(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
子宮頸部細胞における、ＣＡＤＭ１プロモーターおよびＭＡＬプロモーターの増加したメチル化を検出することによって、ＣＩＮ（子宮頸部上皮内腫瘍）２以上を有するＨＰＶ誘導子宮頸部前がん病変を検体において検出することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ＨＰＶ誘導子宮頸部前がん病変は、高リスク型ＨＰＶ誘導子宮頸部前がん病変であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
増加したメチル化は、制限エンドヌクレアーゼを使用して検出されることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
検体の検査細胞におけるＣＩＮ（子宮頸部上皮内腫瘍）２以上を有するＨＰＶ誘導子宮頸部前がん病変を検出するための方法において使用するための部品キットであって、
ＭＡＬプロモーターのメチル化を検出するための手段であって、ＭＡＬプロモーターの核酸配列に特異的な、プローブおよび／もしくはプライマーを含む手段と、
ＣＡＤＭ１プロモーターのメチル化を検出するための手段であって、ＣＡＤＭ１プロモーターに特異的な、プローブおよび／もしくはプライマーを含む手段とを含むことを特徴とするキット。
【請求項５】
ＨＰＶ感染の検出のための手段であって、ＨＰＶに特異的な、プローブおよびプライマーを含む手段をさらに含むことを特徴とする請求項４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんの予防および医療診断の分野に関し、そして、浸潤がん、および前がん子宮頸部病変のようなヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）誘導浸潤がん、およびその高悪性前駆病変に対する分子診断マーカーに関する。本発明は、特に、浸潤性を有するｈｒＨＰＶ誘導前がん病変、およびｈｒＨＰＶ誘導浸潤がんに対するマーカーとして、ＭＡＬゲノム配列、および調節配列、またはそれらの遺伝子産物の使用に関する。
【発明の背景】
【０００２】
子宮頸がんは、女性にとって世界で２番目に一般的ながんであり、年間約２５０，０００人のがん死亡の原因となっている。
【０００３】
子宮頸部扁平上皮癌の発達は、前がん病変、いわゆる子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）の進行を特徴とする。前記ＣＩＮの進行は、１から３に部類分けされ、それぞれ、軽度の異形成（ＣＩＮ１）、中等度の異形成（ＣＩＮ２）、および高悪性の異形成／上皮内癌（ＣＩＮ３）と呼ばれる。ＣＩＮ１は、軽度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）、ＣＩＮ２およびＣＩＮ３は、共に高悪性扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）とも呼ばれる。子宮頸部腺癌については、上皮内腺癌（ＡＣＩＳ）が確立された前駆病変である。原則として、これらの前がん病変は可逆的であるが、より重度の病変では、自然退縮の可能性は低くなる。前がん状態の段階では、擦過細胞診によって検出することができ、必要に応じてわずかな副作用で比較的容易に治療できるため、子宮頸がんは予防可能な病気と考えられる。子宮頸部スクリーニングは、高悪性前がん（すなわち、ＣＩＮ２／３、および上皮内腺癌）、および治療可能ながん病変を早期に診断することによって浸潤性子宮頸がんの死亡率を減少させることを目的とする。一般的な医療行為は、子宮頸がんの発達を予防するために、形態的にＣＩＮ２、ＣＩＮ３、および上皮腺癌と確認された全ての女性の処置を含む。
【０００４】
過去１０年間で、子宮頸癌の発がんは、高リスクヒトパピローマウイルス感染（ｈｒＨＰＶ）によりイニシエート（initiate）されることが立証された。ｐ５３およびＲｂ腫瘍抑制経路を妨げるウイルス性がん遺伝子Ｅ６およびＥ７の発現は、それぞれ、発がん、および悪性形質の維持の両方に必須であることが示された。したがって、ｈｒＨＰＶ検査は、魅力的な一次スクリーニングツールとして登場した。しかし、ｈｒＨＰＶ感染細胞の浸潤がん細胞への進行のために、発がんの多段階プロセスと一致する宿主細胞ゲノムの付加的な変化が必要である。高リスクＨＰＶに感染した女性のごく少数では、高悪性前がん子宮頸部病変（ＣＩＮ２／３）を発症し、もし未処理のままにすれば浸潤がんを発症する。前がん子宮頸部病変を有するほとんどの女性では、病変は自然退縮する。スクリーニングに基づく集団に参加する女性の約５〜６％がｈｒＨＰＶに陽性である（Bulkmansら、Int J Cancer 2004, 110:94-101）。しかし、彼女らの最大２０％（参加女性の１％）のみＣＩＮ２／３以上となる。したがって、ＣＩＮ２／３以上、および上皮腺癌以上のリスクのｈｒＨＰＶ陽性である女性層に認められる頸管塗抹標本にマーカーを適用できなければ、ｈｒＨＰＶテストによる一次スクリーニングは、相当な数の余分なフォローアップ手続きと、女性の間に不要な不安とを伴うだろう。
【０００５】
主要な課題は、臨床的に意味のある病変を有する、検査で陽性の女性の割合を減少させることである。一つの形態は、ｈｒＨＰＶ陽性の女性ための二次（いわゆるトリアージ）検査として細胞診を使用することである。しかし、これでは、細胞診が正常となる相当な数のｈｒＨＰＶ陽性の女性を残し（スクリーニング集団に占める女性の３．５％）、その１０％がＣＩＮ３以上を有するか、または獲得する。さらに、自宅で取得可能な自己サンプリング頚膣標本は、子宮頸部の細胞学的な状態を表すものではないため、細胞診は、自宅で取得可能な自己サンプリング頚膣標本のために選択可能なものではない（Brinkら 2006, J. Clin. Microbiol. 44:2518-2523）。したがって、ＣＩＮ２／３以上、および上皮腺癌以上の有無でｈｒＨＰＶ陽性の女性を分類するための補助、または代替トリアージツールが必要である。
【発明の概要】
【０００６】
発明者らは、擦過、洗浄、もしくはその他の手段、および／または組織から得られた細胞材料において、浸潤性子宮頸がんの前がん子宮頸部病変のようなヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ誘導高悪性前駆病変、および非頸部浸潤がんの高リスクヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）誘導前駆病変を確認するために、特に、ＭＡＬのｍＲＮＡ、およびタンパク質発現だけではなく、ＭＡＬプロモーターの高メチル化を減少させる、ＭＡＬの変化に基づく（分子）診断マーカーを現在開発している。特に、本発明は、早期発見および個々の患者のためのより良い治療オプションを可能とする、ＭＡＬ遺伝子（そのプロモーターを含む）、およびそれらの遺伝子産物のＨＰＶ誘導高悪性前駆病変のためのマーカーとしての使用に関する。
【０００７】
驚くべきことに、Ｔ細胞分化タンパク質としても知られる（ＭＡＬについての詳細は、GenBank Accession NM_002371を参照）、Ｔ細胞成熟関連タンパク質をコードする遺伝子は、子宮頸部発がんにおいて腫瘍抑制遺伝子として関与していること、および主にＭＡＬプロモーターのメチル化によるＭＡＬ遺伝子の低レベルの発現は、子宮頸部発がんの重要な決定因子であることを見出した。ＭＡＬのゲノム配列、および調節配列、ならびにそれらの遺伝子産物は、そのため、浸潤性子宮頸がんおよびそれらの高悪性前駆病変の診断のための貴重なマーカーを提供する。特に、ＣＡＤＭ１（Genbank ID NM_014333.3）のメチル化解析と組み合わせた場合に、浸潤性子宮頸がん、およびその高悪性前駆病変について、子宮頸部の細胞診に見出される感受性を超えた高い感受性が達成される。さらに、本発明は、非子宮頸部ｈｒＨＰＶ関連浸潤がん、およびその高悪性前駆病変を診断するために適している。
【０００８】
子宮頸がんは、ほぼ全面的にヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の感染に関連付けられている。ヒトパピローマウイルスは、ＤＮＡ配列の変化によって識別されるウイルスの１００種類以上の群を構成する。数種のＨＰＶｓは、皮膚、および粘膜についての様々な病気の原因となる。ＨＰＶｓは、感染細胞の悪性変化を誘発する能力に基づいて、低リスク型、および高リスク型に大きく分類される。１、２、４、６、１１、１３、および３２などの低リスク型のＨＰＶは、主に、良性病変、または疣贅に関連付けられている。一方、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、および６８のような高リスク型のＨＰＶは、主に、前がん上皮性病変および悪性上皮性病変に関連付けられている。これらの高リスク型のＨＰＶは、例えば、ＨＰＶ-６およびＨＰＶ−１１のような低リスク型が原因となる疣贅と比較して、通常平坦で、ほとんど分らない成長をもたらす。高リスク型のＨＰＶは、子宮頸部の浸潤癌だけでなく、肛門性器管および／または頭頸部領域におけるような別の場所で浸潤癌を引き起こすことが発見された。したがって、本発明は、Ｔリンパ球成熟関連タンパク質（ＭＡＬ）に関連付けられている浸潤性子宮頸がん、およびその前段階を検出するために適しているだけではなく、ＨＰＶによって、特に高リスク型のＨＰＶによって、誘導される他の浸潤がん、およびそれに対応する前段階を検出するために適している。したがって、本発明は、任意のＨＰＶに誘導される高悪性の前がん病変、または浸潤がんのリスク評価のための方法を提供する。
【０００９】
したがって、本発明は、Ｔリンパ球成熟関連タンパク質（ＭＡＬ）に関連するＨＰＶ誘導高悪性前駆病変、およびＨＰＶ誘導浸潤癌を、それらの必要な対象において検出する方法であって、前記方法は、対象の検査細胞の細胞成分と、検査細胞内の細胞成分の濃度を検出する試薬とを接触させること、および同等の健康な細胞と比較して、検査細胞における細胞成分の濃度の変化を測定することを含む、クレーム１に規定したような方法を提供する。ここで、上記細胞成分は、細胞におけるＭＡＬ濃度を示し、上記変化は、ＨＰＶ誘導前がん病変、またはＨＰＶ誘導浸潤癌の存在を示す。
【００１０】
本発明の文脈中において、極めて適切なＨＰＶ誘導前がん病変、および浸潤性がんは、頸部前がん病変、および浸潤性子宮頸がんだけではなく、口腔、咽頭、肛門、直腸、陰茎、外陰部、膣などのような他の組織において高リスクＨＰＶにより誘導される前がん病変、および浸潤性がんである。
【００１１】
検査細胞は、（前）腫瘍性細胞、増殖頸部細胞、または任意の他の細胞であってよい。ここで、Ｔリンパ球成熟関連タンパク質（ＭＡＬ）に関連付けられた浸潤性を有するＨＰＶ誘導前がん病変、およびＨＰＶ誘導浸潤がんの存在が検出される。
【００１２】
他の実施形態において、本発明は、Ｔリンパ球成熟関連タンパク質（ＭＡＬ）に関連付けられた、浸潤性を有するＨＰＶ誘導前駆病変、またはＨＰＶ誘導浸潤がんを、必要な対象において検出するための、請求項１に規定されたような方法を提供する。前記方法は、検査細胞の標的細胞成分と、ＭＡＬを検出する試薬とを接触させること、および同等の通常細胞と比較して、ＭＡＬの変化を検出することを含み、好ましくは、前記検出において、同等の通常細胞と比較して、検査細胞におけるＭＡＬプロモーター、およびＣｐＧリッチイントロン配列のメチル化の増加、および／または検査細胞におけるＭＡＬの産生の減少が測定される。
【００１３】
他の態様において、本発明は、Ｔリンパ球成熟関連タンパク質（ＭＡＬ）に関連付けられたＨＰＶ誘導高悪性前駆病変、およびＨＰＶ誘導浸潤がんの検出のための請求項１３に規定されたような分子診断マーカーの使用に関する。ここで、前記マーカーは、ＭＡＬプロモーターのメチル化および／またはＭＡＬポリペプチドの産生に関連付けられたｍＲＮＡの発現を示す。そのような使用により、高悪性前駆病変、および浸潤がんの存在を予測できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
図１は、ＭＡＬ５’規制領域、コーディング配列、第一イントロン配列のＣｐＧリッチ部分、および転写された３’非コーディング配列を示す。
【発明の詳細な説明】
【００１５】
「発現」は、構造ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への遺伝子の転写、およびもし適用できるのであれば、ポリペプチドまたはタンパク質へのその後の翻訳を表す。
【００１６】
「ＨＰＶ誘導浸潤がん」は、周辺の組織に浸潤する高リスクＨＰＶにより誘導される癌を表す。これには、全てのＨＰＶ誘導癌ヒストタイプ（histotype）、すなわち子宮頸部、口腔、咽頭、肛門、直腸、陰茎、外陰部、および膣などのような関連する器官における、扁平上皮癌、腺癌、扁平上皮腺癌、および神経内分泌癌を含む。
【００１７】
「浸潤頸がん」は、周辺の組織に浸潤する子宮頸癌を表す。これは、全ての癌ヒストタイプ、すなわち扁平上皮癌、腺癌、扁平上皮腺癌、および神経内分泌癌を含む。
【００１８】
「前がん病変」および「前駆病変」は、がん（cancer）への多段階細胞性進展における、癌（carcinoma）に進行する強く増加された可能性を有する段階を表す。古典的な形態、および病理医は、これらの病変が進展するか、または退縮するか、個々の患者について、予測することができない。現行の特許は、浸潤がんまたはその高悪性前駆病変を予測できる方法に言及している。
【００１９】
「高悪性前がん頸部病変」は、子宮頸がんの多段階細胞性進展における、子宮頸癌に進行する可能性を強く増加された段階を表す。「特異的にハイブリダイズすることができる」は、相補的な核酸配列と特異的に核酸ペアリングすることができ、核酸二重鎖を形成するためにそれらに結合することができる核酸配列を表す。
【００２０】
「相補的」、または「相補的な配列」は、ワトソン−クリック塩基対ルールに対応する他のヌクレオチド配列と水素二重結合を形成するヌクレオチド配列である。例えば、５’−ＡＡＧＧＣＴ−３’の相補的な塩基配列は、３’−ＴＴＣＣＧＡ−５’である。
【００２１】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、例えば、温度、塩濃度、ｐＨ、ホルムアミド濃度などのハイブリッドの安定性に影響を及ぼすハイブリダイゼーション条件を表す。これらの条件は、経験的に、特異的な結合を最大化され、その標的核酸配列へのプライマー、またはプローブの非特異的結合を最小化されている。使用されるような前記用語は、プローブ、またはプライマーが、その標的配列に対して、他の配列よりも際立った程度で検出可能にハイブリダイズする条件を表すこと含む（例えば、少なくともバックグラウンドの２倍以上）。ストリンジェントな条件は、配列に依存し、様々な状況で異なる。長い配列は、特により高い温度でハイブリダイズする。一般的には、ストリンジェントな条件は、イオン強度およびｐＨで定義された、特定の配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、完全に合致したプローブまたはプライマーに相補的標的配列の５０％がハイブリダイズされる時の温度である（定義されたイオン強度およびｐＨ条件下における）。通常、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で約１．０Ｍ  Ｎａイオン未満であり、典型的には、約０．０１〜１．０Ｍ  Ｎａイオン濃度（またはその他の塩）であり、また、前記温度は、短いプローブ、またはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）について少なくとも約３０℃、および長いプローブまたはプライマー（例えば、５０ヌクレオチド以上）について少なくとも６０℃である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化剤を添加して達成することもできる。典型的な低ストリンジェント条件、または「ストリンジェンシーを減少させる条件」は、３７℃で３０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液でハイブリダイゼーションすること、および４０℃で２×ＳＳＣで洗浄することを含む。典型的な高ストリンジェンシー条件は、３７℃で、５０％ホルムアミド、１ Ｍ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳ中でハイブリダイゼーションすること、および６０℃で０．１×ＳＳＣ中で洗浄することを含む。ハイブリダイゼーションの手順は、当技術分野で周知であり、例えば、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., 1994に記載されている。
【００２２】
「オリゴヌクレオチド」は、リン酸結合（例えば、ホスホジエステル、アルキルおよびアリル−ホスフェート、ホスホロチオネート）、または非リン酸結合（例えば、ペプチド、スルフェートなど）により加えられるヌクレオチド単量体（通常、６〜１００ヌクレオチド）の短い配列を表す。オリゴヌクレオチドは、例えば、修飾塩基（例えば、５−メチルシトシン）および修飾糖グループ（例えば、２’−Ｏ−メチルリボシル、２’−Ｏ−メトキシエチルリボシル、２’−フルオロリボシル、２’−アミノリボシルなど）を有する修飾されたヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドは、環状、分枝状、または直鎖状の二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖、および一本鎖ＲＮＡの天然に発生する、または合成された分子であってもよく、任意に、安定な二次構造を形成できるドメイン（例えば、ステムループ、およびループステム構造）を含む。
【００２３】
本明細書において使用される用語である「プライマー」は、核酸鎖に対して相補的なプライマー伸長産物の合成における条件下、すなわち、適切な温度およびｐＨでヌクレオチド、およびＤＮＡポリメラーゼのような重合試薬の存在下に置かれた場合に、ＤＮＡポリメラーゼに接着できる増幅標的にアニーリングすることができ、それにより、ＤＮＡ合成の開始点として提供されるオリゴヌクレオチドを表す。前記（増幅）プライマーは、好ましくは、増幅の効率を最大化するために一本鎖である。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合試薬の存在下で伸長産物の合成を開始するために十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、およびプライマーの起源を含む、多くの要因に依存する。本明細書で使用される「双方向のプライマーのペア」は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅のようなＤＮＡ増幅の分野で一般的に使用されるような１つのフォワード、および１つのリバースプライマーを表す。
【００２４】
「プローブ」は、標的核酸配列の分析、またはそのｃＤＮＡ誘導体における相補配列を有する水素二重結合を認識、および形成する一本鎖のオリゴヌクレオチド配列を表す。
【００２５】
ＭＡＬ（Ｔリンパ球成熟関連タンパク質）遺伝子（GenBank Accession NM_002371）は、本来、Ｔ細胞の発達の間に他と異なって発現する遺伝子として同定された（AlonsoおよびWeisman 1987, Proc.Natl.Acad.Sci USA, 84, 1997-2001）。ＭＡＬは、１７ｋＤａの膜内在性タンパク質としてコードされ、糖脂質が豊富な膜のマイクロドメイン、またはラフトの成分である（Kimら 1995, J.Neurosci.Res、42、413-422）。ＭＡＬは、膜の頂端輸送、および分極上皮細胞における分泌タンパク質のためのタンパク質機構の成分として重要な役割を担っている（Cheongら、1999, Proc.Natl.Acad.Sci. USA,84,6241-6248）。
【００２６】
ＭＡＬ発現の減少は、食道がん、胃がん、および大腸がんを含む多くのヒトのがんにおいて検出された（Mimoriら、2003, Oncogene, 22, 3463-3471;Mimori2007ら, Ann. Surg. Oncol., 14, 1670-1677）。
【００２７】
大腸がんにおいて、ＭＡＬの下方制御は、プロモーターのメチル化に関連付けられている（Moriら、2006, Gastroenterology, 131, 797-808;Lindら、2007 Gastroenterology, 132,  1631-1632）。
【００２８】
腫瘍抑制遺伝子として働くＭＡＬの機能的な役割は、運動性、浸潤、腫瘍形成の抑制をもたらすが、アポトーシスを促進する食道がん細胞におけるＭＡＬ遺伝子の再発現によって実証された（Mimoriら 2003, Oncogene, 22, 3463-3471）。
【００２９】
本発明者らは、ＭＡＬプロモーターのメチル化、およびＭＡＬ発現の減少を含むＭＡＬの変化は、扁平上皮癌、扁平上皮腺癌の両方の子宮頸癌、腺癌、および神経内分泌癌ヒストタイプ、ならびにそれらの高悪性前駆病変において頻繁に起こることを確立した。インビトロ検査は、ＳｉＨａ子宮頸がん細胞株を含むＨＰＶ１６の細胞におけるＭＡＬの過剰発現が、増殖を減少させ、足場非依存性増殖を抑制するとして、子宮頸がんの発達におけるＭＡＬ不活性化の機能的な関与を明らかにした。最も興味深いことに、本発明者らは、ＭＡＬプロモーターの高メチル化だけではなく、ｍＲＮＡの発現の減少も子宮頸部の擦過検体（scrape sample）で顕著に検出することができること、および高悪性ＣＩＮ病変または浸潤癌の存在を予測できることを示した。さらに、ＭＡＬプロモーターのメチル化は、自己サンプリングによって収集された子宮膣検体で検出でき、潜在する高悪性ＣＩＮ病変、または浸潤性子宮頸がんの存在に関連付けられていることが明らかになった。
【００３０】
興味深いことに、１つの新規に選択されたＣＡＤＭ１（Genbank ID NM_014333.3）のプロモーター領域をＭＡＬのメチル化解析に組み合わせることにより、ＣＩＮ２以上についての高い感受性は、細胞診における感受性を超えるに至る。さらに、細胞診とは異なり、両方の遺伝子についてのメチル化解析は、自己サンプリングされた子宮頸部−）膣、および外陰部の標本についても首尾よく実行できる。これらの結果は、ＭＡＬ発現、またはＣＡＤＭ１プロモーターのメチル化の子宮頸部および自己採取された子宮膣標本における減少のどちらかと組み合わせたＭＡＬプロモーターのメチル化の検出は、高悪性のＣＩＮ病変、または子宮頸がんを予測できることを示す。
【００３１】
したがって、本発明は、Ｔリンパ球成熟関連タンパク質（ＭＡＬ）に関連するＨＰＶ誘導高悪性前駆病変、およびＨＰＶ誘導浸潤癌を、それらの必要な対象において検出する方法、またはそれらを示す方法であって、前記方法は、対象の検査細胞の細胞成分と、検査細胞の細胞成分の濃度を検出する試薬とを接触させること、および同等の健康な細胞と比較して、検査細胞における前記細胞成分の発現量の減少を測定することを含む、請求項１に定義されるような方法を提供する。ここで、前記細胞成分は、検査細胞のＭＡＬ濃度を示し、前記変化は、浸潤性を有するＨＰＶ誘導前駆病変、およびＨＰＶ誘導浸潤がんの存在を示す。
【００３２】
対象の検査細胞は、子宮頸部細胞などの粘膜細胞のサンプルに由来する細胞を含み、また、ＨＰＶに関連する前駆病変、またはがんが検出される、口腔、咽頭、陰茎、外陰部、肛門、直腸、および他の組織のような他の組織を含み得る。そのような全てのサンプルは、本発明の方法におけるサンプルとして使用することができる。好ましくは、患者の細胞のサンプルは、検査細胞として子宮頸部の細胞を含む。子宮頸部細胞は、例えば、組織標本、または細胞診標本として提示され得る。細胞診標本は、従来の子宮頸部塗抹標本だけでなく、自己サンプリングによって収集された子宮標本の薄層組織標本、および頚膣または膣標本を含む。
【００３３】
本発明の方法は、特に高リスクＨＰＶｓによって誘導されるＴリンパ球成熟タンパク質（ＭＡＬ）に関連付けられている高悪性前がん病変、および浸潤がんの検出に適している。Ｔリンパ球成熟関連タンパク質（ＭＡＬ）に関連付けられたＨＰＶ誘導高悪性前がん病変、およびＨＰＶ誘導浸潤がんの検出方法は、ＭＡＬ遺伝子転写産物および／またはその転写産物から翻訳されたその後のタンパク質測定の形態のようなＭＡＬ発現の測定に関係し得る。また、Ｔリンパ球成熟関連タンパク質（ＭＡＬ）に関連付けられた浸潤性を有するＨＰＶ誘導高悪性前がん病変、およびＨＰＶ誘導浸潤がんの検出方法は、ＭＡＬ発現容量、および／またはＭＡＬタンパク質産生容量の指標として、ＭＡＬプロモーターのメチル化を測定することを含み得る。
【００３４】
図１は、ＭＡＬ遺伝子のＣｐＧリッチプロモーター領域、およびＣｐＧリッチ第一イントロン配列と同様に、コーディング配列、および転写された３’非コーディング配列を示す。ＣｐＧリッチ配列、特にプロモーター領域のメチル化は、転写の急激な減少、または転写の完全な阻害をもたらす。したがって、プロモーター領域は、この遺伝子の発現可能性について陽性マーカー配列を提供する。また、ＭＡＬ遺伝子の発現は、遺伝子の転写産物を測定することによって検出することができる。このように、この遺伝子におけるＭＡＬタンパク質をコードする領域は、遺伝子の転写産物の検出のためのマーカー配列を提供する。さらにもう一つの方法では、ＭＡＬ遺伝子の発現は、ＭＡＬタンパク質を直接に測定することによって検出することができる。
【００３５】
このように、接触される検査細胞成分は、ＤＮＡ、またはＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような核酸であってもよく、またはタンパク質であってもよい。細胞成分がタンパク質の場合、試薬は、通常、抗ＭＡＬ抗体である。成分が核酸の場合、試薬は、通常、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）プローブ、または（ＰＣＲ）プライマーである。例えば、このようなプローブまたはプライマーを使用することにより、ｍＲＮＡなど遺伝子発現産物を検出することができる。また、成分が核酸である場合、試薬は、制限エンドヌクレアーゼ、好ましくは、検査細胞核酸におけるメチル基の存在の検出のためのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼであってもよく、そのため前記検査細胞核酸は、好ましくはＤＮＡである。
【００３６】
検査細胞の成分は、ｉｎ  ｓｉｔｕで直接検出することができる。また、試薬と接触する前に、当業者に知られている一般的な方法で他の細胞成分から分離することができる（例えば、「Current Protocols in Molecular Biology」Ausubelら  1995 第4版、John Wiley and Sons、「A Laboratoty Guide to RNA: Isolation, analysis, and synthesis」Krieg(ed.), 1996, Wiley-Liss、「Molecular Cloning: A laboratory manual」,  J. Sambrook, E. F. Fritsch. 1989. 3 Vols, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
【００３７】
検出方法は、サザンブロット解析、ノーザンブロット解析、ＲＮａｓｅプロテクション、イムノアッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法（Mullis 1987年、米国特許第４６８３１９５号明細書、米国特許第４６８３２０２号明細書、ｅｎ 米国特許第４８００１５９号明細書）、ＬＣＲ（Barany 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193、ＥＰ出願番号３２０３０８号明細書）、３ＳＲ（Guatelliら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878）、ＳＤＡ（米国特許第５２７０１８４号明細書、ｅｎ米国特許第５４５５１６６号明細書）、ＴＡＳ（Kwohら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Lizardiら, 1988, Bio/Technology 6:1197）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、またはＤＮＡの増幅のための他の方法のような解析を含む。代替方法においてＲＮＡは、ＮＡＳＢＡ法（L. Malekら, 1994, Meth. Molec. Biol. 28, Ch. 36, Isaac PG, ed., Humana Press, Inc., Totowa, N.J.）またはＴＭＡのような方法により検出し得る。
【００３８】
核酸プローブ、プライマー、および抗体は、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤、酵素、またはビオチンもしくはジゴキシゲニンなどのような生物学的に関連した結合構造で、検出可能に標識できる。当業者は、試薬に結合するための他の適切な標識を知っている。また、当業者は、通常の実験を用いてこのような確認することができる。
【００３９】
このような分析を含む検出のための他の方法は、核酸アレイで実行できる（Cheeら, 1996, Science 274（特に5287: 610-614を参照）。例えば、ＤＮＡアレイは、本発明に係る核酸の検出のために使用することができる。そのようなアレイは、ストリンジェントな条件下において、本発明の方法で濃度が検出される核酸細胞成分にハイブリダイズすることができる配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。
【００４０】
本発明は、ＭＡＬ転写産物の濃度の減少が、ＭＡＬ遺伝子の高メチル化を頻繁にもたらすことを示すため、ＭＡＬ遺伝子が高メチル化されているか否かを直接測定することが望ましい場合が多い。特に、主に遺伝子の５’調節領域に位置する「ＣｐＧ島」と呼ばれるＣｐＧリッチ領域は、通常、メチル化されていない。「高メチル化」は、ＭＡＬ遺伝子配列において、通常、メチル化されていない位置における任意のシトシンのメチル化を含む（例えば、ＭＡＬプロモーター、第一エクソン、および第一イントロン配列、図１を参照のこと）。高メチル化は、例えば、ＭＡＬポリヌクレオチド（遺伝子）の制限エンドヌクレアーゼ処理、およびサザンブロット解析により検出することができる。したがって、本発明の方法において、検出される細胞成分はＤＮＡであり、制限エンドヌクレアーゼ解析は、ＭＡＬ遺伝子の高メチル化を検出するために好ましい。任意の制限エンドヌクレアーゼであって、その認識部位としてＣＧを含み、前記Ｃがメチル化された場合に抑制される、制限エンドヌクレアーゼを利用することができる。単独、または組み合わせて使用されるＢｓｓＨＩＩ、ＭｓｐＩ、ＮｏｔＩ、またはＨｐａＩＩのようなメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼが、このようなエンドヌクレアーゼの例である。その他のメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、当業者に公知である。
【００４１】
ＭＡＬプロモーターの高メチル化の検出のための他の方法は、非メチル化シトシンがウラシルに変換され、一方メチル化シトシンが化学修飾から保護されるＤＮＡの亜硫酸水素塩修飾に関する。後続のＰＣＲ増幅、およびシークエンシングは、ＣｐＧ島におけるシトシンが、メチル化された場合に維持されているか、または非メチル化状態の場合にウラシルに置換されているかを明らかにする。他の方法は、認識部位の一部としてＣＧを含む制限エンドヌクレアーゼによる、亜硫酸水素塩修飾されたＤＮＡから生成されたＰＣＲ増幅産物の処理に関する。
【００４２】
メチル化された配列を検査するための代替的な方法は、ＣｐＧリッチ配列を標的とする特異的ＰＣＲ反応後のＤＮＡの亜硫酸塩修飾にも基づくメチル化特異的ＰＣＲである。
【００４３】
本発明の目的のために、ＭＡＬに特異的な抗体（すなわち、抗ＭＡＬ抗体）、または核酸プローブは、生物学的流体、または組織におけるＭＡＬポリペプチド（抗体を使用）、またはＭＡＬポリヌクレオチド（核酸プローブを使用）の存在を検出するために使用し得る。ＭＡＬ配列における任意のコード配列領域、および制御配列領域に基づくオリゴヌクレオチドプライマーは、例えばＰＣＲ法により、ＤＮＡを増幅するために有用である。
【００４４】
ＰＣＲプライマー、核酸プローブ、または制限エンドヌクレアーゼを使用する場合は、５’調節領域、第一イントロン配列、およびＭＡＬ配列のコーディング配列（図１において特定したような）が解析される。
【００４５】
ＭＡＬポリヌクレオチド、またはＭＡＬポリペプチド抗原の検出可能な量を含んでいる任意の標本を使用することができる。核酸は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのような当業者に公知のＲＮＡ ｉｎ  ｓｉｔｕ法によっても解析することができる。本発明の方法に応じた検査のための好ましいサンプルは、（子宮、または膣）擦過検体、頚膣洗浄、または綿棒で集めた標本、および／または（子宮）生検などのような標本が含まれる。対象は、任意の哺乳動物とすることができるが、好ましくはヒトである。
【００４６】
本発明の方法は、ＭＡＬポリペプチド、GenBank Accession No. NP_002362.1、および３つの代替転写産物NP_071883.1、NP_071884.1、NP_071885.1、またはそれらの断片として利用可能な予測されるアミノ酸配列と免疫反応する抗体を利用することができる。異なるエピトープ特異性を有する、本質的にプールされたモノクローナル抗体からなる抗体だけでなく、異なるモノクローナル抗体製剤を用いることができる。モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法によって、タンパク質の断片を含む抗原から作製される（Kohlerら, Nature、256：495,1975）。
【００４７】
本発明で使用される用語である抗体は、ＭＡＬにおけるエピトープ決定基に結合することができるＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２のような、完全な分子だけでなく、それらの断片を含む意味を有する。本明細書で使用される抗体は、ミニ抗体、ペプチドミメティクス、アンチカリン（anticalins）などのような抗原結合特異性を有する他のタンパク質、または非タンパク質分子をも表す。
【００４８】
本発明の診断方法において使用できるモノクローナル抗体は、例えば、イムノアッセイにおいて、液相中において利用すること、または固相キャリア（carrier）に結合させて利用することができる。また、これらのイムノアッセイにおいて、モノクローナル抗体は、検出可能な標識を様々な方法で付けることができる。本発明のモノクローナル抗体を利用することができるイムノアッセイの種類の例としては、直接または間接的な形式の競合イムノアッセイ、および非競合イムノアッセイである。このようなイムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、およびサンドイッチ（イムノメトリック）アッセイである。本発明のモノクローナル抗体を用いた抗原の検出は、生理学的サンプルについての免疫組織化学的アッセイ、または免疫細胞化学的アッセイを含むフォワードモード、リバースモード、または同時モードのいずれかで実行されるイムノアッセイを利用して行うことができる。当業者は、過度の実験をすることなく他のイムノアッセイ形式を知ることができるか、または容易に識別することができる。
【００４９】
モノクローナル抗体は、多くの異なるキャリアに結合することができ、ＭＡＬの存在を検出するために使用することができる。よく知られているキャリアの例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、ならびにマグネタイトを含む。キャリアの性質は、本発明の目的のために、可溶性、または不溶性とすることができる。当業者は、モノクローナル抗体に結合するための他の適切なキャリアを知っているか、または通常の実験を用いて確認することができる。
【００５０】
アッセイを行うには、培養液中に特定の「ブロッカー」を含めることが望ましい（通常は、標識された可溶性抗体を付加される）。「ブロッカー」は、実験試料中の非特異的タンパク質、プロテアーゼ、または抗ヘテロフィリック免疫グロブリンが、固相支持体上の抗体、または放射性標識抗体に偽陽性、または偽陰性の結果をもたらすクロスリンク、またはこれらの抗体を破壊しないことを保証するために添加される。このため、「ブロッカー」の選択は、本発明に記載のアッセイの特異性に実質的に追加することができる。アッセイにおいて使用されるような、同じクラス、またはサブクラス（アイソタイプ）について、多くの直接的に関連しない（すなわち、非特異的）抗体（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＭなど）は、「ブロッカー」として使用することができる。「ブロッカー」の濃度（通常、１〜１００μｇ／μＬ）は、標本において交差反応タンパク質を相互に生じることにより、適切な感度を維持するため、さらには任意の望ましくない相互作用を抑制するために重要である可能性がある。
【００５１】
ＭＡＬ産生、ＭＡＬ遺伝子発現、または疾患の時点における検出のための診断方法は、子宮頸部、または他の組織に由来する細胞調製物を含む検査サンプルが提供される方法を含む。好ましくは、このようなサンプルは、塗沫標本、またはその他の細胞サンプルとして提供される。
【００５２】
哺乳動物、好ましくはヒトから得られた細胞、または組織サンプルは、前記サンプルに含まれる検査細胞の標的細胞成分と、ＭＡＬを検出する試薬との間で接触することを可能とするために適切に前処理され、同等の通常細胞の成分と比較して、ＭＡＬにおける減少量を検出する。サンプルは、個々の細胞の観察を可能とするために好適な支持体上にマウントし得る。よく知られている支持材料の例としては、必要に応じてポリ−Ｌ−リジン、またはシランの層のような、細胞接着およびサンプルの固定を促進させるための層を備えるガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリウレタンを含む。子宮頸部塗抹標本、または生検は、例えば、およびパパニコロー（Ｐａｐ）テスト、または当業者に公知である任意のそれらの修飾のために調製されてもよく、試薬を標的成分に適切に到達させる手順により固定化されてもよい。本発明のある実施形態では、細胞診標本は、従来の塗抹標本サンプル、または子宮頸部細胞の薄層調製物、もしくは液体ベースの細胞学的サンプルの薄層調製物、または当業者に公知である任意の他の種類の調製物として提供される。もし、保存が必要な場合は、通常の手順では、良好に保存された組織の基礎構造を提供するパラフィン包埋に続く固定化のために緩衝ホルマリンを使用する。免疫組織化学的染色、または免疫染色を可能とするために、サンプル材料の抗原性を回復させるか、または暴露しなければならない。ホルムアルデヒド架橋タンパク質の抗原性を取得する１つの方法は、タンパク質分解酵素によるサンプル処理を含む。この方法は、材料の（一部の）消化をもたらし、元のタンパク質の節断片は、抗体に接触することができる。
【００５３】
ホルムアルデヒド架橋抗原の免疫反応を回復するためのもう１つの方法は、熱、またはサンプルの高エネルギー処置を用いた熱処理を必要とする。このような方法は、例えば、米国特許第５２４４７８７号明細書に記載されている。しかし、ホルムアルデヒド固定組織からの抗原を取得するための別の方法は、例えば、Norton, 1994. J. Pathol. 173(4):371-9、およびTaylorら, 1996. Biotech Histochem 71(5):263-70に記載されたように、マイクロ波と組み合わせて、またはオートクレーブの形態で、圧力鍋（pressure cooker）を使用することである。
【００５４】
ホルムアルデヒドについて、いくつかの選択肢を使用し得る。前記選択肢としては、エタノール、メタノール、ブタノール、メタカン（methacarn）、もしくはグリオキサール、クエン酸アセトンなどを使用することができ、または固定剤を組合せて使用することができる。また、このサンプルは、さらに処理する前に風乾させることができる。
【００５５】
サンプル材料は、核酸プローブで検出できるようにするために、ホルマリン固定、およびパラフィン包埋材料の場合には、回復、または暴露しなければならない。ある方法は、タンパク質分解酵素による処理、およびパラホルムアルデヒドによる潅流固定を必要とする。タンパク質の分解消化は、ＨＣｌの変性工程に先行されてもよい。この方法は、標的へのプローブの侵入を可能とする、材料の（一部の）消化をもたらす。例えば、凍結材料のような非ホルマリン固定材料の場合には、非特異的な暴露手順が要求される。サンプルのハイブリダイゼーション前に、トリエタノールアミン緩衝液で処理することによりアセチル化することができる。
【００５６】
続いて、核酸プローブまたは抗体は、適切な緩衝液内のサンプル材料と接触させられ、それらの核酸、またはタンパク質標的に対して特異的にハイブリダイズ、または結合することを許される。標的成分への核酸プローブ、または抗体の特異的結合下において、標識プローブおよび／または抗体は、共焦点レーザー走査型顕微鏡、明視野顕微鏡、セルソーティングに関連する蛍光色素を必要に応じて組み合わせたフローサイトメトリー、または当業者によく知られたこれらの技術の改良のような方法によって検出され得る。
【００５７】
本発明の方法についてのある実施形態では、同等の正常な細胞と比較して、検査細胞におけるＭＡＬプロモーターのメチル化の増加、および／または検査細胞におけるＭＡＬ産生の減少が検出された。
【００５８】
請求項１９に規定されたように、本発明は、対象の検査細胞における浸潤性を有するＨＰＶ誘導前がん病変、およびＴリンパ球成熟関連タンパク質（ＭＡＬ）に関連付けられるＨＰＶ誘導浸潤癌の検出方法において使用するための部品キットも提供する。このようなキットは、検査細胞に適切な回収培地で満たした容器と共に、（子宮）擦過検体を取得するためのブラシ、またはヘラ（spatula）を好適に含み得る。また、灌漑注射器、女性用の使い捨て尿カテーテル、および灌漑流体で満たされた容器を含むサンプリング装置は、頚膣洗浄により子宮頸部細胞を収集することも含む。本発明に係るキットには、ＭＡＬプロモーターのメチル化を検出するため、またはＭＡＬのｍＲＮＡの発現を検出するためのプライマー、およびプローブを含み得る。別の実施形態では、本発明のキットは、子宮頸擦過検体、または組織標本におけるＭＡＬタンパク質発現の検出のための抗体、および試薬を含み得る。
【００５９】
本発明に係る部品のキットは、ＭＡＬ特異的抗体、メチル化感受性制限酵素、または図１の核酸配列にハイブリダイズすることができるプローブもしくはプライマーのようなＭＡＬプロモーターのメチル化、またはＭＡＬ発現を検出するための方法を含む。
【００６０】
また、本発明のキットのさらに別の実施形態では、ＭＡＬプロモーターのメチル化、またはＭＡＬ発現の検出のための手段は、ＨＰＶ感染の検出のため、好ましくは、高リスク型のＨＰＶ感染の検出のための手段と組み合わせ得る。このような手段は、当技術分野で知られているような、ＨＰＶ特異的プライマーもしくはプローブ、ＨＰＶ感染のためのタンパク質マーカー、またはＨＰＶ感染のための代理マーカーも含み得る。本発明のキットの他の実施形態では、ＭＡＬプロモーターのメチル化、またはＭＡＬ発現の検出のための手段は、ＣＡＤＭ１（Genbank ID NM_014333.3）プロモーターのメチル化の検出のための手段と組み合わせ得る。ＣＡＤＭ１プロモーターのメチル化の検出は、上述したようなＭＡＬプロモーターのメチル化の検出におけるそれらの使用と同様の方法で実行される。
【００６１】
本発明を以下の非限定的な実施例の方法で説明する。
【実施例】
【００６２】
例１：子宮頚癌、および高悪性前駆病変におけるＭＡＬサイレンシング
子宮頚癌のマイクロアレイ発現解析において、ＭＡＬは、通常の上皮コントロールサンプルと比較して、子宮頚癌において最も大幅に下方制御される遺伝子の１つとして同定された。
【００６３】
子宮頚癌の組合せの独立した検証において、定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）解析の結果として、これらの腫瘍におけるＭＡＬのｍＲＮＡ発現の下方制御を確認した。ＭＡＬのｍＲＮＡの発現の減少は、通常のコントロールの８％（ｎ＝１２）に比べて、子宮頸癌の１００％（ｎ＝１２）、および高悪性ＣＩＮ病変（ｎ＝１５）の９３％で検出された。インビトロ検査において、子宮頸癌細胞株ＳｉＨａを含むＨＰＶ１６におけるＭＡＬの異所性過剰発現が、増殖の減少、および足場非依存性増殖の抑制をもたらすような、子宮頸がんの発達におけるＭＡＬの不活性化の機能的関与を明らかにした。
【００６４】
例２：子宮頸部発がんにおけるＭＡＬ遺伝子サイレンシングの機能的役割
我々は、子宮頚部発がんの潜在的な機能的役割を確認するために、ＨＰＶ１６を含む子宮頸癌細胞株ＳｉＨａの細胞をＭＡＬ発現ベクター（ＳｉＨａ＿ＭＡＬ）、または空のコントロールベクター（ＳｉＨａ−）で安定して形質転換した。ＳｉＨａ＿ＭＡＬ形質転換体における異所性ＭＡＬの発現は、ＲＴ−ＰＣＲにより確認した。両者の形質転換体について、それらの増殖率、遊走能力、および軟寒天での成長能力について調べた。ＳｉＨａ＿ＭＡＬ形質転換体は、ＳｉＨａ（−）細胞と比較して、増殖率について４３％の減少を示した。このことは、ＭＡＬの異所性発現は、インビトロにおいて、抗増殖効果を有することを示す。我々は、スクラッチアッセイを使用することで、ＳｉＨａ＿ＭＡＬ形質転換体では遊走が強く抑制されることを見出した。さらに、ＳｉＨａ＿ＭＡＬ細胞は、空ベクターを有するＳｉＨａ形質転換体と比較して、足場非依存性増殖について５３％減少することを示した。
【００６５】
それと共に、これらのデータは、ＭＡＬ遺伝子サイレンシングが、子宮頸がんの発達において不可欠な生物学的イベントであり、子宮頸がん細胞におけるＭＡＬの再発現は、増殖、遊走、および足場非依存性増殖のような腫瘍細胞の十分に確立された特性を効果的に抑制することを示した。
【００６６】
例３：プロモーターのメチル化に起因するＭＡＬサイレンシングは、高悪性ＣＩＮ病変、子宮頸部扁平上皮癌、扁平上皮癌、腺癌、および神経内分泌癌で頻繁に起こる
我々が子宮頸がんにおいて再発性の染色体欠失を見つけることができなかった染色体の２ｑ１１−１３にＭＡＬ遺伝子が位置するという事実は、潜在的な転写のエピジェネティック制御を探索することが求められる。メチル化阻害剤、およびヒストン脱アセチル化阻害剤で処理された子宮頸がん細胞株、ならびにＨＰＶ−不死化細胞株は、ＭＡＬのｍＲＮＡ発現の強い上方制御をもたらし、このことは、ＭＡＬの下方制御は、エピジェネティック制御機構に依存していることを示した。
【００６７】
次に、我々は、子宮頸部組織標本におけるＭＡＬプロモーターのメチル化について、ＭＡＬプロモーター内の２つの領域（すなわち、最初のＡＴＧに関して−６８０〜−５７３、および−９２〜−７、それぞれＭ１およびＭ２と表す）を標的として、定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）により解析した。ハウスキーピング遺伝子である・アクチン（ＡＣＴＢ）を、全ＤＮＡの入力測定の基準として選択した。全てのサンプルについて測定したメチル化されたＤＮＡの量は、ＡＣＴＢ量により区分され、あらかじめ定義したカットオフ（例えば、通常コントロールの平均割合＋２．５８×標準偏差）を超える割合を有するサンプルを陽性として分類した。
【００６８】
我々は、Ｍ１およびＭ２の両方の領域のメチル化（以下、高密度メチル化と呼ぶ）が、通常の頸部コントロールサンプル（ｎ＝２２）では全く検出できず、ＣＩＮ１病変の３２％（ｎ＝６６）、ＣＩＮ３病変の８０％（ｎ＝６４）、および頸部扁平上皮癌の９４％（ｎ＝９４）で検出できることを見出した。
【００６９】
我々は、子宮頸部扁平上皮癌の次に、子宮頸部腺癌におけるＭＡＬプロモーターのメチル化についても解析した。子宮頚癌の２０％を占める腺癌は、全国的頸部スクリーニングプログラムで子宮頸部腺癌の発生率が同一であるか、または増加する国において特に関心がある。このことは、子宮頸部腺癌、およびその腺癌前駆病変、すなわち上皮腺癌（ＡＣＩＳ）は、スクリーニングに基づく細胞診において頻繁に見逃されていることを示す。子宮扁平上皮癌と子宮頸部腺癌との間の比較遺伝学的、およびエピジェネティックな研究に基づいて、両者の腫瘍ヒストタイプは、異なる発癌経路を介して発達することが見出された（Dongら、2001、Kangら、2005、Wiltingら、2006、Henkenら、2007）。したがって、子宮頸部扁平上皮癌の検出を可能にする大部分のマーカーは、必ず子宮頸部腺癌を検出するわけではない。よく研究された例は、メチル化マーカーＣＡＤＭ１であり、扁平上皮癌の８３％でメチル化されるが、腺癌ではわずか２３％でメチル化が示されるのみである（Overmeerら、2008）。第二の例は、９遺伝子（ＡＰＣ、ＤＡＰＫ１、ＣＤＨ１、ＨＬＴＦ、ｈＭＬＨ１、ｐ１６、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＴＨＢＳ１、およびＴＩＭＰ３）についてのメチル化についての研究に由来する。この研究は、ＣＤＨ１およびＤＡＰＫ１は、扁平上皮癌においてより高頻度にメチル化され、一方、ＨＬＴＦ、ＴＩＭＰ３、ＲＡＳＳＦ１Ａ、およびＡＰＣは、腺癌においてより高頻度にメチル化されることを示す（Kangら、2005）。同様の結果は、ｐ１６、ＡＰＣ、ＨＩＣ１、ＤＡＰＫ、ＭＧＭＴ、およびＣＤＨ１のメチル化の解析についての研究において得られた。ＡＰＣおよびＨＩＣ１は、腺癌においてより高頻度にメチル化され、一方、ｐ１６およびＤＡＲＫは、扁平上皮癌において顕著にメチル化されることが分かった（Dongら、2001）。
【００７０】
興味深いことに、ＭＡＬプロモーターのメチル化は、知られているマーカーの大部分とは対照的に、扁平上皮癌と同様の頻度で頸部腺癌において検出された。すなわち、９３％（２６／２８）の腺癌は、Ｍ１およびＭ２領域の両者でプロモーターのメチル化を示した。同様の結果を子宮頸部腺扁平上皮癌および神経内分泌癌について得た。
【００７１】
したがって、ＭＡＬプロモーターのメチル化は、全ての子宮頸癌ヒストタイプのための普遍的なメチル化マーカーであることが明らかである。
【００７２】
例４：子宮擦過検体における、ＭＡＬのｍＲＮＡ発現の減少、およびＭＡＬプロモーターのメチル化の検出
我々は、集団ベースのスクリーニング検査に参加する女性のコホート内症例対照研究を用いて、１８カ月のフォローアップ期間内に最大ＣＩＮ１と診断されたｈｒＨＰＶ陽性女性（すなわち、コントロール）に対してフォローアップの１８カ月以内にＣＩＮ２以上（１の癌を含む）ｈｒＨＰＶ陽性の女性の子宮擦過検体（すなわち、症例）を試験した。これらの女性の基準頸部擦過検体（baseline cervical scrape）は、ＲＮＡおよびＤＮＡの両者が保存される保存培地に集められた。
【００７３】
これらの擦過検体のサブセットから単離されたＲＮＡについてｑＲＴ−ＰＣＲの増幅は、コントロールの２８％と比較して、７１％のケースにおいてＭＡＬの発現の減少を示した。さらに、ＭＡＬの発現の減少は、ｈｒＨＰＶ陰性の擦過検体を有する女性の１３％（３／２１）においてのみ見出された。
【００７４】
我々の知る限りでは、我々は、頸部擦過検体におけるｍＲＮＡの下方制御の検出を最初に示した。さらに、子宮擦過検体における発現解析は、上方制御遺伝子に限られており、ｍＲＮＡ発現解析よりも主にタンパク質発現解析に関し、ｐ１６は、よく研究された例である。
【００７５】
次に、メチル化解析は、集団ベースの子宮頸部スクリーニングに参加し、フォローアップの１８月以内にＣＩＮ２以上と診断されたｈｒＨＰＶ  ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲ陽性の女性の子宮擦過検体の大規模な組において実施された（Bulkmansら、2007; Hesselinkら、2006）。これらは、基準時に異常のある細胞診（すなわち、細胞核の異常、または悪化の境界線上）を有する女性、および通常の細胞診を有する女性を含み、後者は、単独の陽性ｈｒＨＰＶ検査により発見された。加えて、１８カ月のフォローアップ期間内に、通常の細胞診、およびＣＩＮ１以下を有するｈｒＨＰＶ陽性コントロールの女性が含まれた。片方、または両方のＭＡＬ領域のメチル化は、通常の細胞診を有するｈｒＨＰＶ陽性コントロールの女性における３１％から、基準時に通常な細胞診、および異常のある細胞診を有するＣＩＮ２以上の女性では、それぞれ６５％、および８４％に変化した。後者の２つのグループを組み合わせることで、ＭＡＬのメチル化は、ＣＩＮ２以上を有する女性の７９％で発見された。
【００７６】
例５：自己サンプリング標本におけるＭＡＬプロモーターのメチル化
我々は、その後、４５，０００の自己サンプリングパッケージの全てが、２度目の督促後も通常の子宮頸部スクリーニング（www.trialregister.nl、トライアルno.NTR962（PROHTECT検査）を参照）のための案内状に応答しなかった女性に送信された前向き研究過程の間に、集められた自己サンプリング頚膣標本をVibaBrush（Rovers Medical Devices、OSS、オランダ）、またはPantarheiサンプラー（Pantarhei Devices, Zeist、オランダ）を用いて解析した。これらの女性の約３分の１は、研究室に自己採取標本を送り返す。これらのサンプルは、ＨＰＶのＰＣＲ解析（すなわち、ベータグロブリンＰＣＲ陽性）に適しており、少なくとも、ｈｒＨＰＶ  ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲ収量による検査は、応答女性の該当する集団における通常のスクリーニングにより、この集団におけるＣＩＮ２以上の病変を見出した（Baisら、Int J Cancer：2007、120:1505-1510）。
【００７７】
フォローアップにおける臨床的に意味のある疾患の証拠のない、全部で１８６人のｈｒＨＰＶ陽性女性と、異常のあるフォローアップ標本、およびＣＩＮ３以上の重度の病変を有する６８人の女性とは、ＭＡＬ  Ｍ１およびＭ２プロモーター領域の両方についてｑＭＳＰにより検査された。後者の女性の自己サンプルの６２％は、片方、または両方のＭＡＬプロモーター領域についてＣＩＮ３以上と診断された。それと比較して、フォローアップにおいて臨床的に意味のある疾患の証拠を有していない女性では、２８％のみであった。これらのデータは、自己サンプリング試料におけるＭＡＬプロモーターのメチル化解析は、十分に実行可能であり、潜在的な高悪性度子宮頸部疾患の検出を促進できることを示す。
【００７８】
例６：生検の頸部擦過検体、および自己サンプリング試料におけるＭＡＬメチル化解析へのＣＡＤＭ１プロモーターのメチル化検出の追加
我々は、ＣＩＮ２以上についての感度を増加させる目的で、以前に頸部癌に機能的に関与することが示された第二のメチル化マーカー、すなわちＣＡＤＭ１（Genbank ID NM_014333;実施例３も参照）の付加的な価値を解析した。ＭＡＬの２つのプロモーター領域とＣＡＤＭ１の１つのプロモーター領域とを組み合わせたメチル化解析により、メチル化陽性高悪性ＣＩＮ病変の数は、８０％から９１％に増加した（これらの領域の少なくとも１つについて陽性結果の場合に陽性とした）。逆に、このＣＡＤＭ１領域の解析の追加は、通常の頚部および低悪性ＣＩＮ病変において、陽性に影響しなかった。他の遺伝子の追加のメチル化データは、感度の数値の顕著な増加は認められなかった。したがって、我々は、この組み合わせは、ＣＩＮ２／３について最適のマーカーパネルを提供すると結論付けた。
【００７９】
頸部擦過検体へのＣＡＤＭ１（Genbank ID NM_014333）メチル化解析の追加により、異常のある細胞診を有する女性において、５％以上のＣＩＮ２病変が検出され、その結果、全ＣＩＮ２以上の検出率は８３％となった。
【００８０】
自己サンプリング標本における、ＭＡＬプロモーター、およびＣＡＤＭ１プロモーターのメチル化解析の結合後は、ｈｒＨＰＶ陽性女性の自己サンプルにおいて６９％陽性となり、後者はＣＩＮ３以上と診断された。逆に、フォローアップにおいて臨床的に意味のある証拠のないｈｒＨＰＶ陽性女性の約３分の１のみが、片方、または両方のマーカーについてメチル化を示した。
【００８１】
ｈｒＨＰＶジェノタイピングデータとメチル化データとの結合後、ＣＩＮ３以上と診断された女性の８４％は、ＣＡＤＭ１メチル化、ＭＡＬメチル化、および／またはＨＰＶ１６が存在することが明らかとなった。ところが、マーカーの陽性の数、フォローアップにおいて臨床的に意味のある疾患の証拠のないｈｒＨＰＶ陽性の女性は、顕著な変化は認められなかった。
【図１−２】
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【図１−１】
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【配列表】
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