(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト細胞系ＮＭ−Ｆ９（ＤＳＭ  ＡＣＣ２６０６）又はＮＭ−Ｄ４（ＤＳＭ  ＡＣＣ２６０５）。
【請求項２】
ＮＭ−Ｆ９  （ＤＳＭ  ＡＣＣ２６０６）である請求項１に記載のヒト細胞系。
【請求項３】
ＮＭ−Ｄ４  （ＤＳＭ  ＡＣＣ２６０５）である請求項１に記載のヒト細胞系。
【請求項４】
細胞系ＮＭ−Ｆ９（ＤＳＭ  ＡＣＣ２６０６）又はＮＭ−Ｄ４（ＤＳＭ  ＡＣＣ２６０５）の細胞において糖タンパク質を発現させることを含む、糖タンパク質の発現方法。
【請求項５】
糖タンパク質を細胞系ＮＭ−Ｆ９  （ＤＳＭ  ＡＣＣ２６０６）の細胞において発現させる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
糖タンパク質を細胞系ＮＭ−Ｄ４  （ＤＳＭ  ＡＣＣ２６０５）の細胞において発現させる、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、最適化されたシアル酸付加度（sialylation degree）を有する高活性糖タンパク質、診断又は治療に用いるための該糖タンパク質を含む医薬組成物、高活性糖タンパク質及びその製造のための条件の決定方法、高活性糖タンパク質の製造方法、並びに分泌性糖タンパク質の示差的シアル酸付加方法に関する。また本発明は、生物学的目的のため、並びに、疾患（特に骨髄移植、好中球減少症、血球減少症、ＡＭＬ及び骨髄異形成症候群、癌、ＨＩＶ及び／又は造血系疾患）の予防的及び／若しくは治療的処置、又は診断のための、組換え発現された高活性糖タンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖タンパク質は、機能及び発生が各糖タンパク質間で大きく異なっている多様な一群である。潜在的治療能を有するタンパク質のうちのほとんどのタンパク質はグリコシル化されており、これは、例えば多数のホルモン（例えば、成長ホルモン、グリカゴン、ＦＳＨ及びＬＨ）、増殖因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦ及びエリスロポエチン）、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、インターフェロンα及びβ、ＴＮＦα）、抗凝固剤（例えば、レピルジン（Lepirudin）、デシルジン（Desirudin））、血液凝固因子（例えば、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子）、ワクチン（例えば、Ｂ型肝炎抗原）及び抗体で見られる。そのようなタンパク質を製造するための確立された細胞産生系は、元のヒトグリコシル化を有するタンパク質を産生することができない。原核生物（例えば、細菌）及びほとんどの真核細胞系（例えば、酵母、昆虫及び植物細胞）は、グリコシル化を欠くタンパク質を合成し、あるいはヒト糖鎖とは大きく異なるグリカンを含有するタンパク質を合成する。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、ヒト細胞と同様にタンパク質をグリコシル化しうる一般に使用されている産生系であるが、ＣＨＯ細胞は、例えば、ガラクトシル化、フコシル化、特に、Ｎアセチルグリコサミンでのグリコシル化及び特にシアル酸付加の種々の態様において、いくつかの重要な相違を有する。
【０００３】
これらの産生系が確立された時点においては、少なくとも或る程度活性である治療用タンパク質が産生されることで十分であった。今日では、（ｉ）治療用タンパク質の適用用量の回数及び濃度を減少させるために、（ｉｉ）治療のコストを減少させるために、並びに（ｉｉｉ）副作用を軽減するために、治療用タンパク質の活性を改善することに集中した多大な努力がなされている。
【０００４】
１つの方法は、発現系の生産性を増加させるものであるが、ほとんどの場合には、これはグリコシル化を全くもたらさないか非常に異常なグリコシル化しかもたらさず、ほとんどの場合には、それはタンパク質には不適当なものである。他の問題点、例えば分子の安定性及びフォールディングの低下も生じ、このため、しばしば、追加的な製造工程が必要となり、これは時間及びコストを浪費し、無駄、副作用及び最適未満の生物活性を与える。
【０００５】
タンパク質の生物活性を改善するための主な方法は、その血清半減期を延長させ、したがってそのバイオアベイラビリティを向上させるものである。これは、ＰＥＧ付加（PEGylation）と称される方法により行われ、この場合、産生されたタンパク質に或る形態のポリエチレングリコールが化学的に付加される。ＰＥＧは分子量を増加させ、したがって血清半減期を延長させる。しかし、この方法にはいくつかの問題が伴う。例えば、ほとんどすべての場合において、ＰＥＧ付加はその細胞エフェクター機能によりタンパク質の活性を減少させ、ヒトにおける反復投与は、しばしば、中和抗体としての有害な免疫応答を引き起こし、及び／又は、該製造方法は追加的な化学修飾を要し、さらなるコスト、無駄及び時間の浪費を招く多段階の方法となる。
【０００６】
糖鎖の修飾は、組換え発現されたタンパク質の血清半減期を改善することに焦点が合わされている。したがって、この技術は、組換え糖タンパク質のシアル酸付加度を最大にすることに焦点が合わされている。シアル酸は、真核細胞の表面上に最もよく見られる末端単糖であり、糖タンパク質のシアル酸付加が多くなればなるほど、循環中のその血清半減期は長くなる、と一般には考えられている。これは、循環非シアル酸付加タンパク質に結合し分解のためにそれを細胞内に導く肝臓内のアシアロタンパク質−受容体としての或る受容体の存在に基づくものである。
【０００７】
組換え糖タンパク質のシアル酸付加度を可能な限り高くまで増加させるためのいくつかの方法が提示されており、これらには例えば、（ｉ）ほとんどの末端にシアル酸付加をもたらすのに寄与する特定のシアリルトランスフェラーゼ又はガラクトシルトランスフェラーゼを過剰発現する組換え宿主細胞系を得ること、（ｉｉ）糖加水分解酵素を、例えばＣｕイオンを培地に加えて調節することにより、宿主細胞シアル酸の分解を妨げること、（ｉｉｉ）オリゴ糖産生を増強するための追加的な複合糖質及び他の基質の存在下、組換え糖タンパク質を産生する宿主細胞を培養すること、（ｉｖ）培養条件を種々変化させること、（ｖ）追加的な糖鎖を導入するために、したがってより多数のシアル酸を導入するために、該タンパク質を突然変異させること、並びに（ｖｉ）該糖タンパク質の産生後、精製されたシアリルトランスフェラーゼでｉｎ  ｖｉｔｒｏシアル酸付加を完了させることが含まれる。これらのすべての技術は一連の欠点を伴い、シアル酸付加度を最大にすることにより血清半減期を延長させるよう意図されているに過ぎない。
【０００８】
前記のとおり、先行技術は一連の決定的な欠点を有し、生物活性の改善、副作用又は毒性の軽減のためのグリコシル化の可能性のごく一部しか検討しておらず、したがって糖タンパク質を何らかの用途に結びつけるものではない。対応する組換え糖タンパク質に関する適当な試験系及び産生系が全く利用できないため、先行技術は、糖タンパク質の生物活性がシアル酸付加度と相関しているかどうかについての認識をほとんど完全に欠いている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、シアル酸の糖ヌクレオチド生合成経路における少なくとも１つの欠損を含有し、かつ糖タンパク質をコードする核酸でトランスフェクトされた発現細胞系において、ある濃度の少なくとも１つのシアル酸前駆体添加物を添加した培地内で高活性糖タンパク質を発現させることを含む方法により製造される高活性糖タンパク質であって、
該濃度が、
（ｉ）種々の濃度の少なくとも１つのシアル酸前駆体を使用する示差的シアル酸付加により、複数の異なるシアル酸付加形態の糖タンパク質を発現させること、
及び
（ｉｉ）適当なバイオアッセイにおいて、参照糖タンパク質と比較して、前記の異なるシアル酸付加形態の活性を測定すること、
及び
（ｉｉｉ）より高い／最高の活性を有するシアル酸付加形態を選択し、該糖タンパク質のより高い／最高の活性レベルと相関する、該シアル酸前駆体添加物の濃度を決定すること
を含む方法により決定される、高活性糖タンパク質を提供することにより、この課題を解決するものである。
【００１０】
したがって、また本発明は方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＮＭ−ｗｔ細胞のグライコエンジニアリング（GlycoEngineering）及び得られたＮＭ−Ｆ９細胞の特徴決定を示す。
【図２】ＮＭ−ｗｔ細胞並びに誘導体ＮＭ−Ｆ９及びＮＭ−Ｄ４によるＴＦ、ｓＴＦ、Ｔｎ、ｓＴｎ、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）、アシアログリコホリンＡ（ＡＧＰＡ）、Ｌｅｘ、ｓＬｅｘ及びＬｅｙの発現を示す。
【図３】（Ａ）レクチンＰＮＡ、ＳＮＡ、ＭＡＡ及びＵＥＡＩを使用するフローサイトメトリーによる、あるいは（Ｂ）チオバルビツール酸法による、ＮＭ−ｗｔ細胞並びに誘導体ＮＭ−Ｆ９及びＮＭ−Ｄ４上の膜複合糖質結合シアル酸の測定を示す。
【図４】（Ａ）ｍＲＮＡ発現分析による、及び（Ｂ）酵素活性分析による、ＮＭ−Ｆ９細胞の遺伝的欠損の分析を示す。
【図５】代謝的相補によるシアル酸付加の復元を示す。
【図６】遺伝的相補によるシアル酸付加の復元を示す。
【図７】ＮＭ−Ｆ９におけるｒｈＧＭ−ＣＳＦの発現を示す。
【図８】種々の分泌シグナルペプチドを使用した場合の、ＮＭ−Ｆ９細胞による、組換え発現された分泌性ＡＧＰＡの発現を示す。
【図９】代謝改変による膜複合糖質の示差的シアル酸付加を示す。
【図１０】代謝的相補による細胞表面上の膜タンパク質の示差的シアル酸付加を示す。
【図１１】代謝的相補による分泌性ｒｈＧＭ−ＣＳＦの示差的シアル酸付加を示す。
【図１２】ＴＦ１細胞上の示差的シアル酸付加ｒｈＧＭ−ＣＳＦの増殖活性を示す。
【図１３】樹状細胞上の示差的シアル酸付加ｒｈＧＭ−ＣＳＦの増殖活性を示す。
【図１４】ｒｈＧＭ−ＣＳＦ濃度に対する増殖活性の依存性を示す。
【図１５】ｒｈＧＭ−ＣＳＦ増殖活性の抑制を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明において、「参照糖タンパク質」という用語は、本発明の糖タンパク質と同一又は類似のタンパク質配列を有する糖タンパク質、好ましくは、同じタンパク質配列を有する糖タンパク質を意味する。グリコシル化構造を欠くことも可能である。参照糖タンパク質は一定の活性を有し、天然由来又は組換え発現されたものでありうる。好ましい参照体は公知の組換え糖タンパク質である。活性、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける受容体媒介活性の改善をもたらす、先行技術の特定のタンパク質配列の突然変異の場合には、本発明のより高い活性の糖タンパク質は、この点に関してより高い活性であることが可能であり、及び／又は、前記活性はより良くなることなく別の生物活性、例えば免疫原性に関してより高い活性でありうる。これらの具体例においては、免疫原性におけるより高い活性は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける使用に有利であり、したがって本発明における、より高い活性の糖タンパク質に匹敵する。当業者であれば、前臨床及び／又は臨床試験計画における適当な選択基準を選択することが可能である。
【００１３】
本発明において、「発現細胞系」なる語は、当業者に公知の又は本明細書に記載の技術による、標的遺伝子の更なる組換え発現又はウイルス若しくは当業者に公知の適当な物質の感染を伴う又は伴わない、タンパク質、糖タンパク質、ウイルス又は他の生物物質の発現に使用しうる細胞又は細胞系を意味する。
【００１４】
本発明において、「シアル酸の糖ヌクレオチド生合成経路における少なくとも１つの欠損を含有する発現細胞系」なる表現は、ＣＭＰ−シアル酸の合成に関与する酵素に欠損を含有する発現細胞系を意味する。欠損は、対応する酵素活性が減少しているか又は完全に存在しないことを意味し、例えば、酵素の遺伝子、遺伝子の発現、酵素の活性、又はその機能に関連した酵素のバイオアベイラビリティのレベルでの種々の主要欠損によるものでありうる。酵素としては、例えばＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ、キナーゼ（例えば、Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸−９−Ｐ（Ｎｅｕ５Ａｃ−９−Ｐ）−シンテターゼ、Ｎｅｕ５Ａｃ−９−Ｐ−ホスファターゼ及びＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンテターゼが挙げられる。シアル酸の糖ヌクレオチド生合成経路における、より好ましい欠損は、エピメラーゼの突然変異であり、より一層好ましいのは、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼにおける、そのｍＲＮＡ発現の欠損を引き起こす欠損である。
【００１５】
該欠損は、標準的な条件下及び／又は無血清条件下での細胞のシアル酸付加の軽減又はシアル酸付加のほぼ完全な若しくは完全な欠如をもたらす。このシアル酸の軽減は、シアル酸前駆体添加物の添加により部分的又は完全に復元されうる。この欠損は、ＣＭＰ−シアル酸の合成に関与する１以上の酵素の欠損に限定されるものではなく、シアル酸前駆体添加物の添加により該効果が部分的又は完全に復元されうるものである限り他の酵素の欠損でありうる。したがって、限定的なものではないが、一例としては、ＣＭＰ−シアル酸輸送体としての、対応する糖輸送酵素が挙げられる。当業者であれば、どのような単一の欠損又は欠損の組合せが本発明に適しているかを判定することが可能であり、それらのいくつかは以下に更に詳しく説明されている。
【００１６】
本発明において、「トランスフェクション」という用語は、ウイルス感染又はトランスフェクション方法（限定的なものではないが、リン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキストラン又はカチオン性脂質試薬との複合体形成及びマイクロインジェクションが含まれる）により組換えタンパク質の発現のために細胞内へ遺伝物質を送達し、それにより発現細胞系の細胞内に核酸を導入するのに用いられうる当業者に公知の方法を意味する。
【００１７】
本発明において、「糖タンパク質をコードする核酸」なる表現は、対象の哺乳動物糖タンパク質又はその活性断片及び／若しくは突然変異体（したがって、任意の糖タンパク質、好ましくは、ヒト由来の任意の糖タンパク質が使用されうる）をコードする核酸配列を意味する。哺乳動物糖タンパク質の具体例には、サイトカインのような分子及びそれらの受容体、例えば、腫瘍壊死因子ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−β；レニン；ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−抗トリプシン；インスリンＡ鎖及びＢ鎖；性腺刺激ホルモン、例えば濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン及びヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）；カルシトニン；グルカゴン；凝固因子、例えば第ＶＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、組織因子及びフォンビルブラント因子；抗凝固因子、例えばプロテインＣ；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性物質；プラスミノーゲン活性化因子、例えばウロキナーゼ、ヒト尿及び組織型プラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血増殖因子；エンケファリナーゼ；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質；血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン；ミュラー抑制性物質；レラキシンＡ鎖及びＢ鎖；プロレラキシン；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；血管内皮増殖因子；ホルモン又は増殖因子に対する受容体；インテグリン；プロテインＡ及びＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば骨由来神経栄養因子、ニューロトロフィン３、４、５、６及び神経成長因子β；血小板由来増殖因子；繊維芽細胞増殖因子；表皮増殖因子；トランスフォーミング増殖因子、例えばＴＧＦα及びＴＧＦβ；インスリン様増殖因子Ｉ及びＩＩ；インスリン様増殖因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８及びＣＤ９；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形成タンパク質；インターフェロン、例えばインターフェロンα、β及びγ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１〜ＩＬ−１２；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；抗体及びイムノアドヘシン；グリコホリンＡ；ＭＵＣ１が含まれる。
【００１８】
好ましい糖タンパク質は、グリコホリンＡ、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＳＨ、ｈＣＧ、ＬＨ、インターフェロン、インターロイキン、抗体及び／又はそれらのフラグメントを含む群から選ばれる。
【００１９】
本発明において、「糖タンパク質」という用語は、ウイルス、ウイルス粒子又はウイルスタンパク質としても定義される。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態においては、核酸は糖タンパク質の分泌性形態又はその断片をコードしている。好ましい実施形態においては、該分泌性形態は膜貫通ドメインを欠く。別の好ましい実施形態においては、該分泌性形態をコードする核酸は少なくとも１つの分泌シグナルを含む。最も好ましい実施形態においては、該分泌シグナルはＧＭ−ＣＳＦ由来である。他の実施形態及び詳細は以下で更に詳しく説明されている。
【００２１】
本発明において、「シアル酸前駆体添加物」なる語は、糖タンパク質の部分的又は完全なシアル酸付加をもたらす、シアル酸の糖ヌクレオチド生合成経路における欠損を部分的又は完全に復元しうる任意の天然又は合成化合物を意味する。本発明の好ましい実施形態においては、種々の濃度のシアル酸前駆体添加物の添加は、種々のシアル酸付加度を有する糖タンパク質の一連の異なるシアル酸形態を与える。それにより、糖タンパク質のシアル酸付加形態は単一のグライコフォーム又は一群のグライコフォームから構成されうる。これは、単一のシアル酸前駆体添加物を使用することにより、又は２以上の前駆体添加物の組合せを使用することにより達成されうる。本発明の好ましい実施形態においては、シアル酸前駆体添加物として、シアル酸中間体及び／又はシアル酸含有糖タンパク質を使用する。別の好ましい実施形態においては、シアル酸前駆体添加物はＭａｎＮＡｃ、アセチル化ＭａｎＮＡｃ、パーアセチル化ＭａｎＮＡｃ又はフェツインである。別の好ましい実施形態においては、ＭａｎＮＡｃ、アセチル化ＭａｎＮＡｃ又はパーアセチル化ＭａｎＮＡｃとフェツインとの組合せを使用する。
【００２２】
好ましいのは、天然シアル酸修飾を有する糖タンパク質を与えるシアル酸前駆体添加物である。天然シアル酸修飾は、出発物質、中間体グライコフォーム又は最終グライコフォームのような、生物において見出されうる修飾である。さらに、天然糖タンパク質、グリコシル化形態（これらは、生物体内に天然で存在するグライコフォームに可能な限り近い）が好ましい。グライコフォーム、例えば、ヒトにおいて見出される糖鎖又はヒト由来の任意の生物学的物質に類似した、シアル酸を有する糖鎖を有する、ヒト糖タンパク質のグライコフォームが使用されるであろう。それらの好ましい形態は、生物において見出されない非天然側鎖により修飾されたシアル酸を含有しない。例えば、糖タンパク質又は糖脂質内に組込まれるシアル酸は、化学合成により導入されうる、置換された若しくは欠失した若しくは付加された若しくは伸長した若しくは短縮した側鎖、及び／又は生物において見出されない、シアル酸への新規鎖間連結（interlinkage）を含まない。
【００２３】
本発明の好ましい形態においては、いずれの細胞生成物のグリコシル化も、非天然シアル酸修飾を与える化学的に操作された前駆体又は代謝産物によって変化させたり又は修飾するのではなく、天然グリコシル化、好ましくはシアル酸付加の度合を最適化することにより変化させたり又は修飾する。化学修飾されたシアル酸代謝産物は、天然グリコシル化に影響を及ぼさない様態でのみ使用されうる。例えば、アセチル化ＭａｎＮＡｃ又はパーアセチル化ＭａｎＮＡｃは天然Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）より遥かに容易に細胞により取り込まれるため、アセチル化ＭａｎＮＡｃ又はパーアセチル化ＭａｎＮＡｃを添加した細胞培養培地としてＭａｎＮＡｃは置換されうる。細胞内で、追加的なアセチル残基が切り離され、ＣＭＰ−シアル酸の生合成のためにＭａｎＮＡｃがプロセシングされる。したがって、アセチル化ＭａｎＮＡｃで処理された細胞により産生される糖タンパク質は、合成により修飾された炭水化物（例えば、合成によりアセチル化されたシアル酸）を何ら示さない。
【００２４】
本発明において、「異なるシアル酸付加形態」なる表現は、少なくとも１つのシアル酸が別のグライコフォームとは異なる糖タンパク質のグライコフォームを意味する。シアル酸における相違は、シアル酸の量、及び／又は該分子の残部上の少なくとも１つのシアル酸の位置におけるものでありうる。個々のシアル酸付加形態は、糖タンパク質の単一のグライコフォーム又はいくつかのグライコフォームの混合物から構成されることが可能であり、それにより、異なるシアル酸付加形態はお互いに、少なくとも１つのグライコフォームにおいて及び／又はグライコフォームの相対組成において異なる。
【００２５】
少なくとも１つのシアル酸付加形態のシアル酸付加度は、当業者に公知の生化学的及び／又は化学的方法により測定することが可能である。例えば、迅速な方法は、シアル酸特異的抗体又はレクチン、例えばＳＮＡ及びＭＡＡで、あるいはシアル酸を含まないグリカンを認識する抗体又はレクチン、例えばＡ７８−Ｇ／Ａ７及びＮｅｍｏｄ−ＴＦ１又はレクチンＰＮＡで、細胞又は糖タンパク質を染色するものである。染色された細胞はフローサイトメトリーにより分析し、染色された糖タンパク質は、糖タンパク質が精製されている場合には通常のＥＬＩＳＡにより、あるいは分析対象の糖タンパク質を捕捉するために糖タンパク質特異的抗体を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡにより分析することが可能である。当業者に公知のこれらのすべての方法は、細胞又は糖タンパク質の示差的シアル酸付加のモニターを可能にする。したがって、結合したシアル酸特異的抗体又はレクチンの量は、細胞又は糖タンパク質に結合したシアル酸の量と相関し、一方、シアル酸を含まないグリカンを認識する結合抗体又はレクチンの量は、細胞又は糖タンパク質に結合したシアル酸の量と逆相関する。シアル酸含量を定量するためのもう１つの方法は、ノイラミニダーゼを使用することにより酵素的に、あるいは酸加水分解により化学的に、糖タンパク質に結合したすべてのシアル酸を遊離させるものである。ついでサンプル中のシアル酸の濃度を、１，２−ジアミノ−４，５−メチレンジオキシベンゼン（ＤＭＢ）でのシアル酸の蛍光測定染色、及び蛍光測定検出器を使用するＨＰＬＣ分析により測定する。あるいは、遊離したシアル酸の量を、チオバルビツレート及びβ−ホルミルピルベートの存在下、５４９ｎｍで比色検出されうるピンク色色素にシアル酸を変換することにより定量する。Ｎ−又はＯ−グリカンに結合したシアル酸の数に関するデータを得るためには、全Ｎ−又はＯ−グリカンを酵素的又は化学的に遊離させる。アンテナ性（antennarity）に関する遊離グリカン（例えば、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより）、結合シアル酸の数（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィーと組合されたＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより）、単糖の組成（例えば、グリカンの酸加水分解の後のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより）及び／又は厳密な構造（例えば、質量分析）を分析するためのいくつかの方法が当業者に利用可能である。
【００２６】
本発明における定義において、「活性」は、生物学的環境中で分子により発揮される機能又は一連の機能である。一般には、本発明の方法により製造される糖タンパク質は、先行技術により製造される糖タンパク質より活性が高く及び／又はより有効な生物学的産物である。したがって、本発明は、ヒト高活性糖タンパク質、及び該糖タンパク質を含む診断、治療又は他の生物学的系及び試験におけるその使用に関する。本発明における定義においては、「高活性糖タンパク質」なる語、その内容の均等物及びその文法的均等物は、選択された用途に関して、改善された又は最適の活性として理解されるべきであり、したがって、該活性は極限値に近似されることが可能であり、例えば最小化又は最大化されることが可能であり、あるいは、先行技術により製造された対応糖タンパク質及び／又は本発明の示差的シアル酸付加により製造された別のシアル酸付加形態より高い又はより低い活性を表す中間値に設定されることが可能であろう。本発明における改善された又はより高い活性はまた、その生物学的及び／又は薬学的意味において好ましい活性を意味する。例えば、糖タンパク質の生物活性は、有害な生物学的影響を軽減することにより（例えば、有害な免疫作用の刺激の低減又は免疫原性の低減により）或る程度は増強されうるであろう。本発明の方法は、最適化された血清半減期、薬物動態、安定性、抗原性及び／又は免疫原性を有する糖タンパク質を製造するために有効に使用されうる。
【００２７】
本発明において、「異なるシアル酸付加形態の活性の測定」なる表現は、糖タンパク質の活性を測定しうる適当なバイオアッセイにおける活性の測定を意味する。当業者であれば、適当なバイオアッセイを決定し、適当なバイオアッセイを構成することが可能である。本発明においては、そのようなバイオアッセイとしては、例えば、生物学的ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、例えば細胞若しくは分子又は混合アッセイ、例えば増殖アッセイ、アポトーシスアッセイ、細胞接着アッセイ、シグナル伝達アッセイ、遊走アッセイ、細胞毒性アッセイ、食作用アッセイ、細胞溶解アッセイ及び結合アッセイが挙げられる。そのようなバイオアッセイにはまた、動物モデル又はヒトを使用するｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ、例えば生体内分布、薬物動態、薬動力学試験、血清半減期試験、バイオアベイラビリティに関する試験、有効性試験、局在性試験、疾患の治療及び予防試験（臨床研究を含む）が含まれる。そのようなバイオアッセイには、化学的、物理的、物理化学的、生物物理学的及び生化学的試験、例えば温度、せん断応力、圧力、ｐＨ、複合体形成（コンジュゲーション）などに対する安定性も含まれる。そのようなバイオアッセイには、糖タンパク質の臨床的使用に関する該糖タンパク質の特性を改善するための免疫原性及び／又は抗原性に関する試験も含まれる。当業者であれば、糖タンパク質及びそのシアル酸付加形態の活性又は記載されている活性の組合せを決定することが可能である。
【００２８】
好ましい実施形態においては、糖タンパク質のより高い活性は、少なくとも１つのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおける、り高い活性、及び／又は少なくとも１つのｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおけるより高い活性、及び／又はより高い安定性、及び／又はより長い血清半減期、及び／又はより長いバイオアベイラビリティ、及び／又は免疫原性の改善、及び／又は抗原性の改善（少なくとも１つのバイオアッセイにより測定される）を特徴とする。全活性における改善（これは本明細書中では、より高い活性とも称される）は、例えば、ヒト又は対応生物において使用される場合の該生成物の、より低い投与量、より長い投与時間間隔、より低い副作用、及び全く無い又はより低い毒性をもたらして、大きく改善された医薬を与えうる。
【００２９】
本発明において、「より高い活性を有するシアル酸付加形態の選択」という用語は、バイオアッセイの少なくとも１つにおける比較において、より高い活性を有する糖タンパク質のシアル酸付加形態の選択を意味する。この比較は、本発明の方法により発現される少なくとも１つのシアル酸付加形態を先行技術のグリコシル化形態の糖タンパク質と比較することにより、あるいは本発明の方法により発現される少なくとも２つのシアル酸付加形態を比較することにより行いうる。好ましくは、相当に最適化されたグライコフォームを達成し、同定し、製造するためには、高活性糖タンパク質は３以上の異なるシアル酸付加形態から選ばれる。当業者であれば、どのシアル酸付加形態が、特定のバイオアッセイに関して、より高い活性を有するかを決定することが可能である。好ましい実施形態においては、より高い活性を有するシアル酸付加形態を選択するためには、バイオアッセイの組合せの活性を考慮する。その場合、それぞれのバイオアッセイが、より高い活性を示す必要があるわけではなく、個々の糖タンパク質の用途及び特徴に応じて、いくつかの好ましい生物学的作用が、それほど好ましくはない他のものを補うことが可能であり、本発明においては尚も全体的にはより高い活性のグライコフォームをもたらしうる。例えば、あるグライコフォームは、細胞に対してその受容体に結合することにより、より遥かに高い活性をもたらして、例えば増殖の誘導のような副次的効果を誘導しうるが、若干減少した血清半減期を示す。したがって、組合せとしては、該受容体をより惹起するより高い活性は、全体的な生物活性においてバイオアベイラビリティが短くなることを補う。もう１つの例においては、より短い半減期、及び受容体惹起をもたらす、より高い活性は、どちらも有利である。さらにもう１つの例においては、ｉｎ  ｖｉｖｏでの活性は改善されないが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの安定性は糖タンパク質の製造及び貯蔵を改善する。さらにもう１つの例においては、長い半減期の一方で、より低い活性が必要とされる。したがって、実際の有利なシアル酸付加形態を、特定の糖タンパク質に基づいて、その後の使用に関して決定する必要がある。本発明は、この統合された系において、これを初めて可能にするものである。このすべての態様は、決定すべき単一の糖タンパク質に左右され、これらは大きく異なり、予想できず、本発明の後述する方法を必要とする。本発明を使用することにより、当業者は、適当なバイオアッセイ及び／又はバイオアッセイの組合せ、並びに前記の点に関して糖タンパク質の所望の用途のためのより高い活性を有する糖タンパク質のシアル酸付加形態を選択することが可能であり、したがって、標準的な方法により製造されうるグリコシル化形態と比べて糖タンパク質を改善することが可能である。本発明を使用することにより、当業者は、該糖タンパク質のより高い活性レベルと相関する、シアル酸前駆体添加物又はシアル酸前駆体添加物の組合せの濃度を決定することが可能である。
【００３０】
本発明において、示差的シアル酸付加により発現させバイオアッセイにおいて比較する複数の異なるシアル酸形態という表現は、バイオアッセイにおいて試験した場合に、先行技術により得られる少なくとも１つの異なるシアル酸付加又はグリコシル化形態と比べて高い活性を示す、本発明の方法により発現される１つのシアル酸形態をも意味する。
【００３１】
前記のすべての定義及び説明は、前記及び後記の糖タンパク質及び方法にも有効である。
【００３２】
驚くべきことに、本発明の組換え発現された糖タンパク質は、シアル酸前駆体添加物の特定の濃度に対応する特定の度合でシアル酸付加された場合に、最高の生物活性を示すことを見出した。最高の生物活性と相関するこのシアル酸付加度は、分析する各糖タンパク質によって異なり、予測可能ではなく、最高のシアル酸付加度が必ずしも達成可能なわけではない。本発明に従って糖タンパク質のシアル酸付加度を同定するためには、細胞欠損によってシアル酸付加の復元及び種々のシアル酸付加度の達成が可能となるようにシアル酸付加能が欠損した細胞を使用及び／又は作製する。シアル酸付加の復元を達成するための１つの方法は、シアル酸生合成経路のシアル酸前駆体添加物を該細胞の培地に添加することによるものである。該欠損細胞及び少なくとも１つのシアル酸前駆体添加物を使用して、該培地に加えるシアル酸前駆体添加物の量を変化させることにより、該細胞により産生される本発明の任意の糖タンパク質のシアル酸付加度を示差的に制御することが可能である。少なくとも２つの異なるシアル酸付加形態が達成されうる。僅か２つの異なる濃度の前記添加物を使用する場合には、異なるシアル酸付加形態の作製が保証されるよう、濃度勾配は十分大きくなければならない。好ましくは、最高値が方法の特徴（例えば、粘度、溶解度、ａｗ値など）により定められる高濃度及び低濃度が選ばれる。示差的にシアル酸付加された糖タンパク質の少なくとも２つの形態、好ましくは複数の形態（異なるシアル酸形態）を単離し、グリコシル化、好ましくはシアル酸付加、活性、血清半減期、薬物動態、薬動力学、ｉｎ  ｖｉｖｏ生物活性、抗原性及び免疫原性のような特性に関して分析することが可能である。そのようにして、該糖タンパク質の、その活性又は任意の他の特性のための最適なシアル酸付加度は、前記の基準の１つ又は組合せにより同定され、その最適シアル酸付加糖タンパク質の製造のための条件は、生産細胞として上記欠損細胞を使用する製造プロセスに移されうる。
【００３３】
本発明はまた、高活性糖タンパク質の製造のための特別な方法及び高活性糖タンパク質そのものを教示する。これらの特別な場合には、シアル酸前駆体添加物の最適濃度が他の技術により決定され又は当業者の論理的思考から推定されうる場合には（例えば、後記実施例に記載のとおり）、個々のシアル酸付加形態は、それを、異なる濃度のシアル酸前駆体添加物の対応発現細胞系内での発現により得られる第２の形態と比較することを要することなく、製造されうる。これらの特別な場合も、高活性糖タンパク質及び本発明の方法において、明らかに本発明に包含される。これらの場合、本発明の基本的な発明原理は尚も、本方法及び得られる高活性糖タンパク質の中心的かつ決定的な部分である。これに関しては、前記及び後記の他の説明も参照されたい。一例としては、シアル酸付加を全く又は最小限度しか伴わないＧＰＡが挙げられ、これは後記の実施例の１つにおいて更に詳しく説明されており、この場合の目的は、初めから、最小限度のシアル酸付加及び最大限度のトムセン−フリーデンライヒ（Thomsen-Friedenreich）を伴う形態の作製でありうる。したがって、シアル酸前駆体添加物を加えることなく、好ましくは、培地内にいずれのシアロ糖タンパク質も存在することなく、最低限度のシアル酸付加を伴う形態のみを作製することで十分でありうる。更なる使用のためのこの形態の適合性は、それを、少なくとも１つの他のシアル酸付加形態と比較することにより判定されうるが、この代わりに、ヒト由来のシアル酸付加又は低シアル酸付加ＧＰＡとも比較しうる。もう１つの例は、最高シアル酸付加が望ましいことが判明しており、最大限度のシアル酸前駆体添加物を使用することで十分でありうる場合である。しかし、後者の場合には、ほとんどすべての場合において、本明細書中の種々のシアル酸付加形態を作製することによりシアル酸前駆体添加物の組成及び濃度を最適化することにより最高シアル酸付加を最適化することが有利である。この特別な場合には、単一のバイオアッセイとしてのシアル酸度の測定のための技術を用いることで十分かもしれないが、他のバイオアッセイとの組合せが好ましい。
【００３４】
新規技術は、新規糖タンパク質の作製及び種々の糖タンパク質の改善（改良バイオジェネリックス（biogenerics）の作製を含む）のための高い潜在性を保有する。
【００３５】
以下において、シアル酸の糖ヌクレオチド生合成経路における欠損を更に詳しく説明する。本発明においては、細胞のシアル酸付加能の低下を引き起こす欠損（好ましくはシアル酸付加能の完全な消失）を有し該欠損が復元されうることにより示差的制御シアル酸付加を可能にする欠損を有する発現細胞系により、高活性糖タンパク質を製造する。「シアル酸の糖ヌクレオチド生合成経路における欠損」とも称される該細胞の分子的欠損は、シアル酸の代謝に関与するタンパク質（例えば、糖輸送における例えばＣＭＰ−シアル酸輸送体、又はＣＭＰ−シアル酸の生合成における例えばキナーゼ、デヒドロゲナーゼ、ホスファターゼ、シンテターゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ及びエピメラーゼ）の機能喪失（loss-of-function）でありうる。また、シアル酸付加の軽減又は欠如を伴うシアル酸付加不能細胞を与える分子的欠損は、シアル酸の代謝に関与するタンパク質（例えば、炭水化物からシアル酸を遊離させる酵素、例えば、ノイラミニダーゼ）の機能獲得（gain-of-function）でありうる。好ましい標的は、ＣＭＰ−シアル酸の輸送に寄与するタンパク質、及びシアル酸生合成経路における律速段階を触媒する酵素である。より好ましくは、該欠損はエピメラーゼ、最も好ましくはＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−２−エピメラーゼに関するものである。
【００３６】
先行技術は、Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）がＣＭＰ−シアル酸の生合成において重要な役割を果たすことを教示している。ＭａｎＮＡｃは、シアル酸の細胞生合成における律速段階を代表するＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−２−エピメラーゼの作用により、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）から形成される。ついでＭａｎＮＡｃは特異的キナーゼ（例えば、Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼ）によりリン酸化される。ＭａｎＮＡｃ−６−ＰはＮｅｕ５Ａｃ−９−Ｐ−シンテターゼによりホスホエノールピルビン酸と縮合してＮ−アセチルノイラミン酸−９−Ｐ（ＮｅｕＡｃ−９−Ｐ）となり、ついで該ホスフェートはＮｅｕ５Ａｃ−９−Ｐ−ホスファターゼにより遊離され、Ｎｅｕ５ＡｃはＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンテターゼにより活性化される。ついでＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃは特異的輸送体（例えば、ＣＭＰ−シアル酸輸送体）により細胞のゴルジ区画内へ輸送され、その部位において、それは、シアル酸を糖タンパク質又は糖脂質の末端ガラクトース（Ｇａｌ）−、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）−又はＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）−残基へ転移させる種々のシアリルトランスフェラーゼ、例えばＳＴ６ＧｌｃＮＡｃシアリルトランスフェラーゼ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉ〜ＶＩ、ＳＴ３Ｇａｌ−Ｉ〜ＶＩ及びＳＴ６Ｇａｌ−Ｉのための供与体として働く。
【００３７】
シアル酸生合成の各酵素、例えばＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−２−エピメラーゼ、キナーゼ、Ｎｅｕ５Ａｃ−９−Ｐ−シンテターゼ、Ｎｅｕ５Ａｃ−９−Ｐ−ホスファターゼ及びＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンテターゼ、又はゴルジ区画内への輸送に必要な各タンパク質は、欠損細胞に欠損酵素の産物を供給することにより該欠損が復元されうるように、細胞のシアル酸付加能を改変するよう、好ましくは軽減するよう、より好ましくは完全に遮断されるよう影響を受けることが可能である。細胞のシアル酸付加能は、シアリルトランスフェラーゼにより触媒される炭水化物へのシアル酸の転移における変化によっても影響されうる。
【００３８】
該細胞欠損を生じさせ、遺伝的、転写、翻訳又はタンパク質レベルでタンパク質の合成及び機能を標的化するよう特異的に該細胞欠損を作製するには、多数の選択肢が存在する。
【００３９】
特定のタンパク質をコードする遺伝子における突然変異は、しばしば、そのタンパク質の機能喪失を引き起こし、あるいは、時には、機能を獲得するタンパク質を与える。例えば、１個若しくは２個のヌクレオチドの置換により又は（１＋ｎ）個若しくは（２＋ｎ）個のヌクレオチド（ここで、ｎは３の倍数である正の整数）の導入若しくは欠失により引き起こされうるフレームシフトにより、遺伝子のコード領域内に停止コドンを与える突然変異が挙げられる。多数の他の「機能喪失」及び「機能獲得」遺伝子突然変異が当業者に公知である。これらの遺伝子突然変異は遺伝子の転写にも影響を及ぼしうる。化学的突然変異原、例えばメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）又は物理的突然変異原、例えばＵＶ光により遺伝的突然変異をランダムに誘発するための多数の方法が当業者に公知である。また、現代の分子生物学的技術によって、当業者は突然変異により遺伝子を特異的に標的化することが可能である。これらの技術を用いて、当業者は特定の遺伝子をノックアウトしたり、あるいは新たな遺伝子を導入して機能獲得突然変異体を作製することが可能である。
【００４０】
転写レベルでは、特定のタンパク質をコードするｍＲＮＡの合成が制御される。遺伝子転写における欠損又は変化は、特定の酵素のｍＲＮＡ合成のスイッチをオフ又はオンにすることができる。例えば、シアル酸の生合成に関与する酵素をコードするＤＮＡのメチル化、又はＤＮＡ結合タンパク質、例えばヒストン、転写因子若しくは転写装置のタンパク質の修飾、例えばアセチル化は転写を妨げたり、あるいは特定の遺伝子の転写のスイッチをオンにすることが可能であろう。前記の及び当業者に公知の遺伝学的及び分子生物学的方法による突然変異の誘発は、任意の遺伝子の転写効率に影響を及ぼすための１つの選択肢である。ＮＭ−Ｆ９細胞内のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−２−エピメラーゼｍＲＮＡの欠如（その欠損はＥＭＳ突然変異原での野生型細胞の処理により作製される）は、機能喪失欠損を作製するための転写の影響の一例である。
【００４１】
翻訳レベルでは、特定の酵素の、合成されたｍＲＮＡを標的化して、好ましくは、リボソームタンパク質の生合成を妨げ又は軽減する。具体例としては、共に特異的ｍＲＮＡ分子を標的化するアンチセンス分子又は小さな干渉性ＲＮＡ分子を使用する翻訳の阻止及び／又はＲＮａｓｅによる特定のｍＲＮＡの分解が挙げられる。どちらの技術も当業者に公知である。
【００４２】
タンパク質レベルでは、酵素活性の欠如は遺伝子突然変異により引き起こされうるであろう。可能な突然変異には、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失及び／又は修飾が含まれる。該突然変異は、新たな及び非天然構造が基質の結合及び／又はその変換を許容しないタンパク質の構造的再折りたたみによる、あるいは基質との相互作用に寄与する活性中心内の残基を変化させることによる、酵素の触媒特性に関するものでありうる。そのような突然変異を作製するための技術は前記で説明されている。
【００４３】
ＣＭＰ−シアル酸の生合成又は輸送は特定のインヒビターによっても影響されうる。これらのインヒビターは、ＣＭＰ−シアル酸生合成に関与する酵素若しくはタンパク質の活性を遮断するシアル酸類似体、又はＣＭＰ−シアル酸の転移に必要ないずれの輸送体の活性を遮断するシアル酸類似体でありうる。これらのインヒビターは、酵素又はタンパク質の調節中心及び／又は触媒中心に結合して、基質の結合及び／又はその変換若しくは輸送を妨げうる。インヒビターは、シアル酸類似体、小有機分子、ペプチドリガンド、抗体及びそのフラグメント、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、スピーゲルマー（Spiegelmer）などを含む群から選ばれる高い結合アフィニティーを有する分子である。
【００４４】
Nemod Biotherapeutics GmbH & Co. KG, Robert-Rossle-Str. 10, 13125 Berlin（ドイツ）により２００３年８月１４日付けでBraunschweig（ドイツ）の“DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH”にＤＳＭ  ＡＣＣ２６０６（ＮＭ−Ｆ９）及びＤＳＭ  ＡＣＣ２６０５（ＮＭ−Ｄ４）として寄託されているＮＭ−Ｆ９及び／又はＮＭ−Ｄ４細胞は、本発明の高活性糖タンパク質の発現のために及び本発明の後記方法における使用のために理想的に適合化された発現細胞系であることが判明している糖改変細胞である。なぜなら、ＮＭ−Ｆ９及びＮＭ−Ｄ４細胞は、代謝的相補により復元されうるようにシアル酸付加能を喪失しているからである。したがって、本発明においては、ＮＭ−Ｆ９及び／又はＮＭ−Ｄ４細胞は、本発明の高活性糖タンパク質及び後記の方法のための、シアル酸の糖ヌクレオチド生合成経路における欠損を有する最も好ましい細胞系である。
【００４５】
ＮＭ−Ｆ９及びＮＭ−Ｄ４細胞におけるシアル酸付加の細胞欠損はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−２−エピメラーゼ活性の欠如により引き起こされ、それにより、シアル酸付加は、該エピメラーゼにより触媒される酵素反応の上流のシアル酸生合成の細胞産物での培地補足（代謝的相補とも称される）により復元されうる。そのようなシアル酸中間体はＭａｎＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ−６−Ｐ、ＮｅｕＡｃ−９−Ｐ、Ｎｅｕ５Ａｃ及びＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃでありうる。ＭａｎＮＡｃが好ましい。驚くべきことに、細胞シアル酸付加度は、細胞培養培地に加えるＭａｎＮＡｃの量により制御することが可能であった。また、細胞シアル酸付加度だけでなく、より一層驚くべきことに、細胞から分泌又は遊離される糖タンパク質の度合も、そのように調節されうる。驚くべきことに、たいていは培地へのウシ胎仔血清（ＦＣＳ）の添加によりもたらされる、細胞培養培地内のシアル酸付加血清タンパク質の存在は、細胞又は分泌性糖タンパク質のシアル酸付加度に影響を及ぼす。これは妥当だと思われる。なぜなら、該細胞は、ＣＭＰ−シアル酸を産生するためのそれ自体の生合成経路を要することなく、ある程度は、ｄｅ  ｎｏｖｏグリコシル化のために、取り込まれた糖タンパク質からのシアル酸を利用するようであり、あるいは異化経路によりシアル酸をシアル酸の公知又は未知前駆体生合成経路へと導入するためである。したがって、該細胞をＦＣＳ非含有培地内で又は更にはシアル酸付加タンパク質非含有培地内で培養する場合には、非常に低い度合のシアル酸付加が得られる。シアル酸付加度は常に、ＦＣＳの存在下では、ＦＣＳを含有しない同じ細胞培養条件下より高い。したがって、与えられた細胞系において最高のシアル酸付加度を達成するためには、ＦＣＳ、又はより好ましくはシアル酸付加糖タンパク質、又は最も好ましくはシアル酸付加糖タンパク質フェツインを培地に加える。このようにして、ＮＭ−Ｆ９細胞又は分泌性糖タンパク質上のシアル酸付加度は、元のＮＭ−ｗｔ細胞のシアル酸付加に比べて２０％未満、好ましくは１０％未満、最も好ましくはほぼ０％のシアル酸付加から、エピメラーゼ欠損を有さない元のＮＭ−ｗｔ細胞シアル酸付加と比べてシアル酸付加を完了する（１００％）シアル酸付加まで制御されうるであろう。
【００４６】
この範囲のなかで、シアル酸付加度を示差的に制御することが可能であり、これは、一定の糖中間体、例えば０〜２００ｍＭ、好ましくは０〜１４０ｍＭ、より好ましくは０〜９０ｍＭの濃度範囲のＭａｎＮＡｃを培地に添加することにより行うことが可能である。非常に高いシアル酸付加度を達成するためには、シアロ糖タンパク質を培地に加えることが可能である。異なるシアル酸付加度を有する各糖タンパク質を単離し、異なるシアル酸付加度を有する同じ糖タンパク質とは別々に分析することが可能である。したがって、本明細書に記載のとおり、あるシアル酸付加度は、単一のグライコフォーム又は複数のグライコフォームの組成物を含みうるシアル酸付加形態に対応する。
【００４７】
したがって、本発明は、後記で更に詳しく説明するとおり、糖タンパク質の示差的シアル酸付加のための方法又はプロセスを提供する。
【００４８】
前記のとおり、異なるシアル酸付加度を有する各糖タンパク質の活性を分析することにより、シアル酸前駆体添加物の最適化濃度を決定することが可能である。分析対象の活性は、目的の糖タンパク質に左右される。例えば、糖タンパク質がサイトカインである場合には、免疫細胞（好ましくは、そのサイトカインにより刺激されることが公知の細胞、より好ましくは、該サイトカインの活性を測定するための標準的なアッセイにおいて使用される細胞）を刺激する該糖タンパク質の能力を分析することになろう。もう１つの例において、糖タンパク質が増殖因子である場合には、細胞増殖（好ましくは、その増殖因子により刺激されることが公知の細胞の細胞増殖、より好ましくは、該増殖因子の増殖活性を測定するための標準的なアッセイにおいて使用される細胞の増殖細胞）を誘導する該糖タンパク質の能力を分析することになろう。もう１つの例においては、血清半減期が対象となる。なぜなら、それは、治療用に適用される糖タンパク質の生物活性に著しく影響を及ぼすからである。本発明は、種々のシアル酸付加度を特徴とする１つの糖タンパク質の種々の形態の発現及び単離を可能にするものであり、該糖タンパク質の任意の活性を分析するために任意のアッセイを適用することにより、該糖タンパク質の活性のための最適なシアル酸付加度を決定することが可能である。
【００４９】
以下においては、糖タンパク質及び高活性糖タンパク質を更に詳しく説明する。糖タンパク質の具体例は前記に挙げられている。前記糖タンパク質の多くは「サイトカイン」に属し、サイトカインは本明細書においては、免疫系の細胞において見出されるホルモンの一般的クラスを意味し、リンホカイン及びモノカインの両方並びにその他を含む。この定義は、局所的に作用し血中に循環せず、本発明に従い使用される場合に個体の免疫応答の改変を引き起こすホルモンを含む（これらに限定されるものではない）と意図される。他の適当な免疫調節性サイトカインの具体例には、限定的なものではないがインターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β及びＩＦＮ−γ）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦα及びＴＮＦβ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＦＬＴ−３リガンド、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＣＤ２及びＩＣＡＭが含まれる。エリスロポエチンに関しては、この分子は前駆細胞を赤血球へ成熟させると考えられている。一方、トロンボポエチンは前駆細胞を血小板経路に沿って誘導すると考えられている。ＣＳＦは、骨髄内に見出される前駆細胞を成熟血液細胞の特定の型へ分化するように誘導するリンホイシンのファミリーを意味する。前駆細胞から生じる成熟血液細胞の個々の型は存在するＣＳＦの型よって異なる。同様に、顆粒球−マクロファージコロニーの形成はＧＭ−ＣＳＦの存在に左右される。また、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αなどのヒト形態に対して実質的な相同性を有する他の哺乳動物のサイトカインは、免疫系に対して同様の活性を示すことが証明されている場合には、本発明において有用であろう。同様に、いずれかの特定のサイトカインに実質的に類似しているがタンパク質配列の比較的わずかな変化を有するタンパク質も本発明において有用であろう。タンパク質分子の機能的能力を妨げることなくタンパク質配列内のいくつかのわずかな変化が可能でありうることはよく知られており、したがって、本発明においてサイトカインとして機能するが現在公知の配列とは若干異なるタンパク質が製造されうる。最後に、本出願における「サイトカイン」なる語の単数形又は複数形の使用は決定的なものではなく、本発明及び特許請求の範囲の解釈を限定するものではない。接着若しくはアクセサリー分子又はそれらの組合せは単独で又はサイトカインと組合せて使用されうる。
【００５０】
好ましい糖タンパク質は、グリコホリンＡ、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＳＨ、ｈＣＧ、ＬＨ、インターフェロン、インターロイキン、抗体及び／又はそのフラグメントを含む群から選ばれる。
【００５１】
本発明においては、高活性糖タンパク質は内因性タンパク質、好ましくは、発現細胞系において組換え手法により製造されるタンパク質でありうる。したがって、目的の糖タンパク質をコードするｃＤＮＡ又は遺伝子を分子生物学的方法により発現ベクター内にクローニングし、発現細胞系内で発現させる。この発現は、好ましくは、安定発現である。すべてのその技術は当業者に公知である。多数の発現ベクターが、当業者に公知の哺乳動物細胞における発現に利用可能であり適している。好ましい実施形態においては、糖タンパク質は細胞により分泌される。したがって、発現ベクターは、糖タンパク質の分泌を促進するように構築される。分泌性糖タンパク質は可溶性糖タンパク質、又は膜貫通ドメインが欠失した膜タンパク質でありうる。好ましい実施形態においては、分泌シグナルペプチドをコードする核酸を、糖タンパク質をコードする核酸内に含ませ、これは、該タンパク質の分泌を促進及び／又は増強する。それらのシグナルペプチド及びそれらのコード核酸は当業者に公知である。本発明の好ましい実施形態においては、シグナルペプチドの核酸は配列番号１の配列又は該配列の突然変異、欠失、挿入及び伸長並びに該配列を含有する融合タンパク質を有する。
【００５２】
本発明においては、ＮＭ−Ｆ９細胞内での２つの高活性糖タンパク質、すなわち可溶性タンパク質としての顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び膜タンパク質としてのグリコホリンＡ（ＧＰＡ）の組換え発現が実施例として記載されている。
【００５３】
ＧＭ−ＣＳＦは、先天性及び適応免疫系の活性化において重要な役割を果たす、骨髄細胞の強力な種特異的増殖因子である。該因子は顆粒球、マクロファージ、好酸球及びそれらの前駆細胞の増殖、発生、分化及び活性化を刺激する。さらに、ＧＭ−ＣＳＦは、体液性及び細胞性免疫応答にとって中心的な樹状前駆細胞の分化及び成熟に決定的に重要である。赤芽球及び巨核球前駆細胞の増殖におけるエリスロポエチン（ＥＰＯ）との相乗作用、並びに種々の他のサイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−４、Ｇ−ＣＳＦ）との相乗作用が観察される。ＧＭ−ＣＳＦは好中球、好酸球及びマクロファージの殺微生物活性、酸化的代謝、食作用活性及び細胞傷害性を増強し、好塩基球からのヒスタミン及びロイコトリエンＣ４の遊離を誘導する。骨髄移植、好中球減少症（特に化学療法及び／又は放射線療法後）並びに化学療法後の感染性疾患及び出血に関する血球減少症の患者を治療する一方で標準的な療法として適用されるヒトＧＭ−ＣＳＦのいくつかの臨床的適応が存在する。さらに、それは回収のための幹細胞の末梢プールを増殖させ、急性骨髄球様白血病及び骨髄形成異常症候群を引き起こす白血病細胞の、化学療法中の細胞周期特異的薬に対する感受性を誘導する。組換えヒトＧＭ−ＣＳＦは種々の疾患における造血系の再構成を支持する。また、いくつかの実験的療法が実施されており、例えば、照射の致死効果を無効にし造血を回復させる、癌治療におけるＧＭ−ＣＳＦ／放射線療法の併用、並びに細胞毒性薬（例えば、癌化学療法、ＨＩＶ）に対する許容度を増強し、より高い投与量及び有意な罹病率減少を可能にするＧＭ−ＣＳＦ／化学療法の併用が挙げられる。ｒｈＧＭ−ＣＳＦは癌及び感染性疾患に対する細胞ワクチン及び癌ワクチンのための有望なアジュバントであり、腫瘍及び感染性疾患に対する、樹状細胞に基づくワクチンの重要成分である。それは養子Ｔ細胞移入にも関与している。一般には、ｒｈＧＭ−ＣＳＦは先天性免疫系を増強し刺激するであろう。
【００５４】
本発明のヒトＧＭ−ＣＳＦは、より高い特異的活性を有するため、先行技術により作製されたＧＭ−ＣＳＦと比較して有利である。この増強された活性は、用量当たり患者当たりの、より少ない物質の使用、及び／又はより少ない投与、及び／又は望ましくない副作用（例えば、組換えＧＭ−ＣＳＦの治療的使用中に観察されている毛細管漏出症候群）の軽減若しくは欠如、及び／又はより低い製造コストを可能にする。
【００５５】
本発明においては、ｒｈＧＭ−ＣＳＦをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−２−エピメラーゼ欠損細胞、例えばＮＭ−Ｆ９において組換え発現させ、ほとんど存在しないシアル酸付加から最大限度のシアル酸付加までの種々のシアル酸付加度を有する種々の形態のｒｈＧＭ−ＣＳＦを、漸増量のシアル酸代謝産物、好ましくはＭａｎＮＡｃ、例えば０〜９０ｍＭのＭａｎＮＡｃ、９０ｍＭ  ＭａｎＮＡｃに加えて１及び３ｍｇ／ｍｌのシアロ糖タンパク質フェツインの存在下での代謝的相補により製造した。ｒｈＧＭ−ＣＳＦの種々のシアロ形態の活性を分析するために、細胞増殖（好ましくは、ＴＦ−１細胞及びヒト単球樹状細胞系ＮｅｍｏｄＤＣ（www.nemod.com））を刺激する能力を測定する標準的なアッセイを選択した。驚くべきことに、ｒｈＧＭ−ＣＳＦの細胞増殖刺激活性はｒｈＧＭ−ＣＳＦのシアル酸付加度に強く左右され、高度にシアル酸付加されているが最大限度にはシアル酸付加されていないｒｈＧＭ−ＣＳＦの１つのシアロ形態が最高活性を示す。商業的に入手可能なｒｈＧＭ−ＣＳＦ、好ましくは、細菌及び酵母において発現されるＬｅｕｋｏｍａｘ（登録商標）及びＬｅｕｋｉｎｅ（登録商標）の細胞増殖活性を同じアッセイで試験したところ、ＮＭ−Ｆ９細胞内で発現される最も活性なシアロ形態より低いことが判明した。Ｌｅｕｋｏｍａｘ（登録商標）又はＬｅｕｋｉｎｅ（登録商標）の最高活性を達成するためには、対応ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験において、５００倍未満までの、ＮＭ−Ｆ９細胞からの最適シアロ形態が必要な可能性がある。Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）、Ｌｅｕｋｏｍａｘ（登録商標）、又はｒｈＧＭ−ＣＳＦの最適シアロ形態の同一濃度で活性を分析したところ、活性の増加は１．５倍まで、好ましくは２倍まで、より好ましくは３倍まで、最も好ましくは４倍まで、非常に好ましくは５倍までであった。先行技術は、ｒｈＧＭ−ＣＳＦの活性がそのグリコシル化に左右されることは示していなかったため、これらの知見は特に驚くべきものである。
【００５６】
ｒｈＧＭ−ＣＳＦの最適シアロ形態で見出される、より高い活性に加えて、そのシアロ形態の比較的高いシアル酸付加度は、治療適用における、より長い血清半減期を保証する。有利には、より長い時間間隔の、より低い用量の投与は、免疫原性及び副作用の軽減又は完全な消失を伴う。後者の２つは更に、ヒト関連グリコシル化パターンにより正の様態で影響される。高活性ｒｈＧＭ−ＣＳＦの高いシアル酸付加度は薬物動態学的特性を大きく改善する。
【００５７】
本発明は、種々の臨床用途だけでなくｉｎ  ｖｉｔｒｏ用途においても（例えば、分化樹状細胞及び活性化Ｔ細胞の作製のために）前記のとおりに有利に使用されうる高活性糖タンパク質分泌性ｒｈＧＭ−ＣＳＦを提供する。
【００５８】
本発明の新規技術は、他の増殖因子及びホルモン、例えばＥＰＯ、ＦＳＨ及びｈＣＧの改善のために、並びに種々の他の糖タンパク質、例えばサイトカイン及び抗体（前記のとおり）、及び本明細書に記載のその他のものの改善のために非常に有益である。
【００５９】
もう１つの例として、アシアログリコホリンＡ（ＡＧＰＡ）をＮＭ−Ｆ９細胞内で組換え発現させた。血液サンプルから単離し次いで酵素により脱シアル酸してトムセン−フリーデンライヒ（Thomsen-Friedenreich）（ＴＦ、コア−１）抗原を露出させたグリコホリンＡ（ＧＰＡ）に基づき、ＴＦ陽性腫瘍の治療のためのワクチンの開発に成功した。
【００６０】
ＧＰＡ及びＡＧＰＡは内在性膜タンパク質である。製造方法の確立のためには、任意の細胞系により、好ましくはＮＭ−Ｆ９及びＮＭ−Ｄ４細胞により細胞培養培地内に分泌されうるＧＰＡの組換え断片を発現させることが非常に有利であろう。したがって、ＧＰＡの細胞外グリコシル化ドメインを含有しＧＰＡの膜貫通ドメインと細胞内ドメインとを欠くＧＰＡ断片をコードする発現ベクターｓｅｃＧＰＡを構築した。最初の実験では、安定にトランスフェクトされたＮＭ−Ｆ９細胞の培地においては分泌性ＡＧＰＡは少量しか検出され得ないことが示された（実施例を参照されたい）。分泌率を上昇させるためには、いくつかの異種シグナルペプチドをＧＰＡ断片に融合させて、内因性シグナルペプチドを除去した。驚くべきことに、配列番号１により特徴付けられるアミノ酸配列を含むＧＭ−ＣＳＦ由来のシグナルペプチドは、ＧＰＡの内因性シグナルペプチド並びにＴ細胞受容体及び抗体κ軽鎖由来のその他の異種シグナルペプチドと比べて最も有効なシグナルペプチドであった。後者の２つのシグナルペプチドのみが分泌性タンパク質の組換え発現における使用に関して利用可能であり当業者に公知である。
【００６１】
本発明は、シアル酸付加を欠損した任意の細胞又は細胞系により発現又は産生される高活性糖タンパク質分泌性アシアログリコホリンＡを提供し、好ましくは、該細胞はヒト細胞であり、より好ましくは該細胞はＮＭ−Ｆ９又はＮＭ−Ｄ４細胞であり、それは、シアル酸付加による遮蔽を伴うことなく好ましい密度でＴＦ抗原を含有する。マウスモデルにおいて抗腫瘍ワクチンとして使用される場合には、それは強力な抗ＴＦ及び抗腫瘍応答を示し、それはヒトｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究において強力なＴＦ特異的抗腫瘍応答をも示し、これはＧＰＡのシアル酸付加又は他のグリコシル化形態によっては達成されず、このことは、これが本発明における高活性糖タンパク質形態であることを示している。その強力な抗腫瘍応答は、それがＴＦ特異的腫瘍に対する強力な抗腫瘍ワクチン成分として治療又は予防場面において有効に使用されうることを示している。
【００６２】
ＴＦ糖鎖は、多数の腫瘍組織上には存在するが健康なヒトの正常細胞上には存在しない周知の腫瘍抗原である。グリコホリンＡ（ＧＰＡ）は、シアル酸付加により遮蔽されたＴＦ抗原の担体である。血液サンプルから単離し次いで酵素により脱シアル酸してＴＦ抗原を露出させたＧＰＡに基づき、ＴＦ陽性腫瘍患者の治療のためのワクチンの開発に成功した。本発明においては、ＧＰＡの唯一のグリコシル化部分でもある細胞外ドメインのみを、シアル酸付加を欠損するヒト細胞（好ましくはＮＭ−Ｆ９及びＮＭ−Ｄ４細胞）内で分泌形態（ｓｅｃＧＰＡ、前記を参照されたい）として組換え産生させる。シアル酸付加欠損細胞、例えばＮＭ−Ｆ９又はＮＭ−Ｄ４細胞を使用する利点は、その細胞内で任意の形態で発現されるＧＰＡ上に存在するＴＦ抗原がシアル酸を含有せず、したがって酵素前処理無しで、規定の標準化されうるワクチンとして使用されうることである。
【００６３】
本発明はまた、糖タンパク質をコードする核酸配列並びに配列番号１の核酸配列又は該配列の突然変異、欠失、挿入及び伸長並びに該配列を含有する融合タンパク質を含む核酸を提供する。配列番号１又は該配列の突然変異、欠失、挿入及び伸長並びに該配列を含有する融合タンパク質により特徴付けられるＧＭ−ＣＳＦ由来のシグナルペプチドは、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞、より好ましくはＮＭ−ｗｔ細胞のサブクローン、最も好ましくはＮＭ−Ｆ９及びＮＭ−Ｄ４細胞内での任意の哺乳動物遺伝子産物（例えば、ＧＰＡ）の分泌性発現を駆動するために使用されうる。該シグナルペプチドは、当業者に公知の技術、例えば、目的タンパク質をコードするｃＤＮＡ内へ該コード領域のフレームと合わせて、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を分子クローニングすることにより、目的タンパク質内に組込まれる。それにより、該内因性シグナルペプチドは完全又は部分的に除去される。この構築物を、当業者に公知の任意の発現ベクター内にサブクローニングし、当業者に公知の任意の方法、例えば化学的トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション又は感染により細胞内に導入すると、シグナルペプチドと目的タンパク質とを含む細胞により融合タンパク質が合成される。該細胞内でのこの融合タンパク質のプロセシング中に、該シグナルペプチドは完全又は部分的に除去される。
【００６４】
本発明においては、「糖タンパク質」なる語は、ウイルス、ウイルス粒子又はウイルスタンパク質としても定義される。本発明に従い製造されうるウイルス、ウイルス粒子又はウイルスタンパク質には、腸内ウイルス、例えばライノウイルス、ポリオウイルス又はアフタウイルス；ヘルペスウイルス、例えば単純ヘルペスウイルス、仮性狂犬病ウイルス又はウシヘルペスウイルス；オルトミクソウイルス、例えばインフルエンザウイルス；ペスティウイルス；ラブドウイルス；パラミクソウイルス、例えばニューカッスル病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス又は麻疹ウイルス；レトロウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス、パルボウイルス又はパポバウイルス；ロタウイルス；コロナウイルス；フラビウイルス、例えば黄熱ウイルス又はダニ媒介脳炎ウイルス；肝炎ウイルス、例えばＡ型肝炎又はＢ型肝炎ウイルスに由来するものが含まれる。
【００６５】
本発明における高活性ウイルス、ウイルス粒子又はウイルスタンパク質は、適当なバイオアッセイ（例えば、ウイルス、ウイルス粒子又はウイルスタンパク質の個々の発現シアル酸付加形態の感染性、ワクチン又はワクチン成分としてのウイルス、ウイルス粒子又はウイルスタンパク質の個々の発現シアル酸付加形態の効力、ウイルス、ウイルス粒子又はウイルスタンパク質の個々の発現シアル酸付加形態の生産性、あるいは当業者に公知の他の有益な医学的又は生物学的特徴の測定）により測定されうるという利点を有する。対応バイオアッセイは、本発明を使用することにより当業者により選択され採用され構築されうる。好ましくは、産生されたウイルスの感染性を、改善されたワクチンが得られるよう示差的シアル酸付加により最適化する。これは該ウイルス、ウイルス粒子又はウイルスタンパク質のシアル酸付加度の最適化を可能にする。
【００６６】
好ましくは、ワクチンにおいて使用するための高活性ヒトウイルス、ウイルス粒子又はウイルスタンパク質を産生するヒト細胞系ＮＭ−Ｆ９又はＮＭ−Ｄ４を使用する。該ヒト細胞系は、正常な翻訳後及び翻訳周辺（peri-translational）修飾並びに集合（例えば、グリコシル化）の能力を有し、本明細書に記載されているとおりのシアル酸付加及びシアル酸付加度の最適化を可能にする。
【００６７】
ウイルスのシアル酸付加は、しばしば、ウイルスの感染性において重要な役割を果たすことが公知である。シアル酸付加度を最適化することにより、より安全な及び／又はより強力なウイルスワクチンが製造されうる。また、この及び／又はより高い生産性は、改善された、したがってより経済的な製造方法につながりうる。
【００６８】
本発明はまた、シアル酸の糖ヌクレオチド生合成経路における少なくとも１つの欠損を含有し、かつ糖タンパク質をコードする核酸でトランスフェクトされた発現細胞系において、ある濃度の少なくとも１つのシアル酸前駆体添加物を添加した培地内で高活性糖タンパク質を発現させることを含む、高活性糖タンパク質の製造方法であって、
該濃度が、
（ｉ）種々の濃度の少なくとも１つのシアル酸前駆体を使用する示差的シアル酸付加により、複数の異なるシアル酸付加形態の糖タンパク質を発現させること、
及び
（ｉｉ）適当なバイオアッセイにおいて、参照糖タンパク質と比較して、異なるシアル酸付加形態の活性を測定すること、
及び
（ｉｉｉ）より高い／最高の活性を有するシアル酸付加形態を選択し、該糖タンパク質のより高い／最高の活性レベルと相関する、該シアル酸前駆体添加物の濃度を決定すること
を含む方法により決定される、高活性糖タンパク質の製造方法を提供する。
【００６９】
前記方法は、高活性糖タンパク質と決定された糖タンパク質の最適シアル酸付加形態の製造を可能にする。当業者にとっては、本発明の方法を使用することにより、分析的又は予備試験的規模で決定された条件を製造規模へ移すこと、並びに増殖及び培地条件を調節し改善することが可能かつ比較的容易である。他の方法に対する本方法のさらなる利点は、生産性の改善につながりうる規模拡大操作中に、シアル酸前駆体添加物の濃度及び組成の適合化を他の培地成分の最適化に加えて行うことにより、高活性タンパク質の所望のシアル酸付加度を安定化しうることである。
【００７０】
本発明における高活性糖タンパク質に関する前記のすべての定義及び説明は、前記及び後記の方法にも有効である。
【００７１】
さらに、本発明は、高活性糖タンパク質の同定／決定方法であって、
ｉ）シアル酸の糖ヌクレオチド生合成経路における少なくとも１つの欠損を含有する発現細胞系を、該糖タンパク質をコードする核酸でトランスフェクトすること、
及び
ｉｉ）種々の濃度の少なくとも１つのシアル酸前駆体添加物を含有する培地を使用する示差的シアル酸付加により、複数の異なるシアル酸付加形態の糖タンパク質を発現させること、
及び
ｉｉｉ）適当なバイオアッセイにおいて、参照糖タンパク質と比較して、前記の異なるシアル酸付加形態の活性を測定すること、
及び
ｉｖ）より高い／最高の活性を有するシアル酸付加形態を選択すること
を含む方法を提供する。
【００７２】
原則として、上記方法は、（ｉ）所定の糖タンパク質の活性とそのシアル酸付加度との間に何らかの相関が存在するかどうかを分析するための分析手段、（ｉｉ）所定の糖タンパク質のその活性に関する最適シアル酸付加形態が何であるかを決定するための分析手段、及び（ｉｉｉ）最適シアル酸付加形態を与える条件を決定するための分析手段として使用されうる。
【００７３】
さらに、本発明は、ヒトグリコシル化、好ましくはシアル酸付加の、生物活性における役割を調べるのに有用である。
【００７４】
また、糖タンパク質の示差的シアル酸付加のための方法であって、シアル酸の糖ヌクレオチド生合成経路における少なくとも１つの欠損を含有する発現細胞系を、該糖タンパク質をコードする核酸で形質転換し、複数の異なる濃度の少なくとも１つのシアル酸前駆体添加物を添加した培地内で該細胞を培養し、複数の異なるシアル酸付加形態の糖タンパク質を得ることを特徴とする方法を提供する。
【００７５】
本発明はまた、高活性ウイルス、ウイルス粒子又はウイルスタンパク質の同定／決定のための方法、その製造及びその示差的シアル酸付加、並びに本発明により提供される方法から得られる高活性ウイルス、ウイルス粒子又はウイルスタンパク質を提供する。
【００７６】
本発明における高活性糖タンパク質に関する前記のすべての定義及び説明は、前記及び後記の方法にも有効である。
【００７７】
本発明は、好ましくは、グライコプロファイリング（GlycoProfiling）、グライコエンジニアリング（GlycoEngineering）、グライコアナリティックス（GlycoAnalytics）及びグライコエクスプレス（GlycoExpress）に基づく技術基盤に組み込まれる。
【００７８】
・グライコプロファイリング（GlycoProfiling）は、グライコエンジニアリング（GlycoEngineering）のための適当な細胞を選択するために、細胞グリコシル化機構及び該グリコシル化機構により産生された糖（優先的には、細胞表面上に存在するもの）を分析するための或る範囲の技術であると理解される。
【００７９】
・グライコエンジニアリング（GlycoEngineering）は、修飾されたグライコプロファイル（GlycoProfile）を有する細胞を与える、細胞のグリコシル化機構を修飾するための或る範囲の技術であると理解される。
【００８０】
・グライコアナリティックス（GlycoAnalytics）は、タンパク質のグリコシル化を分子レベルで分析するための或る範囲の技術であると理解される。
【００８１】
・グライコエクスプレス（GlycoExpress）は、示差的シアル酸付加、高活性タンパク質の同定及び決定並びに高活性糖タンパク質の製造を含む、本発明の後記の技術及び方法を含む。
【００８２】
本発明の糖タンパク質及び方法を含む本明細書に挙げた技術を組合せる利点は、より改善された高活性タンパク質、本発明の意味における、より良好な発現細胞株系、それらの分析及び製造を可能にする。他の利点としては、該方法及び産物の速さ、コスト、安定性及び有効性が挙げられる。
【００８３】
前記のすべての定義及び説明は、前記及び後記の糖タンパク質及び方法にも有効である。
【００８４】
本発明のもう１つの利点は、糖タンパク質の使用及び機能に関して最適化されたシアル酸付加を伴う高活性糖タンパク質を製造するための、統合された系（統合系）に類似したその方法の組合せである。そのような組合せを以下の好ましい具体例において説明するが、該具体例はこれを限定するものではない。
【００８５】
第１ステップにおいては、糖タンパク質、好ましくは分泌性形態の糖タンパク質、好ましくは配列番号１の配列を含む糖タンパク質、より一層好ましくはヒトＧＭ−ＣＳＦ又はＧＰＡをコードする核酸を、好ましくはエレクトロポレーションにより、シアル酸の糖ヌクレオチド生合成経路における欠損を有する発現細胞系内に好ましくはＮＭ−Ｆ９又はＮＭ−Ｄ４を使用してトランスフェクトし、好ましくは単一細胞クローニングにより、安定発現クローン（好ましくは無血清培地内、より一層好ましくはタンパク質非含有培地内で増殖するもの）を選択する。
【００８６】
第２ステップにおいては、種々の濃度の少なくとも１つのシアル酸前駆体を使用することにより、異なるシアル酸付加形態（好ましくは、一連の少なくとも２、より好ましくは３以上、より好ましくは４以上、より一層好ましくは５以上の異なるシアル酸付加形態）の糖タンパク質を示差的シアル酸付加により製造する。少なくとも１つのバイオアッセイ、例えばヒトＧＭ−ＣＳＦに関する細胞増殖ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、又はＧＰＡに関するある腫瘍細胞に対するより高い特異的免疫原性を示すためのマウス若しくはヒトを使用するｉｎ  ｖｉｖｏ免疫試験により、より高い活性のグライコフォームを決定する。好ましい形態においては、糖タンパク質の用途に応じた最高活性を有する高活性糖タンパク質を決定するために、バイオアッセイの組合せを使用する。本明細書に記載のとおり、選択する高活性糖タンパク質は、すべてのバイオアッセイにおいてより良好である必要はなく、１つのバイオアッセイにおけるより高い活性又は改善された特徴で十分でありうる。しかし、好ましくは、選択する高活性糖タンパク質は、少なくとも２つのバイオアッセイ、例えば１つのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル、例えば増殖アッセイにおいて、より良好であり、及び／又は少なくとも１つのｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて、より高い活性、及び／又はより高い安定性、及び／又はより長い血清半減期、及び／又はより長いバイオアベイラビリティ、及び／又は免疫原性の改善、及び／又は抗原性の改善を示す。最も好ましいのは、種々の特徴（例えば、受容体媒介機能におけるより高い活性、及びより長い血清半減期を示すことによる改善されたバイオアベイラビリティ）の組合せによるものでありうる、より高いｉｎ  ｖｉｖｏ生物活性をヒトにおいて有するものである。例えば、記載されている条件下の培地内でＮＭ−Ｆ９及びシアル酸前駆体添加物としての９０ｍＭ  ＭａｎＮＡｃを使用して得られるｒｈＧＭ−ＣＳＦシアル酸付加形態が最高の活性を示したため、これが好ましい高活性糖タンパク質である。
【００８７】
もう１つのバイオアッセイにおける更なる試験のために、１つのバイオアッセイにより、より大きなセットから、より小さな群の糖タンパク質シアル酸付加形態を選択することが、速さ及び手段に関しては有利でありうる。ＧＰＡの場合には、唯一のシアル酸付加形態、すなわち、最低シアル酸付加形態を作製するので十分であり、したがってこれを無血清培地内でシアル酸前駆体添加物無しで行うので十分である（前記及び後記も参照されたい）。この場合、得られた高活性ＧＰＡを、遥かに高い活性（この場合には、動物モデル及びヒトにおいて強力な抗ＴＦ免疫応答をもたらす、より高い免疫原性）を示すヒト由来のシアル酸付加ＧＰＡと比較することが可能である。しかし、好ましくは、少なくとももう１つのシアル酸付加形態を本発明の方法により作製し、該バイオアッセイにおいて比較する。
【００８８】
上記統合系により、高活性糖タンパク質の前記決定の後、該高活性糖タンパク質を製造するためにシアル酸前駆体添加物の対応濃度を使用することにより、糖タンパク質をコードするトランスフェクトされた核酸を含有する同じ発現細胞系を使用することが可能となる。高活性糖タンパク質の製造では、しばしば、製造規模の拡大が望まれる。このためには、シアル酸前駆体添加物の最適条件で十分であるが、所望のシアル酸付加度の高活性タンパク質を安定化するために、例えば他の培地成分を最適化し、異なる反応容器を使用することにより、該シアル酸前駆体添加物の濃度及び組成を調節することが有利又は更には必要かもしれない。これは、本発明を使用することにより当業者により達成されうる。シアル酸前駆体添加物を調節することによりシアル酸付加度を安定化しうることは、先行技術の通常の発現系によっては達成されない該方法の大きな利点である。
【００８９】
高活性糖タンパク質の同定及び製造のために実質的に同じ又は類似した方法を使用することを可能にする統合系は、とりわけ、より高い速度及びより低いコストという明らかな利点を有する。
【００９０】
上記統合系は、例えばグライコプロファイリング（GlycoProfiling）、グライコエンジニアリング（GlycoEngineering）及びグライコアナリティックス（GlycoAnalytics）として本明細書に記載されている他の製造方法、技術及び方法と組合された場合に特に有利かつ有効である。
【００９１】
シアル酸の糖ヌクレオチド生合成経路における復元可能な欠損を有する発現細胞系を作製することは非常に困難である。なぜなら、（ｉ）多数の酵素がシアル酸付加に関与しており、このことは、単一の酵素活性の除去が必ずしも細胞のシアル酸付加能に影響を及ぼさないことを意味し、（ｉｉ）該酵素の多くは重複しており、このことは、１つの酵素活性の喪失が、しばしば、他の酵素により補償されることを意味し、（ｉｉｉ）該欠損の復元は、しばしば、可能ではなく、（ｉｖ）該欠損の代謝的相補は、しばしば、可能ではないからである。本発明は、好ましくは少なくとも２つの酵素によりシアル酸付加されうる脱シアル酸構造に結合する認識分子で初代細胞又は細胞系から発現細胞系を選択することを含む、シアル酸の糖ヌクレオチド生合成経路における欠損を有する発現細胞系の新規製造方法を提供する。
【００９２】
好ましい実施形態においては、選択前に初代細胞又は細胞系からの細胞を突然変異誘発する。突然変異誘発は、化学的若しくは物理的手段によるランダム突然変異誘発又は本明細書に記載の若しくは当業者に公知の部位特異的突然変異誘発により行うことが可能である。
【００９３】
本発明の方法とは対照的に、当業者に公知の現在の方法では、特に標的遺伝子が既知でない場合には、シアル酸前駆体経路における遺伝的欠損を有する細胞を作製することは非常に困難であり、時間を浪費し、しばしば可能でない。
【００９４】
上記の選択は、当業者に公知の技術（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、例えば、磁気細胞選別技術（ＭＡＣＳ技術）若しくは免疫沈降若しくはクロマトグラフィー、及び／又はフローサイトメトリーによる細胞選別、及び／又は例えばフローサイトメトリー若しくは免疫細胞化学による少なくとも１つの認識分子への結合特性による細胞の同定、又は分泌性タンパク質の生化学的分析）により、記載されている認識分子の少なくとも１つを使用することによる、該細胞の富化及び／又は単離により行う。
【００９５】
選択された細胞を発現細胞系として使用することが可能であり、好ましくは、純粋なクローンを作製するために、公知技術により、例えば単一細胞クローニングにより、更にクローニングする。
【００９６】
驚くべきことに、少なくとも２つの酵素によりシアル酸付加されうる脱シアル酸構造を標的化する認識分子の使用は、代謝物質により復元されうる（発現細胞系におけるシアル酸付加度の代謝制御のための前提条件）それらの酵素活性における欠損を有する細胞の選択を可能にし及び／又は該細胞に対して選択を強く偏らせる。
【００９７】
本発明の方法はそのような細胞系の作製を可能にし、あるいは速さ、労力の軽減及び／又は成功確率の点でそれらの作製を著しく促進する。これは特にヒト細胞系に当てはまることであるが、ヒト細胞系だけに当てはまるものではない。
【００９８】
本発明の方法は、突然変異誘発のための標的遺伝子が既知でない場合に特に適しており、選択はシアル酸付加のダウンレギュレーションの表現型効果に基づいたものである。しかし、それは、部位特異的突然変異誘発を用いる場合、例えばシアル酸付加の表現型ダウンレギュレーションにより安定突然変異誘発クローンの選択を著しく促進することによる、部位特異的組換えによるＧｌｃＮＡｃ−エピメラーゼ活性のノックアウトを用いる場合にも有利である。
【００９９】
これらの作製される細胞系は、示差的シアル酸付加の目的のために又は本発明における発現細胞系として製造されうるが、それらは、有益又は使用可能である場合には他の目的にも使用されうる。
【０１００】
シアル酸付加する能力を欠損した細胞系（その欠損を復元する選択肢を伴っているもの）を作製するためには、原則として、すべての哺乳動物細胞系が適用可能である。製造プロセス（製造方法）には、バイオテクノロジーに適した細胞系、例えばＰｅｒ．Ｃ６、ＨＥＫ２９３、Ｋ５６２、ＣＶ１、ＣＯＳ−７、ハイブリドーマ細胞、ナマルワ（Namalwa）、ＢＨＫ及びＣＨＯが好ましい。該欠損を有する新規細胞系を作製するための選抜きの方法は、本発明者らのグライコエンジニアリング（GlycoEngineering）技術に属する前記方法である。
【０１０１】
上記欠損を有する細胞系を作製するために前記方法を開始する前に、候補細胞系のグリコシル化機構を少なくとも部分的に特徴決定すること（グライコプロファイリング（GlycoProfiling））が非常に有用である。このためには、（ｉ）グリコシル化機構、例えばシアリルトランスフェラーゼ、本明細書中に前記で説明されているシアリルトランスフェラーゼ、トランスポーター（輸送体）、エピメラーゼ、シアリダーゼなどの基質である糖鎖構造に重要な酵素のトランスフェラーゼの関連遺伝子のｍＲＮＡ発現、（ｉｉ）関連酵素、好ましくはシアリルトランスフェラーゼの酵素活性、（ｉｉｉ）シアル酸付加されうる又はシアル酸付加される糖鎖決定基の適当な認識分子による決定、を分析しうる技術の少なくとも１つ（好ましくは、そのような技術の組合せ）を用いるのが好ましい。グライコプロファイリング（GlycoProfiling）は、グリコシル化機構の修飾のための方法（グライコエンジニアリング（GlycoEngineering））に関する決定を可能にする候補細胞系のグリコシル化機構を理解することを助ける。例えば、候補ヒト細胞系、例えばＺＲ７５−１、ＨＥＫ２９３、ＮＭ−ｗｔ（Ｋ５６２）、ＫＧ１、ＬＳ１７４Ｔ、ＭＣＦ−７、ＳＷ４８０及びＴ４７Ｄの、グリコシル化に関与する酵素及びタンパク質（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、単糖生合成の酵素及びトランスポーター）のｍＲＮＡ発現プロフィールをＲＴ−ＰＣＲにより分析した。候補細胞系の酵素活性、好ましくはシアリルトランスフェラーゼ活性を分析するためには、バイオアッセイを用いた。バイオアッセイは、糖鎖決定基、好ましくは、少なくとも２つの酵素によりシアル酸付加される又はされうる糖鎖決定基を、適当な方法、例えばフローサイトメトリー及び／又は免疫蛍光顕微鏡検査（好ましくはシアリダーゼと共に、特異的抗体及びレクチンを使用するもの）又は、シアル酸を除去若しくは破壊するための他の方法、例えば穏やかな過ヨウ素酸塩酸化により分析するためにも用いられる。適当なバイオアッセイは公知であり、あるいは当業者により調節又は開発されうる。
【０１０２】
本発明においては、「初代細胞又は細胞系」なる語は、例えば生物学的試料に由来するもの、例えば血液細胞、組織などからの細胞及び既存の細胞系を含むすべての細胞を包含する。細胞及び細胞系は、公然の（declared）細胞系で時々見られる、単一細胞又は細胞混合物に由来する、特徴決定されたクローンよりなることが可能である。該細胞は既に不死化されていることが可能であり、あるいは本発明の方法の拡張部分として不死化されうる。該不死化は例えば腫瘍由来の細胞の場合のように自発的であってもよいし、あるいは当業者に公知の技術、例えばウイルス形質転換により不死化されてもよい。それにより、当業者は、個々の細胞によって異なりうる、不死化の最良の時点を決定することが可能である。また、該細胞は、他の遺伝子により又は他の遺伝子において、改変されていてもよいし又は改変された状態であってもよい。
【０１０３】
本発明において、「シアル酸の糖ヌクレオチド生合成経路における欠損」なる表現は、本明細書に記載されているものと同じ欠損を意味する。
【０１０４】
本発明において、「認識分子」なる語は、部分的に又は好ましくは完全に脱シアル酸されており少なくとも２つの酵素によりシアル酸付加されうる分子に好ましくは及び／又は特異的に結合する分子を意味する。好ましい分子はレクチンであり、より一層好ましいのは、対応する糖鎖構造を認識する抗体である。より一層好ましいのは、ＴＦ（トムセン−フリーデンライヒ（Thomsen-Friedenreich）、コア−１）（例えば、Ｎｅｍｏｄ−ＴＦ１、Ｎｅｍｏｄ−ＴＦ２、Ａ７８−Ｇ／Ａ７）に結合する抗体、又は末端ガラクトース残基を認識する抗体、又はレクチン、例えばＲＣＡ、ＥＣＬ、ＰＮＡ、Ｊａｃａｌｉｎ、ＡＣＡ、ＢＰＬ若しくはＡｍａｒａｎｔｈｉｎ、又はシアル酸に結合するもの、例えばＳＮＡ及びＭＡＡ、又はＰａｎｋｏＭａｂである。
【０１０５】
より好ましい実施形態においては、該認識分子が結合する脱シアル酸構造はα２−３及びα２−６結合シアル酸によりシアル酸付加されうる。
【０１０６】
より一層好ましい実施形態においては、該認識分子が結合する構造はＯ−グリカンである。
【０１０７】
より一層好ましい実施形態においては、該認識分子が結合する構造は、トムセン−フリーデンライヒ（Thomsen-Friedenreich）構造とも称されるコア−１構造（ＧａｌＮＡｃα１−３Ｇａｌ）である。
【０１０８】
より一層好ましい実施形態においては、シアル酸の糖ヌクレオチド生合成経路における欠損を有する発現細胞系の作製のための方法は、コア−１構造を認識する抗体で初代細胞又は細胞系から発現細胞系を選択することを含む。
【０１０９】
より一層好ましい実施形態においては、選択前に該初代細胞又は細胞系に突然変異誘発を行う。
【０１１０】
一例としては、シアル酸の糖ヌクレオチド生合成経路における欠損を含有する本発明の発現細胞系は、ＮＭ−ｗｔ細胞を改変することにより作製した。グライコプロファイリング（GlycoProfiling）（前記を参照されたい）により示された多数の候補細胞系のグリコシル化プロフィールに基づき、ＴＦ陽性細胞を作製するためにグライコエンジニアリング（GlycoEngineering）のための細胞系を選択した。好ましくは、選択される細胞はＣ２ＧＮＴ−Ｌ又はＭに対して陰性であり、より好ましくは、潜在（cryptic）ＴＦに対して陽性であり、より一層好ましくは、α２，３及びα２，６結合シアル酸により非常に高い度合でシアル酸付加されることが可能であり、最も好ましくは、該細胞はＮＭ−ｗｔ細胞である。簡潔に説明すると、該細胞を、当業者に利用可能な任意の方法により、好ましくはフローサイトメトリー又は免疫細胞化学法（実施例に記載されている）により、ＴＦ発現に関して分析する。ＴＦ陽性細胞は、モノクローナル抗体Ａ７８−Ｇ／Ａ７又はＰａｎｋｏＭａｂを使用することにより選択される。ＴＦ陽性細胞の数が少なすぎる場合には、ＴＦ陰性細胞系を突然変異原、好ましくは化学的突然変異原、好ましくはメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）で処理する。ついで、前記のとおりにＴＦ陽性細胞を選択する。ＴＦ陽性細胞に関する選択は反復する必要があり、ついでＴＦ陽性細胞は、安定にＴＦ陽性である細胞を受容するようクローニングする必要がある。そのようにして、ＮＭ−Ｆ９及びＮＭ−Ｄ４細胞を作製した。
【０１１１】
同様の適合化された手法により、例えば、特徴決定されたグリコシル化プロフィールを有する糖タンパク質の製造における使用のために、新規グライコプロフィールで、新規細胞系を受容するよう任意の細胞系を糖改変操作することが可能である。そのようなプロフィールは、改善されたシアル酸付加、よりヒト的なグリコシル化、天然糖タンパク質に類似したグリコシル化、又はより低い若しくはより高い免疫原性のグリコシル化でありうる。
【０１１２】
以下においては、糖タンパク質及び高活性糖タンパク質の医薬組成物又は組成物並びにそれらの用途を更に詳しく説明する。本発明は、本発明の糖タンパク質と希釈剤又は担体とを含む、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用のための本発明の高活性糖タンパク質の組成物又は医薬組成物に関する。本明細書に記載の哺乳動物糖タンパク質及びその組成物は、該糖タンパク質の性質によって定められる広範な用途において使用されうる。これらのすべての用途において、高活性糖タンパク質の使用は常に非常に有益であろう。例えば、本発明の哺乳動物糖タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、例えば任意の種類の細胞アッセイ若しくは免疫学的アッセイ、又は分析アッセイ、例えばＥＬＩＳＡ若しくはＲＩＡにおいて使用されうる。本発明において好ましい糖タンパク質の一例としてＧＭ−ＣＳＦを使用する場合には、この増殖因子を、特定の免疫細胞、例えば樹状細胞又はマクロファージの増殖及び／又は分化を誘導するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用することが可能であり、ついでそれらを、特定の免疫学的アッセイ、例えばＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、Ｔ細胞アッセイ、細胞傷害性アッセイ、細胞泳動アッセイ、細胞接着アッセイ又は食作用アッセイにおいて使用する。本発明のＧＭ−ＣＳＦを細胞増殖アッセイにおいて直接的に使用することも可能である。
【０１１３】
本明細書に記載の高活性哺乳動物糖タンパク質及びその組成物は診断目的にも有用である。例えば、糖タンパク質の最適シアル酸付加形態を診断目的のための標準として製造することが可能であろう。好ましいのは、本明細書に記載の高活性哺乳動物糖タンパク質及びその組成物のｉｎ  ｖｉｖｏ用途である。本発明の高活性哺乳動物糖タンパク質の広範なｉｎ  ｖｉｖｏ用途、例えば任意の種類の感染性疾患、癌、白血病、造血系の疾患、好中球減少症、血球減少症、骨髄異形成症候群及び自己免疫疾患の予防的及び／又は治療的処置は、具体的な糖タンパク質の性質によって定められ、当業者に公知である。該糖タンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏ用途のために適用される哺乳動物種は、該糖タンパク質の起源によって決定される。例えば、ウシＧＨは、乳生産を増加させるためにウシの治療に使用される。本発明の高活性ウシＧＨの適用はその治療を改善するであろう。なぜなら、適用の回数及び望ましくない副作用は減少すると予想されるからである。
【０１１４】
ヒトにおいては、本明細書に記載の糖タンパク質を治療用に使用する。高活性糖タンパク質は常に非常に有益であろう。なぜなら、投与の回数及び望ましくない副作用が軽減されると予想されるからである。患者への投与の場合には、本発明の精製された糖タンパク質を、通常の方法に従い、薬学的に許容される担体又は希釈剤と混合する。治療用製剤は、静脈内注入若しくは皮下注射により、又は当技術分野において公知の任意の他の許容される方法により投与される。該製剤は、所望により、他の治療薬をも含有しうる。投与の量、頻度及び期間は様々であり、使用する特定の化合物の活性、年齢、体重、全身健康状態、性別、投与の食事時間、投与経路、排泄速度、薬物の組合せ及び疾患特異的療法の重篤度を含む種々の要因によって異なるであろう。単一剤形を与える、担体物質と組合される有効成分の量は、治療対象の宿主及び個々の投与方式によって様々である。
【０１１５】
本発明の好ましい実施形態においては、該医薬組成物はワクチン又はワクチン−アジュバントである。本発明においては、ワクチン組成物なる語は、哺乳動物及びヒトにおいてワクチンとして使用されうる任意の組成物に関するものである。ワクチンは、免疫応答を誘導する治療用又は予防用の医薬組成物を意味する。本発明のワクチン組成物の製造方法の形態は特に限定されるものではなく、所望の形態の組成物は、好ましくは、当技術分野において利用可能な単一の方法、又は適当に組合された方法を適用することにより製造されうる。任意のワクチン及び／又はワクチン−アジュバントの投与は皮下、皮内、静脈内、非経口、筋肉内又は任意の他の許容される方法でありうる。前記剤形により予想される製剤及び医薬組成物は、通常の技術を用いて、通常の薬学的に許容される賦形剤及び添加剤を使用して製造されうる。他のアジュバントは該ワクチン又は該糖タンパク質と共に投与されうる。
【０１１６】
ヒト腫瘍ワクチンの一例はアシアログリコホリンＡ（ＡＧＰＡ）である。グリコホリンＡ（ＧＰＡ）は、赤血球の膜に存在し幾つかの細胞系にも見出されるシアル酸付加糖タンパク質である。ワクチンの製造のためには、それをヒト血液製剤（ヒト血液調製物）から単離し、酵素により処理して、ＧＰＡに結合したすべてのシアル酸を除去する。得られるＡＧＰＡは腫瘍特異的糖鎖抗原トムセン−フリーデンライヒ（Thomsen-Friedenreich）（ＴＦ）のキャリアであり、したがって、ＴＦに対する持続性免疫反応を誘導し従って患者のＴＦ陽性腫瘍負荷を排除又は少なくとも軽減するためのワクチンとして適用される。本明細書に記載のシアル酸付加欠損細胞の使用は本発明により、酵素処理を要することなく、かつ、製造用にヒト血液製剤を使用することに限定されることなく、ＡＧＰＡの組換え製造を可能にする。ＡＧＰＡは、腫瘍及び癌患者の免疫療法のためのワクチンとしての糖タンパク質及びその医薬組成物の使用の一例である。
【０１１７】
また、本発明は、ワクチン（特に、適当な賦形剤及び／又はアジュバントを含む医薬組成物に配合された場合）において使用するための、本発明により提供される方法により得られた高活性ウイルスタンパク質、ウイルス粒子及び／又はウイルスを提供する。投与量及び投与方法は前臨床及び臨床開発を通じて当業者により決定されうる。
【０１１８】
ワクチン−アジュバントは、典型的には、弱いとみなされている動物又はヒトワクチンによりもたらされる防御（すなわち、レベル、度合及び／又は持続時間の点で弱い防御）を増強するために使用される。ワクチン−アジュバントとして使用される糖タンパク質の具体例としては、ＧＭ−ＣＳＦ、並びに特定のサイトカイン、例えばＩＬ−２及びＩＬ−７が挙げられる。ワクチン−アジュバントとしての糖タンパク質は、ワクチンとは別々に、あるいはまた、ワクチンと組合せて投与されうる。ワクチン−アジュバントとしての糖タンパク質をワクチンと組合せる場合には、投与する組成物は、与えられた病原体又は抗原に対する特異的応答を惹起するのに有効な免疫原、薬学的に許容されるワクチン担体、及び免疫を増強する量の糖タンパク質を含有する。その概念の一例は、当技術分野で公知の全細胞ワクチンであり、この場合、抗原の担体である細胞によりワクチン−アジュバントが組換え発現される。全細胞ワクチンは、典型的には、細胞死が運命づけられた活性な細胞として適用される。ワクチン接種後、これらの細胞は、ワクチン−アジュバントとして作用する一定量の糖タンパク質、例えばＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２又はＩＬ−７を一定時間にわたって産生する。全細胞ワクチンは、ワクチン接種後の該全細胞ワクチンによりワクチン−アジュバントが更に産生されることなく全細胞ワクチンの利点を尚も有するよう、ワクチン接種前に不活化されうる。本発明は該ワクチン−アジュバントを提供するだけでなく、全細胞ワクチンとして使用される細胞系（１若しくは複数）もまた、本発明により提供される方法により作製されうる。全細胞ワクチンに使用される細胞の特徴は、そのような細胞系又は細胞系の組合せが、可能な限り多数の抗原を発現することである。当業者に公知のとおり、これらの細胞又は細胞系の組合せは、当技術分野において公知の方法により、直接的にワクチン接種されたり、あるいは抗原提示細胞、例えば樹状細胞上に負荷（ローディング）されることが可能である。ついで該抗原負荷樹状細胞はワクチン接種に使用され、あるいは当業者に公知の方法により養子Ｔ細胞療法のために身体外（ex corpore）でＴ細胞を刺激するために使用される。本発明においては、該ワクチンは、本明細書に記載の方法により製造された、ワクチン−アジュバントとして本発明の糖タンパク質を発現する細胞系又は細胞系の組合せでありうる。
【０１１９】
糖タンパク質又はその医薬組成物は、感染性疾患、例えばエイズ、ＳＡＲＳ又は或る形態の肝炎の治療のためのワクチン又はワクチン−アジュバントとして使用されうる。哺乳動物糖タンパク質は、ヒトの感染性疾患、例えばＨＩＶ、ＳＡＲＳ、Ｂ型肝炎若しくはＡ型及びＢ型インフルエンザ、又は動物の感染性疾患、例えばウシウイルス性下痢、ウマインフルエンザ、ネコ白血病、ネコ呼吸疾患の治療のために感染細胞に対する免疫応答を誘導する本発明に従い製造される弱毒化生又は不活化ウイルス産物又は組換え抗原性ウイルス産物の一部である。
【０１２０】
本発明は、本発明の糖タンパク質及び／又はその医薬組成物及び／又はその類似体、修飾体、薬理学的に活性な断片並びに場合によっては使用方法に関する情報を含むキットに関する。本発明の好ましい実施形態においては、該キットは、高い／より高い活性の糖タンパク質、例えばＧＭ−ＣＳＦ、ＥＰＯ又はＦＳＨ及びその薬学的に許容される担体の医薬組成物の容器、並びにワクチン及びその薬学的に許容される担体の医薬組成物の容器を含むワクチンにおける、抗原に対する哺乳動物の免疫原性応答を増強するために使用されうる。
【０１２１】
本発明の糖タンパク質は、感染性疾患の治療のためのワクチン又はワクチン−アジュバントとして使用されうる。また、本発明の糖タンパク質は、感染性疾患の治療のためのワクチン又はワクチン−アジュバントの製造にも使用されうる。
【０１２２】
本発明の糖タンパク質は、疾患、例えば白血病、好中球減少症、血球減少症、癌、骨髄移植、造血系の疾患、不妊症及び自己免疫疾患の予防的及び／又は治療的処置に使用されうる。糖タンパク質の、当業者に公知の治療用途の範囲は、非常に広範である。例えば、Ｇ−ＣＳＦは、白血病性癌患者の化学療法により生じる、生命を脅かす好中球疾患である好中球減少症を治療するための重要な治療剤である。ＧＭ−ＣＳＦは、好中球減少症からの速い回復を達成するために、化学療法後の比較的高齢のＡＭＬ患者の治療に特異的に使用される。さらに、ＧＭ−ＣＳＦは、骨髄移植におけるいくつかの用途及び末梢血幹細胞の動員（mobilization）のための治療剤として承認されている。また、現在研究中である、ＧＭ−ＣＳＦのいくつかの臨床用途（例えば、ＨＩＶ及び癌の治療）が存在する。造血系の或る疾患はＥＰＯで治療され、ＩＦＮ−βは現在、自己免疫疾患である多発性硬化症の治療のための重要な治療剤である。他の一例はＦＳＨであり、これは男性及び女性不妊症の治療に広く使用されている。ｈＣＧは不妊症の治療にも適用されるが、女性における無排卵に焦点が合わされている。ｈＧＨは、臨床的に証明されている利益（例えば、体脂肪減少及び筋組織増加）を有する。
【０１２３】
本発明の糖タンパク質は、白血病、好中球減少症、血球減少症、癌、骨髄移植、造血系の疾患、不妊症及び自己免疫疾患を含む群から選ばれる疾患の予防的及び／又は治療的処置のための医薬の製造にも使用されうる。
【０１２４】
本発明の糖タンパク質、ワクチン又は医薬は、任意の通常の投与経路、例えば非経口、眼内、局所、吸入、経皮、膣内、頬側、経粘膜、経尿道、直腸、鼻腔、経口、肺又は耳経路により使用されうる。
【０１２５】
本発明の治療用糖タンパク質の他の一例は抗体である。抗体は、高いアフィニティーで特異的標的に結合することにより作用する。抗体は、毒素又は放射性同位体に結合している場合、腫瘍細胞又は感染細胞に対する強力な治療剤である。しかし、「裸」抗体も、細胞傷害性及び／又は食作用活性を有する特異的免疫細胞（ＡＤＣＣ）又は補体（ＣＤＣ）を標的に導くことにより、特定の又は細胞標的の排除を媒介しうる。特に、抗体のＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性は、与えられた抗体のグリコシル化における適当な変化により改善されうる。
【０１２６】
本発明は本明細書に記載の特定の方法、組成物及び細胞系には限定されないと理解されるべきである。なぜなら、そのような方法、組成物及び細胞系は、もちろん、様々でありうるからである。また、本明細書中で用いる用語は、個々の実施形態を説明する目的のものであるに過ぎず、添付の特許請求の範囲のみによって定義される本発明の範囲を限定するものではないと理解されるべきである。
【０１２７】
特許請求の範囲を含む本明細書において用いる単数形表現は、文脈が例外を明らかに示している場合を除き、それらの対応複数物を含む。したがって、例えば、「生物」に対する言及は１以上の異なる生物を含み、「細胞」に対する言及は１以上のそのような細胞を含み、「方法」又は「製造方法」に対する言及は、当業者に公知の等価なステップ、方法又は製造方法に対する言及を含む、などである。
【０１２８】
特に示さない限り、本明細書中で用いるすべての科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されているのと同じ意義を有する。本発明の実施又は試験においては、本明細書に記載されているものと類似した又は同等な方法、製造方法及び物質が使用されうるが、適当な方法及び物質は後記で説明されている。
【０１２９】
以下の表１及び２、並びに図１〜１５は、最適化されたシアル酸付加を伴う高活性ヒトタンパク質の製造のための本発明を説明するものである。
【０１３０】
表１：種々のヒト細胞系におけるグリコシルトランスフェラーゼの発現プロフィール。示されている値はＺＲ７５−１に対するパーセントとして表されている。それぞれの場合に、ハウスキーピングβアクチン対照に対するグリコシルトランスフェラーゼｍＲＮＡ発現の測定のために二重ＲＴ−ＰＣＲを用いた。
【０１３１】
表２：モノクローナル抗体及びレクチンによる種々のヒト細胞系における糖鎖決定基の検出。示されている値は、フローサイトメトリー分析により測定した、陰性対照としてのイソタイプ又は二次試薬に対する、抗体／レクチン結合の差引平均である。例えば、モノクローナル抗体Ａ７８−Ｇ／Ａ７及びレクチンＰＮＡ（ピーナツ凝集素）及びアルトカルプス・インテグリフォリア・ジャカリン（Artocarpus integrifolia Jacalin）はＴＦ特異的である。ノイラミニダーゼでの細胞の処理（白色で文字修飾されている）は、アフィニティー結合を可能にするＴＦ露出を引き起こした。
【０１３２】
図１：ＮＭ−ｗｔ細胞のグライコエンジニアリング（GlycoEngineering）及び得られたＮＭ−Ｆ９細胞の特徴決定。ＥＭＳ処理によりランダム突然変異誘発を行った。脱シアル酸エピトープの露出によって、ＥＭＳ処理ＮＭ−ｗｔ細胞のアフィニティー選択及びそれに続くクローニングが可能となり、ＴＦ特異的抗体Ａ７８−Ｇ／Ａ７を使用した免疫細胞化学法で測定される高露出ＴＦ構造を有する細胞クローンが得られた（Ａ，上パネル：ＥＭＳ処理ＮＭ−ｗｔ細胞；下パネル：アフィニティー選択されクローニングされたＮＭ−Ｆ９細胞）。シアル酸付加度は、（Ｂ）ＴＦ特異的抗体Ａ７８−Ｇ／Ａ７、末端βＧａｌ認識性レクチンＰＮＡ及びシアル酸特異的レクチンＳＮＡをアプライするフローサイトメトリーにより、あるいは（Ｃ）チオバルビツール酸法により測定した。
【０１３３】
図２：ＮＭ−ｗｔ細胞並びに誘導体ＮＭ−Ｆ９及びＮＭ−Ｄ４によるＴＦ、ｓＴＦ、Ｔｎ、ｓＴｎ、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）、アシアログリコホリンＡ（ＡＧＰＡ）、Ｌｅｘ、ｓＬｅｘ及びＬｅｙの発現。細胞をフローサイトメトリーにより分析した。また、細胞をシアリダーゼで処理し、ＡＧＰＡ（Ａ６３−Ｃ／Ａ９）及びＴＦ（Ａ７８−Ｇ／Ａ７）の発現を分析した。
【０１３４】
図３：（Ａ）レクチンＰＮＡ、ＳＮＡ、ＭＡＡ及びＵＥＡＩを使用するフローサイトメトリーによる、あるいは（Ｂ）チオバルビツール酸法による、ＮＭ−ｗｔ細胞並びに誘導体ＮＭ−Ｆ９及びＮＭ−Ｄ４上の膜複合糖質結合シアル酸の測定。
【０１３５】
図４：（Ａ）ｍＲＮＡ発現分析による、及び（Ｂ）酵素活性分析による、ＮＭ−Ｆ９細胞の遺伝的欠損の分析。ｍＲＮＡ発現分析は、ＲＮＡの単離、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−２−エピメラーゼ特異的プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ及びゲル電気泳動を含む。対照としてアクチンを泳動させた。酵素活性測定は、１４Ｃ−ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンから１４Ｃ−Ｎ−アセチルマンノサミンへのｉｎ  ｖｉｔｒｏ変換の測定に基づく。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−２−エピメラーゼのｍＲＮＡは検出することができなかった。酵素活性の欠如はエピメラーゼの遺伝的欠損を証明した。
【０１３６】
図５：代謝的相補によるシアル酸付加の復元。ＮＭ−Ｆ９及びＮＭ−ｗｔ細胞を、０又は５０ｍＭのそれぞれＭａｎＮＡｃ又はＧｌｃＮＡｃを含有する血清中で４日間培養した。モノクローナル抗体Ａ７８−Ｇ／Ａ７（抗ＴＦ）及びＡ６３−Ｃ／Ａ９（抗ＡＧＰＡ）並びにレクチンＳＮＡ、ＭＡＡ及びＰＮＡをフローサイトメトリー測定において使用した。ＭａｎＮＡｃの添加はシアル酸付加の復元及びＴＦの消失をもたらした。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−２−エピメラーゼ欠損により、ＧｌｃＮＡｃは代謝され得なかった。
【０１３７】
図６：遺伝的相補によるシアル酸付加の復元。ＮＭ−Ｆ９細胞を、エピメラーゼをコードする構築物ｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ（−）／２Ｅｐｉで安定にトランスフェクトした。モノクローナル抗体Ａ７８−Ｇ／Ａ７及びＡ６３−Ｃ／Ａ９並びにレクチンＳＮＡ及びＰＮＡをフローサイトメトリー測定において使用した。シアル酸付加は完全に復元された。
【０１３８】
図７：ＮＭ−Ｆ９におけるｒｈＧＭ−ＣＳＦの発現。ヒトＧＭ−ＣＳＦ発現ベクターで安定にトランスフェクトされたＮＭ−Ｆ９細胞をクローニングし、ＦＣＳを添加した又は添加していない培地内で培養した。１日後（１ｄ）、２日後（２ｄ）、３日後（３ｄ）及び４日後（４ｄ）に、ＥＬＩＳＡにより上清中のＧＭ−ＣＳＦ濃度を測定した。４日後、ＮＭ−Ｆ９細胞１０５個当たり１４ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦが分泌された。
【０１３９】
図８：種々の分泌シグナルペプチドを使用した場合の、ＮＭ−Ｆ９細胞による、組換え発現された分泌性ＡＧＰＡの発現。分泌性ＡＧＰＡの発現のために、ＧＭ−ＣＳＦのシグナルペプチド（ｓｅｃＧＭ／ＧＰＡ）、Ｔ細胞受容体のシグナルペプチド（ｓｅｃＴＣＲ／ＧＰＡ）、抗体軽鎖κのシグナルペプチド（ｓｅｃＡＫ／ＧＰＡ）及び内因性シグナルペプチド（ｓｅｃＧＰＡ）を含有する４種の発現ベクターを構築した。捕捉体としてのＡ８３−Ｃ／Ｂ１２（抗ＧＰＡ）及び検出体としてのＡ６３−Ｃ／Ａ９を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡにより細胞上清中で分泌性ＡＧＰＡを検出した。
【０１４０】
図９：代謝改変による膜複合糖質の示差的シアル酸付加。ＮＭ−Ｆ９細胞を無血清培地内（Ａ）又はｆｃｓ含有培地内（Ｂ）（種々の濃度のＭａｎＮＡｃを添加したもの）で４日間培養した。膜複合糖質結合シアル酸の量を細胞膜画分のチオバルビツール酸法により測定した。比較のために、ＮＭ−ｗｔ細胞も、ＭａｎＮＡｃ添加を行わないｆｃｓ含有培地内で４日間培養した。
【０１４１】
図１０：代謝的相補による細胞表面上の膜タンパク質の示差的シアル酸付加。ＮＭ−Ｆ９細胞を種々の濃度のＭａｎＮＡｃを添加したＦＣＳ非含有培地内で４日間培養した。比較のために、ＮＭ−ｗｔ細胞も、ＭａｎＮＡｃ添加を行わないＦＣＳ非含有培地内で４日間培養した。シアル酸を含まないＴＦエピトープを認識するレクチンＰＮＡを使用してフローサイトメトリー分析を行った。
【０１４２】
図１１：代謝的相補による分泌性ｒｈＧＭ−ＣＳＦの示差的シアル酸付加。（Ａ）種々の濃度のＭａｎＮＡｃ（０、５０、７０又は９０ｍＭ）及び（Ｂ）−／＋  １又は３ｍｇ／ｍｌのシアロ糖タンパク質フェツインを添加した無血清培地内でｒｈＧＭ−ＣＳＦ産生細胞を４日間培養した。シアル酸を含まないｒｈＧＭ−ＣＳＦをＥＬＩＳＡにより測定した。まず、上清中のｒｈＧＭ−ＣＳＦの濃度を測定し、ついでＮＭ−Ｆ９細胞培養物１ｍｌ当たり１００ｎｇに調節した。つぎに、シアル酸を含まないｒｈＧＭ−ＣＳＦの検出のために、抗ヒトＧＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体を使用してｒｈＧＭ−ＣＳＦを捕捉し、シアル酸を含まないＮ−及びＯ−グリカンをＰＮＡにより検出した。
【０１４３】
図１２：ＴＦ１細胞上の示差的シアル酸付加ｒｈＧＭ−ＣＳＦの増殖活性。示差的シアル酸付加のために、９０ｍＭまでの漸増濃度のＭａｎＮＡｃ（Ａ）及び１ｍｇ／ｍｌの規定（defined）血清シアロ糖タンパク質と共に９０ｍＭ  ＭａｎＮＡｃ（Ｂ）を添加した無血清培地内でＮＭ−Ｆ９細胞を培養した。ＴＦ１細胞を、５ｎｇ／ｍｌの種々のシアル酸付加ｒｈＧＭ−ＣＳＦを含有するＮＭ−Ｆ９上清と共に４８時間インキュベートした。Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）（酵母内で産生）及びＬｅｕｋｏｍａｘ（登録商標）（大腸菌内で産生）を基準として使用した。ＧＭ−ＣＳＦを含有しないＮＭ−Ｆ９上清を陰性対照として使用して、ＢｒｄＵ−増殖アッセイにより細胞増殖を測定した。最高ではないが高いシアル酸付加度を有するｒｈＧＭ−ＣＳＦが、ＴＦ１細胞増殖のための最も活性な増殖因子であった。
【０１４４】
図１３：樹状細胞上の示差的シアル酸付加ｒｈＧＭ−ＣＳＦの増殖活性。示差的シアル酸付加のために、９０ｍＭまでの漸増濃度のＭａｎＮＡｃを添加した無血清培地内でＮＭ−Ｆ９細胞を培養した。ＮｅｍｏｄＤＣ細胞を５ｎｇ／ｍｌの種々のシアル酸付加ｒｈＧＭ−ＣＳＦのＮＭ−Ｆ９上清と共に２４時間インキュベートした。Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）を基準として使用した。ＧＭ−ＣＳＦを含有しないＮＭ−Ｆ９上清を陰性対照として使用して、ＢｒｄＵ−増殖アッセイにより細胞増殖を測定した。異なるシアル酸付加度は、選択された糖タンパク質活性に正又は負の影響を及ぼしうる。
【０１４５】
図１４：ｒｈＧＭ−ＣＳＦ濃度に対する増殖活性の依存性。ｒｈＧＭ−ＣＳＦの最高の活性を得るために、９０ｍＭ  ＭａｎＮＡｃを添加した無血清培地内でＮＭ−Ｆ９細胞を培養した。種々の濃度のＬｅｕｋｏｍａｘ（登録商標）、又は種々の濃度のｒｈＧＭ−ＣＳＦを含有するそのＮＭ−Ｆ９細胞の上清と共に、ＴＦ１細胞を４８時間培養した。ＧＭ−ＣＳＦを含有しないＮＭ−Ｆ９上清を陰性対照として使用して、ＢｒｄＵ−増殖アッセイにより細胞増殖を測定した。完全ヒトＧＭ−ＣＳＦのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性は、大腸菌（Ｌｅｕｋｏｍａｘ）又は酵母（Ｌｅｕｋｉｎｅ）内で発現されたｈＧＭ−ＣＳＦより約５００倍高い。
【０１４６】
図１５：ｒｈＧＭ−ＣＳＦ増殖活性の抑制。ＮＭ−Ｆ９細胞を無血清培地＋／−９０ｍＭ  ＭａｎＮＡｃ内で培養した。ＴＦ１細胞を５ｎｇ／ｍｌのシアル酸付加（ａ）若しくは非シアル酸付加ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（ｃ）又はＬｅｕｋｉｎｅ（登録商標）（ｂ）のＮＭ−Ｆ９上清と共に４８時間培養した。ｒｈＧＭ−ＣＳＦは種々の濃度の抗ヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体ＢＶＤ２−２３  Ｂ６でブロッキングされた。ＧＭ−ＣＳＦを含有しないＮＭ−Ｆ９上清を陰性対照（ｄ）として使用して、ＢｒｄＵ−増殖アッセイにより細胞増殖を測定した。
【０１４７】
以下の実施例は例示として記載されており、限定的なものではない。実施例においては、コンタミネーション（汚染）活性を伴わない標準的な試薬及びバッファーを使用する。リボヌクレアーゼ及びＰＣＲ産物のコンタミネーションを避けるように留意するのが好ましい。
【実施例１】
【０１４８】
グライコプロファイリング（GlycoProfiling）
種々のヒト細胞系からのグリコシルトランスフェラーゼＣ１ＧａｌＴ１、Ｃ２ＧＮＴ−Ｌ、Ｃ２ＧＮＴ−Ｍ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−ＩＩ、ＳＴ３Ｇａｌ−Ｉ、ＳＴ３Ｇａｌ−ＩＩ及びＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの発現プロフィールを調べた。細胞系ＨＥＫ２９３、ＬＳ１７４Ｔ、ＭＣＦ−７及びＳＷ４８０をＤＭＥＭ内で培養し、一方、Ｔ４７Ｄ、ＺＲ７５−１、ＮＭ−ｗｔ及びＫＧ１をＲＰＭＩ１６４０内で培養した。どちらの培地にも１０％ウシ胎児血清及び２ｍＭグルタミンを添加した。すべての細胞を６％ＣＯ２の湿潤雰囲気中、３７℃で増殖させた。当業者に公知の標準的な技術を用いて細胞を回収し破壊した。ＲＮＡを、グアニジンチオシアネート−フェノール−クロロホルムを使用して抽出し、ＲＮａｓｅ非含有ＤＮａｓｅで処理した。ＲＮＡ収量を分光光度法により測定した。
【０１４９】
ｍＲＮＡ発現分析を以下のとおりに行った。５μｇの全細胞ＲＮＡをランダムヌクレオチドヘキサマーでモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素により逆転写した。ＲＴ混合物は逆転写酵素、ｍＲＮＡ鋳型、プライマー、バッファー及びｄＮＴＰを含む。ｃＤＮＡの収量及び完全性を測定するために、並びにゲノムＤＮＡでの考えられうるコンタミネーションに関して確認するために、β−アクチンハウスキーピング遺伝子の発現を利用した。この目的には、イントロンにまたがるβ−アクチン特異的プライマーセットを設計した：β−アクチンフォワードプライマー：5'-GGC ATC GTG ATG GAC TCC G-3'及びβ−アクチンリバースプライマー5'-GCT GGA AGG TGG ACA GCG A-3'（アンプリコン長，６２２ｂｐ）。
【０１５０】
得られたｃＤＮＡ鎖を直接、増幅のために使用した。前記酵素の１つをコードするｃＤＮＡの５’−（フォワード）及び３’−領域（リバース）に特異的にハイブリダイズするフォワードプライマー及びリバースプライマーを設計した（Ｃ１ＧａｌＴ１を、フォワードプライマー：GAG ATT CCA GAG ATA CCA TTG及びリバースプライマー：CGT TCA GGT AAG GTA GGT TGを使用して増幅した（アンプリコン長２６２）；Ｃ２ＧＮＴのフォワード：GTG CTC AGA ATG GGG CAG GAT GTC ACC TGG, リバース：TCA CTA CTA GGA TTC TCC CCA GCA AGC TCC（アンプリコン長３６０）；ＳＴ３Ｇａｌ−Ｉのフォワード：ATG AGG TGG ACT TGT ACG GC, リバース：AAC GGC TCC AGC AAG ATG（アンプリコン長３７５）；ＳＴ３Ｇａｌ−ＩＩのフォワード：CCC TGC TCT TCA CCT ACT CG, リバース：GCA TCA TCC ACC ACC TCT G（アンプリコン長２８２）；ＳＴ６Ｇａｌ−Ｉのフォワード：AAA AAC CTT ATC CCT AGG CTG C, リバース：TGG TAG TTT TTG TGC CCA CA（アンプリコン長３７９）；ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉのフォワード：ACC ACA GCC AAG ACG CTC, リバース：AAG GGT GGT GCA AAG TGT TC（アンプリコン長４０７）；ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−ＩＩのフォワード：CTG CCA GTA AAT TCA AGC TGC, リバース：TTG CTT GTG ATG AAT CCA TAG G（アンプリコン長１８４））。ＰＣＲ反応混合物は、１．５μｌのＰＣＲバッファー［１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５００ｍＭ  ＫＣｌ］、０．８〜１．０μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５μｌのｃＤＮＡ、１．５μｌの２ｍＭデオキシヌクレオチド三リン酸、０．２μｌのＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ、０．２μｌの０．２５μＭβ−アクチンプライマー、０．７〜０．８μｌの５０μＭ酵素特異的プライマー及びＨ２Ｏ（容量１５μｌとする）を含有していた。ＰＣＲは、変性、アニーリング及び伸長のための複数の温度サイクルで行った。サイクル条件は９４℃で１分間、５９℃で１分間及び７２℃で２分間であった。同じチューブ内で０．２μｌのβ−アクチンプライマーでβ−アクチンを同時増幅した。各ＰＣＲ反応を２回行った。
【０１５１】
２６〜２８サイクルの後で得られたＰＣＲ反応のアリコートを２％アガロースゲル中で電気泳動し、臭化エチジウム染色の強度により定量した。ＲＴ−ＰＣＲデータの半定量的分析のために、各ｃＤＮＡ特異的バンドの染色強度を、同時増幅されたβ−アクチンに対応するバンドの染色強度と比較した。比率［（酵素バンドの蛍光単位／β−アクチンの蛍光単位）×１００］を計算することにより、各酵素バンドの強度を、適当なβ−アクチンバンドと相関させた。検出限界は二本鎖ＤＮＡとして１ｎｇであった。該アッセイは２５ｎｇまでは直線関係を示した。
【０１５２】
グライコプロファイリング（GlycoProfiling）は、ＮＭ−ｗｔ細胞のみにおいて、Ｃ２ＧＮＴ−Ｌ及びＣ２ＧＮＴ−Ｍの欠如により、コア２の合成の完全な欠損を示した。ｍＲＮＡ発現における他の低減（ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−ＩＩは８％へ、ＳＴ３Ｇａｌ−Ｉは３２％へ）は無傷ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉ及びＳＴ３Ｇａｌ−ＩＩにより補償されることが可能であった（表１）。ＮＭ−ｗｔのグリコシルトランスフェラーゼプロフィールは、将来のグライコエンジニアリング（GlycoEngineering）及びシアル酸付加研究（ＴＦエピトープを使用することによるもの）のための最良の出発点を表した。
【０１５３】
特にシアル酸に関する糖鎖決定基は、いくつかのモノクローナル抗体及びレクチンをアプライするフローサイトメトリーにより、前記ヒト細胞系において検出された。
【０１５４】
細胞を集め、ＰＢＳで２回洗浄し、３７℃で１時間かけて回復させた。ノイラミニダーゼ処理のために、細胞を、０．１％ＣａＣｌ２及び０．４％ＮａＣｌを含有する０．１Ｍイミダゾールバッファー（ｐＨ６．８）中、ビブリオ・コレラ（V. cholerae）ノイラミニダーゼの存在下又は非存在下にて、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を染色バッファー（４％ＢＳＡを含有するＨＢＳＳ又は１０％ＦＣＳを含有する培地）に再懸濁させた。細胞表面糖鎖決定基の検査のために、種々の抗体及びレクチンを使用した。例えば、ビオチン標識レクチンピーナツ凝集素（ＰＮＡ）、アルトカルプス・インテグリフォリア（Artocarpus integrifolia）由来のジャカリン（jacalin）、アマランツス・カウダツス（Amaranthus caudatus）凝集素（アマランチン（Amaranthin）又はＡＣＡ）及びバウヒニア・プルプレア（Bauhinia purpurea）レクチン（ＢＰＬ）並びにＴＦ特異的モノクローナル抗体Ａ７８−Ｇ／Ａ７を使用して、ＴＦの発現を分析した。ＰａｎｋｏＭａｂは腫瘍−ＭＵＣ１を検出する。Ａ８３−Ｃ／Ｂ１２は、グリコホリンＡをそのグリコシル化には無関係に認識する抗ＧＰＡ抗体である。細胞をレクチン又は抗体と共に４℃で１時間インキュベートし、染色バッファーで２回洗浄した。該抗体の結合は、二次Ｃｙ３−ヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ抗体により検出した。レクチンの結合は、Ｃｙ３結合ストレプトアビジンにより検出した。Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｐｉｃｓ  ＸＬフローサイトメーター（Beckman Coulter, Germany）を使用してフローサイトメトリー分析を行った。Ｅｘｐｏ３２ソフトウェア（Becton Coulter）を使用して定量分析を行った。
【０１５５】
ＺＲ７５−１の場合を除き、ヒト細胞はＴＦ陰性であった。しかし、シアル酸を切り離すノイラミニダーゼで細胞を処理した後、多数の細胞系上で潜在ＴＦが可視化される。分析した細胞系のうち、ＮＭ−ｗｔ細胞が潜在ＴＦの主要キャリアであった。本発明においては、多量の元の潜在ＴＦ及び遊離シアル酸が好ましい（表２）。
【実施例２】
【０１５６】
グライコエンジニアリング（GlycoEngineering）及び新規クローンの特徴決定
ＮＭ−ｗｔ細胞をアルキル化剤メタンスルホン酸エチルで処理することにより、ランダム突然変異誘発を行った。サンプルごとに、ＮＭ−ｗｔ細胞をＰＢＳで洗浄し、５％ＣＯ２、３７℃で一晩、ＥＭＳ（０．１ｍｇ／ｍｌ、メタンスルホン酸エチル、Sigma-Aldrich）を添加した細胞培養培地１ｍｌ当たり１０６細胞で播いた。細胞を洗浄し、新鮮培地を供給した。２日ごとに、トリパンブルー染色により細胞生存度を測定し、免疫細胞化学的染色により細胞を分析した（図１Ａ）。
【０１５７】
ついで、高いＴＦ発現の新規表現型を示す細胞を、ＴＦ特異的抗体を使用して選択した。ＮＭ−ｗｔ細胞をＢ−ＰＢＳ（ＰＢＳ中、０．５％ＢＳＡ）で洗浄し、モノクローナル抗体Ａ７８−Ｇ／Ａ７又はＰａｎｋｏＭａｂのハイブリドーマ培養の上清５０μｌ及びＢ−ＰＢＳの９５０μｌと共に４℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、５０μｌのラット抗マウスＩｇＭ抗体又はラット抗マウスＩｇＧ抗体（ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Miltenyi Biotec, Koln, Germany）に結合しているもの）で操作を繰返した。洗浄後、Miltenyi Biotec（Koln, Germany）により供給された２つの連続的なカラムにより、該製造業者のマニュアルに記載されているとおりに、磁気標識ＴＦ陽性細胞を分離した。９日間の培養の後、単離操作を合計３回繰返した。ＦＡＣＳ分析（フローサイトメトリー）を抗体染色から始めた。約３×１０５細胞を一次モノクローナル抗体［Ａ７８−Ｇ／Ａ７（ＩｇＭ）、ＰａｎｋｏＭａｂ（ＩｇＧ１）のハイブリドーマ培養上清；すべて、細胞培養培地中で１：２希釈されたもの］と共に４℃で１．５時間インキュベートし、ついで、ＰＢＳで１：２００希釈された二次Ｃｙ３結合ヤギ抗マウスＩｇＭ／ＩｇＧ抗体と共に４℃で３０分間インキュベートし、再び洗浄した。再懸濁細胞（２００μｌのＰＢＳ）をフローサイトメトリーにより調べた。以下のパラメーターでＥｘｐｏ３２ソフトウェア（Becton Coulter）を使用して、定量分析を行った：抗体標識細胞に関するパラメーター：前方散乱（ＦＳ）：２６Ｖ，ゲイン１，側方散乱（ＳＳ）：８０７Ｖ，ゲイン５，ＦＬ２：７４０Ｖ，ゲイン１、及びレクチン標識細胞に関するパラメーター：ＦＳ：２６Ｖ，ゲイン１，ＳＳ：８０７Ｖ，ゲイン５，ＦＬ１：７４０Ｖ，ゲイン１。
【０１５８】
３回の単離の後、９３％ＴＦ陽性細胞の細胞集団を得た。しかし、ＴＦ陽性細胞の比率は時間経過と共に減少し、単離操作後の１４日間の期間中にＴＦ陽性細胞約２０％の最低レベルに達した。ＴＦ陽性表現型の安定発現のために、細胞を４回目の単離に付し、ついで最後に、単離されたＴＦ陽性細胞を９６ウェルプレート（１細胞／１００μｌ）内での限界希釈によりクローニングした。得られた３０個の細胞クローンのうち、１３個の細胞クローンが多量のＴＦ抗原を発現し、これらのうちの８個の細胞クローンが全細胞集団の細胞表面上で、均一なＴＦ発現を示した（図１Ａ）。現在までに（約３０ヶ月間）、これらの細胞クローンはＴＦ抗原を安定に発現している。フローサイトメトリーによる分析は、ＮＭ−Ｆ９細胞の場合のＴＦ発現レベルの約３１倍の増加を示し、このことは、このクローン上のＴＦの強力な発現を表しており、約３５の、ＦＡＣＳ分析における差引平均によっても示され、これを更なる特徴決定のために選択した。安定なＴＦ陽性細胞集団を得るためにクローニングが必要なのは、ＴＦ陰性細胞の、より高い増殖速度によるものであり、したがってこれは時間経過と共にＴＦ陽性クローンより優勢に増殖し、例えば、ＮＭ−Ｆ９は、ＮＭ−ｗｔ細胞より遅い倍加速度を有する。
【０１５９】
さらに、ＰａｎｋｏＭａｂ及びラット抗マウスＩｇＧ抗体（ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Miltenyi Biotec, Koln, Germany）に結合しているもの）を使用した以外は上記ＴＦ選択と同じ方法で、ＭＵＣ１選択を行った。より多くの腫瘍特異的ＭＵＣ１エピトープＴＡ−ＭＵＣ１を発現するＴＦ陽性クローンの作製のために、ＮＭ−Ｆ９細胞を処理し、選択し、単一細胞をクローニングした。これは、選択のためにＰａｎｋｏＭａｂを使用して、前記のとおりに行った。安定なクローンＮＭ−Ｄ４は、フローサイトメトリーにおいてＰａｎｋｏＭａｂ染色の増強を示したため、該クローンを更なる特徴決定のために選択した。
【０１６０】
ＮＭ−Ｆ９及びＮＭ−Ｄ４は、より低い連続的な濃度のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有する培地内に継代することにより、無血清培地に適合化することが可能であった。
【０１６１】
ＮＭ−Ｆ９及びＮＭ−Ｄ４を、それらの糖鎖決定基及びトランスフェラーゼ発現に関して詳細に特徴決定した。評価されうる膜複合糖質のシアル酸付加度を、実施例１に記載のとおりにＴＦ特異的抗体Ａ７８−Ｇ／Ａ７及びいくつかのレクチン、例えば末端β−Ｇａｌ認識性ＰＮＡ、シアル酸特異的サムブクス・ニグラ（Sambucus nigra）レクチン（ＳＮＡ）、又はその他の例えばマアキア・アムレンシス（Maackia amurensis）レクチンＩ（ＭＡＡ）及びウレックス・ユーロパエウス（Ulex europaeus）凝集素Ｉ（ＵＥＡＩ）をアプライするフローサイトメトリーにより測定した。ＰＢＳで２回及び４％ＢＳＡ含有ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩）で１回洗浄した後、細胞をＨＢＳＳ／４％ＢＳＡ中、ＦＩＴＣ結合ＰＮＡ（１：４００）、ＦＩＴＣ結合ＳＮＡ（１：５０）、ＦＩＴＣ結合ＭＡＡ（１：５０）又はＦＩＴＣ結合ＵＥＡＩと共に４℃で１時間インキュベートした。洗浄後、分析のために細胞ペレットを２００μｌのＨＢＳＳ／４％ＢＳＡに再懸濁させた。以下のパラメーターでＥｘｐｏ３２ソフトウェア（Becton Coulter）を使用して、定量分析を行った：抗体標識細胞に関するパラメーター：前方散乱（ＦＳ）：２６Ｖ，ゲイン１，側方散乱（ＳＳ）：８０７Ｖ，ゲイン５，ＦＬ２：７４０Ｖ，ゲイン１、及びレクチン標識細胞に関するパラメーター：ＦＳ：２６Ｖ，ゲイン１，ＳＳ：８０７Ｖ，ゲイン５，ＦＬ１：７４０Ｖ，ゲイン１（図２及び３Ａ）。
【０１６２】
野生型細胞の潜在ＴＦはＡ７８−Ｇ／Ａ７及びＰＮＡの結合を妨げたが、誘導体ＮＭ−Ｆ９及びＮＭ−Ｄ４の露出ＴＦは、使用した検出試薬に応じて認識を３０〜７５倍増強した。この結果はＳＮＡの逆アフィニティーにより定性的に確認された（図１Ｂ）。また、膜結合シアル酸の量を定量した。簡潔に説明すると、細胞を集め、ＰＢＳで１回洗浄し、針せん断と組み合わせて細胞溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０，５％ＮｏｎｉｄｅｔＰ４０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，２００μｇ／ｍｌフェニルメチルスルホニルフルオリド）中で細胞溶解した。粗膜画分を４０．０００×ｇで２０分間の遠心分離によりペレット化した。ペレットを水で２回洗浄し、凍結乾燥させた。上清を酵素活性測定に使用した（実施例３を参照されたい）。タンパク質濃度をＲｏｔｉ−Ｑｕａｎｔ−Ｋｉｔ（Roth, Germany）で測定した。該ペレットを２Ｍ酢酸で８０℃で１時間加水分解することにより、膜複合糖質結合シアル酸の含量を測定し、チオバルビツール酸法（Aminoff, Biochem. J. 81, 384-392, 1961）により遊離シアル酸を測定した。ＮＭ−Ｆ９及びＮＭ−Ｄ４細胞内の膜結合シアル酸は、野生型細胞の場合と比較して、約３分の１に減少している（図１Ｃ、３Ｂ）。
【実施例３】
【０１６３】
ＮＭ−Ｆ９細胞の遺伝的欠損の分析
ＮＭ−Ｆ９細胞のＴＦ露出は糖ヌクレオチド生合成経路又は輸送体におけるいくつかのシアリルトランスフェラーゼにおける欠損を要すると予想された。実施例１に記載のとおりに種々の酵素のｍＲＮＡ発現分析を行い、この場合、ＮＭ−Ｆ９酵素に属するゲルバンドをＮＭ−ｗｔのものと比較し、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−２−エピメラーゼｍＲＮＡの全欠如が示された（図４Ａ）。ペーパークロマトグラフィーを使用して１４Ｃ−ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンから１４Ｃ−Ｎ−アセチルマンノサミンへの変換を測定することにより、ＮＭ−ｗｔ及びＮＭ−Ｆ９細胞におけるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−２−エピメラーゼの酵素活性を細胞上清において測定した（実施例２を参照されたい）。１Ｕは３７℃で１分当たり１μｍｏｌのＭａｎＮＡｃの合成に相当する。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−２−エピメラーゼ活性はＮＭ−Ｆ９においては、ＮＭ−ｗｔ細胞における元の３００μＵ／ｍｇから完全に低下した（図４Ｂ）。
【０１６４】
シアル酸付加を復元するＮＭ−Ｆ９細胞の能力を調べるために、培地に５０ｍＭ  ＭａｎＮＡｃを添加した。４日間の培養後、残存しているシアル酸を含まないグライコトープ（glycotope）を、既に記載されているとおりにモノクローナル抗体Ａ７８−Ｇ／Ａ７及びＡ６３−Ｃ／Ａ９並びにレクチンＰＮＡ、ＳＮＡ及びＭＡＡをアプライするフローサイトメトリーにより検出した。ＭａｎＮＡｃを供給することによる代謝的相補は、検出試薬に応じて、潜在膜複合糖質ＴＦの約５０％（ＰＮＡ）〜８０％（Ａ７８−Ｇ／Ａ７）をもたらした。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−２−エピメラーゼ欠損のため、対照ＧｌｃＮＡｃはＮＭ−Ｆ９細胞により代謝され得なかった（図５）。
【０１６５】
また、遺伝的相補によるシアル酸付加の復元を調べた。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−２−エピメラーゼｃＤＮＡをベクターｐｃＤＮＡ３．１内にクローニングした。ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ試薬を使用して、エピメラーゼをコードする構築物ｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ（−）／２ＥｐｉでＮＭ−Ｆ９細胞を安定にトランスフェクトした。細胞を４０％コンフルエンスまで増殖させた。５μｇのＤＮＡを１５０ｍｌのＤＭＥＭに溶解し、３０μｌのＳｕｐｅｒＦｅｃｔと混合した。室温で１０分間のインキュベーションの後、この溶液を細胞に加えた。３時間後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、新鮮な増殖培地と共にインキュベートした。４８時間のインキュベーション時間の後、増殖培地を再び、７００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８又は７５０μｇ／ｍｌゼオシンを含有する培地と交換した。耐性クローンを、４００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８又は２５０μｇ／ｍｌゼオシンを含有する増殖培地内で連続的に維持し、フローサイトメトリーにより分析した。シアル酸を含まないグライコトープを検出するために、モノクローナル抗体Ａ７８−Ｇ／Ａ７及びＡ６３−Ｃ／Ａ９並びにレクチンＰＮＡ及びＳＮＡを使用した。シアル酸付加度は完全に復元された（図６）。
【実施例４】
【０１６６】
ＮＭ−Ｆ９細胞における分泌性糖タンパク質の組換え発現
組換えヒト増殖因子ｒｈＧＭ−ＣＳＦを安定に発現するＮＭ−Ｆ９細胞を、エレクトロポレーションを用いて発現ベクターｐＧＴ６０ｈＧＭ−ＣＳＦ（Invivogen, USA）で該細胞をトランスフェクトすることにより作製した。エレクトロポレーションのために、１０６細胞を集め、洗浄し、４００μｌの低浸透圧バッファー（Eppendorf, Germany）に再懸濁させ、室温で１５分間インキュベートした。ついで細胞懸濁液を８μｇのプラスミドＤＮＡと混合し、２ｍｍの間隙を有するエレクトロポレーションキュベット（Eppendorf）内に移した。３４０Ｖの電圧及び５μ秒の時間を用いてＭｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ（Eppendorf）においてエレクトロポレーションを行った。培地（１０％ｆｃｓ，ＲＰＭＩ１６４０中の１％グルタミン，Biochrom）において、エレクトロポレーションからの回復の１〜２日後、安定にトランスフェクトされた細胞を、１００μｇ／ｍｌの抗生物質ヒグロマイシンＢを使用することにより選択し、限界希釈法によりクローニングした。約４週間後、ＧＭ−ＣＳＦ含量を定量するために使用しうるＧＭ−ＣＳＦ特異的ＥＬＩＳＡ（Becton-Dickenson, USA）を使用することにより、いくつかの細胞クローンの上清を分泌性ｒｈＧＭ−ＣＳＦの存在に関して分析した。ｒｈＧＭ−ＣＳＦの最高の分泌率を有する１つの細胞クローンを更なる実験のために選択した。第１の実験においては、ＧＭ−ＣＳＦを安定に発現する約１０５個のＮＭ−Ｆ９細胞を、ウシ胎仔血清（ｆｃｓ）の存在下及び非存在下にて、培地（前記参照）内で培養した。培地を交換することなく１、２、３及び４日間培養した後、時間経過と共に蓄積した分泌性ｒｈＧＭ−ＣＳＦの量を、ＧＭ−ＣＳＦ特異的ＥＬＩＳＡを用いることにより測定した。ｆｃｓの存在下で培養されたか非存在下で培養されたかには無関係に、４日間で約１４ｎｇのＧＭ−ＣＳＦが１０５個の細胞により放出された（図７）。第１日の後の分泌率は、ｆｃｓの存在下で培養した場合（約６ｎｇ／ｍｌ）には、ｆｃｓの非存在下で培養した場合（約４ｎｇ／ｍｌ）と比べて若干高かった。
【０１６７】
発現ベクター構築物ｓｅｃＧＰＡを使用して、ヒト膜タンパク質グリコホリンＡ（ＧＰＡ）をＮＭ−Ｆ９細胞内で分泌性アシアログリコホリンＡとして組換え発現させた。ｓｅｃＧＰＡは、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を含まないＧＰＡのＮ末端の９１アミノ酸（ａａ）をコードするｃＤＮＡを含有する。このｃＤＮＡを真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ及び／又はｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ  Ｃ（共にInvitrogen）内にサブクローニングした。さらに、内因性シグナルペプチドが異種ヒトシグナルペプチドにより置換された分泌性ＡＧＰＡタンパク質の組換え融合タンパク質を発現させるために、ＮＭ−Ｆ９細胞を使用した。したがって、当業者に公知の分子生物学的方法を用いて、１９個のＮ末端アミノ酸をコードするｃＤＮＡの代わりに、ＧＭ−ＣＳＦ由来のシグナルペプチド（MWLQSLLLLGTVACSIS，ｓｅｃＧＭ／ＧＰＡ）、Ｔ細胞受容体由来のシグナルペプチド（MACPGFLWALVISTCLEFSMA，ｓｅｃＴＣＲ／ＧＰＡ）又は抗体κ軽鎖由来のシグナルペプチド（METDTLLLWVLLLWVPPGSTGD，ｓｅｃＡＫ／ＧＰＡ）をコードする異種ｃＤＮＡが組込まれたｃＤＮＡであるｓｅｃＧＭ／ＧＰＡ、ｓｅｃＴＣＲ／ＧＰＡ及びｓｅｃＡＫ／ＧＰＡを構築した。後者の２つのシグナルペプチドは、任意の遺伝子産物の分泌性発現を増強するための異種シグナルペプチドとしての使用に関して当業者に既に公知である。ｓｅｃＧＭ／ＧＰＡの場合には、該シグナルペプチドとＧＰＡをコードする骨格との間において追加的なアラニンが発現される。それらの３つのｃＤＮＡ構築物を前記発現ベクター内にサブクローニングし、ヌクレオチド配列を確認した。得られた発現ベクターのそれぞれを、上述した手順、すなわちエレクトロポレーション、ヒグロマイシンＢでの選択及び単一細胞クローニングを用いることにより、安定にトランスフェクトされたＮＭ−Ｆ９細胞の作製に使用した。発現ベクターｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯを使用する場合には、２つのＦＲＴリコンビナーゼ認識部位により挟まれたｌａｃＺｅｏ  ＤＮＡカセット（Invitrogen）を含有する遺伝的に改変されたＮＭ−Ｆ９細胞をｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ及びリコンビナーゼ発現ベクターｐＯＧ４４（Invitrogen）で共トランスフェクトした。任意のＧＰＡを細胞培養上清から外へ捕捉するためのＡ８３−ＣＢ１２抗体及び細胞外ドメイン上に局在するＴＦ抗原を認識するＡ６３−Ｃ／Ａ９抗体を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡにより、細胞培養培地内に放出された分泌性ＡＧＰＡの分泌に関して、ｓｅｃＧＭ／ＧＰＡ、ｓｅｃＴＣＲ／ＧＰＡ、ｓｅｃＡＫ／ＧＰＡ又はｓｅｃＧＰＡを発現する細胞クローンをスクリーニングした。図８は、最高量の分泌性ＡＧＰＡ（１ｍｌ当たり及び１０５細胞当たり４０ｎｇ／ｍｌまで）を産生する細胞クローンがｓｅｃＧＭ／ＧＰＡ構築物で作製されたことを示している。その他の構築物を使用して、１ｍｌ当たり及び１０５細胞当たり最大で１３ｎｇの分泌性ＡＧＰＡを検出することが可能であった。さらに、分泌性ＡＧＰＡを産生する細胞クローンの数は、ｓｅｃＧＭ／ＧＰＡ構築物を発現ベクターとして使用した場合には、有意に、より高かった（図８）。
【実施例５】
【０１６８】
代謝的相補による示差的シアル酸付加
５０ｍＭ  ＭａｎＮＡｃでのＮＭ−Ｆ９細胞の代謝的相補により得られるシアル酸付加の部分的復元（図５）に関して、シアル酸付加に対する一定量の糖中間体の影響を詳細に調べた。ＮＭ−Ｆ９細胞を、０〜９０ｍＭ  ＭａｎＮＡｃの存在下、ｆｃｓを含有する又は含有しない培地内で培養し、該細胞膜のシアル酸付加度をチオバルビツール酸法により分析した（実施例３を参照されたい）。細胞シアル酸付加度はｆｃｓの非存在下又は存在下においてＭａｎＮＡｃの量が増加することに伴って代謝的相補により制御されうることを示すことができた（図９）。ｆｃｓ非含有培地におけるＭａｎＮＡｃの添加無しでは、ＮＭ−Ｆ９細胞の膜画分においてはシアル酸は少量のみしか検出されなかった。ｆｃｓ非含有培地に加えるＭａｎＮＡｃの量を次第に増加させることによりシアル酸付加度を徐々に増加させることが可能であった（５０ｍＭ  ＭａｎＮＡｃでプラトーに達した）。３０ｍＭ  ＭａｎＮＡｃを添加したｆｃｓ含有培地においては、シアル酸付加における更なる増加が達成された。ｆｃｓ含有培地に９０ｍＭ  ＭａｎＮＡｃを添加した場合には、元のＮＭ−ｗｔ細胞に匹敵するくらい高い、最高のシアル酸付加度が得られた。種々の濃度のＭａｎＮＡｃでの代謝的相補による膜タンパク質の示差的シアル酸付加を、シアル酸を含まないＴＦエピトープを認識し従ってシアル酸付加度に逆相関するレクチンＰＮＡを使用するフローサイトメトリーにより分析した。細胞膜内のシアル酸の量だけでなく膜内の糖タンパク質上のシアル酸付加度も種々の量のＭａｎＮＡｃ量での代謝的相補により制御可能であることが示されている（図１０）。培地内に存在するＭａｎＮＡｃを次第に増加させることにより、次第に増加するシアル酸付加度が観察された。９０ｍＭ  ＭａｎＮＡｃを用いた場合、ＮＭ−Ｆ９細胞における糖タンパク質のシアル酸付加度はＮＭ−ｗｔ細胞の場合とほぼ同等に高かった。
【０１６９】
最後に、分泌性タンパク質（この場合はｒｈＧＭ−ＣＳＦ）のシアル酸付加度もＭａｎＮＡｃ及び血清タンパク質での代謝的相補により制御可能であるかどうかを試験した。ｒｈＧＭ−ＣＳＦ発現ベクターで安定にトランスフェクトされたＮＭ−Ｆ９細胞（実施例４を参照されたい）を再び、漸増量の０〜９０ｍＭ  ＭａｎＮＡｃと共に、並びに１及び３ｍｇ／ｍｌのシアロ糖タンパク質フェツインの存在下の９０ｍＭ  ＭａｎＮＡｃと共に培養した。４日後、得られた細胞培養上清中のｒｈＧＭ−ＣＳＦの濃度をＥＬＩＳＡにより測定し（実施例４を参照されたい）、ついで細胞培養培地１ｍｌ当たり１００ｎｇに調節した。シアル酸を含まないｒｈＧＭ−ＣＳＦの度合を測定するために、サンドイッチＥＬＩＳＡを確立した。簡潔に説明すると、ＧＭ−ＣＳＦ特異的ＥＬＩＳＡ（Becton-Dickenson）の抗ヒトＧＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体をｒｈＧＭ−ＣＳＦの捕捉に使用し、したがってＰＢＳ中１：２５０の希釈度でマイクロタイタープレートに４℃で一晩コートした。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中での洗浄及びＰＢＳ中の１０％ｆｃｓでのブロッキングの後、１００μｌの該細胞培養上清を該マイクロタイタープレートに加え、室温で２時間インキュベートした。シアル酸を含まないＯ−グリカンをビオチン化ＰＮＡ（５〜１０μｇ／ｍｌ）及びペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（１：２５０希釈物）で検出した。分泌性組換え糖タンパク質、例えばｒｈＧＭ−ＣＳＦも、漸増量のＭａｎＮＡｃによるＮＭ−Ｆ９細胞の相補により示差的にシアル酸付加されうることが示された（図１１）。９０ｍＭ  ＭａｎＮＡｃへの１ｍｇ／ｍｌフェツインの添加により最高のシアル酸付加度が達成される。９０ｍＭ  ＭａｎＮＡｃへの３ｍｇ／ｍｌフェツインの添加はシアル酸付加における更なる増強をもたらさない。
【実施例６】
【０１７０】
種々のシアル酸付加形態の活性の測定による高活性ヒトＧＭ−ＣＳＦの同定
種々のシアル酸付加タンパク質の活性を評価するために、ＧＭ−ＣＳＦの増殖刺激能を採用した。ｒｈＧＭ−ＣＳＦを発現するＮＭ−Ｆ９細胞（実施例４及び５を参照されたい）を、０、３０、５０、７０及び９０ｍＭ  ＭａｎＮＡｃで並びに１ｍｇ／ｍｌのフェツインと共に９０ｍＭ  ＭａｎＮＡｃを添加した無血清培地を含有する種々の調製物において培養した。実施例５に既に記載されているとおりにシアル酸付加を検出した。ＴＦ−１細胞及び単球性樹状細胞系ＮｅｍｏｄＤＣ（それらの増殖速度は共にＧＭ−ＣＳＦに左右される）を、種々のシアル酸付加ｒｈＧＭ−ＣＳＦが５ｎｇ／ｍｌに調節された細胞上清と共にそれぞれ４８時間又は２４時間インキュベートした。細胞増殖を、製造業者のプロトコール（Roche Diagnostik GmbH, Mannheim, Germany）に従いＢｒｄＵ−増殖アッセイにより測定した。固定後、細胞をＰＯＤ標識抗ＢｒｄＵ抗体と共にインキュベートした。後続の染色反応を１Ｍ硫酸により停止させ、４５０ｎｍの吸光度（参照６９０ｎｍ）で分光光度法により検出した。ＧＭ−ＣＳＦを含有しないＮＭ−Ｆ９上清を陰性対照として使用した。それぞれ酵母及び大腸菌内で発現された非シアル酸付加ｒｈＧＭ−ＣＳＦ形態である市販のＬｅｕｋｉｎｅ（登録商標）（Schering AG）及びＬｅｕｋｏｍａｘ（登録商標）（Schering-Plough）を基準として使用した。
【０１７１】
驚くべきことに、ｒｈＧＭ−ＣＳＦの細胞増殖刺激活性はｒｈＧＭ−ＣＳＦのシアル酸付加度によって大きく異なり、９０ｍＭ  ＭａｎＮＡｃを含有する培養から得られた、最高ではないが高度にシアル酸付加されたｒｈＧＭ−ＣＳＦの１つのシアル酸付加形態が最高活性を示した。このｒｈＧＭ−ＣＳＦは、Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）（１００％）と比較した場合に、ＴＦ−１細胞及びＮｅｍｏｄＤＣに関して約１７８±１０％の増殖刺激活性の増加を示した（図１２及び１３）。市販のｒｈＧＭ−ＣＳＦであるＬｅｕｋｏｍａｘ（登録商標）及びＬｅｕｋｉｎｅ（登録商標）の細胞増殖活性は、ＮＭ−Ｆ９細胞内で発現された最も活性なシアル酸付加形態より低いことが判明した（図１２）。５ｎｇ／ｍｌのＬｅｕｋｏｍａｘ（登録商標）又はＬｅｕｋｉｎｅ（登録商標）で観察された最高の増殖活性は、０．０１ｎｇ／ｍｌの、ＮＭ−Ｆ９細胞からの最適シアル酸付加形態により達成される（Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）又はＬｅｕｋｏｍａｘ（登録商標）と比較して約５００倍低いＧＭ−ＣＳＦ；図１４）。同じ濃度のＬｅｕｋｉｎｅ（登録商標）、Ｌｅｕｋｏｍａｘ（登録商標）又はｒｈＧＭ−ＣＳＦの最適シアル酸付加形態で該活性を分析したところ、活性の増加は５倍までであった（図１４）。
【０１７２】
抗ヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体ＢＶＤ２−２３  Ｂ６をＴＦ１細胞増殖アッセイに加えた場合には、ＧＭ−ＣＳＦ活性が特異的にブロッキングされた。５μｇ／ｍｌの抗体濃度では既に、Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）又はｒｈＧＭ−ＣＳＦの最適シアル酸付加形態によるＴＦ−１細胞増殖の刺激は約６０％ブロッキングされ、４０μｇ／ｍｌの抗体濃度では完全に消失した（図１５）。
【０１７３】
配列表：
配列番号１：メチオニン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、セリン、ロイシン、ロイシン、ロイシン、ロイシン、グリシン、トレオニン、バリン、アラニン、システイン、セリン、イソロイシン、セリン。
【表１】
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【表２】
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[１]  シアル酸の糖ヌクレオチド生合成経路における、細胞のシアル酸付加能の低下を引き起こす少なくとも１つの欠損を含有し、かつ糖タンパク質をコードする核酸でトランスフェクトされた発現細胞系において、所望の濃度の少なくとも１つのシアル酸前駆体添加物を添加した培地内で糖タンパク質を発現させるための、少なくとも１つのシアル酸前駆体添加物の所望の濃度を決定する方法であって、該シアル酸前駆体添加物が該欠損を復元して該糖タンパク質のシアル酸付加をもたらす天然又は合成化合物であり、
（ｉ）種々の濃度の少なくとも１つのシアル酸前駆体を使用する示差的シアル酸付加により、複数の異なるシアル酸付加形態の糖タンパク質を発現させること、及び
（ｉｉ）適当なバイオアッセイにおいて、参照糖タンパク質と比較して、前記の異なるシアル酸付加形態の活性を測定すること、及び
（ｉｉｉ）より高い／最高の活性を有するシアル酸付加形態を選択し、該糖タンパク質のより高い／最高の活性レベルと相関する、該シアル酸前駆体添加物の濃度を決定すること
を含む方法。
[２]  ただ１つのシアル酸付加形態がステップ（ｉ）において発現される、１に記載の方法。
[３]  該糖タンパク質のより高い活性が、少なくとも１つのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおけるより高い活性、及び／又は少なくとも１つのｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおけるより高い活性、及び／又はより高い安定性、及び／又はより長い血清半減期、及び／又はより長いバイオアベイラビリティ、及び／又は免疫原性の改善、及び／又は抗原性の改善（少なくとも１つのバイオアッセイにより測定される）を特徴とする、１又は２に記載の方法。 
[４]  糖タンパク質の製造方法であって、
シアル酸の糖ヌクレオチド生合成経路における、細胞のシアル酸付加能の低下を引き起こす少なくとも１つの欠損を含有し、かつ糖タンパク質をコードする核酸でトランスフェクトされた発現細胞系において、１〜３のいずれか１項に記載の方法により決定された濃度の少なくとも１つのシアル酸前駆体添加物を添加した培地内で糖タンパク質を発現させることを含み、該シアル酸前駆体添加物が該欠損を復元して該糖タンパク質のシアル酸付加をもたらす天然又は合成化合物である、前記方法。
[５]  部分的にシアル酸付加された糖タンパク質が生成される、４に記載の方法。
[６]  糖タンパク質が発現細胞系の細胞により分泌される、１〜５のいずれか１項に記載の方法。
[７]  シアル酸の生合成経路における欠損が、ＣＭＰ−シアル酸輸送体を含む、糖輸送に関与するタンパク質、又は、キナーゼ、デヒドロゲナーゼ、ホスファターゼ、シンテターゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ及びエピメラーゼを含む、ＣＭＰ−シアル酸の生合成に関与するタンパク質、の機能喪失である、１〜６のいずれか１項に記載の方法。
[８]  シアル酸の生合成経路における欠損がエピメラーゼの突然変異である、１〜７のいずれか１項に記載の方法。
[９]  発現細胞系がＮＭ−Ｆ９（受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２６０６）又はＮＭ−Ｄ４（受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２６０５）である、１〜８のいずれか１項に記載の方法。
[１０]  糖タンパク質が、グリコホリンＡ、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＳＨ、ｈＣＧ、ＬＨ、インターフェロン、インターロイキン、抗体及び／又はそれらのフラグメントを含む群より選ばれるものである、１〜９のいずれか１項に記載の方法。
[１１]  少なくとも１つのシアル酸前駆体添加物がＭａｎＮＡｃ、アセチル化ＭａｎＮＡｃ、パーアセチル化ＭａｎＮＡｃ又はフェツインである、１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
[１２]  天然シアル酸修飾を有する糖タンパク質を生じるシアル酸前駆体添加物を使用する、１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
[１３]  欠損が、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼの酵素活性の減少又は不在を引き起こす、１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
[１４]  活性糖タンパク質の同定／決定方法であって、
ｉ）シアル酸の糖ヌクレオチド生合成経路における、細胞のシアル酸付加能の低下を引き起こす少なくとも１つの欠損を含有する発現細胞系を、該糖タンパク質をコードする核酸でトランスフェクトすること、
及び
ｉｉ）種々の濃度の少なくとも１つのシアル酸前駆体添加物を含有する培地を使用する示差的シアル酸付加により、複数の異なるシアル酸付加形態の糖タンパク質を発現させることであって、該シアル酸前駆体添加物が該欠損を復元して該糖タンパク質のシアル酸付加をもたらす天然又は合成化合物であり、
及び
ｉｉｉ）適当なバイオアッセイにおいて、参照糖タンパク質と比較して、前記の異なるシアル酸付加形態の活性を測定すること、
及び
ｉｖ）より高い／最高の活性を有するシアル酸付加形態を選択すること
を含む方法。
[１５]  α２−３及びα２−６結合シアル酸によりシアル酸付加されうる脱シアル酸構造に結合する認識分子を用いて初代細胞又は細胞系から発現細胞系を選択することを含む、シアル酸の糖ヌクレオチド生合成経路における、細胞のシアル酸付加能の低下を引き起こす欠損を有する発現細胞系の作製方法。
[１６]  選択前に初代細胞又は細胞系からの細胞に突然変異誘発を行う、１５に記載の方法。
[１７]  構造がＯ−グリカンである、１５又は１６に記載の方法。
[１８]  認識分子がレクチン又は糖鎖特異的抗体である、１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
[１９]  認識分子がレクチン又はコア−１構造を認識する糖鎖特異的抗体である、１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
[２０]  発現細胞系が、Ｐｅｒ．Ｃ６、ＨＥＫ２９３、Ｋ５６２、ＣＶ１、ＣＯＳ−７、ハイブリドーマ細胞、ナマルワ（Ｎａｍａｌｗａ）、ＢＨＫ及びＣＨＯを含む群から誘導される、１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
[２１]  ヒト細胞系ＮＭ−Ｆ９（ＤＳＭ  ＡＣＣ２６０６）又はＮＭ−Ｄ４（ＤＳＭ  ＡＣＣ２６０５）。
[２２]  細胞系ＮＭ−Ｆ９（ＤＳＭ  ＡＣＣ２６０６）又はＮＭ−Ｄ４（ＤＳＭ  ＡＣＣ２６０５）の細胞において糖タンパク質を発現させることを含む、糖タンパク質の発現方法。
[２３]  細胞系ＮＭ−Ｆ９（ＤＳＭ  ＡＣＣ２６０６）の細胞において９０ｍＭ  ＭａｎＮＡｃを添加した培地内でＧＭ−ＣＳＦを発現させることを含む方法により生成されるＧＭ−ＣＳＦ糖タンパク質。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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