(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）細胞の受容体に結合可能な、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）である第１のコンポーネントと、
（ｂ）リボゾーム不活化毒素（ＲＩＰ）であって、前記第１のコンポーネントにコンジュゲートされている第２のコンポーネントと、
を含むことを特徴とする化合物。
【請求項２】
リボゾーム不活化毒素（ＲＩＰ）がタイプＩ  ＲＩＰである請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
リボゾーム不活化毒素（ＲＩＰ）が、サポリン、モモルジン（ＭＯＭ）、種由来ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ−Ｓ）、ボウガニン及びゲロニンのいずれかである請求項１から２のいずれかに記載の化合物。
【請求項４】
毒素がサポリンである請求項１から３のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】
第１のコンポーネントがドロロキシフェン化合物、フルベストラント化合物、イドキシフェン化合物、ラソフォキシフェン化合物、ラロキシフェン化合物、タモキシフェン化合物、及びトレミフェン化合物のいずれかである請求項１から４のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
第１のコンポーネントがラロキシフェン化合物である請求項１から５のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
第１のコンポーネントが第２のコンポーネントに共有結合的にコンジュゲートされている請求項１から６のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
第１のコンポーネントが第２のコンポーネントに化学的リンカーでコンジュゲートされている請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
リンカーがビス−ジアゾ−（ｏ−トリジン）［ＢＤＴ］である請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
第２のコンポーネントに存在する、第１のコンポーネントの結合可能部位の総数をＮとしたときに、前記第１のコンポーネントの前記第２のコンポーネントに対する化学量論的比率が０．５：１からＮ：１の範囲である請求項１から９のいずれかに記載の化合物。
【請求項１１】
第１のコンポーネントの第２のコンポーネントに対する化学量論的比率が、０．５：１〜２．５：１である請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれかに記載の化合物と、医薬的に許容される担体、賦形剤、及びアジュバントの少なくともいずれかとを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１から１１のいずれかに記載の化合物、及び請求項１２に記載の医薬組成物のいずれかの、ＥＲ＋癌細胞を含む癌を治療するための医薬の製造のための使用。
【請求項１４】
癌が、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、及びその他のＥＲ＋癌のいずれかである請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
医薬が、哺乳動物の治療に適している請求項１３から１４のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
哺乳動物がヒトである請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
医薬が、注射及び注入のいずれか（静脈内その他経路による）による対象への投与、及び経口による対象への投与のいずれかに適している請求項１３から１６のいずれかに記載の使用。
【請求項１８】
医薬が、コンジュゲートされていない形態で使用したときの第１のコンポーネントの臨床的血中ピーク濃度の１％から５００％に相当するピーク血中コンジュゲート濃度を得るための、対象への注射に適している請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
医薬が、コンジュゲートされていない形態で使用したときの第１のコンポーネントの臨床的血中ピーク濃度の８０％から１４０％に相当するピーク血中コンジュゲート濃度を得るための、対象への注射に適している請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
請求項１から１１のいずれかに記載の化合物の製造方法であって、第１のコンポーネントと、第２のコンポーネントとを反応させて第１のコンポーネントを第２のコンポーネントにコンジュゲートさせることを含む化合物の製造方法。
【請求項２１】
コンジュゲーション中に、第１のコンポーネントと第２のコンポーネントのｐＨを制御することを含む請求項２０に記載の化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）癌細胞を含む癌の治療に関し、特に乳癌の治療に関する。本発明者らは、医薬コンポーネントと毒素コンポーネントを含むコンジュゲートを提供する。このコンジュゲートは、ＥＲ＋癌細胞を標的としてこれを破壊する能力に優れている。
【背景技術】
【０００２】
世界中の女性の間で乳癌は最もよく見られる癌であり、癌に起因する死の最頻要因となっている。乳癌は様々な要因によって引き起こされると考えられており、血中エストロゲンレベルの上昇はその１つである。エストロゲン受容体ファミリーの分野と、エストロゲン受容体癌細胞と正常なエストロゲン受容体細胞との相違に関して、これまで多くの研究がなされている。そのような研究は、体内のエストロゲン産生を抑制することにより、乳癌を治療することができる医薬の創製を目的としてきた。
【０００３】
この種の癌は、エストロゲン受容体を有する細胞（ＥＲ＋細胞）を含む。これらは、通常約２００，０００から５百万という非常に多数のエストロゲン受容体を有する細胞である。正常な非腫瘍性細胞は、通常約２０，０００から８０，０００のエストロゲン受容体を有している。非常に多数のエストロゲン受容体の存在ゆえに、癌細胞は少量のエストロゲンにも反応して、該ホルモンの存在下で細胞分裂速度が上昇する。
【０００４】
非特許文献１には、乳癌のための新規な全身治療法について論じられている。これらの治療法は、精製抗エストロゲンや選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）などによる内分泌療法、増殖因子受容体を標的とするモノクローナル抗体、小分子シグナル伝達阻害剤、ワクチンや免疫療法を用いたストラテジー、及び抗アンジオジェネシス療法などを含む。
【０００５】
エストロゲン受容体陽性の癌の治療に有効であることが示された医薬の１つは、タモキシフェンである。タモキシフェンは、エストロゲン受容体陽性の腫瘍性細胞のアンタゴニストとして作用する選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）の１例であり、細胞表面のエストロゲン受容体に結合して、エストロゲンの細胞への結合を阻害し細胞分裂を抑制する。これは、乳房組織ではアンタゴニストとして作用するものの、子宮内膜上ではアゴニストとしても作用するので、一部の女性においては子宮内膜癌と関連があるとされてきた。よって、癌を含む子宮内膜の変化は、タモキシフェンの副作用の１つである。
【０００６】
また、タモキシフェンとポルフィリンのコンジュゲートが、癌細胞の光線力学的治療法に有効であることが示唆されている。このポルフィリンは、赤色光照射により光毒性を示し、コンジュゲートされていないポルフィリンよりもＭＣＦ−７乳癌細胞においてより強い細胞殺傷能を有する。乳癌の光線力学的治療法のための、エストロゲン受容体陽性乳癌細胞に選択的に局在するエストラジオール−ポルフィリンコンジュゲートが、非特許文献２に記載されている。
【０００７】
癌治療における有効性について研究がなされた他のコンジュゲートには、抗体−毒素コンジュゲートがある。非特許文献３は、ホジキンリンパ腫の治療のために、サポリンなどのリボゾーム不活化蛋白質をモノクローナル抗体に結合させることを記載している。しかしながら、臨床試験を成功裏に経て認可され製品になったものは、未だ存在しない。
【０００８】
現在、市場に出ている癌治療（特に、乳癌治療）の医薬や療法は、これら癌細胞の分裂を抑制するが、数年後には、この細胞は変異してこれら医薬が作用しなくなる。その結果、この医薬は無用となり患者も治療に反応しなくなる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｓｏｏ  Ｌｏ，Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｒ．Ｄ．  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、「Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ」、２００３年、第１２巻、ｐ．２７７−２８７
【非特許文献２】Ｓｗａｍｙ、Ｊａｍｅｓ、Ｍｏｈｒ、Ｈａｎｓｏｎ、Ｒａｙ、「Ｂｉｏｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ＆  ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、２００２年、第１０巻、ｐ．３２３７−３２４３
【非特許文献３】Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ，Ｐｏｌｉｔｏ他、「Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍｏｔｏｌｏｇｙ」、２０００年、第１１０巻、ｐ．３５１−３６１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで本発明の目的は、ＳＥＲＭによる治療や他の治療法がそうであるように、単にＥＲ＋癌細胞の分裂速度を低減させるのではなく、これら癌細胞を破壊することにより前述の問題を解決するＥＲ＋癌（特に、前述のＥＲ＋乳癌を含む）の新規治療法を提供することにある。
【００１１】
上述の問題点は、次に記載する本発明の態様及び実施形態により解決される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
従って、本発明は、
（ａ）ＥＲ＋細胞の受容体に結合可能な第１のコンポーネントと、
（ｂ）第２のコンポーネントと、
を含み、前記第２のコンポーネントがリボゾーム不活化毒素であって、前記第１のコンポーネントにコンジュゲートされていることを特徴とする化合物を提供する。
【００１３】
第１のコンポーネントは、エストロゲン受容体を有する細胞（所謂、ＥＲ＋細胞）に結合可能であり、換言すればＥＲ＋細胞受容体（即ち、エストロゲン細胞受容体）に結合可能である。前述のように、この文脈では、ＥＲ＋細胞受容体とは、エストロゲン受容体陽性細胞受容体（ＥＲ＋）を指す。この受容体は様々な種類の細胞に存在することがあるが、本発明は、細胞の種類に関わらず、あらゆるＥＲ＋受容体に結合可能なコンポーネントをも包含する。しかしながら、本発明が対象とする典型的な細胞とは、通常多数（典型的には２００，０００から５百万）のエストロゲン受容体を有する腫瘍性の細胞である。本発明は、あらゆる種類の乳癌細胞を特に対象としている。一方、正常な非腫瘍性のエストロゲン受容体細胞は、通常約２０，０００から８０，０００のエストロゲン受容体を有する。
【００１４】
第１のコンポーネントは、前述した基準を満たす限り特に限定されない。しかしながら、好ましい実施形態においては、第１のコンポーネントはラロキシフェンなどの選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）である。
【００１５】
本発明においては通常、リボゾーム不活化毒素は蛋白質（リボゾーム阻害蛋白質毒素はＲＩＰ毒素と呼ばれる）であり、前記ＲＩＰはタイプＩ  ＲＩＰであることが好ましい。典型的には、この種の蛋白質は、非可逆的に蛋白質合成を阻害して細胞死を引き起こす。前記毒素は、前述した基準を満たす限り特に限定されない。好ましい実施形態においては、前記毒素はサポリンである。
【００１６】
好ましい実施形態においては、本発明の化合物における第１のコンポーネントと第２のコンポーネントの化学量論的比率は、０．５：１からＮ：１の範囲である。ここでＮは、第２のコンポーネント中に存在する、第１のコンポーネントの総結合部位数である。この結合部位は、第１のコンポーネントを第２のコンポーネントに結合させることができれば特に限定されない。通常、この結合部位はチロシン及びリシンのいずれかであるが、これらに限定されるものではない。サポリンには最大１４箇所のチロシン結合部位と最大２３箇所のリシン結合部位が存在し、これらの結合部位はそれぞれ独立して第１のコンポーネントの結合部位として機能することができる（即ち、チロシンのみ、リシンのみ、チロシンとリシンの双方の結合点を利用するかに応じて、Ｎ＝１４、Ｎ＝２３及びＮ＝３７のいずれかとなる）。従って、化学量論的比率の好ましい範囲は、０．５：１から３７：１であり、０．５：１から２３：１がより好ましく、０．５：１から１４：１が更に好ましい。しかしながら、どの結合点を利用するかに応じて、これら範囲内のどの比率も使用することができる。
【００１７】
更に特に好ましい実施形態においては、第１のコンポーネントと第２のコンポーネントの化学量論的比率は０．５：１から８：１（０．５：１から８：１未満が好ましい）の範囲であり、０．５：１から２．５：１がより好ましい。また、０．５：１から７：１、０．５：１から６：１、０．５：１から５：１、０．５：１から４：１、０．５：１から３：１、０．５：１から２：１などの化学量論的比率も好ましい。
【００１８】
ここで、化学量論的比率とは、平均的な化学量論的比率及び分子的な化学量論的比率の双方に言及している。例えば、１：１の分子的な化学量論的比率のコンジュゲート（即ち、第２のコンポーネント１分子に第１のコンポーネント１分子がコンジュゲートされている）と、３：１の分子的な化学量論的比率のコンジュゲート（即ち、第２のコンポーネント１分子に第１のコンポーネント３分子がコンジュゲートされている）を同量含む混合物の平均的な化学量論的比率は２：１になる。このようにして、非整数の化学量論的比率も可能である。
【００１９】
本発明は更に、前述した化合物のいずれかを含む医薬組成物を提供する。
【００２０】
他の態様においては、本発明は、前述した化合物及び組成物のいずれかの医療における使用を提供する。
【００２１】
更なる態様において、本発明は、ＥＲ＋細胞を含む癌細胞を治療するための医薬の製造のための、前述した化合物及び組成物の使用を提供する。ＥＲ＋細胞癌の種類は特に限定されないが、癌は、乳癌であることが好ましい。前記医薬は、いかなる哺乳動物の治療にも適しており、その対象が特にヒトであることが好ましい。医薬の投与方法は特に限定されないが、前記医薬は、対象において（静脈内その他経路による）注射及び注入のいずれかと、経口投与に適していることが好ましい。
【００２２】
前記医薬の投与量は、有効性及び毒性に係る要件を満たす限り特に限定されない。本発明の好ましい実施形態においては、前記医薬は、コンジュゲートされていない形態で投与したときの第１のコンポーネントの臨床ピーク血中濃度の１％から５００％に相当するピーク血中コンジュゲート濃度を達成するための、対象への注射に適している。
【００２３】
本発明の更に好ましい実施形態においては、前記医薬は、コンジュゲートされていない形態で投与したときの第１のコンポーネントの臨床ピーク血中濃度の８０％から１４０％を達成するための、対象への注射に適している。
【００２４】
ここで、目標とする血中ラロキシフェン濃度は、ヒトの標準的な治療上のピーク血中ラロキシフェン濃度（即ち、０．５ｎｇ／ｍｌ）に基づいている。
【００２５】
本発明は更に、第１のコンポーネントと第２のコンポーネントを反応させて、第１のコンポーネントと第２のコンポーネントをコンジュゲートさせることにより、前述の化合物を製造する方法を提供する。
【００２６】
本発明は更に、ＥＲ＋細胞を含む癌（特に乳癌）の治療方法であって、対象へ医薬を投与することを含み、該医薬は前述の化合物及び組成物のいずれかを含む方法を提供する。
【００２７】
驚くべきことに、本発明者らは、本発明に係るコンジュゲート化合物と組成物がＥＲ＋癌細胞の効果的な治療を提供し、これらの使用が、ＥＲ＋癌細胞の経日的腫瘍量の著しい初期縮小をもたらすのみならず、非腫瘍性ＥＲ＋細胞にそれ程影響を与えることなくＥＲ＋癌細胞の腫瘍増殖速度を良好且つ持続的に低下させることを見出した。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】各種サポリン：ラロキシフェン（Ｓ：Ｒ）コンジュゲートの濃度を漸減させてこれに曝露させたＭＣＦ−７、ＨＣＣ−１１４３、及びＯＶＣＡＲ−３細胞単層の生存率を示す。各細胞株の細胞生存率（％）は、標準的な乳酸脱水素酵素（ＬＤＡ）放出アッセイにより計算される。このアッセイでは、最低放出（０％生存率）が、マイトマイシンＣ５０μｇ／ｍｌで処理された細胞に相当し、最高放出（１００％生存率）が完全培地のみで処理された細胞に相当する。
【図２】５００ｎＭ  ２：１ラロキシフェン：サポリンコンジュゲート（Ｓ：Ｒ  １：２コンジュゲート）、相当するモル濃度のサポリン（５００ｎＭ）、ラロキシフェン（１，０００ｎＭ）、サポリン（５００ｎＭ）とラロキシフェン（１，０００ｎＭ）の混合物（コンジュゲートされていないサポリンとラロキシフェン）のいずれかに曝露させたＭＣＦ−７、ＨＣＣ−１１４３、ＯＶＣＡＲ−３細胞単層の生存率を示す。各細胞株の細胞生存率（％）は、標準的な乳酸脱水素酵素（ＬＤＡ）放出アッセイにより計算される。このアッセイでは、最低放出（０％生存率）が、５０μｇ／ｍｌマイトマイシンＣで処理された細胞に相当し、最高放出（１００％生存率）が完全培地のみで処理された細胞に相当する。
【図３】リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、０．４ｎｇ／ｍｌラロキシフェン、０．４ｎＭラロキシフェン：サポリン  ２：１コンジュゲート（Ｓ：Ｒ  １：２）のいずれかによる処理により雌性ヌードマウスに形成されたＭＣＦ−７腫瘍の成長プロファイルを示す。マウスは、接種後３６日目と４３日目に後眼窩経路で静脈内投与した。
【図４】コンジュゲート処理による腫瘍体積のパーセント変化を、対照とコンジュゲートされていない物質の場合とを比較して示す。
【図５】コンジュゲート処理による体重のパーセント変化を、対照とコンジュゲートされていない物質の場合とを比較して示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、ＥＲ＋陽性細胞受容体に結合可能な第１のコンポーネントと、第２のコンポーネントとを含む化合物であって、第２のコンポーネントは通常、ＲＩＰタイプＩクラスの毒素であり第１のコンポーネントにコンジュゲートされている化合物を提供する。
【００３０】
本発明における第１のコンポーネントは、ＥＲ＋陽性細胞受容体へ結合可能であり、この機能が維持される限り、第１のコンポーネントは特に限定されない。しかしながら前述の通り、任意の選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）化合物が特に有用であることが分かっている。ＳＥＲＭの種類は特に限定されないが、フルベストラント、タモキシフェン、ラロキシフェン、トレミフェン、ドロロキシフェン、イドキシフェン、及びラソフォキシフェンなどを挙げることができる。なかでも、ラロキシフェン化合物は特に有用である。
【００３１】
第２のコンポーネントは、リボゾーム不活化毒素である。先に述べたように、該コンポーネントは、蛋白質（ＲＩＰ毒素）であることが好ましく、タイプＩ  ＲＩＰであることが更に好ましい。該毒素は、単独では細胞内に侵入することができず、且つ細胞内活動にのみ働きかけることがより好ましい。
【００３２】
ラロキシフェンは閉経後の女性の骨粗鬆症の予防に使用される５１０Ｄａの選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）である。最近の臨床試験（Ｖｏｇｅｌ  ＶＧ、Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ  ＪＰ他、「ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｂｒｅａｓｔ  ａｎｄ  Ｂｏｗｅｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  （ＮＳＡＢＰ）．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ  ｖｓ  Ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｒｉｓｋ  ｏｆ  Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ：  Ｔｈｅ  ＮＳＡＢＰ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ  ａｎｄ  Ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ  （ＳＴＡＲ）Ｐ−２  Ｔｒｉａｌ」、「ＪＡＭＡ」、２００６年、第２９５巻、ｐ．２７２７−２７４１）によれば、エストロゲン受容体陽性乳癌の発症率低減に、ラロキシフェンがタモキシフェンと同程度有効であることが示された。しかしながら、ラロキシフェンを日常的に摂取した患者は、タモキシフェンを日常的に摂取した女性と比較して、子宮癌罹患率が３６パーセント低く且つ血栓の形成も２９パーセント低かった。子宮癌、特に子宮内膜癌はタモキシフェンの重大な副作用である。
【００３３】
ラロキシフェン化合物は、次の構造を有する。
【化１】
0005478492.tif 000002
【００３４】
前記構造式中、炭素に結合した水素の１つ以上が、置換基に置き換えられていてもよい。
【００３５】
ラロキシフェンの置換基は特に限定されず、任意の有機基及び、Ｂ、Ｓｉ、Ｎ、Ｐ、Ｏ、Ｓ原子などの周期表の３Ａ族、４Ａ族、５Ａ族、６Ａ族、７Ａ族の１以上の原子の少なくともいずれか、ハロゲン原子（例えばＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）を含むことができる。
【００３６】
置換基が有機基である場合には、この有機基は炭化水素基を含むことが好ましい。前記炭化水素基は、直鎖、分岐鎖、及び環状の基のいずれかを含むことができる。これとは別に、前記炭化水素基は、脂肪族基及び芳香族基のいずれかを含むことができる。更にこれとは別に、前記炭化水素基は飽和基及び不飽和基のいずれかを含むことができる。
【００３７】
炭化水素基が不飽和基を含む場合には、前記炭化水素基は、１つ以上のアルケン官能性及び１つ以上のアルキン官能性の少なくともいずれかを含むことができる。前記炭化水素基が直鎖及び分岐鎖のいずれかの基を含む場合には、第１級、第２級、及び第３級アルキル基の少なくともいずれかを１つ以上含むことができる。前記炭化水素基が環状の基を含む場合には、芳香族環、脂肪族環、複素環基、及びこれらの基の縮合環誘導体の少なくともいずれかを含むことができる。従って、前記環状の基は、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、インデン、フルオレン、ピリジン、キノリン、チオフェン、ベンゾチオフェン、フラン、ベンゾフラン、ピロール、インドール、イミダゾール、チアゾール、及びオキサゾール基の少なくともいずれか、及び前記基の位置異性体を含む。
【００３８】
炭化水素基の炭素原子数は、特に限定されないが、１−４０Ｃ原子を含む炭化水素基が好ましい。従って、炭化水素基は、低級炭化水素（１−６Ｃ）及び高級炭化水素（７Ｃ原子以上（例えば７−４０Ｃ原子））とすることができる。環状の基における環の原子数は特に限定されないが、前記環状の基における環が、３−１０原子を含むことが好ましい（例えば、３、４、５、６、及び７のいずれか）。
【００３９】
上述したヘテロ原子を含む基、及び上で定義したその他の基は、Ｂ、Ｓｉ、Ｎ、Ｐ、Ｏ、Ｓ原子などの周期表の３Ａ族、４Ａ族、５Ａ族、６Ａ族、７Ａ族の１以上のヘテロ原子、及びハロゲン原子（例えばＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）のいずれかを含むことができる。従って前記置換基は、水酸基、カルボン酸基、エステル基、エーテル基、アルデヒド基、ケトン基、アミン基、アミド基、イミン基、チオール基、チオエーテル基、硫酸基、スルホン酸基、リン酸基などの、有機化学における一般的な官能基の１つ以上を含んでいてもよい。前記置換基はまた、カルボン酸無水物及びカルボン酸ハライドなどの、これらの基の誘導体を含むこともある。
【００４０】
更に、いずれの置換基も、前記置換基及び官能基の少なくともいずれかを２つ以上組み合わせて含んでいてもよい。
【００４１】
本発明の第２のコンポーネントがＲＩＰタイプＩクラスの毒素である場合には、これは特に限定されない。該毒素は、サポリン、モモルジン（ＭＯＭ）、種由来ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ−Ｓ）、ボウガニン、ゲロニンのいずれであってもよく、特にサポリンは、本発明の化合物及び医薬組成物の一部をなす毒素として有用である。
【００４２】
サポリンは、ソープワート（Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の種子から得られる３０ｋＤａのタイプＩリボゾーム不活化蛋白質（ＲＩＰ）である。サポリンのＮ−グルコシダーゼ活性は、リボゾームＲＮＡ２８Ｓ中の特定のヌクレオチドを脱プリン化することにより、蛋白質合成を非可逆的に阻害し細胞死をもたらす。サポリンは、種子から得られるだけでなく、遺伝子組換えによって得ることも可能である。
【００４３】
サポリンの種類は特に限定されないが、ＳＯ−６として知られる形態のサポリンが好ましい。この形態のサポリンは、変性剤、プロテアーゼ、及び熱に対して非常に安定であるという点で特徴的である。更にタイプＩＩ  ＲＩＰ（例えばリシン）とは対照的に、サポリンは、それ自身による細胞結合及び内部移行メカニズムを欠如していることにより、通常の条件化では安全と考えられている（Ｓｔｉｒｐｅ  Ｆ，  Ｇａｓｐｅｒ−Ｃａｍｐａｎｉ  Ａ，  Ｂａｒｂｉｅｒｉ  Ｌ，  Ｆａｌａｓｃａ  Ａ，  Ａｂｂｏｎｄａｎｚａ  Ａ，  Ｓｔｅｖｅｎｓ  ＷＡ、「Ｒｉｂｏｓｏｍｅ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓｅｅｄｓ  ｏｆ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ  Ｌ．  （ｓｏａｐｗｏｒｔ）  ｏｆ  Ａｇｒｏｓｔｅｍｍａ  ｇｉｔｈａｇｏ  Ｌ．  （ｃｏｒｎｃｏｃｋｌｅ）  ａｎｄ  ｏｆ  Ａｓｐａｒａｇｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ  （ａｓｐａｒａｇｕｓ）  ａｎｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｌａｔｅｘ  ｏｆ  Ｈｕｒａ  ｃｒｅｐｉｔａｎｓ  Ｌ．  （ｓａｎｄｂｏｘ  ｔｒｅｅ）」、「Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ」、１９８３年、第２１６巻、ｐ．６１７−６２５）。
【００４４】
第１のコンポーネントと第２のコンポーネントのコンジュゲーションは、特に限定されないが、ビス−ジアゾ−（ｏ−トリジン）［ＢＤＴ］等の化学的リンカーを使用した共有結合的なコンジュゲーションが有効であることが分かっている。更に、リンカーの使用及びリンカーとして使用する化合物は特に限定されないが、前記具体例が効果的に機能することが示されている。
【００４５】
本発明の化合物における第１のコンポーネントと第２のコンポーネントの化学量論的比率は特に限定されず、０．５：１からＮ：１の範囲とすることができる。ここでＮは、第２のコンポーネント中に存在する、第１のコンポーネントの総結合部位数である。これら第１と第２のコンポーネントの化学量論的比率は、特に限定されないが、０．５：１から１４：１であり、０．５：１から８：１、好ましくは０．５：１から２．５：１であるコンジュゲートがＥＲ＋癌細胞の治療に有効である。驚くべきことに、本発明者らは、ラロキシフェン：サポリン比率を約２：１としたときに、乳癌細胞の治療に最も有効なコンジュゲートが得られることを見出した。前記コンジュゲートの使用は、経日的腫瘍体積の著しい初期低下のみならず、持続的且つ良好な腫瘍増殖速度の減少をもたらした。しかしながら、化学量論的比率が０．５：１から８：１未満の範囲内である本発明のコンジュゲートも、同様に有効である。
【００４６】
本発明の化合物を含む医薬組成物にはまた、医薬的に許容される担体、賦形剤、アジュバントの少なくともいずれかを含有させることができるが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
本発明に係る化合物及び組成物は、その使用は特に限定されないが、典型的には、ＥＲ＋細胞を含む癌の治療、特にＥＲ＋癌の中でも乳癌、卵巣癌、子宮頸癌の治療に使用する医薬の製造に使用される。
【００４８】
本発明の化合物及び組成物の使用は、哺乳動物全て、特にヒトに適する。
【００４９】
前記使用は、前記医薬が注射及び注入のいずれか、特に静脈内や皮下（但し、これらに限定されない）、経口投与を含むその他の手段による投与に適している。
【００５０】
前記使用は、対象への注射により、コンジュゲートされていない形態で使用したときの第１のコンポーネントの臨床ピーク血中濃度の１％から５００％の範囲のいずれかのピーク血中濃度を得ることに更に適している。特に前記使用は、注射により臨床ピーク血中濃度の１％から４００％、１％から３００％、特に１％から２００％、好ましくは８０％から１４０％を得るのに更に適している。本発明者らは、驚くべきことに、ラロキシフェン：サポリンの比率が２：１のコンジュゲートを使用して８０％から１４０％を得る治療が、対照群と比較して経日的腫瘍体積の初期における著しい低下のみならず、非腫瘍性ＥＲ＋細胞にそれ程影響を与えずに、ＥＲ＋癌細胞の腫瘍増殖率の低下を良好且つ持続的にもたらすことを見出した。
【００５１】
エストロゲンの競合的拮抗薬として働く（即ち、細胞増殖速度を低下させる）既存の癌治療薬とは異なり、本発明の化合物、医薬組成物、及び治療は、多数のＥＲ受容体を有する細胞（即ち癌細胞）には致死的効果を有するが、その他のＥＲ＋細胞にはそのような効果を示さない。短期治療により癌細胞を破壊すれば、表現型の変化の程度を小さくすることができる。この表現型の変化は、競合的拮抗薬に長期的に曝露された癌細胞に通常見られ、標的細胞の拮抗薬感受性の喪失につながる。本化合物は、癌細胞がＥＲ＋からＥＲ−に変異すると効果を失う。また本化合物は、ハーセプチンよりも優れた利点を２つ有する（ハーセプチンは、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体に作用するヒト化モノクローナル抗体であり、乳癌の治療に使用される）。１つ目は、ハーセプチンが主にＨｅｒ２／ｎｅｕ陽性細胞を標的とするのに対し、本化合物は癌細胞をＨｅｒ２／ｎｅｕ陽性の如何に関わらずＥＲ＋細胞を標的とすることであり、２つ目は、癌細胞の複製を単に遅らせるだけでなくこれを破壊することである。本発明の化合物は、標的とする癌細胞に焦点を合わせることができる光源がない場合でも、癌細胞を標的とすることができるので、光線力学的治療法に見られる問題点がない。本化合物はまた、免疫複合体形成による血管漏出症候群及び腎毒性のリスクが低いという点で、免疫毒素（毒素に結合させたモノクローナル抗体）より優れている。
【００５２】
更に、コンジュゲートが標的細胞に入った後、リンカーに対する細胞内プロテアーゼの作用によりＳＥＲＭ（担体）とタイプＩ  ＲＩＰ（毒素）とが分離されたかどうかとは無関係であり、本化合物は、ＳＥＲＭとその受容体との結合、或いはそのような結合によって活性化される細胞機構に依存しないので、その有効性は変化しない。即ち、一度細胞内に入れば、タイプＩ  ＲＩＰは、リボゾーム延いては全ｍＲＮＡ（ハウスキーピング遺伝子により作られたもの、他の細胞受容体への結合及びこれらの活性化により生じる刺激性シグナル（例えば、ＳＥＲＭ担体の細胞受容体との結合によりもたらされるシグナル）によって誘導されたもの、他の環境的／内的機構及び刺激の少なくともいずれかにより誘導されたものを含む）の翻訳を直接的且つ非可逆的に阻害する。
【実施例】
【００５３】
以下の考察と添付の図面を参照し、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、これら実施例はほんの一例に過ぎない。
【００５４】
実施例１−ラロキシフェンのサポリンへのコンジュゲーション
ラロキシフェン（シグマ）を、ビス−ジアゾ−（ｏ−トリジン）［ＢＤＴ］をリンカーとして（このリンカーは、チロシンを介した結合に有用である）サポリン（シグマ）にコンジュゲートさせた。このリンカーは、酸性溶液中で非常に安定だが、ｐＨが７になるとチロシンや他の芳香性フェノールと極めて急速に反応する。このため前記反応は制御が困難で、適切に制御しないと、該リンカーがサポリンの配列中のチロシン１４残基を介してサポリンと架橋し、その完全性を破壊してしまう。従って、この反応の実施条件は非常に重要である。
【００５５】
ラロキシフェンのサポリンに対する比率が１４：１、８（約）：１及び２：１のコンジュゲートを調製した。
【００５６】
２：１（ラロキシフェン：サポリン）コンジュゲーションのプロトコルを次に示す。コンジュゲーションを行うために、サポリン中のチロシンに対してモル比で１０倍量のＢＤＴを使用し、−２０℃で３０秒から５０秒以上反応させた。水酸化ナトリウムの１モル濃度水溶液（Ｍ．ＮａＯＨａｑ）を適量使用してｐＨを２から５に上昇させた後、１モル塩化水素（Ｍ．ＨＣｌ）を添加して反応を停止させた。紫外分光分析から、３０秒の反応時間で、サポリン１分子に対し平均してＢＤＴ２分子が反応することが示された。インキュベーション時間を延長させることにより、平均して８から１４分子のＢＤＴがサポリン１分子と反応した。各ＢＤＴ分子が１残基のチロシンとだけ反応する確率を高めるために、過剰量のＢＤＴを使用した。このことは、これらＢＤＴ２分子それぞれにおける２番目のジアゾ基が反応せずに残存することにより、構造中にフェノール基を３基有するラロキシフェンとの反応にこれらが利用可能であることを意味する。
【００５７】
得られた混合物を、Ｍ．ＨＣｌを用いてゲル濾過し過剰なＢＤＴを除去した後、ｐＨを７に上げて、ＢＤＴ−サポリンコンジュゲートを大過剰のラロキシフェン溶液（５０％メタノール）と反応させた。ラロキシフェンは、酸性溶液中では安定だがアルカリ溶液中では安定ではないので、得られた溶液を直ちに再度酸性にした。大過剰のラロキシフェンを使用することで、ラロキシフェンは、そのフェノール基のうちの１基だけでＢＤＴを介してサポリンと結合することにより、その化学的改変は最小限に留まり、その完全性は最大限維持される。
【００５８】
ラロキシフェンとの反応により茶色の溶液が生成する。この色は、溶液をクロロホルムで抽出することにより除去した。真空下４０℃での蒸発により、淡い麦色の水層の体積を小さくした後、１３，０００ＲＰＭで遠心して固形物を除去した。得られた淡黄色の溶液をＭ．ＨＣｌによるゲル濾過で精製することにより、無色のラロキシフェン−ＢＤＴ−サポリンコンジュゲート溶液を得た。
【００５９】
実施例２−細胞株
ＭＣＦ−７細胞株（ＥＣＡＣＣ、カタログｎｏ．８６０１２８０３）は、６９歳女性の乳腺癌から単離されたものであり、エストロゲン受容体を発現する。この細胞株を、２ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｎ（シグマ）、１％非必須アミノ酸（シグマ）、１００ＩＵペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（シグマ）、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（シグマ）（完全培地として）を添加した、最小必須培地（シグマ）で維持した。
【００６０】
ＨＣＣ−１１４３細胞株（ＡＴＴＣ、カタログｎｏ．ＣＲＬ−２３２１）は、５２歳女性の原発性乳管癌から単離されたものであり、エストロゲン受容体を発現しない。この細胞株を、２ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｎ（シグマ）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（シグマ）、１ｍＭ  Ｎａ−Ｐｙｒ（シグマ）、１００ＩＵペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（シグマ）、１０％ＦＣＳ（シグマ）（完全培地として）を添加した、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマ）培地で維持した。
【００６１】
最後に、ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３細胞（ＡＴＴＣ、カタログｎｏ．ＨＴＢ−１６１）は、６０歳女性の卵巣腺癌から単離されたものであり、エストロゲン受容体を発現する。この細胞株を、２ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｎ（シグマ）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（シグマ）、１ｍＭ  Ｎａ−Ｐｙｒ（シグマ）、０．０１ｍｇ／ｍｌウシインシュリン（シグマ）、１００ＩＵペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（シグマ）、２０％ＦＣＳ（シグマ）（完全培地として）を添加した、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマ）培地で維持した。
【００６２】
実施例３−クローン原生アッセイ
ＭＣＦ−７、ＨＣＣ−１１４３、ＯＶＣＡＲ−３の各培養物を、培養密度約８０％でトリプシン処理により収穫し、無血清培地で１回洗浄した後、これを、９６ウェル平底プレート（Ｎｕｎｃ）の１ウェル当たり２００μｌの完全培地中に５×１０３細胞で播種した。
【００６３】
４８時間３７℃で培養後、培地を除き、試験物質（ラロキシフェン：サポリンコンジュゲートのＰＢＳ溶液）及び対照物質（サポリン、ラロキシフェン、ＰＢＳ（シグマ）、陽性対照のマイトマイシンＣ（シグマ））のいずれかを異なる希釈度で含有する完全培地で置換した（１００μｌ／ウェル）。実験は、４連で実施した。
【００６４】
１８時間３７℃で培養後、試験化合物を除き、完全培地を各ウェルに２００μｌ／ウェルで添加した。
【００６５】
３７℃で９６時間培養後、培地を除き、０．９％トリトンＸ−１００（シグマ）のＰＢＳ溶液（室温）を、全ウェルに１００μｌ／ウェルで添加した。３７℃で２時間培養した後、全ウェルからＰＢＳ−トリトンＸ−１００溶液５０μｌを新しい平底９６ウェルプレートに移した。
【００６６】
ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙキット（プロメガ）の検出試薬を取扱説明書に従って調製し、検出試薬を全ウェルに５０μｌ／ウェルで添加した。室温暗条件下で３０分間培養した後、全ウェルにＳｔｏｐ溶液を５０μｌ／ウェルで添加して反応を停止させ、４９０ｎｍでの各ウェルの吸光度を測定した。
【００６７】
実施例４−インビボでの抗腫瘍活性
６から８週齢の雌性ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）３０匹に、２×１０７ＭＣＦ−７細胞をマトリゲル（ベクトン・ディッキンソン）（総量２００μｌ）と共に皮下接種した。実験終了まで、体重減少と腫瘍増殖（直交する２軸を測定し、計算式［π×（最小測定値）／２）２×（最大測定値）］により算出）を毎日モニターした。
【００６８】
測定した腫瘍の体積が０．３ｃｍ３に達したときに（接種３６日後）、マウスを数群に分け（各群３匹）、各群に次のいずれかを静脈内（後眼窩静脈経路）投与した。
＊ピーク血中Ｒ：Ｓ  ２：１コンジュゲート濃度０．４ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ（それぞれラロキシフェン０．４ｎｇ／ｍｌ、０．２ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌに相当する）を得るための、ラロキシフェン：サポリン  ２：１コンジュゲート（Ｓ：Ｒ  １：２）のＰＢＳ溶液１００μｌ（これら３群をそれぞれＡ、Ｂ、Ｃとする）
＊ピーク血中ラロキシフェン（コンジュゲート）濃度を０．４ｎｇ／ｍｌ、０．２ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌを得るための、ラロキシフェンのＰＢＳ溶液１００μｌ（これら３群をそれぞれＤ、Ｅ、Ｆとする）
＊ＰＢＳ１００μｌ（１群：Ｇ）
【００６９】
目標とする血中ラロキシフェン濃度は、ヒトの標準的な治療上のピーク血中濃度（即ち０．５ｎｇ／ｍｌ）に基づいている。コンジュゲートとして或いはそれ単独で投与されるラロキシフェンの前記ピーク血中濃度を得るためのマウス個体への投与量は、各マウスの体重（ｇ）に０．０８（マウスの血液量（ｍｌ）は、平均して体重の８％である）と、所望の血中ラロキシフェン濃度（０．４、０．２、０．１ｎｇ／ｍｌ）を乗じて算出した。
【００７０】
初回の投与から７日後（接種後４３日）のマウスに対して、同様の最終血中ラロキシフェン濃度（０．４、０．２、０．１ｎｇ／ｍｌ）が得られるように、コンジュゲート、ラロキシフェン単独、ＰＢＳの２回目投与を行った。
【００７１】
統計学的分析
統計学的差異は、ノンパラメトリックなマン−ホイットニー検定により算出し、ｐ＜０．０５であれば有意と判定した。
【００７２】
結果
この研究は、サポリンとラロキシフェンのコンジュゲートが、雌性生殖器官のＥＲ陽性細胞、或いは他の非ＥＲ陽性細胞を破壊せずに、エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳腺細胞を選択的に殺滅可能かどうかを確立することを目的として行った。この目的でサポリンをラロキシフェンにモル比（Ｒ：Ｓ）１４：１、８：１、２：１でコンジュゲートし、これらコンジュゲートの投与量増加に伴うＭＣＦ−７（ＥＲ陽性乳癌細胞株）、ＨＣＣ−１１４３（ＥＲ陰性乳癌細胞株）、ＯＶＣＡＲ−３（ＥＲ陽性乳癌細胞株）の細胞単層への影響を試験した。
【００７３】
図１に示すように、ラロキシフェン：サポリン  １４：１コンジュゲート（Ｓ：Ｒ  １：１４）は、いずれの細胞株に対しても限定的にしか作用せず、ＨＣＣ−１１４３、ＯＶＣＡＲ−３細胞株と比較し、ＭＣＦ−７細胞株に対して選択的な致死的作用は全く有していないことが分かる。対照的に、ラロキシフェン：サポリン  ８：１コンジュゲート（Ｓ：Ｒ  １：８）は、濃度５００ｎＭ以上で全細胞株に対し致死的であることが示された。２５０ｎＭにおいてのみ、ＭＣＦ−７細胞株に対する選択的な致死的作用の僅かな増加が認められた（ＭＣＦ−７生存率３３．６±２％に対し、ＨＣＣ−１１４３生存率７０．８±５％、ＯＶＣＡＲ−３生存率６１．２±５．６％）。
【００７４】
ラロキシフェン：サポリン  ８：１コンジュゲート（Ｓ：Ｒ  １：８）と同様に、ラロキシフェン：サポリン  ２：１コンジュゲート（Ｓ：Ｒ  １：２）は、試験したコンジュケート濃度のうちの最高濃度では、ＥＲの状態に関わらず全細胞を殺滅した。しかしながらこれより低い投与量では、ラロキシフェン：サポリン  ２：１コンジュゲートは、試験した全３種のコンジュゲート中最も著しい選択的作用を示した。コンジュゲート濃度５００ｎＭでは、ラロキシフェン：サポリン  ２：１コンジュゲートは、ＨＣＣ−１１４３（６２．８±１０．７％）とＯＶＣＡＲ−３（６５．２±３．５％）には限定的にしか作用しなかったものの、ＭＣＦ−７細胞に対してはその大部分を殺滅した（生存率４．９±４．３％）。
【００７５】
これらの結果に鑑みて、更に詳細なインビトロ分析にはラロキシフェン：サポリン  ２：１コンジュゲートを選択した。この目的のために、ＭＣＦ−７、ＨＣＣ−１１４３、及びＯＶＣＡＲ−３細胞の単層を、５００ｎＭラロキシフェン：サポリン  ２：１コンジュゲート、相当モル濃度のサポリン（５００ｎＭ）、ラロキシフェン（１,０００ｎＭ）、サポリン（５００ｎＭ）とラロキシフェン（１，０００ｎＭ）の混合物（サポリンとラロキシフェンはコンジュゲートされていない）で処理した。
【００７６】
図２は２つの独立した実験の平均を示すが、同図に示されるように、ラロキシフェンは、ＥＲ陽性乳癌であるＭＣＦ−７細胞株に対して有意な（ｐ＜０．０５）選択的作用を示したが、ＥＲ陰性のＨＣＣ−１１４３細胞株、卵巣のＥＲ陽性ＯＶＣＡＲ−３細胞株に対してはそのような作用を示さなかった。同様に、サポリンとラロキシフェンの混合物は、ＭＣＦ−７細胞に対して選択的作用を示したが、サポリンそれ自体では有意な（ｐ＞０．０５）致死的作用が得られなかったことから、この作用は、ラロキシフェンの活性によるものと考えられる。モル比２：１でラロキシフェンをサポリンにコンジュゲートさせることにより、両化合物の単なる混合物と比較して、これら化合物のＭＣＦ−７に対する致死的作用を有意に（ｐ，０．０５）増加させる（ＭＣＦ−７生存率１６．０±６．３％に対し５１．６±３．２％）が、ＨＣＣ−１１４３及びＯＶＣＡＲ−３に対しては、致死的作用は限定的にしか増加しなかった（ＨＣＣ−１１４３生存率７２．４±５．７％に対し８４．３±８．５％、ＯＶＣＡＲ−３生存率７７．７±４．９％に対し１０４．４±２．５％）。
【００７７】
ラロキシフェン：サポリン  ２：１コンジュゲート（Ｓ：Ｒ  １：２）のインビボでの腫瘍増殖抑制の有効性を試験するために、雌性ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）にＭＣＦ−７細胞を皮下接種した。腫瘍が形成された時点で（３６日目）、ピーク血中ラロキシフェン：サポリン  ２：１（Ｓ：Ｒ  １：２）濃度を０．４ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭとするために、後眼窩経路でラロキシフェン：サポリン  ２：１コンジュゲート（Ｓ：Ｒ  １：２）を、これらマウスに静脈内ボーラス注射した。この濃度は、ラロキシフェンピーク血中濃度０．４、０．２、０．１ｎｇ／ｍｌを得るのに必要な量に相当し、これはそれぞれヒトの目標ピーク臨床血中ラロキシフェン濃度８０％、４０％、２０％に当たる。対照動物には、ＰＢＳ或いは同量のラロキシフェンを同経路で投与した。４３日目のマウスに対して、ラロキシフェン：サポリン  ２：１（Ｓ：Ｒ  １：２）、ＰＢＳ、ラロキシフェンのいずれかの２回目の投与を行った。
【００７８】
エストロゲン産生に対するＭＣＦ−７細胞の天然の感受性のために、ヌードマウスモデルの経日腫瘍体積の変動は、約４日乃至５日周期の正弦パターンに従う（図３参照）。この周期の長さは、マウスの発情周期の長さと関連する（即ち、４日乃至５日）。その結果、実験的な分析を促進するために、図３は、各実験群の腫瘍体積の変動を経日変化及び５日周期をオーバーラップさせる（オーバーラップは１点当り４日間）ための移動平均（即ち、トレンド線）として示した。
【００７９】
ＰＢＳ処理群は、上述した正弦パターンの腫瘍増殖を示した。このパターンは、各周期における最大腫瘍体積が、最終的に致死的腫瘍サイズに至るまで増加するという自然傾向によって特徴付けられる。０．２ｎｇ／ｍｌと０．１ｎｇ／ｍｌのラロキシフェンで処理した場合には、ＰＢＳ対照群と比較して何ら変化はなかった。０．４ｎｇ／ｍｌラロキシフェン群のみが、経時的な腫瘍サイズの維持或いは僅かな縮小を表す自然傾向を示した。これは、選択的エストロゲン受容体モジュレーターの臨床学的作用様式の特徴である。
【００８０】
ピーク血中ラロキシフェン：サポリン  ２：１（Ｓ：Ｒ  １：２）濃度を０．２ｎＭ、０．１ｎＭとする処理は、いずれもＰＢＳ対照群と比較して、腫瘍増殖における変化を何らもたらさなかった。しかしながら、０．４ｎＭラロキシフェン：サポリン  ２：１（Ｓ：Ｒ  １：２）による処理は、０．４ｎｇ／ｍｌラロキシフェン群及びＰＢＳ対照群と比較して著しい経日腫瘍体積の初期縮小（図３の経日腫瘍体積変化の３７日目と３８日目を参照）もたらした。更には、０．４ｎｇ／ｍｌラロキシフェン群で得られた結果と比較して、良好且つ持続的な腫瘍体積増殖速度の減少（図３の本研究の移動平均トレンド線参照）をももたらした。
【００８１】
実施例５−コンジュゲートのインビトロ活性
この研究の目的は、ヌードマウスに埋込んだ、ヒトのエストロゲン受容体陽性乳癌細胞株である皮下のＺＲ−７５−１の増殖動態に対するコンジュゲートの作用を評価することである。
【００８２】
本研究では、ＺＲ−７５−１の増殖がエストロゲンに依存するため、４０匹以上の正常な４−６週齢の雌性胸腺欠損ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）に対し、腫瘍細胞接種の３日前から毎日５ｍｇ／ｋｇエストラジオールを注射した。エストラジオール処理後の全マウスに、２１Ｇ針とシリンジを用いて２５×１０６のＺＲ−７５−１細胞（ＡＴＣＣより入手）をマトリゲル（ベクトン・ディッキンソン）と共に皮下接種した。
【００８３】
試験物質の初回投与後、３６日間に亘り、４８時間から７２時間毎に体重と腫瘍体積をモニターした。腫瘍体積は、次の計算式を利用して求めた：（腫瘍体積）＝（ａ２×ｂ／２）（式中ａは最小径値、ｂは最大径値）。
【００８４】
形成された腫瘍が約７５−１５０ｍｍ３（個々の腫瘍体積は、１００から２５０ｍｇに及ぶこともある）に達したときに、７群間の平均腫瘍体積が対照群の平均腫瘍重量の１０％以内になるように、マウスを３処理群（各群ｎ＝１２）に分けた。同日中（１日目）に、（Ａ）サポリン−ラロキシフェンコンジュゲート、（Ｂ）コンジュゲートされていないサポリンとラロキシフェンの混合物、及び（Ｃ）ラロキシフェンのみ、のいずれか０．１ｍｌをマウスに静脈内注射した。この処理を、７２時間毎に合計５回（１、３、６、９、１２日目）繰り返した。
【００８５】
全３群における、マウス１匹当たりのラロキシフェンの正味の注射量は同一とし、ピーク血中ラロキシフェン濃度は、０．７ｎｇ／ｍｌとなるように設計した。この濃度は、臨床的な血中ラロキシフェン濃度の範囲内である。これらマウスをまた、ラロキシフェンとコンジュゲートされていないサポリン及びラロキシフェンとコンジュゲートされたサポリンのいずれかを注射し、サポリン：ラロキシフェンのモル比を１：２として算出した場合のサポリンが同量投与されるようにした。
【００８６】
エストラジオールの投与は、皮下の腫瘍の正常な増殖を促すために、埋込み後１５日目に再開した。
【００８７】
瀕死状態であるとき、或いは体重が１４ｇ未満に減少したときに、マウスを安楽死させた（ＣＯ２を使用した窒息により）。個々の腫瘍体積が３，０００ｍｍ３を達したとき、或いは腫瘍が潰瘍化したときにも安楽死させた。実験中、Ｂ群（コンジュゲートされていないサポリン及びラロキシフェンの投与群）のマウス１匹を実験から除かざるを得なかった。
【００８８】
この実験の結果は、サポリン−ラロキシフェンコンジュゲート投与が、ラロキシフェン単独、コンジュゲートされていないラロキシフェン及びサポリンを投与した場合のいずれと比較しても、有意な（ｐ＜０．０５、マン−ホイットニー）ピーク腫瘍体積縮小（５日目）がもたらされたことを示唆している。
【００８９】
更に、処理終了後（１２日目）から３６日目までに、サポリン−ラロキシフェンコンジュゲートを投与したマウスは、一般に、他の２実験群と比較して常に腫瘍体積が小さかった（図４参照）。
【００９０】
マウスの一般的な健康状態の指標は、実験期間中その体重を観察することにより得ることができる。そのため全実験期間中に亘って、各群のマウスの体重を４８時間から７２時間毎に測定した。結果から明らかなように、ラロキシフェン単独、コンジュゲートされていないラロキシフェン及びサポリンを投与した場合のいずれと比較しても、サポリン−ラロキシフェンコンジュゲートを投与されたマウスは、有意に（ｐ＜０．０５、マン−ホイットニー）良好な体重増加プロファイルを示すことが分かった（図５参照）。
【００９１】
実施例６−サポリンへのラロキシフェンの更なるコンジュゲーション
実験Ａ
ラロキシフェン（シグマ）を、ビス−ジアゾ−（ｏ−トリジン）［ＢＤＴ］をリンカーとしてサポリン（シグマ）にコンジュゲートさせた。このリンカーは、酸性溶液中で非常に安定だが、ｐＨが７になるとチロシンや他の芳香性フェノールと極めて急速に反応する。このため前記反応は制御が困難で、適切に制御しないと、該リンカーがサポリンの配列中のチロシン１４残基を介してサポリンと架橋し、その完全性を破壊してしまう。従って、この反応の実施条件は非常に重要である。
【００９２】
ラロキシフェンのサポリンに対する比率が２：１のコンジュゲートを調製した。
【００９３】
２：１（ラロキシフェン：サポリン）コンジュゲートを調製するためのプロトコルを次に示す。コンジュゲーションを行うために、１．２ｍｇの凍結乾燥したサポリン（シグマ）を０．６ｍｌの水に溶解し軽く超音波処理した。この溶液に０．４ｍｌのＤＭＳＯ（シグマ）と０．０１ｍｌの１Ｍ  ＨＣｌを添加し、ＤＭＳＯを混合した。得られた蛋白質溶液を軽く超音波処理した後、０．４ｍｇから１ｍｇのラロキシフェンをこの溶液に添加し、次いでサポリン中のチロシン１残基に対してモル過剰のＢＤＴを添加した。得られた溶液のｐＨを、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（Ｍ．ＮａＯＨａｑ）を適量添加し６．５に上げ、室温で２２分から３４分間反応させた。反応終了後、得られた溶液にリン酸を最終濃度が約９となるように添加し混合した。過剰ＢＤＴは、Ｂｉｏｇｅｌ  Ｐ２カラム（バイオラド）を使用して、３０．４％ＤＭＳＯと９．１％リン酸を含む水溶液（溶離液）で溶出させることにより、粗製コンジュゲート溶液から除去した。サポリンとラロキシフェンを含有する画分を、ＵＶ分光光度法により決定し、使用前に水で透析した。
【００９４】
実験Ｂ
ラロキシフェン−ＨＣｌとＤＳＣ（ジ（Ｎ-スクシンイミジル)カーボネート）（このリンカーは、リシンを介した結合に有用である）を、質量比２：１（ラロキシフェン：ＤＳＣ）で０．２ｍｌのＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）に溶解させた。トリエチルアミン（０．０１ｍｌ）をピリジン（０．１３ｍｌ）に添加し、この調製物を０．０１ｍｌずつラロキシフェン／ＤＳＣ混合物に１５分間かけて順次添加した。このプロセスは、２１℃、定常攪拌下で行った。４０％ＤＭＦを含む１５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でサポリン溶液（０．６ｍｇ／ｍｌ）を調製し、０．０１ｍｌのラロキシフェン／ＤＳＣ溶液を添加した。得られた調製物を先ずボルテックスし混合した後、コロイド状になるまで超音波処理し、次いでコンジュゲーション反応を２１℃で３０分間行った。得られた生成物を、１３，０００ｒｐｍで３分間遠心して得た清澄な上清を直接使用するか、０．１ＨＣｌで処理したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１０カラムを通して、凍結乾燥させ、ＰＢＳに再懸濁してから使用した。
【００９５】
実験Ｃ
サポリンを、２ｍｇ／ｍｌのグルコースを含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させ、得られた溶液に、１Ｍ  ＨＣｌ（０．１ｍｌ）を定常攪拌下で添加しｐＨを３．７に下げた。この調製物に、ラロキシフェンＨＣｌのＤＭＳＯ溶液（３ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌを２１℃、定常攪拌下で添加し、次いで０．００５ｍｌのＢＤＴ試薬を添加した。定常攪拌下のサポリン−ラロキシフェン−ＢＤＴ調製物に、０．１Ｍ  ＮａＯＨを０．０１ｍｌずつ順次添加しｐＨを６．８とし、このｐＨで６０分間反応させた。得られた生成物を、先ず水で透析し、次いで２ｍｇ／ｍｌグルコースを含有するＰＢＳで１晩透析した。このプロセスで生成した茶色の沈殿物を回収し、超音波処理と激しくボルテックスすることにより水に再懸濁させた。遠心分離による清澄化後、上清を分けてから使用した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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