(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０７８，ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０７９，ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０８０，及びＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０７１としてそれぞれ寄託されたMethylobacterium属のメタノール資化性細菌より選ばれるものである，細菌。
【請求項２】
請求項１の細菌とスナゴケのプロトネマとを含んでなる，組成物。
【請求項３】
該細菌と該プロトネマとを培地中に含んでなるものである，請求項２の組成物。
【請求項４】
スナゴケのプロトネマの生育促進方法であって，
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０７８，ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０７９，ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０８０，及びＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０７１としてそれぞれ寄託されたMethylobacterium属のメタノール資化性細菌の少なくとも何れかを準備するステップと，
スナゴケのプロトネマを，該準備した細菌と共に培養するステップと，
を含んでなるものである方法。
【請求項５】
タバコ，オオムギ及びダイズよりなる群より選ばれる種子植物の生育促進方法であって，
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０７８として寄託されたメタノール資化性細菌Methylobacterium aquaticumを準備するステップと，
該選ばれた種子植物の種子に該細菌を接触させて該種子の培養を行うステップと
を含んでなるものである，方法。
【請求項６】
該種子と該細菌との接触が，該種子を該細菌の培養液に曝露することによるものである，請求項５の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，スナゴケ及び特定の種子植物の生育促進に関し，より詳しくはスナゴケ及びそれら種子植物の生育を促進する性質を有する細菌，スナゴケと該細菌を含む組成物，スナゴケと該細菌とを共生させることによる，スナゴケの生育促進方法，並びにそれらの種子植物の種子を該細菌に曝露することによる，それらの種子植物の生育促進方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コケ植物〔センタイ類（蘚苔類 Bryophyta）〕は他の植物同様，炭酸同化作用によりＣＯ2を固定して酸素を放出するが（特許文献１），落葉植物の落ち葉が容易に微生物分解されてＣＯ2を放出するのに対し，枯れても腐食が極めて遅く，そのためＣＯ2の放出が起こりにくいことから，長期的にみると落葉植物に比してＣＯ2の固定能が高い。従来，コケ植物の栽培は，自然において放置に近い状態で行われてきた。しかしながらこの方法では，生育速度が天候に大きく左右されるという問題があり，しかも生育が非常に遅く，植えつけたコケ植物がその場所に群落を形成するまでに１年以上を要するという難点がある。特に，コケ植物のうちスナゴケ（Racomitrium canescens）は，乾燥に強く，日の当たる場所でも育ち，基盤として土を必要とせず，メンテナンスの必要がない等の点から，緑化資材として注目されている（特許文献２，特許文献３，特許文献４，特許文献５）が，その生育が取り分け遅いことが，緑化への幅広い利用におけるボトルネックになっている。このことから，スナゴケの生育を促進する技術に対する潜在的な需要がある。【０００３】
またコケ植物以外の植物についても，例えば農業用の，すなわち食物や飼料用作物の生産に用いられる植物の生育促進は，収穫の短期化や収穫量の増大につながる。従って，そのような生育促進技術があれば有用であり，そのような技術に対する潜在的な需要がある。タバコの１種であるNicotiana tabacumについて，Methylobacterium extorquens が生育促進効果を有することが知られており（非特許文献１），オオムギについてM. extorquensが生育促進効果を有することが知られており（特許文献６），またダイズについてもM. extorquensが生育促進効果を有することが知られているが（特許文献６〜１１），促進効果は必ずしも十分とはいえず，促進効果を有する他の細菌が入手できることが望ましい。【０００４】
【特許文献１】特開２００６−２５４９００公報
【特許文献２】特開２００６−００６２９２公報
【特許文献３】特開２００４−２３６５１８公報
【特許文献４】特開２００２−３６００６０公報
【特許文献５】特開平０７−２２７１４２公報
【特許文献６】米国特許出願公開２００３０２１１０８２
【特許文献７】米国特許５５１２０６９
【特許文献８】米国特許５９６１６８７
【特許文献９】米国特許６１７４８３７
【特許文献１０】米国特許出願公開２００１０００１０９５
【特許文献１１】米国特許出願公開２００６０２２８７９７
【非特許文献１】Journal of Experimental Botany, 57(15), p.4025-4032 (2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記背景のもとで，本発明は，スナゴケ及びタバコやオオムギ等の種子植物の生育を促進する手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は，スナゴケと他の微生物との共生関係の存在を想定し，そのような微生物を求めて検討を行った。採取したスナゴケからの菌の分離を試みたところ，メタノール資化性細菌が存在することを見出した。スナゴケとメタノール資化性細菌との共存はこれまで知られていない。本発明者は，メタノール資化性細菌がスナゴケに対して優先種として存在するものと想定して，それがスナゴケに対し如何なる機能を有するかにつき更に検討したところ，Methylobacterium aquaticum又はMethylobacterium extorquensに属する細菌の内に，スナゴケのプロトネマの生育を促進する作用を有するものが含まれているのを見出し，それらの菌株を単離し特定した。これら２種の細菌にスナゴケのプロトネマの生育を促進するものがあることは，これまで知られていなかった。更に本発明者は，種子植物の幾つかにおいて，発芽前の種子をこれらの細菌にある期間接触させることにより，発芽率の向上や茎及び根の成長の促進をもたらすことを見出した。更に本発明者は，それらの細菌のうちに種子植物の生育をも促進するものが含まれることを見出した。本発明は，これの知見に基づき，更に検討を重ねて完成させたものである。すなわち本発明は，以下を提供する。【０００７】
１．受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０７８，ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０７９，ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０８０，及びＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０７１としてそれぞれ寄託されたMethylobacterium属のメタノール資化性細菌より選ばれるものである，細菌。
２．上記１の細菌とスナゴケのプロトネマとを含んでなる，組成物。
３．該細菌と該プロトネマとを培地中に含んでなるものである，上記２の組成物。
４．スナゴケのプロトネマの生育促進方法であって，
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０７８，ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０７９，ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０８０，及びＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０７１としてそれぞれ寄託されたMethylobacterium属のメタノール資化性細菌の少なくとも何れかを準備するステップと，
スナゴケのプロトネマを，該準備した細菌と共に培養するステップと，
を含んでなるものである方法。
５．タバコ，オオムギ及びダイズよりなる群より選ばれる種子植物の生育促進方法であって，
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０７８として寄託されたメタノール資化性細菌Methylobacterium aquaticumを準備するステップと，
該選ばれた種子植物の種子に該細菌を接触させて該種子の培養を行うステップと
を含んでなるものである，方法。
６．該種子と該細菌との接触が，該種子を該細菌の培養液に曝露することによるものである，上記５の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば，スナゴケのプロトネマの生育を促進することができる。従って，本発明によれば，生育の遅さというスナゴケの難点を克服しプロトネマを早期生育することが可能となる。また本発明は，タバコ及びオオムギの種子からの発芽や茎，根の成長を促すことにより，それらの種子植物の生育を促進することができる。従って，農業にこれを用いることにより，作物の収穫の短期化や収穫量の増大を図ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＤＧＧＥの結果を示す図面代用写真
【図２】細菌の接種の有無及びその種類による，プロトネマの生育比較結果を示す図面代用写真
【図３】細菌の接種の有無及びその種類による，プロトネマの生育比較結果を示すグラフ
【図４】ＭＡ−２２Ａによるカビの生育阻害を示す図面代用写真
【図５】プラントボックス上方から見たタバコの生育状況を示す図面代用写真
【図６】種子からのタバコの生育状態を示すグラフ
【図７】種子からのオオムギの生育状態を示すグラフ
【図８】種子からのダイズの生育状態を示すグラフ
【図９】種子からのダイズの生育状態を示すグラフ
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のMethylobacterium属のメタノール資化性細菌のうち，菌株名がＭＡ−２２Ａ，ＭＣ−２１Ｂ，及びＭＣ−２１Ｃのものは，２００７年１１月２８日付けで，日本国茨城県つくば市東１−１−１つくばセンター中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）に国内寄託され，それぞれ受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４４９，ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５０，及びＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５１が付与され，その後２００８年１２月１６日付で同じくＩＰＯＤにおいてブタペスト条約に基く国際寄託に移管されて，それぞれ受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０７８，ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０７９，及びＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０８０が付与されたものである。
また，菌株名がＭＣ−１１Ａのものは，２００８年１２月１０日付けで同じくＩＰＯＤに国際寄託され，受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０７１が付与されたものである。【００１１】
ＭＡ−２２Ａ，ＭＣ−２１Ｂ，ＭＣ−２１Ｃ，及びＭＣ−１１Ａの性質を次の表１ａ及び表１ｂに示す。【００１２】
【表１ａ】
0005394259.tif 000002
【００１３】
【表１ｂ】
0005394259.tif 000003
【００１４】
上記の各細菌は，天然のスナゴケから単離されたものである。これらの細菌をスナゴケのプロトネマ生育促進に用いるには，例えば，スナゴケのプロトネマの培養に際して，培養液に当該菌の少なくとも何れか一種を準備し，これを接種するだけでよい。その場合培養は例えば，実施例の部に記載のＹ培地（寒天０．８％含有）を用いて，明所（例えば蛍光灯下）にて，高湿度（例えば１００％），２０℃で行えばよいが，これに限定されず，適宜の条件で行ってよい。スナゴケのプロトネマに対する当該細菌の接種量は適宜であり，特に限定はない。例えば，プロトネマ１つあたり，菌のコロニー（約１ｍｍ径）の菌量の１／３０の接種により発育促進が得られるが，これらの菌はスナゴケのプロトネマ付近では増殖し易く，そのため接種する量は，その後の菌の増殖が確認できる限り，これより少ない量でもよい。上記の各細菌はピンク色を呈し，その増殖は，プロトネマを取り囲むピンク色の領域として肉眼で明瞭に確認することができる。接種した菌の増殖が培養を通して確認できる限り，菌の接種は最初の１回のみで十分であるが，所望により適宜追加摂取しても問題はない。こうしてプロトネマを速やかに生育させることで，配偶体へと分化させるための多量のプロトネマを，短い期間で得ることができる。【００１５】
種子植物（タバコ又はオオムギ）の生育促進のためには，それらの種子を各々に適した通常の発芽条件下にて発芽させるに際し，上記各細菌のうちＭＡ−２２Ａ（生菌そのもの又はその培養液）を準備し，これを種子に接触させて通常と同様に培養すればよく，種子の培養過程でその細菌が増殖するから，これを培養物に後から追加で接種する必要は，通常ない。ある程度の期間（例えば５日以上）細菌を種子と共に存在させる限り，発芽率の増加その他の生育促進を得ることができる。
【実施例】
【００１６】
以下，本発明を実施例に基づき詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。【００１７】
〔実施例１〕  スナゴケの生育促進（１）
〔スナゴケの無菌化〕
天然のスナゴケ（Racomitrium canescens，山形県産）を入手した。胞子嚢を，十分量の水（胞子嚢１個当たり１ｍＬ以上）で２回洗浄し，７０％エタノールで１分間処理した。胞子嚢を，更に１％の過塩素酸ナトリウム及び０．５％のＴｗｅｅｎ２０を含有する水溶液に２０分間浸漬した後，滅菌水で５回洗浄した。滅菌水中で胞子嚢を壊し，流出した胞子をピペットで採取した。得られた無菌胞子を，寒天培地（ハイポネックスTM*を水で１０００倍希釈した液＋寒天０．８％）に蒔き，２０℃にて蛍光灯下で培養した。培養開始後約２週間でプロトネマ（原糸体）の生育が肉眼で確認された。
・注：ハイポネックス〔（株）ハイポネックスジャパン製，窒素全量６％（うちアンモニア性窒素２．９０％，硝酸性窒素１．０５％），水溶性リン酸１０．０％，水溶性カリ５．０％，水溶性苦土０．０５％，水溶性マンガン０．００１％，水溶性硼素０．００５％を含有〕【００１８】
下記のＹ培地（寒天０．８％含有）にても同様に培養を行い，プロトネマの生育が肉眼で同様に確認された。この無菌のプロトネマを，微生物による生育促進実験において用いた。【００１９】
【表２】
0005394259.tif 000004
【００２０】
〔スナゴケからの微生物の探索〕
上記天然のスナゴケ（無菌化前のもの）を滅菌水に懸濁させ，液体培地１Ｌ（ハイポネックスTM を水で１０００倍希釈したもの）に加え，蛍光灯下（距離３０ｃｍ，１６時間／日）を当てつつ，約１８℃にて７週間まで撹拌した。撹拌前，撹拌開始４週後，及び撹拌開始７週後の培養液サンプルを採取した。得られたサンプルの各々につき，１／３ＬＢ寒天培地（ポリペプトン３．３ｇ／Ｌ，酵母エキス１．６ｇ／Ｌ，塩化トリウム１０ｇ／Ｌ，寒天１５ｇ／Ｌ），及びハイポネックス１０００倍希釈液を寒天（１．５％）で固めたもののプレートを用いて培養を行い，多数の様々なコロニーを単離し，各々について菌を同定して性質を調べたが，スナゴケの生育を促進するものは見出されなかった。【００２１】
次に，上記天然のスナゴケ（無菌化前のもの）を滅菌水に懸濁させ，上記の各培養条件で培養し，培養開始４週後及び７週後に無作為にサンププリングしてＤＧＧＥ（denaturing gradient gel electrophoresis）解析に付した。すなわち，各培養液の５ｍＬを遠心分離（10,000×ｇ, １０分）により沈殿と上清に分離した。沈殿を採取して０．８５％塩化ナトリウム溶液で洗浄した後，ＢＬ緩衝液〔４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１％Ｔｗｅｅｎ２０，０．５％Nonidet P-40（ナカライテスク製），１ｍＭ ＥＤＴＡ２Ｎａ，ｐＨ８．０〕１ｍＬに懸濁させた。懸濁液を−２０℃にて凍結させ，次いで６０℃にて融解させた。これにプロテイナーゼＫ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を１０ｍＬ加え，３７℃で１０分間放置し，これをＤＮＡ鋳型として，以下の要領でＰＣＲ反応を行った。【００２２】
【表３】
0005394259.tif 000005
【００２３】
・注：プライマーＦ：CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG（配列番号１）
・注：プライマーＲ：ATTACCGCGGCTGCTG（配列番号２）
＜温度条件＞
(1)９５℃，２分
(2)次の３５サイクル
９５℃，１分
５５℃，３０秒
７２℃，３０秒
(3)７２℃，５分
＜ＤＧＧＥ条件＞
Dcodeユニバーサルミューテーション検出システム（Bio-Rad製）のマニュアルに従って，次の通りに行った。
ゲル：９％アクリルアミドゲル
変性剤グラジエント：４０〜６５％
電圧：６０Ｖ
泳動時間：１７時間【００２４】
電気泳動の結果を図１に，得られたＤＮＡ断片の配列に基くデータベースサーチによる検索結果を表４に，それぞれ示す。【００２５】
【表４】
0005394259.tif 000006
【００２６】
その結果，上記培養では認められなかったMethylobacterium, Methylocella, Methylocapsa等，メタノールを資化する細菌が多数含まれていることが見出された。これらのメタノール資化性細菌は，本発明者の知る限りにおいてこれまでスナゴケから検出されたという報告はないが，メタノール資化性細菌は富栄養の培地には生育しにくく，しかも生育が他の菌に比べて遅いことによるものと思われる。メタノール資化性細菌が本DGGE法によってスナゴケから検出されたことは，それらが優先的にスナゴケと共に存在していることを示唆するものである。【００２７】
上記の結果に従い，スナゴケと共に存在しているメタノール資化性細菌を採取するため，上記スナゴケの各サンプルを滅菌水に懸濁し，メタノールを単一炭素源とする培地（表５。本明細書において，「メタノール培地」ともいう。）に蒔いて微生物コロニーの単離を試みた。【００２８】
【表５】
0005394259.tif 000007
【００２９】
【表６】
0005394259.tif 000008
【００３０】
【表７】
0005394259.tif 000009
【００３１】
上記培養の結果，メタノール資化性細菌として合計７株を単離することができた。それら各菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡを分析し，データベース上に公開されている菌株と比較した。各菌株の帰属及び１６Ｓｒ  ＤＮＡ配列を示す（但し，２１Ａ及び４１Ａについては前半の数百塩基までを決定）。
（１）ＭＣ−１１Ａ：Methylobacterium extorquens，１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列：配列番号３
（２）ＭＣ−１１Ｂ：Methylobacterium extorquens，１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列：配列番号４
（３）２１Ａ：Spirosoma属細菌に近縁，１６Ｓｒ  ＤＮＡ配列：配列番号５
（４）ＭＣ−２１Ｂ：Methylobacterium extorquens，１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列：配列番号６
（５）ＭＣ−２１Ｃ：Methylobacterium extorquens，１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列：配列番号７
（６）ＭＡ−２２Ａ：Methylobacterium aquaticum，１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列：配列番号８
（７）４１Ａ：Mesorhizobium属細菌に近縁，１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列：配列番号９【００３２】
〔スナゴケの生育に対する分離菌の作用の検討〕  
予めＹ培地（寒天０．８％含有）で生育させておいたプロトネマをピンセットで１つずつ摘み，新しいＹ培地（寒天０．８％含有）中の２点に移した。メタノール寒天培地に生育させておいた上記細菌のコロニー（直径約１ｍｍ）を，滅菌した白金耳で１つ掻き取り，３００μＬの滅菌水に懸濁させ，植えつけたプロトネマに１０μＬ接種し，２０℃にて蛍光灯下で培養した。比較として，カルチャーコレクションより入手したMethylobacterium extorquens ＡＭ１株（ATCC14718）細菌を同様にしてプロトネマに接種した。また，対照として，細菌を接種しないプロトネマを同様に培養。試験開始４０日後の結果を図２に示す。同図に見られるように，対照に比して，ＭＡ−２２Ａ，ＭＣ−２１Ｂ又はＭＣ−２１Ｃを接種したスナゴケに生育の明らかな促進が認められ，特にＭＡ−２２Ａを接種したものにおいて顕著であった。これに対し，Methylobacterium extorquensのこれまで知られている菌株の１つであるＡＭ１株を接種したプロトネマには，生育促進は見られなかった。更に，ＭＣ−１１Ａ，ＭＣ−１１Ｂ，ＭＣ−２１Ｂ，ＭＣ−２１Ｃ及びＭＡ−２２Ａを接種した各プロトネマ及び細菌を接種しないプロトネマ（対照）について，試験開始３，５及び９週間後の時点における，各プロトネマを囲む楕円の面積として生育の程度を数値化した（図３）（エラーバーは標準偏差を表す。他のグラフにおいても同じ。）。その結果，ＭＡ−２２Ａを接種したプロトネマの生育が特に際立って優れていることが再確認されると共に，他の細菌のうち，ＭＣ−２１Ｂ及びＭＣ−２１Ｃはもとより，ＭＣ−１１Ａ及びＭＣ−１１Ｂにも，生育促進効果のあることが判明した。【００３３】
〔分離菌の特性の検討〕
植物との相互作用において重要と思われる性質について，分離菌を検討した。すなわち，分離菌について，窒素固定能，シデロフォア（Siderophore：鉄イオンキレート化物質）分泌，トリプトファン（Trp）からのインドール酢酸合成能，不溶性リン酸カルシウムの溶解能，β−グルカナーゼ分泌能，ＨＣＮ（カビに対する生育抑制効果を有する）分泌能の有無，及びカビに対する生育阻害作用の有無につき，下記のとおり検討した。
＜試験方法＞【００３４】
（１）窒素固定能：
窒素源を含まない次の組成の寒天培地に菌を画線し，２８℃，暗所にて生育を観察した。生育が認められれば窒素固定能があると判定した。【００３５】
【表８】
0005394259.tif 000010
【００３６】
（２）シデロフォア分泌： 
Anal. Biochem, 160, 47-56, 1987に準じて以下とおりに試験を行った。すなわち，まず次の溶液（Ａ）〜（Ｃ）を準備した。
（Ａ）６０．５ｍｇのＣＡＳ(クロムアズロールＳ:chrome azurol S)を５０ｍＬの水に溶解させ，１０ｍＭ塩酸中の１ｍＭ  ＦｅＣｌ3溶液１０ｍＬと混合した。これに７２．９ｍｇのＨＤＴＭＡ（臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム）を４０ｍＬの水に溶かしたものをゆっくり加えた。
（Ｂ）７５０ｍＬの水，１００ｍＬの１０×ＭＭ９塩類（ＫＨ2ＰＯ4：３ｇ／Ｌ，  ＮＨ4Ｃｌ：１０ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ：５ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ4：２ｍＭ，ＣａＣｌ2：１ｍＭ）, １５ｇの寒天，３０．２４ｇのＰＩＰＥＳ〔ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）〕を混ぜ，水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ  ６．８とした。
（Ｃ）１０％カザミノ酸水溶液３０ｍＬ。
上記溶液（Ａ）〜（Ｃ）を別々にオートクレーブ滅菌した後，約５０℃に冷却し，混合した。これにメタノールを終濃度１％となるよう加え，シャーレにて固めた。得られたプレートは青色を呈した。これに試験菌を画線し生育を観察した（２８℃，暗所）。この培地において，シデロフォア陽性の菌ではコロニーの形成が認められ，その周りに青色が抜け，ピンク色〜透明を呈する。シデロフォア陰性の菌はこの培地には生育しない。【００３７】
（３）トリプトファンからのインドール酢酸合成能：
Applied environmental microbiology, 1995, 61, 793-796に準じて次のとおりに試験を行った。すなわち，試験菌をKing's Ｂ液体培地（Difco proteose peptone No.3：２０ｇ／Ｌ, Ｋ2ＨＰＯ4：１．１５ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ4：１．５ｇ／Ｌ，メタノール：１％，トリプトファン：２．５ｍＭ）に植菌した。これを２８℃，暗所にてしんとう培養し，生育が認められたら培養液を遠心分離し，上清をサンプルとした。サンプル１ｍＬに，１ｍＬの溶液Ｒ１（７．９ＭのＨ2ＳＯ4中ＦｅＣｌ3：１２ｇ／Ｌ）を加えた。室温にて３０分間放置した後，５３０ｎｍにおける吸光度を測定した。ブランクには菌を植えていない培地を用い，それに比べ呈色が起こればインドール酢酸合成能が陽性と判定した。【００３８】
（４）不溶性リン酸カルシウムの溶解能：
FEMS Microbiol, Lett, 170, 265, 1999に準じて次のとおりに試験を行った。すなわち，NBRIP 培地〔National Botanical Research Institute's phosphate growth medium：グルコース１０ｇ／Ｌ，Ｃａ3(ＰＯ4)2：５ｇ／Ｌ，ＭｇＣｌ2：５ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ4：０．２５ｇ／Ｌ，ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ，(ＮＨ4)2ＳＯ4：０．１ｇ／Ｌ，ｐＨ７，寒天１．５％〕を用い，試験菌を寒天培地に画線し，生育を観察した。培地は白濁しており（リン酸カルシウム），菌にリン酸カルシウムの溶解能があれば生育と培地の色の抜けが認められる。【００３９】
（５）β−グルカナーゼ分泌能： 
市販のＲ２Ａ寒天培地に，アズリン染色架橋β−グルカン（Beta-glucan, azurin-dyed, cross-linked）を０．２％加え，オートクレーブ後固めた。培地は青色を呈するが基質は溶解しない。試験菌を画線し，コロニーの周りに溶解した基質の分散が認められれば陽性と判定した。【００４０】
（６）ＨＣＮ分泌能： 
MPMI vol 16, 2003, 525-535に準じて次のとおりに試験を実施した。すなわち，試験菌をCastric's 培地（Can J. Microbiol. 21, 613-618, 1975，Ｌ−グルタミン酸：４０ｍＭ，グリシン：１０ｍＭ，Ｌ−メチオニン：１０ｍＭ，ＭｇＳＯ4：２ｍＭ，ＮａＨ2ＰＯ4：５ｍＭ，Ｋ2ＨＰＯ4：５ｍＭ，ＦｅＣｌ3：２０μＭ，ｐＨ７．０）に植菌し，２８℃，暗所にてしんとう培養した。試験管はキャップができるものを用いた。菌の生育が認められたら培養液を遠心分離し，上清を水で１０倍希釈し，そのうち５０μＬを２５０μＬの０．１ＭＮａＯＨと混合した。これに，２−メトキシエタノール中の０．１Ｍ ｏ−ジニトロベンゼン溶液０．５ｍＬを加え，１５秒後２−メトキシエタノール中の０．２Ｍ ４−ニトロベンズアルデヒド０．５ｍＬを加え，更に３０分後５７８ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に，１〜１６μＭのＫＣＮ溶液を同様に処理し，スタンダードとした。【００４１】
＜結果＞
結果を以下の表に示す。【００４２】
【表９】
0005394259.tif 000011
【００４３】
（７）カビに対する生育阻害作用：
スナゴケの表面に白い糸状のカビが生えたものを分離し，常法により18S rRNA遺伝子の配列を読むことにより，Fusarium oxysporumと同定した。このカビをＲ２Ａ寒天培地（Beckton-Dickinson社）プレートの中程に植え，その周りに分離菌ＭＡ−２２Ａ，ＭＣ−２１Ｂ及びＭＣ−２１Ｃをそれぞれ画線し，28℃で５日程度培養した。カビの菌糸が寒天培地上を広がるのを，ＭＡ−２２Ａ菌が強く阻害していることが判明した。この様子を図４に示す。【００４４】
〔実施例２〕  タバコの生育促進
タバコ（Nicotiana tabacum 及びNicotiana benthamiana：日本たばこ産業（株）葉タバコ研究所より供与。）の種子を７０％エタノールで１分処理した後，２％次亜塩素酸溶液（Tｗｅｅｎ２０を約１％含有）で２０分処理した。種子を滅菌水で４〜５回洗浄した。プラントボックス（プラスチック製，５．５ｃｍ四方，高さ９ｃｍ）に５．５ｃｍ四方に切り取った濾紙を４枚敷き，オートクレーブ滅菌した後，これに滅菌した1/2 Murashige-skoog培地（寒天０．８％を含有する1/2 ＭＳ培地）を５ｍＬずつ加えた。Murashige-skoog液体培地は表１０〜１４に示した組成で構成されるものであり，1/2 ＭＳ培地はこれを1/2希釈したものである。【００４５】
種子を上記濾紙上に並べた（３０個／プラントボックス）。次いで，メタノール培地（表５）（メタノール１％含有）５ｍｌで培養（２８°Ｃ，２〜３日）したＭＣ−２１，ＭＣ−２１Ｃ及びＭＡ−２２Ａ株の培養液の何れかをそれらの種子にかけた（５００μＬ／プラントボックス）。対照として，細菌培養液の代わりに水のみ又はメタノール培地のみを種にかけた群を設けた。４℃，暗所にて４日間静置して種子に吸水させた後，２５℃，蛍光灯下で１日１２時間を明，１２時間を暗として１５日間培養し，種から子葉まで（茎）の長さ，根の長さ，苗の重量を測定した。また測定に先立ち，プラントボックスの上方から生育状況を写真撮影した。【００４６】
【表１０】
0005394259.tif 000012
【００４７】
【表１１】
0005394259.tif 000013
【００４８】
【表１２】
0005394259.tif 000014
【００４９】
【表１３】
0005394259.tif 000015
【００５０】
【表１４】
0005394259.tif 000016
【００５１】
プラントボックス上方から見たタバコ（Nicotiana tabacum 及びNicotiana benthamiana）の生育状況の典型例を図５に示す。同図より，ＭＡ−２２Ａ菌を摂取したタバコにおいて，対照に比して生育が顕著に促進されていることが分かる。【００５２】
また，N. tabacumでの茎の長さ，根の長さ，及び苗の重量の測定結果を，図６(A)にグラフで示す。図において，「茎の長さ」は種子表面から子葉に至るまでの植物体部分の長さを示す。N. tabacumの種子では，メタノール培地（菌株不含）をかけた群では発芽しなかったが，ＭＡ−２２Ａの培養液をかけた群では，対照（水）に比して茎の著しい伸長を伴った顕著な生育の促進が認められ，その効果はＭＣ−２１やＭＣ−２２Ｂには見られないものであった。また全体重量についても，ＭＡ−２２Ａの培養液をかけた群で顕著に増加し，その程度は，ＭＣ−２１やＭＣ−２２Ｂをかけた群に匹敵した。【００５３】
またN. benthamianaの種子での結果を図６(B) に示す。N. benthamianaでは，ＭＣ−２１やＭＣ−２２Ｂをかけた群では，重量が対照（水）の半分程度にしかならず，生育が著しく抑制されていたのに対し，ＭＡ−２２Ａの培養液をかけた群で逆に，顕著な重量増加が見られた。【００５４】
〔実施例３〕  オオムギの生育促進
オオムギの種子（Hordeum vulgare, subsp. vulgare cultivar Akashinriki：岡山大学資源生物科学研究所大麦・野生植物資源研究センターより提供を受けた）を７０％エタノールで１分処理した後，２％次亜塩素酸溶液（Ｔｗｅｅｎ２０を約１％含有）で３０分処理し，次いで滅菌水で４〜５回洗浄した。滅菌したプラントボックスに別途滅菌した４０ｍＬの０．８％寒天を流し込んで固めておいたものに，上記の種子を２０個ずつ並べた（各群につき種子４０個）。上記の方法で培養したＭＣ−２１Ｃ，ＭＡ−２２Ａの培養液を，対応する群の各種子に５μＬずつ落とし，対照群の種子には，水又はメタノール培地のみを滴下した。種子を２５℃，蛍光灯下，１日１２時間を明，１２時間を暗として，８日間培養した後，根の長さ，地上部（葉）の長さ，苗の重量を計測した。【００５５】
結果を図７に示す。ＭＡ−２２Ａの培養液を接触させた種子において，対照（水）及びＭＣ−２１Ｃをかけた群に比して，茎の長さ及び重量が増加するのが認められた。【００５６】
〔実施例４〕  ダイズの生育促進
滅菌したプラントボックスに0.8％寒天，1/2ＭＳ培地を50ｍＬずつ加えて固めた。ダイズ（Glycine max，エンレイ種）の種子を下記の方法で滅菌し，これを上記の固めた培地に植えた（７粒／ボックス）。１サンプルに２ポットを用いた。各ボックスに，ＭＡ−２２Ａ又はＭＣ−２１Ｃ菌懸濁液（何れも，メタノール液体培地５ｍＬで28℃，５日間，振とう培養したものを13000ｒｐｍ，５分間遠心し，滅菌水で２回洗い，最終的に５ｍＬの滅菌水に懸濁させたもの）をダイズ１粒につき20μＬ接種した。対照として，菌懸濁液の代わりに水のみをかけた２ボックスを用意した。これらの種子を４℃で２日間静置して種子に吸水させた。次いで，植物栽培用インキュベーター中で種子を２５℃にて培養し，１３日後に植物体（苗）の根と葉の長さ，及び重量を測定した。
＜ダイズの種子の滅菌方法＞
50ｍＬのチューブに種子を入れ，水でよく洗浄した後，70％エタノールで３分処理した。次いで，エタノールを除き，３％次亜塩素酸ナトリウムを含有する0.1% Tween 20水溶液に種子を30分間浸した後，クリーンベンチ内にて滅菌水で４回洗浄した。【００５７】
培養の結果を図８及び９に示す。これらの図に示すように，ＭＡ−２２Ａを接種したダイズにおいて茎の長さ，葉の長さ及び苗の重量に，何れも顕著な増加が観察された。【００５８】
〔実施例５〕  スナゴケの生育促進（２）
下記のKnop＋Ｂ５ビタミン培地にショ糖10ｇ／Ｌを加え，ｐＨを5.8に調整し，寒天1.0ｗ／ｖ％を加えてスナゴケ用培地を調製した。【００５９】
【表１５】
0005394259.tif 000017
【００６０】
上記スナゴケ用培地100ｍＬを入れた300ｍＬ容三角フラスコ中で，スナゴケのプロトネマを，23℃，24時間日長下で約1.5ヶ月間培養することにより，スナゴケが培地表面を覆った状態とした。スナゴケを培地上から回収し水道水で軽く洗浄し，そのフラスコ２本分を45ｍＬの純水を入れたブレンダー（ワーリング社製）に入れ，毎分10000回転で60秒間破砕した。バーミキュライトをセルロース繊維で成型した培土（フロリアライト：株式会社サンエイ）に対しこのスナゴケ破砕液１ｍＬを撒いた。フロリアライトは使用前にオートクレーブ滅菌しておいた。スナゴケ破砕液を撒いた後，希釈した市販の液肥（商品名ハイポネクス）でフロリアライトを飽和させた。Ｒ２Ａ寒天培地を含むシャーレ一面に培養したメチロトローフ細菌ＭＡ−２２Ａ，ＭＣ−１１Ａ及びＭＣ−２１Ｃを接種源とし，薬匙でかきとった菌体を500μＬの滅菌水に懸濁し，スナゴケ破砕液を撒いた各フロリアライトにその50μＬを種接した。細菌を接種しなかったものを対照区１，３ｍｇ／Ｌのカイネチンを含む液肥を使用し菌を接種しなかったものを対照区２とした。移植後，乾燥させないよう加湿しつつ照明装置付の順化室内で同一条件下にすべてのスナゴケを順化させた。【００６１】
順化開始２週間後において，これらのメチロトローフ細菌を接種したものは，対照区１，２のいずれと比較しても鮮やかな緑色を保っていた。対照区１では，コケの生存率が低く，ガメトフォア形成もごく限られていたのに対し，カイネチンのみ処理した対照区２では，対照区１に比べてコケの生存率が高く，ガメトフォアもよく誘導された。またメチロトローフ細菌を接種したものでも，対照区１に比べ生存率が高く，また，対照区２と同様にガメトフォアがよく誘導され，特にＭＣ−１１Ａ株を接種したものは，最も良好な生育とガメトフォア分化とを示した。このようにメチロトローフ細菌を接種することによって，順化時の生存率とガメトフォア形成率を高めることができた。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明は，スナゴケのプロトネマの早期生育を可能にすることから，スナゴケの効率的な増産の道をひらき，緑化資材としてのスナゴケの広範な利用を可能にする。また本発明は，タバコ，オオムギ及びダイズの生育を促進することから，それらの作物の短期収穫や収穫量の増大に寄与する。
【図３】
0005394259.tif 000018
【図６】
0005394259.tif 000019
【図７】
0005394259.tif 000020
【図８】
0005394259.tif 000021
【図９】
0005394259.tif 000022
【図１】
0005394259.tif 000023
【図２】
0005394259.tif 000024
【図４】
0005394259.tif 000025
【図５】
0005394259.tif 000026
【配列表】
0005394259000001.app