(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験管内で少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞を生成して増殖させる方法であって、
（ａ）ヒト胚芽由来細胞の胚様体への分化を誘導するのに十分な量の血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、骨形態形成蛋白質４（ＢＭＰ−４）又はその両者の存在下に無血清培地中でヒト胚芽由来細胞を含む細胞培養物を培養する段階と、
（ｂ）胚様体を含む前記培養物に成長因子を添加して無血清培地中で前記培養物を培養し続ける段階であって、前記成長因子は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、骨形態形成蛋白質４（ＢＭＰ−４）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３Ｌ（ＦＬ）およびトロンボポエチン（ＴＰＯ）の組み合わせであり、前記成長因子は、前記胚様体培養物中で少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞を増殖させるのに十分な量に添加される段階と、
（ｃ）前記胚様体を単一細胞に解体させる段階と、
（ｄ）前記単一細胞を含む前記培養物に成長因子を添加して無血清培地中で培養する段階であって、前記成長因子は、インスリン、トランスフェリン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）および骨形態形成蛋白質４（ＢＭＰ−４）の組み合わせであり、前記成長因子は、前記単一細胞を含む前記培養物中で少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞を増殖させるのに十分な量に添加される段階と、を含み、
前記胚芽由来細胞、胚様体及び少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞は、この方法の段階（ａ）〜（ｄ）の全般にわたって無血清培地中で成長させられる方法。
【請求項２】
前記胚芽由来細胞が胚芽幹細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記段階（ｂ）および（ｄ）がホメオボックス蛋白質またはその機能性変異体または活性変異体を含む蛋白質を添加することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ホメオボックス蛋白質がＨＯＸＢ４蛋白質またはその機能性変異体または活性変異体を含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）または骨形態形成蛋白質４（ＢＭＰ−４）または両者を細胞培養０〜４８時間以内に前記段階（ａ）に添加する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３Ｌ（ＦＬ）またはトロンボポエチン（ＴＰＯ）またはこれらの任意の組合わせを段階（ａ）開始時点から４８〜７２時間以内に前記培養物に添加する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記成長因子を段階（ａ）開始時点から４８〜７２時間以内に段階（ｂ）に添加する請求項３または４に記載の方法。
【請求項８】
前記成長因子を段階（ａ）開始時点から４８〜７２時間以内に培養段階（ｂ）に添加する請求項４に記載の方法。
【請求項９】
段階（ｂ）にエリスロポエチン（ＥＰＯ）を添加する段階をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記培養物から前記少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞を精製する段階をさらに含む請求項１乃至２のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞を精製する段階は、抗−ＣＤ７１抗体を使用した免疫親和性カラムクロマトグラフィーを利用する段階を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記培養物から前記少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞を分離する段階をさらに含む請求項１乃至２のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞を分離する段階は、大きさ及び／または形態で前記少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞を分離する段階を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記段階（ｂ）および（ｄ）がＨＯＸＢ４と蛋白質伝達ドメイン（ＰＴＤ）とを含む融合蛋白質を添加することをさらに含む請求項３または４に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＰＴＤと前記ＨＯＸＢ４とがリンカーにより接合される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記蛋白質伝達ドメイン（ＰＴＤ）がＴＡＴ蛋白質、その機能性変異体または活性断片である請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＨＯＸＢ４がほ乳動物ＨＯＸＢ４である請求項４に記載の方法。
【請求項１８】
前記ほ乳動物ＨＯＸＢ４がマウスまたはヒトＨＯＸＢ４である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ほ乳動物ＨＯＸＢ４がヒトＨＯＸＢ４である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＨＯＸＢ４が全長蛋白質を含む請求項４に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＨＯＸＢ４が配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列を含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＴＡＴ蛋白質が配列番号１４のアミノ酸配列を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＰＴＤが配列番号１４のアミノ酸配列を有する１つ以上のＴＡＴポリペプチドコピーを含む請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
ヒト胚芽由来細胞を含む前記細胞培養物は、ヒト胚芽幹細胞のライブラリーから由来し、前記ヒト胚芽幹細胞のライブラリーは、各々ヒト集団に存在する少なくとも１つのＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合性または同型接合性である幹細胞を含み、前記幹細胞ライブラリーの各構成員は、前記ライブラリーの残りの構成員に対する異なるセットのＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合性または同型接合性であり、前記方法は、各々ヒト集団に存在する少なくとも１つのＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合性または同型接合性である少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞のライブラリーを生成し、前記幹細胞ライブラリーの各構成員は、前記ライブラリーの残りの構成員に対する異なるセットのＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合性または同型接合性である請求項１乃至２のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ヒト胚芽幹細胞のライブラリーは、ヒト集団に存在するあらゆるＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合性または同型接合性である幹細胞を含み、前記方法は、ヒト集団に存在するあらゆるＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合性または同型接合性である少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞を含む少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞のライブラリーを生成する請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞のヒト造血母細胞への分化を誘導するのに適切な条件下に前記少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞を培養する段階をさらに含む請求項１乃至２のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞のヒト内皮細胞への分化を誘導するのに適切な条件下に前記少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞を培養する段階をさらに含む請求項１乃至２のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記条件は、フィブロネクチンでコーティングされた培養プレート上で前記少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞を培養することを含む請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記培養物は、少なくとも１×１０６個の少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞を含む請求項１乃至２のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記培養物は、少なくとも２×１０６個の少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記培養物は、少なくとも３×１０６個の少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記培養物は、少なくとも４×１０６個の少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞を含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
その投与が必要な患者に投与するための、請求項１〜３２のうちいずれか１項に記載の方法で製造された少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞を含む組成物。
【請求項３４】
請求項３３に記載の組成物であって、前記少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞は、少なくとも細胞数１０，０００個の量である組成物。
【請求項３５】
前記少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞は、細胞数１０，０００〜４，０００，０００個の量である請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
その投与が必要な患者に投与するための、請求項１ないし３２のうち、いずれか１項に記載の方法で製造された少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞を分化させたヒト造血母細胞を含む、組成物。
【請求項３７】
前記少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞は、少なくとも細胞数１０，０００個の量である、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞は、細胞数１０，０００〜４，０００，０００個の量である請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
その投与が必要な患者に投与するための、請求項１ないし３２のうち、いずれか１項に記載の方法で製造された少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞を分化させたヒト内皮細胞を含む、組成物。
【請求項４０】
前記少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞は、少なくとも細胞数１０，０００個の量である請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞は、細胞数１０，０００〜４，０００，０００個の量である請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
治療が必要な患者の造血母細胞疾患を治療するための、請求項１ないし３２のうち、いずれか１項に記載の方法で製造された少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞を分化させたヒト造血母細胞を含む組成物。
【請求項４３】
治療が必要な患者の造血母細胞疾患を治療するための請求項４２に記載の組成物であって、前記ヒト造血母細胞が、少なくとも細胞数１０，０００個の量の、少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞を分化させたものである、組成物。
【請求項４４】
前記少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞は、細胞数１０，０００〜４，０００，０００個の量である請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
治療が必要な患者の内皮細胞疾患を治療するための、請求項１ないし３２のうち、いずれか１項に記載の方法で製造された少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞を分化させたヒト内皮細胞を含む組成物。
【請求項４６】
治療が必要な患者の内皮細胞疾患を治療するための、請求項４５に記載の組成物であって、前記ヒト内皮細胞が少なくとも細胞数１０，０００個の量の、少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞を分化させたものである、組成物。
【請求項４７】
前記少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞は、細胞数１０，０００〜４，０００，０００個の量である請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記内皮細胞疾患は、心筋梗塞、脳卒中、アテローム性動脈硬化症及び虚血で構成された群から選択される請求項４６または４７に記載の組成物。
【請求項４９】
前記虚血は、脳、四肢、心臓、肺、皮膚及び目で発生する請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
試験管内でヒト造血母細胞を生成する方法であって、
（ａ）請求項１乃至３１のうち、いずれか１項に記載の方法で製造された少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞を供給する段階と、
（ｂ）前記少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞のヒト造血母細胞への分化を誘導するのに適切な条件下に前記少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞を成長させる段階と、を含む方法。
【請求項５１】
試験管内でヒト内皮細胞を生成する方法であって、
（ａ）請求項１乃至３２のうち、いずれか１項に記載の方法で製造された少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞を供給する段階と、
（ｂ）前記少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞のヒト内皮細胞への分化を誘導するのに適切な条件下に前記少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞を成長させる段階と、を含む方法。
【請求項５２】
請求項２４または２５に記載の方法で製造された少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞のライブラリー。
【請求項５３】
少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞をヒト造血母細胞、内皮細胞または両者に分化する方法であって、
（ａ）前記患者の細胞表面上に発現されたＭＨＣ蛋白質を確認する段階と、
（ｂ）請求項５２に記載の少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞のライブラリーを提供する段階と、
（ｃ）前記患者の細胞上の該患者のＭＨＣ蛋白質と符合する少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞を選別する段階と、
（ｄ）段階（ｃ）で確認された前記少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞をヒト造血母細胞、内皮細胞または両者に分化させる段階と、
を含む方法。
【請求項５４】
地域センター（ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ）で行われる請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記地域センターが病院である請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記蛋白質を段階（ｂ）の全般にわたって複数回、段階（ｂ）の前記培養物に添加する請求項３または４に記載の方法。
【請求項５７】
前記蛋白質を段階（ｂ）及び（ｄ）の全般にわたって複数回、段階（ｂ）及び（ｄ）の前記培養物に添加する請求項３または４に記載の方法。
【請求項５８】
前記蛋白質を１日１回添加する請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記蛋白質を２日に１回添加する請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項６０】
請求項１に記載の方法で製造された分離された少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞。
【請求項６１】
請求項２に記載の方法で製造された分離された少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞。
【請求項６２】
供与体同種移植片に対して人間受容者の耐性を誘導する薬剤キットであって、
（ａ）Ｔ細胞補助刺激を抑制する製剤と、
（ｂ）請求項１に記載の方法で生成された少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞であって、供与者に対して符合する前記少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞と、
を含む薬剤キット。
【請求項６３】
Ｔ細胞補助刺激を抑制する製剤がＣＤ４０配位子−ＣＤ４０相互作用を抑制する製剤である請求項６２に記載の薬剤キット。
【請求項６４】
ＣＤ２８−Ｂ７相互作用を抑制する製剤をさらに含む請求項６２に記載の薬剤キット。
【請求項６５】
胸腺放射線照射またはＴ細胞枯渇若しくは不活性化による治療を受けていない前記受容者の治療のための請求項６２ないし６４のうち、いずれか１項に記載の薬剤キット。
【請求項６６】
胸腺放射線照射による治療を受けている前記受容者の治療のための請求項６２ないし６４のうち、いずれか１項に記載の薬剤キット。
【請求項６７】
Ｔ細胞を枯渇させるか、不活性化させる治療を受けている前記受容者の治療のための請求項６２ないし６４のうち、いずれか１項に記載の薬剤キット。
【請求項６８】
Ｔ細胞を枯渇させるか、不活性化させる治療及び胸腺放射線照射による治療を受けている前記受容者の治療のための請求項６２ないし６４のうち、いずれか１項に記載の薬剤キット。
【請求項６９】
胸腺内空間を形成させ、及び、供与者反応性Ｔ細胞を枯渇させるか、不活性化させた人間受容者において、供与体同種移植片に対する該受容者の耐性を誘導するための、請求項１に記載の方法で生成された少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞を含む薬剤であって、前記少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞は、前記供与者に対して符合しており、
前記少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞は、前記同種移植片に対して受容者の耐性を誘導する、上記薬剤。
【請求項７０】
前記胸腺内空間は、胸腺放射線照射、ステロイド、コルチコステロイド、ブレキナー及び免疫抑制化学物質または薬物で構成された群から選択される少なくとも１種の処理を前記受容者に実施して形成されたものである、請求項６９に記載の薬剤。
【請求項７１】
前記胸腺内空間は、前記受容者に胸腺放射線照射を実施して形成されたものである、請求項７０に記載の薬剤。
【請求項７２】
前記胸腺内空間は、前記受容者に免疫抑制化学物質または薬物を投与して形成されたものである、請求項７０に記載の薬剤。
【請求項７３】
前記胸腺内空間は、前記受容者にシクロスポリンを投与して形成されたものである、請求項７０に記載の薬剤。
【請求項７４】
前記薬剤キットまたは少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞に、少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞の複数回投与量が含まれる請求項６２に記載の薬剤キットまたは６９に記載の薬剤。
【請求項７５】
前記耐性は、全身放射線照射により形成された造血空間なしに誘導される請求項６２に記載の薬剤キットまたは６９に記載の薬剤。
【請求項７６】
前記少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞と前記同種移植片は、同じ供与者から得る請求項６２に記載の薬剤キットまたは６９に記載の薬剤。
【請求項７７】
前記少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞と前記同種移植片は、互いに異なる供与者から得る請求項６２に記載の薬剤キットまたは請求項６９に記載の薬剤。
【請求項７８】
輸血への利用のための、試験管内で少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞から分化された造血細胞を含む組成物であって、前記造血細胞が、
（ａ）ヒト胚芽由来細胞の胚様体への分化を誘導するのに十分な量の血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、骨形態形成蛋白質４（ＢＭＰ−４）又はその両者の存在下にヒト胚芽由来細胞を含む細胞培養物を培養し、
（ｂ）胚様体を含む前記培養物に、前記胚様体培養物中で少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞を増殖させるのに十分な量で、成長因子を添加し、ここで、前記成長因子が、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、骨形態形成蛋白質４（ＢＭＰ−４）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３Ｌ（ＦＬ）およびトロンボポエチン（ＴＰＯ）の組み合わせであり、
（ｃ）前記胚様体を単一細胞に解体させ、
（ｄ）前記単一細胞を含む培養物に、前記単一細胞を含む培養物中で少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞を増殖させるのに十分な量で、成長因子を添加し、ここで、前記成長因子が、インスリン、トランスフェリン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）および骨形態形成蛋白質４（ＢＭＰ−４）の組み合わせであり、
（ｅ）前記少なくとも二分化性の血管コロニー形成細胞を分化された造血細胞に分化させること
により作成される、上記組成物。
【請求項７９】
前記胚芽由来細胞、胚様体及び少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞を段階（ａ）〜（ｄ）全般にわたって無血清培地中で成長させる請求項７８に記載の組成物。
【請求項８０】
前記段階（ｂ）および（ｄ）がホメオボックス蛋白質またはその機能性変異体または活性断片を含む蛋白質を添加することをさらに含む請求項７８に記載の組成物。
【請求項８１】
前記ホメオボックス蛋白質がＨＯＸＢ４蛋白質またはその機能性変異体または活性変異体を含む請求項８０に記載の組成物。
【請求項８２】
前記胚芽由来細胞が胚芽幹細胞である請求項７８に記載の組成物。
【請求項８３】
前記分化された造血細胞は単一細胞類型として生成される請求項７８ないし８２のうち、いずれか１項に記載の組成物。
【請求項８４】
前記単一細胞類型が赤血球、血小板または食細胞の中から、選択される請求項８３に記載の組成物。
【請求項８５】
前記食細胞が顆粒球、好中球、好塩球、好酸球、リンパ球または単核球の中から、選択される請求項８４に記載の組成物。
【請求項８６】
前記赤血球がヘモグロビンＦを発現する請求項８４に記載の組成物。
【請求項８７】
前記単一細胞類型は、血液で発見される分化された細胞類型の比率とほぼ同一に混合されており、血液で発見される分化された細胞類型の比率は赤血球９６％、血小板１％及び食細胞３％である請求項８３に記載の組成物。
【請求項８８】
複数の分化された造血細胞類型が同一段階で生成される請求項７８ないし８２のうち、いずれか１項に記載の組成物。
【請求項８９】
前記複数の分化された造血細胞類型が赤血球、血小板または食細胞の中から、選択される請求項８８に記載の組成物。
【請求項９０】
前記食細胞が顆粒球、好中球、好塩球、好酸球、リンパ球または単核球の中から、選択される請求項８９に記載の組成物。
【請求項９１】
前記赤血球がヘモグロビンＦを発現する請求項８９に記載の組成物。
【請求項９２】
前記複数の分化された造血細胞類型は、血液で発見される分化された造血細胞類型の比率とほぼ同じ割合で生成され、血液で発見される分化された細胞類型の比率は赤血球９６％、血小板１％及び食細胞３％である請求項８８に記載の組成物。
【請求項９３】
輸血前に前記分化された造血細胞に血しょうを添加する請求項７８ないし８２のうち、いずれか１項に記載の組成物。
【請求項９４】
前記少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞は、患者自身の血液型の分化された造血細胞が生成されるように患者に符合する請求項７８ないし８２のうち、いずれか１項に記載の組成物。
【請求項９５】
前記少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞は、抗原因子Ａ、Ｂ、Ｒｈまたはこれらの任意の組合わせに対して陰性である請求項７８ないし８２のうち、いずれか１項に記載の組成物。
【請求項９６】
前記分化された造血細胞が赤血球であり、前記赤血球を分化させる段階は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）血管コロニー形成細胞を含む請求項７８ないし８２のうち、いずれか１項に記載の組成物。
【請求項９７】
前記少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞は、ＣＤ３４およびＣＤ３１の発現を欠く、請求項３３に記載の組成物、または、請求項６０もしくは６１に記載の分離された少なくとも二分化性のヒト血管コロニー形成細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的にヒト血管コロニー形成細胞を生成して増殖させる方法に係り、さらに具体的に、本発明は、胚芽幹細胞の胚様体（ｅｍｂｒｏｉｄ  ｂｏｄｙ）への分化を誘導するのに十分な量である１つ以上の成長因子の存在下に無血清培地でヒト胚芽由来の幹細胞を培養する第１段階、及び胚様体を含む培地でヒト血管コロニー形成細胞を増殖させるのに十分な量である１つ以上の成長因子の存在下に無血清培地で胚様体を培養する第２段階の２段階工程を利用して、試験管内でヒト血管コロニー形成細胞を生成して増殖させる方法に関する。また、本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞製剤に関する。さらに、本発明は、造血系統または内皮系統でヒト血管コロニー形成単位を分化させる方法だけではなく、血管コロニー形成細胞から部分または完全分化された細胞型を製造する方法に関する。血管コロニー形成細胞及びこれより分化された細胞は、試験管内及び生体内で用途が多様である。増殖されたヒト血管コロニー形成細胞を試験管内で多量に生成する能力は、なによりも各種治療用途で有用な多数のヒト血管コロニー形成誘導体細胞型、例えば、ヒト造血母細胞または内皮細胞、分化された造血細胞、例えば、赤血球及び血小板の誘導可能性を提供する。また、本発明により誘導された増殖された数のヒト血管コロニー形成細胞は、造血細胞及び内皮細胞疾患治療において新規な治療戦略法で、または血液銀行で利用しうる。
【背景技術】
【０００２】
造血母細胞（ＨＳＣ）は、自家再生でき、あらゆる血液細胞系統に発生しうる。骨髄に存在するこれら細胞は、成体造血系の基本となる。これら細胞の移植は、現在臨床で適用される最も一般的な細胞系療法である。
【０００３】
ＨＳＣ移植は、急性または慢性白血病、再生不良性貧血及び各種兔疫不全症候群のみならず、各種悪性非−血液腫よう及び自家免疫疾患患者の治療に利用される。悪性血液腫よう患者の場合、ＨＳＣを移植すれば、高容量の化学療法及び／または放射線療法後に発生しうる治療による形成不全症から患者を救いうる。
【０００４】
ＨＳＣ移植の臨床的有用性は、広範囲であるが、体性ＨＳＣ移植が必要な患者のうち、２／３は、一致型供与者がないために、３種の主要ＨＳＣの供給源（ヒト骨髄、可動化末梢血及び臍帯血）は制限されている。例えば、任意の特定患者の場合に、兄弟姉妹のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が同一に一致する可能性は２５％だけである。
【０００５】
ＨＬＡは、免疫系が細胞を自家（身体に属する）または非自家（外来または身体外から由来）として確認することを補助する細胞表面上の蛋白質である。このＨＬＡ蛋白質は、主組織的合成複合体、すなわち、ＭＨＣとして知られたヒト６番染色体上に位置した領域を形成する遺伝子クラスターがコーディングするに当たって、移植片拒否反応においてＭＨＣ遺伝子座がコーディングする蛋白質が重要な役割をすると知られている。したがって、ＨＬＡ蛋白質をＭＨＣ蛋白質とも称する。移植物のＭＨＣ分子が受容者のＭＨＣ分子と一致（符合）すれば、臨床的移植の成功率を留意的に向上させうるが、ＨＬＡが同じ兄弟姉妹の間で移植する場合であっても、拒否反応を予防することができない。そのような拒否反応は、副組織的合成抗原間の差によって触発されうる。これら多型抗原は、一般的に移植組織細胞上のＭＨＣ分子に結合された“非自家”ペプチドであり、免疫抑制薬物を使用しなければ、たといＭＨＣ抗原が一致するとしても、たびたび副組織的合成抗原間の差によって移植物受容者の免疫系が、結局移植物を拒否することとなる。
【０００６】
Ｉ型及びＩＩ型ＨＬＡ各々には、３種類がある。Ｉ型及びＩＩ型ＨＬＡが一致する人（普通は、兄弟姉妹）を関連供与者という。受容者と供与者との間にＩ型ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃと、ＩＩ型ＨＬＡ−ＤＲＢ１及びＨＬＡ−ＤＱＢ１の一致は生存率の増加と関連される（森ら、２００２  Ｂｌｏｏｄ（９９）：４２００−６）。一致する関連供与者のいない患者の場合には、供与者銀行を通じて調べてＨＬＡ類型が一致する人を求める。しかし、ＨＳＣ移植物のような細胞または組織移植物が必要な患者の数は、移植に適した利用可能な細胞及び組織供給量よりはるかに多い。このような状況下で、受容者のＨＭＣ蛋白質と移植物のＭＨＣ蛋白質とが良好に一致することが、不可能であるとしても驚くべきことではない。したがって、多くの移植物受容者は、ＭＨＣ一致型移植物が得られるまで待っか、またはＭＨＣ一致型でない移植物を受け入れた後、高容量の免疫抑制薬物を耐えて拒否反応危険を甘受しなければならない。したがって、ＨＳＣを生成及び操作能及び／または受容者の移植物に対する耐性誘導能は、ヒト疾病の治療及び管理において相当有利であろう。
【０００７】
鳥類胚芽研究と、以後のカエル及びほ乳動物での研究に基づき、血液及び内皮の発生プログラムが密接に関連されているということが立証された。例えば、内皮細胞及び造血細胞は、卵黄嚢の血島で同時に非常に近接に現れる。卵黄嚢の血島は、卵黄嚢をコロニー化した中はい葉細胞の凝集体から誘導される。これら凝集体の中心は、胚芽造血細胞で発生する一方、周辺群は内部血液細胞を取り囲む血管を形成する内皮細胞に分化する。これら観察結果は、内皮細胞と造血細胞との先祖が共通するという考えを裏付ける。
【０００８】
また、ミノカサゴ及びマウス胚芽において内皮系統及び造血系統は、いずれも特定遺伝子、例えば、Ｆｌｋ１、Ｆｌｔ１、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２、ＣＤ３４、Ｓｃ１、及びＲｕｎｘ１の発現を共有する（Ｆｉｎａら，１９９０  Ｂｌｏｏｄ（７５）：２４１７−２４２６；Ｍｉｌｌａｕｅｒら，１９９３  Ｃｅｌｌ（７２）：８３５−８４６；Ｙａｍａｇｕｃｈｉら，１９９３  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１１８）：４８９−４９８；Ａｎａｇｎｏｓｔｏｕら，１９９４  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ（９１）：３９７４−３９７８；Ｋａｌｌｉａｎｐｕｒら，１９９４  Ｂｌｏｏｄ（８３）：１２００−１２０８１；Ｙｏｕｎｇら，１９９５  Ｂｌｏｏｄ（８５）：９６−１０５，Ａｓａｈａｒａら，１９９７  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２７５）：９６４−９６７；Ｋａｂｒｕｎら，１９９７  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１２４）：２０３９−２０４８）。同様に、特定の遺伝子突然変異は、内皮細胞及び造血細胞発生にいずれも影響を及ぼす（Ｓｈａｌａｂｙら，１９９５  Ｍａｔｕｒｅ（３７６）：６２−６６；Ｒｏｂｂら，１９９５  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ（９２）：７０７５−７０７９；Ｓｈｉｖｄａｓａｎｉら，１９９５  Ｎａｔｕｒｅ（３７３）：４３２−４３４；Ｓｔａｉｎｉｅｒら，１９９５  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１２１）：３１４１−３１５０；Ｂｏｌｌｅｒｏｔら，２００５  ＡＰＭＩＳ（１１３）：７９０−８０３）。また、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に対する受容体であるＦｌｋ１またはＦｌｔ１が欠失されればマウス胚芽で造血及び内皮発生が中断される。
【０００９】
マウス胚芽幹細胞からマウス血管幹細胞の試験管内生成が文献に報告されたことがある（Ｃｈｏｉら，１９９８  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２５：７２７−７３２）。また、造血細胞及び内皮細胞の両方に発生しうるヒト前駆細胞をヒトＥＳ細胞から誘導したが（Ｗａｎｇら、２００４  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２１）：３１−４１及びＷａｎｇら、ＪＥｘｐＭｅｄ（２０１）：１６０３−１６１４）、せいぜいして多くの細胞から少量のみ誘導される。また、血管幹細胞前駆細胞の試験管内増殖のための方法、または条件はない。
【００１０】
したがって、多数のヒト血管幹細胞と血管幹細胞誘導体細胞型、すなわち、造血細胞及び内皮細胞を生成して増殖させる方法と、そのような量の血管幹細胞または誘導体細胞型を含むあらゆる溶液／混合物に対する必要性は、依然として存在する。このような方法は、移植のための細胞の利用可能性を増加させ、免疫学的耐性の誘導のような各種の他の治療用途で有用である。
【００１１】
また、輸血用として利用可能な血液に対する必要性も重要である。赤十字社と他の血液供給会社は、血液がほぼ常に不足するといっている。これは、特に特有の血液型患者、Ｒｈ＋患者、または大量死傷者を招く事故または災難後に実際にそうである。また、戦争時に群隊では、交戦と関連した外傷の治療に使用するために、利用可能な緊急血液が必要である。本発明は、血液銀行及び輸血に使用するための分化された造血細胞を提供する。本発明の細胞及び方法は、伝統的に献血に依存していた方法を乗越え、安全で信頼できるほどの進歩をなし得、利用可能な血液の決定的な不足を防止するのに助けになろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ヒト血管幹細胞または血管コロニー形成細胞を試験管内で生成して増殖させる方法を提供することによって、前記開示された問題点を解消する。本願に開示された新規な方法によりヒト血管幹細胞または血管コロニー形成細胞の増殖能により各種治療用途に使用する細胞を生産しうる。また、本発明は、治療用途に使用するヒト血管幹細胞または血管コロニー形成系統細胞（すなわち、造血細胞及び内皮細胞）を生成する方法を提供する。本発明の方法は、商業的規模で使用できる多数のヒト血管幹細胞または血管コロニー形成細胞のみならず、造血細胞及び内皮細胞、そしてこれより分化された細胞を生成できるという点でも有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞を試験管内で生成して増殖させる方法であって、（ａ）ヒト胚芽由来細胞の胚様体への分化を誘導するのに十分な量である１つ以上の成長因子の存在下に無血清培地でヒト胚芽由来細胞を含む細胞培養物を培養する段階と、（ｂ）胚様体を含む前記培養物に１つ以上の成長因子を添加して無血清培地で前記培養物を培養し続ける段階であって、前記成長因子は、前記胚様体培養物中でヒト血管コロニー形成細胞を増殖させるのに十分な量に存在する段階を含み、前記幹細胞、胚様体及び血管コロニー形成細胞は、（ａ）及び（ｂ）段階を通じて無血清培地で培養される方法を提供する。
【００１４】
また、本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞を試験管内で生成して増殖させる方法であって、（ａ）ヒト胚芽由来細胞胚様体への分化を誘導するのに十分な量である１つ以上の成長因子の存在下に無血清培地でヒト胚芽由来細胞を含む細胞培養物を培養する段階と、（ｂ）胚様体を含む前記培養物に１つ以上の成長因子を添加して、無血清培地で前記培養物を培養し続ける段階であって、前記成長因子は、前記胚様体培養物中でヒト血管コロニー形成細胞を増殖させるのに十分な量に存在する段階と、（ｃ）前記胚様体を単一細胞に解体させる段階と、（ｄ）前記単一細胞を含む前記培養物に１つ以上の成長因子を添加して無血清培地で前記培養物を培養し続ける段階であって、前記成長因子は、前記単一細胞を含む培養物中でヒト血管コロニー形成細胞を増殖させるのに十分な量に存在する段階を含み、前記幹細胞、胚様体及び血管コロニー形成細胞は、前記（ａ）ないし（ｄ）段階を通じて無血清培地で培養される方法を提供する。
【００１５】
本発明の特定の実施形態で、胚芽由来細胞は胚芽幹細胞である。
【００１６】
本発明のヒト血管コロニー形成細胞を生成して増殖させる方法の特定の実施形態で、成長因子は、ホメオボックス蛋白質またはその機能性変移体または活性断片を含む蛋白質である。特定の実施形態で、ホメオボックス蛋白質は、ＨＯＸＢ４またはその機能性変移体または活性断片を含む蛋白質である。ＨＯＸＢ４がマウス及びヒトＨＯＸＢ４をはじめとするほ乳動物ＨＯＸＢ４であることも考慮される。ＨＯＸＢ４蛋白質は、全長ＨＯＸＢ４蛋白質である。追加実施形態で、ＨＯＸＢ４は、配列番号１または配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【００１７】
本発明のヒト血管コロニー形成細胞を生成して増殖させる方法の特定の実施形態で、ＨＯＸＢ４を含む成長因子は、ＨＯＸＢ４と蛋白質伝達ドメイン（ＰＴＤ）とを含む融合蛋白質である。追加実施形態で、ＰＴＤ及びＨＯＸＢ４は、リンカーを通じて接合される。追加実施形態で、ＰＴＤはＴＡＴ蛋白質、その機能性変移体または活性断片（ＴＡＴポリペプチド含む）である。特定の実施形態で、ＴＡＴ蛋白質は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。追加実施形態で、ＰＴＤは配列番号１４のアミノ酸配列を有するＴＡＴポリペプチドの１つ以上のコピーを含む。特定の実施形態で、ＰＴＤは配列番号１５である。
【００１８】
本発明のヒト血管コロニー形成細胞を生成して増殖させる方法の特定の実施形態で、成長因子は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、骨形態形成蛋白質（ＢＭＰ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３Ｌ（ＦＬ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）からなる群から選択される。追加実施形態で、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）または骨形態形成蛋白質（ＢＭＰ）、または両方ともを、ｈＥＳ細胞を含む細胞培養物の培養０〜４８時間内に培養段階（ａ）に添加する。さらなる追加実施形態で、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３Ｌ（ＦＬ）またはトロンボポエチン（ＴＯＰ）、またはその任意の組合わせを培養段階（ａ）の開始後、４８〜７２時間内にｈＥＳ細胞を含む細胞培養物に添加する。
【００１９】
本発明のヒト血管コロニー形成細胞を生成して増殖させる方法の特定の実施形態で、ＨＯＸＢ４蛋白質またはその機能性変移体または活性断片（またはドメイン）を含む成長因子を前記段階に添加するが、この際、前記蛋白質は、複数回、例えば、１日１回または隔日１回添加される。
【００２０】
本発明のヒト血管コロニー形成細胞を生成して増殖させる方法の特定の実施形態で、ホメオボックス蛋白質を含む成長因子を段階（ａ）開始後、４８〜７２時間内に段階（ｂ）に添加する。本発明の方法の特定の実施形態で、Ｈ０ＸＢ４蛋白質またはその機能性変移体または活性断片を段階（ａ）開始後、４８〜７２時間内に段階（ｂ）に添加する。
【００２１】
特定の実施形態で、本発明のヒト血管コロニー形成細胞を生成して増殖する方法は、段階（ｂ）にエリスロポエチン（ＥＰＯ）を添加する段階をさらに含む。特定の実施形態で、００１６段落に記載した本発明の方法は段階（ｂ）及び（ｄ）にエリスロポエチン（ＥＰＯ）を添加する段階をさらに含む。
【００２２】
特定の実施形態で、本発明のヒト血管コロニー形成細胞を生成して増殖する方法は、ヒト血管コロニー形成細胞を精製し／するか、分離する段階（ｓ）をさらに含む。血管コロニー形成細胞は、抗−ＣＤ７１抗体による免疫親和性カラムクロマトグラフィーを利用することによって精製しうる。血管コロニー形成細胞は、大きさ及び／または形態により分離されうる。
【００２３】
本発明のヒト血管コロニー形成細胞を生成して増殖する方法の特定の実施形態で、ヒト胚芽由来幹細胞を含む細胞培養物はヒト胚芽幹細胞のライブラリーから由来し前記ヒト胚芽幹細胞のライブラリーは、各々ヒト集団に存在した１つ以上のＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合体または同種接合体である幹細胞を含み、前記幹細胞のライブラリーのうち、各メンバーは、前記ライブラリーのうち、残りのメンバーに関する他のセットのＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合体または同種接合体である。追加実施形態で、ヒト胚芽幹細胞のライブラリーは、ヒト集団に存在したあらゆるＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合体または同種接合体である幹細胞を含む。これら方法は、各々ヒト集団に存在した１つ以上のＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合体または同種接合体である、ヒト血管コロニー形成細胞のライブラリーを生成し、前記幹細胞のライブラリーの各メンバーは、前記ライブラリーのうち、残りのメンバーに関する他のセットのＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合体または同種接合体である。追加実施形態で、これら方法は、ヒト集団に存在したあらゆるＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合体（ｈｅｍｉｚｙｇｏｕｓ）または同種接合体（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ）であるヒト血管コロニー形成細胞のライブラリーを生成する。したがって、本発明はまた、このような方法により製造されたヒト血管コロニー形成細胞のライブラリーを提供する。このライブラリーは、次のように使われうる。
【００２４】
本発明は、治療が必要な患者にヒト造血母細胞（ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）またはヒト内皮細胞を投与することを含んで、前記患者を治療する方法であって、（ａ）前記患者を選択する段階と、（ｂ）前記患者の細胞表面上に発現されたＭＨＣ蛋白質を確認する段階と、（ｃ）以前００２４段落に記載したヒト血管コロニー形成細胞のライブラリーを提供する段階と、（ｄ）前記患者の細胞上に前記患者のＭＨＣ蛋白質と一致（符合）するライブラリーからヒト血管コロニー形成細胞を選択する段階と、（ｅ）段階（ｄ）で確認された前記ヒト血管コロニー形成細胞を必要によってヒト造血母細胞、内皮細胞または両方ともに分化する段階と、（ｆ）段階（ｅ）から前記造血母細胞、内皮細胞または両方ともを前記患者に投与する段階を含む方法を提供する。地域センター、例えば、病院または医療センター、または任意の他の適した施設でこの方法を行える。
【００２５】
特定の実施形態で、本発明のヒト血管コロニー形成細胞を生成して増殖する方法は、前記ヒト血管コロニー形成細胞のヒト造血母細胞に分化を誘導するのに適した条件下に前記ヒト血管コロニー形成細胞を成長させる段階をさらに含む。
【００２６】
特定の実施形態で、本発明のヒト血管コロニー形成細胞を生成して増殖する方法は、前記ヒト血管コロニー形成細胞のヒト内皮細胞に分化を誘導するのに適した条件下に前記ヒト血管コロニー形成細胞を成長させる段階をさらに含む。追加実施形態で、前記ヒト血管コロニー形成細胞のヒト内皮細胞に分化を誘導するのに適した条件は、繊維結合素被覆培養プレート上で前記ヒト血管コロニー形成細胞を成長させることを含む。
【００２７】
本発明の特定の実施形態で、ヒト血管コロニー形成細胞を生成して増殖する方法で１０，０００個以上のヒト血管コロニー形成細胞、５０，０００個以上のヒト血管コロニー形成細胞、１００，０００個以上のヒト血管コロニー形成細胞、５００，０００個以上のヒト血管コロニー形成細胞、１×１０６個以上のヒト血管コロニー形成細胞、２×１０６個以上のヒト血管コロニー形成細胞、３×１０６個以上のヒト血管コロニー形成細胞または４×１０６個以上のヒト血管コロニー形成細胞を生成する。これら方法により１０，０００ないし４百万個のヒト血管コロニー形成細胞を含むことができる細胞液を生成する。
【００２８】
したがって、本発明はまた、１０，０００個以上のヒト血管コロニー形成細胞、５０，０００個以上のヒト血管コロニー形成細胞、１００，０００個以上のヒト血管コロニー形成細胞、５００，０００個以上のヒト血管コロニー形成細胞、１×１０６個以上のヒト血管コロニー形成細胞、２×１０６個以上のヒト血管コロニー形成細胞、３×１０６個以上のヒト血管コロニー形成細胞または４×１０６個以上のヒト血管コロニー形成細胞を含むヒト血管コロニー形成細胞（無血清培地で成長されうる）の溶液を提供する。これら溶液を被験体に注射可能である。これら溶液は、無血清でありうる。これら溶液のうち、前記ヒト血管コロニー形成細胞は、少なくとも造血細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ）及び内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）に分化できるが、他の細胞型に分化する発生能がより大きい。本発明はまた、血管コロニー形成細胞、造血細胞または内皮細胞の投与により治療可能な疾患を治療する医薬の製造のためのこれら溶液の用途を提供する。
【００２９】
本発明はまた、以前段落に記載した前記細胞液を分離する段階及び前記細胞を患者に注射するのに適した溶液に入れる段階を含む患者に注射するのに適したヒト血管コロニー形成細胞溶液を製造する方法を提供する。本発明はまた、以前段落に記載した前記細胞液を分離する段階及び前記細胞を冷凍に適した溶液に入れる段階を含む冷凍に適したヒト血管コロニー形成細胞溶液を製造する方法を提供する。
【００３０】
本発明はまた、ヒト造血母細胞の投与が必要な患者にヒト造血母細胞を投与する方法であって、（ａ）ヒト造血母細胞の投与が必要な患者を選択する段階と、（ｂ）本発明の方法により生成されて増殖されたヒト血管コロニー形成細胞を供給する段階と、（ｃ）前記ヒト血管コロニー形成細胞をヒト造血母細胞に分化する段階と、（ｄ）前記ヒト造血母細胞の一部または全部を前記患者に投与する段階を含む方法を提供する。
【００３１】
本発明はまた、ヒト造血母細胞の投与が必要な患者にヒト造血母細胞を投与する方法であって、（ａ）ヒト造血母細胞の投与が必要な患者を選択する段階と、（ｂ）ヒト血管コロニー形成細胞を細胞数１０，０００個以上の量で供給する段階と、（ｃ）前記ヒト血管コロニー形成細胞をヒト造血母細胞に分化する段階と、（ｄ）前記ヒト造血母細胞の一部または全部を前記患者に投与する段階を含む方法を提供する。
【００３２】
本発明はまた、ヒト内皮細胞の投与が必要な患者にヒト内皮細胞を投与する方法であって、（ａ）ヒト内皮細胞の投与が必要な患者を選択する段階と、（ｂ）本発明の方法により生成されて増殖されたヒト血管コロニー形成細胞を供給する段階と、（ｃ）前記ヒト血管コロニー形成細胞をヒト内皮細胞に分化する段階と、（ｄ）前記ヒト内皮細胞の一部または全部を前記患者に投与する段階を含む方法を提供する。
【００３３】
本発明はまた、ヒト内皮細胞の投与が必要な患者にヒト内皮細胞を投与する方法であって、（ａ）ヒト内皮細胞の投与が必要な患者を選択する段階と、（ｂ）ヒト血管コロニー形成細胞を細胞数１０，０００個以上の量で供給する段階と、（ｃ）前記ヒト血管コロニー形成細胞をヒト内皮細胞に分化する段階と、（ｄ）前記ヒト内皮細胞の一部または全部を前記患者に投与する段階を含む方法を提供する。
【００３４】
特定の実施形態で、前記ヒト血管コロニー形成細胞は１０，０００ないし４百万個の細胞数の量で存在する。
【００３５】
本発明はまた、内皮細胞疾患の治療が必要な患者の内皮細胞疾患を治療する方法であって、（ａ）内皮細胞疾患の治療が必要な患者を選択する段階と、（ｂ）前記に記載した方法により生成されて増殖されたヒト血管コロニー形成細胞を供給する段階と、（ｃ）前記ヒト血管コロニー形成細胞をヒト内皮細胞に分化する段階と、（ｄ）前記ヒト内皮細胞の一部または全部を前記患者に投与する段階を含む方法を提供する。
【００３６】
本発明はまた、内皮細胞疾患の治療が必要な患者の内皮細胞疾患を治療する方法であって、（ａ）内皮細胞疾患の治療が必要な患者を選択する段階と、（ｂ）ヒト血管コロニー形成細胞を細胞数１０，０００個以上の量で供給する段階と、（ｃ）前記ヒト血管コロニー形成細胞をヒト内皮細胞に分化する段階と、（ｄ）前記ヒト内皮細胞の一部または全部を前記患者に投与する段階を含む方法を提供する。
【００３７】
特定の実施形態で、前記ヒト血管コロニー形成細胞は、１０，０００ないし４百万個の細胞数の量で存在する。
【００３８】
これら方法により治療される内皮細胞疾患は、心筋梗塞症（ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｉｎｆａｃｒｔｉｏｎ）、発作（ｓｔｒｏｋｅ）、アテローム性動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）及び虚血（ｉｓｃｈｅｍｉａ）を含む。虚血は、脳、四肢、心臓、肺、皮膚及び目から発生しうる。
【００３９】
本発明は、試験管内でヒト造血母細胞を製造する方法であって、
（ａ）本発明の方法により生成されて増殖されたヒト血管コロニー形成細胞を供給する段階と、（ｂ）前記ヒト血管コロニー形成細胞のヒト造血母細胞に分化を誘導するのに適した条件下に前記ヒト血管コロニー形成細胞を成長させる段階を含む方法を提供する。
【００４０】
本発明は、試験管内でヒト内皮細胞を製造する方法であって、（ａ）本発明の方法により生成されて増殖されたヒト血管コロニー形成細胞を供給する段階と、（ｂ）前記ヒト血管コロニー形成細胞のヒト内皮細胞に分化を誘導するのに適した条件下に前記ヒト血管コロニー形成細胞を成長させる段階を含む方法を提供する。
【００４１】
本発明はまた、前記血管幹細胞（ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔ  ｃｅｌｌ）の増殖を支持するのに十分な量でホメオボックス蛋白質（例えば、ＨＯＸＢ４）を含む蛋白質または該機能性等価物または活性断片の存在下にほ乳動物の血管コロニー形成細胞を無血清培地中で成長させることを含む血管コロニー形成細胞を増殖する方法を提供する。増殖される前記血管コロニー形成細胞は、臍帯血液（ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）、末梢血液、または骨髄から濃縮されるか、精製されるか、または分離されうる。前記血管コロニー形成細胞は、ヒト血管コロニー形成細胞でありうる。この方法により１０，０００ないし４×１０６個、またはそれ以上の血管コロニー形成細胞を含む溶液を生成しうる。この方法で使われたＨＯＸＢ４蛋白質は、本発明のヒト血管コロニー形成細胞を生成して増殖する方法に使用するのに適した任意蛋白質でありうる。
【００４２】
本発明はまた、本発明の方法によって生成されて増殖されるか、増殖されたヒト血管コロニー形成細胞を使用する免疫耐性の誘導方法を提供する。耐性化ヒト血管コロニー形成細胞は、組織的合成マーカーを同種移植片と共有するように選択され、患者により必要な細胞機能を再生する同種移植片（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）または細胞治療前に、またはそれと同時に人間受容者に投与しうる。次いで生成された免疫耐性は同種移植片または細胞治療の急性または慢性拒否危険を減らす。
【００４３】
本願で開示された方法により生成された多数の血管コロニー形成細胞は、毒性前処理が除外されうる耐性プロトコルを可能にする。供与者ヒト血管コロニー形成細胞は、移植片（ｇｒａｆｔ）の移植前に、または供与者の血管コロニー形成細胞に対して符合する機関、組織、または細胞の移植前に人間受容者に投与しうる。前記ヒト血管コロニー形成細胞及び移植片は、同じ供与者から得られる。前記移植片は、分化された供与者ヒト血管コロニー形成細胞から由来しうる。前記ヒト血管コロニー形成細胞及び移植片は、別途に供与者と符合する他の供与者から得られる。前記ヒト血管コロニー形成細胞は、人間受容者に投与されて耐性が必要な受容者に耐性を誘導しうる。
【００４４】
特定の実施形態で、本発明は、供与者同種移植片に対して人間受容者の耐性を誘導する方法に係り、この方法は、（ａ）前記受容者にＴ細胞共刺激（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）を抑制する薬剤を投与する段階、（ｂ）前記受容者に本願で記載した方法によって、生成されて増殖されるか、増殖されるヒト血管コロニー形成細胞を導入する段階、及び（ｃ）前記同種移植片を前記受容者に移植する段階を含む。前記ヒト血管コロニー形成細胞（供与者細胞）は、受容者が同種移植片を容認するようにする。特定の実施形態で、Ｔ細胞共刺激を抑制する薬剤は、ＣＤ４０配位子−ＣＤ４０共刺激相互作用を抑制するか、遮断する薬剤である。この方法は、ＣＤ２８−Ｂ７相互作用を抑制する薬剤を投与することをさらに含むことができる。この方法は、胸腺照射及び／またはＴ細胞欠乏または不活性化を含めるか、含めない。前述した方法はまた、全身照射により生成された造血空間（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｐａｃｅ）の不在下に混合されたキメラ現象が現れうる。
【００４５】
本発明はまた、供与者同種移植片に対して人間受容者の耐性を増進する方法を提供し、この方法は、（ａ）前記受容者のうち、胸腺空間（ｔｈｙｍｉｃ  ｓｐａｃｅ）を生成する段階と、（ｂ）前記受容者の供与者反応性Ｔ細胞を減らすか、不活性化する段階と、（ｃ）前記供与者の供与者ヒト血管コロニー形成細胞または前記供与者に符合する供与者ヒト血管コロニー形成細胞を前記受容者に導入する段階と、（ｄ）前記同種移植片を前記受容者に移植する段階と、を含み、前記供与者血管コロニー形成細胞は同種移植片に対して耐性を誘導する。特定の実施形態で、この方法は、造血空間生成照射を含まない。この方法は、前記受容者に胸腺照射（分別可能）、ステロイド、コルチコステロイド、ブレキナー（ｂｒｅｑｕｉｎａｒ）、または免疫抑制剤または薬物のうち、選択された１つ以上の治療法で治療することによって、胸腺空間を生成することを含むことができる。
【００４６】
本発明はまた、輸血に使用するのに適した細胞を生成する方法を提供する。例えば、本発明は、輸血に使用しうる赤血球を生成する方法を提供する。それ自体として、本発明は、献血を利用する血液の慢性的欠乏を緩和するのに役に立つ溶液を提供する。
【００４７】
特定の実施形態で、本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞から試験管内で分化された造血細胞を生成する方法を提供し、前記方法は、（ａ）ヒト血管コロニー形成細胞を提供する段階と、（ｂ）前記血管コロニー形成細胞を分化された造血細胞に分化する段階と、を含む。
【００４８】
特定の実施形態で、本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞から試験管内で分化された造血細胞を利用する輸血方法を提供し、前記方法は、（ａ）ヒト血管コロニー形成細胞を提供する段階と、（ｂ）前記血管コロニー形成細胞を分化された造血細胞に分化する段階と、（ｃ）前記分化された造血細胞に輸血する段階と、を含む。
【００４９】
特定の実施形態で、前記血管コロニー形成細胞は冷凍培養物から回収される。
【００５０】
特定の実施形態で、本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞から試験管内で分化された造血細胞を利用する輸血方法を提供し、前記方法は、（ａ）ヒト胚芽由来細胞の胚様体に分化を誘導するのに十分な量で１つ以上の成長因子の存在下に前記ヒト胚芽由来細胞を含む細胞培養物を培養する段階と、（ｂ）１つ以上の成長因子を胚様体を含む前記培養物に添加する段階と、（ｃ）前記血管コロニー形成細胞を分化された造血細胞に分化する段階と、（ｄ）前記分化された造血細胞を輸血する段階と、を含み、ここで、前記成長因子は、前記胚様体培養物でヒト血管コロニー形成細胞を増殖するのに十分な量で存在する。
【００５１】
特定の実施形態で、前記胚芽由来細胞、胚様体及び血管コロニー形成細胞は、前記方法のうち、段階（ａ）の間、無血清培地で成長する。
【００５２】
特定の実施形態で、胚芽由来細胞は、胚芽幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）である。
【００５３】
特定の実施形態で、本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞から試験管内で分化された造血細胞を利用する輸血方法を提供し、前記方法は、（ａ）ヒト胚芽由来細胞の胚様体に分化を誘導するのに十分な量で１つ以上の成長因子の存在下に前記ヒト胚芽由来細胞を含む細胞培養物を培養する段階と、（ｂ）１つ以上の成長因子を胚様体を含む前記培養物に添加する段階と、（ｃ）前記血管コロニー形成細胞を分化された造血細胞に分化する段階と、（ｄ）前記分化された造血細胞を輸血する段階と、を含み、ここで、前記成長因子は、前記胚様体培養物でヒト血管コロニー形成細胞を増殖するのに十分な量で存在する。
【００５４】
特定の実施形態で、前記幹細胞、胚様体及び血管コロニー形成細胞は、前記方法のうち、段階（ａ）及び（ｂ）の間に無血清培地で成長する。
【００５５】
本発明の特定の実施形態で、前記胚芽由来細胞は胚芽幹細胞である。
【００５６】
特定の実施形態で、前記血管コロニー形成細胞は冷凍培養物から回収する。
【００５７】
特定の実施形態で、本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞から試験管内で分化された造血細胞を利用する輸血方法を提供し、前記方法は、（ａ）ヒト胚芽由来細胞の胚様体に分化を誘導するのに十分な量で１つ以上の成長因子の存在下に前記ヒト胚芽由来細胞を含む細胞培養物を培養する段階と、（ｂ）１つ以上の成長因子を胚様体を含む前記培養物に添加する段階（ここで、前記成長因子は、前記胚様体培養物でヒト血管コロニー形成細胞を増殖するのに十分な量で存在する）と、（ｃ）前記胚様体を単一細胞に解体する段階と、（ｄ）１つ以上の成長因子を前記単一細胞を含む前記培養物に添加する段階（ここで、前記成長因子は、前記単一細胞を含む前記培養物でヒト血管コロニー形成細胞を増殖するのに十分な量で存在する）と、（ｅ）前記血管コロニー形成細胞を分化された造血細胞に分化する段階と、（ｆ）前記分化された造血細胞を輸血する段階と、を含む。
【００５８】
特定の実施形態で、前記幹細胞、胚様体及び血管コロニー形成細胞は、前記方法の段階（ａ）〜（ｄ）全体にわたって無血清培地で成長される。
【００５９】
本発明の特定の実施形態で、胚芽由来細胞は胚芽幹細胞である。
【００６０】
特定の実施形態で、成長因子は、ホメオボックス蛋白質、またはその機能性変形体または活性断片を含む蛋白質である。特定の実施形態で、ホメオボックス蛋白質は、ＨＯＸＢ４蛋白質、またはその機能性変形体または活性変形体を含む。
【００６１】
特定の実施形態で、分化造血細胞は単一細胞類型として生成される。特定の実施形態で、単一細胞類型は、赤血球、血小板または食細胞（ｐｈａｇｏｃｙｔｅ）から選択される。特定の実施形態で、食細胞は顆粒球（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ）：好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）、好塩球（ｂａｓｏｐｈｉｌ）、好酸球（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ）、リンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）または単核球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）から選択される。特定の実施形態で、赤血球は、ヘモグロビンＦを発現する。特定の実施形態で、単一細胞類型は、血中から発見される分化細胞類型の比率を適切に均等にするために混合し、ここで血中から発見される分化細胞類型の比率は９６％赤血球、１％血小板及び３％食細胞である。
【００６２】
特定の実施形態で、複数分化造血細胞類型は同じ段階で生成される。特定の実施形態で、複数分化造血細胞類型は、赤血球、血小板または食細胞から選択される。特定の実施形態で、食細胞は、顆粒球、好中球、好塩球、好酸球、リンパ球または単核球から選択される。特定の実施形態で、赤血球は、ヘモグロビンＦを発現する。特定の実施形態で、複数分化造血細胞類型は、血中から発見された分化造血細胞類型の比率と適切に均等な割合で生成され、ここで血中から発見される分化細胞類型の比率は９６％赤血球、１％血小板及び３％食細胞である。
【００６３】
特定の実施形態で、血しょうは輸血前に分化造血細胞に添加される。
【００６４】
特定の実施形態で、血管コロニー形成細胞は、患者自身の血液型の分化造血細胞が生成されることを保障するために患者と一致される。特定の実施形態で、血管コロニー形成細胞は抗原因子Ａ、Ｂ、Ｒｈまたはこれらの任意組合わせに対して陰性である。特定の実施形態で、分化造血細胞は赤血球であり、ここで、赤血球を分化する段階はエリスロポエチン（ＥＰＯ）を含む。
【００６５】
本発明はまた、ヒト血管コロニー形成細胞を提供し、その細胞は分化されて少なくとも造血または内皮細胞類型を生成し、ここで、ヒト血管コロニー形成細胞は他のヒト血管コロニー形成細胞に緩く付着される。
【００６６】
特定の実施形態で、本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞を提供し、その細胞は分化されて少なくとも造血または内皮細胞類型を生成し、ここで、ヒト血管コロニー形成細胞は他のヒト血管コロニー形成細胞に緩く付着される。
【００６７】
特定の実施形態で、本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞を提供し、その細胞は分化されて少なくとも造血または内皮細胞類型を生成し、ここでヒト血管コロニー形成細胞は他のヒト血管コロニー形成細胞に緩く付着され、そしてヒト血管コロニー形成細胞はＣＤ３４蛋白質を発現しない。
【００６８】
特定の実施形態で、本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞を提供し、その細胞は分化されて少なくとも造血または内皮細胞類型を生成し、ここでヒト血管コロニー形成細胞は次の蛋白質：ＣＤ２３、ＣＤ３１、ＫＤＲ及びＣＤ１３３をいずれも発現しない。
【００６９】
特定の実施形態で、本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞を含む細胞培養物を提供し、その細胞は分化されて少なくとも造血または内皮細胞類型を生成し、ここでヒト血管コロニー形成細胞は互いに緩く付着される。
【００７０】
特定の実施形態で、本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞を含む細胞培養物を提供し、その細胞は分化されて少なくとも造血または内皮細胞類型を生成し、ここでヒト血管コロニー形成細胞は互いに緩く付着される。
【００７１】
特定の実施形態で、本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞の実質的に精製された集合体を含む細胞培養物を提供し、その細胞は分化されて少なくとも造血または内皮細胞類型を生成し、ここでヒト血管コロニー形成細胞は互いに付着され、そしてヒト血管コロニー形成細胞はＣＤ３４蛋白質を発現しない。
【００７２】
特定の実施形態で、本発明は、胚芽由来細胞から分化されたヒト血管コロニー形成細胞を含む細胞培養物を提供し、ここでヒト血管コロニー形成細胞は互いに緩く付着される。
【００７３】
特定の実施形態で、細胞培養物は１×１０６以上のヒト血管コロニー形成細胞を含む。特定の実施形態で、細胞培養物は５×１０６以上のヒト血管コロニー形成細胞を含む。
【００７４】
特定の実施形態で、胚芽由来細胞は、胚芽幹細胞株である。特定の実施形態で、胚芽由来細胞は、胚芽（ｅｍｂｒｙｏ）、割球（ｂｌａｓｔｏｍｅｒｅ）、胞胚（ｂｌａｓｔｏｃｙｔ）または内部細胞塊（ｉｎｎｅｒｃｅｌｌ  ｍａｓｓ）から選択される。
【００７５】
特定の実施形態で、本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞を含む薬学製剤を提供し、その細胞は分化されて少なくとも造血または内皮細胞類型を生成し、ここでヒト血管コロニー形成細胞は互いに緩く付着される。
【００７６】
特定の実施形態で、本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞を含む薬学製剤を提供し、その細胞は分化されて少なくとも造血または内皮細胞類型を生成し、ここでヒト血管コロニー形成細胞は互いに緩く付着される。
【００７７】
特定の実施形態で、本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞を含む薬学製剤を提供し、その細胞は分化されて少なくとも造血または内皮細胞類型を生成し、ここでヒト血管コロニー形成細胞は次の蛋白質：ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＫＤＲ及びＣＤ１３３をいずれも発現しない。
【００７８】
特定の実施形態で、薬学製剤は１×１０６以上のヒト血管コロニー形成細胞を含む。特定の実施形態で、薬学製剤は５×１０６以上のヒト血管コロニー形成細胞を含む。
【００７９】
特定の実施形態で、ヒト血管コロニー形成細胞を含む薬学製剤は胚芽由来細胞から分化される。特定の実施形態で、胚芽由来細胞は胚芽幹細胞である。特定の実施形態で、胚芽由来細胞は、胚芽、割球、胞胚または内部細胞塊から選択される。
【００８０】
特定の実施形態で、本発明は、前述した文壇は、いずれもヒト血管コロニー形成細胞の冷凍保存された製剤を提供する。
【００８１】
特定の実施形態で、本発明は、１×１０６以上のヒト血管コロニー形成細胞の冷凍保存された製剤を提供し、ここでヒト血管コロニー形成細胞は次の蛋白質：ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＫＤＲ及びＣＤ１３３をいずれも発現しない。
【００８２】
特定の実施形態で、冷凍保存された製剤は、５×１０６以上のヒト血管コロニー形成細胞を含む。
【００８３】
特定の実施形態で、ヒト血管コロニー形成細胞を含む冷凍保存された製剤は、ＣＤ３４蛋白質を発現しない。特定の実施形態で、ヒト血管コロニー形成細胞を含む冷凍保存された製剤はＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ１３３及びＫＤＲ蛋白質を発現しない。特定の実施形態で、ヒト血管コロニー形成細胞を含む冷凍保存された製剤はＬＭ０２及びＧＡＴＡ２蛋白質を発現しない。
【００８４】
特定の実施形態で、本発明は、前述したようなヒト血管コロニー形成細胞から分化された造血細胞を含む培養物を提供する。
【００８５】
特定の実施形態で、本発明は、前述したようなヒト血管コロニー形成細胞から分化された内皮細胞を含む培養物を提供する。
【００８６】
特定の実施形態で、本発明は、前述したようなヒト血管コロニー形成細胞から分化された平滑筋細胞を含む培養物を提供する。
【００８７】
特定の実施形態で、本発明は、前述したようなヒト血管コロニー形成細胞から分化された心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）を含む培養物を提供する。
【００８８】
特定の実施形態で、本発明は、前述したようなヒト血管コロニー形成細胞を必要とする患者における病態を治療する薬剤の製造での前記ヒト血管コロニー形成細胞の用途を提供する。
【００８９】
特定の実施形態で、本発明は、前述したような細胞培養物を必要とする患者における病態を治療する薬剤の製造での前記細胞培養物の用途を提供する。
【００９０】
特定の実施形態で、本発明は、前述したような薬学製剤を必要とする患者における病態を治療する薬剤の製造での前記薬学製剤の用途を提供する。
【００９１】
本発明は、本発明の前述した様態及び実施形態のうち、任意のものからなった組合わせを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９２】
以下、本発明を完全に理解させるために、下記に詳細な説明を記述する。
【００９３】
特に定義しなければ、本発明で使われるあらゆる技術的用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者に通常的に分かるものと同じ意味を有する。本発明の記述と類似するか、同等な方法及び材料を本発明または本発明を試験するのに使用できるが、適した方法及び材料を下記に記述する。この物質、材料及び実施例は、説明の便宜のためのものに過ぎず、これを制限しようとするものではない。
【００９４】
本発明で言及したあらゆる出版物、特許、特許公開書及び出願書及びその他の文献を全体として参照して含める。
【００９５】
本明細書の全般にわたって、単語“含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）”またはその異なる形態である、例えば“含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）”または“含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”は、言及した整数または整数群を含めるものであり、任意の他の整数または整数群を排除しようとするものではない。
【００９６】
本発明をさらに明確にするために、ここで、下記用語及び定義を提供する。
【００９７】
用語“ヒト胚芽幹細胞”（ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ｈＥＳ細胞）は当分野で使われるものと同じ意味であって、本発明で使用する。この用語は、細胞株として連続継代培養できるヒト桑実胚または胚盤胞の内部細胞群で誘導された細胞を含む。ｈＥＳ細胞は、精子またはＤＮＡを利用した卵細胞の受精、核移植、処女生殖から、またはＨＬＡ領域に同型接合体を利用したｈＥＳ細胞の生成方法を通じて誘導しうる。ヒトＥＳ細胞はまた、精子と卵細胞の融合、核移植、処女生殖、または染色質の再プログラム化及び細胞生産のために前記再プログラム化された染色質を円形質膜に後続導入することを通じて生産された、接合体、卵割球、または胚盤胞段階の哺乳類胚芽から誘導された細胞である。本発明のヒト胚芽幹細胞は、ＡＣＴ−４、Ｎｏ．３、Ｈｌ、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１４及びＡＣＴ３０胚芽幹細胞を含むことができるが、これに制限されるものではない。
【００９８】
用語“蛋白質伝達ドメイン”（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ：“ＰＴＤ”）は、細胞膜を横切って細胞内に転位されるか、または、例えば、ＰＴＤが付着される他の分子（例えば、蛋白質ドメイン）が細胞膜を横切って細胞内への転位速度を高めるか、速度を与える任意のアミノ酸配列を意味するものである。蛋白質伝達ドメインは、巨大蛋白質の一部として天然的に発生したドメインまたは配列（例えば、ウイルス蛋白質、例えばＨＩＶ  ＴＡＴのＰＴＤ）であるか、または合成または人工アミノ酸配列でありうる。
概要
本発明は、ヒト胚芽由来細胞由来のヒト血管コロニー形成細胞の生成及び増殖のための方法、ヒト血管コロニー形成細胞を含む調製物及び組成物、血管コロニー形成細胞から部分的に、または最終的に分化された多様な細胞類型を生産する方法、血管コロニー形成細胞を治療的に使用する方法、及び血管コロニー形成細胞から部分的に、または最終的に分化された多様な細胞類型を治療的に使用する方法を提供する。
【００９９】
用語“血管幹細胞（ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔ）”及び“血管コロニー形成細胞（ｈｅｍａｎｇｉｏ−ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｅｌｌ）”は、本出願書の全般にわたって相互交換的に使われる。これら細胞は、これに制限されるものではないが、１つ以上のマーカーの発現（ＲＮＡまたは蛋白質）または発現欠如（ＲＮＡまたは蛋白質）をはじめとする多様な構造的及び機能的特性に基づいて説明しうる。血管コロニー形成細胞は、少なくとも造血細胞類型または内皮細胞類型を生成するように分化される。血管コロニー形成細胞は、望ましく両性能（ｂｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ）で少なくとも造血細胞類型及び内皮細胞類型を生成するように分化される。このように、本発明の血管コロニー形成細胞は、少なくとも単性能であり、望ましくは、陽性能である。しかし、追加的に血管コロニー形成細胞は、相当な発生能を有することができ、一定実施形態では、他の系統の細胞類型を生成するように分化される。一実施形態で、血管コロニー形成細胞は、他の中はい葉誘導体（ｍｅｓｏｄｅｒｍａｌ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）、例えば、心臓細胞（例えば、心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ））及び／または平滑筋細胞（ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ）を生成するように分化される。
【０１００】
本発明はまた、ＥＳ細胞、胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｔｓ）または卵割球（ｂｌａｓｔｏｍｅｒｅ）、胎盤または臍帯組織（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｔｉｓｓｕｅ）由来臍帯血、末梢血液、骨髄または他の組織を含む任意供給源から得るか、または当分野の他の方法により得た哺乳類血管コロニー形成細胞を増殖させる方法を提供する。ヒト血管コロニー形成細胞はまた、ヒト胚芽由来細胞から生成させうる。ヒト胚芽由来細胞は、実質的に同種細胞個体群、異種細胞個体群、または胚芽組織の一部または全部でありうる。本発明の方法で使用できる胚芽由来細胞の例として、ヒト血管コロニー形成細胞は、ヒト胚芽幹細胞から生成させることができる。このような胚芽幹細胞は、例えば、胚盤胞、プレートされたＩＣＭ、１つ以上の卵割球、または受精、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）、処女生殖（ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｓｉｓ）、童貞生殖（ａｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）、またはその他の有性または無性方式による生産方式とは関係なく、着床前段階胚芽または胚芽類似構造物の他の部分を利用するか、これより誘導された胚芽幹細胞を含む。
【０１０１】
一定実施形態で、血管幹細胞は、血小板及び赤血球細胞を含む造血細胞にさらに分化され、これに制限されるものではない。このような細胞は、輸血時に使用しうる。輸血のための大量の細胞を生成する能力は、国全体の血液銀行及び病院で体験している慢性的な血液不足を軽減させるようになる。一定実施形態で、本発明の方法は、輸血のための万能（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）細胞を生産可能にする。具体的に、Ｏ型及びＲｈ−型の赤血球細胞を容易に生成できて、輸血用の万能血液供給源として提供される。
【０１０２】
本発明の方法は、多様な商業的及び臨床的応用分野で、血管幹細胞を容易に多量に試験管内で増幅させうる。試験管内の血管幹細胞の増幅は、血管幹細胞を増殖させることを意味する。本発明の方法は、ヒト造血細胞の増殖量が商業的に有用な量に到達可能にし、また本発明は、多量の血管幹細胞及び多量のヒト血管幹細胞（例えば、１０，０００、１００，０００または５００，０００細胞以上）を含む細胞調製物に関する。一定実施形態で、細胞調製物は、１×１０６細胞以上を含む。他の実施形態で、細胞調製物は、ヒト血管幹細胞を２×１０６細胞以上に含み、さらに他の実施形態では、ヒト血管幹細胞を３×１０６細胞以上に含む。さらに他の実施形態で、細胞調製物は、ヒト血管幹細胞を４×１０６細胞以上に含む。
【０１０３】
本発明は、１０，０００ないし４百万以上の哺乳類（例えば、ヒト）血管幹細胞を含む溶液、調製物及び組成物に関する。このような溶液、調製物及び組成物のうち、血管幹細胞の数は、１０，０００ないし４百万またはそれ以上の範囲内の任意の数でありえる。この数は、例えば、２０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１百万でありうる。
【０１０４】
同様に、本発明は、ヒト血管幹細胞の子孫細胞の調製物（例えば、ヒト造血細胞、及び内皮細胞を含むヒト造血母細胞）に関する。本発明はまた、血管幹細胞及び／または血管幹細胞系統細胞を生産、保管及び分配する方法に関するものである。
【０１０５】
本発明はまた、ヒトまたは動物患者に輸血するために適した方法及び溶液を提供する。具体的な実施形態で、本発明は輸血のための赤血細胞及び／または血小板、及び／または他の造血細胞類型を製造する方法を提供する。一実施形態で、本発明は血管関連疾患または疾病の治療で、または外傷後の輸血のための血液を提供する血液銀行及び病院での使用に適している。一実施形態で、本発明は万能供与者細胞である赤血細胞を提供する。一実施形態で、前記赤血細胞は、輸血前に機能性であり、ヘモオグロビンＦを発現する。
【０１０６】
本発明はまた、ヒト血管コロニー形成細胞、ヒト血管コロニー形成細胞の実質的に精製された個体群を含む細胞培養物、ヒト血管コロニー形成細胞を含む薬学調製物及び血管コロニー形成細胞の凍結保存調製物を提供する。一実施形態で、本発明は、病態の治療を必要とする患者で病態を治療するための薬物製造でのヒト血管コロニー形成細胞の用途を提供する。一方、本発明は、病態の治療を必要とする患者で病態を治療するための薬物の製造での細胞培養物の用途を提供する。本発明はまた、病態の治療を必要とする患者で病態を治療するための薬物の製造での薬学調製物の用途を提供する。
【０１０７】
血管コロニー形成細胞はこれらの構造的特性に基づいて同定して特徴を糾明する。具体的に、一実施形態で、これら細胞は、互いに緩く付着するという点で独特である（他の血管コロニー形成細胞に緩く付着）。これら細胞は、相互緩く付着するために、血管コロニー形成細胞の培養物またはコロニーは酵素的解体方法を必要とせず、機械的解体法のみを使用して単一細胞に解体させることができる。この細胞は、酵素的解体または機械的解体と酵素的解体との組合わせよりは、機械的解体のみでも、実質的に細胞の生存能を損傷させずに、培養物またはコロニーを十分に脱凝集化させるように、相互緩く付着されている。言い換えれば、酵素的な細胞凝集物の解体以後に観察されるものと比較して、実質的に細胞損傷または死滅をもたらすほどの強い力が加えられる機械的解体を必要としない。
【０１０８】
また、血管コロニー形成細胞は、１つ以上のマーカーの発現または発現欠如（遺伝子レベルまたは蛋白質レベルで評価時）に基づいて、同定するか、または特徴を糾明しうる。例えば、一実施形態で、血管コロニー形成細胞は、１つ以上の下記細胞表面マーカーの発現欠如（例えば、下記マーカーの１つ以上、２つ以上、３つ以上または４つ以上の発現欠如に基づいて、前記細胞の特徴を糾明する）に基づいて同定するか、または特徴を糾明しうる：ＣＤ３４、ＫＤＲ、ＣＤ１３３またはＣＤ３１。これとは異なって、または追加的に、血管コロニー形成細胞は、ＧＡＴＡ２及び／またはＬＭＯ２の発現に基づいて同定するか、または特徴を糾明しうる。追加的に、または代案的に、血管コロニー形成細胞は、表２に分析した１つ以上のマーカーの発現欠如または発現（遺伝子レベルまたは蛋白質レベルで評価時）に基づいて同定するか、特徴を糾明しうる。
【０１０９】
本発明の血管コロニー形成細胞は、これらの構造的または機能的特徴のうち、１つまたはその任意組合わせに基づいて同定するか、特徴を糾明しうる。これら細胞が任意の多数供給源、例えば、胚芽組織（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｔｉｓｓｕｅ）、出生期組織（ｐｒｅｎａｔａｌ  ｔｉｓｓｕｅ）、または周産期組織（ｐｅｒｉｎａｔａｌ  ｔｉｓｓｕｅ）から誘導できるが、用語“血管コロニー形成細胞（ｈｅｍａｎｇｉｏ−ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）”という供給源と関係なく、少なくとも造血細胞類型及び／または内皮細胞類型を生成するように分化することができ、前述した構造的または技術的特性を有する細胞に対して使用するということを留意せねばならない。
胚様体及び血管幹細胞を得るためのヒト胚芽幹細胞の試験管内分化
本発明は、ヒト胚芽幹細胞からまたはヒト胞胚または割球で誘導されるヒト血管幹細胞を生成及び増殖させる方法を提供する。このように生成される血管幹細胞は精製及び／または分離しうる。
【０１１０】
ヒト血管コロニー形成細胞はまたヒト胚芽で誘導される細胞から形成しうる。ヒト胚芽で誘導される細胞は、実質的に同種の細胞群集、異種細胞群集または胚芽組織の一部または全部でありうる。本発明の方法に使われうる、胚芽で誘導される細胞の例として、ヒト血管コロニー形成細胞をヒト胚芽幹細胞から発生させることができる。このような胚芽幹細胞は、受精、体細胞核転移（ＳＣＮＴ）、単性生殖、雄性発生またはその他の生殖または非生殖手段による生成とは関係なく、例えば、胞胚、プレートされたＩＣＭ、１つ以上の割球または着床前段階の胚芽または胚芽類似構造の他の部分から、またはこれらを使用して誘導される胚芽幹細胞を含む。
【０１１１】
さらに、または択一的に、血管コロニー形成細胞は、他の胚芽で誘導される細胞から生成させることができる。例えば、血管コロニー形成細胞は、受精、体細胞核転移（ＳＣＮＴ）、単性生殖、雄性発生またはその他の生殖または非生殖手段による生成とは関係なく、（必ずしも、胚芽幹細胞誘導段階を経る必要はなく）プレートされた胚芽、ＩＣＭ、胞胚、栄養膜／栄養膜はい葉細胞、１つ以上の割球、栄養膜幹細胞、胚芽生殖細胞または着床前段階の胚芽または胚芽類似構造の他の部分から、またはこれらを使用して生成させることができる。同様に、血管コロニー形成細胞は、胚芽で誘導される細胞から部分的に分化された細胞または細胞株を使用して生成させることができる。例えば、ヒト胚芽幹細胞株を使用して発達可能性及び適応性面で血管コロニー形成細胞より発達学的にさらに初期の細胞を生成させる場合、このような胚芽で誘導される細胞を使用して血管コロニー形成細胞を発生させることができる。
【０１１２】
さらに、または択一的に、血管コロニー形成細胞は、非制限的に臍帯、臍帯血、羊水、羊水幹細胞及び胎盤を含む他の胎児期または周産期供給源から発生させることができる。
【０１１３】
血管コロニー形成細胞をヒト胚芽組織から生成させる場合、胚様体形成段階が必要でありえる。しかし、胚様体の形成は、初期発達の間に発生するはい葉の３次元的相互作用を反復するのに少なくとも部分的に助けになるので、胚芽で誘導される細胞が既に胚様体の形成と実質的に同じ目的のための組織化または構造を有する場合、このような段階が必ずしも必要なものではない。例えば、血管コロニー形成細胞をプレートされた胞胚から生成させる場合、胞胚細胞中に一定レベルの３次元的組織化が既に存在する。したがって、細胞間信号、誘導信号または３次元的構造を提供するのに胚様体形成段階が必ずしも必要なものではない。
【０１１４】
本発明の方法及び用途は、胚芽で誘導される細胞から血管コロニー形成細胞を生成させるのに使われうる。特定の実施形態で、胚芽で誘導される細胞は、胚芽幹細胞である。他の特定の実施形態で、胚芽で誘導される細胞は、プレートされた胚芽、ＩＣＭ、胞胚、栄養膜／栄養膜はい葉細胞、１つ以上の割球、栄養膜幹細胞または初期着床前胚芽の他の部分である。前記のうち、任意のものに対し、胚芽で誘導される細胞は、受精、体細胞核転移（ＳＣＮＴ）、単性生殖、雄性発生またはその他の生殖または非生殖手段によって生成される胚芽で由来されうる。
【０１１５】
本出願を通じて、胚芽幹細胞から血管コロニー形成細胞を特異的に生成させることと関連して本発明を開示する場合、本発明はまた、胚芽で誘導される他の細胞から、またはこれを使用して任意の同じ治療用途のために生成させた細胞を使用して血管コロニー形成細胞を生成させることを含む。
【０１１６】
本発明の一部様態で、ヒト胚芽幹細胞はこの方法の出発材料でありうる。胚芽幹細胞は、例えば、栄養供給細胞の存在または不在下に業界に公知された任意の方法で培養しうる。
【０１１７】
胚芽幹細胞は、血清を含有する培地のうち、懸濁物で胚様体（ｅｍｂｒｏｉｄ  ｂｏｄｙ：“ＥＢ”）を形成しうる（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ（２０１）：１６０３−１６１４と、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２１）：３１−４１と、Ｃｈａｄｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｂｌｏｏｄ（１０２）：９０６−９１５）。しかし、血清の添加は、実験での可変性、費用、感染性製剤の可能性及び供給制限をはじめとする若干の問題がある。また、臨床的用途及び特定商業的用途で、血清の使用は、生物学的生成物を規正するさらなる米国及び国際規制の遵守を必要とする。
【０１１８】
本発明は、血清が使われていない胚芽幹細胞からヒト血管幹細胞を生成及び増殖させる方法を提供する。無血清条件が血清を必要とする条件より良好な製造工程（ＧＭＰ）ガイドライン下での大規模製造にさらに有利である。また、無血清条件は、培地に添加される特定因子の半減期を延長させる（例えば、血清が存在しない場合、培地で成長因子、サイトカイン及びＨＯＸＢ４を含む蛋白質の半減期が増加する）。特定の実施形態では、無血清培地がヒト血管幹細胞を生成及び増殖させるための本発明方法を通じて使われる。
【０１１９】
ヒト血管幹細胞を生成及び増殖させるための本方法の第１段階で、ヒト幹細胞は無血清培地で成長されて胚様体に分化されるように誘導される。胚様体形成を誘導するために、胚芽幹細胞をペレット化して１つ以上の形態形成因子及びサイトカインを補充した後、低付着（例えば、超低付着）培養プレートにプレートした無血清培地に（例えば、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ  ＩまたはＩＩ培地（ＳｉｇｍａＴＭ）中に）再懸濁させうる。形態形成因子及びサイトカインは、骨形態形成蛋白質（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、しかしＢＭＰ−３は除き）及びＶＥＧＦ、ＳＣＦ及びＦＬを含むことができるが、これに限定されない。骨形態形成蛋白質及びＶＥＧＦは、単独でまたは他の因子と共に使われうる。形態形成因子及びサイトカインは、細胞培養０〜４８時間から培地に添加されうる。このような条件下に恒温処理した後、血小板形成因子（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ−３配位子及び幹細胞因子（ＳＣＦ）を含むが、これに限定されない初期造血増殖サイトカインの存在下で恒温処理すれば、プレートされたＥＳ細胞がＥＢを形成しうる。ＴＰＯ、Ｆｌｔ−３配位子及びＳＣＦ以外に、ＶＥＧＦ、ＢＭＰ−４及びＨｏｘＢ４も培地に添加されうる。一実施形態で、まずヒトＥＳ細胞をＢＭＰ−４及びＶＥＧＦ１６５（例えば、２５〜１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下に成長させた後、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ１６５、ＳＣＦ、ＴＰＯ及びＦＬＴ３配位子（ｌｉｇａｎｄ）（例えば、１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）及びＨｏｘＢ４（例えば、本願に開示されたような１．５〜５μｇ／ｍｌのトリプル蛋白質伝達ドメイン−ＨｏｘＢ４融合蛋白質）の存在下に成長させる。追加因子をプレートの後、４８〜７２時間に添加しうる。
【０１２０】
本発明の前記方法で、ヒト血管幹細胞は、初期胚様体（“ＥＢ”）から分離される。初期ＥＢから血管幹細胞の分離は、試験管内の細胞の増殖を支援する。ヒト細胞で、血管幹細胞は、１０日未満で成長したＥＢから得られる。本発明の特定の実施形態で、血管幹細胞は２〜６日間成長したヒトＥＢで発生する。一実施形態によれば、血管幹細胞を確認して４〜６日間成長したヒトＥＢから分離しうる。他の実施形態では、血管幹細胞を分離する前にヒトＥＢを２〜５日間成長させる。特定の実施形態では、血管幹細胞を分離する前にヒトＥＢを３〜４．５日間成長させる。
【０１２１】
特定の実施形態で、初期ＥＢを洗浄し（例えば、トリプシン／ＥＤＴＡまたはコラゲン分解酵素Ｂによって）分離する。選択された数の細胞（例えば、２〜５ｘ１Ｏ５細胞）を血管幹細胞成長のために最適化された無血清メチルセルロース培地（例えば、ＢＬ−ＣＦＵ培地、例えばＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  Ｈ４４３６、または血管幹細胞増殖培地（ＨＧＭ）、またはＭＤＭのうち、１．０％メチルセルロース、１〜２％牛血清アルブミン、０．１ｍＭ２−メルカプロエタノール、１０μｇ／ｍｌｒｈ−インシュリン、２００μｇ／ｍｌの鉄結合ヒトトランスフェリン、２０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＧＭ−ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＩＬ−３、２０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＩＬ−６、２０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−Ｇ−ＣＳＦを含有する任意の培地）（“ｒｈ”は、“組み換えヒト”を意味する）と混合する。このような培地には、初期段階サイトカイン（ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＦＬ、ＦＬｔ−３、ＶＥＧＦ、ＢＭＰ、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ４及びＢＭＰ７を含むが、これに限定されない、しかしＢＭＰ３は除き）及びＨＯＸＢ４（または、さらなるホメオボックス蛋白質）を補充しうる。特定の実施形態では、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を培地に添加する。追加実施形態では、ＥＰＯ、ＳＣＦ、ＶＥＧＦ、ＢＭＰ−４及びＨｏｘＢ４を培地に添加する。追加実施形態では、細胞をＥＰＯ、ＴＰＯ及びＦＬの存在下に成長させる。Ｈ９が出発ヒトＥＳ細胞株である特定の実施形態では、ＥＰＯ、ＴＰＯ及びＦＬを培地に添加する。ＥＰＯ、ＴＰＯ及びＦＬ以外に、Ｈ９から誘導された細胞または他のＥＳ細胞のための培地はＶＥＧＦ、ＢＭＰ−４及びＨｏｘＢ４をさらに含むことができる。
【０１２２】
血管幹細胞を含む、本方法によって得られる細胞（前記細胞はＢＬ−ＣＦＵ培地内にありえる）を超低付着培養プレートにプレートし、ＣＯ２恒温処理器で恒温処理して血管幹細胞コロニーを成長させる。一部細胞は、２次ＥＢを形成しうる。３〜６日後、一部の場合３〜４．５日後、血管幹細胞コロニーが観察される。血管幹細胞コロニーは、特徴的な葡萄状形態及び／または小型サイズによって２次ＥＢのような他の細胞と区別されうる。また、血管幹細胞は、特定マーカーの発現（例えば、初期造血細胞マーカー及び内皮細胞マーカーの発現）及び少なくとも造血細胞及び内皮細胞への分化能（以下、血管幹細胞系統細胞誘導参照）で確認されることができる。例えば、血管幹細胞は、成熟した内皮細胞または造血細胞の特徴的な一定の特徴を欠如しても、これら細胞は（例えば、ＣＤ７１＋のような）特定マーカーの存在及び他のマーカー（例えば、ＣＤ３４−）の不在で確認されることができる。血管幹細胞はまた、ＧＡＴＡ−１及びＧＡＴＡ−２蛋白質、ＣＸＣＲ−４、及びＴＰＯとＥＰＯ受容体を発現させることができる。また、血管幹細胞は他のマーカー（例えば、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＫＤＲ、または他の付着分子）の発現が低いか、ないということを特徴とすることができる。また、血管幹細胞は、特定遺伝子、例えば、血管幹細胞及び初期の未発達赤芽細胞発達と関連した遺伝子、例えば、ＳＣＬ、ＬＭＯ２、ＦＬＴ−Ｉ、胚芽胎児グロビン遺伝子、ＮＦ−Ｅ２、ＧＡＴＡ−１、ＥＫＬＦ、ＩＣＡＭ−４、グリコホリウンス（ｇｌｉｃｏｐｈｏｒｉｕｎｓ）及びＥＰＯ受容体の発現を特徴とすることができる。
【０１２３】
したがって、血管幹細胞は大きさ（他の細胞より小さい）によって分離するか、または例えば、免疫親和性カラムクロマトグラフィーによってアンチ−ＣＤ７１＋抗体で精製しうる。
【０１２４】
血管幹細胞は、以下の手続によって大きさ及び／または形態により分離されうる。６〜７日成長後、前記細胞混合物はＥＢ（これは丸くて多数の細胞の塊りである）及び血管幹細胞（これは葡萄状であり、ＥＢより小さく、単一細胞である）を含有する。したがって、血管幹細胞は、形態及び大きさを基準に分離しうる。血管幹細胞は、例えば、細胞混合物を顕微鏡で観察する場合、手作業で選び出すことができる。以後、細胞をコロニー（各コロニーは１００〜１５０個の細胞を有する）に成長させることができる。
【０１２５】
前記のように誘導されるヒト血管幹細胞コロニーを選び出してメチルセルロースＣＦＵ−培地上で再プレートして造血ＣＦＵを形成しうる。特定の実施形態で、ＣＦＵ−培地は、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｈ４４３６を含む。追加実施形態では、血管幹細胞をサイトカイン及び他の因子を補充したＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ培地でプレートする。例えば、個々のＢＬ−ＣＦＣコロニーを手で取ってＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩと組み換え型ヒトＳＣＦ（例えば、２０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＰＯ（例えば、２０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＬ（例えば、２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−３（例えば、２０ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（例えば、２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｇ−ＣＳＦ（例えば、２Ｏｎｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ−４（例えば、１５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＧＦ−１（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）、内皮細胞成長補充物（ＥＣＧＳ、例えば、１００μｇ／ｍｌ）、Ｅｐｏ（例えば、３Ｕ／ｍｌ）を含有するフィブロネクチン−コーティングプレートに移すことができる。試験管内で１週間成長させた後、用心深くピペットで採取して非付着造血細胞を除去し、造血ＣＦＵ分析に直接使用することができる。非付着細胞を除去した後、付着群集をＥＧＭ−２内皮細胞培地（ＣａｍｂｒｅｘＴＭ）で１週間成長させた後、ｖＷＦの発現を調べることができる。
試験管内血管幹細胞の増殖
本発明の特定様態は、血管幹細胞の試験管内増殖に関する。特定の実施形態で、本発明の方法で増殖される血管幹細胞は、前記のようにヒト胚芽幹細胞から誘導される初期胚様体から得られる。
【０１２６】
ヒト胚芽幹細胞（ｈＥＳ細胞）から血管幹細胞を誘導する以外に、増殖させる血管幹細胞はまた、ほ乳動物胚芽（Ｏｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０）：２１−４４、米国特許公報２００４／００５２７７１号）、臍帯組織及び胎盤からの臍帯血（Ｐｅｌｏｓｉ、ｅｔ  ａｌ．  ２００２  Ｂｌｏｏｄ（１００）：３２０３−３２０８；Ｃｏｇｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４  Ｂｌｏｏｄ（１０３）：１３３−５）、末梢血液及び骨髄（Ｐｅｌｏｓｉｅｔａｌ．２００２  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ（１００）：３２０３−３２０８）のような他のほ乳動物供給源から分離しうる。特定の実施形態では、増殖させる非ヒト血管幹細胞を（マウス及び非ヒト霊長類のような）非ヒト胚芽幹細胞から生成させることができる。特定の実施形態で、血管幹細胞は、例えば、磁気ビード陽性選別または精製技術（例えば、ＭＡＣＳカラム）のような方法によって臍帯血（ＵＣＢ）または骨髄から得られる。細胞は、そのＣＤ７１＋状態を基準に選択され、ＣＤ３４−として確認されることがある。また、分離された血管幹細胞は、造血細胞系統及び内皮細胞系統の生成可能性に対して試験しうる。特定の実施形態で、分離または精製され、任意に胚芽、臍帯血、末梢血液、骨髄または他の組織から濃厚化された血管幹細胞は純度９５％を超過する。
【０１２７】
骨髄由来細胞は、出生前（例えば、胚芽または胎児）、幼児期（例えば、ヒトで出生から約３才）、児童期（例えば、ヒトで約３才から約１３才）、思春期（例えば、ヒトで約１３才ないし約１８才）、青年期（例えば、ヒトで約１８才ないし約３５才）、壮年期（ヒトで約３５才ないし約５５才）または老年期（例えば、ヒトで約５５才以上）をはじめとする供与者個人の任意の発達段階から得られる。
【０１２８】
ヒトの骨髄は、例えば、手術中の患者の分層胸骨から採取して得られる。以後、骨髄は体積で０．１〜１ｍｍ３の組織塊りで保存した後、マウス胚芽栄養供給層（例えば、ミトマイシンＣ−処理または照射された栄養供給層）で成長させうる。骨髄細胞は、１〜２週の培養期間にわたってプレートに付着し、血管幹細胞は、形態特性及び／または細胞マーカーを基準に確認及び分離しうる（ＵＳ２００４／００５２７７１号参照）。以後、細胞を本願に開示された方法によって無血清条件で成長及び増殖させうる。
【０１２９】
また、骨髄細胞及び血液または他の組織で由来する細胞を分別して血管幹細胞を得られる。分別方法は、業界に広く公知されており、一般的に陽性選別（すなわち、特定特性を基準にした細胞の保持）及び陰性選別（すなわち、特定特性を基準にした細胞の除去）をいずれも含む。骨髄由来細胞の濃厚化及び分別方法は、ヒト及びマウス細胞に対して最も特徴的である。
【０１３０】
骨髄由来細胞または他の細胞の各種濃厚化及び分別方法が業界に公知されている。ＣＤ７１を発現させる細胞の濃厚化のような陽性選別方法を使用しうる。ＣＤ３、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３２、ＣＤ４５、ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０またはＬｙ６Ｇを発現させる細胞を除去または減少させる陰性選別方法も単独で、または陽性選別技術と共に使用しうる。骨髄細胞の場合、供与者骨髄由来細胞が自家組織でない場合、分化されたＴ細胞を減少または除去させるために細胞製造物で陰性選別を実施しうる。
【０１３１】
一般的に、骨髄由来細胞、血液細胞または他の細胞の選択／濃厚化に使われる方法は、免疫親和性技術を利用するが、密度遠心分離方法も有用である。免疫親和性技術は、業界に公知されたような多様な形態を行えるが、一般的に抗体または抗体誘導体を一部類型の分離技術と共に利用する。前記分離技術は、一般的に抗体によって結合された細胞及び抗体によって結合されていない細胞を物理的に分離させるが、一部の場合、抗体によって結合された細胞を死滅させる分離技術が陰性選別に使われうる。
【０１３２】
蛍光−活性細胞分類（ＦＡＣＳ）、パンニング、免疫磁気分離、免疫親和性クロマトグラフィー、抗体−媒介補体固定、免疫毒素、密度勾配分離などをはじめとする任意の適当な免疫親和性技術を骨髄由来細胞、血液細胞または他の細胞で由来する血管幹細胞の選択／濃厚化に利用しうる。免疫親和性過程で処理した後、所定細胞（陽性選別の場合、免疫親和性試薬によって結合された細胞、陰性選別の場合、免疫親和性試薬によって結合されていない細胞）を回収し、追加回収の免疫親和性選択／濃厚化を経させうる。
【０１３３】
免疫親和性選択／補強は、通常、骨髄で誘導された細胞を含む細胞の製剤を抗体または抗体で誘導された親和性試薬（例えば、所定表面マーカーに対して特異的な抗体）で培養した後、抗体が結合された細胞のために、または細胞に対して選択するのに結合された親和性試薬を使用することで実施する。選択工程は一般的に、
固相基質に（直接または間接）結合された抗体を利用して（パンニング、免疫親和性クロマトグラフィー）または親和性試薬を通じて磁気粒子に結合された細胞の収集に磁場を利用し（免疫磁気分離）、結合された親和性試薬の存否（ＦＡＣＳ）によって単一細胞を含有する液滴を異なる容器に誘導することで達成しうる物理的分離を伴う。代案として、細胞毒性損傷を親和性試薬により結合された細胞に誘導する親和性試薬を利用して骨髄で誘導された細胞製剤から所望しない細胞を除去しうる。細胞毒性損傷は、親和性試薬により活性化されるか（例えば、補体結合）、または親和性試薬により目標細胞に局所化させうる（例えば、リシンＢ鎖のような免疫毒素）。
【０１３４】
前記方法は、骨髄で誘導された細胞または血液細胞の製剤から細胞を補強することに関するものであるが、当業者ならば、類似した陽性及び陰性選択技術を他の組織から出た細胞製剤に適用できるであろう。
【０１３５】
本発明の特定様態は、血管幹細胞の試験管内増殖に関する。特定の実施形態で、本発明の方法により増殖された血管幹細胞は、前述したようなヒト胚芽幹細胞から誘導された早期胚様体から得る。他の実施形態で、血管幹細胞は、ヒト組織（例えば、胎盤または臍帯血液、末梢血液、骨髄など）から単離または補強する。
【０１３６】
特定の実施形態で、血管幹細胞は、ホメオドメイン蛋白質（本明細書でホメオボックス蛋白質とも称する）の存在下に増殖させる。追加実施形態で、血管幹細胞は、ＨＯＸＢ４の存在下に増殖させる。特定の実施形態で、ＨＯＸＢ４は血管幹細胞の増殖方法を通じて血管幹細胞に添加する。
【０１３７】
ＨＯＸＢ４は、骨髄の幹細胞分画で細胞内発現され、次いで、分化の間に下方調節されるホメオドメイン転写因子である（ＨＯＸ２Ｆ、ＨＯＸ２、ＨＯＸ−２．６、そしてラットではＨ０ＸＡ５とも称する）。ＨＯＸＢ４遺伝子の発現は、原始幹細胞表現型の保持と関連している［文献（Ｓａｕｖａｇｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．１９９５  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ９：１７５３−１７６５；Ｂｕｓｋｅ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｂｌｏｏｄ  １００：８６２−８６８；Ｔｈｏｒｓｔｅｉｎｓｄｏｔｔｉｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９９  Ｂｌｏｏｄ  ９４：２６０５−２６１２；Ａｎｔｏｎｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１  Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２９：１１２５−１１３４）］。
【０１３８】
本発明の方法で血管幹細胞の生成及び増殖に使われるＨＯＸＢ４は全長ＨＯＸＢ４（例えば、公開受託番号ＧＩ：１３２７３３１５、ＧＩ：２９３５１５６８と特定されたＨＯＸＢ４ポリペプチド）だけでなく、その任意の機能性変移体及び活性断片を含むが、これに限定されない。野生型ＨＯＸＢ４蛋白質は、配列番号１、配列番号３のアミノ酸配列またはその蛋白質の任意の他の代案的な対立遺伝子形態でコーディングされうる。このような配列は、Ｇｅｎｂａｎｋのように公開的に入手可能なデータベースを通じて接近しうる。また、ＨＯＸＢ４は、細胞内でエクトピカル（ｅｃｔｏｐｉｃａｌ）に発現されるか、培地に提供されうる。エクトピカルに発現されたＨＯＸＢ４は、誘発促進者に実施可能に連結されうる。培地に提供されたＨＯＸＢ４は、他の細胞形態（例えば、フィーダ層）により分泌されるか、または培地に直接添加されうる。
【０１３９】
本発明はまた、ＨＯＸＢ４（全長ＨＯＸＢ４またはＨＯＸＢ４機能性変移体またはＨＯＸＢ４の活性断片を含む融合蛋白質含む）を含む融合蛋白質に関する。ＨＯＸＢ４以外に、この融合蛋白質はまた、任意の追加蛋白質、蛋白質ドメインまたはペプチドを含むことができる。特定の実施形態で、ＨＯＸＢ４は培地から細胞に、次いで核区域に蛋白質が転位されるように、蛋白質伝達ドメイン（ＰＴＤ）に結合しうる。融合蛋白質は、蛋白質ドメイン間に位置した１以上のリンカー配列を含めるか、含めない。
【０１４０】
ＨＯＸＢ４の機能性変移体は、ＨＯＸＢ４の突然変異及び対立遺伝子変移体及びその活性断片を含む。ＨＯＸＢ４の機能性変移体は、本発明の方法によって血管幹細胞を増殖させうる任意のＨＯＸＢ４ポリペプチド及びその活性断片を含む。ＨＯＸＢ４機能性変移体はまた、本来のＨＯＸＢ４蛋白紙に比べて転写活性がさらに大きいＨＯＸＢ４ポリペプチドを含む。ＨＯＸＢ４変移体は、野生型ＨＯＸＢ４と関連して１以上のアミノ酸が置換、付加及び／または欠失された蛋白質を含む。ＨＯＸＢ４変移体はまた、配列番号１または配列番号３に提供された配列と７５％以上類似したポリペプチドを含むが、これに限定されない。したがって、ＨＯＸＢ４変移体は、配列番号１または配列番号３に提供されたアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％及び９９％類似したポリペプチドを含む。
【０１４１】
ＨＯＸＢ４変移体はまた、その補体をコーディングする核酸配列と８０％以上同じ核酸配列でコーディングされたポリペプチドを含む［例えば、野生型ＨＯＸＢ４蛋白質は、配列番号２（ＧＩ：８５３７６１８７）または配列番号４（ＧＩ：２９３５１５６７）の核酸配列によりコーディングされうる］。したがって、ＨＯＸＢ４変移体は、配列番号２または配列番号４に提供された配列と８５％、９０％、９５％及び９９％同一である核酸配列またはその相補配列でコーディングされたＨＯＸＢ４ポリペプチドを含む。
【０１４２】
ＨＯＸＢ４をコーディングする核酸配列は、厳格な条件下で配列番号２または４の核酸配列で結合する任意の核酸配列またはその相補配列またはその断片を含むが、これに限定されない。同様に、遺伝子コードの縮退性によって、配列番号２または４に記載された核酸と異なる核酸も本発明の範囲に含まれる。ＨＯＸＢ４変移体ポリペプチドはまた、スプライス変移体または他の自然発生ＨＯＸＢ４蛋白質または核酸配列を含む。
【０１４３】
ＨＯＸＢ４の活性断片は、本発明の方法によって血管幹細胞を保持しうる全長ＨＯＸＢ４ポリペプチドの任意の断片を含むが、これに限定されない。したがって、一実施形態で、本発明のＨＯＸＢ４蛋白質は、Ｎ末端の一部、例えば、全長ＨＯＸＢ４のＮ末端３１、３２、または３３アミノ酸が欠失されたＨＯＸＢ４蛋白質である。ＨＯＸＢ４蛋白質のうち、任意のものは追加蛋白質または蛋白質ドメインで融合されうる。例えば、ＨＯＸＢ４は蛋白質伝達ドメイン（ＰＴＤ）に連結されうる。
【０１４４】
ＨＯＸＢ４に共有または非共有結合された蛋白質伝達ドメインは、ＨＯＢＸ４が細胞膜を横切って転位させて、蛋白質を細胞の核区域に最終的に到達させうる。
【０１４５】
ＨＯＸＢ４蛋白質で融合されるＰＴＤは、ＨＩＶ転写活性蛋白質（ＴＡＴ）（Ｔａｔ４７−５７）のＰＴＤを含む［文献（Ｓｃｈｗａｒｚｅ  ａｎｄ  Ｄｏｗｄｙ  ２０００  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２１：４５−４８；Ｋｒｏｓｌ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（９）：１４２８−１４３２）］。ＨＩＶ  ＴＡＴ蛋白質において、膜転位活性を与えるアミノ酸配列は、残基４７−５７（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、配列番号５）に該当する［文献（Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．、２００１、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６１：４７３−４７７；Ｖｉｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１６０１０−１６０１７）］。この配列は、単独で蛋白質転位活性を与える。ＴＡＴ  ＰＴＤはまた、９個のアミノ酸ペプチド配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号６）［文献（（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．ＭｏＩ  Ｃｅｌｌｓ  ２００２（３０）：２０２−８）］。ＴＡＴ  ＰＴＤ配列は、ＹＡＲＫＡＲＲＱＡＲＲ（配列番号７）、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号８）、ＹＡＲＡＡＲＲＡＡＲＲ（配列番号９）及びＲＡＲＡＡＲＲＡＡＲＡ（配列番号１０）をはじめとして文献（Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６１：４７３−４７７）（その開示内容を本明細書で参考にして引用する）に開示されたペプチド配列のうち、任意のものでありうる。
【０１４６】
本発明のＨＯＸＢ４蛋白質に融合されうるＰＴＤを含む他の蛋白質は、単純疱疹ウイルス１（ＨＳＶ−Ｉ）ＤＮＡ結合蛋白質ＶＰ２２及びショウジョウバエアンテナペジア（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ、Ａｎｔｐ）ホメオチック転写因子を含む［文献（Ｓｃｈｗａｒｚｅ  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１０）：２９０−２９５）］。Ａｎｔｐに対してアミノ酸４３−５８（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、配列番号１１）は、蛋白質伝達ドメインを表し、ＨＳＶ  ＶＰ２２に対してＰＴＤは残基ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＲＲＰＶＥ（配列番号１２）で表示される。代案として、伝達活性を与える人工ペプチドまたはＨｅｐｔａＡＲＧ（ＲＲＲＲＲＲＲ、配列番号１３）が本発明のＰＴＤとして使われうる。
【０１４７】
追加実施形態で、ＰＴＤペプチドは二重化または多重化されたＰＴＤペプチドでありうる。特定の実施形態で、ＰＴＤは、ＴＡＴ  ＰＴＤペプチドＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号１４）のうち、１つ以上である。特定の実施形態で、ＰＴＤは、ＴＡＴ  ＰＴＤペプチドＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号１５）のうち、３つで構成されたマルチマーである。例えば、三重化合成蛋白質伝達ドメイン（ｔＰＴＤ）のようなマルチマーＰＴＤに融合または結合されたＨＯＸＢ４蛋白質は、細胞内で減少した不安定性及び増加した安定性を表すことができる。このようなＨＯＸＢ４構造はまた、ｈＥＳ細胞の存在下に、そして無血清培地内で安定的でありうる。
【０１４８】
融合蛋白質をコーディングする融合遺伝子の製造技術は、当業系に公知されている。実質的に、異なるポリペプチド配列をコーディングする多様なＤＮＡ断片の連結は、通常的な技術によって行う。他の実施形態で、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成器をはじめとする通常的な技術により合成しうる。代案として、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、後続してアニーリング処理してキメラ遺伝子配列を生成させる２個の連続遺伝子断片間に補完的懸垂を誘発するアンカープライマ（ａｎｃｈｏｒｐｒｉｍｅｒ）を使用して行える［例えば、文献（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：１９９２）参照］。
【０１４９】
特定の実施形態で、ポリ−（Ｈｉｓ）配列のように精製先導配列をコーディングする融合遺伝子がＨＯＸＢ４ポリペプチドまたはＨＯＸＢ４−融合蛋白質の所定部分のＮ末端に結合されて、Ｎｉ２＋金属樹脂を利用する親和性クロマトグラフィーにより融合蛋白質が精製されうる。次いで、精製先導配列をエンテロキナーゼで処理して除去し、精製されたＨＯＸＢ４ポリペプチドを提供しうる［例えば、文献（Ｈｏｃｈｕｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ４１１：１７７；ａｎｄ  Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：８９７２）参照］。
【０１５０】
特定の実施形態で、ＨＯＸＢ４蛋白質またはその機能性変移体または活性ドメインは、リンカー配列を介在するか、介在せず、第２蛋白質または蛋白質ドメイン（例えば、ＰＤＴ）のＣ末端またはＮ末端に連結される。リンカーの正確な長さ及び配列及び連結された配列に対するその配向は多様でありえる。リンカーは、例えば、２、１０、２０、３０個以上のアミノ酸を含むことができ、溶解度、長さ、立体分離のような所定特性を基準に選択しうる。特定の実施形態で、リンカーは、例えば、融合蛋白質の精製、検出または改質に有用な機能性配列を含むことができる。特定の実施形態で、リンカーは、２個以上のグルシンのポリペプチドを含む。
【０１５１】
ドメインが融合される蛋白質ドメイン及び／またはリンカーを改質してＨＯＸＢ４の効率、安定性及び／または機能特性を変更しうる。
【０１５２】
特定の実施形態で、ＨＯＸＢ４は、血管幹細胞内でエクトピカルに発現されるか、または培地に提供される。エクトピカルに発現されたＨＯＸＢ４は、調節配列に実施可能に連結される。調節配列は、当業系に認知されており、ＨＯＸＢ４ポリペプチドの発現を誘導するために選択される。
【０１５３】
培地に提供されたＨＯＸＢ４は、他の細胞類型により分泌されうる。他の細胞類型は、分泌可能なＨＯＸＢ４を発現するために伝えられたマウス間質細胞層のようなフィーダ層でありうる。例えば、ＨＯＸＢ４は、蛋白質の流出及び分泌を促進する疎水性配列または単一ペプチドを含むように融合または操作されうる。代案として、ＰＴＤに共有または非共有結合された融合蛋白質のようなＨＯＸＢ４は培地に直接添加されうる。追加的に、ＨＯＸＢ４は、レトロウイルスベクターまたはアデノウィルスベクターのようなウイルスベクター上に媒介されうる。このようなベクターは、その培養物で血管幹細胞または他の細胞を伝達しうる。
【０１５４】
特定の実施形態で、使われるＨＯＸＢ４蛋白質によって、血管幹細胞の増殖の間に選択された時間でＨＯＸＢ４を培地に添加する。血管幹細胞は、無血清培地で増殖されるために、ＨＯＸＢ４は比較的安定的である。したがって、特定の実施形態で、ＨＯＸＢ４蛋白質または融合蛋白質を毎日ヒト血管幹細胞に添加する。他の実施形態で、ＨＯＸＢ４蛋白質または融合蛋白質を隔日で添加し、また他の実施形態でＨＯＸＢ４蛋白質または融合蛋白質を二日ごとに添加する。一実施形態で、ＨＯＸＢ４融合蛋白質、ＨＯＸＢ４−ＰＴＤは二日ごとに培地に添加する。
【０１５５】
特定の実施形態で、血管幹細胞は、このような細胞の増殖に十分に存在する任意の他の成長因子または蛋白質の存在下に増殖させることができる。
【０１５６】
ヒトまたは非ヒトＥＳ細胞、骨髄、胎盤またはヘソ臍帯血液、末梢血液または他の組織をはじめとする任意の供給源から得た血管幹細胞を前記方法によって増殖させることができる。したがって、特定の実施形態で、選択された数の精製された血管幹細胞または補強された細胞を血管幹細胞成長に対して最適化された無血清メチルセルロース培地（例えば、ＢＬ−ＣＦＵ培地、実施例１及び２参照）と混合する。この培地を初期段階サイトカイン（ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＦＬ、ＶＧＦ、ＢＭＰ類似ＢＭＰ２、ＢＭＰ４及びＢＭＰ７を含むが、これに限定されない。ＢＭＰ３は除外）及びＨＯＸＢ４で補完されうる。特定の実施形態で、エリトロ蛋白質（ＥＰＯ）を培地に添加する。特定の実施形態で、ＥＰＯ、ＴＰＯ及びＦＬを培地に添加する。次いで、細胞を超低付着培養プレートに置いてＣＯ２インキュベータで成長させる。前記のように、血管幹細胞コロニは、特有の葡萄類似外形を表し、他の細胞より比較的小さく、よって、他の細胞類型と区別されうる。血管幹細胞に対してマーカーのみならず、造血細胞または内皮細胞血統でさらに分化されうるその能力を試験しうる。次いで、血管幹細胞を単離し、試験管内で増殖させる。増殖に使われる培地は、初期段階サイトカイン及びＨＯＸＢ４で補完された血管幹細胞成長に対して最適化された無血清メチルセルロース培地（例えば、ＢＬ−ＣＦＵ）を含む。初期段階サイトカインは、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＦＬ、ＶＥＧＦ、ＢＭＰ類似ＢＭＰ２、ＢＭＰ４及びＢＭＰ７を含むが、これに限定されず、ＢＭＰ３は除外する。特定の実施形態で、エリトロ蛋白質（ＥＰＯ）を培地に添加する。追加実施形態で、ＥＰＯ、ＴＰＯ及びＦＬを培地に添加する。
【０１５７】
したがって、血管幹細胞増殖用培地は、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＢＭＰ−４及びＨｏｘＢ４を含み、特定の実施形態で培地は、ＴＰＯ及びＦＬをさらに含むことができる。約３．５日間培養されたＥＢから製造された単一細胞を収集し、２ないし５分間０．０５％トリプシン−０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に解離し、２２Ｇ針を３ないし５回通過させて単一細胞懸濁液を製造した。５分間１，０００ｒｐｍで遠心分離して細胞を収集した。細胞ペレットを５０ないし２００μｌのＳｔｅｍｌｉｎｅ  Ｉ培地に再懸濁させた。血管幹細胞を増殖させるために、２〜５×１０５ｈＥＳ細胞の分化で誘導された単一細胞懸濁液を、５０ｎｇ／μｌのＴｐｏ及びＦＬを含有するか、含有せず、ＩｓｏｃｖｅのＭＤＭのうち、１．０％のメチルセルロース、１ないし２％の牛血清アルブミン、０．１ｍＭの２−メルカプロエタノール、１０μｇ／ｍｌのｒｈ−インシュリン、２００μｇ／ｍｌの鉄で飽和されたヒトトランスフェリン、２０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＧＭ−ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＩＬ−３、２０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＩＬ−６、２０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−Ｇ−ＣＳＦ、３−６単位／ｍｌのｒｈ−Ｅｐｏ、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＢＭＰ−４及び１．５μｇ／ｍｌのｔＰＴＤ−ＨｏｘＢ４を含有する２ｍｌの血管幹細胞増殖培地（ＨＧＭ）と混合した。細胞混合物を超低プレートに置き、４ないし６日間５％ＣＯ２内で３７℃で培養した。
【０１５８】
特定状況では、患者または患者親戚から血管幹細胞を得て前記血管幹細胞を試験管内で増殖させることが望ましい。このような状況は、例えば、化学療法または放射線治療を計画している患者、または（患者自身の幹細胞を利用する）自家ＨＳＣ移植を利用しうる他の状況を含む。したがって、本発明は、本発明の増殖された血管幹細胞または血管幹細胞血統細胞を利用して、細胞に基づいた治療を必要とする患者（例えば、造血再構成または治療、または虚血をはじめとする血管損傷の治療または血管成長を必要とする患者、下記参照）を治療する方法であって、血管幹細胞を患者または患者親戚の骨髄、血液または他の組織から得る治療方法を提供する。したがって、特定の実施形態で、血管幹細胞（または血管幹細胞血統細胞）を必要とする患者の治療方法は、患者または患者親戚から血管幹細胞を単離する段階を含むことができる。患者または患者親戚から単離した血管幹細胞は、本発明の方法によって試験管内で増殖させ、次いで患者に投与しうる。代案として、増殖された血管幹細胞は、さらに成長させて患者治療前に造血細胞または内皮細胞を生成させることができる。
【０１５９】
体細胞核移植のような当業系に公知された任意の方法により、このような患者からヒトＥＳ細胞をも得られる。次いで、本発明の方法を利用して、この患者の血管幹細胞を生成させ、該固有なＥＳ細胞から増殖させる。これら血管幹細胞またはその血統誘導体を、その患者に、または該親戚に投与しうる。
【０１６０】
本発明の方法を使用して、ヒト血管幹細胞を増殖させ、次いで多様な治療及び臨床分野で使われうる商業的量産に到達することができる。また、本願に開示された方法で得た血管幹細胞をさらに分化させて臨床分野で使用するための造血細胞または内皮細胞系統を発生させうる。
【０１６１】
ヒトＥＳ細胞からヒト血管幹細胞を生成及び増殖させる本発明の方法から得た血管幹細胞は、少なくとも内皮細胞または造血細胞に分化する潜在性を有する（すなわち、それらは少なくとも両側潜在性である）。他の血管幹細胞また両側潜在性であり得る。しかし、他の血管幹細胞は、造血細胞及び内皮細胞以外の他の細胞に分化されることもある（すなわち、それらは複合または多数潜在性である）。
複雑性が低下した血管幹細胞を得るためのヒト胚芽幹細胞中のＭＨＣ遺伝子の処理
本発明によるヒト血管幹細胞を生成及び増殖させる方法において出発地点として使われるヒト胚芽幹細胞はまた、ヒト胚芽幹細胞のライブラリから由来し、それらそれぞれは、ヒト個体群に存在する１以上のＭＨＣ対立遺伝子に半接合または同型接合である。所定の実施例において、前記幹細胞ライブラリの各構成員は、前記ライブラリの残りの構成員に比べて異なるセットのＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合または同型接合である。所定の実施例において、前記幹細胞のライブラリは、ヒト個体群に存在するあらゆるＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合または同型接合である。本発明において、１以上の組織適合抗原遺伝子に同型接合である幹細胞は、１以上の（及び一抹の実施例で、全ての）かかる遺伝子に対して無接合である細胞を含む。遺伝子座に対する無接合は、前記遺伝子がその遺伝子座で０、すなわちその遺伝子の対立遺伝子二つとも消失されるか、または非活性化されたことを意味する。あらゆるＭＨＣ遺伝子に無接合である幹細胞は、当業界に公知の標準方法、例えば、遺伝子ターゲッティング及び／または二重接合性の欠損（ＬＯＨ）によって生成されうる。例えば、米国特許出願ＵＳ  ２００４００９１９３６、ＵＳ  ２００３０２１７３７４及びＵＳ  ２００３０２３２４３０、及びＵＳ仮出願番号第６０／７２９，１７３号を参考にする（これらいずれの開示内容も本願に参考として含まれる）。
【０１６２】
従って本発明は、ＭＨＣ複雑性が低下した血管幹細胞のライブラリを含む血管幹細胞を得る方法に係るものである。ＭＨＣ複雑性が低下した血管幹細胞及び血管幹細胞系統細胞は、それが患者一致と関連した困難さを除去するとき、治療分野で利用可能な細胞の供給が増加するであろう。かかる細胞は、ＭＨＣ複合体の遺伝子に対して半接合または同型接合になるように処理された幹細胞から由来しうる。
【０１６３】
ヒトＥＳ細胞は、細胞のＭＨＣ複合体で姉妹染色体の対立遺伝子のうち一つへの変形を含むことができる。遺伝子ターゲッティングのような遺伝子変形を生成させる多様な方法は、ＭＨＣ複合体で遺伝子を変形させるのに利用されうる。また、前記細胞でＭＨＣ複合体の変形された対立遺伝子は、次に同型接合になるように処理し、同じ対立遺伝子が姉妹染色体に存在するようにできる。二重接合性の欠損（ＬＯＨ）のような方法は、細胞がＭＨＣ複合体で同型接合対立遺伝子を有するように処理するのに利用されうる。例えば、親の対立遺伝子からの１セットのＭＨＣ遺伝子のうち１以上の遺伝子がターゲットされ、半接合細胞を生成させることができる。他のセットのＭＨＣ遺伝子は、遺伝子ターゲッティングまたはＬＯＨによって除去され、ヌル（ｎｕｌｌ）細胞株を作ることができる。このヌル細胞株は、多数のＨＬＡ遺伝子、または個別遺伝子を振り落とし、他の点で均一な遺伝的背景を有した半接合または同型接合バンクを製造する胚芽細胞株として再び使われうる。
【０１６４】
一様態において、ライブラリの各構成員が１以上のＨＬＡ遺伝子に対して同型接合であるＥＳ細胞株のライブラリは、本発明の方法によって、血管幹細胞を誘導するのに使われる。他の一様態において、本発明は、血管幹細胞（及び／または血管幹細胞系統細胞）のライブラリを提供するが、このとき、いくつかのＥＳ細胞株価選択されて血管幹細胞に分化される。かような血管幹細胞及び／または血管幹細胞系統細胞は、細胞系治療が必要な患者に使われうる。
【０１６５】
従って、本発明の所定の実施例は、複雑性が低下した胚芽幹細胞から由来したヒト血管幹細胞、造血母細胞、またはヒト内皮細胞を、これを必要とする患者に投与する方法に係るものである。所定の実施例で、該方法は、（ａ）ヒト血管幹細胞、造血母細胞またはヒト内皮細胞を、投与することを含む治療が必要な患者を確認する段階と、（ｂ）患者の細胞表面で発現されたＭＨＣ蛋白質を確認する段階と、（ｃ）本発明の試験管内ヒト血管幹細胞を生成及び増殖させる方法によって製造された、ＭＨＣ複雑性が低下したヒト血管幹細胞のライブラリを提供する段階と、（ｄ）該患者のＭＨＣ蛋白質を、その細胞に一致させるライブラリからヒト血管幹細胞細胞を選択する段階と、（ｅ）選択的に、段階（ｄ）で確認されたヒト血管幹細胞細胞をヒト造血母細胞、内皮細胞または二つとも、または必要によってこれら二系統のうち一つまたは二つともで追加分化される細胞に分化させる段階と、（ｆ）段階（ｄ）及び／または（ｅ）からの任意の細胞を前記患者に投与する段階とを含む。該方法は、地域センター、例えば、病院、クリニック、診療室及び他の健康管理施設で遂行されうる。また、患者に一致すると選択された血管幹細胞は、少ない細胞数で保存される場合、患者治療に先立ち増殖されうる。
ヒト血管コロニー形成細胞／血管幹細胞
所定の様態において、本発明はヒト血管コロニー形成細胞を提供する。これら細胞は、多様な治療及び他の用途を有した唯一の初生細胞類型である。また、この細胞類型は、少なくとも造血及び／または内皮系統の進化を研究するのに重要なツールを提供する。このように本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞を含む組成物及び多様な調製物（薬学調製物を含む）だけではなく、血管コロニー形成細胞から部分的または定期的に分化された１以上の細胞類型を含む組成物及び調製物（薬学調製物を含む）に係るものである。
【０１６６】
「血管幹細胞」及び「血管コロニー形成細胞」という用語は、本出願全体で入れ替えて使われるであろう。これらの細胞は、以下に限定されるものではないが、１以上のマーカの発現（ＲＮＡまたは蛋白質）または発現不足（ＲＮＡまたは蛋白質）を含む多数の構造的及び機能的特性を基に記述されうる。血管コロニー形成細胞は分化し、少なくとも造血細胞類型または内皮細胞類型を発生させることができる。血管コロニー形成細胞は両性潜在性でであり、分化して少なくとも造血細胞類型及び内皮細胞類型を発生させることができることが望ましい。このように、本発明の血管コロニー形成細胞は、少なくとも単一潜在性であり、望ましくは両性潜在性である。追加的ではあるが、血管コロニー形成細胞は、さらに大きいレベルの進化潜在性を有することができ、所定の実施例において、分化して他系統の細胞類型を発生させることができる。所定の実施例において、前記血管コロニー形成細胞は分化し、心臓細胞（例えば、心筋細胞）及び／または平滑筋細胞のような他の中胚葉誘導体を生成できる。
【０１６７】
また、血管コロニー形成細胞は、それらの構造的特性に基づいて確認されたり特性化されうる。具体的に、そして所定の実施例において、これらの細胞は、それらが単に緩く互いに付着されている（他の血管コロニー形成細胞に緩く付着する）という点で唯一である。これらの細胞が互いに単に緩く付着しているために、血管コロニー形成細胞の培養物またはコロニーは、単に機械的な解離技術を利用して酵素的解離技術の必要なしに、単一細胞に解離されうる。前記細胞は、酵素的解離または機械的及び酵素的解離の組合わせよりは機械的解離のみで、前記細胞の生存能を実質的に損傷させずに、前記培養物またはコロニーを解体させるのに十分である。すなわち、機械的な解離は、細胞集合体の酵素的解離に続いて観察されることと比較するとき、実質的な細胞損傷または死亡を引き起こすほど多くの力を必要としない。
【０１６８】
また血管コロニー形成細胞は、１以上のマーカの発現または発現不足（遺伝子濃度または蛋白質の濃度で評価）に基づいて確認されたり特性化されうる。例えば、所定の実施例で、血管コロニー形成細胞は、次の細胞表面マーカ：ＣＤ３４、ＫＤＲ、ＣＤ１３３、またはＣＤ３１のうち１以上の発現不足を基に確認されたり特性化されうる（例えば、前記細胞は、前記マーカのうち１以上、２以上、３以上または４以上の発現不足を基に特性化されうる）。付加的にまたは代案として、血管コロニー形成細胞は、ＧＡＴＡ２及び／またはＬＭＯ２の発現に基づいて確認されたり特性化されうる。付加的にまたは代案として、血管コロニー形成細胞は、表２で分析した１以上のマーカの発現または発現不足（遺伝子の濃度または蛋白質の濃度で評価）に基づいて確認されたり特性化されうる。
【０１６９】
本発明の血管コロニー形成細胞は、かような構造的または機能的特性のうち一つまたは任意の組合わせに基づいて確認されたり特性化されうる。これらの細胞が任意の多数供給源、例えば、胚芽組織、胎児組織または周生期組織から由来しうるが、「血管コロニー形成細胞」という用語は供給源に関係なしに、分化して少なくとも造血細胞類型及び／または内皮細胞類型を生成でき、前述の構造的または機能的特性のうち１以上を有する細胞に適用される。
【０１７０】
次に述べれば、本発明のヒト血管コロニー形成細胞は、下記の構造的特性のうち１以上を有する：（ａ）分化して少なくとも造血細胞類型または内皮細胞類型を生成できる、（ｂ）分化して少なくとも造血細胞類型及び内皮細胞類型を生成できる、（ｃ）互いに（他のヒト血管コロニー形成細胞に）緩く付着する、（ｄ）ＣＤ３４蛋白質を発現しない、（ｅ）ＣＤ３１蛋白質を発現しない、（ｆ）ＫＤＲ蛋白質を発現しない、（ｇ）ＣＤ１３３蛋白質を発現しない、（ｈ）ＧＡＴＡ２蛋白質を発現する、（ｉ）ＬＭＯ２蛋白質を発現する。所定の実施例において、ヒト血管コロニー形成細胞は、本願に記載された構造的または機能的特性のうち２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上または９以上を有する。
【０１７１】
本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞を提供する。かような細胞は分化し、少なくとも造血及び／または内皮細胞類型を生成できる。所定の実施例において、前記細胞は、他のヒト血管コロニー形成細胞に緩く付着することを特徴とする。代案としてまたは付加的に、これらの細胞はまた、所定のマーカの発現または発現不足を基に記述されうる。例えば、これらの細胞はまた、下記の蛋白質：ＣＤ３４、ＫＤＲ、ＣＤ１３３及びＣＤ３１のうち１以上の発現不足を基に記述されうる。
【０１７２】
前述のように、ヒト血管コロニー形成細胞の興味深い特性のうち一つは、互いに緩く付着しているということである。これらの細胞は単に互いに緩く付着しているために、血管コロニー形成細胞の培養物またはコロニーは、単に機械的解離技術によって、酵素的解離技術の必要なしに単一細胞に解離されうる。前記細胞は互いに十分に緩く付着しており、酵素的解離またはそれらの組合わせよりは、機械的解離だけで前記細胞の生存能を実質的に損傷させずに、前記培養物またはコロニーを解体させるのに十分である。すなわち、機械的解離は、細胞損傷または死亡を引き起こすほどに多くの力を必要としない。
【０１７３】
該特性は、前記細胞を技術してそれらを他の細胞類型と表現型で区分するのに有用であるだけではなく、重要な治療上に意味を有する。例えば、比較的大量（１ｘ１０６より大きいか、またはさらに１ｘ１０７より大きかったり、さらに１ｘ１Ｏ８より大きい）の血管コロニー形成細胞が凝血または塞栓、または他の点で肺でのロッジングを引き起こす危険が実質的に少ないヒトまたは他の動物に注入されうる。これは、細胞上治療において重要な進歩である。比較的大量の細胞を安全に投与する能力は、細胞性治療が増加する多数の疾患及び病態の効果的な治療において実用的であって可能なものにする。
【０１７４】
「緩く付着された（付着性が弱い）」という用語は、前記で定性的に記述され、互いに対するヒト血管コロニー形成細胞の行為を指す。血管コロニー形成細胞の培養物またはコロニーは、単に機械的解離技術を利用し、酵素的解離技術の必要なしに単一細胞に解離されうる。前記細胞は互いに十分に緩く付着しており、酵素的解離またはこれらの組合わせよりは、機械的解離だけで前記細胞の生存能を実質的に損傷させずに、前記培養物またはコロニーを解体させるのに十分である。すなわち、機械的解離は、細胞損傷または死亡を引き起こすほどに多くの力を必要としない。
【０１７５】
また前記用語は、さらに定量的に記述されもする。例えば、そして所定の実施例において、「緩く付着した」という用語は、前記培養物のうち細胞の５０％以上が単に機械的解離技術を利用し、酵素的解離技術の必要なしに単一細胞に解離されうる血管コロニー形成細胞の培養物またはコロニーを指すのに使われる。他の実施例において、前記用語は、前記培養物のうち細胞の６０％、６５％、７０％または７５％以上が単に機械的解離技術を利用し、酵素的解離技術の必要なしに単一細胞に解離されうる培養物を指す。さらに他の実施例において、前記用語は、前記培養物のうち細胞の８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上またはさらに１００％が単に機械的解離技術を利用し、酵素的解離技術の必要なしに単一細胞に解離されうる培養物を指す。
【０１７６】
単に機械的解離技術を利用し、酵素的解離技術の必要なしに前記血管コロニー形成細胞を解離させる能力は、機械的解離による前記細胞の健康及び生存能を基にまた評価されうる。すなわち、酵素的解離のない解離が前記細胞のうち相当数を損傷させたり殺すほどに多くの機械的力を要求する場合、前記細胞は、本願で定義したように緩く付着していない。例えば、そして所定の実施例において、「緩く付着した」という用語は、単に機械的解離技術を利用し、酵素的解離技術の必要なしに、同じ細胞を酵素的解離技術を利用して解離したことと比較するとき、前記細胞の健康または生存能に実質的な損傷を与えずに、単一細胞に解離されうる細胞の培養物を指す。例えば、前記細胞の健康または生存能は、同じ細胞の培養物を酵素的解離技術を利用して解離する場合に観察したことと比較するとき、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％より少なく、またはさらに１％より少なく減少する。
【０１７７】
実例的な酵素的解離技術としては、以下に限定されるものではないが、トリプシン、コラゲナーゼ、または細胞−細胞または細胞−マトリックス相互作用を破壊する他の酵素を使用した処理がある。実例的な機械的解離技術としては）、以下に限定されるものではないが、ピペットを介した１以上の通過がある。
【０１７８】
本発明によるヒト血管コロニー形成細胞は、構造的及び機能的に定義される。かような細胞は、胚芽組織、胎児組織、周生組織、及びさらに成人組織を含む多くの供給源のうち任意の供給源から生成されうる。例としては、ヒト血管コロニー形成細胞は、ヒト胚芽幹細胞、他の胚芽誘導細胞（胚盤胞、卵割球、ＩＣＭ、胚芽、栄養膜／栄養膜胚葉細胞、栄養膜幹細胞、原始生殖細胞、胚芽生殖細胞など）、羊水、羊膜幹細胞、胎盤、胎盤幹細胞、及び臍帯から生成されうる。
【０１７９】
本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞、ヒト血管コロニー形成細胞を含む組成物、及びヒト血管コロニー形成細胞を含む製剤（薬学製剤を含む）を提供する。本発明のかような様態の特定された特徴は、下記に詳細に記載されている。本発明は、本発明の下記様態及び実施例の任意の組合わせを含む。
【０１８０】
１つの様態で、本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞を提供する。該細胞は分化し、少なくとも造血及び／または内皮細胞類型を生成できる。特定実施例で該細胞は、他のヒト血管コロニー形成細胞に緩く付着される。特定実施例で該細胞は、ＣＤ３４蛋白質を発現しない。他の特定実施例で該細胞は、下記蛋白質のうち一つ以上を発現しない（例えば、該細胞は、下記蛋白質のうち１個以上、２個以上、３個以上、または４個以上を発現しない）：ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ１３３、ＫＤＲ。他の特定実施例で該細胞は、ＧＡＴＡ２及び／またはＬＭＯ２蛋白質を発現する。他の特定実施例で該細胞は、表２に記載されたマーカのうち一つ以上（例えば、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個など）を発現するか、または発現しない。他の特定実施例で該細胞は、表２に記載されたような発現プロファイルを有する。
【０１８１】
他の様態で本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞を提供する。該細胞は分化し、少なくとも造血及び／または内皮細胞類型を生成でき、該細胞は、任意の下記蛋白質を発現しない：ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＫＤＲ、及びＣＤ１３３。特定実施例で該細胞は、他のヒト血管コロニー形成細胞に緩く付着される。他の実施例で該細胞は、ＧＡＴＡ２及び／またはＬＭＯ２蛋白質を発現する。他の特定実施例で該細胞は、表２に記載されたマーカのうち一つ以上（例えば、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個など）を発現するか、または発現しない。他の特定実施例で該細胞は、表２に記載されたような発現プロファイルを有する。
【０１８２】
さらに他の様態で本発明は、実質的に精製された個体数のヒト血管コロニー形成細胞を含む細胞培養物を提供する。該細胞は分化し、少なくとも造血及び内皮細胞類型を生成でき、該細胞は互いに緩く付着される。特定実施例で該細胞は、ＣＤ３４蛋白質を発現しない。他の特定実施例で該細胞は、下記蛋白質のうち一つ以上を発現しない（例えば、該細胞は、下記蛋白質のうち１個以上、２個以上、３個以上、または４個以上を発現しない）：ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ１３３、ＫＤＲ。他の特定実施例で該細胞は、ＧＡＴＡ２及び／またはＬＭＯ２発現する。他の特定実施例で該細胞は、表２に記載されたマーカのうち一つ以上（１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個など）を発現するか、または発現しない。他の特定実施例で該細胞は、表２に記載されたような発現プロファイルを有する。
【０１８３】
さらに他の様態で本発明は、胚芽組織から分化されたヒト血管コロニー形成細胞を含む細胞培養物を提供する。特定実施例で血管コロニー形成細胞は、互いに他に緩く付着される。特定実施例で該細胞は分化し、少なくとも造血及び／または内皮細胞類型を生成でき、該細胞は互いに緩く付着される。特定実施例で該細胞は、ＣＤ３４蛋白質を発現しない。他の特定実施例で該細胞は、下記蛋白質のうち一つ以上を発現しない（例えば、該細胞は、下記蛋白質のうち１個以上、２個以上、３個以上、または４個以上を発現しない）：ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ１３３、ＫＤＲ。他の特定実施例で該細胞は、ＧＡＴＡ２及び／またはＬＭＯ２蛋白質を発現する。他の特定実施例で該細胞は、表２に記載されたマーカのうち一つ以上（１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個など）を発現するか、または発現しない。他の特定実施例で該細胞は、表２に記載されたような発現プロファイルを有する。
【０１８４】
さらに他の様態で本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞を含む細胞培養物を提供し、該細胞は分化し、少なくとも造血及び／または内皮細胞類型を生成できる。特定実施例で該細胞は、互いに緩く付着される。特定実施例で該細胞は、ＣＤ３４蛋白質を発現しない。他の特定実施例で該細胞は、下記蛋白質のうち一つ以上を発現しない（例えば、該細胞は、下記蛋白質のうち１個以上、２個以上、３個以上、または４個以上を発現しない）：ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ１３３、ＫＤＲ。他の特定実施例で該細胞は、ＧＡＴＡ２及び／またはＬＭＯ２蛋白質を発現する。他の特定実施例で該細胞は、表２に記載されたマーカのうち一つ以上（１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個など）を発現するか、または発現しない。他の特定実施例で該細胞は、表２に記載されたような発現プロファイルを有する。
【０１８５】
さらに他の様態で本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞を含む薬学製剤を提供し、該細胞は分化し、少なくとも造血及び／または内皮細胞類型を生成できる。特定実施例で、血管コロニー形成細胞は互いに緩く付着される。特定実施例で該細胞は、ＣＤ３４蛋白質を発現しない。他の特定実施例で該細胞は、下記蛋白質のうち一つ以上を発現しない（例えば、該細胞は、下記蛋白質のうち１個以上、２個以上、３個以上、または４個以上を発現しない）：ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ１３３、ＫＤＲ。他の特定実施例で該細胞は、ＧＡＴＡ２及び／またはＬＭＯ２蛋白質を発現する。他の特定実施例で該細胞は、表２に記載されたマーカのうち一つ以上（１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個など）を発現するか、または発現しない。他の特定実施例で該細胞は、表２に記載されたような発現プロファイルを有する。薬学製剤は、任意の薬学的に許容可能な担体または賦形剤を使用して製造できる。
【０１８６】
さらに他の様態で本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞を含む薬学製剤を提供し、該血管コロニー形成細胞は、任意の下記蛋白質を発現しない：ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＫＤＲ、及びＣＤ１３３。特定実施例で、該血管コロニー形成細胞は分化し、少なくとも造血及び／または内皮細胞類型を生成できる。特定実施例で、該血管コロニー形成細胞は互いに緩く付着される。他の特定実施例で該細胞は、ＧＡＴＡ２及び／またはＬＭＯ２蛋白質を発現する。他の特定実施例で該細胞は、表２に記載されたマーカのうち一つ以上（１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個など）を発現するか、または発現しない。他の特定実施例で該細胞は、表２に記載されたような発現プロファイルを有する。薬学製剤は、任意の薬学的に許容可能な担体または賦形剤を使用して製造できる。
【０１８７】
前述のうち特定実施例で該組成物または薬学製剤は、１×１Ｏ５以上のヒト血管コロニー形成細胞を含む。前述のうち他の特定実施例で、該組成物または薬学製剤は、１×１Ｏ６以上、５×１Ｏ６以上、１×１Ｏ７以上、または１×１Ｏ７超過のヒト血管コロニー形成細胞を含む。
【０１８８】
追加細胞、組成物、及び製剤は、ヒト血管コロニー形成細胞から部分または末端分化された細胞を含む。例えば、本発明は、血管コロニー形成細胞から分化された一つ以上の造血及び／または内皮細胞類型を含む組成物及び製剤を含む。例示的な造血細胞類型は、造血幹細胞、血小板、ＲＢＣ、リンパ球、巨核球などを含む。追加的な例として、本発明は、血管コロニー形成細胞から分化された、一つ以上の他の細胞類型、例えば、一つ以上の部分または末端分化された中胚葉性細胞類型を含む組成物及び製剤を含む。
【０１８９】
前述のうち特定実施例で本発明は、ヒト血管コロニー細胞またはその細胞から部分または末端分化された細胞の冷凍保存製剤を提供する。
【０１９０】
前述のうち特定実施例で本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞、またはヒト血管コロニー形成細胞の組成物または製剤の治療用途を提供する。かような細胞及び製剤は、明細書を介して記述されたものだけではなく、血液銀行産業での任意の症状または疾患治療時に使用できる。さらに、ヒト血管コロニー形成細胞から分化された細胞、またはヒト血管コロニー形成細胞の組成物または製剤は、明細書を介して記述されたものだけではなく、血液銀行産業での任意の症状または疾患治療時に治療学的に使用できる。
【０１９１】
本発明のヒト血管コロニー形成細胞は、治療学的に使用できる。追加でまたは代案的に、ヒト血管コロニー形成細胞は、内皮及び造血系譜の分化を研究するために、または診断検査で、例えば、（ｉ）ヒト血管コロニー形成細胞を維持させるために、または（ｉｉ）ヒト血管コロニー形成細胞の、一つ以上の部分または末端分化された細胞類型への分化を促進させるために使用できる因子を確認するために使用できる。さらに、ヒト血管コロニー形成細胞は、実験室内または生体内使用に対する一つ以上の部分または末端分化された細胞類型を生成させるために使用できる。
【０１９２】
本発明のヒト血管コロニー形成細胞は、本願に記載された任意の疾患または状態の治療時を含み（これに制限されるものではない）、本願に記載された任意の方法または利用分野で使用できる。
実験室内で増殖された血管幹細胞を含む細胞製剤
本発明の特定実施例で、哺乳動物（ヒトを含む）の血管幹細胞は、商業用数量に達するほどに増殖され、多様な治療学的及び臨床的利用分野で使用する。特定実施例で、血管幹細胞は、１０，０００ないし４百万（またはそれ以上）の次数の細胞数に達するように増殖される。かような細胞数は、出発初期の製剤の３ないし４日内に到達しうる。従って本発明は、多量の血管幹細胞を含む製剤であって、前記製剤が少なくとも１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、百万、２百万、３百万または４百万の細胞を含む製剤に係るものである。
【０１９３】
また本発明は、多量の血管幹細胞を含む溶液、組成物、及び製剤であって、前記溶液、前記組成物、及び前記製剤が少なくとも１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、百万、２百万、３百万または４百万の細胞を含む溶液、組成物、及び製剤に係るものである。血管幹細胞はヒトのものでありうる。
【０１９４】
本発明の他の様態は、本願に開示された方法によって収得された血管幹細胞を、臨床的利用分野で後続的に使われる、造血または内皮の細胞系譜、または系譜二つともに分化させるものに係るものである。従って本発明はまた、多量の造血または内皮細胞を含む細胞製剤に係るものである。本発明はまた、本願に開示された方法によって収得された血管幹細胞を造血及び内皮細胞以外の他の細胞系譜に分化させることに係るものである。従って本発明はまた、多量の他の血管幹細胞分化細胞を含む細胞製剤に係るものである。
【０１９５】
多量（例、千万または百万）の血管幹細胞を含む組成物及び製剤は、本願に記載された通りに収得した血管幹細胞を増殖させることによって収得できる。従って本発明は、ＥＳ細胞（例えば、ヒトＥＳ細胞）または臍帯血、末梢血または骨髄血から収得された血管幹細胞を増殖させることによってなされた多量の血管幹細胞を含む組成物及び製剤に係るものである。さらに増殖方法として、例えば、マウス、ラット、牛、または非ヒト霊長類の血管幹細胞に利用される。また本発明は、ヒト以外の他種の多量の血管幹細胞を含む組成物及び製剤に係るものである。本発明の方法によって増殖された血管幹細胞は、二分化性（ｂｉ−ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）でありうる。すなわち、その細胞は、内皮細胞または造血幹細胞に分化されうる。特定実施例で、ヒトＥＳ細胞から生成されて増殖されたヒト血管幹細胞は、二分化性である。血管コロニー形成細胞は、少なくとも造血細胞類型または内皮細胞類型を提供するために分化されうる。血管コロニー形成細胞は望ましくは二分化性であり、少なくとも造血細胞類型及び内皮細胞類型を提供するために分化されうる。かかる機能において、本発明の血管コロニー形成細胞は少なくとも単一分化性（ｕｎｉ−ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）、望ましくは二分化性である。さらにしかし、血管コロニー形成細胞は高い程度の発生潜在力を有することができ、特定実施例で、他の系譜の細胞類型を提供するために分化されうる。特定実施例で、血管コロニー形成細胞は、他の中胚葉性分化体、例えば、心臓細胞（例えば、心筋細胞）及び／または平滑筋細胞を提供するために分化されうる。
哺乳動物血管幹細胞細胞マーカ
前述の通り、血管コロニー形成細胞は、成体内皮または造血細胞の特徴的な特定の特性が不足している。しかし、かような血管コロニー形成細胞または血管幹細胞は、例えば、ＣＤ７１＋、ＧＡＴＡ−１及びＧＡＴＡ−２蛋白質、ＣＸＣＲ−４、及びＴＰＯ及びＥＰＯの受容体のような多様なマーカによって確認しうる。追加実施例で、血管幹細胞はＬＭＯ−２を発現する。さらに血管幹細胞は、他のマーカの不在または低い発現によって特徴づけられる。従って血管幹細胞は、ＣＤ３４−ＣＤ３１−、及びＫＤＲ−でありうる。追加実施例で、血管幹細胞ＣＤ３４−、ＣＤ３１−、ＫＤＲ−、及びＣＤ１３３−でありうる。
【０１９６】
従って特定実施例で、本発明の方法によって生成されて増殖された血管幹細胞は、表２に記載された任意の一つ以上のマーカの存在または不在によって特徴づけられる。例えば、血管幹細胞は、「ＢＬ−ＣＦＣ」の下に「−」で表示された表２に記載された任意の一つ以上のマーカの発現に対する検査に陰性でありうる。従って、一部実施例で血管幹細胞は、ＣＤ３４発現に対して陰性でありうる。該細胞は、追加でまたは代案的にＣＤ３１、ＣＤ１３３、及び／またはＫＤＲ発現に対して陰性でありうる。追加実施例で血管幹細胞は、「＋」で表２に表示された任意のマーカを発現できる。例えば該細胞は、マーカのうち一つ以上を発現できる。ＬＭＯ−２及びＧＡＴＡ−２。マーカの発現は、例えば、蛋白質発現を検査するための免疫組織化学または免疫吸取紙（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）、またはＲＮＡレベルで発現を検査するためのｍＲＮＡ分析のような任意の方法によって検定できる。
血管幹細胞系譜細胞の分化
また本発明の方法及び細胞製剤は、血管幹細胞分化細胞に係るものである。本発明によって生成されて増殖されたヒト血管幹細胞、及び本発明の方法によって増殖された哺乳動物血管幹細胞は、実験室内で分化して造血細胞（造血幹細胞（ＨＳＣ）を含む）または内皮細胞だけではなく、かような２種系譜でさらに分化された細胞を収得できる。かような細胞は、後述の治療学的及び商業的利用分野で後続的に使用できる。
【０１９７】
特定実施例で造血細胞は、血管幹細胞を無血清ＢＬ−ＣＦＵで３〜１０日間成長させて誘導する。他の実施例で、ｈＥＳ−誘導されたＢＬ−ＣＦＣ細胞の単一細胞懸濁液を１０〜１４日間成長させる。無血清条件が拡大生産及び調節の指針との適合性だけではなく、コスト減少を促進する限り、無血清条件を維持することが最も望ましい。本発明の血管幹細胞はまた、無血清Ｈｅｍ−培養で成長させることができ（Ｂｈａｔｉａ  ｅｔ  ａｌ．１９９７  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ（１８６）：６１９−６２４）、これはヒト造血母細胞を維持させ、ＢＳＡ（例えば、１％ＢＳＡ）、インシュリン（例えば、５μｇ／ｍｌヒトインシュリン）、トランスフェリン培地またはトランスフェリン（例えば、１００μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン）、Ｌ−グルタミン、ベータ−メルカプトエタノール（例えば、１０−４Ｍ）及び成長因子を含む。成長因子は、ＳＣＦ（例えば、３００ｎｇ／ｍｌ）、顆粒球−コロニー−刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）（例えば、５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ−３（例えば、３００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−３（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−６（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）を含むことができる。血管幹細胞から造血細胞を得るのに有用な他の因子としては、血小板形成因子（ＴＰＯ）及びＶＥＧＦ（例えば、文献［Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｅｘ（１０４４）：２９−４０］参照）及びＢＭＰ−４を挙げることができる。前記血管幹細胞はまた、多血統造血成長因子カクテルを補充した無血清メチルセルロース培地で成長できる。従って血管幹細胞は、早期活性成長因子（例えば、ｃ−ｋｉｔ配位子、ｆｌｔ３配位子）、多血統成長因子（例えば、ＩＬ−３、顆粒球大食細胞−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ））及び単一血統成長因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ））、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦを補充し、ＢＳＡ、飽和ヒトトランスフェリン、ヒトＬＤＬを含むイスコーブ改質されたＤｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ：Ｉｓｃｏｖｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  ｍｅｄｉｕｍ）中のメチルセルロースで成長できる。代案として血管幹細胞は、造血細胞（例えば、赤血球、大食細胞または顆粒球）の一類型の成長を支援する単一血統成長因子を含む培地で成長できる。
【０１９８】
一実施例で血管幹細胞コロニーは、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ  Ｉ培地で再懸濁される。次に、細胞を無血清造血ＣＦＵ培地（Ｈ４４３６、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＴＭ）１ｍｌ＋ｔＰＴＤ−ＨｏｘＢ４及び０．５％ＥＸ−ＣＹＴＥ（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｉｎｃ．ＴＭ）１．５μｇ／ｍｌと混合する。次に、細胞混合物を細胞培養未処理プレート上でプレーティングし、３７℃で１０〜１４日間恒温処理した。初期プレーティング１０〜１４日後に発生する造血ＣＦＵは、形態学的に、例えばＷｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ染料によって染色されることを特徴とすることができる。
【０１９９】
造血細胞はまた、当業界に公知のその他条件を利用して血管幹細胞から誘導できる（例えば、ＩＭＤＭ、３０％牛胎児血清（ＦＣＳ）、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１０−４Ｍベータ−メルカプトエタノール及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含む培地で）。また他の実施例で、基本繊維芽細胞成長因子を使用してＥＢ内でＢＬ−ＣＦＣいずれの頻度も向上させ、造血分化を促進できる（Ｆａｌｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１２７）：１９３１−１９４１）。他の実施例で、成長因子造血（ＨＡＰＯ）を利用して血管幹細胞の成長及び造血分化を促進する（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｂｌｏｏｄ（１０３）：４４４９−４４５６）。造血細胞への分化は、例えばＣＤ４５状態（ＣＤ４５＋）及びＣＦＵ分析によって評価できる。
【０２００】
造血細胞を形成するために、ヒト血管幹細胞は、ＣＦＵ−培地で３〜１０日間、または任意にさらに長時間（例えば、１０〜２４日）の間成長できる。本発明のヒト血管幹細胞は、顆粒球、赤血球、大食細胞及び巨核細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ／混合）を含むＣＦＵだけではなく、以下の細胞類型（例えば、ＣＦＵ−Ｇ、ＣＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−Ｍ及びＣＦＵ−ＧＭ）のうちただ一つを含有するユニットを形成するコロニーを形成できる。特定実施例で、ｈＥＳ−誘導されたＢＬ−ＣＦＣ細胞の単一細胞懸濁液は１０〜１４日間成長し、例えば赤血球、骨髄、大食細胞及び多血統造血細胞のような造血細胞を誘導する。
【０２０１】
本発明のさらに他の様態は、本願で記述された方法によって収得されて増殖されたヒト血管幹細胞、またはこれによって増殖された哺乳動物血管幹細胞から誘導された内皮細胞に係るものである。血管幹細胞は、上皮成熟に望ましい条件で成長できる。
【０２０２】
本発明の特定実施例で、内皮細胞を得るために、血管幹細胞をまずファイブロネクチン・コーティングされた表面にプレーティングし、３〜５日（または、他の実施例で３〜７日後）後に、Ｍａｔｒｉｇｅｌの厚い層で再プレーティングして内皮細胞への分化を支援する。前記条件は、血管幹細胞発達中に形成される無血清条件を維持させる。代案として血管幹細胞は、公知の培地で成長して内皮細胞への分化を支援する。かような条件は、例えば２０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、５０ｎｇ／ｍｌ内皮細胞成長補充物（すなわち、脳下垂体抽出物）、１０  ＩＵ／ｍｌヘパリン及び５ｎｇ／ｍｌヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５を含むＥｎｄｏ−培養を含む（Ｔｅｒｒａｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ａｎｉｍ（３６）：１２５−１３２）。当業界に公知の他の条件としては、２５％ＦＣＳ／ウマ血清を補充した培地があり、一部実施例では、ヘパリン（例えば、１０Ｕ／ｍｌ）、インシュリン類似成長因子（ＩＧＦｌ）（例えば、２ｎｇ）及びＥＣ成長補充物（ＥＣＧＳ、例えば１００μｇ）を補充した培地がある。成長因子ＶＥＧＦ及びＥＧＦをまたＨＡＰＯと共に使用し、内皮分化を支援できる（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。血管幹細胞はまた、コラーゲン及びファイブロネクチンでコーティングされたプレート上にシーディングし、例えば内皮細胞への分化を促進できる。該細胞は、フォンビレブラント因子（ｖＷＦ：ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ）及び内皮酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）及び試験管内内皮ネットワーク形成能に対して分析することができる。
【０２０３】
従って、内皮細胞を形成するために、前述の方法によって誘導された血管幹細胞コロニーをピッキングし、内皮分化への第１段階に最適化されたファイブロネクチン・コーティングされた培養プレート上に再プレーティングする。前記細胞は、ＥＧＭ−２またはＥＧＭ−２ＭＶ完全培地（ＣａｍｂｒｅｘＴＭ）でプレーティングできる。３〜５日、代案的な実施例では３〜７日後に、前記細胞を内皮分化を支援するＭａｔｒｉｇｅｌ層のような表面上に再プレーティングする。恒温処理１６〜２４時間後、分枝型チューブコード（ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｔｕｂｅ−ｃｏｒｄ）の形成（例えば、図８参照）で典型的な内皮細胞の挙動が確認される。内皮特定分析、例えばＬＤＬ−吸収はまた、前記細胞が内皮特徴を有するということを確認するのに利用できる。
【０２０４】
本発明の他の様態で、本発明によって生成されて増殖されたヒト血管幹細胞及び本発明の方法によって増殖された哺乳動物血管幹細胞は、試験管内で分化されて他の細胞だけではなく、前記細胞血統からさらに分化された細胞を得ることができる。かようなさらなる細胞血統は、本発明によって生成されて増殖された血管幹細胞及び本発明の方法によって増殖された哺乳動物血管幹細胞から誘導されうるが、これは、前記血管幹細胞が造血及び内皮細胞への分化後の潜在的な発達程度がさらに大きくありうるためである。
【０２０５】
ヒト血管幹細胞及び血管幹細胞血統細胞の臨床的及び商業的実施例
細胞療法
ヒト血管幹細胞は、生体内で他の造血または内皮細胞に分化する可能性がある一方、これらは、前記２個の細胞類型が必要であるか、または治療を向上させることができる細胞治療で使われうる。また、血管幹細胞血統細胞（すなわち、造血細胞及び／または内皮細胞）を含む任意の療法または治療によって処置されうる。下記部分は、本発明の方法によって生成されて増殖されたり、または本発明の方法によって増殖された本発明のヒト血管幹細胞を使用する方法を記述する。
【０２０６】
本発明の特定実施例で、造血細胞を増加させたり治療する処置及び血管成長増加及び／または血管回復促進のための処置が考慮される。従って、特定様態で本発明は、造血細胞または血管成長または回復が必要な患者を治療するための方法及び組成物に係るものである。血管幹細胞は、被験体の血管に注射したり、または手術を介して被験体の血管に投与できる。前記患者及び被験体はヒトでありうる。
【０２０７】
本発明の特定実施例で、ヒト血管幹細胞は移植に使われ、これと異なる場合には、ＨＳＣ移植が使われうる。かような移植は、例えば急性または慢性白血病、再生不良性貧血及び多様な免疫欠乏症だけではなく、多様な非血液学的悪性腫瘍及び自家免疫障害を病む患者の治療のための造血再構成に利用し、高い投与量の化学療法及び／または放射線療法後の治療誘発性形成不全から患者を救済するのに利用できる。かような移植は、生体内または生体外で実施できる（例えば、骨髄移植）。
【０２０８】
本発明の他の実施例でヒト血管幹細胞は、造血再構成または造血治療が必要な患者を治療するのに使われる。かような患者としては、例えばサラセミア（地中海貧血）、鎌状赤血球貧血症、再生不良性貧血症（低形成貧血症ともいう）、血球減少症、骨髄低形成症、血小板欠乏症、造血悪性腫瘍、例えば白血病、夜間発作性血尿症（ＰＮＨ）及びＡＤＡ（例えば、脱アミノ酵素（ＡＤＡ）−欠乏重症複合免疫欠乏症（ＳＣＩＤ））を病む患者を挙げることができる。
【０２０９】
従って、本発明の具体的な実施例は、本発明の血管幹細胞を利用した造血再構成または造血治療を必要とする患者の治療方法に係るものである。従って本発明は、造血再構成または治療を必要とする患者の治療方法であって、これを必要とする患者の選別、本発明の方法によるヒト血管幹細胞の生成と増殖または増殖、前記ヒト血管幹細胞の患者への投与を含む方法に係るものである。従って前記方法は、生成及び増殖されたり、または増殖されたヒト血管幹細胞をヒト造血細胞に分化させた後、造血細胞を患者に投与することを含むことができる。
【０２１０】
代案的な実施例は、ヒト血管幹細胞を大規模に生成し、これを必要とする患者の先立って保管する方法を含む。従って本発明のさらに他の実施例は、造血再構成または治療を必要とする患者の治療方法であって、これを必要とする患者の選択、前述の方法によってすでに分離されて増殖されたヒト血管幹細胞に対する処方、及び前記ヒト血管幹細胞の前記患者への投与を含む方法に係るものである。同様に前記方法は、前記ヒト血管幹細胞をヒト造血細胞に分化させることと、前記造血細胞を患者に投与することとを含むことができる。追加実施例で、１以上のＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合であるか、または同型接合である血管幹細胞を成長させ、任意に商業的な量に成長させ、任意に企業体が保管する。患者がかような細胞または血管幹細胞血統細胞を必要とする場合、臨床医または病院は、事業体にかような細胞を注文する。
【０２１１】
本発明のヒト血管幹細胞は、血管形成微小棲息環境下で内皮細胞に増殖及び分化するために、ヒト血管幹細胞は、治療的方式に使われて患者の傷部位で新しい血管を提供したり、または損傷血管の回復を誘導できる。従って、特定様態で本発明は、新しい血管の成長または損傷血管系の回復を促進させる方法に係るものである。本発明のヒト血管幹細胞は、内皮損傷、例えば心筋梗塞、脳卒中及び虚血性脳、虚血性四肢及び虚血性四肢を含む皮膚傷及び糖尿病動物または患者から発生する傷、及び網膜での虚血性再貫流損傷を治療するのに使用できる。本発明の血管幹細胞で治療できるその他虚血性病態としては、腎臓虚血、肺虚血及び虚血性心筋病症を挙げることができる。血管幹細胞はまた、気球血管形成または脳血管ステントの発達後に損傷された血管の回復を助けるのに使用できる。血管幹細胞はまた、組織移植、手術、及び放射線損傷後に使用できる。また血管幹細胞は、アテローム性動脈硬化症の治療及び／または進展の防止だけではなく、全身硬化症及びレイロード現象（ＲＰ）で発生する内皮細胞損傷を回復させるのに使用できる（Ｂｌａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．（２０）：１３２５−３０）。
【０２１２】
従って本発明は、血管成長の提供や、これを必要とする患者の回復と関連した多様な方法を提供する。一実施例で本発明は、虚血性組織での新しい血管形成をこれを必要とする患者で誘導する方法であって、前記患者に前述のヒト血管幹細胞の精製された製剤を有効量で投与し、前記虚血性組織に新しい血管を形成させることを含む方法を提供する。従って本発明の特定様態は、血管形成をこれを必要とする患者で増大させる方法であり、これを必要とする患者の選別、前述のようなヒト血管幹細胞の分離、及び前記血管幹細胞の前記患者への投与を含む方法を提供する。他の様態で本発明は、損傷された血管の治療を必要とする患者で損傷された血管を治療する方法であって、これを必要とする患者の選別、前述のようなヒト血管幹細胞の増殖または生成と増殖、及び前記血管幹細胞の前記患者への投与を含む方法を提供する。前述の実施例以外に、血管幹細胞は大規模に生成し、血管幹細胞を必要とする患者の選別以前に保管できる。追加実施例で、１以上のＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合であるか、または同型接合である血管幹細胞を成長させ、任意に商業的な量に成長させ、血管幹細胞治療の対象として患者を選別する前に任意に保管する。前述の血管幹細胞または血管幹細胞製剤のうち任意のものを循環系に直接（静脈内に）投与できる。特定実施例（例えば、目での血管回復が必要な場合、例えば網膜の虚血／再貫流損傷の治療の場合）、血管幹細胞または血管幹細胞製剤は、ガラス体内の注射によって投与できる。
【０２１３】
血管幹細胞またはその誘導体細胞の溶液または製剤は、任意の経路で投与でき、かような投与は個別的に決定できる。また、血管幹細胞またはその誘導体細胞の溶液または製剤の投与される有効量は、治療的に有効であって個別的に決定されうる量である。
【０２１４】
追加様態で血管幹細胞血統細胞は、治療的用途、例えば前述の徴候の治療で使われる。従って、本願で記述される方法で生成及び増殖されたり、または増殖される血管幹細胞は、まず試験管内で分化されて造血及び／または内皮細胞を産出した後、前記２個の血統でさらに分化される細胞を産出する。かような細胞は、以後、例えば造血病態の治療、または造血再構成、または虚血または血管損傷の治療のために被験体または患者に投与できる。
【０２１５】
本願で開示される方法によって収得されるヒト血管幹細胞から誘導されるＨＳＣは、成長してさらにＨＳＣを増殖させ、かつ／または他の造血血統細胞類型を誘導する。本発明の特定様態は、移植中の血管幹細胞から誘導されたＨＳＣの用途に係るものである。追加実施例で、分化された造血細胞（例えば、顆粒球、赤血球、骨髄細胞、巨核細胞、血小板、大食細胞、肥満細胞及び好中性白血球（Ｗｉｌｅｓ  ａｎｄ  Ｋｅｌｌｅｒ  １９９１  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１１１）：２５９）が多様な治療、例えば輸血療法または感染治療に使われる。従って本発明の他の実施例は、本発明の血管幹細胞から誘導されたＨＳＣまたは造血血統細胞を利用した造血再構成または治療を必要とする患者の治療方法に係るものである。
【０２１６】
一部様態で本発明は、造血細胞を必要とする患者の治療方法または治療を必要とする患者を選択する段階、本発明の方法によってヒト血管幹細胞を増殖したりまたは分離及び増殖する段階、前記血管幹細胞を造血母細胞及び／または成熟造血細胞に分化させる段階、及び前記造血細胞を前記患者に投与する段階を含む治療に係るものである。
【０２１７】
本発明の他の様態で血管幹細胞は、ここに開示された方法によって成長して内皮細胞を発生させる。前記内皮は、その後患者の損傷部位で損傷された血管の復旧を誘導したり、または新しい血管を提供するのに使われうる。従って、一部様態で本発明は、新しい血管成長を促進したり、または損傷された脈管構造を復旧する方法に係り、ここで血管幹細胞から誘導された内皮細胞が治療剤として使われる。前記内皮細胞は、内皮損傷、例えば心筋梗塞及び肺虚血、発作及び虚血性脳損傷、四肢虚血及び四肢虚血を含む皮膚損傷及び糖尿病動物でも患者に発生する損傷、網膜内虚血性再貫流損傷、腎臓虚血を治療するのに使われうる。前記内皮細胞はまた、気球血管形成術または血管内ステントだけではなく、グラフティングでの配置、手術及び以後の放射線損傷後に損傷された血管の復旧を助けるのに使われうる。また前記内皮細胞は、アテローム性動脈硬化症進行の治療及び／または予防だけではなく、全身硬化症及びレイノー現象で発生する内皮細胞損傷を復旧するのに使われうる。
【０２１８】
前記内皮細胞はさらに分化され、これらの細胞は、例えば前記文段に列挙された一つ以上の前記「内皮細胞」疾病または状態を治療するのに適切に使われうる。
【０２１９】
従って本発明の一部様態は、治療を必要とする患者を選択する段階、本発明の方法によってヒト血管幹細胞を増殖したりまたは分離及び増殖する段階、前記血管幹細胞を内皮細胞に分化させる段階、及び前記内皮細胞を前記患者に投与する段階を含む、内皮または血管損傷を有する患者、または血管成長や復旧を必要とする患者の治療方法に係るものである。
血液銀行
本発明の他の様態は、移植に適した造血細胞を生成する方法を提供する。かような細胞及び方法は数多くの用途を有するが、特に重要な用途は、移植用血液の適合性を向上させるところにあるのである。望ましい一部実施例で本発明は、血管幹細胞／血管コロニー形成単位から分化された赤血球を提供する。かような分化された赤血球は移植に使われうる。
【０２２０】
本発明のさらに他の様態は、血管幹細胞／血管コロニー形成単位から分化された、これを必要とする者のための輸血に使われる造血細胞を生成する方法に係るものである。一部実施例で分化された造血細胞は、外傷、手術中の血液損失、血液疾患、例えば貧血、鎌状赤血球貧血、または溶血性疾患、または悪性疾患を治療するために移植される。一部実施例で赤血球は、外傷、手術中の血液損失、または血液疾患、例えば貧血、鎌状赤血球貧血、または溶血性疾患を治療するために移植される。一部実施例で血小板は、先天性血小板疾患または悪性疾患を治療するために移植される。一部実施例で、赤血球及び血小板の混合群が移植される。
【０２２１】
多くの分化された造血細胞種、特に赤血球は、一般的に生体内混合群として存在するということに注意せねばならない。特に、多様な年齢及び分化レベルの循環赤血球が生体内で発見される。また赤血球は、時間が経過しつつ成熟され、さらに少ない胎児ヘモグロブリン及びさらに多くの成体ヘモグロビンを発現する。本発明は、赤血球の純粋群、または多様な年齢レベル及び分化レベルを有する赤血球の混合群どちらの移植をも考慮する。特定実施例で本発明は、胎児ヘモグロビン（ヘモグロビンＦ）を発現する赤血球の移植を考慮する。
【０２２２】
本発明は、試験管内ヒト血管コロニー形成細胞から分化された造血細胞を生成する方法を提供し、前記方法は、下記段階を含む：
（ａ）ヒト血管コロニー形成細胞を提供する段階、及び
（ｂ）前記血管コロニー形成細胞を分化された造血細胞に分化する段階。
【０２２３】
本発明はまた、ヒト血管コロニー形成細胞から試験管内分化された造血細胞を使用した輸血を遂行する方法を提供し、前記方法は、下記段階を含む：
（ａ）ヒト血管コロニー形成細胞を提供する段階、
（ｂ）前記血管コロニー形成細胞を分化された造血細胞に分化する段階、及び
（ｃ）前記分化された造血細胞で輸血を遂行する段階。
【０２２４】
本発明はまた、ヒト血管コロニー形成細胞から試験管内分化された造血細胞を使用した輸血を遂行する方法を提供し、前記方法は、下記段階を含む：
（ａ）胚芽幹細胞の胚状体への分化を誘導するのに十分な量の一つ以上の成長因子の存在下で、無血清培地内にヒト胚芽幹細胞を含む細胞培養物を培養する段階、
（ｂ）胚状体を含む前記培養物に一つ以上の成長因子を加え、無血清培地内の前記培養物を培養し続ける段階であって、前記成長因子が前記胚状体培養物内のヒト血管コロニー形成細胞を増殖させるのに十分な量である段階、
（ｃ）前記血管コロニー形成細胞を分化された造血細胞に分化する段階、及び
（ｄ）前記分化された造血細胞で輸血を遂行する段階。
【０２２５】
一部実施例で、前記幹細胞、胚状体及び血管コロニー形成は、無血清培地内で前記方法の段階（ａ）及び（ｂ）を介して成長する。
【０２２６】
本発明はまた、ヒト血管コロニー形成細胞から試験管内分化された造血細胞を使用した輸血を遂行する方法を提供し、前記方法は、下記段階を含む：
（ａ）胚芽誘導細胞の胚状体への分化を誘導するのに十分な量の一つ以上の成長因子の存在下で、無血清培地内にヒト胚芽誘導細胞を含む細胞培養物を培養する段階、
（ｂ）胚状体を含む前記培養物に一つ以上の成長因子を加え、無血清培地内の前記培養物を培養し続ける段階であって、前記成長因子が前記胚状体培養物内のヒト血管コロニー形成細胞を増殖させるのに十分な量である段階、
（ｃ）前記胚状体を単一細胞に解体させる段階、
（ｄ）前記単一細胞を含む前記培養物に一つ以上の成長因子を加え、無血清培地内の前記培養物を培養し続ける段階であって、前記成長因子が前記単一細胞を含む培養物内ヒト血管コロニー形成細胞を増殖させるのに十分な量である段階、
（ｅ）前記血管コロニー形成細胞を分化された造血細胞に分化する段階、及び
（ｆ）前記分化された造血細胞で輸血を遂行する段階。
【０２２７】
一部実施例で、前記胚芽誘導細胞、胚状体、血管コロニー形成細胞及び単一細胞は、無血清培地内で前記方法の段階（ａ）ないし（ｄ）を介して成長する。
【０２２８】
一部実施例で、前記胚芽誘導細胞は胚芽幹細胞である。
【０２２９】
一部実施例で前記成長因子は、ホメオボックス蛋白質、またはそれらの機能性変異体または活性断片を含む蛋白質である。一部実施例で前記ホメオボックス蛋白質は、ＨＯＸＢ４蛋白質、またはそれらの機能性変異体または活性断片を含む。
【０２３０】
一部実施例で前記分化された造血細胞は、単一細胞形態、例えば赤血球、血小板、及び食細胞として生成される。しかし、単一細胞形態が生成されるとき、前記細胞形態は、特定細胞形態の成熟度または分化度レベルの側面で異種でありうることに注意せねばならない。例として、分化された赤血球は、成熟度及び細胞年齢レベルの側面で異種でありうる。理論によって拘束されるものではないが、かような赤血球細胞の異種性は、赤血球が生体内で発見される方式を摸倣するために、メリットがありうる。
【０２３１】
一部実施例で前記単一細胞形態は、血液内で発見される分化された細胞形態の比率と同一に混合される。一部実施例で、多重分化された造血細胞形態が同じ段階で生成される。一部実施例で前記食細胞は、顆粒性白血球、好中性白血球、好塩球、好酸球、リンパ球または単核球から選択される。一部実施例で前記造血細胞形態は、血液内で発見される分化された造血細胞形態の比率（９６％赤血球、１％血小板、及び３％食細胞）とほぼ同じ割合で生成される。一部実施例で、移植前に前記分化された造血母細胞に血漿が添加される。一部実施例で、充填細胞、例えば充填赤血球は、血漿の不在または実質的な不在下で移植される。
【０２３２】
一部実施例で、本出願の方法から生成された分化された造血細胞は機能性である。一部実施例で、本出願の方法から生成された血小板は機能性である。一部実施例で、本出願の方法から生成された食細胞は機能性である。一部実施例で、本出願の方法から生成された赤血球は機能性である。一部実施例で前記赤血球は、移植前にヘモグロビンＦを発現する。一部実施例で、前記赤血球は酸素を運搬する。一部実施例で前記赤血球は、自然に誘導された赤血球と同じ寿命を有する。一部実施例で前記赤血球は、自然に誘導された赤血球寿命の７５％の寿命を有する。一部実施例で前記赤血球は、自然に誘導された赤血球寿命の５０％の寿命を有する。一部実施例で前記赤血球は、自然に誘導された赤血球寿命の２５％の寿命を有する。
【０２３３】
一部実施例で本出願方法は、１００ｍｍディシュ当たり１ｘ１０６細胞を生成する。一部実施例で、１００ｍｍディシュ当たり２ｘ１０６細胞が生成される。一部実施例で、１００ｍｍディシュ当たり３ｘ１０６細胞が生成される。一部実施例で、１００ｍｍディシュ当たり４ｘ１０６細胞が生成される。一部実施例で、１００ｍｍディシュ当たり５ｘ１０６細胞が生成される。一部実施例で、１００ｍｍディシュ当たり６ｘ１０６細胞が生成される。一部実施例で、１００ｍｍディシュ当たり７ｘ１０６細胞が生成される。一部実施例で、１００ｍｍディシュ当たり８ｘ１０６細胞が生成される。一部実施例で、１００ｍｍディシュ当たり９ｘ１０６細胞が生成される。一部実施例で、１００ｍｍディシュ当たり１ｘ１０７細胞が生成される。一部実施例で、１００ｍｍディシュ当たり５ｘ１０７細胞が生成される。一部実施例で、１００ｍｍディシュ当たり１ｘ１０８細胞が生成される。
【０２３４】
一部実施例で前記分化段階は、前記技術分野の技術者に公知の条件を使用して遂行される。一部実施例で前記分化段階は、細胞から赤血球への分化に特異的な方法を使用して遂行される（参照としてここに統合されるＷＯ２００５／１１８７８０参考）。一部実施例で前記分化段階は、細胞から血小板への分化に特異的な方法を使用して遂行される。一部実施例で前記分化段階は、細胞から白血球への分化に特異的な方法を使用して遂行される。
【０２３５】
本発明によって使われうる分化剤は、サイトカイン、例えばインターフェロン−アルファＡ、インターフェロン−アルファＡ／Ｄ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、インターフェロン−ガンマ−誘導性蛋白質−１０、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１５、インターロイキン−１７、ケラチノサイト成長因子、レプチン、白血病阻害因子、大食細胞コロニー刺激因子、及び大食細胞炎症蛋白質−１アルファを含む。
【０２３６】
本発明による分化剤はまた、成長因子、例えば６Ｃｋｉｎｅ（組換え）、アクチビンＡ、アルファＡ−インターフェロン、アルファ−インターフェロン、アンフィレグリン、アンギオゲニン、Ｂ−内皮細胞成長因子、ベータセルリン、Ｂ−インターフェロン、脳誘因性神経栄養因子、Ｃ１Ｏ（組換え）、カルジオトロフィン−１、繊毛神経栄養因子、サイトカイン誘導好中性白血球化学走性体−１、内皮細胞成長補助剤、エオタキシン、表皮成長因子、上皮好中性白血球活性化ペプチド−７８、エリスロポイエチン、エストロゲン受容体−アルファ、エストロゲン受容体−Ｂ、繊維芽細胞成長因子（酸性／塩基性、ヘパリン安定化、組換え）、ＦＬＴ−３／ＦＬＫ−２配位子（ＦＬＴ−３配位子）、ガンマ−インターフェロン、神経膠細胞株誘導神経栄養因子、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ、顆粒性白血球コロニー刺激因子、顆粒性白血球大食細胞コロニー刺激因子、ＧＲＯ−アルファ／ＭＧＳＡ、ＧＲＯ−Ｂ、ＧＲＯ−ガンマ、ＨＣＣ−１、ヘパリン結合表皮成長因子類似成長因子、肝細胞成長因子、ヘレグリン−アルファ（ＥＧＦ  ｄｏｍａｉｎ）、インシュリン成長因子結合蛋白質−１、インシュリン類似成長因子結合蛋白質−１／ＩＧＦ−１複合体、インシュリン類似成長因子、インシュリン類似成長因子ＩＩ、２．５Ｓ神経成長因子（ＮＧＦ）、７Ｓ−ＮＧＦ、大食細胞炎症蛋白質−１Ｂ、大食細胞炎症蛋白質−２、大食細胞炎症蛋白質−３アルファ、大食細胞炎症蛋白質−３Ｂ、単核細胞走化性蛋白質−１、単核細胞走化性蛋白質−２、単核細胞走化性蛋白質−３、神経栄養因子−３、神経栄養因子−４、ＮＧＦ−Ｂ（ヒトまたはラット組換え）、オンコスタチン（ヒトまたはマウス組換え）、脳下垂体抽出物、胎盤成長因子、血小板誘導内皮細胞成長因子、血小板誘導成長因子、プレイオトロフィン、ｒａｎｔｅｓ、幹細胞因子、基質細胞誘導因子ｌＢ／ｐｒｅ−Ｂ細胞成長刺激因子、トロンボポエチン、変形成長因子アルファ、変形成長因子−Ｂ１、変形成長因子−Ｂ２、変形成長因子−Ｂ３、変形成長因子−Ｂ５、腫瘍懐死因子（アルファ及びＢ）、及び血管内皮成長因子を含む。
【０２３７】
本発明による分化剤は、ホルモン及びホルモン拮抗剤、例えば１７Ｂ−エストラジオール、副腎皮質刺激ホルモン、アドレノメデュリン、アルファ−メラニン細胞刺激ホルモン、絨毛膜性生殖線刺激ホルモン、コルチコステロイド結合グロブリン、コルチコステロン、デキサメタゾン、エストリオール、濾胞刺激ホルモン、ガストリン１、グルカゴン、ゴナドトロピン、ヒドロコルチゾン、インシュリン、インシュリン型成長因子結合蛋白質、Ｌ−３，３’，５’−トリヨードサイロニン、Ｌ−３，３’，５−トリヨードサイロニン、レプチン、黄体（ｌｅｕｔｉｎｉｚｉｎｇ）ホルモン、Ｌ−チロキシン、メラトニン、ＭＺ−４、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、ＰＥＣ−６０、脳下垂体成長ホルモン、プロゲステロン、プロラクチン、セクレチン、性ホルモングロブリン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出因子、チロキシン結合グロブリン、及びバソプレシンを含む。
【０２３８】
また本発明による分化剤は、細胞外基質成分、例えばフィブロネクチン、フィブロネクチンの蛋白質造血コロニー形成細胞加水分解断片、ラミニン、スロンボスポンジン、アグレカン、及びシンデカンを含む。
【０２３９】
本発明による分化剤はまた、各種因子に対する抗体、例えば抗低密度脂蛋白質受容体抗体、抗プロゲステロン受容体、内部抗体、抗−アルファインターフェロン受容体鎖２抗体、抗−ｃ−ｃケモカイン受容体１抗体、抗−ＣＤ  １１８抗体、抗−ＣＤ  １１９抗体、抗コロニー刺激要因−１抗体、抗ＣＳＦ−１受容体／ｃ−フィン抗体、抗上皮性成長因子（ＡＢ−３）抗体、抗上皮性成長因子受容体抗体、抗上皮性成長因子受容体、リン特異的抗体、抗上皮性成長因子（ＡＢ−１）抗体、抗エリスロポイエチン受容体抗体、抗エストロゲン受容体抗体、抗エストロゲン受容体、Ｃ末端抗体、抗エストロゲン受容体−Ｂ抗体、抗繊維芽細胞成長因子受容体抗体、抗繊維芽細胞成長因子、基本抗体、抗ガンマインターフェロン受容体鎖抗体、抗ガンマインターフェロンヒト組換え抗体、抗ＧＦＲアルファ−１Ｃ末端抗体、抗ＧＦＲアルファ−２Ｃ末端抗体、抗顆粒球コロニー刺激因子（ＡＢ−１）抗体、抗顆粒球コロニー−刺激因子受容体抗体、抗インシュリン受容体抗体、抗インシュリン型成長因子−１受容体抗体、抗インターロイキン−６ヒト組換え抗体、抗インターロイキン−１ヒト組換え抗体、抗インターロイキン−２ヒト組換え抗体、抗レプチンマウス組換え抗体、抗神経成長因子術溶体抗体、抗ｐ６０、ニワトリ抗体、抗副甲状腺ホルモン型蛋白質抗体、抗血小板由来成長因子受容体抗体、抗血小板由来成長因子受容体−Ｂ抗体、抗血小板由来成長因子−アルファ抗体、抗プロゲステロン受容体抗体、抗レチノ酸受容体−アルファ抗体、抗甲状腺ホルモン核受容体抗体、抗甲状腺ホルモン核受容体−アルファ１／Ｂｉ抗体、抗トランスフェリン受容体／ＣＤ７１抗体、抗形質変換成長因子−アルファ抗体、抗形質変換成長因子−Ｂ３抗体、抗腫瘍懐死因子−アルファ抗体、及び抗血管内皮成長因子抗体を含む。
【０２４０】
本発明はまた、前記のように潜在的患者受容者に一致した細胞を提供できる分化された造血細胞のライブラリを提供する。特定実施例において該細胞は、凍結状態で保管される。従って、一実施例において本発明は、一つ以上の適合性抗原に対して同型接合性である分化された造血細胞調製物を提供する段階を含み、ここで該細胞は、本願に開示された方法によって増殖できるヒト血管コロニー形成細胞のライブラリを含む細胞の銀行で選択され、各血管コロニー形成細胞調製物は、ヒト集団に存在する一つ以上のＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合性であるか同型接合性であり、前記血管コロニー形成細胞の銀行は、細胞銀行の残りの構成員について異なるセットのＭＨＣ対立遺伝子に係ってそれぞれ半接合性であるか同型接合性である細胞を含む製薬事業の実施方法を提供する。前述のように、遺伝子的中法（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）または異型接合性の損失法を使用し、血管コロニー形成細胞を誘導するのに使われた半接合体または同型接合体ＭＨＣ対立遺伝子幹細胞を生成できる。特定実施例において、あらゆる血液型の血管コロニー形成細胞が銀行に含まれる。特定実施例において、血管コロニー形成細胞が患者に一致することによって、患者自身の血液型の分化された造血細胞が生産されることを保証する。特定実施例において血管コロニー形成細胞は、抗原因子Ａ、Ｂ、Ｒｈ、またはその任意の組合わせに対して陰性である。特定実施例において分化された造血細胞は、普遍的な供与細胞である。例えば、Ｏ型のＲｈマイナスである造血細胞は、血液輸血に普遍的に使われうる。特定実施例において本発明は、普遍的輸血のためのＯ型のＲｈマイナス赤血球の生産方法を提供する。
【０２４１】
特定実施例において、血管コロニー形成細胞から分化された赤血球は、胎児ヘモグロビンを発現する。胎児ヘモグロビンを発現する赤血球の輸血は、特に鎌状赤血球貧血症の治療時に有用でありうる。従って本発明は、鎌状赤血球貧血症の治療のための改善された方法を提供する。
【０２４２】
一実施例において、特定血管コロニー形成細胞調製物を患者に適当に選択した後、その後それを増殖させて患者の治療に適した量に達すれば分化させ、分化された造血細胞を得た後で受容者に細胞を投与する。製薬事業の実施方法はまた、販売用調製物の分配のための分配システムを確立させることを含んだり、または薬学調製物をマーケティングするための販売グループを確立させることを含むこともできる。
【０２４３】
任意の前記内容で、血管コロニー形成細胞は、直ちに分化させることができたり、または血管コロニー形成細胞は、後続使用のために凍結させることができる。特定実施例において本発明は、後続解凍及び増殖に適当であり、また造血細胞または内皮系統への分化に適当な血管コロニー形成細胞の凍結培養法を提供する。
【０２４４】
ヒト血管コロニー形成細胞は、輸血に使用できる相当数の造血細胞類型を生成するのに使用できる。例えば、相当数の同種性または異種性集団のＲＢＣ及び／または血小板は、ヒト血管コロニー形成細胞から生成されうる。これから分化された血管コロニー形成細胞及び造血細胞類型は預置可能であり、血液製品を広く供与し、輸血及びその他治療に使用する。かような製品を預置することは、供与された血液製品の危険な保管を緩和するように助けになるであろう。さらに、血管コロニー形成細胞及び誘導製品は、生体内遺伝的に操作されて普遍的な供与血液製品を提供できる。
【０２４５】
従って、特定様態において本発明は、血液銀行事業の実施方法を提供する。被験体銀行事業は、そこから生成された血管コロニー形成細胞及び／または造血細胞類型（例、ＲＢＣ、血小板、リンパ球など）の誘導及び保管（長期間または短期間）に関与する。該細胞は、長期間保管のために低温保存されたり、比較的短期間保管のために培養状態で維持されうる。現在使用可能な血液製品を分類するの非常に類似した方式で細胞を分類して交差一致させることができ、該細胞は、類型を基準にして保管できる。さらに、そして特定実施例において、細胞を変形させてＡ陰性及び／またはＢ陰性及び／またはＲｈ陰性の細胞を特異的に生成させることによって、普遍的であるか、またはほぼ普遍的に任意の患者に輸血するのに適当な細胞を生産できる。
【０２４６】
血管コロニー形成細胞及び／または分化された造血細胞類型は、明細書を介して詳細化した任意の本発明の方法を使用して生成できることに留意しなければならない。
【０２４７】
血液銀行事業の実施方法の特定実施例において、細胞（血管コロニー形成細胞及び／または分化された造血細胞類型）は、一つ以上の主要施設で生成して保管する。その後細胞は、例えば患者治療時に使用するために病院または治療施設に伝達されうる。他の特定実施例において、細胞は低温保存状態で維持され、病院またはその他治療施設の規定を基に輸血のためにこれを特別に解凍して準備させる。かかる規定は、議事規定（ｓｔａｎｄｉｎｇ  ｏｒｄｅｒｓ）（例えば、一定数の単位の細胞の一定量を生成させて提供する）でありうる
特定実施例において、当該方法は、病院に請求するためのシステムまたは預置された製品と関連したコストのための保険会社を含む。
【０２４８】
任意の前記内容のうち特定実施例において当該細胞は、患者に投与される投与量を定量し、かつ／または標準血液輸血の間投与される投与量を比較するために、使用者に許容される細胞数、体積、または任意の単位を基準に割り当てられる。
【０２４９】
特定実施例において該細胞は、混合された細胞集団として生成、保管、及び投与される。例えば調製物は、別個の細胞類型と同様に、変化された発生段階の細胞を含むことができる。他の実施例において該細胞は、単一細胞類型の実質的に精製された調製物として生成、保管、及び／または投与される。
【０２５０】
特定実施例において細胞の該調製物は、一つ以上の感染疾病に対して選別される。選別は、発生または保管前後に起こりうる。例えば細胞の該調製物は、前記製品の受容者に伝達されうる肝炎、ＨＩＶ、またはその他血因性感染疾病を確認するために選別されうる。
移植体受容者内での耐性誘導
本発明の方法によって生成されて増殖されたり、または本発明の方法によって増殖されたヒト血管幹細胞を使用して免疫耐性を誘導できる。免疫耐性とは、例えば受容者に非自我（ｎｏｎｓｅｌｆ）ＭＨＣ抗原（例、移植体及び耐性化された血管幹細胞と共有された抗原）の導入に対して、そうでなけば発生する移植体受容者の免疫反応の抑制をいう。従って耐性とは、免疫抑制剤を使用して引き出しうる広範囲なスペクトルの免疫抑制と反対して特異的な供与者抗原によって誘導される免疫反応の抑制をいう。耐性は、体液性反応、細胞性反応、または体液性及び細胞性いずれもの反応を伴うことができる。耐性は、先在する成熟した供与者反応性Ｔ細胞の除去及び／または不活性化、及び新規に発生した供与者反応性Ｔ細胞の長期間（例、一生）の除去及び／または不活性化を含むことができる。
【０２５１】
本発明に記載されたヒト血管幹細胞の生成及び増殖方法は、耐性を誘導するのにいくつかの利得を提供する。本発明の方法は莫大であり、従来には得難い数のヒト血管幹細胞を生成させる。莫大な量のヒト血管幹細胞は、あまり有害ではないあらかじめ調整されたプロトコルを利用して移植体受容者で耐性を誘導できる。また本発明の方法は、ヒト血管幹細胞のライブラリを生成するために提供され、ここでそのそれぞれは、ヒト集団に存在する一つ以上のＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合性であるか同型接合性であり、前記血管幹細胞のライブラリのうち各構成員は、ライブラリ内の他の構成員に対して異なるセットのＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合性であるか同型接合性である。かかるヒト血管幹細胞のライブラリは細胞を選択し、任意の使用可能な供与者移植体と一致できるように耐性のなされたヒト血管幹細胞の選択に使われうる。
【０２５２】
造血細胞または混合されたキメラ現象の骨髄移植及び後続確立（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ）は、以前にネズミ及びヒトモデルいずれででも造血母細胞から由来した新しい組織類型に対して特異的耐性を誘導するということを提示した。造血細胞または混合されたキメラ現象とは、供与者及び受容者幹細胞いずれからも由来した造血細胞の受容者で生産されることをいう。従って、受容者が造血細胞キメラ現象を実現する場合、受容者は、供与者特異的抗体に対して耐性を有するようになるのである。耐性誘導に対する多数のプロトコルで、受容者に投与される耐性がある供与者細胞は、受容者の骨髄に移植する。供与者細胞に対して受容者の骨髄で造血細胞空間が形成されるために、一部プロトコルは（例えば、全身への照射によって）、造血細胞空間を形成する段階を要求するが、かかる段階は、典型的に受容者に毒性を有するか有害である。しかし、非常に莫大な数の供与者耐性がある細胞が使用可能な場合、照射が完全に除去され、あまり有害ではなくあらかじめ調整された処方計画の利点と共に、造血細胞または混合されたキメラ現象を実現するという設置類モデルからの証拠がある。従って、混合されたキメラ現象は、例えば特異的骨髄非破壊性受容者の調節で実現できる。
【０２５３】
従って、本願に記載された新規方法が莫大な数のヒト血管幹細胞を生産できるために、本発明は、調節プロトコルがあまり苛酷ではないか、あまり有害ではない免疫耐性が誘導される利点を提供する。例えば、造血細胞空間の形成段階は、十分な数の耐性がある供与者細胞が使われる場合に省略されうる。
【０２５４】
従って、本発明の特定実施例において、本願に記載された方法によって生成されて増殖されたり、または増殖されたヒト血管幹細胞を使用して免疫耐性を誘導できる。前記メカニズムを基に任意の理論によって拘束されることを希望しない一方、ヒト血管幹細胞は、受容者の骨髄に受容され、受容者の骨髄に移植されて混合されたキメラ現象を生産することによって免疫耐性を誘導できる。
【０２５５】
特定実施例において、供与者ヒト血管幹細胞は、受容者患者に供与者からの移植体を移植したり器官、組織、または細胞を移植する前に（例えば、静脈注射によって）、受容者患者に投与される。特定実施例において、ヒト血管幹細胞は、耐性の誘導の必要がある患者（例、移植組織または移植体受容者）に耐性を誘導するために投与される。従って、特定実施例において、ヒト受容者患者で耐性を誘導する方法は、（ａ）移植または細胞治療の必要がある患者を選択する段階、（ｂ）供与者から由来したり供与者に一致（符合）するヒト血管幹細胞を前記患者に投与する段階であって、ここで前記血管幹細胞は、本発明によって生成されて増殖されたり増殖される段階、及び（ｃ）受容者患者に供与者の器官、組織、または細胞移植体を移植する段階であって、ここで前記血管幹細胞は、供与者抗原に対する耐性を誘導する段階を含む。特定実施例において患者は、器官、組織、または細胞治療を受容し、ここで前記器官、組織、または細胞は、供与者または供与者細胞源から得られる。例えば、供与者からの血管幹細胞は、（１）前記記載された方法によって増殖されて多数の供与者耐性細胞を生成し、（２）生体内増殖されて分化されて造血細胞または内皮細胞または組織を得るが、これは、後続して受容者患者に移植されうる。他の実施例において、器官、組織、または細胞治療は、供与者血管幹細胞から由来しないが、供与者血管幹細胞と一致する。
【０２５６】
本願に使われた用語である「一致した（符合した）」というのは、供与者及び受容者（例、移植体）間のＨＬＡ類型がどれほど類似しているかに係るものである。一実施例において、供与者血管幹細胞及び移植体について、用語「一致した」というのは、拒否反応が起きないようにというＭＨＣ  Ｉ型及び／またはＭＨＣ  ＩＩ型対立遺伝子との一致度をいう。他の実施例において、供与者血管幹細胞及び移植体について用語「一致した」というのは、供与者移植体がその一致する供与者血管幹細胞によって耐性化されるようにというＭＨＣ  Ｉ型及び／またはＭＨＣ  ＩＩ型対立遺伝子との一致度をいう。さらに他の実施例において、供与者血管幹細胞及び移植体について用語「一致した」というのは、免疫抑制が要求されないようにというＭＨＣ  Ｉ型及び／またはＭＨＣ  ＩＩ型対立遺伝子との一致度をいう。
【０２５７】
同種異系抗原または同種異系グラフト（ｇｒａｆｔ）に対して耐性を誘導するための前述の方法は、供与体と受容体との間に、ＭＨＣ遺伝子座またはその他遺伝子座でグラフト拒否反応を招くほどの不一致が存在する場合に使われうる。従って、例えば特定実施例で、１個以上のＭＨＣ遺伝子座で、または認識及び拒否反応を媒介する他の１個以上の遺伝子座で、例えば、極小抗原遺伝子座で不一致が起こりうる。一部実施例で例えば、受容体と供与体とのＨＬＡ対立遺伝子が不一致であって、一つ以上の不一致の抗原を招く。Ｉ型及びＩＩ型ＭＨＣ遺伝子座の場合、供与体と受容体は、例えば、Ｉ型で一致し、ＩＩ型で不一致であり、Ｉ型で不一致であり、ＩＩ型で一致し、Ｉ型で不一致であり、ＩＩ型で不一致であり、Ｉ型で一致し、ＩＩ型で一致しうる。認識及び拒否反応を統制する他の遺伝子座の任意の組合わせで、例えば、極小抗原遺伝子座が一致または不一致でありうる。ＭＨＣ  Ｉ型で不一致であるというのは、一つ以上のＭＨＣ  Ｉ型遺伝子座が不一致であるということを意味し、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、またはＨＬＡ−Ｃのうち一つ以上で不一致であるということを意味する。ＭＨＣ  ＩＩ型で不一致であるというのは、一つ以上のＭＨＣ  ＩＩ型遺伝子座が不一致であるということを意味し、例えば、ＤＰＡ、ＤＰＢ、ＤＱＡ、ＤＱＢ、ＤＲＡ、またはＤＲＢのうち一つ以上で不一致であるということを意味する。例えば、血管幹細胞（ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔ）とグラフトは、ＩＩ型ＨＬＡ−ＤＲＢ１及びＤＱＢ１対立遺伝子で一致しうる。血管幹細胞とグラフトは（一致したＤＲＢ１及びＤＱＢ１対立遺伝子に追加して）、２個以上のＩ型ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、またはＣ、対立遺伝子で一致しうる。
【０２５８】
他の実施例で、耐性化された（ｔｏｌｅｒｉｚｉｎｇ）供与体細胞は、前述の方法によって生成及び増殖または増殖された血管幹細胞から由来した細胞である。この実施例によれば、供与体ヒト血管幹細胞は、試験管内分化されて供与体造血母細胞を生成し、この供与体造血母細胞を受容体患者に投与して耐性を誘導する。前記方法のうち一部の場合、供与体血管幹細胞またはそれから由来した造血母細胞を前記受容体に投与し、前記受容体で耐性を誘導することによって（供与体耐性化細胞に対して）、一致した移植またはグラフトを準備する。
【０２５９】
他の実施例で耐性を誘導する方法は、造血スペースを生成する段階（これによって血管幹細胞またはそれから由来した造血母細胞のグラフト化を促進する）をさらに含む。他の実施例で耐性を誘導する方法は、例えば、先在する供与体−反応性Ｔ細胞を除去及び／または不活性化することによって、供与体血管幹細胞またはそれから由来した造血母細胞の拒否反応を一時的に阻害する段階をさらに含む。造血スペースを生成するために、該方法は、照射（ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ）（例、全身、リンパ球、または選択的胸腺照射）を含むことができる。供与体細胞の拒否反応を予防するために、該方法は、薬物または抗体（例、細胞増殖阻害剤、抗代謝剤、または抗−Ｔ細胞または抗−ＣＤ８または抗−ＣＤ４抗体）の投与、及び／または供与体細胞のグラフト化及び生存、及び混合キメラ現象の形成を促進するその他処理（例、ストローマ細胞または成長因子、サイトカインなどを前記受容体に投与、または受容体の天然抗体を枯渇または不活性化させる他の製剤の投与）をさらに含むことができる。特定実施例で、受容体内で供与体の生存を促進し、かつ／または造血スペースを生成するために、投与される照射、抗体、薬物及び／またはその他製剤は、受容体で胸腺細胞及び／またはＴ細胞を不活性化するのに十分である。かような造血スペースを生成し、かつ／または供与体細胞の拒否反応を一時的に阻害する段階は、例えば、供与体血管幹細胞を前記受容体に導入させる前に遂行できる。代案として、患者に製剤を摂取させたり、または供与体耐性化細胞の投与と同時に、Ｔ−細胞を遮断、除去または不活性化する方法を施行することもできる。
【０２６０】
特定実施例で、造血スペース生成と免疫抑制法とを組合わせて使用する。例えば、受容体に抗−Ｔ細胞抗体摂取を低容量全身照射及び／または胸腺照射と共に遂行する。一実施例で、受容体に抗−ＣＤ４及び抗−ＣＤ８抗体を摂取させ、その後温和な、非骨髄破壊性（ｎｏｎｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ）容量の全身照射（例、骨髄が回復不可能にならないように受容体の骨髄分画を除去する容量）と選択的な胸腺照射とを遂行するか、代案的に追加的な容量のＴ細胞不活性化抗体または共同刺激遮断試薬（例、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ及び／または抗−ＣＤ４０Ｌ抗体）を摂取させる。照射後、供与体血管幹細胞またはそれから由来した造血母細胞を受容体に（例、静脈注射によって）投与できる。この実施例で、供与体細胞のグラフト化を促進するための全身照射は、さまざまな供与体ヒト血管幹細胞またはそれから由来した造血母細胞を投与することに代替されうる。かようなさまざまな供与体ヒト細胞を得ることは、前述の方法によって行われうる。
【０２６１】
他の実施例で、受容体Ｔ細胞を枯渇または不活性化するための処理は、投与された供与体耐性化ヒト血管幹細胞の生存を促進してグラフト化阻害を予防するのに助けになりうる。他の実施例でこの方法は、受容体患者で供与体反応細胞のクローン枯渇を含むことができる。例えば、患者に温和な投与量の全身照射を遂行した後、Ｔ細胞共同刺激遮断及び供与体ヒト血管幹細胞の投与を遂行しうる。代案として、患者に照射なしにＴ細胞共同刺激遮断及びさまざまな供与体ヒト血管幹細胞への投与を遂行することもできる。
【０２６２】
他の実施例で、受容体の骨髄破壊調節なしに耐性を得ることも可能である。一実施例で、受容体に供与体ヒト血管幹細胞を供与体血管幹細胞のグラフト化を容易にするために、抗−ＣＤ４０Ｌと共に摂取させることができる。例えば、受容体にさまざまな供与体血管幹細胞を抗−ＣＤ４０Ｌ単一クローン抗体と共に摂取させた後、何日か以内にＣＴＬＡ４−Ｉｇ投与量を摂取させる。かようなプロトコルは供与体反応性Ｔ細胞を除去し、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用を遮断させる。ヒト血管幹細胞を試験管内生成及び増大させるための前述の新規方法は、かような温和な耐性プロトコルを実行可能にする。
【０２６３】
受容体調節及び／または供与体反応性Ｔ細胞の枯渇または遮断後、本発明の方法で生成した供与体耐性化ヒト血管幹細胞を受容体に投与する。供与体ヒト血管幹細胞は、供与体からの組織または細胞源から収得した血管幹細胞に由来しうる。代案として、供与体ヒト血管幹細胞は、供与体と一致する異なる非供与体源から収得できる。
【０２６４】
特定実施例で、供与体ヒト血管幹細胞を多重投与で（例えば、２、３、４またはその以上の供与体細胞の投与）投与することによって、耐性が誘導される。従って耐性は、供与体耐性化細胞の多重投与を含む方法へ誘導でき、ここで多重投与は、週またはそれ未満の期間内に受容体に行われる。
【０２６５】
特定実施例で、本発明ヒト血管幹細胞が免疫耐性を誘導する能力は、異なる実験モデルシステムを使用して評価できる。例えば、ＳＣＩＤマウスにヒト免疫システムを樹立する能力は、実験モデル内でヒト免疫反応を研究するのに使われてきた。ヒト胎児肝及び胸腺組織を使用し、免疫不全マウス受容体で機能的なヒト免疫システムを再構成できるということはすでに明らかにされている。同様に、本発明ヒト血管幹細胞の機能的力量を類似の実験モデルシステムを使用して評価できる。例えば、マウス内の機能的なヒト免疫システムを設立するのに、ヒト胎児肝を代替するヒト血管幹細胞の能力は、前述の実験モデルを使用して評価できる。また、機能的なヒト免疫システムを有するマウスで（例えば、ヒト胎児肝及び胸腺組織をＳＣＩＤマウス内のヒト免疫システムを設立するのに使用してｈｕ−ＳＣＩＤマウスを生産した場合）、混合キメラ現象を得るために、ヒト「供与体」血管幹細胞（ｈｕ−ＳＣＩＤマウスを設立するのに使われた胎児肝及び胸腺組織に対して不一致）を前述の方法のうちいずれか一つによってｈｕ−ＳＣＩＤマウスに投与できる。その後、供与体血管幹細胞に対して一致する同種移植片（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）をこれらの動物に移植する場合、供与体抗原に対する耐性を評価できる。
【０２６６】
特定実施例で本発明は、細胞配合物に係るものである。効果的な細胞配合物は、次の２成分を含む：免疫耐性を誘導する第１細胞類型及び必要な機能を再生する第２細胞類型。二種の細胞類型は、本発明の方法で製造でき、同じ供与体から収得できる。例えば、供与体由来ヒト血管幹細胞が耐性化供与体細胞として使われうる。供与体由来細胞（例、胚芽幹細胞、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞または初期先祖細胞、または血管幹細胞）も使われ、例えば、造血細胞または内皮細胞（ここに叙述される）、神経細胞、例えば、希突起膠細胞、肝細胞、心筋芽細胞または心筋芽細胞先祖細胞、または造骨細胞及びこれらの先祖細胞を生成できる。従って、前記供与体血管幹細胞または前記供与体胚芽または多能性幹細胞から由来した細胞または組織に受容体が耐性を有するように、供与体ヒト血管幹細胞を受容体で耐性を誘導するのに使用できる。
【０２６７】
他の実施例で、本発明の細胞配合物の二細胞成分を異なる供給源または供与体から得ることができ、このとき２個の供給源または供与体は一致する。例えば、血管幹細胞を胚芽幹細胞供給源から生成でき、グラフト細胞または組織は、ヒト血管幹細胞を生成するのに使われた胚芽幹細胞供給源と異なる供給源から収得できる。かような実施例で、２つの供給源は一致する。
【０２６８】
本明細書に叙述された治療目的のうちいずれかのために、免疫耐性のためのヒト血管幹細胞またはそれから由来した造血細胞が、ヒト投与のための十分な滅菌条件下で製造された等張添加剤を含む薬学組成物の形態で提供できる。
遺伝子治療法での血管幹細胞
本発明の他の様態は、血管幹細胞細胞、またはそれから分化された造血または内皮細胞、または順にこれらの細胞から追加分化された細胞を遺伝子治療法に利用することに係るものである。本発明の哺乳類血管幹細胞の製剤は、治療遺伝子の遺伝子産物によって治療されうる疾病を有する患者に治療遺伝子を伝達するのに使われうる。血管幹細胞は、新生血管形成（例、虚血性組織で側副（ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）の形成を誘導するＶＥＧＦ）、造血作用（例、赤血球生成を誘導するエリスロポイエチン）、血管機能（例、動脈瘤を治療するために血管平滑筋の増殖を誘導する成長因子）または血液細胞機能（例、出血を減少させる凝固因子）または分泌ホルモン（例、成長ホルモン）に係るコードに関与したり、または影響を与える治療遺伝子を伝達するのに特に有用である。遺伝子治療法に係る方法は、先行技術に示されている。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）を参考にしうる。遺伝物質を伝達するための生体適合性カプセルについては、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／０５４５２（Ｂａｅｔｇｅ  ｅｔ  ａｌ．）に記述されている。骨髄由来細胞に遺伝子を伝達する方法についてもすでに報告されている（米国特許第６，４１０，０１５号（Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）参考）。治療遺伝子は、疾病予防または治療に関与する遺伝子産物または蛋白質を暗号化する遺伝子、または疾病予防または治療に関与する細胞調節効果を有する遺伝子と共に、臨床的有用性を有する任意の遺伝子でありうる。かような遺伝子産物は、患者で欠陥があったり消失された遺伝子産物、蛋白質を代替したり細胞調節の効果を有し、患者の疾病または疾患の予防または治療を可能にできる。
【０２６９】
従って本発明は、遺伝子治療法を受けなければならない疾病を有する患者に治療遺伝子を伝達する方法をさらに提供し、該方法は、これを必要とする患者を選別する段階、細胞が治療遺伝子を保有するように血管幹細胞製剤を変形させる段階、及び患者に変形された製剤を投与する段階を含む。かような製剤は、本技術分野に一般的に公知の技法によって変形されうる。変形には血管幹細胞の治療効果を増強させる遺伝子産物を暗号化するＤＮＡまたはＲＮＡ断片を哺乳類血管幹細胞に挿入することが含まれうる。変形された血管幹細胞が患者身体で治療遺伝子産物を生産したり、または所定の治療効果を有するようにする方式で遺伝子を挿入する。一実施例で血管幹細胞は、骨髄と共に患者から収得した細胞供給源から製造される。任意の遺伝子伝達手続き、例えば、ネイキドＤＮＡ統合、ＤＮＡの直接注入、受容体媒介されたＤＮＡ摂取、レトロウイルス媒介された形質感染、ウイルス媒介された形質感染、非ウイルス形質感染、脂質媒介された形質感染、電子伝達、電気泳動、リン酸カルシウム媒介された形質感染、マイクロ注入またはプロテオリポゾーム（これら全ての方法には、遺伝子治療法ベクターを含むことができること）を使用し、遺伝子を血管幹細胞に挿入できる。その他ベクターとしては、レトロウイルスベクター以外にも、ＤＮＡウイルス及びその他ＲＮＡウイルスから由来したベクターを使用できる。ＲＮＡウイルスを使用する場合に明白なように、かようなウイルスは、かようなＲＮＡウイルスに形質感染された血管幹細胞が治療遺伝子産物を暗号化するＤＮＡを提供するように、所定の薬剤を暗号化するＲＮＡを含む。遺伝子を細胞に導入する方法は、本技術分野に公知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｉｄ．参考）。
【０２７０】
本発明の他の様態によれば、治療遺伝子を保有するように変形されたヒト血管幹細胞の精製された製剤が、容器または商業的パッケージで提供され、かような容器または商業的パッケージは、治療遺伝子伝達によって疾病を予防及び／または治療するための遺伝子治療法で、製剤の使用のための説明書をさらに含む。従って本発明は、本発明の哺乳類血管幹細胞の製剤（かような製剤は、製剤の細胞が治療遺伝子を保有するように変形される）、及び遺伝子治療法で治療可能な疾病を有する患者を治療するための説明書を含む商業的パッケージ（すなわち、キット）をさらに提供する。
その他商業的応用及び方法
本発明の特定様態は、ヒト血管幹細胞を商業的量に増大させるものである。特定実施例で、ヒト血管幹細胞を大規模に生産し、必要な場合に保存し、病院、臨床医またはその他ヘルスケア機関に供給する。患者が、例えば、虚血または血管損傷のような処方を受けた場合、または造血再構成が要求される場合、ヒト血管幹細胞を注文して相応の時に供給できる。従って本発明は、商業的規模で細胞を得るために、ヒト血管幹細胞を生成及び増大させる方法と、前記方法から由来したヒト血管幹細胞を含む細胞製剤、及びヒト血管幹細胞を病院及び臨床に提供（すなわち、生産、必要な場合に保存、及び販売）する方法とに係るものである。さらに、血管幹細胞系統細胞を試験管内で生産し、必要な場合に保存し、病院及び臨床医に販売できる。
【０２７１】
従って本発明の特定様態は、本明細書に記述された方法によって増大した血管幹細胞を生産、保存及び分配する方法に係るものである。ヒト血管幹細胞を試験管内で生産及び増大させた後、患者治療に先立ってヒト血管幹細胞を回収、精製、及び必要な場合に保存しうる。代案として、血管幹細胞系統細胞が望まれた場合、患者治療に先立って、ヒト血管幹細胞を試験管内でさらに分化させることもできる。従って、特定実施例では本発明は、血管幹細胞を病院、ヘルスケアセンター、及び臨床医に供給する方法を提供し、本明細書に公開された方法によって生産された血管幹細胞または血管幹細胞系統細胞は保存され、病院、ヘルスケアセンターまたは臨床医の要求によって注文され、血管幹細胞または血管幹細胞系統治療法が要求される患者に投与される。代案的な実施例で、病院、ヘルスケアセンター、または臨床医は、患者の特定データに基づいてヒト血管幹細胞を注文し、ヒト血管幹細胞を患者の状態によって生産し、注文した病院または臨床医に供給される。
【０２７２】
本発明の追加的な様態は、潜在的な患者受容体に一致する細胞を提供できる血管幹細胞及び／または血管幹細胞系統細胞のライブラリに係るものである。従って、一実施例で本発明は、１個以上の組織接合性抗原に対して同質の（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ）血管幹細胞製剤を提供する段階を含む薬学ビジネスを遂行する方法を提供し、このとき細胞は、本明細書に公開された方法によって増大しうるヒト血管幹細胞ライブラリを含むかような細胞銀行から選択され、それぞれの血管幹細胞製剤は、ヒト群集に存在する１個以上のＭＨＣ対立遺伝子に対して半同質（ｈｅｍｉｚｙｇｏｕｓ）であるか同質であり、前記血管幹細胞銀行は、細胞銀行の他のメンバーと比較するとき、ＭＨＣ対立遺伝子の異なるセットに対してそれぞれ半同質であるか同質である。前述のように、遺伝子標的化または異質性（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ）の消失は、血管幹細胞を誘導するのに使われる半同質または同質のＭＨＣ対立遺伝子幹細胞を生成するのに使われうる。一実施例で、患者に適するように特定血管幹細胞製剤を選択した後、患者治療に適切な量に増大させられる。かような方法は、受容体に細胞を投与するに先立って、血管幹細胞を分化させて造血及び／または内皮細胞を収得する段階をさらに含むことができる。薬学ビジネスを遂行する方法はまた、販売用製剤を分配する分配システムを遂行することを含むことができ、薬学製剤のマーケッティングのための販売グループを設立することを含むこともできる。
【０２７３】
本発明の他の様態は、薬学的、化学的、またはバイオ技術会社、病院、または学術または研究機関の設備内の調査機器として、本発明のヒト血液母細胞を利用することに係るものである。例えば、ヒト血液母細胞及び血液母細胞誘導細胞（例えば、内皮細胞）は、新生血管及び抗−新生血管因子をスクリーン及び評価するのに使われ、または組織エンジニアリンに使われうる。また、ここに公知の方法によって得られて拡張された血管幹細胞は、造血及び内皮細胞に分化されうる二重の可能性有するために、これらは、造血及び血管形成の細胞及び分子生物学用として使われうる。さらにヒト血管幹細胞は、これらの細胞、遺伝子、成長因子、及び造血と血管生成とに役割を担当する分化因子の新しいマーカの発見、または潜在的な毒性または保護剤のためのスクリーニング・アッセイの発展及び薬物発見のために使われうる。
【０２７４】
本発明の他の実施例で、（血液細胞のような）血管幹細胞系統細胞はまた、商業的に使われうる。造血細胞は、臨床及びリサーチ適用のために使われうる、ヘモグロビン及び成長因子のような血液生成物を生成するのに使われうる。
【０２７５】
本発明はまた、患者から得たヒトＥＳ細胞収得方法及びＥＳ細胞から由来したヒト血管幹細胞膨脹方法を含む。この血管幹細胞は保存されうる。またこの血管幹細胞は、ＥＳを得た患者、またはこの患者の親戚を治療するのに使われうる。
【０２７６】
前述の方法及び適用は、血管幹細胞の治療、薬学的製剤及び保存に係り、本発明はまた、かような適用に適した血管幹細胞溶液に係るものである。従って本発明は、患者に注射用に適した血管幹細胞の溶液に係るものである。かような溶液は、生理学的に許容される液体（例えば、生理食塩水、緩衝食塩水または均衡食塩水溶液）内で製剤化された細胞を含みうる。溶液は、選択的に生体内細胞分化を促進する因子を含みうる。溶液は、骨髄移植用に使われる方法を許容する技術によって、患者に血管投与（例えば、静脈内注入）することによって投与できる。一部実施例で細胞溶液は、末梢血管、表面末梢血管、または代案として中心静脈投与（例えば、中心静脈カテーテルを介する）内に投与される。溶液内細胞の数はおよそ１０２以上であって、およそ１０９細胞未満でありうる。他の実施例で溶液内細胞の数は、およそ１０１、１０２、５Ｘ１０２、１０３、５Ｘ１０３、１０４、１０５、１０６，１０７、または１０８ないしおよそ５Ｘ１０２、１０３、５Ｘ１０３、１０４、１０５、１０６，１０７、１０８、または１０１０の範囲であって、下限線が常に上限性未満であることを除き、上限線及び下限線は、非独立的に選択される。さらに細胞は、単一または複合投与で投与されうる。
【０２７７】
本発明は、次の実施例を参考としてさらに具体的に技術され、それは単に説明のためであり、前述の前述の発明の制限として考慮されるものではない。
【実施例】
【０２７８】
実施例１：造血及び内皮可能性をいずれも示すヒトＥＳ細胞から由来した血管幹細胞
ヒト胚芽幹細胞系Ｈ１とＨ９とをマウス胚芽線維芽細胞（ＭＥＦｓ）のＥＳ細胞培地で培養する。培養されたヒトＥＳ細胞を２００ｇで遠心分離して分離、ペレット化し、胚状体（ＥＢ）形成培地で再懸濁する。ＥＢ形成培地は、ＢＭＰ−４及びＶＥＧＦが補充された無血清Ｓｔｅｍｌｉｎｅ培地（Ｓｉｇｍａ（登録商標））を含む。この後、細胞を超低付着（ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）培養プレート上にプレーティングし、ＣＯ２インキュベータで培養する。２４−４８時間後、初期造血サイトカイン（ＴＰＯ、Ｆｌｔ−３ＫＹＥ、及びＳＣＦ）を加え、ＥＢを形成するためにさらに２４−４８時間培養する。
【０２７９】
胚状体（ＥＢ）は２−６日間または選択的に２−５日間培養され、この後ＰＢＳで収集、洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡを使用した単一細胞懸濁液で脱凝集する。ＥＢの数を測定し、ほぼ５−１０Ｘ１０６細胞／ｍＬを、ＢＬ−ＣＦＵ培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＴＭ）を含み、サイトカイン及びＰＴＤ−ＨＯＸＢ４融合蛋白質で補充された血管幹細胞成長に最適化された無血清メチルセルロース培地で培養する。この後細胞は、血管幹細胞コロニーを成長させるために、新たな超低付着培養プレート上に再プレーティングする。
【０２８０】
ＥＢは、血管幹細胞コロニーの形成のために、毎日モニタリングする。ほぼ３日目に、血管幹細胞コロニーの形成が観察される。血管幹細胞は、非常に特徴的なブドウ型細胞形態によって特定される。
【０２８１】
細胞の一部からさらにＥＢを形成できるであろう（第２  ＥＢｓ）。第２  ＥＢｓは、図１６ｂから分かるように、ブドウ型形態を有さない。血管幹細胞はまた、第２  ＥＢｓより小さい。
【０２８２】
その後、これら血管幹細胞コロニーは選択、識別されて及び造血コロニー形成ユニット（ＣＦＵｓ）を形成し、さらに分化する能力を検査するために、メチルセルロースＣＦＵ−培地内に再プレーティングされる。同様に、これら血管幹細胞コロニーは選択され、識別され、内皮分化への最初の段階のために最適化されたフィブロネクチン−コーティング培養プレート上に再プレーティングされる。
【０２８３】
該選択された血管幹細胞コロニーから造血前駆細胞の発生を検査するために、顆粒球、赤血球、大食細胞及び巨大核細胞のためのコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）の成長は、成長した後の３−１０日間に測定される。
【０２８４】
該分離された血管幹細胞コロニーから内皮細胞の発生を検査するために、Ｍａｔｒｉｇｅｌの厚い層内に再プレーティングされるとき、分枝された管−腱（ｔｕｂｅ−ｃｏｒｄ）を形成する血管幹細胞の能力を測定する。
【０２８５】
内皮細胞に分化する分離された血管幹細胞コロニーの能力はまた、内皮細胞表面マーカの存在またはＬＤＬ  ｕｐｔａｋｅのような他の内皮特異アッセイを利用して確認しうる。
実施例２：血管幹細胞またはｈＥＳＣ由来ＢＣ細胞の副次的な特徴ヒトＥＳ細胞培養。
【０２８６】
本研究に使われるｈＥＳ細胞系は、以前に記述された（ＷＡＯｌ、ＷＡ０７、及びＷＡ０９としてＮＩＨ登録されている）Ｈ１、Ｈ７、及びＨ９細胞系及びＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから由来した４個の系（ＭＡＯｌ、ＭＡ０３、ＭＡ４０、及びＭＡ０９）である。未分化のヒトＥＳ細胞は、８０％合流さっるまで、完全なｈＥＳ培地Ｅで非活性（ミトマイシンＣ−処理の）マウス胚芽線維芽細胞（ＭＥＦ）細胞で培養される（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  ＆  ＭｃＭａｈｏｎ，Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｏｆ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ：Ｄｅｔａｉｌｅｄ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ａｎｄ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ，ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．Ｖｏｌｕｍｅ  １：Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，ｅｄ．Ｌａｎｚａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，２００４）。その後、未分化のｈＥＳ細胞を２−５分間０．０５％トリプシン−０．５３ｍ  ＭＥＤＴＡ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）で分離し、５分間１，０００ｒｐｍで遠心分離して収集する。
ＥＢ形成
血管幹細胞前駆体（中胚葉）形成を誘導するために、ｈＥＳ細胞（２ないし５Ｘ１０５細胞／ｍｌ）をＢＭＰ−４及びＶＥＧＦ１６５（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓＴＭ）の添加された無血清Ｓｔｅｍｌｉｎｅ培地（例えば、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ  ＩまたはＩＩ、ＳｉｇｍａＴＭ）内の超低付着プレート（ＣｏｒｎｉｎｇＴＭ）上にプレーティングし、５％ＣＯ２で培養する。４８時間後、ＥＢ培地は、初期造血／内皮成長因子の混合物（ｃｏｃｋａｔｉｌ）で補充及び充填する。例えば、培地の半分を４８時間後に除去し、新たな培地にＢＭＰ−４及びＶＥＧＦさらにＳＣＦ、ＴＰＯ及びＦＬＴ３配位子（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を同じ最終濃度で加えた。トリプル蛋白質形質の導入、ドメイン（ｔＰＴＤ）−ＨｏｘＢ４融合蛋白質（１．５μｇ／ｍｌ）を血管幹細胞及びその前駆体を増殖させるために４８−７２時間培養培地に加えた。
血管幹細胞または芽細胞（ｂｌａｓｔ）増殖
３．５−５日後、ＥＢｓを２−５分間０．０５％トリプシン−０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）で分離、収集し、単一細胞懸濁液を２２Ｇニードルを介して３−５回及び４０μＭ  ストレイナを通過させて製造する。細胞は、５分間１，０００ｒｐｍで遠心分離して収集されてカウントされる。細胞ペレットは、無血清Ｓｔｅｍｌｉｎｅ培地の５０−２００ｍｌで再懸濁される。血管幹細胞を増殖するために、２ないし５Ｘ１０５  ｈＥＳ細胞の分化から由来したＥＢｓから得た単一細胞懸濁液は、ＩｓｃｏｖｅのＭＤＭ、１−２％牛血清アルブミン、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール及び成長因子の混合物内の１．０％メチルセルロースＬを含む２ｍｌのＢＬ−ＣＦＣ／血管幹細胞増殖培地（ＢＧＭ）で混合される。例えば、１０μｇ／ｍｌ  ｒｈ−インシュリン、２００  μｇ／ｍｌ鉄飽和ヒトトランスフェリン、２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈ−ＧＭ−ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈ−ＩＬ−３、２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈ−ＩＬ−６、２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈ−Ｇ−ＣＳＦ、３ないし６ユニット／ｍｌ  ｒｈ−ＥＰＯ、５０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈ−ＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈ−ＦＬｔ３配位子、５０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈ−ＶＥＧＦ及び５０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈ−ＢＭＰ−４）（「ｒｈ」は「ヒト組換え」を示す）、及びＴＰＯ及びＦＬの１．５μｇ／ｍｌ包含／非包含ＰＴＤ−ＨｏｘＢ４融合蛋白質の１．５μｇ／ｍｌを加えた。細胞混合物は、超低付着プレート（例えば、６−ウェルプレートの１ウェル内２−５Ｘ１０５細胞／２ｍｌ）にプレーティングし、４−７日間３７℃、５％ＣＯ２で培養した。４−６日後、ブドウ型血管幹細胞芽細胞コロニー（ＢＬ−ＣＦＣｓまたはＢＣｓと示す）は、図１６ａから分かるように、顕微鏡によって観察された。
【０２８７】
ＷＡＯ１  ｈＥＳ細胞及びＭＡＯ１  ｈＥＳ細胞から得た個別細胞の０．３５±０．０１％及び０．５２±０．０６％は、それぞれブドウ型母細胞コロニー（ＢＣｓ）に発育された。開始３日目、ＢＣｓは、＜１０細胞を含み、４日ないし６日間早く増殖して＞１００細胞になった（図１６ａ）。コロニーは、一般的に二次ＥＢｓほど密集しておらず、形態的にさらに均一であった（図１６ｂ）。ｈＥＳ由来母細胞コロニーのＷｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ染色及びサイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）製造は、未成熟芽細胞の形態的特徴を確認した（図１６ｃ）。他のｈＥＳ細胞系（ＷＡ０７［Ｈ７］、ＷＡ０９［Ｈ９］、ＭＡＯ１、ＭＡ０３、ＭＡＯ９、及びＭＡ４０）にこの結果を拡大するために、ＦＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＴｐｏ（５０ｎｇ／ｍｌ）の補充物は、ＢＣコロニーの持続的な成長のために必要である（ＦＬとＴｐｏとがなければ、収得された小（１０−２０細胞）ｈＥＳ−ＢＣｓは、４−８日後に死滅）。他のｈＥＳＣ系間に観察される矛盾は、Ｂｏｗｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．によって以前に観察された通り、この細胞系の内因的特性に起因したものでありうる（２００６  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２４：１３５９−１３６９）。Ｅｐｏ（ヒト組換えＥｐｏの３−６ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）はまた、検査されたあらゆるｈＥＳの成長及びＢＣ形成に必須であった。
【０２８８】
時間過程（２日ないし６日）は、ＥＢ内のヒトＢＬ−ＣＦＣ形成を検査し、狭い時間周期は、ヒトＥＳＣ由来ＥＢｓが多数のＢＬ−ＣＦＣｓ（またはｈＥＳ−ＢＣｓ）を生成する間に発見された。２日目にＥＢｓは、低頻度でｈＥＳ−ＢＣｓを生成し（ＷＡＯ１  ｈＥＳ  ｃｅｌｌｓの場合、５７．３±７．４  ＢＣｓ／１ｘ１０５  ＥＢ  ｃｅｌｌｓ、平均±ＳＥ、ｎ＝３；ＭＡＯ１  ｈＥＳ  ｃｅｌｌｓの場合、３９５±１０．４  ＢＣｓ／ｌｘ１０５  ＥＢ  ｃｅｌｌｓ、ｎ＝３）、そして６日目に造血（赤血球）前駆体が発生した。しかし、３．５日目にＥＢｓは、両胞胚（ＷＡＯ１及びＷＡ０９）及び単一分割細胞（ＭＡＯ１及びＭＡ０９）から由来したｈＥＳＣ系を含む、あらゆる検査ｈＥＳＣ系内で多数の血管幹細胞またはｈＥＳ−ＢＣｓ（ＷＡＯ１  ｈＥＳ細胞の場合、３４７．４±１１．１  ＢＣｓ／ｌＸ１０５  ＥＢ細胞、ｎ＝３；ＭＡＯ１  ｈＥＳ細胞の場合，５２３．３±６０．１  ＢＣｓ／ｌｘ１０５  ＥＢ細胞、ｎ＝３）を生成した。効率（ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）は、ｈＥＳＣ系と成長条件とによって変わるにもかかわらず（表１参照）、ＷＡＯ１−ＧＦＰ及びＭＡＯ１  ｈＥＳ細胞（１２−１３Ｘ１０６細胞）の１つの６−ウェルプレートは、それぞれ２２．１８±３．５１Ｘ１０５（６−８日間増殖、平均±ＳＥ、ｎ＝１７）、そして４９．７３±７．２３Ｘ１０６（６−８日間増殖、ｎ＝９）そして３９６．４±９１．６３ｘ１０６（１０−１３日間増殖、ｎ＝６）の血管幹細胞またはｈＥＳ−ＢＣ細胞を生成した。従って細胞は、前述の良好に定義されて再生可能な条件下で容易に増殖できる。
【０２８９】
【表１】
0005630781.tif 000002
【０２９０】
血管幹細胞の冷凍保存
血管幹細胞（または芽細胞またはｈＥＳ−ＢＣ細胞）は、無血清培地で冷凍保存されうる。血管幹細胞の冷凍保存のために、精製された細胞を同じ二部分に分けた：この細胞の半分を２つの造血ＣＦＵアッセイ及び内皮細胞発達のために直接プレーティングし、他の半分は、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ培地の８％ＤＭＳＯに再懸濁して液体窒素内保存した。その後細胞は、造血及び内皮発達可能性のために解凍して検査した。解凍してから、血管幹細胞をここに記述されているように造血及び内皮系発達のためにプレーティングし、新鮮な、精製された細胞と比較した。内皮細胞系統の場合、冷凍過程後に細胞の７８±２％（平均＋ＳＥ、ｎ＝３）が回収された一方、総造血ＣＦＵｓの６１±７％（ｎ＝３）とＣＦＵ−赤血球の４６±４％（ｎ＝３）とが新鮮なｈＥＳ−ＢＣ細胞と比較するときに残った。ＣＦＵ−混合のためのさらに原始的な多潜在性前駆体の損失は、液体窒素保存でｈＥＳ−ＢＣ細胞回収後にはないと観察された。
血管幹細胞の特徴
ＢＬ−ＣＦＣ免疫細胞の化学分析において、精製されたＢＬ−ＣＦＣｓは、ポリリジン処理したグラススライド上にサイトスピンし、４％パラホルムアルデヒドで固定した。最大遺伝子の発現を検査するために、第１抗体を４℃で一晩培養し、次に蛍光染料で第２抗体を標識し、最後に蛍光顕微鏡で検査した。正常ヒトＢＭ細胞、Ｋ５６２細胞及びＨＵＶＥＣを対照群として使用した。
【０２９１】
免疫細胞化学分析は、ｈＥＳ細胞由来ＢＬ−ＣＦＣｓまたはＢＣｓがＣＤ３１、ＣＤ３４及びＫＤＲがない蛋白質、または他の付着分子と関連したさまざまな血管幹細胞を発現することを明らかにした。ｈＥＳ−ＢＣｓは、ＧＡＴＡ−１（図１６ｄ及び１６ｅ）及びＧＡＴＡ−２蛋白質を示す。ＧＡＴＡ−１は、２つの原始（胚芽）及び最終（成体）造血いずれにも必須な亜鉛フィンガ転写因子であり、マウスの血管幹細胞内で発現される（Ｆｅｒｒｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．２００５  ＭｏＩ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２５：１２１５−１２２７  ａｎｄ  Ｙｏｋｏｍｉｚｏ  ｅｔ  ａｌ．２００７  ＥＭＢＯ  Ｊ  ２６：１８４−１９６）。ＧＡＴＡ−２は、血管幹細胞発達及び分化内多様な段階で作用する亜鉛フィンガ転写因子である（Ｌｕｇｕｓ  ｅｔ  ａｌ．２００７  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３４：３９３−４０５））。ｈＥＳ細胞由来ＢＬ−ＣＦＣｓまたはＢＣｓはまた、ＬＭＯ２（血管幹細胞発達に重要なＬＩＭ−ドメイン蛋白質（Ｇｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３０：６１８７−６１９９）（図１６ｇ及び１６ｈ）とＣＸＣＲ−４（図１６ｎ及び１６ｏ）とを示す。ＣＸＣＲ−４はケモカインＳＤＦ−Ｉ用受容体であって、ｈＥＳＣｓ、造血母細胞及びマウス血管幹細胞から由来した内皮細胞の表面で発現される。ＣＸＣＲ−４は、骨髄内造血前駆体の移動、貯留及び発達に重要な役割を果たす。細胞はさらにＴＰＯ及びＥＰＯ受容体（図１６ｔ及び１６ｕ、及び１６ｑ及び１６ｒ、及び表１）を示し、ＣＤ７１、トランスフェリン受容体用特異抗体に容易に反応する（図１６ｊ及び１６ｋ）（表２及び図１６ｄ−ｖ参考）。細胞は、他の付着分子またはＣＤ３１、ＣＤ３４及びＫＤＲをほとんどまたは発現させない（表２）。ＣＤ３４、ＣＤ３１、及びＫＤＲ発現の不在、及びＣＤ  １３３発現の不在は、表面マーカ発現の独特なプロファイルである。
【０２９２】
遺伝子プロファイル分析において、総ＲＮＡは、精製されたＢＬ−ＣＦＣｓ／ｈＥＳ−ＢＣ細胞、３．５日になったＥＢｓ及び未分化のＥＳ細胞からＲＮＡｅａｓｙ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して分離される。切断されたアンチセンスｃＲＮＡは、マサチューセッツ（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）大学のコアゲノムファシリティでヒトＵ１３３．２アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標），Ｉｎｃ）への混成化のために使われた。β−クラスタグロービン遺伝子の発現プロファイルのために、個別ＣＦＵコロニーが選択され、ＲＮＡは分離及び増幅され、β−，γ−及びε−グロービン遺伝子発現は、前述の（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｂｌｏｏｄ（１０３）：４１３４−４１４１）で分析された。
【０２９３】
ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＴＭアレイによる分子プロファイルは、血管幹細胞と関連した遺伝子内の相当な増加及び初期段階ＥＢｓと比較し、初期原始赤血球母細胞の発達を示す（表２）。ＳＣＬ及びＬＭＯ２、血管幹細胞発生に重要な２つの遺伝子（Ｄ’Ｓｏｕｚａ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｂｌｏｏｄ（１０５）：３８６２−３８７０；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１３１）：２７４９−２７６２；Ｇｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１３０）：６１８７−６１９９））だけではなく、ＦＬＴ−Ｉ（ＶＥＧＦ用受容体）は、ＢＬ−ＣＦＣｓ／母細胞コロニー内で容易に検出された。胚芽（ε−グロービン、５４９倍）及びｆａｔａｌ（γ−グロービン、８１７倍）グロービン遺伝子発現は、ＢＬ−ＣＦＣｓ／ｈＥＳ−ＢＣｓ内で劇的に増加し、ＮＦ−Ｅ２（１２倍）、ＧＡＴＡ−１（６倍）、ＥＫＬＦ（７倍）、ＩＣＡＭ−４（４倍）、グリコフォリン（１４倍）及びＥｐｏ受容体（４倍）メッセージ（ｍｅｓｓａｇｅ）数値もまた適度に増加した。
【０２９４】
【表２−１】
0005630781.tif 000003
【０２９５】
【表２−２】
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【０２９６】
血管幹細胞の機能的特性化
ブドウ状の血管幹細胞コロニーをピッキングし、解剖顕微鏡下で手動に単離して無血清Ｓｔｅｍｌｉｎｅ（Ｓｔｅｍｌｉｎｅ  Ｉ）培地に再懸濁した。その後、この細胞を後述する方法で系統潜在性（ｌｉｎｅａｇｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）についてテストした。
ｈＥＳ−母細胞のクローン形成能（Ｃｌｏｎａｌｉｔｙ）
ｈＥＳ−母細胞コロニーが複製的であって一般的な二分化能（ｂｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ）前駆細胞から由来しているか否かを決定するために、マウス研究（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９８  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１２５）：７２５−７３２；Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９７  Ｎａｔｕｒｅ（３８６）：４８８−４９３）にすでに記載されたような細胞混合実験を遂行した。ＷＡＯ１  −ＧＦＰのＥＢからの細胞及びＭＡＯ１  ｈＥＳ細胞を混合してＢＧＭにプレーティングした。ｈＥＳ−母細胞コロニーを４−６時間後に位相及び蛍光顕微鏡で調べた。一連の３ｒｏ、母細胞コロニーの１００％（７７個のうち７７個）がＧＦＰ陽性またはＧＦＰ陰性ということが明らかにされている（混合ＢＣは観察されていない、図１８ａ及び１８ｂ）
ＧＦＰ陰性コロニーが非活性ＧＦＰ遺伝子を有した細胞を含有する可能性を排除するために、ＧＦＰ陽性及びＧＦＰ陰性コロニーをＧＦＰ配列の存在について調べた。混合実験から１２個の個別ＧＦＰ陽性及び１２個の個別ＧＦＰ陰性コロニーを位相及び蛍光顕微鏡下でハンドピッキングした。遺伝子のＤＮＡをＭｉｃｒｏＤＮＡ  ｋｉｔ（ＱｉａｇｅｎＴＭ）で単離させ、ＧＦＰ特異ｗｊｒＲ反応を遂行した。ＰＣＲ反応に対する内部対照群として、ミオゲニンプライマーをあらゆるＰＣＲ反応に含めたが、これは、２４５ｂｐの断片を生成させる。ＰＣＲ生成物を２％アガロースゲルで分離させ、臭化エチジウム染色によって視覚化させた。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析は、あらゆる陰性コロニーでＧＦＰ遺伝子配列の不在を確認させた（図１８、ＰＣＲ分析）。
【０２９７】
希釈研究で１次及び２次ＢＣのクローン形成性（Ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）をさらに確認した（表３、図１８ｃ）。限界希釈研究は、分化されたＥＢから異なる数（１．５Ｘ１０３〜１．５Ｘ１０４）の細胞を利用して遂行された。単一ＥＢ−細胞懸濁液を１５０ｍｌ  ＢＧＭ（１００細胞ｓ／ｍｌ）で希釈させた後、これらを１５の超低９６−ウェルプレートにプレーティングし、ＢＣ発生のために３７℃で培養した。母細胞コロニーのクローン原因を確認するために、このプレートを、プレーティング後の４時間後に２名の研究員によってマスキングされた条件下でチェックした。二重または三重細胞塊を有したウェルは追加調査から排除した。
【０２９８】
マウスＥＳ細胞研究で、Ｋｅｎｎｅｄｙら（１９９７  Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：４８８−４９３）によって報告されたように、ヒト母細胞コロニー（ｈＥＳ−ＢＣまたはＢＣ）発生はまた、少ない細胞数で発生が貧弱であって細胞密度依存的である。７個のＢＣは、１５個の９６−ウェルプレートから発生した（図１８ｃ）。追加的な限界希釈研究は、ＢＣが二次ＢＣを生成する潜在性を有した細胞を含有しているか否かを決定するために遂行した。
【０２９９】
二次ＢＣ成長に対して、一次母細胞コロニーをハンドピッキングして単一細胞に分離させた。その後、単一細胞を２０ｍｌ  ＢＧＭと混合し（それぞれ２００、３００、及び１，０００細胞）、一連の希釈物を作り、６個の超低９６−ウェルプレートにプレーティングした（０．１ｍｌ／ウェル）。二重または三重細胞塊を有したウェルは研究から排除した。一次ＢＣと同じ形態上の特徴を有した２９個の二次ＢＣは、いずれも５個の９６−ウェルプレートから発生した。かような実験は、一次及び二次ｈＥＳ−ＢＣのクローン形成性を確認した（表３）。
ｈＥＳ−母細胞コロニーの二分化能力（ｂｉｐｏｔｅｎｔｉａｌｃａｐａｃｉｔｙ）
クローン的に誘導された母細胞の二分化能力を説明するために、２つの戦略を使用した。第一の方法で、単一ＢＣ増殖のために、個別ｈＥＳ−ＢＣコロニーをハンドピッキングして造血及び内皮系統の成長を支持する成長因子を有したＳｔｅｍｌｉｎｅ  ＩＩを含有するフィブロネクチン被覆された４８−ウェルプレートに移した。液体培養での成長因子は、組換えヒトＳＣＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｔｐｏ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＬ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−３（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｇ−ＣＳＦ（２Ｏｎｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ−４（１５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＧＦ−Ｉ（１０ｎｇ／ｍｌ）、内皮細胞成長補充因子（ＥＣＧＳ、１００μｇ／ｍｌ）及びＥｐｏ（３Ｕ／ｍｌ）を含有した。培養１週間後、非付着造血細胞を温和にピペッティングして除去し、造血ＣＦＵ分析に直接使用した。非付着細胞を除去した後、付着集団をＥＧＭ−２内皮細胞培地（ＣａｍｂｒｅｘＴＭ）で１週以上培養した後、ｖＷＦの発現を調べた。
【０３００】
個別ＢＬ−ＣＦＣを造血及び内皮系統の成長を支持する成長因子を含む液体培養に移したとき、非付着及び付着細胞いずれも６０％以上（２４のうち１５）のＢＬ−ＣＦＣを発生させ（図１８ｄ及び１８ｅ、表２）、多様な造血サイトカインで補充された半固形培地に再プレーティングした後、これらの６５％（２４のうち１６）は、赤血球（図１８ｉ）、骨髄（図１８ｊ及び１８ｋ）及び多系統（図１８ｍ）を含む造血コロニーを形成した。個別ＢＣの９５％以上（２４のうち２３）は、付着、ストローマ類似細胞を発生させたが、これはＡｃ−ＬＤＬを吸収して（図１８ｇ）ｖＷＦを発現する（図１８ｈ）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（図１８ｆ）に毛細血管構造を形成した。
【０３０１】
第二の方法で、一次及び二次母細胞コロニーからの個別ＢＣをピッキングして２つの群に分け、１つの群は造血ＣＦＵについてテストし、他の１つの群は内皮前駆細胞形成についてテストした。一次ＢＣに対して、９０％以上（２４のうち２２）が造血及び内皮系統を発生させ、１００％及び９２％がそれぞれ造血及び内皮細胞を発生させた（表３）。同様に、限界希釈実験からの７個の個別ＢＣも造血及び内皮系統に分化するこれらの潜在性について調べた。５個のＢＣは、造血及び内皮子孫細胞いずれもを生成し（表３）、通常の実験からのＢＣと比較して低い効率を示したが（７１％ｖｓ．９２％）、これは、発生条件が最適ではないためでありうる。２９個の二次ＢＣに対して、半分以上（２９のうち１５）が造血及び内皮系統を発生させた一方、６（２１％）及び３（１０％）は、それぞれ造血または内皮細胞満を生成させた（表３）。たとえ一次ＢＣが造血及び内皮細胞の前駆体を含んで異種集団を含むとしても、二次限界希釈実験は、一次ＢＣで血管幹細胞の存在を明白に示す。
【０３０２】
【表３】
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【０３０３】
造血前駆細胞分析
造血前駆細胞分析のために、細胞の半分を無血清造血コロニー形成単位（ＣＦＵ）培地（Ｈ４４３６、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＴＭ）１ｍｌ、０．５％ＥＸ−ＣＹＴＥ（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｉｎｃ．ＴＭ）及びｔＰＴＤ−ＨｏｘＢ４１．５μｇ／ｍｌと混合した。細胞はまた、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  ＭＤＭのうち１．０％メチルセルロース、１−２％牛血清アルブミン、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍｌ  ｒｈ−インシュリン、２００μｇ／ｍｌ鉄飽和されたヒトトランスフェリン、２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈ−ＧＭ−ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈ−ＩＬ−３、２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈ−ｌＬ−６、２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈ−Ｇ−ＣＳＦ、３ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ｒｈ−Ｅｐｏ、５０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈ−ＳＣＦ）及び１．５ｔｏ５μｇ／ｍｌ  ＰＴＤ−ＨｏｘＢ４融合蛋白質を含有する無血清造血コロニー形成細胞分析培地と混合させることができる。細胞混合物を未処理１２−ウェル細胞培養プレートにプレーティングして３７℃で１０−１４日間培養した。
【０３０４】
造血ＣＦＵを最初のプレーティング後の１０−１４日に顕微鏡下で調べた。形態的特性化のために、単一造血ＣＦＵをピッキングしてＰＢＳで２回洗浄し、ガラススライド上にサイトスピンし、Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ染料で染色し、細胞形態を顕微鏡下で調べた。
【０３０５】
図１から分かるように、血管幹細胞の造血潜在性の例示として造血ＣＦＵは、Ｈ１−ＧＦＰ  ＥＳ細胞から生成された血管幹細胞から観察された。
【０３０６】
観察された他の造血ＣＦＵの形態は、図２ないし６に図示する。赤血球のためのＣＦＵ（ＣＦＵ−Ｅ）は、図２から分かる形態に特徴があった。多機能ＣＦＵ（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ／Ｍｉｘ）は、図３及び図４に示される形態に特徴があった。顆粒白血球のためのＣＦＵ（ＣＦＵ−Ｇ）及び大食細胞のためのＣＦＵ（ＣＦＵ−Ｍ）は、図５で示される形態に特徴があった。顆粒白血球／大食細胞のためのＣＦＵ（ＣＦＵ−ＧＭ）及び巨核球（ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ）大食細胞のためのＣＦＵ（ＣＦＵ−Ｍｋ）は、図６で示される形態に特徴があった。
【０３０７】
血管幹細胞の造血潜在能の他の例示として、単一細胞懸濁液を１０−１４日間前述の多様なサイトカインを含有する無血清メチルセルロース培地にプレーティングしたとき、赤血球コロニー（図１７ａ）、顆粒白血球（図１７ｂ）、大食細胞（図１７ｃ）及び多系統（図１７ｄ）造血細胞がさらに観察された。ＣＤ２３５ａ（赤血球）、ＣＤ１３（骨髄）及びＣＤ４５（白血球）に対する抗体を利用したＰＡＣＳ分析（図１７ｖ−ｙ）、Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ染色（図１７ｅ−ｇ）及び免疫染色（図１７ｉ−ｋ）で、これらの造血系統の同一性を確認した。ほとんどのＣＦＵ（＞５０％）は、赤血球コアを有した系統であり、プレーティング後の数日内に形成された（例えば、図１参照）。
【０３０８】
赤血球コロニーは、明赤色を有した原始赤血球のものと類似しており、Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ染色は、あらゆる赤血球が核が形成されたということを示している（図１７ｅ−ｇ）。赤血球の発生段階をさらに区別するために、ＣＦＵコロニーをβ−クラスタグロービン遺伝子の発現パターンについて分析した（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｂｌｏｏｄ（１０３）：４１３４−４１４１）。あらゆる赤血球及び多系統コロニーは、胚芽ε−グロービン遺伝子を主に発現し、β−グロービン遺伝子メッセージは検出されず（示すデータなし）、原始卵黄嚢のような状態を暗示した。
【０３０９】
免疫学的特性化のために、ガラススライド上にサイトスピンされたＣＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−Ｇ、及びＣＦＵ−Ｍｉｘ細胞を抗ヒトＣＤ２３５ａ、ＣＤ  １３、及びＣＤ４５抗体で染色した。図１７ｍ−ｐに示されたＦＡＣＳ分析のために、１つのウェルから収集されたＣＦＵ細胞は、マウスＩｇＧｌイソタイプ対照群、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ１３、及びＣＤ４５で染色させ、Ｃｏｕｌｔｅｒフロー細胞測定器で分析した。Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ染色、免疫染色、及びＦＡＣＳ分析でこれらの造血系統の同一性を確認した（図１７ｅ−ｐ）。
【０３１０】
図１７ｖ−ｙに与えられたＦＡＣＳ分析のために、ＬＳＲＩＩの流れ細胞測定器（ＢＤ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＴＭ）で標準手続を利用して３色細胞測定分析を行った。細胞を多様な類型の造血ＣＦＵを有するウェルから収集し、ＩＭＤＭ培地５体積でメチルセルロースを希釈することによって、単離させた。単一細胞懸濁液を部分に分けてイソタイプ対照群または抗原特異的抗体で染色させた。使われた抗体組合わせは、フルオロセイン−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に接合されたＣＤ２３５ａ、Ｒ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）に接合されたＣＤ４５及びアロピコシアニン（ＡＰＣ）に接合されたＣＤ１３であった。また細胞の一定部分はまた、イソタイプ対照群としてＡＰＣ、ＰＥ、及びＦＩＴＣに接合されたマウスＩｇＧで染色させた（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＴＭ）。サンプルをＬＳＲＩＩ流れ細胞測定器で）操作し、ＦｌｏｗＪｏＴＭバージョン６．３．２ソフトウェアで分析した。
内皮前駆細胞分析
内皮前駆細胞分析のために、細胞の残りの伴分を３−７日間ＥＧＭ−２またはＥＧＭ−２ＭＶ完全培地（ＣａｍｂｒｅｘＴＭ）でフィブロネクチン被覆されたプレート（ＢＤ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＴＭ）上にプレートした。単離された血管幹細胞コロニーの内皮細胞への分化能は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上の管形成、ＬＤＬ吸収及び内皮細胞表面マーカーの存在を検出する免疫組織化学を利用して確認された。
Ｍａｔｒｉｇｅｌ上の官形成
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＴＭ）を４−ウェル組織培養プレート（０．２ｍｌ）または９６−ウェルプレート（０．０５ｍｌ）のそれぞれのウェルに添加し、３７℃で４５−９０分間固形化した。ゲル形成後、前記培養物から由来した０．５−１．５Ｘ１０５細胞を含有するＥＧＭ−２またはＥＧＭ−２ＭＶ培地に細胞懸濁液０．２−０．３ｍｌ（例えば、９６−ウェルプレートに対して０．１ｍｌ）をＭａｔｒｉｇｅｌの上部に位置させ、３７℃、５％ＣＯ２で培養させた。毛細管類似（管）構造の形成を１６−２４時間培養後にチェックした。図７は、Ｈ９（ａ）及びＡＣＴ３０（ｂ）細胞から由来した血管幹細胞の管−コード（ｃｏｒｄ）形成の代表的な写真を表す；Ｍａｔｒｉｇｅｌ基材培地上に再プレートした後、血管幹細胞は、毛細血管類似構造を形成し、またＡｃ−ＬＤＬを吸収する付着細胞を発生させた。図８（ａ）は、またＨｌ−ＧＦＰ細胞から由来した内皮潜在性を有する血管幹細胞の管−コード構造の代表的な写真を示す。また、図１７ｑは、血管幹細胞から由来した付着細胞の再プレート後Ｍａｔｒｉｇｅｌ上に形成された毛細管類似構造を示す。このような細胞は、ＡＣ−ＬＤＬを吸収しうる（データは示さない）。
ＡＣ−ＬＤＬ吸収
フィブロネクチン被覆されたウェルで３−７日間成長された血管幹細胞をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７−標識ＡＣ−ＬＤＬ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）１０μｇ／ｍｌと添加し、４−６時間培養した。次いで、細胞を１ＸＰＢＳで３回洗浄し、３０分間４％パラホルムアルデヒドで固定させた。ＡＣ−ＬＤＬの吸収は、蛍光顕微鏡下で視覚化された。例えば、図８ｂは、Ｈｌ−ＧＦＰ細胞から由来した血管幹細胞のＡＣ−ＬＤＬ吸収を表す。図１７ｚ及び１７ａａはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４標識ＡＣ−ＬＤＬとの培養が内皮細胞の中断（ｐｕｎｃｔｕａｔｅ）染色パターン特性を表すということを示す。
免疫細胞化学
フィブロネクチン被覆ウェル上で３−７日間成長した血管幹細胞を１ＸＰＢＳで３回洗浄させ、４％パラホルムアルデヒドでＯ３０分間固定させた。Ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ｖＷＦ）、ＰＥＣＡＭ−１（ＣＤ３１）、ＶＥ−カドヘリン、ＫＤＲ及びＣＤ３４の発現のために、細胞を透過させた後、１次抗−ヒトｖＷＦ（ＤａｋｏＴＭまたはＣｈｅｍｉｃｏｎＴＭ）、ＰＥＣＡＭ−１及びＫＤＲ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＴＭ）、ＶＥ−カドヘリン（Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓＴＭ）、及びＣＤ３４（Ｄａｋｏ）抗体と共に各々４℃で一晩中培養させた後、ロダミンまたはＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴＭ）で標識された相応する２次抗体で３０−６０分間培養させた。ｖＷＦ蛋白質の発現は、ヤギ抗−マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７  ２次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴＭ）と共に３０−６０分間培養することによって検出された。最終洗浄後、細胞を蛍光顕微鏡下でチェックした。図９は、Ｈｌ−ＧＦＰ  ＥＳ細胞から由来した血管幹細胞でのｖＷＦ発現を表す。図１７ｓは、血管幹細胞由来の内皮細胞でのｖＷＦの発現（矢）を表す。血管類似構造での付着細胞は、ＰＥＣＡＭ−１（ＣＤ３１）、ＫＤＲ及びＶＥ−カドヘリンに対して陽性であった（図１７ｔ、１７ｕ、及び１７ｚ−１７ｃｃ）。
【０３１１】
また、新生血管形成は、付着細胞またはハンドピックされたＢＬ−ＣＦＣをＭａｔｒｉｇｅｌと混合して４−５週間生体内の移植する場合に観察された。Ｍａｔｒｉｇｅｌプラグの組織学的検査は、ヒト特異的核及びｖＷＦ抗体と免疫反応性である微細管の存在を確認させた。図１０及び１１参照．
実施例３：代表的なＨＯＸＢ４蛋白質を製造及び精製する方法
代表的なＨＯＸＢ４蛋白質を製造して精製する。これはＴＡＴ−ＨＡ−ＨＯＸＢ４融合蛋白質である。
【０３１２】
ｐＴＡＴ−ＨＡ−ＨｏｘＢ４発現ベクターは、Ｎ−末端ＴＡＴ  ＰＴＤを含む、ｐＴＡＴ−ＨＡ発現ベクターのＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩ部位（ａｇｉｆｔｆｒｏｍ  Ｄｒ．ＳＦ．Ｄｏｗｄｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）内にＮ−末端３２アミノ酸を保有及び未保有するＨｏｘＢ４  ＯＲＦ（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）を含むＰＣＲ断片（センスｐｒｉｍｅｒ  ５’−ＴＡＣ  ＣＴＡ  ＣＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＣＡＣ  ＴＣＧ  ＣＣＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）及びアンチセンスｐｒｉｍｅｒ  ５’−ＴＣＧ  ＴＧＧ  ＣＴＣ  ＣＣＧ  ＡＡＴ  ＴＣＧ  ＧＧＧ  ＧＣＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７））をクローニングすることで生成させた。生成されたｐＴＡＴ−ＨＡ−ＨｏｘＢ４  プラスミドは配列分析により確認され、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳバクテリア（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅＴＭ）内に形質転換された。
【０３１３】
対数期で成長するバクテリア細胞は、３０℃で４時間１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導させ、遠心分離により収集した。６ｘＨｉｓ融合された組み換え型ＴＡＴ−ＨｏｘＢ４蛋白質は、宿主バクテリアにより包含体内に隔離されたことが明らかになったので、細胞を変性溶液（６Ｍグアニジウム、２０ｍＭ  ＮａＰＯ４、及び０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．８）で超音波処理することによって粉砕させ、次いで、６ｘＨｉｓ融合されたＴＡＴ−ＨｏｘＢ４組み換え型蛋白質をニッケル樹脂（ＰｒｏＢｏｎｄ  ｒｅｓｉｎ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）に結合させた。数回洗浄後、ＴＡＴ−ＨｏｘＢ４融合蛋白質を２０ｍＭ  ＮａＰＯ４、ｐＨ４．０，０．５Ｍ  ＮａＣｌ、８Ｍウレア及び１０ｍＭイミダゾールで溶出させた。次いで、ＴＡＴ−ＨｏｘＢ４融合蛋白質をＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラムでＩＭＤＭ培地内に脱塩し、部分に分け、直ちに−８０℃で保管した。
【０３１４】
ＴＡＴ−ＨｏｘＢ４融合蛋白質の純度及び濃度をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気移動により測定し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルー染色で視覚化した。精製されたＴＡＴ−ＨＡ−ＨｏｘＢ４組み換え型蛋白質は、≒３７ＫＤ蛋白質として作用した。精製されたＴＡＴ−ＨＡ−ＨｏｘＢ４蛋白質の濃度は、同じゲルでＢＳＡ蛋白質標準と比較して評価された。
【０３１５】
コンピュータモデリングに基づいて、文献［Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ６１：４７４−４７７）］は変形されたＰＴＤが試験管内、及び生体内の両方で本来のＴＡＴ  ＰＴＤに比べて相当向上した蛋白質伝達可能性を保有するという事実を立証した。変形されたＰＴＤ−ＨＡ−ＨｏｘＢ４融合蛋白質を製造するために、センス５’−ＣＧＡ  ＴＧＧ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＧＣ  ＴＡＣ  ＧＣＡ  ＣＧＣ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＧＣＧ  ＣＧＣ  ＣＡＧ  ＧＣＴ  ＣＧＣ  ＧＣＣ  ＧＧＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ−３’（配列番号１８）及びアンチセンス５’−ＣＡＴ  ＧＧＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＧＧＣ  ＧＣＧ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＧＣＧ  ＣＧＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＧＣＧ  ＴＧＣ  ＧＴＡ  ＧＣＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＣＣＡ  ＴＣＧ−３’（配列番号１９）オリゴをＢａｍＨＩで分解し、キット（ＱｉａｇｅｎＴＭ）を使用して精製した。次いで、ｐＴＡＴ−ＨＡ−ＨｏｘＢ４プラスミドプラスミド内のＴＡＴ断片を、変形されたＰＴＤ断片に置換し、三重化（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅｄ）ＰＴＤ挿入物を制限断片サイズに基づいて選別し、ＤＮＡ配列分析で確認した。このプラスミドは、ｐｔＰＴＤ−ＨＡ−ＨｏｘＢ４として指摘する。ｐＴＡＴ−ＨＡ−ＨｏｘＢ４及びｐｔＰＴＤ−ＨＡ−ＨｏｘＢ４プラスミドはＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳバクテリア（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）で形質転換し、４時間３０℃で１ｍＭＩＰＴＧを添加することによって、ＨｏｘＢ４融合蛋白質発現を誘導した。６ｘＨｉｓ−融合された組み換え型ＴＡＴ−ＨｏｘＢ４及びｔＰＴＤ−ＨｏｘＢ４蛋白質を宿主バクテリアにより封入体内に隔離し、細胞を変性溶液（６Ｍグアニジウム、２０ｍＭＮａＰＯ４及び０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．８）で超音波処理で破壊した後、６ｘＨｉｓ−融合されたＴＡＴ−ＨｏｘＢ４及びｔＰＴＤ−ＨｏｘＢ４組み換え型蛋白質をニッケル樹脂（ＰｒｏＢｏｎｄ  ｒｅｓｉｎ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）に結合した。数回の洗浄後、ＴＡＴ−ＨｏｘＢ４及びｔＰＴＤ−ＨｏｘＢ４融合蛋白質を２０ｍＭＮａＰＯ４、ｐＨ４．０，０．５  Ｍ  ＮａＣｌ、８Ｍウレア＋１０ｍＭイミダゾールで溶出させた。ＴＡＴ−ＨｏｘＢ４及びｔＰＴＤ−ＨｏｘＢ４融合蛋白質をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムでＩＭＤＭ培地で脱塩（ｄｅｓａｌｔ）し、分取して、−８０℃で直ちに保存した。ＴＡＴ−ＨｏｘＢ４及びｔＰＴＤ−ＨｏｘＢ４融合蛋白質の純度及び濃度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気永動法で決定し、クマーシーブルー染色（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）で視覚化した。精製されたＴＡＴ−ＨｏｘＢ４及びｔＰＴＤ−ＨｏｘＢ４組み換え型蛋白質は≒３８ＫＤ蛋白質として作用する。精製されたＴＡＴ−ＨｏｘＢ４及びｔＰＴＤ−ＨｏｘＢ４蛋白質の濃度は、同じゲルでＢＳＡ蛋白質標準物と比較することで推定した。安定性試験のために、ＴＡＴ−ＨｏｘＢ４及びｔＰＴＤＨｏｘＢ４蛋白質をウルトラロー（Ｕｌｔｒａ  ｌｏｗ）２４−ウェルプレート内の生存するｈＥＳＣを含有するステムライン（Ｓｔｅｍ  ｌｉｎｅ）ＩＩ培地または５％ＦＢＳを含有するＩＭＤＭ培地に添加し、３７℃で培養した。培地の分取液を多様な時間で除去し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気永��法で処理し、クマーシーブルー染色で視覚化した。
【０３１６】
文献［Ｂｅｓｌｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００２  Ｂｌｏｏｄ１  ００：２２ａ）］には、ＨｏｘＢ４のＮ−末端の最初３１個のアミノ酸がその機能のために省略され、Ｎ−末端３３個のアミノ酸の除去は、さらに安定した蛋白質を生成するという事実が記録された。その結果は全長ＴＡＴ−ＨｏｘＢ４蛋白質が不安定であり、数回の融解周期後≒３０ＫＤ蛋白質を形成した一方、Ｎ−末端−除去されたＴＡＴ−ＨｏｘＢ４及びｔＰＴＤ−ＨｏｘＢ４蛋白質が反復された融解及び３７℃で一夜間培養しった後、その本来の形状を保持したことを確認させた（図１９Ｃ）。図１９Ａで示したように、ｔＰＴＤ−ＨｏｘＢ４及びＴＡＴＨｏｘＢ４は、変性条件及び脱塩条件下で多数のカラムクロマトグラフィー後、比較的純粋な蛋白質となった。精製されたｔＰＴＤ−ＨｏｘＢ４蛋白質は、ＢＳＡ蛋白質標準物と比較して推定したものであって、２５０ないし３００μｇ／ｍｌのＰＢＳまたはＩＭＤＭ培地のうち、最大溶解度を有しつつ、本来のＳＤＳ−ＰＡＧＥ下で単一≒３８ＫＤバンドとして作用した。ＴＡＴ−ＨｏｘＢ４融合蛋白質から類似した結果を得る。
【０３１７】
文献［Ｋｒｏｓｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００３  Ｎａｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９：１４２８−１４３２）］には、ＴＡＴ−ＨｏｘＢ４蛋白質はＦＢＳを含有する環境で非常に不安定であり、生物学的機能を保持するためには、２時間ごとに改めなければならない説明した。本明細書で存在する結果は、ｔＰＴＤ−ＨｏｘＢ４が５％ＦＢＳを含有する培地で不安定であり、１時間未満の半減期を有することを確認させた（図１９Ｂ）。７０℃で３０分間のＦＢＳ前処理は大部分の酵素活動を除去した。その安定性をさらに調べるために、ｔＰＴＤ−ＨｏｘＢ４蛋白質を無血清ステムライン培地に添加し、３７℃でｈＥＳＣで培養した。図１９Ｃで示したように、ｈＥＳＣへの４８時間培養後にも、ｔＰＴＤ−ＨｏｘＢ４蛋白質の実質的な断片が検出された。
実施例４：ＳＣＩＤマウスに移植されたマトリゲルプラグが内皮細胞を発生させる
血管幹細胞由来内皮細胞またはＨｌ−ＧＦＰヒトＥＳ細胞から由来の純粋な血管幹細胞（１×１０６細胞）を精製し、７００μｌのマトリゲル（ＢＤ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＴＭ）で再懸濁した。この細胞を４週齢ＳＣＩＤマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴＭ）の脊椎領域に皮下注射した。注射後５週目、動物からマトリゲルプラグを除去し、このプラグから凍結標本を製造した。マトリゲルプラグの横断面を固定し、標準ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色だけでなく、抗−ヒト特異的核抗体（ＭＡＢ１２８１、ＣｈｅｍｉｃｏｎＴＭ）及びヒト特異的抗−ｖＷＦ抗体後、蛍光染料標識化された該当２次抗体（ＭＡＢ１２８１のためのヤギ抗−マウスＩｇＧ−テキサスレッド２次抗体）を利用する免疫組織化学法で染色した。図１０は、Ｈ＆Ｅ染色されたマトリゲルプラグの横断面内の血管を立証し、図１１はマトリゲルプラグの横断面内の血管がヒト特異的核抗体に対して陽性であるヒト血管幹細胞由来の細胞であることを立証する。
実施例５：眼球の生体内の虚血／再潅流研究
２種の技術、ガラス体内注射及び養子移入（ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）を利用して、生体内の復旧過程に対するｈＥＳ由来血管幹細胞の寄与度を直接的に調べた。虚血／再潅流（Ｉ／Ｒ）損傷は、眼内圧の上昇を誘発した。Ｉ／Ｒが損傷されたモデルは、血管閉塞（ｖａｓｏ−ｏｂｌｉｔｅｒａｔｉｏｎ）及び無細胞毛細管の生成を含む網膜内皮に対する損傷を起こす。網膜Ｉ／Ｒ損傷後７日目、マウスに６日目、血管幹細胞（“ｈＥＳ−ＢＣ”とも称される）から収集された蛍光標識化された血管幹細胞をｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌｓｉｎｕｓを通じて全身注射したか（ｎ＝１３）、またはガラス体内注射した（ｎ＝４）。
【０３１８】
注射後１日目、マウスを安楽死させ、網膜を除去し、ロダミン−接合されたリシヌスコミュニスアグルチニンＩで標識化した。このようなアグルチニンは、内皮細胞により特異的に発現された糖蛋白質に結合するので、血管外部表面を蛍光標識化するのに利用される。共焦点顕微鏡は、血管幹細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）由来内皮細胞に対する緑色蛍光標識を立証し、これは３３．５±１０％の損傷された眼球の網膜脈管構造を表した。対照群眼球（図２０ａ及び２０ｂ、各々）では、緑色蛍光が観察されず、これは血管幹細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）細胞が単に損傷された領域にのみ同化される無細胞領域に帰り、損傷された網膜内に非潅流性（ｎｏｎ−ｐｅｒｆｕｓｅｄ）無細胞毛細管の再内皮化を起こすという事実を立証する（図２１ａ及び２１ｂ）。このような復旧過程は、同じ方式であらゆる動物（ｎ＝ｌ７）で観察された。
【０３１９】
Ｉ／Ｒ損傷された動物の２番目群（ｎ＝６）を前述したように取扱った後、犠牲させる前に、血管の血管ルメン（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｌｕｍｅｎ）を視覚化し、決定的にこのような細胞により回復された血管を開き、したがって、機能性であるを立証するために３−５ｍｌのＴＲＩＴＣ−接合された（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）デキストリンを使用して潅流固定した。赤色染色は開いた血管を表し、緑色染色は血管幹細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）由来の内皮細胞を立証し、黄色染色は血管幹細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）細胞が開いた脈管構造を発生させた位置を示した。図２１ｄは、ｈＥＳ−ＢＣ細胞注射後２日目、黄色（赤色及び緑色、薄い灰色で現れる）蛍光を有する大血管を図示し、これは細胞が血管壁で統合され、血管が潅流されたことを表す。この動物で、特に顕著なのは緑色だけ観察された多数の微細血管であり、これは開いたルメンを発生させるのに充分に成熟されていない新たな横補償新生脈管構造（ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）を表すものと見られ、よって悲観類されたままで残っていた。図２０ｃは、同じ動物の非損傷された対照群眼球を図示し、明白にＢＣ細胞がいかなる方式でも非損傷された脈管構造と関連されなかったことを立証する。ｈＥＳ−ＢＣ細胞注射後７日目に犠牲されたマウスからの網膜扁平標本（ｍｏｕｎｔ）で、緑色管（非ルメン化、非潅流性血管）の数は、２日目犠牲されたマウスに比べて少なかった。ＴＲＩＴＣ−デキストリン（赤色）で潅流されたｈＥＳ−ＢＣ細胞由来の血管（緑色）を表す黄色血管（薄い灰色または白色で現れる）がさらに多く存在した。これは完全に機能性の血管を表し、血管幹細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）細胞が損傷された眼球の血管内に統合され、潅流された微細血管を有する面積をさらに広げたしたを立証した（図２Ｏｅ）。
【０３２０】
蛍光免疫組織化学法は、血管幹細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）細胞由来の内皮細胞を同時位置させて（ｃｏｌｏｃａｌｉｚｅ）、Ｉ／Ｒ損傷されたマウス眼球の横断面内の損傷された脈管構造を示し、損傷された眼球からの網膜内の神経節細胞層の血管の代表的な横断面を示す（図２Ｏｆ）。血管の抗−ＣＤ３１染色とヒト核抗原染色の同時位置は、脈管構造内の内皮細胞のうち、一部が血管幹細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）細胞から由来したことを提示する。図２０ｆは、内境界膜に隣接する神経節細胞層内の血管ルメンの高配率写真を示す。ルメンは、内皮細胞により囲まれており（図２Ｏｆ、矢印、ＣＤ３１）、血管幹細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）細胞由来の成熟した内皮細胞により囲まれている（図２Ｏｆ、矢印、ヒト核抗原）。
方法
生体内の虚血／再潅流研究のために、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）は研究の序盤に７ないし１０週齢であった。虚血／再潅流損傷は、眼内圧（ＩＯＰ）の上昇を誘発した。虚血の誘発間マウスを吸入麻酔（イソフルラン蒸気）下に置いた。眼球の前方（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃｈａｍｂｅｒ）を食塩水注入ラインに付着された３０−ゲージ針でキャニュラーをさし、眼球前方に２時間の静水圧（８０−９０ｍｍＨｇ、ＴｏｎｏＰｅｎにより測定し、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ  Ｓｏｌａｎ、Ｊａｃｋｓｏｎｖｉｌｌｅ、Ｆｌａ）処理した。これは紅彩の白色症及び赤色反射の損失により確認されるような網膜虚血を引き起こす。１２０分後、針を除去し、ＩＯＰを正常化し、これは再潅流損傷を引き起こす。反対側眼球は対照群として作用した。
【０３２１】
網膜虚血再潅流損傷後７日目、マウスに６日目ｈＥＳ−ＢＣｓから収集された蛍光標識化された血管幹細胞をｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｉｎｕｓを通じて全身注射したか（ｎ＝１３）、またはガラス体内注射した（ｎ＝４）。血管幹細胞の蛍光バイタル標識化は製造社の説明書によって染料ＰＫＨ−６７（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＴＭ）を使用して行った。全身注射の場合、各マウスは４×１０５標識化された血管幹細胞を１００μｌ投与した一方、ガラス体内注射の場合、各マウスは５×１０４血管幹細胞を２μｌ投与した。ガラス体内注射群の反対側対照群の眼球には、無菌性等張食塩水の当量体積を注射した。１日後、マウスを安楽死させ、眼球を除去し、４％パラホルムアルデヒドで１時間固定した。洗浄後、周辺切開術（ｃｉｒｃｕｍｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｌｉｍｂｉｃｉｎｃｉｓｉｏｎ）で眼球を切開して角膜及び水晶体を除去した後、ガラス体液を除去した。次いで、非損傷された神経網膜を、下の脈絡膜から柔らかに取って除去した。非損傷された網膜を均質化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）緩衝液に位置させた。網膜を単離し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ７．５）のうち、１：１０００ロダミン−接合されたＲ．コミュニスアグルチニンＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）内で４℃で一夜間培養した。２４時間後、網膜を４０℃で２４時間１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び１５０ｍＭＮａＣｌで洗浄した後、フロリダ大学（Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ）の光学顕微鏡施設でのＭＲＣ−１０２４共焦点レーザー顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（ＢｉｏＲａｄ）を使用するイメージ化のためにカバースリップ上に標本化した。代案として、Ｚｅｉｓｓレーザースキャニング共焦点顕微鏡を利用して網膜をイメージ化した。
【０３２２】
Ｚｅｉｓｓ共焦点レーザー顕微鏡を使用して顕微鏡検査する場合、網膜はガラスカバースリップ上に位置させ、その湾曲はまつげきわで視神経乳頭の１ｍｍ以内まで延びる４または５番の放射能切開術により扁平化された。標本化された網膜の同時性赤色及び緑色蛍光デジタルイメージキャップチャーは１ＯＸまたは２ＯＸ対物レンズを使用してＺｅｉｓｓ共焦点レーザー顕微鏡からなった。ｚ−区画深さは２μｍで一定に保持し、神経網膜の厚さを通過して全体網膜血管系（表面、中間部及び深い血管プレキシを含む）をスキャニングし、蛍光チャンネル当り典型的に２５−３５個のｚ−区画イメージが発生する。イメージキャップチャーは、網膜の中間部周辺の任意的位置でなされたが、このモデルで大部分の血管損傷が典型的に観察される所がこの領域であるためである。３次元ｚ−スタックは、３個の血管プレキシが単一２次元平面に見られるようにＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ  １．３７ｃ，Ｗａｙｎｅ  Ｒａｓｂａｎｄ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，ＵＳＡ，http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html）を使用して扁平化させた。
【０３２３】
右側眼球がＩ／Ｒ損傷処理されたマウスの２番目群（ｎ＝６）は約２×１０５  ＰＫＨ−６７標識化されたｈＥＳ−ＢＣまたは血管幹細胞を左側ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌｓｉｎｕｓ注射で１００μｌ投与された。マウスは、損傷後２日目及び７日目（各ｎ＝３）安楽死させ、左心室穴を通じて４％緩衝されたパラホルムアルデヒドで３−５ｍｌ  ＴＲＩＴＣ−接合されたデキストリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，５ｍｇ／ｍｌ）で潅流した。次いで、眼球を除去し、切開し、前述したような共焦点顕微鏡によるデジタルイメージキャップチャーのために網膜を扁平に標本化した。反対側（非損傷）眼球は、対照群として作用した。このような潅流固定方法は、機能性血管のみを潅流できるために、開いた血管の視覚化を許容する。
実施例６：糖尿病モデルの生体内の復旧
生体内の復旧は、３ヵ月超過の第２類型糖尿病がある自発的に糖尿病性肥満であるＢＢＺＤＲ／Ｗｏｒラットで研究した。このラットは、無細胞毛細管及び内皮機能異常、外膜細胞損失及び血液網膜障害破壊を含む予備増殖性糖尿病網膜病症の多数の特徴を発生させる（文献［Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９８  Ｂｌｏｏｄ（９２）：３６２−３６７；Ａｓａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．１９９７  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２７５）：９６４−９６７；Ｋａｌｋａ  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．（８６）：１１９８−１２０２；Ｍｕｒｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１０５）：１５２７−１５３６；Ｕｒｂｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．（１４）：３１８−３２２］参照）。
【０３２４】
３ヵ月以上糖尿病が持続されたオスの肥満である第２類型糖尿病性ＢＢＺＤＲ／Ｗｏｒラット（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｍｏｄｅｌｓ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）、やせた年齢一致対照群及び性一致対照群を使用して損傷された毛細管の再内皮化に参与するＢＣの能力を調べた。ラットは、細胞を投与する１日前から研究期間の間、続けてシクロスポリンを筋肉内注射（２ｍｇ／Ｋｇ／日）を行うことによって免疫抑制した。ｈＥＳ−ＥＢｃを遠心分離でペレット化し、３×１０４／μｌの濃度で無菌性食塩水で再懸濁させ、５μｌのこの懸濁液をそれぞれ６個の糖尿病性及び対照群ラットの各眼球内に注射した。ｈＥＳ−ＢＣ投与後の２日目（ｎ＝３糖尿病性、ｎ＝３対照群）及び７日目（ｎ＝３糖尿病性、ｎ＝３対照群）に動物を安楽死させた。各処理群から６個の眼球のうち４個を処理し、網膜扁平標本は、血管を視覚化するためにロダミン共役のＲ．コミュニスを利用し、マウスＩ／Ｒ研究で記述されているように製造した。ラット網膜は、さらに単一クローン抗−ＧＦＰ（ＣｈｅｍｉｃｏｎＴＭ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ；ＰＢＳ中で１：２５０）と反応した後、ＦＩＴＣ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＡｂｅａｍＴＭ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；ＰＢＳ中で１：２００）と反応し、ＧＦＰ−発現ＢＣを視覚化した。マウスＩ／Ｒ研究で述べたような高焦点顕微鏡でデジタルイメージキャプチャを遂行した。
【０３２５】
各処理群からの残り２個の眼球を固定し、２．５Ｍスクロースで脱水した後、冷凍切断のためにＯＣＴ培地に挿入した。５０個以上の切片（１０μｍ厚、１０番目ごとに切片を維持する）を収集し、モノクローンラット抗ＣＤ３１（ＡｂｅａｍＴＭ、ＰＢＳ中で１：１００）、ウサギ抗ヒトｖＷＦ（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＴＭ、ＰＢＳ中で１：２００）及び１：５０ビオチニル化抗ヒト核抗原と反応させた後、ＦＩＴＣ共役抗ラットＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＰＢＳ中で１：３２０）及びＡＭＣＡ共役ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＴＭ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＶＴ、ＰＢＳ中で１：７５）及び最後にテキサスレッド共役ストレプタビジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＰＢＳ中で１：５００）と反応させた（培養間に適切な洗浄が行われている）。その後、切片をＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  ａｎｔｉｆａｄｅ培地（Ｖｅｃｔｏｒ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＴＭ）で標本化し、スポットＣＣＤカメラと連結されたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ  ２蛍光顕微鏡でデジタルイメージをキャプチャした。
【０３２６】
Ｉ／Ｒマウスモデルと同じように、ガラス体内投与されたｈＥＳ−ＢＣ細胞（血管幹細胞）が広い脈管構造及び狭い脈管構造（図２１ａ及び２１ｂ）いずれも有する領域内に広範囲に統合された。図２０ｂはまた、ほぼいずれも緑色であり、非常に急激に狭くなる大血管（図２１ｂの右側上の薄灰色血管）を示す。かような「ピンチオフ」血管は予備増殖性糖尿病網膜病症の特徴であり、このとき、微小血栓症（ｍｉｃｒｏｔｈｒｏｍｂｉ）は、血管変性及び下流虚血を起こす。かようなピンチされた広い血管からの広範囲に分枝化され、連続される牛血管は、緑色ＢＣ細胞の高度の統合を示す（図２１で薄灰色で図示する）。対照的に、緑色ｈＥＳ−ＢＣ細胞は、非糖尿病性対照群動物からの眼球内の残留血管と同時位置していない。非糖尿病性対照群動物からの眼球は、ＢＣ細胞が非損傷の脈管構造内に統合されるのではなく、ｈＥＳ−ＢＣ細胞のガラス体内投与後に、網膜の端にシートとして残っているということを確認させた（図２１ｃ、薄灰色領域）。
【０３２７】
免疫組織化学的分析によって、ガラス体と神経網膜とを分離する内部境界膜直後部の、糖尿病性ラット網膜の神経節細胞層内細胞ライニング血管ルーメン内のヒト核抗原及びＣＤ３１を利用する同時局所化染色（ｃｏｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）を確認した（図２１ｅ及び２１ｆ）。この解剖学的位置は、外見上の網膜血管叢の位置であり、糖尿病で血管病理学の典型的な位置である。かような正確な局所化及び強力な統合によって、血管幹細胞が糖尿病性網膜症に関連した血管の修復に参与することを明白に確認した。ほとんどの切片は、周辺が内皮（ＣＤ３１）及びヒト核抗原マーカいずれに対しても染色される細胞でライニングされた明確に可視的なルーメンを有した血管を示した一方（図２１ｅ及び２１ｆの矢印）、ＢＣ細胞も注入した非糖尿病性対照群ラット眼球内血管幹細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）の細胞統合の証拠は確認されなかった（図２１ｄ、矢印）。
実施例７：ミューリン後肢虚血モデルでの生体内修復
また、ミューリン後肢虚血モデルを介して血管内皮細胞を生成できるＢＣ細胞の能力を調べた。実験は８週齢ないし１２週齢（２０〜３０ｇ）ＮＯＤ−ＳＣＩＤ  β２マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を利用して遂行した。右側後肢の虚血は大腿動脈連結術を利用して誘導し、血管幹細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）（６ｘ１０５  ｈＥＳ−ＢＣ細胞）または無細胞培地を、前記連結術手術直後に虚血性筋肉周辺部位に注入した。
【０３２８】
注入した血管幹細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）の生理的な機能を立証するために、右側虚血性後肢血行を４週間モニタリングし、左側の正常後肢の血行と比較した。免疫蛍光技法を利用してヒト特異的ｖＷＦ（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  ｓｙｓｔｍｅＴＭ、ＭＮ）を検出し、移植された血管幹細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）由来の血管内皮細胞を確認した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４と接合された第２抗体を使用した。血行分析のために、レーザドップラ血液イメージング技法を使用し、大腿動脈連結以前（０日）及び以後（３日から３０日）でのマウスの血行を分析し、血行速度は、非虚血性足での血行に対する虚血性足での血行の割合で計算した。
【０３２９】
図２２ｆ及び図２２ｇで確認しうるように、血管幹細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）は、培地対照群に比べて虚血性足での血行速度の回復に有意的に増強させた（ｐ＜０．０００１）。かような改善は、正常血行速度が得られるまで４週間持続された。
【０３３０】
虚血性筋肉内にｈＥＳ−母細胞コロニー細胞を注入してから４週目に動物を犠牲にし、ヒト特異的ｖＷＦに対して免疫染色した。筋肉内部位は、ヒト特異的ｖＷＦ細胞の陽性染色を保有すると確認されたが、これは、血管組織化を示すものである（図２２ｄ−ｅ）。無細胞培地が注入された梗塞された筋肉から取った対照群組織は、ヒトｖＷＦ染色を表さなかった（図２２ｃ）。
実施例８：ミューリン心筋梗塞モデルでの生体内修復
ミューリン心筋梗塞（ＭＩ）モデルを利用した一連の実験で、前述のように［参照：Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００２  Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ（９３）：１１４０−１１５１］、左側冠状動脈の連結によって、８週齢ないし１２週齢（〜２０〜３０ｇ）ＮＯＤ−ＳＣＩＤ  β２マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴＭ）で心筋梗塞を誘導した。心筋梗塞を誘導して１５分後に、Ｈ１−ＧＦＰ  ｈＥＳ細胞由来の３ｘ１０５  ＧＦＰ−血管幹細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）または無細胞培地を虚血性心筋及び虚血性心筋の周辺に移植した。実験プロトコルは、Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｍ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇガンセンターの動物保護委員会から承認された。血管幹細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）注入後３０日目に、注入された血管幹細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）の７１％（１２／１７）は生存した一方、培地対照群を注入した動物の場合、４２％（８／１９）が生存した（図２２ｈ、ｐ＜０．００２）。
【０３３１】
虚血性心筋及び虚血性心筋の周辺に血管幹細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）を注入し、４週目に動物を犠牲にし、迅速に心臓を摘出した後でＰＢＳ中て洗浄した。心臓は、組織冷凍培地（Ｆｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＴＭ、ＮＪ）内に包埋した。冷凍組織は、１０−μｍスライドに切片化した。
【０３３２】
免疫染色のために回収した梗塞された組織から再生組織部位がヒトｖＷＦに対して特異的に染色される相当数の内皮細胞を含有していることを確認した。高焦点顕微鏡で梗塞された組織内微細血管のルーメン内にヒト特異的ｖＷＦ陽性内皮細胞の混入を確認した（図２２ｉ）。これらの細胞は近接して会合しているが、まだ高度に組織化された血管組織を形成することはなかった（図２２ｂ）。対照群マウスから取った梗塞された心臓組織内で検出できるヒトｖＷＦ陽性細胞はなかった。
【０３３３】
また、移植された血管幹細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）は、心筋細胞を生成させた。移植された血管幹細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）から再生された心筋細胞を確認するために、二重免疫蛍光染色技法を使用し、Ｈ１−ＧＦＰ  ｈＥＳ細胞（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．ＴＭ、ＣＡ）由来のヒト細胞でのみ発現されるＧＦＰ及びｃＴｎＩ、心筋細胞マーカ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．ＴＭ、ＣＡ）を検出した。ＧＦＰのためにはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、またはＴｎＩのためにはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４と接合された第２抗体を使用した。イメージは、蛍光顕微鏡で撮影した。Ｎ＝３．図２３は、ＭＩマウスでＧＦＰ（最も明るく染色された部位）及びｃＴｎＩ（中間ほどに曇った部位）の免疫染色を表し、ＧＦＰ及びｃＴｎＩに対して陽性に染色された細胞は、注入されたｈＥＳ−ＢＣ細胞から由来した心筋細胞であった（図２３、倍率２００ｘ）。矢印は、注入されたｈＥＳ−ＢＣ細胞から由来した二重陽性染色細胞を示す。
【０３３４】
実施例７及び実施例８の結果から確認しうるように、血管幹細胞は、心筋梗塞後の死亡率を低下させ、虚血性後肢でほぼ正常レベルに血行を回復させた。
実施例９：血管幹細胞またはｈＥＳ−ＢＣ細胞は、試験管内で平滑筋細胞を生成させることが可能
本発明の血管幹細胞またはｈＥＳ−ＢＣ細胞はまた、平滑筋細胞に分化され、従って特定実施例で全能細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）でありうる。
【０３３５】
血管幹細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）内での遺伝子発現を調べるために、６日目に細胞を解剖顕微鏡下で注意深く取り、全体ＲＮＡを分離した。ＲＮＡｅａｓｙマイクロｋｉｔ（ＱｉａｇｅｎＴＭ）を利用し、前記ＲＮＡから単一鎖ｃＤＮＡを合成し、このとき、ＳＭＡＲＴ  ＩＩ及びＣＤＳプライマー（ＣｌｏｎｅｔｅｃｈＴＭ）とスーパースクリプトＩＩＩ逆転写酵素（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）を使用し、ｃＤＮＡプールは、ＳＭＡＲＴ  ｃＤＮＡ合成ｋｉｔ（ＣｌｏｎｅｔｅｃｈＴＭ）を利用して構成した。平滑筋遺伝子発現パターンは、ＳＭ２２、平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）、ＧＡＰＤＨ（特質対照群）及び平滑筋カルポニン（ＣＮＮ１）に対して特異的なプライマーを利用し、ＰＣＲで分析した。ヒト大動脈平滑筋細胞（ＡｏＳＭ）由来の全体ＲＮＡは、陽性対照群として使用し、マウス線維芽細胞３Ｔ３全体ＲＮＡは、陰性対照群として使用した。ＰＣＲ生成物は、１％アガロースゲル上で分離し、ＥｔＢｒ蛍光によって露出させた。
【０３３６】
図２４は、血管幹細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）が平滑筋特異性遺伝子ＣＮＮ１、α−ＳＭＡ及びＳＭ２２を発現するところを示す。
【０３３７】
本発明の血管幹細胞から平滑筋細胞を誘導するために、平滑筋培地（ＬｏｎｚａＴＭ）内のフィブロネクチンコーティングされた培養スライド（ＢＤ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＴＭ）上に精製した血管幹細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）をプレーティングし、２−９日間分化を誘導した。次に、細胞を１５分間４％パラホルムアルデヒドで固定し、１Ｘ  ＰＢＳで洗浄し、０．４％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００で透過化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅ）した。平滑筋蛋白質の発現の検出のために、透過化した細胞を４℃で一晩カルポニン（ＣＮＮ１）及びα−ＳＭＡ（Ｄａｋｏ）に対して一次抗体と共に培養した後、ロダミン標識された二次抗体を利用して蛍光顕微鏡で検査した。
【０３３８】
図２４に提示した結果は、前記条件下での試験管内分化後に、ある血管幹細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）はＣＮＮ１及びα−ＳＭＡ陽性平滑筋細胞を発生させるということを明確に立証する。
実施例１０：マウスモデル系の移植受容者での免疫寛容の誘導
本発明の方法によって生成及び増殖されたヒト血管幹細胞は、移植受容者で供与者特異的免疫寛容を誘導するのに利用できる。血管幹細胞または誘導された造血母細胞は、細胞が多数で提供されるとき、無条件受容者（ｕｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）に移植されうる。移植されてキメラ現象を発生させる血管幹細胞の能力は、マウスをヒト免疫細胞で再構成した免疫低下ＮＯＤ／ＳＣＩＤ−Ｔｇマウスモデル系でテストできる。免疫欠乏ＮＯＤ／ＳＣＩＤ−Ｔｇマウスは、全身照射（ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ）で処理し、同じ日にヒト供与者血管幹細胞を注射できる。ヒト胎児胸腺及び胎児肝断片をマウスの腎臓被膜（ｃａｐｓｕｌｅ）下部に移植し、ヒトリンパ球生成及びヒト免疫系の再構成を達成する。移植されたヒト胸腺及び肝断片は、ヒト供与者血管幹細胞に対して不一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）である。次に、第三の非一致（ｎｏｎ−ｍａｔｃｈ）移植片に係る耐性と比較し、ヒト血管幹細胞に対して一致した（ｍａｔｃｈ）移植片に対して耐性をマウスに対して検査できる。
【０３３９】
移植を最適化するために、胸腺照射の投与によって胸腺スペース（ｔｈｙｍｉｃ  ｓｐａｃｅ）を誘導できる。マウスモデルで、受容者マウスは、抗−ＣＤ４及び抗−ＣＤ８ｍＡｂのような抗−Ｔ細胞ｍＡｂを受容することができ、０日目に７  Ｇｙ胸腺照射、そして０ないし４日目にヒト血管幹細胞を受容することができる。
【０３４０】
耐性を評価するために、混合リンパ球反応及び細胞媒介リンパ球溶解研究を遂行しうる。
【０３４１】
また、ｈｕ−ＳＣＩＤマウスまたは類似のモデル系でキメラ現象を誘導する血管幹細胞の能力を検査するために、前述の方法でヒト胎児肝断片をヒト血管幹細胞に代用できる。
実施例１１：移植受容者での免疫寛容の誘導
ヒトで、耐性は、本発明の方法によって生成及び増殖または増殖された多数のヒト血管幹細胞を利用して達成できる。
【０３４２】
末梢キメラ現象は、全身照射の必要なしに多数の血管幹細胞を介して達成できる。しかし、中枢欠損性（ｃｅｎｔｒａｌ  ｄｅｌｅｔｉｏｎａｌ）耐性を達成するためには、高いレベルの胸腺内のキメラ現象を発達させるために、胸腺にスペース（ｓｐａｃｅ）を生成することが最適でありうる。胸腺内のスペースは、特異的照射によってまたは抗−Ｔ細胞抗体の多数の投与の利用によって、または胸腺を枯渇させる薬物によって達成できる。
【０３４３】
移植された臓器、組織または細胞が患者で生存する時間（移植片生存）を延長させるために、そして移植手続きで要求される免疫抑制のレベルを低下させるために、次の手続きを設計する。臓器は任意の臓器、例えば肝、腎臓、膵臓または心臓でありうる。組織は任意の類型の組織、例えば皮膚、骨、角膜、筋肉、靱帯、心臓弁膜などになりうる。細胞または細胞療法は、造血細胞（例えば、虚血治療としての肝葉幹細胞または血液障害の治療のためのその他細胞のようなもの）、糖尿病治療のためのインシュリン分泌性膵臓ベータ細胞のような膵臓細胞、黄斑変性の治療のための網膜色素上皮細胞、及び神経障害の治療のための細胞基盤療法を含むが、これらに限定されるものではない。
【０３４４】
本方法は、次の段階のうち一つ以上を含みうる：共通刺激遮断（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｂｌｏｃｋａｄｅ）または受容者Ｔ細胞の不活性化、耐性誘導細胞、例えばヒト血管幹細胞の移植、選択的に、供与者基質組織の移植またはヒトサイトカイン投与、胸腺照射の投与。十分に多くの個数の供与者ヒト血管幹細胞と胸腺照射及び／またはＴ細胞共通刺激遮断の組合わせは、全身照射の必要性を顕著に減少または除去する。本方法は、これら段階のうち任意のもの、または全部を含むことができ、段階は、次の順序で遂行しうる。
【０３４５】
まず、ウマの抗ヒト胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）またはその他枯渇性抗Ｔ細胞枯渇剤の調製物を受容者に静脈注射する。この抗体調製物は、成熟したＴ細胞を除去する。もし除去されなければ、成熟したＴ細胞は、ヒト血管幹細胞またはこれから誘導される造血母細胞、そして敏感化後には移植片自体の双方いずれの拒否も促進できる。ＡＴＧ調製物は、自然殺傷（ＮＫ）細胞をさらに除去する。ＮＫ細胞は、移植された臓器には恐らく効果を示さないが、新しく導入されたヒト血管幹細胞を拒否するように即刻作用できる。
【０３４６】
受容者Ｔ細胞が移植後に再生する時間の間、受容者胸腺内の供与者抗原の存在は、受容者Ｔ細胞を耐性化するのに重要である。もし受容者Ｔ細胞が再生する前に供与者ヒト血管幹細胞が受容者胸腺で確立されて耐性を誘導できなければ、非骨髄除去性（ｎｏｎ−ｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ）治療法全体を介して、抗受容者Ｔ細胞抗体の反復された投与量が必要でありうる。受容者Ｔ細胞の連続的枯渇が数週間要求できる。
【０３４７】
非骨髄形成過程での第二段階は、特定成長因子またはサイトカインを提供し、ヒト供与者の血管幹細胞または幹細胞の接種（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）を促進するためのものでありうる。
【０３４８】
その後、供与者のヒト血管幹細胞（または供与者と一致するもの）は受容者に注射できる。供与細胞は、受容者の適切なところに位置を占め、受容者の残りの細胞と隣接して成長して増殖し、キメラリンパ造血器系母集団を形成する。かような過程によって、新しく形成されたＢ細胞（及びこれらが生成する抗体）が供与者抗原に露出され、前記移植が自家移植として認識されるのである。
【０３４９】
ヒト血管幹細胞または由来した造血母細胞接種が達成される受容者のＴ細胞レベルで供与者に対する耐性も観察される。一致した臓器移植が造血器系または骨髄キメラ現象が起きた後で何ヵ月が過ぎた受容者で起こる場合に、移植が免疫システムの体液性及び細胞性アーム（ａｒｍ）双方いずれでも受容されねばならない。かような接近は、受容者の患者の正常健康及び免疫力が臓器移植時点には回復されうるように、ヒト供与者血管幹細胞の移植後に十分に長い間の後にも、臓器移植の遂行を可能にするというさらなる利点を有する。
【０３５０】
造血空間を生成する多くの方法が全身照射（ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ）を使用して接種を促進させる。照射の必要性は、多数の供与者血管幹細胞を投与することによって実質的に減少されたり除去できる。供与者ヒト血管幹細胞の投与は、例えば、胸腺空間を誘導する胸腺照射またはＴ細胞共同刺激遮断と同じ処置と共になされうる。
【０３５１】
最後に、Ｔ細胞、特に胸腺またはリンパ節Ｔ細胞は、受容者に短期間の間免疫抑制剤、例えば、サイクロスポリンまたはその他製剤を投与することによってさらに抑制できる。
耐性を測定するために、混合リンパ球反応及び細胞媒介リンパ球溶解研究が受容者でなされうる。
【０３５２】
かような過程のうちいかなるものでも移植された臓器、組織または細胞の生存を助けることができるが、最上の結果は、前記段階の一部または全部が組合わせとして使われる場合に得られる。
実施例１２：ヒトＲＢＣ輸血
本発明の方法によって製造された赤血球（ＲＢＣ）の生存力及び機能性を確認するために、ヒトＲＢＣを使用した輸血がＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスで遂行される。マウスは、輸血１週間前にネンブタル麻酔下で脾臓摘出される。受容者は輸血直前に出血させ、ヘマトクリット２５％を滴下する。出血後１時間以内に、受容者は、０．５ｍＬ  ＰＢＳ内の６ｘ１０９ヒトＲＢＶを静脈注射を介して輸血される。初期に輸血される細胞は、蛍光モニタリングの目的のためにカルボキシフルオレサインジアセテート（ＣＦＳＥ）で標識される。輸血は２日目に、そしてその後４日ごとに反復される。輸血後１日目、そしてその後４週間の間４日ごとにヘパリン処理された毛細管にテールニック（ｔａｉｌ  ｎｉｃｋ）から２０μｌの血液を収集して受容者マウスをモニタリングする。ＲＢＣ及びヒトＲＢＣのパーセントは、顕微鏡検査及びＦＩＴＣ−抗−Ｆｙ６抗体を使用する遊細胞分析器によって測定される。移植された細胞の半減期が測定される。ヘモグロビンＦの発現を測定してＲＢＣの酸素輸送能を検証する。ＲＢＣがヘモグロビンＦを発現し、一般的に由来したＲＢＣと比べられる半減期を有することが期待される。従って、ＲＢＣが機能性であることが期待される。
【０３５３】
本明細書は、良好に定義され、かつ再現可能な条件下で血管幹細胞、またはヒトＥＳ−ＢＣ細胞が確実に由来して増殖されることを証明し、本来の機能を発揮できない血管構造を有する患者のための限りない細胞源を示す。かような細胞の濃度は利用率で限定されず、むしろ個別的な正確な臨床要求に合わせることができる。医師が必要であるとと判断する場合、患者の全生涯にわたって同じ細胞集団が反復的に注入されることも可能なことである。また、一致するまたは減少された複雑性のＨＬＡ  ｈＥＳラインの銀行を作りだす能力は、免疫抑制薬物及び／または免疫調節プロトコルいずれの必要性をも潜在的に減少させたり除去できる。
【０３５４】
本明細書はまた、胚芽幹細胞から由来した血管幹細胞が四種の互いに異なる動物モデルで血管復旧を達成するのに使われうることを初めて証明する。新たな血管の形成は早くて活発であり、ｈＥＳ由来血管幹細胞が生体内で活発な復旧潜在力を有するということを示す。かような結果はまた、血管性疾病を有する患者で、血管化及び機能を回復するのに血管幹細胞が使われうることを示す。従って、血管幹細胞のような内皮前駆体細胞の入養転移（ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）は、血管フローを回復させて毛細管密度を向上させ、四肢損失を減少させ、心筋損傷からの回復を促進するのに有用でありうる。
【０３５５】
本明細書はまた、輸血に使用するための分化された細胞種類を生成する方法を提供する。例えば、本明細書は輸血で使用するための赤血球を生成する方法を提供する。特定実施例で、赤血球はヘモグロビンＦを発現する。
【０３５６】
あらゆる実験は、目及び視覚研究に動物を使用するためのＡＲＶＯ規定の教義及びフロリダ大学の動物管理及び使用委員会が許可したプロトコルによって遂行される。
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【図面の簡単な説明】
【０３５７】
【図１】Ｈ１−ＧＦＰ  ＥＳ細胞から生成された血管芽細胞から誘導された造血ＣＦＵを例示した図面である。
【図２】無血清（Ｓｔｅｍｌｉｎｅ）培養培地中に培養された赤血球系（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ）コロニー形成ユニット（ＣＦＵ−Ｅ）の細胞形態を例示した図面である。
【図３】無血清（Ｓｔｅｍｌｉｎｅ）培養培地中に培養された多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）コロニー形成ユニット（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ／Ｍｉｘ）の細胞形態を例示した図面である。
【図４】無血清（Ｓｔｅｍｌｉｎｅ）培養培地中に培養された多能性コロニー形成ユニット（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ／Ｍｉｘ）の細胞形態を例示した図面である。
【図５】無血清（Ｓｔｅｍｌｉｎｅ）培養培地中に培養された顆粒球コロニー形成ユニット（ＣＦＵ−Ｇ）及び大食細胞コロニー形成ユニット（ＣＦＵ−Ｍ）の細胞形態を例示した図面である。
【図６】無血清（Ｓｔｅｍｌｉｎｅ）培養培地中に培養された顆粒球／大食細胞コロニー形成ユニット（ＣＦＵ−ＧＭ）及び巨核球大食細胞コロニー形成ユニット（ＣＦＵ−Ｍｋ）の細胞形態を例示した図面である。
【図７】マトリゲル系（Ｍａｔｒｉｇｅｌ−ｂａｓｅｄ）培地上で（ａ）Ｈ９  ＥＳ細胞及び（ｂ）ＡＣＴ３０  ＥＳ細胞から誘導された血管芽細胞の再プレートを行った後、チューブコード（ｔｕｂｅ−ｃｏｒｄ）構造の形成を例示した図面である。
【図８】実施例２に説明されているように、ＥＧＭ−２培地中でフィブロネクチン−コーティングされたプレート上に、次いでマトリゲル上に培養されたＨ１−ＧＦＰ  ＥＳ細胞から生成された血管芽細胞のチューブコード構造を例示した図面である。また図８は、実施例２に説明されているように、アレキサフルアー（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）標識化されたＡｃ−ＬＤＬにより恒温処理される時、細胞によるＡｃ−ＬＤＬの吸収を例示した図面である。中間パネル上部及び右側パネル上部は、位相差写真（ｐｈａｓｅ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｐｉｃｔｕｒｅ）を表す。
【図９】実施例２に説明されているように、ＥＧＭ−２培地中でフィブロネクチン−コーティングされたプレート上に培養されたＨ１−ＧＦＰ  ＥＳ細胞から生成された血管芽細胞でフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）の発現（薄い灰色染色）を例示した図面である。
【図１０】実施例４に説明されているように、ＳＣＩＤマウス内に注入されたヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色されたマトリゲルプラグの断面内血管の形成を例示した図面である。
【図１１】実施例４に説明されているように、ヒト特異的核抗体に対する陽性染色（薄い灰色染色）により示されたような、マトリゲルプラグの断面から得た血管がヒト血管芽細胞から誘導された細胞である点を例示した図面である。
【図１２】ヒトＨＯＸＢ４のｍＲＮＡ配列（受託番号：ＮＭ−０２４０１５．４；ＧＩ：８５３７６１８７）（配列番号：２）を例示した図面である。
【図１３】ヒトＨＯＸＢ４のアミノ酸配列（受託番号：ＮＰ−０７６９２０．１；ＧＩ：１３２７３３１５）（配列番号：１）を例示した図面である。
【図１４】ヒトＨＯＸＢ４のｍＲＮＡ配列（受託番号：ＢＣ０４９２０４．１；ＧＩ：２９３５１５６７）（配列番号：４）を例示した図面である。
【図１５】ヒトＨＯＸＢ４のアミノ酸配列（受託番号：ＡＡＨ４９２０４．１；ＧＩ：２９３５１５６８）（配列番号：３）を例示した図面である。
【図１６】実施例１及び実施例２に説明されているように、ヒトＥＳ細胞から誘導された血管芽細胞（ＢＬ−ＣＦＣ）の表現型特性化を例示した図面である：（ａ）血管芽細胞コロニーまたは芽細胞コロニー（ＢＬ−ＣＦＣまたはＢＣ、×４００）；（ｂ）二次的ＥＢ（×４００）；（ｃ）ライト・ギムザ（Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ）染色による芽細胞（ｈＥＳ−ＢＣ細胞）（×１０００）；（ｄ−ｆ）ＧＡＴＡ−１染色：（ｄ）ＧＡＴＡ−１で染色された芽細胞（×６００）；（ｅ）ＧＡＴＡ−１及びＤＡＰＩで染色された芽細胞（×６００）；（ｆ）ＧＡＴＡ−１及びＤＡＰＩで染色されたＢＭ細胞（×４００）；（ｇ−ｉ）ＬＭＯ２染色：（ｇ）ＬＭ０２で染色された芽細胞（×６００）；（ｈ）ＬＭＯ２及びＤＡＰＩで染色された芽細胞（×６００）；（ｉ）ＬＭＯ２及びＤＡＰＩで染色されたＫ５６２細胞（×１０００）；（ｊ−ｍ）ＣＤ７１染色（明るい灰色または薄い灰色）：（ｊ）ＣＤ７１で染色された芽細胞（×６００）；（ｋ）ＣＤ７１及びＤＡＰＩで染色された芽細胞（×６００）；（ｍ）ＣＤ７１及びＤＡＰＩで染色されたＢＭ細胞（×１０００）；（ｎ−ｐ）ＣＸＣＲ−４染色（明るい灰色または薄い灰色）：（ｎ）ＣＸＣＲ−４で染色された芽細胞（×６００）；（ｏ）ＣＸＣＲ−４及びＤＡＰＩで染色された芽細胞（×６００）；（ｐ）ＣＸＣＲ−４及びＤＡＰＩで染色されたＢＭ細胞（×６００）；（ｑ−ｓ）Ｅｐｏ−受容体染色（中間灰色）：（ｑ）Ｅｐｏ−受容体で染色された芽細胞（×６００）；（ｒ）Ｅｐｏ−受容体及びＤＡＰＩで染色された芽細胞（×６００）；（ｓ）Ｅｐｏ−受容体及びＤＡＰＩで染色されたＢＭ細胞（×６００）；（ｔ−ｖ）Ｔｐｏ−受容体染色（中間灰色）：（ｔ）Ｔｐｏ−受容体で染色された芽細胞（×６００）；（ｕ）Ｔｐｏ−受容体及びＤＡＰＩで染色された芽細胞（×６００）；（ｖ）Ｔｐｏ−受容体及びＤＡＰＩで染色されたＢＭ細胞（×１０００）。留意：パネル（ｄ）及び（ｎ）で、ｈＥＳ−ＢＣ（血管芽細胞）細胞は、ＧＡＴＡ−１及びＣＸＣＲ−４抗体で二重染色したが、個別的に表示し；パネル（ｑ）及び（ｔ）でｈＥＳ−ＢＣ（血管芽細胞）細胞は、Ｅｐｏ−受容体抗体及びＴｐｏ−受容体抗体でさらに二重染色し、個別的に表示した。
【図１７】試験管内ヒトＥＳ細胞から誘導された血管芽細胞（ＢＬ−ＣＦＣまたは芽細胞）の機能性特性化を例示した図面である：（ａ−ｄ）精製された血管芽細胞から誘導された造血ＣＦＵ）：（ａ）ＣＦＵ−赤血球系（×１００）；（ｂ）ＣＦＵ−顆粒球（×１００）；（ｃ）ＣＦＵ−大食細胞（×１００）；及び（ｄ）ＣＦＵ−多系統（ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ）（混合物、×１００）；（ｅ−ｈ）ＣＦＵ−細胞のライト・ギムザ染色：（ｅ）赤血球系（×１０００）；（ｆ）顆粒球（×１０００）；（ｇ）大食細胞（×４００）；及び（ｈ）混合物（×１０００）；（ｉ−ｋ）ＣＦＵ細胞の免疫染色：（ｉ）ＣＤ２３５ａで染色されたＣＦＵ−赤血球系細胞（矢印、×１０００）；（ｊ）ＣＤ１３で染色されたＣＦＵ−顆粒球細胞（矢印、×１０００）；（ｋ）ＣＤ４５で染色されたＣＦＵ−混成物細胞（矢印、×１０００）；（ｍ−ｐ及びｖ−ｙ）プーリングされたＣＦＵ細胞のＦＡＣＳ分析：（ｍ）マウスＩｇＧイソタイプ対照群；（ｎ）ＣＤ４５；（ｏ）ＣＤ１３；及び（ｐ）ＣＤ２３５；（ｖ）マウスＩｇＧイソタイプ対照群；（ｗ）ＣＤ４５及びＣＤ２３５ａ；（ｘ）ＣＤ１３及びＣＤ４５；及び（ｙ）ＣＤ１３及びＣＤ２３５ａ；（ｑ−ｕ及びｚ−ｃｃ）精製された血管芽細胞、または芽細胞またはｈＥＳ−ＢＣ細胞から誘導された内皮細胞：（ｑ）血管芽細胞から誘導された付着性細胞をプレートした後、マトリゲル上に形成された毛細管類似構造（×１００）；（ｒ）血管芽細胞から誘導された内皮細胞によるＡｃ−ＬＤＬ吸収（灰色）（×２００）；（ｓ）核がＤＡＰＩで染色されている血管芽細胞−誘導された内皮細胞でｖＷＦの発現（矢印）（×６００）；（ｔ）核（図面内円形フィーチャー）がＤＡＰＩで染色されている血管芽細胞−誘導された内皮細胞でＰＥＣ  ＡＭＩ（明るい染色）の偏在化（×２００）；（ｕ）核（図面内円形フィーチャー）がＤＡＰＩにより染色されている血管芽細胞−誘導された内皮細胞でＶＥ−カドヘリンの偏在化（矢印）（×２００）；（ｚ）Ａｃ−ＬＤＬアップデート（矢印ヘッド部）及びｖＷＦ発現（矢印、×６００）；（ａａ）Ａｃ−ＬＤＬのアップデート（矢印ヘッド部）及びＶＥ−カドヘリンの発現（矢印ヘッド部、×６００）；（ｂｂ）ｖＷＦの発現（矢印）及びＣＤ３１の発現（矢印ヘッド部、×６００）；（ｃｃ）ＶＥ−カドヘリンの発現（矢印）及びＣＤ３１の発現（矢印ヘッド部、×６００）。実施例２を参照。
【図１８】ｈＥＳ細胞から誘導された芽細胞コロニーのクロン形成性（ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を例示した図面である：（ａ−ｃ）芽細胞コロニーのクロン形成性：（ａ）及び（ｂ）芽細胞コロニーのクロン起源を立証した、ＷＡ０１−ＧＦＰとＭＡＯ１  ＥＢとの混合物で発育された２種の芽細胞コロニー：（ａ）相イメージ（×１００）；（ｂ）ＧＦＰイメージ（×１００）；（ｃ）単一細胞から発育された芽細胞コロニー（×４００）；（ｄ−ｅ）造血系統及び内皮系統の両者が観察される（×２００）、液体培養物で単一芽細胞コロニーの増殖：（ｄ）×２００；（ｅ）×４００；（ｆ−ｈ）単一ＢＣから誘導された内皮細胞：（ｆ）単一ＢＣから誘導された付着性細胞をプレートした後、マトリゲル上に形成された毛細管類似構造（×１００）；（ｇ）核がＤＡＰＩで染色されている、単一ＢＣから誘導された内皮細胞によるＡｃ−ＬＤＬ吸収（矢印）（×４００）；（ｈ）核がＤＡＰＩで染色されている、単一ＢＣ−誘導された内皮細胞でｖＷＦの発現（矢印）（×４００）；（ｉ−ｍ）単一ＢＣから誘導された造血ＣＦＵ：（ｉ）ＣＦＵ−赤血球系（×１００）；（ｊ）ＣＦＵ−顆粒球（×１００）；（ｋ）ＣＦＵ−大食細胞（×１００）；及び（ｍ）ＣＦＵ−多系統（混合物、×１００）。ゲルはＷＡ０１−ＧＦＰ＋細胞とＭＡ０１−ＧＦＰ−細胞とのプレート混合物から誘導されたＧＦＰ＋及びＧＦＰ−ｈＥＳ−ＢＣ（血管芽細胞）でＧＦＰ配列のＰＣＲ分析の結果を表す。レーン：ＷＡ０１−ＧＦＰ＋、母体ＷＡ０１／ＧＦＰ＋ｈＥＳ細胞；ＭＡ０１−ＧＦＰ−、母体ＭＡ０１ｈＥＳ細胞；Ｈ２０、水陰性対照群；ＢＣ−ＧＦＰ＋、細胞混合プレートから吸収されたＧＦＰ陽性ＢＣ；１−１０、細胞−混合プレートから吸収されたＧＦＰ陰性ＢＣ．ミオゲニン遺伝子はＰＣＲ反応対照群として使用した。実施例２を参照。
【図１９】ｔＰＴＤ−ＨＯＸＢ４融合蛋白質の特徴を提供する。（Ａ）６ｘＨｉｓ−融合されたｔＰＴＤ−ＨＯＸＢ４組み換え型蛋白質をＥ．ｃｏｌｉで発現させ、ニッケルプロバンド（ＰｒｏＢａｎｄ）樹脂を通じて精製した。脱塩化されたｔＰＴＤ−ＨＯＸＢ４蛋白質の二バッチ（（１）及び（２）で表示）に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを通じてその純度及び濃度を確認した。（Ｂ）ｔＰＴＤ−ＨＯＸＢ４蛋白質は５％ＦＢＳを含む培地中では不安定であったが、（Ｃ）生存ＥＳ細胞を含む無血清培地中では無欠状態を保持した（Ｎ＝幹細胞ＩＩ培地単独；ｈ＝時間）。
【図２０】ｈＥＳ−誘導された血管幹細胞を全身注入した後、虚血性網膜血管構造が剛健に復旧されることを示す図面である。網膜虚血症は、マウス眼球の前室に対して静水圧を２時間ほど加えて誘導した。７日後、蛍光標識された（ＧＦＰ＋）血管幹細胞をガラス体内、または静脈内に注入した。１日後、この動物を安楽死させた。眼球を摘出して切開し、網膜を扁平に固定させ、レーザー走査共焦点顕微鏡を通じて映像化するか、映像化のために切片化した。（ａ）背景に緑色蛍光発光のない典型的な網膜の血管解剖図を示す代表的な対照群（未損傷）眼球の併合図であり、個別ＧＦＰ＋（下部挿入部）及びＧＦＰ−（上部挿入部）チャンネルをさらに確認でき；（ｂ）虚血性血管構造で導入された蛍光標識された（ＧＦＰ＋）血管幹細胞−誘導された細胞（血管構造の明るい部分）を示す、同一動物の処理された眼球の併合図であり、実施例５に記述したように、個別緑色（ＧＦＰ＋血管幹細胞、下部挿入部）及び未標識細胞（上部挿入部）も見られる；（ｃ）未損傷対照群（ＧＦＰ蛍光発光無し（明るいか、薄い灰色））の併合図である、（ｄ）及び（ｅ）は全身血管幹細胞投与以後２日（ｄ）及び７日（ｅ）の虚血性眼球の併合図である（ＧＦＰ＋細胞は明るいか、薄い灰色に見える）。（ｆ、Ｘ６００、共焦点）、蛍光免疫細胞化学でＩ／Ｒ損傷を受けたマウス眼球の横断面で存在する損傷された血管構造に対して血管幹細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）−誘導された内皮細胞を共存させた；内境界膜に隣接した神経節細胞層内血管内腔の高配率拡大図では、周辺に内皮細胞（矢印、ＣＤ３１）及び血管幹細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）から誘導された成熟した内皮細胞（矢印、ヒト核抗原）で取り囲まれた内腔が見られる。挿入上部及び中間パネルは、複合映像を作るために使われた個別ヒト核抗原及びＣＤ３１チャンネルである。下部パネルは、前記のような領域の低倍率拡大図であって、ボックスはあらゆるパネルに表した部分を示す。Ｖ＝ガラス体；ＩＰＬ＝内部網状層；ＲＰＥ＝網膜色素上皮細胞層；Ｃｈ＝脈絡膜。実施例５を参照。
【図２１】糖尿病性ラットの網膜血管構造に血管幹細胞、または未分化細胞またはｈＥＳ−ＢＣ細胞が導入されたことを示す図面である。（ａ）及び（ｂ）は、ガラス体内の血管幹細胞投与後、約２日の糖尿病性ラットの網膜血管構造の併合映像であって、ここでは、大型血管及び小型血管の両方ともに大量で血管幹細胞が導入されたことを示す（明るいか、薄い灰色部分）と、（ｃ）血管幹細胞の投与後、約２日の対照群（非糖尿病性）ラットの併合図であり、血管幹細胞（または血管幹細胞−誘導された細胞）が血管構造で導入されず、網膜の上部上に位置するシートを形成すると現れた（軟らかい灰色層）。（ｄ、Ｘ１００）、ガラス体内の未分化細胞注入後、約２日の非糖尿病性対照群ラット由来切片は、ヒト核抗原染色に対しては陰性であったが、内皮に対しては明らかに陽性であった（ＣＤ３１、矢印）。（ｅ、Ｘ１００）及び（ｆ、Ｘ６００、共焦点）はガラス体内の血管幹細胞の注入後、約２日の糖尿病性ラット由来のラット眼球切片であって、ＣＤ３１及びヒト核抗原抗体で染色したが、ガラス体と神経網膜とを分離する内境界膜に対して直ちに背面に存在する網膜の神経節細胞層内の血管内腔の内層細胞にＣＤ３１及びヒト核抗原が共存染色されたことを確かに見ることができる（明るい部分を示す矢印）。実施例６を参照。
【図２２】血管幹細胞注入後、虚血性後ろ足筋肉及び梗塞された心臓での内皮分化を示す図面である。ａ、ｂ、ｈ及びｉ：梗塞された心臓で血管幹細胞またはｈＥＳ−ＢＣ細胞の分化．（ａ（２００Ｘ））、ヒト特異的ｖＷＦ抗体で免疫染色した対照群マウス由来の梗塞心筋切片であって、ヒトｖＷＦで染色されなかったと現れ、（ｂ、２００Ｘ）及び（ｉ、Ｘ６００共焦点）、ヒト特異的ｖＷＦ抗体で免疫染色した、血管幹細胞の注入後、４週経過した梗塞心筋切片である（（ｂ）及び（ｉ）で薄い灰色または明るい部分）と、（ｈ）シャム手術、培地対照群及び血管幹細胞を処理したマウスの生存曲線である。ｃ−ｇ：虚血性後ろ足筋肉で血管幹細胞の分化。（ｃ、５０Ｘ）、ヒト特異的ｖＷＦ抗体で免疫染色した対照群マウス由来の後ろ足筋肉切片であって、ヒトｖＷＦで染色されなかったと現れ、（ｄ、５０ｘ）及び（ｅ、６００Ｘ、共焦点）、ヒト特異的ｖＷＦ抗体で免疫染色した、血管幹細胞注入後、４週ごろの虚血性後ろ足筋肉切片である（薄い灰色）；（ｆ）手術的に誘導させた虚血性脚に対する血流復元を示す図面である。後ろ足血流は、６×１０５血管幹細胞を与えられたマウス及び培地のみを受けたマウスで結紮後、ないし３０日間連続してモニターリングした。血流は、非虚血性脚に対する虚血性脚での流速として算出し、（ｇ）レーザードップラー血流映像。対照群（培地）及びＢＣ細胞を注入した虚血性動物（各群に対して、ｎ＝６）の映像である。実施例７及び８を参照。
【図２３】心筋梗塞（ＭＩ）マウス由来の心臓組織切片に対するＧＦＰ（最も薄いか、明るい部分）及びｃＴｎＩ（中間灰色）の免疫染色を示す図面である。実施例８を参照。矢印は、注入された血管幹細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）から誘導された二重陽性染色細胞を示す。
【図２４】平滑筋で血管幹細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）が分化したことを表す図面である。血管幹細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）で単離したＲＮＡのＰＣＲを通じて確認時、血管幹細胞は平滑筋特異的遺伝子を発現した。血管幹細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）はまた、試験管内でも平滑筋細胞に分化した。カルポニン及びα−ＳＭＡに対する免疫染色によれば、分化された細胞はこれら２つの平滑筋細胞マーカーを発現すると現れた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７ａ−ｕ】
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【図１７ｖ−ｃｃ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０ａ−ｂ】
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【図２０ｃ−ｅ】
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【図２０ｆ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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