(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトリジンＯ（StreptolysinＯ）含有液を用いて細胞をインビトロで透過処理し、該透過処理した細胞のミトコンドリアのエネルギー代謝活性を測定する方法であって、ストレプトリジンＯ含有液を添加して１５℃以下で反応させた後、細胞透過用低張液を添加して２５〜４５℃で反応させ透過処理を行うことを特徴とするミトコンドリア代謝活性測定方法。
【請求項２】
透過処理した細胞に対して、アデニル酸キナーゼ阻害剤を含む測定用反応液を添加することを特徴とする請求項１記載のミトコンドリア代謝活性測定方法。
【請求項３】
細胞が培養細胞であることを特徴とする請求項１又は２記載のミトコンドリア代謝活性測定方法。
【請求項４】
１０５個以下の細胞を用いて測定を行うことを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のミトコンドリア代謝活性測定方法。
【請求項５】
プレート上で培養した細胞に対して、直接透過処理を行うことを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のミトコンドリア代謝活性測定方法。
【請求項６】
区分けされた複数区画の細胞に対して同時に透過処理を行うことを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のミトコンドリア代謝活性測定方法。
【請求項７】
ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素によるＡＴＰ合成活性を測定することを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のミトコンドリア代謝活性測定方法。
【請求項８】
ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応による発光を検出することによりＡＴＰ合成活性を測定することを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載のミトコンドリア代謝活性測定方法。
【請求項９】
ミトコンドリア膜電位に関連する蛍光を検出することにより呼吸鎖活性を測定することを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載のミトコンドリア代謝活性測定方法。
【請求項１０】
発光又は蛍光を定量することによりＡＴＰを定量することを特徴とする請求項８又は９記載のミトコンドリア代謝活性測定方法。
【請求項１１】
ストレプトリジンＯ含有液と、細胞透過用低張液と、アデニル酸キナーゼ阻害剤を含む測定用反応液とを備えたことを特徴とするミトコンドリア代謝活性測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイスループットスクリーニングに適用可能なミトコンドリア代謝活性測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、哺乳類ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素のＡＴＰ合成活性を測定するには、肝臓などの組織や培養細胞からのミトコンドリア画分を調製する必要があった。かかるミトコンドリア画分の調製には、組織や細胞の低張処理後にホモホジナイザーにより細胞膜を破砕して、その抽出液を低速遠心にて核を除去、その抽出液をさらにショ糖勾配を利用した高速遠心してミトコンドリアを沈殿させていた。この調製作業は煩雑な上、ミトコンドリア膜の損傷が問題となっていた。
【０００３】
また、培養細胞の場合には、１０７細胞ほどを集めて、ジギトニンなど穏和な界面活性剤により透過処理を行った上で活性測定する方法も知られている（非特許文献１参照）。この方法も、上記の方法と同様に、細胞の剥離、遠心、洗浄など作業が煩雑であり、さらに、界面活性剤が、細胞膜だけでなくミトコンドリア膜へも損傷を与えるという問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Manfredi G, Yang L, Gajewski CD, Mattiazzi M; Methods, 2002 vol. 26 (4) pp. 317-26; Measurements of ATP in mammalian cells
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のように、ミトコンドリア画分の調製等の従来技術における煩雑さが、哺乳動物細胞を含む高等真核生物におけるＴＣＡサイクル・呼吸鎖・ＡＴＰ合成という一連のエネルギー代謝研究を困難にしてきた。
本発明の課題は、ミトコンドリア膜の損傷を与えることなく簡便にミトコンドリアの代謝活性を測定できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、哺乳動物細胞を含む高等真核生物におけるＴＣＡサイクル・呼吸鎖・ＡＴＰ合成という一連のエネルギー代謝に関する研究を進める中で、その作業の煩雑さから研究の障害となっていたミトコンドリアの代謝活性を測定する手法について検討した結果、ストレプトリジンＯ（StreptolysinＯ）を用いることにより、ミトコンドリア膜を損傷することなく細胞を透過し、簡便にミトコンドリアの代謝活性を測定することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、（１）ストレプトリジンＯ（StreptolysinＯ）含有液を用いて細胞をインビトロで透過処理し、該透過処理した細胞のミトコンドリアのエネルギー代謝活性を測定する方法であって、ストレプトリジンＯ含有液を添加して１５℃以下で反応させた後、細胞透過用低張液を添加して２５〜４５℃で反応させ透過処理を行うことを特徴とするミトコンドリア代謝活性測定方法や、（２）透過処理した細胞に対して、アデニル酸キナーゼ阻害剤を含む測定用反応液を添加することを特徴とする上記（１）記載のミトコンドリア代謝活性測定方法や、（３）細胞が培養細胞であることを特徴とする上記（１）又は（２）記載のミトコンドリア代謝活性測定方法に関する。
【０００８】
また、本発明は、（４）１０５個以下の細胞を用いて測定を行うことを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載のミトコンドリア代謝活性測定方法や、（５）プレート上で培養した細胞に対して、直接透過処理を行うことを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載のミトコンドリア代謝活性測定方法や、（６）区分けされた複数区画の細胞に対して同時に透過処理を行うことを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれか記載のミトコンドリア代謝活性測定方法や、（７）ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素によるＡＴＰ合成活性を測定することを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれか記載のミトコンドリア代謝活性測定方法や、（８）ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応による発光を検出することによりＡＴＰ合成活性を測定することを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれか記載のミトコンドリア代謝活性測定方法や、（９）ミトコンドリア膜電位に関連する蛍光を検出することにより呼吸鎖活性を測定することを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれか記載のミトコンドリア代謝活性測定方法や、（１０）発光又は蛍光を定量することによりＡＴＰを定量することを特徴とする上記（８）又は（９）記載のミトコンドリア代謝活性測定方法や、（１１）ストレプトリジンＯ含有液と、細胞透過用低張液と、アデニル酸キナーゼ阻害剤を含む測定用反応液とを備えたことを特徴とするミトコンドリア代謝活性測定用キットに関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法を用いることにより、ミトコンドリア膜の損傷を与えることなく簡便にミトコンドリアの代謝活性を測定できる。また、小スケールで簡便に測定できることから、ハイスループットスクリーニングにも適用することが可能であり、様々な代謝疾患に関わる創薬研究にも大きく貢献する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の測定方法においてルシフェリン・ルシフェラーゼ反応による発光を検出することによりＡＴＰ合成活性を測定した結果を示すグラフである（呼吸基質として、コハク酸を使用。）。
【図２】本発明の測定方法においてルシフェリン・ルシフェラーゼ反応による発光を検出することによりＡＴＰ合成活性を測定した結果を示すグラフである（呼吸基質として、リンゴ酸及びピルビン酸を使用。）。
【図３】本発明の測定方法においてルミトコンドリア膜電位に関連する発光を検出することによりＡＴＰ合成活性を測定した結果を示す図である（呼吸基質として、コハク酸を使用。）。
【図４】本発明の測定方法において、βサブユニットをノックダウンした細胞を用いてＡＴＰ合成活性を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のミトコンドリア代謝活性測定方法としては、ストレプトリジンＯ（以下、ＳＬＯという。）含有液を用いて細胞を透過処理し、該透過処理した細胞のミトコンドリアのエネルギー代謝活性を測定する方法であれば特に制限されるものではなく、本発明の方法によれば、ＳＬＯを用いて細胞膜のみに穿孔するので、細胞内にあるミトコンドリア膜は無傷な状態が維持される。また、バッファーの交換のみで測定用の細胞を調製することができることから、非常に簡便に測定することが可能となり、例えば区分けされた複数区画を有するプレートを用いて複数区画の細胞を同時に測定することが可能となる。さらに、従来法では、ミトコンドリア調製におけるサンプルのロスが多く、その測定にも１０７細胞程度の量を要していたが、本発明の方法ではその細胞量を大幅に低減することができる。すなわち、本発明の方法によれば、例えば、１０５個以下の細胞や１０４個以下の細胞で測定することが可能であり、５００−１０００個程度で測定することも可能である。したがって、例えば分裂寿命などのため大量調製できない初代培養細胞などでも適用が可能となり、適用範囲の拡大が図られる。
【００１２】
本発明のミトコンドリア代謝活性測定方法において用いる細胞としては、哺乳動物等の生体から採取した細胞であってもよいし、培養した細胞であってもよい。培養した細胞を用いる場合には、培養したプレートに処理液を直接添加して処理することが好ましく、これにより効率的に測定を進めることができる。特に、区分けされた複数区画を有するプレート（マルチウェルプレート）を用いて培養する場合には、上記のように複数区画の細胞に対して同時に透過処理を行うことができることから、非常に効率的である。
【００１３】
本発明の方法においては、まずＳＬＯ含有液を細胞に添加し反応させるが、その反応温度としては、１５℃以下であることが好ましく、１０℃以下であることがより好ましい。また、ＳＬＯ含有液の濃度としては、０．５〜１００μｇ／ｍＬであることが好ましく、１０〜５０μｇ／ｍＬであることがより好ましい。この反応により、細胞膜にＳＬＯが挿入されると考えられる。なお、常に一定の細胞膜透過処理を行うため、例えばＤＴＴ（ジチオスレイトール）を用いて、ＳＬＯを還元処理することが好ましい。
【００１４】
ＳＬＯ含有液で処理した後、細胞透過用低張液を添加して反応を行う。細胞透過用低張液としては、用いる細胞等に応じて従来公知の細胞用低張液を適宜使用することができる。反応温度としては、２５〜４５℃であることが好ましく、３０〜４０℃であることがより好ましい。これにより、細胞膜に穿孔し、細胞内物質を細胞外に排出して細胞を透過することができる。
【００１５】
なお、上記ＳＬＯ含有液及び細胞透過用低張液を用いた透過処理は、処理された細胞全体の少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の細胞が確実に処理されていることが重要である。細胞が確実に透過処理されているか否かの確認は、例えば、透過処理した細胞に対して、細胞質由来エステラーゼの加水分解によって蛍光を発する蛍光基質を添加して、蛍光顕微鏡で蛍光を発しないことを確認することにより行うことができ、これを利用して最適条件を設定することができる。
【００１６】
透過処理された細胞に対しては、アデニル酸キナーゼ阻害剤を含む測定用反応液を添加することが好ましい。アデニル酸キナーゼ阻害剤（Ａｐ５Ａ）の濃度としては、次工程で添加するＡＤＰに対して、１〜３倍モルであることが好ましく、１〜２倍モルであることがより好ましい。なお、次工程で添加するＡＤＰは、細胞の種類等によっても異なるが、好ましくは５０〜２００μＭである。これにより、細胞に存在する他のＡＴＰ合成酵素を阻害して、ミトコンドリアにおけるＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素によるＡＴＰ合成活性を正確に測定することが可能となる。
【００１７】
続いて、従来公知の方法を用いてＡＴＰ合成活性等のエネルギー代謝活性を測定することができる。例えば、ＡＤＰ、呼吸基質を添加し、ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応による発光をフォトメーターで測定（定量）してＡＴＰ量を定量することができる。また、ミトコンドリア膜電位に関連する蛍光を検出することによりＡＴＰ合成の前段階である呼吸活性を測定（定量）してもよい。
【００１８】
ここで、呼吸基質とは、ＴＣＡサイクルや呼吸鎖を駆動させることが可能な物質であり、コハク酸、ピルビン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸等を例示することができる。これらは、必要に応じて２種以上組み合わせて用いることが好ましく、例えば、ピルビン酸及びリンゴ酸の組み合わせ、アスコルビン酸及びＴＭＰＤ（テトラメチル−ｐ−フェニレンジアミン）の組み合わせを例示することができる。また、ＡＤＰと共に、この呼吸基質を適宜選択して添加することにより、ＴＣＡ回路、呼吸鎖、ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素の機能を調査することが可能となる。
【００１９】
上記の本発明のミトコンドリア代謝活性測定方法に用いられるバッファーを組み合わせてミトコンドリア代謝活性測定用キットとすることができる。かかるミトコンドリア代謝活性測定用キットとしては、具体的には、ＳＬＯ含有液と、細胞透過用低張液と、アデニル酸キナーゼ阻害剤を含む測定用反応液とを備えた測定用キットを例示することができる。
【実施例１】
【００２０】
１．細胞の準備
ＨｅＬａ細胞を、２，５００−５，０００細胞／ウェルで９６ウェル白プレートに播種し、ＣＯ２インキュベーターにて２４時間培養した。培養後の細胞数は、５０００−１００００細胞／ウェル程度であった。
【００２１】
２．ＳＬＯの活性化
９９．７μＬの０．２ｍｇ／ｍｌのＳＬＯ水溶液、１１．２μＬの１０×ＳＬＯ活性化反応液（１１５ｍＭ ＫＯＡｃ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）、及び１．１２μＬの１Ｍ ＤＴＴ（ジチオスレイトール）を３７℃で３０分還元反応を行った。還元終了後は、氷上で保存し１時間以内に以下の細胞処理に使用した。なお、容量は９６ウェルプレートの１０ウェル分で表記する（以下同様。）。
【００２２】
３．反応液等の調製
ＳＬＯ処理反応液（ＳＬＯ含有液）として、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．３］、１２５ｍＭ ＫＯＡｃ、２．５ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）２、１ｍＭ ＤＴＴ、前項で調製した活性化ＳＬＯ溶液、及びプロテアーゼ阻害剤（ロッシュ社製）を１ｍＬ調製し、氷上で保存した。
細胞透過反応液（細胞透過用低張液）として、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ［ｐＨ７．４］、１１５ｍＭ ＫＯＡｃ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＥＧＴＡ、プロテアーゼ阻害剤（ロッシュ社製）を２ｍＬ調製し、室温で保存した。
５倍濃縮の活性測定用反応液として、７５０ｍＭ ＫＣｌ、１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ウシ血清アルブミン（bovine serum albumin）、５０ｍＭ Ｋ３ＰＯ４、及び０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２をｐＨ７．４に塩酸で調製した。
洗浄液として、１×活性測定用反応液を４ｍＬ調製した。
アデニル酸キナーゼ阻害剤を含む測定用反応液として、１×活性測定用反応液、及び１５０μＭ Ａｐ５Ａ（P1P5-di(adenosine-5’) pentaphosphate）を４００μＬ調製した。
代謝活性化反応液として、呼吸基質としての５ｍＭ コハク酸、１００μＭ ＡＤＰ、２％ ＤＭＳＯ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１×活性測定用反応液、並びにルシフェリン及びルシフェラーゼを含むＡＴＰ定量用反応液（ロッシュ社製）を４００μＬ調製した。また、別途、ＡＴＰ阻害剤であるオリゴマイシン（１０μｇ／ｍＬ）、ロテノン（４００μＭ）、アトラクチロシド（１００μＭ）、ＣＣＣＰ（５μＭ）、ＫＣＮ（５ｍＭ）、ＴＴＦＡ（１００μＭ）をそれぞれ添加したものも調製した。
【００２３】
４．細胞の透過処理及び代謝活性測定
細胞を培養した９６ウェルプレートの培地を除去し、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した。氷上にプレートを移し、１００μＬ／ウェルで上記ＳＬＯ処理反応液を加え、氷上で１０分間反応させた。ＳＬＯ処理反応液を除去し、１００μＬ／ウェルで細胞透過反応液を加えて、それを除去した。さらに、細胞透過反応液を１００μＬ／ウェルで加え、３７℃で１０分間反応させた。細胞透過反応液を除去して、洗浄液を２００μＬ／ウェル加えて除去する操作を２回行った。２回洗浄して洗浄液を除去したウェルにアデニル酸キナーゼ阻害剤を含む測定用反応液を４０μＬウェルで加えた。測定直前に、代謝活性化反応液を加えフォトメーターにセットしてルシフェラーゼによる発光を測定した。
【００２４】
５．蛋白質量の測定
ルシフェラーゼによる発光測定終了後、ＰＢＳ（−）で２回洗浄して、１％ＳＤＳを含むＰＢＳ（−）を４０μＬ／ウェルで加えて室温で１０分間可溶化した。可溶化した試料をModified Lowry蛋白質定量法を用いて蛋白質量を測定した。
【００２５】
６．解析
ＡＴＰの検量線から各ウェルのＡＴＰ濃度を計算し、測定開始時のＡＴＰ量をゼロとした。各ウェルの蛋白質量当たりのＡＴＰ量を計算して標準化した。
【００２６】
その結果を図１に示す。ＡＴＰ合成阻害剤を添加していないもの（ＤＭＳＯ）は、ＡＴＰ量が増加しているのに対して、ＡＴＰ阻害剤を添加したものはＡＴＰ量が増加しておらず、適切にＡＴＰ合成活性が測定できていることがわかる。なお、ロテノンは、呼吸鎖複合体Ｉの阻害剤であり、コハク酸を呼吸基質とした場合には、ＡＴＰ合成への影響はほとんどないことが明らかになっている。
【実施例２】
【００２７】
実施例１と同様にＡＴＰ合成活性を測定した。ただし、代謝活性化反応液における呼吸基質は、１ｍＭ リンゴ酸及び１ｍＭ ピルビン酸の組み合わせを用いた。
また、ＡＴＰ阻害剤としては、１０μｇ／ｍＬ オリゴマイシン、４００μＭ ロテノン、１００μＭ ＴＴＦＡ、５ｍＭ マロン酸、１００μＭ カルボキシンを用いた。
【００２８】
その結果を図２に示す。実施例１と同様に、ＡＴＰ合成阻害剤を添加していないもの（ＤＭＳＯ）は、ＡＴＰ量が増加しているのに対して、ＡＴＰ阻害剤を添加したものはＡＴＰ量が増加しておらず、適切にＡＴＰ合成活性が測定できていることがわかる。
【００２９】
なお、呼吸基質としてコハク酸を用いた図１においてはロテノンでＡＴＰ合成が阻害されていないのに対して、呼吸基質としてリンゴ酸及びピルビン酸の組み合わせを用いた図２においてはロテノンでＡＴＰ合成が阻害されることが示されている。すなわち、ロテノンは呼吸鎖複合体１を阻害するものであるところ、コハク酸は呼吸鎖複合体２を活性化するので影響を受けないが、リンゴ酸及びピルビン酸の組み合わせは呼吸差複合体１を活性化するので、ロテノンによる阻害を受けることが示されている。この結果は、呼吸鎖複合体１および呼吸鎖複合体２の機能を区別して調べられることを示している。
【実施例３】
【００３０】
ＨｅＬａ細胞を顕微鏡観察用のガラス底ディッシュ上で培養した。実施例１と同様に細胞の透過処理を行い、活性化測定用反応液を添加した。さらに、ルシフェリン及びルシフェラーゼを含むＡＴＰ定量用反応液（ロッシュ社製）に代えてＴＭＲＥ（Molecular Probes社製）を含む代謝活性化反応液を添加して、蛍光顕微鏡によりＴＭＲＥの蛍光を観察した。
【００３１】
図３の上段に蛍光顕微鏡写真を示す。図の左側から、添加前（２分前）、５分後、２０分後、ＣＣＣＰ（５μＭ）添加後のものを示す。また、図３の下段は、これらの蛍光強度を定量化して、プロットしたものである。
【００３２】
図３に示すように、蛍光顕微鏡観察においても本件の方法は有効であることがわかる。また、ミトコンドリア膜電位の脱共役剤であるＣＣＣＰを添加することにより、膜電位が低下しており、膜電位の変化が有効に測定できていることがわかる。図１及び図３から、ＣＣＣＰによる膜電位の消失とＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素によるＡＴＰ合成活性が対応していることがわかる。
【実施例４】
【００３３】
ｓｈＲＮＡを発現するレトロウイルスを用いて、ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素の触媒サブユニットであるβをノックダウンした（shMock: ◇、shBeta-1: □、shBeta-2: △、shBeta-3: ○）。「shMock」は、ベクターコントロールを導入したＨｅＬａ細胞を示し、「shBeta-1」〜「shBeta -3」は、βのｍＲＮＡ配列から異なる標的配列を含むｓｈＲＮＡを発現したＨｅＬａ細胞を示す。これらのノックダウン細胞を用いて、実施例１と同様にＡＴＰ合成活性を測定した。また、代謝活性化反応液に、１０μｇ／ｍＬ オリゴマイシンを添加したものについても測定した。
【００３４】
図４の左上段は、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の後、βに対する抗体でウエスタンブロッティングを行ったものを示し、左下段の２つは、ＳＤＳによる変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の後、βに対する抗体でウエスタンブロッティングしたものと、電気泳動したゲルをＣＢＢ染色した像を示す。右側のグラフは、これらのノックダウン細胞を用いて、ＡＴＰ合成活性を測定した結果を示すグラフであり、黒で塗りつぶされたシグナルは、オリゴマイシンを添加したものである。
【００３５】
図４に示すように、触媒サブユニットβの発現がほぼ完全に抑えられた細胞shBeta-3は、ＡＴＰ合成活性が全くないことがわかる。このことからも、今回ルシフェラーゼによる発光で検出したＡＴＰの増加が、ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素に由来していることが確認できる。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、ピルビン酸からＴＣＡサイクル・呼吸鎖・ＡＴＰ合成およびＡＴＰ／ＡＤＰトランスポーターを介した一連のエネルギー代謝活性を簡便に測定でき、これらに関わる代謝研究に有用である。多検体サンプルを同時に測定することが可能なので、様々な薬剤を処理した細胞を用いることで、その薬剤のエネルギー代謝への影響を調べることができる。これは代謝異常に対する創薬研究への発展が期待される。また、ｃＤＮＡライブラリーやｓｉＲＮＡライブラリーを用いるなどしてエネルギー代謝に関わる遺伝子の網羅的な同定も潜在的に可能である。また、従来方法と比べて顕著に少ないサンプルで測定可能であるので代謝異常の患者から採取された細胞を用いて、機能不全となっている箇所を同定することもできる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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