(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フォワードプライマーとして配列番号１から７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、リバースプライマーとして配列番号８から１５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを組み合わせて使用することを特徴とするヒトパピローマウイルス核酸増幅用プライマーセット。
【請求項２】
請求項１に記載のプライマーセットに由来する増幅反応が進行したか否かによって存在の有無を決定する試料中のヒトパピローマウイルスの検出方法。
【請求項３】
配列番号４３で示される塩基配列の連続する１８〜２５塩基及び配列番号４４で示される塩基配列の連続する１９〜２７塩基を有するオリゴヌクレオチドプライマーを含む請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項４】
配列番号４３で示される塩基配列及び配列番号４４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを含む請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項５】
請求項１に記載のプライマーセットに由来する増幅反応が進行したか否かによって試料中のヒトパピローマウイルスの存在の有無を決定するにあたり、存在が否定された場合に配列番号４３で示される塩基配列及び配列番号４４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーに由来する増幅産物を検出することで反応液中の増幅反応の進行を保証する試料中のヒトパピローマウイルスの検出方法。
【請求項６】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットと、配列番号１６から４１で示される塩基配列の連続する１４から全長の長さを有するオリゴヌクレオチドから一つ以上選択されるオリゴヌクレオチドプローブを用いて解析する工程を含む、試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングする方法。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドプローブが配列番号１６から４１で示される塩基配列の連続する１４から全長の長さを有するオリゴヌクレオチドセットである請求項６に記載の試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングする方法。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドプローブが配列番号１６から４１で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドから一つ以上選択される請求項６に記載の試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングする方法。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドプローブが配列番号１６から４１で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドセットである請求項６に記載の試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングする方法。
【請求項１０】
請求項１に記載のプライマーセットに由来する増幅反応が進行したか否かによって存在の有無を決定する試料中のヒトパピローマウイルスを検出するためのキット。
【請求項１１】
請求項１に記載のプライマーセットに由来する増幅反応が進行したか否かによって試料中のヒトパピローマウイルスの存在の有無を決定するにあたり、存在が否定された場合に配列番号４３で示される塩基配列及び配列番号４４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーに由来する増幅産物を検出することで反応液中の増幅反応の進行を保証する試料中のヒトパピローマウイルスを検出するためキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のヒトパピローマウイルスの検出及びタイピングを実施するためのオリゴヌクレオチドおよびそのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパピローマウイルス(HPV)は子宮頸癌またはその前癌病変から高率(90%以上)に検出される。HPVはこれまで80以上の遺伝子型が報告されているが、その中で産婦人科領域で感染が確認される型は30種程度であり、さらに癌化のリスクによりグループ化される。したがって、頸部スワブ等の臨床検体からHPVを検出しタイピングすることによりリスクを予測することは非常に重要である。
【０００３】
従来のHPV検出及びタイピング法としてはハイブリッド・キャプチャー法、PCR-RFLP法、ラインプローブ法、DNAアレイ法などが知られているが、感度が低かったり、操作が煩雑であるといった問題点があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、上記のような課題を解決して、明確かつ再現性よく試料中のHPVを検出し、必要に応じてタイピングするためのオリゴヌクレオチドまたは試薬キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究の結果、特定のプライマーセットにより試料中のHPV配列を効率よく増幅させることでHPVの検出を行い、それぞれの増幅産物中のわずかな配列的特徴を認識可能なタイピング用プローブセットを開発することで本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
【０００６】
項１.  フォワードプライマーとして配列番号１で示される塩基配列の連続する１８〜２４塩基及び配列番号２から７の中から選択される一つ以上の塩基配列の連続する１８〜２４塩基を有するオリゴヌクレオチド、リバースプライマーとして配列番号８で示される塩基配列の連続する１６から２１塩基及び配列番号９から１５の中から選択される一つ以上の塩基配列の連続する１６から２１塩基を有するオリゴヌクレオチドを組み合わせて使用することを特徴とするヒトパピローマウイルス核酸増幅用プライマーセット。
項２.  フォワードプライマーとして配列番号１で示される塩基配列の連続する１８〜２４塩基及び配列番号２から７の塩基配列の連続する１８〜２４塩基を有するオリゴヌクレオチド、リバースプライマーとして配列番号８で示される塩基配列の連続する１６から２１塩基及び配列番号９から１５の塩基配列の連続する１６から２１塩基を有するオリゴヌクレオチドを組み合わせて使用することを特徴とするヒトパピローマウイルス核酸増幅用プライマーセット。
項３.  フォワードプライマーとして配列番号１及び配列番号２から７の一つ以上、リバースプライマーとして配列番号８及び配列番号９から１５の一つ以上を組み合わせて使用することを特徴とするヒトパピローマウイルス核酸増幅用プライマーセット。
項４.  フォワードプライマーとして配列番号１から７のオリゴヌクレオチド、リバースプライマーとして配列番号８から１５のオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とするヒトパピローマウイルス核酸増幅用プライマーセット。
項５.  項１〜４に記載のプライマーセットに由来する増幅反応が進行したか否かによって存在の有無を決定する試料中のヒトパピローマウイルスの検出方法。
項６.  配列番号４３で示される塩基配列の連続する１８〜２５塩基及び配列番号４４で示される塩基配列の連続する１９〜２７塩基を有するオリゴヌクレオチドプライマーを含む項１〜４のプライマーセット。
項７.  配列番号４３で示される塩基配列及び配列番号４４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを含む項１〜４のプライマーセット。
項８.  項１〜４に記載のプライマーセットに由来する増幅反応が進行したか否かによって試料中のヒトパピローマウイルスの存在の有無を決定するにあたり、存在が否定された場合に配列番号４３で示される塩基配列及び配列番号４４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーに由来する増幅産物を検出することで反応液中の増幅反応の進行を保証する試料中のヒトパピローマウイルスの検出方法。
項９.  核酸を増幅させる方法が、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲおよびＴＭＡからなる群から選ばれたいずれかの方法である項１〜８に記載の方法。
項１０.  項１〜４記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットと、各増幅産物特異配列に実質的に相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて解析する工程を含む、試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングする方法。
項１１.  オリゴヌクレオチドプローブが配列番号１６から４１で示される塩基配列の連続する１４から全長の長さを有するオリゴヌクレオチドから一つ以上選択される項１０記載の試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングする方法。
項１２.  オリゴヌクレオチドプローブが配列番号１６から４１で示される塩基配列の連続する１４から全長の長さを有するオリゴヌクレオチドセットである項１０記載の試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングする方法。
項１３.  オリゴヌクレオチドプローブが配列番号１６から４１で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドから一つ以上選択される項１０記載の試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングする方法。
項１４.  オリゴヌクレオチドプローブが配列番号１６から４１で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドセットである項１０記載の試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングする方法。
項１５.  配列番号４３および４４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーセットおよび配列番号４２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを含む項１０〜１４記載の試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングする方法。
項１６.  オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはオリゴヌクレオチドプローブが標識されているか、水不溶性単体に固定されていることを特徴とする項１０〜１５記載の試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングする方法。
項１７.  標識が、蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質、ビオチン、ハプテン、抗原、抗体よりなる群から選ばれたいずれかである項１６記載の試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングする方法。
項１８.  項１〜４に記載のプライマーセットに由来する増幅反応が進行したか否かによって存在の有無を決定する試料中のヒトパピローマウイルスを検出するためのキット。
項１９.  項１〜４に記載のプライマーセットに由来する増幅反応が進行したか否かによって試料中のヒトパピローマウイルスの存在の有無を決定するにあたり、存在が否定された場合に配列番号４３で示される塩基配列及び配列番号４４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーに由来する増幅産物を検出することで反応液中の増幅反応の進行を保証する試料中のヒトパピローマウイルスを検出するためキット。
項２０.  項１〜４記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットと、各増幅産物特異配列に実質的に相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて解析する工程を含む、試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングするためのキット。
項２１.  オリゴヌクレオチドプローブが配列番号１６から４１で示される塩基配列の連続する１４から全長の長さを有するオリゴヌクレオチドから一つ以上選択される項２０記載の試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングするためのキット。
項２２.  オリゴヌクレオチドプローブが配列番号１６から４１で示される塩基配列の連続する１４から全長の長さを有するオリゴヌクレオチドセットである項２０記載の試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングするためのキット。
項２３.  オリゴヌクレオチドプローブが配列番号１６から４１で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドから一つ以上選択される項２０記載の試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングするためのキット。
項２４.  オリゴヌクレオチドプローブが配列番号１６から４１で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドセットである項２０記載の試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングするためのキット。
項２５.  配列番号４３および４４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーセットおよび配列番号４２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを含む項２０〜２４記載の試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングする方法。
項２６.  オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはオリゴヌクレオチドプローブが標識されているか、水不溶性単体に固定されていることを特徴とする項２０〜２５記載の試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングするためのキット。
項２７.  標識が、蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質、ビオチン、ハプテン、抗原、抗体よりなる群から選ばれたいずれかである項２６記載の試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングするためのキット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、明確かつ再現性よく試料中のHPVを検出し、必要に応じてタイピングすることができるオリゴヌクレオチドおよびキットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。試料中のHPVを増幅させるためのフォワードプライマーとしては上述のように配列表の配列番号１で示される塩基配列の連続する１８ないし２４塩基及び配列番号２から７の中から選択される一つ以上の塩基配列の連続する１８ないし２４塩基を有するオリゴヌクレオチドからなり、好ましくは配列番号１から７で示される塩基配列の連続する２４塩基である。
【０００９】
同じく、リバースプライマーとしては配列番号８で示される塩基配列の連続する１６ないし２１塩基及び配列番号９から１５の中から選択される一つ以上の塩基配列の連続する１６ないし２１塩基を有するオリゴヌクレオチドからなり、好ましくは配列番号８から１５で示される塩基配列の連続する２１塩基である。
【００１０】
フォワードプライマー、リバースプライマーともにそれぞれ配列番号１、配列番号８で示される塩基配列以外に一つ以上選択されるプライマーは目的に応じて選択されても良いし全てが選択されても良い。
【００１１】
各プライマーセットに由来する増幅反応が進行したか否かによって試料中のヒトパピローマウイルス存在の有無を決定するにあたっては公知の様々な検出方法が利用されうる。例えばアガロースゲル電気泳動法、ポリアクリルアミド電気泳動法、フラグメント解析法、蛍光物質による検出方法などが挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００１２】
配列番号４３で示される塩基配列の連続する１８ないし２５塩基を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号４４で示される塩基配列の連続する１９〜２７塩基を有するオリゴヌクレオチドを配列番号１〜１５のプライマーセットと共に使用するとで、試料中のヒトβアクチン遺伝子を増幅することが可能となり、HPV由来の増幅産物が得られなかった際に、少なくとも核酸抽出、増幅までの工程が正常に進行していることが可能となる。より好ましい形態は、それぞれ連続した２５塩基と２７塩基であり、配列番号１〜１５のプライマーセットと同じ増幅条件でHPV由来の増幅反応に影響を与えることなく特異的に増幅反応を進行させることができる。
【００１３】
増幅反応に先立つ試料からのHPV DNAの抽出方法に関しては、HPV DNAが抽出可能な方法であれば特に限定されない。例えば、フェノール・クロロホルム法や市販の核酸抽出キット(東洋紡製、QIAGEN製  等)などがあげられる。
【００１４】
核酸増幅方法としては、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-based amplification method；Ｎａｔｕｒｅ  第３５０巻、第９１頁(1991)）、ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報、特開平２−２９３４号公報）、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification：Nucleic acid research  第２０巻、第１６９１頁(1992)）、ＲＣＲ（国際公開９０／１０６９号公報）、ＴＭＡ（Transcription mediated amplification method；J.Clin.Microbiol.  第３１巻、第３２７０頁(1993)）などが挙げられる。
【００１５】
なかでもＰＣＲ法は、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のオリゴヌクレオチド及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各オリゴヌクレオチドと、それぞれに相補的な一本鎖試料核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各オリゴヌクレオチドを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２ｎ倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。よって、遺伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも検出することが可能であり、最近非常に広く用いられている技術である。
【００１６】
本発明は、配列番号５，９，１０，１１，１２及び１３で示される塩基配列を有するグループ１のオリゴヌクレオチドと、配列番号２，３，４，７及び１５で示される塩基配列を有するグループ２のオリゴヌクレオチドと、配列番号１，６，８及び１４で示される塩基配列を有するグループ３のオリゴヌクレオチドを、グループ１：グループ２：グループ３＝１：２：３の比率で混合し、核酸増幅方法を行い、増幅反応が進行したか否かによって存在の有無を決定する試料中のヒトパピローマウイルスの検出方法でもある。
【００１７】
配列番号１〜１５に示されるオリゴヌクレオチドプライマーセットを用いた各増幅産物特異配列に実質的に相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いることで、試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングすることができる。
【００１８】
オリゴヌクレオチドプローブは配列番号１６から４１で示される塩基配列の連続する１４ないしそれぞれの配列の全長までの長さを有するオリゴヌクレオチドから一つ以上選択することができる。より好ましくはそれぞれの配列の全長の長さを有するオリゴヌクレオチドプローブである。
【００１９】
増幅反応時に、配列番号４３および４４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーセットを同時に使用しておけば配列番号４２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いることでヒトゲノム由来増幅産物の有無を確認することもできる。
【００２０】
本発明においては、オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはオリゴヌクレオチドプローブを標識されているか、水不溶性単体に固定して使用することも可能である。
【００２１】
標識するにあたっては、蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質、ビオチン、ハプテン、抗原、抗体などが使用できる。
蛍光化学物質としては、ＦＩＴＣ，６−ＦＡＭ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＴＡＭＲＡ，テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５などが挙げられる。発光団としては、ルテニウムなどが挙げられる。酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。
【００２２】
本発明において、キットとしては、ヒトパピローマウイルス用プライマーセット（フォワードプライマー及びリバースプライマー）、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含むものである。
【００２３】
該各オリゴヌクレオチドは、予め上述したような蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質、ビオチン、ハプテン、抗原、抗体などによって標識されていてもよい。
【００２４】
また、キットとしては、ヒトパピローマウイルス用プライマーセット（フォワードプライマー及びリバースプライマー）、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びヒトパピローマウイルス特異検出用オリゴヌクレオチドプローブを含む。
【００２５】
各プライマー及び／またはオリゴヌクレオチドプローブは、予め上述したような蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質、ビオチン、ハプテン、抗原、抗体などによって標識されていてもよい。
【００２６】
検出方法は標識の種類に応じて選択されれば良く、特に限定されるものではない。例えば、プライマー、プローブが異なる蛍光化学物質で標識されている場合は、蛍光検出器、フローサイトメーター等を利用することができる。また、FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer）を利用した検出をしても良い。一方がビオチン、他方が蛍光化学物質や発光団等の場合は、ビオチン標識を利用してハイブリッドの捕捉を行い、捕捉されたハイブリッドの標識を測定する方法などが考えられる。またビオチンと抗原等の両方が捕捉可能な物質の場合は、例えばアビジンを固定した通液フィルターでハイブリッドを捕捉し、次に酵素標識抗体を反応ご当該酵素の発色もしくは発光基質を添加することで検出することも可能である。
【００２７】
このように、本発明の方法では、試料中のHPVをバランス良く効率的に増幅可能なプライマーセット、およびそれぞれの増幅産物中のわずかな配列的特徴を認識可能なオリゴヌクレオチドプローブセット、およびそれらを用いた検出法、タイピング法、それらのキットを提供されるので、明確かつ再現性よく試料中のHPVを検出し、必要に応じてタイピングすることができる。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２９】
（実施例１  HPV DNAの検出）
（１）各種オリゴヌクレオチドの合成
配列番号1〜44に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ1〜44と示す）及びその標識物の合成は、DNA合成受託会社(プロリゴジャパン、(株)日本バイオサービス、等)に依頼した。尚、オリゴ1〜7は、実施例2以降の検討で使用することを考慮して5'末端をFITCで標識した。
【００３０】
（２）陽性コントロールプラスミドの作成
26種のHPV(6、11、16、18、30、31、33、34、35、39、42、44、45、51、52、53、54、55、56、58、59、61、66、68、70、82)のL1遺伝子領域を含む陽性コントロールプラスミドを作成した。
【００３１】
（３）PCR法によるHPV DNAの増幅および検出
(3)-1  PCR法による増幅反応
上述の各陽性コントロールプラスミド、104コピーを使用し、下記試薬を添加して、下記条件によりHPV DNAの増幅反応を実施した。比較実験として公知プライマーペア(オリゴ1とオリゴ8)のみを使用した増幅反応を実施した。
【００３２】
試薬
以下の試薬を含む25μｌ溶液を調製した。
PCR反応液
プライマー(オリゴ1〜15)混合溶液＊       2.0 μl  
×10緩衝液                              2.5 μl
2 mM dNTP                               2.5 μl
25 mM  MgCl2                            1.5 μl
Blend Taq-plus DNAポリメラーゼ          1.0 Ｕ
プラスミドDNA溶液                       104copies
【００３３】
＊:  プライマー(オリゴ1〜15)混合溶液 2.0 μl中の各オリゴの量
15 pmol; オリゴ1、オリゴ6、オリゴ8、オリゴ14
10 pmol; オリゴ2、オリゴ3、オリゴ4、オリゴ7、オリゴ15
5 pmol; オリゴ5、オリゴ9、オリゴ10、オリゴ11、オリゴ12、オリゴ13
【００３４】
増幅条件 (GeneAmp 9700サーマルサイクラーを使用)
94℃・5分
94℃・30秒、50℃・30秒、72℃、30秒（45サイクル）
72℃・2分。
【００３５】
(3)-2  ポリアクリルアミド電気泳動法による検出
それぞれの増幅反応液2μｌを5％ポリアクリルアミドゲルにアプライしＡＴＴＯ社電気泳動装置で１５０Ｖ-３０分間電気泳動を行った。結果は表１に示す。
【００３６】
【表１】
0005584385.tif 000002
【００３７】
本発明のプライマーセットを用いることで、26種全てのHPV DNAを検出することが可能であった。
【００３８】
（実施例２  HPV のタイピング）
（１）各種増幅産物の調製
26種の増幅産物は実施例１で得られた増幅産物を使用した。
【００３９】
（２）各種増幅産物のタイピング
(2)-1  オリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーション
26種のオリゴヌクレオチドプローブ(オリゴ16〜41)は合成の際、3'末端をビオチン標識した。標識プローブは1×Blend Taq緩衝液で0.125 pmol /μｌに調製した。各種増幅産物20μｌは140μｌの1×Blend Taq緩衝液で8倍に希釈した。
ハイブリダイゼーションは希釈済標識プローブ液4μｌと希釈済増幅産物液4μｌをPCR用チューブ内で混合し、GeneAmp 9700サーマルサイクラーを用いて98℃で3分、25℃で3分以上保温することにより実施した。
【００４０】
(2)-2  通液性フィルターを用いた検出
ハイブリダイゼーション済溶液全量をPOD標識アビジン(Dako Cytomation製)の溶液30μｌに加えて、室温にて5分間反応させた。これによって、ビオチン標識プローブとPOD標識アビジンが結合する。この反応液を抗FITC抗体の結合した通液性フィルターに添加するとフィルター上にビオチン標識プローブを介してPOD標識アビジンが結合したFITC標識HPV由来増幅産物が捕捉される。次に、上部より洗浄液およびPOD基質液を順次添加後、フィルター表面の発色を目視によって確認した。なお、抗体の結合したガラス繊維不織布フィルターは特開２００４−１５６９８５号公報の実施例１に準じて行った。結果は表２に示す。
【００４１】
【表２】
0005584385.tif 000003
【００４２】
各標識プローブは各々の型由来増幅産物とのみを特異的に検出することができ、明確なタイピングが可能であった。
【００４３】
（実施例３  HPV DNAのグルーピング検出）
【００４４】
（１）各種増幅産物の調製
26種の増幅産物は実施例１で得られた増幅産物を使用した。
【００４５】
（２）各種増幅産物のグルーピング検出
(2)-1  オリゴヌクレオチドプローブミックスによるハイブリダイゼーション
26種のオリゴヌクレオチドプローブ(オリゴ16〜41)は合成の際、3'末端をビオチン標識した。標識プローブを用いてプローブミックスA(16、 18、 33、 52、 58)、プローブミックスB(31、 35、 39、 45、 51、 56、 59、 68)、プローブミックスC(6、11)を1×Blend Taq緩衝液で各プローブ濃度がそれぞれ0.125 pmol /μｌになるように調製した。各種増幅産物20μｌは140μｌの1×Blend Taq緩衝液で8倍に希釈した。
【００４６】
ハイブリダイゼーションは希釈済標識プローブ液4μｌと希釈済増幅産物液4μｌをPCR用チューブ内で混合し、GeneAmp 9700サーマルサイクラーを用いて98℃で3分、25℃で3分以上保温することにより実施した。
【００４７】
(2)-2  通液性フィルターを用いた検出
ハイブリダイゼーション済溶液全量をPOD標識アビジン(Dako Cytomation製)の溶液30μｌに加えて、室温にて5分間反応させた。これによって、ビオチン標識プローブとPOD標識アビジンが結合する。この反応液を抗FITC抗体の結合した通液性フィルターに添加するとフィルター上にビオチン標識プローブを介してPOD標識アビジンが結合したFITC標識HPV由来増幅産物が捕捉される。次に、上部より洗浄液およびPOD基質液を順次添加後、フィルター表面の発色を目視によって確認した。なお、抗体の結合したガラス繊維不織布フィルターは特開２００４−１５６９８５号公報の実施例１に準じて行った。結果は表３に示す。
【００４８】
【表３】
0005584385.tif 000004
【００４９】
各プライマーミックスは、各々目的とした型のみを特異的に検出することができ、グルーピング検出が可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明により、明確かつ再現性よく試料中のHPVを検出し、必要に応じてタイピングやグルーピング検出することが可能となり、操作も非常に容易であることから、さまざまな場でニーズに応じたHPV検出試薬としての使用が期待される。
【配列表】
0005584385000001.app