(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
テスト対象タンパク質のペプチド配列のうちの９個のアミノ酸残基を分析することにより、前記テスト対象タンパク質のペプチド配列からヘルパーＴ細胞エピトープを決定する方法であって、
（ａ）既知のヘルパーＴ細胞エピトープを解析し、１又は複数のヘルパーＴ細胞エピトープと前記テスト対象タンパク質のペプチド配列のうちの連続する９個のアミノ酸残基の対応する相対位置２，３，５および８番目の位置で，アミノ酸残基が一致するか否かの同一性マッチングを行う工程と、
（ｂ）前記同一性マッチングを行う工程で同一性がマッチしたテスト対象タンパク質のペプチドの前記連続する９個のアミノ酸残基がＭＨＣクラスＩＩ分子と結合するか否か解析及び決定する工程と、
を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記ヘルパーＴ細胞エピトープとの同一性マッチングは、ヘルパーＴ細胞エピトープのデータベースを検索することにより決定される、
方法。。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法であって、
前記既知のヘルパーＴ細胞エピトープ及び前記ＭＨＣクラスＩＩ分子はヒト由来である、
方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法であって、
前記テスト対象タンパク質のペプチドの前記連続する９個のアミノ酸残基がＭＨＣクラスＩＩ分子と結合するか否か解析及び決定する工程は、
インシリコ分析により前記連続する９個のアミノ酸残基がＭＨＣクラスＩＩ分子と結合するか否かにより決定される、
方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法であって、
前記テスト対象タンパク質のペプチドの前記連続する９個のアミノ酸残基がＭＨＣクラスＩＩ分子と結合するか否か解析及び決定する工程は、
インビボ分析により前記連続する９個のアミノ酸残基がＭＨＣクラスＩＩ分子と結合するか否か決定される、
方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法であって、
前記テスト対象タンパク質のペプチドの前記連続する９個のアミノ酸残基がＭＨＣクラスＩＩ分子と結合するか否か解析及び決定する工程は、
前記既知のヘルパーＴ細胞エピトープのうちの連続する９個のアミノ酸残基と前記テスト対象タンパク質のペプチド配列のうちの連続する９個のアミノ酸残基との対応する相対位置１，４，６，７および９番目の位置で、同一のアミノ酸残基を有するか否かにより決定される、
方法。
【請求項７】
ヘルパーＴ細胞エピトープを解析することで、
前記テスト対象タンパク質の免疫原性を解析するための、
請求項１〜６のいずれかの方法の使用。
【請求項８】
前記テスト対象タンパク質の配列からヘルパーＴ細胞エピトープを同定するための請求項１〜６のいずれかの方法の使用であって、
前記ヘルパーＴ細胞エピトープは、ヘルパーＴ細胞エピトープを取り除くためにその配列が変更される、
方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって
ヘルパーＴ細胞エピトープを取り除くことは、前記ヘルパーＴ細胞エピトープの残基１を疎水性の残基から非疎水性の残基に変換することにより達成される、
方法。
【請求項１０】
テスト対象タンパク質のペプチド配列のうちの９個のアミノ酸残基を分析することにより、前記テスト対象タンパク質のペプチド配列から非ヘルパーＴ細胞エピトープを決定する方法であって、
（ａ）既知の非ヘルパーＴ細胞エピトープを解析し、１又は複数の非ヘルパーＴ細胞エピトープと前記テスト対象タンパク質のペプチド配列のうちの連続する９個のアミノ酸残基の対応する相対位置２，３，５および８番目の位置で，アミノ酸残基が一致するか否かの同一性マッチングを行う工程、又は
（ｂ）前記テスト対象タンパク質のペプチドの前記連続する９個のアミノ酸残基がＭＨＣクラスＩＩ分子と結合しないか否か解析及び決定する工程と、
を含む方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、
前記非ヘルパーＴ細胞エピトープとの同一性マッチングは、非ヘルパーＴ細胞エピトープのデータベースを検索することにより決定される、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，Ｔ細胞エピトープが存在するかどうかについてタンパク質配列を迅速に照合するための，Ｔ細胞エピトープ，特にヘルパーＴ細胞エピトープのデータベースに関する。本発明は，完全な又は部分的なデータベースと，特にテストペプチドを用いるエキソビボ（生体外）Ｔ細胞アッセイを行うことによって同定されたエピトープを含む，Ｔ細胞エピトープのデータ構造とを含み，そして，本発明は，データの外挿法によってテストペプチドから同定されたＴ細胞エピトープを含む。本発明はまたデータベース及びデータ構造中にその後含まれるペプチドのＴ細胞エピトープ活性を決定するためのハイスループット方法をも含む。ここで，ハイスループット方法は，Ｔ細胞特に制御性Ｔ細胞のサブセットが，Ｔ細胞エピトープ活性の検出感度を最大にするために，Ｔ細胞アッセイから取り除かれる又は妨げられる方法を含む。
【背景技術】
【０００２】
ヒトに投与される医薬用タンパク質にとって，医薬用タンパク質に対する抗体の発現によって現れる免疫原性は，ヒトにおいて医薬用タンパク質の有効性及び安全性を制限することがある。多くの場合，免疫原性は，ＭＨＣクラスＩＩ分子が結合した医薬用タンパク質に由来するペプチドの提示に起因するヘルパーＴ細胞と，それに続く，前記Ｔ細胞上のＴ細胞受容体によって，ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ複合体が認識されることによる，ヘルパーＴ細胞の活性化が関与している可能性がある。免疫原性において，ヘルパーＴ細胞エピトープが関与している証拠として，ヘルパーＴ細胞によって誘導されたＩｇクラススイッチを示唆するＩｇＧアイソタイプの抗体が検出される，という免疫原性の臨床例を含む。それ自体は，Ｔ細胞エピトープは医薬用タンパク質に対する免疫原性の重要な駆り立て役であると考えられている。そのため，医薬用タンパク質において，上記Ｔ細胞エピトープの測定は，特にヒトでテストをする前に非常に価値がある。なぜなら，上記エピトープの存在は免疫原性を予測する重要な判断材料となりえ，それ故，上記臨床試験をすするめる時に又は上記臨床試験を設計するときの要因となりえるからである。
【０００３】
現在，Ｔ細胞エピトープを測定する方法は，インシリコの方法（インシリコ技術），インビトロの方法（インビトロ技術），エキソビボの方法（エキソビボ技術），及びインビボの方法（インビボ技術）が含まれる。インシリコ技術は，一般的に，ＭＨＣ分子に対するペプチドの結合に関連し，一般的にＭＨＣ分子に対するインビトロでのペプチドの結合を再現しようとする。インシリコ技術は，ＭＨＣと結合するペプチド配列モチーフに基づく方法からペプチドがＭＨＣ分子に結合する様子をコンピュータでモデリングする含む方法にまで及ぶ。ＭＨＣクラスＩＩの場合，インシリコ技術は，ＤＲ分子のホモ二量体がペプチド結合に関わるＨＬＡ−ＤＲに大いに限定される。ＨＬＡ−ＤＱ及びＨＬＡ−ＤＰに結合するペプチドに対するインシリコ技術は，ＤＱ及びＤＰの結合がヘテロ二量体的な性質であることと，及びインビトロのＭＨＣ結合データの有用性が制限されているため，一般的には正確性はかなり下がり，利用できない場合もある。インビトロ技術では，一般的に溶解性又は可溶化ＭＨＣ分子及び標識化又はタグ付きペプチドを用いて，ＭＨＣ分子へのペプチドの物理的な結合を一般的に測定する。エキソビボでの測定は一般的に血液サンプルを用いて，増殖又はサイトカイン放出のいずれかによってペプチドに対するヘルパーＴ細胞の応答を測定する。インビボでの測定では，一般的にマウスを用い，ペプチドの注入後，ペプチドに対するヘルパーＴ細胞応答の測定，又はヘルパーＴ細胞応答の間接的な指標として測定されるペプチドに対するその後の抗体反応の測定が行われる。ヒトＴ細胞エピトープなど非マウスＴ細胞エピトープのインビボでの測定は，ヒト血球をＳＣＩＤマウスに注入した結果，免疫システムが再構築されたマウス，又は，ヒトＭＨＣクラスＩＩのトランスジェニックマウス及びヒトＭＨＣクラスＩＩに対する提示を介してＴ細胞応答を引き起こすマウスのいずれかを一般的に用いる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
インシリコ技術は，ペプチドのＭＨＣクラスＩＩへの結合を迅速に予測できる可能性がある一方で，非寛容Ｔ細胞の存在，ペプチド−ＭＨＣ複合体のＴ細胞受容体による認識，特定のサイトカインの存在，及び共刺激分子の相互作用を含む，ペプチド−ＭＨＣ結合以外に，他の工程を必要とするヘルパーＴ細胞エピトープを正確に測定しない。それ故，インシリコ技術は，Ｔ細胞エピトープの存在をいつも過剰に予測し，加えて，ヘルパーＴ細胞エピトープを限定したＨＬＡ−ＤＱ／ＤＰを正確に予測しない。加えて，ＭＨＣクラスＩＩ結合のみを予測することによって，インシリコ技術は，特定のＭＨＣ結合ペプチド，特に“自己”ペプチドに対するＴ細胞の寛容性又は非反応性を考慮しない。同様に，ＭＨＣクラスＩＩへのペプチドの物理的な結合，又はペプチド−ＭＨＣ複合体へのＴ細胞受容体の結合を含むインビトロ技術は，Ｔ細胞寛容性またはペプチド−ＭＨＣ複合体へのＴ細胞応答性の欠失を考慮しない。加えて，このような技術は時間がかかり，リアルタイムでＴ細胞エピトープを測定できない。エキソビボ技術及びインビボ技術は，Ｔ細胞エピトープを測定するための最も厳密な方法を与える一方で，これらの技術ではリアルタイムでのＴ細胞エピトープを測定できない，そして専門的な技術方法又は特定の動物種を必要とする。このようにリアルタイムで簡単に使用できるＴ細胞エピトープを測定するための新しい方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は，エキソビボ又はインビボでの測定から得られるＴ細胞エピトープの新しいデータベース及びデータ構造を含むＴ細胞エピトープを測定するための新規方法に関する。特に，本発明は，テスト医療用タンパク質に起こりうる，１つ又は２つ以上，特にできる限り全てのペプチドは予めＴ細胞エピトープ活性がテストされており，さらに，それぞれのペプチドに対する上記測定は，Ｔ細胞エピトープが存在するかどうかについて医療用タンパク質配列を迅速に照合するためのデータベース又はデータ構造として示される，エキソビボでの測定から現実のＴ細胞エピトープのデータベース及びデータ構造に関する。それ自体は，どの医療用タンパク質においてもＴ細胞エピトープは，テスト医療用タンパク質配列からのペプチドについて時間のかかる技術的に専門的なエキソビボでの測定を必要としないで，リアルタイムで測定することができる。本発明は，細胞のサブセットを取り除く又は阻害することによって，Ｔ細胞エピトープの検出を増強するための方法も含む。
【０００６】
第一の側面において，本発明は，Ｔ細胞エピトープ活性が予め分析されているペプチドの配列のデータベースを検索することによって，テスト対象のペプチド配列がＴ細胞エピトープを含むかどうかを決定するための方法を提供する。
【０００７】
データベースは，当業者に知られている，本発明を実行することに適した，どのようなデータベースであってもよい。例えば，データベースは，類似した配列を同定するためにＢＬＡＳＴプログラムを用いて検索することができるテキストファイルであってもよい。データベースはデータ構造の一部であってもよい。当業者に知られているどんな適切なデータ構造が利用されてもよい。
【０００８】
好ましくは，データベースの検索は，テスト対象のペプチド配列と同一である，またはテスト対象のペプチド配列に類似する配列を共有するペプチド配列を探すために実行される。
【０００９】
２つのアミノ酸配列間の一致レベルは，最適に比較するために配列を並べ，そして，対応する位置でアミノ酸残基を比較することによって決定されてもよい。同一性の割合は，比較されている配列中の同一アミノ酸残基数によって決定される（すなわち，同一性％＝同一位置数／全位置数×１００）。
【００１０】
２つの配列間の同一性の割合の決定は，当業者に知られている数学アルゴリズムを用いて達せられてもよい。２つの配列を比較するための数学アルゴリズムの一例は，Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７（Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８の改良版である）。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０のＢＬＡＳＴプログラムは，このようなアルゴリズムを組み込んでいる。ＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用するとき，それぞれのプログラムのデフォルトパラメータが用いられてもよい。参照：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ。配列の比較に利用される数学アルゴリズムの別の例は，Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリズムである。ＣＧＣ配列アライメント  ソフトウェア  パッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）は，このようなアルゴリズムを組み込んでいる。技術的に知られている配列分析用の他のアルゴリズムは，Ｔｏｒｅｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｒｏｂｏｔｔｉ（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，１０：３−５に記載されているＡＤＶＡＮＣＥ及びＡＤＡＭ；及びＰｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４−８に記載されているＦＡＳＴＡを含む。ＦＡＳＴＡの範囲内で，ｋｔｕｐは検索の感度とスピードを設定する制御オプションである。
【００１１】
ヘルパーＴ細胞エピトープのデータベース及びデータ構造を構築するための好ましい方法では，９アミノ酸配列と結合するコアＭＨＣ（“コア９ｍｅｒ”）の範囲内で，多数のアミノ酸の組合せを示している多数のペプチドが，特にＴ細胞増殖又はサイトカイン放出アッセイ出力を用いて，ヘルパーＴ細胞応答を誘導するためのＴ細胞アッセイ（主にヒトＴ細胞アッセイ）でテストされる。一般に，コア９ｍｅｒのどちらかの末端に位置するアミノ酸を含む，全長が１０〜１５のアミノ酸のペプチドがテストされる。代わりに，それぞれのコア９ｍｅｒ末端がある同じ２つのアミノ酸を有する，例えば，各末端に２つのアラニン残基を有する１５ｍｅｒがテストされてもよい。コア９ｍｅｒの範囲でアミノ酸配列の全ての組合せを完全に分析するために，９ｍｅｒ中に５．１２×１０１１通りの異なったアミノ酸の組合せ（すなわち，２０９）が必要とされる。このように本発明の好ましい方法の１つは，ヘルパーＴ細胞活性が前もってテストされていないコア９ｍｅｒ配列を全て分析すること，及び，上記全分析からヘルパーＴ細胞エピトープデータベース又はデータ構造を編集する，加えて，ヘルパーＴ細胞活性が予め分析されているコア９ｍｅｒのデータを編集することである。このようなデータベース又はデータ構造によって，その後，利用者は，ヘルパーＴ細胞エピトープ活性について，どんな特定のコア９ｍｅｒ配列も迅速に分析することができる。
【００１２】
データベース及びデータ構造を構築するための好ましい態様方法は，限定された一連のコア９ｍｅｒ  Ｔ細胞エピトープ活性についてのデータは，ヘルパーＴ細胞エピトープ活性と関連するアミノ酸の部分的な配列を同定するために分析される。一度上記部分的な配列が同定されると，さらに可能性があるヘルパーＴ細胞エピトープの配列は，部分的な配列を同定するために使用される実際のＴ細胞エピトープに対する配列に加えて，データベース及びデータ構造に当てはめられる及び入力されてもよい。例えば，ヘルパーＴ細胞エピトープのコア９ｍｅｒの範囲内で，位置１，４，６，７，及び９のアミノ酸は，アミノ酸２，３，５，及び８をＴ細胞受容体と相互作用する主要アミノ酸として残して，ＭＨＣクラスＩＩに結合することに最初に関与する。それ故，データセットは，位置１，４，６，７，及び９で固定残基と，ＦＸＸＦＸＦＦＸＦのコア９ｍｅｒ配列を有する１６０，０００ペプチドのみ必要としている，位置２，３，５，及び８を制限したアミノ酸中の変異とを有するＭＨＣ結合ペプチドに取得されてもよい。ここで，Ｆ＝固定アミノ酸残基及びＸ＝可能性のある全ての組合せ中，２０の天然アミノ酸のいずれかを含む変異型残基である。ヘルパーＴ細胞活性をもたらさないと知られている特定のペプチド配列（例えば，各Ｘ＝プロリン）を除外すること，及び，ヘルパーＴ細胞活性を誘導しないとして既に知られているＸの配列を除外することは，テストされる必要があるペプチド数を減少させる。代わりに，又は，加えて，疎水性（疎水性＝Ａｌａ，Ｉｌｅｕ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｖａｌ）ではない位置１を有する９ｍｅｒ配列を除外することもまた，テストされる必要があるペプチド数を減少させる。
【００１３】
本発明の好ましい方法では，１つ又は２つ以上のテストペプチド配列は，ヘルパーＴ細胞活性が予め分析されている同一のペプチド又は類似のペプチドについて，データベース又はデータ構造を検索することによって分析される。一般的に，全長が９〜１５のアミノ酸のペプチド，好ましくは９アミノ酸は，同一のペプチド又は類似のペプチドについてデータベースを検索することによって分析される。同一の９ｍｅｒ配列有するペプチドを同定すること，又は（一般的に，テストペプチド配列とデータベースペプチド配列の中で対応する相対位置で５又はそれ以上のアミノ酸を有する）テストペプチドとホモロジーを有するペプチドを同定することを含む。好ましい一態様では，データベース又はデータ構造においてテストペプチド配列及びペプチド配列内において，対応する相対位置１，４，６，７，及び９で，同一のアミノ酸又は類似のアミノ酸を有するペプチドが同定される。代わりに，データベース又はデータ構造中，テストペプチド配列とペプチド配列内において，同一又は類似の対応する相対位置２，３，５，及び８を有するペプチドが検出される。例えば，もしデータベース中のＴ細胞エピトープ配列がＡＡＡＦＡＨＩＡＬ（すなわち対応する相対位置１，４，６，７，及び９）またはＡＤＥＡＧＡＡＫＡ（すなわち，対応する相対位置２，３，５及び８）からなる（または含む）ならば，配列ＡＤＥＦＧＨＩＫＬを有するテスト９アミノ酸ペプチドは，Ｔ細胞エピトープの可能性があると考えられる。ＭＨＣに結合することが大きな影響を与えないならば，同定されたＴ細胞エピトープの可能性があるペプチドが除外されるようにインシリコの方法，又はインビトロの方法を通常用いるので，一般的に，上記ペプチドの分析，特に対応する相対位置２，３，５及び８のペプチドの分析は，推定コア９ｍｅｒＭＨＣ結合の個別に分析することをも含む。例えば，配列ＧＤＥＦＧＨＩＫＬを有するテスト９アミノ酸ペプチドが，データベースペプチドＡＤＥＡＧＡＡＫＡと対応する相対位置２，３，５，及び８で一致する一方，このペプチドは，位置１で疎水性アミノ酸が欠損しているため，又はペプチド−ＭＨＣ結合のインシリコ又はインビトロでの測定の後にＭＨＣ結合が欠失しているため，Ｔ細胞エピトープとして除外されると思われる。
【００１４】
本発明は，データベース又はデータ構造に包含されるためのデータを取得する方法を含み，ヘルパーＴ細胞からサイトカインの放出が測定されるエリスポットフォーマットなど，標準エキソビボ  ヘルパーＴ細胞アッセイフォーマットを用いるヘルパーＴ細胞エピトープ活性について個々にペプチドを分析することを含む。一般的に上記アッセイフォーマットは，１回の実験で普通実質的にテストされうるペプチド数を５００ペプチド未満に制限し，ペプチド中のＴ細胞エピトープ検出感度も制限する。潜在的に上記アッセイフォーマットは，再構成又は小型化することができ，例えば，ヘルパーＴ細胞の誘導についてペプチドプールをテストし，その後のヘルパーＴ細胞を誘導する個々の上記ペプチドプールを再複製することによって，又は，高密度のペプチドまたは細胞が同時にテストされるマイクロフォーマット，例えばピン上に前もって合成されたペプチドアレイ，そしてＴ細胞増殖及びサイトカイン放出の高感度アッセイは上記高密度アッセイに適用されるマイクロフォーマットを使用することによって，ペプチドスループットを大いに増進する。代わりに，異なるペプチドをテストするためのペプチド高密度アレイ又は細胞アレイを用いるよりもむしろ，ペプチドが微液滴内で細胞と反応するエキソビボＴ細胞アッセイが，流動性微液滴中で行われうる。上記微液滴は，例えばＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別装置）を用いて，例えば，サイトカインの放出又は増殖中のＴ細胞への蛍光標識したＢＵＤＲ（５’−ブロモデオキシウリジン）などの蛍光トレーサーの取込を蛍光測定することによって，個々に分析することができる。他のアッセイフォーマットは，個々に活性化したヘルパーＴ細胞が検出され，活性化ペプチド配列が決定されるアッセイを含む。上記アッセイフォーマットは，個々のペプチド又はペプチドグループが四量体のＭＨＣクラスＩＩと結合することができる，ＭＨＣクラスＩＩ四量体を利用することによって促進されてもよい。そして，その後，活性ペプチドが，セミランダムに合成されたペプチドグループについて，活性ペプチドと結合したタグによって，又はマススペクトロメトリーで活性ペプチドを直接同定することによって，その後包含物を同定することができるように，Ｔ細胞の活性がテストされてもよい。
【００１５】
上記全てのアッセイフォーマットに関するかぎり，本発明は，テストアンチゲンと反応するヘルパーＴ細胞において大幅に増加する結果となる，細胞サブセット特にＴ細胞サブセットの除去，及び特にＴ細胞混合アッセイから制御性Ｔ細胞の除去によって，Ｔ細胞エピトープの検出感度を改善する。従って，第２の側面は，本発明は，以下の工程を含む，テスト対象の物質に対するヘルパーＴ細胞応答に関するデータベースを作成する方法を提供する。
（ａ）生物から抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）及びＴ細胞を単離する工程
（ｂ）前記単離した細胞から制御性Ｔ細胞を枯渇するか又は抑制する工程
（ｃ）前記制御性Ｔ細胞が枯渇化した細胞を前記テスト対象の物質とインキュベートする工程
（ｄ）前記テスト対象の物質に対するＴ細胞応答を測定する工程
従って，本発明は，制御性Ｔ細胞が培養液から取り除かれ，結果としてテスト抗原に対するＴ細胞応答が上昇する，Ｔ細胞エピトープを最適に検出するための新規Ｔ細胞アッセイ方法をも含む。特に，制御性Ｔ細胞は，表面にＣＤ２５抗原を高レベルに発現しているＴ細胞（ＣＤ２５ｈｉ  Ｔ細胞）を取り除くことによって取り除かれ，好ましくは，ＣＤ２５ｈｉ  Ｔ細胞が５〜７５％の間，特にＣＤ２５ｈｉ  Ｔ細胞が１０〜２５％の間で，取り除く，阻害する，又は破壊する方法が採用される。
【００１６】
ＡＰＣｓとＴ細胞は，通常，血液サンプルから得られる。しかしながら本発明において，扁桃腺，パイアー斑，腫瘍，及び細胞株由来のＴ細胞及びＡＰＣｓを含む，供給源が異なるＴ細胞及び／又はＡＰＣｓが使用されてもよい。好ましい一態様では，本方法は，ヒト抹消血単核球（ＰＢＭＣｓ）を用いて行われる。
【００１７】
本明細書において，“枯渇”という用語は，一部の制御性Ｔ細胞の排出を意味する。これは，物理的に細胞を取り除くことによって，又はＴ細胞の活動を阻害する若しくは調節することによって行われうる。このように標的Ｔ細胞の活性は減少する。
【００１８】
なお，当業者であれば，本発明の一部として，制御性Ｔ細胞の枯渇方法又は標的方法の範囲で，ＣＤ２５ｈｉにより制御性Ｔ細胞を枯渇する方法の代わりを用いてもよいことがわかる。なお，本発明は，Ｔ細胞アッセイにおいて，制御性Ｔ細胞の影響を調節する方法をも含むことがわかる。枯渇または標的のために，制御性Ｔ細胞表面に発現した分子は，これら細胞を枯渇するためにＣＤ２５との組み合わせ又はＣＤ２５の代わりに用いてもよい。上記分子は，ＧＩＴＲ，ＣＴＬＡ−４，ＣＤ１０３，ＣＣケモカイン受容体４，ＣＤ６２Ｌ，及びＣＤ４５ＲＡに限定されず，表面結合サイトカイン又はＩＬ−１０及びＴＧＦβなどの表面型サイトカインをも含む。固相に制御性Ｔ細胞を吸着するために，上記制御性Ｔ細胞の破壊又は阻害を引き起こすために，又は，そうでなければＴ細胞アッセイ用に他のＴ細胞から制御性Ｔ細胞を分離するために，特定の抗体と結合することを含む複数の方法によって，枯渇が達せられてもよい。調節のために，制御性Ｔ細胞によって分泌される分子は，上記分泌が防止されてもよいし，又は分泌後，ブロック／阻害／破壊されてもよい。上記分子は，ＩＬ−１０，ＩＬ−４，ＩＬ−５およびＴＧＦβなどのサイトカインを含んでもよく，そして上記分子は，上記分子に結合する有機分子または無機分子，例えば，抗体または可溶性受容体を用いてブロックされてもよく，又は，ｓｉＲＮＡ，アンチセンス  オリゴヌクレオチド，若しくは制御性Ｔ細胞に送達される，若しくは上記細胞内で誘導される他の核酸などの制御性核酸によってブロックされてもよい。制御性Ｔ細胞活性の調節は，これらの細胞の抑制機能を破壊するように，制御性Ｔ細胞上の標的受容体または他の表面分子によって達せられてもよい。制御性Ｔ細胞上の他の表面分子は，ＧＩＴＲ，ＣＴＬＡ−４，ＣＤ１０３，ＣＣケモカイン受容体４，ＣＤ６２Ｌ，及びＣＤ４５ＲＡを含むがこれらに限定されるものではない。上記機能阻害は，例えば，アゴニスト機能を有する特定の抗体によって，又は制御性Ｔ細胞が除去ではなく非機能的になるようにリガンド標的相互作用をブロックする可能性がある特定の抗体によって達せられてもよい。制御性Ｔ細胞活性の調節は，制御性Ｔ細胞によって分泌される標的受容体の分子をブロックすることによって，又は，上記分泌分子によって活性化される若しくはダウンレギュレートされる経路をブロックすることによって達せられてもよい。また，調節のために，制御性Ｔ細胞は，例えば，ｆｏｘｐ３などの転写因子をブロックすることによって，または制御性Ｔ細胞に関連する他の機能若しくは経路をブロックすることによって達せられてもよい。上記阻害またはブロックは，有機分子若しくは無機分子によって，又はｓｉＲＮＡ，アンチセンス  オリゴヌクレオチド，若しくは制御性Ｔ細胞に送達される若しくは上記細胞内で誘導される他の核酸などの制御性核酸によって達せられてもよい。有機分子，無機分子，又は核酸分子が作用を阻害するため又はそうでなければ制御性Ｔ細胞を調節するために用いられる全ての場合で，かつ上記分子自体がＴ細胞アッセイを妨げる全ての場合，上記分子は上記アッセイから取り除かれる又は上記アッセイを妨げない形態に修飾されることが好ま���い。例えば，制御性Ｔ細胞によって分泌される分子を取り除くために用いられる特定の抗体又はタンパク質は，Ｔ細胞アッセイより前に選択的に取り除かれるか，又はＴ細胞アッセイを妨げない特定の形態で用いられる。例えば，ヒトＴ細胞アッセイのために，ヒト型の抗体又はタンパク質は，抗体又はタンパク質自体に対するＴ細胞応答を避けるために用いられる。
【００１９】
好ましくは，本アッセイ方法は，ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）が用いられ，次の重要な工程を有する；
（１）   ＰＢＭＣｓがヒト血液サンプルから単離される
（２）   ＣＤ８＋Ｔ細胞が取り除かれる
（３）   ＣＤ２５ｈｉＴ細胞が枯渇される
（４）   培養液は，１つまたは２つ以上の濃度でテスト抗原とインキュベートされ，１つまたは２つ以上の点でＴ細胞増殖及び／又はサイトカイン放出のテストをされる
【００２０】
本発明において，Ｔ細胞エピトープ活性の測定は，１つのＭＨＣアロタイプ又は複数のＭＨＣクラスＩＩアロタイプに関連するＴ細胞エピトープ活性に関連しうる。このように個々のペプチドは，１つ又は複数のＭＨＣアロタイプのどちらかでテストをすることができ，それ故，データベースは，１つ又は複数のＭＨＣアロタイプのどちらかと関連しうる。本発明の好ましい方法において，ペプチドは，複数のＭＨＣアロタイプ，例えばヒトヘルパーＴ細胞エピトープでテストされ，ペプチドは一般的に少なくとも２０の異なるＭＨＣ型ヒト血液サンプル（一般的に４０−６０血液サンプル）と，このようなＭＨＣ型サンプルから決定されるＭＨＣ関連活性ペプチドと一緒にテストされる。本発明の好ましい方法において，Ｔ細胞エピトープデータベースとデータ構造は，ＭＨＣアロタイプとの関連に関するデータに注釈を付される。加えて，Ｔ細胞エピトープデータベースは，Ｔ細胞エピトープを含むペプチドに対するドナーの詳細，プライマリー又はセカンダリー反応，増殖，及びサイトカイン測定に関連するデータなどＴ細胞応答の詳細，ドナー反応の割合，反応の大きさ，及び全ＭＨＣアロタイプタイプのドナー反応に注釈が付されてもよい。
【００２１】
複数のペプチドのＴ細胞エピトープ活性を決定するために用いられる方法にかかわらず，本発明は，Ｔ細胞エピトープが存在する医薬用タンパク質配列を早く照合するために特にＴ細胞エピトープ（主にヘルパーＴ細胞エピトープ）のデータベース及びデータ構造を開示する。上記Ｔ細胞エピトープデータベース及びデータ構造は，Ｔ細胞エピトープ活性について複数の個々のペプチドのテストから，又は公知のＴ細胞エピトープを全て含む他のデータの入力から得られてもよい。上記Ｔ細胞エピトープデータベース及びデータ構造は，完全なペプチドセットからの，又はデータがデータベースを照合することで，テストされた幾つかのペプチドを利用できないような不完全なペプチドセットからのデータを含んでもよい。データベース及びデータ構造の概念に加えて，本発明は，上記データベース及びデータ構造に含めるために複数のペプチドをテストする新規方法，特に複数のペプチドのヘルパーＴ細胞エピトープ活性を決定するための方法をも含む。
【００２２】
本発明の特定の用途は，Ｔ細胞エピトープ，特にヘルパーＴ細胞エピトープが存在するかどうかについて，タンパク性の医薬品を分析することである。これは，特に，上記医薬品の免疫原性又はワクチンの可能性を決定するために役立ち，Ｔ細胞エピトープ並びにＴ細胞応答の頻度及び大きさなどの他の因子が存在することで，及び上記反応へのドナーＭＨＣの関連性によって測定される。本発明の方法でタンパク質配列を分析することによって，異なるタンパク質変異体の免疫原性が決定されうる薬学的研究において，本発明は特に役立つ。薬学的使用において，頻度の最も低いＴ細胞エピトープを有するタンパク質変異体は，普通，免疫原性の可能性が最も低いリードとして選択される。
【００２３】
本発明のさらなる用途は，治療的使用またはワクチン使用のどちらかの目的で新規タンパク性医薬品の生成である。治療的使用のために，本発明の方法は，開始タンパク質に由来する新規タンパク質変異体を作り出すために使用される。ここで，Ｔ細胞エピトープ数は減少している，又はＴ細胞エピトープが上記変異体内で取り除かれている。一般的に医薬用タンパク質変異体は，Ｔ細胞エピトープ活性を有さないデータベースから選ばれた新しい配列を有する開始タンパク質中の置換配列によって作り出され，それによって上記置換は，開始タンパク質とデータベースペプチドからの配列の組合せを通して，又はデータベースペプチドからの配列の組合せによって，新しいＴ細胞エピトープを作り出さない。ワクチン使用目的で，本発明の方法は，変異体中でＴ細胞エピトープ数が増加した開始タンパク質に由来する新規タンパク質変異体を作り出すために用いられる。本発明の特に有用な方法は，開始タンパク質の所望の特性を保持し，Ｔ細胞エピトープの減少または除去を通して，潜在的に減少した免疫原性など，改良された特性をも含む，新規改質タンパク質変異体を作製することである。
【００２４】
このような方法は，一般的に次の重要な工程を含む；
（ａ）新しいタンパク質に所望の特性を与えるために必要とされるアミノ酸（“所望の残基”）を決定するために，１つ又は２つ以上の既存のタンパク質を分析する工程；
（ｂ）改質タンパク質中に包含するために前記所望の残基を，既存のタンパク質中の所望の残基に対応する位置に含む１つまたは２つ以上のペプチドを，ペプチド配列データベース群から選択する工程であって，選択されたペプチドがＴ細胞エピトープではない，工程；
（ｃ）前記選択されたペプチドを１つ又は２つ以上包含することによって改質タンパク質を合成する工程。
【００２５】
ワクチンの使用において，本発明の特に有用な方法は，開始タンパク質の所望の特性を保持し，加えてＴ細胞エピトープをも含む，新規改質タンパク質変異体を生成する。上記方法は，一般的に次の重要な工程を含む；
（ａ）新しいタンパク質に所望の特性を与えるために必要とされるアミノ酸（“所望の残基”）を決定するために，１つ又は２つ以上の既存のタンパク質を分析する工程；
（ｂ）改質タンパク質中に包含するために前記所望の残基を，既存のタンパク質中の所望の残基に対応する位置に含む１つまたは２つ以上のペプチドを，ペプチド配列データベース群から選択する方法であって，選択されたペプチドがＴ細胞エピトープではないか，上記ペプチドのいくつか又は全てがＴ細胞エピトープを含む工程；
（ｃ）前記選択されたペプチドを１つ又は２つ以上の包含することによって改質タンパク質を合成する工程。
【００２６】
本明細書において，“改質タンパク質変異体”とは，タンパク質の所望の特性を維持しながら，使用目的によって，タンパク質の潜在的な免疫原性を増加させるか又は減少させるかのどちらかに適合しているタンパク質である。例えば，治療的な使用に適しているタンパク質は，副作用を引き起こしうるどのＴ細胞エピトープも取り除くことによって改良されうる。代わりに，ワクチンとしての使用に適しているタンパク質は，潜在的な免疫反応を増加するために，ひいては与えられる保護作用を増加するために更に加えられるＴ細胞エピトープを含んでもよい。
【００２７】
本明細書において，“所望の特性”は，所要の機能を維持するためにタンパク質に要求されたタンパク質の特性をいう。例えば，医薬用タンパク質に対して，これは，酵素など標的分子の活性を阻害する能力でありうる。代わりに，所望の特性は，血液中のタンパク質半減期を増大するタンパク質の一部に起因する。加えて，ワクチンとして用いられるタンパク質にとって，免疫原性反応を誘導するエピトープは保持される。
【００２８】
当然のことながら，本発明は，Ｔ細胞エピトープ活性の測定の供給源に関わらず，いずれのＴ細胞エピトープデータベース又はデータ構造をも含むことを，当業者であれば理解しうる。当然のことながら，本発明のデータベース及びデータ構造は，エキソビボＴ細胞アッセイ又はインビボ研究，例えば，ペプチドを生物に注入し，生Ｔ細胞の活性測定を行う研究からのＴ細胞アッセイなどの生Ｔ細胞を採用するアッセイで同定されたＴ細胞エピトープに関する。当然のことながら，本発明のデータベース及びデータ構造は，活性Ｔ細胞エピトープに関するデータ及びＴ細胞に影響を与えないペプチドに関するデータも含む。当然のことながら，上記データベース又はデータ構造は，特定のペプチド配列に関するデータが含まれない部分的なデータベースであってもよい。代わりに，上記データベース又はデータ構造は，特定の長さ，一般的にペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端でアミノ酸と接する，ヘルパーＴ細胞エピトープに対する９ｍｅｒのペプチド配列の可能性がある全てのペプチド配列を含む，完全なデータベース及びデータ構造でありうる。当然のことながら，本発明のデータベース及びデータ構造は，Ｔ細胞エピトープ，好ましくはＭＨＣクラスＩＩと関連するヘルパーＴ細胞型，さらにＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープ，特に細胞毒性Ｔ細胞エピトープに関する。本発明のデータベース及びデータ構造は，Ｔ細胞を直接ダウンレギュレートする又は阻害する制御性Ｔ細胞及びペプチドを刺激するペプチドなどのＴ細胞において他の活性を有するペプチドをも含む又はそのようなペプチドからなってもよい。
【００２９】
本発明は，次の実施例によって示されるが限定されるものではない。本発明の範囲は，次の実施例によって限定的に考慮されるべではない。図及び表は以下の実施例に関連し，次のとおりである。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
表１は，他のＴ細胞エピトープから様々なＭＨＣ接触残基のバックグラウンドにおいてＴ細胞エピトープに由来する一定のＴ細胞受容体接触残基を有するペプチドのＴ細胞増殖アッセイの結果を示す（参照：実施例３）。
【００３１】
【図１】図１は，様々なペプチド又はＫＬＨを加えた後，ヘルパーＴ細胞応答（刺激指数＝ペプチド有無でのＴ細胞増殖率）に対するＣＤ２５ｈｉ  Ｔ細胞の枯渇の影響を示す（参照：実施例１）。
【図２】図２は，Ｔ細胞アッセイによって同定されたＴ細胞エピトープが非Ｔ細胞エピトープのデータベースペプチド配列を選択することで置換される，段階希釈した抗ＣＤ２０抗体及びエピトープ修飾抗体のキメラ分子の結合のＦＡＣＳ分析の結果をしめす（参照：実施例４）。
【図３】図３は，完全に一致したＴ細胞エピトープコア９ｍｅｒ，及び相対的に対応する２，３，５および８残基を有するＭＨＣ結合９ｍｅｒに対するＴ細胞エピトープデータベースを検索することによって得られた，ヒト化Ａ３３及び抗ＨＥＲ２抗体の可変領域配列の比較分析をしめす（参照：実施例５）。
【図４】図４は，全ヒト化Ａ３３及び抗ＨＥＲ２抗体のＴ細胞アッセイをしめす（参照：実施例５）。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００３２】
Ｔ細胞エピトープを決定，及びＴ細胞エピトープデータベースの作製する方法
末梢血単核球は，アデンブルク病院地域研究倫理委員会によって付与された承認に従って，国立輸血サービス（アデンブルク病院，ケンブリッジ，英国）から得られる（２４時間以内に取り出される血液から）健康な人たちからなるドナーの軟膜から単離された。ＰＢＭＣはフィコール（ＧＥヘルスケア，チャルフォント  セント  ジャイルズ，英国）密度遠心法によって軟膜から単離され，ＣＤ８＋Ｔ細胞は，ＣＤ８＋ＲｏｓｓｅｔｔｅＳｅｐＴＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，バンクーバー，カナダ）を用いて枯渇させた。ドナーは，ＡｌｌｓｅｔＴＭ  ＳＳＰ−ＰＣＲベース組織タイピングキット（Ｄｙｎａｌ，ウィラル，英国）を用いてＨＬＡ−ＤＲハロタイプを同定することと同様に，コントロール抗原キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ），破傷風トキソイド（Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｐａｓｔｅｕｒ，リオン，フランス）及びインフルエンザＨＡからのコントロールペプチドエピトープ（Ｃ３２，ａａ３０７−３１９）へのＴ細胞応答を決定することによって，特徴づけられた。
【００３３】
ＣＤ２５ｈｉ  Ｔ細胞の枯渇は，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製（ギルフォード，英国）の抗ＣＤ２５マイクロビーズを用いて，サプライヤー標準プロトコール及び磁石を用いて行われた。各ドナーのバイアル１０本を溶解し，細胞は２％不活性化ヒト血清／ＰＢＳ（Ａｕｔｏｇｅｎ  Ｂｉｏｃｌｅａｒ，カルン，ウィルシャー，英国）３０ｍｌに再懸濁した。細胞が全ＰＢＭＣとして保持されている状態の細胞５×１０７個を，１５ｍｌチューブ３本に移した。抗ＣＤ２５マイクロビーズ希釈混合物は，ビーズ３００μｌと分離バッファー（０．５％ヒト血清／２ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳ）４２００μｌを用いて作製した。１５ｍｌチューブを遠心し，マイクロチューブ希釈混合物５００μｌに再懸濁した。その後，カラムで分離する前に，チューブは５，１０，又は２０分間，４℃で保持した。カラムは，スタンドに保持した磁石内にカラムをおき，分離バッファー２ｍＬをカラムに加え，分離バッファーを滴下させてセットした。ビーズとインキュベート後，分離バッファー１０ｍｌを加え，チューブを１５００ｒｐｍで７分間遠心した。その後細胞は分離バッファー５００μｌに再懸濁し，カラムに加え，続いて分離バッファー１ｍｌで２回洗浄した。カラムを通過したフローは１５ｍＬチューブに集められ，ＣＤ２５ｈｉＴ細胞枯渇フラクションに含めた。これらの細胞は，１５００ｒｐｍで７分間遠心沈殿し，計数前にＡＩＭＶ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ペーズリー，英国）に再懸濁した。
【００３４】
細胞はＣＤ４及びＣＤ２５で染色し，細胞数はＦＡＣＳで検出した。５−１０×１０５個の各細胞集団は，９６ウェルＵ底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，フリッケンハオゼ，ドイツ）の１ウェルに播種した。プレートを１２００ｒｐｍで４分間遠心して，細胞を沈殿させた。上清を取り除き，細胞は抗体希釈液５０μｌで再懸濁した。抗体希釈液は，ＦＡＣＳバッファー（１％ヒト血清／０．０１％アジ化ナトリウム／ＰＢＳ）に１／５０倍希釈したＦＩＴＣラベル抗ＣＤ４抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ミネアポリス，米国）と１／２５倍希釈したＰＥラベル抗ＣＤ２５抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ミネアポリス，米国）からなる。コントロールウェルは又，未染色，アイソタイプコントロールで染色，１つのラベル抗体で染色した。
【００３５】
プレートは，暗所で，３０分間氷上でインキュベートした。その後，プレートを１２００ｒｐｍで４分間遠心して，細胞を沈殿させた。上清を取り除き，細胞はＦＡＣＳバッファー２００μｌに再懸濁した。これを２回繰り返し，その後，細胞をＦＡＣＳチューブに移した。細胞はＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，オックスフォード，英国）にセットした後，データを集め，大きさ，粒度，及び蛍光タグに基づいて分析した。
【００３６】
増殖アッセイは次のように行った。ＰＢＭＣを枯渇した全ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＰＢＭＣを枯渇したＣＤ８＋ＣＤ２５ｈｉＴ細胞を，それぞれＡＩＭＶ１００μｌに２×１０５／ウェルとなるように加えた。平底９６ウェルプレートを用いて，それぞれのテスト条件で３枚培養を行った。各ペプチド１００μｌに，最終濃度が５μＭとなるように細胞培養液を加えた。細胞は，各ウェルを１ｍＣｉ／ｍｌ  ３ＨＴｄＲ（ＧＥヘルスケア，チャルフォント  セント  ジャイルズ，英国）で１８時間パルスラベルする前に，ペプチド及びタンパク質抗原と７日間インキュベートした。
【００３７】
増殖アッセイにおいて，刺激指数２又は２より大きい（ＳＩ≧２）値を閾値として用い，そのため，この閾値より上の増殖応答を含むペプチドはポジティブ（点線）とみなされる。全データは，１つの方法，すなわち対応のないスチューデントＴ検定を用いて変動係数（ＣＶ），標準偏差（ＳＤ）及び有意差（ｐ＜０．０５）を決定するために分析される。ＳＩ≧２を示す全反応は，未処理の培地コントロールと有意差（ｐ＜０．０５）があった。
【００３８】
一連のボーダーライン又は弱Ｔ細胞エピトープ（ペプチド２（ＧＤＫＦＶＳＷＹＱＱＧＳＧＱＳ），６（ＩＫＰＥＡＰＧＣＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＶＴＲＱＲＹ），９（ＱＳＩＳＮＷＬＮＷＹＱＱＫＰＧ）），１対の強Ｔ細胞エピトープ（ペプチド２５（ＰＫＹＲＮＭＱＰＬＮＳＬＫＩＡＴ），及び２６（ＴＶＦＹＮＩＰＰＭＰＬ）），及びＫＬＨ抗原をテストしたヒトドナーの一人のＰＢＭＣ中のＴ細胞増殖反応を示す結果を図１に示した。その結果は，ＣＤ２５ｈｉＴ細胞を枯渇した後，全ペプチドに対するＴ細胞応答の増加を示す。最大反応は全ペプチドに対して決定され，その後，１０又は２０分，ＣＤ２５ｈｉＴ細胞が枯渇する。これらの結果は，ペプチド２及び９等のペプチド例では，ペプチド内のＴ細胞エピトープ検出が前もってＴ細胞応答に対してボーダーライン又はネガティブと記録されたＣＤ２５ｈｉＴ細胞が枯渇した後，Ｔ細胞応答が強く増大したことを示す。
【００３９】
上記ペプチド２，９，２５，及び２６の変異は，次の通りである；
２−Ｆ→Ｇ（ＧＤＫＧＶＳＷＹＱＱＧＳＧＱＳ）
９−Ｌ→Ｇ（ＱＳＩＳＮＷＧＮＷＹＱＱＫＰＧ）
２５Ｍ→Ｇ（ＰＫＹＲＮＧＱＰＬＮＳＬＫＩＡＴ）
２６Ｆ→Ｇ（ＴＶＧＹＮＩＰＰＭＰＬ）
【００４０】
これらのペプチドは，上記のように１０分間及び２０分間にＣＤ２５ｈｉＴ細胞の枯渇もしくはドナー４７５を含む，増殖アッセイで再テストした。ドナー４７５を含むドナーは，これらの変異ペプチドのいずれかに対して重要なＴ細胞応答を与えない。このようにペプチド２，６，９，２５及び２６は，ヘルパーＴ細胞エピトープとしてデータベースに入力され，一方，ペプチド２−Ｆ→Ｇ，９−Ｌ→Ｇ，２５Ｍ→Ｇ及び２６Ｆ→ＧはヘルパーＴ細胞エイトー婦応答に対してネガティブとして入力される。ＳｔｕｒｎｉｏｌｏらのＴＥＰＩＴＯＰＥ方法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ１７（１９９９）ｐ５５５−５６１）による非変異ペプチド配列の平行分析から，これらのペプチドによるＭＨＣクラスＩＩ結合のための予測されるＰ１位置は，その後，Ｇ（グリシン）残基に突然変異されるアミノ酸であり，従ってこれらのペプチドは，ＭＨＣクラス結合のための相対的な１，４，６，７及び９位置のアミノ酸とＴ細胞受容体を認識するための２，３，５及び８位置のアミノ酸を含む，コアＭＨＣ結合９ｍｅｒ中に推定残基を有するデータベース中で注釈を付される。
【実施例２】
【００４１】
固定ＭＨＣ接触残基を有するペプチドの分析
相対的な１，４，６，７，及び９の位置を固定した次のペプチドは，（ｉ）実施例１の方法を用いて作成されたＴ細胞エピトープのデータベース，（ｉｉ）ペプチド−ＭＨＣ結合予測のためのＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズム（Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏら，同書），及び（ｉｉｉ）実施例１のＴ細胞アッセイ方法を用いて分析された。
１−ＮＷＬＲＮＹＤＱＫＱＧＡＴ
２−ＮＷＬＥＧＹＨＱＫＩＧＡＴ
３−ＮＷＬＬＫＹＭＱＫＦＧＡＴ
４−ＮＷＬＰＳＹＴＱＫＷＧＡＴ
５−ＮＷＬＹＶＹＡＱＫＲＧＡＴ
６−ＮＷＬＮＤＹＱＱＫＥＧＡＴ
７−ＮＷＬＧＨＹＩＱＫＬＧＡＴ
８−ＮＷＬＫＭＹＦＱＫＰＧＡＴ
９−ＮＷＬＳＴＹＷＱＫＹＧＡＴ
１０−ＮＷＬＡＡＹＡＱＫＡＧＡＴ
１１−ＮＷＧＲＮＹＤＱＫＱＧＡＴ
１２−ＮＷＧＥＧＹＨＱＫＩＧＡＴ
１３−ＮＷＧＬＫＹＭＱＫＦＧＡＴ
１４−ＮＷＧＰＳＹＴＱＫＷＧＡＴ
１５−ＮＷＧＹＶＹＡＱＫＲＧＡＴ
１６−ＮＷＧＮＤＹＱＱＫＥＧＡＴ
１７−ＮＷＧＧＨＹＩＱＫＬＧＡＴ
１８−ＮＷＧＫＭＹＦＱＫＰＧＡＴ
１９−ＮＷＧＳＴＹＷＱＫＹＧＡＴ
２０−ＮＷＧＡＡＹＡＱＫＡＧＡＴ
【００４２】
ペプチド１−１０は全て，Ｎ末端配列としてＮＷＬの３アミノ酸を含み，一方，ペプチド１１−２０はＮ末端配列の三番目のアミノ酸がＬの代わりにＧである以外は，ペプチド１−１０のアナログである。Ｔ細胞エピトープデータベースの照合は，上記ペプチド１から１０に対して，実施例１のペプチド９に相当するペプチドＱＳＩＳＮＷＬＮＷＹＱＱＫＰＧ中の同一の対応する相対的位置１，４，６，７および９を有する先のヘルパーＴ細胞エピトープを同定し，それゆえ先のＴＥＰＩＴＯＰＥ分析はＭＨＣ結合コア９ｍｅｒのＬＮＷＹＱＱＫＰＧを示した。ペプチド１１から２０はコア９ｍｅｒ中の重要な疎水性Ｐ１アンカーが欠けており，従って，一時的に非エピトープとして記録される。ペプチド１１−２０ではなくペプチド１−１０がＭＨＣクラスＩＩアロタイプの範囲と結合するということを予測するこの分析はペプチド１から２０のＴＥＰＩＴＯＰＥ分析によって支持された。
【００４３】
実施例１のＴ細胞アッセイ方法を用いる，及び４７５のドナー（参照：図１）を用いる，ペプチド１−２０の分析は，ペプチド１から６及び８から１０は有意なヘルパーＴ細胞応答を与え，一方，ペプチド７及びペプチド１１−２０は有意な応答を与えないことを明示する。これは，実施例１からペプチド９と一致するデータベースは，Ｔ細胞エピトープとして，予め分析されていないペプチド１から６及び８から１０（共通の相対的な位置１，４，６，７及び９）を正確に同定する結果になるということを示す。対応する相対的位置２，３，５，及び８での一致に対してデータベースでのさらなる照合は，非Ｔ細胞エピトープとしてＴ細胞アッセイによって前もって記録される，及び，ペプチド７（ＮＷＬＧＨＹＩＱＫＬＧＡＴ）（及びペプチド１７（ＮＷＧＧＨＹＩＱＫＬＧＡＴ））に対して同一の位置２，３，５，及び８を有する，ペプチド配列ＧＦＧＨＥＩＧＰＬＧＥＰを同定した。これは，これらのＴ細胞受容体接触残基は，ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチド内で，Ｔ細胞応答において結果が得られないということを示した。これは対応する相対的位置２，３，５及び８で同一の残基を有する非Ｔ細胞エピトープペプチドを有するペプチド７及び１７のデータベースの一致は，非Ｔ細胞エピトープとして，予め分析していないペプチド７及び１７を正確に同定する結果になることを示した。全体的に，対応する相対的位置２，３，５及び８を有するペプチドからの情報は，テストペプチドがＴ細胞エピトープを含むかどうかを決定できるけれども，この実施例は既知のＴ細胞エピトープに対して一致する共通の相対的位置１，４，６，７及び９を有するテストペプチドの存在的なＴ細胞エピトープ活性を明示する。
【実施例３】
【００４４】
実施例３：固定Ｔ細胞受容体接触残基を有するペプチドの分析
ＭＨＣ結合ペプチドにおいて，ＭＨＣ接触残基（対応する相対的位置１，４，６，７及び９）のいずれの組合せのバックグランドにおいても，Ｔ細胞応答を誘導するための固定Ｔ細胞受容体接触残基（相対的位置２，３，５及び８）の能力は，コア９ｍｅｒのＬＱＨＷＳＹＰＬＴを有する確定されたデータベースＴ細胞エピトープからＴ細胞受容体接触残基を用いてテストされる。Ｔ細胞受容体接触残基＿ＱＨ＿Ｓ＿＿Ｌは，次に示す他の４つのＴ細胞エピトープデータベースのバックグラウンドに置換された；ＦＬＬＴＲＩＬＴＩ，ＩＬＷＥＷＡＳＶＲ，ＬＳＣＡＡＧＧＲＡ，及びＦＫＧＥＱＧＰＫＧは，テストペプチドＦＱＨＴＳＩＬＬＩ，ＩＱＨＥＳＡＳＬＲ，ＬＱＨＡＳＧＧＬＡ，及びＦＱＨＥＳＧＰＬＧとなる。コントロールペプチドは，また，次のように改変されたＰ１残基（Ｆ−＞Ｇ）で作製される；改変されたＰ１残基（Ｆ−＞Ｇ）は，ＧＱＨＷＳＹＰＬＴ，，ＧＱＨＴＳＩＬＬＩ，ＧＱＨＥＳＡＳＬＲ，ＧＱＨＡＳＧＧＬＡ，及びＧＱＨＥＳＧＰＬＧである。
【００４５】
これらのペプチドは，さまざまなＭＨＣクラスハロタイプをもつ５０個のドナーを用いて実施例１のＴ細胞アッセイ方法でテストされた。（５０個中）反応するドナー数と，反応するドナーに対する平均刺激指数（ＳＩ）は，測定され，テストペプチドと比較した。結果は表１に示した。結果は，固定Ｔ細胞受容体接触残基＿ＱＨ＿Ｓ＿＿Ｌは，他の４つのＴ細胞エピトープと異なるバックグラウンドＭＨＣ接触残基それぞれのヘルパーＴ細胞応答を誘発することができたことを示す。そして，もしＭＨＣ結合は疎水性Ｐ１残基の除去によって，上記Ｔ細胞応答が除去されるならば，上記Ｔ細胞応答は除去されたことを示す。この例は，固定バックグラウンドのＭＨＣ結合残基において，対応する相対的位置２，３，５，及び８での可能性のあるＴ細胞受容体接触残基の全ての組合せをテストすることによって，このようにＴ細胞アッセイにおいて２０４ペプチド（１６０，０００）の分析を必要とすることによって，公知のＴ細胞エピトープ活性を有するペプチドの大きなデータベースを作製する可能性をも示す。
【実施例４】
【００４６】
実施例４：Ｔ細胞エピトープ除去による多様な抗ＣＤ２０抗体の作製
Ｔ細胞エピトープのデータベースを，抗ＣＤ２０抗体Ｌｅｕ１６において公知のＴ細胞エピトープを同定するために用いた（Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０５（２００６）ｐ３９７２−３９７８）。次のように，Ｌｅｕ１６軽鎖可変領域（ＬＨ）配列５’−ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＩＬＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＮＹＭＤＷＹＱＫＫＰＧＳＳＰＫＰＷＩＹＡＴＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＦＮＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ−３’のＮ末端から始まる重複している１５ｍｅｒとともに，Ｌｅｕ１６重鎖可変領域（ＶＨ）配列５’−ＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＮＭＨＷＶＫＱＴＰＧＱＧＬＥＷＩＧＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＤＹＹＣＡＲＳＮＹＹＧＳＳＹＷＦＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳ−３’のＮ末端から始まる重複している１５ｍｅｒは，ＶＨ中の３つの実際のＴ細胞エピトープ（同一のコア９ｍｅｒ）が同一，及びＶＬ中の潜在的な２つのＴ細胞エピトープ（疎水性Ｐ１アンカーを有する対応する相対的位置２，３，５及び８で同一の残基）が同一になると分析した。
データベースエピトープ９ｍｅｒ
Ｌｅｕ１６ＶＨ        ＬＶＫＰＧＡＳＶＫ            ＬＶＫＰＧＡＳＶＫ
ＦＫＧＫＡＴＬＴＡ            ＦＫＧＫＡＴＬＴＡ
ＬＴＳＥＤＳＡＤＹ            ＬＴＳＥＤＳＡＤＹ
Ｌｅｕ１６ＶＬ        ＩＬＳＡＳＰＧＥＫ            ＬＬＳＧＳＰＡＥＫ
ＭＤＷＹＱＫＫＰＧ            ＬＤＷＹＱＫＫＰＧ
【００４７】
リコンビナントＤＮＡ技術は，当技術分野において公知の方法を用いて，必要に応じて，これらの方法に用いた酵素の使用についてサプライヤの取扱説明書を使って行った。一般的な方法の供給源には，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｖｏｌｓ  １−３，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓを含む。Ｌｅｕ１６可変領域遺伝子は，Ｇｉｌｌｅｓらの方法を用いてクローニングされ修飾され，同書に，上記Ｔ細胞エピトープ関連コア９ｍｅｒを置換するために新規ペプチド配列を取り込まれる。適合する非エピトープ９ｍｅｒペプチドは，次のようにデータベースから選択された。
推定Ｔ細胞エピトープ      データベース非エピトープ９ｍｅｒ
Ｌｅｕ１６ＶＨ        ＬＶＫＰＧＡＳＶＫ        ⇒        ＶＶＫＰＧＡＳＶＫ
ＦＫＧＫＡＴＬＴＡ        ⇒        ＦＫＧＲＶＴＬＴＡ
ＬＴＳＥＤＳＡＤＹ        ⇒        ＬＲＳＥＤＳＡＶＹ
Ｌｅｕ１６ＶＬ        ＩＬＳＡＳＰＧＥＫ        ⇒        ＴＬＳＡＳＰＧＥＫ
ＭＤＷＹＱＫＫＰＧ        ⇒        ＭＡＷＹＱＱＫＰＧ
【００４８】
これら修飾した９ｍｅｒは，ＰＣＲによってＬｅｕ  ＶＨ及びＶＬ配列に導入され，得られた遺伝子は，キメラの重鎖及び軽鎖それぞれをコードするためにヒトＩｇＧ１及びヒトκ定常領域を提供する別々のベクターにクローニングした。未修飾（キメラ）の及びエピトープ修飾したＬｅｕ１６重鎖及び軽鎖を含むプラスミドは，ＮＳ０細胞にトランスフェクトされ，安定形質転換細胞は，抗体を回収し，プロテインＡを用いて精製するために選択された。
【００４９】
抗体のテストは，Ｇｉｌｌｉｅｓら（同書）に従って行い，ＣＤ２０＋ヒトＤａｕｄｉ  Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ種細胞株（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）をターゲットとして用いた。結合アッセイは，挿入されたデータベース非エピトープを有する修飾された抗体と比較して，キメラ抗ＣＤ２０の結合をテストするために，ＦＡＣＳフォーマットで行われた。結果（図２）は，Ｌｅｕ１６由来の抗ＣＤ２０抗体を修飾したエピトープが，キメラ抗ＣＤ２０抗体と比較して，Ｄａｕｄｉ細胞と同じ効率で結合することを示す。抗ＣＤ２０抗体で修飾したエピトープは，キメラの抗ＣＤ２０抗体に替わる潜在的な低免疫原性を提供する。
【実施例５】
【００５０】
実施例５：Ｔ細胞エピトープの有無についてのＡ３３と抗ＨＥＲ２抗体可変領域の比較
２つのヒト化抗体の可変領域配列である，ヒト化Ａ３３抗体（ＵＳ６３０７０２６，Ｃｅｌｌｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．）とハーセプチン（登録商標）（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ８９（１９９２）ｐ４２８５，ＵＳ５８２１３３７）として知られているヒト化抗ＨＥＲ２抗体を，Ｔ細胞エピトープデータベースを検索することによって比較した。実施例１に従って生成されたＴ細胞エピトープのデータベースを用いて，同一の９ｍｅｒ配列が検索され，対応する相対的位置２，３，５及び８を有する９ｍｅｒも検索された。結果は図３に示す。ヒト化Ａ３３の場合，Ｔ細胞エピトープ活性に陽性なペプチドから得られた３つの同一の９ｍｅｒは，ヒト化Ａ３３からのコア９ｍｅｒで，同書に掲載されたＳｔｕｒｎｉｏｌｏらの文献でＭＨＣクラスＩＩへの結合が予想されていた，対応する相対的位置２，３，５，及び８を有するエピトープとでは２カ所が共に一致していることがデータベースで同定された。一致の範囲は，Ｔ細胞エピトープ活性を有さないデータベースペプチドで見つけられた（データは示さず）。ヒト化抗ＨＥＲ２抗体の場合，Ｔ細胞エピトープ活性にポジティブなペプチドから同一の９ｍｅｒがデータベースで同定されず，コア９ｍｅｒがＭＨＣクラスＩＩを結合すると予測される対応する相対的位置２，３，５及び８を有するエピトープとでは１カ所の一致が同定された。
【００５１】
ヒト化Ａ３３と抗ＨＥＲ２抗体は，実施例４の方法に従って構築された。これらは，増殖アッセイにおいて５３ドナーを用いて実施例１のようにしてＴ細胞アッセイで分析され，１ｍＬの抗体を加えて最終濃度１０μｇ／ｍｌとすることで行われた。図４のデータから，抗体添加後，５〜８日間で最大刺激指数を示し，また，有意なＴ細胞応答が，ヒト化Ａ３３では５３のドナーから１２が観察され，ヒト化抗ＨＥＲ抗体では５３のドナーから２のみが観察された。
【００５２】
これらのデータは，ヒト化Ａ３３抗体の可変領域は有意なＴ細胞エピトープ（実在３，予想３）を含み，一方，ヒト化抗ＨＥＲ２抗体は，確認されたＴ細胞エピトープを含まず，他のエピトープから位置２，３，５及び８で所定モチーフを有する１つのエピトープのみが予測されたことを示す。これらのデータはまたヒト化Ａ３３と比較して，ヒト化抗ＨＥＲ２抗体（ハーセプチン（登録商標））の臨床免疫原性のレベルが低いことと一致する。
【００５３】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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