(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、及びSEQ ID NO:8からなる集合から選択されたアミノ酸残基の配列、又は、
(b) SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、及びSEQ ID NO:8からなる集合から選択されたアミノ酸残基の配列に少なくとも95％の配列同一性を有する配列、
を含む単離されたポリペプチドであって、氷晶の形成及び/又は成長を低減又は抑制することが可能なポリペプチド。
【請求項２】
前記配列は、SEQ ID NO:1である、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記配列は、SEQ ID NO:2である、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記配列は、SEQ ID NO:3である、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記配列は、SEQ ID NO:4である、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記配列は、SEQ ID NO:5である、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記配列は、SEQ ID NO:6である、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記配列は、SEQ ID NO:7である、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記配列は、SEQ ID NO:8である、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項１０】
請求項1乃至9の何れかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
更に、請求項1乃至9の何れかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチドの前記配列の発現を適切な宿主細胞において命令可能な発現シグナルを含む、請求項10記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項10及び11の何れかに記載のポリヌクレオチドを含むベクタ。
【請求項１３】
請求項10及び11の何れかに記載のポリヌクレオチド又は請求項12記載のベクタ又は請求項1乃至9の何れかに記載のポリペプチドを含む、単離された組換え細胞。
【請求項１４】
請求項1乃至9の何れかに記載のポリペプチドを含む食用製品。
【請求項１５】
前記食用製品は、冷凍されている、請求項14記載の食用製品。
【請求項１６】
前記食用製品は、冷凍菓子製品である、請求項14記載の食用製品。
【請求項１７】
前記食用製品は、アイスクリーム製品又はパンである、請求項14記載の食用製品。
【請求項１８】
請求項1乃至9の何れかに記載のポリペプチドを含む固体支持材料。
【請求項１９】
請求項1乃至9の何れかに記載のポリペプチドを生成する方法であって、
i)請求項10及び11の何れかに記載のポリヌクレオチド又は請求項12記載のベクタを提供する工程、
ii)工程i)において提供された前記ポリヌクレオチド又は前記ベクタに含まれるポリヌクレオチドの組換え発現による、請求項1乃至9の何れかに記載のポリペプチドの生成に適した宿主細胞を提供する工程、
iii)請求項1乃至9の何れかに記載のポリペプチドを生成する工程、及び、
iv)前記ポリペプチドを精製及び/又は単離する工程、を備える方法。
【請求項２０】
請求項1乃至9の何れかに記載のポリペプチドのin situ生成のための方法であって、
i)発酵性食品出発材料を提供する工程、
ii)前記発酵性食品出発材料を発酵させることが可能であり且つ、前記発酵性食品出発材料を発酵させる時、適切な条件下において、請求項1乃至9の何れかに記載のポリペプチドを生成可能な微生物を提供する工程、
iii)前記微生物の存在下において、前記発酵性食品出発材料を発酵させることにより、発酵食用製品を製造する工程、を備え
前記発酵食用製品は、請求項1乃至9の何れかに記載のポリペプチドを含む方法。
【請求項２１】
冷凍食用製品において氷晶形成を低減又は抑制する方法であって、
i)冷凍食用製品、又はその製造に必要な一種類以上の原料を提供する工程、
ii)前記製品及び/又は前記原料を、前記製品の製造前、製造中、又は製造後に、請求項1乃至9の何れかに記載のポリペプチドに接触させる工程、を備え、
これにより、前記冷凍食用製品における氷晶形成を低減又は抑制する方法。
【請求項２２】
冷凍食用製品において氷晶成長を低減又は抑制する方法であって、
i)冷凍食用製品、又はその製造に必要な一種類以上の原料を提供する工程、
ii)前記製品及び/又は前記原料を、前記製品の製造前、製造中、又は製造後に、請求項1乃至9の何れかに記載のポリペプチドに接触させる工程、を備え、
これにより、前記冷凍食用製品において氷晶成長を低減又は抑制する方法。
【請求項２３】
冷凍食用製品において氷晶を構築する方法であって、
i)冷凍食用製品、又はその製造に必要な一種類以上の原料を提供する工程、
ii)前記製品及び/又は前記原料を、前記製品の製造前、製造中、又は製造後に、請求項1乃至9の何れかに記載のポリペプチドに接触させる工程、を備え、
これにより、前記冷凍食用製品において氷晶を構築する方法。
【請求項２４】
冷凍食用製品のテクスチャ又は官能特性を調節する方法であって、
i)冷凍食用製品、又はその製造に必要な一種類以上の原料を提供する工程、
ii)前記製品及び/又は前記原料を、前記製品の製造前、製造中、又は製造後に、請求項1乃至9の何れかに記載のポリペプチドに接触させる工程、を備え、
これにより、前記冷凍食用製品のテクスチャ又は官能特性を調節する方法。
【請求項２５】
冷凍食用製品の製造又は保存中に氷晶形成を監視する方法であって、
i)冷凍食用製品、又はその製造に必要な一種類以上の原料を提供する工程、
ii)前記製品及び/又は前記原料を、前記製品の製造前、製造中、又は製造後に、請求項1乃至9の何れかに記載のポリペプチドに接触させる工程、
iii)前記凍結食用製品の製造又は保存中の様々な時点において氷晶形成を監視する工程、を備える方法。
【請求項２６】
雌個体において体外受精(IVF)処置を実行する方法であって、
i)雌個体から一つ以上の卵母細胞を、卵胞液を含む生体試料と共に、摘出する工程、
ii)請求項1乃至9の何れかに記載のポリペプチドの存在下で、前記一つ以上の卵母細胞を、前記生体試料と共に凍結させる工程、
iii)一つ以上の前記摘出卵母細胞を体外で受精させる工程、
iv)一つ以上の前記受精卵母細胞を前記雌個体に移植する工程、を備え、
前記雌個体がヒトを含まない、方法。
【請求項２７】
雌個体における妊娠の可能性又は確率を増加させる方法であって、
ii)雌個体から一つ以上の卵母細胞を、卵胞液を含む生体試料と共に、摘出する工程、
iii)請求項1乃至9の何れかに記載のポリペプチドの存在下で、前記一つ以上の卵母細胞を、前記生体試料と共に凍結させる工程、
iv)一つ以上の前記摘出卵母細胞を体外で受精させる工程、
v)一つ以上の受精卵母細胞を前記雌個体に移植する工程、を備え、
前記雌個体がヒトを含まず、
請求項1乃至9の何れかに記載のポリペプチドの存在下で前記一つ以上の卵母細胞を凍結させる前記工程は、妊娠の可能性又は確率を増加させる、方法。
【請求項２８】
前記試料は、更に、顆粒膜黄体細胞又は濾胞細胞を含み、前記雌個体の前記卵胞から回収された他の卵巣細胞を含む、請求項26及び27の何れかに記載の方法。
【請求項２９】
前記試料は、更に、卵母細胞の周囲からの凍結細胞を含む、請求項28記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、氷晶形成及び/又は氷晶成長を低減又は抑制する活性をもたらす氷結合能力を備えた新規のポリペプチドに関する。こうしたポリペプチドを製造及び使用する方法も開示する。
【背景技術】
【０００２】
本願は、出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部とした2007年11月21日提出の米国仮出願第61/003,979号の非仮出願である。上述した仮出願又は本願において引用した全ての特許又は非特許文献は、出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部とする。
【０００３】
極圏水域に生息する海生真骨魚の体温は、周囲の海と温度平衡の状態にあるため、冬期には、或いは、例えば、南極水域では年間を通して、約-1.8℃の温度となる。海生真骨魚の血液は、海水に対して低浸透圧であり、融点は、約-0.7℃になると予想される。したがって、極圏の真骨魚は、過冷却状態にあり、こうした過酷な気候条件への適応が無ければ、致命的な凍結に至ると考えられる。
【０００４】
同様の観測は、節足動物、植物、真菌、及び細菌を含め、低温に適応した様々な地上生物にも当てはまるが、こうした生物の多くは、海生魚より遙かに低い温度に晒される。
【０００５】
好冷(低温を好む)生物は、地球上の恒久的に低温な領域全てにおいて適応に成功しており、深海、極寒の山頂、及び極地において、-60℃もの低温下でも確認できる。致死的な条件であるにもかかわらず、こうした生物は、恒久的低温環境に特有の主要な障害を克服している。こうした障害には、酵素活性の減少、膜流動性の低下、栄養素及び老廃物の輸送の変質、転写、翻訳、及び細胞分裂の速度低下、ポリペプチドの低温変性、不適切なポリペプチドの折り畳み、並びに細胞内での氷生成が含まれる。
【０００６】
特定の生物が氷点下の温度で生存することを可能にするメカニズムに関する研究により、こうした生物が、少なくとも二種類の戦略、即ち、氷の成長を抑制すること、或いは制御された氷晶形成を引き起こすことによる(低分子量物質の合成による束一的な、及び独自のポリペプチドの合成による非束一的な)水の凝固点の降下に依存していることが明らかとなった。不凍ポリペプチド(AFP)と、多価アルコール、遊離アミノ酸、及び糖類等の低分子量物質とは、前者のプロセスに関与し、氷核ポリペプチド(INP)は、後者に関与すると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許US6,914,043号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Liou et al. 1999, Biochemistry 38(35):11415-24
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
不凍ポリペプチド(AFP、一部の出版物では、熱的ヒステリシスポリペプチド、THP、又は氷構造化ポリペプチド、ISPとも呼ばれる)は、溶液の凝固点を実質的に降下させるが、予測される融点は、緩やかに低下するのみとなる。これは、凝固点が劇的に降下する一方で、溶液の融点は、束一的な融点の低下により予測されることを意味する。これは氷が存在する溶液では確かであるが、不凍ポリペプチドが不凍溶液の過冷却点を低下させることが可能であるかについての問題は、殆ど解決していない。
【００１０】
凍結温度の変位は、限定されており、十分に低い温度では急速な氷の成長が生じる。融解温度と凍結温度との分離は、通常、熱的ヒステリシス(TH)と呼ばれ(Knightら 1991、Raymond及びDeVries 1997、Wilson 1993)、氷の成長の温度は、ヒステリシス凝固点と呼ばれる。融点とヒステリシス凝固点との間の差は、ヒステリシス又は不凍活性と呼ばれる。AFPの第二の機能性は、凍結状態におけるものであり、氷再結晶化抑制(RI)を示す。AFPは、再結晶化温度を上回る温度において、小さな結晶を代償として大きな結晶の形成を抑制する(Knightら 1984, 1995、Knight及びDuman 1986、Ramlovら 1996)。
【００１１】
氷形成抑制のメカニズム
不凍ポリペプチドが氷の成長を抑制するメカニズムは、依然として研究中である。AFPは、全て両親媒性であると思われる。これは、分子内の一部分が他の部分よりも疎水性が高いことを意味する。これらの活性に関するこれまでの説明は、親水性側が氷晶に結合するというものである。しかしながら、氷/水を見比べた時、どちらが定義上最も親水性が高いのか――氷なのか水なのか、と問う正当な理由があることから、この考え方は、過去十年、正当性を疑われてきた。疎水性の側/ドメインを介したAFPの氷との結合について、様々な証拠が明らかになってきているが、結合の正確なメカニズムが分かっていないため、全ての証拠は、これまでのところ、状況的なものとなっている。
【００１２】
しかしながら、不凍ポリペプチドが、不凍ポリペプチドの種類(及びアイソフォーム)に応じて、様々な氷表面上の面を認識して結合することは、現時点で意見が一致している。氷の成長は、不凍ポリペプチドが結合した場所では停止するが、不凍分子間では、ある程度まで継続する(Raymond及びDeVries 1977、DeLucaら 1998、Marshallら 2004)。不凍ポリペプチド分子間で成長する氷の曲率が十分に大きくなった(又は湾曲した)時、氷の成長は、曲面の表面張力の増加により停止する(ケルビン効果として知られる(Atkins及びDe Paula 2002、Wilson 1994, 2005、Kristiansen 2005))。この時点では、湾曲した氷表面と結合することは、水分子にとって、エネルギ的に好ましいものではなくなる。
【００１３】
したがって、ヒステリシス凝固点は、水分子にとって、氷と結合することがエネルギ的に再び好ましくなり、氷の成長が爆発的に継続する温度である(Knightら 1991、Raymond及びDeVries 1997、Wilson 1993)。殆どの魚類の不凍液では、ヒステリシス凝固点において、針状の氷の成長が見られる。これは、魚類の不凍ポリペプチドが氷晶のプリズム面と結合するが、基底面とは結合しないという事実によるものと想定される。ヒステリシス凝固点における成長は、この場合、基底面に対する水分子の結合(付加)によるものであり、一方、プリズム面での成長は依然として抑制されるため、氷晶は長い槍状(針状体)に成長する。
【００１４】
昆虫からの不凍ポリペプチドを含有する溶液において、ヒステリシス凝固点における成長パターンは、よりランダムであり、この理由は、昆虫の不凍ポリペプチドが基底面にも結合し(更に、こうした動物からの溶液において観察される遙かに高い不凍活性を発生させ)、したがって、温度が十分に低くなると(ヒステリシス凝固点)、氷晶上のあらゆる場所における点で成長が起こるためであることが示唆されている。
【００１５】
昆虫の不凍ポリペプチド存在下で、ヒステリシス凝固点において氷の成長が発生している時、氷の成長パターンは、針状ではなく、カリフラワ状となる。したがって、熱的ヒステリシスは、少なくとも二種類のパラメータ、即ち、1)不凍ポリペプチドの種類(生物、アイソフォームに依存する)と、2)濃度とに依存し、但し、濃度依存性は、飽和を示す(DeVries 1983、Kaoら 1985、Schragら 1982)。
【００１６】
明らかに、不凍ポリペプチド分子のサイズと、観測されたヒステリシスの量との間には、正の相関が存在する(Kaoら 1985、Schragら 1982、Wuら 2001)。不凍効果を決定する上述したパラメータとは別に、不凍活性と氷結晶分率(氷晶がヒステリシスのギャップ内にある時)との間に相互関係が存在することが実証されている。この効果は、昆虫の不凍ポリペプチドの場合に最も顕著となる(Zachariassenら 2002)。
【００１７】
昆虫由来不凍ポリペプチド
幾つかのAFPが、昆虫から発見されている。これは、魚類が遭遇し得るものより遙かに低い温度に昆虫が晒されるためであると推測される(海水の凝固点は約-1.8℃)。
【００１８】
現在まで、昆虫AFPの構造は、テネブリオ・モリトル(Tenebrio molitor)、コリストニューラフミフェラーナ(Choristoneura fumiferana)、 及びデンドロイデスカナデンシス(Dendroides canadensis)の三種について解明されている。特性が明らかになった三種類の昆虫からのAFPのうち二種類(T.molitor及びD.canadensisに由来)は、多くの共通構造を有しており、これは、両者が甲虫に由来し、一方、C.fumiferanaは蛾であるためと推測される。
【００１９】
特性が非常によく解明されている昆虫AFPの一例は、甲虫テネブリオモリトル由来のAFPである。このポリペプチドは、少なくとも九種類のアイソフォームで見つかっており、全て非常に良く似ているが、84個、96個から120個のアミノ酸に至るまでの長さを有する(Liouら 1999)。公知の九種類のアイソフォーム全てにおいて、12個のアミノ酸の反復配列、T/A-C-T-X-S-X-X-C-X-X-A-Xが見つかっている。この配列は、これらののAFPにおいて、六乃至九回反復される。TmAFPは、反復アミノ酸配列の右巻きβ-へリックス構造である。平坦なβシート上にある非常に規則的なトレオニン残基の列は、トレオニン残基間の距離が氷格子構造の水分子における酸素原子の位置と正確に一致すると予測されることから、水/氷と相互作用すると考えられる。このAFPは、極めて規則的な構造を有すると共に、多数のシステイン-システイン硫黄架橋により、高い構造安定性がもたらされると予測されており、アミノ酸六個毎にシステインが存在している。
【００２０】
D.canadensisからは、長さ及び分子量(7.3乃至12.3kDa)が異なる13種類のアイソフォームが単離されている(Andorfer及びDuman 2000、Dumanら 2002)。これらのAFPにおいて、反復配列は、T.molitorにおいて見られたものと同じであるが、一部の反復配列に13番目のアミノ酸が存在する場合がある(Duman 1998、Liら 1998a, 1998b)。システインは、T.molitor由来のAFPと正確に同じ位置に配置されている(Liら 1998a, 1998b)。
【００２１】
C.fumiferana由来のAFPのアミノ酸配列は、昆虫由来の他の二種類のAFPアミノ酸配列と相同ではない。しかしながら、配列T-X-Tが、アミノ酸15個毎に見られ、但し、最後のトレオニンのみが保存され、最初のトレオニンは、多くの場合、バリン(V)、アルギニン(R)、又はイソロイシン(I)により置換されている。C.fumiferana由来のAFPはまた、含有するシステインが他の二種類の昆虫AFPよりも少ない(Doucetら 2000)。しかしながら、全てのシステインがジスルフィド結合に関与している(Gauthierら 1988)。明らかに、C.fumiferana由来のAFPは、疎水性コアを含んでおり、ポリペプチドは、共に構造を安定させる水素結合及びジスルフィド架橋のネットワークにより安定化されている(Graetherら 2000, 2003、Leinalaら 2002)。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、一態様において、特定のカミキリムシ科の樹皮下甲虫により生成され、複数の氷結合部位を有する不凍ポリペプチドを含む、不凍ポリペプチド及びそのフラグメントを対象とする。以下詳細に開示する、こうしたポリペプチドの作成及び使用方法も、本発明の範囲内に含まれる。
【００２３】
カミキリムシ科の樹皮下甲虫であるRhagium inquisitor及びRhagium mordaxは、成虫期及び幼虫期の両方において、-30℃もの低温に晒されながら、北スカンジナビアの木の切り株の樹皮下で越冬可能である。これらの種は共に、凍結回避生物(freeze avoiders)と呼ばれる耐寒動物の集合に属し、これは、体組織中に氷を形成することなく、極めて低い温度において生存することを意味する。これらの種は、長期間に渡って過冷却状態をとっていると考えられる。
【００２４】
ランダムな核生成により、或いは、周囲からの氷の接触の結果として、準安定状態の過冷却液体内での氷の形成が原則的には発生し得るため、過冷却状態はカミキリムシ科の樹皮下甲虫にとって致死的となり得る。カミキリムシ科の樹皮下甲虫は、こうした氷の形成が起きた場合には生存し続けることができない。
【００２５】
したがって、R.inquisitor及びR.mordaxは、気候条件に適応しており、長期間に渡って低温で生存することができる。このため、カミキリムシ科の樹皮下甲虫は、不凍ポリペプチド(AFP)のソースとして興味深い。R.inquisitorにおいて、低温への適応は、血リンパ領域における抗凍結性のグリセロールの蓄積、潜在的な氷核形成剤の体液からの排除(過冷却の可能性を遙かに高める)、及び冬の到来に先立つ多数の不凍ポリペプチドの合成を伴ってきた。これまで、R.inquisitorにおいて発見された不凍ポリペプチドの不凍活性(7℃)は、知られている中で最も高いと考えられてきた。
【００２６】
R.mordaxの幼虫は、抗凍結化合物の蓄積が非常に限られているにもかかわらず、R.inquisitorとほぼ同じ低温において生存可能である。現在好適とされる一仮説によれば、Rhagium mordaxが低温に耐える能力は、冬の到来に先立つ一種類以上の不凍ポリペプチド(AFP)の合成及び蓄積のみに、ほぼ完全に由来する可能性がある。
【００２７】
本発明による不凍ポリペプチドは、驚くべきことに、現在知られている他の昆虫AFPに比べ、大幅に少ないシステイン残基を有すること分かっている。この特徴は、本発明によるポリペプチドが多くの最先端の昆虫不凍ポリペプチドより少ない反復配列を有する事実と併せて、異種宿主生物における発現において、より良好な候補となる。
【００２８】
現在好適な実施形態において、本発明による不凍ポリペプチドと、不凍活性を示すその機能性フラグメントとは、好ましくは、四個未満のシステイン残基、例として三個のシステイン残基、例えば二個のシステイン残基を有する。
【００２９】
本発明による不凍ポリペプチドは、以下の開示により明らかとなるように、様々な実用性及び産業上の応用性を有する。当該ポリペプチド、又は当該ポリペプチドをコードする遺伝子は、氷晶成長を抑制するために様々な形で使用可能である。ポリペプチドは、直接的に導入してもよく、或いは、宿主細胞においてポリペプチド(群)を生成するための適切な発現シグナルの制御下で発現する遺伝子として導入してもよい。
【００３０】
不凍ポリペプチドの適切な濃度は、用途に応じて変化するが、一般には、約1ppb(パーツパービリオン)乃至約1ppt(パーツパーサウザンド)の範囲となる(即ち、約1μg/l乃至約1mg/l)。
【００３１】
本発明の一部の態様において、ポリペプチドは、食用製品に導入されるか、或いは食用製品に接触させられ、冷凍状態での食用製品の製造及び/又は保存中等に、氷晶の成長及び/又は形成を低減又は抑制する。
【００３２】
驚くべきことに、本発明によるポリペプチドは、他の公知の不凍ポリペプチド存在下で得られる結晶とは著しく異なる氷晶化をもたらすことが発見された。特に、例えば、US6,914,043記載の不凍タンパク質III型HPLC12、或いはUS6,312,733記載の氷晶成長抑制剤等、公知の不凍ポリペプチドは針状構造を有する氷晶をもたらすが、本発明によるポリペプチド存在下では、小球構造を有する結晶が得られることが発見された。
【００３３】
したがって、本発明の大きな利点の一つは、本発明によるポリペプチドを、例えば、アイスクリームに組み込んだ場合、上述した公知のIII型の不凍ポリペプチドを使用した時に得られる粗い針状結晶と比較して、製造及び保存中にアイスクリームにおいて形成された結晶が本質的に小球構造を有するという事実により、食感の向上が得られる。
【００３４】
野菜を含む冷凍食用製品のテクスチャ、味、及び有効保存期間は、本発明によるポリペプチドの作用の結果、大きく向上する。例えば、セロリ、ジャガイモ、アスパラガス、エンドウ豆、ニンジン、豆類、ブロッコリ、スイートコーン、ホウレンソウ等の冷凍野菜のテクスチャ、味、及び有効保存期間が向上する。同様に、イチゴ、ブルーベリ、ラズベリ、柑橘果実、バナナ、ブドウ、キウィ、モモ、パイナップル、プラム、サクランボ、トマト、及びマンゴを含む様々な冷凍果実のテクスチャ、味、及び有効保存期間が増進する。
【００３５】
野菜及び他の食用製品への導入は、例えば、標的生物への適切なポリヌクレオチドの遺伝子導入により達成可能である。食品加工開始前又は収穫及び加工開始後の、恒常的又は誘導的なポリヌクレオチドの発現により、全植物ポリペプチドの約0.1質量%まで等、食品を含む食用製品を有効に保護する上で、十分に高いレベルの本発明によるポリペプチドが生成する。発現は、組織特異性に基づくことも可能である。例えば、果実の成熟遺伝子との連結により、生産植物からの収穫後でも発現をもたらし得る。
【００３６】
当該ポリペプチドは、本発明の重要な一態様において、消費まで或いは消費中も、冷凍状態であること或いは冷凍状態を維持することが予想される食物に添加され、特に、冷凍又は低温状態で消費される食用製品に添加される。
【００３７】
多くの冷凍食品は、例えば、アイスクリーム、フローズンヨーグルト、アイスミルク、シャーベット、アイスキャンディ、冷凍ホイップクリーム、冷凍クリームパイ、冷凍プディング等、冷凍又は低温状態で消費されることを目的とする。特に、殆どの家庭用霜取り不要冷凍庫において起こる冷凍-解凍サイクルを通じて、或いは冷凍状態での持続的な保存時において発生する大きな氷晶の形成は、テクスチャ及び風味に悪影響を及ぼす。この氷晶成長プロセスは、本発明による不凍ポリペプチドを使用することにより、低減又は完全に防止し得るか、或いは少なくとも最小限にとどめ得る。本発明による不凍ポリペプチドは、食用製品全体に組み入れてよく、及び/又は、即ち、代案等として、凝結及び氷晶形成が最も容易に発生すると予想される場所である食用製品の表面に付加してもよい。
【００３８】
本発明の別の重要な態様は、本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを備えた、パン酵母等の酵母に関する。本態様に関する方法は、こうしたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにより生地の酵母を形質転換 する方法を含む。当該ポリヌクレオチドを酵母において導入及び発現し、例えば冷凍生地においてこうした酵母を使用すると、解凍しても酵母の生存率は高いまま維持されることから、生地は、解凍時に自然に発酵する。不凍ポリペプチド存在下では、保存により蓄積される損傷が少なく、解凍した試料では、酵母細胞の高い生存率が維持されるため、より長い冷凍状態での保存時間が可能となるか、或いは、より少量の生地を保存すればよくなる。
【００３９】
不凍ポリペプチドを冷凍発酵食用製品に組み入れる別の方法は、食物を発酵させる間に、発酵プロセスに関与する生物に不凍ポリペプチドを生成させることである。したがって、本発明は、冷凍発酵食品を調製するための方法をも含む。この方法は、(a)食品を発酵させて発酵食品を生成することが可能な、本発明によるポリペプチドを分泌することが可能な微生物に、食品を接触させる工程と、(b)製品内又は製品表面上における氷晶成長及び/又は形成の抑制に有効な量で本発明による不凍ポリペプチドが存在する発酵食品が製造されるように発酵が起こる条件下で、当該微生物と共に食品を培養する工程と、(c)冷凍発酵食品を製造するために、好ましくは-5℃未満の温度で発酵食品を冷凍する工程とを備える。
【００４０】
本発明の更に別の態様は、冷凍保存される予定の生体細胞又はその抽出物に対する、本発明による不凍ポリペプチドの導入を対象とする。例えば、本発明による不凍ポリペプチドを含む細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、及び動物細胞は、冷凍-解凍プロセスによる固有特性の損失が最小限となる状態又は全く存在しない状態で、細胞又は組織の生存率が増加する。細胞より小さい試料又は細胞抽出物は、冷凍に対して、特に長期保存において、同様の感受性を有する場合がある。代表的な例は、インビトロポリペプチド翻訳系、酵素調製物、及び、特に葉緑体又はミトコンドリア膜調製物等、敏感な膜成分を含む試料である。
【００４１】
特に、オルガネラを含む試料は、本発明による不凍ポリペプチドの添加により、冷凍損傷に対する耐性の増加を示し得る。動物軟組織は、対象ポリペプチド存在下では、冷凍により示す損傷が少なくなり、本発明によるポリペプチドの添加は、細胞培養物の保管等、冷凍時及び解凍後の細胞の完全性が重要である或いは望まれる状況において有用となる。したがって、細胞又は組織の保管場所等において冷凍保存予定の試料には、本発明によるポリペプチドをルーチンとして添加してもよい。保存されることが多い生体細胞の種類には、細菌の遺伝的変異体、真菌(酵母を含む)、及び特に、高等真核細胞(ハイブリドーマ株及び組織培養細胞株等)がある。
【００４２】
本発明は、他の態様において、食品分野に特定されない用途を対象とする。本発明によるポリペプチドの非食品用途の一つは、気候的な凍結条件からの作物及び植物の保護である。本発明による不凍ポリペプチドは、導入遺伝子の発現により内部的に細胞質に組み入れてよく、或いは、例えば、噴霧その他を行うことにより、ポリペプチドを外部的に植物に付与してもよい。したがって、外部的な付与は、植物に対するポリペプチドの直接的な付与、或いはポリペプチドを分泌する生物の植物に対する外的な堆積により達成し得る。導入のためのこうした選択肢は、他の用途に対しても応用される。
【００４３】
別の実施形態は、器官、組織、又は他の生体試料の周囲の液体への不凍ポリペプチドの導入である。具体的な用途の一つは、移植手術用又は保存目的のための病院への輸送中である。本発明による不凍ポリペプチドは、氷点下の温度での短期又は長期保存を可能にし、これにより付随する代謝又は劣化を最小化する一方で、氷晶成長による細胞損傷を実質的減少させる。他の医学的に重要且つ温度に敏感な生体試料には、血液及び血液製剤と、治療剤と、ポリペプチド薬物と、バイオアッセイ試薬と、ワクチンとがある。
【００４４】
本発明は、更に、本発明によるポリペプチドを含む化粧品又は皮膚用調製物を提供する。化粧品又は局所的皮膚用調製物における本発明によるポリペプチドの使用により、低温による皮膚の構造的損傷及び細胞損傷の効果的な治療だけでなく、予防が可能となり、こうした気候及び天候により誘発される明確な温度の低下による損傷は、細胞酵素の最適温度の消失による細胞内及び細胞外空間における細胞生理状態の変化と、皮膚の損傷、皮膚の発赤、及び皮膚のつっぱり感と、例えば、低温、風、及び/又は紫外線光により誘発される知覚過敏と、温度に敏感な肌と、環境ストレス(温度変化、紫外線光、喫煙、スモッグ、活性酸素種、遊離基により発生)により生じる皮膚、唇、及び鼻及び口の領域及び外皮付属器の粘膜の悪化とを引き起こす。
【００４５】
更に、本発明には、本発明による不凍ポリペプチドと、当業者に周知の最先端の安定剤、乳化剤、及び界面活性剤、及び他の添加物との混合物に基づく組成物及び用途が含まれる。こうした化合物は、腐食の抑制、酸化の抑制、変色の防止、微生物増殖の抑制、乳液の安定化等のために提供し得る。
【００４６】
上述した内容から明らかとなるように、本発明は、一態様において、食用製品を含む物体又は物質の凍結又は過冷却に伴う氷晶形成を抑制及び/又は低減可能なポリペプチドを対象とする。過冷却条件は、通常は状態変化(即ち、水相から氷)が生じる温度未満まで、こうした状態変化を発生させることなく物質を冷却することを可能にする条件である。したがって、液体を凍結させずに凝固点未満まで冷却することが、過冷却の構成要素であり、これにより準安定状態が生じる。
【００４７】
本発明によるポリペプチドは、本明細書を通じて、不凍ポリペプチドと、及び短く略してポリペプチドと、互換的に表される。
【００４８】
一態様において、SEQ ID NO:1乃至SEQ ID NO:8から成る集合から選択されたポリペプチドが提供される。SEQ ID NO:1乃至SEQ ID NO:8というアノテーション、及び配列識別番号の範囲の開始番号と終了番号とを示す他の同様のアノテーションは、本明細書での使用において、別の記述がない限り、当該配列識別番号の一つ一つ全てを表し、上述した例においては、配列識別番号SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、及びSEQ ID NO:8というようになる。
【００４９】
SEQ ID NO:1乃至SEQ ID NO:8の何れかを含む、或いは何れかから成るポリペプチド、不凍活性を有するそのフラグメント、及びSEQ ID NO:1乃至SEQ ID NO:8の何れかと少なくとも約75%の同一性を有するそのバリアント、又はそのフラグメントも、本発明の範囲に含まれる。特に、少なくとも20個のアミノ酸と、氷結合及び不凍活性とを有する、SEQ ID NO:1乃至SEQ ID NO:8の何れかを含む、或いは何れかから成るポリペプチドのフラグメントを、更に開示する。フラグメントは、好ましくは200個未満のアミノ酸、例として、好ましくは150個未満のアミノ酸、例えば、好ましくは100個未満のアミノ酸、例として80個のアミノ酸、例えば、60個のアミノ酸を有する。
【００５０】
本発明は、更に、図3に示したように、SEQ ID NO:9乃至SEQ ID NO:72――合計64の特異的「氷結合部位」IBSの何れか一つ以上を含むポリペプチド等、本発明による一つ以上の「氷結合部位」(IBS)を備えるポリペプチドを対象とする。
【００５１】
特に、本発明は、以下のポリペプチドに対するものである。
【００５２】
SEQ ID NO:9乃至SEQ ID NO:16から成る集合から選択された四つ以上の配列、例として五つ以上の配列、例えば六つ以上の配列、例として七つ又は全ての配列を含むポリペプチド。
【００５３】
SEQ ID NO:17乃至SEQ ID NO:24から成る集合から選択された四つ以上の配列、例として五つ以上の配列、例えば六つ以上の配列、例として七つ又は全ての配列を含むポリペプチド。
【００５４】
SEQ ID NO:25乃至SEQ ID NO:32から成る集合から選択された四つ以上の配列、例として五つ以上の配列、例えば六つ以上の配列、例として七つ又は全ての配列を含むポリペプチド。
【００５５】
SEQ ID NO:33乃至SEQ ID NO:40から成る集合から選択された四つ以上の配列、例として五つ以上の配列、例えば六つ以上の配列、例として七つ又は全ての配列を含むポリペプチド。
【００５６】
SEQ ID NO:41乃至SEQ ID NO:48から成る集合から選択された四つ以上の配列、例として五つ以上の配列、例えば六つ以上の配列、例として七つ又は全ての配列を含むポリペプチド。
【００５７】
SEQ ID NO:49乃至SEQ ID NO:56から成る集合から選択された四つ以上の配列、例として五つ以上の配列、例えば六つ以上の配列、例として七つ又は全ての配列を含むポリペプチド。
【００５８】
SEQ ID NO:57乃至SEQ ID NO:64から成る集合から選択された四つ以上の配列、例として五つ以上の配列、例えば六つ以上の配列、例として七つ又は全ての配列を含むポリペプチド。
【００５９】
SEQ ID NO:65乃至SEQ ID NO:72から成る集合から選択された四つ以上の配列、例として五つ以上の配列、例えば六つ以上の配列、例として七つ又は全ての配列を含むポリペプチド。
【００６０】
更に、配列SEQ ID NO:73乃至80の一つ以上、例として、SEQ ID NO:73乃至80の四つ以上の配列、例として五つ以上の配列、例えば六つ以上の配列、例として七つ又は全ての配列を、保存された「氷結合ドメイン」IBDの形態で含むポリペプチドが提供される。
【００６１】
SEQ ID NO:81乃至89は、本発明によるポリペプチドにおいて、単独又は任意の組み合わせで存在し得る他の保存ドメインに関連する。
【００６２】
本発明は、更に、本発明によるポリペプチドにおいて、二回、三回、四回、五回、六回、七回、八回、八回より多く、及び好ましくは30回未満等、複数回に渡って存在し得る、一般的氷結合ドメイン、即ち一般的IBDの形態であるSEQ ID NO:90を対象とする。以下の本発明の項目の記述において開示したように、同一配列が複数回存在する場合があり、或いはSEQ ID NO:90のバリアントが複数回存在する場合がある。
【００６３】
氷結合ドメインの対を成す組み合わせを含むポリペプチドを以下の表1に記載する。本明細書においてSEQ ID NO:73乃至SEQ ID NO:80として開示した、八個の氷結合ドメインの独立した全ての組み合わせの形態で、合計64種類の異なる組み合わせを記載している。
【００６４】
本発明は、更に、SEQ ID NO:73乃至SEQ ID NO:80から成る集合から選択された四つ以上の配列、例として五つ以上の配列、例えば六つ以上の配列、例として七つ又は全ての配列を含むポリペプチドを対象とする。
【００６５】
別の態様において、配列SEQ ID NO:90の四つ以上のコピー、例として五つ以上のコピー、例えば六つ以上のコピー、例として七つ以上のコピー、例えば八つ以上のコピー、及び好ましくは、20未満のコピーを含むポリペプチドが提供される。
【００６６】
上述したように、本発明は、一態様において、異なる氷結合ドメイン(IBD)の組み合わせを備えるポリペプチドを対象とし、組み合わせは、次の表1に提示した、対を成す氷結合ドメイン配列の64の組み合わせの集合から選択される、二つのIBDの組み合わせの何れかのうち、少なくとも一つの組み合わせ、例として少なくとも二つの組み合わせ等を含み、当該ポリペプチドは、好ましくは、SEQ ID NO:90により定義された、20未満の一般的氷結合ドメイン、例として15未満の一般的氷結合ドメイン等、例えば12未満の一般的氷結合ドメイン、例として10未満の一般的氷結合ドメイン等を有する。
【００６７】
【表１】
0005474809.tif 000002
【００６８】
上の表1に示したマトリックスにおいて提示した個別の文字/数字の組み合わせのそれぞれを互いに組み合わせて、下の表2に記載した組み合わせを作成する。一例として、組み合わせA1A1は、二つのIBD Iドメインと、別の二つのIBD Iドメインの組み合わせから生じたものであり、一方、組み合わせB3A6は、一つのIBD II及び一つのIBD IIIと、一つのIBD I及び一つのIBD VIとの組み合わせから生じたものである。したがって、結果的に生じたポリペプチドは、次のポリペプチド氷結合ドメインを備える:IBD I、IBD II、IBD III、及びIBD VI。
【００６９】
したがって、本発明は、更に、異なる氷結合ドメイン(IBD)の組み合わせを備えるポリペプチドを提供し、組み合わせは、次の表2に提示した、任意の四つの氷結合ドメイン配列の4096の組み合わせの集合から選択された、四つのIBDの組み合わせの何れかのうち、少なくとも一つの組み合わせ、例として少なくとも二つの組み合わせ等、例えば三つの組み合わせを含み、ポリペプチドは、好ましくは、SEQ ID NO:90により定義された、20未満の一般的氷結合ドメイン、例として15未満の一般的氷結合ドメイン等、例えば12未満の一般的氷結合ドメイン、例として10未満の一般的氷結合ドメイン等を有する。
【００７０】
更に表2について、組み合わせは、64×64の行列により生じたものであり、組み合わせA1A1は、二つのIBD Iドメインと、別の二つのIBD Iドメインの組み合わせであり、一方、組み合わせB3A6は、一つのIBD II及び一つのIBD IIIドメインと、一つのIBD I及び一つのIBD VIドメインとの組み合わせから生じたものである。これにより、後者は、次のポリペプチドドメインを備える:IBD I、IBD II、IBD III、及びIBD VI。
【００７１】
【表２−１】
0005474809.tif 000003
【表２−２】
0005474809.tif 000004
【表２−３】
0005474809.tif 000005
【表２−４】
0005474809.tif 000006
【表２−５】
0005474809.tif 000007
【表２−６】
0005474809.tif 000008
【表２−７】
0005474809.tif 000009
【表２−８】
0005474809.tif 000010
【表２−９】
0005474809.tif 000011
【表２−１０】
0005474809.tif 000012
【表２−１１】
0005474809.tif 000013
【表２−１２】
0005474809.tif 000014
【表２−１３】
0005474809.tif 000015
【００７２】
上記のポリペプチドは、更に、SEQ ID NO:81乃至89から成る集合から選択された一つ以上の配列を含むことができる。
【００７３】
更に、以上のように定義された複数の同一又は異なるポリペプチドと、生理学的に許容される担体とを含む組成物が提供される。組成物は、乾燥組成物であることが可能であり、当該乾燥組成物は、凍結乾燥された形態又は噴霧乾燥された形態であり得る。
【００７４】
更に別の態様において、本発明は氷結合活性を有し且つ氷晶の成長及び/又は形成を低減又は抑制可能なポリペプチドを対象とし、
当該ポリペプチドは、配列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQ ID NO:90)を含み、
X1は、S、A、G、及びDから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
X2は、A、V、I、T、及びSから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
X3は、嵩高くないアミノ酸残基から成るアミノ酸残基の集合から選択され、
X4は、S、I、T、及びVから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
X5は、S、A、I、及びTから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
X6は、S、T、及びVから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
X7は、嵩高くないアミノ酸残基から成るアミノ酸残基の集合から選択され、
X8は、S、T、及びVから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
X9は、S、A、及びGから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
SEQ ID NO:1の残基X2、X4、X6、及びX8のうち少なくとも一個は、T又はVであり、
ポリペプチドのアミノ酸残基の合計数は、250未満である。
【００７５】
配列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQ ID NO:90)を、本明細書では、一般的「氷結合ドメイン」と呼ぶ。当該ドメインが氷結合に直接的に関与するか、氷結合に間接的にのみ関与するか(即ち、ポリペプチドが氷結合活性を有する上で必要であるか)は、この定義において重要ではない。
【００７６】
本発明は、更に、SEQ ID NO:90との実質的な相同性/同一性を有する配列等、複数の一般的「氷結合ドメイン」を含むポリペプチドに関する。この点において、SEQ ID NO:90に対する実質的な相同性は、位置X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、及びX9のうち一箇所、或いは多くとも二箇所のみにおいて、SEQ ID NO:90の配列と異なる任意の配列を包含するものとする。
【００７７】
これに関して使用される複数とは、整数2、3、4、5、6、7、8、9、例として10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20未満、例えば25未満を包含するものとし、複数の一般的「氷結合ドメイン」の何れかは、SEQ ID NO:90と同一、実質的に同一、又は実質的に相同にすることができる。
【００７８】
本発明は、更に、SEQ ID NO:90の一つ以上のコピーを含み、更に、随意的に、SEQ ID NO:90の一つ以上のコピー、或いはそれに実質的に同一又は実質的に相同な配列を含む、本発明によるポリペプチドの修飾物及び誘導体に関する。
【００７９】
「単離ポリペプチド」という用語は、本発明のポリペプチドに、自然状態ではポリペプチドに付随する細胞成分の混入が、少なくとも本質的に存在しないことを明確にする。
【００８０】
本発明によるポリペプチドは、融合ポリペプチドとして発現可能である。こうした融合ポリペプチドは、活性コンフォメーションにおいてポリペプチドを精製及び/又は生成することの支援等、多数の機能を果たすことができる。融合ポリペプチドの一例は、親和性タグと融合した本発明によるポリペプチドである。融合ポリペプチドは、本明細書に定める補体/補体対の一部を形成することも可能であり、但し、この用語は、ポリペプチドのみに限定されない。本明細書に定めるスプライスバリアント、対立遺伝子バリアント、オーソログ、パラログ等のポリペプチドの修飾物も、本発明の範囲に含まれる。融合ポリペプチドの例は、以下、更に詳細に説明する。
【００８１】
本発明によるポリペプチドは、検出可能な標識、例えば、蛍光検出可能な標識により標識可能である。これにより、本発明によるポリペプチドを単離又は同定する上で実施者を支援することができる。
【００８２】
更に、本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、前記ヌクレオチドを直線状又は環状の形態で含むベクタ等のポリヌクレオチドコンストラクトと、前記ポリヌクレオチド又は前記ヌクレオチドを含むベクタにより形質転換された宿主細胞と、前記宿主細胞を含むトランスジェニック生物とが提供される。
【００８３】
ポリヌクレオチドは、別の記述がない限り「核酸」及び「核酸分子」と互換的に使用される。原則として、本発明は、こうしたポリヌクレオチド、又はこうしたポリヌクレオチドの相補鎖を、例えば、cDNA又は「アンチセンスオリゴヌクレオチド」の形態で利用できる。ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが本発明によるポリペプチドをコードする限り、個々のヌクレオチドの縮重配列にすることができる。
【００８４】
ポリヌクレオチドは、自然における宿主生物から単離された天然遺伝子の個々のヌクレオチドを全て含む必要はない。こうした天然遺伝子の任意の切断物であって、天然遺伝子と少なくとも75%相同又は同一、例として少なくとも80%相同又は同一、例えば少なくとも85%相同又は同一、例として少なくとも90%相同又は同一、例えば少なくとも91%相同又は同一、例として少なくとも92%相同又は同一、例えば少なくとも93%相同又は同一、例として少なくとも94%相同又は同一、例えば少なくとも95%相同又は同一、例として少なくとも96%相同又は同一、例えば少なくとも97%相同又は同一、例として少なくとも98%相同又は同一、例えば少なくとも99%相同又は同一、例として少なくとも99.5%相同又は同一である配列を含むものは、本発明に包含されるものとする。天然遺伝子のこうした任意の機能性切断物は、適切な宿主生物において発現可能な、その任意の誘導体又は修飾物を含め、「構造遺伝子」と示すものとする。
【００８５】
発現は、例えば、クローニングベクタ又は発現ベクタにおいてクローン化したポリヌクレオチド配列を、宿主生物に導入して発現させる時に得ることができる。発現は、一般にプロモータを含む調節配列により適切に命令され、当該プロモータも、コアプロモータと、発現のエンハンサを含む一つ以上の調節エレメントなどのエレメントを含み得る。
【００８６】
宿主生物は、一般に、組み換え宿主であり、即ち、発現対象のポリヌクレオチド配列を自然状態で包含しない宿主、或いは、自然状態では発現対象のポリヌクレオチド配列を天然の発現シグナルと機能的にリンクする状態で含まない宿主である。分泌シグナル配列が前に付く場合、本発明によるポリペプチドは、分泌が発生するか否かに関係なく、分泌の対象となる。
【００８７】
自然状態において存在する同じ又は関連する配列から当該ポリヌクレオチドを区別する目的で、本発明によるポリヌクレオチドは、明瞭性の観点から、「単離」ポリヌクレオチドと呼ぶ。同様に、本明細書に定める「異種(heterologous)ポリヌクレオチド」という用語は、本発明によるポリペプチドの天然型とは異なるポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンストラクトを意味する。本発明によるポリヌクレオチドは、染色体に組み込まれた形でもあり得るし、或いはエピソームの形でもあり得る。
【００８８】
本発明は更に、本発明によるポリペプチドに特異的な抗体、又はその結合フラグメントを提供する。当該抗体は、任意の最先端の方法により生産可能であり、例えば、裸の抗体、抗体の結合フラグメント、抗体成分、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、及びヒト化抗体にすることが可能である。
【００８９】
更に、本発明の範囲には、a)本発明によるポリヌクレオチドと、b)本発明によるポリペプチドと、c)前記ポリペプチドに特異的な本発明による抗体とを共に生成及び使用する方法が提供される。本発明による抗体は、ポリペプチドの母集団から、本明細書に定める「標的ポリペプチド」又は「標的ペプチド」を同定又は区分するために使用できる。「標的ペプチド」は、本明細書に定める「抗原ペプチド」であり得る。
【００９０】
他の態様において、本発明によるポリペプチド及び/又は抗体を含む固体支持体と、こうした固体支持体を作成及び使用する方法とが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】R.Inquisitor AFPのフラグメントのアミノ酸配列を示す図である。推定氷結合モチーフを黒の囲みにより示す。フォワード(F)プライマ及びリバース(R)プライマを配列により記載しており、これらが由来するポリペプチドの部分も示している。当該アミノ酸配列は、X回反復され且つ一乃至八個のアミノ酸残基により分離された氷結合(IB)モチーフ(コンセンサスA/G-Q/R-G-T-A-T-T-T-A-T-G-X-A/G)を表す又は包含するドメインを有する。
【図２】R.mordax由来のAFP1乃至8の全長cDNA配列を示す図である。推定シグナルペプチドのコード配列に下線を付す。これらのcDNAに対応するAFP(AFP1乃至8)は、主にN末端部において異なり、AFP4は、シグナル配列を有していないと思われる。AFPは、それぞれ、コアコンセンサス配列T-A-T-T-T-A-Tを有するアミノ酸配列の反復を八回含む。これは、R.Inquisitor(図1)においても観察された推定IBモチーフの部分と一致しており、これはR.mordaxのIBモチーフ、又は少なくともその一部を表すと考えられる。
【図３】Rhagium mordax由来のAFP1乃至8の全長アミノ酸配列を示す図である。これらの配列は、それぞれSEQ ID NO:1乃至SEQ ID NO:8により表す。推定シグナル配列は、下線により示し、推定氷結合モチーフは、囲み内に示す。
【図４】発現ベクタpET26B(+)においてクローン化した全長cDNAを包含する大腸菌(E.coli)細胞を示す図である。IPTGを使用して、関連するAFPの合成を誘導することができる。最初に、大腸菌においてAFP1の合成を誘導した。その結果から、大腸菌内にて生成されたAFP1が大腸菌細胞に凍結に耐える能力を与えることが実証される。
【図５】野性型(wt)RmAFP1及び欠失変異体(Δ2乃至9、WC(Trp-Cys))のSDS-PAGEゲルを示す。RmAFP変異体は、RmAFP1のC末端から氷結合ドメインが一つずつ欠失したもの(Δ2乃至Δ9)(例えば、Δ4は、推定氷結合ドメイン4乃至9(図2参照)が欠失していることを示す)と、C末端にTrp及びCys残基を含む変異体(WC)として構築した。これらをpGEXベクタ系(GE Healthcare)においてクローン化し、大腸菌において形質変換した(株:Origami、BL21)。タンパク質は、GSTとRmAFPとの間にトロンビン切断部位を含む、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現させた。
【図６】1)RmAFP1及び2の溶液と、2)ゲンゲ、Zoarces viviparus(3型AFPを有するデンマークの魚)の血清とにおける、ヒステリシス凝固点で発生する「氷の成長爆発(ice growth-explosion)」の進行を示す図である。何れの場合も、温度を低下させる前に、溶液中で小さな氷晶をアニールさせた。RmAFP溶液において温度を低下させた時、初期の氷晶(1Aの矢印)は、ヒステリシス凝固点に達する前に、成長又は形状の変化を示さなかった。ヒステリシス凝固点(1B)では、氷晶が突発し、周囲が過冷却されていることから、溶液は凍結する。この場合、ヒステリシス凝固点における氷の成長パターンは、カリフラワ状となることに留意されたい(1B、1C)。これは、冷却時に氷晶がゆっくりと形状を変え、六角形の基礎平面を有する両錐(2A)となる(2)(Z.viviparusの血清)に見られる事象とは対照的である。ヒステリシス凝固点において、氷の成長は針状となり(2B)、溶液中の全ての氷が針状体として成長している(2C)。
【図７】クローン化及び精製されたRhagium mordax AFP1の分子量決定を示す図である。
【図８】rRmAFP1の二量体化を示す図である。A:未変性条件下においてrRmAFPは、サイズ排除カラム(Superdex 75、10/30、GE Healthcare)を通過させた場合、同じMw範囲内の他のタンパク質よりも短い保持時間を有するため、二量体として振る舞う。rRmAFP1のSECによるMW推定値は、Superdex 75をウシ血清アルブミン(68KDa、BSA)、トリプシン(25KDa)、及びヒトシスタチンC(13KDa)により較正した時、28KDaとなった。B:SDS-PAGEを行った場合も、同様にrRmAFPは二量体として振る舞い、推定Mwは28KDaとなる。レーン1:ウシ血清アルブミン(BSA)、2:トリプシン、3:RNAse A、4:シスタチンC、5:リゾチーム、6:RmAFP1、7:グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)。
【図９】本発明によるポリペプチドの円偏光二色性分光測定(CD)を示す図である。
【図１０】6乃至100℃の温度範囲内でのRmAFP1の温度安定性を示す図であり、6乃至70℃の温度範囲において続けて11回のスキャンを行った。
【図１１】RmAFP1の活性及び安定性に対するpHの影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
定義
不凍タンパク質は、氷晶と結合して結晶成長を抑制することで、溶液の凍結温度を非束一的に低下させるが、当該タンパク質は、束一的効果によってのみ、溶液の融解温度を変更させる。この熱的ヒステリシス(凍結及び融解温度間の差)は、単一の氷晶の成長に対する温度の影響を観察することで決定される。融解が生じるのは、氷晶の面が丸くなる時であり、凍結が生じるのは、氷晶がC軸線に沿って伸長する時である。
【００９３】
したがって、「不凍活性」という用語は、融解及び凍結温度の分離を示す。更に、融点と凝固点との差を示す。更に、再結晶温度を上回る温度における、小さな結晶を代償とした大きな結晶の形成の抑制を示す。不凍活性という用語は、熱的ヒステリシスと互換的に使用できる。
【００９４】
本明細書での使用において、「核酸」又は「核酸分子」は、デオキシリボ核酸(DNA)又はリボ核酸(RNA)、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により生成されたフラグメント、並びにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、及びエクソヌクレアーゼ作用の何れかによりにより生成されたフラグメント等のポリヌクレオチドを示す。ポリヌクレオチド分子は、天然ヌクレオチドのモノマー(DNA及びRNA等)、又は天然ヌクレオチドの類似体(例えば、天然ヌクレオチドのアルファエナンチオマ形態)、又は両方を組み合わせにより構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分及び/又はピリミジン若しくはプリン基部分に改変を有し得る。糖修飾は、例えば、一つ以上のヒドロキシル基のハロゲン、アルキル基、アミン、及びアジド基との置換を含み、或いは、糖をエーテル又はエステルとして官能化し得る。更に、糖部分全体を、アザ糖及び炭素環糖類似体等、立体的及び電子的に類似する構造により置換し得る。塩基部分における修飾の例は、アルキル化プリン及びピリミジン、アシル化プリン又はピリミジン、又は他の周知の複素環置換基を含む。ポリヌクレオチド単量体は、ホスホジエステル結合又はこうした連結の類似物により連結可能である。ホスホジエステル結合の類似物は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニリデート、ホスホラミデート等を含む。「核酸分子」という用語はまた、ポリアミド主鎖に結合した天然又は修飾ポリヌクレオチド塩基を含む、所謂「ペプチドポリヌクレオチド」を含む。ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であり得る。
【００９５】
「ポリヌクレオチド分子の相補鎖」という用語は、参照ヌクレオチド配列と比較して相補的ヌクレオチド配列と逆の配向性とを有するポリヌクレオチド分子を示す。例えば、配列5'ATGCACGGG3'は、5'CCCGTGCAT3'に対して相補的である。
【００９６】
「縮重ヌクレオチド配列」とは、あるポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド分子に比較して一つ以上の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列を示す。縮重コドンは、異なるヌクレオチドのトリプレットを含むが、同じアミノ酸残基をコードする(即ち、GAU及びGACトリプレットはそれぞれAspをコードする)。
【００９７】
「構造遺伝子」という用語は、メッセンジャRNA(mRNA)に転写されるポリヌクレオチド分子を示し、メッセンジャRNAは、その後、特定のポリペプチドに特有なアミノ酸の配列へ翻訳される。
【００９８】
「単離ポリヌクレオチド分子」は、生物のゲノムDNAに一体化されていないポリヌクレオチド分子である。例えば、細胞のゲノムDNAから分離された、成長因子をコードするDNA分子は、単離DNA分子である。単離ポリヌクレオチド分子の別の例は、生物のゲノムに一体化されていない化学合成ポリヌクレオチド分子である。特定の種から単離されたポリヌクレオチド分子は、その種の染色体の完全なDNA分子よりも小さい。
【００９９】
「核酸分子コンストラクト」は、自然には存在しない配置で結合及び並置されたポリヌクレオチドのセグメントを含むように人為的介入により改変された、一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチド分子である。
【０１００】
「直線状DNA」は、5'及び3'末端を有する非環状DNA分子を示す。直線状DNAは、酵素消化又は物理的破砕により、プラスミド等の閉環状DNA分子から調製可能である。
【０１０１】
「相補的DNA(cDNA)」は、逆転写酵素によりmRNA鋳型から形成された一本鎖DNA分子である。一般に、mRNAの一部に相補的なプライマを、逆転写の開始に利用する。当業者は、こうした一本鎖DNA分子と、その相補的DNA鎖とから成る二本鎖DNA分子を示す際にも「cDNA」という用語を使用する。「cDNA」という用語は、更に、RNA鋳型から合成されたcDNA分子のクローンを示す。
【０１０２】
「プロモータ」は、構造遺伝子の転写を命令するヌクレオチド配列である。一般に、プロモータは、構造遺伝子の転写開始部位に近接した、遺伝子の5'非コード領域に位置する。転写の開始において機能するプロモータ内の配列エレメントは、コンセンサスヌクレオチド配列により特徴付けられる場合が多い。こうしたプロモータエレメントは、RNAポリメラーゼ結合部位、TATA配列、CAAT配列、分化特異的エレメント(DSE、McGeheeら, Mol. Endocrinol. 7:551 (1993))、サイクリックAMP応答エレメント(CRE)、血清応答エレメント(SRE、Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1:47 (1990))、グルココルチコイド応答エレメント(GRE)、及び他の転写因子のための結合部位、例えばCRE/ATF(O'Reillyら, J. Biol. Chem. 267:19938 (1992))、AP2(Yeら, J. Biol. Chem. 269:25728 (1994))、SP1、cAMP応答エレメント結合ポリペプチド(CREB、Loeken, Gene Expr. 3:253 (1993))、及び八量体因子(一般的には、Watsonら編, Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987)と、Lemaigre及びRousseau, Biochem. J. 303:1 (1994)とを参照)を含む。プロモータが誘導プロモータである場合、転写速度は誘導剤に応答して上昇する。対照的に、プロモータが恒常的プロモータである場合、転写速度は、誘導剤により調節されない。抑制可能なプロモータも公知である。
【０１０３】
「コアプロモータ」は、TATAボックス及び転写開始位を含む、プロモータ機能のための必須ヌクレオチド配列を含む。この定義によれば、コアプロモータは、活性の増強又は組織特異的活性の付与を行い得る特定の配列の不在下で、検出可能な活性を有しても有さなくてもよい。
【０１０４】
「調節エレメント」は、コアプロモータの活性を調節するヌクレオチド配列である。例えば、調節エレメントは、特定の細胞、組織又はオルガネラにおいて排他的又は選択的に転写を可能にする細胞因子と結合するヌクレオチド配列を含有し得る。こうした種類の調節エレメントは、通常、「細胞特異的」、「組織特異的」、又は「オルガネラ特異的」に発現される遺伝子に関連する。
【０１０５】
「エンハンサ」は、転写の開始部位に対するエンハンサの距離又は配向性に関係なく、転写の効率を高めることが可能な調節エレメントの一種である。
【０１０６】
「異種DNA」は、所定の宿主細胞内において天然には存在しないDNA分子又はDNA分子の集団を示す。特定の宿主細胞に対して異種であるDNA分子は、宿主DNAを非宿主DNA(即ち、外来性DNA)と組み合わせる限り、宿主細胞種に由来するDNA(即ち、内因性DNA)を含有し得る。例えば、転写プロモータを含む宿主DNAセグメントと機能的にリンクされた、ポリペプチドをコードする非宿主DNAセグメントを含有するDNA分子は、異種DNA分子と見做される。逆に、異種DNA分子は、外来プロモータと機能的にリンクされた内因性遺伝子を含むことができる。別の例として、野生型細胞に由来する遺伝子を含むDNA分子は、そのDNA分子が野生型遺伝子を欠いている突然変異細胞に導入される場合、異種DNAと見做される。
【０１０７】
「ポリペプチド」は、天然又は合成的に生成されるかに関係なく、好ましくはペプチド結合のみによって接合されるアミノ酸残基の重合体である。非宿主DNA分子の発現により生成されるポリペプチドは、「異種」ペプチド又はポリペプチドである。「アミノ酸残基」は、ペプチド結合又はペプチド結合とは異なる結合により連結された天然又は非天然アミノ酸残基であり得る。アミノ酸残基は、D型配置又はL型配置であり得る。
【０１０８】
「ホモポリマ」は、幾つかの同様なポリペプチドを元のポリペプチドに追加して、同じポリペプチドの多数のコピーを更に大きな一つのポリペプチドとして形成することで構築されたポリペプチドである。
【０１０９】
「ヘテロポリマ」は、幾つかの異なるポリペプチドを元のポリペプチドに追加して、異なるポリペプチドの多数のコピーを更に大きな一つのポリペプチドとして形成することで構築されたポリペプチドである。
【０１１０】
「嵩高くない(non-bulky)アミノ酸残基」は、好ましくは、環状(脂肪族又は芳香族)側鎖を持つアミノ酸、例えば、Pro、Phe、Trp、Tyr、及びHis、或いは、長い又は分岐した脂肪族側鎖を持つアミノ酸、例えば、Arg、Lys、Leu、Ile、Met、及びValを除いた天然アミノ酸であり、更に一般的には、嵩高い(bulky)アミノ酸は、少なくとも3つの炭素原子を有する側鎖を持ち、それらの炭素原子は連結されて分岐又は非分岐側鎖を形成する。ここで好まれる「嵩高くないアミノ酸残基」の例には、Gly、Ala、及びSerが含まれる。
【０１１１】
「本発明によるポリペプチド」は、本特許出願の特許請求の範囲、或いは本特許出願の特許請求の範囲に基づいて許可された特許に記載の任意のポリペプチドである。
【０１１２】
「本発明によるポリヌクレオチド」又は「本発明による核酸」は、本特許出願の特許請求の範囲、或いは本特許出願の特許請求の範囲に基づいて許可された特許に記載の任意のポリペプチドを含む、「本発明によるポリペプチド」をコードする任意のポリヌクレオチドである。
【０１１３】
「挿入遺伝エレメント」は、そのエレメントが人為的操作により細胞内へ導入された後、宿主細胞の染色体に組み込まれたDNAのセグメントである。本発明において、挿入遺伝エレメントは、最も一般的には、エレクトロポレーション又は他の手法により細胞に導入された、直線状化されたプラスミドに由来する。挿入遺伝エレメントは、元の宿主細胞からその子孫へ受け渡される。
【０１１４】
「クローニングベクタ」は、宿主細胞において自律的に複製する能力を有する、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ等のポリヌクレオチド分子である。クローニングベクタは、一般に、ベクタの必須の生物学的機能を失うことなく、判定可能な形でポリヌクレオチド分子を挿入することができる一つ又は少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位と、クローニングベクタにより形質転換された細胞の同定及び選択での使用に適したマーカ遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含有する。マーカ遺伝子は、一般に、テトラサイクリン耐性又はアンピシリン耐性を提供する遺伝子を含む。
【０１１５】
「発現ベクタ」は、宿主細胞において発現される遺伝子をコードするポリヌクレオチド分子である。一般に、発現ベクタは、転写プロモータ、遺伝子、及び転写ターミネータを含む。遺伝子発現は、通常、プロモータの制御下に置かれ、こうした遺伝子は、プロモータに「機能的にリンクされた」と言われる。同様に、調節エレメントがコアプロモータの活性を調節する場合、調節エレメントとコアプロモータとは、機能的にリンクしている。
【０１１６】
「組換え宿主」は、クローニングベクタ又は発現ベクタ等の異種ポリヌクレオチド分子を含む細胞である。
【０１１７】
「挿入的形質転換体」は、異種DNAが細胞のゲノムDNAに挿入されている組換え宿主細胞である。
【０１１８】
「融合ポリペプチド」は、少なくとも二つの遺伝子のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子により発現されるハイブリッドポリペプチドである。例えば、融合ポリペプチドは、本発明によるポリペプチドの少なくとも一部を、親和性マトリクスに結合するポリペプチドに融合した形で含むことができる。こうした融合ポリペプチドは、親和性クロマトグラフィを使用して、本発明によるポリペプチドを大量に単離する手段を提供する。
【０１１９】
「分泌シグナル配列」という用語は、より大きなポリペプチドの構成要素として、そのより大きなポリペプチドを、それが合成される細胞の分泌経路へと方向付けるペプチド(「分泌ペプチド」)をコードするDNA配列を示す。当該より大きなポリペプチドは、通常、分泌経路を介して移動する間に、切断されて分泌ペプチドを取り除く。
【０１２０】
「単離ポリペプチド」は、炭水化物、脂質、又は天然状態においてポリペプチドに付随する他のポリペプチド関連不純物等の細胞成分の混入が本質的に存在しないポリペプチドである。一般に、単離ポリペプチドの調製物は、ポリペプチドを高度に純化された形態で、即ち、少なくとも純度約80%、少なくとも純度約90%、少なくとも純度約95%、約95%より高い純度、又は99%より高い純度で、含有する。特定のポリペプチド調製物が単離ポリペプチドを含有することを示すための一方法は、ポリペプチド調製物のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)-ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びゲルのクマシブリリアントブルー染色後の単一バンドの出現によるものである。しかしながら、「単離された」という用語は、二量体等の他の物理的形態、或いは異なるグリコシル化又は誘導体化をされた形態での同じポリペプチドの存在を排除しない。
【０１２１】
「アミノ末端」及び「カルボキシル末端」という用語は、本明細書での使用において、ポリペプチド内の位置を示す。文脈によっては、これらの用語は、ポリペプチドの特定の配列又は部分に関して、近接性又は相対位置を示すために使用される。例えば、ポリペプチド内の参照配列のカルボキシル末端に位置する特定の配列は、その参照配列のカルボキシル終端に近接して位置するが、必ずしも完全なポリペプチドのカルボキシル終端にあるわけではない。
【０１２２】
「発現」という用語は、遺伝子産物の生合成を示す。例えば、構造遺伝子の場合、発現は、mRNAへの構造遺伝子の転写と、一つ以上のポリペプチドへのmRNAの翻訳とを含む。
【０１２３】
「スプライスバリアント」という用語は、本明細書での使用において、一つの遺伝子から転写されるRNAの異なる形態を示す。スプライスのバリエーションは、転写されたRNA一分子内の代替スプライス部位の使用により、或いは、頻度は低いが、別々に転写されたRNA分子間において、自然に起こり、同じ遺伝子から異なったmRNAが転写されるという結果になり得る。スプライスバリアントは、変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。スプライスバリアントという用語は、更に、本明細書での使用において、遺伝子から転写されたmRNAのスプライスバリアントによりコードされるポリペプチドを示す。
【０１２４】
「補体/抗補体対」という用語は、適切な条件下で、非共有結合した安定的な対を形成する非同一部分を示す。例えば、ビオチン及びアビジン(又はストレプトアビジン)は、補体/抗補体対の典型的な例である。他の補体/抗補体対の例は、受容体/リガンド対、抗体/抗原(又はハプテン又はエピトープ)対、センス/アンチセンスポリヌクレオチド対等を含む。補体/抗補体対を後で分離させることが望ましい場合、補体/抗補体対は、109M-1未満の結合親和性を有することが好ましい。
【０１２５】
「抗イディオタイプ抗体」は、免疫グロブリンの可変領域ドメインと結合する抗体である。この文脈において、抗イディオタイプ抗体は、抗抗体の可変領域と結合し、したがって、抗イディオタイプ抗体は、本発明によるポリペプチドのエピトープを模倣する。
【０１２６】
「抗体フラグメント」は、F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fabのような、抗体の一部分である。構造に関係なく、抗体フラグメントは、無傷の抗体により認識されるものと同じ抗原と結合する。例えば、抗(本発明によるポリペプチド)モノクローナル抗体フラグメントは、本発明によるポリペプチドのエピトープと結合する。
【０１２７】
「抗体フラグメント」という用語は、更に、特異的抗原と結合する合成又は遺伝子操作されたポリペプチドを含み、例として、軽鎖可変領域から成るポリペプチド、重鎖及び軽鎖の可変領域から成る「Fv」フラグメント、軽鎖及び重鎖可変領域がペプチドリンカにより連結された組換え一本鎖ポリペプチド分子(「scFvポリペプチド」)、及び超可変領域を模倣するアミノ酸残基から成る最小認識ユニットを含む。
【０１２８】
「キメラ抗体」は、齧歯類抗体に由来する可変ドメイン及び相補性決定領域を含むが、抗体分子の残りの部分がヒト抗体に由来する、組換えポリペプチドを示す。
【０１２９】
「ヒト化抗体」は、モノクローナル抗体のマウス相補性決定領域がマウス免疫グロブリンの可変重鎖及び軽鎖からヒト可変ドメインへ転送された組換えポリペプチドである。
【０１３０】
「検出可能な標識」は、診断に有用な分子を生成するために抗体部分にコンジュゲートすることができる分子又は原子である。検出可能な標識の例は、キレート化剤、光活性剤、放射性同位体、蛍光剤、常磁性イオン、又は他のマーカ成分を含む。
【０１３１】
「親和性タグ」という用語は、本明細書での使用において、第二のポリペプチドに付加され、その第二のポリペプチドの精製又は検出をもたらす、或いはその第二のポリペプチドが基質に付着するための部位を提供することができる、ポリペプチドセグメントを示す。原則として、抗体又は他の特異的結合剤が利用可能な任意のペプチド又はポリペプチドを親和性タグとして使用できる。親和性タグは、ポリヒスチジントラクト、ポリペプチドA(Nilssonら, EMBO J. 4:1075 (1985)、Nilssonら, Methods Enzymol. 198:3 (1991))、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(Smith及びJohnson, Gene 67:31 (1988))、Glu-Glu親和性タグ(Grussenmeyerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952 (1985))、P物質、FLAGペプチド(Hoppら, Biotechnology 6:1204 (1988))、ストレプトアビジン結合ペプチド、或いは他の抗原エピトープ又は結合ドメインを含む。一般的には、Fordら, polypeptide Expression and Purification 2:95 (1991))を参照されたい。親和性タグをコードするDNAは、民間業者(例えば、Pharmacia Biotech、ニュージャージ州ピスカタウェイ)から入手できる。
【０１３２】
「裸の抗体」は、治療用剤とコンジュゲートされていない、抗体フラグメントと対比される完全な抗体である。裸の抗体は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体の両方を含み、キメラ抗体及びヒト化抗体等、特定の組換え抗体を含む。
【０１３３】
本明細書での使用において、「抗体成分」という用語は、完全な抗体と抗体フラグメントとの両者を含む。
【０１３４】
「標的ポリペプチド」又は「標的ペプチド」は、少なくとも1つのエピトープを含み、腫瘍細胞又は感染病原体抗原を有する細胞等の標的細胞上で発現されるアミノ酸配列である。T細胞は、主要組織適合性複合体分子により、標的ポリペプチド又は標的ペプチドに対して提示されるペプチドエピトープを認識し、通常は、標的細胞を溶解するか、或いは標的細胞の部位に他の免疫細胞を徴集し、これにより標的細胞を死滅させる。
【０１３５】
「抗原ペプチド」は、主要組織適合性複合体分子と結合して、T細胞により認識されるMHC-ペプチド複合体を形成し、これによりT細胞への提示に基づく細胞傷害性リンパ球応答を誘導するペプチドである。したがって、抗原ペプチドは、適切な主要組織適合性複合体分子と結合し、細胞溶解又は抗原を結合又は発現する標的細胞に対する特異的サイトカインの放出等の細胞傷害性T細胞応答を誘導することができる。抗原ペプチドは、抗原提示細胞又は標的細胞上において、クラスI及びクラスII主要組織適合性複合体分子のコンテクストで結合され得る。
【０１３６】
真核生物では、RNAポリメラーゼIIが、構造遺伝子の転写を触媒してmRNAを生成する。特定のmRNAの配列と相補的な配列を有するRNA転写産物が生成するようにRNAポリメラーゼII鋳型を含ませたポリヌクレオチド分子を設計することができる。こうしたRNA転写産物は「アンチセンスRNA」と呼ばれ、アンチセンスRNAをコードするポリヌクレオチド分子は「アンチセンス遺伝子」と呼ばれる。アンチセンスRNA分子は、mRNA分子と結合し、mRNAの翻訳を抑制することができる。
【０１３７】
「本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド」は、(a)本発明によるポリペプチドをコードする遺伝子の一部と安定した三本鎖を形成可能な配列、又は(b)こうした遺伝子のmRNA転写産物の一部と安定した二本鎖を形成可能な配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【０１３８】
「バリアント遺伝子」という用語は、本発明によるポリペプチドの改変物であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を示す。こうしたバリアントは、本発明による遺伝子の天然の多型、及び本発明によるポリペプチドのアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換を含む合成遺伝子を含む。遺伝子のその他のバリアント形態は、本明細書に記載したヌクレオチド配列の挿入及び欠失を含むポリヌクレオチド分子である。本発明によるバリアント遺伝子は、その遺伝子が、本発明によるポリペプチドのヌクレオチド配列、又はそれに相補的な配列を有するポリヌクレオチド分子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするかを判定することにより同定できる。
【０１３９】
或いは、バリアント遺伝子は、配列比較により同定できる。最大の一致が得られるように整合させた時、2つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が同一である場合、2つのアミノ酸配列は「100%のアミノ酸配列同一性」を有する。同様に、最大の一致が得られるように整合させた時、2つのヌクレオチド配列のヌクレオチド残基が同一である場合、2つのヌクレオチド配列は「100%のヌクレオチド配列同一性」を有する。配列比較は、DNASTAR(ウィスコンシン州マディソン)製のLASERGENEバイオインフォマティクス計算ソフトに含まれるもの等の、標準的なソフトウェアプログラムを用いて実行できる。最適な整合性を決定することで2つのヌクレオチド及びアミノ酸配列を比較するための他の方法は、当業者に周知である(例えば、Peruski及びPeruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997)、Wuら(編), "Information Superhighway and Computer Databases of polynucleotides and polypeptides," in Methods in Gene Biotechnology, pages 123 151 (CRC Press, Inc. 1997)、 及びBishop (編), Guide to Human Genome Computing, 2nd Edition (Academic Press, Inc. 1998)を参照されたい)。配列同一性を決定するための特定の方法については後述する。
【０１４０】
バリアント遺伝子を同定するために使用する特定の方法に関係なく、バリアント遺伝子は、抗(本発明によるポリペプチド)抗体と特異的に結合する能力により特徴付けることが可能なポリペプチドをコードする。
【０１４１】
「対立遺伝子バリアント」という用語は、本明細書での使用において、同じ染色体座を占める遺伝子の二つ以上の異なる形態の何れかを示す。対立遺伝子のバリエーションは、突然変異により自然に生じ、集団内で表現型多型を発生させ得る。遺伝子突然変異は、サイレントである(コードされたポリペプチドに変化がない)場合があり、或いは変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする場合もある。対立遺伝子バリアントという用語は、更に本明細書での使用において、遺伝子の対立遺伝子バリアントによりコードされたポリペプチドを示す。
【０１４２】
「オーソログ」という用語は、一つの種から得られるポリペプチド又はポリペプチドであり、異なる種に由来するポリペプチド又はポリペプチドの機能的対応物であるものを示す。オーソログ間の配列の差は、種分化の結果である。
【０１４３】
「パラログ」とは、一つの生物により産生される、別個ではあるが構造的には関連しているポリペプチドである。パラログは、遺伝子重複により生じると考えられる。例えば、αグロビン、βグロビン、及びミオグロビンは、互いにパラログである。
【０１４４】
標準的な解析法の不正確さのため、ポリマの分子量及び長さは近似値であると理解される。こうした値が「約」X又は「およそ」Xと表現される場合、Xの記載値は、±20%、例として±10%、例えば±5%の精度を有すると理解される。
【実施例】
【０１４５】
本発明は、一実施形態において、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、及びSEQ ID NO:8から成る集合から選択されたアミノ酸残基の配列を含む、若しくはこれにより構成される、氷晶の形成及び/若しくは成長を低減若しくは抑制可能な単離ポリペプチド、氷晶の形成及び/若しくは成長を低減若しくは抑制可能なそのフラグメント、又は前記配列の何れかに対して少なくとも75%の同一性を有する配列を提供する。
【０１４６】
更に、本発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列を含み、本発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列の発現を適切な宿主細胞において命令可能な発現シグナルを更に含む、単離ポリヌクレオチドが提供される。更に、本発明によるポリペプチドを発現可能な、本発明によるポリヌクレオチドを含むベクタが提供される。単離された組換え細胞は、本発明によるポリヌクレオチド、又は本発明によるベクタ、又は本発明によるポリペプチドを含むことができる
【０１４７】
更に、本発明によるポリペプチドを含む食用製品が提供され、当該食用製品は冷凍することができるものであり、又はアイスクリーム製品のような冷凍菓子製品の形態、又はパンでもあり得る。
【０１４８】
非食品用途の例として、本発明によるポリペプチドを含む固体支持材が提供される。
【０１４９】
本発明は、更に、本発明によるポリペプチドを作成又は使用する方法に関し、一実施形態において、本発明によるポリペプチドを生成する方法を含み、当該方法は、
i)本発明によるポリヌクレオチド又は本発明によるベクタを提供する工程と、
ii)工程i)において提供されたポリヌクレオチドの組換え発現による、本発明によるポリペプチドの生成に適した宿主細胞を提供する工程と、
iii)本発明によるポリペプチドを生成する工程と、随意的に、
iv)前記ポリペプチドを精製及び/又は単離する工程と、を含む。
【０１５０】
本発明によるポリペプチドのin situ生成を目標とする場合には、
i)発酵性出発材料を提供する工程と、
ii)前記発酵性食品出発材料を発酵させる能力があり且つ、発酵性食品出発材料を発酵させる時、適切な条件下において、本発明によるポリペプチドを生成することができる微生物を提供する工程と、
iii)前記微生物の存在下において、前記食品出発材料を発酵させることにより、発酵食用製品を製造する工程と、を含む方法が提供され、
当該発酵食用製品は、本発明によるポリペプチドを含む。
【０１５１】
他の実施形態において、以下の方法が提供される:
冷凍食用製品において氷晶形成を低減又は抑制する方法であって、
i)冷凍食用製品、又はその製造に必要な一種類以上の原料を提供する工程と、
ii)前記製品及び/又は原料を、場合に応じて製品の製造前、製造中、又は製造後に、本発明によるポリペプチドに接触させる工程と、を含み、
これにより、冷凍食用製品における氷晶形成を低減又は抑制する方法。
【０１５２】
冷凍食用製品において氷晶成長を低減又は抑制する方法であって、
i)冷凍食用製品、又はその製造に必要な一種類以上の原料を提供する工程と、
ii)前記製品及び/又は原料を、場合に応じて製品の製造前、製造中、又は製造後に、本発明によるポリペプチドに接触させる工程と、を含み、
これにより、冷凍食用製品において氷晶成長を低減又は抑制する方法。
【０１５３】
冷凍食用製品において氷晶を構築する方法であって、
i)冷凍食用製品、又はその製造に必要な一種類以上の原料を提供する工程と、
ii)前記製品及び/又は原料を、場合に応じて製品の製造前、製造中、又は製造後に、本発明によるポリペプチドに接触させる工程と、を含み、
これにより、冷凍食用製品において氷晶を構築する方法。
【０１５４】
冷凍食用製品のテクスチャ又は官能特性を調節する方法であって、
i)冷凍食用製品、又はその製造に必要な一種類以上の原料を提供する工程と、
ii)前記製品及び/又は原料を、場合に応じて製品の製造前、製造中、又は製造後に、本発明によるポリペプチドに接触させる工程と、を含み、
これにより、冷凍食用製品のテクスチャ又は官能特性を調節する方法。
【０１５５】
冷凍食用製品の製造又は保存中に氷晶形成を監視する方法であって、
i)冷凍食用製品、又はその製造に必要な一種類以上の原料を提供する工程と、
ii)前記製品及び/又は原料を、場合に応じて製品の製造前、製造中、又は製造後に、本発明によるポリペプチドに接触させる工程と、
iii)凍結食用製品の製造又は保存中の様々な時点において氷晶形成を監視する工程と、を含む方法。
【０１５６】
雌又は女性個体において体外受精(IVF)処置を実行する方法であって、雌又は女性個体から一つ以上の卵母細胞を、任意で卵胞液を含む生体試料と共に、摘出する工程と、本発明によるポリペプチドの存在下で、一つ以上の卵母細胞を、任意で前記生体試料と共に、凍結させる工程と、一つ以上の摘出卵母細胞を体外で受精させる工程と、一つ以上の受精卵母細胞を雌又は女性個体に移植する工程と、を含む方法。
【０１５７】
雌又は女性個体における妊娠の可能性又は確率を増加させる方法であって、雌又は女性個体から一つ以上の卵母細胞を、任意で卵胞液を含む生体試料と共に、摘出する工程と、本発明によるポリペプチドの存在下で、一つ以上の卵母細胞を、任意で前記生体試料と共に、凍結させる工程と、一つ以上の摘出卵母細胞を体外で受精させる工程と、一つ以上の受精卵母細胞を雌又は女性個体に移植する工程と、を含み、本発明によるポリペプチドの存在下で一つ以上の卵母細胞を凍結させる工程は、卵母細胞上において、又は卵母細胞が存在する環境内において、氷晶成長及び/又は形成を低減し、これにより、妊娠の可能性又は確率を増加させる方法。
【０１５８】
試料は、更に、顆粒膜黄体細胞又は濾胞細胞を含み、随意的に、雌又は女性個体の卵胞から回収された他の卵巣細胞を含むことが可能である。一実施形態において、試料は、更に、卵母細胞の周囲からの凍結細胞を含む。
【０１５９】
本発明は、他の実施形態において、氷結合活性を有し且つ配列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQ ID NO:90)の一つ以上のコピー、例として、一般的氷結合ドメインSEQ ID NO:90の二つ、三つ、四つ、五つ、六つ、七つ、八つ、九つ、又は十の個別に選択されたコピーを含むポリペプチドを対象とし、ここで、
X1は、S、A、G、及びDから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
X2は、A、V、I、T、及びSから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
X3は、嵩高くないアミノ酸残基から成るアミノ酸残基の集合から選択され、
X4は、S、I、T、及びVから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
X5は、S、A、I、及びTから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
X6は、S、T、及びVから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
X7は、嵩高くないアミノ酸残基から成るアミノ酸残基の集合から選択され、
X8は、S、T、及びVから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
X9は、S、A、及びGから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
SEQ ID NO:90の残基X2、X4、X6、及びX8の少なくとも一つは、T又はVであり、
ポリペプチドのアミノ酸残基の最大数は、1000未満である。
【０１６０】
本発明によるポリペプチドのアミノ酸残基の最大数は、好ましくは500未満、例として400未満、例えば300未満、例として250未満、例えば240未満、例として230未満、例えば220未満、例として210未満、例えば200未満、例として190未満、例えば180未満、例として150未満、例えば140未満、例として130未満、例えば120未満、例として110未満、例えば100未満、例として95未満、例えば90未満、例として85未満、例えば80未満、例として75未満、例えば70未満、例として65未満、例えば60未満、例として55未満、例えば50未満、例として45未満、例えば40未満、例として30未満、例えば20未満、例として15未満である。
【０１６１】
上述したポリペプチドのサイズの限定と機能的に関連して、本発明によるポリペプチドのアミノ酸残基の最小数は、10以上、例として12以上、例えば14以上、例として16以上、例えば18以上、例として20以上、例えば22以上、例として24以上、例えば26以上、例として28以上、例えば30以上、例として32以上、例えば34以上、例として36以上、例えば38以上、例として40以上、例えば42以上、例として44以上、例えば46以上、例として48以上、例えば50以上、例として55以上、例えば60以上、例として65以上、例えば70以上、例として75以上、例えば80以上、例として85以上、例えば90以上、例として95以上、例えば100以上にしてよく、ここで、任意の最大数と最小数とを対にする時、最大数は、最小数より大きい。
【０１６２】
一実施形態において、本発明によるポリペプチドは、それぞれがSEQ ID NO:90の配列又は本明細書に記載されたそのバリアント若しくは誘導体若しくは修飾物を含み、好ましくは多くとも250個のアミノ酸を有する、複数の一般的氷結合ドメインを含む。
【０１６３】
一実施形態において、本発明は、更に独立して選択されたSEQ ID NO:90のコピーの形態で第二の配列を含むポリペプチド配列に関し、当該SEQ ID NO:90の更なるコピーは、SEQ ID NO:90の第一のコピーと重複しない。本発明は、別の実施形態において、SEQ ID NO:90の第三のコピーを更に含むポリペプチドに関し(即ち、ポリペプチドは、独立して選択されたSEQ ID NO:90の三つのコピーを有する)、更に他の実施形態において、ポリペプチドは、更に、SEQ ID NO:90の第四のコピーを含む(即ち、ポリペプチドは、独立して選択されたSEQ ID NO:90の三つのコピーを有する)。独立して選択されたSEQ ID NO:90のコピーは、本明細書に開示したように、同一であっても異なっていてもよい。
【０１６４】
SEQ ID NO:90のコピーは、互いに対して任意の順序で存在可能であり、任意の2配列は、少なくとも2個のアミノ酸残基、例として少なくとも3個のアミノ酸残基、例えば少なくとも4個のアミノ酸残基、例として少なくとも5個のアミノ酸残基、例えば少なくとも6個のアミノ酸残基、例として少なくとも7個のアミノ酸残基、例えば少なくとも8個のアミノ酸残基、例として少なくとも9個のアミノ酸残基、例えば少なくとも10個のアミノ酸残基、例として少なくとも11個のアミノ酸残基、例えば少なくとも12個のアミノ酸残基、例として少なくとも13個のアミノ酸残基、例えば少なくとも14個のアミノ酸残基、例として少なくとも15個のアミノ酸残基、例えば少なくとも16個のアミノ酸残基、例として少なくとも17個のアミノ酸残基、例えば少なくとも18個のアミノ酸残基、例として少なくとも19個のアミノ酸残基、例えば少なくとも20個のアミノ酸残基、例として少なくとも21個のアミノ酸残基、例えば少なくとも22個のアミノ酸残基、例として少なくとも23個のアミノ酸残基、例えば少なくとも24個のアミノ酸残基、例として少なくとも25個のアミノ酸残基、例えば少なくとも26個のアミノ酸残基、例として少なくとも27個のアミノ酸残基、例えば少なくとも28個のアミノ酸残基、例として少なくとも29個のアミノ酸残基、例えば少なくとも30個のアミノ酸残基により隔離され得る。
【０１６５】
本発明によるポリペプチドは、固体支持体又は半固体支持体等の担体に連結可能である。ポリペプチドは、例えば、本発明によるポリペプチドを望ましい形でディスプレイする材料の表面等、こうした任意の担体に共有結合又は非共有結合することが可能である。
【０１６６】
本発明は、更に、親和性タグに融合させた本発明によるポリペプチドに関する。こうした親和性タグの例は、文献から公知であり、例えば、Hisタグ、ポリペプチドAタグ、アビジン/ストレプトアビジン、ポリペプチドG、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、緑色蛍光ポリペプチド(GFP)、ポリアルギニン、ポリシステイン、c-myc、カルモジュリン結合ポリペプチド、インフルエンザウイルス血球凝集素、マルトース結合タンパク質(MBP)(HA)から成る集合から選択可能である。
【０１６７】
本発明は、更に、一個以上のアミノ酸残基が修飾されたポリペプチドを包含し、当該一つ以上の修飾は、アセチル化又はカルボキシル化、グリコシル化、例として、グリコシル化に影響を与える酵素、例えば哺乳類グリコシル化又は脱グリコシル化酵素に対して、ポリペプチドを晒すことに起因するグリコシル化、ホスホリル化、例として、ホスホリル化アミノ酸残基、例えばホスホチロシン、ホスホセリン、及びホスホトレオニンをもたらす、アミノ酸残基の修飾等、インビボ又はインビトロ化学誘導体化からなる集合から選択されることが好ましい。
【０１６８】
本発明によるポリペプチドは、天然発生のL-アミノ酸、天然発生のD-アミノ酸、及び非天然発生の合成アミノ酸から成る集合から独立して選択される一個以上のアミノ酸を含むことができる。
【０１６９】
本発明は、更に、ポリペプチドのN末端及び/又はC末端を望ましくない分解から保護及び/又は安定化させるために保護基が導入された本発明のポリペプチドに関する。こうした保護基は、分岐又は非分岐アルキル基、ホルミル基及びアセチル基等のアシル基、更に、アセトアミドメチル等、それらの置換形態を含む集合から選択し得る。
【０１７０】
本発明は、更に、本発明によるポリペプチドの修飾物及び誘導体と、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチドと、前記ヌクレオチドを含むベクタと、前記ベクタにより形質転換された宿主細胞と、前記細胞を含むトランスジェニック生物とに関する。
【０１７１】
ブダペスト条約に基づく特許寄託
以下の細菌株は、ブダペスト条約の条項に従い、2007年6月4日にDSMZに寄託された。
Escherichia coli ALO3231
DSM 19401:プラスミドpGEM-T-Easy-RmAFP1を含有する大腸菌株JM109
Escherichia coli ALO3232
DSM 19402:プラスミドpGEM-T-Easy-RmAFP2を含有する大腸菌株JM109
Escherichia coli ALO3233
DSM 19403:プラスミドpGEM-T-Easy-RmAFP3を含有する大腸菌株JM109
Escherichia coli ALO3234
DSM 19404:プラスミドpGEM-T-Easy-RmAFP4を含有する大腸菌株JM109
Escherichia coli ALO3235
DSM 19405:プラスミドpGEM-T-Easy-RmAFP5を含有する大腸菌株JM109
Escherichia coli ALO3236
DSM 19406:プラスミドpGEM-T-Easy-RmAFP6を含有する大腸菌株JM109
Escherichia coli ALO3237
DSM 19407:プラスミドpGEM-T-Easy-RmAFP7を含有する大腸菌株JM109
Escherichia coli ALO3238
DSM 19408:プラスミドpGEM-T-Easy-RmAFP8を含有する大腸菌株JM109
【０１７２】
以下の記述は、上述したDSMZ寄託番号に関連して、下記の地域及び国に対して行うものである。
【０１７３】
EPO:出願人は、欧州特許の付与の公告まで、又は出願が拒絶され、若しくは取り下げられ、若しくは取り下げられたものと見做された場合には出願日から20年間、EPC規則28(3)に規定されているように、生物材料が、請求人指名の専門家(EPC規則28(4))に対する試料の分譲によってのみ入手できるものとすることを本明細書において要求する。
【０１７４】
オーストラリア:出願人は、特許付与の前、又は出願の失効、拒絶、又は取り下げの前にのみ、微生物の試料の供給が発明について利害関係のない当業者である人物(オーストラリア特許規則の規則3.25(3))に対してのみ行われるものとすることを本明細書において通知する。
【０１７５】
カナダ:出願人は、カナダ特許が出願に基づいて発行されるまで、又は出願が拒絶されるまで、又は放棄され回復の余地がなくなるまで、又は取り下げられるまでは、特許庁長官のみが、出願において言及した寄託生物材料の試料の供給を、長官が指名する独立した専門家に対して許可することを要求する。
【０１７６】
クロアチア:出願人は、出願の公開から特許の付与までの間、請求に基づき、独立した専門家のみに対して試料が利用できるものとすることを本明細書において要求する。
【０１７７】
デンマーク:出願人は、(デンマーク特許庁により)本願が公衆の閲覧に供されるまで又は公衆の閲覧に供されることなくデンマーク特許庁により最終決定がされるまで、出願において言及した寄託生物材料の試料の供給を、当技術の専門家に対してのみ行うものとすることを本明細書において要求する。
【０１７８】
フィンランド:出願人は、(国立特許登録委員会により)本願が公衆の閲覧に供されるまで又は公衆の閲覧に供されることなく国立特許登録委員会により最終決定がされるまで、出願において言及した寄託生物材料の試料の供給を、当技術の専門家に対してのみ行うものとすることを本明細書において要求する。
【０１７９】
ドイツ:出願人は、特許の付与まで、又は出願が拒絶若しくは取り下げとなった場合には出願日から20年間、出願人が指名する独立した専門家にのみ試料が分譲されるものとすることを本明細書において要求する。
【０１８０】
アイスランド:出願人は、本願についてアイスランド特許庁により特許が付与されるまで、又は特許を生じない最終決定がされるまで、出願において言及した寄託生物材料の試料の供給を、当技術の専門家に対してのみ行うものとすることを本明細書において要求する。
【０１８１】
ノルウェイ:出願人は、(ノルウェイ特許庁により)本願が公衆の閲覧に供されるまで又は公衆の閲覧に供されることなくノルウェイ特許庁により最終決定がされるまで、出願において言及した寄託生物材料の試料の供給を、当技術の専門家に対してのみ行うものとすることを本明細書において要求する。
【０１８２】
シンガポール:出願人は、出願において言及した寄託生物材料の試料の供給を、専門家のみ利用できるものとすることを本明細書において要求する。
【０１８３】
スペイン:出願人は、スペイン特許の付与の公告まで、又は出願が拒絶若しくは取り下げとなった場合には出願日から20年間、SPL第45条に規定されているように、生物材料が、出願において言及した寄託生物材料の試料の独立した専門家に対する分譲によってのみ入手できるものとすることを本明細書において要求する。
【０１８４】
スウェーデン:出願人は、(スウェーデン特許庁により)本願が公衆の閲覧に供されるまで又は公衆の閲覧に供されることなくスウェーデン特許庁により最終決定がされるまで、出願において言及した寄託生物材料の試料の供給を、当技術の専門家に対してのみ行うものとすることを本明細書において要求する。
【０１８５】
イギリス:出願人は、出願において言及した寄託生物材料の試料の供給を、専門家のみ利用できるものとすることを本明細書において要求する。
【０１８６】
配列の相同性及び同一性の決定
一態様において、本発明は、更に、SEQ ID NO:1乃至SEQ ID NO:8の何れか、又はそのオーソログ等、本発明によるポリペプチドに対して、実質的に類似する配列同一性を有する単離ポリペプチドを提供する。
【０１８７】
「実質的に類似する配列同一性」という用語は、本明細書での使用において、配列SEQ ID NO:1乃至SEQ ID NO:8の何れか、又はそのオーソログに対して、少なくとも70%、例として少なくとも72%、例えば少なくとも74%、例として少なくとも76%、例えば少なくとも78%、例として少なくとも80%、例えば少なくとも82%、例として少なくとも84%、例えば少なくとも86%、例として少なくとも88%、例えば少なくとも90%、例として少なくとも91%、例えば少なくとも92%、例として少なくとも93%、例えば少なくとも94%、例として少なくとも95%、例えば少なくとも96%、例として少なくとも97%、例えば少なくとも98%、例として少なくとも99%、又は99%超の配列同一性を有するポリペプチドを示す。
【０１８８】
本発明では、a)上述した配列SEQ ID NO:1乃至SEQ ID NO:8の何れかのアミノ酸配列を有するポリペプチドとの同一性又は類似性の決定、及びb)ストリンジェントな条件下で行われるハイブリダイゼーションという、二つの基準を使用して同定可能なバリアントポリヌクレオチド分子も考えられる。例えば、特定の遺伝子バリアントは、洗浄ストリンジェンシが、55℃乃至65℃で0.1%SDSを含む0.5×乃至2×SSCに相当するストリンジェントな洗浄条件下での洗浄後、配列SEQ ID NO:1乃至SEQ ID NO:8の何れか等、本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はそのようなポリヌクレオチドの相補鎖とのハイブリダイズを維持するポリヌクレオチドを含む。或いは、バリアント遺伝子は、洗浄ストリンジェンシが55℃乃至65℃で0.1%SDSを含む0.1×乃至0.2×SSCに相当するストリンジェントな洗浄条件下での洗浄後、配列SEQ ID NO:1乃至SEQ ID NO:8の何れか等、本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はそのようなポリヌクレオチドの相補鎖とのハイブリダイズを維持するポリヌクレオチド分子として特徴付けできる。
【０１８９】
配列同一性パーセントは、従来の方法により決定される。例えば、Altschulら, Bull. Math. Bio. 48:603 (1986)と、Henikoff及びHenikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992) とを参照されたい。簡潔に言えば、ギャップ開始ペナルティとして10、ギャップ延長ペナルティとして1、並びにHenikoff及びHenikoff(同書)の「BLOSUM62」スコア行列を使用して、整合性スコアを最適化するように二つのアミノ酸配列を整合させる。次に、同一性パーセントを、([完全一致の合計数]/[長い方の配列の長さ+二配列を整合させるために長い方の配列に導入したギャップ数])×(100)として計算する。
【０１９０】
当業者は、二つのアミノ酸配列を整合させるために利用可能な多数の確立されたアルゴリズムが存在することを理解する。Pearson及びLipmanの「FASTA」類似性検索アルゴリズムは、本明細書で開示されたアミノ酸配列と、推定上又はバリアントのアミノ酸配列とが共有する同一性のレベルを調べるのに適したポリペプチド整合法である。FASTAアルゴリズムは、Pearson及びLipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)と、Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)とにおいて説明されている。
【０１９１】
簡潔に言えば、FASTAでは、最初に、保存アミノ酸置換、挿入、又は欠失を考慮せずに、クエリ配列(例えば、配列SEQ ID NO:1乃至SEQ ID NO:8の何れか)と、最高の同一性密度(ktup変数が1の場合)又は同一性の対(ktup=2の場合)を有する試験配列とにより共有される領域を同定することにより、配列類似性を特徴付ける。次に、アミノ酸置換行列を使用して、対を成す全てのアミノ酸の類似性を比較することにより、最高の同一性密度を有する10領域を再評価し、最高スコアに寄与する残基のみを含むように、領域の端部を「トリミング」する。「カットオフ」値(配列の長さ及びktup値に基づいて所定式により計算される)より大きいスコアを有する領域が幾つか存在する場合、トリミングした初期領域を調べ、当該領域を結合してギャップを伴った近似的な整合性を形成することが可能であるかを判断する。最後に、二つのアミノ酸配列の最高スコア領域を、Needleman-Wunsch-Sellersアルゴリズム(Needleman及びWunsch, J. Mol. Biol. 48:444 (1970)、Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974))を修正したものを用いて整合させ、そこではアミノ酸の挿入及び欠失が許容される。FASTA分析の好適なパラメータは、ktup=1、ギャップ開始ペナルティ=10、ギャップ延長ペナルティ=1、及び置換行列=BLOSUM62である。これらのパラメータは、Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)の付録2において説明されるように、スコア行列ファイル(「SMATRIX」)を修正することにより、FASTAプログラムに導入することができる。
【０１９２】
FASTAは、上述した比を用いて、ポリヌクレオチド分子の配列同一性を決定するためにも使用できる。ヌクレオチド配列の比較のために、ktup値は、1乃至6の範囲、好ましくは3乃至6、最も好ましくは3にすることができる。他のパラメータは、ギャップ開始ペナルティ=10及びギャップ延長ペナルティ=1に設定できる。
【０１９３】
本発明によるポリペプチドにおけるアミノ酸残基の置換
本発明は、更に、配列SEQ ID NO:1乃至SEQ ID NO:8の何れかのアミノ酸配列と比較して、一個以上の保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドと、一個以上の保存アミノ酸置換を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを対象とする。即ち、配列SEQ ID NO:1乃至SEQ ID NO:8の何れかの一個以上のアミノ酸置換を含むバリアントを得ることができる。バリアントは、アルキルアミノ酸によるアルキルアミノ酸の置換、芳香族アミノ酸による芳香族アミノ酸の置換、硫黄含有アミノ酸による硫黄含有アミノ酸の置換、ヒドロキシ含有アミノ酸によるヒドロキシ含有アミノ酸の置換、酸性アミノ酸による酸性アミノ酸の置換、塩基性アミノ酸による塩基性アミノ酸の置換、又はモノカルボキシルアミノ酸によるモノカルボキシルアミノ酸の置換が行われた配列を含む。
【０１９４】
一般的なアミノ酸において、例えば、「保存的アミノ酸置換」は、次の集合のそれぞれの中でのアミノ酸間の置換により示すことができる:(1)グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン、(2)フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、(3)セリン及びトレオニン、(4)アスパラギン酸及びグルタミン酸、(5)グルタミン及びアスパラギン、並びに(6)リシン、アルギニン及びヒスチジン。
【０１９５】
BLOSUM62の表は、ポリペプチド配列セグメントの約2,000の局所多重アライメントに由来するアミノ酸置換行列であり、500を超える関連ポリペプチドの集合の保存性の高い領域を表す(Henikoff及び Henikoff, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:10915 (1992))。したがって、BLOSUM62置換頻度を使用して、本発明のアミノ酸配列に導入し得る保存的アミノ酸置換を定義することができる。化学的特性のみに基づいて(上述したように)アミノ酸置換を設計することも可能だが、「保存的アミノ酸置換」という言葉は、好ましくは、BLOSUM62の値が-1より大きいものにより表される置換を示す。例えば、BLOSUM62の値が0、1、2、又は3であることにより置換が特徴付けされる場合、当該アミノ酸置換は保存的となる。この系によれば、好適な保存アミノ酸置換は、1以上のBLOSUM62の値(例えば、1、2、又は3)により特徴付けられ、一方、より好適な保存アミノ酸置換は、2以上のBLOSUM62の値(例えば、2又は3)により特徴付けられる。
【０１９６】
ポリペプチドの特定のバリアントは、本明細書に開示した対応するアミノ酸配列(即ち、配列SEQ ID NO:1乃至SEQ ID NO:8の何れか)に対して、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は95%超の配列同一性を有することを特徴とし、それには例えば、アミノ酸配列における変異が一つ以上の保存アミノ酸置換によるものである場合がある。
【０１９７】
「保存的アミノ酸」バリアント等のアミノ酸配列のバリアントは、例えば、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発、リンカスキャニング突然変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応を用いた突然変異誘発等により得ることができる(Ausubel (1995)の8 10乃至8 22頁、及びMcPherson (編), Directed Mutagenesis: A Practical Approach (IRL Press 1991)参照)。
【０１９８】
本発明によるポリペプチドは、更に、非天然発生アミノ酸残基を含むことができる。非天然発生アミノ酸には、例えば、トランス-3-メチルプロリン、2,4-メタノプロリン、シス-4-ヒドロキシプロリン、トランス-4-ヒドロキシプロリン、N-メチルグリシン、アロ-トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、3-及び4-メチルプロリン、3,3-ジメチルプロリン、tert-ロイシン、ノルバリン、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン、及び4-フルオロフェニルアラニンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１９９】
非天然発生アミノ酸残基をポリペプチドに組み入れる幾つかの方法が当技術分野において公知である。例えば、化学的にアミノアシル化されたサプレッサtRNAを用いてナンセンス突然変異が抑制されるインビトロ系を利用できる。アミノ酸を合成する方法及びtRNAをアミノアシル化する方法は、当技術分野において公知である。ナンセンス突然変異を含むプラスミドの転写及び翻訳は、一般に、大腸菌S30抽出物と市販の酵素及び他の試薬とを含む無細胞系において実行される。ポリペプチドはクロマトグラフィにより精製する。例えば、Robertsonら, J. Am. Chem. Soc. 113:2722 (1991)、Ellmanら, Methods Enzymol. 202:301 (1991)、Chungら, Science 259:806 (1993)、及びChungら, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:10145 (1993)を参照されたい。
【０２００】
多重アミノ酸置換は、Reidhaar-Olson及びSauer(Science 241:53 (1988))又はBowie及びSauer(Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:2152 (1989))により開示されているもの等、公知の突然変異誘発及びスクリーニング方法を用いて作成及び試験可能である。簡潔に言えば、これらの筆者は、ポリペプチドにおいて二つ以上の位置を同時にランダム化して、機能性ポリペプチドを選択し、その後、当該突然変異誘発ポリペプチドの配列決定を行って、各位置において許容される置換の範囲を決定する方法を開示している。使用可能な他の方法には、ファージディスプレイ(例えば、Lowmanら, Biochem. 30:10832 (1991)、Ladnerら,米国特許第5,223,409号、Huse,国際公開公報第WO92/06204号)、及び領域指定突然変異誘発(Derbyshire ら, Gene 46:145 (1986)、及びNerら, DNA 7:127, (1988))が含まれる。
【０２０１】
開示した本発明によるヌクレオチド及びポリペプチド配列のバリアントは、Stemmer, Nature 370:389 (1994)、Stemmer, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91:10747 (1994)、及び国際公開公報第WO97/20078号に開示されているDNAシャッフリングにより生成することもできる。簡潔に言えば、バリアントDNA分子は、親DNAのランダムフラグメンテーション、及びそれに続くPCRを用いた再構築により点突然変異をランダムに導入する、インビトロ相同組換えにより生成される。この手法は、対立遺伝子バリアント又は異なる種からのDNA分子等の親DNA分子のファミリを使用することによって修正し、当該プロセスに更なる変異性を導入することができる。所望の活性を選択又はスクリーニングした後、突然変異誘発及びアッセイを更に繰り返すことは、望ましい突然変異を選択すると同時に有害な変異を除外する選択を行うことにより、配列の急速な「進化」をもたらす。
【０２０２】
本明細書で開示された突然変異誘発方法は、宿主細胞内のクローン化突然変異ポリペプチドの活性を検出するために、高スループットの自動スクリーニング方法と組み合わせることができる。生物学的に活性なポリペプチド、又は特異的抗体と結合するポリペプチドをコードする突然変異DNA分子は、宿主細胞から回収し、近代的設備を用いて迅速に配列決定することができる。こうした方法は、対象となるポリペプチド内の個々のアミノ酸残基の重要性を迅速に判定することを可能にすると共に、未知の構造のポリペプチドへ応用することもできる。
【０２０３】
本発明によるポリペプチドのフラグメント
本発明は、更に、ポリペプチドの「機能性フラグメント」と、こうした機能性フラグメントをコードする本発明によるポリヌクレオチド分子を含む。本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子の機能性フラグメントを得るために、ルーチンであるポリヌクレオチド分子のデリーション解析を実行できる。一例として、配列SEQ ID NO:1乃至SEQ ID NO:8の何れかをコードするDNA分子を、Bal31ヌクレアーゼにより消化して、一連の入れ子型欠失を得ることができる。その後、当該フラグメントを適当なリーディングフレームにおいて発現ベクタに挿入し、発現したポリペプチドを単離し、抗抗体と特異的に結合する能力について試験する。エクソヌクレアーゼ消化に代わる別の方法では、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を使用して、欠失又は終止コドンを導入し、所望のフラグメントの生産を指定する。或いは、本発明による遺伝子の特定のフラグメントは、ポリメラーゼ連鎖反応法を使用して合成できる。
【０２０４】
SEQ ID NO:1乃至SEQ ID NO:8のフラグメントは、本明細書に開示したSEQ ID NO:9乃至SEQ ID NO:72として示す一つ以上の氷結合部位を含むことが好ましい。キメラポリペプチド及びポリペプチドフラグメントも提供される。
【０２０５】
次のフラグメント:GSYSCRAVGVDASTVTDVQGTCHAKATGPGAVASGTSVDGSTSTATATGSCは、全長配列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ NO:7、及びSEQ ID NO:8に由来し、代替残基としてC末端部のC及びN末端部のGSを含む。
【０２０６】
機能性ドメインを同定する方法は、同業者に周知である。例えば、インターフェロンの何れか又は両方の末端の切断についての研究は、Horisberger及びDi Marco, Pharmac. Ther. 66:507 (1995)に要約されている。更に、ポリペプチドの機能解析用の標準的手法は、例えば、Treuterら, Molec. Gen. Genet. 240:113 (1993)、Contentら, "Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2 5A synthetase induced by human interferon," in Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (編), pages 65 72 (Nijhoff 1987)、Herschman, "The EGF Receptor," in Control of Animal Cell Proliferation, Vol. 1, Boyntonら (編) pages 169 199 (Academic Press 1985)、Coumailleauら, J. Biol. Chem. 270:29270 (1995)、 Fukunagaら, J. Biol. Chem. 270:25291 (1995)、Yamaguchiら, Biochem. Pharmacol. 50:1295 (1995)、及びMeiselら, Plant Molec. Biol. 30:1 (1996)により説明されている。
【０２０７】
本発明では、更に、配列SEQ ID NO:1乃至SEQ ID NO:8の何れかのアミノ酸配列と比較してアミノ酸変化を有する、本発明によるポリペプチドの機能性フラグメントも考えられる。バリアントポリペプチドは、本明細書で開示した特定のアミノ酸配列との同一性のレベルを決定することにより、構造に基づいて同定できる。バリアントポリペプチドを構造に基づいて同定するための別のアプローチでは、可能性のあるバリアントポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子が、上述したように配列SEQ ID NO:1乃至SEQ ID NO:8の何れかのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子とハイブリダイズ可能かを判定する。
【０２０８】
本発明は、更に、本明細書に記載された本発明によるポリペプチドのエピトープ部分を含むポリペプチドフラグメント又はペプチドを提供する。こうしたフラグメント又はペプチドは、ポリペプチド全体が免疫原として使用される場合に抗体応答を誘発するポリペプチドの一部である「免疫原性エピトープ」を含み得る。免疫原性エピトープを含むペプチドは、標準的な方法を用いて同定できる(例えば、Geysenら, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81:3998 (1983)参照)。
【０２０９】
対照的に、ポリペプチドフラグメント又はペプチドは、抗体が特異的に結合可能なポリペプチド分子の領域である「抗原性エピトープ」を含み得る。特定のエピトープは、直線状又は連続した一続きのアミノ酸から成り、こうしたエピトープの抗原性は、変性剤により破壊されない。ポリペプチドのエピトープを模倣し得る比較的短い合成ペプチドを使用して、そのポリペプチドに対する抗体の生成を刺激することができるということは、当技術分野において公知である(例えば、Sutcliffeら, Science 219:660 (1983))参照)。したがって、本発明の抗原性エピトープを含むペプチド及びポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドと結合する抗体をもたらす上で有用である。
【０２１０】
抗原性エピトープを含むペプチド及びポリペプチドは、配列SEQ ID NO:1乃至SEQ ID NO:8の何れかの中から、少なくとも4乃至10個のアミノ酸、例として少なくとも10乃至15個のアミノ酸、例えば約15乃至約30個を含むことができる。こうしたエピトープペプチド及びポリペプチドは、本明細書に記載したように、本発明によるポリペプチドを断片化することにより、或いは化学的なペプチドの合成により生成できる。更に、エピトープは、ランダムペプチドライブラリのファージディスプレイにより選択できる(例えば、Lane 及びStephen, Curr. Opin. Immunol. 5:268 (1993)、及びCorteseら, Curr. Opin. Biotechnol. 7:616 (1996)を参照)。エピトープを同定して、エピトープを含む小さいペプチドから抗体を生成する標準的な方法は、例えば、Mole, "Epitope Mapping," in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, Manson (編), pages 105 116 (The Humana Press, Inc. 1992)、Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter及びLadyman (編), pages 60 84 (Cambridge University Press 1995)、及びColiganら (編), Current Protocols in Immunology, pages 9.3.1 9.3.5 and pages 9.4.1 9.4.11 (John Wiley & Sons 1997))により説明されている。
【０２１１】
本発明によるバリアント遺伝子の特定のヌクレオチド配列に関係なく、当該遺伝子は、配列SEQ ID NO:1乃至SEQ ID NO:8の何れかと特異的に結合することが可能な抗体と特異的に結合する能力により特徴付けし得るポリペプチドをコードする。
【０２１２】
本発明による不凍ポリペプチド又は氷結合部位又は氷結合ドメインを含む融合ポリペプチド
本発明は、更に、不凍融合ポリペプチドを含む。本発明の不凍融合ポリペプチドは、特定の細胞内コンパートメント又は細胞外空間、特定の細胞又は特定の細胞型を標的にし得る。細胞内コンパートメントを標的とすることを指定又は決定するポリペプチドセグメントの付着により、不凍セグメントは、特定の細胞オルガネラを標的にし得る。ペプチドをオルガネラに方向付けるだけでなく、不凍機能は、他のポリペプチドセグメントに囲まれた時にも機能性を維持し得る。抗体又は結合における細胞特異性を有する他の分子との融合により、凍結時の細胞損傷に対する耐性を、こうした細胞型に与えることができる。この手法は、器官(organs)においても使用できる。本発明によるポリペプチドを結合し得るポリペプチドの例を以下に列記する。
融合の対象(タンパク質)
融合の利点
タンパク質A
可検出性、グラム陽性菌からの分泌、精製、容易に分裂して遊離ペプチドを生じる
β-ガラクトシダーゼ
酵素アッセイによる測定、ウェスタンブロット法における可検出性
β-ラクタマーゼ
ウェスタンブロット法における可検出性、グラム陰性菌のペリプラズムへの分泌
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
ウェスタンブロット法における可検出性、植物抽出物における酵素アッセイによる測定
病原性関連ポリペプチドprib
双子葉植物からの分泌
アルファ-アミラーゼ
単子葉植物からの分泌
フィトヘムアグルチニン
植物における液胞へのターゲティング
RuBPCASE小サブユニット
植物における葉緑体へのターゲティング
ファセオリン
種子での蓄積
アルコールデヒドロゲナーゼ
酵母での発現
アルファ接合因子
酵母からの分泌
ルシフェラーゼ
発光による可検出性
【０２１３】
したがって、本発明によるポリペプチドを含む融合ポリペプチドは、組換え宿主において本発明によるポリペプチドを発現させるため、及び発現させたポリペプチドを単離するために使用できる。ある種の融合ポリペプチドは、本発明によるポリペプチドを組換え宿主細胞から誘導するペプチドを含む。本発明によるポリペプチドを真核宿主細胞の分泌経路へ方向付けるためには、分泌シグナル配列(シグナルペプチド、リーダ配列、プレプロ配列、又はプレ配列としても知られる)を適切な発現ベクタに提供する。分泌シグナル配列は本発明によるポリペプチドに由来してもよいが、適したシグナル配列は、別の分泌ポリペプチドに由来してもよく、或いはデノボ合成してもよい。二つの配列が正しいリーディングフレームにおいて接合され、新たに合成されたポリペプチドが宿主細胞の分泌経路へ方向付けされる形になるような位置で、分泌シグナル配列は、本発明による配列をコードする遺伝子と機能的にリンクされる。分泌シグナル配列は、一般に、対象のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して5'に位置するが、特定の分泌シグナル配列は、対象のヌクレオチド配列の他の場所に位置してもよい(例えば、Welchら、米国特許第5,037,743号、Hollandら、米国特許第5,143,830号を参照)。
【０２１４】
本発明による遺伝子又は哺乳類細胞により生成された別のポリペプチド(例えば、米国特許第5,641,655号に記載されるような組織型プラスミノーゲン活性化因子シグナル配列等)の分泌シグナル配列は、組換え哺乳類宿主における本発明による遺伝子の発現に有用だが、酵母シグナル配列は、酵母細胞における発現に好適である。適切な酵母シグナル配列の例は、酵母接合フェロモンアルファ因子(MF-アルファ1遺伝子によりコードされる)、インベルターゼ(SUC2遺伝子によりコードされる)、又は酸ホスファターゼ(PHO5遺伝子によりコードされる)に由来するものである。例えば、Romanosら, "Expression of Cloned Genes in Yeast," in DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2nd Edition, Glover及びHames (編), pages 123 167 (Oxford University Press 1995)を参照されたい。
【０２１５】
細菌細胞では、発現したポリペプチドの毒性を減少させ、安定性を高め、回収を促進するために、異種ポリペプチドを融合ポリペプチドとして発現させるのが望ましい場合が多い。例えば、本発明による遺伝子は、グルタチオン-S-トランスフェラーゼポリペプチドを含む融合ポリペプチドとして発現させることができる。グルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合ポリペプチドは、一般に可溶性であり、固定化グルタチオンカラムにおいて大腸菌溶解物から容易に精製可能である。同様のアプローチにおいて、マルトース結合ポリペプチドポリペプチドを含む本発明による融合ポリペプチドは、アミロース樹脂カラムにより単離可能であり、一方、ポリペプチドA遺伝子の切断されたC末端を含む融合ポリペプチドは、IgG-セファロースを用いて精製可能である。細菌細胞において融合ポリペプチドとして異種ポリペプチドを発現するための確立された技術は、例えば、Williamsら, "Expression of Foreign polypeptides in E. coli Using Plasmid Vectors and Purification of Specific Polyclonal Antibodies," in DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2nd Edition, Glover及びHames (編), pages 15 58 (Oxford University Press 1995)により説明されている。加えて、市販の発現系も利用可能である。例えば、PINPOINT Xaポリペプチド精製系(Promega Corporation、ウィスコンシン州マディソン)は、発現中にビオチン化されるポリペプチドを含む融合ポリペプチドを、アビジンを含む樹脂により単離する方法を提供する。
【０２１６】
原核細胞又は真核細胞により発現される異種ポリペプチドを単離するのに有用なペプチドタグには、ポリヒスチジンタグ(ニッケルキレート樹脂に対する親和性を有する)、c-mycタグ、カルモジュリン結合ポリペプチド(カルモジュリン親和性クロマトグラフィを用いて単離)、P物質、RYIRSタグ(抗RYIRS抗体と結合)、Glu-Gluタグ、及びFLAGタグ(抗FLAG抗体と結合)が含まれる。例えば、Luoら, Arch. Biochem. Biophys. 329:215 (1996)、Morgantiら, Biotechnol. Appl. Biochem. 23:67 (1996)、及びZhengら, Gene 186:55 (1997)を参照されたい。こうしたペプチドタグをコードするポリヌクレオチド分子は、例えば、Sigma-Aldrich Corporation (ミズーリ州セントルイス)から入手できる。
【０２１７】
融合ポリペプチドの別の形態は、本発明によるポリペプチドと、免疫グロブリン重鎖定常領域、一般には、二つの定常領域ドメイン及びヒンジ領域を含むが可変領域が無いFcフラグメントとを含む。一例として、Changらの米国特許第5,723,125号では、ヒトインターフェロンとヒト免疫グロブリンFcフラグメントとを含む融合タンパク質を説明している。インターフェロンのC末端は、ペプチドリンカ部分によりFcフラグメントのN末端に連結されている。ペプチドリンカの例には、免疫学的に不活性なT細胞不活性配列を主に含むペプチドがある。ペプチドリンカの一例は、アミノ酸配列:GGSGG SGGGG SGGGG S(SEQ ID NO:91)を有する。この融合ポリペプチドにおいて、好適なFc部分は、溶液中で安定であり且つ補体活性化作用を殆ど又は全く有しないヒトガンマ4鎖である。したがって、本発明では、本発明によるポリペプチド又はそのフラグメントとヒトFcフラグメントとを含み、本発明によるポリペプチド又はそのフラグメントのC末端がペプチドリンカを介してFcフラグメントのN末端に付着した融合ポリペプチドが考えられる。
【０２１８】
別のバリエーションにおいて、本発明によるポリペプチドを含む融合ポリペプチドは、更に、IgG配列を含む。本発明によるポリペプチド部分は、IgG配列のアミノ末端部と、本発明によるポリペプチド部分のアミノ末端と共有結合したシグナルペプチドとに共有結合しており、当該IgG配列は、以下の順序で以下の要素を含むか、或いはこれらから成る:ヒンジ領域、CH2ドメイン、及びCH3ドメイン。したがって、当該IgG配列は、CH1ドメインを欠いている。本発明によるポリペプチド部分は、氷結合活性を示す。抗体と非抗体部分との両方を含む融合タンパク質を生成するためのこの一般的なアプローチは、LaRochelleらによるEP742830(WO95/21258)において説明されている。
【０２１９】
融合タンパク質は、融合タンパク質の各成分を調製して化学的にコンジュゲートさせることにより、当業者に公知の方法で調製可能である。或いは、融合ポリペプチドの両成分を適切なリーディングフレーム内においてコードするポリヌクレオチドを、公知の手法を用いて生成し、本明細書に記載の方法により発現させることができる。融合タンパク質の酵素的及び化学的切断のための一般的な方法は、例えば、Ausubel (1995) の16 19乃至16 25頁において説明されている
【０２２０】
本発明によるポリペプチド及びフラグメントの生成のための一般的方法
【０２２１】
本発明による不凍ポリペプチドの合成は、生物学的形態及び合成的形態という、二種類の形態で追求し得る。生物学的方法は、ポリペプチドコード配列又は遺伝子の発現によるものであり、合成的方法は、ポリペプチドの化学合成によるものである。
【０２２２】
好適な合成方法では、Merrifieldが開発したもの(J. Am. Chem. Soc., (1963) 85:2149-2156)等の固相ペプチド合成を利用する。この方法は、不凍活性のための特定の組成又は配合を試験する上で特に有用である。
【０２２３】
大量生産には、通常、生物学的発現が好適である。コードするポリヌクレオチド又は遺伝子は、組換え修飾を有する天然遺伝子、或いは完全に合成された配列でもよく、適切な発現系において発現させる。適切なベクタへの天然配列セグメントの挿入のために利用する方法は、当業者に周知であり、Maniatis又はWuら(1987) Methods in Enzymology, Vol. 153, Academic Press, New York, N.Y.を参照されたい。
【０２２４】
合成配列をホスホラミダイト化学反応により合成して、配列の特定のセクションを作成できる(Beaucage及びCarruthers, (1981) Tet. Letters, 22:1859-1862)。オーバーラップするセグメントを合成し、その後、互いに連結して、より大きな遺伝子を生成できる。
【０２２５】
最後に、不凍セグメント用の特定の配列を選択することで、当業者に明らかであるように、互いに容易に連結させ得る、或いは挿入してタンデムリピートを発生させ得る、制限酵素切断部位を導入し得る。
【０２２６】
不凍ポリペプチドの精製は、ポリペプチド精製に関する当業者に公知の方法による。標準的な精製手法は、細胞溶解物、或いは、ポリペプチドが分泌される場合は培地から、行い得る。代表的な方法は、カラムクロマトグラフィ、硫安塩析、抗体親和性クロマトグラフィ等である。天然発生ポリペプチド(例えば、魚類において産生されるもの)についての好適な精製方法は、DeVriesら、(1977) Biochem Biophys. Acta 495:388-392に記載されている。
【０２２７】
好ましくは、不凍ポリペプチドは、実質的に均一に、通常は少なくとも純度約70%乃至80%、好ましくは純度約90乃至95%、最も好ましくは純度99%以上まで精製される。一般に、ポリペプチドは、自然状態で付随する魚の化合物の混入を実質的に含まない。
【０２２８】
全長ポリペプチド、機能性フラグメント、及び融合ポリペプチドを含め、本発明のポリペプチドを、従来の手法に従って組換え宿主細胞において有利に産生し得ることは、以上から明らかである。
【０２２９】
本発明による遺伝子を発現させるためには、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を、発現ベクタにおける転写発現を制御する調節配列と機能的にリンクさせ、その後、宿主細胞へ導入する必要がある。プロモータ及びエンハンサ等の転写調節配列に加え、発現ベクタは、翻訳調節配列と、発現ベクタを有する細胞の選択に適したマーカ遺伝子を含むことができる。
【０２３０】
真核細胞における外来ポリペプチドの生成に適した発現ベクタは、一般に、(1)細菌宿主における発現ベクタの増殖及び選択の手段を提供するための細菌複製起点及び抗生物質耐性マーカをコードする原核生物DNAエレメントと、(2)プロモータ等、転写の開始を制御する真核生物DNAエレメントと、(3)転写終結/ポリアデニル化配列等、転写物のプロセシングを制御するDNAエレメントとを含む。
【０２３１】
上述したように、発現ベクタは、更に、異種ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路内へ方向付ける分泌配列をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。例えば、発現ベクタは、本発明による遺伝子と、当該遺伝子又は他の分泌される遺伝子に由来する分泌配列を含み得る。
【０２３２】
細菌と共に一般的に使用されるベクタの例は、pETシリーズ(NOVAGEN)、pGEXシリーズ(GE Healthcare)、pBADシリーズ(Invitrogen)である。酵母におけるのベクタの例には、Pichia用のpPICシリーズ(Invitrogen)、Kluyveromyces lactis由来のpKlac系(New England biolabs)、S.cereviseaeベクタ(Patel, O., Fearnley, R., 及びMacreadie, I.. 3002. Saccharomyces cerevisiae expression vectors with thrombin-cleavable N- and C-terminal 6x(His) tags. Biotechnol Lett. 2003 25(4):331- 334)、及びS.cereviseae用のpYes系(Invitrogen)がある。
【０２３３】
真菌において使用するベクタの例には、pBARシリーズ(Pall, M. L.及びJ. Brunelli. 1993に記載。独特な制限部位を有するポリリンカを含有する一連の六種類のコンパクトな真菌形質転換ベクタ。Fungal Genetics Newsletter 40: 59-61)がある。pIExプラスミドベースのシステム(Merck)又はバキュロウイルスベースのシステム(Merck)は、昆虫細胞において有用なシステムの二例である。同様の製品を他社から入手できる。
【０２３４】
昆虫細胞において使用するベクタの例には、テトラサイクリン調節システムpTet及びpTre、アデノウイルスベースのシステムであるAdeno-X、レトロウイルスベースのシステムであるRethto-X(全てClontech)、及びpcDNAベクタ(Invitrogen)が含まれる。ここでも、更に多くの例があり、販売されている。
【０２３５】
本発明によるポリペプチドは、哺乳類細胞で発現され得る。適切な哺乳類宿主細胞の例には、アフリカミドリザル腎細胞(Vero、TCC CRL 1587)、ヒト胚腎細胞(293-HEK、ATCC CRL 1573)、ベビーハムスタ腎細胞(BHK-21、BHK-570、ATCC CRL 8544、ATCC CRL 10314)、イヌ腎細胞(MDCK、ATCC CCL 34)、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO-K1、ATCC CCL61、CHO DG44[Chasinら, Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986])、ラット下垂体細胞(GE1、ATCC CCL82)、HeLa S3細胞(ATCC CCL2.2)、ラット肝細胞癌細胞(H-4-II-E、ATCC CRL 1548)、SV40形質転換サル腎細胞(COS-1、ATCC CRL 1650)、及びマウス胚細胞(NIH-3T3、ATCC CRL 1658)が含まれる。
【０２３６】
哺乳類宿主の場合、転写及び翻訳調節シグナルは、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、シミアンウイルス等のウイルスに由来し得、当該調節シグナルは高レベルで発現する特定の遺伝子に関連するものである。適切な転写及び翻訳の調節配列は、アクチン、コラーゲン、ミオシン、及びメタロチオネイン遺伝子といった哺乳類遺伝子から得ることもできる。
【０２３７】
転写調節配列は、RNA合成の開始を命令する上で十分なプロモータ領域を含む。適切な真核生物プロモータには、マウスメタロチオネインI遺伝子のプロモータ(Hamerら, J. Molec. Appl. Genet. 1:273 (1982))、ヘルペスウイルスのTKプロモータ(McKnight, Cell 31:355 (1982))、SV40早期プロモータ(Benoistら, Nature 290:304 (1981))、ラウス肉腫ウイルスプロモータ(Gormanら, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79:6777 (1982))、サイトメガロウイルスプロモータ(Foeckingら, Gene 45:101 (1980))、及びマウス乳腺腫瘍ウイルスプロモータ(一般的には、Etcheverry, "Expression of Engineered polypeptides in Mammalian Cell Culture," in polypeptide Engineering: Principles and Practice, Clelandら(編), pages 163 181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)を参照)が含まれる。
【０２３８】
或いは、原核生物のプロモータが真核生物のプロモータにより調節される場合、バクテリオファージT3 RNAポリメラーゼプロモータ等の原核生物プロモータを使用して、哺乳類細胞における遺伝子発現を制御することができる(Zhouら, Mol. Cell. Biol. 10:4529 (1990)、及びKaufmanら, Nucl. Acids Res. 19:4485 (1991))。
【０２３９】
発現ベクタは、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、マイクロプロジェクタイル媒介導入、エレクトロポレーション等を含む様々な標準的手法を用いて、宿主細胞に導入することができる。トランスフェクト細胞を選択して増殖させ、宿主細胞ゲノムに安定的に挿入された発現ベクタを含む組換え宿主細胞を提供できる。
【０２４０】
ベクタを真核細胞に導入する手法と、優性選択マーカを使用して、こうした安定した形質転換体を選択する手法は、例えば、Ausubel (1995)、及びMurray (編), Gene Transfer and Expression Protocols (Humana Press 1991)に記載されている。したがって、本発明による遺伝子は、鳥類、真菌、昆虫、酵母、及び植物細胞等の高等真核生物において発現し得る。
【０２４１】
例えば、適切な選択マーカの一つは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性を与える遺伝子である。この場合、G-418等のネオマイシン系薬物の存在下で選択を行う。選択系は、対象の遺伝子の発現レベルを増加させる「増幅」と呼ばれるプロセスにも使用できる。増幅は、形質転換体を低レベルの選択剤の存在下で培養し、その後、導入遺伝子の産物を高レベルで生成する細胞を選択するために選択剤を増量することにより実行される。
【０２４２】
適切な増幅可能選択マーカは、メトトレキセートに対する耐性を与えるジヒドロ葉酸レダクターゼである。他の薬剤耐性遺伝子(例えば、ハイグロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ)を使用することもできる。或いは、緑色蛍光ポリペプチド等、表現型を変化させるもの、又はCD4、CD8、クラスI MHC、及び胎盤アルカリホスファターゼ等の細胞表面ポリペプチドを導入するマーカを使用して、FACSソーティング及び磁気ビーズ分離技術等の手段により、非トランスフェクト細胞からトランスフェクト細胞を選別することができる。
【０２４３】
本発明によるポリペプチドは、更に、ウイルスデリバリー系を使用した培養哺乳類細胞により生成し得る。この目的でのウイルスの例には、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、及びアデノ随伴ウイルス(AAV)が含まれる。アデノウイルスは、二本鎖DNAウイルスであり、現在最も研究されている異種ポリヌクレオチドデリバリー用遺伝子導入ベクタである(総説については、Beckerら, Meth. Cell Biol. 43:161 (1994)と、Douglas及びCuriel, Science & Medicine 4:44 (1997)とを参照)。アデノウイルス系の利点には、比較的長いDNAの挿入を受け入れること、高タイターで増殖する能力、広範囲の哺乳類細胞型に感染する能力、及び様々なプロモータを含む多数の利用可能なベクタによる使用を可能とする柔軟性、が含まれる。
【０２４４】
アデノウイルスゲノムの一部を欠失させることで、より大きな異種DNAの挿入(最長7kb)が許容される。これらの挿入物は、直接のライゲーション、又は、同時にトランスフェクトするプラスミドとの相同組換えにより、ウイルスDNAに組み込むことができる。選択肢の一つは、ウイルスベクタから必須のE1遺伝子を欠失させることであり、その結果、ウイルスベクタは、E1遺伝子が宿主細胞から提供されない限り、複製が不可能となる。例えば、アデノウイルスベクタを感染させたヒト293細胞(ATCC No.CRL-1573、45504、45505)を、接着細胞として、又は比較的細胞密度の高い懸濁培養で成長させ、相当量のポリペプチドを生成することができる(Garnierら, Cytotechnol. 15:145 (1994)を参照)。
【０２４５】
トランスジェニック生物を発生させる方法については、当技術分野において公知であり、表3を参照されたい。
【表３】
0005474809.tif 000016
【０２４６】
バキュロウイルス系は、本発明によるクローン化遺伝子を昆虫細胞に導入する効率的手段を提供する。適切な発現ベクタは、Autographa californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)に基づくものであり、ショウジョウバエ(Drosophila)熱ショックタンパク質(hsp)70プロモータ、Autographa californica核多角体病ウイルスの前初期遺伝子プロモータ(ie-1)及び遅延初期39Kプロモータ、バキュロウイルスp10プロモータ、及びショウジョウバエメタロチオネインプロモータ等の周知のプロモータを含む。
【０２４７】
組換えバキュロウイルスを作成する第二の方法は、Luckow(Luckowら, J. Virol. 67:4566 (1993))に記載のトランスポゾンに基づく系を利用する。この系は、転送ベクタを利用するものであり、BAC-to-BACキットとして販売されている(Life Technologies、メリーランド州ロックビル)。この系では、Tn7トランスポゾンを含む転送ベクタPFASTBAC(Life Technologies)を利用して、本発明によるポリペプチドをコードするDNAを、「バクミド」と呼ばれる大型プラスミドとして大腸菌内で維持されるバキュロウイルスゲノムに移動させる。Hill-Perkins及びPossee., J. Gen. Virol. 71:971 (1990)、Bonningら, J. Gen. Virol. 75:1551 (1994)、及びChazenbalk及びRapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995)を参照されたい。
【０２４８】
加えて、転送ベクタは、発現した本発明によるポリペプチドのC末端又はN末端におけるエピトープタグ、例えばGlu-Gluエピトープタグ(Grussenmeyerら, Proc. Nat'l Acad. Sci. 82:7952 (1985))をコードするDNAとのインフレーム融合体を含むことができる。当技術分野で公知の手法を使用することにより、本発明による遺伝子を含む転送ベクタは、大腸菌において形質転換に用いられ、組換えバキュロウイルスを示す分断化lacZ遺伝子を含むバクミドについてスクリーニングされる。その後、組換えバキュロウイルスゲノムを含むバクミドDNAを、通常の技法で単離する。
【０２４９】
一例であるPFASTBACベクタは、相当程度まで改変可能である。例えば、ポリヘドリンプロモータを除去し、バキュロウイルス感染において早期に発現し且つ分泌されたポリペプチドの発現に有利であることが証明されているバキュロウイルス塩基性ポリペプチドプロモータ(Pcor、p6.9、又はMPプロモータとしても知られる)により置換し得る(Hill-Perkins及びPossee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990)、 Bonningら, J. Gen. Virol. 75:1551 (1994)、及びChazenbalk及びRapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995)を参照)。こうした転送ベクタコンストラクトでは、長短何れかのタイプの塩基性タンパク質プロモータを使用することができる。更に、本発明によるポリペプチドの天然分泌シグナル配列を昆虫ポリペプチドに由来する分泌シグナル配列で置換した転送ベクタを構築することができる。例えば、エクジステロイドグルコシルトランスフェラーゼ(EGT)、ミツバチメリチン(Invitrogen Corporation、カリフォルニア州カールズバッド)、又はバキュロウイルスgp67(PharMingen、カリフォルニア州サンディエゴ)に由来する分泌シグナル配列をコンストラクトにおいて使用し、天然の分泌シグナル配列と置き換えることができる。
【０２５０】
組換えウイルス又はバクミドは、宿主細胞をトランスフェクトするために使用される。適切な昆虫宿主細胞には、IPLB-Sf-21に由来する細胞系、Sf9(ATCC CRL 1711)、Sf21AE、及びSf21(Invitrogen Corporation、カリフォルニア州サンディエゴ)等のSpodoptera frugiperda蛹卵巣細胞系と、ショウジョウバエSchneider-2細胞、及びTrichoplusia niに由来するHIGH FIVEO 細胞系(Invitrogen)(米国特許第5,300,435号)とが含まれる。市販の無血清培地を使用して、細胞を培養及び維持することができる。適切な培地は、Sf9細胞用のSf900 IITM(Life Technologies)又はESF 921TM(Expression Systems)、及びT.ni細胞用のEx-cellO405TM(JRH Biosciences、カンザス州レネクサ)又はExpress FiveOTM(Life Technologies)である。組換えウイルスを使用する場合、細胞は、通常、約2乃至5×105細胞の接種密度から1乃至2×106細胞の密度まで増殖させ、その時点で組換えウイルスのストックを0.1乃至10、更に一般的には3に近い感染効率(MOI)で添加する。
【０２５１】
バキュロウイルス系において組換えポリペプチドを生成するための確立された手法は、Baileyら, "Manipulation of Baculovirus Vectors," in Methods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (編), pages 147 168 (The Humana Press, Inc. 1991)、Patelら, "The baculovirus expression system," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Gloverら (編), pages 205 244 (Oxford University Press 1995)、Ausubel (1995) at pages 16 37 to 16 57、Richardson (編), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995)、及びLucknow, "Insect Cell Expression Technology," in polypeptide Engineering: Principles and Practice, Clelandら(編), pages 183 218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)において提示されている。
【０２５２】
酵母細胞を含む真菌細胞を用いて、本明細書に記載の遺伝子を発現させることもできる。この点において特に対象となる酵母には、Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、及びPichia methanolicaが含まれる。酵母における発現に適したプロモータには、GAL1(ガラクトース)、PGK(ホスホグリセリン酸キナーゼ)、ADH(アルコールデヒドロゲナーゼ)、AOX1(アルコールオキシダーゼ)、HIS4(ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ)等からのプロモータが含まれる。多くの酵母クローニングベクタが設計されており、容易に入手できる。これらのベクタには、YIp5等のYIpに基づくベクタ、YRp17等のYRpベクタ、YEp13等のYEpベクタ、及びYCp19等のYCpベクタが含まれる。外来性DNAによりS.cerevisiae細胞を形質転換して、組換えポリペプチドを生成する方法は、例えば、Kawasaki、米国特許第4,599,311号、Kawasakiら、米国特許第4,931,373号、Brake、米国特許第4,870,008号、Welchら、米国特許第5,037,743号、及びMurrayら、米国特許第4,845,075号により開示されている。形質転換細胞は、通常は薬剤耐性又は特定の栄養素(例えば、ロイシン)の不在下で増殖する能力である選択マーカで決定される表現型により選択される。Saccharomyces cerevisiaeでの使用に適したベクタ系の一つは、グルコース含有培地中での増殖により形質転換細胞を選択可能な、Kawasakiら(米国特許第4,931,373号)により開示されているPOT1ベクタ系である。酵母での使用に適した他のプロモータ及びターミネータには、糖分解酵素遺伝子(例えば、Kawasaki、米国特許第4,599,311号、Kingsmanら、米国特許第4,615,974号、及びBitter、米国特許第4,977,092号を参照)及びアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子からのものが含まれる。米国特許第号4,990,446号、第5,063,154号、第5,139,936号、及び第4,661,454号も参照されたい。一般的に使用及び/又は市販される、酵母での使用に適したベクタの他の例は、pPICシリーズ(Invitrogen)、Kluyveromyces lactis由来のpKlac系(New England Biolabs)、及びS.cerevisaeベクタ(Patelら, Biotechnology letters 2003 vol 25(4):331-334)と、S.cerevisae用のpYes 系(Invitrogen)である。真菌では、pBARシリーズが有用である(Pallら, 1993 vol. 40:59-61, Functional Genetics Newsletter)。
【０２５３】
Hansenula polymorpha、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces fragilis、Ustilago maydis、Pichia pastoris、Pichia methanolica、Pichia guillermondii、及びCandida maltosaを含む他の酵母の形質転換系も、当技術において周知である。例えば、Gleesonら, J. Gen. Microbiol. 132:3459 (1986)、及びCregg、米国特許第4,882,279号を参照されたい。アスペルギルス細胞は、McKnightら、米国特許第4,935,349号の方法により利用し得る。Acremonium chrysogenumを形質転換する方法は、Suminoら、米国特許第5,162,228号に開示されている。ニューロスポラを形質転換する方法は、Lambowitz、米国特許第4,486,533号に開示されている。
【０２５４】
例えば、組換えポリペプチドを生成する宿主としてのPichia methanolicaの使用は、Raymond、米国特許第5,716,808号、Raymond、米国特許第5,736,383号、Raymondら、Yeast 14:11-23 (1998)、及び国際公開公報第WO97/17450号、第WO97/17451号、及び第WO98/02565号により開示されている。P.methanolicaの形質転換に使用するDNA分子は、通常、形質転換前に直線状化可能な二本鎖の環状プラスミドとして調製される。P.methanolicaにおけるポリペプチド生成では、プラスミド内のプロモータ及びターミネータは、P.methanolicaアルコール利用遺伝子(AUG1又はAUG2)等、P.methanolica遺伝子のものにすることができる。他の有用なプロモータには、ジヒドロキシアセトンシンターゼ(DHAS)、ギ酸脱水素酵素(FND)、及びカタラーゼ(CAT)遺伝子のものが含まれる。宿主染色体へのDNAの組込みを促進するためには、プラスミドの発現セグメント全体が、両末端において宿主DNA配列と隣接していることが好ましい。Pichia methanolicaでの使用に適した選択マーカは、ホスホリボシル-5-アミノイミダゾールカルボキシラーゼ(AIRC、EC 4.1.1.21)をコードし、アデニンの不在下でade2宿主細胞の増殖を可能にする、P.methanolica ADE2遺伝子である。メタノールの使用を最小限にすることが望ましい大規模な産業プロセスでは、両方のメタノール利用遺伝子(AUG1及びAUG2)が欠失した宿主細胞を使用することが可能である。分泌ポリペプチドの生成では、液胞プロテアーゼ遺伝子(PEP4及びPRB1)が欠失した宿主細胞を使用できる。エレクトロポレーションを使用して、対象のポリペプチドをコードするDNAを含むプラスミドのP.methanolica細胞への導入を促進する。P.methanolica細胞は、電界強度が2.5乃至4.5kV/cm、好ましくは約3.75kV/cm、時定数(t)が1乃至40ミリ秒、最も好ましくは約20ミリ秒である、指数関数的に減衰するパルス電場を用いたエレクトロポレーションにより、形質転換することができる。
【０２５５】
発現ベクタは、植物プロトプラスト、無傷の植物組織、又は単離植物細胞に導入することもできる。発現ベクタを植物組織に導入する方法には、Agrobacterium tumefaciensによる植物組織の直接感染又は共培養、マイクロプロジェクタイル媒介導入、DNA注入、エレクトロポレーション等が含まれる。例えば、Horschら, Science 227:1229 (1985)、Kleinら, Biotechnology 10:268 (1992)、及びMikiら, "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants", in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glickら(編), pages 67 88 (CRC Press, 1993)を参照されたい。
【０２５６】
或いは、本発明による遺伝子は、原核宿主細胞において発現させることができる。本発明によるポリペプチドを原核宿主において発現させるために使用できる適切なプロモータは当業者に周知であり、T4、T3、Sp6、及びT7ポリメラーゼを認識可能なプロモータと、バクテリオファージラムダのPR及びPLプロモータと、大腸菌のtrp、recA、熱ショック、lacUV5、tac、lpp-lacSpr、phoA、及びlacZプロモータと、B.subtilisのプロモータと、バシラス属(Bacillus)のバクテリオファージのプロモータと、ストレプトミセス属(Streptomyces)のプロモータと、バクテリオファージラムダのintプロモータと、pBR322のblaプロモータと、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のCATプロモータとが含まれる。原核生物のプロモータについては、Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277 (1987)、Watsonら, Molecular Biology of the Gene, 4th Ed. (Benjamin Cummins 1987)、及びAusubelら (1995)により概説されている。
【０２５７】
適切な原核生物宿主には、大腸菌及び枯草菌(Bacillus subtilus)が含まれる。大腸菌の適切な株には、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE、DH1、DH4I、DH5、DH5I、DH5IF、DH5IMCR、DH10B、DH10B/p3、DH11S、C600、HB101、JM101、JM105、JM109、JM110、K38、RR1、Y1088、Y1089、CSH18、ER1451、及びER1647が含まれる(例えば、Brown (編), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)を参照)。枯草菌の適切な株には、BR151、YB886、MI119、MI120、及びB170が含まれる(例えば、Hardy, "Bacillus Cloning Methods", DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (編) (IRL Press 1985)を参照)。
【０２５８】
本発明によるポリペプチドを大腸菌等の細菌で発現させる場合、ポリペプチドは、通常、不溶性の顆粒として細胞質中に維持されていてよく、或いは細菌の分泌配列によりペリプラズムの空間に方向付けてもよい。前者の場合は、細胞を溶解し、顆粒を回収し、例えばグアニジンイソチオシアネート又は尿素を用いて変性させる。次に、変性ポリペプチドは、尿素と、還元型及び酸化型グルタチオンの組み合わせとの溶液に対する透析、及びその後の緩衝生理食塩溶液に対する透析等により、変性剤を希釈することにより、再び折りたたんで二量体化することができる。後者の場合、細胞を(例えば、超音波処理又は浸透圧ショックにより)破砕し、ペリプラズム空間の内容物を放出させて、ポリペプチドを回収することにより、変性及び再折りたたみの必要性を除去して、ポリペプチドを可溶性の機能的な形態でペリプラズムから回収できる。
【０２５９】
ポリペプチドを原核宿主において発現させる方法は、当業者に周知である(例えば、Williamsら, "Expression of foreign polypeptides in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Gloverら (編), page 15 (Oxford University Press 1995)、Wardら, "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)、及びGeorgiou, "Expression of polypeptides in Bacteria," in polypeptide Engineering: Principles and Practice, Clelandら(編), page 101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)を参照)。
【０２６０】
発現ベクタを細菌、酵母、昆虫、及び植物の細胞に導入する標準的な方法は、例えばAusubel (1995)により提示されている。
【０２６１】
哺乳類細胞系が生成する外来ポリペプチドの発現及び回収を行う一般的な方法は、例えば、Etcheverry, "Expression of Engineered polypeptides in Mammalian Cell Culture," in polypeptide Engineering: Principles and Practice, Clelandら (編), pages 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996)により提示されている。細菌系によって生成されたポリペプチドを回収する標準的な手法は、例えば、Grisshammerら, "Purification of over-produced polypeptides from E. coli cells," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Gloverら (編), pages 59 92 (Oxford University Press 1995)により提示されている。組換えポリペプチドをバキュロウイルス系から単離する確立された方法は、Richardson (ら), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995)に記載されている。
【０２６２】
代わりの方法として、本発明のポリペプチドは、純固相合成、部分固相法、フラグメント縮合、又は古典的な溶液中合成により合成できる。これらの合成方法は当業者には周知である(例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963), Stewartら, "Solid Phase Peptide Synthesis" (2nd Edition), (Pierce Chemical Co. 1984)、Bayer及びRapp, Chem. Pept. Prot. 3:3 (1986)、Athertonら, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press 1989)、Fields及びColowick, "Solid-Phase Peptide Synthesis," Methods in Enzymology Volume 289 (Academic Press 1997)、及びLloyd-Williamsら, Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and polypeptides (CRC Press, Inc. 1997)を参照)。「ネイティブケミカルライゲーション」及び「発現ポリペプチドライゲーション」等、完全に化学合成する戦略の変形も標準的である(例えば、Dawsonら, Science 266:776 (1994)、Hackengら, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:7845 (1997)、Dawson, Methods Enzymol. 287: 34 (1997)、Muirら, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:6705 (1998)、及びSeverinov及びMuir, J. Biol. Chem. 273:16205 (1998)を参照)。
【０２６３】
本発明では、本明細書に記載のペプチド又はポリペプチドを含む組成物が考えられる。こうした組成物は、更に担体を含み得る。担体は、通常の有機又は無機担体であり得る。担体の例には、水、緩衝溶液、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、コーン油等が含まれる。
【０２６４】
本発明によるポリペプチドの単離
本発明のポリペプチドは、混入する高分子、特に他のポリペプチド及びポリヌクレオチドに関して、少なくとも純度約80%、少なくとも純度約90%、少なくとも純度約95%、又は95%を超える純度まで精製することが可能であり、感染性及び発熱性因子を含まない。本発明のポリペプチドはまた、薬学的に純粋な状態、即ち99.9%を超える純度まで精製することもできる。特定の調製物において、精製されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。
【０２６５】
分画及び/又は従来の精製方法を用いて、天然源から精製された本発明によるポリペプチドのの調製物と、組換え宿主細胞から精製された本発明による組換えポリペプチド及び本発明による融合ポリペプチドを得ることができる。一般に、試料の分画には、硫安沈殿及び酸又はカオトロープ抽出を使用し得る。精製段階の例は、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、FPLC、及び逆相高速液体クロマトグラフィを含み得る。適切なクロマトグラフ媒体には、誘導体化デキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特殊シリカ等が含まれる。PEI、DEAE、QAE、及びQの誘導体が好ましい。クロマトグラフ媒体には、Phenyl-Sepharose FF(Pharmacia)、Toyopearl butyl 650(Toso Haas、ペンシルバニア州モンゴメリービル)、Octyl-Sepharose(Pharmacia)等、フェニル基、ブチル基、又はオクチル基により誘導体化された媒体、或いはAmberchrom CG 71(Toso Haas)等のポリアクリル樹脂が含まれる。適切な固体支持体には、使用される条件下で不溶性であるガラスビーズ、シリカに基づく樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋ポリアクリルアミド樹脂等が含まれる。これらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、及び/又は炭化水素部分によるポリペプチドの付着を可能にする反応基で修飾し得る。
【０２６６】
結合化学反応の例には、臭化シアン活性化、N-ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化、及びカルボジイミド結合化学反応のためのカルボキシル及びアミノ誘導体が含まれる。上記及び他の固体媒体は、当技術において周知であり、広く使用されており、民間供給業者から入手できる。ポリペプチドを単離及び精製する特定の方法の選択は、ルーチン的に検討される問題であり、選択した支持体の性質によりある程度は決定される。例えば、Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology 1988)、及びDoonan, polypeptide Purification Protocols (The Humana Press 1996)を参照されたい。
【０２６７】
当業者は、本発明によるポリペプチドの単離及び精製の追加的な変形例を考案することができる。例えば、下記のように得られた、本発明によるポリペプチド及びそのフラグメントを認識する特異抗体を用いて、免疫親和性精製により大量のポリペプチドを単離することができる。
【０２６８】
本発明のポリペプチドは、特定の性質を利用して単離することもできる。例えば、固定化金属イオン吸着(IMAC)クロマトグラフィを使用して、ポリヒスチジンタグを含むものを含む、ヒスチジンに富んだポリペプチドを精製することができる。簡潔に言えば、最初に、ゲルに二価金属イオンを充填し、キレートを形成する(Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1 (1985))。ヒスチジンに富んだポリペプチドは、使用した金属イオンに依存して異なる親和性でこの基質に吸着され、競合溶出、pHの低下、又は強力なキレート剤の使用により溶出される。他の精製方法には、レクチン親和性クロマトグラフィ及びイオン交換クロマトグラフィによるグリコシル化ポリペプチドの精製が含まれる(M. Deutscher, (編), Meth. Enzymol. 182:529 (1990))。本発明の別の態様では、対象のポリペプチドと親和性タグ(例えば、マルトース結合ポリペプチド、免疫グロブリンドメイン)との融合体を構築して、精製を促進し得る。
【０２６９】
本発明によるポリペプチド又はそのフラグメントは、更に、上述したように化学合成により調製し得る。本発明によるポリペプチドは、単量体又は多量体であってよく、グリコシル化又は非グリコシル化、PEG化又は非PEG化されてよく、最初のメチオニンアミノ酸残基を含んでも含まなくてもよい。
【０２７０】
本発明によるポリペプチドに対して特異的な抗体の生成
本発明による氷結合ポリペプチド又はそのフラグメントに対する抗体は、例えば、適切な宿主生物内において本発明による遺伝子を備える発現ベクタから生成された産物を抗原として使用すること、或いは、天然源から単離された、又は従来の任意の固相合成戦略を使用して合成された、本発明によるポリペプチドを使用することにより、得ることができる。特に有用な抗体は、本発明によるポリペプチドと「特異的に結合」する。抗体は、次の二つの特性のうち少なくとも一つを示す場合、特異的に結合すると見做される:(1)抗体が結合活性の閾値レベルで本発明によるポリペプチドと結合する。(2)抗体が、下に規定するように、本発明によるポリペプチドに関連するポリペプチドと有意に交差反応しない。
【０２７１】
第1の特性に関しては、ポリペプチド、ペプチド、又はエピトープと、106M-1以上、好ましくは107M-1以上、より好ましくは108M-1以上、最も好ましくは109M-1以上の結合親和性(Ka)で結合する場合に、抗体は、特異的に結合している。抗体の結合親和性は、例えば、スキャッチャード分析(Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660 (1949))により、当業者が容易に判定できる。第二の特性に関しては、例えば、標準的なウェスタンブロット解析において、本発明によるポリペプチドは検出されるが、同様又は同一の量で付与された公知のポリペプチドが検出されない場合、抗体は、関連するポリペプチド分子と有意に交差反応していない。
【０２７２】
抗体は、本発明による、抗原性エピトープを含むペプチド又はポリペプチドを使用して生成できる。本発明の抗原性エピトープ含有ペプチド及びポリペプチドは、SEQ ID NO:5乃至12の何れかにに含まれる少なくとも4個、又は15個乃至約30個の間のアミノ酸の配列を含むことが好ましい。しかしながら、30乃至50個のアミノ酸、或いは本発明によるポリペプチドの全アミノ酸配列を含めた任意の長さのアミノ酸を含む、本発明のアミノ酸配列の更に長い部分を含むペプチド又はポリペプチドも、本発明によるポリペプチドと結合する抗体を誘導するのに有用である。エピトープ含有ペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒中において実質的な溶解性を提供するように選択することが望ましい(即ち、配列は、相対的に親水性の残基を含み、疎水性の残基を避けることが好ましい)。更に、プロリン残基を含むアミノ酸配列も、抗体生成に望ましい場合がある。
【０２７３】
一例として、本発明によるポリペプチド内の潜在的な抗原部位は、LASERGENE(DNASTAR、ウィスコンシン州マディソン)のPROTEANプログラム(バージョン3.14)により実行されるジェームソン-ウルフ法、Jameson and Wolf, CABIOS 4:181, (1988)を使用して同定可能である。この分析では、デフォルトのパラメータを使用した。
【０２７４】
ジェームソン-ウルフ法は、ポリペプチド構造予測に関する六つの主要なサブルーチンを組み合わせることで潜在的な抗原決定基を予測する。簡潔に言えば、ホップ-ウッズ法、Hoppら, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 78:3824 (1981)を最初に用いて、局所的親水性が最大の領域に相当するアミノ酸配列を特定した(パラメータ:七残基平均)。第二段階では、エミニの方法、Eminiら, J. Virology 55:836 (1985)を用いて、表面確率を計算した(パラメータ:表面決定閾値(0.6)=1)。第三に、カープラス-シュルツ法、Karplus及びSchultz, Naturwissenschaften 72:212 (1985)を用い、主鎖の柔軟性を予測した(パラメータ:柔軟性閾値(0.2)=1)。分析の第四及び第五段階では、チョウ-ファスマンの方法、Chou, "Prediction of polypeptide Structural Classes from Amino Acid Composition," in Prediction of polypeptide Structure and the Principles of polypeptide Conformation, Fasman (編), pages 549 586 (Plenum Press 1990)及びGarnier-Robson, Garnierら, J. Mol. Biol. 120:97 (1978)を用い、二次構造予測をデータに適用した(チョウ-ファスマンパラメータ:コンフォメーション表=64ポリペプチド、α領域閾値=103、β領域閾値=105、ガルニエ-ロブソンパラメーター:α及びβ決定定数=0)。第六のサブルーチンでは、柔軟性パラメータとヒドロパシー/溶媒可触性ファクターとを組み合わせて、「抗原指数」として指定される表面輪郭数値を決定した。最後に、それぞれのピーク値の20、40、60、又は80%を加算することで主な表面のピークを大きくするピーク広がり関数を、抗原指数に適用し、内部領域に対する表面領域の移動性に由来する付加的な自由エネルギを考慮に入れた。しかしながら、螺旋領域は柔軟性が少ない傾向にあるため、この計算は、螺旋領域に存在する主なピークには適用しなかった。
【０２７５】
組換え又は天然源から単離されたポリペプチドに対するポリクローナル抗体は、当業者に周知の方法を用いて調製できる。例えば、Greenら, "Production of Polyclonal Antisera," in Immunochemical Protocols (Manson編), pages 1 to 5 (Humana Press 1992)、及び Williamsら, "Expression of foreign polypeptides in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Gloverら(編), page 15 (Oxford University Press 1995)を参照されたい。ポリペプチドの免疫原性は、ミョウバン(水酸化アルミニウム)又はフロイントの完全若しくは不完全アジュバント等のアジュバントの使用によって高めることができる。免疫化に有用なポリペプチドには、免疫グロブリンポリペプチド又はマルトース結合ポリペプチドとの融合体又はその一部といった融合ポリペプチドも含まれる。ポリペプチド免疫原は全長分子であってもその一部であってもよい。ポリペプチド部分が「ハプテン様」である場合、こうした部分は、免疫化のため、高分子担体(キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ウシ血清アルブミン(BSA)、又は破傷風毒素等)と結合又は連結する利点を有し得る。
【０２７６】
ポリクローナル抗体は一般に、ウマ、ウシ、イヌ、ニワトリ、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ヤギ、又はヒツジ等の動物において産出されるが、本発明によるポリペプチドに特異的な抗体は、ヒト以外の霊長類抗体に由来してもよい。診断上及び治療上有用な抗体をヒヒにおいて産出するための一般的手法は、例えば、Goldenbergら, 国際特許公報第WO91/11465号、及びLosmanら, Int. J. Cancer 46:310 (1990)において確認し得る。
【０２７７】
或いは、本発明によるポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体も生成可能である。特定の抗原に対する齧歯類モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法で取得し得る(例えば、Kohlerら, Nature 256:495 (1975), Coliganら (編), Current Protocols in Immunology, Vol. 1, pages 2.5.1 2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) ["Coligan"]、Picksleyら, "Production of monoclonal antibodies against polypeptides expressed in E. coli," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Gloverら (編), page 93 (Oxford University Press 1995)参照)。
【０２７８】
簡潔に言えば、モノクローナル抗体は、遺伝子産物を含む組成物をマウスに注射し、血清サンプルを取り出すことにより抗体生成の有無を確認し、脾臓を取り出してBリンパ球を取得し、Bリンパ球を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを生成し、ハイブリドーマをクローニングし、当該抗原に対する抗体を生成する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を生成するクローンを培養し、ハイブリドーマ培養物から抗体を単離することにより得ることができる。
【０２７９】
加えて、本発明によるポリペプチドに特異的な抗体は、ヒトモノクローナル抗体に由来してもよい。ヒトモノクローナル抗体は、抗原投与に応答して特定のヒト抗体を生成するように操作されたトランスジェニックマウスから得られる。この手法では、内因性の重鎖及び軽鎖遺伝子座のターゲティング破壊を含む胚性幹細胞系に由来するマウス系統にヒトの重鎖及び軽鎖遺伝子座の要素が導入される。当該トランスジェニックマウスはヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成可能であり、このマウスを使用して、ヒト抗体を分泌するハイブリドーマを生成できる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、例えば、Greenrら, Nature Genet. 7:13 (1994)、Lonbergら, Nature 368:856 (1994)、及びTaylorら, Int. Immun. 6:579 (1994)に記載されている。
【０２８０】
モノクローナル抗体は、十分に確立された様々な手法によりハイブリドーマ培養物から単離及び精製できる。こうした単離手法には、ポリペプチド-Aセファロースによる親和性クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、及びイオン交換クロマトグラフィが含まれる(例えば、Coligan, pages 2.7.1 2.7.12及びpages 2.9.1 2.9.3、Bainesら, "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, pages 79 104 (The Humana Press, Inc. 1992)を参照)。
【０２８１】
特定の用途では、本発明によるポリペプチドに特異的な抗体のフラグメントを調製することが望ましい場合がある。こうした抗体フラグメントは、例えば、抗体のタンパク質加水分解により得ることができる。抗体フラグメントは、抗体全体を従来の方法によってペプシン又はパパインで消化することにより得ることができる。例として、抗体フラグメントは、F(ab')2と表される5Sフラグメントをもたらすペプシンによる抗体の酵素的切断により生成できる。この断片は、チオール還元剤により更に切断して、3.5S Fab'一価フラグメントを生成できる。随意的に、切断反応は、ジスルフィド結合の切断により生じるスルフヒドリル基の保護基を用いて行うことができる。別の方法として、ペプシンを用いた酵素的切断により、二つの一価Fabフラグメント及び一つのFcフラグメントを直接生成する。これらの方法は、例えばGoldenberg、米国特許第4,331,647号、Nisonoffら, Arch Biochem. Biophys. 89:230 (1960)、Porter, Biochem. J. 73:119 (1959)、Edelmanら及びColigan, 共にMethods in Enzymology Vol. 1, (Academic Press 1967)に記載される。
【０２８２】
一価軽鎖/重鎖フラグメント形成する重鎖の分離、断片の更なる切断、又は他の酵素的、化学的、若しくは遺伝子的手法等、抗体を切断する他の方法も、無傷抗体に認識される抗原に当該フラグメントが結合する限り使用し得る。
【０２８３】
例えば、Fv断片は、VH及びVL鎖の会合を含む。この会合は、Inbarら, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659 (1972)に記載されるように、非共有結合性であり得る。或いは、可変鎖を分子間ジスルフィド結合により結合すること、又はグルタルアルデヒドのような化学物質によりクロスリンクすることができる(例えば、Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992)を参照)。
【０２８４】
Fv断片は、ペプチドリンカにより接続されたVH及びVL鎖を含んでもよい。これらの一本鎖抗原結合ポリペプチド(scFv)は、オリゴヌクレオチドにより接続されたVH及びVLドメインをコードするDNA配列を含む構造遺伝子を構築することにより調製される。当該構造遺伝子を発現ベクタに挿入し、これを大腸菌等の宿主細胞に導入する。組換え宿主細胞は、二つのVドメインがリンカペプチドにより架橋された単一のポリペプチド鎖を合成する。scFvを生成する方法は、例えばWhitlowら, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97 (1991)に記載されている(Birdら, Science 242:423 (1988)、Ladnerら, 米国特許第4,946,778号、Packら, Bio/Technology 11:1271 (1993)、及びSandhu, 前掲も参照)。
【０２８５】
一例として、scFVは、インビトロでリンパ球をポリペプチドに晒し、ファージ又は類似のベクタ中の抗体ディスプレイライブラリを(例えば、固定化又は標識ポリペプチド又はペプチドの使用により)選択することで取得できる。潜在的なポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ(ファージディスプレイ)又は大腸菌等の細菌上に提示されたランダムペプチドライブラリをスクリーニングすることにより取得できる。当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ランダム突然変異導入及びランダムポリヌクレオチド合成等、多数の方法で取得できる。これらのランダムペプチドディスプレイライブラリを使用して、ポリペプチド、或いはリガンド又は受容体等のポリペプチド、生体高分子又は合成高分子、或いは有機物質又は無機物質であり得る既知の標的と相互作用するペプチドをスクリーニングすることができる。こうしたランダムペプチドディスプレイライブラリを作成及びスクリーニングする手法は当技術において周知であり(Ladnerら, 米国特許第5,223,409号、Ladnerら, 米国特許第4,946,778号、Ladnerら, 米国特許第5,403,484号、Ladnerら, 米国特許第5,571,698号、及びKayら, Phage Display of Peptides and polypeptides (Academic Press, Inc. 1996))、ランダムペプチドディスプレイライブラリと、こうしたライブラリをスクリーニングするためのキットとは、例えば、CLONTECH Laboratories, Inc.(カリフォルニア州パロアルト)、Invitrogen Inc.(カリフォルニア州サンディエゴ)、New England Biolabs, Inc.(マサチューセッツ州ベバリー)、及びPharmacia LKB Biotechnology Inc.(ニュージャージ州ピスカタウェイ)から市販されている。ランダムペプチドディスプレイライブラリを、本明細書に開示した配列を用いてスクリーニングすることで、結合するポリペプチドを同定することができる。
【０２８６】
抗体フラグメントの別の形態は、単一の相補性決定領域(CDR)をコードするペプチドである。CDRペプチド(「最小認識単位」)は、対象の抗体のCDRをコードする遺伝子を構築することにより取得できる。こうした遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて抗体産生細胞のRNAから可変領域を合成することにより調製される(例えば、Larrickら, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106 (1991)、Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritterら(編), page 166 (Cambridge University Press 1995)、及びWardら, "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birchら, (編), page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)参照)。
【０２８７】
或いは、本発明によるポリペプチドに特異的な抗体は、「ヒト化」モノクローナル抗体から得てもよい。ヒト化モノクローナル抗体は、マウス相補性決定領域をマウス免疫グロブリンの可変重鎖及び軽鎖からヒト可変ドメインへ転送することにより生成される。その後、対応するマウスのフレームワーク領域を、ヒト抗体に典型的な残基によって置換する。ヒト化モノクローナル抗体に由来する抗体成分の使用により、マウス定常領域の免疫原性に関連する潜在的な問題が除去される。マウス免疫グロブリン可変ドメインをクローニングするための一般的な手法は、例えば、Orlandiら, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:3833 (1989)に記載されている。ヒト化モノクローナル抗体を生成する手法は、例えば、Jonesら, Nature 321:522 (1986)、Carterら, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:4285 (1992)、Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992)、Singerら, J. Immun. 150:2844 (1993)、Sudhir (編), Antibody Engineering Protocols (Humana Press, Inc. 1995)、Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies," in polypeptide Engineering: Principles and Practice, Clelandら(編), pages 399 434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)、及びQueenら, 米国特許第5,693,762号(1997)に記載されている。
【０２８８】
ポリクローナル抗イディオタイプ抗体は、標準的な技術を使用して、本発明によるポリペプチドに特異的な抗体又は抗体フラグメントにより動物を免疫化することにより調製することができる。例えば、Greenら, "Production of Polyclonal Antisera," in Methods In Molecular Biology: Immunochemical Protocols, Manson (編), pages 1 12 (Humana Press 1992)を参照されたい。また、Coligan, pages 241 to 247も参照されたい。或いは、モノクローナル抗イディオタイプ抗体を、上述した技術において、本発明によるポリペプチドに特異的な抗体又は抗体フラグメントを免疫原として使用して調製することもできる。別の例として、ヒト化抗イディオタイプ抗体又はヒト以外の霊長類の抗イディオタイプ抗体も、上述した手法を用いて調製することができる。抗イディオタイプ抗体を生成する方法は、例えば、Irie, 米国特許第5,208,146号、Greeneら, 米国特許第5,637,677号、及びVarthakavi及びMinocha, J. Gen. Virol. 77:1875 (1996)に記載されている。
【０２８９】
宿主細胞及び関連する用途
本発明によるポリペプチドを含み得る宿主細胞は、例えば、動物細胞、哺乳類宿主細胞、昆虫細胞、魚細胞、真菌細胞、酵母細胞、細菌細胞、及び植物細胞により例示できる。
【０２９０】
本発明による不凍ポリペプチドをコードする天然又は合成核酸フラグメントは、最終的な標的発現細胞での導入及び/又は発現が可能なポリヌクレオチドコンストラクトに組み入れる。通常、ポリヌクレオチドコンストラクトは、酵母又は細菌等の単細胞又は多細胞宿主での複製に適しているが、培養された哺乳類又は他の真核細胞系、特に植物のゲノムへの導入及び組み込みを対象とする場合もある。細菌又は酵母への導入用に調製されたポリヌクレオチドは、宿主に認識される複製系と、所望の不凍ポリペプチド産物をコードするポリヌクレオチドフラグメントと、不凍ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の5'末端に結合された転写及び翻訳開始調節配列と、当該配列の3'末端に結合された転写及び翻訳終結調節配列とを含む。転写調節配列は、宿主により認識される異種プロモータを含む。都合の良いことに、複製系と転写及び翻訳調節配列とを、不凍ポリペプチドコード配列用の挿入部位と共に含む、利用可能な発現ベクタを採用してもよい。
【０２９１】
当該遺伝子は、不凍ポリペプチドのコード配列を含有する任意のポリヌクレオチドセグメントを含む。通常、遺伝子は、コード配列に加えて、上流及び下流の関連配列、特に、何らかのエンハンサ、プロモータ、リボソーム結合部位、又は転写開始マーカを含む。下流セグメントは、メッセージのポリアデニル化及びプロセシングにも重要である場合があり、したがって、通常の例において考慮される。
【０２９２】
発現のための細胞又は細胞の集合への遺伝子の導入は、ポリペプチドを対象の試料へ全般的に導入する別の方法である。形質転換の最終産物も本発明の産物として含まれ、「形質転換細胞」という用語は、形質転換された実際の細胞と、その細胞の全ての子孫とを含む。一般的な場合、最終的な生物体が、細胞を含み、細胞のそれぞれが遺伝子を含む。標準的な形質転換手順は、細菌(Maniatis)、真菌(Shermanら (1986) Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics CSH)、植物(van den Elzenら(1985) Plant Mol. Biol., 5:149-154)、及び動物(Hanahan, (1988) Ann. Rev. Genetics, 22:479-519)について存在する。
【０２９３】
酵母及び真菌宿主細胞
本発明による使用に適した酵母宿主細胞の非限定的な例には、Saccharomyces属及びCandida属のメンバーを含むSaccharomycetaceae科の酵母が含まれる。好適な例には、Saccharomyces fragilis、Saccharomyces cervisae、Saccharomyces lactis、Candida pseudotropicalisが含まれるが、これらに限定されない。
【０２９４】
細菌
細菌細胞は、本発明によるポリペプチドの生成のための、本発明による宿主細胞として有用である。
【０２９５】
乳酸菌等の細菌は、多くの酵母及びカビと共に、数千年に渡って、例えば、チーズ、ピクルス、醤油、ザウアークラウト、酢、ワイン、及びヨーグルト等の発酵食品の調製に使用されてきた。
【０２９６】
本発明による不凍ポリペプチドは、こうした食品の調製に使用される微生物の生存率を維持する上で有用であると共に、動物試料組成物及び人間が消費する食品を含むプレバイオティクス及びプロバイオティクス食用組成物の調製に有用である。
【０２９７】
本発明に関連し且つ本発明による宿主細胞に適した好適な細菌の例には、例えば、Escherichia coli、Streptococcus cremoris、Streptococcus lactis、Streptococcus thermophilus、Leuconostoc citrovorum、Leuconostoc mesenteroides、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus lactis、Lactobacillus bulgaricus、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium breve、Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus、Streptococcus thermophilus、Lactobacillus acidophilus、Bifidobacteria、Lactobacillus casei、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus. casei、及びBifidobacterium longumが含まれる。
【０２９８】
細菌は、生物学的害虫防除プログラムにおいて農薬の代用品としても使用できる。本発明は、一実施形態において、こうした用途に特に適しており、本発明によるポリヌクレオチドを有すると共に、環境に優しい生物農薬として使用可能な本発明によるポリペプチドを生成する組換え微生物を提供する。一例には、グラム陽性土壌細菌のBacillus thuringiensisがある。
【０２９９】
本発明による使用に適した細菌宿主細胞の他の非限定的な例には、グラム陽性菌及びグラム陰性菌が含まれる。好適な細菌細胞は、グラム陽性球菌、グラム陽性桿菌、グラム陰性球菌、及びグラム陰性桿菌から成る集合からも選択できる。本発明による使用に適した細菌宿主細胞の例には、以下の属から選択された細菌が含まれるが、これらに限定されない:Acaricomes、Acetitomaculum、Acetivibrio、Acetobacter、Acetobacterium、Acetobacteroides、Acetohalobium、Acetomicrobium、Acetomonas、Acetonema、Achromobacter、Acidaminobacter、Acidaminococcus、Acidicaldus、Acidimicrobium、Acidiphilium、Acidithiobacillus、Acidobacterium、Acidocaldus、Acidocella、Acidomonas、Acidovorax、Acinetobacter、Acrocarpospora、Actinacidiphilus、Actinoacidiphilus、Actinoalloteichus、Actinobacillus、Actinobaculum、Actinobifida、Actinobispora、Actinocatenispora、Actinocorallia、Actinokineospora、Actinomadura、Actinomyces、Actinoplanes、Actinopolyspora、Actinopycnidium、Actinospica、Actinosporangium、Actinostreptospora、Actinosynnema、Actinotalea、Actinotelluria、Adhaeribacter、Aequorivita、Aerobacter、Aerococcus、Aerococcus状生物、Aeromicrobium、Aeromonas、Aestuariibacter、Afipia、Agarbacterium、Aggregatibacter、Agitococcus、Agreia、Agrobacterium、Agrococcus、Agromonas、Agromyces、Ahrensia、Albidovulum、Alcaligenes、Alcanivorax、Algibacter、Algicola、Algoriphagus、Alicycliphilus、Alicyclobacillus、Alishewanella、Alistipes、Alkalibacillus、Alkalibacter、Alkalibacterium、Alkalilimnicola、Alkalispirillum、Alkanindiges、Allisonella、Allobaculum、Allochromatium、Allofustis、Alteromonas、Alysiella、Aminobacter、Aminobacterium、Aminomonas、Ammonifex、Ammoniphilus、Amoebobacter、Amorphosporangium、Amphibacillus、Ampullariella、Amycolata、Amycolatopsis、Anaeroarcus、Anaerobacter、Anaerobaculum、Anaerobiospirillum、Anaerobranca、Anaerocellum、Anaerococcus、Anaerofilum、Anaerofustis、Anaerolinea、Anaeromusa、Anaerophaga、Anaeroplasma、Anaerosinus、Anaerostipes、Anaerotruncus、Anaerovibrio、Anaerovirgula、Anaerovorax、Ancalomicrobium、Ancylobacter、Aneurinibacillus、Angiococcus、Angulomicrobium、Anoxybacillus、Antarctobacter、Aquabacter、Aquabacterium、Aquamicrobium、Aquaspirillum、Aquicella、Aquifex、Aquiflexum、Aquimarina、Aquimonas、Arcanobacterium、Archangium、Arcicella、Arcobacter、Arenibacter、Arhodomonas、Arizona、Arsenicicoccus、Arsenophonus、Arthrobacter、Asanoa、Asiosporangium、Asticcacaulis、Astrosporangium、Atopobium、Atopococcus、Atopostipes、Aurantimonas、Aureobacterium、Avibacterium、Axonoporis、Azoarcus、Azohydromonas、Azomonas、Azorhizobium、Azorhizophilus、Azospira、Azospirillum、Azotobacter Bacillus、Bacteriovorax、Bacterium、Bacteroides、Balnearium、Balneatrix、Barnesiella、Bartonella、Bdellovibrio、Beggiatoa、Beijerinckia、Belliella、Belnapia、Beneckea、Bergeriella、Betabacterium、Beutenbergia、Bifidobacterium、Bilophila、Blastobacter、Blastochloris、Blastococcus、Blastomonas、Blastopirellula、Bogoriella、Bordetella、Borrelia、Bosea、Brachybacterium、Brachymonas、Brachyspira、Brackiella、Bradyrhizobium、Branhamella、Brenneria、Brevibacillus、Brevibacterium、Brevigemma、Brevundimonas、Brochothrix、Brucella、Bryantella、Budvicia、Bulleidia、Burkholderia、Buttiauxella、Butyribacterium、Butyrivibrio、Byssovorax、Caenibacterium、Caldanaerobacter、Caldicellulosiruptor、Caldilinea、Caldithrix、Caldocellum、Caloramator、Caloranaerobacter、Caminibacillus、Caminibacter、Caminicella、Campylobacter、Capnocytophaga、Carbophilus、Carboxydocella、Carboxydothermus、Cardiobacterium、Carnobacterium、Caryophanon、Caseobacter、Castellaniella、Cat Scratch Disease Bacillus、Catellatospora、Catellibacterium、Catellicoccus、Catenibacterium、Catenococcus、Catenulispora、Catenuloplanes、Catenulospora、Caulobacter、Cdc Enteric Group 36/37、Cdc Group Vd、Cedecea、Cellulomonas、Cellulophaga、Cellulosimicrobium、Cellvibrio、Centipeda、Cerasibacillus、Chainia、Chelatobacter、Chelatococcus、Chitinibacter、Chitinimonas、Chitinophaga、Chlorobaculum、Chlorobium、Chloroflexus、Chondrococcus、Chondromyces、Chromatium、Chromobacterium、Chromohalobacter、Chryseobacterium、Chryseomonas、Chrysiogenes、Citreicella、Citricoccus、Citrobacter、Clavibacter、Clavisporangium、Clo Group Type 2、Clostridium、Cobetia、Cohnella、Collimonas、Collinsella、Colwellia、Comamonas、Conchiformibius、Conexibacter、Coprothermobacter、Corallococcus、Coriobacterium、Corynebacterium、Couchioplanes、Crossiella、Cryobacterium、Cryptanaerobacter、Cryptobacterium、Cryptosporangium、Cupriavidus、Curtobacterium、Curvibacter、Cyclobacterium、Cystobacter、Cytophaga、Dactylosporangium、Dechloromonas、Dechlorosoma、Deefgea、Deferribacter、Defluvibacter、Dehalobacter、Dehalospirillum、Deinococcus、Deleya、Delftia、Demetria、Dendrosporobacter、Denitrovibrio、Dermabacter、Dermacoccus、Dermatophilus、Derxia、Desemzia、Desulfacinum、Desulfarculus、Desulfatibacillum、Desulfitobacterium、Desulfoarculus、Desulfobacca、Desulfobacter、Desulfobacterium、Desulfobacula、Desulfobulbus、Desulfocapsa、Desulfocella、Desulfococcus、Desulfofaba、Desulfofrigus、Desulfofustis、Desulfohalobium、Desulfomicrobium、Desulfomonile、Desulfonatronovibrio、Desulfonatronum、Desulfonauticus、Desulfonema、Desulfonispora、Desulfopila、Desulforegula、Desulforhabdus、Desulforhopalus、Desulfosarcina、Desulfospira、Desulfosporosinus、Desulfotalea、Desulfothermus、Desulfotignum、Desulfotomaculum、Desulfovermiculus、Desulfovibrio、Desulfovirga、Desulfovirgula、Desulfurella、Desulfurobacterium、Desulfuromonas、Desulfuromusa、Dethiosulfovibrio、Devosia、Dialister、Diaphorobacter、Dichelobacter、Dichotomicrobium、Dickeya、Dictyoglomus、Dietzia、Diplococcus、Dokdoa、Dokdonella、Dokdonia、Dolosicoccus、Donghaeana、Dorea、Duganella、Dyadobacter、Dyella、Eberthella、Ectothiorhodospira、Edwardsiella、Eggerthella、Eikenella、Elizabethkingia、Elytrosporangium、Empedobacter、Enhygromyxa、Ensifer、Enterobacter、Enterococcus、Enterovibrio、Epilithonimonas、Eremococcus、Erwinia、Erysipelothrix、Erythrobacter、Erythromicrobium、Escherichia、Ethanoligenens、Eubacterium、Ewingella、Excellospora、Exiguobacterium、Faecalibacterium、Faenia、Falcivibrio、Fastidiosipila、Ferribacter、Ferrimonas、Ferrobacillus、Fervidobacterium、Filibacter、Filifactor、Filobacillus、Filomicrobium、Finegoldia、Flammeovirga、Flavimonas、Flavobacterium、Flectobacillus、Flexibacter、Flexistipes、Flexithrix、Fluoribacter、Fluviicola、Formivibrio、Francisella、Frankia、Frateuria、Friedmanniella、Frigoribacterium、Fulvimarina、Fulvimonas、Fusibacter、Fusobacterium、Gaetbulibacter、Gaffkya、Gallibacterium、Gallicola、Garciella、Gardnerella、Gariaella、Gelidibacter、Gemella、Gemmata、Gemmatimonas、Gemmobacter、Geoalkalibacter、Geobacillus、Geobacter、Geodermatophilus、Geopsychrobacter、Georgenia、Geosinus、Geospirillum、Geothermobacter、Geothrix、Geovibrio、Giesbergeria、Gillisia、Glaciecola、Globicatella、Gluconacetobacter、Gluconoacetobacter、Gluconobacter、Glycomyces、Goodfellowia、Gordona、Gordonia、Gracilibacillus、Gracilibacter、Granulicatella、Granulobacter、Grimontia、Group Ii D、Guggenheimella、Gulosibacter、Haemophilus、Hafnia、Hahella、Halanaerobacter、Halanaerobium、Haliangium、Haliscomenobacter、Haloactinomyces、Haloanaerobacter、Haloanaerobium、Halobacillus、Halobacteroides、Halocella、Halochromatium、Halococcus、Halolactibacillus、Halomonas、Halonatronum、Halorhodospira、Halothermothrix、Halothiobacillus、Helcococcus、Helicobacter、Heliobacillus、Heliobacterium、Heliophilum、Heliorestis、Herbaspirillum、Herbidospora、Herminiimonas、Herpetosiphon、Hespellia、Hippea、Hirschia、Hoeflea、Holdemania、Holophaga、Hongiella、Hordeomyces、Hyalangium、Hydrocarboniphaga、Hydrogenivirga、Hydrogenobacter、Hydrogenobaculum、Hydrogenomonas、Hydrogenophaga、Hydrogenophilus、Hydrogenothermophilus、Hydrogenothermus、Hydrogenovibrio、Hylemonella、Hymenobacter、Hyphomicrobium、Hyphomonas、Idiomarina、Ignatzschineria、Ignavigranum、Ilyobacter、Inflabilis、Inquilinus、Intrasporangium、Iodobacter、Isobaculum、Isochromatium、Isoptericola、Jahnia、Janibacter、Jannaschia、Janthinobacterium、Jensenia、Jeotgalibacillus、Jeotgalicoccus、Jiangella、Jonesia、Kangiella、Kerstersia、Kibdellosporangium、Kibdelosporangium、Kineococcus、Kineosphaera、Kineosporia、Kingella、Kitasatoa、Kitasatospora、Kitasatosporia、Klebsiella、Kluyvera、Knoellia、Kocuria、Kofleria、Koserella、Kozakia、Kribbella、Ktedobacter、Ktedonobacter、Kurthia、Kutzneria、Kytococcus、Labrys、Laceyella、Lachnobacterium、Lachnospira、Lactobacillus、Lactobacterium、Lactococcus、Lactonifactor、Lamprocystis、Lampropedia、Laribacter、Lautropia、Leadbetterella、Lebetimonas、Lechevalieria、Leclercia、Leeuwenhoekiella、Legionella、Leifsonia、Leisingera、Leminorella、Lentibacillus、Lentzea、Leptospirillum、Leptothrix、Leptotrichia、Leucobacter、Leuconostoc、Leucothrix、Levilinea、Levinea、Limnobacter、List、Listeria、Listonella、Loktanella、Lonepinella、Longispora、Lophomonas、Luteibacter、Luteimonas、Luteococcus、Lysobacter、Macrococcus、Macromonas、Magnetospirillum、Mahella、Malikia、Malonomonas、Manjusharmella、Mannheimia、Maribacter、Maricaulis、Marichromatium、Marinibacillus、Marinilabilia、Marinilactibacillus、Marinithermus、Marinitoga、Marinobacter、Marinobacterium、Marinococcus、Marinomonas、Marinospirillum、Marinovum、Marmoricola、Massilia、Mechercharimyces、Mechercharomyces、Megamonas、Megasphaera、Meiothermus、Melittangium、Mesonia、Mesophilobacter、Mesorhizobium、Methanomonas、Methylobacillus、Methylobacter、Methylobacterium、Methylocapsa、Methylocella、Methylocystis、Methylomicrobium、Methylomonas、Methylophaga、Methylophilus、Methylopila、Methylosarcina、Methylotenera、Methylovorus、Microbacterium、Microbispora、Microbulbifer、Microcella、Micrococcus、Microcyclus、Microechinospora、Microellobosporia、Microlunatus、Micromonas、Micromonospora、Micropolyspora、Micropruina、Microscilla、Microstreptospora、Microtetraspora、Microvirgula、Millisia、Mima、Mitsuokella、Mobiluncus、Modestobacter、Moellerella、Mogibacterium、Moorella、Moraxella、Moraxella (Branhamella)、Moraxella (Moraxella)、Morganella、Moritella、Muricauda、Muricoccus、Myceligenerans、Mycetocola、Mycobacterium、Mycoplana、Myroides、Myxobacter、Myxococcus、Nakamurella、Nannocystis、Natroniella、Natronincola、Nautilia、Naxibacter、Neisseria、Nereida、Nest
erenkonia、Nevskia、Nicoletella、Nih Group 12、Nitratifractor、Nitratireductor、Nitratiruptor、Nitrobacter、Nocardia、Nocardioides、Nocardiopsis、Nonomuraea、Novosphingobium、Obesumbacterium、Oceanibulbus、Oceanicaulis、Oceanicola、Oceanimonas、Oceanithermus、Oceanobacillus、Oceanobacter、Oceanomonas、Oceanospirillum、Ochrobactrum、Octadecabacter、Odontomyces、Oenococcus、Oerskovia、Oleiphilus、Oleispira、Oligella、Oligotropha、Olsenella、Opitutus、Orenia、Oribacterium、Ornithinicoccus、Ornithinimicrobium、Ornithobacterium、Oryzihumus、Ottowia、Oxalicibacterium、Oxalobacter、Oxalophagus、Oxobacter、Paenibacillus、Paludibacter、Pandoraea、Pannonibacter、Pantoea、Papillibacter、Parabacteroides、Paracoccus、Paracolobactrum、Paralactobacillus、Paraliobacillus、Parascardovia、Parasporobacterium、Parvibaculum、Parvimonas、Parvopolyspora、Pasteurella、Pasteuria、Patulibacter、Paucibacter、Paucimonas、Paucisalibacillus、Pectinatus、Pectobacterium、Pediococcus、Pedobacter、Pelczaria、Pelobacter、Pelodictyon、Pelomonas、Pelosinus、Pelospora、Pelotomaculum、Peptococcus、Peptoniphilus、Peptostreptococcus、Peredibacter、Persephonella、Persicivirga、Persicobacter、Petrimonas、Petrobacter、Petrotoga、Phaeobacter、Phaeospirillum、Phascolarctobacterium、Phenylobacterium、Phocoenobacter、Photobacterium、Photorhabdus、Phyllobacterium、Phytomonas、Pigmentiphaga、Pilimelia、Pimelobacter、Pirellula、Planctomyces、Planifilum、Planobispora、Planococcus、Planomicrobium、Planomonospora、Planosporangium、Planotetraspora、Plantibacter、Pleomorphomonas、Plesiocystis、Plesiomonas、Podangium、Polaribacter、Polaromonas、Polyangium、Polymorphospora、Pontibacillus、Porphyrobacter、Porphyromonas、Pragia、Prauserella、Prevotella、Proactinomyces、Promicromonospora、Promyxobacterium、Propionibacterium、Propionicimonas、Propioniferax、Propionigenium、Propionimicrobium、Propionispira、Propionispora、Propionivibrio、Prosthecobacter、Prosthecochloris、Prosthecomicrobium、Protaminobacter、polypeptideiphilum、Proteus、Providencia、Pseudaminobacter、Pseudoalteromonas、Pseudoamycolata、Pseudobutyrivibrio、Pseudoclavibacter、Pseudomonas、Pseudonocardia、Pseudoramibacter、Pseudorhodobacter、Pseudospirillum、Pseudoxanthomonas、Psychrobacter、Psychroflexus、Psychromonas、Psychroserpens、Pullulanibacillus、Pusillimonas、Pyxicoccus、Quadrisphaera Rahnella、Ralstonia、Ramibacterium、Ramlibacter、Raoultella、Rarobacter、Rathayibacter、Reinekea、Renibacterium、Renobacter、Rhabdochromatium、Rheinheimera、Rhizobacter、Rhizobium、Rhizomonas、Rhodanobacter、Rhodobacter、Rhodobium、Rhodoblastus、Rhodocista、Rhodococcus、Rhodocyclus、Rhodoferax、Rhodomicrobium、Rhodonellum、Rhodopila、Rhodopirellula、Rhodoplanes、Rhodopseudomonas、Rhodospirillum、Rhodothalassium、Rhodothermus、Rhodovibrio、Rhodovulum、Riemerella、Rikenella、Robiginitalea、Roseateles、Roseburia、Roseiflexus、Roseinatronobacter、Roseobacter、Roseococcus、Roseospira、Roseospirillum、Roseovarius、Rothia、Rubritepida、Rubrivivax、Rubrobacter、Ruegeria、Ruminobacter、Ruminococcus、Runella、Saccharibacter、Saccharococcus、Saccharomonospora、Saccharophagus、Saccharopolyspora、Saccharothrix、Sagittula、Salana、Salegentibacter、Salinibacter、Salinibacterium、Salinicoccus、Salinimonas、Salinispora、Salinivibrio、Salinospora、Salipiger、Salmonella、Samsonia、Sanguibacter、Saprospira、Sarcina、Sarraceniospora、Scardovia、Schlegelella、Schwartzia、Sebekia、Sedimentibacter、Sedimenticola、Segniliparus、Seinonella、Sejongia、Selenomonas、Seliberia、Serinicoccus、Serratia、Shewanella、Shigella、Shinella、Shuttleworthia、Silanimonas、Silvimonas、Simonsiella、Simplicispira、Simsoniella、Sinococcus、Sinorhizobium、Skermania、Slackia、Smaragdicoccus、Smithella、Sodalis、Soehngenia、Sorangium、Sphaerobacter、Sphaerophorus、Sphaerosporangium、Sphaerotilus、Sphingobacterium、Sphingobium、Sphingomonas、Sphingopyxis、Sphingosinicella、Spirilliplanes、Spirillospora、Spirillum、Spirochaeta、Spirosoma、Sporacetigenium、Sporanaerobacter、Sporichthya、Sporobacter、Sporobacterium、Sporocytophaga、Sporohalobacter、Sporolactobacillus、Sporomusa、Sporosarcina、Sporotalea、Sporotomaculum、Stackebrandtia、Staleya、Staphylococcus、Stappia、Starkeya、Stella、Stenotrophomonas、Sterolibacterium、Stigmatella、Streptacidiphilus、Streptimonospora、Streptoallomorpha、Streptoalloteichus、Streptobacillus、Streptobacterium、Streptococcus、Streptomonospora、Streptomyces、Streptomycetoides、Streptomycoides、Streptosporangium、Streptoverticillium、Subdoligranulum、Subtercola、Succiniclasticum、Succinimonas、Succinispira、Succinivibrio、Sulfitobacter、Sulfobacillus、Sulfuricurvum、Sulfurihydrogenibium、Sulfurimonas、Sulfurospirillum、Sutterella、Suttonella、Syntrophobacter、Syntrophobotulus、Syntrophococcus、Syntrophomonas、Syntrophothermus、Syntrophus、Tatlockia、Tatumella、Taxeobacter、Taylorella、Teichococcus、Telluria、Tenacibaculum、Tepidanaerobacter、Tepidibacter、Tepidimicrobium、Tepidimonas、Tepidiphilus、Terasakiella、Terrabacter、Terracoccus、Terribacillus、Terrimonas、Tessaracoccus、Tetragenococcus、Tetrasphaera、Tetrathiobacter、Thalassobacillus、Thalassobacter、Thalassobius、Thalassolituus、Thalassomonas、Thalassospira、Thauera、Thaxtera、Thermacetogenium、Thermaerobacter、Thermanaeromonas、Thermanaerovibrio、Thermicanus、Thermincola、Thermithiobacillus、Thermoactinomyces、Thermoanaerobacter、Thermoanaerobacterium、Thermoanaerobium、Thermoanaerolinea、Thermobacterium、Thermobacteroides、Thermobifida、Thermobispora、Thermobrachium、Thermochromatium、Thermocrinis、Thermocrispum、Thermodesulfatator、Thermodesulfobacterium、Thermodesulfobium、Thermodesulforhabdus、Thermodesulfovibrio、Thermoflavimicrobium、Thermohydrogenium、Thermolithobacter、Thermomicrobium、Thermomonas、Thermomonospora、Thermonema、Thermonospora、Thermopolyspora、Thermosediminibacter、Thermosiculum、Thermosinus、Thermosipho、Thermosyntropha、Thermotoga、Thermovenabulum、Thermovibrio、Thermovirga、Thermus、Thetysia、Thialkalimicrobium、Thialkalivibrio、Thioalkalimicrobium、Thioalkalivibrio、Thiobaca、Thiobacillus、Thiobacter、Thiocapsa、Thiococcus、Thiocystis、Thiodictyon、Thiohalocapsa、Thiolamprovum、Thiomicrospira、Thiomonas、Thiopedia、Thioreductor、Thiorhodoccocus、Thiorhodococcus、Thiorhodovibrio、Thiosphaera、Thiothrix、Thorsellia、Tindallia、Tissierella、Tolumonas、Trabulsiella、Treponema、Trichococcus、Trichotomospora、Truepera、Tsukamurella、Tuberibacillus、Turicella、Turicibacter、Unclassified、Ureibacillus、Uruburuella、Vagococcus、Varibaculum、Variovorax、Veillonella、Verrucomicrobium、Verrucosispora、Vibrio、Victivallis、Virgibacillus、Virgisporangium、Vitreoscilla、Vogesella、Volcaniella、Volucribacter、Vulcanibacillus、Vulcanithermus、Waksmania、Wautersia、Weeksella、Weissella、Williamsia、Wolinella、Woodsholea、Xanthobacter、Xanthomonas、Xenophilus、Xenorhabdus、Xylanibacter、Xylanibacterium、Xylanimicrobium、Xylanimonas、Xylella、Xylophilus、Yania、Yersinia、Yokenella、Zavarzinia、Zimmermannella、Zobellia、Zoogloea、Zooshikella、Zymobacter、Zymobacterium、Zymomonas and Zymophilus。
【０３００】
本発明によるポリペプチドを含む植物
植物宿主細胞及び他のトランスジェニック生物における本発明によるポリヌクレオチド及びポリペプチドの使用は、気候条件が作物の生産にとって最適ではない時、貴重な作物の損失を防止できる。特に、本発明は、最先端の植物及び作物が耐えられない気候条件に耐えることが可能な、新規且つ革新的なトランスジェニック植物及び作物を提供する。本発明によるポリヌクレオチドを含み且つポリペプチドを生成する、本発明による植物宿主細胞の形態である作物の例には、ブドウ、キャノーラ等の油料種子植物、穀類(オートムギ、オオムギ、ライムギ等)、柑橘系果実、及びサトウキビが含まれる。
【０３０１】
本発明は、更に、本発明によるポリペプチドを含むトランスジェニック果物及び野菜を対象とする。本発明によるポリペプチドを含むトランスジェニック果物及び野菜は、例えば、保存中及び/又は輸送中に、より低温の温度に耐えることができる。例には、イチゴ、ブルーベリ、ラズベリ、柑橘系果実、バナナ、ブドウ、キウィ、モモ、パイナップル、プラム、サクランボ、トマト、及びマンゴが含まれる。
【０３０２】
本発明によるポリペプチドを含む花
本発明により考えられる冷凍花には、チューリップ、バラ、ユリが含まれる。
【０３０３】
魚
本発明に適した魚の例には、以下が含まれる。ビンナガマグロ(Thunnus alalunga)、アラスカアブラガレイ(Atheresthes stomias)、タイセイヨウマダラ(Gadus morhua)、タチウオ(Trichiurus lepturus)、タイセイヨウサケ(Salmo salar)、アトランティックウルフフィッシュ(Anarhichas lupus)、ブラックドラム(Pogonias cromis)、クロアジモドキ(Parastromateus niger)、フユヒラメ(ソール、Pleuronectes americanus)、カマストガリザメ (Carcharhinus limbatus)、ナマズ(Ictalurus furcatus), アオガニ(Callinectes sapidus)、カジキ(Makaira nigricans)、ロックフィッシュ (Sebastes auriculatus)、フグ (Sphoeroides annulatus)、スコーピオンフィッシュ (Scorpaena guttata)、シープヘッド(Semicossyphus pulcher)、ロックフィッシュ(Sebastes pinniger)、フエダイ(Lutjanus purpureus)、ナマズ(Ictalurus punctatus)、ロックフィッシュ(Sebastes goodei, Sebastes nebulosus)、マスノスケ(Oncorhynchus tshawytscha)、マサバ(Scomber japonicus)、ギンザケ(シルバー、ミディアムレッド、Oncorhynchus kisutch)、オナガザメ(Alopias vulpinus)、ハタ(Epinephelus fulva)、カスク(Brosme brosme)、シイラ(Coryphaena hippurus)、ソール(Microstomus pacificus)、ソール(Pleuronectes vetulus)、アブラソコムツ(Lepidocybium flavobrunneum)、マトウダイ(Zeus faber)、メヌケ(Sebastes norvegicus)、フエダイ(Lutjanus griseus)、ソール(カレイ) (Glyptocephalus cynoglossus)、バラクーダ(Sphyraena barracuda)、コダラ(Melanogrammus aeglefinus)、スマ(Euthynnus affinis)、フエダイ(Lutjanus synagris)、キンムツ(Ophiodon elongatus)、サバヒ(Chanos chanos)、テラピア(Tilapia mossambica)、ナイルテラピア(Tilapia nilotica)、フグ(Sphoeroides maculatus)、アマダイ(Caulolatilus princeps)、バラムツ(Ruvettus pretiosus)、オレンジラフィ(Hoplostethus atlanticus)、バラクーダ(Sphyraena argentea)、カツオ(Sarda chiliensis)、タラ(アラスカタラ、Gadus macrocephalus)、ジャック(Caranx caninus)、ジャック(Selene peruviana)、メヌケ (Sebastes alutus)、サバ(Scomber scombrus)、シエラ(Scomberomorus sierra)、フエダイ(Lutjanus peru)、マゼランアイナメ(Dissostichus eleginoides)、ソール(カレイ、Eopsetta jordani)、カラフトマス(ハンプバック)(Oncorhynchus gorbuscha)、ポラック(Pollachius virens)、ロックフィッシュ(Sebastes maliger)、ニジマス(スチールヘッド)(Oncorhynchus mykiss)、ドラム(レッドフィッシュ)(Sciaenops ocellatus)、タイ(Chrysophrys auratus)、Snapper (Lutjanus campechanus), Rockfish (Sebastes proriger), Sole (Flounder, Errex zachirus), Rockfish (Sebastes aleutianus), Schoolmaster (Lutjanus apodus), Sheepshead (Archosargus probatocephalus), Shark, Mako (Isurus oxyrinchus), フエダイ(Lutjanus vivanus)、マナガツオ(Pampus argenteus)、ロックフィッシュ(Sebastes brevispinis)、カツオ(Katsuwonus pelamis)、スパインフット(Siganus javus)、ニベ又はコルビナ(Roncador stearnsi)、カレイ(Platichthys stellatus)、カジキ(Tetrapturus audax)、バス(Morone chrysops x saxatilis)、メカジキ(Xiphias gladius)、コイ(Barbodes schwanefeldi)、ポラック(アラスカポラック、Theragra chalcogramma)、メルルーサ(Urophycis tenuis)、ロックフィッシュ(Sebastes entomelas)、カレイ(Scophthalmus aquosus), ニベ(イエローフィッシュ、Pseudosciaena manchurica)、ロックフィッシュ(Sebastes ruberrimus), マグロ(Thunnus albacares)、ホソヒラアジ(Selaroides leptolepis), ヒラマサ(Seriola lalandei)、 カレイ(Limanda ferruginea)、ロックフィッシュ(Sebastes flavidus)、フエダイ(Ocyurus chrysurus )、ホッキョクイワナ(Salvelinus alpinus)、ターボット、カラスガレイ(Reinhartdius hippoglossoides)、オヒョウ(Hippoglossus hippoglossus)。
【０３０４】
冷凍食品及び食用製品
冷凍野菜を含む冷凍食品の再結晶化は、こうした食品の味及び食感の低下につながる。本発明による不凍ポリペプチドは、再結晶化を防ぐことを目的として、冷凍食品又は冷凍の対象となる食品の処理に使用できる。本発明による処理の対象となる食品の例には、アイスクリームと、フローズンヨーグルトと、スープと、プディングと、ソルベと、アイスキャンディと、カスタード、プリン等冷凍デザートと、他の冷凍用の液体又は半液体が含まれる。セロリ、ジャガイモ、アスパラガス、エンドウ豆、ニンジン、豆類、ブロッコリ、スイートコーン、ホウレンソウ、アリコベール等の冷凍野菜も、本発明に含まれる。
【０３０５】
本発明によるポリペプチドは、ラクトース結晶の形成にも影響し得る。したがって、特定の理論に拘束されることなく、本発明によるポリペプチドは、ラクトースの結晶化及び/又は成長を阻害すると考えられる。アイスクリームの冷凍中、全ての原料(ラクトースを含む)の分量は、減少する液体水の分量を除き、徐々に濃縮されることが知られている。ラクトースの分量が特定のレベルに達すると、ラクトース結晶が結晶化を始める。この結晶化は、低速のプロセスであり、-20℃で発生する。一般的に、アイスクリームは、約-20℃で保存される。しかしながら、多くの場合、アイスクリームは、安定且つ一定の温度で保存されず、約-20℃を中心に温度が変動する。したがって、温度が-20℃より高い期間中、ラクトースの結晶が成長し、新たな結晶が形成される。結果として、アイスクリームの食感は粗さが増し、殆どの人がこの食感を不快に感じる。驚くべきことに、本発明によるポリペプチドを、アイスクリームの冷凍前に、アイスクリームに添加した場合、ラクトース結晶の形成が著しく減少し、約-20℃での保存中に新たな結晶の形成が著しく防止されることが分かった。結果として、保存アイスクリーム製品の品質が著しく向上する。
【０３０６】
本発明による冷凍食用製品の例は、以下更に詳しく開示する。
【０３０７】
本発明によるポリペプチドを含む冷凍発酵製品
冷凍又は冷蔵食品は、現在の先進国において人間の食生活を支えるものである。したがって、高品質な製品を消費者に対して保証するために、食品科学者により広範な研究がなされてきたし、現在も行われ続けている。冷凍野菜と、アイスクリーム及びヨーグルト等の冷凍デザートについて、これは特に当てはまる。
【０３０８】
アイスクリーム及びヨーグルト等の冷凍デザートは、一般に冷凍状態で食される。したがって、冷凍製品のテクスチャ及び風味は、消費者にとって重要である。テクスチャは、大部分が氷晶のサイズにより左右される。こうした冷凍デザートの製造者は、滑らかなテクスチャの製品を確保するために多大な努力と経費を費やしてきた。しかしながら、冷凍保存中には、氷晶が成長し、テクスチャを粗くして損なわせる場合がある。冷凍保存中の氷晶の成長は、再結晶化として知られている。この問題は、輸送中及び最新の霜無し冷凍庫における保存中等、冷凍保存状態が理想的ではない場合に特に一般的となる。零度を上回る温度(即ち、0℃超)における比較的短い期間の後、或いは冷凍温度が持続されている場合でも、冷凍食品は、氷の再結晶化プロセスのため、人間の消費にとって望ましくない状態、更には適していない状態にもなり得る。
【０３０９】
不凍ポリペプチドを冷凍発酵食品に組み入れる理想的な方法は、発酵プロセスに関与する微生物に、食品の発酵中に不凍ポリペプチドを生成させることである。
【０３１０】
したがって、本発明は、冷凍発酵食品を調製する方法を含む。この方法は、(a)食品を発酵させて発酵食品を生成することができ、本発明によるポリペプチドを分泌することが可能な微生物に、食品を接触させる工程と、(b)製品の氷再結晶化の抑制に有効な量で不凍ポリペプチドを有する発酵食品が製造されるように発酵が起こる条件下で、当該微生物と共に食品を培養する工程と、(c)冷凍発酵食品を製造するために、-5℃未満の温度で発酵食品を冷凍する工程とを備える。
【０３１１】
一実施形態において、食品は、ヨーグルト、バターミルク、又はチーズを製造するために発酵させることが可能な乳製品(例えば、ミルク)であり得る。
【０３１２】
本発明の微生物は、通常、細菌(例えばLactobacillus bulgaricus、Streptococcus cremoris、Streptococcus lactis、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium longum)であるが、酵母等の真菌であってもよい(例えば、Saccharomyces fragilis、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces lactis等)。本発明によれば、こうした微生物は、本発明によるポリペプチドを分泌可能となるように遺伝子操作される。
【０３１３】
最も好適な実施形態において、本発明は、ヨーグルトを製造するためにミルクを発酵可能であり且つ不凍ポリペプチドを分泌可能な細菌種Lactobacillus bulgaricus及びStreptococcus lactisと共にミルクを培養させることと、ヨーグルトを製造する条件下で細菌及びミルクを培養することと、フローズンヨーグルトを製造するために、-5℃未満の温度でヨーグルトを冷凍することとを含む。
【０３１４】
本発明は、更に、ヨーグルトと、本発明によるポリペプチドをコードする遺伝子を含む微生物とを含む組成物を提供する。
【０３１５】
本明細書での使用において、「発酵」は、微生物の使用による、食品内の炭水化物又はポリペプチドの化学変換を示す。このプロセスにおいて、炭水化物は、乳酸に変換されることが多い。
【０３１６】
本明細書での使用において、「発酵食品」は、微生物による発酵を含むプロセスにより調製された食べられる食品を示す。
【０３１７】
本明細書での使用において、「ヨーグルト」は、微生物の作用によるミルクの乳酸発酵により製造された乳製品を示す。
【０３１８】
本明細書での使用において、「組換え生成ポリペプチド」は、組換えDNA技術を使用して生成されたポリペプチドを示す。組換えDNA技術は、周知であり、自然界では自然に接合しない少なくとも二つのDNAのセグメント(例えば、細菌プロモータ及びポリペプチドコード配列)を接合することを特徴とする。
【０３１９】
参照配列は、全長の天然発生ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列より短くてもよいが、ポリペプチドの場合は少なくとも12残基長であり、ポリヌクレオチドの場合は少なくとも36塩基長となる。
【０３２０】
本発明は、更に、食品を発酵させて発酵食品を生成することが可能であり且つ本発明によるポリペプチドを分泌することが可能な微生物を添加することにより、冷凍発酵食品を調製する方法を提供する。本発明によるポリペプチドを分泌し且つ食品を発酵させる微生物の使用は、氷晶形成及び冷凍温度に影響を与える他の方法に対して、幾つかの利点を有する。例えば、当該方法は、食品への添加前に本発明によるポリペプチドを精製するというコストのかかる必要性を回避する。加えて、これにより、精製プロトコルによる何らかの混入の可能性と、外来微生物に関連する発熱性(pyrogenicity)とが排除される。更に、本発明によるポリペプチドは、請求の範囲に記載される当該発明の発酵微生物により分泌されるため、このプロセスに必要な工程は他の方法より少ない。
【０３２１】
本発明の食品は、通常、ミルクであるが、可食発酵食品を製造するために発酵される他の食品も使用し得る。例には、キャベツ(発酵させてザウアークラウトを製造できる)、キュウリ(発酵させてピクルスを製造できる)、大豆(発酵させて味噌及び他の製品を製造できる)が含まれる。
【０３２２】
当該方法の一工程において、食品を発酵することができる微生物と、当該食品を接触又は混合させる。食品の発酵に有用な微生物の例は周知である(例えば、van de Guchte, 1992, FEMS Microbiology Reviews, 88:73-92を参照)。
【０３２３】
好適な実施形態において、食品は、ミルク(例えば、雌牛[即ち、ウシ]、雌羊、雌馬、又は山羊からのもの)である。通常は細菌である発酵微生物のミルクに対する作用により、ヨーグルト、バターミルク、又は特定のチーズが、細菌及び培養条件の選択に応じて製造される。最も好適な実施形態において、本発明の方法は、乳汁からヨーグルトを製造するために使用される。ヨーグルトは、世界中で様々な名称により呼ばれている。一般的な様々なヨーグルトの名称及び原産国を以下に列記する。
【０３２４】
製品名
原産国
Jugurt/Eyran/Ayran
トルコ他
Busa
トルキスタン
Kissel Mleka
バルカン半島諸国
Urgotnic
バルカン山脈
Leban/Laban
レバノン/アラブ諸国
Zabady (Zabbady)
エジプト/スーダン
Mast/Dough
イラン/アフガニスタン
Roba
イラク
Dahi/Dadhi/Dahee
インド
Mazun/Matzoon/Matsun/ Matsoni
アルメニア
Katyk
トランスコーカシア
Tiaourti
ギリシア
Cieddu
イタリア
Mezzoradu
シチリア
Gioddu
サルディニア
Biokys
チェコスロバキア
Karmdinka
ポーランド
Tarho
ハンガリ
Tykmaelk/Ymer
ハンガリ
Villi (Fiili)
フィンランド
Filmjolk/Fillbunke/ Surmelk/Taettemjolk/ Tettemelk
スカンジナビア
Iogurte
ブラジル/ポルトガル
Proghurt
チリ
Skyr
アイスランド
Gruzovina
ユーゴスラビア
Kefir/Donskaya/Varentes
Kurunga/Koumiss/ Ryazhenka/Guslyanka
ソビエト連邦
Tarag
モンゴル
Shosim/Sho/Thara
ネパール
【０３２５】
ヨーグルト製造方法は、出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部としたNakazawa及びHosono編、Functions of Fermented Milk, 1992, Elsevier Applied Science, London-New York, p. 32において確認できる。米国において、ヨーグルトは、雌牛の全乳又はスキムミルクから製造される。ミルクは、固形分10.5乃至11.5%に規格化され、混入微生物を全て破壊するために90℃を越える温度まで加熱され(30乃至60分)、その後、冷却される。次に、Streptococcus thermophilus及びLactobacillus bulgaricusの1:1の比の混合培養物を材料に接種する。こうした二種類の生物を組み合わせた作用が、通常、製品中において所望の風味と酸味を得るために必要となる。また、ブルガリア菌、L.jugarti、L.acidophilus、Bifido bacterium種、酵母、乳酸真菌を含む他の高発酵性細菌も使用されてきた。ヨーグルトを製造するためのミルクの発酵に使用される細菌及び他の生物の例を以下に列記する。
【０３２６】
属
習性
発酵
主な種
Streptococcusa
連鎖球菌
ホモ
S.cremoris、lactis、thermophilus
Leuconostocb
双球菌
ヘテロ
L.citrovorum、mesenteroides
Lactobacillusc
桿状
ホモ
L.acidophilus、bulgaricus、casei、jugurti、lactis
Bifidobacterium
桿状
ヘテロ
B.bifidum, breve、longum
その他:
酵母(Torulopsis holmil;Saccharomyces fragilis、cerevisiae、lactis;Candida pseudotropicalis等)
真菌(Geotrichum candidum)
酢酸菌(Acetobacter aceti、rasens)
a 現在は、Lactococcus lactis subsp.cremoris、Lac、lactis subsp.lactis、及びS.thermophilus。
b 現在は、L.mesenteroides subsp. cremoris及びL.mesenteroides subsp.mesenteroides。
c 現在は、L.acidophilus、L.delbrueckii subsp.bulgaricus、L.casei subsp.casei、L.helveticus biovar.jugurti、及びL.delbrueckii subsp. lactis.
【０３２７】
微生物は、本発明によるポリペプチドを分泌できるように遺伝子操作され得る(即ち、組換えDNA技術の手法の利用等)。
【０３２８】
異種ポリペプチドを発現及び分泌可能なバクテリア及び真菌を操作する方法は、十分に確立されている(例えば、出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部としたManiatisら(1982), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.、Berger及びKimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology 152 (Academic Press, Inc., San Diego, Calif.)、Simonら, 1986, Appl. Environ. Microbiol. 52:394-395、及びvon Wrightら, 1985, Appl. Environ. Microbiol. 50:1100-1102を参照))。
【０３２９】
AFPを発現及び分泌可能な微生物の生成は、当業者には明らかな様々な形で実行可能である。AFPをコードするDNA配列は、微生物内のポリペプチドへのDNAの(RNA転写物への)転写及び翻訳を可能にするオペロンに機能的にリンクされる(即ち、その機能が確保されるように位置決めされる)ことが好ましい。細菌及び真菌の両方について、プロモータは、当技術分野において周知である。乳酸菌における発現に好適なオペロンには、それらの使用が宿主における外来遺伝子の発現の駆動に成功してきたことから、S.thermophilusのラクトースオペロン又はL.lacticのlac ABCDFEGXオペロンが含まれる(例えば、Simonsら, 1993, J. Bact. 175:5186-5175、Molletら, 1993, J. Bact. 175:4315-4324を参照)。
【０３３０】
本発明によるポリペプチドは、安定性又は他の有益な特性を高めるために、融合ポリペプチドとして発現させてもよい。更に、本発明によるポリペプチドは、ポリペプチドをコードする遺伝子の改変により改変し得る。一般に、遺伝子の改変は、部位特異的突然変異誘発法等、様々な周知の手法により容易に達成し得る(例えば、Gillman及びSmith, 1979, Gene 8:81-97及びRobertsら, 1987, Nature 328:731-734を参照)。
【０３３１】
本発明の微生物は、本発明によるポリペプチドを分泌可能である。したがって、本発明によるポリペプチドは、シグナルペプチド配列に結合させることが好ましい。適切なシグナルペプチド配列の例には、L.lactis ssp lactis MG 1363のusp45遺伝子及びL.lactis ssp cremoris SK11細胞外被関連プロテアーゼ遺伝子が含まれる(van Asseldonkら, 1990, Gene 95:155-160、De vosら, 1989, J. Dairy Sci. 72:3398-3405)。
【０３３２】
L.lactis等のバクテリアでは、同じ宿主に由来することから、usp45シグナルペプチドが好適である。好適な一実施形態において、本発明によるポリペプチド遺伝子は、転写終結配列に結合され、宿主系における本発明によるポリペプチドの転写の正確な終止が確保される。
【０３３３】
上述した要素を含む遺伝子コンストラクトは、pUC19、pNZ18、及びpDBN183等のプラスミドをベクタとして使用することで構築される(Solaimanら, 1992, Plasmid, 28:25-36)。当該遺伝子コンストラクトは、相同組換え手法を使用して、乳酸菌種のゲノムに組み込まれる(Molletら, 1993, J. Bact., 175:4315-4324)。乳酸菌及び大腸菌株は、Maniatisら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 前掲及びChagnandら, 1992, Can. J. Microbiol. 38:67-74において推奨されているように維持することができる。
【０３３４】
本発明によるポリペプチドを含む微生物は、従来の何れかのやり方で食品に付与し得る。ミルク等の製品の場合、細菌又は真菌は、発酵及び冷凍の対象となる食品と密接に混合することができる。所望の製品を製造するために異なる微生物の混合物が使用される場合があることは、当業者には公知であろう。例えば、ヨーグルトの調製においては、S.thermophilus及びL.bulgaricusが共に使用される場合が多い。
【０３３５】
食品に添加されるFAE微生物の数は、微生物及び食品の特性により決まる。一般に、乳酸FAEスタータ細菌(1ml当たり1010乃至1011)は、低温殺菌及び冷却されたミルクに1乃至5%で培養され、この割合により、製品において適切な量の本発明によるポリペプチドが生じる。製品におけるAFPの量は、氷の再結晶化を防止又は抑制する上で有効な量にするべきである(1乃至100mg/ミルク1リットル)。これは、Knightら (1988) Cryobiology, vol. 25, pp. 55-60に記載のスプラット冷却アッセイを使用して決定できる。
【０３３６】
方法の別の工程において、発酵食品は、ブラストフリーザ(-20乃至40℃)、コンタクトプレートフリーザ(-300乃至40℃)、又は真空凍結乾燥機等、従来の冷凍施設での工程を使用して冷凍される。上述した実施形態の無数の変形が可能であることは、当業者には明らかであろう。
【０３３７】
本発明によるポリペプチドを含むアイスクリーム
別の態様において、本発明は、本発明によるポリペプチドを含むアイスクリーム製品を提供する。アイスクリーム製品は、本発明によるポリペプチドと共に、乳化剤系を含むこともできる。この乳化剤系は、当業者に公知の任意の系にし得る。しかしながら、US2005/0163902又はWO2008/064675に記載のもの等、プロパン-1,2-ジオール及び脂肪酸のモノエステルを含む系が特に好適である。
【０３３８】
本明細書において後述するように製造されたアイスクリームにおいて、本発明によるポリペプチドは、アイスクリームの製造中に他の原料と混合した精製ポリペプチドとして添加してよく、或いは、本発明によるポリペプチドは、ミルクの発酵に使用される微生物から分泌された結果として存在してもよい。
【０３３９】
本発明によるアイスクリームを製造する一方法は、次の通りである。
【０３４０】
第一の工程において、食品中間体を、上述した乳化剤系に接触させる。
【０３４１】
「食品中間体」という用語は、本明細書での使用において、アイスクリームを調製するのに適した原料の混合物を意味する。アイスクリームを調製するのに適した原料は、水、乳脂肪又は植物性脂肪等の脂肪、無脂肪乳固形物(MSNF)、甘味料、安定剤、香料、及び着色料を含む。更に、本発明によるポリペプチドは、乳固形物に既に存在してもよく、或いは、別個の原料として混合物に添加されてもよい。
【０３４２】
好ましくは、食品中間体は、脂肪を含む。好ましくは、脂肪は、高ラウリン脂肪又は乳脂肪である。「高ラウリン脂肪」という用語は、主要な脂肪酸がラウリン酸である脂肪を意味する。硬化パーム核油及び硬化ココナツ油等の高ラウリン脂肪は、β'安定性である。したがって、食品中間体は、β'安定脂肪を含むことが好ましい。
【０３４３】
第一の接触工程後、選択された原料を共に混合する。一般に、最初に液体材料を共に混合し、乾燥原料を、その後で添加する。液体原料は、低温でもよく、約60℃に加熱してもよい。調合は、粉末を組み込むために急速な攪拌を必要とし、高速ブレンダが使用される場合が多い。
【０３４４】
バター/バターオイル又は植物性脂肪を使用する場合、理想的には、別個に溶解させ、調合物に40℃で添加するか、或いは、静的ミキサを介して、注入ポンプを用いてホモジナイザの入口で添加するべきである。
【０３４５】
調合物は、その後、低温殺菌する。低温殺菌は、病原菌及び低温細菌等の腐敗性生物を破壊するために実行される。低温殺菌には、低温殺菌、均質化、及び冷却の三つの個別段階が存在する。
【０３４６】
調合物の均質化は、脂肪球を破壊又はそのサイズを減少させて1μm未満になるようにして脂肪乳剤を形成するために実行される。
【０３４７】
低温殺菌は、連続低温殺菌又はバッチ低温殺菌により実行し得る。
【０３４８】
現在、利用される最も一般的な低温殺菌原理は、通常アイスクリーム調合物を平板熱交換器において80乃至90℃の範囲の温度で少なくとも16秒間加熱する連続低温殺菌である。連続低温殺菌は、通常、大型の断熱供給タンク内での原料の調合後、高温短時間(HTST)熱交換器において実行される。成分の可溶化のため、30℃乃至40℃までのある程度の予熱を要する場合がある。HTSTシステムは、加熱部、冷却部、及び再生部を備えている。
【０３４９】
バッチ低温殺菌は、温水ジャケットを備えたタンクで全ての調合原料をゆっくりと加熱する旧式の方法である。タンクの底部及び側部のよどみを回避するため、加熱プロセスは、調合物と加熱媒体との間の差温(デルタT)を低くして緩やかに行う必要がある。デルタTを低くしなければならず、調合物体積/タンク表面の比は一般に高いため、混合物を60℃の温度に加熱するだけでも数分を要する。タンク表面から調合物への熱の伝達を高めるために、調合物の効果的な攪拌が必要となる。バッチ低温殺菌のエネルギ消費量は非常に高く、連続低温殺菌とは異なり、熱回収は存在しない。
【０３５０】
低温殺菌後、調合物は、高圧を用いて均質化する。均質化は、一般に、約80℃の温度で行われ、均質化圧力は、65乃至75℃の温度で90bar(1300psi)乃至250bar(3600psi)の範囲にすることができる。バッチタンクは、通常、タンデムで使用され、一方が保持している間に他方が準備される。自動タイマ及びバルブにより、適切な保持時間を満たす状態が確保される。
【０３５１】
均質化は、低温殺菌の前後何れかに実行してよい。
【０３５２】
その後、調合物を、熱交換器(プレート或いは二重又は三重管)に通すことにより、冷蔵温度(4℃)まで冷却する。
【０３５３】
混合物は、約4℃の熟成温度まで冷却する。その後、調合物を少なくとも四時間熟成させるが、一晩熟成させることが好ましい。これにより、脂肪が結晶化し、ポリペプチド及び多糖が完全に水和する時間が与えられる。
【０３５４】
熟成後、調合物を香味タンクへ引き入れ、任意の液体香料、フルーツピューレ、又は着色料を添加する。次に、調合物は、動的凍結プロセスに入り、水の一部を凍結させると共に、ホイップして凍結調合物に空気を入れる。凍結は、連続凍結プロセス又はバッチ式凍結/ホイップにより実行し得る。
【０３５５】
連続凍結は、バレルフリーザにおいて実行し得る。バレルフリーザは、アンモニア又はフレオン等の沸騰冷媒に覆われた、掻取り式管状熱交換器である。調合物は、ポンプによりバレルフリーザに通し、約30秒乃至3分間後に他方の端部から引き出す。バッチ式フリーザの場合、このプロセスには10乃至15分間を要する。調合物が他方の端部から引き出された時、水の約50%が凍結されている。バレルフリーザ内部には、フリーザ表面から氷を掻取り続ける回転ブレードが存在する。機械の内側には、調合物をホイップし空気を取り込むことを促進する攪拌器が存在する。
【０３５６】
アイスクリームは、相当な量の空気を含み、一般的にはそれは体積の半分にまで至る。これにより、製品には特徴的な軽さが付与される。空気含有量は、オーバランと呼ばれる。
【０３５７】
水の約半分が凍結した状態でアイスクリーム引き出す際に、果実片、ナッツ、又はクッキー等の粒状物質を半凍結スラリに添加し得る。その後、アイスクリームをパッケージして、-30℃〜-40℃のブラストフリーザ内に置き、残りの水の大部分を凍結させる。
【０３５８】
硬化には、ブラストフリーザにおけるパッケージ製品の静的(静止)凍結が含まれる。凍結速度は、理想的には急速であるべきであり、そのため、凍結手法には、対流の増強(強制空気ファンを備える凍結トンネル)又は伝導の増強(プレートフリーザ)の何れかと共に低温(-40℃)が用いられる。
【０３５９】
従来の硬化プロセスの代わりに、アイスクリームは、アイスクリームの温度を-12℃乃至-18℃へ低下させる低温押出機(単軸又は二軸スクリュ押出機)へ、アイスクリームフリーザからポンプで送ってもよい。充填又は押出しの後、アイスクリームは、そのまま低温保存してもよい。
【０３６０】
硬化したアイスクリームは、-25℃未満で保存するべきである。約-25℃未満では、アイスクリームは、急速な氷晶成長の危険無く、長期間に渡り非常に安定している。
【０３６１】
上述したように、本発明のプロセスは、食品中間体を乳化剤系に接触させる工程を含む。
【０３６２】
好適な一実施形態において、当該プロセスは、乳化剤系を水に溶解させる工程を含む。この実施形態では、乳化剤系を水に溶解させ、その後、食品中間体を水と接触させてよい。
【０３６３】
好適な一実施形態において、当該プロセスは、乳化剤系を脂肪に溶解させる工程を含む。この実施形態では、乳化剤系を脂肪に溶解させ、その後、食品中間体を脂肪と接触させてよい。
【０３６４】
好適な一実施形態において、当該プロセスは、動的凍結工程を含む。
【０３６５】
「動的凍結工程」という用語は、本明細書での定義において、食品中間体を攪拌しながら、食品中間体を凍結条件下に置くことを意味する。これは、食品中間体を静止状態で凍結条件下に置く静止凍結工程とは対照的である。
【０３６６】
好適な一実施形態において、当該プロセスは、凍結工程を含む。
【０３６７】
好適な一実施形態において、当該プロセスは、フリーザからの引き出し温度が-4℃未満である凍結工程を含む。好ましくは、フリーザからの引き出し温度は、約-4℃乃至-7℃であり、好ましくは約-5℃乃至-7℃であり、より好ましくは約-5℃乃至-6℃であり、より好ましくは約-6℃である。引き出し温度は、アイスクリームがアイスクリームフリーザから出るときのアイスクリームの温度である。
【０３６８】
本発明によるポリペプチドを含む空気混入食品
本発明は、更に、本発明によるポリペプチドを含む空気混入食品を提供する。空気混入製品として特徴付けし得る食品の例として、アイスクリーム、シャーベット、ソルベ、及びフローズンヨーグルトを挙げることができる。
【０３６９】
「空気混入」という用語は、例えば、機械的手段を用いて、気体を意図的に調合物に組み入れたことを意味する。気体は、任意の気体にすることができるが、食品に関しては、空気、窒素、亜酸化窒素、又は二酸化炭素等の食品用の気体が好ましい。本発明の空気混入食品は、気泡の集団を含み、少なくとも65%の気泡が20μm未満の直径を有する。好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%の気泡が、20μm未満の直径を有する。好ましくは少なくとも50%、より好ましくは少なくとも60%、最も好ましくは少なくとも75%の気泡が、10μm未満の直径を有する。
【０３７０】
空気混入の程度は、一般に、「オーバラン」に関して定められる。本発明に関連して、オーバランパーセントは、空気混入製品の体積と、空気混入製品の元になった非空気混入調合物の体積とにより定められる。
オーバラン =［(最終空気混入製品の体積-非空気混入混合物の体積)×100］/ 非空気混入混合物の体積
【０３７１】
オーバランは、大気圧で測定する。製品中に存在するオーバランの量は、所望の製品特性に応じて変化する。
【０３７２】
好ましくは、食品は、少なくとも20%、より好ましくは少なくとも50%、最も好ましくは少なくとも80%のオーバランを有する。好ましくは、食品は、多くとも400%、より好ましくは多くとも200%、最も好ましくは多くとも120%のオーバランを有する。
【０３７３】
空気混入食品は、例えば、非空気混入調合物から開始して、小さな気泡の大きな集団を含む空気混入食品を製造するプロセスであるプレエアレーションルートの使用等、当技術分野において公知の任意のプロセスを用いて製造し得る。
【０３７４】
プレエアレーションルートにおいては、本発明によるポリペプチドと、随意的に他の原料とを含む調合物(即ち、水溶液及び/又は懸濁液)に、空気混入工程が施される。空気混入工程は、多数の非常に小さな気泡(直径20μm未満)が形成されるように、十分に高い「強度」のものにする必要がある。空気混入プロセスの強度は多数の要素により決まり、最も重要なものは、空気混入工程におけるエネルギ散逸率と、空気混入工程における調合物及び気泡が受ける流動の性質と、調合物の粘度及び温度とである。加えて、空気混入工程は、所望の空気混入の度合い(即ち、オーバラン)を達成する上で十分な長さにするべきである。
【０３７５】
機械的空気混入装置は、調合物を剪断するロータに基づく場合が多い。エネルギ散逸率は、装置の回転速度の関数である。概して言えば、小さな気泡を生成するためには、高いエネルギ散逸率(したがって、高い回転速度)が必要となる(例えば、"Chemical Engineering for the Food Industry", Fryer, Pyle and Rielly, Blackie, London, 1997を参照)。
【０３７６】
空気混入工程の有効性は、空気混入装置における流動の性質にも依存する。空気混入は、通常、最初に比較的大きな気泡を混入し、その後、破砕して小さなものにすることで達成される。伸長流動又は伸張流動は、単純な剪断流動に比べて、大きな気泡を破砕する上で特に有効であることが知られている(例えば、Rallinson, J. M. Ann. Rev. Fluid Mech. 16, pp 45-66, 1984を参照)。伸長流動の少なくとも一成分を提供できる適切な高剪断空気混入プロセス及び装置には、Oakesミキサ(E.T. Oakes Corp)、Megatronミキサ(Kinematica AG)、Mondoミキサ(Haas-Mondomix BV)、又はSilversonミキサ(Silverson Machines Inc.)等のロータ-ステータ装置における連続的なホイップと、掻取り式熱交換器等の連続流動装置におけるガス注入後の混合及び分散と、例えば、Hobart泡立てミキサ(Hobart UK)、Kenwood Chefミキサ(Kenwood Ltd)、Ultra-Turraxミキサ(IKA Werke GmbH & Co. KG)、又は電動手持ちミキサ、例えば、Brevilleキッチンハンドブレンダを使用する、表面でのエントレインメントを含むバッチ式ホイップと、が含まれる。
【０３７７】
空気混入工程の有効性は、調合物の粘度及び/又は温度にも依存する。調合物の粘度の増加及び/又は温度の低下により、空気混入装置の気泡に対するサイズ低減効果が増大する。更に、空気混入工程の有効性は、調合物の配合にも依存する。
【０３７８】
空気混入工程の有効性は、使用するプロセス及び装置と空気が混入される調合物との具体的な詳細に依存するが、上述した要素を考慮して、任意の特定な状況において適切なプロセス条件を決定することは、当業者が扱うことの範囲内にある。特に、非常に小さな気泡の割合は、散逸エネルギの増加及び/又は伸長流成分の増加及び/又は調合物の粘度の増加及び/又は調合物の温度の低下により増加させることができる。
【０３７９】
空気混入混合物は、例えば、最終製品がアイスクリーム又はシャーベット等の冷凍空気混入製品である場合、空気混入中及び/又は空気混入後に、随意的に冷凍させてもよい。冷凍は、例えば、掻取り式熱交換器において、空気混入と同時に実行し得る。同時的な冷凍及び空気混入は、氷が形成される際の調合物粘度の増加のため、小さな気泡の形成を助け得る。空気混入後に冷凍される場合は、更なる気体の取込みが殆ど又は全く生じないように行うことが好ましい。
【０３８０】
氷の含有量は、低温押出し、空気混入混合物を塩水又はグリコール等の冷液槽に浸漬したモールドに入れること、空気混入混合物の一部を液体窒素等の低温流体槽に直接滴下すること、又は空気混入混合物を含む容器をフリーザ、ブラストフリーザ、又は低温貯蔵庫等の低温環境に置くこと等の後続の冷凍工程により、更に増加させ得る。後続の冷凍工程は、更なる気体の取込みが殆ど又は全く生じないようにするために、低剪断又は無剪断で行うことが好ましい。
【０３８１】
本発明によるポリペプチドに加えて、本発明の空気混入食品(及びそれらが作られる混合物)は、脂肪、ミルク、クリームと、特に乳化相の形態にある油又は脂肪と、砂糖、食塩、果物及び/又は野菜材料、抽出物、ジュース、多糖等の増粘剤、安定剤、着色剤、香料、モノグリセリド等の化学乳化剤と、酸及び保存料とのような、食品に従来見られる他の原料を含んでもよい。好ましい食品には、アイスクリーム、ソルベ、ムース、ホイップクリーム、ミルクセーキ及びスムージ等の空気混入飲料、低脂肪スプレッド(例えば、脂肪含有量0乃至60重量%)、ドレッシング及びソースが含まれる。食品は、アイスクリーム、ソルベ、又はムースなどの、冷凍及び冷蔵空気混入菓子であることが好ましい。
【０３８２】
本発明の冷凍空気混入菓子は、本発明によるポリペプチドと、随意的に、本発明によるポリペプチド以外の一つ以上の不凍ポリペプチドとを含む。空気混入製品において、不凍ポリペプチドの総量は、一般に、少なくとも約0.0001重量%、より好ましくは少なくとも0.0005重量%、最も好ましくは少なくとも約0.001重量%である。不凍ポリペプチドは、非常に低い濃度で使用可能であるため、当該菓子は、0.05重量%未満の不凍ポリペプチドを含むことが好ましい。好適な範囲は、約0.001乃至0.01重量%である。不凍ポリペプチドは、個別に、或いは当分野において公知の他の不凍ポリペプチドと組み合わせて、使用可能である。
【０３８３】
冷凍空気混入製品は、随意的に、チョコレート若しくはクーベルチュールの層等のコーティング、及び/又はナッツ、フルーツ、タフィ、若しくはチョコレート片等の内包物を含み得る。この場合、冷凍空気混入菓子の脂肪含有量には、コーティング又は内包物に存在する脂肪は含まない。
【０３８４】
一実施形態において、冷凍空気混入菓子は、3重量%以下、好ましくは2重量%以下、より好ましくは1重量%以下の脂肪を含む。好適な実施形態において、菓子は、ファットフリーであり、これは菓子が実質的に脂肪を含まないことを意味する(即ち、0.1重量%未満)。
【０３８５】
本発明によるポリペプチドをハイドロフォビン及び界面活性剤と共に含む空気混入食品
本発明は、更に、本発明によるポリペプチドをハイドロフォビン及び界面活性剤と共に含む菓子等の冷凍空気混入食品を提供する。好ましくは、空気混入食品は、少なくとも65%の気泡が20μm未満の直径を有する気泡の集団を含む。
【０３８６】
冷凍空気混入菓子に存在するハイドロフォビンの量は、一般的に、菓子の配合と気相の量とに応じて変化する。一般に、菓子は、少なくとも0.001重量%、より好ましくは少なくとも0.005又は0.01重量%のハイドロフォビンを含む。一般に、菓子は、1重量%未満のハイドロフォビンを含む。ハイドロフォビンは、単一のソース又は複数のソースに由来してよく、例えば、ハイドロフォビンは、二種類以上のハイドロフォビンポリペプチドの混合物にしてよい。
【０３８７】
ハイドロフォビンは、気相を安定させるために利用可能な形態及び量で添加される。「添加」という用語は、泡安定化の特性を利用する目的でハイドロフォビンが菓子に意図的に導入されることを意味する。結果として、ハイドロフォビンポリペプチドを含む可能性のある真菌の混入物質を含む原料が存在する場合又は添加される場合、これは、本発明のコンテクストにおけるハイドロフォビンの添加を構成しない。
【０３８８】
一般に、ハイドロフォビンは、気液界面において自己アセンブリーできる形態で菓子に添加される。
【０３８９】
一般に、ハイドロフォビンは、単離形態で添加され、一般には、固形分の重量に基づいて、少なくとも純度10%等の部分的に精製された状態で本発明の菓子に添加される。「単離形態で添加」とは、ハイドロフォビンを自然に発現するマッシュルーム等の天然の生物の一部としてハイドロフォビンが添加されないことを意味する。そうではなくて、ハイドロフォビンは、通常、天然発生源から抽出されるか、或いは宿主生物における組換え発現により取得される。
【０３９０】
一実施形態において、ハイドロフォビンは、単量体、二量体、及び/又はオリゴマ(即ち、10個以下の単量体単位から成る)の形態で菓子に添加される。好ましくは、添加されるハイドロフォビンの少なくとも50重量%、より好ましくは少なくとも75、80、85、又は90重量%が、これらの形態の少なくとも一つである。いったん添加されると、ハイドロフォビンは、通常、気液界面でアセンブリーする状態となるため、単量体、二量体、及びオリゴマの量は減少すると予測される。
【０３９１】
「界面活性剤」(又は「表面活性剤」)という用語は、本明細書での使用において、溶解した媒体の表面張力を低下させるため、液体/蒸気界面において積極的に吸収を行う物質を意味する。この用語は、表面に自発的に広がることにより液体の表面張力を低下させる難溶性物質を含む。本発明のコンテクストにおいて、「界面活性剤」という用語は、ハイドロフォビンを含まない。
【０３９２】
「界面活性剤」という用語は、別の(非表面活性)原料、例えば、ペクチン、ローカストビーンガム、グアガム等の安定剤に、非常に少量存在し得る微量の表面活性成分を含まない。このような場合、界面活性剤の量は、通常、食品の0.05重量%未満である。
【０３９３】
界面活性剤は、一般には、味覚及び/又はテクスチャへの有益な効果のため、空気混入食品に使用される成分である。こうした界面活性剤には(限定ではなく)以下が含まれる。
・カゼイン、乳清(及びそのポリペプチド分画)、カゼイン酸ナトリウム、カゼイン酸カルシウム、及び加水分解乳清ポリペプチド等の乳ポリペプチド、
・ゼラチン、卵ポリペプチド、及び大豆ポリペプチド等の他のポリペプチド、
・飽和又は不飽和脂肪酸のモノグリセリド及びジグリセリド、例えば、パルミチン酸モノグリセリル、
・六水酸基アルコール(通常ソルビトール)のポリオキシエチレン誘導体、グリコール、グリコールエステル、ポリグリセロールエステル、ソルビタンエステル、ステアロイルラクチラート、酢酸エステル、乳酸エステル、クエン酸エステル、アセチル化モノグリセリド、ジアセチル酒石酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンエステル(ポリソルベート80等)、
・アルキルポリ(エチレンオキシド)、脂肪アルコール、及びスクロースエステル等の非イオン性界面活性剤、
・リン脂質及びリン脂質の混合物(例えば、レシチン)、並びに上記の何れかの混合物。
【０３９４】
界面活性剤は、好ましくは、製品の少なくとも0.05重量%、より好ましくは少なくとも0.1重量%の量で存在する。界面活性剤は、好ましくはポリペプチドであり、より好ましくは乳ポリペプチドであり、食品の重量の少なくとも0.5%、より好ましくは少なくとも1%の量で存在する。界面活性剤は、好ましくは食品の重量の多くとも20%、より好ましくは多くとも10%、最も好ましくは多くとも5%の量で存在する。
【０３９５】
本発明による空気混入食品は、ハイドロフォビン及び界面活性剤を含む非空気混入調合物から開始して、小さな気泡の大きな集団を含む空気混入食品を製造するプロセスである「プレエアレーション」ルート(上記において詳細に開示)を用いて製造し得る。「後添加」と呼ばれる別のルートは、空気混入後に界面活性剤を添加するプロセスを提供する。
【０３９６】
後添加ルートは、空気混入が行われた後で界面活性剤を添加することにより、ハイドロフォビンの量を、気泡が形成される時点で界面活性剤の量に対して増加させ、最終製品においても変わらない状態にする方法を提供する。したがって、ハイドロフォビンを含むが界面活性剤を含まない調合物に空気を混入し、その後、界面活性剤を含む第二の調合物を空気混入調合物と組み合わせる。第二の調合物は、組み合わせた混合物が所望の最終製品の配合となるように調合する。混合工程を用いて、組み合わせた調合物の均質性を向上させてもよい。混合工程は、更なる気体の取込みが殆ど又は全く無いように(即ち、オーバランが、混合工程中に10%を超えて増加しないように)、比較的低剪断及び短時間で行うことが好ましい。適切な混合装置には、静的ミキサと、オーガ、ブレンダ、又はフルーツフィーダ等のインライン動的ミキサと、撹拌槽等のバッチ式混合装置とが含まれる。バッチ式プロセスにおいて、第二の(界面活性剤含有)調合物は、一般に、処理期間の終わり近くに注入される。混合工程は、例えば、掻取り式熱交換器又はスクリュ押出機において、第二の調合物を、製品が退出するポイントの近くで、掻取り式熱交換器又はスクリュ押出機のバレルに注入することにより、連続的なプロセスで行うことができる。
【０３９７】
空気混入混合物は、例えば、最終製品がアイスクリーム又はソルベ等の冷凍空気混入製品となる場合、空気混入中及び/又は空気混入後に、随意的に冷凍させてもよい。冷凍は、例えば、掻取り式熱交換器において、空気混入と同時に実行し得る。同時的な冷凍及び空気混入は、氷が形成される際の調合物粘度の増加のため、小さな気泡の形成を支援する。空気混入後に冷凍される場合は、更なる気体の取込みが殆ど又は全く生じないように行うことが好ましい。空気混入後に界面活性剤を加える場合(即ち、後添加ルート)、冷凍は混合工程前及び/又は混合工程中に実行し得る。界面活性剤の流れは、混合前に冷却又は部分的に冷凍してもよい。
【０３９８】
本発明によるポリペプチドを含む冷凍水性菓子
一般に冷凍水性菓子は、比較的小型であり、例えば、1ml未満、より好ましくは0.5ml未満の平均体積を有する。一例として、5mm乃至10mの直径を有するビーズは、約0.065ml乃至約0.5mlの体積を有する。一般に、個々の冷凍菓子は、消費者が各菓子を容易に区別できるような最小平均体積を有する。例えば、個々の冷凍菓子は、少なくとも約0.02mlの最小平均体積を有することが好ましい。
【０３９９】
個々の冷凍水性菓子は、立方体状又は球状等、任意の形状に形成し得る。好ましくは、冷凍菓子は、実質的に球形である。
【０４００】
冷凍水性菓子は、核又は層等、製品の少なくとも一部又は領域が本発明によるポリペプチドを含有しない、複合製品の形態にしてもよい。この例は、本発明によるポリペプチドを含有する水氷の層にコーティングされた、本発明によるポリペプチドが存在しないアイスクリームの核を含む製品である。好ましくは、複合菓子の実質的に外側の層、即ち、他の個々の冷凍菓子と接触する領域が、本発明によるポリペプチドを含む。複合製品の場合、菓子に添加される本発明によるポリペプチドの量の重量%は、完全な製品に対してではなく、本発明によるポリペプチドを含有する菓子の構成要素に対してのみ計算されることは理解されよう。
【０４０１】
冷凍水性菓子は、空気混入状態又は非空気混入状態にし得る。非空気混入状態とは、冷凍菓子が20%未満、好ましくは10%未満のオーバランを有することを意味する。非空気混入冷凍菓子には、気体含有量を増加させるホイップ等の故意の工程を施さない。但し、非空気混入冷凍菓子の調製中に、空気等、少量の気体が製品に取り込まれ得ることは理解されよう。
【０４０２】
水氷菓子は、一般に、砂糖、水、着色料、フルーツ酸又は他の酸性化剤、果物又は果物香料、及び安定剤を含有する。固形分の総量は、好ましくは少なくとも6重量%、より好ましくは少なくとも8重量%、又は少なくとも10、12、15、又は20重量%であり、約35重量%の高さまでにし得る。好ましくは、固形分総量は、35重量%未満であり、より好ましくは25重量%未満である。水氷は、空気混入状態又は非空気混入状態にし得る。空気混入状態の場合、オーバランは、一般に、約50%未満であり、例えば、約25%乃至30%である。一実施形態において、本発明の水氷菓子は、非空気混入状態である。
【０４０３】
好ましくは、水氷菓子は、2重量%未満、より好ましくは1重量%未満の人工甘味料を含む。非常に好適な実施形態において、アスパルテーム又はアセサルフェーム等の人工甘味料は、水氷菓子中に含まれない。
【０４０４】
本発明の冷凍水性菓子は、一般に、一種類以上の安定剤を含み、例として、ガム、寒天、アルギン酸塩及びその誘導体、ゼラチン、ペクチン、レシチン、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、カラギナン、及びファーセレランから選択された一種類以上の安定剤等を含む。好ましくは、ガム及びカラギナンの混合物といった安定剤の混合物が使用される。好適な実施形態において、冷凍菓子は、0.1乃至1重量%の安定剤を含む。
【０４０５】
本発明の冷凍水性菓子は、一般に、少なくとも約0.0005重量%の本発明によるポリペプチドを含む。本発明によるポリペプチドは、非常に低い濃度で使用可能であるため、菓子は、0.05重量%未満の本発明によるポリペプチドを含むことが好ましい。好適な範囲は、約0.001乃至0.01重量%である。
【０４０６】
本発明の冷凍水性菓子は、当技術において公知の多数の手法を使用して製造できる。例えば、液体窒素の冷凍室に液体調合物を滴下することで、自由流動ビーズを製造できる(WO96/29896参照)。鋳造手法、例えば、液体の事前調合物を冷却鋳型へ導入することにより、他の形状も製造可能である。成形された製品は、複雑な形状を含み、高度な表面定義を有する。
【０４０７】
アイスクリーム含有製品等には、-20℃乃至-25℃を下回る低温硬化工程を施す必要はないが、但し、特に製品が本発明によるポリペプチドを含まない層又は核を有する複合製品である場合、必要に応じてこれを使用してもよい。
【０４０８】
本発明の冷凍水性菓子製品は、消費者に対する販売用の容器に個別の単位としてパッケージし得る。こうした容器の容積は、通常100ml乃至1000ml、例として200ml乃至500mlである。
【０４０９】
しかしながら、製品を小売店、例えば、ファストフード店舗において、小型の容器に分配する場合、或いは異なる形状、風味、及び/又は色合いを有する本発明の冷凍菓子を消費者が選択可能なピックンミックス形式で分配する場合、製品は、小売を目的とした大型容器にパッケージすることも可能である。こうした大型容器は、例えば、約1000mlより大きな容積、例えば、少なくとも2000ml又は5000mlの容積を有し得る。
【０４１０】
本発明によるポリペプチドを含む個別冷凍乳菓子
本発明は、更に、製品内において他の個別冷凍菓子に接触可能な複数の個別空気混入冷凍乳菓子を含む、冷凍菓子製品を提供する。
【０４１１】
氷菓子は、冷凍状態(即ち、食品の温度が0℃未満となる条件下及び、好ましくは、食品が相当な量の氷を含む条件下)での消費を目的とした甘味加工食品である。本発明の氷菓子は、1乃至8重量%の脂肪を含み、固形分の総量は10乃至25重量%である。こうした脂肪及び全固形分の量は、水溶性の混入気体と、本発明によるポリペプチドとの組み合わせにおいて、所望のテクスチャと外観とを共に有する製品をもたらす。一般的な水氷の配合(脂肪を含まない)と、標準的なアイスクリームの配合(少なくとも約30重量%の固形分総量を有する)とは、個別冷凍乳菓子の定義に含まれない。
【０４１２】
本発明の氷菓子は、好ましくは2乃至6重量%、より好ましくは2.5乃至5重量%の脂肪を含む。脂肪は、バター脂、ココナツ油、パーム油、ココアバター、ヒマワリ油、オリーブ油、又は菜種油、及びその混合物又は分画等、任意の適切なソースに由来し得る。
【０４１３】
氷菓子の固形分総量は、菓子の乾燥重量、即ち、水以外の全原料の重量の合計を、総重量のパーセンテージで表したものである。測定は、Ice Cream, 6th Edition, p 296に記載されたように行う。本発明の氷菓子は、氷菓子の10乃至25重量%の固形分総量を有する。固形分総量は、好ましくは少なくとも12%、より好ましくは少なくとも15%、最も好ましくは少なくとも18%である。固形分総量は、好ましくは多くとも24%、より好ましくは多くとも22%である。
【０４１４】
本発明による氷菓子は、氷を含有する。固形分総量は、10乃至25重量%であるため、含水量は、これに応じて、90乃至75重量%である。-18℃の温度では、全てではないが殆どの水が凍結する。
【０４１５】
本発明の氷菓子は、一般に、少なくとも約0.0001重量%、より好ましくは少なくとも0.0005重量%の本発明によるポリペプチドを含む。本発明によるポリペプチドは、非常に低い濃度で使用可能であるため、菓子は、0.05重量%未満の本発明によるポリペプチドを含むことが好ましい。好適な範囲は、約0.001乃至0.01重量%、より好ましくは0.005乃至0.01重量%である。
【０４１６】
空気混入剤とは、その表面活性及び/又はそれが付与する粘度により、小気泡の形成を支援し、その合体又は分離に抵抗する任意の成分を示す。空気混入剤は、混入気体を含まないと理解するべきである。好ましくは、空気混入剤は、ポリペプチドに基づく空気混入剤であり、例えば、HygelTM及びHyfoamaTM(Kerry Biosciencesより入手可能)等の加水分解乳ポリペプチド、又はVersawhip(Kerry Biosciencesより入手可能)及びD-100TM(Gunter Industriesより入手可能)等の加水分解大豆ポリペプチドである。或いは、空気混入剤は、タンパク質に基づかないものでもよく、例えば、Myverol 18-04K(植物油から調製された95%蒸留モノグリセリド、Quest Internationalより入手可能)等のモノグリセリド又はPGE55(脂肪酸のポリグリセロールエステル、Daniscoより入手可能)等のポリグリセロールエステルでもよい。菓子中の空気混入剤の量は、少なくとも0.1重量%、好ましくは少なくとも0.15重量%である。
【０４１７】
好ましくは、空気混入剤の量は、0.5重量%未満、好ましくは0.4重量%未満、より好ましくは0.25重量%未満である。
【０４１８】
本発明の氷菓子は、安定剤を含み得る。安定剤は、ゼラチン等のポリペプチドと、アラビアガム、ガッティガム、カラヤガム、トラガカントガム等の植物押出物と、ローカストビーンガム、グアガム、タラガム、サイリウム種子ガム、クインス種子ガム、又はタマリンド種子ガム等の種子ガムと、コンニャクマンナンと、寒天、アルギン酸塩、カラギナン、又はファーセレラン等の海草抽出物と、低メトキシル又は高メトキシル型のペクチン等のペクチンと、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、微結晶性セルロース、メチル及びメチルエチルセルロース、又はヒドロキシルプロピル及びヒドロキシプロピルメチルセルロース等のセルロース誘導体と、デキストラン、キサンタン、又はβ-1,3-グルカン等の微生物ガムとを含む。安定剤は、単一の安定剤、又は二種以上の安定剤の混合物にしてよい。好ましくは、安定剤は、ローカストビーンガムである。安定剤の量は、好ましくは多くとも0.3重量%、より好ましくは多くとも0.25重量%である。例えば、安定剤の量は、一般に、0乃至0.2重量%である。
【０４１９】
本発明の氷菓子は、好ましくは少なくとも1重量%、より好ましくは少なくとも1.5重量%の量のポリペプチドを(任意のポリペプチドに基づく空気混入剤に加えて)含有し得る。少なくともこの量のポリペプチドを含有する氷菓子は、ミルクアイス型の製品として知覚され、実質的にポリペプチドを含まない氷菓子に比べ、多くの消費者にとってより魅力あるものとなる。好ましくは、ポリペプチド含有量は、8重量%未満、より好ましくは6重量%未満、最も好ましくは3重量%未満である。本発明での使用に適したポリペプチドには、乳ポリペプチド、卵ポリペプチド、及びゼラチンと、大豆ポリペプチド等の植物性ポリペプチドとが含まれる。特に好適なものは、優れた風味と熱安定性とのため、乳ポリペプチドである。乳ポリペプチドの適切なソースには、ミルク、濃縮乳、粉乳、乳清、乳清粉末、及び乳清ポリペプチド濃縮分離物が含まれる。
【０４２０】
本発明の氷菓子は、一般に、糖類、例えば、スクロース、フルクトース、デキストロース、ラクトース、コーンシロップ、糖アルコールを含み、更に、他の原料、例えば着色料及び香料を含み得る。
【０４２１】
氷菓子は、好ましくは、少なくとも20%、より好ましくは少なくとも40%、最も好ましくは少なくとも60%のオーバランを有する。好ましくは、オーバランは、多くとも150%、より好ましくは多くとも120%、最も好ましくは多くとも120%である。
【０４２２】
「調合物」は、空気混入前(又は溶解した氷菓子の脱気後)の非空気混入調合物を示す。オーバランは、大気圧で測定される。
【０４２３】
本発明の氷菓子は、製品全体を構成してよく、或いは、複合製品の構成要素であってもよい。複合製品において、本発明の氷菓子は、製品の他の構成要素(群)とのテクスチャ及び外観の対比を提供する。好ましくは、こうした複合製品は、その構造の個別の要素として氷菓子を含む。例えば、比較的軟らかいアイスクリームの核を、氷菓子の層によりコーティングして、アイスクリームの核を取り囲む堅く砕けやすい層を提供することができる。別の例は、内包物としての氷菓子の組み込みである。或いは、氷菓子には、少なくとも一表面において、例えば、水の光沢、非空気混入水氷、又はチョコレートの連続的又は部分的コーティングを設けてもよい。複合製品において、固形分総量と、脂肪、空気混入剤、氷構造化ポリペプチド、安定剤、及びポリペプチドの含有量との決定は、氷菓子のみを考慮し、複合製品の他の構成要素は考慮に入れない。
【０４２４】
本発明によるポリペプチドを含む個別冷凍乳菓子は、当技術分野において公知の任意の適切な方法により調製し得る。しかしながら、好ましくは、個別冷凍乳菓子は、次の工程を備える方法により生成される。
(a)原料の調合物を調製する。
(b)調合物を低温殺菌及び均質化する。
(c)本発明によるポリペプチドを添加する。
(d)少なくとも50重量%の二酸化炭素、亜酸化窒素、又はその混合物を含有する混入気体により、調合物の冷凍及び空気混入を同時に行い、(例えば、アイスクリームフリーザにおいて)氷菓子を製造する。
(e)氷菓子を低温硬化させる。工程(c)は、工程(b)の前、最中、又は後で行ってもよい。
【０４２５】
調合物は、少なくとも50重量%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは100%の二酸化炭素、亜酸化窒素、又はその混合物を含有する気体により空気混入を行う。混入気体の残りの部分は、一般に、空気等の窒素含有気体である。最も好ましくは、混入気体は、100%二酸化炭素である。
【０４２６】
冷凍後、結果的に生じた氷菓子は、低温硬化工程の前に、例えば、押し出し成形と、その後の切断又は鋳造により成形し得る。好ましくは、氷菓子は、4乃至-1.5℃、より好ましくは-2.5乃至-1.5℃の温度で押し出される。比較的高い押し出し温度により、特に良好な発泡体状の外観が生じる。
【０４２７】
好ましくは、低温硬化工程は、約-25℃以下の温度で、例えばブラストフリージングにより行われる。低温硬化後、氷菓子は、好ましくは、-25乃至-10℃の範囲の温度、一般的には約-18度で保存される。
【０４２８】
本発明によるポリペプチドを含む低脂肪乳製品
本発明は、更に、冷凍低脂肪乳製品を提供する。冷凍乳菓子は、アイスクリーム、ミルクアイス、フローズンヨーグルト、及びシャーベット等、一般にミルク又は乳固形分を含有する菓子である。「ミルク」という用語は、豆乳等の代用乳を含むが、哺乳類の乳汁が好適である。好ましくは、冷凍乳菓子は、アイスクリーム又はミルクアイスである。
【０４２９】
本発明の低脂肪製品は、3重量%以下、好ましくは2重量%以下、より好ましくは2重量%以下、又は1重量%以下の脂肪を含むことが好ましい。一実施形態において、製品は、無脂肪であり、これは製品が実質的に脂肪を含まないことを意味する(即ち、0.1重量%未満)。チョコレート又はクーベルチュールの層等、乳成分を含まない組成物により製品がコーティングされる場合、製品の脂肪含有量の決定において、コーティングは無視するべきである。
【０４３０】
ミルクを含む冷凍菓子は、好ましくは、少なくとも約3重量%の無脂肪乳固形物(MSNF)、より好ましくは約5重量%乃至約25重量%のMSNFを含有する。
【０４３１】
本発明の冷凍製品には安定剤が存在し得るが、場合によっては、本発明によるポリペプチドの安定化効果が、安定剤の代用となり得ることに留意されたい。しかしながら、所望の製品安定性を発生させるためには、1重量%未満の非常に低脂肪な製品等、一部の製品の配合では、本発明によるポリペプチドに加えて、かなりのレベルの安定剤が依然として必要となり得る。その場合でも、本発明によるポリペプチドがテクスチャ及び味に対する安定剤の悪影響を低減又は改善するため、結果的に生じた製品は、以前の製品に比べ向上する。
【０４３２】
適切な安定剤には、アルギン酸塩、ゼラチン、アカシアガム、グアガム、カラヤガム、ローカストビーンガム、カラギナン及びその塩、キサンタンガム、微結晶性セルロース、セルロースエーテル、又はその混合物が含まれる。安定剤の量は、好ましくは、1.5重量%以下、より好ましくは1重量%以下、例として0.1乃至0.8重量%である。
【０４３３】
一実施形態において、製品は、少なくとも0.5重量%の安定剤、例として少なくとも0.7重量%の安定剤を含む。好ましくは、こうした製品における脂肪のレベルは、2又は1重量%未満である。別の実施形態において、製品は、0.5重量%未満の安定剤を含む。好ましくは、こうした製品における脂肪のレベルは、少なくとも2重量%である。
【０４３４】
本発明の冷凍菓子は、一般に、少なくとも約0.0001重量%、より好ましくは少なくとも0.0005重量%の本発明によるポリペプチドを含む。本発明によるポリペプチドは、非常に低い濃度で使用可能であるため、菓子は、0.05重量%未満の本発明によるポリペプチドを含むことが好ましい。好適な範囲は、約0.001乃至0.01重量%であり、より好ましくは0.005乃至0.01重量%である。
【０４３５】
当該冷凍菓子は、空気混入状態又は非空気混入状態にしてよく、好ましくは空気混入状態にする。非空気混入状態とは、冷凍菓子が20%未満、好ましくは10%未満のオーバランを有することを意味する。非空気混入冷凍菓子には、気体含有量を増加させるホイップ等の故意の工程を施さない。但し、非空気混入冷凍菓子の調製中に、空気等、少量の気体が製品に取り込まれ得ることは理解されよう。空気混入製品中に存在するオーバランの量は、所望の製品特性に応じて変化する。例えば、アイスクリーム内のオーバランのレベルは、一般に、約70乃至100%であり、ムース等の菓子類においては、オーバランは200乃至250重量%の高さであり得る一方、ミルクアイスにおけるオーバランは、25乃至30%である。空気混入冷凍菓子は、好ましくは、30%乃至200%、より好ましくは50%乃至150%のオーバランを有する。
【０４３６】
本発明の冷凍菓子は、当技術分野において公知の様々な手法を使用して製造できる。製品は、一般に、静止状態で凍結させるか、或いは、掻取り式熱交換器内等において、攪拌しながら凍結させる。本発明によるポリペプチドの添加により形状及び構造の安定性が保持されるため、当該製品は、複雑な形状を含み、高度な表面定義を有し得る。
【０４３７】
本発明によるポリペプチドは、製品の凍結前、凍結中、又は凍結後に添加することができる。凍結後に添加する場合には、混合することができるように、製品が依然として可塑性を有する間に本発明によるポリペプチドを添加し、それは例えば、掻取り式熱交換器等からの押し出し後、硬化させる前である。
【０４３８】
アイスクリーム製品等には、-20℃乃至-25℃を下回る随意的な低温硬化工程を施すことができる。
【０４３９】
本発明は、本発明の低脂肪冷凍菓子製品を製造するための組成物を包含し、当該組成物は、本発明によるポリペプチド、好ましくは少なくとも0.005重量%の本発明によるポリペプチドを含む。こうした組成物には、液体事前調合物と、例えば粉末の乾燥調合物とが含まれ、そこにミルク又は水等の水性液体を追加する。
【０４４０】
電子レンジでの解凍用に設計された、本発明によるポリペプチドを含む冷凍食品
冷凍は、食品を保存するための非常に一般的な手法である。特定の顕著な例外を除き、冷凍食品は、通常、使用又は更なる処理(例えば、調理)のために解凍される。解凍は、冷凍食品を室温に置いておくことで十分に達成される。しかしながら、家庭の規模であっても、十分な解凍を達成するためには、かなりの時間を要する。解凍は、冷凍食品への伝導熱又は対流熱の付与により、産業規模でも達成される。しかしながら、こうした解凍を達成するために必要な装置は、消費者は容易に利用できない。
【０４４１】
電子レンジは、産業及び家庭の両方に関連して普及が進んでいる。電子レンジの用途の一つは冷凍食品の解凍である。電子レンジ解凍は、室温での解凍より迅速である。電子レンジ解凍には、依然として多数の欠点がある。
・冷凍食品の熱拡散性が低いことから、パルスマイクロ波を使用して、温度平衡を確立できるようにする必要がある。
・液体水は、氷に比べ遙かに容易にマイクロ波エネルギを吸収し、「ホットスポット」及び不均一な解凍を発生させる傾向にある。
・サイズ及び形状に関して、食品の状態が適切である必要がある。
・断続的なマイクロ波パルスのみを使用する必要があるため、食品を完全に解凍するためにはかなり時間がかかる。
【０４４２】
水の中間相、乳化剤、及び本発明によるポリペプチドを含む組成物が食品に組み込まれており、少なくとも一定量の水が未凍結の水として冷凍食品中有に存在する場合、より優れた製品が得られることが分かっている。
【０４４３】
本明細書における中間相という言葉は、層状構造と、従来の中間相、即ち、ラメラ、立方、六方(1及び2)、L2、及びL1と、更に分散中間相、即ち、リポソーム、キュボソーム、及びヘキソゾームとを含む。加えて、こうした表面を同様に形作るミセルの形成を含む。
【０４４４】
上述した冷凍食品は、直接的なマイクロ波エネルギの付与により、断続的又はパルス状のマイクロ波を使用する必要なく、均一且つ迅速に解凍し得ることが分かった。
【０４４５】
冷凍食品中に存在する時に本発明の系が未凍結の水の割合を維持する能力は、当該組成物が中間相を形成する能力を持つことによると考えられる。中間相とは、極性乳化剤と水とが、それらの極性に従って明確な構造に組織化された構造である。乳化剤の極性末端基は、水相又は水相群と接触している。多数の異なる中間相構造が存在すると考えられている。乳化剤の極性末端基に近い水は、凍結から保護されるような形で組織化される。
【０４４６】
本発明の組成物における乳化剤に対する水の比は、使用される乳化剤と、組成物の特定の用途とに依存する。任意の特定の乳化剤/水系において、0℃未満で存在する液水(「未凍結水」)の量は、最高限度に至るまでは水の割合と共に増加する傾向にあることが分かっている。この最高点までは、系内の実質的に全ての水が未凍結であると考えられる。この点を超えると、存在する水のうち固定された量が未凍結となり、残りが凍結する。
【０４４７】
好ましくは、本発明の組成物は、-15℃以下の温度である冷凍食品中に存在する時、少なくとも一定量の未凍結水を含む。好ましくは、本発明の組成物は、-20℃以下の温度である冷凍食品中に存在する時、少なくとも一定量の未凍結水を含む。好ましくは、本発明の組成物は、約-25℃の温度である冷凍食品中に存在する時、少なくとも一定量の未凍結水を含む。好ましくは、本発明の組成物は、約-40℃の温度である冷凍食品中に存在する時、少なくとも一定量の未凍結水を含む。
【０４４８】
冷凍食品中に存在する時、本発明の組成物は、0℃未満の温度で熱力学的に安定した一定量の未凍結水を含むことが好ましい。
【０４４９】
好ましくは、水成分は、組成物の総重量に基づいて少なくとも0.1%の量で存在する。好ましくは、水成分は、組成物の総重量に基づいて少なくとも1%の量で存在する。好ましくは、水成分は、組成物の総重量に基づいて少なくとも2%の量で存在する。好ましくは、水成分は、組成物の総重量に基づいて少なくとも3%の量で存在する。好ましくは、水成分は、組成物の総重量に基づいて少なくとも5%の量で存在する。好ましくは、水成分は、組成物の総重量に基づいて少なくとも10%の量で存在する。
【０４５０】
好ましくは、水成分は、組成物の総重量に基づいて多くとも99.9%の量で存在する。好ましくは、水成分は、組成物の総重量に基づいて多くとも50%の量で存在する。好ましくは、水成分は、組成物の総重量に基づいて多くとも40%の量で存在する。好ましくは、水成分は、組成物の総重量に基づいて多くとも30%の量で存在する。好ましくは、水成分は、組成物の総重量に基づいて多くとも25%の量で存在する。
【０４５１】
好ましくは、水成分は、組成物の総重量に基づいて0.1乃至99.9%の量で存在する。より好ましくは、水成分は、組成物の総重量に基づいて1乃至25%の量で存在する。
【０４５２】
好ましくは、乳化剤は、組成物の総重量に基づいて少なくとも0.1%の量で存在する。好ましくは、乳化剤は、組成物の総重量に基づいて少なくとも50%の量で存在する。好ましくは、乳化剤は、組成物の総重量に基づいて少なくとも60%の量で存在する。好ましくは、乳化剤は、組成物の総重量に基づいて少なくとも70%の量で存在する。好ましくは、乳化剤は、組成物の総重量に基づいて少なくとも80%の量で存在する。好ましくは、乳化剤は、組成物の総重量に基づいて少なくとも99.0%の量で存在する。好ましくは、乳化剤は、組成物の総重量に基づいて少なくとも99.9%の量で存在する。
【０４５３】
好ましくは、乳化剤は、組成物の総重量に基づいて99.9%までの量で存在する。好ましくは、乳化剤は、組成物の総重量に基づいて99%までの量で存在する。好ましくは、乳化剤は、組成物の総重量に基づいて97%までの量で存在する。好ましくは、乳化剤は、組成物の総重量に基づいて95%までの量で存在する。好ましくは、乳化剤は、組成物の総重量に基づいて90%までの量で存在する。
【０４５４】
好ましくは、乳化剤は、組成物の総重量に基づいて0.1乃至99.9%の量で存在する。より好ましくは、乳化剤は、組成物の総重量に基づいて75乃至90%の量で存在する。
【０４５５】
好ましくは、本発明によるポリペプチドは、組成物の総重量に基づいて少なくとも0.001%の量で存在する。好ましくは、本発明によるポリペプチドは、組成物の総重量に基づいて少なくとも0.01%の量で存在する。好ましくは、本発明によるポリペプチドは、組成物の総重量に基づいて少なくとも0.1%の量で存在する。好ましくは、本発明によるポリペプチドは、組成物の総重量に基づいて少なくとも1%の量で存在する。好ましくは、本発明によるポリペプチドは、組成物の総重量に基づいて少なくとも5%の量で存在する。好ましくは、本発明によるポリペプチドは、組成物の総重量に基づいて少なくとも10%の量で存在する。
【０４５６】
好ましくは、本発明によるポリペプチドは、組成物の総重量に基づいて多くとも90%の量で存在する。好ましくは、本発明によるポリペプチドは、組成物の総重量に基づいて多くとも50%の量で存在する。好ましくは、本発明によるポリペプチドは、組成物の総重量に基づいて多くとも25%の量で存在する。好ましくは、本発明によるポリペプチドは、組成物の総重量に基づいて多くとも15%の量で存在する。好ましくは、本発明によるポリペプチドは、組成物の総重量に基づいて多くとも10%の量で存在する。
【０４５７】
好ましくは、本発明によるポリペプチドは、組成物の総重量に基づいて0.001乃至90%の量で存在する。より好ましくは、本発明によるポリペプチドは、組成物の総重量に基づいて0.01乃至10%の量で存在する。
【０４５８】
好適な態様において、組成物は、25%(w/w)未満の油を含む。より好ましくは、組成物は、10%(w/w)未満の油を含む。より好ましくは、組成物は、5%(w/w)未満の油を含む。より好ましくは、組成物は、1%(w/w)未満の油を含む。更に好ましくは、組成物は、0.1%(w/w)未満の油を含む。最も好ましくは、組成物は、油を含まない。
【０４５９】
他の成分も、冷凍食品中に存在する時に一定量の未凍結水を保持する能力に影響を与えないならば、本発明の組成物に存在し得る。
【０４６０】
ものを合わせるための手法の例は混合である。本発明によるポリペプチド及び乳化剤との水の混合は、当業者に明らかな多数の手段の何れかにより達成し得る。一例は、電動ミキサにおける混合である。
【０４６１】
本発明によるポリペプチド、乳化剤、及び水に対する付加的な原料が組成物内に存在する場合、これらは、任意の適切な段階において組み込んでよい。
【０４６２】
好ましくは、当該食品は、食品全体に存在する未凍結水の量が均一且つ迅速な電子レンジ解凍を可能にするために十分な量の当該組成物を含む。実際には、これは、食品全体に存在する未凍結水の量が少なくとも0.1%(w/w)であることに等しい。
【０４６３】
使用レベルは、特定の食品、用途、及び凍結後に食品のテクスチャを保つために必要な水の量に応じて変化する。
【０４６４】
食品全体の約0.1%程度の量の未凍結水は、電子レンジでの加熱時に迅速且つ均一に解凍する製品をもたらす。この均一な解凍は、テクスチャ特性が改善された食品をもたらす。本発明による0.1%の未凍結水を得るためには、約0.20%のPGEを要する。乳化剤の正確な量は、乳化剤の性質に依存し、当業者が容易に決定し得る。例えば、0.14%のDimodan(R) MO90又は0.14%のGrindsted(R) PGE O70(Danisco、デンマーク)は、同じ効果を生じる。
【０４６５】
好ましくは、食品は、少なくとも0.1%(w/w)の量の本発明の組成物を含む。好ましくは、食品は、少なくとも0.2%(w/w)の量の本発明の組成物を含む。好ましくは、食品は、少なくとも0.3%(w/w)の量の本発明の組成物を含む。好ましくは、食品は、少なくとも0.4%(w/w)の量の本発明の組成物を含む。好ましくは、食品は、少なくとも0.5%(w/w)の量の本発明の組成物を含む。
【０４６６】
好ましくは、食品は、10%(w/w)未満の量の本発明の組成物を含む。好ましくは、食品は、5%(w/w)未満の量の本発明の組成物を含む。好ましくは、食品は、4%(w/w)未満の量の本発明の組成物を含む。好ましくは、食品は、3%(w/w)未満の量の本発明の組成物を含む。
【０４６７】
好ましくは、食品は、0.1乃至5%(w/w)、より好ましくは0.5乃至3%(w/w)の量の本発明の組成物を含む。
【０４６８】
本発明の組成物を食品に付与する方式は、対象となる食品の性質に依存する。例えば、食品が室温で液体又は半液体である場合、組成物は、単に食品に混合することで組み入れ得る。
【０４６９】
本発明の一部の実施形態において、水、本発明によるポリペプチド、及び乳化剤は、食品に別々に添加してもよい。水の後で、本発明によるポリペプチド及び乳化剤を添加してもよく、或いは、本発明によるポリペプチド及び乳化剤の後で、水を添加してもよい。
【０４７０】
本発明によるポリペプチド、乳化剤、及び水は、食品への添加前に混ぜ合わせることが好適である。
【０４７１】
或いは、当該組成物は、食品調製プロセス中の任意の時点で組み込んでよい。例えば、組成物は、食品の表面に噴霧してよい。組成物は、食品に注入してもよい(例えば、鶏肉、精肉、又は魚の場合)。
【０４７２】
当業者は、この組み込みを行う最善の時期を判断可能であろう。
【０４７３】
好ましくは、当該食品は、低脂肪スプレッド、マヨネーズ、ヨーグルト、パン用フィリング、マーガリン、還元果実、果実調製物、フルーツフィリング、リップル、フルーツソース、煮込み果実、コーヒークリーム、インスタントフルーツデザート、菓子類(マシュマロ等)、ジャガイモに基づく食品(チップス、フレンチフライ、及びコロッケ)、調製済み食品(キャセロール及びシチュー等)、及びファインフード(サラダドレッシングを含むドレッシング、ケチャップ、ビネグレットドレッシング及びスープ)から選択される。当該食品は、飲料、又は、生肉、調理肉、生鶏肉製品、調理済み鶏肉製品、未加工海産物、調理済み海産物を含む、未加工、加工又は低温殺菌食品[未加工及び調理済みの肉、鶏肉、海産物製品]、ソーセージ、フランクフルト、インスタント食品、パスタソース、低温殺菌スープ、マリネ、水中油型乳剤、油中水乳剤、チーズスプレッド、プロセスチーズ、乳製品デザート、フレーバミルク、クリーム、発酵乳製品、チーズ、バター、練乳製品、チーズスプレッド、低温殺菌液状卵、アイスクリームミックス、大豆製品、低温殺菌液状卵、菓子製品、フルーツ製品、及び脂肪に基づく又は水を含むフィリングを有する食品であってよい。当該食品は、パン、ケーキ、ベーカリ菓子、及びパン生地等のベーカリ製品であってもよい。
【０４７４】
本発明による化粧品及び皮膚用組成物
本発明は、更に、本発明によるポリペプチドを、不凍ポリペプチド及び不凍糖タンパク質から選択された一つ以上の追加的なポリペプチドと随意的に組み合わせて含む化粧品又は皮膚用調製物を提供する。
【０４７５】
当該調製物は、本発明によるポリペプチドのみを含んでよく、或いは、調製物は、少なくとも一つの追加的な不凍ポリペプチドを含んでもよい。更に、当該組成物は、少なくとも一つの不凍糖タンパク質を本発明によるポリペプチドと共に含んでもよい。
【０４７６】
当該調製物において、調製物中の本発明によるポリペプチドは、調製物の総重量に基づいて、0.0001重量%乃至50重量%の濃度、例えば、0.001重量%乃至50重量%、0.1重量%乃至10重量%、又は0.1重量%乃至1重量%の濃度で存在し得る。
【０４７７】
不凍ポリペプチド及び不凍糖タンパク質から選択された一つ以上の追加的なポリペプチドが、本発明によるポリペプチドと共に存在する場合、ポリペプチドの総量は、調製物の総重量に基づいて、0.0001重量%乃至50重量%、例えば、0.001重量%乃至50重量%、0.1重量%乃至10重量%、又は0.1重量%乃至1重量%の濃度となり得る。
【０４７８】
好ましくは、少なくとも一つの付加的な不凍ポリペプチドは、AFP1、AFP2、AFP3、及びAFP4型から選択された少なくとも一つのポリペプチド、例えば、pseudopluronectes americanus、myoxocephalus scorpius、myoxocephalus aenaeus、及び/又はmyoxocephalus scorpiodesにより合成されたAFP1型の少なくとも一つのポリペプチド、hemitripterus americanus、osmerus mordax、及び/又はclupea harengus harengusにより合成されたAFP2型の少なくとも一つのポリペプチド、macrozoarces americanus、rhigophila dearbomi lycodes polaris、及び/又は「ウルフフィッシュ」anarhichas lupusにより合成されたAFP3型の少なくとも一つのポリペプチド、及び/又はmyoxocephalus octodecimspinosisにより合成されたAFP4型の少なくとも一つのポリペプチドを含み得る。好ましくは、少なくとも一つの不凍糖タンパク質は、trematomas borgrevinki、dissostichus mawsoni、boreogadus saida、及び/又はgadus morhuaにより合成された少なくとも一つのポリペプチドを含み得る。
【０４７９】
本発明の一態様において、調製物中の一つ以上のポリペプチドの少なくとも一部は、カプセル化し得る。
【０４８０】
本発明は、更に、本発明によるポリペプチドと、pseudopluronectes americanus、myoxocephalus scorpius、myoxocephalus aenaeus、myoxocephalus scorpiodes、hemitripterus americanus、osmerus mordax、clupea harengus harengus、macrozoarces americanus、rhigophila dearborni、lycodes polaris、anarhichas lupus、myoxocephalus octodecimspinosis、trematomas borgrevinki、dissostichus mawsoni、boreogadus saida、及びgadus morhuaのうち少なくとも一つにより合成された不凍ポリペプチド及び不凍糖タンパク質から選択された一つ以上のポリペプチドと、を含む化粧品又は皮膚用調製物を提供する。
【０４８１】
好ましくは、化粧品又は皮膚用調製物中の本発明によるポリペプチドの総量は、調製物の総重量に基づいて、0.001重量%乃至50重量%、例えば、0.1重量%乃至10重量%の濃度となる。好ましくは、化粧品又は皮膚用調製物中のポリペプチドの総量は、調製物の総重量に基づいて、0.001重量%乃至50重量%、例えば、0.1重量%乃至10重量%の濃度となる。
【０４８２】
本発明は、更に、o/w型クリーム、w/o型クリーム、w/o/w型クリーム、o型クリーム、w/o型エマルジョン、水分散液、ゲルクリーム、w/o型スティック、又はo型スティックであると共に、様々な態様を含め、本発明の調製物を含んだ化粧品又は皮膚用製品を提供する。
【０４８３】
本発明は、更に、望ましくない皮膚状態の治療又は予防のための方法を提供する。当該方法は、本発明によるポリペプチドと、随意的に一つ以上のポリペプチドとを、皮膚の少なくとも各部に付与することを含み、ポリペプチドは、不凍ポリペプチド及び不凍糖タンパク質から選択される。
【０４８４】
一態様において、当該望ましくない皮膚状態は、皮膚炎、色素異常症、外因性及び内因性の皮膚の老化の症状、及び/又は紫外線放射により生じた皮膚の損傷を含み得る。
【０４８５】
化粧品及び皮膚用調製物の技術分野において、「不凍ポリペプチド」という用語は、極端な温度条件下においても、生物が重要な細胞構造の機能的活性を保持することを可能にするポリペプチドを表すために使用される。その機能を考慮すると、この意味での「不凍ポリペプチド」は、細胞レベルでの「凍結防止化合物」を表す。
【０４８６】
本発明によるポリペプチドが、従来技術の調製物よりも、低温による皮膚の構造的損傷及び細胞損傷に対する良好な保護を提供し、皮膚の遮断性を良好に維持又は回復し、皮膚の乾燥と良好に対抗し、色素異常症に対して良好に作用し、皮膚の炎症状態に良好に作用し、老化に対して良好に作用し、環境の影響から皮膚を良好に保護することは、当業者には予見できなかった。
【０４８７】
本発明によるポリペプチドを、随意的に付加的な不凍ポリペプチド(AFP)及び/又は不凍糖タンパク質(AFGP)と共に使用すること、或いは本発明によるポリペプチドの有効含有量を有する化粧品又は局所的皮膚用調製物を、随意的に付加的なAFP及び/又はAFGPと共に使用することで、低温による皮膚の構造的損傷及び細胞損傷の効果的な治療だけでなく、その予防が可能となり、こうした気候及び天候により誘発される明確な温度の低下による損傷は、細胞酵素の最適温度の消失による細胞内及び細胞外空間における細胞生理状態の変化と、皮膚の損傷、皮膚の発赤、及び皮膚のつっぱり感と、例えば、低温、風、及び/又は紫外線光により誘発される知覚過敏と、温度に敏感な肌と、環境ストレス(温度変化、紫外線光、喫煙、スモッグ、活性酸素種、遊離基により発生)により生じる皮膚、唇、並びに鼻及び口の領域及び外皮付属器の粘膜の悪化とを引き起こす。
【０４８８】
本発明によるポリペプチドを、随意的に付加的なAFP及び/又はAFGPと共に使用すること、或いは本発明によるポリペプチドの有効含有量を随意的に付加的なAFP及び/又はAFGPと共に有する化粧品又は局所的皮膚用調製物を使用することは、皮膚の異常、敏感、若しくは機能低下状態、又は外皮付属器の異常、敏感、若しくは機能低下状態と、皮膚及び/又は外皮付属器の早期老化の兆候(例えば、皺、老人性角化症、毛細血管拡張症)と、皮膚及び外皮付属基における環境誘発(喫煙、スモッグ、活性酸素種、遊離基)及び特に光誘発性の皮膚及び外皮付属器の悪化と、光誘発性皮膚損傷と、色素異常症と、敏感肌、炎症肌、及び肌の痒みと、乾燥皮膚状態及び角質層障壁の障害と、脱毛及び発毛の改善と、例えば、皺及び皮膚再生の低下等の皮膚老化の兆候と、炎症性の皮膚状態と、アトピー性湿疹、脂漏性湿疹、多形性光線皮膚症、乾癬、白斑とに対して、効果的な治療及び予防となり、敏感肌及び炎症肌を和らげ、コラーゲン、ヒアルロン酸、及びエラスチンの合成と、健康な肌の通常のヒアルロン酸及びグリコサミノグリカン含有量の変化を刺激し、肌のセラミド合成を刺激し、特に皮膚の異常又は機能低下状態の場合に細胞内DNA合成を刺激し、細胞の再生と皮膚の再生とを増加させ、皮膚自体の予防及び修復メカニズムを(例えば、機能不全の酵素、DNA、脂質、ポリペプチドについて)増進させると共に、細胞間連絡の減少と、皮膚の異常、敏感、若しくは機能低下状態、又は皮膚付属器の異常、敏感、若しくは機能低下状態と、健康な皮膚のセラミド、脂質、及びエネルギ代謝の変化と、脂質及びポリペプチドの過酸化における変化と、生理的経皮水分損失における変化と、皮膚の水和の減少と、正常な浸透圧調節及び皮膚の水分含量の減少と、天然保湿要素の含有量の変化と、DNA損傷及び内因性DNA補修メカニズムの減少、メタロプロテイナーゼ、及び/又は他のプロテアーゼの活性の減少、又はこうした酵素に対応する内因性阻害物質の抑制と、健康な皮膚の結合組織構成要素の正常な翻訳後修飾からの逸脱と、毛髪及び毛髪領域におけるふけの形成と、皮膚の脆弱性、柔軟性の喪失、及び皮膚の疲労と、正常なケラチノサイトの増殖の増加と、レーザ及び研磨治療の局所的適用の場合における治療前及び治療後の皮膚及び毛髪の自然再生及び構造化の減少とに対して、効果的な治療及び予防となり、例えば、皮膚の皺及び傷跡を減らし、結果的に生じる皮膚の炎症を妨げ、損傷した皮膚における再生プロセスを促進する役割を果たす。
【０４８９】
したがって、アトピー性湿疹を含む炎症性の皮膚状態の予防及び治療及び/又は敏感及び乾燥状態になりやすい皮膚の場合の皮膚の保護のために、本発明によるポリペプチドを、随意的に付加的なAFP及び/又はAFGPと共に使用することも、本発明によるものとなる。
【０４９０】
したがって、色素異常症の治療及び/又は予防用の化粧品又は皮膚用調製物の製造のために化粧品又は皮膚用調製物を使用することも、本発明によるものとなる。
【０４９１】
したがって、内因性及び/又は外因性の皮膚の老化の兆候の治療及び/又は予防用、及び皮膚に対する紫外線放射の悪影響の治療及び予防用の化粧品又は皮膚用調製物の製造のために調製物を使用することも、本発明によるものとなる。
【０４９２】
そのため、セラミド生合成を増加させる化粧品又は皮膚用調製物の製造のために、本発明によるポリペプチドを、随意的に付加的なAFP及び/又はAFGPと共に使用することも、本発明の態様となる。
【０４９３】
更に、皮膚の障壁機能を強化する化粧品又は皮膚用調製物の製造のためにAFP及び/又はAFGPを使用することは、本発明の別の態様となる。
【０４９４】
本発明による化粧品又は皮膚用調製物は、好ましくは、調製物の総重量に基づいて、0.0001重量%乃至50重量%、特に好ましくは0.01重量%乃至10重量%の上述した本発明によるポリペプチドを、随意的に付加的なAFP及び/又はAFGPと共に、或いは、二つ以上の上述したAFP及び/又はAFGPの組み合わせと共に含有する。
【０４９５】
本発明によれば、通常の抗酸化物質を、本発明による活性物質の組み合わせを含有する調製物において使用することができる。
【０４９６】
抗酸化物質は、アミノ酸(例えばグリシン、ヒスチジン、チロシン、トリプトファン、β-アラニン)及びその誘導体、イミダゾール(例えば、ウロカニン酸)及びその誘導体、D,L-カルノシン、D-カルノシン、L-カルノシン等のペプチド及びその誘導体(例えば、アンセリン)、カロチノイド、カロチン(例えば、α-カロチン、β-カロチン、リコピン)及びその誘導体、リポ酸及びその誘導体(例えば、ジヒドロリポ酸)、アウロチオグルコース、プロピルチオウラシル及び他のチオール(例えば、チオレドキシン、グルタチオン、システイン、シスチン、シスタミン及びグリコシル、N-アセチル、メチル、エチル、プロピル、アミル、ブチル、及びラウリル、パルミトイル、オレイル、γ-リノレイル、コレステリル、及びそれらのグリセリルエステル)及びその塩、チオジプロピオン酸ジラウリル、チオジプロピオン酸ジステアリル、チオジプロピオン酸及びその誘導体(エステル、エーテル、ペプチド、脂質、ヌクレオチド、ヌクレオシド、及び塩)及び非常に低い耐量(例えば、pmol乃至μmol/kg)におけるスルホキシミン化合物(例えば、ブチオニンスルホキシミン、ホモシステインスルホキシミン、ブチオニンスルホン、ペンタ、ヘキサ、及びヘプタチオニンスルホキシミン)、及び他の(金属)キレート化剤(例えば、α-ヒドロキシ脂肪酸、パルミチン酸、フィチン酸、ラクトフェリン)、α-ヒドロキシ酸(例えば、クエン酸、乳酸、リンゴ酸)、フミン酸、胆汁酸、胆汁抽出物、ビリルビン、ビリベルジン、EDTA、EGTA、及びその誘導体、不飽和脂肪酸及びその誘導体(例えば、γ-リノレン酸、リノール酸、オレイン酸)、葉酸及びその誘導体、アラニンアセト酢酸、フラボノイド、ポリフェノール、カテコール、ビタミンC及びその誘導体(例えば、パルミチン酸アスコルビル、リン酸アスコルビルMg、酢酸アスコルビル)、トコフェロール及びその誘導体(例えば、ビタミンEアセテート)、及びベンゾイン樹脂の安息香酸コニフェリル、ルチン酸及びその誘導体、フェルラ酸及びその誘導体、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール、ノルジヒドログアイアシン酸、ノルジヒドログアイアレチン酸、トリヒドロキシブチロフェノン、尿酸及びその誘導体、マンノース及びその誘導体、亜鉛及びその誘導体(例えば、ZnO、ZnSO4)、セレン及びその誘導体(例えば、セレノメチオニン)、スチルベン及びその誘導体(例えば、スチルベンオキシド、トランススチルベンオキシド)並びに本発明に適する上述した活性成分の誘導体(塩、エステル、エーテル、糖、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ペプチド、及び脂質)の集合から選択される利点を有する。
【０４９７】
調製物中の抗酸化物質(一種類以上の化合物)の量は、調製物の総重量に基づいて、好ましくは0.001重量%乃至30重量%、特に好ましくは0.05重量%乃至20重量%、特に好ましくは1重量%乃至10重量%である。
【０４９８】
加えて、限定ではないが特に、エステルワックス、トリグリセリドワックス、又は炭化水素ワックスから選択し得る溶解ワックスを使用したいわゆる固体脂質ナノ粒子として、本発明による活性成分をカプセル化することは利点を有し得る。加えて、ポリマ中において、例えば、高度に架橋されたポリメタクリレート及び/又は三酢酸セルロースに基づく粒子において、及び/又はポリ(オキシメチル尿素)、ナイロン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエステル、ゼラチン、及びポリオレフィンにより作成されたシェルを備えたコア/シェル粒子として、本発明による活性成分をカプセル化することは利点を有し得る。
【０４９９】
本発明に従って使用される活性成分又は本発明に従って使用される活性成分の有効含有量を有する化粧品又は局所的皮膚用調製物による、予防、或いは化粧法又は皮膚科的処置は、通常の形で、本発明に従って使用される活性成分又は本発明に従って使用される活性成分の有効含有量を有する化粧品又は局所的皮膚用調製物を、影響を受けた皮膚の領域に塗布することで実行し得る。
【０５００】
本発明に従って使用された活性成分は、様々な形態をとり得る通常の化粧品及び皮膚用調製物に組み込むことができるという利点を有する。したがって、例えば、溶液、油中水(W/O)型又は水中油(O/W)型のエマルジョン、又は多重エマルジョン、例えば、水中油中水(W/O/W)型又は油中水中油(O/W/O)型、水分散液又は脂肪分散液、ゲル、ピカリングエマルジョン、固形スティック、又はエアロゾルであり得る。
【０５０１】
本発明のために、例えば、クリーム、ローション、化粧用乳液、及びスティックの形態となる本発明によるエマルジョンは、利点を有しており、例えば、脂肪、油、ワックス、及び/又は他の脂肪性物質を含んでよく、この種の処方においては、水と一種類以上の乳化剤とが通常使用される。
【０５０２】
本発明にしたがって使用される活性成分を、皮膚及び毛髪の洗浄及び治療用の水溶液系又は界面活性剤調合物に組み入れることも本発明の目的において可能であり、有利である。
【０５０３】
当業者は、当然ながら、通常の補助物及び添加物無しでは、要求の厳しい化粧品組成は殆ど考えられないことを認識している。その例には、ビルダ、充填剤、香料、染料、乳化剤、ビタミン又はポリペプチド等の追加の活性成分、光防護剤、安定剤、防虫剤、アルコール、水、塩、及び抗菌、タンパク質分解、又は角質溶解活性物質等が含まれる。
【０５０４】
対応する要件は、必要な変更を加えて、医薬調製物に適用される。
【０５０５】
本発明の目的のための局所的医薬組成物は、一般に、一種類以上の有効濃度の薬剤を含む。簡潔にするため、化粧及び医薬用途、及び関連製品の間の明確な区別については、ドイツ連邦共和国の法規定を参照する(例えば、化粧品指令、食品薬品法)。
【０５０６】
これに関連して、本発明に従って使用される活性成分を、他の目的で他の活性成分を既に含んでいる調製物への添加物として添加することも同様に利点を有する。
【０５０７】
したがって、本発明の目的のための化粧品又は局所的皮膚用調製物は、その処方に応じて、例えば、皮膚保護クリーム、クレンジング乳液、日焼け止めローション、栄養クリーム、デイ又はナイトクリーム、リップケアクリーム、鼻腔用スプレ等として使用することができる。一部の例においては、本発明による組成物を製剤処方の基剤として使用することが可能であり利点を有する。
【０５０８】
更に、日光からの保護が主目的ではないが、UV保護物質を含有する化粧品及び皮膚用調製物を提供することも本発明の目的にとって有利である。したがって、例えば、UVA及び/又はUVBフィルタ物質が、通常、デイクリーム又はメイクアップ製品に組み込まれている。更に、UV保護物質は、抗酸化物質と、必要な場合における保存料と同様に、調製物の劣化に対する効果的な保護を提供する。更に、日焼け止めの形態の化粧品及び皮膚用調製物も好ましい。
【０５０９】
したがって、本発明による調製物は、本発明による一つ以上の活性成分の組み合わせに加えて、少なくとも一つのUVAフィルタ物質及び/又はUVBフィルタ物質を追加的に含むことが好ましい。当該処方には、必須ではないが、随意的に、水相及び/又は油相で存在可能な一つ以上の有機又は無機顔料をUVフィルタ物質として含めることができる。
【０５１０】
好適な無機顔料は、水中において不溶性又は難溶性である金属酸化物及び/又は他の金属化合物、特に、チタニウム(TiO2)、亜鉛(ZnO)、鉄(例えば、Fe2O3)、ジルコニウム(ZrO2)、珪素(SiO2)、マンガン(例えば、MnO)、アルミニウム(Al2O3)、セリウム(例えば、Ce2O3)の酸化物、対応する金属の混合酸化物、及びこうした酸化物の混合物である。
【０５１１】
本発明によれば、こうした顔料には、表面処理(「被覆」)を行うことが有利となる場合があり、これにより、例えば、こうした顔料の両親媒性又は疎水性が形成又は保持される。この表面処理は、顔料に、それ自体公知の方法により薄い疎水性層を設けることを含むことができる。
【０５１２】
本発明によれば、例えば、オクチルシラノールで被覆された二酸化チタン顔料が有利となる。適切な二酸化チタン粒子は、Degussaより商標名T805として入手できる。更に、TAYCAより商標名MT100Tとして入手可能なもの等、ステアリン酸アルミニウムにより被覆されたTiO2顔料は、特に利点を有する。
【０５１３】
無機顔料の更に有利な被覆には、末端がトリメチルシロキシユニットによりブロックされた完全メチル化直線状シロキサン重合体の混合物であるジメチルポリシロキサン(ジメチコンとも呼ばれる)が含まれる。本発明の目的にとって特に有利な顔料は、このように被覆された酸化亜鉛顔料である。
【０５１４】
更に有利なものは、ジメチルポリシロキサン、特に200乃至350のジメチルシロキサンユニットの平均鎖長をもつジメチルポリシロキサンとシリカゲルとの混合物で、シメチコンとも呼ばれるものによる無機顔料の被膜である。特に、無機顔料が水酸化アルミニウム又は水和アルミニウム酸化物(アルミナとも呼ばれる、CAS No.1333-84-2)により更に被覆される場合に有利である。特に有利なものは、シメチコン及びアルミナにより被覆された二酸化チタンであり、その被膜は更に水を含むことも可能である。その一例は、Merckから商標名Eusolex T2000として入手可能な二酸化チタンである。
【０５１５】
本発明の目的にとって有利な有機顔料には、2,2'-メチレンビス(6-(2H-ベンゾトリアゾール-2-イル)-4-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノール)[INCI:ビスオクチルトリアゾール]であり、CIBA-Chemikalien GmbHから商標名Tinosorb(R)Mとして入手可能である。
【０５１６】
本発明による調製物は、毛髪又は皮膚を紫外線放射の全範囲から保護する化粧品調製物を提供する上で、UVA及び/又はUVB範囲のUV放射を吸収する物質を含有するという利点を有し、当該フィルタ物質の総量は、例えば、調製物の総重量に基づいて、0.1重量%乃至30重量%、好ましくは0.5乃至20重量%、特に1.0乃至15重量%である。これらは毛髪又は皮膚用の日焼け止めとしても使用することができる。
【０５１７】
本発明にとって更に有利なUVAフィルタ物質は、ジベンゾイルメタン誘導体、特に4-(tert-ブチル)-4'-メトキシジベンゾイルメタン(CAS No.70356-09-1)であり、Givaudanより商標名Parsol(R)1789として、Merckにより商標名Eusolex(R)9020として販売されている。
【０５１８】
有利な他のUVAフィルタ物質には、フェニレン-1,4-ビス-(2-ベンゾイミダジル)-3,3',5,5'-テトラスルホン酸及びその塩、特に、対応するナトリウム、カリウム、又はトリエタノールアンモニウム塩、具体的には、INCI名ビスイミダジレートであるフェニレン-1,4-ビス-(2-ベンゾイミダジル)-3,3',5,5'-テトラスルホン酸ビス-ナトリウム塩が含まれ、これはHaarmann&Reimerから商標名Neo Heliopan APとして入手可能である。
【０５１９】
同じく有利なものには、1,4-ジ(2-オキソ-10-スルホ-3-ボルニリデンメチル)ベンゼン及びその塩(特に、対応する10-スルファト化合物、具体的には対応するナトリウム、カリウム、又はトリエタノールアンモニウム塩)があり、これはベンゼン-1,4-ジ(2-オキソ-3-ボルニリデンメチル-10-スルホン酸)とも呼ばれる。
【０５２０】
本発明にとって有利なUVフィルタ物質は、所謂広域フィルタ、即ち、UVA及びUVB放射の両方を吸収するフィルタ物質である。
【０５２１】
有利な広域フィルタ又はUVBフィルタ物質には、例えば、ビス-レゾルシニルトリアジン誘導体が含まれる。特に好適なものは、2,4-ビス{[4-(2-エチルヘキシルオキシ)-2-ヒドロキシルフェニル}-6-(4-メトキシフェニル)-1,3,5-トリアジン(INCI:アニソトリアジン)であり、CIBA-Chemikalien GmbHから商標名Tinosorb(R)Sとして入手可能である。
【０５２２】
高い又は非常に高いUVA保護を特徴とする、本発明の目的にとって特に有利な調製物は、幾つかのUVA及び/又は広域フィルタを含有することが好ましく、特に、ジベンゾイルメタン誘導体[例えば4-(tert-ブチル)-4'-メトキシジベンゾイルメタン]、ベンゾトリアゾール誘導体[例えば、2,2'メチレン-ビス-(6-(2H-ベンゾトリアゾール-2-イル)-4-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)-フェノール]、フェニレン-1,4-ビス-(2-ベンゾイミダジル)-3,3',5,5'-テトラスルホン酸及び/又はその塩、1,4-ジ(2-オキソ-10-スルホ-3-ボルニリデンメチル)-ベンゼン及び/又はその塩、及び/又は2,4-ビス-{[4-(2-エチルヘキシルオキシ)-2-ヒドロキシ]-フェニル}-6-(4-メトキシフェニル)-1,3,5-トリアジンを、個別に又は互いに任意の組み合わせで含有することが好ましい。
【０５２３】
本発明により有利に使用可能な他の光保護フィルタ物質は、2-シアノ-3,3-ジフェニルアクリレート(オクトクリレン)であり、Uvinul(R)N539の名称でBASFから入手可能である。
【０５２４】
本発明による調製物において、ポリマ結合又はポリマUVフィルタ物質、特にWO-A-92/20690に記載されるものを使用することも大きな利点を有し得る。
【０５２５】
加えて、本発明による化粧品又は皮膚用調製物に、更にUVA及び/又はUVBフィルタ、例えば、4-イソプロピルベンジルサリチレート、2-エチルヘキシルサリチレート(オクチルサリチレート)、及びホモメンチルサリチレート等、特定のサリチル酸誘導体を組み込むことも利点を有し得る場合がある。
【０５２６】
当然ながら、本発明の目的のために使用可能な上述したUVフィルタの当該リストは、これらに限定することを意図するものではない。
【０５２７】
本発明による調製物は、毛髪又は皮膚を紫外線放射の全範囲から保護する化粧品調製物を可能にする上で、UVA及び/又はUVB範囲のUV放射を吸収する物質を、例えば、調製物の総重量に基づいて、0.1重量%乃至30重量%、好ましくは0.5重量%乃至20重量%、特に1.0重量%乃至15重量%の総量で含有するという利点を有する。これらは毛髪又は皮膚用の日焼け止め組成物としても使用することができる。
【０５２８】
本発明による化粧品及び皮膚用調製物は、こうした調製物において通常使用されるような化粧品活性剤、補助剤、及び添加物を含んでよく、例えば、抗酸化物質、保存剤、殺菌剤、香料、消泡剤、染料、着色顔料、増粘剤、界面活性剤、乳化剤、皮膚軟化剤、湿潤剤及び/又は保湿剤、脂肪、油、ワックス、並びにアルコール、ポリオール、ポリマ、気泡安定剤、電解質、有機溶媒、又はシリコン誘導体等の化粧品又は皮膚用処方における他の通常の成分を含んでよい。
【０５２９】
本発明による化粧品又は皮膚用調製物が溶液又はエマルジョン又は分散液の形態で存在する場合、溶媒として使用し得るものは、水又は水溶液と、カプリン酸又はカプリル酸のトリグリセリド等の油、好ましくはキャスタオイルと、脂肪、ワックス、及び他の天然及び合成脂質、好ましくは、低炭素数のアルコール、例えば、イソプロパノール、プロピレングリコール又はグリセロールを有する脂肪酸のエステル、又は低炭素数のアルカン酸又は脂肪酸を有する脂肪アルコールのエステルと、低炭素数のアルコール、ジオール、又はポリオール及びそれらのエーテル、好ましくはエタノール、イソプロパノール、プロピレングリコール、グリセロール、エチレングリコール、エチレングリコールモノエチル又はモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、モノエチルエーテル、又はモノブチルエーテル、ジエチエレングリコールモノメチルエーテル又はモノエチルエーテル及び類似産物とである。
【０５３０】
特に、上述した溶媒の混合物を使用し得る。アルコール溶媒の場合には、水を更に成分とし得る。
【０５３１】
本発明によるエマルジョン、オレオゲル、或いは水分散液又は脂肪分散液の油相は、3乃至30炭素原子の鎖長を有する飽和及び/又は不飽和の分岐及び/又は非分岐アルカンカルボキシル酸及び3乃至30炭素原子の鎖長を有する飽和及び/又は不飽和の分岐及び/又は非分岐アルコールのエステルと、芳香族カルボキシル酸及び3乃至30炭素原子の鎖長を有する飽和及び/又は不飽和の分岐及び/又は非分岐アルコールのエステルとから有利に選択される。この場合、こうしたエステル油は、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸イソプロピル、オレイン酸イソプロピル、ステアリン酸n-ブチル、ラウリン酸n-ヘキシル、オレイン酸n-デシル、ステアリン酸イソクチル、ステアリン酸イソノニル、イソノナン酸イソノニル、パルミチン酸2-エチルヘキシル、ラウリン酸2-エチルヘキシル、ステアリン酸2-ヘキシルデシル、パルミチン酸2-オクチルドデシル、オレイン酸オレイル、エルカ酸オレイル、オレイン酸エルシル、エルカ酸エルシル、及びこうしたエステルの合成、半合成、及び天然混合物、例えばホホバ油から有利に選択し得る。
【０５３２】
更に、油相は、分岐及び非分岐炭化水素及び炭化水素ワックス、シリコン油、ジアルキルエーテル、飽和又は不飽和の分岐又は非分岐アルコール、及び脂肪酸トリグリセリド、即ち、8乃至24、特に12乃至18炭素原子の鎖長を有する飽和及び/又は不飽和の分岐及び/又は非分岐アルカンカルボキシル酸のトリグリセロールエステルから有利に選択し得る。例えば、脂肪酸トリグリセリドは、合成、半合成及び天然の油、例えば、オリーブ油、ヒマワリ油、大豆油、ピーナッツ油、菜種油、アーモンド油、ヤシ油、ココナツ油、パーム核油等から有利に選択し得る。
【０５３３】
こうした油及びワックス成分の任意の混合物を、本発明により有利に使用し得る。適切である場合には、ワックス、例えば、パルミチン酸セチルを、油相の唯一の脂質成分として利用することも有利となり得る。
【０５３４】
油相は、イソステアリン酸2-エチルヘキシル、オクチルドデカノール、イソノナン酸イソトリデシル、イソ-エイコサン、2-エチルヘキシルココエート、安息香酸C12-15アルキル、カプリル/カプリン酸トリグリセリド、及びジカプリリルエーテルから有利に選択し得る。
【０５３５】
特に有利な混合物は、安息香酸C12-15アルキルとイソステアリン酸2-エチルヘキシルとの混合物、安息香酸C12-15アルキルとイソノナン酸イソトリデシルとの混合物、及び安息香酸C12-15アルキルと、イソステアリン酸2-エチルヘシルと、イソノナン酸イソトリデシルとの混合物である。
【０５３６】
炭化水素のうち、液体パラフィン、スクアラン、及びスクアレンを本発明により有利に使用し得る。
【０５３７】
油相は、更に、環状又は直線状シリコン油を含むこと、或いはこうした油により全体が構成されることで利点を有し得るが、シリコン油(群)とは別に、他の油相成分を付加的な内容物として使用することが好適である。
【０５３８】
シクロメチコン(オクタメチルシクロテトラシロキサン)を、本発明により使用されるシリコン油として利用することは利点を有する。しかしながら、他のシリコン油、例えばヘキサメチルシクロトリシロキサン、ポリジメチルシロキサン、及びポリ(メチルフェニルシロキサン)も、本発明により有利に使用し得る。
【０５３９】
特に有利な混合物は、シクロメチコンとイソノナン酸イソトリデシルとの混合物、及びシクロメチコンと、イソステアリン酸2-エチルヘキシルとの混合物である。
【０５４０】
適切な場合、本発明による調製物の水相は、低炭素数のアルコール、ジオール、又はポリオール、及びそのエーテル、好ましくはエタノール、イソプロパノール、プロピレングリコール、グリセロール、エチレングリコール、エチレングリコールモノエチル又はモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、モノエチルエーテル、又はモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル又はモノエチルエーテル、及び類似産物、更には、低炭素数のアルコール、例えば、エタノール、イソプロパノール、1,2-プロパンジオール、グリセロール、及び特に1種類以上の増粘剤を含むことで利点を有し、増粘剤は、二酸化ケイ素、ケイ酸アルミニウム、多糖及びその誘導体、例えば、ヒアルロン酸、キサンタンガム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、特に、ポリアクリレート、好ましくは、所謂カルボポールの集合からのポリアクリレート、例えばカルボポールのタイプ980、981、1382、2984、又は5984から、何れの場合も個別に又は組み合わせとして、有利に選択し得る。
【０５４１】
本発明により使用し得るゲルは、通常、低炭素数のアルコール、例えば、エタノール、イソプロパノール、1,2-プロパンジオール、グリセロール、及び水又は上述した油を、増粘剤の存在下で含み、増粘剤は、油性アルコールゲルの場合は二酸化ケイ素又はケイ酸アルミニウムが好ましく、水性アルコール又はアルコールゲルの場合はポリアクリレートが好ましい。
【０５４２】
固形スティックは、例えば、天然又は合成ワックス、脂肪アルコール、又は脂肪酸エステルを含み得る。
【０５４３】
本発明による化粧用スティックとしての使用に適した通常の基材には、液体油(例えば、液体パラフィン、キャスタオイル、ミリスチン酸イソプロピル)、半固体成分(例えば、ペトロラタム、ラノリン)、固体成分(例えば、蜜蝋、セレシン、及び微晶質ワックス、又はオゾケライト)、及び高融点のワックス(例えば、カルナバワックス及びカンデリラワックス)が含まれる。
【０５４４】
エアロゾル容器から噴霧可能な本発明による化粧品及び/又は皮膚用調製物に適した推進剤は、通常の公知の揮発性液化推進剤、例えば、炭化水素(プロパン、ブタン、イソブタン)であり、個別に、又は互いに混合物とし、利用し得る。加圧空気も有利に使用し得る。
【０５４５】
当業者は、当然ながら、本発明をエアロゾル調製物の形態で実現するために原則としては適切である非毒性推進剤が存在する事実を熟知しているであろうが、しかしながら、こうしたもの、特に、フルオロハイドロカーボン及びフルオロクロロハイドロカーボン(FCHC)は、環境又は他の付随する状況に対する受け入れ難い影響のため、使用しないことを推奨する。
【０５４６】
本発明による化粧品調製物は、本発明による有効量の活性成分と、好ましくは水である通常使用される溶媒とだけでなく、有機増粘剤、例えば、アラビアガム、キサンタンガム、アルギン酸ナトリウム、セルロース誘導体、好ましくはメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、又は無機増粘剤、例えば、ケイ酸アルミニウム、例えばベントナイト、又はポリエチレングリコール及びポリエチレングリコールステアレート又はポリエチレングリコールジステアレートの混合物を更に含むゲルの形態であってもよい。ゲルは、増粘剤を、例えば0.1乃至30重量%、好ましくは0.5乃至15重量%の量で含む。
【０５４７】
本発明による化粧品又は皮膚用調製物が、他の活性物質、特に天然活性物質及びその誘導体、例えば、アルファリポ酸、フィトエン、D-ビオチン、コエンザイムQ10、アルファグルコシルルチン、カルニチン、カルノシン、オスモライト、クローバ抽出物、ホップ抽出物、ホップ-モルト抽出物等を含有する場合、本発明の目的にとって特に有利となる。
【０５４８】
活性成分(一つ以上の物質)の濃度は、調製物の総重量に基づいて、0.0001重量%乃至30重量%が有利となる。本発明による化粧品又は皮膚用調製物は、当技術において公知である任意の方法により調整し得る。
【０５４９】
器官及び組織試料の処理
本発明による不凍ポリペプチドを含む組成物を潅流させた器官又は組織試料では、こうした器官及び組織試料又は他の生体物質を、低温で保存することが可能となり、これにより、組織、器官、細胞、又は他の生体物質に凍結損傷を発生させるリスク無しに、試料の劣化又は分解が防止される。多くの場合、器官及び生体組織に対する損傷は、対象となる器官又は組織の凍結状態の発生よりもむしろ、生じる可能性のある再結晶の方により多く引き起こされる。
【０５５０】
当該生体物質、器官、及び組織試料の例には、例えば、一つ以上のポリペプチドを含む試料、一つ以上のポリペプチドを含む一つ以上のミクロソーム又はミセルを含む試料、全血を含む試料、血漿を含む試料、血小板を含む試料、赤血球を含む試料、精液を含む試料、配偶子を含む試料が含まれる。
【０５５１】
組織培養試料は、動物細胞及びヒト細胞等の哺乳類細胞、齧歯類細胞、及び昆虫細胞を含む任意の形態の生体細胞を含むことができる。処理対象となる器官は、例えば、腎臓、肺、心臓、脾臓、又は肝臓にすることができる。したがって、器官又は生体試料の再結晶化を抑制する方法が提供され、当該方法は、器官又は生体試料を本発明によるポリペプチドに、当該ポリペプチドが組織又は生体試料の再結晶化を防止可能な条件下で、接触させる工程を備える。
【０５５２】
更に、組織又は生体試料の保存を改善する方法が提供され、当該方法は、器官又は生体試料を本発明によるポリペプチドに、当該ポリペプチドが対象となる器官又は生体試料に接触可能な条件下で接触させ、これにより、未処理の器官又は生体試料の保存温度と対照的に、保存対象の器官又は生体試料を氷点下温度で保存することを可能にする工程を備える。
【０５５３】
ガラス化に基づく新たな方法が、最近開発されている。しかしながら、この方法では、配偶子、胚又は幹細胞の解凍中に弛緩が発生し、これが氷晶の形成を意味するという事実が問題となっている。解凍プロセス中、こうした氷晶は、再結晶化により成長する。このガラス化プロセス中、配偶子、胚、又は幹細胞が存在する溶媒中に、本発明による一つ以上のポリペプチドが存在する場合、結晶形成及び結晶成長は、著しく低減され、更には防止さえされ得ると考えられる
【０５５４】
本発明によるポリペプチドの他の凍結防止用途を、以下更に詳細に開示する。
【０５５５】
別個の態様において、本発明は、上昇温度、下降温度、及び氷点下温度を共に含む、温度異常等の非生理学的状態に晒された際に受ける損傷から細胞及びその膜を保護する方法に関する。凍結範囲を上回る温度と、凍結範囲を下回るがガラス化状態にある温度とを含め、氷の形成を含まない広範な条件において、細胞生存率の改善が観察される。これまで、こうしたポリペプチドの知られた特性は、氷晶と相互作用する能力のみであった。氷晶が形成される条件においては、ソース生物で自然に発生する濃度でポリペプチドをヒト細胞に使用すると、細胞の損傷の減少ではなく、むしろ悪化が生じるが、低い濃度を用いることで、損傷が減少し、生存率が改善することが更に発見された。したがって、当該ポリペプチドは、細胞懸濁液、組織、及び器官全体の保存及び生存能力の改善に利益をもたらす。ポリペプチドは、更に、哺乳類細胞膜のイオンチャネルをブロックする能力を有し、これにより、病状の治療に更なる有用性を提供することが発見された。
【０５５６】
本発明は、不凍ポリペプチドの、認識されていたが未活用であった特質と、細胞及び細胞膜と相互作用する能力とを利用する。当該相互作用は、細胞懸濁液中の個別の細胞、組織及び器官内の連結された細胞集団、及び血管系に広がる細胞構造を含め、広範な構造において細胞膜との間に発生する。相互作用は、細胞の生存能力及び生存率の改善、機能性持続の延長、細胞及び細胞組織の安定性及び構造的完全性、悪条件下での膜及び細胞に対する構造的損傷の発生の低減、及び細胞膜を介したイオン輸送の制御を含め、細胞膜と、こうした細胞膜が組み込まれた構造とに、様々な利益を与える好ましいものである。
【０５５７】
当該様々な種類の相互作用は、こうした相互作用の有益な影響が、氷晶の存在下だけでなく、氷晶が全く形成されない条件下においても観察されることから、こうしたポリペプチドの氷晶の増殖に対する公知の効果とは無関係であるい。例えば、利点は、低温度から、生理的温度を大きく超える温度にいたるまでの範囲で観察される。したがって、本発明は、生理的条件及び非生理的条件を含む状況と、氷晶の存在を伴う状況及び氷晶が完全に欠如した状況とにまで及ぶ。したがって、生存細胞及び細胞膜に対する有益な影響が観察される非生理的条件には、(i)水の通常の凝固点(0℃)を上回るため氷形成の可能性が無いが、細胞の生理的温度は下回る温度により定められる、下降温度条件と、(ii)例えば150K乃至約4K等、ガラス形成(又はガラス遷移)温度以下の温度と、ガラス化を促進し且つ結晶化を抑制するガラス化剤の存在とにより定められる、ガラス化条件と、(iii)氷晶の形成を可能にする、水の通常の凝固点から約4Kまで等の、凍結条件と、(iv)細胞の生理的温度を上回る温度、例えば、生理的な範囲の温度から生理的温度を約10℃上回る温度までにより定められる、上昇温度条件と、(v)非生理的pH条件及び他の生理的化学組成からの変動等、細胞の生理的化学環境とは異なる化学環境により定めらる条件、及びこうした条件の非生理的温度条件との組み合わせとが含まれる。
【０５５８】
本発明の目的の適用性は、細胞膜の不安定性に関連する疾病と、細胞膜を介した異常なイオン輸送を引き起こす細胞内区間と細胞外空間との間のイオンの不均衡に関連する疾病といった異常な生理的条件に及ぶ。この作用の予期せぬ性質は、ATPイオンポンプ及びカルバコールとの相互作用を含む細胞の他の代謝機能へ干渉すること無く、上皮細胞におけるカルシウム及びカリウムイオンチャネル等のイオンチャネルの遮断が達成されるという発見により高められる。更に、本発明は、表皮組織を回復、保護、及び修復するように設計された化粧品又は薬物の使用などを介して、正常な生理的条件にある細胞に利益をもたらす。
【０５５９】
本発明は、動物細胞及び植物細胞を共に含む広範な生体細胞に対する適用性を有する。しかしながら、本発明に関連する特に意外且つ興味深い発見は、哺乳類の細胞、組織、及び器官の処理及び保存における不凍ポリペプチドの有用性である。自然形態において、こうしたポリペプチドは、哺乳類以外の種にのみ存在しており、こうした種と哺乳類種との間の、細胞及び膜の構造、並びに血液及び細胞質の組成における差異のため、ここで発見された利点は、予想外且つ驚くべきものである。そのため、本発明は、哺乳類の正常な生理的条件とは異なる条件に晒された哺乳類細胞、組織、器官、及び生物体へ適用される際に特に興味深く有用性を有するものとなる。本発明が適用可能な細胞の例には、哺乳類の卵母細胞、肝細胞、赤血球、及び白血球と、様々な種類の植物細胞とがある。組織及び器官の例は、肝臓、心臓、及び腎臓の組織及び器官自体である。生物体の例は、胚、自律的な動物個体、植物の種子、及び植物個体である。
【０５６０】
本発明により生じる付加的な利点は、数多く多様である。これらに含まれるものには、低温度での凍結中に高い冷却速度を維持する必要性の排除と、公知の抗凍結剤より大幅に低い濃度において溶液の粘度を引き上げる当該ポリペプチドの能力と、凍結時に食品を保護する当該ポリペプチドの能力とである。本発明の他の利点、利益、及び用途は、以下の説明により明らかとなろう。
【０５６１】
低温保存の技術分野において、以下の用語は、次の定義により使用される。
【０５６２】
細胞、組織、器官、又は生物に対する「異常」又は「非生理的条件」とは、正常な生理的条件とは異なる条件を示す。異常又は非生理的条件には、細胞、組織、又は器官にとって、又は生物自体にとって自然である、健康な生物の正常な生理的温度より大幅に高い又は低い温度と、二酸化炭素、酸素、無機塩、又は有機化合物の量の過剰又は欠乏と、健康な生物のものより大幅に高い又は低いpH値と、こうした条件の組み合わせとが含まれる。
【０５６３】
「不凍ポリペプチド」、「不凍ポリペプチド」(「AFP」)、「不凍糖タンパク質」、及び「不凍糖ペプチド」(「AFGP」)は、水の凝固点を非束一的に低下させる周知の特性を有する、一部の動物の体液に見られる高分子を示す。不凍ポリペプチド、ポリペプチド、糖タンパク質、及び糖ペプチドは、「熱的ヒステリシスポリペプチド」としても知られれ、これは、凍結が生じる温度が、ポリペプチドの任意の束一的特性に帰属させることが可能な度合いより大きく押し下げられる一方で、氷が融解中に融解する温度は、束一的性質のみに従い、落ち込みが大幅に少なくなるためである。
【０５６４】
「低温度」は、0℃を下回る温度を示す。
【０５６５】
「凍結」は、水の液相から水の固相への遷移を示す。
【０５６６】
「上昇温度」は、例えば、生理的温度の僅かに上回る温度から、生理的温度を約20℃、好ましくは約10℃、より好ましくは約5℃上回る温度まで等、細胞、組織、器官、又は生物体の正常な生理的温度より高い温度を示す。
【０５６７】
「下降温度」は、細胞、組織、器官、又は生物体の正常な生理的温度より低いが、固相への相転移を引き起こすほどには十分に低くない温度を示す。
【０５６８】
「単離及び精製」は、天然に発生する生物から抽出され、クロマトグラフィ等の従来の実験的手法により、好ましくは少なくとも約85%、より好ましくは少なくとも約95%の濃度まで濃縮された分子種を示す。本発明は、更に、分子の天然発生形態と同一であるか、高い類似性を有するか、或いは相同である分子構造を有し、化学的手段又は組換えDNA手法により合成されたものであり得る分子にまで及ぶ。
【０５６９】
「哺乳類」は、生物学において一般的に使用される通り、例えば、ブタ、ウシ、ウサギ、ウマ、及びヒトを含む、任意の温血哺乳動物を示す。
【０５７０】
「極地魚種」は、北極圏及び南極圏内の領域を含む地球の極地域の水中に生息する冷血水生動物、特に脊椎動物を示す。本発明との関連において特に対象となる極地魚種は、氷結状態となる、或いは氷結状態であり続ける水中に留まるものである。
【０５７１】
「針状体」及び「針状」は、結晶の増殖の優勢な方向がc軸線に沿っている、即ち、底面に垂直であり、針に似た形状を有する結晶が形成される氷晶及び氷晶成長を示す。
【０５７２】
「生存可能」は、生存が可能であること、正常な生理的条件下において、又は正常な生理的条件への復帰時に、存続及び成長可能であること、或いは、通常は発芽に好ましい条件下において、発芽が可能であることを示す。
【０５７３】
「ガラス化」は、結晶氷とは対照的に、ガラス相、即ち、非結晶性固体が形成されるような形での低温度における凝固を示す。
【０５７４】
「見掛けのガラス化」は、顕微鏡下での目視観察により決定されるようなガラス化を示す。生体物質のガラス化は、グリセロール及びプロピレングリコール等の多価アルコール、或いはジメチルスルホキシド等の他の化合物を含む、様々な凍結防止剤又は「ガラス化」剤の何れかを生体物質に導入することにより一般に達成される。ガラス化剤の導入には、比較的高い速度の冷却が伴う場合が多い。それぞれの場合の最適な速度は、系の組成及び熱力学により変化する。卵子、精子、胚等の小さな組織化されていない細胞と、器官とについて、殆どの場合に標準的となる冷却速度は、一般に、約100℃/分乃至約2,000℃/分、好ましくは約200℃/分乃至約1,750℃/分、より好ましくは約700℃/分乃至約1,750℃/分の範囲に含まれる。1500℃/分程度の速度が、多く使用される。
【０５７５】
本発明の実施において、本発明による不凍ポリペプチドは、一般に溶液、好ましくは水溶液の形態で使用される。本発明による不凍ポリペプチドは、個別に、或いは他のポリペプチドと組み合わせて使用し得る。ポリペプチドを組み合わせて使用する時には、たとえ体液の異なる成分から単離され、異なる溶媒又は溶液に再溶解され、おそらくは混合物が自然環境で存在する時のものとは異なる総濃度であるとしても、発生源の種において天然発生する時の生理的組み合わせにおいて、即ち、ポリペプチドが抽出される魚、昆虫、又は他の生物の体液で見られるものと同じポリペプチド種の混合及び割合において、ポリペプチドを使用することが最も有利である場合が多い。しかしながら、特定の場合、ソース混合物においてポリペプチドを分画化し、最適な形で分画を選択及び再結合させることにより、活性及び有効性が改善されることもある。
【０５７６】
本発明において使用される溶液における本発明による不凍ポリペプチドの濃度は、大きく変化し得るが、特定の場合には、一定の濃度範囲内で結果の改善が得られ、特定の場合には、ポリペプチド自体が引き起こす損傷を回避するため、濃度を一定の範囲に限定する必要がある。しかしながら、一般に、ポリペプチドは、約0.01mg/mL乃至約80mg/mL、好ましくは約0.1mg/mL乃至約60mg/mL、より好ましくは約1mg/mL乃至約40mg/mL、最も好ましくは約1mg/mL乃至約20mg/mLの濃度で使用される。ヒト細胞に使用する場合、特に細胞の生理的温度を下回る温度では、好適な濃度は、約0.1mg/mL乃至約40mg/mL、より好ましくは約0.1mg/mL乃至約3mg/mLである。組織の生理的温度を下回る温度において組織を保護するためにポリペプチドが使用される用途では、好適な濃度は、約0.1mg/mL乃至約50mg/mLの範囲であり、組織がヒト組織である場合、好適な濃度は、約0.1mg/mL乃至約3mg/mLの範囲である。細胞の生理的温度を下回るが、細胞の凍結温度を上回る温度において、或いは、細胞の凍結温度を下回る温度だが、ガラス化剤又は他の非ペプチド凍結防止剤の存在下において、一般的な細胞を保護するためにポリペプチドが使用される用途では、好適な濃度は、約0.01mg/mL乃至約60mg/mLの範囲であり、より好適な濃度は、約1mg/mL乃至約40mg/mLの範囲である。細胞膜を介したイオンチャネルを遮断するためにポリペプチドが使用される用途では、好適な濃度は、少なくとも約0.01mg/mL、より好ましくは少なくとも約0.1mg/mL、最も好ましくは約0.5mg/mL乃至約40mg/mLである。不凍ポリペプチドの濃度は全て、異なる不凍ポリペプチドの混合物を溶液が含有する時の個別の不凍ポリペプチドの濃度の合計として表現される。
【０５７７】
本発明において使用される不凍ポリペプチドの水溶液は、生物因子を保存するために有用であることが当技術において公知である電解質溶液に含まれる、塩と、糖と、イオンと、他の栄養素との多種多様な混合物のいずれかを更に含み得る。これらには、組織培養培地、臓器潅流流体等が含まれる。電解質溶液は、ポリペプチドの生物学的適合性を促進する上で特に有用である。当技術において公知である多数の電解質溶液の例は、NaCl濃度が0.9%又は0.95%である生理食塩水と、Facts and Comparisons, p. 50, Lippincott Publishing Co., St. Louis, Mo. (October 1981)に記載のリンゲル注射液(米国)と、Best及びTaylor, Basis of Medical Practice, 6th ed., Baltimore (1950)に記載の哺乳類リンゲル液(イギリス及びカナダ)と、Facts and Comparisons, p. 50, Lippincott Publishing Co., St. Louis, Mo. (October 1981)に記載の乳酸リンゲル液(米国)と、Hartmann, A. F., J. Am. Med. Assoc. 103:1349-1354 (1934) に記載の乳酸リンゲル液(Hartmann)と、Fox, C. L.ら, J. Am. Med. Assoc. 148:825-833 (1952) に記載の酢酸リンゲル液と、Locke, F. S., Zbl. Physiol. 8:166 (1894); 14:670 (1900); 15:490 (1901)に記載のロック液と、Tyrode, M. J., Arch. Int. Pharmacodyn. 20:205 (1910)に記載のタイロード液と、Krebs, H. A.ら, Hoppe-Seyle's Z. Physiol. Chem. 210:33-66 (1932)に記載のクレブスヘンゼライト液と、Krebs, H. A., Hoppe-Seyle's Z. Physiol. Chem. 217:193 (1933)に記載のクレブスリンゲルリン酸塩溶液と、Krebs, H. A., Biochem. Biophys. Acta 4:249-269 (1950)に記載のクレブス血清代用溶液と、Krebs, H. A., Biochem. Biophys. Acta 4:249-269 (1950)に記載のクレブス改良リンゲルII溶液と、Krebs, H. A., Biochem. Biophys. Acta 4:249-269 (1950)に記載のクレブス改良リンゲルIII溶液と、 Hem, R.ら, Biochem. J. 101:284 (1966)に記載のウシ血清アルブミン及び赤血球を含むクレブス肝臓潅流液と、Schimassek, H.ら, Biochem. Z. 336,440 (1963)に記載のシマセック肝臓潅流液と、Nishiitsutsuji-Uwo, J.ら, Biochem. J. 103:852-862 (1967)に記載のクレブス腎臓潅流液と、Crow, K. E.ら, Biochem. J. 172:29-36 (1978) 肝細胞培養液と、Bahlman, J.ら, Am. J. Physiol. 212:77 (1967)に記載のバールマン腎臓潅流液と、Fulgraffら, Arch. Int. Pharmacodyn. 172:49 (1972)に記載のフルグラフ腎臓潅流液とである。
【０５７８】
任意の特定の用途に対する電解質溶液の最適な選択は、例えば、不凍ポリペプチドによる処理又は保護の対象となる細胞の形態(細胞懸濁液、組織、又は器官として、細胞が存在しているか)、細胞が由来する動物、細胞が晒された又は晒されることが予期される条件等、用途により変化する。
【０５７９】
ガラス化条件を含む本発明の実施形態において、不凍ポリペプチドは、氷点下温度への冷却持における細胞内液及び細胞外液の固化中に氷晶形成を防止又は抑制するガラス化剤と組み合わせて使用される。様々なガラス化剤が当技術において公知であり、個別に、或いは他のガラス化剤又は生物学的に適合する溶質と組み合わせて使用し得る。ガラス化剤の例は、グリセロール、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、ポリビニルピロリドン、グルコース、スクロース、プロパンジオール、ブタンジオール、及びカルボキシメチルセルロースである。多価アルコールの類はガラス化剤として有用である。主な例は、グリセロール、エチレングリコール、プロパンジオール、ブタンジオール、及びブタントリオールである。ガラス化剤の濃度は、系内の他の成分の濃度と、冷却速度と、到達する最低温度とに応じて、大きく変化し得る。一般に、最善の結果は、約5重量%乃至約35受領%の濃度により得られる。ガラス化は、通常、例えば、100℃/分を超える速度、好ましくは1,000℃/分を超える速度等、急速な冷却速度により実施し得る
【０５８０】
非ペプチド凍結防止剤の使用を含む実施形態では、必ずしも氷晶の形成を回避することなく、多くの同じ考慮事項が当てはまる。ガラス化剤の例として上述した作用物質は、同様の濃度範囲内において、凍結防止剤としての役割も果たす。
【０５８１】
細胞及び/又は細胞膜に対する不凍ポリペプチドの有益な効果は、当該ポリペプチドを細胞に接触させて配置し、通常は有害となる条件に晒す期間を通じて、或いはその実質的な部分にわたって、こうした接触を維持することにより達成される。細胞が細胞懸濁液の形態である時、この種の接触は、単にポリペプチドを懸濁流体に添加することで達成される。細胞が組織又は器官の形態である時、接触は、組織又は器官をポリペプチドの溶液に浸漬することで達成される。細胞が血管系を含む組織又は器官の形態である時、接触は、ポリペプチドの溶液により血管系を潅流し、潅流後、貯蔵期間、保存期間、又は有害条件に晒す期間を通じて、血管系に当該ポリペプチド溶液を保持することにより達成される。潅流の方法は、生理学及び外科的手順について技能を有する者には周知である。
【０５８２】
本発明による不凍ポリペプチドによる処理から利益を得る可能性がある細胞には、広範な種類の細胞が含まれる。例には、卵母細胞、胚、白血球、赤血球、血小板、膵島、及び肝細胞がある。本発明により利益を得る可能性がある器官も非常に多様である。例には、肝臓、腎臓、心臓、脳、肺、膵臓、脾臓、卵巣、及び胃が含まれる。本発明により利益を得る可能性がある組織には、こうした器官の任意の組織と、皮膚組織、骨髄組織、角膜組織、及び他の広範囲のものとが含まれる。本発明は、哺乳類全般に適用性を有し、ヒトの細胞、組織、及び器官に関連して使用される時、特に興味深く実用性のあるものとなる。
【０５８３】
細胞膜を介したイオン輸送の抑制における本発明による不凍ポリペプチドの効果は、様々なイオンに及び、特に、Ca++、K+、及びNa+イオンと、これらのイオンの二種類以上の組み合わせとに関連する。
【０５８４】
過剰なイオン輸送は低体温症に伴う生理的影響の一つであるため、本発明による不凍ポリペプチドがイオン輸送を抑制する能力は、下降温度条件下において細胞の生存能力を強化する当該ポリペプチドの能力に関連し得る。したがって、イオン輸送抑制の効果を達成するために投与されるポリペプチドの量及び濃度は、一般に、下降温度に晒された状態における生存能力を強化する際に使用される量と同じ又は類似するものとなる。
【０５８５】
細胞膜を介したイオン輸送を抑制する能力により、当該ポリペプチドは、過剰な膜貫通イオン輸送が存在する疾病及び異常な生理的状態の治療においても有用となる。こうした疾病及び状態の例には、嚢胞性線維症、カールタジュナ症候群、尿崩症、糖尿病、及び抗利尿ホルモン異常がある。この効果のためのポリペプチドの投与は、経口摂取と、血管注射と、局所付与と、こうした疾病及び状態の治療又は管理において使用される時に他の薬物又は治療剤が投与される様々な一般的手段とにより達成し得る。ここでも、有用な結果のための濃度は、一般に、上述したものと同じであり、投与の用量又は頻度は、治療される状態の進展の度合いと、治療に対して観察される応答とにより決定される。
【０５８６】
本発明のポリペプチドを含む不凍ポリペプチドの適用は、細胞構造を有する食品の保存における当該ポリペプチドの使用にも及ぶ。特にこの付与の対象となる食品は、食肉及び肉製品であるが、他の種類の食品も同様に利益を得る。本発明の目的上、食肉及び肉製品は、生の食肉及び鶏肉と、冷凍、缶詰、及び乾燥状態とした食肉及び鶏肉を含む。こうした食品の多くは、輸送又は保存中に損傷を避けるために冷却した場合、膨圧と、新鮮さと、味、食感、及び全般的魅力に貢献する他の品質とを失う傾向にある。こうした品質は、本発明によるポリペプチドの溶液による食品の処理により維持することができる。処理の方式は、食品の種類毎に変化するが、一般には、浸漬、潅流、又は他の任意の種類の吸収、或いは長期間の接触を達成する他の手段の何れかによる、溶液中のポリペプチドとの食品の平衡化が含まれる。本発明の他の用途に関連して上述した溶液の種類及び浸漬及び潅流の方法は、この場合にも適用可能である。
【０５８７】
本発明によるポリペプチドを含む流体
例えば、冷媒及び多数の様々な種類の水溶液等の流体及び液体に対する添加物としての本発明による不凍ポリペプチドの使用は、冷媒又は水溶液の凍結を防止する目的で、本発明に従って提供される。溶液の凍結を防止する特徴は、多数の様々な技術分野において有益となる。
【０５８８】
本発明によるポリペプチドに結合される担体及び固体支持体
本発明によるポリペプチドは、固体支持体又は半固体支持体等の担体に結合させるることができる。当該ポリペプチドは、こうした任意の担体、例えば、本発明によるポリペプチドを所望の形でディスプレイする材料の表面と、共有結合又は非共有結合させることができる。本発明による表面及び固体支持体は、固体又は半固体支持体等の表面に直接的又は間接的に取り付けられた、一つ以上の本発明によるポリペプチド、又は不凍活性を示すその機能性フラグメントを含むことができる。取付には、原則として、ポリペプチドを表面に共有結合又は非共有結合により、例えば、直接的に、リンカ残基を介して、又は表面との反応性接触の状態にポリペプチドを維持するケージ構造におけるポリペプチドの捕獲を介して、取り付ける、あらゆる最先端技術、或いは本発明によるポリペプチド(群)を固体支持体又は半固体支持体に取り付ける他の任意の方法が含まれる。
【０５８９】
ポリペプチドを固体又は半固体支持体に取り付けるために、多数の手法を利用できる。固体表面に対するポリペプチドの取付は、例えば、Cordekら 1999, Anal. Chem., 71: 1529-1533、Blasiら 2005, Enzyme and Microbial Tech., 36: 818-823、Parradoら (1995), Proc. Chem., 30(8): 735-741、Yakovlevaら (2003), Biosensors and Bioelectronics, 19: 21-34、Cao, L., Carrier-bound Immobilized Enzymes. Principles, Applications and Design, Wiley-VCH, 2005、及びImmobilization of Enzymes and Cells (Methods in Biotechnology), Birkerstaff, G.F.編, Humana Press, 1997において開示されている。他の手法も利用可能であり、当業者に周知である。
【０５９０】
本発明の一態様において、一つ以上の本発明によるポリペプチドを含むコーティング組成物が提供される。当該コーティング組成物は、以下更に詳細に開示する、色素及び樹脂を含む、一つ以上の他の原料を含むこともできる。
【０５９１】
ゾルゲル法により形成されたケイ酸塩ガラスにおけるポリペプチドを含む生体分子の固定化には多くの注目が集まっている(Eggersら, Protein Sci. 2001, 10, 250-261))。当該プロセスには、アルコキシドを加水分解してゾルを生成することが含まれ、その後、ゾルは重縮合を受けてゲルを形成する。生体分子は、ゾルからゲルへの転移中にゲル内に捕獲されることで不動化される。ゾルゲル材料は、従来の生体分子捕獲用有機ポリマに比べ、こうした材料では物理的強度、化学的安定性、生体適合性、及び微生物の攻撃に対する耐性が増加しているため利点を提供する。
【０５９２】
本発明によるポリペプチドのゾルゲルカプセル化は、ポリオールシリケート及びポリオールシロキサンに基づく先駆物質、特にグリセロールに由来するものを使用して実行できる。ポリ(グリセリルシリケート)(PGS)は、高度の生体適合性と、穏やかなカプセル化条件とにより区別されると共に、再現性があり且つ効率的なポリペプチドのシリカ内部への閉じ込めを可能にするアプローチにおいて、ポリペプチドのゾルゲル生体捕獲用に調製及び利用することができる。
【０５９３】
上述した方法は、メタロシリケート、アルキルシロキサン、官能性シロキサン、及び様々な複合ゾルゲルまで拡張可能であり、これにより、本発明による不凍ポリペプチドを含む、物理化学的に多様な範囲のバイオドープポリマの製造が可能となる。
【０５９４】
本発明によるハイブリッド材料は、好ましくは、ゾルゲルバイオセラミックを特徴付ける高い安定性及び堅牢性と共に、遊離型の不凍ポリペプチドのものに近い活性を示す。
【０５９５】
本発明の一態様では、当業者に周知のゾルゲルプロセスを使用して、本発明によるポリペプチドを固体又は半固体支持体に取り付ける。ゾルゲルプロセスは、従来通りであり、一般的には、粘度増加状態にあるコロイド状のマイクロメータ未満の粒子のネットワークにおいて、ネットワークがガラスの約半分の密度を有して完全に堅固になるまで相互接続を形成することにより製造される、光学的に透明な非晶質シリカ又はシリケート材料に由来するゾルゲルガラスを製造する。したがって、一つ以上の本発明によるポリペプチドを含むゾルゲルガラスも特許請求の範囲となる。特に、Gill及びBallesteros, J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8587-8598を参照する。架橋粒子のゾルを形成する溶液重合は、例えば、US5,863,996において開示されており、本発明に関連して使用可能である。
【０５９６】
本発明の別の態様によるコーティング組成物は、本発明によるポリペプチド(群)に適合する、即ち、ポリペプチドがコーティング組成物の一部を形成する時に不凍活性を発揮することを可能にする樹脂を含むことが好ましい。樹脂は、当技術において周知であり、ポリペプチド適合性樹脂も、従来技術において開示されている。例えばWO01/72911及びUS5,998,200を参照されたい。
【０５９７】
更に、本発明によるポリペプチドを含む三次元ナノアーキテクチャを有するメソ多孔エアロゲルを含む組成物が、本発明により提供される。当該三次元ナノアーキテクチャは、内部にナノ接着された、コロイド金属カプセル化不凍ポリペプチドバイオ複合体超構造を含むことが好ましい。したがって、内部にナノ接着されたコロイド金属カプセル化不凍ポリペプチドバイオ複合体を備えた三次元ナノ構造を有するメソ多孔エアロゲルを作成する方法が提供され、当該方法は、本発明による一つ以上の不凍ポリペプチドとコロイド金属とを共に混合することにより、金属カプセル化不凍ポリペプチドバイオ複合体を形成する工程と、触媒と、ケイ素アルコキシド等のアルコキシドとを共に混合することにより、シリカゾル等のゾルを形成する工程と、前記シリカゾル等のゾルと、前記バイオ複合体とを共に混合してゾルのゲル化を可能にすることにより、ゲルを形成する工程と、前記ゲルを抽出して二酸化炭素により超臨界的に乾燥させ、内部にナノ接着された金属カプセル化不凍ポリペプチドバイオ複合体超構造を備えたエアロゲルを作成する工程とを備える。一実施形態において、当該メソ多孔エアロゲルは、シリカメソ多孔エアロゲルである。US2004/0209338を参照する。
【０５９８】
ガスハイドレートの形成の抑制における本発明によるポリペプチドの使用
本発明によるポリペプチドは、海洋におけるガスハイドレートの形成の抑制においても用途が存在し得る。ガスハイドレートは、水と適切なサイズの「ゲスト」ガス分子との混合物から形成される氷状の結晶性分子錯体であることは周知である。水(ホスト)分子は、水素結合時、幾つかの格子間空隙を有する格子構造を形成する。当該ゲストガス分子は、格子空隙を占有可能であり、最小限の数の空隙が充填された時、結晶構造は安定した状態となり、水氷の凝固点を十分に上回る温度であっても、固体のガスハイドレートが生じる。ガスハイドレートが解離(融解)する時、結晶格子は崩壊して液体水となり(或いは、水の凝固点を下回る条件の場合には氷に転換し)、ガスが放出される。商業的には、ガスをエネルギ生産に利用し得る。しかしながら、この現象は、制御されない形でガスが漏れ出した場合の環境的なリスクを呈する。これは、地震が時折起こる地域において起こり得る。
【０５９９】
ガスハイドレート形成に関する問題が海底のパイプラインにおいても生じることは周知である。しかしながら、本発明によるポリペプチドの氷晶形成を抑制する特性のため、こうしたハイドレートの構造が氷晶の構造に非常に似ているという事実により、前記ポリペプチドの存在がガスハイドレートの形成を防止し得ると考えられる。
【０６００】
本発明の選択項目を以下に開示する。
【０６０１】
1.複数の連続的に結合されたアミノ酸残基を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、配列:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQ ID NO:90)を含み、
ここで、
X1は、S、A、G、及びDから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
X2は、A、V、I、T、及びSから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
X3は、嵩高くないアミノ酸残基から成るアミノ酸残基の集合から選択され、
X4は、S、I、T、及びVから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
X5は、S、A、I、及びTから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
X6は、S、T、及びVから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
X7は、嵩高くないアミノ酸残基から成るアミノ酸残基の集合から選択され、
X8は、S、T、及びVから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
X9は、S、A、及びGから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
SEQ ID NO:90の残基X2、X4、X6、及びX8のうち少なくとも一個は、T又はVであり、
前記ポリペプチドのアミノ酸残基の合計数は、250未満であり、
氷結合能力を有するポリペプチド。
【０６０２】
2.X1は、Sである、項目1記載のポリペプチド。
【０６０３】
3.X1は、Aである、項目1記載のポリペプチド。
【０６０４】
4.X1は、Gである、項目1記載のポリペプチド。
【０６０５】
5.X1は、Dである、項目1記載のポリペプチド。
【０６０６】
6.X2は、Aである、項目1記載のポリペプチド。
【０６０７】
7.X2は、Vである、項目1記載のポリペプチド。
【０６０８】
8.X2は、Iである、項目1記載のポリペプチド。
【０６０９】
9.X2は、Tである、項目1記載のポリペプチド。
【０６１０】
10.X2は、Sである、項目1記載のポリペプチド。
【０６１１】
11.X3は、環状脂肪族側鎖又は芳香族側鎖を含まない、項目1記載のポリペプチド。
【０６１２】
12.X4は、Sである、項目1記載のポリペプチド。
【０６１３】
13.X4は、Iである、項目1記載のポリペプチド。
【０６１４】
14.X4は、Tである、項目1記載のポリペプチド。
【０６１５】
15.X4は、Vである、項目1記載のポリペプチド。
【０６１６】
16.X5は、Sである、項目1記載のポリペプチド。
【０６１７】
17.X5は、Aである、項目1記載のポリペプチド。
【０６１８】
18.X5は、Iである、項目1記載のポリペプチド。
【０６１９】
19.X5は、Tである、項目1記載のポリペプチド。
【０６２０】
20.X6は、Sである、項目1記載のポリペプチド。
【０６２１】
21.X6は、Tである、項目1記載のポリペプチド。
【０６２２】
22.X6は、Vである、項目1記載のポリペプチド。
【０６２３】
23.X7は、環状脂肪族側鎖又は芳香族側鎖を含まない、項目1記載のポリペプチド。
【０６２４】
24.X8は、Sである、項目1記載のポリペプチド。
【０６２５】
25.X8は、Tである、項目1記載のポリペプチド。
【０６２６】
26.X8は、Vである、項目1記載のポリペプチド。
【０６２７】
27.X9は、Sである、項目1記載のポリペプチド。
【０６２８】
28.X9は、Aである、項目1記載のポリペプチド。
【０６２９】
29.X9は、Gである、項目1記載のポリペプチド。
【０６３０】
30.SEQ ID NO:90の前記残基X2、X4、X6、及びX8のうち少なくとも一個は、Tである、項目1記載のポリペプチド。
【０６３１】
31.SEQ ID NO:90の前記残基X2、X4、X6、及びX8のうち少なくとも二個は、Tである、項目1記載のポリペプチド。
【０６３２】
32.SEQ ID NO:90の前記残基X2、X4、X6、及びX8のうち少なくとも三個は、Tである、項目1記載のポリペプチド。
【０６３３】
33.SEQ ID NO:90の前記残基X2、X4、X6、及びX8の四個全てがTである、項目1記載のポリペプチド。
【０６３４】
34.SEQ ID NO:90の前記残基X2、X4、X6、及びX8のうち少なくとも一個は、Vである、項目1記載のポリペプチド。
【０６３５】
35.SEQ ID NO:90の前記残基X2、X4、X6、及びX8のうち少なくとも二個は、Vである、項目1記載のポリペプチド。
【０６３６】
36.SEQ ID NO:90の前記残基X2、X4、X6、及びX8のうち少なくとも三個は、Vである、項目1記載のポリペプチド。
【０６３７】
37.SEQ ID NO:90の前記残基X2、X4、X6、及びX8の四個全てがVである、項目1記載のポリペプチド。
【０６３８】
38.前記ポリペプチドのアミノ酸残基の最大数は、240未満、例として230未満、例えば220未満、例として210未満、例えば200未満、例として190未満、例えば180未満、例として150未満、例えば140未満、例として130未満、例えば120未満、例として110未満、例えば100未満、例として95未満、例えば90未満、例として85未満、例えば80未満、例として75未満、例えば70未満、例として65未満、例えば60未満、例として55未満、例えば50未満、例として45未満、例えば40未満、例として30未満、例えば20未満、例として15未満である、項目1記載のポリペプチド。
【０６３９】
39.前記ポリペプチドのアミノ酸残基の最小数は、10以上、例として12以上、例えば14以上、例として16以上、例えば18以上、例として20以上、例えば22以上、例として24以上、例えば26以上、例として28以上、例えば30以上、例として32以上、例えば34以上、例として36以上、例えば38以上、例として40以上、例えば42以上、例として44以上、例えば46以上、例として48以上、例えば50以上、例として55以上、例えば60以上、例として65以上、例えば70以上、例として75以上、例えば80以上、例として85以上、例えば90以上、例として95以上、例えば100以上である、項目1記載のポリペプチド。
【０６４０】
40.更に、SEQ ID NO:90の前記第一のコピーと重複しないSEQ ID NO:90の第二のコピーを含み、SEQ ID NO:90の前記第二のコピーは、配列:
Xa-Xb-Xc-Xd-Xe-Xf-Xg-Xh-Xi(SEQ ID NO:90)を含み、
ここで、
Xaは、S、A、G、及びDから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
Xbは、A、V、I、T、及びSから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
Xcは、嵩高くないアミノ酸残基から成るアミノ酸残基の集合から選択され、
Xdは、S、I、T、及びVから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
Xeは、S、A、I、及びTから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
Xfは、S、T、及びVから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
Xgは、嵩高くないアミノ酸残基から成るアミノ酸残基の集合から選択され、
Xhは、S、T、及びVから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
Xiは、S、A、及びGから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
SEQ ID NO:90の残基Xb、Xd、Xf、及びXhのうち少なくとも一個は、T又はVである、項目1記載のポリペプチド。
【０６４１】
41.Xaは、Sである、項目40記載のポリペプチド。
【０６４２】
42.Xaは、Aである、項目40記載のポリペプチド。
【０６４３】
43.Xaは、Gである、項目40記載のポリペプチド。
【０６４４】
44.Xaは、Dである、項目40記載のポリペプチド。
【０６４５】
45.Xbは、Aである、項目40記載のポリペプチド。
【０６４６】
46.Xbは、Vである、項目40記載のポリペプチド。
【０６４７】
47.Xbは、Iである、項目40記載のポリペプチド。
【０６４８】
48.Xbは、Tである、項目40記載のポリペプチド。
【０６４９】
49.Xbは、Sである、項目40記載のポリペプチド。
【０６５０】
50.Xcは、環状脂肪族側鎖又は芳香族側鎖を含まない、項目40記載のポリペプチド。
【０６５１】
51.Xdは、Sである、項目40記載のポリペプチド。
【０６５２】
52.Xdは、Iである、項目40記載のポリペプチド。
【０６５３】
53.Xdは、Tである、項目40記載のポリペプチド。
【０６５４】
54.Xdは、Vである、項目40記載のポリペプチド。
【０６５５】
55.Xeは、Sである、項目40記載のポリペプチド。
【０６５６】
56.Xeは、Aである、項目40記載のポリペプチド。
【０６５７】
57.Xeは、Iである、項目40記載のポリペプチド。
【０６５８】
58.Xeは、Tである、項目40記載のポリペプチド。
【０６５９】
59.Xfは、Sである、項目40記載のポリペプチド。
【０６６０】
60.Xfは、Tである、項目40記載のポリペプチド。
【０６６１】
61.Xfは、Vである、項目40記載のポリペプチド。
【０６６２】
62.Xgは、環状脂肪族側鎖又は芳香族側鎖を含まない、項目40記載のポリペプチド。
【０６６３】
63.Xhは、Sである、項目40記載のポリペプチド。
【０６６４】
64.Xhは、Tである、項目40記載のポリペプチド。
【０６６５】
65.Xhは、Vである、項目40記載のポリペプチド。
【０６６６】
66.Xiは、Sである、項目40記載のポリペプチド。
【０６６７】
67.Xiは、Aである、項目40記載のポリペプチド。
【０６６８】
68.Xiは、Gである、項目40記載のポリペプチド。
【０６６９】
69.SEQ ID NO:90の前記残基Xb、Xd、Xf、及びXhのうち少なくとも一個は、Tである、項目40記載のポリペプチド。
【０６７０】
70.SEQ ID NO:90の前記残基Xb、Xd、Xf、及びXhのうち少なくとも二個は、Tである、項目40記載のポリペプチド。
【０６７１】
71.SEQ ID NO:90の前記残基Xb、Xd、Xf、及びXhのうち少なくとも三個は、Tである、項目40記載のポリペプチド。
【０６７２】
72.SEQ ID NO:90の前記残基Xb、Xd、Xf、及びXhの四個全てがTである、項目40記載のポリペプチド。
【０６７３】
73.SEQ ID NO:90の前記残基Xb、Xd、Xf、及びXhのうち少なくとも一個は、Vである、項目40記載のポリペプチド。
【０６７４】
74.SEQ ID NO:90の前記残基Xb、Xd、Xf、及びXhのうち少なくとも二個は、Vである、項目40記載のポリペプチド。
【０６７５】
75.SEQ ID NO:90の前記残基Xb、Xd、Xf、及びXhのうち少なくとも三個は、Vである、項目40記載のポリペプチド。
【０６７６】
76.SEQ ID NO:90の前記残基Xb、Xd、Xf、及びXhの四個全てがVである、項目40記載のポリペプチド。
【０６７７】
77.SEQ ID NO:90の前記第一及び第二のコピーは、一個以上のアミノ酸残基により分離されている、項目40記載のポリペプチド。
【０６７８】
78.SEQ ID NO:90の前記第一及び第二のコピーは、2個のアミノ酸残基、例として3個のアミノ酸残基、例えば4個のアミノ酸残基、例として5個のアミノ酸残基、例えば6個のアミノ酸残基、例として7個のアミノ酸残基、例えば8個のアミノ酸残基、例として9個のアミノ酸残基、例えば10個のアミノ酸残基、例として11個のアミノ酸残基、例えば12個のアミノ酸残基、例として13個のアミノ酸残基、例えば14個のアミノ酸残基、例として15個のアミノ酸残基、例えば16個のアミノ酸残基、例として17個のアミノ酸残基、例えば18個のアミノ酸残基、例として19個のアミノ酸残基、例えば20個のアミノ酸残基、例として21個のアミノ酸残基、例えば22個のアミノ酸残基、例として23個のアミノ酸残基、例えば24個のアミノ酸残基、例として25個のアミノ酸残基、例えば26個のアミノ酸残基、例として27個のアミノ酸残基、例えば28個のアミノ酸残基、例として29個のアミノ酸残基、例えば30個のアミノ酸残基により分離されている、項目40記載のポリペプチド。
【０６７９】
79.SEQ ID NO:90の前記第一及び第二のコピーは、少なくとも2個のアミノ酸残基、例として少なくとも3個のアミノ酸残基、例えば少なくとも4個のアミノ酸残基、例として少なくとも5個のアミノ酸残基、例えば少なくとも6個のアミノ酸残基、例として少なくとも7個のアミノ酸残基、例えば少なくとも8個のアミノ酸残基、例として少なくとも9個のアミノ酸残基、例えば少なくとも10個のアミノ酸残基、例として少なくとも11個のアミノ酸残基、例えば少なくとも12個のアミノ酸残基、例として少なくとも13個のアミノ酸残基、例えば少なくとも14個のアミノ酸残基、例として少なくとも15個のアミノ酸残基、例えば少なくとも16個のアミノ酸残基、例として少なくとも17個のアミノ酸残基、例えば少なくとも18個のアミノ酸残基、例として少なくとも19個のアミノ酸残基、例えば少なくとも20個のアミノ酸残基、例として少なくとも21個のアミノ酸残基、例えば少なくとも22個のアミノ酸残基、例として少なくとも23個のアミノ酸残基、例えば少なくとも24個のアミノ酸残基、例として少なくとも25個のアミノ酸残基、例えば少なくとも26個のアミノ酸残基、例として少なくとも27個のアミノ酸残基、例えば少なくとも28個のアミノ酸残基、例として少なくとも29個のアミノ酸残基、例えば少なくとも30個のアミノ酸残基により分離されている、項目40記載のポリペプチド。
【０６８０】
80.SEQ ID NO:90の前記第一及び第二のコピーは、100個未満のアミノ酸残基、例として95個未満のアミノ酸残基、例えば90個未満のアミノ酸残基、例として85個未満のアミノ酸残基、例えば80個未満のアミノ酸残基、例として75個未満のアミノ酸残基、例えば70個未満のアミノ酸残基、例として65個未満のアミノ酸残基、例えば60個未満のアミノ酸残基、例として55個未満のアミノ酸残基、例えば50個未満のアミノ酸残基、例として45個未満のアミノ酸残基、例えば40個未満のアミノ酸残基、例として35個未満のアミノ酸残基、例えば30個未満のアミノ酸残基、例として25個未満のアミノ酸残基、例えば24個未満のアミノ酸残基、例として23個未満のアミノ酸残基、例えば22個未満のアミノ酸残基、例として21個未満のアミノ酸残基、例えば20個未満のアミノ酸残基、例として19個未満のアミノ酸残基、例えば18個未満のアミノ酸残基、例として17個未満のアミノ酸残基、例えば16個未満のアミノ酸残基、例として15個未満のアミノ酸残基、例えば14個未満のアミノ酸残基、例として13個未満のアミノ酸残基、例えば12個未満のアミノ酸残基、例として11個未満のアミノ酸残基、例えば10個未満のアミノ酸残基、例として9個未満のアミノ酸残基、例えば8個未満のアミノ酸残基、例として7個未満のアミノ酸残基、例えば6個未満のアミノ酸残基、例として5個未満のアミノ酸残基により分離されている、項目40記載のポリペプチド。
【０６８１】
81.SEQ ID NO:90の前記第一のコピーは、SEQ ID NO:90の第二のコピーのN末端側に位置する、項目40記載のポリペプチド。
【０６８２】
82.SEQ ID NO:90の前記第二のコピーは、SEQ ID NO:90の第一のコピーのN末端側に位置する、項目40記載のポリペプチド。
【０６８３】
83.更に、SEQ ID NO:90の前記第一及び第二のコピーと重複しないSEQ ID NO:90の第三のコピーを含み、SEQ ID NO:90の第三のコピーは、配列:
Xaa-Xba-Xca-Xda-Xea-Xfa-Xga-Xha-Xia(SEQ ID NO:90)を含み、
ここで、
Xaaは、S、A、G、及びDから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
Xbaは、A、V、I、T、及びSから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
Xcaは、嵩高くないアミノ酸残基から成るアミノ酸残基の集合から選択され、
Xdaは、S、I、T、及びVから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
Xeaは、S、A、I、及びTから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
Xfaは、S、T、及びVから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
Xgaは、嵩高くないアミノ酸残基から成るアミノ酸残基の集合から選択され、
Xhaは、S、T、及びVから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
Xiaは、S、A、及びGから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
SEQ ID NO:90の残基Xba、Xda、Xfa、及びXhaのうち少なくとも一個は、T又はVである、項目40記載のポリペプチド。
【０６８４】
84.Xaaは、Sである、項目83記載のポリペプチド。
【０６８５】
85.Xaaは、Aである、項目83記載のポリペプチド。
【０６８６】
86.Xaaは、Gである、項目83記載のポリペプチド。
【０６８７】
87.Xaaは、Dである、項目83記載のポリペプチド。
【０６８８】
88.Xbaは、Aである、項目83記載のポリペプチド。
【０６８９】
89.Xbaは、Vである、項目83記載のポリペプチド。
【０６９０】
90.Xbaは、Iである、項目83記載のポリペプチド。
【０６９１】
91.Xbaは、Tである、項目83記載のポリペプチド。
【０６９２】
92.Xbaは、Sである、項目83記載のポリペプチド。
【０６９３】
93.Xcaは、環状脂肪族側鎖又は芳香族側鎖を含まない、項目83記載のポリペプチド。
【０６９４】
94.Xdaは、Sである、項目83記載のポリペプチド。
【０６９５】
95.Xdaは、Iである、項目83記載のポリペプチド。
【０６９６】
96.Xdaは、Tである、項目83記載のポリペプチド。
【０６９７】
97.Xdaは、Vである、項目83記載のポリペプチド。
【０６９８】
98.Xeaは、Sである、項目83記載のポリペプチド。
【０６９９】
99.Xeaは、Aである、項目83記載のポリペプチド。
【０７００】
100.Xeaは、Iである、項目83記載のポリペプチド。
【０７０１】
101.Xeaは、Tである、項目83記載のポリペプチド。
【０７０２】
102.Xfaは、Sである、項目83記載のポリペプチド。
【０７０３】
103.Xfaは、Tである、項目83記載のポリペプチド。
【０７０４】
104.Xfaは、Vである、項目83記載のポリペプチド。
【０７０５】
105.Xgaは、環状脂肪族側鎖又は芳香族側鎖を含まない、項目83記載のポリペプチド。
【０７０６】
106.Xhaは、Sである、項目83記載のポリペプチド。
【０７０７】
107.Xhaは、Tである、項目83記載のポリペプチド。
【０７０８】
108.Xhaは、Vである、項目83記載のポリペプチド。
【０７０９】
109.Xiaは、Sである、項目83記載のポリペプチド。
【０７１０】
110.Xiaは、Aである、項目83記載のポリペプチド。
【０７１１】
111.Xiaは、Gである、項目83記載のポリペプチド。
【０７１２】
112.SEQ ID NO:90の前記残基Xba、Xda、Xfa、及びXhaのうち少なくとも一個は、Tである、項目83記載のポリペプチド。
【０７１３】
113.SEQ ID NO:90の前記残基Xba、Xda、Xfa、及びXhaのうち少なくとも二個は、Tである、項目83記載のポリペプチド。
【０７１４】
114.SEQ ID NO:90の前記残基Xba、Xda、Xfa、及びXhaのうち少なくとも三個は、Tである、項目83記載のポリペプチド。
【０７１５】
115.SEQ ID NO:90の前記残基Xba、Xda、Xfa、及びXhaの四個全てがTである、項目83記載のポリペプチド。
【０７１６】
116.SEQ ID NO:90の前記残基Xba、Xda、Xfa、及びXhaのうち少なくとも一個は、Vである、項目83記載のポリペプチド。
【０７１７】
117.SEQ ID NO:90の前記残基Xba、Xda、Xfa、及びXhaのうち少なくとも二個は、Vである、項目83記載のポリペプチド。
【０７１８】
118.SEQ ID NO:90の前記残基Xba、Xda、Xfa、及びXhaのうち少なくとも三個は、Vである、項目83記載のポリペプチド。
【０７１９】
119.SEQ ID NO:90の前記残基Xba、Xda、Xfa、及びXhaの四個全てがVである、項目83記載のポリペプチド。
【０７２０】
120.SEQ ID NO:90の前記異なるコピーは、一個以上のアミノ酸残基により分離されている、項目83記載のポリペプチド。
【０７２１】
121.SEQ ID NO:90の前記第二及び前記第三のコピーは、一個以上のアミノ酸残基により分離されている、項目83記載のポリペプチド。
【０７２２】
122.SEQ ID NO:90の前記第一のコピーと、SEQ ID NO:90の前記第三のコピーとは、2個のアミノ酸残基、例として3個のアミノ酸残基、例えば4個のアミノ酸残基、例として5個のアミノ酸残基、例えば6個のアミノ酸残基、例として7個のアミノ酸残基、例えば8個のアミノ酸残基、例として9個のアミノ酸残基、例えば10個のアミノ酸残基、例として11個のアミノ酸残基、例えば12個のアミノ酸残基、例として13個のアミノ酸残基、例えば14個のアミノ酸残基、例として15個のアミノ酸残基、例えば16個のアミノ酸残基、例として17個のアミノ酸残基、例えば18個のアミノ酸残基、例として19個のアミノ酸残基、例えば20個のアミノ酸残基、例として21個のアミノ酸残基、例えば22個のアミノ酸残基、例として23個のアミノ酸残基、例えば24個のアミノ酸残基、例として25個のアミノ酸残基、例えば26個のアミノ酸残基、例として27個のアミノ酸残基、例えば28個のアミノ酸残基、例として29個のアミノ酸残基、例えば30個のアミノ酸残基により分離されている、項目83記載のポリペプチド。
【０７２３】
123.SEQ ID NO:90の前記第一のコピーと、SEQ ID NO:90の前記第三のコピーとは、少なくとも2個のアミノ酸残基、例として少なくとも3個のアミノ酸残基、例えば少なくとも4個のアミノ酸残基、例として少なくとも5個のアミノ酸残基、例えば少なくとも6個のアミノ酸残基、例として少なくとも7個のアミノ酸残基、例えば少なくとも8個のアミノ酸残基、例として少なくとも9個のアミノ酸残基、例えば少なくとも10個のアミノ酸残基、例として少なくとも11個のアミノ酸残基、例えば少なくとも12個のアミノ酸残基、例として少なくとも13個のアミノ酸残基、例えば少なくとも14個のアミノ酸残基、例として少なくとも15個のアミノ酸残基、例えば少なくとも16個のアミノ酸残基、例として少なくとも17個のアミノ酸残基、例えば少なくとも18個のアミノ酸残基、例として少なくとも19個のアミノ酸残基、例えば少なくとも20個のアミノ酸残基、例として少なくとも21個のアミノ酸残基、例えば少なくとも22個のアミノ酸残基、例として少なくとも23個のアミノ酸残基、例えば少なくとも24個のアミノ酸残基、例として少なくとも25個のアミノ酸残基、例えば少なくとも26個のアミノ酸残基、例として少なくとも27個のアミノ酸残基、例えば少なくとも28個のアミノ酸残基、例として少なくとも29個のアミノ酸残基、例えば少なくとも30個のアミノ酸残基により分離されている、項目83記載のポリペプチド。
【０７２４】
124.SEQ ID NO:90の前記第二のコピーと、SEQ ID NO:90の前記第三のコピーとは、2個のアミノ酸残基、例として3個のアミノ酸残基、例えば4個のアミノ酸残基、例として5個のアミノ酸残基、例えば6個のアミノ酸残基、例として7個のアミノ酸残基、例えば8個のアミノ酸残基、例として9個のアミノ酸残基、例えば10個のアミノ酸残基、例として11個のアミノ酸残基、例えば12個のアミノ酸残基、例として13個のアミノ酸残基、例えば14個のアミノ酸残基、例として15個のアミノ酸残基、例えば16個のアミノ酸残基、例として17個のアミノ酸残基、例えば18個のアミノ酸残基、例として19個のアミノ酸残基、例えば20個のアミノ酸残基、例として21個のアミノ酸残基、例えば22個のアミノ酸残基、例として23個のアミノ酸残基、例えば24個のアミノ酸残基、例として25個のアミノ酸残基、例えば26個のアミノ酸残基、例として27個のアミノ酸残基、例えば28個のアミノ酸残基、例として29個のアミノ酸残基、例えば30個のアミノ酸残基により分離されている、項目83記載のポリペプチド。
【０７２５】
125.SEQ ID NO:90の前記第二のコピーと、SEQ ID NO:90の前記第三のコピーとは、少なくとも2個のアミノ酸残基、例として少なくとも3個のアミノ酸残基、例えば少なくとも4個のアミノ酸残基、例として少なくとも5個のアミノ酸残基、例えば少なくとも6個のアミノ酸残基、例として少なくとも7個のアミノ酸残基、例えば少なくとも8個のアミノ酸残基、例として少なくとも9個のアミノ酸残基、例えば少なくとも10個のアミノ酸残基、例として少なくとも11個のアミノ酸残基、例えば少なくとも12個のアミノ酸残基、例として少なくとも13個のアミノ酸残基、例えば少なくとも14個のアミノ酸残基、例として少なくとも15個のアミノ酸残基、例えば少なくとも16個のアミノ酸残基、例として少なくとも17個のアミノ酸残基、例えば少なくとも18個のアミノ酸残基、例として少なくとも19個のアミノ酸残基、例えば少なくとも20個のアミノ酸残基、例として少なくとも21個のアミノ酸残基、例えば少なくとも22個のアミノ酸残基、例として少なくとも23個のアミノ酸残基、例えば少なくとも24個のアミノ酸残基、例として少なくとも25個のアミノ酸残基、例えば少なくとも26個のアミノ酸残基、例として少なくとも27個のアミノ酸残基、例えば少なくとも28個のアミノ酸残基、例として少なくとも29個のアミノ酸残基、例えば少なくとも30個のアミノ酸残基により分離されている、項目83記載のポリペプチド。
【０７２６】
126.SEQ ID NO:90の前記第一のコピーと、SEQ ID NO:90の前記第三のコピーとは、100個未満のアミノ酸残基、例として95個未満のアミノ酸残基、例えば90個未満のアミノ酸残基、例として85個未満のアミノ酸残基、例えば80個未満のアミノ酸残基、例として75個未満のアミノ酸残基、例えば70個未満のアミノ酸残基、例として65個未満のアミノ酸残基、例えば60個未満のアミノ酸残基、例として55個未満のアミノ酸残基、例えば50個未満のアミノ酸残基、例として45個未満のアミノ酸残基、例えば40個未満のアミノ酸残基、例として35個未満のアミノ酸残基、例えば30個未満のアミノ酸残基、例として25個未満のアミノ酸残基、例えば24個未満のアミノ酸残基、例として23個未満のアミノ酸残基、例えば22個未満のアミノ酸残基、例として21個未満のアミノ酸残基、例えば20個未満のアミノ酸残基、例として19個未満のアミノ酸残基、例えば18個未満のアミノ酸残基、例として17個未満のアミノ酸残基、例えば16個未満のアミノ酸残基、例として15個未満のアミノ酸残基、例えば14個未満のアミノ酸残基、例として13個未満のアミノ酸残基、例えば12個未満のアミノ酸残基、例として11個未満のアミノ酸残基、例えば10個未満のアミノ酸残基、例として9個未満のアミノ酸残基、例えば8個未満のアミノ酸残基、例として7個未満のアミノ酸残基、例えば6個未満のアミノ酸残基、例として5個未満のアミノ酸残基により分離されている、項目83記載のポリペプチド。
【０７２７】
127.SEQ ID NO:90の前記第二のコピーと、SEQ ID NO:90の前記第三のコピーとは、100個未満のアミノ酸残基、例として95個未満のアミノ酸残基、例えば90個未満のアミノ酸残基、例として85個未満のアミノ酸残基、例えば80個未満のアミノ酸残基、例として75個未満のアミノ酸残基、例えば70個未満のアミノ酸残基、例として65個未満のアミノ酸残基、例えば60個未満のアミノ酸残基、例として55個未満のアミノ酸残基、例えば50個未満のアミノ酸残基、例として45個未満のアミノ酸残基、例えば40個未満のアミノ酸残基、例として35個未満のアミノ酸残基、例えば30個未満のアミノ酸残基、例として25個未満のアミノ酸残基、例えば24個未満のアミノ酸残基、例として23個未満のアミノ酸残基、例えば22個未満のアミノ酸残基、例として21個未満のアミノ酸残基、例えば20個未満のアミノ酸残基、例として19個未満のアミノ酸残基、例えば18個未満のアミノ酸残基、例として17個未満のアミノ酸残基、例えば16個未満のアミノ酸残基、例として15個未満のアミノ酸残基、例えば14個未満のアミノ酸残基、例として13個未満のアミノ酸残基、例えば12個未満のアミノ酸残基、例として11個未満のアミノ酸残基、例えば10個未満のアミノ酸残基、例として9個未満のアミノ酸残基、例えば8個未満のアミノ酸残基、例として7個未満のアミノ酸残基、例えば6個未満のアミノ酸残基、例として5個未満のアミノ酸残基により分離されている、項目83記載のポリペプチド。
【０７２８】
128.SEQ ID NO:90の前記第三のコピーは、SEQ ID NO:90の前記第一のコピー及びSEQ ID NO:90の前記第二のコピーの両方のN末端側に位置する、項目83記載のポリペプチド。
【０７２９】
129.SEQ ID NO:90の前記第三のコピーは、SEQ ID NO:90の前記第一のコピーのN末端側に位置し、SEQ ID NO:90の前記第二のコピーのC末端側に位置する、項目83記載のポリペプチド。
【０７３０】
130.SEQ ID NO:90の前記第三のコピーは、SEQ ID NO:90の前記第二のコピーのN末端側に位置し、SEQ ID NO:90の前記第一のコピーのC末端側に位置する、項目83記載のポリペプチド。
【０７３１】
131.SEQ ID NO:90の前記第三のコピーは、SEQ ID NO:90の前記第一のコピー及びSEQ ID NO:90の前記第二のコピーの両方のC末端側に位置する、項目83記載のポリペプチド。
【０７３２】
132.更に、SEQ ID NO:90の前記第一、第二、及び第三のコピーと重複しないSEQ ID NO:90の第四のコピーを含み、SEQ ID NO:90の第四のコピーは、配列:
Xab-Xbb-Xcb-Xdb-Xeb-Xfb-Xgb-Xhb-Xib(SEQ ID NO:90)を含み、
ここで、
Xabは、S、A、G、及びDから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
Xbbは、A、V、I、T、及びSから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
Xcbは、嵩高くないアミノ酸残基から成るアミノ酸残基の集合から選択され、
Xdbは、S、I、T、及びVから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
Xebは、S、A、I、及びTから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
Xfbは、S、T、及びVから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
Xgbは、嵩高くないアミノ酸残基から成るアミノ酸残基の集合から選択され、
Xhbは、S、T、及びVから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
Xibは、S、A、及びGから成るアミノ酸残基の集合から選択され、
SEQ ID NO:90の残基Xbb、Xdb、Xfb、及びXhbのうち少なくとも一個は、T又はVである、項目83記載のポリペプチド。
【０７３３】
133.Xabは、Sである、項目83記載のポリペプチド。
【０７３４】
134.Xabは、Aである、項目83記載のポリペプチド。
【０７３５】
135.Xabは、Gである、項目83記載のポリペプチド。
【０７３６】
136.Xabは、Dである、項目83記載のポリペプチド。
【０７３７】
137.Xbbは、Aである、項目83記載のポリペプチド。
【０７３８】
138.Xbbは、Vである、項目83記載のポリペプチド。
【０７３９】
139.Xbbは、Iである、項目83記載のポリペプチド。
【０７４０】
140.Xbbは、Tである、項目83記載のポリペプチド。
【０７４１】
141.Xbbは、Sである、項目83記載のポリペプチド。
【０７４２】
142.Xcbは、環状脂肪族側鎖又は芳香族側鎖を含まない、項目83記載のポリペプチド。
【０７４３】
143.Xdbは、Sである、項目83記載のポリペプチド。
【０７４４】
144.Xdbは、Iである、項目83記載のポリペプチド。
【０７４５】
145.Xdbは、Tである、項目83記載のポリペプチド。
【０７４６】
146.Xdbは、Vである、項目83記載のポリペプチド。
【０７４７】
147.Xebは、Sである、項目83記載のポリペプチド。
【０７４８】
148.Xebは、Aである、項目83記載のポリペプチド。
【０７４９】
149.Xebは、Iである、項目83記載のポリペプチド。
【０７５０】
150.Xebは、Tである、項目83記載のポリペプチド。
【０７５１】
151.Xfbは、Sである、項目83記載のポリペプチド。
【０７５２】
152.Xfbは、Tである、項目83記載のポリペプチド。
【０７５３】
153.Xfbは、Vである、項目83記載のポリペプチド。
【０７５４】
154.Xgbは、環状脂肪族側鎖又は芳香族側鎖を含まない、項目83記載のポリペプチド。
【０７５５】
155.Xhbは、Sである、項目83記載のポリペプチド。
【０７５６】
156.Xhbは、Tである、項目83記載のポリペプチド。
【０７５７】
157.Xhbは、Vである、項目83記載のポリペプチド。
【０７５８】
158.Xibは、Sである、項目83記載のポリペプチド。
【０７５９】
159.Xibは、Aである、項目83記載のポリペプチド。
【０７６０】
160.Xibは、Gである、項目83記載のポリペプチド。
【０７６１】
161.SEQ ID NO:90の前記残基Xbb、Xdb、Xfb、及びXhbのうち少なくとも一個は、Tである、項目83記載のポリペプチド。
【０７６２】
162.SEQ ID NO:90の前記残基Xbb、Xdb、Xfb、及びXhbのうち少なくとも二個は、Tである、項目83記載のポリペプチド。
【０７６３】
163.SEQ ID NO:90の前記残基Xbb、Xdb、Xfb、及びXhbのうち少なくとも三個は、Tである、項目83記載のポリペプチド。
【０７６４】
164.SEQ ID NO:90の前記残基Xbb、Xdb、Xfb、及びXhbの四個全てがTである、項目83記載のポリペプチド。
【０７６５】
165.SEQ ID NO:90の前記残基Xbb、Xdb、Xfb、及びXhbのうち少なくとも一個は、Vである、項目83記載のポリペプチド。
【０７６６】
166.SEQ ID NO:90の前記残基Xbb、Xdb、Xfb、及びXhbのうち少なくとも二個は、Vである、項目83記載のポリペプチド。
【０７６７】
167.SEQ ID NO:90の前記残基Xbb、Xdb、Xfb、及びXhbのうち少なくとも三個は、Vである、項目83記載のポリペプチド。
【０７６８】
168.SEQ ID NO:90の前記残基Xbb、Xdb、Xfb、及びXhbの四個全てがVである、項目83記載のポリペプチド。
【０７６９】
169.SEQ ID NO:90の前記第一のコピー及びSEQ ID NO:90の前記第四のコピーは、一個以上のアミノ酸残基により分離されている、項目83記載のポリペプチド。
【０７７０】
170.SEQ ID NO:90の前記第二のコピー及びSEQ ID NO:90の前記第四のコピーは、一個以上のアミノ酸残基により分離されている、項目83記載のポリペプチド。
【０７７１】
171.SEQ ID NO:90の前記第三のコピー及びSEQ ID NO:90の前記第四のコピーは、一個以上のアミノ酸残基により分離されている、項目83記載のポリペプチド。
【０７７２】
172.SEQ ID NO:90の前記第一のコピーと、SEQ ID NO:90の前記第四のコピーとは、2個のアミノ酸残基、例として3個のアミノ酸残基、例えば4個のアミノ酸残基、例として5個のアミノ酸残基、例えば6個のアミノ酸残基、例として7個のアミノ酸残基、例えば8個のアミノ酸残基、例として9個のアミノ酸残基、例えば10個のアミノ酸残基、例として11個のアミノ酸残基、例えば12個のアミノ酸残基、例として13個のアミノ酸残基、例えば14個のアミノ酸残基、例として15個のアミノ酸残基、例えば16個のアミノ酸残基、例として17個のアミノ酸残基、例えば18個のアミノ酸残基、例として19個のアミノ酸残基、例えば20個のアミノ酸残基、例として21個のアミノ酸残基、例えば22個のアミノ酸残基、例として23個のアミノ酸残基、例えば24個のアミノ酸残基、例として25個のアミノ酸残基、例えば26個のアミノ酸残基、例として27個のアミノ酸残基、例えば28個のアミノ酸残基、例として29個のアミノ酸残基、例えば30個のアミノ酸残基により分離されている、項目83記載のポリペプチド。
【０７７３】
173.SEQ ID NO:90の前記第二のコピーと、SEQ ID NO:90の前記第四のコピーとは、2個のアミノ酸残基、例として3個のアミノ酸残基、例えば4個のアミノ酸残基、例として5個のアミノ酸残基、例えば6個のアミノ酸残基、例として7個のアミノ酸残基、例えば8個のアミノ酸残基、例として9個のアミノ酸残基、例えば10個のアミノ酸残基、例として11個のアミノ酸残基、例えば12個のアミノ酸残基、例として13個のアミノ酸残基、例えば14個のアミノ酸残基、例として15個のアミノ酸残基、例えば16個のアミノ酸残基、例として17個のアミノ酸残基、例えば18個のアミノ酸残基、例として19個のアミノ酸残基、例えば20個のアミノ酸残基、例として21個のアミノ酸残基、例えば22個のアミノ酸残基、例として23個のアミノ酸残基、例えば24個のアミノ酸残基、例として25個のアミノ酸残基、例えば26個のアミノ酸残基、例として27個のアミノ酸残基、例えば28個のアミノ酸残基、例として29個のアミノ酸残基、例えば30個のアミノ酸残基により分離されている、項目83記載のポリペプチド。
【０７７４】
174.SEQ ID NO:90の前記第三のコピーと、SEQ ID NO:90の前記第四のコピーとは、2個のアミノ酸残基、例として3個のアミノ酸残基、例えば4個のアミノ酸残基、例として5個のアミノ酸残基、例えば6個のアミノ酸残基、例として7個のアミノ酸残基、例えば8個のアミノ酸残基、例として9個のアミノ酸残基、例えば10個のアミノ酸残基、例として11個のアミノ酸残基、例えば12個のアミノ酸残基、例として13個のアミノ酸残基、例えば14個のアミノ酸残基、例として15個のアミノ酸残基、例えば16個のアミノ酸残基、例として17個のアミノ酸残基、例えば18個のアミノ酸残基、例として19個のアミノ酸残基、例えば20個のアミノ酸残基、例として21個のアミノ酸残基、例えば22個のアミノ酸残基、例として23個のアミノ酸残基、例えば24個のアミノ酸残基、例として25個のアミノ酸残基、例えば26個のアミノ酸残基、例として27個のアミノ酸残基、例えば28個のアミノ酸残基、例として29個のアミノ酸残基、例えば30個のアミノ酸残基により分離されている、項目83記載のポリペプチド。
【０７７５】
175.SEQ ID NO:90の前記第一のコピーと、SEQ ID NO:90の前記第四のコピーとは、少なくとも2個のアミノ酸残基、例として少なくとも3個のアミノ酸残基、例えば少なくとも4個のアミノ酸残基、例として少なくとも5個のアミノ酸残基、例えば少なくとも6個のアミノ酸残基、例として少なくとも7個のアミノ酸残基、例えば少なくとも8個のアミノ酸残基、例として少なくとも9個のアミノ酸残基、例えば少なくとも10個のアミノ酸残基、例として少なくとも11個のアミノ酸残基、例えば少なくとも12個のアミノ酸残基、例として少なくとも13個のアミノ酸残基、例えば少なくとも14個のアミノ酸残基、例として少なくとも15個のアミノ酸残基、例えば少なくとも16個のアミノ酸残基、例として少なくとも17個のアミノ酸残基、例えば少なくとも18個のアミノ酸残基、例として少なくとも19個のアミノ酸残基、例えば少なくとも20個のアミノ酸残基、例として少なくとも21個のアミノ酸残基、例えば少なくとも22個のアミノ酸残基、例として少なくとも23個のアミノ酸残基、例えば少なくとも24個のアミノ酸残基、例として少なくとも25個のアミノ酸残基、例えば少なくとも26個のアミノ酸残基、例として少なくとも27個のアミノ酸残基、例えば少なくとも28個のアミノ酸残基、例として少なくとも29個のアミノ酸残基、例えば少なくとも30個のアミノ酸残基により分離されている、項目83記載のポリペプチド。
【０７７６】
176.SEQ ID NO:90の前記第二のコピーと、SEQ ID NO:90の前記第四のコピーとは、少なくとも2個のアミノ酸残基、例として少なくとも3個のアミノ酸残基、例えば少なくとも4個のアミノ酸残基、例として少なくとも5個のアミノ酸残基、例えば少なくとも6個のアミノ酸残基、例として少なくとも7個のアミノ酸残基、例えば少なくとも8個のアミノ酸残基、例として少なくとも9個のアミノ酸残基、例えば少なくとも10個のアミノ酸残基、例として少なくとも11個のアミノ酸残基、例えば少なくとも12個のアミノ酸残基、例として少なくとも13個のアミノ酸残基、例えば少なくとも14個のアミノ酸残基、例として少なくとも15個のアミノ酸残基、例えば少なくとも16個のアミノ酸残基、例として少なくとも17個のアミノ酸残基、例えば少なくとも18個のアミノ酸残基、例として少なくとも19個のアミノ酸残基、例えば少なくとも20個のアミノ酸残基、例として少なくとも21個のアミノ酸残基、例えば少なくとも22個のアミノ酸残基、例として少なくとも23個のアミノ酸残基、例えば少なくとも24個のアミノ酸残基、例として少なくとも25個のアミノ酸残基、例えば少なくとも26個のアミノ酸残基、例として少なくとも27個のアミノ酸残基、例えば少なくとも28個のアミノ酸残基、例として少なくとも29個のアミノ酸残基、例えば少なくとも30個のアミノ酸残基により分離されている、項目83記載のポリペプチド。
【０７７７】
177.SEQ ID NO:90の前記第三のコピーと、SEQ ID NO:90の前記第四のコピーとは、少なくとも2個のアミノ酸残基、例として少なくとも3個のアミノ酸残基、例えば少なくとも4個のアミノ酸残基、例として少なくとも5個のアミノ酸残基、例えば少なくとも6個のアミノ酸残基、例として少なくとも7個のアミノ酸残基、例えば少なくとも8個のアミノ酸残基、例として少なくとも9個のアミノ酸残基、例えば少なくとも10個のアミノ酸残基、例として少なくとも11個のアミノ酸残基、例えば少なくとも12個のアミノ酸残基、例として少なくとも13個のアミノ酸残基、例えば少なくとも14個のアミノ酸残基、例として少なくとも15個のアミノ酸残基、例えば少なくとも16個のアミノ酸残基、例として少なくとも17個のアミノ酸残基、例えば少なくとも18個のアミノ酸残基、例として少なくとも19個のアミノ酸残基、例えば少なくとも20個のアミノ酸残基、例として少なくとも21個のアミノ酸残基、例えば少なくとも22個のアミノ酸残基、例として少なくとも23個のアミノ酸残基、例えば少なくとも24個のアミノ酸残基、例として少なくとも25個のアミノ酸残基、例えば少なくとも26個のアミノ酸残基、例として少なくとも27個のアミノ酸残基、例えば少なくとも28個のアミノ酸残基、例として少なくとも29個のアミノ酸残基、例えば少なくとも30個のアミノ酸残基により分離されている、項目83記載のポリペプチド。
【０７７８】
178.SEQ ID NO:90の前記第一のコピーと、SEQ ID NO:90の前記第四のコピーとは、100個未満のアミノ酸残基、例として95個未満のアミノ酸残基、例えば90個未満のアミノ酸残基、例として85個未満のアミノ酸残基、例えば80個未満のアミノ酸残基、例として75個未満のアミノ酸残基、例えば70個未満のアミノ酸残基、例として65個未満のアミノ酸残基、例えば60個未満のアミノ酸残基、例として55個未満のアミノ酸残基、例えば50個未満のアミノ酸残基、例として45個未満のアミノ酸残基、例えば40個未満のアミノ酸残基、例として35個未満のアミノ酸残基、例えば30個未満のアミノ酸残基、例として25個未満のアミノ酸残基、例えば24個未満のアミノ酸残基、例として23個未満のアミノ酸残基、例えば22個未満のアミノ酸残基、例として21個未満のアミノ酸残基、例えば20個未満のアミノ酸残基、例として19個未満のアミノ酸残基、例えば18個未満のアミノ酸残基、例として17個未満のアミノ酸残基、例えば16個未満のアミノ酸残基、例として15個未満のアミノ酸残基、例えば14個未満のアミノ酸残基、例として13個未満のアミノ酸残基、例えば12個未満のアミノ酸残基、例として11個未満のアミノ酸残基、例えば10個未満のアミノ酸残基、例として9個未満のアミノ酸残基、例えば8個未満のアミノ酸残基、例として7個未満のアミノ酸残基、例えば6個未満のアミノ酸残基、例として5個未満のアミノ酸残基により分離されている、項目83記載のポリペプチド。
【０７７９】
179.SEQ ID NO:90の前記第二のコピーと、SEQ ID NO:90の前記第四のコピーとは、100個未満のアミノ酸残基、例として95個未満のアミノ酸残基、例えば90個未満のアミノ酸残基、例として85個未満のアミノ酸残基、例えば80個未満のアミノ酸残基、例として75個未満のアミノ酸残基、例えば70個未満のアミノ酸残基、例として65個未満のアミノ酸残基、例えば60個未満のアミノ酸残基、例として55個未満のアミノ酸残基、例えば50個未満のアミノ酸残基、例として45個未満のアミノ酸残基、例えば40個未満のアミノ酸残基、例として35個未満のアミノ酸残基、例えば30個未満のアミノ酸残基、例として25個未満のアミノ酸残基、例えば24個未満のアミノ酸残基、例として23個未満のアミノ酸残基、例えば22個未満のアミノ酸残基、例として21個未満のアミノ酸残基、例えば20個未満のアミノ酸残基、例として19個未満のアミノ酸残基、例えば18個未満のアミノ酸残基、例として17個未満のアミノ酸残基、例えば16個未満のアミノ酸残基、例として15個未満のアミノ酸残基、例えば14個未満のアミノ酸残基、例として13個未満のアミノ酸残基、例えば12個未満のアミノ酸残基、例として11個未満のアミノ酸残基、例えば10個未満のアミノ酸残基、例として9個未満のアミノ酸残基、例えば8個未満のアミノ酸残基、例として7個未満のアミノ酸残基、例えば6個未満のアミノ酸残基、例として5個未満のアミノ酸残基により分離されている、項目83記載のポリペプチド。
【０７８０】
180.SEQ ID NO:90の前記第三のコピーと、SEQ ID NO:90の前記第四のコピーとは、100個未満のアミノ酸残基、例として95個未満のアミノ酸残基、例えば90個未満のアミノ酸残基、例として85個未満のアミノ酸残基、例えば80個未満のアミノ酸残基、例として75個未満のアミノ酸残基、例えば70個未満のアミノ酸残基、例として65個未満のアミノ酸残基、例えば60個未満のアミノ酸残基、例として55個未満のアミノ酸残基、例えば50個未満のアミノ酸残基、例として45個未満のアミノ酸残基、例えば40個未満のアミノ酸残基、例として35個未満のアミノ酸残基、例えば30個未満のアミノ酸残基、例として25個未満のアミノ酸残基、例えば24個未満のアミノ酸残基、例として23個未満のアミノ酸残基、例えば22個未満のアミノ酸残基、例として21個未満のアミノ酸残基、例えば20個未満のアミノ酸残基、例として19個未満のアミノ酸残基、例えば18個未満のアミノ酸残基、例として17個未満のアミノ酸残基、例えば16個未満のアミノ酸残基、例として15個未満のアミノ酸残基、例えば14個未満のアミノ酸残基、例として13個未満のアミノ酸残基、例えば12個未満のアミノ酸残基、例として11個未満のアミノ酸残基、例えば10個未満のアミノ酸残基、例として9個未満のアミノ酸残基、例えば8個未満のアミノ酸残基、例として7個未満のアミノ酸残基、例えば6個未満のアミノ酸残基、例として5個未満のアミノ酸残基により分離されている、項目83記載のポリペプチド。
【０７８１】
181.SEQ ID NO:90の前記第四のコピーは、SEQ ID NO:90の前記第一のコピーのN末端側に位置する、項目83記載のポリペプチド。
【０７８２】
182.SEQ ID NO:90の前記第四のコピーは、SEQ ID NO:90の前記第一のコピーのC末端側に位置する、項目83記載のポリペプチド。
【０７８３】
183.SEQ ID NO:90の前記第四のコピーは、SEQ ID NO:90の前記第二のコピーのN末端側に位置する、項目83記載のポリペプチド。
【０７８４】
184.SEQ ID NO:90の前記第四のコピーは、SEQ ID NO:90の前記第二のコピーのC末端側に位置する、項目83記載のポリペプチド。
【０７８５】
185.SEQ ID NO:90の前記第四のコピーは、SEQ ID NO:90の前記第三のコピーのN末端側に位置する、項目83記載のポリペプチド。
【０７８６】
186.SEQ ID NO:90の前記第四のコピーは、SEQ ID NO:90の前記第三のコピーのC末端側に位置する、項目83記載のポリペプチド。
【０７８７】
187.担体に取り付けられた、項目1乃至186の何れかに記載のポリペプチド。
【０７８８】
188.前記担体は、随意的にビオチニル化された、ストレプトアビジン等のアビジン部分を有する、項目187記載のポリペプチド。
【０７８９】
189.固体支持体又は半固体支持体に、共有結合等により取り付けられた、項目1乃至186の何れかに記載のポリペプチド。
【０７９０】
190.Hisタグ等の親和性タグと機能的に融合された、項目1乃至186の何れかに記載のポリペプチド。
【０７９１】
191.N末端フランキング配列と機能的に融合された、項目1乃至186の何れかに記載のポリペプチド。
【０７９２】
192.C末端フランキング配列と機能的に融合された、項目1乃至186の何れかに記載のポリペプチド。
【０７９３】
193.シグナルペプチドと機能的に融合された、項目1乃至186の何れかに記載のポリペプチド。
【０７９４】
194.プロ領域と機能的に融合された、項目1乃至186の何れかに記載のポリペプチド。
【０７９５】
195.プレプロ領域と機能的に融合された、項目1乃至186の何れかに記載のポリペプチド。
【０７９６】
196.一つ以上のアミノ酸が修飾されており、前記修飾(群)は、好ましくは、アセチル化又はカルボキシル化、グリコシル化、例として、グリコシル化に影響を与える酵素、例えば哺乳類グリコシル化又は脱グリコシル化酵素に対して、ポリペプチドを晒すことに起因するグリコシル化、ホスホリル化、例として、ホスホリル化アミノ酸残基、例えばホスホチロシン、ホスホセリン、及びホスホトレオニンをもたらす、アミノ酸残基の修飾等、インビボ又はインビトロ化学誘導体化からなる集合から選択される、項目1乃至186の何れかに記載のポリペプチド。
【０７９７】
197.一個以上のアミノ酸残基は、好ましくは、タンパク質分解に対する耐性及び安定性を改善するため、又は溶解特性を最適化するため、又はポリペプチドを治療剤としてより適切にするために修飾される、項目1乃至186の何れかに記載のポリペプチド。
【０７９８】
198.天然発生のL-アミノ酸残基以外のアミノ酸残基を含む、項目197記載のポリペプチド。
【０７９９】
199.D-アミノ酸残基を含む、項目198記載のポリペプチド。
【０８００】
200.非天然発生の合成アミノ酸を含む、項目198記載のポリペプチド。
【０８０１】
201.好ましくは、前記ポリペプチドのN末端及びC末端を望ましくない分解から保護及び/又は安定化させる化学的置換基の形態である一個以上の保護基を含む、項目197記載のポリペプチド。
【０８０２】
202.前記一つ以上の保護基は、ポリペプチドのインビボ活性に悪影響を与えない、項目201記載のポリペプチド。
【０８０３】
203.前記一つ以上の保護基は、前記N末端のアルキル化又はアシル化により導入される、項目201記載のポリペプチド。
【０８０４】
204.前記一つ以上の保護基は、C1乃至C5分岐又は非分岐アルキル基、ホルミル基及びアセチル基などのアシル基、更に、アセトアミドメチル(Acm)基等、それらの置換形態を含むN末端保護基から選択される、項目201記載のポリペプチド。
【０８０５】
205.前記一つ以上の保護基は、前記ペプチドのN末端に結合するか、或いは前記N末端アミノ酸残基の代わりに使用される、アミノ酸のデスアミノ類似体を含むN末端保護基から選択される、項目201記載のポリペプチド。
【０８０６】
206.前記一つ以上の保護基は、C末端保護基から選択され、前記C末端のカルボキシル基は、組み込まれた状態又は組み込まれていない状態であり、例として、エステル、ケトン、及びアミド、更にはデスカルボキシル化されたアミノ酸類似体である、項目201記載のポリペプチド。
【０８０７】
207.前記一つ以上の保護基は、エステル又はケトンを形成するアルキル基、例として低級(C1乃至C6)アルキル基、例えば、メチル、エチル、及びプロピルと、アミドを形成するアミノ基、例として一級アミン(-NH2)、及びモノ及びジアルキルアミノ基、例として、メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルエチルアミノ等とを含むC末端保護基から選択される、項目201記載のポリペプチド。
【０８０８】
208.N末端部のフリーなアミノ基(群)及び末端のフリーなカルボキシル基(群)は、前記ポリペプチドから完全に取り除き、前記ポリペプチドの生物学的活性に有意な影響を与えることなく、そのデスアミノ及びデスカルボキシル化形態を発生させることが可能である、項目201記載のポリペプチド。
【０８０９】
209.項目1乃至208の何れかに記載のポリペプチドの酸付加塩であって、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸、或いは、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、又はサリチル酸等の有機酸により前記ポリペプチドを処理し、前記ポリペプチドの水溶性塩をもたらすことにより取得可能である酸付加塩。
【０８１０】
210.項目1乃至208の何れかに記載のポリペプチドを生成する方法であって、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する工程と、インビトロ又は適切な宿主生物においてインビボで前記ポリヌクレオチドを発現させ、これにより項目1乃至208の何れかに記載のポリペプチドを生成する工程とを備える方法。
【０８１１】
211.項目1乃至208の何れかに記載のポリペプチドのポリペプチド部分をコードするポリヌクレオチド。
【０８１２】
212.項目211記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクタであって、前記ポリヌクレオチドは、随意的に、適切な宿主細胞における前記ポリヌクレオチドの発現を制御する調節配列と機能的にリンクされる、発現ベクタ。
【０８１３】
213.項目1乃至208の何れかに記載のポリペプチド及び/又は項目211記載のポリヌクレオチド及び/又は項目212記載の発現ベクタを含む、組換え又はトランスジェニック宿主細胞。
【０８１４】
214.組換え又はトランスジェニック宿主細胞を発生させる方法であって、項目1乃至208の何れかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する工程と、前記ポリヌクレオチドを前記組換え又はトランスジェニック宿主細胞に導入する工程と、随意的に、更に前記ポリヌクレオチドを前記組換え又はトランスジェニック宿主細胞において発現させ、これにより、前記ポリペプチドを生成する組換え又はトランスジェニック宿主細胞を発生させる工程とを備える方法。
【０８１５】
215.項目213記載の宿主細胞を含むトランスジェニック哺乳類生物。
【０８１６】
216.当該哺乳類宿主細胞は、四種類の主要な系統である新口動物、脱皮動物、扁平動物、冠輪動物の何れかに属する、哺乳類細胞を含む、単系統群である左右相称動物から選択された動物細胞である、項目215に記載のトランスジェニック哺乳類生物。
【０８１７】
217.前記哺乳類宿主細胞は、割球細胞、卵細胞、胚幹細胞、赤血球、線維芽細胞、肝細胞、筋芽細胞、筋管、ニューロン、卵母細胞、骨芽細胞、破骨細胞、精細胞、T細胞、及び接合子から成る集合から選択された動物細胞である、項目215記載のトランスジェニック哺乳類生物。
【０８１８】
218.トランスジェニック哺乳類細胞を発生させる方法であって、項目1乃至208の何れかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する工程と、前記ポリヌクレオチドを前記組換え又はトランスジェニック宿主細胞に導入する工程と、随意的に、更に前記ポリヌクレオチドを前記トランスジェニック哺乳類宿主細胞において発現させ、これにより、前記ポリペプチドを生成するトランスジェニック哺乳類宿主細胞を発生させる工程とを備える方法。
【０８１９】
219.項目1乃至208の何れかに記載のポリペプチド及び/又は項目211記載のポリヌクレオチド及び/又は項目212記載の発現ベクタを含む、トランスジェニック魚。
【０８２０】
220.前記魚は、サケである、項目219記載のトランスジェニック魚。
【０８２１】
221.前記魚は、カレイである、項目219記載のトランスジェニック魚。
【０８２２】
222.前記魚は、タラである、項目219記載のトランスジェニック魚。
【０８２３】
223.前記魚は、ニシンである、項目219記載のトランスジェニック魚。
【０８２４】
224.項目213記載の宿主細胞を含むトランスジェニック植物。
【０８２５】
225.前記宿主細胞は、好ましくは、アリューロン細胞、厚角細胞、内皮細胞、内胚乳細胞、表皮細胞、葉肉細胞、分裂組織細胞、柵状細胞、柔細胞、師管細胞、花粉生殖細胞、花粉栄養細胞、厚壁細胞、仮道管細胞、木部導管細胞、及び接合子細胞から成る集合から選択された、分類群として有胚植物又は緑色植物亜界(Viridiplantae又はChlorobionta)の植物細胞である、項目224記載のトランスジェニック植物宿主細胞。
【０８２６】
226.前記植物は、ジャガイモである、項目224記載のトランスジェニック植物。
【０８２７】
227.前記植物は、トマトである、項目224記載のトランスジェニック植物。
【０８２８】
228.前記植物は、ブドウである、項目224記載のトランスジェニック植物。
【０８２９】
229.前記植物は、キュウリである、項目224記載のトランスジェニック植物。
【０８３０】
230.前記植物は、コムギである、項目224記載のトランスジェニック植物。
【０８３１】
231.前記植物は、オオムギである、項目224記載のトランスジェニック植物。
【０８３２】
232.前記植物は、ライムギである、項目224記載のトランスジェニック植物。
【０８３３】
233.前記植物は、オートムギである、項目224記載のトランスジェニック植物。
【０８３４】
234.前記植物は、タバコである、項目224記載のトランスジェニック植物。
【０８３５】
235.前記植物は、柑橘類植物である、項目224記載のトランスジェニック植物。
【０８３６】
236.前記植物は、リンゴである、項目224記載のトランスジェニック植物。
【０８３７】
237.前記植物は、イチゴである、項目224記載のトランスジェニック植物。
【０８３８】
238.前記植物は、ラズベリである、項目224記載のトランスジェニック植物。
【０８３９】
239.トランスジェニック植物を発生させる方法であって、項目1乃至208の何れかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する工程と、前記ポリヌクレオチドを前記植物に導入する工程と、随意的に、更に前記ポリヌクレオチドを前記植物において発現させ、これにより、前記ポリペプチドを生成するトランスジェニック植物を発生させる工程とを備える方法。
【０８４０】
240.項目1乃至208の何れかに記載のポリペプチド及び/又は項目211記載のポリヌクレオチド及び/又は項目212記載のベクタを含む、組換え細菌宿主細胞。
【０８４１】
241.前記細菌宿主細胞は、グラム陽性菌宿主細胞及びグラム陰性菌宿主細胞から選択される、項目240記載の細菌宿主細胞。
【０８４２】
242.前記細菌細胞は、乳酸菌株である、項目240記載の細菌宿主細胞。
【０８４３】
243.前記細菌細胞は、連鎖球菌株である、項目240記載の細菌宿主細胞。
【０８４４】
244.前記細菌細胞は、ビフィドバクテリウム株である、項目240記載の細菌宿主細胞。
【０８４５】
245.組換え細菌細胞を発生させる方法であって、項目1乃至208の何れかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する工程と、前記ポリヌクレオチドを前記細菌細胞に導入する工程と、随意的に、更に前記ポリヌクレオチドを前記細菌細胞において発現させ、これにより、前記ポリペプチドを生成する組換え細菌細胞を発生させる工程とを備える方法。
【０８４６】
246.項目1乃至208の何れかに記載のポリペプチド及び/又は項目211記載のポリヌクレオチド及び/又は項目212記載のベクタを含む、組換え酵母細胞。
【０８４７】
247.前記酵母細胞は、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、又はピチア属から選択される、項目246記載の酵母宿主細胞。
【０８４８】
248.前記酵母は、Saccharomyces cerevisiaeである、項目246記載の酵母宿主細胞。
【０８４９】
248.前記酵母は、Scizosacchomyces pompeである、項目246記載の酵母宿主細胞。
【０８５０】
250.前記酵母は、Pichia pastorisである、項目246記載の酵母宿主細胞。
【０８５１】
251.組換え酵母細胞を発生させる方法であって、項目1乃至208の何れかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する工程と、前記ポリヌクレオチドを前記酵母細胞に導入する工程と、随意的に、更に前記ポリヌクレオチドを前記酵母細胞において発現させ、これにより、前記ポリペプチドを生成する組換え酵母細胞を発生させる工程とを備える方法。
【０８５２】
252.項目1乃至208の何れかに記載のポリペプチド及び/又は項目211記載のポリヌクレオチド及び/又は項目212記載のベクタを含む、組換え真菌宿主細胞。
【０８５３】
253.前記真菌細胞は、アスペルギルス属に属する、項目252記載の酵母宿主細胞。
【０８５４】
254.組換え真菌細胞を発生させる方法であって、項目1乃至208の何れかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する工程と、前記ポリヌクレオチドを前記真菌細胞に導入する工程と、随意的に、更に前記ポリヌクレオチドを前記真菌細胞において発現させ、これにより、前記ポリペプチドを生成する組換え真菌細胞を発生させる工程とを備える方法。
【０８５５】
255.項目1乃至208の何れかに記載のポリペプチドに特異的な抗体又はその結合フラグメント。
【０８５６】
256.前記抗体は、ポリクローナルである、項目255記載の抗体。
【０８５７】
257.前記抗体は、モノクローナルである、項目255記載の抗体。
【０８５８】
258.前記抗体フラグメントは、F(ab')2、F(ab)2、Fab'、及びFabから成る集合から選択された抗体の一部を含む、項目255記載の抗体フラグメント。
【０８５９】
259.前記抗体フラグメントは、特異的抗原と結合する、合成又は遺伝子操作されたポリペプチドである、項目255記載の抗体フラグメント。
【０８６０】
260.前記抗体フラグメントは、軽鎖可変領域を含む又はこれより成る抗体フラグメント、重鎖及び軽鎖の可変領域から成る「Fv」フラグメントを含む又はこれより成る抗体フラグメント、軽鎖及び重鎖可変領域がペプチドリンカにより連結される組換え一本鎖ポリペプチド分子(「scFvポリペプチド」)を含む又はこれより成る抗体フラグメント、及び超可変領域を模倣するアミノ酸残基から成る最少認識単位を含む又はこれより成る抗体フラグメントから成る集合から選択された、項目255記載の抗体フラグメント。
【０８６１】
261.前記抗体は、齧歯類抗体に由来する可変ドメイン及び相補性決定領域を含むが、前記抗体分子の残りの部分がヒト抗体に由来する組換えポリペプチドの形態のキメラ抗体である、項目255記載の抗体フラグメント。
【０８６２】
262.前記抗体は、モノクローナル抗体のマウス相補性決定領域がマウス免疫グロブリンの可変重鎖及び軽鎖からヒト可変ドメインへ転送された組換えポリペプチドの形態のヒト化抗体である、項目255記載の抗体フラグメント。
【０８６３】
263.更に、より容易に検出可能な部分を生成するために抗体部分にコンジュゲート可能な分子又は原子の形態である検出可能な標識を含む又はこれに結合する、項目255乃至262の何れかに記載の抗体
【０８６４】
264.前記標識は、キレート化剤、光活性剤、放射性同位体、蛍光剤、及び常磁性イオンからなる集合より選択される、項目263記載の抗体。
【０８６５】
265.項目1乃至208の何れかに記載のポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体又はその結合フラグメントを発生させる方法であって、抗体反応を引き出す条件下で項目1乃至208の何れかに記載のポリペプチドにより哺乳類の対象に免疫を付与する工程と、前記ポリペプチドと特異的に結合する抗体を同定する工程と、随意的に前記抗体又はその結合断片を前記哺乳類の対象から単離する工程とを備える方法。
【０８６６】
266.項目1乃至208の何れかに記載のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を発生させる方法であって、抗体反応を引き出す条件下で項目1乃至208の何れかに記載のポリペプチドにより哺乳類の対象に免疫を付与する工程と、項目1乃至208の何れかに記載のポリペプチドに対して特異的なモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマを調製する工程と、前記ポリペプチドと特異的に結合する抗体を同定する工程とを備える方法。
【０８６７】
267.項目1乃至208の何れかに記載のポリペプチドと担体とを含む組成物。
【０８６８】
268.項目1乃至208の何れかに記載のポリペプチド又は項目267記載の組成物を含む着氷防止面。
【０８６９】
269.項目268記載の着氷防止面を備える冷蔵庫。
【０８７０】
270.項目268記載の着氷防止面を備える冷凍庫。
【０８７１】
271.項目268記載の着氷防止面を備える窓。
【０８７２】
272.項目268記載の着氷防止面を備える風車。
【０８７３】
273.項目268記載の着氷防止面を備える無線探知及び測距装置(レーダ)。
【０８７４】
274.項目268記載の着氷防止面を自動車。
【０８７５】
275.項目268記載の着氷防止面を備える熱ポンプ。
【０８７６】
276.項目268記載の着氷防止面を備える帆船。
【０８７７】
277.項目268記載の着氷防止面を備える路面。
【０８７８】
278.項目268記載の着氷防止面を備える、水等の液体源の方向を変えるためのパイプ。
【０８７９】
279.プラスチック製である項目278記載のパイプ。
【０８８０】
280.金属製である項目278記載のパイプ。
【０８８１】
281.項目268記載の着氷防止面を備える屋根構築物。
【０８８２】
282.項目268記載の着氷防止面を備える瓶。
【０８８３】
283.項目268記載の着氷防止面を備える缶。
【０８８４】
284.項目268記載の着氷防止面を備えるアンテナ装置。
【０８８５】
285.項目268記載の着氷防止面を備えるフロントガラスワイパ。
【０８８６】
286.項目268記載の着氷防止面を備えるゴムタイヤ。
【０８８７】
287.項目268記載の着氷防止面を備える空調設備。
【０８８８】
288.項目268記載の着氷防止面を備える鉄道線路。
【０８８９】
289.項目268記載の着氷防止面を備える列車車輪。
【０８９０】
290.項目268記載の着氷防止面を備える電力ケーブル。
【０８９１】
291.項目1乃至208の何れかに記載のポリペプチド又は項目267記載の組成物を含む氷核形成面。
【０８９２】
292.項目291記載の氷核形成面を備える冷蔵庫。
【０８９３】
293.項目291記載の氷核形成面を備える冷凍庫。
【０８９４】
294.項目291記載の氷核形成面を備える窓。
【０８９５】
295.項目291記載の氷核形成面を備える風車。
【０８９６】
296.項目291記載の氷核形成面を備える無線探知及び測距装置(レーダ)。
【０８９７】
297.項目291記載の氷核形成面を備える自動車。
【０８９８】
298.項目291記載の氷核形成面を備える熱ポンプ。
【０８９９】
299.項目291記載の氷核形成面を備える帆船。
【０９００】
300.項目291記載の氷核形成面を備える路面。
【０９０１】
301.項目291記載の氷核形成面を備える、水等の液体源の方向を変えるためのパイプ。
【０９０２】
302.プラスチック製である項目301記載のパイプ。
【０９０３】
303.金属製である項目301記載のパイプ。
【０９０４】
304.項目291記載の氷核形成面を備える屋根構築物。
【０９０５】
305.項目291記載の氷核形成面を備える瓶。
【０９０６】
306.項目291記載の氷核形成面を備える缶。
【０９０７】
307.項目291記載の氷核形成面を備えるアンテナ装置。
【０９０８】
308.項目291記載の氷核形成面を備えるロントガラスワイパ。
【０９０９】
309.項目291記載の氷核形成面を備えるゴムタイヤ。
【０９１０】
310.項目291記載の氷核形成面を備える空調設備。
【０９１１】
311.項目291記載の氷核形成面を備える鉄道線路。
【０９１２】
312.項目291記載の氷核形成面を備える列車車輪。
【０９１３】
313.項目291記載の氷核形成面を備える電力ケーブル。
【０９１４】
314.水性液体組成物の凝固点を低下させる方法であって、項目1乃至209の何れかに記載のポリペプチドと前記水性液体組成物とを接触させる工程を備え、前記接触により、前記水性液体組成物の凝固点の低下が生じる方法。
【０９１５】
315.前記液体組成物は、塗料組成物を含む、項目314記載の方法。
【０９１６】
316.前記液体組成物は、冷凍庫において使用する不凍剤を含む、項目314記載の方法。
【０９１７】
317.前記液体組成物は、冷蔵庫において使用する不凍剤を含む、項目314記載の方法。
【０９１８】
318.前記液体組成物は、エンジンにおいて使用する不凍剤を含む、項目314記載の方法。
【０９１９】
319.前記液体組成物は、フロントガラス洗浄剤を含む、項目314記載の方法。
【０９２０】
320.前記液体組成物は、シリコンを含む、項目314記載の方法。
【０９２１】
321.前記液体組成物は、塗料、ラッカ、又はニス等のコーティング組成物を含む、項目314記載の方法。
【０９２２】
322.前記液体組成物は、ワックスを含む、項目314記載の方法。
【０９２３】
323.前記液体組成物は、油を含む、項目314記載の方法。
【０９２４】
324.前記液体組成物は、セメントを含む、項目314記載の方法。
【０９２５】
325.前記液体組成物は、コンクリートを含む、項目314記載の方法。
【０９２６】
326.前記液体組成物は、石鹸を含む、項目314記載の方法。
【０９２７】
327.前記液体組成物は、錠前において使用される不凍組成物を含む、項目314記載の方法。
【０９２８】
328.水性液体組成物の再結晶化を低減又は除去する方法であって、項目1乃至209の何れかに記載のポリペプチドと前記水性液体組成物とを凍結前に接触させ、これにより、前記水性液体組成物の再結晶化を低減又は除去する工程を備える方法。
【０９２９】
329.前記液体組成物は、塗料組成物を含む、項目328記載の方法。
【０９３０】
330.前記液体組成物は、冷凍庫において使用する不凍剤を含む、項目328記載の方法。
【０９３１】
331.前記液体組成物は、冷蔵庫において使用する不凍剤を含む、項目328記載の方法。
【０９３２】
332.前記液体組成物は、エンジンにおいて使用する不凍剤を含む、項目328記載の方法。
【０９３３】
333.前記液体組成物は、フロントガラス洗浄剤を含む、項目328記載の方法。
【０９３４】
334.前記液体組成物は、シリコンを含む、項目328記載の方法。
【０９３５】
335.前記液体組成物は、ラッカを含む、項目328記載の方法。
【０９３６】
336.前記液体組成物は、ワックスを含む、項目328記載の方法。
【０９３７】
337.前記液体組成物は、油を含む、項目328記載の方法。
【０９３８】
338.前記液体組成物は、セメントを含む、項目328記載の方法。
【０９３９】
339.前記液体組成物は、コンクリートを含む、項目328記載の方法。
【０９４０】
340.前記液体組成物は、石鹸を含む、項目328記載の方法。
【０９４１】
341.前記液体組成物は、錠前において使用される不凍組成物を含む、項目328記載の方法。
【０９４２】
342.生体試料又は器官を保存、及び/又はその凝固点を低下させる方法であって、項目1乃至209記載のポリペプチドと前記生体試料又は前記器官を接触させ、これにより過冷却状態又は冷凍状態での前記生体試料又は前記器官の保存を可能にする方法。
【０９４３】
343.前記生体試料は、ポリペプチドを含む、項目342記載の方法。
【０９４４】
344.前記生体試料は、ミクロソーム又はミセルを含む、項目342記載の方法。
【０９４５】
345.前記生体試料は、全血を含む、項目342記載の方法。
【０９４６】
346.前記生体試料は、血漿を含む、項目342記載の方法。
【０９４７】
347.前記生体試料は、血小板を含む、項目342記載の方法。
【０９４８】
348.前記生体試料は、赤血球を含む、項目342記載の方法。
【０９４９】
349.前記生体試料は、精液を含む、項目342記載の方法。
【０９５０】
350.前記生体試料は、配偶子を含む、項目342記載の方法。
【０９５１】
351.前記生体試料は、昆虫細胞の細胞培養物を含む、項目342記載の方法。
【０９５２】
352.前記生体試料は、哺乳類細胞の細胞培養物を含む、項目342記載の方法。
【０９５３】
353.前記哺乳類細胞は、齧歯類細胞である、項目352記載の方法。
【０９５４】
354.前記哺乳類細胞は、ヒト細胞である、項目352記載の方法。
【０９５５】
355.前記生体試料は、器官を含む、或いは器官により成る、項目342記載の方法。
【０９５６】
356.前記器官は、腎臓、肺、心臓、脾臓、又は肝臓から成る集合から選択される、項目355記載の方法。
【０９５７】
357.保存中に生体試料又は器官の再結晶化を抑制する方法であって、項目1乃至209記載のポリペプチドを前記生体試料又は器官に接触させ、これにより、再結晶化を抑制し、過冷却状態又は冷凍状態での前記生体試料又は器官の保存を可能にする方法。
【０９５８】
358.前記生体試料は、ポリペプチドを含む、項目357記載の方法。
【０９５９】
359.前記生体試料は、ミクロソーム又はミセルを含む、項目357記載の方法。
【０９６０】
360.前記生体試料は、全血を含む、項目357記載の方法。
【０９６１】
361.前記生体試料は、血漿を含む、項目357記載の方法。
【０９６２】
362.前記生体試料は、血小板を含む、項目357記載の方法。
【０９６３】
363.前記生体試料は、赤血球を含む、項目357記載の方法。
【０９６４】
364.前記生体試料は、精液を含む、項目357記載の方法。
【０９６５】
365.前記生体試料は、配偶子を含む、項目357記載の方法。
【０９６６】
366.前記生体試料は、昆虫細胞の細胞培養物を含む、項目357記載の方法。
【０９６７】
367.前記生体試料は、哺乳類細胞の細胞培養物を含む、項目357記載の方法。
【０９６８】
368.前記哺乳類細胞は、齧歯類細胞である、項目367記載の方法。
【０９６９】
369.前記哺乳類細胞は、ヒト細胞である、項目367記載の方法。
【０９７０】
370.前記哺乳類細胞は、前記生体試料は、器官を含む、或いは器官により成る、項目357記載の方法。
【０９７１】
371.前記器官は、腎臓、肺、心臓、脾臓、又は肝臓から成る集合から選択される、項目370記載の方法。
【０９７２】
372.食品等の食用又は飲用組成物を保存する方法であって、前記食品を項目1乃至209の何れかに記載のポリペプチドと接触させ、これにより、通常は前記食品が凍結状態となる温度において、非凍結状態で前記食用又は飲用組成物の保存を改善又は長期化することを可能とする、方法。
【０９７３】
373.前記組成物は、ミルク、発酵乳製品、チーズ、挽肉、魚すり身、ヨーグルト、ソルベ、シャーベット、プディング、野菜ピューレ、フルーツピューレ、パン生地、アイスミルク、カスタード、水氷、スラッシュアイス、スムージ、アイスクリーム、グラニタ、ペースト、及び食肉から成る集合から選択される、項目372の方法。
【０９７４】
374.食品等の食用又は飲用組成物における氷晶の再結晶化を低減又は抑制する方法であって、前記食品を項目1乃至209の何れかに記載のポリペプチドと接触させ、これにより、通常は氷晶が形成される温度での保存中に、前記組成物において形成される氷晶の再結晶化を低減又は抑制する方法。
【０９７５】
375.前記組成物は、ミルク、発酵乳製品、チーズ、挽肉、魚すり身、ヨーグルト、ソルベ、シャーベット、プディング、野菜ピューレ、フルーツピューレ、パン生地、アイスミルク、カスタード、水氷、スラッシュアイス、スムージ、アイスクリーム、グラニタ、ペースト、及び食肉から成る集合から選択される、項目374の方法。
【０９７６】
376.個人の皮膚に塗布することが可能な化粧品の耐寒性を増加させる方法であって、項目1乃至209の何れかに記載のポリペプチドを化粧品に接触させ、これにより皮膚に塗布されている間の前記化粧品の耐寒性を増加させる工程を備える方法。
【０９７７】
377.水を吸収することが可能な製品の含水量を増加させる方法であって、項目1乃至209の何れかに記載のポリペプチドを接触させ、これにより前記製品の含水量を増加させる工程を備える方法。
【０９７８】
378.外科処置により腫瘍を取り除く方法であって、前記腫瘍に凍結工程を施す前に、項目1乃至209の何れかに記載のポリペプチドを前記腫瘍に注入し、これにより前記腫瘍の破壊を促進する工程と備える方法。
【０９７９】
379.外科処置による脂肪組織の制御された除去のための方法であって、前記脂肪組織を除去する前に、項目1乃至209の何れかに記載のポリペプチドを前記脂肪組織に注入する工程を備える方法。
【０９８０】
380.原油製品においてクラスレート形成を抑制する方法であって、項目1乃至209の何れかに記載のポリペプチドを前記原油製品に添加し、これによりクラスレート形成を抑制する工程を備える方法。
【０９８１】
381.乾燥中、或いは高又は低オスモル濃度に晒されている間に、生体試料を安定化させる方法であって、項目1乃至209の何れかに記載のポリペプチドを接触させ、これにより乾燥中、或いは高又は低オスモル濃度に晒されている間に、生体試料を安定化させる方法。
【０９８２】
382.前記生体試料は、ポリペプチド、ミクロソーム、ミセル、全血、血漿、血小板、赤血球、精液、配偶子のうち一つ以上を含む、項目381の方法。
【０９８３】
383.前記生体試料は、細胞培養物を含む、項目381の方法。
【０９８４】
384.前記細胞培養物は、昆虫細胞、哺乳類細胞、齧歯類細胞、及びヒト細胞のうち一つ以上を含む、項目383の方法。
【０９８５】
385.異なる分子を含む組成物から一つ以上の分子を精製する方法であって、項目1乃至209の何れかに記載のポリペプチドを含む組成物の存在下において前記精製を実行し、これにより、前記様々な分子を含む前記組成物の凝固点を下回る温度において前記精製を行うことを可能にする工程を備える方法。
【０９８６】
386.異なる分子を含む前記組成物の前記分子は、ポリペプチドと、ペプチドと、アミノ酸と、糖と、脂肪酸と、DNA分子と、RNA分子と、リン脂質と、例えば、ミトコンドリア、リボソーム等のオルガネラと、アデノシン三リン酸とから成る集合から選択される、項目385の方法。
【０９８７】
387.脱水の対象となる組成物の脱水の改善のための方法であって、前記組成物を項目1乃至209の何れかに記載のポリペプチドに接触させ、前記組成物を脱水する工程を備える方法。
【０９８８】
388.項目1乃至209記載のポリペプチドを含む組成物。
【０９８９】
389.項目1乃至209記載のポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドは、表面に均一又は不均一に分布する組成物。
【０９９０】
390.項目1乃至209記載のポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドは、前記組成物全体に均一又は不均一に分布する組成物。
【０９９１】
391.項目1乃至209記載のポリペプチドを含む、冷凍用の組成物であって、前記ポリペプチドは、冷凍前に添加される組成物。
【０９９２】
392.項目1乃至209記載のポリペプチドを含む、冷凍用の組成物であって、前記ポリペプチドは、冷凍後に添加される組成物。
【０９９３】
393.項目1乃至209記載のポリペプチドを含む製薬組成物。
【０９９４】
394.項目1乃至209記載のポリペプチドを含み、着氷を防止する表面。
【０９９５】
395.項目1乃至209記載のポリペプチドを含み、氷に結合する表面。
【０９９６】
396.項目1乃至209記載のポリペプチドを含む生体試料。
【０９９７】
397.項目1乃至209記載のポリペプチドを含む食用組成物。
【０９９８】
398.項目1乃至209記載のポリペプチドを含む液体組成物。
【０９９９】
399.項目1乃至209記載のポリペプチドを含む固体組成物。
【１０００】
400.項目1乃至209記載のポリペプチドを含む固体組成物であって、前記ポリペプチドは、表面に分布する固体組成物。
【１００１】
401.項目1乃至209記載のポリペプチドを含む固体組成物であって、前記ポリペプチドは、試料全体に均一又は不均一に分布する固体組成物。
【１００２】
次に、本発明を、Rhagium mordax由来の不凍タンパク質の組換え発現、精製、及び解析を説明することにより更に詳細に説明する。
【１００３】
実施例
R.mordax由来の不凍ポリペプチドの同定及び精製に二種類の戦略を使用した。
1)Kristiansenら(2005)において公開された方法を不凍ポリペプチドの精製に使用した。
2)R.inquisitor AFPのN及びC末端領域内の領域に一致するように設計された二種類の縮重プライマを設計した(図1)。これらを使用して、従来のRT-PCR反応において、冬期に収集した動物から単離されたR.mordax RNAからcDNA領域を増幅した。こうしたcDNAは、R.mordax由来の推定AFPの中央領域をコードする。このアプローチにより、二つのタイプ(ファミリ)のポリペプチドの中央部分(99乃至108aa)の配列が得られた。
3)その後、9種類のアイソザイムについて全長AFP配列を取得した。推定AFPをコードするcDNAのそれぞれの中央部分に特異的なプライマを、関連する5'末端の増幅(5'RACE)と組み合わせて、Clontech Smart RACE cDNA増幅キットを用いて利用した。各cDNAの5'末端が得られた後、この配列を使用して、全長クローンを取得する。これは、RT-PCR反応においてmRNAポリAテールに一致するプライマと組み合わせて、各cDNAの一番端の5末端に一致するプライマを使用することで実行される。グループIのAFPの様々なアイソフォームをコードする合計九種類の全長cDNAが取得され、コードされたポリペプチドが推定された。
【１００４】
発現及び精製
Rhagium mordax RmAFP由来の不凍タンパク質(AFP)の六種類のアイソフォームをクローン化した。図5は、野性型(wt)のアイソフォームRmAFP1及び欠損変異体(Δ2乃至9、WC(Trp-Cys))のSDS-PAGEゲルを示す。当該RmAFP変異体は、RmAFP1のC末端から氷結合ドメインが一つずつ欠失したもの(Δ2乃至Δ9)(例えば、Δ4は、推定氷結合ドメイン4乃至9が欠失していることを示す)と、C末端にTrp及びCys残基を含む変異体(WC)として構築した。これらをpGEXベクタ系(GE Healthcare)においてクローン化し、大腸菌において形質変換した(株:Origami、BL21)。タンパク質は、GSTとRmAFPとの間にトロンビン切断部位を含む、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現させた。細胞は、フレンチプレスにより溶解させ、精製は、セファロースビーズに共有結合した還元グルタチオンを用いた親和性クロマトグラフィと、サイズ排除クロマトグラフィとに基づくものとした。図5の矢印は、AFP1の欠失誘導体の位置を示す。
【１００５】
活性測定
Rhagium mordax不凍タンパク質の野性型アイソフォームと、これらの変異体とを、ナノリットル浸透圧計を用いて活性について試験した。結果を下の表4に示す。当該RmAFP変異体は、RmAFP1のC末端から氷結合ドメインが一つずつ欠失したものと、C末端にTrp及びCys残基を含む変異体として構築した。THappは、個別の測定において、精製されたAFP、或いは融合タンパク質又は氷分画としてのAFPの濃度を考慮せずにアッセイから直接推定した熱的ヒステリシスであり、但し、アスタリスク付きのTHは、氷分画に対するTHのプロットにおける点を通る直線の外挿により推定された。nは、測定数である。未決定だが、現在進行中であるものがある(N.D.)。Δ5乃至9及びΔ4乃至9において検出可能な活性を発見した事実は、それぞれ四個及び三個の推定氷結合モチーフを含むAFP1の切断型が、氷晶の成長を防止する能力を維持することを実証している。欠失変異体の比活性度は決定しておらず、wtタンパク質と相対的な活性は、現時点では未知である。
【１００６】
【表４】
0005474809.tif 000017
【１００７】
RmAFP活性の目視検査
図6は、1)RmAFP1の溶液と、2)ゲンゲ、Zoarces viviparus(3型AFPを有するデンマークの魚)の血清とにおける、ヒステリシス凝固点で発生する「氷の成長爆発」の進行を示す。何れの場合も、温度を低下させる前に、溶液中で小さな氷晶をアニールさせた。RmAFP溶液において温度を低下させた時、初期の氷晶(1Aの矢印)は、ヒステリシス凝固点に達する前に、成長又は形状の変化を示さなかった。ヒステリシス凝固点(1B)では、氷晶が突発し、周囲が過冷却されていることから、溶液は凍結する。この場合、ヒステリシス凝固点における氷の成長パターンは、カリフラワ状となることに留意されたい(1B、1C)。これは、冷却時に氷晶がゆっくりと形状を変え、六角形の基礎平面を有する両錐(2A)となる(2)(Z.viviparusの血清)に見られる事象とは対照的である。ヒステリシス凝固点において、氷の成長は針状となり(2B)、溶液中の全ての氷が針状体として成長している(2C)。要するに、RmAFPは、全ての氷の成長又は氷晶形状の変化を抑制することが可能である(1)。これは、一般に(2)に見られるパターンに従う魚の不凍タンパク質溶液とは大きく異なる。
【１００８】
RmAFP1の物理化学的解析――質量分析(MALDI-ToF)
クローン化及び精製されたRhagium mordax AFP1の分子量決定を図7に示す。精製された組換えrRmAFP1の質量分析による解析を、Alphalyse(デンマーク、オーデンセ)によるMALDI-ToFにより実行した。rRmAFP1の分子量決定では、平均値12555Daが得られた。この相違は、装置を較正する際に外部基準を使用したためである可能性がある。
【１００９】
サイズ排除クロマトグラフィ
rRmAFP1の二量化についても調査しており、その結果を図8に示す。未変性条件下において、rRmAFPは、サイズ排除カラム(Superdex 75、10/30、GE Healthcare)を通過させた場合、同じMw範囲内の他のタンパク質よりも短い保持時間を有するため、二量体として振る舞う。rRmAFP1のSECによるMW推定値は、Superdex 75をウシ血清アルブミン(68KDa、BSA)、トリプシン(25KDa)、及びヒトシスタチンC(13KDa)により較正した時、28KDaとなった。これは、図8Aに示している。SDS-PAGEを行った場合も、同様にrRmAFPは二量体として振る舞い、推定Mwは28KDaとなる。レーン1:ウシ血清アルブミン(BSA)、2:トリプシン、3:RNAse A、4:シスタチンC、5:リゾチーム、6:RmAFP1、7:グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)。これは、図8Bに示している。
【１０１０】
円偏光二色性分光測定
円偏光二色性分光測定(CD)をコペンハーゲン大学にて行った。結果は、図9において確認できる。図9Aによれば、遠紫外線CDスペクトルは、当該組換えタンパク質が規定の構造を有すること示す。図9Bに示した近紫外線CDスペクトルは、rRmAFPがβシート構造の高い含有量を有することを示唆している。
【１０１１】
示差走査熱量測定
温度安定性を、示差走査熱量測定(DSC;Scal、ロシア、モスクワ)。結果を図10に示す。RmAFP1の遷移温度Tmは、47.7℃と推定された。第一のスキャンは、6乃至100℃の温度範囲において実行し、6乃至70℃の温度範囲において続けて11回のスキャンを行った。曲線の非対象形状は、タンパク質二量体の解離と、その後の単量体のアンフォールディングを示唆する。11回のスキャンにより生じた曲線の全体的な類似性は、連続的な加熱/冷却サイクルにおいて、材料を全く損失することなく、複数回に渡ってRmAFPが変性及び復元可能であることを示している。下部の線は、緩衝液対照に対して実施した同様の加熱サイクルの結果を表す。その後、12回の加熱/冷却サイクルを受けた試料の活性を分析し、出発物質の活性から変化していない0.94℃の熱的ヒステリシスTHappが得られた。これらの研究は、適度に安定しているが、しかしながら、変性後に生物学的活性を有する分子へ復元する顕著な特徴を備えたタンパク質を示唆している。
【１０１２】
活性及び安定性に対するpHの影響
活性及び安定性に対するpHの影響についても調査した。RmAFPの安定性に対するpHの影響を、表示pH値において一時間の前インキュベーションを行った後のpH7.2におけるTHとして、図11に示す。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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