(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イムノバインダーにおける特定の位置での置換のための１もしくはそれより多くのアミノ酸残基を割り出す方法であって：
ａ）サブタイプにより群分けされたＶH及び／又はＶLのアミノ酸配列の第一のデータベースを提供する工程であって、該ＶH及び／又はＶLのアミノ酸配列が生殖細胞系および／または成熟抗体のアミノ酸配列を含む、工程；
ｂ）サブタイプにより群分けされ、かつ少なくとも１つの所望の機能特性を有するものとして選択された、ＱＣアッセイから選択されたｓｃＦｖ  ＶH及び／又はＶLのアミノ酸配列の第二のデータベースを提供する工程；
ｃ）第一のデータベースのフレームワーク位置と第二のデータベースの相応のフレームワーク位置でのアミノ酸残基についてのアミノ酸頻度を決定する工程であって、各アミノ酸位置での各アミノ酸残基のアミノ酸頻度は、該アミノ酸位置での各アミノ酸残基の、特定のサブタイプの全ての分析された配列のパーセンテージとして決定される、工程；
ｄ）該アミノ酸残基を、（ｉ）該アミノ酸が１より大きい濃縮係数を有する場合に、イムノバインダーの相応のアミノ酸位置での置換のための好ましいアミノ酸残基として割り出し、又は（ｉｉ）該アミノ酸残基が１未満の濃縮係数を有する場合に、イムノバインダーの相応のアミノ酸位置で排除されるべきアミノ酸残基として割り出す工程であって、該濃縮係数が、該第二のデータベース内の残基の相対アミノ酸頻度の、該第一のデータベース内の相応の位置での残基の相対アミノ酸頻度に対する比率を決定することによって定量される、工程
を含む前記方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、工程ｄ）のアミノ酸残基が４〜６の濃縮係数を有する前記方法。
【請求項３】
請求項１から２までのいずれか１項に記載の方法において、第一のデータベースが、生殖細胞系のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列からなる前記方法。
【請求項４】
請求項１から２までのいずれか１項に記載の方法において、第一のデータベースが、成熟のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列からなる前記方法。
【請求項５】
請求項１又は４に記載の方法において、成熟のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列が、Ｋａｂａｔデータベース（ＫＤＢ）からの配列である前記方法。
【請求項６】
請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法において、第二のデータベースが、ＱＣアッセイから選択されたｓｃＦｖ抗体のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列からなる前記方法。
【請求項７】
請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法において、イムノバインダーが、ｓｃＦｖ抗体、全長免疫グロブリン、Ｆａｂフラグメント、Ｄａｂもしくはナノボディーである前記方法。
【請求項８】
請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法において、機能特性が、改善された安定性、改善された可溶性、非凝集、発現の改善、封入体精製工程に引き続く再フォールディング率における改善又は前記の改善の２もしくはそれより多くの組み合わせである前記方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法において、発現の改善が原核細胞において確認される前記方法。
【請求項１０】
請求項１から６及び８から９までのいずれか１項に記載の方法において、機能特性が抗原結合親和性における改善ではないことを条件とする前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００７年６月２５日に出願された"単鎖抗体の配列に基づくエンジニアリング及び最適化"というタイトルの米国仮出願第６０／９３７，１１２号に基づく優先権を主張する。本出願は、また、２００８年５月１２日に出願された"単鎖抗体の配列に基づくエンジニアリング及び最適化"というタイトルの米国仮出願第６１／０６９，０５７号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
抗体は、癌、自己免疫疾患及び他の疾病の処置における非常に有効かつ効果的な治療剤であることが実証されている。全長抗体は、一般に臨床的に使用されているが、一方で、抗体フラグメントの使用によりもたらされうる、高められた組織浸透性、Ｆｃ−エフェクター機能が存在しないことと他のエフェクター機能を付与する能力とを兼ね備えること、より短い生体内半減期に由来する全身性副作用の見込みが殆どないことなどの多くの利点がある。抗体フラグメントの薬物動力学的特性は、該フラグメントが、局所的な治療アプローチのために特に良好に適合されうることを示している。更に、抗体フラグメントは、ある一定の発現システムにおいては、全長抗体よりも生産が容易なことがある。
【０００３】
抗体フラグメントの１つの型は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）であり、該抗体は、リンカー配列を介して軽鎖可変ドメイン（ＶL）に結合された重鎖可変ドメイン（ＶH）から構成されている。このように、ｓｃＦｖは、全ての抗体定常ドメインを欠損しており、先の可変／定常ドメインのインターフェースのアミノ酸残基（インターフェース残基）は、溶媒曝露となる。ｓｃＦｖは、全長抗体（例えばＩｇＧ分子）から、確立された組み換え工学技術によって製造することができる。しかしながら、全長抗体のｓｃＦｖへの変換は、しばしば、該タンパク質の粗悪な安定性及び可溶性と、低い生産収率と、免疫原性の危険を生ずる高い凝集傾向をもたらす。
【０００４】
従って、ｓｃＦｖの可溶性及び安定性などの特性を改善する多くの試みがなされてきている。例えば、Ｎｉｅｂａ，Ｌ他（Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．（１９９７）１０：４３５−４４４）は、インターフェースの残基であることが知られている３つのアミノ酸残基を選択して、それらを突然変異させた。それらの突然変異によって、細菌中での突然変異されたｓｃＦｖのペリプラズム内発現の増加が観察されることに加えて、熱力学的安定性及び可溶性は大きく変化しないものの、熱的に誘発される凝集率の低下が観察された。ｓｃＦｖ内の特定のアミノ酸残基に対して部位特異的突然変異誘発を行った他の研究も報告されている（例えばＴａｎ，Ｐ．Ｈ．他（１９８８年）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７５：１４７３−１４８２；Ｗｏｅｒｎ，Ａ．及びＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．（１９９８年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７：１３１２０−１３１２７；Ｗｏｒｎ，Ａ．及びＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．（１９９９年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３８：８７３９−８７５０を参照のこと）。これらの様々な研究において、突然変異誘発のために選択されたアミノ酸残基は、ｓｃＦｖ構造内のそれらの既知の位置に基づき（例えば分子モデリング研究から）選択された。
【０００５】
別のアプローチでは、非常に発現に乏しいｓｃＦｖからの相補性決定領域（ＣＤＲ）が、好適な特性を有することが実証されたｓｃＦｖのフレームワーク領域に移植された（Ｊｕｎｇ，Ｓ．及びＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．（１９９７年）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：９５９−９６６）。得られたｓｃＦｖは、改善された可溶性発現及び熱力学的安定性を示した。
【０００６】
ｓｃＦｖにおける機能特性の改善のためのエンジニアリングにおける進展は、例えばＷｏｅｒｎ，Ａ．及びＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．（２００１年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０５：９８９−１０１０で論評されている。しかしながら、優れた機能特性を有するｓｃＦｖの合理的な設計を可能とする新たなアプローチ、特にエンジニアリングのために潜在的に問題のあるアミノ酸残基の選択において専門家を補助するアプローチは、依然として必要とされている。
【０００７】
発明の概要
本発明は、安定性及び／又は可溶性について潜在的に問題のあるｓｃＦｖ配列内のアミノ酸残基の割り出しを、配列に基づく分析を使用して可能にする方法を提供する。更に、本発明の方法により割り出されたアミノ酸残基は、突然変異のために選択することができ、かつ突然変異されたエンジニアリングされたｓｃＦｖを製造し、それを安定性及び／又は可溶性などの改善された機能特性についてスクリーニングすることができる。特に好ましい一実施態様において、本発明は、機能的に選択されたｓｃＦｖのデータベースを使用して、生殖細胞系の及び／又は成熟の抗体免疫グロブリン配列における相応の位置よりも変動性に許容性が高いか低いかのいずれかのアミノ酸残基位置を割り出す方法を提供し、これにより、斯かる割り出された残基位置は、安定性及び／又は可溶性などのｓｃＦｖ機能性を改善するようにエンジニアリングするために適している可能性があることが示される。このように、本発明は、機能的に選択されたｓｃＦｖ配列のデータベースの使用の使用に基づいて、"機能的コンセンサス"アプローチの利点を提供し、かつ実証している。
【０００８】
更に他の好ましい実施態様においては、本発明は、イムノバインダーにおける関連のアミノ酸位置（例えば、少なくとも１つの望ましい特性を有するｓｃＦｖ配列のデータベース、例えばＱＣアッセイで選択されたデータベースと、成熟抗体配列のデータベース、例えばＫａｂａｔデータベースとの比較によって割り出されたアミノ酸位置）で置換されるべき好ましいアミノ酸残基（又は選択的に、排除されるべきアミノ酸残基）を割り出すための方法を提供する。このように、本発明は、更に、特定のアミノ酸残基を選択するための"濃縮／排除"方法を提供する。更になおも、本発明は、本願に記載される"機能的コンセンサス"アプローチを使用して割り出された特定のフレームワークアミノ酸位置を突然変異させることによる、イムノバインダー（例えばｓｃＦｖ、全長免疫グロブリン、Ｆａｂフラグメント、単独ドメイン抗体（例えばＤａｂ）及びナノボディー）のエンジニアリングの方法を提供する。好ましい実施態様においては、フレームワークアミノ酸位置は、存在するアミノ酸残基を、本願に記載される"濃縮／排除"分析法を使用して"濃縮された"残基であると見出された残基によって置換することによって突然変異される。
【０００９】
一態様では、本発明は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）であって該ｓｃＦｖがＶH及びＶLアミノ酸配列を有するものにおける突然変異のためのアミノ酸位置を割り出す方法において、
ａ）ｓｃＦｖのＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列を、多数の抗体のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列を含むデータベースに入力して、該ｓｃＦｖのＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列とデータベースの該抗体のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列とをアラインメントさせることと、
ｂ）ｓｃＦｖのＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内のアミノ酸位置と、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸内の相応の位置とを比較することと、
ｃ）該ｓｃＦｖのＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内のアミノ酸位置が、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置で保存されているアミノ酸残基によって占められているかどうかを調べることと、
ｄ）該アミノ酸位置が、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸内の相応の位置で保存されていないアミノ酸残基によって占められている場合に、該ｓｃＦｖのＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内のアミノ酸位置を、突然変異のためのアミノ酸位置として割り出すことと
を含む方法を提供する。
【００１０】
本発明の方法は、更に、ｓｃＦｖのＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の突然変異のために割り出されたアミノ酸位置を突然変異させることを含んでよい。例えば、突然変異について割り出されたアミノ酸位置は、データベースの抗体のＶHもしくはＶL内の相応の位置で保存されているアミノ酸残基で置換することができる。加えて又は代わりに、突然変異について割り出されたアミノ酸位置を無作為なもしくは指向的な突然変異誘発によって突然変異させて、突然変異されたｓｃＦｖのライブラリーを作製し、引き続き前記の突然変異されたｓｃＦｖのライブラリーをスクリーニングし、そして少なくとも１つの改善された機能特性を有するｓｃＦｖを選択する（例えば、酵母クオリティー・コントロールシステム（ＱＣシステム）を使用するライブラリーのスクリーニングによって）ことができる。
【００１１】
様々な種類のデータベースを本発明の方法で使用できる。例えば、一実施態様においては、データベースの抗体のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列は、生殖細胞系の抗体のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列である。もう一つの実施態様においては、データベースの抗体のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列は、再配置され親和性成熟した抗体のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列である。更にもう一つの特に好ましい実施態様においては、データベースの抗体のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列は、少なくとも１種の所望の機能特性（例えばｓｃＦｖ安定性もしくはｓｃＦｖ可溶性）を有するように選択されたｓｃＦｖ抗体のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列である。更にもう一つの実施態様においては、１つより多くのデータベースを比較目的のために使用することができる。例えば、特に好ましい一実施態様においては、少なくとも１種の所望の機能特性を有するように選択されたｓｃＦｖのデータベース、並びに１もしくはそれより多くの生殖細胞系データベース又は再配置され親和性成熟した抗体データベースが使用され、その際、ｓｃＦｖデータベースからの配列比較結果は、他のデータベースからの結果と比較される。
【００１２】
本発明の方法を使用して、例えばｓｃＦｖのＶH領域、ｓｃＦｖのＶL領域又はその両方を分析することができる。
【００１３】
本発明の方法を使用して関連のｓｃＦｖ内の関連の単独のアミノ酸位置を分析できるが、一方で、より好ましくは、該方法を使用して、ｓｃＦｖ配列に沿った多重のアミノ酸位置が分析される。このように、好ましい一実施態様においては、前記方法の工程ｂ）では、ｓｃＦｖのＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の多重のアミノ酸位置は、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置と比較される。例えば、好ましい一実施態様において、ｓｃＦｖのＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列内の各フレームワーク位置は、データベースの抗体のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列内のそれぞれの相応のフレームワーク位置で比較される。加えて又は代わりに、ｓｃＦｖの１もしくはそれより多くのＣＤＲ内の１もしくはそれより多くの位置を分析することができる。更にもう一つの実施態様においては、ｓｃＦｖのＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列内のそれぞれのアミノ酸位置は、データベースの抗体のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列内のそれぞれの相応のアミノ酸位置と比較される。
【００１４】
データベースの配列のうち"保存"されているアミノ酸位置は、１もしくはそれより多くの特定の型のアミノ酸残基によって占められていてよい。例えば、一実施態様においては、"保存"されている位置は、その位置で非常に高い頻度で生ずる１つの特定のアミノ酸残基によって占められている。すなわち、該方法の工程ｃ）で、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置で保存されるアミノ酸残基は、該データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内のその位置に最も頻度の高いアミノ酸残基もしくは最も高く濃縮されているアミノ酸残基である。この状況では、エンジニアリングされたｓｃＦｖを作製するためには、突然変異について割り出されたアミノ酸位置は、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置で最も頻繁に確認されるアミノ酸残基もしくは最も高く濃縮されているアミノ酸残基で置換されていてよい。もう一つの実施態様においては、データベースの配列のうち"保存"されているアミノ酸位置は、例えば、（ｉ）疎水性アミノ酸残基、（ｉｉ）親水性アミノ酸残基、（ｉｉｉ）水素結合を形成できるアミノ酸残基又は（ｉｖ）β−シートを形成する性向を有するアミノ酸残基によって占められていてよい。すなわち、該方法の工程ｃ）で、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置は、（ｉ）疎水性アミノ酸残基、（ｉｉ）親水性アミノ酸残基、（ｉｉｉ）水素結合を形成できるアミノ酸残基又は（ｉｖ）β−シートを形成する性向を有するアミノ酸残基で保存される。
【００１５】
従って、エンジニアリングされたｓｃＦｖを作製するためには、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置が疎水性アミノ酸残基で保存されている場合には、ｓｃＦｖ内で突然変異のために割り出されたアミノ酸位置は、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置で最も最も頻出する疎水性アミノ酸残基で置換されていてよい。加えて又は代わりに、ｓｃＦｖ内の突然変異について割り出されたアミノ酸位置を、ｓｃＦｖ内のその位置で最適であると選択された疎水性アミノ酸残基（例えば分子モデリング研究を基礎としてｓｃＦｖの構造と機能を最も維持しそうな疎水性残基）で置換されていてよい。加えて又は代わりに、ｓｃＦｖ内の突然変異について割り出されたアミノ酸位置は、エンジニアリングされたｓｃＦｖのライブラリーの作製のために部位特異的突然変異誘発を介して１パネルの疎水性アミノ酸残基で置換されていてよく、かつ最も好ましい置換は、所望の機能特性についてライブラリーをスクリーニングする（例えば酵母ＱＣシステムで）ことによって選択することができる。
【００１６】
更に、エンジニアリングされたｓｃＦｖを作製するためには、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置が親水性アミノ酸残基で保存されている場合には、ｓｃＦｖ内で突然変異のために割り出されたアミノ酸位置は、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置で最も最も頻出する親水性アミノ酸残基で置換されていてよい。加えて又は代わりに、ｓｃＦｖ内の突然変異について割り出されたアミノ酸位置を、ｓｃＦｖ内のその位置で最適であると選択された親水性アミノ酸残基（例えば分子モデリング研究を基礎としてｓｃＦｖの構造と機能を最も維持しそうな親水性残基）で置換されていてよい。加えて又は代わりに、ｓｃＦｖ内の突然変異について割り出されたアミノ酸位置は、エンジニアリングされたｓｃＦｖのライブラリーの作製のために部位特異的突然変異誘発を介して１パネルの親水性アミノ酸残基で置換されていてよく、かつ最も好ましい置換は、所望の機能特性についてライブラリーをスクリーニングする（例えば酵母ＱＣシステムで）ことによって選択することができる。
【００１７】
なおも更に、エンジニアリングされたｓｃＦｖを作製するためには、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置が水素結合を形成しうるアミノ酸残基で保存されている場合には、ｓｃＦｖ内で突然変異のために割り出されたアミノ酸位置は、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置で最も最も頻出する水素結合を形成しうるアミノ酸残基で置換されていてよい。加えて又は代わりに、ｓｃＦｖ内の突然変異について割り出されたアミノ酸位置を、ｓｃＦｖ内のその位置で最適であると選択された水素結合を形成しうるアミノ酸残基（例えば分子モデリング研究を基礎としてｓｃＦｖの構造と機能を最も維持しそうな残基）で置換されていてよい。加えて又は代わりに、ｓｃＦｖ内の突然変異について割り出されたアミノ酸位置は、エンジニアリングされたｓｃＦｖのライブラリーの作製のために部位特異的突然変異誘発を介して１パネルの水素結合を形成しうるアミノ酸残基で置換されていてよく、かつ最も好ましい置換は、所望の機能特性についてライブラリーをスクリーニングする（例えば酵母ＱＣシステムで）ことによって選択することができる。
【００１８】
なおも更に、エンジニアリングされたｓｃＦｖを作製するためには、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置がβ−シートを形成する性向を有するアミノ酸残基で保存されている場合には、ｓｃＦｖ内で突然変異のために割り出されたアミノ酸位置は、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置で最も最も頻出するβ−シートを形成する性向を有するアミノ酸残基で置換されていてよい。加えて又は代わりに、ｓｃＦｖ内の突然変異について割り出されたアミノ酸位置を、ｓｃＦｖ内のその位置で最適であると選択されたβ−シートを形成する性向を有するアミノ酸残基（例えば分子モデリング研究を基礎としてｓｃＦｖの構造と機能を最も維持しそうな残基）で置換されていてよい。加えて又は代わりに、ｓｃＦｖ内の突然変異について割り出されたアミノ酸位置は、エンジニアリングされたｓｃＦｖのライブラリーの作製のために部位特異的突然変異誘発を介して１パネルのβ−シートを形成する性向を有するアミノ酸残基で置換されていてよく、かつ最も好ましい置換は、所望の機能特性についてライブラリーをスクリーニングする（例えば酵母ＱＣシステムで）ことによって選択することができる。
【００１９】
もう一つの実施態様においては、ｓｃＦｖにおける突然変異のためのアミノ酸位置を割り出すための本発明の方法は、ｓｃＦｖ抗体のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列と高い類似性を有するこれらの抗体のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列のみがデータベース中に含まれる制約されたデータベースであるデータベースを用いて実施することができる。
【００２０】
好ましい一実施態様においては、分析されるアミノ酸位置（すなわちデータベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の"相応の位置"）の保存を定量化するために、アミノ酸位置に、シンプソンの指数を使用して保存の度合いが割り当てられる。
【００２１】
本発明の方法は、また、ｓｃＦｖ配列内のアミノ酸位置のペアを決定するために使用でき、これらの共変ペア位置の一方もしくは両方を突然変異のために割り出すことができるように互いに共変することができるアミノ酸位置を割り出すために使用することもできる。このように、もう一つの実施態様においては、本発明は、以下の工程：
ａ）データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列に対して共分散分析を行って、アミノ酸位置の共変ペアを割り出す工程；
ｂ）アミノ酸位置の共変ペアと、ｓｃＦｖのＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置とを比較する工程；
ｃ）前記のｓｃＦｖのＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置が、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内のアミノ酸位置の共変ペアで保存されるアミノ酸残基によって占められているかどうかを決定する工程；及び
ｄ）前記のｓｃＦｖのＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置の一方もしくは両方を、ｓｃＦｖ内の相応の位置の一方もしくは両方が、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内のアミノ酸位置の共変ペアで保存されていないアミノ酸残基によって占められている場合に、突然変異のためのアミノ酸位置として割り出す工程
を含む方法を提供する。
【００２２】
この共分散分析は、個々のアミノ酸位置の分析と組み合わせることができ、こうして、工程ａ）〜ｄ）を有する前記のｓｃＦｖにおける突然変異のためのアミノ酸位置を割り出す方法は、更に以下の工程：
ｅ）データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列に対して共分散分析を行って、アミノ酸位置の共変ペアを割り出す工程；
ｆ）アミノ酸位置の共変ペアと、ｓｃＦｖのＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置とを比較する工程；
ｇ）前記のｓｃＦｖのＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置が、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内のアミノ酸位置の共変ペアで保存されるアミノ酸残基によって占められているかどうかを決定する工程；及び
ｈ）前記のｓｃＦｖのＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置の一方もしくは両方を、ｓｃＦｖ内の相応の位置の一方もしくは両方が、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内のアミノ酸位置の共変ペアで保存されていないアミノ酸残基によって占められている場合に、突然変異のためのアミノ酸位置として割り出す工程
を含むことができる。
【００２３】
共変分析法は、単独の共変ペアに適用でき、又は選択的にアミノ酸位置の多重の共変ペアを、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内で割り出すことができ、かつｓｃＦｖのＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置と比較することができる。
【００２４】
該方法は、更に、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内のアミノ酸位置の共変ペアで保存されていないアミノ酸残基によって占められているｓｃＦｖ内の一方もしくは両方の相応の位置を突然変異することを含みうる。例えば、一実施態様において、アミノ酸位置の共変ペアで保存されていないアミノ酸残基によって占められているｓｃＦｖ内の相応の位置の一方は、アミノ酸位置の共変ペアで最も頻出するアミノ酸残基で置換される。もう一つの実施態様において、アミノ酸位置の共変ペアで保存されていないアミノ酸残基によって占められているｓｃＦｖ内の相応の位置の両方は、アミノ酸位置の共変ペアで最も頻出するアミノ酸残基で置換される。
【００２５】
ｓｃＦｖ配列での突然変異のためのアミノ酸位置の割り出しのための本発明の配列に基づく方法は、ｓｃＦｖの構造分析を可能にする他の方法と組み合わせることができる。例えば、一実施態様において、該配列に基づく方法は、ｓｃＦｖの構造を更に分析するために、分子モデリング法と組み合わせることができる。このように、一実施態様においては、工程ａ）〜ｄ）を有する前記の方法は、更に、以下の工程、例えば：
ｅ）ｓｃＦｖのＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列を分子モデリングに供する工程；及び
ｆ）突然変異のための、ｓｃＦｖのＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列内の少なくとも１つの付加的なアミノ酸位置を割り出す工程
を含んでよい。この方法は、更に、分子モデリングによって突然変異のために割り出されたｓｃＦｖのＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列内の少なくとも１つの付加的なアミノ酸位置を突然変異することを含む。
【００２６】
もう一つの態様においては、本発明は、本発明の方法により製造されたｓｃＦｖ組成物であって、突然変異のために割り出された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置で１もしくはそれより多くの突然変異がなされているｓｃＦｖ組成物に関する。医薬品製剤であって、一般にｓｃＦｖ組成物と製剤学的に認容性の担体とを含む製剤も提供される。
【００２７】
更にもう一つの態様においては、本発明は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）であって該ｓｃＦｖがＶH及びＶLのアミノ酸配列を有するものにおける突然変異のために１もしくはそれより多くのフレームワークアミノ酸位置を割り出す方法において：
ａ）ＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列の第一のデータベースを提供すること；
ｂ）少なくとも１つの所望の機能的特性を有するものとして選択されたｓｃＦｖ抗体のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列の第二のデータベースを提供すること；
ｃ）第一のデータベースの各フレームワーク位置と第二のデータベースの各フレームワーク位置でのアミノ酸変動性を決定すること；
ｄ）アミノ酸の変動性の度合いが第一のデータベースと第二のデータベースとの間で異なる１もしくはそれより多くのフレームワーク位置を割り出すことで、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）における突然変異のための１もしくはそれより多くのフレームワークアミノ酸位置を割り出すこと
を含む方法を提供する。
【００２８】
好ましくは、各フレームワーク位置でのアミノ酸変動性は、シンプソンの指数を使用した保存の度合いの割り当てによって決定される。一実施態様においては、１もしくはそれより多くのフレームワークアミノ酸位置は、第一のデータベースと比較した場合により低いシンプソンの指数値（ＳＩ）を第二のデータベース中で有する１もしくはそれより多くのフレームワークアミノ酸位置に基づいて突然変異のために割り出される。もう一つの実施態様においては、１もしくはそれより多くのフレームワークアミノ酸位置は、第一のデータベース（例えば生殖細胞系データベース）と比較した場合により高いシンプソンの指数値を第二のデータベース中で有する１もしくはそれより多くのフレームワークアミノ酸位置に基づいて突然変異のために割り出される。好ましい一実施態様においては、第二のデータベース（例えばＱＣデータベース）のアミノ酸位置は、第一のデータベース（例えばＫａｂａｔデータベース）における相応のアミノ酸位置のＳＩ値よりも、少なくとも０．０１小さいＳＩ値を有し、より好ましくは０．０５（例えば０．０６、０．０７、０．０８、０．０９もしくは０．１）小さいＳＩ値を有する。より好ましい実施態様においては、第二のデータベースのアミノ酸位置は、第一のデータベースにおける相応のアミノ酸位置のＳＩ値よりも、少なくとも０．１小さい（例えば０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５もしくは０．５小さい）ＳＩ値を有する。
【００２９】
もう一つの実施態様においては、本発明は、イムノバインダーにおいて置換のために好ましいアミノ酸残基を割り出す方法であって：
ａ）群分けされたＶHもしくはＶLのアミノ酸配列（例えばＫａｂａｔファミリーサブタイプにより群分けされた生殖細胞系及び／又は成熟抗体の配列）の第一のデータベースを提供すること；
ｂ）少なくとも１つの所望の機能特性を有するものとして（例えばＱＣアッセイにより）選択された群分けされたｓｃＦｖ抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列の第二のデータベースを提供すること；
ｃ）第一のデータベースのフレームワーク位置と第二のデータベースの相応のフレームワーク位置とでのアミノ酸残基についてのアミノ酸頻度を決定すること；
ｄ）該アミノ酸を、そのアミノ酸残基が第一のデータベースに対してより高い頻度で第二のデータベースに出現する場合に、イムノバインダーの相応のアミノ酸位置での置換のために好ましいアミノ酸残基（すなわち、濃縮された残基）として割り出すこと
を含む方法を提供する。
【００３０】
更にもう一つの態様においては、本発明は、イムノバインダーから排除されるべきアミノ酸残基を割り出す方法であって：
ａ）群分けされたＶHもしくはＶLのアミノ酸配列（例えばＫａｂａｔファミリーサブタイプにより群分けされた生殖細胞系及び／又は成熟抗体の配列）の第一のデータベースを提供すること；
ｂ）少なくとも１つの所望の機能特性を有するものとして（例えばＱＣアッセイにより）選択された群分けされたｓｃＦｖ抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列の第二のデータベースを提供すること；
ｃ）第一のデータベースのフレームワーク位置と第二のデータベースの相応のフレームワーク位置とでのアミノ酸残基についてのアミノ酸頻度を決定すること；
ｄ）該アミノ酸を、そのアミノ酸残基が第一のデータベースに対してより低い頻度で第二のデータベースに出現する場合に、イムノバインダーの相応のアミノ酸位置での置換のために好ましくないアミノ酸残基として割り出すこと（その際、前記のアミノ酸残基の種類は好ましくないアミノ酸残基（すなわち排除された残基）である）
を含む方法を提供する。ある特定の好ましい実施態様においては、好ましくないアミノ酸残基は、濃縮係数（ＥＦ）が１未満である場合に割り出される。
【００３１】
ある特定の実施態様においては、第一のデータベースは、生殖細胞系のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列を含む。他の実施態様においては、第一のデータベースは、生殖細胞系のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列からなる。更にもう一つの実施態様においては、第一のデータベースは、成熟のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列を含む。もう一つの実施態様においては、第一のデータベースは、成熟のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列からなる。例示的な一実施態様においては、成熟のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列は、Ｋａｂａｔデータベース（ＫＤＢ）からである。
【００３２】
ある特定の実施態様においては、第二のデータベースは、ＱＣアッセイから選択された、ｓｃＦｖ抗体のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列を含む。もう一つの実施態様においては、第二のデータベースは、ＱＣアッセイから選択された、ｓｃＦｖ抗体のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列からなる。
【００３３】
一実施態様においては、望ましい機能特性は、改善された安定性である。もう一つの実施態様においては、望ましい機能特性は、改善された可溶性である。更にもう一つの実施態様において、望ましい機能特性は非凝集である。なおももう一つの実施態様において、望ましい機能特性は発現での改善（例えば原核細胞において）である。更にもう一つの実施態様において、機能特性は、封入体精製工程に引き続く再フォールディング率における改善である。一定の実施態様において、望ましい機能特性は、抗原結合親和性の改善ではない。もう一つの実施態様においては、１もしくはそれより多くの所望の機能の組合せが達成される。
【００３４】
なおもう一つの態様において、本発明は、イムノバインダーのエンジニアリング方法において：
ａ）該イムノバインダー内で突然変異のための１もしくはそれより多くのアミノ酸位置を選択すること；及び
ｂ）突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置を突然変異させること
を含み、
突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置が重鎖アミノ酸位置である場合に、前記のアミノ酸位置は、ＡＨｏナンバリングを使用した位置１、６、７、１０、１２、１３、１４、１９、２０、２１、４５、４７、５０、５５、７７、７８、８２、８６、８７、８９、９０、９２、９５、９８、１０３及び１０７（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、６、７、９、１１、１２、１３、１８、１９、２０、３８、４０、４３、４８、６６、６７、７１、７５、７６、７８、７９、８１、８２ｂ、８４、８９及び９３）からなる群から選択され、かつ
突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置が軽鎖アミノ酸位置である場合に、前記のアミノ酸位置は、ＡＨｏナンバリングを使用した位置１、２、３、４、７、１０、１１、１２、１４、１８、２０、２４、４６、４７、５０、５３、５６、５７、７４、８２、９１、９２、９４、１０１及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、２、３、４、７、１０、１１、１２、１４、１８、２０、２４、３８、３９、４２、４５、４８、４９、５８、６６、７３、７４、７６、８３及び８５）からなる群から選択される前記方法を提供する。
【００３５】
一実施態様においては、本発明は、イムノバインダーをエンジニアリングする方法であって：
ａ）突然変異のためにイムノバインダー内の１もしくはそれより多くのアミノ酸位置を選択すること；及び
ｂ）突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置を突然変異させること
を含み、その際、前記突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置は、
（ｉ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ３のアミノ酸位置１、６、７、８９及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、６、７、７８及び８９）；
（ｉｉ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ１ａのアミノ酸位置１、６、１２、１３、１４、１９、２１、９０、９２、９５及び９８（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、６、１１、１２、１３、１８、２０、７９、８１、８２ｂ及び８４）；
（ｉｉｉ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ１ｂのアミノ酸位置１、１０、１２、１３、１４、２０、２１、４５、４７、５０、５５、７７、７８、８２、８６、８７及び１０７（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、９、１１、１２、１３、１９、２０、３８、４０、４３、４８、６６、６７、７１、７５、７６及び９３）；
（ｉｖ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶκ１のアミノ酸位置１、３、４、２４、４７、５０、５７、９１及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、３、４、２４、３９、４２、４９、７３及び８５）；
（ｖ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶκ３のアミノ酸位置２、３、１０、１２、１８、２０、５６、７４、９４、１０１及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置２、３、１０、１２、１８、２０、４８、５８、７６、８３及び８５）；及び
（ｖｉ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶλ１のアミノ酸位置１、２、４、７、１１、１４、４６、５３、８２、９２及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、２、４、７、１１、１４、３８、４５、６６、７４及び８５）
からなる群から選択される前記方法を提供する。
【００３６】
もう一つの実施態様においては、前記突然変異は、更に、ＡＨｏナンバリングを使用したアミノ酸位置１２、１３及び１４４（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１２、８５及び１０３）からなる群から選択される重鎖アミノ酸位置の１もしくはそれより多くの（好ましくは全ての）鎖置換を含む。
【００３７】
ある特定の好ましい実施態様においては、突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置は、少なくとも１つの望ましい機能特性を有するとして（例えば酵母ＱＣシステムにおいて）選択された抗体配列における相応のアミノ酸位置で見出されたアミノ酸残基へと突然変異される。更に他の実施態様においては、突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置は、本発明の濃縮／排除分析の方法論に従って割り出されたアミノ酸残基（例えば"濃縮されたアミノ酸残基"）へと突然変異される。
【００３８】
好ましくは、イムノバインダーはｓｃＦｖであるが、他のイムノバインダー、例えば全長免疫グロブリン及び他の抗体フラグメント（例えばＦａｂもしくはＤａｂ）も、該方法に従ってエンジニアリングすることができる。本発明は、また、当該エンジニアリング方法に従って製造されたイムノバインダー並びに該イムノバインダーと製剤学的に認容性の担体とを含む組成物を包含する。
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
イムノバインダーにおける特定の位置での置換のための１もしくはそれより多くのアミノ酸残基を割り出す方法であって：
ａ）サブタイプにより群分けされたＶH及び／又はＶLのアミノ酸配列の第一のデータベースを提供する工程；
ｂ）サブタイプにより群分けされ、かつ少なくとも１つの所望の機能特性を有するものとして選択されたＶH及び／又はＶLのアミノ酸配列の第二のデータベースを提供する工程；
ｃ）第一のデータベースのフレームワーク位置と第二のデータベースの相応のフレームワーク位置でのアミノ酸残基についてのアミノ酸頻度を決定する工程；
ｄ）該アミノ酸残基を、（ｉ）該アミノ酸が１より大きい濃縮係数を有する場合に、イムノバインダーの相応のアミノ酸位置での置換のための好ましいアミノ酸残基として割り出し、又は（ｉｉ）該アミノ酸残基が１未満の濃縮係数を有する場合に、イムノバインダーの相応のアミノ酸位置で排除されるべきアミノ酸残基として割り出す工程
を含む前記方法。
（項目２）
項目１に記載の方法において、工程ｄ）のアミノ酸残基が４〜６の濃縮係数を有する前記方法。
（項目３）
項目１又は２に記載の方法において、第一のデータベースが、生殖細胞系のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列を含む前記方法。
（項目４）
項目１から３までのいずれか１項に記載の方法において、第一のデータベースが、生殖細胞系のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列からなる前記方法。
（項目５）
項目１から４までのいずれか１項に記載の方法において、第一のデータベースが、成熟のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列を含む前記方法。
（項目６）
項目１から５までのいずれか１項に記載の方法において、第一のデータベースが、成熟のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列からなる前記方法。
（項目７）
項目５又は６に記載の方法において、成熟のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列が、Ｋａｂａｔデータベース（ＫＤＢ）からの配列である前記方法。
（項目８）
項目１から７までのいずれか１項に記載の方法において、第二のデータベースが、ＱＣアッセイから選択されたｓｃＦｖ抗体のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列を含む前記方法。
（項目９）
項目１から７までのいずれか１項に記載の方法において、第二のデータベースが、ＱＣアッセイから選択されたｓｃＦｖ抗体のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列からなる前記方法。
（項目１０）
ＶH及び／又はＶLのアミノ酸配列を有するイムノバインダーを改善する方法であって：
ａ）突然変異のための１もしくはそれより多くのフレームワークアミノ酸位置を割り出す工程；
ｂ）工程ａ）で割り出されたそれぞれの特定のフレームワーク位置について、置換のために好ましいアミノ酸残基を割り出す工程；及び
ｃ）それぞれの特定のフレームワーク位置のアミノ酸残基を、工程ｂ）で割り出された好ましいアミノ酸残基へと突然変異させる工程
を含む前記方法。
（項目１１）
項目１０に記載の方法において、工程ａ）を、所定のフレームワーク位置での変動性の度合いを決定することによって実施する前記方法。
（項目１２）
項目１０又は１１に記載の方法において、工程ａ）を、保存の度合いをシンプソンの指数を使用して各フレームワーク位置に割り当てることによって実施する前記方法。
（項目１３）
項目１０から１２までのいずれか１項に記載の方法において、工程ｂ）の好ましいアミノ酸残基を、項目１から９までのいずれか１項に記載の方法により割り出す前記方法。
（項目１４）
重鎖可変領域もしくはそのフラグメント及び／又は軽鎖可変領域もしくはそのフラグメントを含むイムノバインダーの機能特性を改善するための方法であって：
ａ）該イムノバインダー内で突然変異のための１もしくはそれより多くのアミノ酸位置を選択すること；及び
ｂ）突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置を突然変異させること
を含み、
突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置が重鎖アミノ酸位置である場合に、前記のアミノ酸位置は、ＡＨｏナンバリングを使用した位置１、６、７、１０、１２、１３、１４、１９、２０、２１、４５、４７、５０、５５、７７、７８、８２、８６、８７、８９、９０、９２、９５、９８、１０３及び１０７（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、６、７、９、１１、１２、１３、１８、１９、２０、３８、４０、４３、４８、６６、６７、７１、７５、７６、７８、７９、８１、８２ｂ、８４、８９及び９３）からなる群から選択され、かつ
突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置が軽鎖アミノ酸位置である場合に、前記のアミノ酸位置は、ＡＨｏナンバリングを使用した位置１、２、３、４、７、１０、１１、１２、１４、１８、２０、２４、４６、４７、５０、５３、５６、５７、７４、８２、９１、９２、９４、１０１及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、２、３、４、７、１０、１１、１２、１４、１８、２０、２４、３８、３９、４２、４５、４８、４９、５８、６６、７３、７４、７６、８３及び８５）からなる群から選択される前記方法。
（項目１５）
項目１４に記載の方法において、イムノバインダーが、ＶＨ３重鎖可変領域を含み、かつ突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置が、ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ３のアミノ酸位置１、６、７、８９及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、６、７、７８及び８９）からなる群から選択される前記方法。
（項目１６）
項目１４に記載の方法において、イムノバインダーがＶＨ１ａ重鎖可変領域を含み、かつ突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置が、ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ１ａのアミノ酸位置１、６、１２、１３、１４、１９、２１、９０、９２、９５及び９８（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、６、１１、１２、１３、１８、２０、７９、８１、８２ｂ及び８４）からなる群から選択される前記方法。
（項目１７）
項目１４に記載の方法において、イムノバインダーがＶＨ１ｂ重鎖可変領域を含み、かつ突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置が、ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ１ｂのアミノ酸位置１、１０、１２、１３、１４、２０、２１、４５、４７、５０、５５、７７、７８、８２、８６、８７及び１０７（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、９、１１、１２、１３、１９、２０、３８、４０、４３、４８、６６、６７、７１、７５、７６及び９３）からなる群から選択される前記方法。
（項目１８）
項目１４に記載の方法において、イムノバインダーがＶκ１軽鎖可変領域を含み、かつ突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置は、ＡＨｏナンバリングを使用したＶκ１のアミノ酸位置１、３、４、２４、４７、５０、５７、９１及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、３、４、２４、３９、４２、４９、７３及び８５）からなる群から選択される前記方法。
（項目１９）
項目１４に記載の方法において、イムノバインダーがＶκ３軽鎖可変領域を含み、かつ突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置が、ＡＨｏナンバリングを使用したＶκ３のアミノ酸位置２、３、１０、１２、１８、２０、５６、７４、９４、１０１及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置２、３、１０、１２、１８、２０、４８、５８、７６、８３及び８５）からなる群から選択される前記方法。
（項目２０）
項目１４に記載の方法において、突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置が、ＡＨｏナンバリングを使用したＶλ１のアミノ酸位置１、２、４、７、１１、１４、４６、５３、８２、９２及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、２、４、７、１１、１４、３８、４５、６６、７４及び８５）からなる群から選択される前記方法。
（項目２１）
項目１４から２０までのいずれか１項に記載の方法において、突然変異が、更に、ＡＨｏナンバリングを使用したアミノ酸位置１２、１３及び１４４（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１２、８５及び１０３）からなる群から選択される重鎖アミノ酸位置の１もしくはそれより多くの（好ましくは全ての）鎖置換を含む前記方法。
（項目２２）
項目１４から２１までのいずれか１項に記載の方法において、突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置を、ＱＣアッセイから選択された抗体配列における相応のアミノ酸位置で見出されたアミノ酸残基へと突然変異させる前記方法。
（項目２３）
項目１４から２２までのいずれか１項に記載の方法において、突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置を、項目１から９までのいずれか１項に記載の方法により割り出されるアミノ酸残基へと突然変異させる前記方法。
（項目２４）
項目１から２３までのいずれか１項に記載の方法において、イムノバインダーが、ｓｃＦｖ抗体、全長免疫グロブリン、Ｆａｂフラグメント、Ｄａｂもしくはナノボディーである前記方法。
（項目２５）
項目１から９又は項目１４から２４までのいずれか１項に記載の方法において、機能特性が、改善された安定性、改善された可溶性、非凝集、発現の改善、封入体精製工程に引き続く再フォールディング率における改善又は前記の改善の２もしくはそれより多くの組み合わせである前記方法。
（項目２６）
項目２５に記載の方法において、発現の改善が原核細胞において確認される前記方法。
（項目２７）
項目１から９及び２５から２６までのいずれか１項に記載の方法において、機能特性が抗原結合親和性における改善ではないことを条件とする前記方法。
（項目２８）
項目１から２７までのいずれか１項に記載の方法により製造されたイムノバインダー。
（項目２９）
項目２８に記載のイムノバインダーと、製剤学的に認容性の担体とを含む組成物。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、本発明の方法によるｓｃＦｖの一般的な配列に基づく分析の概要を示すフローチャート図である。
【図２】図２は、ｓｃＦｖの配列に基づく分析に関する例示的な多工程法のフローチャート図である。
【図３】図３は、酵母における安定で可溶性のｓｃＦｖの選択のための例示的なクオリティー・コントロール（ＱＣ）システムの概略図である。
【図４】図４は、もう一つの例示的なクオリティー・コントロール（ＱＣ）システムの概略図である。
【図５】図５は、体細胞突然変異の前の本来の生殖細胞系の配列内の特定のフレームワーク（ＦＷ）位置での変動性と、ＱＣシステムで選択された体細胞突然変異の後の成熟抗体の配列内の相応するＦＷ位置での変動性の分析の概略図である。
【図６】図６は、２５〜９５℃の温度範囲での熱誘発ストレス後にＥＳＢＡ１０５変異体について観察された変性プロフィールを示している。
【図７】図７は、コンセンサス逆突然変異（Ｓ−２、Ｄ−２、Ｄ−３）、アラニンへの突然変異（Ｄ−１）もしくはＱＣ残基（ＱＣ７．１、ＱＣ１１．２、ＱＣ１５．２、ＱＣ２３．２）のいずれかを含む一組のＥＳＢＡ１０５変異体についての熱安定性の比較を示している。
【図８】図８は、２５〜９５℃の温度範囲での熱誘発ストレス後にＥＳＢＡ２１２変異体について観察された変性プロフィールを示している。
【図９】図９は、野生型ＥＳＢＡ１０５及びその可溶性変異体のＰＥＧ沈殿可溶性曲線を示している。
【図１０】図１０は、広い温度範囲（２５〜９６℃）での熱負荷後に測定された、野生型ＥＳＢＡ１０５及びその可溶性変異体についての熱変性プロフィールを示している。
【図１１】図１１は、熱ストレスの条件下で２週間インキュベートした後の、様々なＥＳＢＡ１０５可溶性突然変異体の分解挙動を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。
【００４０】
以下の発明の詳細な説明を考慮することで、本発明はより良好に理解され、かつ前記に示されるもの以外の対象物も明らかになる。斯かる説明は、付随する図面について言及している：
図１は、本発明の方法によるｓｃＦｖの一般的な配列に基づく分析の概要を示すフローチャート図である。
【００４１】
第一工程において、可溶性及び安定性を改善させるべきｓｃＦｖの配列を提供し（ボックス１）、引き続き該配列を、抗体配列データベース（ボックス２）、例えばオープンソースの生殖細胞系の配列データベース（例えばＶｂａｓｅ、ＩＭＧＴ；ボックス３）、オープンソースの成熟抗体の配列データベース（例えばＫＤＢ；ボックス４）又は完全なヒトの安定かつ可溶性のｓｃＦｖフラグメントのデータベース（例えばＱＣ；ボックス５）と比較する。
【００４２】
ボックス３に記載されるようなオープンソースの生殖細胞系の配列データベースを適用することによって、進化の過程で淘汰されたため、全長抗体コンテクスト中の可変ドメインの安定性に寄与すると思われる、高度に保存された位置の割り出しが可能となる（ボックス３′）。オープンソースの成熟抗体の配列データベース４との比較によって、それぞれのＣＤＲとは無関係の安定性、可溶性及び／又は結合性の改善を表すパターンの割り出しが可能となる（ボックス４′）。更に、完全にヒトの安定かつ可溶性のｓｃＦｖフラグメントのデータベース（ボックス５）との比較によって、特にｓｃＦｖの形式で安定性及び／又は可溶性に決定的な残基の割り出しに加えて、特にｓｃＦｖの形式、例えばＶL及びＶHの組み合わせで、それぞれのＣＤＲとは無関係な安定性、可溶性及び／又は結合性の改善を示すパターンの割り出しがもたらされる（ボックス５′）。
【００４３】
後続工程（ボックス６）において、決定的な残基は、それぞれのデータベースで割り出される最も頻出する好適なアミノ酸によって置換がなされる。
【００４４】
最後に（ボックス７）、決定的な残基の無作為なもしくは指向的な突然変異誘発と、それに引き続く酵母のＱＣ−システムにおける改善された安定性及び／又は可溶性についてのスクリーニングが実施されうる。それらの突然変異体は、再び上述の手順に供してよい（ボックス２への矢印）。
【００４５】
図２は、ｓｃＦｖの配列に基づく分析に関する例示的な多工程法のフローチャート図である。
【００４６】
第一工程（ボックス１）において、フレームワーク中の全ての残基の頻度が、各位置での種々のアミノ酸の出現率をバイオインフォマティックツールによって提供された結果に基づき比較することによって決定される。第二工程において、各位置での保存の度合いが、例えばシンプソンの指数を使用することによって式Ｄ＝Σｎｉ（ｎｉ−１）／Ｎ（Ｎ−１）を用いて定義される。第三工程において、全体の自由エネルギーを最小にする最良の置換が決定される（例えばボルツマンの法則：ΔΔＧｔｈ＝−ＲＴｌｎ（ｆ親／ｆコンセンサス）に当てはめることによって）。最後に（工程４）、潜在的な安定化突然変異の役割が確かめられる。このために、局所的な及び非局所的な相互作用、カノニカル残基、インターフェース、曝露度及びβ−ターン性などの要因を考慮することができる。
【００４７】
図３は、酵母における安定で可溶性のｓｃＦｖの選択のための例示的なクオリティー・コントロール（ＱＣ）システムの概略図である。このシステムで、還元性環境において安定で可溶性のｓｃＦｖを発現可能な宿主細胞が、安定で可溶性のｓｃＦｖ−ＡＤ−Ｇａｌ１１ｐ融合タンパク質の存在に依存して発現される誘導性のリポーター構築物の存在により選択される。該融合タンパク質とＧａｌ４（１−１００）との相互作用は、機能的な転写因子を形成し、それにより選択可能なマーカーの発現が活性化される（図３Ａを参照のこと）。不安定な及び／又は不溶性のｓｃＦｖは、機能的な転写因子の形成と選択可能なマーカーの発現の誘導をすることができず、従って選択から排除される（図３Ｂ）。選択されたｓｃＦｖは、安定で可溶性のタンパク質を、ジスルフィド結合が折り畳まれない還元性条件下でさえも、折り畳まれて得ることができるが、一方で、不安定な及び／又は不溶性のｓｃＦｖは、折り畳まれず、凝集し、かつ／又は分解する傾向がある。酸化性条件下では、選択されたｓｃＦｖは、依然として優れた可溶性と安定性という特性を呈する。
【００４８】
図４は、もう一つの例示的なクオリティー・コントロール（ＱＣ）システムの概略図である。可溶性のｓｃＦｖを選択するための全体的なコンセプトは、この場合でも図３に記載したものと同じであるが、ｓｃＦｖは、活性化ドメイン（ＡＤ）及びＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を含む機能的な転写因子に直接的に融合されている。図４Ａは、機能的な転写因子に融合された場合に、選択可能なマーカーの転写を妨げない、例示的な可溶性で安定なｓｃＦｖを図示している。それに対して、図４Ｂは、不安定なｓｃＦｖが転写因子に融合されることで、選択可能なマーカーの転写を活性化することができない非機能的な融合構築物をもたらすというシナリオを示している。
【００４９】
図５は、体細胞突然変異の前の本来の生殖細胞系の配列内の特定のフレームワーク（ＦＷ）位置での変動性と、ＱＣシステムで選択された体細胞突然変異の後の成熟抗体の配列内の相応するＦＷ位置での変動性の分析の概略図である。種々の変動性値が、生殖細胞系とＱＣ配列内のそれぞれのＦＷ位置（例えば高度に変動性のフレームワーク残基（"ｈｖＦＲ"））に割り当てられうる（すなわち、それぞれ"Ｇ"値及び"Ｑ"値）。ある特定の位置についてＧ＞Ｑである場合には、その位置には、限られた数で好適な安定なＦＷ残基が存在する。ある特定の位置についてＧ＜Ｑである場合には、このことは、その残基が最適な可溶性及び安定性について自然淘汰されていることを示しうる。
【００５０】
図６は、２５〜９５℃の温度範囲での熱誘発ストレス後にＥＳＢＡ１０５変異体について観察された変性プロフィールを示している。生殖細胞系コンセンサス残基への逆突然変異（Ｖ３Ｑ、Ｒ４７ＫもしくはＶ１０３Ｔ）を有するＥＳＢＡ−１０５変異体は、点線で示されている。本発明の方法によって割り出された好ましい置換を含む変異体（ＱＣ１１．２、ＱＣ１５．２及びＱＣ２３．２）は、実線によって示されている。
【００５１】
図７は、コンセンサス逆突然変異（Ｓ−２、Ｄ−２、Ｄ−３）、アラニンへの突然変異（Ｄ−１）もしくはＱＣ残基（ＱＣ７．１、ＱＣ１１．２、ＱＣ１５．２、ＱＣ２３．２）のいずれかを含む一組のＥＳＢＡ１０５変異体についての熱安定性の比較を示している。各変異体の熱安定性（任意のアンフォールディング単位で）が提供される。
【００５２】
図８は、２５〜９５℃の温度範囲での熱誘発ストレス後にＥＳＢＡ２１２変異体について観察された変性プロフィールを示している。生殖細胞系コンセンサス残基への逆突然変異（Ｖ３ＱもしくはＲ４７Ｋ）を有するＥＳＢＡ２１２変異体は、点線で示されている。ＥＳＢＡ２１２親分子は、実線によって示されている。
【００５３】
図９は、野生型ＥＳＢＡ１０５及びその可溶性変異体のＰＥＧ沈殿可溶性曲線を示している。
【００５４】
図１０は、広い温度範囲（２５〜９６℃）での熱負荷後に測定された、野生型ＥＳＢＡ１０５及びその可溶性変異体についての熱変性プロフィールを示している。
【００５５】
図１１は、熱ストレスの条件下で２週間インキュベートした後の、様々なＥＳＢＡ１０５可溶性突然変異体の分解挙動を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。
【００５６】
発明の詳細な説明
本発明は、安定性、可溶性及び親和性を制限されることなく含む、イムノバインダーの特性、特にｓｃＦｖの特性を、配列に基づきエンジニアリングして、最適化するための方法に関する。より具体的には、本発明は、突然変異させることで、ｓｃＦｖの１もしくはそれより多くの物理的特性が改善されるｓｃＦｖ内のアミノ酸位置を割り出す抗体配列分析を用いてｓｃＦｖ抗体を最適化するための方法を開示している。本発明は、また、本発明の方法により製造された、エンジニアリングされたイムノバインダー、例えばｓｃＦｖに関する。
【００５７】
本発明は、少なくとも部分的に、複数の抗体配列のデータベースにおける、重鎖と軽鎖のそれぞれのフレームワーク位置でのアミノ酸の頻度の分析に基づいている。特に、生殖細胞系データベース及び／又は成熟抗体データベースの頻度の分析は、所望の機能特性を有するものとして選択されたｓｃＦｖ配列のデータベースの頻度分析と比較されている。変動性の度合いを各フレームワーク位置に割り当て（例えばシンプソンの指数を用いて）、そしてその各フレームワーク位置での変動性の度合いを種々のタイプの抗体配列データベース内で比較することによって、目下、ｓｃＦｖの機能特性（例えば安定性、可溶性）に重要なフレームワーク位置を割り出すことができた。これは、目下、フレームワークのアミノ酸位置に対する"機能的コンセンサス"を定義することを可能にする。その際、生殖細胞系及び／又は成熟の抗体免疫グロブリン配列における相応の位置よりも変動性に許容性が高いか低いかのいずれかであるフレームワーク位置が割り出されている。このように、本発明は、機能的に選択されたｓｃＦｖ配列のデータベースの使用の使用に基づいて、"機能的コンセンサス"アプローチの利点を提供し、かつ実証している。更になおも、本発明は、本願に記載される"機能的コンセンサス"アプローチを使用して割り出された特定のフレームワークアミノ酸位置を突然変異させることによる、イムノバインダー（例えばｓｃＦｖ）のエンジニアリングの方法を提供する。
【００５８】
本発明をより容易に理解できるようにするために、特定の用語をまず定義する。特に定義がなされない限り、本願で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有するものによって通常理解されるのと同じ意味を有する。本願に記載されるのと類似のもしくは同等の方法及び材料を本発明の実施もしくは試験において使用できるが、好適な方法及び材料は、以下に記載される。本願に挙げられる全ての文献、特許出願、特許及び他の参考資料は、参照をもってその全体が開示されたものとする。抵触の場合には、本願明細書が、それらの定義を含めて支配することとなる。更に、材料、方法及び実施例は、説明的なものにすぎず、限定を意図するものではない。
【００５９】
本願で使用される用語"抗体"は、"免疫グロブリン"と同義である。本発明による抗体は、全体の免疫グロブリン又は単独の可変ドメインなどの免疫グロブリンの少なくとも１種の可変ドメインを含むそのフラグメント、つまり当業者によく知られるＦｖ（Ｓｋｅｒｒａ Ａ．及びＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−４１）、ｓｃＦｖ（Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．他（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−２６；Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．他（１９８８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−８３）、Ｆａｂ、（Ｆａｂ′）２もしくは他のフラグメントであってよい。
【００６０】
本願で使用される用語"抗体フレームワーク"とは、ＶＬもしくはＶＨのいずれかの可変ドメインの部分であって、この可変ドメインの抗原結合ループのための足場としてはたらくものを指す（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．他（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２）。
【００６１】
本願で使用される用語"抗体ＣＤＲ"とは、抗体の相補性決定領域であって、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．他（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２によって定義される抗原結合ループからなるものを指す。抗体Ｆｖフラグメントの２つの可変ドメインのそれぞれは、例えば３つのＣＤＲを含む。
【００６２】
用語"単鎖抗体"又は"ｓｃＦｃ"は、抗体重鎖可変領域（ＶH）及び抗体軽鎖可変領域（ＶL）を含み、それらがリンカーによって連結合されている分子を指すことが意図される。斯かるｓｃＦｖ分子は、一般構造：ＮＨ2−ＶL−リンカー−ＶH−ＣＯＯＨ又はＮＨ2−ＶH−リンカー−ＶL−ＣＯＯＨを有してよい。
【００６３】
本願で使用される場合、"同一性"とは、２種のポリペプチド、分子又は２種の核酸の間の配列の一致を指す。２つの比較された配列の両者のある位置が同じ塩基もしくはアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合に（例えば、２つのポリペプチドのそれぞれのある位置がリジンによって占められている場合に）、それぞれの分子は、その位置で同一である。２種の配列の間の"パーセンテージの同一性"は、２種の配列によって共有される一致した位置の数を比較された位置の数によって除算したものに１００を乗算した関数である。例えば、２種の配列における１０個の位置の６個が一致している場合に、それらの２種の配列は６０％の同一性を有する。一般に、２種の配列を最大の同一性となるようにアラインメントして比較がなされる。斯かるアラインメントは、例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ他（１９７０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３の方法を用いて、Ａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）などのコンピュータプログラムによって適宜実行されて提供することができる。
【００６４】
"類似の"配列は、アライメントされた場合に、同一の及び類似のアミノ酸残基を共有するものであり、その際、類似の残基は、アライメントされた参照配列中の相応のアミノ酸残基についての保存的置換である。この点に関しては、参照配列中の残基の"保存的置換"は、相応の参照残基と物理的にもしくは機能的に類似の残基、例えば類似の大きさ、形状、電荷、共有結合もしくは水素結合の形成能を含む化学特性などを有する残基による置換である。このように、"保存的置換により修飾された"配列は、参照配列もしくは野生型配列とは異なるものであり、１もしくはそれより多くの保存的置換が存在する配列である。２種の配列の間の"パーセンテージの類似性"は、２種の配列によって共有される一致した残基もしくは保存的置換を含む位置の数を比較された位置の数によって除算したものに１００を乗算した関数である。例えば、２種の配列における１０個の位置の６個が一致し、かつ１０個の位置の２個が保存的置換を含む場合に、それらの２種の配列は、８０％の正の類似性を有する。
【００６５】
本願で使用される"アミノ酸コンセンサス配列"とは、少なくとも２種の、好ましくはそれより多くのアライメントされたアミノ酸配列の行列を用いて、かつそれぞれの位置での最も頻出するアミノ酸を決定できるようなアライメントでギャップを許容して生成できるアミノ酸配列を指す。コンセンサス配列は、それぞれの位置で最も頻出するアミノ酸を含む配列である。２もしくはそれより多くのアミノ酸が単独の位置で等しく現れる場合に、コンセンサス配列は、これらのアミノ酸の両方もしくは全てを含む。
【００６６】
タンパク質のアミノ酸配列は、様々なレベルで解析することができる。例えば、保存もしくは変動は、単一残基レベル、多重残基レベル、ギャップありの多重残基などで表現することができる。残基は、同一の残基の保存を表すか、又はクラスレベルで保存されることがある。アミノ酸クラスの例は、極性であるが、非荷電のＲ基（セリン、トレオニン、アスパラギン及びグルタミン）；正に荷電したＲ基（リジン、アルギニン及びヒスチジン）；負に荷電したＲ基（グルタミン酸及びアスパラギン酸）；疎水性のＲ基（アラジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン及びチロシン）；並びに特殊なアミノ酸（システイン、グリシン及びプロリン）を含む。他のクラスは、当業者に公知であり、かつ構造決定又は置換可能性を評価する他のデータを用いて定義されることがある。その意味で、置換可能なアミノ酸とは、置換することができ、その位置で機能的保存を維持できる任意のアミノ酸を指すことができる。
【００６７】
本願で使用される場合に、１つのアミノ酸配列（例えば第一のＶHもしくはＶL配列）を１もしくはそれより多くの追加のアミノ酸配列（例えばデータベース中の１もしくはそれより多くのＶHもしくはＶL配列）とアラインメントする場合に、１つの配列（例えば第一のＶHもしくはＶL配列）中のアミノ酸配列は、その１もしくはそれより多くの追加のアミノ酸配列中の"相応の位置"と比較されうる。本願で使用される場合に、"相応の位置"は、配列が最適にアラインメントされた場合、すなわち配列が最も高いパーセントの同一性もしくはパーセントの類似性を達成するようにアラインメントされた場合、比較される配列中の対応位置を表す。
【００６８】
本願で使用される場合に、用語"抗体データベース"とは、２もしくはそれより多くの抗体アミノ酸配列のコレクションを指し、一般に、何十種、何百種、あるいは何千種に及ぶ抗体アミノ酸配列のコレクションを指す。抗体データベースは、抗体ＶH領域、抗体ＶL領域又はその両方のアミノ酸配列、例えばそのコレクションを蓄積するか、又はＶH及びＶL領域を含むｓｃＦｖ配列のコレクションを蓄積しうる。好ましくは、該データベースは、検索可能な固定化された媒体、例えば検索可能なコンピュータプログラム内のコンピュータに蓄積される。一実施態様においては、抗体データベースは、生殖細胞系の抗体配列を含む又はそれらからなるデータベースである。もう一つの実施態様においては、抗体データベースは、成熟（すなわち発現される）抗体配列を含むもしくはそれらからなるデータベース（例えば成熟抗体配列のＫａｂａｔデータベース、例えばＫＢＤデータベース）である。更にもう一つの実施態様においては、抗体データベースは、機能的に選択された配列（例えばＱＣアッセイから選択された配列）を含むかあるいはそれらからなる。
【００６９】
用語"イムノバインダー"とは、イムノバインダーが特異的に標的抗原を認識する、抗体の抗原結合部位の全てもしくは部分を含む分子、例えば重鎖及び／又は軽鎖の可変ドメインの全てもしくは部分を含む分子を指す。イムノバインダーの限定されない例には、全長免疫グロブリン分子及びｓｃＦｖ並びに抗体フラグメント、例えば限定されないが、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、つまりＶL、ＶH、ＣL及びＣH１ドメインからなる一価のフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ′）2フラグメント、つまり２つのＦａｂフラグメントを含みヒンジ領域でジスルフィド橋によって連結された二価のフラグメント；（ｉｉｉ）実質的にヒンジ領域の部分を有するＦａｂであるＦａｂ′フラグメント（ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｐａｕｌ編、第三版、１９９３年）を参照）；（ｉｖ）ＶH及びＣH１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｖｉ）Ｄａｂなどの単一ドメイン抗体（Ｗａｒｄ他（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）であって、ＶHもしくはＶLドメインからなる抗体、つまりカメリド抗体（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ他、Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６−４４８（１９９３）及びＤｕｍｏｕｌｉｎ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１：５００−５１５（２００２）を参照）もしくはサメ抗体（例えばサメＩｇ−ＮＡＲ Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））並びに（ｖｉｉ）ナノボディー、つまり単独の可変ドメインと２つの定常ドメインを含む重鎖可変領域が含まれる。
【００７０】
本願で使用される場合に、用語"機能特性"は、例えばポリペプチドの製造特性もしくは治療効力を改善するために、当業者に改善（例えば従来のポリペプチドに対して）が望まれる及び／又は好ましい、ポリペプチド（例えばイムノバインダー）の特性である。一実施態様において、機能特性は、改善された安定性（例えば熱安定性）である。もう一つの実施態様において、機能特性は、改善された可溶性（例えば細胞条件下で）である。更にもう一つの実施態様において、機能特性は非凝集である。なおももう一つの実施態様において、機能特性は発現での改善（例えば原核細胞において）である。更にもう一つの実施態様において、機能特性は、封入体精製工程に引き続く再フォールディング率における改善である。一定の実施態様において、機能特性は、抗原結合親和性の改善ではない。
【００７１】
ｓｃＦｖの配列に基づく分析
本発明は、突然変異について選択されるｓｃＦｖ配列内でのアミノ酸位置の割り出しを可能にするｓｃＦｖ配列の分析のための方法を提供する。突然変異について選択されたアミノ酸位置は、ｓｃＦｖの機能特性、例えば可溶性、安定性及び／又は抗原結合性に影響することが予測されるものであって、その際、斯かる位置での突然変異が、ｓｃＦｖの性能を改善すると予測されるものである。このように、本発明は、ｓｃＦｖ配列内でアミノ酸位置を単純に無作為に突然変異するよりも焦点が絞られたｓｃＦｖのエンジニアリングをして性能を最適化することができる。
【００７２】
ｓｃＦｖ配列の配列に基づく分析の一定の態様は、図１のフローチャートに図示されている。この図に示されるように、最適化されるべきｓｃＦｖの配列は、安定で可溶性であると選択されたｓｃＦｖ配列から構成される抗体データベースを含む１もしくはそれより多くの抗体データベース中の配列と比較される。これは、特にｓｃＦｖの形式で安定性及び／又は可溶性に決定的な残基の割り出し、並びに特にｓｃＦｖの形式で（例えばＶL及びＶHの組み合わせ）それぞれのＣＤＲとは独立した安定性、可溶性及び／又は結合性の改善を示すパターンの割り出しを可能にしうる。決定的な残基が割り出されたら、それらの残基は、例えばそれぞれのデータベース中で割り出された最も頻度の高い好適なアミノ酸によって及び／又は無作為なもしくは指向的な突然変異誘発によって置換されうる。
【００７３】
このように、一態様では、本発明は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）であって該ｓｃＦｖがＶH及びＶLアミノ酸配列を有するものにおける突然変異のためのアミノ酸位置を割り出す方法において、
ａ）ｓｃＦｖのＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列を、多数の抗体のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列を含むデータベースに入力して、該ｓｃＦｖのＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列とデータベースの該抗体のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列とをアラインメントさせることと、
ｂ）ｓｃＦｖのＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内のアミノ酸位置と、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸内の相応の位置とを比較することと、
ｃ）該ｓｃＦｖのＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内のアミノ酸位置が、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置で保存されているアミノ酸残基によって占められているかどうかを調べることと、
ｄ）該アミノ酸位置が、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸内の相応の位置で保存されていないアミノ酸残基によって占められている場合に、該ｓｃＦｖのＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内のアミノ酸位置を、突然変異のためのアミノ酸位置として割り出すことと
を含む方法に関する。
【００７４】
このように、本発明の方法においては、関連するｓｃＦｖの配列（すなわちＶH、ＶLもしくは両方の配列）は、抗体データベースの配列と比較され、その関連のｓｃＦｖ中のアミノ酸位置が、データベース中の配列の相応の位置において"保存"されているアミノ酸残基によって占められているかどうかが調べられる。前記のｓｃＦｖ配列のアミノ酸位置が、データベースの配列内の相応の位置で"保存"されていないアミノ酸残基によって占められている場合に、そのｓｃＦｖのアミノ酸位置が、次いで突然変異のために選択される。好ましくは、分析されるアミノ酸位置は、関連のｓｃＦｖ内のフレームワークのアミノ酸位置である。更により好ましくは、関連のｓｃＦｖ内のすべてのフレームワークのアミノ酸位置が分析されうる。選択的な一実施態様において、関連のｓｃＦｖの１もしくはそれより多くのＣＤＲ内の１もしくはそれより多くのアミノ酸位置が分析されうる。更にもう一つの実施態様において、関連のｓｃＦｖでの各アミノ酸位置が分析されうる。
【００７５】
アミノ酸残基が抗体データベースの配列内の特定のアミノ酸位置（例えばフレームワークの位置）で"保存"されているかどうかを調べるためには、特定の位置での保存度が計算されうる。所定の位置でのアミノ酸多様度を定量できる、当該技術分野において知られる種々の様式の選択肢が存在し、その全ては、本発明の方法に適用することができる。好ましくは、保存度は、多様度の尺度であるシンプソン多様度指数を使用して計算される。各位置に存在するアミノ酸の数に加えて、各アミノ酸の相対存在度が考慮される。シンプソン指数（Ｓ．Ｉ．）は、２種の無作為に選択された抗体配列が、ある位置に同じアミノ酸を含む確率を表す。シンプソン指数は、保存度を測定する場合には、豊富さ及び均等度といった２つの主要な係数が考慮される。本願で使用される場合に、"豊富さ"は、特定の位置に存在する異なるアミノ酸種の数の尺度である（すなわち、その位置でデータベースに表される種々のアミノ酸残基の数が豊富さの尺度である）。本願で使用される場合に、"均等度"は、特定の位置に存在する各アミノ酸の存在度の尺度である（すなわち、データベースの配列内のその位置でアミノ酸残基が生ずる頻度が、均等度の尺度である）。
【００７６】
残基の豊富さは、それ自身で、特定の位置での保存度を調べるための尺度として使用できる一方で、ある位置に存在する各アミノ酸残基の相対頻度は考慮されない。それは、データベースの配列内の特定の位置で非常にまれに生ずるアミノ酸残基について、その同じ位置で非常に頻繁に生ずるのと同等の重みづけとなることを示している。均等度は、ある位置の豊富さを形作る種々のアミノ酸の相対存在度の尺度である。シンプソン指数は、豊富さと均等度の両方を考慮に入れるので、それが、本発明により保存度を定量化する好ましい方法である。特に、非常に保存された位置での低い頻度の残基は、潜在的に問題があるものと見なされるため、突然変異のために選択されうる。
【００７７】
シンプソン指数のための式は、Ｄ＝Σｎi（ｎi−１）／Ｎ（Ｎ−１）であり、その際、Ｎは、調査における（例えばデータベースにおける）配列の全数であり、かつｎは、分析される位置での各アミノ酸残基の頻度である。データベースにおけるアミノ酸事象（ｉ）の頻度は、該データベースで生ずるアミノ酸の回数（ｎi）である。回数ｎiそれ自身は、相対頻度で示される。つまり、それらは事象の全数によって正規化される。最大多様度が生ずる場合に、Ｓ．Ｉ．値はゼロであり、かつ最小多様度が生ずる場合に、Ｓ．Ｉ．値は１である。このように、Ｓ．Ｉ．範囲は０〜１であり、多様度と指数値との間は逆数の関係である。
【００７８】
データベースの配列内のフレームワークのアミノ酸位置の分析のための多重の工程をまとめたフローチャートは、図２に更に詳細に記載される。
【００７９】
従って、前記方法の好ましい一実施態様においては、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置には、シンプソンの指数を使用して保存度が割り当てられる。その相応の位置のＳ．Ｉ．値は、その位置の保存の指標として使用されうる。
【００８０】
他の実施態様において、密接に関連した抗体配列の信頼性のあるアラインメント（すなわち、タンパク質構造の類似性が考慮される配列アラインメント）が、本発明において、調べられた位置でのアミノ酸の相対存在度と保存度との行列の生成のために使用される。これらの行列は、抗体−抗体データベース比較での使用のために設計される。それぞれの残基の観察された頻度が計算され、期待された頻度（それは各位置についてのデータセットにおける各残基の頻度である）と比較される。
【００８１】
所定のｓｃＦｖ抗体の記載された方法による分析は、所定のｓｃＦｖ抗体におけるある特定の位置での生物学的に許容される突然変異及び普通でない残基についての情報を提供し、かつこのフレームワーク内での潜在的な弱点の予測を可能にする。Ｓ．Ｉ．値と相対頻度を基準として使用して、アミノ酸頻度データのセットに"最良に"当てはまるアミノ酸置換のエンジニアリングには、定型作業を使用することができる。
【００８２】
前記の配列に基づく分析は、ｓｃＦｖのＶH領域か、ｓｃＦｖのＶL領域か、又はその両方に適用することができる。このように、一実施態様においては、ｓｃＦｖのＶHのアミノ酸配列は、データベースに入力され、そして該データベースの抗体のＶHのアミノ酸配列とアラインメントされる。もう一つの実施態様においては、ｓｃＦｖのＶLのアミノ酸配列は、データベースに入力され、そして該データベースの抗体のＶLのアミノ酸配列とアラインメントされる。更にもう一つの実施態様においては、ｓｃＦｖのＶH及びＶLのアミノ酸配列は、データベースに入力され、そして該データベースの抗体のＶH及びＶLのアミノ酸配列とアラインメントされる。ある配列とデータベースにおける他の配列のコレクションとをアラインメントさせるためのアルゴリズムは、当該技術分野では十分に確立されている。それらの配列は、配列間で最高のパーセントの同一性もしくは類似性が達成されるようにアラインメントされる。
【００８３】
本発明の方法は、ｓｃＦｖ配列内の関連の１つのアミノ酸位置を分析するために使用することができるか、又はより好ましくは、関連の多重のアミノ酸位置を分析するために使用することができる。このように、前記方法の工程ｂ）では、ｓｃＦｖのＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の多重のアミノ酸位置を、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置と比較することができる。分析するのに好ましい位置は、ｓｃＦｖのＶH及び／又はＶLの配列内のフレームワーク位置である（例えば各ＶH及びＶLのフレームワーク位置を分析することができる）。加えてあるいは択一的に、ｓｃＦｖの１もしくはそれより多くのＣＤＲ内の１もしくはそれより多くの位置を分析することができる（しかし、それはＣＤＲに関するアミノ酸位置を突然変異させるのに好ましくないことがある。それというのも、ＣＤＲ内の突然変異は、フレームワーク領域内の突然変異よりも恐らく抗原結合活性に影響するからである）。なおも更に、本発明の方法は、ｓｃＦｖのＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列内の各アミノ酸位置の分析を可能にする。
【００８４】
本発明の方法では、関連のｓｃＦｖの配列を、多様な異なる種類の抗体の配列データベースの１もしくはそれより多くの中の配列と比較することができる。例えば、一実施態様においては、データベースの抗体のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列は、生殖細胞系の抗体のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列である。もう一つの実施態様においては、データベースの抗体のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列は、再配置され親和性成熟した抗体のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列である。更にもう一つの好ましい実施態様においては、データベースの抗体のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列は、ｓｃＦｖ安定性もしくはｓｃＦｖ可溶性などの少なくとも１種の所望の機能特性を有するように選択されたｓｃＦｖ抗体のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列である（更に以下で議論される）。
【００８５】
抗体配列情報は、生殖細胞系の配列の配列アラインメントから、あるいは天然に存在する生殖細胞系の配列から得ること、収集すること、及び／又は生成することができる。それらの配列のソースは、制限されないが、以下の１もしくはそれより多くのデータベースを含むことができる：
・  Ｋａｂａｔデータベース（．ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．Ｅｄｕ（２００７年１０月現在）；Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｗｕ（２００１年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９：２０５−２０６；Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｗｕ（２０００年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２１４−２１８）。２０００年からの生データは、米国のＦＴＰによって入手でき、かつ英国にミラーリングされている。
【００８６】
・  Ｋａｂａｔｍａｎは、利用者に配列の普通でない特徴についてＫａｂａｔ配列を検索することを可能にし、かつ利用者に特定の抗体配列中のＣＤＲに関するカノニカルな割り当ての発見を可能にするデータベースを含む。
【００８７】
・  ＡＡＡＡＡウェブサイト（ｗｗｗ．ｂｉｏｃ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ／ａｎｔｉｂｏｄｙ（２００７年１０月現在））、Ａｎｎｅｍａｒｉｅ Ｈｏｎｅｇｇｅｒによって作製された抗体のページであり、抗体についての配列情報と構造データを提供している。
【００８８】
・  ＡＢＧ：  抗体の３Ｄ構造のディレクトリ  −  Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｇｒｏｕｐ（ＡＢＧ）によって作製されたディレクトリであり、それは利用者にタンパク質データバンク（ＰＤＢ）に収集された抗体構造へのアクセスを可能にする。該ディレクトリにおいて、各ＰＤＢエントリは、全情報を回復容易にするためにオリジナルのソースへとハイパーリンクを有している。
【００８９】
・  ＡＢＧ：  マウスのＶH及びＶKの生殖細胞系セグメントの生殖細胞系の遺伝子ディレクトリ、それはメキシコ自治大学生物工学研究所ＵＮＡＭ（メキシコ国立大学）の抗体グループのウェブページの一部である。
【００９０】
・  ＩＭＧＴ（登録商標）、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム（登録商標）（Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ（モンペリエ第二大学、ＣＮＲＳ）によって１９８９年に作製）ＩＭＧＴは、ヒト及び他の脊椎動物種に関する免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体及び免疫系の関連タンパク質に特化した統合知識リソースである。ＩＭＧＴは、配列データベース（ＩＭＧＴ／ＬＩＧＭ−ＤＢ、全て注釈付の配列についての翻訳を有するヒト及び他の脊椎動物由来のＩＧ及びＴＲの包括的データベース、ＩＭＧＴ／ＭＨＣ−ＤＢ、ＩＭＧＴ／ＰＲＩＭＥＲ−ＤＢ）、ゲノムデータベース（ＩＭＧＴ／ＧＥＮＥ−ＤＢ）、構造データベース（ＩＭＧＴ／３Ｄ構造−ＤＢ）、ウェブリソース（ＩＭＧＴレパートリ）（ＩＭＧＴ、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム（登録商標）；ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ（２００７年１０月現在）；Ｌｅｆｒａｎｃ他（１９９９年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：２０９−２１２；Ｒｕｉｚ他（２０００年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２１９−２２１；Ｌｅｆｒａｎｃ他（２００１年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９：２０７−２０９；Ｌｅｆｒａｎｃ他（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：３０７−３１０）からなる。
【００９１】
・  Ｖ ＢＡＳＥ  −  Ｇｅｎｂａｎｋ及びＥＭＢＬデータライブラリの最新リリース中の配列を含む千種類の公表された配列から収集された全てのヒト生殖細胞系可変領域配列の包括的ディレクトリ。
【００９２】
好ましい一実施態様においては、抗体配列情報は、還元性環境における高められた安定性及び可溶性に関して選択された定義されたフレームワークを有するｓｃＦｖライブラリーから得られる。より好ましくは、還元性環境における高められた安定性及び可溶性を有するｓｃＦｖフレームワークの細胞内選択を可能にする酵母クオリティー・コントロール（ＱＣ）−システム（例えばＰＣＴ出願ＷＯ２００１／４８０１７号；米国出願番号２００１／００２４８３１号及びＵＳ２００３／００９６３０６号；米国特許第７，２５８，９８５号及び第７，２５８，９８６号）が記載されている。このシステムにおいて、ｓｃＦｖライブラリーは、特定の公知の抗原を発現できる宿主細胞中に形質転換され、抗原−ｓｃＦｖ相互作用の存在でのみ生存する。形質転換された宿主細胞は、抗原とｓｃＦｖの発現に適していて、抗原−ｓｃＦｖ相互作用の存在でのみ細胞の生存が可能な条件下で培養される。このように、生存している細胞で発現され、かつ還元性環境において安定で可溶性の定義されたフレームワークを有するｓｃＦｖを単離することができる。従って、ＱＣ−システムは、大きなｓｃＦｖライブラリーのスクリーニングをして、それにより還元性環境中で安定で可溶性のフレームワークを有するこれらの好ましいｓｃＦｖを単離するために使用することができ、かつこれらの選択されたｓｃＦｖの配列は、ｓｃＦｖ配列データベース中に収集することができる。斯かるｓｃＦｖデータベースは、次いで、関連の他のｓｃＦｖ配列との本発明の方法を使用した比較のために使用することができる。ＱＣ−システムを使用して事前に選択され定義された好ましいｓｃＦｖフレームワーク配列は、更に詳細に、ＰＣＴ出願ＷＯ２００３／０９７６９７号及び米国出願第２００６００３５３２０号に記載されている。
【００９３】
本来のＱＣ−システムの別形は、当該技術分野で公知である。図３に図解される一つの例示的実施態様において、ｓｃＦｖライブラリーは、Ｇａｌ４酵母転写因子の活性化ドメイン（ＡＤ）に融合され、それはまたいわゆるＧａｌ１１ｐタンパク質（１１ｐ）の一部に融合されている。そのｓｃＦｖ−ＡＤ−Ｇａｌ１１ｐ融合構築物は、次いで、宿主細胞中に形質転換され、それは、Ｇａｌ４の最初の１００個のアミノ酸を発現し、こうしてＧａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ；Ｇａｌ４（１−１００））を含む。Ｇａｌ１１ｐは、Ｇａｌ４（１−１００）に直接的に結合することが知られる点突然変異である（Ｂａｒｂｅｒｉｓ他．Ｃｅｌｌ，８１：３５９（１９９５））。形質転換された宿主細胞は、ｓｃＦｖ融合タンパク質の発現に適しており、かつｓｃＦｖ融合タンパク質がＧａｌ４（１−１００）と相互作用するのに十分に安定で可溶性であり、それによりＤＢＤに結合されたＡＤを含む機能的転写因子を形成する（図３Ａ）場合にのみ細胞の生存が可能である条件下で培養される。このように、生存している細胞で発現され、かつ還元性環境において安定で可溶性の定義されたフレームワークを有するｓｃＦｖを単離することができる。この例示的なＱＣシステムの更なる説明は、Ａｕｆ ｄｅｒ Ｍａｕｅｒ他のＭｅｔｈｏｄｓ，３４：２１５−２２４（２００４）に記載されている。
【００９４】
もう一つの例示的な実施態様において、本発明の方法で使用されるＱＣシステムを、図４に示す。このバージョンのＱＣシステムでは、ｓｃＦｖもしくはｓｃＦｖライブラリーが、機能的転写因子に直接的に融合され、そして選択可能なマーカーを含む酵母菌株で発現される。その選択可能なマーカーは、機能的なｓｃＦｖ−転写因子融合物の存在下で活性化されるだけである。それは、該構築物が全体として安定かつ可溶性である必要があることを意味する（図４Ａ）。ｓｃＦｖが不安定である状況では、それは凝集物を形成し、場合により分解され、それによりそこに融合された転写因子の分解も引き起こされることで、選択可能なマーカーの発現をもはや活性化できなくなる（図４Ｂを参照）。
【００９５】
本発明の方法では、関連のｓｃＦｖの配列を、抗体データベース内の全ての配列と比較することができるか、又は択一的に、データベース中の配列の選択された部分のみを比較目的に使用することができるに過ぎない。すなわち、該データベースは、関連のｓｃＦｖとの高い割合の類似性もしくは同一性を有するこれらの配列のみに限定又は制約することができる。このように、本発明の方法の一実施態様においては、該データベースは、ｓｃＦｖ抗体のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列と高い類似性を有するこれらの抗体のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列のみが含まれる制約されたデータベースである。
【００９６】
関連のｓｃＦｖを該データベースに入力して、該データベース内の抗体の配列と比較されると、配列情報が解析されて、所定の位置のアミノ酸の頻度と変動性についての情報が提供され、そして潜在的に問題のあるアミノ酸位置、特にｓｃＦｖのフレームワーク内の潜在的に問題のあるアミノ酸位置が予測される。斯かる情報は、また、ｓｃＦｖの特性を改善する突然変異の設計にも使用できる。例えば、抗体可溶性は、溶媒曝露される疎水性残基を、この位置にしばしば存在する親水性残基に置き換えることによって改善できる。
【００９７】
本発明の方法では、データベースの抗体の配列内の特定の位置で"保存"されうるアミノ酸残基の多くの考えられる種類がある。例えば、１つの特定のアミノ酸残基は、その位置で非常に高い頻度で見出されることがあり、それは、前記の特定のアミノ酸残基がその特定の位置で好ましいことを示している。従って、該方法の一実施態様においては、工程ｃ）で、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置で保存されるアミノ酸残基は、該データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内のその位置に最も頻度の高いアミノ酸残基である。他の実施態様においては、その位置は、特定の種類もしくはクラスのアミノ酸残基で"保存"されうる（すなわち、その位置は、単独の特定のアミノ酸残基のみによって優先的に占められずに、むしろ、それぞれ同じ種類もしくはクラスの残基である幾つかの異なるアミノ酸残基によって優先的に占められる。例えば、工程ｃ）で、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置は、（ｉ）疎水性アミノ酸残基、（ｉｉ）親水性アミノ酸残基、（ｉｉｉ）水素結合を形成できるアミノ酸残基又は（ｉｖ）β−シートを形成する性向を有するアミノ酸残基で保存されうる。
【００９８】
該方法の工程ｄ）では、ｓｃＦｖのＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内のアミノ酸位置は、該アミノ酸位置が、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置で保存されていないアミノ酸残基によって占められている場合に、突然変異のためのアミノ酸位置として割り出される。あるアミノ酸位置を、"保存されていない"アミノ酸残基によって占められているので、潜在的に問題があるとして割り出す状況は多数考えられる。例えば、データベース内の相応のアミノ酸位置が疎水性残基で保存され、かつｓｃＦｖ内の位置が親水性残基によって占められている場合に、この位置は、ｓｃＦｖにおいては潜在的に問題となることがあり、その位置は突然変異のために選択することができる。同様に、データベース内の相応のアミノ酸位置が親水性残基で保存され、かつｓｃＦｖ内の位置が疎水性残基によって占められている場合に、この位置は、ｓｃＦｖにおいては潜在的に問題となることがあり、その位置は突然変異のために選択することができる。このように、本願に開示される方法の好ましい一実施態様においては、疎水性アミノ酸残基は、親水性残基によって置換され、又はその逆もある。更に他の場合には、データベース内の相応のアミノ酸位置が水素結合を形成できるアミノ酸残基又はβシートを形成する性向を有するアミノ酸残基で保存され、かつｓｃＦｖ内の位置が、それぞれ水素結合を形成できないアミノ酸残基又はβシートを形成する性向を有さないアミノ酸残基によって占められている場合に、この位置は、ｓｃＦｖにおいては潜在的に問題となることがあり、その位置は突然変異のために選択することができる。従って、本発明の方法のもう一つの好ましい実施態様においては、水素結合を形成しうるアミノ酸残基は、β−シートを形成する性向を有するアミノ酸残基によって置換され、又はその逆もある。
【００９９】
好ましい一実施態様においては、本発明で記載される方法は、単独で又は組み合わせて使用することで、抗体の単鎖フラグメントの安定性及び／又は可溶性を改善するためのアミノ酸置換の組み合わせリストを作製することができる。
【０１００】
共分散分析
本発明は、また、データベース内の抗体の配列と比較した場合の、ｓｃＦｖの配列内での共分散を分析するための方法に関する。共変する残基は、例えば（ｉ）フレームワーク領域（ＦＲ）中の残基及びＣＤＲ中の残基；（ｉｉ）あるＣＤＲ中の残基及び別のＣＤＲ中の残基；（ｉｉｉ）あるＦＲ中の残基及び別のＦＲ中の残基；又は（ｉｖ）ＶH中の残基及びＶL中の残基であってよい。抗体の三次構造で互いに相互作用する残基は、好ましいアミノ酸残基が、共変ペアの両方の位置で保存されうるように共変することができ、一方の残基が変化したら他方の残基も抗体構造の位置のために同様に変化せねばならない。一組のアミノ酸配列における共分散分析の実施方法は当業者に公知である。例えば、Ｃｈｏｕｌｉｅｒ，Ｌ他（２０００年）Ｐｒｏｔｅｉｎ ４１：４７５−４８４は、ヒト及びマウスの生殖細胞系のＶL及びＶHの配列アラインメントに共分散分析を適用することを記載している。
【０１０１】
共分散分析は、保存されたアミノ酸位置を分析するための前記方法（前記方法中の工程ａ）〜ｄ））と組み合わせることができ、こうして、該方法は更に、以下の工程：
ｅ）データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列に対して共分散分析を行って、アミノ酸位置の共変ペアを割り出す工程；
ｆ）アミノ酸位置の共変ペアと、ｓｃＦｖのＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置とを比較する工程；
ｇ）前記のｓｃＦｖのＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置が、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内のアミノ酸位置の共変ペアで保存されるアミノ酸残基によって占められているかどうかを決定する工程；及び
ｈ）前記のｓｃＦｖのＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置の一方もしくは両方を、ｓｃＦｖ内の相応の位置の一方もしくは両方が、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内のアミノ酸位置の共変ペアで保存されていないアミノ酸残基によって占められている場合に、突然変異のためのアミノ酸位置として割り出す工程
を含む。
【０１０２】
加えて又は選択的に、共分散分析は、それ自身で実施でき、こうして本発明は、以下の工程：
ａ）データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列に対して共分散分析を行って、アミノ酸位置の共変ペアを割り出す工程；
ｂ）アミノ酸位置の共変ペアと、ｓｃＦｖのＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置とを比較する工程；
ｃ）前記のｓｃＦｖのＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置が、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内のアミノ酸位置の共変ペアで保存されるアミノ酸残基によって占められているかどうかを決定する工程；及び
ｄ）前記のｓｃＦｖのＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置の一方もしくは両方を、ｓｃＦｖ内の相応の位置の一方もしくは両方が、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内のアミノ酸位置の共変ペアで保存されていないアミノ酸残基によって占められている場合に、突然変異のためのアミノ酸位置として割り出す工程
を含む方法を提供する。
【０１０３】
本発明の共分散分析方法を使用して、１つの共変ペア又は１つより多くの共変ペアを分析することができる。このように、該方法の一実施態様においては、アミノ酸位置の複数の共変ペアがデータベースの抗体のＶH及び／又はＶLのアミノ酸配列内で割り出され、それは、ｓｃＦｖのＶH及び／又はＶLのアミノ酸配列内で相応の位置と比較される。
【０１０４】
該方法は、更に、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内のアミノ酸位置の共変ペアで保存されていないアミノ酸残基によって占められているｓｃＦｖ内の一方もしくは両方の相応の位置を突然変異することを含みうる。一実施態様において、アミノ酸位置の共変ペアで保存されていないアミノ酸残基によって占められているｓｃＦｖ内の相応の位置の一方は、アミノ酸位置の共変ペアで最も頻出するアミノ酸残基で置換される。もう一つの実施態様において、アミノ酸位置の共変ペアで保存されていないアミノ酸残基によって占められているｓｃＦｖ内の相応の位置の両方は、アミノ酸位置の共変ペアで最も頻出するアミノ酸残基で置換される。
【０１０５】
分子モデリング
潜在的に問題のある残基についてｓｃＦｖを分析するための本発明の配列に基づく方法は、抗体の構造／機能の関連性を分析するための当業者に公知の他の方法と組み合わせることができる。例えば、好ましい一実施態様においては、本発明の配列に基づく分析方法は、付加的な潜在的に問題のある残基を割り出すために分子モデリングと組み合わされる。ｓｃＦｖを含む抗体構造のコンピュータモデリングのための方法とソフトウェアは、当該技術分野で確立されており、かつ本発明の配列に基づく方法と組み合わせることができる。このように、もう一つの実施態様においては、工程ａ）〜ｄ）で示される残基の配列に基づく方法は、更に、以下の工程：
ｅ）ｓｃＦｖのＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列を分子モデリングに供する工程；及び
ｆ）突然変異のための、ｓｃＦｖのＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列内の少なくとも１つの付加的なアミノ酸位置を割り出す工程
を含む。該方法は、更に、分子モデリングによって突然変異のために割り出されたｓｃＦｖのＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列内の少なくとも１つの付加的なアミノ酸位置を突然変異することを含む。
【０１０６】
"機能的コンセンサス"対"従来型コンセンサス"分析
特に好ましい一実施態様において、１もしくはそれより多くのフレームワーク位置での変動性の度合いは、抗体の配列の第一のデータベース（例えば生殖細胞系データベース、例えばＶｂａｓｅ及び／又はＩＭＧＴ）もしくは成熟抗体データベース（例えばＫＢＤ）と、１もしくはそれより多くの所望の特性を有するものとして選択されたｓｃＦｖの第二のデータベース、例えば酵母でのＱＣスクリーニングにより選択されたｓｃＦｖのデータベース、すなわちＱＣデータベースとの間で比較される。図５で図説されるように、変動性値（例えばシンプソンの指数値）を、第一の（例えば生殖細胞系）データベース内のフレームワーク位置に割り当てることができ、それは図５では"Ｇ"値と呼ばれ、かつ変動性値（例えばシンプソンの指数値）を、第二のデータベース（例えばＱＣデータベース）内の相応のフレームワーク位置に割り当てることができ、それは図５では"Ｑ"値として呼ばれる。Ｇ値が特定の位置でＱ値よりも大きい場合に（すなわち、生殖細胞系配列においてその位置で選択されたｓｃＦｖの配列におけるよりも変動性が高い場合に）、これは、その位置には制限された数の安定なｓｃＦｖフレームワークアミノ酸残基が存在することを示しており、その安定なｓｃＦｖフレームワークアミノ酸残基は、任意のＣＤＲで使用するために好適なことがある。選択的に、Ｇ値が特定の位置でＱ値よりも小さい場合に（すなわち、選択されたｓｃＦｖの配列においてその位置で生殖細胞系配列におけるよりも変動性が高い場合に）、これは、その特定の位置がｓｃＦｖにおいて変動性の許容性が高いことを示し、こうしてその位置は、アミノ酸置換によってｓｃＦｖの安定性及び／又は可溶性が最適化されうる位置を表すことがある。表Ａは、アミノ酸位置の番号と、高度に変動性のフレームワーク残基（ｈｖＦＲ）であってＧがＱより大きいかＧがＱより小さいかのいずれかである残基のまとめ表である。表Ａに示されるように、アミノ酸の全番号（Ａａ＃）における変動性と、高度に変動性のフレームワーク残基（ｈｖＦＲ）における変動性は、生殖細胞系とＱＣ−ＦＷとの間で大きく高まった。表Ａの作製のために分析された配列は、ＱＣアッセイ（ＷＯ０３０９７６９７号に記載される；ここでは"Ｑ"として呼称される）を使用して選択された約９０のｓｃＦｖの配列と、２００７年１０月にｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ／ａｎｔｉｂｏｄｙ／Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌから検索された全ての生殖細胞系のＶH及びＶLの配列であった。表Ａの分析のためには、ＶH及びＶLのドメインは、そのサブタイプによって群分けしなかった。
【０１０７】
表Ａ：まとめ表
【表１】
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【０１０８】
上記を考慮すると、更にもう一つの態様においては、本発明は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）であって該ｓｃＦｖがＶH及びＶLのアミノ酸配列を有するものにおける突然変異のために１もしくはそれより多くのフレームワークアミノ酸位置を割り出す方法において：
ａ）ＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列（例えば生殖細胞系及び／又は成熟の抗体の配列）の第一のデータベースを提供すること；
ｂ）少なくとも１つの所望の機能的特性を有するものとして選択されたｓｃＦｖ抗体のＶH、ＶLもしくはＶH及びＶLのアミノ酸配列の第二のデータベースを提供すること；
ｃ）第一のデータベースの各フレームワーク位置と第二のデータベースの各フレームワーク位置でのアミノ酸変動性を決定すること；
ｄ）アミノ酸の変動性の度合いが第一のデータベースと第二のデータベースとの間で異なる１もしくはそれより多くのフレームワーク位置を割り出すことで、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）における突然変異のための１もしくはそれより多くのフレームワークアミノ酸位置を割り出すこと
を含む方法を提供する。
【０１０９】
好ましくは、各フレームワーク位置でのアミノ酸変動性は、シンプソンの指数を使用した保存の度合いの割り当てによって決定される。一実施態様においては、１もしくはそれより多くのフレームワークアミノ酸位置は、第一のデータベースと比較した場合により低いシンプソンの指数値を第二の（ｓｃＦｖ）データベース中で有する１もしくはそれより多くのフレームワークアミノ酸位置に基づいて突然変異のために割り出される。もう一つの実施態様においては、１もしくはそれより多くのフレームワークアミノ酸位置は、第一のデータベース（例えば生殖細胞系データベースもしくは成熟抗体データベース）と比較した場合により高いシンプソンの指数値を第二のデータベース中で有する１もしくはそれより多くのフレームワークアミノ酸位置に基づいて突然変異のために割り出される。
【０１１０】
３種のヒトのＶHファミリーと３種のヒトのＶLファミリーについての、変動性分析及び突然変異のための残基の割り出しは、更に詳細に実施例２及び３で以下に記載する。
【０１１１】
濃縮／排除分析
もう一つの態様においては、本発明は、（例えば安定性及び／又は可溶性などの機能特性を改善するために）イムノバインダー内の関連のフレームワーク位置で好ましいアミノ酸残基置換を選択するための（又は選択的に、特定のアミノ酸置換を排除するための）方法を提供する。本発明の方法は、抗体配列の第一のデータベース（例えばＶｂａｓｅ及び／又はＩＭＧＴなどの生殖細胞系データベースもしくは、より好ましくはＫａｂａｔデータベース（ＫＢＤ）などの成熟抗体データベース）における関連のフレームワーク位置でのアミノ酸残基の頻度と、１もしくはそれより多くの所望の特性を有するものとして選択されたｓｃＦｖの第二のデータベース、例えば酵母におけるＱＣスクリーニングによって選択されたｓｃＦｖのデータベース、すなわちＱＣデータベースにおける相応のアミノ酸位置でのアミノ酸残基の頻度とを比較する。
【０１１２】
所定の位置のアミノ酸残基を、コンセンサス配列のアミノ酸残基に対して突然変異させるために確立された方法に反して、驚くべきことに、"機能的コンセンサス"アプローチは、改善された所望の機能特性を有する抗体をもたらすことが判明した。これは、選択されたフレームワーク中で一定の変動性の度合いを本来示す高度に保存された位置が、無作為突然変異誘発に許容性であるべきであり、かつｓｃＦｖ形式の本来の残基より優れた代替アミノ酸を見出す確率の増大を表すという事実によることがある。更に、稀なアミノ酸についての顕著な優先性は、一定の残基に対する自然選択の指標である。これらの２つの統計的指針に基づき、重鎖と軽鎖の中の種々の残基を、浮動性位置（変動許容性）もしくは好ましい置換（普通でない残基）のいずれかとして選択できる。
【０１１３】
ある特定のアミノ酸残基の相対頻度が、第一のデータベース、すなわち生殖細胞系データベース及び／又は成熟抗体データベースに対して望ましい機能的特徴を有する配列を含む第二のデータベースにおいて増大する場合に、それぞれの残基は、所定の位置で、ｓｃＦｖの安定性及び／又は可溶性を改善するために好ましい残基であると見なされる。その反対に、ある特定のアミノ酸残基の相対頻度が、第二のデータベースにおいて第一のデータベースと比較して低下した場合に、そのそれぞれの残基を、その位置でのｓｃＦｖ形式の状況で好ましくないものと見なす。
【０１１４】
以下の実施例４に詳細に説明されるように、第一のデータベース（例えば成熟抗体配列のデータベース）からの抗体配列（例えばＶHもしくはＶL配列）は、それらのＫａｂａｔファミリーサブタイプ（例えばＶＨ１ｂ、ＶＨ３など）により群分けされうる。各配列サブタイプ（すなわちサブファミリー）内で、各アミノ酸位置での各アミノ酸残基（例えばＡ、Ｖなど）の頻度は、そのサブタイプの全ての分析された配列のパーセンテージとして決定される。同じことが、第二のデータベース（すなわち、１もしくはそれより多くの所望の特性を有するものとして、例えばＱＣスクリーニングによって選択されたｓｃＦｖのデータベース）の全ての配列について行われる。各サブタイプについて、特定の位置での各アミノ酸残基型について得られたパーセンテージ（相対頻度）は、第一のデータベースと第二のデータベースとの間で比較される。ある特定のアミノ酸残基の相対頻度が、第二のデータベース（例えばＱＣデータベース）において第一のデータベース（例えばＫａｂａｔデータベース）に対して高められている場合に、これは、それぞれの残基が有利に選択され（すなわち"濃縮された残基"）、該配列に好ましい特性を付与することを示している。反対に、該アミノ酸残基の相対頻度が第二のデータベースにおいて第一のデータベースに対して低下されている場合に、これは、それぞれの残基が有利ではない（すなわち"排除された残基"）ことを示している。従って、濃縮された残基は、イムノバインダーの機能特性（例えば安定性及び／又は可溶性）を改善するために好ましい残基である一方で、排除された残基は、好ましくは回避される。
【０１１５】
前記を考慮して、一実施態様においては、本発明は、イムノバインダーの特定の位置における置換のためのアミノ酸残基を割り出す方法であって：
ａ）群分けされたＶH及び／又はＶLのアミノ酸配列（例えばＫａｂａｔファミリーサブタイプにより群分けされた生殖細胞系及び／又は成熟抗体の配列）の第一のデータベースを提供すること；
ｂ）少なくとも１つの所望の機能特性を有するものとして（例えばＱＣアッセイにより）選択された群分けされたｓｃＦｖ抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列の第二のデータベースを提供すること；
ｃ）第一のデータベースのフレームワーク位置と第二のデータベースの相応のフレームワーク位置とでのアミノ酸残基についてのアミノ酸頻度を決定すること；
ｄ）該アミノ酸を、そのアミノ酸残基が第一のデータベースに対してより高い頻度で第二のデータベースに出現する場合に（すなわち、濃縮された残基）、イムノバインダーの相応のアミノ酸位置での置換のために好ましいアミノ酸残基として割り出すこと
を含む方法を提供する。
【０１１６】
第二の（ｓｃＦｖ）データベース（例えばＱＣデータベース）におけるアミノ酸残基の濃縮は、定量することができる。例えば、第二のデータベース内の残基の相対頻度（ＲＦ２）を第一のデータベース内の残基の相対頻度（ＲＦ１）との間の比率を測定することができる。この比率（ＲＦ２：ＲＦ１）を、"濃縮係数"（ＥＦ）と呼ぶことがある。従って、ある特定の実施態様においては、工程（ｄ）でのアミノ酸残基は、第一のデータベースと第二のデータベースとの間のアミノ酸残基の相対頻度の比率（ここでは、"濃縮係数"）が少なくとも１（例えば１〜１０）である場合に割り出される。好ましい一実施態様においては、濃縮係数は、１．０より大きいもしくは約１．０（例えば、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４もしくは１．５）である。なおももう一つの好ましい実施態様においては、濃縮係数は、約４．０〜約６．０である（例えば、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９もしくは６．０）。もう一つの実施態様においては、濃縮係数は、約６．０〜約８．０である（例えば、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９もしくは８．０）。他の実施態様においては、濃縮係数は、１０より大きい（例えば、１０、１００、１０００、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、１０9もしくはそれより大きい）。ある一定の実施態様においては、無限大の濃縮係数が達成されることがある。
【０１１７】
もう一つの実施態様においては、本発明は、イムノバインダーから特定の位置で排除されるべきアミノ酸残基を割り出す方法であって：
ａ）群分けされたＶH及び／又はＶLのアミノ酸配列（例えばＫａｂａｔファミリーサブタイプにより群分けされた生殖細胞系及び／又は成熟抗体の配列）の第一のデータベースを提供すること；
ｂ）少なくとも１つの所望の機能特性を有するものとして（例えばＱＣアッセイにより）選択された群分けされたｓｃＦｖ抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列の第二のデータベースを提供すること；
ｃ）第一のデータベースのフレームワーク位置と第二のデータベースの相応のフレームワーク位置とでのアミノ酸残基についてのアミノ酸頻度を決定すること；
ｄ）該アミノ酸を、そのアミノ酸残基が第一のデータベースに対してより低い頻度で第二のデータベースに出現する場合に、イムノバインダーの相応のアミノ酸位置での置換のために好ましくないアミノ酸残基として割り出すこと（その際、前記のアミノ酸残基の種類は好ましくないアミノ酸残基（すなわち排除された残基）である）
を含む方法を提供する。
【０１１８】
ある特定の好ましい実施態様においては、前記の工程ｄ）における好ましくないアミノ酸残基は、濃縮係数（ＥＦ）が１未満である場合に割り出される。更に、本発明は、ＶH及び／又はＶLのアミノ酸配列を有するイムノバインダーを改善する方法であって：
ａ）突然変異のための１もしくはそれより多くのフレームワークアミノ酸位置を割り出す工程；
ｂ）工程ａ）で割り出されたそれぞれの特定のフレームワーク位置について、置換のために好ましいアミノ酸残基を割り出す工程；及び
ｃ）それぞれの特定のフレームワーク位置のアミノ酸残基を、工程ｂ）で割り出された好ましいアミノ酸残基へと突然変異させる工程
を含む方法を提供する。好ましくは、工程ａ）は、所定のフレームワーク位置での変動性の度合いを、本願に開示される方法に従って決定することによって、すなわち保存の度合いをシンプソンの指数を使用してそれぞれのフレームワーク位置に割り当てることによって実施される。置換に適したアミノ酸は、好ましくは、前記に開示された方法に従って割り出される。それは、少なくとも１の濃縮係数、より好ましくは少なくとも４〜６の濃縮係数を有する。イムノバインダーの相応のアミノ酸残基を次いで、当該技術分野で公知の分子生物学的方法を使用して好ましいアミノ酸残基に突然変異させる。該イムノバインダーは、好ましくはｓｃＦｖ抗体、全長免疫グロブリン、Ｆａｂフラグメント、Ｄａｂもしくはナノボディーである。
【０１１９】
ｓｃＦｖの突然変異
本発明の方法において、ｓｃＦｖ内の１もしくはそれより多くのアミノ酸位置がｓｃＦｖの機能特性に関して潜在的に問題があるものと割り出された場合に、該方法は、更に、これらの１もしくはそれより多くのアミノ酸位置を、ｓｃＦｖのＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内で突然変異することを含むことができる。例えば、突然変異について割り出されたアミノ酸位置は、データベースの抗体のＶHもしくはＶL内の相応の位置で保存もしくは濃縮されているアミノ酸残基で置換することができる。
【０１２０】
突然変異について割り出されたアミノ酸位置は、当該技術分野で十分に確立された幾つかの考えられる突然変異誘発法の１つを使用して突然変異することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発を用いて、関連のアミノ酸位置での特定のアミノ酸置換をすることができる。また、部位特異的突然変異誘発を用いて、限られたレパートリーのアミノ酸置換が関連のアミノ酸位置に導入された突然変異されたｓｃＦｖ一組を作製することもできる。
【０１２１】
加えて又は代わりに、突然変異について割り出されたアミノ酸位置を無作為なもしくは指向的な突然変異誘発によって突然変異させて、突然変異されたｓｃＦｖのライブラリーを作製し、引き続き前記の突然変異されたｓｃＦｖのライブラリーをスクリーニングし、そしてｓｃＦｖを選択する、好ましくは少なくとも１つの改善された機能特性を有するｓｃＦｖを選択することができる。好ましい一実施態様においては、該ライブラリーは、還元性の環境において高められた安定性及び／又は可溶性を有するｓｃＦｖフレームワークの選択を可能にする、酵母クオリティー・コントロールシステム（ＱＣシステム）（前記にさらに詳細に記載される）を使用してスクリーニングされる。
【０１２２】
ｓｃＦｖライブラリーをスクリーニングするための他の好適な選択技術は、制限されないが、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ及び酵母ディスプレイ（Ｊｕｎｇ他（１９９９年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：１６３−１８０；Ｗｕ他（１９９９年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：１５１−１６２；Ｓｃｈｉｅｒ他（１９９６年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５：２８−４３）などのディスプレイ技術を含む、当該技術分野で記載されている。
【０１２３】
一実施態様においては、突然変異について割り出されたアミノ酸位置は、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置で最も高く濃縮されているアミノ酸残基で置換されている。もう一つの実施態様において、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置は、疎水性アミノ酸残基で保存され、かつｓｃＦｖ内で突然変異のために割り出されたアミノ酸位置は、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置で最も高く濃縮されている疎水性アミノ酸残基で置換されている。なおももう一つの実施態様において、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置は、親水性アミノ酸残基で保存され、かつｓｃＦｖ内で突然変異のために割り出されたアミノ酸位置は、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置で最も高く濃縮されている親水性アミノ酸残基で置換されている。なおももう一つの実施態様において、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置は、水素結合を形成可能なアミノ酸残基で保存され、かつｓｃＦｖ内で突然変異のために割り出されたアミノ酸位置は、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置で最も高く濃縮されている水素結合を形成可能なアミノ酸残基で置換されている。更にもう一つの実施態様において、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置は、β−シートを形成する性向を有するアミノ酸残基で保存され、かつｓｃＦｖ内で突然変異のために割り出されたアミノ酸位置は、データベースの抗体のＶHもしくはＶLのアミノ酸配列内の相応の位置で最も高く濃縮されているβ−シートを形成する性向を有するアミノ酸残基で置換されている。
【０１２４】
一実施態様においては、全体の自由エネルギーを最小化する最良の置換は、１もしくはそれより多くの関連のアミノ酸位置でなされるべき突然変異として選択される。全体の自由エネルギーを最小化する最良の置換は、ボルツマンの法則を用いて決定できる。ボルツマンの法則のための式は、ΔΔＧth＝ＲＴｌｎ（ｆ親／ｆコンセンサス）である。
【０１２５】
潜在的に安定化する突然変異の役割は、更に、例えば局所的な及び非局所的な相互作用、カノニカル残基、インターフェース、曝露度及びβ−ターン性の調査によって決定できる。当該技術分野で知られる分子モデリング方法は、例えば、潜在的に安定化する突然変異の役割を更に調査するにあたり適用できる。また、１パネルの考えられる置換が考慮される場合に、分子モデリング方法を用いて、"最適な"アミノ酸置換を選択することができる。
【０１２６】
特定のアミノ酸位置に依存して、更なる分析を保証することができる。例えば、残基は、重鎖と軽鎖との間の相互作用に関連することがあり、又は塩橋もしくは水素結合により他の残基と相互作用することがある。これらの場合に、特定の分析が必要となることがある。本発明のもう一つの実施態様においては、安定性のための潜在的に問題のある残基は、共変ペア中のカウンターパートと適合性のあるものと変更することができる。選択的に、そのカウンターパートの残基を突然変異させて、問題があるものとして最初に割り出されたアミノ酸と適合させることができる。
【０１２７】
可溶性最適化
ｓｃＦｖ抗体中の可溶性について潜在的に問題のある残基は、ｓｃＦｖ中の溶媒曝露される疎水性アミノ酸を含むが、それは、全長抗体の場合には、可変ドメインと定常ドメインとの間のインターフェースで覆い隠されている。定常ドメインを欠くエンジニアリングされたｓｃＦｖにおいては、可変ドメインと定常ドメインとの間の相互作用に関与する疎水性残基は、溶媒曝露されることとなる（例えばＮｉｅｂａ他（１９９７年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１０：４３５−４４を参照）。ｓｃＦｖの表面上のこれらの残基は、凝集を生ずるので、可溶性の問題を引き起こす傾向にある。
【０１２８】
ｓｃＦｖ抗体で溶媒曝露される疎水性アミノ酸を交換することについて多くのストラテジーが記載されている。当業者によく知られているように、ある特定の位置での残基の改変は、安定性、可溶性及び親和性などの抗体の生物物理的特性に影響する。多くの場合に、これらの特性は相互関係を有する。それは、１つの単独アミノ酸の変化が、幾つかの前記の特性に影響しうることを意味する。従って、溶媒曝露される疎水性残基を非保存的に突然変異させることによって、安定性が低下し、かつ／又はその抗原に対する親和性が失われることがある。
【０１２９】
他のアプローチは、タンパク質ディスプレイ技術の徹底した使用及び／又はスクリーニングの労力によって可溶性の問題を解決することを意図している。しかし、斯かる方法は時間を費やすものであり、しばしば、可溶性タンパク質を得ることに失敗するか、又は抗体のより低い安定性又はその親和性の低下が生ずる。本発明においては、溶媒曝露される疎水性残基を、配列に基づく分析を用いて、より高い親水性を有する残基へと突然変異することを設計する方法が開示される。潜在的に問題のある残基は、特定の位置で最も頻出する親水性アミノ酸を選択することによって交換することができる。ある残基が、抗体中の任意の他の残基と相互作用することが判明したら、その潜在的に問題のある残基は、最も頻出する残基ではなく、共変ペアの第二のアミノ酸と適合しうるものへと突然変異させることができる。選択的に、共変ペアの第二のアミノ酸は、アミノ酸の組み合わせの復元のために突然変異させることもできる。更に、配列間の類似性のパーセンテージは、２つの相互関係を有するアミノ酸の最適な組み合わせを見出すのを補助するために考慮することができる。
【０１３０】
ｓｃＦｖの表面上の疎水性アミノ酸は、制限されないが、溶媒曝露、実験情報及び配列情報並びに分子モデリングを基礎とするアプローチを含む幾つかのアプローチを使用して割り出される。
【０１３１】
本発明の一実施態様においては、可溶性は、ｓｃＦｖ抗体の表面上の曝露される疎水性残基と、データベース中のこれらの位置に存在する最も頻出する親水性残基とを交換することによって改善される。この根拠は、その頻出する残基が恐らく問題がないということによる。当業者に認められているように、保存的置換は、通常は、分子の脱安定化への影響は小さいが、一方で、非保存的置換は、ｓｃＦｖの機能的特性に有害なことがある。
【０１３２】
時として、抗体の表面上の疎水性残基は、重鎖と軽鎖との間の相互作用に関連することがあり、又は塩橋もしくは水素結合により他の残基と相互作用することがある。これらの場合に、特定の分析が必要となることがある。本発明のもう一つの実施態様においては、安定性について潜在的に問題のある残基は、最も頻出する残基へではなく、共変ペアと適合性のものへと突然変異できるか、又は第二の突然変異は、共変アミノ酸の組み合わせの復元のために実施することができる。
【０１３３】
付加的な方法は、溶媒曝露される疎水性位置での突然変異の設計に使用することができる。本発明のもう一つの実施態様においては、改変されるべきｓｃＦｖに最も高い類似性を表す配列へのデータベースの制約を使用する方法が開示される（更に前記で議論した）。斯かる制約された参照データベースを適用することによって、該突然変異は、最適化されるべき抗体の特定の配列の点で最適であるように設計される。この状況で、選択された親水性残基は、多数の配列（すなわち、制約されないデータベース）と比較した場合に、実際は、それぞれの位置で十分に現れないことがある。
【０１３４】
安定性最適化
単鎖抗体フラグメントは、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを共有結合で連結するペプチドリンカーを含む。斯かるリンカーは可変ドメインがばらばらになることを回避するのに効果的であり、それによりｓｃＦｖはＦｖフラグメントより優れたものとなるが、ｓｃＦｖフラグメントは、依然として、Ｆａｂフラグメント又は全長抗体（その両者において、ＶH及びＶLは、定常ドメインを介して間接的に結合されているにすぎない）と比較してよりアンフォールディング及び凝集の傾向にある。
【０１３５】
ｓｃＦｖにおけるもう一つの共通の問題は、分子間凝集をもたらすｓｃＦｖの表面上の疎水性残基の曝露である。更に、時として、親和性成熟のプロセスの間に獲得される体細胞突然変異は、β−シートのコアに親水性残基を配置する。斯かる突然変異は、ＩｇＧ形式であるいはＦａｂフラグメントでさえも十分に許容できるが、ｓｃＦｖにおいては、これは明らかに脱安定化と結果としてのアンフォールディングの原因となる。
【０１３６】
ｓｃＦｖ脱安定化の原因となる公知の要因には、ｓｃＦｖ抗体の表面上にある溶媒曝露される疎水性残基、該タンパク質のコアに覆い隠された普通でない親水性残基、並びに重鎖と軽鎖との間の疎水性インターフェースに存在する親水性残基が含まれる。更に、コア内の非極性残基間でのファン・デル・ワールス充填相互作用は、タンパク質安定性に重要な役割を担うことは知られている（Ｍｏｎｓｅｌｌｉｅｒ Ｅ．及びＢｅｄｏｕｅｌｌｅ Ｈ．（２００６年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６２：５８０−９３、Ｔａｎ他（１９９８年）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７５：１４７３−８２；Ｗｏｅｒｎ Ａ．及びＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ Ａ．（１９９８年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：１３１２０−７）。
【０１３７】
このように、一実施態様においては、ｓｃＦｖ抗体の安定性を高めるために、非常に保存された位置での普通でない及び／又は好ましくないアミノ酸が割り出され、そしてこれらの保存された位置でより一般的なアミノ酸へと突然変異される。斯かる普通でない及び／又は好ましくないアミノ酸には、（ｉ）ｓｃＦｖ抗体の表面上の溶媒曝露される疎水性残基；（ｉｉ）タンパク質中で覆い隠された普通でない親水性残基；（ｉｉｉ）重鎖と軽鎖との間の疎水性インターフェース中に存在する親水性残基；及び（ｉｖ）ＶH／ＶLインターフェースＶH／ＶLを立体障害によって妨害する残基が含まれる。
【０１３８】
このように、本発明の一実施態様においては、安定性の増加は、その位置で出現の乏しいアミノ酸を、これらの位置で最も頻出するアミノ酸によって置換することによって達成できる。出現頻度は、一般に、生物学的許容性の指標を提供する。
【０１３９】
残基は、重鎖と軽鎖との間の相互作用に関連することがあり、又は塩橋、水素結合もしくはジスルフィド結合により他の残基と相互作用することがある。これらの場合に、特定の分析が必要となることがある。本発明のもう一つの実施態様においては、安定性のための潜在的に問題のある残基は、共変ペア中のカウンターパートと適合性のあるものと変更することができる。選択的に、そのカウンターパートの残基を突然変異させて、問題があるものとして最初に割り出されたアミノ酸と適合させることができる。
【０１４０】
付加的な方法を用いて、安定性の改善のために突然変異を設計することができる。本発明のもう一つの実施態様においては、改変されるべきｓｃＦｖに最も高い類似性を表す配列へのデータベースの制約を使用する方法が開示される（更に前記で議論した）。斯かる制約された参照データベースを適用することによって、該突然変異は、最適化されるべき抗体の特定の配列の点で最適であるように設計される。該突然変異は、データベース配列の選択されたサブセットに存在する最も頻出するアミノ酸を使用する。この状況で、選択された残基は、多数の配列（すなわち、制約されないデータベース）と比較した場合に、実際は、それぞれの位置で十分に現れないことがある。
【０１４１】
ｓｃＦｖ組成物及び製剤
本発明のもう一つの態様は、本発明の方法により製造されたｓｃＦｖ組成物に関する。このように、本発明は、エンジニアリングされたｓｃＦｖ組成物であって、関連の当初のｓｃＦｖと比較して１もしくはそれより多くの突然変異が導入されている組成物を提供し、その際、前記突然変異は、１もしくはそれより多くの生物学的特性、例えば安定性もしくは可溶性に影響することが予測される位置、特に１もしくはそれより多くのフレームワーク位置に導入される。一実施態様においては、ｓｃＦｖは、１つの突然変異されたアミノ酸位置（例えば、１つのフレームワーク位置）を含むようにエンジニアリングされている。他の実施態様においては、ｓｃＦｖは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０つもしくは１０つより多くの突然変異されたアミノ酸位置（例えば、フレームワーク位置）を含むようにエンジニアリングされている。
【０１４２】
本発明のもう一つの態様は、本発明のｓｃＦｖ組成物の医薬品製剤に関する。斯かる製剤は、一般に、ｓｃＦｖ組成物と製剤学的に認容性の担体を含む。本願で使用される"製剤学的に認容性の担体"には、生理学的に適合可能な、いずれかの及びあらゆる溶剤、分散媒、コーティング、抗微生物剤及び抗菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、担体は、例えば静脈内の、筋内の、皮下の、非経口の、脊髄の、表皮の投与（例えば、注射もしくは点滴による）又は局所（例えば目もしくは皮膚への）に適している。投与経路に応じて、ｓｃＦｖは、該化合物を、酸の作用と、該化合物を不活性化しうる他の中性条件から保護するための材料でコーティングされてよい。
【０１４３】
本発明の医薬化合物には、１もしくはそれより多くの製剤学的に認容性の塩が含まれうる。"製剤学的に認容性の塩"とは、親化合物の所望の生物学的活性を保ち、いかなる不所望な毒性学的作用を付与しない塩を指す（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．他（１９７７年）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照）。斯かる塩の例には、酸付加塩及び塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、非毒性の無機酸、例えば塩化水素酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸など、並びに非毒性の有機酸、例えば脂肪族のモノカルボン酸及びジカルボン酸、フェニル置換されたアルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族のスルホン酸などから誘導される塩が含まれる。塩基付加塩には、アルカリ土類金属、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど、並びに非毒性の有機アミン、例えばＮ，Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどから誘導される塩が含まれる。
【０１４４】
また、本発明の医薬組成物は、製剤学的に認容性の酸化防止剤を含んでよい。製剤学的に認容性の酸化防止剤の例には、（１）水溶性の酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、システイン塩酸、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油溶性の酸化防止剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど、並びに（３）金属キレート化剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが含まれる。
【０１４５】
本発明の医薬組成物で使用できる好適な水性の及び非水性の担体の例には、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物、植物油、例えばオリーブ油及び注入可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルが含まれる。適切な流動性は、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散液の場合には必要な粒度の維持によって、かつ界面活性剤の使用によって維持することができる。
【０１４６】
また、これらの組成物は、助剤、例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤を含有してもよい。微生物の存在の抑制は、滅菌手法（上記）によって、かつ様々な抗微生物剤及び抗菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含むことによって保証することができる。また、等張剤、例えば糖類、塩化ナトリウムなどを該組成物に含ませることも望ましいことがある。更に、注入可能な医薬品形の延長された吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅延させる剤を含むことによってもたらすことができる。
【０１４７】
製剤学的に認容性の担体には、滅菌の水溶液もしくは水性分散液及び滅菌の注射可能な溶液もしくは分散液の即時調製物用の滅菌の粉末が含まれる。かかる媒体及び剤の製剤学的に有効な物質のための使用は、当該技術分野で公知である。任意の慣用の媒体もしくは剤が該有効化合物と不適合性である場合を除き、本発明の医薬組成物でのその使用が検討される。補助的な有効化合物を該組成物に導入することもできる。
【０１４８】
治療用組成物は、一般に、滅菌されており、かつ製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならない。該組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム又は高い薬剤濃度に適した他の規則構造物として製剤化することができる。担体は、溶剤もしくは分散媒であって、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール及び液状ポリエチレングリコールなど）を含有するもの、並びにそれらの好適な混合物であってよい。適切な流動性は、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒度の維持によって、かつ界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合に、等張剤、例えば糖類、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトールもしくは塩化ナトリウムが該組成物中に含まれることが好ましい。注射可能な組成物の延長された吸収は、該組成物中に、吸収を遅らせる剤、例えばモノステアリン酸塩及びゼラチンを含ませることによってもたらすことができる。
【０１４９】
滅菌の注射可能な溶液は、有効化合物を必要量で好適な溶剤中に前記列挙した成分１種もしくはその組み合わせと共に導入し、所望であれば、引き続き滅菌精密濾過を行うことによって製造することができる。一般に、分散液は、有効化合物を、基礎分散媒と前記列挙したものからの必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクル中に導入することによって製造される。滅菌の注射可能な溶液の製造のための滅菌粉末の場合には、好ましい製造方法は、真空乾燥及び凍結乾燥（凍結乾燥）であり、それにより事前に滅菌濾過された溶液から有効成分と任意の付加的な所望の成分との粉末が得られる。
【０１５０】
担体材料と組み合わせて単独の剤形を生成できる有効成分の量は、処置される被験体と、特定の投与様式とに応じて変動する。担体材料と組み合わせて単独の剤形を生成できる有効成分の量は、一般に、治療効果を生ずる組成物の量である。一般に、１００パーセントから外れて、この量は、製剤学的に認容性の担体と組み合わせて、約０．０１パーセントないし約９９パーセントの有効成分、好ましくは約０．１パーセントないし約７０パーセント、最も好ましくは約１パーセントないし約３０パーセントの有効成分である。
【０１５１】
投与計画は、最適な所望の応答（例えば治療応答）が提供されるように調節される。例えば、単独のボーラスを投与してよく、幾つかの分割された用量を経時的に投与してよく、あるいは治療状況の緊急性によって指示される場合にはその用量は比例的に低減もしくは増加させてよい。特に、投与を容易にし、かつ投薬を均一にするために、非経口組成物を投与単位剤形で製剤化することが特に好ましい。本願で使用される投与単位剤形とは、処置されるべき被験体のために単位投与量として適合された物理的に別個の単位を指す；それぞれの単位は、必要な医薬品担体と組み合わせて所望の治療効果をもたらすように計算された予め決められた量の有効化合物を含有する。本発明の投与単位剤形についての仕様は、（ａ）有効化合物の独特の特徴及び達成されるべき特定の治療効果と、（ｂ）個体における感受性の処置のためにかかる有効化合物を配合する技術につきものの制限とによって規定され、かつそれらに直接的に依存する。
【０１５２】
"機能的コンセンサス"アプローチを基礎とするイムノバインダーエンジニアリング
実施例２及び３で詳細に説明されるように、本願に記載される"機能的コンセンサス"アプローチは、改善された特性について選択されたｓｃＦｖ配列のデータベースを使用してフレームワーク位置の変動性を分析するものであるが、それは、生殖細胞系データベース及び／又は成熟抗体データベースにおける同じ位置での変動性と比較することで、変動性に許容性が高いか低いかのいずれかであるアミノ酸位置の割り出しを可能にする。実施例５及び６で詳細に説明されるように、サンプルのｓｃＦｖ内のある特定のアミノ酸位置を生殖細胞系のコンセンサス残基に逆突然変異させることで、中性のもしくは有害な作用が奏され、その一方で、"機能的コンセンサス"を含むｓｃＦｖ変異体は、野生型のｓｃＦｖ分子と比較して高められた熱安定性を示す。従って、ここで機能的コンセンサスアプローチを通じて割り出されたフレームワーク位置は、ｓｃＦｖの機能特性を変更する、好ましくは改善するための、ｓｃＦｖ改変のための好ましい位置である。本願で使用される場合に、用語"機能特性"とは、例えば改善された安定性、改善された可溶性、非凝集、発現の改善、封入体精製工程に引き続く再フォールディング率における改善又は前記の改善の２もしくはそれより多くの組み合わせを指す。好ましくは、ｓｃＦｖの機能特性の改善は、抗原結合親和性の改善を含まない。
【０１５３】
実施例３で第３表〜第８表に示されるように、以下のフレームワーク位置が、示されたＶHもしくはＶL配列における改変のために好ましい位置として割り出された（以下に使用される番号付けは、ＡＨｏナンバリングシステムである；ＡＨｏナンバリングをＫａｂａｔシステムのナンバリングに変換する変換表は、実施例１の第１表及び第２表に示される）：
ＶＨ３：アミノ酸位置１、６、７、８９及び１０３；
ＶＨ１ａ：アミノ酸位置１、６、１２、１３、１４、１９、２１、９０、９２、９５及び９８；
ＶＨ１ｂ：アミノ酸位置１、１０、１２、１３、１４、２０、２１、４５、４７、５０、５５、７７、７８、８２、８６、８７及び１０７；
Ｖκ１：アミノ酸位置１、３、４、２４、４７、５０、５７、９１及び１０３；
Ｖκ３：アミノ酸位置２、３、１０、１２、１８、２０、５６、７４、９４、１０１及び１０３；並びに
Ｖλ１：アミノ酸位置１、２、４、７、１１、１４、４６、５３、８２、９２及び１０３。
【０１５４】
従って、これらのアミノ酸位置の１もしくはそれより多くを、ｓｃＦｖ分子などのイムノバインダーにおけるエンジニアリングのために選択して、それにより該イムノバインダーの変異体（すなわち変異された）形を生成できる。好ましくは、該エンジニアリングは、抗原結合親和性に影響を及ぼすことなく、１もしくはそれより多くの改善された機能特性を有するイムノバインダーをもたらす。好ましい一実施態様において、得られたイムノバインダーは、改善された安定性及び／又は可溶性の特徴を有する。このように、なおももう一つの態様においては、本発明は、イムノバインダーをエンジニアリングする方法、特に（ｉ）ＶＨ３、ＶＨ１ａもしくはＶＨ１ｂのドメインタイプの重鎖可変領域もしくはそれらのフラグメントであってＶHフレームワーク残基を含む領域及び／又は（ｉｉ）Ｖκ１、Ｖκ３もしくはＶλ１のドメインタイプの軽鎖可変領域もしくはそれらのフラグメントであってＶLフレームワーク残基を含む領域を含むイムノバインダーの１もしくはそれより多くの機能特性を改善するための方法であって：
ａ）突然変異のためにイムノバインダー内の１もしくはそれより多くのアミノ酸位置を選択すること；及び
ｂ）突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置を突然変異させること
を含み、その際、前記突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置は、
（ｉ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ３のアミノ酸位置１、６、７、８９及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、６、７、７８及び８９）；
（ｉｉ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ１ａのアミノ酸位置１、６、１２、１３、１４、１９、２１、９０、９２、９５及び９８（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、６、１１、１２、１３、１８、２０、７９、８１、８２ｂ及び８４）；
（ｉｉｉ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ１ｂのアミノ酸位置１、１０、１２、１３、１４、２０、２１、４５、４７、５０、５５、７７、７８、８２、８６、８７及び１０７（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、９、１１、１２、１３、１９、２０、３８、４０、４３、４８、６６、６７、７１、７５、７６及び９３）；
（ｉｖ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶκ１のアミノ酸位置１、３、４、２４、４７、５０、５７、９１及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、３、４、２４、３９、４２、４９、７３及び８５）；
（ｖ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶκ３のアミノ酸位置２、３、１０、１２、１８、２０、５６、７４、９４、１０１及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置２、３、１０、１２、１８、２０、４８、５８、７６、８３及び８５）；及び
（ｖｉ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶλ１のアミノ酸位置１、２、４、７、１１、１４、４６、５３、８２、９２及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、２、４、７、１１、１４、３８、４５、６６、７４及び８５）
からなる群から選択される前記方法を提供する。
【０１５５】
好ましい一実施態様においては、該方法は、イムノバインダーの１もしくはそれより多くの機能特性を改善するが、但し、ｓｃＦｖの１もしくはそれより多くの機能特性は、抗原結合親和性における改善を含まない。
【０１５６】
もう一つの好ましい実施態様においては、突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置は、ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ３のアミノ酸位置１、６、７、８９及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、６、７、７８及び８９）からなる群から選択される。
【０１５７】
もう一つの好ましい一実施態様においては、突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置は、ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ１ａのアミノ酸位置１、６、１２、１３、１４、１９、２１、９０、９２、９５及び９８（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、６、１１、１２、１３、１８、２０、７９、８１、８２ｂ及び８４）からなる群から選択される。
【０１５８】
もう一つの好ましい一実施態様においては、突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置は、ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ１ｂのアミノ酸位置１、１０、１２、１３、１４、２０、２１、４５、４７、５０、５５、７７、７８、８２、８６、８７及び１０７（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、９、１１、１２、１３、１９、２０、３８、４０、４３、４８、６６、６７、７１、７５、７６及び９３）からなる群から選択される。
【０１５９】
もう一つの好ましい実施態様においては、突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置は、ＡＨｏナンバリングを使用したＶκ１のアミノ酸位置１、３、４、２４、４７、５０、５７、９１及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、３、４、２４、３９、４２、４９、７３及び８５）からなる群から選択される。
【０１６０】
もう一つの好ましい実施態様においては、突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置は、ＡＨｏナンバリングを使用したＶκ３のアミノ酸位置２、３、１０、１２、１８、２０、５６、７４、９４、１０１及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置２、３、１０、１２、１８、２０、４８、５８、７６、８３及び８５）からなる群から選択される。
【０１６１】
もう一つの好ましい実施態様においては、突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置は、ＡＨｏナンバリングを使用したＶλ１のアミノ酸位置１、２、４、７、１１、１４、４６、５３、８２、９２及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、２、４、７、１１、１４、３８、４５、６６、７４及び８５）からなる群から選択される。
【０１６２】
様々な実施態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくは２０より多くの前記のアミノ酸位置が突然変異のために選択される。
【０１６３】
なおももう一つの態様においては、本発明は、（ｉ）ＶＨ３、ＶＨ１ａもしくはＶＨ１ｂのドメインタイプの重鎖可変領域もしくはそれらのフラグメントであってＶHフレームワーク残基を含む領域及び／又は（ｉｉ）Ｖκ１、Ｖκ３もしくはＶλ１のドメインタイプの軽鎖可変領域もしくはそれらのフラグメントであってＶLフレームワーク残基を含む領域を含むイムノバインダーの安定性及び／又は可溶性の特性を改善する方法であって：
ａ）突然変異のためにイムノバインダー内の１もしくはそれより多くのアミノ酸位置を選択すること；及び
ｂ）突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置を突然変異させること
を含み、その際、前記突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置は、
（ｉ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ３のアミノ酸位置１、８９及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、７８及び８９）；
（ｉｉ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ１ａのアミノ酸位置１、１２、１３、１４、１９、２１、９０、９２、９５及び９８（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、１１、１２、１３、１８、２０、７９、８１、８２ｂ及び８４）；
（ｉｉｉ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ１ｂのアミノ酸位置１、１０、１２、１３、１４、２０、２１、４５、４７、５０、５５、７７、７８、８２、８６、８７及び１０７（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、９、１１、１２、１３、１９、２０、３８、４０、４３、４８、６６、６７、７１、７５、７６及び９３）；
（ｉｖ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶκ１のアミノ酸位置１、３、４、２４、４７、５０、５７及び９１（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、３、４、２４、３９、４２、４９及び７３）；
（ｖ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶκ３のアミノ酸位置２、３、１０、１２、１８、２０、５６、７４、９４及び１０１（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置２、３、１０、１２、１８、２０、４８、５８、７６及び８３）；及び
（ｖｉ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶλ１のアミノ酸位置１、２、４、７、１１、１４、４６、５３、８２及び９２（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、２、４、７、１１、１４、３８、４５、６６及び７４）
からなる群から選択される前記方法を提供する。
【０１６４】
このように、なおももう一つの態様においては、本発明は、（ｉ）ＶＨ３、ＶＨ１ａもしくはＶＨ１ｂのドメインタイプの重鎖可変領域もしくはそれらのフラグメントであってＶHフレームワーク残基を含む領域及び／又は（ｉｉ）Ｖκ１、Ｖκ３もしくはＶλ１のドメインタイプの軽鎖可変領域もしくはそれらのフラグメントであってＶLフレームワーク残基を含む領域を含むイムノバインダーの安定性及び／又は可溶性を、イムノバインダーの抗原結合親和性に影響を及ぼすことなく改善するための方法であって：
ａ）突然変異のためにイムノバインダー内の１もしくはそれより多くのアミノ酸位置を選択すること；及び
ｂ）突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置を突然変異させること
を含み、その際、前記突然変異のために選択された１もしくはそれより多くのアミノ酸位置は、
（ｉ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ３のアミノ酸位置１及び１０３（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１及び８９）；
（ｉｉ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ１ａのアミノ酸位置１、１２、１３、１４、１９、２１、９０、９５及び９８（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、１１、１２、１３、１８、２０、７９、８２ｂ及び８４）；
（ｉｉｉ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶＨ１ｂのアミノ酸位置１、１０、１２、１３、１４、２０、２１、４５、４７、５０、５５及び７７（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、９、１１、１２、１３、１９、２０、３８、４０、４３、４８及び６６）；
（ｉｖ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶκ１のアミノ酸位置１及び３（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１及び３）；
（ｖ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶκ３のアミノ酸位置２、３、１０、１２、１８、２０、９４及び１０１（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置２、３、１０、１２、１８、２０、７６及び８３）；及び
（ｖｉ）ＡＨｏナンバリングを使用したＶλ１のアミノ酸位置１、２、４、７、１１、１４、８２及び９２（Ｋａｂａｔナンバリングを使用したアミノ酸位置１、２、４、７、１１、１４、６６及び７４）
からなる群から選択される前記方法を提供する。
【０１６５】
好ましくは、イムノバインダーはｓｃＦｖであるが、他のイムノバインダー、例えば全長免疫グロブリン、Ｆａｂフラグメント、Ｄａｂ、ナノボディー又は本願に記載される任意の他の種類のイムノバインダーも該方法に従ってエンジニアリングすることができる。本発明は、また、当該エンジニアリング方法に従って製造されたイムノバインダー並びに該イムノバインダーと製剤学的に認容性の担体とを含む組成物を包含する。
【０１６６】
ある特定の例示的な実施態様においては、本発明の方法によりエンジニアリングされたイムノバインダーは、当該技術分野で認められる治療的に重要な標的抗原を結合するイムノバインダー又は治療的に重要なイムノバインダーから誘導された可変領域（ＶＬ及び／又はＶＬ領域）もしくは１もしくはそれより多くのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及び／又はＣＤＲＨ３）を含むイムノバインダーである。例えば、ＦＤＡもしくは他の規制当局によって現在承認されているイムノバインダーを、本発明による方法に従ってエンジニアリングすることができる。より具体的には、これらの例示的なイムノバインダーは、それらに制限されないが、抗ＣＤ３抗体、例えばムロモナブ（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ（登録商標）ＯＫＴ３；Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ；Ａｒａｋａｗａ他のＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，（１９９６）１２０：６５７−６６２；Ｋｕｎｇ及びＧｏｌｄｓｔｅｉｎ他のＳｃｉｅｎｃｅ（１９７９），２０６：３４７−３４９を参照）、抗ＣＤ１１抗体、例えばエファリズマブ（Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、抗ＣＤ２０抗体、例えばリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）／Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ，Ｌｏｎｄｏｎ）もしくはイブリツモマブ（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）、Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）（米国特許第５，７３６，１３７；第６，４５５，０４３；及び第６，６８２，７３４を参照）、抗ＣＤ２５（ＩＬ２Ｒα）抗体、例えばダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）もしくはバシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、抗ＣＤ３３抗体、例えばゲムツズマブ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＮＪ−米国特許第５，７１４，３５０及び第６，３５０，８６１を参照）、抗ＣＤ５２抗体、例えばアレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、抗ＧｐＩＩｂ／ｇＩＩａ抗体、例えばアブシキシマブ（ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｈｏｒｓｈａｍ，ＰＡ）、抗ＴＮＦα抗体、例えばインフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｈｏｒｓｈａｍ，ＰＡ）もしくはアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ−米国特許第６，２５８，５６２を参照）、抗ＩｇＥ抗体、例えばオマリズマブ（Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、抗ＲＳＶ抗体、例えばパリビズマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ−米国特許第５，８２４，３０７を参照）、抗ＥｐＣＡＭ抗体、例えばエドレコロマブ（Ｐａｎｏｒｅｘ（登録商標���、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）、抗ＥＧＦＲ抗体、例えばセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、Ｉｍｃｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）もしくはパニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）、Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体、例えばトランスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、抗α４インテグリン抗体、例えばナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標）、ＢｉｏｇｅｎＩｄｅｃ）、抗Ｃ５抗体、例えばエクリズマブ（Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標）、Ａｌｅｘｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃｈｅｓｉｒｅ，ＣＴ）及び抗ＶＥＧＦ抗体、例えばベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ−米国特許第６，８８４，８７９を参照）もしくはラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を含む。
【０１６７】
上記にもかかわらず、様々な実施態様において、ある特定のイムノバインダーは、本発明のエンジニアリング方法での使用から排除され、かつ／又は該エンジニアリング方法によって製造されたイムノバインダー組成物から排除される。例えば、様々な実施態様において、イムノバインダーがＰＣＴ公報ＷＯ２００６／１３１０１３号及びＷＯ２００８／００６２３５号に開示されるいずれかのｓｃＦｖ抗体もしくはその変異体、例えばＥＳＢＡ１０５又はＰＣＴ公報ＷＯ２００６／１３１０１３号及びＷＯ２００８／００６２３５号に開示されるその変異体ではないという条件がある。前記の公報のそれぞれの内容は、参照をもって本願明細書に明白に開示されたものとする。
【０１６８】
他の様々な実施態様においては、前記方法によりエンジニアリングされるべきイムノバインダーがＰＣＴ公報ＷＯ２００６／１３１０１３号もしくはＷＯ２００８／００６２３５号に開示されるいずれかのｓｃＦｖ抗体もしくはその変異体である場合に、該エンジニアリング方法により置換のために選択されうる考えられるアミノ酸位置のリストが以下のアミノ酸位置：Ｖκ１もしくはＶλ１のＡＨｏ位置４（Ｋａｂａｔ４）；Ｖκ３のＡＨｏ位置１０１（Ｋａｂａｔ８３）；ＶＨ１ａもしくはＶＨ１ｂのＡＨｏ位置１２（Ｋａｂａｔ１１）；ＶＨ１ｂのＡＨｏ位置５０（Ｋａｂａｔ４３）；ＶＨ１ｂに関するＡＨｏ位置７７（Ｋａｂａｔ６６）；ＶＨ１ｂに関するＡＨｏ位置７８（Ｋａｂａｔ６７）；ＶＨ１ｂに関するＡＨｏ位置８２（Ｋａｂａｔ７１）；ＶＨ１ｂに関するＡＨｏ位置８６（Ｋａｂａｔ７５）；ＶＨ１ｂに関するＡＨｏ位置８７（Ｋａｂａｔ７６）；ＶＨ３に関するＡＨｏ位置８９（Ｋａｂａｔ７８）；ＶＨ１ａに関するＡＨｏ位置９０（Ｋａｂａｔ７９）；及び／又はＶＨ１ｂに関するＡＨｏ位置１０７（Ｋａｂａｔ９３）のいずれかもしくは全てを含まないという条件がありうる。
【０１６９】
さらに他の様々な実施態様において、前記方法によりエンジニアリングされるべき任意のイムノバインダー及び／又は前記方法により製造された任意のイムノバインダーに関しては、該エンジニアリング方法により置換のために選択されうる考えられるアミノ酸位置のリストが、以下のアミノ酸位置：Ｖκ１もしくはＶλ１のＡＨｏ位置４（Ｋａｂａｔ４）；Ｖκ３のＡＨｏ位置１０１（Ｋａｂａｔ８３）；ＶＨ１ａもしくはＶＨ１ｂのＡＨｏ位置１２（Ｋａｂａｔ１１）；ＶＨ１ｂのＡＨｏ位置５０（Ｋａｂａｔ４３）；ＶＨ１ｂに関するＡＨｏ位置７７（Ｋａｂａｔ６６）；ＶＨ１ｂに関するＡＨｏ位置７８（Ｋａｂａｔ６７）；ＶＨ１ｂに関するＡＨｏ位置８２（Ｋａｂａｔ７１）；ＶＨ１ｂに関するＡＨｏ位置８６（Ｋａｂａｔ７５）；ＶＨ１ｂに関するＡＨｏ位置８７（Ｋａｂａｔ７６）；ＶＨ３に関するＡＨｏ位置８９（Ｋａｂａｔ７８）；ＶＨ１ａに関するＡＨｏ位置９０（Ｋａｂａｔ７９）；及び／又はＶＨ１ｂに関するＡＨｏ位置１０７（Ｋａｂａｔ９３）のいずれかもしくは全てを含まないという条件がありうる。
【０１７０】
他の実施態様
本発明は、また、米国仮特許出願第６０／９０５，３６５の添付（Ａ−Ｃ）及び米国仮特許出願第６０／９３７，１１２の添付（Ａ−Ｉ）に示される方法論、参考資料及び／又は組成物のいずれをも含むが、それらに制限されないが、割り出されるデータベース、バイオインフォマティクス、インシリコデータ操作及び解釈方法、機能的アッセイ、好ましい配列、好ましい残基の位置／変更、フレームワークの割り出しと選択、フレームワークの変更、ＣＤＲアラインメント及び統合並びに好ましい変更／突然変異を含むと解される。
【０１７１】
これらの方法論及び組成に関する更なる情報は、米国第６０／８１９，３７８号；及び同第６０／８９９，９０７号及びＰＣＴ公報ＷＯ２００８／００６２３５（発明の名称"ｓｃＦｖ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｗｈｉｃｈ Ｐａｓｓ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ａｎｄ／Ｏｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｌａｙｅｒｓ"、それぞれ２００６年７月と２００７年２月２日出願）；Ｗ００６１３１０１３号Ａ２（発明の名称"Ｓｔａｂｌｅ Ａｎｄ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ＴＮＦａ"、２００６年６月６日出願）；ＥＰ１５０６２３６号Ａ２（発明の名称"Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋｓ Ｗｈｉｃｈ Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｏｆ Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｓａｍｅ"、２００３年５月２１日出願）；ＥＰ１４７９６９４号Ａ２（発明の名称"Ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ ＳｃＦｖ ｗｉｔｈ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｔｈａｔ ｉｓ ｓｔａｂｌｅ ｉｎ ａ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ"、２０００年１２月１８日出願）；ＥＰ１２４２４５７号Ｂ１（発明の名称"Ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ Ｗｉｔｈ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ Ｔｈａｔ Ｉｓ Ｓｔａｂｌｅ Ｉｎ Ａ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ"、２０００年１２月１８日出願）；Ｗ００３０９７６９７号Ａ２（発明の名称"Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋｓ Ｗｈｉｃｈ Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｏｆ Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｓａｍｅ"、２００３年５月２１日出願）；及びＷ００１４８０１７号Ａ１（発明の名称"Ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ Ｗｉｔｈ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ Ｔｈａｔ Ｉｓ Ｓｔａｂｌｅ Ｉｎ Ａ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ"、２０００年１２月１８日出願）；並びにＨｏｎｅｇｇｅｒ他のＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７−６７０（２００１）に見出すことができる。
【０１７２】
更に、本発明は、また、他の抗体形式、例えば全長抗体もしくはそのフラグメント、例えばＦａｂ、Ｄａｂなどの発見及び／又は改善に適した方法論及び組成を含むものと解される。従って、ここで割り出された原理と残基は、広範なイムノバインダーに適用できる所望の生物物理学的及び／又は治療的な特性を達成するため選択もしくは変更に適している。一実施態様においては、治療的に関連する抗体、例えばＦＤＡ承認抗体は、ここに開示される１もしくはそれより多くの残基位置の改変によって改善される。
【０１７３】
しかしながら、本発明は、イムノバインダーのエンジニアリングに制限されない。例えば、当業者は、本発明が、他の非免疫グロブリンの結合分子、例えばそれらに制限されないが、フィブロネクチン結合分子、例えばアドネクチン（ＷＯ０１／６４９４２号及び米国特許第６，６７３，９０１号、同第６，７０３，１９９号、同第７，０７８，４９０号及び同第７，１１９，１７１号を参照）、アフィボディ（例えば米国特許第６，７４０，７３４号及び同第６，６０２，９７７号及びＷＯ００／６３２４３号を参照）、アンチカリン（リポカリンとしても公知）（ＷＯ９９／１６８７３号及びＷＯ０５／０１９２５４号を参照）、Ａドメインタンパク質（ＷＯ０２／０８８１７１号及びＷＯ０４／０４４０１１号を参照）及びアンキリン反復タンパク質、例えばダルピンもしくはロイシン反復タンパク質（ＷＯ０２／２０５６５号及びＷＯ０６／０８３２７５号を参照）のエンジニアリングに適用できると認識している。
【０１７４】
本願開示を、以下の実施例によって更に概説するが、それは更なる限定と解釈されるべきでない。本願を通して引用されている全ての図面及び全ての参考文献、特許及び公開特許出願の内容は、参照をもって本願明細書に明白に開示されたものとする。
【０１７５】
例１：  抗体位置ナンバリングシステム
この例では、抗体重鎖可変領域と軽鎖可変領域におけるアミノ酸残基位置を特定するために使用される２つの異なるナンバリングシステムに関する変換表を提供する。Ｋａｂａｔナンバリングシステムは、更にＫａｂａｔ他（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．他（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２）に説明されている。ＡＨｏナンバリングシステムは、更にＨｏｎｅｇｇｅｒ，Ａ及びＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ（２００１年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７−６７０で更に説明されている。
【０１７６】
重鎖可変領域ナンバリング
第１表：  重鎖可変ドメイン中の残基位置に関する変換表
【表２】
0005506670.tif 000003
【０１７７】
１列目、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムでの残基位置。２列目、１列目に示された位置についてのＡＨｏのナンバリングシステムにおける相応の番号。３列目、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムでの残基位置。４列目、３列目に示された位置についてのＡＨｏのナンバリングシステムにおける相応の番号。５列目、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムでの残基位置。６列目、５列目に示された位置についてのＡＨｏのナンバリングシステムにおける相応の番号。
【０１７８】
軽鎖可変領域ナンバリング
第２表：  軽鎖可変ドメイン中の残基位置に関する変換表
【表３】
0005506670.tif 000004
【０１７９】
１列目、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムでの残基位置。２列目、１列目に示された位置についてのＡＨｏのナンバリングシステムにおける相応の番号。３列目、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムでの残基位置。４列目、３列目に示された位置についてのＡＨｏのナンバリングシステムにおける相応の番号。５列目、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムでの残基位置。６列目、５列目に示された位置についてのＡＨｏのナンバリングシステムにおける相応の番号。
【０１８０】
例２：  ｓｃＦｖ配列の配列に基づく分析
この例においては、ｓｃＦｖ配列の配列に基づく分析を詳細に説明する。分析方法をまとめたフローチャートを図１に示す。
【０１８１】
ヒト免疫グロブリン配列の収集及びアラインメント
ヒトの成熟抗体及び生殖細胞系の可変ドメインの配列を、種々のデータベースから収集し、カスタマイズされたデータベースに一文字コードのアミノ酸配列として入力した。抗体配列を、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ配列アラインメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ他，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，４８（３）：４４３−５３（１９７０））のＥＸＣＥＬ実装を使用してアラインメントした。該データベースを、次いで、後続の分析と比較を容易にするために、以下のように、４つのアレイ（当初のデータソースにより）に細分した：
ＶＢａｓｅ：  ヒト生殖細胞系配列
ＩＭＧＴ：  ヒト生殖細胞系配列
ＫＤＢデータベース：  成熟抗体
ＱＣデータベース：  クオリティー・コントロールスクリーニングによって選択された選択ｓｃＦｖフレームワークを含むＥＳＢＡＴｅｃｈの内部データベース
ＱＣスクリーニングシステムと、それから選択される望ましい機能特性を有するｓｃＦｖフレームワーク配列は、更に、例えばＰＣＴ公報ＷＯ ２００１／４８０１７号；米国出願第２００１００２４８３１号；ＵＳ２００３００９６３０６号；米国特許第７，２５８，９８５号及び同第７，２５８，９８６号；ＰＣＴ公報ＷＯ２００３／０９７６９７号及び米国出願第２００６００３５３２０号に記載されている。
【０１８２】
ギャップの導入及び残基位置の命名法は、免疫グロブリン可変ドメインに関してはＡＨｏナンバリングシステムによって行った（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，Ａ．及びＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．（２００１年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７−６７０）。引き続き、フレームワーク領域とＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔ他（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．他（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２）に従って特定される。ＫＤＢデータベースにおいて７０％未満の一致を有するか又はフレームワーク領域に多重の未定の残基を含む配列を破棄した。データベース内の任意の他の配列と９５％より高い同一性を有する配列も、分析における不規則ノイズを回避するために排除した。
【０１８３】
配列のサブグループへの割り当て
抗体配列を、別個のファミリーへと、配列ホモロジーに基づく分類法に従って抗体をクラスタ化することによって分類した（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ｍ．他（１９９２年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓ．Ｃ．及びＷｉｎｔｅｒ．Ｇ．（１９９３年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：１４５６−１４６１）；Ｃｏｘ，Ｊ．Ｐ．他（１９９４年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６）。ファミリーコンセンサスに対するホモロジーのパーセンテージを、７０％の類似性に制約した。示された配列が２もしくはそれより多くの種々の生殖細胞系ファミリーの間で不一致であるか、もしくはホモロジーのパーセンテージが７０％（任意のファミリーに対して）未満であった場合に、最も近い生殖細胞系のカウンターパートを決定し、ＣＤＲ長さ、カノニカルなクラス及び定義しているサブタイプ残基を詳細に分析して、該ファミリーを正しく割り当てた。
【０１８４】
統計的分析
ファミリークラスタが定義されたら、"クオリティー・コントロール（"ＱＣ"）スクリーニング"（斯かるＱＣスクリーニングはＰＣＴ公報ＷＯ２００３／０９７６９７号に詳細に説明される）において割り出されたヒットについて統計的分析を実施した。分析は、該分析のために最小の数の配列が必要とされるので、最も代表的なファミリー（ＶＨ３、ＶＨ１ａ、ＶＨ１ｂ、Ｖκ１、Ｖκ３及びＶλ１）について可能であるに過ぎなかった。各位置ｉについての残基頻度ｆｉ（ｒ）を、特定の残基型がデータセット内で確認された回数を配列の全数で除算することによって計算した。位置的エントロピーＮ（ｉ）を、全ての位置の変動性の尺度として（Ｓｈｅｎｋｉｎ，Ｐ．Ｓ．他（１９９１年）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １１：２９７−３１３；Ｌａｒｓｏｎ，Ｓ．Ｍ．及びＤａｖｉｄｓｏｎ，Ａ．Ｒ．（２０００年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．９：２１７０−２１８０；Ｄｅｍａｒｅｓｔ，Ｓ．Ｊ．他（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５：４１−４８）、単純な豊富さよりもより多くのアミノ酸組成についての情報を提供するシステムにおける多様性の数学的尺度であるシンプソンの指数を用いて計算した。各位置ｉについての多様性の度合いを、存在する異なるアミノ酸の数と、各残基の相対存在度を考慮して計算した。
【０１８５】
【数１】
0005506670.tif 000005
【０１８６】
前記式中：Ｄは、シンプソンの指数であり、Ｎは、アミノ酸の全数であり、ｒは、各位置に存在する異なるアミノ酸の数であり、かつｎは、特定のアミノ酸型の残基の数である。
【０１８７】
選択されたＦｖフレームワークのＱＣデータベース（ＱＣスクリーニングによって選択された）を、種々の基準を用いてスクリーニングして、ユニークな特徴を定義した。該配列データベース中の種々のアレイを使用して、Ｆｖフレームワーク内の残基位置の変動性の度合いを定義し、選択されたＦｖフレームワーク中に存在する本来一般的でない変動許容な位置を割り出した。１０％と等しいかそれより高い位置的エントロピースコアの差を、閾値として定義した。付加的な位置を、所定の位置の残基が他の配列アレイに稀に確認されるアミノ酸、すなわち生殖細胞系データベース（ＶＢａｓｅ及びＩＭＧＴ）及びＫＤＢデータベースに稀に確認されるアミノ酸によって占められている場合に選択した。ある残基の挙動が真に異なることが見出された（他の配列アレイのいずれかで低いか現れない）場合に、その残基位置をユニークとして定義した。
【０１８８】
選択されたＦｖフレームワーク配列のユニークな特徴の割り出しの背後にある原理的説明は、フレームワークの証明された優れた特性と、これらの知見の改善された足場のための潜在的な使用である。選択されたフレームワーク中で一定の変動性の度合いを本来示す高度に保存された位置は、無作為突然変異誘発に許容性であるべきであり、かつｓｃＦｖ形式の本来の残基より優れた代替アミノ酸を見出す確率の増大を表すことが見込まれる。更に、稀なアミノ酸についての顕著な優先性は、一定の残基に対する自然選択の指標である。これらの２つの統計的指針に基づき、重鎖と軽鎖の中の種々の残基を、浮動性位置（変動許容性）もしくは好ましい置換（普通でない残基）のいずれかとして選択した。
【０１８９】
例３：  変動許容性の残基位置と普通でない残基の位置の割り出し
例２で上述した配列に基づくｓｃＦｖ分析アプローチを使用して、３種の重鎖可変領域ファミリー（ＶＨ３、ＶＨ１ａ及びＶＨ１ｂ）及び３種の軽鎖可変領域ファミリー（Ｖκ１、Ｖκ３及びＶλ１）を分析して、変動許容性のアミノ酸位置を割り出した。特に、シンプソンの指数を使用して計算された多様性の度合いを、前記のＶｂａｓｅ、ＩＭＧＴ、ＫＤＢ及びＱＣ（選択されたｓｃＦｖ）の４種のデータベース内の配列についての各アミノ酸位置について決定した。変動許容性のアミノ酸位置と普通でない残基のアミノ酸位置を、Ｖｂａｓｅ及びＩＭＧＴの生殖細胞系データベースについてのこれらの位置でのシンプソンの指数値における、ＱＣの選択されたｓｃＦｖデータベースと比較した差異に基づき割り出した。付加的に、関連の割り出された位置について、生殖細胞系コンセンサス残基を割り出し、そのコンセンサス残基のＱＣ及びＫＤＢのデータベースにおける頻度を決定した。
【０１９０】
重鎖可変領域ファミリーのＶＨ３、ＶＨ１ａ及びＶＨ１ｂについての変動性の分析結果を、それぞれ第３表、第４表及び第５表に以下に示す。各表に関して、それぞれの列は以下の通りである：第１列：ＡＨｏナンバリングシステムを用いたアミノ酸残基位置（Ｋａｂａｔナンバリングシステムへの変換は、例１の第１表として示された変換表を用いて行うことができる）；第２列ないし第５列：第１列に示された残基位置についてのデータベース中の各抗体アレイに関して計算された多様性；第６列：相応の生殖細胞系ファミリー及びＫＤＢのコンセンサス残基；第７列：第６列におけるコンセンサス残基に関するＫＤＢデータベースにおける相対残基頻度；並びに第８列：第６列におけるコンセンサス残基に関するＱＣの選択されたｓｃＦｖデータベースにおける相対残基頻度。
【０１９１】
第３表：  ＶＨ３ファミリーについての生殖細胞系において割り出されたコンセンサスアミノ酸の残基の変動性分析と相応の頻度
【表４】
0005506670.tif 000006
【０１９２】
第４表：  ＶＨ１ａファミリーについての生殖細胞系において割り出されたコンセンサスアミノ酸の残基の変動性分析と相応の頻度
【表５】
0005506670.tif 000007
【０１９３】
第５表：  ＶＨ１ｂファミリーについての生殖細胞系において割り出されたコンセンサスアミノ酸の残基の変動性分析と相応の頻度
【表６】
0005506670.tif 000008
【０１９４】
軽鎖可変領域ファミリーのＶκ１、Ｖκ３及びＶλ１についての変動性の分析結果を、それぞれ第６表、第７表及び第８表に以下に示す。各表に関して、それぞれの列は以下の通りである：第１列：ＡＨｏナンバリングシステムを用いたアミノ酸残基位置（Ｋａｂａｔナンバリングシステムへの変換は、例１の第１表として示された変換表を用いて行うことができる）；第２列ないし第５列：第１列に示された残基位置についてのデータベース中の各抗体アレイに関して計算された多様性；第６列：相応の生殖細胞系ファミリー及びＫＤＢのコンセンサス残基；第７列：第６列におけるコンセンサス残基に関するＫＤＢデータベースにおける相対残基頻度；並びに第８列：第６列におけるコンセンサス残基に関するＱＣの選択されたｓｃＦｖデータベースにおける相対残基頻度。
【０１９５】
第６表：  Ｖκ１ファミリーについての生殖細胞系において割り出されたコンセンサスアミノ酸の残基の変動性分析と相応の頻度
【表７】
0005506670.tif 000009
【０１９６】
第７表：  Ｖκ３ファミリーについての生殖細胞系において割り出されたコンセンサスアミノ酸の残基の変動性分析と相応の頻度
【表８】
0005506670.tif 000010
【０１９７】
第８表：  Ｖλ１ファミリーについての生殖細胞系において割り出されたコンセンサスアミノ酸の残基の変動性分析と相応の頻度
【表９】
0005506670.tif 000011
【０１９８】
前記の第３表〜第８表に示されるように、ＱＣシステム選択されたｓｃＦｖフレームワークにおける残基位置のサブセットは、生殖細胞系（ＶＢａｓｅ及びＩＭＧＴ）及び成熟抗体（ＫＤＢ）に存在しないか又は出現が不十分なある特定の残基に対して強く偏っているものと判明し、ｓｃＦｖの安定性が、クオリティー・コントロール酵母スクリーニングシステムで選択されたフレームワーク配列のユニークな特徴に基づき合理的に改善されうることが示唆された。
【０１９９】
例４：  好ましい残基の選択
ｓｃＦｖの機能特性（例えば安定性及び／又は可溶性）を改善することが知られる特定のアミノ酸位置での好ましいアミノ酸残基を選択（又は選択的にアミノ酸残基を排除）するために、成熟抗体配列のＫａｂａｔ配列からのＶＨ配列とＶＬ配列とを、そのファミリーサブタイプ（例えばＶＨ１ｂ、ＶＨ３など）によって群分けした。配列の各サブファミリー内で、各アミノ酸位置での各アミノ酸残基の頻度を、１群のサブタイプの分析された全ての配列のパーセンテージとして決定した。いわゆるＱＣシステムによって増大された安定性及び／又は可溶性について予め選択された抗体からなるＱＣデータベースの配列全てについても同じことを行った。各サブタイプに関して、Ｋａｂａｔ配列及びＱＣ配列について得られた各アミノ酸残基について得られたパーセンテージ（相対頻度）を、それぞれの相応の位置で比較した。ある特定のアミノ酸残基の相対頻度がＱＣデータベースにおいてＫａｂａｔデータベースと比較して高まった場合に、そのそれぞれの残基を、所定の位置でのｓｃＦｖの安定性及び／又は可溶性を改善するために好ましい残基と見なした。その反対に、ある特定のアミノ酸残基の相対頻度が、ＱＣデータベースにおいてＫａｂａｔデータベースと比較して低下した場合に、そのそれぞれの残基を、その位置でのｓｃＦｖ形式の状況で好ましくないものと見なした。
【０２００】
第９表は、種々のデータベースにおけるＶＨ１ｂサブタイプに関するアミノ酸位置Ｈ７８（ＡＨｏナンバリング；Ｋａｂａｔ位置Ｈ６７）での残基頻度の例示的分析を示す。第９表における列は、以下の通りである：第１列：残基型；第２列：ＩＭＧＴ生殖細胞系データベースにおける残基頻度；第３列：Ｖｂａｓｅ生殖細胞系データベースにおける残基頻度；第４列：ＱＣデータベースにおける残基頻度；第５列：Ｋａｂａｔデータベースにおける残基頻度。
【０２０１】
第９表：  ２種の生殖細胞系データベース、ＱＣデータベース及び成熟抗体のＫａｂａｔデータベースにおけるＶＨ１ｂサブタイプに関する位置７８（ＡＨｏナンバリング）での相対残基頻度
【表１０】
0005506670.tif 000012
【０２０２】
ＱＣデータベースにおいて、アラニン（Ａ）残基は、２４％の頻度で確認され、それは成熟Ｋａｂａｔデータベース（ＫＤＢ＿ＶＨ１Ｂ）における同じ残基について確認される２％の頻度の１２倍である。従って、位置Ｈ７８（ＡＨｏナンバリング）でのアラニン残基は、その位置で、ｓｃＦｖの機能特性（例えば安定性及び／又は可溶性）を増大させるために好ましい残基と見なされる。反対に、バリン（Ｖ）残基は、ＱＣデータベースにおいて４７％の相対頻度で確認され、それは、成熟Ｋａｂａｔデータベースで確認される８６％よりもかなり低く、かつ生殖細胞系データベースで同じ残基について確認される９０％より大（ＩＭＧＴ−ｇｅｒｍで９１％及びＶｂａｓｅ ｇｅｒｍで１００％）よりもかなり低い。従って、バリン残基（Ｖ）は、位置Ｈ７８でｓｃＦｖ形式の状況では好ましくない残基であると見なされた。
【０２０３】
例５：  ２つの異なるアプローチからのＥＳＢＡ１０５ ｓｃＦｖ変異体の比較
この例では、２つの異なるアプローチによって製造されたｓｃＦｖ変異体の安定性を比較した。親のｓｃＦｖ抗体は、今までに記載されていた（例えばＰＣＴ公報ＷＯ２００６／１３１０１３号及びＷＯ２００８／００６２３５号を参照）ＥＳＢＡ１０５であった。１セットのＥＳＢＡ１０５変異体は、クオリティー・コントロール酵母スクリーニングシステムを用いて選択した（"ＱＣ変異体"）。その変異体も、今までに記載されていた（例えばＰＣＴ公報ＷＯ２００６／１３１０１３号及びＷＯ２００８／００６２３５号を参照）。他の変異体のセットは、ある特定のアミノ酸位置を、前記の例２及び３で記載された配列分析によって割り出された好ましい生殖細胞系コンセンサス配列へと逆突然変異させることによって製造した。その逆突然変異は、アミノ酸配列内で、生殖細胞系配列で保存されているが、選択されたｓｃＦｖにおいて普通でないもしくは低い頻度のアミノ酸を含む位置について調査することによって選択した（生殖細胞系コンセンサスエンジニアリングアプローチと呼ぶ）。
【０２０４】
全ての変異体を、安定性について、該分子を熱誘発ストレスにかけることによって試験した。広範囲の温度（２５〜９５℃）での負荷によって、全ての変異体について、熱的アンフォールディング転移の大まかな中心点（ＴＭ）を決定することができた。野生型分子とその変異体についての熱安定性の測定は、ＦＴ−ＩＲ ＡＴＲ分光分析法によって、ＩＲ光を干渉計中に案内して実施した。測定された信号は、インターフェログラムであり、この信号でフーリエ変換を行うと、最終スペクトルは、慣用の（分散型）赤外分光分析法からのスペクトルと同一である。
【０２０５】
熱的アンフォールディングの結果を、以下の第１０表にまとめ、図６で図示する。第１０表中の列は、以下の通りである：第１列：ＥＳＢＡ１０５変異体；第２列：突然変異を含むドメイン；第３列：ＡＨｏナンバリング中の突然変異；第４列：図６における熱的アンフォールディング曲線から計算されたＴＭ中心点；第５列：親のＥＳＢＡ１０５と比較した相対活性；第６列：第１列で特定された変異体についての突然変異誘発ストラテジー。
【０２０６】
第１０表：  ２つの異なるアプローチからのＥＳＢＡ１０５変異体の比較と、ＦＴ−ＩＲで測定された全体の安定性へのそれらの寄与（熱的アンフォールディング転移について計算された中心点）
【表１１】
0005506670.tif 000013
【０２０７】
ＱＣ変異体と比較すると、生殖細胞系コンセンサスへの逆突然変異は、ＥＳＢＡ１０５の熱安定性と活性に対して悪影響を有しているか、又はそれらに対して影響を有さない。このように、これらの結果は、種々の抗体及び形式において安定性を改善するために他で使用されていたコンセンサスエンジニアリングアプローチと食い違っている（例えばＳｔｅｉｐｅ，Ｂ他（１９９４年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４０：１８８−１９２；Ｏｈａｇｅ，Ｅ．及びＳｔｅｉｐｅ，Ｂ．（１９９９年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９１：１１１９−１１２８；Ｋｎａｐｐｉｋ，Ａ．他（２０００年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６，Ｅｗｅｒｔ，Ｓ．他（２００３年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：１５１７−１５２８；並びにＭｏｎｓｅｌｌｉｅｒ，Ｅ．及びＢｅｄｏｕｅｌｌｅ，Ｈ．（２００６年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６２：５８０−５９３を参照）。
【０２０８】
別個の実験において、前記のＱＣ変異体（ＱＣ１１．２、ＱＣ１５．２及びＱＣ２３．２）及び追加のＱＣ変異体（ＱＣ７．１）を、コンセンサス逆突然変異（Ｓ−２、Ｄ−２及びＤ−３）か又はアラニンへの逆突然変異（Ｄ−１）のいずれかを有する第二の変異体のセットと比較した（第１１表を参照）。選択されたフレームワーク位置での残基の個性を第１１表に示し、測定された熱安定性（任意のアンフォールディング単位で）を、図７に示す。幾つかのコンセンサス変異体（Ｓ−２及びＤ−１）が、熱安定性において顕著な増大を示すものの、この増大は、４種のＱＣ変異体のそれぞれによって達成される熱安定性における増大よりも小さかった。
【０２０９】
第１１表：  コンセンサス逆突然変異（Ｓ−２、Ｄ−２、Ｄ−３）、アラニンへの突然変異（Ｄ−１）もしくはＱＣ残基（ＱＣ７．１、ＱＣ１１．２、ＱＣ１５．２、ＱＣ２３．２）のいずれかを含む一組のＥＳＢＡ１０５変異体の選択されたフレームワーク位置でのフレームワーク残基の個性を提供する。親のＥＳＢＡ１０５抗体と異なる残基を、太字のイタリック体で示している。アミノ酸位置は、Ｋａｂａｔナンバリングで提供される。
【０２１０】
【表１２】
0005506670.tif 000014
【０２１１】
従って、ここにある結果は、"クオリティー・コントロール酵母スクリーニングシステム"で加えられた選択圧が、本来（まだ依然としてヒトで）めったに確認されず、恐らく、これらのフレームワークの優れた生物物理学的特性の原因となる共通の特徴を含む足場の分集合をもたらすことを裏付けている。６０℃で種々のＥＳＢＡ１０５変異体を負荷することによって、選択されたｓｃＦｖフレームワークデータベースで割り出された好ましい置換の優れた特性を再確認することができた。このように、本願に記載される、ＱＣ酵母スクリーニングシステムから得られた選択されたｓｃＦｖ配列を基礎とする"機能的コンセンサス"アプローチは、生殖細胞系コンセンサスアプローチを用いて製造された変異体よりも優れた熱安定性を有するｓｃＦｖ変異体をもたらすことが裏付けられている。
【０２１２】
例６：  ＥＳＢＡ２１２ ｓｃＦｖ変異体
この例では、ＥＳＢＡ１０５と異なる結合特異性を有するｓｃＦｖ抗体の生殖細胞系コンセンサス変異体（ＥＳＢＡ２１２）の安定性を比較した。全てのＥＳＢＡ２１２変異体は、ある特定のアミノ酸位置を、前記の例２及び３で記載された配列分析によって割り出された好ましい生殖細胞系コンセンサス配列へと逆突然変異させることによって製造した。その逆突然変異は、アミノ酸配列内で、生殖細胞系配列で保存されているが、選択されたｓｃＦｖにおいて普通でないもしくは低い頻度のアミノ酸を含む位置について調査することによって選択した（生殖細胞系コンセンサスエンジニアリングアプローチと呼ぶ）。図５と同様に、全ての変異体を、安定性について、該分子を熱誘発ストレスにかけることによって試験した。
【０２１３】
ＥＳＢＡ２１２変異体についての熱的アンフォールディングの結果を、以下の第１２表にまとめ、図８で図示する。第１２表中の列は、以下の通りである：第１列：ＥＳＢＡ２１２変異体；第２列：突然変異を含むドメイン；第３列：ＡＨｏナンバリング中の突然変異；第４列：図７における熱的アンフォールディング曲線から計算されたＴＭ中心点；第５列：親のＥＳＢＡ２１２と比較した相対活性；第６列：第１列で特定された変異体についての突然変異誘発ストラテジー。
【０２１４】
第１２表：  生殖細胞系コンセンサス残基へと逆突然変異されたＥＳＢＡ２１２変異体の比較と、ＦＴ−ＩＲで測定された全体の安定性へのそれらの寄与（熱的アンフォールディング転移について計算された中心点）
【表１３】
0005506670.tif 000015
【０２１５】
無関係のＥＳＢＡ１０５ ｓｃＦｖ抗体について確認されたのと同様に、生殖細胞系コンセンサスへの逆突然変異は、ＥＳＢＡ２１２の熱安定性及び活性に悪影響を有するか、又は影響を有さなかった。このように、これらの結果は、慣用のコンセンサスに基づくアプローチの不備を更に強調するのに役立つ。これらの不具合は、本発明の機能的コンセンサス方法論の使用によって対処できる。
【０２１６】
例７：  改善された可溶性を有するｓｃＦｖの生成
この例においては、構造モデリングと配列分析に基づくアプローチを使用して、改善された可溶性をもたらすｓｃＦｖフレームワーク領域における突然変異を割り出した。
【０２１７】
ａ） 構造分析
ＥＳＢＡ１０５ ｓｃＦｖの３Ｄ構造を、ＥｘＰＡＳｙウェブサーバを介してアクセス可能な、自動化されたタンパク質構造ホモロジーモデリングサーバを用いてモデリングした。その構造を、相対的な溶媒到達可能表面（ｒＳＡＳ）により分析し、残基を以下のように分類した：（１）ｒＳＡＳ≧５０％を示す残基については曝露；及び（２）５０≦ｒＳＡＳ≧２５％を有する残基については部分曝露。ｒＳＡＳ≧２５％を有する疎水性残基は、疎水性パッチとして見なされた。見出された各疎水性パッチの溶媒到達可能領域を確認するために、ＥＳＢＡ１０５に対する高いホモロジーと、２．７Åより高い解像度とを有する２７のＰＤＢファイルから計算を行った。その平均ｒＳＡＳ及び標準偏差を、それらの疎水性パッチについて計算し、そのそれぞれについて詳細に調査した（第１３表を参照）。
【０２１８】
第１３表：  疎水性パッチの評価
【表１４】
0005506670.tif 000016
【０２１９】
１列目、ＡＨｏナンバリングシステムでの残基位置。２列目、１列目に示される位置のドメイン。３列目、２７個のＰＤＢファイルから計算された平均溶媒到達可能領域。４列目、３列目の標準偏差。５列目〜９列目、ＡＨｏから検索された疎水性パッチの構造的役割。
【０２２０】
ＥＳＢＡ１０５で割り出された疎水性パッチの殆どは、可変−定常ドメイン（ＶＨ／ＣＨ）インターフェースと一致していた。このことは、ｓｃＦｖ形式における溶媒曝露される疎水性残基の今までの知見と相関していた（Ｎｉｅｂａ他、１９９７年）。２つの疎水性パッチ（ＶＨ２及びＶＨ５）は、ＶＬ−ＶＨ相互作用にも寄与するので、後続の分析から排除した。
【０２２１】
ｂ） 可溶性突然変異の設計
１２２個のＶＬ配列と１３７個のＶＨ配列の全体は、Ａｎｎｅｍａｒｉｅ Ｈｏｎｅｇｇｅｒの抗体ウェブページ（ｗｗｗ．ｂｉｏｃ．ｕｚｈ．ｃｈ／ａｎｔｉｂｏｄｙ）から検索した。それらの配列は、本来、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ／ｈｏｍｅ．ｄｏ）から抽出されたＦｖもしくはＦａｂの形式の３９３個の抗体構造と一致していた。それらの配列は、分析のために、種もしくは亜群にもかかわらず、本来の残基よりも高い親水性を有する代替アミノ酸を見出す確率を高めるために使用した。データベース内の任意の他の配列と９５％より高い同一性を有する配列は、偏りを減らすために排除した。それらの配列をアラインメントさせ、残基頻度について分析した。配列分析ツールとアルゴリズムを適用し、ＥＳＢＡ１０５における疎水性パッチを撹乱する親水性突然変異を割り出して選択した。それらの配列を、免疫グロブリン可変ドメイン（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ及びＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ  ２００１年）に関してＡＨｏナンバリングシステムに従ってアラインメントさせた。その分析は、フレームワーク領域に限定された。
【０２２２】
カスタマイズされたデータベースにおける、各位置ｉについての残基頻度ｆ（ｒ）を、特定の残基がデータセット内で確認された回数を配列の全数で除算することによって計算した。第一ステップで、種々のアミノ酸の出現頻度を、各疎水性パッチについて計算した。ＥＳＢＡ１０５で割り出された各疎水性パッチについての残基頻度は、前記のカスタマイズされたデータベースから分析した。第１４表は、疎水性パッチでの残基頻度をデータベースに存在する残基の全体で割ったものを報告している。
【０２２３】
第１４表：  ＥＳＢＡ１０５で割り出された疎水性パッチについてのｓｃＦｖもしくはＦａｂ形式における成熟抗体からの２５９個の配列の残基頻度
【表１５】
0005506670.tif 000017
【０２２４】
第１列、残基型。第２列ないし第５列、重鎖における疎水性パッチについての残基の相対頻度。第６列及び第７列、軽鎖における疎水性パッチについての残基の相対頻度。
【０２２５】
第二ステップにおいて、疎水性パッチでの親水性残基の頻度を用いて、各疎水性パッチでの最も豊富な親水性残基を選択することによって可溶性突然変異を設計した。第１５表は、このアプローチを使用して割り出された可溶性突然変異体を報告している。親の残基と突然変異体の残基の疎水性を、幾つかの論文で公表された値の平均疎水性として計算し、側鎖の溶媒への曝露のレベルの関数で表現した。
【０２２６】
第１５表：  疎水性パッチを撹乱するＥＳＢＡ１０５に導入された種々の可溶性突然変異
【表１６】
0005506670.tif 000018
【０２２７】
*  位置１４４での疎水性パッチは、データベース中に最も豊富な親水性残基によって交換されないが、Ｓｅｒについては、これは既にＥＳＢＡ１０５のＣＤＲのドナー中に含まれていたからである。
【０２２８】
１列目、ＡＨｏナンバリングシステムでの残基位置。２列目、１列目に示される位置のドメイン。３列目、２７個のＰＤＢファイルから計算された平均溶媒到達可能領域。４列目、ＥＳＢＡ１０５における親の残基。５列目、ＡＨｏから検索された４列目の平均疎水性。６列目、１列目に示される位置での最も豊富な親水性残基。７列目、ＡＨｏから検索された６列目の平均疎水性。
【０２２９】
ｃ） 可溶性ＥＳＢＡ１０５変異体の試験
可溶性突然変異を、単独で又は多重の組み合わせで導入し、そして再フォールディング率、発現、活性及び安定性並びに凝集パターンについて試験した。第１６表は、可溶性への潜在的な寄与と、突然変異が抗原結合を変更する危険性のレベルとに基づいて最適化された各ＥＳＢＡ１０５変異体に導入される可溶性突然変異の様々な組合せを示している。
【０２３０】
第１６表：  ＥＳＢＡ１０５に関する可溶性変異体の設計
【表１７】
0005506670.tif 000019
【０２３１】
*  別個に第二回目で試験した。
【０２３２】
**  下線は、軽鎖と重鎖のそれぞれに含まれる突然変異の数を隔てている。
【０２３３】
１列目、ＡＨｏナンバリングシステムでの残基位置。２列目、１列目に示される位置のドメイン。３列目、ＥＳＢＡ１０５における種々の疎水性パッチでの親の残基。４列目、示された位置に可溶性突然変異を含む種々の突然変異。
【０２３４】
ｉ．  可溶性測定
ＥＳＢＡ１０５及び変異体の最大可溶性を、遠心分離されたＰＥＧ−タンパク質混合物の上清中のタンパク質濃度を測定することによって決定した。２０ｍｇ／ｍｌの出発濃度を、３０〜５０％の飽和度の範囲のＰＥＧ溶液と１：１で混合した。これらの条件を、Ｌｏｇ ＳのＰｅｇ濃度（％ｗ／ｖ）に対する線形依存性の実験的な測定後に野生型ＥＳＢＡ１０５について確認された可溶性プロフィールに基づき選択した。優れた可溶性を示した変異体ＥＳＢＡ１０５の幾つかの例の可溶性曲線を、図９に示す。可溶性値の完全なリストを、また第１７表にも提供する。
【０２３５】
第１７表：  該突然変異を親のＥＳＢＡ１０５と比較して推定される最大可溶性及び活性
【表１８】
0005506670.tif 000020
【０２３６】
ｉｉ．  熱安定性測定
親のＥＳＢＡ１０５についての熱安定性測定と可溶性の再調査を、ＦＴ−ＩＲ ＡＴＲ分光分析法を用いて実施した。それらの分子を、広範な温度（２５〜９５℃）に熱負荷した。変性プロフィールは、インターフェログラム信号にフーリエ変換をかけることによって得られた（図１０を参照）。該変性プロフィールを用いて、ボルツマンシグモイドモデルを適用することで、全てのＥＳＢＡ１０５変異体について熱的アンフォールディング転移の中心点（ＴＭ）を見積もった（第１８表）。
【０２３７】
第１８表：  全ての可溶性変異体についての熱的アンフォールディング転移の中心点（ＴＭ）
【表１９】
0005506670.tif 000021
【０２３８】
ｉｉｉ．  凝集測定
ＥＳＢＡ１０５及びその可溶性変異体を、また時間依存性試験で分析して、分解挙動と凝集挙動を評価した。この目的のために、可溶性タンパク質（２０ｍｇ／ｍｌ）を、高められた温度（４０℃）でリン酸緩衝液中でｐＨ６．５でインキュベートした。対照サンプルを、−８０℃に保持した。それらのサンプルを、２週間のインキュベート期間の後に、分解（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及び凝集（ＳＥＣ）について分析した。これにより、分解を受けやすい変異体（図１１を参照）又は可溶性もしくは不溶性の凝集物を形成する傾向を示す変異体（第１９表を参照）の破棄が可能となった。
【０２３９】
第１９表：  不溶性凝集測定
【表２０】
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【０２４０】
ｉｖ．  可溶性変異体の発現及び再フォールディング
それらの可溶性変異体を、また親のＥＳＢＡ１０５分子と比較して、発現及び再フォールディング率について試験した。これらの研究結果を、第２０表に示す。
【０２４１】
第２０表：  可溶性変異体の発現及び再フォールディング
【表２１】
0005506670.tif 000023
【０２４２】
全ての親水性の可溶性突然変異体は親のＥＳＢＡ１０５分子と比較して改善された可溶性を示したが、これらの分子の幾つかだけが他の生物物理学的特性について好適であることが示された。例えば、多くの変異体は、親のＥＳＢＡ１０５分子と比較して、低減された熱安定性及び／又は再フォールディング率を有した。特に、位置ＶＬ１４７での親水性置換は、安定性をひどく低下させた。従って、熱安定性に大きな影響を及ぼさない可溶性突然変異を組み合わせて、それらの特性の確認のために更なる熱ストレスを受けさせた。
【０２４３】
４種の異なる可溶性突然変異の組み合わせを含む３種の突然変異体（Ｏｐｔ１．０、Ｏｐｔ０．２及びＶＨ：Ｖ１０３Ｔ）は、再現性、活性もしくは熱安定性に影響を及ぼすことなく、ＥＳＢＡ１０５の可溶性を大きく改善した。しかしながら、ＥＳＢＡ１０５においてＯｐｔ１．０とＯｐｔ０．２の組み合わされた突然変異を有する突然変異体（Ｏｐｔ１＿２）は、４０℃で２週間インキュベートした後に、高められた量の不溶性の凝集物を示した（第１９表を参照）。これは、β−シートターンにおける位置ＶＬ１５でのＶａｌの役割によって説明できる。それというのも、Ｖａｌは、全てのアミノ酸のうちで最も高いβ−シート傾向を有するからである。この結果は、位置ＶＬ１５での単独の可溶性突然変異が許容されるが、他の疎水性パッチを撹乱する可溶性突然変異体との組み合わせにおいては許容されないことを裏付けている。従って、Ｏｐｔ０＿２及びＶＨ：Ｖ１０３Ｔに含まれる突然変異は、ｓｃＦｖ分子の可溶性特性を改善するために最良の性能を有するものとして選択された。
【０２４４】
例８：  ｓｃＦｖの増強された可溶性及び安定性の生成
可溶性設計によって割り出されたＥＳＢＡ１０５変異体を、更に、クオリティー・コントロール（ＱＣ）アッセイによって割り出された安定化突然変異と置き換えることによって最適化した。前記の例７で割り出された可溶性突然変異の１〜３つを、ＱＣ７．１及び１５．２で見出された全ての安定化突然変異（すなわちＶＬドメインにおけるＤ３１Ｎ及びＶ８３Ｅ並びにＶＨドメインにおけるＶ７８Ａ、Ｋ４３及びＦ６７Ｌ）と組み合わされて含む全部で４つの構築物を作製した。全ての最適化された構築物により、野生型ｓｃＦｖよりも高い可溶性を有するタンパク質が得られた（第２０表を参照）。最良の構築物は、一貫して、野生型に対して可溶性について２倍より高い増大を示した。ｓｃＦｖ分子の活性と安定性のいずれも、安定化突然変異と可溶性増強突然変異との組み合わせによって大きな影響を受けなかった。
【０２４５】
第２１表：  最適化された可溶性及び安定性を有するｓｃＦｖ
【表２２】
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【０２４６】
全ての４つの変異体についての可溶性値を、ｓｃＦｖの可溶性に対する各突然変異の寄与の分析のために使用した。全ての突然変異は、これらの残基の幾つかが一次配列と３Ｄ構造の両者において互いに比較的近いにもかかわらず、ｓｃＦｖの可溶性に相加的に寄与すると思われた。その分析は、ＶＨドメイン中の３つの可溶性増強突然変異（Ｖ１２Ｓ、Ｌ１４４Ｓ、Ｖ１０３Ｔ（もしくはＶ１０３Ｓ））の組み合わせが、ｓｃＦｖ可溶性の６０％までの原因となることを示している。疎水性パッチは全てのイムノバインダーの可変ドメインで保存されているので、前記の最適な突然変異の組み合わせを使用して、事実上いかなるｓｃＦｖも又は他のイムノバインダー分子の可溶性をも向上させることができる。
【０２４７】
等価物
当業者は、単に通常の実験を用いて、本願に記載される本発明の特定の実施態様に対する多くの等価物を認識し、又は確認することができる。斯かる等価物は、特許請求の範囲によって含まれると意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
0005506670.tif 000029
【図５】
0005506670.tif 000030
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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