(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２０または配列番号３３の核酸配列を有する、ビスフェノールＡに特異的に結合できるＤＮＡアプタマー。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡアプタマーを利用したビスフェノールＡの検出方法。
【請求項３】
前記ビスフェノールＡは、水、土壌、空気、食品、廃棄物、動植物器官及び動植物組織のいずれか一つ以上から採取された試料から検出されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１に記載のＤＮＡアプタマーを含有するビスフェノールＡの検出用組成物。
【請求項５】
請求項１に記載のＤＮＡアプタマーを含有するビスフェノールＡの検出キット。
【請求項６】
請求項１に記載のＤＮＡアプタマーを含有するビスフェノールＡの検出センサー。
【請求項７】
請求項１に記載のＤＮＡアプタマーを利用したビスフェノールＡの除去方法。
【請求項８】
請求項１に記載のＤＮＡアプタマーを含有するビスフェノールＡの除去用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビスフェノールＡに特異的に結合できる核酸アプタマー及びこれを利用したビスフェノールＡの検出及び除去方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビスフェノールＡは、ポリカーボネートやエポキシ樹脂等のプラスチック製造の原料として、哺乳瓶、歯科で使うレジン、飲み物の缶のコーティング等に広く使われている。しかし、ビスフェノールＡは合成エストロゲンとして作用できる内分泌系かく乱物質（endocrine disrupter）として、これが遊離して生物体に吸収されると内分泌系の正常な機能を邪魔したり混乱させ、極微量存在する場合においても生物蓄積によって生殖機能低下、成長障害、奇形または癌等を誘発する深刻な障害を起こす環境ホルモンである。従って、自然システムでこのような化学物質の検出は、公衆の健康及び環境保護のために必須である。
【０００３】
しかし、環境産業及び食品産業における微量残留有害物質の検査、製薬産業における安全性評価等においてビスフェノールＡ等の環境ホルモンの検出が求められてきたが、微量のビスフェノールＡを検出するのに多々の困難があった。従って、このようなビスフェノールＡを効果的に検出及び除去できる新しい技術の開発が求められている。
【０００４】
一方、アプタマーとは、単鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり、高親和性でターゲット物質を特異的に認知できる小さい一本鎖オリゴ核酸をいう。アプタマーは、検出分析システムで分子を認識できるバイオセンサーの一要素として利用できるため、抗体の代替物質と認識されてきている。特に、アプタマーは抗体とは異なって毒素をはじめとする種々の有機物及び無機物の標的分子として利用され、一旦特定物質に特異的に結合するアプタマーを分離すると、自動化されたオリゴマー合成方法で低コストと一貫性を持って再生産可能であるため、経済的であった。そこで、１９９６年に初めて蛍光表示されたアプタマーを利用して標的蛋白質を測定したアプタマー基盤のバイオセンサーが開発されて以後、このようなアプタマーの長所と構造的特性を基盤として多様なアプタマーバイオセンサーが開発されており（Y.S. Kim & M.B. Kim, News & Information for Chemical Engineers, 26(6): 690, 2008）、これと共に多様な化学物質を検出できる新しいアプタマーの発掘が求められている。
【０００５】
そこで、本発明者は、ビスフェノールＡを効果的に検出して除去できるようにビスフェノールＡに特異的に結合するアプタマーを分離しようと鋭意努力した結果、ＳＥＬＥＸ（Syetematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment）工程を通して、ビスフェノールＡにのみ特異的に結合するアプタマーを選別し、選別されたアプタマーが他の類似する構造を有するビスフェノールＢを含んだ非汚染性ビスフェノールには結合することなく、ビスフェノールＡにのみ特異的に結合することを確認し、本発明の完成に至った。
【発明の要約】
【０００６】
本発明の目的は、ビスフェノールＡに特異的に結合するアプタマーを提供することである。
【０００７】
本発明の他の目的は、前記アプタマーを含有するビスフェノールＡの検出用組成物、検出キット及び検出センサーを提供することである。
【０００８】
本発明のさらに他の目的は、前記アプタマーを利用したビスフェノールＡの検出及び除去方法を提供することである。
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明は配列番号１乃至配列番号７で表される核酸配列のいずれか一つの核酸配列を含むことを特徴とするビスフェノールＡに特異的に結合できる核酸アプタマーを提供する。
【００１０】
また、本発明は、配列番号８乃至配列番号３４で表される核酸配列のいずれか一つの核酸配列と９０％以上１００％未満の相同性を有する核酸配列であることを特徴とするビスフェノールＡに特異的に結合できる核酸アプタマーを提供する。
【００１１】
また、本発明は、前記アプタマーを利用したビスフェノールＡの検出または除去方法を提供する。
【００１２】
また、本発明は、前記アプタマーを含有するビスフェノールＡの検出または除去用組成物を提供する。
【００１３】
また、本発明は、前記アプタマーを含有するビスフェノールＡの検出キット及び検出センサーを提供する。
【００１４】
また、本発明は、ビスフェノールＡの検出または除去のための、配列番号１乃至配列番号７で表される核酸配列のいずれか一つの核酸配列を含むことを特徴とするビスフェノールＡに特異的に結合できる核酸アプタマーの用途を提供する。
【００１５】
本発明の他の特徴及び具現例は、以下の詳細な説明及び添付された特許請求の範囲からより一層明白になる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明に係るビスフェノールＡに特異的に結合するアプタマーの選別過程及びビスフェノールＡの検出過程の概略図である。
【図２】リアルタイムＰＣＲ分析法によってビスフェノールＡ結合カラム及び非結合カラムに対する親和度を示したグラフ及び選別されたビスフェノールＡに特異的に結合するアプタマー（＃３及び＃１２−５）の２次構造を示す図である。
【図３】ビスフェノールＡとアプタマー＃３の結合を３次元ゾル−ゲルチップを利用して確認した結果を示した図である。
【図４】２つのビスフェノールＡアプタマー＃３及び＃１２−５を利用した３次元ゾル−ゲルチップのサンドイッチ分析結果を示した図である。
【図５】ビスフェノールＡと異なるビスフェノール類の構造式（Ａ）及び各化合物に対するビスフェノールＡアプタマー＃３の親和度を示したグラフである。
【図６】正しい位置をとった（trimmed）アプタマー（＃３−ｔｒ１、＃３−ｔｒ２、＃３−ｔｒ３及び＃３−ｔｒ４）の構造を示した図である。
【図７】正しい位置をとった（trimmed）アプタマー（＃３−ｔｒ１、＃３−ｔｒ２、＃３−ｔｒ３及び＃３−ｔｒ４）のビスフェノールＡに対する結合力を確認した結果を示したグラフである。
【発明の詳細な説明】
【００１７】
本明細書において「アプタマー」とは、高い親和性でターゲット物質を特異的に認知できる小さい一本鎖オリゴ核酸をいう。この時、前記アプタマーがＲＮＡの場合には、規定された核酸配列においてＴはＵであることを特徴とする。
【００１８】
本明細書において「試料」とは、目的の分析物を含有すると推定されて、分析が行われる組成物を意味する。
【００１９】
本明細書において「９０％以上１００％未満の相同性を有する核酸配列」とは、１乃至数個のヌクレオチドが挿入、欠失または置換されて９０％以上１００％未満の配列に共通性があるもので、類似するビスフェノールＡ結合能を示す核酸配列を意味する。
【００２０】
本発明は一観点において、次のような配列番号１乃至配列番号７で表される核酸配列のいずれか一つの核酸配列を含むことを特徴とするビスフェノールＡに特異的に結合できる核酸アプタマーに関するものである。
【００２１】
配列番号１：５’−ＣＣＴＧＡＧＫＷＡＣ  ＴＧＹＣＣ−３’（Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｙ＝ＴまたはＣ）
配列番号２：５’−ＧＣＣＧＴＴＧＧＴＧ  ＴＧＧＴＧＧＧＣＣＹ  ＡＧＧＧＣＣＧＧＣＧ  ＧＣＧＣＡＣＡＧＣＴ  ＧＴＴＡＴＡＧＡＣＧ  ＹＣＴＣＣＡＧＣ−３’（Ｙ＝ＣまたはＴ）
配列番号３：５’−ＴＧＡＣＧＧＴＧＧＣ  ＧＴＧＧＡＧＧＧＣＧ  ＣＧＴＡＴＣＡＡＴＣ  ＧＴＴＧＡＴＣＧＣＡ  ＧＧＧＣＣＧＴＣＡＴ  ＡＣＣＧＫＴＳＧＲＧ−３’（Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｓ＝ＣまたはＧ、Ｒ＝ＡまたはＧ）
配列番号４：５’−ＡＴＣＧＡＲＴＫＣＣ  ＣＳＣＧＧＣＣＧ−３’（Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｋ＝ＧまたはＴ；Ｓ＝ＣまたはＧ）
配列番号５：５’−ＧＴＡＴＴＧＴＣＮＴ  ＮＣＮＮＡＴＣＣＴＣ  ＧＮＮＣＴＮＧＣＴＧ  ＴＣＮＴ−３’（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ）
配列番号６：５’−ＧＣＧＧＧＴＡＣＣＧ  ＴＧＣＴ−３’
配列番号７：５’−ＣＧＧＴＧＧＧＴＧＧ  ＮＮＡＧＮＴＧＮＧＡ  ＮＡ−３’（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ）
【００２２】
この時、前記アプタマーを構成する全てのヌクレオチドの数は、１４〜２００ｎｔｓであってもよいが、好ましくは１４〜６３ｎｔｓであることを特徴とする。
【００２３】
本発明において、前記配列番号１で表される核酸配列を含む核酸アプタマーは、次の配列番号８乃至配列番号１８で表される核酸配列のいずれか一つの核酸配列であることを特徴とする。
【００２４】
＃３１：５’−ＣＧＧＣＣＣＴＡＧＧ  ＡＴＧＡＣＣＴＧＡＧ  ＴＡＣＴＧＴＣＣＣＴ  ＣＡＣＣＣＣＴＡＣＴ  ＴＣＣＧＣＣＡＣＴＧ  ＧＣＣＣＡＡＣＡＧＣ−３’（配列番号８）
＃２３：５’−ＴＧＣＣＴＡＧＧＡＴ  ＧＡＣＣＴＧＡＧＴＡ  ＣＴＧＴＣＣＡＧＧＣ  ＴＣＣＧＡＣＣＴＴＧ  ＴＣＣＣＴＧＣＣＧＣ  ＣＡＣＴＣＴＣＣＣＡ−３’（配列番号９）
＃４７：５’−ＧＣＧＧＡＣＧＧＧＣ  ＴＣＧＧＣＴＣＡＣＣ  ＴＡＧＧＡＴＧＡＣＣ  ＴＧＡＧＴＡＣＴＧＴ  ＣＣＣＣＧＴＧＧＣＧ  ＣＴＡＡＴＴＣＧＧＧ−３’（配列番号１０）
＃５０：５’−ＣＧＧＣＣＣＧＣＣＣ  ＣＴＡＧＧＡＴＧＡＣ  ＣＴＧＡＧＴＡＣＴＧ  ＴＣＣＧＣＧＧＧＡＣ  ＧＧＴＡＴＣＧＣＴＧ  ＡＧＡＣＡＧＧＴＧＣ−３’（配列番号１１）
＃４１：５’−ＣＧＧＣＡＧＣＣＣＴ  ＡＧＧＡＴＧＡＣＣＴ  ＧＡＧＴＡＣＴＧＴＣ  ＣＧＣＧＡＡＡＧＡＣ  ＴＣＣＡＴＧＧＴＡＣ  ＣＣＧＧＴＧＣＴＴＡ−３’（配列番号１２）
＃２７：５’−ＧＧＧＧＧＣＧＴＣＧ  ＮＣＣＴＡＧＧＡＴＧ  ＡＣＣＴＧＡＧＴＡＣ  ＴＧＴＣＣＧＣＡＣＮ  ＣＡＧＧＧＡＧＧＡＴ  ＧＣＡＴＴＧＡＣ−３’（配列番号１３）
＃４５：５’−ＧＴＧＴＣＣＣＣＡＣ  ＧＴＣＣＴＡＧＧＡＴ  ＧＡＣＣＴＧＡＧＴＡ  ＣＴＧＴＣＣ  ＡＡＴＧ  ＣＣＧＣＴＣＣＴＣＣ  ＣＧＡＴＧＣＡＧＡＣ−３’（配列番号１４）
＃１１：５’−ＣＴＣＴＴＣＮＣＴＣ  ＣＡＡＴＴＣＧＴＡＡ  ＧＡＴＧＡＣＣＴＧＡ ＧＧＴＣＴＧＣＣＣＡ  ＡＣＧＧＴＧＴＴＴＡ  ＧＡＡＣＣＣＣＴＴＧ−３’（配列番号１５）
＃１２−３：５’−ＣＧＣＡＧＣＧＣＧＣ  ＣＣＣＴＧＡＧＴＡＣ  ＴＧＴＣＣＧＣＣＣＡ  ＡＣＧＧＴＧＴＧＡＣ  ＧＧＣＣＣＴＧＣＧＡ  ＴＣＡＡＣＧＡＴＴＧ−３’（配列番号１６）
＃１２−４：５’−ＧＧＧＣＣＧＴＣＣＴ  ＡＧＧＡＴＧＡＣＣＴ  ＧＡＧＴＡＣＴＧＴＣ  ＣＧＣＣＣＡＡＣＧＧ  ＴＧＴＧＡＣＧＧＣＣ  ＣＴＧＣＧＡＴＣＡＡ−３’（配列番号１７）
＃２２：５’−ＣＣＣＴＣＧＣＣＣＴ  ＧＡＧＴＡＣＴＧＴＣ  ＣＣＣＣＧＴＣＣＧＴ  ＣＣＧＧＴＧＡＧＧＧ  ＣＣＡＣＴＡＴＣＧＣ  ＴＡＡＣＴＧＡＴＣＡ−３’（配列番号１８）
【００２５】
本発明において、前記配列番号２で表される核酸配列を含む核酸アプタマーは、次の配列番号１９乃至配列番号２２で表される核酸配列から選択されたいずれか一つの核酸配列であることを特徴とする。
【００２６】
＃４：５’−ＡＧＧＣＣＧＴＴＧＧ  ＴＧＴＧＧＴＧＧＧＣ  ＣＴＡＧＧＧＣＣＧＧ  ＣＧＧＣＧＣＡＣＡＧ  ＣＴＧＴＴＡＴＡＧＡ  ＣＧＴＣＴＣＣＡＧＣ−３’（配列番号１９）
＃１２−５：５’−ＣＣＧＣＣＧＴＴＧＧ  ＴＧＴＧＧＴＧＧＧＣ  ＣＴＡＧＧＧＣＣＧＧ  ＣＧＧＣＧＣＡＣＡＧ  ＣＴＧＴＴＡＴＡＧＡ  ＣＧＴＣＴＣＣＡＧＣ−３’（配列番号２０）
＃６：５’−ＣＣＧＣＣＧＴＴＧＧ  ＴＧＴＧＧＴＧＧＧＣ  ＣＴＡＧＧＧＣＣＧＧ  ＣＧＧＣＧＣＡＣＡＧ  ＣＴＧＴＴＡＴＡＧＡ  ＣＧＣＣＴＣＣＡＧＣ−３’（配列番号２１）
＃１２−７：５’−ＣＣＧＣＣＧＴＴＧＧ  ＴＧＴＧＧＴＧＧＧＣ  ＣＣＡＧＧＧＣＣＧＧ  ＣＧＧＣＧＣＡＣＡＧ  ＣＴＧＴＴＡＴＡＧＡ  ＣＧＣＣＴＣＣＡＧＣ−３’（配列番号２２）
【００２７】
本発明において、前記配列番号３で表される核酸配列を含む核酸アプタマーは、次の配列番号２３乃至配列番号２５で表される核酸配列から選択されたいずれか一つの核酸配列であることを特徴とする。
【００２８】
＃１２−２：５’−ＴＧＡＣＧＧＴＧＧＣ  ＧＴＧＧＡＧＧＧＣＧ  ＣＧＴＡＴＣＡＡＴＣ  ＧＴＴＧＡＴＣＧＣＡ  ＧＧＧＣＣＧＴＣＡＴ  ＡＣＣＧＴＴＧＧＡＧ−３’（配列番号２３）
＃１２−９：５’−ＴＧＡＣＧＧＴＧＧＣ  ＧＴＧＧＡＧＧＧＣＧ  ＣＧＴＡＴＣＡＡＴＣ  ＧＴＴＧＡＴＣＧＣＡ  ＧＧＧＣＣＧＴＣＡＴ  ＡＣＣＧＴＴＧＧＧＧＧ−３’（配列番号２４）
＃１２−６：５’−ＴＧＡＣＧＧＴＧＧＣ  ＧＴＧＧＡＧＧＧＣＧ  ＣＧＴＡＴＣＡＡＴＣ  ＧＴＴＧＡＴＣＧＣＡ  ＧＧＧＣＣＧＴＣＡＴ  ＡＣＣＧＧＴＣＧＧＧ−３’（配列番号２５）
【００２９】
本発明において、前記配列番号４で表される核酸配列を含む核酸アプタマーは、次の配列番号２６乃至配列番号２８で表される核酸配列から選択されたいずれか一つの核酸配列であることを特徴とする。
【００３０】
＃２：５’−ＧＣＣＧＡＣＡＧＧＧ  ＣＡＴＧＧＧＡＣＧＣ  ＴＡＴＣＡＧＣＧＧＴ  ＧＴＣＡＡＴＣＧＡＡ  ＴＴＣＣＣＧＣＧＧＣ  ＣＧＣＣＡＴＧＣＧＧ−３’（配列番号２６）
＃１４：５’−ＧＧＴＣＣＣＣＧＣＡ  ＧＣＴＣＡＴＡＣＧＧ  ＣＧＣＴＣ  ＣＡＧＣＧ  ＴＡＡＴＣＧＡＡＴＴ  ＣＣＣＧＣＧＧＣＣＧ  ＣＣＡＴＧＣＧＧＣＣ−３’（配列番号２７）
＃４６：５’−ＧＣＧＡＧＴＧＧＣＣ  ＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡ  ＧＣＧＴＡＡＴＣＣＣ  ＣＡＣＧＣＡＣＡＴＣ  ＧＡＧＴＧＣＣＣＣＣ  ＧＧＣＣＧＧＴＧＣＴ−３’（配列番号２８）
【００３１】
本発明において、前記配列番号５で表される核酸配列を含む核酸アプタマーは、次の配列番号２９または配列番号３０で表される核酸配列であることを特徴とする。
【００３２】
＃１２：５’−ＧＴＡＴＴＧＴＣＡＴ  ＴＣＡＴＡＴＣＣＴＣ  ＧＴＧＣＴＴＧＣＴＧ  ＴＣＣＴＣＡＣＣＣＣ  ＡＣＣＣＡＣＣＡＧＡ  ＡＴＧＧＡＡＡ−３’（配列番号２９）
＃１３：５’−ＣＣＴＧ  ＧＴＡＴＴＧ  ＴＣＴＴＧＣＣＡＡＴ  ＣＣＴＣＧＣＣＣＴＧ  ＧＣＴＧＴＣＴＴＡＣ  ＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣ  ＣＣＧＣＣＴＧＡＡＧ−３’（配列番号３０）
【００３３】
本発明において、前記配列番号６で表される核酸配列を含む核酸アプタマーは、次の配列番号３１または配列番号３２で表される核酸配列であることを特徴とする。
【００３４】
＃４８：５’−ＧＴＣＧＡＣＴＣＧＣ  ＧＧＧＴＡＣＣＧＴＧ  ＣＴＣＡＡＴＧＴＣＣ  ＣＡＡＴＣＣＧＧＧＧ  ＡＡＧＣＧＴＴＴＡＧ  ＡＣＣＣＧＣＡＧＣＣ  ＣＡＣ−３’（配列番号３１）
＃４０：５’−ＧＴＣＧＣＣＡＣＴＧ  ＣＧＧＧＴＡＣＣＧＴ  ＧＣＴＴＧＧＧＣＮＡ  ＣＣＧＡＴＧＮＡＣＣ  ＮＴＧＮＮＡＣＣＧＴ  ＧＴＴＴＮＧＣＣ−３’（配列番号３２）
【００３５】
本発明において、前記配列番号７で表される核酸配列を含む核酸アプタマーは、次の配列番号３３または配列番号３４で表される核酸配列であることを特徴とする。
【００３６】
＃３：５’−ＣＣＧＧＴＧＧＧＴＧ  ＧＴＣＡＧＧＴＧＧＧ  ＡＴＡＧＣＧＴＴＣＣ  ＧＣＧＴＡＴＧＧＣＣ  ＣＡＧＣＧＣＡＴＣＡ  ＣＧＧＧＴＴＣＧＣＡ  ＣＣＡ−３’（配列番号３３）
＃３２：５’−ＧＧＧＣＧＧＴＧＧＧ  ＴＧＧＣＧＡＧＴＴＧ  ＴＧＡＧＡＣＧＣＴＧ  ＧＡＧＧＡＧＧＴＴＧ  ＣＴＧＣＣＣＣＣＧＧ  ＣＡＣＡＴＴＧＧＧＡ−３’（配列番号３４）
【００３７】
核酸アプタマーは、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡとして提供されて、本発明において前記核酸がＲＮＡの場合には、前記核酸配列においてＴはＵと表され、このような配列が本発明の範囲に含まれることは、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者には自明である。
【００３８】
本発明の一実施例においては図１に示したように、前記配列番号８乃至３４で表される核酸配列のアプタマーをＳＥＬＥＸ工程を通して選別した後、リアルタイムＰＣＲ方法及び平衡ろ過法を通して親和度を測定して、前記配列番号８乃至３４で表される核酸配列がビスフェノールＡに対し特異的に結合することを確認した。前記配列番号８乃至３４で表される核酸配列のビスフェノールＡアプタマーは、配列番号１乃至７のように共通の保存される領域を有し、そこで、このような共通の保存される領域を有するアプタマーは、ビスフェノールＡに特異的に結合することができる。また、このような共通の保存される領域の存在は、前記配列番号８乃至配列番号３４で表される核酸配列から選択されたいずれか一つの核酸配列と９０％以上１００％未満の相同性を有する核酸配列は、ビスフェノールＡに特異的に結合できる核酸アプタマーであることを意味する。グループ１の場合、配列番号１の共通配列を有する１１個のアプタマーが取得され、これらが全てビスフェノールＡに特異的に結合できることから、これらと９０％以上の相同性を有する核酸配列もビスフェノールＡに特異的に結合できることは自明である。
【００３９】
本発明の他の実施例においては、前記配列番号８乃至３４で表される核酸アプタマーのうち最も高い親和度を見せた配列番号３３で表される核酸配列のアプタマー＃３に対しビスフェノールＡ以外の他のビスフェノール類、例えばビスフェノールＢ（Bisphenol B，ＢＰＢ）、４，４'−ビスフェノール（4,4’-Bisphsenol，ＢＰ）、６ＦビスフェノールＡ（6F Bisphenol A，６Ｆ）等に対する実施例２−２の方法で親和性（Ｋｄ）を測定した結果、ＢＰＢの場合、ビスフェノールＡとは一つのメチル基しか差がないにも係わらず、アプタマー＃３はＢＰＢには親和性を示さず、ビスフェノールＡに対してだけ特異的に親和性を示すことを確認した。
【００４０】
本発明はまた他の観点において、アプタマーを利用したビスフェノールＡの検出方法に関するものである。前記ビスフェノールＡは、水、土壌、空気、食品、廃棄物、動植物器官及び動植物組織のいずれか一つ以上から採取された試料から検出されることを特徴とするが、これらに限定されない。この時、前記水は江水（river water）、海水、湖水及び雨水等を含み、廃棄物は下水、廃水等を含み、前記動植物は人体を含む。
【００４１】
本発明の他の実施例においては、前記配列番号８乃至３４で表される核酸アプタマーの中最も高い親和度を見せた配列番号３３で表される核酸配列のアプタマー＃３に対しゾル−ゲルチップを利用したサンドイッチ分析を行った結果、ビスフェノールＡ特異的に結合することを確認した。従って、本発明は前記ビスフェノールＡに特異的に結合するアプタマーを含有するビスフェノールＡの検出センサーに関するものである。
【００４２】
前記ビスフェノールＡに特異的に結合するアプタマーを含有する検出センサーシステムは、キット（kit）状で提供できる。ビスフェノールＡ検出用キットは、瓶、筒（tub）、小さい袋（sachet）、封筒（envelope）、チューブ、アンプル（ampoule）等のような形態を有し、これらは部分的にまたは全体的にプラスチック、ガラス、紙、ホイル、ワックス等から形成してもよい。容器は、最初は容器の一部または機械的、接着性、またはその他の手段によって容器に付着できる、完全にまたは部分的に分離可能な栓を装着してもよい。容器はまた注射針によって内容物にアクセスできる、ストッパーが装着される。前記キットは外部パッケージを含むことができ、外部パッケージは構成要素の使用に関する使用説明書を含んでもよい。
【００４３】
また、本発明に係るビスフェノールＡに特異的に結合するアプタマーは、ビスフェノールＡだけを特異的に検出するが、これを含んでビスフェノールＡの検出または除去用組成物を提供できることは、本発明が属する技術分野において当業者に自明なことである。
【００４４】
本発明はまた他の観点において、ビスフェノールＡに特異的に結合するアプタマーを利用したビスフェノールＡの除去方法に関するものである。本発明の一様態によると、好ましくは前記アプタマーが固定されたビーズをカラムに充鎮してビスフェノールＡが含まれた試料を通過させてビスフェノールＡを除去することができる。
【実施例】
【００４５】
［実施例１］ビスフェノールＡに特異的に結合するアプタマーの分離
１−１：ビスフェノールＡアガロース親和性カラム（Bisphenol A-Agarose Affinity Column）の準備
ビスフェノールＡに特異的に結合するアプタマーを分離するためにビスフェノールＡ−アガロース親和性カラムを次のように準備した。
【００４６】
まず、２０ｍＭのビスフェノールＡ（4,4’-dihydroxy-2,2-diphenylpropane、Sigma-Aldrich, USA）を５０％ＤＭＦに溶解した。エポキシ活性化したセファロース６Ｂレジン（Epoxy-activated Sepharose 6B resin；GE Healthcare Bio-Sciences Corp., USA）の分液はビスフェノールＡをエーテル結合を介してヒドロキシ基で固定するのに使用された。ビスフェノールＡは、カップリングバッファー（coupling buffer：５０％ＤＭＦ、ｐＨ１３.０）で約１１〜２４μｍｏｌｅの活性基を有する６００μＬエポキシ活性化レジンと３８℃で、５ｒｐｍで回転させながら一晩反応させてカップリングさせた。
【００４７】
ターゲット−カップリングされたレジンは、順次カップリングバッファー、１Ｍアセテートバッファー、蒸溜水で洗浄された後、カップリングされたレジンを１Ｍエタノールアミン（ethanolamine，ｐＨ８.０）と６時間４２℃で回転させながらインキュベーションして、固定化過程の間、自由/非占有基（free/unoccupied group）をブロッキングした。ブロッキング後に、ビーズは洗浄バッファー（０．１Ｍアセテート、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０）で洗浄されて、２０％エタノールに再懸濁された後、使用するまで４℃で保管された。
【００４８】
流出物（flow-through）及び廃棄されるウォシングバッファー内の未結合のビスフェノールＡの量は、分光光度計（Bio-Rad, USA）を用いて２８０ｎｍで測定し、結合したビスフェノールＡの濃度は初期濃度と未結合の濃度の差で算出した。対照区としてビスフェノールＡをカップリングさせないでエタノールアミンで遮断させただけのレジンの分液を利用した。
【００４９】
１−２：ｓｓＤＮＡ  ｐｏｏｌの準備及びビスフェノールＡに特異的に結合するアプタマーの選別
次の配列を有するランダムｓｓＤＮＡライブラリーを化学的に合成してＰＡＧＥ（Genotech Inc., Korea）で分離した。
５’−ＧＧＧＣＣＧＴＴＣＧＡＡＣＡＣＧＡＧＣＡＴＧ−Ｎ６０−ＧＧＡＣＡＧＴＡＣＴＣＡＧＧＴＣＡＴＣＣＴＡＧＧ−３’（配列番号３５）
【００５０】
Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ＰＣＲ方法がｓｓＤＮＡの準備のために行われ、ｓｓＤＮＡの濃度は、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  Ｏｌｉｇｒｅｅｎ  ｓｓＤＮＡ試薬及びキット（Invitrogen, USA）を利用して測定された。ｓｓＤＮＡはＮｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ１（Sigma-Aldrich, USA）を使って確認した。初期プールは１０１５ｍｏｌｅｃｕｌｅｓを含む。前記ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ＰＣＲには次に示すフォワードプライマーだけを使用した。
フォワードプライマー：５’−ＧＧＧＣＣＧＴＴＣＧＡＡＣＡＣＧＡＧＣＡＴＧ−３'（配列番号３６）
【００５１】
ＳＥＬＥＸの選別と増幅過程を１２回行った。ビスフェノールＡ結合のレジンは、ＳＥＬＥＸ過程の各ラウンド前に結合バッファー（binding buffer：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，２５ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５％ＤＭＳＯ，ｐＨ８）で洗浄した。ランダムｓｓＤＮＡライブラリープールは、９５℃で５分間加熱した後、室温で１〜２時間冷却された。毎選別ラウンドで６００μＬのレジンにカップリングされた１９μｍｏｌｅのビスフェノールＡは結合バッファーでランダムＤＮＡプールと混合された。このような混合物はｙｅｌｌｏｗカラム（Bio-Rad, USA）で、室温で１時間インキュベートされた。非結合のｓｓＤＮＡは結合バッファーで洗浄することによって除去された。
【００５２】
ビスフェノールＡカップリングされたレジンから結合されたｓｓＤＮＡを溶離させるために、溶離バッファー（５０ｍＭ  Ｂｉｓｐｈｅｎｏｌ  Ａ，１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２００ｍＭ  ＮａＣｌ，２５ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５０％ＤＭＳＯ，ｐＨ８．０）をカラムに添加した後、流出物を取得した。溶離されたｓｓＤＮＡを沈殿させるために、２０μｇのイーストｔＲＮＡをキャリアで添加した。レジンに対する陰性選別工程（即ち、レジンから非結合の候補者を除去）は、３回目サイクル後のサイクルに含まれた。９回目及び１１回目選別ラウンド後の溶離されたアプタマープールは、ｐＧＥＭＴ  ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ（Promega, USA）を使ってクローンされ、個々のクローンはシーケンシングされた（Solgent Inc., Korea）。１１回目選別ラウンド及び１２回目の最後の選別ラウンドから５４個のアプタマーを選別したが、この中でいくつは重複したことが明らかになり、最終的には下記に示したように、合わせて２７個のアプタマーを選別した。
【００５３】
グループ１
＃３１  ５’−ＣＧＧＣＣＣＴＡＧＧ  ＡＴＧＡＣＣＴＧＡＧ  ＴＡＣＴＧＴＣＣＣＴ  ＣＡＣＣＣＣＴＡＣＴ  ＴＣＣＧＣＣＡＣＴＧ  ＧＣＣＣＡＡＣＡＧＣ−３’（配列番号８）
＃２３  ５’−ＴＧＣＣＴＡＧＧＡＴ  ＧＡＣＣＴＧＡＧＴＡ  ＣＴＧＴＣＣＡＧＧＣ  ＴＣＣＧＡＣＣＴＴＧ  ＴＣＣＣＴＧＣＣＧＣ  ＣＡＣＴＣＴＣＣＣＡ−３’（配列番号９）
＃４７  ５’−ＧＣＧＧＡＣＧＧＧＣ  ＴＣＧＧＣＴＣＡＣＣ  ＴＡＧＧＡＴＧＡＣＣ  ＴＧＡＧＴＡＣＴＧＴ  ＣＣＣＣＧＴＧＧＣＧ  ＣＴＡＡＴＴＣＧＧＧ−３’（配列番号１０）
＃５０  ５’−ＣＧＧＣＣＣＧＣＣＣ  ＣＴＡＧＧＡＴＧＡＣ  ＣＴＧＡＧＴＡＣＴＧ  ＴＣＣＧＣＧＧＧＡＣ  ＧＧＴＡＴＣＧＣＴＧ  ＡＧＡＣＡＧＧＴＧＣ−３’（配列番号１１）
＃４１  ５’−ＣＧＧＣＡＧＣＣＣＴ  ＡＧＧＡＴＧＡＣＣＴ  ＧＡＧＴＡＣＴＧＴＣ  ＣＧＣＧＡＡＡＧＡＣ  ＴＣＣＡＴＧＧＴＡＣ  ＣＣＧＧＴＧＣＴＴＡ−３’（配列番号１２）
＃２７  ５’−ＧＧＧＧＧＣＧＴＣＧ  ＮＣＣＴＡＧＧＡＴＧ  ＡＣＣＴＧＡＧＴＡＣ  ＴＧＴＣＣＧＣＡＣＮ  ＣＡＧＧＧＡＧＧＡＴ  ＧＣＡＴＴＧＡＣ−３’（配列番号１３）
＃４５  ５’−ＧＴＧＴＣＣＣＣＡＣ  ＧＴＣＣＴＡＧＧＡＴ  ＧＡＣＣＴＧＡＧＴＡ  ＣＴＧＴＣＣＡＡＴＧ  ＣＣＧＣＴＣＣＴＣＣ  ＣＧＡＴＧＣＡＧＡＣ−３’（配列番号１４）
＃１１  ５’−ＣＴＣＴＴＣＮＣＴＣ  ＣＡＡＴＴＣＧＴＡＡ  ＧＡＴＧＡＣＣＴＧＡ  ＧＧＴＣＴＧＣＣＣＡ  ＡＣＧＧＴＧＴＴＴＡ  ＧＡＡＣＣＣＣＴＴＧ−３’（配列番号１５）
＃１２−３  ５’−ＣＧＣＡＧＣＧＣＧＣ  ＣＣＣＴＧＡＧＴＡＣ  ＴＧＴＣＣＧＣＣＣＡ  ＡＣＧＧＴＧＴＧＡＣ  ＧＧＣＣＣＴＧＣＧＡ  ＴＣＡＡＣＧＡＴＴＧ−３’（配列番号１６）
＃１２−４  ５’−ＧＧＧＣＣＧＴＣＣＴ  ＡＧＧＡＴＧＡＣＣＴ  ＧＡＧＴＡＣＴＧＴＣ  ＣＧＣＣＣＡＡＣＧＧ  ＴＧＴＧＡＣＧＧＣＣ  ＣＴＧＣＧＡＴＣＡＡ−３’（配列番号１７）
＃２２  ５’−ＣＣＣＴＣＧＣＣＣＴ  ＧＡＧＴＡＣＴＧＴＣ  ＣＣＣＣＧＴＣＣＧＴ  ＣＣＧＧＴＧＡＧＧＧ  ＣＣＡＣＴＡＴＣＧＣ  ＴＡＡＣＴＧＡＴＣＡ−３’（配列番号１８）
【００５４】
グループ２
＃４  ５’−ＡＧＧＣＣＧＴＴＧＧ  ＴＧＴＧＧＴＧＧＧＣ  ＣＴＡＧＧＧＣＣＧＧ  ＣＧＧＣＧＣＡＣＡＧ  ＣＴＧＴＴＡＴＡＧＡ  ＣＧＴＣＴＣＣＡＧＣ−３’（配列番号１９）
＃１２−５  ５’−ＣＣＧＣＣＧＴＴＧＧ  ＴＧＴＧＧＴＧＧＧＣ  ＣＴＡＧＧＧＣＣＧＧ  ＣＧＧＣＧＣＡＣＡＧ  ＣＴＧＴＴＡＴＡＧＡ  ＣＧＴＣＴＣＣＡＧＣ−３’（配列番号２０）
＃６  ５’−ＣＣＧＣＣＧＴＴＧＧ  ＴＧＴＧＧＴＧＧＧＣ  ＣＴＡＧＧＧＣＣＧＧ  ＣＧＧＣＧＣＡＣＡＧ  ＣＴＧＴＴＡＴＡＧＡ  ＣＧＣＣＴＣＣＡＧＣ−３’（配列番号２１）
＃１２−７  ５’−ＣＣＧＣＣＧＴＴＧＧ  ＴＧＴＧＧＴＧＧＧＣ  ＣＣＡＧＧＧＣＣＧＧ  ＣＧＧＣＧＣＡＣＡＧ  ＣＴＧＴＴＡＴＡＧＡ  ＣＧＣＣＴＣＣＡＧＣ−３（配列番号２２）
【００５５】
グループ３
＃１２−２  ５’−ＴＧＡＣＧＧＴＧＧＣ  ＧＴＧＧＡＧＧＧＣＧ  ＣＧＴＡＴＣＡＡＴＣ  ＧＴＴＧＡＴＣＧＣＡ  ＧＧＧＣＣＧＴＣＡＴ  ＡＣＣＧＴＴＧＧＡＧ−３’（配列番号２３）
＃１２−９  ５’−ＴＧＡＣＧＧＴＧＧＣ  ＧＴＧＧＡＧＧＧＣＧ  ＣＧＴＡＴＣＡＡＴＣ  ＧＴＴＧＡＴＣＧＣＡ  ＧＧＧＣＣＧＴＣＡＴ  ＡＣＣＧＴＴＧＧＧＧＧ−３’（配列番号２４）
＃１２−６  ５’−ＴＧＡＣＧＧＴＧＧＣ  ＧＴＧＧＡＧＧＧＣＧ  ＣＧＴＡＴＣＡＡＴＣ  ＧＴＴＧＡＴＣＧＣＡ  ＧＧＧＣＣＧＴＣＡＴ  ＡＣＣＧＧＴＣＧＧＧ−３’（配列番号２５）
【００５６】
グループ４
＃２  ５’−ＧＣＣＧＡＣＡＧＧＧ  ＣＡＴＧＧＧＡＣＧＣ  ＴＡＴＣＡＧＣＧＧＴ  ＧＴＣＡＡＴＣＧＡＡ  ＴＴＣＣＣＧＣＧＧＣ  ＣＧＣＣＡＴＧＣＧＧ−３’（配列番号２６）
＃１４  ５’−ＧＧＴＣＣＣＣＧＣＡ  ＧＣＴＣＡＴＡＣＧＧ  ＣＧＣＴＣＣＡＧＣＧ  ＴＡＡＴＣＧＡＡＴＴ  ＣＣＣＧＣＧＧＣＣＧ  ＣＣＡＴＧＣＧＧＣＣ−３’（配列番号２７）
＃４６  ５’−ＧＣＧＡＧＴＧＧＣＣ  ＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡ  ＧＣＧＴＡＡＴＣＣＣ  ＣＡＣＧＣＡＣＡＴＣ  ＧＡＧＴＧＣＣＣＣＣ  ＧＧＣＣＧＧＴＧＣＴ−３’（配列番号２８）
【００５７】
グループ５
＃１２  ５’−ＧＴＡＴＴＧＴＣＡＴ  ＴＣＡＴＡＴＣＣＴＣ  ＧＴＧＣＴＴＧＣＴＧ  ＴＣＣＴＣＡＣＣＣＣ  ＡＣＣＣＡＣＣＡＧＡ  ＡＴＧＧＡＡＡ−３’（配列番号２９）
＃１３  ５’−ＣＣＴＧＧＴＡＴＴＧ  ＴＣＴＴＧＣＣＡＡＴ  ＣＣＴＣＧＣＣＣＴＧ  ＧＣＴＧＴＣＴＴＡＣ  ＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣ  ＣＣＧＣＣＴＧＡＡＧ−３’（配列番号３０）
【００５８】
グループ６
＃４８  ５’−ＧＴＣＧＡＣＴＣＧＣ  ＧＧＧＴＡＣＣＧＴＧ  ＣＴＣＡＡＴＧＴＣＣ  ＣＡＡＴＣＣＧＧＧＧ  ＡＡＧＣＧＴＴＴＡＧ  ＡＣＣＣＧＣＡＧＣＣ  ＣＡＣ−３’（配列番号３１）
＃４０  ５’−ＧＴＣＧＣＣＡＣＴＧ  ＣＧＧＧＴＡＣＣＧＴ  ＧＣＴＴＧＧＧＣＮＡ  ＣＣＧＡＴＧＮＡＣＣ  ＮＴＧＮＮＡＣＣＧＴ  ＧＴＴＴＮＧＣＣ−３’（配列番号３２）
【００５９】
グループ７
＃３  ５’−ＣＣＧＧＴＧＧＧＴＧ  ＧＴＣＡＧＧＴＧＧＧ  ＡＴＡＧＣＧＴＴＣＣ  ＧＣＧＴＡＴＧＧＣＣ  ＣＡＧＣＧＣＡＴＣＡ  ＣＧＧＧＴＴＣＧＣＡ  ＣＣＡ−３’（配列番号３３）
＃３２  ５’−ＧＧＧＣＧＧＴＧＧＧ  ＴＧＧＣＧＡＧＴＴＧ  ＴＧＡＧＡＣＧＣＴＧ  ＧＡＧＧＡＧＧＴＴＧ  ＣＴＧＣＣＣＣＣＧＧ  ＣＡＣＡＴＴＧＧＧＡ−３’（配列番号３４）
【００６０】
前記配列から下線の部分は保存される共通配列を表す。即ち、グループ１の５’−ＣＣＴＧＡＧＫＷＡＣＴ  ＧＹＣＣ−３’（Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｙ＝ＴまたはＣ；配列番号１）、グループ２の５’−ＧＣＣＧＴＴＧＧ  ＴＧＴＧＧＴＧＧＧＣ  ＣＹＡＧＧＧＣＣＧＧ  ＣＧＧＣＧＣＡＣＡＧ  ＣＴＧＴＴＡＴＡＧＡ  ＣＧＹＣＴＣＣＡＧＣ（Ｙ＝ＣまたはＴ、配列番号２）、グループ３の５’−ＴＧＡＣＧＧＴＧＧＣ  ＧＴＧＧＡＧＧＧＣＧ  ＣＧＴＡＴＣＡＡＴＣ  ＧＴＴＧＡＴＣＧＣＡ  ＧＧＧＣＣＧＴＣＡＴ  ＡＣＣＧＫＴＳＧＲＴ  ＡＣ（Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｓ＝ＣまたはＧ、Ｒ＝ＡまたはＧ；配列番号３）、グループ４の５’−ＡＴＣＧＡＲＴＫＣＣ  ＣＳＣＧＧＣＣＴ  ＡＣ（Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｋ＝ＧまたはＴ；Ｓ＝ＣまたはＧ；配列番号４）、グループ５の５’−Ｇで５’ＴＣＮＴ  ＮＣＮＮＡＴＴＴＧＡ  ＧＮＮＣＴＮＧＣ５’−ＴＧＮＴ  ＡＣ（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ；配列番号５）、グループ６の配列番号６：５’−ＧＣＧＧＧＴＡＣＣＧ  ＴＧＣＴ  ＡＣ（配列番号６）、グループ７の配列番号７：５’−ＣＧＧＴＧＧＧＴＧＧ  ＮＮＡＧＮＴＧＮＧＡ  ＮＡ−３’（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ；配列番号７）が各グループのアプタマーが含む共通配列である。
【００６１】
［実施例２］ビスフェノールＡの検出活性測定
２−１：リアルタイムＰＣＲ方法を利用したビスフェノールＡに対する結合親和度測定
リアルタイムＰＣＲ方法を利用して、ＳＥＬＥＸ方法を行う前の初期ｓｓＤＮＡプール（pool）、各１１回目及び１２回目選別ラウンドから分離して取得した湧出物（Ｒ１１及びＲ１２）、前記１１回目選別ラウンド及び１２回目選別ラウンドから取得したアプタマー（１１回目選別ラウンドで＃３（配列番号３３）、＃６（配列番号２１）；１２回目選別ラウンドで＃１２−３（配列番号１６）、＃１２−５（配列番号２０））に対し結合親和度を測定した。この時、ＢＰＡ結合されたカラムに対する対照群としてＢＰＡが結合されていない対照群カラム（control-column）を使用した。
【００６２】
即ち、先ずフォワードプライマー（forward primer）とリバースプライマー（reverse primer）を５ｐｍｏｌ／μＬの濃度で混合した後、リアルタイムＰＣＲを次の条件で行った。即ち、５０℃で２分間１回サイクル、９５℃で１０分間１回サイクルを行い、その次に９５℃で１５秒、６０℃で３０秒、そして７２℃で、３０秒で４０回サイクルを行い、さらに７２℃で１０分間１回サイクルを行った。この時、リアルタイムＰＣＲ反応混合物としては、２５ｍＬ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍｉｘ（２ｘ）（Takara, Japan）、２ｍＬ  ｐｒｉｍｅｒ  ｐａｉｒ  ｍｉｘ（５ｐｍｏｌ／ｍＬ  ｅａｃｈ  ｐｒｉｍｅｒ）（Bioneer, Korea）及び２２.５ｍＬ  Ｈ２Ｏを利用し、前記リアルタイムＰＣＲの結果は、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ＳＤＳ  ７０００（Eurogentec, Belgium）で確認した。
フォワードプライマー：５’−ＧＧＧＣＣＧＴＴＣＧＡＡＣＡＣＧＡＧＣＡＴＧ−３’（配列番号３６）
リバースプライマー：５’−ＣＣＴＡＧＧＡＴＧＡＣＣＴＧＡＧＴＡＣＴＧＴＣＣ−３’（配列番号３７）
【００６３】
その結果、図２Ａに示したように、アプタマー＃３（配列番号３３）、＃６（配列番号２１）、＃１２−３（配列番号１６）及び＃１２−５（配列番号２０）共にビスフェノールＡに対し親和度を有することが明らかになり、この中で＃３（配列番号３３）及び＃１２−５（配列番号２０）は、ビスフェノールＡに対して特に高い親和度を示すことが明らかになった。
【００６４】
特に、アプタマー＃１２−５（配列番号２０）は、対照群カラムに対しては非常に低い親和度を示し、ビスフェノールＡに対しては非常に高い親和度を示すことが確認されて、ビスフェノールＡの検出及び除去のために有効なアプタマーとして使用できることが確認された。
一方、いくつかのアプタマーに対しＭ．Ｚｕｋｅｒに従って、Ｍｆｏｌｄプログラムを使用し、自由エネルギーを最小化することで２次構造の分析を行ったところ、（http://frontend.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/cgi-bin/dna-form1.cgi）、この中アプタマー＃３（配列番号３３）及びアプタマー＃１２−５（配列番号２０）の２次構造は図２Ｂに示した通りである。
【００６５】
２−２：平衡ろ過法によるビスフェノールＡに対する解離常数（Ｋｄ）の測定
結合アッセイを平衡ろ過法によって行った。Ｋｄ決定のために、フォルドされたｓｓＤＮＡの一連の希釈液は２００μＬ反応溶液に７５μＭビスフェノールＡを含む結合バッファーに溶解し、室温で１時間インキュベートした。混合物はＹＭ３  Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ  ｃｏｌｕｍｎｓ（Amicon）にロードした後、１２，０００ｇで６０分間遠心分離して、約１６０μＬのろ過液を取得した。
【００６６】
前記分子量カットオフ膜に残っている溶液は、ビスフェノールＡに結合するｓｓＤＮＡと結合しないｓｓＤＮＡを共に含んでいるが、ろ過液はｓｓＤＮＡに非結合のビスフェノールＡだけを含んでいる。ろ過液サンプルを分光分析機（Spectrophotometer，Bio-rad）を用いて２７８ｎｍで測定してビスフェノールＡの濃度を決定した。
【００６７】
解離常数を算出するために、Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ  １０．０ソフトウェアを利用して、次の平衡式に結合されたビスフェノールＡ：ｓｓＤＮＡ濃度のパーセントをプロット化して、データポイントを非線形回帰分析によって固定した。
ｙ＝（Ｂｍａｘ．ｓｓＤＮＡ）／（Ｋｄ＋ｓｓＤＮＡ）
この時、ｙは飽和度（saturation）の程度で、Ｂｍａｘは最大結合地点の数で、Ｋｄは解離（dissociation）常数である。
【００６８】
その結果、前記実施例２−１のリアルタイムＰＣＲ分析法で最も優秀な親和度を示すアプタマーとして選別された＃３（配列番号３３）及び＃１２−５（配列番号２０）の解離常数を調べた結果、アプタマー＃３（配列番号３３）の解離常数は８．３ｎＭ、アプタマー＃１２−５（配列番号２０）の解離常数は２３０ｎＭとなった。
【００６９】
即ち、図２ＡのリアルタイムＰＣＲ分析ではアプタマー＃１２−５（配列番号２０）のアプタマーが強い結合力を示すことが明らかになったが、平衡ろ過方法で解離常数を調べた結果、アプタマー＃３（配列番号３３）が最も強い親和度を有することが明らかになった。
【００７０】
一般に巨大分子に対する抗体の親和度と比較する際に、小さい分子に対する抗体の親和度は非常に低いことを考慮すると、本発明に係るアプタマーがｎＭレベルの親和度を示すことは非常に異例なことである。即ち、本発明に係るアプタマーはビスフェノールＡに対する非常に強い親和度を示すことを確認した。
【００７１】
［実施例３］ゾル−ゲルチップを利用したビスフェノールＡのアプタマー結合確認
選別されたビスフェノールＡアプタマーの親和度をテストするために、ゾル−ゲルチップを準備した。まず、ゾル−ゲルスポットを陰性対照群、ビスフェノールＡと共に、図３に示したように陰性対照群（●）とビスフェノールＡ（●）をｓｃｉＦＬＥＸＡＲＲＡＹＥＲ（Scienion,Germany）を利用して表面改質されたシリコン表面に固定化した。
【００７２】
前記で使われたゾル−ゲルスポットのためのゾル組成物は下記のように製造した。まずテトラメチルオルソシリケート（tetramethyl orthosilicate，ＴＭＯＳ）とメチルトリメトキシシリケート（methyltrimethoxysilicate，ＭＴＭＳ）を混合して、ゾル組成物を製造した。そして、溶液Iとしては、１０ｍＭ  ＨＣｌを準備した。
【００７３】
一方、１０ｍＭ  ＳＰ緩衝溶液（ｐＨ５．８）１０μＬ及び２次蒸溜水（double distilled water，ＤＤＷ）２０μＬを混合した後、前記混合物に、実験群の場合ビスフェノールＡを１０μＬずつ添加して、５秒の間ボルテックス攪拌しスピン−ダウンして溶液ＩＩを製造した。陰性対照群の場合、緩衝溶液（buffer）だけを使用した。
【００７４】
それから、アプタマー#３をターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase；Fermentas, Canada）とＣｙ３−ｄＵＴＰ（GeneChem, Korea）を利用してラベリングして準備した。
【００７５】
ゾル−ゲルスポットを１３〜１５時間ゲル化した後、各ウェルを２μＭのｃｙ３−ラベルされたアプタマーでアッセイした。次に、洗浄過程を経てＦＬＡ５１００蛍光スキャナー（FUJIFILM, Japan）で観察し、Ｍｕｌｔｉ−ｉｍａｇｅ分析機及びＭｕｌｔｉ−ｇａｕｇｅプログラムで分析した。
【００７６】
その結果、図３に示したように、ビスフェノールＡが固定化されたチップのみにおいてシグナルが示され、本発明に係るアプタマーがビスフェノールＡを特異的に検出する可能性があることを確認した。
【００７７】
［実施例４］ゾル−ゲルチップでビスフェノールＡアプタマーを利用したビスフェノールＡ検出
選別されたビスフェノールＡアプタマーの親和度をテストするため、ゾル−ゲルチップを準備した。先ず、ゾル−ゲルスポットを陰性対照群、選別された複数のアプタマー（アプタマー＃３及び＃１２−５）、陽性対照群と共に、図４に示したような順序で陽性対照群（Ｐ）、＃１２−５アプタマー、＃３アプタマー及び陰性対照群（Ｎ）順にＯｍｎｉＧｒｉｄ  Ａｃｃｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ（DIGI LAB, USA）を利用してＰＭＭＡコーティングされた９６−ウェル上に固定化した。
【００７８】
前記で使用されたゾル−ゲルスポットのためのゾル組成物は、次のように製造した。先ず、テトラメチルオルトシリケート（ＴＭＯＳ）とメチルトリメトキシシリーケイト（ＭＴＭＳ）を混合して、ゾル組成物を製造した。そして、溶液Ｉとしては１００ｍＭ  ＨＣｌを準備した。
【００７９】
一方、１００ｍＭ  ＳＰ緩衝溶液（ｐＨ５.８）及び２次蒸溜水（ＤＤＷ）２０μＬを混合した後、前記混合物に、陽性対照群の場合１０μＬのＣｙ３抗体（Santa Cruz, USA）を、実験群の場合、選別したアプタマー（アプタマー＃３及び＃１２−５）を１０μＬずつ添加して、５秒の間ボルテックス攪拌してスピン−ダウンして、溶液ＩＩを製造した。陰性対照群の場合、緩衝溶液だけを使用した。
【００８０】
それから、アプタマー#３及び＃１２−５をターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Fermentas, Canada）とＣｙ３−ｄＵＴＰ（GeneChem, Korea）を利用してラベリングして準備した。
【００８１】
ゾル−ゲルスポットを１３〜１５時間ゲル化した後、各ウェルに５０μＭのビスフェノールＡと２μＭのｃｙ３−ラベルされたアプタマーでサンドイッチアッセイした。即ち、各ウェルに図３に示したように、上段右側ウェルにはビスフェノールＡ（ＢＰＡ）とアプタマー＃１２−５を、下段左側ウェルには緩衝溶液とアプタマー＃３のみを、下段右側ウェルにはＢＰＡとアプタマー＃３を処理して培養した。次に、洗浄過程を経てＦＬＡ５１００蛍光スキャナー（FUJIFILM, Japan）で観察し、Ｍｕｌｔｉ−ｉｍａｇｅ分析機及びＭｕｌｔｉ−ｇａｕｇｅプログラムで分析した。
【００８２】
その結果、図４に示したように、ビスフェノールＡが存在する場合にのみ＃１２−５アプタマー及び＃３アプタマーを固定した位置にシグナルが示され（赤円で表示）、本発明に係るアプタマーがビスフェノールＡを特異的に検出する可能性があることを確認した。
【００８３】
［実施例５］ビスフェノールＡ以外のビスフェノール類に対する親和性測定
ビスフェノールＡ特異的に結合するかを確認するため、アプタマー＃３（配列番号３３）を利用して追加的にビスフェノールＡと類似する構造を有する他のビスフェノール類、例えば、図５Ａに提示されたビスフェノールＢ（ＢＰＢ）、４，４’−ビスフェノール（ＢＰ）、６ＦビスフェノールＡ（６Ｆ）等に対する実施例２−２の方法で親和性（Ｋｄ）を測定した。
【００８４】
その結果、図５Ｂに示したように、アプタマー＃３の場合、ビスフェノールＡに対する解離常数は０．８ｎＭ、６Ｆは２０８ｎＭ、ＢＰＢは１３９ｍＭ、ＢＰは１３９ｍＭを示し、アプタマー＃３はビスフェノールＡにのみ特異的に結合することが明らかになった。
【００８５】
図５ＡのＢＰＢの場合、ビスフェノールＡとは一つのメチル基しか差がないにも係わらず、アプタマー＃３はＢＰＢには親和性を示すことなく、ビスフェノールＡに対してだけ特異的に親和性を示した。
【００８６】
［実施例６］平衡ろ過法による＃３  ｔｒｉｍｍｅｄ  ｆｏｒｍアプタマーのビスフェノールＡに対する結合力の確認
前記＃３（配列番号３３）のｔｒｉｍｍｅｄ  ｆｏｒｍアプタマーのビスフェノールＡに対する結合力を確認するため、結合アッセイを平衡ろ過法によって行った。具体的には、下記配列番号３８乃至配列番号４１の配列と表され、図６と同じ構造を形成させた＃３  ｔｒｉｍｍｅｄ  ｆｏｒｍアプタマー（＃３−ｔｒ１、＃３−ｔｒ２、＃３−ｔｒ３及び＃３−ｔｒ４）を製作した。
【００８７】
＃３−ｔｒ１：５’−ＣＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＣＡＧＧＴＧＧＧＡＴＡＧＣＧＴＴＣＣＧＣＧＴＡＴＧＧＣＣＣＡＧＣＧ−３’（配列番号３８）
＃３−ｔｒ２：５’−ＴＧＣＣＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＣＡＧＧＴＧＧＧＡＴＡＧＣＧＴＴＣＣＧＣＧＴＡＴＧＧＣＣＣＡＧＣＧＣＡ−３’（配列番号３９）
＃３−ｔｒ３：５’−ＡＧＣＡＴＧＣＣＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＣＡＧＧＴＧＧＧＡＴＡＧＣＧＴＴＣＣＧＣＧＴＡＴＧＧＣＣＣＡＧＣＧＣＡＴＣＡ−３’（配列番号４０）
＃３−ｔｒ４：５’−ＡＣＡＣＧＡＧＣＡＴＧＣＣＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＣＡＧＧＴＧＧＧＡＴＡＧＣＧＴＴＣＣＧＣＧＴＡＴＧＧＣＣＣＡＧＣＧＣＡＴＣＡＣＧＧＧＴ−３’（配列番号４１）
【００８８】
前記＃３  ｔｒｉｍｍｅｄ  ｆｏｒｍアプタマー（＃３−ｔｒ１、＃３−ｔｒ２、＃３−ｔｒ３及び＃３−ｔｒ４）の希釈液は、２００μＬ反応溶液に７５μＭビスフェノールＡを含む結合バッファーに溶解して、室温で１時間インキュベーションした。対照群としてビスフェノールＡだけを結合バッファーに溶解させた溶液を使用した。混合物は、ＹＭ３  Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ  ｃｏｌｕｍｎｓ（Ａｍｉｃｏｎ）にローディングした後、１２，０００ｇで６０分間遠心分離して、約１５０μＬのろ過液を取得した。前記分子量カットオフ膜に残っている溶液は、ビスフェノールＡに結合するｓｓＤＮＡと、結合しないｓｓＤＮＡを共に含んでいるが、ろ過液はｓｓＤＮＡに非結合のビスフェノールＡだけを含んでいる。ろ過液サンプルを分光分析機（Spectrophotometer, Bio-rad）で２７６ｎｍで測定して、ビスフェノールＡの濃度を決定した。対照群と比較して、ビスフェノールＡが各ｔｒｉｍｍｅｄ  ｆｏｒｍアプタマーに結合する比率を計算してグラフで示す。
【００８９】
その結果、表１及び図７に示したように、ビスフェノールＡが各ｔｒｉｍｍｅｄ  ｆｏｒｍアプタマーに結合する割合は、＃３−ｔｒ１が５．８％、＃３−ｔｒ２が１１．１％、＃３−ｔｒ３が１７．９％、＃３−ｔｒ４が２２.３％となった。即ち、＃３−ｔｒ４がビスフェノールＡに最も強い親和度を有することが明らかになった。
【００９０】
【表１】
0005456796.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【００９１】
以上、説明したように、本発明はビスフェノールＡに特異的に結合できる核酸アプタマー及びこれを利用したビスフェノールＡの検出方法及び除去方法を提供する効果がある。
本発明に係るビスフェノールＡに特異的に結合できる核酸アプタマーは、ｎＭレベルの親和度を有し、極微量のビスフェノールＡも検出することが可能で、ビスフェノールＡとは一つのメチル基しか差がないビスフェノールＢ等の他のビスフェノール類に対しては親和性を示すことなく、ビスフェノールＡに対してだけ特異的に検出できるため、従来検出が難しかった環境ホルモンであるビスフェノールＡの検出及び除去に効果的である。
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当分野における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施様態に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかであろう。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定まると言えるであろう。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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