(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のペプチドを含有することを特徴とするヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）−Ａ＊０２０１陽性者用癌ワクチン組成物。
ＷＴ１187P1Fペプチド：Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val（配列番号１１）、
ＷＴ１187P2Mペプチド：Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val（配列番号１６）、又は
ＷＴ１126P1Fペプチド：Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu（配列番号３４）
【請求項２】
以下のペプチドを含有し、ヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）−Ａ＊０２０１陽性者を投与対象とする、癌の治療又は予防のための組成物。
ＷＴ１187P1Fペプチド：Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val（配列番号１１）、
ＷＴ１187P2Mペプチド：Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val（配列番号１６）、又は
ＷＴ１126P1Fペプチド：Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu（配列番号３４）
【請求項３】
ヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）−Ａ＊０２０１陽性者の癌の治療又は予防のための、以下のペプチド。
ＷＴ１187P1Fペプチド：Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val（配列番号１１）、
ＷＴ１187P2Mペプチド：Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val（配列番号１６）、又は
ＷＴ１126P1Fペプチド：Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu（配列番号３４）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルムス腫瘍の癌抑制遺伝子ＷＴ１の遺伝子産物であるタンパク質（以下、ＷＴ１タンパク質と略記することもある。）又はその部分ペプチド（以下、ＷＴ１ペプチドと略記することもある。）を含有するヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）−Ａ＊０２０６陽性者用癌ワクチン組成物に関する。本発明はまた、上記ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドをコードするＤＮＡ又はＲＮＡを含有するＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者用癌ワクチン組成物、ＷＴ１特異的ＣＴＬｓの誘導方法、癌抗原を提示する樹状細胞の誘導方法、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者用の癌の診断方法、及び癌の治療又は予防方法に関する。
本発明はさらに、ＷＴ１ペプチドの改変ペプチドを含有するＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者用癌ワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルムス腫瘍遺伝子ＷＴ１は、小児腎腫瘍であるウイルムス腫瘍の腫瘍形成に関与する遺伝子として単離された（非特許文献１参照）。この遺伝子は、細胞増殖及び細胞分化の調節機構、並びにアポトーシス及び組織発達と関連するジンク・フィンガー転写因子をコードする遺伝子である。【０００３】
ＷＴ１遺伝子は、最初は腫瘍抑制遺伝子として分類された。しかし、近年以下の（i）〜（iii）の証拠；
（i）白血病及び骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）のような造血器悪性腫瘍を含む種々のヒトの悪性腫瘍及び固形癌における野生型ＷＴ１遺伝子の高発現、
（ii）ＷＴ１アンチセンス・オリゴヌクレオチドで処理されたヒト白血病細胞及び固形癌細胞の増殖阻害、
（iii）野生型ＷＴ１遺伝子の構成的発現によるマウス骨髄性前駆細胞の増殖促進と分化阻止
に基づき、野生型ＷＴ１遺伝子が、様々なタイプの悪性疾患で腫瘍抑制作用というより発癌作用を行っていることが示唆されている（特許文献１参照）。
さらに、ＷＴ１遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌などの固形癌においても高発現することが知られている（特許文献２参照）。【０００４】
異物を排除するための免疫機構には、一般に、抗原を認識して抗原提示細胞として機能するマクロファージ、該マクロファージの抗原提示を認識して種々のリンホカインを産生して他のＴ細胞などを活性化するヘルパーＴ細胞、該リンホカインの作用により抗体産生細胞に分化するＢリンパ球などが関与する液性免疫と、抗原の提示を受けて分化した細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）が標的細胞を攻撃し破壊する細胞性免疫とがある。【０００５】
現在のところ、癌の免疫は主として、ＣＴＬｓが関与する細胞性免疫によるものと考えられている。ＣＴＬｓによる癌免疫においては、主要組織適合抗原（Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＨＣ）クラスＩと癌抗原との複合体の形で提示された癌抗原を認識した前駆体Ｔ細胞が分化増殖して生成したＣＴＬｓが癌細胞を攻撃し、破壊する。この際、癌細胞はＭＨＣクラスＩ抗原と癌抗原との複合体をその細胞表面に提示しており、これがＣＴＬｓの標的とされる（非特許文献２〜５参照）。ＭＨＣは、ヒトではヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）と呼ばれる。【０００６】
標的細胞である癌細胞上にＭＨＣクラスＩ抗原により提示される前記の癌抗原は、癌細胞内で合成された抗原タンパク質が細胞内プロテアーゼによりプロセシングされて生成した約８〜１２個のアミノ酸から成るペプチドであると考えられている（非特許文献２〜５参照）。現在、種々の癌について抗原タンパク質の検索が行われているが、癌特異抗原として証明されているものは少ない。【０００７】
本発明者らは、ＷＴ１遺伝子の発現産物のアミノ酸配列中で、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２又はＨＬＡ−Ａ＊０２０１との結合において、アンカーアミノ酸として機能すると予想される少なくとも１個のアミノ酸を含有する連続する７〜３０個のアミノ酸から成るポリペプチドを合成し、これらのペプチドがＨＬＡ−Ａ＊２４０２又はＨＬＡ−Ａ＊０２０１と結合する（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性又はＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性）ことを確認すると共に、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２又はＨＬＡ−Ａ＊０２０１と結合した場合に、ＣＴＬｓを誘導し且つ標的細胞に殺細胞効果を及ぼす反応（以下、ＣＴＬ反応と略記する。）を示すことを見出した。また、このことから、これらのペプチドはＷＴ１遺伝子の発現産物のタンパク質由来のＣＴＬエピトープであると同定された。【０００８】
現在のところ、ＷＴ１特異的ＣＴＬｓエピトープはＨＬＡ−Ａ＊２４０２及びＨＬＡ−Ａ＊０２０１（特許文献３参照）、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３（特許文献４参照）並びにＨＬＡ−Ａ＊１１０１（特許文献５参照）に対してのみ同定され、前記ポリペプチドに基づくＣＴＬ反応は、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３拘束性及びＨＬＡ−Ａ＊１１０１拘束性によってのみ引き出される特異的反応であることが確認されている。
このことは、癌抑制遺伝子ＷＴ１の遺伝子産物であるタンパク質が有望な腫瘍拒絶抗原（腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ともいう。）である可能性をもたらした。事実、高頻度のＷＴ１特異的ＣＴＬｓ又は高抗体価の抗ＷＴ１抗体は、健常供血者の末梢血ではなく癌患者の末梢血で検出された。【０００９】
しかしながら、ＨＬＡは個人を規定するマーカーでもあるから、多様である。ＨＬＡの場合、ＭＨＣクラスＩ抗原はＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃ、クラスＩＩ抗原はＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ及びＨＬＡ−ＤＲとそれぞれ複数存在する。またＨＬＡのそれぞれの抗原結合部位は多型に富んでおり、たとえばＨＬＡ−Ａには２７種類以上、ＨＬＡ−Ｂには５９種類以上、ＨＬＡ−Ｃには１０種類以上の多型（対立遺伝子）が知られている。
従って、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３又はＨＬＡ−Ａ＊１１０１以外の型のＨＬＡに結合し、ＣＴＬ反応を誘導する癌抗原を特定することにより、免疫療法を適用することができる対象を広げることが望まれていた。【００１０】
一方、ＷＴ１ペプチドの改変ペプチドのうち、以下に示す３つのペプチドが、２件の文献で報告されている；
ＷＴ１187P1Yペプチド（ＹＬＧＥＱＱＹＳＶ；配列番号１２）及び
ＷＴ１126P1Yペプチド（ＹＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号３５）（いずれも特許文献６参照）、並びに、
ＷＴ１126P9Mペプチド（ＲＭＦＰＮＡＰＹＭ；配列番号５２）（特許文献７参照）。
さらに、欧州特許１１２７０６８の審査における意見書において、以下に示す２つのペプチドが報告されている；
ＷＴ１126P2Lペプチド（ＲＬＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号３９）
ＷＴ１126P2L＆P9Vペプチド（ＲＬＦＰＮＡＰＹＶ；配列番号７５）（非特許文献７参照）。
しかしながら、これらのＷＴ１改変ペプチドがＨＬＡ−Ａ＊２４０２、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３又はＨＬＡ−Ａ＊１１０１以外の型のＨＬＡに結合し、ＣＴＬ反応を誘導する癌抗原となるかについては、一切報告されていない。
【特許文献１】特開平９−１０４６２９号公報
【特許文献２】特開平１１-０３５４８４号公報
【特許文献３】国際公開第ＷＯ００／０６６０２号パンフレット
【特許文献４】特願２００６−０４５２８７号
【特許文献５】特願２００６−３５５３５６号
【特許文献６】国際公開第ＷＯ２００５／０５３６１８号パンフレット
【特許文献７】国際公開第ＷＯ２００７／０１６４６６号パンフレット
【非特許文献１】Ｇｅｓｓｌｅｒ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、第３４３巻、７７４−７７８頁、１９９０年
【非特許文献２】Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第５巻、７０９頁、１９９３年
【非特許文献３】Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第５巻、７１９頁、１９９３年
【非特許文献４】Ｃｅｌｌ，第８２巻、１３頁、１９９５年
【非特許文献５】Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、第１４６巻、１６７頁、１９９５年
【非特許文献６】Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、第１１巻、１７０７頁、１９９１年
【非特許文献７】欧州特許１１２７０６８の審査における意見書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、白血病を含む悪性腫瘍患者に対しての癌抑制遺伝子ＷＴ１の遺伝子産物であるタンパク質（ＷＴ１タンパク質）又はその部分ペプチド（ＷＴ１ペプチド）をベースとする癌の治療及び／又は予防法の適用をＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者に広げることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するため、本発明者は鋭意研究を行った。その結果、ヒトＷＴ１タンパク質由来のＷＴ１187ペプチド（ＳＬＧＥＱＱＹＳＶ）及びＷＴ１126ペプチド（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ）に関して、従来はＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性のＣＴＬｓを誘導することのみ知られていたが、驚くべきことに、当該ペプチドはＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性のＣＴＬｓをも誘導することを見出した。また、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性のＣＴＬｓを誘導するＷＴ１ペプチドとしては、国際公開第ＷＯ００／０６６０２号パンフレットに記載されているペプチドのみが知られていたが、ＷＴ１187ペプチドの改変ペプチド（ＷＴ１187改変ペプチドともいう）及びＷＴ１126ペプチドの改変ペプチド（ＷＴ１126改変ペプチドともいう）も、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子に結合することを見出した。本発明者は、これらの知見に基づきさらに鋭意研究を行い、本発明を完成するに至った。【００１３】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１７）に関する。
（１）癌抑制遺伝子ＷＴ１の遺伝子産物であるタンパク質又はその部分ペプチドを含有することを特徴とするヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）−Ａ＊０２０６陽性者用癌ワクチン組成物。
（２）癌抑制遺伝子ＷＴ１の遺伝子産物であるタンパク質が、以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかのタンパク質である上記（１）に記載の組成物。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者に対して免疫原性を有するタンパク質
（３）部分ペプチドが、
ＷＴ１187ペプチド：Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val（配列番号２）、
ＷＴ１126ペプチド：Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu（配列番号３）、
ＷＴ１187P1Fペプチド：Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val（配列番号１１）、
ＷＴ１187P2Mペプチド：Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val（配列番号１６）、
ＷＴ１187P3Mペプチド：Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val（配列番号２０）、
ＷＴ１126P1Fペプチド：Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu（配列番号３４）、
ＷＴ１126P2Lペプチド：Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu（配列番号３９）、
ＷＴ１126P3Mペプチド：Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu（配列番号４６）、又は
ＷＴ１126P9Vペプチド：Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val（配列番号４９）
である上記（１）に記載の組成物。
（４）さらに、アジュバントを含有する上記（１）〜（３）のいずれか一項に記載の組成物。
（５）癌抑制遺伝子ＷＴ１の遺伝子産物であるタンパク質又はその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有することを特徴とするヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）−Ａ＊０２０６陽性者用癌ワクチン組成物。
（６）癌抑制遺伝子ＷＴ１の遺伝子産物であるタンパク質又はその部分ペプチドをコードするＲＮＡを含有することを特徴とするヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）−Ａ＊０２０６陽性者用癌ワクチン組成物。
（７）ヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）−Ａ＊０２０６陽性者由来の末梢血単核球を、癌抑制遺伝子ＷＴ１の遺伝子産物であるタンパク質又はその部分ペプチドの存在下で培養し、該末梢単核球からＷＴ１特異的ＣＴＬｓを誘導する工程を含むことを特徴とする、ＷＴ１特異的ＣＴＬｓの誘導方法。
（８）ヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）−Ａ＊０２０６陽性者由来の未熟樹状細胞を、癌抑制遺伝子ＷＴ１の遺伝子産物であるタンパク質又はその部分ペプチドの存在下で培養し、該未熟樹状細胞から該タンパク質又はその部分ペプチドを提示する樹状細胞を誘導する工程を含むことを特徴とする、癌抑制遺伝子ＷＴ１の遺伝子産物であるタンパク質又はその部分ペプチドを提示する樹状細胞の誘導方法。
（９）ヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）−Ａ＊０２０６陽性者由来の試料中の癌抑制遺伝子ＷＴ１の遺伝子産物であるタンパク質若しくはその部分ペプチド、これに対する抗体又はＷＴ１特異的ＣＴＬｓを検出又は定量する工程及び次いで該タンパク質若しくはその部分ペプチド、これに対する抗体又はＷＴ１特異的ＣＴＬｓ量を、癌を発症していない場合と比較する工程、又は上記（７）に記載の方法により誘導されるＷＴ１特異的ＣＴＬｓ又は上記（８）に記載の方法により誘導される樹状細胞をＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性対象に投与する工程及び次いで該ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性対象における該ＣＴＬｓ又は樹状細胞の位置又は部位を決定する工程を含むことを特徴とする、ヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）−Ａ＊０２０６陽性者用の癌の診断方法。
（１０）以下のペプチドを含有することを特徴とするヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）−Ａ＊０２０１陽性者用癌ワクチン組成物。
癌抑制遺伝子ＷＴ１の遺伝子産物であるタンパク質の部分ペプチドであるＷＴ１187ペプチド：Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val（配列番号２）又はＷＴ１126ペプチド：Arg Met Phe Pro Asn Ala  Pro Tyr Leu（配列番号３）の改変ペプチドであり、かつＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者に対して免疫原性を有するペプチド【００１４】
（１１）ペプチドが、
ＷＴ１187P1Fペプチド：Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val（配列番号１１）、
ＷＴ１187P2Mペプチド：Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val（配列番号１６）、
ＷＴ１187P3Mペプチド：Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val（配列番号２０）、
ＷＴ１126P1Fペプチド：Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu（配列番号３４）、
ＷＴ１126P2Lペプチド：Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu（配列番号３９）、
ＷＴ１126P3Mペプチド：Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu（配列番号４６）、又は
ＷＴ１126P9Vペプチド：Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val（配列番号４９）
である上記（１０）に記載の組成物。
（１２）癌抑制遺伝子ＷＴ１の遺伝子産物であるタンパク質又はその部分ペプチドを含有する組成物を、ヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）−Ａ＊０２０６陽性者に投与する、癌の治療又は予防方法。
（１３）ヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）−Ａ＊０２０６陽性者の癌の治療又は予防のための、癌抑制遺伝子ＷＴ１の遺伝子産物であるタンパク質又はその部分ペプチド。【００１５】
（１４）以下のペプチドを含有する組成物を、ヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）−Ａ＊０２０１陽性者に投与する、癌の治療又は予防方法。
癌抑制遺伝子ＷＴ１の遺伝子産物であるタンパク質の部分ペプチドであるＷＴ１187ペプチド：Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val（配列番号２）又はＷＴ１126ペプチド：Arg Met Phe Pro Asn Ala  Pro Tyr Leu（配列番号３）の改変ペプチドであり、かつＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者に対して免疫原性を有するペプチド
（１５）ヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）−Ａ＊０２０１陽性者の癌の治療又は予防のための、以下のペプチド。
癌抑制遺伝子ＷＴ１の遺伝子産物であるタンパク質の部分ペプチドであるＷＴ１187ペプチド：Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val（配列番号２）又はＷＴ１126ペプチド：Arg Met Phe Pro Asn Ala  Pro Tyr Leu（配列番号３）の改変ペプチドであり、かつＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者に対して免疫原性を有するペプチド【００１６】
（１６）癌抑制遺伝子ＷＴ１の遺伝子産物であるタンパク質又はその部分ペプチドをコードするＲＮＡをヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）−Ａ＊０２０６陽性者の樹状細胞に導入する、癌の治療又は予防方法。
（１７）ヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）−Ａ＊０２０６陽性者の癌の治療又は予防のための、癌抑制遺伝子ＷＴ１の遺伝子産物であるタンパク質又はその部分ペプチドをコードするＲＮＡ。【００１７】
本発明はまた、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者の癌の治療又は予防のための癌ワクチン組成物を製造するための、癌抑制遺伝子ＷＴ１の遺伝子産物であるタンパク質又はその部分ペプチドの使用に関する。
本発明はまた、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者の癌の治療又は予防のための癌ワクチン組成物を製造するための、以下のペプチドの使用に関する。
癌抑制遺伝子ＷＴ１の遺伝子産物であるタンパク質の部分ペプチドであるＷＴ１187ペプチド：Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val（配列番号２）又はＷＴ１126ペプチド：Arg Met Phe Pro Asn Ala  Pro Tyr Leu（配列番号３）の改変ペプチドであり、かつＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者に対して免疫原性を有するペプチド。【００１８】
なお本発明において、「癌ワクチン組成物」とは、ヒトを含む動物に接種又は投与して、癌の予防又は治療のために用いる医薬を意味する。「治療」とは、病態を完全に治癒させることの他、完全に治癒しなくても症状の進展及び／又は悪化を抑制し、病態の進行をとどめること、又は病態の一部若しくは全部を改善して治癒の方向へ導くことを、「予防」とは病態の発症を防ぐこと、抑制すること又は遅延させることを、それぞれ意味するものとする。
また例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者又はＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者由来の末梢血単核球、未熟樹状細胞、ＷＴ１特異的ＣＴＬｓ及び試料等とは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者又はＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者から分離又は採取された末梢血単核球、未熟樹状細胞、ＷＴ１特異的ＣＴＬｓ及び血液等の生体試料等をそれぞれ意味する。また、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者又はＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者由来のＷＴ１特異的ＣＴＬｓには、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者又はＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者から分離又は採取された末梢血単核球、未熟樹状細胞、又は血液等の生体試料から誘導されたＣＴＬｓも含まれる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性対象におけるインビボ及びインビトロでのＷＴ１特異的ＣＴＬｓの誘導が可能となる。従来、ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドを含むワクチンを用いる免疫療法の適用は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性患者及びＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性患者に限定されていたが、本発明により、対象をＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性患者にまで広げることが可能になった。ＨＬＡ−Ａ２は、白色人種で最も頻度の高いＨＬＡクラスＩの血清型（約５０％）であり、その大多数は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１であるが、白色人種の約４％はＨＬＡ−Ａ＊０２０６を持つ。また、日本人においては、ＨＬＡ−Ａ２４（その大多数はＨＬＡ−Ａ＊２４０２である）は最も頻度の高い血清型（約５８％)であり、ＨＬＡ−Ａ２は日本人で約４２％を示す。しかし、ＨＬＡ−Ａ２を持つ日本人の約４３％のみがＨＬＡ−Ａ＊０２０１を持ち、その残りはＨＬＡ−Ａ＊０２０６又はＨＬＡ−Ａ＊０２０７を持つ。換言すると、日本人の約１８％はＨＬＡ−Ａ＊０２０１を持ち、日本人の約１７％はＨＬＡ−Ａ＊０２０６を持つ。そのため、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性拘束性ＣＴＬエピトープと同様に、少なくとも日本人でＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性拘束性ＣＴＬエピトープをみつけたことは、癌免疫療法の適用をＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者に広げることができるので非常に有用である。さらに、この対立遺伝子（アレル）は、中国人の１４％、韓国人の９％に見られるので、本発明の癌ワクチン組成物の適用をさらに広げることが可能となる。【００２０】
本発明の癌ワクチン組成物は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者におけるＷＴ１を発現する癌、例えば、造血器腫瘍、固形癌などの治療に有用である。また、本発明の癌ワクチン組成物は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者の癌発病予防に対して有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性健常供血者のＰＢＭＣｓからのＷＴ１187ペプチド特異的ＣＴＬｓの細胞傷害活性を示す図である。ａは、51ＣｒでラベルされたＢ−ＬＣＬｓに対する細胞傷害活性を示す図である。ｂは、ＰＢＭＣｓにパルスするＷＴ１187ペプチドの濃度に平行して、51Ｃｒでラベルされた自家Ｂ−ＬＣＬｓに対する細胞傷害活性が増加することを示す図である。
【図２】ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性健常供血者のＰＢＭＣｓからのＷＴ１187ペプチド特異的ＣＴＬｓの細胞傷害活性を示す図である。ａ及びｂは、図１ａに示されている供血者以外の二人の異なる健常供血者から得たＣＴＬｓの51ＣｒでラベルされたＢ−ＬＣＬｓに対する細胞傷害活性を示す図である。
【図３】ａは、ＷＴ１遺伝子で形質転換したＢ−ＬＣＬｓ又は空のベクターで形質転換したＢ−ＬＣＬｓに対するＷＴ１187ペプチド特異的ＣＴＬｓの細胞傷害活性を示す図である。ｂは、０２０６Ｋ５６２細胞、Ｋ５６２細胞、ＫＨ８８細胞及びＪＹ細胞に対するＷＴ1187ペプチド特異的ＣＴＬｓの細胞傷害活性を示す図である。
【図４】ＨＬＡクラスＩ抗体及びＨＬＡクラスＩＩ抗体によるＷＴ１187ペプチド特異的ＣＴＬｓの細胞傷害活性の抑制を示した図である。
【図５】ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性健常供血者のＰＢＭＣｓからのＷＴ１126ペプチド特異的ＣＴＬｓの、51ＣｒでラベルされたＢ−ＬＣＬｓに対する細胞傷害活性を示す図である。
【図６】ａ及びｂは、０２０６Ｋ５６２細胞、Ｋ５６２細胞、ＫＨ８８細胞及びＪＹ細胞に対する別々のドナーから誘導されたＷＴ1126ペプチド特異的ＣＴＬｓの細胞傷害活性を示す図である。
【図７】ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性のドナー１のＰＢＭＣｓを改変ペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓをＷＴ１126ペプチドのテトラマー及び抗ＣＤ８抗体で染色してフローサイトメーターで解析した結果を示す図である。
【図８】ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性のドナー１のＰＢＭＣｓをＷＴ１126P1Fペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓの細胞傷害活性を測定した結果を示す図である。
【図９】ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性のドナー１のＰＢＭＣｓをＷＴ１126P2Lペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓの細胞傷害活性を測定した結果を示す図である。
【図１０】ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性のドナー２のＰＢＭＣｓをＷＴ１126P2Ｌペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓをＷＴ１126ペプチドのテトラマー及び抗ＣＤ８抗体で染色してフローサイトメーターで解析した結果を示す図である。
【図１１】ドナー２のＰＢＭＣｓをＷＴ１126P2Lペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓの細胞傷害活性を測定した結果を示す図である。
【図１２】ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性のドナー３のＰＢＭＣｓをＷＴ１126改変ペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓの細胞傷害活性を測定した結果を示す図である。
【図１３】ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性のドナー３のＰＢＭＣｓをＷＴ１126P9Vペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓの細胞傷害活性を測定した結果を示す図である。
【図１４】ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性のドナー４のＰＢＭＣｓをＷＴ１126改変ペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓの細胞傷害活性を測定した結果を示す図である。
【図１５】ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性のドナー４のＰＢＭＣｓをＷＴ１126改変ペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓの細胞傷害活性を測定した結果を示す図である。
【図１６】ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性のドナーのＰＢＭＣｓをＷＴ１187改変ペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓの細胞傷害活性を測定した結果を示す図である。
【図１７】ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性のドナーのＰＢＭＣｓをＷＴ１187P1Fペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓの細胞傷害活性を測定した結果を示す図である。
【図１８】ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性のドナーのＰＢＭＣｓをＷＴ１187P2Mペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓの細胞傷害活性を測定した結果を示す図である。
【図１９】ＷＴ１187ペプチドの改変ペプチドの特異的細胞免疫誘導活性の評価結果を示す図である。
【図２０】ＷＴ１187ペプチドの改変ペプチドの特異的細胞免疫誘導活性の評価結果を示す図である。
【図２１】ＷＴ１187ペプチドの改変ペプチドの特異的細胞免疫誘導活性の評価結果を示す図である。
【図２２】ＷＴ１187ペプチドの改変ペプチドの特異的細胞免疫誘導活性の評価結果を示す図である。
【図２３】ＷＴ１126ペプチドの改変ペプチドの特異的細胞免疫誘導活性の評価結果を示す図である。
【図２４】ＷＴ１126ペプチドの改変ペプチドの特異的細胞免疫誘導活性の評価結果を示す図である。
【図２５】ＷＴ１126ペプチドの改変ペプチドの特異的細胞免疫誘導活性の評価結果を示す図である。
【図２６】ＷＴ１126ペプチドの改変ペプチドの特異的細胞免疫誘導活性の評価結果を示す図である。
【図２７】ＷＴ１126ペプチドの改変ペプチドの特異的細胞免疫誘導活性の評価結果を示す図である。
【図２８】ＷＴ１187ペプチドの改変ペプチドの特異的細胞免疫誘導活性の評価結果を示す図である。
【図２９】ＷＴ１187ペプチドの改変ペプチドの特異的細胞免疫誘導活性の評価結果を示す図である。
【図３０】ＷＴ１126ペプチドの改変ペプチドの特異的細胞免疫誘導活性の評価結果を示す図である。
【図３１】ＷＴ１126ペプチドの改変ペプチドの特異的細胞免疫誘導活性の評価結果を示す図である。
【図３２】ＷＴ１126ペプチドの改変ペプチドの特異的細胞免疫誘導活性の評価結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明を説明する。
本明細書及び図面において、アミノ酸残基を略号で表示する場合、次の略号で記述する。
Ala又はＡ：アラニン残基
Arg又はＲ：アルギニン残基
Asn又はＮ：アスパラギン残基
Asp又はＤ：アスパラギン酸残基
Cys又はＣ：システイン残基
Gln又はＱ：グルタミン残基
Glu又はＥ：グルタミン酸残基
Gly又はＧ：グリシン残基
His又はＨ：ヒスチジン残基
Ile又はＩ：イソロイシン残基
Leu又はＬ：ロイシン残基
Lys又はＫ：リジン残基
Met又はＭ：メチオニン残基
Phe又はＦ：フェニルアラニン残基
Pro又はＰ：プロリン残基
Ser又はＳ：セリン残基
Thr又はＴ：トレオニン残基
Trp又はＷ：トリプトファン残基
Tyr又はＹ：チロシン残基
Val又はＶ：バリン残基【００２３】
本発明におけるＷＴ１タンパク質としては、ウイルムス腫瘍の原因遺伝子として単離されたジンク・フィンガー型の転写因子の遺伝子産物で、かつＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子に結合して悪性腫瘍の標的抗原となり得るものが挙げられる。本発明におけるＷＴ１タンパク質としては、具体的には、４４９個のアミノ酸からなるヒトＷＴ１タンパク質（配列表：配列番号１）、又は、このアミノ酸配列において、１若しくは数個（好ましくは、約２〜６個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者に対して免疫原性を有するタンパク質が好ましく挙げられる。挿入されるアミノ酸又は置換されるアミノ酸は、遺伝子によりコードされる２０種類のアミノ酸以外の非天然アミノ酸であってもよい。【００２４】
ＷＴ１タンパク質の部分ペプチド（ＷＴ１ペプチド）とは、ＷＴ１タンパク質を構成するアミノ酸配列の一部からなるペプチドをいう。ＷＴ１ペプチドとしては、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子に結合して細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するＷＴ１タンパク質由来の８〜１２個のアミノ酸からなるペプチドが挙げられ、好ましくは８〜９個のアミノ酸からなるペプチドが挙げられる。また、特に好ましくは、国際公開第ＷＯ００／０６６０２号パンフレットに記載のＷＴ１187ペプチド（Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val；配列番号２）又はＷＴ１126ペプチド：Arg Met Phe Pro Asn Ala  Pro Tyr Leu（配列番号３）である。【００２５】
また、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者に対して免疫原性を有するペプチドであれば、ＷＴ１ペプチドにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された改変ペプチドも本発明におけるＷＴ１ペプチドとして用いることができる。このような改変ペプチドとしては、ＷＴ１187ペプチドの改変ペプチド及びＷＴ１126ペプチドの改変ペプチドが挙げられる。【００２６】
ＷＴ１187ペプチドの改変ペプチドとしては、Ｎ末端から４〜８番目のアミノ酸残基がＷＴ１187ペプチドのＮ末端から４〜８番目のアミノ酸残基（ＥＱＱＹＳ）と同じであるペプチドが好適であり、Ｎ末端から４〜９番目のアミノ酸残基がＷＴ１187ペプチドのＮ末端から４〜９番目のアミノ酸残基（ＥＱＱＹＳＶ）と同じであるペプチドがより好適である。このようなＷＴ１187ペプチドの改変ペプチドとしては、以下の配列番号４〜２６及び５４〜６２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。【００２７】
ＷＴ１187P1Gペプチド（ＧＬＧＥＱＱＹＳＶ；配列番号４）
ＷＴ１187P1Aペプチド（ＡＬＧＥＱＱＹＳＶ；配列番号５）
ＷＴ１187P1Vペプチド（ＶＬＧＥＱＱＹＳＶ；配列番号６）
ＷＴ１187P1Lペプチド（ＬＬＧＥＱＱＹＳＶ；配列番号７）
ＷＴ１187P1Iペプチド（ＩＬＧＥＱＱＹＳＶ；配列番号８）
ＷＴ１187P1Mペプチド（ＭＬＧＥＱＱＹＳＶ；配列番号９）
ＷＴ１187P1Wペプチド（ＷＬＧＥＱＱＹＳＶ；配列番号１０）
ＷＴ１187P1Fペプチド（ＦＬＧＥＱＱＹＳＶ；配列番号１１）
ＷＴ１187P1Yペプチド（ＹＬＧＥＱＱＹＳＶ；配列番号１２）
ＷＴ１187P2Vペプチド（ＳＶＧＥＱＱＹＳＶ；配列番号１３）
ＷＴ１187P2Qペプチド（ＳＱＧＥＱＱＹＳＶ；配列番号１４）
ＷＴ１187P2Iペプチド（ＳＩＧＥＱＱＹＳＶ；配列番号１５）
ＷＴ１187P2Mペプチド（ＳＭＧＥＱＱＹＳＶ；配列番号１６）
ＷＴ１187P3Lペプチド（ＳＬＬＥＱＱＹＳＶ；配列番号１７）
ＷＴ１187P3Aペプチド（ＳＬＡＥＱＱＹＳＶ；配列番号１８）
ＷＴ１187P3Vペプチド（ＳＬＶＥＱＱＹＳＶ；配列番号１９）
ＷＴ１187P3Mペプチド（ＳＬＭＥＱＱＹＳＶ；配列番号２０）
ＷＴ１187P3Pペプチド（ＳＬＰＥＱＱＹＳＶ；配列番号２１）
ＷＴ１187P3Wペプチド（ＳＬＷＥＱＱＹＳＶ；配列番号２２）
ＷＴ１187P3Fペプチド（ＳＬＦＥＱＱＹＳＶ；配列番号２３）
ＷＴ１187P3Yペプチド（ＳＬＹＥＱＱＹＳＶ；配列番号２４）
ＷＴ１187P3Sペプチド（ＳＬＳＥＱＱＹＳＶ；配列番号２５）
ＷＴ１187P3Iペプチド（ＳＬＩＥＱＱＹＳＶ；配列番号２６）
ＷＴ１187P9Lペプチド（ＳＬＧＥＱＱＹＳＬ；配列番号５３）【００２８】
ＷＴ１187P1Dペプチド（ＤＬＧＥＱＱＹＳＶ；配列番号５４）
ＷＴ１187P1Eペプチド（ＥＬＧＥＱＱＹＳＶ；配列番号５５）
ＷＴ１187P1Hペプチド（ＨＬＧＥＱＱＹＳＶ；配列番号５６）
ＷＴ１187P1Kペプチド（ＫＬＧＥＱＱＹＳＶ；配列番号５７）
ＷＴ１187P1Nペプチド（ＮＬＧＥＱＱＹＳＶ；配列番号５８）
ＷＴ１187P1Pペプチド（ＰＬＧＥＱＱＹＳＶ；配列番号５９）
ＷＴ１187P1Qペプチド（ＱＬＧＥＱＱＹＳＶ；配列番号６０）
ＷＴ１187P1Rペプチド（ＲＬＧＥＱＱＹＳＶ；配列番号６１）
ＷＴ１187P1Tペプチド（ＴＬＧＥＱＱＹＳＶ；配列番号６２）【００２９】
ＷＴ１126ペプチドの改変ペプチドとしては、Ｎ末端から４〜８番目のアミノ酸残基がＷＴ１126ペプチドのＮ末端から４〜８番目のアミノ酸残基（ＰＮＡＰＹ）と同じであるペプチドが好適である。このようなＷＴ１126ペプチドの改変ペプチドとしては、以下の配列番号２７〜５２及び６３〜７５のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。【００３０】
ＷＴ１126P1Gペプチド（ＧＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号２７）
ＷＴ１126P1Aペプチド（ＡＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号２８）
ＷＴ１126P1Vペプチド（ＶＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号２９）
ＷＴ１126P1Lペプチド（ＬＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号３０）
ＷＴ１126P1Iペプチド（ＩＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号３１）
ＷＴ１126P1Mペプチド（ＭＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号３２）
ＷＴ１126P1Wペプチド（ＷＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号３３）
ＷＴ１126P1Fペプチド（ＦＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号３４）
ＷＴ１126P1Yペプチド（ＹＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号３５）
ＷＴ１126P2Vペプチド（ＲＶＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号３６）
ＷＴ１126P2Qペプチド（ＲＱＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号３７）
ＷＴ１126P2Aペプチド（ＲＡＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号３８）
ＷＴ１126P2Lペプチド（ＲＬＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号３９）
ＷＴ１126P2Iペプチド（ＲＩＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号４０）
ＷＴ１126P3Iペプチド（ＲＭＩＰＮＡＰＹＬ；配列番号４１）
ＷＴ１126P3Lペプチド（ＲＭＬＰＮＡＰＹＬ；配列番号４２）
ＷＴ１126P3Gペプチド（ＲＭＧＰＮＡＰＹＬ；配列番号４３）
ＷＴ１126P3Aペプチド（ＲＭＡＰＮＡＰＹＬ；配列番号４４）
ＷＴ１126P3Vペプチド（ＲＭＶＰＮＡＰＹＬ；配列番号４５）
ＷＴ１126P3Mペプチド（ＲＭＭＰＮＡＰＹＬ；配列番号４６）
ＷＴ１126P3Pペプチド（ＲＭＰＰＮＡＰＹＬ；配列番号４７）
ＷＴ１126P3Wペプチド（ＲＭＷＰＮＡＰＹＬ；配列番号４８）
ＷＴ１126P9Vペプチド（ＲＭＦＰＮＡＰＹＶ；配列番号４９）
ＷＴ１126P9Aペプチド（ＲＭＦＰＮＡＰＹＡ；配列番号５０）
ＷＴ１126P9Iペプチド（ＲＭＦＰＮＡＰＹＩ；配列番号５１）
ＷＴ１126P9Mペプチド（ＲＭＦＰＮＡＰＹＭ；配列番号５２）【００３１】
ＷＴ１126P1Dペプチド（ＤＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号６３）
ＷＴ１126P1Eペプチド（ＥＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号６４）
ＷＴ１126P1Hペプチド（ＨＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号６５）
ＷＴ１126P1Kペプチド（ＫＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号６６）
ＷＴ１126P1Nペプチド（ＮＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号６７）
ＷＴ１126P1Pペプチド（ＰＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号６８）
ＷＴ１126P1Qペプチド（ＱＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号６９）
ＷＴ１126P1Sペプチド（ＳＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号７０）
ＷＴ１126P1Tペプチド（ＴＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号７１）
ＷＴ１126P2I&P9Iペプチド（ＲＩＦＰＮＡＰＹＩ；配列番号７２）
ＷＴ１126P2I&P9Vペプチド（ＲＩＦＰＮＡＰＹＶ；配列番号７３）
ＷＴ１126P2L&P9Iペプチド（ＲＬＦＰＮＡＰＹＩ；配列番号７４）
ＷＴ１126P2L&P9Vペプチド（ＲＬＦＰＮＡＰＹＶ；配列番号７５）【００３２】
中でも、ＷＴ１187ペプチドの改変ペプチドとしては、ＷＴ１187P1Fペプチド（配列番号１１）、ＷＴ１187P2Mペプチド（配列番号１６）又はＷＴ１187P3Mペプチド（配列番号２０）が好ましく、ＷＴ１187P1Fペプチド又はＷＴ１187P2Mペプチドがより好ましく、ＷＴ１187P2Mペプチドがさらに好ましい。ＷＴ１126ペプチドの改変ペプチドとしては、ＷＴ１126P1Fペプチド（配列番号３４）、ＷＴ１126P2Lペプチド（配列番号３９）、ＷＴ１126P3Mペプチド（配列番号４６）又はＷＴ１126P9Vペプチド（配列番号４９）が好ましく、ＷＴ１126P2Lペプチド、ＷＴ１126P3Mペプチド又はＷＴ１126P9Vペプチドがより好ましく、ＷＴ１126P9Vペプチドがさらに好ましい。【００３３】
本発明の癌ワクチン組成物におけるＷＴ１ペプチドとしては、ＷＴ１187ペプチド、ＷＴ１126ペプチド、ＷＴ１187P1Fペプチド、ＷＴ１187P2Mペプチド、ＷＴ１187P3Mペプチド、ＷＴ１126P1Fペプチド、ＷＴ１126P2Lペプチド、ＷＴ１126P3Mペプチド又はＷＴ１126P9Vペプチドが好ましい。より好ましくは、ＷＴ１187ペプチド、ＷＴ１126ペプチド、ＷＴ１187P1Fペプチド、ＷＴ１187P2Mペプチド、ＷＴ１126P2Lペプチド、ＷＴ１126P3Mペプチド又はＷＴ１126P9Vペプチドであり、さらに好ましくはＷＴ１187ペプチド、ＷＴ１126ペプチド、ＷＴ１187P2Mペプチド又はＷＴ１126P9Vペプチドであり、特に好ましくは、ＷＴ１187ペプチド又はＷＴ１126ペプチドである。【００３４】
また、ＷＴ１ペプチドとして、ＷＴ１ペプチドの誘導体も用いることができる。例えば、ＷＴ１187ペプチド及びＷＴ１126ペプチドの誘導体としては、上記９個の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、種々の物質を結合させたものなどが挙げられる。例えば、アミノ酸、ペプチド、それらのアナログ等を結合させてもよい。ＷＴ１187ペプチド又はＷＴ１126ペプチド、又はその改変ペプチドにこのような物質が結合している場合、これらの物質が、例えば、生体内酵素などにより、あるいは細胞内プロセッシングなどの過程により処理され、最終的に上記９個のアミノ酸からなるペプチドを生じ、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子との複合体として細胞表面に提示されることにより、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６を持つ患者においてＷＴ１特異的ＣＴＬ反応を引き出すことができる。【００３５】
ＷＴ１ペプチドは、当該技術分野において通常用いられる方法によって製造され得る。例えば、Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966 ; The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976;  ペプチド合成、丸善（株）、１９７５；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）１９８５；医薬品の開発  続  第１４巻・ペプチド合成、広川書店、１９９１などに記載されているペプチド合成方法によって合成することができる。【００３６】
ＷＴ１ペプチド及び改変ペプチドのスクリーニング方法としては、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６を持つ何人かの患者のＰＢＭＣｓ（末梢血単核球）を用いて、１回のペプチドのみの刺激でＩＦＮγアッセイを行い、反応がよいペプチドを選択する方法が、簡便であるため好ましい。【００３７】
本発明においては、上記のＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者に対して免疫原性を有するＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドをコードするＤＮＡなどのポリヌクレオチドも癌ワクチン組成物の有効成分として使用することができる。すなわち、ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチドを、適切なベクター、好ましくは発現ベクターに挿入した後、ヒトを含む動物に投与することにより、生体内で癌免疫を生じさせることができる。ポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが挙げられ、ＤＮＡ又はＲＮＡが好ましい。ポリヌクレオチドの塩基配列は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者に対して免疫原性を有するＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドのアミノ酸配列に基づき決定することができる。該ポリヌクレオチドは、例えば、公知のＤＮＡ又はＲＮＡ合成法、ＰＣＲ法などにより製造することができる。このような、ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドをコードするＤＮＡを含有するＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者用癌ワクチン組成物も、本発明の１つである。ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドとしては、ＷＴ１ペプチドが好ましく、ＷＴ１187ペプチド若しくはＷＴ１126ペプチド又はその改変ペプチドがより好ましく、ＷＴ１187ペプチド又はＷＴ１126ペプチドが最も好ましい。上記ＤＮＡが挿入される発現ベクターとしては、特に限定されない。なお、ＲＮＡは、ベクターに挿入せずに、そのまま組成物の有効成分として使用できる。【００３８】
本発明の癌ワクチン組成物は、アジュバントを含有することができる。アジュバントとしては、抗原となるＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドを投与する場合、これらと一緒に、又はＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドとは別に投与して、その抗原に対する免疫応答を非特異的に高める物質であれば限定されない。アジュバントとしては、例えば、沈降性アジュバント又は油性アジュバントが挙げられる。沈降性アジュバントとしては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム、リン酸アルミニウム、ミョウバン、ペペス又はカルボキシビニルポリマーなどが挙げられる。油性アジュバントは油が抗原水溶液を包んでミセルをつくることができるものが好ましく、例えば具体的には、流動パラフィン、ラノリン、フロイント、モンタナイド  ＩＳＡ７６３ＡＶＧ、モンタナイド  ＩＳＡ５１、不完全フロイントアジュバント又は完全フロイントアジュバントなどが挙げられる。アジュバントは２種以上を混合して用いることもできる。好ましくは、油性アジュバントである。
本発明の癌ワクチン組成物におけるアジュバントの配合量は、抗原に対する免疫応答を非特異的に高める量であれば特に限定されず、アジュバントの種類等により適宜選択すればよい。【００３９】
本発明の癌ワクチン組成物は、経口投与、又は非経口投与、例えば腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与、鼻腔内投与などにより投与することができる。また、非経口投与としては、ワクチン組成物を皮膚に塗布したり、貼付剤にワクチン組成物を含有させて皮膚に貼付したりすることにより、有効成分であるＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドを経皮吸収させる投与方法も挙げられる。さらに、本発明のワクチン組成物は、吸引等により投与することもできる。好ましくは、非経口投与により投与する。より好ましくは、皮内投与、又は皮下投与により投与する。皮内投与、皮下投与する体の部位は、例えば、上腕等が好ましい。【００４０】
本発明の癌ワクチン組成物は、投与経路に応じて、種々の製剤形態、例えば、固形製剤、液状製剤等をとりうる。例えば、経口投与のための内服用固形剤若しくは内服用液剤、又は非経口投与のための注射剤等とすることができる。【００４１】
経口投与のための内服用固形剤としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等が挙げられる。
内服用固形剤においては、ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドはそのままか、添加剤と混合又は造粒（例えば、攪拌造粒法、流動層造粒法、乾式造粒法、転動攪拌流動層造粒法等）され、常法に従って製造される。例えば、カプセル剤であれば、カプセル充填等によって、錠剤であれば、打錠剤等によって製造することができる。添加剤は、１種又は２種以上を適宜配合してもよい。添加剤としては、例えば、ラクトース、マンニトール、グルコース、微結晶セルロース、トウモロコシデンプン等の賦形剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等の結合剤；トウモロコシデンプン等の分散剤；繊維素グリコール酸カルシウム等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；グルタミン酸、アスパラギン酸等の溶解補助剤；安定剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース等のセルロース類、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等の合成高分子類等の水溶性高分子；白糖、粉糖、ショ糖、果糖、ブドウ糖、乳糖、還元麦芽糖水アメ、粉末還元麦芽糖水アメ、ブドウ糖果糖液糖、果糖ブドウ糖液糖、ハチミツ、ソルビトール、マルチトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、アスパルテーム、サッカリン、サッカリンナトリウム等の甘味剤等が挙げられる。【００４２】
顆粒剤又は錠剤は、必要によりコーティング剤等で被覆されていてもよいし、また該コーティングは２以上の層であってもよい。コーティング剤としては、例えば、白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等が挙げられる。カプセル剤として製造する場合には、上記賦形剤を適宜選択し、プランルカスト水和物と均等に混和又は粒状、若しくは粒状としたものに適当なコーティング剤で剤皮を施したものをカプセルに充填するか、適当なカプセル基剤（ゼラチン等）にグリセリン又はソルビトール等を加えて塑性を増したカプセル基剤で被包成形してもよい。これらカプセル基剤には必要に応じて、着色剤又は保存剤（二酸化イオウ；パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等のパラベン類）等を加えることができる。カプセル剤には、ハードカプセル又はソフトカプセルが含まれる。【００４３】
経口投与のための内服用液剤としては、水剤、懸濁剤・乳剤、シロップ剤、ドライシロップ剤等の用時溶解型製剤、エリキシル剤等が挙げられる。このような内服用液剤においては、ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドは、内服用液剤で一般的に用いられる希釈剤に溶解、懸濁又は乳化される。希釈剤としては、例えば、精製水、エタノール又はそれらの混液等が挙げられる。さらにこの液剤は、湿潤剤、懸濁化剤、乳化剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、保存剤又は緩衝剤等を含有していてもよい。また、ドライシロップ剤は、例えばプランルカスト水和物と、例えば、白糖、粉糖、ショ糖、果糖、ブドウ糖又は乳糖等とを混合等して製造することができる。また、ドライシロップ剤は、常法に従って顆粒としてもよい。【００４４】
非経口投与のための剤型としては、注射剤、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、貼付剤、噴霧剤、スプレー剤等が挙げられるが、注射剤が好ましい。例えば、ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドと慣用の担体と共に注射剤とされることが好ましい。
非経口投与のための注射剤としては、水性注射剤又は油性注射剤のいずれでもよい。水性注射剤とする場合、公知の方法に従って、例えば、水性溶媒（注射用水、精製水等）に、医薬上許容される添加剤を適宜添加した溶液に、ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドを混合した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。医薬上許容される添加剤としては、例えば、上述したアジュバント；塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等の等張化剤；リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等の緩衝剤；パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等の保存剤；ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等の増粘剤；亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等の安定化剤；塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等のｐＨ調整剤等が挙げられる。また注射剤には、適当な溶解補助剤、例えば、エタノール等のアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール；ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０、リソレシチン、プルロニックポリオール等の非イオン界面活性剤等をさらに配合してもよい。また、例えば、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等のタンパク質；アミノデキストラン等のポリサッカリド等を含有してもよい。油性注射剤とする場合、油性溶媒としては、例えば、ゴマ油又は大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル又はベンジルアルコール等を配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプル又はバイアル等に充填される。注射剤等の液状製剤は、凍結保存又は凍結乾燥等により水分を除去して保存することもできる。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。【００４５】
また、本発明の癌ワクチン組成物の他の形態として、リポソーム中へＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドを混合し、さらに必要に応じて、多糖及び／又は癌ワクチン組成物中に配合される他の成分を含有させることもできる。【００４６】
本発明の癌ワクチン組成物の投与量は、使用するＷＴ１タンパク質若しくはＷＴ１ペプチド、又はＤＮＡや、患者の年齢体重、対象疾患などによっても異なるが、例えば、ＷＴ１187ペプチド又はＷＴ１126ペプチド等のＷＴ１ペプチドを含むワクチン組成物の場合、ＷＴ１ペプチド量として、１日に体重あたり当り約０．１μｇ〜１ｍｇ／ｋｇが好ましい。また、ＷＴ１ペプチドの投与量は、通常０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、この量を数日〜数カ月に１回投与するのが好ましい。【００４７】
本発明の癌ワクチン組成物は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者用の癌ワクチン組成物である。ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者を選択するためのＨＬＡ型は、例えば供血者の末梢血から決定できる。ＨＬＡ型を決定する方法としては、ＳＢＴ（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｂａｓｅｄ  Ｔｙｐｉｎｇ）法又はＳＳＰ法などのＤＮＡタイピング法あるいはＨＬＡタイピング法など公知の方法が挙げられる。ＳＢＴ法はＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅し、増幅産物の塩基配列を既存アリルの塩基配列情報と照合して精密にＨＬＡ遺伝子型を判定し得る。ＳＳＰ法は、ＨＬＡアリルに特異的な多種のプライマーでＰＣＲ後、電気泳動を行い、陽性バンドを確認することによりＨＬＡ遺伝子型を判定し得る。【００４８】
本発明の癌ワクチン組成物をＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者に投与すると、該ワクチン組成物に含まれるＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性を有するＷＴ１タンパク質若しくはＷＴ１ペプチド、又は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡにより発現されるＷＴ１タンパク質若しくはＷＴ１ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者の抗原提示細胞（樹状細胞）の表面にあるＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子に結合する。これにより、特異的な抗腫瘍免疫、すなわちＷＴ１特異的ＣＴＬｓが誘導され、かかるＷＴ１特異的ＣＴＬｓにより対象（ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者）中の癌細胞が傷害される。このような抗腫瘍免疫は、例えばＷＴ１特異的ＣＴＬ反応、癌細胞に対する細胞傷害性試験（例えば、51Ｃｒ遊離細胞傷害性試験）などにより確認できる。例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＷＴ１特異的ＣＴＬ反応を引き出すことがすでに報告された９個のアミノ酸からなるＷＴ１タンパク質由来のＷＴ１187ペプチド及びＷＴ１126ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性反応を引き出させることができる。日本人の約１７％がＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性であり、その拘束性もＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性とほぼ同様の多さである。以下の実施例１〜５においては、ＷＴ１187ペプチド特異的ＣＴＬｓは、３人の異なるＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性供血者のＰＢＭＣｓから生成した。誘導されたＣＴＬｓは、ＷＴ１発現ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性白血病細胞に対して細胞傷害活性を示す。さらに、ＷＴ１187ペプチド特異的ＣＴＬ活性及びＷＴ１126ペプチド特異的ＣＴＬ活性は、抗ＨＬＡクラスＩ抗体により抑制され得るため、その活性はＨＬＡクラスＩ拘束性ＣＴＬｓによるものであることを確認できる。ＷＴ1１87ペプチド及び／又はＷＴ１126ペプチド、又はその改変ペプチドを含むＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１と同様に、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性癌患者のワクチンとなり得る。そのことから、造血器腫瘍、固形癌などの悪性腫瘍患者に対してのＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドをベースとする免疫療法は、その適用をＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性癌患者に広げることが可能となる。本発明の癌ワクチン組成物をＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者に投与するＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者の癌の治療及び／又は予防方法は、本発明の好ましい実施形態の１つである。【００４９】
本発明の癌ワクチン組成物は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者においてＷＴ１遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍；胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌などの固形癌の治療及び／又は予防のために使用することができる。【００５０】
さらに、本発明の癌ワクチン組成物の投与方法として、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性患者の末梢血からＰＢＭＣｓを集め、その中から樹状細胞を取り出し、本発明の癌ワクチン組成物に有効成分として含まれるペプチド、例えば、ＷＴ１187ペプチド又はＷＴ１126ペプチド、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ等のポリヌクレオチドをパルスして患者に皮下投与などで患者に戻す方法も挙げられる。樹状細胞にＷＴ１ペプチド等をパルスする際の条件としては、本発明の効果を奏する限り特に限定されず、通常の条件を採用することができる。【００５１】
ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドをコードするＲＮＡを癌ワクチン組成物に用いる場合には、該ＲＮＡがＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者の樹状細胞に導入されるように組成物を投与することが好ましい。ＲＮＡをＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者の樹状細胞に導入する方法としては、例えば、上述したようにＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者から樹状細胞を採取し、該樹状細胞に、電気パルスによりＲＮＡを導入する方法が挙げられる。樹状細胞に導入されたＲＮＡから発現するＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドは、該樹状細胞表面に提示されるため、ＲＮＡをパルスされた樹状細胞をＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者の体内に戻すことにより、生体内で速やかに癌免疫を生じさせることができる。このような、ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドをコードするＲＮＡをＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者の樹状細胞に導入する、癌の治療又は予防方法は、本発明の好ましい実施形態の１つである。【００５２】
本発明の別の態様は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者由来の末梢血単核球を、ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドの存在下で培養し、該末梢単核球からＷＴ１特異的ＣＴＬｓを誘導するＷＴ１特異的ＣＴＬｓの誘導方法に関する。末梢血単核球が由来する対象は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性であれば、特に限定されない。ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドとしては、ＷＴ１187ペプチド若しくはＷＴ１126ペプチド又はその改変ペプチドが挙げられ、ＷＴ１187ペプチド又はＷＴ１126ペプチドが好適である。例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者由来の末梢血単核球を、ＷＴ１187ペプチド（又はＷＴ１126ペプチド）の存在下で培養することにより、末梢血単核球中のＣＴＬｓ前駆細胞からＷＴ１特異的ＣＴＬｓが誘導される。ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者由来の末梢血単核球の培養条件は特に限定されず、通常の条件で培養することができる。このように得られたＣＴＬｓは、ＷＴ１187ペプチド（又はＷＴ１126ペプチド）とＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子との複合体を認識する。従って、本発明により誘導されるＷＴ１特異的ＣＴＬｓを用いると、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者においてＷＴ１高発現腫瘍細胞を特異的に傷害することができ、対象であるＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者の造血器腫瘍、固形癌を治療及び／又は予防することができる。ＷＴ１特異的ＣＴＬｓをＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性対象者に投与する方法としては特に限定されず、例えば、上述した癌ワクチン組成物と同様にして投与することができる。【００５３】
本発明の別の態様は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドを必須構成成分として含む、ＷＴ１特異的ＣＴＬｓを誘導するためのキットに関する。好ましくは、該キットは、上記ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者由来のＷＴ１特異的ＣＴＬｓの誘導方法に用いられる。このようなキットは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドの他に、例えば、末梢血単核球の取得手段、アジュバント、反応容器などを含んでいてもよい。このようなキットを用いると、ＷＴ１187ペプチド又はＷＴ１126ペプチド等の癌抗原とＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子との複合体を認識するＷＴ１特異的ＣＴＬｓを効率よく誘導することができる。【００５４】
本発明のさらに別の態様は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者由来の未熟樹状細胞を、ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドの存在下で培養し、該未熟樹状細胞から該ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドを提示する樹状細胞を誘導する、ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドを提示する樹状細胞の誘導方法に関する。ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドとしては、ＷＴ１187ペプチド若しくはＷＴ１126ペプチド又はその改変ペプチドが挙げられ、ＷＴ１187ペプチド又はＷＴ１126ペプチドが好適である。未熟樹状細胞が由来する対象は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性であれば、特に限定されない。未熟樹状細胞は、例えば、末梢血単核球などに含まれているため、かかる細胞をＷＴ１187ペプチド又はＷＴ１126ペプチドの存在下で培養してもよい。このように得られる樹状細胞をＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者に投与すると、上記ＷＴ１特異的ＣＴＬｓが効率よく誘導され、それにより対象の造血器腫瘍、固形癌を治療及び／又は予防することができる。樹状細胞をＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性対象者に投与する方法としては特に限定されず、例えば、上述した癌ワクチン組成物と同様にして投与することができる。【００５５】
本発明の別の態様は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドを必須構成成分として含む、ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドを提示する樹状細胞を誘導するためのキットに関する。好ましくは、該キットは、上記樹状細胞の誘導方法に用いられる。このようなキットは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドの他に、例えば、未熟樹状細胞や末梢血単核球の取得手段、アジュバント、反応容器などを含んでいてもよい。このようなキットを用いると、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子を介してＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドを提示する樹状細胞を効率よく誘導することができる。【００５６】
（１）ＷＴ１タンパク質若しくはＷＴ１ペプチド、上記の方法により誘導されるＷＴ１特異的ＣＴＬｓ、又は上記の方法により誘導される樹状細胞、又は、（２）ＷＴ１タンパク質若しくはＷＴ１ペプチド、上記の方法により誘導されるＷＴ１特異的ＣＴＬｓ、又は上記の方法により誘導される樹状細胞に対する抗体を用いることによって、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者の癌を診断することができる。このような癌の診断方法も、本発明の１つである。（１）においては、好ましくは、上述した誘導方法により誘導されるＷＴ１特異的ＣＴＬｓを用いて診断を行う。ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドとしては、ＷＴ１187ペプチド若しくはＷＴ１126ペプチド又はその改変ペプチドが挙げられ、ＷＴ１187ペプチド又はＷＴ１126ペプチドが好適である。【００５７】
本発明のＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者の癌の診断方法としては、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者由来の試料中のＷＴ１タンパク質若しくはＷＴ１ペプチド、これに対する抗体又はＷＴ１特異的ＣＴＬｓを検出又は定量する工程、及び次いで該タンパク質若しくはその部分ペプチド、これに対する抗体又はＷＴ１特異的ＣＴＬｓ量を、癌を発症していない場合と比較する工程を含む方法が挙げられる。
癌を発症した患者由来の試料（例えば、血液）中には、癌細胞から流出したＷＴ１ペプチド及び／又はＷＴ１タンパク質が含まれ、さらに癌抗原に対する免疫応答が高まっていることから、該ＷＴ１ペプチド又はＷＴ１タンパク質に対する抗体、ＷＴ１特異的ＣＴＬｓ等の量が増加している。このため、癌を発症していない場合と比較して該試料中のＷＴ１ペプチド若しくはＷＴ１タンパク質、これに対する抗体又はＷＴ１特異的ＣＴＬｓ量が増加している場合には、癌を発症している可能性がある。抗体量は、例えば、ＥＬＩＳＡ法で測定することができる。ＷＴ１特異的ＣＴＬｓは、以下に記載するＭＨＣテトラマー等ＷＴ１マルチマーを用いる方法により検出することができる。【００５８】
また例えば、上記ＣＴＬｓ、樹状細胞又は抗体をＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性対象由来の試料とインキュベーションするか、又はＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性対象に投与し、次に該ＣＴＬｓ、樹状細胞又は抗体の、例えば、位置、部位、量等を決定することで、癌の診断が可能となる。ＣＴＬｓ及び樹状細胞は癌細胞に集まる性質を有するため、ＣＴＬｓ又は樹状細胞を投与後に該ＣＴＬｓ又は樹状細胞の位置又は部位を調べることにより、癌を診断することが可能となる。上記方法により誘導されるＷＴ１特異的ＣＴＬｓ又は上記方法により誘導される樹状細胞をＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性対象に投与する工程及び次いで該ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性対象における該ＣＴＬｓ又は樹状細胞の位置又は部位を決定する工程を含むＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者の癌の診断方法も、本発明の１つである。
また、例えば、ＣＴＬｓ又は樹状細胞をＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性対象由来の試料とインキュベーションして反応させた後、次いで該ＣＴＬｓ又は樹状細胞に対する抗体を加えてさらにインキュベーションし、抗体に付した標識等によって該抗体と結合した癌細胞とＣＴＬｓとの複合体、該抗体と結合した樹状細胞等を検出又は定量することにより、癌の診断が可能となる。癌を発症していない場合と比較して癌細胞とＣＴＬｓとの複合体、該抗体と結合した樹状細胞が増加している場合には、癌を発症している可能性がある。上記ＣＴＬｓ、樹状細胞又は抗体は、標識されたものであってもよい。かかる標識を付すことで、診断を効率よく行うことができる。ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性対象由来の試料としては、尿、血液、組織抽出液、唾液、涙液、その他の体液等のＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性対象から採取した生体試料が挙げられ、血液が好ましい。【００５９】
上記ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドを用いるヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）−Ａ＊０２０６陽性者用の癌の診断方法としては、例えば、ＷＴ１ペプチドを抗原として用いるＭＨＣテトラマーアッセイ、ＭＨＣペンタマーアッセイ、ＭＨＣデキストラマーが挙げられる。例えば、ＷＴ１187ペプチド又はＷＴ１126ペプチドを抗原ペプチドとして用いるＭＨＣテトラマーアッセイ又はＭＨＣペンタマーアッセイにおいては、ＭＨＣ／ＷＴ１187ペプチド複合体又はＭＨＣ／ＷＴ１126ペプチド複合体をプローブとして、ヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）−Ａ＊０２０６陽性者におけるＷＴ１特異的ＣＴＬｓを検出することができる。癌を発症した患者においては、ＷＴ１特異的ＣＴＬｓの発現頻度が高まっていることから、ＷＴ１特異的ＣＴＬｓの発現頻度により、ヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）−Ａ＊０２０６陽性者の癌を診断することができる。また、癌を発症した患者においては、癌抗原に対する免疫応答が高まっていることから、ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドに対するヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）−Ａ＊０２０６陽性者の免疫応答を調べることによっても、癌を診断することができる。免疫応答を調べる方法としては、ＥＬＩＳＡでＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドに対する抗体を測定する方法が挙げられる。このような、癌抑制遺伝子ＷＴ１の遺伝子産物であるタンパク質又はその部分ペプチドを用いるヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）−Ａ＊０２０６陽性者用の癌の診断方法も、本発明の１つである。ＭＨＣテトラマーアッセイ、ＭＨＣペンタマーアッセイは、市販のキット、例えば、「ＷＴ１テトラマー」（医学生物学研究所）を用い、公知の方法により行うことができる。【００６０】
さらに、ＷＴ１タンパク質若しくはＷＴ１ペプチド、上記方法により誘導されるＷＴ１特異的ＣＴＬｓ、又は上記方法により誘導される樹状細胞に対する抗体をＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性対象由来の試料と反応させる工程、及び次いで該抗体とＷＴ１タンパク質若しくはＷＴ１ペプチド、ＷＴ１特異的ＣＴＬｓ又は樹状細胞との複合体を検出又は定量する工程を含む方法によっても、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性対象の癌の診断が可能である。癌を発症していない場合と比較して抗体とＷＴ１タンパク質若しくはＷＴ１ペプチド、ＷＴ１特異的ＣＴＬｓ又は樹状細胞との複合体が増加している場合には、癌を発症している可能性がある。
樹状細胞に対する抗体としては、ＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ＊０２０６複合体を認識する抗体が挙げらる。このような抗体は、ＷＴ１ペプチド及びＨＬＡ−Ａ＊０２０６を認識できるため、樹状細胞のＣｌａｓｓＩ上にＷＴ１ペプチドが提示されている場合に該樹状細胞を認識することができるものである。
また、ＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ＊０２０６／ＣＴＬｓのＴＣＲ（Ｔ細胞抗原受容体）複合体を認識する抗体も、樹状細胞に対する抗体として使用できる。このような抗体は、樹状細胞とＣＴＬｓとの複合体及び癌細胞とＣＴＬｓとの複合体を認識することができる抗体である。
ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性対象由来の試料とこのような抗体とをインキュベーションして反応させて複合体を形成させ、次いで抗体に付した蛍光等により該抗体と結合した癌細胞とＣＴＬｓとの複合体、該抗体と結合したＷＴ１ペプチドを提示する樹状細胞等を検出又は定量することにより、癌の診断が可能となる。癌を発症していない場合と比較して該抗体と結合した癌細胞とＣＴＬｓとの複合体、該抗体と結合したＷＴ１ペプチドを提示する樹状細胞等が増加している場合には、癌を発症している可能性がある。【００６１】
ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドを含有する組成物を、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者に投与する、癌の治療又は予防方法も、本発明の１つである。ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドを含有する組成物及びその好ましい態様は、上述した癌ワクチン組成物と同様である。【００６２】
ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者の癌の治療又は予防のための、ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチド；及び、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者の癌の治療又は予防のための癌ワクチン組成物を製造するための、ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチドの使用も、本発明の１つである。ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１ペプチド並びにその好ましい態様は、上述した癌ワクチン組成物におけるのと同様である。【００６３】
癌抑制遺伝子ＷＴ１の遺伝子産物であるタンパク質の部分ペプチドであるＷＴ１187ペプチド（配列番号２）又はＷＴ１126ペプチド（配列番号３）の改変ペプチドであり、かつＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者に対して免疫原性を有するペプチドを含有するＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者用癌ワクチン組成物も、本発明の１つである。【００６４】
ＷＴ１187ペプチドの改変ペプチド又はＷＴ１126ペプチドの改変ペプチドとしては、上述したＷＴ１187ペプチド又はＷＴ１126ペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチドが挙げられる。ＷＴ１187ペプチドの改変ペプチドとしては、Ｎ末端から４〜８番目のアミノ酸残基がＷＴ１187ペプチドのＮ末端から４〜８番目のアミノ酸残基と同じであるペプチドが好ましい。このような改変ペプチドとしては、上述した配列番号４〜１２、配列番号１５及び１６、配列番号１８〜２０、並びに配列番号２２〜２５のペプチドが好ましい。また、ＷＴ１187P9Lペプチド（ＳＬＧＥＱＱＹＳＬ；配列番号５３）も好ましい。ＷＴ１126ペプチドの改変ペプチドとしては、Ｎ末端から４〜８番目のアミノ酸残基がＷＴ１126ペプチドのＮ末端から４〜８番目のアミノ酸残基と同じであるペプチドが好ましく、例えば、上述した配列番号２７〜３７及び配列番号３９〜５２のペプチドが好ましい。【００６５】
また、本発明の別の好ましい態様においては、ＷＴ１187ペプチドの改変ペプチドとして、上述した配列番号４〜２６及び５３〜６２のペプチドを、ＷＴ１126ペプチドの改変ペプチドとして、配列番号２７〜５２及び６３〜７５のペプチドを、それぞれ用いることができる。配列番号４〜７５の改変ペプチドの中でも、ＷＴ１187P1Dペプチド、ＷＴ１187P1Eペプチド、ＷＴ１187P1Hペプチド、ＷＴ１187P1Pペプチド及びＷＴ１187P2Qペプチド、並びにＷＴ１126P1Dペプチド、ＷＴ１126P1Eペプチド、ＷＴ１126P1Pペプチド、ＷＴ１126P2Aペプチド及びＷＴ１126P2Qペプチドを除くペプチドが好ましい。【００６６】
中でも、ＷＴ１187ペプチドの改変ペプチドとしては、ＷＴ１187P1Fペプチド、ＷＴ１187P2Mペプチド又はＷＴ１187P3Mペプチドが好ましく、ＷＴ１187P1Fペプチド又はＷＴ１187P2Mペプチドがより好ましい。ＷＴ１126ペプチドの改変ペプチドとしては、ＷＴ１126P1Fペプチド、ＷＴ１126P2Lペプチド、ＷＴ１126P3Mペプチド又はＷＴ１126P9Vペプチドが好ましく、ＷＴ１126P1Fペプチド又はＷＴ１126P2Lペプチドがより好ましい。【００６７】
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者に対して免疫原性を有するＷＴ１187ペプチドの改変ペプチド又はＷＴ１126ペプチドの改変ペプチドの使用量としては、上述したＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者用癌ワクチン組成物におけるＷＴ１ペプチドと同様である。また、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者用癌ワクチン組成物のその他の成分及び好ましい態様については、上述したＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者用ワクチン組成物と同様である。【００６８】
上記ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者に対して免疫原性を有するＷＴ１187ペプチドの改変ペプチド又はＷＴ１126ペプチドの改変ペプチドをコードするＤＮＡ及びＲＮＡも、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者用癌ワクチン組成物の有効成分とすることができる。このようなＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者用癌ワクチン組成物も、本発明の１つである。
上記ＤＮＡ又はＲＮＡを含むＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者用癌ワクチン組成物のその他の成分及び癌ワクチン組成物の好ましい態様としては、上述したＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者用癌ワクチン組成物において用いられるものと同様である。【００６９】
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者由来の末梢血単核球を、上記ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者に対して免疫原性を有するＷＴ１187ペプチドの改変ペプチド又はＷＴ１126ペプチドの改変ペプチドの存在下で培養することにより、該末梢単核球からＷＴ１特異的ＣＴＬｓを誘導することができる。このようなＷＴ１特異的ＣＴＬｓの誘導方法も、本発明の１つである。
好ましいＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者に対して免疫原性を有するＷＴ１187ペプチドの改変ペプチド又はＷＴ１126ペプチドの改変ペプチドとしては、上述したＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者用癌ワクチン組成物において用いられるものと同様である。【００７０】
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者由来の未熟樹状細胞を、上記ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者に対して免疫原性を有するＷＴ１187ペプチドの改変ペプチド又はＷＴ１126ペプチドの改変ペプチドの存在下で培養することにより、該未熟樹状細胞から該改変ペプチドを提示する樹状細胞を誘導することができる。このような、ＷＴ１187ペプチドの改変ペプチド又はＷＴ１126ペプチドの改変ペプチドを提示する樹状細胞の誘導方法も本発明の１つである。好ましい改変ペプチドとしては、上述したＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者用癌ワクチン組成物において用いられるものと同様である。【００７１】
上記ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者に対して免疫原性を有するＷＴ１187ペプチドの改変ペプチド又はＷＴ１126ペプチドの改変ペプチド、これに対する抗体、該改変ペプチドにより誘導されるＷＴ１特異的ＣＴＬｓ、又は該改変ペプチドにより誘導される樹状細胞を用いると、ヒト白血球型抗原ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者の癌を診断することができる。このような、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者用の癌の診断方法も本発明の１つである。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者用の癌の診断方法及びその好ましい態様は、上述したＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者用の癌の診断方法及びその好ましい態様と同様である。
また、このようなＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者用の癌の診断方法としては、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者に対して免疫原性を有するＷＴ１187ペプチドの改変ペプチド又はＷＴ１126ペプチドの改変ペプチドを抗原として用いるＭＨＣテトラマーアッセイ、ＭＨＣペンタマーアッセイ、ＭＨＣデキストラマー等が挙げられる。好ましい改変ペプチドとしては、上述したＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者用癌ワクチン組成物において用いられるものと同様である。【００７２】
上記ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者に対して免疫原性を有するＷＴ１187ペプチドの改変ペプチド又はＷＴ１126ペプチドの改変ペプチド、該改変ペプチドにより誘導されるＷＴ１特異的ＣＴＬｓ、又は該改変ペプチドにより誘導される樹状細胞に対する抗体を用いると、ヒト白血球型抗原ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者の癌を診断することができる。このような、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者用の癌の診断方法も本発明の１つである。好ましい改変ペプチドとしては、上述したＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者用癌ワクチン組成物において用いられるものと同様である。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者用の癌の診断方法及びその好ましい態様は、上述したＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者用の癌の診断方法及びその好ましい態様と同様である。【００７３】
以下のペプチドを含有する癌ワクチン組成物を、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者に投与する癌の治療又は予防方法も、本発明の１つである。
癌抑制遺伝子ＷＴ１の遺伝子産物であるタンパク質の部分ペプチドであるＷＴ１187ペプチド（配列番号２）又はＷＴ１126ペプチド（配列番号３）の改変ペプチドであり、かつＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者に対して免疫原性を有するペプチド。
好ましい改変ペプチドとしては、上述したＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者用癌ワクチン組成物と同様である。また、癌ワクチン組成物及びその好ましい態様としては、上述したＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者用ワクチン組成物と同様である。【００７４】
本発明はまた、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者の癌の治療又は予防のための、以下のペプチド；及びＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者の癌の治療又は予防のための癌ワクチン組成物を製造するための、以下のペプチドの使用に関する。
癌抑制遺伝子ＷＴ１の遺伝子産物であるタンパク質の部分ペプチドであるＷＴ１187ペプチド（配列番号２）又はＷＴ１126ペプチド（配列番号３）の改変ペプチドであり、かつＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者に対して免疫原性を有するペプチド。
好ましい改変ペプチドとしては、上述したＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者用癌ワクチン組成物において用いられるものと同様である。また、癌ワクチン組成物及びその好ましい態様としては、上述したＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者用ワクチン組成物において用いられるものと同様である。
【実施例】
【００７５】
次に、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されない。なお、実施例において略語は以下の意味を示す。また合成ペプチドはＳＩＧＭＡ  ＧＥＮＯＳＹＳ  ＪＡＰＡＮから購入した。【００７６】
ＤＣｓ：樹状細胞
ＰＢＭＣｓ：末梢血単核球
ＣＤ：Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（白血球分化抗原）
ＧＭ−ＣＳＦ：顆粒球・単球コロニー刺激因子
ＩＬ：インターロイキン
ＴＮＦα：ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α（腫瘍壊死因子）
ＰＧＥ：プロスタグランジン
Ｇｙ：グレイ
Ｂ−ＬＣＬｓ：Ｂ−リンパ芽球様細胞株
ＥＢウイルス：エプスタイン・バー・ウイルス
tBu：ｔ−ブチル
Trt：トリフェニルメチル
Fmoc:９-フルオレニルメチルオキシカルボニル【００７７】
実施例１  （ＷＴ１ペプチドと結合するＨＬＡ分子の予測）
ＮｅｔＭＨＣ２．０サーバー予測プログラムを用いて、ＷＴ１187ペプチド（配列番号２）と結合できるＨＬＡ分子の予測を行った。
その結果、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１の拘束性を持つＷＴ１特異的ＣＴＬｓを引き出す能力のあるＷＴ１187ペプチドは、ＮｅｔＭＨＣ２．０サーバー予測プログラム（ＮｅｔＭＨＣ  ２．０  Ｓｅｒｖｅｒ−ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍ；http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC-2.0/)において、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子に対して高い結合親和性を示唆する位置にランク付けされた。【００７８】
実施例２（ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性健常供血者のＰＢＭＣｓからのＷＴ１187ペプチド特異的ＣＴＬｓの作製、及びそれを用いた細胞傷害性試験）
（１）ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性健常供血者のＰＢＭＣｓの分離とＤＣｓの作製
まず、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６健常供血者（３人）の末梢血から、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心法によってＰＢＭＣｓを分離した。次いで、抗ヒトＣＤ１４粒子−ＤＭ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｎｙ製）を用いて、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性健常供血者のＰＢＭＣｓからＣＤ１４陽性細胞を選択した。この場合、ＣＤ１４陽性細胞は、単球中に多いと考えられた。選択したＣＤ１４陽性細胞を、１ｖ／ｖ％ヒトＡＢ血清、８００ＩＵ/ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ  ＩＮＣ，Ｒｏｋｅｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）、及び１０００ＩＵ/ｍＬのＩＬ−４（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ  ＩＮＣ製）を含むＸ−ＶＩＶＯ１５培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で培養してＤＣｓが作製された。【００７９】
（２）自家成熟ＤＣｓの誘導
（１）で作製したＤＣｓを３７℃で１日培養した後、１０ｎｇ/ｍＬのＴＮＦα（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α；Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ  ＩＮＣ，Ｒｏｋｅｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）、１０ｎｇ/ｍＬのＩＬ−β、１０００ＩＵ/ｍＬのＩＬ−６及び１μｇ/ｍＬのＰＧＥ２を含む成熟サイトカインカクテルをＤＣｓ培養ウエルに添加した。３７℃で２４時間培養することにより、自家成熟ＤＣｓが得られた。【００８０】
（３）ＷＴ１187ペプチド特異的ＣＴＬｓの誘導
自家成熟ＤＣｓにＷＴ１187ペプチドをパルスした後、放射線照射（３０Ｇｙ）し、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性健常供血者から得たＣＤ８陽性Ｔ細胞濃縮ＰＢＭＣｓと共培養した。ＷＴ１187 ペプチドでのＤＣｓのパルスは、１０μｇ/ｍＬのＷＴ１187ペプチドと共に、ＤＣｓを３７℃で３０分間培養することにより行った。ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性健常供血者のＰＢＭＣｓからＣＤ８マイクロビーズ及びＭＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ製）を用いて濃縮された。
２回目の刺激から、ペプチドをパルスされた後放射線照射された自家ＰＢＭＣｓが、選択的刺激細胞として用いられた。２回目の刺激の２日後、組換えｒＩＬ−２（塩野義製薬株式会社から提供）とＩＬ−７（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ  ＩＮＣ製）とがそれぞれ１０ＩＵ/ｍＬと１０ｎｇ/ｍＬの濃度で、培養液に添加された。４回目の刺激後、３７℃で１０日間培養して得られた細胞（ＣＴＬｓ）を遠心機で遠心して回収した。この細胞（ＣＴＬｓ）用いて、51Ｃｒ遊離細胞傷害性試験により標的細胞に対する細胞傷害活性を調べた。【００８１】
（４）細胞傷害性試験
細胞傷害性試験は、51Ｃｒ遊離細胞傷害性試験により行った。51Ｃｒ遊離細胞傷害性試験は、以下のように行われた。まず、標的細胞（１×１０７個／ｍＬ）を１００μＬの51Ｃｒ（比活性１ｍＣｉ／ｍｌ）とともに、ＲＰＭＩ１６４０（日本製薬社製）＋１０％ウシ胎児血清培地中にて３７℃で１．５時間培養し、標的細胞を51Ｃｒでラベルした。次いで、51Ｃｒでラベルされた標的細胞が、種々の数の（３）で得られたＣＴＬｓ（１００μＬのアッセイ培地に懸濁したもの）を含むウエル（丸底の９６ウエルプレート）に添加され、混合され、３７℃で４時間培養された。ＣＴＬｓと標的細胞とは、ＣＴＬｓを「Ｅ」とし、51Ｃｒでラベルした標的細胞を「Ｔ」として、Ｅ／Ｔ（細胞数）比が１：１、５：１、２０：１又は２５：１となるよう混合した。培養後、１００μＬの上清が各ウエルから集められた。標識細胞から遊離及び放出された51Ｃｒを測定し、51Ｃｒの特異的溶解（％）を算出した。特異的溶解（％）は以下の方法で算出された。【００８２】
【数１】
0005478260.tif 000002
【００８３】
上記式中、自然放出量は、標的細胞のみの培養上清の蛍光発光量をいい、最大放出量は、１質量％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００で処理することにより標的細胞を完全に溶解した培養液の蛍光発光量をいう。【００８４】
標的細胞としては、以下に記載するＢ−ＬＣＬｓ、Ｋ５６２細胞、ＪＹ細胞及びＫＨ８８細胞を使用した。なお、ＫＨ８８細胞は、後述する実施例９で使用したＫＨ８８ＯＦ８細胞と同じである。
Ｂ−ＬＣＬｓは、ＥＢウイルスを用いてＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性供血者から得た末梢血Ｂリンパ球の形質転換によって樹立されたが、ＷＴ１を発現しない。
Ｋ５６２細胞は、慢性骨髄性白血病芽球クライシスを持つ患者から樹立され、ＷＴ１を発現するが、ＨＬＡクラスI非発現細胞株である。本発明者は、野生のＷＴ１発現ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性白血病細胞株を得ることができなかった。そのため、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６遺伝子をＫ５６２細胞に導入して形質転換によって作られた０２０６Ｋ５６２細胞も使用した。ＨＬＡ−Ａ＊０２０６遺伝子で形質転換された０２０６Ｋ５６２細胞は、抗ＨＬＡ−Ａ２抗体（クローンＢＢ７．２；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製)を用いるＦＡＣＳ分析によって、細胞表面にＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子を発現することが確認された。
ＷＴ１遺伝子で形質転換されたＢ−ＬＣＬ細胞は、ウエスタンブロット分析によってＷＴ１を発現することが確認された。なお、空のベクターで形質転換されたＢ−ＬＣＬ細胞をコントロールとした。
ＪＹ細胞株は、ＷＴ１非発現ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陰性ＥＢウイルスで形質転換されたＢ細胞株である。
ＫＨ８８は、ＷＴ１発現ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陰性白血病細胞株である。
全ての細胞株は、１０ｖ／ｖ％の加熱不活性化したウシ胎仔血清、５０ＩＵ/ｍＬのペニシリン及び５０ｍｇ/ｍＬのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０培養液で培養された。【００８５】
（５）抗体及びフローサイトメトリー解析
抗ヒトＣＤ１４、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−ＤＲ  ｍＡｂｓはベクトン・ディッキンソン株式会社（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）から購入した。ＤＣｓの濃縮と成熟の確認は、上記でリストしたモノクロナール抗体（ｍＡｂｓ）用いる細胞の細胞表面抗原の分析によって行った。サンプルは、ＣｅｌｌＱｅｓｔソフトウエアーを用いてフローサイトメーター（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）で解析された。【００８６】
（６）結果
ＷＴ１187ペプチド特異的ＣＴＬｓをＨＬＡ−Ａ＊０２０６の供血者のＰＢＭＣｓから作り出すことができるかどうかを試験した。ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性健常供血者からのＣＤ８陽性Ｔ細胞濃縮ＰＢＭＣｓを、ＷＴ１187ペプチドをパルスされた自家ＤＣｓ又はＰＢＭＣｓで繰り返して刺激して得られたＣＴＬｓについて、ＷＴ１187ペプチド特異的細胞傷害活性を調べた。ＣＴＬｓは、ＷＴ１187ペプチドをパルスされなかったＢ−ＬＣＬ細胞よりＷＴ１187ペプチドをパルスされた自家Ｂ−ＬＣＬ細胞に対してより強い細胞傷害活性を示した（図１ａ)。図１ａにおいて、縦軸は細胞傷害活性を、横軸は、ペプチド刺激により得られたＣＴＬｓ（エフェクター：Ｅ）と標的細胞（ターゲット：Ｔ）の比（Ｅ／Ｔ比）をそれぞれ表す。三角（▲）は１０μｇ／ｍＬのＷＴ１187ペプチドでパルスされた細胞を示し、四角（■）はＷＴ１187ペプチドでパルスされなかった細胞を示す。また、異なる二人のＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性健常供血者から分離したＰＢＭＣｓから同様に作り出されたＣＴＬｓでも、上記と同様の細胞傷害活性が確認された（図２ａ及びｂ）。図２中、三角（▲）は１０μｇ／ｍＬのＷＴ１187ペプチドでパルスされた細胞を示し、四角（■）はＷＴ１187ペプチドでパルスされなかった細胞を示す。これらの結果は、それら細胞傷害活性がＷＴ１187ペプチドに特異的であることを示すものである。【００８７】
さらに、ＣＴＬｓの細胞傷害活性は、ＤＣｓ又はＰＢＭＣｓにパルスするＷＴ１187ペプチドの濃度が高くなるのに平行して増加し、０．１μｇ／ｍＬの濃度でプラトーに達した（図１ｂ）。特異的溶解のＷＴ１187ペプチドのハーフマキシマム濃度（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍａｌ  ｌｙｓｉｓ）は、約５×１０-5μｇ／ｍＬであった。これは、ＣＴＬｓのＴＣＲｓ（Ｔ細胞抗原レセプター）のＷＴ１187ペプチド／ＨＬＡ−Ａ＊０２０６複合体への親和性が相対的に高かったことを示している。この結果は、ＷＴ１187ペプチドによって誘導されるＣＴＬｓが、ＷＴ１187ペプチドを認識できることを強く示唆している。【００８８】
次いで、上記のようにＷＴ１187ペプチドをパルスされたＤＣｓ又はＰＢＭＣｓを用いてＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性供血者のＣＤ８陽性Ｔ細胞濃縮ＰＢＭＣｓを刺激することにより作製されたＣＴＬｓを用いて、内在的にＷＴ１を発現する種々の標的細胞に対する細胞傷害活性を調べた。その結果を図３ａ及びｂに示す。なお、図３ａ及びｂに示す各標的細胞に対する細胞傷害活性が、同時に測定された。
図３ａは、ＷＴ１遺伝子で形質転換したＢ−ＬＣＬｓ（ＷＴ１発現、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性；▲)又は空のベクターで形質転換したＢ−ＬＣＬｓ（ＷＴ１非発現、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性；■)に対するＷＴ１187ペプチド特異的ＣＴＬｓの細胞傷害活性を示す図である。図３ｂは、０２０６Ｋ５６２細胞（ＷＴ１発現、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性；■)、Ｋ５６２細胞（ＷＴ１発現、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陰性；□)、ＫＨ８８細胞（ＷＴ１発現、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陰性；●）及びＪＹ細胞（ＷＴ１非発現、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陰性；▲）に対するＷＴ1187ペプチド特異的ＣＴＬｓの細胞傷害活性を示す図である。【００８９】
ＣＴＬｓは、空ベクターで形質転換したＢ−ＬＣＬｓ（ＷＴ１非発現ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性）よりＷＴ１で形質転換したＢ−ＬＣＬｓ（ＷＴ１発現ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性）に対して強い細胞傷害活性を示した（図３ａ）。さらに、図３ｂに示すように、そのＣＴＬｓは、Ｋ５６２（ＷＴ１発現ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陰性）、ＫＨ８８（ＷＴ１発現ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陰性）、又はＪＹ（ＷＴ１非発現ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陰性）細胞よりＨＬＡ−Ａ＊０２０６で形質転換した０２０６Ｋ５６２細胞（ＷＴ１発現ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性）に対してより強い細胞傷害活性を示した。換言すると、ＣＴＬｓは、ＷＴ１発現ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性標的白血病細胞に対して有意な細胞傷害活性を示したが、ＷＴ１非発現及び／又はＨＬＡ−Ａ＊０２０６陰性細胞に対しては、細胞傷害活性を示さなかった。この結果は、インビトロで作り出されるＷＴ１187ペプチドに特異的なＣＴＬｓが、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６の拘束性を有する白血病を含む内在的にＷＴ１を発現している腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を示すことを示す。図３ｂに示したその結果は、ＷＴ１187ペプチドに特異的なＣＴＬｓによってもたらされる細胞傷害活性が、ＨＬＡ−ＡクラスＩに制限（拘束）されることを強く示唆した。これは、強い細胞傷害活性がＫ５６２細胞より０２０６Ｋ５６２細胞に対して観察されたためである。
以上のことから、前記培養細胞（ＣＴＬｓ）は、ＷＴ１187ペプチド特異的ＣＴＬｓであることが立証された。
なお、図に示された結果は、典型的データであり、かつ基本的に多少のばらつきはあるがいずれも再現可能である。【００９０】
実施例３（ＷＴ１187ペプチド特異的ＣＴＬｓの拘束ＨＬＡクラスの確認）
実施例２で得られたＷＴ１187ペプチド特異的ＣＴＬｓの細胞傷害活性がＨＬＡクラスＩ拘束性であるかを確認した。ＨＬＡクラスＩ又はＨＬＡクラスＩＩに対するｍＡｂの存在又は非存在下で51Ｃｒ遊離細胞傷害性試験が行われた。標的細胞として、自家Ｂ−ＬＣＬｓが使用された。Ｅ／Ｔ比は５：1で行われた。
その結果を図４に示す。図４中のａは、Ｂ−ＬＣＬｓ（ＷＴ１187非発現ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性）を標的細胞として、ＨＬＡクラスＩに対するｍＡｂ（抗−ＨＬＡクラスＩｍＡｂ）及びＨＬＡクラスＩＩに対するｍＡｂ（抗−ＨＬＡクラスＩＩｍＡｂ）非存在下で試験を行なった結果である。ｂは、ＷＴ１187ペプチドをパルスしたＢ−ＬＣＬｓ（ＷＴ１187発現ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性）を標的細胞として、抗−ＨＬＡクラスＩｍＡｂ非存在下かつ抗−ＨＬＡクラスＩＩｍＡｂ存在下で試験を行なった結果である。ｃは、ＷＴ１187ペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性を標的細胞として、抗−ＨＬＡクラスＩｍＡｂ存在下かつ抗−ＨＬＡクラスＩＩｍＡｂ非存在下で試験を行なった結果である。ｄは、ＷＴ１187ペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性を標的細胞として、抗−ＨＬＡクラスＩｍＡｂ及び抗−ＨＬＡクラスＩＩｍＡｂ非存在下で試験を行なった結果である。
図４より、ＷＴ１187ペプチド特異的ＣＴＬｓの細胞傷害活性は、抗ＨＬＡクラスＩＩ抗体ではなく抗ＨＬＡクラスＩ抗体の添加により完全に抑制された。ＷＴ１187ペプチド特異的ＣＴＬｓの細胞傷害活性は、予想どおりＨＬＡクラスＩ拘束性であることを示した。【００９１】
実施例４（腫瘍細胞に対する細胞傷害性試験）
実施例２で得られたＷＴ１187ペプチド特異的ＣＴＬｓを用いて、インビトロで、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６の拘束性をもつＷＴ１発現腫瘍細胞に対する細胞傷害性試験を行った。細胞傷害性試験は、実施例２に記載の51Ｃｒ遊離細胞傷害性試験を用いて行われた。その結果、そのＷＴ１187ペプチド特異的ＣＴＬｓは、ＷＴ１発現腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を示した（図に示していない）。【００９２】
実施例５（ＷＴ１126ペプチド特異的ＣＴＬｓの作製、及びそれを用いた細胞傷害性試験）
実施例２（３）において、ＷＴ１187ペプチドに替えてＷＴ１126ペプチド（配列番号３）を用いたこと以外は同様にして、ＷＴ１126ペプチド特異的ＣＴＬｓを作製した。このＣＴＬｓを用いて、実施例２と同様にして細胞傷害性試験を行い、ＷＴ１126ペプチド特異的細胞傷害活性を測定した。図５に、図２ｂと同一のＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性健常供血者のＰＢＭＣｓから誘導されたＷＴ１126ペプチド特異的ＣＴＬｓの細胞傷害活性を示す。図５において、三角（▲）は１０μｇ／ｍＬのＷＴ１126ペプチドでパルスされた細胞を示し、四角（■）はＷＴ１126ペプチドでパルスされなかった細胞を示す。ＣＴＬｓは、ＷＴ１126ペプチドをパルスされなかったＢ−ＬＣＬ細胞よりＷＴ１126ペプチドをパルスされた自家Ｂ−ＬＣＬ細胞に対してより強い細胞傷害活性を示した（図５)。この結果は、ＣＴＬｓの細胞傷害活性がＷＴ１126ペプチドに特異的であることを示すものである。【００９３】
また、実施例２と同様にして、ＷＴ１126ペプチドをパルスされたＤＣｓ又はＰＢＭＣｓを用いてＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性供血者のＣＤ８陽性Ｔ細胞濃縮ＰＢＭＣｓを刺激することにより作製されたＣＴＬｓを用いて、内在的にＷＴ１を発現する種々の標的細胞に対する細胞傷害活性を調べた。各標的細胞に対する細胞傷害活性を、図６ａ及びｂに示す。図ａ及びｂにおける標的細胞は、０２０６Ｋ５６２細胞（ＷＴ１発現、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性；■)、Ｋ５６２細胞（ＷＴ１発現、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陰性；□)、ＫＨ８８細胞（ＷＴ１発現、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陰性；●）及びＪＹ細胞（ＷＴ１非発現、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陰性；▲）である。図６ａは、図２ａと同一のＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性健常供血者のＰＢＭＣｓから誘導されたＷＴ１126ペプチド特異的ＣＴＬｓの細胞傷害活性を示す図であり、図６ｂは、図２ｂと同一のＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性健常供血者のＰＢＭＣｓから誘導されたＷＴ１126ペプチド特異的ＣＴＬｓの細胞傷害活性を示す図である。【００９４】
ＷＴ１126ペプチド特異的ＣＴＬｓは、ＷＴ１187ペプチド特異的ＣＴＬｓと同様に、ＷＴ１発現ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性標的白血病細胞に対して有意な細胞傷害活性を示したが、ＷＴ１非発現及び／又はＨＬＡ−Ａ＊０２０６陰性細胞に対しては、細胞傷害活性を示さなかった。この結果は、インビトロで作り出されるＷＴ１126ペプチドに特異的なＣＴＬｓが、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６の拘束性を有する白血病を含む内在的にＷＴ１を発現している腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を示すことを示す。図６ａ及びｂに示した結果は、ＷＴ１126ペプチドに特異的なＣＴＬｓによってもたらされる細胞傷害活性が、ＨＬＡ−ＡクラスＩに制限（拘束）されることを強く示唆した。これは、強い細胞傷害活性がＫ５６２細胞より０２０６Ｋ５６２細胞に対して観察されたためである。
以上のことから、これらのＣＴＬｓは、ＷＴ１126ペプチド特異的ＣＴＬｓであることが立証された。
なお、図に示された結果は、典型的データであり、かつ基本的に多少のばらつきはあるがいずれも再現可能である。【００９５】
実施例６（ワクチン組成物の調製）
以下の癌ワクチン組成物１〜８を調製した。なお、これらは、本発明の癌ワクチン組成物の一例である。
癌ワクチン組成物１
ＷＴ１187ペプチド              ３ｍｇ
モンタナイドＩＳＡ５１        ４００ｍｇ
５％ブドウ糖液                ４００ｍｇ
上記成分を混合し、癌ワクチン組成物１とした。【００９６】
癌ワクチン組成物２
ＷＴ１187ペプチド                １ｍｇ
モンタナイドＩＳＡ５１        ４００ｍｇ
５％ブドウ糖液                ４００ｍｇ
上記成分を混合し、癌ワクチン組成物２とした。【００９７】
癌ワクチン組成物３
ＷＴ１187ペプチド            ０．００１ｍｇ
モンタナイドＩＳＡ５１        ４００ｍｇ
５％ブドウ糖液                ４００ｍｇ
上記成分を混合し、癌ワクチン組成物３とした。【００９８】
癌ワクチン組成物４
ＷＴ１187ペプチド              １０ｍｇ
モンタナイドＩＳＡ５１        ４００ｍｇ
５％ブドウ糖液                ４００ｍｇ
上記成分を混合し、癌ワクチン組成物４とした。【００９９】
癌ワクチン組成物５〜８
上記癌ワクチン組成物１〜４において、ＷＴ１187ペプチドに替えてＷＴ１126ペプチドを使用して、癌ワクチン組成物５〜８を製造した。【０１００】
実施例７（改変ペプチドのＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子に対する親和性）
ＷＴ１187ペプチド、ＷＴ１126ペプチド及びこれらのペプチドにおいてＮ末端から１番目、２番目、３番目又は９番目のアミノ酸残基を置換した改変ペプチドについて、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子に対する親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）をＮｅｔＭＨＣ２．０サーバー予測プログラムで分析した。ＷＴ１187ペプチドの改変ペプチドについての分析結果を表１に、ＷＴ１187ペプチドの改変ペプチドについての分析結果を表２に、それぞれ示す。親和性の数値が小さい（結合可能なペプチド濃度が低い）ほど、親和性が高いことを意味する。【０１０１】
【表１】
0005478260.tif 000003
【０１０２】
【表２】
0005478260.tif 000004
【０１０３】
実施例８（改変ペプチドのＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子に対する親和性）
ＷＴ１187ペプチド、ＷＴ１126ペプチド及びこれらのペプチドにおいてＮ末端から１番目、２番目、３番目又は９番目のアミノ酸残基を置換した改変ペプチドについて、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子に対する親和性をＮｅｔＭＨＣ２．０サーバー予測プログラムで分析した。ＷＴ１187ペプチドの改変ペプチドについての分析結果を表３に、ＷＴ１126ペプチドの改変ペプチドについての分析結果を表４に、それぞれ示す。親和性の数値が小さいほど、親和性が高いことを意味する。
【０１０４】
【表３】
0005478260.tif 000005
【０１０５】
【表４】
0005478260.tif 000006
【０１０６】
実施例９（ＷＴ１126改変ペプチドによるＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性のＣＴＬ誘導の比較）
（１）目的
実施例８の結果を考慮し、ＷＴ１126改変ペプチドとして、ＷＴ１126P1Fペプチド（配列番号３４）、ＷＴ１126P2Lペプチド（配列番号３９）、ＷＴ１126P3Mペプチド（配列番号４６）及びＷＴ１126P9Vペプチド（配列番号４９）を選択し、細胞傷害活性が高いＣＴＬを誘導することができるＷＴ１126改変ペプチドをスクリーニングすることを目的に、本実験を行った。なお実施例９〜１２において用いた試薬、培地、実験方法等は、特に断らない限り実施例１と同じである。実施例９〜１２において、培養は、特に断らない限り３７℃で行った。【０１０７】
（２）材料及び方法
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を発現している健康人ドナー（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１健常供血者）から、末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を分離し、さらに、抗ヒトＣＤ１４粒子−ＤＭ（Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＣＤ１４  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ−ＤＭ）を用いてＣＤ１４陽性細胞を分離した。本細胞を、１ｖ／ｖ％ヒトＡＢ血清（1% human AB serum）が入ったＸ−ＶＩＶＯ１５培地に、８００ＩＵ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ及び１０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−４を添加して得た培養液で、１日培養した。【０１０８】
本培養物に、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦα、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−β、１０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−６及び１μｇ／ｍＬのＰＧＥ２を含む成熟サイトカインカクテル（maturation cytokine cocktail）を添加した。さらに一日培養した後に、自家成熟ＤＣｓ（mature DCs）が得られた。【０１０９】
実施例１３で得られた１０ｕｇ／ｍＬのＷＴ１126改変ペプチド（ＷＴ１126P1Fペプチド、ＷＴ１126P2Lペプチド、ＷＴ１126P3Mペプチド又はＷＴ１126P9Vペプチド）でパルスした自家成熟ＤＣｓを、４時間培養した後に、放射線照射（３５Ｇｙ）し、ＣＴＬｓ誘導の刺激細胞として用いた。
２４ウェルプレートの一つのウェルに、レスポンダー（responder）としてＰＢＭＣｓ（２×１０６個／ウェル）と前述のＤＣｓ（２×１０５個／ウェル）とを共培養した。一週間後、ペプチドをパルスした放射線照射（７５Ｇｙ）Ｔ２細胞で再刺激した。再刺激の３日後に２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を添加した。ペプチドパルスした放射線照射Ｔ２細胞による刺激を同様にさらに３回繰り返した後、responder細胞中のＣＤ８陽性細胞を濃縮した。【０１１０】
そのＣＤ８陽性Ｔ細胞について、ＷＴ１126ペプチドのＨＬＡ−Ａ＊０２０１テトラマーを用いたフローサイトメーターによる反応性の解析及びさまざまな標的細胞に対する細胞傷害活性を検討した。
標的細胞としては、表５に示すＫ５６２細胞、０２０６Ｋ５６２細胞、ＪＹ細胞、ＫＨ８８ＯＦ８細胞、ＴＦ−１細胞及びＴＨＰ−１細胞を用いた。これらの細胞の特徴を、表５に示す。また、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性のドナーの血液からＥＢウイルス感染により樹立されたＢリンパ芽球様細胞（Ｂ−ＬＣＬ）も標的細胞として用いた。【０１１１】
【表５】
0005478260.tif 000007
【０１１２】
（３）結果
図７に、各ＷＴ１126改変ペプチドで刺激したＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性のドナー１のＰＢＭＣｓをＰＥ（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）で標識したＷＴ１126ペプチドのＨＬＡ−Ａ＊０２０１のテトラマー（医学生物学研究所）及びＡＰＣ−Ｃｙ７（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ−Ｃｙａｎｉｎｅ−７）で標識した抗ＣＤ８抗体で染色し、フローサイトメーターで解析した結果を示す。ＰＢＭＣｓを上記テトラマー及び抗ＣＤ８抗体で染色すると、改変ペプチドによる刺激によって誘導されたＣＴＬｓは該テトラマー及び抗ＣＤ８抗体と結合し、その結果該テトラマーによる蛍光及び抗ＣＤ８抗体による蛍光が検出される。図７ａ〜ｅにおいて、縦軸はＨＬＡ−Ａ＊０２０１テトラマーによる蛍光強度を、横軸は、抗ＣＤ８抗体による蛍光強度をそれぞれ示す。図７ａ〜ｅ中の四角の囲みは、誘導された、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性を有し、ＷＴ１126ペプチドを認識可能なＣＴＬｓの頻度(％)を示す。図７ａは、ＷＴ１126改変ペプチドで刺激していないＰＢＭＣｓを上記テトラマー及び抗ＣＤ８抗体で染色したもの（バックグランド）である。図７ｂはＷＴ１126P1Fペプチドで刺激したＰＢＭＣｓを染色し、解析した結果である。図７ｃはＷＴ１126P2Lペプチドで刺激したＰＢＭＣｓを染色し、解析した結果である。図７ｄはＷＴ１126P3Mペプチドで刺激したＰＢＭＣｓを染色し、解析した結果である。図７eはＷＴ１126P9Vペプチドで刺激したＰＢＭＣｓを染色し、解析した結果である。【０１１３】
ＷＴ１126P1Fペプチドで刺激したＰＢＭＣｓにおいて誘導された上記ＣＴＬｓの頻度は０．１４％（図７ｂ）であり、ＷＴ１126P2Lペプチドで刺激したＰＢＭＣｓにおいて誘導された上記ＣＴＬｓの頻度は０．３７％（図７ｃ）であり、これらのペプチドにより誘導されたＣＴＬｓは、ＨＬＡテトラマー陽性かつＣＤ８陽性であり、ＷＴ１126ペプチドのＨＬＡ−Ａ＊０２０１のテトラマーと結合可能なＣＴＬｓであった。この結果より、ＰＢＭＣｓのＷＴ１126改変ペプチド刺激により野生型ペプチド（ＷＴ１126ペプチド）を認識できるＣＴＬｓが誘導されたことが示された。【０１１４】
図８に、ドナー１のＰＢＭＣｓをＷＴ１126P1Fペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓの細胞傷害活性を測定した結果を示す。図８において、縦軸は細胞傷害活性を、横軸は、ペプチド刺激により得られたＣＤ８陽性Ｔ細胞（エフェクター：Ｅ）と標的細胞（ターゲット：Ｔ）との比（Ｅ／Ｔ比）をそれぞれ表す。菱型（◆）は、標的細胞としてＪＹ細胞を用いた場合を、四角（■）は、標的細胞として、ＷＴ１126P1FペプチドをパルスしたＪＹ細胞を用いた場合を、それぞれ表わす。
ＪＹ細胞はＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性、かつＷＴ１陰性であり、ＣＴＬｓは、ＷＴ１126P1FペプチドをパルスしたＪＹ細胞に対してペプチドをパルスしていないＪＹ細胞に対してよりも強い細胞傷害活性を示した。この結果より、刺激に用いたペプチド特異的なＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性のＣＴＬｓが誘導されたことが示された。【０１１５】
図９に、ドナー１のＰＢＭＣｓをＷＴ１126P2Lペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓの細胞傷害活性を測定した結果を示す。図９において、縦軸は細胞傷害活性を、横軸は、ペプチド刺激により得られたＣＤ８陽性Ｔ細胞（エフェクター：Ｅ）と標的細胞（ターゲット：Ｔ）との比（Ｅ／Ｔ比）をそれぞれ表す。図９ａでは、菱型（◆）は、標的細胞としてＪＹ細胞を用いた場合を、四角（■）は、標的細胞として、ＷＴ１126P2LペプチドをパルスしたＪＹ細胞を用いた場合を、それぞれ表す。図９ｂでは、菱型（◆）は、標的細胞としてＴＦ−１細胞を用いた場合を、四角（■）は、標的細胞としてＴＨＰ−１細胞を用いた場合を、三角（▲）は、標的細胞としてＫＨ８８ＯＦ８細胞を用いた場合を、バツ（×）は、標的細胞としてＢ−ＣＬＣ細胞を用いた場合を、それぞれ表す。【０１１６】
誘導したＣＴＬｓは、ＷＴ１126P2LペプチドをパルスしたＪＹ細胞に対して、該ペプチドをパルスしていないＪＹ細胞に対するよりも強い細胞傷害活性を示した（図９ａ）。また、誘導したＣＴＬｓは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性かつＷＴ１陽性のＴＦ−１細胞及びＴＨＰ−１細胞に対しては、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陰性かつＷＴ１陽性のＫＨ８８ＯＦ８細胞株、及びＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性かつＷＴ１陰性のＢ−ＬＣＬ細胞に対してよりも強い細胞傷害活性を示した（図９ｂ）。この結果から、ＷＴ１126P2Lペプチドの刺激で誘導されたＣＴＬｓはＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性であり、内因性にＷＴ１を発現する癌細胞を傷害することが明らかとなった。【０１１７】
図１０に、ＷＴ１126P2Lペプチドで刺激したＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性のドナー２のＰＢＭＣｓをＰＥで標識したＷＴ１126ペプチドのＨＬＡ−Ａ＊０２０１のテトラマー及びＡＰＣ−Ｃｙ７で標識した抗ＣＤ８で染色し、フローサイトメーターで解析した結果を示す。すなわち図１０は、誘導したＣＴＬｓをＷＴ１126ペプチドのテトラマー及び抗ＣＤ８抗体で染色してフローサイトメーターで解析した結果を示す。縦軸はＨＬＡ−Ａ＊０２０１テトラマーによる蛍光強度を、横軸は、抗ＣＤ８抗体による蛍光強度をそれぞれ示す。【０１１８】
図１０の右上（ＵＲ）の画分の細胞が、誘導されたＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性を有する、ＷＴ１126ペプチドを認識可能なＣＴＬｓである。ＷＴ１126P2Lペプチドで刺激したＰＢＭＣｓのリンパ球のうち５．４３％がＨＬＡテトラマー陽性かつＣＤ８陽性であり、ＷＴ１126ペプチドのＨＬＡ−Ａ＊０２０１のテトラマーと結合可能なＣＴＬｓであった。この結果より、ＰＢＭＣｓの改変ペプチド刺激により野生型ペプチドを認識できるＣＤ８陽性のＣＴＬｓが誘導されたことが示された。【０１１９】
図１１に、ドナー２のＰＢＭＣｓをＷＴ１126P2Lペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓの細胞傷害活性を測定した結果を示す。図１１ａ及び図１１ｂにおいて、縦軸は、細胞傷害活性を、横軸は、ペプチド刺激により得られたＣＤ８陽性Ｔ細胞（エフェクター：Ｅ）と標的細胞（ターゲット：Ｔ）との比（Ｅ／Ｔ比）を表す。図１１ａでは、菱型（◆）は、ＪＹ細胞を標的細胞として用いた場合を、四角（■）は、標的細胞として、ＷＴ１126ペプチドをパルスしたＪＹ細胞を用いた場合を、それぞれ示す。図１１ｂでは、菱型（◆）は、ＪＹ細胞を標的細胞として用いた場合を、四角（■）は、標的細胞として、ＷＴ１126P2ＬペプチドをパルスしたＪＹ細胞を用いた場合を、それぞれ示す。【０１２０】
誘導したＣＴＬｓは、ＷＴ１126ペプチドをパルスしたＪＹ細胞に対してペプチドをパルスしていないＪＹ細胞に対してよりも強い細胞傷害活性を示した（図１１ａ）。また、誘導したＣＴＬｓは、ＷＴ１126P2LペプチドをパルスしたＪＹ細胞に対して、ペプチドをパルスしていないＪＹ細胞に対してよりも強い細胞傷害活性を示した（図１１ｂ）。この結果から、ＷＴ１126P2Lペプチドで刺激して誘導されたＣＴＬｓは、ＷＴ１126P2Lペプチド及び野生型のＷＴ１126ペプチドの両方を認識できることが明らかとなった。【０１２１】
実施例１０（ＷＴ１126改変ペプチドによるＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性のＣＴＬｓ誘導の比較）
（１）目的
実施例７の結果を考慮し、ＷＴ１126改変ペプチドとして、ＷＴ１126P1Fペプチド、ＷＴ１126P2Lペプチド、ＷＴ１126P3Mペプチド及びＷＴ１126P9Vペプチドを選択し、細胞傷害活性が高いＣＴＬｓを誘導することができるＷＴ１126改変ペプチドをスクリーニングすることを目的に、本実験を行った。【０１２２】
（２）材料及び方法
ＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子を発現している健康人ドナー（ＨＬＡ−Ａ＊０２０６健常供血者）から、末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を分離し、さらに、抗ヒトＣＤ１４粒子−ＤＭ（Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＣＤ１４  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ−ＤＭ）を用いてＣＤ１４陽性細胞を分離した。本細胞を、１ｖ／ｖ％ヒトＡＢ血清（1% human AB serum）が入ったＸ−ＶＩＶＯ１５培地に、８００ＩＵ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ及び１０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−４を添加して得た培養液で、１日培養した。【０１２３】
本培養物に、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦα、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−β、１０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−６及び１μｇ／ｍＬのＰＧＥ２を含む成熟サイトカインカクテル（maturation cytokine cocktail）を添加した。さらに一日培養した後に、自家成熟ＤＣｓ（mature DCs）が得られた。【０１２４】
実施例１３で得られた１０ｕｇ／ｍＬのＷＴ１126改変ペプチド（ＷＴ１126P1Fペプチド、ＷＴ１126P2Lペプチド、ＷＴ１126P3Mペプチド又はＷＴ１126P9Vペプチド）でパルスした自家成熟ＤＣｓを、４時間培養した後に、放射線照射（３５Ｇｙ）し、ＣＴＬｓ誘導の刺激細胞として用いた。【０１２５】
２４ウェルプレートの一つのウェルに、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を濃縮したＰＢＭＣｓ（２×１０６個／ウェル）と前述のＤＣｓ（１×１０５個／ウェル）とを共培養した。１０日後、ペプチドをパルスした放射線照射（３５Ｇｙ）ＰＢＭＣｓ細胞で再刺激した。再刺激の２日後に１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７を添加した。同様の刺激をさらに４回繰り返した後、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を濃縮した。そのＣＤ８陽性Ｔ細胞について、さまざまな標的細胞に対する細胞傷害活性を検討した。
標的細胞としては、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性のドナーの血液からＥＢウイルス感染により樹立されたＢ−ＬＣＬ細胞、Ｋ５６２細胞及び０２０６Ｋ５６２細胞を用いた。【０１２６】
（３）結果
図１２に、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性のドナー３のＰＢＭＣｓをペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓの細胞傷害活性を測定した結果を示す。図１２ａは、ＷＴ１126P2Lペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓの細胞傷害活性を、図１２ｂは、ＷＴ１126P3Mペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓの細胞傷害活性を、図１２ｃは、ＷＴ１126P9Vペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓの細胞傷害活性を、それぞれ示す。図１２ａ〜ｃにおいて、縦軸は細胞傷害活性を、横軸は、ペプチド刺激により得られたＣＤ８陽性Ｔ細胞（エフェクター：Ｅ）と標的細胞（ターゲット：Ｔ）との比（Ｅ／Ｔ比）をそれぞれ表す。菱型（◆）は、標的細胞として自己Ｂ−ＬＣＬ細胞を用いた場合を、四角（■）は、標的細胞として、刺激に用いたＷＴ１126改変ペプチドをパルスした自己Ｂ−ＬＣＬ細胞を用いた場合を、それぞれ表す。【０１２７】
ＷＴ１126P2Lペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓは、ＷＴ１126P2LペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性かつＷＴ１陰性の自己Ｂ−ＬＣＬ細胞に対して、ペプチドをパルスしていない自己Ｂ−ＬＣＬ細胞に対してよりも強い細胞傷害活性を示した（図１２ａ）。ＷＴ１126P3Mペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓは、ＷＴ１126P3MペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性かつＷＴ１陰性の自己Ｂ−ＬＣＬ細胞に対して、ペプチドをパルスしていない自己Ｂ−ＬＣＬ細胞に対してよりも強い細胞傷害活性を示した（図１２ｂ）。ＷＴ１126P9Vペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓは、ＷＴ１126P9VペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性かつＷＴ１陰性の自己Ｂ−ＬＣＬ細胞に対して、ペプチドをパルスしていない自己Ｂ−ＬＣＬ細胞に対してよりも強い細胞傷害活性を示した（図１２ｃ）。
この結果より、刺激に用いたペプチド特異的なＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性のＣＴＬｓが誘導されたことが示された。【０１２８】
図１３に、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性のドナー３のＰＢＭＣｓをＷＴ１126P9Vペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓの細胞傷害活性を測定した結果を示す。図１３において、縦軸は細胞傷害活性を、横軸は、ペプチド刺激により得られたＣＤ８陽性Ｔ細胞（エフェクター：Ｅ）と標的細胞（ターゲット：Ｔ）との比（Ｅ／Ｔ比）をそれぞれ表す。菱型（◆）は、標的細胞として自己Ｂ−ＬＣＬ細胞を用いた場合を、四角（■）は、標的細胞として、自己Ｂ−ＬＣＬ細胞にＷＴ１遺伝子を導入した細胞を用いた場合を、それぞれ表す。
図１３より、ＷＴ１126P9Vペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性かつＷＴ１陰性の自己Ｂ−ＬＣＬ細胞にＷＴ１遺伝子を導入してＷＴ１陽性とした細胞に対して、ＷＴ１遺伝子を導入していない自己Ｂ−ＬＣＬ細胞に対してよりも強い細胞傷害活性を示した。この結果から、ＷＴ１126P9Vペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性であり、内因性に提示された野生型のＷＴ１126ペプチドを認識して、細胞傷害活性を示すことが明らかとなった。【０１２９】
図１４に、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性のドナー４のＰＢＭＣｓをペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓの細胞傷害活性を測定した結果を示す。図１４ａは、ＷＴ１126P2Lペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓの細胞傷害活性を、図１４ｂは、ＷＴ１126P3Mペプチドで刺激して誘導したＣＴＬの細胞傷害活性を、図１４ｃは、ＷＴ１126P9Vペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓの細胞傷害活性をそれぞれ示す。図１４ａ〜ｃにおいて、縦軸は細胞傷害活性を、横軸は、ペプチド刺激により得られたＣＤ８陽性Ｔ細胞（エフェクター：Ｅ）と標的細胞（ターゲット：Ｅ）との比（Ｅ／Ｔ比）をそれぞれ表す。菱型（◆）は、標的細胞として自己Ｂ−ＬＣＬ細胞を用いた場合を、四角（■）は、標的細胞として、刺激に用いたＷＴ１126改変ペプチドをパルスした自己Ｂ−ＬＣＬ細胞を用いた場合を、それぞれ表す。【０１３０】
ＷＴ１126P2Lペプチドペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓは、ＷＴ１126P2LペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性かつＷＴ１陰性の自己Ｂ−ＬＣＬ細胞に対して、ペプチドをパルスしていない自己Ｂ−ＬＣＬ細胞に対してよりも強い細胞傷害活性を示した（図１４ａ）。ＷＴ１126P3Mペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓは、ＷＴ１126P3MペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性かつＷＴ１陰性の自己Ｂ−ＬＣＬ細胞に対してペプチドをパルスしていない自己Ｂ−ＬＣＬ細胞に対してよりも強い細胞傷害活性を示した（図１４ｂ）。ＷＴ１126P9Vペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓは、ＷＴ１126P9VペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性かつＷＴ１陰性の自己Ｂ−ＬＣＬ細胞に対してペプチドをパルスしていない自己Ｂ−ＬＣＬ細胞に対してよりも強い細胞傷害活性を示した（図１４ｃ）。この結果より、刺激に用いたペプチド特異的なＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性のＣＴＬｓが誘導されたことが示された。【０１３１】
図１５に、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性のドナー４のＰＢＭＣｓをペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓの細胞傷害活性を測定した結果を示す。標的細胞としては、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陰性かつＷＴ１陽性のＫ５６２細胞と、Ｋ５６２細胞にＨＬＡ−Ａ＊０２０６遺伝子を導入し内因性にＷＴ１の抗原ペプチドを提示させた細胞（０２０６Ｋ５６２細胞）とをそれぞれ用いた。図１５ａは、ＷＴ１126P2Lペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓの細胞傷害活性を、図１５ｂは、ＷＴ１126P3Mペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓの細胞傷害活性を、図１５ｃは、ＷＴ１126P9Vペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓの細胞傷害活性をそれぞれ示す。図１５ａ〜ｃにおいて、縦軸は細胞傷害活性を、横軸は、ペプチド刺激により得られたＣＤ８陽性Ｔ細胞（エフェクター：Ｅ）と標的細胞（ターゲット：Ｅ）との比（Ｅ／Ｔ比）をそれぞれ表す。また、菱型（◆）は、標的細胞としてＫ５６２細胞を用いた場合を、四角（■）は、標的細胞として、Ｋ５６２細胞にＨＬＡ−Ａ＊０２０６遺伝子を導入し内因性にＷＴ１の抗原ペプチドを提示させた０２０６Ｋ５６２細胞を用いた場合をそれぞれ表す。【０１３２】
図１５ａ〜ｃより、ＷＴ１126P2Lペプチド、ＷＴ１126P3Mペプチド又はＷＴ１126P9Vペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓは、何れの場合も、０２０６Ｋ５６２細胞に対して、Ｋ５６２細胞に対してよりも強い細胞傷害活性を示した。これら結果より、これらの改変ペプチド刺激で誘導されたＣＴＬｓは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性であり、内因性に提示された野生型のＷＴ１126ペプチドを認識して、細胞傷害活性を示すことが明らかとなった。【０１３３】
実施例１１（ＷＴ１187改変ペプチドによるＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性のＣＴＬｓ誘導の比較）
（１）目的
実施例８の結果を考慮し、ＷＴ１187改変ペプチドとして、ＷＴ１187P1Fペプチド（配列番号１１）、ＷＴ１187P2Mペプチド（配列番号１６）及びＷＴ１187P3Mペプチド（配列番号２０）を選択し、細胞傷害活性が高いＣＴＬｓを誘導することができるＷＴ１187改変ペプチドをスクリーニングすることを目的に、本実験を行った。【０１３４】
（２）材料及び方法
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を発現している健康人ドナー（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１健常供血者）から、末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を分離し、さらに、抗ヒトＣＤ１４粒子−ＤＭ（Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＣＤ１４  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ−ＤＭ）を用いてＣＤ１４陽性細胞を分離した。本細胞を、１ｖ／ｖ％ヒトＡＢ血清（1% human AB serum）が入ったＸ−ＶＩＶＯ１５培地に、８００ＩＵ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ及び１０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−４を添加して得た培養液で、１日培養した。【０１３５】
本培養物に、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦα、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−β、１０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−６及び１μｇ／ｍＬのＰＧＥ２を含む成熟サイトカインカクテル（maturation cytokine cocktail）を添加した。さらに一日培養した後に、自家成熟ＤＣｓ（mature DCs）が得られた。
実施例１３で得られた１０ｕｇ／ｍＬのＷＴ１187改変ペプチド（ＷＴ１187P1Fペプチド、ＷＴ１187P2Mペプチド又はＷＴ１187P3Mペプチド）でパルスした自家成熟ＤＣｓを、４時間培養した後に、放射線照射（３５Ｇｙ）し、ＣＴＬｓ誘導の刺激細胞として用いた。
２４ウェルプレートの一つのウェルに、レスポンダー（responder）としてＰＢＭＣｓ（２×１０６個／ウェル）と前述のＤＣｓ（２×１０５個／ウェル）とを共培養した。一週間後、ペプチドをパルスした放射線照射（７５Ｇｙ）Ｔ２細胞で再刺激した。再刺激の３日後に２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を添加した。ペプチドパルスした放射線照射Ｔ２細胞による刺激を同様にさらに３回繰り返した後、responder細胞中のＣＤ８陽性細胞を濃縮した。そのＣＤ８陽性Ｔ細胞について、ＪＹ細胞を標的細胞に対する細胞傷害活性を検討した。【０１３６】
（３）結果
図１６に、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性のドナーのＰＢＭＣｓをＷＴ１187P1Fペプチド（図１６ａ）又はＷＴ１187P2Mペプチド（図１６ｂ）で刺激して誘導したＣＴＬｓの細胞傷害活性を測定した結果を示す。図１６ａ及び図１６ｂにおいて、縦軸は細胞傷害活性を、横軸は、ペプチド刺激により得られたＣＤ８陽性Ｔ細胞（エフェクター：Ｅ）と標的細胞（ターゲット：Ｔ）との比（Ｅ／Ｔ比）をそれぞれ表す。菱型（◆）は、標的細胞としてＪＹ細胞を用いた場合を、三角（▲）は、標的細胞としてＷＴ１187ペプチドをパルスしたＪＹ細胞を用いた場合を、四角（■）は、標的細胞として、刺激に用いたＷＴ１187改変ペプチド（ＷＴ１187P1Fペプチド）をパルスしたＪＹ細胞を用いた場合をそれぞれ表す。ＪＹ細胞はＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性かつＷＴ１陰性である。【０１３７】
ＷＴ１187P1Fペプチドで誘導したＣＴＬｓは、ＷＴ１187ペプチドをパルスしたＪＹ細胞及びＷＴ１187P1FペプチドをパルスしたＪＹ細胞に対して同等な細胞傷害活性を示し、その活性はペプチドをパルスしていないＪＹ細胞に対してよりも強かった（図１６ａ）。ＷＴ１187P2Mペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓは、ＷＴ１187ペプチドをパルスしたＪＹ細胞及びＷＴ１187P2MペプチドをパルスしたＪＹ細胞に対して同等な細胞傷害活性を示し、その活性はペプチドをパルスしていないＪＹ細胞に対してよりも強かった（図１６ｂ）。これらの結果から、改変ペプチド刺激で誘導されたＣＴＬｓは、改変ペプチドと野生型のＷＴ１187ペプチドの両方を認識できることが明らかとなった。【０１３８】
実施例１２（ＷＴ１187改変ペプチドによるＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性のＣＴＬｓ誘導の比較）
（１）目的
実施例７の結果を考慮し、ＷＴ１187改変ペプチドとして、ＷＴ１187P1Fペプチド、ＷＴ１187P2Mペプチド及びＷＴ１187P3Mペプチドを選択し、細胞傷害活性が高いＣＴＬｓを誘導することができるＷＴ１187改変ペプチドをスクリーニングすることを目的に、本実験を行った。【０１３９】
（２）材料及び方法
ＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子を発現している健康人ドナー（ＨＬＡ−Ａ＊０２０６健常供血者）から、末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を分離し、さらに、抗ヒトＣＤ１４粒子−ＤＭ（Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＣＤ１４  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ−ＤＭ）を用いてＣＤ１４陽性細胞を分離した。本細胞を、１ｖ／ｖ％ヒトＡＢ血清（1% human AB serum）が入ったＸ−ＶＩＶＯ１５培地に、８００ＩＵ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ及び１０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−４を添加して得た培養液で、１日培養した。【０１４０】
本培養物に、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦα、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−β、１０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−６及び１μｇ／ｍＬのＰＧＥ２を含む成熟サイトカインカクテル（maturation cytokine cocktail）を添加した。さらに一日培養した後に、自家成熟ＤＣｓ（mature DCs）が得られた。
実施例１３で得られたＷＴ１187改変ペプチド（ＷＴ１187P1Fペプチド、ＷＴ１187P2Mペプチド又はＷＴ１187P3Mペプチド）でパルスした自家成熟ＤＣｓを、４時間培養した後に、放射線照射（３５Ｇｙ）し、ＣＴＬｓ誘導の刺激細胞として用いた。
２４ウェルプレートの一つのウェルに、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を濃縮したＰＢＭＣｓ（２×１０６個／ウェル）と前述のＤＣｓ（１×１０５個／ウェル）とを共培養した。１０日後、ペプチドをパルスした放射線照射（３５Ｇｙ）ＰＢＭＣｓ細胞で再刺激した。再刺激の２日後に１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７を添加した。同様の刺激をさらに４回繰り返した後、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を濃縮した。そのＣＤ８陽性Ｔ細胞について、さまざまな標的細胞に対する細胞傷害活性を検討した。
標的細胞としては、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性のドナーの血液からＥＢウイルス感染により樹立されたＢ−ＬＣＬ細胞、Ｋ５６２細胞及び０２０６Ｋ５６２細胞を用いた。【０１４１】
（３）結果
図１７に、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性のドナーのＰＢＭＣｓをＷＴ１187P1Fペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓの細胞傷害活性を測定した結果を示す。図１７において、縦軸は細胞傷害活性を、横軸は、ペプチド刺激により得られたＣＤ８陽性Ｔ細胞（エフェクター：Ｅ）と標的細胞（ターゲット：Ｔ）との比（Ｅ／Ｔ比）をそれぞれ表す。図１７ａでは、菱型（◆）は、標的細胞としてＢ−ＬＣＬ細胞を用いた場合を、四角（■）は、標的細胞としてＷＴ１187ペプチドをパルスしたＢ−ＬＣＬ細胞を用いた場合を、三角（▲）は、標的細胞としてＷＴ１187P1FペプチドをパルスしたＢ−ＬＣＬ細胞を用いた場合をそれぞれ表す。図１７ｂでは、菱型（◆）は、標的細胞としてＫ５６２細胞を用いた場合を、四角（■）は、標的細胞として、Ｋ５６２細胞にＨＬＡ−Ａ＊０２０６遺伝子を導入し内因性にＷＴ１の抗原ペプチドを提示させた０２０６Ｋ５６２細胞を用いた場合を、それぞれ表す。【０１４２】
ＷＴ１187P1Fペプチドで誘導したＣＴＬｓは、ＷＴ１187ペプチドをパルスしたＢ−ＬＣＬ細胞及びＷＴ１187P1FペプチドをパルスしたＢ−ＬＣＬ細胞に対して同等な細胞傷害活性を示し、その活性はペプチドをパルスしていないＢ−ＬＣＬ細胞に対してよりも強かった（図１７ａ）。また、標的細胞としてＨＬＡ−Ａ＊０２０６陰性かつＷＴ１陽性のＫ５６２細胞と、Ｋ５６２細胞にＨＬＡ−Ａ＊０２０６遺伝子を導入し内因性にＷＴ１の抗原ペプチドを提示させた細胞（０２０６Ｋ５６２細胞）を用いた場合、ＷＴ１187P1Fペプチドで誘導したＣＴＬｓは、０２０６Ｋ５６２細胞に対して、Ｋ５６２細胞に対してよりも強い細胞傷害活性を示した（図１７ｂ）。これらの結果から、ＷＴ１187P1Fペプチド刺激で誘導されたＣＴＬｓは、ＷＴ１187P1Fペプチド及び野生型のＷＴ１187ペプチドの両方を認識できること、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性であり、内因性に提示された野生型のＷＴ１187ペプチドを認識して、細胞傷害活性を示すことが明らかとなった。【０１４３】
図１８に、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性のドナーのＰＢＭＣｓをＷＴ１187P2Mペプチドで刺激して誘導したＣＴＬｓの細胞傷害活性を測定した結果を示す。図１８において、縦軸は細胞傷害活性を、横軸は、ペプチド刺激により得られたＣＤ８陽性Ｔ細胞（エフェクター：Ｅ）と標的細胞（ターゲット：Ｔ）との比（Ｅ／Ｔ比）をそれぞれ表す。図１８ａでは、菱型（◆）は、標的細胞としてＢ−ＬＣＬ細胞を用いた場合を、四角（■）は、標的細胞としてＷＴ１187ペプチドをパルスしたＢ−ＬＣＬ細胞を用いた場合を、三角（▲）は、標的細胞として、ＷＴ１187P2MペプチドをパルスしたＢ−ＬＣＬ細胞を用いた場合を、それぞれ表す。図１８ｂでは、菱型（◆）は、標的細胞としてＫ５６２細胞を用いた場合を、四角（■）は、標的細胞として、Ｋ５６２細胞にＨＬＡ−Ａ＊０２０６遺伝子を導入し内因性にＷＴ１の抗原ペプチドを提示させた０２０６Ｋ５６２細胞を用いた場合を、それぞれ表す。【０１４４】
ＷＴ１187P2Mペプチドで誘導したＣＴＬｓは、ＷＴ１187ペプチドをパルスしたＢ−ＬＣＬ細胞及びＷＴ１187P2MペプチドをパルスしたＢ−ＬＣＬ細胞に対して同等な細胞傷害活性を示し、その活性はペプチドをパルスしていないＢ−ＬＣＬ細胞に対してよりも強かった（図１８ａ）。また、標的細胞としてＨＬＡ−Ａ＊０２０６陰性かつＷＴ１陽性のＫ５６２細胞と、Ｋ５６２細胞にＨＬＡ−Ａ＊０２０６遺伝子を導入し内因性にＷＴ１の抗原ペプチドを提示させた細胞（０２０６Ｋ５６２細胞）を用いた場合、ＷＴ１187P2Mペプチドで誘導したＣＴＬｓは、０２０６Ｋ５６２細胞に対して、Ｋ５６２細胞に対してよりも強い細胞傷害活性を示した（図１８ｂ）。これらの結果からＷＴ１187P2Mペプチド刺激で誘導されたＣＴＬｓは、ＷＴ１187P2Mペプチド及び野生型のＷＴ１187ペプチドの両方を認識できること、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性であり、内因性に提示された野生型のＷＴ１187ペプチドを認識して、細胞傷害活性を示すことが明らかとなった。【０１４５】
実施例９〜１２の結果から、ＷＴ１126ペプチドの改変ペプチドであるＷＴ１126P1Fペプチド、ＷＴ１126P2Lペプチド、ＷＴ１126P3Mペプチド及びＷＴ１126P9Vペプチドの刺激で誘導されたＣＴＬｓは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性であり、内因性に提示された野生型のＷＴ１126ペプチドを認識して、細胞傷害活性を示すことが明らかとなった。中でも、ＷＴ１126P9Vペプチド、ＷＴ１126P2Lペプチド及びＷＴ１126P3Mペプチドは効果が高かった。
ＷＴ１187ペプチドの改変ペプチドであるＷＴ１187P1Fペプチド、ＷＴ１187P2Mペプチド及びＷＴ１187P3Mペプチドの刺激で誘導されたＣＴＬｓは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性であり、内因性に提示された野生型のＷＴ１187ペプチドを認識して、細胞傷害活性を示すことが明らかとなった。中でも、ＷＴ１187P2Mペプチド及びＷＴ１187P1Fペプチドは効果が高かった。
従って、これらの改変ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者においてＷＴ１遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌の治療及び予防に有効であることが示された。【０１４６】
ＷＴ１126ペプチドの改変ペプチドであるＷＴ１126P1Fペプチド、ＷＴ１126P2Lペプチド、ＷＴ１126P3Mペプチド及びＷＴ１126P9Vペプチドの刺激で誘導されたＣＴＬｓは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性であり、内因性に提示された野生型のＷＴ１126ペプチドを認識して、細胞傷害活性を示すことが明らかとなった。中でも、ＷＴ１126P1Fペプチド及びＷＴ１126P2Lペプチドは効果が高かった。
ＷＴ１187ペプチドの改変ペプチドであるＷＴ１187P1Fペプチド、ＷＴ１187P2Mペプチド及びＷＴ１187P3Mペプチドの刺激で誘導されたＣＴＬｓは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性であり、内因性に提示された野生型のＷＴ１187ペプチドを認識して、細胞傷害活性を示すことが明らかとなった。中でも、ＷＴ１187P2Mペプチド及びＷＴ１187P1Fペプチドは効果が高かった。従って、これらの改変ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者においてＷＴ１遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌の治療及び予防に有効であることが示された。【０１４７】
実施例１３  ＷＴ１187P2Vペプチド（ＳＶＧＥＱＱＹＳＶ；配列番号１３；H-Ser-Val-Gly-Glu-Gln-Gln-Tyr-Ser-Val-OH）の合成
１．保護ペプチド樹脂(H-Ser(tBu)-Val-Gly-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Val-Alko-Resinの合成
Fmoc-Val-Alko-樹脂（ここで、Alkoはｐ−アルコキシベンジルアルコール）０．４ｇ(渡辺化学製；０．８０ｍｍｏｌ／ｇ）をAdvanced ChemTech社製ACT496型固相合成機の反応槽内に入れ、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド）で洗浄（工程１）、２５％ピペリジンＤＭＦ溶液で処理（５分×１回及び３０分×１回）してＦｍｏｃ基を切断後（工程２）、再びＤＭＦで樹脂を洗浄し（工程３）H-Val-Alko-樹脂を得た。この反応槽内にＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリジノン）０．７ｍＬ、及びＤＩＰＣＩ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド）１２１ｍｇ（０．９６ｍｍｏｌ）のＮＭＰ溶液０．９ｍＬを加え、更にFmoc-Ser(tBu)-OH ３６８ｍｇ（０．９６ｍｍｏｌ）及びＨＯＢＴ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）１水和物１４７ｍｇ（０．９６ｍｍｏｌ）のＮＭＰ溶液１．８ｍＬを加えて６０分間室温でカップリング反応を行った（工程４）。同量のFmoc-Ser(tBu)-OH、ＨＯＢＴ１水和物、及びＤＩＰＣＩを用いて再度カップリング反応を行い（工程５）樹脂をＤＭＦで洗浄（工程６）、脱保護（工程７）、及び洗浄（工程８）を行うことによりH-Ser(tBu)-Val-Alko-樹脂を得た。次いで工程４から工程８を繰り返すことによりFmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Val-OH、及びFmoc-Ser(tBu)-OHを順次カップリングした。反応槽よりペプチド樹脂を取り出しエーテルで洗浄、その後減圧乾燥することによりH-Ser(tBu)-Val-Gly-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Val-Alko-Resin  ９８０ｍｇを得た。上記合成工程の概要を表６に示す。【０１４８】
＜合成工程＞
【表６】
0005478260.tif 000008
【０１４９】
２．保護ペプチド樹脂の脱保護
H-Ser(tBu)-Val-Gly-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Val-Alko-Resin ９８０ｍｇにトリフルオロ酢酸／水／トリイソプロピルシラン（９５／２．５／２．５（容量比））混合液５ｍＬを加え、室温で２．５時間攪拌した。樹脂を濾去し濾液を冷ジエチルエーテルに加え、得られた析出物をグラスフィルターで濾取した。濾上物をジエチルエーテルで洗浄し、減圧乾燥することにより粗ペプチド２６８ｍｇを得た。【０１５０】
３．粗ペプチドの精製
得られた粗ペプチド２６８ｍｇを２０％酢酸水に溶解し逆相液体クロマトグラフィーにより精製した。
ポンプ：島津LC-8A
カラム：YMC-Pack Pro C18 AS12S11-2530WT 3cmΦ×25cm
溶出液１：H2O/0.1%TFA
溶出液２（２液）：CH3CN/0.1%TFA
流速：10mＬ/min
検出：UV220nm【０１５１】
カラムを２液濃度１％で平衡化した後、粗ペプチド溶液をチャージした。その後３０分間かけて２液濃度８％に上昇させ、さらに１２０分間かけて２液濃度を１４％に上昇させた。目的物を含む分画を集めアセトニトリルを減圧留去し、凍結乾燥することにより、目的とするＷＴ１187P2Vペプチド（ＳＶＧＥＱＱＹＳＶ；配列番号１３；H-Ser-Val-Gly-Glu-Gln-Gln-Tyr-Ser-Val-OH）１０５ｍｇを得た。
精製後のペプチドのＨＰＬＣ分析及び質量分析に用いた条件は、以下のとおりである。【０１５２】
HPLC分析（島津LC-10Avp）
カラム：YMC-Pack Pro C18 AS-302 4.6mmΦ×150mm
溶出液１：H2O/0.1%TFA
溶出液２：CH3CN/0.1%TFA
グラディエント：溶出液２の濃度を３０分間で１０％から４０％に上昇させた。
流速：1mL/min
検出：UV220nm
純度：97.4%、保持時間：11.22分【０１５３】
アミノ酸分析（日立L-8500アミノ酸分析装置）
加水分解：1%フェノール/6N塩酸水、110℃  24時間
分析法：ニンヒドリン法
Ser:1.78(2)  Glx:3.26(3)  ＊ Gly:(1)  Val:2.04(2)  Tyr:1.06(1)
＊) Gly=基準アミノ酸、 (  ) 内  理論値【０１５４】
質量分析（Applied Biosystems API 150EX質量分析計）
m/z =996.9 [M+1]＋   (理論値＝996.5)
アミノ酸配列分析（Applied Biosystems 491 プロテインシークエンサー）
N末SerからC末Valまで順次確認した。【０１５５】
上記と同様にして、表７及び表８に示した各ペプチドを合成した。【０１５６】
【表７】
0005478260.tif 000009
【０１５７】
【表８】
0005478260.tif 000010
【０１５８】
表９〜表１２に示した各ペプチドも、同様にして合成した。ただし、精製後のペプチドのＨＰＬＣ分析及び質量分析に用いた条件は、以下のとおりである。
HPLC分析（Agilent HP1100又はThermo Fisher Scientific Surveyor）
カラム：Thermo Fischer Scientific BioBasic-18 3mmΦ×250mm
溶出液１：H2O/0.1%TFA
溶出液２：CH3CN/0.1%TFA
グラディエント：溶出液２の濃度を２０分間かけて表中記載の濃度に変化させた。
流速：0.4mL/min
検出：215nm【０１５９】
質量分析
Thermo Bioanalysis Dynamo質量分析計（MALDI-TOF）【０１６０】
【表９】
0005478260.tif 000011
【０１６１】
【表１０】
0005478260.tif 000012
【０１６２】
【表１１】
0005478260.tif 000013
【０１６３】
【表１２】
0005478260.tif 000014
【０１６４】
実施例１４  （ＨＬＡ−Ａ＊０２０１発現トランスジェニックマウスを用いた改変ペプチドの特異的免疫細胞誘導活性能の評価、及び誘導された特異的免疫細胞の野生型ペプチドに対する交差反応性の確認）
＜方法＞
（１）改変ペプチド候補
ＷＴ１187ペプチド、ＷＴ１126ペプチド及びこれらの改変ペプチド（ＷＴ１187ペプチド又はＷＴ１126ペプチドのＮ末端から１番目、２番目、３番目又は９番目の一つ又は二つのアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換したペプチド）について、当該技術分野において既知の方法であるBIMAS（http://www.mpiib-berlin.mpg.de/MAPPP/binding.html）、SYFPEITHI（http://www.mpiib-berlin.mpg.de/MAPPP/binding.html）、RANLPEP（http://immunax.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html）及びNetMHC3.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/）の４つのコンピューターデータベースの方法を利用して、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子に対する結合性（親和性）を分析した。ＷＴ１187ペプチド及びその改変ペプチドの分析結果を表１３〜１６及び表２１に、ＷＴ１126ペプチド及びその改変ペプチドの分析結果を表１７〜２０及び表２２〜２３に、それぞれ示した。推定される結合性の高さをスコア(Score)によって示す。【０１６５】
【表１３】
0005478260.tif 000015
【０１６６】
【表１４】
0005478260.tif 000016
【０１６７】
【表１５】
0005478260.tif 000017
【０１６８】
【表１６】
0005478260.tif 000018
【０１６９】
【表１７】
0005478260.tif 000019
【０１７０】
【表１８】
0005478260.tif 000020
【０１７１】
【表１９】
0005478260.tif 000021
【０１７２】
【表２０】
0005478260.tif 000022
【０１７３】
【表２１】
0005478260.tif 000023
【０１７４】
【表２２】
0005478260.tif 000024
【０１７５】
【表２３】
0005478260.tif 000025
【０１７６】
いずれか１つのデータベースでも野生型ペプチド（ＷＴ１187ペプチド又はＷＴ１126ペプチド）と同等又はそれ以上の結合性を有すると推定された改変ペプチドを、野生型ペプチドとともに、続く（２）〜（４）の試験の対象とした。【０１７７】
（２）ペプチドの薬剤調製と投与
実施例１３で合成し凍結乾燥したペプチドを、ＤＭＳＯ（ナカライテスク社製）にて４０ｍｇ／ｍＬに調製した。その後、調製したペプチドＤＭＳＯ液３２．５μＬと５４０μＬの注射用蒸留水（大塚製薬社製）とを混合した。次に、この混合液の５５０μＬを、ガラスシリンジを用いて、７００μＬのフロイントの不完全アジュバント（Montanide ISA51）と混合することによりwater-in-oilエマルションを作製した。３００μＬの当該薬剤（water-in-oilエマルション）をＨＬＡ−Ａ＊０２０１発現トランスジェニックマウス（ストレイン名 HLA-A2+HLA-DR1+/Iaβ°β2m、EMMA ID番号 EM:01783）の尾根部皮下に免疫した。１ペプチドあたり２又は３匹のマウスを利用して評価した。【０１７８】
（３）脾細胞の調製
免疫７日後に脾臓を摘出した。スライドガラスのフロスト部分にて擦り破壊したのちACK Lysing Buffer（Lonza社製）にて溶血処理することにより、脾細胞を調製した。このときＣＴＭ（Complete T-cell Medium、インビトロジェン社製のＲＰＭＩ−１６４０培地に、１０％ＦＢＳ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、１％ＭＥＭビタミン及び５５μＭ  ２−メルカプトエタノールを最終濃度で添加）を培地として用い、脾細胞濃度５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した。【０１７９】
（４）Ｅｌｉｓｐｏｔ法
ＩＦＮγを指標としたＥＬＩＳＰＯＴ法を実施することにより、投与したペプチドがＷＴ１特異的免疫細胞の誘導活性を有するか評価した。方法は添付書に従って行なった。ＥＬＩＳＰＯＴ（日本ベクトンディッキンソン社製  カタログ番号  ５５１０８３）のプレートに、先ずＣＴＭ培地を１ウェルあたり５０μＬずつ播種したのち、脾細胞含有液を１００μＬずつ播種した（１ウェルあたり５×１０５ｃｅｌｌｓ）。更に、投与ペプチド又は野生型ペプチドを１ウェルあたり５０μＬずつ添加した（ペプチド最終濃度２μｇ／ｍＬ）。当アッセイ方法は細胞傷害活性を予測できる代替法の一つとして知られている（J.Immunological Methods, 1995, 181, 45-54）。【０１８０】
＜結果＞
ＷＴ１187ペプチドの改変ペプチドの特異的細胞免疫誘導活性の評価結果を図１９〜図２２及び図２８〜図２９に、ＷＴ１126ペプチドの改変ペプチドの評価結果を図２３〜図２７及び図３０〜３２にそれぞれ示す。図１９〜図３２のそれぞれの図において、縦軸は脾細胞５×１０５個中に存在する抗原ペプチド特異的反応細胞の数（Ｓｐｏｔｓ／５×１０５ｃｅｌｌｓ）を、横軸は評価に用いたマウス個体（２又は３匹）を、それぞれ示す。白の棒グラフは、抗原ペプチド未刺激の際に反応した特異的免疫細胞の数、灰色の棒グラフは野生型ペプチドによる刺激に反応した特異的免疫細胞の数、黒の棒グラフは投与（改変）ペプチドによる刺激に反応した特異的免疫細胞の数を、それぞれ示す。【０１８１】
図１９〜３２の各図は、以下のペプチドの特異的細胞免疫誘導活性を、それぞれ示す。
図１９  ａ：ＷＴ１187P1Aペプチド、ｂ：ＷＴ１187P1Fペプチド、ｃ：ＷＴ１187P1Gペプチド、ｄ：ＷＴ１187P1Iペプチド、ｅ：ＷＴ１187P1Lペプチド、ｆ；ＷＴ１187P1Mペプチド。
図２０  ａ：ＷＴ１187P1Vペプチド、ｂ：ＷＴ１187P1Wペプチド、ｃ：ＷＴ１187P2Iペプチド、ｄ：ＷＴ１187P2Mペプチド、ｅ：ＷＴ１187P2Qペプチド、ｆ：ＷＴ１187P2Vペプチド。
図２１  ａ：ＷＴ１187P3Aペプチド、ｂ：ＷＴ１187P3Fペプチド、ｃ：ＷＴ１187P3Iペプチド、ｄ：ＷＴ１187P3Lペプチド、ｅ：ＷＴ１187P3Mペプチド、ｆ：ＷＴ１187P3Pペプチド。
図２２  ａ：ＷＴ１187P3Sペプチド、ｂ：ＷＴ１187P3Vペプチド、ｃ：ＷＴ１187P3Wペプチド、ｄ：ＷＴ１187P3Yペプチド、ｅ：ＷＴ１187P9Lペプチド。【０１８２】
図２３  ａ：ＷＴ１126P1Aペプチド、ｂ：ＷＴ１126P1Fペプチド、ｃ：ＷＴ１126P1Gペプチド、ｄ：ＷＴ１126P1Iペプチド、ｅ：ＷＴ１126P1Lペプチド、ｆ：ＷＴ１126P1Mペプチド。
図２４  ａ：ＷＴ１126P1Vペプチド、ｂ：ＷＴ１126P1Wペプチド、ｃ：ＷＴ１126P2Aペプチド、ｄ：ＷＴ１126P2Iペプチド、ｅ：ＷＴ１126P2Lペプチド、ｆ：ＷＴ１126P2Qペプチド。
図２５  ａ：ＷＴ１126P2Vペプチド、ｂ：ＷＴ１126P3Aペプチド、ｃ：ＷＴ１126P3Gペプチド、ｄ：ＷＴ１126P3Iペプチド、ｅ：ＷＴ１126P3Lペプチド、ｆ：ＷＴ１126P3Mペプチド。
図２６  ａ：ＷＴ１126P3Pペプチド、ｂ：ＷＴ１126P3Vペプチド、ｃ：ＷＴ１126P3Wペプチド、ｄ：ＷＴ１126P9Aペプチド、ｅ：ＷＴ１126P9Iペプチド、ｆ：ＷＴ１126P9Mペプチド。
図２７：ＷＴ１126P9Vペプチド。【０１８３】
図２８  ａ：ＷＴ１187P1Dペプチド、ｂ：ＷＴ１187P1Eペプチド、ｃ：ＷＴ１187P1Hペプチド、ｄ：ＷＴ１187P1Kペプチド。
図２９  ａ：ＷＴ１187P1Nペプチド、ｂ：ＷＴ１187P1Pペプチド、ｃ：ＷＴ１187P1Qペプチド、ｄ：ＷＴ１187P1Rペプチド、ｅ：ＷＴ１187P1Tペプチド。
図３０  ａ：ＷＴ１126P1Dペプチド、ｂ：ＷＴ１126P1Eペプチド、ｃ：ＷＴ１126P1Hペプチド、ｄ：ＷＴ１126P1Kペプチド、ｅ：ＷＴ１126P1Nペプチド、ｆ：ＷＴ１126P1Pペプチド。
図３１  ａ：ＷＴ１126P1Qペプチド、ｂ：ＷＴ１126P1Sペプチド、ｃ：ＷＴ１126P1Tペプチド、ｄ：ＷＴ１126P2I&P9Iペプチド、ｅ：ＷＴ１126P2I&P9Vペプチド、ｆ：ＷＴ１126P2L&P9Iペプチド。
図３２：ＷＴ１126P2L&P9Vペプチド。【０１８４】
これらの結果から、ＷＴ１187P1Dペプチド、ＷＴ１187P1Eペプチド、ＷＴ１187P1Hペプチド、ＷＴ１187P1Pペプチド若しくはＷＴ１187P2Qペプチド、又はＷＴ１126P1Dペプチド、ＷＴ１126P1Eペプチド、ＷＴ１126P1Pペプチド、ＷＴ１126P2Aペプチド若しくはＷＴ１126P2Qペプチドを除く改変ペプチドを投与した場合に、顕著に特異的免疫細胞が効率よく誘導されることが判明した。【０１８５】
次に、改変ペプチドにより誘導された特異的免疫細胞の野生型ペプチドに対する交差反応性について解析した（表２４〜２５）。その結果、ＷＴ１187改変ペプチドのうち、ＷＴ１187P1Aペプチド、ＷＴ１187P1Iペプチド、ＷＴ１187P1Lペプチド、ＷＴ１187P1Mペプチド、ＷＴ１187P1Nペプチド、ＷＴ１187P1Qペプチド、ＷＴ１187P1Tペプチド、ＷＴ１187P1Vペプチド、ＷＴ１187P2Vペプチド、ＷＴ１187P2Mペプチド、ＷＴ１187P2Iペプチド、ＷＴ１187P3Aペプチド、ＷＴ１187P3Fペプチド、ＷＴ１187P3Pペプチド、ＷＴ１187P3Sペプチド、ＷＴ１187P3Vペプチド及びＷＴ１187P9Lペプチドが、ＷＴ１126改変ペプチドのうち、ＷＴ１126P1Sペプチド、ＷＴ１126P2Iペプチド、ＷＴ１126P2Lペプチド、ＷＴ１126P2Vペプチド、ＷＴ１126P3Wペプチド、ＷＴ１126P9Iペプチド、ＷＴ１126P9Mペプチド及びＷＴ１126P9Vペプチドが、改変ペプチド及び野生型ペプチドの両者を効率よく認識可能な特異的免疫細胞を特に誘導できることが判明した。【０１８６】
【表２４】
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【０１８７】
【表２５】
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【産業上の利用可能性】
【０１８８】
本発明の癌ワクチン組成物は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性者のＷＴ１を発現する癌の治療及び予防に用いる医薬として有用である。本発明の癌ワクチン組成物はまた、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性者のＷＴ１を発現する癌の治療及び予防に用いる医薬として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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