(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
虚血及び再灌流障害の少なくとも１つを予防、軽減又は処置するための医薬組成物の製造における、血漿由来ヒトＣ１インヒビターと比べて少ない末端シアル酸残基を有し、前記少ない末端シアル酸残基により血漿中濃度半減期が６時間未満であるＣ１インヒビターの使用であって、前記Ｃ１インヒビターが再灌流の開始の少なくとも１０分後に投与される、使用。
【請求項２】
Ｃ１インヒビターが、再灌流の開始の少なくとも１時間後に投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｃ１インヒビターが、再灌流の開始の少なくとも３時間後に投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
Ｃ１インヒビターが、再灌流の開始の少なくとも６時間後に投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
Ｃ１インヒビターが、再灌流の開始の少なくとも９時間後に投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
Ｃ１インヒビターが、再灌流の開始の少なくとも１８時間後に投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
Ｃ１インヒビターが、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース及びフコースから選択される末端残基を有するグリカンを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
Ｃ１インヒビターが、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１〜７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
Ｃ１インヒビターが、遺伝子操作された細胞又は生物から得られる、請求項１〜８のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
Ｃ１インヒビターが、トランスジェニック非ヒト動物から得られる、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
Ｃ１インヒビターが、トランスジェニック非ヒト動物の乳から得られる、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
トランスジェニック非ヒト動物が、ウシ又はウサギ目の動物である、請求項１０又は１１に記載の使用。
【請求項１３】
ウサギ目の動物が、ウサギである、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
Ｃ１インヒビターが、体重１ｋｇ当たり５０〜２０００ユニットの範囲内の量で使用される、請求項１〜１３のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
医薬組成物が、血栓溶解剤も含むか又は血栓溶解剤と併用されるか若しくはその後のそのような薬剤での処置の後に使用されるものである、請求項１〜１４のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
医薬組成物が、少なくとも１つの虚血及び再灌流障害の予期されない突発性又は急性の発生を予防、軽減又は処置するためのものである、請求項１〜１５のいずれかに記載の使用。
【請求項１７】
医薬組成物が、脳卒中又は周産期の脳卒中の後の虚血及び再灌流障害の少なくとも１つを予防、軽減又は処置するためのものである、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
医薬組成物が、少なくとも１つの予期される虚血及び再灌流障害の発生を予防、軽減又は処置するためのものである、請求項１〜１５のいずれかに記載の使用。
【請求項１９】
虚血及び再灌流障害の予期される発生が、臓器移植時又はその後の、予期される虚血及び再灌流障害の発生である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
医薬組成物が、レクチン経路を介して生じることが知られている虚血及び再灌流障害の少なくとも１つを予防、軽減又は処置するためのものである、請求項１〜１９のいずれかに記載の使用。
【請求項２１】
レクチン経路を介して生じることが知られている虚血及び再灌流障害が、心筋、腎臓、胃腸の虚血及び再灌流障害又は脳卒中である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
Ｃ１インヒビターが、神経保護効果を発揮する、請求項１７に記載の使用。
【請求項２３】
Ｃ１インヒビターが、海馬及び／又は皮質において、神経保護効果を発揮する、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
Ｃ１インヒビターが、虚血及び／又は再灌流により誘発された病変を軽減する、請求項１〜２３のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、虚血再灌流障害、特に脳卒中の結果生じることのある脳虚血再灌流障害を予防、軽減及び処置するためのＣ１インヒビターの治療的使用及び予防的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
虚血再灌流障害は、良く知られている病態であり、予期される病態であることもあるし、予期されない病態であることもある。予期されない虚血再灌流障害の最も一般的なものの１つは脳卒中である。先進国において、脳卒中は３番目に多い死因であり、長期障害の最も多い原因である。脳卒中は循環器疾患の1つであり、脳に通じる動脈及び脳内に存在する動脈に影響を与える。脳卒中は、このような動脈が血塊又は破裂によって詰まったときに生じ、その結果、その詰まった動脈に支配されている脳組織において虚血が起こる。血流が遮断され、主に生きた組織が酸素化されなくなるために、脳に直接的ダメージが生じ、回復が起こらなければ最終的には梗塞になる。しかし、（生理的又は治療的に）傷害が回復されると、今度は虚血組織の再灌流によってさらに間接的なダメージが生じることがある。長期間の虚血の場合、低酸素症からの「直接的」ダメージのみが主要なメカニズムである。より短期間の虚血では、間接的すなわち再灌流を介したダメージの方が、最終的な結果にとってより重要になる。
【０００３】
補体Ｃ１のインヒビターであるＣ１インヒビター（Ｃ１ＩＮＨ）は、モデル齧歯類における脳虚血再灌流に対して、虚血再灌流障害の軽減による神経保護作用を示すことが報告されている（非特許文献１及び非特許文献２）。脳虚血再灌流障害に対するＣ１ＩＮＨの神経保護作用にはＣ１ｑは必要ではない（非特許文献３）。さらに最近では、Ｃ１ＩＮＨが、炎症と血管系から虚血部位への細胞のリクルートとを阻害することで、虚血再灌流障害に対して抗炎症作用および抗アポトーシス作用を発揮することが非特許文献４で報告されている。しかし、脳卒中の前後でＣ１ＩＮＨの投与が治療に有効である時間枠は幾分狭い。
【非特許文献１】De Simoni et al., 2003, J Cereb Blood Flow Metab. 23: 232-9
【非特許文献２】Akita et al., 2003, Neurosurgery 52: 395-400
【非特許文献３】De Simoni et al., 2004, Am J Pathol. 164: 1857-63
【非特許文献４】Storini et al., 2005, Neurobiol Dis. 19: 10-7
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、本発明の目的は、投与時間に関してより広い時間枠を有するＣ１ＩＮＨを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、一過性局所脳虚血のモデルマウスにおいて天然の血漿由来Ｃ１インヒビター（Ｃ１ＩＮＨ）を虚血後に投与した場合、虚血再灌流障害を軽減する活性がほとんど失われているのに対し、Ｃ１ＩＮＨ組換え標品は、虚血及び／又は再灌流の少なくとも１時間後に投与された場合でも神経保護効果を発揮することができるという驚くべき発見に基づくものである。驚くべきことに、神経保護効果は、虚血及び／又は再灌流の１８時間後にＣ１ＩＮＨを注射した場合でも得られる。天然の血漿由来Ｃ１ＩＮＨとＣ１ＩＮＨ組換え標品の差は、前者が少なくとも２４時間の血漿中半減期を有する完全にシアル化された糖タンパク質であり、後者は血漿中半減期がより短くなっており、グリコシル化が血漿由来産物と異なっている点である。
【０００６】
天然の血漿由来Ｃ１ＩＮＨとＣ１ＩＮＨ組換え標品の間の既知の差に、グリコシル化の程度及び種類がある。組換え糖タンパク質は、オリゴマンノース型、ハイブリッド型及び複合型構造を含む、広範囲の様々なＮ−グリカンを含む。一方、血漿由来Ｃ１ＩＮＨのＮ−グリカンは、完全にシアル化された複合型構造から主に構成されている。グリコシル化が異なる結果、血漿由来糖タンパク質の血漿中半減期は少なくとも２４時間であるが、組換えＣ１ＩＮＨの血漿中半減期は短くなっている。
【０００７】
したがって、１つの態様では、本発明は、虚血の後及び／又は再灌流の後にＣ１インヒビターを投与することによる、虚血及び再灌流障害の少なくとも１つを予防、軽減、又は処置する方法に関する。該方法は、血漿由来Ｃ１ＩＮＨの血漿中半減期より短い血漿中半減期を有するＣ１ＩＮＨを有効量投与するステップを含むことが好ましい。或いは、方法は、血漿由来Ｃ１ＩＮＨと比較してグリコシル化が異なるＣ１ＩＮＨを有効量投与するステップを含むことが好ましい。この方法は任意の種類の虚血再灌流障害を予防、減少及び／又は処置するためのＣ１インヒビターの治療的及び／又は予防的使用に関する。
【０００８】
Ｃ１インヒビターはＣ１エステラーゼインヒビターとも呼ばれ、本明細書では、補体Ｃ１のインヒビターと定義される。Ｃ１ＩＮＨはセリンプロテイナーゼインヒビターのスーパーファミリーに属し、補体系のＣ１ｒ及びＣ１ｓの唯一のインヒビターであり、接触系（contact system）の第ＸＩＩａ因子及びカリクレインの主要なインヒビターである。さらに、Ｃ１ＩＮＨは凝固系及び線溶系のその他のセリンプロテアーゼ、例えば第ＸＩ因子、組織型プラスミノーゲン活性化因子、プラスミンも阻害する（Schapira et al. 1985, Complement 2: 111; Davis, 1988, Ann. Rev. Immunol. 6: 595）。ヒトＣ１ＩＮＨは５００アミノ酸のタンパク質で、アミノ酸２２個からなるシグナル配列が含まれている（Carter et al.  1988, Euro. J. Biochem. 173; 163）。血漿Ｃ１ＩＮＨは約７６ｋＤａの糖タンパク質であり、高度にグリコシル化されており、その分子質量の２６％までが糖である（Perkins et al., 1990, J. Mol. Biol. 214 , 751）。本発明の方法に使用するためのＣ１ＩＮＨは、配列番号１に記載の成熟ヒトＣ１ＩＮＨのアミノ酸配列と少なくとも６５、６７、６８、６９、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列のタンパク質であることが好ましい。
【０００９】
本発明の目的のためには、２つのアミノ酸配列の間の同一性の程度とは、２つの配列間で同一のアミノ酸の百分率を指す。最初に、Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)に記載のBasic Local Alignment Search Tool（ＢＬＡＳＴ）アルゴリズムを用いて、相同なポリペプチド配列をサーチする。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは国立バイオテクノロジー情報センター（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）から公に利用することができる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｂ及びＥによって、アラインメントの感度及び速度が決定される。ＢＬＡＳＴプログラムはデフォルトで、語長（Ｗ）が３、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)参照）アラインメント（Ｂ）が５０、期待値（Ｅ）が１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４を使用している。次に、相同な配列の同一性（上に定義）の程度の決定には、ＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントアルゴリズム（Higgins D. et al (1994). Nucleic Acids Res. 22:4673-4680）が用いられ、そのパラメーターは以下の通りである：ギャップサイズ：５、ギャップオープン：１１、ギャップエクステンション：１、ミスマッチ：−１５、ワードサイズ：３。
【００１０】
Ｃ１ＩＮＨはＣ１ＩＮＨ活性を有することが好ましく、該Ｃ１ＩＮＨ活性とは、例えばDrouet et al. (1988, Clin Chim Acta. 174:121-30)に記載されているようにアッセイすることができるものである。より好ましくは、Ｃ１ＩＮＨはヒトＣ１ＩＮＨ（ｈＣ１ＩＮＨ）であり、これはＣ１ＩＮＨが人間に天然に存在するアミノ酸配列（例えば配列番号１又はＣＡＡ３０３１４）を有することを意味すると理解されるが、Ｃ１ＩＮＨが例えばヒト血漿で産生される又はヒト血漿から得られることは意味しないと理解される。
【００１１】
本発明の１つの態様によれば、本発明の方法に使用するためのＣ１ＩＮＨの血漿中半減期は、血漿由来Ｃ１ＩＮＨの血漿中半減期と比較して短いことが好ましく、さらに好ましくは、本発明のＣ１ＩＮＨの血漿中半減期はヒト血漿由来Ｃ１ＩＮＨの血漿中半減期よりも短い。「血漿中半減期が短い」とは、血漿由来Ｃ１ＩＮＨの循環半減期に対する本発明のＣ１ＩＮＨの循環半減期の負の変化を意味する。本文脈において、血漿由来Ｃ１ＩＮＨとは、天然のＣ１ＩＮＨを指し、通常これは血漿に由来し、血漿から精製されてもよいが、化学的又は酵素的に修飾されていない。
【００１２】
血漿中半減期の測定は、Ｃ１ＩＮＨ投与後の様々な時点で血液試料を採取し、各試料中のＣ１ＩＮＨ濃度を決定することで行われる。血清濃度と時間の関係から、血漿中半減期を算出することができる。血漿由来Ｃ１ＩＮＨの循環半減期に対する本発明のＣ１ＩＮＨの血漿中半減期の減少は、好ましくは少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約６倍、より好ましくは少なくとも約８倍、最も好ましくは少なくとも約１０倍である。すなわち、本発明のＣ１ＩＮＨの血漿中半減期は、好ましくは血漿由来Ｃ１ＩＮＨ（すなわち対応する天然物）の血漿中半減期の６０、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１２．５又は１０％未満である。
【００１３】
例えば、トランスジェニックウサギの乳から得られる、本明細書中の実施例で用いられる本発明のＣ１ＩＮＨの血漿中半減期は、ヒト体内において約３時間であり、これは、人間中における血漿由来Ｃ１ＩＮＨの平均血漿中半減期の約１／４〜１／８未満である。血漿由来Ｃ１ＩＮＨと比較したときの本発明のＣ１ＩＮＨの血漿中半減期の減少は、全く同一の条件下ではないとしても、似たような条件下で決定されることが好ましいと理解される。すなわち、同じ生物（マウスなどの実験動物又はヒト対象であってもよい）かつほぼ同数の被検対象を用い、対応する投与量及び試料採取計画（sample regimen）で行うことが好ましい。さらに、両方のＣ１ＩＮＨ標品の平均血漿中半減期は、標準的な統計解析の方法によって決定され得るように比較されると理解される。 
【００１４】
半減期のより短いＣ１ＩＮＨは、天然のＣ１ＩＮＨであれ組換え産物のＣ１ＩＮＨであれ、任意の適した方法で作製することができる。例えば、（血漿由来Ｃ１ＩＮＨと比較して）糖鎖構造が修飾されたＣ１ＩＮＨを生じる組換え宿主細胞若しくは生物中においてインビボで作製してもよいし、又は天然のＣ１ＩＮＨの糖鎖構造をインビトロで化学的若しくは酵素的に修飾してもよい。本発明のＣ１ＩＮＨは血漿由来Ｃ１ＩＮＨと比較して以下のように修飾されていることが好ましい：（糖タンパク質の天然の変種又は組換え技術により発現された変種からの）糖鎖の一部分の除去、好ましくはＮ−結合型糖鎖からのシアル酸及び／若しくはガラクトースの除去並びに／又はマンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン及び／若しくはフコース残基が露出するような糖鎖の除去。
【００１５】
本発明の別の態様では、本発明の方法に使用するためのＣ１ＩＮＨは、血漿由来Ｃ１ＩＮＨと比較してグリコシル化が異なっていることが好ましい。本発明のＣ１ＩＮＨの糖鎖構造への修飾としては、低グリコシル化、過グリコシル化が生じる修飾、Ｃ１ＩＮＨのアシアリオ（asialio）型が生じる修飾、又は異なるグリコシル化パターンを生じるその他の任意の修飾等を挙げることができる。
【００１６】
インビトロにおいて、低グリコシル化は、Ｃ１ＩＮＨの糖鎖の一部分又は完全な糖鎖の欠失により生じてもよい。修飾は、Ｎ−若しくはＯ−結合型糖鎖の両方又は１種類の糖鎖のみに関するものであってよい。修飾は全ての糖鎖に関するものでも、一部の糖鎖に関するものでもよい。過グリコシル化は、例えばＣ１ＩＮＨ分子に余分に糖鎖部分が追加されるか又は完全な糖鎖が付加される結果生じてもよい。Ｃ１ＩＮＨのアシアロ型、すなわち末端シアル酸残基が減少している型は通常、シアル酸基の除去により得られる。糖タンパク質の血中半減期が、そのＮ−及びＯ−結合型糖鎖群の組成及び構造に大きく依存することは周知である。一般的に、糖タンパク質の半減期が最大になるには、そのＮ−及びＯ−結合型糖鎖群が末端シアル酸を有する必要がある。この末端シアル酸が存在しないと、ガラクトース残基の露出により、糖タンパク質は血中から急速に除去される。糖タンパク質の糖鎖部分に末端ガラクトース残基が存在すると、肝臓のアシアロ糖タンパク質受容体による血漿クリアランスが促進されることがよく確立されている。したがって、好ましい実施形態では、本発明の方法に使用するためのＣ１ＩＮＨは、血漿由来ヒトＣ１インヒビターと比較して末端シアル酸残基レベルが減少していることが好ましい。シアル酸は様々な方法で除去することができる。例えば,化学的又は酵素的（例えばシアリダーゼでの処理）に除去することができる。この目的に適したシアリダーゼはChou et al.（1996, J Biol Chem. 271(32):19219-24及び1994, J Biol Chem. 269(29):18821-6）に記載されており、例えばV-labs, Inc.社（Covington, Louisiana, USA）から入手することができる。別の好ましい実施形態では、本発明の方法に使用するためのＣ１ＩＮＨは、露出したマンノース、Ｎ−アセチルグルコサミンマンノースリン酸、ガラクトース及び／又はＮ−アセチルガラクトサミン残基を有することが好ましい。露出した糖残基は通常、グリカン枝上にある末端糖残基であるか、又は少なくとも、その糖残基に親和性を有する部分（例えば、糖結合ドメイン）が相互作用のために接近することができる糖残基である。露出したガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース、フコース又はマンノースリン酸残基を有するＣ１ＩＮＨは、例えば、β−Ｄ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ、エンド−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ及び／又はα−Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの１又は複数による酵素処理によって得ることができる（例えばV-labs, Inc.社（Covington, Louisiana, USA）から入手することもできる）。
【００１７】
インビボにおいて、Ｃ１ＩＮＨの糖鎖の修飾は、組換え体産生系（recombinant production systems）を用いて導入してもよい。酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞及び哺乳類細胞など、原核細胞培養物及び真核細胞培養物の両方を用いることができる。例えば、哺乳類の産生系にはＣＯＳ細胞及びＣＨＯ細胞が適している。哺乳類の細胞培養系はシアリル化された糖基を有する糖タンパク質を産生することができるが、最適な、天然の又は完全なグリコシル化を得ることは多くの場合困難であるため、組換えによって産生された糖タンパク質は通常、対応する天然物とグリコシル化パターンが異なっている。通常、この異なるグリコシル化パターンは（対応する天然物と比較して）不完全なグリコシル化であり、露出したガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン及び／又はマンノース残基を有する。同様に、酵母又は真菌のような真核微生物におけるＣ１ＩＮＨの産生も、露出したマンノース残基を有するＣ１ＩＮＨを生じる。
【００１８】
被修飾糖鎖構造を有するＣ１ＩＮＨは、トランスジェニック動物、好ましくはトランスジェニックウサギ、ウシ、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジなどの非ヒト動物中で作製されてもよい。このような糖タンパク質は、非ヒトトランスジェニック動物の乳から該糖タンパク質が得られるように、非ヒトトランスジェニック動物の乳腺で発現されることが好ましい。当業者であれば、どのトランスジェニック動物が産生に用いるのに最も良いかは、産生される具体的な糖タンパク質及び産生される必要のある量に依存すると理解するであろう。本発明において使用するためのＣ１ＩＮＨは、トランスジェニックウシ又はウサギ目（Lagomorpha）の動物、好ましくはウサギ科（Leporidae）の動物、より好ましくはアナウサギ属(Oryctolagus)の動物、最も好ましくはアナウサギ種(Oryctolagus cuniculus)の動物の乳から得られるＣ１ＩＮＨであることが特に好ましい。
【００１９】
Ｃ１ＩＮＨタンパク質の糖鎖構造への、天然の血漿由来対応物と比較して異なる種類の修飾は、組換え産生系から得られても良く、例えば、異なるグリコシル化、低グリコシル化又は過グリコシル化が、別々に又は組み合わせて、同時に又は連続して導入されても良く、ある種類の修飾が分子のある部分に導入され、別の種類の修飾が分子の別の部分に導入されても良い。このタンパク質の治療効果に寄与する修飾の好ましい組合わせとしては、例えば本発明のＣ１ＩＮＨ上の露出したガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース、フコース及び／又はマンノースリン酸残基を挙げることができる。
本発明のＣ１ＩＮＨは、例えばオリゴマンノース型又は高マンノース型のグリカンを有してもよい。Ｃ１ＩＮＨのグリカンの末端残基の少なくとも約５、１０、１５、２０、４０又は６０％は、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコースアミン、マンノース、フコース及びマンノースリン酸残基から選択されることが好ましい。例えば本発明に使用するための好ましいＣ１ＩＮＨが含むシアル酸は、その対応する天然Ｃ１ＩＮＨと比較して、約１／２、１／４、１／５、又は１／６未満であり、かつ／又は該Ｃ１ＩＮＨのＮ−結合型グリカンの少なくとも約５、１０、１５、２０、４０又は６０％が、エクアトリアルな３−及び４−ＯＨ基を有する末端ヘキソース（例えばマンノース及びＮ−アセチルグルコサミン）を有する中性グリカンである。対照的に、血漿由来Ｃ１ＩＮＨでは、オリゴマンノース型のグリコシル化は見られない。本発明における使用に好ましいＣ１ＩＮＨは、例えば、対応する天然物の１／５〜１／６未満のシアル酸を含み、そのＮ−結合型グリカンの約１５％が末端マンノース残基を有する中性グリカンである、ウサギの乳腺で産生された組換えヒトＣ１ＩＮＨである。
【００２０】
好ましい実施形態では、本発明における使用のためのＣ１ＩＮＨのグリコシル化が異なるため、その血漿由来対応物に比べて、マンノース結合タンパク質への親和性が高くなる。マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）は、マンナン結合タンパク質、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）、マンナン結合レクチン、又は殺菌性Ｒａ反応性因子とも呼ばれる。ＭＢＰは、可溶性のＣａ２＋−依存性（Ｃ−型）レクチンの一群に属するコレクチンである。ＭＢＰは、レクチン経路（補体活性化の古典経路及び代替経路と異なる）を介する補体の活性化因子である。補体系は先天性免疫防御の重要な構成要素であり、３つの経路、すなわち古典経路、代替経路、及び最近発見されたレクチン若しくはマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）経路により活性化される。
【００２１】
古典経路の活性化は、触媒領域Ｃ１ｒ及びＣ１ｓが認識タンパク質Ｃ１ｑを介して免疫複合体に結合すると開始される（図１１参照）。
【００２２】
代替経路は、抗体依存的にゆっくりと常に代謝回転しており、補体に対して特異的に保護されていない粒子を攻撃する。
【００２３】
レクチン又はＭＢＬ経路は、様々な病原体上の糖鎖構造又はその他の細胞構造へのＭＢＬの結合によって開始又は活性化される。マンナン結合レクチン関連セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）−１及び−２の２つのセリンプロテアーゼ（図１１参照）がＭＢＬに関連があり、セリンプロテアーゼＣ１ｓ及びＣ１ｒと高い類似性を有する。この複合体は、マンナンに結合すると、Ｃ４−及びＣ３−活性化能を有する。この複合体にはジスルフィド結合で連結された２つのセリンプロテアーゼＭＡＳＰ−１及びＭＡＳＰ−２が含まれる。この形態のＭＡＳＰはＣ４及びＣ３を開裂することができ、その結果、活性化が起こる。本発明のＣ１ＩＮＨは、ヒトＭＢＰに対し、その血漿由来対応物よりも高い親和性を有することが好ましい。
【００２４】
ＭＢＰは、マンノース及びＮ−アセチルグルコサミン及び／又はＮ−アセチル−ヘキソサミンなどの、エクアトリアルな３−及び４−ＯＨ基を有する露出したヘキソースを認識する。したがって、好ましい本発明のＣ１ＩＮＨは そのような末端ヘキソースを有する。本発明のＣ１ＩＮＨの、ＭＢＰ、好ましくはヒトＭＢＰへの高い親和性は、露出したマンノース及びＮ−アセチルグルコサミン残基を有しないその天然血漿由来の対応物と比べ、ＭＢＰのより効率的なターゲティング、結合及び／又は阻害を可能にするようなものであることが好ましい。ここで、ヒトＭＢＰは、Kawasaki et al.（1983, J. Biochem 94:937-47）によって特徴付けされたタンパク質であって、Taylor et al.（1989, Biochem. J. 262 (3), 763-771）に記載のアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＣＡＡ３４０７９）を有するものを指すと理解される。オリゴ糖と複合体を形成しているラットＭＢＰの構造がWeis et al.（1992, Nature. 360:127-34）に記載されている。ヒトＭＢＰについてのさらなる記述については、例えば米国特許第６，８４６，６４９号及びその中の参考文献を参照されたい。
【００２５】
これらの経路(古典経路、代替経路及びレクチン又はＭＢＬ経路)は全て、膜侵襲複合体（ＭＡＣ又はＣ５ｂ−Ｃ９）の構築を最終的に導くのに必須な酵素活性を生じさせる(図１１参照)。生理的条件下では、補体系の活性化は可溶性の膜関連制御タンパク質の協調的作用によって効率的に制御されている。これらのタンパク質の１つが、Ｃ１ｓ及びＣ１ｒに結合するセリンプロテアーゼインヒビターであるＣ１インヒビター（Ｃ１ＩＮＨ）であり、これは古典経路のインヒビターとして現在知られている唯一のものである。さらに、Ｃ１ＩＮＨは、ＭＡＳＰ−１及びＭＡＳＰ−２に結合し阻害することで、ＭＢＬ−仲介性の補体活性化を不活性化することができる。
【００２６】
各種補体経路の活性化は、Wielisaキット（製品番号ＣＯＭＰＬ３００、Wieslab社製、Sweeden）を用いてヒト血清中で測定されることが好ましい。これは市販の酵素免疫測定法であり、３種類の補体経路の各々の検出に特異的で、Ｃ５ｂ−Ｃ９の沈殿を共通の読取り値（read-out）とする。簡潔には、マイクロタイターストリップのウェルが、３種類の補体経路の各々の特異的活性化因子でコーティングされている。ヒト血清を、それぞれの経路だけが活性化されるように特異的ブロッカーを含む希釈液で希釈する。さらに本発明のＣ１ＩＮＨ又はその血漿由来対応物を０〜７５μｍｏｌの濃度範囲で添加し、室温で３０分間インキュベートし、ウェルに添加する。その後、ウェル内で希釈ヒト血清を３７℃、６０分間インキュベートしている間に、特異的なコーティングにより補体が活性化される。その後、ウェルを洗浄し、形成されたＣ５ｂ−Ｃ９を特異的なアルカリホスファターゼ標識抗Ｃ５ｂ−Ｃ９抗体で検出する。さらなる洗浄ステップの後、アルカリホスファターゼ基質溶液とインキュベートすることで特異的抗体を検出する。補体活性化の量は色の強度に相関し、吸光度で測定される（光学濃度ＯＤ）。このキットを用いて、本発明の組換えヒトＣ１ＩＮＨ（ｒｈＣ１ＩＮＨ）及び血漿由来Ｃ１ＩＮＨ（ｐｄＣ１ＩＮＨ）がどちらも同様の古典経路阻害能を有することが分かった。しかし、本発明のＣＩＩＮＨは、ＭＢＬ経路に対して、血漿由来Ｃ１ＩＮＨより約２０％高い阻害能を有することが分かった（実施例３参照）。
【００２７】
したがって、この好ましい実施形態では、本発明に使用するためのＣ１ＩＮＨのグリコシル化が異なるために、ＭＢＰへの親和性が血漿由来対応物よりも高くなり、その結果、より効率的にＭＢＰを阻害し、より効率的にレクチン経路を阻害する。好ましくは、レクチン経路のより効率的な阻害とは、少なくとも５％高い阻害であり、さらにより好ましくは少なくとも１０％高い阻害であり、さらにより好ましくは少なくとも１５％高い阻害であり、さらにより好ましくは少なくとも２０％、さらにより好ましくは少なくとも２５％、さらにより好ましくは少なくとも３０％、さらにより好ましくは少なくとも３５％、さらにより好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも４５％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも５５％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも６５％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％高い阻害を指す。レクチン経路の活性化は、上述のWielisaキットを用いて測定されることが好ましい。
【００２８】
本発明の方法は、あらゆる種類の虚血及び再灌流障害を予防、軽減又は処置するために適用されてよい。好ましくは本発明の方法は、少なくとも部分的にレクチン経路を介して、より好ましくは主にレクチン経路を介して生じることが分かっている虚血及び再灌流障害に適用される。心筋の虚血及び再灌流障害(J Immunology 2005, 175: 541-546)、腎虚血再灌流障害（Am J Pathol. 2004 165(5):1677-88）胃腸の虚血再灌流障害（J Immunol. 2005 15:174(10):6373-80）及び脳卒中（deSimoni et al, 2004 Am J. Pathol. 164:1857-63）については、再灌流障害は主にレクチン経路を介して生じ、古典経路を介して生じることはほとんどないことが示されている。したがって、本発明のＣ１ＩＮＨは、天然の血漿由来対応物と比べて、レクチン経路のより強力なインヒビターであることが好ましい。本発明のＣ１ＩＮＨは、天然の血漿由来対応物と比較して、人間内におけるより強力なインビボのレクチン経路インヒビターであることが好ましい。
【００２９】
本明細書の実施例で使用される実験モデルと異なり、実生活における虚血の発生は予期されないものであることが多い。したがって、通常、虚血及び／又はその後の再灌流発生前にＣ１ＩＮＨを投与するというのは実行可能な選択肢ではなく、必然的に実際のＣ１ＩＮＨの投与は虚血及び／又はその後の再灌流の（数時間後とまでいかなくとも）少し後に投与される。しかしこれにより、従来の血漿由来Ｃ１ＩＮＨの治療的有用性が大きく制限されている。なぜなら、従来の血漿由来Ｃ１ＩＮＨは虚血再灌流の後に投与されてもほとんど効果がなく、治療に有効な時間枠が非常に狭いためである（図２及びdeSimoni et al, 2004 Am J. Pathol. 164:1857-63参照）。対照的に、上述の本発明に使用するためのＣ１ＩＮＨは、虚血若しくは虚血発症の少なくとも１時間後及び／又は再灌流開始３０分後に注射した場合でも神経保護効果を発揮することができる。したがって、虚血及び再灌流障害の予期されない又は予期される発生の少なくとも１つを予防、軽減又は処置する方法の好ましい実施形態では、本発明のＣ１ＩＮＨは少なくとも虚血期間の最後又は虚血期間後（すなわち虚血組織が再灌流されているとき）に投与される。本発明のＣ１ＩＮＨは、虚血期間後又は再灌流開始後の少なくとも１０、１５、２０、３０、４５、６０、９０又は１２０分後に投与されることがより好ましい。本発明のＣ１ＩＮＨは、虚血又は虚血及び／若しくは再灌流の発症から２４時間、１２時間、６時間、４時間又は３時間以内に投与されることが好ましい。別の好ましい実施形態では、Ｃ１インヒビターは、虚血又は虚血及び／若しくは再灌流の発症から少なくとも３時間後、好ましくは少なくとも６時間後、より好ましくは少なくとも９時間後、さらにより好ましくは少なくとも１８時間後に投与される。
【００３０】
１つの好ましい実施形態では、本方法は、虚血再灌流の予期されない突発的な又は急性の発生を予防、軽減又は処置するために適用される。虚血再灌流障害の予期されない突発的な又は急性の発生に関連する状態及び障害としては特に制限されないが、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）後、脳卒中（周産期脳卒中を含む）後、出血性ショック後、腸虚血後、経皮経管冠動脈形成術（ＰＣＴＡ）の失敗による緊急冠動脈手術後、血管遮断（例えば、骨格筋虚血につながる大動脈遮断）を伴う任意の血管手術後、又は膵管若しくは胆管処置（ＥＲＣＰ）後の膵炎の後の、虚血再灌流障害等を挙げることができる。そのような場合には、本発明のＣ１ＩＮＨを急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、脳卒中（周産期脳卒中を含む）、出血性ショック、腸虚血、経皮経管冠動脈形成術（ＰＣＴＡ）の失敗による緊急冠動脈手術、血管遮断（例えば、骨格筋虚血につながる大動脈遮断）を伴う任意の血管手術、又は膵管若しくは胆管処置（ＥＲＣＰ）後の膵炎の、少なくとも１、５、１０、１５、２０、３０、４５、６０、９０又は１２０分後に投与することが好ましい。或いは、本発明のＣ１ＩＮＨを投与する時間は、再灌流開始の少なくとも１、５、１０、１５、２０、３０、４５、６０、９０又は１２０分後と好ましく定義することもできる。
【００３１】
さらに、予期されない虚血再灌流障害とは、好ましくは治療又は手術により虚血を誘発せずに再灌流が誘発された虚血再灌流障害と定義することができる。そのような治療又は手術としては特に限定されないが、
−薬理学的な血栓溶解（脳卒中、急性冠不全症候群、末梢動脈閉塞、肺動脈塞栓、腎動脈閉塞に対する静脈内療法及び血管内療法を含む）
−物理的な血栓溶解（例えば経皮的冠動脈インターベンション、末梢血管形成術、内臓血管形成術）
−冠動脈バイパス術
−頸動脈血管内膜切除術
−腸間膜虚血
−出血性ショック、心原性ショック、神経原性ショック、アナルフィラキシー（analphylactic）ショックなどのショック
−皮弁の失敗（例えば形成手術）
−指及び肢の再移植
−絞扼性腸
等を挙げることができる。
【００３２】
或いは、別の好ましい実施形態では、本方法は、虚血再灌流の予期される発生を予防、軽減、又は処置するために適用される。虚血再灌流障害の予期される発生としては、治療又は手術により虚血及びその後の再灌流の両方が誘発される状況を好ましく挙げることができる。血流が無くなるか低くなる一時的な期間（すなわち、虚血又は低酸素症）及びその後の再灌流を誘発する治療又は手術として以下のものを挙げることができるが、これらに限定されるものではない：
−心肺バイパス
−大動脈瘤や脳動脈瘤などの動脈瘤修復
−手術中にクランプを用いる頸動脈血管内膜切除術
−超低体温循環停止
−止血帯の使用（すなわち外傷時における）
−固形臓器移植
−その他の医原性の血流の乱れ
【００３３】
さらに、虚血再灌流障害の予期される発生に関連する状態及び疾患としては特に制限されないが、臓器移植（肺、肝臓、腎臓、心臓）後の虚血再灌流障害、血管の遮断（例えば、骨格筋虚血につながる大動脈の遮断）を伴う任意の血管手術後の虚血再灌流障害、膵管若しくは胆管処置（ＥＲＣＰ）後の膵炎後の虚血再灌流障害、体外循環法（ＥＣＣ）の期間中又は後の虚血再灌流障害等を挙げることができる。
【００３４】
虚血及び再灌流障害の予期される発生の少なくとも１つの予防、軽減又は処置のための方法の好ましい実施形態では、本発明のＣ１ＩＮＨは少なくとも虚血期間の最後又は後（すなわち虚血組織が再灌流されているとき）に投与される。本発明のＣ１ＩＮＨは、虚血期間の後又は再灌流開始後、少なくとも１０、１５、２０、３０、４５、６０、９０又は１２０分後に投与されることがさらに好ましい。本発明のＣ１ＩＮＨは、虚血又は虚血及び／若しくは再灌流発症から２４、１２、６、４又は３時間後までに投与されることが好ましい。別の好ましい実施形態では、Ｃ１インヒビターは、虚血後又は虚血及び／若しくは再灌流発症後少なくとも１時間後、虚血後又は虚血及び／若しくは再灌流発症後少なくとも３時間後、好ましくは少なくとも６時間後、より好ましくは少なくとも９時間後、さらにより好ましくは少なくとも１８時間後に投与される。
【００３５】
或いは、本発明の別の態様では、虚血及び再灌流障害の予期される発生の少なくとも１つの予防、軽減又は処置のための方法が提供され、該方法では、虚血及び再灌流の前又は期間中に本発明のＣ１ＩＮＨが投与される。本発明のＣ１ＩＮＨの血漿中半減期に応じて、可能な限り最良の結果を得るために、本発明のＣ１ＩＮＨが投与され得る可能な限り最も早い時点を調節することができると当業者には理解される。
【００３６】
１つの好ましい実施形態によれば、持続投与が必要な対象に及び／又は臓器移植の場合は移植される臓器に本発明のＣ１ＩＮＨが持続投与される。移植される臓器は好適な溶媒及び好適な量のＣ１ＩＮＨを含む組成物中で保存されることが好ましい。
【００３７】
或いは、又は前述の好ましい実施形態との組合せにおいて、予期される種類の虚血及び再灌流障害の発生の前とは、好ましくは、少なくとも１つの虚血及び再灌流障害の予期される発生の最大で３時間前、好ましくは最大で２時間前、より好ましくは最大で１時間前、最も好ましくは最大で３０分前に投与が行われることを意味する。
【００３８】
持続投与が必要な対象とは、虚血及び再灌流障害の予期される発生が起こり得る対象である。虚血及び再灌流障害の予期される発生については既に本明細書に記載した。
【００３９】
虚血及び再灌流障害の予期される発生の前のＣ１ＩＮＨの投与は、虚血及び再灌流障害に関連する全てではなくともほとんどのダメージの発生を、虚血及び再灌流障害発生後にＣ１ＩＮＨが投与される場合と同様に（より優れてはいなくとも）予防し得るため魅力的である。
【００４０】
より好ましい実施形態では、本方法は、虚血再灌流の予期されない発生に適用される。脳卒中又は周産期脳卒中の後に起こる虚血再灌流障害がさらにより好ましい。虚血再灌流のこれらの種類の予期されない発生において、本発明者らは本発明のＣ１インヒビターが虚血性ペナンブラで神経保護効果を発揮することを実証した。虚血性ペナンブラとは、好ましくは海馬及び／又は皮質を指す。好ましくは、神経保護効果とは、海馬における虚血発症の３時間後まで、及び皮質における虚血発症の９時間後までに本発明のＣ１インヒビターで処置した後の海馬及び／又は皮質における神経変性が抑制（counteract）されることを指す。より好ましくは、神経変性は、海馬において４、５、６時間以上まで、及び虚血において１０、１１、１２時間以上まで抑制される。好ましくは、神経変性は実施例２のように評価される。すなわち、神経細胞の変性に特異的なマーカー、好ましくはJade（Schmued LC, et al, 参考文献 4）で脳切片を染色し、蛍光顕微鏡法で解析する。この方法を用いた場合に、神経変性の抑制とは、非処置サンプルと比較して、処置サンプルにおいて可視化される染色された細胞が少なくとも２％少ないことを指す。好ましくは神経変性の抑制とは、染色される細胞が少なくとも５％、少なくとも７％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％以上少ないことを指す。
【００４１】
或いは、又は前述の実施形態との組合せにおいて、インヒビターを使用することで、虚血及び／又は再灌流により誘発された病変が軽減する。より好ましくは、脳卒中又は周産期脳卒中後に虚血再灌流障害が発生したときに、本発明のＣ１インヒビターを使用することで梗塞サイズが減少する。さらにより好ましくは、梗塞サイズは実施例２に示すように定量される。さらにより好ましくは、この定量方法を用いた場合に、虚血発症の少なくとも３時間後において、梗塞サイズの少なくとも１０％、さらにより好ましくは少なくとも２０％、さらにより好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の減少が達成される。
【００４２】
本発明の方法に使用するためのＣ１ＩＮＨは、従来の医薬組成物の一部であってもよいし、それらと併用してもよい。これらの医薬組成物は通常、Ｃ１ＩＮＨ及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含有する。これらの医薬組成物は、局所療法又は全身療法のどちらが望ましいか、処置する部位、及び活性化合物の安定性に応じて、複数の方法で投与されてよい。好適な製剤は投与方法によって決まる。医薬組成物は、非経口投与、例えば静脈内、動脈内、皮下、腹腔内若しくは筋肉内への注射若しくは注入、又は髄腔内投与若しくは頭蓋内投与により投与されることが好ましい。好ましい実施形態では、医薬組成物は静脈内注入により投与される。非経口投与に好適な製剤は当該技術分野で公知であり、通常は液剤である。非経口投与のためのＣ１ＩＮＨ標品は無菌でなければならない。滅菌は、凍結乾燥及び再構成の前又は後に滅菌ろ過膜でろ過することで容易に達成される。Ｃ１ＩＮＨ標品は、注入又はボーラス注入により持続的に投与されてもよい。液状Ｃ１ＩＮＨ製剤は、例えば注入ポンプにより投与されてもよい。静脈内注入用の典型的な組成物は、１００〜５００ｍｌの滅菌０．９％ＮａＣｌ又は５％グルコース（必要に応じて２０％アルブミン溶液を添加）と１００〜５００ｍｇのＣ１ＩＮＨとを含むように作製することができる。典型的な筋肉注射用の医薬組成物は、例えば１〜１０ｍｌの滅菌緩衝水溶液と１〜２５０ｍｇの本発明のＣ１ＩＮＨとを含むように作製することができる。非経口投与可能な組成物の製造方法は当該技術分野で周知であり、様々な文献にさらに詳細に記載されており、例えばRemington's Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing, Easton, PA, 1980)（全ての目的のために、その全体を参照により組み込む）を挙げることができる。
【００４３】
本発明の方法において使用する場合、Ｃ１ＩＮＨの有効量、すなわち有効な濃度及び頻度は、使用する具体的な医薬組成物、状態の重症度及び患者の通常の健康状態によって決定される。一般的に、本発明に使用するためのＣ１ＩＮＨに基づく医薬組成物の有効量は、ルーチンな最適化によって決定することができる。好適な出発点は、血漿由来Ｃ１ＩＮＨに基づく同等な医薬組成物に使用されている用量である。本発明の医薬組成物の大きな利点は、高い初期用量で処置に用いることができることであり、それによって処置が成功する可能性が高まる。この高い初期用量は、本発明の医薬組成物中のＣ１ＩＮＨのクリアランスが、対応する天然物よりも速いために可能となっている。特に急性症例の処置において、本発明のＣ１ＩＮＨの高い初期用量が利点となり得る。この高い初期用量とは、投与され得る対応する天然物の用量の少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、３倍又は４倍であってもよい。
【００４４】
好ましい実施形態では、本発明のＣ１ＩＮＨは、個体の体重に対して５０、１００、２００、４００、６００、８００、又は１０００Ｕ／ｋｇを超える用量で、好ましくは個体の体重に対して５０〜２０００、１００〜１０００、２００〜８００、４００〜７００又は５００〜７００Ｕ／ｋｇの範囲で静脈内投与される。１ユニット（Ｕ）のＣ１ＩＮＨとは、ヒトの血液１ミリリットル中に存在するＣ１ＩＮＨの量である。そのような１ユニットは、約２７５マイクログラムの血漿由来Ｃ１ＩＮＨに相当する。分子量を１１０，０００ダルトンとすると、ヒト血漿中のＣ１ＩＮＨ濃度は２．５マイクロモル毎リットルである（Nuijens et al. (1989), J. Clin. Invest. 84:443）。
【００４５】
本発明の方法の別の好ましい実施形態では、医薬組成物は、血栓溶解剤をさらに含むか、又は血栓溶解剤と併用して使用されるものであるか若しくは血栓溶解剤による処置の後（after subsequent treatment）に使用されるものである。本願において、血栓溶解剤とは、血餅（血栓）を溶解させて動脈又は静脈を再度開くことのできる薬剤（薬物）を指すと理解される。通常、血栓溶解剤はセリンプロテアーゼであり、プラスミノーゲンをプラスミンに変換し、プラスミンはフィブリノゲン及びフィブリンを分解し、血餅を溶解させる。好ましい血栓溶解剤としては、レテプラーゼ（r-Pa又はRetavase）、アルテプラーゼ（t-PA又はActivase）、ウロキナーゼ（Abbokinase)、プロウロキナーゼ、アニソイル化された精製ストレプトキナーゼ活性化複合体（anisoylated purified streptokinase activator complex）（ＡＰＳＡＣ）、ストレプトキナーゼ等を挙げることができる。
【００４６】
別の態様、特に米国以外の法域では、本発明は、本明細書で既に記載した任意の方法に従って再灌流障害を予防、軽減又は処置するための医薬の製造のための、本明細書で既に記載した本発明のＣ１ＩＮＨの使用に関する。
【００４７】
本明細書及び請求項において、動詞「含む」及びその活用形は、非限定的な意味で使用されており、この語の前の物が含まれつつも、具体的に言及されていない物も排除されないことを意味する。さらに、言及されている要素について、文脈から明らかに要素が１つだけであることが要求されない限り、１つ以上の要素が存在する可能性は排除されない。
実施例
【実施例１】
【００４８】
以前の実験で、虚血期間の初めに投与されたｒｈＣ１ＩＮＨ（１５Ｕ／マウス）の単回投与が、本発明者らの局所脳虚血のモデルマウスにおける虚血から４８時間後の評価で、血漿由来Ｃ１ＩＮＨとよく似た様式で、有意に虚血容積を減少させることが示された。本実施例で、本発明者らは、虚血容積及び機能欠損に対するｒｈＣ１ＩＮＨの神経保護活性の有効性の時間枠を調べた。本発明者らは、神経変性及びグリア反応を評価することで７日間の転帰に対するｒｈＣ１ＩＮＨの影響についても実験した。
【００４９】
１．  方法
１．１  一過性局所脳虚血
以前に報告があるように、虚血は中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）によって起こる(前述のDe Simoni et al., 2003 and 2004)。麻酔をＮ２Ｏ／Ｏ２（７０／３０％）混合物中の５％イソフルランによって誘導し、同じ混合物中の１．５〜２％イソフルランによって維持した。各動物における血管閉塞の妥当性（adequacy）を確かなものにするために、脳表面に配置して頭蓋骨上に印象材で固定（座標はＡＰ＝−１ｍｍ、Ｌ＝−３．５ｍｍ）した０．５ｍｍのフレキシブル光ファイバープローブ（Transonic社製、タイプＭ、直径０．５ｍｍ）を用いたレーザードップラー流量計（Transonic社製、ＢＬＦ−２１）により、血流を測定した。簡潔には、右総頸動脈を露出させ、シリコーン処理をしたフィラメント（７−０）を総頸動脈の切開部を通して内頸動脈内に導入し、前大脳動脈とＭＣＡへの分岐部を塞ぐように前大脳動脈へと進めた。血流が虚血前のベースラインに対して７０％を超えて減少するまでフィラメントを進めた。虚血３０分後、ナイロンフィラメントを慎重に除去して血流を回復させた。
【００５０】
１．２  薬物処置
虚血からの様々な時点で、１５Ｕ／マウスの用量でｒｈＣ１ＩＮＨを１５０μｌ又は同体積の生理食塩水をマウスに単回ｉｖ注射した：
−虚血期間の初め（ｒｈＣ１ＩＮＨ−ｐｒｅ）
−虚血期間の終り（ｒｈＣ１ＩＮＨ−ｐｏｓｔ）
−虚血期間開始１時間後（ｒｈＣ１ＩＮＨ １ｈ−ｐｏｓｔ）
この実験で使用したｒｈＣ１ＩＮＨは、乳腺中にヒトＣ１ＩＮＨを発現するトランスジェニックウサギを用いて産生し、国際公開第０１／５７０７９号パンフレットに記載されているようにして、これらの動物から得られた乳から精製した。
【００５１】
１．３  神経障害の評価
虚血の４８時間後に、マウスに固有な２つの神経機能を基準にして各マウスを評価した。評価は、実験条件を知らされていない訓練を受けた研究者が行った。、全体障害については、以下のカテゴリーの各々についてマウスに０〜２８のスコアを付けた：毛、耳、目、姿勢、自発的活動、てんかん性の行動。局所障害については、以下のカテゴリの各々についてマウスに０〜２８のスコア付けた：体の対称性、歩行、クライミング、旋回行動、前肢の対称性、強制旋回、感覚反応。データは中央値及び２５パーセンタイル〜７５パーセンタイルにて示す。
【００５２】
１．４  梗塞面積の定量
虚血の４８時間後に、マウスにEquitensinで深く麻酔を施し（１２０μｌ／マウス、ｉｐ）、０．１モル／ｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）を３０ｍｌ、続いてＰＢＳ中冷却パラホルムアルデヒド（paraformaldheyde）（４％）を６０ｍｌ経心臓的に灌流した。頭蓋骨から脳を慎重に取り出し、凍結保護のために、ＰＢＳ中の３０％スクロースに４℃で一晩移した。その後、イソペンタン中に−４５℃で３分間浸漬することで脳を急速に凍結し、その後、バイアル中に密封し、使用時まで−７０℃で保存した。病変サイズを決定するために、脳の２０μｍの冠状切片を２４０μｍ間隔で連続切断し、ニュートラルレッド（Neutral Red Gurr Certistain、BDH社製、England）で染色した。各薄片について、盲検で梗塞領域を評価し、組織学的染色の相対的薄さにより表した。梗塞領域は、各切片の対側半球の領域から同側半球中の健康組織の領域を引くことで決定した。梗塞体積は、コンピュータ支援画像分析機で定量して分析画像システム（Analytical Image System）で算出した各脳薄片の梗塞領域を統合することで算出した。
【００５３】
１．５  オープンフィールド試験
虚血の７日後に、マウスの行動をオープンフィールド試験により評価した。この試験は、長期虚血マウスの不安行動及び探索行動、並びに自発運動活性（locomor activity）の有用な試験となり得る。オープンフィールドは、４つの異なる物体を含むプラスチック製ボックス（４１×４１×４１ｃｍ）からなる。オープンフィールド領域は、２８×２８ｃｍの中心ゾーンとそれを囲む周辺ゾーン（border zone）に分けた。マウスを個別にオープンフィールドの中心に置き、実験条件を知らされていない研究者がその行動を５分間観察した。内部横断（inside crossing）（主に不安行動に関係）、外部横断（outside crossing）（主に自発運動に関係）、立ち上がり行動（主に探索行動に関係）、及び物体との接触（主に感覚／自発的行動に関係）の回数を数えた。
【００５４】
１．６  神経細胞の計数
虚血の７日後に、マウスを前述のように経心臓的に灌流した。神経細胞の数は、脳の２０μｍの冠状切片を６４０μｍ間隔で連続切断し、クレシルバイオレット(クレシルバイオレット酢酸、Sigma社製、St. Louis、MO)で染色して決定した。同側半球及び対側半球の３つの２０μｍ切片を神経細胞の計数のために選択した。第１の切片はブレグマからの定位座標前後方向＋０．８６のものである。神経細胞の消失量は、両半球の３つの切片で生存する神経細胞の数をプールすることで算出し、体側半球の百分率で示した。Soft Imaging System社製のColorviewビデオカメラとAnalySISソフトウェアとにインターフェースで連結されたオリンパス社製ＢＸ６１顕微鏡を用いた。定量分析は、４０倍の倍率で、処置について知らされていない研究者が行った。
【００５５】
１．７  アストロサイト及びミクログリアの免疫組織化学
虚血の７日後に、経心臓的に灌流した虚血マウスの厚さ２０μｍの冠状切片を作製し、アストロサイト及びミクログリア／マクロファージ免疫染色の評価に用いた。簡潔には、切片をＰＢＳ（０．１モル／Ｌ）中の０．４％トリトンＸ１００で３０分間すすぎ、続いてＰＢＳ中の０．１％トリトンＸ１００及び３％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）で１５分すすいだ。その後、アストロサイト及びミクログリアに対する抗体（抗ＧＦＡＰ抗体１：１５００、Chemicon社製；抗ＣＤ１１ｂ抗体１：２５０、Dr. A. Doni, Mario Negri Instituteの好意により寄贈された）と一緒に切片を一晩インキュベートした。次の日、ＰＢＳで切片を洗浄し、ビオチン化２次抗体と一緒に１時間インキュベートし、洗浄し、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼと一緒にインキュベートした。３’−３−ジアミノベンジジン四塩酸塩と反応させた後、光学顕微鏡解析の前に、切片を洗浄し、乾燥させ、段階希釈アルコール（graded alcohol）で脱水し、キシレンで固定し、DPX mountantを用いてカバーガラスに封入した。
【００５６】
２．  結果
２．１  効果の時間枠
２．１．１  神経障害の評価
虚血の４８時間後に、ｒｈＣ１ＩＮＨ又は生理食塩水を受けた虚血マウスにおける神経障害を評価した。生理食塩水処置した虚血マウスと比較して、ｒｈＣ１ＩＮＨ処置マウスは全ての群で、有意ではないがわずかな減少が観察された（ｒｈＣ１ＩＮＨ−ｐｒｅ：９及び１２；ｒｈＣ１ＩＮＨ−ｐｏｓｔ：７及び１１；ｒｈＣ１ＩＮＨ １ｈ−ｐｏｓｔ：９及び１３、生理食塩水：１０及び１２．５、それぞれ全体障害及び局所障害の中央値）（データ示さず）。
【００５７】
２．１．２  梗塞サイズの評価
虚血の４８時間後に、生理食塩水処置マウス(４１．５１±７．０１ｍｍ３)と比較して、ｒｈＣ１ＩＮＨ処置マウスは、用量１５Ｕ／マウス、−ｐｒｅ、−ｐｏｓｔ、及び１ｈ−ｐｏｓｔにおいて虚血容積の大幅な減少を示した（それぞれ１３．６７±２．５９ｍｍ３、９．０６±０．７７ｍｍ３及び８．２４±１．００ｍｍ３）（図１、データは平均値±ＳＥＭで表す）。
【００５８】
２．２  ７日間の転帰
２．２．１  オープンフィールド試験
虚血は、虚血処置していない動物と比較して、立ち上がり行動の回数を有意に減少させたが、ｒｈＣ１ＩＮＨ処置群ではこのパラメータは非虚血マウスと変わらなかった。評価したその他のパラメータについては、３つの群で差はなかった。
【００５９】
２．２．２  神経細胞の計数
ｒｈＣ１ＩＮＨの保護効果が長く続くかを評価するために、虚血誘発及び薬物処置の７日後の神経細胞の喪失を評価した。その結果、生理食塩水処置マウスの平均が１４％±２．１８％であるに対し、ｒｈＣ１ＩＮＨ処置マウスの平均は４％±１．２４％（データ示さず）であり、この時点においてもまだｒｈＣ１ＩＮＨの保護効果があることが示された。
【００６０】
２．２．３  ミクログリア／マクロファージ及びアストロサイトの免疫組織化学
虚血の７日後に、生理食塩水を受けた虚血マウスの損傷を受けた海馬及び線条体において、活性化されたミクログリア及び浸潤されたマクロファージが大量に観察された（データ示さず）。１５ユニットのｒｈＣ１ＩＮＨ−ｐｒｅにより、検討したこれら両部分において、この活性化及び浸潤を抑制（counteract）することができた（データ示さず）。
【００６１】
生理食塩水処置した虚血マウスの同側海馬は、アストロサイトのわずかな増加を示し、これはｒｈＣ１ＩＮＨ処置した虚血マウスにおける観察結果と変わらなかった（データ示さず）。脳のその他の領域では、どちらの群においても、関連するアストロサイト活性化は見られなかった。
【００６２】
３．  結論
本発明のデータは、用量１５Ｕ／マウスのｒｈＣ１ＩＮＨが、虚血期間の開始時（−ｐｒｅ）に与えられた場合と虚血期間の最後（−ｐｏｓｔ、すなわち再灌流時）に与えられた場合とで、虚血容積を減少させるのに同様に有効であることを示している。もっと重要なことは、このインヒビターが、虚血発症の１時間後（１ｈ−ｐｏｓｔ）に注射されたときでも神経保護効果を発揮することができるということである。その上、ｒｈＣ１ＩＮＨの保護作用は虚血の７日後でも存在する。これらの結果は、血漿由来ｈＣ１ＩＮＨと著しい対照を成しており、血漿由来ｈＣ１ＩＮＨは虚血の１時間後に注射された場合、その神経保護効果を発揮する能力をほとんど完全に失っていた（図２参照）。
【００６３】
本研究の主な結果は以下の通りである。
１．マウス血漿中におけるｒｈＣ１ＩＮＨの半減期は、（用量１５Ｕ／マウスにおいて）約３時間である。抗原と機能的活性が良く相関しており、これは組換えタンパク質が活性型でのみ血漿中を循環していることを示している。組織分布が血漿レベルの減少に寄与した可能性もある。
【００６４】
２．  ｒｈＣ１ＩＮＨは、用量１５Ｕ／マウス、−ｐｒｅにおいて、虚血容積を非常に効果的に減少させる（６９％の減少）。
【００６５】
３．  用量１５Ｕ／マウスのｒｈＣ１ＩＮＨは、Fluoro-Jade染色による評価で、海馬中の変性している神経細胞の数を明確に減少させることができ、これは、虚血容積の減少が神経細胞のスペアリング（sparing）によるものであることを示している。
【００６６】
４．  ｒｈＣ１ＩＮＨは、虚血期間の開始時（−ｐｒｅ）、虚血期間の最後（−ｐｏｓｔ、すなわち再灌流時）、又は虚血発症１時間後（１ｈ−ｐｏｓｔ、すなわち再灌流の開始から３０分後）に与えられたとき、虚血容積を減少させるのに同様に有効である。したがって、虚血の１時間後に与えられたときには既に有効でないｐｄＣ１ＩＮＨよりも、ｒｈＣ１ＩＮＨは有効性の時間枠が広い。
【００６７】
５．  虚血開始の７日後に行った神経細胞の計数により示されているように、ｒｈＣ１ＩＮＨ−ｐｒｅ投与の神経保護効果は長時間続く。
【００６８】
６．  ｒｈＣ１ＩＮＨは、虚血から４８時間後の評価で、全体及び局所障害のわずかな改善を誘発した。この知見は、ｐｄＣ１ＩＮＨにおける観察結果と同様である。長期間の行動の転帰に対するｒｈＣ１ＩＮＨの影響を評価するため、オープンフィールド試験によりマウスの行動を分析した。虚血の７日後における虚血マウスの立上がり行動のスコアは、虚血処置していないマウスと比較して有意に低い。ｒｈＣ１ＩＮＨ処置マウスではこの低下は見られず、スコアは対照マウスと変わらなかった。
【００６９】
７．  ｒｈＣ１ＩＮＨは、早期（４８時間）及び後期（７日目）における評価で、虚血マウス脳におけるミクログリア／マクロファージの活性化／リクルートを抑制することができる。これらの細胞は脳組織の炎症反応の指標である。
【００７０】
８．  ４８時間目において虚血により誘導される強いアストロサイト反応がｒｈＣ１ＩＮＨによって弱められる。アストロサイト活性化が両実験群において７日目に顕著に低下し、生理食塩水処置マウスとｒｈＣ１ＩＮＨ処置マウスとの間で差は見られなかった。
【実施例２】
【００７１】
局所脳虚血のモデルマウスにおけるｒｈＣ１−ＩＮＨの神経保護作用の研究
本研究者らは、１５ＵのｒｈＣ１−ＩＮＨが、マウス脳虚血／再灌流のモデルにおいて、虚血／再灌流発症の１時間後に投与された場合であっても顕著な神経保護作用を有する(これは処置後のこのような時間においてはもはや効果をもたないｐｄＣ１−ＥＮＨとは異なる)ことを以前に実証している。この神経保護は長時間続き、実際、ｒｈＣ１−ＩＮＨで処置したマウス虚血脳は、虚血及び処置の７日後においてもまだ梗塞サイズの減少を示す。以下の実験で、本発明者らは、虚血容積に対するｒｈＣｌ−ＩＮＨの神経保護活性について、その有効性の時間枠（１時間後を超える）及び用量反応を決定する。さらに、本発明者らは同じプロトコールを用いて、ｐｄＣｌ−ＩＮＨ、ウサギｒｈＣｌ−ＩＮＨ及びウシｒｈＣｌ−ＩＮＨ間で（ウサギｒｈＣｌ−ＩＮＨの最も効果的な量及び時点において）直接比較を行った。
【００７２】
方法
動物
動物及び動物の世話に関する手順は、国内の法律及び政策(D.L. n.116, G.U. suppl. 40, 18 February 1992)並びに国際法及び国際政策(EEC Council Directive 86/609, OJ L 358,1; Dec.12,1987; NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, U.S. National Research Council 1996)に準拠した施設ガイドラインに沿って行った。Ｃ５７Ｂ１／６雄マウス（２６〜２８ｇ、Charles River、Calco, Italy）を１ケージ当たり５頭収容し、一定の温度（２１±１℃）及び相対湿度（６０％）下で、規則的な明暗スケジュール（７ａｍ〜７ｐｍ）に置いた。飼料（マウス用のAltromin社製固形飼料）及び水は適宜与えられた。
【００７３】
一過性局所脳虚血
以前に記載されている通りに、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）によって虚血を生じさせた1、3。麻酔を、ＮａＯ／Ｏａ（７０／３０％）混合物中の５％イソフルランによって誘導し、同じ混合物中の１．５〜２％イソフルランによって維持した。各動物における血管閉塞の妥当性を確かなものにするために、脳表面に配置して頭蓋骨上に印象材で固定（座標はＡＰ＝−１ｍｍ、Ｌ＝−３．５ｍｍ）した０．５ｍｍのフレキシブル光ファイバープローブ（Transonic社製、タイプＭ、直径０．５ｍｍ）を用いたレーザードップラー流量計（Transonic社製、ＢＬＦ−２１）により、血流を測定した。簡潔には、右総頸動脈を露出させ、シリコーン処理をしたフィラメント（７−０）を総頸動脈の切開部を通して内頸動脈内に導入し、前大脳動脈とＭＣＡへの分岐部を塞ぐように前大脳動脈へと進めた。血流が虚血前のベースラインに対して７０％を超えて減少するまでフィラメントを進めた。虚血から３０分後に、ナイロンフィラメントを慎重に除去して血流を回復させた。
【００７４】
薬物処置
虚血からの様々な時点で様々な用量のＣ１−ＩＮＨ（ウサギｒｈＣｌ−ＩＮＨ、ウシｒｈＣｌ−ＩＮＨ又はｐｄＣｌ−ＩＮＨ）をマウスに単回ｉｖ注射した。対照マウスは同体積の生理食塩水を受けた。
【００７５】
神経障害の評価
虚血の４８時間後に、マウスに固有な２つの神経機能を基準にして各マウスを評価した。評価は、実験条件を知らされていない訓練を受けた研究者が行った。全体障害については、以下のカテゴリーの各々についてマウスに０〜２８のスコアを付けた：毛、耳、目、姿勢、自発的活動、てんかん性の行動。局所障害については、以下のカテゴリーの各々についてマウスに０〜２８のスコアを付けた：体の対称性、歩行、クライミング、旋回行動、前肢の対称性、強制旋回、感覚反応．データは中央値及びパーセンタイルで示す。
【００７６】
梗塞サイズの定量
虚血の４８時間後に、Equitensin（１２０ｊｉｌ／マウス、ｉｐ）でマウスに深く麻酔を施し、０．１モル／ｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）を３０ｍｌ、続いて冷却ＰＢＳ中パラホルムアルデヒド（paraformaldheyde）（４％）を６０ｍｌ経心臓的に灌流した。頭蓋骨から脳を慎重に取り出し、凍結保護のために、ＰＢＳ中の３０％スクロースに４℃で一晩移した。その後、イソペンタン中に−４５℃で３分間浸漬することで脳を急速に凍結し、その後バイアル中に密封し、使用時まで−７０℃で保存した。病変サイズの決定については、脳の２０μｍの冠状切片を２４０（ｊ，ｍ間隔で連続切断し、ニュートラルレッド（Neutral Red Gurr Certistain、BDH社製、England）で染色した。各薄片について、盲検で梗塞領域を評価し、組織学的染色の相対的薄さにより表した。梗塞領域は、各切片の対側半球の領域から同側半球中の健康組織の領域を引くことで決定した。梗塞体積は、コンピュータ支援画像分析機で定量して分析画像システムで算出した各脳薄片の梗塞領域を統合することで算出した。
【００７７】
神経変性の評価
神経細胞の変性のマーカーであるFluoro-Jade４を用いた染色により、厚さ２０ｊａｍの切片上で神経変性の有無を評価した。簡潔には、切片を乾燥させ、蒸留水及びエタノール（１００％〜７５％）中で再水和した。次いで、切片を０．０６％過マンガン酸カリウム中で１５分間インキュベートし、蒸留水で洗浄し、０．００１％Fluoro-Jade染色液に３０分間移した。染色後、蛍光顕微鏡解析の前に、切片を蒸留水ですすぎ、乾燥させ、キシレンに浸漬し、DPX mountant（BDH, Poole, UK）を用いてカバーガラスに封入した。
【００７８】
結果
一過性虚血における有効性の時間枠
有効性の時間枠を評価するために、虚血の開始から３、６、９、１８及び２４時間目に、１５ＵのウサギｒｈＣ１−ＩＮＨ又は生理食塩水を与えた。４８時間後、虚血発症の３及び６時間後にウサギｒｈＣｌ−ＩＮＨで処置した虚血マウスは、生理食塩水で処置した虚血マウス（４４．４３±５．９４ｍｍ３）と比較して、虚血容積の顕著な減少を示した（それぞれ、１１．７１±０．６３ｍｍ３及び２０．３８±２．３７ｍｍ３）。ウサギｒｈＣｌ−ＩＮＨは、虚血の９及び１８時間後に投与された場合も、少し効果は低いものの有効であった（それぞれ２３．６３±４．１１ｍｍ３及び２７．１３±２．５８ｍｍ３）。虚血の２４時間後では、インヒビターはその有益な作用を失っていた（４１．９２±２．７６ｍｍ３）。（図３）。Fluoro-Jade染色で、生理食塩水処置マウスの線条体皮質及び海馬において神経変性が起こっていることが示された。ｒｈＣｌ−ＩＮＨを早い時点で投与した場合、海馬（３時間まで）及び皮質（９時間まで）における神経変性を抑制することができた。マウスを虚血の６及び９時間後にこのインヒビターで処置した場合、海馬内に変性している神経細胞がいくらか観察された。虚血容積がより大きい、処置のより遅い時点（１８及び２４時間）では、Fluoro-Jade染色は、皮質内に神経変性を起こしている神経細胞が存在することを示していた。検討した全ての時点において、線条体は、生理食塩水処置動物及びｒｈＣｌ−ＩＮＨ処置動物の両方で、広範囲な神経変性を示した（図５、６及び７）。各動物について、実験条件について知らされていない研究者によるFluoro-Jade染色の半定量的評価を行った（図４）。
【００７９】
一過性虚血における用量反応
ヒトの遺伝性血管浮腫に対して用いるＣ１−ＩＮＨの用量が本発明者らがマウスの脳卒中に対して用いた用量より少ないことから、本発明者らの虚血モデルにおいて用いる用量を少なくした。以前の実験結果に基づき、３ｈ ｐｏｓｔ処置を用量反応実験に選んだ。虚血及び再灌流の発症３時間後に、異なる用量のウサギｒｈＣｌ−ＩＮＨ（５及び１０ユニット）を与えた。１０Ｕ／マウスの用量でもまだ虚血容積を減少させるのに有効であった（２２．１０±３．６５ｍｍ３）が、一方、５ＵのウサギｒｈＣｌ−ＩＮＨでは脳のダメージの程度は変わらなかった（４７．３９±４．０８ｍｍ３）。これらのデータは、ウサギｒｈＣｌ−ＩＮＨが虚血病変を用量依存的に変え得ることを示している（図８）。
【００８０】
１０ＵのｒｈＣｌ−ＩＮＨで処置したマウスでは、Fluoro-Jade染色で示されたように、神経変性している神経細胞が線条体においていくらか観察されたが、海馬及び皮質では観察されなかった。一方、５ＵのｒｈＣｌ−ＩＮＨで処置した虚血マウスは、線条体皮質で大きな神経変性を呈していた（示さず）。
【００８１】
全体神経障害及び局所神経障害は、有効性の時間枠又は用量反応実験のどちらにおいても有意な差を示さなかった（示さず）。
【００８２】
（ウサギ及びウシからの）ｐｄＣｌ−ＩＮＨ及びｒｈＣｌ−ＩＮＨの影響の比較
ｐｄＣ１−ＩＮＨについての本発明者らの以前のデータは、異なる一過性脳虚血モデルを用いて得られたものである。ｐｄＣｌ−ＩＮＨ、ウシｒｈＣｌ−ＩＮＨ及びウサギｒｈＣｌ−ＩＮＨを直接比較するために、これらの化合物を同じ実験プロトコール（シリコーンコーティングしたフィラメント）で虚血を誘発したマウスに与えた。インヒビターは虚血発症３時間後に１５Ｕ／マウスの用量で投与された。
【００８３】
予想された通り、ｐｄＣｌ−ＩＮＨはこの時点では神経保護作用を発揮できなかった（４７．３９±４．０８ｍｍ３）。予想と異なり、ウサギｒｈＣｌ−ＩＮＨ処置マウスより程度は低いものの、ウシｒｈＣｌ−ＩＮＨ処置虚血マウスでは、生理食塩水処置マウスと比較して有意に虚血容積が減少していた（図９）。驚くべきことに、ウシｒｈＣｌ−ＩＮＨは全体障害及び局所障害の両方を有意に改善した（図１０）。
【００８４】
Fluoro-Jade染色により、ｐｄＣｌ−ＩＮＨで処置した虚血マウスの脳の検討した全ての領域（皮質、線条体及び海馬）において大きな神経変性が示された。ウシｒｈＣｌ−ＩＮＨ処置マウスの脳を染色した結果、マウス６頭のうち３頭で皮質及び海馬における顕著な神経変性が観察され、他の３頭では神経変性はごくわずかにしか存在していなかったことから、皮質及び海馬における様々なレベルの神経変性が示された。線条体は、マウス６頭中６頭で広範囲なFluoro-Jade染色を呈した。
【００８５】
コメント
本研究の最も関心のあるデータは、ウサギｒｈＣｌ−ＩＮＨの有効性の時間枠である。虚血から３時間後には既に神経保護効果を失ってしまっているｐｄＣｌ−ＩＮＨとは異なり、用量１５Ｕ／マウスのウサギｒｈＣｌ−ＩＮＨは、虚血発症の１８時間後まで虚血容積を有意に減少させることができた。この驚くべき特徴により、ｒｈＣｌ−ＩＮＨはヒトの脳卒中治療のための候補となり得る。ｐｄＣｌ−ＩＮＨとｒｈＣｌ−ＩＮＨの効果が異なるのは、２つの分子のグリコシル化が異なるために、ｒｈＣｌ−ＩＮＨのマンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）への親和性が、血漿由来のものと比較して高くなっているからであると考えられる。ＭＢＰに結合することで、ｒｈＣｌ−ＭＨは心臓、腎臓及び胃腸の虚血／再灌流におけるダメージの原因に関与する補体レクチン経路を阻害する７，９。このほとんど特徴解析されていない経路の脳虚血における役割はまだ分かっておらず、ｒｈＣｌ−ＩＮＨによる神経保護のメカニズムを明らかにするためにはさらなる実験が必要である。
【００８６】
虚血発症後の時間枠における、ｐｄＣ１ＩＮＨよりも優れたｒｈＣ１ＩＮＨの神経保護効果は、細胞表面抗原への結合及び／又は組織へのより効率的な浸透のいずれかによる、組織損傷部位への組換え分子のより効率的なターゲティングによるものであるとさらに説明できるかも知れない。本発明に記載した観察結果の基礎となる正確な分子メカニズムを完全に解明するにはさらなる研究が必要である。
【００８７】
Fluoro-Jade染色からは、時間によって病変がどのように発達するかについての間接的な証拠が得られる。ｒｈＣｌ−ＩＮＨによる早期処置は、虚血性ペナンブラ（海馬及び皮質）を完全に救出する。処置（投与）が遅くなるほど、ペナンブラ中でより多くの神経細胞が変性する。これらの知見は、ｒｈＣｌ−ＩＮＨが虚血性ペナンブラに神経保護作用を発揮することを確認するものである。ウサギｒｈＣｌ−ＩＮＨは用量依存的に虚血容積を減少させることができる。有効性の時間枠の実験で用いたｒｈＣｌ−ＩＮＨの最も効果的な用量（１５Ｕ／マウス、約６００Ｕ／ｋｇに相当）は、ヒトの遺伝性血管浮腫に使用されるもの（約２５〜１００Ｕ／ｋｇ）より非常に大きい。より低い用量でも神経変性及び虚血性梗塞を減少させるのに有効であるかを検証するために、用量反応実験を行った。その結果、４００Ｕ／ｋｇ（ｌ０Ｕ／マウス）のｒｈＣｌ−ＩＮＨは、効果は下がるものの、まだ虚血性傷害を有意に抑制することができることが示された。ＨＡＥに用いた用量（５Ｕ／マウス、２００Ｕ／ｋｇ）の８倍の用量は有効ではなかった。これらの知見は、様々な炎症状態（inflammation settings）の治療用途に高用量のＣｌ−ＩＮＨが必要であることを示す証拠５と一致している。特に、虚血／再灌流による脳のダメージの原因に関わるメカニズムである内皮接着分子に対する重要な阻害効果６を得るためには、このような用量が必要である。最後に、ウシｒｈＣｌ−ＩＮＨは、虚血３の時間後に１５Ｕ／マウスの用量で与えられたとき、ウサギｒｈＣｌ−ＩＮＨほど顕著ではないが、神経保護を提供した。このウシからのｒｈＣｌ−ＩＮＨはまた、生理食塩水処置マウスとの比較で、神経障害を改善することができた。これらの知見は、この分子が虚血マウスの全体的状態を改善することができることを示している。
【実施例３】
【００８８】
ｒｈＣ１ＩＮＨ及び血漿由来Ｃ１ＩＮＨの、古典経路及びＭＢＬ経路の活性化阻害能の比較
【００８９】
材料及び方法
２種類の異なる血清源を用い、Wieslab（商標）complement system Screen（Euro-Diagnostica社製、Malmf、Sweeden）により、古典経路及びレクチン経路の機能に対するｒｈＣ１ＩＮＨ及びｐｄＣ１ＩＮＨ（Cetor、Sanquin社製、Amsterdam、The Netherlands）の効果を調べた。１つの血清源はキットに含まれており、この血清源はキット中で陽性対照として使用される（以下、血清試料１と呼ぶ）。もう一方の血清試料は市販のヒト血清プール（２５人の異なるドナーのプール；Kordia社製、Leiden、The Netherlands）から入手した（以下、血清試料２と呼ぶ）。両方の血清試料を、独立に３連で（in independent triplo’s）、０、１５、３０及び７５μｍｏｌのｒｈＣ１ＩＮＨ又はｐｄＣ１ＩＮＨと一緒に室温で３０分間インキュベートした。したがって、ｐｄＣ１ＩＮＨ及びｒｈＣ１ＩＮＨのストック溶液を適切な濃度に水で希釈した。１５、３０及び７５μｍｏｌのｒｈＣ１ＩＮＨ又はｐｄＣ１ＩＮＨに相当する体積を取り、水で１５μｌに調整した。Wieslab Complement Systemとの干渉の対照とするために、ｒｈＣ１ＩＮＨを溶解する緩衝液（２０ｍＭクエン酸塩、０．１９Ｍスクロース（ｐＨ６．８）；０．２２μｍフィルター処理済）をｒｈＣ１ＩＮＨと同じ希釈系列で用意した。（キットと共に提供された）古典経路及びＭＢＬ経路両方の陽性対照（ＰＣ）及び陰性対照（ＮＣ）並びに両方の血清試料を、メーカーの取扱説明書に従って、古典経路用はDiluent CP中に、ＭＢＬ経路用はDiluent MP中に１／１０１に希釈した。これらの希釈血清のうち、１２７．５μｌに２２．５μｌの水、ｐｄＣ１ＩＮＨ、ｒｈＣ１ＩＮＨ又は緩衝液を添加し、室温で３０分間インキュベートした。次に、１００μｌ／ウェルのＰＣ、ＮＣ、Diluent CP又はDiluent MP（ブランク）と試料を適当なプレートにピペットで取り、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、ウェルを３００μｌ／ウェルの洗浄溶液で３回洗浄し、続いて１００μｌ／ウェルのコンジュゲートと一緒に室温で３０分間インキュベートした。もう一度洗浄した後、ウェルを１００μｌ／ウェルの基質と共にインキュベートし、再度、室温で３０分間インキュベートした。１００μｌ／ウェルの５ｍＭ ＥＤＴＡを添加して反応を停止させ、４０５ｎｍにおける吸光度を読み取った。
【００９０】
結果の計算には、ＰＣ、ＮＣ及び試料の吸光度からブランク(Diluent CP又はDiluent MP)の吸光度を引いた。各測定について補体活性化の百分率を次式を用いて算出した：（試料−ＮＣ）／（ＰＣ−ＮＣ）×１００。これは、ＰＣが常に１００％に設定されることを意味する。各条件につき、平均、標準偏差及びＣＶ％を算出した。
【００９１】
結果
Wielisaを用いて分析した古典経路に対するｒｈＣ１ＩＮＨ及びｐｄ−Ｃ１ＩＮＨの効果
古典経路活性化に対するｒｈＣ１ＩＮＨ及びｐｄＣ１ＩＮＨの両方の阻害特性を、２種類の異なる血清試料で解析した。図１２、１３及び１６に示すように、両方の血清試料においてｒｈＣ１ＩＮＨ及びｐｄＣ１ＩＮＨはどちらも、古典経路を介するＣ５ｂ−９の堆積を用量依存的に減少させた。濃度７５μMのｒｈＣ１ＩＮＨは、血清１において古典経路活性化をｐｄＣ１ＩＮＨよりわずかに強く阻害しているようであるが、このような効果は血清試料２では見られなかった。テストしたその他のすべての濃度において、ｒｈＣ１ＩＮＨとｐｄＣ１ＩＮＨの間で阻害特性の差は観察されなかった。したがって、ヒト血清における古典経路活性化の阻害において、ｒｈＣ１ＩＮＨ及びｐｄＣ１ＩＮＨはどちらも等しく有効であると結論付けられた。
【００９２】
Wielisaを用いて分析したＭＢＬ経路に対するｒｈＣ１ＩＮＨ及びｐｄ−Ｃ１ＩＮＨの効果
同じ実験の組合せにおいて、ＭＢＬ経路活性化に対するｒｈＣ１ＩＮＨ及びｐｄＣ１ＩＮＨの阻害特性も解析した。図１４、１５及び１６に示すように、ｒｈＣ１ＩＮＨ及びｐｄＣ１ＩＮＨは両方とも、ＭＢＬ経路活性化も用量依存的に減少させた。しかし、差の見られなかった古典経路とは対照的に、ｒｈＣ１ＩＮＨはｐｄＣ１ＩＮＨと比較してＭＢＬ経路のより協力なインヒビターのようであった。テストした３種類の濃度全てにおいて、また、両方の血清試料において、ｒｈＣ１ＩＮＨが介するＭＢＬ経路の阻害は、ｐｄＣ１ＩＮＨと比較して約２０％高い。したがって、ｒｈＣ１ＩＮＨはｐｄＣ１ＩＮＨよりも効果的なＭＢＬ経路のインヒビターであると結論付けられた。
【００９３】
結論
結果は、古典経路の阻害についてｒｈＣ１ＩＮＨ及びｐｄＣ１ＩＮＨがどちらも等しく有効であること、しかし、ｒｈＣ１ＩＮＨはＭＢＬ経路のより強力なインヒビターであることを示している。テストした全ての濃度で、ｒｈＣ１ＩＮＨが介するＭＢＬ経路阻害はｐｄ１ＩＮＨと比較して約２０％高かった。
【００９４】
参考文献
１．De Simoni, M. G. et al. Neuroprotection by complement (Cl) inhibitor in mouse transient brain ischemia. J Cereb Blood Flow Met 23, 232-239 (2003).
２．De Simoni, M. G. et al. The powerful neuroprotective action of Cl-inhibitor on brain ischemia-reperfusion injury does not require Clq. Am JPathol 164, 1857-63 (2004).
３．Storini, C. et al. Cl inhibitor protects against brain ischemia-reperfusion injury via inhibition of cell recruitment and inflammation. Neurobiol Disease 19,10-17 (2005).
４．Schmued, L. C. & Hopkins, K. J. Fluoro-Jade B: a high affinity fluorescent marker for the localization of neuronal degeneration. Brain Res 874, 123-30. (2000).
５．Caliezi, C. et al. Cl esterase inhibitor: an anti-inflammatory agent and its potential use in the treatment of diseases other than hereditary angioedema. Pharmacol Rev 52,91-112 (2000).
６．Cai, S. et al. A direct role for Cl inhibitor in regulation of leukocyte adhesion. J Immunol 174, 6462-6 (2005).
７．Walsh, M. C. et al. Mannose-binding lectin is a regulator of inflammation that accompanies myocardial ischemia and reperfusion injury. J Immunol 175, 541-6 (2005).
８．Moller-Kristensen, M. et al. Mannan-binding lectin recognizes structures on ischaemic reperfused mouse kidneys and is implicated in tissue injury. Scand JImmunol 61,426-34 (2005).
９．Hart, M. L. et al. Gastrointestinal ischemia-reperfusion injury is lectin complement pathway dependent without involving Clq. J Immunol 174, 6373-80 (2005).
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】虚血の初め（ｐｒｅ）、終り（ｐｏｓｔ）及び１時間後（１ｈ  ｐｏｓｔ）に、生理食塩水又は１頭当たり１５ＵのｒｈＣ１ＩＮＨ（組換えヒトＣ１ＩＮＨ、実施例１．２参照）で処置されたマウスの虚血から４８時間後における梗塞サイズの評価。
【図２】虚血の初め（ｐｒｅ）、終り（ｐｏｓｔ）及び１時間後（１ｈ  ｐｏｓｔ）に、生理食塩水又は１頭当たり１５Ｕの血漿由来ｈＣ１ＩＮＨで処置されたマウスの虚血から２４時間後における梗塞サイズの評価。
【図３】虚血開始後の様々な時点において生理食塩水又は１５Ｕ／マウスのウサギｒｈＣ１−ＩＮＨを受けたマウスの虚血から４８時間後において評価した梗塞体積。データは平均値±ＳＥＭ（１群当たりｎ＝６マウス）で表す。生理食塩水に対して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、一元配置ＡＮＯＶＡ及び事後検定としてダネット。
【図４】Fluoro-Jade染色の半定量的評価。−＝陽性度ゼロ、＋＝低陽性度、＋＋＝中陽性度、＋＋＋＝高陽性度。
【図５】虚血発症後の様々な時点において生理食塩水又は１５Ｕ／マウスのウサギｒｈＣ１−ＩＮＨを受けた虚血マウスの線条体におけるFluoro-Jade染色による神経変性を表す画像。バー：１００μｍ。
【図６】虚血発症後の様々な時点において生理食塩水又は１５Ｕ／マウスのウサギｒｈＣ１−ＩＮＨを受けた虚血マウスの歯状回におけるFluoro-Jade染色による神経変性を表す画像。バー：１００μｍ。
【図７】虚血発症後の様々な時点において生理食塩水又は１５Ｕ／マウスのウサギｒｈＣ１−ＩＮＨを受けた虚血マウスの皮質におけるFluoro-Jade染色による神経変性を表す画像。バー：１００μｍ。
【図８】虚血発症３時間後に生理食塩水又は５、１０、１５Ｕ／マウスのウサギｒｈＣ１−ＩＮＨを受けたマウスにおける虚血から４８時間後に評価した梗塞体積。データは平均値±ＳＥＭ（１群当たりｎ＝６マウス）で表す。生理食塩水に対して＊＊Ｐ＜０．０１、一元配置ＡＮＯＶＡ及び事後検定としてダネット。
【図９】虚血発症３時間後に生理食塩水或いは１５Ｕ／マウスのｐｄＣ１−ＩＮＨ又はウシ若しくはウサギｒｈＣ１−ＩＮＨを受けたマウスにおける虚血４８時間後に評価した梗塞体積。データは平均値±ＳＥＭ（１群当たりｎ＝６マウス）で表す。生理食塩水に対して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、一元配置ＡＮＯＶＡ及び事後検定としてダネット。
【図１０】虚血発症３時間後に生理食塩水或いは１５Ｕ／マウスのｐｄＣ１−ＩＮＨ又はウシ若しくはウサギｒｈＣ１−ＩＮＨを受けたマウスにおける虚血から４８時間後に評価した、全体障害（上パネル１０ａ）及び局所障害（下パネル１０ｂ）。（１群当たりｎ＝６マウス）。生理食塩水に対して、＊＊Ｐ＜０．０１、一元配置ＡＮＯＶＡ及び事後検定としてクラスカル・ワリス。
【図１１】補体活性化の種々の経路の概略。
【図１２】古典補体経路の活性化に対するｒｈｃ１ＩＮＨ及びｐｄＣ１ＩＮＨの効果。正常ヒト血清の２つの異なる試料にｒｈＣ１ＩＮＨ又はｐｄＣ１ＩＮＨを用量（ｘ軸）を増やしながら添加した（試料１：図１２、試料２：図１３）。対照として、ｒｈＣ１ＩＮＨを溶解する緩衝液（２０ｍＭクエン酸塩、０．１９Ｍスクロース（ｐＨ６．８）；０．２２μｍフィルター処理済）をｒｈＣ１ＩＮＨと同様に希釈して用いた。Ｃ５ｂ−９の堆積を読取り値とし、アッセイに用いた正常血清対照を１００％とした（ｙ軸）。データは平均値及びＳＤ（ｎ＝３）である。
【図１３】古典補体経路の活性化に対するｒｈｃ１ＩＮＨ及びｐｄＣ１ＩＮＨの効果。正常ヒト血清の２つの異なる試料にｒｈＣ１ＩＮＨ又はｐｄＣ１ＩＮＨを用量（ｘ軸）を増やしながら添加した（試料１：図１２、試料２：図１３）。対照として、ｒｈＣ１ＩＮＨを溶解する緩衝液（２０ｍＭクエン酸塩、０．１９Ｍスクロース（ｐＨ６．８）；０．２２μｍフィルター処理済）をｒｈＣ１ＩＮＨと同様に希釈して用いた。Ｃ５ｂ−９の堆積を読取り値とし、アッセイに用いた正常血清対照を１００％とした（ｙ軸）。データは平均値及びＳＤ（ｎ＝３）である。
【図１４】ＭＢＬ補体経路の活性化に対するｒｈｃ１ＩＮＨ及びｐｄＣ１ＩＮＨの効果。正常ヒト血清血清の２つの異なる試料にｒｈＣ１ＩＮＨ又はｐｄＣ１ＩＮＨを用量（ｘ軸）を増やしながら添加した（試料１：図１４、試料２：図１５）。対照として、ｒｈＣ１ＩＮＨを溶解する緩衝液（２０ｍＭクエン酸塩、０．１９Ｍスクロース（ｐＨ６．８）；０．２２μｍフィルター処理済）をｒｈＣ１ＩＮＨと同様に希釈して用いた。Ｃ５ｂ−９の堆積を読取り値とし、アッセイに用いた正常血清対照を１００％とした（ｙ軸）。データは平均値及びＳＤ（ｎ＝３）である。
【図１５】ＭＢＬ補体経路の活性化に対するｒｈｃ１ＩＮＨ及びｐｄＣ１ＩＮＨの効果。正常ヒト血清血清の２つの異なる試料にｒｈＣ１ＩＮＨ又はｐｄＣ１ＩＮＨを用量（ｘ軸）を増やしながら添加した（試料１：図１４、試料２：図１５）。対照として、ｒｈＣ１ＩＮＨを溶解する緩衝液（２０ｍＭクエン酸塩、０．１９Ｍスクロース（ｐＨ６．８）；０．２２μｍフィルター処理済）をｒｈＣ１ＩＮＨと同様に希釈して用いた。Ｃ５ｂ−９の堆積を読取り値とし、アッセイに用いた正常血清コントロールを１００％とした（ｙ軸）。データは平均値及びＳＤ（ｎ＝３）である。
【図１６】補体活性化の古典経路及びＭＢＬ経路両方の活性化に対するｒｈｃ１ＩＮＨ及びｐｄＣ１ＩＮＨの効果。正常ヒト血清の２つの異なる試料にｒｈＣ１ＩＮＨ又はｐｄＣ１ＩＮＨを用量を増やしながら添加した。対照として、ｒｈＣ１ＩＮＨを溶解する緩衝液（２０ｍＭクエン酸塩、０．１９Ｍスクロース（ｐＨ６．８）；０．２２μｍフィルター処理済）をｒｈＣ１ＩＮＨと同様に希釈して用いた。読取り値はＣ５ｂ−９の堆積とし、測定毎に、補体活性化の百分率を次式で算出した：（試料−ＮＣ）／（ＰＣ−ＮＣ）×１００。ＰＣを１００％とした。結果を、３つの独立した希釈物（verdunning）の、テストした各濃度における平均ＳＤで示す。
【図１】
0005394748.tif 000002
【図２】
0005394748.tif 000003
【図３】
0005394748.tif 000004
【図４】
0005394748.tif 000005
【図５】
0005394748.tif 000006
【図６】
0005394748.tif 000007
【図７】
0005394748.tif 000008
【図８】
0005394748.tif 000009
【図９】
0005394748.tif 000010
【図１０】
0005394748.tif 000011
【図１１】
0005394748.tif 000012
【図１２】
0005394748.tif 000013
【図１３】
0005394748.tif 000014
【図１４】
0005394748.tif 000015
【図１５】
0005394748.tif 000016
【図１６】
0005394748.tif 000017
【配列表】
0005394748000001.app