(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルにおけるターゲット配列の存在を検出するための構造であって、プライマ部分配列、プロモータ部分配列、及びセレクタ部分配列を含み、前記プライマ部分配列の５’末端が前記プロモータ部分配列の３’末端に連結し、前記プロモータ部分配列の５’末端が前記セレクタ部分配列の３’末端に連結し：
ｉ．前記プライマ部分配列が前記ターゲット配列と相補的であり；
ｉｉ．前記プロモータ部分配列が前記セレクタ部分配列の転写を方向付けることが可能であり；
ｉｉｉ．前記セレクタ部分配列及びその相補性部分配列が、前記サンプルに存在する任意の部分配列とアニーリングしないことを特徴とする構造。
【請求項２】
請求項１に記載の構造において、該プロモータが、前記プライマ部分配列の転写を方向付けしないことを特徴とする構造。
【請求項３】
請求項１に記載の構造において、該プロモータが、Ｔ７若しくはＴ３又はＳＰ６プロモータ部分配列であることを特徴とする構造。
【請求項４】
請求項１に記載の構造において、前記プライマ部分配列が鋳型にアニーリングし、伸長しうることを特徴とする構造。
【請求項５】
請求項１に記載の構造において、当該構造が同定可能な標識を含むことを特徴とする構造。
【請求項６】
請求項１に記載の構造において、前記セレクタ部分配列が、インビトロ転写用の鋳型として作用することを特徴とする構造。
【請求項７】
サンプルにおける別個のターゲット部分配列の存在を検出するための複数の異なる型のプライマ−プロモータ−セレクタ構造を含むキットであって、各々の構造がプライマ部分配列、プロモータ部分配列、及びセレクタ部分配列を含み、前記プライマ部分配列の５’末端が前記プロモータ部分配列の３’末端に連結し、前記プロモータ部分配列の５’末端が前記セレクタ部分配列の３’末端に連結し：
ｉ．前記プライマ部分配列が前記ターゲット配列と相補的であり；
ｉｉ．前記プロモータ部分配列が前記セレクタ部分配列の転写を方向付けることが可能であり；
ｉｉｉ．前記セレクタ部分配列及びその相補性部分配列が、前記サンプルに存在する任意の部分配列とアニーリングしないことを特徴とするキット。
【請求項８】
請求項７に記載のキットにおいて、該異なる型の構造の各々のプライマ部分配列及びセレクタ部分配列が異なることを特徴とするキット。
【請求項９】
請求項７に記載のキットにおいて、各々の構造の型のプライマ部分配列が異なり、セレクタ部分配列が同一であることを特徴とするキット。
【請求項１０】
請求項７に記載のキットが、前記転写産物に組み込み可能な標識ＮＴＰｓを更に含むことを特徴とするキット。
【請求項１１】
請求項１０に記載のキットにおいて、前記ＮＴＰが光学標識されることを特徴とするキット。
【請求項１２】
請求項７に記載のキットにおいて、該プロモータが、Ｔ７若しくはＴ３又はＳＰ６プロモータ配列であることを特徴とするキット。
【請求項１３】
請求項１２に記載のキットが、該Ｔ７、Ｔ３又はＳＰ６プロモータ部分配列と二本鎖を形成可能な非鋳型Ｔ３、Ｔ７又はＳＰ６プロモータ部分配列を更に含むことを特徴とするキット。
【請求項１４】
請求項７に記載のキットが、異なる型のオリゴヌクレオチドを付着させるように構成した別個にコード化した一組の微小粒子を更に含むことを特徴とするキット。
【請求項１５】
請求項７に記載のキットが、前記プライマ部分配列が伸長するときに伸長産物に組み込まれるように設計された、一組の標識したｄｄＮＴＰ又はｄＮＴＰを更に含むことを特徴とするキット。
【請求項１６】
請求項７に記載のキットが、ハプテン標識したｄｄＮＴＰ又はｄＮＴＰを更に含むことを特徴とするキット。
【請求項１７】
請求項１６に記載のキットが、分離を促進するための磁性粒子を更に含むことを特徴とするキット。
【請求項１８】
請求項７に記載のキットが：
（ａ）前記ターゲット配列の３’側に配置された前記サンプルにおけるターゲット部分配列；又は
（ｂ）前記プライマ部分配列；
とアニーリング可能なオリゴヌクレオチドを更に含むことを特徴とするキット。
【請求項１９】
請求項１８に記載のキットにおいて、前記オリゴヌクレオチドが標識されていることを特徴とするキット。
【請求項２０】
サンプルにおけるターゲット配列の相対的発生量を決定する方法であって：
ａ．少なくとも１のプライマ−プロモータ−セレクタ構造をサンプルにおけるターゲット配列に結合するステップであって、該構造がプライマ部分配列、プロモータ部分配列、及びセレクタ部分配列を含み、前記プライマ部分配列の５’末端が前記プロモータ部分配列の３’末端に連結し、前記プロモータ部分配列の５’末端が前記セレクタ部分配列の３’末端に連結し：
ｉ．前記プライマ部分配列が前記ターゲット配列とアニーリングし；
ｉｉ．前記プロモータ部分配列が前記セレクタ部分配列の転写を方向付けることが可能であり；
ｉｉｉ．前記セレクタ部分配列及びその相補性部分配列が、前記サンプルに存在する任意の部分配列とアニーリングしないステップと；
ｂ．前記セレクタ部分配列を増幅するステップと；
ｃ．増幅産物の相対量を検出するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法において、前記プライマ部分配列及び前記ターゲット配列が増幅しないことを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項２０に記載の方法において、前記セレクタ部分配列の増幅がインビトロ転写（ＩＶＴ）によるものであり、前記増幅産物が、前記セレクタ部分配列に相補的な配列を含むＲＮＡであることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２０に記載の方法において、前記ターゲット配列がｍＲＮＡ及びウイルス性ＲＮＡを含むＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はＰＣＲ産物であることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法において、前記ターゲット配列が前記プライマ部分配列とアニーリング可能な形態で存在することを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２３に記載の方法において、前記ターゲット配列が特定遺伝子の対立遺伝子であることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項２３に記載の方法が、ターゲット配列とアニーリングしなかった構造から、前記ターゲット配列とアニーリングした構造を分離するステップを更に具えることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２３に記載の方法において、前記プライマ−プロモータ−セレクタ構造のプライマ部分を伸長するステップを更に具えることを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法において、該伸長したプライマを含む構造が、伸長しなかった構造から分離されることを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２６に記載の方法において、該アニーリングと伸長とをしなかった構造又は未反応の転写反応試薬の分離が、サイズ排除又は親和力分離、磁力分離を含む固相分離、酵素処理、又はこれらの任意の組合せによって行われることを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２７に記載の方法において、該伸長が鋳型を媒介した伸長又は鋳型を媒介した核酸連結によって行われることを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法において、伸長によって、標識したｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ又は標識したオリゴヌクレオチドが組み込まれることを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項２７に記載の方法において、前記伸長構造が固相に捕捉されることを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法において、前記固相が磁性粒子であることを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項３０に記載の方法において、前記伸長及び核酸連結が対立遺伝子に特異であることを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項２０に記載の方法において、前記増幅産物の相対量を検出するステップが、コード化した微小粒子上に陳列されたプローブのＲＴ触媒伸長によるものであり、前記増幅産物が伸長用の鋳型として作用することを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法において、検出が増幅と同時に行われることを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法において、該同時に行われる増幅及び増幅産物の検出が１００ｎｌ以下の反応量で生じることを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項２２に記載の方法において、前記ＩＶＴ反応によって、検出可能な光学的特性が該ＲＮＡ産物に導入されることを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項２２に記載の方法において、前記増幅産物の相対量を検出するステップが、コード化した微小粒子に陳列される捕捉プローブと増幅産物をアニーリングすることによるものであることを特徴とする方法。
【請求項４０】
ゲノムサンプルにおけるヘテロ接合体の喪失を決定する方法であって：
ａ．対立遺伝子に特異的であり、遺伝子の正常型対立遺伝子に特異的な第１のプライマ−プロモータ−セレクタ構造と、対立遺伝子に特異的であり、遺伝子の変異型対立遺伝子に特異的な第２のプライマ−プロモータ−セレクタ構造とを用いるステップであって、各々の構造がプライマ部分配列、プロモータ部分配列、及びセレクタ部分配列を含み、前記プライマ部分配列の５’末端が前記プロモータ部分配列の３’末端に連結し、前記プロモータ部分配列の５’末端が前記セレクタ部分配列の３’末端に連結し：
ｉ．前記プロモータ部分配列が前記セレクタ部分配列の転写を方向付けることが可能であり；
ｉｉ．前記セレクタ部分配列及びその相補性配列が、該サンプルに存在する任意の部分配列とアニーリングしないステップと；
ｂ．前記構造の前記プライマ部分配列を前記ゲノムサンプルとアニーリングするステップと；
ｃ．該セレクタ配列を増幅するステップと；
ｄ．該増幅した対立遺伝子の相対発生量を示す信号強度を決定し、ヘテロ接合体の喪失があるかどうかを決定するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項４１】
請求項２０に記載の方法が、遺伝子発現分析、対立遺伝子の計数、又は対立遺伝子コピー数決定に用いられることを特徴とする方法。
【請求項４２】
遺伝子発現分析のためにｍＲＮＡのサンプルに存在する第１のターゲット配列の相対量を決める方法であって、当該方法が：
ａ．前記ターゲット配列を含むｍＲＮＡのサンプルを提供するステップと；
ｂ．プライマ部分配列と、プロモータ部分配列と、セレクタ部分配列とを含む構造を提供するステップであって、前記プライマ部分配列の５’末端が前記プロモータ部分配列の３’末端に連結し、前記プロモータ部分配列の５’末端が前記セレクタ部分配列の３’末端に連結し：
ｉ．前記プロモータ部分配列が前記セレクタ部分配列の転写を方向付けることが可能であり；
ｉｉ．前記セレクタ部分配列及びその相補性配列が、前記サンプルに存在する任意の部分配列とアニーリングしないステップと；
ｃ．前記構造の前記プライマ部分配列をサンプルにおける遺伝子材料とアニーリングするステップと；
ｄ．ｍＲＮＡとアニーリングしない前記構造を除去するステップと；
ｅ．指定期間中に、該セレクタ配列を転写するステップと；
ｆ．該転写によって産生したＲＮＡの量を決定するステップと；
ｇ．前記サンプルにおける前記第１のターゲット配列の相対量を示すために、同一の反応ステップａ）ないしｆ）で産生するが、第２のターゲット配列及び別個セレクタで産生したＲＮＡ量に対して、前記ＲＮＡ量を相関させるステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法において、前記ｍＲＮＡが細胞から分離されるか、あるいはゲノムＤＮＡ、ＰＣＲ産物、又は増幅反応物から産生されることを特徴とする方法。
【請求項４４】
請求項４２に記載の方法において、該転写プライマ−プロモータ−セレクタ構造が、Ｔ３若しくはＴ７又はＳＰ６プロモータ配列を具えることを特徴とする方法。
【請求項４５】
請求項４２に記載の方法において、前記セレクタ部分配列又はその相補性部分配列のいずれも、前記ｍＲＮＡのサンプルにおいて部分配列と相補性ではないことを特徴とする方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法において、いくつかの構造が前記ｍＲＮＡにおけるいくつかの指定された部分配列の量を決定し、各々の構造の特定のセレクタ部分配列が特定のプライマ部分配列に関連づけられることを特徴とする方法。
【請求項４７】
請求項４２に記載の方法において、前記転写が前記セレクタ部分配列と相補的な標識したＲＮＡ部分配列又は標識しないＲＮＡ部分配列を産生することを特徴とする方法。
【請求項４８】
請求項４２に記載の方法において、ＲＮＡが、微小粒子に陳列されたオリゴヌクレオチドとアニーリングすることによって捕捉されることを特徴とする方法。
【請求項４９】
請求項４８に記載の方法において、前記ＲＮＡの量が、捕捉した、標識したＲＮＡオリゴヌクレオチドに関連する光学信号を記録することにより決定されることを特徴とする方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法において、光学信号を産生可能な検出用の部分が、標識したヌクレオチドを用いて、転写時に前記ＲＮＡに添加されることを特徴とする方法。
【請求項５１】
請求項５０に記載の方法において、前記標識したヌクレオチドが、フルオロフォアを含むことを特徴とする方法。
【請求項５２】
請求項５１に記載の方法において、前記標識したヌクレオチドが、フルオロフォアを含む抗体で修飾可能なハプテンを含むことを特徴とする方法。
【請求項５３】
請求項４８に記載の方法において、前記オリゴヌクレオチドが、コード化した微小粒子に陳列されることを特徴とする方法。
【請求項５４】
請求項５２に記載の方法において、捕捉に続いて、前記オリゴヌクレオチドが伸長し、標識したｄＮＴＰ若しくはｄｄＮＴＰ又は標識しないｄＮＴＰ若しくはｄｄＮＴＰが添加されることを特徴とする方法。
【請求項５５】
請求項４８、５２、又は５３のいずれか１項に記載の方法において、前記ＲＮＡの相対量が、該捕捉したＲＮＡオリゴヌクレオチドに関連する光学信号の強度を、前記別個の指定された部分配列に関連する光学信号の強度と相関させることにより決定されることを特徴とする方法。
【請求項５６】
請求項４２に記載の方法が、前記サンプルにおける同一又は別個のｍＲＮＡにある追加の指定された部分配列を、当該追加の指定された各部分配列について同一ステップａ）乃至ｇ）を行った後にモニタリングするステップを更に具えることを特徴とする方法。
【請求項５７】
請求項４４に記載の方法が、前記Ｔ７プロモータ部分配列と二本鎖を形成する別のＴ７プロモータ部分配列を更に含むことを特徴とする方法。
【請求項５８】
請求項４２に記載の方法において、該ステップｃ）が、結合したハプテンを含むヌクレオチドを有する前記構造を伸長するステップと、該伸長した構造を前記ハプテン用の配位子を保有する微小粒子に捕捉させるステップとを更に具えることを特徴とする方法。
【請求項５９】
請求項５８に記載の方法が、アニーリングされないか、あるいは伸長されない構造からの精製に続く、前記伸長構造の捕捉ステップを更に具えることを特徴とする方法。
【請求項６０】
請求項５８に記載の方法において、前記ハプテンがビオチン又は抗原部分であり、前記配位子がストレプトアビジン若しくはニュートラアビジン又は抗体であることを特徴とする方法。
【請求項６１】
請求項５８に記載の方法において、前記微小粒子が、請求項４８に記載の微小粒子を更に含むビードアレイにあることを特徴とする方法。
【請求項６２】
ＤＮＡ又はＲＮＡのサンプルにおけるターゲットの多型部位又は突然変異部位の存在を決定する方法であって：
ａ．前記多型部位又は突然変異部位を含むＲＮＡ又はＤＮＡのサンプルを提供するステップと；
ｂ．該対象の各部位のためにプライマ−プロモータ−セレクタ構造を提供するステップであって、各々の構造がプライマ部分配列、プロモータ部分配列、及びセレクタ部分配列を含み、前記プライマ部分配列の５’末端が前記プロモータ部分配列の３’末端に連結し、前記プロモータ部分配列の５’末端が前記セレクタ部分配列の３’末端に連結し：
ｉ．前記プライマ部分配列が前記ターゲットの多型部位又は突然変異部位をアニーリングし；
ｉｉ．前記プロモータ部分配列が前記セレクタ部分配列の転写を方向付けることが可能であり；
ｉｉｉ．前記セレクタ部分配列及びその相補性配列が、前記サンプルに存在する任意の部分配列とアニーリングしないステップと；
ｃ．前記ＲＮＡ又はＤＮＡの配列領域と相補的なヌクレオチドで伸長構造を産生するために、該３’方向に前記プライマ部分配列を伸長するステップであって、前記ヌクレオチドが前記伸長構造に組み込まれる親和性ハプテンを含み、前記ターゲットの配列のヌクレオチドが前記プライマ部分配列の３’末端と相補的であるステップと；
ｄ．固体担体表面に陳列した配位子に前記親和性ハプテンを結合することにより過剰な未使用の構造から前記伸長構造を分離するステップと；
ｅ．ＲＮＡを産生するために、前記固体担体に結合した前記伸長構造の該セレクタ配列を転写するか、あるいは前記固体担体に結合しない前記伸長構造の前記セレクタ配列を転写するステップと；
ｆ．産生したＲＮＡの存在を決定するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項６３】
請求項６２に記載の方法において、前記親和性ハプテンがビオチン又は抗原部分であり、前記配位子がストレプトアビジン若しくはニュートラアビジン又は抗体であることを特徴とする方法。
【請求項６４】
請求項６２に記載の方法において、前記固体担体が磁性又は常磁性であり、前記固体担体へのハプテンの結合に続き、前記固体担体がその位置を固定するように磁力で引きつけられ、次いで未使用構造が除去されることを特徴とする方法。
【請求項６５】
請求項６２に記載の方法において、前記固体担体が親和力カラムの形態であるか、あるいは分離がカラム分離を含むことを特徴とする方法。
【請求項６６】
請求項６２に記載の方法において、前記ＲＮＡの除去がなされるか、あるいは前記構造の伸長に続いて適所に保持されることを特徴とする方法。
【請求項６７】
請求項６５に記載の方法において、前記除去がＲＮａｓｅＨにより触媒された消化によるものであることを特徴とする方法。
【請求項６８】
請求項６２に記載の方法において、カラム分離がエキソヌクレアーゼＩ処理に先行することを特徴とする方法。
【請求項６９】
請求項６２に記載の方法において、産生したＲＮＡがコード化した微小粒子に陳列したオリゴヌクレオチドにアニーリングすることによって捕捉し、別個のコード化した微小粒子が別個のオリゴヌクレオチドを陳列することを特徴とする方法。
【請求項７０】
請求項６２に記載の方法において、分離に続いて、前記オリゴヌクレオチドが標識した伸長産物を産生するように、標識したｄＮＴＰ又は標識したｄｄＮＴＰを含む反応において伸長することを特徴とする方法。
【請求項７１】
請求項６２に記載の方法において、ＲＮＡが標識したＮＴＰの組み込みによって標識されることを特徴とする方法。
【請求項７２】
請求項７０又は７１に記載の方法において、特異なオリゴヌクレオチドを陳列することが既知の微小粒子からの信号によって、多型又は突然変異の存在が同定されることを特徴とする方法。
【請求項７３】
請求項６２に記載の方法において、対象の各々の多型部位／突然変異部位に対して構造対が提供され、第１のセレクタ部分配列を含む前記対の一方のヌクレオチドが３’末端で、該プライマが該正常型の対立遺伝子と相補的であり、第２のセレクタ部分配列を具える前記対の他方のヌクレオチドが３’末端で、前記プライマが変異型の対立遺伝子と相補的であることを特徴とする方法。
【請求項７４】
ＤＮＡ又はＲＮＡのサンプルにおいて多型部位又は突然変異部位の存在を決定する方法であって：
ａ．前記多型部位又は突然変異部位を含むＲＮＡ又はＤＮＡのサンプルを提供するステップと；
ｂ．各々の前記多型部位又は突然変異部位のために：
ｉ．前記多型部位又は突然変異部位に直接的に連結したヌクレオチドに相補的な３’末端のヌクレオチドを含むプライマ部分配列と；
ｉｉ．セレクタ部分配列と；
ｉｉｉ．前記セレクタ部分配列の転写に向かうように方向付けることが可能な転写プロモータの部分配列と；
を含む構造を提供するステップと；
ｃ．対象の部位で前記ヌクレオチドと相補的な５’末端を含むオリゴヌクレオチドを提供するステップと；
ｄ．核酸連結産物を産生するために第１のオリゴヌクレオチドと前記構造とを核酸連結するステップと；
ｅ．余分な核酸連結されない構造を除去するステップと；
ｆ．ＲＮＡを産生するために、前記核酸連結産物のセレクタ配列を転写するステップと；
ｇ．産生したＲＮＡの存在を決定するステップと；
を具え、前記プライマ部分配列の５’末端が前記プロモータ部分配列の３’末端に連結し、前記プロモータ部分配列の５’末端が前記転写プロモータの部分配列の３’末端に連結することを特徴とする方法。
【請求項７５】
請求項７４に記載の方法が、標識したｄＮＴＰｓを有する前記核酸連結産物を伸長する、ステップ（ｄ）とステップ（ｅ）との間のステップであって、前記標識を配位子によって結合可能な部位を提供するステップと、固体担体表面上に陳列した配位子に該１以上の標識を結合することによって、前記核酸連結産物をターゲットから分離する、ステップ（ｅ）とステップ（ｆ）との間のステップとを更に具えることを特徴とする方法。
【請求項７６】
請求項７４に記載の方法が、サンプルにおけるウイルスからｍＲＮＡの存在を検出するのに用いられ、磁性捕捉ビーズが対象のｍＲＮＡとハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチド保有する共集合ビードアレイと、コード化検出ビーズが、ステップａ．ないしｆ．における反応で得られる前記ＲＮＡを特徴づけるべくオリゴヌクレオチドを保有することを特徴とする方法。
【請求項７７】
対象が突然変異の遺伝子座及び／又は多型の遺伝子座に対してホモ接合型、ヘテロ接合型、又は正常型であるかどうかを決定する方法であって、請求項６２又は７４に記載の方法を実施するステップと、当該ステップによって産生される変異型のＲＮＡに対する正常型のＲＮＡの相対数及び比率を決定するステップとを具えることを特徴とする方法。
【請求項７８】
請求項６２又は７４に記載の方法が、対象におけるヘテロ接合型の喪失を決定するために用いられることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願
本特許出願は、２００５年９月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／７１９０６３号に対する優先権を主張する。
【０００２】
潜在的な政府利権の状態
本発明は、部分的に中小企業技術革新制度（ＳＢＩＲ）基金番号ＤＡＭＤ１７−０３−Ｃ−００４７  Ｃから、米軍により管理されているプログラム下で資金提供を受けて開発されたものである。政府が本発明の権利を有している。
【背景技術】
【０００３】
インビトロ転写又はＩＶＴを用いたｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの線形増幅は、分子生物学の公知の方法である（Ｋｒｉｅｇ＆Ｍｅｌｔｏｎ，１９８４，Ｍｅｌｔｏｎ，１９８４参照）。ＩＶＴは各ターゲットに対して、そのターゲットの元のコピー数に比例する多数のＲＮＡ生成物を生成するので、相対的メッセージ発生量の決定が可能であり（米国特許第５，５４５，５２２号、第５，７１６，７８５号，第５，８９１，６３６号；Ｖａｎ  Ｇｅｌｄｅｒら，１９９０）、従って、遺伝子発現の分析の関係において、広く適用されてきた（米国特許第５，５１４，５４５号）。ＩＶＴは、病原体のＲＮＡ又は低次のｍＲＮＡを検出することが可能な、指数関数的なターゲット増幅を確実にする等温法の中心原理でもある（米国特許第５，３９９，４９１号；欧州特許第０３６８  ９０６  Ｂ２号；Ｇｕａｔｅｌｌｉら，１９９０）。
【０００４】
従来技術によると、米国特許第６，２９１，１７０号及び、第５１４，５４５号、並びに米国特許出願第２００５／０１３０１９４号及び第２００５／０１２３９４３号で開示されているように、従来の配列ステップは次のとおりである：ｃＤＮＡ合成は、５’末端にＴ７プロモータ配列（非鋳型鎖）を含有するＲＮＡのｐｏｌｙＡの３’末端に相補性のあるプライマを用いて最も頻繁に行われる；代替的に、配列又は遺伝子特異的プライマは５’末端以外の場所に配置されてもよい。ＲＮＡ鋳型のＲＮａｓｅＨ消化又は、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの熱変性の後で、全長又は部分長のｄｓＤＮＡを生成するために（プライマの配置に依存する）、二本鎖のＴ７プロモータ配列（及び近接領域）を取り入れて、第二鎖のＤＮＡ合成が行われる（Ｇｏｕｂｌｅｒ，Ｕ．，１９８３）。その方法を実際に実現するにあたっては、ＤＮＡポリメラーゼ又はＲＴを第二鎖の合成に触媒作用を効果的に及ぼすようにその反応に添加しなければならない（大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼの使用を記述した米国特許第５，５４５，５２２号；Ｋｗｏｈら，１９８９を参照）。アンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）は、インビトロ転写によってＤＮＡの第二鎖から合成され、ａＲＮＡの生成物は、例えば分子標識（Ｖｅｔ，Ｊ．Ａ．Ｍ．，２００２；以下は２００５年９月２日に出願されたＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社の特許１１／２１８８３８も参照）、又はハイブリダイゼーション保護アッセイ（米国特許第６，００４，７４５号；Ａｒｎｏｌｄら）、又はプローブ伸長のような変異体を含むオリゴヌクレオチドプローブを捕捉するハイブリダイゼーションにより、検出される。この分野のこれらの方法は全て、元のｍＲＮＡターゲットからの二本鎖のｃＤＮＡの合成と、ＲＮＡ分解の介在ステップを必要とする。これらの方法は、複雑かつ時間のかかるステップにより、事実上、実験室の研究に制限されてきた。臨床上の設定において、このような複雑なプロトコルの使用は、このような複雑な（「難解な」）分析を処理する資格を有する実験室の技術スタッフに、特別な訓練、及び多くの場合は証明を要求することになる。
【０００５】
核酸の検出及び配列分析−ＩＶＴは、ＤＮＡ分析に適用することもでき、突然変異又は多型性分析を含んでいる。一般的に、これらの適用は、変異体の多重度において、最も一般的にはポリメラーゼ連鎖反応（Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．Ｃ．，２００５、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号；Ｍｕｌｌｉｓを参照）の適用や全体的なゲノム増幅による、遺伝物質の指数関数的な増幅、すなわち、ゲノムＤＮＡを必要とする（例えば、核酸連結媒介全体のゲノム増幅で、ＵＳＣＤが米国特許第５，６８６，２４３号を取得していることを参照）。ＩＶＴは、とりわけ、ＩＶＴ反応において生成されるＲＮＡ鎖の、連続的な多重検出を伴うそのステップの組合せを可能にする利点を有するＰＣＲ増幅（例えば、２００５年９月２日に出願されたＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社の出願；第１１／２１８８３８号出願（ＩＶＴ）を参照）に続く、鎖選択の方法を提供する。
【０００６】
信頼性のある多重増幅の設計及び検出反応を簡単にし、かつ速めること、及び、遺伝発現分析（米国特許第５，５１４，５４５号）及び、複雑な手順を臨床上の設定に好適なより簡単で強いプロトコルによる核酸分析に関するその他のタスクに置き換えることは有益である。特にこのコンテキストにおいては、好ましくはホモジニアスアッセイフォーマット（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒｍａｔ）の実現を可能にする方法において、統合されたプロトコル、すなわち、複数の分析のステップを結合するプロトコルを開発することが有益である。アッセイ完成のために必要となる時間、及び特に「実践の」時間を短くするために、複数の増幅生成物の検出によって増幅と分析を組み合わせることは、特に有益である。更に、好ましくはホモジニアスアッセイフォーマットの実現と適合する方法において、ステップの組合せは、小型化を促進し、次いで、試薬の消費及びサンプル及び実験室設備の双方の汚染の危険を減ずるであろう。
【０００７】
ＩＶＴ反応、特にここに記述されているような（二本鎖の鋳型よりむしろ）単鎖の鋳型を用いるＩＶＴ反応は、これらの利点の多くを提供している。
【０００８】
実際に、単鎖型のプロモータの鋳型鎖を利用し、かつ対象の親ＤＮＡ鎖のコピーを生成する単鎖鋳型（ｓｓｔ）からの転写に触媒作用をもたらす単鎖型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの能力が、文献に記述されている（Ｋｕｋａｒｉｎ，Ａ．ら，２００３；Ｋｏｒｅｎｃｉｃ  Ｄ．ら，２００２；Ｔｅｍｉａｋｏｖ  Ｄ．ら，２００２）。しかしながら、（従来の）ＩＶＴの実際の実装においては、この反応はインビトロ転写の有害な副作用であると考えられている。
【０００９】
現在のところ、ｓｓｔ−ＩＶＴ反応は、主に、ある一般的には所望されない特徴のために、複雑な分析プロトコルの開発と実現に完全には応用されていない。まず、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ鋳型を用いた標準のＩＶＴフォーマットと比較した場合、大きくない収量により、相当数のターゲット分子を必要とする従来の構成において行われるアッセイプロトコルの感度が制限され、同等にイオン強度が大きくないバッファにおける乏しい動作は、一般的にアッセイプロトコルの存在内において用いられるその他の上流または下流の酵素反応に適合しない。しかしながら、下に記述するようにこれらの点に取り組むことにより、増幅と同時検出との統合と複数生成物の分析を可能にする方法で、ｓｓｔ−ＩＶＴは核酸分析の多数の適用に好適になるよう最適化することができる。
【００１０】
背景技術の参考文献（全てが引用として参照されている）
下記のものは、確実に下の用語及び表現の理解を手伝うための背景技術とすることができる。これらの参考文献は、時に著者、番号、又はその他の筋書によって下の本文に引用される。
【特許文献１】米国特許第５，５１４，５４５号，１９９６． Ｅｂｅｒｗｉｎｅ，Ｊ．“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ ＲＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．”
【特許文献２】欧州特許第０  ３６８  ９０６  Ｂ２号(Ｇｉｎｇｕｅｒａｓら； 等温の指数関数的増幅（“３ＳＲ”）を論ずる）
【特許文献３】米国特許第５，３９９，４９１号(Ｋａｃｉａｎら；等温の指数関数的増幅を論ずる) Ｔ  Ｋｉｅｖｉｔｓら, Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈ  ３５（Ｉｓｓｕｅ  ３），Ｄｅｃ  １９９１，ｐｐ  ２７３  ２８６；ＥＰ  ２７３０８６（ＮＡＳＢＡを論ずる）
【特許文献４】米国特許出願第ＵＳ２００３／００８２５８４  Ａ１号：“Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”，Ｓｈｉ  Ｌ．ら
【特許文献５】米国特許第５，６８６，２４３号
【特許文献６】米国特許第５，７５９，８２０号（Ｄｙｎａｌ  ＡＳ）Ｈｏｒｎｅｓ  Ｅ．ら，“Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃＤＮＡ”
【特許文献７】米国特許第５，７１６，７８５号；第５，８９１，６３６号，及び米国特許第５，５４５，５２２号（Ｖａｎ  Ｇｅｌｄｅｒら)；Ｖａｎ  Ｇｅｌｄｅｒら，１９９０“Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｆｒｏｍ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｃＤＮＡ”，ＰＮＡＳ  ８７，１６６３−１６６７Ｓ）；
【特許文献８】２００２年８月２３日出願の米国特許出願（ＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）：“Ｍｕｌｔｉａｎａｌｙｔｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｒｒａｙｓ”第１０／２０４７９９号（ランダムコード化アレイ検出（Ｒａｎｄｏｍ  Ｅｎｃｏｄｅｄ  Ａｒｒａｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）であるＲＥＡＤＴＭを論じる）；
【特許文献９】２００２年１０月１５日出願の米国特許出願（ＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社，下に時に「ｅＭＡＰ」として引用される）：“Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  Ｌｏｃｉ  ｂｙ  Ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ”；第１０／２７１，６０２号；
【特許文献１０】２００４年１０月２６日出願の米国特許出願（ＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社，下に時に「多重発現プロファイリング（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）」として引用される）：“Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｐｒｏｂｅｓ，”第１０／９７４，０３６号，（そこには、差次的遺伝子発現の分析を減ずることに関する論文も含有しており、本特許出願公開において、センス及びアンチセンス鎖はＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡ−ｐｏｌ）のプロモータ配列の取り込むことにより生成される）；
【特許文献１１】２００１年１２月２８日出願の米国特許出願（ＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）：“Ｍｕｌｔｉａｎａｌｙｔｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｒｒａｙｓ”；第１０／０３２，６５７号（“Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｅｎｃｏｄｅｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ”）
【特許文献１２】２００５年９月２日出願の米国特許出願（ＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）：“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ”；第 １１／２１８８３８号；そこに引用されている仮特許出願：２００４年９月２日出願の“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｐｔｕｒｅ，Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ”；第６０／６０６６６６号；２００４年９月２日出願の“ＩＶＴ−ＲＴ  ｅＭＡＰ  Ａｓｓａｙｓ；ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｅｎｃｏｄｅｄ ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＩＶＴ”；第６０／６０６６６６号も参照。
【特許文献１３】２００２年８月２３日出願の米国特許出願（ＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）：“Ｍｕｌｔｉａｎａｌｙｔｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｒｒａｙｓ”； 第１０／２０４，７９９号（ランダムコード化アレイ検出であるＲＥＡＤＴＭを論じる）；
【特許文献１４】２００１年１２月２８日出願の米国特許出願（ＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）：“Ｍｕｌｔｉａｎａｌｙｔｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｒｒａｙｓ”；第１０／０３２，６５７号
【特許文献１５】２００２年７月９日出願の米国特許出願（ＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）：“Ａｒｒａｙｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒｅｏｆ，”；第１０／１９２，３５２号
【特許文献１６】２００１年１月２４日出願の米国特許出願（ＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社，下に時に「ＰＡＲＳＥＴＭ」として引用される)：“Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，”， 第０９／７６８，４１４号
【特許文献１７】米国特許第６，２５１，６９１号（ＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社，下に時に「ＬＥＡＰＳ」として引用される)：“Ｌｉｇｈｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｎｅａｒ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ”：特に図８を参照；
【特許文献１８】米国特許第６，２９１，１７０号
【特許文献１９】米国特許第５，６８６，２４３号
【特許文献２０】米国特許出願第２００５／０１３０１９４号及び第２００５／０１２３９４３号
【特許文献２１】米国特許第５，２８３，１７４号、第５，６３９，５９９号  Ａｒｎｏｌｄ
【特許文献２２】米国特許第６，２９１，１７０号
【特許文献２３】米国特許第６，００４，７４５号
【特許文献２４】米国特許第４，６８３，２０２号
【特許文献２５】米国特許第６，７９７，５２４  ＢＡＳ号
【特許文献２６】米国特許出願第１０／９７３７００号
【特許文献２７】米国特許出願第１０／３４８１２３号
【特許文献２８】米国仮特許出願第６０／６２８４６４号
【非特許文献１】Ｓｅｏ，Ｍ．Ｙ．，Ｒｈａ，Ｓ．Ｙ，Ｙａｎｇ  Ｓ．Ｈ．，Ｋｉｍ，Ｓ．Ｃ．，Ｌｅｅ，Ｇ．Ｙ．，Ｌｅｅ，Ｇ．Ｙ．，Ｐａｒｋ，Ｃ．Ｈ．，Ｃｈｕｎｇ，Ｈ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｔｈｅ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｂｉｌａｔｅｒａｌ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｕｒｖｅｙｅｄ  ｂｙ  ｃＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｉｎｔ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １３：１７−２４
【非特許文献２】Ｓｅｌｌｅｒｓ，Ｗ．Ｒ．２００５．Ｎａｔｕｒｅ，Ｊｕｌｙ  ７  ｉｓｓｕｅ
【非特許文献３】Ｈｉｒｓｃｈ  Ｆ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ９７：６２１−６２３，６４３−６５５．
【非特許文献４】Ｏｇｉｎｏ  Ｓ，Ｗｉｌｓｏｎ  ＲＢ．，２００４．ｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  ＭｏＩ  Ｄｉａｇｎ．２００４  Ｊａｎ；４（１）：１５−２９．
【非特許文献５】Ｄｕｔｔａ  Ｓ，Ｎａｎｄａｇｏｐａｌ  Ｋ，Ｇａｎｇｏｐａｄｈｙａｙ  ＰＫ，Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ  Ｋ．，２００５．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｄｏｗｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｉｎｄｉａｎ  Ｐｅｄｉａｔｒ．２００５  Ａｐｒ；４２（４）：３３９−４４．
【非特許文献６】Ｇｕｂｌｅｒ，Ｕ．，ａｎｄ  Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｂ．（１９８３）Ｇｅｎｅ  ２５，２６３−２６９
【非特許文献７】Ｖｅｔ，Ｊａｃｑｕｅｌｉｎｅ  Ａ．Ｍ．，Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｒｉｊｔ  Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｌｏｍ  Ｈｅｎｋ  Ｊ．２００２．Ｍｏｌｅｃｕ  ｂｅａｃｏｎｓ：ｃｏｌｏｒｆｕｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ  ２（１）
【非特許文献８】Ｋｕｋａｒｉｎ  Ａ．，Ｒｏｎｇ  Ｍ，ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ  ＷＴ．２００３．Ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｏｆ  Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｌｌｏｗｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｔｅｍｐｌａｔｅ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７８（４）：２４１９−２４
【非特許文献９】Ｋｏｒｅｎｃｉｃ  Ｄ，Ｓｏｌｌ  Ｄ，Ａｍｂｒｏｇｅｌｌｙ  Ａ．２００２．Ａ  ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｎ−ｖｉｔｒｏ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０（２０）：ｅ１０５
【非特許文献１０】Ｔｅｍｉａｋｏｖ  Ｄ，Ａｎｉｋｉｎ  Ｍ， ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ  ＷＴ．２００２．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｏｎ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７７（４９）：４７０３５−４３）．
【非特許文献１１】Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，１９８２．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ(ＣＳＨＬ）
【非特許文献１２】Ｋｒｉｅｇ  &  Ｍｅｌｔｏｎ．１９８４．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡｓ  ａｒｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＳＰ６  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｃＤＮＡｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １２，７０５７−７０７（ＳＰ６、Ｔ６、Ｔ７プロモータ配列の使用を論ずる)
【非特許文献１３】Ｍｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．１９８４．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ＳＰ６  ｐｒｏｍｏｔｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，７０３５−７０５６．
【非特許文献１４】Ｓｙｖａｎｅｎ  ＡＣ．２００５  Ｔｏｗａｒｄ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ＳＮＰ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００５  Ｊｕｎ；３７  ｓｕｐｐｌ：Ｓ５−１０．
【非特許文献１５】Ｓｃｈｏｕｔｅｎ  ＪＰ，ＭｃＥｌｇｕｎｎ  ＣＪ，Ｗａａｉｊｅｒ  Ｒ，Ｚｗｉｊｎｅｎｂｕｒｇ  Ｄ，Ｄｉｅｐｖｅｎｓ  Ｆ，Ｐａｌｓ  Ｇ．２００２．Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ４０  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｂｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００２  Ｊｕｎ  １５；３０（１２）：ｅ５７．
【非特許文献１６】Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ，“Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ，ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｂｙ  ａ  ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌｅｄ  ａｆｔｅｒ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７，１８７４−１８７８（１９９０）
【非特許文献１７】Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ，“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｗｉｔｈ  ａ ｂｅａｄ−ｂａｓｅｄ  ｓａｎｄｗｉｃｈ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒｍａｔ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ  ８６，１１７３−１１７７（Ｆｅｂ  １９８９） (熱サイクルを用いた転写媒介増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を論ずる）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
開示されているのは、単鎖のプライマ−プロモータ−セレクタ構造とインビトロ転写により媒介される方法であって：多重遺伝子発現の分析と；多重対立遺伝子の計数と；遺伝子コピー数の多型性分析と；及び突然変異と多型性の同定のための対立遺伝子識別とを行うために、前述した単鎖のプライマ−プロモータ−セレクタ構造（便宜上、ここでは単鎖鋳型ＩＶＴ（ｓｓｔ−ＩＶＴ）ともいうフォーマット）のメッセージ発生量と対立遺伝子コピー数決定を用いている。単鎖のプライマ−プロモータ−セレクタ構造は、セレクタ配列のみの増幅用のＩＶＴをプライマ３’伸長の反対方向に方向付ける方法に関連した３つの機能的に独立した部分からなる。
【００１２】
一般的に、全てのターゲット増幅法は、プライマの収縮部分のターゲットに特異なアニーリングに始まり、続いて、伸長、逆転写、又は別のオリゴヌクレオチドへのプライマの結合がある。この構造は、一般的に、配列が特異なターゲットプライミング部分配列と、Ｔ７（又はＴ３、又はＳＰ６、その他適当な）プロモータ部分配列（鋳型鎖）と、試験的に特定のプライミング部分配列に独自に関連付けられているセレクタ部分配列とを具えている。ｓｓｔ−ＩＶＴ反応において、Ｔ７（又はその他の）プロモータ配列は、逆転写（ＲＴ）（又は、ＤＮＡ鋳型の場合、より一般的には伸長；図１を参照）と逆方向へ転写が向かうよう方向付けをする。結果として、ここに開示されており、従来のＩＶＴフォーマットと対照的なｓｓｔ−ＩＶＴは、部分ではなく、かつ、原型のターゲットのどの部分でもないように設計された配列を増幅する。ｓｓｔ−ＩＶＴ用のＲＮＡ鋳型は、メッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又はウィルス性ゲノムＲＮＡであり、より一般的には以前のＩＶＴ反応により生成されたＲＮＡ生成物である。本発明の方法は、例えば、（単鎖のターゲットを生成するための）変性、及び／又は断片化（Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．，１９８２）の後に続くｇＤＮＡの分析にも有用である。ｓｓｔ−ＩＶＴの性能及び能率は、単鎖ＤＮＡ鋳型のようであるが、二本鎖（ｄｓ）Ｔ７プロモータ部分配列（プライマ（鋳型）内に組み込まれたこのような鎖、その他はそこへアニール化される（非鋳型））を有するセレクタを用いて改良される。
【００１３】
ｓｓｔ−ＩＶＴ用鋳型を生成するために、伸長又は逆転写（ＲＴ）反応を行って、対象のターゲット鎖にアニーリングした後に、プライマを伸長することができる。使用されないプライマからの伸長生成物のその後の分離を促進するために、この反応は修飾ｄＮＴＰｓ、例えばビオチン又はその他のハプテンで修飾されたｄＮＴＰｓを用いて行われ、その結果、例えばＲＴ反応の完了の後に、修飾ｄＮＴＰｓを含むｃＤＮＡ生成物を固相へ捕捉することができる。分離ステップは、カラム精製を用いて行うことができ、修飾ｄＮＴＰｓの必要がなくなる。
【００１４】
一実施例において、ｓｓｔ−ＩＶＴはＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ二本鎖を鋳型として利用することができ、プライマ−プロモータ−セレクタ構造を用いて逆転写により生成されるｃＤＮＡは、完全な原型のｍＲＮＡへアニール化されたままである。一変異体においては、ｓｓｔ−ＩＶＴ反応を、固相基質へ付着させたＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ二本鎖で行うことができる。
【００１５】
ｓｓｔ−ＩＶＴ反応は、長さが等しく、次々とセレクタ部分配列に対して相補性の多数のＲＮＡ断片を生成する。このセレクタ部分配列（及びその相補性配列）は、その反応において、存在する又は存在すると予測されるその他の配列と異なるように設計されることが好ましい。それは、続く固相反応の独特の捕捉配列（ｃａｐｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）として作用し、ランダムコード化アレイ検出（ＲＥＡＤＴＭ）フォーマット（米国特許第６，７９７，５２４号を参照）のコード化された微小粒子（「ビーズ」）上で行われることが好ましい。コード化された固相担体上に陳列されたプローブへの捕捉は、修飾ＮＴＰｓの組み込みによって標識したＲＮＡ生成物の光学的検出又は、修飾ｄＮＴＰｓを用いるプローブ伸長（「ｅＭＡＰ」は、特許出願第１０／２７１，６０２号及び米国特許出願第１１／２１８８３８号を参照）に触媒作用を及ぼす鋳型媒体の逆転写を可能にする；図１。
【００１６】
更に以下に述べるように、ここに開示した（及び、図２、３、及び４において示す）プロトコルは、複雑なアプリケーションを実質的に簡略化し、処理速度を上げる。これらのプロトコルは、以下の利点を有している（ＲＮＡターゲット及びＲＴについての記載は、必要な変更を加えると、ＤＮＡ及びプライマ伸長にあてはまる）：
−  単機能プライマのみが用いられ、実施の際に、一実施例においてｍＲＮＡ鋳型の消化、及び第２のプライマとＤＮＡポリメラーゼの導入を必要とする第２のＤＮＡ鎖合成は不要でありなくすことができる。；
−  第二鎖合成を可能にするために通常必要とされるＲＮａｓｅＨを用いたＲＮＡ消化ステップもまた、なくすことができる；この反応がヘテロ二本鎖部分ではないＴ７及びセレクタ配列のみを用いるので、ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡのヘテロ二本鎖の存在がｓｓｔ−ＩＶＴを妨げない。
−  ターゲットに特異的なプライマは、配列とセレクタ配列の長さによって決まる転写配列又は長さの影響を受けることなく、対象のｍＲＮＡターゲットに沿ってどこにでも配置できる；下記のように、コード化された微小粒子への転写物捕捉の効率を最大化するために、転写物は短い（出願第１０／９７４，０３６を参照）；転写物は異なる配列を有しており、その結果、異なる遺伝子並びに有意な配列類似性を示す遺伝子ファミリ内の遺伝子の検出と計数が可能である；
−  ここに、より詳細に記するように、比較的簡単にしたプロトコルによって、好ましくはＲＥＡＤフォーマットを用いて、同時ターゲット捕捉と、増幅と、「単一チューブ」及び均一のフォーマットにおける多重検出を含むいくつかのステップを組合せることができる。ここに述べるように、統合もまた、最小化を促進する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上述したように、ここに開示した方法で使用するプライマ−プロモータ−セレクタ構造は、それぞれ指定された長さの最大３つの異なる部分配列、すなわち、遺伝子特異的プライマ配列、その構造の５’末端の方へインビトロ逆転写を方向付けるよう設計されたＴ７（又はその他）プロモータ用の鋳型鎖配列、及び独特の「選択」又は「セレクタ」配列を具える。本発明の方法は、セレクタ配列のＲＮＡコピーを生成するようにＩＶＴを方向付ける。ＲＮＡ転写物は、特異的セレクタ配列に合致するプローブを表示するコード化された微小粒子（「ビーズ」）への捕捉により検出される。独特のセレクタ配列は独特の反応生成物を与え、（元の）類似した配列のターゲットセットから特異的単位複製配列の選択を可能にする（Ａｌｌｅｌｅ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  セクション２参照）。鋳型として役立つＲＴ反応が、ｃＤＮＡ生成物を完全に生成するのか、部分的な長さのみ生成するのかどうかにかかわらず、全てのメッセージは「カウント」される。後者は打ち切られたＲＴ反応を反映している。類似のメッセージのバックグラウンド内にある特異的メッセージの検出、並びに、突然変異又は多型性の検出に対して、対立遺伝子特異的構造対を用いて、構造内の合致するプライマ配列のみが伸長と増幅転写物の形成を媒介していることが好ましい。このアプローチは、指定されたｍＲＮＡサブセット、ウイルス性ゲノムＲＮＡ／ＤＮＡ、対立遺伝子、及び遺伝子の検出と分析に特に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
１．プライマ−プロモータ−セレクタ構造の一般特性を用いたインビトロ転写
例１では、配列特異的ＲＴプライマ、Ｔ７プロモータ、及びＲＴプライマに独自に関連するセレクタ部分配列を具える構造を用いて、適切な反応状態下でのｓｓｔ−ＩＶＴの性能を説明している。ここに示すように、そのモデル系においては、１ｆｍｏｌのプライマ／ｒｘｎまで（ここでは、他の場合と同様に、特に記述されていなければ、反応量（“ｒｘｎ”）は１０ｕｌである）の検出の限界を伴い、ｓｓｔ−ＩＶＴ反応は、配列特異的用量反応を示す。非鋳型鎖の添加は、有意な範囲のターゲット濃度〜１０倍に信号強度を増やすが、検出の限界に影響はない（図５）。このように、アッセイ内で到達する信号強度によって、ｓｓｔ−ＩＶＴをＴ７プロモータの非鋳型鎖を添加して、あるいは添加せずに特異的アプリケーションの要求に応じて行うことができる。
【００１９】
短いＲＮＡを生成するＬＬ−２Ｒ  ＲＴ／Ｔ７／Ｓｅｌ  ｓｓＤＮＡ＋ＮＴ  Ｔ７についてのｓｓｔ−ＩＶＴ反応の時間経過を図６に示す。４時間のインキュベーションの後に低濃度の鋳型（１ｆｍｏｌ／ｒｘｎ）で収量の更なる改善が観察されるが、最初のうちは、反応が非常に早く、２時間以内にほぼ完成する。
【００２０】
２．ＲＮＡ分析
２．１  ｍＲＮＡの計数：メッセージ発生量の決定
本発明の方法は、迅速な遺伝子発現プロファイリング用のフォーマットの実現、すなわち、一組の指定されたメッセージ（典型的には、その他のメッセージのあるところで）のそれぞれの発生量の同時検出を可能にする。これは、治療薬又は病原菌のような外部刺激に応じて、１組の特異遺伝子発現パターンのモニタリング又はプロファイリングを伴うアプリケーションについて、特に興味深い。
【００２１】
現行のプロトコルは４つのステップを具える（図２）：
１．ＲＴプライマ／Ｔ７／セレクタ構造を用いるｃＤＮＡ合成（逆転写による）
２．使用されない構造の除去−一つのモードにおいては、ｃＤＮＡの捕捉による
３．個々のｃＤＮＡに対応するセレクタ配列の線形増幅
４．逆転写／ハイブリダイゼーションによるＲＮＡ生成物のオンチップ検出
代替的に、ステップ３と４を組み合わせてもよい。：
３．以下に詳細に述べるように、微小粒子の「共集合」アレイを用いた同時増幅／検出
【００２２】
例２は、１３００ｆｍｏｌ／ｒｘｎ乃至０．１ｆｍｏｌ／ｒｘｎのターゲット濃度範囲にわたるモデルカナマイシンｍＲＮＡを用いたアッセイの感受性を示す。この変異体アッセイは、カラム精製（磁気分離ではなく）を使用し、従って、ｃＤＮＡの合成に、ビオチン化（又は、修飾した）ｄＮＴＰｓを必要としない。このフォーマットでは、アッセイは０．１ｆｍｏｌ／ｒｘｎの検出限界を有する用量反応を示す。
【００２３】
未使用プライマの除去（「浄化」）−使用されないプライマ−プロモータ−セレクタ構造は、転写物の形態が使用されないプライマだけになることを防ぐために、ｓｓｔ−ＩＶＴを開始する前に慎重に除去しなければならない。すなわち、キャリーオーバ量によっては、ｓｓｔ−ＩＶＴは、強度がアッセイの感受性を制限できるターゲットに無関係な信号を生成できる。
【００２４】
更に、ｃＤＮＡ合成のためにビオチン化（又は、その他のハプテン化）ｄＮＴＰｓを使用するには、ストレプトアビジン（又は、ハプテンＡＢ）でコーティングした磁性又は非磁性粒子上に捕捉する前に、使用しないヌクレオチドを除去することが必要である。
【００２５】
ｄＮＴＰｓの除去は、下流のオンチップＲＴ−ｅＭＡＰ反応（標識されないｄＮＴＰｓのために排除される傾向にある）中に、蛍光標識したｄＮＴＰｓの結合度を改善し、従ってアッセイ信号強度を増すためにも所望される。
【００２６】
いくつかの精製方法がここに提供されている。１の標準的なアプローチにおいては、過剰ＲＴプライマを消化するために、エキソヌクレアーゼ処理をアルカリホスファターゼ処理と組み合わせて、ＩＶＴ反応の前に（例えば、ＥｘｏＳａｐ−ＩＴ、品番７８２００、ＵＳＢを使用して）ｄＮＴＰｓを除去する。
【００２７】
別のアプローチで、過剰プライマとＮＴＰｓをカラム精製によって反応から除去することができる（例２も参照）。ｃＤＮＡ又は伸長生成物からのプライマの効果的な分離を確実にするためには、プライマは生成物より実質上短くなくてはならない。
【００２８】
第３のアプローチでは、カラム精製は、ＥｘｏＩの構造の消化と組み合わせることができる。エキソヌクレアーゼＩ処理とカラム精製との組合せを用いた未使用プライマの除去効率を例３に示す。結果は、現バージョンのアッセイプロトコルにおける最適なプライマ濃度が、１００ｆｍｏｌ／ｒｘｎを越えてはならないことを示唆している。ＥｘｏＩ処理は、（更にＲＴプライマの残余濃度を低減することにより）Ｓ／Ｎ比を改善するが、プライマの許容濃度は増えない。
【００２９】
余分な構造を除去する別の方法は、磁性ビーズへの捕捉によるものと、磁力によるビーズの分離である。この方法は、「オンチップ」フォーマットにおいてＩＶＴと伸長の統合を促進する付加的な利点を有する。
【００３０】
図９に示すように、磁気分離は少なくとも３つの異なる流動形態において行われる。すなわち、「磁石の先端」、ナノセップの装置（Ｐａｌｌ、カタログ参照）又はナノ反応器（図９に示すような）を用いる。磁気分離を生じさせるｓｓｔ−ＩＶＴプロトコルは、ｃＤＮＡ合成のために、ビオチン化されたｄＮＴＰ’ｓと非修飾のｄＮＴＰ’ｓの混合物を用い、次いでストレプトアビジンでコーティングした磁性ナノ粒子を用いたビオチン化生成物の捕捉を行う。磁性ビーズ洗浄のための別の（第４の）構成は、定型の１．５ｍｌチューブの１ｍｌの洗浄バッファから遠心分離によりビーズを集め、次いで、チューブ壁に沿ってペレットを持ち上げるためにチューブを磁石の近くに置き、次いで全ての洗浄バッファをチューブの底から除去し、プライマの除去が完成するまでこの手順を２−３回繰り返すことである。
【００３１】
現行のプロトコルにおけるｃＤＮＡ合成のすぐ後の、ビーズや微小粒子を含有する固相マトリクスに対するｃＤＮＡの付着により、分離、精製、及び少量のｃＤＮＡのかなりの濃度を可能にし、このようにアッセイの感受性を増す可能性がある。
【００３２】
粒子は、磁性捕捉粒子（例えば、引用によって組み込まれている米国特許出願第１０／０３２，６５７号を参照）を含む適当な型（例えば、引用によって組み込まれている米国特許出願第１０／９７３，０００号；第１０／３４８，１２３号を参照）であってもよく、これによって、粒子に結合した伸長生成物が、磁場の適用によって基質表面近く又は上に集結する。
【００３３】
以下に述べるように、本発明のアッセイフォーマットは、次の利点を与える：
設計の柔軟性  −  ｍＲＮＡに沿ってどこにでもプライマ配列を配置できることによって、米国特許出願第１０／９７４，０３６号に述べられているように、オンチップ検出により検出される生成物のサイズを制限するために、ここに開示したｓｓｔ−ＩＶＴ反応は、ｍＲＮＡの５’末端近くに、又は、従来の遺伝子発現法で要求されるように３’末端近くにプライマを配置する必要がなくなり、従って設計の柔軟性が改善される。更に、元のターゲット配列における類似度にかかわらず、配列内で異なる転写物を生成することにより多重分析の特異性が実質的に強化されている。
【００３４】
特異的配列の短い転写物  −  ターゲット特異的プライマは、配列及びセレクタ配列の長さによって決定される転写物の配列又は長さに影響を及ぼすことなく、対象のｍＲＮＡターゲットに沿ってどこにでも配置することができる；以下に述べるように、コード化された微小粒子への転写物捕捉効率を最大にするために、転写物は短いのが好ましい（米国特許出願第１０／９７４，０３６号を参照）。
【００３５】
この構造におけるｓｓｔ−ＩＶＴセレクタ配列の特異的かつ独特の配列、及びプライマの設計と構造の核酸連結（ここに述べるような）により、相同性メッセージ間に対象の配列の相違点を導入して、類似する遺伝子発現間を区別することができる。これは、例えば、遺伝子コピーの計数、及びサイトカインメッセージセット又はトウモロコシの遺伝子ファミリメッセージセットの識別、といった遺伝子ファミリ内の特異遺伝子の分析に特に有益な設計上の特徴である。
【００３６】
第二鎖合成の除去  −  遺伝子発現分析の現行プロトコルの煩雑な一面は、第二鎖のＤＮＡ合成が必要なことであり、これは次々とＲＮＡ鋳型を消化（又は、除去）する必要がある。実際問題として、ある逆転写酵素のＤＮＡポリメラーゼ活性がＤＮＡ合成に触媒作用を及ぼす間に、ＤＮＡポリメラーゼをｍＲＮＡ消化の後に続く反応に添加しなければならない。１つの広く用いられているプロトコル（米国特許第５，５４５，５２２号、米国特許第５，５１４，５４５号；Ｇｕｂｌｅｒ，Ｖ．，１９８３）は、ランダムプライミングに頼っているが、リガーゼの添加を必要とし、必須数の酵素を３つにする（ＩＶＴ用のＲＮＡポリメラーゼの添加の前に）。しかしながら、特に対象の指定メッセージセットが与えられた場合は、本発明の方法は実質上プロトコルを単純化できる。
【００３７】
ＲＮＡポリメラーゼの結合及びその構造の５’末端の方への進行は、二本鎖プロモータ配列がない場合でも、実質上有効に生ずる。すなわち、好ましくは、ｃＤＮＡの固相への捕捉を介して、又はカラム精製による、第一鎖（ｃＤＮＡ）合成と未使用プライマの除去に続いて、ＩＶＴ反応はセレクタ配列のコピーを生成する。非鋳型（ＮＴ）Ｔ７鎖を、１０までのファクタで増幅ゲインを強化するために、ＩＶＴバッファの一部として添加することができることが好ましく、これは、おそらく二本鎖プロモータ配列に遭遇するときの、ＲＮＡポリメラーゼの結合親和力の増加を反映している。
【００３８】
ＲＮａｓｅＨ消化の除去  −  遺伝子発現分析の現行プロトコルにおいて、ｓｓｔ−ＩＶＴの鋳型は、ＲＴプライマ構造の一部を形成し、ｃＤＮＡ合成後、単鎖形態で残る。例４は、第二鎖ｃＤＮＡ合成が可能な従来の二本鎖ＩＶＴ反応において、必要なＲＮＡのＲＮａｓｅＨを消化する従来のステップを、省略できるかどうかを決定するために行う実験を説明するものである。ｓｓｔ−ＩＶＴ反応のモデル構造（図１０）及び全体的なアッセイプロトコル（図１１）を用いて、例４に述べる実験は、Ｔ７プロモータに近接したＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖の存在が、鋳型プロモータ鎖（ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）へのＮＴ鎖のアニーリングを妨げないことを示しており、ＲＮａｓｅＨの消化をプロトコルから除去できることを示唆し、実質的に追加アッセイを単純化している。
【００３９】
固相ＩＶＴ（Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ＩＶＴ）  −  固相ＩＶＴは、ここに述べるように、未使用プライマを除去するための逆転写（又は、より一般的にはプライマの伸長）に続いて、磁気の「クリーンアップ」ステップの実装を可能にしている。更に、例えば、好適な設計の磁気トラップ（例えば、３つの型の微小誘導子、すなわち、らせん型（Ａｈｎら，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈ．ＭＩｃｒｏｅｎｇ．３，１−９，（１９９３））、ソレノイド型（Ａｈｎら，ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  Ｃｏｍｐ．，Ｐａｃｋａｇ．Ｍａｎｕｆａｃｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１７，４６３−４６９（１９９４））、参照）、トロイダル蛇行（ｔｏｒｏｉｄａｌ  ｍｅａｎｄｅｒ）型（Ａｈｎら，ＩＥＥＥ．Ｔｒａｎｓ．Ｉｎｄｕｓ．Ｅｌｅｃ  ４５，８６６−８７５（１９９８）参照）（全て引用として組み込まれている））を用いた磁気捕捉は最少量の溶液への転写物の封入を可能にする。ビオチン化ｃＤＮＡ（及びこれを用いて、アニール化したＲＮＡターゲット）の、ストレプトアビジンでコーティングされた磁性粒子への捕捉の前に、非結合ビオチン化ｄＮＴＰｓを完全に除去（例えば、アルカリホスファターゼ処理により、又は、カラム精製により、）して、ビオチン化ｄＮＴＰｓからの競合により損なわれる捕捉効率を強化することが好ましい。
【００４０】
例５は、ビオチン化ｓｓＤＮＡのＲＴプライマモデル化合物を用いて、液体内で行われた、及び固相上で行われたｓｓｔ−ＩＶＴ反応効率の比較を提供する。選択された条件下で、固相ｓｓｔ−ＩＶＴは溶液中の反応の収量のほぼ半分の収量を有している（図１２）。しかしながら、固相反応により生成され、モデル化合物の１０ｆｍｏｌ／ｕｌの濃度で得られる信号強度は、統合されたアッセイプロトコルの部分としてその反応を用いるのに十分に有用である。
【００４１】
２段階ＩＶＴ増幅  −  本発明の別の態様は、核酸連結ステップを伴う複数回の増幅におけるｓｓｔ−ＩＶＴのアプリケーションであり、従って従来のｃＤＮＡ合成が省かれる（米国特許第５，５１４，５４５号参照）（図１３）。この方法は、前のｃＤＮＡと第二鎖の合成を伴うｍＲＮＡ検出、並びに、ゲノムＤＮＡ分析に適用される。初めに、この方法においては、ＰＣＲを用いて、一末端でＴ７プロモータ領域を増幅し、選択的に、ＰＣＲ生成物の他の末端でセレクタ配列の導入した、対象の配列を増幅する。
【００４２】
その後は、１０２乃至１０３のゲインで、従来のＩＶＴ反応によりＲＮＡを生成する一方で、従来のＩＶＴ反応を、特定のプライマがＴ７プロモータ配列（同時係属出願第１１／２１８８３８号に記載されるような）を含むことに関する。単位複製配列鎖の選択方法として用いることができる。合成されたＲＮＡは、次いで（図４の第１バージョンで示すように）プロモータオリゴヌクレオチドとセレクタオリゴヌクレオチドのアニーリング用の鋳型として使用することができ、核酸連結が後に続く。ｓｓｔ−ＩＶＴにより増幅された合成プロモータ−セレクタ構造は、１０２乃至１０３の範囲内で追加のゲインが生じる。このように、元のＲＮＡは１０５−１０６増幅し、対応するセレクタ配列によって検出することができる。
【００４３】
差動「サンプル−対照」発現プロファイル分析。  発現分析の標準的な方法は、対象のサンプル「事例若しくは、罹患した又は変化した組織／細胞」と、参照「対照又は標準」サンプルとの比較、又は遺伝子導入プラント対標準プラントにおける発現の差異に常に頼っている。本発明はまた、ｓｓｔ−ＩＶＴの利点を用いて相対的な遺伝子発現の決定を補償する。従来の相対的遺伝子発現分析方法は、「事例」と「対照」のサンプルの双方についての、分析ステップに続いて取得した異なる信号の強度比率の決定に頼っている（米国特許第６，１１０，４２６号）。
【００４４】
同じストラテジを、相対的遺伝子発現モニタリングに適用することができる。特異な２色の染色は、個々のｓｓｔ−ＩＶＴ反応中に「事例」ＲＮＡ及び「対照」ＲＮＡ生成物内へ異なる蛍光ＮＴＰｓを組み入れることによって行うことができ、その後にハイブリダイゼーション捕捉による生成物の２色の検出が続く（図１）。代替的に、異なる「セレクタ」配列を、「事例」及び「対照」ＲＮＡ生成物用に設計して、単色検出を用いて別々のｓｓｔ−ＩＶＴ反応を得ることができる。
【００４５】
相対的な遺伝子発現プロファイルを決定する別の可能性は、単色減法検出法（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｌｏｒ  ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いることである（米国特許第ＷＯ２００５０４２７６３  ＢＡＳ号）。このように、「事例」及び「対照」のセレクタ配列は、逆相補性（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）として設計し、二本鎖デュプレクスを作ることが可能でなければならない。ＲＮＡ生成物（すなわち、ＲＮＡ及びａＲＮＡ）検出のアッセイ段階で、事例と標準サンプルの２つの個別の反応液を、ＲＮＡ−ＲＮＡデュプレクスの形成を可能にする条件下で共に混合する。図１に示すように、共集合単一アレイ（ｃｏ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｒｒａｙ）中のビーズ上に適宜のセンス及びアンチセンス捕捉プローブに、ＲＮＡ又はａＲＮＡ生成物の過剰分を捕捉して、図１にあるように、ＲＴ  ｅＭＡＰ、又はハイブリダイゼーションのいずれかによって、生成物を検出することができ、従って、「事例」サンプル中の特定遺伝子又は遺伝子セットの過剰又は過小発現を示す。
【００４６】
２．２  対立遺伝子の計数
多重対立遺伝子を計数するために、対立遺伝子特異的逆転写、又は対立遺伝子特異的核酸連結をｓｓｔ−ＩＶＴと結合して、例えば類似した遺伝子の存在下で、指定された遺伝子の発現パターンを選択的に決定し、対立遺伝子の多型性を検出できる（Ｓｙｖａｎｅｎ  Ａ．Ｃ．，２００５）。
【００４７】
２．２．１  逆転写を介しての分析
対立遺伝子特異的逆転写は、次の４つのステップを具えるアッセイプロトコルにおいてＩＶＴと結合される（図３）：
１．Ｔ７／セレクタ及び逆転写によるｃＤＮＡ合成を伴う、対立遺伝子特異的逆転写プライマのアニーリング（ＤＮＡ分析の場合：ＤＮＡポリメラーゼを用いたプライマ伸長）；
２．未使用プライマの除去（ここに述べた利用可能な方法の１つを使用）；
３．セレクタ配列の転写；
４．逆転写又はハイブリダイゼーションによる結果として生ずるＲＮＡのオンチップ検出
【００４８】
この方法の原理は、ターゲット特異のプライマの３’末端が特異的対立遺伝子用に設計されて、プライマとターゲットがプライマ配列の３’末端で（及び近傍で）合致する場合にのみプライマ伸長が生ずることを除けば、例２に説明した原理に似ている。好ましい実施例において、３’末端の組成が異なるプライマ対を用いて、２つの対立遺伝子を識別することができる。
【００４９】
２．２．２  核酸連結を介しての分析
ＲＮＡ鋳型を用いた対立遺伝子特異的核酸連結（米国特許第５，６８６，２４３号、米国特許出願第ＵＳ  ２００３／００８２５８４  Ａ１号）をＩＶＴと結合し、次の４つのステップを具えるプロトコルにおいて、対立遺伝子特異の線形増幅を確実に行う（図４）：
１．設計された対象の変異部位に隣接する、２つのオリゴヌクレオチドプローブ−１つは「プロモータ」、もう一つは「セレクタ」−のｍＲＮＡ鋳型へのアニーリング；
２．無傷のプロモータ−セレクタ構造を生成するプローブの連結；
３．セレクタ配列の転写
４．逆転写又はハイブリダイゼーションによる結果として生ずるＲＮＡのオンチップ生成
【００５０】
「プロモータ」及び「セレクタ」のオリゴヌクレオチド  −  対象の各ターゲットに対して、対象の部位の両側に鋳型が合致するように、２つのオリゴヌクレオチドを設計する。プロモータ及びセレクタオリゴヌクレオチドの（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓのＴ４  ＤＮＡリガーゼ又はＴａｑ  ＤＮＡリガーゼによる）核酸連結は、無傷のプロモータ−セレクタ構造を生成する。５’末端のプロモータのオリゴヌクレオチド配列か３’末端のセレクタオリゴヌクレオチド配列のいずれかが、対象の部位でのターゲット配列に合致した場合のみに無傷の構成が生成される。プロモータ−セレクタ構造は、ｓｓｔ−ＩＶＴ反応用の鋳型として作用し、セレクタのＲＮＡコピーを生成し、次いで検出される。すなわち、対象の対立遺伝子以外のターゲット対立遺伝子は、無傷のＩＶＴプロモータ−セレクタ構造の形態を媒介せず、よって計数されない。従って、例６に示したトウモロコシ雑種におけるある遺伝子ファミリの場合、及び、より一般的なその他の遺伝子ファミリの場合のように、その方法は、単一ヌクレオチドと同程度だけ対象の配列とは異なる他のｍＲＮＡ配列の存在下で、特異的ｍＲＮＡ配列の計数を可能にする。逆に言えば、全ての対立遺伝子を計数できれば、多縮重プライマのオリゴヌクレオチドを提供して、指定部位で標準的又は変異的対立遺伝子に合致させることができる。
【００５１】
一般的に、このフォーマットにおいては、ＲＮＡ鋳型は、ｓｓｔ−ＩＶＴを開始する前に（標準的な方法で）除去するか消去すべきである。ｍＲＮＡの計数と同様に、反応の効率は、非鋳型鎖プロモータ（好ましくはＩＶＴ反応バッファの一部として）の添加により改善される。この方法の主な利点は、精製ステップが必要ないことであり、未使用プライマはセレクタ部分配列に結合せず、よって検出されない。
【００５２】
別の代案は逆転写の代わりに核酸連結を使用して、３’末端に第２の「捕捉」オリゴヌクレオチド捕捉部分を有する（図４の第２バージョンに示すような）プライマ−プロモータ−セレクタ構造を連結することにより、ｓｓｔ−ＩＶＴ鋳型鎖にビオチンのような捕捉部分を導入することである。ｍＲＮＡ計数と同様に、このフォーマットは未使用プライマを除去する必要がある。
【００５３】
合成されたビオチン化構造は、少量の核酸連結の後の凝縮のために、又は、検出ビーズと共に共集合アレイ内へ構造を配置するために用いることができる。
【００５４】
３．ＤＮＡ分析
本発明の方法は、ｇＤＮＡの分析やＰＣＲにより生成される単位複製配列に容易に適用される。好ましい実施例においては、プライマ−プロモータ−セレクタ構造は、対象のＤＮＡ部分配列に対向して方向付けられる。次いで、単鎖ＤＮＡへの構造のアニーリングを可能にする条件（例えば、加熱によるｄｓＤＮＡターゲットの変性）下で、３’末端で又は３’末端近傍で合致する時に、この構造がＤＮＡポリメラーゼ触媒反応液中で伸長される（図３）。
【００５５】
代替として、Ｔ７配列をｇＤＮＡ（又はＤＮＡ単位複製配列）に導入するために、二本鎖ターゲットをまず化学分解して、ターゲット特異的構造でアニーリングを可能にするために、結合力のある３’末端を残す（Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．，１９８２）。次いで、ＤＮＡポリメラーゼの変型を置換する鎖によって、プライマが伸長し、よってＴ７配列を導入する（図１５）。後に図３に示すように未使用ターゲット特異的プライマの除去に続いて、伸長生成物を用いてセレクタ部分配列のｓｓｔ−ＩＶＴ増幅を用い検出する。
【００５６】
３．１  遺伝子コピー数多型性の分析
染色体及び遺伝子の複数コピーの存在は、いくつかの障害、例えばダウン症（Ｄｕｔｔａ  Ｓ．，２００５）及び脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）（Ｏｇｉｎｏ  Ｓ．，２００４）や、いくつかの癌の類型：乳がん（Ｓｅｏ，Ｍ．Ｙ．ら，２００４）、皮膚がん（Ｓｅｌｌｅｒｓ，Ｗ．Ｒ．２００５）及びその他のがんと関連することが知られている。遺伝子のコピー数によって、特定の薬での治療、例えば、ゲフィチニブでの肺がん治療（Ｈｉｒｓｃｈ  Ｆ．Ｒ．２００５）に対する患者の反応を予測することができる。このように、迅速で便利な分析フォーマットは、日常の臨床上の処理を行う上で所望されている。
【００５７】
実際良くあることだが、単一遺伝子又は少数の対立遺伝子が重要である時のみ、本発明の方法を、溶液中のＲＮＡ生成物の検出と組み合わせて用いることが好ましい。そのために、ハイブリダイゼーション保護フォーマット（例えば、米国特許第５，２８３，１７４号及び第５，６３９，５９９号のＡｒｎｏｌｄら参照）の使用、又は、分子標識（Ｖｅｔら，２００２）若しくはアニーリング転写物上の構成変換が蛍光の変化を生成する「ループ化」構成のプローブ（２００５年９月２日出願の米国特許出願第１１／２１８８３８号参照）を用いる蛍光エネルギ移送フォーマットの使用を含む標準的な方法の変形が利用可能である。
【００５８】
好ましい実施例においては、増量対照サンプル（既知のコピー数で）を含むアリコートが、予め設定した量の対象の臨床サンプルに添加され、強度対対照サンプル量のプロットのインターセプトは、臨床サンプル中の遺伝子コピー数を表す。
【００５９】
分子標識又は「ループ化」プローブ（「ループ化プローブ」に関連する、２００４年１１月１６日出願の米国特許出願第６０／６２８４６４号参照）を、微小粒子のような固相担体上に陳列すると、検出感度は上がり、磁性微小粒子が更なる利点を提供することができる。本発明の方法にこれらの検出方法を組み合わせると、増幅反応のリアルタイムモニタリングも可能となる。
【００６０】
３．２  対立遺伝子識別
突然変異又は多型性を表すＤＮＡ配列中の変異部位は、ここに述べた対立遺伝子特異的分析方法を用いて分析することができ、ＤＮＡポリメラーゼ触媒伸長用の特異的プライマを使用する。同様にして、上述した、ＲＮＡ分析用の核酸連結媒介分析方法は、ＤＮＡ分析に容易に適用され、核酸連結のための鋳型として単鎖ＤＮＡを用いている。従来の核酸連結媒介対立遺伝子とＳＮＰｓ識別（Ｓｃｈｏｕｔｅｎ  ＪＰ．，２００２）との主な違いは、核酸連結に続いて構造を増幅するために、ＰＣＲの代わりにＩＶＴ反応を適用することである。ＲＮＡ分析と同様に、核酸連結媒介方法は、オリゴヌクレオチドプローブとプライマを除去する必要をなくすという有意な利点を有し、従って、均質のアッセイフォーマットの実現を容易にする。このことは本発明の方法を、ウィルス性病原体の検出と同定を含む、病原体のスクリーニングに適用するとき、特に、以下に詳述するように、続く増幅と検出を伴うウイルス性ＲＮＡの濃縮と併用するときに、特に望ましい。
【００６１】
４  プロトコルステップの統合
４．１  生成物の同時検出を伴うＩＶＴ：共集合ビードアレイ
ここに述べたものは、ＲＮＡ生成物を生成するためのｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡの線形増幅と、平行検出フォーマット、好ましくはランダムコード化アレイ検出（ＲＥＡＤＴＭ）を用いたこれらの生成物の同時検出とを組み合わせる方法である。
【００６２】
例えば、捕捉プローブを伸長する固相逆転写によって、又は、分子標識（上述）又は「ループ化」構造中のプローブへの捕捉により生成されるときに、ｓｓｔ−ＩＶＴによって生成される短い１つのセレクタＲＮＡ転写物を検出でき、アニーリング転写物上の型変換が蛍光性の変化を生じさせる（Ｖｅｔ，Ｊ．Ａ．Ｍ．，２００２）。効率的なＩＶＴを可能にする低イオン化強度の条件下で、捕捉効率を向上させるために、ペプチド核酸（ＰＮＡ）捕捉プローブ（出願第１０／２２７，０１２号参照）を有利に用いることができる。
【００６３】
上述したように、ｓｓｔ−ＩＶＴと後の多重検出との統合は、アッセイプロトコルにおける追加ステップをなくし、それによって、速度を向上し、反応物消費を減らし、サンプルの汚染の可能性とサンプル処理から生ずるエラーを低減するであろう。直接オンチップの、好ましくは囲まれた区画における、分析と検出の組合せが、特に所望されるであろう。そのために、本発明は、同時のオンチップＩＶＴ増幅のフォーマットと逆転写による結果として生ずるＲＮＡの検出を開示している。
【００６４】
一実施例においては、コード化されたビーズのランダムアレイが、鋳型捕捉プローブ並びに生成物分析プローブを陳列するビーズを含むように共集合している。図１６に示すように、このような共集合アレイは、ビオチン化ｃＤＮＡ（又は、ｃＤＮＡターゲット鎖に組み込まれた対応するハプテンに向けられた、例えば抗体のような、その他の捕捉部分を陳列するビーズ）を捕捉するための、ニュートラアビジンでコーティングされたビーズ（又は磁性ビーズ）と、（例えば、標識されたヌクレオチドを有する伸長の後に続く）検出を可能にするｓｓｔ−ＩＶＴ反応で生成された特異的ＲＮＡ鎖の検出を可能にするためのセレクタ配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを陳列するコード化されたビーズとを含むことができる。
【００６５】
同時増幅及びオンチップ検出の可能な実装の１つが、例７で述べられている。図１７に示すように、同時反応はチップに塗布した１ｆｍｏｌ／ｕｌのモデルビオチン化ｄｓＤＮＡ検出限界を伴う用量作用を示す。すでに説明したように、固相ＩＶＴは単鎖鋳型を用いて同様に行うことができる。これらの結果は、反応を最小化させ密封したコンパーメントにしたフォーマットでのｓｓｔ−ＩＶＴと検出用ＲＴ媒介プローブ伸長との組み合わせの実行可能性を示す。この共集合のフォーマットによれば、同時生成物分析を伴うｓｓｔ−ＩＶＴを、１マイクロリッタ以下、より好ましくは５０ナノリッタ以下の全反応量で（例えば、２００５年９月２日に出願された米国出願第１１／２１８８３８号に示すような構成を用いて）、実行できる（ｃＤＮＡ、又は核酸連結したオリゴヌクレオチドプローブ対のようなその他のＩＶＴ、又はｓｓｔ−ＩＶＴ鋳型の捕捉の後に続いて）。
【００６６】
４．２  ＲＮＡの捕捉、増幅及び多重検出
比較的単純なプロトコルによると、更なるステップ、特に、標準プロトコルによるｍＲＮＡの磁性粒子への捕捉（米国特許第５，７５９，８２０号）とｓｓｔ−ＩＶＴ及び多重検出の統合が可能である。核酸連結媒介のＲＮＡ分析（ここでは特にウイルス性ゲノムＲＮＡの検出、参照）について図１８に示すように、プロモータ−セレクタ構造の２つの要素により、捕捉されたｍＲＮＡ（又はウイルス性ＲＮＡ）鎖の合致する部分配列をアニーリングすることが可能であり、核酸連結に続いて、コード化されたビーズ上での増幅及び同時検出が、未使用プロモータを除去する必要なく、上述した共集合のアレイフォーマットに類似した方法で行われる。実際に、核酸連結、ｓｓｔ−ＩＶＴ及びＲＴ媒介のプローブ伸長は、同一バッファにて行うことができる。
【００６７】
コード化した微小粒子のアレイの共集合の前に、溶液体中のターゲット捕捉用の磁性粒子の使用、又は生成物分析用に既に集合した、コード化ビードアレイ上に磁性捕捉粒子を磁場を介して沈着させることにより、少量の元のＲＮＡ鎖の濃縮が可能となり、後のｓｓｔ−ＩＶＴ増幅の生成物は、そこに封入されたままになる。
【００６８】
本発明の方法と装置を、更に次の例において説明する。
【００６９】
例１．ｓｓＩＶＴ反応の特徴：用量反応及び時間経過
長さ６４と６２ｎｔであり、それぞれがＩＬ−２ＲとＩＬ−４ＩのｍＲＮＡ用のＲＴプライミング配列、並びに、Ｔ７プロモータ鋳型鎖、及び独特のセレクタ配列をそれぞれ具える２つの異なる構造は、Ｔ７プロモータの非鋳型鎖の添加して、あるいはすることなく、ｓｓ−ＩＶＴの鋳型として用いた。このアプローチの潜在的な感受性を解明するために、これらのプライマの濃度を、１００−０．１ｆｍｏｌ／１０μｌ  ｒｘｎの範囲で変化させた。３７℃での２時間のインキュベーションの間に（ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔＴＭＴ７キット（Ａｍｂｉｏｎ，品番１３５４）により）得られたＲＮＡを、オンチップの逆転写に用いて、次いで、ＩＬ−２Ｒ及びＩＬ−４Ｉセレクタに合致する捕捉配列で機能化したコード化ビーズ上で結果信号を検出した（図５）。ＩＬ−２Ｒ  ｓｓＤＮＡについてのＩＶＴ反応の時間経過は、３７℃で、２、４、６、及び１８時間のインキュベーション時間で同様であった。
【００７０】
例２．カラム精製を用いたアッセイ感受性：カナマイシンｍＲＮＡ
アッセイにおける第１のステップは、ｃＤＮＡ合成である。長さ６４ｎｔのＲＴ／Ｔ７／Ｓｅｌ配列からなるＲＴプライマの構造を、長さ５００ｎｔまでのｃＤＮＡを生成できるように設計した。用いた試薬は次の通りであった：
カナマイシンｍＲＮＡ  −  正の対照（Ｐｒｏｍｅｇａ，品番Ｃ１３８１）
ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，品番１８０８０−０５１）
ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔＴＭ  Ｔ７  キット（Ａｍｂｉｏｎ，品番１３５４）
Ｃｙ３  ｌａｂｅｌｅｄ  ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，品番ＰＡ５３０２１）
ＢＡＳ  ＢｅａｄＣｈｉｐＴＭ（ＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｌｔｄ）
ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，品番２８１０４）
全ての反応物はサーモサイクラ内で処理した。
【００７１】
用量反応を行うために、ＲＮａｓｅＯｕｔ処理したＤＥＰＣ水（４０Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ  ｏｕｔを１４μｌ、プラスＤＥＰＣ水を２６６μｌ）を用いて、次のｍＲＮＡ希釈溶液を用意した：１３００、１００、１０、１乃至０．１（ｆｍｏｌ／ｕｌ）。
【００７２】
Ｍｉｘ１：０．１μＭ  ＲＴ／Ｔ７／Ｓｅｌ構造を１ｕｌ、ＲＮＡ（異なる濃度）を１ｕｌ、５倍濃度ＦＳバッファを２μｌ、ＤＥＰＣ処理した純水を６μｌ、を結集してｃＤＮＡを合成した。試験管を６５℃で５分間インキュベーションし、次いで、４℃で１０分間のインキュベーションした。インキュベーションの間、次のＭｉｘ２を各試験管に添加した：５倍濃度ＦＳバッファを２μｌ、０．１Ｍ  ＤＴＴを２μｌ、１０ｍＭのｄＮＴＰ混合物を１μｌ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ酵素（２００Ｕ／μｌ）を１μｌ、ＤＥＰＣ処理した純水を４μｌ。ＲＴ反応を５０℃で６０分間行い、８５℃で５分間酵素を不活性化して、次いで酵素を４℃での１０分間のインキュベーションした。最終的なｃＤＮＡ混合物１０μｌを、ＱｉａｇｅｎのＰＣＲ精製キットを用いたカラム上で製造業者の指示に従い、精製した。
【００７３】
精製したｃＤＮＡ１μｌを、各７５ｍＭＮのＮＴＰｓを１μｌ、Ｔ７  １０倍濃度反応バッファを１μｌ、Ｔ７酵素混合物を１μｌ、０．１μＭのＴ７のＮＴ部位を１μｌ、ＤＥＰＣ処理した純水２μｌを含むＩＶＴ混合物１０μｌに添加し、３７℃で２時間インキュベーションした。
【００７４】
ＲＮＡ生成物を次のようなオンチップの逆転写標識ステップによって検出した：
結果として生じたＩＶＴ反応液１０μｌを、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ酵素（２００Ｕ／μｌ）を１μｌ、５倍濃度ＦＳバッファを２μｌ、０．１ＭのＤＴＴを１μｌ、１０μＭのｄＮＴＰｓ（ｄＣＴＰなし）を２μｌ、２５μＭのＣｙ３−ｄＣＴＰを１μｌ、ＤＥＰＣ処理の純水３μｌのＲＴ混合液１０μｌと混合し、生成物２０μｌを、セレクタ配列用のプローブを含む検出ビーズを用いて、集合させたビードチップの上に置いた。このチップを５０℃で１５分間インキュベーションし、ＤＥＰＣ処理した純水２０μｌで３回洗い、写像した。結果を図７に示す。
【００７５】
例３：精製
カラム精製とＥｘｏＩ消化の組合せを用いて、濃度の異なる構造と反応させ、最適なＲＴ構造濃度の範囲を決定する実験を行った。特に、事前にＥｘｏＩ処理をして、あるいはせずに、反応混合物をカラム（Ｑｉａｇｅｎ，品番２８１０４）上に配置した。カラム精製に続いて、２μｌの溶出液部分を直接ｓｓｔ−ＩＶＴ反応に用い、ＲＮＡ生成物をオンチップＲＴ媒介のプローブ伸長により検出した（図８）。構造１μｌ（濃度が異なる）、ＥｘｏＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ），品番Ｍ０２９３Ｓ）１μｌ、５倍濃度のＦＳバッファ２μｌ（例２を参照）からなる反応混合物１０μｌ中で、３７℃で３０分間ＥｘｏＩ処理を行い、次いで８０℃で２０分間ＥｘｏＩを不活性化した。消化に最適なバッファ条件は、ＥｘｏＩ１０倍濃度バッファ（ＮＥＢ）により提供されるが、ＦＳバッファを用いて、アッセイのＥｘｏＩ処理の実際の条件を再現した。
【００７６】
例４：ＲＮａｓｅＨ消化ステップの除去
まず、ＲＮａｓｅＨ消化の必要性を、ＲＮＡに対するアニール化オリゴヌクレオチドの構成が、実際のアッセイにおける構成に似ていると仮定したモデル系で試験した。その構造は、長さ５０ｎｔのＩＬ−２Ｒ  ＲＮＡを有し、ＲＮＡに対してアニール化するＲＴ構成部分のみを有するＲＴ／Ｔ７／Ｓｅｌ構造をアニーリングした結果、得られた。ｓｓｔ−ＩＶＴ反応に続いて、生成物を逆転写によりオンチップで検出した。別の条件を図１０の説明で示す。ＲＮａｓｅＨ（２Ｕ／μｌのうちの１μｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，品番１８０２１−０１４）消化を、３７℃で２０分間行った。
【００７７】
第２のステップとして、カラム精製ステップの後、ＲＮａｓｅＨ消化効果又はその欠落を、全アッセイで（例２）チェックした。この目的で、５倍濃度のＦＳバッファ２μｌ、０．１ＭのＤＴＴ２μｌ、及びＲＮａｓｅＨ１μｌを、生成したｃＤＮＡ１０μｌに添加した。ＲＮａｓｅＨ消化のない対照反応液には、溶出バッファ４μｌを加えた。結果を図１１に示す。
【００７８】
例５：固相ｓｓｔ−ＩＶＴ
対照を含めて、この反応は特定の濃度の構造に対して行った。１００ｆｍｏｌ／μｌでの３’−末端をビオチン化したｓｓＤＮＡ  ＲＴ／Ｔ７／Ｓｅｌ  ＩＬ−２Ｒの１μｌを磁性ビーズ（０．２μｍのナノ粒子，分子プローブ，品番Ｃ−２１４７６）１０μｌに添加して、１５分間インキュベーションして、その後、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ８で広く洗浄した。最終的な量を、構造濃度１０ｆｍｏｌ／μｌのビーズを有するように、を１０μｌに調整した（図１２、１列目）。ＩＶＴ混合物（例２を参照）１０μｌを、固定化構造に添加し、反応混合物を３７℃で２時間インキュベーションした。生成物をＲＴ  ｅＭＡＰ法により検出した。２列目は洗浄ステップのない同一の構成を表し、３列目は磁性ビーズがない状態の同一実験、すなわち、溶液中のＩＶＴ反応を表している。３つのケース全てにおいて、構成濃度は、１０ｆｍｏｌ／μｌに調整した。
【００７９】
例６：非常に相同したｍＲＮＡ配列の識別：トウモロコシの近交系
あるアプリケーションでは、対象のターゲットを伴う実質的な配列相同性を示す数百又は数千のターゲット集団内での特異なターゲットの検出を要する。これらのアプリケーションは一般的に、ハイブリダイゼーションを介する分析により提供されるもの以上の配列特異性を必要とする。上述した２つの設計を用いて、トウモロコシゼイン遺伝子ファミリ中のｍＲＮＡ配列の非常に近い相同部分を検出した。２つのトウモロコシ近交系Ｂ７３とＢＳＳＳ５３において、ゼイン遺伝子のあるｍＲＮＡ配列は、全９４５ｎｔの配列上で、９５％乃至９９％の相同度を示す。これらの配列を検出し、現行の方法でそれぞれの発現レベルを評価する課題は、非常に困難な処理であり、多数のクローンセットを配列することが必要である。
【００８０】
従って、別個の「セレクタ」配列のｓｓｔ−ＩＶＴ増幅の前に、高度に並列な分析フォーマットのこれらのメッセージのそれぞれの発生量を同時決定する間に、逆転写又は多型性部位での核酸連結による配列特異的伸長の組合せは、高い相同性配列のｍＲＮＡ間の識別を助ける。
【００８１】
図１４は、多型性部位と、このような核酸連結又は構造の３’−末端配置の可能性のある部位の位置を説明している。共通の突然変異を有する２つの配列を含むが、一方のみが第２の特異な突然変異を有している（例えば、遺伝子１６と３１が同一の突然変異Ｔ／Ｇを有し、複数の配列アライメントにおいてその他の配列全てからそれらを識別するが、遺伝子３１は独特の突然変異Ｃ／Ｇを有している）配列識別のいくつかの複雑なケースに対しては、上述した方法は、各近位の多型性部位へ特定のセレクタ配列を割り当てるというの利点を有する。
【００８２】
例７：同時のオンチップ増幅／検出反応：
Ｔ７プロモータ及び２８ｎｔの転写配列（Ｋａｎ  ｍＲＮＡの５’−末端に等しい）を含み、及び非鋳型（ＮＴ）鎖の３’−末端をビオチン化したＤＮＡを、濃度の異なるビードチップへ塗布し、捕捉可能にするために初期の１０分のインキュベーションを行って、残留遊離ＤＮＡは洗浄によって除去した。同時のＩＶＴ／ＲＴ反応用の試薬の混合物２０μｌを、次いでチップ表面上に塗布した。反応混合物は、各７５ｍＭのＮＴＰｓ２μｌ、Ｔ７の１０倍濃度反応バッファ２μｌ、Ｔ７の酵素混合物２μｌ、０．１μＭのＴ７プロモータ用ＮＴ部位２μｌ、１０μＭのｄＮＴＰ混合物（ｄＣＴＰ無し）２μｌ、２５μＭのＣｙ３  ｄＣＴＰを１μｌ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ酵素（２００Ｕ／μｌ）を１μｌ、及びＤＥＰＣ処理純水２μｌを含んでいた。反応は吸湿チャンバ内でオンチップで行い、３７℃で１時間インキュベーション（ＩＶＴ）して、その後、５０℃で１５分間のインキュベーション（ＲＴ媒介プローブの伸長）を行った。結果と実験スキームを図１７と図１６にそれぞれ示す。
【００８３】
ここに用いられた用語、表現及び例は単なる例示であって限定ではなく、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ規定され、請求項の主題の全ての均等物を含んでいると理解すべきである。請求項中のプロセス及び方法のステップは、どのような順序で実行してもよく、請求項に特定されていない限り、請求項内に示した順序を含んでいる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図１は、ここに述べたプライマ−プロモータ−セレクタ構造に、ＲＴ（又は、プライマ伸長）及びインビトロ転写の方向、並びにハイブリダイゼーションを介した検出、又は伸長を介した検出のいずれかで生成される生成物の検出を示す図である。
【図２】図２は、ここに述べた構造と方法を用いた多重遺伝子発現分析方法を示す図である。
【図３】図３は、ここに述べた構造と方法を用いたＳＮＰ又は突然変異の伸長を介した検出を示す図である。
【図４】図４は、ここに述べた構成と方法を用いたＳＮＰ又は突然変異の核酸連結を介した検出を示す図である。
【図５】図５は、検出で生成された信号に基づき、ｓｓｔ−ＩＶＴ反応がここに記載されている構造の配列と濃度に依存することを示す図である。
【図６】図６は、構造ＩＬ−２Ｒ  ＲＴ／Ｔ７／Ｓｅｌ及びＴ７プロモータのＮＴ部位の様々な開始濃度についてのｓｓｔ−ＩＶＴの時間経過を示す図である。
【図７】図７は、ここに記載した構造を用いた異なるＲＮＡ濃度（カナマイシンｍＲＮＡ）の検出用アッセイの用量反応を示す図である。
【図８】図８は、異なる濃度の構造に対するカラム精製前のＥｘｏＩ処理の効果を示す図である。
【図９】図９は、磁性捕捉−流動精製、及び過剰構造からのアッセイ生成物の膜精製用のデバイスと方法を示す図である。
【図１０】図１０は、図の説明で述べた異なる鋳型構造でのＩＶＴ反応の（添加したＴ７プロモータ用のＮＴ部位の有無及びＲＮａｓｅＨによるｍＲＮＡ消化の有無を）に続く、１００ミリ秒と５００ミリ秒の双方の曝露で生成される相対信号を示す図である。
【図１１】図１１は、カナマイシンｍＲＮＡの検出及び増幅用のここに述べた構造を用い、カラム精製を含み、ｍＲＮＡのＲＮａｓｅＨ消化ステップを除去して行うアッセイを示す図である。
【図１２】図１２は、ＲＴ−ｅＭＡＰ検出前にストレプトアビジンでコーティングしたマイクロビーズへ固定されたプライマ−Ｔ７−セレクタ構造を用いた固相ｓｓｔ−ＩＶＴの結果を示す図である。
【図１３】図１３は、ここに述べた構造を用いた高収量ＩＶＴ（結合核酸連結−ｓｓｔ−ＩＶＴ反応）増幅法用の複数ラウンドを示す図である。
【図１４】図１４は、太字で示した多型性部位を有するいくつかの非常に相同性の高いトウモロコシ配列を示す図である。
【図１５】図１５は、導入プライマの伸長の後のｇＤＮＡの断片化を示す図である。
【図１６】図１６は、ここに述べた固定化したプライマ−Ｔ７−セレクタ構造又はｄｓＤＮＡを用いたｓｓｔ−ＩＶＴ反応を、捕捉を介した伸長によって結果物であるＲＮＡの検出と統合した形で行う共集合ビードアレイを示す図である。
【図１７】図１７は、共集合ビードアレイ上に固定した異なる濃度のビオチン化ｄｓＤＮＡを用いた同時ＩＶＴ／ＲＴ反応の結果を示す図である。
【図１８】図１８は、核酸連結を介したＲＮＡのウイルス性検出プロトコルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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