(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の多糖誘導体の集団を含む組成物であって、
前記タンパク質はインスリン又はインスリン様タンパク質であり、
前記多糖は、２個から１２５個の間の糖ユニットを含み、末端シアル酸基を有し、かつヘパリン、ヒアルロン酸、及びコンドロイチン硫酸からなる群から選択される少なくとも１種の糖ユニットを含む、アニオン性多糖であり、
前記集団が、少なくとも８５％がＢ鎖のＮ末端のみで誘導体化されているタンパク質誘導体からなる、組成物。
【請求項２】
前記インスリン又はインスリン様タンパク質が、前記多糖により、前記多糖の還元末端ユニットにおいて誘導体化されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記多糖誘導体が一般式（Ｉ）で表される、請求項１に記載の組成物
【化１】
0005586669.tif 000009
［式中、
ｍは、１〜１２４であり、
ＨＮＢは、インスリン又はインスリン様タンパク質のＢ鎖のＮ末端であるＢ−ＮＨ２に由来し、
Ｌは、結合又は連結基であり、又はポリペプチドを含み、
ＧｌｙＯは、糖ユニットであり、
前記連結基は、存在する場合、一般式−Ｙ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１−Ｃ（Ｏ）−で表され、
ＹはＮＲ２又はＮＲ２−ＮＲ２であり、Ｒ１はアルカンジイル、アリーレン、アルカリーレン、ヘテロアリーレン及びアルキルヘテロアリーレンからなる群から選択される二官能有機基であり、これらはいずれもカルボニル、エステル、スルフィド、エーテル、アミド及び／又はアミン結合によって置換及び／又は介在されていてよく、
Ｒ２はＨ又はＣ１−６アルキルである］。
【請求項４】
Ｌが結合又は基
【化２】
0005586669.tif 000010
である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記多糖が１０〜８０個の糖ユニットを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記多糖が２０〜６０個の糖ユニットを含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記多糖が４０〜５０個の糖ユニットを含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記アニオン性多糖の多分散度が１．３未満である、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
前記アニオン性多糖の多分散度が１．２未満である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
医薬組成物であって、１種又は複数の薬学的に許容される賦形剤を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
治療に使用するための、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
インスリン又はインスリン様タンパク質の多糖誘導体を製造する方法であって、アニオン性多糖又は反応中間体を、ｐＨ範囲４．０〜６．０の酸性ｐＨの第１の水性溶液中でインスリン又はインスリン様タンパク質のＢ鎖のＮ末端アミンのみと化学的に反応させ、
これによって得られる多糖誘導体が、第１の水性溶液よりｐＨが高い、ｐＨ範囲６．５〜８．５の第２の水性溶液中で精製され、
前記アニオン性多糖が、２個から１２５個の間の糖ユニットを含み、末端シアル酸基を有し、かつヘパリン、ヒアルロン酸、及びコンドロイチン硫酸からなる群より選択される少なくとも１種の糖ユニットを含み、
前記反応中間体が、前記アニオン性多糖と二官能性試薬とを反応させて形成され、
産生した多糖誘導体のうち、少なくとも８５％がＢ鎖のＮ末端のみで誘導体化される、方法。
【請求項１３】
前記アニオン性多糖がインスリン又はインスリン様タンパク質と反応する反応性アルデヒド基を有し、誘導体化反応が還元的条件で実施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記反応性アルデヒド基が前記多糖の非還元末端にある、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記反応性アルデヒドが前記多糖の還元末端にあり、前記非還元末端は、インスリン又はインスリン様タンパク質と反応しないように不動態化されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
製剤添加剤の存在下で実施される、請求項１２〜１５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリンの新規な多糖誘導体及びそのような誘導体の製造法に関する。これら誘導体は、インスリンの安定性、薬物動態及び薬力学の向上に有用である。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、炭水化物代謝の異常であり、インスリンの産生が不十分であること又はインスリンに対する感受性が低いことが原因である。インスリンは、膵臓のランゲルハンス島ベータ細胞で合成され、身体のほとんどの細胞が正常にグルコースを利用するのに必要である。糖尿病患者では、正常なグルコース利用能が阻害され、それによって血糖値が上昇する（高血糖）。
【０００３】
糖尿病には２つの種類がある。１型糖尿病は、インスリン依存型糖尿病すなわちＩＤＤＭである。ＩＤＤＭは、以前は若年発症糖尿病と呼ばれていた。ＩＤＤＭの場合、インスリンは膵臓によって分泌されず、したがって外部から補給しなければならない。成人発症２型糖尿病は、一部の進行した症例ではインスリンを必要とするが、通常、食餌療法によってコントロールできる。
【０００４】
１９２０年代にインスリンが単離される前は、ほとんどの患者がこの疾患の発症後短期間のうちに死亡した。糖尿病を治療せずにいるとケトーシス、すなわち血中にケトン体（脂肪分解物）が蓄積した状態になり、ケトーシスの後には悪心及び嘔吐を伴うアシドーシス（血中における酸の蓄積）の状態に至る。異常な炭水化物及び脂肪の代謝による毒性生成物は増え続けるため、患者は糖尿病性昏睡に陥ることになる。
【０００５】
糖尿病の治療には、通常、インスリンを規則正しく注射することが必要である。これにより、救命上、臨床治療上劇的な改善がもたらされる。しかし、インスリン注射を打つことは不便なため、インスリンの投与及び生体への取り込みを改善すべく非常な努力が注がれてきた。
【０００６】
インスリン分子は、ジスルフィド結合によって結合している２つのアミノ酸の鎖からなる（分子量５８０４）。膵島のベータ細胞は、プロインスリンとして知られる、１本鎖のインスリン前駆物質を分泌する。プロインスリンのタンパク質分解によって、４つの塩基性アミノ酸（プロインスリン鎖の３１、３２、６４及び６５番目、それぞれＡｒｇ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ）と連結（「Ｃ」）ポリペプチドがはずされる。この結果得られる２本鎖のインスリン分子において、Ａ鎖はアミノ末端にグリシンを有し、Ｂ鎖はアミノ末端にフェニルアラニンを有している。
【０００７】
インスリンは、単量体、２量体、又は３つの２量体で形成される６量体として存在することができる。６量体には２個のＺｎ２＋原子が配位している。生物活性は単量体に存在する。最近まではヒトの糖尿病を治療するためにウシインスリン及びブタインスリンがもっぱら使われていたが、種間でインスリンに多くの違いがあることは知られている。ブタインスリンはヒトインスリンに最も類似しており、Ｂ鎖のＣ末端にスレオニン残基ではなくアラニン残基を有している点だけが異なっている。このような違いにもかかわらず、多くの哺乳動物のインスリンは似たような特異的な活性を有している。最近までは、この疾患の治療に使用されるインスリンはすべて、動物の抽出物から供給されていた。遺伝子組換え技術の出現によって、ヒトインスリンの商業規模の製造（例えばインディアナ州、インディアナポリスのＥｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社から市販されているＨｕｍｕｌｉｎ（登録商標）インスリン）が可能となっている。
【０００８】
インスリンを誘導体化してその薬物動態特性を向上させようという試みがなされてきた。販売されている製品、ＰＥＧ−インスリン（Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社）がある。ＰＥＧは、任意の数のエチレンオキシドの繰り返し単位を含む中性で水溶性の非毒性ポリマーである。ＰＥＧ化は、活性分子のサイズを大きくし、また、薬物動態の最適化、生物学的利用能の上昇、免疫原性及び投与回数の低減などによって最終的に薬物の性能を向上させようとするものである。ＰＥＧ−インスリンの設計及び開発については、ＷＯ２００４０９１４９４にさらに詳しく記載されている。
【０００９】
ＰＥＧ化インスリン誘導体の製造方法としては種々の方法が知られている。Ｄａｖｉｓら（米国特許第４，１７９，３３７号）は、トリクロロ−ｓ−トリアジン（塩化シアヌル）をＰＥＧとタンパク質のリンカーとして使った、ＰＥＧ−インスリンコンストラクトの合成について記載している。この発明者らは、大過剰量（５０×）の塩化シアヌル活性化ＰＥＧ（２０００Ｄａ）を、ホウ酸バッファー（ｐＨ９．２）中で２時間インスリンと反応させるという合成スキームに従っている。この発明者らは、部分的に活性（約５０％）なＰＥＧ−インスリン複合体を生成することができた。この複合体は、非免疫原性であり非抗原性であった。Ｏｂｅｒｍｅｉｅｒら（カナダ特許第１，１５６，２１７号）は、先に引用したＤａｖｉｓの特許に従ってＰＥＧ−インスリン複合体を調製すると約５０％のトリ−ＰＥＧ−インスリンを含有する不均一な複合体の混合物が生成すること、また、他の考えられるＰＥＧ−インスリン誘導体の組合せ（モノ−及びジ−ＰＥＧ−インスリン）ではＢ鎖１位のＰｈｅ残基において置換されていないことを見出した。
【００１０】
Ｏｂｅｒｍｅｉｅｒら（カナダ特許第１，１５６，２１７号）は、Ｂ鎖１位のＰｈｅ残基において特異的に修飾されたＰＥＧ−インスリン複合体の合成について記載している。Ｏｂｅｒｍｅｉｅｒらの発明の基本は、アルカリ性条件下、有機溶媒（例えばＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ピリジンなど）中で、Ａ鎖１位のＧｌｙ残基及びＢ鎖２９位のＬｙｓ残基の反応性アミンをｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−ｂｏｃ）又はメチルスルホニルエチルオキシカルボニル（Ｍｓｃ）基で保護することである。保護された（モノ−、ジ−及びトリ−）インスリンの複合混合物から、従来のクロマトグラフィー技術によってＮαＡ１，ＮεＢ２９−ビス−保護インスリン種を分離した。分離の後、純粋なＮαＡ１，ＮεＢ２９−ビス−保護インスリンを、活性化した（例えば酸塩化物又はイソシアネート）ＰＥＧ誘導体と反応させ、引き続きペプチド化学で一般的な技術を使って保護基を除去した。Ｏｂｅｒｍｅｉｅｒらは、アルカリ性反応条件下では、Ａ鎖１位のＧｌｙとＢ鎖２９位のＬｙｓのアミノ基はＢ鎖１位のＰｈｅのアミノ基よりも反応性に富むことに気づいた。この発明者らは、部位特異的なｍＰＥＧ（１５００）−Ｂ１−インスリン複合体が、ウサギにおける血糖値の低下に（モル基準で計算して）１００％インスリンの効果を及ぼすとした。
【００１１】
Ｇｅｉｇｅｒら（１９８０年）及びＥｈｒａｔら（１９８３年）は、Ｏｂｅｒｍｅｉｅｒら、Ｇｅｉｇｅｒら及びＥｈｒａｔらが記載している多段階法に類似した保護／複合化／脱保護のスキームを使って生成した、Ｂ鎖１位のＰｈｅ残基において特異的に修飾されたＰＥＧ−インスリン付加体について記載しているが、彼らはＰＥＧ（１５００）−Ｂ１−インスリン複合体がネイティブインスリンに比べてはるかに抗原性が低く、はるかに安定（肝酵素に対して）であることに気づいた。他のＰＥＧ−インスリンの調製（Ｃａｌｉｃｅｔｉら、１９９９年；Ｕｃｈｉｏら１９９９年；Ｈｉｎｄｓら、２００２年）は、１）先に略述した基本的な３段階、保護／複合化／脱保護のスキームが中心となるか、２）インスリン分子を非特異的に修飾することになるか、又は３）最も効果的な複合体、すなわちＰＥＧ−Ｂ１−インスリンが生成されないかのいずれかである。
【００１２】
Ｌｉｕら（米国特許第６，３２３，３１１号Ｂ１）は、ＰＥＧ−Ｂ１−インスリン複合
体を合成する有用な方法について記載している。この方法は、Ｏｂｅｒｍｅｉｅｒの３段階、保護／複合化／脱保護のスキームを拡張したものであるが、各段階の間で反応中間体を単離する必要がない（すなわち、ワンポット合成である）。したがって、インスリンは、Ａ鎖１位のＧｌｙ残基及びＢ鎖２９位のＬｙｓ残基において保護され、直ちにＰＥＧと反応させられ、次いで種を単離する前に脱保護される。Ｌｉｕらは、彼らのワンポット反応によって適切な位置異性体（すなわちＰＥＧ−Ｂ１−インスリン）が最大５０％と、引き続く誘導体化にリサイクルし得る未反応インスリン３０％を得ることができると主張している。これらのコンストラクトの調製が迅速に行われると仮定しても、完了するのに最低５日かかることになる。また、この発明では、許容し得る結果を達成するのに大過剰のＰＥＧ試薬が必要となる。この発明の生成物は有効であるかもしれないが、その調製にはやはり、タンパク質が、タンパク質に不利な環境（高ｐＨ及び低ｐＨ）において長時間にわたり３つの反応段階を経ることが必要となる。
【００１３】
ＵＳ２００７０８３００６に記載の発明は、インスリンＢ鎖のＮ末端（ＰｈｅＢ１）で特異的にＰＥＧ化された高純度のインスリン誘導体を１段階で簡単に調製する方法を提供することによって、従来技術のインスリンＰＥＧ化法の欠点を解決しようとするものである。ＰｈｅＢ１におけるＰＥＧ化が最もありそうにない反応生成物であることを示唆する従来の経験（Ｃａｌｉｃｅｔｉら、１９９９年、上記）と異なり、この方法は、ｐＨをコントロールする特定の条件、金属イオンキレート剤の使用、及びＰＥＧ化の主たる部位となるＰｈｅＢ１アミノ末端の相対的反応性を高めるための有機溶媒の添加を使用している。ＰｈｅＢ１残基における部位特異的なＰＥＧ化によってインスリンに付与される多くの有益な特性（例えば、弱い免疫原性／抗原性、高いタンパク質分解的、化学的及び物理的安定性、長い循環半減期、高い水溶性／有機溶媒可溶性、十分な生物活性）を考えれば、このような結果を達成するための簡単で、費用対効果が高く、また容易にスケーラブルな方法があれば、当技術分野において著しい進歩をもたらすことになろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】ＷＯ２００４０９１４９４
【特許文献２】米国特許第４，１７９，３３７号
【特許文献３】カナダ特許第１，１５６，２１７号
【特許文献４】米国特許第６，３２３，３１１号Ｂ１
【特許文献５】ＵＳ２００７０８３００６
【特許文献６】ＵＳ−Ａ−５８４６，９５１
【特許文献７】ＷＯ−Ａ−０１８７９２２
【特許文献８】ＷＯ２００５／０１６９７４
【特許文献９】ＷＯ２００６／０１６１６８
【特許文献１０】ＷＯ９２／２２３３１
【特許文献１１】ＷＯ２００５／０１６９７３
【特許文献１２】ＷＯ０６／００５４０
【特許文献１３】ＷＯ２００５／０３１４９
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（２００３年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
従来技術を考慮すると、ヒト及び動物の治療に使うことができ、また、最適化された安定性及び半減期を有しかつ毒性の低い改善されたインスリン誘導体を提供する必要がある
。本発明者らは、インスリンにＰＳＡを結合することによって前述したような特性が付与されることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
ポリシアル酸（ＰＳＡ）は、ある種の細菌によってまた哺乳動物のある種の細胞において産生される、天然の分枝していないシアル酸のポリマーである。それらは、ｎ＝約８０又はそれ以上から少ない方ではｎ＝２までのシアル酸残基から、天然の細菌由来型のポリマーの限られた酸加水分解によって、又はノイラミニダーゼによる消化によって、又は分画によって様々な重合度で生成し得る。
【００１８】
近年、ポリシアル酸の生物学的特性、特にα−２，８結合したホモポリマーポリシアル酸の生物学的特性は、タンパク質及び低分子量薬物分子の薬物動態特性に変更を加えるために利用されてきた。ポリシアル酸による誘導体化によって、カタラーゼやアスパラギナーゼを含めた多くの治療用タンパク質の循環半減期は劇的に改善されることになり、また、以前にこのような治療用タンパク質に曝露されたことによる望ましくない（時には必然的な）結果としてすでに抗体が存在している場合であっても、このようなタンパク質を使用することが可能となる［Ｆｅｒｍａｎｄｅｓ及びＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、１９９６年、１９９７年］。α−２，８結合したポリシアル酸は、ＰＥＧの代わりとなる魅力的なポリマーであり、当然のことながら人体の一部である生分解性ポリマーであって組織のノイラミニダーゼによって分解してシアル酸、すなわち非毒性の糖となる免疫学的には見えない生分解性ポリマーである。
【００１９】
本発明者らは、先に、タンパク質などの治療薬に多糖（特にＰＳＡ）を結合させる方法について記載している［ＵＳ−Ａ−５８４６，９５１、ＷＯ−Ａ−０１８７９２２］。これらの方法の幾つかは、第一級アミン基で反応するタンパク質反応性アルデヒド部分を創出するために、ポリマーの「非還元」末端を化学的に誘導体化することに依存するものである。非還元シアル酸末端ユニットは隣接ジオールを有しているため、過ヨウ素酸塩で容易に（及び選択的に）酸化されモノアルデヒド体を生じることができる。このモノアルデヒド体はタンパク質に対してより反応性であり、また、還元的アミノ化及び他の化学作用によるタンパク質結合のための好適に反応性な元素を含んでいる。この反応を、図１及び２に示す。
【００２０】
図１は、コロミン酸（大腸菌由来のα−２，８結合したポリシアル酸）を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化して、非還元末端にタンパク質反応性アルデヒドを形成することを示す図である。また、
図２は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムでシッフ塩基を選択的に還元して、タンパク質のアミノ基と安定な非可逆的共有結合を形成することを示す図である。
【００２１】
本発明者らは、以前の刊行物、例えばＢｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（２００３年）に、ポリシアリル化インスリンの合成について記載した。この参考文献では、２２ｋＤａ及び３９ｋＤａのコロミン酸を酸化し、遺伝子組換えヒトインスリンのアミノ基と反応させている。使用したＣＡの多分散度は１．３３及び１．４０であり、これは治療用としては大き過ぎる。
【００２２】
本発明者らはまた、ＷＯ２００５／０１６９７４として公開されている以前の特許出願に、インスリン−コロミン酸複合体の合成について記載した。しかし、この出願では、複合体がすべて特異的にＮ末端であるということではなく、様々な複合体が生成する。
【００２３】
コロミン酸が例えばアミノ酸の側鎖と反応することによって、前述した従来の複合化反応の間に、意図しない副産物が生じることがある。このような副産物は、ヒト及び動物の
治療用として規制当局から要求される化学的に定義された複合体を製造する際には、非常にやっかいであると考えられる。
【００２４】
反応生成物の多くの物理化学的特性は類似しているため、意図した反応生成物（例えば、モノポリシアリル化生成物）を、種々の意図しない生成物から精製することは容易なことではない。これは、イオン交換クロマトグラフィーやゲル浸透クロマトグラフィー（それぞれ電荷及び大きさに基づいて分離する）などの技術では、不十分な精製プロファイルしか得られないことを意味する。
【００２５】
本発明の第１の態様によれば、タンパク質の多糖誘導体の集団を含む組成物であって、前記タンパク質はインスリン又はインスリン様タンパク質であり、前記多糖はアニオン性であり、２個から１２５個の間の糖ユニットを含み、前記集団は実質的に前記タンパク質のＮ末端誘導体のみからなるような組成物が提供される。
【００２６】
以下、用語インスリンを使用する場合、インスリン様タンパク質も含むことを意図する。インスリン様タンパク質とは、インスリンの活性に相当する活性を有するタンパク質を意味する。インスリンは通常、血中グルコース濃度を低下させる。インスリンはまた、単糖類、アミノ酸及び脂肪酸の細胞透過性を増大し、解糖、ペントースリン酸回路及び肝臓におけるグリコーゲン合成を促進する。インスリン様タンパク質は、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０１３０８由来のヒトインスリンが有する活性の少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも５０％を有することが好ましい。
【００２７】
先に詳述したような必要な活性を有しているインスリンの突然変異体もまた使うことができる。「インスリン様」タンパク質は、「インスリンホモログ」と呼ぶこともできる。２つの配列が相同であるかどうかは、当技術分野でよく知られている配列類似性又は同一性のパーセントを使って、決まった手順で算出される。配列は、プロセシングを経ていないヒトインスリンの前駆体である配列番号１と比較しなければならない。２５〜５４番目の残基はインスリンＢ鎖に対応し、９０〜１１０番目の残基はインスリンＡ鎖に対応する。ホモログの配列も、活性型のヒトインスリンのものと比較することができる。
【００２８】
ホモログは、核酸又はアミノ酸レベルで５０％又はそれ以上の類似性又は同一性を有していることが好ましく、核酸又はアミノ酸レベルで６０％、７０％、８０％又はそれ以上であるとさらに好ましく、９５％又は９９％などの９０％又はそれ以上の同一性又は類似性を有しているとさらに好ましい。類似性又は同一性を計算するのに多くのプログラムが利用できる。好ましいプログラムはＢＬＡＳＴｎ、ＢＬＡＳＴｐ及びＢＬＡＳＴｘプログラムであり、これらはデフォルトパラメータで動き、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで入手可能である。例えば、２つのアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴｎプログラムを使い、デフォールトパラメータ（スコア＝１００、語長＝１１、期待値＝１１、低複雑配列のフィルタリング＝ｏｎ）を使って比較することができる。上記レベルの相同性は、これらのデフォルトパラメータを使って計算される。
【００２９】
インスリンは天然、すなわちヒト若しくは動物由来のものであっても、又は合成、例えば遺伝子組み換え法によって作られたものであってもよい。
【００３０】
当技術分野でよく知られているように、インスリンは２つのペプチド鎖を含む。本発明においては、好ましくは、インスリンはそのＢ鎖のＮ末端において多糖で誘導体化される。
【００３１】
「集団」とは、組成物中に１種を超える多糖誘導体が存在するということである。これらの誘導体は、同数の又は異なる数の糖ユニットを含んでいてよい。好ましくは、組成物
中の多糖の多分散度は１．３未満であり、さらに好ましくは１．１未満である。
【００３２】
この集団において、実質的にすべてのタンパク質はＮ末端でのみ誘導体化されている。インスリンには２つのペプチド鎖が存在するので、２つのＮ末端ユニットがある。好ましくは、この集団のＢ鎖の少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは９５％が、Ｎ末端でアニオン性多糖によって誘導体化されている。Ａ鎖のＮ末端は誘導体化されている必要はない。
【００３３】
Ｎ末端における誘導体化の程度は、ペプチドマッピング又はエドマン分解などの当技術分野における標準的な技術を使って測定することができる。
【００３４】
好ましくは、多糖は少なくとも２個、さらに好ましくは少なくとも５個、最も好ましくは少なくとも１０個、例えば少なくとも５０個の糖ユニットを有する。
【００３５】
アニオン性多糖は、好ましくはポリシアル酸、ヘパリン、ヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸から選択される。好ましくは、多糖はポリシアル酸であり、実質的にシアル酸ユニットのみからなる。しかし、多糖は、分子中にシアル酸以外のユニットを有していてもよい。例えば、シアル酸ユニットは他の糖ユニットと交互に存在していてもよい。しかし、多糖は実質的にシアル酸のユニットからなることが好ましい。
【００３６】
多糖は末端シアル酸基を有していることが好ましく、また、先に詳述したように、α−２−８結合又はα−２−９結合によって互いに結合している少なくとも２つのシアル酸ユニットを含む多糖である、ポリシアル酸であることがさらに好ましい。好適なポリシアル酸の重量平均分子量は２から１００ｋＤａの範囲、好ましくは１から３５ｋＤａの範囲にある。最も好ましいポリシアル酸の分子量は１０から２０ｋＤａの範囲にあって、通例約１４ｋＤａである。最も好ましくは、ポリシアル酸は細菌由来であって、例えば大腸菌Ｋ１、髄膜炎菌、非発酵陰性桿菌（Ｍａｒａｘｅｌｌａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）若しくはＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの多糖Ｂ、又は大腸菌Ｋ９２株由来のＫ９２多糖である。大腸菌Ｋ１由来のコロミン酸であることが最も好ましい。
【００３７】
アニオン性多糖、好ましくはポリシアル酸は、塩又は遊離酸の形態をしていてよい。細菌源からの回収後その分子量が小さくなっているというような、加水分解物の形態であってもよい。多糖、好ましくはポリシアル酸は、多分散度が１．３を上回るような、例えば２又はそれ以上であるような、分子量が広く分布している物質であってよい。好ましくは、分子量の多分散度は１．３未満又は１．２未満であり、１．１未満、例えば１．０１程度に低いことが好ましい。
【００３８】
通常、本発明の化合物はインスリンのポリシアル酸誘導体であって、２〜１２５個のシアル酸ユニットを含む。さらに、本発明の化合物は１０〜８０個のシアル酸ユニット、好ましくは２０〜６０個のシアル酸ユニット、最も好ましくは４０〜５０個のシアル酸ユニットを含む。
【００３９】
本発明の第１の態様における多糖誘導体は、インスリンのＮ末端とアニオン性多糖が共有結合した複合体であり得る。多糖とインスリンの他の会合手段としては、静電引力が挙げられる。しかし、共有結合が好ましい。この共有結合は、カルボキシル基とアミン基のアミド結合であってよい。インスリンが多糖と共有結合的に結合すると考えられるもう１つの結合は、シッフ塩基を介する。アミンと複合化するのに好適な基については、ＷＯ２００６／０１６１６８に詳しく記載されている。
【００４０】
本発明においては、多糖は、天然の多糖であってもよく、又は天然の多糖の誘導体、例
えば糖残基上の１個若しくは複数の活性基の反応によって誘導体化された多糖、又は多糖鎖末端の誘導体化基に共有結合した多糖であってもよい。
【００４１】
多糖は、その還元又は非還元末端ユニットのいずれかを介してインスリンに結合することができる。
【００４２】
多糖類をタンパク質に結合させる方法は、当技術分野ではよく知られており、ＷＯ９２／２２３３１及びＷＯ−Ａ−０１８７９２２に詳しく記載されている。本発明において好ましい方法を、以下にさらに詳しく説明する。方法については、本出願の図１及び２においても説明されている。
【００４３】
多糖は、その還元及び非還元末端ユニットを介してインスリンに結合することができる。これは、１つの多糖鎖が２つのインスリンタンパク質に結合することができる、すなわちその還元及び非還元両末端において誘導体化することができることを意味する。
【００４４】
多糖は、インスリンペプチドに直接結合、すなわち図１及び２に示すように結合していてもよく、又はリンカーを介して結合していてもよい。好適なリンカーは、Ｎ−マレイミド、ビニルスルホン、Ｎ−ヨードアセトアミド、オルトピリジル又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド含有試薬に由来する。このリンカーもまた、生物学的安定性又は生物分解性を有していてよく、例えばポリペプチド又は合成オリゴマーを含んでいてよい。リンカーは、ＷＯ２００５／０１６９７３に詳しく記載されているように、二官能部分から得ることができる。好適な二官能試薬は、例えばＢｉｓ−ＮＨＳである。この試薬は一般式Ｚ−Ｒ１−Ｚ（式中、Ｚはそれぞれ官能基であって同じ又は異なっていてもよく、Ｒ１は二官能有機基である）で表すことができる。好ましくは、Ｒ１はアルカンジイル、アリーレン、アルカリーレン、ヘテロアリーレン及びアルキルヘテロアリーレンからなる群から選択され、これらのいずれもカルボニル、エステル、スルフィド、エーテル、アミド及び／又はアミン結合によって置換及び／又は介在されていてよい。Ｃ３〜Ｃ６アルカンジイルは特に好ましい。最も好ましくは、Ｒ１は、好適な二官能試薬の適切な部分に一致している。
【００４５】
好ましい多糖誘導体は一般式（Ｉ）で表される
【００４６】
【化１】
0005586669.tif 000002
【００４７】
［式中、
ｍは、少なくとも１であり、
ＨＮＢは、インスリン又はインスリン様ペプチドのＮ末端であるＢ−ＮＨ２に由来しており、
Ｌは結合又は連結基であり、又はポリペプチド若しくは合成オリゴマーを含み、
ＧｌｙＯはアニオン性糖ユニットであり、
前記連結基は、存在する場合、一般式−Ｙ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１−Ｃ（Ｏ）−で表され、
ＹはＮＲ２又はＮＲ２−ＮＲ２であり、Ｒ１は先に定義したような二官能有機基であり、Ｒ２はＨ又はＣ１−６アルキルである］。
【００４８】
本発明のこの態様において、インスリンは多糖の非還元末端に結合している。末端多糖ユニットはシアル酸ユニットである。多糖中の他の糖ユニットはＧｌｙＯで表され、それらは同じであっても異なっていてもよい。好適な糖ユニットとしては、ヘパリン、ヒアルロン酸又はコンドロイチン硫酸が挙げられる。
【００４９】
インスリンが直接多糖に結合している場合、基Ｌは結合である。しかし、基Ｌは代替的に、Ｎ−マレイミド、ビニルスルホン、Ｎ−ヨードアセトアミド、オルトピリジル又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド含有試薬に由来するものであってよい。この試薬は先に定義したような一般式Ｚ−Ｒ１−Ｚで表すことができる。本実施形態において、Ｌは典型的には基
【００５０】
【化２】
0005586669.tif 000003
【００５１】
である。
【００５２】
本発明の別の態様は、医薬組成物であって１種又は複数の薬学的に許容される賦形剤を含んでいる、先に定義したような組成物である。
【００５３】
医薬組成物は、水性懸濁液の形態をしていてよい。この水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に好適な賦形剤と混合した状態で新規化合物を含有している。この医薬組成物は、滅菌注射型の水性又は均質懸濁液の形態をしていてよい。この懸濁液は、好適な分散又は湿潤剤及び懸濁化剤を使って、公知の技術に従って配合することができる。
【００５４】
医薬組成物は、ヒト又は獣医学用として、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内、局所又は気管内投与することができる。
【００５５】
これら組成物はさらに製剤添加剤を含んでいてよい。製剤添加剤とは、Ｗａｎｇらの文献（１９９９年）に記載されているような、インスリンを内部又は外部のいずれかから安定させることができる賦形剤のことをいう。このような賦形剤は、安定化剤、可溶化剤又は金属イオンであってよい。製剤添加剤の好適な例には、１種又は複数のバッファー、安定化剤、界面活性剤、塩、ポリマー、金属イオン、糖、ポリオール又はアミノ酸が挙げられる。これらは単独で又は組み合わせて使うことができる。
【００５６】
通常、安定化剤は、変性タンパク質の不安定化によって作用して、タンパク質アンフォールディングのギブズ自由エネルギーの増加をもたらす。このような安定化剤は、好ましくは糖又はポリオール、例えばスクロース、ソルビトール、トレハロース、グリセロール、マンニトール、ラクトース及びエチレングリコールである。安定化用バッファーはリン酸ナトリウムである。
【００５７】
可溶化剤は、好ましくは界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤である。好適な例としては、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｐｌｕｏｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、Ｂｒｉｊ  ３５及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が挙げられる。
【００５８】
金属イオンは、好ましくは二価の金属イオンである。好ましい金属イオンとしては、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｓｒ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋及びＦｅ２＋が挙げられる。
【００５９】
製剤添加剤は、ＰＳＡ、ＰＥＧ又はヒドロキシ−β−シクロデキストリンから選択され
るポリマーであってもよい。
【００６０】
ｍ−クレゾールなどの保存剤も使うことができる。
【００６１】
製剤添加剤として使うのに好適なアミノ酸及びアミノ酸誘導体としては、ヒスチジン、グリシン、その他類似のアミノ酸及びアスパラギン酸ナトリウムが挙げられる。
【００６２】
本発明のまた別の態様は、化合物であって治療に使用する先に記載した化合物である。
【００６３】
本発明のまた別の態様によれば、インスリン又はインスリン様タンパク質の多糖誘導体を製造する方法であって、２〜１２５個の糖ユニットを含むアニオン性多糖が、実質的にインスリン又はインスリン様タンパク質のＮ末端アミンにおいてのみ化学的に反応する方法が提供される。
【００６４】
語句「実質的にＮ末端アミンにおいてのみ化学的に反応する」とは、集団の誘導体において、タンパク質の少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％がＮ末端アミンにおいてのみ誘導体化されていることを意味する。好ましくは、これは、インスリンＢ鎖のＮ末端アミンにおいてである。
【００６５】
この方法によって得ることができる多糖誘導体及び以下に詳述するような好ましい実施形態のいずれもまた、本発明の一部を形成する。
【００６６】
本発明者らは、多糖をタンパク質に複合化する新規方法を開発した。それによって、タンパク質のＮ末端の高い反応性を利用することができ、また、すでに確立されている方法（図１及び２）、すなわち過ヨウ素酸塩で酸化された天然型コロミン酸でタンパク質を還元的にアミノ化する方法を用いた場合に得られる生成物の複雑さが回避される。
【００６７】
多糖はまた、修飾された形態のインスリンと反応することもできる。例えば、インスリン上の１つ又は複数の基が、例えば還元又は酸化によって化学的に変換されていてもよい。例えば、反応性のカルボニルを、酸化的条件を用いてインスリンの末端アミノ基の位置に生じさせることもできる。
【００６８】
本発明の方法で用いられる好適な多糖は、新規組成物に関して先に説明して通りである。
【００６９】
本発明の化合物は、従来技術に記載されている好適な方法のいずれによっても製造することができる。例えば、代表的な方法は、本発明者らの以前の特許出願ＷＯ９２／２２３３１に記載されている。
【００７０】
通常、アニオン性の多糖は、インスリンの誘導体化前に活性化されている。例えば、反応性のアルデヒド基を有しており、誘導体化反応は還元的条件下で行うことができる。反応性のアルデヒド基は、多糖のヒドロキシル基を制御酸化することによって生成することができる。最も好ましくは、この反応性アルデヒドは予備工程で生成される。この予備工程においては、多糖を制御された酸化条件下で、例えば、水性溶液中過ヨウ素酸ナトリウムを使って反応させる。この工程を行うことが可能な酵素を使うこともできるが、好ましくは、酸化は化学的酸化である。反応性のアルデヒド基は、多糖の非還元末端又は還元末端にあってもよい。インスリン、通常そのＮ末端は、次いで反応性アルデヒド基と反応して付加物、すなわち、還元されるとインスリンのＮ末端誘導体を生じるような付加物を生成することができる。
【００７１】
多糖の活性化は、多糖主鎖の中間部鎖の切断が実質的にないような、すなわち分子量の減少が実質的にないような条件下で行うことが好ましい。酸化剤は好適には過ルテニウム酸塩であるか、又は好ましくは過ヨウ素酸塩である。酸化は、過ヨウ素酸塩を用いて、１ｍＭから１Ｍの範囲の濃度、３から１０の範囲のｐＨ、０から６０℃の範囲の温度で、１分間から４８時間の範囲の時間行うことができる。
【００７２】
誘導体化反応に好適な還元条件は、水素と触媒、又は好ましくはホウ水素化物(borohydride)等の水素化物を利用し得る。これらは固定化してもよい（例えば、Ａｍｂｅｒｌｉ
ｔｅ（商標）−担持型ホウ水素化物）。好ましくは、水素化ホウ素ナトリウム等のアルカリ金属水素化物が、１μＭ〜０．１Ｍの範囲の濃度、４〜１０の範囲のｐＨ、０℃〜６０℃の範囲の温度、及び１分〜７２時間の範囲の期間で、還元剤として使用される。出発原料上のペンダントカルボキシル基が還元されない反応条件が選択される。他の好適な還元剤は、酸性条件下でのシアノホウ水素化物(cyanoborohydride)、例えば、ポリマー担持型シアノホウ水素化物又はアルカリ金属シアノホウ水素化物、Ｌ−アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、Ｌ−セレクトリド、トリアセトキシホウ水素化物等である。
【００７３】
本発明者らの先の特許出願ＷＯ０６／００５４０に記載したような、ＮＨＳなどのペンダント官能基を有するものを含めて、他の活性化された多糖誘導体を本発明で使用することができる。
【００７４】
１つの実施形態では、反応性アルデヒドは多糖の還元末端にあり、非還元末端は、インスリンのペンダント基と反応しないような不動態化されている。
【００７５】
コロミン酸の還元末端の反応性は、タンパク質標的に対しては弱いが、化学的に定義された複合体を製造する際には問題となる。
【００７６】
多糖の還元末端に反応性アルデヒドを有する多糖を調製するのに好適な化学反応は、本発明者らの先の特許出願ＷＯ０５／０１６９７４に記載されている。この方法は、予備的な選択的酸化工程を有し、これに続いて還元が行われ、次いでさらに酸化することで、還元末端にアルデヒドを有しかつ不動態化された非還元末端を有する化合物を生成する。
【００７７】
ＷＯ２００５／０１６９７３は、タンパク質の複合化に有用なポリシアル酸誘導体、特に遊離スルフヒドリル剤を有するポリシアル酸誘導体について記載している。ポリシアル酸化合物は、ヘテロ二官能性試薬と反応して、部位特異的複合化のためのペンダント官能基をスルフヒドリル基に導入する。本発明で使われるアニオン性多糖もまた、このようにしてヘテロ二官能性試薬で誘導体化することができる。
【００７８】
多糖は、インスリンと反応する前に誘導体化することができる。例えば、多糖は、二官能性試薬と反応することができる。
【００７９】
多糖は、予備的反応工程を経ることができ、その工程において、末端の糖上に第一級アミン基、第二級アミン基及びヒドラジンから選択される基が形成される。ここで、末端の糖は好ましくはシアル酸である。次いで、この多糖を二官能性試薬と反応させて反応中間体を形成する反応工程を行う。これについてはＷＯ２００６／０１６１６８にさらに詳しく記載されている。この中間体は次いで、インスリン又はインスリン様ペプチドと反応することができる。二官能性試薬は、先に記述したように一般式Ｚ−Ｒ１−Ｚで表すことができる。
【００８０】
本発明者らは、ある種の反応条件がインスリンのＮ末端における選択的誘導体化を促進することを見出した。Ｎ末端における選択的反応を促進するために、誘導体化反応は酸性
ｐＨの第１の水溶液中で実施すべきであり、得られた多糖誘導体は次いで第１の水溶液よりｐＨが高い第２の水溶液中で精製すべきである。酸性ｐＨとは、７より低い値のｐＨを意味する。通例、第１の水溶液のｐＨは４．０〜６．５、好ましくは４．０〜６．０の範囲であり、第２の水溶液のｐＨは６．５〜９．０、好ましくは６．５〜８．５又は６．５〜８．０の範囲である。誘導体化反応を低ｐＨで行うことによって、選択的誘導体化はタンパク質の中間鎖位置においてよりもＮ末端において促進される。
【００８１】
さらに、本発明者らは、ある種の製剤添加剤を使用すると、選択的で安定な多糖インスリン誘導体の形成が促進されることを見出した。このような製剤添加剤は、１種又は複数のバッファー、安定化剤、界面活性剤、塩、ポリマー、金属イオン、糖、ポリオール又はアミノ酸から選択することができる。これらは、反応媒体に添加してもよいし、又は代替的に安定化剤として最終製品組成物に添加してもよい。
【００８２】
本発明の１つの実施形態では、製剤添加剤はソルビトール、トレハロース又はスクロースである。別の実施形態では、製剤添加剤は非イオン性界面活性剤である。製剤添加剤はまた、ＰＳＡ、ＰＥＧ又はヒドロキシ−β−シクロデキストリンから選択されるポリマーであってもよい。別の実施形態では、製剤添加剤は２価の金属イオンである。好ましい２価の金属イオンとしては、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｓｒ２＋又はＦｅ２＋が挙げられる。
【００８３】
製剤添加剤はバッファーであってもよい。製剤添加剤がバッファーである場合、リン酸ナトリウム又は酢酸ナトリウムであることが好ましい。
【００８４】
本発明の方法において、多糖誘導体の精製は当技術分野で知られている種々の方法を用いて行うことができる。好適な精製法の例としては、ＨＩＣ（疎水的相互作用クロマトグラフィー）、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）及びＩＥＣ（イオン交換クロマトグラフィー）が挙げられる。
【００８５】
分子量分布が広いポリシアル酸の集団は、多分散度がより低い画分、すなわち、平均分子量が異なる画分に分別することができる。分画は、本発明者らの先の特許出願ＷＯ２００５／０１６９７４及びＷＯ２００５／０３１４９に記載されているように、好適な塩基性のバッファーを溶離に用いたアニオン交換クロマトグラフィーで行われることが好ましい。この分画方法は、誘導体に対してと同様、多糖出発物質にとっても好適である。このように、この技術は、本発明の基本的なプロセス工程の前又は後に適用することができる。こうして得られるインスリンの多糖誘導体の多分散度は、１．１未満であることが好ましい。
【００８６】
本発明によるインスリンの誘導体化によって、インスリンの半減期が延長され、安定性が向上し、免疫原性が低減し、かつ／又は溶解性したがって生物学的利用能及び薬物動態特性が制御されるようになる。この新規方法は、モノポリシアリル化インスリン複合体の創製にとって特に重要である。
【００８７】
本発明を実施例１〜６によって、また以下の図面を参照しながら説明する。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】過ヨウ素酸ナトリウムを使ったコロミン酸（大腸菌からのα−２，８結合したポリシアル酸）の酸化を示す図である。
【図２】シアノホウ水素化ナトリウム(sodium cyanoborohydride)でシッフ塩基を選択的に還元して、タンパク質のアミノ基と安定な非可逆的共有結合を形成することを示す図である。
【図３】異なる温度での、２２ｋＤａＣＡＯ−ｒｈ−インスリン複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図４】温度が誘導体化の程度に及ぼす影響を示す図である。
【図５】異なるモル比での、２７ｋＤａＣＡＯ−ｒｈ−インスリン複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図６】モル比が誘導体化の程度に及ぼす影響を示す図である。
【図７】８及び１１ｋＤａＣＡＯ−ｒｈ−インスリン複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図８】８ｋＤａＣＡＯ−ｒｈ−インスリン製剤及びインスリンのＳＥ−ＨＰＬＣを示す図である。
【図９】１０、１５及び２１．５ｋＤａＣＡＯ−インスリン製剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性を示す図である。
【図１０】複合体精製用のＩＥＣ又はＨＩＣカラムを備えた分取ＨＰＬＣの実験装置を示す図である。
【図１１】ＨｉＴｒａｐ  Ｂｕｔｙｌ  ＦＦカラムを使った疎水的相互作用クロマトグラフィーによるＣＡＯ−インスリン複合体の精製を示す図である。
【図１２】例として１３ｋＤａＣＡＯを使ったＨＩＣのピーク２のＣＡＯ−インスリン複合体の、ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＦＦカラムを使ったアニオン交換クロマトグラフィーによる精製を示す図である。
【図１３】１３ｋＤａ及び２７ｋＤａ ＣＡＯ−インスリン複合体の等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲルを示す図である。
【図１４】マウスにおけるＣＡＯ−インスリン複合体のｉｎ  ｖｉｖｏでの結果を示す図である。
【図１５】エドマンアミノ酸分解法の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００８９】
１．タンパク質とコロミン酸の定量
レゾルシノール試薬を用いたポリシアル酸（シアル酸として）の量的評価を、他の文献［Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓら、１９９３年、ＦｅｒｎａｎｄｅｓとＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、１９９６年、１９９７年］に記載されているようなレゾルシノール法［Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ、１９５７年］により実施した。タンパク質は、ＢＣＡ比色法又は２８０ｎｍでのＵＶ吸収法によって測定した。
【００９０】
２．コロミン酸の活性化
新たに調製した０．０２Ｍメタ過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）溶液（８倍モル過剰）を２０℃でＣＡと混合し、この反応混合物を暗所で１５分間磁気攪拌した。次いで、２倍体積のエチレングリコールをこの反応混合物に添加して過剰ＮａＩＯ４を消費し、この混合物を２０℃でさらに３０分間攪拌した。酸化コロミン酸（ＣＡＯ）を、４℃で、０．０１％炭酸アンモニウムバッファー（ｐＨ７．４）に対して長時間（２４ｈ）透析した（分画分子量３．５ｋＤａ透析チューブ）。限外濾過（分画分子量３．５ｋＤａ）を使用して透析チューブからのＣＡＯ溶液を濃縮した。所定の体積まで濃縮した後、濾液を凍結乾燥し、次に使用するまで−４０℃で保管した。あるいは、ＣＡＯをエタノールを用いた沈殿（２回）によって反応混合物から回収した。
【００９１】
３．ＣＡ及び誘導体の酸化状態の決定
２，４ジニトロフェニルヒドラジン（２，４−ＤＮＰＨ）を用いてコロミン酸の酸化度の質的評価を実施した。２，４ジニトロフェニルヒドラジンは、カルボニル化合物との相互作用で難溶性の２，４ジニトロフェニルヒドラゾンを生じる。非酸化物（ＣＡ）／酸化物（ＣＡＯ）を２，４−ＤＮＰＨ試薬（１．０ｍｌ）に添加し、それぞれの溶液を振とう
した後、結晶状の沈殿が認められるまで３７℃で静置した［Ｓｈｒｉｎｅｒら、１９８０年］。ＣＡの酸化の程度（量的）を、アルカリ溶液中でフェリシアン化物イオンが還元されるとフェロシアン化鉄（プルシアンブルー（Persian blue））になることに基づく方法［ＰａｒｋとＪｏｈｎｓｏｎ、１９４９年］を用いて測定し、次いで６３０ｎｍで測定した。この例では、グルコースを標準として使用した。
【００９２】
４．ゲル浸透クロマトグラフィー
コロミン酸の試料（ＣＡとＣＡＯ）を、ＮａＮＯ３（０．２Ｍ）、ＣＨ３ＣＮ（１０％、５ｍｇ／ｍｌ）に溶解し、屈折率を検出する２×ＧＭＰＷＸＬカラムでクロマトグラフィーによる分離を行った（ＧＰＣシステム：ＶＥ１１２１  ＧＰＣ溶媒ポンプ、ＶＥ３５８０  ＲＩ検出器及びＴｒｉｓｅｃ３ソフトウェア（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ）を使った照合）。各試料（５ｍｇ／ｍｌ）は０．４５μｍナイロン膜で濾過し、移動相として０．２Ｍ  ＮａＮＯ３とＣＨ３ＣＮ（１０％）を使って０．７ｃｍ／分で移動させた。
【００９３】
５．コロミン酸の安定性
ＰＥＧ化の化学反応のルールは、ポリシアリル化には適用することができない。なぜならば、これら分子では物理化学的特性が異なるからである。ＰＳＡは酸に不安定なポリマーであり、中性ｐＨ付近において数週間安定である（図３）。図３の結果は、ｐＨ６．０及び７．４においてＣＡＯが８日間安定であること、ｐＨ５．０ではゆっくりと分解する（４８時間後には最初の分子量の９２％）こと、ｐＨ４．０でもゆっくりと分解する（４８時間後には最初の分子量の７０％）ことを示している。ポリシアル酸は高度に親水性であるが、ＰＥＧは両親媒性分子である。ＰＥＧ化に使う条件を用いてポリシアリル化を実施すると、多くの場合タンパク質の凝集及び沈殿が見られる。
【００９４】
６．製剤添加剤を用いたＮ末端タンパク質−ＣＡ複合体の調製
６．１  インスリン−ＣＡ複合体の調製（Ｎ末端法）
インスリン（５８０４Ｄａ）を白色固体として供給した。このインスリンを最小量の１００ｍＭ  ＨＣｌで溶解し、次いで所定のｐＨに調整して氷の上に置いた。複合化のために添加すべきＣＡＯの量は、下式に基づいて算出した。
ＣＡＯの重量＝｛タンパク質の量（ｇ）／（タンパク質の分子量）｝×（ＣＡＯの分子量）×（ＣＡＯのモル過剰）
必要量のＣＡＯを秤量した。ＣＡＯをｐＨ６．０の１０ｍＭ  ＮａＯＡｃに可溶化し、全ＣＡＯが溶解するまでこの混合物を穏やかにボルテックスで撹拌し、次いですべての凝集／沈殿物を除去すべく濾過して新しい容器に入れた。必要量のインスリンタンパク質溶液をこのＣＡＯ溶液に添加して７．５モル過剰（小規模）及び５モル過剰（大規模）のＣＡＯを得、その反応混合物を４±１℃の穏やかな振とう機に置いておくことによって穏やかに混合した。１００ｍｇ／ｍｌ  ＮａＣＮＢＨ３溶液を添加して最終反応混合物において８ｍｇ／ｍｌとなるようにし、穏やかに混合した後、最終反応混合物のｐＨを確認し、場合によって、４±１℃で０．５Ｍ  ＮａＯＨ／ＨＣｌを用いてｐＨを６．０に調整した。最後に、ｐＨ６．０の１０ｍＭのＮａＯＡｃを用いて反応混合物の体積を調整し、反応混合物中のタンパク質濃度を１ｍｇ／ｍｌとした。チューブを密封し、所望の温度（４±１℃）で２４時間攪拌した。適当な方法（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンバッファー、ｐＨ７．４）によって反応を停止し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１８％トリスグリシンゲルを使用）、ＳＥ−ＨＰＬＣ（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２カラム）用に試料を取り出し、反応混合物のｐＨを確認した。すべての沈殿物を取り除くために、ＳＥ−ＨＰＬＣ分析及び精製の前に、反応混合物を１３０００ｒｐｍで５分間遠心した。ＳＥ−ＨＰＬＣ用の好ましいバッファーは、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．９）であった。
【００９５】
６．２  最適化
Ｎ末端誘導体化及び無作為誘導体化のために、インスリン上に一定範囲の分子量を有するＣＡＯ（１０〜３０ｋＤａ）を用いて還元的アミノ化を実施した。複合化反応のためのプロセス変数の範囲を調べた。ＣＡＯ１０〜２０（小規模）及び５〜１０（大規模）モル過剰。試薬＝５０〜１００ｍＭ  ＮａＣＮＢＨ３、反応用バッファー＝１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ５．５〜６．５、温度＝４±１℃、時間＝１６〜２４時間など。
【００９６】
最適反応条件は以下の通りであることが分かった。ＣＡＯ＝７．５（小規模）及び５（大規模）モル過剰、試薬＝５０ｍＭ  ＮａＣＮＢＨ３、反応用バッファー＝１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ５．５、温度＝４±１℃、時間＝２４時間。
【００９７】
６．３  インスリン−ＣＡ複合体（Ｎ末端法）の精製及び特性評価
前記混合物から遊離ＣＡＯを除去するために、ＨＩＣ（ＨｉＴｒａｐ  Ｂｕｔｙｌ  ＦＦ）を使用した。インスリン反応混合物を、濃縮（ＮＨ４）２ＳＯ４（例えば３Ｍ）、２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．４）を用いた最小限の体積で希釈してローディング溶液を調製し、ローディング溶液の（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度を０．８Ｍとする。ｐＨが７．４であるかどうか確認するか、０．５Ｍ  ＨＣｌ／ＮａＯＨで調整する。このローディング溶液は０．２μｍ膜フィルターで濾過する必要がある。
【００９８】
この溶液を、予めＨＩＣバッファーＢ（２０ｍＭリン酸ナトリウム＋０．８Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７．４）で平衡化したＨＩＣカラム（流速＝０．５ｍｌ／分）にローディングする。ローディング画分を回収して（各画分１．５カラム体積）標識し（Ｌ１〜Ｌｘ）、次いでカラムをＨＩＣバッファーＢで洗浄し（少なくとも５カラム体積、流速＝０．５ｍｌ／分、１．５カラム体積画分）、画分を回収して標識した（Ｗ１〜Ｗｘ）。ＨＩＣバッファーＡ（１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．４）（流速＝５ｍｌ／分）で生成物を溶出して、画分を回収して（１カラム体積画分、６カラム体積）標識した（Ｅ１〜Ｅｘ）。連続した２つの画分がタンパク質を含んでいない場合（ＵＶ２８０ｎｍ）には、次の工程を実施した。精製の間、試料は氷の上で保持した。タンパク質濃度をＵＶ（２８０ｎｍ）で分析した（インスリン１ｍｇ／ｍｌの吸光係数は２８０ｎｍで約１．０４３であった）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥ−ＨＰＬＣ用に試料を取った。
【００９９】
タンパク質画分を含有するＨＩＣ画分を、ＩＥＣバッファーＡ（２０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．４）で洗浄する。硫酸アンモニウムが存在していれば、Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０（ＭＷ：５Ｋｄ）で除去する。ｐＨを確認し、必要であればｐＨ７．４に調整する。予めＩＥＣバッファーＡで平衡化しておいたＩＥＣカラムにロードする。下記のようにしてグラジエントシステムを適用した。
【０１００】
ローディング：ＩＥＣバッファーＡ中の注入試料を０．２５ｍｌ／分でロード、３ＣＶで洗浄
洗浄：グラジエントシステム：ＩＥＣバッファーＡ：９０％、ＡＥＸバッファーＢ（２０ｍＭリン酸バッファー＋１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）：１０％、５ＣＶでグラジエント及び３ＣＶで洗浄、流速：０．２５ｍｌ／分
ＩＥＣバッファーＡ：６８％、ＩＥＣバッファーＢ：３２％、５ＣＶでグラジエント及び３ＣＶで洗浄、流速：０．２５ｍｌ／分
ＩＥＣバッファーＡ：３５％、ＩＥＣバッファーＢ：６５％、５ＣＶでグラジエント及び３ＣＶで洗浄、流速：０．２５ｍｌ／分
ＩＥＣバッファーＡ：０％、ＩＥＣバッファーＢ：１００％、５ＣＶでグラジエント及び３ＣＶで洗浄、流速：０．２５ｍｌ／分
精製複合体を含有するＩＥＣ画分を合わせ、バッファーをＰＢＳバッファーに変えて洗浄し塩を除去する。塩除去後のｐＨを７．４に調整する。次いで、溶液を４±１℃で濃縮し、タンパク質濃度をＵＶ分光法（２８０ｎｍ）で分析した。複合体を滅菌濾過し、活性
測定用及びＳＤＳ−ＰＡＧＥとＳＥ−ＨＰＬＣによる特性評価用に試料を取った。必要に応じて、アリコートをタンパク質定量及びＣＡ定量用に取り除いた。残りは、再び使用するまで、またＳＥ−ＨＰＬＣによる物理的安定性を調べるまで４±１℃で保管した。
【０１０１】
溶液中のインスリンの安定性に及ぼす様々なプロセスの影響及び誘導体化の程度を調べた。
【０１０２】
６．４  インスリン−１４ｋＤａＣＡ複合体（単分散）の調製
インスリン（５８０８Ｄａ）を白色固体として供給した。このインスリンを、最小限量の１００ｍＭ  ＨＣｌを添加して溶解し、所与のｐＨに調整して、氷上に置いた。複合化のために添加する１４ｋＤａ  ＣＡの量は、下式に基づいて算出した。
１４ｋＤａＣＡＯの重量＝｛タンパク質の量（ｇ）／（タンパク質の分子量）｝×（ＣＡＯの分子量）×（ＣＡＯのモル過剰）
１４ｋＤａ  ＣＡＯの必要量を秤量した。１４ｋＤａ  ＣＡＯを、１０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ６．０に可溶化し（最終反応体積の２０％体積をここで使用した）、すべての１４ｋＤａ  ＣＡＯが溶解するまでこの混合物を穏やかにボルテックス撹拌し、次いですべての凝集／沈殿物を除去すべく濾過して新しい容器に入れた。必要量のインスリンタンパク質溶液をこの１４ｋＤａ  ＣＡＯ溶液に添加して７．５モル過剰（小規模）及び５モル過剰（大規模）の１４ｋＤａ  ＣＡＯを得、その反応混合物を４±１℃の穏やかな振とう機に置いておくことによって穏やかに混合した。１００ｍｇ／ｍｌ  ＮａＣＮＢＨ３溶液を添加して最終反応混合物において６３．５ｍＭ又は４ｍｇ／ｍｌとなるようにし、穏やかに混合した後、最終反応混合物のｐＨを確認し、場合によって、４±１℃の０．５Ｍ  ＮａＯＨ／ＨＣｌでｐＨを６．０に調整した。最後に、ｐＨ６．０の１０ｍＭのＮａＯＡｃを使って反応混合物の体積を調整し、反応混合物中のタンパク質濃度を１ｍｇ／ｍｌとした。チューブを密封し、所望の温度（４±１℃）で２４時間攪拌した。適当な方法によって反応を停止し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１８％トリスグリシンゲルを使用）、ＳＥ−ＨＰＬＣ（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２カラム）用に試料を取り出し、反応混合物のｐＨを確認した。すべての沈殿物を取り除くために、ＳＥ−ＨＰＬＣ分析及び精製の前に、反応混合物を１３０００ｒｐｍで５分間遠心した。ＳＥ−ＨＰＬＣ用の好ましいバッファーは、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．９）であった。
【０１０３】
６．５  最適化
Ｎ末端誘導体化及び無作為誘導体化のために、インスリン上に一定範囲の分子量を有するＣＡ（１０〜３０ｋＤａ）を用いて還元的アミノ化を実施した。複合化反応のためのプロセス変数の範囲を調べた。ＣＡＯ  １０〜２０（小規模）及び５〜１０（大規模）モル過剰。試薬＝５０〜１００ｍＭ  ＮａＣＮＢＨ３、反応用バッファー＝１０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ５〜７．４、温度＝４〜３７±１℃、時間＝１６〜２４時間など。
【０１０４】
最適反応条件は以下の通りであることが分かった。ＣＡＯ＝７．５（小規模）及び５（大規模）モル過剰、試薬＝６３．５ｍＭ  ＮａＣＮＢＨ３（４ｍｇ／ｍｌ）、反応用バッファー＝１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ６．０、温度＝４±１℃、時間＝２４時間。
【０１０５】
６．６  インスリン−ＣＡ複合体（Ｎ末端法）の精製及び特性評価
混合物から遊離ＣＡＯを除去するために、ＨＩＣを使用した。インスリン反応混合物を、濃縮（ＮＨ４）２ＳＯ４（例えば３Ｍ）、２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．４）を使った最小限の体積で希釈してローディング溶液を調製し、ローディング溶液の（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度を０．８Ｍとする。ｐＨが７．４であるかどうか確認し、７．４でなければ０．５Ｍ  ＨＣｌ／ＮａＯＨで調整する。このローディング溶液は０．２μｍ膜フィルターで濾過する必要がある。
【０１０６】
この溶液を、予めＨＩＣバッファーＢ（２０ｍＭリン酸ナトリウム＋０．８Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７．４）で平衡化したＨＩＣカラム（流速＝０．５ｍｌ／分）にロードする。ローディング画分を回収して（各画分１．５カラム体積）標識する（Ｌ１〜Ｌｘ）。次いでカラムをＨＩＣバッファーＢで洗浄し（少なくとも５カラム体積、流速＝０．５ｍｌ／分、１．５カラム体積画分を回収）、画分を回収して標識する（Ｗ１〜Ｗｘ）。ＨＩＣバッファーＡ（１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．４）（流速＝５ｍｌ／分）で生成物を溶出して、画分を回収して（１カラム体積画分、６カラム体積）標識する（Ｅ１〜Ｅｘ）。連続した２つの画分がタンパク質を含んでいない（ＵＶ２８０ｎｍ）場合には、次の工程を実施した。精製の間、試料は氷の上で保持した。タンパク質濃度をＵＶ（２８０ｎｍ）で分析した（１ｍｇ／ｍｌのインスリンの吸光係数は２８０ｎｍで約１．０４３であった）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥ−ＨＰＬＣ用に試料を取った。
【０１０７】
タンパク質画分を含有するＨＩＣ画分を、ＩＥＣバッファーＡ（２０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．４）で洗浄する。硫酸アンモニウムが存在していれば、Ｖｉｖａｓｐｉｎ
２０（ＭＷ：５Ｋｄ）で除去する。ｐＨを確認し、必要であればｐＨ７．４に調整する。予めＩＥＣバッファーＡで平衡化しておいたＩＥＣカラムにロードする。下記のようにしてグラジエントシステムを適用した。
【０１０８】
ローディング：ＩＥＣバッファーＡ中の注入試料を０．２５ｍｌ／分でロード、３ＣＶで洗浄
洗浄：グラジエントシステム：ＩＥＣバッファーＡ：９０％、ＡＥＸバッファーＢ（２０ｍＭリン酸バッファー＋１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）：１０％、５ＣＶでグラジエント及び３ＣＶで洗浄、流速：０．２５ｍｌ／分
ＩＥＣバッファーＡ：６８％、ＩＥＣバッファーＢ：３２％、５ＣＶでグラジエント及び３ＣＶで洗浄、流速：０．２５ｍｌ／分
ＩＥＣバッファーＡ：３５％、ＩＥＣバッファーＢ：６５％、５ＣＶでグラジエント及び３ＣＶで洗浄、流速：０．２５ｍｌ／分
ＩＥＣバッファーＡ：０％、ＩＥＣバッファーＢ：１００％、５ＣＶでグラジエント及び３ＣＶで洗浄、流速：０．２５ｍｌ／分
精製複合体を含有するＩＥＣ画分を併せ、バッファーをＰＢＳバッファーに変えて洗浄し塩を除去する。塩除去後のｐＨを７．４に調整する。次いで、溶液を４±１℃で濃縮し、タンパク質濃度をＵＶ分光法（２８０ｎｍ）で分析する。複合体を滅菌濾過し、活性測定用及びＳＤＳ−ＰＡＧＥとＳＥ−ＨＰＬＣによる特性評価用に試料を取った。必要に応じて、アリコートをタンパク質定量及びＣＡ定量用に取り除いた。残りは、再び使うまで、またＳＥ−ＨＰＬＣによる物理的安定性を調べるまで４±１℃で保管した。
【０１０９】
溶液中のインスリンの安定性に及ぼす様々なプロセスの影響及び誘導体化の程度を調べた。
【０１１０】
６．７  インスリン製剤のＳＥ−ＨＰＬＣ
４℃で冷蔵されたＪａｓｃｏ  ＡＳ−２０５７  ｐｌｕｓオートサンプラー、Ｊａｓｃｏ  ＵＶ−９７５  ＵＶ／ＶＩＳ検出器を装備したＬｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ（ＪＡＳＣＯ）でＨＰＬＣを実施した。データは、ＩＢＭ／ＰＣでＥＺｃｈｒｏｍ
Ｅｌｉｔｅソフトウェアを使って記録した。ＳＥＣ試料を、０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．９の均一濃度の移動相を用いて、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２カラムで分析した（図８）。図８は、インスリンに起因すると考えられる、ＲＴ＝７５．４０８におけるただ１つのピークを示す。
【０１１１】
６．８  ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動とウェスタンブロット
１８％トリグリインゲル(triglyine gel)を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。試料を
還元又は非還元バッファーのいずれかで希釈し、タンパク質５．０μｇを各ウェルにロードした。ゲルをトリグリセリン緩衝系で泳動し、クーマシーブルーで染色した（図５及び７）。抗ＰＳＡ抗体を使ってウェスタンブロットを行った。図４は、インスリン製剤（部位特異的、Ｎ−末端）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【０１１２】
６．９  ２７及び１３ｋＤａＣＡＯ−インスリンの等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲル
Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＩＥＦゲルを用いて、インスリンとＣＡＯ−インスリン複合体等電点の差を測定した。試料を溶解して０．５ｍｇ／ｍｌ濃度とした。５μｌの試料を５μｌのＮｏｖｅｘ  ＩＥＦ試料バッファー、ｐＨ３〜１０で希釈した後、タンパク質試料をゲルにロードした。
【０１１３】
６．１０  安定性の研究
滅菌インスリン複合体をＰＢＳバッファー中、４℃で、６週間保管した。試料の未変性ＰＡＧＥを毎週行った。
【０１１４】
６．１１  インスリン製剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性
インスリン製剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性を、雌ＣＤ−１マウス、７〜８週齢で調べた。０．３  ＩＵのタンパク質量（同一の活性）をマウスに皮内注射した。マウスは４匹ずつ７群に分け、インスリン製剤を、各群の各マウスに下記のように投与した。インスリン（０．３  ＩＵ／マウス）、Ｌａｎｔｕｓ（Ａｖｅｎｔｉｓ）インスリン−ＰＳＡ複合体（１４ｋＤａ）、ＰＢＳ。各マウスから血液１滴を取り、血中グルコースをアキュチェックアクティブ（ＡＣＣＵ−ＣＨＥＫ  Ａｃｔｉｖｅ）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で測定した。
【０１１５】
結果
ＣＡの活性化及び酸化度の測定
Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）残基の線状α−２，８結合ホモポリマーであるコロミン酸（ＣＡ）を使用した。２０ｍＭ過ヨウ素酸塩を用いて、コロミン酸の酸化曝露を室温で１５分間実施した。過ヨウ素酸塩処理後の内部α−２，８結合Ｎｅｕ５Ａｃ残基の完全性を、ゲル浸透クロマトグラフィーで分析し、酸化（ＣＡＯ）物質に関して得られたクロマトグラフを、未酸化ＣＡのクロマトグラフと比較した。酸化ＣＡ及び未酸化ＣＡはほぼ一致した溶離プロファイルを呈していることが分かったが、連続する酸化工程がポリマー鎖の著しい開裂を引き起こしているという証拠はない。
【０１１６】
グルコースを標準として使い、アルカリ溶液中でフェリシアン化物イオンを還元してフェロシアン化物（プルシアンブルー）［ＰａｒｋとＪｏｈｎｓｏｎ、１９４９年］とすることによって、ＣＡの酸化状態の定量を行った。コロミン酸が、化学量論（＞１００％）量の還元剤より多くの量の還元剤、すなわち還元末端ヘミケタールと導入アルデヒド（もう一方の末端）の還元力を併せた還元力を含む、１１２ｍｏｌ％の見かけのアルデヒド含量を有していることが分かった。
【０１１７】
ポリシアル化反応の最適化
温度、反応剤モル比、及び鎖長を変えながら、ＣＡＯとｒｈ−インスリン１ｍｇを使ってポリシアル化条件を最適化した。結果を図５〜１２に示す。４℃は、ＣＡＯとインスリンの反応の間の安定性に関して最適な温度であるように思われる。しかし、これより高い温度では、複合化がより大きくなり、ＣＡＯのインスリンに対するモル比が７．５：１でより効果的になることができる。
【０１１８】
表１は、モル比がポリシアリル化に及ぼす影響を示す。
【０１１９】
【表１】
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【０１２０】
ＰＢＳコントロールの影響下、図９で使用した複合体の中では、２１．５ｋｄのＣＡＯ−インスリンがマウスの血中グルコースの低下に最も有意な影響を及ぼした。
【０１２１】
表２は、異なる鎖長を有するＣＡＯ−インスリン複合体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性についてのｔ検定（統計解析、対応のある検定）を示す。
【０１２２】
【表２】
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【０１２３】
アスタリスクは、Ｔｒｉｓバッファーに対して群間の差が生じる確率を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１
【０１２４】
【表３】
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【０１２５】
アステリスクは、ＰＢＳバッファーに対して群間の差が生じる確率を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１
１５ｋＤａ  ＣＡＯ−インスリンのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性に及ぼすｐＨの影響から、ｐＨ６．０の方がｐＨ７．４よりもより有効であることが分かった。したがって、以後の実験はｐＨ６．０で実施した。ペプチドマッピング及びエドマン分解からのデータによって、ｐＨ６．０のポリシアル化条件で得られた複合体が、インスリンＢ鎖においてＮ末端で特異的にブロックされることが確認された。
【０１２６】
インスリン複合体の調製、精製及び特性評価
単分散ＣＡＯ−インスリンをうまく複合化することができ、高度に純粋な複合体をスケールアップＨＩＣ及びＩＥＣによって精製することができた。精製効率は、図１０に明示するようなＩＥＣ及びＨＩＣを分取ＨＰＬＣ機器と組み合わせた装置によって向上した。
【０１２７】
低ｐＨ値（ｐＨ６．０）、４±１℃の温度で反応を行うことによって、Ｎ末端選択的な方法でインスリンのコロミン酸（ＣＡ）複合体を調製及び精製する手順については、先に詳しく述べている。この手順は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下で複合化し、次いで疎水的相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて精製することで遊離ＣＡを除去し（図１１）、その後イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）によってインスリンを除去する（図１２）というものである。インスリンＢ鎖のＮ末端（ＰｈｅＢ１）における選択的誘導体化に有利なように、また、反応時のインスリンの凝集を最小限に抑えるために、低ｐＨとした。最終反応バッファーの組成は、ｐＨ６．０の１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ中、１ｍｇ／ｍｌインスリン、８ｍｇ／ｍｌ  ＮａＣＮＢＨ３、及び５モル過剰ＣＡＯであった。
【０１２８】
図１３の、１３Ｋｄａ及び２７Ｋｄａ  ＣＡＯ−インスリン複合体の等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲルは、ポリシアリル化インスリンが一定の等電点（ｐＩ）を有していないことを示している。
【０１２９】
インスリン−ＣＡＯ複合体の形成及び安定性は、ＳＥ−ＨＰＬＣ（インスリンと比較したインスリン−ＰＳＡの保持時間の変化、両部分の共溶出）、イオン交換クロマトグラフィー（複合体をＩＥＣカラムに結合する）及びポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、高分子量種を含むバンドをシフトさせる）により確認された。
【０１３０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ効率（ＣＤ−１マウス、平均２５ｇ）で使用したインスリン複合体は、インスリンに比べて優れたｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性（延長）及び平滑（ピークが見られないプロファイル）を示した。図１４で明らかなように、複合体の血中グルコース低減能の延長は、製剤で用いたポリマーの鎖長に比例していた。
【０１３１】
２７ｋＤａ  ＣＡＯ−インスリン複合体の安定性調査では、未変性ＰＡＧＥによる観察に基づき、４℃で４０日間の保管の間に分解がなかったことが示された。
【０１３２】
スケールアップ調製及び精製による１４ｋＤａ−インスリン複合体の特性評価
７００ｍｇの出発反応物としてのインスリンの例では、スケールアップカラム精製を使って２３０ｍｇの１４ｋＤａ  ＣＡＯ−インスリン（タンパク質重量）を得た。
【０１３３】
クロマトグラムを比較すると、図１５のアミノ酸量の変化によって、Ｎ末端のアミノ酸が明らかになる。ｐＨ７．４のＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍＬ水性試料を水で１００倍に希釈した。この希釈溶液２μＬを分析用に取った。結論として、配列Ｇ−Ｉ−Ｖ−Ｅは、インスリンＡ鎖であると同定される。アミノ酸Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ａｓｎ／Ｇｌｎが欠けていることによって、インスリンＢ鎖がＮ末端でブロックされていることが示された。
【０１３４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ活性検定において、ＰＳＡ複合体が活性であることが判明した。ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性の調査によれば、ＰＳＡ−インスリン複合体がインスリンよりはるかに優れていることは明らかである。
【０１３５】
参考文献
【０１３６】
【表４】
0005586669.tif 000007
0005586669.tif 000008
【図１】
0005586669.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
0005586669.tif 000024
【図１５】
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【配列表】
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