(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ｏ2−（２，４−ジニトロフェニル）１−［（４−エトキシカルボニル）ピペラジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート（JS-K)又はその医薬として許容される塩若しくはエステル；及び
（ｂ）以下の式：
ＨＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）b（Ｃ3Ｈ6Ｏ）a（Ｃ2Ｈ4Ｏ）bＯＨ
｛式中、ａが５０〜８０であり、そしてｂが１０〜５０である｝
を有するポロキサマー
を混合するステップを含む方法によって生成される組成物であって、
ポロキサマーの量がミセルを生成するのに十分である、前記組成物。
【請求項２】
前記ポロキサマーが、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ１２３である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ａが５０〜７０であり、そしてｂが１０〜２５である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ＪＳ−Ｋの量が、前記ミセルの０．９８質量％であるか、又はそれ未満である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
ＪＳ−Ｋの量が、前記ミセルの０．５２質量％であるか、又はそれ未満である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の組成物及び医薬として許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物を含む、癌治療用の医薬組成物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物を含む、癌細胞の殺傷するための医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物を含む、癌細胞の成長を予防又は低減するための医薬組成物。
【請求項１０】
前記癌が、前立腺、白血病、骨髄増殖性障害、骨髄異形成症候群、リンパ腫、睾丸癌、頭頸部癌、食道癌、胃癌、肝癌、小腸癌、胆嚢癌、直腸癌、肛門癌、肉腫、子宮癌、頸癌、膀胱癌、骨肉腫、腎癌、メラノーマ、結腸癌、卵巣癌、肺癌、中枢神経系癌、多発性骨髄腫、皮膚癌、または乳癌を含む、請求項７〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が低血圧を誘発しない、請求項７〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、非経口、経口、皮下、病巣内、腹腔内、静脈内、または筋肉内に投与用である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００８年３月７日に出願された米国仮特許出願第６１／０３４，６１７号明細書に対する優先権を主張する。本願は、その教示内容のすべてに対して、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
確認
本発明に至る研究は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）助成金番号ＲＯ１  ＣＡ１２９６１１によって一部資金提供を受けた。米国政府は、本発明における特定の権利を有する場合がある。
【背景技術】
【０００３】
癌は、悪性腫瘍細胞の制御されない成長であり、現代医学の時代における主要な健康問題であり、米国における死因として心臓疾患に次いで２番目に位置づけられる。急性骨髄性白血病（「ＡＭＬ」）は、成人における最も一般的な急性白血病である（Ｇｒｅｅｒ  Ｊ．Ｐ．ら  （２００４年）  「Ｗｉｎｔｒｏｂｅ’ｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ」，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、２０９８−２１４２頁）。この疾患を患う大部分の患者はそれによって死亡する。１９７０年代初期以来、処置の中心は、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）およびアントラサイクリンとなっている（Ｇｒｅｅｒ  Ｊ．Ｐ．ら  （２００４年）  「Ｗｉｎｔｒｏｂｅ’ｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ」、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、２０９８−２１４２頁）。急性前骨髄球性白血病の処置におけるオールトランスレチノイン酸は注目すべき例外であり、新しい作用剤で、疾患の転帰に対して大きな効果を有するものは全くない状況である。
【０００４】
幹細胞移植は、患者の年齢および好適なドナーの入手可能性により、その制限を有する。さらに、最近の試験は、幹細胞救助による高用量処置が、標準用量の化学療法に対して生存優位性を提供しない場合があることを示唆している（Ｃａｓｓｉｌｅｔｈ  Ｐ．Ａ．ら  （１９９８年）  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３３９（２３）：１６４９−１６５６頁）。その結果として、ＡＭＬおよび他のタイプの癌の処置を目的とした新しい作用機序を有する新しい作用剤が必要であることは明白である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一酸化窒素（ＮＯ）は、その細胞内の標的が複数あることが理由で、独特の細胞毒性剤である。そのようなものとして、それは極めて強力な抗新生物剤の構成要素となる。ＮＯに伴う主な課題は、ＮＯの多面発現効果に起因する、ＮＯを生成する化合物による低血圧の誘発であった。ＮＯが、血管系、免疫系および神経系における機能を有する主要な生物学的エフェクター分子であることは知られている（Ｍｏｎｃａｄａ  Ｓ．ら  （１９９１年）  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ４３：１０９−１４２頁）。ＮＯは、一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）によってインビボで生成される（Ｍｏｎｃａｄａ  Ｓ．ら  （１９９１年）  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ４３：１０９−１４２頁）。例えば、ＮＯは、正常および悪性腫瘍細胞の成長を阻害する（Ｎａｔｈａｎ  Ｃ．  （１９９２年）  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６：３０５１−３０６４頁）。さらに、ＮＯは、ＡＭＬ細胞内で、成長を阻害し、分化を誘導する（Ｍａｇｒｉｎａｔ  Ｇ．ら  （１９９２年）  Ｂｌｏｏｄ  ８０：１９８０−１９８６年；Ｓｈａｍｉ  Ｐ．Ｊ．ら  （１９９５年）  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９；５２７−５３３頁；Ｓｈａｍｉ  Ｐ．Ｊ．ら  （１９９８年）  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １２：１４６１−１４６６頁）。ＮＯの広範囲のインビボ使用に伴う課題は、低血圧をもたらす血管組織に対するその効果を含む、非癌性細胞に対するその非特異的作用である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書では、抗癌処置および予防において有用な組成物が説明される。組成物は、（ａ）Ｏ2−アリール置換ジアゼニウムジオレートと（ｂ）両親媒性物質とから構成され、ここで両親媒性物質の量はリポソームまたはミセルを生成するのに十分である。本明細書中に記載の組成物は、インビボでのＯ2−アリール置換ジアゼニウムジオレートの溶解性および安定性の増大など、極めて多くの利点を提供する。組成物はまた、低血圧を誘発しない。抗癌処置および予防における組成物を使用するための方法もまた、本明細書中で説明される。下記の利点は、特に添付の特許請求の範囲において指摘される要素および組み合わせにより、実現され、達成されるであろう。前述の概要および以下の詳細な説明の双方は、例示的で説明的なものにすぎず、かつ制限されるものでないことは理解されるべきである。
【０００７】
添付の図面は、本明細書に援用され、その一部を構成するものであり、下記のいくつかの態様を図示する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本明細書において有用ないくつかのＯ2−アリール置換ジアゼニウムジオレートの構造を示す。
【図２】Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ミセル中での遊離ＪＳ−Ｋ対ＪＳ−Ｋで透析を比較する棒グラフである。
【図３】Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ミセル中でのＪＳ−Ｋ安定性に対する濾過の効果を示す棒グラフである。
【図４】Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ミセル中での遊離ＪＳ−Ｋ対ＪＳ−Ｋの細胞毒性を示す棒グラフである。
【図５Ａ】Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ミセルの特徴づけを示す。
【図５Ｂ】Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ミセルの特徴づけを示す。
【図６】Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ１２３ミセル中での遊離ＪＳ−Ｋ対ＪＳ−Ｋの細胞毒性を示す棒グラフである。
【図７】Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ミセル中でのＪＳ−Ｋおよび全身血圧を示すグラフである。
【図８】インビボでのＨＬ−６０細胞の成長に対するＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ミセル中でのＪＳ−Ｋを示すグラフである。
【図９】Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ１２３に取り込まれ、かつＧＳＨ、血清、およびＲＰＭＩ／１０％  ＦＢＳに暴露された遊離ＪＳ−ＫおよびＪＳ−Ｋの半減期を示す。
【図１０】ＧＳＴ−活性化ＮＯドナー設計のスキームを図示する。
【図１１】インビボでのＪＳ−Ｋの構造および反応機序を図示する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本化合物、組成物、および／または方法が開示され、説明される前に、下記の態様が、当然変化しうることから、特定の化合物、合成方法、または用途に限定されないことは理解されるべきである。本明細書で使用される用語が、あくまで特定の態様を説明することを目的とし、限定することを意図しないことも理解されるべきである。
【００１０】
以下に続く本明細書および特許請求の範囲においては、多くの用語に対して参照がなされることになり、それらは以下の意味を有するように定義されるものとする。
【００１１】
単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、文脈上他に明示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意する必要がある。それ故、例えば、「薬学的担体（ａ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃａｒｒｉｅｒ）」への言及は、２つ以上のかかる担体の混合物などを含む。
【００１２】
「任意選択の（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」または「場合により（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は、その後に説明される事象または環境が生じうるかまたは生じえないことと、説明が事象または環境が生じる事例およびそれが生じない事例を含むことを意味する。例えば、語句「場合により置換された低級アルキル」は、低級アルキル基が置換されうるかまたは置換されえないことと、説明が未置換低級アルキルおよび置換がある場合の低級アルキルの双方を含むことを意味する。
【００１３】
本明細書および結末の特許請求の範囲における、組成物または物品における特定の要素または成分の重量部への言及は、重量部が表される組成物または物品における、要素または成分と任意の他の要素または成分の間の重量関係を意味する。それ故、２重量部の成分Ｘと５重量部の成分Ｙを含有する化合物において、ＸおよびＹは２：５の重量比で存在し、かつ追加的成分が化合物中に含有されるか否かに無関係にかかる比で存在する。成分の重量パーセントは、他に具体的に述べられない限り、成分が含まれる調合物または組成物の総重量を基準とする。
【００１４】
複数の項目、構成要素、組成要素、および／または材料は、本明細書で使用される場合、便宜上、共通リスト内に提示される場合がある。しかし、これらのリストは、リストの各メンバーが別々の固有のメンバーとして個別に同定されたものとして解釈されるべきである。したがって、反対する表示を有しない限り、かかるリストの個別のいかなるメンバーも、共通の群内に提示されていることのみに基づいて、同じリストの他のメンバーと事実上等しいものとして解釈されるべきでない。
【００１５】
濃度、量、および他の数値のデータは、本明細書中で、範囲形式で表現または提示される場合がある。かかる範囲形式が、あくまで便益や簡潔性のために使用され、それ故、範囲の限界として明示される数値を含むだけでなく、各数値および部分範囲が明示されるような範囲内に包含されるすべての個別の数値または部分範囲を含むように柔軟に解釈されるべきであることは、理解されるべきである。例として、「約１〜５」の数値範囲は、約１〜約５の明示される値を含むだけでなく、指定される範囲内の個別の値および部分範囲を含むように解釈されるべきである。したがって、この数値範囲内に、２、３、および４などの個別の値および１〜３、２〜４、および３〜５などの部分範囲、ならびに個別に１、２、３、４、および５が含まれる。同じ原則が、最小または最大として１つの数値のみに言及する範囲に適用される。さらに、かかる解釈は、記述されている範囲の幅または特性とは無関係に適用されるべきである。
【００１６】
本明細書で使用される用語「アルキル基」は、１〜２４個の炭素原子の分岐または未分岐の飽和炭化水素基、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなどである。「低級アルキル」基は、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基である。
【００１７】
用語「シクロアルキル基」は、本明細書で使用される場合、少なくとも３つの炭素原子から構成される非芳香族炭素に基づく環である。シクロアルキル基の例として、限定はされないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが挙げられる。用語「ヘテロシクロアルキル基」は、上で定義されるシクロアルキル基であり、ここで環の炭素原子の少なくとも１つは、限定はされないが、窒素、酸素、硫黄、またはリンなどのヘテロ原子で置換される。
【００１８】
用語「アリール基」は、本明細書で使用される場合、限定はされないが、ベンゼン、ナフタレンなどを含む任意の炭素に基づく芳香族基である。用語「芳香族」はまた、「ヘテロアリール基」を含み、それは芳香族基の環内に取り込まれる少なくとも１つのヘテロ原子を有する芳香族基として定義される。ヘテロ原子の例として、限定はされないが、窒素、酸素、硫黄、およびリンが挙げられる。アリール基は、置換または未置換であってもよい。アリール基は、限定はされないが、ハロ、ヒドロキシ、アルキルチオ、アリールチオ、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、モノ−もしくはジ−置換アミノ、アンモニオまたは置換アンモニオ、ニトロソ、シアノ、スルホナト、メルカプト、ニトロ、オキソ、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、ベンジル、フェニル、置換ベンジル、置換フェニル、ベンジルカルボニル、フェニルカルボニル、サッカリド、置換ベンジルカルボニル、置換フェニルカルボニルおよびリン誘導体を含む１つ以上の基で置換されていてもよい。アリール基は、２つ以上の融合環を含んでもよく、ここで環の少なくとも１つは芳香環である。例として、ナフタレン、アントラセン、および他の融合芳香族化合物が挙げられる。
【００１９】
用語「低下させる」は、癌細胞成長または腫瘍成長の速度を低下させることを示す。例えば、癌細胞成長速度は、陽性対照と比較される場合、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９９％低下させることが可能である。
【００２０】
用語「予防する」は、陽性対照と比較される場合、癌細胞成長速度または腫瘍成長をゼロにすることを示す。
【００２１】
用語「低血圧」は、被検体の血圧が、症候を引き起こすかまたは健康状態に干渉する程度に十分に低い異常な状態を示す。例えば、９０／６０より低い血圧を有する被検体は、低血圧を患っている可能性がある。
【００２２】
用語「ミセル」は、液体コロイド中に分散された両親媒性分子の凝集体を示す。水溶液中の典型的なミセルは、周囲媒体と接触状態にある親水性「ヘッド」領域と凝集体を形成し、ミセル中心における疎水性テールを隔離する。ミセルの形状およびサイズは、両親媒性物質の分子構造と、両親媒性物質濃度、温度、ｐＨ、およびイオン強度などの溶液条件の関数である。Ｏ2−アリール置換ジアゼニウムジオレートは、大部分、ミセルの疎水性部分内部に取り込まれる。
【００２３】
用語「リポソーム」は、両親媒性物質によって生成される二層系を示す。水性コアは、二層を生成するように並ぶ両親媒性物質の疎水性テールの結果としてリポソーム中に存在する。
【００２４】
本願を通じて用いられるＡ、Ｘ、Ｙ、Ｒ1〜Ｒ4、ａ、ｂ、ｍ、ｎ、ｏ、およびｐなどの変数は、これと異なる規定がない限り、先に定義される場合と同じ変数である。
【００２５】
Ｉ．組成物およびその調製
抗癌処置にとって有用な医薬組成物が本明細書中に記載される。組成物は、インビボでＮＯを被検体に送達するのに有用である。ＮＯは、微生物および腫瘍細胞の成長に対する宿主の免疫防御に寄与する強力な細胞毒素である（Ｍｏｎｃａｄａ  Ｓ．ら  （１９９１年）  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ４３：１０９−１４２頁；（Ｎａｔｈａｎ  Ｃ．  （１９９２年）  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６：３０５１−３０６４頁）。実際、ＮＯは、インビトロで腫瘍細胞に対して強力な細胞毒性を示す（Ｒａｎｇｅｉ−Ｙａｇｕｉ  Ｃ．Ｏ．ら  （２００５年）  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．８（２）：１４７−６３頁）。ＮＯは、ＡＭＬ細胞において、成長を阻害し、分化およびアポトーシスを誘導する（Ｍａｇｒｉｎａｌ  Ｇ．ら  （１９９２年）  Ｂｌｏｏｄ  ８０：１９８０−１９８６頁；Ｓｈａｍｉ  Ｐ．Ｊ．ら  （１９９５年）  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９；５２７−５３３頁；Ｓｈａｍｉ  Ｐ．Ｊ．ら  （１９９８年）  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １２：１４６１−１４６６頁）。ＮＯは、複数の細胞内標的を有し、細胞成長を阻害しうるため、標的送達の場合、抗新生物剤として使用するための非常に魅力的な分子である（Ｈｅｎｒｙ  Ｙ．ら  （１９９３年）  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ７：１１２４−１１３４頁）；１７−２８頁）。これらの機序および標的は、（スーパーオキシドの存在下でペルオキシ亜硝酸を生成することによる）タンパク質チロシンニトロソ化、タンパク質チオールニトロシル化、ＡＤＰリボシル化、ミトコンドリア呼吸の阻害、リボヌクレオチドレダクターゼの阻害、タンパク質グルタチオン化、およびＤＮＡ鎖破壊の誘導を含む（Ｈｅｎｒｙ  Ｙ．ら  （１９９３年）  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ７：１１２４−１１３４頁）；１７−２８頁）。
【００２６】
ＮＯは癌の処置および治療において極めて多くの利点および用途を有するが、それは強力な血管拡張剤であり、血管系における可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）／ｃＧＭＰシグナル形質導入経路を活性化することによって低血圧を誘発する（Ｍｏｎｃａｄａ  Ｓ．ら  （１９９１年）  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ４３：１０９−１４２頁；Ｎａｔｈａｎ  Ｃ．（１９９２年）  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６：３０５１−３０６４頁）。この特性は、溶液中にＮＯを自発的に生成する薬剤（ニトロプルシドナトリウムなど）の抗腫瘍目的でのインビボ投与を実現不能にする。本明細書中に記載の組成物は、これらの制限に対処する。
【００２７】
本明細書中に記載の組成物は、癌の処置のために被検体に容易に投与可能な、リポソームまたはミセル中のＯ2−アリール置換ジアゼニウムジオレートから構成される。組成物および方法は以下に詳述される。
【００２８】
ａ．Ｏ2−アリール置換ジアゼニウムジオレート
ジアゼニウムジオレートは、Ｎ2Ｏ2官能基を有する化合物である。米国特許第６，６１０，６６０号明細書に開示されるＯ2−アリール置換ジアゼニウムジオレートおよびそれを調製するための方法は、本明細書中で使用してもよく、その教示内容は参照により援用される。一態様では、Ｏ2−アリール置換ジアゼニウムジオレートは、式Ｉを有する。
【化１】
0005529762.tif 000002
ここでＸは有機部分を含み、かつＹはアリール基を含み、ここでアリール基の環の原子は、Ｏ2−酸素、またはその医薬的に許容できる塩もしくはエステルに結合される。Ｙが式Ｉの化合物から切断される場合、ＮＯは自発的に放出される。理論に縛られたくないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、被検体においてインビボでＹを切断し、かつＮＯを生成しうる（一般的機序については図１０、およびＪＳＫを使用する特異的機序については図１１を参照）。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼは、白血病および固形腫瘍の多くの形態で過剰発現される。したがって、インビボでの式Ｉを有する化合物の癌細胞への送達、次いで、その後のＮＯを生成するための化合物の切断は、癌を処置するための有効な方法である。本明細書中に記載の組成物は、例えば式Ｉに記載のジアゼニウムジオレートを癌細胞に送達するための有効な方法を提供する。
【００２９】
一態様では、式ＩにおけるＸは、置換もしくは未置換アルキル基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、またはアリール基であってもよい。別の態様では、Ｘは、環内部に取り込まれた少なくとも１つの窒素原子を有するヘテロシクロアルキル基である。かかるヘテロシクロアルキル基の例として、限定はされないが、式ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶを有する基が挙げられる。
【化２】
0005529762.tif 000003
ここでＡは、Ｎ、Ｏ、またはＳであり、ｍは１〜１２であり、ｏは１または２であり、ｐは１〜５であり、Ｒ3は、水素、アルキル基（例えばＣ1〜Ｃ8直鎖またはＣ3〜Ｃ8分岐鎖アルキル基）、シクロアルキル基（例えばＣ3〜Ｃ8）、アリール基、カルボキシラト基であり、かつ、Ｒ4は、水素またはアルキル基（例えばＣ1〜Ｃ6直鎖アルキル基またはＣ3〜Ｃ6分岐鎖）である。
【００３０】
他の態様では、Ｘは、式Ｖを有する基である。
【化３】
0005529762.tif 000004
ここでｎは１または２であり、かつ、Ｒ1は、置換もしくは未置換アリール基、置換もしくは未置換ヘテロアリール基、または式−Ｃ（Ｏ）ＯＲ2を有するエステルもしくは式−Ｃ（Ｏ）Ｒ2を有するケトンであり、ここでＲ2は、アルキル基またはアリール基を含む。例えば、式Ｖを参照すると、ｎは１であり、かつＲ1は式−Ｃ（Ｏ）ＯＲ2（式中、Ｒ2はＣ1〜Ｃ5アルキル基である）を有しうる。別の態様では、式Ｖにおけるｎは１であり、かつＲ1は式−Ｃ（Ｏ）ＯＥｔを有する。
【００３１】
式ＩにおけるＹはアリール基を含み、ここでアリール基の環の原子はＯ2−酸素に結合される。本明細書において有用なアリール基の例として、限定はされないが、アクリジン、アントラセン、ベンゼン、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、ベンゾオキサゾール、ベンゾピラゾール、ベンゾチアゾール、カルバゾール、クロロフィル、シンノリン、フラン、イミダゾール、インドール、イソベンゾフラン、イソインドール、イソオキサゾール、イソチアゾール、イソキノリン、ナフタレン、オキサゾール、フェナントレン、フェナントリジン、フェノチアジン、フェノキサジン、フタルイミド、フタラジン、フタロシアニン、ポルフィン、プテリジン、プリン、ピラジン、ピラゾール、ピリダジン、ピリジン、ピリミジン、ピロコリン、ピロール、キノリジニウムイオン、キノリン、キノキサリン、キナゾリン、シドノン、テトラゾール、チアゾール、チオフェン、チロキシン、トリアジン、またはトリアゾールが挙げられる。
【００３２】
別の態様では、Ｙは、通常生体内に見出される分子またはその置換基に対して同一であるかまたは構造的に類似しうる。これらの生物学的に関連のある基は、ビタミンもしくはその誘導体、ホルモンもしくはその誘導体、ピリミジンもしくはその誘導体、リボシルピリミジン（ｒｉｂｏｓｙｌｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）もしくはその誘導体、プリンもしくはその誘導体、またはリボシルプリン（ｒｉｂｏｓｙｌｐｕｒｉｎｅ）もしくはその誘導体でありうる。他の態様では、Ｙは、ヌクレオチド、ヌクレオシド、および核酸；ペプチドホルモン、非ペプチドホルモン、ビタミンおよびポルフィリンなどの他の酵素共同因子を含むペプチド、ならびにその他でありうる。生物学的に関連のあるアリール基の例として、チロキシン、ＮＡＤ（またはＮＡＤＨ）、クロロフィル、ヒポキサンチン、ウリジン、およびビタミンＫ5が挙げられる。これらの態様では、上で同定された化合物は、アリール基を有する。
【００３３】
Ｙにおいて存在するアリール基は、種々の基で置換されていてもよい。一態様では、Ｙは少なくとも１つのニトロ基を有する。別の態様では、Ｙは、少なくとも１つのニトロ基または２つのニトロ基を有するフェニル基である。一態様では、Ｙは、式ＶＩを有する。
【化４】
0005529762.tif 000005
【００３４】
別の態様では、Ｏ2−アリール置換ジアゼニウムジオレートは、Ｏ2−（２，４−ジニトロフェニル）１−［（４−エトキシカルボニル）ピペラジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート（ｄｉｏｌａｔｅ）（ＪＳ−Ｋ）、Ｏ2−（２，４−ジニトロフェニル）１−［４−フェニルピペラジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート（ＪＸＣ−２−４０）、Ｏ2−（２，４−ジニトロフェニル）１−［４−ピリミジン−２−イル）ピペラジン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート（ＪＸＣ−２−５６）、またはＯ2−（２，４−ジニトロフェニル）１−［（４−エトキシカルボニル）−２，４−ジアザシクロ−ヘプタン−１−イル］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート（ＪＳ−３６−２５）である。これらの化合物の構造は、図１に提供される。
【００３５】
本明細書中に記載のＯ2−アリール置換ジアゼニウムジオレートはいずれも、その医薬的に許容できる塩もしくはエステルであってもよい。医薬的に許容できる塩は、遊離酸を適量の医薬的に許容できる塩基で処理することによって調製される。代表的な薬学的に許容される塩基は、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化第一鉄、水酸化亜鉛、水酸化銅、水酸化アルミニウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、リジン、アルギニン、ヒスチジンなどである。一態様では、反応は、室温など、約０℃〜約１００℃の温度で、単独でまたは不活性の水溶性有機溶媒と組み合わせて、水中で行われる。使用される塩基に対する構造式Ｉの化合物のモル比は、任意の特定の塩に対して所望される比を提供するように選択される。例えば、遊離酸出発材料のアンモニウム塩を調製する場合、出発材料は約１当量の薬学的に許容される塩基で処理され、中性塩が得られうる。
【００３６】
エステル誘導体は、典型的には、（下記の実施例において例示される）化合物の酸形態に対する前駆物質として調製され、それ故にプロドラッグとして役立ちうる。一般に、これらの誘導体は、メチル、エチルなどの低級アルキルエステルとなる。アミド誘導体−（ＣＯ）ＮＨ2、−（ＣＯ）ＮＨＲおよび−（ＣＯ）ＮＲ2（式中、Ｒは上で定義されるアルキル基である）は、カルボキシル酸含有化合物とアンモニアまたは置換アミンとの反応によって調製することが可能である。
【００３７】
ｂ．両親媒性物質
本明細書において有用な両親媒性物質は、ミセルまたはリポソームを形成することが可能な親水性および親油性基を有する化合物である。両親媒性物質は、最小の毒性を有するように生体適合性である必要がある。リポソームおよびミセルを調製するための、本明細書において有用な両親媒性物質は、生体適合性かつ生体分解性の物質から生成されるホモポリマー、共重合体、ブロック共重合体を含む。かかるポリマーの例として、限定はされないが、ポリ（アミノ酸）；ポリ乳酸；ポリ（エチレンイミン）；ポリ（メタクリル酸２−（ジメチルアミノ）エチル）（ｐｏｌｙ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅｓ））、ポリエチレングリコールとヒドロキシアルキルアクリレートとアクリルアミドの共重合体（例えばＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）、ＰＥＧ−β−ポリ（α−アミノ酸）、ポリ（Ｌ−乳酸）−ポリ（エチレングリコール）ブロック共重合体、またはポリ（Ｌ−ヒスチジン）−ポリ（エチレングリコール）ブロック共重合体が挙げられる。
【００３８】
一態様では、両親媒性物質はポロキサマーである。一態様では、ポロキサマーは、ポリオキシエチレン（例えばポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖によって隣接された、ポリオキシプロピレン（例えば、ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖から構成される非イオン性トリブロック共重合体である。一態様では、ポロキサマーは、式
ＨＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）b（Ｃ3Ｈ6Ｏ）a（Ｃ2Ｈ4Ｏ）bＯＨ
（式中、ａは、１０〜１００、２０〜８０、２５〜７０、もしくは２５〜７０、または５０〜７０であり；ｂは、５〜２５０、１０〜２２５、２０〜２００、５０〜２００、１００〜２００、または１５０〜２００である）を有する。別の態様では、ポロキサマーは、２，０００〜１５，０００、３，０００〜１４，０００、または４，０００〜１２，０００の分子量を有する。本明細書において有用なポロキサマーは、ＢＡＳＦによって製造される商標名Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）の下で販売されている。本明細書において有用なポロキサマーの非限定例として、限定はされないが、表１に記載のものが挙げられる。
【００３９】
【表１】
0005529762.tif 000006
【００４０】
他の態様では、両親媒性物質は、リン脂質などの脂質であってもよく、それはリポソームの調製において有用である。例として、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンが挙げられる。他の態様では、両親媒性物質は、コレステロール、糖脂質、脂肪酸、胆汁酸、またはサポニンを含む。
【００４１】
ｃ．組成物の調製
本明細書中に記載の組成物は、Ｏ2−アリール置換ジアゼニウムジオレートと両親媒性物質とを、溶媒中、適切な濃度で混合し、ミセルまたはリポソームを生成することにより、容易に調製することが可能である。特定の態様では、Ｏ2−アリール置換ジアゼニウムジオレートおよび両親媒性物質は、水中で混合され、次いで加熱によってミセルを生成する。Ｏ2−アリール置換ジアゼニウムジオレートおよび両親媒性物質の量は、変化しうる。一態様では、両親媒性物質の量は、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）が低下するのに十分である必要がある。臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は、上部でミセルが自発的に形成される界面活性剤の濃度として定義される。表１は、両親媒性物質として本明細書において有用なポロキサマーのＣＭＣを提供する。特定の態様では、使用される両親媒性物質の濃度は、両親媒性物質のＣＭＣより数倍高い可能性がある。Ｏ2−アリール置換ジアゼニウムジオレートに加え、追加的な生物活性剤をミセルまたはリポソームに取り込むことが可能であると考えられる。例えば、本態様では、下記の他の抗癌剤を本明細書で使用してもよい。
【００４２】
特定の態様では、添加剤を使用し、本明細書中に記載の組成物の安定性を高めることが可能である。一態様では、アルブミンなどの添加剤は、両親媒性物質およびＯ2−アリール置換ジアゼニウムジオレートに添加される場合、得られるミセルまたはリポソームを安定化することが可能である。例えば、１％ヒト血清アルブミンの、２％Ｐ１２３  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）中に溶解された１ｍＭのＪＳ−Ｋへの添加は、有意により安定であるミセルの形成をもたらした。
【００４３】
本明細書中に記載の組成物は、非常に安定である。換言すれば、Ｏ2−アリール置換ジアゼニウムジオレートは、血清およびＧＳＨなどのペプチドへの暴露などのストリンジェントな生理的条件から保護される。さらに、組成物は、扱いやすく、かつＯ2−アリール置換ジアゼニウムジオレートが組成物から浸出することなく、濾過などの精製ステップに耐えることが可能である。最終的に、組成物は水溶性である。一般に、Ｏ2−アリール置換ジアゼニウムジオレートは水不溶性である。したがって、Ｏ2−アリール置換ジアゼニウムジオレートがミセルまたはリポソーム中に取り込まれる場合、Ｏ2−アリール置換ジアゼニウムジオレートを被検体に投与することがはるかに容易になる。
【００４４】
ｄ．医薬組成物
一態様では、本明細書中に記載の組成物のいずれかを少なくとも１つの薬学的に許容されるキャリアと組み合わせることで、医薬組成物を生成することが可能である。医薬組成物は、当該技術分野で公知の技術を用いて調製してもよい。一態様では、組成物は、組成物を薬学的に許容されるキャリアと混合することによって調製される。用語「混合する（ａｄｍｉｘｉｎｇ）」は、化学反応または物理的相互作用が全く生じないように、２つの成分を共に混合することとして定義される。用語「混合する」はまた、式Ｉを有する化合物と薬学的に許容されるキャリアとの間の化学反応または物理的相互作用を含む。
【００４５】
薬学的に許容されるキャリアは、当業者にとって公知である。これらは、最も典型的には、生理的ｐＨでの滅菌水、生理食塩水、および緩衝溶液などの溶液を含む、ヒトへの投与のための標準のキャリアとなる。
【００４６】
医薬送達が意図された分子は、医薬組成物中で調合することが可能である。医薬組成物は、選択される分子に加え、キャリア、増粘剤、希釈剤、緩衝液、保存剤、表面活性剤などを含んでもよい。医薬組成物はまた、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔剤などの１種以上の活性成分を含んでもよい。
【００４７】
医薬組成物は、局所または全身処置が望ましいか否かに加え、処置されるべき領域に依存して、複数の方法で投与してもよい。投与は、非経口、経口、皮下、病巣内、腹腔内、静脈内、または筋肉内であってもよい。
【００４８】
投与用調製物は、無菌の水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンを含む。非水性キャリアの例として、アルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液、例えば生理食塩水および緩衝媒体が挙げられる。非経口媒体は、開示される組成物および方法の追加的使用として必要とされる場合、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンガー、または固定油を含む。静脈内媒体は、開示される組成物および方法の追加的使用として必要とされる場合、流体および栄養素補液、電解質補液（例えばリンガーデキストロースに基づくもの）などを含む。保存剤および他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどもまた存在しうる。
【００４９】
特定の場合における活性化合物の実際の好ましい量は、使用中の特定の化合物、調合される特定の組成物、適用の様式（ｍｏｄｅ  ｏｆ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、ならびに処置されている特定の位置および哺乳動物に従って変化することは理解されるであろう。所与の宿主における用量は、従来からの検討事項を用いて、例えば対象化合物と公知の作用剤との特異的活性の慣習的な比較により、例えば適切な従来の薬理学的プロトコルにより、決定してもよい。医薬化合物の用量を決定する当業者である医師および調合師は、標準的推奨に従い、用量を難なく決定することになる（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｂａｒｎｈａｒｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９９９年））。
【００５０】
ＩＩ．使用の方法
本明細書中に記載の組成物は、有効な抗癌剤である。化学療法剤に耐性がある腫瘍細胞は、臨床腫瘍学における主要な課題を示す。本発明の方法および組成物を使用し、細胞成長を阻害するか、細胞分化を誘発するか、アポトーシスを誘発するか、ＭＤＲ表現型を阻害するか、転移を阻害するか、血管新生を阻害するかまたはそれ以外に腫瘍細胞の悪性表現型を無効にするかもしくは低下させるため、「標的」細胞を、本明細書中に記載の１種以上の組成物と接触させる。特定の態様では、Ｏ2−アリールジアゼニウムジオレート化合物と少なくとも１種の他の作用剤から構成される組成物を投与してもよい。本明細書中に記載の組成物は、化学および放射線療法の有効性を改善することが可能である。１つのアプローチは、本明細書中に記載の組成物を化学または放射線治療的介入と併用することを含む。この処置のオプションは、ＤＮＡ損傷剤と共にコンビナトリアルな治療的効果を提供しうる。さまざまな癌治療剤およびかかる作用剤を使用する処置の方法は、当該技術分野で周知である。
【００５１】
一態様では、追加的な作用剤は、抗癌剤であってもよい。これらの組成物は、細胞の増殖を殺滅または阻害するのに有効な組み合わせ量で提供されうる。このプロセスは、細胞を組成物および作用剤または因子と同時に接触させることを含みうる。これは、細胞を単一の組成物または両方の作用剤（例えばＯ2−アリールジアゼニウムジオレートおよび化学療法剤）を含む医薬調合物と接触させるか、または細胞を２つの異なる組成物または調合物と同時に接触させることによって行うことが可能であり、ここで一方の組成物は本明細書中に記載のＯ2−アリールジアゼニウムジオレート組成物を含み、かつ他方は作用剤を含む。
【００５２】
あるいは、Ｏ2−アリールジアゼニウムジオレート組成物による処置のいずれかは、数分から数週の範囲の間隔で、他の作用剤処置に先行または後続しうる。他の作用剤と本明細書中に記載のＯ2−アリールジアゼニウムジオレート組成物のいずれかとが細胞に別々に適用される場合の態様では、作用剤とＯ2−アリールジアゼニウムジオレート化合物とが依然として細胞に対して有利に組み合わされた（例えば相乗）効果を発揮可能となるように、各送達の間隔として有意な期間が過ぎないようにすべきである。一態様では、細胞は、両方の様式と、約１２〜２４時間以内に、または互いの約６〜１２時間後に、最大で約１２時間の遅延時間で、接触することが可能である。いくつかの状況では、例えば各投与の間で数日（２、３、４、５、６もしくは７日）から数週（１、２、３、４、５、６、７もしくは８週）が経過する場合、治療剤のみでの処置の期間を延長することが望ましい場合がある。
【００５３】
抗癌剤の例として、限定はされないが、白金化合物（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、窒素マスタード、チオテパ、メルファラン、ブスルファン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、テモゾロマイド、ダカルバジン、ベンダムスチン）、抗腫瘍抗生物質（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、プリカマイシン、ダクチノマイシン）、タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル）、代謝拮抗薬（例えば、５−フルオロウラシル、シタラビン、ペメトレキセド、チオグアニン、フロクスウリジン、カペシタビン、およびメトトレキセイト）、ヌクレオシド類似体（例えば、フルダラビン、クロファラビン、クラドリビン、ペントスタチン、ネララビン）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、トポテカンおよびイリノテカン）、低メチル化剤（例えば、アザシチジンおよびデシタビン）、プロテオソーム阻害剤（例えばボルテゾミブ）、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシドおよびテニポシド）、ＤＮＡ合成阻害剤（例えばヒドロキシウレア）、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、およびビンブラスチン）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ）、モノクローナル抗体（例えば、リツキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、トシツモマブ、トラツズマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ベバシズマブ）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、ホテムスチン、およびロムスチン）、酵素（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ）、生物剤（例えば、インターフェロンおよびインターロイキン）、ヘキサメチルメラミン、ミトタン、血管新生阻害剤（例えば、サリドマイド、レナリドマイド）、ステロイド（例えば、プレドニゾン、デキサメタゾン、およびプレドニゾロン）、ホルモン剤（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、ロイプロリド、ビカルタミド、グラニセトロン、フルタミド）、アロマターゼ阻害剤（例えば、レトロゾールおよびアナストロゾール）、三酸化ヒ素、トレチノイン、非選択的シクロオキシゲナーゼ阻害剤（例えば、非ステロイド性抗炎症剤、サリチル酸塩、アスピリン、ピロキシカム、イブプロフェン、インドメタシン、ナプロシン、ジクロフェナク、トルメチン、ケトプロフェン、ナブメトン、オキサプロジン）、選択的シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００５４】
本明細書中に記載の方法は、種々の異なるタイプの癌を処置するために適用可能である。一態様では、癌は、前立腺癌、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、毛様細胞白血病、形質細胞白血病）、骨髄増殖性障害（例えば、本態性血小板増加症、真性赤血球増加症、原発性骨髄線維症）、骨髄異形成症候群、リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、睾丸癌、頭頸部癌、食道癌、胃癌、肝癌、小腸癌、胆嚢癌、直腸癌、肛門癌、肉腫、子宮癌、頸癌、膀胱癌、骨肉腫、腎癌、メラノーマ、結腸癌、卵巣癌、肺癌、中枢神経系癌、多発性骨髄腫、皮膚癌、または乳癌を含む。本明細書中に記載の組成物の主な利点の１つは、組成物が、抗癌処置において有効である一方、低血圧を誘発しない点である。上で考察のように、ＮＯの広範なインビボ使用に伴う問題は、非癌性細胞に対するその非特異的作用であり、低血圧をもたらす血管組織に対するその効果を含む。記載される組成物はこの問題を回避し、それにより、抗癌処置および予防において、さらにより魅力的なものになる。
【００５５】
他の態様では、本明細書中に記載の組成物は、パージング剤として使用することが可能である。例えば、幹細胞は、癌（例えば、白血病または多発性骨髄腫）を患う患者から採取することが可能であり、かつ幹細胞は、本明細書中に記載の組成物で処置し、任意の残存する悪性腫瘍細胞を殺滅することが可能である。これはまた、本明細書中で、移植片の「パージング」と称される。次いで、処置された幹細胞は、患者に対し、高用量の化学療法／放射線後の幹細胞（骨髄）移植において使用することが可能である。
【００５６】
次の実施例が、本明細書中に記載され、主張される化合物、組成物、および方法がいかに作られ、評価されるかについての完全な開示および説明を当業者に提供するために示され、純粋に例示的であるように意図され、かつ発明者がその発明であると見なすことの範囲を限定するように意図されていない。数（例えば、量、温度など）に対する精度を保証するための努力がなされているが、一部の誤りや逸脱は考慮されるべきである。他に指定がない限り、部は重量部であり、温度は℃であるかまたは周囲温度であり、かつ圧力は大気圧またはその近傍である。反応条件、例えば、成分濃度、所望される溶媒、溶媒混合物、温度、圧力ならびに、上記プロセスから得られる生成物の純度および収率を最適化するのに使用可能な他の反応範囲および条件の極めて多数の変形および組み合わせがある。かかるプロセス条件を最適化するには、合理的かつルーチン的な実験のみが必要となる。
【実施例】
【００５７】
実施例１
本実施例は、ミセル中でのＪＳ−Ｋの負荷の範囲について例示する。ＪＳ−Ｋを、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ１２３およびＬ１２１ポリマー中に負荷し、ミセルを形成した。溶液中のＪＳ−Ｋ対Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリマーの割合は１０重量％であった。次いで、ＪＳ−Ｋミセル調製物を２時間透析した。遊離ＪＳ−Ｋを用いた同じ手順に従う並行実験を対照として設定した。透析の２時間後、ＪＳ−ＫレベルをＨＰＬＣによって測定し、保持されるＪＳ−Ｋのパーセントを評価した。遊離ＪＳ−Ｋのパーセント保持は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ１２３およびＬ１２１ミセルの各々におけるＪＳ−Ｋについての７５±１０％および７８±１１％と比べて３１％に過ぎなかったが、それについては図２を参照のこと。結果は、ミセル調製物中のＪＳ−Ｋが透析後に保持される一方、遊離ＪＳ−Ｋは透析の間に大部分が失われることを示した。
【００５８】
実施例２
本実施例は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ミセルに対する濾過の効果について例示する。ＪＳ−ＫはＰ１２３ミセル中に負荷された（溶液中のＪＳ−Ｋ対Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリマーは１．５７重量％であった）。次いで、一定分量のＪＳ−Ｋ調製物を０．２μＭの膜フィルタを通して濾過し、室温で保持した。一定間隔で、調製物からの２０μＬの一定分量を回収し、ＪＳ−ＫレベルをＨＰＬＣによって測定した。濾過されていないＰ１２３  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ミセル中の類似のＪＳ−Ｋ調合物に対して並行測定を行った。測定されたＪＳ−Ｋレベルは経時的に低下した。結果は、濾過ミセルと未濾過ミセルの間にＪＳ−Ｋ濃度における差異が全くないことを示し、これはこれらのミセルが分解されることなく濾過されうることを示唆しており、それについては図３を参照のこと。
【００５９】
実施例３
本実施例は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ミセルがＧＳＨの存在下でＪＳ−Ｋを安定化させることを例示する。これらの実験では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ−１２３ミセル中で調合された遊離ＪＳ−ＫおよびＪＳ−Ｋを、ｐＨ７．４および室温で、ＰＢＳ中、４．０ｍＭ  ＧＳＨとともに、１０ｍＭの濃度でインキュベートした。溶液中のＪＳ−Ｋ対Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリマーの割合は１．５７重量％であった。一定間隔で、ＪＳ−ＫレベルをＨＰＬＣによって測定した。これらの条件下で、遊離ＪＳ−Ｋは、ＧＳＨの存在下で６分間の半減期を有した。同じ条件下、ＧＳＨの存在下でのＰ−１２３ミセル中のＪＳ−Ｋは、３７分間の半減期を有した。これらの結果は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ミセルが、ＧＳＨによって表される遊離チオールによる求核攻撃の極めてストリンジェントな条件下で、ＪＳ−Ｋの半減期を実質的に（Ｐ−１２３の場合には６倍）延長することを示す。
【００６０】
実施例４
本実施例は、血清中、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ミセル中での遊離ＪＳ−Ｋ対ＪＳ−Ｋの安定性について例示する。ＪＳ−Ｋを、Ｌ１２１およびＰ１２３  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ミセル中に負荷した。溶液中のＪＳ−Ｋ対Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリマーの割合は０．９８重量％であった。次いで、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ＪＳ−Ｋを、８ｍＬの全容量でＦＢＳとともに３７℃でインキュベートした。ＪＳ−Ｋの最終濃度は１００μＭであった。ＦＢＳの最終濃度は９０％  ｖ／ｖであった。ｐＨは７．６であった。対照を、同じ濃度での遊離ＪＳ−Ｋを使用し、同じ条件下で設定した。１ｍＬの一定分量を一定間隔で採取した。ジクロロメタン抽出後、ＪＳ−Ｋレベルを、上で概説したプロトコルを用いるＨＰＬＣによって測定した。実験を２通りに行い、測定値を使用し、血清中の異なるＪＳ−Ｋの調合物の半減期を計算した。
【００６１】
これらの条件下で、遊離ＪＳ−Ｋは１．２分間の半減期を有した。Ｌ１２１  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ミセル中のＪＳ−Ｋは７１分間の半減期を有する一方、Ｐ１２３ミセル中のＪＳ−Ｋは９１分間の半減期を有した。これらの実験は、遊離ＧＳＨの場合よりインビボに近い条件を再現し、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ミセルが、タンパク質および高分子への暴露という極めてストリンジェントな条件下で、ＪＳ−Ｋを安定化させる能力を示す。
【００６２】
実施例５
本実施例では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ミセル中のＪＳ−Ｋの粒子サイズおよびｐＨ効果を測定する。Ｍａｌｖｅｒｎ  ３０００  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｗｏｒｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ））を使用する動的光散乱を用い、異なるｐＨ条件下、ＪＳ−Ｋを有する場合と有しない場合とでＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ１２３ミセルの粒子サイズを測定した。３ｍＬの体積のＰＢＳ中の４つの別々の試料に対し、測定を行った。１つの実験セットでは、（ＪＳ−Ｋを有しない）Ｐ１２３ミセルに対し、４．５〜７．４の範囲の異なるｐＨ条件下で行った。室温で４時間の平衡化後、粒子サイズを測定した。凝集は全く認められず、これはミセルの完全性が保持されることを示した。表２における結果は、ｐＨがＰ１２３  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ミセルのサイズ（ひいては安定性）に影響を与えないことを示す。
【００６３】
【表２】
0005529762.tif 000007
【００６４】
別の実験セットでは、ＪＳ−ＫをｐＨ７．４でＰ１２３ミセル中に負荷し、粒子サイズを異なる間隔で測定した。溶液中のＪＳ−Ｋ対Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリマーの割合は０．５２重量％であった。表３における結果は、観察期間にわたり、ＪＳ−Ｋを負荷したＰ１２３ミセルが安定であったことを示す。
【００６５】
【表３】
0005529762.tif 000008
【００６６】
再び凝集は全く認められず、それはミセルの完全性が保持されることを示した。これらの測定から３つの結論を導くことができる。第１に、これらの条件下で、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ミセルは、観察期間にわたって非常に安定である。第２に、ミセルへのＪＳ−Ｋの負荷は、粒子サイズまたはミセルの安定性に影響を与えなかった。第３に、試験範囲内で、ｐＨはミセルの安定性に影響を与えなかった。
【００６７】
実施例６
本実施例では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ミセル中でのＪＳ−Ｋのインビトロ細胞毒性を試験した。上記のように、ＪＳ−Ｋを、Ｆ６８、Ｐ１０５、またはＦ１２７  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ミセル中に負荷した。溶液中のＪＳ−Ｋ対Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリマーの割合は４重量％であった。次いで、遊離ＪＳ−ＫまたはミセルＪＳ−Ｋを、０．５μＭの濃度でＨＬ−６０細胞に加えた。同様の対照実験を、等しい濃度の、ＪＳ−Ｋを有しない各Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ミセルで設定した。３日のインキュベーション後、細胞成長を、ＭＴＳアッセイを使用して測定した。遊離ＪＳ−Ｋは、白血病細胞の成長を６２％阻害した（図４）。Ｆ６８ミセルはＪＳ−Ｋの細胞毒性効果を増大させなかった一方、Ｐ１０５またはＦ１２７ミセル中に調合したＪＳ−Ｋは細胞成長をそれぞれ約９０％阻害した（図４）。等しい濃度（０．０８％  ｗ／ｖ）での等価な空のミセルは細胞成長に対する有意な効果を全く有さなかった（示さない）。
【００６８】
これらの結果は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ミセルの調合物がＪＳ−Ｋの有効性を高めうることを示す。想定どおり、最高のＣＭＣおよび最低の分配係数を有するＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリマー（表１および図５）は、遊離ＪＳ−Ｋの有効性を改善しなかった。ＣＭＣおよび分配係数を同じ範囲内で有するＰ１０５およびＦ１２７（表２および図３）は、ＪＳ−Ｋの細胞毒性をほぼ同じ程度まで増大させた。
【００６９】
他の実験では、ＪＳ−ＫをＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ１２３ミセルに負荷し、ＨＬ−６０細胞に対するそのインビトロ細胞毒性を遊離ＪＳ−Ｋと比較した。溶液中のＪＳ−Ｋ対Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリマーの割合は１．９７重量％であった。結果は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ１２３ミセル中へのＪＳ−Ｋの調合がそのインビトロでのＩＣ50を０．４５から０．０９μＭへ減少させることを示し、それはその細胞毒性活性が実質的に増大することを示した（図６）。これらの結果は、ミセル中でのＪＳ−Ｋの安定化および薬剤の細胞内蓄積の増大に起因する可能性が高い。
【００７０】
実施例７
本実施例は、全身血圧に対するＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ミセル中のＪＳ−Ｋの効果について例示する。ＪＳ−Ｋを、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ１２３ミセルに負荷し、インビボ実験において使用し、ＪＳ−ＫのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ミセル調製物が全身血圧に対するＪＳ−Ｋの効果に作用するか否かを判定した。溶液中のＪＳ−Ｋ対Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリマーの割合は１．５３重量％であった。
【００７１】
覚醒した無麻酔のＮＯＤ／ＳＣＩＤおよびＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ＩＬ２Ｒγnullマウスを、これらの実験に使用した。マウスを、Ｐ１２３ミセル中のＪＳ−Ｋまたは遊離ＪＳ−Ｋの静脈内用量を増加させて処置した。収縮期血圧を、テールカフ技術を用いて５分置きに１時間、次いで２時間時点で測定した。遊離ＪＳ−Ｋは、５μモル／ｋｇの用量で、収縮期血圧におけるベースラインの約２０％の持続的低下をもたらした一方、Ｐ１２３ミセル中のＪＳ−Ｋは、同じ用量でもたらさなかった（図７）。
【００７２】
Ｐ１２３ミセル中のＪＳ−Ｋが低血圧を誘発しなかった一方、遊離ＪＳ−Ｋが等しい用量で低血圧を誘発したという事実は、ＪＳ−ＫのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ミセル調製物が血流中の薬剤をインビボで安定化させるという間接的証拠を示す。より高用量で認められる低血圧は、遊離薬剤とミセル中のＪＳ−Ｋの間の動的平衡に起因する可能性が高い。
【００７３】
実施例８
本実施例は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ミセル中のＪＳ−Ｋのインビボでの抗白血病活性について例示する。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ＩＬ２Ｒγnullマウスの各横腹に、５×１０6個のＨＬ−６０細胞を接種した。腫瘍が触知可能になったとき、処置を、１−空のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ１２３ミセルを注射した対照（マウス４匹）；２−遊離ＪＳ−Ｋを注射したマウス（マウス３匹）；および３−Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ１２３ミセル中に調合されたＪＳ−Ｋを注射したマウス（マウス３匹）のような３つの変数の場合で開始した。溶液中のＪＳ−Ｋ対Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリマーの割合は２．０重量％であった。注射を、静脈内に１週につき３回与えた。遊離ＪＳ−Ｋおよびミセルに調合されたＪＳ−Ｋの用量は４μモル／ｋｇであった。ミセルに調合されたＪＳ−Ｋでの処置は、腫瘍成長において遊離薬剤より大きい遅延をもたらした。ＳＡＳ  ＰＲＯＣ  ＭＩＸＥＤを用いる線形混合モデルを、ランダム効果を用いて図８におけるデータに適合させ、同じ動物内での測定値間での相関を明らかにした。このモデルでは、時間の一次および二次効果によって適合させた腫瘍成長の速度は、遊離ＪＳ−Ｋで処置した動物中では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ１２３ミセル中に調合されたＪＳ−Ｋで処置した動物より有意に高いことが判明した（Ｆ検定によるとｐ＝０．０１）。
【００７４】
結果によると、ＪＳ−Ｋのインビボでの抗腫瘍活性が確認され、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ミセル調製物中のＪＳ−Ｋの抗腫瘍有効性の増大が示唆される。これは、ミセルによる薬剤の安定化、ひいては腫瘍への薬剤送達の増大に起因する可能性が非常に高い。
【００７５】
実施例９
インビトロでの異なる媒体中でのＪＳ−Ｋの安定性を評価した。ＪＳ−Ｋを、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ１２３ミセル中に、２．２５％のＪＳ−Ｋ対Ｐ１２３の比で負荷した。ミセルに可溶化されたＪＳ−Ｋまたは遊離ＪＳ−Ｋを、それぞれ５０および１０μモルの濃度で、異なる媒体中で、３７℃でインキュベートした。遊離ＪＳ−Ｋは、その溶解性に限界があるため、より低い濃度を使用した。異なる媒体中のＪＳ−Ｋの濃度を、高圧液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）を用い、最大で６０分間の間隔で測定した。曲線下面積（ＡＵＣ）ＨＰＬＣの測定値を使用し、異なる媒体中のＪＳ−Ｋの半減期（Ｔ1/2）およびパーセント回復（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ）を判定した。遊離ＪＳ−Ｋおよびミセルに可溶化されたＪＳ−Ｋは、１０％ウシ胎仔血清を有するＲＰＭＩ媒体に加えたとき、それぞれ９．６＋／−１．３分間および５３．４＋／−１．９６分間のＴ1/2を有した（６つの別々の実験の平均およびＳＥＭ、Ｐ＝０．００００４）（図９）。遊離およびミセルに可溶化されたＪＳ−Ｋの、ＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ中での６０分間のインキュベーション後におけるパーセント回復は、１０．５３＋／−１．４２および５０．７１＋／−８．２７であった（６つの別々の実験の平均およびＳＥＭ、Ｐ＝０．０００１）。遊離ＪＳ−Ｋおよびミセルに可溶化されたＪＳ−Ｋは、プールされたヒト血漿に加えたとき、それぞれ２６＋／−０分間および８０＋／−３分間のＴ1/2を有した（２つの別々の実験の平均およびＳＥＭ、Ｐ＝０．０３５３）（図９）。遊離およびミセルに可溶化されたＪＳ−Ｋの、プールされたヒト血漿中での６０分間のインキュベーション後におけるパーセント回復は、３９＋／−０および５９．５＋／−１．５であった（２つの別々の実験の平均およびＳＥＭ、Ｐ＝０．０５）（図９）。
【００７６】
本明細書中に示される本発明の主な改良および他の実施形態を、当業者は着想するであろうし、これらの発明は、上述の説明において示される教示内容の利点を有する。したがって、本発明が開示される特定の実施形態に限定されるべきでなく、かつ改良および他の実施形態が添付の特許請求の範囲の範囲内に含められるように意図されることは理解されるべきである。特定の用語が本明細書中で使用されるが、それらはあくまで一般的かつ説明的意味で使用され、限定目的に使用されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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