(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：143の配列からなるPPFポリペプチド。
【請求項２】
治療上有効量の請求項１記載のPPFポリペプチドを含む、食物摂取を減少するための医薬組成物。
【請求項３】
治療上有効量の請求項１のPPFポリペプチドを含む、肥満を治療または予防するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ペプチドケミストリーと関連し、より詳細には、膵臓ポリペプチドファミリー(「PPF」)ポリペプチドに関連する。
【０００２】
発明の背景
数多くの関連ホルモンが膵臓ポリペプチドファミリー(「PPF」)を形成している。膵臓ポリペプチド(「PP」)は、インスリン抽出物の狭雑物として発見され、その機能の重要性というよりはその起源となる臓器により命名された(Kimmelら、Endocrinology 83: 1323-30 (1968))。PPは、特徴的な構造モチーフを含む36アミノ酸から成るペプチド(SEQ ID NO: 1)である。それに続き、ある関連ペプチドが小腸の抽出物中に発見され、そのN-およびC-末端がチロシンであることからペプチドYY (「PYY」) (SEQ ID NO: 2)と命名された(Tatemoto、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 2514-8 (1982))。後に、第三のペプチドが脳抽出物中に見出され、ニューロペプチドY (「NPY」) (SEQ ID NO: 4)と命名された (Tatemotoら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5485-9 (1982)；Tatemotoら、Nature 296: 659-60 (1982))。
【０００３】
これら三種の関連ペプチドは、多様な生物学的効果を発揮することが報告されている。PPの効果には、膵臓分泌および胆嚢弛緩の阻害が含まれる。PPの中枢投与は、緩慢ではあるが、視床下部および脳幹に局在する受容体を媒介すると思われる採餌の増加を促す(Gehlert、Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 218: 7-22 (1998)にレビューされている)。
【０００４】
PYY(SEQ ID NO: 2)の遊離が食事後に起こる。別種のPYY、PYY(3-36) (SEQ ID NO: 3)が存在する (Eberleinら、Peptides 10: 797-803 (1989)； Grandtら、Regul. Pept. 51: 151-9 (1994))。この断片は、ヒトおよびイヌの小腸抽出液中に含まれる全PYY様免疫反応活性のおおよそ40％を成し、また、血漿の全PYY様免疫反応活性の36％(空腹状態)、食事後には50％を僅かに超える程度に及ぶ。それは、見かけ上、PYYのジぺプチジルペプチダーゼ-IV(DPP4)による解離産物と見られる。PYY(3-36)は、Y2およびY5受容体の選択的リガンドであることが報告されており、それら受容体は、N-末端側がトランケートされたNPY アナログ(即ち、そのC-末端断片)に選択的である点において、薬理学的にユニークであるように思われる。PYYの末梢投与は、胃酸分泌、胃の運動性、膵臓の外分泌(Yoshinagaら、Am. J. Physiol. 263: G695-701 (1992)；Guanら、Endocrinology 128: 911-6 (1991)；Pappasら、Gastroenterology 91: 1386-9 (1986))、胆嚢の収縮および小腸の運動性(Savageら、Gut 28: 166-70 (1987))を抑えることが報告されている。後脳/脳幹内あるいは周辺への直接注射後に見られるように、胃排出、胃の運動性および胃酸分泌に及ぼすPYYの中枢注射の効果は、末梢への注射後に見られるそれらの効果とは異なるかもしれない(ChenおよびRogers、Am. J. Physiol. 269: R787-92 (1995)；Chenら、Regul. Pept. 61: 95-98 (1996)；YangおよびTache、Am. J. Physiol. 268: G943-8 (1995)；Chenら、Neurogastroenterol. Motil. 9: 109-16 (1997))。例えば、PYYの中枢投与には、胃酸分泌を刺激した、阻害しなかった、という点において、本明細書中に述べられる末梢投与されたPYY(3-36)の効果とは反対のいくつかの効果があった。胃の運動性は、TRHの刺激と共によってのみ抑制されたが、単独投与によっては抑制されず、また、高用量では、PP受容体との想定される相互作用を介して確かに刺激された。PYYは、中枢投与により、食餌および水分の摂取を促進することが示された(Morleyら、Brain Res. 341: 200-3 (1985)；Corpら、Am. J. Physiol. 259: R317-23 (1990))。
【０００５】
さらに、NPY (SEQ ID NO: 4)の、特に、視床下部における中枢効果は、食餌の摂取を促進するものであったことが最も初期に報告された１つにある(Stanleyら、Peptides 6: 1205-11 (1985))。PYYおよびPPは、これらの効果を擬似することが報告され、PYYは、NPYよりも強力あるいは同等の効力を持っている(Morleyら、Brain Res. 341: 200-3 (1985)；Kanataniら、Endocrinology 141: 1011-6 (2000)；Nakajimaら、J. Pharmacol. Exp. Ther. 268: 1010-4 (1994))。先に調べられた如何なる薬理学的因子による誘導よりも高くかつ非常に長期持続的な、NPYに誘導される採餌効果がいくつかのグループにより見出されている。NPYにより誘導される採餌促進効果が、数多くの種において再現されている。三大栄養素 (脂肪、蛋白および炭水化物)のうち、炭水化物の摂取が選択的に促進された。NPYの食欲誘発効果に対する耐性は見られず、また10日間にわたって繰り返しそのペプチドを投与した場合に著しい体重増加率の上昇が観察された。空腹になると、視床下部室傍核におけるNPY濃度が時間とともに上昇するが、食餌の摂取により速やかにコントロールレベルまで戻った。
【０００６】
薬理学的研究およびクローニングなどにより、ペプチドのPPファミリーに対する多くの膜七回貫通型受容体が暴かれ、それらの受容体は、Y1からY6(それに加え、想定されるPYY-選択的受容体Y7)と命名帰属された。これら受容体の典型的なシグナリング応答は、他のGi/G0-蛋白共役受容体のシグナリング、即ち、アデニルシクラーゼの阻害と類似している。受容体間の配列相同性は明らかに低いが、Y1、Y4およびY6受容体間のアミノ酸配列相同性に関するクラスタリングが存在することは明らかである一方、Y2とY5は、他のファミリーを形成している。他の結合部位が、種々のペプチドの効力順位から同定されている。未だクローン化されていないNPY -選択的受容体はY3と呼ばれ、PYY-選択的受容体の存在も示されている(想定されるY7) (Michelら、Pharmacol. Rev. 50:143-50 (1998)；Gehlert、Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 218: 7-22 (1998))。
【０００７】
Y1およびY5受容体が、食餌摂取応答に関するプライマリーなメディエーターとして指摘されている(Marshら、Nat. Med. 4: 718-21 (1998)；Kanataniら、Endocrinology 141: 1011-6 (2000))。これらの受容体を介して、内在性NPYが食餌摂取挙動を促進するというのはごく一般的な考え方となっている。肥満に対する推奨された治療は、専ら、NPY受容体のアンタゴニズムに向けられたものである一方、食思不良に対する治療は、このリガンドのアゴニストに対するものとなっている(例えば、米国特許第5,939,462号明細書；6,013,622号明細書；および4,891,357号明細書を参照)。一般的に、PYYおよびNPYは、調べられた全てのY1やY5 (およびY2)受容体アッセイにおいて、同程度 あるいは同等に効果的であることが報告されている(Gehlert、Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 218: 7-22 (1998))。
【０００８】
Y2 受容体は、ニューロペプチドY受容体のC-末端側の断片に対する親和性を持つことにより、薬理学的に、Y1と区別される。ニューロペプチドYの3-36断片やペプチドYYが改善された親和性および選択性を提供したものの、Y2受容体は、ニューロペプチドY(13-36)の親和性により最もよく区別される(Dumontら、Soc. for Neurosci. Abstracts 19:726 (1993)を参照)。Y1受容体およびY2受容体の両方を介するシグナル伝達は、アデニルシクラーゼの阻害と共役している。Y2受容体への結合は、N-タイプ・カルシウムチャンネルの選択的阻害により、シナプス内のカルシウムレベルを減少させることも見出された。さらに、Y2受容体は、Y1受容体のように、セカンドメッセンジャーと特殊な共役を示している(米国特許第6,355,478号明細書を参照)。Y2受容体は、海馬、黒質、視床、視床下部や脳幹などの脳の大部分に見られる。ヒト、マウス、サルおよびラットのY2受容体がクローン化されている(例えば、米国特許第6,420,532号明細書および6,355,478号明細書を参照)。
【０００９】
想定されるY3受容体の主な特徴は、NPYを認識する一方、PYYには、少なくともそれよりも一段弱い効果を持っている。Y3受容体は、NPYに選択性を示す結合部位/受容体のみを意味している。
【００１０】
PYYに選択性を示すもう１つの結合部位/受容体が存在し、PYY-選択性受容体と呼ばれ、それは、本明細書中でY7受容体として言及される。この受容体、あるいはこのクラスの受容体に対する異なる結合順位が報告されており、このファミリーにおいて一種以上の受容体の存在する可能性が示唆されている。ほとんどの場合、それは、PYYがNPYに比べて3-5倍強力であった受容体を述べるために適用されている。International Union of Pharmacologyは、NPY、PYYおよびPP受容体に関する命名法について、PYYとNPYの間に少なくとも20倍の効力の違いが観察されない限り、用語PYY-選択性受容体は使用されないということを勧告している(Michelら、Pharmacol. Rev. 50: 143-50 (1998))。しかしながら、本開示の目的から、Y7受容体あるいはPYY-選択性受容体に対する引用は、どの程度であれ、NPYを上回るPYYに対する選択性を持つ受容体を意味する。
【００１１】
肥満および関連疾患は、米国および世界中における公衆衛生の共通かつ重大な問題となっている。上半身肥満は、２型糖尿病の最も強力なリスクファクターであり、また心臓循環器疾患の大きなリスクファクターにもなっている。肥満は、高血圧、動脈硬化、鬱血性心臓麻痺、ストローク、胆嚢疾患、骨関節炎、睡眠無呼吸症、多房性卵巣症候群のような生殖器疾患、乳癌、前立腺癌、大腸癌、さらに全身麻酔による併発症の高発生率などを引き起こすリスクファクターと認識されている(例えば、Kopelman、Nature 404: 635-43 (2000)を参照)。それは寿命を縮め、上記の合併症、また感染症、静脈瘤、黒色表皮腫、湿疹、運動不耐、インスリン抵抗、高血圧、高コレステロール血症、胆石症、整形障害および血栓症などを引き起こす重大なリスクを持っている(Rissanenら、Br. Med. J. 301: 835-7 (1990))。また、肥満は、インスリン抵抗性症候群、あるいは「シンドローム X」と呼ばれる一連の症状に対するリスクファクターともなっている。最近の試算では、肥満および関連疾患に関する治療コストは、世界中のトータルで1,500億ドルにのぼる。肥満の病理は、多重ファクターによるものと信じられているが、基本的な問題は、肥満患者における栄養分利用率とエネルギー消費のバランスが、脂肪組織が過剰になるまで取れていないことである。現在、肥満は、治療に乏しく、慢性的で、本質的に手に負えない代謝疾患となっている。肥満の人の体重を減少させるために有用な治療薬があれば、肥満の人の健康に非常に大きな有益効果を持つであろう。
【００１２】
さらなるPYYアナログポリペプチドの開発の必要性がある。したがって、そのようなPYYアナログポリペプチドおよびそれらの産生と使用するための方法を提供することが本発明の目的である。
【００１３】
本明細書に引用される全ての文書は、本明細書中にその全てが説明されるが如く、引用として本申請書の中に取り込まれる。
【００１４】
発明の概要
本発明は、概して、PYY(3-36)の全長にわたりPYY(3-36)と少なくとも50％の配列相同性を持ち、かつ少なくともN-末端ポリプロリンPPFモチーフおよびC-末端テールPPFモチーフを含む少なくとも二つのPPFモチーフをも含む膵臓ポリペプチドファミリー(「PPF」)ポリペプチドに関連している。さらなる本発明のPPFモチーフは、PP、PYYおよびNPYを含む如何なるPPファミリーポリペプチドの如何なるモチーフにも対応することができる。ある実施例において、PPFポリペプチドは、非天然アミノ酸を含まない。別例として、PPFポリペプチドは、既知の天然に存在する変種を含まない。
【００１５】
一例において、本発明のPPFポリペプチドは、PYYアナログポリペプチドを含んでいる。本発明のもう１つの局面において、本発明のPPFポリペプチドは、PP、PYYまたはNPYの付加断片の少なくとも１つに共有結合した、PP、PYYまたはNPYポリペプチドのある断片を持つPPFキメラポリペプチドを含んでいる：各PP、PYYまたはNPY断片は、あるPPFモチーフを含む。本発明のそのようなPPFアナログポリペプチドおよびPPFキメラポリペプチドは、PYY(3-36)の全長にわたりネイティブのPYY(3-36)と少なくとも50％の配列相同性を持つであろう。１つの実施例において、好ましいPPFキメラポリペプチドは、あるPPのN-末端断片とあるPYYのC-末端断片とを組合せで含む。別例において、PPFキメラポリペプチドは、あるPPのN-末端断片とあるNPYのC-末端断片を組合せで含む。他の実施例において、PPFキメラポリペプチドは、あるPYYのN-末端断片とあるPPあるいはNPYのC-末端断片を含む。他の実施例において、PPFキメラポリペプチドは、あるNPYのN-末端断片とあるPYYあるいはPPのC-末端断片を組合せで含んでいる。別例において、PPFキメラポリペプチドは、あるPPのN-末端断片とあるNPYのC-末端断片を組合せで含まなくてもよい。さらに、別例において、PPFキメラポリペプチドは、PYYのC-末端断片を持つ、NPYのN-末端断片を含まなくてもよい。
【００１６】
本発明の別の局面において、肥満を治療あるいは予防する方法が提供される。その方法は、効果的な量の本発明のPPFポリペプチドを必要とする人に治療的あるいは予防的に投与することを含む。好ましい例として、その人とは、肥満あるいはオーバーウエイトの人である。「肥満」は、一般的に、ボディーマス指数(BMI：Body Mass Index)が30以上として定義されるが、本開示の目的から、BMI が30以下の人を含む、体重を減らす必要性あるいは願望のある如何なる人も「肥満」の範囲に含められる。インスリン耐性、グルコース不耐性あるいは如何なるタイプの糖尿病(例えば、1型、２型あるいは妊娠糖尿病)の人は、本方法により恩恵を受けることができる。さらに本発明の別例において、本発明の化合物は、食餌摂取を減らしたり、栄養素の利用率を減らしたり、体重減少を引き起こしたり、体内組成に影響を与えたり、体内エネルギー量を変化させたりあるいはエネルギー消費および脂質プロフィールを改善(LDLコレステロールおよびトリグリセリドのレベルを減少させることおよび/またはHDLコレステロールのレベルを変化させることを含む)するための方法に使用されることができる。したがって、一例として、本発明の方法は、必要な人において、栄養素の利用率を減少により軽減させることのできる症状あるいは疾患の治療あるいは予防に有用である。その方法には、当該者に効果的な量の本発明のPPFポリペプチドを治療的あるいは予防的に投与することが含まれる。そのような症状あるいは疾患には、それに限定されないが、高血圧、脂質代謝異常症、心臓血管障害、摂食障害、インスリン耐性、肥満、１型、２型および妊娠糖尿病を含む如何なる種の糖尿病が含まれる。本発明の化合物はまた、肥満に関連するストローク、癌 (例えば、子宮癌、乳癌、前立腺癌および大腸癌)、胆嚢疾患、無呼吸睡眠、受精率の減少および骨関節炎など(Lyznickiら、Am. Fam. Phys. 63:2185、2001を参照)、他の症状を治療あるいは予防するために有用となりえる。
【００１７】
本発明の化合物は、膵島あるいは細胞のグルコースに対する応答を賦活、誘導、促進、あるいは回復させるために有効となりえる。これらの作用はまた、前述あるいは米国特許出願US20040228846に記載されているような代謝疾患の症状を治療あるいは予防するために有効であるかもしれない。
【００１８】
必要な人における食物摂取の減少、体重の減少および肥満治療の結果による高血圧の改善に加え、本発明の化合物は、高血圧の治療あるいは予防を目的に使用されてもよい。
【００１９】
本発明の化合物は、例えば、感染性下痢(例えば、ウイルス性あるいは細菌性)、炎症性下痢  重度短腸症候群あるいはイレオストミー(例えば、Harrison's principles of Internal Medicine、McGraw Hill Inc.、New York、12th ed.を参照)のような外科的処置後に典型的に起こる下痢など、腸内の吸収減少や過剰な電解質および水分の分泌と関連する胃腸疾患の如何なる合併症に対する治療あるいは予防に使用されることができる。感染性下痢の例として、限定はしないが、急性ウイルス性下痢、急性細菌性下痢(例えば、サルモネラ、カンピロバクターおよびクロストリヂウム)または原生動物感染による下痢あるいは旅行者下痢症(例えば、ノロウイルスあるいはロタウイルス)などが含まれる。炎症性下痢の例としては、限定はしないが、吸収不良症候群、熱帯性下痢、慢性膵炎、クローン病、下痢および過敏性腸症候群が含まれる。本発明のペプチドが、例えば、手術後あるいはコレラによるような胃腸疾患が関わる緊急あるいは生命を脅かす状態を治療あるいは予防することができることが見出されている。さらに、本発明の化合物は、エイズ(AIDS)患者の腸機能障害、特に悪液質の間の治療に使用されることができる。また、本発明の化合物は、哺乳動物において、胃腸管の細胞増殖を促進させたり、脂肪分解(例えば、脂肪組織における)を制御したり、血流量を調節したりするだけでなく、小腸の液および電解質の分泌を阻害したり、栄養素の輸送を増大させるために有用となりえる。
【００２０】
本発明の化合物は、それらの胃腸保護活性により、前記状態を治療あるいは予防するために有用となりえる。したがって、本発明の化合物は、胃腸あるいは粘膜傷害の治療に有用となりえる。障害の典型的なタイプには、それらに限定はしないが、炎症性腸疾患、腸萎縮症、腸粘膜あるいは腸粘膜機能の脱落により象徴される状態、および毒物、放射線、有毒物、感染および/または傷害などへの露出により生ずるかもしれない状態を含む胃腸管の他の障害状態などが含まれる。さらに、本発明の化合物は、鎮痛薬、抗炎症薬、成長ホルモン、ヘパリン、あるいは炎症性腸疾患あるいは上述した他の状態に使用できる他の如何なる治療薬と混合してもよい。
【００２１】
さらに、本発明の化合物は、それらの抗分泌作用によって軽減あるいは改善できる病気および疾患の治療あるいは予防に有用である。そのような抗分泌作用には、胃分泌および/または膵臓分泌の阻害が含まれ、胃炎、膵炎、バレット食道、および胃食道逆流症を含む病気および疾患の治療あるいは予防に有用なものとなりえる。これらの病気は、本発明の胃腸保護機能により、治療あるいは予防することができる。
【００２２】
本発明の化合物は、異常なアルミニウム濃度と関連した病気あるいは状態を治療あるいは予防する人(例えば、アルツハイマー病に悩まされている、あるいはアルツハイマー病が進行するリスクを持った患者、痴呆を示す患者、あるいは職業的な暴露により高アルミニウムレベルを示す患者)の中枢神経系におけるアルミニウム濃度を減少させるために有用であるかもしれない。
【００２３】
また、本発明は、PPFポリペプチドの送達に有用な医薬的に許容される希釈剤、保存料、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび/または担体と一緒に、治療的あるいは予防的有効量の少なくとも１つの本発明のPPFポリペプチド、またはその医薬上許容される塩を含む医薬組成物に関連する。
【００２４】
これらおよび他の本発明の局面は、以下の好ましい実施例および詳述に関する引用を以ってより明確に理解されるであろう。
【００２５】
発明の詳細な記述
本発明は、概して、PYY(3-36)の全長にわたりPYY(3-36)と少なくとも50％の配列相同性を持つ膵臓ポリペプチドファミリー(「PPF」)ポリペプチドに関連している。本発明のPPFポリペプチドは、少なくともN-末端ポリプロリンPPFモチーフおよびC-末端テールPPFモチーフを含む少なくとも二つのPPFモチーフを含んでいる。本発明の別のPPFモチーフは、PP、PYYおよびNPYを含む如何なるPPファミリーポリペプチドのモチーフ、例えば、PYYのタイプII β-ターン領域あるいはPYYのC-末端エンドのα-へリックスモチーフに相当してもよい。ある実施例において、本発明のPPFポリペプチドは、如何なる非天然アミノ酸も含めない。
【００２６】
本発明は、また、代謝状態および疾患の治療および予防に有用なPPFポリペプチドに関連している。ある好ましい実施例において、本発明のPPFポリペプチドは、天然のヒトPP、PYY、PYY(3-36)あるいはNPYと比べ、代謝状態および疾患の治療および/または予防において比較しうるあるいはより高い効果を持つことができる。もう一方として、本発明の好ましいPPFポリペプチドは、PP、PYY、PYY(3-36)あるいはNPYと比べて低い効果を持つかもしれないが、改善された簡単な生産、安定性、および/またはフォーミュレーションの簡便さなど、他の好ましい特徴を持つことができる。
【００２７】
ある好ましい実施例において、理論により限定されることなしに、本発明の新規PPFポリペプチドのヒトへの末梢投与は、栄養素利用率を減少させるものと信じられ、それにより肥満および関連代謝状態あるいは疾患の治療および予防に有用である。そのように、本発明は、PPFポリペプチドの組成や栄養素利用率の減少から利益を得るかもしれない代謝状態あるいは疾患を治療および予防するためのその必要のある対象において栄養素利用率を減少させるためのそれらの使用方法を提供する。これらの方法は、例えば、肥満、２型に限らず非インスリン依存性糖尿病を含む糖尿病、摂食障害、インスリン耐性症候群、および心臓血管障害の治療に有用となりえる。
【００２８】
セクションの題は、編集目的のために本明細書中のみで使用され、記載される内容を如何なる見方によって限定するようには解釈されない。
【００２９】
本発明のPPFポリペプチドとPPFモチーフ
前述したように、本発明は、少なくとも二つのPPFモチーフを少なくとも部分的に含む新規PPFポリペプチドに関連する。その少なくとも二つのモチーフとは、少なくともN-末端ポリプロリンPPFモチーフとC-末端テールPPFモチーフを含む。また、本発明のPPFポリペプチドは、あるネイティブPYY(3-36)と、そのPYY(3-36)の全長にわたり50％の配列同等性を持つであろう。本発明のポリペプチドは、ヒトのネイティブPP、PYYまたはNPYの生物学的活性を少なくとも部分的に保持するであろう；例えば、本発明のポリペプチドは、概して、PP、PYYまたはNPYのアゴニストあるいはアンタゴニストとなる。ある好ましい実施例で、本発明のポリペプチドは、代謝状態あるいは疾患の治療および予防において、生物学的な活性を持つであろう。さらに、本発明のPPFポリペプチドは、内部リンカー化合物を含んでもよく、内部のアミノ酸残基に化学修飾を含んでもよく、あるいはN-末端またはC-末端残基が化学修飾されてもよい。ある好ましい実施例において、本発明のポリペプチドは、天然のL-アミノ酸および/または修飾された天然アミノ酸残基のみを含む。別の好ましい実施例において、本発明のポリペプチドは、非天然アミノ酸残基を含まない。
【００３０】
本発明のPPFモチーフは、PP、PYYおよびNPYを含む如何なるネイティブのPPファミリーポリペプチドの如何なるモチーフと対応してもよい。「PPFモチーフ」は、一般に、ネイティブのPPファミリーポリペプチドの生物学的活性に重要な一次的、二次的あるいは三次的な構造組成である；すなわち、生物学的活性は、そのモチーフの欠失あるいはそれに対する妨害により実質的に減少する。好ましいPPFモチーフは、ネイティブのPPファミリーポリペプチドのN-末端ポリプロリン・タイプIIモチーフ、ネイティブのPPファミリーポリペプチドのタイプ II β-ターンモチーフ、ネイティブのPPファミリーポリペプチドのC-末端エンドのα-へリックスモチーフ、およびネイティブのPPファミリーポリペプチドのC-末端テールモチーフを含む。より特別に、N-末端ポリプロリン領域において、ネイティブのPPファミリーポリペプチドの残基５および残基８に相当するアミノ酸は、概して、プロリンとして保存されている。タイプ IIβ-ターンモチーフは、一般に、ネイティブのPPファミリーポリペプチドの残基12-14に対応するアミノ酸を含むであろう。α-へリックスモチーフは、一般に、α-へリックスターンが溶液中で形成されるために十分な数のアミノ酸残基を含む限り、ネイティブのPPファミリーポリペプチドの残基14付近に対応するアミノ酸からそのC-末端を含む如何なるポイントまでも達し得る。また、α-へリックスモチーフは、α-へリックスターンが溶液中で形成される限り、ネイティブのPPファミリー配列にアミノ酸置換、挿入および欠失を含めることができる。C-末端テールモチーフは、一般に、ネイティブのPPファミリーポリペプチドの最後のおおよそ10残基、より好ましくはネイティブのPPファミリーポリペプチドの最後の７、６あるいは５残基、およびより好ましくはアミノ酸残基32-35に対応するアミノ酸を含む。
【００３１】
１つの実施例において、本発明のPPFポリペプチドは、如何なる非天然アミノ酸も含まず、さらに、如何なるネイティブのPPFポリペプチド(例えば、PP、NPY(1-36)、NPY(3-36)、PYY(1-36)、PYY(3-36)、NPY(2-36)、NPY(4-36)、PYY(2-36)、PYY(4-36)、PP(2-36)、PP(3-36)、あるいはPP(4-36))をも含まない条件を持つ。本発明のPPFポリペプチドは、また、好ましくは以下を含まない：Tyr1hPP、Lys4hPP、Asn7hPP、Arg19hPP、Tyr21hPP、Glu21hPP、Ala23hPP、Gln23hPP、Gln34hPP、Phe6Arg19hPP、Phe6Tyr21hPP、Phe6Glu21hPP、Phe6Ala23hPP、Phe6Gln23hPP、Pro13Ala14hPP、Ile31Gln34PP、Arg19Tyr20Tyr21Ser22Ala23hPP、Lys4Arg19Tyr20Tyr21Ser22Ala23hPP、Lys4Arg19Tyr20Tyr21Ser22Ala23hPP(2-36)、Ala1NPY、Tyr1NPY、Ala2NPY、Leu2NPY、Phe2NPY、His2NPY、Ala3NPY、Ala4NPY、Ala6NPY、Tyr7pNPY、Ala7NPY、Ala9NPY、Ala10NPY、Ala11NPY、Gly12NPY、Ala13NPY、Gly14NPY、Ala15NPY、Ala16NPY、Ala17NPY、Gly18NPY、Ala19NPY、Lys19NPY、Ala20NPY、Ala21NPY、Ala22NPY、Gly23NPY、Ala24NPY、Trp24pNPY、Ala25NPY、Lys25NPY、Ala26NPY、Ala27NPY、Phe27NPY、Ala28NPY、Ala29NPY、Gln29NPY、Ala30NPY、Phe30NPY、Ala31NPY、Trp31pNPY、Ala32NPY、Trp32NPY、Ala33NPY、Lys33NPY、Ala34NPY、Pro34NPY、Leu34NPY、Ala35NPY、Lys35NPY、Ala36NPY、Phe36NPY、His36NPY、Glu4Pro34pNPY、Arg6Pro34pNPY、Phe6Pro34pNPY、Cys6Pro34pNPY、Asn6Pro34pNPY、Phe7Pro34pNPY、Arg7Pro34 pNPY、Cys7Pro34 pNPY、Asp7Pro34 pNPY、Phe8Pro34 pNPY、Arg8Pro34 pNPY、Cys8Pro34 pNPY、Asp8Pro34 pNPY、Asn8Pro34pNPY、Pro11Pro34pNPY、Ser13Pro14pNPY、Trp24,31pNPY、Ala31Pro32pNPY、Cys31Pro34pNPY、Leu31Pro34NPY、Phe32Pro34pNPY、Ala21,25Pro34pNPY、Pro11Tyr13Pro14Pro34pNPY、Ahx(9-22)pNPY、Ahx(9-17)pNPY、des-AA(10-20)-Cys7,21Pro34-pNPY、des-AA(10-17)-pNPY、des-AA(10-17)-Cys2,27-pNPY、des-AA(10-17)-Ala7,21-pNPY、des-AA(10-17)-Cys7,21-pNPY、des-AA(10-17)-Glu7Lys21-pNPY、des-AA(10-17)Cys7,21Pro34pNPY、des-AA(10-17)Glu7Lys21Pro34pNPY、des-AA(10-17)Cys7,21Leu31Pro34pNPY、des-AA(11-17)Cys7,21Pro34pNPY、Pro34PYY、His34PYY、Lys25hPYY(5-36)、Arg4hPYY(4-36)、Gln4hPYY(4-36)、Asn4hPYY(4-36)、Lys25hPYY(4-36)、Leu3hPYY(3-36)、Val3hPYY(3-36)、Lys25hPYY(3-36)、Tyr1,36pPYY、Pro13Ala14hPYY、Leu31Pro34PYY、FMS-PYY、FMS-PYY(3-36)、Fmoc-PYY、Fmoc-PYY(3-36)、FMS2-PYY、FMS2-PYY(3-36)、Fmoc2-PYY、Fmoc2-PYY(3-36)、hPP(1-7)-pNPY、hPP(1-17)-pNPY、hPP(19-23)-pNPY、hPP(19-23)-Pro34pNPY、hPP(19-23)-His34pNPY、rPP(19-23)-pNPY、rPP(19-23)-Pro34pNPY、rPP(19-23)-His34pNPY、hPP(1-7)-pNPY、hPP(1-17)-pNPY、hPP(1-17)-His34pNPY、pNPY(1-7)-hPP、pNPY(1-7、19-23)-hPP、cPP(1-7)-pNPY(19-23)-hPP、cPP(1-7)-NPY(19-23)-His34hPP、hPP(1-17)-His34pNPY、hPP(19-23)-pNPY、hPP(19-23)-Pro34pNPY、hPP(19-23)-His34pNPY、rPP(19-23)-pNPY、rPP(19-23)-Pro34pNPY、rPP(19-23)-His34pNPY、pNPY(1-7)-hPP、pNPY(19-23)-hPP、pNPY(19-23)-Gln34hPP、pNPY(19-23)-His34hPP、pNPY(19-23)-Phe6Gln34hPP、pNPY(19-23)-Phe6His34hPP、pNPY(1-7,19-23)-hPP、pNPY(1-7,19-23)-Gln34hPP、cPP(20-23)-Pro34-pNPY、cPP(21-23)-Pro34-pNPY、cPP(22-23)-Pro34-pNPY、cPP(1-7)-Pro34-pNPY、cPP(20-23)-Pro34-pNPY、cPP(1-7,20-23)-Pro34-pNPY、cPP(1-7)-pNPY(19-23)-hPP、cPP(1-7)-pNPY(19-23)-His34hPP、あるいはcPP(1-7)-gPP(19-23)-hPP。
【００３２】
他の実施例において、本発明のそのようなPPFポリペプチドは、また、以下をも含まない：Thr27hPYY(3-36)、Ile30hPYY(3-36)、Ser32hPYY(3-36)、Lys33hPYY(3-36)、Asn34hPYY(3-36)、Lys35hPYY(3-36)、Thr36hPYY(3-36)、Lys25Thr27hPYY(3-36)、Lys25Ile30hPYY(3-36)、Lys25Ser32hPYY(3-36)、Lys25Lys33hPYY(3-36)、Lys25Asn24hPYY(3-36)、Lys25Lys35hPYY(3-36)、Lys25Thr36hPYY(3-36)、Thr27Ile28hPYY(3-36)、Thr27Val28hPYY(3-36)、Thr27Gln29hPYY(3-36)、Thr27Ile30hPYY(3-36)、Thr27Val30hPYY(3-36)、Thr27Ile31hPYY(3-36)、Thr27Leu31hPYY(3-36)、Thr27Ser32hPYY(3-36)、Thr27Lys33hPYY(3-36)、Thr27Asn34hPYY(3-36)、Thr27Lys35hPYY(3-36)、Thr27Thr36hPYY(3-36)、Thr27Phe36hPYY(3-36)、Phe27Ile30hPYY(3-36)、Phe27Ser32hPYY(3-36)、Phe27Lys33hPYY(3-36)、Phe27Asn34hPYY(3-36)、Phe27Lys35hPYY(3-36)、Phe27Thr36hPYY(3-36)、Gln29Ile30hPYY(3-36)、Gln29Ser32hPYY(3-36)、Gln29Leu33hPYY(3-36)、Gln29Asn34hPYY(3-36)、Gln29Leu35hPYY(3-36)、Gln29Thr36hPYY(3-36)、Ile30Ile31hPYY(3-36)、Ile30Leu31hPYY(3-36)、Ile30Ser32hPYY(3-36)、Ile30Lys33hPYY(3-36)、Ile30Asn34hPYY(3-36)、Ile30Lys35hPYY(3-36)、Ile30Thr36hPYY(3-36)、Ile30Phe36hPYY(3-36)、Val30Ser32hPYY(3-36)、Val30Lys33hPYY(3-36)、Val30Asn34hPYY(3-36)、Val30Lys35hPYY(3-36)、Val30Thr36hPYY(3-36)、Ile31Ser32hPYY(3-36)、Ile31Lys33hPYY(3-36)、Ile31Asn34hPYY(3-36)、Ile31Lys35hPYY(3-36)、Ile31Thr36hPYY(3-36)、Ile31Phe36hPYY(3-36)、Leu31Ser32hPYY(3-36)、Leu31Lys33hPYY(3-36)、Leu31Asn34hPYY(3-36)、Leu31Lys35hPYY(3-36)、Leu31Thr36hPYY(3-36)、Ser32Lys33hPYY(3-36)、Ser32Asn34hPYY(3-36)、Ser32Lys35hPYY(3-36)、Ser32Thr36hPYY(3-36)、Ser32Phe36hPYY(3-36)、Lys33Asn34hPYY(3-36)、Lys33Lys35hPYY(3-36)、Lys33Thr36hPYY(3-36)、Lys33Phe36hPYY(3-36)、Asn34Lys35hPYY(3-36)、Asn34Phe36hPYY(3-36)、Lys35Thr36hPYY(3-36)、Lys35Phe36hPYY(3-36)、Thr27hPYY(4-36)、Phe27hPYY(4-36)、Ile28hPYY(4-36)、Val28hPYY(4-36)、Gln29hPYY(4-36)、Ile30hPYY(4-36)、Val30hPYY(4-36)、Ile31hPYY(4-36)、Leu31hPYY(4-36)、Ser32hPYY(4-36)、Lys33hPYY(4-36)、Asn34hPYY(4-36)、Lys35hPYY(4-36)、Thr36hPYY(4-36)、Phe36hPYY(4-36)、Lys25Thr27hPYY(4-36)、Lys25Phe27hPYY(4-36)、Lys25Ile28hPYY(4-36)、Lys25Val28hPYY(4-36)、Lys25Gln29hPYY(4-36)、Lys25Ile30hPYY(4-36)、Lys25Val30hPYY(4-36)、Lys25Ile31hPYY(4-36)、Lys25Leu31hPYY(4-36)、Lys25Ser32hPYY(4-36)、Lys25Lys33hPYY(4-36)、Lys25Asn24hPYY(4-36)、Lys25Lys35hPYY(4-36)、Lys25Thr36hPYY(4-36)、Lys25Phe36hPYY(4-36)、Thr27Ile28hPYY(4-36)、Thr27Val28hPYY(4-36)、Thr27Gln29hPYY(4-36)、Thr27Ile30hPYY(4-36)、Thr27Val30hPYY(4-36)、Thr27Ile31hPYY(4-36)、Thr27Leu31hPYY(4-36)、Thr27Ser32hPYY(4-36)、Thr27Lys33hPYY(4-36)、Thr27Asn34hPYY(4-36)、Thr27Lys35hPYY(4-36)、Thr27Thr36hPYY(4-36)、Thr27Phe36hPYY(4-36)、Phe27Ile28hPYY(4-36)、Phe27Val28hPYY(4-36)、Phe27Gln29hPYY(4-36)、Phe27Ile30hPYY(4-36)、Phe27Val30hPYY(4-36)、Phe27Ile31hPYY(4-36)、Phe27Leu31hPYY(4-36)、Phe27Ser32hPYY(4-36)、Phe27Lys33hPYY(4-36)、Phe27Asn34hPYY(4-36)、Phe27Lys35hPYY(4-36)、Phe27Thr36hPYY(4-36)、Phe27Phe36hPYY(4-36)、Gln29Ile30hPYY(4-36)、Gln29Val30hPYY(4-36)、Gln29Ile31hPYY(4-36)、Gln29Leu31hPYY(4-36)、Gln29Ser32,hPYY(4-36) Gln29Leu33hPYY(4-36)、Gln29Asn34hPYY(4-36)、Gln29Leu35hPYY(4-36)、Gln29Thr36hPYY(4-36)、Gln29Phe36hPYY(4-36)、Ile30Ile31hPYY(4-36)、Ile30Leu31hPYY(4-36)、Ile30Ser32hPYY(4-36)、Ile30Lys33hPYY(4-36)、Ile30Asn34hPYY(4-36)、Ile30Lys35hPYY(4-36)、Ile30Thr36hPYY(4-36)、Ile30Phe36hPYY(4-36)、Val30Ile31hPYY(4-36)、Val30Leu31hPYY(4-36)、Val30Ser32hPYY(4-36)、Val30Lys33hPYY(4-36)、Val30Asn34hPYY(4-36)、Val30Lys35hPYY(4-36)、Val30Thr36hPYY(4-36)、Val30Phe36hPYY(4-36)、Ile31Ser32hPYY(4-36)、Ile31Lys33hPYY(4-36)、Ile31Asn34hPYY(4-36)、Ile31Lys35hPYY(4-36)、Ile31Thr36hPYY(4-36)、Leu31Phe36hPYY(4-36)、Leu31Phe36hPYY(4-36)、Leu31Ser32hPYY(4-36)、Val31Lys33hPYY(4-36)、Leu31Asn34hPYY(4-36)、Leu31Lys35hPYY(4-36)、Leu31Thr36hPYY(4-36)、Leu31Phe36hPYY(4-36)、Ser32Lys33hPYY(4-36)、Ser32Asn34hPYY(4-36)、Ser32Lys35hPYY(4-36)、Ser32Thr36hPYY(4-36)、Ser32Phe36hPYY(4-36)、Lys33Asn34hPYY(4-36)、Lys33Lys35hPYY(4-36)、Lys33Thr36hPYY(4-36)、Lys33Phe36hPYY(4-36)、Asn34Lys35hPYY(4-36)、Asn34Phe36hPYY(4-36)、Lys35Thr36hPYY(4-36)、Lys35Phe36hPYY(4-36)、Thr27hPYY(5-36)、Phe27hPYY(5-36)、Ile28hPYY(5-36)、Val28hPYY(5-36)、Gln29hPYY(5-36)、Ile30hPYY(5-36)、Val30hPYY(5-36)、Ile31hPYY(5-36)、Leu31hPYY(5-36)、Ser32hPYY(5-36)、Lys33hPYY(5-36)、Asn34hPYY(5-36)、Lys35hPYY(5-36)、Thr36hPYY(5-36)、Phe36hPYY(5-36)、Lys25Thr27hPYY(5-36)、Lys25Phe27hPYY(5-36)、Lys25Ile28hPYY(5-36)、Lys25Val28hPYY(5-36)、Lys25Gln29hPYY(5-36)、Lys25Ile30hPYY(5-36)、Lys25Val30hPYY(5-36)、Lys25Ile31hPYY(5-36)、Lys25Leu31hPYY(5-36)、Lys25Ser32hPYY(5-36)、Lys25Lys33hPYY(5-36)、Lys25Asn24hPYY(5-36)、Lys25Lys35hPYY(5-36)、Lys25Thr36hPYY(5-36)、Lys25Phe36hPYY(5-36)、Thr27Ile28hPYY(5-36)、Thr27Val28hPYY(5-36)、Thr27Gln29hPYY(5-36)、Thr27Ile30hPYY(5-36)、Thr27Val30hPYY(5-36)、Thr27Ile31hPYY(5-36)、Thr27Leu31hPYY(5-36)、Thr27Ser32hPYY(5-36)、Thr27Lys33hPYY(5-36)、Thr27Asn34hPYY(5-36)、Thr27Lys35hPYY(5-36)、Thr27Thr36hPYY(5-36)、Thr27Phe36hPYY(5-36)、Phe27Ile28hPYY(5-36)、Phe27Val28hPYY(5-36)、Phe27Gln29hPYY(5-36)、Phe27Ile30hPYY(5-36)、Phe27Val30hPYY(5-36)、Phe27Ile31hPYY(5-36)、Phe27Leu31hPYY(5-36)、Phe27Ser32hPYY(5-36)、Phe27Lys33hPYY(5-36)、Phe27Asn34hPYY(5-36)、Phe27Lys35hPYY(5-36)、Phe27Thr36hPYY(5-36)、Phe27Phe36hPYY(5-36)、Gln29Ile30hPYY(5-36)、Gln29Val30hPYY(5-36)、Gln29Ile31hPYY(5-36)、Gln29Leu31hPYY(5-36)、Gln29
Ser32,hPYY(5-36) Gln29Leu33hPYY(5-36)、Gln29Asn34hPYY(5-36)、Gln29Leu35hPYY(5-36)、Gln29Thr36hPYY(5-36)、Gln29Phe36hPYY(5-36)、Ile30Ile31hPYY(5-36)、Ile30Leu31hPYY(5-36)、Ile30Ser32hPYY(5-36)、Ile30Lys33hPYY(5-36)、Ile30Asn34hPYY(5-36)、Ile30Lys35hPYY(5-36)、Ile30Thr36hPYY(5-36)、Ile30Phe36hPYY(5-36)、Val30Ile31hPYY(5-36)、Val30Leu31hPYY(5-36)、Val30Ser32hPYY(5-36)、Val30Lys33hPYY(5-36)、Val30Asn34hPYY(5-36)、Val30Lys35hPYY(5-36)、Val30Thr36hPYY(5-36)、Val30Phe36hPYY(5-36)、Ile31Ser32hPYY(5-36)、Ile31Lys33hPYY(5-36)、Ile31Asn34hPYY(5-36)、Ile31Lys35hPYY(5-36)、Ile31Thr36hPYY(5-36)、Leu31Phe36hPYY(5-36)、Leu31Phe36hPYY(5-36)、Leu31Ser32hPYY(5-36)、Val31Lys33hPYY(5-36)、Leu31Asn34hPYY(5-36)、Leu31Lys35hPYY(5-36)、Leu31Thr36hPYY(5-36)、Leu31Phe36hPYY(5-36)、Ser32Lys33hPYY(5-36)、Ser32Asn34hPYY(5-36)、Ser32Lys35hPYY(5-36)、Ser32Thr36hPYY(5-36)、Ser32Phe36hPYY(5-36)、Lys33Asn34hPYY(5-36)、Lys33Lys35hPYY(5-36)、Lys33Thr36hPYY(5-36)、Lys33Phe36hPYY(5-36)、Asn34Lys35hPYY(5-36)、Asn34Phe36hPYY(5-36)、Lys35Thr36hPYY(5-36)、あるいはLys35Phe36hPYY(5-36)。
【００３３】
他の実施例において、本発明のPPFポリペプチドは、如何なる非天然アミノ酸残基も含まず、好ましくは、hPYYのC-末端テールモチーフを含む。そのC-末端テールモチーフは、好ましくは、hPYYアミノ酸残基32-35、例えば、Thr、Arg、Gln、Arg(SEQ ID NO: 351)から成る。そのような１つの実施例として、本発明のPPFポリペプチドは、如何なるネイティブのPPファミリーポリペプチドを含まない(例えば、NPY(1-36)、NPY(3-36)、PYY(1-36)、PYY(3-36))、NPY(2-36)、PYY(4-36)、PYY(5-36))、(2-36)NPY、(2-36)PYY、Gln34hPP、Ile31Gln34PP、Ala1NPY、Tyr1NPY、Ala2NPY、Leu2NPY、Phe2NPY、His2NPY、Ala3NPY、Ala4NPY、Ala6NPY、Tyr7pNPY、Ala7NPY、Ala9NPY、Ala10NPY、Ala11NPY、Gly12NPY、Ala13NPY、Gly14NPY、Ala15NPY、Ala16NPY、Ala17NPY、Gly18NPY Ala19NPY、Lys19NPY、Ala20NPY、Ala21NPY、Ala22NPY、Gly23NPY、Ala24NPY、Trp24pNPY、Ala25NPY、Lys25NPY、Ala26NPY、Ala27NPY、Phe27NPY、Ala28NPY、Ala29NPY、Gln29NPY、Ala30NPY、Phe30NPY、Ala31NPY、Trp31pNPY、Ala36NPY、Phe36NPY、His36NPY、Ahx(9-22)pNPY、Ahx(9-17)pNPY、des-AA(10-17)-pNPY、des-AA(10-17)-Cys2,27-pNPY des-AA(10-17)-Ala7,21-pNPY、des-AA(10-17)-Cys7,21-pNPY、des-AA(10-17)-Glu7Lys21-pNPY、Lys25hPYY(5-36)、Arg4hPYY(4-36)、Gln4hPYY(4-36)、Asn4hPYY(4-36)、Lys25hPYY(4-36)、Leu3hPYY(3-36)、Val3hPYY(3-36)、Lys25hPYY(3-36)、Tyr1,36pPYY、Pro13Ala14hPYY、FMS-PYY、FMS-PYY(3-36)、Fmoc-PYY、Fmoc-PYY(3-36)、FMS2-PYY、FMS2-PYY(3-36)、Fmoc2-PYY、Fmoc2-PYY(3-36)、hPP(1-7)-pNPY、hPP(1-17)-pNPY、hPP(19-23)-pNPY、rPP(19-23)-pNPY、hPP(1-7)-pNPY、hPP(1-17)-pNPY、hPP(19-23)-pNPY、rPP(19-23)-pNPY、pNPY(19-23)-Gln34hPP、pNPY(19-23)-Phe6Gln34hPP、あるいはpNPY(1-7,19-23)-Gln34hPP。
【００３４】
別の局面において、hPYYのC-末端テールモチーフを含む、本発明のそのようなPPFポリペプチドは、以下をも含まない：Thr27hPYY(3-36)、Ile30hPYY(3-36)、Thr36hPYY(3-36)、Lys25Thr27hPYY(3-36)、Lys25Ile30hPYY(3-36)、Lys25Asn24hPYY(3-36)、Lys25Thr36hPYY(3-36)、Thr27Ile28hPYY(3-36)、Thr27Val28hPYY(3-36)、Thr27Gln29hPYY(3-36)、Thr27Ile30hPYY(3-36)、Thr27Val30hPYY(3-36)、Thr27Ile31hPYY(3-36)、Thr27Leu31hPYY(3-36)、Thr27Thr36hPYY(3-36)、Thr27Phe36hPYY(3-36)、Phe27Ile30hPYY(3-36)、Phe27Thr36hPYY(3-36)、Gln29Ile30hPYY(3-36)、Gln29Thr36hPYY(3-36)、Ile30Ile31hPYY(3-36)、Ile30Leu31hPYY(3-36)、Ile30Thr36hPYY(3-36)、Ile30Phe36hPYY(3-36)、Val30Thr36hPYY(3-36)、Ile31Thr36hPYY(3-36)、Ile31Phe36hPYY(3-36)、Leu31Thr36hPYY(3-36)、Thr27hPYY(4-36)、Phe27hPYY(4-36)、Ile28hPYY(4-36)、Val28hPYY(4-36)、Gln29hPYY(4-36)、Ile30hPYY(4-36)、Val30hPYY(4-36)、Ile31hPYY(4-36)、Leu31hPYY(4-36)、Thr36hPYY(4-36)、Phe36hPYY(4-36)、Lys25Thr27hPYY(4-36)、Lys25Phe27hPYY(4-36)、Lys25Ile28hPYY(4-36)、Lys25Val28hPYY(4-36)、Lys25Gln29hPYY(4-36)、Lys25Ile30hPYY(4-36)、Lys25Val30hPYY(4-36)、Lys25Ile31hPYY(4-36)、Lys25Leu31hPYY(4-36)、Lys25Thr36hPYY(4-36)、Lys25Phe36hPYY(4-36)、Thr27Ile28hPYY(4-36)、Thr27Val28hPYY(4-36)、Thr27Gln29hPYY(4-36)、Thr27Ile30hPYY(4-36)、Thr27Val30hPYY(4-36)、Thr27Ile31hPYY(4-36)、Thr27Leu31hPYY(4-36)、Thr27Thr36hPYY(4-36)、Thr27Phe36hPYY(4-36)、Phe27Ile28hPYY(4-36)、Phe27Val28hPYY(4-36)、Phe27Gln29hPYY(4-36)、Phe27Ile30hPYY(4-36)、Phe27Val30hPYY(4-36)、Phe27Ile31hPYY(4-36)、Phe27Leu31hPYY(4-36)、Phe27Thr36hPYY(4-36)、Phe27Phe36hPYY(4-36)、Gln29Ile30hPYY(4-36)、Gln29Val30hPYY(4-36)、Gln29Ile31hPYY(4-36)、Gln29Leu31hPYY(4-36)、Gln29Thr36hPYY(4-36)、Gln29Phe36hPYY(4-36)、Ile30Ile31hPYY(4-36)、Ile30Leu31hPYY(4-36)、Ile30Thr36hPYY(4-36)、Ile30Phe36hPYY(4-36)、Val30Ile31hPYY(4-36)、Val30Leu31hPYY(4-36)、Val30Thr36hPYY(4-36)、Val30Phe36hPYY(4-36)、Ile31Thr36hPYY(4-36)、Leu31Phe36hPYY(4-36)、Leu31Phe36hPYY(4-36)、Leu31Thr36hPYY(4-36)、Leu31Phe36hPYY(4-36)、Thr27hPYY(5-36)、Phe27hPYY(5-36)、Ile28hPYY(5-36)、Val28hPYY(5-36)、Gln29hPYY(5-36)、Ile30hPYY(5-36)、Val30hPYY(5-36)、Ile31hPYY(5-36)、Leu31hPYY(5-36)、Thr36hPYY(5-36)、Phe36hPYY(5-36)、Lys25Thr27hPYY(5-36)、Lys25Phe27hPYY(5-36)、Lys25Ile28hPYY(5-36)、Lys25Val28hPYY(5-36)、Lys25Gln29hPYY(5-36)、Lys25Ile30hPYY(5-36)、Lys25Val30hPYY(5-36)、Lys25Ile31hPYY(5-36)、Lys25Leu31hPYY(5-36)、Lys25Thr36hPYY(5-36)、Lys25Phe36hPYY(5-36)、Thr27Ile28hPYY(5-36)、Thr27Val28hPYY(5-36)、Thr27Gln29hPYY(5-36)、Thr27Ile30hPYY(5-36)、Thr27Val30hPYY(5-36)、Thr27Ile31hPYY(5-36)、Thr27Leu31hPYY(5-36)、Thr27Thr36hPYY(5-36)、Thr27Phe36hPYY(5-36)、Phe27Ile28hPYY(5-36)、Phe27Val28hPYY(5-36)、Phe27Gln29hPYY(5-36)、Phe27Ile30hPYY(5-36)、Phe27Val30hPYY(5-36)、Phe27Ile31hPYY(5-36)、Phe27Leu31hPYY(5-36)、Phe27Thr36hPYY(5-36)、Phe27Phe36hPYY(5-36)、Gln29Ile30hPYY(5-36)、Gln29Val30hPYY(5-36)、Gln29Ile31hPYY(5-36)、Gln29Leu31hPYY(5-36)、Gln29Thr36hPYY(5-36)、Gln29Phe36hPYY(5-36)、Ile30Ile31hPYY(5-36)、Ile30Leu31hPYY(5-36)、Ile30Thr36hPYY(5-36)、Ile30Phe36hPYY(5-36)、Val30Ile31hPYY(5-36)、Val30Leu31hPYY(5-36)、Val30Thr36hPYY(5-36)、Val30Phe36hPYY(5-36)、Ile31Thr36hPYY(5-36)、Leu31Phe36hPYY(5-36)、Leu31Phe36hPYY(5-36)、Leu31Thr36hPYY(5-36)、Leu31Phe36hPYY(5-36)。
【００３５】
さらに別の実施例において、本発明のPPFポリペプチドは、WO 03/026591およびWO 03/057235に開示したそれらPPF関連ポリペプチドを含まない。それら開示の全容は、本明細書中に引用により取り込まれる。
【００３６】
他の実施例において、本発明のポリペプチドは、少なくとも34アミノ酸長である。別の実施例において、そのPPFポリペプチドは、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、あるいは33アミノ酸長でもよい。さらに、１つの実施例において、本発明のポリペプチドは、L-アミノ酸残基および/または修飾されたLアミノ酸残基のみを含む。さらに別の実施例において、本発明のポリペプチドは、非天然アミノ酸残基を含まない。
【００３７】
さらなる別の実施例として、本発明のPPFポリペプチドは、あるネイティブのPYY(3-36)と、そのPYY(3-36)の全長にわたり、少なくとも60%、65%、70%、80%、または90%の配列同等性を持つことができる。本発明のそのようなPPFポリペプチドは、ネイティブのPPと少なくとも50%、60%、65%、70%、80%、あるいは90%の配列同等性を持てる。さらに別の実施例において、本発明のそのようなPPFポリペプチドは、ネイティブのNPYと少なくとも50%、60%、65%、70%、80%、あるいは90%の配列同等性を持つことができる。
【００３８】
より特定すると、ある最初の局面において、本発明は、少なくとも二つのPPFモチーフを含む新規PPFポリペプチドに関連する。その少なくとも二つのPPFモチーフは、少なくともN-末端ポリプロリンPPFモチーフとC-末端テールPPFモチーフを含み、そのPPFポリペプチドは、如何なる非天然アミノ酸も含まない。本発明のそのようなPPFポリペプチドは、ネイティブのPYY(3-36)とそのPYY(3-36)の全長にわたり少なくとも50%配列同等性を持つであろう。ある好ましい実施例において、そのようなPPFポリペプチドは少なくとも34アミノ酸残基を持つ。別の好ましい実施例において、本発明のそのようなPPFポリペプチドは、あるネイティブのPYY(3-36)と、そのPYY(3-36)の全長にわたり、少なくとも60%、65%、70%、80%、または90%の配列同等性を持つことができる。本発明のそのようなPPFポリペプチドは、また、ネイティブのPPと少なくとも50%、60%、65%、70%、80%、あるいは90%の配列同等性を持つことができる。さらに別の実施例において、本発明のそのようなPPFポリペプチドは、ネイティブのNPYと少なくとも50%、60%、65%、70%、80%、あるいは90%の配列同等性を持つことができる。
【００３９】
別の局面において、本発明のPPFポリペプチドは、PYYアナログポリペプチドを含む。本発明のさらに別の局面において、本発明のPPFポリペプチドは、PP、PYYまたはNPYポリペプチドの少なくとも１つの付加断片に共有結合したPP、PYYまたはNPYポリペプチドから構成されるPPFキメラポリペプチドを含む：各PP、PYYまたはNPY断片は、PPFモチーフを含む。本発明のそのようなPPFアナログポリペプチドおよびPPFキメラポリペプチドは、PYY(3-36)の全長にわたりネイティブのPYY(3-36)と少なくとも50％の配列相同性を持つであろう。ある好ましい実施例において、本発明のそのようなPPFポリペプチドは、あるネイティブのPYY(3-36)と、そのPYY(3-36)の全長にわたり、少なくとも60%、65%、70%、80%、または90%の配列同等性を持つことができる。本発明のPPFポリペプチドは、また、ネイティブのPPと少なくとも50%、60%、65%、70%、80%、あるいは90%の配列同等性を持つことができる。さらに別の実施例において、本発明のPPFポリペプチドは、ネイティブのNPYと少なくとも50%、60%、65%、70%、80%、あるいは90%の配列同等性を持つことができる。ある実施例において、望ましいPPFポリペプチドは、N-末端PP断片とC-末端NPY断片の組合せを含まなくてもよい。
【００４０】
背景として、PYY、NPYおよびPPは、胃腸機能、血圧および採食行動などの調節に関与するC-末端がアミド化されたペプチドのファミリーを構成する。理論により限定する意思なしに、これらペプチドがY受容体サブタイプに選択的に結合し活性化する能力は、いわゆる「PP-フォールド」を含む安定な溶液構造に強く依存するものと信じられている。表 1 (以下)は、既知の受容体へのPPファミリーリガンドの効力および種々のリガンドの効力順位を表示している。
【００４１】
【表１−１】
0005638177.tif 000002
【表１−２】
0005638177.tif 000003
【００４２】
Y受容体の結合親和性の違いは、その二次および三次構造の違いによることが示唆されている。例えば、Keireら、Biochemistry 2000, 39, 9935-9942を参照。ネイティブのブタPYYの特徴には、残基23、24および25のよじれにより分かれる残基17-22および25-33の二つのC-末端へリックスセグメント、残基12-14付近に中心があるターン、および残基30および31付近で折りたたまれたN-末端が含まれる。さらに、完全長ブタPYYの特徴として、N-およびC-末端における残基間の疎水性相互作用で安定化されたPPフォールドが含まれることが明らかになっている。
【００４３】
「PP」とは、如何なる種から得られるあるいは由来する膵臓ペプチドポリペプチドを意味する。したがって、用語「PP」には、SEQ ID NO: 1として示すヒト完全長36-アミノ酸ペプチドおよびPPの変異種、例えば、マウス、ハムスター、ニワトリ、ウシ、ラットおよびイヌのPPの両方が含められる。この意味において、「PP」、「野生型PP」および「ネイティブPP」、即ち、非修飾PPは相互交換的に用いられる。
【００４４】
「NPY」とは、如何なる種から得られるあるいは由来するニューロペプチドYポリペプチドを意味する。したがって、用語「NPY」には、SEQ ID NO: 4として示すヒト完全長36-アミノ酸ペプチドおよびNPYの変異種、例えば、マウス、ハムスター、ニワトリ、ウシ、ラットおよびイヌのNPYの両方が含められる。この意味において、「NPY」、「野生型NPY」および「ネイティブNPY」、即ち、非修飾NPYは相互交換的に用いられる。
【００４５】
「PYY」とは、如何なる種から得られるあるいは由来するあるペプチドPYYポリペプチドを意味する。したがって、用語「PYY」には、SEQ ID NO: 2として示すヒト完全長36-アミノ酸ペプチドおよびPYYの変異種、例えば、マウス、ハムスター、ニワトリ、ウシ、ラットおよびイヌのPYYの両方が含められる。この意味において、「PYY」、「野生型PYY」および「ネイティブPYY」、即ち、非修飾PYYは相互交換的に用いられる。本発明の背景において、本発明のPYYアナログポリペプチドに関する引用について述べた全ての修飾は、ネイティブPYYの36-アミノ酸配列に基づく(SEQ ID NO: 2)。
【００４６】
「PPアゴニスト」、「PYYアゴニスト」、あるいは「NPYアゴニスト」は、それぞれ、ネイティブのヒトPP、PYYあるいはNPYの生物学的活性を発揮する化合物を意味する。ある好ましい実施例において、その用語は、栄養素利用率の減少に関して、ネイティブのヒトPP、PYYあるいはNPYと類似した生物学的効果を発揮する化合物を言及し、例えば、(1)食餌摂取アッセイ、胃排出アッセイ、膵臓分泌アッセイ、あるいは体重減少アッセイにおいて、ネイティブのヒトPP、PYYあるいはNPYの生物学的活性と類似した活性を持つ化合物、および(2) 例えば、最後野を含むY受容体が豊富な組織に由来する標識PP、PYY、PYY(3-36)あるいは NPYを用いたY受容体アッセイあるいは競合結合アッセイにおいて特異的に結合する化合物などが含まれる。ある好ましい実施例において、そのアゴニストは、PP、PYY、PYY(3-36)、および/またはNPYではない。好ましくは、そのアゴニストは、そのようなアッセイにおいて1 μMよりも高い親和性、より好ましくは、1-5 nMよりも高い親和性で結合するであろう。そのようなアゴニストは、PPFモチーフ、PP、PYYあるいはNPYの活性断片、あるいは小化学分子を持つポリペプチドを含んでもよい。
【００４７】
「アミノ酸」および「アミノ酸残基」とは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸および修飾アミノ酸を意味する。反例を示さない限り、一般的あるいは特異的な名称によるアミノ酸に対する如何なる参照には、もしそれらの構造が許すなら、Dおよび Lの立体異性体の両方に対する参照が含められる。天然アミノ酸は、アラニン (Ala)、アルギニン (Arg)、アスパラギン (Asn)、アスパラギン酸 (Asp)、システイン (Cys)、グルタミン (Gln)、グルタミン酸 (Glu)、グリシン (Gly)、ヒスチジン (His)、イソロイシン(Ile)、ロイシン(Leu)、リジン (Lys)、メチオニン (Met)、フェニルアラニン(Phe)、プロリン (Pro)、セリン (Ser)、トレオニン(Thr)、トリプトファン (Trp)、チロシン (Tyr)およびバリン(Val)を含む。非天然アミノ酸は、限定はしないが、ホモリジン、ホモアルギニン、アゼチジンカルボン酸、2-アミノアジピン酸、3-アミノアジピン酸、ベータアラニン、アミノプロピオン酸、2-アミノ酪酸、4-アミノ酪酸、6-アミノカプロン酸、2-アミノヘプタン酸、2-アミノイソ酪酸、3-アミノイソ酪酸、2-アミノピメリン酸、tert-ブチルグリシン、2,4-ジアミノ酪酸、デスモシン、2,2'-ジアミノピメリン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸、N-エチルグリシン、N-エチルアスパラギン、ホモプロリン、ヒドロキシルリジン、アロ-ヒドロキシルリジン、3-ヒドロキシルプロリン、4-ヒドロキシルプロリン、イソデスモシン、アロ-イソロイシン、N-メチルアラニン、N-メチルグリシン、N-メチルイソロイシン、N-メチルペンチルグリシン、N-メチルバリン、ナフチルアラニン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、ペンチルグリシン、ピペコリン酸、チオプロリン、サルコシンおよびシトルリンを含む。さらに、非天然アミノ酸は、それらのN-末端アミノ基あるいは側鎖官能基が化学的にブロックされたり、可逆的または非可逆的あるいは化学的に修飾された修飾アミノ酸残基を含む；例えば、N-メチル化DおよびLアミノ酸あるいはアミノ酸残基で、その側鎖機能官能基は、他の機能官能基に化学的に修飾されている。例えば、修飾アミノ酸には、メチオニンスルフォキシド； メチオニンスルフォン； アスパラギン酸- (ベータ-メチルエステル)、アスパラギン酸の修飾アミノ酸； N-エチルグリシン、グリシンの修飾アミノ酸； あるいはアラニンカルボキサミド、アラニンの修飾アミノ酸が含まれる。他に含められる残基は、Sandbergら、J. Med. Chem. 41: 2481-91, 1998に記載されている。
【００４８】
「Ahx」は、6-アミノカプロン酸を意味する。
【００４９】
PPFに関するヒトの正確なペプチド配列を以下に示す(一文字のアミノ酸コードによる)：
PP：(SEQ ID NO： 1)
APLEPVYPGD NATPEQMAQY AADLRRYINM LTRPRY 
PYY：(SEQ ID NO： 2)
YPIKPEAPGE DASPEELNRY YASLRHYLNL VTRQRY  
PYY(3-36)：(SEQ ID NO： 3)
IKPEAPGE DASPEELNRY YASLRHYLNL VTRQRY  
NPY：(SEQ ID NO： 4)
YPSKPDNPGE DAPAEDMARY YSALRHYINL ITRQRY  
【００５０】
ヒトPYYの種ホモログには、SEQ ID NO: 7-29のアミノ酸配列が含まれる。
前記のように、これらのペプチドは、生理学的に発現された場合にはC-末端がアミド化されているが、本発明の目的にはされる必要はない。換言すると、本発明のPPFポリペプチドのみならずこれらペプチドのC-末端は、遊離のOHあるいはNH2基でもよい。これらのペプチドは、別の翻訳後修飾を受けてもよい。当業者には、本発明のPPFポリペプチドがN-末端のメチオニン残基を以って作られてもよいことも理解するであろう。
【００５１】
本発明の好ましいPPFポリペプチドには、ネイティブPPFポリペプチド、NPY(2-36)、NPY(4-36)、PYY(2-36)、PYY(4-36)、PP(2-36)、PP(4-36)、Ala1NPY、Ala3NPY、Ala4NPY、Ala6NPY、Ala7NPY、Tyr7pNPY、Ala9NPY、Ala10NPY、Ala11NPY、Ala13NPY、Gly14NPY、Ala15NPY、Ala16NPY、Ala17NPY、Ala19NPY、Lys19NPY、Ala21NPY、Ala22NPY、Lys25NPY、Ala26NPY、Phe27NPY、Ala28NPY、Gln29NPY、Ala30NPY、Ala31NPY、Phe36NPY、His36NPY、Leu3hPYY(3-36)、Val3hPYY(3-36)、Lys25hPYY(3-36)、Pro13Ala14hPYY、hPP(1-7)-pNPY、hPP(1-17)-pNPY、Tyr1NPY、Ala7NPYあるいはhPP(19-23)-pNPYを含まない条件付で以下の式(I) (SEQ ID NO: 30)のPPFポリペプチドを含む：
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Pro Xaa6 Xaa7 Pro Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Tyr Xaa21 Xaa22 Xaa23 Leu Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28 Xaa29 Xaa30 Xaa31 Thr Arg Gln Arg Xaa36
［式中、
Xaa1はTyr、Ala、Phe、Trp、あるいは無し；
Xaa2はPro、Gly、d-Ala、ホモ-Pro、ヒドロキシ-Pro、あるいは無し；
Xaa3はIle、Ala、ノル-Val、Val、Leu、Pro、Ser、Thrあるいは無し；
Xaa4はLys、Ala、Gly、Arg、d-Ala、ホモ-Lys、ホモ-Arg、Glu、Asp、あるいは無し；
Xaa6はGlu、Ala、Val、Asp、Asn、あるいはGln；
Xaa7はAla、Asn、His、Ser、あるいはTyr；
Xaa9はGly、Ala Ser、サルコシン、Pro、あるいはAib；
Xaa10はGlu、Ala、Asp、Asn、Gln、Pro、Aib、あるいはGly；
Xaa11はAsp、Ala、Glu、Asn、Gln、Pro、Aib、あるいはGly；
Xaa12はAlaあるいはd-Ala；
Xaa13はSer、Ala、Thr、Pro、あるいはホモ-Ser；
Xaa14はPro、Ala、ホモ-Pro、ヒドロキシ-Pro、Aib、あるいはGly；
Xaa15はGlu、Ala、Asp、Asn、Gln、Pro、Aib、あるいはGly；
Xaa16はGlu、Ala、Asp、Asn、あるいはGln；
Xaa17はLeu、Ala、Met、Trp、Ile、Val、あるいはノル-Val；
Xaa18はAsn、Asp、Ala、Glu、Gln、Ser、あるいはThr；
Xaa19はArg、Tyr、Lys、Ala、Gln、あるいはN(メチル)Ala；
Xaa21はTyr、Ala、Met、Phe、あるいはLeu；
Xaa22はAla、Ser、Thr、あるいはd-Ala；
Xaa23はSer、Ala、Asp、Thr、あるいはホモ-Ser；
Xaa25はArg、ホモ-Arg、Lys、ホモ-Lys、Orn、あるいはCit；
Xaa26はHis、Ala、Arg、ホモ-Arg、ホモ-Lys、Orn、あるいはCit；
Xaa27はTyrあるいはPhe；
Xaa28はLeu、Ile、Val、あるいはAla；
Xaa29はAsnあるいはGln；
Xaa30はLeu、Ala、ノル-Val、Val、Ile、あるいはMet； 
Xaa31はAla、Val、Ile、あるいはLeu； および
Xaa36はTyr、N(メチル)Tyr、His、Trp、あるいはPhe；である］
【００５２】
他の実施例において、式IのPPFポリペプチドは、以下をも含まない：Phe27hPYY(3-36)、Ile28hPYY(3-36)、Val28hPYY(3-36)、Gln29hPYY(3-36)、Val30hPYY(3-36)、Ile31hPYY(3-36)、Leu31hPYY(3-36)、Phe36hPYY(3-36)、Lys25Phe27hPYY(3-36)、Lys25Ile28hPYY(3-36)、Lys25Val28hPYY(3-36)、Lys25Gln29hPYY(3-36)、Lys25Val30hPYY(3-36)、Lys25Ile31hPYY(3-36)、Lys25Leu31hPYY(3-36)、Lys25Phe36hPYY(3-36)、Phe27Ile28hPYY(3-36)、Phe27Val28hPYY(3-36)、Phe27Gln29hPYY(3-36)、Phe27Val30hPYY(3-36)、Phe27Ile31hPYY(3-36)、Phe27Leu31hPYY(3-36)、Phe27Phe36hPYY(3-36)、Gln29Val30hPYY(3-36)、Gln29Ile31hPYY(3-36)、Gln29Leu31hPYY(3-36)、Gln29Phe36hPYY(3-36)、Val30Ile31hPYY(3-36)、Val30Leu31hPYY(3-36)、 Val30Phe36hPYY(3-36)、あるいはLeu31Phe36hPYY(3-36)。
【００５３】
当業者に認識されるであろうように、式Iのポリペプチドは、遊離酸型あるいはC-末端がアミド化されていてもよい。
【００５４】
本発明のPYYアナログポリペプチド
概して、本発明のPYYアナログポリペプチドは、少なくともN-末端ポリプロリンPPFモチーフおよびC-末端テールPPFモチーフを持った少なくとも二つのPPFモチーフを含むであろうし、また、一般的に、ネイティブのヒトPYYの生物学的活性を少なくとも部分的に保持するであろう；例えば、本発明のPYYアナログポリペプチドは、一般的に、PYYアゴニストであろう。さらに、PYYアナログポリペプチドは、PYY(3-36)と少なくとも50％の配列相同性を持つであろう。ある好ましい実施例において、本発明のPYYアナログポリペプチドは、代謝状態あるいは疾患の治療および予防においてPYY活性を示すであろう。
【００５５】
ある実施例において、本発明のPYYアナログポリペプチドは、如何なる非天然アミノ酸も含まず、さらに、如何なるPYYポリペプチドあるいはそれらのN-末端1-４の欠失(例えば、PYY(1-36)、PYY(2-36)、PYY(3-36))、PYY(4-36))を含まない条件を持つ。本発明のPYYアナログポリペプチドは、好ましくは、以下をも含まない：Pro34PYY、His34PYY Lys25hPYY(5-36)、Arg4hPYY(4-36)、Gln4hPYY(4-36)、Asn4hPYY(4-36)、Lys25hPYY(4-36)、Leu3hPYY(3-36)、Val3hPYY(3-36)、Lys25hPYY(3-36)、Tyr1,36pPYY、Pro13Ala14hPYY、Leu31Pro34PYY、FMS-PYY、FMS-PYY(3-36)、Fmoc-PYY、Fmoc-PYY(3-36)、FMS2-PYY、FMS2-PYY(3-36)、Fmoc2-PYY、あるいはFmoc2-PYY(3-36)。
【００５６】
別の実施例において、本発明のそのようなPYYアナログポリペプチドは、以下をも含まない：Thr27hPYY(3-36)、Ile30hPYY(3-36)、Ser32hPYY(3-36)、Lys33hPYY(3-36)、Asn34hPYY(3-36)、Lys35hPYY(3-36)、Thr36hPYY(3-36)、Lys25Thr27hPYY(3-36)、Lys25Ile30hPYY(3-36)、Lys25Ser32hPYY(3-36)、Lys25Lys33hPYY(3-36)、Lys25Asn24hPYY(3-36)、Lys25Lys35hPYY(3-36)、Lys25Thr36hPYY(3-36)、Thr27Ile28hPYY(3-36)、Thr27Val28hPYY(3-36)、Thr27Gln29hPYY(3-36)、Thr27Ile30hPYY(3-36)、Thr27Val30hPYY(3-36)、Thr27Ile31hPYY(3-36)、Thr27Leu31hPYY(3-36)、Thr27Ser32hPYY(3-36)、Thr27Lys33hPYY(3-36)、Thr27Asn34hPYY(3-36)、Thr27Lys35hPYY(3-36)、Thr27Thr36hPYY(3-36)、Thr27Phe36hPYY(3-36)、Phe27Ile30hPYY(3-36)、Phe27Ser32hPYY(3-36)、Phe27Lys33hPYY(3-36)、Phe27Asn34hPYY(3-36)、Phe27Lys35hPYY(3-36)、Phe27Thr36hPYY(3-36)、Gln29Ile30hPYY(3-36)、Gln29Ser32hPYY(3-36)、Gln29Leu33hPYY(3-36)、Gln29Asn34hPYY(3-36)、Gln29Leu35hPYY(3-36)、Gln29Thr36hPYY(3-36)、Ile30Ile31hPYY(3-36)、Ile30Leu31hPYY(3-36)、Ile30Ser32hPYY(3-36)、Ile30Lys33hPYY(3-36)、Ile30Asn34hPYY(3-36)、Ile30Lys35hPYY(3-36)、Ile30Thr36hPYY(3-36)、Ile30Phe36hPYY(3-36)、Val30Ser32hPYY(3-36)、Val30Lys33hPYY(3-36)、Val30Asn34hPYY(3-36)、Val30Lys35hPYY(3-36)、Val30Thr36hPYY(3-36)、Ile31Ser32hPYY(3-36)、Ile31Lys33hPYY(3-36)、Ile31Asn34hPYY(3-36)、Ile31Lys35hPYY(3-36)、Ile31Thr36hPYY(3-36)、Ile31Phe36hPYY(3-36)、Leu31Ser32hPYY(3-36)、Leu31Lys33hPYY(3-36)、Leu31Asn34hPYY(3-36)、Leu31Lys35hPYY(3-36)、Leu31Thr36hPYY(3-36)、Ser32Lys33hPYY(3-36)、Ser32Asn34hPYY(3-36)、Ser32Lys35hPYY(3-36)、Ser32Thr36hPYY(3-36)、Ser32Phe36hPYY(3-36)、Lys33Asn34hPYY(3-36)、Lys33Lys35hPYY(3-36)、Lys33Thr36hPYY(3-36)、Lys33Phe36hPYY(3-36)、Asn34Lys35hPYY(3-36)、Asn34Phe36hPYY(3-36)、Lys35Thr36hPYY(3-36)、Lys35Phe36hPYY(3-36)、Thr27hPYY(4-36)、Phe27hPYY(4-36)、
Ile28hPYY(4-36)、Val28hPYY(4-36)、Gln29hPYY(4-36)、Ile30hPYY(4-36)、Val30hPYY(4-36)、Ile31hPYY(4-36)、Leu31hPYY(4-36)、Ser32hPYY(4-36)、Lys33hPYY(4-36)、Asn34hPYY(4-36)、Lys35hPYY(4-36)、Thr36hPYY(4-36)、Phe36hPYY(4-36)、Lys25Thr27hPYY(4-36)、Lys25Phe27hPYY(4-36)、Lys25Ile28hPYY(4-36)、Lys25Val28hPYY(4-36)、Lys25Gln29hPYY(4-36)、Lys25Ile30hPYY(4-36)、Lys25Val30hPYY(4-36)、Lys25Ile31hPYY(4-36)、Lys25Leu31hPYY(4-36)、Lys25Ser32hPYY(4-36)、Lys25Lys33hPYY(4-36)、Lys25Asn24hPYY(4-36)、Lys25Lys35hPYY(4-36)、Lys25Thr36hPYY(4-36)、Lys25Phe36hPYY(4-36)、Thr27Ile28hPYY(4-36)、Thr27Val28hPYY(4-36)、Thr27Gln29hPYY(4-36)、Thr27Ile30hPYY(4-36)、Thr27Val30hPYY(4-36)、Thr27Ile31hPYY(4-36)、Thr27Leu31hPYY(4-36)、Thr27Ser32hPYY(4-36)、Thr27Lys33hPYY(4-36)、Thr27Asn34hPYY(4-36)、Thr27Lys35hPYY(4-36)、Thr27Thr36hPYY(4-36)、Thr27Phe36hPYY(4-36)、Phe27Ile28hPYY(4-36)、Phe27Val28hPYY(4-36)、Phe27Gln29hPYY(4-36)、Phe27Ile30hPYY(4-36)、Phe27Val30hPYY(4-36)、Phe27Ile31hPYY(4-36)、Phe27Leu31hPYY(4-36)、Phe27Ser32hPYY(4-36)、Phe27Lys33hPYY(4-36)、Phe27Asn34hPYY(4-36)、Phe27Lys35hPYY(4-36)、Phe27Thr36hPYY(4-36)、Phe27Phe36hPYY(4-36)、Gln29Ile30hPYY(4-36)、Gln29Val30hPYY(4-36)、Gln29Ile31hPYY(4-36)、Gln29Leu31hPYY(4-36)、Gln29Ser32hPYY(4-36)、Gln29Leu33hPYY(4-36)、Gln29Asn34hPYY(4-36)、Gln29Leu35hPYY(4-36)、Gln29Thr36hPYY(4-36)、Gln29Phe36hPYY(4-36)、Ile30Ile31hPYY(4-36)、Ile30Leu31hPYY(4-36)、Ile30Ser32hPYY(4-36)、Ile30Lys33hPYY(4-36)、Ile30Asn34hPYY(4-36)、Ile30Lys35hPYY(4-36)、Ile30Thr36hPYY(4-36)、Ile30Phe36hPYY(4-36)、Val30Ile31hPYY(4-36)、Val30Leu31hPYY(4-36)、Val30Ser32hPYY(4-36)、Val30Lys33hPYY(4-36)、Val30Asn34hPYY(4-36)、Val30Lys35hPYY(4-36)、Val30Thr36hPYY(4-36)、Val30Phe36hPYY(4-36)、Ile31Ser32hPYY(4-36)、Ile31Lys33hPYY(4-36)、Ile31Asn34hPYY(4-36)、Ile31Lys35hPYY(4-36)、Ile31Thr36hPYY(4-36)、Leu31Phe36hPYY(4-36)、Leu31Phe36hPYY(4-36)、Leu31Ser32hPYY(4-36)、Val31Lys33hPYY(4-36)、Leu31Asn34hPYY(4-36)、Leu31Lys35hPYY(4-36)、Leu31Thr36hPYY(4-36)、Leu31Phe36hPYY(4-36)、Ser32Lys33hPYY(4-36)、Ser32Asn34hPYY(4-36)、Ser32Lys35hPYY(4-36)、Ser32Thr36hPYY(4-36)、Ser32Phe36hPYY(4-36)、Lys33Asn34hPYY(4-36)、Lys33Lys35hPYY(4-36)、Lys33Thr36hPYY(4-36)、Lys33Phe36hPYY(4-36)、Asn34Lys35hPYY(4-36)、Asn34Phe36hPYY(4-36)、Lys35Thr36hPYY(4-36)、Lys35Phe36hPYY(4-36)、Thr27hPYY(5-36)、Phe27hPYY(5-36)、Ile28hPYY(5-36)、Val28hPYY(5-36)、Gln29hPYY(5-36)、Ile30hPYY(5-36)、Val30hPYY(5-36)、Ile31hPYY(5-36)、Leu31hPYY(5-36)、Ser32hPYY(5-36)、Lys33hPYY(5-36)、Asn34hPYY(5-36)、Lys35hPYY(5-36)、Thr36hPYY(5-36)、Phe36hPYY(5-36)、Lys25Thr27hPYY(5-36)、Lys25Phe27hPYY(5-36)、Lys25Ile28hPYY(5-36)、Lys25Val28hPYY(5-36)、Lys25Gln29hPYY(5-36)、Lys25Ile30hPYY(5-36)、Lys25Val30hPYY(5-36)、Lys25Ile31hPYY(5-36)、Lys25Leu31hPYY(5-36)、Lys25Ser32hPYY(5-36)、Lys25Lys33hPYY(5-36)、Lys25Asn24hPYY(5-36)、Lys25Lys35hPYY(5-36)、Lys25Thr36hPYY(5-36)、Lys25Phe36hPYY(5-36)、Thr27Ile28hPYY(5-36)、Thr27Val28hPYY(5-36)、Thr27Gln29hPYY(5-36)、Thr27Ile30hPYY(5-36)、Thr27Val30hPYY(5-36)、Thr27Ile31hPYY(5-36)、Thr27Leu31hPYY(5-36)、Thr27Ser32hPYY(5-36)、Thr27Lys33hPYY(5-36)、Thr27Asn34hPYY(5-36)、Thr27Lys35hPYY(5-36)、Thr27Thr36hPYY(5-36)、Thr27Phe36hPYY(5-36)、Phe27Ile28hPYY(5-36)、Phe27Val28hPYY(5-36)、Phe27Gln29hPYY(5-36)、Phe27Ile30hPYY(5-36)、Phe27Val30hPYY(5-36)、Phe27Ile31hPYY(5-36)、Phe27Leu31hPYY(5-36)、Phe27Ser32hPYY(5-36)、Phe27Lys33hPYY(5-36)、Phe27Asn34hPYY(5-36)、Phe27Lys35hPYY(5-36)、Phe27Thr36hPYY(5-36)、Phe27Phe36hPYY(5-36)、Gln29Ile30hPYY(5-36)、Gln29Val30hPYY(5-36)、Gln29Ile31hPYY(5-36)、Gln29Leu31hPYY(5-36)、Gln29Ser32,hPYY(5-36)、Gln29Leu33hPYY(5-36)、Gln29Asn34hPYY(5-36)、Gln29Leu35hPYY(5-36)、Gln29Thr36hPYY(5-36)、Gln29Phe36hPYY(5-36)、Ile30Ile31hPYY(5-36)、Ile30Leu31hPYY(5-36)、Ile30Ser32hPYY(5-36)、Ile30Lys33hPYY(5-36)、Ile30Asn34hPYY(5-36)、Ile30Lys35hPYY(5-36)、Ile30Thr36hPYY(5-36)、Ile30Phe36hPYY(5-36)、Val30Ile31hPYY(5-36)、Val30Leu31hPYY(5-36)、Val30Ser32hPYY(5-36)、Val30Lys33hPYY(5-36)、Val30Asn34hPYY(5-36)、Val30Lys35hPYY(5-36)、Val30Thr36hPYY(5-36)、Val30Phe36hPYY(5-36)、Ile31Ser32hPYY(5-36)、Ile31Lys33hPYY(5-36)、Ile31Asn34hPYY(5-36)、Ile31Lys35hPYY(5-36)、Ile31Thr36hPYY(5-36)、Leu31Phe36hPYY(5-36)、Leu31Phe36hPYY(5-36)、Leu31Ser32hPYY(5-36)、Val31Lys33hPYY(5-36)、Leu31Asn34hPYY(5-36)、Leu31Lys35hPYY(5-36)、Leu31Thr36hPYY(5-36)、Leu31Phe36hPYY(5-36)、Ser32Lys33hPYY(5-36)、Ser32Asn34hPYY(5-36)、Ser32Lys35hPYY(5-36)、Ser32Thr36hPYY(5-36)、Ser32Phe36hPYY(5-36)、Lys33Asn34hPYY(5-36)、Lys33Lys35hPYY(5-36)、Lys33Thr36hPYY(5-36)、Lys33Phe36hPYY(5-36)、Asn34Lys35hPYY(5-36)、Asn34Phe36hPYY(5-36)、Lys35Thr36hPYY(5-36)、あるいはLys35Phe36hPYY(5-36)。
【００５７】
別の実施例において、本発明のPYYアナログポリペプチドは、如何なる非天然アミノ酸残基を含まず、好ましくは、hPYYのC-末端テールモチーフを含む。そのC-末端モチーフは、このましくは、hPYYのアミノ酸残基32-35、例えば、Thr、Arg、Gln、Arg (SEQ ID NO: 351)を含む。そのような実施例において、本発明のPYYアナログポリペプチドは、如何なるネイティブPYYポリペプチドあるいはそれらのN-末端1-4残基の欠失(例えば、PYY(1-36)、PYY(2-36)、PYY(3-36)およびPYY(4-36))をも含まない。そのようなPYYアナログは、好ましくは、以下を含まない：Lys25hPYY(5-36)、Arg4hPYY(4-36)、Gln4hPYY(4-36)、Asn4hPYY(4-36)、Lys25hPYY(4-36)、Leu3hPYY(3-36)、Val3hPYY(3-36)、Lys25hPYY(3-36)、Tyr1,36pPYY、Pro13Ala14hPYY、FMS-PYY、FMS-PYY(3-36)、Fmoc-PYY、Fmoc-PYY(3-36)、FMS2-PYY、FMS2-PYY(3-36)、Fmoc2-PYY、あるいはFmoc2-PYY(3-36)。
【００５８】
別の局面において、hPYYのC-末端テールモチーフを含む本発明のそのようなPYYアナログポリペプチドは、また、以下を含まない：Thr27hPYY(3-36)、Ile30hPYY(3-36)、Thr36hPYY(3-36)、Lys25Thr27hPYY(3-36)、Lys25Ile30hPYY(3-36)、Lys25Asn24hPYY(3-36)、Lys25Thr36hPYY(3-36)、Thr27Ile28hPYY(3-36)、Thr27Val28hPYY(3-36)、Thr27Gln29hPYY(3-36)、Thr27Ile30hPYY(3-36)、Thr27Val30hPYY(3-36)、Thr27Ile31hPYY(3-36)、Thr27Leu31hPYY(3-36)、Thr27Thr36hPYY(3-36)、Thr27Phe36hPYY(3-36)、Phe27Ile30hPYY(3-36)、Phe27Thr36hPYY(3-36)、Gln29Ile30hPYY(3-36)、Gln29Thr36hPYY(3-36)、Ile30Ile31hPYY(3-36)、Ile30Leu31hPYY(3-36)、Ile30Thr36hPYY(3-36)、Ile30Phe36hPYY(3-36)、Val30Thr36hPYY(3-36)、Ile31Thr36hPYY(3-36)、Ile31Phe36hPYY(3-36)、Leu31Thr36hPYY(3-36)、Thr27hPYY(4-36)、Phe27hPYY(4-36)、Ile28hPYY(4-36)、Val28hPYY(4-36)、Gln29hPYY(4-36)、Ile30hPYY(4-36)、Val30hPYY(4-36)、Ile31hPYY(4-36)、Leu31hPYY(4-36)、Thr36hPYY(4-36)、Phe36hPYY(4-36)、Lys25Thr27hPYY(4-36)、Lys25Phe27hPYY(4-36)、Lys25Ile28hPYY(4-36)、Lys25Val28hPYY(4-36)、Lys25Gln29hPYY(4-36)、Lys25Ile30hPYY(4-36)、Lys25Val30hPYY(4-36)、Lys25Ile31hPYY(4-36)、Lys25Leu31hPYY(4-36)、Lys25Thr36hPYY(4-36)、Lys25Phe36hPYY(4-36)、Thr27Ile28hPYY(4-36)、Thr27Val28hPYY(4-36)、Thr27Gln29hPYY(4-36)、Thr27Ile30hPYY(4-36)、Thr27Val30hPYY(4-36)、Thr27Ile31hPYY(4-36)、Thr27Leu31hPYY(4-36)、Thr27Thr36hPYY(4-36)、Thr27Phe36hPYY(4-36)、Phe27Ile28hPYY(4-36)、Phe27Val28hPYY(4-36)、Phe27Gln29hPYY(4-36)、Phe27Ile30hPYY(4-36)、Phe27Val30hPYY(4-36)、Phe27Ile31hPYY(4-36)、Phe27Leu31hPYY(4-36)、Phe27Thr36hPYY(4-36)、Phe27Phe36hPYY(4-36)、Gln29Ile30hPYY(4-36)、Gln29Val30hPYY(4-36)、Gln29Ile31hPYY(4-36)、Gln29Leu31hPYY(4-36)、Gln29Thr36hPYY(4-36)、Gln29Phe36hPYY(4-36)、Ile30Ile31hPYY(4-36)、Ile30Leu31hPYY(4-36)、Ile30Thr36hPYY(4-36)、Ile30Phe36hPYY(4-36)、Val30Ile31hPYY(4-36)、Val30Leu31hPYY(4-36)、Val30Thr36hPYY(4-36)、Val30Phe36hPYY(4-36)、Ile31Thr36hPYY(4-36)、Leu31Phe36hPYY(4-36)、Leu31Phe36hPYY(4-36)、Leu31Thr36hPYY(4-36)、Leu31Phe36hPYY(4-36)、Thr27hPYY(5-36)、Phe27hPYY(5-36)、Ile28hPYY(5-36)、Val28hPYY(5-36)、Gln29hPYY(5-36)、Ile30hPYY(5-36)、Val30hPYY(5-36)、Ile31hPYY(5-36)、Leu31hPYY(5-36)、Thr36hPYY(5-36)、Phe36hPYY(5-36)、Lys25Thr27hPYY(5-36)、Lys25Phe27hPYY(5-36)、Lys25Ile28hPYY(5-36)、Lys25Val28hPYY(5-36)、Lys25Gln29hPYY(5-36)、Lys25Ile30hPYY(5-36)、Lys25Val30hPYY(5-36)、Lys25Ile31hPYY(5-36)、Lys25Leu31hPYY(5-36)、Lys25Thr36hPYY(5-36)、Lys25Phe36hPYY(5-36)、Thr27Ile28hPYY(5-36)、Thr27Val28hPYY(5-36)、Thr27Gln29hPYY(5-36)、Thr27Ile30hPYY(5-36)、Thr27Val30hPYY(5-36)、Thr27Ile31hPYY(5-36)、Thr27Leu31hPYY(5-36)、Thr27Thr36hPYY(5-36)、Thr27Phe36hPYY(5-36)、Phe27Ile28hPYY(5-36)、Phe27Val28hPYY(5-36)、Phe27Gln29hPYY(5-36)、Phe27Ile30hPYY(5-36)、Phe27Val30hPYY(5-36)、Phe27Ile31hPYY(5-36)、Phe27Leu31hPYY(5-36)、Phe27Thr36hPYY(5-36)、Phe27Phe36hPYY(5-36)、Gln29Ile30hPYY(5-36)、Gln29Val30hPYY(5-36)、Gln29Ile31hPYY(5-36)、Gln29Leu31hPYY(5-36)、Gln29Thr36hPYY(5-36)、Gln29Phe36hPYY(5-36)、Ile30Ile31hPYY(5-36)、Ile30Leu31hPYY(5-36)、Ile30Thr36hPYY(5-36)、Ile30Phe36hPYY(5-36)、Val30Ile31hPYY(5-36)、Val30Leu31hPYY(5-36)、Val30Thr36hPYY(5-36)、Val30Phe36hPYY(5-36)、Ile31Thr36hPYY(5-36)、Leu31Phe36hPYY(5-36)、Leu31Phe36hPYY(5-36)、Leu31Thr36hPYY(5-36)、あるいはLeu31Phe36hPYY(5-36)。
【００５９】
また、本発明のPYYアナログポリペプチドは、好ましくは、少なくとも34アミノ酸長である。さらに、ある好ましい実施例において、本発明のPYYアナログポリペプチドは、天然L-アミノ酸残基および/または修飾天然L-アミノ酸残基のみから成る。別のある好ましい実施例において、本発明のPYYアナログポリペプチドは、非天然アミノ酸残基を含まない。
【００６０】
さらに特定すると、ある局面において、本発明は、１つあるいはそれ以上のアミノ酸配列修飾を含むPYYアナログポリペプチドに関連する。そのような修飾には、置換、挿入および/または欠失の単独あるいは組合せが含まれる。ある好ましい局面において、本発明のPYYアナログポリペプチドは、「非必須」アミノ酸残基に１つあるいはそれ以上の修飾を含む。本発明の立場において、「非必須」アミノ酸残基とは、PYYアナログポリペプチドのPYYアゴニスト活性を失活させたり、実質的に低下させることなく、変化、即ち、欠失あるいは置換することのできる、ネイティブのヒトPYYアミノ酸配列中の残基である。好ましくは、本発明のPYYアナログポリペプチドは、ネイティブのヒトPYYの栄養素利用率の低減に関する生物学的活性の少なくとも25％、好ましくは、約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、あるいは99%の活性を保持する。別の実施例において、本発明のPYYアナログポリペプチドは、改良されたPYYアゴニスト活性を示す。好ましくは、本発明のPYYアナログポリペプチドは、ネイティブのヒトPYYの栄養素利用率の低減に関する生物学的活性の少なくとも110%、125%、130%、140%、150%、200%、あるいはそれ以上の活性を示す。
【００６１】
好ましいPYYアナログポリペプチドは、本明細書中に記載したアッセイのうちの１つ (好ましくは、食餌摂取、胃排出、膵臓分泌、あるいは体重減少アッセイ) において効力を持つものであり、その効力は、同じアッセイにおいて、NPY、PYYあるいはPYY(3-36)と同等あるいはさらに強い効力を持つ。それとは別に、本発明の好ましいPYYアナログポリペプチドは、PP、NPY、PYYあるいはPYY(3-36)と比較して、改善された製造の容易さ、安定性、および/またはフォーミュレーションの簡便さを示すかもしれない。
【００６２】
置換
ある実施例において、本発明のPYYアナログポリペプチドは、ネイティブのヒトPYY(SEQ ID NO: 2)中に、１つあるいはそれ以上の置換を単独あるいは１つまたはそれ以上の挿入あるいは欠失との組合せで持てる。好ましくは、その置換は、PYYアナログポリペプチドのPYYアゴニスト活性を失わせたり、実質的に減弱させることがない。１つの局面として、本発明は、ネイティブのヒトPYY(SEQ ID NO: 2)のアミノ酸配列中に一置換あるいは１つ以上のアミノ酸残基に連続的あるいは非連続的な置換を持つPYYアナログポリペプチドと関連している。好ましくは、本発明のPYYアナログポリペプチドは、１つ、二つあるいは三つのアミノ酸置換を含む。
【００６３】
好ましくは、ネイティブのヒトPYY(SEQ ID NO: 2)のC-末端へリックス領域のアミノ酸残基(例えば、残基20、24、25、27および29)、テールエンド残基(3236)、および/またはN-末端の残基5および８のプロリンは置換されない。ある好ましい実施例において、ネイティブのヒトPYY (SEQ ID NO: 2)の部位32-36アミノ酸残基は置換されない。別の実施例において、ネイティブのヒトPYY (SEQ ID NO: 2)のアミノ酸残基は、以下から選択される１つあるいはそれ以上のアミノ酸配列部位で置換されない：部位5、7、8、20、24、25、27、29、32、33、34、35、36、およびそれらの如何なる組合せ。
【００６４】
好ましい置換には、保存的なアミノ酸置換が含まれる。「保存的アミノ酸置換」とは、置換されるアミノ酸が類似する側鎖あるいは物理的特徴(例えば、静電性、水素結合性、立体異性、疎水性)を持つアミノ酸と置換されることを意味する。類似する側鎖を持つアミノ酸のファミリーは、既によく知られている。これらのファミリーには、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、メチオニン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン)、β-分枝側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を持つアミノ酸が含まれる。
【００６５】
別の実施例において、本発明のPYYアナログポリペプチドは、１つあるいはそれ以上の非天然アミノ酸および/または非アミノ酸、例えば、アミノ酸擬似体の置換をPYY (SEQ ID NO: 2)の配列中に含んでもよい。ある好ましい実施例において、PYY (SEQ ID NO: 2)配列中に挿入されるアミノ酸擬似体は、NH-X-CO-、X = (CH2)n (nは、2-20の範囲でよい)あるいはNH-CH2CH2 (-O-CH2CH2-O-)m-CH2-CO- (m = 1-5)のようなβ-擬似体あるいはリンカー分子でもよい。好ましいリンカー分子には、アミノカプロイル (「Aca」)、β-アラニル、および8-アミノ-3,6-ジオキサオクタノイルが含まれる。β-ターン擬似体は、商業的に入手が可能であり(BioQuadrant Inc、ケベック、カナダ)、文献に記載されている(Hanessianら、Tetrahedron 12789-854 (1997)； Guら、Tetrahedron Letters 44: 5863-6 (2003)； Bourguetら、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 13: 1561-4 (2003)； Griecoら、Tetrahedron Letters 43: 6297-9 (2002)； Souersら、Tetrahedron 57: 7431-48 (2001)； Tsaiら、Bioorganic & Medicinal Chemistry 7: 29-38 (1999)； Virgilioら、Tetrahedron 53: 6635-44 (1997))。好ましいβ-ターン擬似体には、以下に示す擬似体Ａおよび擬似体Ｂが含まれる。
【００６６】
【化１】
0005638177.tif 000004
【００６７】
アミノ酸配列β-ターン擬似体置換を含む好ましいPYYアナログポリペプチドは、ネイティブのヒトPYY (SEQ ID NO: 2)を含み、その中の部位ｘおよびｘ+1アミノ酸がβ-ターン擬似体に置換される：そのｘは、ネイティブのヒトPYYのアミノ酸部位8-14のアミノ酸の中から選ばれる。別法として、既知のジペプチドターン・インデューサ、例えば、Ala-AibおよびAla-Proジペプチドを置換してもよい。
【００６８】
アミノ酸配列置換を含む好ましいPYYアナログポリペプチドは、ネイティブのPPFポリペプチド、PYY(2-36)、PP(2-36)、Ala13NPY、Leu3hPYY(3-36)、Val3hPYY(3-36)、hPP(1-7)-pNPYあるいはhPP(1-17)-pNPYではない条件を持ち、以下に示す式(II) (SEQ ID NO: 88)のPYYアナログポリペプチドを含む：
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Pro Xaa6 Xaa7 Pro Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Tyr Xaa21 Xaa22 Xaa23 Leu Arg Xaa26 Tyr Xaa28 Asn Xaa30 Xaa31 Thr Arg Gln Arg Xaa36。
その中の
Xaa1はTyr、Ala、Phe、Trpあるいは無し； 
Xaa2はPro、Gly、d-Ala、ホモ-Pro、ヒドロキシ-Proあるいは無し；
Xaa3はIle、Ala、NorVal、Val、Leu、Pro、SerあるいはThr；
Xaa4はLys、Ala、Gly、Arg、d-Ala、ホモ-Lys、ホモ-Arg、GluあるいはAsp；
Xaa6はGlu、Ala、Val、Asp、AsnあるいはGln；
Xaa7はAla、Asn、His、SerあるいはTyr；
Xaa9はGly、Ala、Ser、サルコシン、ProあるいはAib；
Xaa10はGlu、Ala、Asp、Asn、Gln、Pro、AibあるいはGly；
Xaa11はAsp、Ala、Glu、Asn、Gln、Pro、AibあるいはGly；
Xaa12はAlaあるいはd-Ala；
Xaa13はSer、Ala、Thr、あるいはホモ-Ser； 
Xaa14はPro、Ala、ホモ-Pro、ヒドロキシ-Pro、AibあるいはGly；
Xaa15はGlu、Ala、Asp、Asn、Gln、Pro、AibあるいはGly；
Xaa16はGlu、Ala、Asp、AsnあるいはGln；
Xaa17はLeu、Ala、Met、Trp、Ile、Valあるいはノル-Val；
Xaa18はAsn、Asp、Ala、Glu、Gln、SerあるいはThr；
Xaa19はArg、Tyr、Lys、Ala、GlnあるいはN(Me)Ala；
Xaa21はTyr、Ala、Met、PheあるいはLeu；
Xaa22はAla、Ser、Thrあるいはd-Ala；
Xaa23はSer、Ala、Thrあるいはホモ-Ser；
Xaa26はHisあるいはAla；
Xaa28はLeu、Ile、ValあるいはAla；
Xaa30はLeu、Ala、NorVal、Val、IleあるいはMet； 
Xaa31はAla、Val、Ile,あるいはLeu；および
Xaa36はTyr、N(Me)Tyr、His、TrpあるいはPheである。
【００６９】
別の実施例において、式IIのPYYアナログポリペプチドは以下を含まない：Ile28hPYY(3-36)、Val28hPYY(3-36)、Val30hPYY(3-36)、Ile31hPYY(3-36)、Leu31hPYY(3-36)、Phe36hPYY(3-36)、Val30Ile31hPYY(3-36)、Val30Leu31hPYY(3-36)、Val30Phe36hPYY(3-36)あるいはLeu31Phe36hPYY(3-36)。
【００７０】
当業者には認識されるであろうように、式IIのポリペプチドは、遊離酸型でもC-末端がアミド化されていてもよい。
【００７１】
アミノ酸配列置換を含む他の好ましいPYYアナログポリペプチドは、ネイティブのPPFポリペプチド、NPY(2-36)、PYY(2-36)、PP(2-36)、Ala3NPY、Ala4NPY、Ala6NPY、Ala7NPY、Tyr7pNPY、Ala9NPY、Ala10NPY、Ala11NPY、Ala13NPY、Gly14NPY、Ala15NPY、Ala16NPY、Ala17NPY、Ala19NPY、Lys19NPY、Ala21NPY、Ala22NPY、Lys25NPY、Ala26NPY、Phe27NPY、Ala28NPY、Gln29NPY、Ala30NPY、Ala31NPY、Phe36NPY、His36NPY、Leu3hPYY(3-36)、Val3hPYY(3-36)、Lys25hPYY(3-36)、Pro13Ala14hPYY、Tyr1NPY、Ala7NPY、あるいはhPP(19-23)-pNPYでない条件を持ち、以下に示す式(III) (SEQ ID NO: 348)のPYYアナログポリペプチドを含む：
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Pro Xaa6 Xaa7 Pro Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Tyr Xaa21 Xaa22 Xaa23 Leu Arg Xaa26 Tyr Xaa28 Asn Xaa30
Xaa31 Thr Arg Gln Arg Xaa36
［式中、
Xaa1はTyr、Phe、Trp、あるいは無し； 
Xaa2はPro、Gly、d-Ala、ホモ-Pro、ヒドロキシ-Pro、あるいは無し；
Xaa3はIle、Ala、ノル-Val、Val、Leu、Pro、Ser、あるいはThr；
Xaa4はLys、Ala、Gly、Arg、d-Ala、ホモ-Lys、ホモ-Arg、GluあるいはAsp；
Xaa6はGlu、Ala、Val、Asp、Asn、あるいはGln；
Xaa7はAla、Asn、His、Ser、あるいはTyr；
Xaa9はGly、Ala Ser、サルコシン、Pro、あるいはAib；
Xaa10はGlu、Ala、Asp、Asn、Gln、Pro、AibあるいはGly；
Xaa11はAsp、Ala、Glu、Asn、Gln、Pro、Aib、あるいはGly；
Xaa12はAlaあるいはd-Ala；
Xaa13はSer、Ala、Thr、Pro、あるいはホモ-Ser； 
Xaa14はPro、Ala、ホモ-Pro、ヒドロキシ-Pro、Aib、あるいはGly；
Xaa15はGlu、Ala、Asp、Asn、Gln、Pro、Aib、あるいはGly；
Xaa16はGlu、Ala、Asp、Asn、あるいはGln；
Xaa17はLeu、Ala、Met、Trp、Ile、Val、あるいはノル-Val；
Xaa18はAsn、Asp、Ala、Glu、Gln、SerあるいはThr；
Xaa19はArg、Tyr、Lys、Ala、Gln、あるいはN(メチル)Ala；
Xaa21はTyr、Ala、Met、Phe、あるいはLeu；
Xaa22はAla、Ser、Thr、あるいはd-Ala；
Xaa23はSer、Ala、Thr、あるいはホモ-Ser；
Xaa26はHisあるいはAla；
Xaa28はLeu、Ile、Val、あるいはAla；
Xaa30はLeu、Ala、ノル-Val、Val、Ile、あるいはMet； 
Xaa31はAla、Val、Ile、あるいはLeu； および
Xaa36はTyr、N(メチル)Tyr、His、Trp、あるいはPheである］
【００７２】
別の実施例において、式IIIのPYYアナログポリペプチドはまた、以下を含まない：Ile28hPYY(3-36)、Val28hPYY(3-36)、Val30hPYY(3-36)、Ile31hPYY(3-36)、Leu31hPYY(3-36)、Phe36hPYY(3-36)、Val30Ile31hPYY(3-36)、Val30Leu31hPYY(3-36)、Val30Phe36hPYY(3-36)、あるいはLeu31Phe36hPYY(3-36)。
【００７３】
当業者には認識されるであろうように、式IIIのポリペプチドは、遊離酸型でもC-末端がアミド化されていてもよい。
【００７４】
アミノ酸配列置換を含んでいる他の好ましいPYYアナログポリペプチドは、ネイティブのPPFポリペプチド、PYY(2-36)、Ala13NPY、Leu3hPYY(3-36)、あるいはVal3hPYY(3-36)でない条件を持ち、以下に示す式(IV) (SEQ ID NO: 349)のPYYアナログポリペプチドを含む：
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Pro Xaa6 Xaa7 Pro Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Tyr Xaa21 Xaa22 Xaa23 Leu Arg Xaa26 Tyr Xaa28 Asn Xaa30
Xaa31 Thr Arg Gln Arg Xaa36
［式中、
Xaa1はTyr、Phe、Trp、あるいは無し； 
Xaa2はPro、Gly、d-Ala、ホモ-Pro、ヒドロキシ-Pro、あるいは無し；
Xaa3はIle、Ala、ノル-Val、Val、Leu、Pro、Ser あるいはThr；
Xaa4はLys、Ala、Gly、Arg、d-Ala、ホモ-Lys、ホモ-Arg、Glu、あるいはAsp；
Xaa6はGlu、Ala、Val、Asp、Asn、あるいはGln；
Xaa7はAla、Asn、His、Ser、あるいはTyr；
Xaa9はGly、Ala Ser、サルコシン、Pro、あるいはAib；
Xaa10はGlu、Ala、Asp、Asn、Gln、Pro、Aib、あるいはGly；
Xaa11はAsp、Ala、Glu、Asn、Gln、Pro、Aib、あるいはGly；
Xaa12はAla あるいはd-Ala；
Xaa13はSer、Ala、Thr、あるいはホモ-Ser； 
Xaa14はPro、Ala、ホモ-Pro、ヒドロキシ-Pro、Aib、あるいはGly；
Xaa15はGlu、Ala、Asp、Asn、Gln、Pro、Aib、あるいはGly；
Xaa16はGlu、Ala、Asp、Asn、あるいはGln；
Xaa17はLeu、Ala、Met、Trp、Ile、Val、あるいはノル-Val；
Xaa18はAsn、Asp、Ala、Glu、Gln、Ser あるいはThr；
Xaa19はArg、Tyr、Lys、Ala、Gln、あるいはN(メチル)Ala；
Xaa21はTyr、Ala、Met、Phe、あるいはLeu；
Xaa22はAla、Ser、Thr、あるいはd-Ala；
Xaa23はSer、Ala、Thr、あるいはホモ-Ser；
Xaa26はHis あるいはAla；
Xaa28はLeu、Ile、Val、あるいはAla；
Xaa30はLeu、Ala、ノル-Val、Val、Ile、あるいはMet； 
Xaa31はAla、Val、Ile、あるいはLeu； および
Xaa36はTyr、N(メチル)Tyr、His、Trp、あるいはPheである］
【００７５】
別の実施例において、式IVのPYYアナログポリペプチドは以下を含まない：Ile28hPYY(3-36)、Val28hPYY(3-36)、Val30hPYY(3-36)、Ile31hPYY(3-36)、Leu31hPYY(3-36)、Phe36hPYY(3-36)、Val30Ile31hPYY(3-36)、Val30Leu31hPYY(3-36)、Val30Phe36hPYY(3-36)、あるいはLeu31Phe36hPYY(3-36)。
【００７６】
当業者には認識されるであろうように、式IVのポリペプチドは、遊離酸型でもC-末端がアミド化されていてもよい。
【００７７】
アミノ酸配列リンカー置換を含んでいるPYYアナログポリペプチドは、以下を含む：PYY(1-4)アミノカプロイル(14-36) (IUPAC [Aca5-13]PYY) (アミノカプロイルは「Aca」と省略)、PYY(1-4)Aca(15-36)、PYY(1-4)Aca(16-36)、PYY(1-4)Aca(22-36) (IUPAC [Aca5-21]PYY)、およびPYY(1-4)Aca(25-36) (IUPAC [Aca5-24]PYY) (SEQ ID NOS: 180-184)。
【００７８】
欠失およびトランケーション
他の実施例において、本発明のPYYアナログポリペプチドは、ネイティブのヒトPYY (SEQ ID NO: 2)のアミノ酸配列から、１つあるいはそれ以上のアミノ酸残基を単独あるいは１つあるいはそれ以上の挿入あるいは置換との組合せで削除できる。ある局面において、本発明のPYYアナログポリペプチドは、そのポリペプチドが(SEQ ID NO: 2)ではないことを条件に、ネイティブのヒトPYY (SEQ ID NO: 3)のN-末端あるいはC-末端から１つあるいはそれ以上のアミノ酸残基を削除できる。他の実施例において、本発明のPYYアナログポリペプチドは、ネイティブのヒトPYY (SEQ ID NO: 2)のアミノ酸部位2-35の間で１つあるいはそれ以上のアミノ酸残基を削除できる。そのような欠失には、ネイティブのヒトPYY (SEQ ID NO: 2)のアミノ酸部位2-35の間で１つあるいはそれ以上の保存的あるいは非保存的な欠失が含まれる。ある好ましい実施例において、ネイティブのヒトPYY (SEQ ID NO: 2)のアミノ酸部位24-36のアミノ酸残基は削除されない。
【００７９】
他の実施例において、式I-Vに記載されたPPFポリペプチドは、ネイティブPPFポリペプチドの生物学的活性の少なくとも１つを保持できる範囲で、N-あるいはC-末端トランケーション、あるいは式I、II、III、IVあるいはV のアミノ酸部位2-35の内部における欠失を含めてもよい。好ましい実施例において、部位5-8および24-36のアミノ酸残基、より好ましくは、部位8および32-35、が削除される。
【００８０】
挿 入
他の実施例において、本発明のPYYアナログポリペプチドは、単独または１つあるいはそれ以上の欠失および/または置換との組合せで、天然のヒト PYY のアミノ酸配列 (SEQ ID NO: 2) に挿入される１つあるいはそれ以上のアミノ酸残基を持ってもよい。他の局面において、本発明は、天然のヒト PYY のアミノ酸配列 (SEQ ID NO: 2) に一アミノ酸挿入または一残基以上のアミノ酸の連続的あるいは非連続的な挿入を有するPYYアナログポリペプチドに関連している。好ましい１つの実施例において、アミノ酸残基は、天然のヒト PYY のアミノ酸配列 (SEQ ID NO: 2) の部位24 から 36 には挿入されない。
【００８１】
他の実施例において、本発明のPYYアナログポリペプチドは、１つあるいはそれ以上の非天然アミノ酸が天然のヒト PYY のアミノ酸配列 (SEQ ID NO: 2) に挿入できる。好ましい実施例において、PYY のアミノ酸配列 (SEQ ID NO: 2) に挿入される非天然アミノ酸は、β-ターン擬似体あるいは架橋分子であるかもしれない。好ましい架橋分子としては、アミノカプロイル (「Aca」)]、β-アラニル、そして8-アミノ-3、6-ジオキサオクタノイルが含まれる。好ましいβ-ターン擬似体としては、以下に表記された擬似体Aや 擬似体B およびAla-Aib、Ala-Pro ジペプチドも含まれる。
【００８２】
【化２】
0005638177.tif 000005
【００８３】
他の実施例において、本発明のPYYアナログポリペプチドには、そのポリペプチドの何れかの末端部位に、「エクステンション：伸張」あるいは「テール：尾」と呼ばれるポリアミノ酸配列が挿入されてもよい(例えば、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリアラニンなど)。
【００８４】
アミノ酸配列の挿入を含む好ましいPYYアナログポリペプチドは、天然のヒト PYY 全長に沿った各アミノ酸部位にアラニン置換を含んでいる。そのようなPYYアナログポリペプチドは 、PYY +(Ala)xを含み、その x は 1' から36 (SEQ ID NO:54-87) から選択されたものである。
【００８５】
誘導体
本発明は、本発明のPYYアナログポリペプチドの誘導体にも関連している。そのような誘導体には、１つあるいはそれ以上の、ポリエチレングリコール (PEG)のような水溶性ポリマー分子や様々な長さの脂肪酸鎖 (例えばステアリル基、パルミトイル基、オクタノイル基)が結合したもの、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリアラニンなどのポリアミノ酸の付加あるいは短鎖アルキル、官能性 アルキル (例えば、分枝、環状、融合、アダマンチル) 、および芳香環基が付加されたPYYアナログポリペプチドが含まれる。水溶性ポリマー分子は、好ましくは約 500 から 20,000ダルトンの範囲の分子量を持つ。
【００８６】
そのようなポリマーの結合は、PYYアナログポリペプチド配列の C-あるいはN-末端またはアミノ酸残基側鎖に単一的に存在する。あるいは、PYYアナログポリペプチドの配列に沿った複数箇所に誘導化部位が存在してもよい。リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、あるいはシステインによる１つあるいはそれ以上の置換は、さらなる誘導化部位を与えることができる(例えば、米国特許5,824,784号 および 5,824,778号 を参照)。好ましくは、そのPYYアナログポリペプチドは、１、２、あるいは３つのポリマー分子と結合してもよい。
【００８７】
水溶性ポリマー分子は、好ましくは、アミノ基、カルボキシル基、あるいはチオール基と結合し、C-あるいはN-末端、またはリジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、あるいはシステインの側鎖と結合していてもよい。あるいは、水溶性ポリマー分子は、ジアミン基やジカルボキシル基と結合できる。好ましい１つの実施例において、 本発明のPYYアナログポリペプチドは、リジンアミノ酸のイプシロンアミノ基を介して１、２、あるいは３つのPEG分子と結合している。
【００８８】
本発明中のPYYアナログポリペプチドの誘導体は、１つあるいはそれ以上のアミノ酸残基に化学的な変換を持つPYYアナログポリペプチドも含まれる。そのような化学的変換には、アミド化、糖化、アシル化、硫酸化、リン酸化、アセチル化、および環化が含まれる。その化学反応は、PYYアナログポリペプチド配列中の C-あるいはN-末端、またはアミノ酸残基の側鎖で単独に起こりうる。１つの実施例において、これらのペプチドは、C-末端側に非結合型の水酸基 (-OH)あるいはアミノ基 (-NH2) を持てる。他の実施例において、そのN-末端アミノ酸は、イソブチロキシカルボニル基、イソプロピロキシカルボニル基、n- ブチロキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、イソカプロイル基 (isocap) 、オクタニル基、オクチルグリシン基 (G(Oct)) 、8- アミノオクタニル酸基あるいはFmoc 基により保護されることができる。ある好ましい実施例において、環化は、ジスルフィド結合の形成を介して形成することができる (例えば、 SEQ ID NO: 171 を参照)。または、PYYアナログポリペプチドの配列に沿って、数箇所の化学変換部位が存在してもよい。
【００８９】
好ましいアナログ体および誘導体
本発明のある好ましい局面において、PYYアナログポリペプチドは、先に記載された修飾、即ち、欠失、挿入、および置換の組合せを含んでいる。
ある例によっては、好ましいPYYアナログポリペプチドには、１つあるいはそれ以上のアミノ酸置換との組合せでN-末端の削除を含めることができる。例えば、好ましいPYYアナログポリペプチドは、１つあるいはそれ以上の以下に記載されるアミノ酸を持つPYY(3-36)を含む：Ala3、Leu3、Pro3、Ala4、Gly4、d-Ala4、ホモ-Lys4、Glu4、Ala5、Ala6、Val6、d-Ala7、Tyr7、His7、Ala8、Ala9、Ala10、Ala11、d-Ala12、Ala13、ホモ-Ser13、Ala14、Ala15、Gln15、Ala16、Ala17、Met17、Ala18、Ser18、ノル-Val18、Ala19、N-Me-Ala19、Lys19、ホモ-Arg19、Ala20、Ala21、d-Ala22、Ala23、Ala24、Ala25、Lys25、ホモ-Arg25、Ala26、Ala27、Ala28、Ala29、Ala30、Ala31、Ala32、Ala33、Lys33、Ala34、Ala35、Ala36、His36、Trp36、N-Me-Tyr36、および Phe36 。好ましくは、そのPYYアナログポリペプチドは、１つ、二つ、あるいは三つのアミノ酸置換を含む。ある好ましいPYYアナログポリペプチドは、いつかのアミノ酸挿入とも組み合わせで削除を含んでいる (例えば、SEQ ID NOS: 89-174 を参照)。
【００９０】
好ましいPYYアナログポリペプチドは、ネイティブPPFポリペプチドを含まないという条件で、以下の式(V) (SEQ ID NO: 350)のポリペプチドを含む：
Xaa3 Xaa4 Pro Xaa6 Xaa7 Pro Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Tyr Xaa21 Xaa22 Xaa23 Leu Arg Xaa26 Tyr Xaa28 Asn Xaa30 Xaa31 Thr Arg Gln Arg Xaa36
［式中、
Xaa3は、Ile、Ala、Pro、Ser、Thr、あるいは ノル-Val；
Xaa4は、Lys、Ala、Gly、Glu、Asp、d-Ala、ホモ- Lys、あるいはホモ- Arg；
Xaa6は、Glu、Ala、Val、Asp、Asn、あるいは Gln；
Xaa7は、Ala、Asn、His、Ser、あるいは Tyr；
Xaa9は、Gly、Ala、Ser、サルコシン、Pro、あるいは Aib；
Xaa10は、Glu、Ala、Asp、Asn、Gln、Pro、Aib、あるいは Gly；
Xaa11は、Asp、Ala、Glu、Asn、Gln、Pro、Aib、あるいは Gly；
Xaa12は、Ala あるいは d-Ala；
Xaa13は、Ser、Ala、Thr、あるいはホモ- Ser；
Xaa14は、Pro、Ala、ホモ- Pro、ヒドロキシ-Pro、Aib、あるいは Gly；
Xaa15は、Glu、Ala、Asp、Asn、Gln、Pro、Aib、あるいは Gly；
Xaa16は、Glu、Ala、Asp、Asn、あるいは Gln；
Xaa17は、Leu、Ala、Met、Trp、Ile、Val、あるいはノル-Val；
Xaa18は、Asn、Asp、Ala、Glu、Gln、Ser あるいは Thr；
Xaa19は 、Arg、Tyr、Lys、Ala、Gln、あるいは N(メチル)Ala；
Xaa21は 、Tyr、Ala、Met、Phe、あるいは Leu；
Xaa22は、Ala、Ser、Thr、あるいは d-Ala；
Xaa23は、Ser、Ala、Thr、あるいはホモSer；
Xaa26は、His あるいは Ala；
Xaa28は、Leu あるいは Ala；
Xaa30は、Leu、Ala、ノル-Val、あるいは Ile；
Xaa31は、Ala あるいは Val； および
Xaa36は、Tyr、N(メチル)Tyr、His、あるいは Trp； である］。
【００９１】
当該技術に熟練した人には認識されるであろうように、式Vのポリペプチドは、遊離酸型あるいはC-末端がアミド化されていてもよい。
【００９２】
他の好ましいPYYアナログポリペプチドは、SEQ ID NO：31-87、93、95、96、110、114-116、118、120、124-129、131-132、137-141、146-156、158、160-164、167-168、170-171、174-217、221-222、225、228-229、231-239、242-245、247-249、251、255-258、260、264、266-286、および288-347 を含む。
【００９３】
本発明の範囲内には、式II からVのPYYアナログポリペプチドも含まれ、そこで示されているアミノ酸残基は、化学修飾あるいは誘導化されている(例えば、脂肪酸による誘導、PEG化、アミド化、糖化など)。また、示されているアミノ酸残基がD-アミノ酸残基であることも本発明の範囲内と意図される。
【００９４】
他の実施例において、好ましいPYYアナログポリペプチドは、特にC-末端テール部のPPF モチーフに対応する領域以外で、本明細書中に記載されるような内部欠失を有する式II からVのPYYアナログポリペプチドを含む。
【００９５】
非天然アミノ酸の置換を含んでいる好ましいPYYアナログポリペプチドは、PYY(3-36)を含み、その中に含まれる部位 x および x+1 のアミノ酸は、擬似体Aおよび擬似体B より成るグループから選択されたβ-ターン擬似体で置換され、そのxは、部位8-14 から選ばれる (例えば、SEQ ID NO：211-217および  231-237 を参照)。
【００９６】
本発明のPYYアナログポリペプチドの好ましい誘導体は、ポリマーと結合したPYYアナログポリペプチドを含み、そのPYYアナログポリペプチドは、先に記載された如何なる修飾、欠失、挿入、置換、あるいはそれらの組合せを含み、そのポリマー分子はリジン残基と結合している。他のPYYアナログポリペプチドの好ましい誘導体は、以下の置換および変換を有するPYY、PYY(3-36) あるいはPYY(4-36) を含む：[Lys4-脂肪酸鎖]PYY(3-36)；[Lys4-脂肪酸鎖]PYY(4-36)；[Ala2Lys19-脂肪酸鎖]PYY(3-36)； [Ile3-脂肪酸鎖]PYY(3-36)；[Ser13-OAc] PYY(3-36) (OAcは脂肪酸あるいはアセチル基のO- アシル化)；[Ser23-OAc]PYY(3-36)；[Ile2-オクタノイル鎖]PYY(3-36)；[Lys19-オクタノイル鎖]PYY(3-36)；および[Lys19-ステアリル鎖]PYY(3-36)(例えば、SEQ ID NO：185-208 を参照)。
【００９７】
本発明のPYYアナログポリペプチドのさらなる例は、以下に記載する配列表中および実施例の項において提供される。
【００９８】
PPF キメラポリペプチド
本発明のさらなる別の局面において、本発明のPPFポリペプチドは、第二のPP、PYYあるいはNPYポリペプチドの少なくとも１つの付加的な断片と共役結合したPP、PYYあるいはNPYポリペプチドの断片を有するPPFキメラポリペプチドを含み、各々のPP、PYYあるいはNPY断片はPPF モチーフを含んでいる。また、本発明のPPFキメラポリペプチドは、１つ、二つ、三つ、あるいは四つのポリペプチド断片と結合したPP ファミリーポリペプチドの断片を含むことができ、その結合したポリペプチド断片の少なくとも１つは、第二のPP ファミリーポリペプチドの断片である。ある種の実施例において、PPFポリペプチドは、NPY・C-末端断片を有するN-末端PP断片を含まない。本発明のPPFキメラポリペプチドは、あるネイティブのPYY(3-36)と、そのPYY(3-36)の全長にわたり、少なくとも50%の配列同等性を持つものとする。ある好ましい実施例において、本発明のそのようなPPFキメラポリペプチドは、ネイティブのPYY(3-36)と、そのPYY(3-36)の全長にわたり、少なくとも60%、65%、70%、80%、あるいは90%の配列同等性を持つことができる。本発明のそのようなPPFキメラポリペプチドはまた、ネイティブのPPと、少なくとも50%、60%、65%、70%、80%、あるいは90%の配列同等性を持てる。さらに他の実施例において、本発明のそのようなPPFポリペプチドは、ネイティブのNPYと、少なくとも50%、60%、65%、70%、80%、あるいは90%の配列同等性を持つことができる。さらに本発明のPPFキメラポリペプチドは、好ましくは、少なくともそのN-末端にポリプロリンモチーフを、そしてそのC-末端にはPPFモチーフを有するであろう。
【００９９】
この場合も、本発明のPPFポリペプチドは、概して、ヒト・ネイティブPP、PPY、あるいはNPY の生物活性を少なくとも部分的に保持するものとする。好ましい１つの実施例において、本発明のPPFキメラポリペプチドは、代謝状態や代謝病の治療および予防に関する生物活性を有するであろう。
【０１００】
ポリペプチド断片は、アミド結合あるいは化学架橋基への結合に限定せず、当該技術において知られている如何なる様式で共有結合させてもよい。化学架橋基には、ポリペプチドの立体構造を誘導あるいは安定化させるようなペプチド擬似体を含めることができる。本発明の好ましいPPFキメラポリペプチドは、PYY-PP、PYY-NPY、PP-PYY、PP-NPY、NPY-PP、あるいはNPY-PYY キメラを含む。
【０１０１】
本発明のPPFキメラポリペプチドは、少なくとも長さ21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、あるいは34アミノ酸長でもよい。さらに、好ましい１つの実施例において、本発明のPYYアナログポリペプチドは、天然L-アミノ酸残基および/または修飾天然L-アミノ酸残基のみを含む。または、好ましい１つの実施例において、本発明のPYYアナログポリペプチドは非天然アミノ酸残基を含まない。
【０１０２】
さらに、前述したように、本発明のPPFキメラポリペプチドは、好ましくは以下のものを含まない：hPP(1-7)-pNPY、hPP(1-17)-pNPY、hPP(19-23)-pNPY、hPP(19-23)-Pro34pNPY、hPP(19-23)-His34pNPY、rPP(19-23)-pNPY、rPP(19-23)-Pro34pNPY、rPP(19-23)-His34pNPY, hPP(1-17)-His34pNPY、pNPY(1-7)-hPP、pNPY(1-7、19-23)-hPP、cPP(1-7)-pNPY(19-23)-hPP、cPP(1-7)-NPY(19-23)-His34hPP、hPP(1-17)-His34pNPY、hPP(19-23)-pNPY、hPP(19-23)-Pro34pNPY、pNPY(1-7)-hPP、pNPY(19-23)-hPP、pNPY(19-23)-Gln34hPP、pNPY(19-23)-His34hPP、pNPY(19-23)-Phe6Gln34hPP、pNPY(19-23)-Phe6His34hPP、pNPY(1-7、19-23)-hPP、pNPY(1-7、19-23)-Gln34hPP、cPP(20-23)-Pro34-pNPY、cPP(21-23)-Pro34-pNPY、cPP(22-23)-Pro34-pNPY、cPP(1-7)-Pro34-pNPY、cPP(20-23)-Pro34-pNPY、cPP(1-7、20-23)-Pro34-pNPY、cPP(1-7)-pNPY(19-23)-hPP、cPP(1-7)-pNPY(19-23)-His34hPP、cPP(1-7)-gPP(19-23)-hPP、cPP(1-7)-pNPY(19-23)-Ala31Aib32Gln34-hPP、cPP(1-7)-pNPY(19-23)-Ala31Aib32His34-hPP hPP(1-7)-Ala31Aib32-pNPY、hPP(1-17)-Ala31Aib32-pNPY、pNPY(1-7)-Ala31Aib32Gln34-hPP、あるいはpNPY(1-7, 19-23)-Ala31Aib32Gln34-hPP。
【０１０３】
好ましい１つの実施例において、本発明のPPFキメラポリペプチドは、PPファミリー・アナログポリペプチドの断片を含めることができる。例えば、そのPPFキメラポリペプチドは、PPアナログポリペプチドおよびNPYアナログポリペプチドと同様に、本明細書中に記載されるPPYアナログポリペプチドを含んでもよい。
【０１０４】
好ましいPYYアナログポリペプチドは、本明細書中に記載されているアッセイ(好ましくは、食餌摂取、胃排出、膵臓分泌、あるいは体重減少アッセイ)のうちの１つにおいて、同じアッセイにおけるNPY、PYY、あるいはPYY(3-36) の活性と同等あるいはそれ以上の強い活性を示すポリペプチドである。または、本発明の好ましいPYYアナログポリペプチドは、PP、NPY、PYY、あるいはPYY(3-36)と比べ、製造の簡便性、安定性、および/またはフォーミュレーションの簡便性において改善されているかもしれない。
【０１０５】
好ましくは、本発明のPPFキメラポリペプチドは、栄養素利用率、食餌摂取量の低下、体重増加効果、および/または代謝状態や代謝病の治療および予防における生物活性に関し、ネイティブPYYの活性の少なくとも25%、好ましくは約 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、あるいは99%を保持する。他の実施例において、本発明のPPFキメラポリペプチドは、改善されたPYYアゴニスト活性を持つ。好ましくは、本発明のPPFキメラポリペプチドは、栄養素利用率、食餌摂取量の低下、体重増加効果、および/あるいは代謝状態や代謝病の治療および予防における生物活性に関し、ネイティブPYYの活性の少なくとも約 110%、125%、130%、140%、150%、200%、あるいはそれ以上の活性を保持している。
【０１０６】
さらに特定すると、一局面において、PPFキメラポリペプチドは、好ましくはPYY断片に結合したPP 断片を含んでいる。１つの実施例において、本発明のPPFキメラポリペプチドは、PPのN-末端断片、あるいはそのC-末端でPYYあるいはPYYアナログポリペプチドのC-末端断片に結合したPPアナログポリペプチドを含んでいる。別の実施例において、本発明のPPFキメラポリペプチドは、PYYのN-末端断片、PYY(3-36)、あるいはそのC-末端でPPあるいはPPアナログポリペプチドのC-末端断片に結合したPYYアナログポリペプチドを含んでいる。
【０１０７】
別の局面において、そのPPFキメラポリペプチドは、好ましくは、NPYの断片に結合したPYY の断片を含んでいる。１つの実施例において、本発明のPPFキメラポリペプチドは、PYY のN-末端断片、PYY(3-36)、あるいはそのC-末端でNPYあるいはNPYアナログポリペプチドのC-末端断片に結合したPYYアナログポリペプチドを含んでいる。他の実施例において、本発明のPPFキメラポリペプチドは、NPYのN-末端断片、あるいはそのC-末端でPYY、またはPYYあるいはポリペプチドのC-末端断片に結合したNPYあるいはポリペプチドを含んでいる。
【０１０８】
さらなる別の局面において、PPFキメラポリペプチドは、好ましくは、NPYの断片に結合したPP の断片を含んでいる。１つの実施例において、本発明のPPFキメラポリペプチドは、PPのN-末端断片、あるいはそのC-末端にNPYまたはNPYアナログポリペプチドのC-末端断片が結合したPPアナログポリペプチドを含んでいる。他の実施例において、本発明のPPFキメラポリペプチドは、NPYのN-末端断片、あるいはそのC-末端でPPまたはPPアナログポリペプチドのC-末端断片に結合したNPYアナログポリペプチドを含んでいる。PP の断片、PPアナログポリペプチド、PYY、PYY(3-36)、PYYアナログポリペプチド、NPY、あるいはNPYアナログポリペプチドは、好ましくは、PP、PPアナログポリペプチド、PYY、PYY(3-36)、PYYアナログポリペプチド、NPY、あるいはNPYアナログポリペプチド中のいずれの4 -20 アミノ酸残基を含む断片である。好ましい１つの実施例において、断片の長さは、最終的に少なくとも34 アミノ酸長のPPFキメラポリペプチドが得られるように選択される。
【０１０９】
本発明のPPFキメラポリペプチドは、そのPPFキメラポリペプチドのアミノ酸配列中に、限定されないが、置換、欠失、および挿入、さらにはそれらのどのような組合せによるさらなる修飾を含めることができる。好ましい一局面において、本発明のPPFキメラポリペプチドは、ある「非必須」アミノ酸残基による修飾を１つあるいはそれ以上含んでいる。本発明の背景において、「非必須」アミノ酸残基とは、そのPPFキメラポリペプチドのPYYアゴニスト活性が損なわれたり、実質的に減少させることなく、例えば、PPファミリーポリペプチド断片のヒト・ネイティブアミノ酸配列における変換、即ち、欠失あるいは置換可能な残基である。
【０１１０】
本発明はまた、PPFキメラポリペプチドの誘導体にも関連している。そのような誘導体は、１つあるいはそれ以上のポリエチレングリコール (PEG)のような水溶性ポリマー分子や様々な長さの脂肪酸鎖 (例えばステアリル基、パルミトイル基、オクタノイル基)が結合したり、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリアラニンなどのポリアミノ酸の付加されたPPFキメラポリペプチドを含む。PPFキメラポリペプチドへの修飾には、短鎖アルキル、官能性アルキル (例えば、分枝、環状、融合、アダマンチル) 、および芳香環基のような小分子の置換を含めることもできる。水溶性ポリマー分子は、好ましくは約 500 から 20,000ダルトンの範囲の分子量を持つものとする。
【０１１１】
そのようなポリマー結合体や小分子置換修飾は、PPFキメラポリペプチド配列中のN-またはC-末端、あるいはアミノ酸残基の側鎖において単独で施してもよい。または、PPFキメラポリペプチドの配列に沿って、複数の誘導化部位が存在してもよい。１つあるいはそれ以上のリジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、あるいはシステインによる置換は、さらなる誘導化部位を与えることができる (例えば、米国特許第5,824,784号 および 5,824,778号 を参照)。好ましくは、そのPYYアナログポリペプチドは、１、２、あるいは３つのポリマー分子と結合させることができる。
【０１１２】
水溶性ポリマー分子は、好ましくは、アミノ基、カルボキシル基、あるいはチオール基と、また、C-あるいはN-末端、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、あるいはシステインの側鎖に結合させることができる。または、水溶性ポリマー分子は、ジアミン基およびジカルボキシル基と結合させてもよい。好ましい１つの実施例において、本発明のPPFキメラポリペプチドは、リジンアミノ酸のイプシロンアミノ基を介して、１、２、あるいは３つのPEG分子と結合している。本発明のPPFキメラポリペプチドの誘導体は、１つあるいはそれ以上のアミノ酸残基が化学的に変換されているPPFキメラポリペプチドをも含む。そのような化学的変換には、アミド化、糖化、アシル化、硫酸化、リン酸化、アセチル化、および環化が含まれる。これらの化学反応は、PPFキメラポリペプチド配列中の C-あるいはN-末端、またはアミノ酸残基側鎖で単独に起こすことができる。１つの実施例において、これらのペプチドは、C-末端側に非結合型の水酸基 (-OH) あるいはアミノ基 (-NH2) を持つことができる。他の実施例において、そのN-末端は、イソブチロキシカルボニル基、イソプロピロキシカルボニル基、n- ブチロキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、イソカプロイル基 (isocap) 、オクタニル基、オクチルグリシン基 (G(Oct)) 、あるいは8- アミノオクタニル酸基により保護することができる。ある好ましい実施例において、環化は、ジスルフィド結合を介して形成することができる。または、PYYアナログポリペプチドの配列に沿って、複数箇所の化学変換部位が存在してもよい。
【０１１３】
好ましい一局面において、PPFキメラポリペプチドは、SEQ ID NO：238-347 のアミノ酸配列を有するものが含まれる。
【０１１４】
本発明のPPFキメラポリペプチドの例は、以下に記載される配列表中に提供され、さらに以下の実施例の項において論じられる。
【０１１５】
代謝状態や代謝疾患の治療および予防におけるPPFポリペプチドの利用
内在性NPY (概説はSchwartzら、Nature 404: 661-71 (2000)を参照) および PYY (Morleyら、Brain Res. 341: 200-3 (1985))が、その受容体を介して、摂食行動を増加させることが一般に認められている。肥満治療を目的とした方法では、常にY受容体を拮抗させることが試みられるが、拒食症の治療に関する適用は、このリガンドファミリーに対するアゴニストで行われている。しかし、共有の継続米国特許出願第20020141985号中に記載および請求されているように、PYYアナログポリペプチドの末梢投与が、特許や化学論文 (例えば、体重を増加させるためのPYY 受容体アゴニストの利用に関して開示された米国特許第 5,912,227 号および 6,315,203号を参照) に報告されているような栄養素利用率の増加よりはむしろ、栄養素利用率の減少に対して強力な効果を有するという驚くべき発見がなされた (Batterham らの Nature 418: 650-4, 2002；WO 03/026591；およびWO 03/057235も参照のこと)。食餌摂取阻害、胃排出の減速、胃酸分泌阻害、および膵臓酵素分泌阻害の作用範囲は、1型、2型、あるいは妊娠性糖尿病のような代謝病、肥満およびその他のインスリン耐性症候群 (シンドロームX)の発症、そして栄養素利用率を減少させるための如何なる利用法における臨床的利点を発揮するために効果的である。
【０１１６】
そのように、本発明の別の局面において、肥満の治療あるいは予防のための方法が提供され、その方法には、治療的あるいは予防的に有効な量のPPFポリペプチドを必要とする対象への投与が含まれる。好ましい実施例として、その対象は、肥満あるいはオーバーウエイトの人である。「肥満」は、一般的に、ボディーマス指数(BMI：Body Mass Index)が30以上として定義されるが、本開示の目的から、BMI が30以下の人に加え、体重を減らす必要性あるいは願望のある如何なる人も「肥満」の範囲に含められる。インスリン耐性、グルコース不耐性あるいは如何なるタイプの糖尿病(例えば、1型、２型あるいは妊娠糖尿病)の人は、本方法による恩恵を受けることができる。
【０１１７】
本発明の他の局面において、食物摂取量の減少、栄養素利用率の減少、体重減少の誘導、身体組成の変化、および身体エネルギー含量の変化あるいはエネルギー消費量の増加、糖尿病の治療、および脂質状態(LDL コレステロールやトリグリセリドレベルの減少および/またはHDL コレステロールレベルの変化を含む) の改善の方法が提供され、その方法には、有効な量の本発明のPPFポリペプチドの対象者への投与が含まれる。好ましい１つの実施例において、本発明の方法は、対象者における栄養素利用率の減少により緩和されるような状態や疾患の治療および予防に利用され、その方法には、治療的あるいは予防的に有効な量の本発明のPPFポリペプチドの前述された対象者への投与が含まれる。そのような状態および疾患には、これに限定されないが、高血圧、異常脂質血症、心疾患、摂食障害、インスリン耐性、肥満、およびどのような種類の糖尿病も含まれる。
【０１１８】
理論により限定されることなく、末梢投与された本発明のPPFポリペプチドの食物摂取量の減少、胃排出速度の低下、栄養素利用率の減少、および体重減少の誘導に関する効果は、１つあるいはそれ以上の特徴的なPPファミリー受容体クラスあるいはそれらと類似したものとの相互作用によって決定されるものと考えられる。さらに特定すると、PYY選択的 (あるいはY7) 受容体に類似した１つあるいは複数の受容体が関与しているようである。
【０１１９】
本発明に有用なその他のアッセイには、身体組成に対するPPF化合物の効果を測定できるアッセイが含まれる。ある典型的なアッセイは、代謝病のための食餌性肥満 (DIO) マウスモデルの利用と関連したものでよい。処置の開始に先立ち、四週齢のオスC57BL/6J マウスに、高脂肪食 (#D12331, 脂肪由来カロリー 58% 、Research Diets, Inc.)が六週間与えられる。実験期間中、それらのマウスは高脂肪食を摂取し続ける。実験期間中、水は無制限に与えられることができる。同週齢の非肥満マウス群には、DIO 群との代謝パラメーター比較のため、低脂肪食 (#D12329, 脂肪由来カロリー 11%) が与えられる。
【０１２０】
DIO マウスには、ビヒクル (ジメチルスルフォキシド[DMSO]の50%水溶液) n=20あるいは本発明の化合物 n=12 の何れかを導入するための浸透ポンプを肩甲骨皮下 (SC) に埋め込むことができる。後者の群へのポンプは、本発明の化合物を任意の濃度、例えば1,000 μg/kg/日で七日間与えられるように設定される。
【０１２１】
体重および食物摂取は、実験期間中を通して、定期的に測定することができる。呼吸商 (RQ、二酸化炭素生産量÷酸素消費量と定義される)および代謝率は、全動物間接熱量測定法 (Oxymax, Columbus Instruments、Columbus, OH) により決定することができる。それらのマウスは、過剰量のイソフルランにより安楽死させ、肥満指数 (両側の精巣中の脂肪体重量) が測定される。さらに、精巣重量の測定に先立ち、各々のマウスの身体組成 (非脂肪重量、脂肪重量)が、二重エネルギーX 線吸収測定(DEXA) 機器を使用し、製造者(Lunar Piximus, GE Imaging System)による指導書に従って分析することができる。本発明の方法において、本発明の好ましいPPF ポリペプチドは、本明細書に記載されるアッセイ(好ましくは食物摂取、胃排出、膵臓分泌、体重減少、あるいは身体組成アッセイ)のうちの１つにおいて、同じアッセイによるPP、NPY、PYY、あるいはPYY(3-36) の活性よりも強い活性を保持するポリペプチドである。
【０１２２】
必要とされる対象者における食物摂取量の減少、体重減少、あるいは肥満の治療に結果する高血圧の改善に加え、本発明の化合物は、実施例４に記載されるように、高血圧の治療に利用できる。
【０１２３】
本発明の化合物は、膵島あるいは膵細胞におけるグルコース応答の増強、誘導、促進あるいは回復に対しても有用であるかもしれない。これらの作用は、前述および米国特許出願第20040228846号に記載されているような代謝疾患に関連した治療あるいは予防にも有用であるかもしれない。そのような活性を測定するアッセイは、当該技術分野においては周知のことである。例えば、米国特許出願第20040228846 号においては(その全体が参照として取り込まれる)、アッセイは、胎児膵島細胞の成熟度決定だけでなく、膵島単離あるいは培養膵細胞のためにも記述されている。米国特許出願第20040228846号の例において、膵臓ペプチドポリペプチド (PP)、ニューロペプチド Y (NPY)、ニューロペプチド K (NPK)、PYY、セクレチン、グルカゴン様ペプチド-1 (GLP-1)およびボンベシンを含む腸由来ホルモンペプチドはシグマ社から購入した。XI 型コラゲナーゼは、シグマ社より入手した。RPMI1640 培地および牛胎児血清はギブコ社より購入した。抗インスリン抗体を含む放射免疫測定キット ([ 125I]-RIAキット)はリンコ社(セントルイス) より購入した。
【０１２４】
分娩後、P-02のラットから膵島を得た。成体ラット膵島は6-8週齢ラットより得た。胎児ラットの膵島は以下のようにして得た。妊娠ラットを、妊娠21 日目に屠殺した。胎児を子宮から取り出した。各々の胎児腹部から10-14 の膵臓を取り出し、Hanks 緩衝液で二度洗浄した。これらの膵臓を集め、6 ml の 1 mg/ml コラゲナーゼ (XI 型、Sigma) 溶液に懸濁し、37℃で8-10分間、一定の速さで振とうした。消化反応は、10 倍量の氷冷 Hanks緩衝液の添加、さらにHanks緩衝液による三回の洗浄により停止させた。次に、膵島をFicoll 勾配法により純化し、1 μM IBMX の存在下あるいは非存在下において、10%牛胎児血清 (FBS)/RPMI 培地中で培養した。五日目の終わりに、20 の膵島を別々のチューブに採取し、定常的なインスリン放出のアッセイを行った。一般的に、膵島は、先ずKRP緩衝液で洗浄し、次に3 mM  (低) グルコースを含む 1 ml のKRP緩衝液中で37℃、30分間、一定の速さで振とうインキュベートした。その上澄液を回収後、その膵島を17 mM  (高) グルコース溶液中で37℃、一時間インキュベートした。低濃度あるいは高濃度グルコース刺激により放出されたインスリンは、[ 125I]-RIAキットを用いた放射免疫測定法 (RIA) により測定した。E21胎児の膵島は、200 ng/ml のPYY、PP、CCK、NPK、NPY、セクレチン、GLP-1あるいはボンベシンの存在下において五日間培養した。
【０１２５】
標準的なげっ歯類用飼料 Purina 5008 を与えられた全てのfa/fa ラットに糖尿病を自然発症する近交系ラットモデル (F30 世代以上) であるZucker Diabetic Fatty (ZDF)ラット(オス)を用いた典型的なインビボアッセイも提供される。ZDF fa/fa オスラットにおいて、約７週齢より高血糖症が発現し始め、通常、グルコースレベル (fed)は、10 から11週齢までに500 mg/DLに達する。糖尿病の進行中のインスリンレベル (fed)は高い。しかし、19週齢までに、インスリンは痩せたラットの対照群と同等のレベルまで低下する。肥満ラットのトリグリセリドおよびコレステロールレベルは、通常、痩せたラットよりも高い。そのアッセイにおいて、七週齢のZDFラットよりなる三群 (各群六匹)は、ALZA ポンプによる14日間の注入処理を受けた：1) ビヒクル、2) PYY 100 pmol/kg/時間、3) PYY 500pmol/kg/時間。7 日目、および 14 日目に以下の４種の測定が注入前後で行われた：1) 血漿グルコースレベル、2) 血漿インスリンレベル、3) 血漿インスリンレベル、および経口的ブドウ糖負荷試験。したがって、これらのアッセイは、本発明の化合物に関する目的の活性を試験するために利用することができる。
【０１２６】
PPFペプチドのために考えられる他の利用法には、アルツハイマー病の治療、予防、あるいはその発症の遅延を目的とした中枢神経系におけるアルミニウム濃度の低下が含まれる(米国特許第6,734,166号、その全体が参照として取り込まれる)。アルミニウムに及ぼす効果を測定するアッセイは、当該技術分野において周知されており、二倍体マウスおよびTs マウスを用いた方法が米国特許第6,734,166号に記載されている。これらのマウスは、個別にNalgene（登録商標）メタボリズムあるいはポリプロピレン製のケージで飼育され、環境に適応するため、実験三日間前にそのかごに入れられた。マウスは、食餌が与えられない安楽死前16時間以外は、自由に食餌と水が摂取できるようにした (LabDiet（登録商標） NIH Rat and Moust/Auto 6F5K52、ミズリー州セントルイス)。マウスには、毎日、活性物質あるいは生理食塩水の何れかが腹腔内注射された。一実験のために13 日目に、別の実験のために3 日目にマウスを屠殺し、試料を採取した。マウスの脳試料は、清潔なテフロンライナー中で重量測定後、分析のため、微量元素用硝酸でマイクロ波分解処理をした。次に、試料中のアルミニウム濃度を誘導結合プラズマ質量分析装置により分析した (Nuttall ら, Annals of Clinical and Laboratory Science 25, 3, 264-271 (1995)を参照)。ノイズとなる物質の混入を最小限に抑えるため、分析における全ての操作は、HEPA 空気ろ過システムを利用したクリーンルームで行った。
【０１２７】
本発明の化合物は、抗分泌作用、および腸運動抑制作用に関連する、広範な生物活性を示す。それらの化合物は、上皮細胞との直接的な相互作用あるいは、おそらく、腸内分泌を刺激するホルモンまたは神経伝達物質の分泌を阻害することにより消化管分泌を抑制できる。抗分泌作用には、胃液分泌および/または膵液分泌の阻害が含まれ、胃炎、膵炎、バレット食道、および逆流性食道炎を含む病気や疾患の治療あるいは予防に有効となりえる。
【０１２８】
本発明の化合物は、例えば、感染性下痢(例えば、ウイルス性または細菌性)、炎症性下痢、短腸症候群あるいはイレオストミーのような外科的処置後に典型的に起こる下痢など、腸内の吸収減少や過剰な電解質および水分の分泌と関連する胃腸疾患の如何なる合併症(例えば、Harrison’s principles of Internal Medicine、McGraw Hill Inc.、New York、12th ed.を参照)に対する治療あるいは予防に使用されることができる。感染性下痢の例として、限定はしないが、急性ウイルス性下痢、急性細菌性下痢(例えば、サルモネラ、カンピロバクターおよびクロストリヂウム)または原生動物感染による下痢あるいは旅行者下痢症(例えば、ノロウイルスあるいはロタウイルス)などが含まれる。炎症性下痢の例としては、限定はしないが、吸収不良症候群、熱帯性下痢、慢性膵炎、クローン病、下痢および過敏性腸症候群が含まれる。本発明のペプチドが、例えば、手術後あるいはコレラのような胃腸疾患が関わる緊急あるいは生命を脅かす状態を治療あるいは予防できることが見出されている。
【０１２９】
本発明の化合物は、腸の障害と関連した症状 (例えば、下痢) に対する単なる治療ではなく、胃腸障害そのものに対する治療や予防にも有効となりえる。腸に対するこのような障害とは、潰瘍性大腸炎、炎症性大腸炎、腸管萎縮症、腸粘膜障害、および/または腸粘膜機能障害、あるいはそれらの結果として生ずる症状でもよい (WO 03/105763、その全体が参照として本明細書中に取り込まれる)。WO 03/105763に記載されているように、そのような活性を測定するアッセイには、標準的なげっ歯類用飼料 (Teklad LM 485、Madison, WI)および水が無制限に与えられ、12時間照明サイクルの下で飼育された体重 250-300 g の11 週齢HSD ラット(オス)を使用するものが含まれる。動物は、実験24時間前から絶食させた。簡便で、再現性のある慢性結腸炎症モデル(ラット)がMorris GPらによって報告されている (：Hapten- induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon、Gastroenterology. 1989； 96:795-803)。そのモデルは、比較的長期の炎症と潰瘍形成を提示し、ある特異的な調節の下において炎症性結腸障害の病態生理学的な研究をしたり、ヒト炎症性大腸炎に対して適用できる可能性のある新たな治療法を評価する機会を提供する。
【０１３０】
ラットは、3%イソフルオランで麻酔し、37℃に温度調節されたパッドの上に置いた。強制注射針を結腸に7 cm 挿入した。Mazelin らの記載 (Protective role of vagal afferents in experimentally-induced colitis in rats. Juton Nerv Syst. 1998；73:38 45)にあるように、50% (v/v) エタノールに溶解させたハプテン、トリニトロベンゼンスルフォン酸 (TNBS)、を30 mg/kg の用量となるようにその0.4-0.6 mlを強制注射針で結腸内腔に注入した。対照群には生理食塩水 (0.9% 食塩) を経腸的に注入した。
【０１３１】
大腸炎の誘導後四日目に、麻酔したラットから結腸を切除してから断頭により安楽死させた。切除した結腸と脾臓の重量を測定し、障害の全体的な形態を記録するために結腸の写真を撮った。炎症は、充血および腸壁肥大部位と定義した。
【０１３２】
本発明の化合物はまた、膵臓癌の治療あるいは予防 (例えば、膵臓癌の増殖阻害) にも利用できる。本発明の方法には、癌細胞の増殖を減少させることも含まれる。本発明により治療されるであろう良性型の膵臓癌には、漿液性嚢胞腺腫、微嚢胞性腫瘍および固形嚢胞性腫瘍が含まれる。本法はまた、膵管、膵腺房、あるいは膵島由来の上皮性悪性腫瘍などの悪性膵臓癌細胞の増殖抑制に対しても効果的である。米国特許第5,574,010号 (その全体が参照として取り込まれる)には、抗増殖活性を試験する典型的なアッセイ法例が記載されている。例えば、その5,574,010 号特許には、PANC-1 および MiaPaCa-2がAmerican Type Culture Collection、ATCC (Rockville, Md.) のような供給元より商業的に入手可能なヒト膵臓腺癌細胞の二細胞株であることが記載されている。これら二種の癌細胞は、10% 牛胎児血清、29.2 mg/L グルタミン、25 μg ゲンタマイシン、5 ml ペニシリン、ストレプトマイシン、およびファンギゾン溶液 (JRH Biosciences, Lenexa, Kans.)を添加したRPMI-1640 培地で、NAPCO ウォータジャケット付 CO2培養器中で37℃にて培養した。全ての細胞系は、週に1-2 回、コンフルエントな単層となった時、0.25%トリプシン (Clonetics, San Diego, Calif.) で培養容器より剥離回収した。細胞は、4℃、500 g で7 分間の遠心分離で沈殿させ、トリプシンを含まない強化RPMI-1640培地に懸濁した。細胞をトリパンブルー処理し、血球計算板にて生存細胞数を数えた。
【０１３３】
各細胞系の 10,000、20,000、40,000、80,000 個の細胞を培養用96穴マイクロプレート (Costar, Cambridge, Mass.) の各ウェルに、最終容量が 200 μlとなるように添加した。細胞を、PYYあるいは試験ペプチド処理前の24時間、培養用96穴マイクロプレートに接着させた。ペプチド添加前に新鮮な培地に交換した。PYYあるいは試験化合物の何れかを添加した膵臓癌細胞のインビトロでの培養は、6 時間から 36時間継続させた。細胞に、PYYを各ウェルあたり250 pmol、25 pmol、および2.5 pmolの用量となるように加えた (N=14)。試験化合物は、各ウェルあたり400 pmol、40 pmol、および4 pmolの用量となるように細胞に加えた。対照となるウェルには、接着細胞に対する用量および物理的干渉を模倣するために2 μl の0.9% 生理食塩水を添加した。各96穴マイクロプレートには、実験を通して各プレート間での比較を行えるように18 ウェルの対照用ウェルを用意した。96穴マイクロプレート中のPANC-1 および MiaPaCa-2両細胞に関して、PYYおよび試験化合物の処理が様々な濃度で六回繰り返された。
【０１３４】
培養の終了時、3-(4,5-ジメチルチアゾリル-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド、MTT テトラゾリウムブロミド (Sigma, St. Louis, Mo.)を0.5 mg/ml となるように新鮮な培養培地に加えた。培養培地を交換し、癌細胞をMTT テトラゾリウム ブロミドの存在下、37℃で4時間培養した。培養の終了時、培養培地は吸引除去した。ホルマゾンの沈殿結晶を200μl のジメチルスルホキシド(シグマ、ミズリー州セントルイス)に溶解させた。可溶化したホルマゾンは、ELISA リーダー (Molecular Devices, Menlo Park, Calif.)を用い、波長500 nm の吸収を測定することにより定量した。MTT アッセイは、ミトコンドリアにおけるNADH 依存性デヒドロゲナーゼ活性を測定するもので、インビトロでの癌細胞の化学療法剤に対する応答を定量する方法の中で最も感度が良くかつ信頼性の高い方法である (Alley, M. C.、Scudiero, D. A.、Monk, A.、Hursey, M. L.、Dzerwinski, M. J.、Fine, D. L.、Abbott, B. J.、Mayo, J. G.、Shoemaker, R. H. および Boyd, M. R., Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay. Cancer Res., 48:589-601, 1988；Carmichael, J.、DeGraff, W. G.、Gazdar, A. F.、Minna, J. D.およびMitchell, J. B., Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: Assessment of chemosensitivity testing. Cancer Res., 47:936-942, 1987； McHale, A. P.、McHale, L., Use of a tetrazolium based colorimetric assay in assessing photoradiation therapy in vitro. Cancer Lett., 41:315-321, 1988；およびSaxton, R. E.、Huang, M. Z.、Plante D.、Fetterman, H. F.、Lufkin, R. B.、Soudant, J.、Castro, D. J., Laser and daunomycin chemophototherapy of human carcinoma cells. J. Clin. Laser Med. and Surg., 10(5):331-336, 1992.)。500 nm における吸光度測定値の分析は、同様の試験条件のウェルの集計と対照と様々な濃度のペプチドで処理されたものとの間で観察された差異の一元分散分析(one-way ANOVA)による検証によって分析した。
【０１３５】
インビボにおけるアッセイの実施例も提供される。ヒト膵管腺癌細胞Mia Paca-2を用いて、ペプチドYYおよび試験化合物のインビボでの生育阻害を調べた。70,000 〜100,000個のヒトMia Paca-2細胞を無胸腺マウス(オス) 48匹に局所性移植した。一週間後、それらの動物に、浸透ポンプを介してPYYあるいは試験化合物の何れかを200 pmol/kg/時の用量で四週間投与した。対照群には生理食塩水が投与された。解剖時に、腫瘍の大きさと重量の両方を測定した。対照マウスには、組織切片からも明らかなように、その膵臓にヒト癌細胞の顕著な増殖が認められた。九週目において、対照群の90% のマウスに相当の転移性疾患が見られた。腫瘍の重量は、試験化合物あるいはPYY投与マウスにおいてそれぞれ60.5%、27%まで減少した。
【０１３６】
好ましい実施例において、本発明のPPFペプチドは、全ての徴候にとって、約0.5 μg から5 mg の用量で一回か分与または制御連続的な遊離により、あるいは、用量あたり約0.01 μg/kg から約500 μg/kg、さらに好ましくは約0.05 μg/kg から約250 μg/kg、最も好ましくは約50 μg/kg以下で末梢投与される。これらの範囲の用量は、当然、それぞれのアナログや誘導体の有する効力を以って変更されたり、当該技術に熟練した人によって決定されてもよい。
【０１３７】
本発明の方法において、本発明のPPFポリペプチドは、単独、または１つあるいはそれ以上の他の化合物および長期的あるいは短期的に栄養素利用率を低減させる作用を有する物質の組成を別々あるいはいっしょに投与することができ、その化合物および組成には、限定されないが、アミリンあるいはその類縁アゴニスト、サケ・カルシトニン、コレシストキニン(CCK)またはCCKアゴニスト、レプチン(OB蛋白質)またはレプチンアゴニスト、エクセンジンまたはその類縁アゴニスト、GLP-1またはGLP-1アゴニストが含まれる。適切なアミリン・アゴニストとしては、例えば、[25,28,29Pro-] ヒトアミリン (「プラムリンタイド：pramlintide」として知られ、米国特許第 5,686,511号および 5,998,367号に記載されている)が含まれる。使用されるCCKは、好ましくは、CCKオクタペプチド(CCK-8)である。レプチンは、例えば、以下に記載されている：Pelleymounterら、Science 269: 540-3 (1995)；Halaasら、Science 269: 543-6 (1995)；Campfieldら、Science 269: 546-9 (1995)。適切なエクセンジンには、エクセンジン-3およびエクセンジン-4が含まれ、エクセンジン・アゴニスト化合物には、例えば、PCT出願WO 99/07404、WO 99/25727、および WO 99/25728に記載されているような物質が含まれる。
【０１３８】
ポリペプチド生産および精製
本明細書に記載されているPPFポリペプチドは、当該技術分野で周知の標準的な遺伝子組み換え技術あるいは化学的ペプチド合成技術 、例えば、自動化あるいは半自動化ペプチド合成機の何れかまたは両方により調製することができる。
【０１３９】
本発明のPPFポリペプチドは、従来の技術に従って、溶液中あるいは固体支持体上で合成することができる。様々な自動合成機が商業的に利用可能であり、例えば、既知の手順に従って使用できる。例えば、Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d. ed. Pierce Chemical Co. (1984)； Tamら、J. Am. Chem. Soc. 105: 6442 (1983)； Merrifield, Science 232: 341-7 (1986)；およびBarany and Merrifield、The Peptides, Gross and Meienhofer、eds, Academic Press, New York, 1-284 (1979)。固相ペプチド合成は、NMP/HOBt(Option 1)系および保護基導入を伴うtBoc あるいは Fmoc 系を利用した自動ペプチド合成機(例えば、Model 430A, Applied Biosystems Inc., Foster City, California)を使用して行うことができる(Applied Biosystems User's Manual for the ABI 430A Peptide Synthesizer, Version 1.3B July 1, 1988, section 6, pp. 49-70を参照) 。ペプチドはまた、アドバンスト・ケムテック合成機 (Advanced ChemTech Model MPS 350, Louisville, Kentucky)によっても構築できる。ペプチドは、例えば、ウォーターズDelta Prep 3000 系および C4、C8、あるいは C18 調製用カラム (10 μ, 2.2x25 cm；Vydac, Hesperia, California)を用いた 逆相系HPLC (調製用および分析用) により精製することができる。活性蛋白質が容易に合成され、そして活性ペプチドを同定するために設計されたスクリーニングアッセイによる活性評価を行うことができる。
【０１４０】
または、本発明のPPFポリペプチドは、当前記技術分野で周知の遺伝子組換え技術 (例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor (1989を参照) により生産してもよい。遺伝子組換え技術により生産されたこれらのPYYアナログポリペプチドは、ポリヌクレオチドから発現されることができる。当前記技術に熟練した人は、コドン利用度の縮重を考慮して、DNAおよびRNAを含む、そのようなPYYアナログポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが野生型PYY cDNA から得られることを理解するであろう。これらのポリヌクレオチド配列は、微生物宿主における転写やmRNAへの翻訳を促進するコドンを含めることができる。そのような製造配列は、当前記技術分野において周知の方法により容易に構築されることができる。例えば、WO 83/04053を参照。前記ポリヌクレオチドはまた、任意的にN-末端メチオニン残基をコードできる。本発明に有用な非ペプチド化合物は、当前記技術分野で周知の方法により調製できる。例えば、含リン酸アミノ酸およびそのようなアミノ酸を含むペプチドは、当前記技術分野において周知の方法を利用して調製できる(例えば、Bartlett and Landen, Bioorg. Chem. 14: 356-77 (1986) を参照)。
【０１４１】
様々な発現ベクター/宿主系が、PPF ポリペプチドをコードする配列を維持および発現させるために利用できる。これらには、限定はしないが、組換えバクテリオファージ、プラスミドあるいはコスミドDNA 発現ベクターにより形質変換した細菌のような微生物； 酵母発現ベクターにより形質変換した酵母；ウイルス発現ベクター (例えば、バキュロウイルス) を感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター (例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaM； タバコモザイクウイルス、TMV)あるいは細菌発現ベクター(例えば、Ti あるいはpBR322 プラスミド) で形質変換した植物細胞系；あるいは動物細胞系が含まれる。組換え蛋白質生産に利用される哺乳動物細胞には、限定はしないが、VERO 細胞、HeLa cells、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系、COS 細胞 (例えば、COS-7)、WI 38、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562 および 293 細胞が含まれる。組換え蛋白質発現の手順例は、以下の本明細書中に記述されている。
【０１４２】
本発明により提供されるポリヌクレオチド配列は、そのままで、新規で有用なウイルスおよびプラスミドDNA ベクターの作成、新規で有用な形質変換および遺伝子導入された原核生物および真核生物宿主細胞 (培養で増殖させた細菌、酵母、および哺乳動物細胞を含む)の作成、および本発明のPPF ポリペプチドを発現できるそのような宿主細胞の培養増殖のための新規で有用な方法を作り出すことに有用である。本明細書のPPF ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、PP、PYY、あるいはNPYの低生産性を緩和される場合、あるいはこれらのレベルを増加させる必要性が満たされる場合は遺伝子治療に有用となりえる。
【０１４３】
本発明はまた、本発明のPPF ポリペプチドの組換えDNA 生産の工程も提供する。提供される工程は、そのようなPPF ポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞からのPPF ポリペプチド生産工程で、以下が含まれる：(a) そのようなPPF ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む前記宿主細胞をそのDNA 分子の発現を促進する条件下で培養すること；および (b) そのようなPPF ポリペプチドを取得すること。
【０１４４】
宿主細胞は、原核あるいは真核生物であり、細菌、哺乳動物細胞 (例えば、チャイニーズ・ハムスター卵巣 (CHO) 細胞、サル由来細胞、ハムスター腎細胞、癌細胞あるいはその他の細胞)、酵母細胞、および昆虫細胞が含められる。
【０１４５】
組換え蛋白質発現のための哺乳動物宿主系もまた、当業者にはよく知られている。宿主細胞株は、発現された蛋白質をプロセスしたり、その蛋白質の活性提供に有効であろう翻訳後修飾を行うことができるような特別な能力で選択されてもよい。そのようなポリペプチドの修飾には、限定されないが、アセチル化、カルボキシル化、糖化、リン酸化、脂質化およびアシル化が含まれる。「プレプロ」型蛋白質を切断する翻訳後修飾過程は、正しい挿入、折りたたみおよび/または機能にとって重要となりえる。CHO、HeLa、MDCK、293、WI38 、およびその類などのような異なる宿主細胞には、このような翻訳後修飾に対する特有の細胞機構および特性メカニズムがあり、導入された外来性蛋白質の修飾および合成工程を正確に行える保証のある宿主細胞を選ぶことができる。
【０１４６】
または、本発明のPPF ポリペプチドを生産するために、酵母細胞系を利用してもよい。PPF ポリペプチド をコードするcDNA 領域はPCRにより増幅される。酵母プレプロ-αリーダー配列をコードするDNAは、酵母ゲノミックDNAから、α成熟因子遺伝子の 1-20ヌクレオチドを含むプライマーとこの遺伝子の255-235ヌクレオチドと相補的なプライマーを用いたPCR により増幅される(Kurjan and Herskowitz, Cell, 30: 933-43 (1982))。プレプロ-αリーダー配列をコードする配列とPPF ポリペプチド をコードする配列断片は、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ (ADH2) プロモーターを含むプラスミドに組み込まれ、それにより、そのプロモーターがプレプロ-α 因子と成熟PPF ポリペプチドの融合蛋白質の発現を促進する。Rose と Broachが言及しているように( Meth. Enz. 185: 234-79, Goeddel ed., Academic Press., San Diego, California (1990))、そのベクターは、そのクローニング部位の下流にさらにADH2 転写終了配列、酵母「2-μ」 複製開始因子、酵母 leu-2d 遺伝子、酵母 REP1 およびREP2遺伝子、大腸菌 E. coli β-ラクタマーゼ遺伝子、およびE. coli複製開始因子が含まれる。β-ラクタマーゼ遺伝子および酵母 leu-2d 遺伝子は、それぞれ細菌および酵母におけるセレクションを提供する。またleu-2d 遺伝子は、高レベルの発現を誘導するため、酵母細胞中のプラスミドコピー数の増加を促す。REP1 およびREP2遺伝子は、プラスミドのコピー数の調節に関与する蛋白質をコードしている。
【０１４７】
前段落で記載されているDNA 構築物は、例えば、リチウム酢酸処理 (Steams ら, Meth. Enz. 185: 280-97 (1990))などの、既知の方法により酵母細胞に導入される。ADH2 プロモーターは、生育培地中のグルコースが消費し尽くされた際に誘導される (Price ら, Gene 55: 287 (1987))。プレプロ-α配列は、細胞中の融合蛋白質の分泌に効果を及ぼす。同時に、酵母KEX2 蛋白質は、成熟PYY 類似ポリペプチドからプレプロ-α配列を切り離す(Bitter ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330-4 (1984))。
【０１４８】
本発明のPPF ポリペプチドはまた、例えば、Pichia 発現系(Invitrogen, San Diego, California) などの商業的に入手可能な酵母系を利用して、製造業者の使用説明書に従い発現させてもよい。この系はまた、分泌を促すプレプロ-α 配列にも依存するが、挿入配列の転写はメタノールによるアルコールオキシダーゼ (AOX1) プロモーターにより駆動される。分泌されたPPF ポリペプチドは、例えば、細菌や哺乳動物細胞上清からPPF ポリペプチドを精製するために使用される方法などにより酵母の培養培地から精製される。
【０１４９】
または、PYY アナログポリペプチドをコードするcDNAは、バキュロウイルス発現ベクターpVL1393 (PharMingen, San Diego, California)中にクローン化できる。次に、このPPF ポリペプチドを含むベクターを、製造業者 (PharMingen) の使用説明書に従い、sF9 蛋白質非含有培地中でSpodoptera frugiperda に感染させ、組換え蛋白質を生産させる。この蛋白質は、ヘパリン-セファロースカラム (Pharmacia, Piscataway, New Jersey)および逐次分子篩カラム (Amicon, Beverly, Massachusetts)により培地から精製濃縮され、PBS に再懸濁する。SDS-PAGE分析により、単一のバンドおよびその蛋白質のサイズを確認し、Proton 2090 ペプチドシークエンサによるエドマン・シークエンシングによるN-末端側配列の確認を行う。
【０１５０】
例えば、予測される成熟PYYアナログポリペプチドをコードするDNAは、好ましいプロモーターおよび、任意に、リーダー配列を含むプラスミド中にクローン化してもよい(例えば 、Better ら、Science 240: 1041-3 (1988)を参照)。この構築物の配列は、自動化シークエンシングにより確認できる。
【０１５１】
次に、そのプラスミドは、細菌のCaCl2 処理および加熱処理を利用する標準的な方法により、E. coli MC1061株中に導入される (前記Sambrook らの引用文献を参照)。形質転換させた細菌は、カルベニシリンを添加したLB 培地中で生育させ、発現蛋白質の生産を適切な培地中で生育させることにより誘導した。その蛋白質がリーダー配列を有する場合、成熟PYYアナログポリペプチドの分泌に影響を及ぼすリーダー配列は、分泌の過程で切り離されるであろう。分泌された組換え蛋白質は、以下に記載される方法により、細菌培養培地から精製される。
【０１５２】
または、本発明のPPF ポリペプチドは、昆虫細胞系を利用して発現させてもよい。蛋白質発現のための昆虫細胞系は、当該技術に熟練した人によく知られている。そのようなある１つの系において、Autographa カリフォルニア核多角体病ウイルス (AcNPV) が、Spodoptera frugiperda 細胞あるいはTrichoplusia larvae 細胞中で外来性遺伝子を発現させるためのベクターとして利用される。PPF ポリペプチドをコードする配列は、ポリヘドリン遺伝子など、そのウイルスの非必須領域中にクローン化され、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置かれる。PYYアナログポリペプチドが適切に挿入された場合、ポリヘドリン遺伝子は不活性化され、被覆蛋白質を持たない組換えウイルスが生産される。次に、その組換えウイルスをS. frugiperda 細胞あるいはT. larvae 細胞に感染させ、それら細胞中においてPYYアナログポリペプチドを発現する(Smithら、 J. Virol. 46: 584 (1983)；Engelhard ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3224-7 (1994))。
【０１５３】
別の実施例において、PPF ポリペプチドをコードするDNA配列は、PCRにより増幅され、例えば 、pGEX-3X  (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) などの適当なベクター中にクローン化してもよい。pGEX-3Xベクターは、そのベクターによりコードされるグルタチオン-S-トランスフェラーゼ (GST) を含む融合蛋白質を生産するように設計されており、あるDNA 断片によりコードされる蛋白質はベクター中のクローニング部位に挿入される。PCR 用のプライマーは、例えば、適切な制限酵素切断部位が含まれるように設計できる。その組換え融合蛋白質は、融合蛋白質中のGST部位と切り離すことができる。pGEX-3X/PYYアナログポリペプチド構築物は、E. coli XL-1 Blue 細胞 (Stratagene, La Jolla, California) 中に形質変換させ、単離した個々の形質転換体は、カルベニシリンを添加したLB培地中37℃で波長600 nm における光学密度が0.4になるまで培養し、そして0.5 mM イソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) の存在下でさらに4 時間培養する。個々の形質転換体からプラスミドを精製し、自動シークエンサーを用いた部分的配列決定により、目的のPPFポリペプチドをコードする遺伝子挿入が適切な方向に存在しているかを確認する。
【０１５４】
細菌で不溶性の封入体中に生産されることが予想される融合蛋白質は以下のように精製することができる。細胞を遠心分離機により回収する；0.15 M NaCl、1 mM EDTA含有10 mM Tris, pH 8で洗浄する； 次に、室温で15 分間0.1 mg/mL リゾチーム(Sigma) 処理をする。この溶解物を透明に近くなるまで超音波処理し、12,000 x g 10 分間の遠心分離で細胞破片を沈殿させる。融合蛋白質を含む沈殿物を10 mM EDTA 含有50 mM Tris緩衝液 (pH 8) に再懸濁後、50% グリセロール上に重層し、6,000 x g で30 分間遠心分離する。その沈殿物を、Mg++ および Ca++ を含まない標準的リン酸緩衝化生理食塩水 (PBS) 中に再懸濁する。この融合蛋白質はさらに、再懸濁沈殿物を変性SDS ポリアクリルアミドゲルで分画することにより精製される (前記Sambrook らを参照)。ゲルを 0.4 M 塩化カリウムに浸して可視化させた蛋白質を切り取り、SDS を含まないゲル泳動緩衝液中で電気溶出する。GST/PYYアナログポリペプチド融合蛋白質が細菌中に可溶性蛋白質として生産される場合は、GST 精製モジュール (Pharmacia Biotech) を使用して精製できる。
【０１５５】
融合蛋白質は、成熟PYY ポリペプチド からGST を切り離すための消化に付与してもよい。消化反応 (20-40 μg融合蛋白質、0.5 mL PBS に溶かした20-30 ユニットのヒト・トロンビン (4000 U/mg (Sigma))は、室温で16-48 時間行い、その反応生成物を変性SDS -PAGEゲルにより分画する。ゲルは 0.4 M 塩化カリウムに浸して蛋白質のバンドを可視化させる。PYYアナログポリペプチドの予想される分子量に対応する蛋白質バンドの同定は、自動シークエンサー (Applied Biosystems Model 473A, Foster City, California) を用いた部分的配列決定により確認することができる。
【０１５６】
本発明のPPF ポリペプチドの組換え発現法の特に好ましい方法において、pCMV ベクター (5' CMV プロモーター、3' HGHポリA 配列) およびpSV2neo (ネオマイシン耐性遺伝子を含んでいる) 中にPYYアナログポリペプチドをコードするcDNA を含むプラスミドは、リン酸カルシウム法により293 細胞にトランスフェクションすることができる。好ましくは、ベクターは、トランスフェクション前にScaI で一本鎖とべきである。同様にして、ネオマイシン耐性遺伝子を導入した同様のpCMV ベクターを使用した代替構築体も利用できる。安定な細胞株は、0.5 mg/ml G418 (ネオマイシン様抗生物質) を含む生育倍地中で10-14 日間培養し、限界希釈法による単一細胞クローンから選別される。細胞株は、ELISA、ウエスタンブロッティングによるPYYアナログポリペプチドの発現によりスクリーンされ、高発現細胞株が大量培養のために増殖される。
【０１５７】
長期間にわたりその形質転換細胞が使用できることが好ましく、高収率の蛋白質産生および安定な発現が望まれる。一旦、そのような細胞が望ましい発現カセットと選別用マーカー遺伝子を含むベクターで形質転換したら、その細胞は、選択用培地に交換する前に、強化倍地中で1-2 日培養してもよい。選別用マーカーは、選別に対して耐性を与え、その存在は、導入された配列を首尾よく発現している細胞の成育および回収を可能とする。耐性を示す安定形質転換細胞群は、その細胞にとって適切な細胞培養技術により増殖することができる。
【０１５８】
組換え蛋白質を生産するために形質転換された細胞を回収するために、多くの選別系が利用可能である。そのような選別系には、限定はしないが、tk-細胞中のHSV チミジンキナーゼ遺伝子、hgprt-細胞中のヒポキサンチン- グアニンフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、およびaprt-細胞中のアデニンフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれる。また、メトトレキセートに対する耐性を与えるdhfr 、マイコフェノール酸に対する耐性を与えるgpt 、アミノグリコシド、G418に対する耐性を与えるneo 、クロロスルフロンに対する耐性を与えるals 、およびハイグロマイシンに対する耐性を与えるhygroによる選別に基づく抗-代謝産物耐性もまた利用できる。その他の有用である選別用遺伝子には、細胞にトリプトファンの代わりにインドールの利用を可能とさせるtrpB 遺伝子、あるいはヒスチジンの代わりにヒスチノールの利用を可能とさせるhisD 遺伝子が含まれる。形質転換体の同定に視覚的な指標を提供するマーカーには、アントシアニン、β-グルクロニダーゼとその基質であるGUS、およびルシフェラーゼとその基質であるルシフェリンが含まれる。
【０１５９】
本発明のPPF ポリペプチドの多くは、自動化ペプチド合成と組換え技術の両者の組合せにより生産できる。例えば、本発明中のあるPPF ポリペプチドは、欠失、置換、およびPEG化による挿入を含む修飾の組合わせを含めることができる。そのようなPPF ポリペプチドは段階的に生産することができる。最初の段階において、欠失、置換、挿入、およびこれらのうちの何れかの組合わせによる修飾を含む中間体PPF ポリペプチドが前記組換え技術により生産できる。次に、以下に記載されるような任意の精製過程の後、その中間体PPF ポリペプチドは、望まれるPPF ポリペプチドを得るために適切なPEG化試薬 (例えば、NeKtar Therapeutics, San Carlos, Californiaより入手) を使用した化学的修飾によりPEG化される。当該技術に熟練した人は、前記過程が、欠失、置換、挿入、誘導体化、当該技術分野で周知の他の修飾手段から選択された修飾の組合わせを含むPPF ポリペプチドに適用するために一般化でき、かつ本発明により意図されることできることを理解するであろう。
【０１６０】
本発明により生産されたPPF ポリペプチドの精製が望まれるかもしれない。ペプチドの精製技術は、当該技術に熟練した人に広く知られている。これらの技術は、ある段階における細胞環境のポリペプチドと非ポリペプチドへの粗分画を含んでいる。ポリペプチドを他の蛋白質から分離後、目的のポリペプチドは、部分的あるいは完全な精製 (または単一への精製) を行うために、クロマトグラフィーおよび電気泳動技術を使ってさらに精製できる。純粋に調製されたペプチドに特に適した分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、および等電点電気泳動法である。ペプチドを精製する特に効果的な方法は、逆相系 HPLC 、それに続いておこなわれる液体クロマトグラフィー/ 質量分析 (LC/MS)およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化 (MALDI) 質量分析による純化産物の特性決定である。純度のさらなる確認はアミノ酸分析により得られる。
【０１６１】
本発明の局面は、コードされる蛋白質あるいはペプチドの精製、特別な実施例においては、実質的な精製に関連している。本明細書で使用される用語「精製されたペプチド」とは、他の組成より分離可能な組成を言及することを意図しており、そのペプチドは、それが天然に得られる状態と比べて相対的に如何なる程度でも精製されている。したがって、精製されたペプチドはペプチドとも言及され、それは天然に存在する環境から独立している。
【０１６２】
一般的に、「精製された」という用語は、様々な他の組成を除くための分画化を受けたペプチド組成を言及し、その組成は実質的にその発現されるべき生物活性を保持している。用語「実体的に精製された」とは、その組成中においてペプチドが主な成分である組成を言及し、その組成中におけるペプチドの含量は、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、あるいはそれ以上である。
【０１６３】
ペプチド精製に利用される様々な方法は、当該技術に熟練した人によく知られている。これらには、例えば、硫酸アンモニウム、PEG、抗体、およびその類による沈殿；熱変性とそれに続く遠心分離；イオン交換、ゲルろ過、逆相、ヒドロキシアパタイトおよび親和性クロマトグラフィー；等電点電気泳動法；ゲル電気泳動；およびこれらとさらに他の技術との組合わせが含まれる。当該技術分野において一般的に知られるように、これらの様々な精製過程を行う順序は、変えることも、あるいはある過程を省くこともでき、それでも実質的に精製された蛋白質あるいはペプチドを調製するために適した方法を与えるものと信じられる。
【０１６４】
ペプチドを常に最も純化された状態で提供する一般的な必要条件はない。実際に、ある特定の実施例においては、低純度の精製産物が必要となる場合も期待される。部分的精製は、より少ない精製段階の組合わせ、あるいは同様の一般的な精製法とは異なる形式での利用により達成することができる。例えば、HPLC 装置を利用した陽イオン交換クロマトグラフィーは、低圧クロマトグラフィー系を利用した同様の技術に比べて、一般的に、高い純度の精製が得られるものと理解される。相対的に低純度の精製を行う方法は、蛋白質生産物の総回収率あるいは発現した蛋白質の活性維持という点において利点を持てる。
【０１６５】
その過程において得られた他の組成からそのようなPPF ポリペプチドを任意に精製および単離することができる。ポリペプチドを精製するための方法は、米国特許第5,849,883 号に記載されている。これらの文書は、本発明のPPF ポリペプチドの精製および単離に有用であると思われる、G-CSF 組成の精製および単離のために特別に模範的な方法例を記述している。これらの特許の開示により、当該技術に熟練した人は、与えられた資源中からのPPFポリペプチドの精製に有用となりえる多くの精製技術を認識するであろうことは明らかである。
【０１６６】
また、陰イオン交換クロマトグラフィーと免疫親和性クロマトグラフィーの組合わせが、精製された本発明のPPFポリペプチド組成を産生するために利用できるものと期待される。
【０１６７】
薬剤組成
本発明はまた、治療的あるいは予防的に効果的な量の少なくとも１つの本発明のPPFポリペプチド、あるいは医薬的に容認される希釈剤、保存剤、化溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび/あるいはPPFポリペプチドのデリバリーに有効な担体とともに医薬的に容認される塩類を含む薬剤組成にも関連している。そのような組成には、様々な緩衝液成分 (例えば、酢酸、クエン酸、酒石酸、リン酸、トリス)、 pH およびイオン強度の希釈剤；界面活性剤や化溶化剤などの添加物 (例えば、モノオレイン酸ソルビタン、レシチン、プルロニクス、ツイーン20 と80、ポリソルベート20 と80、プロピレングリコール、エタノール、PEG-40、ドデシル硫酸ナトリウム)、抗酸化剤 (例えば、モノチオグリセロール、アスコルビン酸、アセチルシスチン、亜硫酸塩(重亜硫酸塩およびメタ重亜硫酸塩))、保存剤 (例えば、フェノール、メタクレゾール、ベンジルアルコール、パラベン (メチル、プロピル、ブチル)、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、フェニル水銀塩 (酢酸、ホウ酸、硝酸))、および等張化剤/膨張化剤 (例えば、グリセリン、塩化ナトリウム、マンニトール、ショ糖、トレハロース、デキストロース); ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー物質の微粒子性調製物への混和、あるいはリポソームに関連した物質を含めることができる。そのような物質は、本発明のPYY アナログポリペプチドの物理的安定性、インビボでの放出速度およびインビボでの吸収速度に影響を与えるであろう (Remington's Pharmaceutical Sciences 1435-712, 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1990))。
【０１６８】
PP、PYY、あるいはNPY がそれらの薬理学的性質の観点において有用であるように、一般的に、本発明のPPF ポリペプチドも有用であろう。ある好ましい使用法は、代謝状態および代謝疾患の治療あるいは予防のためのPPF ポリペプチドの末梢投与である。特に、本発明の化合物は、栄養素利用率、食物摂取量の低下、および体重減少させる因子としての活性を有している。
【０１６９】
本発明のPPF ポリペプチドは、注射、経口投与、鼻腔内投与、肺投与、あるいは当該技術に熟練した人に認識されるであろうような別の投与を含む末梢投与のために製剤設計されることができる。より特別に、本発明に従った医薬的組成の投与は、その経路を介して標的となる組織に到達しえる限り、どのような経路からでも投与してよい。好ましい１つの実施例において、医薬的組成は、以下に示されている従来型の何れの末梢投与法によってでも、対象に対して導入してもよい：例えば、静脈内注射、経皮、筋肉内、乳内、腹腔内、莢膜内、球後、肺内 (例えば、時限放出)；経口、舌下、鼻腔、肛門、膣、あるいは経皮投与、または特定の部位からの外科的移植。処置は、投与期間中に一回あるいは複数回にわたる投与でよい。本発明の組成の制御的継続放出もまた予想される。
【０１７０】
再構成のためのフォーミュレーションは、液体あるいは凍結乾燥剤のような固体でもよい。本発明の水溶性組成は、有効量のPPF ポリペプチドを、医薬的に容認されている担体あるいは水性媒体に溶解あるいは分散させたものを含んでいる。用語「医薬的あるいは薬理学的に容認される」とは、動物あるいはヒトに投与した際、有害、アレルギー性あるいは他の好ましくない反応を呈さない分子や組成を言及する。本明細書で使用されるように、「医薬的に容認される担体」には、溶媒、分散剤、コーティング剤、抗菌、および抗カビ剤、等張化剤、吸収遅延化剤およびその類の何れかあるいは全てが含まれる。医薬的活性物質のためのそのような媒体や物質の使用は、当該技術分野においてよく知られている。
【０１７１】
従来の媒体あるいは物質因子とその活性成分が配合不和でない限り、治療組成におけるその使用が期待される。補助的な活性成分はまた、その組成に含ませることができる。いくつかの実施例において、PPF ポリペプチドと他のアミリン、アミリン類縁アゴニスト、CCKあるいはCCKアゴニスト、またはレプチンやレプチンアゴニスト、エクセンジンあるいはその類縁アゴニスト、およびカンナビノイド CB1 受容体拮抗剤、β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ-1 阻害剤などの食物摂取抑制剤、血漿グルコース低下、あるいは脂質変換剤、肥満治療のために販売されたシブトラミンを単独あるいは同時に投与する溶剤として提供することは便利なものとなるであろう。その他の実施例においては、前記PPF ポリペプチドとは別々に追加的な製剤因子を投与することがより有効であるかもしれない。
【０１７２】
本発明のPPF ポリペプチドは、遊離塩基の溶液、あるいは、例えば、モノオレイン酸ソルビタン、ポリオキシエチレンモノラウリル酸ソルビタン (ツイーン20)、ポリオキシエチレンモノオレイン酸ソルビタン (ツイーン80)、レシチン、ポリオキシエチレン- ポリオキシプロピレン共重合ポリマー (プルロニクス)、ヒドロキシプロピルセルロース) などの界面活性剤や包接化物質 (ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン、スルホブチルエーテル-β-シクロデキストリン (Captisol)、ポリビニルピロリドン) と適切に混和された医薬的に容認される塩溶液として投薬用に調整することができる。医薬的に容認されている塩には、酸添加塩 (蛋白質の遊離アミノ基と結合したもの) や、例えば、塩酸やリン酸などの無機酸、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデリン酸などの有機酸などと形成される酸添加塩が含まれる。また、遊離カルボキシル基と形成する塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、あるいは水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基などに由来することができる。そのような産物は、当該技術に熟練した人によく知られる方法によって容易に調製される。また、分散剤は、グリセロール、液状ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物の類、および油を用いて調製することができる。通常の保存および使用条件下において、これらの調製物には微生物の生育を防ぐための保存料が含まれる。
【０１７３】
１つの実施例において、本発明の医薬組成は、非経口投与に適するように製剤設計される(例えば、注射や輸液)。好ましくは、PPF ポリペプチドは、例えば、 pH 約3.0 から約 8.0、好ましくは pH約3.5 から約 7.4、pH約3.5 から約 6.0、pH約3.5 から約 5.0、あるいはpH約3.7 から約 4.7 の緩衝液などの水性媒体中に懸濁させる。有用な緩衝液には、酢酸ナトリウム/酢酸、乳酸ナトリウム/乳酸、アスコルビン酸、クエン酸ナトリウム/クエン酸、重炭酸ナトリウム/重炭酸酸、コハク酸ナトリウム/コハク酸、ヒスチジン、安息香酸ナトリウム/安息香酸、リン酸ナトリウム、トリス (ヒドロキシメチル) アミノメタンが含まれる。リポジトリあるいは「デポー」徐放性製剤型の調剤は、治療的に効果的な量が、皮下注射あるいは経皮投与後数時間または数日に渡って血流中にデリバーされるように利用することができる。
【０１７４】
この注射可能な使用に適した医薬的組成には、滅菌された水溶液や散剤および滅菌注射可能な水溶液や散剤の用時調製用滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、製剤は、無菌化され、かつ容易に注射できる程度の液状である。また、本発明のPPF ポリペプチドは、その製造および保存条件下において安定であることが望まれ、そして細菌やカビなどの微生物の混入から保護されてなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール (例えば、ソルビトール、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど)、ジメチルアセタミド、クレモフォー EL、適切な混合物の類、およびオイル (例えば、大豆、ゴマ、ひまし油、綿実、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、グリコフロール、とうもろこし) を含む溶液あるいは分散剤でよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどによるコーティング、分散剤の場合は必要な粒子サイズおよび界面活性剤の使用により維持される。微生物の作用からの保護は、例えば、メタクレゾール、ベンジルアルコール、パラベン(メチル、プロピル、ブチル)、塩化ブタノール、フェノール、フェニル水銀塩 (酢酸、ホウ酸、硝酸)、ソルビン酸、チメロサール、およびその類の抗菌および抗カビ剤によってもたらすことができる。多くの場合、強壮剤(例えば、糖、塩化ナトリウム)を含めることが好ましいであろう。注射可能組成の延長吸収は、徐放性製剤 (例えば、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチン) によりもたらすことができる。
【０１７５】
無菌注射可能溶剤は、必要量の活性化合物を前記列挙された様々な成分と適当な溶剤中に必要に応じて混合し、ろ過滅菌することにより調合できる。一般的に、散剤は、滅菌された活性物質と無菌化された基礎分散化媒体および上記に列挙された様々な成分を必要に応じて混合することにより調合される。無菌注射可能溶剤のための無菌粉末を調製する場合、その好ましい調製法は、活性成分と予めろ過滅菌した溶液の類から付加的な好ましい成分の混合粉末物が得られる真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【０１７６】
一般的に、PPF 化合物は、患者に対して投与するために、安定かつ安全な医薬組成中に調合されることができる。本発明の方法に使用されることが期待される医薬フォーミュレーションは、約 0.01 から20% (w/v)、好ましくは0.05 から10% のPPF 化合物を含められる。このPPF 化合物は、最終的な組成のpH が約 3.0 から約 7.0 となるように酢酸、リン酸、クエン酸、あるいはグルタミン酸緩衝液中でよく、等張化剤として糖質あるいは多価アルコールを、また任意に、m-クレゾール、ベンジルアルコール、パラベン(メチル、エチル、プロピル、ブチル)、およびフェノールの中から選択された保存料を約 0.005 から5.0% (w/v) の濃度で含んでよい。配合されたペプチドが多目的な産物の中に含まれる場合、そのような保存料が一般的に含まれる。
【０１７７】
本発明の特別な実施例において、本発明の医薬フォーミュレーションは、以下の範囲の濃度のPPF 化合物を含めることができる：例えば、約0.01 から約98% (w/w)の範囲、あるいは約1 から約98% (w/w)の範囲、あるいは好ましくは約80 から約90% (w/w)の範囲、または好ましくは約0.01 から約50% (w/w)の範囲、またはさらに好ましくは、本実施例における約10 から約25% (w/w)の範囲。望まれる濃度の溶液を得るために、注射液には十分量の水を使用できる。本明細書に記載されている医薬フォーミュレーションは凍結乾燥できる。典型的なフォーミュレーションは、9.3% のショ糖を浸透圧調整剤含有10 mM 酢酸ナトリウム緩衝液溶液 (pH 4.2)中1 mg/ml のPPF化合物でよい。
【０１７８】
一般的に、本発明のPPF ポリペプチドの医薬的あるいは予防的な有効量は、患者の年齢、体重、および病気の状態あるいは重篤性または代謝状態や代謝疾患の程度により決定されるだろう (例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences 697-773；Wang and Hanson、Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers, Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report No. 10, Supp. 42:2S (1988) を参照)。通常、およそ0.001μg/kg 体重/日 から約1,000μg/kg 体重/日 の間の用量が与えられるが、熟練した施術者により認識されるであろうように、量を増減して与えてもよい。投薬は、フォーミュレーションにより、一日一回、二回、三回、四回、あるいはそれ以上、あるいはさらに低頻度で、例えば、一週間に一回、一ヶ月に一回、あるいは三ヶ月に一回でよく、本明細書に記載されているその他の製剤と併せて投与してもよい。本発明は、本明細書中に列挙する投薬量に限定しないことに留意するべきである。
【０１７９】
適切な投与量は、用量-反応データと併せて、代謝状態や代謝疾患の程度を決定するために確立されたアッセイを通して確定できる。最終的な投薬法は、例えば、薬物の特異的活性、患者の障害および応答性の重篤性、年齢、状態、体重、患者の性別および食事、感染状態、投与時間、およびその他の臨床的な因子などの薬物作用に影響する因子を考慮に入れ、担当医師により決定されるものとする。調査が行われると、特定の病気や症状に対する適切な用量や治療期間が明らかになるであろう。
【０１８０】
一回、あるいは二回、三回、四回、またはそれ以上の複数回投与をした場合の効果的な投与量は、通常、約0.5 から 30μg から約 5 mg/日、好ましくは約10 から 30μg から約 2 mg/日、そして更に好ましくは約5 から 100μg から約 1 mg/日、最も好ましくは約5 μg から約500 μg/日 の範囲となる。したがって、典型的な投与量は、一日に与えられるべき薬物の総量と回数に由来することができる。例えば、典型的な投与量は、約 0.125 μg/投与 ( 一日四回で、合計0.5 μg 投与) から約 0.2 mg/投与( 一日一回で、合計2 mg 投与) の範囲でよい。投与量は、0.01 から 100μg/kg/投与の範囲でもよい。投与されるべき正確な用量は、当該技術に熟練した人により決定されてもよく、また、投与される個人の年齢、体重、症状だけではなく特定の化合物の効力にも依存する。投薬は、例えば、肥満、糖尿病、あるいはインスリン抵抗性症候群の最初の兆候出現時または診断直後に、栄養素利用率、食物摂取量、体重、血中グルコースの抑制あるいは血漿脂質の低下が必要なときはいつでも開始すべきである。投薬は、例えば、注射、好ましくは皮下投与、筋肉注射、経口、鼻腔、経皮投与などどのような経路によっても行われてもよい。特定の経路から、例えば、経口投与の場合、生物学的利用率の低下を考慮して、例えば、約5-100 倍まで増量できる。
【０１８１】
１つの実施例において、医薬製剤が非経口的に投与される場合、その組成は、0.1 μg/kg から 100 mg/kg 体重/日、好ましくは1 μg/kg から 50 mg/kg 体重/日の範囲の量の PPF ポリペプチドがデリバーされるフォーミュレーションである。典型的な一日量は、低用量限界が 2、5、 10、20、 40、 60 、あるいは 80 mg/kg 体重/日から高用量限界が80、100、150、200、あるいは250 mg/kg 体重/日でよい。非経口投与は、最初の投与に続き、薬物の医薬的に効果的な血中濃度を維持するための継続的な投与により行うことができる。当業者は、優良な医療行為および個人の患者の臨床症状によって決定されるように、効果的な用量および投与計画を容易に最適化するであろう。
【０１８２】
投与回数は、投与薬剤の薬物動態パラメーターおよび投与経路に依存するであろう。最適な医薬フォーミュレーションは、投与経路と必要量に依存して、当該技術に熟練した人により決定されるであろう (前記Remington's Pharmaceutical Sciences 1435-1712を参照)。そのような医薬フォーミュレーションは、投与された薬剤の物理的状態、安定性、生体内での放出速度および生体内でのクリアランス速度に影響を与えることができる。投与経路に依存して、体重、体表面積あるいは組織の大きさに基づいて、適切な用量が計算できる。適切な治療用量を決定するために必要な計算のさらなる調整は、当該技術に熟練したヒトにより、動物実験やヒトによる臨床試験で観察された薬物動態データだけでなく、特に、本明細書に開示した用量の情報やアッセイに照らしあわせ、必要以上の実験を行うことなく日常的に行われる。
【０１８３】
本発明の医薬組成や治療法は、ヒトおよび動物医学の領域において有用となりえることが理解されるであろう。したがって、処置される対象は、哺乳動物、好ましくはヒトあるいは他の動物でよい。動物の用途として、その対象は、例えば、牛、羊、豚、馬、羊などの牧場動物、犬や猫などのペット、外来および/もしくは動物園の動物、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、およびハムスターなどの実験用動物；およびニワトリ、七面鳥、アヒル、雁などの家禽を含めることができる。
【０１８４】
さらに、本発明は、本発明のPPF ポリペプチド、医薬応用のために本発明の前述したPPF ポリペプチドを調整するために適切な成分、および医薬応用のために前記PPFポリペプチドおよび成分を使用するための手順を含むキットが期待される。
【０１８５】
本発明に対する理解を補助するために、以下の実施例を含める。本発明に関する実験は、当然、本発明を特別に限定するものように解釈されるべきではなく、当業者の範囲内であろう、現在知られているあるいは今後開発されるような本発明の修正・変更は、本明細書および以下の請求項に述べられるように、本発明の範囲内に入るものとみなされる。
【０１８６】
実施例
本発明は、以下の非限定的な実施例に関するより詳細を記述し、本発明のより詳しい全貌を提供するが、これらの範囲を限定するように解釈されるべきではない。実施例は、本発明のPPF ポリペプチドの調製、および本発明のこれらPPF ポリペプチドのインビトロおよび/またはインビボでの試験について説明している。当該技術に熟練した人は、これらの実施例中に記載される技術が本発明の実行において有効に機能する発明者によって記述される技術であり、そのままでその実行のための好ましい様式に構成されていることを理解するであろう。しかし、当該技術に熟練した人は、開示された方法および類似あるいは同様の結果が得られる特定の方法に、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多くの変更が加えられることを本開示に照らして判断すべきことは理解すべきである。
【０１８７】
実施例 1. PPF ポリペプチドの調製
本発明のポリペプチドは、Rink アミドカラム(Novabiochem)を用いたシンフォニー・ペプチド合成機 (Protein Technologies, Inc.) で、0.050-0.100 mmol、0.43-0.49 mmol/g の付与で合成できる。Fmoc アミノ酸 (5.0 eq、0.250-0.500 mmol) は、0.10 M の濃度となるように、1-メチル-2-ピロリジノンに溶解した。その他の試薬 (HBTU、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン) はすべて、0.55 M ジメチルホルムアミド溶液として調製した。次に、Fmoc で保護されたアミノ酸は、HBTU (2.0 eq、0.100-0.200 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物 (1.8 eq、0.090-0.18 mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン (2.4 eq、0.120-0.240 mmol)を用いて樹脂結合アミノ酸と二時間カップリングさせる。最後のアミノ酸カップリングに続き、ペプチドは、ジメチルホルムアミドに溶解した20%(v/v) ピペリジン中で一時間処理して保護基を除去する。ペプチド配列が決定されると、シンフォニー・ペプチド合成機は、その樹脂を切断するようにプログラムされている。トリフルオロ酢酸 (TFA) による樹脂からのペプチドの切断は、93% TFA、3% フェノール、3% 水および 1% トリイソプロピルシランを用いて一時間行われる。切断されたペプチドは、t-ブチルメチルエステルにより沈殿させ、遠心分離により沈殿物として回収後、凍結乾燥する。この沈殿物を水 (10-15 ml) に再懸濁、ろ過後、C18 カラムを用いた、0.1% TFA を含んだアセトニトリル/水の濃度勾配法による逆相 HPLC を通して精製する。得られたペプチドは、逆相 HPLCにより単一に精製し、その純度はLCMS により確認する。
【０１８８】
脂肪酸 (例えば、オクタン酸やステアリン酸)を利用した、本発明のペプチドのN-キャッピングする一般的な方法は以下の通りである：Rink アミド樹脂 (0.1 mmol) 上のペプチドを NMP (5 ml) に懸濁する。別の容器に、HBTU (0.3 mmol)および HOBt (0.3 mmol) を入れ、DMF (5 mL) に溶解後、DIEA (0.6 mmol) を添加する。この溶液を樹脂に加え、その懸濁物を二時間攪拌する。溶媒をろ過除去後、NMP (5 ml で四回) および ジクロロメタン (20 ml) で十分洗浄、乾燥後、TFAによる樹脂からのペプチドの切断を一時間行う。切断および精製後の目的のペプチドの収量は約 40 mg である。
【０１８９】
PEG による修飾は、溶液中で、リジンアミノ酸のイプシロンアミノ基あるいは精製ペプチドの末端アミノ基において、商業的に入手可能な 活性化 PEG エステルを使用して行うことができる。得られるPEG 化誘導体は、逆相 HPLCにより単一に精製され、その純度は、LCMSおよび MALDI-MSにより確認する。
【０１９０】
本発明のポリペプチドは、当該技術に熟練した人に一般的に知られる結合アッセイ技術を利用した様々な種類のY-受容体結合アッセイにより試験することができる。そのようなアッセイには以下に記載される方法が含まれる。
NPY・Y1 受容体結合アッセイ：膜画分は、内因的にニューロペプチド Y1 受容体を発現するSK-N-MC 細胞(コンフルエント培養)より調製される。膜画分は、ポリスチレン製の96- ウェルプレート中、60 pM の [125I]- ヒトペプチド YY (2200 Ci/mmol、PerkinElmer Life Sciences)、および非標識 PPF ポリペプチドと室温で60 分間反応させる。次に、ウェル中の内容物をPerkin Elmer プレート回収装置を用いて96-ウェルガラス繊維プレート上に回収する。乾燥させたガラス繊維プレートにシンチレーション溶液を加え、Perkin Elmer シンチレーション計数機で測定する。
NPY・Y2 受容体結合アッセイ:：膜画分は、内因的にニューロペプチド Y2 受容体を発現するSK-N-BE 細胞(コンフルエント培養)より調製される。膜画分は、ポリスチレン製の96- ウェルプレート中、30 pM の [125I]- ヒトペプチド YY (2200 Ci/mmol、PerkinElmer Life Sciences)、および非標識 PPF ポリペプチドと室温で60 分間反応させる。次に、ウェル中の内容物をPerkin Elmer プレート回収装置を用いて96-ウェルガラス繊維プレート上に回収する。乾燥させたガラス繊維プレートにシンチレーション溶液を加え、Perkin Elmer シンチレーション計数機で測定する。
NPY・Y4 受容体結合アッセイ：CHO-K1 細胞に、ニューロペプチド Y4受容体遺伝子をコードするcDNA を一過的に導入し、その48 時間後、コンフルエント培養の細胞から膜画分を調整する。膜画分は、ポリスチレン製の96- ウェルプレート中、18 pM の [125I]- ヒト膵臓ポリペプチド (2200 Ci/mmol、PerkinElmer Life Sciences)、および非標識 PPF ポリペプチドと室温で60 分間反応させる。次に、ウェル中の内容物をPerkin Elmer プレート回収装置を用いて96-ウェルガラス繊維プレート上に回収する。乾燥させたガラス繊維プレートにシンチレーション溶液を加え、Perkin Elmer シンチレーション計数機で測定する。
NPY・Y5 受容体結合アッセイ：CHO-K1 細胞に、ニューロペプチド Y5 受容体遺伝子をコードするcDNA を一過的に導入し、その48 時間後、コンフルエント培養の細胞から膜画分を調整する。膜画分は、ポリスチレン製の96-ウェルプレート中、44 pM の [125I]- ヒトペプチド YY (2200 Ci/mmol、PerkinElmer Life Sciences)、および非標識 PPF ポリペプチドと室温で60 分間反応させる。次に、ウェル中の内容物をPerkin Elmer プレート回収装置を用いて96-ウェルガラス繊維プレート上に回収する。乾燥させたガラス繊維プレートにシンチレーション溶液を加え、Perkin Elmer シンチレーション計数機で測定する。
【０１９１】
実施例による、特定の好ましい本発明の PPF ポリペプチドおよび前記のようにな様々な種類のY- 受容体結合アッセイにおけるこれらペプチドの活性を表 2 に示す。
【０１９２】
【表２−１】
0005638177.tif 000006
【表２−２】
0005638177.tif 000007
【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
0005638177.tif 000011
【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
0005638177.tif 000014
【０１９３】
実施例 2. 食餌摂取アッセイにおいて食餌摂取を抑制するPPF ポリペプチド
NIH/Swiss マウス群 (8-24 週齢、メス)を、午前六時に照明を入れる12時間 照明サイクルにより飼育する。特に記述されている場合を除き、水および標準的なマウス用飼料は無制限に与えられる。約 1,500 時間後、実験をはじめる一日前、これらの動物の絶食を開始する。実験を行う朝、動物をそれぞれの実験毎のグループに分ける。通常、n=4 ケージ、3 マウス/ケージ。
時間= 0 分に、ビヒクルあるいは10 nmol/kg から 100 nmol/kg の範囲の化合物を全ての動物に腹腔内注射し、予め重量を測っておいた標準的な飼料 (10-15 g) を直ちに与えた。消費された食餌量を決定するため、30、60、および120 分後に飼料を取り出し、その重量を測定する (Morley、Flood ら., Am. J. Physiol. 267: R178-R184, 1994)。食餌摂取量は、時間= 0 分に与えた飼料の重量から、例えば、30、60、120、180、および/または240 分後に残っている飼料の重量を差し引くことにより計算する。顕著な処置効果は、分散分析(ANOVA)により同定された (p<0.05)。顕著な差異が見られた場合、試験群の平均値と対象群の平均値とをダネット検定 (Dunnett's test) により比較する (Prism v. 2.01, GraphPad Software Inc., San Diego, California)。
【０１９４】
図 1 から 4 は、本発明のいくつかの好ましいPPF ポリペプチドが、前記食餌摂取アッセイにおいて、蓄積食餌摂取量を減少効果させることを示している。
【０１９５】
実施例 3. 高脂肪食を与えられた (食餌誘導肥満あるいは DIO) C57ML/6 マウスおよび高脂肪食を与えられた HSD ラットにおいて体重の増加を抑制するPPF ポリペプチド
マウス：C57BL/6 マウス (オス、実験開始時に4 週齢) に、高脂肪食 (HF、脂肪由来カロリー 58%)あるいは低脂肪食 (LF、脂肪由来カロリー 11%) を与える。四週間後、予め決定された量のPPF ポリペプチドを二週間継続して皮下投与する浸透ポンプ (Alzet # 2002) をそれぞれのマウスに移植する。体重および食餌摂取量を一週間毎に測定する (Surwit ら、Metabolism-Clinical and Experimental, 44: 645-51, 1995)。試験化合物の効果は、処置グループあたり少なくとも 14 匹のマウスにおける %体重変化の平均値 +/- 標準偏差 (即ち、実験開始時の体重からの % 変化) として表示される (p<0.05 分散分析、ダネット検定、 Prism v. 2.01, GraphPad Software Inc., San Diego, California)。
ラット：処置前夜、高脂肪食 (脂肪由来カロリー 45%)を摂取しているSprague-Dawley（登録商標）ラット (オス、平均体重 415 g) を、24 時間の食餌摂取が均等な二群に分けた。試験当夜、消灯直前 (1800 時間) に、各々の動物に、ビヒクル (10% DMSO)あるいは化合物 (1 mg/kg) を腹腔内注射し、個々のラットを独立したDietPro 自動給餌ケージに移した。各ケージには、コンピュータと連結した体重計上に食餌受け、および水の入った容器を設置した。その後24 時間、一時間毎に食餌摂取量を記録した。これらの動物は、連続六日間の注射を施した。体重量は毎晩測定した。
【０１９６】
図 5 および 6 は、本発明のいつかのPPF ポリペプチドが、前記DIO マウスアッセイにおける体重増加に対する減少効果を示すことを示している。図 7 は、一日一回の注射が、高脂肪食ラットにおいて、数夜にわたる体重増加に対して著しい減少効果させることを示している。さらに、図 8 は、本発明の PPF ポリペプチドが、食餌摂取アッセイおよび DIO マウスアッセイの両方において、PYY(3-36) よりも強い効果を持つことを示している。
【０１９７】
実施例４．血圧を低下させるPPFポリペプチド
22.8±0.8 ℃、12時間間照明のもとに飼育される Harlan Sprague Dawleyラット(オス)を用いて、PPFポリペプチドの循環器系に及ぼす効果をテレメトリにより調べた。実験は照明時間内に実施された。テレメトリは、意識のある、非麻酔下、ストレスのない状態のラットにおける動脈血圧、心拍および動脈dP/dtを含むリアルタイム血液動態をラットに埋め込んだラジオトランスミッターを経由して測定することを可能にする。本実施例において、ラットには、ビヒクル、10nmol/kg PYY、10nmol/kg PYY(3-36)あるいは10nmol/kgのPPFポリペプチド数種がリモート静注された。リモート静脈投与は、留置血管アクセスポートにより行った(Access Technologies (Stokie, IL)。ポートは、肩甲骨間の皮下筋上に固定される。カテーテルは、頚静脈に装着される。データは、注入の後、60分まで集められた。
【０１９８】
図９A-Bに示すように、化合物１の平均動脈圧を上昇させる効果は、PYY(3-36)の効果と類似している。図９C-Dは、化合物３の平均動脈圧を上昇させる効果および心拍数を減少させる効果がPYY(1-36)の効果と類似する一方、それらの効果が化合物２により抑制されることを図示している。
【０１９９】
実施例５．PYYおよびPYYアゴニストの抗分泌効果
胃酸分泌
Harlan Sprague Dawleyラット(オス)は、22.8±0.8 ℃、12時間照明のもとに飼育された。実験は照明時間内に実施された。ラット餌(Teklad LM485, Madison, WI)を与えた動物は、実験前20時間、絶食させた。実験開始まで、その動物には水は自由なだけ与えた。
そのラット(11-16週齢、体重291-365グラム)に胃孔(David Osborn作製(Department of Biology, UCLA))を外科的に装着させた。一夜絶食させたラットの体重を量った後、それらの胃孔を開け、胃の中まで伸張するPE250チューブをその中に装着させた屈曲性のタイゴンチューブ(3/8 X 1/16インチ)と接続させた。生理食塩水を細いPE250チューブから注入し、タイゴンチューブからの流出液を採取した。胃孔を通した適切な流れおよび胃を空にすることを確実にするために、流出が容易かつ流出液が清明になるまで、〜５mlの生理食塩水(室温)で胃は数回洗浄された。胃酸分泌は、５mlの生理食塩水(pH 7.0)を注入に続き３mlの空気を送入することにより流出液を採取して10分間隔で測定された。pHメータ(ベックマンモデル番号PHI34、Fullerton, CA)を用いて、各３mlの胃酸を0.01Nの水酸化ナトリウムでpH７に調整した。採取総量に対して補正した、各調整に必要とされる塩基の量は、各サンプル中の酸のモル数を計算するために利用された。
【０２００】
ベースライン・サンプルを採取し、その回収量を記録した後、その動物に、125μg/kgのペンタガストリン(Sigma、ロット＃40K0616)を筋注にて投与し、10分間隔の胃酸サンプリングをさらに２時間継続した。ペンタガス トリン投与40分後、定常的な胃酸分泌が典型的に観察される時点で、そのラットに動物あたり１、３、10、100μg/kgのPYY(3-36) (3.45、10.34、34.5、344.8μg/kg)または生理食塩水(それぞれのn=3、2、4、4、6)を筋注で投与した。
【０２０１】
図10に図示するように、胃酸産生量は、ペンタガストリンの注射後20、30、および40分ポイントの平均として算出された、ペンタガストリンによる分泌に対する％として表示されている。ペンタガストリンに応答して、胃酸分泌は、ベースライン9.3±5.8μmol/10分から注射後40分の62.8±3.8μmol/10分まで6.8倍に上昇した(平均値：P<0.01)。ペンタガストリン投与後40分に投与したPYY(3-36)は、用量依存的にかつ著しく胃酸産生を阻害した。PYY(3-36)10μgおよび100μgの用量で、酸分泌は、それぞれ74.7±7.2％および84.7±9.7％まで減少した(P<0.01、P<0.01およびP<0.01；ｔテスト、PYY(3-36)投与後20分)(図11-17中のｔ=60分を参照)。PYY(3-36)によるペンタガストリン刺激による酸分泌阻害の用量応答性を図11に示す。PYY(3-36)の制酸効果に対するED50は、11.31μg/kg±0.054 logユニットであった。
【０２０２】
胃排出
胃排出に及ぼすPYY(3-36)の効果を測定するために、最後野の真空吸引破壊(APx)を持ち、意識のある非絶食Harlan Sprague Dawleyラット(オス)およびシャムオペレーションラットを用いた。実験は、手術後少なくとも２週間後(体重426±8グラム)および３週間後(544±9グラム)に再度行った。ラットは、無作為に処理グループ群に帰属された。全ラットは、22.7℃、12時間照明サイクルで飼育され(実験は、照明時に実施)、餌および水は任意に与えられた(飼料LM-485 Teklad, Madison, Wisconsin, USA)。
【０２０３】
生理食塩水中に溶解させたPYY(3-36)は、１mlの水で５μCi D-[3-3H]-グルコース(ロット# 3165036、Dupont, Wilmington, DE, USA)を摂取させる前に、0、1または10μgの用量を0.1ml筋注ボーラスとして投与された。ビヒクルあるいは異なる用量のPYYは、液状食餌を経口的に与えた後、筋注投与された。
15の処理群が存在した：
(1) 対照 生理食塩水            n=4
(2) 対照3 μg/kg            n=3
(3) 対照30μg/kg            n=4
(4) 対照90μg/kg            n=5
(5) 対照300μg/kg            n=5
(6) シャム生理食塩水            n=5
(7) シャム 3μg/kg            n=2
(8) シャム 30μg/kg            n=4
(9) シャム 90μg/kg            n=3
(10)シャム 300 μg/kg            n=5
(11) APx(最後野真空吸引破壊群) 生理食塩水    n=5
(12) APx 3μg/kg            n=3
(13) APx 30μg/kg            n=3
(14) APx 90μg/kg            n=3
(15) APx 300μg/kg            n=5
【０２０４】
血液は、測定のための摂食-15、0、15、30、60および90分後に、ラットの局部麻酔を施した尾から採取した。また、血漿は、血漿グルコースに由来するトリチウムを測定(β-カウンターで測定、CPM/10μl)するために分離された。血漿におけるトリチウムの出現は、先に、胃排出を反映することが示されている。血漿中のトリチウム出現の集積は、トリチウム摂食前のレベル以上の増加として、トラペゾイダル法を利用して計算された(30分間の曲線下の領域面積)。
【０２０５】
非手術ラット群において、PYY(3-36)は、放射活性の出現を用量依存的に阻害した(30μg/kg、90μg/kg、300μg/kg PYY[336]のそれぞれに対して10.5±1.5、7.26±1.52および3.20±1.21 cpm/μL/分；P<0.0001、分散分析(ANOVA)；図12)。シャムオペレーション群では、PYY(3-36)の10μg(n=4)および30μg(n=3)の投与はまた、生理食塩水投与コントロール群(n=5)と比べて、用量依存的に放射活性の出現を遅延させた(それぞれ11.89±3.23、9.88±2.45、18.94±3.23 cpm/μL/分；P<0.05)。シャム群におけるPYYの最大効果は、非手術群以下のED50で、非手術ラット群よりも低かった(43.77から10.20 μg/kg PYY [3-36]まで減少)。真空吸引破壊(APx)ラット群では、胃排出は、シャムオペレーション群あるいは非手術群と比べて遅かったが(9.38±3.25 cpm/μL/分；P<0.05、0.05)、PYY(3-36)の投与によっては変化しなかった。回帰分析でも用量依存性は確認されなかった。
【０２０６】
以上の結果は、正常Sprague Dawleyラットにおいて、PYY(3-36)が胃排出の速さを調節できることを示している。胃排出の用量依存的阻害は、PYYの投与後に観察された(10、30および100 μg/ラット)。PYY100μgの用量による阻害は、アミリン(10μg)による阻害とほぼ同程度であった。最後野破壊動物は、非手術群あるいはシャムオペレーション群と比較して胃排出が遅延する傾向を示した。PYY(3-36)投与は、最後野破壊動物郡において胃排出速度に及ぼす付加的な効果を持たなかった。
【０２０７】
胆嚢排出
胆嚢排出に及ぼすPYY(3-36)の効果を調べるために、８週齢NIH SWISSマウス(オス)を22.8±0.8度、12時間照明サイクル、そして任意に標準食餌(Teklad LM7012, Madison, WI)および水へのアクセスが可能な条件で飼育した。マウスは、実験前3時間絶食させた。t=0において、PYY(3-36)、CCK-8あるいは生理食塩水を意識のあるマウスに筋注した。30分後、マウスは頸椎脱臼により安死させ、中位開腹により胆嚢を取り出して秤量した。
処理群：
グループA：生理食塩水 100μl        t=0    筋注  n=14
グループB：PYY(3-36) 1μg/kg        t=0    筋注  n=6
グループC：PYY(3-36) 10μg/kg        t=0    筋注  n=10 
グループD：PYY(3-36) 100μg/kg        t=0    筋注  n=8
グループE：CCK-8 1μg/kg          t=0  筋注  n=3
グループF：CCK-8 10μg/kg          t=0    筋注  n=3
グループG：PYY(3-36) 10μg/kg + CCK-8 1μg/kg    t=0    筋注  n=4
グループH：PYY(3-36) 10μg/kg + CCK-8 10μg/kg  t=0  筋注  n=4
【０２０８】
結果は、図18および19に図示した。PYY(3-36)は、9.94μg/kg ± 0.24 logユニットのED50で、基底胆嚢排出を用量依存的に阻害した。最大用量(グループD)は、生理食塩水投与コントロール群(グループA)に比べて胆嚢重量を168％まで増加させた(P<0.005)。PYY(3-36)はCCK-8に刺激される胆嚢排出には影響を及ぼさなかった。その結果は、PYY(3-36)による阻害がCCK-依存的な経路を介していないことを示している。外因的なCCKに応答する胆嚢排出はPYY(3-36)に影響されなかった。同様の結果が意識のあるイヌにおけるPYY(3-36)で得られた；400 ng/kgボーラス投与 + 800 pmol/kg/時間の注入は、CCK-8で刺激される胆嚢収縮を阻害しなかった。
【０２０９】
PYY(3-36)の胆嚢排出に及ぼす効果がコリン迷走神経系経路を介しているということは可能である。この考え方は、特異的ペプチドYY(PYY)の結合部位が最近ラットの最後野、弧束核、および運動背側神経核(まとめて、迷走神経背側コンプレックス(DVC)と言及される)領域にオートラジオグラフィーで同定されたという知見により支持される。これらの髄脳幹領域は、運動性および分泌を含む、胃腸機能の迷走神経反射を担っている。PYY(3-36)は、胃排出のようなコリン性迷走神経メカニズムにより調節される他の消化機能を阻害する。
【０２１０】
実施例６．PYYおよびPYYアゴニストの胃保護効果
Harlan Sprague Dawleyラット(オス)を22.8±0.8度、12時間照明サイクル、そして任意に標準げっ歯類用食餌(Teklad LM485, Madison, WI)および水へのアクセスが可能な条件で飼育した。ラット(200-220グラム)は実験前20時間絶食させた。
【０２１１】
t=-30分に、PYY(3-36)あるいは生理食塩水を筋注投与した。t=0に、１mlのエタノール(エチルアルコール-200プルーフ、米薬局方適合)あるいは生理食塩水を摂取させた。t=30分に、それらラットは、５％イソフルオランで麻酔された。中位開腹切開が施された。胃を露出させ、幽門と下部食道括約部が結紮された。胃を刺激し、小彎に沿って開口し、粘膜を裏返して露出させた。粘膜は、生理食塩水で緩やかに洗浄し、処理をブラインドされた観察者によりダメージ(潰瘍、拡張した血管、粘膜裏装の脱離)が評価された。粘膜のダメージは０(ダメージなし)から５(胃の100％が充血および潰瘍で覆われいる)の間でスコアーされた。
処理グループ：
グループA：生理食塩水100μl  t=-30  筋注；１mlH2O摂食    t=0；n=4
グループB：生理食塩水100μl  t=-30  筋注；１mlエタノール摂食  t=0；n=6
グループC：PYY(3-36)1μg/kg  t=-30  筋注；１mlエタノール摂食  t=0；n=5
グループD：PYY(3-36)10μg/kg  t=-30  筋注；１mlエタノール摂食  t=0；n=4
グループE：PYY(3-36)100μg/kg  t=-30  筋注；１mlエタノール摂食  t=0；n=5
グループF：PYY(3-36)300μg/kg  t=-30  筋注；１mlエタノール摂食  t=0；n=5
【０２１２】
PYY(3-36)は、10、100および300 μg/kgを注射後、傷害スコアーをそれぞれ27.4±6.4、29.3±11.6および53.7± 7.9% (n=4、5、5、p<0.05 ANOVA)まで用量依存的に減少させた(図20)。PYY(3-36)は、ラットにおいて胃保護効果を示した。内在的に循環するPYY(3-36)は、胃酸の分泌調節や胃粘膜を保護する生理機能を果たすのかもしれない。
【０２１３】
他のペプチドも想定されるが、確かな好ましいPPFポリペプチドを以下の表に示す。
【０２１４】
【表３−１】
0005638177.tif 000015
【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
0005638177.tif 000019
【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【表３−１０】
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【表３−１１】
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【表３−１２】
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【表３−１３】
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【表３−１４】
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【表３−１５】
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【表３−１６】
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【表３−１７】
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【表３−１８】
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【表３−１９】
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【０２１５】
本発明が、好ましい例および実施例に関して記述されている一方、当該技術に熟練した人には変更や修飾が施されるであろうことが理解される。したがって、付随する請求項は、請求されたような本発明の範囲内に帰するそのような全ての同義的な変更をも包括することを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０２１６】
【図１】図１は、食餌摂取アッセイにおける本発明のPPFポリペプチドの活性を図示している。
【図２】図２は、食餌摂取アッセイにおける本発明の別のPPFポリペプチドの活性を図示している。
【図３】図３は、食餌摂取アッセイにおける本発明のまた別のPPFポリペプチドの活性を図示している。
【図４】図４は、食餌摂取アッセイにおける本発明のさらに別のPPFポリペプチドの活性を図示している。
【図５】図５は、DIOマウスモデルにおける本発明のPPFポリペプチドの活性を図示している。
【図６】図６は、DIOマウスモデルにおける本発明の別のPPFポリペプチドの活性を図示している。
【図７】図７は、ラットにおける体重増加を図示している。
【図８】図８は、食餌摂取アッセイおよびDIOマウスにおける本発明のPPFポリペプチドの活性をPYY(3-36)と比較して図示している。
【図９】図９Ａ-Ｄは、本発明のPPFポリペプチドの心拍および血圧に及ぼす影響をPYYおよびPYY(3-36)と比較して図示している。
【図１０】図10は、本発明のPPFポリペプチドの胃酸分泌活性を図示している。
【図１１】図11は、本発明のPPFポリペプチドの胃酸分泌活性を図示している。
【図１２】図12は、本発明のPPFポリペプチドの胃排出活性を図示している。
【図１３】図13は、本発明のPPFポリペプチドの胃排出活性を図示している。
【図１４】図14は、本発明のPPFポリペプチドの胃排出活性を図示している。
【図１５】図15は、本発明のPPFポリペプチドの胃排出活性を図示している。
【図１６】図16は、本発明のPPFポリペプチドの胃排出活性を図示している。
【図１７】図17は、本発明のPPFポリペプチドの胃排出活性を図示している。
【図１８】図18は、本発明のPPFポリペプチドの胆嚢排出活性を図示している。
【図１９】図19は、本発明のPPFポリペプチドの胆嚢排出活性を図示している。
【図２０】図20は、本発明のPPFポリペプチドの胃粘膜保護活性を図示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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