(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗Ｄ因子抗体またはその抗Ｄ因子結合フラグメントであって、該抗体は、
（ｉ）配列番号６に対して少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および、配列番号５に対して少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、（ｉｉ）配列番号８に対して少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および、配列番号７に対して少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、（ｉｉｉ）配列番号１０に対して少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および、配列番号９に対して少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、あるいは（ｉｖ）配列番号１２に対して少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および、配列番号１１に対して少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、抗Ｄ因子抗体またはその抗Ｄ因子結合フラグメント。
【請求項２】
請求項１に記載の抗Ｄ因子抗体またはその抗Ｄ因子結合フラグメントであって、該抗体は、以下：
（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン；ならびに配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン；ならびに配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン；または
（ｉｖ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン；ならびに配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン
を含む、抗Ｄ因子抗体またはその抗Ｄ因子結合フラグメント。
【請求項３】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項２に記載の抗Ｄ因子抗体またはその抗Ｄ因子結合フラグメント。
【請求項４】
前記軽鎖可変ドメインが配列番号７のアミノ酸配列を含み、そして、前記重鎖可変ドメインが配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗Ｄ因子抗体またはその抗Ｄ因子結合フラグメント。
【請求項５】
前記軽鎖可変ドメインが配列番号５のアミノ酸配列を含み、そして、前記重鎖可変ドメインが配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗Ｄ因子抗体またはその抗Ｄ因子結合フラグメント。
【請求項６】
前記軽鎖可変ドメインが配列番号９のアミノ酸配列を含み、そして、前記重鎖可変ドメインが配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗Ｄ因子抗体またはその抗Ｄ因子結合フラグメント。
【請求項７】
前記軽鎖可変ドメインが配列番号１１のアミノ酸配列を含み、そして、前記重鎖可変ドメインが配列番号１２のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗Ｄ因子抗体またはその抗Ｄ因子結合フラグメント。
【請求項８】
配列番号７の１０４位のアミノ酸がバリンまたはロイシンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗Ｄ因子抗体またはその抗Ｄ因子結合フラグメント。
【請求項９】
以下のアミノ酸配列：
ＱＸ１ＱＬＶＱＳＧＸ２ＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＧＭＮＷＶＸ３ＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＴＴＹＡＤＤＦＫＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＸ４ＹＹＣＸ５ＲＥＧＧＶＮＮＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２７）、および
ＤＩＱＸ６ＴＱＳＰＳＳＬＳＸ７ＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＩＴＳＴＤＩＤＤＤＭＮＷＹＱＱＫＰＧＫＸ８ＰＫＬＬＩＸ９ＤＧＮＴＬＲＰＧＶＰＳＲＦＳＸ１０ＳＧＳＧＸ１１ＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＬＱＳＤＳＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２６）、
を含むポリペプチドを含む抗Ｄ因子抗体またはその抗Ｄ因子結合フラグメントであって、ここで、Ｘ１はＩまたはＶであり；Ｘ２はＰまたはＳであり；Ｘ３はＫまたはＲであり；Ｘ４はＴまたはＶであり；そして、Ｘ５はＥまたはＡであり；Ｘ６はＶまたはＭであり；Ｘ７はＭまたはＡであり；Ｘ８はＰまたはＶであり；Ｘ９はＳまたはＹであり；Ｘ１０はＳまたはＧであり；そして、Ｘ１１はＡまたはＴである、抗Ｄ因子抗体またはその抗Ｄ因子結合フラグメント。
【請求項１０】
配列番号２６の１０４位のアミノ酸がバリンまたはロイシンである、請求項９に記載の抗Ｄ因子抗体またはその抗Ｄ因子結合フラグメント。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗Ｄ因子抗体またはその抗原結合フラグメントであって、該結合フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、またはＦｖフラグメントである、抗Ｄ因子抗体またはその抗Ｄ因子結合フラグメント。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗Ｄ因子抗体またはその抗Ｄ因子結合フラグメントをコードする、単離された核酸。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１５】
原核生物細胞または真核生物細胞である、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
前記真核生物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗Ｄ因子抗体またはその抗Ｄ因子結合フラグメントを含む、薬学的組成物。
【請求項１８】
診断アッセイにおいて使用するための請求項１７に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
抗Ｄ因子抗体またはその抗Ｄ因子結合フラグメントの製造方法であって、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の宿主細胞を培地中で培養する工程；および該宿主細胞の培養物のペリプラズム調整物または該宿主細胞の培養物の上清を採集する工程を包含する、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法に従って生成された、抗Ｄ因子抗体またはその抗Ｄ因子結合フラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
補体系は、免疫複合体のクリアランスならびに病原体、外来抗原、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞に対する免疫反応において中心的な役割を果たしている。一方で、補体は病的炎症および自己免疫疾患にも関与している。したがって、補体カスケードの過剰または制御されない活性化を阻害すれば、そうした疾患および症候の患者に臨床効果をもたらすことができる。
【背景技術】
【０００２】
補体系は、古典経路および代替経路と呼ばれる２つの異なる活性化経路を包含する（非特許文献１）。古典経路は、カルシウム／マグネシウム依存性カスケードであり、通常は抗原抗体複合体の形成により活性化される。代替経路は、マグネシウム依存性カスケードであり、ある種の感受性表面（酵母およびバクテリアの細胞壁多糖ならびにある種の生体高分子材料など）上でのＣ３の沈着および活性化により活性化される。補体経路が活性化すると、たとえば、アナフィラトキシンＣ３ａ、Ｃ４ａおよびＣ５ａならびに膜侵襲複合体（ＭＡＣ：ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｔｔａｃｋ  ｃｏｍｐｌｅｘ）Ｃ５ｂ−９など、補体タンパク質の生物活性のあるフラグメントが生成され、白血球走化性、マクロファージ、好中球、血小板、マスト細胞および内皮細胞の活性化、血管透過性、細胞溶解および組織傷害などの炎症活性を誘発する。
【０００３】
代替補体経路の活性化に不可欠で特異性が高いセリンプロテアーゼにＤ因子がある。Ｄ因子はＣ３ｂと結合したＢ因子を切断し、それにより代替経路のＣ３／Ｃ５コンバターゼの活性要素であるＣ３ｂ／Ｂｂ酵素が生じる。Ｄ因子は、ヒトにおける血漿中濃度が極めて低く（１．８μｇ／ｍｌ）、代替補体経路の活性化の律速酵素であることが明らかになっているため、阻害に好適な標的になる可能性がある（非特許文献２；非特許文献３）。
【０００４】
動物モデルおよびエキソビボ試験では、補体活性化をダウンレギュレートすると、いくつかの疾患適応症、たとえば、全身性エリテマトーデスおよび糸球体腎炎（非特許文献４）、関節リウマチ（非特許文献５）、心肺バイパスおよび血液透析（非特許文献６）、臓器移植における超急性（ｈｙｐｅｒｃｕｔｅ）拒絶反応（非特許文献７）、心筋梗塞（非特許文献８；非特許文献９）、再灌流傷害（非特許文献１０）および成人呼吸窮迫症候群（非特許文献１１）の処置に有効であることが証明されている。さらに、熱傷、重度の喘息、アナフィラキシーショック、腸の炎症、蕁麻疹、血管浮腫、血管炎、多発性硬化症、重症筋無力症、膜性増殖性糸球体腎炎およびシェーグレン症候群など、これ以外の炎症症候および自己免疫／免疫複合体病も補体活性化と密接に関係している（非特許文献１２）。
【０００５】
補体による障害の分野では抗体治療剤が求められており、本発明のヒト化抗体はこうしたニーズを満たすのに有用な高親和性抗体となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｖ．Ｍ．Ｈｏｌｅｒｓ，Ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｅｄ．Ｒ．Ｒ．Ｒｉｃｈ，Ｍｏｓｂｙ  Ｐｒｅｓｓ；１９９６，３６３−３９１
【非特許文献２】Ｐ．Ｈ．Ｌｅｓａｖｒｅ  ａｎｄ  Ｈ．Ｊ．Ｍｕｌｌｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９７８；１４８：１４９８−１５１０
【非特許文献３】Ｊ．Ｅ．Ｖｏｌａｎａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９８５；３１２：３９５−４０１
【非特許文献４】Ｙ．Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．；１９９６，９３：８５６３−８５６８
【非特許文献５】Ｙ．Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９５；９２：８９５５−８９５９
【非特許文献６】ＣＳ．Ｒｉｎｄｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ，１９９５；９６：１５６４−１５７２
【非特許文献７】Ｔ．Ｊ．Ｋｒｏｓｈｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１９９５；６０：１１９４−１２０２
【非特許文献８】Ｊ．Ｗ．Ｈｏｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９３；１５０：１０５５−１０６４
【非特許文献９】Ｈ．Ｆ．Ｗｅｉｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０；２４９：１４６−１５１
【非特許文献１０】Ｅ．Ａ．Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９５；２６８：Ｈ４４８−Ｈ４５７
【非特許文献１１】Ｒ．Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９２；１４９：１７４４−１７５０
【非特許文献１２】Ｖ．Ｍ．Ｈｏｌｅｒｓ，ｉｂｉｄ．，ＢＰ．Ｍｏｒｇａｎ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ，１９９４：２４：２１９−２２８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、全般的にはＤ因子に関係する生物活性を阻害することができる抗体である、マウス抗体１６６−３２の重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を含む抗体に関する。たとえば、濃度１８μｇ／ｍｌ（ヒトＤ因子の血中モル濃度の約１．５倍に相当；抗Ｄ因子抗体とＤ因子のモル比は約１．５：１）において、この抗体が代替補体活性を顕著に阻害することが観察できる（たとえば、米国特許第６，９５６，１０７号明細書を参照）
さらに、本発明は、マウスＭＡｂ１６６−３２のヒト化抗体にも関する。本発明は、この抗体の可変重鎖および軽鎖のアミノ酸配列および対応する核酸配列を含む。本発明の別の実施形態は、これらの抗体のＣＤＲ配列を含む。
【０００８】
本発明の別の実施形態は、本発明の抗体を含む組成物を含む。別の実施形態では、本発明は、本発明の抗体配列を持つ細胞株およびベクターを提供する。一態様では、本発明は、本発明の抗体および組成物の製造および使用方法を含む。
【０００９】
本（ｐｒｅｓｅｔ）発明の別の実施形態は、過剰または制御されない補体活性化に関係する障害を処置する薬物または組成物を調製するためのこうしたヒト化抗体の使用である。障害は、心肺バイパス手術における補体活性化；急性心筋梗塞、動脈瘤、脳卒中、出血性ショック、挫滅、多臓器不全、血液量減少性ショック（ｈｙｐｏｂｏｌｅｍｉｃ  ｓｈｏｃｋ）、腸管虚血または虚血の原因となる他の事象後の虚血再灌流による補体活性化を含む。また、補体活性化は、重度の火傷、内毒素血症、敗血症性ショック、成人呼吸窮迫症候群、血液透析；アナフィラキシーショック、重度の喘息、血管浮腫、クローン病、鎌状赤血球貧血、連鎖球菌感染後糸球体腎炎および膵炎などの炎症症候に関係することも明らかになっている。障害は、医薬品副作用、薬剤アレルギー、ＩＬ−２による血管漏出症候群またはＸ線造影剤アレルギーによる場合もある。さらに、障害は、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、関節リウマチ、アルツハイマー病および多発性硬化症などの自己免疫疾患も含む。また、補体活性化は、移植拒絶反応にも関係している。さらに、補体活性化は、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症などの眼疾患にも関係している。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
配列番号１の重鎖可変ドメイン配列を含む、マウス抗体。
（項目２）
配列番号２の軽鎖可変ドメイン配列を含む、マウス抗体。
（項目３）
項目１に記載の重鎖可変ドメイン配列および項目２に記載の軽鎖可変ドメイン配列を含む、マウス抗体。
（項目４）
配列番号１３、１４、１５、１６、１７および１８を含む、抗体。
（項目５）
配列番号１および配列番号２を含む、キメラ抗体。
（項目６）
配列番号６；配列番号８；配列番号１０；および配列番号１２からなる群から選択される重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含む、ヒト化抗体の可変ドメイン。
（項目７）
配列番号５；配列番号７；配列番号９および配列番号１１からなる群から選択される軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含む、ヒト化抗体の可変ドメイン。
（項目８）
配列番号５の可変ドメイン配列および配列番号６の可変ドメイン配列を含む、ヒト化抗Ｄ因子抗体。
（項目９）
配列番号７の可変ドメイン配列および配列番号８の可変ドメイン配列を含む、ヒト化抗Ｄ因子抗体。
（項目１０）
配列番号９の可変ドメイン配列および配列番号１０の可変ドメイン配列を含む、ヒト化抗Ｄ因子抗体。
（項目１１）
配列番号１１の可変ドメイン配列および配列番号１２の可変ドメイン配列を含む、ヒト化抗Ｄ因子抗体。
（項目１２）
配列番号１６の配列を持つＣＤＲ−Ｌ１；配列番号１７、２１または２３の配列を持つＣＤＲ−Ｌ２および配列番号１８、２２または２４の配列を持つＣＤＲ−Ｌ３を含む可変軽鎖を持つ、ヒト化抗Ｄ因子抗体。
（項目１３）
配列番号１３または２５の配列を持つＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１４の配列を持つＣＤＲ−Ｈ２；および配列番号１５または２０の配列を持つＣＤＲ−Ｈ３を含む可変重鎖を持つ、ヒト化抗Ｄ因子抗体。
（項目１４）
以下のアミノ酸配列：
ＱＸＩＱＬＶＱＳＧＸ２Ｅ  ＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶ  ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ  ＳＹＧＭＮＷＶＸ３ＱＡ  ＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷ  ＩＮＴＹＴＧＥＴＴＹＡＤＤＦＫＧＲＦＶＦ  ＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹ  ＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤ  ＴＡＸ４ＹＹＣＸ５ＲＥＧ  ＧＶＮＮＷＧＱＧＴＬ  ＶＴＶＳＳ（配列番号２７）、を含むポリペプチドであって、
ここで配列中、Ｘ１はＩまたはＶであり；Ｘ２はＰまたはＳであり；Ｘ３はＫまたはＲであり；Ｘ４はＴまたはＶであり；Ｘ５はＥまたはＡである、ポリペプチド。
（項目１５）
以下のアミノ酸配列：
ＤＩＱＸ６ＴＱＳＰＳＳＬＳＸ７ＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＩＴＳＴＤＩＤＤＤＭＮＷＹＱＱＫＰＧＫＸ８ＰＫＬＬＩＸ９ＤＧＮＴＬＲＰＧＶＰＳＲＦＳＸ１０ＳＧＳＧＸ１１ＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＬＱＳＤＳＬＰＹＴＦＧＱ  ＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２６）、を含むポリペプチドであって、
ここで配列中、Ｘ６はＶまたはＭであり；Ｘ７はＭまたはＡであり；Ｘ８はＰまたはＶであり；Ｘ９はＳまたはＹであり；Ｘ１０はＳまたはＧであり、Ｘ１１はＡまたはＴである、ポリペプチド。
（項目１６）
配列番号６、８、１０または１２のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
（項目１７）
配列番号５、７、９または１１のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
（項目１８）
項目１４に記載のポリペプチドを含む、ヒト化抗体。
（項目１９）
項目１５または３３に記載のポリペプチドをさらに含む、項目１８に記載のヒト化抗体。
（項目２０）
項目１〜１３、１８〜１９、３１または３２のいずれか１項に記載の抗体フラグメント。
（項目２１）
配列番号３の配列を含む、単離された核酸。
（項目２２）
配列番号４の配列を含む、単離された核酸。
（項目２３）
項目１〜１３、１８〜１９、３１または３２のいずれか１項に記載の抗体をコードする、単離された核酸。
（項目２４）
項目１４〜１７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸。（項目２５）
項目２３に記載の核酸を含む、ベクター。
（項目２６）
項目２４に記載の核酸を含む、ベクター。
（項目２７）
項目２５または２６に記載のベクターを含む、細胞株。
（項目２８）
項目１〜１３、１８または１９のいずれか１項に記載の抗体を含む、組成物。
（項目２９）
補体による障害を処置する、項目２８に記載の組成物の使用。
（項目３０）
前記障害は加齢黄斑変性症または糖尿病性網膜症などの眼疾患である、項目２９に記載の使用。
（項目３１）
配列番号７の１０４番目のアミノ酸はバリンまたはロイシンである、項目７に記載の可変ドメイン。
（項目３２）
配列番号７の１０４番目のアミノ酸がバリンまたはロイシンである配列番号７の可変ドメイン配列および配列番号８の可変ドメイン配列を含む、項目９に記載のヒト化抗Ｄ因子抗体。
（項目３３）
配列番号２６の１０４番目のアミノ酸はバリンまたはロイシンである、項目１５に記載のポリペプチド。
（項目３４）
配列番号７の１０４番目のアミノ酸はバリンまたはロイシンである、項目１７に記載のポリペプチド。
（項目３５）
項目１〜１３、１８〜１９、３１または３２のいずれか１項に記載のヒト化抗Ｄ因子抗体またはそのフラグメントを作製する、方法。
（項目３６）
マウス抗体１６６−３２および／またはヒト化抗Ｄ因子抗体クローン＃５６、＃１１１、＃２５０もしくは＃４１６および／またはヒト化抗Ｄ因子抗体クローン＃５６、＃１１１、＃２５０もしくは＃４１６の可変ドメインまたはＨＶＲ配列を含む抗体と競合する、抗体。
（項目３７）
マウス抗体１６６−３２および／またはヒト化抗Ｄ因子抗体クローン＃５６、＃１１１、＃２５０もしくは＃４１６および／またはヒト化抗Ｄ因子抗体クローン＃５６、＃１１１、＃２５０もしくは＃４１６の可変ドメインまたはＨＶＲ配列を含む抗体と同じエピトープに結合する、抗体。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、マウスＭＡｂ１６６−３２の可変重鎖のアミノ酸配列（図１Ａ）およびマウスＭＡｂ１６６−３２の可変軽鎖（図１Ｂ）のアミノ酸配列を示す。
【図２】図２Ａおよび図２Ｂは、マウスＭＡｂ１６６−３２の可変重鎖の核酸配列（図２Ａ）およびマウスＭＡｂ１６６−３２の可変軽鎖の核酸配列（図２Ｂ）を示す。
【図３】マウスＭＡｂ１６６−３２の重鎖の比較を示す。
【図４】マウスＭＡｂ１６６−３２の軽鎖を示す。
【図５】ヒト化抗体クローン＃５６、＃１１１、＃２５０および＃４１６それぞれの可変重鎖および可変軽鎖のアミノ酸配列を示す。
【図６】ヒト化抗体Ｆａｂクローン＃５６、＃１１１、＃２５０および＃４１６に対する溶血アッセイの結果を示す。
【図７】ヒト化抗体Ｆａｂクローン＃５６、＃１１１、＃２５０および＃４１６による代替補体活性の阻害を示す。
【図８Ａ】可変重鎖（ＶＨ）コンセンサスフレームワークであり、本発明を実施する際に用いてもよい例示的なアクセプターヒトコンセンサスフレームワーク配列を示し、配列識別子は以下のとおりである：ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号２８）、ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号２９〜３１）、ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号３２）、ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号３３〜３５）、ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号３６）、ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号３７〜３９）、ヒトＶＨサブグループＶＩＩコンセンサスフレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号５５）、ヒトＶＨサブグループＶＩＩコンセンサスフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号５６〜５８）、ヒトＶＨアクセプターフレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号４０）、ヒトＶＨアクセプターフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号４１〜４２）、ヒトＶＨアクセプター２フレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号４３）およびヒトＶＨアクセプター２フレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号４４〜４６）。
【図８Ｂ】可変重鎖（ＶＨ）コンセンサスフレームワークであり、本発明を実施する際に用いてもよい例示的なアクセプターヒトコンセンサスフレームワーク配列を示し、配列識別子は以下のとおりである：ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号２８）、ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号２９〜３１）、ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号３２）、ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号３３〜３５）、ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号３６）、ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号３７〜３９）、ヒトＶＨサブグループＶＩＩコンセンサスフレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号５５）、ヒトＶＨサブグループＶＩＩコンセンサスフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号５６〜５８）、ヒトＶＨアクセプターフレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号４０）、ヒトＶＨアクセプターフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号４１〜４２）、ヒトＶＨアクセプター２フレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号４３）およびヒトＶＨアクセプター２フレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号４４〜４６）。
【図９Ａ】可変軽鎖（ＶＬ）コンセンサスフレームワークであり、本発明を実施する際に用いてもよい例示的なアクセプターヒトコンセンサスフレームワーク配列を示し、配列識別子は以下のとおりである：ヒトＶＬκサブグループＩコンセンサスフレームワーク（配列番号４７）、ヒトＶＬκサブグループＩＩコンセンサスフレームワーク（配列番号４８）、ヒトκサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク（配列番号４９）およびヒトκサブグループＩＶコンセンサスフレームワーク（配列番号５０）。
【図９Ｂ】可変軽鎖（ＶＬ）コンセンサスフレームワークであり、本発明を実施する際に用いてもよい例示的なアクセプターヒトコンセンサスフレームワーク配列を示し、配列識別子は以下のとおりである：ヒトＶＬκサブグループＩコンセンサスフレームワーク（配列番号４７）、ヒトＶＬκサブグループＩＩコンセンサスフレームワーク（配列番号４８）、ヒトκサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク（配列番号４９）およびヒトκサブグループＩＶコンセンサスフレームワーク（配列番号５０）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
定義
本出願において使用する用語については、当業者に通常の一般的な意味で解釈すべきである。ただし、出願人は以下の用語を以下に規定するように詳細に定義したい。
【００１２】
抗体鎖ポリペプチド配列に関する「実質的に同一」という語句は、抗体鎖が参照ポリペプチド配列に対して少なくとも７０％または８０％または９０％または９５％の配列同一性を示すと解釈できる。核酸配列に関するこの用語は、ヌクレオチド配列が参照核酸配列に対して少なくとも約８５％または９０％または９５％または９７％の配列同一性を示すと解釈できる。
【００１３】
「同一性」または「相同性」という語は、必要に応じて配列を整列させギャップを入れ、全配列のパーセント同一性が最大になるようにした後、候補配列のアミノ酸残基と、対応する比較対象の配列の残基とが同一である割合という意味で解釈すべきであり、保存的置換については配列同一性の一部として一切考慮しない。Ｎ末端またはＣ末端の伸長と挿入のいずれも同一性または相同性を低下させるものと解釈してはならない。アライメントの方法およびコンピュータプログラムは、当該技術分野において周知である。配列同一性を、配列解析ソフトウェアを用いて測定してもよい。
【００１４】
「抗体」という語は、最も広い意味で用いるが、具体的にはモノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体など）、ポリクローナル抗体および多重特異的抗体（二重特異性抗体など）を含む。抗体（Ａｂ）および免疫グロブリン（Ｉｇ）は、同じ構造特性を持つ糖タンパク質である。抗体は特定の標的に対して結合特異性を示すのに対し、免疫グロブリンは、抗体と標的特異性のない他の抗体様分子との両方を含む。未変性の抗体および免疫グロブリンは、ほとんどの場合、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質で、同一の２本の軽（Ｌ）鎖および同一の２本の重（Ｈ）鎖からなる。重鎖にはそれぞれ一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）があり、これにいくつかの定常ドメインが続いている。軽鎖にはそれぞれ一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）があり、他方の末端に定常ドメインがある。
【００１５】
本明細書で使用する場合、「抗ヒトＤ因子抗体」とは、補体活性化を阻害または実質的に低減する形でヒトＤ因子に特異的に結合する抗体をいう。
【００１６】
抗体の可変ドメインの文脈における「可変」という語は、抗体において可変ドメインの一定部分の配列が大きく異なることをいい、特定の標的に対する個々の抗体の結合および特異性を対象として用いられる。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布するものではない。可変性は、軽鎖可変ドメインでも重鎖可変ドメインでも相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）と呼ばれる３つセグメントに集中しており、この領域は超可変領域（ＨＶＲ：ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）とも呼ばれる。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ：フレームワーク）とも呼ばれている。未変性の重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、大部分がβシート構造（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）をとり３つのＣＤＲで連結された４つのＦＲ領域を含み、ＣＤＲはβシート構造を連結し、場合によってはβシート構造の一部になるループを形成している。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域と近接して保持され、他方の鎖のＣＤＲと共に、抗体の標的結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔらを参照）。本明細書で使用する場合、他に記載がない限り、免疫グロブリンのアミノ酸残基の番号付けに関してはＫａｂａｔらの免疫グロブリンのアミノ酸残基番号付けシステム（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．  １９８７）に従って行う。
【００１７】
本明細書で使用する場合、「超可変領域」、「ＨＶＲ」または「ＨＶ」という語は、配列が超可変性である、および／または構造的に明確なループを形成する抗体可変ドメインの領域をいう。通常、抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）およびＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの６つの超可変領域を含む。超可変領域の多くの図表が使用されており、本明細書中に包含される。Ｋａｂａｔの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列可変性に基づくもので、最も多く使われている（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａは代わりに、構造ループの位置に言及している（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。ＡｂＭの超可変領域は、ＫａｂａｔのＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａの構造ループの折衷案であり、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ  ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアで使用されている。「接触」超可変領域は、利用可能な複合体結晶構造の解析に基づいている。これらの超可変領域の残基をそれぞれ以下に示す。
【００１８】
【化１】
0005474158.tif 000002
超可変領域は、ＶＬに２４〜３６または２４〜３４（Ｌ１）、４６〜５６または５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）、ＶＨに２６〜３５（Ｈ１）、５０〜６５または４９〜６５（Ｈ２）および９３〜１０２、９４〜１０２または９５〜１０２（Ｈ３）のように「伸長超可変領域」を含んでもよい。これらの定義ごとに上掲のＫａｂａｔらに従って可変ドメイン残基に番号を付ける。
【００１９】
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書に定義する超可変領域残基またはＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
【００２０】
「Ｋａｂａｔと同様の可変ドメイン残基番号付け」または「Ｋａｂａｔと同様のアミノ酸位置番号付け」という語およびその変形は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）において、集めた抗体の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに用いた番号付けシステムをいう。この番号付けシステムを用いると、実際の直鎖アミノ酸配列に含まれるアミノ酸が、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短縮あるいは可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲへの挿入に伴い減少したり付加されたりすることがある。たとえば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入（ｉｎｓｅｒｔ）（Ｋａｂａｔによる残基５２）および重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（たとえば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂおよび８２ｃなど）を含んでもよい。個々の抗体の残基のＫａｂａｔ番号については、抗体配列の相同性領域において「標準」Ｋａｂａｔ番号付け配列とのアライメントを行い決定してもよい。
【００２１】
可変ドメインの残基（軽鎖の約１〜１０７残基および重鎖の１〜１１３残基）について言及する際は、通常、Ｋａｂａｔの番号付けシステムが用いられる（たとえば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。免疫グロブリン重鎖定常領域の残基について言及する際は、「ＥＵ番号付けシステム」または「ＥＵインデックス」が用いられるのが一般的である（たとえば、上掲のＫａｂａｔらにより報告されたＥＵインデックス；重鎖定常ドメインのヒンジ領域は、重鎖の約２１６〜２３０残基（ＥＵ番号付け）である）。「Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックス」とは、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基番号付けをいう。本明細書では他に記載がない限り、抗体の可変ドメインの残基番号に関する言及は、Ｋａｂａｔの番号付けシステムによる残基番号である。本明細書では他に記載がない限り、抗体の定常ドメインの残基番号に関する言及は、ＥＵ番号付けシステムによる残基番号である（たとえば、米国仮特許出願第６０／６４０，３２３号明細書、ＥＵ番号付けの図を参照）。
【００２２】
「抗体フラグメント」という語は、全長抗体の一部、通常、標的結合領域または可変領域をいう。抗体フラグメントの例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメントが挙げられる。抗体の「機能的フラグメントまたはアナログ」という語句は、全長抗体と同様の定性的生物活性を持つ化合物をいう。たとえば、抗ヒトＤ因子抗体の機能的フラグメントまたはアナログは、補体活性化を阻止または実質的に低減するようにＤ因子に結合できるものである。本明細書で使用する場合、抗体に関する「機能的フラグメント」とは、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２フラグメントをいう。「Ｆｖ」フラグメントは、完全な標的認識および結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、非共有結合で緊密に会合した１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインのダイマーからなる（ＶＨ−ＶＬダイマー）。この構造（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）において各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用し、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面で標的結合部位が規定される。全体として、６つのＣＤＲが抗体に標的結合特異性を与える。しかしながら、単一可変ドメイン（または標的に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても標的を認識し、これと結合することができる。「一本鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインが単一のポリペプチド鎖に存在する。通常、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、ｓＦｖが標的結合に望ましい構造を形成することができるようになっている。
【００２３】
Ｆａｂフラグメントは、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、Ｆａｂフラグメントと異なり、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に抗体ヒンジ領域から１つまたは複数のシステインなど、少数の残基が付加されている。Ｆ（ａｂ’）フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２ペプシン消化産物のヒンジシステインにおいてジスルフィド結合を切断することで得られる。抗体フラグメントのさらなる化学的カップリングは、当業者に知られている。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「モノクローナル抗体」という語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体をいい、言い換えれば、集団を構成する個々の抗体は、微量で存在する場合がある、自然に発生する突然変異を除けば同一である。モノクローナル抗体は、特異性が高く、単一の標的（ｔａｒｇｅｔｉｃ）部位を標的とする。さらに、一般に複数の決定基（エピトープ）に対して複数の抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物と異なり、各モノクローナル抗体は、標的上の単一の決定基を標的とする。モノクローナル抗体は、その特異性ばかりでなく、ハイブリドーマ培養により他の免疫グロブリンに汚染されずに合成できるという点でも好都合である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団から得られたものとしての抗体の特徴を示すもので、抗体を任意の特定の方法で作製する必要があるものと解釈してはならない。たとえば、本発明に用いるモノクローナル抗体を周知の技法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。本発明に従って使用できる親モノクローナル抗体に関しては、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５（１９７５）に最初に記載されたハイブリドーマ法で作製してもよいし、組換え法で作製してもよい。
【００２５】
非ヒト（マウスなど）抗体の「ヒト化」形態は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体のこれ以外の標的結合部分配列など）であり、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つおよび一般には２つの可変ドメインの実質的に全部を含み、ＣＤＲ領域の全部または実質的に全部は、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域であり、ＦＲ領域の全部または実質的に全部は、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、一般には選択したヒト免疫グロブリン鋳型の免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部をさらに含んでもよい。
【００２６】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野において周知である。通常、ヒト化抗体は、ヒト以外の供給源から導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を持っている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、「移入」残基と呼ばれ、一般に「移入」可変ドメインから取り出す。ヒト化は本質的に、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法［Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）］に準じて、齧歯動物ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列と置き換えることで行うことできる。そのため、こうした「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインよりも実質的に小さなドメインを非ヒト種由来の対応する配列で置き換えたキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）。実際のヒト化抗体は、いくつかのＣＤＲ残基、場合よってはいくつかのＦＲ残基も齧歯動物抗体の類似部位の残基で置き換えられているヒト抗体であるのが一般的である。
【００２７】
抗体をヒトの治療に使用することを意図しているとき、軽鎖でも重鎖でも、ヒト化抗体の作製に用いるヒト可変ドメインの選択は、抗原性および／またはＨＡＭＡ（ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ヒト抗マウス抗体）反応を低下させる上で場合によって重要になることがある。ＨＡＭＡ反応の低減または除去は通常、好適な治療薬の臨床開発において重要な側面である。たとえば、Ｋｈａｘｚａｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．（１９８８），８０：９３７；Ｊａｆｆｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（１９８６），４１：５７２；Ｓｈａｗｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８５），１３５：１５３０；Ｓｅａｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄ．（１９８４），３：１３８；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（１９８３），６２：９８８；Ｈａｋｉｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１），１４７：１３５２；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８８），３３２：３２３；Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９０），５０：１４９５を参照されたい。本明細書に記載のように、本発明は、ＨＡＭＡ反応を低減または除去するようにヒト化した抗体を提供する。また、当該技術分野において公知の通常の方法を用いて、これらの抗体の変異体を得てもよく、その一部を以下にさらに記載する。いわゆる「ベストフィット」法に従い、齧歯動物抗体の可変ドメイン配列について既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーをスクリーニングする。齧歯動物のＶドメイン配列に最も近いヒトＶドメイン配列を特定し、その配列内のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）をヒト化抗体用に受け入れる（Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７））。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク領域を用いる。複数の異なるヒト化抗体に対して、同じフレームワークを用いてもよい（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３））。
【００２８】
たとえば、本明細書に記載する抗体のアミノ酸配列は、フレームワークおよび／または超可変配列（単数または複数）を多様化するための出発（親）配列としての役割を果たしてもよい。本明細書では、出発超可変配列を連結する、選択されたフレームワーク配列をアクセプターヒトフレームワークという。アクセプターヒトフレームワークは、ヒト免疫グロブリン（そのＶＬおよび／またはＶＨ領域）のフレームワーク、またはそれに由来するフレームワークでもよいが、そのフレームワークがヒト患者において免疫原性がほとんどないか、まったくないことが証明されているようなヒトコンセンサスフレームワーク配列のフレームワーク、またはそれに由来するフレームワークでもよい。本明細書において、「アクセプターヒトフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来するＶＬまたはＶＨフレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、それらと同じアミノ酸配列を含んでもよいし、既存のアミノ酸配列の変化を含んでいてもよい。既存のアミノ酸に変化がある場合、既存のアミノ酸の変化は好ましくは５以下、好ましくは４以下あるいは３以下で存在する。一実施形態では、ＶＨアクセプターヒトフレームワークの配列は、ＶＨヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と同一である。一実施形態では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークの配列は、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と同一である。「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、選択したヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の中で最も多く見られるアミノ酸残基を示すフレームワークである。通常、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループから行う。配列のサブグループは、Ｋａｂａｔらと同様のサブグループであるの一般的である。一実施形態では、ＶＬのサブグループは、Ｋａｂａｔらと同様のサブグループκＩである。一実施形態では、ＶＨのサブグループは、Ｋａｂａｔらと同様のサブグループＩＩＩである。
【００２９】
アクセプターがヒト免疫グロブリンに由来する場合、ドナーフレームワーク配列に対する相同性に基づき選ばれたヒトフレームワーク配列を任意に選択してもよく、これにはドナーフレームワーク配列をヒトフレームワーク配列の集合体の中の様々なヒトフレームワーク配列と整列させ、最も相同的なフレームワーク配列をアクセプターとして選択する。アクセプターヒトフレームワークは、公共データベースで入手可能なヒト抗体生殖系列配列のフレームワーク、またはそれに由来するフレームワークであってもよい。
【００３０】
一実施形態では、本明細書のヒトコンセンサスフレームワークは、ＶＨサブグループＶＩＩおよび／またはＶＬκサブグループＩコンセンサスフレームワーク配列のフレームワーク、またはそれに由来するフレームワークである。
【００３１】
一実施形態では、抗Ｄ因子抗体の作製に使用するヒトフレームワークの鋳型は、ＶＨ鎖のＶＩ−４．１ｂ＋（ＶＨ７ファミリー）とＪＨ４ｄの組み合わせ（図３）および／またはＶＬ鎖のＤＰＫ４（ＶκＩファミリー）とＪＫ２の組み合わせ（図４）を含む鋳型を含む、フレームワーク配列を含んでもよい。
【００３２】
したがって、ＶＨアクセプターヒトフレームワークは、ＱＸ１ＱＬＶＱＳＧＸ２ＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳ（配列番号２７のアミノ酸１〜２５）を含むＦＲ１、配列中、Ｘ１はＩまたはＶであり、Ｘ２はＰまたはＳである；ＷＶＸ３ＱＡＰＧＱＧＬＥ（配列番号２７のアミノ酸３６〜４６）を含むＦＲ２、配列中、Ｘ３はＫまたはＲである；ＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＸ４ＹＹＣＸ５Ｒ（配列番号２７のアミノ酸６７〜９８）を含むＦＲ３、配列中、Ｘ４はＴまたはＶであり、Ｘ５はＥまたはＡである；ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号８のアミノ酸１０５〜１１５または配列番号２７のアミノ酸１０５〜１１５）を含むＦＲ４のフレームワーク配列のうち１つ、２つ、３つまたは全部を含んでもよい。
【００３３】
ＶＨコンセンサスフレームワークの例として、
ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号２８）；
ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号２９〜３１）；
ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号３２）；
ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号３３〜３５）；
ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号３６）；
ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号３７〜３９）；
ヒトＶＨサブグループＶＩＩコンセンサスフレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号５５）；
ヒトＶＨサブグループＶＩＩコンセンサスフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号５６〜５８）；
ヒトＶＨアクセプターフレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号４０）；
ヒトＶＨアクセプターフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号４１〜４２）；ヒトＶＨアクセプター２フレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号４３）；または
ヒトＶＨアクセプター２フレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号４４〜４５）が挙げられる。
【００３４】
一実施形態では、ＶＨアクセプターヒトフレームワークは、
ＱＶＱＬＶＱＳＧＰＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳ（配列番号８のアミノ酸１〜２５）を含むＦＲ１、
ＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥ（配列番号８のアミノ酸３６〜４６）を含むＦＲ２、
ＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＥＲ（配列番号８のアミノ酸６７〜９８）、
ＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＥ（配列番号８のアミノ酸６７〜９７）、
ＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣ（配列番号８のアミノ酸６７〜９６）、
ＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳ（配列番号５１）または
ＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲ（配列番号５２）を含むＦＲ３
ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号８のアミノ酸１０５〜１１５または配列番号２７のアミノ酸１０５〜１１５）を含むＦＲ４
のフレームワーク配列のうち１つ、２つ、３つまたは全部を含む。
【００３５】
ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、
ＤＩＱＸ６ＴＱＳＰＳＳＬＳＸ７ＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号２６のアミノ酸１〜２３）を含むＦＲ１、配列中、Ｘ６はＶまたはＭであり、Ｘ７はＭまたはＡである；
ＷＹＱＱＫＰＧＫＸ８ＰＫＬＬＩＸ９（配列番号２６のアミノ酸３５〜４９）を含むＦＲ２、配列中、Ｘ８はＰまたはＶであり、Ｘ９はＳまたはＹである；
ＧＶＰＳＲＦＳＸ１０ＳＧＳＧＸ１１ＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣ（配列番号２６のアミノ酸５７〜８８）を含むＦＲ３、配列中、Ｘ１０はＳまたはＧであり、Ｘ１１はＡまたはＴである；
ＦＧＱＧＴＫＸ１２ＥＩＫ（配列番号５４）を含むＦＲ４、配列中、Ｘ１２はＶまたはＬである、
フレームワーク配列のうち１つ、２つ、３つまたは全部を含んでもよい。
【００３６】
ＶＬコンセンサスフレームワークの例として、
ヒトＶＬκサブグループＩコンセンサスフレームワーク（配列番号４７）；
ヒトＶＬκサブグループＩＩコンセンサスフレームワーク（配列番号４８）；
ヒトＶＬκサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク（配列番号４９）；または
ヒトＶＬκサブグループＩＶコンセンサスフレームワーク（配列番号５０）
が挙げられる
一実施形態では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、
ＤＩＱＶＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号７のアミノ酸１〜２３）を含むＦＲ１、
ＷＹＱＱＫＰＧＫＶＰＫＬＬＩＳ（配列番号７のアミノ酸３５〜４９）を含むＦＲ２、
ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣ（配列番号７のアミノ酸５７〜８８）を含むＦＲ３、
ＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号７のアミノ酸９８〜１０７）または
ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５３）を含むＦＲ４
のフレームワーク配列のうち１つ、２つ、３つまたは全部を含んでもよい。
【００３７】
アクセプターの配列は、ヒト免疫グロブリン由来かヒトコンセンサスフレームワーク由来かを問わず、選択したヒトフレームワーク配列と同一であってもよいが、本発明は、アクセプター配列が、ヒト免疫グロブリン配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列に対する既存のアミノ酸置換を含む場合があることを意図している。これらの既存の置換数は、好ましくはわずかであり、ほとんどの場合、ヒト免疫グロブリン配列またはコンセンサスフレームワーク配列に対して４、３、２または１個のアミノ酸の相違にとどまる。
【００３８】
非ヒト抗体の超可変領域残基については、ＶＬおよび／またはＶＨアクセプターヒトフレームワークに組み込む。たとえば、ＫａｂａｔのＣＤＲ残基、Ｃｈｏｔｈｉａの超可変性ループ残基、Ａｂｍの残基および／または接触残基に対応する残基を組み込んでもよい。任意に、２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）、２６〜３５（Ｈ１）、５０〜６５または４９〜６５（Ｈ２）および９３〜１０２、９４〜１０２または９５〜１０２（Ｈ３）などの伸長超可変領域残基を組み込む。
【００３９】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号１３、配列番号２３および配列番号２５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１５および配列番号２０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１７、配列番号２１および配列番号２４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；および（ｆ）配列番号１８、配列番号２２および配列番号１９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＨＶＲを含む抗体を提供する。
【００４０】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号１３および配列番号２５から選択されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１５および配列番号２０から選択されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１７、配列番号２１および配列番号２４から選択されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；および（ｆ）配列番号１８、配列番号２２および配列番号１９から選択されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＨＶＲを含む抗Ｄ因子抗体を提供する。いくつかの実施形態では、配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であるアミノ酸配列を持つＨＶＲは、参照配列に対して置換、挿入または欠失を含むが、そのアミノ酸配列を含む抗体は、Ｄ因子に結合する能力を保持している。いくつかの実施形態では、配列番号１３、配列番号２５、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２０、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２３、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２２および配列番号２４からなる群から選択される参照配列において全体で１〜１０個のアミノ酸が置換、挿入または欠失されている。いくつかの実施形態では、本発明は、（ａ）配列番号１３および配列番号２５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１５および配列番号２０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１７、配列番号２１および配列番号２４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；および（ｆ）配列番号１８、配列番号２２および配列番号１９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＨＶＲを含む抗体を提供する。
【００４１】
一態様では、本発明は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２から選択される重鎖可変ドメインを含む抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号５、配列番号７、配列番号９および配列番号１１から選択される軽鎖可変ドメインを含む抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号６を含む重鎖可変ドメインを含む抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号５を含む軽鎖可変ドメインを含む抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号６を含む重鎖可変ドメインをおよび配列番号５を含む軽鎖可変ドメインを含む抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号８を含む重鎖可変ドメインを含む抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号７を含む軽鎖可変ドメインを含む抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号８を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号７を含む軽鎖可変ドメインを含む抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号１０を含む重鎖可変ドメインを含む抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号９を含む軽鎖可変ドメインを含む抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号１０を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号９を含む軽鎖可変ドメインを含む抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号１２を含む重鎖可変ドメインを含む抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号１１を含む軽鎖可変ドメインを含む抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号１２を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号１１を含む軽鎖可変ドメインを含む抗体を提供する。
【００４２】
一態様では、本発明は、配列番号６、８、１０および１２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む抗Ｄ因子抗体を提供する。いくつかの実施形態では、参照配列に対して配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であるアミノ酸配列は、置換、挿入または欠失を含むが、そのアミノ酸配列を含む抗体はＤ因子に結合する能力を保持している。いくつかの実施形態では、配列番号６、８、１０または１２からなる群から選択される配列において全体で１〜１０個のアミノ酸が置換、挿入または欠失されている。いくつかの実施形態では、置換、挿入または欠失は、ＨＶＲ外の領域で（すなわち、ＦＲにおいて）起こる。いくつかの実施形態では、抗Ｄ因子抗体は、配列番号６、８、１０または１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号５、７、９および１１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む抗Ｄ因子抗体を提供する。いくつかの実施形態では、配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であるアミノ酸配列は、参照配列に対して置換、挿入または欠失を含むが、そのアミノ酸配列を含む抗体はＤ因子に結合する能力を保持している。いくつかの実施形態では、配列番号５、７、９および１１からなる群から選択される配列において全体で１〜１０個のアミノ酸が置換、挿入または欠失されている。いくつかの実施形態では、置換、挿入または欠失は、ＨＶＲ外の領域で（すなわち、ＦＲにおいて）起こる。いくつかの実施形態では、抗Ｄ因子抗体は、配列番号５、７、９および１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
【００４４】
抗Ｄ因子抗体は、任意の好適なフレームワーク可変ドメイン配列を含んでもよく、ただし、抗体はＤ因子に結合する能力を保持している。たとえば、いくつかの実施形態では、本発明の抗Ｄ因子抗体は、ＶＩ．４．１ｂ＋およびＪＨ４ｄの組み合わせである重鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む（図３を参照）。いくつかの実施形態では、本発明の抗Ｄ因子抗体は、ヒトサブグループＶＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗Ｄ因子抗体は、配列番号８のアミノ酸１〜２５を含むＦＲ１、配列番号８のアミノ酸３６〜４６を含むＦＲ２、配列番号８のアミノ酸６７〜９８を含むＦＲ３および配列番号８のアミノ酸１０５〜１１５を含むＦＲ４を含む、重鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む。これらの抗体の一実施形態では、重鎖可変ドメイン配列は、４０および／または８８番目（Ｋａｂａｔの番号付け）に置換（単数または複数）を含む。これらの抗体の一実施形態では、４０番目は、システイン（Ｃ）またはアラニン（Ａ）であり、および／または８８番目は、システイン（Ｃ）またはアラニン（Ａ）である。いくつかの実施形態では、本発明の抗Ｄ因子抗体は、ＤＰＫ４およびＪＫ２の組み合わせである軽鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む（図４を参照）。いくつかの実施形態では、本発明の抗Ｄ因子抗体は、ヒトκＩ（κＩ）軽鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗Ｄ因子抗体は、配列番号７のアミノ酸１〜２３を含むＦＲ１、配列番号７のアミノ酸３５〜４９を含むＦＲ２、配列番号７のアミノ酸５７〜８８を含むＦＲ３および配列番号７のアミノ酸９８〜１０７を含むＦＲ４を含む、軽鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む。これらの抗体の一実施形態では、軽鎖可変フレームワーク配列は、１５、４３および／または１０４番目（Ｋａｂａｔの番号付け）に１つまたは複数の置換（単数または複数）を含む。これらの抗体の一実施形態では、１５番目はシステイン（Ｃ）またはバリン（Ｖ）であり、４３番目はシステイン（Ｃ）またはアラニン（Ａ）であり、および／または１０４番目はバリン（Ｖ）またはロイシン（Ｌ）である。
【００４５】
さらに、抗Ｄ因子抗体は、任意の好適な定常ドメイン配列を含んでもよく、ただし、抗体はＤ因子に結合する能力を保持している。たとえば、いくつかの実施形態では、本発明の抗Ｄ因子抗体は、重鎖定常ドメインの少なくとも一部を含む。一実施形態では、本発明の抗Ｄ因子抗体は、α、δ、ε、γ，またはμ重鎖の１つあるいはこれら組み合わせの重鎖定常ドメインを含む。免疫グロブリンは、重鎖定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列によって異なるクラスまたはアイソタイプに分類される。免疫グロブリンにはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの５つのクラスがあり、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる重鎖を持っている。γおよびαクラスは、ＣＨ配列および機能の比較的小さな相違に基づきさらにサブクラスに分けられ、たとえば、ヒトではＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２のサブクラスで表される。一実施形態では、本発明の抗Ｄ因子抗体は、エフェクター機能（結合親和性など）に対して望ましい作用を与えるアミノ酸位置に置換を含む、重鎖定常ドメインを含む。一実施形態では、本発明の抗Ｄ因子抗体は、エフェクター機能（結合親和性など）に対して作用を与えないアミノ酸位置に置換を含む、重鎖定常ドメインを含む。一実施形態では、本発明の抗Ｄ因子抗体は、ＩｇＧタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４など）の重鎖定常ドメインを含み、１１４（Ｋａｂａｔの番号付け；ＥＵ番号付けの１１８に相当）、１６８（Ｋａｂａｔの番号付け；ＥＵ番号付けの１７２に相当）、１７２（Ｋａｂａｔの番号付け；ＥＵ番号付けの１７６に相当）および／または２２８（ＥＵ番号付け）番目に置換をさらに含む。一実施形態では、本発明の抗Ｄ因子抗体は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４など）タイプの重鎖定常ドメインを含み、さらに１１４番目に置換を含み、１１４番目がシステイン（Ｃ）またはアラニン（Ａ）であり、１６８番目がシステイン（Ｃ）またはアラニン（Ａ）であり、１７２番目がシステイン（Ｃ）またはアラニン（Ａ）であり、および／または２２８番目がプロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）またはセリン（Ｓ）である。
【００４６】
さらに、たとえば、いくつかの実施形態では、本発明の抗Ｄ因子抗体は、軽鎖定常ドメインの少なくとも一部を含む。任意の脊椎動物種の軽鎖は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づきκおよびλと呼ばれる明らかに異なる２タイプに分類できるため、一実施形態では、本発明の抗Ｄ因子抗体は、κまたはλ軽鎖の１つあるいはこれら組み合わせの軽鎖定常ドメインを含む。一実施形態では、本発明の抗Ｄ因子抗体は、エフェクター機能（結合親和性など）に対して望ましい作用を与えるアミノ酸位置に置換を含む、軽鎖定常ドメインを含む。一実施形態では、本発明の抗Ｄ因子抗体は、エフェクター機能（結合親和性など）に対して作用を与えないアミノ酸位置に置換を含む、軽鎖定常ドメインを含む。一実施形態では、本発明の抗Ｄ因子抗体は、κタイプの軽鎖定常ドメインを含み、さらに１１０、１４４、１４６および／または１６８番目（Ｋａｂａｔの番号付け）に置換を含む。一実施形態では、本発明の抗Ｄ因子抗体は、κタイプの軽鎖定常ドメインを含み、１１０がシステイン（Ｃ）またはバリン（Ｖ）である１１０番目に、１４４がシステイン（Ｃ）またはアラニン（Ａ）である１４４番目に、１４６がイソロイシン（Ｉ）またはバリン（Ｖ）である１４６番目に、および／または１６８がシステイン（Ｃ）またはセリン（Ｓ）である１６８番目に置換をさらに含む。
【００４７】
一態様では、本発明は、マウス抗体１６６−３２および／またはヒト化抗Ｄ因子抗体クローン＃５６、＃１１１、＃２５０もしくは＃４１６および／またはヒト化抗Ｄ因子抗体クローン＃５６、＃１１１、＃２５０もしくは＃４１６の可変ドメインまたはＨＶＲ配列を含む抗体と競合する抗体を提供する。さらに、マウス抗体１６６−３２および／またはヒト化抗Ｄ因子抗体クローン＃５６、＃１１１、＃２５０もしくは＃４１６および／またはヒト化抗Ｄ因子抗体クローン＃５６、＃１１１、＃２５０もしくは＃４１６の可変ドメインまたはＨＶＲ配列を含む抗体と同じエピトープに結合する抗体も提供する。
【００４８】
一実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対する抗体の一価親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）がより低い、たとえば、キメラ抗体の一価親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしてのキメラ抗体の親和性など）よりも少なくとも１倍または２倍低い抗Ｄ因子抗体であって、配列番号２の軽鎖可変ドメインおよび配列番号１の重鎖可変ドメインを含む、それらからなる、または本質的にそれらからなる、抗体を提供する。
【００４９】
一実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対する抗体の二価親和性（Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性など）がより低い、たとえば、キメラ抗体の二価親和性（Ｄ因子に対するＩｇＧとしてのキメラ（ｃｉｈｍｅｒｉｃ）抗体の親和性など）よりも少なくとも１倍または２倍低い抗Ｄ因子抗体であって、配列番号２の軽鎖可変ドメインおよび配列番号１の重鎖可変ドメインを含む、それらからなる、または本質的にそれらからなる、抗体を提供する。
【００５０】
別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対する抗体の一価親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）がより高い、たとえば、キメラ抗体の一価親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしてのキメラ抗体の親和性など）よりも少なくとも１倍または２倍高い抗Ｄ因子抗体であって、配列番号２の軽鎖可変ドメインおよび配列番号１の重鎖可変ドメインを含む、それらからなる、または本質的にそれらからなる、抗体を提供する。
【００５１】
別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対する抗体の二価親和性（Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性など）がより高い、たとえば、キメラ抗体の二価親和性（Ｄ因子に対するＩｇＧとしてのキメラ抗体の親和性など）よりも少なくとも１倍または２倍高い抗Ｄ因子抗体であって、配列番号２の軽鎖可変ドメインおよび配列番号１の重鎖可変ドメインを含む、それらからなる、または本質的にそれらからなる、抗体を提供する。
【００５２】
別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が１．０ｎＭ（１．０×１０−９Ｍ）以上である、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が０．５ｎＭ（０．５×１０−９Ｍ）以上である、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が１．０ｐＭ（１．０×１０−１２Ｍ）以上である、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が０．５ｐＭ（０．５×１０−１２Ｍ）以上である、抗Ｄ因子抗体を提供する。
【００５３】
別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の二価形態での親和性（Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性など）が１．０ｎＭ（１．０×１０−９Ｍ）以上である、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対する抗体の二価形態での親和性（Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性など）が０．５ｎＭ（０．５×１０−９Ｍ）以上である、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対する抗体の二価形態での親和性（Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性など）が１．０ｐＭ（１．０×１０−１２Ｍ）以上である、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対する抗体の二価形態での親和性（Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性など）が０．５ｐＭ（０．５×１０−１２Ｍ）以上である、抗Ｄ因子抗体を提供する。
【００５４】
別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が０．５ｍＭ（０．５×１０−６Ｍ）と０．５ｐＭ（０．５×１０−１２Ｍ）の間にある、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が１５ｎＭ（１５×１０−９Ｍ）と０．１ｎＭ（０．１×１０−９Ｍ）の間にある、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が５．５ｎＭ（５．５×１０−９Ｍ）と１ｎＭ（１×１０−９Ｍ）の間にある、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が０．５ｐＭ（０．５×１０−１２Ｍ）と２ｐＭ（２×１０−１２Ｍ）の間にある、抗Ｄ因子抗体を提供する。
【００５５】
別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の二価形態での親和性（Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性など）が０．５ｍＭ（０．５×１０−６Ｍ）と０．５ｐＭ（０．５×１０−１２Ｍ）の間にある、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の二価形態での親和性（Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性など）が１０ｎＭ（１０×１０−９Ｍ）と０．０５ｎＭ（０．０５×１０−９Ｍ）の間にある、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の二価形態での親和性（Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性など）が５．５ｎＭ（５．５×１０−９Ｍ）と１ｎＭ（１×１０−９Ｍ）の間にある、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の二価形態での親和性（Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性など）が０．５ｐＭ（０．５×１０−１２Ｍ）と２ｐＭ（２×１０−１２Ｍ）の間にある、抗Ｄ因子抗体を提供する。
【００５６】
別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が約０．３７ｎＭ（３．７×１０−１０Ｍ）である、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が約０．３３ｎＭ（３．３×１０−１０Ｍ）である、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が約０．５１ｎＭ（５．１×１０−１０Ｍ）である、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が約２．７ｎＭ（２．７×１０−９Ｍ）である、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が約１．４ｎＭ（１．４×１０−９Ｍ）である、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が約１．４ｐＭ（１．４×１０−１２Ｍ）である、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の二価形態での親和性（Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性など）が約１．１ｐＭ（１．１×１０−１２Ｍ）である、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が約０．１９ｎＭ（０．１９×１０−９Ｍ）である、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の二価形態での親和性（Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性など）が約０．０８ｎＭ（０．０８×１０−９Ｍ）である、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が約１２．３ｎＭ（１２．３×１０−９Ｍ）である、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の二価形態での親和性（Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性など）が約９．０ｎＭ（９．０×１０−９Ｍ）である、抗Ｄ因子抗体を提供する。
【００５７】
別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が約１．４ｐＭ（１．４×１０−１２Ｍ）＋／−０．５である、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の二価形態での親和性（Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性など）が約１．１ｐＭ（１．１×１０−１２Ｍ）＋／−０．６である、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が約０．１９ｎＭ（０．１９×１０−９Ｍ）＋／−．０１である、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の二価形態での親和性（Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性など）が約０．０８ｎＭ（０．０８×１０−９Ｍ）＋／−０．０１である、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が約１２．３ｎＭ（１２．３×１０−９Ｍ）＋／−２である、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の二価形態での親和性（Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性など）が約９．０ｎＭ（９．０×１０−９Ｍ）＋／−１である、抗Ｄ因子抗体を提供する。
【００５８】
別の実施形態では、抗Ｄ因子抗体は、Ｄ因子に対する一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が約３．７ｎＭ（３．７×１０−９Ｍ）＋／−２であってもよい。別の実施形態では、抗Ｄ因子抗体は、Ｄ因子に対する一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が約３．３ｎＭ（３．３×１０−９Ｍ）＋／−２であってもよい。別の実施形態では、抗Ｄ因子抗体は、Ｄ因子に対する一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が約５．１ｎＭ（５．１×１０−９Ｍ）＋／−２であってもよい。別の実施形態では、抗Ｄ因子抗体は、Ｄ因子に対する一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が約２．７ｎＭ（２．７×１０−９Ｍ）＋／−２であってもよい。別の実施形態では、抗Ｄ因子抗体は、Ｄ因子に対する一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が約１．４ｎＭ（１．４×１０−９Ｍ）＋／−２であってもよい。別の実施形態では、抗Ｄ因子抗体は、Ｄ因子に対する一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が約１．４ｐＭ（１．４×１０−１２Ｍ）＋／−２であってもよい。別の実施形態では、抗Ｄ因子抗体は、Ｄ因子に対する二価形態での親和性（Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性など）が約１．１ｐＭ（１．１×１０−１２Ｍ）＋／−２であってもよい。別の実施形態では、抗Ｄ因子抗体は、Ｄ因子に対する一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が約０．１９ｎＭ（０．１９×１０−９Ｍ）＋／−２であってもよい。別の実施形態では、抗Ｄ因子抗体は、Ｄ因子に対する二価形態での親和性（Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性など）が約０．０８ｎＭ（０．０８×１０−９Ｍ）＋／−２であってもよい。別の実施形態では、抗Ｄ因子抗体は、Ｄ因子に対する一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が約１２．３ｎＭ（１２．３×１０−９Ｍ）＋／−２であってもよい。別の実施形態では、抗Ｄ因子抗体は、Ｄ因子に対する二価形態での親和性（Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性など）が約９．０ｎＭ（９．０×１０−９Ｍ）＋／−２であってもよい。
【００５９】
受容体に対するリガンドの結合親和性については、当該技術分野において確立されているように種々のアッセイのいずれかにより判定し、様々な定量値で表してもよい。したがって、一実施形態では、結合親和性をＫｄ値で表し、（たとえば、アビディティー効果を最小化して）固有の結合親和性で示してもよい。通常および好ましくは、結合親和性を、無細胞かそれとも細胞に結合した状況においてインビトロで測定する。本明細書でより詳細に記載する場合、結合親和性の差が何倍かについては、類似のアッセイ条件で結合親和性値を判定する、ヒト化抗体（Ｆａｂ形態など）の一価の結合親和性値と参照／比較抗体（Ｆａｂ形態など）（ドナー超可変領域配列を持つマウス抗体など）の一価の結合親和性値との比で定量してもよい。したがって、一実施形態では、結合親和性の差が何倍かをＦａｂ形態のヒト化抗体と該参照／比較Ｆａｂ抗体のＫｄ値の比で判定する。たとえば、一実施形態では、本発明の抗体（Ａ）の親和性が参照抗体（Ｍ）の親和性よりも「３倍低い」場合、ＡのＫｄ値は３倍であれば、ＭのＫｄ値は１倍になり、ＡのＫｄとＭのＫｄの比は３：１になる。これに対し、一実施形態では、本発明の抗体（Ｃ）の親和性が参照抗体（Ｒ）の親和性よりも「３倍高い」場合、ＣのＫｄ値は１倍であれば、ＲのＫｄ値は３倍になり、ＣのＫｄとＲのＫｄとの比は、１：３になる。本明細書に記載のアッセイを含めて、たとえば、Ｂｉａｃｏｒｅ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ：ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）およびＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）など、当該技術分野において公知の多くのアッセイのいずれかを用いて結合親和性測定値を得ることができる。
【００６０】
さらに、本発明の抗体のＫｄ値は、使用した個々のアッセイの条件によって異なっても構わない。たとえば、一実施形態では、結合親和性測定値を、Ｆａｂまたは抗体を固定化してリガンド、すなわちＤ因子の結合を測定するアッセイで得てもよいし、あるいは、Ｆａｂまたは抗体のリガンド、すなわちＤ因子を固定化してＦａｂまたは抗体の結合を測定するアッセイで得てもよい。一実施形態では、結合親和性測定値を、再生条件として（１）１０ｍＭのグリセインまたは４ＭのＭｇＣｌ２（ｐＨ１．５）および（２）ｐＨ１．５、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０〜ｐＨ７．２など、ｐＨ１．０〜ｐＨ７．５のｐＨを含めて構わないアッセイで得てもよい。一実施形態では、結合親和性測定値を、結合条件として（１）ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）またはＨＥＰＥＳ緩衝食塩水および（２）Ｔｗｅｅｎ−２０、すなわち０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含めても構わないアッセイで得てもよい。一実施形態では、結合親和性測定値を、リガンド、すなわち（ｉ．ｅ）Ｄ因子の供給源を、市販の供給源から入手しても構わないアッセイで得てもよい。一実施形態では、結合親和性測定値を、（１）Ｆａｂまたは抗体を固定化してリガンド、すなわちＤ因子の結合を測定し、（２）再生条件として４ＭのＭｇＣｌ２（ｐＨ７．２）を含み、（３）結合条件として０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ｐＨ７．２）を含む、アッセイで得てもよい。一実施形態では、結合親和性測定値を、（１）リガンド、すなわちＤ因子を固定化してＦａｂまたは抗体の結合を測定し、（２）再生条件に１０ｍＭのグリシン（ｐＨ１．５）を含み、（３）結合条件としてＰＢＳ緩衝液を含む、アッセイで得てもよい。
【００６１】
「細胞」、「細胞株」および「細胞培養」という語は、子孫を含む。また、人為的または偶発的突然変異があるため、ＤＮＡ内容物においてすべての子孫が正確に同一であるとは限らない場合があることが理解されよう。最初の形質転換細胞でスクリーニングすると、同じ機能または生物学的特性を持つ変異体の子孫が含まれる。本発明に用いる「宿主細胞」は通常、原核生物宿主または真核生物宿主である。
【００６２】
「ベクター」という語は、好適な宿主でＤＮＡの発現を行うのに適した制御配列に作動的に連結されたＤＮＡ配列を含む、ＤＮＡコンストラクトをいう。こうした制御配列は、転写を行うプロモーター、そうした転写を制御する任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列ならびに転写および翻訳の終止を制御する配列を含む。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子または可能であれば単純なゲノムインサートであってもよい。ベクターは好適な宿主に形質転換されれば、宿主ゲノムと無関係に複製を行い機能することができ、場合によっては、ゲノム自体に統合されることもある。プラスミドは最も多く使われるベクター形態であるため、本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」を同義で用いることがある。一方、本発明は、同等の機能を持ち、かつ当該技術分野においてすでに公知であるか、将来公知になる他のベクター形態を含むことを意図している。
【００６３】
本明細書で使用する場合、「標識」という語は、たとえば、抗体などの分子またはタンパク質に直接または間接にコンジュゲートできる検出可能な化合物または組成物をいう。標識は、それ自体が検出可能（放射性同位元素標識または蛍光標識など）であってもよいし、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物または組成物の化学的変化を触媒してもよい。
【００６４】
本明細書で使用する場合、「固相」とは、本発明の抗体が付着できる非水系マトリックスをいう。本明細書に包含される固相の例として、一部または全部をガラスで形成されたもの（コントロールドポアガラスなど）、多糖類（アガロースなど）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコールおよびシリコーンが挙げられる。ある実施形態では、固相は、文脈に応じてアッセイプレートのウェルを含んでもよく、他の場合では、精製カラム（アフィニティークロマトグラフィーカラムなど）である。
【００６５】
抗体の作製
宿主細胞の選択および形質転換
本明細書においてベクター内のＤＮＡのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、原核生物細胞、酵母細胞または高等真核細胞である。この目的に好適な原核生物は、たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、ＳｅｒｒａｔｉａおよびＳｈｉｇｅｌｌａなどの腸内細菌ならびにＢａｃｉｌｌｉ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓなど、グラム陰性生物とグラム陽性生物の両方を含む。好ましいＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主の１つにＥ．ｃｏｌｉ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）があるが、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）など、他の菌株も好適である。これらの例は例示的なもので、限定的なものではない。
【００６６】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物も、抗体をコードするベクターの好適なクローニング宿主または発現宿主である。下等真核宿主微生物では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが最も多く使用される。しかしながら、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ；および、たとえば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、ＴｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍならびにＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓおよびＡ．ｎｉｇｅｒなどのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主といった糸状菌など、他の多くの属、種および菌株も一般に入手可能であり、本発明に有用である。
【００６７】
グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。原則として（ｉｎ  ｐｒｉｎｃｉｐａｌ）、脊椎動物培養または無脊椎動物培養を問わず、高等真核細胞培養であれば有効である。無脊椎動物細胞の例として、植物および昆虫細胞が挙げられる。Ｌｕｃｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６，４７−５５（１９８８）；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｅｔｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．Ｖｏｌ．８，ｐｐ．２７７−２７９（Ｐｌｅｎａｍ  ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  １９８６）；Ｍｓｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５，５９２−５９４（１９８５）を参照されたい。多くのバキュロウイルス株および変異株ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（毛虫）、Ａｅｄｅｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）およびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉなどの宿主の、対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。たとえば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶのＬ−１変異体およびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５株など、トランスフェクション用の種々のウイルス株が一般に入手可能であり、こうしたウイルスを、本発明に従って本明細書のウイルス、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクション用のウイルスとして用いてもよい。さらに、ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマトおよびタバコなどの植物細胞培養も宿主として用いる。
【００６８】
培養（組織培養）における脊椎動物細胞および脊椎動物細胞の増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）は、日常的に行われる手順になっている。Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，ｅｄｓ．（１９７３）を参照されたい。有用な哺乳動物宿主細胞株の例として、サル腎臓；ヒト胎児腎臓細胞株；ベビーハムスター腎細胞；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎細胞；ヒト肺細胞；ヒト肝細胞；マウス乳腺腫瘍；およびＮＳ０細胞がある。
【００６９】
抗体作製のため宿主細胞を上述のベクターで形質転換させて、プロモーターの誘導、形質転換体の選択または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適切に改変された従来の栄養培地で培養する。
【００７０】
本発明の抗体変異体の産生に用いる宿主細胞については、種々の培地で培養してもよい。Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ：Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ，Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ，Ｓｉｇｍａ）などの市販されている培地は、宿主細胞の培養に好適である。さらに、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号明細書；同第４，６５７，８６６号明細書；同第４，５６０，６５５号明細書；同第５，１２２，４６９号明細書；同第５，７１２，１６３号明細書または同第６，０４８，７２８号明細書に記載の培地であればどれでも宿主細胞用の培地として用いることができる。これらの培地のいずれかに、ホルモンおよび／または他の増殖因子（インスリン、トランスフェリンまたは上皮増殖因子など）、塩（Ｘがナトリウム、カルシウム、マグネシウムである、Ｘクロリド；およびホスファートなど）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬剤など）、微量元素（ほとんどの場合、マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として規定される）およびグルコースまたは同等のエネルギー源を必要に応じて補充してもよい。当業者に知られている適切な濃度で他に必要な任意の栄養補助剤を含ませてもよい。温度、ｐＨおよび同種のものなどの培養条件については、発現用に選択される宿主細胞で以前使用された条件であり、当業者には理解されるであろう。
【００７１】
抗体の精製
組換え技法を用いる場合、抗体を細胞内、ペリプラズムに産生させてもよいし、培地に直接分泌させてもよい。抗体変異体を細胞内で産生させる場合、第１のステップとして、宿主細胞あるいは溶解フラグメントのいずれかである微粒子状の破片を、たとえば、遠心分離または除外濾過により除去してもよい。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）には、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムに分泌させた抗体を単離する手順が記載されている。簡単に説明すると、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）およびフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ：ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ）の存在下で約３０分かけて細胞ペーストを解凍する。細胞残屑を遠心分離により除去してもよい。抗体変異体を培地に分泌させる場合、通常最初にこうした発現系の上清を、市販のタンパク質濃縮フィルター、たとえば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎの除外濾過ユニットを用いて濃縮させる。前記のステップのいずれかにＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を加えてタンパク質分解を阻害してもよく、抗生物質を加えて外来性の汚染菌の増殖を防止しても構わない。
【００７２】
細胞から調製した抗体組成物については、たとえば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動（ｅｌｅｃｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、透析およびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができるが、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製法である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体変異体に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインにより決まる。ヒトＩｇＧ１重鎖、ＩｇＧ２重鎖またはＩｇＧ４重鎖に基づく抗体の精製にはプロテインＡを用いてもよい（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。すべてのマウスアイソタイプおよびヒトＩｇＧ３に推奨されるのはプロテインＧである（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７−１５７５（１９８６））。親和性リガンドが結合するマトリックスは、ほとんどの場合、アガロースであるが、他のマトリックスを利用することもできる。コントロールドポアガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定したマトリックスを用いると、アガロースの場合よりも流速を速くし、処理時間を短くすることができる。抗体変異体がＣＨ３ドメインを含む場合、精製にはＢａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸＴＭ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が有用である。回収する抗体変異体に応じて、イオン交換カラムによる分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカによるクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）を用いたヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィーによるクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫酸アンモニウム沈殿など、他のタンパク質精製技法も利用可能である。
【００７３】
任意の予備精製ステップ（単数または複数）に続いて、目的の抗体変異体および汚染物質を含む混合物を、約２．５〜４．５のｐＨで溶出緩衝液を用いて低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供してもよく、低塩濃度（約０〜０．２５Ｍ塩など）で行うのが好ましい。
【００７４】
医薬製剤
ポリペプチドまたは抗体の治療製剤を凍結乾燥製剤または水溶液として保存するため、純度が所望の程度のポリペプチドと、当該技術分野において通常用いられる任意の「薬学的に許容される」キャリア、賦形剤または安定剤（すべて「賦形剤」と呼ばれる）とを混合して調製してもよい。たとえば、緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張剤、非イオン性洗浄剤、酸化防止剤およびこれ以外の各種添加剤がある。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｏｓｏｌ，Ｅｄ．（１９８０）を参照）。こうした添加剤は、使用する投与量および濃度でレシピエントに無毒でなければならない。
【００７５】
緩衝剤は、ｐＨを生理的条件に近い範囲に保つのに役立つ。緩衝剤は、約２ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度で存在するのが好ましい。本発明に用いるのに好適な緩衝剤として、有機酸と無機酸の両方およびその塩、たとえば、クエン酸塩緩衝剤（たとえば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸塩緩衝剤（たとえば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸塩緩衝剤（たとえば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸塩緩衝剤（たとえば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、など）、フマル酸塩緩衝剤（たとえば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝剤（たとえば、グルコン酸−グリコン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ−ｇｌｙｃｏｎａｔｅ）混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グリウコン酸カリウム（ｐｏｔｔａｓｓｉｕｍ  ｇｌｙｕｃｏｎａｔｅ）混合物など）、シュウ酸塩緩衝剤（たとえば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸塩緩衝剤（たとえば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物など）および酢酸塩緩衝剤（たとえば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物など）が挙げられる。さらに、リン酸塩緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤およびトリスなどのトリエチルアミンが挙げられる。
【００７６】
保存剤については、微生物の増殖を遅延させるために加えてもよく、０．２％〜１％（ｗ／ｖ）の範囲の量で加えても構わない。本発明に用いるのに好適な保存剤として、フェノール、ベンジルアルコール、メタ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ベンザルコニウム（ｂｅｎｚａｌｃｏｎｉｕｍ）ハライド（たとえば、クロリド、ブロミド、ヨウ化物）、ヘキサメトニウムクロリド、メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノールおよび３−ペンタノールが挙げられる。
【００７７】
「安定剤」と呼ばれることもある等張化剤は、本発明の液体組成物の等張性を確保するために加えてもよく、多価（ｐｏｌｈｙｄｒｉｃ）糖アルコール、好ましくはグリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールなどの三価以上の糖アルコールが挙げられる。
【００７８】
安定剤は賦形剤の大きなカテゴリーをいい、機能面は充填剤から、治療薬を可溶化する添加剤あるいは変性または容器壁への付着の防止に役立つ添加剤など、多岐にわたる。典型的な安定剤には、多価糖アルコール（上記に列挙した）；アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニンなどのアミノ酸、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｌ）、ガラクチトール、グリセロールおよびイノシトールなどのシクリトールを含む同種のものなどの有機糖類または糖アルコール；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウムなどの含硫還元剤；低分子量ポリペプチド（すなわち＜１０残基）；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコースなどの単糖類；ラクトース、マルトース、スクロースなどの二糖類およびラフィノースなどのトリサッカリド；デキストランなどの多糖類が挙げられる。安定剤については、活性タンパク質１重量部当たり０．１〜１０，０００重量部の範囲で存在してもよい。
【００７９】
非イオン界面活性剤または洗浄剤（「湿潤剤」とも呼ばれる）を加えて、治療薬の可溶化の促進および撹拌による凝集からの治療用タンパク質の保護を行い、それによりさらに製剤が表面に剪断応力（ｓｔｒｅｓｓｅｄ）を受けてもタンパク質の変性が起こらないようにしてもよい。好適な非イオン界面活性剤として、ポリソルベート（２０、８０など）、ポリオキサマー（１８４、１８８など）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−８０など）が挙げられる。非イオン界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０７ｍｇ／ｍｌ〜約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲で存在してもよい。
【００８０】
さらに他の賦形剤として、充填剤（デンプンなど）、キレート化剤（ＥＤＴＡなど）、酸化防止剤（アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥなど）および共溶媒が挙げられる。また、本明細書の製剤は、個々の適応症の処置に必要な複数の活性化合物、好ましくは相互に悪影響を与えない相補活性を持つ化合物を含んでもよい。たとえば、免疫抑制薬をさらに加えることが望ましい場合がある。こうした分子は、併用して所期の目的に対して有効になる量で好適に存在させる。さらに、活性成分を、たとえば、コアセルベーション（ｃｏａｓｃｅｒｖａｔｉｏｎ）技法または界面重合により調製されたマイクロカプセル（たとえば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタシラート）マイクロカプセル）に、コロイド状薬物送達系（たとえば、リポソーム、アルブミンミクロフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）に、またはマクロエマルジョンに封入してもよい。こうした技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｏｓａｌ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【００８１】
インビボ投与で使用する製剤は、無菌でなければならない。これは、たとえば、無菌濾過膜による濾過で容易に成し遂げられる。徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の好適な例として、抗体変異体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、たとえば、薄膜またはマイクロカプセルなどの形状製品である。徐放性マトリックスの例として、ポリエステル、ヒドロゲル（たとえば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリラート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書）、Ｌ−グルタミン酸およびエチル−Ｌ−グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーとロイプロリドアセタートとで構成される注射用ミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマーおよびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーでは１００日わたり分子を放出することができるが、ある種のヒドロゲルではタンパク質の放出期間が短くなる。封入抗体が長時間体内にとどまる場合、３７℃で湿気にさらされると変性または凝集することがあり、その結果、生物活性が消失し、免疫原性が変化する恐れがある。安定化のための合理的な戦略を関連する機構に応じて考え出してもよい。たとえば、凝集の機構がチオ−ジスルフィド相互交換による分子間のＳ−Ｓ結合形成であると分かった場合、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、含水量の制御、適切な添加剤の使用および特異的なポリマーマトリックス組成物の開発により安定化を達成することができる。
【００８２】
個々の障害または症候の処置に有効となる治療用ポリペプチド、抗体またはそのフラグメントの量は、障害または症候の性質によって異なるが、標準的な臨床技法により判定することができる。可能であれば、ヒトで試験する前にまずインビトロで、次いで有用な動物モデル系で用量反応曲線および本発明の医薬組成物を判定することが望ましい。
【００８３】
好ましい実施形態では、皮下注射により治療用ポリペプチド、抗体またはそのフラグメントの水溶液を投与する。各用量は、体重１キログラム当たり約０．５μｇ〜約５０μｇ、一層好ましくは体重１キログラム当たり約３μｇ〜約３０μｇの範囲であってもよい。
【００８４】
皮下投与の投与スケジュールは、疾患のタイプ、疾患の重症度および治療薬に対する被検体の感受性など、多くの臨床的因子により月に１回から１日１回までの幅があってもよい。
【００８５】
ヒト化抗体の使用
本発明のヒト化抗体は、たとえば、特定の細胞、組織または血清中の目的標的の発現を検出する診断アッセイに有用である。診断用途では、一般に抗体変異体を検出可能な部分で標識する。多くの標識が利用可能である。蛍光の変化を定量する技法は、上述してある。化学発光基質は、化学反応により電子的に励起され、次いで（たとえばケミルミノメーターを用いて）測定できる光を発する場合があるか、蛍光アクセプターにエネルギーを供与する。酵素標識の例として、ルシフェラーゼ（ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼなど；米国特許第４，７３７，４５６号明細書）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ：ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ（グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース−６−ホスファートデヒドロゲナーゼなど）、複素環式オキシダーゼ（ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなど）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼおよび同種のものが挙げられる。酵素を抗体にコンジュゲートする技法については、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍ．（Ｅｄ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ＆  Ｈ．Ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，７３：１４７−１６６（１９８１）に記載されている。
【００８６】
場合によっては、標識を抗体変異体と間接的にコンジュゲートする。当業者であれば、これを行うための種々の技法を知っているであろう。たとえば、抗体変異体をビオチンとコンジュゲートし、上述の標識に関する３つの大きなカテゴリーをアビジンとコンジュゲートしてもよいし、その逆もまた同様である。ビオチンは、アビジンに選択的に結合するため、この標識をこうした間接的な形で抗体変異体とコンジュゲートしてもよい。あるいは、標識と抗体変異体との間接的なコンジュゲーションを達成するため、抗体変異体を低分子ハプテン（ジグロキシンなど）とコンジュゲートし、上記の異なるタイプの標識の１つを抗ハプテン抗体変異体（抗ジグロキシン抗体など）とコンジュゲートする。こうして、標識と抗体変異体との間接的なコンジュゲーションを達成することができる。
【００８７】
本発明の別の実施形態では、抗体変異体を標識する必要がなく、その存在を、抗体変異体に結合する標識抗体を用いて検出してもよい。
【００８８】
本発明の抗体を、競合結合アッセイ、直接的および間接的サンドイッチアッセイおよび免疫沈降アッセイなど、任意の既知のアッセイ方法に用いてもよい。Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）を参照。
【００８９】
競合結合アッセイは、標識標準物質が限られた量の抗体変異体との結合に際して被検サンプルと競合する能力に基づく。被検サンプル中の標的の量は、抗体に結合する標準物質の量に反比例する。標準物質の量を判定しやすくするため、競合の前または後に抗体を不溶化するのが一般的である。結果として、抗体に結合する標準物質および被検サンプルを、非結合のままである標準物質および被検サンプルと都合よく分けることができる。
【００９０】
サンドイッチアッセイでは、それぞれが異なる免疫原性部分またはエピトープまたは検出対象のタンパク質に結合することができる、２つの抗体を用いる。サンドイッチアッセイの場合、固体支持体上に固定化された第１の抗体が解析対象の被検サンプルに結合し、その後、第２の抗体が被検サンプルに結合し、したがって不溶性の３つの部分からなる複合体が形成される。たとえば、米国特許第４，３７６，１１０号明細書を参照されたい。第２の抗体については、それ自体が検出可能な部分で標識されていてもよいし（直接サンドイッチアッセイ）、検出可能な部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定してもよい（間接サンドイッチアッセイ）。たとえば、サンドイッチアッセイの一タイプはＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合、検出可能な部分が酵素である。
【００９１】
免疫組織化学の場合、腫瘍サンプルは、新鮮なものでも凍結されていてもよいし、パラフィンに包埋され、たとえば、ホルマリンなどの防腐剤で固定されていてもよい。
【００９２】
さらに、抗体をインビボ診断アッセイに用いてもよい。通常、抗体変異体を放射性ヌクレオチド（．ｓｕｐ．１１１Ｉｎ、．ｓｕｐ．９９Ｔｃ、．ｓｕｐ．１４Ｃ、．ｓｕｐ．１３１Ｉ、．ｓｕｐ．３Ｈ、．ｓｕｐ．３２Ｐまたは．ｓｕｐ．３５Ｓなど）で標識し、免疫シンチオグラフィーを用いて腫瘍の位置を特定できるようする。たとえば、本発明の高親和性抗ＩｇＥ抗体を用いて、たとえば、喘息患者の肺に存在するＩｇＥの量を検出してもよい。
【００９３】
本発明の抗体については、キット、すなわち、診断アッセイ実施上の注意事項が付いた、所定量の試薬を組み合わせたパッケージで提供してもよい。抗体変異体を酵素で標識する場合、キットは、酵素が必要とする基質および補助因子（検出可能な発色団またはフルオロフォアを与える基質前駆体など）を含んでもよい。さらに、安定剤、緩衝液（ブロック緩衝液または溶解緩衝液など）および同種のものなど、他の添加剤を含んでも構わない。種々の試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬の溶液中濃度を規定するため、大きく異なる場合がある。特に、溶解時に適切な濃度の試薬溶液を与える賦形剤などの試薬については、乾燥粉末（ほとんどの場合、凍結乾燥）として提供してもよい。
【００９４】
抗体のインビボでの使用
本発明の抗体については、哺乳動物の処置に使用してもよいことを意図している。一実施形態では、たとえば、前臨床データを取得するため、抗体をヒト以外の哺乳動物に投与する。ヒト以外の処置対象の例示的な哺乳動物として、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、齧歯類および前臨床試験が行われる他の哺乳動物が挙げられる。こうした哺乳動物については、抗体で処置する疾患の確立された動物モデルであってもよいし、目的の抗体の毒性を研究するために用いてもよい。これらの各実施形態では、哺乳動物に対して用量漸増研究を行っても構わない。
【００９５】
抗体またはポリペプチドについては、非経口投与、皮下投与、腹腔内投与、肺内投与および鼻腔内投与、さらに局所免疫抑制処置に対する必要に応じて、病巣内投与など任意の好適な手段で投与する。非経口注入として、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与または皮下投与が挙げられる。さらに、パルス注入で、特に抗体変異体の用量を減少させながら抗体変異体を好適に投与する。好ましくは注射により、最も好ましくは、投与が短期かそれとも長期かなどにもよるが、静脈内注射または皮下注射により投薬を行う。
【００９６】
疾患の予防または処置における抗体またはポリペプチドの適切な投与量は、処置対象の疾患のタイプ、疾患の重症度および経過、抗体変異体の投与が予防目的かそれとも治療目的か、これまでの治療、患者の臨床歴および抗体に対する反応ならびに主治医の裁量によって異なる。
【００９７】
たとえば、１回または複数回の別々の投与かそれとも連続注入かにより、患者に投与する初回候補投与量は、疾患のタイプおよび重症度に応じて抗体約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１５０ｍｇ／ｋｇ（０．１〜２０ｍｇ／ｋｇなど）である。典型的な１日の投与量は、上記の因子に応じて約１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上までの幅があってもよい。数日間またはそれ以上にわたる反復投与の場合、症候に応じて、疾患症状に所望の抑制効果が見られるまで処置を維持する。しかしながら、他の投与量レジメンが有用な場合もある。この療法の進行については、従来の技法およびアッセイにより容易にモニターできる。例示的な投薬レジメンは、国際公開第９４／０４１８８号パンフレットに開示されている。
【００９８】
抗体組成物については、医療実施基準に一致した様式で製剤化、投薬および投与を行う。こうした観点から考慮すべき因子として、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床症候、障害の原因、薬の送達部位、投与方法、投与のスケジューリングおよび開業医に知られている他の因子が挙げられる。投与される抗体の「治療有効量」は、こうした考慮すべき事項により決定されるが、疾患または障害の予防、軽減または処置に必要な最低量である。抗体については、問題の障害の予防または処置にその時点で使用されている１種または複数種の薬とともに製剤化しなくてもよいが、任意にそれとともに製剤化する。こうした他の薬の有効量は、製剤内に存在する抗体の量、障害または処置のタイプおよび上記で論じた他の因子によって異なる。これらの薬は通常、上文で使用したのと同じ投与量および投与経路で、あるいは、それまでに使用した投与量の約１〜９９％で用いる。
【００９９】
Ｄ因子を標的として認識する本発明の抗体については、補体による障害の処置に用いてもよい。これらの障害は、過剰または制御されない補体活性化に関係している。障害は、心肺バイパス手術における補体活性化；急性心筋梗塞、動脈瘤、脳卒中、出血性ショック、挫滅、多臓器不全、血液量減少性ショック（ｈｙｐｏｂｏｌｅｍｉｃ  ｓｈｏｃｋ）および腸管虚血による補体活性化を含む。これらの障害は、重度の火傷、内毒素血症、敗血症性ショック、成人呼吸窮迫症候群、血液透析；アナフィラキシーショック、重度の喘息、血管浮腫、クローン病、鎌状赤血球貧血、連鎖球菌感染後糸球体腎炎および膵炎などの炎症症候である疾患または症候をさらに含む。障害は、医薬品副作用、薬剤アレルギー、ＩＬ−２による血管漏出症候群またはＸ線造影剤アレルギーによる場合もある。さらに、障害は、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、関節リウマチ、アルツハイマー病および多発性硬化症などの自己免疫疾患も含む。また、補体活性化は、移植拒絶反応にも関係している。最近、補体活性化と加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症などの眼疾患との間に強い相関関係が示されている。
【実施例】
【０１００】
以下の実施例は説明を目的するものであって、限定を目的とするものではない。
（実施例１）
Ｄ因子マウスＭＡｂ１６６−３２のヒト化
マウスｍＡｂ１６６−３２の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列を公共データベースで入手可能なヒト抗体生殖系列配列と比較した。上記のステップ１に記載されているような鋳型を決定する際、全長、フレームワーク内の類似ＣＤＲの位置、全体の相同性、ＣＤＲの大きさなど、複数の判断基準を用いた。これらの判断基準をすべて総合して、図３および図４に示した１６６−３２ＭＡｂ重鎖および軽鎖配列とそれぞれのヒト鋳型配列との配列アライメントに示すような、最適なヒト鋳型の選択に適した結果を得た。
【０１０１】
この場合、この抗体の設計には複数のヒトフレームワーク鋳型を用いた。ＶＨ鎖に選んだヒト鋳型は、ＶＩ−４．１ｂ＋（７−０４．１遺伝子座）（アクセス＃  Ｘ６２１１０）（ＶＨ７ファミリー）とＪＨ４ｄの組み合わせであった（図３を参照）。ＶＬ鎖に選んだヒト鋳型は、ＤＰＫ４（ＶＫ  Ｉファミリー）とＪＫ２の組み合わせであった（図４を参照）。
【０１０２】
鋳型を選択したら、ＤＮＡ合成およびオーバーラップＰＣＲでＦａｂライブラリーを作成した。ライブラリーは、選んだそれぞれのヒト鋳型で合成した合成ＭＡｂ１６６−３２ＣＤＲで構成された。部分的ＶＨおよびＶＬ配列をコードする重複ヌクレオチドを、１８〜２１ヌクレオチドが重複する約６３〜約７６ヌクレオチドの範囲で合成した。Ｄ因子抗原に対するヒト化Ｆａｂのライブラリーを発現するベクターを作製し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂに形質転換し、その後ＸＬ−１Ｂの菌叢上に置いた。
【０１０３】
サイズ（独立クローン数）と多様性（突然変異の分布）についてライブラリーの質を評価した。軽鎖と重鎖との二重挿入を持つ個々のクローンは、配列決定された２０のうち約１４であった。ゆらぎによるフレームワーク突然変異は、均一に分布していた。
【０１０４】
フレームワーク領域ＦＲ１に特異的な配列およびリーダー配列（ＧｅｎｅＩＩＩ）の末端にアニールされたオーバーハンギング配列を含むビオチン化フォワードプライマーと保存された定常領域（ＣＫまたはＣＨ１）のリバースプライマーとを用いて、標準的なＰＣＲ条件下でＶＬおよびＶＨ遺伝子のＰＣＲ増幅を行った。アガロースゲル電気泳動または市販のＰＣＲ精製キットでＰＣＲ産物を精製し、取り込まれなかったビオチン化プライマーおよび非特異的ＰＣＲ産物を除去した。
（実施例２）
ライブラリーのスクリーニング
一次スクリーニングには捕捉フィルターリフトを用いた。実際のスクリーニングサイズは、理論的なライブラリーサイズよりも３倍超大きくなる。シングルポイントＥＬＩＳＡアッセイで候補をさらにスクリーニングした。最良のバインダーを、Ｆａｂ濃度に基づきＤ因子を用いた抗原の直接滴定によりさらに確認した
捕捉リフトスクリーニング
Ｄ因子に対するＦａｂの結合についての一次スクリーニングには捕捉フィルターリフトアッセイを用いた。高力価のファージを蒔いて、使用するまで（約６〜８時間）３７℃でインキュベートした。ヤギ抗ヒトκを１０ｍｌのＰＢＳＴで１０ｕｇ／ｍｌに希釈し；標準的なプラークリフト手順に従ってプラークリフト用のニトロセルロースフィルターを調製し、次いでシェーカーの１０ｍｌのブロッキング緩衝液に２時間浸した。このフィルターをＰＢＳＴで３回すすいだ。フィルターをプラーク菌叢に置き、室温で約１５〜２４時間インキュベートした。その後、フィルターをプレートから除去し、ＴＢＳＴで３回すすいだ。
【０１０５】
Ｄ因子（５０ｕｇ／ｍｌ）をＰＢＳＴで０．１ｕｇ／ｍｌに希釈し、１フィルター当たり４ｍｌを加えた。フィルターをシェーカーの溶液で室温にて２時間インキュベートし、続いて５分ずつ３回すすいだ。希釈した１６６−２２２−ＨＲＰ（ＰＢＳＴで１：１０，０００に希釈）を１フィルター当たり４ｍｌの容量で加え、このフィルターをシェーカーで１時間インキュベートした。フィルターを４回すすいだ。フィルターを乾燥させてからＴＭＢ基質に浸し、続いて水に浸して反応を止めた。陽性クローンを同定した。
（実施例３）
シングルポイントＥＬＩＳＡによるスクリーニング
二次スクリーニングにはシングルポイントＥＬＩＳＡによるアッセイを用いた。Ｉｍｍｕｌｏｎ  ＩＩプレートをヤギ抗ヒトＦａｂ（１：１２，０００、５０ｕｌ／ウェル）で室温にて一晩コートした。翌日、このプレートをプレートウォッシャーで４回洗浄した。ブロッキング緩衝液を１ウェル当たり１００ｕｌの容量で加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。その後、プレートを４回洗浄した。
【０１０６】
（１５ｍｌのペリプラズム調製物あるいは上清から）スクリーニング対象のＦａｂをそれぞれ１ウェル当たり５０ｕｌの容量で加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを４回洗浄し、続いて０．０１ｕｇ／ｍｌでビオチン化Ｄ因子を５０ｕｌ／ウェル加えた。プレートを室温で１時間インキュベートし、次いで４回洗浄した。ストレプトアビジン−ＨＲＰを加え（ＰＢＳＴで１：１０，０００に希釈）、室温で１時間インキュベートした。プレートを５回洗浄し、その後ＴＭＢ基質を５０ｕｌ／ウェル加えて展開した。十分に現像される場合（１０〜４５分）、停止緩衝液を５０ｕｌの容量で加え、プレートを４５０ｎｍで読み取った。
（実施例４）
ヒト化抗Ｄ因子クローンのシーケンシング
ヒトＤ因子に対する結合親和性に優れた１６個のヒト化クローンを配列決定した（表１を参照）。この中で、軽鎖の２番目（１００％ヒト）および４９番目（１００％マウス）と、重鎖の９３番目（１００％マウス）とが高度に保存されていることから、これらが抗体結合能力を保つ上で重要であることが示唆される。
【０１０７】
【表１】
0005474158.tif 000003
ＢＩＡｃｏｒｅ解析および溶血阻害アッセイによりクローン＃５６を評価した。ＢＩＡｃｏｒｅ解析を行ったところ、クローン＃５６のヒトＤ因子に対する親和性はキメラ１６６−３２Ｆａｂと類似していることが示された（表４を参照）。溶血阻害アッセイでは、クローン＃５６はキメラ１６６−３２Ｆａｂよりもやや作用が強いことが示された（図６を参照）。クローン＃５６は、軽鎖のフレームワークに２個のマウス残基および重鎖に４個のマウス残基を含む（表１を参照）。これらの結果を踏まえて、さらなる最適化を行った。
【０１０８】
【表２】
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ＢＩＡｃｏｒｅ解析によりクローン＃１１１および＃１１４の特徴付けを行った（表４を参照）。さらに、溶血阻害アッセイによりクローン＃１０４、＃１１１、＃１１４および＃１３０の特徴付けも行った（図６を参照）。溶血阻害アッセイで示さるように、これらのクローンは、キメラ１６６−３２よりも親和性が高く、代替経路の阻害においてキメラＦａｂよりも作用が強い（図７）。クローン＃１１１は、軽鎖にクローン＃５６と同じ２個のマウス残基（４および４９番目）を含む。さらに、このクローンは、クローン＃５６に見られるような重鎖の９７番目に保存されたマウス残基を含む。クローン＃１１１には軽鎖ＣＤＲ３と重鎖ＣＤＲ３の両方に好ましい突然変異が１つある。スクリーニング対象の２つの独立したライブラリー（ヒト化ライブラリーおよびヒト化／ＣＤＲ３最適化ライブラリー）から、最良のクローンはコンセンサス残基が類似していることが見出された。
【０１０９】
クローン＃１１１の親和性をさらに最適化するため、単一の突然変異をＣＤＲ−Ｈ１およびＣＤＲ−Ｌ２に同時に導入して抗体ライブラリーを作成した。手短に言えば、このライブラリーを、部位特異的突然変異誘発アプローチを用いて単一の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドをクローン＃１１１の鋳型にアニーリングして作成した。全体でヒトＤ因子に対する親和性が非常に高い２４個のクローンを配列決定した。この２４個のクローンの中で、複数の好ましい重複突然変異を同定した。ＢＩＡｃｏｒｅ解析のため、クローン＃２５０、＃３１５、＃３４５および＃４１６を選択した（表４を参照）。ＢＩＡｃｏｒｅデータから、これらのクローンはヒトＤ因子に対する親和性が当初のクローン＃１１１よりも高いことが示された。さらに、溶血阻害アッセイ（図６を参照）および代替経路の阻害（図７）ではクローン＃２５０、＃３１５、＃３４８および＃４１６についても検査した。
（実施例５）
ＡＰ（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｐａｔｈｗａｙ）溶血アッセイ
溶血阻害アッセイおよびＢＩＡｃｏｒｅ解析を用いてヒト化クローンの生物学的機能を判定した（以下の実施例６を参照）。以下の手順に従って溶血アッセイを行った。１：２０希釈ウサギ赤血球（ＲＲＢＣ：ｒａｂｂｉｔ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）（０．５ｍｌ＋９．５ｍｌのＧＶＢ／Ｍｇ−ＥＧＴＡ緩衝液）２０ｕｌを２０ｍｌの食塩水（０．９％ＮａＣｌ）で約１：２×１０４に希釈し、コールターカウンターでカウントした。次いで、細胞濃度を約２〜５×１０４細胞／ｍｌに調節した。各プレートに約５００×１０６／プレートＲＲＢＣまたは約１ｍｌのＲＲＢＣ／プレート（５００×１０６／２〜５×１０４）を加えた。
【０１１０】
細胞を６ｍｌのＧＶＢ／Ｍｇ−ＥＧＴＡ緩衝液／プレートで希釈し、混合し、４℃で１３６０ｒｐｍ×４分回転させて３回洗浄した。ＲＲＢＣペレットを３ｍｌのＧＶＢ／Ｍｇ−ＥＧＴＡ緩衝液／プレートに懸濁し、氷冷保存した。
【０１１１】
使用の直前に−８０℃のフリーザーからヒト血清を解凍した。この血清をＧＶＢ／Ｍｇ−ＥＧＴＡ緩衝液（５ｍｌ／プレート）で２０％血清の濃度（最終１０％）に希釈し、氷冷保存した。
【０１１２】
【表３】
0005474158.tif 000005
サンプルを５〜６℃で３０秒間、次いで３７℃で４０分間振盪した。振盪しながらサンプルを５〜６℃に冷却し、次いで２，０００ｒｐｍ×３分、４℃で遠心した。約８０ｕｌの上清を平底９６ウェルプレートに移し、標準的なプレートリーダーを用いて５９０ｎｍでＯＤ値を読み取った。阻害率を以下のとおり計算した：阻害率＝｛［（Ｓ−ＳＢ）−（Ｕ−ＳＢ）］／（Ｓ−ＳＢ）｝×１００％。（Ｕ＝サンプル１、２または３（それぞれ表３のカラム１、２または３）。
（実施例６）
ＢｉａＣｏｒｅによる抗ヒトＤ因子Ｆａｂの速度論的解析
固定化−アミンカップリング法を用いてヒトＤ因子（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ，０．１ｍｇ／ｍｌ）をＣＭ５チップ（ＢｉａＣｏｒｅ）に直接固定化した。その手順を以下のとおり簡単に記載する：（１）流速（ＰＢＳ）を５μｌ／分で一定にする。（２）３５μｌのＥＤＣ／ＮＨＳ（１：１）を注入。（３）酢酸塩緩衝液（ｐＨ４．５）に溶かした３５μｌのヒトＤ因子を注入。（４）３５μｌのエトールアミンを注入して活性化基をブロックする。（５）５μｌの１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）で表面をクリーンアップする。リガンド（ヒトＤ因子）の固定化レベルは約１，０００ＲＵである。α−ヒトＤ因子（ｈｕＤｉ、４０μｌ、３１．５μｇ／ｍｌ）を用いて行った試験では、９００ＲＵ前後で相対感度を得た。
【０１１３】
速度論的解析−すべての抗ヒトＤ因子ＦａｂをＰＢＳ緩衝液で希釈した。各サンプルを、高保有率での４０μｌ注入パルスにより段階的な濃度（１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭ、１００ｎＭ、１２５ｎＭおよび１５０ｎＭ）で調製した。ｐＨ１．５で１０ｍＭグリシンの５μｌパルスを与えて再生を行った。速度論的パラメータについては、ＢＩＡｖａｌｕａｔｉｏｎバージョンを用いてＦａｂ結合トレースを擬一次反応速度に基づき１：１結合モデルにフィッティングさせて得たＤ因子（Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性など）は５．５ｎＭ（５．５×１０−９Ｍ）と１ｎＭ（１×１０−９Ｍ）の間にある。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の二価形態での親和性（Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性など）が０．５ｐＭ（０．５×１０−１２Ｍ）と２ｐＭ（２×１０−１２Ｍ）の間にある、抗Ｄ因子抗体を提供する。
【０１１４】
別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が約０．３７ｎＭ（３７×１０−１０Ｍ）である、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が約０．３３ｎＭ（３．３×１０−１０Ｍ）である、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が約０．５１ｎＭ（５．１×１０−１０Ｍ）である、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が約２．７ｎＭ（２．７×１０−９Ｍ）である、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が約１．４ｎＭ（１．４×１０−９Ｍ）である、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が約１．４ｐＭ（１．４×１０−１２Ｍ）である、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の二価形態での親和性（Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性など）が約１．１ｐＭ（１．１×１０−１２Ｍ）である、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の一価形態での親和性（Ｄ因子に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など）が約０．１９ｎＭ（０．１９×１０−９Ｍ）である、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の二価形態での親和性（Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性など）が約０．０８ｎＭ（０．０８×１０−９Ｍ）である、抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に対して抗体の一価形態での親和性（３．０に対するＦａｂフラグメントとしての抗体の親和性など、抗Ｄ因子抗体を提供する。以下の表４に結果を示す。データはすべてグローバルフィッティングルーチンにより得ている。
【０１１５】
【表４】
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当業者であれば、通常の実験を用いるのみで本明細書に記載する本発明の具体的な実施形態に対する等価物を数多く認識するか、確認することができるであろう。そうした等価物については、以下の特許請求の範囲に包含されることを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【配列表】
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