(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウラシルと、式（Ｉ）：
【化１】
0005586034.tif 000013
（式中、Ａは、Ｃ１−４アルキル基で置換されたＣ６−１０アリール基である）
で表される化合物とを酸化剤及び塩基の存在下で反応させて、式（ＩＩ）：
【化２】
0005586034.tif 000014
（式中、Ａは前記と同義である）で表される蛍光性化合物を得ることを特徴とする、ウラシルの検出方法であって、該塩基の使用量が、式（Ｉ）で表される化合物に対して１００〜１０００当量である、方法。
【請求項２】
Ａが、３−メチルフェニル基である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
試料中から、該蛍光性化合物を有機溶媒を用いて抽出する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）酸化剤が、フェリシアン化カリウムである、及び／又は（ｉｉ）塩基が、水酸化カリウムである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
酸化剤の使用量が、式（Ｉ）で表される化合物に対して０．００１〜３当量である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
（ｉ）反応温度が、５０〜１２０℃である、及び／又は（ｉｉ）反応時間が、１〜１５分である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
式（Ｉ）：
【化３】
0005586034.tif 000015
（式中、Ａは請求項１と同義である）
で表される化合物を含む、ウラシル検出用試薬。
【請求項８】
Ａが、３−メチルフェニル基である、請求項７記載の試薬。
【請求項９】
請求項７又は８記載の試薬を含む、ウラシル検出用キット。
【請求項１０】
式（ＩＩ）：
【化４】
0005586034.tif 000016
（式中、Ａは請求項１と同義である）
で表される蛍光性化合物。
【請求項１１】
Ａが、３−メチルフェニル基である、請求項１０記載の化合物。
【請求項１２】
請求項１記載の方法を用いて、ヒト患者由来の血液試料及び／又は尿試料中のウラシルを検出することを含む、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ欠損症の検査方法。
【請求項１３】
ウラシルと、式（Ｉ）：
【化５】
0005586034.tif 000017
（式中、Ａは請求項１と同義である）
で表される化合物とを反応させて、式（ＩＩ）：
【化６】
0005586034.tif 000018
（式中、Ａは前記と同義である）で表される蛍光性化合物を得ることを特徴とする、ウラシルの検出方法であって、（ｉ）反応温度が、９０℃である、及び／又は（ｉｉ）反応時間が、２分である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウラシル特異的な蛍光検出方法、ウラシル検出用試薬、及び該反応を用いたジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ欠損症の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）をはじめとするフッ化ピリミジン系抗癌剤は、乳癌や消化器癌などの悪性腫瘍に対して頻用されている代表的な抗癌剤である。しかし、フッ化ピリミジン分解の律速酵素であるジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（ＤＰＤ）を遺伝的に欠損している患者に、フッ化ピリミジン系抗癌剤を投与した場合、フッ化ピリミジンの血中濃度の上昇に伴い血液障害や骨髄抑制などの重篤な副作用を引き起こし、最悪の場合死に至ることが知られている。ＤＰＤは、通常、ウラシル及びチミンを分解する酵素であるため、ＤＰＤ欠損患者では、尿中あるいは血中のウラシルとチミンの濃度、特にウラシル濃度が高くなることが知られている。従って、フッ化ピリミジン系抗癌剤を投与する患者に対して、投与前に尿中あるいは血中のウラシル濃度を定量できれば、ＤＰＤ欠損の診断が可能であるので、ＤＰＤ欠損患者へのフッ化ピリミジン系抗癌剤の投与による事故を未然に防ぐことができる。【０００３】
これまでに、尿中あるいは血中のウラシル定量法として、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる方法（S. Sumi, K. Kidouchi, S. Ohba and Y. Wada, J. Chromatogr. B 1995, 672, 233-239）や、抗ウラシルモノクローナル抗体を用いる免疫学的測定法（特開２００８−１２０８２４号及び特開２００１−１１２４７２号）が開発されてきた。しかし、ＨＰＬＣ法には、１検体の測定に時間がかかり多検体を同時に解析できないこと、高額な装置が必要であること等の欠点があった。また、免疫学的測定法にも、基質特異性が低くＤＰＤ欠損の判定が困難であること、高額であること等の欠点があった。【０００４】
ウラシルの定量以外のＤＰＤ活性測定法として、末梢血単核球のＤＰＤ活性を直接測定する方法（B. E. Harris, R.Song, S. Soong and R. B. Diasio, Cancer Res. 1990, 50, 197-201）や、放射性同位体で標識されたウラシルを投与した後代謝された呼気中の標識ＣＯ２量を測定する方法（L. K. Mattison, H. Ezzeldin, M. Carpenter, A. Modak, M. R. Johnson and R. B. Diasio, Clin. Cancer Res., 2004, 10, 2652-2658）が報告されている。しかし、前者には、ＨＰＬＣ分離を必要とするため多検体を同時に分析ができないこと、後者には、放射性物質を使用すること、他の酵素の影響によりＤＰＤ欠損と誤診断する可能性があること等の諸問題があった。【０００５】
このような背景から、これまでに開発されたＤＰＤ活性測定法は、病院での日常的な検査に利用されておらず、現在では、フッ化ピリミジン系抗癌剤の投与後に嘔気などの副作用や血液検査での異常が認められた場合に限り、その患者のＤＰＤ活性が測定されている。そのため、ＤＰＤ欠損が判明してフッ化ピリミジンの投与を中断したにも関わらず、副作用が重篤化して死に至った例が、世界中で多数報告されている（鷹羽智之、森山仁、横山剛、的場周一郎、澤田壽仁、日本消化器外科学会雑誌、2008年、41巻、2075〜2080頁）。【０００６】
従って、簡便な方法で短時間に高精度かつ経済的にウラシルを検出することが可能なウラシル定量法及びＤＰＤ欠損症の検査法の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−１２０８２４号
【特許文献２】特開２００１−１１２４７２号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】S. Sumi, K. Kidouchi, S. Ohba and Y. Wada, J. Chromatogr. B 1995, 672, 233-239
【非特許文献２】B. E. Harris, R.Song, S. Soong and R. B. Diasio, Cancer Res. 1990, 50, 197-201
【非特許文献３】L. K. Mattison, H. Ezzeldin, M. Carpenter, A. Modak, M. R. Johnson and R. B. Diasio, Clin. Cancer Res., 2004, 10, 2652-2658
【非特許文献４】鷹羽智之、森山仁、横山剛、的場周一郎、澤田壽仁、日本消化器外科学会雑誌、2008年、41巻、2075〜2080頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、簡便な方法で短時間に高精度かつ経済的にウラシルを検出することが可能な、新規なウラシル特異的反応を特徴とする、ウラシルの検出方法を提供することを目的とする。また、該反応用試薬及び該反応を用いたＤＰＤ欠損症の検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、下記の式（Ｉ）で表される化合物を用いることにより、ウラシル特異的な反応が起こることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
即ち、本発明は以下に関する。
［１］ウラシルと、式（Ｉ）：【００１２】
【化１】
0005586034.tif 000002
【００１３】
（式中、Ａは、置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいヘテロアリール基である）
で表される化合物（以下、化合物（Ｉ）と略記することもある）とを反応させて、式（ＩＩ）：【００１４】
【化２】
0005586034.tif 000003
【００１５】
（式中、Ａは前記と同義である）で表される蛍光性化合物（以下、化合物（ＩＩ）と略記することもある）を得ることを特徴とする、
ウラシルの検出方法。
［２］Ａが、置換されたアリール基である、上記［１］記載の方法。
［３］Ａが、３−メチルフェニル基である、上記［１］記載の方法。
［４］試料中から、該蛍光性化合物を有機溶媒を用いて抽出する工程を含む、上記［３］記載の方法。
［５］ウラシルと式（Ｉ）で表される化合物との反応が、酸化剤及び塩基の存在下で行われることを含む、上記［１］記載の方法。
［６］酸化剤が、フェリシアン化カリウムである、上記［５］記載の方法。
［７］酸化剤の使用量が、式（Ｉ）で表される化合物に対して０．００１〜３当量である、上記［５］記載の方法。
［８］塩基が、水酸化カリウムである、上記［５］記載の方法。
［９］塩基の使用量が、式（Ｉ）で表される化合物に対して０．１〜２０００当量である、上記［５］記載の方法。
［１０］反応温度が、５０〜１２０℃である、上記［１］記載の方法。
［１１］反応時間が、１〜１５分である、上記［１］記載の方法。
［１２］式（Ｉ）：【００１６】
【化３】
0005586034.tif 000004
【００１７】
（式中、Ａは上記［１］と同義である）
で表される化合物を含む、ウラシル検出用試薬。
［１３］Ａが、置換されたアリール基である、上記［１２］記載の試薬。
［１４］Ａが、３−メチルフェニル基である、上記［１２］記載の試薬。
［１５］上記［１２］記載の試薬を含む、ウラシル検出用キット。
［１６］式（ＩＩ）：【００１８】
【化４】
0005586034.tif 000005
【００１９】
（式中、Ａは上記［１］と同義である）
で表される蛍光性化合物。
［１７］Ａが、置換されたアリール基である、上記［１６］記載の化合物。
［１８］Ａが、３−メチルフェニル基である、上記［１６］記載の化合物。
［１９］上記［１］記載の方法を用いて、試料中のウラシルを検出することを含む、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ欠損症の検査方法。
［２０］試料が、ヒト患者由来の血液試料及び／又は尿試料である、上記［１９］記載の検査方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、簡便な方法で短時間に高精度かつ経済的にウラシルを検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ウラシル（各濃度）と３−メチルベンズオキシムを反応させて、得られた化合物を蛍光光度分析した結果を示す図である。
【図２】ウラシル（各濃度）と３−メチルベンズオキシムを反応させて、得られた化合物を蛍光光度分析した結果を示す図である。
【図３】ウラシルと４−トリフルオロメチルベンズアミドオキシムを反応させて、得られた化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図４】ウラシル以外の試料と、３−メチルベンズオキシムを反応させて、得られた化合物を蛍光光度分析した結果を示す図である。
【図５】ウラシルと３−メチルベンズオキシムあるいはウラシルとベンズオキシムを反応させて得られた化合物を各種条件下で処理した後、蛍光光度分析した結果を示す図である。
【図６】尿中のウラシルを３−メチルベンズオキシムを用いて検出した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明において用いられる用語の定義について、以下に詳述する。
【００２３】
「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子を意味する。
【００２４】
「アルキル基」とは、直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基であり、例えば、Ｃ１−４アルキル基が挙げられる。具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル等が挙げられる。
【００２５】
「１乃至９個のハロゲン原子で置換されていてもよいアルキル基」とは、そのハロゲン原子が上記定義の「ハロゲン原子」で、そのアルキル部位が上記定義の「アルキル基」である、１乃至９個のハロゲン原子で置換されていてもよいアルキル基をいう。例えば、１乃至９個（例、１乃至３個）のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−４アルキル基が挙げられ、具体的には、上記「アルキル基」で列挙したものの他、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、ペンタフルオロエチル等が挙げられる。
【００２６】
「アルケニル基」とは、直鎖状もしくは分岐鎖状のアルケニル基であり、例えば、Ｃ１−４アルケニル基が挙げられ、具体的には、ビニル、アリル、１−プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１−メチルアリル、２−メチルアリル、１−メチル−１−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、１−エチルビニル等が挙げられる。
【００２７】
「アルキニル基」とは、直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキニル基であり、例えば、Ｃ１−４アルキニル基が挙げられ、具体的には、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル等が挙げられる。
【００２８】
「アルコキシ基」とは、直鎖状もしくは分岐鎖状のアルコキシ基であり、例えば、Ｃ１−４アルコキシ基が挙げられ、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ等が挙げられる。
【００２９】
「１乃至９個のハロゲン原子で置換されていてもよいアルコキシ基」とは、そのハロゲン原子が上記定義の「ハロゲン原子」で、そのアルコキシ部位が上記定義の「アルコキシ基」である、１乃至９個のハロゲン原子で置換されていてもよいアルコキシ基をいう。例えば、１乃至９個（例、１乃至５個）のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−４アルコキシ基が挙げられ、具体的には、上記「アルコキシ基」で列挙したものの他、トリフルオロメトキシ、２，２，２−トリフルオロエトキシ、ペンタフルオロエトキシ等が挙げられる。
【００３０】
「置換されていてもよいアリール基」の「アリール基」としては、例えばＣ６−１０アリール基が挙げられ、具体的には、フェニル、ナフチル等が挙げられ、なかでも好ましくはフェニルである。
【００３１】
「置換されていてもよいアリール基」の「置換基」としては、下記置換基群（以下、置換基群Ａと略記する）から選択される置換基が挙げられる。該アリール基は、置換可能な位置に１乃至３個の置換基で置換されていてもよく、該置換基が２個以上存在する場合には、各置換基は同一でも異なっていてもよい。
【００３２】
置換基群Ａ：
（１）１乃至９個のハロゲン原子で置換されていてもよいアルキル基、
（２）アルケニル基、
（３）アルキニル基、及び
（４）１乃至９個のハロゲン原子で置換されていてもよいアルコキシ基。
【００３３】
「置換されていてもよいヘテロアリール基」の「ヘテロアリール基」としては、
炭素原子以外に、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する、単環式Ｃ５−６ヘテロアリール基；
炭素原子以外に、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する、単環式Ｃ５−６ヘテロアリール基と、Ｃ６−１０アリール基が縮合した、縮合環式Ｃ９−１３ヘテロアリール基；及び
炭素原子以外に、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する、単環式Ｃ５−６ヘテロアリール基同士が縮合した、縮合環式Ｃ８−１０ヘテロアリール基；
が挙げられる。具体的には、ピリジル、ピラジル、ピリミジル、ピリダジル、トリアジニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、フリル、オキサゾリル、チエニル、チアゾリル、キノリニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、インドリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル等が挙げられる。
【００３４】
「置換されていてもよいヘテロアリール基」の「置換基」としては、上記置換基群Ａから選択される置換基が挙げられる。該へテロアリール基は、置換可能な位置に１乃至３個の置換基で置換されていてもよく、該置換基が２個以上存在する場合には、各置換基は同一でも異なっていてもよい。
【００３５】
以下、本発明の好適な態様について説明する。
【００３６】
本発明は、ウラシルと、式（Ｉ）で表される化合物とを反応させて、式（ＩＩ）で表される蛍光性化合物を得ることを特徴とする、ウラシルの検出方法を提供する。
【００３７】
【化５】
0005586034.tif 000006
【００３８】
上記式（Ｉ）、式（ＩＩ）中、Ａは、置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいヘテロアリール基を示す。
Ａとして好ましくは、置換されていてもよいアリール基であり、より好ましくは、上記置換基群Ａから選択される１乃至３個の置換基で置換されていてもよい、Ｃ６−１０アリール基である。なかでも好ましくは、１乃至９個（例、１乃至３個）のハロゲン原子で置換されていてもよいアルキル（例、Ｃ１−４アルキル）基１乃至３個で置換された、Ｃ６−１０アリール基であり、更に好ましくは、３−メチルフェニル、４−トリフルオロメチルフェニルであり、特に好ましくは、３−メチルフェニルである。
ウラシルを高感度に検出できるという点において、Ａが無置換のフェニルである場合も、また好ましい。
【００３９】
化合物（Ｉ）としては、以下の化合物（Ｉ−Ａ）〜（Ｉ−Ｅ）が好ましい。
［化合物（Ｉ−Ａ）］
Ａが、置換されていてもよいアリール基である、化合物（Ｉ）。
［化合物（Ｉ−Ｂ）］
Ａが、上記置換基群Ａから選択される１乃至３個の置換基で置換されていてもよい、Ｃ６−１０アリール基である、化合物（Ｉ）。
［化合物（Ｉ−Ｃ）］
Ａが、１乃至９個（例、１乃至３個）のハロゲン原子で置換されていてもよいアルキル（例、Ｃ１−４アルキル）基１乃至３個で置換されていてもよい、Ｃ６−１０アリール基である、化合物（Ｉ）。
［化合物（Ｉ−Ｄ）］
Ａが、３−メチルフェニル、フェニル又は４−トリフルオロメチルフェニルである、化合物（Ｉ）。
［化合物（Ｉ−Ｅ）］
式：
【００４０】
【化６】
0005586034.tif 000007
【００４１】
で表される化合物（即ち、３−メチルベンズアミドオキシム）。
【００４２】
化合物（Ｉ）は、市販品を入手可能であるか、自体公知の方法により製造することができる。
【００４３】
化合物（ＩＩ）としては、以下の化合物（ＩＩ−Ａ）〜（ＩＩ−Ｅ）が好ましい。
［化合物（ＩＩ−Ａ）］
Ａが、置換されていてもよいアリール基である、化合物（ＩＩ）。
［化合物（ＩＩ−Ｂ）］
Ａが、上記置換基群Ａから選択される１乃至３個の置換基で置換されていてもよい、Ｃ６−１０アリール基である、化合物（ＩＩ）。
［化合物（ＩＩ−Ｃ）］
Ａが、１乃至９個（例、１乃至３個）のハロゲン原子で置換されていてもよいアルキル（例、Ｃ１−４アルキル）基１乃至３個で置換されていてもよい、Ｃ６−１０アリール基である、化合物（ＩＩ）。
［化合物（ＩＩ−Ｄ）］
Ａが、３−メチルフェニル、フェニル又は４−トリフルオロメチルフェニルである、化合物（ＩＩ）。
［化合物（ＩＩ−Ｅ）］
式：
【００４４】
【化７】
0005586034.tif 000008
【００４５】
で表される蛍光性化合物。
化合物（ＩＩ−Ｅ）の如くフェニル基にアルキル基（好ましくはメチル基）等の疎水性官能基が導入された蛍光性化合物は、有機溶媒（例、酢酸エチル）で抽出可能であり、特に好ましい。尿中又は血中からの有機溶媒を用いての抽出が可能となることによって、試料（尿・血液）中の蛍光性夾雑物質の影響を受けることなく、多検体を用いた短時間の測定が可能となる。
【００４６】
上記のウラシルと化合物（Ｉ）との反応（以下、本発明の反応ともいう）は、酸化剤及び塩基（特に、強塩基）の存在下で反応が好適に進行するため、さらに酸化剤及び塩基を加えることが好ましい。
酸化剤としては、自体公知の酸化剤を適宜用いることができるが、このような酸化剤としては、例えば、フェリシアン化カリウム、塩化鉄（ＩＩＩ）、塩化銅（ＩＩ）、ヨウ素酸ナトリウム、過マンガン酸カリウム、硝酸カリウム、硝酸セリウムアンモニウム、ニクロム酸カリウム等が挙げられる。なかでも好ましくは、フェリシアン化カリウムである。酸化剤の使用量は、化合物（Ｉ）に対して、例えば０．００１〜３当量であり、好ましくは０.５〜２.５当量である。
塩基としては、自体公知の塩基を適宜用いることができるが、このような塩基としては、例えば、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸リチウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素リチウム等が挙げられる。なかでも好ましくは、水酸化カリウムである。塩基の使用量は、化合物（Ｉ）に対して、例えば０．１〜２０００当量であり、好ましくは１００〜１０００当量である。
【００４７】
加熱により反応が好適に進行するため、本発明の反応は、５０〜１２０℃の反応温度で行うことが好ましく、８０〜１２０℃で行うことがより好ましく、９０℃で行うことが特に好ましい。
【００４８】
極めて短時間の反応及び長時間の反応では得られる化合物（ＩＩ）の蛍光強度が減少するため、本発明の反応は、１〜１５分の反応時間で行うことが好ましく、１〜５分で行うことが更に好ましく、２分で行うことが特に好ましい。
【００４９】
本発明の反応は、溶媒を用いて行うこともできる。該溶媒としては、自体公知の溶媒を用いることができ反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、水、Ｎ，Ｎ-ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アルコール類（例えばメタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等）等が挙げられる。なかでも好ましくは、水である。また、下記の試料に含まれる水が、溶媒として働いてもよい。
【００５０】
本発明の反応により得られる化合物（ＩＩ）は蛍光性を有するので、励起波長領域の励起光を化合物（ＩＩ）に照射し、蛍光波長領域の蛍光強度を測定することにより、ウラシルを検出することが可能となる。
該励起波長領域は、励起光を照射することにより化合物（ＩＩ）が蛍光を呈するものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜適切な波長領域を選択して測定することができる。例えば２５０〜４００ｎｍの波長領域の励起光を照射することが好ましく、３１０〜３５０ｎｍの波長領域の励起光を照射することがより好ましく、３１０〜３３０ｎｍの波長の励起光を照射することが特に好ましい。
該蛍光波長領域は、蛍光波長領域であれば特に限定されず、当業者であれば適宜適切な波長領域を選択して測定することができる。例えば３５０〜５００ｎｍの波長領域における蛍光強度を測定することが好ましく、３６０〜４４０ｎｍの波長領域の蛍光強度を測定することがより好ましく、３６５〜４１０ｎｍの波長の蛍光強度を測定することが特に好ましい。
該蛍光強度は、自体公知の検出方法により測定することができるが、例えば蛍光分光光度計を用いて測定することができる。
【００５１】
本発明の反応により得られる化合物（ＩＩ）を含む反応液は、反応直後では強アルカリ性である。蛍光強度の増強を目的として酸（例、酢酸）による中和や、塩（例、塩化ナトリウム）による塩析、あるいは有機溶媒（例、酢酸エチル）による抽出等の処理をさらに行うことが好ましい。
中和（ｐＨ６〜７）工程→塩析工程→抽出工程を実施することが特に好ましい。
【００５２】
化合物（Ｉ）は、そのままあるいは他の添加物とともに、ウラシル検出用試薬とすることができる。該添加物としては、例えば、酸、酸性試薬等が挙げられる。
「酸」としては、無機酸または有機酸が挙げられ、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸、蟻酸等が挙げられる。
「酸性試薬」としては、該酸の水溶液等が挙げられる。
【００５３】
ウラシル検出用試薬は、そのままあるいは他の物品とともに、ウラシル検出用キットとすることができる。該物品としては、例えば、本発明の反応を有利に進めることができる、酸化剤、塩基及び溶媒、並びに説明書、包装材料、反応容器、体液試料又は老廃物試料の前処理フィルター等が挙げられる。
該酸化剤、塩基及び溶媒としては、上記と同様のものが挙げられる。
該説明書には、検出対象、使用されるべき試料、使用方法及び保管方法（例、冷蔵保存、密閉容器での保存等）等が記載され得る。
包装材料、反応容器及び体液試料又は老廃物試料の前処理フィルターとしては、自体公知のものを用いることができる。
【００５４】
本発明の反応はウラシルに特異的な反応である。「ウラシルに特異的」とはウラシルとのみ反応することをいい、例えば、遊離のウラシル以外の核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド及び核酸塩基誘導体（例、プソイドウリジン等の稀少核酸塩基、５−フルオロウラシル等のフッ化ピリミジン系抗癌剤等）等とは反応しないことをいう。
【００５５】
本発明の反応は、このようなウラシルに特異的な反応であるので、本発明の反応を用いて試料中のウラシルを検出することにより、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ欠損症を検査することが可能となる。
該試料としては例えば、哺乳類（例、ヒト（特にヒト患者）等）由来の体液試料（例、血液試料等）及び／又は老廃物試料（例、尿試料等）が挙げられる。
【００５６】
また、本発明の反応はウラシルに特異的な反応であるので、細胞染色、ＲＮＡの塩基配列の読み取り等にも有用である。
【実施例】
【００５７】
以下に実施例、参考例及び試験例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、これによって本発明が限定されるものではない。【００５８】
実施例１：ウラシルと３−メチルベンズアミドオキシムとの反応【００５９】
【化８】
0005586034.tif 000009
【００６０】
ウラシル水溶液（０μＭ（参考例）、１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、１５０μＭ、２００μＭ又は２５０μＭ、各々０．２５ｍｌ）、３−メチルベンズアミドオキシム水溶液（４ｍＭ、０．２５ｍｌ）、フェリシアン化カリウム水溶液（８ｍＭ、０．２５ｍｌ）及び水酸化カリウム水溶液（４Ｍ、０．２５ｍｌ）を混合し、９０℃で２分間加熱した。得られた化合物を、下記の条件で蛍光光度分析に供した。蛍光光度分析の測定結果を、表１、図１、図２に示す。
蛍光光度分析:
機種：日本分光  ＦＰ−６３００  Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ
Ｅｘ／Ｅｍ＝３３０ｎｍ／４１０ｎｍ
スリット幅：５ｎｍ、５ｎｍ
感度：ｍｅｄｉｕｍ
レスポンス：ｍｅｄｉｕｍ【００６１】
【表１】
0005586034.tif 000010
【００６２】
実施例２：ウラシルと４−トリフルオロメチルベンズアミドオキシムとの反応【００６３】
【化９】
0005586034.tif 000011
【００６４】
ウラシル水溶液（１ｍＭ、１００ｍｌ）、４−トリフルオロメチルベンズアミドオキシム（４ｍＭ、１００ｍｌ）、フェリシアン化カリウム水溶液（８．０ｍＭ、１００ｍｌ）及び水酸化カリウム水溶液（２Ｍ、１００ｍｌ）を混合し、１００℃で１０分間加熱した。反応後、反応液を酢酸エチルで抽出し、得られた有機層を濃縮した。この操作を１３回繰り返し、得られた残渣を混合した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル／メタノール＝９／１→８／２→７／３）により精製して、目的化合物（２５ｍｇ）を白色粉末として得た（収率：６％）。得られた化合物を、1Ｈ-ＮＭＲに供した。結果を図３に示す。
測定機：ｖａｒｉａｎ  ＵＮＩＴＹ  ｐｌｕｓ  ５００（５００ＭＨｚ）
1H NMR (DMSO-d6, 400MHz) δ=8.89 (broad s, 0.25H), 8.29 (d, J=8.0 Hz, 0.5H), 8.08 (d, J=7.8Hz, 0.5H), 7.72 (d, J=8.0Hz, 0.5H), 7.68 (d, J=7.8Hz, 0.5H), 6.68 (broad s, 0.25H).【００６５】
以上のことから、ウラシルと化合物（Ｉ）の反応により、化合物（ＩＩ）が得られること（図３）、化合物（ＩＩ）が蛍光性化合物であることがわかった（表１、図１）。また、ウラシル濃度と蛍光強度には相関があることがわかった（表１、図１）。さらに、蛍光強度は４１０ｎｍの蛍光波長で最も高くなることがわかった（図２）。【００６６】
参考例１：ウラシル以外の試料と３−メチルベンズアミドオキシムとの反応
ウラシルを、以下の表２に示す測定試料に変更した以外は、実施例１と同様にして、蛍光光度分析に供した。結果を図４に示す。【００６７】
【表２】
0005586034.tif 000012
【００６８】
以上のことから、本発明の反応は、基質特異性が非常に高く、遊離のウラシル以外の核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸塩基誘導体（例、プソイドウリジン等の稀少核酸塩基、５−フルオロウラシル等のフッ化ピリミジン系抗癌剤、ジヒドロウラシル等のウラシル代謝産物、メチルウラシル等）等に対して蛍光性を与えないことがわかった（図４）。【００６９】
実施例３：尿中ウラシル濃度の定量（尿中ウラシルの直接定量）
（試薬：計１ｍＬ）
試薬組成Ａ（テスト試薬）
（１）８％希釈尿（尿試料：健常人ボランティア（３７歳・男性））：１２５μＬ
（２）水またはウラシル標準液：１２５μＬ
（３）４ｍＭ  ３−メチルベンズアミドオキシム水溶液：２５０μＬ
（４）８ｍＭ  フェリシアン化カリウム水溶液：２５０μＬ
（５）２Ｍ  水酸化カリウム水溶液：２５０μＬ
試薬組成Ｂ（尿由来の蛍光ブランク）
（１）８％希釈尿（尿試料：健常人ボランティア（３７歳・男性））：１２５μＬ
（２）水：１２５μＬ
（３）水：２５０μＬ
（４）８ｍＭ  フェリシアン化カリウム水溶液：２５０μＬ
（５）２Ｍ  水酸化カリウム水溶液：２５０μＬ
試薬組成Ｃ（試薬由来の蛍光ブランク）
（１）水：１２５μＬ
（２）水：１２５μＬ
（３）４ｍＭ  ３−メチルベンズアミドオキシム水溶液：２５０μＬ
（４）８ｍＭ  フェリシアン化カリウム水溶液：２５０μＬ
（５）２Ｍ  水酸化カリウム水溶液：２５０μＬ
（操作）
（１）上記組成の試薬を順に反応容器に添加した
（２）９０℃で２分加熱した
（３）氷浴で２分冷却した
（４）反応液の蛍光強度を測定した（測定条件は実施例１に準じた）
（５）同じ尿のクレアチニン濃度を測定した
クレアチニン濃度は以下の２種類の方法のいずれかにより測定した。尚いずれの方法も詳細な手順は、付属の説明書に従って行った。
方法１
本方法は、尿試験紙であるオーションスティックス１０ＰＡ（アークレイファクトリー, Shiga, Japan）を用いた方法である。
（操作）
（１）試験紙を尿に２秒間浸漬した
（２）試験紙に付いた余剰尿を軽く拭き取り、試験紙を水平に保持して６０秒間静置した
（３）試験紙の色調変化によりクレアチニン濃度を判定した
方法２
本方法は、Creatinine Assay Kit（Cayman, MI, USA）を用いた方法である。
（操作）
（１）１５μＬの１０倍希釈尿に、キット付属のAlkaline Picrate Solutionを１５０μＬ加え、室温で１０分間インキュベーションした
（２）４９０−５００ｎｍの吸光度を測定した（Initial absorbance: Ｉａｂｓ）
（３）この溶液にキット付属のAcid Solutionを５μＬ加え、室温で２０分間インキュベーションした
（４）４９０−５００ｎｍの吸光度を測定（Final absorbance: Ｆａｂｓ）
（５）クレアチニン標準液を用いて作成した検量線を用いて、Ｆａｂｓ−Ｉａｂｓの値よりクレアチニン濃度を算出した
（結果）
蛍光誘導体化反応によって生じる尿中ウラシル由来の蛍光強度は、試薬組成Ａの反応で得られる強度から、試薬組成Ｂおよび試薬組成Ｃで得られる各蛍光強度の値を差し引き、添加検量線を作成することで、尿中ウラシル濃度を定量することができる。検量線から得られた値をさらにクレアチニン補正することで、１４．１μｍｏｌ／ｇ・Ｃｒｅの値を得た。この値は、日本人の尿中ウラシル濃度の平均値の範囲内にある。クレアチン補正は、尿中ウラシルの尿量誤差を回避するために行なった。以上の結果より、本発明の方法が、尿中のウラシルを定量できることが明らかとなった。【００７０】
試験例１：蛍光性化合物である化合物（ＩＩ）の有機溶媒抽出
（ｉ）ウラシル水溶液（４０μＭ、０．２５ｍｌ）、（ｉｉ）化合物（Ｉ）［３−メチルベンズアミドオキシム水溶液又はベンズアミドオキシム水溶液］（４ｍＭ、０．２５ｍｌ）、（ｉｉｉ）フェリシアン化カリウム水溶液（８ｍＭ、０．２５ｍｌ）及び水酸化カリウム水溶液（２Ｍ、０．２５ｍｌ）を混合し、９０℃で２分間加熱した。反応液を、図５に示す条件で処理し、さらに下記の条件で蛍光光度分析に供した。蛍光光度分析の測定結果を図５に示す。
蛍光光度分析:
機種：日本分光  ＦＰ−６３００  Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ
Ｅｘ／Ｅｍ＝３１５ｎｍ／３６５ｎｍ
励起バンド幅：５ｎｍ
蛍光バンド幅：５ｎｍ
化合物（Ｉ）として、３−メチルベンズアミドオキシムを用いた場合、中和後に有機溶媒によって抽出することにより、顕著な蛍光強度の増加が観察された。【００７１】
実施例４：尿中ウラシル濃度の定量（溶媒抽出を介した尿中ウラシルの定量）
（試薬：計１ｍＬ）
（１）８％希釈尿（尿試料：健常人ボランティア（２３歳・男性））：１２５μＬ
（２）水またはウラシル標準液：１２５μＬ
（３）４ｍＭ  ３−メチルベンズアミドオキシム水溶液：２５０μＬ
（４）８ｍＭ  フェリシアン化カリウム水溶液：２５０μＬ
（５）２Ｍ  水酸化カリウム水溶液：２５０μＬ
（操作）
（１）上記組成の試薬を順に反応容器に添加した
（２）９０℃で２分加熱した
（３）氷浴で２分冷却した
（４）酢酸３０μＬを添加して混和した
（５）塩化ナトリウム４００ｍｇを添加して激しく混和した
（６）酢酸エチル１ｍＬを添加して激しく混和した
（７）上層の蛍光強度を測定した（測定条件は試験例１に準じた）
（８）同じ尿のクレアチニン濃度を測定した（測定方法は実施例３に準じた）
（結果）
結果を図６に示す。検量線から得られた値をさらにクレアチニン補正することで、４０．１μｍｏｌ／ｇ・Ｃｒｅの値を得た。この値は、日本人の尿中ウラシル濃度の平均値の範囲内にある。クレアチン補正は、尿中ウラシルの尿量誤差を回避するために行なった。
以上の結果より、本発明の方法は、尿中に蛍光性の夾雑物質が多量に含まれる場合、有機溶媒抽出によって、尿中のウラシルを適正に定量できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明の反応はウラシルとの特異的な反応であるので、本発明の反応によれば、簡便な方法で短時間に高精度かつ経済的にウラシルを検出することが可能となる。また、ウラシル濃度と本発明の反応により得られる化合物の蛍光強度には相関があるので、本発明の反応によれば、特殊な技術を必要とせずにウラシルを定量することが可能となる。従って、本発明の方法によれば、ＤＰＤ欠損症を簡便に検査することが可能となり、癌化学療法において有益である。【００７３】
本出願は、日本で出願された特願２０１０−４４６１０を基礎としておりそれらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図３】
0005586034.tif 000019
【図５】
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【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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