(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ７５ＮＴＲ受容体分子に対する結合特異性を有する化合物から成る神経変性疾患を治療する又は神経細胞の生存を促進するための薬剤であって、この化合物が下記化学式
【化２１】
0005586673.tif 000031
（式中、ｎは０〜８の整数であり；ｍは１〜８の整数であり；Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子及び炭素数が１〜８のアルキル基からなる群から選択され；Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、水素原子及び炭素数が１〜８のアルキル基からなる群から選択される。）で表される化合物、又はその医薬的に許容された塩である薬剤。
【請求項２】
ｎが１である請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記化合物が下式
【化５】
0005586673.tif 000032
の構造を持つ化合物である請求項１又は２に記載の薬剤。
【請求項４】
前記疾患が、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、てんかん、パーキンソン病、ピック病、脊髄損傷、脳梗塞、低酸素症、虚血症、脳損傷、糖尿病性神経障害、末梢性神経障害、神経移植、多発性硬化症、末梢神経障害、脱毛及びｐ７５を発現する細胞の変性又は機能不全を含む病気からなる群から選択される請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項５】
前記細胞の生存が、ニューロン（神経細胞）、希突起膠細胞、シュワン細胞、毛嚢細胞又はこれらの組み合わせの生存である請求項１〜４のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項６】
単位用量の活性成分と医薬グレードの担体から成る医薬調合物であって、該活性成分が下記化学式
【化２１】
0005586673.tif 000033
（式中、ｎは０〜８の整数であり；ｍは１〜８の整数であり；Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子及び炭素数が１〜８のアルキル基からなる群から選択され；Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、水素原子及び炭素数が１〜８のアルキル基からなる群から選択される。）で表される化合物、又はその医薬的に許容された塩である医薬調合物。
【請求項７】
ｎが１である請求項６に記載の医薬調合物。
【請求項８】
前記活性成分が下式
【化５】
0005586673.tif 000034
の構造を持つ化合物、又はその医薬的に許容された塩である請求項６又は７に記載の医薬調合物。
【請求項９】
前記調合物が、非経口又は経口の投与のための調合物である請求項６〜８のいずれか一項に記載の医薬調合物。
【請求項１０】
更に第二活性成分を含む請求項６〜９のいずれか一項に記載の医薬調合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願：本出願は２００５年４月１５日出願の米国仮出願番号６０／６７１，７８５に基づくものであり、またこれによる優先権を主張するものであり、当該出願内容は引用することにより本明細書に組み込まれているものとする。
助成金：本研究はＮＩＨ助成金番号ＮＳ３０６８７による助成を受けた。従って、米国政府は本出願において開示された対象について特定の権利を有する。
この発明は、一般的に患者における神経変性疾患及び他の疾患の治療に関する。より具体的には、本出願で開示した対象の方法は、患者の神経変性疾患又は他の疾患を治療するために患者にｐ７５ＮＴＲ受容体分子と特異的に結合する有効量の化合物の投与に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニューロトロフィン（神経栄養因子）は、ニューロン（神経細胞）、希突起膠細胞、シュワン細胞、毛嚢細胞及び他の細胞を含む特定の細胞の発生、機能及び／又は生存における役割を演ずるポリペプチドである。神経細胞及び他のタイプの細胞の死又は機能障害は多くの神経変性疾患に直接関係していると見なされている。ニューロトロフィン局在性、ニューロトロフィンの発現レベル及び／又は、ニューロトロフィンを結合する受容体の発現レベルの変化は、従って神経細胞の変性に関連すると示唆されてきた。変性は特にアルツハイマー、パーキンソン及びＡＬＳ神経変性疾患に生ずる。希突起膠細胞の変性は、中枢神経システム傷害、多発性硬化症及び他の病理学的状態に生じうる。
【０００３】
様々なニューロトロフィンが同定されており、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３），ニューロトロフィン−４／５（ＮＴ−４／５）、ニューロトロフィン−６（ＮＴ−６）及び脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）等が挙げられる。ニューロトロフィンは、プロニューロトロフィンとして知られている前駆体型及び成熟型の両者で発見されている。成熟型は、約１２０アミノ酸長のタンパク質であり、生理的状態では安定な、近似的に２５ｋＤａの非共有結合性ホモダイマーとして存在する。各ニューロトロフィンモノマーは、ニューロトロフィンファミリーを通して比較的高程度のアミノ酸保存を示し、ループ１，２及び４と呼ばれる、３個の溶媒に露出したβ−ヘアピンループを持つ。
【０００４】
成熟したニューロトロフィンは優先的に受容体Ｔｒｋ及びｐ７５ＮＴＲと結合するが、成熟型ではタンパク質分解より除去されるＮ−末端領域を持つプロニューロトロフィンは、主にｐ７５ＮＴＲ受容体と相互作用し、またＮ−末端領域を介して選別受容体ソルティリン(Fahnestock,M.,Michalski,B.,Xu, B.,Coughlin,M.D.(2001)Mol Cell Neurosci 18,210-220;Harrington,A.W.他(2004)Proc Natl Acad Sci USA 101,6226-6230;Nykjaer,A.他(2004)Nature 427,843-848)と相互作用する。ｐ７５ＮＴＲ受容体はＴｒｋｓと相互作用し、Ｔｒｋのシグナリングを修飾するが、独立してＩＲＡＫ／ＴＲＡＦ６／ＮＦκＢ、ＰＩ３／ＡＫＴ等のプロ生存シグナル，及びＮＲＡＧＥ／ＪＮＫ(Mamidipudi, V., Li, X., Wooten,M.W.(2002)J Biol Chem 277,28010-28018;Roux,P.P.,Bhakar,A.L.,Kennedy,T.E.,Barker,P.A.(2001)J Biol Chem 276,23097-23104;Salehi,A.H.,他(2000)Neuron 27,279-288)の様なプロアポトティックシグナル等の幾つかのシグナリングシステムと結合する。
【０００５】
治療目的で投与されると、ニューロトロフィンは、低い血清中半減期を示す不安定性、恐らく低い経口生体利用性及び中枢神経系への制限された透過性(Podulso,J.F.,Curran,G.L.(1996)Brain Res Mol Brain Res 36,280-286;Saltzman,W.M.,Mak,M.W.,Mahoney,M.J.,Duenas, E.T.,Cleland,J.L.(1999)Pharm Res 16, 232-240;Partridge,W.M.(2002)Adv Exp Med Bio513,397-430)など、最適以下の薬理的特徴を示す。さらに、二重受容体シグナリングネットワークの作用を持つことで得られるニューロトロフィンの非常に多面的な効果は、不都合な効果の可能性を増す。
【０００６】
非配位体型のｐ７５ＮＴＲはプロアポトティックであり、ニューロトロフィン結合により誘導されるホモ２量体化はこの効果を除くと言うこと(Wang,J.J.,Rabizadeh,S.,Tasinato,A.,Sperandio, S.,Ye,X.,Green,M.,Assa-Munt,N.,Spencer,D.,及びBredesen,D.E.(2000)J Neurosci Res 60,587-593)が示唆されており、Fabs(Maliartchouk,S.,Debeir,T.,Beglova,N.Cuello,A.C.,Gehring,K,及びSaragovi,H.U.(2000)J Biol Chem 275,9946-9956)及び環状ヘ゜フ゜チト゛(Longo,F.M.,Manthorpe,M.,Xie,Y.M.,Varon,S. (1997J Neurosci Res 48,1-17)のようなｐ７５ＮＲＴリガンド（配位体）は、二価の型で細胞生存を促進するのに対し、単量体ｐ７５ＮＲＴリガンドは、生存に効果がないことを示している、これらの研究と矛盾しない。しかしながら、これらの単量体リガンドは、天然のリガンドと同じように、受容体と結合しないかも知れない。活性型のＮＧＦは、ｐ７５ＮＴＲと結合の可能性がある部位を２個の持つホモ二量体であるが、最近の構造的証拠によると、活性型ＮＧＦは１個のｐ７５ＮＴＲ分子と結合するだけであり、他の分子と結合しないと言うことが示唆されている(He,X.L.,Garcia,K.C.(2004)Science 304,870-875)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
不幸なことに、今までは、技術的及び倫理的考察が、ニューロトロフィンに基づく治療薬の開発を阻害した。例えば、組み換えＤＮＡ技術を用いて十分量の純粋なニューロトロフィンを生産することは技術的に困難である。さらに、ニューロトロフィンを生産するためにヒト胎児細胞を用いることは可能であるが、この様な細胞（通常流産胎児から得るが）を用いることについて生ずる倫理的派生問題は、このアプローチを用いることをほとんど不可能にした。従って、健康異常又は疾患の治療に用いる特異的ニューロトロフィン受容体をターゲットにできる、ニューロトロフィンに基づく好ましい薬剤類似の特徴を持つ小分子試薬の開発を求める、当技術分野において未対処のニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書において、患者の神経変性疾患又は他の疾患を治療するために、患者にｐ７５ＮＴＲ受容体分子と特異的に結合する有効量の化合物を投与することからなる方法を開示する。
また、神経細胞（ニューロン）、希突起膠細胞又は他の細胞をｐ７５ＮＴＲ受容体分子に対して特異的に結合する化合物で処理することからなる、これらの細胞の生存を促進させる方法を本明細書で開示する。
また、ｐ７５ＮＴＲ受容体分子に対して特異的に結合する化合物を本明細書で開示する。
【０００９】
幾つかの実施態様において、神経変性疾患を、アルツハイマー病、ハンチントン病、ピック病、筋萎縮性側索硬化症、てんかん、パーキンソン病、ピック病、脊髄損傷、脳梗塞、低酸素症、虚血症、脳損傷、糖尿病性神経障害、末梢性神経障害、神経移植、多発性硬化症、末梢神経障害、脱毛及びｐ７５を発現する細胞の変性、又は機能不全を含む他の病気からなる群から選択した。
幾つかの実施態様において、患者はヒト患者である。
幾つかの実施態様において、ｐ７５ＮＴＲ受容体分子に結合する化合物はニューロトロフィンβ−ターンループの類似体である。
幾つかの実施態様において、薬理作用団を構成する該化合物は図１ｃに示された薬理作用団と実質的に同一である。
幾つかの実施態様において、該化合物は小分子又はペプチドである。
【００１０】
参考態様において、該化合物は下式
【化１】
0005586673.tif 000002
の化合物から選択される。
【００１１】
該化合物は、幾つかの実施態様において、下記化学式（Ｉ）、及び参考態様において、該化合物は下記化学式（ＩＩ）
【化２】
0005586673.tif 000003
（式中、ｎは０〜８の整数であり；Ｌ１及びＬ２は、アルキレン基、置換アルキレン基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、シクロアルケン基、置換シクロアルケン基、アリール基、置換アリール基、アルケニレン基及び置換アルケニレン基から成る群から選択される連結基であり；Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、シクロアルキル基、ハロ基、シアノ基、ニトロ基、メルカプト基、水酸基、アルコキシル基、アリール基、アリールオキシル基、置換アリール基及びアラルキルオキシル基からなる群からそれぞれ独立して選択され；Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４及びＡ５は、それぞれ独立して、Ｎ原子及びＣＨ基からなる群から選択され；Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４及びＢ５は、それぞれ独立して、Ｏ原子、Ｓ原子及びＮＲ４基（式中、Ｒ４は水素原子、アルキル基、置換アルキル基、シクロアルキル基、アリール基及び置換アリール基からなる群から選択される。）からなる群から選択され；Ｄ１及びＤ２は下記群
【化３】
0005586673.tif 000004
（式中、各Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、独立して、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、置換アリール基、アラルキル基、ヒドロキシルアルキル基、ヒドロキシシクロアルキル基、アルコキシシクロアルキル基、アミノアルキル基、アシルオキシル基、アルキルアミノアルキル基及びアルコキシカルボニル基からなる群から選択され；各Ｒ７は独立して水素原子、水酸基、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、アシルオキシル基及びアルコキシル基からなる群から選択され；又はＲ７及びＲ５若しくはＲ７及びＲ９は共にＣ２〜Ｃ１０のアルキル基、Ｃ２〜Ｃ１０の水酸化アルキル基又はＣ２〜Ｃ１０のアルケン基を表す。）から選択される。）のいずれかの化合物から選択され、又はその医薬的に許容された塩である。
【００１２】
幾つかの実施態様及び参考態様において、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立して−（ＣＨ２）ｍ−基であり、ここでｍは１〜８の整数である。
幾つかの実施態様において、前記化合物は下記構造の化学式（Ｉ）
【化４】
0005586673.tif 000005
（式中、ｍは１〜８の整数であり；Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、アリールオキシル基、置換アリール基及びアラルキルオキシル基からなる群から選択され；Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、置換アリール基、アラルキル基、水酸基、アルコキシル基、ヒドロキシアルキル基、ヒドロキシシクロアルキル基、アルコキシシクロアルキル基、アミノアルキル基、アシルオキシル基、アルキルアミノアルキル基及びアルコキシカルボニル基からなる群から選択される。）で表される。
【００１３】
幾つかの実施態様において、前記化学式（Ｉ）の化合物は下式
【化５】
0005586673.tif 000006
の構造を持つ。
【００１４】
参考態様において、前記化学式（ＩＩ）で表される化合物は下式
【化６】
0005586673.tif 000007
（式中、ｍは１〜８の整数であり；Ｒ３は水素原子、アルキル基、置換アルキル基、シクロアルキル基、ハロ基、水酸基、アルコキシル基、アリール基、アリールオキシル基、置換アリール基及びアラルキルオキシル基からなる群から選択され；Ｒ５及びＲ６は、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、置換アリール基、アラルキル基、水酸基、アルコキシル基、ヒドロキシアルキル基、ヒドロキシシクロアルキル基、アルコキシシクロアルキル基、アミノアルキル基、アシルオキシル基、アルキルアミノアルキル基及びアルコキシカルボニル基からなる群からそれぞれ独立して選択される。）の構造を持つ。
【００１５】
参考態様において、前記化学式（ＩＩ）で表される化合物は下式
【化７】
0005586673.tif 000008
の構造を持つ。
幾つかの実施態様において、前記ニューロトロフィンは神経成長因子（NGF）である。
幾つかの実施態様において、前記β−ターンループは前記ＮＧＦのループ１である。
【００１６】
参考態様において、前記化合物は下式
【化８】
0005586673.tif 000009
で表される。
幾つかの実施態様において、前記化合物は、ｐ７５ＮＴＲ受容体分子のニューロトロフィン結合部位に対する結合特異性を持つ。
幾つかの実施態様において、前記化合物は、ｐ７５ＮＴＲ受容体分子に対する結合特異性を持つ親化合物の誘導体からなり、この誘導体もｐ７５ＮＴＲ受容体に対する結合特異性を持つ。
幾つかの実施態様において、前記誘導体は、親化合物と比較して、親水性、親油性、両親媒性、溶解度、生体利用性及び肝臓での分解抵抗性からなる群から選択される特徴の少なくとも1つにおいて増強を示す。
【００１７】
前記化合物は、幾つかの実施態様において、下記化学式（Ｉ）、及び参考態様において、該化合物は下記化学式（ＩＩ）
【化２】
0005586673.tif 000010
（式中、ｎは０〜８の整数であり；Ｌ１及びＬ２は、アルキレン基、置換アルキレン基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、シクロアルケン基、置換シクロアルケン基、アリール基、置換アリール基、アルケニレン基及び置換アルケニレン基から成る群から選択される連結基であり；Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立して、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、シクロアルキル基、ハロ基、シアノ基、ニトロ基、メルカプト基、水酸基、アルコキシル基、アリール基、アリールオキシル基、置換アリール基及びアラルキルオキシル基からなる群からそれぞれ選択され；Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４及びＡ５は、それぞれ独立して、Ｎ原子及びＣＨ基からなる群から選択され；Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４及びＢ５は、それぞれ独立して、Ｏ原子、Ｓ原子及びＮＲ４基（式中、Ｒ４は水素原子、アルキル基、置換アルキル基、シクロアルキル基、アリール基及び置換アリール基からなる群から選択される。）からなる群から選択され；Ｄ１及びＤ２は下記群
【化３】
0005586673.tif 000011
（式中、各Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、独立して、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、置換アリール基、アラルキル基、ヒドロキシルアルキル基、ヒドロキシシクロアルキル基、アルコキシシクロアルキル基、アミノアルキル基、アシルオキシル基、アルキルアミノアルキル基及びアルコキシカルボニル基からなる群から選択され；各Ｒ７は独立して水素原子、水酸基、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、アシルオキシル基及びアルコキシル基からなる群から選択され；又はＲ７及びＲ５若しくはＲ７及びＲ９は共にＣ２〜Ｃ１０のアルキル基、Ｃ２〜Ｃ１０の水酸化アルキル基又はＣ２〜Ｃ１０のアルケン基を表す。）から選択される。）のいずれかの化合物から選択され、又はその医薬的に許容された塩であり、ただし化学式（Ｉ）の化合物は下記化合物
【化５】
0005586673.tif 000012
ではなく、かつ化学式（ＩＩ）の化合物は下記化合物
【化７】
0005586673.tif 000013
ではない。
【００１８】
本明細書に開示した対象の目的は、ニューロトロフィン類似体を用いて、細胞生存を促進する方法を提供することである。
以下に説明されているように、本書に添付した実施例及び図と関係して、既述の及び本明細書に開示した、全体及び部分で扱われている対象の目的及び他の目的は、記載が進むにつれ明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１ａ】表示されたβ−ターンループ１，２及び４を持つヒトＮＧＦのＸ−線結晶構造のリボン表現を示す。ループ１に対する平均側鎖部位を図示する。
【図１ｂ】表示された動物種から得たＮＧＦ及びＮＴ３からのループ１のペプチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−３）の比較及び薬理作用団（ファーマコフォア）の指定を示す。正にイオン化可能な残基を"＋"で表示する。"ＨＢＤ"及び"ＨＢＡ"はそれぞれ、水素結合供与体及び水素結合受容体である。
【図１ｃ】薬理作用団の特徴を３Ｄループモデルに応用したものを示す。水素結合フィーチャー（Ｆｅａｔｕｒｅ）は、受容体及び供与体の配置を示す相対部位をもつ球面体で表示されている。一つの球体は、モデルにおける推測上の受容体／供与体フィーチャーの中央に置かれ、その一方で、他方の球体は、相互作用可能な全ての分子上の相補的フィーチャーの標的配置を示す。球の直径は、３Ｄ配座ライブラリースキャンにおける化学的フィーチャーマッチングに対する、空間的許容度を示す。
【図１ｄ】本明細書で開示したように、ライブラリースクリーニングによって活性であると分かった、新しい薬理作用団を適用して同定された２つの化合物の薬理作用団への代表的フィットを開示する３Ｄループモデルを示す。
【００２０】
【図２ａ】培地のみ又はＢＤＮＦ又は化合物１（図の中では"ＬＭ１１Ａ−２８"又は"２８"と呼ばれる）、２（図の中では"ＬＭ１１Ａ−７"又は"７"と呼ばれる）３，（図において"ＬＭ１１Ａ−２４"又は"２４"と呼ばれる）、４（図において"ＬＭ１１Ａ−３１"又は"３１"と呼ばれる）又は５（図において"ＬＭ１１Ａ−３６"又は"３６"と呼ばれる）を含む培地で処理した、Ｅ１６−１７マウス海馬神経細胞培養の一連の蛍光顕微鏡写真を示す。培養細胞は、処理４８時間後の神経細胞特異的、生長関連タンパク質ＧＡＰ４３の発現のために染色された。各化合物の２Ｄ構造は、各画像に隣接して位置する。
【図２ｂ】ＢＤＮＦ，ＮＧＦ，及び化合物１〜５に対する神経細胞の一連の投与量応答の生存率曲線を示す。同程度の力価を得及び５ｎＭまでＮＧＦ及び化合物１〜４の間で最大応答を得たが、化合物５では応答がなかった。ＢＤＮＦは同様の力価を持つが、より高い最大応答を示す。各化合物１〜５は、５ｎＭ以上では減少する応答を示した。生存数は形態学的に無傷でまた青色ホルマザンＭＴＴ−変換生成物を含むウェル（穴）の中の全細胞数により測定した(Longo,F.M.,Manthorpe,M.,Xie,Y.M.,及びVaron,S.(1997)J Neurosci Res48,1-17)。計数を２５ｎｇ／ｍｌＢＤＮＦ存在下の生存数又はベースライン生存数を使って標準化した。全ての測定についてｎは４〜１８である。標識記号及びバーは平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍ．を示し、またラインはデーターを単純指数関数上昇モデルで近似したものである。各グラフの点線は、挿入したＮＧＦ応答を表す。
【００２１】
【図３ａ】化合物４の濃度を増加させた場合の、ＮＧＦ ＥＬＩＳＡで測定した、一連のＮＧＦ／ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃ結合曲線を示す。標識記号は平均値＋／−標準誤差である。全ての測定について、ｎ＞１０である。ラインは化合物４に対して、全体としてのＲ２値が０．９３である変法Ｇａｄｄｕｍ／Ｓｃｈｉｌｄ式にフィットさせた。また、０ｎＭ化合物での結合曲線と、＞５００ｎＭ化合物４での曲線間の比較のための、ポストホックＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ／Ｄｕｎｎ検定を持つＡＮＯＶＡによりＰ＜０．０００１である。化合物不在のＮＧＦに対するＫＤは０．８−０．９ｎＭ(Nykjaer,A.その他,(2004)Nature 427,843-848)であり、約１ｎＭという以前の論文と合致する。標識記号"●"、"▽"，"■"，"◇"，"▲"，及び"○"は、それぞれ化合物４濃度、ゼロ、１２５，５００，１，５００，４５００及び１０，０００ナノモルを表す。
【図３ｂ】化合物３の濃度を増加させた場合の、ＮＧＦ  ＥＬＩＳＡで測定した、一連のＮＧＦ／ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃ結合曲線を示す。標識記号は平均値＋／−標準誤差である。全ての測定について、ｎ＞１０である。ラインは化合物３に対して、全体としてのＲ２値が０．９６である変法Ｇａｄｄｕｍ／Ｓｃｈｉｌｄ式にフィットさせた。また、０ｎＭ化合物での結合曲線と、＞１２５ｎＭ化合物３での曲線の間の比較のための、ポストホックＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ／Ｄｕｎｎ検定を持つＡＮＯＶＡによりＰ＜０．０００１である。化合物不在のＮＧＦに対するＫＤは０．８−０．９ｎＭ(Nykjaer,A.その他,(2004)Nature 427,843-848)であり、約１ｎＭという以前の論文と合致する。標識記号"●"、"▽"，"■"，"◇"，"▲"，及び"○"は、それぞれ化合物３濃度、ゼロ、１２５，５００，１，５００，４５００及び１０，０００ナノモルを表す。
【００２２】
【図３ｃ】化合物５の濃度を増加させた場合の、一連のＮＧＦ／ＴｒｋＡ−Ｆｃ結合曲線を示す。１０，０００ｎＭまで顕著な効果が見られない。標識記号は平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍ．である。全ての測定についてｎ＞１０である。標識記号"●"、"▽"，"■"は、それぞれ、化合物５の濃度０，４，５００及び１０，０００ナノモルを表す。
【図３ｄ】化合物４の濃度を増加させた場合の、一連のＮＧＦ／ＴｒｋＡ−Ｆｃ結合曲線を示す。１０，０００ｎＭまで化合物の効果が見られない。標識記号は平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍ．である。全ての測定についてｎ＞４である。標識記号"●"、"▽"，"■"は、それぞれ、化合物４の濃度０，４，５００及び１０，０００ナノモルを表す。
【図３ｅ】化合物３の濃度を増加させた場合の、一連のＮＧＦ／ＴｒｋＡ−Ｆｃ結合曲線を示す。１０，０００ｎＭまで化合物の効果が見られない。標識記号は平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍ．である。全ての測定についてｎ＞４である。標識記号"●"、"▽"，"■"は、それぞれ、化合物３の濃度０，４，５００及び１０，０００ナノモルを表す。
【図３ｆ】抗ｐ７５ＮＴＲ発現３Ｔ３細胞から、化合物５ではなく、化合物４による抗ｐ７５ＮＴＲＡｂ９６５１の排除を示すウェスタンブロットのディジタル画像を示す。上部のパネルはＩｇＧ重鎖を示し、下部のパネルはβ−アクチンを示す。このグラフは計量結果を示す。バーは結合抗体（レーン４）に標準化した平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍ．を示す。各条件に対しｎ＝４である。単一星印（＊）は、化合物無しの場合の結合量と比較しての、ステューデントｔ−検定によるＰ＜０．０００５を示す。抗体及び化合物処理は、各レーンに示されている。Ａｂ９６５１はｐ７５ＮＴＲ−ネガティブ細胞では結合しない（レーン１及び２）。Ａｂ９６５１はｐ７５ＮＴＲ−ポジティブ（陽性）細胞に結合し（レーン４）、また化合物４により顕著に排除される（レーン５）が、化合物５は効果がない（レーン６）。
【００２３】
【図３ｇ】Ａｂ９６５１がベースライン生存率（ＣＭ）に効果が無く、ＢＤＮＦを部分的に阻害し、また化合物３及び化合物４による海馬神経細胞生存率の増加を完全に抑えることを示す棒グラフである。黒色の棒は非免疫血清処理を表す。灰色の棒はＡｂ９６５１処理を示す。バーは平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍ．を意味する。各条件に対しｎ＞２６である。二重星印（＊＊）は（Ａｂ９６５１と非免疫の場合の間の比較に対し）Ｐ＜０．００００１を示す。ＮＳはステューデントｔ−検定で顕著でないことを示す。ＢＤＮＦ＋Ａｂ９６５１存在下での生存率は、ＣＭ＋Ａｂ９６５１下での生存率よりも顕著に高い（Ｐ＜０．００００１）が、抗体存在下でのＣＭと化合物３，４及び５の間の差異は有意ではない。
【図３ｈ】ｐ７５ＮＴＲ欠失はＢＤＮＦを部分的に阻害し、またＮＧＦ，化合物３及び化合物４による海馬神経細胞生存率の増加を完全に阻害することを示す棒グラフである。ニューロトロフィンは１．８ｎＭで適用され、化合物は５ｎＭで適用された。黒色の棒はｐ７５ＮＴＲ＋／＋細胞を示す。灰色の棒は、ｐ７５ＮＴＲ−／−細胞を示す。バーは平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍ．を表す。各条件において、ｎ＞５である。単一星印（＊）はＰ＜０．０５を表し、二重星印（＊＊）はＰ＜０．００５を示す。ＮＳは（ノックアウト及び野生型の比較において）ステューデントｔ−検定により有意でないことを示す。ｐ７５ＮＴＲ−／−培養細胞において、ＢＤＮＦ処理はＮＧＦ（Ｐ＜０．０５）、又は化合物３〜５（Ｐ＜０．０１）よりも高い生存率をもたらした。ゲノムタイプの間では、ベースライン生存率と有意な差異がなかった。
【図３ｉ】全ＴｒｋＢと比較した、抗リン酸化ＴｒｋＹ４９０を用いた、海馬神経培養細胞のウェスタンブロットのディジタル画像を示す。ＢＤＮＦがＴｒｋＢを活性化したが、ＮＧＦ及び化合物３〜５は、１０分又は３０分後に、検知できる活性化をもたらさなかった。
【図３ｊ】全ＴｒｋＡと比較した、抗リン酸化ＴｒｋＹ４９０を用いたＴｒｋＡ発現３Ｔ３細胞のウェスタンブロットのディジタル画像を示す。ＮＧＦはＴｒｋＡを活性化することが示されているが、化合物４は測定できる活性化を示さなかった。ＴｒｋＢ及びＴｒｋＡ活性化についての、２種の独立した検定結果は同一であった。
【００２４】
【図４】図４ａ〜４ｄは、培地（Ｃ），５０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ（Ｂ）、５０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ（Ｎ），又は２０ｎＭの化合物３〜５で処理した海馬神経培養細胞の抽出物のウェスタンブロットのディジタル画像を示し、リン酸化したシグナリング因子（白抜きの矢印）及び対応する全因子（黒色の矢印）に対応する代表的なバンドを示し、また活性化度を示す全因子に対するリン酸化因子の比の計量結果を示す。バーは平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍ．を示す。黒色棒は１０分後のサンプリングを表す。灰色棒は３０分後のサンプリングを表す。各計量値は独立したｎ＝６ブロットによる。単一星印（＊）は、ＣＭと比較した時の、ステューデントｔ−検定によるＰ＜０．００１を表わす。他の比較に関しては、各ブラケットの上に示すようにステューデントｔ−検定によるＰ値を示す。  図４ａは、ＮＦκＢ−ｐ６５活性化解析を示すウェスタンブロットのディジタル画像を示し、全ての生物学的活性化処理に対して同様の活性化速度を示す。  図４ｂは、ＡＫＴ活性化解析を示すウェスタンブロットのディジタル画像を示し、ＮＧＦに比べて活性化合物による活性化には短いラグタイムがあることを示す。  図４ｃは、ＥＲＫ４４活性化解析を示すウェスタンブロットのディジタル画像を示し、ＮＧＦに比べ化合物は１０分後では活性化度が低いことを示す。  図４ｄは、ＥＲＫ４２活性化解析を示すウェスタンブロットのディジタル画像を示し、ＮＧＦ及び化合物３〜５に比べ、ＢＤＮＦ処理は活性化が持続することを示す。  図４ｅは、シグナリング経路阻害剤及びＢＤＮＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）、ＮＧＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）又は化合物３〜５（５ｎＭ）で処理した培養海馬神経細胞の生存率を示す棒グラフであり、ＮＦκＢ及びＰ１３Ｋ経路阻害剤による大幅な阻害、ＢＤＮＦ及びＮＧＦ活性化阻害へのＥＲＫの小効果及び化合物３〜５の活性化阻害へのＥＲＫの無効果を示す。ＳＮ５０は、ＮＦκＢ転位阻害剤である。ＬＹは、Ｐ１３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２を示す。ＰＤは、ＥＲＫ阻害剤である、ＰＤ９８０５９を示す。平均値＋ｓ．ｅ．ｍ．を示す各バーについてｎ＝１８である。ＮＳは、データが有意でないことを示す。各群の対照（阻害剤なし）に比較し、単一星印（＊）はＰ＜０．０５，二重星印（＊＊）はＰ＜０．００１を示す。白抜き、黒色、淡灰色及び深灰色棒は、それぞれ、対照、ＳＮ５０，ＬＹ及びＰＤを表わす。  図４ｆは、ＮＦκＢ経路活性化のシグナリング活性解析のウェスタンブロットのディジタル画像である。バーは平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍ．を示す。各条件に対しＮ＞６．Ｐ値は示されている。活性化は０及び０．５ｎＭ ＮＦκＢの間で検知され、５ｎＭでプラトーになる。  図４ｇは、ＡＫＴ経路活性化のシグナリング活性解析のウェスタンブロットのディジタル画像である。バーは平均値＋／−標準誤差を示す。各条件に対しｎ＞６．Ｐ値は示されている。活性化はＡＫＴの０．５及び１ｎＭの間で検知され、５ｎＭでプラトーになる。  図４ｈは、ｐ７５ＮＴＲ−／−細胞において、成長因子及び化合物によるＡＫＴ活性化を示すウェスタンブロットのディジタル画像である。各条件に対しｎ＞９である。培地のみと、ＮＧＦ又は化合物３〜５の間には有意な差が無かった。
【００２５】
【図５ａ】化合物３〜５が成熟した希突起膠細胞の死を促進せず、プロＮＧＦ誘導の死を阻害することを示す棒グラフである。成熟した希突起膠細胞は、指定されたように処理され、やはりＴＵＮＥＬポジティブであるＭＢＰ−ポジティブ細胞の割合を測定して、細胞死を検定した。プロＮＧＦなしでは、化合物は細胞死を促進しなかった。２．８ｎｇ／ｍｌ（０．０５ｎＭ）のプロＮＧＦ存在下で、化合物５ではなく、化合物３及び化合物４は、細胞死を阻害した。バーは平均値＋ｓ．ｅ．ｍ．を表わす。プロＮＧＦ存在下で１ｎＭ化合物５の場合（単一測定）を除き、各条件についてｎ＞２であった。化合物非存在下でプロＮＧＦ処理と比較し、ステューデントｔ−検定によりＰ＜０．０５であった。黒色、淡灰色及び深灰色棒はそれぞれ化合物３，４及び５を示す。
【図５ｂ】化合物３及び４によるｐ７５ＮＴＲからのプロＮＧＦの排除を示す線グラフである。１００ｎｇ／ｍｌプロＮＧＦを表示した濃度の化合物と共にインキュベートし、ＥＬＩＳＡにより検知した。各条件についてｎ＝４である。標識記号は平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍ．を示す。全ての化合物処理の試料からのシグナルは、プロＮＧＦ単独の結果より、ステュデントｔ−検定によるＰ＜０．０１を持って、顕著に低かった。標識記号"Δ"及び"●"はそれぞれ化合物４及び化合物３を表わす。
【図６ａ】Ａβ１−４２（１０μＭ又は３０μＭ）添加後の海馬神経細胞の生存率を示す棒グラフを示す。Ａβ１−４２を添加して３日間処理後、神経細胞は約４０％失われた。ＮＧＦ（１００ｐｇ／ｍｌ）の添加により、Ａβ１−４２に対する防護効果はなかった。
【図６ｂ】テスト化合物と共にＡβ１−４２（１０μＭ）添加した後の海馬神経細胞の生存率を示す棒グラフを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本明細書では以下の略語を用いる。
２Ｄ：２次元の；３Ｄ：３次元の；Ａβ：アミロイド−β；Ａｂ：抗体；ＡＤ：アルツハイマー病；ＢＣＡ：ビシンコニン酸；ＢＤＮＦ：脳由来の神経栄養因子；ｂ．ｉ．ｄ．：１日２回；ｃｍ：センチメートル；ｄ：日；Ｄ：ダルトン；ＤＭＥＭ：ダルベッコ変法イーグル培地；ＥＣＬ：電気発生化学発光；ＥＤＴＡ：エチレンジアミン４酢酸；ＥＬＩＳＡ：固相酵素免疫測定法；ＥＲＫ：細胞外シグナル制御タンパク質キナーゼ；ＦＢＳ：仔牛胎児血清；ｇ：グラム；ｈ：時間；ＨＢＡ：水素結合受容体；ＨＢＤ：水素結合供与体；ＨＥＰＥＳ：４−２−ヒドロキシエチル−１−ピペラジンエタンスルホン酸；ＨＲＰ：セイヨウワサビペルオキシダーゼ；ＩｇＧ：免疫グロビンＧ；ＩＰ：腹腔内の；ＩＶ：静脈内；Ｋ３２：３２番目リジン残基；ｋｃａｌ：キロカロリー；ｋｇ：キログラム；ＭＢＰ：ミエリン塩基性タンパク質；ｍｇ：ミリグラム；ｍｉｎ：分；ｍｌ：ミリリットル；ｍＭ：ミリモル；ｍｏｌ：モル；ＭＴＴ：３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物；ＭＷ：分子量；ＮａＣｌ：塩化ナトリウム；ｎｇ：ナノグラム；ｎＭ：ナノモル；ＮＳ：有意でない；ＮＭＲ：核磁気共鳴；ＮＧＦ：神経成長因子；ｎＭ：ナノモル；Ｐ：確率；ｐ７５ＮＴＲ：ｐ７５神経栄養受容体；ＰＢＳ：リン酸緩衝塩；ｐｍｏｌ：ピコモル；ＰＭＳＦ：フェニルメチルスルホニルフッ化物；ＰＯ：経口の（口から）；ｐｒｏ−ＮＧＦ：ＮＧＦの非処理の前駆体；ＰＶＤＦ：ポリビニリジンジフッ化物；ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム；ＳＥ：標準誤差；ｓ．ｅ．ｍ．：測定の標準誤差；Ｔｒｉｓ：２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール；ＴＵＮＥＬ：末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介デオキシウリジン３リン酸ニック−エンドラベリング；μｇ：マイクログラム；μｌ：マイクロリットル；μＭ：マイクロモル；％：パーセント；℃：摂氏度；＞：と等しく又はより大きく；＞：より大きく；＜：と等しく又はより小さく；＜：より小さく
【００２７】
神経変性疾患及び他の疾患に関わる患者では、ニューロトロフィン局在性、ニューロトロフィン発現レベル、ニューロトロフィンと結合する受容体の発現レベル及び／又は受容体シグナリングの変化及び機能的転帰が生ずる。従って、細胞変性又は機能障害を防ぐために、上記の疾患に罹る患者に、ｐ７５ＮＴＲ機能又はプロＮＧＦ／ＮＧＦ結合を変化させる、対応するニューロトロフィン因子、又はこの類似体を提供することで、この様な神経変性疾患は緩和されるか、又は予防できる。本明細書に初めて開示したように、神経変性疾患又は他の疾患を治療する方法及び／又はｐ７５ＮＴＲ受容体分子に結合特異性をもつ化合物を投与することにより細胞生存を促進する方法を提供する。
【００２８】
本明細書において開示した対象物の方法及び化合物は、ｐ７５ＮＴＲ受容体分子に対する結合特異性を有する化合物に関する。本明細書で用いたように、ｐ７５ＮＴＲ受容体に結合特異性を有する化合物のコンピューターによるスクリーニングによる発見は、神経及び他の細胞の生存をポジティブに制御するに適している。詳しくは、ニューロトロフィンに対し栄養性応答を示す細胞、又は構成的又は障害又は疾患に応答してｐ７５ＮＴＲを発現する細胞において、上記化合物は生存シグナリングを促進する。ニューロトロフィン誘導による細胞死を起こしやすい細胞には、上記化合物はアポトーシスを誘導せず、ニューロトロフィンが介する細胞死を阻害する。
【００２９】
Ｉ．定義
本明細書で用いる用語は詳細な実施態様を記載する目的のためであり、制限付きでないことを理解されたい。
もし別に定義されなければ、本明細書で用いた全ての技術的及び科学的用語は、本明細書で開示した対象物に関わる同業者の１人に通常理解される意味と同じである。本明細書に記載した事柄と同様又は等価な全ての方法及び物質は、本明細書に開示した対象物の実施又は試験において用いることができるが、本明細書では代表的な方法及び物質を記載する。
長年にわたる特許法協定に従い、原文の"不定冠詞−ある（a, an）""定冠詞−その（the）"は、クレイムを含む本出願で用いられる場合、"１又は２以上"を意味する。従って、例えば、"ある担体"は、１又は２以上の担体の混合物、２又は３以上の担体の混合物、等々を表す。
もし別途示されなければ、明細書及び請求の範囲で用いられる構成要素の量、反応条件、等々を表す全ての数は、用語"約"で全ての事例において修正されると理解すべきである。従って、それと反対に示されない場合は、本明細書及び添付した請求の範囲に述べられた数字的なパラメーターは、本明細書に開示された対象物により見出された好ましい特性によって変わりうる近似的なものである。
重さ、時間、投与量、その他の量のような測定しうる値に関して、本明細書で用いられた、用語"約"は、特定の値から、或る例では±２０％又は±１０％、他の例では±５％、更に他の例では±１％、更にまた他の例では±０．１％の変化量を含み、この様なものとして、この様な変化量は開示した方法を実行する上で適切である。
【００３０】
本明細書に使用されているように、用語"神経変性疾患"は、神経障害により特徴付けられる全ての疾患を含み、また制限付けることなく、次のアルツハイマー病、ハンチントン病、ピック病、筋萎縮性側索硬化症、てんかん、パーキンソン病、脊髄損傷、脳梗塞、低酸素症、虚血症、脳障害、糖尿病性神経障害、糖尿病性神経障害、神経移植、多発性硬化症、末梢神経障害、ｐ７５を発現する細胞の変性又は機能不全を伴う病気及び脱毛症のようなｐ７５ＮＴＲ発現細胞の変性を伴う他の病気を含む。
【００３１】
本明細書で用いるように、用語"アルキル基"は、線状の（即ち"直鎖の"）、分枝状の、又は環状の（"シクロアルキル基"）、飽和又は少なくとも部分的にまたある場合は完全に不飽和な（即ち、アルケニル基及びアルキニル基）炭化水素鎖を包含するＣ１〜２０を表し、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、エテニル基、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、オクテニル機、ブタジエニル基、プロピニル基、メチルプロペニル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル機、ヘプチニル基及びアレニル基が挙げられる。"分枝した"とは、メチル基、エチル基、又はプロピル基のような、低級アルキル基が直鎖状のアルキル鎖に付加したアルキル基を表す。"低級アルキル基"は、例えば、１，２，３，４，５，６，７，又は８炭素原子のような、１〜約８までの炭素原子、を有するアルキル基（即ち、Ｃ１−８アルキル基）を表す。"高級アルキル基"は、例えば、１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，又は２０炭素原子、の様な約１０〜約２０の炭素原子を持つアルキル基を表す。或る実施態様において、"アルキル基"は、特に、Ｃ１〜８直鎖アルキル基を表す。別な実施態様において、"アルキル基"は、特に、Ｃ１〜８分岐鎖アルキル基を表す。
【００３２】
アルキル基は、任意に、１又は２以上の、同一又は異なってもよいアルキル基置換基により置換できる（"置換アルキル基"）。"アルキル基の置換基"としては、アルキル基、置換アルキル基、ハロ基、アリールアミノ基、アシル基、水酸基、アリールオキシル基、アルコキシル基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アラルキルオキシル基、アラルキルチオ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、オキソ基及びシクロアルキル基が挙げられるが、これらに制限されない。任意に、アルキル鎖にそって１又は２以上の酸素原子、イオウ原子又は置換又は非置換の窒素原子を挿入できるが、ここで窒素置換基は、水素原子、低級アルキル基（以下"アルキルアミノアルキル基"と呼ぶ）又はアリール基である。
この様に、本明細書で用いられるように、用語"置換アルキル基"は、ここで定義されたように、１又は２以上の原子又はアルキル基の官能基が、他の原子又は官能基で置き換えられたアルキル基を含み、例えば、アルキル基、置換アルキル基、ハロゲン原子、アリール基、置換アリール基、アルコキシル基、水酸基、ニトロ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、硫酸塩基及びメルカプト基が挙げられる。
【００３３】
さらに、本明細書で用いるように、用語アルキル基及び／又は"置換アルキル基"には、"アリル基"又は"アリル型基"が含まれる。用語"アリル型基"又は"アリル基"は、−ＣＨ２ＨＣ＝ＣＨ２基及び置換により作られたその誘導体を表わす。用語アルキル基及び／又は"置換アルキル基"は、アリル基、メチルアリル基、ジメチルアリル基、等々のようなアリル基を含むが、これらに制限されない。用語"アリル位"又は"アリル部位"は、アリル型基の飽和した炭素原子を表す。従って、アリル位に付加する水酸基又は他の置換基のような官能基は、"アリル型基"と表わす。
【００３４】
本明細書で用いる用語"アリール基"は、互いに縮合し、共有結合で連結した、又はメチレン基又はエチレン基部分のような、しかしこれらに制限されない、共通の官能基に結合した単一の芳香族環、又は、多環の芳香族環であることができる芳香族置換基を指す。共通の連結基はまた、ベンゾフェノンの場合のようなカルボニル基、又はジフェニルエーテルにおけるような酸素分子、又はジフェニルアミンにおけるような窒素分子でもあることができる。用語"アリール基"は、特に、複素環式芳香族化合物を含む。芳香族環は、例えば、フェニル基、ナフチル基、ビフェニル基、ジフェニルエーテル基、ジフェニルアミン基及びベンゾフェノン基からなる。特別な実施態様において、用語"アリール基"は、約５〜約１０の炭素原子、例えば、５，６，７，８，９又は１０炭素原子、からなる環状芳香族を意味し、また５−及び６−員環炭化水素及び複素環式芳香族環を含む。
【００３５】
アリール基は同一又は異なる１又は２以上のアリール基置換基で任意に置換しうる（"置換アリール基"）。"アリール基の置換基"としては、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、アラルキル機、水酸基、アルコキシル基、アリールオキシル基、アラルキルオキシル基、カルボキシル基、アシル基、ハロ基、ニトロ基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アラルコキシカルボニル基、アシルオキシル基、アシルアミノ基、アロイルアミノ基、カルバモイル基、アルキルカルバモイル基、ジアルキルカルバモイル基、アリールチオ基、アルキルチオ基、アルキレン基及び−ＮＲ'Ｒ''基を含み、ここでＲ'及びＲ''は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基及びアラルキル基であってもよい。
【００３６】
従って、本明細書で用いられたように、用語"置換アリール基"は、本明細書で定義されたようなアリール基を含み、前記アリール基の１又は２以上の原子又は官能基は、他の原子又は、例えば、アルキル基、置換アルキル基、ハロゲン原子、アリール基、置換アリール基、アルコキシル基、水酸基、ニトロ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、硫酸塩基及びメルカプト基を含む、官能基と置き換えうる。
アリール基の特別な例としては、シクロペンタジエニル基、フェニル基、フラン基、チオフェン基、ピロール基、ピラン基、ピリジン基、イミダゾール基、ベンジミダゾール基、イソチアゾール基、イソキサゾール基、ピラゾール基、ピラジン基、トリアジン基、ピリミジン基、キノリン基、イソキノリン基、インドール基、カルバゾール基、等々が挙げられるが、これらに制限されない。
【００３７】
本明細書で用いる、次のような化学式で表される構造：
【化９】
0005586673.tif 000014
は、環状構造を表し、例えば、置換基Ｒを含む、３−炭素、４−炭素、５−炭素、６−炭素等々の脂肪族及び／又は芳香族環状化合物を表わすが、ここでＲ基は、存在しても、存在しなくともよく、存在する場合は、１又は２以上のＲ基は各々、環状構造の１又は２以上の可能な炭素原子上で置換されるものであるが、上記の環状化合物に制限されない。Ｒ基が存在するか否か及びＲ基の数は、整数ｎ値で決められる。各Ｒ基は、もし１以上ならば、他のＲ基上ではなく、環状構造の可能な炭素原子上で置換される。例えば、ｎが０〜２の整数である構造：
【化１０】
0005586673.tif 000015
は、以下の化合物群：
【化１１】
0005586673.tif 000016
等々を含むが、これらに制限されない。
【００３８】
ｎが１である、構造：
【化１２】
0005586673.tif 000017
は、以下のような化合物：
【化１３】
0005586673.tif 000018
を含み、ここで、１つのＲ置換基は、他の表示された置換基により占領されてないベンゾフラン親構造上のどの炭素原子にも付加することができて、上記の場合は、炭素原子６はＸで置換され、また炭素原子２はＹで置換されている。
【００３９】
環状（環）構造において結合を表す破線は、その結合が環上に存在しても、しなくとも良いことを示す。環状構造において結合を表す線が破線であることは、環状構造が飽和環状構造、部分飽和環状構造及び不飽和環状構造からなる群から選択されることを意味する。
幾つかの実施態様において、本出願で開示された対象物により記述された化合物は、連結基を持つ。本明細書に用いられるように、用語"連結基"は、２又は３以上の他の化学分子を結合させて安定した構造をもたらす化学的構成部分からなる。代表的な連結基としては、２又は３以上のアリール基を連結させるフラニル基、フェニレン基、チエニル基、又はピローリル基が挙げられるが、これらに制限されない。
芳香族環又は複素環式芳香族環の指定された原子が"存在しない"と規定された場合、指定された原子は直接結合により置き換えられる。連結基又はスペーサー基が存在しないと規定された場合、連結基又はスペーサー基は直接結合により置き換えられる。
【００４０】
"アルキレン基"は、例えば、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，又は２０個の炭素原子である、１〜約２０個の炭素原子を持つ、直鎖型又は分枝型の２価の脂肪族炭化水素群を表わす。アルキレン基は直鎖、分枝又は環状であることができる。アルキレン基もまた、任意に、不飽和であり、及び／又は１又は２以上の"アルキル基置換基"により置換されていてもよい。アルキレン基に沿って、任意に、１又は２以上の酸素原子、イオウ原子、又は置換又は非置換窒素原子（これはまた"アルキルアミノアルキル基"とも呼ばれる）とが挿入され、ここで窒素置換基は既述のようにアルキル基でアラルキレン基の例としては、メチレン（−ＣＨ２−）基；エチレン（−ＣＨ２−ＣＨ２−）基、プロピレン（−（ＣＨ２）３−）基；シクロへキシレン（−Ｃ６Ｈ１０−）基；−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−基；−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−基；−（ＣＨ２）ｑ−Ｎ（Ｒ）−（ＣＨ２）ｒ−基があり、ここでｑ及びｒの各々は、独立して０〜約２０の整数であり、例えば、０，１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，又は２０であり、またＲは水素原子又は低級アルキル基：メチレンジオキシル（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）基；及びエチレンジオキシル（−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−）基でアラルキレン基は、約２〜３個の炭素原子を持ち、またさらに６〜２０個の炭素原子を持つことができる。
【００４１】
本明細書で用いるように、用語"アシル基"は、そのカルボキシル基の−ＯＨ基が他の置換基に置き変えられた有機酸基を表す（例えば、ＲＣＯ−で代表されるように、Ｒは、本明細書で定義されたようなアルキル基又はアリール基である）。従って、用語"アシル基"は、特に、アセチルフラン基及びフェナシル基のようなアリールアシル基を含む。アシル基の特別な例は、アセチル基及びベンゾイル基である。
【００４２】
"環状"及び"シクロアルキル"は、例えば、３，４，５，６，７，８，９又は１０個の炭素原子のような、約３〜約１０個の炭素原子の非芳香族型モノ又はマルチ環状系を指す。シクロアルキル基は任意に部分的に不飽和であることができる。シクロアルキル基は、また任意に、本明細書で定義したようにアルキル基置換基で置換することができる。環状アルキル鎖に沿って、１又は２以上の酸素原子、イオウ原子、又は、窒素置換基が水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、又は置換アリール基である置換、又は非置換の窒素原子を任意に挿入でき、このようにして複素環式基を提供する。代表的なモノサイクリックなシクロアルキル環としてはシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロへキシル基、シクロヘプチル基、等々があるが、これらに制限されない。更に、シクロアルキル基は、任意に既述のように定義されたアルキレン基、例えばメチレン基、エチレン基、プロピレン基等々、のような、連結基で、任意に、置換できる。この様な場合、シクロアルキル基は、例えば、シクロプロピルメチル基及びシクロブチルメチル基等々を指す。更に、多環シクロアルキル環としては、アダマンチル基、オクタヒドロナフチル基、デカリン、樟脳、カンファン及びノラダマンチルがある。
【００４３】
"アルコキシル基"又は"アルコキシアルキル基"はアルキル−Ｏ−基を指し、ここでアルキル基は既述の通りである。本明細書で用いる"アルコキシル基"は、炭素数が１〜２０であってもよく、直鎖型、分枝型、又は環状、飽和又は不飽和オキソ炭化水素鎖を含むことができ、例えば、メトキシル基、エトキシル基、プロポキシル基、イソプロポキシル基、ブトキシル基、ｔ−ブトキシル基及びペントキシル基が挙げられる。
"アリールオキシル基"はアリール−Ｏ−基を指し、ここでアリール基は、既述の通りであり、置換アリール基を含む。本明細書で用いる"アリールオキシル基"という語は、フェニルオキシル基、又はヘキシルオキシル基及びアルキル基、置換アルキル基、ハロ基又はアルコキシル置換フェニルオキシル基又はヘキシルオキシル基を指すことができる。
"アラルキル基"はアリール−アルキル−基を指し、ここでアリール基及びアルキル基は既述の通りであり、置換アリール基及び置換アルキル基を含む。アラルキル基の例としては、ベンジル基、フェニルエチル基、又はナフチルメチル基がある。
"アラルキルオキシル基"は、アラルキル−Ｏ−基を指し、ここでアラルキル基は既述の通りでアラルキルオキシル基の例としては、ベンジルオキシル基がある。
【００４４】
"ジアルキルアミノ基"は−ＮＲＲ'基を指し、各Ｒ及びＲ'は、独立して既述の通りのアルキル基及び／又は置換アルキル基でアラルキルアミノ基の例としては、エチルメチルアミノ基、ジメチルアミノ基及びジエチルアミノ基がある。
"アルコキシカルボニル基"はアルキル−Ｏ−ＣＯ−基を指す。アルコキシカルボニル基の例としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ブチルオキシカルボニル基及びｔ−ブチルオキシカルボニル基がある。
"アリールオキシカルボニル基"はアリール−Ｏ−ＣＯ−基を指す。アリールオキシカルボニル基の例としては、フェノキシ−及びナフトキシ−カルボニル基がある。
"アラルコキシカルボニル基"はアラルキル−Ｏ−ＣＯ−基を指す。アラルコキシカルボニル基の例としては、ベンジルオキシカルボニル基がある。
"カルバモイル基"はＨ２Ｎ−ＣＯ−基を指す。
【００４５】
"アルキルカルバモイル基"はＲ'ＲＮ−Ｏ−基を指し、ここでＲ及びＲ'の一つは水素原子であり、またＲ及びＲ'の他の一つは、既述の通りのアルキル基及び／又は置換アルキル基である。
"ジアルキルカルバモイル基"はＲ'ＲＮ−ＣＯ−基を指し、ここでＲ及びＲ'の各々は独立して既述の通りのアルキル基及び／又は置換アルキル基を表わす。
"アシルオキシル基"はアシル−Ｏ−基を指し、ここでアシル基は既述の通りである。
"アシルアミノ基"は、アシル−ＮＨ−基を指し、ここでアシル基は既述のとおりである。
用語"アルケニレン基"は、炭素−炭素二重結合を持つ非環式炭素鎖（即ち、開かれた鎖構造）を示し、１又は２以上の回数、任意に、置換できる、ＣｎＨ２ｎー２という化学式で表される。代表的なアルケニレン基としては、エテニレン基、プロペニレン基、１−又は２−ブテニレン基、１−又は２−ペンチレン基等々があるが、これらに制限されない。
"アロイルアミノ基"はアロイル−ＮＨ−基を指し、ここでアロイル基は既述の通りである。
【００４６】
用語"アミノ基"は、−ＮＨ２基を指す。
用語"カルボニル基"は、−（Ｃ＝Ｏ）−基を指す。
用語"カルボキシル基"は、−ＣＯＯＨ基を指す。
用語"シアノ基"は、−ＣＮ基を指す。
本明細書で用いられる用語"ハロ基"、"ハロゲン化物"又は"ハロゲン原子"は、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基及びヨード基を指す。
用語"水酸基"は、−ＯＨ基を指す。
用語"ヒドロキシアルキル基"は、１個の−ＯＨ基で置換されたアルキル基を指す。
用語"メルカプト基"は、−ＳＨ基を指す。
用語"オキソ基"は、１個の炭素原子が一個の酸素原子で置き換えられた、本明細書で既述の、化合物を指す。
用語"ニトロ基"は、−ＮＯ２基を指す。
用語"チオ基"は、１個の炭素原子又は酸素原子が、１個のイオウ原子で置き換えられた、本明細書に既述の、化合物である。
用語"硫酸塩基"は、−ＳＯ４基を指す。
【００４７】
用語"シクロアルケニル基"は、例えば、環当たり、３，４，５，６，７又は８炭素原子のように、環当たり３又は４以上の炭素原子を有する、１環、２環、３環又は４環を持つ、１又は２以上の環を有する部分的に不飽和な環状炭化水素基を指す。典型的なシクロアルケニル基としては、シクロプロペニル基、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基等々があるが、これらに制限されない。
用語"置換シクロアルケニル基"は、可能な付加部位に１又は２以上の置換基で、好ましくは１，２，３又は４置換基で、置換されたシクロアルケニル基を指す。典型的な置換基としては、アルキル基、置換アルキル基、ハロ基、アリールアミノ基、アシル基、水酸基、アリールオキシル基、アルコキシル基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アラルキルオキシル基、アラルキルチオ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、オキソ基及びシクロアルキル基があるが、これらに制限されない。
【００４８】
用語"独立して選択される"が用いられる場合、指定された置換基（例えば、Ｒ１及びＲ２基のようなＲ基又はＸ基及びＹ基）は同一又は異なる。例えば、Ｒ１及びＲ２ともに置換アルキル基である、又はＲ１は水素原子であり、Ｒ２は置換アルキル基である等々。
"Ｒ"、"Ｒ'"、"Ｘ"、"Ｙ"、"Ｙ'"、"Ａ"、"Ａ'"、"Ｂ"、"Ｌ"、又は"Ｚ"基は、本明細書において特に特定しない場合、名前を持つ官能基として当業者に認識される構造を一般的に持つ。表示の目的のために、上述のある代表的"Ｒ"，"Ｘ"及び"Ｙ"基は、以下のように定義される。これらの定義は、本開示を閲覧する通常の技術者にとって自明である定義を、補助し例示することを意図しており、除外するものではない。
【００４９】
本明細書で用いる用語"治療"は、動物又は哺乳動物、特にヒトの病気及び／又は（不健康）状態について全ての治療をカバーしており、また以下３点を含む：即ち（ｉ）病気、疾患及び／又は状態に罹りやすい、又は病気、疾患及び／又は状態を引き起こしうる作用因子に曝される危険性のあるヒトが病気、疾患及び状態に罹ることを防止すること；だが、この作用因子を持つと診断されてない；（ｉｉ）病気、疾患及び／又は状態を阻害すること、即ち、病気の伸展を止めること；
及び（ｉｉｉ）病気、疾患及び／又は状態を軽減すること、即ち、病気、疾患及び／又は状態からの回復を起こすこと。
【００５０】
用語"類似物"は、他の既知の化合物と同様な機能及び／又は構造特性を有する化合物、又は生物原料、即ちポリペプチド又はその断片、の既知の化合物のような、既知の化合物の断片を表わす。
"結合特異性"は、他のタンパク質又は他の種類の分子の相補的部位を認識し、相互作用することができる、蛋白質又は他の種類の分子の活性を表わす。
本明細書で用いる用語"薬理作用団"は、選択された生物効果、即ち、酵素の阻害、受容体への結合、イオンのキレーション等々、を発揮することができる分子部分の特別なモデル又は表現を指す。選択された薬理作用団は、１以上の生化学的効果を持つことができる、即ち一つの酵素の阻害剤であり、また第２の酵素の作用剤であることができる。治療薬は１又は２以上の薬理作用団を含み、これらは同一又は異なる生化学的活性を有する。
【００５１】
本明細書で用いられる用語"誘導体"は、親化合物と差異をつけるために化学的に修飾した化合物を指す。この様な化学的な修飾としては、例えば、水素原子をアルキル基、アシル機、又はアミノ基での置き換えを挙げることができる。誘導体は、例えば、グリコシル化、ペグ化、又は類似した工程で修飾可能であり、親化合物の少なくとも１個の生物学的又は免疫学的機能を保持する。
用語"親水性"は、水に対して親和性を持つ；水を直ちに吸収する及び／又は水に溶ける、の様にこの分野の共通のやり方で用いられる。
用語"親油性"は、脂質に対する親和性、脂質と結合する傾向、又は脂質に溶解可能であるとして、この分野共通のやり方で用いられる。
本明細書で用いられる用語"両親媒性"は、別々に、疎水性領域と、親水性領域を有する構造を表す。従って、構造の一部は水性媒体及び他の極性媒体と有利に相互作用し、構造の他の部分が非極性媒体と有利に相互作用する。
【００５２】
本明細書で用いられる用語"溶解度"は、特定の温度で、指定量の溶媒に溶ける溶質の最大量を表す。
本明細書で用いられる"生体利用性"は患者に投与された指定量の化合物の全体的利用度（即ち、血液／血漿中濃度）を指す。この用語は更に、作用部位に到達する化合物の速度及び、吸収率を含む。
【００５３】
ＩＩ．化合物
本出願で開示した対象物は、ｐ７５ＮＴＲ受容体分子に対する結合特異性を有する化合物を提供する。これらの化合物は、関係する医薬化合物及び方法と同様に、神経変性疾患及び他の疾患の治療及び予防に有用である。
開示した化合物を本明細書では下記のように標識する：
化合物１〜７の構造
【表１】
0005586673.tif 000019
【００５４】
【表２】
0005586673.tif 000020
【００５５】
【表３】
0005586673.tif 000021
【００５６】
ＩＩ．Ａ．構造
本出願に開示した対象物に従い、ｐ７５ＮＴＲ受容体分子に対する結合特異性を持つ、ニューロトロフィンβ−ターンループの参考化合物又は類似体は、下式
【化１】
0005586673.tif 000022
の化合物から選択される。
【００５７】
幾つかの実施態様において、下記化学式（Ｉ）、及び参考態様において、下記化学式（ＩＩ）
【化２】
0005586673.tif 000023
（式中、ｎは０〜８の整数であり；Ｌ１及びＬ２は、アルキレン基、置換アルキレン基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、シクロアルケン基、置換シクロアルケン基、アリール基、置換アリール基、アルケニレン基及び置換アルケニレン基から成る群から選択される連結基であり；Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立して、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、シクロアルキル基、ハロ基、シアノ基、ニトロ基、メルカプト基、水酸基、アルコキシル基、アリール基、アリールオキシル基、置換アリール基及びアラルキルオキシル基からなる群からそれぞれ選択され；Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４及びＡ５は、それぞれ独立して、Ｎ原子及びＣＨ基からなる群から選択され；Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４及びＢ５は、それぞれ独立して、Ｏ原子、Ｓ原子及びＮＲ４基（式中、Ｒ４は水素原子、アルキル基、置換アルキル基、シクロアルキル基、アリール基及び置換アリール基からなる群から選択される。）からなる群から選択され；Ｄ１及びＤ２は下記群
【化３】
0005586673.tif 000024
（式中、各Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、独立して、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、置換アリール基、アラルキル基、ヒドロキシルアルキル基、ヒドロキシシクロアルキル基、アルコキシシクロアルキル基、アミノアルキル基、アシルオキシル基、アルキルアミノアルキル基及びアルコキシカルボニル基からなる群から選択され；各Ｒ７は独立して水素原子、水酸基、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、アシルオキシル基及びアルコキシル基からなる群から選択され；又はＲ７及びＲ５若しくはＲ７及びＲ９は共にＣ２〜Ｃ１０のアルキル基、Ｃ２〜Ｃ１０の水酸化アルキル基又はＣ２〜Ｃ１０のアルケン基を表す。）から選択される。）のいずれかの化合物が開示される。
【００５８】
化学式（Ｉ）又は（ＩＩ）の典型的化合物の特別な群は、Ｌ１及びＬ２が独立して、ｍが１〜８の整数である−（ＣＨ２）ｍ−基である。
特別な典型的化合物として、下記化学式（Ｉ）で表される化合物が挙げられる。
【化４】
0005586673.tif 000025
（式中、ｍは１〜８の整数であり；Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、アリールオキシル基、置換アリール基及びアラルキルオキシル基からなる群から選択され；Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、置換アリール基、アラルキル基、水酸基、アルコキシル基、ヒドロキシアルキル基、ヒドロキシシクロアルキル基、アルコキシシクロアルキル基、アミノアルキル基、アシルオキシル基、アルキルアミノアルキル基及びアルコキシカルボニル基からなる群から選択される。）
【００５９】
化学式（Ｉ）で表される典型的化合物として、下記化合物が挙げられる。
【化５】
0005586673.tif 000026
【００６０】
化学式（ＩＩ）で表される参考化合物として、下記化合物が挙げられる。
【化６】
0005586673.tif 000027
（式中、ｍは１〜８の整数であり；Ｒ３は水素原子、アルキル基、置換アルキル基、シクロアルキル基、ハロ基、水酸基、アルコキシル基、アリール基、アリールオキシル基、置換アリール基及びアラルキルオキシル基からなる群から選択され；Ｒ５及びＲ６は、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、置換アリール基、アラルキル基、水酸基、アルコキシル基、ヒドロキシアルキル基、ヒドロキシシクロアルキル基、アルコキシシクロアルキル基、アミノアルキル基、アシルオキシル基、アルキルアミノアルキル基及びアルコキシカルボニル基からなる群からそれぞれ独立して選択される。）
【００６１】
化学式（ＩＩ）で表される更なる参考化合物として、下記化合物が挙げられる。
【化７】
0005586673.tif 000028
【００６２】
参考態様において、ｐ７５ＮＴＲ受容体分子に対する結合特異性を有する代表的化合物として、次の化学式で表される化合物が挙げられる。
【化８】
0005586673.tif 000029
【００６３】
本出願で開示した対象物に従い、代表的ニューロとフィンは、ＮＧＦを含めることができるが、これに限らない。より具体的には、Ｐ７５ＮＴＲ受容体分子に結合特異性を有するニューロトロフィンβ−ターンループとしては、ＮＧＦのループ１があるが、これに限らない。
本明細書で開示したように、ｐ７５ＮＴＲ受容体分子に対して結合特異性を有する化合物、又は類似体の代表的構造は、ｐ７５ＮＴＲ受容体分子のニューロトロフィン結合部位に対して結合できる。
本明細書で開示した化合物は、また、ｐ７５ＮＴＲ受容体分子に結合特異性を有する、親化合物の誘導体を含んで居り、これらの誘導体もｐ７５ＮＴＲ受容体分子に結合特異性を有する。誘導体は、親化合物と比較して、疎水性、親油性、両溶媒性、溶解度、生体利用度及び肝臓での分解抵抗性からなる群から選択された特性の少なくとも一つについて増大を示すことができる。
幾つかの実施態様において、本明細書で開示した化合物は、図１ｃに表示した薬理作用団と実質的に同一の薬理作用団を含むことができることを理解すべきである。
その様な化合物の代表例としては、化学式（Ｉ）及び（ＩＩ）が挙げられるが、これらに制限されない。
【００６４】
ＩＩ．Ｂ．製剤
本明細書で開示した化合物は、好ましい投与ルートに適応したルーティン手順に従い製剤化できる。従って、本明細書で開示した化合物は、油性又は水性の媒体を使った懸濁液、溶液、又は乳状液の様な形をとることができ、また浮遊剤、安定剤及び／又は分散剤を含むことができる。本明細書で開示した化合物は、埋め込み、又は注射のための調整品として製剤化できる。従って、例えば、上記化合物は、適切な高分子又は疎水性材料（例えば、許容可能な油のなかの乳濁液）、又はイオン交換樹脂、又は発泡溶解誘導体（例えば、発泡溶解塩）と共に製剤化できる。又は、活性な構成要素は、例えば、無菌の発熱物質不含の水のような、適切な媒体と使用前に混合するための粉末状であることができる。各々の投与方法に対する適切な製剤については、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,A.Gennaro,編,第20版,Lippincott,Williams & Wilkins,Philadelphia,Pa.に、見出すことができる。
【００６５】
例えば、非経口投与のための製剤は共通の添加物として、無菌水又は無菌生理食塩水、ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール、植物由来の油、水和化したナフタレン等々が含まれる。特に、生体許容性、生体分解可能ラクチド重合体、ラクチド／グリコール・コポリマー  、又はポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン・コポリマーは活性化合物の放出を制御するための有用な添加物となることができる。他の潜在的に有用な非経口の運搬システムとしては、エチレン−酢酸ビニル・コポリマー粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み輸液システム及びリポソームが挙げられる。吸入投与に対する製剤は、例えば、ラクトースを添加物として含み、又は、例えば、ポリオキシエチレン−９−アウリルエーテル、グリココレート及びデオキシコレートを含む水溶液であることができて、又は点鼻液の形での投与に対する油性溶液であることができて、又は鼻腔内に作用させるゲルとして含む。非経口性投与の製剤は、また、舌下錠投与のためのグリココレート、直腸投与のためのメトキシサリチル酸塩、又は膣投与のためのクエン酸を含むことができる。
【００６６】
静脈内投与のための製剤は、無菌の等張緩衝液による溶液からなることができる。必要な場合、この製剤は、また、溶解補助剤及び注射部位の苦痛緩和のための局所麻酔を含むことができる。一般的に、構成要素は単一投薬形態において、例えば、活性試薬の量を示すアンプル又は小袋のような密封した容器の中に、凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、別々に、又は混合して提供される。化合物が輸液として投与される場合、無菌の医薬用級の水、生理食塩水、又はデキストローズ／水を入れた輸液ビンを伴う製剤として調剤できる。化合物が注射で投与される場合、注射のための無菌水アンプル、又は生理食塩水のアンプルが提供され、構成成分を投与に先立って混合できる。
適切な製剤としては、更に抗酸化剤、緩衝、靜菌薬、殺菌性抗生物質及び意図されている受容者の体液と等張な調整液にさせる溶質を含む、水性及び非水性無菌注射溶液；懸濁剤及び増粘剤を含む水性及び非水性の無菌懸濁液がある。
【００６７】
この化合物は更に、局所投与のために調剤される。適切な局所製剤としては、液体、ローション、クリーム、又はゲル状態の１又は２以上の化合物がある。局所投与は、治療領域に直接処理することによって行うことができる。例えば、治療領域の皮膚に（ローション又はゲル状の）製剤をすり込むこと、又は治療領域に液体製剤を噴霧適用して、その様な処理が行われる。
幾つかの製剤では、生体埋め込み材料は、上記化合物で覆われることができて、細胞と埋め込み物の相互作用は改善される。
上記化合物の製剤は、少量の湿潤剤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含むことができる。上記化合物からなる製剤は、液体溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、ピル、カプセル、持続放出製剤、又は粉末であることができる。
上記化合物は座薬として、伝統的結合剤及びトリグリセリドのような担体と共に調剤できる。
経口調剤は医薬品級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルローズ、炭酸カルシウム等々のような標準的担体を含むことができる。
本出願で開示した化合物からなる医薬品調剤は、化合物の放出を制御し、それによって、化合物を指定時刻に、又は持続した放出を行う、試薬を含むことができる。
【００６８】
ＩＩ．Ｃ  担体
医薬的に許容される担体は、当業者にはよく知られており、約０．０１〜約０．１Ｍ及び好ましくは０．０５Ｍリン酸緩衝液及び０．８％生理食塩水を含むが、これに制限されない。そのような医薬的に許容された担体は、水性又は非水性溶液、懸濁液及び乳濁液である。
本出願で開示された対象物の使用に適した、非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油及びオレイン酸エチルの様な注射可能有機エステルを含むが、これらに制限されない。
本出願で開示した対象物への使用に適した水性担体としては、生理食塩水及び緩衝液媒体を含め、水、エタノール、アルコール性／水性溶液、グリセロール、乳濁液又は懸濁液が挙げられるが、これらに制限されない。経口担体は、エリクシル剤、シロップ、カプセル、錠剤、等々であることができる。
本出願で開示した対象物への使用に適した液性担体は、溶液、懸濁液、乳濁液、シロップ、エリクシル及び与圧化合物を調製して用いることができる。活性な構成成分は、水、有機溶媒、両者の混合物、又は医薬的に許容される油又は脂肪の様な、医薬的に許容可能な液性担体に溶解又は懸濁できる。液性担体は、溶解補助剤、乳化剤、緩衝液、保存液、甘味、芳香試薬、懸濁剤、濃縮剤、着色剤、粘性制御剤、安定剤、又は浸透圧制御因子のような、他の適切な医薬的な添加物を含みうる。
【００６９】
本出願で開示した対象物への使用に適した液性担体として、水（部分的に上記のような添加物、例えば、セルローズ誘導体、好ましくは、カルボキシメチルセルローズナトリウム溶液を部分的に含む）、アルコール（１水酸基を有するアルコール及び例えば、グリコールのような、多価水酸基アルコールを含む）及びこれらの誘導体及び油（例えば、分画されたココナッツ油及びラッカセイ油）が挙げられるが、これらに制限されない。非経口投与のためには、担体はまたエチルオレイン酸塩及びイソプロピルミリスチン酸塩のような、油性エステルを含むことができる。無菌の液性担体は、非経口の投与の為の化合物からなる無菌の液性形態で有用である。本明細書で開示された、与圧化合物のための液性担体は、ハロゲン化した炭化水素又は多の医薬的に許容された噴射剤であることができる。
【００７０】
本出願で開示した対象物への使用に適した固体担体として、ラクトース、デンプン、グルコース、メチル−セルローズ、ステアリン酸マグネシウム、リン酸２カルシウム、マンニトール等々のような不活性物質が挙げられるが、これらに制限されない。固体担体はさらに、芳香剤、潤滑剤、可溶剤、懸濁剤、充填剤、滑走剤、圧縮補助剤、結合剤、又は錠剤―粉砕剤のような、１又は２以上の物質を含み；これはカプセル化した材料でもあることができる。粉末状の担体は、細かく分割した固体で、細かく分割した活性化合物との混合物である。錠剤として、活性化合物は、必要な圧縮特性を持つ担体と適切な割合に混ぜられ、望みの形、大きさに圧縮される。粉末及び錠剤は、好ましくは、９９％までの活性化合物を含む。適切な固体担体としては、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、滑石、砂糖、ラクトース、デクストリン、デンプン、ゲラチン、セルローズ、ポリビニルピロリジン、低融点ワックス及びイオン交換樹脂が挙げられる。
【００７１】
本出願で開示した対象物への使用に適した非経口担体として、塩化ナトリウム溶液、リンゲル−デキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル及び不揮発油が挙げられるが、これらに制限されない。静脈内担体としては、流動性及び栄養補強剤、リンゲル−デキストロース等に基づく電解質補強剤がある。保存剤及び他の添加物も存在可能であり、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス、等々がある。
本出願で開示した対象物への使用に適した担体は、必要に応じて、技術上従来の技術で用いられる、錠剤分解物質、稀釈剤、顆粒化剤、潤滑剤、結合材等々と、混合される。担体はまた、技術上既知であるが、反応により化合物に悪影響を与えない方法を用いて無菌化できる。
【００７２】
ＩＩ．Ｄ．塩
開示した化合物は、更に医薬上許容される塩からなることができること、を理解すべきである。
この様な塩としては、医薬上許容される酸添加による塩、医薬上許容される塩基添加による塩、医薬上許容される金属塩、アンモニウム及びアルキル化したアンモニウム塩が挙げられるが、これらに制限されない。
酸添加塩としては、有機酸のみならず、無機酸の塩が含まれる。適切な無機酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硫酸、硝酸、等々がある。適切な有機酸の代表的な例としては、ギ酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、安息香酸、ケイ皮酸、クエン酸、フマル酸、グリコール酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、シュウ酸、ピクリン酸、ピルビン酸、サリチル酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、酒石酸、アスコルビン酸、パモ酸、ビスメチレンサリチル酸、エタンスルホン酸、グルコン酸、シトラコン酸、アスパルチン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ＥＤＴＡ，グリコール酸、ｐ−アミノ安息香酸、グルタミン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、過塩素酸塩、硼酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、グリセロリン酸塩、ケトグルタール酸塩等々が挙げられる。
【００７３】
塩基添加塩としては、エチレンジアミン、Ｎ−メチル−グルカミン、リジン、アルギニン、オルニチン、コリン、Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、プロカイン、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン、ジエチルアミン、ピペラジン、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、テトラメチルアンモニウムヒロロキシド、トリエチルアミン、ジベンジルアミン、エフェナミン、デヒドロアビエチルアミン、Ｎ−エチルピペリジン、ベンジルアミン、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、例えば、リジン及びアルギニンジシクロヘキシルアミンのような塩基性アミノ酸、等々が挙げられるが、これらに制限されない。
金属塩の例としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム塩等々が挙げられる。
アンモニウム及びアルキル化アンモニウム塩の例としては、アンモニウム、メチルアンモニウム、ジメチルアンモニウム、トリメチルアンモニウム、エチルアンモニウム、ヒドロキシエチルアンモニウム、ジエチルアンモニウム、ブチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム塩等々が挙げられる。有機塩基の例としては、リジン、アルギニン、グアニジン、ジエタノールアミン、コリン等々がある。
【００７４】
ＩＩＩ．使用の方法
本出願で開示した対象物は、患者の神経変性疾患及び他の疾患又は状態を治療する新しい方法を提供する。より具体的には、本出願で開示した対象物の方法は、神経変性疾患又は他の疾患、又は状態を治療するために、患者のｐ７５ＮＴＲ受容体分子に対して結合特異性を持つ化合物の投与を含む。上記化合物は、生存シグナルの誘導及び／又はプロＮＧＦ−誘導の細胞死の阻害を引き起こすために有効量を投与できて、この有効量は神経変性疾患及び他の疾患との関わりで決定される。
治療される病気は、少なくとも部分的に、ニューロトロフィンのｐ７５ＮＴＲ受容体への結合を介する全ての病気である。その様な病気としては、アルツハイマー病、ハンチントン病、ピック病、筋萎縮性側索硬化症、癲癇、パーキンソン病、脊髄損傷、脳梗塞、低酸素症、虚血症、脳損傷、糖尿病性神経障害、末梢神経障害、神経移植、多発性硬化症、末端神経障害、脱毛、ｐ７５発現細胞の変性又は機能喪失を含む状態があるが、これらに制限されない。
【００７５】
ｐ７５ＮＴＲ受容体分子に対する結合特異性を持つ化合物は、例えば、化学療法を原因とする髪毛嚢細胞生存の誘導のような他の容態ばかりではなく、化学療法及び／又は神経変性疾患に原因する神経変性疾患のような神経変性疾患の予防を含む、神経変性疾患の治療に用いることができる。
本出願で開示した対象物は、更に、細胞生存を促進する新しい方法を提供する。代表的な細胞としては、中隔細胞、海馬細胞、皮質細胞、感覚細胞、交感神経細胞、運動神経細胞、髪毛嚢細胞、前駆細胞及び幹細胞があるが、これらに制限されない。特異的には、上記方法は、ｐ７５ＮＴＲ受容体分子に対し結合特異性を持つ化合物で細胞を処理することからなり、ここで上記化合物は、生存シグナリングを誘導し、またプロＮＧＦ誘導細胞死を阻害する。
【００７６】
ＩＩＩＡ．投与
本出願で開示した対象物は、患者におけるｐ７５ＮＴＲ結合を介する病気を改善するために、ｐ７５ＮＴＲ受容体化合物に対する結合特異性を有する化合物を投与する方法を開示する。上記方法は、本明細書で開示した全ての化合物のように、ｐ７５ＮＴＲに対する結合特異性を有する、有効量の化合物を患者に投与するステップからなる。
本明細書で用いるように、投与は当業者に知られている様々な方法の中のどの方法を用いても、達成又は行うことができる。上記化合物を、例えば、皮下に、静脈内に、非経口的に、腹腔内に、皮内に、筋肉内に、局所的に、腸内に（例えば、経口的に）、直腸に、鼻腔内に、口内に、舌下に、膣内に、吸入スプレイで、医薬ポンプ又は埋め込んだリザーバーを通して、通常の非毒性の生理的に許容される担体又は媒体を含む投薬投与量を投与できる。
【００７７】
更に、本出願で開示された化合物は、処置の必要に応じて、局所的領域に投与されうる。これは、例えば、シアラスチックメンブレン又は繊維のような膜も含め、手術の間の局所的輸液、局所的適用、経皮パッチ、注射、カテーテル、座薬、埋め込み（埋め込みは、任意に、多孔性、非多孔性、又はゼラチン性の材料である）によって行われるが、これらに制限されない。
上記化合物が投与される状態（例えば、シロップ、エリクシル、カプセル、錠剤、溶液、発泡体、乳濁液、ゲル、ゾル）は、化合物が投与される経路に部分的に依存するであろう。例えば、粘膜（例えば、口内粘膜、直腸、小腸粘膜、気管粘膜）投与のために、鼻ドロップ、噴霧質、吸入物、ネブライザー、点眼又は座薬が用いられる。上記化合物は、また、神経突起の成長、神経細胞生存、又は埋め込み物表面と細胞の相互作用を、促進するために、生体埋め込み可能材料を被覆するために用いることができる。本出願で開示した上記化合物及び薬剤は、鎮痛剤、抗炎症剤、麻酔剤及びｐ７５ＮＴＲを介する病気の１又は２以上の症状又は原因を制御する他の薬剤のような、生物学的に活性な薬剤と共に投与できる。
【００７８】
更に、投与は、適切な期間、複数の投薬量を患者に投与することからなることができる。この様な投与療法は日常業務の方法に従い、本明細書に開示の総説に基づき決定できる。
本出願で開示した対象材料の化合物は、製剤における唯一の活性薬剤として用いる；又はこの化合物は、他の活性な構成要素とのコンビネーション（例えば、互いにほとんど同時の投与、又は同一製剤の中で）として用いることができるが、他の活性な構成要素としては、例えば、（ｉ）ニューロトロフィン；又は、（ｉｉ）神経変性病における、神経細胞生存又は軸索の生存を促進する他の因子又は薬剤であり、これらの薬剤としてはアミロイド−β阻害剤、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、ブチリルコリンエステラーゼ阻害剤及びグルタミン酸受容体アンタゴニスト、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸塩サブタイプが挙げられるが、これらに制限されない。
【００７９】
ＩＩＩ．Ｂ．投与量
本明細書で開示した化合物の投与のために、齧歯動物モデルに投与する投与量に基づく、ヒト投与量に外挿する従来の方法は、マウス投与量をヒト投与量に換算する換算因子を用いて行うことができる：ｋｇあたりのヒト投与量＝ｋｇ当たりのマウス投与量ｘ１２（Freireich他、(1966)Cancer Chemotherapy Rep.50,219-244）。また、薬剤投与量は、体重よりも体表面積平方メートル当たりのミリグラムでも与えられるが、その理由は、この方法がある種の代謝的及び排出機能に対し、良い相関を与えるからである。更に、体表面積は、異なる動物種のみならず、成人及び子供の投薬量のための共通分母として用いられる（Freireich他、(1966)Cancer Chemotherapy Rep.50,219-244）。要約すると、すべての与えられた動物種におけるｍｇ／ｋｇ投与量を等価なｍｇ／ｓｑｍ投与量として表すために、投薬量に適切なｋｍ因子を掛ける。ヒト成人では、１００ｍｇ／ｋｇは１００ｍｇ／ｋｇｘ３７ｋｇ／ｓｑｍ＝３７００ｍｇ／ｍ２である。
【００８０】
本明細書に開示している化合物がこの類似体又は断片の形をとることができる範囲で、活性及び有効量の投与量は変わりうることを理解しなければならない。しかしながら、当業者は本出願で開示した対象物により想定されるタイプの化合物の活性を容易に検定できる。
本明細書で開示した化合物は、単位投与量で用いることができて、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,Easton,PA,1980）に記載されているように、製剤技術でよく知られている如何なる方法によっても製造できる。
本出願で開示された化合物の代表的な投与量は、齧歯動物モデルに対し１０〜１００μｇ／グラム体重である。投与量範囲は特定の化合物及びその活性に依存することは当業者に理解されるだろう。投与量範囲は、神経変性疾患又は神経変性が関わる他の疾患及び症状が改善される及び／又は細胞が生存する上で、期待する効果をもたらすに充分なほど大投与量であるが、扱いにくい様々な副作用を起こす程は大投与量でないと理解すべきである。治療上の有効性に対する適切な範囲は、投与の経路、年齢及び治療を受ける患者の状態に応じて、当業者により直ちに決定される。個々の治療者は、様々な複雑さに応じて、投与量を調整する。本明細書で開示した化合物が、開示した対象物に従って用いられるならば、予期しうる許容できない毒性効果はない。
【００８１】
本明細書で開示された化合物の有効量は、測定できる生物学的応答をもたらすに充分な量からなる。本明細書で開示した対象物の治療化合物中の活性構成成分の実際の薬用濃度は、特定の患者及び／又は使用に対する好ましい治療効果を達成するために有効な、活性化合物の量を投与するために変わりうる。好ましくは、最小薬用量を投与することであり、また薬用量は、薬用量規定毒性がない場合、最小有効薬用量まで上げられる。通常の当業者は、治療上有効薬用量の決定及び調整について及び何時またどの様にその様な調整を行うかという事と共に、熟知している。
更に、本出願で開示した対象物の方法に関して、好ましい患者は、脊椎動物の患者である。好ましい脊椎動物は、温血動物であり；好ましい温血脊椎動物は、哺乳動物である。本出願で開示した対象物の原理は、用語"患者"に含まれている、全ての脊椎動物に関して有効であることを示すが、本出願で開示した方法により治療される患者は、好ましくはヒトである。この文脈では、脊椎動物とは、神経変性疾患の治療が望まれる全ての脊椎動物種であると理解すべきである。本明細書で用いるように、用語"患者"は、ヒト及び動物患者を含む。従って、獣医の治療上の使用は、本出願で開示された対象物に基づき提供される。
【００８２】
従って、本出願で開示された対象物は、ヒト及び、シベリアタイガーのような、絶滅の危機にあるために重要な哺乳類；ヒトによる消費のために農場で飼育される経済的に重要な哺乳類；及び／又は、ペット又は動物園で飼われている動物のような、ヒトにとって社会的に重要な動物などの、哺乳類の治療に提供される。この様な動物の例としては、ネコ及び犬のような肉食動物；ピッグ、ホッグ及び野生イノシシのような豚及び／又は牛、雄牛、羊、キリン、鹿、山羊、バイソン及びラクダ；馬のような反芻動物及び／又は有蹄類が含まれるが、これらに限らない。また、絶滅危惧種の及び／又は動物園のトリ類及びニワトリ及びより具体的には、七面鳥、鶏、アヒル、ガチョウ、ホロホロ鳥等々の家禽の治療を含め、トリの治療が提供されるが、これらのトリ類はまた、ヒトにとっても経済的にも重要である。従って、また家畜としての豚、反芻動物、有蹄類、馬（競走馬も含め）、家禽類等々、の治療も提供される。
【実施例】
【００８３】
以下、実施例にて本発明を例証する。本開示及び当業者の一般レベルを考慮して、以下の実施例は例示だけが目的であり、本出願で開示した対象物の精神及び範囲から離れることなく、無数の変化、修正、変換を用いることができることは、当業者に理解されるだろう。
【００８４】
実施例の材料及び方法
計算的研究
計算研究は、Accelrys(San Diego,California,USA)から得たAccelrys Catalyst(R)及びInsightIIシステムを用いて行った。
抗体及びタンパク質
ポリクロナルラビット抗−ＮＧＦ抗体はChemicon(Temecula, California, USA）から得た。モノクローナル抗−リン酸−ＥＲＫＴ２０２／Ｙ２０４、ポリクローナル抗−ＥＲＫ４２／４４，モノクローナル抗−リン酸−ＡＫＴＳ４７３，ポリクローナル抗−ＡＫＴ，ポリクローナル抗−リン酸−ＮＦκＢ−ｐ６５（Ｓｅｒ５６３），及び部位特異的ポリクローナル 抗−ＴｒｋＹ４９０は、Cell Signaling Technology,Inc.(Beverly, Massachusetts, USA)より得たモノクローナル抗ＮＦκＢ−ｐ６５抗体はSanta Cruz Biotechnology,Inc.(Santa Cruz,California,USA)より得た。モノクローナル抗−アクチン抗体はSigma-Aldrich Corp.(St.Louis,Missouri,USA）より得た。ポリクローナルＴｒｋＡ及びＴｒｋＢ抗体は、Upstate USA,Inc.(Charlottesville,Virginia,USA)より得た。抗−ｐａｎ−Ｔｒｋ１０８７及び１０８８抗体は、以前に特性が報告され(Zhou,Holtzman,D.M.,Weiner,R.I., Mobley,W.C.(1994)Proc Natl Acad Sci USA 91,3824)、またWilliam C.Mobley 博士(Stanford University,California,USA)より得た。組み換えｐ７５ＮＴＲの細胞外領域のニューロトロフィン結合領域（残基４３−１６１，システイン繰り返し領域ＩＩ，ＩＩＩ，及びＩＶ）に対して得たｐ７５ＮＴＲポリクローナルうさぎ抗体９６５１(Huber,L.J.,Chao,M.V.(1995)Dev Bio 167,227-238)及び９６５０は、Moses Chao博士(Skirball Inst.,NYU,New York,USA)より提供された。組み換えヒトＮＧＦは、Invitrogen(Carlsbad,California,USA)から得た、またＢＤＮＦをSigma-Aldrich(St.Louis,Missouri,USA)より得た。ｐ７５ＮＴＲ／Ｆｃ及びＴｒｋＡ／Ｆｃキメラは、R&D Systems(Minneapolis, Minnesota,USA)より得た。フリン抵抗性プロ−ＮＧＦは、前述(Beattie,M.S.他(2002)Neuron 36,375-386)のように作成した。
【００８５】
神経バイオアッセイ
海馬神経細胞はＥ１６−１７マウス胎児より前述(Yang,T.他(2003)J Neurosci 23,3353-3363)の様に調整した。低密度培養は、各ウェルにポリ−Ｌ−リジン−塗布Ａ／２プレートに２５μｌの細胞懸濁液（２０００神経細胞／ウェル；１２，５００細胞／ｃｍ２）、２５μｌの１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ及び様々な濃度の組み換えＢＤＮＦ，ＮＧＦ，又はｐ７５−結合性化合物を加えて、開始した。ｐ７５ＮＴＲ＋／＋及びｐ７５ＮＴＲ−／−ニューロンを使う研究には、ｐ７５ＮＴＲ遺伝子のエクソン３に突然変異を有するマウス（Lee.K.F.他(1992)Cell 69.737-749)をＢ６コンジェニック（類似遺伝子系）バックグランドに掛け合わせた（＞１０Ｂ６バッククロス）。
【００８６】
培養４８時間後に、与えられた細胞がＭＴＴを青色ホルマザン産物に変換するか否かの視覚的測定による標準的な形態学的基準のコンビネーションを用いて、生存細胞を、前述(Longo,F.M.,Manthorpe,M.,Xie,Y.M.,Varon,S. 1997)J Neurosci Res 48,1-17)のように検定した。神経細胞の生存数は、各ウェル中の形態学的に原形を保ち、青色産物(LongoF.M.,Manthorpe,M., Xie,Y.M.,Varon,S.(1997)J Neurosci Res48,1-17)で満たされた全細胞数を計数することにより測定した。ニューロトロフィン及び化合物の各濃度に対して、デュプリケート（二重）のウェルを計数し、結果値を平均化した。各化合物の活性は、盲検計数で確認した。計数は２５ｎｇ／ｍｌＢＤＮＦによる生存数又はベースライン生存数により規格化した。用量依存性曲線のフィッティングは、SYSTAT software Inc.(Richmond,California,USA)から得たSigmaplotにより行った。
【００８７】
シグナリング経路阻害研究のために、LY294002,PD98059(EMD Biosciences/Calbiochem,SanDiego, California, USAより得た)及びSN50(Alexis Corp.,Lausen,Switzerland)を、それぞれ最終濃度25μM,50μM,及び2.5μg/ml培養細胞に加え、同時にBDNF,NGF,又はp75-結合性化合物を加えた。抗体阻害研究のために、BDNF,NGF,又はp75-結合性化合物存在下に、p75ＮＴＲ抗血清及び対照非免疫性血清を最終稀釈１：１００にして用いた。シグナリング阻害剤、ｐ７５ＮＴＲ抗体又はｐ７５ＮＴＲ−／−神経細胞に適用する全ての研究のために、生存数は４８時間後に検定した。
【００８８】
タンパク質抽出及びウェスタンブロット解析
Ｔｒｋ、ＡＫＴ，ＮＦκＢ，及びＥＲＫ活性化の検定のために、Ｅ１６−１７マウス由来の海馬神経細胞をポリ−Ｌ−リジン塗布６ウェルプレート(Corning,Inc.,Corning,New York,USA)中１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で培養し、その後ニューロトロフィン又は化合物添加前に、２時間無血清ＤＭＥＭ中でインキュベートした。表示した時点で、神経細胞を、２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０，１３７ｍＭ ＮａＣｌ，１％ＩｇｅｐａｌＣＡ−６３０，１０％グリセロール、１ｍＭ ＰＭＳＦ，１０μｇ／ｍｌアプロチニン、１μｇ／ｍｌロイペプチン、５００μＭ オルトバナデート(Zhou,J.,Valletta,J.S.,Grimes,M.L.,Mobley,W.C.(1995)J Neurochem 65,1146-1156)からなる溶解緩衝液中に採取した。
細胞溶解液を遠心し、上清を集め、タンパク質濃度をPierce(Rockford, Illinois,USA)より得たＢＣＡタンパク質アッセイ試薬を用いて測定した。ウェスタンブロットは前述(Yang,T.他(2003)J Neurosci 23,3353-3363)の様に行った。ウェスタンブロットシグナルは、Amersham(Piscataway,New Jersey,USA)から得たＥＣＬ化学発光システムを用いて測定した(Yang,T.他(2003)J Neurosci 23,3353-3363)。
【００８９】
ｐ７５ＮＴＲ及びＴｒｋＡからのＮＧＦ排除
ＮＧＦ ＥＬＩＳＡを前述(Longo,F.M.他(1999)J Neurosci Res 55,230-237)のように行った。要約すると、９６−ウェルプレートに、R&D System(Minneapolis,Mineasota,USA)から得た０．１ｐｍｏｌ（１ｎＭ）のｐ７５／Ｆｃ又はＴｒｋＡ／Ｆｃ組み換えタンパク質を加え４℃で一晩インキュベートし、その後ブロッキング緩衝液を加え室温で１時間インキュベートした。１００ｎｇ／ｍｌのプロＮＧＦ又は様々な濃度のＮＧＦ及びｐ７５−結合性化合物を試料緩衝液で稀釈し、各ウェルに加え、室温で６時間振とうしながらインキュベートした。その後、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むトリス緩衝液塩液（ＴＢＳ）で５回洗浄し、抗−ＮＧＦうさぎポリクローナル抗体を加え４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＤで５回洗浄後、ウェルに抗−うさぎＩｇＧ ＨＲＰ共役体を加え、室温で２．５時間インキュベートし、５回洗浄した。３，３'、５，５'−テトラメチル−ベンジジン基質を加え、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００９０】
ｐ７５ＮＴＲ抗体競合
空ベクター又はｐ７５ＮＴＲ(Huang,C.S.他(1999)J Biol Chem 274,36707-36714)を発現するＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞は、William Mobley博士(Stanford University,California,USA)より供与を受けた。細胞を単層に増殖し、２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中に採取し、沈殿にさせ、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡを含む氷冷したＤＭＥＭ ＨＥＰＥＳに再懸濁した。各実験ポイントに対し、密集成長した１個の６ウェルプレートから得た６〜９ｘ１０６細胞を用いた。
結合解析のために、ｐ７５ＮＴＲ抗体（１：１００）を１００ｎＭのｐ７５−結合性化合物の存在下又は非存在下に、ゆっくり回転させながら４℃で９０分間結合させ、その後ＰＢＳで４回洗浄した。最終的な細胞沈殿物を溶解緩衝液に再懸濁した。
ウェスタンブロットは、前述のように行った。ｐ７５ＮＴＲ抗体の存在を測定するために、ブロットをAmersham/Pharmacia Biotech(Piscataway,NewJersey,USA)から得たセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合のヤギの抗−うさぎＩｇＧをプローブとして検査した。シグナルは、Amersham Biosciences(Piscataway,NewJersey,USA)から得たＥＣＬ化学発光システムにより測定した。負荷したタンパク量変化を補正するために、ブロットを切り出し、Sigma(St.Louis.Missouri,USA)から得たβ−アクチンモノクローナル抗体によるプローブで再検査した。
【００９１】
希突起膠細胞培養、プロ−ニューロトロフィン処理及び細胞死検定
子ラットから得た皮質の希突起膠細胞は前述(Yoon他(1998)J Neurosci 18,3273-3281, Harrington,A W., Kim,J.Y.,Yoon,S.O.(2002)J Neurosci 22,156-166)のように調整した。細胞を０．０５ｎＭ（２．８ｎｇ／ｍｌ）の組み換え型、開裂抵抗性プロＮＧＦで処理した。対照として、３５０ｍＭイミダゾールを含む等容積のプロＮＧＦ精製緩衝液で細胞を処理した。処理２４時間後、細胞を固定し、前述(Beattie,M.S.他(2002)Neuron 36,375-386)のようにＭＢＰ及びＴＵＮＥＬ染色のために加工した。実験条件毎に最少６００細胞のために、ウェルあたり２００〜２５０個の細胞をカウントした。
【００９２】
実施例１
計算によるモデリング、薬理作用団の生成、仮想的及び機能的スクリーニング
受容体と相互作用する可能性が高いループ構造を模倣し、化合物産出性の薬理作用団を作り出すために、次の２条件を仮定した：（１）リガンド（配位子）ペプチド構造の自由度はタンパク質中に存在することにより制限を受ける；（２）標的とした受容体サブサイト（副部位）においてループ構造の変化を伴う"誘導適合"は殆どない、又はその構造変化は小分子リガンドの柔軟性により対応する。これらの２条件を適用した場合、天然のリガンドに似た様態で、受容体と相互作用する小分子コンフォメーションの相互作用／活性化が可能となる。
ＮＧＦβ−ヘアピンループに類似した、活性な二量体の環状ペプチドの計算研究によると、エネルギー的及び構造的な制約により、両ペプチドサブユニットのβ―ヘアピン折りたたみが同時に行われることは不可能だと言うことを示唆し、このことは、ペプチドはモノマー的に働くことを意味する。更に、３Ｄ配座ライブラリーの初期の仮想的スクリーニングに基づき、多くの機能的に二量体の、分子量が５００Ｄ以下の、非ペプチド分子が存在する可能性はない。
【００９３】
従って、単一のループ１構造を模倣する化合物を発見することに努力は絞られた。化合物が選択され、図１にまとめた手順を用いて細胞生存検定によりスクリーニングが行われた。計算研究の結果によると、原位置（インサイチュ）で、繋がれたループ１骨組み及び側鎖構造の近位部分は、自由度を制約する、またループ分子動力学シミュレーションで得たサンプル集合から選んだ中間構造を抽出し、新しい薬理作用団モデルを作り上げるために用いた（図１ａ）。薬理作用団の特徴の置き換えについての手引を、ループ系統学、側鎖化学及び合成の活性ペプチドについての発明者の経験、を考察することで得た。
【００９４】
第１近似として、異なる動物種のニューロトロフィン及び異なるニューロトロフィンファミリーメンバーからの類似したループ１領域は、同様にｐ７５ＮＴＲと結合すると仮定した。ＢＤＮＦループ１の１次構造は、ＮＧＦ及びＮＴ−３と顕著に異なっており、薬理作用団の複雑性を減らすために、後者２構造のみ用いた。水素結合供与体として働くヒスチジンの特性(McDonald,I, Thornton,J.M.,(1994)WWW Edition December 1994)から、部位３４での使用が示唆され、一方、部位３２でのＫからＲへの変異から、この部位での正にイオン化可能なフィーチャーの使用が示唆される（図１ｂ及び１ｃ）。
８００，０００以上の化合物の各々の、平均３５配座が、新しい薬理作用団に対してスクリーニングされ、計算した内部エネルギー値１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下とフィットする約８００化合物を得た（図１ｄ）。この数は、仮想的な浅い受容体結合ポケットと折り合える立体的な適合性及び官能基の最大柔軟性、を基にして、目視検査により約６０にまで減少した。最初、３５化合物が得られ、その中、２３化合物が水に可溶であった。
【００９５】
ニワトリＤＲＧ神経細胞生存検定を用いた予備的研究により、テストした２３化合物中４化合物が顕著に活性であった。更なる研究を、胎児マウス海馬神経細胞を用いて行った。低密度及びグリア細胞の補助無しという条件で、これらの神経細胞の生存は、培地へのニューロトロフィン添加に、部分的に依存した。
前もってテストした２３化合物を、これらの海馬細胞培養においてスクリーニングした結果、これらの化合物のうち３化合物（化合物２〜４）はＤＲＧ培養を用いて活性を有すると同定され、また４番目及び５番目の活性化合物（化合物１及び７）をＤＲＧ及び海馬検定により同定した。これらの結果は、スクリーニング過程の収率１７％に対応する。この方法は更に支持されて、ＮＧＦループ４（ＬＭ１４Ａ）のモデルに基づく予備的研究において、同定された活性化合物について高い陽性率が得られた（スクリーニングした８化合物中３陽性（３７％））。
【００９６】
ｐ７５−結合性化合物存在下の、ＮＧＦ−ｐ７５ＮＴＲ結合の回帰分析を行った。Ｓｉｇｍａｐｌｏｔの非線形回帰分析モジュールを用いて、修正したＧａｄｄｕｍ／Ｓｃｈｉｌｄ式(adapted from Motulsky,H.J.,及びChristopoulos,A.(2003) A Practical Guide to Curve Fitting, 第2版. (San Diego,California,GraphPad Software,Inc.)：
【数１】
0005586673.tif 000030
に対し、データーを適合（フィット）させた。ここで、トップ＝最大シグナル；ボトム＝バックグランドシグナル；［Ｃ］＝化合物濃度；Ｓ＝Ｓｃｈｉｌｄ係数；Ｈｉｌｌ勾配＝Ｈｉｌｌ係数；［ＮＧＦ］＝ＮＧＦ濃度、ＥＣ５０＝最大結合（トップ−ボトム）の５０％をもたらすＮＧＦの濃度；及びＡ２＝非シフト曲線のＥＣ５０の２倍をもたらす化合物濃度。本明細書では、１．０〜１．６の範囲の計算したＨｉｌｌ勾配は、一般的に１と顕著に差がない。
【００９７】
実施例２
海馬神経細胞生存を促進する化合物
強力な神経栄養性活性をもつ化学的に様々な化合物を同定するために、ニュロトロフィンループ１及び小規模インビトロ生物検定に基づく高効率仮想スクリーニングを用いた（図１）。約８００，０００化合物をコンピューター内でスクリーニングし、インビトロ検定に付した２３化合物のうち４ポジティブという高効率（１７％）をもたらした。
選択した化合物の作用機序を理解し、これらの化合物が標的となった受容体ｐ７５ＮＴＲを介して働くという予測をテストするために、ＮＧＦ及びＢＤＮＦと比較しての、ｐ７５−結合性化合物の生存促進活性の用量依存関係を、ＮＧＦが神経細胞の生存を促進する培養条件における胎児海馬神経細胞を用いて調べた。培養系において、これらの細胞はほとんどＴｒｋＡを発現しないので(Brann,A.B.,他(1999)J Neurosci 19,8199-8206;Bui,N.T.,他(2002)J Neurochem 81,594-605)、神経栄養性活性は主にＴｒｋＢ及びｐ７５ＮＴＲを経たＢＤＮＦ及び主にｐ７５ＮＴＲを経たＮＧＦにより媒介される。
【００９８】
化合物１〜４（図２ａ、構造）を加えると、神経細胞生存率増大（図２ａ、顕微鏡写真）と一致して、ＧＡＰ−４３陽性の神経突起を有する細胞の数が増加した。活性化合物（図２ｂ）の用量応答プロフィルによって、ＥＣ５０値は、１００−３００ｐＭであり、またＮＧＦ応答の８０〜１００％の内部活性が示された。これとは別に、化合物３及び４の合成加工物も同様の結果を示した。構造的に化合物３に類似した化合物５は、神経栄養活性を全く、又は殆ど持たなかった。化合物１〜５の構造を表１に示す。
各化合物５ｎＭ以上の濃度に対し、ｐ７５ＮＴＲに無関係な機序、又は受容体多量体形成及び高受容体占有による生存シグナルの変化により神経栄養活性を持たない化合物（例えば、化合物５）によっても、生存率は、ベースライン又はそれ以下に減少した（図２ｂ）。海馬神経細胞システムにおける応答曲線が、ＮＧＦの応答曲線に似たことは、生存シグナルの活性化が、ｐ７５ＮＴＲのＮＧＦ結合領域を介するという結論と一致する。
【００９９】
最初同定した４化合物のうち、２化合物（カフェインの誘導体である化合物３及びアミノ酸誘導体である化合物４）は、リピンスキー基準(Lipinski,C.A.(2000)J Pharm Toxicol Methods 44,235-249)で、最も"薬剤類似の"特性を持つと予想され、また詳細な機序研究のために血液脳関門計算(Fu,X.C.,Chen,C.X.,Liang,W.Q.,Yu,Q.S.(2001)Acta Pharmacol Sin 22,663-668;Clark,D.E.(2002)J Pharm Sci 88,815-821)が選ばれた。予備的研究によると、化合物４は顕著な経口摂取及び血液脳関門透過性を示したので、化合物４が優先された。比較的に不活性型の化合物５は化合物３に構造的に似ていたのでネガティブ（陰性）対照として選ばれた（図２ａ）。
【０１００】
実施例３
Ｔｒｋ受容体とではなく、ｐ７５ＮＴＲ受容体と相互作用し及びこれを経由して働く化合物
ｐ７５−結合性化合物とニューロトロフィン受容体との相互作用を検定するために、組み換えキメラタンパク質ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃ及びＴｒｋＡ−Ｆｃに対するＮＧＦの結合に及ぼす、化合物の効果を濃度を上昇させて調べた。これらの実験において、化合物５（図３ｃ）ではなく、化合物４（図３ａ）及び化合物３（図３ｂ）は、ＮＧＦ／ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃ結合曲線を顕著に右側にシフトさせた。各活性化合物によるＮＧＦ結合の阻害は、ＮＧＦ濃度を上げることにより元に戻り、このことは、少なくとも部分的に、事実上競合であるという機序と矛盾しない。データを阻害剤存在下でのリガンド結合を記述するＧａｄｄｕｍ−Ｓｃｈｉｌｄ式に適合させ(Motulsky,H.J.,及びChristopoulos,A.(2003)A Practical Guide to Curve Fitting,第2版(San Diego,California,GraphPad Software,Inc.))、得られたＳｃｈｉｌｄ係数は両活性化合物に対して著しく１．０より小さく（化合物４，０．５８＋／−０．０４；化合物３，０．２６＋／−０．０１）、例えば、多重リガンド−受容体結合部位(Lutz,M.,及びKenakin,T.(1999)定量的分子薬学及び新薬発見における情報科学(Quantitative Molecular Pharmacology and Informatics in Drug Discovery)(Hoboken,New Jersey: John Wiley & Sons);Neubig,R.R.,Spedding,M,Kenakin, T.,及びChristopoulos, A.(2003)Pharmacol Rev 55,597-606)のような、より複雑なモデルを示唆する。
【０１０１】
これらの結果は、化合物の効果は、受容体のＮＧＦ結合表面の一部だけとの相互作用及び／又は間接的にＮＧＦ結合に影響のあるアロステリック効果に依るというモデルと矛盾しない。Ｇａｄｄｕｍ−Ｓｃｈｉｌｄ解析により、Ｓｃｈｉｌｄ係数が１の場合、化合物のＫｄと同等であることができるＡ２（即ち、ＥＣ５０を右方向に２倍シフトさせる化合物の濃度）として知られている効力の尺度が与えられる。化合物４及び３に対して導かれたＡ２値は、それぞれ１１９２＋／−１．２及び３１．６＋／−１．３ｎＭであった。しかしながら、Ｓｃｈｉｌｄ係数は顕著に１とは異なるので、真のＫｄ値を決めることはできない。
【０１０２】
化合物４の場合、その生物効果に対するＥＣ５０値は約１５０ｐＭであり、他方、そのＡ２値は約４桁ほど大きい。小分子の生物効力とリガンド排除により見積もられる結合の間の大きな差異は、よく見られ(Lutz,M.,及びKenakin,T.(1999)定量的分子薬学及び新薬発見における情報科学(Quantitative Molecular Pharmacology and Informatics in Drug Discovery)(Hoboken, New Jersey: John Wiley & Sons))，幾つかの原因が考えられ：結合における受容体部位と機能検定の間の差異；最大の生物効果は非常に低い受容体占有率で見られる等の、リセプター後のシグナル増幅；より小さな拮抗剤による多価リガンドの部分的な排除；及び標的リセプターとは無関係の機序により化合物が働く等が挙げられる。後者の可能性については、ｐ７５ＮＴＲ依存性を見積もるために、ｐ７５ＮＴＲブロッキング抗体及びｐ７５ＮＴＲ＋／−神経細胞を用いて対処した。更に、ｐ７５ＮＴＲに対するｐ７５−結合性化合物の特異性は、活性化合物は、ＴｒｋＡに対するＮＧＦ結合性に効果がないという知見によって支持された（図３ｄ、３ｅ）。
【０１０３】
次に、化合物のｐ７５−結合活性は、ｐ７５ＮＴＲ−依存性であることが確定できた。マウス背根神経節神経細胞においてＮＧＦ及びＮＧＦループ１ペプチド類似体の神経栄養活性を抑制することが前に示された(Longo,F.、M.,Manthorpe,M.,Xie,Y.M.,Varon,S.(1997)J Neurosci Res 48,1-17)、Ａｂ９６５１は、ＢＤＮＦの神経栄養活性を部分的に抑制し（図３ｇ）、また化合物３及び４の神経栄養活性を完全に抑制するが、非免疫抗体は効果がなかった。他の、別に得られた、ウサギポリクローナル抗−ｐ７５ＮＴＲ抗体（Ａｂ９６５０）を用いて、殆ど同一の結果が得られ、ｐ７５ＮＴＲ抑制の特異性を確認した。作成されたいずれの抗体もベースライン生存率を変化させなかったことは、これらの培養において、抗体作成は生存率を促進も、阻害もしないことを示唆する。これらの結果は、ＢＤＮＦはＴｒｋＢ及びｐ７５ＮＴＲを介して働くが、ＮＧＦ及びｐ７５−結合性化合物は主に、ｐ７５ＮＴＲを介して働くということと一致する。
【０１０４】
さらに、ニューロトロフィン及びｐ７５−結合性化合物に対するｐ７５ＮＴＲ−欠損（−／−）細胞の応答を調べた（図３ｈ）。これらの培養条件でベースライン生存率は、野生株と欠損細胞の間で同等であったが、ｐ７５ＮＴＲ−欠損細胞では、ＢＤＮＦに対する応答は部分的で、またＮＧＦ及びｐ７５−結合性化合物に対しては応答せず、ｐ７５ＮＴＲ−抗体研究において見出した知見と類似したパターンであった。最後に、各化合物が最大の応答を引き起こす濃度である、５０ｎｇ／ｍｌＮＧＦと共に５ｎＭの化合物３又は４を処理すると、生存率に対する相加効果は見られず、ｐ７５−結合性化合物は直接ｐ７５ＮＴＲとの結合を介して働くという仮説をさらに支持する。
【０１０５】
化合物３及び４は、ＮＧＦ−ＴｒｋＡ／Ｆｃ結合に対して効果がなかったが、ＴｒｋＡ及びＢの活性化は生存を促進する主要な機序であるので、ｐ７５−結合性化合物が、海馬神経細胞の主要なＴｒｋである、ＴｒｋＢを活性化するかどうか、又は僅かに発現したＴｒｋＡを活性化するかどうか、についての疑問が残る。また、ｐ７５ＮＴＲに結合するリガンドは、Ｔｒｋ活性化に影響を与える。これらのことを考慮すると、ｐ７５−結合性化合物がＴｒｋ活性化を促進するかどうかを確認することは興味深い。ＴｒｋＹ４９０リン酸化について示したように、Ｔｒｋ活性化のよく確立されたマーカーである、Ｔｒｋ自働リン酸化の活性化能について、化合物３及び４を吟味した。海馬細胞培養において、ＢＤＮＦ処理により、強いＴｒｋ活性化がもたらされた（図３ｉ）が、ＮＧＦ又はｐ７５−結合性化合物処理では活性化は見られなかった。ＮＧＦでシグナルがないことは、これらの培養では、殆ど又は全くＴｒｋＡが作られないことを確認し、またＮＧＦの栄養効果は主にｐ７５ＮＴＲを介するという考察が支持された。３Ｔ３−ＴｒｋＡ細胞において、ＮＧＦ処理により、期待されたＴｒｋＡ自働リン酸化反応が行われたが、ｐ７５−結合性化合物はまた活性化を示さなかった（図３ｊ）。これらの結果により、Ｔｒｋ受容体の活性化は、ｐ７５−結合性化合物による細胞生存の促進において、主要な働きをしてないことが、示唆される。
【０１０６】
実施例４
ｐ７５ＮＴＲを介して働く化合物
非活性な化合物にはなく、活性な化合物によるｐ７５ＮＴＲからのＮＧＦの排除、生物機能の塞がれてないｐ７５ＮＴＲ存在依存性、Ｔｒｋ相互作用及び活性化の欠如、ＮＧＦ及び化合物間の相加効果の欠如、を総合すると、ｐ７５−結合性化合物は直接ｐ７５ＮＴＲと相互作用し、ｐ７５ＮＴＲを介して働くことが強く示唆される。
このことは、ｐ７５−結合性化合物を選択するために、本明細書で用いた薬理作用団モデルと一致する。主要な初期の選択基準、インビトロ（試験管内）でテストした小群から化学的に多様なポジティブ化合物の高率な同定及び様々な生化学及び生物学的検定における類似した作用としてこのモデルに適合するとすると、ｐ７５−結合性化合物は、受容体の他の部位ではなく、受容体のｐ７５ＮＴＲニューロトロフィン結合部位で相互作用するということを示唆する証拠がある。
【０１０７】
ｐ７５ＮＴＲ作用と結びついたプロ生存シグナルとしては、Ｐ１３Ｋ及びＡＫＴ活性化(Roux,P.P.,Bhakar,A.L.,Kennedy,T.E.,Barker,P.A.(2001)J Biol Chem 276,23097-23104;Lachyankar,M.B.,他(2003)J Neurosci Res 71,157-172)、NFκB(Mamidipudi,V.,Li,X.,Wooten,M.W.(2002)J Biol Chem 277,28010-28018;Carter,B.D.,他(1996)Science 272,542-545;Gentry,J.J.,Casaccia-Bonnefil,P.,Carter,B.D.(2000)J Biol Chem 275,7558-7565;Foehr,E.D.,他(2003)J Neurosci Res 73,7556-7563),及びERK(Lad,S.P.,Neet,K.E.(2003)J Neurosci Res 73,614-626)が挙げられる。これらの各シグナル中間体は、様々な程度のオーバーラップ及び混線を伴い、また異なる反応速度を伴う経路を介して、Ｔｒｋ及びｐ７５ＮＴＲによって独立して制御され得ることが示された。海馬神経細胞を２０ｎＭ化合物３及び４（急速なシグナル活性化のための平坦域の濃度）で処理すると、ＮＦκＢ経路(Sakurai,H.,Chiba,H.,Miyoshi,H.,Sugita,T.,Toriumi,W.(1999)J Biol Chem 274,30353-30356)の活性化の指標である、ＮＦκＢ−ｐ６５リン酸化の約１．５倍の増加（図４ａ）が導かれ、これは両ニューロトロフィンタンパク質により誘導される結果と同程度であり、また同じ時間的経過である。
【０１０８】
同一濃度の化合物５は、ＮＦκＢ−ｐ６５リン酸化を誘導しなかった。化合物３及び４によるＮＦκＢの活性化と一致して、ＮＦκＢ転位の特異的ペプチド阻害剤である、ＳＮ５０(Lin,Y.Z.,Yao,S.Y., Veach,R.A.,Torgerson,T.R.,Hawiger,J.(1995)J Biol Chem 270,14255-14258)は、ベースライン生存率には影響をせずに、化合物３及び４及びニューロトロフィンにより促進される細胞生存率を顕著に下げた（図４ｅ）。
ＡＫＴ活性化の研究に於いて、化合物３及び４は、２０ｎＭにおいて、ＮＧＦを用いて３０分で見られた活性化と同じ程度の活性化を示したが、ＢＤＮＦはかなり大きな応答を示した。さらに、化合物３及び４によって促がされた活性化の開始は、ＮＧＦによる開始よりも遅かった（図４ｂ）。これらの知見と一致して、ＡＫＴ活性化を阻害する、Ｐ１３キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２は、化合物処理なしの場合、又は化合物５処理の場合のベースライン生存率を含め、全ての場合に著しく生存率を低下させた（図４ｅ）。
【０１０９】
ＥＲＫシグナリングの研究により、ＥＲＫ４４活性化は、有意ではあるが小さな応答を示すｐ７５−結合性化合物より大きな割合でニューロトロフィンにより誘導されることが分かった（図４ｃ）。ＥＲＫ４２活性化は、全体的により強く、またｐ７５−結合性化合物を伴うより、ＢＤＮＦ及びＮＧＦを伴ってより大きい。３０分までにシグナルは大きく減少するが、ＢＤＮＦ処理の後では、活性化状態はより長時間持続する（図４ｄ）。ＮＧＦ及びｐ７５−結合性化合物と比較して、ＢＤＮＦにより誘導されたＥＲＫ活性化が大きいという発見と一致して、ＥＲＫ阻害剤ＰＤ９８０５９は、ＢＤＮＦによる生存率促進を顕著に減少させ、一方ＮＧＦ活性に対しては、小さくはあるが有意の影響を持ち、化合物３又は４による生存率促進に対して有意な減少をもたらさなかった。
これらの観察結果より、ＮＦκＢ及びＰ１３Ｋとは異なり、ＥＲＫ活性化は、ｐ７５−結合性化合物による生存促進に対して重要な因子ではないことが示唆される。この差異は恐らく、Ｐ７５−結合性化合物と共に観察されたＥＲＫ活性化のレベルが、蛋白質リガンドと比べ、低いことに関係するのであろう。Ｐ１３Ｋ活性化は、ＡＫＴを介する経路及び介しない経路(Zhang,Y., 他(2003)J Neurosci 23,7385-7394)を通して生存を促進させることができて、またこの系におけるＰ１３Ｋの下流域の本質的な機序は決まってないままである。ＢＤＮＦによるＡＫＴ及びＥＲＫｓのより強い活性化は恐らく、ＴｒｋＢの影響を表すのであろう。
【０１１０】
化合物を介するＡＫＴ及びＮＦκＢ活性化と、神経細胞生存率の間の関係をさらに調べるために、化合物の用量−活性化研究を行った（図４ｆ、４ｇ）。この結果、化合物４はＡＫＴ及びＮＦκＢの活性化を濃度範囲０．５ｎＭ〜３ｎＭで誘導し、この濃度は生存率を促進するに必要な濃度に類似することを示し、また化合物誘導の生存を媒介するシグナリング機序での役割と一致する。
さらに、ｐ７５ＮＴＲ−／−培養神経細胞では、ＮＧＦ及び化合物によるＡＫＴシグナリングの活性化は完全に欠けていることが分かり（図４ｈ）、ＮＧＦ及びｐ７５−結合性化合物はｐ７５ＮＴＲを介してＡＫＴ生存シグナリングを活性化するという仮説と一致する。化合物誘導の生存がｐ７５ＮＴＲ依存的であるという事実（図３ｇ、３ｈ）を考慮すると、これらの発見により、ｐ７５−結合性化合物は、培養海馬神経細胞の生存を、少なくとも部分的には、ＡＫＴ及びＮＦκＢを介する生存−促進シグナリング経路の活性化をもたらすｐ７５ＮＴＲとの相互作用を通して誘導することが示唆される。
【０１１１】
実施例５
化合物３及び４は成熟した希突起膠細胞の細胞死を促進せず、プロＮＧＦ−誘導死を阻害する。
ＮＧＦ及びｐ７５−結合性化合物は、本明細書の研究で用いた培養海馬神経細胞の細胞生存を、促進するが、成熟ＮＧＦ又はプロＮＧＦのｐ７５ＮＴＲ配位は、ある種の細胞の生存を促進するよりむしろ細胞死と結びつけられてきた(Lee, R.,Kermani,P,Teng, K.K.,Hempstead,B.L.(2001)Science 294,1945-1948;Casaccia-Bonnefil,P.,Carter,B.D.,Dobrowsky,R.T.,Chao,M.V.(1996)Nature 386,716-719)。本明細書で開示したｐ７５−結合性化合物が、ニューロトロフィンが細胞死を促進する系において、生存を促進するか、又は死を引き起こすか確認するために、ｐ７５−結合性化合物及びプロＮＧＦ処理した成熟希突起膠細胞の生存率を調べた。
成熟希突起膠細胞は、ｐ７５ＮＴＲを発現するが、ＴｒｋＡを発現せず、ＮＧＦ又はプロＮＧＦ処理によりアポトティック細胞死を起こす(Beattie, M.S.,他(2002)Neuron 36,375-386;Casaccia-Bonnefil,P.,Carter,B.D.,Dobrowsky,R.T.,Chao,M.V.(1996)Nature 386,716-719;Yoon,S.O.,Casaccia-Bonnefil,P., Carter,B.,Chao,M.V.(1998)J Neurosci 18,3273-3281)。ＮＧＦ又はプロＮＧＦとは異なり、化合物３，４及び５単独では、細胞死を促進しなかった（図５ａ）。さらに、プロＮＧＦ誘導の細胞死は化合物３及び４により、濃度１〜１０ｎＭの範囲で、著しく阻害されたが、化合物５では阻害されず、１０ｎＭでは、生存率を下げるようであった（図５ａ）。
【０１１２】
ｐ７５−結合性化合物がｐ７５ＮＴＲへのプロＮＧＦ結合を抑えるかどうか確認するために、ｐ７５ＮＴＲへのプロＮＧＦ結合を濃度１５００ｎＭ〜１０、０００ｎＭの範囲で検定した。化合物３及び４は、プロＮＧＦ結合を同等に、最高濃度では約３０％減少まで、阻害した（図５ｂ）。プロＮＧＦ誘導による細胞死抑制と比べ、プロＮＧＦ結合阻害には高い濃度が必要と言うことは、以下の可能性を示唆する：１）共受容体（例えば、ソルティリン）存在下で天然の受容体コンフォメーションを持つ細胞ベースの検定では、プロＮＧＦ−ｐ７５ＮＴＲ相互作用は、インビトロ検定と比べて、ｐ７５−結合性化合物によって壊されやすいかも知れない；２）低濃度では、化合物は定量的にプロＮＧＦ結合を変化させ、細胞死の誘導を減少するが、プロＮＧＦ結合全量を減少させない；又は３）化合物は、プロＮＧＦ結合に影響を与えることなしに、ｐ７５ＮＴＲによるプロ（親）生存的なシグナリングを優先的に活性化する。生存経路の優先的な活性化は、希突起膠細胞に発現されている、ソルティリンの様な、共受容体への結合を欠くばかりでなく、化合物による受容体構造の変え方に違いがあることに拠るかも知れない。実際、予備的な研究によると、プロＮＧＦがソルティリン及びｐ７５ＮＴＲの両者へ関与すると、効率的なリガンド結合、受容体複合体活性化及びアポトティック細胞死への作用が促進される(Nykjaer, A.,Willnow,T.E.,及びPetersen,C.M.(2005)Curr Opin Neurobiol 15,49-57)。
【０１１３】
実施例６
化合物３はＡβ−誘導の神経変性を抑制する
既によく確立された手順を用いて、Ａβを３日間水の中でプレインキュベートしオリゴマーを形成させた。Ｅ１７海馬神経細胞を５日間インキュベートし、テスト化合物と共にＡβを添加する前に成熟させた。成熟した神経細胞は高いＡβ脆弱性を示す。
ネガティブ対照として加えたＡβ４２−１（３０μＭ）は、細胞死を起こさなかった。Ａβ１−４２を１０μＭ又は３０μＭ加えると、３日間の処理で、神経細胞の約４０％の損失を引き起こした（図６ａ）。これらの結果は、既に報告されたインビトロＡβ誘導細胞死レベル(Michaelis,M.L.,他(2006)J Pharm Exp Ther 312:659-668)と似ている。以前報告した発見(Yankner,B.A.,他(1990)PNAS 87:9020-9023)であるが、ＮＧＦ（１００ｐｇ／ｍｌ）を添加しても、Ａβ１−４２の効果を阻止できなかった。
化合物（ＮＣ）なしにＡβ１−４２を添加すると、４０％の神経細胞の損失をもたらした（図６ｂ）。不活性な化合物５及び６の存在は、Ａβ１−４２の毒性を抑えなかった。しかしながら、化合物３を添加すると、用量応答的な効果及び約１０ｎＭのＥＣ５０値を示して、Ａβ誘導の細胞死を抑制した。与えられた測定領域にある全細胞数当たりの、生存細胞の割合でデータを表示する。多数の生物検定のうち、条件当たり少なくとも２０領域について平均値＋／−ＳＥを示す。低いナノモル濃度で、好ましい分子量（５００以下）で、また好ましいＬｉｐｉｎｓｋｉスコアで、化合物４が、完全にＡβ誘導の変性を抑制する活性を持つと言うことは、インビボ（生体内）ＡＤモデルにおいて、前臨床開発のための高い優先度をリードする化合物であることを示す。化合物４はまた、Ａβ誘導による皮質及び中隔神経細胞の変性を抑えることが示された。
【０１１４】
実施例７
化合物４は中高年のマウスの脱毛を阻害する
３ヶ月間の毒性試行において、加齢性の脱毛があることが５匹の媒体処理マウスのうち３匹に、また５化合物４処理雄マウスのうち０匹に示された。追跡研究に於いて、２ヶ月間の、１０匹の媒体処理マウスのうち４匹、また９化合物４処理中高年雄マウスのうち０匹が、脱毛を示した。
これらの研究を総合すると、１５匹の媒体処理マウスのうち７匹及び１４匹の化合物４処理マウスのうち０匹が、脱毛を示した。得られた結果のｐ値は、０．００１（Ｆｉｓｈｅｒの直接確率検定）であり、前臨床研究において、顕著な効果があることを支持する。これらのデータによると、ｐ７５ＮＴＲは毛嚢細胞の細胞死、またそれにより、脱毛過程（カタゲン（中間期）として知られる）を調節することを示す。これらの発見は、加齢又は円形脱毛症のような病理学的状態における脱毛の抑制に対する、ｐ７５ＮＴＲを標的とする小分子化合物の投与の有効性を初めて示す。
【０１１５】
実施例のまとめ
与えられたリガンドと相互作用する受容体群の１部分を標的とすることで、自然に又は人工的に発生する、受容体を介する効果の一部分が活性化することが期待される。Ｔｒｋの活性化を最小にすることを含め、この様なシグナリングパターンの差異が、臨床的に有用となることが証明されそうである。例えば、実施例に開示した化合物は、ニューロトロフィンが細胞死を促進する条件で生存を促進し、またニューロトロフィン処理によって発生し、恐らくＴｒｋシグナリングを介した、過剰な交感神経繊維発芽及び痛み伝達の増強調節を誘導する可能性を減少させる(Wash,G.S.,Krol,K.M.,Kawaja,M.D.(1999)J.Neurosci19,258-273)。
【０１１６】
参考文献
以下に記載する参考文献及び本明細書に引用した全ての参照文献は、これらが補足し、説明し、背景を提供し、又は方法、技術及び／又は本明細書で使用される化合物を教示する限り、本明細書に参照文献として取り込まれている。
Appel, S. H. (1981) Ann Neurol 10, 499.
Beattie, M.S. et al. (2002) Neuron  36, 375-386.
Brann, A.B., et al. (1999) J Neurosci  19, 8199-8206. 
Bui, N.T., et al. (2002) J Neurochem  81, 594-605.
Carter, B.D., et al. (2002) Science 272, 542-545.
Casaccia-Bonnefil, P., Carter, B.D., Dobrowsky, R.T., Chao, M.V. (1996) Nature 386, 716-719.
Clark, D.E. (2002) J Pharm Sci  88, 815-821.
Fahnestock, M., Michalski, B., Xu, B., Coughlin, M.D. (2001) Mol Cell Neurosci 18, 210-220.
Foehr, E.D., et al. (2003) J Neurosci Res 73, 7556-7563.
Freireich et al., (1966) Cancer Chemother Rep. 50, 219-244.
Fu, X.C., Chen, C.X., Liang, W.Q., Yu, Q.S. (2001) Acta Pharmacol Sin 22, 663-668.
Gentry, J.J., Casaccia-Bonnefil, P., Carter, B.D. (2000) J Biol Chem 275, 7558-7565.
【０１１７】
Harrington, A.W. et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101, 6226-6230.
Harrington, A.W, Kim, J.Y., Yoon, S.O. (2002) J Neurosci  22, 156-166.
He, X.L., Garcia, K.C. (2004) Science 304, 870-875.
Huang, C.S. et al. (1994) J Biol Chem  274, 36707-36714.
Huber, L.J., Chao, M.V. (1995) Dev Bio 167, 227-238.
Lachyankar, M.B., et al. (2003) J Neurosci Res 71, 157-172.
Lad, S.P., Neet, K.E. (2003) J Neurosci Res 73, 614-626.
Lee, K.F. et al. (1992) Cell  69, 737-749.
Lee, R., Kermani, P., Teng, K.K., Hempstead, B.L. (2001) Science 294, 1945-1948.
Lin, Y.Z., Yao, S.Y., Veach, R.A., Torgerson, T.R., Hawiger, J. (1995) J Biol Chem 270, 14255-14258.
Lipinski, C.A. (2000) J Pharm Toxicol Methods 44, 235-249. 
Longo, F.M. et al. (1999) J Neurosci Res  55, 230-237.
Longo, F.M., Manthorpe, M., Xie, Y.M., Varon, S. (1997) J Neurosci Res  48, 1-17.
Lutz, M., and Kenakin, T. (1999) Quantitative Molecular Pharmacology and Informatics in Drug Discovery (Hoboken, New Jersey:  John Wiley & Sons).
Maliartchouk, S., Debeir, T., and Beglova, N. Cuello, A.C., Gehring, K, and Saragovi, H. U. (2000) J Biol Chem 275, 9946-9956.
Mamidipudi, V., Li, X., Wooten, M.W. (2002) J Biol Chem 277, 28010-28018. 
McDonald, I, Thornton, J.M., (1994) WWW Edition December 1994.
Michaelis, M.L., Ansar, S., Chen, Y., Reiff, E.R., Seyb, K.I., Himes, R.H., Audus, K.L., and Georg, G.I. (2006) J Pharm Exp Ther 312:659-668.
Motulsky, H.J., and Christopoulos, A. (2003) A Practical Guide to Curve Fitting, 2nd edn. (San Diego, California, GraphPad Software, Inc.).
Neubig, R.R., Spedding, M, Kenakin, T., and Christopoulos, A. (2003) Pharmacol Rev 55, 597-606.
Nykjaer, A. et al., (2004) Nature 427, 843-848.  
Nykjaer, A., Willnow, T.E., and Petersen, C.M. (2005) Curr Opin Neurobiol 15, 49-57.
Partridge, W.M. (2002) Adv Exp Med Bio 513, 397-430).  
Podulso, J.F., Curran, G.L. (1996) Brain Res Mol Brain Res 36, 280-286.
【０１１８】
Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, ed., 20th edition, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.
Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Pub. Co., Easton, Pa., 1980.
Roux, P.P., Bhakar, A.L., Kennedy, T.E., Barker, P.A. (2001) J Biol Chem 276, 23097-23104.
Sakurai, H., Chiba, H., Miyoshi, H., Sugita, T., Toriumi, W. (1999) J Biol Chem 274, 30353-30356.
Salehi, A.H., et al. (2000) Neuron 27, 279-288.
Saltzman, W.M., Mak, M.W., Mahoney, M.J., Duenas, E.T., Cleland, J.L. (1999) Pharm Res 16, 232-240.
Walsh, G.S., Krol, K.M., Kawaja, M.D. (1999) J Neurosci 19, 258-273.
Wang, J.J., Rabizadeh, S., Tasinato, A., Sperandio, S., Ye, X., Green, M., Assa-Munt, N., Spencer, D., and Bredesen, D.E. (2000) J Neurosci Res 60, 587-593.
Yang, T. et al. (2003) J Neurosci  23, 3353-3363.
Yankner, B.A., Caceres, A., Duffy, L.K. (1990) PNAS 87:9020-9023.
Yoon, S.O., Casaccia-Bonnefil, P., Carter, B., Chao, M.V. (1998) J Neurosci  18, 3273-3281.
Zhang, Y., et al. (2003) J Neurosci 23, 7385-7394.
Zhou, J., Holtzman, D.M., Weiner, R.I., Mobley, W.C. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91, 3824.
Zhou, J., Valletta, J.S., Grimes, M.L., Mobley, W.C. (1995) J Neurochem  65, 1146-1156.
【０１１９】
以前に権利主張された対象物の様々な詳細については、本明細書で権利主張した対象物の観点から離れない限り変更されうることは理解されるであろう。さらに、前述の記載は、例示の目的だけに行われ、限定を目的にしたものではない。
【図１】
0005586673.tif 000035
【図２ａ】
0005586673.tif 000036
【図２ｂ】
0005586673.tif 000037
【図３】
0005586673.tif 000038
【図４】
0005586673.tif 000039
【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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