(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酪酸の形成に関与する、酪酸キナーゼをコードするｂｕｋ遺伝子が削除されているクロストリディア種の微生物を、炭素源を含んでなる適切な培養培地中で培養し、その培養培地からｎ−ブタノールを回収することによる、ｎ−ブタノールを製造する方法であって、前記削除がｂｕｋ遺伝子のコード配列の少なくとも５０％の除去である、方法。
【請求項２】
ホスホトランスブチリラーゼをコードするｐｔｂ遺伝子がさらに削除されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物においてアセトンの形成に関与する、ＣｏＡ−トランスフェラーゼをコードするｃｔｆＡＢ遺伝子が減弱されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
アセト酢酸デカルボキシラーゼをコードするａｄｃ遺伝子がさらに削除されている、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物においてｌｄｈ遺伝子が削除されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記微生物が酢酸を生産することができないように改変されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
以下の遺伝子：
・ホスホトランスアセチラーゼをコードするｐｔａ、および
・酢酸キナーゼをコードするａｃｋ
から選択される、酢酸の形成に関与する少なくとも１つの遺伝子が削除されている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ｈｙｄＡ遺伝子が減弱されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記微生物が、Ｃ．アセトブチリカム、Ｃ．ベイジェリンキ、Ｃ．サッカロペルブチルアセトニカムまたはＣ．サッカロブチリカムからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
培養が連続的かつ安定である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ａ）ｎ−ブタノールを生産する微生物を発酵させる工程、
ｂ）発酵中、ガスストリッピングによりｎ−ブタノールを排除する工程、
ｃ）その凝縮液から蒸留によりｎ−ブタノールを単離する工程
を含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
酪酸の形成に関与する、酪酸キナーゼをコードするｂｕｋ遺伝子が削除されているクロストリディア種の微生物であって、前記削除がｂｕｋ遺伝子のコード配列の少なくとも５０％の除去である、微生物。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
技術分野
本発明は、代謝的に操作された微生物により発酵可能な炭素源からｎ−ブタノールへ高収量で生物変換する方法を含む。
【０００２】
背景技術
ｎ−ブタノールは、水混和性（約７〜８％）は限られているが、グリコール類、ケトン類、アルコール類、アルデヒド類、エーテル類ならびに芳香族および脂肪族炭化水素などのあらゆる汎用溶媒と自由に混和できる、揮発性が中程度の無色の中性の液体である。ｎ−ブタノールは、ｉ）他の化学物質を製造するため、ｉｉ）溶媒として、また、ｉｉｉ）化粧品などの配合製品中の成分として用いられる。ｎ−ブタノールの供給原料としての主要な用途は、アクリル酸／メタクリル酸エステル、グリコールエーテル類、ｎ−ブチルアセテート、アミノ樹脂およびｎ−ブチルアミン類の合成における用途である。現在、世界で年間９００万トンを超えるｎ−ブタノールが消費されている。
【０００３】
さらに最近、ｎ−ブタノールは蒸気圧が低く、エネルギー量が高く（ガソリンに近い）、かつ、水の存在下での分離に感受性が小さいために、エタノールよりも良好なバイオ燃料であることが示されている。さらに、ｎ−ブタノールは標準的な自動車エンジンでの使用に関してエタノールよりも高い濃度で配合でき、自動車製造業者は環境規制を満たすために性能面で妥協する必要がない。ｎ−ブタノールはまた、パイプライン輸送に適しており、結果として、ガソリンにすぐさま導入できる可能性があり、付加的な大規模インフラを必要としない。
【０００４】
ｎ−ブタノールは、溶媒生成クロストリディア(solventogenic Clostridia)による炭水化物の発酵により、アセトン／ｎ−ブタノール／エタノール（ＡＢＥ）混合物として生産され得る。ＡＢＥ発酵は二相性である。最初の酸生成相では、酢酸および酪酸の生産により高い増殖率が達成される。次の溶媒生成相では、増殖率は低下し、第一相で生産された有機酸の消費と並行して溶媒（ＡＢＥ）が生産される。発酵中、二酸化炭素と水素が生産される。
【０００５】
図１に示されているｎ−ブタノールの生物生産には中間体としてのブチリル−ＣｏＡの形成が必要とされ、これはａｄｈＥ１およびａｄｈＥ２によりコードされている２つの異なる二機能性アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼにより、生理学的条件に応じて還元され得る。ブチリル−ＣｏＡはまた、それぞれｐｔｂおよびｂｕｋ遺伝子によりコードされているホスホトランスブチリラーゼおよび酪酸キナーゼによって酪酸へ変換することもできる。アセトンは、それぞれｃｔｆＡＢおよびａｄｃ遺伝子によりコードされているＣｏＡ−トランスフェラーゼおよびアセト酢酸デカルボキシラーゼによってアセト−アセチル−ＣｏＡ（ブチリル−ＣｏＡの生産における中間体）から生産される。水素はｈｙｄＡ遺伝子によりコードされている鉄単独ヒドロゲナーゼにより生産される。一酸化炭素の存在下で培養を行う場合には、ヒドロゲナーゼ阻害剤、ｎ−ブタノール、エタノールおよび乳酸が主要な発酵生成物となる。乳酸はｌｄｈ遺伝子によりコードされている乳酸デヒドロゲナーゼによってピルビン酸から生産される。
【０００６】
不活性化されたｂｕｋ遺伝子を有するクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)株（非複製プラスミドとの１回の交叉により得られる）はすでに文献に記載されている(Green et al., 1996)。０．８ｋｂの内部ｂｕｋ断片を有する非複製ベクターｐＪＣ４ＢＫは染色体ｂｕｋ遺伝子に組み込まれ、内因性遺伝子の不活性化をもたらした。得られた株は、プラスミドの名称から「変異株ＰＪＣ４ＢＫ」と命名された。この文献で厳密に示されたように、この遺伝子の組み込みは、プラスミド切断により野生型へ戻り得る、この種の遺伝子不活性化の不安定性のために、酵素活性を完全に失うことも無ければ、酪酸の形成も起こらない。その後、この変異株がいくつかの研究に用いられた(Green and Bennett, 1998; Desai and Harris, 1999; Harris et al.,2000)。
【０００７】
従来、商業的なＡＢＥ発酵は、生産クロストリディア（Clostridia）の連続培養不安定性のためにバッチ様式でのみ行われていた。いくつかの溶媒生成発酵法が記載されている。これらの方法はｎ−ブタノール、アセトンおよびエタノールを６：３：１の比率で生じる。文献では、溶媒収率は、発酵可能な炭素源の２９〜３４％（ｎ−ブタノール単独では１８〜２５％）であることが報告されている。生産されるｎ−ブタノールの毒性のために、一般に、全溶媒濃度１６〜２４ｇ／ｌ、ｎ−ブタノール濃度１０〜１４ｇ／ｌが限界である。しかしながら、「低コスト」ガスストリッピング技術の使用により発酵中に溶媒が回収可能であることが最近実証されたことから、これら溶媒が低力価であることは、もはやこの方法の経済的制限とはならないと思われる。
【０００８】
本発明により解決される課題は、野生型の表現型に戻る可能性を伴わずに数世代にわたって培養可能な、酪酸キナーゼ活性を持たない安定な変異株を得ることである。この株は、クロストリディア（Clostridia）の遺伝的に安定な培養物により、グルコースまたは他の糖類などの安価な炭素基質からｎ−ブタノールを高収量で生物学的に生産するのに有用である。不活性化のためのいくつかの生化学的工程および代謝調節の複雑性は、工業的に実現可能なｎ−ブタノール生産法のために、代謝的に操作された全細胞触媒の使用を必要とする。
【発明の概要】
【０００９】
本発明者らは上述の問題を解決した。本発明によれば、遺伝的に安定なクロストリディア（Clostridia）培養物によって、発酵可能な炭素源を、主生成物としてのｎ−ブタノールへ生物学的に変換する方法が提供される。グルコースをモデル基質として用い、組換えクロストリジウム・アセトブチリカムをモデル宿主として用いる。本発明の一つの態様において、ブチリル−ＣｏＡを酪酸へと代謝することができない安定な組換えＣ．アセトブチリカムは、酪酸キナーゼをコードする遺伝子（ｂｕｋ）を削除することによって構築される。本発明の別の態様において、アセトンを生産することができない組換えＣ．アセトブチリカムは、ＣｏＡ−トランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｃｔｆＡＢ）を削除することによって構築される。本発明のさらなる態様において、乳酸を生産することができない組換え株は、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｌｄｈ）を削除することによって構築される。さらに、酢酸を生産することができない組換えＣ．アセトブチリカムは、ホスホトランスアセチラーゼおよび／または酢酸キナーゼをコードする遺伝子（ｐｔａおよびａｃｋ）を削除することによって構築される。本発明の最後の態様では、ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｈｙｄＡ）を減弱することによって水素生産フラックスが低減され、そして、還元当量のフラックスがｎ−ブタノールの生産にふり向けられる。
【００１０】
本発明は一般に、アセチル−ｃｏＡに容易に変換されるいずれの炭素基質を含むようにも適用可能である。
【００１１】
よって、本発明の目的は、（ａ）ブチリル−ＣｏＡから酪酸への変換に関与する２つの遺伝子のうち少なくとも１つの削除、および（ｂ）ＣｏＡ−トランスフェラーゼ活性をコードする２つの遺伝子のうち少なくとも１つの削除を含む、ｎ−ブタノールの生産に有用な組換え生物を提供することである。所望により、この組換え生物は、（ｉ）（ａ）乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、（ｂ）ホスホトランスアセチラーゼまたは酢酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子からなる群から選択される内因性遺伝子における不活性化変異、および（ｉｉ）ヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の減弱を含む。
【００１２】
別の実施態様では、本発明は、（ａ）本発明の組換え生物を単糖類、オリゴ糖類、多糖類および一炭素基質からなる群から選択される少なくとも１つの炭素源と接触させ、それによりｎ−ブタノールが生産されること；所望により、（ｂ）その生産中にガスストリッピング工程によってｎ−ブタノールを回収すること；および（ｃ）その凝縮液から蒸留によりｎ−ブタノールを精製することを含む、組換え生物から高収量でｎ−ブタノールを製造するための安定な方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
本明細書に組み込まれ、その一部をなす添付図面は、本発明を具体的に例示するものであり、本明細書とともに本発明の原理を説明するものである。
【００１４】
【図１】炭水化物からのブタノール生産系の開発における中枢代謝の遺伝子操作を示す。１：ピルビン酸−フェレドキシンオキシドレダクターゼ；２：チオラーゼ；３：β−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；４：クロトナーゼ；５：ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；６：乳酸デヒドロゲナーゼ；７：ホスホトランスアセチラーゼ；８：酢酸キナーゼ；９：アセトアルデヒドデスヒドロゲナーゼ；１０：エタノールデヒドロゲナーゼ；１１：ＣｏＡトランスフェラーゼ（アセトアセチル−ＣｏＡ：酢酸／酪酸：ＣｏＡトランスフェラーゼ）；１２：アセト酢酸デカルボキシラーゼ；１３：ホスホトランスブチリラーゼ；１４：酪酸キナーゼ；１５：ブチルアルデヒド−ブタノールデヒドロゲナーゼ；１６：ヒドロゲナーゼ。
【発明の具体的説明】
【００１５】
本明細書において、特許請求の範囲および明細書の解説のために下記の用語を用いることがある。
【００１６】
「微生物」とは、細菌のような原核生物および酵母のような真核生物を含む、あらゆる種類の単細胞生物を指す。
【００１７】
「適切な培養培地」とは、当業者によく知られているような、使用する微生物に適合する培養培地を指す。
【００１８】
「炭素基質」または「炭素源」とは、微生物が代謝可能な任意の炭素源を意味し、その基質は少なくとも１つの炭素原子を含む。本発明者らは特に、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、一炭素基質およびポリオール（グリセロールなど）といった再生可能な、安価かつ発酵可能な炭素源を指す。一炭素基質はメタノールなどの炭素原子を１個だけ含む炭素分子と定義される。
【００１９】
式（ＣＨ２Ｏ）ｎの単糖類はオースまたは単純糖とも呼ばれ、単糖類としては、サッカロース、フルクトース、グルコース、ガラクトースおよびマンノースが挙げられる。１を超える単糖類を含む他の炭素源は二糖類、三糖類、オリゴ糖類および多糖類と呼ばれる。二糖類としては、サッカロース（スクロース）、ラクトースおよびマルトースが挙げられる。デンプンおよびヘミセルロースは、「複合糖」としても知られる多糖類である。
【００２０】
よって、「炭素源」とは、上記で挙げたいずれかの製品およびその混合物を意味する。
【００２１】
「減弱」とは、遺伝子の発現の低下、または遺伝子の産物であるタンパク質の活性の低下を指す。当業者ならばこの結果を得るための多くの手段を知っており、例えば、
・遺伝子への、この遺伝子の発現レベルまたはコードされているタンパク質の活性レベルを低下させる変異の導入
・その遺伝子の天然プロモーターの、低い発現をもたらす低強度プロモーターとの置換
・対応するメッセンジャーＲＮＡまたはタンパク質を脱安定化する要素の使用
・発現が必要なければ、その遺伝子の削除
がある。
【００２２】
「削除されている遺伝子」とは、その遺伝子のコード配列の実質的部分が除去されていることを意味する。好ましくは、コード配列の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％が除去されている。
【００２３】
本発明の説明において、酵素はそれらの特異的活性によって同定される。従って、この定義には、他の生物、より詳しくは他の微生物にも存在する定義された特異的活性を有するあらゆるポリペプチドが含まれる。多くの場合、類似の活性を有する酵素は、ＰＦＡＭまたはＣＯＧとして定義される特定のファミリーへの分類によって同定することができる。
【００２４】
ＰＦＡＭ(protein families database of alignments and hidden Markov models; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)は、タンパク質配列アラインメントの大きなコレクションを表す。各ＰＦＡＭは複数のアライメントの表示、タンパク質ドメインの表示、生物間の分布の評価、他のデータベースへのアクセス、および既知のタンパク質構造の表示を可能とする。
【００２５】
ＣＯＧ（clusters of orthologous groups of proteins; http://www.ncbi.nlm.nih. gov/COG/）は、３０の主要な系統発生的ラインを表す４３の完全に配列決定されたゲノムに由来するタンパク質配列を比較することによって得られる。各ＣＯＧは少なくとも３つのラインから定義され、これによりこれらによって保存されているドメインの同定が可能となる。
【００２６】
相同配列とそれらの相同％を特定する手段は当業者によく知られており、特に、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/から使用可能なＢＬＡＳＴプログラム（このウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターを使用）が挙げられる。次に、得られた配列を、例えば、プログラムＣＬＵＳＴＡＬＷ(http://www.cbi.ac.uk/clustalw/)またはＭＵＬＴＡＬＩＮ(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)を用いて（これらのウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターを使用）、活用（例えば、アライメント）することができる。
【００２７】
当業者ならば、既知の遺伝子に関してＧｅｎＢａｎｋで得られた参照番号を用い、他の生物、細菌株、酵母、真菌、哺乳類、植物などにおいて等価な遺伝子を決定することもできる。この慣用手段は、他の微生物から得られた遺伝子との配列アライメントを行い、別の生物で対応する遺伝子をクローニングするための縮重プローブをデザインすることによって決定できるコンセンサス配列を用いて行うのが有利である。これらの分子生物学の常法は当業者によく知られており、例えば、Sambrook et al. (Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York, 1989.)に記載されている。
【００２８】
本発明によれば、微生物を、炭素源を含んでなる適切な培養培地中で培養し、培養培地からｎ−ブタノールを同時回収することによりｎ−ブタノールを発酵的にバッチ生産または連続生産する方法が提供され、前記微生物では、酪酸の形成に関与する少なくとも１つの遺伝子が削除されている。
【００２９】
本発明の特定の実施態様によれば、微生物が、ホスホトランスブチリラーゼ（ｐｔｂ）または酪酸キナーゼ（ｂｕｋ）をコードする少なくとも１つの遺伝子の削除のために、ブチリル−ＣｏＡから酪酸へ変換することができないように改変されている方法が提供される。クロストリディア（Clostridia）における遺伝子の削除は、ｉ）削除する遺伝子をエリスロマイシン耐性遺伝子で置換し、ｉｉ）そのエリスロマイシン耐性遺伝子をレコンビナーゼで除去することを可能にする、最近、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６６９９７に記載された方法を用いて行うことができる。
【００３０】
本発明の別の実施態様では、微生物は、ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ｃｔｆＡＢ）またはアセト酢酸デカルボキシラーゼ（ａｄｃ）をコードする少なくとも１つの遺伝子の減弱または削除のために、アセトンを生産することができない。これらの遺伝子の１つの削除は、最近、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６６９９７に記載された方法を用いて行うことができる。
【００３１】
本発明のさらなる実施態様では、本発明の方法に用いられる微生物は乳酸を生産することができない。特にこれは、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ｌｄｈの削除のためであり得る。ｌｄｈの削除は、最近、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６６９９７に記載された方法を用いて行うことができる。
【００３２】
別の実施態様では、微生物は、酢酸を生産することができないように改変されている。これは、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）または酢酸キナーゼ（ａｃｋ）をコードする遺伝子の少なくとも１つの削除によって達成することができる。これらの遺伝子の１つの削除は、最近、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６６９９７に記載されている方法を用いて行うことができる。
【００３３】
本発明の一つの実施態様によれば、水素生産フラックスが低減され、還元当量のフラックスがｎ−ブタノール生産にふり向けられる微生物も提供され、これは水素生産の形での還元当量のシンクを提供する酵素であるヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｈｙｄＡ）を減弱することにより行うことができる。ｈｙｄＡの減弱は、天然プロモーターを低強度プロモーターで置換するか、または対応するメッセンジャーＲＮＡもしくはタンパク質を脱安定化する要素によって行うことができる。必要であれば、対応するＤＮＡ配列の削除によって、遺伝子の完全な減弱を行うこともできる。
【００３４】
好ましくは、使用する微生物は、Ｃ．アセトブチリカム、Ｃ．ベイジェリンキ(C. beijerinckii)、Ｃ．サッカロペルブチルアセトニカム(C. saccharoperbutylacetonicum)またはＣ．サッカロブチリカム(C. saccharobutylicum)からなる群から選択される。
【００３５】
本発明の別の実施態様では、培養は連続的かつ安定である。
【００３６】
別の実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）微生物を、グルコース、キシロース、アラビノース、スクロース、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、セルロース、キシラン、デンプンまたはその誘導体およびグリセロールからなる群から選択される少なくとも１つの炭素源と接触させ、それによりｎ−ブタノールが生産される工程；
（ｂ）その発酵中にガスストリッピングによりｎ−ブタノールを回収する工程；および
（ｃ）その凝縮液から蒸留によりｎ−ブタノールを単離する工程
を含む。
【００３７】
当業者ならば、本発明の微生物のための培養条件を定義することができる。特に、クロストリディア（Clostridia）は、２０℃〜５５℃、好ましくは２５℃〜４０℃、より具体的には約３５℃（Ｃ．アセトブチリカムの場合）の温度で発酵させる。
【００３８】
発酵は一般に、少なくとも１つの単純な炭素源と、必要であればその代謝産物の生産に必要な補助基質を含有する、使用する細菌に適合した既知の定義された組成の無機培養培地が入った発酵槽で行われる。
【００３９】
本発明はまた、上記に記載されたような微生物に関する。好ましくは、この微生物はＣ．アセトブチリカム、Ｃ．ベイジェリンキ、Ｃ．サッカロペルブチルアセトニカムまたはＣ．サッカロブチリカムからなる群から選択される。
【実施例】
【００４０】
実施例１：
酪酸を生産することができない株：クロストリジウム・アセトブチリカムΔｃａｃ１５１５ΔｕｐｐΔｂｕｋの構築
ｂｕｋ遺伝子を削除するために、Croux & Soucaille (2006)が特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６６９９７に記載している相同組換え戦略を用いる。この戦略によって、関連する遺伝子の大部分が削除されるとともにエリスロマイシン耐性カセットの挿入が可能となる。ｐＣｏｎｓ：：ｕｐｐにおけるｂｕｋ削除カセットは次のようにして構築した。
【００４１】
【表１】
0005442441.tif 000002
【００４２】
ｂｕｋ前後の２つのＤＮＡ断片を、鋳型としてのＣ．アセトブチリカム由来の全ＤＮＡと２つの特異的オリゴヌクレオチド対とともにＰｗｏポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅した。プライマー対ＢＵＫ  １−ＢＵＫ  ２とＢＵＫ  ３−ＢＵＫ  ４を用い、２つのＤＮＡ断片をそれぞれ得た。両プライマーＢＵＫ  １およびＢＵＫ  ４はＢａｍＨＩ部位を導入し、プライマーＢＵＫ  ２およびＢＵＫ  ３はＮｒｕＩ部位を導入する相補的領域を有する。ＤＮＡ断片ＢＵＫ  １−ＢＵＫ  ２とＢＵＫ  ３−ＢＵＫ  ４を、プライマーＢＵＫ  １およびＢＵＫ  ４を用いたＰＣＲ融合実験で連結し、得られた断片をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔにクローニングし、ｐＴＯＰＯ：ｂｕｋを得た。ｐＴＯＰＯ：ｂｕｋのユニークなＳｔｕＩ部位に、ｐＵＣ１８−ＦＲＴ−ＭＬＳ２のＳｔｕＩ断片から、両側にＦＲＴ配列を有する抗生物質耐性ＭＬＳ遺伝子を導入した。得られたプラスミドのＢａｍＨＩ消化の後に得られたＢＵＫ削除カセットをｐＣｏｎｓ：：ｕｐｐのＢａｍＨＩ部位にクローニングして、ｐＲＥＰΔＢＵＫ：：ｕｐｐプラスミドを得た。
【００４３】
このｐＲＥＰΔＢＵＫ：：ｕｐｐプラスミドを用い、エレクトロポレーションにより、Ｃ．アセトブチリカムＭＧＣΔｃａｃ１５Δｕｐｐ株を形質転換した。ペトリプレート上でエリスロマイシン（４０μｇ／ｍｌ）耐性クローンを選択した後、１つのコロニーを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含む液体合成培地で２４時間培養し、１００μｌの非希釈培養物をエリスロマイシン４０μｇ／ｍｌと５−ＦＵ  ４００μＭを含むＲＣＡ上にプレーティングした。エリスロマイシンと５−ＦＵの双方に耐性のあるコロニーを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡとチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡの双方にレプリカプレーティングし、５−ＦＵ耐性にチアムフェニコール感受性も伴っているクローンを選択した。エリスロマイシン耐性で、チアムフェニコール感受性であるクローンの遺伝子型をＰＣＲ分析（ｂｕｋ削除カセットの外側に位置するプライマーＢＵＫ  ０およびＢＵＫ  ５を使用）により確認した。ｐＲＥＰΔｂｕｋ：：ｕｐｐが欠失したΔｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ｍｌｓＲ株を単離した。
【００４４】
Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ｍｌｓＲ株を、Ｓ．セレビシエ(S. cerevisiae)由来のＦｌｐレコンビナーをコードするＦｌｐ  １遺伝子を発現するｐＣＬＦ１．１ベクターで形質転換した。形質転換し、ペトリプレート上でチアムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）耐性に関して選択した後、１つのコロニーを、チアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含む合成液体培地で培養し、適当な希釈物をチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡ上にプレーティングした。チアムフェニコール耐性クローンを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡとチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡの双方にレプリカプレーティングした。エリスロマイシン感受性で、チアムフェニコール耐性であるクローンの遺伝子型を、プライマーＢＵＫ  ０とＢＵＫ  ５を用いたＰＣＲ分析により確認した。ｐＣＬＦ１．１を消失させるため、エリスロマイシン感受性で、チアムフェニコール耐性であるΔｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ株の２連続の２４時間培養を行った。ｐＣＬＦ１．１を消失したΔｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ株を、エリスロマイシンとチアムフェニコールの双方に対するその感受性に従って単離した。
【００４５】
実施例２：
酪酸およびアセトンを生産することができない株：Ｃ．アセトブチリカムΔｃａｃ１５１５ΔｕｐｐΔｂｕｋΔｃｔｆＡＢの構築
ｃｔｆＡＢ遺伝子を削除するために、Croux & Soucaille (2006)が特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６６９９７に記載している相同組換え戦略を用いる。この戦略によって、関連する遺伝子の大部分が削除されるとともにエリスロマイシン耐性カセットの挿入が可能となる。ｐＣｏｎｓ：：ｕｐｐにおけるｃｔｆＡＢ削除カセットは次のようにして構築した。
【００４６】
【表２】
0005442441.tif 000003
【００４７】
ｃｔｆＡＢ前後の２つのＤＮＡ断片を、鋳型としてのＣ．アセトブチリカム由来の全ＤＮＡと２つの特異的オリゴヌクレオチド対とともにＰｗｏポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅した。プライマー対ＣＴＦ  １−ＣＴＦ  ２とＣＴＦ  ３−ＣＴＦ  ４を用い、２つのＤＮＡ断片をそれぞれ得た。両プライマーＣＴＦ  １およびＣＴＦ  ４はＢａｍＨＩ部位を導入し、プライマーＣＴＦ  ２およびＣＴＦ  ３はＳｔｕＩ部位を導入する相補的領域を有する。ＤＮＡ断片ＣＴＦ  １−ＣＴＦ  ２とＣＴＦ  ３−ＣＴＦ  ４を、プライマーＣＴＦ  １およびＣＴＦ  ４を用いたＰＣＲ融合実験で連結し、得られた断片をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔにクローニングし、ｐＴＯＰＯ：ＣＴＦを得た。ｐＴＯＰＯ：ＣＴＦのユニークなＳｔｕＩ部位に、ｐＵＣ１８−ＦＲＴ−ＭＬＳ２のＳｔｕＩ断片から、両側にＦＲＴ配列を有する抗生物質耐性ＭＬＳ遺伝子を導入した。得られたプラスミドのＢａｍＨＩ消化の後に得られたＵＰＰ削除カセットをｐＣｏｎｓ：：ｕｐｐのＢａｍＨＩ部位にクローニングして、ｐＲＥＰΔＣＴＦ：：ｕｐｐプラスミドを得た。
【００４８】
このｐＲＥＰΔＣＴＦ：：ｕｐｐプラスミドを用い、エレクトロポレーションにより、Ｃ．アセトブチリカムＭＧＣΔｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ株を形質転換した。ペトリプレート上でエリスロマイシン（４０μｇ／ｍｌ）耐性クローンを選択した後、１つのコロニーを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含む液体合成培地で２４時間培養し、１００μｌの非希釈培養物をエリスロマイシン４０μｇ／ｍｌと５−ＦＵ  ４００μＭを含むＲＣＡ上にプレーティングした。エリスロマイシンと５−ＦＵの双方に耐性のあるコロニーを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡとチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡの双方にレプリカプレーティングし、５−ＦＵ耐性にチアムフェニコール感受性も伴っているクローンを選択した。エリスロマイシン耐性で、チアムフェニコール感受性であるクローンの遺伝子型をＰＣＲ分析（ｃｔｆＡＢ削除カセットの外側に位置するプライマーＣＴＦ  ０およびＣＴＦ  ５を使用）により確認した。ｐＲＥＰΔＣＴＦ：：ｕｐｐが欠失したΔｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋΔｃｔｆＡＢ：：ｍｌｓＲ株を単離した。
【００４９】
Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋΔｃｔｆＡＢ：：ｍｌｓＲ株を、Ｓ．セレビシエ由来のＦｌｐレコンビナーをコードするＦｌｐ  １遺伝子を発現するｐＣＬＦ１．１ベクターで形質転換した。形質転換し、ペトリプレート上でチアムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）耐性に関して選択した後、１つのコロニーを、チアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含む合成液体培地で培養し、適当な希釈物をチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡ上にプレーティングした。チアムフェニコール耐性クローンを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡとチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡの双方にレプリカプレーティングした。エリスロマイシン感受性で、チアムフェニコール耐性であるクローンの遺伝子型を、プライマーＣＴＦ  ０とＣＴＦ  ５を用いたＰＣＲ分析により確認した。ｐＣＬＦ１．１を消失させるため、エリスロマイシン感受性で、チアムフェニコール耐性であるΔｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋΔｃｔｆＡＢ株の２連続の２４時間培養を行った。ｐＣＬＦ１．１を消失したΔｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋΔｃｔｆＡＢ株を、エリスロマイシンとチアムフェニコールの双方に対するその感受性に従って単離した。
【００５０】
実施例３：
酪酸、アセトンおよび乳酸を生産することができない株：Ｃ．アセトブチリカムΔｃａｃ１５１５ΔｕｐｐΔｂｕｋΔｃｔｆＡＢΔｌｄｈの構築
ｌｄｈ遺伝子を削除するために、Croux & Soucaille (2006)が特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６６９９７に記載している相同組換え戦略を用いる。この戦略によって、関連する遺伝子の大部分が削除されるとともにエリスロマイシン耐性カセットの挿入が可能となる。ｐＣｏｎｓ：：ｕｐｐにおけるｌｄｈ削除カセットは次のようにして構築した。
【００５１】
【表３】
0005442441.tif 000004
【００５２】
ｌｄｈ（ＣＡＣ２６７）前後の２つのＤＮＡ断片を、鋳型としてのＣ．アセトブチリカム由来の全ＤＮＡと２つの特異的オリゴヌクレオチド対とともにＰｗｏポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅した。プライマー対ＬＤＨ  １−ＬＤＨ  ２とＬＤＨ  ３−ＬＤＨ  ４を用い、１１３５ｂｐと１１７７ｂｐのＤＮＡ断片をそれぞれ得た。両プライマーＬＤＨ  １およびＬＤＨ  ４はＢａｍＨＩ部位を導入し、プライマーＬＤＨ  ２およびＬＤＨ  ３はＳｔｕＩ部位を導入する相補的領域を有する。ＤＮＡ断片ＬＤＨ  １−ＬＤＨ  ２とＬＤＨ  ３−ＬＤＨ  ４を、プライマーＬＤＨ  １およびＬＤＨ  ４を用いたＰＣＲ融合実験で連結し、得られた断片をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔにクローニングし、ｐＴＯＰＯ：ＬＤＨを得た。ｐＴＯＰＯ：ＬＤＨのユニークなＳｔｕＩ部位に、ｐＵＣ１８−ＦＲＴ−ＭＬＳ２の１３７２ｂｐのＳｔｕＩ断片から、両側にＦＲＴ配列を有する抗生物質耐性ＭＬＳ遺伝子を導入した。得られたプラスミドのＢａｍＨＩ消化の後に得られたＵＰＰ削除カセットをｐＣｏｎｓ：：ｕｐｐのＢａｍＨＩ部位にクローニングして、ｐＲＥＰΔＬＤＨ：：ｕｐｐプラスミドを得た。
【００５３】
このｐＲＥＰΔＬＤＨ：：ｕｐｐプラスミドを用い、エレクトロポレーションにより、Ｃ．アセトブチリカムＭＧＣΔｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋΔｃｔｆＡＢ株を形質転換した。ペトリプレート上でエリスロマイシン（４０μｇ／ｍｌ）耐性クローンを選択した後、１つのコロニーを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含む液体合成培地で２４時間培養し、１００μｌの非希釈培養物をエリスロマイシン４０μｇ／ｍｌと５−ＦＵ  ４００μＭを含むＲＣＡ上にプレーティングした。エリスロマイシンと５−ＦＵの双方に耐性のあるコロニーを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡとチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡの双方にレプリカプレーティングし、５−ＦＵ耐性にチアムフェニコール感受性も伴っているクローンを選択した。エリスロマイシン耐性で、チアムフェニコール感受性であるクローンの遺伝子型をＰＣＲ分析（ｌｄｈ削除カセットの外側に位置するプライマーＬＤＨ  ０およびＬＤＨ  ５を使用）により確認した。ｐＲＥＰΔＬＤＨ：：ｕｐｐが欠失したΔｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋΔｃｔｆＡＢΔｌｄｈ：：ｍｌｓＲ株を単離した。
【００５４】
Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋΔｃｔｆＡＢΔｌｄｈ：：ｍｌｓＲ株を、Ｓ．セレビシエ由来のＦｌｐレコンビナーをコードするＦｌｐ  １遺伝子を発現するｐＣＬＦ１．１ベクターで形質転換した。形質転換し、ペトリプレート上でチアムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）耐性に関して選択した後、１つのコロニーを、チアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含む合成液体培地で培養し、適当な希釈物をチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡ上にプレーティングした。チアムフェニコール耐性クローンを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡとチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡの双方にレプリカプレーティングした。エリスロマイシン感受性で、チアムフェニコール耐性であるクローンの遺伝子型を、プライマーＬＤＨ  ０とＬＤＨ  ５を用いたＰＣＲ分析により確認した。ｐＣＬＦ１．１を消失させるため、エリスロマイシン感受性で、チアムフェニコール耐性であるΔｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋΔｃｔｆＡＢΔｌｄｈ株の２連続の２４時間培養を行った。ｐＣＬＦ１．１を消失したΔｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋΔｃｔｆＡＢΔｌｄｈ株を、エリスロマイシンとチアムフェニコールの双方に対するその感受性に従って単離した。
【００５５】
実施例４：
酪酸、アセトン、乳酸および酢酸を生産することができない株：Ｃ．アセトブチリカムΔｃａｃ１５１５ΔｕｐｐΔｂｕｋΔｃｔｆＡＢΔｌｄｈΔｐｔａ−ａｃｋの構築
ｐｔａおよびａｃｋ遺伝子を削除するために、Croux & Soucaille (2006)が特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６６９９７に記載している相同組換え戦略を用いる。この戦略によって、関連する遺伝子の大部分が削除されるとともにエリスロマイシン耐性カセットの挿入が可能となる。ｐＣｏｎｓ：：ｕｐｐにおけるｐｔａ−ａｃｋ削除カセットは次のようにして構築した。
【００５６】
【表４】
0005442441.tif 000005
【００５７】
ｐｔａ−ａｃｋ前後の２つのＤＮＡ断片を、鋳型としてのＣ．アセトブチリカム由来の全ＤＮＡと２つの特異的オリゴヌクレオチド対とともにＰｗｏポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅した。プライマー対ＰＡ  １−ＰＡ  ２とＰＡ  ３−ＰＡ  ４を用い、２つのＤＮＡ断片をそれぞれ得た。両プライマーＰＡ  １およびＰＡ  ４はＢａｍＨＩ部位を導入し、プライマーＰＡ  ２およびＰＡ  ３はＳｔｕＩ部位を導入する相補的領域を有する。ＤＮＡ断片ＰＡ  １−ＰＡ  ２とＰＡ  ３−ＰＡ  ４を、プライマーＰＡ  １およびＰＡ  ４を用いたＰＣＲ融合実験で連結し、得られた断片をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔにクローニングし、ｐＴＯＰＯ：ＰＡを得た。ｐＴＯＰＯ：ＰＡのユニークなＳｔｕＩ部位に、ｐＵＣ１８−ＦＲＴ−ＭＬＳ２のＳｔｕＩ断片から、両側にＦＲＴ配列を有する抗生物質耐性ＭＬＳ遺伝子を導入した。得られたプラスミドのＢａｍＨＩ消化の後に得られたＵＰＰ削除カセットをｐＣｏｎｓ：：ｕｐｐのＢａｍＨＩ部位にクローニングして、ｐＲＥＰΔＰＡ：：ｕｐｐプラスミドを得た。
【００５８】
このｐＲＥＰΔＰＡ：：ｕｐｐプラスミドを用い、エレクトロポレーションにより、Ｃ．アセトブチリカムＭＧＣΔｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋΔｃｔｆＡＢΔ株を形質転換した。ペトリプレート上でエリスロマイシン（４０μｇ／ｍｌ）耐性クローンを選択した後、１つのコロニーを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含む液体合成培地で２４時間培養し、１００μｌの非希釈培養物をエリスロマイシン４０μｇ／ｍｌと５−ＦＵ  ４００μＭを含むＲＣＡ上にプレーティングした。エリスロマイシンと５−ＦＵの双方に耐性のあるコロニーを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡとチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡの双方にレプリカプレーティングし、５−ＦＵ耐性にチアムフェニコール感受性も伴っているクローンを選択した。エリスロマイシン耐性で、チアムフェニコール感受性であるクローンの遺伝子型をＰＣＲ分析（ｐｔａ−ａｃｋ削除カセットの外側に位置するプライマーＰＡ  ０およびＰＡ  ５を使用）により確認した。ｐＲＥＰΔＰＡ：：ｕｐｐが欠失したΔｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋΔｃｔｆＡＢΔｌｄｈΔｐｔａ−ａｃｋ：：ｍｌｓＲ株を単離した。
【００５９】
Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋΔｃｔｆＡＢΔｌｄｈΔｐｔａ−ａｃｋ：：ｍｌｓＲ株を、Ｓ．セレビシエ由来のＦｌｐレコンビナーをコードするＦｌｐ  １遺伝子を発現するｐＣＬＦ１．１ベクターで形質転換した。形質転換し、ペトリプレート上でチアムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）耐性に関して選択した後、１つのコロニーを、チアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含む合成液体培地で培養し、適当な希釈物をチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡ上にプレーティングした。チアムフェニコール耐性クローンを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡとチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡの双方にレプリカプレーティングした。エリスロマイシン感受性で、チアムフェニコール耐性であるクローンの遺伝子型を、プライマーＰＡ  ０とＰＡ  ５を用いたＰＣＲ分析により確認した。ｐＣＬＦ１．１を消失させるため、エリスロマイシン感受性で、チアムフェニコール耐性であるΔｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋΔｃｔｆＡＢΔｌｄｈΔｐｔａ−ａｃｋ株の２連続の２４時間培養を行った。ｐＣＬＦ１．１を消失したΔｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋΔｃｔｆＡＢΔｌｄｈΔｐｔａ−ａｃｋ株を、エリスロマイシンとチアムフェニコールの双方に対するその感受性に従って単離した。
【００６０】
実施例５：
低水素生産株：Ｃ．アセトブチリカムΔｃａｃ１５１５ΔｕｐｐΔｂｕｋΔｃｔｆＡＢΔｌｄｈΔｈｙｄＡの構築
ｈｙｄＡ遺伝子を削除するために、Croux & Soucaille (2006)が特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６６９９７に記載している相同組換え戦略を用いる。この戦略によって、関連する遺伝子の大部分が削除されるとともにエリスロマイシン耐性カセットの挿入が可能となる。ｐＣｏｎｓ：：ｕｐｐにおけるｈｙｄＡ削除カセットは次のようにして構築した。
【００６１】
【表５】
0005442441.tif 000006
【００６２】
ｈｙｄＡ（ＣＡＣ０２８）前後の２つのＤＮＡ断片を、鋳型としてのＣ．アセトブチリカム由来の全ＤＮＡと２つの特異的オリゴヌクレオチド対とともにＰｗｏポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅した。プライマー対ＨＹＤ  １−ＨＹＤ  ２とＨＹＤ  ３−ＨＹＤ  ４を用い、１２６９ｂｐと１３１７ｂｐのＤＮＡ断片をそれぞれ得た。両プライマーＨＹＤ  １およびＨＹＤ  ４はＢａｍＨＩ部位を導入し、プライマーＨＹＤ  ２およびＨＹＤ  ３はＳｔｕＩ部位を導入する相補的領域を有する。ＤＮＡ断片ＨＹＤ  １−ＨＹＤ  ２とＨＹＤ  ３−ＨＹＤ  ４を、プライマーＨＹＤ  １およびＨＹＤ  ４を用いたＰＣＲ融合実験で連結し、得られた断片をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔにクローニングし、ｐＴＯＰＯ：ＨＹＤを得た。ｐＴＯＰＯ：ＨＹＤのユニークなＳｔｕＩ部位に、ｐＵＣ１８−ＦＲＴ−ＭＬＳ２の１３７２ｂｐのＳｔｕＩ断片から、両側にＦＲＴ配列を有する抗生物質耐性ＭＬＳ遺伝子を導入した。得られたプラスミドのＢａｍＨＩ消化の後に得られたＵＰＰ削除カセットをｐＣｏｎｓ：：ｕｐｐのＢａｍＨＩ部位にクローニングして、ｐＲＥＰΔＨＹＤ：：ｕｐｐプラスミドを得た。
【００６３】
このｐＲＥＰΔＨＹＤ：：ｕｐｐプラスミドを用い、エレクトロポレーションにより、Ｃ．アセトブチリカムＭＧＣΔｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋΔｃｔｆＡＢΔΔｌｄｈ株を形質転換した。ペトリプレート上でエリスロマイシン（４０μｇ／ｍｌ）耐性クローンを選択した後、１つのコロニーを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含む液体合成培地で２４時間培養し、１００μｌの非希釈培養物をエリスロマイシン４０μｇ／ｍｌと５−ＦＵ  ４００μＭを含むＲＣＡ上にプレーティングした。エリスロマイシンと５−ＦＵの双方に耐性のあるコロニーを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡとチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡの双方にレプリカプレーティングし、５−ＦＵ耐性にチアムフェニコール感受性も伴っているクローンを選択した。エリスロマイシン耐性で、チアムフェニコール感受性であるクローンの遺伝子型をＰＣＲ分析（ｈｙｄＡ削除カセットの外側に位置するプライマーＨＹＤ  ０およびＨＹＤ  ５を使用）により確認した。ｐＲＥＰΔＨＹＤ：：ｕｐｐが欠失したΔｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋΔｃｔｆＡＢΔｌｄｈΔｈｙｄＡ：：ｍｌｓＲ株を単離した。
【００６４】
Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋΔｃｔｆＡＢΔｌｄｈΔｈｙｄＡ：：ｍｌｓＲ株を、Ｓ．セレビシエ由来のＦｌｐレコンビナーをコードするＦｌｐ  １遺伝子を発現するｐＣＬＦ１．１ベクターで形質転換した。形質転換し、ペトリプレート上でチアムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）耐性に関して選択した後、１つのコロニーを、チアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含む合成液体培地で培養し、適当な希釈物をチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡ上にプレーティングした。チアムフェニコール耐性クローンを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡとチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡの双方にレプリカプレーティングした。エリスロマイシン感受性で、チアムフェニコール耐性であるクローンの遺伝子型を、プライマーＨＹＤ  ０とＨＹＤ  ５を用いたＰＣＲ分析により確認した。ｐＣＬＦ１．１を消失させるため、エリスロマイシン感受性で、チアムフェニコール耐性であるΔｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋΔｃｔｆＡＢΔｌｄｈΔｈｙｄＡ株の２連続の２４時間培養を行った。ｐＣＬＦ１．１を消失したΔｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋΔｃｔｆＡＢΔｌｄｈΔｈｙｄＡ株を、エリスロマイシンとチアムフェニコールの双方に対するその感受性に従って単離した。
【００６５】
実施例６：
ｎ−ブタノール生産株のバッチ発酵
まず、株を、２．５ｇ／ｌの酢酸アンモニウムを添加した、嫌気性フラスコ培養のSoni et al (Soni et al, 1987, Appl. Microbiol. Biotechnol. 27:1-5)に記載の合成培地にて分析した。３５℃での一晩培養物を用い、３０ｍｌ培養物をＯＤ６００が０．０５となるまで接種した。培養物を３５℃で３日間インキュベートした後、グルコース、有機酸および溶媒を、分離にＢｉｏｒａｄ  ＨＰＸ  ９７Ｈカラム、検出に屈折計を用い、ＨＰＬＣにより分析した。
【００６６】
次に、適当な表現型を有する株を、嫌気性バッチプロトコールを用い、３００ｍｌの発酵槽（ＤＡＳＧＩＰ）での生産条件下で試験した。
【００６７】
この目的で、発酵槽に２５０ｍｌの合成培地を満たし、窒素で３０分スパージし、２５ｍｌの前培地物を０．０５〜０．１の間の光学密度（ＯＤ６００ｎｍ）まで接種した。
【００６８】
培養温度は３５℃に一定維持し、ｐＨはＮＨ４ＯＨ溶液を用い、常に５．５に調節した。発酵中、振盪速度は３００ｒｐｍで維持した。
【００６９】
実施例７：
ｎ−ブタノール生産株の連続発酵
最良のｎ−ブタノール生産株をSoni et al (Soni et al, 1987, Appl. Microbiol. Biotechnol. 27:1-5)が記載している合成培地中のケモスタット培養にて分析した。３５℃での一晩培養物を用い、嫌気性ケモスタットプロトコールを用いて、３００ｍｌの発酵槽（ＤＡＳＧＩＰ）に接種した。
【００７０】
この目的で、発酵槽に２５０ｍｌの合成培地を満たし、窒素で３０分スパージし、２５ｍｌの前培地物を０．０５〜０．１の間の光学密度（ＯＤ６００ｎｍ）まで接種した。３５℃、ｐＨ５．５（ＮＨ４ＯＨ溶液を用いて調節）および振盪速度３００ｒｐｍで１２時間のバッチ培養の後、発酵培地を連続的に除去することにより容量を維持しつつ、希釈率０．０５ｈ−１で酸素不含合成培地を発酵槽に連続的に供給した。培養の安定性を、これまでに記載されているＨＰＬＣプロトコールを用いた生成物分析によって追跡した。
【００７１】
実施例８：
バッチ培養におけるｎ−ブタノール生産株の評価
生産株を小フラスコで評価した。１０％の解凍培養物（一般に３ｍｌ）を用い、３０ｍｌの合成培地（ＭＳＬ４）に接種した。８０℃で１５分、熱ショックをかけ、増殖の誘導前に存在している栄養細胞を死滅させた。次に、これらの培養物を３７℃で６〜７日間増殖させた。細胞外化合物を、下記のパラメーター：溶出剤（Ｈ２ＳＯ４）；濃度：０．２５ｍＭ；流速：０．５ｍｌ／分；温度：２５℃；時間：５０分を用いたＨＰＬＣにより定量した。
【００７２】
【表６】
0005442441.tif 000007
【００７３】
表２に見られるように、酪酸キナーゼをコードする遺伝子（ｂｕｋ）が削除されると、培地中に検出される最大酪酸濃度が、Ｃ．アセトブチリカムΔｃａｃ１５Δｕｐｐ株における培養２日後の３．１３ｇ／ｌから、Ｃ．アセトブチリカムΔｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＭＳＬｒ株における培養５日後の０．４３ｇ／ｌまで低下する。特に、アルコール／グルコース収量（Ｙｂｕ＋Ｙｅｔ）は有意に増加するが、アセトン／グルコース収量（Ｙａｃ）は有意に減少する。
【００７４】
【表７】
0005442441.tif 000008
【００７５】
参照文献
Desai RP, Harris LM, Welker NE, Papoutsakis ET.
Metabolic flux analysis elucidates the importance of the acid-formation pathways in regulating solvent production by Clostridium acetobutylicum.
Metab Eng. 1999,1:206-13. 
Green EM, Bennett GN.
Genetic manipulation of acid and solvent formation in clostridium acetobutylicum ATCC 824 
Biotechnol Bioeng. 1998, 58:215-21. 
Green EM, Boynton ZL, Harris LM, Rudolph FB, Papoutsakis ET, Bennett GN.
Genetic manipulation of acid formation pathways by gene inactivation in Clostridium acetobutylicum ATCC 824.
Microbiology. 1996,142 :2079-86. 
Harris LM, Desai RP, Welker NE, Papoutsakis ET.
Characterization of recombinant strains of the Clostridium acetobutylicum butyrate kinase inactivation mutant: need for new phenomenological models for solventogenesis and butanol inhibition?
Biotechnol Bioeng. 2000,;67:1-11. 
Soni B. K., Soucaille P. Goma G.
Continuous acetone butanol fermentation : influence of vitamins on the metabolic activity of Clostridium acetobutylicum. 
Appl. Microbiol. Biotechnol. 1987. 27 : 1-5.
【図１】
0005442441.tif 000009
【配列表】
0005442441000001.app