(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物における疼痛の治療における使用のための組成物であって、治療的有効量のＰＡＰ、またはその酵素的に活性な変異体、断片もしくは誘導体、を含み、
前記酵素的に活性な変異体、断片もしくは誘導体は、下記からなる群から選択される１つ以上の修飾を含むＰＡＰである、組成物：アミノ酸付加、アミノ酸欠損、保存的アミノ酸置換、非天然アミノ酸置換、Ｄ−またはＤ，Ｌ−ラセミ混合物異性体型アミノ酸置換、アミノ酸化学置換、カルボキシ末端修飾またはアミノ末端修飾、生体適合性の分子への結合、および生体適合性の支持構造への結合。
【請求項２】
前記疼痛は、慢性疼痛、慢性炎症痛、神経因性疼痛、慢性神経因性疼痛、アロディニア、痛覚過敏、手術の後の疼痛、神経損傷、外傷、組織損傷、炎症、癌、ウイルス感染、帯状疱疹、糖尿病性神経障害、変形性関節症、熱傷、関節痛、腰痛、内臓痛、片頭痛、群発性頭痛、頭痛、線維筋痛症または分娩に関連する疼痛である請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記疼痛は、過剰量のリゾホスファチジン酸によって特徴付けられる請求項１記載の組成物。
【請求項４】
前記疼痛は、アデノシンまたはアデノシン受容体の機能における欠損によって特徴付けられる請求項１記載の組成物。
【請求項５】
前記動物はヒトである請求項１記載の組成物。
【請求項６】
前記ＰＡＰは、ヒト  ＰＡＰ、ウシ  ＰＡＰ、ラット  ＰＡＰおよびマウス  ＰＡＰ、ならびにそれらの酵素的に活性な断片、変異体および誘導体からなる群から選択される請求項１記載の組成物。
【請求項７】
前記ＰＡＰは、組み換えＰＡＰである請求項１記載の組成物。
【請求項８】
前記ＰＡＰ、またはその酵素的に活性な変異体、断片もしくは誘導体は、注入、経口投与、外科的な埋め込み型のポンプ、幹細胞、ウイルス遺伝子療法またはネイキッドＤＮＡ遺伝子治療を介して投与される請求項１記載の組成物。
【請求項９】
前記投与は、静脈内注入、硬膜外注入、または髄腔内注入を介する請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
前記投与は、ＰＡＰを発現している胚性幹細胞の髄腔内注入を介する請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
前記投与は、３日に約１回の髄腔内注入による請求項９記載の組成物。
【請求項１２】
前記投与は、アデノシン、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、ＡＭＰ類似体、アデノシンキナーゼ阻害剤、５’−アミノ−５’−デオキシアデノシン、５−ヨードツベルシジン、アデノシンデアミナーゼ阻害剤、２’−デオキシコホルマイシン、ヌクレオシド輸送体阻害剤、ジピリダモールのうち１つ以上と組み合わされる請求項８記載の組成物。
【請求項１３】
前記投与は、１つ以上の鎮痛薬と組み合わされる請求項８記載の組成物。
【請求項１４】
前記鎮痛薬はオピエートである請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
前記投与は、ＰＡＰまたはその酵素的に活性な変異体、断片もしくは誘導体をコードする核酸配列を含む、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスのベクター移入カセットを使用したウイルス遺伝子療法を介している請求項８記載の組成物。
【請求項１６】
動物における嚢胞性線維症の治療における使用のための組成物であって、治療的有効量のＰＡＰ、またはその酵素的に活性な変異体、断片もしくは誘導体を含み、
前記酵素的に活性な変異体、断片もしくは誘導体は、下記からなる群から選択される１つ以上の修飾を含むＰＡＰである、組成物：アミノ酸付加、アミノ酸欠損、保存的アミノ酸置換、非天然アミノ酸置換、Ｄ−またはＤ，Ｌ−ラセミ混合物異性体型アミノ酸置換、アミノ酸化学置換、カルボキシ末端修飾またはアミノ末端修飾、生体適合性の分子への結合、および生体適合性の支持構造への結合。
【請求項１７】
前記ＰＡＰ、またはその酵素的に活性な変異体、断片もしくは誘導体は、肺へのエアロゾル化または肺中への経肺投与によって投与される請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
動物の肺におけるアデノシンのレベルを増加させる組成物であって、治療的有効量のＰＡＰ、またはその酵素的に活性な変異体、断片もしくは誘導体を含み、
前記酵素的に活性な変異体、断片もしくは誘導体は、下記からなる群から選択される１つ以上の修飾を含む、組成物：アミノ酸付加、アミノ酸欠損、保存的アミノ酸置換、非天然アミノ酸置換、Ｄ−またはＤ，Ｌ−ラセミ混合物異性体型アミノ酸置換、アミノ酸化学置換、カルボキシ末端修飾またはアミノ末端修飾、生体適合性の分子への結合、および生体適合性の支持構造への結合。
【請求項１９】
動物における疼痛の治療における使用のためのキットであって、治療的有効量のＰＡＰ、またはその酵素的に活性な変異体、断片もしくは誘導体を含む、組成物、および局所組織へのＰＡＰの送達のための外科的な埋め込み型のポンプ装置を含み、
前記酵素的に活性な変異体、断片もしくは誘導体は、下記からなる群から選択される１つ以上の修飾を含むＰＡＰである、キット：アミノ酸付加、アミノ酸欠損、保存的アミノ酸置換、非天然アミノ酸置換、Ｄ−またはＤ，Ｌ−ラセミ混合物異性体型アミノ酸置換、アミノ酸化学置換、カルボキシ末端修飾またはアミノ末端修飾、生体適合性の分子への結合、および生体適合性の支持構造への結合。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００７年１１月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／００３，２０５号の利益を主張するものである。その開示は、参照によりその全体が本願明細書に組み込まれる。
【０００２】
本願明細書において開示された主題は、疼痛の治療のための前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
アメリカ人は、心臓疾患、糖尿病および癌の合計よりも多く疼痛を発症している。実際、約５０００万人のアメリカ人が慢性疼痛に罹患し、治療のために１年あたり約１０００億ドルを費やしている。残念なことに、最も強い入手可能な鎮痛薬の多くは、嗜癖、依存症ならびに心臓発作および脳卒中の増加したリスクを含む、深刻な副作用を有する。さらに、多くの慢性疼痛の症状は、現存する薬物療法によって効果的に治療できない。ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）（２００４年では２８億ドル；Ｇ．Ｄ．Ｓｅａｒｌｅ  ＆  Ｃｏ．、米国、イリノイ州、スコーキー）およびＶＩＯＸＸ（登録商標）（２００４年では１４億ドル、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．社、米国、ニュージャージー州、ホワイトハウス・ステーション）などの薬物の収益を考慮すると、慢性疼痛のための効果的な治療は、ヒトの健康に非常に役立つだろう。従って、効果的な疼痛治療について、未だ対処されていないニーズがある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
いくつかの実施態様では、方法が、治療的有効量のＰＡＰ、またはその活性な断片、変異体もしくは誘導体、あるいは治療的有効量の活性増強ＰＡＰ修飾因子を含む組成物または医薬製剤を投与することによって、動物における疼痛を治療するために提供される。いくつかの実施態様では、全てのタイプの疼痛（慢性疼痛、慢性炎症痛、神経因性疼痛、慢性神経因性疼痛、アロディニア、痛覚過敏、神経損傷、外傷、組織損傷、炎症、癌、ウイルス感染、帯状疱疹、糖尿病性神経障害、変形性関節症、熱傷、関節痛または腰痛、内臓痛、三叉神経痛、片頭痛、群発性頭痛、頭痛、線維筋痛症および分娩に関連する疼痛のうち１つ以上によって特徴付けられる疼痛を含むが、これらに限定されない）が治療される。
【０００５】
いくつかの実施態様では、方法が、少なくとも一部がリゾホスファチジン酸の過剰によって特徴付けられる障害について動物を治療するために提供され、当該動物に治療的有効量のＰＡＰ、またはその活性な断片、変異体もしくは誘導体、あるいは治療的有効量の活性増強ＰＡＰ修飾因子を含む組成物または医薬製剤を投与する工程を含む。
【０００６】
いくつかの実施態様では、当該動物はヒトである。
【０００７】
いくつかの実施態様では、当該ＰＡＰは、ヒト  ＰＡＰ、ウシ  ＰＡＰ、ラット  ＰＡＰおよびマウス  ＰＡＰ、ならびにそれらの活性な断片、変異体および誘導体からなる群から選択される。
【０００８】
いくつかの実施態様では、当該ＰＡＰまたはその活性な断片、変異体もしくは誘導体は、下記のうち１つ以上からなる群から選択される１つ以上の修飾を含む：保存的アミノ酸置換；非天然アミノ酸置換、Ｄ−またはＤ，Ｌ−ラセミ混合物異性体型アミノ酸置換、アミノ酸化学置換、カルボキシ末端修飾またはアミノ末端修飾、生体適合性の分子（脂肪酸およびＰＥＧを含む）への結合、および生体適合性の支持構造（アガロース、セファロースおよびナノ粒子を含む）への結合。
【０００９】
いくつかの実施態様では、当該ＰＡＰは、組み換え法によって得られる。
【００１０】
いくつかの実施態様では、当該ＰＡＰまたは当該ＰＡＰの活性増強修飾因子は、注入、経口投与、外科的な埋め込み型のポンプ、幹細胞、ウイルス遺伝子療法、ネイキッドＤＮＡ遺伝子治療のうちの１つ以上を介して投与される。いくつかの実施態様では、当該注入は、静脈内注入、硬膜外（ｅｐｉｄｅｒａｌ）注入、または髄腔内注入である。いくつかの実施態様では、当該投与は、ＰＡＰを発現している胚性幹細胞の髄腔内注入を介する。いくつかの実施態様では、当該投与は、３日に約１回の髄腔内注入による。いくつかの実施態様では、当該投与は、アデノシン、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）またはＡＭＰ類似体のうち１つ以上と組み合わされる。いくつかの実施態様では、当該投与は、公知の鎮痛薬と組み合わされる。いくつかの実施態様では、公知の鎮痛薬はオピエートである。いくつかの実施態様では、当該投与は、ＰＡＰまたはその活性な変異体もしくは断片をコードする核酸配列を含む、レトロウイルス、アデノウイルスまたははアデノ随伴ウイルスのベクターの移入カセットを使用したウイルス遺伝子療法を介する。
【００１１】
いくつかの実施態様では、方法が、動物における嚢胞性線維症を治療するために提供され、当該方法は、当該動物に、治療的有効量のＰＡＰ、またはその活性な断片、変異体もしくは誘導体、あるいは治療的有効量の活性増強ＰＡＰ修飾因子を含む組成物または医薬製剤を投与する工程を含む。いくつかの実施態様では、当該投与は、肺中のエアロゾル化による。
【００１２】
いくつかの実施態様では、方法が、少なくとも一部がアデノシンまたはアデノシン受容体の機能の欠損によって特徴付けられる障害を有する動物の肺におけるアデノシンのレベルを増加させるために提供され、当該方法は、当該動物に治療的有効量のＰＡＰ、またはその活性な断片、変異体もしくは誘導体、あるいは治療的有効量の活性増強ＰＡＰ修飾因子を含む組成物または医薬製剤を投与する工程を含む。
【００１３】
いくつかの実施態様では、単離されたＰＡＰペプチドが提供される。当該ペプチドは、ヒト  ＰＡＰ、乳牛  ＰＡＰ、ラット  ＰＡＰおよびマウス  ＰＡＰ、ならびにそれらの断片、変異体、および誘導体からなる群から選択することができる。いくつかの実施態様では、当該ＰＡＰペプチドをコードする単離されたヌクレオチド配列が提供される。いくつかの実施態様では、当該ヌクレオチド配列を含む発現ベクターが提供される。いくつかの実施態様では、当該発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。いくつかの実施態様では、当該ＰＡＰまたはその活性な変異体もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含むレトロウイルス、アデノウイルスもしくはアデノ随伴ウイルスのベクターの移入カセットが提供される。
【００１４】
いくつかの実施態様では、当該ＰＡＰペプチド、またはその活性な断片、変異体もしくは誘導体を含む組成物が提供され、当該組成物は、動物への投与のために、またはヒトへの投与のための医薬製剤として調製される。
【００１５】
いくつかの実施態様では、方法が、候補小分子の存在下および不存在下でのＰＡＰの活性を測定し、当該ＰＡＰ活性の増加または減少を引き起こす候補小分子をＰＡＰ修飾因子として同定することによって、ＰＡＰ活性の小分子修飾因子についてスクリーニングするために提供される。
【００１６】
いくつかの実施態様では、キットが、治療的有効量のＰＡＰ、またはその活性な断片、変異体もしくは誘導体を含む組成物または医薬製剤、および局所組織へのＰＡＰの送達のための外科的な埋め込み型のポンプ装置を含み、動物における疼痛の治療のために提供される。
【００１７】
いくつかの実施態様では、方法は、痛み止めに対する個体の反応を診断するために提供され、当該個体のＰＡＰゲノムの遺伝子座の中および周囲の１つ以上の一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入、欠損および／または他のタイプの遺伝的変異を同定する工程、ならびに当該ＳＮＰ、挿入、欠損および／または他のタイプの遺伝的変異と、当該痛み止めに対する所定の反応とを関連付ける工程を含む。
【００１８】
いくつかの実施態様では、方法は、疼痛についての個体の閾値を診断するために提供され、当該個体のＰＡＰゲノムの遺伝子座の中および周囲の１つ以上の一塩基多型（ＳＮＰ）挿入、欠損および／または他のタイプの遺伝的変異を同定する工程、ならびに、当該ＳＮＰ、挿入、欠損および／または他のタイプの遺伝的変異と、疼痛についての所定の閾値とを関連付ける工程を含む。
【００１９】
いくつかの実施態様では、方法は、急性疼痛から慢性疼痛への移行についての個体の傾向を診断するために提供され、当該個体のＰＡＰゲノムの遺伝子座の中および周囲の１つ以上の一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入、欠損および／または他のタイプの遺伝的変異を同定する工程、ならびに当該ＳＮＰ、挿入、欠損および／または他のタイプの遺伝的変異と、疼痛についての所定の閾値とを関連付ける工程を含む。
【００２０】
いくつかの実施態様では、方法は、疼痛の薬物療法に対する個体の反応、疼痛についての閾値、または急性疼痛から慢性疼痛への移行に対する傾向を診断するために提供され、当該方法は、当該個体と対照集団とのＰＡＰ発現レベルにおける相違を関連付ける工程、および差次的な発現の程度と、疼痛の薬物療法に対する所定の反応、または疼痛についての所定の閾値とを関連付ける工程を含む。
【００２１】
従って、疼痛および嚢胞性線維症の治療のための方法および組成物を提供することが、本願明細書において開示された主題の目的である。これらの目的および他の目的は、本願明細書において開示された主題によって、全体または一部が達成される。
【００２２】
上記の本願明細書において開示された主題の目的、他の目的および利点は、以下の記載、図および実施例の検討によって明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）の分泌型および膜貫通型のアイソフォームを発現する細胞を示す模式図。ＰＡＰの触媒部位（活性部位）は、細胞外間隙および小胞内腔に位置する（図示せず）。ＳＰ＝シグナルペプチド。ＴＭ＝膜貫通領域。
【図２】各前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）アイソフォームの唯一の３’非翻訳領域に相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）なリボプローブによるｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション実験からの顕微鏡写真。図２Ａ（左側の顕微鏡写真）は、ＰＡＰ膜貫通型アイソフォームが、マウス後根神経節（ＤＲＧ）ニューロン中で高いレベルで発現していることを示す。図２Ｂ（右側の顕微鏡写真）は、分泌型アイソフォームが、検出不可能なレベルであるほどに低い発現であることを示す。スケールバー  ＝  ５０μｍ。
【図３】酸性ホスファターゼ活性を定量化するための蛍光定量アッセイを示す一連の棒グラフ。左側の棒グラフ：シグマ（米国、ミズーリ州、セントルイス）から購入した純粋なウシ前立腺酸性ホスファターゼ（ｂＰＡＰ）タンパク質。右側の棒グラフ：形質移入された細胞可溶化物からアッセイされたマウス前立腺酸性ホスファターゼ（ｍＰＡＰ）。活性は、ＰＡＰ阻害剤  Ｌ−酒石酸塩（１０ｍＭ）によって減少する。これらのアッセイは、製造者の手順に従って行われ（ＥｎｚＣｈｅｋ  Ａｓｓａｙ、インビトロジェン、米国、カリフォルニア州、カールズバッド）、蛍光マイクロプレートリーダーを使用して定量化された。
【図４】リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）に誘起された情報伝達の、ウシ  ＰＡＰ（ｂＰＡＰ）の阻害を示すグラフ。Ｒａｔ１細胞にカルシウム感受性の指標  Ｆｕｒａ２−ＡＭを入れ、１．５時間、３７℃でｂＰＡＰとインキュベーションされたＬＰＡで刺激した（「ａ」の下のグラフの左側を参照）。洗い流しの後、この細胞は、１．５時間、３７℃で（しかし、ｂＰＡＰは入れずに）インキュベーションされたＬＰＡで刺激された（「ｂ」の下のグラフの右側を参照）。３つの独立した実験の平均的な割合は、＋／−ＳＥＭで（グレーで）プロットされる。ｎ＝計６０細胞が分析された。小さなエラーバーは、実験間の高度な再現性を強調する。
【図５】同一の視野において、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）−Ｖｅｎｕｓで形質移入されたＲａｔ１細胞（薄い線）は、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）に誘起されたカルシウムの反応が、形質移入されていない細胞（濃い線）よりも小さいことを示すグラフ（１５のＰＡＰ＋および１５の形質移入されていない細胞からの平均；これは２度再現された）。この効果は、（ＰＡＰと融合していない）Ｖｅｎｕｓを形質移入された細胞においては見出されなかった。
【図６】前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）によるリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）に誘起された情報伝達の阻害は、ホスファターゼ活性を必要とすることを示すグラフ。図６Ａおよび図６Ｃ（それぞれ左側の上および下のグラフ）については、Ｒａｔ１線維芽細胞は、野生型マウス  ＰＡＰ（ｍＰＡＰ）で形質移入された。図６Ｂおよび図６Ｄ（それぞれ、右側の上および下のグラフ）については、Ｒａｔ１線維芽細胞は、ホスファターゼデッドの（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｄｅａｄ）ＰＡＰ変異体で形質移入された。形質移入後、細胞にカルシウム感受性の指標  Ｆｕｒａ２−ＡＭを入れ、ＬＰＡで刺激した。図６Ａおよび図６Ｂは、形質移入されていない細胞またはＰＡＰコンストラクトで形質移入された細胞におけるＦｕｒａ２の反応（Ｖｅｎｕｓ蛍光によって視覚化されている）を示す図である。図６Ｃおよび図６Ｄは、形質移入されていない細胞（影付きのバー）およびＰＡＰコンストラクトで形質移入された細胞（白抜きのバー）についての、６０秒のＬＰＡ刺激の間の曲線下面積の定量を示す棒グラフである。統計：独立ｔ検定。図６Ｃおよび図６Ｄにおける絶対面積は、ｆｕｒａ２について、異なる日における細胞のローディングディッシュ（ｌｏａｄｉｎｇ  ｄｉｓｈ）中の可変性によって異なることに注意。
【図７】末梢神経損傷がどのようにリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）受容体の情報伝達に依存する神経因性疼痛を引き起こすかを示す模式図。前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）は、ＬＰＡを、モノグリセリド（ＭＧ）および無機リン酸（Ｐｉ）に脱リン酸化する。ＰＡＰは、損傷後に、後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンにおいて下方制御される。
【図８】神経因性疼痛行動を示すグラフ。図８Ａ（グラフの左側）は、末梢神経への損傷が、惹起段階（Ｉｎｉ；影付きの濃灰色）の間にアロディニアおよび痛覚過敏を引き起こし、これは、維持段階（影付きの薄灰色）の間持続することを示す。図８Ｂ（中央のグラフ）は、神経損傷前の可溶性前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）の注入は、惹起を阻止できることを示す。図８Ｃ（グラフの右側）は、神経損傷後のＰＡＰの注入が、維持段階の間、鎮痛性であることを示す。
【図９】神経因性疼痛は、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）ホスファターゼ活性の増加によって、治療できることを示す模式図。前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）はＬＰＡを分解し、ＬＰＡに誘起された情報伝達を減少させる。いくつかの方法（ａ−ｄ）が、侵害受容システムにおけるＰＡＰを増加させるために存在する。
【図１０】ｉｎ  ｖｉｖｏでのリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）に誘起された感作の、ウシ前立腺酸性ホスファターゼ（ｂＰＡＰ）の阻害を示すグラフ。媒体の髄腔内注入前（ベースライン；ＢＬ）および媒体（黒色の実線）、２０μＵ  ｂＰＡＰ（黒色の点線）、１ｎｍｏｌ  ＬＰＡ（灰色の点線）または１ｎｍｏｌ  ＬＰＡ＋２０μＵ  ｂＰＡＰ（灰色の実線）の髄腔内注入後の、野生型Ｃ５７ＢＬ／６  オスマウスの、機械的感受性（図１０Ａ、グラフの左側）および有害な熱感受性（図１０Ｂ、グラフの右側）。全ての試料は、３７℃で１０分間、注入の前にインキュベーションされた。注入量：５μＬ。Ｎ＝条件あたり５匹のマウス。エラーバー：＋／−ＳＥＭ。統計：媒体に対する独立ｔ検定。ｐ＜０．０５（＊）；ｐ＜０．００５（＊＊）；ｐ＜０．０００５（＊＊＊）。
【図１１】ウシ前立腺酸性ホスファターゼ（ｂＰＡＰ）およびヒト前立腺酸性ホスファターゼ（ｈＰＡＰ）が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて鎮痛性であることを示すグラフ。媒体の髄腔内注入の前（ベースライン；ＢＬ）、および媒体（実線、図１１Ａおよび図１１Ｂ）またはＢＳＡ（実線、図１１Ｃおよび図１１Ｄ）または２０μＵ  ｂＰＡＰ（点線、図１１Ａおよび図１１Ｂ）または１．３ｍｇ／ｍＬ  ｈＰＡＰ（点線、図１１Ｃおよび図１１Ｄ）の髄腔内注入後の、野生型Ｃ５７ＢＬ／６  オスマウスの有害な熱感受性（図１１Ａおよび図１１Ｃ）および機械的感受性（図１１Ｂおよび図１１Ｄ）。注入量：５μＬ。Ｎ＝条件あたり５匹のマウス。エラーバー：±ＳＥＭ。統計：媒体に対する独立ｔ検定。ｐ＜０．０５（＊）；ｐ＜０．００５（＊＊）。
【図１２】組み換えＡＬＰの髄腔内注入の前（ベースライン；ＢＬ）および組み換えＡＬＰの髄腔内注入の後（矢印；５０００Ｕ／ｍＬ；計２５，０００ｍＵ）の野生型Ｃ５７ＢＬ／６  マウスの、有害な熱感受性（図１２Ａ）および機械的感受性（図１２Ｂ）への、ウシ  アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の効果を示すグラフ。ＰＡＰおよびＡＬＰについてのユニット定義は、基本的に同じである（１Ｕは、１分間あたり、３７℃で、それぞれｐＨ  ４．８またはｐＨ  ９．８で、１μｍｏｌの４−ニトロフェニルリン酸エステルを加水分解する）。従って、２５，０００ｍＵ  ＡＬＰは、下記図１３に示されたデータを与えるように使用された２５０ｍＵ  ｈＰＡＰよりも、１００倍のホスファターゼ活性を有する。ベースライン値に対して、各時点の反応を比較するため、対応ｔ検定が使用された。これらのアッセイにおけるいずれの時点においても有意差はなかった。全てのデータは、平均値±ＳＥＭとして示される（エラーバーのうちのいくつかは、サイズが小さいため、不明瞭である）。より低い濃度のＡＬＰ（２５０ｍＵ、髄腔内）が使用された場合、熱感受性または機械的感受性を減少させないことも見出された（データは示されていない）。
【図１３】活性なヒト前立腺酸性ホスファターゼ（ｈＰＡＰ、２５０ｍＵ）の髄腔内注入は、マウスにおける有害な熱刺激に対する鎮痛を引き起こすことを示すグラフ。増加した肢の退避潜時（ｐａｗ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ  ｌａｔｅｎｃｙ）は、鎮痛を示す。増加した肢の退避潜時は、不活性なｈＰＡＰで処置されたマウスにおいては認められない。野生型Ｃ５７ＢＬ／６  オスマウスの熱感受性は、活性なｈＰＡＰ（実線）または不活性なｈＰＡＰ（点線）の髄腔内注入の前（ベースラインは、０日の時点である）および注入後６日間示される。注入量：５μＬ。Ｎ＝条件あたり１０匹のマウス。統計：不活性なｈＰＡＰに対する独立ｔ検定。エラーバー：＋／−ＳＥＭ。
【図１４】ヒト前立腺酸性ホスファターゼ（ｈＰＡＰ）の髄腔内注入の用量依存性を示すグラフ。１番上のグラフ（図１４Ａ）は、放射熱源に対する肢の退避潜時への、不活性なｈＰＡＰ（影付きの円）、または、増加した量（０．２５ｍＵ、影付きの四角；２．５ｍＵ、影付きの三角；２５ｍＵ、濃い円；または２５０ｍＵ、濃い四角）の活性なｈＰＡＰの髄腔内注入の用量依存性を示す。図１４Ｂは、不活性なＰＡＰを注入したマウスに対する、曲線下面積（ＡＵＣ；単位は潜時（秒）×注入後の時間（時間）である；注入後７２時間（３日間）について積分した）としてプロットされた、同様のデータを示す。図１４Ｂの挿入図は、対数目盛でプロットされたデータである。図１４Ｃは、ベースライン（ＢＬ）に対する、肢の退避潜時の最大の％増加としてプロットされた２日間の時点からのデータのグラフである。図１４Ｃの挿入図は、対数目盛上にプロットされた２日間の時点のデータである。注入量：５μＬ。０．２５ｍＵ、２．５ｍＵ、および２５ｍＵの量について、Ｎ＝８の野生型Ｃ５７ＢＬ／６  オスマウス；不活性なｈＰＡＰおよび２５０ｍＵの量について、Ｎ＝２４−７４の野生型Ｃ５７ＢＬ／６  オスマウス。曲線は、Ｐｒｉｓｍ  ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ（商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、米国、カリフォルニア州、ラ・ホーヤ）を使用して、非線形回帰分析によって作成された。エラーバー：＋／−ＳＥＭ。有意差は、ベースラインと比較して示される（対応ｔ検定）；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００５；＊＊＊Ｐ＜０．０００５。
【図１５】マウスにおける機械的感受性は、活性なヒト前立腺酸性ホスファターゼ（ｈＰＡＰ、２５０ｍＵ）の髄腔内注入による治療後に変化しないことを示すグラフ。野生型Ｃ５７ＢＬ／６  オスマウスの熱感受性は、活性なｈＰＡＰ（実線）または不活性なｈＰＡＰ（点線）の髄腔内注入の前（ベースラインは、０日の時点である）および注入後６日間示される。注入量：５μＬ。Ｎ＝条件あたり１０匹のマウス。いずれの時点においても有意差はなかった。エラーバー：＋／−ＳＥＭ。
【図１６】髄腔内硫酸モルヒネの用量依存性の抗侵害受容性効果を示すグラフ。１番上のグラフ（図１６Ａ）は、放射熱源に対する肢の退避潜時への、媒体（影付きの円）または増加した量（０．０１μｇ、濃い四角；０．１μｇ、三角；１μｇ、円；１０μｇ、影付きの四角；５０μｇ、濃い円）の硫酸モルヒネの髄腔内注入（モルヒネ／Ｖ−矢印）の用量依存性を示す。２つの最も高い用量で副作用が認められた。１０μｇの用量で、３匹のマウスが麻痺し、ストラウブ挙尾を示し、３−５時間続いた。５０μｇの用量で、２匹のマウスが死亡し、一方、３匹の他のマウスは麻痺し、ストラウブ挙尾を示し、１−２時間続いた。ストラウブ挙尾は、水平より上方に保持された硬直した尾として視覚化される（ＨｙｌｄｅｎおよびＷｉｌｃｏｘ、１９８０）。高用量の髄腔内モルヒネは、運動障害および致死をもたらすことが知られる（ＤｉｒｉｇおよびＹａｋｓｈ、１９９５；Ｇｒａｎｔら、１９９５；Ｎｉｓｈｉｙａｍａら、２０００）。図１６Ｂは、媒体を注入されたマウスに対する、曲線下面積（ＡＵＣ；単位は、潜時（秒）×注入後の時間（時間）である；全時間経過について積分した）としてプロットされた同様のデータを示す。図１６Ｂの挿入図は、対数目盛でプロットされたデータを示す。図１６Ｃは、ベースライン（ＢＬ）に対する、肢の退避潜時における最大の％増加としてプロットされた１時間の時点からのデータを示す。図１６Ｃの挿入図は、対数目盛上にプロットされた、１時間の時点のデータを示す。注入（髄腔内）量は、５μＬだった。ｎ＝８の野生型マウスが用量あたり使用された。曲線は、Ｐｒｉｓｍ  ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ（商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、米国、カリフォルニア州、ラ・ホーヤ）を使用して、非線形回帰分析によって作成された。有意差は、ベースラインと比較して示される（対応ｔ検定）；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００５；＊＊＊Ｐ＜０．０００５。全てのデータは、平均値±ＳＥＭとして示される。
【図１７】ウシ前立腺酸性ホスファターゼ（ｂＰＡＰ）が、マウスの炎症痛の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）モデルにおいて鎮痛性であることを示すグラフ。野生型Ｃ５７ＢＬ／６  オスマウスの有害な熱感受性（図１７Ａ）および機械的感受性（図１７Ｂ）は、後肢へのＣＦＡの注入の前（ベースライン；ＢＬ）、１日後、およびＢＳＡ（実線）または２０μＵ  ｂＰＡＰ（点線）の髄腔内注入後に示される。注入量：５μＬ。Ｎ＝条件あたり５匹のマウス。エラーバー：±ＳＥＭ。統計：媒体に対する独立ｔ検定。ｐ＜０．０５（＊）。
【図１８】ヒト前立腺酸性ホスファターゼ（ｈＰＡＰ）は、マウスの炎症痛の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）モデルにおいて鎮痛性であることを示すグラフ。ＣＦＡを注入された（または注入されていない）、野生型Ｃ５７ＢＬ／６  オスマウスの後肢の熱感受性は、活性なｈＰＡＰ（注入された肢、太い実線；注入されていない肢、薄い実線）または不活性なｈＰＡＰ（注入された肢、太い点線；注入されていない肢、薄い点線）のいずれかの髄腔内注入後に示される。活性なｈＰＡＰは、不活性なｈＰＡＰと比較して、ＣＦＡで処置された肢および処置されていない肢の両方の熱感受性を減少させる。
【図１９】ヒト前立腺酸性ホスファターゼ（ｈＰＡＰ）が、マウスの炎症痛の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）モデルにおいて鎮痛性であることを示すグラフ。ＣＦＡを注入された（または注入されていない）、野生型Ｃ５７ＢＬ／６  オスマウスの後肢の機械的感受性は、活性なｈＰＡＰ（注入された肢、太い実線；注入されていない肢、薄い実線）または不活性なｈＰＡＰ（注入された肢、太い点線；注入されていない肢、薄い点線）のいずれかの髄腔内注入後に示される。活性なｈＰＡＰは、ＣＦＡを注入された肢のみにおいて、不活性なＰＡＰと比較して、機械的感受性を減少させる。Ｎ＝１０のマウスが試験された。
【図２０】ウシ前立腺酸性ホスファターゼ（ｂＰＡＰ）が、マウスの神経因性疼痛の神経部分損傷（ＳＮＩ）モデルにおいて鎮痛性であることを示すグラフ。野生型Ｃ５７ＢＬ／６  オスマウスの損傷した後肢（左肢、影付きの四角）または損傷していない後肢（右肢、白抜きのダイアモンド）の有害な熱感受性は、活性なｂＰＡＰの髄腔内注入後に示される。熱感受性の減少は、ｂＰＡＰ注入から約３日間後の損傷した肢および損傷していない肢の両方について認められた。Ｎ＝７のマウスが試験された。
【図２１】ウシ前立腺酸性ホスファターゼ（ｂＰＡＰ）は、マウスの神経因性疼痛の神経部分損傷（ＳＮＩ）モデルにおいて鎮痛性であることを示すグラフ。野生型Ｃ５７ＢＬ／６  オスマウスの損傷した左後肢（影付きの四角）または損傷していない右後肢（白抜きのダイアモンド）の機械的感受性は、活性なｂＰＡＰの髄腔内注入後に示される。機械的感受性の減少は、ｂＰＡＰ注入から約３日間後に、損傷した肢については認められたが、損傷していない肢については認められなかった。Ｎ＝７のマウスが試験された。
【図２２】ヒト前立腺酸性ホスファターゼ（ｈＰＡＰ）は、マウスの神経因性疼痛の神経部分損傷（ＳＮＩ）モデルにおいて鎮痛性であることを示すグラフ。野生型Ｃ５７ＢＬ／６  オスマウスの損傷した後肢および損傷していない後肢の熱感受性は、活性なｈＰＡＰ（損傷した肢、影付きの四角；損傷していない肢、白抜きの四角）または不活性なｈＰＡＰ（損傷した肢、影付きの三角；損傷していない肢、白抜きの三角）の髄腔内注入後に示される。熱感受性の減少は、活性なｈＰＡＰ注入から約３日間後に、損傷した肢および損傷していない肢の両方で認められた。
【図２３】ヒト前立腺酸性ホスファターゼ（ｈＰＡＰ）は、マウスの神経因性疼痛の神経部分損傷（ＳＮＩ）モデルにおいて鎮痛性であることを示すグラフ。野生型Ｃ５７ＢＬ／６  オスマウスの損傷した後肢および損傷していない後肢の機械的感受性は、活性なｈＰＡＰ（損傷した肢、影付きの四角；損傷していない肢、白抜きの四角）または不活性なｈＰＡＰ（損傷した肢、影付きの三角；損傷していない肢、白抜きの三角）の髄腔内注入後に示される。機械的感受性の減少は、活性なｈＰＡＰ注入から約３日間後に、損傷した肢については認められたが、損傷していない肢については認められなかった。
【図２４】ＰＡＰ−／−  マウスは、炎症痛の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）モデル（図２４Ａおよび図２４Ｂ）、および神経因性疼痛の神経部分損傷（ＳＮＩ）モデル（図２４Ｃおよび図２４Ｄ）において、増強された侵害受容反応を呈することを示すグラフ。野生型マウスおよびＰＡＰ−／−  マウスは、１本の後肢へのＣＦＡの注入（ＣＦＡ−矢印）の前（ベースライン、ＢＬ）および後（野生型マウス、白抜きの円；ＰＡＰ−／−  マウス、濃い四角）に、放射熱源を使用して熱感受性（図２４Ａ）、および電気的ｖｏｎ  Ｆｒｅｙセミフレキシブルチップを使用して機械的感受性（図２４Ｂ）について試験された。非炎症の後肢（野生型マウス、灰色の円；ＰＡＰ−／−  マウス、灰色の四角）は、対照としての役割を果たす。ＳＮＩ  モデルについては、坐骨神経の腓腹腓骨枝および総腓骨枝は、結紮され、次いで、切除された（損傷−矢印）。損傷した後肢（野生型マウス、白抜きの円；ＰＡＰ−／−  マウス、濃い四角）および損傷していない後肢（対照；野生型マウス、灰色の円；ＰＡＰ−／−  マウス、灰色の四角）は、熱感受性（図２４Ｃ）および機械的感受性（図２４Ｄ）について試験された。対応ｔ検定は、各時点で、野生型マウス（ｎ＝１０）とＰＡＰ−／−  マウス（ｎ＝１０）との間で、反応を比較するために使用された；同じ肢の比較。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００５；＊＊＊Ｐ＜０．０００５。全てのデータは、平均値±ＳＥＭとして示される。
【図２５Ａ】ＰＡＰ−／−  マウスにおける脊髄内前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）の侵害受容性効果、およびＰＡＰ−／−  マウスにおける慢性炎症痛の行動表現型のＰＡＰレスキューを示すグラフ。野生型マウス（ＷＴ）およびＰＡＰ−／−（ＰＡＰ  ＫＯ）マウスは、１本の後肢（すなわち、左後肢）への完全フロイントアジュバントの注入（ＣＦＡ−矢印）の前（ベースライン、ＢＬ）および後に、熱感受性（図２５Ａ）について試験された。非炎症の（右）後肢は、対照としての役割を果たす。１日後、野生型マウスおよびＰＡＰ−／−  マウスの半数は、活性なヒト  ＰＡＰ（ｈＰＡＰ−矢印；２５０ｍＵ、髄腔内）を注入され、一方、残りの半分は、不活性なｈＰＡＰを注入された。これらの、不活性なｈＰＡＰを注入されたマウスからのデータは、上記図２４Ａにおいて示された。図２５Ａでは、野生型の対照の肢についてのデータが薄い影付きの円で示され、野生型の炎症した肢については濃い影付きの円で、活性なｈＰＡＰを投与した野生型の対照の肢については薄い影付きの三角で、活性なｈＰＡＰを投与した野生型の炎症した肢については影付きでない三角で、ＰＡＰ  ＫＯの対照の肢については薄い影付きの四角で、ＰＡＰ  ＫＯの炎症した肢については濃い影付きの四角で、活性なＰＡＰを投与したＰＡＰ  ＫＯの対照の肢については薄い影付きのダイアモンドで、活性なＰＡＰを投与したＰＡＰ  ＫＯの炎症した肢については影付きでないダイアモンドで示される。対応ｔ検定は、各時点で、野生型マウス（ｎ＝１０／群）とＰＡＰ−／−  マウス（ｎ＝１０／群）との間で、反応を比較するために使用された；同じ肢の比較（ｎ＝４０匹のマウスがこの実験のために使用された）。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００５；＊＊＊Ｐ＜０．０００５。全てのデータは、平均値±平均値の標準誤差として示される。
【図２５Ｂ】ＰＡＰ−／−  マウスにおける脊髄内前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）の侵害受容性効果、およびＰＡＰ−／−  マウスにおける慢性炎症痛の行動表現型のＰＡＰレスキューを示すグラフ。野生型マウス（ＷＴ）およびＰＡＰ−／−（ＰＡＰ  ＫＯ）マウスは、１本の後肢（すなわち、左後肢）への完全フロイントアジュバントの注入（ＣＦＡ−矢印）の前（ベースライン、ＢＬ）および後に、機械的感受性（図２５Ｂ）について試験された。非炎症の（右）後肢は、対照としての役割を果たす。１日後、野生型マウスおよびＰＡＰ−／−  マウスの半数は、活性なヒト  ＰＡＰ（ｈＰＡＰ−矢印；２５０ｍＵ、髄腔内）を注入され、一方、残りの半分は、不活性なｈＰＡＰを注入された。これらの、不活性なｈＰＡＰを注入されたマウスからのデータは、図２４Ｂにおいて示された。図２５Ｂでは、野生型の対照の肢についてのデータが薄い影付きの円で示され、野生型の炎症した肢については影付きでない円で、活性なｈＰＡＰを投与した野生型の対照の肢については濃い影付きのダイアモンドで、活性なｈＰＡＰを投与した野生型の炎症した肢については影付きでないダイアモンドで、ＰＡＰ  ＫＯの対照の肢については影付きでない四角で、ＰＡＰ  ＫＯの炎症した肢については濃い影付きの四角で、活性なＰＡＰを投与したＰＡＰ  ＫＯの対照の肢については薄い影付きの三角で、活性なＰＡＰを投与したＰＡＰ  ＫＯの炎症した肢については影付きでない三角で示される。対応ｔ検定は、各時点で、野生型マウス（ｎ＝１０／群）とＰＡＰ−／−  マウス（ｎ＝１０／群）との間の反応を比較するために使用された；同じ肢の比較（ｎ＝４０匹のマウスがこの実験のために使用された）。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００５；＊＊＊Ｐ＜０．０００５。全てのデータは、平均値±平均値の標準誤差として示される。
【図２６−１】細胞および侵害受容性回路（ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ  ｃｉｒｃｕｉｔ）中での、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、アデノシンへのアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）の脱リン酸化によって明らかとなった、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）エクト−５’−ヌクレオチダーゼ活性に関連するデータを示す。図２６Ａは、アデノシン濃度の増加によって測定された、１ｍＭ  ＡＭＰ、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、またはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）への、ヒト前立腺酸性ホスファターゼ（ｈＰＡＰ、２．５Ｕ／ｍＬ）の効果を示すグラフである。脱リン酸化反応（時点あたりｎ＝３）は、示された時点での熱変性によって停止された。アデノシンへのヌクレオチドの変換は、高性能液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）によって測定された。データは、平均値±ＳＥＭとして示される。図２６Ｂは、１ｍＭ  ＡＭＰとヒト前立腺酸性ホスファターゼ（ｈＰＡＰ）とのインキュベーションの前（ｔ＝０）および後（ｔ＝２４０分）のＨＰＬＣ  クロマトグラムを示す。アデノシン（ａｄｏ）およびＡＭＰに対応するピークが示される。任意の単位（ａ．ｕ．）。図２６Ｃおよび図２６Ｄは、マウス膜貫通型ＰＡＰ（ＴＭ−ＰＡＰ）発現コンストラクト（図２６Ｃ）、または空のｐｃＤＮＡ３．１  ベクター（図２６Ｄ）で形質移入され、次いで、ＡＭＰ組織化学を使用して染色されたＨＥＫ  ２９３細胞を示す顕微鏡写真である。細胞膜は透過処理されなかったため、細胞外ホスファターゼ活性をアッセイすることができた。同一の結果が、各遺伝子型の５匹のさらなるマウスから得られた。ＡＭＰ（図２６Ｃおよび図２６Ｄにおいては６ｍＭである）が基質として使用され、バッファーのｐＨは５．６だった。スケールバー：図２６Ｃ−図２６Ｄにおいては５０μｍである。
【図２６−２】細胞および侵害受容性回路（ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ  ｃｉｒｃｕｉｔ）中での、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、アデノシンへのアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）の脱リン酸化によって明らかとなった、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）エクト−５’−ヌクレオチダーゼ活性に関連するデータを示す。図２６Ｅ−図２６Ｈは、ＡＭＰ組織化学を使用して染色された、野生型（図２６Ｅおよび図２６Ｇ）およびＰＡＰ−／−（図２６Ｆおよび図２６Ｈ）成体マウスからの、腰後根神経節（ＤＲＧ；図２６Ｅおよび図２６Ｈ）および脊髄（図２６Ｇ−２６Ｈ）を示す顕微鏡写真である。野生型およびＰＡＰ−／−の脊髄の前角における運動神経もまた、染色された。同一の結果が、各遺伝子型の５匹のさらなるマウスから得られた。ＡＭＰ（図２６Ｅ−図２６Ｈにおいては０．３ｍＭである）が基質として使用され、バッファーのｐＨは５．６だった。スケールバー：図２６Ｅ−図２６Ｆにおいては５０μｍである；図２６Ｇおよび図２６Ｈにおいては５００μｍである。
【図２７】前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）が、抗侵害受容のためにＡ１−アデノシン受容体を必要とすることを示すグラフ。野生型のマウス（白抜きの円）およびＡ１Ｒ−／−  マウス（濃い四角）は、ヒト前立腺酸性ホスファターゼの髄腔内注入（ｈＰＡＰ−矢印）の前（ベースライン、ＢＬ）および後に、熱感受性（図２７Ａ）および機械的感受性（図２７Ｂ）について試験された。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）が、野生型マウスおよびＡ１Ｒ−／−  マウスの１本の後肢へ注入された（ＣＦＡ−矢印）。活性な、または不活性なヒト前立腺酸性ホスファターゼ（ｈＰＡＰ）が、１日後（ｈＰＡＰ−矢印）に、髄腔内に注入された。炎症した後肢（野生型マウス、白抜きの円；Ａ１Ｒ−／−  マウス、濃い四角）および非炎症の後肢（対照；野生型マウス、影付きの円；Ａ１Ｒ−／−  マウス、影付きの四角）が、熱感受性（図２７Ｃ）および機械的感受性（図２７Ｄ）について試験された。神経部分（ＳＮＩ）モデルが、野生型マウスおよびＡ１Ｒ−／−  マウスにおいて神経因性疼痛（損傷−矢印）を引き起こすために使用された。活性な、または不活性なｈＰＡＰが、４日後に髄腔内に注入された（ｈＰＡＰ−矢印）。損傷した後肢（野生型マウス、白抜きの円；Ａ１Ｒ−／−  マウス、濃い四角）および損傷していない後肢（対照；野生型マウス、影付きの円；Ａ１Ｒ−／−  マウス、影付きの四角）が、熱感受性（図２７Ｅ）および機械的感受性（図２７Ｆ）について試験された。全ての実験について、マウスあたり２５０ｍＵのｈＰＡＰが注入された。ｔ検定が、野生型マウス（ｎ＝１０）とＡ１Ｒ−／−  マウス（ｎ＝９）との間で、各時点で反応を比較するために使用された；同じ肢の比較。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００５；＊＊＊Ｐ＜０．０００５。全てのデータは、平均値±ＳＥＭとして示される。
【図２８】Ａ１−アデノシン受容体（Ａ１Ｒ）が、ウシ  前立腺酸性ホスファターゼ（ｂＰＡＰ）の抗侵害受容のために必要とされることを示すグラフ。野生型マウス（白抜きの円、ｎ＝７）およびＡ１Ｒ−／−  マウス（濃い四角、ｎ＝７）が、活性なｂＰＡＰの髄腔内注入（０．３Ｕ／ｍＬ；矢印）の前（ベースライン、ＢＬ）および後に、熱感受性（図２８Ａ）および機械的感受性（図２８Ｂ）について試験された。対応ｔ検定が、野生型マウスとノックアウトマウスとの間で、反応を各時点で比較するために使用された。有意差は、下記のように示される；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００５；＊＊＊Ｐ＜０．０００５。全てのデータは、平均値±ＳＥＭとして示される。
【図２９】前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）の抗侵害受容性効果は、選択的  Ａ１−アデノシン受容体（Ａ１Ｒ）拮抗薬で、一過性に阻害できることを示すグラフ。野生型マウスは、１本の後肢（炎症した肢、白抜きの円または濃い四角）への、完全フロイントアジュバントの注入（ＣＦＡ−矢印）の前（ベースライン、ＢＬ）および後に、有害な熱感受性（図２９Ａ）および機械的感受性（図２９Ｂ）について試験された。非炎症の後肢は、対照としての役割を果たした（影付きの円または四角）。全てのマウスは、活性なｈＰＡＰを注入された（ｈＰＡＰ−矢印；２５０ｍＵ、髄腔内）。２日後に、マウスの半数は媒体（ＣＰＸ／Ｖ−矢印、円；腹腔内（ｉ．ｐ．）；行動測定の１時間前）を注入され、一方、残りの半分は、８−シクロペンチル−１，３−ジプロピルキサンチンを注入された（ＣＰＸ／Ｖ−矢印、四角；１ｍｇ／ｋｇ  腹腔内；行動測定の１時間前）。ＣＰＸは、ｈＰＡＰの全ての抗侵害受容性効果に一過性に拮抗した。対照的に、ＣＰＸは、９日目（ｈＰＡＰの抗侵害受容性効果がなくなった４日後）に注入された場合、熱感受性または機械的感受性に影響しなかった。対応ｔ検定は、媒体を注入されたマウス（ｎ＝１０）と、ＣＰＸを注入されたマウス（ｎ＝１０）との間で、反応を各時点で比較するために使用された；同じ肢の比較。＊＊＊Ｐ＜０．０００５。全てのデータは、平均値±ＳＥＭとして示される。
【図３０】髄腔内  Ｎ６−シクロペンチルアデノシン（ＣＰＡ）（選択的  Ａ１−アデノシン受容体（Ａ１Ｒ）作動薬）の用量依存性の抗侵害受容性効果を示すグラフ。図３０Ａは、放射熱源への肢の退避潜時に対する、媒体または増加した用量（０．０００５ｎｍｏｌ−５ｎｍｏｌ）のＣＰＡの（髄腔内）注入（ＣＰＡ／Ｖ−矢印）の効果を示す。２つの最も高い用量のＣＰＡを注入されたほとんど全てのマウスは、１時間続いた前肢および後肢の麻痺によって、２０秒のカットオフに達した（囲まれた領域）。高用量のアデノシン受容体作動薬は、運動麻痺を引き起こすことが知られる（Ｓａｗｙｎｏｋ、２００６）。図２０Ｂは、媒体を注入されたマウスに対する、曲線下面積（ＡＵＣ；単位は、潜時（秒）×注入後の時間（時間）である；全時間経過にわたって積分した）としてプロットされた図３０Ａと同様のデータを示す。図３０Ｂの挿入図は、対数目盛でプロットされたデータを示す。図３０Ｃは、ベースライン（ＢＬ）に対する、肢の退避潜時における最大の％増加としてプロットされた、１時間の時点からのデータを示す。図３０Ｃの挿入図は、対数目盛上にプロットされた１時間の時点からのデータを示す。（髄腔内）注入量は５μＬだった。用量あたり、ｎ＝８の野生型マウスが使用された。全てのデータは、平均値±平均値の標準誤差として示される。曲線は、Ｐｒｉｓｍ  ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ（商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、米国、カリフォルニア州、ラ・ホーヤ）を使用して、非線形回帰分析によって作成された。有意差は、ベースラインに対して示される（対応ｔ検定）；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００５；＊＊＊Ｐ＜０．０００５。全てのデータは、平均値±ＳＥＭとして示される。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本願明細書において開示された主題に従って、方法および組成物が、疼痛および嚢胞性線維症の治療のために提供される。いくつかの実施態様では、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）と呼ばれるタンパク質が、これらの障害の治療のために提供される。ＰＡＰタンパク質は、髄腔内に（脊髄へ）注入される場合、動物モデルにおける慢性炎症痛および神経因性疼痛の治療に非常に効果的である。ＰＡＰタンパク質の単回注入は、最大３日間の鎮痛を生じさせることができる。疼痛を３日間軽減する、このような単回投与は、現存する疼痛治療を大いに改善する。
【００２５】
（Ｉ．定義）
下記の用語は、当業者によってよく理解されると考えられるが、下記の定義は、本願明細書において開示された主題の説明を容易にするために記載される。
【００２６】
長年の特許法の慣習に従い、語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、本願（請求項を含む）において使用される場合、「１つ以上の」を意味する。
【００２７】
特段の記載がない限り、本願明細書および請求項で使用される成分の量、反応条件などを表す全ての数字は、語「約」によって、全ての例において、改変されるものとして理解されるものとする。従って、異なる記載がない限り、本願明細書および請求項に記載されるパラメータの数値幅は、本願明細書において開示された主題によって得ようとする所望の特性に応じて、変化する可能性がある近似値である。
【００２８】
本願明細書で使用される用語「動物」は、特定の治療のレシピエントとなるヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などを含む（しかしこれらに限定されない）、全ての動物（例えば、１の動物）を指す。
【００２９】
「アミノ酸配列」ならびに「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」などの用語は、本願明細書において互換的に使用され、当該アミノ酸配列を、言及されるタンパク質分子に関連する、完全な、天然のアミノ酸配列（すなわち、自然に生じるタンパク質中で見出されるアミノ酸のみを含む配列）に限定することは意図されていない。本願明細書において開示された主題のタンパク質およびタンパク質の断片は、組み換え法によって産生することができ、または、自然に存在する供給源から単離することができる。
【００３０】
同様に、本願明細書において開示された全ての遺伝子、遺伝子の名称、および遺伝子産物は、本願明細書において開示された組成物および方法を利用できる全ての種からの相同体に対応することが意図される。従って、当該用語は、ヒトおよびマウスからの遺伝子および遺伝子産物を含むが、これらに限定されない。特定の種からの遺伝子または遺伝子産物が開示された場合、この開示は例示のみが意図され、それが現れる文脈が明白に示していない限り、制限的に解釈されないものとすることが理解される。従って、例えば、本願明細書において開示された遺伝子については、いくつかの実施態様では、ジェンバンク（登録商標）受入番号に基づく哺乳類の核酸およびアミノ酸配列に関連し、他の動物（他の哺乳類、魚類、両性類、爬虫類、および鳥類を含むが、これらに限定されない）からの相同の、かつ／またはオルソロガスな遺伝子および遺伝子産物を含むように意図される。
【００３１】
用語「ＬＰＡ」は、リゾホスファチジン酸の略である。
【００３２】
ＰＡＰの「修飾因子」は、ＰＡＰ触媒活性を調節できる小分子を指している。ＰＡＰ修飾因子は、ＰＡＰ活性の活性化剤または阻害剤のいずれかであってもよい。
【００３３】
用語「ＰＡＰ」は、前立腺酸性ホスファターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．２．）活性を有するタンパク質を意味する。用語「ＡＣＰＰ」（すなわち、前立腺酸性ホスファターゼ）は、本願明細書において、「ＰＡＰ」と互換的に使用される。ジェンバンク（登録商標）データベースは、様々な種からのＰＡＰのアミノ酸および核酸配列を開示し、これらのうちいくつかは、下記表１に要約される。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
「組み換え発現カセット」または単に「発現カセット」は、細胞中の特定の核酸の転写を可能にする核酸成分で組み換え的または合成的に産生された、核酸コンストラクトである。当該組み換え発現カセットは、プラスミド、ウイルス、または他のベクターの一部であってもよい。典型的に、当該組み換え発現カセットとしては、転写される核酸、プロモーター、および／または他の制御配列が挙げられる。いくつかの実施態様では、当該発現カセットはまた、例えば、複製開始点、および／または、染色体組み込み因子（例えば、レトロウイルス  ＬＴＲ）も含む。
【００３６】
「レトロウイルス」は、逆転写酵素およびレトロウイルスのビリオンを介して増殖する、１本鎖の、２倍体のＲＮＡウイルスである。レトロウイルスは、複製可能、または複製不可能である可能性がある。用語「レトロウイルス」は、いずれかの公知のレトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）などのｃ型  レトロウイルス）を指す。本願明細書において開示された主題の「レトロウイルス」としてはまた、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２）、およびレトロウイルスのレンチウイルスファミリー（ヒト免疫不全ウイルス  ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ならびにウマ免疫不全ウイルス（ＥＩＶ）など、しかしこれらに限定されない）が挙げられる。
【００３７】
本願明細書におけるいくつかの用語は、互換的に使用できる。従って、「ビリオン」、「ウイルス」、「ウイルス粒子」、「ウイルスベクター」、「ウイルスのコンストラクト」、「ベクター粒子」、「ウイルスベクター移入カセット」および「シャトルベクター」は、核酸を、ウイルス様侵入機構を通じて細胞中に導入できるウイルスおよびウイルス様粒子を指す可能性がある。このようなベクター粒子は、特定の条件下で、これが感染する細胞への、遺伝子の導入を媒介することができる。このような細胞は、本願明細書において、「標的細胞」と命名される。当該ベクター粒子が、これが感染する細胞へ遺伝子を導入するために使用される場合、このようなベクター粒子は、「遺伝子送達媒体」または「送達媒体」とも命名される。レトロウイルスベクターは、ウイルスの感染工程を利用することによって、効率的に遺伝子を導入するために使用されている。レトロウイルスゲノムにクローン化された外来遺伝子は、レトロウイルスによる感染または導入に対して感受性の高い細胞へ、効率的に送達できる。他の遺伝子操作を通じて、当該レトロウイルスゲノムの複製能を破壊できる。ベクターは、新たな遺伝物質を細胞に導入するが、増殖することはできない。
【００３８】
（ＩＩ．前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ））
ＰＡＰは、ヒスチジン酸性ホスファターゼ  スーパーファミリーのメンバーである。ヒスチジン酸性ホスファターゼは、活性部位内に位置する、高度に保存された、ＲＨＧＸＲＸＰ（配列番号：１）モチーフを含む。ＰＡＰは、例えば、熱変性を含む方法、および当該タンパク質と、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）とのインキュベート（これは、全てのヒスチジン残基を化学的に修飾する）、または、活性部位のヒスチジン残基（Ｈｉｓ１２）のアラニンへの変異（ＭｃＴｉｇｕｅおよびＶａｎ  Ｅｔｔｅｎ、１９７８；Ｏｓｔａｎｉｎら、１９９４）によって、触媒的に不活性にすることができる。その名称が意味する通り、ＰＡＰは、主に前立腺で発現するが、本願明細書において開示された主題は、ＰＡＰがまた、高いレベルで、小径ＤＲＧニューロンにおいて発現することを示す（実施例３−５、図１および図２Ａ）。ＰＡＰは、分泌型（可溶性）タンパク質、または触媒性ホスファターゼ領域が細胞外に位置する、１型  膜貫通型（ＴＭ）タンパク質のいずれかとして発現する（図１）。分泌型は、広範に研究されてきており、前立腺癌についての、血液の診断マーカーとして使用される（ＯｓｔｒｏｗｓｋｉおよびＫｕｃｉｅｌ、１９９４；Ｒｏｉｋｏら、１９９０）。
【００３９】
フッ化物抵抗性酸性ホスファターゼ（ＦＲＡＰ）は、多くの小径後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンの、従来からの組織化学的マーカーであり、疼痛の機構と関連する。ＦＲＡＰの分子同一性（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は、未知だった。遺伝的アプローチを使用し、本願明細書において開示された主題は、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ、ＥＣ  ３．１．３．２）の膜貫通型アイソフォームは、ＦＲＡＰであることを示す。マウスおよびヒトの、疼痛感受性の、ペプチド作動性および非ペプチド作動性の侵害受容性ニューロンは、ＰＡＰを発現しており、疼痛におけるＰＡＰについての予期しない役割を示唆する（実施例３−５）。
【００４０】
ＰＡＰおよびＦＲＡＰは、多くの特徴を共通して有する。例えば、ＦＲＡＰは、電子顕微鏡観察によると、細胞膜、ゴルジおよび小胞体に局在化しており、特に、ＤＲＧニューロンのシナプス前膜の付近に多い（ＣｓｉｌｌｉｋおよびＫｎｙｉｈａｒ−Ｃｓｉｌｌｉｋ、１９８６；Ｋｎｙｉｈａｒ−Ｃｓｉｌｌｉｋら、１９８６；ＫｎｙｉｈａｒおよびＧｅｒｅｂｔｚｏｆｆ、１９７０）。これらの超微細構造的なデータは、膜貫通型ＰＡＰが、ＤＲＧにおける主なアイソフォームであるという事実と一致している（実施例３−５）。ＰＡＰおよびＦＲＡＰはまた、両方とも、Ｌ−酒石酸塩によって、可逆的に阻害される（図３；実施例６）。ＰＡＰおよびＦＲＡＰは、両方とも、坐骨神経の切除後に、侵害受容回路（ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ  ｃｉｒｃｕｉｔ）において下方制御される（Ｃｏｓｔｉｇａｎら、２００２；ＣｓｉｌｌｉｋおよびＫｎｙｉｈａｒ−Ｃｓｉｌｌｉｋ、１９８６；実施例３；表２）。ＰＡＰおよびＦＲＡＰは、酸性ホスファターゼとして分類される。しかし、これらは両方とも、酸性（ｐＨ  ５）および中性のｐＨで触媒的に活性である。ＰＡＰおよびＦＲＡＰは、ホスホリル−ｏ−チロシン、ホスホリル−ｏ−セリン、パラ−ニトロフェニルリン酸エステル（ｐ−ＮＰＰ）、チアミン一リン酸およびヌクレオチド（特に、ヌクレオチド一リン酸エステル（アデノシン一リン酸；ＡＭＰなど））を含む、同じ基質を脱リン酸化する（ＯｓｔｒｏｗｓｋｉおよびＫｕｃｉｅｌ、１９９４；ＳｉｌｖｅｒｍａｎおよびＫｒｕｇｅｒ、１９８８ａ）。
【００４１】
いくつかのグループはまた、ＰＡＰが、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）を、モノグリセリド（ＭＧ）および無機リン酸に脱リン酸化することを見出した（図７）（ＨｉｒｏｙａｍａおよびＴａｋｅｎａｗａ、１９９９；Ｔａｎａｋａら、２００４）。実際、過剰発現によって増加するＰＡＰレベルは、前立腺癌細胞の増殖の減少を引き起こした（Ｌｉｎら、１９９４）。減少した増殖は、ＰＡＰが、ＬＰＡを不活性化させ、その分裂促進効果を遮断するという事実に起因する可能性がある（Ｔａｎａｋａら、２００４）。この仮説の裏付けとして、ＰＡＰ−／−  マウスにおけるＰＡＰ活性の減少は、前立腺細胞の過剰増殖をもたらす（Ｖｉｈｋｏ、未発表）。
【００４２】
リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）は、多くの生物学的過程（増殖、分化、生存、および疼痛を含む）を制御する強力なリゾリン脂質媒介物である（Ｂｒｉｎｄｌｅｙら、２００２；Ｉｎｏｕｅら、２００４；Ｍｏｏｌｅｎａａｒ、２００３；Ｍｏｏｌｅｎａａｒら、２００４；Ｔｉｇｙｉら、１９９４）。ＬＰＡは、傷を負った場合に、血小板ならびにニューロンおよび他の細胞から放出される（Ｅｉｃｈｈｏｌｔｚら、１９９３；Ｓｕｇｉｕｒａら、１９９９；Ｘｉｅら、２００２）。
【００４３】
ＬＰＡ１、ＬＰＡ２、ＬＰＡ３およびＬＰＡ４と呼ばれる、４つのよく特徴付けられたＬＰＡ受容体がある（ＡｎｌｉｋｅｒおよびＣｈｕｎ、２００４；Ｎｏｇｕｃｈｉら、２００３；Ｔａｋｕｗａら、２００２）。これらの受容体は、多様な下流の情報伝達分子に結合し、全身の多くの細胞で発現する。ＬＰＡ１およびＬＰＡ３はまた、ＤＲＧニューロンで発現する（実施例５を参照；Ｉｎｏｕｅら、２００４；Ｒｅｎｂａｃｋら、２０００）。さらに、Ｌｅｅらは、ＬＰＡ５と呼ばれる５番目のＬＰＡ受容体を発見し、これもＤＲＧで発現することを示した（Ｌｅｅら、２００６）。ＬＰＡ受容体の活性化は、カルシウムイメージング、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路の活性化、Ｅｌｋ１の転写活性化、およびＲｈｏＡ／ＲＯＣＫ経路の活性化を使用してルーチン的に測定される（ＭｉｌｌｓおよびＭｏｏｌｅｎａａｒ、２００３）。ＬＰＡ受容体の情報伝達は、受容体の脱感作、またはＬＰＡの脱リン酸化（分解）のいずれかによって終わる。現在、細胞外でＬＰＡを脱リン酸化するいくつかの公知のホスファターゼがある：１）ＰＡＰ；２）リゾホスファチジン酸性ホスファターゼ（ＬＰＡＰ；ＡＣＰ６としても知られる）；および３）脂質リン酸ホスファターゼ  １〜３（ＬＰＰ１〜３）（ホスファチジン酸ホスファターゼ  ２Ａ〜Ｃ型（ＰＰＡＰ２Ａ〜Ｃ）としても知られる）（Ｂｒｉｎｄｌｅｙら、２００２；ＨｉｒｏｙａｍａおよびＴａｋｅｎａｗａ、１９９９；Ｐｙｎｅら、２００５；Ｔａｎａｋａら、２００４）。読み出し情報としてカルシウムイメージングを使用し、ＬＰＰ１の過剰発現は、ＬＰＡの脱リン酸化を介してＬＰＡ受容体の情報伝達を阻害することが示された（Ｐｉｌｑｕｉｌら、２００１；Ｚｈａｏら、２００５）。ＰＡＰは、このような細胞ベースのアッセイを使用して研究されていない。
【００４４】
ＬＰＡは、ＤＲＧニューロンおよび疼痛に関連する行動への、いくつかの、十分に裏づけされた直接的な効果を有する（ＰａｒｋおよびＶａｓｋｏ、２００５）。Ｅｌｍｅｓおよび共同研究者は、細胞内カルシウムレベルが、ＬＰＡによる刺激後に、小径ＤＲＧニューロンにおいて増加することを見出した（Ｅｌｍｅｓら、２００４）。ＬＰＡはまた、後肢に注入された場合、脊髄背側部に位置するワイドダイナミックレンジニューロンにおける活動電位の持続時間および頻度を増加させ、かつ侵害受容性屈筋反応を増加させることが示された（Ｅｌｍｅｓら、２００４；Ｒｅｎｂａｃｋら、１９９９）。皮膚に注入された場合、ＬＰＡは、かゆみ／ひっかき行動をもたらすことが示された（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、２００６；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、２００４）。かゆみシグナルは、末梢からＣＮＳへ、小径ＤＲＧニューロンによって伝達される（Ｈａｎら、２００６；Ｓｃｈｍｅｌｚら、１９９７）。
【００４５】
ＬＰＡの髄腔内注入は、数日間マウスにおいて持続する、深刻なアロディニアおよび熱痛覚過敏を引き起こすことが示された（髄腔内＝ｉ．ｔ．＝脊髄の脳脊髄液（「ＣＳＦ」）へ）（Ｉｎｏｕｅら、２００４）。さらに、Ｉｎｏｕｅおよび共同研究者は、薬理学的および遺伝的アプローチを使用して、ＬＰＡ受容体の情報伝達が神経因性疼痛の惹起に必要とされることを示した。Ｉｎｏｕｅおよび共同研究者は、ＬＰＡ１−／−  マウスは、神経損傷後に、アロディニアおよび熱痛覚過敏を発症しないことを見出した。彼らはまた、神経因性疼痛は、ＬＰＡ１  アンチセンスオリゴヌクレオチドの髄腔内注入、ボツリヌストキシン  Ｃ３  細胞外酵素の髄腔内注入（ＢｏＴＸＣ３は、ＬＰＡ１の下流で活性化されるＲｈｏＡを阻害する）、およびＲＯＣＫ（これはＲｈｏＡの下流にある）の全身性薬理学的阻害によって遮断することができることを見出した（Ｉｎｏｕｅら、２００４）。決定的ではないが、彼らの研究は、ＤＲＧにおけるＬＰＡ１受容体の活性化が、これらの効果のために必要とされることを示唆した。
【００４６】
髄腔内ＬＰＡ注入はまた、坐骨神経における脱髄、および電位開口型のカルシウムチャネルのα２δ１  サブユニット（Ｃａα２δ１）の上方制御をもたらすことが示された（Ｉｎｏｕｅら、２００４）。Ｃａα２δ１は、神経因性疼痛モデルにおけるＤＲＧにおいて上方制御され、薬物ガバペンチンの標的である（Ｆｉｅｌｄら、２００６；Ｌｕｏら、２００１；Ｍａｎｅｕｆら、２００６）。ガバペンチンは、ヒトにおける神経因性疼痛を治療するために、頻繁に処方される（ＢａｉｌｌｉｅおよびＰｏｗｅｒ、２００６；Ｄｗｏｒｋｉｎら、２００３）。まとめると、これらの研究は、ＬＰＡ情報伝達が、ＤＲＧニューロンの生理機能、侵害受容回路の感作、および病理学的な疼痛状態の促進において直接的な役割を果たすことを示す。
【００４７】
本願明細書において開示された主題は、いずれかの特定の機構に制限されない一方、下記は、１つの提案されるモデルである。健康な、未損傷の動物では、ＰＡＰは、ＬＰＡを脱リン酸化（分解）し、不活性な非情報伝達状態においてＬＰＡ受容体（ＬＰＡ−Ｒ）を維持するように機能する（図７）。末梢神経損傷後、ＬＰＡは、血小板およびニューロンによって放出され、細胞外ＬＰＡ濃度を急激に上昇させる。これらの異常に高いレベルのＬＰＡは、ＬＰＡを分解する膜貫通型ＰＡＰの触媒能を圧倒する。次いで、これらの高濃度のＬＰＡは、ＬＰＡ受容体を活性化させ（図７）、神経因性疼痛を惹起する（図７；Ｉｎｏｕｅら、２００４）。従って、当該惹起段階は、精製された、可溶性ＰＡＰタンパク質（分泌型アイソフォーム）を、脊髄の脳脊髄液（ＣＳＦ）へ大量瞬時投与することによって遮断できる（図８Ａ−８Ｃ）。ＰＡＰの、この大量瞬時投与は、過剰なＬＰＡを分解し、ＬＰＡ受容体の情報伝達を阻害し、従って、アロディニアおよび痛覚過敏を防ぐ（すなわち、神経因性疼痛の惹起を防ぐ）。
【００４８】
グルタミン酸塩の受容体の活性化もまた、神経因性疼痛を惹起するために必要とされる（Ｄａｖａｒら、１９９１）。ＬＰＡの情報伝達は、ニューロンの感作または脱分極によって、グルタミン酸塩の放出を促進できる（ＣｈｕｎｇおよびＣｈｕｎｇ、２００２）。神経損傷後、ＰＡＰ発現およびＦＲＡＰ活性は急激に低下し、ＤＲＧニューロンにおいて低いままである（実施例３）（Ｃｏｓｔｉｇａｎら、２００２；ＣｓｉｌｌｉｋおよびＫｎｙｉｈａｒ−Ｃｓｉｌｌｉｋ、１９８６）。ＰＡＰがなければ、ＬＰＡ濃度は、健康な動物と比較して、損傷した動物において高いだろう。これらの異常なＬＰＡ濃度は、慢性的に、ＤＲＧニューロン上のＬＰＡ受容体を活性化できる。この慢性的な活性化は、ＤＲＧニューロンを感作でき、神経損傷後の数日間（維持段階の間）持続するアロディニアおよび痛覚過敏に寄与する可能性がある（図７）。異常なレベルのＬＰＡはまた、神経因性疼痛の維持段階に関与するミクログリアを活性化できる（ＨａｉｎｓおよびＷａｘｍａｎ、２００６；Ｍｏｌｌｅｒら、２００１；Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇら、２００４；Ｔｓｕｄａら、２００３）。本願明細書において開示された主題によれば、ＰＡＰ活性は、可溶性ＰＡＰを脊髄ＣＳＦへ注入することによって、維持段階の間に回復できる（図８）。過剰なＰＡＰは、ＬＰＡを分解でき、ＬＰＡに誘起された情報伝達を減少させることができ、機械的感受性および熱感受性をベースライン値まで回復できる。従って、いくつかの実施態様では、ＰＡＰは、神経因性疼痛のための治療として提供される（図９）。
【００４９】
本願明細書において開示された主題は、ウシ  ＰＡＰが、ＬＰＡを不活性化させることを示す（実施例７；図４）。図４において見出すことができる通り、細胞内カルシウムレベルは、Ｒａｔ１細胞がＬＰＡ＋ｂＰＡＰによって刺激された場合、はっきりと変化しなかった。しかし、これらの同様の細胞がＬＰＡのみによって刺激された場合、細胞内カルシウムレベルは劇的に変化した。これらのデータは、ｂＰＡＰが、ＬＰＡを脱リン酸化し、かつ、不活性化することを明白に示す。さらに、図５は、マウスＰＡＰが、ＬＰＡの脱リン酸化を介して、細胞ベースの構成におけるＬＰＡに誘起された情報伝達を急激に減少させることを示す（実施例８）。ＬＰＡの情報伝達のＰＡＰ調節が、ホスファターゼ活性に依存することをさらに示すため、ホスファターゼデッドのマウスＰＡＰ発現コンストラクト（ＰＡＰ変異体）を、活性部位残基ヒスチジン  １２をアラニンに変異させることによって、操作した。次いで、Ｒａｔ１線維芽細胞は、ＰＡＰまたはＰＡＰ変異体で形質移入され、カルシウムの反応について、ＰＡＰを形質移入された細胞と、形質移入されていない細胞とが、同一の視野において比較された（実施例９）。図６Ａ−６Ｄにおいて見出すことができる通り、ＬＰＡに誘起されたカルシウム反応は、ＰＡＰ変異体を形質移入された細胞とは対照的に、ＰＡＰを形質移入された細胞において顕著に減少した。これらの結果は、ＰＡＰを形質移入された細胞における減少したＬＰＡ反応は、ＰＡＰホスファターゼ活性に依存することを示す。これらの発見は、ＰＡＰが、脱リン酸化を通じて、ＬＰＡを不活性化することを示唆する。
【００５０】
さらに、いずれかの１つの作用機構に拘束されることなく、本願明細書において開示された主題は、エクトヌクレオチダーゼとして作用し、アデノシンの生成によって疼痛を抑制するＰＡＰの能力にさらに関連する。実施例１３に記載される通り、急性および慢性の疼痛に対するＰＡＰの、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける効果は、髄腔内アデノシンおよびＡ１−受容体（Ａ１Ｒ）拮抗薬の効果に似ていると思われる。図３０を参照。さらに、ＰＡＰ抗侵害受容は、Ａ１Ｒ拮抗薬によって一過性に阻害できると思われる。図２９を参照。
【００５１】
（ＩＩＩ．代表的な実施態様）
実施例１０−１１は、ＰＡＰが、脳脊髄液への注入から３日間、マウスにおいて鎮痛薬として機能することを示す。図１０Ａおよび図１０Ｂは、活性なウシ  ＰＡＰの髄腔内注入が、マウスにおけるＬＰＡに誘起された機械的感作および熱感作を阻害することを示す。図１１Ａ−１１Ｄ、１３および１４Ａ−１４Ｃは、活性なヒトまたはウシのＰＡＰの髄腔内注入が、鎮痛薬として機能し、マウスにおける熱感受性を減少させることを示す一方、図１２Ａおよび図１２Ｂは、別のホスファターゼ（ウシ  アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ））は、熱感受性または機械的感受性を減少させないことを示す。図１７Ａ−１７Ｂ、１８、および１９は、ウシおよびヒトのＰＡＰが、マウスにおける慢性的な機械的炎症痛および熱炎症痛を減少させることができることを示す。図２０−２３は、神経損傷によるアロディニアおよび痛覚過敏は、脊髄におけるＰＡＰ活性を増加させることによって、防ぐことができることを示す。例えば、神経部分損傷（ＳＮＩ）手術によって引き起こされた神経因性疼痛は、損傷した肢における熱刺激に対する痛覚過敏をもたらす。ヒトまたはウシのＰＡＰのいずれかの注入は、約３日間、ＳＮＩ−損傷した肢における痛覚過敏を顕著に減少させ、損傷していない肢における鎮痛を生じさせる。ＳＮＩ手術によって引き起こされた機械的感受性（アロディニア）はまた、ｈＰＡＰまたはｂＰＡＰの注入後、約３日間、顕著に減少する。ｈＰＡＰおよびｂＰＡＰは、損傷していない肢における機械的感受性を変化させない。前述のデータは、ＰＡＰの単回用量が、マウスがほぼ完全に回復する時点まで、慢性疼痛を治療することを示す。実施例１２は、ＰＡＰが、ＰＡＰ  ノックアウトマウスにおけるアロディニアおよび痛覚過敏（ｈｙｐｅｒａｎａｌｇｅｓｉａ）を阻害することを示す。
【００５２】
従って、ＰＡＰは、慢性疼痛（動物およびヒトにおける神経因性疼痛および炎症痛を含むが、これらに限定されない）のための治療として提供される。ＰＡＰ、その活性な変異体、断片もしくは誘導体、またはＰＡＰの小分子修飾因子は、本願明細書において開示された主題において提供される。ＰＡＰ、またはその活性な変異体、断片もしくは誘導体は、精製されたＰＡＰタンパク質を髄腔内に注入することによって投与でき、または、小分子修飾因子を（全ての可能性がある経路を介して）投与することによって、疼痛感受性のニューロン上に通常存在するＰＡＰを活性化することができる。これらの治療は、手術の前後に、外科的疼痛の治療、分娩に関連する疼痛の治療、慢性炎症痛（変形性関節症、熱傷、関節痛、腰痛）の治療、内臓痛、片頭痛、群発性頭痛、頭痛および線維筋痛症の治療、ならびに慢性神経因性疼痛の治療のために使用できる。神経因性疼痛は、神経損傷（外傷、手術、癌、ウイルス感染様帯状疱疹および糖尿病性神経障害によってもたらされた損傷を含むが、これらに限定されない）によって引き起こされる。
【００５３】
ヒト  ＰＡＰタンパク質の分泌型アイソフォームは、市販されており、ＰＡＰは、男性の血液内を循環している（Ｖｉｈｋｏら、１９７８ａ）。これは、疼痛を患っている患者へのＰＡＰタンパク質の注入が、耐容性がよいことを示唆する。さらに、選択的ＰＡＰ阻害剤が製薬会社によって以前に同定されているため、ＰＡＰは「新薬の開発につながるような（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）」タンパク質である（Ｂｅｅｒｓら、１９９６）。ＰＡＰ活性化剤またはアロステリック調節因子もまた、疼痛の治療のための効果的な薬物として、この開示において提供される。ＰＡＰの小分子修飾因子を同定するための方法は、この開示において提供される。このような方法としては、本願明細書において開示された主題の生化学的かつ細胞ベースのアッセイ（実施例１２に記載されたアッセイを含む）を使用するＰＡＰ修飾因子についての高処理スクリーニング（ＨＴＳ）が挙げられる。いくつかの実施態様では、大化合物のライブラリーがスクリーニングされ、非常に低い用量でＰＡＰを活性化する薬物が同定される。ＰＡＰは、ＬＰＡ受容体よりもずっと少ない組織において発現すると考えられ、ＰＡＰ活性を増加させる小分子は、より高い特異性かつ、より少ない副作用で、神経因性疼痛および炎症痛、ならびに他のヒトの疾病（嚢胞性線維症など）を治療するために使用できる。
【００５４】
本願明細書において開示された主題は、いずれかの特定の機構に限定されない一方で、１つのモデルでは、ＰＡＰは、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）のアデノシンへの変換を触媒することによって、本願明細書において開示された鎮痛効果を引き起こす。実験結果は、ＰＡＰが、脊髄組織におけるＡＭＰを脱リン酸化できることを示す。さらに、アデノシンは、鎮痛薬であり、神経因性疼痛を患っているヒトにおけるアロディニアを減少させる（Ｌｙｎｃｈら、２００３；Ｓｊｏｌｕｎｄら、２００１）。ＡＭＰは、げっ歯類の脊髄に注入された場合に、アデノシンに変換され、アデノシン受容体の活性化を介して鎮痛を引き起こす（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎら、２００１）。従って、本願明細書において開示された主題のいくつかの実施態様では、ＰＡＰは、疼痛の治療のために、ＡＭＰとともに同時投与される。いくつかの実施態様では、ＰＡＰによって、アデノシンに脱リン酸化できるＡＭＰの類似体は、ＰＡＰとともに同時投与される。いくつかの実施態様では、これらの類似体は、生物学的組織において、より安定であり、親油性であり、好ましい薬物代謝および薬物動態（ＤＭＰＫ）を有する。本願明細書に記載された主題のいくつかの実施態様では、疼痛の治療のためのＰＡＰの投与は、アデノシン、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、ＡＭＰ類似体、アデノシンキナーゼ阻害剤、アデノシンキナーゼ阻害剤  ５’−アミノ−５’−デオキシアデノシン、アデノシンキナーゼ阻害剤  ５−ヨードツベルシジン、アデノシンデアミナーゼ阻害剤、アデノシンデアミナーゼ阻害剤  ２’−デオキシコホルマイシン、ヌクレオシド輸送体の阻害剤、ヌクレオシド輸送体の阻害剤  ジピリダモールのうち１つ以上と組み合わされる。本願明細書に記載された主題のいくつかの実施態様では、疼痛の治療のためのＰＡＰの投与は、１つ以上の公知の鎮痛薬（オピエート（例えば、モルヒネ、コデインなど）を含むが、これに限定されない）と組み合わされる。
【００５５】
アデノシンおよびアデノシン受容体作動薬は、嚢胞性線維症（ＣＦ）のための治療として当該技術分野において試験される。いくつかの実施態様では、ＰＡＰは、患者の肺へエアロゾル化され、内在性のＡＭＰがアデノシンに変換され、従って、ＣＦのための治療として機能する。
【００５６】
男性と女性とで異なって影響するいくつかの疼痛の症状がある（Ｃｒａｆｔら、２００４；ＧｉｌｅｓおよびＷａｌｋｅｒ、１９９９）。ＰＡＰの発現は、前立腺で、アンドロゲンに制御される（Ｐｏｒｖａｒｉら、１９９５）。本願明細書において開示された主題のいくつかの実施態様では、ＰＡＰは、ヒトの健康に影響する様々な疼痛の症状を治療および診断するために有用である。いくつかの実施態様では、方法は、痛み止めに対する個体の反応を診断するために提供され、当該個体のＰＡＰゲノムの遺伝子座の中および周囲の１つ以上の一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入または欠損を同定する工程、ならびに当該ＳＮＰを、当該痛み止めに対する所定の反応と関連付ける工程を含む。いくつかの実施態様では、方法は、疼痛についての個体の閾値を診断するために提供され、当該個体のＰＡＰゲノムの遺伝子座の中および周囲の１つ以上の一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入または欠損を同定する工程、ならびに当該ＳＮＰと、疼痛についての所定の閾値とを関連付ける工程を含む。いくつかの実施態様では、方法は、男性および女性のＤＲＧニューロンにおけるＰＡＰの差次的な発現と、疼痛反応とを関連付けるために提供され、当該方法は、ＰＡＰが男性および女性のＤＲＧニューロンにおいて差次的に発現する程度を特定する工程、ならびに男性と女性との間での、疼痛または痛み止めに対する反応差を同定する工程、ならびに差次的な発現の程度と、疼痛または痛み止めに対する反応差とを関連付ける工程を含む。
【００５７】
（ＩＶ．ＰＡＰ含有組成物）
本願明細書において開示された主題の実施態様における使用のためのＰＡＰタンパク質の調製物は、様々な方法を使用して調製できる。ヒト  ＰＡＰは、シグマアルドリッチおよび他の業者から市販されている。ＰＡＰの生成は、一般的に、調製物が無菌であり、エンドトキシンフリーであり、ヒトへの使用について許容できることを保証するために、品質管理を必要とする。
【００５８】
ＰＡＰまたは活性なＰＡＰ変異体、断片もしくは誘導体の適した調製物を得る組み換え法もまた、適している。ＰＡＰ  ｃＤＮＡ（実施例１に記載されたｃＤＮＡなど）を使用して、組み換えタンパク質は、組み換えタンパク質発現のための多くの公知の方法のうちの１つ（例えば、Ｖｉｈｋｏら、１９９３参照）によって産生できる。本願明細書において開示された主題のＰＡＰペプチドをコードする、単離されたヌクレオチド配列、およびこれらのヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。当該発現ベクターを含む宿主細胞もまた提供される。本願明細書において開示された主題は、ウイルスベクター移入カセット（ＰＡＰまたはその活性な変異体もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレトロウイルスのベクター移入カセットなど、しかしこれらに限定されない）を含む。
【００５９】
活性なＰＡＰ変異体および断片は、変異誘発技術（部位特異的な変異原性（Ｏｓｔａｎｉｎら、１９９４）、体細胞超変異（ＷａｎｇおよびＴｓｉｅｎ、２００６）および欠損コンストラクトの作製を含む）を使用して産生でき、より安定であるか、または、ＬＰＡおよびＡＭＰのような基質についてより高いｋｃａｔを有するｈＰＡＰのバージョンを展開させることができる。本願明細書において開示された主題の活性なＰＡＰ変異体、断片または誘導体は、保存的アミノ酸置換、非天然アミノ酸置換、Ｄ−またはＤ，Ｌ−ラセミ混合物異性体型アミノ酸置換、アミノ酸化学置換、カルボキシ末端修飾またはアミノ末端修飾、および生体適合性の分子（脂肪酸およびＰＥＧを含む）への結合を含む、１つ以上の修飾を含む可能性がある。
【００６０】
用語「保存的に置換された変異体」は、１つ以上の残基が、機能的に類似する残基で保存的に置換され、かつ、（例えば、ＰＡＰの）参照ペプチドについて本願明細書に記載されたような活性を示す、参照ペプチドの配列と実質的に同一のアミノ酸残基配列を含むペプチドを指す。語句「保存的に置換された変異体」はまた、残基が、化学的に誘導体化された残基で置換されたペプチド（ただし、得られたペプチドは、本願明細書において開示された参照ペプチドの活性を示す）を含む。
【００６１】
保存的な置換の例としては、１つの非極性（疎水性）残基（イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなど）の、別のものへの置換、（アルギニンとリジンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、グリシンとセリンとの間などの）１つの極性（親水性）残基の、別のものへの置換、１つの塩基性残基（リジン、アルギニンまたはヒスチジンなど）の、別のものへの置換、または１つの酸性残基（アスパラギン酸またはグルタミン酸など）の、別のものへの置換が挙げられる。
【００６２】
本願明細書において開示された主題のペプチドはまた、当該ペプチドの必要な活性が維持される限り、配列が本願明細書において開示されているペプチドの配列に対する１つ以上の付加および／もしくは欠損、または残基を含むペプチドを含む。用語「断片」は、本願明細書において開示されたペプチドの配列よりも短いアミノ酸残基配列を含むペプチドを指す。
【００６３】
ＰＡＰ、および、特に、より小さな分子量の活性なＰＡＰ変異体、断片または誘導体は、従来の方法を使用した化学合成によって得ることができる。例えば、固相合成技術は、ＰＡＰまたはその活性な変異体、断片もしくは誘導体を得るために使用できる。
【００６４】
いくつかの実施態様では、ＰＡＰの調製物は、ＰＡＰタンパク質または活性なＰＡＰ変異体、断片もしくは誘導体が、固定化担体（アガロース、セファロース、およびナノ粒子などの担体を含む）と複合体を形成して、提供される。このような固定化を通じて、ＰＡＰは、分解から保護され、より長い期間、原位置に維持される。このようにして、本願においては、ＰＡＰ鎮痛が３日間認められ、いくつかの実施態様では、数週間または数ヶ月まで延長することができる。
【００６５】
（Ｖ．治療方法）
ＰＡＰは、動物における疼痛および嚢胞性線維症の治療のために、様々な方法によって投与できる。当該ＰＡＰ、その活性な変異体、断片もしくは誘導体、および／またはＰＡＰ修飾因子は、注入、経口投与、座剤、外科的な埋め込み型のポンプ、肺へのエアロゾル化、幹細胞、ウイルス遺伝子療法、またはネイキッドＤＮＡ遺伝子治療のうち１つ以上を介して投与できる。注入としては、いずれのタイプの注入（静脈内注入、硬膜外注入または髄腔内注入など、しかしこれらに限定されない）を挙げることができる。
【００６６】
いくつかの実施態様では、ＰＡＰ活性の小分子修飾因子は、経口投与によって投与される。
【００６７】
いくつかの実施態様では、ＰＡＰ、またはその活性な変異体、断片もしくは誘導体を含む、治療的有効量の組成物または医薬製剤は、動物またはヒトに、注入によって投与される。いずれかの適した注入方法（髄腔内、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、門脈内、皮内、硬膜外、または皮下など）を使用できる。いくつかの実施態様では、ＰＡＰは、望ましくない生理的効果を引き起こさない、全ての生理学的に許容できる担体中で分散される。適した担体の例としては、生理食塩水およびリン酸緩衝食塩水が挙げられる。注入可能な溶液は、従来の方法を使用して、担体中に、活性なＰＡＰの適した調製物を溶解または分散することによって調製できる。いくつかの実施態様では、ＰＡＰは、０．９％  生理食塩水中で与えられる。いくつかの実施態様では、ＰＡＰは、リポソーム（イムノリポソームなど）、または当該技術分野で公知の他の送達系もしくは製剤に封入されて提供される。
【００６８】
いくつかの実施態様では、治療的有効量のＰＡＰ、もしくはその活性な変異体、断片もしくは誘導体を含む組成物または医薬製剤は、局所組織へのＰＡＰの送達のための外科的な埋め込み型のポンプ装置を通じて提供される。いくつかの実施態様では、当該外科的な埋め込み型のポンプ装置は、埋め込み型注入ポンプおよび埋め込み型脊髄内カテーテルを含む、髄腔内の薬物送達系である。例えば、慢性疼痛治療のためにオピエートを送達するために使用される市販の装置を参照（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ、米国、ミネソタ州、ミネアポリス）。いくつかの実施態様では、キットは、治療的有効量のＰＡＰ、またはその活性な変異体、断片もしくは誘導体、および局所組織へのＰＡＰの送達のための外科的な埋め込み型のポンプ装置を含む組成物または医薬製剤を含み、動物における疼痛の治療のために提供される。
【００６９】
いくつかの実施態様では、動物は、嚢胞性線維症について、ＰＡＰで治療される。いくつかの実施態様では、当該動物は、治療的有効量のＰＡＰ、またはその活性な変異体、断片もしくは誘導体、あるいは治療的有効量のＰＡＰ活性増強修飾因子を含む、組成物または医薬製剤が投与され、当該ＰＡＰ組成物は肺中でエアロゾル化される。
【００７０】
いくつかの実施態様では、動物は、ＰＡＰを発現している胚性幹（ＥＳ）細胞の髄腔内注入を通じて、ＰＡＰまたはその活性な変異体もしくは断片を投与される（例えば、Ｗｕら、２００６参照）。この方法は、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）による、患者特異的なＥＳ細胞の誘導を利用する。このアプローチの成否は、動物モデルにおいて示された。造血幹細胞（ＨＳＣ）、ニューロンまたは他の細胞型に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化でき、対象動物またはヒトに移植できる細胞が産生される。
【００７１】
いくつかの実施態様では、治療的有効量のＰＡＰ、またはその活性な変異体、断片もしくは誘導体は、１日１回投与できる。いくつかの実施態様では、当該用量は、週に２または３回投与される。いくつかの実施態様では、投与は、週に１回または隔週で１回行われる。
【００７２】
いくつかの実施態様では、当該治療的有効量のＰＡＰまたはその活性な変異体もしくは断片は、当業者に「遺伝子治療」として知られる方法によって投与される。本願明細書で使用される遺伝子治療は、外因性核酸を、対象の適切な細胞に挿入することによって、対象の病的状態を治療するための一般的な方法を指す。当該核酸は、その機能性を維持するような様式で、例えば、特定のポリペプチドを発現する能力を維持するような様式で細胞に挿入される。いくつかの実施態様では、治療的有効量のＰＡＰは、ウイルス遺伝子療法を介して、ＰＡＰまたはその活性な変異体もしくは断片をコードする核酸配列を含むウイルスベクター移入カセット（例えば、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスのカセット）を使用して投与される。
【００７３】
本願明細書において開示された主題の方法に関して、好ましい対象は、脊椎動物の対象である。好ましい脊椎動物は、温血動物である。好ましい温血脊椎動物は哺乳類である。現在開示された方法によって治療される対象は、好ましくはヒトであるが、本願明細書において開示された主題の原則は、用語「対象」に含まれる全ての脊椎動物種に対する有効性を示すことが理解される。この構成において、脊椎動物は、障害の治療が望ましい全ての脊椎動物種であることが理解される。本願明細書で使用される「対象」は、ヒトおよび動物の対象の両方を含む。従って、動物の治療用途が、本願明細書において開示された主題に従って提供される。
【００７４】
このように、本願明細書において開示された主題は、哺乳類（ヒトなど）、および絶滅の危機に瀕しているために重要な哺乳類（アムールトラなど）、経済的に重要な哺乳類（ヒトによって消費されるべく農場で育てられる動物など）、および／または、ヒトにとって社会的に重要な動物（ペットとして、または動物園で飼育されている動物など）の治療のために提供される。このような動物の例としては、肉食動物（ネコおよびイヌなど）、ブタ（ｓｗｉｎｅ）（ブタ（ｐｉｇ）、雄ブタ、およびイノシシを含む）、反芻動物および／または有蹄動物（ウシ、雄ウシ、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン、およびラクダならびにウマなど）が挙げられるが、これらに限定されない。トリの治療（絶滅の危機に瀕したトリ、および／または、動物園で、もしくはペットとして飼育されるトリなど（例えば、オウム）、ならびに家禽（ｆｏｗｌ）、特に家畜化された家禽、すなわち、家禽類（ｐｏｕｌｔｒｙ）（例えば、シチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウなど）の治療を含む）も、ヒトにとって経済的に重要であるため、提供される。従って、家畜（家畜化されたブタ、反芻動物、有蹄動物、ウマ（競争馬を含む）、家禽などを含むが、これらに限定されない）の治療もまた、提供される。
【００７５】
（ＶＩ．診断学）
いくつかの実施態様では、対象の遺伝子型は、疼痛および／または疼痛の薬物療法に対する対象の反応を予測するための有用な情報を特定するために使用できる。本願明細書で使用される用語「遺伝子型」は、生物の遺伝子の構造を意味する。遺伝子型の発現は、生物の表現型、すなわち、生物の身体的特徴を生み出す可能性がある。用語「表現型」は、生物および環境の遺伝子型の相互作用によって生じる、生物のいずれかの観察可能な特性を指す。表現型は、表現型の可変の発現度および浸透率を包含する可能性がある。代表的な表現型としては、可視の表現型、生理的な表現型、感受性の表現型、細胞の表現型、分子の表現型、およびそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。当該表現型は、疼痛反応および／または疼痛の薬物療法に対する反応に関連する可能性がある。特定の対象の遺伝子型は、参照遺伝子型、または１人以上の他の対象の遺伝子型と比較でき、現在の、または予測的な表現型に関連する有用な情報を与える。
【００７６】
本願明細書で使用される、対象の「遺伝子型を特定する」とは、生物の少なくとも一部の遺伝子の構造を特定すること、特に、表現型の指標または予測として使用できる、対象における遺伝的変動を特定することを指す可能性がある。特定された遺伝子型は、対象の全ゲノムである可能性があるが、通常、ずっと少ない配列しか必要とされない。いくつかの実施態様では、遺伝子型の特定は、対象におけるＰＡＰゲノムの遺伝子座内およびその周囲の１つ以上の多型性（一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入、欠損および／または他のタイプの遺伝的変異を含む）を同定する工程を含む。本願明細書で使用される用語「多型性」は、集団における、２以上の遺伝的に特定された別の変異配列（すなわち、対立遺伝子）の発生を指す。多型マーカーは、相違が生じる遺伝子座である。代表的なマーカーは、少なくとも２の対立遺伝子を有し、それぞれ、１％よりも大きい頻度で生じる。多型の遺伝子座は、１の塩基対（例えば、一塩基多型（ＳＮＰ））ほどに小さくてもよい。
【００７７】
いくつかの実施態様では、本願明細書において開示された主題は、痛み止めに対する個体の反応を診断するための方法であって、当該個体のＰＡＰゲノムの遺伝子座の中および周囲の１つ以上のＳＮＰ、挿入、欠損および／または他のタイプの遺伝的変異を同定する工程、ならびに当該ＳＮＰ、挿入、欠損および／または他のタイプの遺伝的変異を、当該痛み止めに対する所定の反応と関連付ける工程を含む方法を提供する。例えば、痛み止めに対する個体の（または、集団のサブセットの）反応は、対照集団における当該痛み止めに対する反応と比較できる。それから、個体（または、集団のサブセット）が、ＰＡＰ遺伝子に関連する１つ以上の遺伝的変動を有するかどうかを特定することができる。いくつかの実施態様では、特定の遺伝的変動が、疼痛または疼痛の薬物療法に対して反応する能力に関連する可能性がある。例えば、遺伝的変動は、特定の疼痛反応行動に統計的に関連する可能性がある。従って、いくつかの実施態様では、本願明細書において開示された主題は、個体の（または、集団のサブセットの）、疼痛についての閾値および／または急性疼痛から慢性疼痛への移行に対する傾向を診断する方法であって、当該個体のＰＡＰゲノムの遺伝子座の中および周囲の１つ以上の一塩基多型（ＳＮＰ）挿入、欠損および／または他のタイプの遺伝的変異を同定する工程、ならびに当該ＳＮＰ、挿入、欠損および／または他のタイプの遺伝的変異を、疼痛についての所定の閾値または急性疼痛から慢性疼痛への移行に対する傾向と関連付ける工程を含む方法を提供する。いくつかの実施態様では、当該方法は、男性および女性のＤＲＧニューロンにおけるＰＡＰ発現の相違を関連付ける工程、男性および女性の間の疼痛または痛み止めに対する反応差を同定する工程、ならびに差次的な発現の程度を、疼痛または痛み止めに対する反応差と関連付ける工程に関する。
【００７８】
遺伝的変動（ＳＮＰなど）を特定する様々な方法は、当該技術分野で公知である。例えば、米国特許第６，９７２，１７４号は、可能性のあるＳＮＰ部位に隣接するポリメラーゼ連鎖伸張反応に基づく、ＳＮＰを特定する方法を提供する。米国特許第６，１１０，７０９号には、対象となる核酸の第１の増幅、次いで制限解析、および固形担体上の結合因子への増幅産物の固定化による、核酸分子におけるＳＮＰの存在または不存在を検出するための方法が記載されている。国際公開第９３０２２１２号には、ジデオキシヌクレオチドが、様々な長さの増幅産物を作製するために使用される核酸の増幅および配列決定のための別の方法が記載されている。次いで、この様々な長さの産物は、ゲル電気泳動によって分離され、視覚化される。国際公開第００２０８５３号には、さらに、配列変化によって引き起こされた核酸の構造変化についてスキャンするために、しっかりと制御されたゲル電気泳動の条件を使用して、一塩基変化を検出する方法が記載されている。
【実施例】
【００７９】
（ＶＩＩ．実施例）
本願明細書において開示された主題は、これから、さらに十分に、代表的な実施態様が示される下記の実施例への参照とともに記載される。しかし、本願明細書において開示された主題は、異なる形式で具体化でき、本願明細書に記載された実施態様に制限されるように解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施態様は、この開示を詳細かつ完全にし、当業者に実施態様の範囲を完全に伝達するように提供される。
【００８０】
（実施例１）
（方法）
（分子生物学）
ＡＣＰＰ−膜貫通型アイソフォーム（マウス  ＰＡＰ）の全長の発現コンストラクト（ジェンバンク（登録商標）受入番号  ＮＭ＿２０７６６８からのｎｔ  ６４−１３１７；配列番号：２）を、鋳型としてのＣ５７ＢＬ／６  マウスの三叉神経のｃＤＮＡ、およびＰｈｕｓｉｏｎ  ポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、米国、マサチューセッツ州、ベバリー）を使用して、ＲＴ−ＰＣＲの増幅によって作製した。ＰＣＲ産物を、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン、米国、カリフォルニア州、カールズバッド）にクローン化し、完全に配列決定した。ＡＣＰＰ、分泌型変異体（ジェンバンク（登録商標）受入番号  ＮＭ＿０１９８０７からのｎｔ  １５４４−２６２５；配列番号：３）およびＡＣＰＰ、膜貫通型変異体（ジェンバンク（登録商標）受入番号  ＮＭ＿２０７６６８からのｎｔ  １４９７−２５７７；配列番号：４）の、アイソフォーム特異的な、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションのプローブを、ＰＣＲ増幅によって、鋳型としてのＣ５７ＢＬ／６  マウスのゲノムＤＮＡおよびＰｈｕｓｉｏｎ  ポリメラーゼを使用して作製した。プローブをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＫＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国、カリフォルニア州、ラ・ホーヤ）にクローン化し、完全に配列決定した。
【００８１】
カルボキシル−末端のトロンビン切断部位−ヘキサヒスチジンタグに融合した、マウス  ＰＡＰの分泌型アイソフォーム（ジェンバンク（登録商標）受入番号  ＮＭ＿０１９８０７からのｎｔ  ６４−１２０６；配列番号：５）を含む、ｐＦａｓｔＢＡＣ  バキュロウイルス発現ベクターを作製した。同様に、カルボキシル−末端  トロンビン切断部位−ヘキサヒスチジンタグに融合した、ヒト  ＰＡＰの分泌型アイソフォーム（ジェンバンク（登録商標）受入番号  ＮＭ＿００１０９９からのｎｔ  ４３−１２００；配列番号：６）を含む、ｐＦａｓｔＢＡＣ  バキュロウイルス発現ベクターを作製した。
【００８２】
（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション）
ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションを、ジゴキシゲニンで標識されたアンチセンスリボプローブおよびセンス（対照）リボプローブを使用して、Ｄｏｎｇらが記載したように行った。
【００８３】
（細胞培養）
ＨＥＫ  ２９３細胞を、３７℃、５％  ＣＯ２で、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、高グルコース（１％  ペニシリン、１％  ストレプトマイシンおよび１０％  ウシ胎児血清を添加した）中で培養した。形質移入のため、ウェルあたり６×１０５の細胞を、６−ウェルのディッシュ中に播種した。細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ（インビトロジェン、米国、カリフォルニア州、カールズバッド）を使用して、０．５μｇ  ＡＣＰＰ−膜貫通型アイソフォームおよび０．５μｇ  ファルネシル化されたＥＧＦＰ（ＥＧＦＰｆ）で同時形質移入した。形質移入の２４時間後に、試料を、全ての細胞が形質移入されたことを確かめるために、内在性ＥＧＦＰｆの蛍光についてイメージ化した。次いで、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中４％  パラホルムアルデヒドで固定し、ＦＲＡＰ組織化学を使用して染色した。
【００８４】
（組織の調製）
脊椎動物が関与する全ての手順は、ノースカロライナ大学（チャペルヒル）およびオウル大学での、動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ）によって承認された。
【００８５】
ＦＲＡＰ組織化学については、野生型の成体オスマウスおよびＰＡＰ−／−  成体オスマウス（６−１２週齢）を、ペントバルビタールで麻酔し、２０ｍＬ  ０．９％  生理食塩水（４℃）、次いで、２５ｍＬ  固定液（４％  パラホルムアルデヒド、０．１Ｍ  リン酸バッファー、ｐＨ  ７．３、４℃）で、経心的に灌流した。脊柱を解剖し、次いで、２０％  ショ糖、０．１Ｍ  リン酸バッファー、ｐＨ  ７．３中で、４℃で凍結保護した（２−３日間）。腰膨大（Ｌ４−Ｌ６領域）を含む脊髄、およびＬ４−Ｌ６  ＤＲＧを、慎重に解剖し、ＯＣＴ中で凍結した。
【００８６】
免疫蛍光染色については、野生型の成体オスマウスを、頸椎脱臼または断頭によって屠殺した。腰髄およびＤＲＧ（Ｌ４−Ｌ６）を解剖し、次いで、それぞれ、６時間および２時間、後置（ｐｏｓｔｆｉｘｅｄ）した。組織を、２０％  ショ糖、０．１Ｍ  リン酸バッファー中、ｐＨ７．３、４℃で、２４時間凍結保護し、ＯＣＴ中で凍結し、クリオスタットによって、１５−２０μｍで切り出し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓ  スライドに載せた。スライドを−２０℃で保存した。クリオスタット切片（Ｆｒｅｅ−ｆｌｏａｔｉｎｇ  ｓｅｃｔｉｏｎ）を３０μｍで切り出し、すぐに染色した。
【００８７】
（ＦＲＡＰ組織化学）
ＦＲＡＰ／チアミン  モノホスファターゼ（ＴＭＰａｓｅ）組織化学を、基本的に、Ｓｈｉｅｌｄｓら（２００３）が記載したようにして、ＳｉｌｖｅｒｍａｎおよびＫｒｕｇｅｒ（１９８８）によって提案された改変をして行なった。細胞または組織の切片を、４０ｍＭ  Ｔｒｉｚｍａ−マレイン酸（ＴＭ）バッファー（ｐＨ  ５．６）で２度洗浄し、次いで、８％（ｗ／ｖ）ショ糖を含むＴＭバッファーで１度洗浄した。ＦＲＡＰを有する細胞および軸索上に鉛を沈殿させるため、試料を、３７℃で２時間、ＴＭバッファー（８％  ショ糖（ｗ／ｖ）、６ｍＭ  チアミン一リン酸クロリド、２．４ｍＭ  硝酸鉛を含む）中でインキュベーションした。硝酸鉛は、使用の直前に、調製したてのものでなければならない。非特異的なバックグラウンド染色を減少させるため、試料を２％  酢酸で１分間、１回洗浄した。次いで、試料をＴＭバッファーで３回洗浄し、１０秒間、１％  硫化ナトリウムで現像し、ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）で数回洗浄し、Ｇｅｌ／Ｍｏｕｎｔ（Ｂｉｏｍｅｄａ社、米国、カリフォルニア州、フォスターシティ）に取り付けた。画像は、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐおよびオリンパス  ＤＰ−７１  カメラを使用して得た。
【００８８】
ＦＲＡＰ活性についてＨＥＫ  ２９３細胞をアッセイした場合、デュプリケートの試料を、０．１％  トリトン  Ｘ−１００を含む（または含まない）最初のＴＭ洗浄液で染色した。ＦＲＡＰ組織化学的染色は、洗浄液で透過処理された細胞において強く、おそらく、小胞体およびゴルジ体中のＴＭ−ＰＡＰの細胞内の貯蔵を検出していた。
【００８９】
（免疫蛍光）
クリオスタット切片およびスライドに載せた切片を、５０ｍＭ  トリス塩基、４６０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．３％  トリトン  Ｘ−１００、ｐＨ  ７．６（ＴＢＳ＋ＴＸ；高塩濃度は、最適なＰＡＰ抗体染色のために必須だった）で３回洗浄し、６０分間、１０％  ヤギ血清を含むＴＢＳ＋ＴＸ４中でブロッキングし、次いで、一晩、４℃で、ブロッキング溶液で希釈された一次抗体とインキュベーションした。使用した抗体は、下記を含む：  １：１０００  ウサギ抗ＧＦＰ（Ａ−１１１２２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、米国、オレゴン州、ユージーン）、１：１０００  ニワトリ抗ＧＦＰ（ＧＦＰ−１０２０、Ａｖｅｓ  Ｌａｂｓ、米国、オレゴン州、タイガード）、１：２５０  マウス抗ＮｅｕＮ（ＭＡＢ３７７、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、米国、マサチューセッツ州、ビルリカ）、１：８００  モルモット抗ＣＧＲＰ（Ｔ−５０２７、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国、カリフォルニア州、サンカルロス）、１：７５０  ウサギ抗ＣＧＲＰ（Ｔ−４０３２、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国、カリフォルニア州、サンカルロス）、１：１０００  ウサギ抗Ｐ２Ｘ３（ＡＢ５８９５、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、米国、マサチューセッツ州、ビルリカ）、１：３００  モルモット抗Ｐ２Ｘ３（ＧＰ１０１０８、Ｎｅｕｒｏｍｉｃｓ、米国、ミネソタ州、イダイナ）、１：１００  マウス抗ＰＫＣγ（クローン  ＰＫＣ６６、カタログ番号  １３−３８００、Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国、カリフォルニア州、サウスサンフランシスコ）、１：１０００  ウサギ抗ＰＫＣγ（ｃ−１９、カタログ番号  ｓｃ−２１１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国、カリフォルニア州、サンタクルーズ）、１：１０００  ウサギ抗ヒトＰＡＰ（Ｂｉｏｍｅｄａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国、カリフォルニア州、フォスターシティ）。
【００９０】
Ｂｉｏｍｅｄａの抗ＰＡＰ抗体の特異性は、下記によって確かめた：ａ）一次抗体を除いた場合の染色の不存在、および、ｂ）ＰＡＰ−／−  マウスからの、ＤＲＧおよび脊髄切片中の染色の不存在。Ｍｒｇｐｒｄを発現している細胞および軸索を、ＭｒｇｐｒｄΔＥＧＦＰｆ  マウスからの組織を、抗ＧＦＰ抗体で染色することによって、視覚化した。次いで、切片をＴＢＳ＋ＴＸで３回洗浄し、２時間、室温で、二次抗体とインキュベーションした。全ての二次抗体を、ブロッキング溶液中で１：２５０に希釈し、Ａｌｅｘａ−４８８、Ａｌｅｘａ−５６８、またはＡｌｅｘａ−６３３  蛍光色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、米国、オレゴン州、ユージーン）、またはＦＩＴＣ、Ｃｙ３、もしくはＣｙ５  蛍光色素（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、米国、ペンシルベニア州、ウエストグローブ）と結合させた。ＩＢ４結合を検出するため、１：１００  Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ  ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ  ＧＳ−ＩＢ４−Ａｌｅｘａ  ４８８（Ｉ−２１４１１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、米国、オレゴン州、ユージーン）を、二次抗体のインキュベーション中に添加した。ビオチンに結合した二次抗体を使用し、次いで、１：２５０  ストレプトアビジン−Ｃｙ３（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、米国、ペンシルベニア州、ウエストグローブ）、またはＴｙｒａｍｉｄｅ  Ｓｉｇｎａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ、米国、マサチューセッツ州、ボストン、製造者の手順に従った）のいずれかを使用することによって、抗ＰＡＰ抗体シグナルを増幅することが必要だった。
【００９１】
染色後、切片をＴＢＳ＋ＴＸで３回洗浄し、次いで、ＰＢＳで３回洗浄し、Ｇｅｌ／Ｍｏｕｎｔ（Ｂｉｏｍｅｄａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国、カリフォルニア州、フォスターシティ）に濡れたまま載せた。画像は、ライカ  ＴＣＳ−ＮＴ  共焦点顕微鏡（ライカ  マイクロシステムズ、ドイツ、ウェッツラー）を使用して得た。全ての細胞数は、パーセンテージ＋／−平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表わされる。
【００９２】
（ＦＲＡＰ組織化学と合わせた免疫蛍光）
ＤＲＧ中の、免疫蛍光組織化学とＦＲＡＰ組織化学との間の重複を示すため、隣接する１５μｍの切片を、抗ＰＡＰ抗体で染色し、かつＦＲＡＰ組織化学のために染色した。同様の方法は、ＦＲＡＰを、抗体およびレクチンマーカーと共局在化させるために、以前に使用されており、隣接する切片の使用により、共発現細胞の数を過小評価している（Ｄｏｄｄら、１９８３；ＮａｇｙおよびＨｕｎｔ、１９８２；ＳｉｌｖｅｒｍａｎおよびＫｒｕｇｅｒ、１９８８；ＳｉｌｖｅｒｍａｎおよびＫｒｕｇｅｒ、１９９０）。技術的な制限によって、免疫蛍光およびＦＲＡＰ組織化学のための、同様のＤＲＧ切片の連続的な処理が阻まれた。
【００９３】
脊髄組織における重複を示すため、同一の切片を抗ＰＡＰ抗体で第１に染色し、共焦点顕微鏡観察を使用してイメージ化し、次いで、この切片をＦＲＡＰのために組織化学的に染色し、透過型光学顕微鏡観察によってイメージ化した。この手順は、公表された方法に基づく（Ｗａｎｇら、１９９４）。蛍光および透過光の画像は、必要に応じて画像を拡大縮小および回転することによって、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐでオーバーレイを行った。
【００９４】
（行動）
Ｃ５７ＢＬ／６  オスマウス（２−３ヶ月齢）を、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国、メイン、バーハーバー）から、ＰＡＰタンパク質の注入に関連する全ての行動実験のために購入した。全てのマウスは、行動試験の１日前に、試験室、設備および実験者に順化させた。実験者は、行動試験の間、遺伝子型および薬物治療について知らされていなかった。
【００９５】
熱感受性は、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ法（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓら、１９８８）に従い、Ｐｌａｎｔａｒ  Ｔｅｓｔ装置（ＩＩＴＣ）で１本の後肢を熱することによって測定した。放射熱源の強さを、肢の退避反射が、野生型Ｃ５７ＢＬ／６  マウスにおいて平均して約１０秒内に惹起されるように較正した。カットオフタイムは２０秒だった。１回の測定結果は、１日ごとに各肢から得て、肢の退避潜時を特定した。尾浸漬（ｔａｉｌ  ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ）アッセイを行うため、マウスをタオル中で穏やかに拘束し、尾の末端から３分の１を４６．５℃の水に浸漬した。退避した尾についての潜時を、マウスあたり１回測定した。機械的感受性を、電気的ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ装置（ＩＩＴＣ）に取り付けられた半硬化チップ（ｓｅｍｉ−ｒｉｇｉｄ  ｔｉｐ）を使用して、他で記載されたように（Ｃｕｎｈａら、２００４；Ｉｎｏｕｅら、２００４）測定した。各肢から３回の測定結果を得て（５分間隔で離した）、次いで、グラム単位の肢の退避の閾値を特定するために平均した。
【００９６】
持続性の炎症痛を引き起こすため、２０μＬ  完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ、シグマ）を、１本の後肢の無毛皮膚の中央下部（ｃｅｎｔｒａｌｌｙ  ｂｅｎｅａｔｈ）に、２７Ｇの針で注入した。神経因性疼痛の神経部分損傷（ＳＮＩ）モデルを記載されたように（Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００３）行った。
【００９７】
（髄腔内注入）
ｈＰＡＰ、ｂＰＡＰおよび溶媒対照を、記載されたように（Ｆａｉｒｂａｎｋｓ、２００３）、無麻酔のマウスの腰部に注入した。
【００９８】
（実施例２）
（組み換えＰＡＰの調製）
Ｃ末端にトロンビン切断部位およびヘキサヒスチジン精製タグを含む、マウス  ＰＡＰ（分泌型アイソフォーム；ジェンバンク（登録商標）受入番号  ＮＭ＿０１９８０７からのｎｔ  ６４−１２０６；配列番号：５）バキュロウイルス発現コンストラクトを、実施例１に記載されたクローンおよび当該技術分野において標準的な手順を使用して作製した。組み換えマウス  ＰＡＰを、個別払いのタンパク質精製コア施設を使用して精製した。トロンビン−ヘキサヒスチジン  Ｃ末端タグを有する、ｈＰＡＰ（分泌型アイソフォーム；ジェンバンク（登録商標）受入番号  ＮＭ＿００１０９９からのｎｔ  ４３−１２００；配列番号：６）発現コンストラクトを同様に構築した。大量の組み換えｈＰＡＰタンパク質は、当該技術分野で公知の手順を使用して、このコンストラクトによって産生できた。組み換えｈＰＡＰタンパク質は、ヒトの臨床治験における薬物として有用であり、ヒトにおける髄腔内  ｈＰＡＰの安全性を評価するために使用できる。
【００９９】
（実施例３）
（ＰＡＰとしてのＦＲＡＰの分子同定）
約５０年間、多くの小径ＤＲＧニューロンが、酸性ホスファターゼ（一般的に、ＦＲＡＰまたはチアミン  モノホスファターゼと呼ばれる）を含むことが知られてきた（ＣｓｉｌｌｉｋおよびＫｎｙｉｈａｒ−Ｃｓｉｌｌｉｋ、１９８６；Ｋｎｙｉｈａｒ−Ｃｓｉｌｌｉｋ、１９８６；Ｃｏｌｍａｎｔ、１９５９）。ＦＲＡＰは、脊髄のラミナ  ＩＩにおける非ペプチド作動性  ＤＲＧニューロンおよびその無髄軸索末端、ならびにペプチド作動性（ＣＧＲＰ＋、物質  Ｐ＋）ニューロンの一部を標識するために使用した（ＨｕｎｔおよびＭａｎｔｙｈ、２００１；Ｃａｒｒら、１９９０）。マーカーとしてのＦＲＡＰの使用は、特定のレクチン（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ  Ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ  Ｂ４（ＩＢ４）など）もまた、非ペプチド作動性ニューロンを標識し、ＦＲＡＰと共局在化することが見出された際に（ＳｉｌｖｅｒｍａｎおよびＫｒｕｇｅｒ、１９８８）、衰退した。さらに、ＦＲＡＰをコードする遺伝子は、明確に同定されたことがなかった。
【０１００】
１９８０年代初期に、Ｄｏｄｄおよび共同研究者は、クロマトグラフィーを使用して、ラット  ＤＲＧから、ＦＲＡＰタンパク質を部分的に精製した（Ｄｏｄｄら、１９８３）。部分的に精製されたＦＲＡＰタンパク質は、分子量が、ヒト  前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）と類似しており、Ｌ（＋）−  酒石酸塩（いくつかの酸性ホスファターゼの非選択的阻害剤）によって阻害された。これらの生化学的実験は、ＦＲＡＰがＰＡＰである可能性を示唆した。しかし、部分的に精製されたＦＲＡＰタンパク質に対して産生された抗体、およびヒト  ＰＡＰに対する抗体は、脊髄のラミナ  ＩＩにおける小径ＤＲＧニューロンおよびその軸索末端を免疫染色しなかった（ＳｉｌｖｅｒｍａｎおよびＫｒｕｇｅｒ、１９８８、Ｄｏｄｄら、１９８３）。これらの決定的でない免疫組織化学的発見は、ＰＡＰがＦＲＡＰと同一であるかどうかについて疑問を投げかける。
【０１０１】
このあいまい性を解決するため、ＦＲＡＰとＰＡＰとの間の関連性を、分子的技術、遺伝的技術および免疫組織化学的技術を使用して、再度試験した。ＰＡＰは、分泌型タンパク質、または触媒的酸性ホスファターゼ領域が細胞外に局在する、１型  膜貫通型（ＴＭ）タンパク質のいずれかとして発現する（Ｋａｉｊａら、２００６；Ｒｏｉｋｏら、１９９０）。図１を参照。この分泌型は、広範に研究されてきており、前立腺癌と機能的に関連する（Ｋａｉｊａら、２００６）。膜貫通型の変異体は、カルボキシル末端の近くに１つの疎水性領域を含む（ＨｕｎｔおよびＭａｎｔｙｈ、２００１）（疎水性の分析に基づく）。
【０１０２】
どちらかのＰＡＰアイソフォームが、小径ＤＲＧニューロン（ＦＲＡＰなど）において発現しているかどうかを特定するため、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションを、アイソフォーム特異的なプローブで行った。これらの研究により、ＴＭ−ＰＡＰは、小径ＤＲＧニューロンの一部で発現しており（図１および図２Ａ参照）、一方、分泌型アイソフォームは、検出不可能なほどに低いレベルで発現していることが明らかになった。図２Ｂを参照。
【０１０３】
次に、ＦＲＡＰ組織化学的活性が、ＰＡＰ酵素活性に依存している程度を直接的に試験した。これを行うため、マウス  ＴＭ−ＰＡＰをＨＥＫ  ２９３細胞中で過剰発現させ、細胞をＦＲＡＰ組織化学を使用して染色した。空ベクターを形質移入された対照細胞は染色の兆候を示さなかった一方で、ＴＭ−ＰＡＰを形質移入された細胞は、細胞膜が未処置のままであるか、または、洗浄剤で透過処理された場合に、しっかりと染色された。これは、ＴＭ−ＰＡＰが、ＦＲＡＰの組織化学的活性について十分であり、かつ、ＴＭ−ＰＡＰが、基質を細胞外で脱リン酸化できることを示した。同様の結果を、ＴＭ−ＰＡＰがＲａｔ１  線維芽細胞に形質移入された場合に得た。
【０１０４】
ＰＡＰΔ３／Δ３（以下、ＰＡＰ−／−と呼ぶ）ノックアウトマウスからのＤＲＧおよび脊髄組織もまた分析した。これらのマウスでは、エクソン  ３の欠損は、前立腺における、ＰＡＰタンパク質の切断およびＰＡＰ触媒活性の完全な喪失を引き起こす。脊髄におけるＤＲＧニューロンおよび軸索末端のＦＲＡＰ組織化学的染色は、ＰＡＰ−／−  マウスにおいては顕著に消失した。
【０１０５】
ＦＲＡＰ染色の不存在は、ＰＡＰ−／−  マウスにおけるニューロンまたは軸索末端の発生上の損失によるものではなかった。野生型マウスおよびＰＡＰ−／−  マウスは、腰神経節における全てのＮｅｕＮ＋  ニューロンに関連するＰ２Ｘ３＋  ニューロンと同じ数を有する（４３．４＋／−１．９％  対  ４２．４＋／−１．９％  ５（平均値の標準誤差）。有意差はない。対応ｔ検定；ｎ＝１５００  ＮｅｕＮ＋  ニューロン、遺伝子型ごとに計測した）。Ｐ２Ｘ３は、非ペプチド作動性ＤＲＧニューロンを標識し、ＰＡＰとともに広範に共局在化している。さらに、共焦点画像解析は、脊髄を、ＣＧＲＰに対する抗体（ペプチド作動性神経終末を標識するため）、イソレクチン  Ｂ４（ＩＢ４、非ペプチド作動性神経終末を標識するため）、およびタンパク質キナーゼ  Ｃ−γに対する抗体（ＰＫＣγ、ラミナ  ＩＩｉｎｎｅｒおよびＩＩＩにおける介在ニューロンを標識するため）を使用して試験した場合、遺伝子型間（各遺伝子型からｎ＝２のマウス）の肉眼での解剖学的な相違を明らかにしなかった。
【０１０６】
これらのデータは、ＰＡＰが、ＦＲＡＰ様活性を有する、ＤＲＧおよび脊髄における唯一の酸性ホスファターゼであることを示す。さらに、これらの機能獲得実験および機能喪失実験は、小径ＤＲＧニューロンにおけるＦＲＡＰは、ＰＡＰによってコードされることを決定的に示す。
【０１０７】
ＰＡＰが、ヒト  ＤＲＧ組織において同様に発現していることを示すために実験を行った。ＦＲＡＰ組織化学的活性は、ヒトにおける小径ＤＲＧニューロンにある（ＳｉｌｖｅｒｍａｎおよびＫｒｕｇｅｒ、１９８８ａ）。ＲＴ−ＰＣＲは、鋳型として、ヒト  ＤＲＧからの全ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、米国、カリフォルニア州、パロアルト）、ヒト  ＰＡＰのイントロンにまたがるプライマー（イントロンにまたがるプライマーは、増幅生成物が、ゲノムＤＮＡではなくｃＤＮＡに由来することを保障する）を使用して行った。正しいサイズのバンドを、わずか３０サイクル後に得た。公表されたＦＲＡＰの組織化学的データと合わせると、この発見は、ヒト  小径（おそらく、侵害受容性）ニューロンがＰＡＰを発現していることを強く示唆する。
【０１０８】
ＰＡＰタンパク質およびＦＲＡＰの組織化学的活性はまた、ＤＲＧニューロンにおいて細胞レベルで共局在化していることが見出された。これを行うため、いくつかの市販の抗ヒト  ｈＰＡＰ抗血清を購入し、マウス前立腺（陽性対照）、ＤＲＧおよび脊髄組織で試験した（市販の抗マウスまたは抗ラットのＰＡＰ抗体は存在しない）。１つのウサギ  ポリクローナル抗血清は、脊髄のラミナ  ＩＩ内の前立腺上皮細胞、小径ＤＲＧニューロンおよび軸索末端を染色し、そこはまさにＦＲＡＰ組織化学が認められた部位だった。尾状核（ｎｕｃｌｅｕｓ  ｃａｕｄａｌｉｓ）のラミナ  ＩＩにおける小径三叉神経の神経節ニューロンおよび軸索もまた、当該抗体によって標識された。三叉神経の染色は、ＰＡＰが頭に関連する疼痛（頭痛または歯痛など）の治療に効果的である可能性があることを示唆する。抗体の特異性は、ａ）一次抗体を除外した場合の染色の不存在、および、ｂ）ＰＡＰ−／−  マウスからのＤＲＧおよび脊髄切片における染色の不存在によって確かめた。
【０１０９】
ＴＭ−ＰＡＰの発現は、ＰＡＰタンパク質が、細胞外で、ＤＲＧニューロンの細胞膜上に局在することを示唆した（Ｑｕｉｎｔｅｒｏら、２００７）。これは、抗ＰＡＰ抗体を使用して、生きた、分離されたマウス  ＤＲＧニューロンの表面標識によって確かめた。
【０１１０】
ＤＲＧニューロンおよび脊髄を、ＰＡＰがペプチド作動性または非ペプチド作動性の侵害受容回路において発現しているかどうかを特定するために、抗体で二重に標識した（表２）。マウス  Ｌ４−Ｌ６  ＤＲＧニューロンおよび腰髄切片を、様々な感覚神経マーカーに対する抗体、およびＰＡＰに対する抗体で二重に標識した。成体  ＭｒｇｐｒｄΔＥＧＦＰｆ  マウスからの組織を、Ｍｒｇｐｒｄを発現しているニューロンを同定するために使用した（Ｚｙｌｋａら、２００５）。ＩＢ４およびＭｒｇｐｒｄΔＥＧＦＰｆは、非ペプチド作動性のニューロンおよび終末のマーカーであり、一方、ＣＧＲＰは、ペプチド作動性のニューロンおよび終末のマーカーである。これらの研究は、ＰＡＰタンパク質が、主に、マウス脊髄のラミナ  ＩＩにおける非ペプチド作動性ニューロン、およびその軸索末端に局在することを明らかにした。
【０１１１】
表２は、マウス  Ｌ４−Ｌ６  ＤＲＧニューロン内のＰＡＰ、および感覚神経マーカーの共局在の研究の定量分析の結果を示す。画像は、共焦点顕微鏡観察によって得た。組み合わせあたり、少なくとも３５０の細胞を計測した。共焦点画像からの細胞数は、実質的に全ての非ペプチド作動性ＤＲＧニューロンがＰＡＰを共発現し、全てのＩＢ４＋（ｎ＝４９７の細胞を計測した）のうち９１．６％、全てのＭｒｇｐｒｄ＋  ニューロン（ｎ＝３５７の細胞を計測した）のうち９９．２％、および全てのＰ２Ｘ３＋  ニューロン（ｎ＝８２４の細胞を計測した）のうち９２．６％がＰＡＰを発現していることを示した（Ｚｙｌｋａら、２００５）。ペプチド作動性ＣＧＲＰ＋  ニューロン（ｎ＝１３６４の細胞を計測した）のうちより低いパーセンテージ（１７．１％）がＰＡＰを発現していた。非ペプチド作動性ニューロンにおけるＰＡＰのこの優先的な発現は、ＦＲＡＰ組織化学を感覚神経マーカーと組み合わせて使用した以前の研究と一致する（ＨｕｎｔおよびＭａｎｔｙｈ、２００１；Ｃａｒｒら、１９９０）。
【０１１２】
ＤＲＧにおけるＰＡＰの膜貫通型アイソフォームにおける主な発現は、ＦＲＡＰが小径ＤＲＧニューロンの膜に局在していることを示す超微細構造的研究（ＣｓｉｌｌｉｋおよびＫｎｙｉｈａｒ−Ｃｓｉｌｌｉｋ、１９８６）と一致している。従って、ＴＭ−ＰＡＰおよびＦＲＡＰは、ＤＲＧニューロン（膜結合性）中の同様の細胞内局在（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）および細胞内局在（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を共有しており、ＰＡＰがＦＲＡＰをコードすることをさらに示唆している。まとめると、これらの発見は、５０年にわたる謎を解決し、侵害受容性ニューロンにおけるＦＲＡＰがＰＡＰと等しいことを示す。
【０１１３】
【表２】
0005584132.tif 000003
【０１１４】
（実施例４）
（疼痛感覚の機構におけるＰＡＰの役割）
マイクロアレイ解析は、坐骨神経の切除（Ｃｏｓｔｉｇａｎら、２００２）および神経因性疼痛モデルにおける神経損傷（Ｄａｖｉｓ−Ｔａｂｅｒ、２００６）から３日後に、ラット  ＤＲＧにおいて多数の遺伝子が上方制御または下方制御されることを示した。Ｃｏｓｔｉｇａｎらが示したマイクロアレイのデータセット（Ｃｏｓｔｉｇａｎらが添付図２として示した）を再分析し、全ての２４１の遺伝子を発現の倍率変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）によって並べた（なぜなら、当該遺伝子はアルファベット順で記載され、これは生物学的に無意味だからである）。再分析は、ＰＡＰ  ｍＲＮＡが坐骨神経の切除後に、３．５倍下方制御され、遺伝子全体で２番目に多く下方制御されることを示した。表３を参照。同様に、ＰＡＰ  ｍＲＮＡは、神経因性疼痛モデルにおいて最も激しく下方制御される遺伝子のうちの１つである（Ｄａｖｉｓ−Ｔａｂｅｒ、２００６）。ＰＡＰ発現は、神経因性疼痛のこれらの動物モデルにおいて下方制御されるため、神経因性疼痛は、ＰＡＰ活性を回復することによって治療できる可能性がある。
【０１１５】
【表３】
0005584132.tif 000004
【０１１６】
（実施例５）
（ＤＲＧニューロンはＬＰＡ受容体を発現する）
ＬＰＡ受容体の発現をＤＲＧニューロンで分析し、ＬＰＡ受容体の情報伝達の調節におけるＰＡＰについての役割を確かめた。これらの研究を開始した時点で、ＲＴ−ＰＣＲの実験は、ＬＰＡ１は、ＤＲＧにおける唯一のＬＰＡ受容体であることを示した（Ｉｎｏｕｅら、２００４；Ｒｅｎｂａｃｋら、２０００）。より詳細にこれらの受容体の発現を試験するため、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションを、アンチセンスのＬＰＡ１リボプローブおよびＬＰＡ３  リボプローブで行った。これらの実験は、ＬＰＡ１が、全てのマウス  ＤＲＧニューロンにおいて発現し、一方、ＬＰＡ３は小径ＤＲＧニューロンの一部で発現することを明らかにした。ＬＰＡ３が、Ｍｒｇｐｒｄと共発現しているかどうかを特定するため、二重蛍光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｏｕｂｌｅ）のｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションを、アンチセンスのＭｒｇｐｒｄリボプローブおよびＬＰＡ３リボプローブで、以前に公表された方法（Ｚｙｌｋａら、２００３）を使用して行った。当該実験は、全てのＭｒｇｐｒｄ＋  ニューロンがＬＰＡ３を発現することを明らかにした。逆に、ほぼ全てのＬＰＡ３＋  細胞は、Ｍｒｇｐｒｄを発現していた（ＬＰＡ３＋  のみを発現する少数の細胞があったが）。要約すると、全てのＤＲＧニューロンは、ＬＰＡ１を発現しており、一方、Ｍｒｇｐｒｄ＋  ニューロンは、ＬＰＡ１およびＬＰＡ３を共発現している。これらのデータは、全てのＤＲＧニューロンが、ＬＰＡ受容体を介して信号を送る可能性を有することを示唆する。Ｍｒｇｐｒｄ＋  ニューロンはまた、ＰＡＰを発現するため（表２を参照）、ＬＰＡ受容体の情報伝達は、ＰＡＰタンパク質レベルを増加および減少させることによって調節できる。
【０１１７】
（実施例６）
（溶液中のＰＡＰ活性の測定のための定量的蛍光定量アッセイ）
ＰＡＰ活性を定量化する方法は、再現性のある量の、活性なＰＡＰタンパク質を培養細胞に添加し、または、下記の実験のために生きたマウスに注入できるようにするために必要だった。これを達成するため、２つのよく確立された方法を、ＰＡＰ活性を測定するために試験した：１）パラ−ニトロフェニルリン酸エステル（ｐ−ＮＰＰ）の加水分解を使用する比色分析；および２）ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルリン酸エステル（ＤｉＦＭＵＰ）の加水分解を使用する蛍光定量アッセイ（ＥｎｚＣｈｅｋ  Ａｃｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｋｉｔ（インビトロジェン（米国、カリフォルニア州、カールズバッド）製）のように市販されている）。直接的な比較に基づき、蛍光定量アッセイは、ＰＡＰ活性の定量化のためには、ｐ−ＮＰＰよりもずっと感度がよいことを特定した。精製されたウシ  ＰＡＰ（ｂＰＡＰ、分泌型アイソフォーム）およびマウス  ＰＡＰ（ｍＰＡＰ）についての代表的なデータは、図３に示される。ＰＡＰ  ホスファターゼ活性は、Ｌ−酒石酸塩（よく特徴付けられたＰＡＰ阻害剤）によって阻害される（ＯｓｔｒｏｗｓｋｉおよびＫｕｃｉｅｌ、１９９４）。重要なことには、このアッセイは、標準曲線を作成することによって、酵素活性（ユニット／ｍｇ  タンパク質）を特定するために使用できる。従って、当該蛍光定量アッセイは、純粋なＰＡＰタンパク質および細胞可溶化物からのＰＡＰのホスファターゼ活性を定量化するために使用できる。
【０１１８】
（実施例７）
（ウシ  ＰＡＰは、ＬＰＡを脱リン酸化し、ＬＰＡに誘起された情報伝達を阻害する）
以前の研究は、ヒト  ＰＡＰが、試験管中でＬＰＡを脱リン酸化することを見出した（ＨｉｒｏｙａｍａおよびＴａｋｅｎａｗａ、１９９９；Ｔａｎａｋａら、２００４）。脱リン酸化されたＬＰＡは、ＬＰＡ受容体をもはや活性化できないと仮定されるが、これは、より生物学的に有意義な、細胞ベースのアッセイを使用して、正式に示されたことがなかった。ＰＡＰが、ＬＰＡを不活性化させることを証明するため、１μｍ  ＬＰＡを、過剰な（０．２ｍＵ）ウシ  ＰＡＰと、試験管中で１．５時間、３７℃でインキュベーションした（図４中の「ａ」）。平行して、１μｍ  ＬＰＡ（ｂＰＡＰは含まない）を含む第２の試験管を、１．５時間、３７℃でインキュベーションした（図４中の「ｂ」）。Ｒａｔ１  細胞に、カルシウム感受性色素  Ｆｕｒａ２−アセトキシメチル（ＡＭ）エステルを添加し（Ｄｏｎｇら、２００１）、（ＬＰＡ＋ｂＰＡＰ）を、これらの細胞に１分間かけて投与した（図４中の「ａ」を参照）。短い洗い流し時間の後、（ＬＰＡ）を細胞に１分間かけて投与した（図４中の「ｂ」を参照）。図４において見出すことができる通り、細胞内カルシウムレベルは、Ｒａｔ１  細胞をＬＰＡ＋ｂＰＡＰで刺激した場合、あまり変化しなかった。しかし、細胞内カルシウムレベルは、これらの同様の細胞をＬＰＡで刺激した場合に、劇的に変化した。これらのデータは、ｂＰＡＰが、ＬＰＡを脱リン酸化し、かつ、不活性化することを明白に示す。このような不活性化は、ＬＰＡに誘起された情報伝達を効果的に阻害する。ｂＰＡＰおよびｈＰＡＰは、市販されているため（シグマ、米国、ミズーリ州、セントルイス）、これらの純粋なタンパク質を、非遺伝的アプローチで、下記の実験においてＰＡＰ活性を増加させるために使用した。
【０１１９】
（実施例８）
（ｍＰＡＰは、Ｒａｔ１  線維芽細胞におけるＬＰＡに誘起されたカルシウムの反応を急激に減少させる）
外因性ｂＰＡＰは、ＬＰＡに誘起された情報伝達を遮断できるため、ＬＰＡに誘起された情報伝達を、ＰＡＰを過剰発現するＲａｔ１  細胞において急激に減少させることができる、と仮定した。この仮説を検証するため、黄色蛍光タンパク質  ＶｅｎｕｓをＴＭ−ＰＡＰのＣ末端に融合することによって、蛍光で標識したｍＰＡＰ  コンストラクトを作製した（Ｎａｇａｉら、２００２）。これによって、ＰＡＰ−Ｖｅｎｕｓを形質移入された生細胞を直接的に視覚化することができた。ＰＡＰ−Ｖｅｎｕｓがホスファターゼ活性を有することを、ＦＲＡＰ組織化学を使用して、形質移入された細胞の染色によって示した。次いで、触媒的に活性な融合コンストラクトを、Ｒａｔ１  細胞に形質移入し、細胞内カルシウムにおけるＬＰＡに誘起された変化を、カルシウム感受性色素  Ｆｕｒａ２−ＡＭで測定した。図５において見出すことができる通り、ＬＰＡに誘起されたカルシウム反応の振幅および持続時間は、ＰＡＰ−Ｖｅｎｕｓを形質移入された細胞において、形質移入されていない細胞と比較して急激に減少する。これは、マウス  ＰＡＰは、細胞ベースの条件におけるＬＰＡに誘起された情報伝達を急激に減少させることを示す。これらの発見は、公表された結果と合わせて、マウス、乳牛およびヒトのＰＡＰが、ＬＰＡを脱リン酸化することを示す。これは、ＰＡＰについての高度に保存された機能を示唆する。
【０１２０】
（実施例９）
（ＬＰＡ反応は、ＰＡＰホスファターゼ活性に依存する）
ＰＡＰが、ＬＰＡの脱リン酸化によって、ＬＰＡ情報伝達を調節するという仮説を裏付けるため、ホスファターゼデッドのマウス  ＰＡＰ発現コンストラクト（ＰＡＰ変異体）を、活性部位残基ヒスチジン  １２をアラニンに変異させ、次いで、蛍光タンパク質  ＶｅｎｕｓをＣ末端に融合させること（このＰＡＰ変異体を形質移入された細胞の視覚化を可能にするため）によって開発した。第１に、野生型  ＰＡＰ−Ｖｅｎｕｓと同程度に効率的に、ＰＡＰ変異コンストラクトが発現し、膜に局在していることを確かめた。第２に、フッ化物抵抗性酸性ホスファターゼ（ＦＲＡＰ）組織化学を使用し、ＰＡＰ変異コンストラクトにホスファターゼ活性が欠けていることを確かめた。次いで、Ｒａｔ１  線維芽細胞を、ＰＡＰまたはＰＡＰ変異体で形質移入し、細胞にカルシウム感受性色素  Ｆｕｒａ２−ＡＭを添加した。次いで、細胞を１００ｎＭ  ＬＰＡで刺激した。ＰＡＰを形質移入された細胞について、形質移入されていない細胞と、同一の視野で、カルシウムの反応を比較した。図６Ａおよび図６Ｃにおいて見出すことができる通り、ＬＰＡに誘起されたカルシウム反応は、ＰＡＰを形質移入された細胞で顕著に減少し、図５に示した結果を再現した。対照的に、ＬＰＡに誘起されたカルシウムの反応は、ホスファターゼデッドのＰＡＰ変異体を形質移入された細胞においては変化しなかった。図６Ｂおよび図６Ｄを参照。これらの結果は、図６Ａおよび図６Ｃに示される、ＰＡＰを形質移入された細胞における減少したＬＰＡ反応が、ＰＡＰホスファターゼ活性に依存することを示す。
【０１２１】
（実施例１０）
（疼痛治療のためのＰＡＰの使用）
異常な量のＬＰＡは、侵害受容システムを刺激し、神経因性疼痛（アロディニアおよび痛覚過敏を含む）を惹起する。図７を参照。神経因性疼痛は、ＬＰＡ  ホスファターゼ活性を増加させることによって治療できるだろう（図７）。本願明細書に記載されたデータは、ＰＡＰが、ＬＰＡを分解し、かつＬＰＡに誘起された情報伝達を低下させることができることを示す。従って、ＰＡＰ注入は、神経因性疼痛に関連する、いくつかの細胞型（ニューロン、ミクログリア細胞、シュワン細胞）におけるＬＰＡに誘起された情報伝達を制御でき、さらなる効果（シュワン細胞におけるＬＰＡに誘起された情報伝達の遮断および脱髄の遮断など）を有する。これらの可能性は、（（Ｚｙｌｋａら、２００５）において行われたように）電子顕微鏡観察を使用して坐骨神経をイメージングし、次いで、対照および処置された動物におけるミエリンの厚さを測定することによって検証できる。
【０１２２】
さらに、ＰＡＰ発現およびＦＲＡＰ活性は、神経損傷後、下方制御される。従って、神経損傷後のＰＡＰの注入は、神経因性疼痛の維持段階の間、ＰＡＰ活性を回復し、アロディニアを減少させることができる。図８を参照。神経因性疼痛は、脊髄におけるＬＰＡ濃度の低下、および慢性疼痛状態の惹起または維持の遮断によって治療できる。高濃度のＬＰＡを低下させる１つの方法は、神経損傷の前または後に、脊髄への純粋なＰＡＰタンパク質の直接的な注入（髄腔内注入）によるものである。図８を参照。脊髄へのＰＡＰタンパク質の大量瞬時投与によって、ＰＡＰは、損傷後に放出されるＬＰＡを分解できる。これは、ＬＰＡ受容体の情報伝達を効果的に阻害し、神経損傷後のマウスの熱感作および機械的感作を遮断する。あるいは、ＰＡＰは、静脈内に注入でき、または（筋肉内注入またはミニポンプを介して）神経損傷の部位に直接的に送達できる。侵害受容システムにおけるＰＡＰの増加のためのさらなる方法としては、ＰＡＰ作動薬の投与、および遺伝子治療または幹細胞のアプローチを使用したＰＡＰの投与が挙げられる。図９を参照。
【０１２３】
（実施例１１）
（ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるアロディニアおよび痛覚過敏のＰＡＰ阻害）
（用量の選択）
髄腔内（ｉ．ｔ．）への初回量１００ｍＵのＰＡＰは、１μｍｏｌの蛍光定量用基質が、１分間あたり１Ｕのウシ  ＰＡＰによって分解されるという発見に基づいて選択した。ｂＰＡＰは、ＬＰＡと同程度に効率的に蛍光定量用基質を加水分解すると仮定すると、これは、１μｍｏｌの加水分解されたＬＰＡ／Ｕ  ｂＰＡＰ／分の速度と等しい。ＬＰＡ（１ｎｍｏｌ、髄腔内）は、神経損傷後に見られるものと大きさが等しい、行動性アロディニアおよび痛覚過敏を引き起こした（Ｉｎｏｕｅら、２００４）。同様の量のＬＰＡが、神経損傷後に、血小板によって放出されると仮定すると、１分間に１ｎｍｏｌのＬＰＡを分解するために、１ｍＵのｂＰＡＰが必要とされるだろう。従って、１００ｍＵの用量のＰＡＰは、１００倍の過剰を意味し、ＣＳＦおよび脊髄実質における、拡散および希釈を説明する。
【０１２４】
直接的な腰椎穿刺法は、０．９％  生理食塩水中に溶解させた、５μＬの約１００ｍＵのＰＡＰ（シグマ、米国、ミズーリ州、セントルイス）を、マウス脊髄の腰椎の第５領域と第６領域との間に、髄腔内（ｉ．ｔ．）注入するために使用された（Ｆａｉｒｂａｎｋｓ、２００３）。ＰＡＰタンパク質が、腹腔内に注入した場合、脊髄組織に到達しそうにないため、髄腔内注入を選択した。ウシ血清アルブミンを、シグマ（米国、ミズーリ州、セントルイス、カタログ番号  Ｐ８３６１、ピキア・パストリス中で発現したもの、＞４０００  Ｕ／ｍｇ  タンパク質）から購入した。硫酸モルヒネ（シグマ、米国、ミズーリ州、セントルイス、カタログ番号  Ｍ８７７７）を、０．９％  生理食塩水で希釈した。
【０１２５】
ｂＰＡＰまたはｈＰＡＰの髄腔内注入は、明白な副作用を有していなかった。例えば、麻痺、筋力低下、嗜眠、興奮性、感染または死亡は、行動試験の期間の持続時間（いくつかの場合では最大１４日間）において認められなかった。ＰＡＰタンパク質は、脊髄の細胞外（ＰＡＰ＋  ニューロンの軸索上）に位置するため、ｂＰＡＰおよびｈＰＡＰタンパク質はｉｎ  ｖｉｖｏにおける耐性が良好であることが予期された。さらに、ＰＡＰは、ＣＮＳ（すなわち、血液脳関門の後ろ）に注入され、ＣＮＳは免疫特権を持つため、免疫応答はありそうもないと考えられた。免疫およびミクログリアの活性化の信号は、分子マーカーを使用してモニターできる。
【０１２６】
ＰＡＰ活性はまた、プラスミドもしくはウイルスの伝達、またはＰＡＰの分泌型アイソフォームを過剰発現する細胞株の注入などによる、さらなる方法を使用して、増加させることができる。
【０１２７】
ＰＡＰは、熱変性、ＤＥＰＣ治療、または組み換えタンパク質への、触媒的に不活性な点変異（Ｈｉｓ１２→Ａｌａ）の導入によって、不活性化できる。
【０１２８】
（ｂＰＡＰは、ｉｎ  ｖｉｖｏでＬＰＡに誘起された感作を阻害する）
ウシ  ＰＡＰタンパク質（ｂＰＡＰ）（シグマ（米国、ミズーリ州、セントルイス）から購入した）が、髄腔内に注入された場合に、無毒性であることを証明するため、かつ、ｂＰＡＰが、ＬＰＡに誘起された情報伝達をｉｎ  ｖｉｖｏで調節できることを証明するため、４群の野生型  Ｃ５７ＢＬ／６  オスマウスに、下記を（髄腔内）注入した：１）媒体、２）２０μＵ  ｂＰＡＰ、３）１ｎｍｏｌ  ＬＰＡ、または４）１ｎｍｏｌ  ＬＰＡ＋２０μＵ  ｂＰＡＰ。２０μＵ  ｂＰＡＰは、３７℃で、１０分間インキュベーションした場合、１ｎｍｏｌ  ＬＰＡを脱リン酸化できることを見出した。従って、全ての試料を、３７℃で１０分間で、注入の前にインキュベーションした。
【０１２９】
第１に、機械的感受性は、電気的ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ装置（ＩＩＴＣ）で測定した。次いで、熱感受性を、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ法（後肢の放射加熱；ＩＩＴＣ  Ｐｌａｎｔａｒ  Ｔｅｓｔ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して測定した。図１０において見出すことができる通り、１ｎｍｏｌ  ＬＰＡは、持続性の機械的アロディニアおよび熱痛覚過敏を、以前に報告された通り（Ｉｎｏｕｅら、２００４）に引き起こした。１ｎｍｏｌ  ＬＰＡを、ｂＰＡＰとともに１０分間、３７℃でインキュベーションしてから注入した場合、ＬＰＡに対する行動性感作は認められなかった。原則として、図１０中のデータは、ｂＰＡＰが、ＬＰＡを分解でき、ＬＰＡに誘起された情報伝達をｉｎ  ｖｉｖｏで阻害できることを示す。驚いたことに、熱感受性は、媒体を注入されたマウスと比較して、ｂＰＡＰを注入されたマウスにおいて、３日間顕著に増加したことが見出された。図１０Ｂを参照。
【０１３０】
熱感受性におけるこの有意な増加を、さらに媒体を注入されたマウスおよびｂＰＡＰを注入されたマウスで再現した。これらの同様の動物における機械的感受性は、溶媒対照と比較した場合、有意差がなかった（６時間の時点を除く）。これらの発見は、ｂＰＡＰが鎮痛特性をｉｎ  ｖｉｖｏで有することを示す。
【０１３１】
有意な熱鎮痛は、ＬＰＡ＋ｂＰＡＰを注入されたマウスにおいて認められなかった（１日目の時点を除く）。ＬＰＡ＋ｂＰＡＰを注入されたマウスと、ｂＰＡＰを注入されたマウスとの間のこの相違は、注入の前のＬＰＡの不完全な脱リン酸化による可能性があり、または、ＬＰＡ＋ｂＰＡＰの試料におけるモノグリセリドおよび無機リン酸の存在による可能性がある（ＬＰＡの脱リン酸化は、モノグリセリドおよび無機リン酸を産生する）。体重は、全実験期間にわたって安定しており、食欲の減少または感染がないことを示していた。全体的に見て、これらの実験は、ｂＰＡＰの髄腔内注入が無毒性であり、マウスにおいて耐容性が良好であることを示す。
【０１３２】
（ｂＰＡＰおよびｈＰＡＰは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて鎮痛性である）
ＰＡＰについて疼痛に関連する機能を特定するため、ウシ  ｂＰＡＰを野生型マウスの脊髄に注入した。次いで、注入前および注入後５日まで、Ｈａｒｇｒｅａｖｅ法（後肢の放射加熱）を使用し、熱感受性についてこれらのマウスを試験し、電気的ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ装置を使用し、機械的感受性についてこれらのマウスを試験した。ｂＰＡＰを注入したマウスは、媒体を注入された対照と比較して、有意に増加した、熱刺激からの後肢の退避潜時を最大３日間示した。図１１Ａを参照し、点線を実線と比較すること。対照的に、機械的感受性においては、有意差がなかった（６時間の時点を除く）。図１１Ｂを参照。図１１Ａおよび図１１Ｂにおけるデータは、図１０Ａおよび図１０Ｂから得て、ｈＰＡＰ行動性の結果との比較を容易にするために再度プロットしたことに注意すること。当該データは、ｂＰＡＰ注入が麻痺または嗜眠を引き起こさなかったという事実と合わせると、ＰＡＰが鎮痛性であり、麻痺性または催眠性ではないことを強く示唆する。さらに、ヒト  ｈＰＡＰの髄腔内注入もまた、注入後３日間、有意な熱鎮痛を引き起こすが、機械的鎮痛は引き起こさない。図１１Ｃおよび図１１Ｄを参照。ｈＰＡＰの調製物を、注入前に０．９％  生理食塩水で透析し、そのため、この鎮痛効果は、タンパク質調製物中の小分子の混入物によるものではないようだった。さらに、ウシおよびヒトのＰＡＰが、同様の鎮痛効果を、同様の持続時間で生じさせたという事実は、この効果がＰＡＰに特異的であることをさらに示唆する。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を注入した場合、鎮痛は認められなかった。図１１Ｃおよび図１１Ｄを参照。ＢＳＡは、分子量がＰＡＰと似ているが、ホスファターゼ活性を欠いているタンパク質である。さらに、熱感受性または機械的感受性の変化は、異なる分泌型ホスファターゼ、すなわち、ウシ  アルカリホスファターゼの髄腔内注入後には認められなかった。図１２Ａおよび図１２Ｄを参照。
【０１３３】
ＰＡＰ触媒活性が、鎮痛効果に必要とされるかどうかを直接的に検証するため、活性なｈＰＡＰおよび熱失活したｈＰＡＰを使用した。図１３は、５μＬの活性なｈＰＡＰ（実線）または不活性なｈＰＡＰ（点線）の髄腔内注入後６日間の、１０匹の野生型Ｃ５７ＢＬ／６  オスマウスの平均的な熱感受性を示す。活性なｈＰＡＰの抗侵害受容性効果は、用量依存的だった。図１４Ａ−１４Ｃを参照。図１５は、５μＬの活性なｈＰＡＰ（実線）または不活性なｈＰＡＰ（点線）の髄腔内注入後６日間の、１０匹の野生型Ｃ５７ＢＬ／６  オスマウスの平均的な機械的感受性を示す。ここでも、ヒト  ｈＰＡＰの髄腔内注入は、注入後３日間、有意な熱鎮痛を引き起こしたが、機械的鎮痛を引き起こさなかった。
【０１３４】
次に、ＰＡＰの抗侵害受容を、一般的に使用されるオピオイド鎮痛薬であるモルヒネと、有害な熱刺激に対する感受性についての同様の行動アッセイを使用して比較した。モルヒネの抗侵害受容の用量依存性は、図１６Ａ−１６Ｃに示される。図１４Ａ−１４Ｃにおけるデータを、図１６Ａ−１６Ｃにおけるデータと比較すると、ＰＡＰおよびモルヒネの抗侵害受容は、単回の髄腔内注入後の振幅が似ているように思われるが（それぞれ、４０．８％±３．３％  対  ６２．２％±９．９％、最も高い用量での、ベースラインよりも上における増加）、ＰＡＰ抗侵害受容は、モルヒネよりもずっと長く持続した（それぞれ、最も高い用量において、３日間  対  ５時間）。以前の報告は、同様の高用量のモルヒネ（５０μｇ、髄腔内、単回注入）が、マウスにおいて、４．６±１．０時間持続したことを見出した（Ｇｒａｎｔら、１９９５）。
【０１３５】
（完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）炎症痛モデル）
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）炎症痛モデルを、ＰＡＰが慢性的な機械的炎症痛および熱炎症痛を逆転できるかどうかを特定するために使用した。成体（２−３ヶ月齢）の、月齢をマッチさせ、体重をマッチさせたオスのＣ５７ＢＬ／６  マウスのベースラインの機械的感受性を、無毛皮膚（右後肢）を電気的ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ装置（ＩＩＴＣ）で調査することによって定量化した。Ｈａｒｇｒｅａｖｅ法（これは、後肢の放射加熱（ＩＩＴＣ  Ｐｌａｎｔａｒ  Ｔｅｓｔ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を必要とする）を、同じ群のマウスにおける熱感受性を試験するために使用した（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓら、１９８８）。ベースラインの熱感受性および機械的感受性を、試験化合物の注入の前に特定した。次いで、マウスに、２０μＬ  ＣＦＡを注入した。１日後、全てのマウスは、ＣＦＡを注入された後肢において、深刻な熱過敏症および機械的過敏症を示した。次いで、マウスの半数に、１．３ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（対照）を髄腔内注入し、残りの半分にはｂＰＡＰを注入し（図１７Ａおよび図１７Ｂを参照）、または、半数に活性なｈＰＡＰを、半数に不活性なｈＰＡＰを注入した。図１８および図１９を参照。次いで、マウスを、注入から最大７日後まで、ｖｏｎ  ＦｒｅｙおよびＨａｒｇｒｅａｖｅｓ試験を使用して、機械的感受性および熱感受性について試験した。平均的な感受性をプロットし、統計検定（対応ｔ検定）を、ＰＡＰが、過敏症（アロディニア；痛覚過敏）、感受性低下（鎮痛）を引き起こすかどうか、または効果がないかどうかを特定するために使用した。
【０１３６】
明らかに、ｂＰＡＰは、熱的刺激および機械的刺激によって引き起こされた炎症痛を顕著に逆転させた。図１７Ａおよび図１７Ｂを参照。同様の効果は、活性なｈＰＡＰの注入についても認められた。図１８および図１９を参照。この鎮痛効果は、少なくとも３日間続いた。これは、単回用量のＰＡＰは、マウスがほぼ完全に回復する状態まで、慢性疼痛を治療できることを示す。
【０１３７】
（神経因性疼痛のＰＡＰ治療）
ＰＡＰタンパク質の髄腔内注入が、神経因性疼痛の維持を遮断できる程度を特定した。神経因性疼痛の惹起の遮断と、神経因性疼痛の維持の遮断との間の主な相違は、ＰＡＰが神経部分損傷（ＳＮＩ）手術に関連していつ注入されたか、ということと関連する。図８を参照。神経損傷前のＰＡＰの注入によって、神経因性疼痛の惹起の遮断における有効性を測り、一方、損傷から４−５日後のＰＡＰの注入によって、維持された疼痛の遮断における有効性を検証した。末梢神経損傷は、症候および薬物に対する反応性の観点から、ヒト  神経因性疼痛の最も近いモデルとなるため、ＳＮＩ  モデルを使用した（Ａｂｄｉら、１９９８；ＬａＢｕｄａおよびＬｉｔｔｌｅ、２００５）。
【０１３８】
神経部分損傷（ＳＮＩ）モデルをマウスにおいて神経障害様の疼痛状態を生じさせるために使用した。公表された手順（Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００３）に従って、動物施設で外科手術を行った。手短に言えば、マウスをハロタンで麻酔し、右坐骨神経の腓腹および腓骨の枝を結紮し、次いで、各神経から約１ｍｍ切り出した。脛骨神経を残した。これは、右後肢において深刻な機械的アロディニアを引き起こすが、熱痛覚過敏はほとんどない（Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００３）。
【０１３９】
右（対照−未処置）および左（損傷した）の後肢を、機械的感受性（ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ法を使用；上記）および熱感受性（Ｈａｒｇｒｅａｖｅ法；上記）について、手術前（ベースライン）およびＳＮＩ手術後に試験した。活性なｂＰＡＰまたはｈＰＡＰを、最大のホスファターゼ活性を有するが、最小の副作用を有することが経験的に見出された用量を使用して、髄腔内に注入した。等量の不活性なｈＰＡＰタンパク質を、認められた鎮痛効果が、ＰＡＰ  ホスファターゼ活性によることを証明するために注入した。注入（髄腔内）を、上記のように、手術から５−６日後（維持実験）に行った。対照と実験動物との間の熱感受性および／または機械的感受性における有意差を特定するため、統計検定（ｔ検定）を使用した。損傷した肢については、ｂＰＡＰの髄腔内注入は、約３日間続く、熱感受性（図２０参照）および機械的感受性（図２１参照）の減少を引き起こした。損傷していない肢については、減少した感受性は、熱感受性にのみに認められ、機械的感受性では認められなかった。髄腔内への活性なｈＰＡＰの注入において、熱感受性（図２２を参照）および機械的感受性（図２３を参照）についての非常に類似する結果が認められた。
【０１４０】
これらのデータは、精製されたＰＡＰタンパク質を髄腔内に注入することによって、または、疼痛感受性ニューロン上に通常存在するＰＡＰを活性化するために、小分子アロステリック調節因子を投与することによって、慢性疼痛が、ヒトおよび他の動物の対象において治療できることを示唆する。これらの薬物治療は、外科的疼痛の治療、慢性炎症痛（例えば、変形性関節症、熱傷、関節痛、腰痛）の治療、および慢性神経因性疼痛の治療のために、手術の前または後に使用できる。
【０１４１】
（実施例１２）
（ＰＡＰ  ノックアウトマウスにおけるアロディニアおよび痛覚過敏のＰＡＰ阻害）
ＰＡＰは、一般的に、前立腺においてのみ機能すると考えられていた（ＯｓｔｒｏｗｓｋｉおよびＫｕｃｉｅｌ、１９９４）。しかし、本願において開示されたデータは、ＰＡＰが侵害受容性ニューロンにおいても機能できることを示唆する。ＰＡＰについて疼痛に関連する機能をさらに評価するため、年齢をマッチさせた野生型Ｃ５７ＢＬ／６  オスマウスおよびＰＡＰ−／−  オスマウス（１０世代にわたって、Ｃ５７ＢＬ／６に戻し交配した）を、急性および慢性の疼痛行動アッセイを使用して評価した。機械的感受性の基準（電気的ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ）または急激な有害な熱感受性のいくつかの異なる基準を使用したところ、遺伝子型の間の有意差は見出されなかった。表４を参照。
【０１４２】
対照的に、ＰＡＰ−／−  マウスは、慢性炎症痛の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）モデルにおける野生型マウスと比較して、非常に大きな熱痛覚過敏および機械的アロディニアを示した。図２４Ａおよび図２４Ｂを参照。さらに、ＰＡＰ−／−  マウスは、神経因性疼痛の神経部分損傷（ＳＮＩ）モデル（Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００３）において非常に大きな熱痛覚過敏を示した。図２４Ｃを参照。
【０１４３】
【表４】
0005584132.tif 000005
【０１４４】
ＰＡＰ−／−  マウスは、ＣＦＡ炎症痛モデルにおいて増強された痛覚過敏およびアロディニアを示したため、ＰＡＰ−／−  マウスにおけるこれらの増強された熱的形質および機械的形質をレスキューするｈＰＡＰ治療の能力を試験した。ｈＰＡＰの髄腔内（ｌｎｔｒａｔｈａｃｅａｌ）注入は、ＰＡＰ−／−（ＰＡＰ  ＫＯ）マウスの対照（右）の肢における熱的退避潜時を野生型マウスと同程度まで増加させる。図２５Ａを参照。従って、ＰＡＰ−／−  マウスは、ＰＡＰ活性の急激な増加に対して反応する能力があると思われる。ｈＰＡＰの注入は、ＰＡＰ−／−  マウスの炎症した（左）肢における熱的および機械的な炎症痛の形質を顕著にレスキューする。図２５Ａおよび図２５Ｂを参照し、不活性なＰＡＰに対する活性なＰＡＰについてのデータを比較すること。ｈＰＡＰの局在的な脊髄投与は、動物全体のＰＡＰの欠損によって引き起こされる行動障害をレスキューできる。
【０１４５】
（実施例１３）
（アデノシンのＰＡＰ生成）
ＰＡＰの抗侵害受容性効果は、触媒活性を必要とする。いずれかの１つの理論に結び付けられることなく、これは、ＰＡＰが、脱リン酸化を介して、脊髄中の侵害受容性神経伝達を制御する分子を生成することを示唆する。ＰＡＰおよびＴＭＰａｓｅは、多くの異なる基質を脱リン酸化できる（Ｄｚｉｅｍｂｏｒ−Ｇｒｙｓｚｋｉｅｗｉｃｚら、１９７８；ＳａｎｙａｌおよびＲｕｓｔｉｏｎｉ、１９７４；ＳｉｌｖｅｒｍａｎおよびＫｒｕｇｅｒ、１９８８ｂ；Ｖｉｈｋｏ、１９７８ｂ）。１つの可能性がある基質はＡＭＰである。ＡＭＰの脱リン酸化は、脊髄片における侵害受容性神経伝達を阻害し、哺乳類におけるよく研究された鎮痛特性を有する分子である、アデノシンを生成する（ＬｉおよびＰｅｒｌ、１９９４；ＬｉｕおよびＳａｌｔｅｒ、２００５；Ｐｏｓｔ、１９８４；Ｓａｗｙｎｏｋ、２００６）。
【０１４６】
本願明細書において開示された主題に先立って、ＰＡＰおよびＴＭＰａｓｅが、ＡＭＰからアデノシンを生成できるという直接的な証拠はなかった。代わりに、アデノシンの生成は、無機リン酸の生成を測定することで推測された（Ｖｉｈｋｏ、１９７８ｂ）。ＰＡＰが、ＡＭＰおよび他のアデニンヌクレオチドからアデノシンを生成することができるかどうかを直接的に試験するため、ＰＡＰを１ｍＭのＡＭＰ、ＡＤＰまたはＡＴＰと、ｐＨ  ７．０で４時間インキュベーションした。アデニンヌクレオチドおよびアデノシンを、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびＵＶ吸光度を使用して検出した（Ｌａｚａｒｏｗｓｋｉら、２００４）。これらの研究は、ＰＡＰが、ＡＭＰをアデノシンへと、迅速に脱リン酸化でき、ずっと低い程度でＡＤＰをアデノシンへと、脱リン酸化できることを明らかにした。図２６Ａおよび図２６Ｂを参照。重要なことには、予想外のピークはクロマトグラム中に見られず、ＰＡＰがヌクレオチドに対するさらなる加水分解活性を有する可能性を除外した。
【０１４７】
次に、ＰＡＰがＨＥＫ  ２９３細胞、ＤＲＧニューロンおよび脊髄中の細胞外ＡＭＰを脱リン酸化できる程度を、ＡＭＰ酵素組織化学を使用して研究した。ＴＭ−ＰＡＰを形質移入されたＨＥＫ  ２９３細胞がしっかり染色された一方、対照細胞は染色されず（図２６Ｃおよび２６Ｄ参照）、ＴＭ−ＰＡＰが細胞外ＡＭＰを脱リン酸化し、従って、エクト−５’−ヌクレオチダーゼ活性を有することが強調された。さらに、野生型マウスからの小径ＤＲＧニューロンが強く染色された一方、大径ニューロンの顆粒状細胞質の染色は弱かった。対照的に、ＰＡＰ−／−マウスからのＤＲＧニューロン中には、弱い顆粒染色のみが存在した。図２６Ｅおよび図２６Ｆ参照。これらのデータは、ＰＡＰが、小径ニューロンの細胞体上の主要なエクト−５’−ヌクレオチダーゼであることを示す。最後に、ラミナ  ＩＩにおける軸索末端のＡＭＰの組織化学的染色は、野生型マウスと比較してＰＡＰ−／−では減少したが、なくならなかった。図２６Ｇおよび図２６Ｈを参照。これは、ＰＡＰが、ＡＭＰをアデノシンに脱リン酸化する能力を有する、脊髄中のもしかすると多くの酵素のうちの１つであることを示す。
【０１４８】
アデノシンは、Ｇｉ共役  Ａ１−アデノシン受容体（Ａ１Ｒ）を通じて、抗侵害受容を媒介する（ＬｅｅおよびＹａｋｓｈ、１９９６；Ｓａｗｙｎｏｋ、２００６）。Ａ１ＲがＰＡＰ抗侵害受容に必要とされるかどうかを直接的に試験するため、野生型Ｃ５７ＢＬ／６  マウスおよびＡ１アデノシン受容体ノックアウトマウス（Ａ１Ｒ−／−、Ａｄｏｒａ１−／−；１２世代にわたって、Ｃ５７ＢＬ／６  マウスに戻し交配されたもの）に、ｈＰＡＰを髄腔内注入した。次いで、有害な熱感受性および機械的感受性を測定した（Ｈｕａら、２００７；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、２００１）。ｈＰＡＰは、野生型マウスにおける３日間、肢の退避潜時を顕著に増加させたが、Ａ１Ｒ−／−マウスにおいては効果がなかった。図２７Ａを参照。同様に、ｂＰＡＰは、野生型マウスにおける、有害な熱刺激に対する肢の退避潜時を増加させたが、Ａ１Ｒ−／−マウスにおいては効果がなかった。図２８を参照。予想通り、ｈＰＡＰは、未損傷の動物における機械的感受性に影響しなかった。図２７Ｂを参照。
【０１４９】
野生型マウスおよびＡ１Ｒ−／−マウスの反応もまた、ＣＦＡ慢性炎症痛モデルおよびＳＮＩ神経因性疼痛モデルを使用して試験した。以前の発見（Ｗｕら、２００５）を再現して、ＣＦＡの注入および神経損傷の後（しかし、ＰＡＰ注入の前）に、Ａ１Ｒ−／−マウスは野生型マウスと比較して、強い熱痛覚過敏を示した。図２７Ｃおよび図２７Ｅを参照。ｈＰＡＰ髄腔内注入の後、熱的閾値および機械的閾値は、野生型マウスの炎症／損傷肢において増加したが、Ａ１Ｒ−／−マウスでは増加しなかった。図２７Ｃ−図２７Ｆを参照。同様に、選択的Ａ１Ｒ拮抗薬である８−シクロペンチル−１，３−ジプロピルキサンチン（ＣＰＸ；シグマ、米国、ミズーリ州、セントルイス；カタログ番号  Ｃ１０１；１ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、５％  ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、１．２５％  ＮａＯＨを含む０．９％  生理食塩水に溶解している）は、対照および炎症のある後肢において、ｈＰＡＰの抗侵害受容性効果を一過性に逆行させた。図２９を参照。逆に、選択的Ａ１Ｒ作動薬である、Ｎ６−シクロペンチルアデノシン（ＣＰＡ；シグマ、米国、ミズーリ州、セントルイス、カタログ番号  Ｃ８０３１；０．９％  生理食塩水に希釈されたＤＭＳＯ中の１０ｍＭ  原液）の、野生型マウスへの（髄腔内）注入は、髄腔内ｈＰＡＰと同様に、熱刺激に対する肢の退避潜時において用量依存的な増加を生じた（図３０参照）。しかし、ｈＰＡＰとは異なり、ＣＰＡは短期間の効果（数時間（数日間ではない）続く）を有し、ＣＰＡは、２つの最も高い用量で、一過性の麻痺を引き起こした。まとめると、これらの結果は、ＰＡＰの抗侵害受容性効果は、アデノシンの生成、次いでＡ１Ｒの活性化に起因する可能性があることを示す。さらに、これらの結果は、エクトヌクレオチダーゼとしての、ＰＡＰについての新規なｉｎ  ｖｉｖｏの機能を示唆する。
【０１５０】
（実施例１４）
（ＰＡＰの小分子修飾因子を同定するための高処理スクリーニング）
高処理生化学的アッセイを、ＰＡＰ活性を調節する薬物を同定するために開発した。このアッセイは、純粋なｈＰＡＰタンパク質、および蛍光定量的ＰＡＰ基質（ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルリン酸エステル（ＤｉＦＭＵＰ）；インビトロジェンから市販されている）の使用に依存する。ｈＰＡＰによるＤｉＦＭＵＰの脱リン酸化を、蛍光定量的マイクロプレートリーダー（ＦＬＩＰＲまたはＦｌｅｘｓｔａｔｉｏｎなど）を使用してモニターした。第１に、ｈＰＡＰタンパク質およびＤｉＦＭＵＰ基質の適切な濃度を、９６ウェルプレートにおける使用のために同定し、次いで、２，０００の化合物（ＮＣＩ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｅｔ）を、ｈＰＡＰの反応速度を促進（活性化剤）または抑制（阻害剤）させる小分子を同定するためにスクリーニングした。このスクリーニングからのデータを使用し、Ｚ因子は、０．８６であると算出された（この数字は、０−１の範囲に及ぶ可能性があり、０．５は有用なＨＴＳについてのカットオフである。０．８６は、非常に高い値であり、当該アッセイの再現性が高く、大きなシグナル・ノイズ比を有することを示す）（Ｚｈａｎｇら、１９９９）。当該スクリーニングから、６つの候補ｈＰＡＰ阻害剤および３つの候補ｈＰＡＰ活性化剤を同定した。未使用の化合物（ＮＣＩから注文した）を入手し、用量−反応実験を行った。これらの実験によって、全ての９つの候補は実際に活性化剤または阻害剤であることを確認した。これらの化合物がｈＰＡＰに対して特異的である程度を、ｈＰＡＰ、ｂＰＡＰ、ジャガイモ酸性ホスファターゼおよびウシ  アルカリホスファターゼへのこれらの化合物の効果を試験することによって評価した。従って、ｈＰＡＰの活性化剤および阻害剤は、再現性のある、小型化された、経済的なＨＴＳを使用して、同定することができる。当該アッセイは、ＰＡＰのさらなる小分子修飾因子を同定するために有用である。
【０１５１】
（略称）
℃  ＝  セルシウス度
μＬ  ＝  マイクロリットル
μｍｏｌ  ＝  マイクロモル
μＵ  ＝  マイクロユニット
ＡＬＰ  ＝  アルカリホスファターゼ
ＡＭＰ  ＝  アデノシン一リン酸
ＢＬ  ＝  ベースライン
ｂＰＡＰ  ＝  ウシ前立腺酸性ホスファターゼ
ＢＳＡ  ＝  ウシ血清アルブミン
ＣＦ  ＝  嚢胞性線維症
ＣＦＡ  ＝  完全フロイントアジュバント
ＣＳＦ  ＝  脳脊髄液
ＤＥＰＣ  ＝  ジエチルピロカーボネート
ＤＲＧ  ＝  後根神経節
ＦＲＡＰ  ＝  フッ化物抵抗性酸性ホスファターゼ
ｈＰＡＰ  ＝  ヒト前立腺酸性ホスファターゼ
ｈｒ  ＝  時間
ｉ．ｔ．  ＝  髄腔内
ＬＰＡ  ＝  リゾホスファチジン酸
ＬＴＲ  ＝  末端反復配列
ｍｇ  ＝  ミリグラム
ＭＧ  ＝  モノグリセリド
ｍＬ  ＝  ミリリットル
ｍｍ  ＝ミリメートル
ｍＰＡＰ  ＝  マウス前立腺酸性ホスファターゼ
ｍＵ  ＝  ミリユニット
ｎｍｏｌ  ＝  ナノモル
ＰＡＰ  ＝  前立腺酸性ホスファターゼ
ＰＢＳ  ＝  リン酸緩衝食塩水
ＰＥＧ  ＝  ポリ（エチレングリコール）
Ｐｉ  ＝  無機リン酸
ｓ  ＝  秒
ＳＮＩ  ＝  神経部分損傷
ＳＮＰ  ＝  一塩基多型
ＴＭ−ＰＡＰ  ＝  膜貫通型前立腺酸性ホスファターゼ
ｗ／ｖ  ＝  体積に対する重量
【０１５２】
（参考文献）
下記の参考文献、および本願明細書において引用される全ての参考文献（特許、特許出願、学術雑誌論文および全てのデータベース登録（例えば、ジェンバンク（登録商標）受入番号（開示された配列と関連するジェンバンク（登録商標）データベースに示された全てのアノテーションを含む）を含む）は、これらが、本願明細書で使用される方法論、技術、および／または組成物について補充、説明、その背景を提供し、またはこれらを教示する範囲で、参照によって本願明細書に組み込まれる。
【０１５３】
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Ｃｈｕｎｇ、Ｊ．Ｍ．、およびＣｈｕｎｇ、Ｋ．（２００２）。Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ＤＲＧ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ  ｐａｉｎ．Ｐａｉｎ  Ｐｒａｃｔ  ２、８７−９７。
Ｃｏｃｋａｙｎｅ、Ｄ．Ａ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｓ．Ｇ．、Ｚｈｕ、Ｑ．Ｍ．、Ｄｕｎｎ、Ｐ．Ｍ．、Ｚｈｏｎｇ、Ｙ．、Ｎｏｖａｋｏｖｉｃ、Ｓ．、Ｍａｌｍｂｅｒｇ、Ａ．Ｂ．、Ｃａｉｎ、Ｇ．、Ｂｅｒｓｏｎ、Ａ．、Ｋａｓｓｏｔａｋｉｓ、Ｌ．ら（２０００）。Ｕｒｉｎａｒｙ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｈｙｐｏｒｅｆｌｅｘｉａ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｐａｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒ  ｉｎ  Ｐ２Ｘ３−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０７、１０１１−１０１５。
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Ｃｏｓｔｉｇａｎ、Ｍ．、Ｂｅｆｏｒｔ、Ｋ．、Ｋａｒｃｈｅｗｓｋｉ、Ｌ．、Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ｒ．Ｓ．、Ｄ’Ｕｒｓｏ、Ｄ．、Ａｌｌｃｈｏｒｎｅ、Ａ．、Ｓｉｔａｒｓｋｉ、Ｊ．、Ｍａｎｎｉｏｎ、Ｊ．Ｗ．、Ｐｒａｔｔ、Ｒ．Ｅ．、およびＷｏｏｌｆ、Ｃ．Ｊ．（２００２）。Ｒｅｐｌｉｃａｔｅ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｒａｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｈｕｎｄｒｅｄｓ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｏｒｓａｌ  ｒｏｏｔ  ｇａｎｇｌｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｒｖｅ  ｉｎｊｕｒｙ．ＢＭＣ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３、１６。
Ｃｏｘ、Ｊ．Ｊ．、Ｒｅｉｍａｎｎ、Ｆ．、Ｎｉｃｈｏｌａｓ、Ａ．Ｋ．、Ｔｈｏｒｎｔｏｎ、Ｇ．、Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｅ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｌｌ、Ｋ．、Ｋａｒｂａｎｉ、Ｇ．、Ｊａｆｒｉ、Ｈ．、Ｍａｎｎａｎ、Ｊ．、Ｒａａｓｈｉｄ、Ｙ．ら（２００６）。Ａｎ  ＳＣＮ９Ａ  ｃｈａｎｎｅｌｏｐａｔｈｙ  ｃａｕｓｅｓ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｉｎａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ  ｐａｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４４、８９４−８９８。
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Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ、Ｂ．、Ｈａｌｌｄｎｅｒ、Ｌ．、Ｄｕｎｗｉｄｄｉｅ、Ｔ．Ｖ．、Ｍａｓｉｎｏ、Ｓ．Ａ．、Ｐｏｅｌｃｈｅｎ、Ｗ．、Ｇｉｍｅｎｅｚ−Ｌｌｏｒｔ、Ｌ．、Ｅｓｃｏｒｉｈｕｅｌａ、Ｒ．Ｍ．、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｔｅｒｕｅｌ、Ａ．、Ｗｉｅｓｅｎｆｅｌｄ−Ｈａｌｌｉｎ、Ｚ．、Ｘｕ、Ｘ．Ｊ．ら（２００１）。Ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ，ａｎｘｉｅｔｙ，ａｎｄ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｈｙｐｏｘｉｃ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  Ａ１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９８、９４０７−９４１２。
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Ｍｏｑｒｉｃｈ、Ａ．、Ｅａｒｌｅｙ、Ｔ．Ｊ．、Ｗａｔｓｏｎ、Ｊ．、Ａｎｄａｈａｚｙ、Ｍ．、Ｂａｃｋｕｓ、Ｃ．、Ｍａｒｔｉｎ−Ｚａｎｃａ、Ｄ．、Ｗｒｉｇｈｔ、Ｄ．Ｅ．、Ｒｅｉｃｈａｒｄｔ、Ｌ．Ｆ．、およびＰａｔａｐｏｕｔｉａｎ、Ａ．（２００４）。Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＴｒｋＣ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＴｒｋＡ  ｌｏｃｕｓ  ｃａｕｓｅｓ  ａ  ｓｕｂｓｅｔ  ｏｆ  ｄｏｒｓａｌ  ｒｏｏｔ  ｇａｎｇｌｉａ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｔｏ  ｓｗｉｔｃｈ  ｆａｔｅ．Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ７、８１２−８１８。
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Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、Ｓ．Ｌ．、Ｓｌｕｋａ、Ｋ．Ａ．、およびＡｒｎｏｌｄ、Ｍ．Ａ．（２００１）。Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ  ｐｕｓｈ−ｐｕｌｌ  ｍｉｃｒｏｐｒｏｂｅ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｄｏｒｓａｌ  ｈｏｒｎ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ７６、２３４−２４６。
Ｐｉｌｑｕｉｌ、Ｃ．、Ｓｉｎｇｈ、Ｉ．、Ｚｈａｎｇ、Ｑ．、Ｌｉｎｇ、Ｚ．、Ｂｕｒｉ、Ｋ．、Ｓｔｒｏｍｂｅｒｇ、Ｌ．Ｍ．、Ｄｅｗａｌｄ、Ｊ．、およびＢｒｉｎｄｌｅｙ、Ｄ．Ｎ．（２００１）。Ｌｉｐｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−１  ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｓ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄａｔｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｒｅｂｙ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｉｔｓ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  ６４、８３−９２。
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Ｐｏｒｖａｒｉ、Ｋ．、Ｋｕｒｋｅｌａ、Ｒ．、Ｋｉｖｉｎｅｎ、Ａ．、およびＶｉｈｋｏ、Ｐ．（１９９５）。Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｔ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２１３、８６１−８６８。
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Ｑｕｉｎｔｅｒｏ、ｌｌｅａｎａ  Ｂ．、Ｃｅ’ｓａｒ  Ｌ．Ａｒａｕｊｏ、Ａｎｉｔｔａ  Ｅ．Ｐｕｌｋｋａ、Ｒｉｉｋｋａ  Ｓ．Ｗｉｒｋｋａｌａ、Ａｎｎａｋａｉｓａ  Ｍ．Ｈｅｒｒａｌａ、Ｅｅｖａ−Ｌｉｉｓａ  Ｅｓｋｅｌｉｎｅｎ、Ｅｉｊａ  Ｊｏｋｉｔａｌｏ、Ｐｅｋｋａ  Ａ．Ｈｅｌｌｓｔｒｏ  ”ｍ、Ｈａｎｎｕ  Ｊ．Ｔｕｏｍｉｎｅｎ、Ｐａｓｉ  Ｐ．Ｈｉｒｖｉｋｏｓｋｉ、およびＰｉｒｋｋｏ  Ｔ．Ｖｉｈｋｏ（２００７）。Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｉｓ  Ｎｏｔ  ａ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔａｒｇｅｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６７（１４）、６５４９−６５５４。
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Ｒｏｃｈｅｖｉｌｌｅ、Ｍ．、Ｌａｎｇｅ、Ｄ．Ｃ．、Ｋｕｍａｒ、Ｕ．、Ｐａｔｅｌ、Ｓ．Ｃ．、Ｐａｔｅｌ、Ｒ．Ｃ．、およびＰａｔｅｌ、Ｙ．Ｃ．（２０００）。Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｄｏｐａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ：ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏ−ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８、１５４−１５７。
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Ｓｃｈｍｅｌｚ、Ｍ．、Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｒ．、Ｂｉｃｋｅｌ、Ａ．、Ｈａｎｄｗｅｒｋｅｒ、Ｈ．Ｏ．、およびＴｏｒｅｂｊｏｒｋ、Ｈ．Ｅ．（１９９７）。Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃ−ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｉｔｃｈ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １７、８００３−８００８。
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Ｓｈａｎｅｒ、Ｎ．Ｃ．、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｒ．Ｅ．、Ｓｔｅｉｎｂａｃｈ、Ｐ．Ａ．、Ｇｉｅｐｍａｎｓ、Ｂ．Ｎ．、Ｐａｌｍｅｒ、Ａ．Ｅ．、およびＴｓｉｅｎ、Ｒ．Ｙ．（２００４）。Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  ｒｅｄ、ｏｒａｎｇｅ  ａｎｄ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２、１５６７−１５７２。
Ｓｈｉ、Ｔ．Ｊ．、Ｔａｎｄｒｕｐ、Ｔ．、Ｂｅｒｇｍａｎ、Ｅ．、Ｘｕ、Ｚ．Ｑ．、Ｕｌｆｈａｋｅ、Ｂ．、およびＨｏｋｆｅｌｔ、Ｔ．（２００１）。Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｒｖｅ  ｉｎｊｕｒｙ  ｏｎ  ｄｏｒｓａｌ  ｒｏｏｔ  ｇａｎｇｌｉｏｎ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃ５７  ＢＬ／６Ｊ  ｍｏｕｓｅ：ｍａｒｋｅｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｂｏｔｈ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １０５、２４９−２６３。
Ｓｈｉｅｌｄｓ、Ｓ．Ｄ．、Ｅｃｋｅｒｔ、Ｗ．Ａ．、３世、およびＢａｓｂａｕｍ、Ａ．Ｉ．（２００３）。Ｓｐａｒｅｄ  ｎｅｒｖｅ  ｉｎｊｕｒｙ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ  ｐａｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ：  ａ  ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ａｎｄ  ａｎａｔｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ  Ｐａｉｎ  ４、４６５−４７０。
Ｓｈｉｍｉｚｕ、Ｉ．、Ｉｉｄａ、Ｔ．、Ｇｕａｎ、Ｙ．、Ｚｈａｏ、Ｃ．、Ｒａｊａ、Ｓ．Ｎ．、Ｊａｒｖｉｓ、Ｍ．Ｆ．、Ｃｏｃｋａｙｎｅ、Ｄ．Ａ．、およびＣａｔｅｒｉｎａ、Ｍ．Ｊ．（２００５）。Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔｈｅｒｍａｌ  ａｖｏｉｄａｎｃｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ＡＴＰ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｐ２Ｘ３．Ｐａｉｎ  １１６、９６−１０８。
Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ、Ｊ．Ｄ．、およびＫｒｕｇｅｒ、Ｌ．（１９８８ａ）。Ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｓ  ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ａ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｇａｎｇｌｉｏｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｍａｍｍａｌｓ：ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｆｌｕｏｒｉｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  （ＦＲＡＰ）  ｏｆ  ｒｏｄｅｎｔｓ．Ｓｏｍａｔｏｓｅｎｓ  Ｒｅｓ  ５、２１９−２４６。
Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ、Ｊ．Ｄ．、およびＫｒｕｇｅｒ、Ｌ．（１９８８ｂ）。Ｌｅｃｔｉｎ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｓｅｐａｒａｔｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｄｏｒｓａｌ  ｒｏｏｔ  ｇａｎｇｌｉｏｎ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｎｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  “ｎｏｃｉｃｅｐｔｏｒ”  ｔｈｉｎ  ａｘｏｎｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ｔｅｓｔｉｓ  ａｎｄ  ｃｏｒｎｅａ  ｗｈｏｌｅ−ｍｏｕｎｔ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．Ｓｏｍａｔｏｓｅｎｓ  Ｒｅｓ  ５、２５９−２６７。
Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ、Ｊ．Ｄ．、およびＫｒｕｇｅｒ、Ｌ．（１９９０）。Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ａｎｄ  ａｕｔｏｎｏｍｉｃ  ｇａｎｇｌｉａ：ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｅｃｔｉｎ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｅｎｚｙｍｅ  ｍａｒｋｅｒｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ  １９、７８９−８０１。
Ｓｊｏｌｕｎｄ、Ｋ．Ｆ．、Ｂｅｌｆｒａｇｅ、Ｍ．、Ｋａｒｌｓｔｅｎ、Ｒ．、Ｓｅｇｅｒｄａｈｌ、Ｍ．、Ａｒｎｅｒ、Ｓ．、Ｇｏｒｄｈ、Ｔ．、およびＳｏｌｅｖｉ、Ａ．（２００１）。Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ  ａｒｅａ  ｏｆ  ｔａｃｔｉｌｅ  ａｌｌｏｄｙｎｉａ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ  ｐａｉｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｒｖｅ  ｉｎｊｕｒｙ：ａ  ｍｕｌｔｉ−ｃｅｎｔｒｅ、ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｓｔｕｄｙ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐａｉｎ  ５、１９９−２０７。
Ｓｎｉｄｅｒ、Ｗ．Ｄ．、およびＭｃＭａｈｏｎ、Ｓ．Ｂ．（１９９８）。Ｔａｃｋｌｉｎｇ  ｐａｉｎ  ａｔ  ｔｈｅ  ｓｏｕｒｃｅ：ｎｅｗ  ｉｄｅａｓ  ａｂｏｕｔ  ｎｏｃｉｃｅｐｔｏｒｓ．Ｎｅｕｒｏｎ  ２０、６２９−６３２。
Ｓｏｕｓｌｏｖａ、Ｖ．、Ｃｅｓａｒｅ、Ｐ．、Ｄｉｎｇ、Ｙ．、Ａｋｏｐｉａｎ、Ａ．Ｎ．、Ｓｔａｎｆａ、Ｌ．、Ｓｕｚｕｋｉ、Ｒ．、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ、Ｋ．、Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ、Ａ．、Ｂｏｙｃｅ、Ｓ．、Ｈｉｌｌ、Ｒ．ら（２０００）。Ｗａｒｍ−ｃｏｄｉｎｇ  ｄｅｆｉｃｉｔｓ  ａｎｄ  ａｂｅｒｒａｎｔ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐａｉｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  Ｐ２Ｘ３  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０７、１０１５−１０１７。
Ｓｔｕｃｋｙ、Ｃ．Ｌ．、Ｋｏｌｔｚｅｎｂｕｒｇ、Ｍ．、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｍ．、Ｅｎｇｌｅ、Ｍ．Ｇ．、Ａｌｂｅｒｓ、Ｋ．Ｍ．、およびＤａｖｉｓ、Ｂ．Ｍ．（１９９９）。Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｓｋｉｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｔｈｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｎｏｃｉｃｅｐｔｏｒｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １９、８５０９−８５１６。
Ｓｕｇｉｕｒａ、Ｔ．、Ｎａｋａｎｅ、Ｓ．、Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ、Ｓ．、Ｗａｋｕ、Ｋ．、Ｙｏｓｈｉｏｋａ、Ｙ．、Ｔｏｋｕｍｕｒａ、Ａ．、およびＨａｎａｈａｎ、Ｄ．Ｊ．（１９９９）。Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｌｋｙｌ  ｅｔｈｅｒ−ｌｉｎｋｅｄ  ａｎａｌｏｇ  ｉｎ  ｒａｔ  ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｔｏｗａｒｄ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４４０、１９４−２０４。
Ｔａｋｕｗａ、Ｙ．、Ｔａｋｕｗａ、Ｎ．、およびＳｕｇｉｍｏｔｏ、Ｎ．（２００２）。Ｔｈｅ  Ｅｄｇ  ｆａｍｉｌｙ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ：ｔｈｅｉｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１３１、７６７−７７１。
Ｔａｎａｋａ、Ｍ．、Ｋｉｓｈｉ、Ｙ．、Ｔａｋａｎｅｚａｗａ、Ｙ．、Ｋａｋｅｈｉ、Ｙ．、Ａｏｋｉ、Ｊ．、およびＡｒａｉ、Ｈ．（２００４）。Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｄｅｇｒａｄｅｓ  ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎ  ｓｅｍｉｎａｌ  ｐｌａｓｍａ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５７１、１９７−２０４。
Ｔｅｇｅｄｅｒ、Ｉ．、Ｃｏｓｔｉｇａｎ、Ｍ．、Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ｒ．Ｓ．、Ａｂｅｌｅ、Ａ．、Ｂｅｌｆｅｒ、Ｉ．、Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｈ．、Ｅｈｎｅｒｔ、Ｃ．、Ｎｅｊｉｍ、Ｊ．、Ｍａｒｉａｎ、Ｃ．、Ｓｃｈｏｌｚ、Ｊ．ら（２００６）。ＧＴＰ  ｃｙｃｌｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ａｎｄ  ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｂｉｏｐｔｅｒｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｐａｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ。
Ｔｅｎｓｅｒ、Ｒ．Ｂ．（１９８５）。Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｏｆ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎ（ｆｌｕｏｒｉｄｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎ  ｄｏｒｓａｌ  ｒｏｏｔ  ｇａｎｇｌｉｏｎ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｎｅｕｒｅｃｔｏｍｙ  ａｎｄ  ｒｈｉｚｏｔｏｍｙ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ３３２、３８６−３８９。
Ｔｅｎｓｅｒ、Ｒ．Ｂ．、Ｖｉｓｅｌｌｉ、Ａ．Ｌ．、およびＳａｖａｇｅ、Ｄ．Ｈ．（１９９１）。Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｆｔｅｒ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ  １３０、８５−８８。
Ｔｉｇｙｉ、Ｇ．、Ｄｙｅｒ、Ｄ．Ｌ．、およびＭｉｌｅｄｉ、Ｒ．（１９９４）。Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｏｓｓｅｓｓｅｓ  ｄｕａｌ  ａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９１、１９０８−１９１２。
Ｔｉｇｙｉ、Ｇ．、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｄ．Ｊ．、Ｂａｋｅｒ、Ｄ．、Ｗａｎｇ、Ｄ．Ａ．、Ｙｕｅ、Ｊ．、Ｎｕｓｓｅｒ、Ｎ．、Ｖｉｒａｇ、Ｔ．、Ｚｓｉｒｏｓ、Ｖ．、Ｌｉｌｉｏｍ、Ｋ．、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｄ．、およびＰａｒｒｉｌｌ、Ａ．（２０００）。Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｇｒｏｗｔｈ−ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９０５、３４−５３。
Ｔｉｇｙｉ、Ｇ．、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｄ．Ｊ．、Ｓｅｂｏｋ、Ａ．、Ｙａｎｇ、Ｃ．、Ｄｙｅｒ、Ｄ．Ｌ．、およびＭｉｌｅｄｉ、Ｒ．（１９９６）。Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｅｕｒｉｔｅ  ｒｅｔｒａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ＰＣ１２  ｃｅｌｌｓ：ｃｏｎｔｒｏｌ  ｂｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ−Ｃａ２＋  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｈｏ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ６６、５３７−５４８。
Ｔｉｇｙｉ、Ｇ．、およびＭｉｌｅｄｉ、Ｒ．（１９９２）。Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄａｔｅｓ  ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｕｒｒｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｏｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｉｔｅ  ｒｅｔｒａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ＰＣ１２  ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７、２１３６０−２１３６７。
Ｔｓｕｄａ、Ｍ．、Ｓｈｉｇｅｍｏｔｏ−Ｍｏｇａｍｉ、Ｙ．、Ｋｏｉｚｕｍｉ、Ｓ．、Ｍｉｚｏｋｏｓｈｉ、Ａ．、Ｋｏｈｓａｋａ、Ｓ．、Ｓａｌｔｅｒ、Ｍ．Ｗ．、およびＩｎｏｕｅ、Ｋ．（２００３）。Ｐ２Ｘ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａ  ｇａｔｅ  ｔａｃｔｉｌｅ  ａｌｌｏｄｙｎｉａ  ａｆｔｅｒ  ｎｅｒｖｅ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ４２４、７７８−７８３。
米国特許第６，９７２，１７４号明細書
米国特許第６，１１０，７０９号明細書
Ｖａｄａｋｋａｎ、Ｋ．Ｉ．、Ｊｉａ、Ｙ．Ｈ．、およびＺｈｕｏ、Ｍ．（２００５）。Ａ  ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ  ｐａｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｍｏｎ  ｐｅｒｏｎｅａｌ  ｎｅｒｖｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｊ  Ｐａｉｎ  ６、７４７−７５６。
Ｖａｎ  Ｂｒｏｃｋｌｙｎ、Ｊ．Ｒ．、Ｇｒａｌｅｒ、Ｍ．Ｈ．、Ｂｅｒｎｈａｒｄｔ、Ｇ．、Ｈｏｂｓｏｎ、Ｊ．Ｐ．、Ｌｉｐｐ、Ｍ．、およびＳｐｉｅｇｅｌ、Ｓ．（２０００）。Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｓ  ａ  ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＥＤＧ−６．Ｂｌｏｏｄ  ９５、２６２４−２６２９。
ｖａｎ  Ｋｏｐｐｅｎ、Ｃ．、Ｍｅｙｅｒ  ｚｕ  Ｈｅｒｉｎｇｄｏｒｆ、Ｍ．、Ｌａｓｅｒ、Ｋ．Ｔ．、Ｚｈａｎｇ、Ｃ．、Ｊａｋｏｂｓ、Ｋ．Ｈ．、Ｂｕｎｅｍａｎｎ、Ｍ．、およびＰｏｔｔ、Ｌ．（１９９６）。Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｉ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｙ  ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１、２０８２−２０８７。
Ｖｉｈｋｏ、Ｐ．、Ｋｕｒｋｅｌａ、Ｒ．、Ｐｏｒｖａｒｉ、Ｋ．、Ｈｅｒｒａｌａ、Ａ．、Ｌｉｎｄｆｏｒｓ、Ａ．、Ｌｉｎｄｑｖｉｓｔ、Ｙ．、およびＳｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｇ．（１９９３）。Ｒａｔ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ，ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ  ｂｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌｓ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９０、７９９−８０３。
Ｖｉｈｋｏ、Ｐ．、Ｓａｊａｎｔｉ、Ｅ．、Ｊａｎｎｅ、Ｏ．、Ｐｅｌｔｏｎｅｎ、Ｌ．、およびＶｉｈｋｏ、Ｒ．（１９７８ａ）。Ｓｅｒｕｍ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２４、１９１５−１９１９。
Ｖｉｈｋｏ、Ｐ．（１９７８ｂ）。Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｓｏｅｎｚｙｍｅ、ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ａｎｄ  ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ．Ｐａｒｔ  ＩＩ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２４、１７８３−１７８７。
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国際公開第９３０２２１２号パンフレット
国際公開第００２０８５３号パンフレット
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Ｗｕ、Ｌｉ−Ｃｈｅｎ、Ｓｕｎ、Ｃｈｉａｏ−Ｗａｎｇ、Ｒｙａｎ、Ｔｈｏｍａｓ  Ｍ．、Ｐａｗｌｉｋ、Ｋｅｖｉｎ  Ｍ．、Ｒｅｎ、Ｊｉｎｘｉａｎｇ、およびＴｏｗｎｅｓ、Ｔｉｍ  Ｍ．（２００６）。Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｙ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  １０８（４）、１１８３−１１８８。
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Ｙｅ、Ｘ．、Ｈａｍａ、Ｋ．、Ｃｏｎｔｏｓ、Ｊ．Ｊ．、Ａｎｌｉｋｅｒ、Ｂ．、Ｉｎｏｕｅ、Ａ．、Ｓｋｉｎｎｅｒ、Ｍ．Ｋ．、Ｓｕｚｕｋｉ、Ｈ．、Ａｍａｎｏ、Ｔ．、Ｋｅｎｎｅｄｙ、Ｇ．、Ａｒａｉ、Ｈ．ら（２００５）。ＬＰＡ３−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐａｃｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  ４３５、１０４−１０８。
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Ｚｈａｏ、Ｙ．、Ｕｓａｔｙｕｋ、Ｐ．Ｖ．、Ｃｕｍｍｉｎｇｓ、Ｒ．、Ｓａａｔｉａｎ、Ｂ．、Ｈｅ、Ｄ．、Ｗａｔｋｉｎｓ、Ｔ．、Ｍｏｒｒｉｓ、Ａ．、Ｓｐａｎｎｈａｋｅ、Ｅ．Ｗ．、Ｂｒｉｎｄｌｅｙ、Ｄ．Ｎ．、およびＮａｔａｒａｊａｎ、Ｖ．（２００５）。Ｌｉｐｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−１  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄｉｎｄｕｃｅｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｒｅｌｅａｓｅ，ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３８５、４９３−５０２。
Ｚｗｉｃｋ、Ｍ．、Ｄａｖｉｓ、Ｂ．Ｍ．、Ｗｏｏｄｂｕｒｙ、Ｃ．Ｊ．、Ｂｕｒｋｅｔｔ、Ｊ．Ｎ．、Ｋｏｅｒｂｅｒ、Ｈ．Ｒ．、Ｓｉｍｐｓｏｎ、Ｊ．Ｆ．、およびＡｌｂｅｒｓ、Ｋ．Ｍ．（２００２）。Ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓ  ａ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ  Ｂ４−ｐｏｓｉｔｉｖｅ、ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｖａｎｉｌｌｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １−ｐｏｓｉｔｉｖｅ、ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２２、４０５７−  ４０６５。
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【０１５４】
本願明細書において開示された主題の様々な詳細は、本願明細書において開示された主題の範囲から逸脱することなく、変えることができることが理解されるだろう。さらに、前述の記載は、説明のみを目的とするものであり、制限する目的のためのものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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