝ＮＲ１３のうちから選択され、前記式中、Ｒ１３およびＲ１４は、水素および任意に置換されたＣ１−６脂肪族から独立して選択される。Ｒ１３またはＲ１４がＣ１−６脂肪族である場合、Ｒ１３またはＲ１４は、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−４脂肪族）、−Ｎ（Ｃ１−４脂肪族）２、ハロゲン、−ＯＨ、−Ｏ−（Ｃ１−４脂肪族）、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２（Ｃ１−４脂肪族）、−Ｏ（ハロＣ１−４脂肪族）または−ハロ（Ｃ１−４脂肪族）のうちから選択される１つ以上の置換基で置換されていてもよく、前記式中、各Ｃ１−４脂肪族は未置換である。
【００２３】
非芳香族複素環の窒素における置換基は、−Ｒ１５、−ＮＲ１５Ｒ１６、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、−ＣＯ２Ｒ１５、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、−ＳＯ２Ｒ１５、−ＳＯ２ＮＲ１５Ｒ１６、−Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ１５Ｒ１６、−Ｃ（＝ＮＨ
）ＮＲ１５Ｒ１６または−ＮＲ１５ＳＯ２Ｒ１６のうちから選択され、前記式中、Ｒ１５およびＲ１６は、水素、任意に置換されたＣ１−６脂肪族、任意に置換されたフェニル（Ｐｈ）、任意に置換された−Ｏ（Ｐｈ）、任意に置換された−ＣＨ２（Ｐｈ）、任意に置換された−ＣＨ２ＣＨ２（Ｐｈ）、または未置換の５〜６員ヘテロアリールもしくは複素環のうちから独立して選択される。Ｒ１５またはＲ１６がＣ１−６脂肪族基またはフェニル環である場合、Ｒ１５またはＲ１６は、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−４脂肪族）、−Ｎ（Ｃ１−４脂肪族）２、ハロゲン、−（Ｃ１−４脂肪族）、−ＯＨ、−Ｏ−（Ｃ１−４脂肪族）、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２（Ｃ１−４脂肪族）、−Ｏ（ハロＣ１−４脂肪族）、または−ハロ（Ｃ１−４脂肪族）のうちから選択される１つ以上の置換基で置換されていてもよく、前記式中、各Ｃ１−４脂肪族は未置換である。
【００２４】
「糖類」という用語は、実験的一般式（ＣＨ２Ｏ）ｎを有する１つ以上の単位から構成された炭水化物、すなわち糖を定義する。糖類はさらに、単位の数に応じて、単糖、二糖、または多糖に分類されるか、あるいは１つ以上の酸素原子が窒素原子によって置き換えられている場合にはアミノ糖（aminosaccharide ）に分類される。また、１つ以上のヒドロキシ基が水素原子と置き換えられる場合には、糖類はデオキシ糖に分類され得る。
【００２５】
糖類置換基は、任意の１級または２級のヒドロキシ基において、例えば、アルキル、アルコキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、エーテル、エステル、アセタール、カーボネートまたはカルバメートによってさらに置換されていてもよい。
【００２６】
「単糖」という用語は、単一の炭水化物または糖の単位を定義する。単糖の２つのファミリーは、アルドースまたはケトースである。アルドースは、この単糖を直鎖状開鎖の式で記述する場合、アルデヒドとして炭素鎖の末端にカルボニル基を有する。カルボニルが炭素鎖の他の位置にある場合、その単糖はケトンであり、ケトースと呼ばれる。３つの炭素からなる単糖は、トリオースであり、アルドースのグリセルアルデヒドおよびケトースのジヒドロキシアセトンがある。単糖は、ジヒドロキシアセトンを除いて、１つ以上の不斉中心を有する。接頭辞Ｄ−またはＬ−は、カルボニル炭素から最も離れた不斉炭素の炭素原子の立体配置を表す。その骨格に４個、５個、６個、および７個の炭素原子を有する単糖は、それぞれ、テトロース、ペントース、ヘキソースおよびヘプトースと称される。これらの各々は、２系列、すなわち、アルドテトロースおよびケトテトロース、アルドペントースおよびケトペントース、アルドヘキソースおよびケトヘキソース、並びにアルドヘプトースおよびケトヘプトースとして存在する。テトロースには、エリトロースおよびトレオースが含まれる。ペントースには、リボース、アラビノース、キシロースおよびリキソースが含まれる。ヘキソースには、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトースおよびタロースが含まれる。骨格に５つ以上の炭素を有する単糖は、通常、カルボニル炭素がその鎖に沿ったヒドロキシ基のうちの１つと共有結合を形成している環式構造、すなわち環構造として生じる。六員環化合物はピラノースと称され、五員環化合物はフラノースと称される。六員環の形成は、不斉炭素原子を含むヘミアセタールを形成するアルデヒドおよびアルコールの反応によって生じる。Ｃ−１炭素を中心とする立体配置の一方はα型と称され、他方はβ型と称される。
【００２７】
「二糖」という用語は、互いに共有結合で結合された２つの単糖を含む分子部分を指す。二糖には、マルトース［グルコース−グルコース］、ラクトース［ガラクトース−グルコース］、およびスクロース［フルクトース−グルコース］が含まれる。
【００２８】
「多糖」という用語は、互いに共有結合で結合された多数の単糖単位を包含する。多糖には、デンプン、ヒアルロン酸、アミロース、アミロペクチン、デキストラン、シクロデキストリンおよびグリコーゲンが含まれる。
【００２９】
「アミノ糖」という用語は、１つ以上のヒドロキシ基がアミノ基と置き換えられた炭水化物分子を指す。これには、単糖グルコサミンおよびムラミン酸、並びに多糖キチンが含まれる。前記アミノ基はアセチル化されてもよく、これにはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよびＮ−アセチル−Ｄ−ムラミン酸が挙げられる。
【００３０】
「デオキシ糖」という用語は、１つ以上のヒドロキシ基が水素と置き換えられた炭水化物分子を指す。これらには、例えば、Ｌ−ラムノース（６−デオキシ−Ｌ−マンノース）、Ｌ‐フコース（６−デオキシ−Ｌ−ガラクトース）、およびＤ‐フコース（ロデオース）が含まれる。
【００３１】
「治療」という用語は、哺乳動物、特にヒトにおける病的状態の任意の治療を指し、次のものを含む：（ｉ）その病的状態になる傾向にあるが、まだその状態とは診断されていない対象において病的状態が生じるのを防止すること。従って、その治療は、疾病状態に対する予防的治療となる。（ｉｉ）病的状態を抑制すること、つまり、その進行を阻止すること。（ｉｉｉ）病的状態を軽減すること、すなわち病的状態を退縮させること。あるいは（ｉｖ）病的状態によって媒介される状態を軽減すること。
【００３２】
「治療上有効な量」という用語は、上記に定義したような治療を必要とする哺乳動物に投与する場合の、そのような治療を行うのに十分な本発明の化合物の量を指す。治療上有効な量は、治療される対象および疾病状態、対象の体重および年齢、疾病状態の重症度、投与の方法などに応じて変化するであろう。そのような量は当業者により容易に決定され得る。
【００３３】
「医薬として許容される塩」という用語は、当業者によく知られている塩、例えば、本発明の化合物のモノ塩（例えばアルカリ金属塩およびアンモニウム塩）およびポリ塩（例えば、ジ塩またはトリ塩）を含むが、これらに限定されるものではない。式Ｉの化合物の医薬として許容される塩は、例えば、−ＯＨまたは−ＮＨ−中の水素のような交換可能な基が医薬として許容されるカチオン（例えばナトリウム、カリウムまたはアンモニウムイオン）で置き換えられる場合であり、例えば、適切な塩基との反応によって、対応する式Ｉの化合物から好都合に調製され得る。化合物が安定した非毒性の酸性塩または塩基性塩を形成するのに十分なほど塩基性または酸性である場合、化合物を塩として投与することが適切であり得る。医薬として許容される塩の例は、生理学的に許容されるアニオンを形成する酸によって形成された有機酸付加塩であり、例えば、トシル酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、琥珀酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸塩、α−グリセロリン酸塩である。塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩および炭酸塩を含む適切な無機塩を形成してもよい。医薬として許容される塩は、当技術分野においてよく知られている標準的な手順を用いて、例えば、アミンのような十分に塩基性の化合物を適切な酸と反応させて、生理学的に許容されるアニオンを生成することにより、得ることができる。カルボン酸のアルカリ金属塩（例えばナトリウム、カリウムまたはリチウム）またはアルカリ土類金属（例えばカルシウム）塩も形成することができる。
【００３４】
本願において用いられる「疾病」、「障害」または「状態」という用語は、任意の疾病またはその他の有害な状態、あるいは、利尿薬または医薬組成物の治療的投与がその治療に役立つことが分かっている疾病を意味する。そのような疾病または状態には、高血圧症、浮腫、急性腎不全、うっ血性心不全、慢性腎不全、腹水、眼内圧、またはネフローゼ症候群、並びにそれらの状態に起因する合併症またはそれらの状態により悪化した合併症が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
本明細書において用いられる「利尿剤」という用語は、尿の形成および排泄の促進に資
する薬剤または他の物質を意味する。
本明細書において用いられる「高血圧症」という用語は、血圧上昇によって特徴づけられる障害を指す。
【００３６】
「抗体」は、免疫グロブリンと呼ばれる、グリコシル化したタンパク質群に属するものであって、抗原と特異的に結合することができるものを指す。
「抗原」は、抗体形成を起こす化合物を指す。
【００３７】
「抗原決定基」または「抗原決定基部位」は、抗原が抗体により認識される実際の部位を指す。前記用語は、「エピトープ」と互換的に用いられる。
「担体」は、抗体形成を促進するために抗原またはハプテンを結合またはコンジュゲートさせる高分子量（巨大分子）ポリマー材料、通常はタンパク質を指す。所望により、担体はその構造内に標識を組み込むことができる。
【００３８】
「コンジュゲート」は、担体に化学結合された抗原またはハプテンを指し、コンジュゲートも同様に他の基を含むことができる。
「ＥＬＩＳＡ」は、固相に結合させた抗体または抗原と、酵素抗原コンジュゲートまたは酵素抗体コンジュゲートとを使用して、試料中に存在する抗原または抗体の量を検知し定量化する酵素結合免疫吸着検定法を指す。ＥＬＩＳＡ法の説明は、１９８２年にカリフォルニア州ロスアルトスのラング・メディカル・パブリケーション（Lange Medical Publications）より発行されたディ．ピー．サイツ（D.P. Sites）らによる「Basic and Clinical Immunology 」、第４版、第２２章に記載されている。上記文献は参照によって本願に援用される。
【００３９】
「ＥＭＩＴ」は、試料中の未知物の量を検知するために（１）酵素標識ハプテン、（２）ハプテンに対する特異抗体、（３）前処理試薬、（４）緩衝化酵素基質（buffered-enzyme substrate ）、および（５）標準物を用いる酵素増幅免疫検定法（enzyme-multiplied immunoassay technique ）を指す。ＥＭＩＴ法の説明は、フロリダ州ボカラトン所在のシーアールシー  プレス  インコーポレイテッド（CRC Press, Inc. ）より１９８０年に発行された、イー．ティ．マッジオ（E. T. Maggio）編「Enzyme Immunoassay」、特に１４１〜１５０頁、２３４〜５頁および２４２〜３頁に記載されている。これらの資料は参照により援用される。
【００４０】
「エピトープ」は、分子の、抗体によって特異的に認識される部分を指す。また、「エピトープ」は決定基とも称される。
「蛍光免疫検定法」は、抗体を用いる検定法であって、測定しようとする分子種が、抗体−リガンド複合体中において蛍光性の分子種で標識された物質に結合するか、前記物質に置き換わるか、または結合に関して前記物質と競合する検定法を指す。この検定法の一部の実施形態において、複合体は分離され、蛍光性分子種の有無により被測定分子種の量の測定値が与えられる。他の実施形態においては、複合体を分離することなくその形成を検知することができるように、複合体は、複合体形成していない蛍光性分子種とは異なる蛍光特性を有する。蛍光免疫検定法技術の説明は、「A Review of Fluoroimmunoassay and Immunofluorometric Assay」、ディ．エス．スミス（D. S. Smith ）ら（１９８１年）、Ann. Clin. Biochem. ( １９８１年) 第１８巻：２５３−２７４頁に記載されており、該文献は参照により本願に援用される。
【００４１】
「ハプテン」は、より大きな分子に結合されたときに抗体形成を引き起こし得る、通常は低分子量である化合物を指す。
「標識」は、分子内の検出可能な基を指す。一般的な標識の中には、ラジオイムノアッセイにおいて有用な放射性分子種、蛍光免疫検定法において有用な蛍光性分子種、並びに
ＥＬＩＳＡ法およびＥＭＩＴ法などに有用な酵素分子種がある。
【００４２】
「リガンド」は、抗体結合部位を有し、かつ受容体と結合することができる任意の分子を指す。
「標準物」は、特定の分子が既知濃度で存在する試料であって、種々の試料の、未知濃度の同じ特定分子を定量するために用いられるものを指す。
【００４３】
本発明の特定の化合物は、互変異性型で存在してもよく、前記化合物のすべてのそのような互変異性型は本発明の範囲内にあることが当業者には明らかであろう。
別途明示されていないかぎり、本願において記述される構造は、その構造のすべての立体化学的形態、すなわち、各不斉中心に対するＲおよびＳの立体配置をも含むことが意図されている。従って、本化合物のエナンチオマー混合物およびジアステレオマー混合物と同様に、単一の立体化学異性体も、本発明の範囲内にある。別途明示されていないかぎり、本願において記述される構造は、同位体で標識された１つ以上の原子が存在する点においてのみ異なる化合物も含むことが意図されている。例えば、重水素もしくはトリチウムによる水素の置換、または１３Ｃもしくは１４Ｃ標識された炭素による炭素の置換を除き本発明の構造を有している化合物は、本発明の範囲内にある。
【００４４】
本発明の一態様は式Ｉの化合物を含む医薬組成物に関する。１つの好ましい実施形態において、前記組成物は式Ｉの化合物を含み、前記式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は独立して、Ｈ、ハロゲンまたは低級アルキルである。別の実施形態においては、Ｘ１が不在であり、かつ、Ｒ４は（＝Ｏ）であるか；または、Ｘ１が結合であり、かつ、Ｒ４はヒドロキシである。別の実施形態において、Ｘ１Ｒ４は−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３である。別の実施形態において、Ｒ２は−Ｃ（Ｏ）ＯＲであり、ここで、Ｒは、好ましくは、Ｈまたは任意に置換されたアルキルであり、ここで、アルキルは、メチル、エチル、ブチル、オクチルまたはウンデシルであり得る。別の実施形態において、Ｒ２は−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲであり、Ｒは、好ましくは、Ｈまたは任意に置換されたアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールである。
【００４５】
本発明の一実施形態において、Ｘ２は−Ｏ−であり、かつＲ８は任意に置換された糖類、好ましくは、アルドヘキソピラノース（aldohexopyranose）、アルドペントピラノース（aldopentopyranose ）、アルドペントフラノース（aldopentofuranose ）またはケトースから選択される単糖である。他の実施形態において、Ｒ８は、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−リボース、Ｄ−フコースまたはＬ−ラムノースである。好ましい実施形態において、Ｒ８はＤ−グルコースである。１つの特定の実施形態において、式Ｉの化合物はキサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドである。
【００４６】
別の実施形態において、Ｘ２は−Ｏ−であり、かつ、Ｒ８は−ＣＨ２ＣＯ２Ｒまたは−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＲであり、ここで、Ｒは、好ましくは、Ｈまたは任意に置換されたアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールである。
【００４７】
本発明の別の実施形態によれば、前記医薬組成物は、式Ｉの化合物を含み、前記式中、Ｘ２Ｒ８はアシル基、リン酸基、ホスホン酸基、アルキルホスホン酸基または硫酸基である。１つの特定の実施形態において、前記化合物はキサンツレン酸８−Ｏ−サルフェートである。
【００４８】
本発明は、１つ以上の追加の利尿剤化合物または心血管作動薬と組み合わされた、治療上有効な量の式Ｉによって表わされる化合物と、医薬として許容される担体とを含む医薬組成物をさらに提供する。
【００４９】
本願に記載される医薬組成物は、高血圧症、浮腫、急性腎不全、うっ血性心不全、慢性腎不全、腹水、眼内圧またはネフローゼ症候群、またはそれらの状態に起因する合併症またはそれらの状態によって悪化した合併症の治療または予防に有用である、
治療または予防される特定の状態に応じて、その状態を治療または予防するために通常投与される追加の治療剤を、本発明の化合物と一緒に投与してもよい。例えば、高血圧症の治療において、高血圧症を治療するために、１つ以上の追加の利尿剤化合物または心血管作動薬を本発明の化合物と組み合わせてもよい。追加の利尿薬は、ループ利尿薬、チアシド系利尿薬、カリウム保持性利尿薬、炭酸脱水酵素阻害薬および浸透圧性利尿薬のうちから選択される。心血管作動薬は、アンジオテンシン変換酵素阻害薬、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、β−アドレナリン遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、コレステロール調整薬（cholesterol altering drug ）、トリグリセリド低下剤、ｃ反応性タンパク質低下剤、ホモシステイン低下剤、アスピリンおよびその誘導体、イオンチャネル型薬剤（ionotropic agent）、抗不整脈薬および血液の抗凝結薬（抗凝血剤）のうちから選択される。これらの薬剤には、フロセミド、ブメタニド、トルセミド、エタクリン酸、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、スピロノラクトン、アミロライド、トリアムテレン、アセタゾラミド、メタゾラミド、ジクロルフェナミド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、インダパミド、メトラゾン、ポリチアジド、クロルサリドン、ドルゾラミド、ブリンゾラミド、グリセリン、マンノース、尿素、リシノプリル、モエキシプリル、エナラプリル、イルベサルタン、バルサルタン、ロサルタン、ナドロール、プロプラノロール、アテノロール、チモロールおよびビソプロロールが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
式Ｉの化合物は、医薬組成物として製剤され、選択された投与経路すなわち、経口、非経口、静脈内、筋肉内、局所的、皮下の投与経路、に適合した様々な形態で、ヒト患者のような哺乳類宿主に投与することができる。したがって、本化合物は、例えば、不活性の希釈剤または吸収可能な可食性担体のような医薬として許容されるビヒクルと組み合わせて、経口により、全身に投与されてもよい。本化合物は硬質または軟質シェルゼラチンカプセルに封入されてもよいし、またはタブレットに圧縮されてもよいし、あるいは患者の食事の食物に直接組み込まれてもよい。経口による治療のための投与については、活性合物は、１つ以上の賦形剤と組み合わされてもよく、摂取可能なタブレット、口腔錠、トローチ、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液、シロップ剤、オブラート（wafer ）などの形で用いられてもよい。そのような組成物および調合剤は、少なくとも０．１％の活性化合物を含むべきである。組成物および調合剤の割合は、もちろん、所与の単位剤形の重量の約２〜約６０％の間で好都合に変更され得る。そのような治療上有用な組成物における活性化合物の量は、有効な用量レベルが得られるような量である。
【００５１】
前記タブレット、トローチ、ピル、カプセル剤などはまた、下記のもの、すなわち、トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチンのような結合剤；リン酸カルシウムのような賦形剤；コーンスターチ、馬鈴薯デンプン、アルギン酸などのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；および、スクロース、フルクトース、ラクトースまたはアスパルテームのような甘味剤を含んでもよく、あるいはペパーミント、ウインターグリーン油またはさくらんぼ香味料のような香料が添加されていてもよい。単位剤形がカプセルである場合、そのカプセルは、上記の種類の材料に加えて、植物油またはポリエチレングリコールのような液体担体を含み得る。コーティングとしての、またはそうでなければ固体の単位剤形の物理的形態を変更するための、様々な他の材料が存在し得る。例えば、タブレット、ピルまたはカプセル剤は、ゼラチン、ろう、セラックまたは、糖などでコーティングされてもよい。シロップまたはエリキシルは、活性化合物と、甘味料としてスクロースまたはフルクトースと、防腐剤としてメチルパラベンおよびプロピルパラベンと、色素と、さくらんぼ風味またはオレンジ風味のような香味料とを含み
得る。もちろん、任意の単位剤形を調製するのに用いられるいかなる物質も、使用される量において薬学的に許容可能かつほぼ無毒でなければならない。さらに、活性化合物は、徐放性製剤および装置に組み込まれてもよい。
【００５２】
活性化合物はまた、注入または注射によって、静脈内または腹腔内に投与されてもよい。活性化合物またはその塩の溶液は、任意選択で非毒性の界面活性剤が混合された、水中において調製され得る。また、分散液は、グリセリン、液体ポリエチレングリコール、トリアセチンおよびそれらの混合物、および油中において調製することができる。通常の貯蔵条件および使用条件下では、これらの調合剤は、微生物の増殖を防止するために防腐剤を含む。注射または注入に適した製薬剤形としては、注射または注入可能な無菌の溶液または分散液の即時調製に適合させ、任意でリポソームに封入された活性成分を含む、無菌の水溶液もしくは分散液または滅菌粉末を挙げることができる。すべての場合において、最終剤形は、無菌で、流動体で、かつ製造条件および保存条件下において安定していなければならない。液体担体またはビヒクルは、例えば、水、エタノール、多価アルコール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、非毒性のグリセリルエステルおよびそれらの適切な混合物を含む溶媒または液体分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、リポソームの形成により、分散液の場合は必要な粒径を維持することにより、または界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物の活動の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、緩衝剤、塩化ナトリウムを含むことが望ましいであろう。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンを組成物中に使用することによってもたらされ得る。
【００５３】
滅菌注射剤溶液は、必要量の活性化合物を、適切な溶媒に、必要により上記に列挙した他の様々な成分と共に混合し、次いで濾過滅菌を行うことにより調製される。滅菌注射剤溶液の調製用の滅菌粉末の場合には、好ましい調製法は真空乾燥法および凍結乾燥法である。それらの方法は、予め滅菌濾過された溶液中に存在する活性成分と追加の所望成分との粉末を生成する。局所投与に関しては、本化合物は純粋な形態で、すなわち該化合物が液体であるときに、適用され得る。しかしながら、一般的には、本化合物を組成物または調合物として、皮膚科学的に許容される担体と組み合わせて皮膚に投与することが望ましいであろう。前記担体は固体でも液体でもよい。
【００５４】
有用な固体担体としては、タルク、粘土、微結晶性セルロース、シリカ、アルミナなどのような微粉固体が挙げられる。有用な液体担体としては、水、アルコール、またはグリコール、あるいは水−アルコール／グリコールの混合物が挙げられる。これらの液体担体中において、本化合物は、非毒性界面活性剤の援助により、有効な濃度で溶解または分散され得る。香料および抗菌添加剤のようなアジュバントを加えて、所与の用途のための特性を最適化することができる。結果として生ずる液体組成物は、吸収性パッドから投与されてもよいし、包帯および他の包帯材を含浸させるために用いてもよいし、ポンプ式またはエアゾール式噴霧器を用いて患部上に噴霧されてもよい。
【００５５】
合成高分子、脂肪酸、脂肪酸塩およびエステル、脂肪族アルコール、修飾セルロースまたは修飾無機物質のような増粘剤を液体担体と共に使用して、使用者の皮膚に直接塗布するための、塗り広げられるペースト、ゲル、軟膏、石鹸などを形成することができる。
【００５６】
本発明の化合物を皮膚に送達するために用いることができる有用な皮膚用組成物の例は、ジャケ（Jacquet ）ら（米国特許第４，６０８，３９２号明細書）、ゲリア（Geria ）（米国特許第４，９９２，４７８明細書）、スミス（Smith ）ら（米国特許第４，５５９，１５７明細書）およびウォルツマン（Wortzman）（米国特許第４，８２０，５０８明細
書）の各文献に開示されている。
【００５７】
本組成物はまた、鼻咽喉または気管支の組織の粘膜を介して吸収されるのに適した形態に調製され、粉末もしくは液体のスプレー剤または吸入薬、トローチ剤、咽喉塗布剤などの便利な形態であってもよい。目または耳の薬剤については、調合剤は、液状または半固体状で、個々のカプセル剤として与えられてもよいし、または点眼・点耳薬などとして用いられてもよい。局所適用物は、疎水性または親水性の基剤に含めて軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、塗布剤、粉末剤などとして製剤され得る。
【００５８】
動物薬については、組成物は、例えば長期作用性または速放性の基剤中で乳房内調合剤として製剤されてもよい。
本発明の化合物の有用な投与量は、それらのインビトロ活性および動物モデルにおけるインビボ活性の比較により決定することができる。マウスおよび他の動物における有効用量をヒトへ外挿する方法は当技術分野において知られており、例えば、米国特許第４，９３８，９４９号明細書を参照されたい。
【００５９】
一般に、ローション剤のような液状組成物における本発明の化合物の濃度は、約０．１〜２５重量％であり、好ましくは約０．５〜１０重量％である。ゲル剤または粉末剤のような半固体または固形組成物における濃度は、約０．１〜５重量％、好ましくは０．５〜２．５重量％である。
【００６０】
単位用量当たりの組成物は、液体・固体にかかわらず、０．１％〜９９％の活性物質（化合物Ｉまたはその塩）を含み、好ましい範囲は、約１０〜６０％である。前記組成物は、一般に、組成物の全重量に基づいて、約１５ｍｇ〜約１，５００ｍｇの重量の活性成分を含むが、一般に、約２５０ｍｇ〜１，０００ｍｇの範囲の投与量を用いることが望ましい。非経口投与において、単位剤形は、通常、わずかに酸性化された滅菌水溶液、または溶液を意図した可溶性粉末の形態にある純粋な化合物である。注射、注入または経口摂取に対する単回投与量は、成人に対して、一日あたり１〜３回、約０．５〜５０ｍｇ／ｋｇのレベルとなるように投与され得る。
【００６１】
抗体の生産
本開示は、キサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドを特異的に認識することができる抗体を生産するための方法をさらに含む。そのような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリによって生成されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、および上記のうちいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられるが、これらに限定されるものではない。そのような抗体は、例えば、生物学的試料中のキサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドの検出に用いられてもよいし、または、別例として、異常なキサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド活性の抑制のための方法として用いられてもよい。したがって、そのような抗体は、疾病治療方法の一部として利用されてもよく、かつ／または、キサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドの異常なレベルについて患者を試験し得る診断法の一部として用いられてもよい。
【００６２】
抗体の生産のために、キサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドの、例えばＫＬＨまたはオバルブミンのような担体タンパク質とのコンジュゲートを、例えばＥＤＣのような水溶性カルボジイミドによるキサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドのカルボキシル基の活性化によって生成し、キサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドのバイオコンジュゲート免疫原を形成する。様々な宿主動物を、例えば、アジュバントを用いるプロトコールでキサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドバイオコンジュゲート免疫原
を用いた注射によって免疫すればよい。そのような宿主動物には、ウサギ、マウス、ラット、ヤギおよびニワトリなどが含まれる。免疫学的応答を増大させるために、宿主生物種に応じて様々なアジュバントが用いられ得る。そのようなアジュバントとしては、フロイントのアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（Ｒ) 多価アルコール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（bacille Calmette-Guerin ）およびコリネバクテリウム・パルブムのような潜在的に有用なヒト用アジュバントが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６３】
ポリクローナル抗体は、キサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドバイオコンジュゲート免疫原のような抗原によって免疫された動物の血清に由来する抗体分子の不均一集団である。ポリクローナル抗体を生産するためには、上述の宿主動物を、同じく上述のアジュバントで補足したキサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドバイオコンジュゲート免疫原を用いた注射によって免疫すればよい。
【００６４】
宿主動物を用いて、抗原に対するポリクローナル抗体を生成する方法は、当技術分野において一般に知られている。典型的な調製法において、１種以上のキサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドバイオコンジュゲート免疫原が哺乳類または鳥類の宿主に導入される。適切な宿主には、例えば、サル、ウシ、ウサギ、ラット、マウスなどが含まれる。これは、通常、例えば完全フロイントアジュバントを用いて乳化された生理食塩水溶液として皮下注射によって行われる。動物の抗体力価はＥＬＩＳＡによって調べることができる。数週間後、例えばフロイント不完全アジュバントに含めたキサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドバイオコンジュゲート免疫原の追加免疫は、抗体力価を増加させるように作用し得る。約１か月後に動物から採血することにより抗体を収集する。全血を２５℃で数時間にわたって凝結させる。硫酸アンモニウム水溶液を水溶液の４０重量％に達するように添加すると、ＩｇＧ画分が沈殿する。沈殿物を遠心分離によって収集し、その沈殿物を生理食塩水または緩衝液中に所望の濃度になるように再懸濁する。
【００６５】
精製された抗体画分は、診断分析系において使用するためにさらに修飾されてもよい。そのような修飾は、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ（Ｒ) 、ラクトペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、およびＥＬＩＳＡ検定法で使用されるその他のもののような酵素との連結を包含し得る。抗体は蛍光性部分で修飾されてもよい。最適には、この蛍光が、抗体と抗原との結合の際に消光または増強されるとよい。抗体抗原相互作用の程度を検定するためのこれらの手法は、当技術分野において周知である。本開示のキサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド、キサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド・コンジュゲートおよび抗体はまた、ナトリウムのバランス異常による様々な疾患の検知および診断にも有用であり、特にＥＬＩＳＡまたはＥＭＩＴのような検定法のための較正溶液に有用な高純度物質を提供する点において有用である。
【００６６】
特定の抗原に対する抗体の均質集団であるモノクローナル抗体は、細胞株を連続培養して抗体分子を産生させる任意の手法によって得ることが可能である。該手法には、コーラー(Koehler) およびミルシテイン（Milstein）のハイブリドーマ技術（Nature、第２５６巻：４９５−７頁（１９７５年）；および米国特許第４，３７６，１１０号明細書）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（コスバー（Kosbor）ら、Immunology Today、第４巻：７２頁（１９８３年）；コート（Cote）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第８０巻：２０２６−３０頁（１９８３年））、ならびにＥＢＶハイブリドーマ技術（コール（Cole）ら、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy、アラン  アール．リス  インコーポレイテッド（Alan R. Liss, Inc.）、ニューヨーク、７７−９６頁（１９８５年）より）が含まれるが、これらに限定されるものではない。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤなどの任意のクラスの免疫グロブリンおよびそれらの任意のサブクラス
であり得る。この開示のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、インビトロで培養してもよいし、またはインビボで培養してもよい。インビボにおいて高力価のｍＡｂが産生されるため、これが現在の好ましい製造方法となる。
【００６７】
さらに「キメラ抗体」の生産のために開発された技術（モリソン（Mo rrison）ら、Proc. Natl. Acad. Sci.、第８１巻：６８５１−６８５５頁（１９８４年）；タケダら、Nature、第３１４巻：４５２−５４頁（１９８５年））を用いることができる。前記技術は
、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒に継ぎ合わせることによる。キメラ抗体は、マウスｍＡｂに由来する可変領域と、ヒト免疫グロブリンの定常領域とを有する分子のような、異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。
【００６８】
これに代わって、単鎖抗体の生産について記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号明細書；バード（Bird）、Science 、第２４２巻：４２３−２６頁（１９８８年）；ヒューストン（Huston）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第８５巻：５８７９−８３頁（１９８８年）；およびウォード（Ward）ら、Nature、第３３４巻：５４４−４６頁（１９８９年））は、遺伝子−単鎖抗体を生成するのに適合され得る。単鎖抗体は、一般的には、Ｆｖ領域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントをアミノ酸ブリッジによって連結して、単鎖ポリペプチドを生じることにより形成される。
【００６９】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、既知の技術によって生成され得る。例えば、そのようなフラグメントには、抗体分子のペプシン消化によって生成され得るＦ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成され得るＦａｂフラグメントが含まれるが、これらに限定されるものではない。上記に代わり、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にするために、Ｆａｂ発現ライブラリを構築してもよい（ヒューズ（Huse）ら、Science 、第２４６巻：１２７５−８１頁（１９８９年））。
【００７０】
診断薬、標準物またはキットに使用される酵素は、コンジュゲーションの容易さ、ターンオーバー率、および未知物（分析対象）が測定されることになっている生理液に応じて、広く変化し得る。最適な代表的酵素としては、米国特許第３，８１７，８３７号明細書に見られるヒドロリアーゼ、ヌクレアーゼ、アミダーゼ、エステラーゼなどが挙げられる。前記特許文献は参照によって本願に援用される。
【００７１】
診断薬、標準物またはキットにおいて使用するための、本明細書に記載するような抗体を標識する方法および装置は、米国特許第４，３６６，２４１号明細書に記載されている。前記特許文献は参照によって本願に援用される。
【００７２】
診断法
本発明は、ヒト体液（全血、尿、ＣＳＦ、血清、血漿、眼球、糞便、汗）中のキサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドの定量化をさらに含む。この定量化は、ナトリウムバランス異常の疾患との関連付けに用いられ得る。そのような疾患には、高血圧症（低レニン、低アンジオテンシン）、うっ血性心不全（浮腫）、ネフローゼ症候群、肝硬変、月経前浮腫、周期的浮腫および心臓性ショックが含まれ得る。キサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドの定量化が有用であると判明するかもしれないその他の臨床状態としては、患者が非常に多量の水分を与えられる術後環境および戦場環境、並びにフロセミド投与と組み合わせたカリウム保持が挙げられる。キサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドの定量化は、「エスケープ現象（Escape Syndrome ）」にも有用であり得る。エスケープ現象では、腫瘍が不適当に増大して、アルドステロンに影響し、次いで、ナトリウム排泄が低下することにより心血管系において体液貯留が２リットル増加する。この段階で
は、体液およびナトリウムの喪失が引き起こされて２リットルの過剰状態が維持されることにより、「エスケープ現象」が生じる。体液過剰な状態がキサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドの増加をもたらし、その増加が、次に、ナトリウム排泄および付随する体液喪失を刺激することにより「エスケープ現象」をもたらすことが提案されている。
【００７３】
キサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドの過剰または不足に関連した疾病状態を診断するためには、様々な方法を用いることができる。
本明細書において記載する方法は、例えば、少なくとも１つの本明細書に記載する特異抗体試薬を含む、あらかじめパッケージにされた診断キットを用いることにより実施され得る。前記診断キットは、例えば、病徴を示している患者または疾病を発症するおそれがある患者を診断するために臨床環境において、便利に使用され得る。
【００７４】
下記に記載する診断法においては、いかなるヒト生体試料または組織を用いてもよい。例えば、全血、尿、唾液、脳脊髄液、血清、血漿、眼球、糞便または汗を用い得る。
生体試料中におけるキサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドを検出するための診断法は、例えば、固相酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を含む不均一系酵素免疫検定法のような免疫検定法、および酵素増幅免疫検定法（ＥＭＩＴ）などの溶液相均一系酵素免疫検定法を含む。キサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドは、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）またはキャピラリー電気泳動質量分析法（ＣＥ−ＭＳ）によって、例えば尿試料の固相抽出による任意の前処理を伴って、測定され得る。さらに、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を展開してもよい。前記技術においては、標的膜分子に結合するキサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドの機能的性質を調査するために、チップを用いた光学的バイオセンサシステムが用いられる。前記技術において、キサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドの供給源は、血清、尿および細胞培養培地のような不純混合物に由来する。ＳＰＲ技術は、異なる種類の細胞においてキサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドに対する細胞膜受容体を発見し、特徴付けるのに有用であろう。
【００７５】
キサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドに対する免疫検定法は、典型的には、キサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドを識別することができる、検出可能に標識された抗体の存在下において、体液、組織抽出物、新規に採取した細胞、または組織培養においてインキュベートされた細胞のような生物学的試料をインキュベートすることと、当技術分野において周知である多数の技術のうちのいずれかにより、結合抗体を検出することとを含む。
【００７６】
生体試料を、ニトロセルロースのような固相支持体または担体、または細胞、細胞小片または可溶性タンパク質を固定可能な他の固体担体に接触させ、それらの担体上に固定化する。次に、前記支持体を適切な緩衝剤で洗浄した後、検出可能に標識された遺伝子特異抗体によって処理する。次に、前記固相支持体に対して、未結合の抗体を除去するために、緩衝剤による２回目の洗浄を行う。その後、固体支持体上に結合されている標識の量を従来の手段によって検出し得る。
【００７７】
「固相支持体または担体」という用語は、抗原または抗体を結合することができる任意の支持体を包含することが意図される。周知の支持体または担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然セルロースおよび修飾セルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩およびマグネタイトが挙げられる。担体の性質は、本開示の目的に対しては、ある程度まで可溶性であってもよいし、または不溶性であってもよい。つながれる分子が抗原または抗体に結合することができる限り、支持体材料は、実際には、任意の可能な構造的構成を有してよい。したがって、支持体の構成は、ビーズのように球状であってもよいし、あるいは試験管の内面もしく
は棒の外面のように円筒状であってもよい。別例として、表面が、シート、試験片などのように平坦であってもよい。好ましい支持体としては、ポリスチレンビーズが挙げられる。当業者であれば、抗体または抗原を結合させるのに適した他の多くの担体を知っているか、または通常の実験により、そのような担体を確認することができるであろう。
【００７８】
実際には、多くの免疫検定法にはマイクロタイタープレートが好都合に用いられる。係留される成分の固定化は、非共有結合でも共有結合でもよい。非共有結合は、単に固体表面をキサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドバイオコンジュゲートの溶液でコーティングして乾燥させることによって行われ得る。別例として、キサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドに特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体、を用いて、該タンパク質を固体表面に係留してもよい。前記表面は、予め調製されて、保存されていてもよい。前記検定を行うために、非固定化成分が、係留成分を含むコーティング表面に添加される。反応が完了した後、未反応成分は、形成されたいかなる複合体も固体表面に固定されたままとなるような条件下で（例えば洗浄によって）除去される。固体表面上に係留された複合体の検知は、多くの方法によって行うことができる。事前に固定化されない成分が予め標識される場合には、表面上に固定された標識の検出により、複合体が形成されたことが示される。事前に固定化されない成分が予め標識されない場合には、間接的な標識を用いて表面上に係留された複合体を検出することができる。例えば、事前に固定化されない成分に対して特異的な標識抗体を使用する（次いで該抗体を標識された抗Ｉｇ抗体で直接標識するか、または間接的に標識する）。
【００７９】
例えば、キサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドのような小さな分析対象を測定するためには、競合的阻害検定が頻繁に用いられる。これは、競合的阻害検定が、例えば標準的なＥＬＩＳＡ形式において用いられる場合のように２つの抗体ではなく、１つの抗体の結合しか必要としないためである。２つの抗体が小さな分子と同時に結合しようとする場合に生じる立体障害の可能性から、サンドイッチアッセイ形式が適さない場合があり、従って、競合的阻害検定法が望ましいことがある。逐次的な競合的阻害検定法（sequential competitive inhibition assay ）においては、試料およびコンジュゲートされた分析対象をサンドイッチ検定法のように段階的に添加するが、古典的な競合的阻害検定法においては、これらの試薬を同時に一緒にインキュベートする。
【００８０】
逐次的な競合的阻害検定形式では、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）で９６ウェルのマイクロタイタープレートをコーティングする。試料が添加されると、ＭＡｂは試料中から遊離の分析対象を捕捉する。次の工程では、ビオチンまたはＨＲＰのいずれかで標識された既知量の分析対象が添加される。すると、この標識された分析対象も、プレート上に吸着したＭＡｂに結合しようとするが、標識された分析対象は、先に結合した試料由来の分析対象の存在によってＭＡｂへの結合を妨げられる。これは、前記モノクローナル抗体が試料由来の未標識の分析対象と既に結合していれば、標識された分析対象はプレート上のモノクローナル抗体と結合しないことを意味する。試料中の未標識の分析対象の量は、標識された分析対象によって生成されるシグナルに反比例する。シグナルが低いほど、試料中に未標識の分析対象がより多く存在することになる。未標識の分析対象標準物の段階希釈物を用いて、標準曲線を構成することができる。次に、サンドイッチＥＬＩＳＡ形式で行われるのと同じようにして、その後得られたサンプルの値を標準曲線から読み取ることができる。
【００８１】
古典的な競合的阻害検定形式では、標識された分析対象（コンジュゲートされた分析対象）および未標識の分析対象（試料由来の分析対象）を同時に添加する必要がある。その後、標識された分析対象および未標識の分析対象の双方が、プレート上のモノクローナル捕捉抗体の結合部位に対して同時に競合する。逐次的な競合的阻害形式と同様に、有色のシグナルは、試料中の未標識の標的分析対象の濃度に反比例する。
【００８２】
標識された分析対象の検出は、ＴＭＢのようなペルオキシダーゼ基質を用いることによりなされてもよい。そのような検出は、マイクロタイタープレートリーダーで読み取ることができる。例えば、標準曲線（１点のブランクおよび７点の標準物）および３点の対照を用いて、９６ウェルマイクロタイタープレート形式で、２１個の試料を３連で、３７個の試料を２連で試験することができる。
【００８３】
別の例として、本開示に有用な抗体または抗体のフラグメントを用いて、キサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドの存在を定量的または定性的に検出してもよい。これは、例えば、蛍光標識された抗体（以下を参照）を使用する免疫蛍光法を、光学顕微鏡による検出、フローサイトメトリーによる検出、または蛍光分析による検出を併せることによって行うことができる。
【００８４】
本開示に有用な抗体（またはそのフラグメント）は、加えて、キサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドのｉｎ  ｓｉｔｕ検出のために、免疫蛍光または免疫電子顕微鏡法におけるように組織学的に使用されてもよい。ｉｎ  ｓｉｔｕ検出は、患者から組織学的標本を取り出し、その標本に本開示の標識抗体を適用することにより行われ得る。抗体（またはフラグメント）は、好ましくは、生体試料を標識抗体（またはフラグメント）で覆うことにより適用される。そのような手順を用いることにより、検査組織中におけるキサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドの存在だけでなく、その分布も測定することが可能である。当業者は、本開示を用いて、そのようなｉｎ  ｓｉｔｕ検出を行うために様々な組織学的方法（染色法など）のいずれをも変更することができることを容易に理解するであろう。
【００８５】
当業者であれば、通常の実験を用いることによって、各測定に対する操作条件および最適な検定条件を決定することができるであろう。
遺伝子ペプチド特異抗体が検出可能に標識され得る方法のうちの１つは、遺伝子ペプチド特異抗体を酵素に連結して、それを酵素免疫検定法（ＥＩＡ）において用いることによる（フェラー（Voller）、Ric Clin Lab、第８巻：２８９−９８（１９７８年）［「The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 」、Diagnostic Horizons 第２巻：１−７頁、１９７８年、Microbiological Associates Quarterly Publication、ウォーカーズヴィル、メリーランド州］；フェラー（Voller）ら、J. Clin. Pathol.、第３１巻：５０７−２０頁（１９７８年）；バトラー（Butler）、Meth. Enzymoｌ、第７３巻：４８２−５２３頁（１９８１年）；マッジオ（Maggio）編、「Enzyme Immunoassay」、シーアールシー  プレス（CRC Press ）、フロリダ州ボカラトン、（１９８０年）；イシカワら編、「酵素免疫測定法」、医学書院、東京（１９８１年））。抗体に結合される酵素は、適切な基質、好ましくは色素形成基質と、例えば、分光測光法、蛍光測定、あるいは視覚手段によって検出可能な化学部分を生成するように、反応するであろう。検出可能に抗体を標識するために用いることができる酵素としては、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌性ヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β‐ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これらに限定されるものではない。検出は、その酵素に対する色素形成基質を使用する比色法によって行うことができる。また、基質の酵素反応の程度を、同様に準備した標準物と比較する目視比較によって、検出を行なってもよい。
【００８６】
様々な他の免疫検定法のうちのいずれを用いて検出を行ってもよい。例えば、抗体または抗体フラグメントを放射活性物質により標識することによって、ラジオイムノアッセ（
ＲＩＡ）を使用してキサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドを検出することが可能である（例えば、ワイントラウブ、ビー（Weintraub, B. ）、「Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques」、The Endocrine Society 、１９８６年３月、を参照されたい）。放射性同位体は、ガンマカウンターもしくはシンチレーションカウンターの使用、またはオートラジオグラフィーのような手段によって検出することができる。
【００８７】
蛍光性化合物で抗体を標識することも可能である。蛍光標識した抗体を適切な波長の光に曝露すると、蛍光によりその抗体の存在を検出することができる。とりわけ最も一般に使用される蛍光標識化合物としては、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレサミンがある。
【００８８】
抗体はまた、１５２Ｅｕのような蛍光発光金属、または他のランタノイドを用いて、検出可能に標識することができる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート化基を用いて抗体に付加することができる。
【００８９】
また抗体は、該抗体を化学発光化合物に結合させることにより検出可能に標識することができる。化学発光標識された抗体の存在は、次いで、化学反応の間に発生するルミネセンスの存在の検出により測定される。特に有用な化学発光標識化合物は、ルミノール、イソルミノール、テロマティックアクリジニウムエステル（theromatic acridinium ester ）、イミダゾール、アクリジニウム塩およびオキザラートエステルである。
【００９０】
同様に、本開示の抗体を標識するために生物発光化合物を用いてもよい。生物発光は、生物系において見られる化学発光の一種であり、該発光においては、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増大させる。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在の検出により測定される。標識を目的とする重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
【００９１】
本願の全体にわたって、様々な刊行物、特許文献および公開特許出願は識別する引用部によって参照される。本願で参考文献として載せられた刊行物、特許明細書および公開特許明細書の開示は、本開示が関係する技術的現状をより完全に説明するために、参照により本開示に援用される。
【００９２】
酵素増幅免疫検定法（ＥＭＩＴ）は、キサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドの大きさが小さいので使用され得る。例えばディアシュ（Dias）らが述べている方法により、定性的検定法および定量的検定法の双方において様々なＥＭＩＴ法を用いることができる（ディアシュ（Dias）ら、「The EMIT Cyclosporine Assay: development of application protocols for the Boehringer Mannheim Hitachi 911 and 917 analyzers 」、Clin. Biochem.、１９９７年３月；第３０巻（２）：１５５−６２頁を参照されたい）。臨床環境におけるＥＭＩＴの利点としては、（１）試料調製が最小限であるかまたは不要であること、（２）試料サイズが小さいこと、（３）ＨＰＬＣとＲＩＡのような他の方法との相関性に優れること、（４）遊離の酵素標識と結合した酵素標識とを分離する必要がないので短時間（１分未満）であること、最も一般的な化学分析装置に対する適応が容易であることが挙げられる。
【００９３】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、固定されたキサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド特異抗体に対する溶液相反応体としてキサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドを検出することも可能である。ＳＰＲ法の開発のために、マクドネル（McDonn
ell ）およびリッチ（Rich）らの技術を用いてもよい（マクドネル、ジェイ．エム．（McDonnell, J.M. ）、「Surface plasmon resonance: towards an understanding of the mechanisms of biological molecular recognition.」、Current Opinion in Chemical Biology 、２００１年、第５巻（５）：５７２〜５７７頁；リッチ、アール．エル．（Rich, R.L.）ら、「High-resolution and high-throughput protocols for measuring drug/human serum albumin interactions using BIACORE 」、Analytical Biochemistry 、２００１年、第２９６巻（２）：１９７〜２０７頁）。様々なフロースルーセルを構成して、それらのフロースルーセルをＢｉａｃｏｒｅという商標を有する機器のような市販のＳＰＲバイオセンシング機器とインラインに配置してもよい。一般に、ＳＰＲ活性金被覆スライドガラス上に特異抗体を固定して該スライドガラスがフローセルの１つの壁を形成し、水性緩衝液中のキサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド分析対象を、フローセルを横断して流れるように注入する。光（可視または近赤外）が、いわゆる「表面プラズモン共鳴」条件に近い角度および波長でスライドガラスを通って金表面上に照射されると、金の光学的反射率は、金の表面上、または金上の薄いコーティング中における生体分子の存在に対して非常に敏感に変化する。溶液相の反応体と固定された抗体との間における結合の程度は、この反射率変化を観測することによって容易に観察かつ定量される。
【００９４】
高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、尿中のキサンツレン酸−８−Ｏ−ｂ−Ｄグルコシドを検出するために使用され得る。例えば、Ｃ１８カートリッジにおける尿試料の固相抽出およびそれに続く陽イオン交換樹脂カラムの通過を用いることができる。試料の検出は、ＵＶ、蛍光または光散乱法によって行われ得る（例えば、マルシリオ（Marsilio）ら、Clinical Chemistry、１９９８年、第４４巻：１６８５〜１６９１頁を参照されたい）また、生体試料中のキサンツレン酸−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドを定量するために、任意で固相抽出による尿試料の前処理を伴ってキャピラリー電気泳動（ＣＥ）またはキャピラリー電気泳動質量分析法（ＣＥ−ＭＳ）を使用してもよい。（ヘ（He）ら、J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 、１９９９年４月３０日、第７２７巻（1 −２）：４３〜５２頁；テオドリディス（Theodoridis ）ら、J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 、２０００年８月４日、第７４５巻（１）：４９−８２頁）
本発明について、以下の非限定的な実施例に言及することにより、より詳細に説明する。
【００９５】
実施例
【実施例１】
【００９６】
キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドの合成
【００９７】
【化２】
0005456975.tif 000003
工程１：キサンツレン酸２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル８−Ｏ−β−Ｄ−グル
コシドの合成。（例えば、リアル（Real）ら、J. Biol. Chem.、１９９０年、第２６５巻（１３）、７４０７〜７４１２頁参照）
キサンツレン酸は、米国ウイスコンシン州ミルウォーキー所在のアルドリッチ（Aldrich ）から商業的に入手した。１ＭのＮａＯＨ水溶液（１０ｍＬ）中のキサンツレン酸（９３０ｍｇ、４．５３ｍｍｏｌ）を１０℃に冷却した。アセトン（１６ｍＬ）中の２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル８−α−Ｄ−グルコピラノシルブロミド（２．０３ｇ、４．９４ｍｍｏｌ）を１０分間にわたって滴下して添加した。その溶液を４時間かけて室温に温めた。追加の１ＭのＮａＯＨ（３ｍＬ）水溶液を３０分にわたってゆっくりと添加し、その溶液を３０分間攪拌した。その混合物を水およびジエチルエーテルで抽出した。水性部分をｐＨ３．５まで酸性化し、１：１のテトラヒドロフラン／酢酸エチルでさらに抽出した。合わせた有機層を、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムによって脱水した。濾過に続いて、粗製キサンツレン酸テトラ−Ｏ−アセチル８−β−Ｄ−グルコシド中間物を真空内で濃縮して、約１グラムの粗製残留物を得た。残留物を４：１のジメチルスルホキシド／水（２８ｍＬ）と共に粉砕し、濾過して乾燥させると、オフホワイトの固体中間物として２１５ｍｇのキサンツレン酸テトラ−Ｏ−アセチル８−β−Ｄ−グルコシドが生じた。母液を高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってさらに精製して、さらに６０ｍｇの中間物を回収し（Ｃ１８、０．２％のトリフルオロ酢酸を含む水／アセトニトリル；段階的溶離）、合わせて１１．５％の収率となった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１．９７（ｓ、３Ｈ）、１．９９（ｓ、３Ｈ）、２．００（ｓ、３Ｈ）、２．０６（ｓ、３Ｈ）、４．０５−４．３０（ｍ、３Ｈ）、５．０７（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．２３（ｄｄ、Ｊ＝９．６、７．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．４４（ｔ、Ｊ＝９．６０Ｈｚ、１Ｈ）、５．６７（ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、１Ｈ）、６．６５（ｓ、１Ｈ）、７．３７（ｔ、Ｊ＝８．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．４８（ｄｄ、Ｊ＝７．５、１．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．８１（ｄｄ、Ｊ＝８．１、１．２Ｈｚ、１Ｈ）、９．４４（ｂｓ、１Ｈ）。ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ５３６．４４（Ｍ＋Ｈ＋）。
【００９８】
工程２：キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド
工程１からのキサンツレン酸２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド（１９０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を、メタノール（５ｍＬ）中９５％ナトリウムメトキシド（４０ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）溶液に添加した。その混合物を１時間撹拌した。前記混合物を１ＭのＨＣｌ水溶液でｐＨ３．５に調節した。そのスラリーを２０ｍＬのジエチルエーテルで希釈して濾過した。濾過ケーキを１：１メタノール／ジエチルエーテルで洗浄し、真空内で乾燥させて、収率８２％で１１８ｍｇのキサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドを得た。ＦＴＩＲ（ｎｅａｔ）３０００−３７００（ｂｒ  ｓ）、３３６５、２９３４、１６２６、１６０２ｃｍ−１。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ３．１０−３．７０（ｍ、６ＨおよびＨ２Ｏ）、４．８７（ｄ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．９５（ｍ、１Ｈ）、５．１６（ｍ、１Ｈ）、５．３３（ｍ、１Ｈ）、５．８１（ｍ、１Ｈ）、６．４７（ｓ、１Ｈ）、７．２１（ｔ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．０７（ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．２４（ｄｄ、Ｊ＝８．４、１．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．４７（ｓ、＜１Ｈ、部分的交換）、１０．４７（ｂｒ、ｓ、１Ｈ）。１３Ｃ−ＮＭＲ（７５．４ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ６０．７４、６９．６２、７３．４９、７６．５６、７７．６６、１０３．７３、１０７．７３、１１９．６５、１２２．７２、１２６．７９、１３２．００、１４６．２４、１４７. ０５、１６２．８５、１６６．８８、１７８．３３。エレクトロスプレイイオン化質量スペクトル（ＥＳＩ−ＭＳ）ｍ／ｚ  ３６８．３１（Ｍ＋Ｈ＋）。
【実施例２】
【００９９】
キサンツレン酸８−Ｏ−サルフェートの合成
【０１００】
【化３】
0005456975.tif 000004
２．９ｍＬの１Ｎ  ＮａＯＨおよび２．１ｍＬのｄＨ２Ｏ（脱イオン水）中のキサンツレン酸（３００ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）溶液に三酸化硫黄トリメチルアミン（４０７ｍｇ、２．９２ｍｍｏｌ）および５ｍＬのアセトンを室温で添加した。反応容器（２０×１２５ｍｍチューブ）を窒素下で密封し、７０℃で１６時間にわたって撹拌した。反応物は室温に冷却し、減圧下で乾燥状態に濃縮した。残留物を、アセトン、アセトニトリル、ジクロロメタン、酢酸エチルおよび次いでジエチルエーテルによって連続的に洗浄した。回収した固体を、真空下で一晩放置した。前記固体を３ｍＬのｄＨ２Ｏに溶解して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｒ）ＳＰ−Ｃ２５カラム（４×１１ｃｍ、４０−１２５μ）にかけ、ｄＨ２Ｏで溶離したところ、２５０℃（ｄｅｃ．）を超える融点（ｍｐ）を有する光沢褐色粉末として表題化合物のナトリウム塩（４７４ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ）が９８．８％の収率で得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δ６．６７（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、７．２８（ｂｒ  ｄｄ、Ｊ＝８．１、７．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．５６（ｂｒ  ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．７９（ｂｒ  ｄ、Ｊ＝８．１Ｈｚ、１Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δ１０８．５、１２２．１、１２４．９、１２５．６、１２６．１、１３２．６、１４０．７、１４４．７、１６６．３、１８１．０。ＩＲ（固体、ｃｍ−１）２８３５、２５４５、１６８７、１６０１、１３７２、１３７２、１２５４。
【実施例３】
【０１０１】
キサンツレン酸８−Ｏ−サルフェートおよびキサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドの単離
尿毒症のヒト患者からの尿試料を２４時間の期間にわたって収集した。典型的な収集量は患者１人当たり２〜３リットルであった。個々の試料を乾燥状態に凍結乾燥し、１００ｍＬの脱イオン水で還元した。還元した試料（装荷量２５ｍＬ）を、ゲル濾過ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラムクロマトグラフィを用いて１０ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ６．８）によって１０℃で溶離することによりサイズ分画し、２８５ｎｍのＵＶおよび導電率によって監視した。ＵＶ活性を有し、かつオスモル濃度＜１００ｍＯｓｍである後期溶出（塩ピークの後）画分１０ｍＬを、生物学的活性について、ブリッカー（Ｂｒｉｃｋｅｒ）らのカエル皮膚検定法によってスクリーニングした。（Kidney International  第４４巻（１９９３年）１１月；４４（５）：９３７〜４７頁）。活性を有する画分（各１０ｍＬ）を凍結乾燥によって濃縮し、１ｍＬの脱イオン水で還元した。
【０１０２】
生物学的活性を有する還元されたＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５画分を、オクタデシルシリル( フェノメネクス（Phenomenex）のＳｐｈｅｒｅＣｌｏｎｅ（ＴＭ）ＯＤＳ２、 ３５
℃) 準分取ＨＰＬＣカラムにおける高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；装荷量１ｍＬ）において、０．１Ｍのピリジウムアセテート（pyridium acetate）：メタノールを０〜４０％メタノール／１１分の勾配で４ｍＬ／分として、各２ｍＬの画分を収集することによってさらに分画した。溶離は、蛍光（励起３３２ｎｍ、発光４３０ｎｍ）およびＵ
Ｖ（３３８ｎｍ）によって監視した。１２．４分の保持時間（ＲＴ）を有する画分を、複数回の実施分について合わせ、ほぼ１０倍に濃縮した。前記画分を上記のＨＰＬＣ系に再度供し、１ｍＬの注入量で、９２％０．１Ｍ／８％メタノールを４ｍＬ／分とするアイソクラティック方式で実施した。蛍光は、励起３３２ｎｍ、発光４３０ｎｍで監視した。ＵＶは３３８ｎｍで監視した。これらの最大値はキサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドに対するものである。１０〜１３分の溶出液を、１２秒（０．８ｍＬ）の画分として収集した。１１．２〜１１．６分のＲＴの間に溶出する画分は、キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドを含み、１２．０〜１２．５分のＲＴの間に溶出する画分は、キサンツレン酸８−Ｏ−サルフェートを含んでいた。キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドまたはキサンツレン酸８−Ｏ−サルフェートのいずれかを含む画分を別々に貯留して、サバント（Savant）のＳｐｅｅｄ−Ｖａｃ（Ｒ）Ｐｌｕｓ（ＳＣ２１０Ａ）にて中温で濃縮した。貯留物を、Ｃ−１８逆相ＨＰＬＣカラム（フェノメネクスＰ／ＮＯ  ００Ｇ−４３７５−Ｅ０、ＳＹＮＥＲＧＩ（ＴＭ）４ｕ  Ｈｙｄｒｏ−ＲＰ  ８０Ａ  ２５０×４．６ｍｍ、４ミクロン）を用いた分析規模のアイソクラティックＨＰＬＣに再び供した。ＨＰＬＣ精製は、３５℃で、８％のメタノールおよび０．１％の０．１Ｍピリジウムアセテートを１ｍＬ／分で用いるアイソクラティック方式で実施した。溶出物を、３３８ｎｍのＵＶ吸光度と、励起３３２ｎｍ、発光４３０ｎｍによる蛍光検出によって監視した。キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドを含む画分は、ＲＴ＝１０．２〜１０．６分であった。別個のキサンツレン酸８−Ｏ−サルフェートの実施分からの各画分は、ＲＴ＝１１〜１１．５分であった。画分を合わせ、ｐＨを上げるために時々ピリジンを添加しながら、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃで濃縮した。精製されたキサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドを、同じ分析カラムに再度供して、ピリジウムアセテートを除去するために２０％メタノール水溶液で溶離した。キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドはこの手法による濃縮の際に結晶を形成した。単離キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド（Ｃ１６Ｈ１７ＮＯ９）について：ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）３６７．０９、３６８．０９４（Ｍ＋Ｈ）および２２９（Ｍ−グルコース＋Ｎａ＋）；１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δ３．５８（ｄｄ、Ｊ＝９、９．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．６５（ｄｄ、Ｊ＝９、９．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．６７（ｍ、１Ｈ）、３．８０（ｄｄ、１Ｈ）、３．８１（ｄｄ、Ｊ＝８、９．５Ｈｚ）、３．９５（ｄｄ、１Ｈ）、５．２４（ｄ、Ｊ＝８Ｈｚ、１Ｈ）、６．９３（ｓ、１Ｈ）、７．４７（ｔ、Ｊ＝８Ｈｚ、１Ｈ）、７．５９（ｄｄ、Ｊ＝８、２Ｈｚ、１Ｈ）、７．９０（ｄｄ、Ｊ＝８、２Ｈｚ）ｐｐｍ；１３Ｃ−ＮＭＲ（１２６ＭＨｚおよびＤ２Ｏ／ＣＤ３ＯＤ）δ６０．８、６９．７、７２．９、７５．７、７６．７、１０１．２、１０８．１、１１７．９、１１８．２、１２４．５、１２５．２、１３０．６、１４３．９、１４５．５、１６５．９、１８０．３ｐｐｍ。
【０１０３】
単離キサンツレン酸８−Ｏ−サルフェート（Ｃ１０Ｈ７ＮＯ７Ｓ）について：ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）２８４．９９４、２８５．９９８（Ｍ＋Ｈ＋）。
【実施例４】
【０１０４】
正常なスプラーグ・ドーリー（Sprague Dawley）ラットにおける合成キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド（２μｇ静脈内投与）に対するナトリウム利尿反応
雌のスプラーグ・ドーリーラット（ＳＤラット）（２５０ｇ）をエーテルで軽く麻酔し、ＰＥ１０チューブを用いて、尾静脈カテーテルを配置した。加えて、潤滑剤としてＫＹゼリーおよび２％リドカインを用いて尿道カテーテルを挿入した。尿を１．５ｍＬの微小遠心管内に収集できるように、ラットを改造したＰｌｅｘｉｇｌａｓ（Ｒ）チューブ内に拘束した。生理食塩水の輸液を時間ゼロにおいて開始し、検定法の継続期間中、０．０２ｍＬ／分とした。同じ静脈内カテーテルを用いて試験化合物を注入した。２μｇの合成キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドを、表示した時間において、生理食塩水中１ｍＬの量で、１０分間にわたって注入した。管を１４，０００ｒｐｍで遠心分離機にかけて、尿からあらゆるＲＢＣを分離した。尿中のＮａ＋およびＫ＋の濃度を各イオン選択性電
極によって測定した。Ｎａ＋およびＫ＋の排泄速度は、（尿の量／収集時間）×（尿中イオン濃度）によって計算した。結果を図１〜図４に示す。静脈内投与による２μｇの合成キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドは、正常なラットにおいて持続的なナトリウム利尿反応をもたらした。Ｎａ＋の排泄は、図３および図４に示されるように、尿量の増加よりも、尿中Ｎａ＋濃度の増加によるものであった。２５０ｇのラットで細胞外容量を５０ｍＬとすると、試験化合物の濃度は、１０−６Ｍ、可能最小投与量となった。同様の実験において、非誘導体の合成キサンツレン酸は、２μｇの静脈内投与でＮａ＋排泄を増加させなかった。しかしながら、その後合成キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドを投与するとナトリウム利尿をもたらした。
【実施例５】
【０１０５】
正常なＳＤラットにおける合成キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド（１０μｇ静脈内投与）に対するナトリウム利尿反応
雌のＳＤラット（２５０ｇ）をエーテルで軽く麻酔し、ＰＥ１０チューブを用いて尾静脈カテーテルを配置した。加えて、潤滑剤としてＫＹゼリーおよび２％リドカインを用いて尿道カテーテルを挿入した。１．５ｍＬ微小遠心管に尿を収集できるように、ラットを改造したＰｌｅｘｉｇｌａｓ（Ｒ）チューブ内に拘束した。時間ゼロにおいて生理食塩水の輸液を開始し、検定法の期間中、０．０２ｍＬ／分とした。同じ静脈内カテーテルを用いて試験化合物を注入した。１０μｇの合成キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドを、表示した時間において、静脈内に、生理食塩水中１ｍＬの量で、１０分間わたって注入した。表示した時間において、生理食塩水の輸液を、１０分間にわたって１０倍の０．２ｍＬ／分まで増加し、検定法の継続期間中は０．０２ｍＬ／分に戻した。管を１４，０００ｒｐｍで遠心分離機にかけて、尿からあらゆるＲＢＣを分離した。尿中のＮａ＋およびＫ＋の濃度を各イオン選択性電極によって測定した。Ｎａ＋およびＫ＋の排泄速度は、（尿の量／収集時間）×（尿中イオン濃度）によって計算した。結果を図５〜図８に示す。１０μｇの静脈内投与による合成キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドは、正常なラットにおいて持続的なナトリウム利尿反応をもたらした。Ｋ＋排泄は、キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドに応じて増加することはなかった。図６における初期のナトリウム利尿反応（１０〜２０分）は、図８に示される尿量の増加によるものであり、図７に示される尿中Ｎａ＋濃度の増加によるものではなかった。しかしながら、投与６０〜９０分後までは、ナトリウム利尿は、図７に示されるような尿中Ｎａ＋濃度の増加によるものであった。
【０１０６】
尿の生成は、投与１４０分後に減少し、その結果ナトリウム利尿の低下をもたらした。しかしながら、生理食塩水の輸液を、１０分間にわたって１０倍の０．２ｍＬ／分まで増加すると、Ｎａ＋排泄速度は、図６に見られるように、２μＥｑ／分から１０μＥｑ／分まで増加した。これらのデータは、水分補給およびＧＦＲが十分で、流体が充分に遠位尿細管に達した場合のみ、キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドが遠位尿細管におけるＮａ＋再吸収を抑制してＮａ＋排泄をもたらすという考えと一致する。
【実施例６】
【０１０７】
正常なＳＤラットにおける合成キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド（１０μｇ）およびそれに続くフロセミド（１００μｇ）に対するナトリウム利尿反応（経口投与）
雌のＳＤラット（２５０ｇ）をエーテルで軽く麻酔し、潤滑剤としてＫＹゼリーおよび２％リドカインを用いて尿道カテーテルを挿入した。尿を１．５ｍＬの微小遠心管中に収集できるように、ラットを改造したＰｌｅｘｉｇｌａｓ（Ｒ）チューブ内に拘束した。生理食塩水の輸液は投与しなかった。合成キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドを、表示した時間において、１ｍＬの量の水に入れて、１分間の間に、経口ゾンデにより注入した。６０分後に、１００μｇのフロセミドを、経口ゾンデによって同様に投与した。管を１４，０００ｒｐｍで遠心分離機にかけて、尿からあらゆるＲＢＣを分離した。尿中の
Ｎａ＋およびＫ＋の濃度を各イオン選択性電極によって測定した。
【０１０８】
Ｎａ＋およびＫ＋の排泄速度は、（尿の量／収集時間）×（尿中イオン濃度）によって計算した。結果を図９〜図１２に示す。合成キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド（１０μｇ）は、正常なラットにおいてナトリウム利尿反応をもたらすことにおいて、経口で活性であった。経口投与６０分後、フロセミド（１００μｇ）は、図９〜図１１に見られるように、持続的なＮａ＋排泄をもたらした。キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドで前処理してからフロセミドで処理すると、Ｎａ＋排泄が増加したが、図１０でＫ＋排泄は増加しなかった。フロセミドのみを経口投与すると、Ｎａ＋排泄およびＫ＋排泄の双方をもたらした（データは図示せず）。キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドによる前処理は、フロセミド誘発性のＫ＋排泄を抑制した。
【実施例７】
【０１０９】
尿毒症のＳＤラットにおける、単離キサンツレン酸８−Ｏ−Ｂ−Ｄ−グルコシド（３μｇ）およびそれに続くフロセミド（２０μｇ）に対するナトリウム利尿反応（静脈内投与）
体重２２５ｇの雌のＳＤラットについて、一方の腎臓と、もう一方の腎臓の３０〜５０％とを結紮することにより尿毒症にした。２週間後、前記ラットは、ナトリウム利尿活性に関して試験する準備ができた。ラットをエーテルで軽く麻酔し、ＰＥ１０チューブを用いて尾静脈カテーテルを配置した。加えて、潤滑剤としてＫＹゼリーおよび２％リドカインを用いて尿道カテーテルを挿入した。尿を１．５ｍＬの微小遠心管中に収集できるように、ラットを改造したＰｌｅｘｉｇｌａｓ（Ｒ）チューブ内に拘束した。検定期間中、生理食塩水の輸液を時間ゼロにおいて開始し、０．０２ｍＬ／分とした。同じ静脈内カテーテルを用いて、表示した時間において、単離キサンツレン酸８−Ｏ−β−グルコシドを生理食塩水中１ｍＬの量で、１０分間にわたって注入した。２時間後、２０μｇのフロセミドを同じ手法で注入した。管を１４，０００ｒｐｍで遠心分離機にかけて、尿からあらゆるＲＢＣを分離した。尿中のＮａ＋およびＫ＋の濃度を各イオン選択性電極によって測定した。Ｎａ＋およびＫ＋の排泄速度は、（尿の量／収集時間）×（尿中イオン濃度）によって計算した。
【０１１０】
結果を図１３〜図１６に示す。３μｇ静脈内投与の単離キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドは、尿毒症のラットにおいて持続的なナトリウム利尿反応をもたらした。図１３に示される尿毒症のラットにおいては、Ｎａ＋排泄の時間的経過は７０分でピークに達した。これは、図１に示される正常なラットにおける合成キサンツレン酸８−Ｏ−β−グルコシドに類似した時間的経過である。図１４および図１５のＫ＋排泄は、単離キサンツレン酸８−Ｏ−β−グルコシドに応答した増加はなかった。フロセミドに対する利尿反応は、Ｎａ＋排泄の点からもその時間的経過の点からも典型的なものであった。
【０１１１】
通常、フロセミドは、フロセミドの臨床的使用においてＫ＋の補給が必要である程度まで、Ｋ＋の排泄も引き起こす。正常なラットにおける同様の効果を図２５（フロセミドのみ）に示す。キサンツレン酸８−Ｏ−β−グルコシドによる前処理に続いてフロセミドで処理すると、図１４および１５に示されるこの検定法においてＫ＋排泄の典型的な増加が防止された。
【実施例８】
【０１１２】
尿毒症のＳＤラットにおける単離キサンツレン酸８−Ｏ−サルフェート（２．０μｇ）に対する尿中Ｎａ＋およびＫ＋排泄反応（静脈内投与）
体重２２５ｇの雌のＳＤラットを、一方の腎臓ともう一方の腎臓の３０〜５０％とを結紮することにより尿毒症にした。２週間後、前記ラットは、ナトリウム利尿活性に関して試験する準備ができた。ラットをエーテルで軽く麻酔し、ＰＥ１０チューブを用いて尾静
脈カテーテルを配置した。加えて、潤滑剤としてＫＹゼリーおよび２％リドカインを用いて尿道カテーテルを挿入した。尿を１．５ｍＬの微小遠心管中に収集できるように、ラットを改造したＰｌｅｘｉｇｌａｓ（Ｒ）チューブ内に拘束した。検定期間中、生理食塩水の輸液を時間ゼロにおいて開始し、０．０２ｍＬ／分とした。同じ静脈内カテーテルを用いて試験化合物を注入した。単離キサンツレン酸８−Ｏ−サルフェート（２μｇ）を、表示した時間において、生理食塩水中１ｍＬの量で、１０分間にわたって注入した。その後、生理食塩水の輸液を、検定法の継続期間中、０．０２ｍＬ／分に戻した。管を１４，０００ｒｐｍで遠心分離機にかけて、尿からあらゆるＲＢＣを分離した。尿中のＮａ＋およびＫ＋の濃度を各イオン選択性電極によって測定した。Ｎａ＋およびＫ＋の排泄速度は、（尿の量／収集時間）×（尿中イオン濃度）によって計算した。
【０１１３】
結果を図１７〜図２０に示す。単離キサンツレン酸８−Ｏ−サルフェート（２μｇ、静脈内投与）は、尿毒症のラットにおいて持続的なナトリウム利尿反応をもたらした。ナトリウム利尿の時間的経過は３０分以内にピークに達し、次いで、図１７および図１８に見られるように、処理の７０分以内に対照レベルに近づいた。Ｋ＋排泄は、図１８および図１９に示されるように、単離キサンツレン酸８−Ｏ−サルフェートに応答して増加はしなかった。
【実施例９】
【０１１４】
正常なＳＤラットにおける合成キサンツレン酸８−Ｏ−サルフェート（２０μｇ）に対する尿中Ｎａ＋およびＫ＋排泄反応（経口投与）
雌のＳＤラット（２５０ｇ）をエーテルで軽く麻酔し、潤滑剤としてＫＹゼリーおよび２％リドカインを用いて尿道カテーテルを挿入した。尿を１．５ｍＬの微小遠心管中に収集できるように、ラットを改造したＰｌｅｘｉｇｌａｓ（Ｒ）チューブ内に拘束した。生理食塩水の輸液は投与しなかった。キサンツレン酸８−Ｏ−サルフェートを、表示した時間において水中１ｍＬの量で１分間にわたって経口ゾンデによって注入した。管を１４，０００ｒｐｍで遠心分離機にかけて、尿からあらゆるＲＢＣを分離した。尿中のＮａ＋およびＫ＋の濃度を各イオン選択性電極によって測定した。Ｎａ＋およびＫ＋の排泄速度は、（尿の量／収集時間）×（尿中イオン濃度）によって計算した。結果を図２１〜図２４に示す。キサンツレン酸８−Ｏサルフェート（２０μｇ）は、正常なラットにおいてナトリウム利尿反応を引き起こすことに関して、経口では活性を有さなかった。特に、図２１において尿中Ｎａ＋濃度は５０ｍＭ未満のままであったが、静脈内投与したキサンツレン酸８−Ｏ−サルフェートでは、図１９において尿中Ｎａ＋濃度が６０ｍＭから１６０ｍＭまで増加した。さらに、キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドは、図１１において、尿中Ｎａ＋濃度を１６０ｍＭに増加させ、正常なラットにおいて経口で活性を有していた。
【実施例１０】
【０１１５】
キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドおよびキサンツレン酸８−サルフェートに対するポリクローナル抗体作製のためのプロトコール
以下のプロトコールは、尿中および血漿中のキサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドを検出し測定するためのＥＬＩＳＡ検定法の開発における、キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドに対するポリクローナル抗体の作製について説明する。キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドを巨大タンパク質ＫＬＨに共有結合で連結させ、ウサギにおいて免疫反応を誘発する。さらに、キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドとＫＬＨとの間において、スペーサーアーム（１２Å）としてＡＳＢＡを用いる。スペーサーアームにより、免疫反応におけるキサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドのより良好な提示が可能となる。抗体の反応性のスクリーニングでは、キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドを同様にＢＳＡに連結させ、次いでＥＬＩＳＡウェル上にコーティングする。その後、ウサギ血清を、前記ＢＳＡとコンジュゲートしたキサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ
−グルコシドとともにインキュベートすることにより、ウサギ血清をキサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド抗体についてスクリーニングする。これらのウサギ抗体は、レポーター酵素であるホースラディシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートされたヤギ抗ウサギ抗体によって検出する。基質、すなわちテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をＨＲＰとともにインキュベートし、生成物を４００ｎｍで測定する。
【０１１６】
キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドに対する抗血清の力価を測定したならば、この特異的ポリクローナル抗体を用いた競合ＥＬＩＳＡによって尿試料についてキサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドの存在を試験する。ＥＬＩＳＡ法によるキサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドの検証は、蛍光検出を伴う従来のＨＰＬＣ法によって行われるであろう。このＨＰＬＣ法は、ヒト尿中のキサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドの単離において最初に開発されたものである。尿試料において、キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドのＵＶスペクトルを調べることもできる。現在のＨＰＬＣ法による、尿中のキサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドの検出限界は、固相抽出（ＳＰＥ）を用いない場合で２．７ｕＭである。ＳＰＥはＨＰＬＣの検出限界をｎＭに低下させるものと予想される。
【０１１７】
キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドおよびキサンツレン酸８−サルフェートの臨床上の血漿中および尿中レベルは、ＥＬＩＳＡ法およびＳＰＥ／ＨＰＬＣ法の双方によって確立されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】正常なＳＤラットにおける合成キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄグルコシドの静脈内（ｉ．ｖ．）投与（２μｇ用量）に応答した尿中Ｎａ＋排泄を示す図。
【図２】正常なＳＤラットにおける合成キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドの静脈内投与（２μｇ用量）に応答した尿中Ｎａ＋およびＫ＋排泄を示す図。
【図３】正常なＳＤラットにおける合成キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドの静脈内投与（２μｇ用量）後の尿中のＮａ＋およびＫ＋濃度を示す図。
【図４】正常なＳＤラットにおける合成のキサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドの静脈内投与（２μｇ用量）後の尿量を示す図。
【図５】正常なＳＤラットにおける合成キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドの静脈内投与（１０μｇ用量）に応答したＮａ＋排泄を示す図。
【図６】正常なＳＤラットにおける合成キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドの静脈内投与（１０μｇ用量）に応答した尿中Ｎａ＋およびＫ＋排泄を示す図。
【図７】正常なＳＤラットにおける合成キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドの静脈内投与（１０μｇ用量）に応答した尿中のＮａ＋およびＫ＋濃度を示す図。
【図８】正常なＳＤラットにおける合成キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドの静脈内投与（１０μｇ用量）後の尿量を示す図。
【図９】正常なＳＤラットでの経口（ｐ．ｏ．）投与における、合成キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド（１０μｇ）およびそれに続くフロセミド（１００μｇ）に応答した尿中Ｎａ＋排泄を示す図。
【図１０】正常なＳＤラットでの経口（ｐ．ｏ．）投与における、合成キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド（１０μｇ）およびそれに続くフロセミド（１００μｇ）に応答した尿中Ｎａ＋およびＫ＋排泄を示す図。
【図１１】正常なＳＤラットでの経口（ｐ．ｏ．）投与における、合成キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド（１０μｇ）およびそれに続くフロセミド（１００μｇ）に応答した尿中のＮａ＋およびＫ＋濃度を示す図。
【図１２】正常なＳＤラットでの経口（ｐ．ｏ．）投与における、合成キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド（１０μｇ）およびそれに続くフロセミド（１００μｇ）の投与後の尿量を示す図。
【図１３】尿毒症のＳＤラットでの静脈内投与における、単離キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド（３μｇ）およびそれに続くフロセミド（２０μｇ）に応答した尿中Ｎａ＋排泄を示す図。
【図１４】尿毒症のＳＤラットでの静脈内投与における、単離キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド（３μｇ）およびそれに続くフロセミド（２０μｇ）に応答した尿中Ｎａ＋およびＫ＋排泄を示す図。
【図１５】尿毒症のＳＤラットでの静脈内投与における、単離キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド（３μｇ）およびそれに続くフロセミド（２０μｇ）に応答した尿中のＮａ＋およびＫ＋濃度を示す図。
【図１６】尿毒症のＳＤラットでの静脈内投与における、単離キサンツレン酸８−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド（３μｇ）およびそれに続くフロセミド（２０μｇ）に応答した尿量を示す図。
【図１７】尿毒症のＳＤラットでの静脈内投与における、単離キサンツレン酸８−Ｏ−サルフェート（２μｇ）に応答した尿中Ｎａ＋排泄を示す図。
【図１８】尿毒症のＳＤラットでの静脈内投与における、単離キサンツレン酸８−Ｏ−サルフェート（２μｇ）に応答した尿中Ｎａ＋およびＫ＋排泄を示す図。
【図１９】尿毒症のＳＤラットでの静脈内投与における、単離キサンツレン酸８−Ｏ−サルフェート（２μｇ）に応答した尿中のＮａ＋およびＫ＋濃度を示す図。
【図２０】尿毒症のＳＤラットでの静脈内投与における、単離キサンツレン酸８−Ｏ−サルフェート（２μｇ）に応答した尿量を示す図。
【図２１】正常なＳＤラットでの経口投与における、合成キサンツレン酸８−Ｏ−サルフェート（２０．０μｇ）に応答した尿中Ｎａ＋排泄を示す図。
【図２２】正常なＳＤラットでの経口投与における、合成キサンツレン酸８−Ｏ−サルフェート（２０．０μｇ）に応答した尿中Ｎａ＋およびＫ＋排泄を示す図。
【図２３】正常なＳＤラットでの経口投与における、合成キサンツレン酸８−Ｏ−サルフェート（２０．０μｇ）に応答した尿中のＮａ＋およびＫ＋濃度を示す図。
【図２４】正常なＳＤラットでの経口投与における、合成キサンツレン酸８−Ｏ−サルフェート（２０．０μｇ）に応答した尿量を示す図。
【図２５】正常なＳＤラットにおける、フロセミド（０．５ｍｇ、静脈内投与）に応答した尿中Ｎａ＋およびＫ＋排泄を示す図。
【図２６】正常なＳＤラットにおける、フロセミド（０．５ｍｇの静脈内投与）に応答した尿排泄速度を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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