(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法であって、
非ヒトの複数の精子細胞を得る工程と、
該複数の精子細胞を選別ストレスにさらす工程と、
所望の特性について該複数の精子細胞を選択する工程であって、該所望の特性は性特性を含む、工程と、
タンパク質含有精子細胞エキステンダーを該複数の選択された精子細胞に加えて第１の維持促進された精子細胞混合物を形成する工程と、
該第１の維持促進された精子細胞混合物を冷却して、第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物を生成する工程と、
タンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを該第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物に加えて第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物を形成する工程と、
該第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物を冷凍する工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
前記複数の精子細胞を得る工程が複数の哺乳動物精子細胞を得る工程を含む、請求項１に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項３】
前記複数の哺乳動物精子細胞を得る工程が、ウシの精子細胞、ウマの精子細胞、ブタの精子細胞、ヒツジの精子細胞、シカの精子細胞、イヌの精子細胞、およびイルカ科の精子細胞からなる群から選択される複数の哺乳動物精子細胞を得る工程を含む、請求項２に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項４】
所望の特性について前記複数の精子細胞を選択する前記工程が、フローサイトメトリーによって実施される、請求項１に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項５】
所望の特性について前記複数の精子細胞を選択する前記工程が、該複数の精子細胞を性特性について選択する工程を含む、請求項１に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項６】
前記複数の精子細胞を性特性について選択する前記工程が、該複数の精子細胞をＸ染色体含有特性およびＹ染色体含有特性からなる群から選択される性特性について選択する工程を含む、請求項５に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項７】
タンパク質含有精子細胞エキステンダーを前記複数の選択された精子細胞に加えて第１の維持促進された精子細胞混合物を形成する前記工程が、動物ベースのタンパク質含有精子細胞エキステンダーを該複数の選択された精子細胞に加えて第１の維持促進された精子細胞混合物を形成する工程を含む、請求項１に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項８】
動物ベースのタンパク質含有精子細胞エキステンダーを前記複数の選択された精子細胞に加えて第１の維持促進された精子細胞混合物を形成する前記工程が、リポタンパク質含有精子細胞エキステンダーを該複数の選択された精子細胞に加えて第１の維持促進された精子細胞混合物を形成する工程を含む、請求項７に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項９】
リポタンパク質含有精子細胞エキステンダーを前記複数の選択された精子細胞に加えて第１の維持促進された精子細胞混合物を形成する前記工程が、卵黄含有精子細胞エキステンダーを該複数の選択された精子細胞に加えて第１の維持促進された精子細胞混合物を形成する工程を含む、請求項８に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項１０】
卵黄含有精子細胞エキステンダーを前記複数の選択された精子細胞に加えて第１の維持促進された精子細胞混合物を形成する前記工程が、５０％未満の卵黄、４５％未満の卵黄、４０％未満の卵黄、３５％未満の卵黄、３０％未満の卵黄、２５％未満の卵黄、２０％未満の卵黄、１５％未満の卵黄、１０％未満の卵黄、および５％未満の卵黄からなる群から選択される卵黄の割合を有する卵黄含有精子細胞エキステンダーを加える工程を含む、請求項９に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項１１】
卵黄含有精子細胞エキステンダーを前記複数の選択された精子細胞に加えて第１の維持促進された精子細胞混合物を形成する前記工程が、２０％の卵黄を有する卵黄含有精子細胞エキステンダーを加える工程を含む、請求項１０に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項１２】
卵黄含有精子細胞エキステンダーを前記複数の選択された精子細胞に加えて第１の維持促進された精子細胞混合物を形成する前記工程が、卵黄含有精子細胞エキステンダーを該複数の選択された精子細胞に加えて、０．８％を超える卵黄、１．６％を超える卵黄、３．２％を超える卵黄、および６．４％を超える卵黄からなる群から選択される卵黄の割合を有する第１の維持促進された精子細胞混合物を形成する工程を含む、請求項１１に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項１３】
卵黄含有精子細胞エキステンダーを前記複数の選択された精子細胞に加えて第１の維持促進された精子細胞混合物を形成する前記工程が、卵黄含有精子細胞エキステンダーを該複数の選択された精子細胞に加えて、３．２％の卵黄を有する第１の維持促進された精子細胞混合物を形成する工程を含む、請求項９に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項１４】
タンパク質含有精子細胞エキステンダーを前記複数の選択された精子細胞に加えて第１の維持促進された精子細胞混合物を形成する前記工程が、卵黄ベースのエキステンダー、ミルクベースのエキステンダー、クエン酸エキステンダー、ＴｒｉｓエキステンダーおよびＴＥＳＴエキステンダーからなる群から選択されるタンパク質含有精子細胞エキステンダーを加える工程を含む、請求項１に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項１５】
前記第１の維持促進された精子細胞混合物を冷却して第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物を生成する前記工程が、該第１の維持促進された精子細胞混合物を１０℃未満、９℃未満、８℃未満、７℃未満、６℃未満、５℃未満、４℃未満、３℃未満、２℃未満および１℃未満からなる群から選択される温度へ冷却する工程を含む、請求項１に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項１６】
前記第１の維持促進された精子細胞混合物を冷却して第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物を生成する前記工程が、該第１の維持促進された精子細胞混合物を５℃の温度に冷却する工程を含む、請求項１に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項１７】
タンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを前記第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物に加えて第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物を形成する前記工程が、グリセロール含有精子細胞エキステンダーを該第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物に加えて第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物を形成する工程を含む、請求項１に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項１８】
グリセロール含有精子細胞エキステンダーを前記第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物に加えて第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物を形成する前記工程が、３％を超えるグリセロール、６％を超えるグリセロール、１２％を超えるグリセロールおよび２４％を超えるグリセロールからなる群から選択されるグリセロールの割合を有するグリセロール含有精子細胞エキステンダーを加える工程を含む、請求項１７に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項１９】
グリセロール含有精子細胞エキステンダーを前記第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物に加えて第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物を形成する前記工程が、６％のグリセロールを有するグリセロール含有精子細胞エキステンダーを加える工程を含む、請求項１７に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項２０】
タンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを前記第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物に加えて第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物を形成する前記工程が、該第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物の量と等しい量を有するタンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを加える工程を含む、請求項１に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項２１】
前記第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物の量と等しい量を有する前記タンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを２段階で加える工程をさらに含む、請求項２０に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項２２】
タンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを前記第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物に加えて第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物を形成する前記工程が、滅菌凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを該第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物に加えて第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物を形成する工程を含む、請求項１に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項２３】
タンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを前記第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物に加えて第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物を形成する前記工程が、低密度勾配凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを該第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物に加えて第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物を形成する工程を含む、請求項１に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項２４】
低密度勾配凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを前記第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物に加えて第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物を形成する前記工程が、実質的に液状の凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを該第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物に加えて第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物を形成する工程を含む、請求項２３に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項２５】
低密度勾配凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを前記第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物に加えて第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物を形成する前記工程が、遠心分離に有効な凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを加える工程を含む、請求項２３に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項２６】
低密度勾配凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを前記第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物に加えて第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物を形成する前記工程が、実質的に均一な密度の凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを該第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物に加えて第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物を形成する工程を含む、請求項２３に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項２７】
低密度勾配凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを前記第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物に加えて第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物を形成する前記工程が、実質的に精子細胞圧縮粒子を含まない凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを加える工程を含む、請求項２３に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項２８】
低密度勾配凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを前記第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物に加えて第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物を形成する前記工程が、低粘度凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを該第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物に加えて第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物を形成する工程を含む、請求項２３に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項２９】
タンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを前記第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物に加えて第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物を形成する前記工程が、タンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを該第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物に加えて、０．４％を超える卵黄、０．８％を超える卵黄、１．６％を超える卵黄および３．２％を超える卵黄からなる群から選択される卵黄の割合を有する第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物を形成する工程を含む、請求項１に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項３０】
タンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを前記第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物に加えて第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物を形成する前記工程が、タンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを該第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物に加えて、１．６％の卵黄を有する第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物を形成する工程を含む、請求項１に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項３１】
前記第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物を未浄化状態で維持する工程をさらに含む、請求項１に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項３２】
前記未浄化の第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物を遠心分離にかける工程をさらに含む、請求項３１に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項３３】
前記遠心分離した未浄化の第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物の一部をデカントする工程をさらに含む、請求項３２に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項３４】
前記第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物の精子細胞濃度を冷凍前精子細胞濃度に調節する工程をさらに含む、請求項１に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項３５】
前記第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物の精子細胞濃度を冷凍前精子細胞濃度に調節する前記工程が、タンパク質含有精子細胞エキステンダーを該第２の維持促進された精子細胞混合物に加える工程を含む、請求項３４に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項３６】
タンパク質含有精子細胞エキステンダーを前記第２の維持促進された精子細胞混合物に加える前記工程が、動物ベースのタンパク質含有精子細胞エキステンダーを該第２の維持促進された精子細胞混合物に加える工程を含む、請求項３５に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項３７】
動物ベースのタンパク質含有精子細胞エキステンダーを前記第２の維持促進された精子細胞混合物に加える前記工程が、リポタンパク質含有精子細胞エキステンダーを該第２の維持促進された精子細胞混合物に加える工程を含む、請求項３６に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項３８】
リポタンパク質含有精子細胞エキステンダーを前記第２の維持促進された精子細胞混合物に加える前記工程が、卵黄含有精子細胞エキステンダーを該第２の維持促進された精子細胞混合物に加える工程を含む、請求項３７に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項３９】
卵黄含有精子細胞エキステンダーを前記第２の維持促進された精子細胞混合物に加える前記工程が、５０％未満の卵黄、４５％未満の卵黄、４０％未満の卵黄、３５％未満の卵黄、３０％未満の卵黄、２５％未満の卵黄、２０％未満の卵黄、１５％未満の卵黄、１０％未満の卵黄、および５％未満の卵黄からなる群から選択される卵黄の割合を有する卵黄含有精子細胞エキステンダーを加える工程を含む、請求項３８に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項４０】
卵黄含有精子細胞エキステンダーを前記第２の維持促進された精子細胞混合物に加える前記工程が、２０％の卵黄を有する卵黄含有精子細胞エキステンダーを加える工程を含む、請求項３８に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項４１】
タンパク質含有精子細胞エキステンダーを前記第２の維持促進された精子細胞混合物に加える前記工程が、３％を超えるグリセロール、６％を超えるグリセロール、１２％を超えるグリセロールおよび２４％を超えるグリセロールからなる群から選択されるグリセロールの割合を有するタンパク質含有精子細胞エキステンダーを加える工程を含む、請求項３５に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項４２】
タンパク質含有精子細胞エキステンダーを前記第２の維持促進された精子細胞混合物に加える前記工程が、タンパク質含有精子細胞エキステンダーを、６％のグリセロールを有する該第２の維持促進された精子細胞混合物に加える工程を含む、請求項３５に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項４３】
前記第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物の精子細胞濃度を冷凍前精子細胞濃度に調節する前記工程が、該第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物の精子細胞濃度を種に適当な冷凍前精子細胞濃度に調節する工程を含む、請求項３４に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項４４】
前記第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物の精子細胞濃度を種に適当な冷凍前精子細胞濃度に調節する前記工程が、該第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物の精子細胞濃度を、ウシの冷凍前精子細胞濃度、ウマの冷凍前精子細胞濃度、ブタの冷凍前精子細胞濃度、ヒツジの冷凍前精子細胞濃度、シカの冷凍前精子細胞濃度、イヌの冷凍前精子細胞濃度およびイルカ科の精子細胞濃度からなる群から選択される冷凍前精子細胞濃度に調節する工程を含む、請求項４３に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項４５】
前記第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物の精子細胞濃度を種に適当な冷凍前精子細胞濃度に調節する前記工程が、該第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物の精子細胞濃度を、１ミリリットルにつき１００，０００，０００未満の数の精子細胞、１ミリリットルにつき５０，０００，０００未満の数の精子細胞、１ミリリットルにつき４０，０００，０００未満の数の精子細胞、１ミリリットルにつき３０，０００，０００未満の数の精子細胞、１ミリリットルにつき２０，０００，０００未満の数の精子細胞、１ミリリットルにつき１５，０００，０００未満の数の精子細胞、１ミリリットルにつき１０，０００，０００未満の数の精子細胞、１ミリリットルにつき５，０００，０００未満の数の精子細胞および１ミリリットルにつき２，０００，０００未満の数の精子細胞からなる群から選択される精子細胞濃度に調節する工程を含む、請求項４３に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項４６】
前記第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物の精子濃度を種に適当な冷凍前精子細胞濃度に調節する前記工程が、該第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物の精子細胞濃度を１ミリリットルにつき１０，０００，０００の数の精子細胞に調節する工程を含む、請求項４３に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項４７】
前記第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物の精子細胞濃度を冷凍前精子細胞濃度に調節する前記工程が、５０％未満の卵黄、４５％未満の卵黄、４０％未満の卵黄、３５％未満の卵黄、３０％未満の卵黄、２５％未満の卵黄、２０％未満の卵黄、１５％未満の卵黄、および１０％未満の卵黄からなる群から選択される前記第２の維持促進された精子細胞混合物の冷凍前卵黄含量を確立する工程を含む、請求項３４に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【請求項４８】
前記第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物の精子細胞濃度を冷凍前精子細胞濃度に調節する前記工程が、該第２の維持促進された精子細胞混合物の、１６．５％の冷凍前卵黄含量を確立する工程を含む、請求項４に記載の選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００５年７月２９日に出願された米国仮出願第６０／７０４，００１号および２００５年９月２日に出願された米国本出願第１１／２１９，６０７号（上記出願の各々は、本明細書に参考として援用される）への優先権およびそれらの利益を主張する国際特許出願である。
【０００２】
一般に、本明細書で開示される本発明の技術は、精子細胞エキステンダー内のタンパク質含量を減少させる方法および装置に関する。より具体的には、この発明の技術は、多段階精子細胞維持促進過程で用いられる凍結保護物質成分のタンパク質含量を除去することを含むことができる。本発明の技術は、選別精子の用途での使用に特に適するであろう。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
精子細胞エキステンダーは、精子細胞の研究を必要とする様々な生物学分野で、一般に用いることができる。例えば、精子細胞エキステンダーを広範に使用できる一学問分野は、人工授精の分野である。自然授精は雄から雌への直接授精を含むであろうが、人工授精は一般的に、雄から精子細胞を収集すること、それらの本来の環境から取り出されたそのような精子細胞の人為操作をある程度実施すること、次に、操作した精子細胞を雌に挿入することを含むことができる。人為操作の正確な程度は、特定の用途の正確な性質に従って異なることができる。例えば、一部の人為操作は、単に、おそらく複数の雌の動物との複数の授精事象のために、収集した精子試料を複数の分量に分割することを含むことができる。しかし、他の用途は、程度のより強い人為操作を必要とするであろう。
【０００４】
例えば、人為操作は、使用目的によっては、精子細胞が示す特性に基づいて精子細胞を集団別に分類することを含むことができる。そのような用途の１つは、Ｘ染色体保有およびＹ染色体保有の精子細胞集団に精子細胞を分離する、フローサイトメトリーの使用を含むことができる。フローサイトメーターは、一般的に、流体の流れにのって伴出される精子細胞を１度に１つずつ、各精子細胞の情報を得ることができる検問領域を通して流すことによって、そのような分離を達成することができる。検問は、一般的に光学を用いることによって、例えば、おそらく、精子細胞をレーザー光線と交差させ、生じた光散乱または蛍光を測定することによって達成することができる。性特性は、おそらく、個々の精子細胞内のＤＮＡに結合する蛍光色素で精子細胞を染色することによって、判定することができる。レーザーが個々の精子細胞を照らすと、色素は蛍光を発することができる。次に、おそらく、Ｘ染色体を有する精子細胞はＹ染色体を有する精子細胞よりも多くのＤＮＡを有し、したがって、おそらく、レーザーに励起されるとより多くの蛍光を発するので、おそらく、細胞の特定および分離を可能にすることを認識することによって、性特性による精子細胞の選別を達成することができる。
【０００５】
人為操作の他の例は、おそらく、後の使用のために精子細胞を冷凍することを含むことができる。精子細胞を冷凍することは、精子細胞の効果的な使用にしばしば重要であることがあるが、その理由は、冷凍が、そうしなければ生存能力が一般的に低下する時点を越えるある期間、精子細胞の生存能力を少なくともある程度保存することができるからである。精子細胞生存能力のそのような延長は、おそらく精子細胞の代謝を遅くすることによって、および、おそらくそれによってそれらの耐用寿命を延長することによって、冷凍技術で達成することができる。詳細には、精子細胞を約１０℃冷やすごとに、精子細胞の代謝を約５０％遅くすることができることが、おそらく知られているであろう。さらに、冷凍された精子細胞は、特定の用途に便利なフォーマットで、例えばおそらく冷凍ストロー、冷凍ペレットまたは他の形態の冷凍人工標本として包装することができる。冷凍された精子細胞は、例えば精子細胞収集施設、精子細胞維持促進施設および人工授精施設が異なる場所に広く分散している場合など、長距離輸送の役に立つことができる。
【０００６】
それらの本来の環境から精子を取り出すことは、それらの生存能力を維持する自然の支持機構からそれらを移動させることになろうことは認識されよう。精子細胞エキステンダーは、精子細胞に対して少なくともある程度のそのような支持を回復する働きをすることができる。例えば、精子細胞エキステンダーの一機能は、例えば、おそらく、精子細胞が置かれるであろう媒体のｐＨまたは浸透圧を調節することによって、精子細胞を緩衝することであろう。精子細胞エキステンダーの他の機能は、おそらく、栄養素を精子細胞に供給すること、または精子細胞のエネルギー源の役目を果たすことであろう。冷凍用途においては、さらなる機能は、精子細胞に及ぼす冷凍の悪影響を最小にするための、凍結保護物質の役目を果たすことであろう。精子細胞エキステンダーのそのような機能は、少なくともある程度、任意の個々の精子細胞エキステンダーを構成する構成要素によって達成されることが認識されよう。
【０００７】
例えば、タンパク質含量は各種の精子細胞エキステンダーの頻繁に使用される構成要素であろう。タンパク質含量は、精子細胞エキステンダー内で１つまたは複数の機能を果たすことができる。タンパク質含量の主要な目的は、栄養素を提供することおよび、おそらく、精子細胞のためのエネルギー源の役目を果たすことであろう。しかし、数種類のタンパク質は凍結保護機能を有することもでき、例としては、おそらく、凍結過程によるであろう精子細胞膜から失われた脂質を補充するためのリポタンパク質の使用がある。さらに、精子細胞エキステンダーのタンパク質含量は、様々な形態をとることができる。一部のタンパク質含量は植物に基づき、例としては、大豆に由来するレシチンがある。他のタンパク質含量は動物に基づいてもよく、例としては、おそらく、普通の鶏卵を含む供与源に由来する卵黄がある。
【０００８】
凍結保護物質も、各種の精子細胞エキステンダーの頻繁に使用される構成要素の例であろう。さらに、凍結保護物質は精子細胞エキステンダー内で様々な形態をとることができる。一般的に用いられる１つの凍結保護物質は、グリセロールであろう。グリセロールは、おそらく、精子細胞内部に含まれる水およびその周辺の水に結合することによって、おそらく、その結果精子細胞を脱水することによって、および、したがっておそらく、精子細胞を損傷する可能性のある細胞内の氷の形成を減少させることによって、凍結過程で精子細胞を保護することができる。しかし、精子細胞を凍結から保護するためにグリセロールを用いることは、ある不利を伴うこともあろう。例えば、グリセロールは精子細胞に対して少なくともある程度の毒性をもたらすことがあり、それの影響はグリセロールの量が多くなるとより顕著になる可能性がある。さらに、グリセロールは精子細胞に対して高浸透圧性である可能性があり、そのことは、グリセロールを加えた精子細胞に対してある程度のショックをもたらすことがある。詳細には、グリセロールのそのような高浸透圧特性は、精子細胞膜を境にした溶質濃度の差の結果として、グリセロールと接触する精子細胞を急速に縮小または拡大させることができる。そのような急速な縮小および拡大は、おそらく精子細胞に損傷を引き起こすであろう。
【０００９】
したがって、精子細胞に及ぼすグリセロールの悪影響を最小にするために、精子細胞エキステンダーのためにある手法を開発することができた。例えば、実際問題として、おそらく、低下温度でグリセロールを精子細胞と組み合わせることが、精子細胞に及ぼすグリセロールの毒作用を低減することができることが認識されよう。したがって、グリセロールを用いる精子細胞エキステンダーは、しばしば、２つ以上のエキステンダー分画を含む多段階過程で調製することができる。さらに詳しくは、ある精子細胞エキステンダーは、グリセロールを含まない「Ａ」分画、およびグリセロールを含む「Ｂ」分画を含むことができる。このことは、精子細胞エキステンダーを２つ以上の段階で、例えば、おそらく室温で精子細胞エキステンダーのＡ分画に精子細胞を加えることができる第１段階、続いて、Ａ分画に加えた精子細胞をより低い温度に冷却し、グリセロールを含むＢ分画をそのようなより低い温度で加える第２段階で調製することを可能にする。さらに、精子細胞に及ぼすグリセロールの高浸透圧性の影響を軽減するために、おそらく、各グリセロール添加段階で精子細胞をより少ない量のグリセロールに曝露させることによって精子細胞に対するショックを低減するように、おそらくＢ分画を多段階で加えることができる。グリセロールを加えることができる段階の数は、おそらくある期間にわたってグリセロールを１滴ずつ加えることを含めて、おそらくわずか２段階または４段階からおそらく多段階まで異なることができる。
【００１０】
しかし、そのような手法における他の精子細胞エキステンダー成分とグリセロールとの相互作用は、かなりの欠点を伴う可能性がある。詳細には、卵黄などの精子細胞エキステンダーのタンパク質成分は、Ｂ分画に存在する場合、そのようなエキステンダーの取扱いの障害をもたらすことがある。これは、そのようなタンパク質成分が精子細胞エキステンダー中に形成する容積の大きさによることがある。この現象は、おそらく、遠心を必要とする、精子細胞エキステンダーのＢ分画での卵黄の使用によって強調することができる。遠心は、精子細胞を濃縮するために、様々な精子細胞用途で一般的に用いられる技術であろう。例えば、フローサイトメトリーの適用において、フローサイトメーターを通って精子細胞が通過することは、自然界で見られるものよりも低い濃度に精子細胞の濃度を希釈する傾向が見られることがある。この理由は、フローサイトメーターが一般的にシース流体内で精子細胞を伴出することを必要とし、それは精子細胞が含まれる物質の量を増加させることがあるからであろう。遠心は、おそらく、精子細胞に遠心力を加えることによってそれらを濃縮することによって、精子細胞をより高い濃度に戻すことができる。しかし、卵黄を含む精子細胞エキステンダーのＢ分画を遠心分離することは問題を起こす可能性があり、その理由は、卵黄に含まれるリポタンパク質の容積の大きさが、Ｂ分画に存在するであろう精子細胞を押しつぶすか、さもなければ損傷させる結果、そのような精子細胞を圧縮する傾向があることであろう。
【００１１】
その結果、おそらく、卵黄などのタンパク質含量を含む精子細胞エキステンダーのＢ分画を浄化することが必要であろう。浄化の目標は、おそらく、より詳細には、おそらく卵黄のリポタンパク質成分などのタンパク質濃度による凝集塊または他の局所的に高密度の領域を除去することによってそのようなタンパク質含有エキステンダーにより低く、より均一な密度を付与し、それにより精子細胞を有害に圧縮することなく遠心をおそらく達成することができるようにすることであろう。浄化は、様々な適当な方法のいずれかにより、例えばおそらく濾過により達成することができる。しかし、全ての形態の浄化は、達成するために資源の献上を必要とするであろう。例えば、浄化は、フィルターまたは他の必要な装置などの材料費、さもなければよそに捧げることのできるであろう人的資源を拘束するような人件費、精子細胞維持促進過程を遅らせる可能性のある時間経費、および、上記の全てと関連する財務費を伴うであろう。
【００１２】
さらに、卵黄などのタンパク質含量を含むように精子細胞エキステンダーのＢ分画を単に調製することは、ある程度の固有の欠点を伴う可能性がある。浄化と同様に、そのようなＢ分画の調製は、材料費、人件費、時間経費および財務費を伴うであろう。さらに、そのようなＢ分画のタンパク質含量による経時的な破壊傾向は、その使用をさらに難しくする可能性がある。詳細には、そのようなＢ分画は保存性が良くないことがあるので、それは必要に応じた調製を必要とし、おそらくスケジュールを混乱させて、Ｂ分画をさもなければ事前に大量に調製することができるならば実現することができる効率を低下させるであろう。この欠点は、特に、精子細胞の用途が、Ａ分画に対する比が比較的高いＢ分画を必要とする状況で酷いことがある。そのようなＢ分画の破壊傾向は、例えば、Ｂ分画がおそらく破壊のために細菌で汚染される可能性がある場合のように、汚染リスクをもたらすこともあり、そのことは、汚染されたＢ分画が不注意で用いられる可能性がある精子細胞用途に、悪影響を及ぼす可能性がある。そのような破壊傾向は、例えば、Ｂ分画を１つの場所から他へ、おそらく長距離にわたって輸送することが望まれるであろう場合のように、環境条件を綿密に監視することができない状況でのそのようなＢ分画の使用を制限することもある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従来の精子細胞エキステンダーに関係する上記の問題点は、長く感じられていたそれらに対する有効な解決法の必要性を示すものであろう。構成要素の実施は可能であったろうが、この必要を満たす実際の試みは、ある程度不足していたかもしれない。これは、当業者が、関係する問題および難題の性質を完全に認識または理解しなかったことによるものであろう。この理解不足の結果、これらの長く感じられていた必要を満たす試みは、ここで特定された問題または難題の１つまたは複数を効果的に解決することができなかったのであろう。これらの試みは本発明の技術によってとられる技術的な方向から離れていたでさえあろうし、本発明の技術の成果がある程度、その分野の一部の者にとられる手法の予想外の結果とみなされることさえあろう。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の技術は、精子細胞エキステンダー内のタンパク質含量を低減する方法および装置に関し、以下の特徴、すなわち、精子細胞エキステンダー内のタンパク質含量を低減する技術、精子細胞エキステンダーの凍結保護物質含有Ｂ分画内のタンパク質含量を低減する技術、浄化を必要としない精子細胞エキステンダーの調製技術、遠心分離に適する低密度勾配精子細胞エキステンダーの調製技術、精子細胞エキステンダーの調製における個々の段階の間でタンパク質含量を低減する技術、および、精子細胞エキステンダー内の低減されたタンパク質含量の新規値を確立する技術の１つまたは複数を含むことができる。したがって、本明細書で記載する精子細胞エキステンダー内のタンパク質含量を低減する方法および装置の目的物は、上記の各問題に実用的に対処する。当然、本発明のさらなる目的は、下記の記載および図面から明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の技術は様々な態様を含み、それらは異なる方法で組み合わせることができる。以下の記載は、構成要素を列挙し、本発明の技術の実施形態のいくつかを説明するために提供される。これらの構成要素は最初の実施形態で列挙されるが、それらは任意の方法で、およびいくつでも組み合わせて、さらなる実施形態を形成することができることを理解されたい。様々に記載された実施例および好ましい実施形態は、本発明の技術を、明示的に記載されたシステム、技術および用途だけに限定すると解釈されてはならない。さらに、この記載は、任意の数の開示構成要素を、各構成要素単独で、さらに、この出願または任意の以降の出願における全ての構成要素の任意のおよび全ての様々な置換および組合せで含む、全ての様々な実施形態、システム、技術、方法、装置および用途の記載および請求項を裏付けるもの、およびそれらを含むものと理解されなければならない。
【００１６】
次に主に図１に関して、一部の実施形態は、選別事象によって損傷した選別精子細胞を冷凍するための方法を含むことができる。選別事象という用語は、精子細胞が、そのような精子細胞によって保持される特性の識別に基づいて選別される様々な事象のいずれかを含むと理解されてもよく、様々な実施形態におけるそれらの例としては、免疫雌雄鑑別技術、浮力技術または、おそらく、フローサイトメトリー技術でさえも挙げることができる。損傷したという用語は、そのために精子細胞を用いることができる、例えば精子細胞の生存能力、精子細胞の生殖能または、おそらく、精子細胞の寿命も含め、いかなる所望の態様に対しても悪影響を及ぼす傾向のある、選別事象のいかなる影響も含むと理解することができる。冷凍という用語は、精子細胞を保存するためのいかなる技術も含むと理解することができ、例としては、少なくともその技法のある時点でそれらの温度を０℃未満に下げることが含まれる。
【００１７】
さらに、実施形態は複数の精子細胞を得ること、そのような複数の精子細胞を選別ストレスへさらすこと、およびそのような複数の精子細胞を所望の特性について選択することを含むことができる。得ることという用語により、精子細胞を得るための様々な公知の技術のいずれかを使用することができることと理解することができ、例として、おそらく、徒手技術または人工膣関係の技術が含まれる。選別ストレスという用語は、精子細胞が選別事象の結果として経験するであろうストレスを含むと理解することができ、選別ストレスに精子細胞をさらすことには、おそらく、単に選別事象を達成することを含めることができる。
【００１８】
一部の実施形態では、第１の維持促進された（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）精子細胞混合物を形成するために、タンパク質含有精子細胞エキステンダーを複数の選択された精子細胞に加えることができる。精子細胞エキステンダーという用語は、精子細胞に少なくともある程度の保守機能を与える物質を含むと理解することができる。そのような種類の保守機能としては、例えば、精子細胞を緩衝する役目を果たすこと、栄養素を精子細胞に提供すること、または、おそらく、精子細胞のための凍結保護物質の働きをすることさえも挙げることができる。おそらく、卵黄ベースのエキステンダー、ミルクベースのエキステンダー、クエン酸含有エキステンダー、クエン酸ナトリウム含有エキステンダー、トリス含有エキステンダーおよびＴＥＳＴ含有エキステンダーを含めて、様々な精子細胞エキステンダーが公知であろうと認識することができる。さらに、第１の維持促進された精子細胞混合物という用語は、そのようなタンパク質含有精子細胞エキステンダーのそのような複数の選択された精子細胞との組合せを含むと理解することができる。
【００１９】
様々な実施形態は、そのような第１の維持促進された精子細胞混合物を冷却して、第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物を形成することをさらに含むことができる。冷却という用語は、第１の維持促進された精子細胞混合物の温度を、０℃より上の任意の温度に下げることを含むと理解することができる。冷却は、おそらく様々な周知技術、例えばおそらく冷蔵、水浴または氷浴のいずれかによって達成することができる。様々な実施形態において、第１の維持促進された精子細胞混合物は、おそらく約１０℃未満、約９℃未満、約８℃未満、約７℃未満、約６℃未満、約５℃未満、約４℃未満、約３℃未満、約２℃未満、または、おそらく、約１℃未満までさえも冷却することができる。ある実施形態は、第１の維持促進された精子細胞混合物を約５℃まで冷却することを含むことができる。さらに、一部の実施形態では第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物を形成するために、タンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーをそのような第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物に加えることができる。第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物という用語は、そのような第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物のそのようなタンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーとの組合せを含むと理解することができる。様々な実施形態は、そのような第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物を冷凍することを含むこともできる。
【００２０】
一部の実施形態では、第１の維持促進された精子細胞混合物はある割合の卵黄を含むことができる。これは、例えば、複数の選択された精子細胞に加えられるタンパク質含有精子細胞エキステンダーの中に含まれるタンパク質量の関数でよく、そのようなタンパク質は卵黄でよい。様々な実施形態において、第１の維持促進された精子細胞混合物の中に含まれる卵黄の割合としては、約０．８％を超える卵黄、約１．６％を超える卵黄、約３．２％を超える卵黄または、おそらく、約６．４％を超える卵黄さえも挙げることができる。一部の実施形態は、第１の維持促進された精子細胞混合物中に含まれる約３．２％の割合の卵黄を含むことができる。
【００２１】
さらに、一部の実施形態では第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物も、ある割合の卵黄を含むことができる。これは、例えば、おそらくタンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物に加えることによる希釈効果の関数であることができる。様々な実施形態において、第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物の中に含まれる卵黄の割合としては、約０．４％を超える卵黄、約０．８％を超える卵黄、約１．６％を超える卵黄または、おそらく、約３．２％を超える卵黄さえも挙げることができる。一部の実施形態は、第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物中に含まれる約１．６％の割合の卵黄を含むことができる。
【００２２】
一部の実施形態では、第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物は、未浄化状態で維持することができる。第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物を未浄化状態で維持する場合には、遠心分離のいかなる段階より前に、そのような第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物を浄化してはいけないことが理解されよう。さらに、ある実施形態は、そのような第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物を遠心分離にかけることを含むことができる。この遠心分離は、おそらく、そのような第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物中に含まれる精子細胞を、おそらく、そのような精子細胞に遠心力を加えることにより、密度に基づいて第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物の他の成分から精子細胞を分離することによって、濃縮する役目を果たすことができる。様々な実施形態は、そのような遠心分離された第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物の一部をデカントすることを、さらに含むことができる。例えば、遠心分離によって濃縮された精子細胞はほとんど１つの領域に集めることができ、容積部分を除去することは、おそらく、そのような濃縮された精子細胞を含んでいる容積部分を除去すること、または、おそらく、そのような濃縮された精子細胞を含まない全ての容積部分を除去することさえ含むことができる。
【００２３】
次に主に図２に関して、一部の実施形態は、選別事象によって損傷した選別精子細胞を処理するための方法を含むことができる。処理という用語は、そのような精子細胞の少なくとも１つの特性を少なくともある程度変えるために精子細胞を処理する、いかなる事象も含むと理解することができる。様々な実施形態において、処理は、例えば、そのような精子細胞の冷凍、解凍、または、おそらく、遠心分離さえ含むことができる。
【００２４】
さらに、実施形態は複数の精子細胞を得ること、そのような複数の精子細胞を選別ストレスへさらすこと、およびそのような複数の精子細胞を所望の特性について選択することを含むことができる。一部の実施形態は、タンパク質非含有精子細胞エキステンダーを提供すること、タンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを提供すること、および、そのようなタンパク質非含有精子細胞エキステンダーをそのようなタンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーと組み合わせて凍結保護物質含有遠心分離媒体を形成することを、さらに含むことができる。遠心分離媒体という用語は、ある時点で遠心分離される精子細胞に資する、いかなる媒体も含むと理解することができる。
【００２５】
一部の実施形態では、そのようなタンパク質非含有精子細胞エキステンダーをそのようなタンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーと組み合わせて凍結保護物質含有遠心分離媒体を形成することは、冷温で達成することができる。そのような冷温には、約１０℃未満、約９℃未満、約８℃未満、約７℃未満、約６℃未満、約５℃未満、約４℃未満、約３℃未満、約２℃未満、または、おそらく、約１℃未満でさえ含めることができる。ある実施形態は、約５℃でそのようなタンパク質非含有精子細胞エキステンダーをそのようなタンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーと組み合わせて、凍結保護物質含有遠心分離媒体を形成することを含むことができる。
【００２６】
一部の実施形態では、凍結保護物質含有遠心分離媒体は、未浄化状態で維持することができる。未浄化状態は、浄化されていない物質が存在する可能性がある状態を含むと、理解することができる。浄化は、物質により低く、より均一な密度を付与することを含むと理解することができ、おそらく、濾過または布ごしなどの技術を含むことができる。凍結保護物質含有遠心分離媒体を未浄化状態で維持する場合には、遠心分離のいかなる段階より前に、そのような凍結保護物質含有遠心分離媒体を浄化してはいけないことが理解されよう。
【００２７】
様々な実施形態は、選別ストレスを受けて所望の特性について選択された複数の精子細胞を、そのような未浄化凍結保護物質含有遠心分離媒体に加えて、おそらく未浄化凍結保護物質含有精子細胞遠心分離媒体を形成することをさらに含むことができる。未浄化凍結保護物質含有精子細胞遠心分離媒体という用語は、おそらく、単に、そのような複数の精子細胞が加えられた未浄化凍結保護物質含有遠心分離媒体を含むと理解することができる。さらに、ある実施形態は、そのような未浄化凍結保護物質含有精子細胞遠心分離媒体を遠心分離にかけることを含むことができる。遠心分離という用語は、その物質の少なくとも２個の構成要素を密度に基づいて分離するために、その物質に遠心力を加えることを含むと理解することができる。この遠心分離は、おそらく、そのような未浄化凍結保護物質含有精子細胞遠心分離媒体に含まれる精子細胞を、おそらく、そのような精子細胞に遠心力を加えることにより、密度に基づいて未浄化凍結保護物質含有精子細胞遠心分離媒体の他の成分から精子細胞を分離することによって、濃縮する役目を果たすことができる。
【００２８】
様々な実施形態は、そのような遠心分離された未浄化凍結保護物質含有精子細胞遠心分離媒体の一部をデカントすることをさらに含むことができる。デカントすることは、ある物質、おそらくそのような遠心分離された未浄化凍結保護物質含有精子細胞遠心分離媒体の少なくとも一部の容積部分を除去することを含むと理解することができ、それはおそらく、例えばそのような容積部分を注ぎ出すことを含め、様々な周知の技術のいずれかによって達成することができる。注目すべきことに、除去するそのような容積部分を、そのような容積部分に存在する遠心分離された成分の量に基づいて選択することができる可能性がある。例えば、遠心分離によって濃縮された精子細胞はほとんど１つの領域に集めることができ、ある容積部分を除去することは、おそらく、そのような濃縮された精子細胞を含んでいる容積部分を除去すること、または、おそらく、そのような濃縮された精子細胞を含まない全ての容積部分を除去することさえ含むことができる。
【００２９】
ある実施形態は、タンパク質含有精子細胞エキステンダーを提供し、そのようなタンパク質含有精子細胞エキステンダーを凍結保護物質含有遠心分離媒体と組み合わせて、タンパク質含有凍結保護物質含有遠心分離媒体を生成することをさらに含むことができる。さらに、様々な実施形態は、選別ストレスを受けて所望の特性について選択された複数の精子細胞を、そのようなタンパク質含有凍結保護物質含有遠心分離媒体に加えて、タンパク質含有凍結保護物質含有精子細胞遠心分離媒体を形成することをさらに含むことができる。一部の実施形態は、そのようなタンパク質含有凍結保護物質含有精子細胞遠心分離媒体を未浄化状態で維持することをさらに含むことができる。
【００３０】
さらに、ある実施形態では、そのようなタンパク質含有凍結保護物質含有精子細胞遠心分離媒体は、ある割合の卵黄を含むことができる。これは、例えば、凍結保護物質含有遠心分離媒体と組み合わされたタンパク質含有精子細胞エキステンダーに含まれるタンパク質量の関数でよく、そのようなタンパク質は卵黄でよい。様々な実施形態において、タンパク質含有凍結保護物質含有精子細胞遠心分離媒体に含まれる卵黄の割合としては、約０．４％を超える卵黄、約０．８％を超える卵黄、約１．６％を超える卵黄、または、おそらく、約３．２％を超える卵黄さえも挙げることができる。一部の実施形態は、タンパク質含有凍結保護物質含有精子細胞遠心分離媒体に含まれる約１．６％の割合の卵黄を含むことができる。
【００３１】
一部の実施形態では、タンパク質含有凍結保護物質含有精子細胞遠心分離媒体を遠心分離にかけることは、おそらく、選別精子細胞を遠心分離する一般的な方法で利用される遠心分離媒体と比較して、わずかな割合の卵黄を有するそのようなタンパク質含有凍結保護物質含有精子細胞遠心分離媒体を遠心分離することを含むことができる。選別精子細胞を遠心分離する一般的な方法は、おそらく、本明細書で開示される新規技術を利用しない全ての選別精子細胞遠心分離法を含むと理解することができ、特に、おそらく、当技術分野で公知であろう選別精子細胞遠心分離法を含むことができる。さらに、一部分という用語は、そのような一般的な方法で利用される遠心分離媒体に含まれるものよりも少ない量の卵黄を含むと理解することができる。一部の実施形態では、そのような一部分には、おそらく、選別精子細胞を遠心分離する一般的な方法で利用される遠心分離媒体と比較して約５０％未満、選別精子細胞を遠心分離する一般的な方法で利用される遠心分離媒体と比較して約２５％未満、選別精子細胞を遠心分離する一般的な方法で利用される遠心分離媒体と比較して約１０％未満、選別精子細胞を遠心分離する一般的な方法で利用される遠心分離媒体と比較して約５％未満、選別精子細胞を遠心分離する一般的な方法で利用される遠心分離媒体と比較して約４％未満、選別精子細胞を遠心分離する一般的な方法で利用される遠心分離媒体と比較して約３％未満、選別精子細胞を遠心分離する一般的な方法で利用される遠心分離媒体と比較して約２％未満、または、おそらく、選別精子細胞を遠心分離する一般的な方法で利用される遠心分離媒体と比較して約１％未満でさえも含めることができる。一部の実施形態では、選別精子細胞を遠心分離する一般的な方法で利用される遠心分離媒体と比較してそのようなわずかな割合の卵黄は、約３％未満の卵黄を有するタンパク質含有凍結保護物質含有精子細胞遠心分離媒体でよい。一部の実施形態は、おそらく、グリセロールを含み、約１１％未満の卵黄を有するタンパク質含有凍結保護物質含有精子細胞遠心分離媒体を遠心分離することを含むことさえできる。
【００３２】
次に主に図３に関して、一部の実施形態は、選別事象によって損傷した選別精子細胞を維持促進するための方法を含むことができる。維持促進という用語は、精子細胞に、精子細胞エキステンダーの機能の少なくとも１つまたは複数を与えることを含むと理解することができる。
【００３３】
さらに、様々な実施形態は複数の精子細胞を得ること、そのような複数の精子細胞を選別ストレスへさらすこと、およびそのような複数の精子細胞を所望の特性について選択することを含むことができる。実施形態は、第１のタンパク質含量価（ｃｏｎｔｅｎｔ  ｖａｌｕｅ）を有するタンパク質含有精子細胞エキステンダーを確立することを、さらに含むことができる。そのような第１のタンパク質含量価は、そのようなタンパク質含量を変化させる可能性のある以降のあらゆる事象の前の、そのような確立されたタンパク質含有精子細胞エキステンダーのタンパク質含量を含むと理解することができる。
【００３４】
様々な実施形態は、選別ストレスを受けて所望の特性について選択された複数の精子細胞を第１のタンパク質含量価を有するタンパク質含有精子細胞エキステンダーに加えること、および、おそらくタンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを含むタンパク質非含有精子細胞エキステンダーを、第１のタンパク質含量価を有する前記タンパク質含有精子細胞エキステンダーに加えることを含むこともできる。様々な実施形態において、タンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを、第１のタンパク質含量価を有するタンパク質含有精子細胞エキステンダーに加えることは、冷温で達成することができる。そのような冷温には、約１０℃未満、約９℃未満、約８℃未満、約７℃未満、約６℃未満、約５℃未満、約４℃未満、約３℃未満、約２℃未満、または、おそらく、約１℃未満でさえ含めることができる。ある実施形態は、約５℃でタンパク質非含有精子細胞エキステンダーを、第１のタンパク質含量価を有するタンパク質含有精子細胞エキステンダーに加えることを含むことができる。
【００３５】
さらに、一部の実施形態は、第１のタンパク質含量価を有するそのようなタンパク質含有精子細胞エキステンダーの総タンパク質含量を、そのような第１のタンパク質含量価より低い第２のタンパク質含量価に低減することをさらに含むことができる。総タンパク質含量は、おそらく単に任意の所与の時間におけるタンパク質含有精子細胞エキステンダーの総タンパク質量であることができ、総タンパク質含量を低減するという用語は、おそらくタンパク質含量を直接的に除去すること、または、おそらく単にそのようなタンパク質含有精子細胞エキステンダー内の非タンパク質成分の量を増加させることを含めて、そのような低減を達成するための様々な適当な方法のいずれかを含むと理解することができる。
【００３６】
一部の実施形態では、第１のタンパク質含量価は、例えばそのようなタンパク質が卵黄でよい場合、ある割合の卵黄を含むことができる。様々な実施形態において、そのような卵黄の割合の例としては、約０．８％を超える卵黄、約１．６％を超える卵黄、約３．２％を超える卵黄、または、おそらく、約６．４％を超える卵黄さえも挙げることができる。一部の実施形態は、約３．２％の割合の卵黄を含むことができる。
【００３７】
さらに、一部の実施形態では、総タンパク質含量をそのような第１のタンパク質含量価よりも低い第２のタンパク質含量価に低減することは、そのようなタンパク質含有精子細胞エキステンダーの卵黄の割合を低減することを含むことができる。これは、例えば、おそらく複数の精子細胞を加え、および、タンパク質非含有精子細胞エキステンダーをそのようなタンパク質含有精子細胞エキステンダーに加えることによる、希釈効果の関数であることができる。様々な実施形態において、そのような第２のタンパク質含量価の卵黄の割合の例としては、約０．４％を超える卵黄、約０．８％を超える卵黄、約１．６％を超える卵黄、または、おそらく、約３．２％を超える卵黄さえも挙げることができる。一部の実施形態では、そのような第２のタンパク質含量価の卵黄の割合は、約１．６％でよい。
【００３８】
一部の実施形態では、第２のタンパク質含量価を有するそのようなタンパク質含有精子細胞エキステンダーを、未浄化状態で維持することができる。第２のタンパク質含量価を有するタンパク質含有精子細胞エキステンダーを未浄化状態で維持する場合には、遠心分離のいかなる段階よりも前に、第２のタンパク質含量価を有するそのようなタンパク質含有精子細胞エキステンダーを浄化してはならないと理解することができる。さらに、ある実施形態は、第２のタンパク質含量価を有するそのようなタンパク質含有精子細胞エキステンダーを遠心分離にかけることを含むことができる。この遠心分離は、おそらく、第２のタンパク質含量価を有するそのようなタンパク質含有精子細胞エキステンダーに含まれる精子細胞を、おそらく、精子細胞に遠心力を加えることにより、密度に基づいて第２のタンパク質含量価を有するタンパク質含有精子細胞エキステンダーの他の成分からそのような精子細胞を分離することによって、濃縮する役目を果たすことができる。様々な実施形態は、第２のタンパク質含量価を有するそのような遠心分離されたタンパク質含有精子細胞エキステンダーの一部をデカントすることをさらに含むことができる。例えば、遠心分離によって濃縮された精子細胞はほとんど１つの領域に集めることができ、ある容積部分を除去することは、おそらく、そのような濃縮された精子細胞を含んでいる容積部分を除去すること、または、おそらく、そのような濃縮された精子細胞を含まない全ての容積部分を除去することさえも含むことができる。
【００３９】
様々な実施形態は、補助的なタンパク質含有精子細胞エキステンダーを第２のタンパク質含量価を有するタンパク質含有精子細胞エキステンダーに加え、そのようなタンパク質含有精子細胞エキステンダーの総タンパク質含量を第１のタンパク質含量価よりも高い第３のタンパク質含量価に増加させることを含むこともできる。補助的なタンパク質含有精子細胞エキステンダーという用語は、第２のタンパク質含量価を有するタンパク質含有精子細胞エキステンダーを補う、いかなる追加のタンパク質含有精子細胞エキステンダーを含むと理解することができる。補うという用語は、追加の精子細胞エキステンダー成分を加えること、例えば、おそらく、追加の量のタンパク質を加えることを含むと理解することができる。
【００４０】
さらに、一部の実施形態では、総タンパク質含量を第３のタンパク質含量価に増加させることは、そのようなタンパク質含有精子細胞エキステンダーの卵黄の割合を増加させることを含むことができる。これは、例えば、おそらく、補助的なタンパク質含有精子細胞エキステンダーを、第２のタンパク質含量価を有するタンパク質含有精子細胞エキステンダーに加えることの関数でよい。様々な実施形態において、そのような第３のタンパク質含量価の卵黄の割合の例としては、約１％を超える卵黄、約５％を超える卵黄、約１０％を超える卵黄、約１５％を超える卵黄、約２０％を超える卵黄、約２５％を超える卵黄、または、おそらく、約５０％を超える卵黄さえも挙げることができる。一部の実施形態では、そのような第３のタンパク質含量価の卵黄の割合は、約１６．５％でよい。さらに、様々な実施形態は、第１のタンパク質含量価よりも高い第３のタンパク質含量価を有するタンパク質含有精子細胞エキステンダーを冷凍することを含むことができる。
【００４１】
次に図１〜３に関し、様々な実施形態において、複数の精子細胞としては、例えば、おそらくウシの複数の精子細胞、ウマの複数の精子細胞、ブタの複数の精子細胞、ヒツジの複数の精子細胞、シカの複数の精子細胞、イヌの複数の精子細胞、または、おそらく、イルカ科の複数の精子細胞さえも含む、哺乳動物の複数の精子細胞をおそらく挙げることができる。さらに、一部の実施形態は、所望の特性についてそのような複数の精子細胞を選択することを含むことができる。選択するという用語は、個々の精子細胞を、それらが求める所望の特性を所有するかどうかについての判定に基づいて特定することを含むと理解することができる。一部の実施形態では、所望の特性について精子細胞を選択することは、精子細胞を選別することを含むことができる。選別という用語は、所望の特性を有する選択された精子細胞をそのような所望の特性を有さない精子細胞から分離して、おそらく、例えばそのような所望の特性を有する精子細胞の集団およびそのような所望の特性を有さない精子細胞の集団へ分ける働きをすることを含むと理解することができる。精子細胞の選別は、おそらく免疫雌雄鑑別技術、浮力技術または、おそらく、フローサイトメトリー法も含めて、様々な適当な技術のいずれかによって達成することができる。さらに、所望の特性という用語は、所与の精子細胞用途に望まれる精子細胞のいかなる識別可能な特性も含むと理解することができる。例えば、一部の実施形態において、所望の特性としては精子細胞の性特性、おそらく精子細胞のＸ染色体含有特性も、または、精子細胞のＹ染色体含有特性も挙げることができる。
【００４２】
様々な実施形態において、タンパク質含有精子細胞エキステンダーという用語は、少なくともある程度のタンパク質含量を含むいかなる精子細胞エキステンダーも含むと理解することができる。さらに、様々な実施形態において、タンパク質含有精子細胞エキステンダーは、おそらく、植物ベースのタンパク質含量または、おそらく、動物ベースのタンパク質含量を含むことができ、それは、それぞれ植物性供与源および動物性供与源に由来するタンパク質を含むと理解することができる。ある実施形態では、動物ベースのタンパク質含有精子細胞エキステンダーは、おそらく、リポタンパク質含有精子細胞エキステンダーを含むことができる。リポタンパク質は、おそらく、そのようなタンパク質の少なくとも１成分が脂質であるタンパク質のサブクラスであることができると認識することができる。そのようなリポタンパク質含量は、おそらく鶏卵を含めて様々な動物卵から収集された卵黄をおそらく含め、様々な動物性供与源におそらく由来することができる。
【００４３】
したがって、ある実施形態では、タンパク質含有精子細胞エキステンダーは、おそらく、卵黄含有精子細胞エキステンダーを含むことができる。そのような卵黄含有精子細胞エキステンダーの正確な卵黄含量は、精子細胞が用いられるであろう特定の用途の必要性に従い変えてもよいと認識することができる。しかし、一部の実施形態において、卵黄含有精子細胞エキステンダーの卵黄含量の例としては、約５０％未満の卵黄、約４５％未満の卵黄、約４０％未満の卵黄、約３５％未満の卵黄、約３０％未満の卵黄、約２５％未満の卵黄、約２０％未満の卵黄、約１５％未満の卵黄、約１０％未満の卵黄、または、おそらく約５％未満の卵黄さえも挙げることができる。ある実施形態では、卵黄含有精子細胞エキステンダーの卵黄含量は、約２０％の卵黄であることができる。
【００４４】
様々な実施形態で、凍結保護物質を精子細胞エキステンダーの構成要素として含めることができる。したがって、様々な実施形態で、精子細胞エキステンダーは、おそらく、タンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを、または、おそらく、タンパク質含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーさえも含むことができる。おそらく、様々な公知の凍結保護物質が精子細胞エキステンダーへのそのような添加物として適当であろうと、認識することができる。様々な実施形態において、おそらく、そのような凍結保護物質にはグリセロールが含まれるであろう。そのようなグリセロール含有精子細胞エキステンダーの正確なグリセロール分は、精子細胞が用いられるであろう特定の用途の必要性に従い変えてもよいと認識することができる。しかし、一部の実施形態において、グリセロール含有精子細胞エキステンダーは、約３％を超えるグリセロール、約６％を超えるグリセロール、約１２％を超えるグリセロール、または、おそらく約２４％を超えるグリセロールさえも有することができる。ある実施形態では、グリセロール含有精子細胞エキステンダーのグリセロール分は、約６％であることができる。
【００４５】
さらに、ある実施形態において、ある物質に対してタンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーをその物質と等量で加えることができ、おそらく、そのような付加を多段階で達成することを含む。例えば、タンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物に加えることは、そのような第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物の量に等しい量を有するそのようなタンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを、おそらく２つ以上の段階で加えることを含むことができる。同様に、タンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーおよびタンパク質非含有精子細胞エキステンダーを組み合わせることは、そのようなタンパク質非含有精子細胞エキステンダーの量に等しい量のそのようなタンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを、おそらく２つ以上の段階で加えることを含むことができる。さらに、タンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーをタンパク質含有精子細胞エキステンダーに加えることは、そのようなタンパク質含有精子細胞エキステンダーの量に等しい量を有するそのようなタンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを、おそらく２つ以上の段階で加えることを含むことができる。
【００４６】
ある実施形態では、タンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーは、低密度勾配凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを含むことができる。したがって一部の実施形態では、タンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物に加えることは、低密度勾配凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーをそのような第１の冷却され維持促進された精子細胞混合物に加えることを含むことができる。さらに、一部の実施形態において、タンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを提供することは、低密度勾配凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを提供することを含むことができる。また、一部の実施形態において、タンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーをタンパク質含有精子細胞エキステンダーに加えることは、低密度勾配凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーをそのようなタンパク質含有精子細胞エキステンダーに加えることを含むことができる。
【００４７】
低密度勾配という用語は、その容積を通して最小限の密度変化を有する精子細胞エキステンダーを含むと理解することができる。一部の実施形態において、低密度勾配凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーは、おそらく、実質的に液状の凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを含むことができる。実質的に液状という用語は、凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーの全ての構成要素が実質的に液体状態にある凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを含むと、理解することができる。様々な実施形態において、低密度勾配凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーは、おそらく、遠心分離に有効な凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを含むことができる。遠心分離に有効なという用語は、例えば、おそらく、その構成要素の明らかに区別される密度差、または、おそらく、その構成要素のあるものに圧縮リスクをもたらすことができる局在的な高密度領域の欠如さえも含め、遠心分離に資する特性を有する凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを含むと理解することができる。様々な実施形態において、低密度勾配凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーは、おそらく、実質的に均一な密度の凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを含むことができ、それは、最小数のより高い密度の局在的領域を含み、おそらく、局在的なより高い密度の領域をほとんど含みさえしないと理解することができる。様々な実施形態において、低密度勾配凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーは、おそらく、精子細胞圧縮粒子を実質的に含まない凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを含むことができる。精子細胞圧縮粒子という用語は、おそらく遠心力を含む各種の力にさらされると、損傷を与えるほど精子細胞を圧縮する傾向があるであろういかなる粒子、または集合した粒子の群を含むと理解することができる。様々な実施形態では、低密度勾配凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーは、おそらく、低粘度凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを含むことができる。低粘度という用語は、他のいかなる構成要素がいかなる構成要素を圧縮する傾向もなく、その構成要素が互いにすり抜けることを可能にするのに十分な凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーの粘度を含むと理解することができる。
【００４８】
様々な実施形態は、ある物質の精子濃度を冷凍前精子濃度に調節することを含むことができる。冷凍前精子濃度という用語は、そのような精子細胞がその後冷凍されるであろう精子濃度を含むと理解することができる。例えば、一部の実施形態は、第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物の精子濃度を冷凍前精子濃度に調節することを含むことができ、他の実施形態は、第２のタンパク質含量価を有するタンパク質含有精子細胞エキステンダーの精子濃度を冷凍前精子濃度に調節することを含むことができる。様々な実施形態において、そのような冷凍前精子濃度に調節することは、例えば、おそらく、タンパク質含有精子細胞エキステンダーを第２の維持促進された精子細胞混合物に加えること、または、おそらく、補助的なタンパク質含有精子細胞エキステンダーを、第２のタンパク質含量価を有するタンパク質含有精子細胞エキステンダーに加えることを含む、タンパク質含有精子細胞エキステンダーを加えることを含むことができる。
【００４９】
様々な実施形態では、精子濃度を冷凍前精子濃度に調節することは、精子濃度を種に適当な冷凍前濃度に調節することを含むことができる。種に適当な冷凍前精子濃度という用語は、そのような精子細胞が得られた動物種に適当である、そのような精子細胞がその後冷凍されるであろう精子濃度を含むと理解することができる。種に適当な冷凍前精子濃度は様々な動物種で知ることができること、または、おそらく、いくつかの冷凍事象についての通常の経験的観察を通して決定することさえできると、認識することができる。一部の実施形態では、種に適当な冷凍前精子濃度としては、ウシの冷凍前精子濃度、ウマの冷凍前精子濃度、ブタの冷凍前精子濃度、ヒツジの冷凍前精子濃度、シカの冷凍前精子濃度、イヌの冷凍前精子濃度、または、おそらくイルカ科の精子濃度さえも挙げることができる。さらに、様々な実施形態において、種に適当な冷凍前精子濃度の例としては、１ミリリットルにつき約１００，０００，０００未満の数の精子細胞、１ミリリットルにつき約５０，０００，０００未満の数の精子細胞、１ミリリットルにつき約４０，０００，０００未満の数の精子細胞、１ミリリットルにつき約３０，０００，０００未満の数の精子細胞、１ミリリットルにつき約２０，０００，０００未満の数の精子細胞、１ミリリットルにつき約１５，０００，０００未満の数の精子細胞、１ミリリットルにつき約１０，０００，０００未満の数の精子細胞、１ミリリットルにつき約５，０００，０００未満の数の精子細胞、または、おそらく、１ミリリットルにつき約２，０００，０００未満の数の精子細胞さえ挙げることができる。ある実施形態では、おそらくウシの冷凍前精子濃度にかかわるものを含め、種に適当な冷凍前濃度は、１ミリリットルにつき約１０，０００，０００の数の精子細胞であることができる。
【００５０】
一部の実施形態では、精子濃度を冷凍前精子濃度に調節することは、冷凍前卵黄含量を確立することを含むことができる。例えば、第２の冷却され維持促進された精子細胞混合物の精子濃度を冷凍前精子濃度に調節することは、そのような第２の維持促進された精子細胞混合物の冷凍前卵黄含量を確立することを含むことができる。同様に、第２のタンパク質含量価を有するタンパク質含有精子細胞エキステンダーの精子濃度を冷凍前精子濃度に調節することは、そのようなタンパク質含有精子細胞エキステンダーの冷凍前卵黄含量を確立することを含むことができる。冷凍前卵黄含量は、おそらく、冷凍前濃度の物質の卵黄含量を単に含むと理解することができる。様々な実施形態において、冷凍前卵黄含量は、選別精子細胞を冷凍する一般的な方法の卵黄含量の割合の範囲内の卵黄含量を含むことができる。選別精子細胞を冷凍するそのような一般的な方法は、おそらく、本明細書で開示される新規技術を利用しない全ての選別精子細胞冷凍方法を含むと理解することができ、特に、おそらく、当技術分野で公知であろう選別精子細胞冷凍方法を含むことができる。様々な実施形態において、冷凍前卵黄含量としては、おそらく、一般的な選別精子細胞冷凍方法の冷凍前卵黄含量の約５０％以内、一般的な選別精子細胞冷凍方法の冷凍前卵黄含量の約２５％以内、一般的な選別精子細胞冷凍方法の冷凍前卵黄含量の約２０％以内、一般的な選別精子細胞冷凍方法の冷凍前卵黄含量の約１５％以内、一般的な選別精子細胞冷凍方法の冷凍前卵黄含量の約１０％以内、一般的な選別精子細胞冷凍方法の冷凍前卵黄含量の約５％以内、一般的な選別精子細胞冷凍方法の冷凍前卵黄含量の約２％以内、および、おそらく、一般的な選別精子細胞冷凍方法の冷凍前卵黄含量の約１％以内でさえ挙げることができる。
【００５１】
さらに、ある実施形態において、冷凍前卵黄含量は、おそらく、約５０％未満の卵黄、約４５％未満の卵黄、約４０％未満の卵黄、約３５％未満の卵黄、約３０％未満の卵黄、約２５％未満の卵黄、約２０％未満の卵黄、約１５％未満の卵黄、または、おそらく、約１０％未満の卵黄の絶対価でも、確立することができる。一部の実施形態では、冷凍前卵黄含量は、約１６．５％で確立することができる。
【００５２】
無菌の精子細胞エキステンダーの使用を、ある実施形態で含むことができる。例えば、様々な実施形態において、タンパク質非含有精子細胞エキステンダーは無菌のタンパク質非含有精子細胞エキステンダーを含むことができ、タンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーは無菌のタンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーを含むことができる。
【００５３】
次に、さらに主に図１に関し、様々な実施形態は初期混合物（１）を含むことができ、様々な実施形態で、それは、おそらく、初期の損傷した選別精子細胞の混合物を含むことができる。混合物は、２つ以上の物質を混合された状態で含むと理解することができ、初期混合物（１）は、混合することができる任意の２つの構成成分に関して完全飽和未満の混合物を含むと理解することができる。様々な実施形態において、初期混合物（１）は、おそらく、５０％未満の飽和、２５％未満の飽和、１０％未満の飽和、５％未満の飽和、２％未満の飽和、または、おそらく１％未満の飽和さえも達成した混合物を含むことができる。
【００５４】
一部の実施形態は、２つ以上の発生期（ｎａｓｃｅｎｔ）の物質を初期混合物の関係で含むことができる。初期混合物の関係は、初期混合物（１）の中に一緒に存在する関係にある２つ以上の物質を含むと、理解することができる。発生期の物質は、初期混合物の関係で他の物質と飽和未満の組合せで存在する物質を含むと、理解することができる。さらに、一部の実施形態で、混合物は２つ以上の発生期の成分を含むことができ、そのような成分は、初期混合物（１）の成分であると理解することができる。例えば、様々な実施形態は、初期混合物の関係の所望の特性について選択された発生期の複数の精子細胞（２）、初期混合物の関係の発生期のタンパク質非含有精子細胞エキステンダー成分（３）、初期混合物の関係の発生期のタンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダー成分（４）、または、おそらく、初期混合物の関係の発生期のタンパク質含有精子細胞エキステンダー成分（５）でさえ、含むことができる。
【００５５】
一部の実施形態において、発生期の物質は、初期混合物（１）の少なくとも１つの成分の最も近くに実質的に未結合の状態で位置する物質を含むことができる。最も近くに位置するという用語は、その２つの組合せを可能にするように初期の混合物（１）のそのような成分と十分に近いそのような発生期の物質の位置を含むと、理解することができる。実質的に未結合の状態という用語は、初期混合物（１）のそのような成分とほとんど不飽和の結合の状態にあるそのような発生期の物質の存在を含むと理解することができ、それは、おそらく、５０％を超えるものが結合されずに存在すること、７５％を超えるものが結合されずに存在すること、９０％を超えるものが結合されずに存在すること、９５％を超えるものが結合されずに存在すること、または、おそらく、９９％を超えるものが結合されずに存在することさえ、含むことができる。例えば、様々な実施形態は、初期混合物（１）の少なくとも１つの成分の最も近くに実質的に未結合の状態で位置する、所望の特性について選択された複数の精子細胞、初期混合物（１）の少なくとも１つの成分の最も近くに実質的に未結合の状態で位置するタンパク質非含有精子細胞エキステンダー成分、初期混合物（１）の少なくとも１つの成分の最も近くに実質的に未結合の状態で位置するタンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダー成分、または、おそらく、初期混合物（１）の少なくとも１つの成分の最も近くに実質的に未結合の状態で位置するタンパク質含有精子細胞エキステンダー成分さえ含むことができる。
【００５６】
さらに、ある実施形態は、発生期の物質および初期混合物（１）の成分の間で、障壁のないゾーンを含むことができる。そのような障壁のないゾーンは、そのような発生期の物質および初期混合物（１）のそのような成分の結合を阻止する傾向があるような要素を全く含まないゾーンを含むと理解することができる。一部の実施形態は、発生期の物質および初期混合物（１）の成分がそれに対して応答性であることができる、誘導結合力（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒｃｅ）を含むことさえできる。そのような誘導結合力は、初期混合物の関係にある２つ以上の物質の結合を誘導する傾向がある、いかなる力も含むと理解することができる。誘導結合力の例としては、おそらく、密度関連の力、濃度関連の力、または、おそらく、様々な液体を容器に入れることによって生じる単純流体力さえ挙げることができる。応答性という用語は、そのような発生期の物質または初期混合物（１）の成分に及ぼす、そのような誘導結合力に起因するいかなる影響も含むと理解することができる。
【００５７】
さらに、一部の実施形態では、初期混合物（１）は卵黄含量を含むことができる。これは、例えば、発生期のタンパク質含有精子細胞エキステンダー成分中のタンパク質量の関数でよく、おそらくそのようなタンパク質は卵黄でよい。様々な実施形態において、初期混合物内に含まれる卵黄の割合の例としては、約０．４％を超える卵黄、約０．８％を超える卵黄、約１．６％を超える卵黄、または、おそらく、約３．２％を超える卵黄さえも挙げることができる。一部の実施形態は、初期混合物（１）内に含まれる約１．６％の割合の卵黄を含むことができる。
【００５８】
様々な実施形態において、初期混合物（１）は、未浄化初期混合物（１）を含むことができる。様々な実施形態は、冷温初期混合物を含むこともできる。一部の実施形態では、冷温初期混合物は、約１０℃未満、約９℃未満、約８℃未満、約７℃未満、約６℃未満、約５℃未満、約４℃未満、約３℃未満、約２℃未満、または、おそらく、約１℃未満の初期混合物（１）でさえよい。さらに、一部の実施形態において、冷温初期混合物は、約５℃の混合物でよい。
【００５９】
次に、さらに主に図２に関して、一部の実施形態は、損傷した選別精子細胞の処理媒体を含むことができる。処理媒体という用語は、精子細胞を処理するように置くことができる、精子細胞に資するいかなる媒体も含むと理解することができる。さらに、実施形態は、所望の特性について選択された複数の精子細胞、未浄化タンパク質非含有精子細胞エキステンダー成分、未浄化タンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダー成分、ならびに、所望の特性について選択された前記複数の精子細胞、前記未浄化タンパク質非含有精子細胞エキステンダー成分、および前記未浄化タンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダー成分が懸濁されている未浄化遠心分離媒体（７）を含むこともできる。未浄化という用語は、未浄化状態で維持される物質を含むと理解することができ、未浄化状態という用語は、浄化されていない物質が存在する可能性がある状態を含むと、理解することができる。遠心分離媒体という用語は、ある時点で遠心分離にかけられる精子細胞に資する、いかなる媒体も含むと理解することができる。
【００６０】
ある実施形態は、未浄化遠心分離媒体（７）に懸濁される、未浄化タンパク質含有精子細胞エキステンダー成分をさらに含むことができる。さらに、一部の実施形態では、そのような未浄化遠心分離媒体（７）は、卵黄含量を含むことができる。これは、例えば、おそらく、そのような未浄化タンパク質含有精子細胞エキステンダー成分中のタンパク質量の関数でよく、おそらくそのようなタンパク質は卵黄でよい。様々な実施形態において、未浄化遠心分離媒体（７）に含まれる卵黄の割合としては、約０．４％を超える卵黄、約０．８％を超える卵黄、約１．６％を超える卵黄、または、おそらく、約３．２％を超える卵黄さえも挙げることができる。一部の実施形態は、未浄化遠心分離媒体（７）に含まれる約１．６％の割合の卵黄を含むことができる。さらに、ある実施形態において、未浄化遠心分離媒体（７）は、少なくとも少量のグリセロールを含むことができ、約１１％未満の卵黄を有することができる。
【００６１】
さらに、ある実施形態において、未浄化遠心分離媒体（７）は、おそらく、冷温の未浄化遠心分離媒体（７）を含むことができる。そのような冷温の未浄化遠心分離媒体（７）は、約１０℃未満、約９℃未満、約８℃未満、約７℃未満、約６℃未満、約５℃未満、約４℃未満、約３℃未満、約２℃未満、または、おそらく、約１℃未満の温度の未浄化遠心分離媒体（７）さえも含むことができる。一部の実施形態において、冷温の未浄化遠心分離媒体（７）は、約５℃の温度の未浄化遠心分離媒体（７）を含むことができる。
【００６２】
一部の実施形態では、未浄化遠心分離媒体（７）は、おそらく、最小数の局在的高密度領域（６）を有することができ、これには、おそらく、局在的高密度領域（６）が皆無のことさえも含まれる。局在的という用語は、そのような未浄化遠心分離媒体（７）の小容積内に集めることができる未浄化遠心分離媒体（７）の領域を含むと理解することができ、これには、おそらく、未浄化遠心分離媒体（７）の総容積の３％未満、２％未満、１％未満、０．０５％未満、または、おそらく０．０１％未満の容積さえも含まれる。局在的高密度領域（６）という用語は、周囲の領域よりも実質的に高い密度を有する未浄化遠心分離媒体（７）の局在的領域を含むと理解することができ、これには、おそらく、周囲の密度の１０％を超えるもの、周囲の密度の２０％を超えるもの、周囲の密度の３０％を超えるもの、周囲の密度の４０％を超えるもの、周囲の密度の５０％を超えるもの、周囲の密度の１００％を超えるもの、周囲の密度の２００％を超えるもの、周囲の密度の３００％を超えるもの、周囲の密度の４００％を超えるもの、または、おそらく周囲の密度の５００％を超えるものさえ含まれる。
【００６３】
次に、さらに主に図３に関し、ある実施形態は、中間の、損傷した選別精子細胞の維持促進媒体を含むことができる。精子細胞維持促進媒体は、精子細胞を維持促進のために置くことができる、精子細胞に資するいかなる媒体も含むと理解することができる。中間という用語は、精子細胞処理過程の中間段階を表す精子細胞維持促進媒体を含むと、理解することができる。例えば、様々な実施形態において、そのような中間段階は、おそらく、凍結保護物質を予め調製した精子細胞媒体に加えること、タンパク質含量を予め調製した精子細胞媒体に加えること、または、おそらく、予め調製した精子細胞媒体を遠心分離することを含むことができる。
【００６４】
さらに、さらなる実施形態は、所望の特性について選択された複数の精子細胞（８）、タンパク質非含有精子細胞エキステンダー成分（９）、タンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダー成分（１０）およびタンパク質含有精子細胞エキステンダー成分（１１）を含むことができる。ある実施形態は、約１．６％を超えない総タンパク質含量（１２）を含むこともできる。これは、例えば、おそらく、そのような中間精子細胞維持促進媒体のタンパク質含有精子細胞エキステンダー成分内のタンパク質量の関数でよい。一部の実施形態では、タンパク質含有精子細胞エキステンダー内のタンパク質は、おそらく、卵黄でよい。したがって、約１．６％を超えない総タンパク質含量は、おそらく、約１．６％を超えない卵黄含量を含むことができる。
【００６５】
ある実施形態は、所望の特性について選択された複数の精子細胞（８）、タンパク質非含有精子細胞エキステンダー成分（９）、タンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダー成分（１０）およびタンパク質含有精子細胞エキステンダー成分（１１）を懸濁することができる、冷却中間維持促進媒体を含むこともできる。一部の実施形態では、そのような冷却中間維持促進媒体は、おそらく約１０℃未満、約９℃未満、約８℃未満、約７℃未満、約６℃未満、約５℃未満、約４℃未満、約３℃未満、約２℃未満、または、おそらく、約１℃未満の温度の中間維持促進媒体でさえ含むことができる。ある実施形態では、そのような冷却中間維持促進媒体は、約５℃の温度を有することができる。
【００６６】
いくつかの利点が、本発明の技術に付属することができる。詳細には、様々な実施形態において、タンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーの使用は、従来の精子細胞エキステンダーをかなり改善することができる。例えば、他の精子細胞エキステンダーへのそのようなタンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーの添加は、おそらく、おそらく卵黄を含むそのようなタンパク質のより低い濃度のために、凝集塊または他の局所的に高密度な領域を低減させることができる。このことは、ある適用、例えば、精子細胞に損傷を起こす可能性のある遠心分離における精子細胞の圧縮を低減または、おそらく排除することさえできる。さらに、精子細胞エキステンダー内のそのような凝集塊の減少は、そのようなエキステンダーを浄化する必要性をなくすることができ、関連資材の節約、省力化、時間の節約および経費節約につながる。さらに、タンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーは、破壊の影響に対する感受性が低くなることができる。これは、そのような精子細胞エキステンダーの、必要時ではなく、事前の大量調製を可能にすることができる。さらに、破壊の影響を軽減することは、細菌による汚染のリスクを低減することができる。さらに、そのような精子細胞エキステンダーはおそらく環境条件により低感受性であることができるので、環境条件が変動するであろう長距離にわたってそれを輸送することがより可能になる。
【００６７】
したがって、そのようなタンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーは、様々な用途において精子細胞エキステンダーの有効なＢ分画でありうる。さらに、そのようなタンパク質非含有凍結保護物質含有精子細胞エキステンダーの使用は、それが使用される精子細胞エキステンダーの効果にかなり有害な影響を及ぼすことはできないであろう。例えば、人工授精技術に関する実施形態において、そのような精子細胞エキステンダーの使用は、おそらく、一般的な精子細胞エキステンダーを使用して達成されるものとはあまり異ならない結果を生むことができる。詳細には、様々な実施形態において、おそらく、そのような精子細胞エキステンダーで達成される妊娠率は一般的な精子細胞エキステンダーで達成されるものと同等でありえ、これには、様々な実施形態において、おそらく統計学的に同等（Ｐ＞０．０５）であることさえも含まれる。
【００６８】
本明細書で記載されるように、本発明の技術を用いる、いくつかの実施例を報告することができる。重要なことは、これらの実施例は、本発明の技術の一部の実施形態だけを表すと理解されなければならない。したがって、これらの実施例は本明細書で記載される本発明の技術の範囲を限定するものと解釈されてはならないと、認識することができる。
【実施例】
【００６９】
（実施例１）
卵黄を含むエキステンダーのＢ分画を含む選別精子を収集および処理するための１つの可能な手法は、以下の通りでよい。Ｔｒｉｓ−Ａキャッチ媒体（２ｍｌ）を、５０ｍｌファルコンチューブに置くことができる。選別精子を、合計１２．５ｍｌの選別量について約１時間かけて、５０ｍｌファルコンチューブに収集することができる。この分量は、グリセロール非含有であることができ、Ａ分画と呼ぶことができる。この実施例のＡ分画内の卵黄の割合は、３．２％［（２ｍｌ「キャッチ」）／（１２．５ｍｌ総容積）×（２０％卵黄「キャッチ」）＝３．２％）］である。３．２％卵黄混合物は、およそ９０分にわたって５℃に冷やすことができる。冷却期間の後、等量のグリセロール含有２０％卵黄エキステンダー（Ｂ分画；１２％グリセロール）を、およそ１５分間隔で２つの等分割として段階的に加えることができる。この実施例で次に１１．６％卵黄ＡＢエキステンダー［（（１２．５ｍｌ  Ａ分画）×（３．２％卵黄）＋（１２．５ｍｌ  Ｂ分画）×（２０％卵黄））／２５ｍｌ総容積＝１１．６％卵黄］に含まれる冷却選別精子は、濃縮のために遠心分離することができる。グリセロール含有エキステンダーを冷却精子に加えるこの方法は、精子を含まない液滴がおそらく選別過程で収集され、精子ペレットがあまりに多量の状態で残された場合に起こるであろう精子ペレットの過維持促進を回避することができ、最終グリセロール分が常に６％であることを確実にすることができる。上清の除去の後、２００μｌの精子ペレットが残るであろう。同じ雄からの精子ペレットをプールし、総容積を重量で決定することができる。選別精子総数は、おそらく複数の血球計数器カウントにより決定することができ、ペレットの精子濃度は、所望の冷凍濃度に、おそらく２０％卵黄ＡＢエキステンダーで調節することができる。
【００７０】
この実施例では、１２．５ｍｌの選別された分量中の精子濃度が１×１０６精子数／ｍｌで、総精子数が１２．５×１０６であり、遠心分離後回収率が８５％であるならば、２００μ精子ペレット中の精子濃度は約５３×１０６精子数／ｍｌ（１０．６×１０６の総精子数）である。この方法で１０×１０６精子数／ｍｌの冷凍濃度が所望である場合、８６０μｌの２０％卵黄ＡＢエキステンダーを２００μｌの精子ペレットに加えることができる。このモデルに基づき、選別精子を冷凍するための最終的な卵黄の割合は１８．４％［（（０．２００ｍｌ精子ペレット）×（１１．６％卵黄）＋（０．８６０ｍｌＡＢエキステンダー）×（２０％卵黄））／１．０６ｍｌ総容積＝１８．４％最終卵黄］である。
【００７１】
上の実施例を、２０％卵黄Ｂエキステンダーの代わりに０％卵黄Ｂエキステンダーで置換して用いると、遠心分離する２５ｍｌの分量に含まれる卵黄の割合は１．６％［（（１２．５ｍｌ  Ａ分画）×（３．２％卵黄）＋（１２．５ｍｌ  Ｂ分画）×（０％卵黄））／２５ｍｌ総容積＝１．６％卵黄］である。この実施例の精子ペレットを２０％卵黄ＡＢエキステンダーで１０×１０６精子数／ｍｌの最終冷凍濃度に調節すると、最終的な卵黄の割合は１６．５％［（（０．２００ｍｌ精子ペレット）×（１．６％卵黄）＋（０．８６０ｍｌＡＢエキステンダー）×（２０％卵黄））＋１．０６ｍｌ総容積＝１６．５％卵黄］である。
【００７２】
したがって、最終的な卵黄の割合は、おそらく、２つの異なるＢ分画エキステンダーの間でわずかに異なるだけであろうことを理解することができる。０％卵黄Ｂエキステンダーを用いる場合、より高い精子濃度（＞１０×１０６精子数／ｍｌ）が所望のときには、最終的な卵黄の割合はより小さくなるであろう。
【００７３】
（実施例２）
さらなる実施例を、以下の通り報告することができる。６頭の雄牛から得られた初回射精からの精子を供試し、試験は３回反復した。この試験のための精子は選別されなかったが、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色し、選別時に起こるような極端な希釈を行った。目的は、卵黄を加えるかまたは加えずにグリセロール含有エキステンダー（Ｂ分画）を投与された精子の、解凍後運動性を比較することであった。さらなる目的は、選別精子に必要とされる最適グリセロール含量を特定することであった。したがって、３、４、５および６％の最終グリセロール含量を、０および２０％の卵黄を含むＢ分画エキステンダーで試験した。０．２５ｍｌストロー内で冷凍された精子を３７℃水浴上で３０秒間解凍し、３７℃でインキュベートした。総運動性の視覚的推定値は、インキュベーションから３０分および１２０分後に、処理に盲目の２人の観察者が判定した。
【００７４】
Ｂ分画エキステンダー内の卵黄の排除は、解凍後の精子運動性に悪影響を及ぼさなかった。実際、運動性は、両方のインキュベーション時間において、２０％卵黄を含むものと比較して、卵黄を含まないＢ分画エキステンダーで処理された精子で統計学的により高かった（Ｐ＜０．０５）。チャート１を参照のこと。
【００７５】
【表１】
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３％の最終グリセロール濃度は、解凍後３０分および１２０分に統計学的により低い運動性をもたらしたが、４〜６％グリセロールの関数としては、運動性はより高く、異ならなかった。チャート２を参照のこと。この実施例から、おそらく、３％グリセロールは選別精子のために十分な凍結保護を提供しなかったと、結論することができる。運動性は４〜６％グリセロールの間で異ならなかったこと、および、十分な凍結保護（それは、雄牛の間で異なることがある）の提供が望ましいであろうことから、性別で選別された精子の凍結保存のための６％グリセロールの最終濃度が適当であろう。
【００７６】
【表２】
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（実施例３）
他の実施例を、以下の通り報告することができる。目的は、０％卵黄グリセロール（１２％）含有エキステンダーで処理したＸ染色体を含む精子で授精させたホルスタイン雌牛における３０日妊娠率を、２０％卵黄を含むそれと比較することであった。
【００７７】
各２頭の雄牛からのＸ染色体を有する精子を、フローサイトメーターを用いてＤＮＡ含有量に基づいて単離した。各チューブが１２．５ｍｌおよび約１２，０００，０００個の精子を含むまで、グリセロールを含まない２ｍｌの２０％卵黄−ＴＲＩＳエキステンダーを含む５０ｍｌプラスチックチューブに、選別精子を収集した。選別精子は、９０分間冷却した（５℃）。冷却後、精子を含む選別チューブ（５０ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎ）を均一に分け、グリセロール含有エキステンダー（Ｂ分画）を加えた。冷却精子は、０％卵黄または２０％卵黄を含むＢ分画エキステンダーを投与された。次に、選別精子（２５ｍｌ総容積）を含むチューブを、５℃において８５０×ｇで２０分間遠心分離した。上清を除去すると、選別精子は約２００μｌのペレットに残された。類似した精子ペレットをプールし、２０％卵黄−ＡＢ媒体（６％の最終グリセロール含量）で、１０×１０６精子数／ｍｌに調節した。生成物内の最終的な卵黄の割合は、選別日によって異なった（範囲：１６．５〜１８．２％）。処理剤がＡＩ技術者に盲目化されるように精子（２×１０６）を０．２５ｍｌのコード化されたストローに充填し、冷凍ラックに置き、ＬＮ２蒸気中で低温保存した。各雄牛および処理剤からの同数のストローをゴブレットに入れ、アルミニウム棹に付けた。
【００７８】
精子の解凍後の運動性は、３７℃で３０分のインキュベーションの後、「トラック」運動性を用いて測定した。運動性が次第に高まった精子の平均割合は、２０％卵黄Ｂ分画エキステンダーで処理した冷凍コードについては４４％、０％卵黄Ｂ分画エキステンダーのそれは４３％であった。
【００７９】
１１９頭の非同期ホルスタイン雌牛は、異なる卵黄媒体および２頭のホルスタイン雄牛の間で均衡させた。授精は、スタンディング発情の観察から１２または２４時間後であった。この実施例では３名の人工授精師を用いた。授精の約１ヵ月後に、超音波を用いて妊娠を判定した。データは、ＡＮＯＶＡにかけた。
【００８０】
０％卵黄「Ｂ」分画エキステンダーで処理した選別精子と、２０％卵黄「Ｂ」分画エキステンダーのそれとの間で、妊娠率は異ならなかった（Ｐ＞０．０５）。表１を参照のこと。
【００８１】
実際の妊娠率は雄牛およびＡＩ技術者に関して類似し（Ｐ＞０．０５）、統計的相互作用はなかった。数字上では、雄の５２Ｈ００３９の妊娠率は雄の５２Ｈ００３８よりも高かった。表２を参照のこと。集団のより大きなサンプリングは、２頭の雄牛の間の妊娠率に有意差をもたらしたであろう。この実施例については、９５％信頼区間（ＣＩ）が大きいことを記すことが重要であろう。
【００８２】
【表３】
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上記のことから容易に理解することができるように、本発明の基礎概念は様々な方法で具現化することができる。適当な精子細胞維持促進を達成することは、精子細胞維持促進の技術ならびに装置を含む。この出願では、記載される様々な装置によって達成されることが示された結果の一部として、および利用に固有の段階として精子細胞維持促進技術が開示される。それらは、単に、装置を意図および記載されたように利用した、当然の結果である。さらに、一部の装置が開示されるが、これらはある方法を達成するだけでなく、いくつかの方法で変更することができることを理解しなければならない。重要なことは、上記のこと全てに関して、これらの態様の全ては、この開示に内包されることを理解しなければならない。
【００８３】
本明細書に含まれる議論は、基本的記載の役目を果たすものとする。読者は、特定の議論が全ての可能な実施形態を明示的に記載しないであろうこと、および多くの代替手段が潜在することを承知しなければならない。それは、また、本発明の一般的性質を完全には説明せず、各特徴または構成要素が実際にどのようにより広い機能または多種多様な代替もしくは同等の要素を代表することができるのかを、明示的に示さないかもしれない。前と同じように、これらはこの開示に暗に含まれる。本発明が装置指向の用語で記載される場合、装置の各構成要素は暗黙裡に機能を果たす。記載される装置のために装置クレームが含まれるだけでなく、本発明および各構成要素が果たす機能を記述するために、方法クレームまたはプロセスクレームも含まれよう。記載も用語も、以降のいかなる特許出願に含まれる請求項の範囲を限定するものではない。
【００８４】
本発明の本質から逸脱することなく、様々な変更を加えることができることも、理解されなければならない。そのような変更も、本明細書に暗に含まれる。それらは、なお、この発明の範囲内である。示される明示的な実施形態、多種多様な暗黙の代替実施形態、および広範な方法またはプロセスなどを含む広い開示がこの開示に含まれ、以降のいかなる特許出願の請求項を起草する場合にも、それに基づくことができる。そのような言語は変化すること、および、より広いもしくはより詳細な請求が後日に（例えば、いかなる要求される最終期限までに）、または、出願人がその後この出願に基づいて特許出願をしようとする場合に、遂行されうることを理解しなければならない。この理解に立ち、この開示が、出願人の権利の範囲内とみなされるものと同じくらい広い請求項ベースの審査を求めることができ、本発明の多くの態様を独立して、および全体の体系として含む特許を生むように設計することができる、それ以降に出願されるいかなる特許出願も支持するものと理解されるべきであることを、読者は承知しなければならない。
【００８５】
さらに、本発明の各様々な構成要素および請求項は、様々な方法で達成することもできる。さらに、使用されるかまたは暗示される場合、構成要素は、物理的に連結されてもされなくともよい個々のならびに複数の構造物を含むものと理解されるべきである。この開示は、それが任意の装置実施形態、方法もしくはプロセス実施形態の変形実施形態、または、単にこれらのいずれかの構成要素の変形形態であろうと、そのような各変形形態を含むものと理解されなければならない。特に、開示が本発明の構成要素に関するものなので、機能または結果だけが同じであるとしても、各構成要素の用語は、同等の装置用語または方法用語で表すことができることを理解しなければならない。そのような同等で、より広い、または、さらにより総合的な総称は、各構成要素または作用の記載に包含されると考えるべきである。本発明が権利を有する潜在的に広い範囲を明示的にするために、所望の場合、そのような用語を置換することができる。一例としてであるが、全ての作用はその作用を起こすための手段として、または、その作用を引き起こす構成要素として表すことができることを、理解しなければならない。同様に、開示される各物理的構成要素は、その物理的構成要素が促進する作用の開示を含むものと理解しなければならない。一例としてであるがこの最後の態様に関して、「エキステンダー」の開示は、明示的に議論されようとされまいと、「維持促進」行為の開示を含むものと理解されなければならず、逆に言えば、有効な「維持促進」行為の開示があるならば、そのような開示は、「エキステンダー」および「維持促進手段」の開示さえも含むものと理解されなければならない。そのような変更および代替用語は、本明細書に明示的に含まれるものと理解されるべきである。
【００８６】
この特許出願で指摘されるいかなる特許、刊行物または他の参考文献は、本明細書で参照により組み込まれる。さらに、用いられる各用語に関して、この出願におけるその利用が広義な解釈と矛盾しない限り、例えば、参照により組み込まれるランダムハウスウェブスター大辞典第２版に載っているような通常の辞書定義が、各用語および全ての定義、代替用語および同義語に組み込まれるものと理解されなければならないことを理解しなければならない。最後に、本出願と一緒に提出された情報開示書または他の情報ステートメントに記載された全ての参考文献は、本明細書に添付され、本明細書で参照により組み込まれるが、上記のものそれぞれに関しては、参照により組み込まれたそのような情報またはステートメントがこの／これらの発明の特許化と矛盾すると考えられるような範囲まで、そのようなステートメントが出願人によって出されたと明らかにみなすべきではない。
【００８７】
ゆえに、出願人は、少なくともｉ）本明細書で開示および記載される各精子細胞エキステンダー装置、ｉｉ）開示および記載される関連方法、ｉｉｉ）これらの各装置および方法の類似した、同等の、および暗黙的でさえある変形形態、ｉｖ）開示および記載されるような、示された各機能を果たす代替デザイン、ｖ）開示および記載されるそれを果たすことが暗黙の、示された各機能を果たす代替デザインおよび方法、ｖｉ）別個および独立の発明として示される各特徴、成分および段階、ｖｉｉ）開示される様々なシステムまたは成分によって強化される用途、ｖｉｉｉ）そのようなシステムまたは成分によって生産される生成物、ｉｘ）指摘した任意の特定の分野または装置に次に適用されるような、提示または記載される各システム、方法および構成要素、ｘ）本明細書の上で添付の実施例のいずれかに関して実質的に記載される方法および装置、ｘｉ）開示される各構成要素の様々な組合せおよび置換、ならびにｘｉｉ）提示した独立請求項または概念の各１つおよびあらゆる１つへの従属物としての潜在的に従属する各請求項または概念に対して、発明を請求、表明する裏付けを有すると、理解されなければならない。
【００８８】
審査のために今回または後に提出されようが、請求項に関し、実際性のために、および審査負担の大幅な維持促進を回避するために、出願人はいかなるときでも、最初の請求項だけを、または、おそらく最初の従属体だけを有する最初の請求項だけを提出することができると、理解されなければならない。１つの独立した請求項または概念の下で他の任意の独立した請求項または概念の下の従属体または構成要素として提出される様々な従属体または他の構成要素のいずれかの追加を可能にするために、裏付けは、新規事項法、例えば、それらに限定されないが、欧州特許条約第１２３条（２）および米国特許法第１３２条、または他のそのような法によって要求される程度に存在すると理解されなければならない。この出願においてであるにせよまたは以降のいかなる出願においてであるにせよ、いかなるときでもいかなる請求項でも起草する際に、出願人は、法的に有効な限り完全で幅広い適用範囲を獲得する所存であることも、理解されなければならない。実体のない代替物が作製される限り、出願人が、いかなる特定の実施形態も文字通りに含むようにいかなる請求項も実際起草しなかった限り、および、他に該当する限り、出願人が全ての可能性を予想することが単にできなかった可能性があるので、出願人が、そのような適用範囲をいかなる形であれ放棄する所存であったかまたは実際に放棄したと理解されてはならない。当業者は、そのような代替実施形態を文字通りに含んでいたであろう請求項を起草したと、合理的に予想されてはならない。
【００８９】
さらに、使用されるならばまたは使用される場合、伝統的な請求項解釈に従い、移行句「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の使用は、本明細書で「オープンエンドの」請求項を維持するために使用される。ゆえに、文脈上特に必要がない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形形態は、明示された構成要素、または段階、または構成要素もしくは段階の群が含まれることを意味するが、いかなるものであれ他の構成要素、または段階、または構成要素もしくは段階の群の除外を意味しないものとする。法的に許される最も幅広い適用範囲を出願人に与えるように、そのような用語は、それらの最も広い形で解釈されなければならない。
【００９０】
最後に、いかなるときに示されるいかなる請求項も、本発明のこの明細書の一部としてここに参照により組み込まれ、出願人は、そのような請求項のそのような組み込まれた内容の全てまたは一部を、請求項またはその任意の構成要素もしくは成分のいずれかまたは全てを裏付ける追加説明として用いる権利を明示的に留保し、さらに、出願人は、この出願、または以降のいかなるその継続、分割もしくは一部継続出願によってその保護を求める事項を定義するために、あるいは、いかなる国の特許法、規則もしくは規制または条約のいかなる権利も取得し、それらに従う料金の削減を獲得し、または、それらに適合するために、そのような請求項またはその任意の構成要素もしくは成分の組み込まれた内容のいかなる部分もまたは全てを、本明細書から請求項へ、またはその逆へ必要に応じて移動する権利を留保し、参照によって組み込まれたそのような内容は、以降のいかなるその継続、分割もしくは一部継続出願、またはその再提出もしくは維持促進も含むこの出願の係属の全期間、存続するものとする。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１は、混合関係にある様々な初期の物質を示す。
【図２】図２ａは、先行技術の精子細胞エキステンダーを示す。図２ｂは、未浄化遠心分離媒体を示す。
【図３】図３は、中間の精子細胞エキステンダーを示す。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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