(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
モリテラ(Moritella sp.)属に属し、１６ＳｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列が配列表の配列番号１に記載の配列であり、且つ下記菌学的性質及び下記生理・生化学的性質を有し、ホスホリパーゼＡ1活性、ホスホリパーゼＣ活性、リゾホスホリパーゼＣ活性及びスフィンゴミエリン分解活性を有する酵素を産生することを特徴とする新規微生物。
Ａ．菌学的性質
（１）細胞形態：１．０〜１．２μｍ×２．０〜３．０μｍの多形態桿菌
（２）グラム染色性：陰性
（３）胞子の有無：陰性
（４）運動性：陽性
（５）コロニー形態（４８時間培養）
（イ）直径：１．０〜２．０ｍｍ
（ロ）色調：クリーム色
（ハ）形：円形
（ニ）隆起状態：レンズ状
（ホ）周縁：全縁
（ヘ）表面の形状など：スムーズ
（ト）透明度：半透明
（チ）粘稠度：バター様
（６）生育温度試験（℃）
（イ）２０℃：陰性
（ロ）１５℃：＋ｗ
（７）カタラーゼ反応：陽性
（８）オキシダーゼ反応：陽性
（９）グルコースの発酵：陽性
（１０）Ｏ／Ｆテスト（酸化／発酵）：陽性／陽性
（１１）嫌気条件での生育：陽性
Ｂ．生理・生化学的性質
（１）硝酸塩還元：陽性
（２）インドール産生：陰性
（３）ブドウ糖酸性化：陰性
（４）アルギニンジヒドロラーゼ：陰性
（５）ウレアーゼ：陰性
（６）エスクリン加水分解：陰性
（７）ゼラチン加水分解：陰性
（８）β−ガラクトシダーゼ：陰性
（９）ブドウ糖：陰性
（１０）Ｌ−アラビノース：陰性
（１１）Ｄ−マンノース：陽性
（１２）セロビオース：陽性
（１３）でんぷん加水分解：陰性
（１４）Ｄ−マンニトール：陰性
（１５）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：陰性
（１６）マルトース：陰性
（１７）グルコン酸カリウム：陰性
（１８）ｎ−カプリン酸：陰性
（１９）アジピン酸：陰性
（２０）ｄ１−リンゴ酸：陰性
（２１）クエン酸ナトリウム：陰性
（２２）酢酸フェニル：陰性
（２３）チトクロームオキシダーゼ：陽性
（２４）キシロース：陰性
（２５）グリセロール：陰性
（２６）Ｄ−ガラクトース：陰性
【請求項２】
モリテラ(Moritella sp.)属に属し、ホスホリパーゼＡ1活性、ホスホリパーゼＣ活性、リゾホスホリパーゼＣ活性及びスフィンゴミエリン分解活性を有する酵素を産生する、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７６６として寄託された新規微生物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の新規微生物によって産生されたホスホリパーゼＡ1活性、ホスホリパーゼＣ活性、リゾホスホリパーゼＣ活性及びスフィンゴミエリン分解活性を有する酵素を有効量含有することを特徴とする脂質改質剤。
【請求項４】
前記酵素が菌体及び／又は培養液に含まれている形で使用されていることを特徴とする請求項３に記載の脂質改質剤。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の新規微生物によって産生されたホスホリパーゼA１活性を有する酵素を用いてリン脂質を加水分解し、２−アシルリゾリン脂質を得ることを特徴とする２−アシルリゾリン脂質の製造方法。
【請求項６】
前記酵素が菌体及び／又は培養液に含まれている形で使用されていることを特徴とする請求項５に記載の２−アシルリゾリン脂質の製造方法。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の新規微生物によって産生された酵素を用いてリン脂質を加水分解し、ジアシルグリセロールを得ることを特徴とするジアシルグリセロールの製造方法。
【請求項８】
前記酵素が菌体及び／又は培養液に含まれている形で使用されていることを特徴とする請求項７に記載のジアシルグリセロールの製造方法。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の新規微生物によって産生された酵素を用いてリン脂質を加水分解し、セラミドを得ることを特徴とするセラミドの製造方法。
【請求項１０】
前記酵素が菌体及び／又は培養液に含まれている形で使用されていることを特徴とする請求項９に記載のセラミドの製造方法。
【請求項１１】
請求項１又は２に記載の新規微生物によって産生された酵素を用いて油脂中のリン脂質を加水分解することを特徴とする油脂の脱ガム法。
【請求項１２】
前記酵素が菌体及び／又は培養液に含まれている形で使用されていることを特徴とする請求項１１に記載の脱ガム法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モリテラ(Moritella sp.)属に属し、ホスホリパーゼＡ1活性、ホスホリパーゼＣ活性、リゾホスホリパーゼＣ活性及びスフィンゴミエリン分解活性を有するを酵素を産生する新規微生物、この新規微生物によって産生された酵素を有効量含有する脂質改質剤、この脂質改質剤を用いた油脂の脱ガムおよび脂質生化学研究への利用、２−アシルリゾリン脂質の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホスホリパーゼは、リン脂質のエステル結合を加水分解する酵素である。リン脂質代謝におけるそれらの重要性と一致して、これら酵素は、原核生物及び真核生物間に広く分布している。ホスホリパーゼは、生物学的な膜の代謝、構築及び再構成に影響を与え、シグナルカスケードに関与している。【０００３】
ホスホリパーゼには、リン脂質における標的となる結合の位置に従ったそれらの特異性の違いによるいくつかのタイプが知られている。図１に示すように、ホスホリパーゼＡ1は、グリセロリン脂質のsn-１位のエステル結合を加水分解して、遊離の脂肪酸及び2-アシルリゾリン脂質を産生する。ホスホリパーゼＡ２は、グリセロリン脂質のsn-2位のエステル結合を加水分解して、遊離の脂肪酸及び1-アシルリゾリン脂質を産生する。ホスホリパーゼＡ1及びホスホリパーゼＡ２酵素は、細胞内又は細胞外、膜結合性又は可溶性であり得る。細胞内ホスホリパーゼＡ２は、殆ど全ての高等動物に見ることができる。ホスホリパーゼCは、グリセロリン酸エステルを加水分解し、１，２−ジアシルグリセロール及びリン酸塩基を産生する。【０００４】
現在、油脂脱ガム化のために多くの方法が使用されている。油脂の脱ガムのプロセスでは、ホスホリパーゼ酵素が使用されている。ホスホリパーゼＡ1及びホスホリパーゼＡ２は、例えば、”ENZYMAXTM脱ガム化” (Lurgi Life Science Technologies GmbH、ドイツ)のような、種々の商業的な過程における油脂の脱ガムに使用されている。ホスホリパーゼCも、リン脂質に対する作用で生じるリン酸残基が非常に水溶性でその除去が簡単であり、ジグリセリドが油脂とともに留まり損失を減らすことから、油脂の脱ガムへの使用が考慮されている｛例えば、 Dahlke (1998) “An enzymatic process for the physical refining of seed oils,” Chem. Eng. Technol. 21:278-281； Clausen (2001) “Enzymatic oil degumming by a novel microbial phospholipase,” Eur. J. Lipid Sci. Technol. 103:333-340を参照｝。【０００５】
リゾリン脂質は通常のリン脂質より高い界面活性を有し、食品への利用に際して極めて効果的な脂質形態であることが知られている。リゾリン脂質は食品の乳化安定性、食感、弾力性をリン脂質以上に改善できるとともに他の乳化剤の使用量を節約することができる。また、食品用途の他に化粧品用乳化剤としても利用価値がある。【０００６】
リゾリン脂質の調製方法としてホスホリパーゼＡ2による方法が知られている。現在、工業的に利用できるホスホリパーゼＡ2は豚膵臓を起源とする酵素だけであり、１−アシルリゾリン脂質によるエマルジョンに比べて、２−アシルリゾリン脂質によるエマルジョンは油層分離率が著しく低い点（第３５回油化学討論会、講演番号Ｐ１０）で有利である。【０００７】
ホスホリパーゼはトリグリセリドを加水分解しないので、基質中にトリグリセリドが存在していても、ジグリセリドやモノグリセリドが生成せず、リン脂質の加水分解生成物であるリゾリン脂質の精製を阻害しない。糸状菌等の真菌に由来するホスホリパーゼＡ1 の調製法が開発されたが、培養に長時間を要し、菌体を含む培地からの酵素の抽出操作は煩雑である。【０００８】
ホスホリパーゼＡ1は動物の膵臓や肝臓、微生物に存在し、ホスホリパーゼＡ2と共にリン脂質の代謝回転に寄与している。また、リン脂質の脂肪酸分子内分布の解析や脂質生化学研究において有用な酵素であるが、現在のところ精製品も含めて市販品はない。【０００９】
リゾホスホリパーゼＣは１および２−アシルリゾリン脂質からリン酸残基を取り除き、モノアシルグリセロールおよびリン酸ベースを産生する。リゾホスホリパーゼＣにより脂肪酸組成既知の１および２−アシルリゾリン脂質からモノアシルグリセロールを生産することで、脂肪酸組成既知のモノアシルグリセロールを製造することができ、脂質生化学研究への利用が期待される。【００１０】
スフィンゴミエリンは、ホスホリパーゼＣやスフィンゴミエリナーゼにより特異的にセラミドに変換される。生成されるセラミドは皮膚の保湿成分などとして利用される。
【特許文献１】特開平１０−３２３１８２号公報
【特許文献２】特開平１１−２２８９８６号公報
【特許文献３】特開平１１−３１８４３４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、（１）油脂の脱ガム、リン脂質の改質、脂質生化学研究などに有用なホスホリパーゼＡ1、ホスホリパーゼＣ、リゾホスホリパーゼＣ、スフィンゴミエリン分解酵素の新たな供給源を提供すること、（２）油脂の製造過程における脱ガムへの利用及びリゾリン脂質を調製しうる方法を提供すること、（３）リゾホスホリパーゼＣを用いたモノアシルグリセロールの調製方法を提供すること、（４）スファゴミエリン分解酵素を用いたセラミドの調製方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、モリテラ(Moritella sp.)属に属し、ホスホリパーゼＡ1活性、ホスホリパーゼＣ活性、リゾホスホリパーゼＣ活性及びスフィンゴミエリン分解活性を有する酵素を産生する新規微生物（ＨＦＨＩ−００１４株）及びその新規微生物が分泌する酵素を有効量含有する脂質改質剤により上記課題を解決するものである。【００１３】
すなわち、２−アシルリゾリン脂質は、この新規微生物によって産生されたホスホリパーゼA１活性を有する酵素を用いてリン脂質を加水分解することにより得ることができる。ジアシルグリセロールはこの新規微生物によって産生されたホスホリパーゼＣ活性を有する酵素を用いてリン脂質を加水分解することにより得ることができる。セラミドはこの新規微生物によって産生されたスフィンゴミエリン分解活性を有する酵素を用いてリン脂質を加水分解することにより得ることができる。この新規微生物によって産生された酵素を用いて油脂中のリン脂質を加水分解することにより油脂の脱ガムに利用することができる。【００１４】
なお、この新規微生物は後述する菌学的性質及び生理・生化学的性質を有している。また、この新規微生物は１６ＳｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列が配列表の配列番号１に記載の配列になっている。なお、この新規微生物は独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに識別のための表示がＨＦＨＩ−００１４、受領番号がＦＥＲＭ  ＡＰ−２０８０６として寄託され、２００７年１月２２日に国内寄託から国際寄託へ移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７６６が付与されている。前記酵素は菌体及び／又は培養液に含まれている形で使用することができる。【００１５】
培養液とは、Moritella  sp. ＨＦＨＩ−００１４株を培養して得られる培養産物をすべて包含するものであり、菌体を含んでいても、含んでいなくてもよい。本発明の培養液は、これらの菌株を、例えば常法に従ってペプトンと酵母エキスを含む培地等で培養した後、慣用の方法で単離、精製することにより得られる。本発明の調製法及び製造法においては、遠心によって菌体を除去した培地（培養上清）を用いることが好ましい。基質としてはホスホリパーゼＡ1およびホスホリパーゼＣについては大豆、菜種などの植物、イクラ、イカ、卵黄などの陸産及び海産動物、バクテリア、酵母などの微生物由来の天然に存在するリン脂質、及び化学的、酵素的に調製されたリン脂質など、sn-1および２位にエステル結合を有するリン脂質であれば用いることができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、リン脂質の改質、脂質生化学研究などに有用なホスホリパーゼＡ1活性およびホスホリパーゼＣ活性、リゾホスホリパーゼＣ活性、スフィンゴミエリン分解活性を有する培養液を提供することができるという効果がある。【００１７】
また、本発明によれば、１０℃という低温状況下においてもリン脂質から２−アシルリゾリン脂質およびジアシルグリセロール、モノグリセロールを製造することができ、スフィンゴミエリンからセラミドを製造することができ、従って、酵素による処理中に温度によって油脂やタンパク質が変質するのを避けることができるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ホスホリパーゼによるリン脂質の加水分解の態様を説明するための説明図である。
【図２】細菌基準株データベースにより得られた相同率上位30配列を用いて推定した分子系統解析結果を示す説明図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
まず、本発明に係る微生物（ＨＦＨＩ−００１４）を、Ｋ２８培地を用い、好気条件下、１０℃で5日間培養し、その菌学的性状を観察したところ、表１に示す通りであった。【００２０】
【表１】
0005526355.tif 000002
【００２１】
本発明に係る微生物（ＨＦＨＩ−００１４）は運動性を有するグラム陰性の多形態桿菌であり、グルコースを発酵し、カタラーゼ反応およびオキシダーゼ反応ともに陽性を示した。【００２２】
また、本発明に係る微生物（ＨＦＨＩ−００１４）の生理・生化学性状試験を行なったところ、表２に示す通りであった。【００２３】
【表２】
0005526355.tif 000003
【００２４】
本発明に係る微生物（ＨＦＨＩ−００１４）はAIPキットの判定の結果、硝酸塩を還元し、アルギニンジヒドロラーゼ活性を示さなかった。また、セロビオースおよびD-マンノースを酸化した。【００２５】
また、本発明に係る微生物（ＨＦＨＩ−００１４）の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列を調べたところ、配列表の配列番号１に示す通りであった。【００２６】
また、この16S rDNAの塩基配列解析の結果を用いて相同性検索を行ったところ、表３及び表４に示す通りであった。表３は細菌基準株データベースに対する相同性検索の結果を示し、表４は国際塩基配列データベースに対する相同性検索の結果を示す。【００２７】
【表３】
0005526355.tif 000004
【００２８】
【表４】
0005526355.tif 000005
【００２９】
また、細菌基準株データベースにより得られた相同率上位30配列を用いて推定した分子系統解析結果を図２に示す。【００３０】
16S rDNAの塩基配列解析結果を用いて行った細菌基準株データベースに対する相同性検索及び国際塩基配列データベースに対する相同性検索の結果、Moritella marinaや Moritella purofundaなどのMoritella sp.と高い相同性を示した。しかし、既知のMoritellaでは性状が一致する種はなく、Moritella sp.ＨＦＨＩ−００１４株は新規のMoritella sp.であると認められる。【００３１】
本願微生物（ＨＦＨＩ−００１４）は２００６年２月２２日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号中央第６）に国内寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０８０６が付与され、２００７年１月２２日に国内寄託から国際寄託へ移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７６６が付与された。
【実施例】
【００３２】
以下、実験例により本発明を更に詳細に説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。【００３３】
実験例１  Moritella  sp. ＨＦＨＩ−００１４株をＫ２８培地（ペプトン ０．５％、酵母エキス ０．１％、人工海水 ５０％）に植菌して１０℃で約７２時間振盪培養した。遠心で菌体を除去して培養上清を得た。基質として１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（16:0/ 18:1(n-9)-PC）、又は１−オレオイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（18:1(n-9)/ 16:0-PC） 5mg、培養上清０．５ｍｌにジエチルエーテル０．５ｍｌを加え、全量を１．０ｍｌにした。１０℃で１３時間撹拌した後、フォルチ法で脂質を抽出した後、シリカゲルＴＬＣでリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、モノアシルグリセロール（ＭＧ）を分画した。塩酸メタノール法でＬＰＣ、ＭＧの構成脂肪酸を塩酸メタノール法でメチルエステルとして得た後、ガスクロマトグラフィで定量分析した。原料とＬＰＣ、ＭＧの脂肪酸組成を表５に示す。【００３４】
【表５】
0005526355.tif 000006
【００３５】
両基質ともＬＰＣにはｓｎ−１位とｓｎ−２位の脂肪酸が検出されたが、ｓｎ−２位の脂肪酸が多く残っており、ｓｎ−１位のアシル基が選択的に加水分解された。即ち、酵素溶液として用いた培養上清中には、主要な加水分解活性としてホスホリパーゼＡ1活性が存在することが確認された。また、両基質ともＭＧにはｓｎ−２位の脂肪酸のみが検出され、ホスホリパーゼＡ1によって生成した２−アシルリゾリン脂質に作用するリゾホスホリパーゼＣ活性が存在することが示された。【００３６】
実験例２ Moritella  sp. ＨＦＨＩ−００１４株をＫ２８培地（ペプトン ０．５％、酵母エキス ０．１％、人工海水 ５０％）に植菌して１０℃で約７２時間振盪培養した。遠心で菌体を除去して培養上清を得た。基質としての大豆油０．５ｍｇに培養上清０．５ｍｌにジエチルエーテル０．５ｍｌを加え、１０℃で１８時間撹拌した。反応溶液をシリカゲルＴＬＣに展開した結果、遊離酸の生成は検出されず、加水分解は確認されなかった。従って、この培養上清はトリグリセリドに働くリパーゼ活性を有しないことが判明した。【００３７】
実験例３ Moritella  sp. ＨＦＨＩ−００１４株をＫ２８培地（ペプトン ０．５％、酵母エキス ０．１％、人工海水 ５０％）に植菌して１０℃で約７２時間振盪培養した。遠心で菌体を除去して培養上清を得た。基質としてのジアシルグリセロール（ＤＧ）１．０ｍｇに培養上清０．５ｍｌにジエチルエーテル０．５ｍｌを加え、１０℃で１８時間撹拌した。反応溶液をシリカゲルＴＬＣに展開した結果、遊離酸およびＭＧの生成は検出されず、加水分解は確認されなかった。従って、この培養上清はＤＧに作用するリパーゼ活性を有しないことが判明した。【００３８】
実験例４ Moritella  sp. ＨＦＨＩ−００１４株をＫ２８培地（ペプトン ０．５％、酵母エキス ０．１％、人工海水 ５０％）に植菌して１０℃で約７２時間振盪培養した。遠心で菌体を除去して培養上清を得た。基質としてのＭＨ  １．０ｍｇに培養上清０．５ｍｌにジエチルエーテル０．５ｍｌを加え、１０℃で１８時間撹拌した。反応溶液をシリカゲルＴＬＣに展開した結果、遊離酸の生成は検出されず、加水分解は確認されなかった。従って、この培養上清はＭＧに作用するリパーゼ活性を有しないことが判明した。【００３９】
実験例５ Moritella  sp. ＨＦＨＩ−００１４株をＫ２８培地（ペプトン ０．５％、酵母エキス ０．１％、人工海水 ５０％）に植菌して１０℃で約７２時間振盪培養した。遠心で菌体を除去して培養上清を得た。基質としての卵黄（ＰＣ） １．０ｍｇに培養上清 ０．５ｍｌにジエチルエーテル０．５ｍｌを加え、１０℃で１３時間撹拌した。反応溶液をシリカゲルＴＬＣに展開した結果、遊離脂肪酸およびＰＣ、ＬＰＣ、ＭＧの他にＤＧの生成が検出された。即ち、酵素溶液として用いた培養上清中には、主要な加水分解活性としてホスホリパーゼＣ活性が存在することが確認された。【００４０】
実験例６ Moritella  sp. ＨＦＨＩ−００１４株をＫ２８培地（ペプトン ０．５％、酵母エキス ０．１％、人工海水 ５０％）に植菌して１０℃で約７２時間振盪培養した。遠心で菌体を除去して培養上清を得た。基質としての大豆由来の１−アシルリゾリン脂質１．０ｍｇに培養上清０．５ｍｌにジエチルエーテル０．５ｍｌを加え、１０℃で８時間撹拌した。反応溶液をシリカゲルＴＬＣに展開した結果、ＬＰＣのほかにＭＧの生成が検出された。即ち、酵素溶液として用いた培養上清中には、１−アシルリゾリン脂質に作用するリゾホスホリパーゼＣ活性が存在することが確認された。【００４１】
実験例７ Moritella  sp. ＨＦＨＩ−００１４株をＫ２８培地（ペプトン ０．５％、酵母エキス ０．１％、人工海水 ５０％）に植菌して１０℃で約７２時間振盪培養した。遠心で菌体を除去して培養上清を得た。基質としての卵黄由来のスフィンゴミエリン２．０ｍｇに培養上清０．５ｍｌにジエチルエーテル０．５ｍｌを加え、１０℃で１６時間撹拌した。反応溶液をシリカゲルＴＬＣに展開した結果、セラミドの生成が検出された。即ち、酵素溶液として用いた培養上清中には、スフィンゴミエリン分解活性が存在することが確認された。【００４２】
以上、実験例１〜７の結果をまとめると表６に示す通りとなり、本発明に係る微生物Moritella  sp. ＨＦＨＩ−００１４株の培養上清は、ホスホリパーゼＡ1活性、ホスホリパーゼＣ活性、リゾホスホリパーゼＣ活性及びスフィンゴミエリン分解活性を備え、ホスホリパーゼＡ２活性及びリパーゼ活性を備えていないことがわかる。【００４３】
【表６】
0005526355.tif 000007
【産業上の利用可能性】
【００４４】
培養液中に含まれるホスホリパーゼＡ1活性、ホスホリパーゼＣ活性、リゾホスホリパーゼＣ活性及びスフィンゴミエリン分解活性を有する酵素を分離・精製することにより食品や化粧品を工業的に乳化する用途や脱ガムに利用できる。
【図１】
0005526355.tif 000008
【図２】
0005526355.tif 000009
【配列表】
0005526355000001.app