(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの消化管、特には胃の培養条件下でヘリコバクター・ピロリ菌を凝集することが可能な、ＤＳＭ１７６４６、ＤＳＭ１７６４７、ＤＳＭ１７６４８、ＤＳＭ１７６４９、ＤＳＭ１７６５０、ＤＳＭ１７６５１、ＤＳＭ１７６５２又はＤＳＭ１７６５３として寄託された乳酸桿菌細胞の、ヘリコバクター・ピロリ菌への感染によって生じる疾患、特には胃潰瘍等の胃腸病の予防及び／又は治療用の医薬品又は食餌療法用組成物を製造するための使用。
【請求項２】
組成物が１０２〜１０１５、好ましくは１０６又は１０８〜１０１２、特には１０８〜１０１０個の乳酸桿菌細胞を含有する請求項１に記載の使用。
【請求項３】
組成物が経口投与用に調製される請求項１〜２の１つに記載の使用。
【請求項４】
乳酸桿菌細胞が凍結乾燥される請求項１〜３の１つに記載の使用。
【請求項５】
担体がマルトデキストリン、微結晶性セルロース、澱粉、特にはコーンスターチ、レブロース、乳糖、ブドウ糖、及びこういった物質の混合物を含む群から選択される請求項１〜４の１つに記載の医薬品組成物又は使用。
【請求項６】
組成物が０．１〜９５重量％の担体と、５〜９９．９重量％の凍結乾燥させた乳酸桿菌細胞を含有する請求項１〜５の１つに記載の使用。
【請求項７】
組成物が１０２〜１０１５、好ましくは１０６〜１０９、特には１０７〜１０９個の乳酸桿菌細胞を含有する請求項１〜６の１つに記載の使用。
【請求項８】
生理学的に耐容性の担体が食品材料であり、特には乳製品、発酵乳製品、牛乳、ヨーグルト、チーズ、シリアル、ミューズリーバー、及び幼児用加工食品を含む群から選択される請求項１〜７の１つに記載の使用。
【請求項９】
生理学的有効量の凍結乾燥させた又は凍結乾燥させていない乳酸桿菌細胞を生理学的に耐容性の担体と混合し、経口投与用に調製することからなる、請求項１〜８の１つに記載の使用にかかる、医薬品及び／又は食餌療法用組成物の製造方法。
【請求項１０】
ＤＳＭ１７６４６、ＤＳＭ１７６４７、ＤＳＭ１７６４８、ＤＳＭ１７６４９、ＤＳＭ１７６５０、ＤＳＭ１７６５１、ＤＳＭ１７６５２又はＤＳＭ１７６５３として寄託された、ヒトの消化管、特には胃の培養条件下でヘリコバクター・ピロリ菌を凝集することが可能な、単離された乳酸桿菌細胞。
【請求項１１】
請求項１０に記載の乳酸桿菌細胞の生理学的有効量と、生理学的に耐容性である担体を含有する、医薬品組成物及び／又は食餌療法用組成物。
【請求項１２】
医薬品又は食餌療法用組成物を製造するための請求項１０に記載の乳酸桿菌細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規の乳酸桿菌株とその使用、特には医薬品及び／又は食餌療法用組成物での使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロバイオティック微生物には、その生きている形態において人間又は動物の身体に有益な効果を示す生きている細胞つまり生菌が含まれる。プロバイオティック組成物はこういった微生物を含有している。有益な効果とは、特には、消化管の微生物叢の改善である。特には、不要なその他微生物をプロバイオティック微生物とその不要な微生物との即時の相互作用、又はプロバイオティック微生物の発現産物による不要な微生物の代謝の阻害に負うところの即時の相互作用、又は固有の免疫システムの強化により微生物叢内で抑制することが可能である。概して、胃腸管での定着をめぐっての競合により、問題を起こすほどには不要な微生物が粘膜に定着することはできない又は不要な微生物が排除されるというのが主なメカニズムではないかと考えられる。
【０００３】
プロバイオティック微生物群は、例えば、乳酸桿菌株によって形成されている。これらは典型的にはグラム陽性の微好気性又は嫌気性細菌であり、糖を発酵させ酸、特には乳酸を産生する。
【０００４】
米国特許番号第５７１６６１５号の文献により、その成分の一部として乳酸桿菌を含有する医薬品組成物が当該分野で知られている。この医薬品組成物は、とりわけ、胃腸管の疾患の治療に使用可能である。
【０００５】
ＵＳ２００５／０１８６１９０Ａ１の文献により、スフィンゴミエリナーゼ又はスフィンゴミエリナーゼ含有乳酸桿菌を含有する食餌療法用又は医薬品組成物が当該分野で知られている。この組成物はヘリコバクター・ピロリ菌の感染の治療に適している。
【０００６】
ＷＯ２００４／０８７８９１の文献により、ヘリコバクター・ピロリ菌に感染した胃腸管の治療用の医薬品又は食餌療法用組成物の製造に適した乳酸桿菌株が当該分野で知られている。
【０００７】
ＷＯ２００５／０６０９３７Ａ１の文献により、乳酸桿菌の生菌を含有する錠剤処方が当該分野で知られている。これらは経口投与と病原体に感染した胃腸管の治療に適している。
【０００８】
ＷＯ２００４／０３１３６８Ａ１の文献により、ヘリコバクター・ピロリ菌への感染に関連した炎症の治療に適した乳酸桿菌株が当該分野で知られている。
【０００９】
乳酸桿菌とヘリコバクター・ピロリ菌の相互作用は更にＷａｎｇその他によるＡｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．８０：７３７−４１（２００４）、Ｆｅｌｌｅｙその他によるＢｅｓｔ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ＆  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １７（５）：７８５−７９１（２００３）、Ｃａｚｚａｔｏその他によるＳｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ４８（１）：２６−３１（２００４）、及びＳｇｏｕｒａｓその他によるＡｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７０（１）：５１８−５２６（２００４）の文献により当該分野で知られている。
【００１０】
ヘリコバクター・ピロリ菌は胃でコロニーを形成する螺旋形状の細菌であり、ウレアーゼの産生により胃内のｐＨ値が上昇し、これにより細菌は胃酸から守られる。細菌は粘膜内に侵入し、胃の上皮細胞に留まる。こういった感染により体が本来有している免疫システムが活性化されるが、免疫反応は感染を排除するに十分な効果は有しておらず、この結果、免疫反応が強化される。最終的に、胃炎又は胃潰瘍を伴う慢性的な炎症及び疾患が生じる。現在に至るまで、ヘリコバクター・ピロリ菌の免疫システムに対する耐性メカニズムは知られていない。
【００１１】
ヘリコバクター・ピロリ菌に対して従来の乳酸桿菌株が効果を発揮するメカニズムについては、多様な理論が上記の文献にて提示されている。しかしながら、メカニズムについて確実な所見は存在していない。
【００１２】
総じて、胃内のヘリコバクター・ピロリ菌の菌数を非常に低く維持する、生理学的な副作用のない乳酸桿菌株を開発することが望ましい。
【特許文献１】米国特許番号第５７１６６１５号
【特許文献２】ＵＳ２００５／０１８６１９０Ａ１
【特許文献３】ＷＯ２００４／０８７８９１
【特許文献４】ＷＯ２００５／０６０９３７Ａ１
【特許文献５】ＷＯ２００４／０３１３６８Ａ１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、本発明の技術的な目的はヘリコバクター・ピロリ菌の胃粘膜への定着を阻害する乳酸桿菌株を提供することである。
【００１４】
更に、本発明の技術的目的は、特にはヘリコバクター・ピロリ菌感染の予防に効果の高い食餌療法用及び／又は医薬品組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
この技術的目的を達成するために、本発明はヒトの消化管、特には胃の培養条件下においてヘリコバクター・ピロリ菌を凝集することが可能な、単離された好ましくは乳酸桿菌の生菌を教示する。
【００１６】
本発明は、特定の選ばれた乳酸桿菌株は遊離のヘリコバクター・ピロリ菌に結合して凝集体を形成可能であるとの驚くべき見解に基づいたものである。これらの比較的大きな凝集体は粘膜を突き通ることができなくなり、この結果、ヘリコバクター・ピロリ菌は胃の上皮細胞にはもう到達、感染できず、死滅する。最後に、免疫システムの慢性的な炎症反応が活性化されなくなるため、胃炎又は胃潰瘍を伴う疾患が信頼性高く予防できる。凝集体は胃腸管を通過して、自然な形で体外に排出される。既に感染している場合であっても、本発明の乳酸桿菌株のこの作用機序は有用であり、これはヘリコバクター・ピロリ菌への更なる感染を予防することで、既に存在しているヘリコバクター・ピロリ菌を除菌して現在の感染をより制御し易くなるからである。通常、これは患者本来の免疫システムでも可能である。加えて、本発明の乳酸桿菌株はヘリコバクター・ピロリ菌のウレアーゼ活性の阻害も可能であると考えられ、これにより凝集体となったヘリコバクター・ピロリ菌は胃酸の攻撃に対してのその保護を失う。その限りにおいて、相乗効果も得られる。
【００１７】
ヒトの胃管の必須培養条件には１．８〜４．５の範囲のｐＨ値とペプシンとＮａＣｌの存在が含まれる。こういった培養条件に特徴的な基準培地は以下の成分：水、５ｇ／ｌのＮａＣｌ及び３ｇ／ｌのペプシンを含み、ｐＨ値はＨＣｌで２．０に調節される。
【００１８】
凝集という用語は、少なくとも１μｍ〜１０００μｍ及びそれ以上のサイズを有する菌細胞の凝集体の発生を意味し、乳酸桿菌細胞及びヘリコバクター・ピロリ菌細胞を、例えば以下の実施例においては、上述したように、特には基準媒体に懸濁させたものを含む。
【００１９】
本発明の目的のために、多種多様な乳酸桿菌株をそのヘリコバクター・ピロリ菌との凝集能について調査し、以下の株が本発明の株として同定され、ＤＳＭＺ  Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  1ｂ、Ｄ−３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、  Ｇｅｒｍａｎｙ）に寄託された：ＤＳＭ１７６４６、ＤＳＭ１７６４７、ＤＳＭ１７６４８、ＤＳＭ１７６４９、ＤＳＭ１７６５０、ＤＳＭ１７６５１、ＤＳＭ１７６５２及びＤＳＭ１７６５３。ＤＳＭ１７６４６、ＤＳＭ１７６４９、ＤＳＭ１７６５２及びＤＳＭ１７６５３はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ株である。ＤＳＭ１７６４７、ＤＳＭ１７６４８及びＤＳＭ１７６５１はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ株である。ＤＳＭ１７６５０はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ株である。
【００２０】
本発明は更に、生理学的有効量の好ましくは本発明の乳酸桿菌の生菌と生理学的に耐容性の担体を含む医薬品及び／又は食餌療法用組成物に関する。医薬品組成物とは治療又は予防だけを目的とした組成物であり、有効な薬剤の他には製剤にて一般的な補助物質及び／又は担体のみが存在する。食餌療法用組成物とは、有効な薬剤の他に食品材料と栄養補助剤も含む組成物である。
【００２１】
本発明は更に、特にはヘリコバクター・ピロリ菌への感染によって生じる疾患、例えば胃腸病の予防及び／又は治療用の医薬品又は食餌療法用組成物を製造するための、好ましくは本発明の乳酸桿菌生菌の使用に関する。胃腸病には特に胃炎、胃潰瘍及び胃ガンが属する。
【００２２】
本発明による医薬品組成物は例えば１０２〜１０１５、好ましくは１０６又は１０８〜１０１２、特には１０８〜１０１０個の乳酸桿菌細胞を含有することを特徴とする。基準値は投与単位、例えば錠剤である。好ましくは、組成物は経口投与用に調製される。乳酸桿菌細胞は適切に凍結乾燥される。
【００２３】
本発明の医薬品組成物のガレノス製剤は、本技術で一般的なやり方で調製可能である。適切な固形又は液状ガレノス製剤形態は例えば顆粒、粉末、糖衣錠、錠剤、（マイクロ）カプセル、坐薬、シロップ、ジュース、懸濁液又はエマルジョンであり、これらの製造には通常の手段、例えば担体、爆薬、結合剤、コーティング剤、膨張剤、滑剤又は潤滑剤、風味剤、甘味料及び溶液メディエータを用いる。ここで補助物質としては炭酸マグネシウム、二酸化チタン、乳糖、マンニトール及びその他糖類、滑石、乳たんぱく質、ゼラチン、澱粉、セルロース及び誘導体、動物性及び植物性油、例えば肝油、ひまわり油、ピーナッツ油又はゴマ油、ポリエチレングリコール及び溶媒、例えば滅菌水及び一価アルコール又は多価アルコール、例えばグリセリンが挙げられる。本発明の医薬品組成物は、少なくとも１つの本発明で使用の乳酸桿菌株の細胞を既定の用量で薬学的に適し、かつ生理学的な耐容性が良好な担体と、場合によっては更に適切な活性の追加又は補助物質と混合し、所望の投与形態に調製することで製造可能である。担体は特にはマルトデキストリン、微結晶性セルロース、澱粉、特にはコーンスターチ、レブロース、乳糖、ブドウ糖、及びこういった物質の混合物を含む群から選択された物質である。組成物は０．１〜９５重量％の担体と、５〜９９．９重量％の凍結乾燥させた乳酸桿菌細胞を細胞及び担体の総量に対して含有しても又はこれらから構成してもよい。
【００２４】
食餌療法用組成物の場合、１０２〜１０１５、好ましくは１０６〜１０９、特には１０７〜１０９個の乳酸桿菌細胞を含有する組成物を提供し得る。基準値は投与単位、例えばエンドユーザに販売される食品材料の包装単位である。生理学的に耐容性の担体は通常は食品材料であり、特には乳製品、発酵乳製品、牛乳、ヨーグルト、チーズ、シリアル、ミューズリーバー、及び幼児用加工食品を含む群から選択したものである。
【００２５】
本発明は更に本発明の医薬品及び／又は食餌療法用組成物の製造方法に関し、凍結乾燥させた又は凍結乾燥させていない、好ましくは乳酸桿菌の生菌を生理学的に耐容性の担体と混合し、経口投与用に調製する。
【００２６】
最後に、本発明はヘリコバクター・ピロリ菌への感染によって引き起こされる疾患、特に胃炎又は胃潰瘍の予防、或いは罹患した又はこういった病気を発病すると疑われる患者の治療方法に関し、患者に生理学的有効量の本発明の医薬品及び／又は食餌療法用組成物を１日１〜５回投与する。投与は一定期間、例えば１〜３０週間に亘って、又は期間無制限で行うことができる。特に、後者は持続的な予防、同様に疾患の再発予防に適している。
【００２７】
以下において、実施形態のみを代表する実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する。
【実施例１】
【００２８】
使用株の保存
乳酸桿菌株の保存は凍結状態で行った。ＭＲＳ培地（５５ｇ／ｌ、ｐＨ６．５、Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）で静止期（ＯＤ６００／ｍｌ  ４〜８）まで培養した培養物１ｍｌを５００μｌの５０容量％の滅菌グリセリン溶液と混合し、混合物を−８０℃まで急速冷凍した。
【００２９】
ヘリコバクター・ピロリ菌の保存は凍結状態で行った。５容量％の脱繊維化した馬の血液（Ｏｘｏｉｄ）を追加したブルセラ培養液（２８ｇ／ｌ、ｐＨ７．０、ＢＤ、ＵＳＡ）で静止期まで培養した培養物１ｍｌを５００μｌの５０容量％の滅菌グリセリン溶液と混合し、混合物を−８０℃まで急速冷凍した。馬の血液は使用前に凍結し、２０℃で分解し、血球を破壊した。
【実施例２】
【００３０】
本発明の乳酸桿菌株によるヘリコバクター・ピロリ菌の凝集
乳酸桿菌の培養を３７℃のＭＲＳ培地で２４〜４８時間に亘って閉じたファルコン管内で行った。
【００３１】
ヘリコバクター・ピロリ菌を５〜６日間に亘って三角フラスコ内で微好気性環境下で培養した。その他の条件は実施例１と同様である。
【００３２】
培養後、細胞形態を顕微鏡で観察した。球菌形態の細胞のみならずＳ状形態の細胞から成る培養物について分析した。異なる形態が交じり合った培養物についても調査した。
【００３３】
各種細胞を３２００ｇで１０分間に亘っての遠心分離により採取し、上清を除去した。細胞を５ｍｌの緩衝液で１回洗浄し、５ｍｌの緩衝液（１．５ｇ／ｌのＮａ２ＨＰＯ４＊２Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４及び８．８ｇ／ｌのＮａＣｌを含有するＰＢＳ緩衝液）に再懸濁させた。ｐＨ値はＨＣｌを用いて７．０に調節した。ＯＤ６００値を測定し、緩衝液の添加により２に調節した。
【００３４】
こうして得られた２．５ｍｌの細胞懸濁液全て（ヘリコバクター・ピロリ菌／乳酸桿菌）を混合し、混合物を１０分間に亘ってボルテックスにかけた。結果を顕微鏡で観察した。自己凝集についての対照実験をそれぞれ乳酸桿菌及びヘリコバクター・ピロリ菌だけの培養物を別に調査することで行った。
【００３５】
図１において、乳酸桿菌とヘリコバクター・ピロリ菌の混合物の懸濁液では大きな凝集体が形成されているのが見て取れるが、こういった凝集体は対照実験では見られない。この結果は本発明の株全てについて得られ、図１では乳酸桿菌株ＤＳＭ１７６４８のみを例示として示している。
【００３６】
図１ＡはＤＳＭ１７６４７株によるヘリコバクター・ピロリ菌の典型的な凝集体を図示している。図１ＢはＤＳＭ１７６４８株のみを図示している。図１Ｃはヘリコバクター・ピロリ菌のみを図示している。倍率は１０００倍である。凝集体は典型的にはサイズが１μｍ、通常は５μ〜５０μｍ、又は図１Ａのように１０００μｍ以上にもなる（最大）。
【００３７】
原則として、問題となっている乳酸桿菌株は、調査対象である株により乳酸桿菌とヘリコバクター・ピロリ菌からそういった凝集が引き起こされるか否かについてのこういった凝集試験で調査可能である。
【実施例３】
【００３８】
胃管の条件のシミュレーション
生体内の条件をシミュレーションするために、実施例２の実験を繰り返したが、乳酸桿菌細胞の再懸濁は人工胃液（５ｇ／ｌのＮａＣｌ及び３ｇ／ｌのペプシン（Ｓｉｇｍａ））で行った。ｐＨはＨＣｌを用いて２に調節した。この培養は３７℃で３０分に亘って行った。ヘリコバクター・ピロリ菌は細胞直近領域のｐＨ値をｐＨ４にまで上昇可能なため、実施例２に記載のように、細胞を採取し次にｐＨ４の酢酸塩緩衝液に再懸濁させた。緩衝液の調節のために、４１ｍｌの０．１モル／ｌの酢酸と０．２モル／ｌの酢酸ナトリウム溶液の溶液をｐＨ４まで調節した。次に水を用いて最終容量の１００ｍｌまで満たした。
【００３９】
ヘリコバクター・ピロリ菌細胞を実施例２に沿って培養した。
【００４０】
実施例２に沿って細胞を採取した後、実施例２とは異なり、細胞を酢酸塩緩衝液（上記参照）に再懸濁させた。その後、実施例２による凝集実験を行った。結果を図２に示す。図２ＡはＤＳＭ１７６４８株による、人工胃を通過後のヘリコバクター・ピロリ菌の典型的な凝集を示す。図２Ｂは人工胃を通過後のＤＳＭ１７６４８株のみを示す。図２Ｃはヘリコバクター・ピロリ菌のみを図示する。倍率は１０００倍である。混合物で得られた凝集体のサイズは２μｍ〜１０００μｍ以上の範囲にあることが見て取れる。
【００４１】
この凝集試験の変形も又、本発明の乳酸桿菌株の同定に適している。
【実施例４】
【００４２】
乳酸桿菌の凍結乾燥の影響
実施例１に沿って細菌を取り出した。乳酸桿菌培養物の分割量１ｍｌを３２００ｇで１０分に亘っての遠心分離により採取した。上清を除去し、ペレットを真空下で２時間に亘って凍結乾燥させた。こうやって得られた本発明の各乳酸桿菌株のペレットをｐＨ７．０の１ｍｌのＰＢＳ緩衝液に再懸濁させた。再懸濁させた乳酸桿菌細胞を体積比１：１で新たに取り出したヘリコバクター・ピロリ菌培養物と混合し、凝集の有無を実施例２及び３同様に判断した。乳酸桿菌細胞によるヘリコバクター・ピロリ菌の凝集誘発能は、上記実施例による調査で示されるように、凍結乾燥の影響を受けなかった（但し、写真資料は作成しなかった）。
【実施例５】
【００４３】
種の決定
本発明の乳酸桿菌株の分類学上の種の決定を、その炭化水素発酵パターンを用いて行った。これはＡＰＩ５０ＣＨシステム（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて決定され、分析はＡＰＩＬＡＢ  ＰＬＵＳソフトウェア（同供給業者によるバージョン３．３．３）で行った。種の決定は供給業者の指示に沿って行った。
【実施例６】
【００４４】
本発明の乳酸桿菌株を用いての医薬品組成物の製造
本発明の乳酸桿菌株又は幾つかの乳酸桿菌株の細胞を実施例４のようにして取り出し、凍結乾燥させる。その後、ペレットを直径最大約１ｍｍの粒径まで粉砕する。得られた粒状物を以下の比率（重量％）で担体又は補助物質と混合する。
２０重量％粒状物
２重量％二酸化ケイ素（Ｓｙｌｏｉｄ  ＡＬ−１ＦＰ、ＧＲＡＣＥ  Ｄａｖｉｄｓｏｎ）
１重量％ステアリン酸マグネシウム（ＭＦ−２−Ｖ、Ａｃｋｒｏｓ）
７７重量％微結晶性セルロース（Ａｖｉｃｅｌ  ＰＨ１１２、ＦＭＣ）
【００４５】
混合はＱｕｉｎｔｅｃｈ  Ｍｉｃｒｏｍｉｘｅｒ内でポジション７０レベルＩＩで行う。全成分を同時に添加する。混合は約１２０秒行う。次に、得られた混合物を市販の打錠機で標準条件下で打錠する。ただし、圧力は可能な限り低くし（＜１０ｋＮ）、重量約５００ｍｇの錠剤を形成する。各錠剤は約１０８〜１０１０個の乳酸桿菌細胞を含有する。
【実施例７】
【００４６】
本発明の乳酸桿菌株を用いた食餌療法用組成物の製造
本発明の乳酸桿菌株又は幾つかの乳酸桿菌株の細胞を実施例４のように取り出し、凍結乾燥させる。約１０７〜１０８個の乳酸桿菌細胞を含有する凍結乾燥物をそれぞれ約１Ｌの市販の低温殺菌牛乳と混合し、５℃で短時間均質化する。均質化した牛乳を次に瓶に詰め、慣用の方法で包装する。
【図１】
0005392672.tif 000002
【図２】
0005392672.tif 000003