(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１２のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメインを認識し、かつ、ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメイン内のＲＧＤ配列を認識しない抗体またはその抗原結合能を有する断片。
【請求項２】
請求項１に記載の抗体またはその抗原結合能を有する断片であって、ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメインドメインを認識し、かつ、ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメイン内のループ領域を認識しない抗体またはその抗原結合能を有する断片。
【請求項３】
請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合能を有する断片であって、ＡＤＡＭ−１５及びインテグリンαｖβ３依存性細胞接着を阻害する抗体またはその抗原結合能を有する断片。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合能を有する断片であって、ＡＤＡＭ−１５及びインテグリンα９β１依存性細胞接着を阻害する抗体またはその抗原結合能を有する断片。
【請求項５】
請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合能を有する断片であって、癌細胞の増殖を抑制することを特徴とする抗体またはその抗原結合能を有する断片。
【請求項６】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合能を有する断片。
【請求項７】
前記抗体が、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５０で特定されるハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体である、請求項６に記載の抗体またはその抗原結合能を有する断片。
【請求項８】
前記抗体が、キメラ抗体、又は、ヒト化抗体である、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合能を有する断片。
【請求項９】
前記抗体断片が、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）若しくはこれらの重合体、又は、二量体化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）である、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合能を有する断片。
【請求項１０】
前記抗体の断片が、抗体のＣＤＲ配列を含むペプチドである、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合能を有する断片。
【請求項１１】
前記ＣＤＲ配列が、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列
番号１９、または配列番号２０のアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載の抗体または
その抗原結合能を有する断片。
【請求項１２】
請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合能を有する断片をコードするＤＮＡ。
【請求項１３】
請求項１２に記載のＤＮＡを含有する組み換えベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組み換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換細胞。
【請求項１５】
ハイブリドーマ細胞系である、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５０で特定されるハイブリドーマ細胞系である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
請求項１４又は請求項１５に記載の細胞を培養し、培養物中で抗体またはその抗原結合能を有する断片を生成させ、培養物から抗体またはその抗原結合能を有する断片を抽出することを特徴とする、請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合能を有する断片の製造方法。
【請求項１８】
請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合能を有する断片を有効成分として含有する、医薬組成物。
【請求項１９】
細胞増殖、細胞遊走、細胞浸潤、細胞間接着、又は、血管新生に起因する疾患の治療薬
又は予防薬である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
抗癌剤又は癌転移抑制剤である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合能を有する断片を備える診断薬。
【請求項２２】
細胞増殖、細胞遊走、細胞浸潤、細胞間接着、又は、血管新生に起因する疾患の診断薬
である、請求項２１に記載の診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＤＡＭ−１５（A Disintegrin And Metalloprotease）を特異的に認識する抗体および当該抗体の断片（以下、総称して「抗体等」という）、該抗体等をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該ベクターで形質転換した細胞、前記抗体等を産生する細胞、前記抗体等の製造方法、前記抗体等を含有する医薬組成物、前記抗体等を含有する診断薬に関する。また、本発明は、ヒトＡＤＡＭ−１５を特異的に認識するモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体；前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞；前記モノクローナル抗体の製造方法；前記ハイブリドーマ細胞の製造方法；前記抗体を含有する治療剤；前記抗体を含有する診断剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＤＡＭは、システイン残基を多く含むディスインテグリンドメインと、金属プロテアーゼ様ドメインを含む分子であり、金属プロテアーゼ活性のみならず接着分子活性をも発揮し得る機能性タンパク質であることから注目を集めている。ＡＤＡＭの多くは膜貫通ドメインを有して細胞膜に局在し、細胞表面における分子制御に極めて重要な役割を果たしている。ＡＤＡＭファミリータンパク質は、現在30種以上が同定されており、その膜外部が細胞接着、細胞融合、タンパク質分解、細胞内シグナル伝達の機能を有することから、受精、神経発生、筋芽細胞融合、サイトカインや他の膜タンパク質の膜外部の切断に関与していると考えられている。特に、ＡＤＡＭファミリータンパク質は、ヘビ毒ディスインテグリンに構造が似た膜係留タンパク質であることから、細胞間および細胞−マトリックス相互作用に関わる様々な生物学上の過程（例えば、受精、筋発生、および神経発生等）に関係している。これまで、新規なＡＤＡＭ分子の探索とその機能解明及びその制御方法に関して、創薬上の観点から精力的な研究が行われてきた。【０００３】
例えば、ＡＤＡＭ−１及びＡＤＡＭ−２は、卵子のインテグリンを介することにより、卵子と精子の受精に関与すると考えられている（非特許文献１参照）。ＡＤＡＭ−１０は、ノッチシグナル（Notch signal）の制御に関与し、神経形成に重要な役割を果たしていること、及び、膜蛋白のプロセシングさらには細胞外マトリックス成分の分解に関与することが示唆されている（非特許文献２参照）。最近では、軟骨細胞外基質アグリカンの分解酵素であると考えられていたアグリカナーゼの１種が精製、クローニングされ、それがＡＤＡＭファミリーの分子であることが報告されている（非特許文献３参照）。従って、ＡＤＡＭ−１０の酵素活性を制御することにより、関節炎や変形性関節症の治療薬の開発が期待される。ＡＤＡＭ−１３は、アフリカツメガエルにおいて、発生期に発現し、その形態形成に重要な役割を果たしていると考えられている(非特許文献４参照)。現在のところ、哺乳動物由来のＡＤＡＭ−１３は報告されていない。ＡＤＡＭ−１７は、腫瘍壊死因子（TNF）の転換酵素（可溶性TNFの生成酵素）として知られている。ＴＮＦの異常亢進により起因する疾患（炎症、発熱、循環器系異常、移植片対宿主反応、自己免疫疾患等）の予防及び／又は治療薬として、ＡＤＡＭ−１７の阻害剤が精力的に研究されている。ＡＤＡＭ−１７そのもの、及び、ＡＤＡＭ−１７の阻害剤のスクリーニング方法については既に開示されている（特許文献１、及び、特許文献２参照）。【０００４】
ＡＤＡＭ−１５は、ＡＤＡＭファミリータンパク質に属する、分子量約90KDaの膜貫通型糖タンパク質である。ＡＤＡＭ−１５は、そのディスインテグリン領域を介して、細胞と細胞の接着に関与する接着分子としての機能を備えることが明らかにされている（非特許文献５参照）。２０以上あるＡＤＡＭファミリータンパク質のうち、ヒトＡＤＡＭ−１５のみがディスインテグリン領域にＲＧＤトリペプチド配列を有し、組換え型ヒトＡＤＡＭ−１５とインテグリンαｖβ３との特異的な相互作用は、ＲＧＤ配列に依存することが示唆されている。また、ＡＤＡＭ−１５は、インテグリン（αｖβ３、α５β１、αＩＩβ３、α９β１）と相互作用し、細胞−細胞間の接着に関わる可能性が示唆されている。また、ディスインテグリン領域のＲＧＤ配列を含む、４８１番目から４９２番目のアミノ酸配列（RPTRGDCDLPEF）（ループ配列）における、Ｒ４８１、Ｃ４８７、Ｄ４８８、Ｌ４８９、Ｐ４９０、Ｅ４９１又は及びＦ４９２がアラニンに置換されたＡＤＡＭ−１５は、α９β１インテグリンとの相互作用能が低下する。このことから、ＡＤＡＭ−１５におけるＲ４８１、Ｃ４８７、Ｄ４８８、Ｌ４８９、Ｐ４９０、Ｅ４９１及び又はＦ４９２が、ＡＤＡＭ−１５とα９β１インテグリンとの相互作用に必要であることが示されている（非特許文献６参照）。【０００５】
遺伝子組換えＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメインを投与すると、乳癌細胞の増殖が阻害されることから、ＡＤＡＭ−１５とインテグリンの相互作用が、癌細胞の増殖に関与していると考えられる（非特許文献７参照）。【０００６】
また、ＡＤＡＭ−１５は、細胞遊走にも関与すると考えられている。例えば、ＡＤＡＭ−１５を過剰発現したNIH3T3細胞では、遊走が低下することが報告されている（非特許文献８参照）。また、Jurkat細胞にＡＤＡＭ−１５を過剰発現させると、細胞凝集が増加することが報告されている（非特許文献９参照）。更に、ＡＤＡＭ−１５は、細胞接着分子であるＶＥカドヘリンと共局在することが報告されている（非特許文献１０参照）。これらのことから、ＡＤＡＭ−１５は、細胞間接着に重要な役割を持つと考えられている。【０００７】
ＡＤＡＭ−１５は、全身の組織で発現しているが、血管内皮細胞でも発現しており、ＡＤＡＭ−１５ノックアウトマウスでは、血管新生が抑制されることが報告されている（非特許文献１１参照）。更に、ＨＵＶＥＣをＶＥＧＦで刺激すると、ＶＥＧＦＲ−２とＡＤＡＭ−１５の発現が増加することから、ＡＤＡＭ−１５と血管新生の関与が示唆されている（非特許文献１２参照）。【０００８】
ＡＤＡＭ−１５との関与が報告されている、細胞増殖、細胞遊走、細胞間接着、血管新生はそれぞれ癌及び癌の転移と密接に関係していることから、ＡＤＡＭ−１５が癌及び癌の転移と関与していると考えられる。【０００９】
更に、ＡＤＡＭ−１５は関節リウマチや動脈硬化などで発現が亢進していることから、組織修復過程に関与すると考えられる。また、ＡＤＡＭ−１５は、心筋梗塞発症後早期に梗塞部位および非梗塞部位でその発現が亢進していることから、心臓における組織修復過程に関与すると考えられる。【００１０】
しかし、ＡＤＡＭ−１５の構造とこれらのＡＤＡＭ−１５の多彩な機能との関係について詳細に報告されたものはなく、ＡＤＡＭ−１５の機能が、どの構造により発揮されているかについては知られていなかった。【００１１】
また、ＡＤＡＭ−１５に対するモノクローナル抗体として、例えば、Ｒ＆Ｄ社から販売されている２３Ｇ９等が知られているが、これらの抗体とＡＤＡＭ−１５の機能との関係は報告されていなかった。また、ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメインを認識する抗体は、これまで報告されていなかった。【００１２】
現在、癌の治療薬として数多くの医薬が知られているが、その多くは副作用が強いことから、より副作用が低減しつつ治療効果を有する癌の予防薬及び／又は治療薬等の開発が望まれている。これまでの抗癌剤は、癌細胞に対して特異的な殺細胞作用又は細胞増殖抑制作用を備えることにより、副作用が少なくかつ癌を治療することができる薬剤として開発されてきた。しかし、実際には、多くのこのような薬剤がまだ正常細胞にも作用し、重篤な副作用を来たしていた。
特許文献1 : 米国特許第５８３０７４２号
特許文献2 : 米国特許第６０１３４６６号
非特許文献1 : Almeida, E.A. et al., Cell, 81, 1095-1104, 1995
非特許文献2 : Wen, C. et al., Development, 124, 4759-4767, 1997
非特許文献3 : Tortorella, M. D. et al., Science, 284, 1664-1666, 1999
非特許文献4 : Alfandari, D. et al., Dev.Biol., 182, 314-330, 1997
非特許文献5 : Zhang, X.P. et al., J. Biol.Chem. 273, 7345-7350, 1998
非特許文献6 : Nath, D. et al., J. Cell Sci. 112, 579-587,1999 
非特許文献7 : Eto, K. et al. J. Biol. Chem. 277, 17804-17810, 2002
非特許文献8 : Trochon-Joseph, V., et al., Cancer Res, 64, 2062-2069, 2004
非特許文献9 : Herren, B., et al., Exp Cell Res, 271, 152-160, 2001
非特許文献10 : Charrier, L., et al., J Biol Chem, 282, 16948-16958, 2007
非特許文献11 : Ham, C., et al., Exp Cell Res, 279, 239-247, 2002
非特許文献12 : Horiuchi, K., et al., Mol Cell Biol, 23, 5614-5624, 2003
非特許文献13 : Komiya, K., et al., Arthritis Res Ther, 7, R1158-1173, 2005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、これまでの抗癌剤開発の観点と異なる観点、即ち、癌細胞の細胞−細胞間接着に焦点を当てた癌の治療薬を提供することを目的とする。即ち、本発明は、癌細胞の増殖、及び、癌細胞の細胞−細胞間接着を抑制する、副作用が低減された癌の治療薬を提供することを目的とする。また、本発明は、ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメインを認識し、抗癌剤として利用可能な抗体等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、ＡＤＡＭ−１５を認識する抗体について、鋭意検討を行った結果、ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメインを認識する抗体に、癌細胞増殖抑制作用及び細胞接着阻害作用があることを見出した。本発明者らは、当該抗体の癌細胞増殖抑制作用及び細胞接着阻害作用がＡＤＡＭ−１５とインテグリンとの結合により発揮されるものと考え、更に研究を行った結果、驚くべきことに、当該抗体は、これまでＡＤＡＭ−１５のインテグリン結合部位であると考えられてきた、ディスインテグリンドメイン中のＲＧＤ配列、及び、ループ配列を認識しないことを見出した。本発明者らは、これらの研究成果から、これまでに知られていたＡＤＡＭ−１５のインテグリン結合部位とは異なる部位を認識する抗体に癌細胞増殖抑制作用及び細胞接着阻害作用があることを見出し、本発明を完成した。【００１５】
すなわち、本発明は、以下に記載のＡＤＡＭ−１５を特異的に認識する抗体等、該抗体等をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該ベクターで形質転換した細胞、前記抗体等を産生する細胞、前記抗体等の製造方法、前記抗体等を含有する医薬組成物、前記抗体等を含有する診断薬を提供する。【００１６】
（１）ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメインを認識し、かつ、ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメイン内のＲＧＤ配列を認識しない抗体またはその断片。
（２）ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメインドメインを認識し、かつ、ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメイン内のループ領域を認識しない抗体またはその断片。
（３）上記（１）又は（２）に記載の抗体またはその断片であって、ＡＤＡＭ−１５及びインテグリンαｖβ３依存性細胞接着を阻害する抗体またはその断片。
（４）上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の抗体またはその断片であって、ＡＤＡＭ−１５及びインテグリンα９β１依存性細胞接着を阻害する抗体またはその断片。
（５）上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の抗体またはその断片であって、癌細胞の増殖を抑制することを特徴とする抗体またはその断片。
（６）上記抗体が、モノクローナル抗体である、上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
（７）上記抗体が、配列番号１２のアミノ酸配列を有する重鎖および／または配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、上記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
（８）上記抗体が、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９５０で特定されるハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体である、上記（６）に記載の抗体またはその断片。
（９）上記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は、ヒト抗体である、上記（１）〜（７）のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
（１０）上記抗体断片が、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）若しくはこれらの重合体、又は、二量体化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）である、上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
（１１）上記抗体の断片が、抗体のＣＤＲ配列を含むペプチドである、上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
（１２）上記ＣＤＲ配列が、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、または配列番号２０のアミノ酸配列を有する、上記（１１）に記載の抗体またはその断片。
（１３）上記（１）〜（１２）のいずれか１項に記載の抗体またはその断片をコードするＤＮＡ。
（１４）上記（１３）に記載のＤＮＡを含有する組み換えベクター。
（１５）上記（１４）に記載の組み換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換細胞。
（１６）ハイブリドーマ細胞系である、上記（１５）に記載の細胞。
（１７）受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９５０で特定されるハイブリドーマ細胞系である、上記（１６）に記載の細胞。
（１８）上記（１５）又は（１６）に記載の細胞を培養し、培養物中で抗体またはその断片を生成させ、培養物から抗体またはその断片を抽出することを特徴とする、上記（１）〜（１２）のいずれか１項に記載の抗体またはその断片の製造方法。
（１９）上記（１）〜（１２）のいずれか１項に記載の抗体またはその断片を有効成分として含有する、医薬組成物。
（２０）細胞増殖、細胞遊走、細胞間接着、又は、血管新生に起因する疾患の治療薬又は予防薬である、上記（１９）に記載の医薬組成物。
（２１）抗癌剤又は癌転移抑制剤である、上記（１９）に記載の医薬組成物。
（２２）上記（１）〜（１２）のいずれか１項に記載の抗体またはその断片を備える診断薬。
（２３）細胞増殖、細胞遊走、細胞間接着、又は、血管新生に起因する疾患の診断薬である、上記（２２）に記載の診断薬。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の抗ＡＤＡＭ−１５抗体等は、優れたＡＤＡＭ−１５機能抑制作用を示すことから、細胞増殖、細胞遊走、細胞間接着、血管新生に起因する疾患の治療効果を奏すると考えられている。よって、本発明の抗体等は、癌（例えば、癌細胞の増殖、転移）、炎症性疾患（例えば、関節リウマチ、変形性関節症、肝炎、気管支喘息、綿維症、糖尿病、動脈硬化、多発性硬化症、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病等））、感染症（例えば、肝炎）、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、自己免疫性甲状腺疾患、尿細管間質性腎炎、重症筋無力症）および骨疾患（例えば、骨粗鬆症）等に対する治療効果を奏する。また、本発明の抗体は、細胞や組織におけるＡＤＡＭ−１５の発現を病理学的に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の１つの実施形態によれば、ＡＤＡＭ−１５と結合する抗体等であって、かつ、ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメイン内のＲＧＤ配列を認識しない抗体等、及び、ＡＤＡＭ−１５と結合する抗体等であって、かつ、ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメイン内のループ領域を認識しない抗体等が提供される。【００１９】
本発明の抗体等は、本発明の抗体等として利用可能である限り、ＡＤＡＭ−１５以外の物質へ結合（または認識）してもよいが、好ましくは、ＡＤＡＭ−１５と特異的に結合（または認識）する抗体等である。ここで、抗体が、あるタンパク質またはその断片に「特異的に結合（または認識）する」とは、その抗体が他のアミノ酸配列に対するその親和性よりも、これらのタンパク質またはその断片の特定のアミノ酸配列に対して実質的に高い親和性で結合することを意味する。ここで、「実質的に高い親和性」とは、所望の測定装置または方法によって、その特定のアミノ酸配列を他のアミノ酸配列から区別して検出することが可能な程度に高い親和性を意味する。実質的に高い親和性で結合する場合の結合定数（Ｋａ）としては、例えば、少なくとも１０７Ｍ−１であり、好ましくは、少なくとも１０８Ｍ−１であり、より好ましくは、少なくとも１０９Ｍ−１である。このような結合定数として、さらにより好ましくは、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１又はそれより高い、例えば、１０１３Ｍ−１又はそれより高いものである。【００２０】
本発明の抗体等が認識するＡＤＡＭ−１５としては、特に限定は無いが、好ましくは、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヒト等の哺乳動物のＡＤＡＭ−１５であり、より好ましくは、ヒトＡＤＡＭ−１５である。これらのＡＤＡＭ−１５のアミノ酸配列およびそれをコードするヌクレオチド配列の情報は、GenBankのような遺伝子配列データベースから公に入手可能である（例えば、GeneID: 8751(Homo sapiens), 11490(Mus musculus), 57025(Rattus norvegicus)等）。【００２１】
また、本発明の抗体等が認識するＡＤＡＭ−１５は、ＡＤＡＭ−１５と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。ここで「実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド」とは、天然型のＡＤＡＭ−１５、好ましくはヒトＡＤＡＭ−１５、と実質的に同等の生物学的性質を有するポリペプチドであって、該アミノ酸配列中の複数個のアミノ酸、好ましくは１〜１０個のアミノ酸、より好ましくは１〜数個（例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個）のアミノ酸が置換、欠失及び／又は挿入されているアミノ酸配列を有する変異ポリペプチド、並びに、該天然型ＡＤＡＭ−１５、好ましくはヒトＡＤＡＭ−１５、のアミノ酸配列中に、複数個のアミノ酸、好ましくは１〜１０個のアミノ酸、より好ましくは１〜数個（例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個）のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有する変異ポリペプチドを意味する。また、ＡＤＡＭ−１５と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、前記の置換、欠失、挿入及び付加のうち、複数の変異を有する変異ポリペプチドであってもよい。【００２２】
また、本発明の別の実施形態によれば、ＡＤＡＭ−１５を認識する抗体等であって、ＡＤＡＭ−１５及びインテグリンαｖβ３依存性細胞接着を阻害する抗体等、及び、ＡＤＡＭ−１５及びインテグリンα９β１依存性細胞接着を阻害する抗体等が提供される。ＡＤＡＭ−１５とインテグリンは、同一細胞表面上に発現したものであってもよいし、それぞれ異なる細胞の表面上に発現したものであってもよいが、好ましくは、それぞれ異なる細胞の表面上に発現したものである。【００２３】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、好ましくは、モノクローナル抗体である。本発明において、「モノクローナル抗体」は、抗原に対して高度に特異的であり、単一の抗原を認識するものである。【００２４】
更に、本発明の抗体は、非ヒト動物の抗体、非ヒト動物の抗体のアミノ酸配列とヒト由来の抗体のアミノ酸配列を有する抗体、及び、ヒト抗体を包含する。非ヒト動物の抗体としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サル、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、アヒル等の抗体を挙げることができ、好ましくは、ハイブリドーマを作製することができる動物の抗体であり、より好ましくはマウスの抗体である。非ヒト動物の抗体のアミノ酸配列とヒト由来の抗体のアミノ酸配列を有する抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体を挙げることができる。上記において、「キメラ抗体」とは、非ヒト動物由来の抗ＡＤＡＭ−１５抗体の定常領域をヒトの抗体と同じ定常領域を有するように遺伝子工学的に改変した抗体のことであり、好ましくは、ヒト・マウス・キメラ抗体（欧州特許公開公報ＥＰ０１２５０２３参照）である。「ヒト化抗体」とは、非ヒト動物由来の抗ヒトＡＤＡＭ−１５抗体のＨ鎖とＬ鎖の相補認識領域（ＣＤＲ）以外の一次構造をヒトの抗体に対応する一次構造に遺伝子工学的に改変した抗体のことである。ここで、ＣＤＲとは、Ｋａｂａｔら（"Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat, E.ら, U.S. Department of Health and Human Services, 1983）またはＣｈｏｔｈｉａら（Chothia & Lesk, J. Mol. Biol., 196, 901-917, 1987）の定義によるものである。「ヒト抗体」とは、完全にヒト由来の抗体遺伝子の発現産物であるヒト抗体のことであり、例えば、ヒトの抗体産生に関与する遺伝子を導入したトランスジェニック動物を用いて作製したモノクローナル抗体（欧州特許公開公報ＥＰ０５４６０７３参照）等を挙げることができる。治療の対象がヒトであり、ＡＤＡＭ−１５抗体産生動物がマウスの場合には、好ましくは、ヒト・マウスのキメラ抗体又はヒト化抗体であり、より好ましくは、ヒトモノクローナル抗体である。【００２５】
本発明の抗体のイムノグロブリンクラスは特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ，ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＹのいずれのイムノグロブリンクラスであってもよい。また、本発明の抗体はいずれのアイソタイプの抗体をも包含するものである。【００２６】
本発明はまた、１つの実施形態において、抗ＡＤＡＭ−１５抗体の断片を提供する。ここで、「抗体の断片」とは、抗体の一部分（例：ドメイン）であって、抗体の抗原への作用（例：結合能、中和能）を保持するもののことである。このような抗体の断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ（以下、「ｓｃＦｖ」という）、ジスルフィド結合Ｆｖ（以下、「ｄｓＦｖ」という）若しくはこれらの重合体、二量体化Ｖ領域（以下、「Ｄｉａｂｏｄｙ」という）、またはＣＤＲを含むペプチドを挙げることができる。Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧをタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。Ｆａｂ’は、該Ｆ（ａｂ’）のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。ｓｄＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬがペプチドリンカーで連結された抗原結合活性を有するポリペプチドである。ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のシステイン残基に置換されたアミノ酸残基がジスルフィド結合を介して結合している抗原結合活性を有する断片である。Ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した断片である。本発明のＤｉａｂｏｄｙは、モノスペシフィックでもよいし、バイスペシフィック（多重特異性抗体）でもよい。二量体化しているｓｃＦｖは、同一であっても良いし、異なっていても良い。【００２７】
本発明の抗体の断片としては、また、抗ＡＤＡＭ−１５抗体の一部を含むペプチドが含まれる。ここで、「抗体の一部を含むペプチド」とは、抗体を構成するアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列を備えるペプチドであって、抗体の抗原への作用（例：結合能、中和能）を保持するもののことである。抗体の一部を含むペプチドは、その抗体に由来しないアミノ酸配列を含んでいてもよい。抗ＡＤＡＭ−１５抗体の一部を含むペプチドとして、好ましくは、抗ＡＤＡＭ−１５抗体のＣＤＲ配列を含むペプチドである。ここで、ＣＤＲ配列を含むペプチドとは、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び、ＣＤＲ３から選ばれる少なくとも１つのＣＤＲのアミノ酸配列を含むペプチドのことである。抗ＡＤＡＭ−１５抗体の一部を含むペプチドとして、より好ましくは、重鎖可変領域のＣＤＲ３及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むペプチドである。【００２８】
本発明の抗ＡＤＡＭ−１５抗体の代表例の重鎖および軽鎖は、それぞれ配列番号１２および配列番号１４のアミノ酸配列を有する。また、本発明の抗ＡＤＡＭ−１５抗体の代表例の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７並びに配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０のアミノ酸配列を有する。【００２９】
本発明の抗体は、ＡＤＡＭ−１５の機能を阻害することから、ＡＤＡＭ−１５が関連する疾患の治療薬および予防薬として使用することができる。ここで、「ＡＤＡＭ−１５が関連する疾患とは、細胞増殖、細胞遊走、細胞浸潤、細胞間接着、又は、血管新生に起因する疾患のことであり、このような疾患としては、例えば、癌（食道癌、甲状腺癌、膀胱癌、大腸癌、胃癌、膵臓癌、胸部癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、神経芽細胞腫、神経膠芽腫、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、ウィルムス腫瘍）及びその転移、子宮内膜症等の細胞増殖または血管新生に起因する疾患；関節炎、感染症（肝炎等）、気管支喘息、綿維症、自己免疫疾患（例えば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性筋炎（ＰＭ）、自己免疫性甲状腺疾患、尿細管間質性腎炎、重症筋無力症（ＥＡＭＧ）、臓器特異的自己免疫疾患等）、リウマチ性関節炎（慢性関節リウマチ（ＲＡ）、変形性関節症（ＯＡ））、多発性硬化症（再発寛解型多発性硬化症等）、炎症性腸炎（潰瘍性大腸炎、クローン病等）、進行性全身性硬化症（ＰＳＳ）、シェーグレン症候群、皮膚筋炎（ＤＭ）、結節性動脈周囲炎（ＰＮ）、甲状腺疾患（バセドウ病等）、ギラン・バレー症候群、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、突発性血小板減少性紫斑病、自己免疫溶血性貧血、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、Ｉ型糖尿病、移植時の拒絶反応、手術後の癒着、子宮内膜症、乾癬、狼瘡、アレルギー、喘息、好中球機能異常等の炎症性疾患または細胞遊走に起因する疾患；血管再建術後再狭窄、心臓冠動脈血管閉塞性疾患、脳血管閉塞性疾患、腎血管閉塞性疾患、末梢血管閉塞性疾患、動脈硬化、脳梗塞等の血管閉塞性疾患または血管内膜肥厚に起因する疾患を挙げることができる。本発明のＡＤＡＭ−１５関連疾患として、好ましくは、癌である。【００３０】
本発明の抗体は、ＡＤＡＭ−１５関連疾患の診断薬として使用することができる。診断薬として使用する場合、使用する抗体またはその断片は、ＡＤＡＭ−１５を特異的に認識する抗体またはその断片であることが望ましい。【００３１】
１．抗ＡＤＡＭ−１５抗体作製
本発明の抗体は、例えば、ＡＤＡＭ−１５、又は、ＡＤＡＭ−１５の一部を有するペプチドを、必要に応じて免疫賦活剤（例えば、鉱油若しくはアルミニウム沈殿物と加熱死菌若しくはリポ多糖体、フロインドの完全アジュバント、または、フロインドの不完全アジュバント等）とともに、非ヒト哺乳動物または鳥類に免疫することにより作製することができる。【００３２】
免疫原として使用するＡＤＡＭ−１５は、好ましくは、哺乳動物のＡＤＡＭ−１５であり、特に好ましくは、ヒトＡＤＡＭ−１５である。本発明において抗原として使用するＡＤＡＭ−１５は、（１）ヒトやその他の哺乳動物のＡＤＡＭ−１５を発現するあらゆる細胞、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織に由来するタンパク質、（２）ＡＤＡＭ−１５をコードする遺伝子ＤＮＡ、好ましくはｃＤＮＡを細菌、酵母、動物細胞等の細胞株に導入、発現させた組換えタンパク質、又は、（３）合成タンパク質として得ることができる。【００３３】
例えば、本発明の抗体の作製に使用する免疫原は、ＡＤＡＭ−１５をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入し、発現させることにより得ることができる。例えば、本発明の抗体の作製に使用する免疫原として、ＡＤＡＭ−１５を細胞膜上に過剰発現させた細胞自体を用いることができる。また、本発明の抗体の作製に使用する免疫原として、ＡＤＡＭ−１５を発現した細胞の膜画分等を用いることもできる。ＡＤＡＭ−１５を細胞膜上に過剰発現させた細胞は、ＡＤＡＭ−１５をコードする遺伝子（例えば、ｃＤＮＡ）を公知の遺伝子工学技術を用いてクローニングし、ＡＤＡＭ−１５を細胞膜上に過剰発現することにより得ることができる。また、ＡＤＡＭ−１５を細胞膜上に過剰発現させた細胞の膜画分は、ＡＤＡＭ−１５を発現させた細胞（好ましくは、過剰発現させた細胞）を破壊しその膜画分を抽出することにより得ることができる。【００３４】
免疫原として、ＡＤＡＭ−１５の一部を有するペプチドを使用する場合には、これらのペプチドをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入し、発現させることにより免疫原を得ることができる。ＡＤＡＭ−１５の一部を有するペプチドとして、好ましくは、ＡＤＡＭ−１５のループ領域を含むペプチドである。【００３５】
また、ＡＤＡＭ−１５又はＡＤＡＭ−１５の一部を有するペプチドは、Ｆｍｏｃ法またはＢｏｃ法等を用いて化学合成により作製することができる。例えば、ＡＤＡＭ−１５又はＡＤＡＭ−１５の一部を有するペプチドのＣ末端のアミノ酸をポリスチレン担体に固定化し、９-フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）またはtert-ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）で保護されたアミノ酸を、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）等の縮合剤を用いて反応させることにより結合させ、洗浄、脱保護の工程を繰り返すことにより、所望のアミノ酸配列を有するペプチドを得ることができる。【００３６】
また、ＡＤＡＭ−１５又はＡＤＡＭ−１５の一部を有するペプチドは、自動ペプチド合成機を用いて合成することもできる。このようなペプチド合成機としては、例えば、ＰＳＳＭ−８（島津製作所）；モデル４３３Ａペプチドシンセサイザ（アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems, Inc.））；ＡＣＴ３９６Ａｐｅｘ（アドバンストケムテック社（Advanced ChemTech Inc.））等が挙げられる。【００３７】
また、ＡＤＡＭ−１５と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドの製造方法としては、例えば、合成オリゴヌクレオチド部位突然変異導入法（gapped duplex法）、亜硝酸あるいは亜硫酸処理によってランダムに点突然変異を導入する方法、Ｂａ１３１酵素等により欠失変異体を作製する方法、カセット変異法、リンカースキャニング法、ミスインコーポレーション法、ミスマッチプライマー法、ＤＮＡセグメント合成法などを挙げることができる。【００３８】
免疫原は、免疫される動物に対して投与により抗体産生が可能な部位に単独であるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際しては、抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。【００３９】
免疫動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サル、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、アヒル等ハイブリドーマを作製することが可能な動物であれば特に限定はないが、好ましくは、マウスまたはラットであり、より好ましくは、マウスである。【００４０】
動物への免疫原の投与は、例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射または足蹠注射により行うことができるが、好ましくは、皮下注射または腹腔内注射である。使用する免疫原の量は、抗体を産生できる量であれば特に限定は無いが、好ましくは、０．１〜１０００μｇであり、より好ましくは、１〜５００μｇであり、より更に好ましくは、１０〜１００μｇである。免疫は、１回または適当な間隔をあけて数回行うことができる。通常１〜６週毎に１回の免疫を合計２〜１０回程度行い、好ましくは、１〜５週間に１回の免疫を合計２〜５回行い、より好ましくは、３週間に１回の免疫を合計３回行う。最後の免疫から１〜２週間後に、免疫した動物の眼窩または尾静脈から採血を行い、その血清を用いて抗体価の測定を行う。抗体価の測定は、当業者に周知の方法で行うことができる。例えば、放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）、固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法を挙げることができ、好ましくは、ＥＬＩＳＡ法である。本発明の抗体は、十分な抗体価を示す動物の血清から精製することにより得ることができる。【００４１】
本発明のモノクローナル抗体は、上記方法により免疫した免疫感作動物から得た抗体産生細胞と、骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）を融合することにより得られるハイブリドーマを培養することにより得ることができる。当該融合方法としては、例えば、ミルステインらの方法（Galfre, G. & Milstein,C.,Methods Enzymol.73:3-46,1981）を挙げることができる。【００４２】
使用する抗体産生細胞は、上記方法により免疫し血清が十分な抗体価を示したマウスまたはラットの脾臓、膵臓、リンパ節、末梢血より採取することができ、好ましくは、脾臓より採取する。【００４３】
使用する骨髄腫系細胞は、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ又はヒト等の哺乳動物に由来する細胞であって、in vitro で増殖可能な細胞であれば特に限定はない。このような細胞としては、例えば、Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８（Ｘ６３）（Nature, 256, 495, 1975）、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１（ＮＳ１）（Eur. J. Immunol., 6, 292, 1976）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Curr. Top. Microbiol. Immunol., 81, 1, 1978）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（６５３）（J. Immunol., 123, 1548, 1979）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／Ｏ）（Nature, 276, 269, 1978）、Ｓｐ２／Ｏ／ＦＯ−２（ＦＯ−２）（J. Immunol. Methods, 35, 1, 1980）等を挙げることができ、好ましくは、抗体産生細胞と同種動物由来の細胞であり、より好ましくは、抗体産生細胞と同系統の動物由来の細胞である。例えば、マウス由来の骨髄腫系細胞として、好ましくは、Ｐ３Ｕ１又はＰ３Ｘ６３−Ａｇ８−６５３である。ミエローマ細胞は凍結保存するか、ウマ、ウサギまたはウシ胎児血清を添加した一般的な培地で継代して維持することができる。また、細胞融合に用いられる骨髄腫系細胞としては、対数増殖期の細胞が好ましい。【００４４】
抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを形成させる方法としては、ポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」という）等を用いる方法（ＰＥＧ法）、センダイウイルスを用いる方法、電気融合装置を用いる方法などがあげられる。
例えば、ＰＥＧ法の場合、上述の方法に従って得られた抗体産生細胞及び骨髄腫細胞を、培地、ＰＢＳ(Phosphate Buffered Saline)等で洗浄後、３０〜６０％のＰＥＧ（平均分子量１０００〜６０００）等の細胞凝集性媒体を含む適当な培地または緩衝液中で、脾細胞と骨髄腫細胞を１：２〜１０：１（好ましくは、５：１〜１０：１）の混合比で懸濁し、温度約２５〜３７℃、ｐＨ６〜８の条件下で、約３０秒〜３分間程度反応させる（Elsevier Publishing, 1988）。反応終了後、ＰＥＧ溶液を除いて培地に再懸濁し、セルウェルプレート中に播種して培養を続ける。【００４５】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常、ＨＡＴ（ヒポキサンチン（Hypoxanthine）−アミノプテリン（aminopterin）−チミジン（thymidine））を添加した動物細胞用培地で選択的に増殖させることにより、ハイブリドーマ細胞の選別を行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマ細胞が生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常、５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％ＣＯ2下で行なうことができる。
培養後、培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡ等により、抗原タンパク質に結合し、非抗原タンパク質に結合しないサンプルを選択する。例えば、「新臨床免疫実験操作法」（part 3）（科学評論社、1997）に記載された細胞ＥＬＩＳＡ法を用いて確認及びスクリーニングを行うことができる。このようなクローンから限界希釈法を１から５回、好適には２から４回繰り返すことにより単一細胞化を行い、安定して高い抗体価を示す細胞を選択することができる。【００４６】
本発明のモノクローナル抗体は、上述の方法により得られたハイブリドーマをin vitroで培養し、培養液を精製することによって得ることができる。また、本発明のモノクローナル抗体は、予めプリスタンを腹腔内に投与した同系動物または免疫不全動物にハイブリドーマを移植した後、腹水化させ、採取した腹水を精製することによっても得ることができる。【００４７】
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用することができる。例えば、アフィニティクロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。アフィニティクロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムを挙げることができる。例えば、プロテインＡカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose F. F.（Amersham Biosciences）を挙げることができる。また、ＩｇＹ及びＩｇＭの場合には、メルカプトピリジンをリガンドとしたカラムを用いることができる。更に、抗体のクラスによらず、ＡＤＡＭ−１５固相化カラム、イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー等を用いることもできる。モノクローナル抗体の精製は、例えば、遠心分離後、プロテインＡカラム又はプロテインＧカラム等を用いてＩｇＧ画分を回収することにより行うことができる。【００４８】
２．ヒト型キメラ抗体・ヒト化抗体、ヒト抗体の作製
（１）ヒト型キメラ抗体
本発明のヒト型キメラ抗体は、ＡＤＡＭ−１５と結合し、ＡＤＡＭ−１５の機能を阻害する非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡを調製し、これをヒト由来免疫グロブリンの定常領域ｃＤＮＡと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる（Morrison, S.L.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855, 1984）。【００４９】
非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡは、例えば、次の方法により得ることができる。当該モノクローナル抗体を産生する動物Ｂ細胞からｍＲＮＡを抽出する。ｍＲＮＡの抽出は、当業者に周知の方法で行うことができ、例えば、グアニジン−超遠心法（Chirgwin, J. M.ら, Biochemistry, 18, 5294-5299, 1979）、ＡＧＰＣ法（Chomczynski, Pら, Analytical Biochemistry, 162, 156-159, 1987）等によりＲＮＡを調製した後、ｍＲＮＡピュリフィケーションキット（Purification Kit）（ファルマシア社製、タカラバイオ社製）等により精製することにより行うことができる。抽出したｍＲＮＡからオリゴｄＴプライマーを使用することによりｃＤＮＡを作製してベクターに組み込む。ベクターに組み込んだｃＤＮＡの中から、非ヒト動物由来モノクローナル抗体の一部をプローブとして使用して、非ヒト動物由来モノクローナル抗体をコードしているｃＤＮＡを単離する。単離されたｃＤＮＡの塩基配列を決定することにより、目的のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ配列を得ることができる。【００５０】
また、非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡを得る別の方法として、次の方法が挙げられる。上述の方法で得られたｃＤＮＡを、ＶＨまたはＶＬを増幅可能なプライマー（例えば、非ヒト動物として、マウスを利用する場合、マウスＨ鎖定常領域（Ｃ領域）とハイブリダイズするプライマー及びマウスＬ鎖γ鎖定常領域の保存配列とハイブリダイズするプライマー等（R. Orlandiら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3833, 1989））を用いてＰＣＲ法で増幅することにより、または、モノクローナル抗体を産生する動物Ｂ細胞からｍＲＮＡを抽出し、当該ＶＨまたはＶＬを増幅可能なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ法で当該ＶＨまたはＶＬを増幅させる。得られたＰＣＲ産物から目的のＤＮＡ断片を抽出する。目的のＤＮＡ断片の抽出は、例えば、アガロースゲル電気泳動後に目的のＤＮＡのサイズを示すバンドを切り出し、当該ゲル切片よりＤＮＡを抽出することにより行うことができる。当該ベクター及び抽出したＤＮＡを制限酵素で処理した後、抽出したＤＮＡをベクターに組み込み、組み込まれたＤＮＡがコードするＤＮＡ配列を決定することにより、目的のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ配列を得ることができる。【００５１】
ヒト型キメラ抗体のヒト抗体ＣＨ及びＣＬとしては、任意のヒト抗体のＣＨ及びＣＬを用いることができる。例えば、ヒトγ１、γ２のＣＨ及びヒトκのＣＬを挙げることができる。ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子としては、染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いることができる。上述の方法により得られた非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡは、例えば、それぞれヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡと結合し、動物細胞用発現ベクターに組み込むことにより、本発明のキメラ抗体を発現するベクターを作製することができる。【００５２】
ヒト型キメラ抗体の発現に使用するエンハンサー及びプロモーターとしては、免疫グロブリン遺伝子自身のエンハンサー及びプロモーターまたは非免疫グロブリン用エンハンサー及びプロモーターを挙げることができる。例えば、非ヒト動物としてマウスを使用する場合、免疫グロブリン遺伝子の発現調節機構はマウスとヒトで共通であることから、Ｊ遺伝子とＣ遺伝子間に存在するマウスまたはヒトのエンハンサー配列を含む形で組換えＤＮＡを作製することもできる。【００５３】
動物細胞用発現ベクターとしては、例えば、pSV2-gpt(R. C. Mulligan and P. Berg, Science, 209, 1422, 1980) を使用することができる。上述の方法により作製した本発明のヒト型キメラ抗体のＨ鎖及びＬ鎖をコードする遺伝子は、同一のベクターに組み込まれていても良いし、異なるベクターに組み込まれていても良い。【００５４】
（２）ヒト化抗体
本発明のヒト化抗体は、ＡＤＡＭ−１５と結合し、ＡＤＡＭ−１５の活性を阻害する非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲをコードするアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨ及びＶＬのフレームワーク領域（ＦＲ）に移植したＶ領域をコードするＤＮＡを構築し、構築したＤＮＡをヒト由来免疫グロブリンの定常領域ｃＤＮＡと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる（L. Rieohmannら, Nature, 332, 323, 1988; Kettleborough, C. A.ら, Protein Eng., 4, 773-783, 1991; Clark M., Immunol. Today., 21, 397-402, 2000参照）。【００５５】
非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＣＤＲは、上述の方法によって得られた非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列と、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列とを比較し、各ＣＤＲのアミノ酸配列を得ることができる。既知の抗体のアミノ酸配列は、例えば、プロテイン・データ・バンク等のデータベースに登録されている抗体のアミノ酸配列より得ることができる。【００５６】
また、ヒト抗体のＦＲとしては、移植後の抗体が本発明の効果を奏するものであれば特に限定は無いが、好ましくは、ヒト化抗体のＶ領域が非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶ領域と類似の立体構造となるヒト抗体のＦＲ、または、使用する非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＦＲのアミノ酸配列と相同性が高いヒト抗体ＦＲである。選択したヒト抗体のＦＲを有するヒト化抗体のＶ領域が、非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶ領域と類似の立体構造となるか否かは、例えば、選択したヒト抗体のＦＲを含むＶ領域のＤＮＡ配列情報を基にコンピューターモデリングにより立体構造を予測し、使用した非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶ領域の立体構造との比較を行うことにより判断することができる。使用する非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＦＲのアミノ酸配列は、上述の方法により得られたＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列及びＣＤＲのアミノ酸配列の情報より得ることができる。また、ヒト化抗体のＶ領域が非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶ領域と類似の立体構造となるヒト抗体のＦＲ、または、使用する非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＦＲのアミノ酸配列と相同性が高いヒト抗体ＦＲとするため、得られたヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列に適宜変異を導入することもできる。【００５７】
使用するヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡ配列は、非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＣＤＲのアミノ酸配列とヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列を結合したアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列として設計する。ヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡは、設計したＤＮＡ配列を基に、当業者に周知の方法によって作製することができる。例えば、設計したＤＮＡを基に１００ｂｐ前後の長さのＤＮＡ断片を合成ＤＮＡとして化学合成し、当該ＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅することによって得ることができる。また、当該１００ｂｐ前後のＤＮＡ断片をリガーゼ等の酵素を用いて結合させ、設計されたヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡ配列の両末端の配列をコードするプライマーを用いてＰＣＲを行い、所望の長さのＤＮＡ断片を抽出することによっても得ることができる。更に、ＰＣＲ使用するヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡは、ＣＤＲグラフティングとして知られる方法によっても得ることができる。また、使用するヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡは、部位特異的変異によりＣＤＲをコードするＤＮＡをヒト抗体のＶ領域のＤＮＡに組み込むことによっても得ることができる。部位特異的変異は、例えば、ジーンテイラーサイトダイレクティッドミュータジェネシスシステム（Gene Tailor Site-Directed Mutagenesis System）（インビトロジェン社）、トランスフォーマー（Transformer）部位特異的突然変異誘発キット（クローンテック社）、サイトダイレクティッドミュータジェネシスシステム（Site-Directed Mutagenesis System）（タカラバイオ社）等を用いて、当該キットの説明に従うことにより行うことができる。【００５８】
ヒト化抗体のヒト抗体ＣＨ及びＣＬとしては、任意のヒト抗体のＣＨ及びＣＬを用いることができる。例えば、ヒトγ１、γ２のＣＨ及びヒトκのＣＬを挙げることができる。ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子としては、染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いることができる。上述の方法により得られたヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡは、例えば、それぞれヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡと結合し、動物細胞用発現ベクターに組み込むことにより、本発明のヒト化抗体を発現するベクターを作製することができる。【００５９】
ヒト化抗体の発現に使用するエンハンサー及びプロモーターとしては、免疫グロブリン遺伝子自身のエンハンサー及びプロモーターまたは非免疫グロブリン用エンハンサー及びプロモーターを挙げることができる。例えば、非ヒト動物としてマウスを使用する場合、免疫グロブリン遺伝子の発現調節機構はマウスとヒトで共通であることから、Ｊ遺伝子とＣ遺伝子間に存在するマウスまたはヒトのエンハンサー配列を含む形で組換えＤＮＡを作製することもできる。【００６０】
動物細胞用発現ベクターとしては、例えば、pSV2-gpt(R. C. Mulligan and P. Berg, Science, 209, 1422, 1980) を使用することができる。上述の方法により作製した本発明のヒト化抗体のＨ鎖及びＬ鎖をコードする遺伝子は、同一のベクターに組み込まれていても良いし、異なるベクターに組み込まれていても良い。【００６１】
なお、上述のヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体の作製において使用される、非ヒト動物由来モノクローナル抗体は、ＡＤＡＭ−１５と結合し、ＡＤＡＭ−１５の活性を阻害する抗体であれば特に限定はないが、好ましくは、マウスモノクローナル抗体である。【００６２】
（３）ヒト抗体
ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体ファージライブラリーまたはヒト抗体産生トランスジェニックマウスを利用することにより得ることができる（富塚ら, Nature Genet., 15, 146-156(1997)）。【００６３】
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞由来の様々な配列をもつ抗体遺伝子プールからＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子をファージ遺伝子に導入することにより、ヒト抗体のＦａｂまたはｓｃＦｖ等を融合タンパク質として表面に提示させたファージのライブラリーである。このようなヒト抗体ファージライブラリーとしては、正常なヒトの持つ抗体のＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子を末梢血リンパ球などからＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、ライブラリー化することにより得られたナイーブ・非免疫ライブラリー（ケンブリッジアンチボディテクノロジー（Cambridge Antibody Technology）社；メディカルリサーチカウンセル（Medical Research Council）；ダイアックス（Dyax）社等）、ヒトＢ細胞内の機能的な特定の抗体遺伝子を選び、Ｖ遺伝子断片のＣＤＲ３領域などの抗原結合領域の部分を適当な長さのランダムなアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドによって置換し、ライブラリー化した合成ライブラリー（バイオインベント（BioInvent）社；クルーセル（Crucell）社；モルホシス（Morphosys）社）、及び、癌、自己免疫疾患または感染症患者、あるいは、対象抗原をワクチンとして接種した人のリンパ球から作製したライブラリーである、免疫ライブラリーを挙げることができる。【００６４】
例えば、ナイーブヒト抗体ファージライブラリーは、以下の方法により作製することができる。人の末梢血からｍＲＮＡを調製し、イムノグロブリンのγ、μ、κ、λ鎖の定常領域に特異的なプライマーを用いて、Ｖ遺伝子のｃＤＮＡを合成し、各Ｖ遺伝子をＶ遺伝子ファミリーに特異的なＤＮＡプライマーのセットを用いて合成し、それらを（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３等のリンカーペプチドをコードするリンカーＤＮＡを用いてＰＣＲによって連結し、ｓｃＦｖ遺伝子を合成する。合成したｓｃＦｖ遺伝子を、両側にベクター導入用の制限酵素サイトを使って、ｐＣＡＮＴＡｂ５Ｅ等のファージミドベクターに挿入し、当該ベクターを大腸菌に形質転換し、ヘルパーファージによるレスキューを行う。【００６５】
ヒト抗体ファージライブラリーを利用する場合、例えば、標的となるＡＤＡＭ−１５を固相に固定化し、ファージ抗体ライブラリーを反応させて、非結合のファージを洗浄除去した後、結合したファージを回収することにより、所望のクローンを得ることができる（パンニング）。また、得られたファージを増幅させ、増幅させたライブラリーについて更にパニングを繰り返し行うことにより、得られたクローンの精度を上げることができる。得られたクローンのＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子を解析することにより、これらの遺伝子配列を有する完全なヒト抗体を作製することもできる。【００６６】
ヒト抗体産生トランスジェニックマウスは、内因性免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子をノックアウトしたマウスにヒト抗体のＩｇ遺伝子を導入したマウスである。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスは、例えば、以下の方法により得ることができる。ヒト−マウスハイブリッド細胞を４８時間コルセミド（紡錘糸形成阻害剤）処理することにより、１から数本の染色体が核膜に包まれた構造体である、ミクロセルを形成する。サイトカラシンＢ存在下で単離されたミクロセルを染色体受容細胞（マウスＥＳ細胞）とポリエチレングリコールにより融合し、ミクロセルハイブリッドＥＳ細胞を作製し、マウス胚へ注入する。【００６７】
ヒト抗体産生トランスジェニックマウスを免疫動物として、上述の抗ＡＤＡＭ−１５抗体作製方法に準じて抗原を免疫することにより、抗ＡＤＡＭ−１５ヒト抗体を得ることができる。【００６８】
３．抗体断片の作製
本発明の抗体の断片（Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ若しくはこれらの重合体、Ｄｉａｂｏｄｙ、または、ＣＤＲを含むペプチド）は、以下の方法により作製することができる。【００６９】
本発明のＦ（ａｂ’）２断片は、本発明のＡＤＡＭ−１５に結合するＩｇＧ抗体をタンパク質分解酵素ペプシンで処理し、Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断することにより、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片として得ることができる。また、本発明のＦ（ａｂ’）２断片は、後述のＦａｂ’をチオエーテル結合またはジスルフィド結合させることにより得ることができる。【００７０】
本発明のＦａｂ’断片は、上述の方法により得られた本発明のＡＤＡＭ−１５に結合するＦ（ａｂ’）２を還元剤であるジチオスレイトール処理して得ることができる。また、本発明のＦａｂ’断片は、本発明のＡＤＡＭ−１５に結合する抗体のＦａｂ’をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。【００７１】
本発明のＦａｂ断片は、本発明のＡＤＡＭ−１５に結合する抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理し、Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断することにより、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分の領域とＬ鎖の全領域がジスルフィド結合により結合された分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片として得ることができる。また、本発明のＦａｂ断片は、本発明のＡＤＡＭ−１５に結合する抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。【００７２】
本発明のｓｃＦｖは、本発明のＡＤＡＭ−１５に結合する抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、これらの遺伝子の間にリンカー配列をコードするＤＮＡを挿入し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、当該ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。リンカーの長さは、ＶＨとＶＬが会合することができる長さであれば特に限定は無いが、好ましくは１０〜２０残基であり、より好ましくは１５残基である。また、リンカーの配列は、ＶＨとＶＬの二つのドメインのポリペプチド鎖の折りたたみを阻害しないものであれば特に限定は無いが、好ましくは、グリシン及び／またはセリンからなるリンカーであり、より好ましくは、ＧＧＧＧＳ（Ｇ：グリシン、Ｓ：セリン）またはその繰り返し配列である。【００７３】
本発明のｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基を部位特異的突然変異によりシステイン残基に置換し、ＶＨ及びＶＬを当該システイン残基間のジスルフィド結合で結合させることにより得ることができる。置換するアミノ酸は、立体構造に基づき抗原結合に影響の無いアミノ酸残基であれば特に限定はない。【００７４】
本発明のＤｉａｂｏｄｙは、上述のｓｃＦｖをコードするＤＮＡにおいて、リンカーのアミノ酸配列が８残基以下（好ましくは５残基）となるように構築し、当該ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。バイスペシフィックなＤｉａｂｏｄｙは、異なる２種類のｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬのＤＮＡを組み合わせてｓｃＦｖを作製することにより得ることができる。【００７５】
本発明の、ＣＤＲを含むペプチドは、本発明のＡＤＡＭ−１５に結合する抗体のＶＨまたはＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを構築し、当該ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。【００７６】
４．ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメインを認識し、かつ、ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメイン内のＲＧＤ配列を認識しない抗体等の選択
本発明のＡＤＡＭ−１５に結合する抗体等は、上述の方法により得られた抗体等のうち、所望のエピトープを認識する抗体等を選択することにより得ることができる。また、本発明のＡＤＡＭ−１５を認識する抗体等は、上述の抗ＡＤＡＭ−１５抗体作製方法において、抗原として所望のエピトープ配列（好ましくは、ディスインテグリンドメイン配列）を有するペプチドを投与することにより得ることができる。【００７７】
ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメインを認識する抗体等は、当業者に周知の方法により選択することにより得ることができる。例えば、ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメインを認識する抗体等は、ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメインペプチドと、上記方法により得られた抗体等との結合活性を測定し、結合活性の高い抗体等を選択することにより得ることができる。本発明の抗ＡＤＡＭ−１５抗体等とＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメインとの結合における結合定数（Ｋａ）としては、例えば、少なくとも１０７Ｍ−１であり、好ましくは、少なくとも１０８Ｍ−１であり、より好ましくは、少なくとも１０９Ｍ−１である。このような結合定数として、さらにより好ましくは、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１又はそれより高い、例えば、１０１３Ｍ−１又はそれより高いものである。また、ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメインを認識する抗体等は、ＡＤＡＭ−１５を構成するアミノ酸のうち、ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメインにアラニンミューテーションを導入した全長ＡＤＡＭ−１５変異体またはＡＤＡＭ−１５変異体断片を作製して、当該変異体等と前記方法により得られた抗体等との結合活性を測定し、当該抗体等と全長ＡＤＡＭ−１５またはＡＤＡＭ−１５断片との結合活性と比較して、変異体との結合活性が低い抗体等を選択することにより得ることができる。【００７８】
ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメインを認識し、かつ、ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメイン内のＲＧＤ配列を認識しない抗体等は、前記方法により得られたＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメインを認識する抗体等の中から、ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメイン内のＲＧＤ配列を認識しない抗体等を当業者に周知の方法により選択することにより得ることができる。例えば、ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメインを認識し、かつ、ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメイン内のＲＧＤ配列を認識しない抗体等は、ＡＤＡＭ−１５を構成するアミノ酸のうち、ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメイン内のＲＧＤ配列の少なくとも１アミノ酸にアラニンミューテーションを導入した全長ＡＤＡＭ−１５変異体またはＡＤＡＭ−１５変異体断片を作製して、当該変異体等と得られた抗体等との結合活性を測定し、全長ＡＤＡＭ−１５またはＡＤＡＭ−１５断片との結合活性と比較して、結合活性が変化しない抗体等を選択することにより得ることができる。【００７９】
５．ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメインドメインを認識し、かつ、ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメイン内のループ領域を認識しない抗体の選択
ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメインを認識し、かつ、ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメイン内のループ領域を認識しない抗体等は、前記方法により得られたＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメインを認識する抗体等の中から、ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメイン内のループ領域を認識しない抗体等を当業者に周知の方法により選択することにより得ることができる。例えば、ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメインを認識し、かつ、ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメイン内のループ領域を認識しない抗体等は、ＡＤＡＭ−１５を構成するアミノ酸のうち、ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメイン内のループ領域の少なくとも１アミノ酸にアラニンミューテーションを導入した全長ＡＤＡＭ−１５変異体またはＡＤＡＭ−１５変異体断片を作製して、当該変異体等と得られた抗体等との結合活性を測定し、全長ＡＤＡＭ−１５またはＡＤＡＭ−１５断片との結合活性と比較して、結合活性が変化しない抗体等を選択することにより得ることができる。【００８０】
得られた抗体とＡＤＡＭ−１５若しくはその断片又はそれらの変異体との結合は、当業者に周知の方法で測定することができる。このような方法として、例えば、ウエスタンブロッティング、Ｘ線結晶解析の他、ビアコアシステム（ビアコア社）を挙げることができる。【００８１】
６．ＡＤＡＭ−１５及びインテグリンαｖβ３依存性細胞接着の阻害活性測定
得られた抗体がＡＤＡＭ−１５及びインテグリンαｖβ３依存性細胞接着を阻害するか否かは、例えば、得られた抗体の存在下／非存在下における、ＡＤＡＭ−１５リコンビナントタンパク質を固相化したプレートへの、インテグリンαｖβ３発現細胞の結合を比較することにより調べることができる。コントロールとして抗インテグリンαｖβ３抗体の存在下／非存在下における、ＡＤＡＭ−１５リコンビナントタンパク質を固相化したプレートへの、インテグリンαｖβ３発現細胞の結合を測定することにより、測定している細胞接着が、インテグリンαｖβ３依存性細胞接着であるか否かを知ることができる。【００８２】
７．ＡＤＡＭ−１５及びインテグリンα９β１依存性細胞接着
得られた抗体がＡＤＡＭ−１５及びインテグリンαｖβ３依存性細胞接着を阻害するか否かは、例えば、得られた抗体の存在下／非存在下における、ＡＤＡＭ−１５リコンビナントタンパク質を固相化したプレートへの、インテグリンα９β１発現細胞の結合を比較することにより調べることができる。コントロールとして抗インテグリンα９β１抗体の存在下／非存在下における、ＡＤＡＭ−１５リコンビナントタンパク質を固相化したプレートへの、インテグリンα９β１発現細胞の結合を測定することにより、測定している細胞接着が、インテグリンα９β１依存性細胞接着であるか否かを知ることができる。【００８３】
５．医薬組成物
得られた抗体等は、ＡＤＡＭ−１５とインテグリンとの結合を阻害することにより、情報の細胞内シグナル伝達を遮断できることから、このようなシグナルが関与する疾患の治療薬として使用することができる。ＡＤＡＭ−１５とインテグリンを発現している細胞や癌細胞を用い、得られた抗体等の存在下での結合阻害をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで観察することにより、本発明の抗体等の対象疾患を見出すことができる。【００８４】
本発明の抗体等（特に、モノクローナル抗体）を有効成分とする製剤は、癌（食道癌、甲状腺癌、膀胱癌、大腸癌、胃癌、膵臓癌、胸部癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、神経芽細胞腫、神経膠芽腫、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、ウィルムス腫瘍）及びその転移、子宮内膜症等の細胞増殖または血管新生に起因する疾患；関節炎、感染症（肝炎等）、気管支喘息、綿維症、自己免疫疾患（例えば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性筋炎（ＰＭ）、自己免疫性甲状腺疾患、尿細管間質性腎炎、重症筋無力症（ＥＡＭＧ）、臓器特異的自己免疫疾患等）、リウマチ性関節炎（慢性関節リウマチ（ＲＡ）、変形性関節症（ＯＡ））、多発性硬化症（再発寛解型多発性硬化症等）、炎症性腸炎（潰瘍性大腸炎、クローン病等）、進行性全身性硬化症（ＰＳＳ）、シェーグレン症候群、皮膚筋炎（ＤＭ）、結節性動脈周囲炎（ＰＮ）、甲状腺疾患（バセドウ病等）、ギラン・バレー症候群、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、突発性血小板減少性紫斑病、自己免疫溶血性貧血、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、Ｉ型糖尿病、移植時の拒絶反応、手術後の癒着、子宮内膜症、乾癬、狼瘡、アレルギー、喘息、好中球機能異常等の炎症性疾患または細胞遊走に起因する疾患；血管再建術後再狭窄、心臓冠動脈血管閉塞性疾患、脳血管閉塞性疾患、腎血管閉塞性疾患、末梢血管閉塞性疾患、動脈硬化、脳梗塞等の血管閉塞性疾患または血管内膜肥厚に起因する疾患等の治療剤（therapeutic agent）または予防剤（prophylactic agent）として用いることができる。【００８５】
上記の方法により得られた抗体等は、必要により精製した後、常法に従って製剤化し、各種疾患等の予防および／または治療剤として用いることができる。本発明の抗体を医薬として使用する場合、投与部位としては、経口投与、口腔内投与、気道内投与、皮下投与、筋肉内投与、血管内（静脈内）投与等を挙げることができる。本発明の抗体は、単独で投与されても良いし、薬事上および薬理学的に許容される担体（「医薬品添加物事典」薬事日報社、「Handbook of Pharmaceutical Excipients」APhA Publications社参照）、希釈剤もしくは添加剤などを使用した医薬組成物として投与されてもよい。また、本発明の医薬組成物は、非経口投与または経口に適する剤形として提供される。【００８６】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、点鼻剤、坐剤、貼布剤、軟膏等を挙げることができる。注射剤は、静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形を包含する。このような注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記抗体等を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール、その他の補助薬を含む等張液等が用いることができ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｃａｓｔｏｒ  ｏｉｌ）〕等と併用することができる。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などを用いることができ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等と併用することができる。調製された注射液は、通常、適当なアンプル、バイアル、シリンジに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体を通常の点鼻薬用基剤、坐薬用基剤に混合することによって調製される。また、上記抗体を適当な賦形剤を添加することにより、凍結乾燥製剤を調製し、用時、注射用水、生理食塩水などで溶解して注射液とすることもできる。なお、一般的に抗体などのタンパク質の経口投与は消化器により分解されるため、困難とされるが、抗体断片や修飾した抗体断片と剤形の創意工夫により、経口投与の可能性もある。経口投与の製剤としては、例えば、カプセル剤、錠剤、シロップ剤、顆粒剤等を挙げることができる。【００８７】
上記の非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好適である。このような投薬単位の剤形としては、注射剤（アンプル、バイアル、プレフィルド・シリンジ）、点鼻剤、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、好ましくは、注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記抗体等が含有されている。【００８８】
本発明の医薬組成物の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどにより適宜選択することができるが、例えば、癌患者の予防および／または治療のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１月１〜１０回程度、好ましくは１月１〜５回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量または投与回数を増加させてもよい。【００８９】
６．診断薬
本発明の抗体等は、ＡＤＡＭ−１５を特異的に認識することができるので、被検液中のＡＤＡＭ−１５の定量に使用することができる。本発明の抗体等を備える診断薬は、炎症性疾患、例えばリウマチ関節炎、肝炎、気管支喘息、線維症、糖尿病、癌転移、動脈硬化、多発性硬化症、肉芽腫等の診断剤、また臓器移植後の慢性拒絶反応抑制、全身性自己免疫疾患・エリテマトーデス・ぶどう膜炎・ベーチェト病・多発性筋炎・糸状体増殖性腎炎・サルコイドーシス等の自己免疫疾患の診断剤として用いることができる。本発明の診断薬は、抗体分子を用いた公知の方法に基づくことができる。このような方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ（Catty, Raykundalia, 1989）、ラジオイムノアッセイ（Catty, Murphy, 1989）、免疫組織化学的方法（Heiderら、1993）、イムノメトリック法、または、ウェスタンブロット等を挙げることができる。本発明の診断薬の検体としては、例えば、生検として被験者から採取した組織試料または液体を使用することができる。使用される生検は、ＡＤＡＭ−１５の免疫学的測定の対象となるものであれば特に限定はなく、例えば、組織、血液、尿、漿液、髄液、関節液、眼房水、涙液、唾液またはそれらの分画物若しくは処理物を挙げることができる。本発明の診断薬による分析は、定性的、定量的または半定量的に行うことができる。【００９０】
得られた抗体を、診断薬として使用するため、例えば、公知の方法または市販のキットを用いることにより各種標識化（例えば、ビオチン標識、ＦＩＴＣ標識、ＡＰＣ標識）することができる。このような標識として、好ましくは、Biotin Labeling Kit（同仁化学）を用いたビオチン標識である。【００９１】
これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要としない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。【００９２】
以上のように、本発明の抗体等を用いることによって、ＡＤＡＭ−１５を感度良く定量することができる。さらに、本発明の抗体等を用いる、生体内でのＡＤＡＭ−１５の定量法を利用することにより、ＡＤＡＭ−１５が関連する各種疾患の予知、有無、程度、予後、医薬品の効果等を診断することができる。例えば、ＡＤＡＭ−１５の濃度の増減が検出された場合は、ＡＤＡＭ−１５が関連する疾患、例えば炎症性疾患である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。【００９３】
その他、本発明の抗体等は、ＡＤＡＭ−１５を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画に含まれるＡＤＡＭ−１５の検出、被検細胞内におけるＡＤＡＭ−１５の挙動の分析等に使用することができる。【００９４】
以下、本発明をより詳細に説明するため実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。【００９５】
以下の実施例において特に言及しない場合、細胞培養用の培地としては次の培地を使用した。CHO-K1細胞を培養する場合、5% FCS含有D-MEM Ham’s F-12培地(Wako)；ヒトα9 integrin恒常的に発現させたCHO細胞(ha9 /CHO)を培養する場合、600μg/ml G418、5% FCS含有D-MEM Ham’s F-12培地；ヒト腎癌細胞株(NRC-12)及びヒト乳癌細胞株(MDA-MB-435S：435S)を培養する場合、10% FCS含有TIL培地(IBL)；COS-7細胞を培養する場合、10%FCS含有D-MEM(Wako)培地。
【実施例】
【００９６】
（実施例１）ヒトα９インテグリン恒常的発現株の作製
ヒトα９インテグリン遺伝子はG361細胞から抽出したトータルRNAから、ReverTraAce (TOYOBO)を用いて合成したcDNAを鋳型としてPCRを行うことでクローニングした。ヒトα９インテグリン遺伝子のクローニングは5’側断片と3’側断片に分割して、以下のプライマーを用いて行った。
ヒトα９インテグリン遺伝子5’側断片
センスプライマー：5’-TTTTAAGCTTGCCACCATGGGCGGCCCGGCTG-3’（配列番号１）
アンチセンスプライマー：5’-AAACTGCAGTCCGGAGCACTGGATTTATCTTCT-3’（配列番号２）
ヒトα９インテグリン遺伝子3’側断片
センスプライマー：5’-AAATCCGGATGTTTGGTCCATATC-3’（配列番号３）
アンチセンスプライマー：5’-AAATCTAGATCACTGGTTTTTCTGGACCCAGTC-3’（配列番号４）【００９７】
ヒトα９インテグリン遺伝子5’側断片のPCR産物はHindIIIとPstIを、3’側断片のPCR産物はEcoRVを用いて37℃で1時間、制限酵素処理し、それぞれをpBluescript SK(+)ベクター(Stratagene)に組み込み、プラスミド抽出を行った(5’側断片：α９F/pBS、3’側断片：α９R/pBS)。それぞれのプラスミドをAccIIIとXbaIを用いて37℃で1時間、制限酵素処理した。α９R断片を精製し、α９F/pBSのAccIII、XbaI部位に導入した。このプラスミドをHindIIIとXbaIで制限酵素処理することでインサート部位を切り出し、pcDNA3.1(+)ベクター(Invitrogen)に導入した(α９/pcDNA3.1(+))。【００９８】
α９/pcDNA3.1(+)をLipofectamine-2000(Invitrogen)を用いてCHO-K1細胞に遺伝子導入し、Geneticin G418(Invitrogen)が600μg/mlになるように調整した10% FCS(SIGMA-Aedrich)含有DMEM Ham'sF-12(WAKO)により薬剤耐性細胞を選別した。選別された細胞はフローサイトメトリーによりスクリーニングをし、限界希釈を繰り返すことでヒトα９インテグリンを恒常的に発現するCHO-K1細胞を樹立した(以下、「hα９/CHO細胞」という)。【００９９】
（実施例２）ヒトＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメイン/ pGEX-6P-1の作製
ヒトＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメインのDNA鎖をPCR法で複製した。HUVECのcDNA 1μＬを鋳型とし、それぞれ0.5μＬの100μMセンスプライマーと100μMアンチセンスプライマー、8μＬの2.5mM dNTP mix、0.5μＬのEX-Tagポリメラーゼ(2.5U/100μＬ: Takara)、10μＬの10×PCRバッファー、を79.5μＬの超純水に加え、PCR反応液を調整した。サーマルサイクラーを用いて、94℃で5分を1サイクル、94℃で1分、55℃で1分、72℃で1分を35サイクル、72℃で5分を1サイクルでPCR反応を行なった。使用したプライマーは以下のとおりである。
センスプライマー：5’-CCTATGGCTGCTTTCTGC-3’（配列番号５）
アンチセンスプライマー：5’-CATGCACACAGCTTGCCC-3’（配列番号６）【０１００】
PCR産物を2%アガロースゲルで電気泳動し、目的のバンドを切り出し、DNA精製キット(Wizard SV Gel and PCR Clearn-up System:PROMEGA)を用いて精製した。作製したDNA鎖をTAクローニングによって複製した。TAクローニングの方法は以下のとおりである。1μＬのPCR産物、0.5μＬのpCRII-TOPOベクター(Invitrogen)、1μＬのsalt solution(Invitrogen)を、3.5μＬの滅菌水に加え、反応液を調整し、室温で5分静置した後に、JM-109に形質転換した。このように作製した、ヒトＡＤＡＭ−１５ disintegrin domain / TOPO を鋳型とし、ヒトＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメインのDNA鎖にBamHI / XhoI部位を付加した。0.5μＬの鋳型DNA、それぞれ0.2μＬの100μMセンスプライマーと100μMアンチセンスプライマー、8μＬの2.5mM dNTP mix、0.5μＬのEX-Tagポリメラーゼ(2.5U/100μＬ: Takara)、10μＬの10×PCRバッファーを、80.6μＬの超純水に加え、PCR反応液を調整した。サーマルサイクラーを用いて、94℃で5分を1サイクル、94℃で1分、53℃で1分、72℃で30秒を35サイクル、72℃で5分を1サイクルでPCR反応を行なった。使用したプライマーは以下のとおりである。
センスプライマー：5’-AAGGATCCGCTGCTTTCTGCGGA-3’（配列番号７）
アンチセンスプライマー：5’-ATTCTCGAGATCCCCTAGGCTGACAT-3’（配列番号８）【０１０１】
PCR産物を2%アガロースゲルで電気泳動し、目的のバンドを切り出し、DNA精製キット(Wizard SV Gel and PCR Clearn-up System:PROMEGA)を用いて精製した。作製したDNA鎖を、BamHI / XhoIで制限酵素処理したpGEX-6P-1ベクターに挿入した。これをJM-109に形質転換し、複製した。その後、midi prepキット(QIAGEN)を用いて精製した。【０１０２】
（実施例３）ヒトＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメイン−ＧＳＴタンパク質の作製
実施例２で作製した、ヒトＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメイン/ pGEX-6P-1をJM-109に形質転換し、アンピシリン(SIGMA-Ardrich)を添加したLB培地で増殖させ、対数増殖期に200μM IPTG(Amersham Bioscience)を添加することでGST融合タンパク質の発現を誘導した。大腸菌を回収後、NETN-150バッファー(50mM Tris pH7.2, 1mM EDTA, 150mM NaCl, 0.5% NP-40)に懸濁し、ソニケーションをかけることでタンパク質を抽出した。遠心後、その上清をグルタチオンセファロースビーズ4B(Amersham Bioscience)に添加し、4℃で2時間転倒混和した。ビーズをNETN-100バッファー(50mM Tris pH7.2, 1mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5%NP-40)で洗浄し、還元型グルタチオン溶液(100mM Tris pH8.8, 20mM Reduced Glutathione(Wako))で溶出し、これをGST融合タンパク質とした。また、GSTを切断したタンパク質を作製する際には、大腸菌で発現させたタンパク質をグルタチオンセファロースビーズに吸着させるまでは同様の方法で行い、ビーズをNETN-100バッファーで洗浄した後に、prescission protease(Amersham Bioscience) を用いて酵素処理することでGSTを切断した。【０１０３】
（実施例４）ヒトＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメインタンパク質(RAA置換体)の作製
ヒトＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメインにおけるＲＧＤ配列をＲＡＡ配列に置換したタンパク質（以下、「ヒトＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメインタンパク質(RAA置換体)」という）は、次の方法により作製した。実施例２で作製した、ヒトＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメイン/ pGEX-6P-1を鋳型としてそれぞれ1.25μＬの、100μg/mlのセンスプライマーと100μg/mlのアンチセンスプライマー、1μＬの2.5mM dNTP mix、1μＬのpfu turboポリメラーゼ(2.5U/μＬ)、5μＬの10×PCRバッファーを、40.4μＬの超純水に加え、PCR反応液を調整した。サーマルサイクラーを用いて、95℃で30秒を1サイクル、95℃で30秒、55℃で1分、68℃で5分30秒を18サイクル、72℃で7分を1サイクルでPCR反応を行なった。使用したプライマーは以下のとおりである。
センスプライマー：5’-CAGTGTCCTACCAGAGCTGCTTGTGACTTGCCTG-3’（配列番号９）
アンチセンスプライマー：5’-CAGGCAAGTCACAAGCAGCTCTGGTAGGACGACACTG-3（配列番号１０）【０１０４】
その後、QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Invitrogen)のマニュアルに従い、DpnIで制限酵素処理し、pGEX-6P-1ベクターに挿入した。これをJM-109に形質転換し、複製した。その後、midi prepキット(QIAGEN)を用いて精製した。その後、実施例３と同様の方法によりGST融合タンパク質を作製し、GSTをprescission proteaseで酵素処理することでGSTを除去したヒトＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメインタンパク質(RAA置換体)を作製した。【０１０５】
（実施例５）抗ヒトＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメインモノクローナル抗体(8F7)の作製
実施例３で作製した、ヒトＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメイン−ＧＳＴタンパク質をBALB/cマウス（メス、７週令: SAMKYO LABO SERVICE CORPORATION）に計4回免疫した。初回は100μgのタンパク質を完全フロイントアジュバンド(SIGMA)で乳化して、以降は50μgのタンパク質を不完全フロイントアジュバンド(SIGMA)で乳化して、マウスに免疫した。４回免疫後、マウスから採血し、その血清を用いて抗体価測定をELISAにより行った。その後、50μgのタンパク質をPBSに溶解し、追加免疫した。【０１０６】
免疫後、マウスから脾臓を摘出し、脾細胞とX63-Ag8-653ミエローマ細胞を、ポリエチレングリコール(IBL)を用いて細胞融合させた。その後、HAT培地で選択培養し、ハイブリドーマのコロニー形成が認められた後に、その培養上清を用いて抗原タンパク質に対する結合性をELISA法によってスクリーニングした。ELISA法においては、抗原としてヒトＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメイン−ＧＳＴタンパク質を各ウェルに50ng固相に固定し、一次抗体として2倍希釈したハイブリドーマの培養上清を用いた。陽性コロニーを2回、限界希釈することで単一クローンを得た。得られたクローンの培養上清を抗原カラムで精製し、モノクローナル抗体(クローン名：8F7、以下、「8F7」という)を樹立した。このモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、受領番号ＦＥＲＭ  AＢＰ−１０９５０（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５０）として、茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに２００８年２月１３日付で寄託されている。【０１０７】
作製した8F7の抗原特異性をELISA法により確認した。ELISA法においては、GST、ヒトＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメイン−ＧＳＴタンパク質、ヒトＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメインループ領域−ＧＳＴタンパク質、ヒトＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメインタンパク質、ヒトＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメインタンパク質(RAA置換体)、及び、マウスオステオポンチンＮ−ハーフ−ＧＳＴタンパク質をそれぞれ10μg/mlから段階希釈して固相に固定し、一次抗体として、0.1μg/mlに調整した8F7を用いた。結果を図１に示す。ELISA法による検討では、GSTに交差反応を示すものの、その反応は微弱である。一方、ヒトＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメイン−ＧＳＴに対する反応が強いことが認められた。更に、ディスインテグリンドメイン内でも、インテグリンとの接着に必要であるとされるループ領域(以下、「ループ領域」という)に対しては、結合しないことが示された。【０１０８】
また、作製した8F7の抗原特異性をウェスタンブロットにより確認した。ヒトＡＤＡＭ−１５/ pOTB7(Invitrogenから購入)をXhoIとBamHIで制限酵素処理し、同様に制限酵素処理したpcDNA 3.1(+)ベクター(Invitrogen)に組み換えた。これをJM-109に形質転換し、複製した。その後、midi prepキット(QIAGEN)を用いて精製することにより、ヒトＡＤＡＭ−１５/ pcDNA 3.1(+)を得た。COS-7細胞を6cm培養プレートで8割コンフルエントまで培養し、4μgのヒトＡＤＡＭ−１５/ pcDNA 3.1(+)と20μＬのLipofectamine-2000(Invitrogen)を添加した3mlのOPTI-MEM培地(GIBCO)を用いて37℃で6時間培養した。その後、3mlの10% FCS含有DMEM培地に交換し、37℃で48時間培養することにより、ヒトＡＤＡＭ−１５導入COS-7細胞を得た。【０１０９】
作製したＡＤＡＭ−１５を一過性に過剰発現させたCOS-7細胞、及び、遺伝子を導入していないCOS-7細胞を、プロテアーゼインヒビター(complete mini: Roche)含有LIPA バッファーで溶解し、細胞溶解液を10% SDSで電気泳動し、PVDF膜(MILLIPORE)に転写した。転写したPVDF膜を5%スキムミルク/ TBS-Tにより室温で1時間ブロッキング反応を行った後に、TBS-Tで3回洗浄し、実施例５で作製した8F7( 0.5μg/ml)を添加し、4℃で一晩反応させた。TBS-Tで3回洗浄し、10000倍希釈した二次抗体(anti-mouse IgG HRP標識：Jackson immunoresearch)を添加し、室温で1時間反応させた。TBS-Tで3回洗浄し、ECL溶液(GE imaginationatwork)を室温で5分間反応させ、暗室にてフィルムへ転写し、現像した。【０１１０】
結果を図２に示す。ウェスタンブロットによる検討では、ヒトＡＤＡＭ−１５を一過性に過剰発現させたCOS-7の細胞溶解液のみでバンドが検出されたことから、8F7がヒトＡＤＡＭ−１５を特異的に認識していることが示された。
（実施例６）抗ＡＤＡＭ−１５モノクローナル抗体23G9と8F7の結合活性比較【０１１１】
前記ELISA法と同様の方法により市販されている抗ＡＤＡＭ−１５モノクローナル抗体である、23G9（Ｒ＆Ｄ社）と8F7の結合活性を比較した。【０１１２】
結果を図３に示す。8F7は、ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメインに対して、ＲＧＤ配列非依存的に高い結合活性を示した。一方で、23G9は、ヒトＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメイン（d.d.）及びヒトＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメイン−ＧＳＴタンパク質（d.d.-GST）に対する結合活性が、GSTに対する結合活性よりも低いことから、ＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメインを認識していないことが示された。よって、8F7はこれまで知られていた抗ＡＤＡＭ−１５抗体とは異なる結合部位に結合することにより、これまで見出されていないＡＤＡＭ−１５を阻害することによる各種機能を備えることが示唆された。【０１１３】
（実施例７）hα９/CHO細胞を用いた細胞接着及び細胞接着阻害試験
GSTを除去したヒトＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメインリコンビナントタンパク質、又は、ヒトＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメインタンパク質(RAA置換体)を、PBSで0〜5μg/mＬに調製し、96ウェルプレートの各ウェルに50μＬずつ添加し、37℃で1時間インキュベートして、固相化させた。その後、0.5%BSA/PBSを各ウェルに200μＬずつ添加し、室温で1時間インキュベートすることでブロッキング反応を行なった。PBSで洗浄後、実施例１で作製したhα９/CHO細胞、又は、非遺伝子導入CHO-K1細胞を0.25%BSA含有培地(D-MEM Ham’sF-12)で1×105cells/mlに調製して、各ウェルに200μＬずつ添加し、37℃で1時間インキュベートして固相に固定化させたタンパク質に接着させた。その後、あらかじめ37℃に温めておいたPBSで洗浄して、接着していない細胞を除去した。クリスタルバイオレットを各ウェルに50μＬずつ添加し、室温で30分間インキュベートすることで、細胞を固定、染色した。水道水で洗浄後、20%酢酸水を各ウェルに100μＬずつ添加し、細胞を溶解後、プレートリーダーで590nmの吸光度を測定した。【０１１４】
細胞接着試験と同様の方法でGSTを除去したヒトＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメインリコンビナントタンパク質（2.5μg/mlに調製）を固相化させ、ブロッキング反応を行なった。ＡＤＡＭ−１５を阻害することによる細胞接着阻害活性試験においては、固相化したタンパク質に濃度を0〜10μg/mlまで段階希釈させた8F7を添加した。37℃で20分間インキュベートし、細胞を接着させた。その後、細胞接着試験と同様の方法で細胞接着を検討した。【０１１５】
hα９/CHO細胞、及び、非遺伝子導入CHO-K1細胞（コントロール）の、ヒトＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメイン（以下、「d.d.」という)、及び、ヒトＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメイン(RAA置換体)（以下、「d.d.-RAA」という）に対する接着試験の結果を図４Ａに示す。hα９/CHO細胞は、d.d.を固相化した場合、その固相化濃度依存的に細胞接着活性が高くなった。また、hα９/CHO細胞は、d.d.-RAAを固相化した場合にも、d.d.を固相化した場合とほぼ同等の細胞接着活性を示すことから、hα９/CHO細胞とd.d.との相互作用は、d.d.のＲＧＤ配列に非依存性であることが示された。ここで、CHO-K1細胞は内在的にαｖβ１インテグリン、αｖβ５インテグリン、α５β１インテグリンなどRGD配列に結合するインテグリンを発現している（Eto, K., Huet, C., Tarui, T., Kupriyanov, S., Liu, H. Z., Puzon-McLaughlin, W., Zhang, X. P., Sheppard, D., Engvall, E., and Takada, Y. Functional classification of ADAMs based on a conserved motif for binding to integrin alpha 9beta 1: implications for sperm-egg binding and other cell interactions. J Biol Chem, 277: 17804-17810, 2002.）。よって、CHO-K1細胞のd.d.又はd.d.-RAA固相化表面への細胞接着がこれらのインテグリンによるものであるか否かについて検討した。その結果、非遺伝子導入CHO-K1細胞は、d.d.及びd.d.-RAAの固相化の有無に関わらず、低い細胞接着活性を示した。このことから、hα９/CHOのＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメイン固相化表面への接着は、α９インテグリンを介した接着であると考えられる。また、hα９/CHOのＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメイン固相化表面への接着は、d.d.-RAAでも減少しないことから、α９インテグリンとＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメイン介した接着は、ＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメインのＲＧＤ配列には非依存性であると考えられる。【０１１６】
また、8F7抗体による、hα９/CHO細胞のd.d.及びd.d.-RAA固相化表面への接着の阻害試験の結果を図４Ｂに示す。8F7抗体は、濃度依存的に、d.d.及びd.d.-RAAに対するhα９/CHOの細胞接着を阻害した。前記の結果より、hα９/CHO細胞のd.d.及びd.d.-RAA固相化表面への接着は、α９インテグリンを介した接着であると考えられることから、8F7は、ヒトＡＤＡＭ−１５とヒトα９β１インテグリンとの相互作用を抑制することが確認された。【０１１７】
（実施例８）ヒト腎癌細胞株NRC-12細胞におけるインテグリンの発現
ヒト腎癌細胞株NRC-12細胞を用いて、8F7のRGD非依存的な接着を抑制できるかを検討するために、NRC-12細胞におけるintegrinの発現をフローサイトメトリーで確認した。0.5%BSA、0.01NaN3/PBS(FACSバッファー)で細胞を5×106/mlに調整し、96穴V底プレートの各ウェルに100mlずつ添加し、プレート遠心機で細胞を回収した。その後、CFBSを各ウェルに100mlずつ添加し、氷上で30分間インキュベートすることで、細胞膜表面上のFcレセプターをブロッキングした。一次抗体を0.5μg添加し、氷上で20分間インキュベートした。FACSバッファーで2回洗浄後、200倍希釈した二次抗体(anti-mouse IgG FITC標識：Jackson immunoresearch)を各ウェルに100μＬずつ添加し、氷上で20分間インキュベートした。FACSバッファーで2回洗浄後、7-AAD(50μg/ml)を各ウェルに20μＬずつ添加し、氷上で20分間インキュベートした。FACSバッファーで3回洗浄後、細胞をメッシュに通し、最終的に500μＬのFACSバッファーに溶解した。その後、FACSキャリバー(日本ベクトン・ディッキンソン)用いて、FL-1を検出し、cell questで解析した。【０１１８】
結果を図５に示す。ヒト腎癌細胞株NRC-12細胞には、α９β１インテグリンの発現はみられず、αｖβ３インテグリン、α５β１インテグリンなどRGD配列に結合するインテグリンが発現していた。
（実施例９）ヒト腎癌細胞株NRC-12細胞を用いた細胞接着及び細胞接着阻害試験
実施例６と同様の方法により、ヒト腎癌細胞株NRC-12細胞の、d.d.、固相化したd.d.と合成ペプチド（GRGDS）の混合物（d.d.+GRGDS）、d.d.と合成ペプチド（GRGES）の混合物（d.d.+GRGES）、合成ペプチド（GRGDS）をＢＳＡ（牛血清アルブミン）と結合させたもの（GRGDS-BSA）、合成ペプチド（GRGDS）をＢＳＡ（牛血清アルブミン）と結合させたものと合成ペプチド（GRGDS）の混合物（GRGDS-BSA+GRGDS）、又は、合成ペプチド（GRGDS）をＢＳＡ（牛血清アルブミン）と結合させたもの合成ペプチド（GRGES）の混合物（GRGDS-BSA+GRGES）への細胞接着活性を測定した。また、実施例６と同様の方法により、ヒト腎癌細胞株NRC-12細胞の、d.d固相化表面への細胞接着に対する、8F7の阻害活性を測定した。【０１１９】
結果を図６に示す。ヒト腎癌細胞株NRC-12細胞は、ＡＤＡＭ−１５のd.d. 及び 合成ぺプチドGRGDS-BSAにＲＧＤ配列依存的に接着した。また、8F7抗体は、濃度依存的に、d.d.固相化表面に対するヒト腎癌細胞株NRC-12細胞の接着を阻害した。前述の通り、ヒト腎癌細胞株NRC-12細胞は、α９β１インテグリンを発現せず、RGD配列に結合するインテグリン（αｖβ３インテグリン、α５β１インテグリン）を発現することから、8F7は、d.d.とインテグリンとのRGD依存的な相互作用による細胞接着を抑制すると考えられる。【０１２０】
（実施例１０）ヒト乳癌細胞株435Sにおけるインテグリンの発現
ヒト乳癌細胞株435S（MDA-MB-435S）におけるＡＤＡＭ−１５とintegrinの発現をフローサイトメトリーで確認した。フローサイトメトリーは、実施例７に記載の方法に準じて行った。【０１２１】
結果を図７に示す。ヒト乳癌細胞株435Sにおいて、ＡＤＡＭ−１５、αｖβ３インテグリン、α５β１インテグリン、α９β１インテグリンの発現を検討したところ、全ての分子が発現していることが確認された。しかし、その発現レベルに差があり、αｖβ３インテグリン、α５β１インテグリンは、α９β１インテグリンと比較して、発現レベルが高かった。【０１２２】
（実施例１１）ヒト乳癌細胞株435S細胞を用いた細胞接着及び細胞接着阻害試験
ヒト乳癌細胞株435Sでのインテグリンの発現が確認できたため、これらのインテグリンが機能的であるかどうかを細胞接着試験により検討した。即ち、d.d.又はd.d.-RAAに対する435Sの細胞接着を以下の方法により測定した。d.d、d.d.-RAA、ヒトテネーシンＣ分子内に存在する３番目のフィブロネクチンtypeIIIドメインのリコンビナント蛋白（hTNfn3）のＲＧＤ配列をＲＡＡに置換した蛋白（hTNfn3(RAA)）、又は、GRGDS-BSAを、PBSで0〜5μg/mＬに調製し、96ウェルプレートの各ウェルに50μＬずつ添加し、37℃で1時間インキュベートして、固相化させた。その後、0.5%BSA/PBSを各ウェルに200μＬずつ添加し、室温で1時間インキュベートすることでブロッキング反応を行なった。PBSで洗浄後、ヒト乳癌細胞株435S細胞を0.25%BSA含有培地(TIL)で1×105cells/mlに調製して、各ウェルに200μＬずつ添加し、37℃で1時間インキュベートして固相化させたタンパク質に接着させた。その後、あらかじめ37℃に温めておいたPBSで洗浄して、接着していない細胞を除去した。クリスタルバイオレットを各ウェルに50μＬずつ添加し、室温で30分間インキュベートすることで、細胞を固定、染色した。水道水で洗浄後、20%酢酸水を各ウェルに100μＬずつ添加し、細胞を溶解後、プレートリーダーで590nmの吸光度を測定した。【０１２３】
ヒト乳癌細胞株435S細胞を用いた細胞接着試験の結果を図８Ａに示す。ヒト乳癌細胞株435Sはd.d.又はd.d.-RAAに接着したが、その接着率は低かった。【０１２４】
これまでの報告で、インテグリンは２価イオン(Mn、Mg、Caイオンなど)により、活性化することが証明されている。また、ＡＤＡＭ−１５とインテグリンの接着には２価イオンによるインテグリンの活性化が必要であることも報告されている（Eto, K et al. RGD-independent binding of integrin alpha9beta1 to the ADAM-12 and -15 disintegrin domains mediate cell-cell interaction.  J Biol. Chem. 275: 34922-34930,2000）。そこで、上述のヒト乳癌細胞株435S細胞を用いた細胞接着試験において、Mnイオンを用いることにより、インテグリンを活性化させた。【０１２５】
結果を図８Ｂに示す。Mnイオン添加により、d.d.又はd.d.-RAAに対するヒト乳癌細胞株435S細胞の接着率が増加した。【０１２６】
（実施例１２）ヒト乳癌細胞株435S細胞を用いた細胞接着阻害試験
ヒト乳癌細胞株435S細胞を用いた細胞接着阻害試験においては、Mnイオンを用いることにより、インテグリンを活性化させた。細胞接着試験と同様の方法でd.d、又は、d.d.-RAA（6.25μg/mlに調製）を固相化させ、ブロッキング反応を行なった。ＡＤＡＭ−１５を阻害することによる細胞接着阻害活性試験においては、固相に固定したタンパク質に8F7を添加した。また、インテグリンを阻害することによる細胞接着阻害活性試験においては、ヒト乳癌細胞株435S細胞2×104細胞に、ヒトα9β1インテグリンに対する抗体であるY9A2(chemicon)、又は、ヒトαvβ3インテグリンに対する抗体であるLM-609(chemicon)を添加し、37℃で20分間インキュベートした。その後、細胞接着試験と同様の方法で細胞を各ウェルに添加して細胞接着を測定した。【０１２７】
結果を図９に示す。8F7とインテグリンに対する抗体を用いて細胞接着阻害試験を行った結果、d.d.に対する細胞接着は、αｖβ３インテグリンに対する抗体により抑制された。しかし、α９β１インテグリンに対する抗体では抑制されなかった。一方で、d.d.-RAAに対する細胞接着は、α９β１インテグリンに対する抗体で抑制された。また、8F7は、d.d. に対する細胞接着とd.d.-RAAに対する細胞接着の両方を抑制した。即ち、RGD配列を含むd.d.には、αｖβ３インテグリンなど、RGDレセプターを介して結合しており、α９β１インテグリンを介する結合は見られなかった。一方で、RGD配列を含まないd.d.-RAAに対しては、α９β１インテグリンを介した結合が見られた。【０１２８】
前述の通り、フローサイトメトリーにより乳癌細胞株435S細胞におけるインテグリンの発現を確認した結果では、α９β１インテグリンと比較して、αｖβ３インテグリン、及び、α５β１インテグリンが強く発現している。これらのことから、乳癌細胞株435S細胞におけるＡＤＡＭ−１５とインテグリンの結合では、αｖβ３インテグリンやα５β１インテグリンが優位的に働くと予想される。【０１２９】
（実施例１３）細胞増殖試験
ヒト乳癌細胞株435S細胞（MDA-MB-435S：435S）を10% FCS含有TIL培地で2×104 / mlに調整し、96ウェルプレートの各ウェルに100μＬずつまき、37℃で一晩培養した後、FCS不含TIL培地に交換し、同様に一晩培養した。培地を除去し、5%FCS含有TIL培地で20μg/mlに調整した抗体(実施例５で作製した8F7、又は、抗ヒトαｖβ３インテグリン抗体LM-609(chemicon))を各ウェルに100μＬずつ添加し、cell counting kit-8(DOUJINDO)を各ウェルに10μＬずつ添加した。37℃で2時間30分インキュベートした後にプレートリーダーで450nmの吸光度を測定した。これを0時間とし、抗体を含む5%FCS含有TIL培地で48時間培養した細胞においても、同様の方法で実験を行った。450nm(48時間)/450nm(0時間)の割合を算出し、これらの割合を抗体非添加群と比較した。【０１３０】
結果を図１０に示す。8F7を添加することにより、ヒト乳癌細胞株435S細胞の細胞増殖率が約20%低下した。このことから、ＡＤＡＭ−１５とインテグリンとの相互作用が乳癌細胞の細胞増殖に促進的にはたらいていることが示唆された。ＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメインリコンビナントタンパク質を作用させると、乳癌細胞の増殖が阻害されることが報告されており、本実験の結果と一致した。【０１３１】
（ELISA法）
本明細書に記載の実施例において、ELISA法は、次の方法により行った。まず、抗原を96ウェルプレートに添加し、4℃で一晩固相化させた。その後、PBSで3回洗浄し、1％BSA、0.05% NaN3/PBSを200ml/wellで添加することでブロッキング反応を行った。0.05%Tween/PBSで5回洗浄後、1% BSA、0.05% Tween/PBSで希釈した一次抗体を各ウェルに100μＬずつ添加し、37℃で1時間反応させた。0.05%Tween/PBSで7回洗浄後、1% BSA、0.05% Tween/PBSで1000倍希釈した二次抗体(anti-mouse IgG  HRP標識: Jackson immunoresearch)を50ml/wellで添加し、37℃で30分反応させた。0.05%Tween/PBSで9回洗浄後、o-フェニレンジアミン溶液(Wako)を50ml/wellで添加し、室温、暗所で15分反応させた。2N硫酸で反応停止後、プレートリーダーを用いてOD490の吸光度を測定した。【０１３２】
抗体価測定においては、抗原としてヒトＡＤＡＭ−ディスインテグリンドメイン−ＧＳＴタンパク質を各ウェルに50ng固相化させ、一次抗体として、抗原を免疫したマウスの血清を1000〜1000000倍希釈して用いた。【０１３３】
（統計学的処理）
本明細書における細胞接着阻害試験においては、抗体非添加群のOD590を基準とし、抗体添加群で得られたOD590の割合を算出した。細胞増殖試験においては、各々で48時間後 / 0時間の値を算出し、抗体非添加群で得られた割合を基準にし、抗体添加群の割合を算出した。これらの実験はすべて3回ずつ行い、スチューデントのt検定を行った。【０１３４】
（実施例１４）ヒト乳癌細胞株435S 細胞を用いた細胞浸潤阻害試験
8F7の細胞浸潤に及ぼす影響を調べるために細胞浸潤試験を行った。細胞浸潤試験はマトリゲルインベージョンチャンバー(BD社)を用いて行った。無血清のTIL培地(免疫生物研究所社)をウェルとインサートに500mlずつ添加し、インサートをウェルに浸した。37℃で2時間インキュベーションすることで、マトリゲルを水和した。その後、インサート内の培地を吸引除去し、化学誘因物質を750ml添加した別のウェルに浸した。化学誘因物質はヒト繊維芽肉腫細胞株HT-1080細胞株の培養上清を用いた。無血清のTIL培地で1×105個/mlに調整した435S細胞懸濁液をインサートに500ml添加し、37℃で22時間インキュベーションすることで浸潤を誘導した。抗体による細胞浸潤の阻害効果を調べる場合は、乳癌細胞をインサートに添加する前に、8F7抗体またはコントロール抗体を10mg/mlになるように添加し、37℃で20分インキュベーションし、435S細胞懸濁液をインサートに添加した。浸潤後に、インサート内の細胞懸濁液を吸引除去し、綿棒でマトリゲルと非浸潤細胞を拭き取った。その後、冷却したメタノールにインサートを浸し、-80℃で20分インキュベーションすることで、浸潤細胞を固定した。固定後、ギムザ溶液(武藤化学株式会社)にインサートを15分浸し、浸潤細胞を染色した。水道水で洗浄後、インサートからフィルターを取り外し、スライド上に置き、マウント剤にて封入した。光学顕微鏡でフィルター下層の浸潤面を観察し、核が観察できる細胞を浸潤細胞として計数した。なお、6視野を計数し、その平均値を算出した。【０１３５】
結果を図１１に示す。抗体を添加していない場合の浸潤細胞数を基準として抗体添加群で得られた浸潤細胞数の割合を算出した。また、これらの実験は３回ずつ行い、スチューデントのt検定を行った。コントロール抗体添加時には浸潤細胞数はほとんど変化していないのに対して、8F7抗体添加時には浸潤細胞の比率が３０％程度まで減少しており、統計的な有意差を持って8F7が細胞浸潤に対して阻害効果を持つことが確認できた。【０１３６】
（実施例１５）抗体のアミノ酸配列解析
ハイブリドーマ細胞を、ｉｌｌｕｓｔｒａ Ｑｕｉｃｋｐｒｅｐ Ｍｉｃｒｏ ｍＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサインス社）を用いてＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｒＳｃｒｉｐｔＦｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲキット（インビトロジェン社）にてｃＤＮＡを作製した。Ｈｅａｖｙ  ｐｒｉｍｅｒ増幅キット（アマシャムバイオサイエンス社）およびＬｉｇｈｔｐｒｉｍｅｒ増幅キット（アマシャムバイオサイエンス社）を用いてＰＣＲを行い、抗体の重鎖（Ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）および抗体の軽鎖（Ｌｉｇｈｔｃｈａｉｎ）ｃＤＮＡを伸張させ、重鎖のＰＣＲ産物をｐＴＡベクター（東洋紡績社）へ、そして軽鎖のＰＣＲ産物をＭｉｇｈｔｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ <Ｂｌｕｎｔ Ｅｎｄ>(タカラバイオ社)組み込み、ｃＤＮＡ配列、アミノ酸配列を決定した。ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍを利用して決定した。【０１３７】
上述の方法で得られたｃＤＮＡ配列を元にｐｒｉｍｅｒを作製し、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ Ｋｉｔ (インビトロジェン社)を用いて抗体の重鎖および抗体の軽鎖の５’ＲＡＣＥおよび３’ＲＡＣＥを行い、抗体遺伝子の全長解析を行った。その結果、重鎖と軽鎖、ＣＤＲ領域のアミノ酸配列は以下の通りとなった（図１２および図１３も参照）。【０１３８】
（重鎖）
［ＣＤＲＨ１］
ＳＹＮＭＨ（配列番号１５）
［ＣＤＲＨ２］
ＡＩＹＰＧＤＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１６）
［ＣＤＲＨ３］
ＤＲＧＤＹＧＹＧＦＡＹ（配列番号１７）
（軽鎖）
［ＣＤＲＬ１］
ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号１８）
［ＣＤＲＬ２］
ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１９）
［ＣＤＲＬ３］
ＳＱＮＴＨＶＰＰＷＴ（配列番号２０）
【産業上の利用可能性】
【０１３９】
本発明の抗ＡＤＡＭ−１５抗体等は、優れたＡＤＡＭ−１５機能抑制作用を示すことから、細胞増殖、細胞遊走、細胞浸潤、細胞間接着、血管新生に起因する疾患の治療薬又は予防薬として利用することができる。特に、本発明の抗体は、癌（例えば、癌細胞の増殖、転移）、炎症性疾患（例えば、関節リウマチ、変形性関節症、肝炎、気管支喘息、綿維症、糖尿病、動脈硬化、多発性硬化症、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病等））、感染症（例えば、肝炎）、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、自己免疫性甲状腺疾患、尿細管間質性腎炎、重症筋無力症）および骨疾患（例えば、骨粗鬆症）等に対する治療薬又は予防薬として利用することができる。また、本発明の抗体は、細胞や組織におけるＡＤＡＭ−１５の発現を病理学的に検出することができることから、上記各種疾患の診断薬として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】抗ヒトＡＤＡＭ−１５モノクローナル抗体８Ｆ７の結合特異性をＥＬＩＳＡ法により測定した結果を表す図である。図中、縦軸は４９０ｎｍにおける吸光度を表し、横軸は固相化されたポリペプチドの濃度を表す。GST、ヒトＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメイン−ＧＳＴタンパク質（d.d.-GST）、ヒトＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメインループ領域−ＧＳＴタンパク質（loop-GST）、ヒトＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメインタンパク質（d.d.）、ヒトＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメインタンパク質(RAA置換体)（d.d.-RAA）、及びマウスオステオポンチンＮ−ハーフ−ＧＳＴタンパク質（mOPN N-half-GST）をそれぞれ10μg/mlから段階希釈して固相に固定し、一次抗体として、0.1μg/mlに調整した8F7を用いた。ベースラインとしてPBSのみの吸光度を用いた。
【図２】ヒトＡＤＡＭ−１５モノクローナル抗体８Ｆ７の結合特異性をウェスタンブロットにより測定した結果を表す図である。図中、（＋）はＡＤＡＭ−１５を遺伝子導入したＣＯＳ−７の細胞溶液サンプルを表し、（−）は遺伝子導入していないＣＯＳ−７の細胞溶液サンプルを表す。また、矢印は目的のバンドを示す。
【図３】８Ｆ７と２３Ｇ９のＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメインへの結合活性をＥＬＩＳＡ法により測定した結果を表す図である。図中、縦軸は４９０ｎｍにおける吸光度を表し、横軸は固相化されたポリペプチドの濃度を表す。また、hTNC-GSTは、ヒト・テネイシンＣ−ＧＳＴタンパク質を表す。
【図４】８Ｆ７のＲＧＤ配列非依存性細胞接着阻害活性を測定した結果を表す。Ａは、ＣＨＯ−Ｋ１及びｈα９／ＣＨＯの、ｈＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメインへの細胞接着を測定した結果を示す。図中、縦軸は５９０ｎｍにおける吸光度を表し、横軸は固相化されたポリペプチドの濃度を表す。Ｂは、ｈα９／ＣＨＯの、ｈＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメインへの細胞接着に対する、８Ｆ７の阻害活性を測定した結果を示す。図中、縦軸は５９０ｎｍにおける吸光度を表し、横軸は固相化されたポリペプチドの濃度を表す。
【図５】ヒト腎癌細胞株ＮＲＣ−１２におけるインテグリンの発現をフローサイトメトリーにより測定した結果を表す。α９β１インテグリンはＹ９Ａ２、αｖβ３インテグリンはＬＭ６０９、α５β１インテグリンはＪＢＳ５を用いて検出した。
【図６】８Ｆ７のＲＧＤ配列依存性細胞接着阻害活性を測定した結果を表す。Ａは、ＮＲＣ−１２とｈＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメインの細胞接着を検討した結果を表す。図中、縦軸は５９０ｎｍにおける吸光度を表し、横軸は固相化されたポリペプチドの濃度を表す。Ｂは、ＮＲＣ−１２の、ｈＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメインへの細胞接着に対する、８Ｆ７の阻害活性を測定した結果を示す。図中、縦軸は５９０ｎｍにおける吸光度を表し、横軸は固相化されたポリペプチドの濃度を表す。
【図７】ヒト乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ）におけるインテグリンの発現をフローサイトメトリーにより測定した結果を表す。α９β１インテグリンはＹ９Ａ２、αｖβ３インテグリンはＬＭ６０９、α５β１インテグリンはＪＢＳ５を用いて検出した。
【図８】ヒト乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ）を用いた細胞接着試験の結果を表す。Ａは、ｈＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメインへの細胞接着を測定した結果を示す。図中、縦軸は５９０ｎｍにおける吸光度を表し、横軸は固相化されたポリペプチドの濃度を表す。Ｂは、Ｍｎイオン存在下で、ｈＡＤＡＭ−１５ディスインテグリンドメインへの細胞接着を測定した結果を示す。図中、縦軸は５９０ｎｍにおける吸光度を表し、横軸は固相化されたポリペプチドの濃度を表す。
【図９】ヒト乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ）を用いた細胞接着阻害試験の結果を表す。Ａは、ヒト乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ）のＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメインへの接着を８Ｆ７で阻害した結果を示す。Ｂは、ヒト乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ）のＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメイン（ＲＡＡ置換体）への接着を８Ｆ７で阻害した結果を示す。Ｃは、ヒト乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ）のＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメインへの接着をＹ９Ａ２又はＬＭ６０９で阻害した結果を示す。Ｄは、ヒト乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ）のＡＤＡＭ−１５のディスインテグリンドメイン（ＲＡＡ置換体）への接着をＹ９Ａ２又はＬＭ６０９で阻害した結果を示す。全ての図において、図中、縦軸は抗体非添加を１００％とした場合の細胞接着率を表し、横軸は投与した抗体を表す。
【図１０】ヒト乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ）の細胞増殖におけるＡＤＡＭ−１５の機能及び８Ｆ７による当該機能の阻害活性を測定した結果を表す。各抗体は２０μｇ／ｍＬで添加した。図中、縦軸は４８時間後の細胞増殖率を表す。
【図１１】ヒト乳癌細胞株435S 細胞を用いた細胞浸潤阻害試験の結果を示す。
【図１２】抗ヒトADAM-15抗体（8F7）重鎖の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列はシングルレターコードで示した。シグナル配列はイタリックで、抗体のN末端に相当するアミノ酸残基（Q）は二重下線で示した。Kabat numbering systemにより類推されるCDRは下線で示した。また、抗体の可変部と定常部の境界のアミノ酸残基（A）は太字下線で示した。
【図１３】抗ヒトADAM-15抗体（8F7）軽鎖の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列はシングルレターコードで示した。シグナル配列はイタリックで、抗体のN末端に相当するアミノ酸残基（D）は二重下線で示した。Kabat numbering systemにより類推されるCDRは下線で示した。また、抗体の可変部と定常部の境界のアミノ酸残基（R）は太字下線で示した。
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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