(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）で表される化合物：
【化１】
0005586588.tif 000040
式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ１−１０ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；
Ｕは、−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＮＨ（ＣＯ）−、−ＮＨＳＯ−、または−ＮＨＳＯ２−であり；
Ｗは、−（ＣＨ２）ｍ−、−ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ−、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、−ＳＯ−、−ＳＯ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＳＯ−、−ＳＯ２（ＣＨ２）ｎ−、または−（Ｃ
Ｈ２）ｎＳＯ２−であり、ｍは１、２、または３であり、およびｎは０、１、または２であり；
Ｘは、−Ｏ−であり；
Ｙは、
【化２】
0005586588.tif 000041
式中、
ＶおよびＴは、それぞれ独立して、−ＣＨ−または−Ｎ−であり；
Ｒは、Ｈ、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミノ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ１−１０ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；ならびに
Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立して、Ｃ４−１０シクロアルキル、Ｃ１−１０ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
Ａ１およびＡ２のそれぞれは、非置換であるか、またはハロゲン、ニトロ、シアノ、アミノ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、アリール、またはヘテロアリールで置換されており、；
その際、Ａ１およびＡ２のそれぞれは、Ａ１およびＡ２以外のＣ３−１０シクロアルキル、Ｃ１−１０ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールと縮合していてもよく、
前記Ａ１およびＡ２以外のＣ３−１０シクロアルキル、Ｃ１−１０ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールは、非置換であるか、またはハロゲン、ニトロ、シアノ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ１−１０ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールで置換されている；ならびに
Ｚは、−Ｃ（Ｏ）、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｓ）−、−ＮＲ’−Ｃ（Ｓ）−、または−ＯＣ（ＮＨ）−であり；この際、Ｒ’は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ１−１０ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールである。
【請求項２】
Ｗが、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＯＣＨ２−、−ＳＣＨ２−、または−ＳＯＣＨ２−である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｙが、
【化３】
0005586588.tif 000042
式中、
Ｒｉ、Ｒｉｉ、Ｒｉｉｉ、Ｒｉｖ、Ｒｖ、Ｒｖｉ、Ｒｖｉｉ、およびＲｖｉｉｉは、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミノ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、アミノ、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ１−１０ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；ならびに
Ｔは、請求項１に定義されたものと同じである、で表される請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｚが−ＯＣ（Ｏ）−である請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｕが−ＮＨＳＯ２−である請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ１がシクロプロピルである請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ２がＣ１−５アルキルまたはＣ３−８シクロアルキルである請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｙが、
【化４】
0005586588.tif 000043
式中、
Ｒｉ、Ｒｉｉ、Ｒｉｉｉ、Ｒｉｖ、Ｒｖ、Ｒｖｉ、Ｒｖｉｉ、およびＲｖｉｉｉは、請求項３に記載されたものと同じである、で表される請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｚが−ＯＣ（Ｏ）−であり、Ｕが−ＮＨＳＯ２−であり、Ｒ１がシクロプロピルであり、およびＲ２がＣ１−５アルキルまたはＣ３−８シクロアルキルである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
下記立体化学：
【化５】
0005586588.tif 000044
を有する請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
化合物１〜５１および５４〜６０のひとつである、請求項１に記載の化合物。
【化６−１】
0005586588.tif 000045
【化６−２】
0005586588.tif 000046
【化６−３】
0005586588.tif 000047
【化６−４】
0005586588.tif 000048
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物である抗ウイルス薬および製薬上許容されるキャリアを含む薬剤組成物。
【請求項１３】
免疫調節薬、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物である抗ウイルス薬以外の抗ウイルス薬、またはＮＳ５Ｂポリメラーゼ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ４Ｂ、もしくはｐ７阻害剤をさらに含む、請求項１２に記載の薬剤組成物。
【請求項１４】
Ｃ型肝炎ウイルス感染症を治療するために使用される請求項１２または１３に記載の薬剤組成物。
【請求項１５】
Ｃ型肝炎ウイルス感染症の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
クロスリファレンス
本特許出願は、２００８年５月１６日出願の、米国仮特許出願６１／０５３、８５７号の利益を請求し、この内容は、参照され、ここに組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景
Ｃ型肝炎ウイルス（Hepatitis C virus、HCV）、（＋）−１本鎖型ＲＮＡウイルスは、非Ａ（non-A）、非Ｂ（non-B）肝炎の主な場合における主要な原因物質である。ＨＣＶ感染症は、人の切実な健康問題である。たとえば、ＷＯ０５／００７６８１；ＷＯ８９／０４６６９；ＥＰ３８１２１６；Ａｌｂｅｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、３１（Ｓｕｐｐｌ．１）、１７−２４（１９９９）；Ａｌｔｅｒ、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、３１（Ｓｕｐｐｌ．１）、８８−９１（１９９９）；およびＬａｖａｎｃｈｙ、Ｊ．Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ、６、３５−４７（１９９９）を参照。
【０００３】
ＨＣＶ感染による肝炎は、ウイルスがすばやく突然変異して、自然免疫応答（natural immune response）から免れてしまうるため、治癒するのが困難である。現状で有用な抗ＨＣＶ治療は、インターフェロンα、インターフェロンα／リバビリンの併用、およびＰＥＧ化インターフェロンαのみである。しかしながら、インターフェロンαまたはインターフェロンα／リバビリンの併用の持続応答力（sustained response rate）は、５０％以下であることがわかっており、患者らはこれらの治療薬の副作用に非常に苦しんでいる。たとえば、Ｗａｌｋｅｒ、ＤＤＴ、４、５１８−５２９（１９９９）；Ｗｅｉｌａｎｄ、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｒｅｖ．、１４、２７９−２８８（１９９４）；およびＷＯ０２／１８３６９を参照。それゆえに、より効果的で、より耐性の高い治療薬の開発が求められている。
【０００４】
ウイルス複製のために、ＨＣＶプロテアーゼは、およそ３０００のアミノ酸を含む必要がある。それは、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｃ）、エンベロープタンパク質（Ｅ１およびＥ２）、および数種の非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂ）を含む。
【０００５】
ＮＳ３タンパク質はセリンプロテアーゼ活性を有しており、ウイルス複製および感染力に必須であると考えられている。ＮＳ３プロテアーゼの必要性は、黄熱病ウイルスＮＳ３プロテアーゼにおける突然変異がウイルス感染を減少させるという事実によって推察される。たとえば、Ｃｈａｍｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７、８８９８−８９０２（１９９０）を参照。また、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの活性部位における突然変異が、チンパンジーモデルのＨＣＶ感染症を完全に抑制したことが実証された。たとえば、Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（４）２０４６−５１（２０００）を参照。さらには、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼは、ＮＳ３／ＮＳ４ａ、ＮＳ４ａ／ＮＳ４ｂ、ＮＳ４ｂ／ＮＳ５ａ、ＮＳ５ａ／ＮＳ５ｂ接合部でのタンパク質分解を容易にし、それゆえにウイルス複製の間に４つのウイルスタンパク質を産生することに関与している。たとえば、ＵＳ２００３／０２０７８６１を参照。結果として、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼ酵素は、ＨＣＶ感染症を治療するための魅力的な目標である。有用なＮＳ３  ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤は、ＷＯ０２／１８３６９、ＷＯ００／０９５５８、ＷＯ００／０９５４３、ＷＯ  ９９／６４４４２、ＷＯ９９／０７７３３、ＷＯ９９／０７７３４、ＷＯ９９／５０２３０、ＷＯ９８／４６６３０、ＷＯ９８／１７６７９、ＷＯ  ９７／４３３１０、ＵＳ５、９９０、２７６、Ｄｕｎｓｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１０、１５７１−１５７９（２０００）；Ｌｌｉｎａｓ−Ｂｒｕｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１０、２２６７−２２７０（２０００）；およびＳ．ＬａＰｌａｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１０、２２７１−２２７４（２０００）に記載されている。
【発明の概要】
【０００６】
要約
本発明は、ある大環状化合物がＨＣＶ  ＮＳ３活性およびＨＣＶ  ＲＮＡレベルの抑制に効果的であるという予期せぬ発見に基づくものである。
【０００７】
ひとつの形態において、本発明は、式（Ｉ）で表される化合物に関する：
【０００８】
【化１】
0005586588.tif 000002
【０００９】
式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ１−１０ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；
Ｕは、−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＮＨ（ＣＯ）−、−ＮＨＳＯ−、または−ＮＨＳＯ２−；Ｗは、−（ＣＨ２）ｍ−、−ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ−、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、−ＳＯ−、−ＳＯ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＳＯ−、−ＳＯ２（ＣＨ２）ｎ−、または−（ＣＨ２）ｎＳＯ２−であり、ｍは、１、２、または３であり、およびｎは、０、１、または２であり；
Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、または−ＯＣＨ２−であり；
Ｙは
【００１０】
【化２】
0005586588.tif 000003
【００１１】
式中、
ＶおよびＴは、それぞれ独立して、−ＣＨ−または−Ｎ−であり；
Ｒは、Ｈ、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミノ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ１−１０ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；ならびに
Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立して、ハロゲン、ニトロ、シアノ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、アリール、またはヘテロアリールで置換されていてもよいＣ４−１０シクロアルキル、Ｃ１−１０ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；あるいは他のＣ３−１０シクロアルキル、Ｃ１−１０ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールと縮合していてもよく、この際、ハロゲン、ニトロ、シアノ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ１−１０ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールで置換されていてもよい；ならびに
Ｚは、−Ｃ（Ｏ）、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｓ）−、−ＮＲ’−Ｃ（Ｓ）−、または−ＯＣ（ＮＨ）−であり；この際、Ｒ’は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ１−１０ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールである。
【００１２】
種々のＵ、Ｗ、Ｘ、およびＺで表される基は、言うまでもなく、２価である。それぞれの基は、上記と同じ配置で表され、規定された記号（variable）は、式中で表される。記号Ｕの規定である−ＮＨＳＯ−基を例としてみると、式中で示されるように、Ｃ＝ＯとＲ１の間に記号Ｕが割り込んでいる。該−ＮＨＳＯ−基におけるＮ原子は、Ｃ＝ＯおよびＲ１に結合しているＳ原子に結合している。
【００１３】
式（Ｉ）によれば、上述の化合物の一様態（subset）としては、以下の形態のうちのひとつを有するものである：Ｒ１はシクロプロピルであり；Ｒ２はＣ１−５アルキルまたはＣ３−８シクロアルキルであり；Ｗは、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＯＣＨ２−、−ＳＣＨ２−、または−ＳＯＣＨ２−であり；Ｕは−ＮＨＳＯ２−であり；Ｚは−ＯＣ（Ｏ）−であり；ＸはＯであり；およびＹは
【００１４】
【化３】
0005586588.tif 000004
【００１５】
式中、
Ｒｉ、Ｒｉｉ、Ｒｉｉｉ、Ｒｉｖ、Ｒｖ、Ｒｖｉ、Ｒｖｉｉ、およびＲｖｉｉｉは、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミノ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニルｌ、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ１−１０ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
である。
【００１６】
他の形態において、本発明は、式（ＩＩ）の化合物に関する：
【００１７】
【化４】
0005586588.tif 000005
【００１８】
式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ１−１０ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミノ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ１−１０ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；
Ｕは、−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＮＨ（ＣＯ）−、−ＮＨＳＯ−、または−ＮＨＳＯ２−であり；
Ｗは、−（ＣＨ２）ｍ−、−ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ−、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、−ＳＯ−、−ＳＯ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＳＯ−、−ＳＯ２（ＣＨ２）ｎ−、または−（ＣＨ２）ｎＳＯ２−であり、ｍは、１、２、または３であり、およびｎは、０、１、または２であり；
Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、または−ＯＣＨ２−であり；
Ｔは、
【００１９】
【化５】
0005586588.tif 000006
【００２０】
式中、
Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立して、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミノ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ１−１０ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールで置換されていてもよいＣ３−１０シクロアルキル、Ｃ１−１０ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；ならびに
Ｚは、−Ｃ（Ｏ）、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｓ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｓ）−、または−ＯＣ（ＮＨ）−であり；この際、Ｒ’は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ１−１０ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールである。
【００２１】
記号Ｕ、Ｗ、Ｘ、およびＺで規定されたそれぞれの基は、上記と同じ配置で表され、規定された記号は、式中で表される。
【００２２】
式（ＩＩ）によれば、上述の化合物の一様態（subset）としては、以下の形態のうちのひとつを有するものである：Ｒ１は、シクロプロピルであり；Ｒ２はＣ１−５アルキルまたはＣ３−８シクロアルキルであり；Ｗは、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＯＣＨ２−、−ＳＣＨ２−、または−ＳＯＣＨ２−であり；Ｕは−ＮＨＳＯ２−であり；Ｚは−ＯＣ（Ｏ）−であり；およびＴは
【００２３】
【化６】
0005586588.tif 000007
【００２４】
式中、
ｎは１または２である、
である。
【００２５】
「アルキル」との語は、−ＣＨ３または−ＣＨ（ＣＨ３）２などの、飽和の、直鎖状または分枝状の炭化水素部位を意味する。「アルコキシ」との語は、−Ｏ−（Ｃ１−６アルキル）ラジカルを意味する。「アルケニル」との語は、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ３などの、少なくともひとつの二重結合を含む、直鎖状または分枝状の炭化水素部位を意味する。「アルキニル」との語は、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３などの、少なくともひとつの三重結合を含む、直鎖状または分枝状の炭化水素部位を意味する。「シクロアルキル」との語は、シクロヘキシルなどの、飽和の、環状炭化水素部位を意味する。「シクロアルケニル」との語は、シクロヘキセニルなどの、少なくともひとつの二重結合を含む、非芳香族の環状炭化水素部位を意味する。「ヘテロシクロアルキル」との語は、４−テトラヒドロピラニルなどの、少なくとも１つの環へテロ原子（たとえば、Ｎ、Ｏ、またはＳ）を有する、飽和の、環状部位を意味する。「ヘテロシクロアルケニル」との語は、４−ピラニルなどの、少なくとも１つの環へテロ原子（たとえば、Ｎ、Ｏ、またはＳ）を有する、非芳香族の環状部位を意味する。「アリール」との語は、１以上の芳香族環を有する炭化水素部位を意味する。アリール部位の例としては、フェニル（Ｐｈ）、フェニレン、ナフチル、ナフチレン、ピレニル、アントリルおよびフェナントリルが挙げられる。「ヘテロアリール」との語は、少なくとも１つのヘテロ原子（たとえば、Ｎ、Ｏ、またはＳ）を含む、１以上の芳香族環を有する部位を意味する。ヘテロアリール部位の例としては、フリル、フリレン、フルオレニル、ピロリル、チエニル、オキサゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、キナゾリニル、キノリル、イソキノリルおよびインドリルが挙げられる。「アミノ」との語は、−ＮＨ２、−ＮＨ−（Ｃ１−６アルキル）、または−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２のラジカルを意味する。
【００２６】
特記しない限り、本明細書に記載のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、およびヘテロアリールは、置換および非置換の双方の部位を含む。シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、およびヘテロアリール上の可能性のある置換基としては、以下に制限されないが、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０へテロシクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ１０アルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、アミノ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルアミノ、Ｃ１−Ｃ２０ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルスルホンアミノ、アリールスルホンアミノ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルイミノ、アリールイミノ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルスルホンイミノ、アリールスルホンイミノ、ヒドロキシル、ハロゲン、チオ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルチオ、アリールチオ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アシルアミノ、アミノアシル、アミノチオアシル、アミジノ、グアニジン、ウレイド、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、アシル、チオアシル、アシルオキシ、カルボキシル、およびカルボキシルエステルが挙げられる。これに対し、アルキル、アルケニル、またはアルキニル上の可能性のある置換基としては、Ｃ１−Ｃ１０アルキルを除いた上記の全ての置換基が挙げられる。シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリールおよびヘテロアリールはまた、互いに縮合していてもよい。
【００２７】
本発明の化合物の６０の例を以下に記載する。
【００２８】
【化７−１】
0005586588.tif 000008
【００２９】
【化７−２】
0005586588.tif 000009
【００３０】
【化７−３】
0005586588.tif 000010
【００３１】
【化７−４】
0005586588.tif 000011
【００３２】
他の実施形態において、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス感染症を治療する方法に関する。当該方法は、上述の式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表される化合物の１以上を、必要とする患者に投与することを含む。
【００３３】
さらに他の実施形態において、本発明は、ＨＣＶ感染症の治療に用いる薬剤組成物にも関する。当該組成物は、少なくとも１以上の、式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表される化合物の有効量を含み、および薬学的に許容されるキャリヤを含む。ＨＣＶライフサイクルにおいて、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼ以外のターゲット（標的）阻害剤、たとえば、ＮＳ５Ｂポリメラーゼ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ４Ｂ、またはｐ７を含みうる。このような阻害剤の例としては、以下に制限されないが、Ｎ−［３−（１−シクロブチルメチル−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１、２−ジヒドロ−キノリン−３−イル）−１、１−ジオキソ−１、４−ジハイドロ−１ｌ６−ベンゾ［１、２、４］チアジアジン−７−ｙｌ］−メタンスルホンアミド（ＷＯ０４０４１８１８）、ｔｒａｎｓ−１、２−ジ−４−［（フェニルアセチル−ピロリジン−２−（Ｓ）−カルボニル）アミノ］−フェニルエチレン（N-[3-(1-cyclobutylmethyl-4-hydroxy-2-oxo-1,2-dihydro-quinolin-3-yl)-1,1-dioxo-1,4-dihydro-1l6-benzo[1,2,4]thiadiazin-7-yl]-methanesulfonamide (WO04041818), trans-1,2-di-4-[(phenylacetyl-pyrrolidine-2-(S)-carbonyl) amino]-phenylethylene）（ＷＯ０４０１４１３）、および１−アミノアダマンタン（1-aminoadamantane）（Ａｍｅｎｔａｄｉｎｅ、Ｇｒｉｆｆｉｎ、２００４、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８５：ｐ４５１）などが挙げられる。薬剤組成物は、さらに免疫調節薬または第２の抗ウイルス薬をさらに含む。免疫調節薬とは、免疫反応を媒介する活性薬剤を意味する。免疫調節薬の例としては、以下に制限されないが、Ｎｏｖ−２０５（Ｎｏｖｅｌｏｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、ＷＯ０２０７６４９０）およびＩＭＯ−２１２５（Ｉｄｅｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．、ＷＯ０５００１０５５）などが挙げられる。抗ウイルス薬とは、ウイルスを殺すかまたはその複製を抑制する活性薬剤を意味する。抗ウイルス薬としては、以下に制限されないが、リバビリン、α−インターフェロン、ペグ化インターフェロン、および２−（２−｛２−シクロヘキシル−２−［（ピラジン−２−カルボニル）−アミノ］−アセチルアミノ｝−３、３−ジメチル−ブチリル）−オクタヒドロ−シクロペンタ［ｃ］ピロール−１−カルボン酸（１−シクロプロピルアミノオキサリル−ブチル）−アミド（2-(2-{2-cyclohexyl-2-[(pyrazine-2-carbonyl)-amino]-acetylamino}-3,3-dimethyl-butyryl)-octahydro-cyclopenta[c]pyrrole-1-carboxylic acid (1-cyclopropylaminooxalyl-butyl)-amide）（Ｔｅｌａｐｒｅｖｉｒ、Ｖｅｒｔｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．、ＷＯ０２０１８３６９）や、３−［２−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−ウレイド）−３、３−ジメチル−ブチリル］−６、６−ジメチル−３−アザ−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボン酸（２−カルバモイル−１−シクロブチルメチル−２−オキソ−エチル）−アミド（3-[2-(3-tert-butyl-ureido)-3,3-dimethyl-butyryl]-6,6-dimethyl-3-aza-bicyclo[3.1.0]hexane-2-carboxylic acid (2-carbamoyl-1-cyclobutylmethyl-2-oxo-ethyl)-amide）（Ｂｏｃｅｐｒｅｖｉｒ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＷＯ０３０６２２６５）、および４−フルオロ−１、３−ジハイドロ−イソインドール−２−カルボン酸  １４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−シクロプロパンスルホニルア��ノカルボニル−２、１５−ジオキソ−３、１６−ジアザ−トリシクロ［１４．３．０．０４、６］ノナデシ−７−エン−１８−イルエステル（4-fluoro-1,3-dihydro-isoindole-2-carboxylic acid 14-tert-butoxycarbonylamino-4-cyclopropanesulfonylaminocarbonyl-2,15-dioxo-3,16-diaza-tricyclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-en-18-yl ester）（ＩＴＭＮ−１９１、ＩｎｔｅｒＭｕｎｅ  Ｉｎｃ．、ＵＳ２００５／０２６７０１８）のような、ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤などが挙げられる。
【００３４】
また、本発明の範囲には、本明細書中記述された治療における薬剤の製造のための薬剤組成物の使用も含まれる。
【００３５】
本発明の１つまたは１つ以上の実施形態の詳細は、下記明細書中に記述されている。本発明の他の形態、目的および有用性は、明細書および請求の範囲から明らかである。
【００３６】
詳細な説明
本発明の化合物は、公知の方法によって、市販の原料から合成することができる。たとえば、本発明の化合物は、下記スキーム１に示される経路により調製できる。
【００３７】
【化８】
0005586588.tif 000012
【００３８】
スキーム１に示されるように、多環状化合物（ｉ）は、まず最初に、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−プロリン（ｉｉ）とカップリングし、続いてメチル化により中間体（ｉｉｉ）を形成する。中間体（ｉｉｉ）は、Ｎ−ブトキシカルボニル基を除去して脱保護され、Ｎ−フリー化合物（ｉｖ）が得られる。Ｎ−フリー化合物（ｉｖ）は、カルボン酸（ｖ）とカップリングして、中間体（ｖｉ）が得られる。中間体（ｖｉ）は、加水分解されて、酸（ｖｉｉ）が得られ、酸（ｖｉｉ）はアミン化合物（ｖｉｉｉ）とカップリングして、２つの末端アルケニル基を有するピロリジン化合物（ｉｘ）が得られる。中間体（ｉｘ）はグラブス触媒の存在下で、オレフィンメタセシス反応をして、所望の大環状化合物（ｘ）が得られる。
【００３９】
下記スキーム２および３は、本発明の化合物の合成経路の２つの代替経路である。
【００４０】
【化９】
0005586588.tif 000013
【００４１】
【化１０】
0005586588.tif 000014
【００４２】
上述の方法は、また、所望の化合物を最終的に合成するために、適した保護基を追加したり除去したりといった、追加の工程を、特に、スキーム１〜３において記載された工程の前後のどちらかに含むこともある。また、様々な合成工程が、所望の化合物を得るために代替順序で行われうる。式（Ｉ）で表される適切な化合物を合成するのに有用な合成化学の変形および保護基方法論（保護および脱保護）は公知であり、たとえば、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、２ｎｄ  Ｅｄ．、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９１）；  Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ、Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９４）；および  Ｌ．  Ｐａｑｕｅｔｔｅ、  ｅｄ．、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  （１９９５）ならびにこれらの続版に記載された方法を含む。
【００４３】
模範となる化合物１〜６０が実際に合成される方法を下記の詳細な説明に示した。
【００４４】
本明細書中に記載された化合物は、非芳香族二重結合および不斉中心を含む。それゆえに、それらはラセミ化合物もしくはラセミ混合物、単一のエナンチオマー、個々のジアステレオマー、ジアステレオマー混合物、互変異性体、およびｃｉｓまたはｔｒａｎｓ異性体が生じる。そのような異性体は、全て考えられる。たとえば、上記式（Ｉ）および（ＩＩ）で表される化合物は、それぞれ、以下の立体化学構造（ＩＩＩ）および（ＩＶ）を有する：
【００４５】
【化１１】
0005586588.tif 000015
【００４６】
上記化合物は、それら化合物自身と、それらの塩、プロドラックおよび溶媒和物も含む。たとえば、上記塩は、化学式（Ｉ）上の正の電荷を有する基（たとえば、アミノ）とアニオンとの間で形成されてもよい。好適なアニオンとしては、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、トシレート、酒石酸塩、フマル酸塩、グルタミン酸塩、グルクロン酸塩、乳酸塩、グルタル酸塩およびマレイン酸を含む。同様にして、式（Ｉ）で表される化合物の負電荷（たとえば、カルボキシレート）は、カチオンと塩を形成してもよい。好適なカチオンとしては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、およびテトラメチルアンモニウムイオン等のアンモニウムカチオンなどが挙げられる。式（Ｉ）で表される化合物は、また、第４級窒素原子を含む塩も含む。プロドラッグの例としては、エステルや他の製薬上許容される誘導体があり、これらは患者に投与されると、活性な式（Ｉ）で表される化合物が提供できる。溶媒和物とは、活性な式（Ｉ）で表される化合物と製薬上許容される溶媒との間で形成される複合体を意味する。製薬上許容されうる溶媒としては、水、エタノール、イソプロパノール、酢酸エチル、酢酸およびエタノールアミンが挙げられる。
【００４７】
また、本発明の範囲には、式（Ｉ）で表される化合物の１以上の有効量を投与することによって、ＨＣＶ感染症を治療する方法も含まれる。「治療する(treating)」または「治療(treatment)」という語は、ＨＣＶ感染症、ＨＣＶ感染症の症状、またはＨＣＶ感染症になりやすい体質を治癒する(cure)、緩和する(relieve)、変化させる(alter)、影響を与える(affect)、改善する(ameliorate)、または抑制する(prevent)ことを目的として、その感染症、感染症の症状、または感染症になりやすい体質を持つ、患者に有効量の式（Ｉ）で表される化合物１以上を投与することと規定される。「有効量」ということばは、処置された患者に治療効果を付与する活性な本発明の化合物の量を意味する。有効服用量は、当業者には認識されているように、治療される疾患のタイプ、投与経路、賦形剤量、および他の治療療法との併用の可能性に左右されて変動する。
【００４８】
本発明の方法を実施するために、１以上の本発明の化合物を含む組成物は、非経口で、経口で、経鼻で、経直腸で、局所に、または口腔に投与されうる。本明細書で用いられる場合、「非経口に」との語は、皮下の、皮内の、静脈内の、筋肉内の、関節内の、動脈内の、滑液嚢内の、胸骨内の、髄腔内の、病巣内の、または頭蓋内の注射、および任意の適当な注入技術を意味する。
【００４９】
注射可能な滅菌組成物は、１，３−ブタンジオール中の溶液のような、非毒性の非経口で許容されうる希釈剤または溶媒中の溶液または懸濁液でありうる。用いられうるかような許容されうる媒体および溶媒としては、マンニトール、水、リンゲル溶液（Ringer’s solution）および等張塩化ナトリウム溶液がある。また、固定油（たとえば、合成モノまたはジグリセリド）が溶媒または懸濁化媒体として従来用いられている。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体のような脂肪酸は、オリーブ油またはヒマシ油（特にポリオキシエリレン化されたもの）のような製薬上許容されうる天然油のように、注射剤の調製に有用である。これらの油の溶液または懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈剤もしくは分散剤、カルボキシメチルセルロース、または類似の分散剤を含みうる。ツィーン（Ｔｗｅｅｎ）もしくはスパン（Ｓｐａｎ）などの一般的に用いられている他の界面活性剤または類似の乳化剤、あるいは製薬上許容されうる固体の、液体のまたは他の剤形の製造に一般的に用いられているバイオアベイラビリティ向上剤もまた、製剤化の目的で用いられうる。
【００５０】
経口投与用の組成物は、カプセル、錠剤、乳剤および水性懸濁剤、分散剤、ならびに溶液などの、経口で許容されうる任意の剤形でありうる。錠剤の場合、一般的に用いられる担体としては乳糖およびコーンスターチが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤もまた、一般的に添加される。カプセル形態での経口投与の目的で、有用な希釈剤としては乳糖および乾燥コーンスターチが挙げられる。水性懸濁剤または乳剤を経口的に投与する場合には、乳化剤または懸濁化剤と組み合わされた油相中に活性成分を懸濁または溶解させればよい。所望により、ある種の甘味剤、矯味剤または着色剤を添加してもよい。
【００５１】
経鼻エアロゾルまたは吸入組成物は、医薬の製剤の分野において周知の技術に従って調製されうる。たとえば、かような組成物は、ベンジルアルコールもしくは他の適当な保存剤、バイオアベイラビリティを改善するための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または本技術分野において公知の他の可溶化剤もしくは分散剤を用いて、食塩水中の溶液として調製されうる。
【００５２】
１以上の活性な本発明の化合物を有する組成物は、また、直腸投与用に坐薬の形態で投与されうる。
【００５３】
薬剤組成物中の担体は、組成物中の活性成分と適合し（好ましくは、当該活性成分を安定化でき）、治療される対象に対して有害でないという意味で「許容されうる」ものでなければならない。１または２以上の可溶化剤が、活性な本発明の化合物を送達するための医薬の賦形剤として用いられうる。他の担体としては、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウムおよびディーアンドシーイエロー（Ｄ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ）♯１０が挙げられる。
【００５４】
上述した本発明の化合物は、インビトロでのアッセイ（後述する実施例６１および６２を参照）によりＨＣＶ感染症の治療における効果を予めスクリーニングされた後、動物実験および臨床試験によって確認されうる。他の方法は本技術分野における当業者には明らかであろう。
【００５５】
以下の具体例は単に例示のためのものであって、開示の残部をいかようにも制限するものではないと解釈されるべきである。さらに実験することなく、当業者であれば本明細書の記載に基づいて本発明をその全体にわたって実施可能であると考えられる。本明細書で引用されている全ての文献は、その全体が参照により本明細書に引用される。
【００５６】
実施例１：｛４−シクロプロパンスルホニルアミノカルボニル−２、１５−ジオキソ−１８−［２−（４−トリフルオロメチル−フェニル）−ベンゾ［４、５］フロ［３、２−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシ］−３、１６−ジアザ−トリシクロ［１４．３．０．０４、６］ノナデシ−７−エン−１４−イル｝−カルバミン酸シクロペンチルエステル（{4-Cyclopropanesulfonylaminocarbonyl-2,15-dioxo-18-[2-(4-trifluoromethyl-phenyl)-benzo[4,5]furo[3,2-d]pyrimidin-4-yloxy]-3,16-diazatricyclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-en-14-yl}-carbamic acid cyclopentyl ester）（化合物１）の合成
化合物Ｉ−３を、下記に示される経路で、市販の１−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−２−ビニル−シクロプロパンカルボン酸エチルエステルから調製した：
【００５７】
【化１２】
0005586588.tif 000016
【００５８】
１−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−２−ビニル−シクロプロパンカルボン酸エチルエステル（1-t-butoxycarbonylamino-2-vinyl-cyclopropanecarboxylic acid ethyl ester）（０．３４ｇ、１．３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５ｍＬ）およびメタノール（５ｍＬ）溶液に、ＬｉＯＨ（０．１３ｇ、５．３ｍｍｏｌ）の水（１．４ｍＬ）懸濁液を添加した。室温で一晩撹拌した後、反応を１０％ＨＣｌ（２ｍＬ）でクエンチして溶媒を真空下で除去した。得られた固体粉末を、水（１０ｍＬ）で洗浄し、化合物Ｉ−１（０．２７ｇ、９０％）を得た。
【００５９】
【化１３】
0005586588.tif 000017
【００６０】
化合物Ｉ−１（０．５２ｇ、２．３ｍｍｏｌ）、２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１、１、３、３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロ−リン酸メタンアミニウム（2-(1H-7-azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyl uronium hexafluoro-phosphate methanaminium）（ＨＡＴＵ、１．７４ｇ、４．６ｍｍｏｌ）、および４−ジメチルアミノピリジン（１．３９ｇ、１１．６ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍＬ）の溶液を室温で１時間撹拌し、続いてシクロプロパンスルホンアミド（０．５７ｇ、４．７ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（１．８１ｍＬ、１４．０ｍｍｏｌ）、および１、８−ジアザビシクロ［５、４、０］ウンデシ−７−エン（1,8-diazabicyclo[5,4,0]undec-7-ene）（１．８０ｇ、１１．７ｍｍｏｌ）を１５分以上かけてゆっくりと添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した後、溶媒を真空下で除去した。残部をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、化合物Ｉ−２（０．５１ｇ、６６％）を得た。
【００６１】
【化１４】
0005586588.tif 000018
【００６２】
化合物Ｉ−２（０．５０ｇ、１．５ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（８ｍＬ）溶液に、ＳＯＣｌ２（０．２６ｇ、２．２ｍｍｏｌ）を室温で添加した。反応混合物を１時間還流した後、ＭｅＯＨおよびＳＯＣｌ２を真空下で除去した。残部を、ペンタンで粉砕し、ろ過して黄色がかった白色固体の中間体Ｉ−３（０．３２ｇ、９１％）を得た。
【００６３】
【化１５】
0005586588.tif 000019
【００６４】
化合物１を、下記に示される経路で調製した。
【００６５】
【化１６】
0005586588.tif 000020
【００６６】
３−アミノ−ベンゾフラン−２−カルボン酸アミド（3-amino-benzofuran-2-carboxylic acid amide）（１．００ｇ、５．７ｍｍｏｌ）およびピリジン（１ｍＬ、１２．２６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２５ｍＬ）溶液を１０分間０℃で撹拌した。得られた溶液に、４−トリフルオロメチル−ベンジルクロリド（１．４８ｇ、７．１ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。その後、温度を室温に上げて、混合物を１２時間撹拌した。溶媒が減圧下で除去された後、得られた固体を回収し、水で洗浄し、および空気乾燥して、Ｉ−４（１．９２ｇ、９６．０％）を得た。ＭＳ：  ｍ／ｚ  ３４９．０（Ｍ＋＋１）。
【００６７】
Ｉ−４（１．９２ｇ、５．５ｍｍｏｌ）および２Ｎ  ＮａＯＨ（１３ｍＬ）のＥｔＯＨ（２５ｍＬ）分散液を１２時間８５℃に加熱した。冷却後、混合物を酸性化した後、ＥｔＯＨは除去された。得られた固体を回収し、ろ過、水で洗浄、乾燥して、Ｉ−５（１．７１ｇ、９５．０％）を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  ３３１  （Ｍ＋＋１）。
【００６８】
Ｉ−５（１．７１ｇ、５．２ｍｍｏｌ）および過剰のオキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）を２時間還流した。冷却および十分に濃縮した後、混合物を塩化メチレンおよび１０％水酸化ナトリウムで抽出した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、濃縮して、ＣＨ２Ｃｌ２およびｎ−ヘキサンで結晶化して、化合物Ｉ−６（１．４９ｇ、８２％）を得た。
【００６９】
【化１７】
0005586588.tif 000021
【００７０】
Ｂｏｃ−ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシ−プロリン（boc-trans-4-hydroxy-proline）（０．５３ｇ、２．３ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（２５ｍＬ）懸濁液に、ｔ−ＢｕＯＫ（０．８２ｇ、５．１ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。混合物を室温まで温め、１時間撹拌した後、化合物Ｉ−６（０．８１ｇ、２．３ｍｍｏｌ）を１０℃でゆっくりと加えた。撹拌を一晩継続した。ヨードメタン（１．０２ｇ、６．９ｍｍｏｌ）を添加して、反応混合物を室温でさらに３０分撹拌した。反応混合物をｐＨ６〜７になるよう、１０％ＨＣｌ水溶液で中和し、塩化メチレンで抽出した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、真空で濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィで精製して、化合物Ｉ−７（１．１２ｇ、８６％）を得た。
【００７１】
【化１８】
0005586588.tif 000022
【００７２】
化合物Ｉ−７（１．１３ｇ、２．０ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（２０ｍＬ）溶液に、ＳＯＣｌ２（１．２１ｇ、９．８ｍｍｏｌ）を室温で添加した。反応混合物を１時間還流し、ＭｅＯＨおよびＳＯＣｌ２を除去した。残部をペンタン中で粉砕した。懸濁液をろ過して、黄色がかかった白色固体の化合物Ｉ−８（０．８７ｇ、９５％）を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  ４５８．１（Ｍ＋＋１）。
【００７３】
ＨＡＴＵ（１．１２ｇ、３．０ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ、０．４１ｇ、３．０ｍｍｏｌ）、Ｉ−８（０．８６ｇ、１．９ｍｍｏｌ）および２−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−ノン−８−エノ酸（2-t-butoxycarbonylamino-non-8-enoic acid）（１．２１ｇ、１．９ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍＬ）溶液に、室温で、Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ、１．０２ｇ、９．９ｍｍｏｌ）を添加した。一晩撹拌後、混合物を真空下で濃縮した。残部をシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、化合物Ｉ−９（１．０３ｇ、７３％）を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  ７１１．３（Ｍ＋＋１）。
【００７４】
化合物Ｉ−９（１．０１ｇ、１．４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２０ｍＬ）溶液に、０．５Ｍ  ＬｉＯＨ（５．７ｍＬ、２．９ｍｍｏｌ）を室温で添加した。一晩撹拌後、反応混合物は、１０％ＨＣｌ溶液でｐＨ＜７に中和され、真空下で濃縮された。得られた残部は、ろ過、水で洗浄され、化合物Ｉ−１０（０．９１ｇ、９２％）を得た。ＭＳ：  ｍ／ｚ  ６９７．３（Ｍ＋＋１）。
【００７５】
化合物Ｉ−３（０．２８ｇ、０．４ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（０．３１ｇ、０．８ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（０．０８ｇ、０．６ｍｍｏｌ）および化合物Ｉ−１０（０．０９ｇ、０．４ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液に、ＮＭＭ（０．１２ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を室温で添加した。一晩撹拌した後、反応混合物を真空下で濃縮した。残部をシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、化合物Ｉ−１１（０．１０ｇ、８５％）を得た。
【００７６】
【化１９】
0005586588.tif 000023
【００７７】
化合物Ｉ−１１（０．１０ｇ、０．１１ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液に、ホベイダ−グラブス第２世代（Hoveyda-Grubbs 2nd）（３５ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）をＮ２雰囲気下、室温で添加した。その後、反応混合物を４０℃で２４時間撹拌して、メタセシス環化（metathesis cyclization）を行った。反応をクエンチし、反応混合物はカラムクロマトグラフィで精製し、化合物１（３０ｍｇ、３１％）を得た。
【００７８】
【化２０】
0005586588.tif 000024
【００７９】
実施例２：｛４−シクロプロパンスルホニルアミノカルボニル−２、１５−ジオキソ−１８−［２−（４−トリフルオロメチル−フェニル）−ベンゾ［４、５］フロ［３、２−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシ］−３、１６−ジアザ−トリシクロ［１４．３．０．０４、６］ノナデシ−７−エン−１４−イル｝−カルバミン酸シクロペンチルエステル（{4-Cyclopropanesulfonylaminocarbonyl-2,15-dioxo-18-[2-(4-trifluoromethyl-phenyl)-benzo[4,5]furo[3,2-d]pyrimidin-4-yloxy]-3,16-diaza-tricyclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-en-14-yl}-carbamic acid cyclopentyl ester）（化合物２）
化合物２を、下記に示される経路で調製した。
【００８０】
【化２１】
0005586588.tif 000025
【００８１】
化合物Ｉ−ＩＩ（０．１１ｇ、０．１４ｍｍｏｌ）の５ｍＬ  ＣＨ２Ｃｌ２溶液に、４Ｎ  ＨＣｌのジオキサン（２ｍＬ）を室温で４時間かけて添加した。ＨＣｌ、ジオキサン、およびＣＨ２Ｃｌ２は濃縮により除去され、粗化合物Ｉ−１２を得て、精製せずに次の工程に用いた。
【００８２】
粗化合物Ｉ−１２をアセトニトリル２ｍＬに溶解し、その後飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１ｍＬ）を添加した。１０分間撹拌した後、クロロギ酸シクロペンチル（cyclopentyl chloroformate）（０．０２ｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を室温で反応混合物に添加した。反応混合物をさらに２時間撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチした後、混合物はＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、粗化合物Ｉ−１３（０．１１ｇ、８３％）を得た。
【００８３】
【化２２】
0005586588.tif 000026
【００８４】
化合物Ｉ−１３をホベイダ−グラブス第２世代（Hoveyda-Grubbs 2nd）（３５ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）で処理し、上記実施例のようにして、メタセシス環化を行い、化合物２を得た。
【００８５】
【化２３】
0005586588.tif 000027
【００８６】
実施例３〜５２：化合物３〜５２の合成
化合物３〜５２は、実施例１および２と同様の方法で調製した。
【００８７】
【化２４−１】
0005586588.tif 000028
【００８８】
【化２４−２】
0005586588.tif 000029
【００８９】
【化２４−３】
0005586588.tif 000030
【００９０】
【化２４−４】
0005586588.tif 000031
【００９１】
【化２４−５】
0005586588.tif 000032
【００９２】
【化２４−６】
0005586588.tif 000033
【００９３】
実施例５３：｛４−シクロプロパンスルホニルアミノカルボニル−１８−［２−（５、６−ジヒドロ−４Ｈ−シクロペンタチアゾール−２−イル）−７−メトキシ−キノリン−４−イルオキシ］−２、１５−ジオキソ−３、１６−ジアザ−トリシクロ［１４．３．０．０４、６］ノナデシ−７−エン−１４−イル｝−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（{4-Cyclopropanesulfonylaminocarbonyl-18-[2-(5,6-dihydro-4H-cyclopentathiazol-2-yl)-7-methoxy-quinolin-4-yloxy]-2,15-dioxo-3,16-diaza-tricyclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-en-14-yl}-carbamic acid tert-butyl ester）の合成
化合物５３を、下記に示される経路で調製した。
【００９４】
【化２５】
0005586588.tif 000034
【００９５】
アミノ-チオキソ-酢酸エチルエステル（amino-thioxo-acetic acid ethyl ester）（６．００ｇ、４５．０ｍｍｏｌ）および２−クロロ−シクロペンタノン（５．６０ｇ、４７．０ｍｍｏｌ）のトルエン混合物を４時間還流下で加熱した。そのようにして得られた茶色溶液を室温まで冷却し、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）および食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過して真空下で濃縮した。ベージュ色固体をフラッシュクロマトグラフィのシリカゲルカラム（１０％ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液）によって精製して、薄茶色の粘稠油の５、６−ジヒドロ−４Ｈ−シクロペンタチアゾール−２−カルボン酸エチルエステルＩ−１４（７．６０ｇ、８６％）を得た。ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ＋）＝１９８．３。
【００９６】
５、６−ジヒドロ−４Ｈ−シクロペンタチアゾール−２−カルボン酸エチルエステルＩ−１４（２．００ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）の４：１：１  ＴＨＦ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（３０ｍＬ）溶液と、２Ｎ  ＮａＯＨ水溶液（７．５ｍＬ、１．５ｅｑ．）とを室温で５時間処理した。混合物は真空下で乾燥し、５、６−ジヒドロ−４Ｈ−シクロペンタチアゾール−２−カルボン酸Ｉ−１５を得て、このまま精製せずに次の工程に直接用いた。ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ＋）＝１７０．２。
【００９７】
４−メトキシ−２−アミノ−アセトフェノン（１．６７ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）および５、６−ジヒドロ−４Ｈ−シクロペンタチアゾール−２−カルボン酸Ｉ−１５（１．６９ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）のピリジン（８０ｍＬ）溶液を、クールバスを用いて−３０℃に冷却した。続いてオキシ塩化リン（２．８ｍＬ、３０．０ｍｍｏｌ）を１５分の間、滴下した。反応は−３０℃で０．５時間撹拌後、バスを除去して反応混合物を室温まで温めた。反応混合物を２時間撹拌後、氷水に注いだ。混合物のｐＨを、２Ｎ  ＮａＯＨ水溶液で１１に調整し、混合物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、ろ過、および真空下で濃縮した。粗生成物を、フラッシュクロマトグラフィのシリカゲルカラム（３０％ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液）で精製し、薄ベージュ色固体のアミド化合物Ｉ−１６（１．１０ｇ、３５％）を得た。ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ＋）＝３１７．３。
【００９８】
アミド化合物Ｉ−１６（０．７１ｇ、２．２ｍｍｏｌ）の無水ｔ−ＢｕＯＨ（１０ｍＬ）の懸濁液に、ｔ−ＢｕＯＫ（１．００ｇ、８．８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、２時間還流下で加熱し、室温まで冷却し、ＨＣｌ（４Ｎのジオキサン溶液、３ｍＬ）の添加により酸性にした。混合物を真空下で濃縮し、得られた残部は１０％ＫＨＳＯ４の溶液中に注入された。ろ過後、固体をエタノールと水で洗浄し、真空下で乾燥させて、ベージュ固体の化合物Ｉ−１７（０．４１ｇ、６１％）を得た。
【００９９】
【化２６】
0005586588.tif 000035
【０１００】
化合物Ｉ−１７（０．６６ｇ、２．２ｍｍｏｌ）、プロリン化合物Ｉ−１８（０．８９ｇ、２．２ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（１．２ｇ、４．５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３０ｍＬ）溶液を０℃まで冷却した。ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（Diisopropyl azodicarboxylate）（ＤＩＡＤ、０．９ｍＬ、４．５ｍｍｏｌ）を１５分かけて滴下して加えた。反応混合物を、その後室温までゆっくり温め、一晩撹拌を続けた。溶媒を真空下で除去した後、混合物をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で希釈して、水（１００ｍＬ）および食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、真空下で濃縮した。残部を、フラッシュクロマトグラフィのシリカゲルカラム（５０％ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液）で精製し、エステル化合物Ｉ−１９（１．２３ｇ、８２％）を得た。ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ＋）＝６７９．３。
【０１０１】
エステル化合物  Ｉ−１９  （１．９１ｇ、トリフェニルホスフェートオキサイド（triphenylphosphate oxide）含有）のＴＨＦ（４０ｍＬ）溶液に、．２Ｎ  ＮａＯＨ水溶液（１０ｍＬ）を添加した。ＭｅＯＨ  １０ｍＬの添加により、均一溶液が得られ、得られた溶液を室温で４時間撹拌した。混合物を、１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ３に調整した後、ＣＨ２Ｃｌ２で２回抽出した。有機層を無水ＭｇＳＯ４で乾燥させて、ろ過して、真空下で濃縮した。残部を、フラッシュクロマトグラフィのシリカゲルカラム（１０％ＭｅＯＨのＣＨ２Ｃｌ２溶液）で精製し、黄色固体の酸性化合物Ｉ−２０（０．９４ｇ、１．４ｍｍｏｌ、６４％（２段階））を得た。ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ＋）＝６６５．３。
【０１０２】
酸性化合物Ｉ−２０（０．７３ｇ、１．１ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（０．９１ｇ、２．２ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（０．１ｇ、１．１ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）溶液を室温で０．５時間撹拌し、続いて、エチル１−アミノ−２−ビニルシクロプロパンカルボキシレート（０．２９ｇ、１．１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１．２  ｍＬ、６．７ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）溶液を添加した。添加終了後、反応混合物を室温でさらに６時間撹拌し、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で希釈し、水（１００ｍＬ）および食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４に乾燥し、ろ過して、真空下で濃縮した。残部を、フラッシュクロマトグラフィのシリカゲルカラム（５０％ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液）で精製し、黄色固体の酸性化合物Ｉ−２１（０．７２ｇ、８２％）を得た。ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ＋）＝８０２．３。
【０１０３】
エステル化合物Ｉ−２１（０．６８ｇ、０．８５ｍｍｏｌ）のトルエン（７０ｍＬ）溶液に、窒素で脱気した。ホベイダ−グラブス触媒第２世代（Ｈｏｖｅｙｄａ−Ｇｒｕｂｂｓ  ２ｎｄ）（０．０５ｇ、１０％ｍｏｌ）を室温で添加した。反応混合物を５０℃で一晩加熱した。溶媒を濃縮し、残部を、フラッシュクロマトグラフィのシリカゲルカラム（１％ＭｅＯＨのエーテル溶液）で精製し、化合物Ｉ−２２（０．３３ｇ、５０％）を得た。ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ＋）＝７７４．３。
【０１０４】
化合物Ｉ−２２（０．３３ｇ、０．４３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３０ｍＬ）溶液に、２Ｎ  ＮａＯＨ水溶液（６ｍＬ）を添加した。ＭｅＯＨ  ６ｍＬの添加により、均一溶液が得られ、得られた溶液を室温で２時間撹拌した。混合物を、１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ３に調整した後、ＣＨ２Ｃｌ２で２回抽出した。有機層を無水ＭｇＳＯ４で乾燥させて、ろ過して、真空下で濃縮した。粗化合物Ｉ−２３を、精製せずに次の工程に用いた。ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ＋）＝７４６．３。
【０１０５】
化合物Ｉ−２３（０．２３ｇ、０．３ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（０．２３ｇ、０．６ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．０３ｇ、０．３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２０ｍＬ）溶液を室温で０．５時間撹拌し、続いて、シクロプロパンスルホン酸アミド（０．１１ｇ、０．９ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．３ｍＬ、２ｍｍｏｌ）およびＤＢＵ（０．３ｍＬ、２ｍｍｏｌ）を添加した。添加した後、反応混合物を５０℃で６時間加熱し、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で希釈し、水（５０ｍＬ）および食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４に乾燥し、ろ過して、真空下で濃縮した。残部を、フラッシュクロマトグラフィのシリカゲルカラム（５０％ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液）で精製し、黄色固体の化合物５３（０．１２ｇ、４７％）を得た。
【０１０６】
【化２７】
0005586588.tif 000036
【０１０７】
実施例５４：｛４−シクロプロパンスルホニルアミノカルボニル−１８−［６−（３−フルオロ−フェニル）−９−チア−１、５、７−トリアザ−フルオレン−８−イルオキシ］−２、１５−ジオキソ−１２−オキサ−３、１６−ジアザ−トリシクロ［１４．３．０．０４、６］ノナデシ−７−エン−１４−イル｝−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（{4-Cyclopropanesulfonylaminocarbonyl-18-[6-(3-fluoro-phenyl)-9-thia-1,5,7-triaza-fluoren-8-yloxy]-2,15-dioxo-12-oxa-3,16-diaza-tricyclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-en-14-yl}-carbamic acid tert-butyl ester）（化合物５４）
化合物５４を、下記に示される経路で調製した。
【０１０８】
【化２８】
0005586588.tif 000037
【０１０９】
６−（３−フルオロ−フェニル）−７Ｈ−９−チア−１、５、７−トリアザ−フルオレン−８−オン（6-(3-fluoro-phenyl)-7H-9-thia-1,5,7-triaza-fluoren-8-one）（１．８３ｇ、６．１６ｍｍｏｌ）のＰＯＣｌ３（５．６６ｍＬ、６１．６ｍｍｏｌ）溶液を３時間還流下で加熱した。真空でＰＯＣｌ３を除去した後、残部は水に注ぎ、飽和ＮａＨＣＯ３でｐＨ＞７にクエンチし、１５分間撹拌した後、ろ過をして粗化合物Ｉ−２４（１．８２ｇ、９３％）を得た。ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ＋）＝３１６．０．。
【０１１０】
Ｂｏｃ−４Ｒ−ヒドロキシプロリン（１．３３ｇ、５．７６ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（１３．３ｍＬ）懸濁液に、ｔ−ＢｕＯＫ（１．９４ｇ、１７．２８ｍｍｏｌ）を室温で添加した。反応混合物を１．５時間撹拌した後、化合物Ｉ−２４（１．８２ｇ、５．７６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１８．２ｍＬ）に溶解させて、氷バスの反応混合物に一晩で滴下した。得られた混合物を、冷水に注ぎ、および水溶液を１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ＜２に調整し、ろ過して、粗化合物Ｉ−２５（２．７７ｇ、９４％）を得た。ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ＋）＝５１１．１。
【０１１１】
化合物Ｉ−２５（３．４１ｇ、６．６８ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（５．０８ｇ、１３．３６ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（１．３５ｇ、１０．０２  ｍｍｏｌ）およびシクロプロパンスルホン酸（１−アミノ−２−ビニル−シクロプロパンカルボニル）−アミド（１．６９ｇ、７．３５ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（３３．４ｍＬ）溶液に、ＮＭＭ（３．６７ｍＬ、３３．４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。得られた混合物は、飽和ＮＨ４Ｃｌでクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、飽和ＮａＨＣＯ３と食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。濃縮後、残部をシリカゲルクトマトグラフィ（５０％ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液）により精製し、化合物Ｉ−２６（３．２０ｇ、６６％）を得た。ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ＋）＝７２３．２。
【０１１２】
Ｉ−２６（０．５１ｇ、０．６９ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（３．４５ｍＬ）の溶液に、ＣＦ３ＣＯＯＨ（０．５３ｍＬ、６．９ｍｍｏｌ）を室温で添加した。反応混合物は一晩撹拌した後、溶液を濃縮して粗化合物Ｉ−２７を得た。当該化合物は、精製せずに次の工程に用いた。ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ＋）＝６２３．２。
【０１１３】
化合物Ｉ−２７（０．４３ｇ、０．６９ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（０．３４ｇ、０．９ｍｍｏｌ）  および（ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−３−（ペント−４−エンイルオキシ）プロパン酸（０．２５ｇ、０．９ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（３．４５ｍＬ）溶液に、ＮＭＭ（０．３ｍＬ、２．７６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物は、室温で一晩撹拌した。得られた混合物は、飽和ＮＨ４Ｃｌでクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、飽和ＮａＨＣＯ３および食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。濃縮後、残部はシリカゲルクロマトグラフィ（５０％ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液）で精製し、化合物Ｉ−２８（０．５２ｇ、８５％）を得た。ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ＋）＝８７７．７。
【０１１４】
Ｉ−２８（０．５２ｇ、０．５９ｍｍｏｌ）のトルエン（５９ｍＬ）溶液を窒素で脱気した。ホベイダ−グラブス触媒第２世代（Hoveyda-Grubbs 2nd）（０．０４ｇ、１０％ｍｏｌ）を室温で添加した。反応混合物を５０℃で一晩加熱した。溶媒を濃縮し、残部を、ＴＬＣ（１％ＭｅＯＨのエーテル溶液）で精製し、化合物５４（０．０７ｇ、１４％）を得た。
【０１１５】
【化２９】
0005586588.tif 000038
【０１１６】
実施例５５〜６０：化合物５５〜６０の合成
化合物５５〜６０は、実施例５４と同様の方法で調製した。
【０１１７】
【化３０】
0005586588.tif 000039
【０１１８】
実施例６１：ＮＳ３／４Ａプロテアーゼの抑制
タンパク質発現および精製
Ｎ−末端Ｈｉｓ６−ｔａｇｇｅｄ−ＮＳ４Ａ（２１−３２）−ＧＳＧＳ−ＮＳ３（３−１８１）をコード化する遺伝子を含むプラスミドをタンパク質過剰発現（protein over-expression）のために、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｓｔｒａｉｎ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。形質転換されたＢＬ２１  （ＤＥ３）  ｐＬｙｓＳの単一コロニーをＬａｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地２００ｍＬ中でカナマイシン（Kanamycin）およびクロラムフェニコール（Chloramphenicol）と一緒に３７℃で一晩培養した。細菌培養物を、抗生物質を含む６Ｌ  ＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ）に形質転換し、２２℃で揺らしながら培養した。６００ｎｍの吸収が０．６に達した後、培養物を１ｍＭイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）と、２２℃で５時間誘導した。培養物を、続いて、遠心分離（６、０００×ｇ  １５分間、４°Ｃ）により採取した。細胞ペレットを１５０ｍＬバッファーＡ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）  ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭ  イミダゾール、１０％（ｖ／ｖ）  グリセロール）に再懸濁した。混合物を、マイクロフルイダイザー（Microfluidizer）を３０ｐｓｉの条件で、４回通過させて破壊した後、細胞破片は、遠心分離（５８、２５０×ｇ  ３０分間、４°Ｃ）により取り除いた。Ｈｉｓ６−ｔａｇｇｅｄタンパク質を含む細胞溶解物を、ｇｒａｄｉＦｒａｃシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、１０ｍＭイミダゾール存在下、２５ｍＬ  Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）カラム上に３ｍＬ／分でチャージした。カラムは１０カラム容積の溶菌バッファーで洗浄した。固定されたＮＳ４Ａ（２１−３２）−ＧＳＧＳ−ＮＳ３（３−１８１）を、８カラム容積の３００ｍＭイミダゾールが添加されたバッファーＡで溶出させた。溜めたフラクションをさらに、バッファーＢ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１％（ｗ／ｖ）  ＣＨＡＰＳ、１０％（ｖ／ｖ）  グリセロール、５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、および１Ｍ  ＮａＣｌ）を備えたＱ−セファロース（Q-Sepharose）カラムによって精製した。ＮＳ４Ａ（２１−３２）−ＧＳＧＳ−ＮＳ３（３−１８１）を含む溶離液を回収し、バッファーＣ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１％（ｗ／ｖ）  ＣＨＡＰＳ、５ｍＭ  ＤＴＴ、１０％ （ｖ／ｖ）  グリセロール）が予め備えられたセファクリル−７５（sephacryl-75）カラム（１６´１００ｃｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のサイズ−フラクションクロマトグラフィでさらに精製した。精製されたタンパク質を使用までの間、−８０℃で冷凍保存した。
【０１１９】
ＨＰＬＣマイクロボア分析
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％グリセロール、０．０１２％  ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、５μＭ  基質Ａｃ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ（ＥＤＡＮＳ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−φ−［ＣＯＯＡｌａ］−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ（ＤＡＢＣＹＬ）−ＮＨ２（ＲＥＴ  Ｓ１、ＡＮＡＳＰＥＣ）および１０μＭ試験化合物を含む溶液を調製した。８０μＬの溶液を、９６−ウェルプレートのそれぞれのウェルに添加した。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％  グリセロール、および０．０１２％  ＣＨＡＰＳを含む１０ｎＭ  ＮＳ３／４Ａプロテアーゼを２０μＬ添加することにより、反応を停止した。ＮＳ３／４Ａプロテアーゼの最終濃度は２ｎＭで、基質ＲＥＴ  Ｓ１のＫｍより低かった。
【０１２０】
分析溶液は、３０℃で３０分間培養した。その後、１００μＬの１％ＴＦＡの添加により反応を停止した。２００μＬずつ、アジレント９６−ウェルプレートのそれぞれのウェルに移した。
【０１２１】
反応生成物は、後述する逆相ＨＰＬＣを用いて分析した。ＨＰＬＣシステム一式（HPLC system included）：アジレント（Agilent）  １１００、脱気剤（Degasser）  Ｇ１３７９Ａ、バイナリポンプ（Binary pump）  Ｇ１３１２Ａ、オートサンプラー（Autosampler）  Ｇ１３６７Ａ、カラム  恒温チャンバー（thermostated chamber）  Ｇ１３１６Ａ、ダイオードアレイ検出器（Diode array detector）  Ｇ１３１５Ｂ、カラム：アジレント（Agilent）、ＺＯＲＢＡＸ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８、４．６ｍｍ、５mｍ、Ｐ／Ｎ  ９９３９６７−９０２、カラム  恒温ｔｈｅｒｍｏｓｔａｔ：室温、インジェクション容量（Injection volume）：１００μＬ、溶媒Ａ＝ＨＰＬＣグレード  水＋０．０９％ＴＦＡ、溶媒Ｂ＝ＨＰＬＣグレード  アセトニトリル＋０．０９％ＴＦＡ。ＨＰＬＣの所要時間の合計は、７．６分で、溶媒Ｂが２５〜５０％までは４分間の線形勾配をつけ、溶媒Ｂが５０％を３０秒間維持し、さらに溶媒Ｂが５０〜２５％まで３０秒勾配をつけた。カラムは、次のサンプルのインジェクション前に、２５％溶媒Ｂで２．６分間洗浄（re-equilibrated）した。ＩＣ５０値（ＮＳ３／４Ａ活性の５０％抑制が観測される濃度）は、それぞれＨＰＬＣの結果に基づいて、サンプル化合物にそれぞれ計算した。
【０１２２】
化合物１〜６０について、上述の抑制分析を行った。５４個の化合物は、２０ｎＭよりもＩＣ５０値が低く、４個の化合物は、ＩＣ５０値が２０から１００ｎＭの範囲内であることを示す結果が示された。
【０１２３】
実施例６２：ＨＣＶレプリコン細胞分析プロトコル
ＨＣＶレプリコンを含む細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Ｇ４１８  １．０ｍｇ／ｍＬおよび適当な補充剤（supplements）（培地Ａ（media A））を含むＤＭＥＭ中に培養（maintain）した。
【０１２４】
１日目、レプリコン細胞単一層を、トリプシン／ＥＤＴＡ混合物で処理し、除去して、培地Ａで最終濃度４８，０００細胞／ｍＬとなるよう希釈した。溶液（１ｍＬ）を、２４ウェル組織培養プレートのそれぞれのウェルに添加し、組織培養５％ＣＯ２インキュベータで３７℃、終夜培養した。
【０１２５】
２日目、テスト化合物（ＤＭＳＯ１００％中）を、１０％ＦＢＳおよび適当な補充剤（supplements）（培地Ｂ（media B））を含むＤＭＥＭで逐次希釈した。ＤＭＳＯの最終濃度が、希釈系列を通して、０．２％になるようにした。
【０１２６】
レプリコン細胞単一層の培地を除去して、その後、様々な濃度の化合物を含む培地Ｂを添加した。化合物を含まない培地Ｂを、化合物フリーのコントロールとして、他のウェルに添加した。
【０１２７】
細胞を、組織培養５％ＣＯ２インキュベータで３７℃、７２時間、培地Ｂ中の化合物または０．２％ＤＭＳＯと培養した。その後、培地を除去し、レプリコン細胞単一層を、ＰＢＳで一度洗浄した。ＲＮイージーキットまたはＴＲＩＺＯＬ試薬からＲＮＡ抽出試薬を、細胞に添加し、すぐにＲＮＡの分解を回避した。トータルＲＮＡ（total RNA）を、メーカーから提供された指示書に従い、抽出効率および一貫性（consistency）を改良するために変更を加えて、抽出した。最終的に、ＨＣＶレプリコンＲＮＡを含む全ての細胞ＲＮＡを、溶離して、次の工程まで−８０℃で保存した。
【０１２８】
特定のプライマーの２つセット：ひとつはＨＣＶ用であり、他方はＡＣＴＢ（ベータ−アクチン）用、を用いて、ＴａｑＭａｎ（商標）  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ定量分析を行った。同じＰＣＲウェルで、ＨＣＶおよびＡＣＴＢ  ＲＮＡを共に定量するためのＰＣＲ反応に、トータルＲＮＡを加えた。各ウェル中のＡＣＴＢ  ＲＮＡのレベルに基づいて、失敗した実験を判定し、それを除いた。それぞれのウェルのＨＣＶ  ＲＮＡのレベルは、同じＰＣＲプレート中の標準曲線（a standard curve run）によって計算した。ＨＣＶ  ＲＮＡレベルの化合物処理による抑制のパーセンテージは、ＤＭＳＯまたは化合物フリーのコントロールを抑制０％として計算した。ＥＣ５０（ＨＣＶ  ＲＮＡレベルの抑制が５０％に達したときの濃度）は、得られた化合物の滴定曲線によって計算した。
【０１２９】
化合物１〜６０は、ＨＣＶレプリコン細胞分析で確認された。結果は、５２個の化合物はＥＣ５０値が２０ｎＭよりも低いことを示し、３個の化合物は、ＥＣ５０値が２０〜１００ｎＭの範囲内であることが示された。
【０１３０】
他の実施形態
本明細書に開示されたすべての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせられうる。本明細書に開示されたそれぞれの特徴は、同一の、等価な、または類似の目的に資する他の特徴により置換されうる。よって、そうでないと明記しない限り、開示されたそれぞれの特徴は、等価な、または類似の上位概念の一連の特徴の例示にすぎない。
【０１３１】
上述の記載から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に把握することができ、その思想および範囲から逸脱することなく、本発明を種々の用途および条件に適合させる目的で種々の変更および修飾を加えることが可能である。よって、他の実施形態もまた、後述する特許請求の範囲に含まれる。