(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗トランスフェリン受容体抗体または抗トランスフェリン受容体一本鎖Ｆｖフラグメント(ＴｆＲｓｃＦｖ)標的化カチオン性イムノリポソーム複合体の製造方法であって：
(ａ)抗トランスフェリン受容体抗体またはＴｆＲｓｃＦｖを製造し；
(ｂ)該抗トランスフェリン受容体抗体またはＴｆＲｓｃＦｖとカチオン性リポソームを混合して、カチオン性イムノリポソームを形成させ（ここで、該抗トランスフェリン受容体抗体またはＴｆＲｓｃＦｖは、該カチオン性リポソームに化学的に結合していない）；そして
(ｃ)該カチオン性イムノリポソームとガドペンタテートジメグルミンを１：１０から１：３５(mgガドペンタテートジメグルミン：μgリポソーム)の範囲の比率で混合して、該抗トランスフェリン受容体抗体またはＴｆＲｓｃＦｖ標的化カチオン性イムノリポソーム複合体を形成する
ことを含む、方法。
【請求項２】
該抗トランスフェリン受容体抗体またはＴｆＲｓｃＦｖが、該カチオン性リポソームとの混合前に、カルボキシ末端にシステイン部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらに該カチオン性イムノリポソームと、Ｋ[Ｋ(Ｈ)ＫＫＫ]５−Ｋ(Ｈ)ＫＫＣ(ＨｏＫＣ)(配列番号１)ペプチドを含むペプチドの混合を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該カチオン性リポソームが、１種以上のカチオン性脂質および１種以上の中性またはヘルパー脂質の混合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該抗トランスフェリン受容体抗体またはＴｆＲｓｃＦｖを、該カチオン性リポソームと、１：２０から１：４０(ｗ：ｗ)の範囲の比率で混合する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該カチオン性リポソームが、ジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェートとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび／またはコレステロールの混合物；またはジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび／またはコレステロールの混合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該カチオン性イムノリポソームを、該ガドペンタテートジメグルミンと、１：１４から１：２８(mgガドペンタテートジメグルミン：μgリポソーム)の比率で混合する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該カチオン性イムノリポソームを、該ガドペンタテートジメグルミンと、１：２１(mgガドペンタテートジメグルミン：μgリポソーム)のモル比で混合する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
請求項１の方法により製造したカチオン性イムノリポソーム複合体。
【請求項１０】
カチオン性リポソーム、抗トランスフェリン受容体抗体または抗トランスフェリン受容体一本鎖Ｆｖフラグメント(ＴｆＲｓｃＦｖ)、およびガドペンタテートジメグルミンを含む抗トランスフェリン受容体抗体またはＴｆＲｓｃＦｖ標的化カチオン性イムノリポソーム複合体（ここで、該抗トランスフェリン受容体抗体またはＴｆＲｓｃＦｖが該カチオン性リポソームに化学的に結合していない）であって、該ガドペンタテートジメグルミンおよび該カチオン性イムノリポソームが１：１０から１：３５(mgガドペンタテートジメグルミン：μgリポソーム)の範囲の比率で存在する、カチオン性イムノリポソーム複合体。
【請求項１１】
該ガドペンタテートジメグルミンが該カチオン性リポソーム内に封入されている、請求項１０に記載のカチオン性イムノリポソーム複合体。
【請求項１２】
該ガドペンタテートジメグルミンが該カチオン性リポソームの内または外単層と結合している、請求項１０に記載のカチオン性イムノリポソーム複合体。
【請求項１３】
該カチオン性リポソームが１種以上のカチオン性脂質および１種以上の中性またはヘルパー脂質の混合物を含む、請求項１０に記載のカチオン性イムノリポソーム複合体。
【請求項１４】
該抗トランスフェリン受容体抗体またはＴｆＲｓｃＦｖおよび該カチオン性リポソームが１：２０から１：４０(ｗ：ｗ)の範囲の比率で存在する、請求項１０に記載のカチオン性イムノリポソーム複合体。
【請求項１５】
該カチオン性リポソームがジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェートとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび／またはコレステロールの混合物；またはジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび／またはコレステロールの混合物を含む、請求項１０に記載のカチオン性イムノリポソーム複合体。
【請求項１６】
該ガドペンタテートジメグルミンおよび該カチオン性イムノリポソームが１：１４から１：２８(mgガドペンタテートジメグルミン：μgリポソーム)のモル比で存在する、請求項１０に記載のカチオン性イムノリポソーム複合体。
【請求項１７】
該ガドペンタテートジメグルミンおよび該カチオン性イムノリポソームが１：２１(mgガドペンタテートジメグルミン：μgリポソーム)のモル比で存在する、請求項１０に記載のカチオン性イムノリポソーム複合体。
【請求項１８】
さらに、該複合体と結合したＫ[Ｋ(Ｈ)ＫＫＫ]５−Ｋ(Ｈ)ＫＫＣ(ＨｏＫＣ)(配列番号１)ペプチドを含む、請求項１０に記載のカチオン性イムノリポソーム複合体。
【請求項１９】
請求項１０から１８のいずれかに記載のカチオン性イムノリポソーム複合体を含む患者の臓器または組織を造影するための薬物であって、該カチオン性イムノリポソーム複合体が、該造影実施前に患者に投与される、薬物。
【請求項２０】
該投与が静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、眼内投与、腹腔内投与、腫瘍内投与、鼻腔内投与、脳内(intracereberal)投与または皮下投与を含む、請求項１９に記載の薬物。
【請求項２１】
請求項１０から１８のいずれかに記載のカチオン性イムノリポソーム複合体を含む患者の癌性組織を造影するための薬物であって、該カチオン性イムノリポソーム複合体が、該造影実施前に患者に投与される、薬物。
【請求項２２】
請求項１０から１８のいずれかに記載のカチオン性イムノリポソーム複合体を含む患者の癌性転移を造影するための薬物であって、該カチオン性イムノリポソーム複合体が、該造影実施前に患者に投与される、薬物。
【請求項２３】
該投与が静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、眼内投与、腹腔内投与、腫瘍内投与、鼻腔内投与、脳内投与または皮下投与を含む、請求項２１に記載の薬物。
【請求項２４】
該投与が静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、眼内投与、腹腔内投与、腫瘍内投与、鼻腔内投与、脳内投与または皮下投与を含む、請求項２２に記載の薬物。
【請求項２５】
請求項１０から１８のいずれかに記載のカチオン性イムノリポソーム複合体を含む癌を有する患者の腫瘍組織を造影するための薬物であって、腫瘍組織を造影するために該カチオン性イムノリポソーム複合体が患者に投与され、該投与と同時に、または前もしくは後に腫瘍組織を処置するために抗癌剤が患者に投与される、薬物。
【請求項２６】
該投与が静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、眼内投与、腹腔内投与、腫瘍内投与、鼻腔内投与、脳内投与または皮下投与を含む、請求項２５に記載の薬物。
【請求項２７】
該抗癌剤が化学療法剤、遺伝子または小分子である、請求項２５に記載の薬物。
【請求項２８】
該化学療法剤がドセタキセル、ミトキサントロンおよびゲムシタビンから成る群から選択される、請求項２７に記載の薬物。
【請求項２９】
該抗癌剤が該カチオン性イムノリポソームと結合している、請求項２７に記載の薬物。
【請求項３０】
該抗癌剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡである、請求項２２に記載の薬物。
【請求項３１】
該アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは該ｓｉＲＮＡが該カチオン性イムノリポソームと結合している、請求項３０に記載の薬物。
【請求項３２】
該抗癌剤をカチオン性イムノリポソーム複合体の前または後に送達する、請求項２５に記載の薬物。
【請求項３３】
該抗癌剤をカチオン性イムノリポソーム複合体の少なくとも１２時間前または後に送達する、請求項３２に記載の薬物。
【請求項３４】
抗癌剤が投与される代わりに、患者に放射線療法が適用される、請求項２５に記載の薬物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、薬剤送達、癌処置および診断および医薬の分野である。本発明は、癌性腫瘍を含む疾患の処置および造影のために、分子の全身送達するための抗体または抗体フラグメント標的化イムノリポソームの製造方法を提供する。本発明はまたイムノリポソームおよび組成物、ならびに種々の組織の造影法も提供する。本リポソーム複合体は、例えば、磁気共鳴造影に使用するための、造影剤の封入に有用である。送達系の特異性は、抗体または抗体フラグメントの標的化に由来する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
初期段階で、原発性および転移性疾患の両方である癌を検出する能力は、該疾患の疼痛および病苦の終息である目標に向けた主要な段階である。遺伝子治療のための腫瘍標的化送達系の開発は、現在達成可能であるよりも、より効率的な造影剤の送達の可能性を広げている。磁気共鳴造影(ＭＲＩ)は、臓器の３次元解剖学的画像を獲得できる。これらと常磁性画像の組合せは、腫瘍の正確な局在化ならびに腫瘍増殖および血管形成の長手方向および定量的モニタリングをもたらす。(Gillies, R.J., et al., Neoplasia 2:139-451(2000); Degani, H., et al., Thrombosis & Haemostasis 89:25-33(2003))。
【０００３】
癌診断に用いられる最も一般的な常磁性造影剤の一つは、Magnevist(登録商標)(ガドペンタテートジメグルミン)(Ｍａｇ)(Berlex Imaging, Montville, NJ)である。ガドリニウムは希土類元素である。それは、そのイオン(Ｇｄ＋＋)が７個の不対電子を有するため、常磁性特性を有する。ＭＲＩスキャンで観察されるコントラスト増進は、主に水素プロトンスピン格子緩和時間(Ｔｉ)に対するＧｄ＋＋の強い効果のためである。遊離ガドリニウムは非常に毒性であり、故に臨床使用には適さないが、ジエチレントリアミン五酢酸(ＤＴＰＡ)とのキレート化は、十分に耐容性で、安定で、強い常磁性の複合体を産生する。この金属キレートは代謝不活性である。しかしながら、ガドペンタテートジメグルミンのｉ.ｖ.注射後、メグルミンイオンは、疎水性(hydhophobic)ガドペンテタートから解離し、それは細胞外水にのみ分布する。それは自然の血液−脳関門を通過できず、故に、正常脳組織、嚢胞、術後瘢痕等に蓄積せず、尿中に急速に排泄される。それは約１.６時間の半減期を有する。投与量の約８０％が６時間以内に尿中に排泄される。
【０００４】
しかしながら、現在の造影剤には著しい制約があり、それらは、主として造影剤の灌流および拡散の程度ならびにグルコース取り込みに基づいているということを含む。これらの遊離(非複合体化)薬剤では、変化は腫瘍、炎症性疾患、および(乳房において)ホルモン効果でさえ見られる(例えばほとんどのガドリニウムベースのおよびヨウ素ベースの造影剤は、間質性空間への灌流および拡散を記録するものであり、ＦＤＧ−ＰＥＴはグルコース取り込みを検出する)。故に、これらの造影剤は腫瘍を特異的に標的としていない。加えて、活動的良性変化は必ずしも悪性と切り離すことができるわけではない、例えば胸部ＭＲＩの良性増大領域、慢性膵炎と膵臓癌腫。また、小腫瘍によるこれらの薬剤の取り込みが不十分であり、故に、感受性が乏しく、そして早期検出性に欠け、これは肺癌のような疾患において特に決定的である。孤在性肺小結節または胸膜小結節を検出することができない可能性がある。故に、必要とされるのは、このような薬剤を、体内の特異的組織、例えば、腫瘍組織および転移巣に送達する機構である。
【発明の開示】
【０００５】
発明の要旨
一つの態様において、本発明は、抗体または抗体フラグメント標的化カチオン性イムノリポソーム複合体の製造方法であって、抗体または抗体フラグメントを製造し、該抗体または抗体フラグメントとカチオン性リポソームを混合して、カチオン性イムノリポソームを形成させ（ここで、該抗体または抗体フラグメントは、該カチオン性リポソームに化学的に結合していない）、そして該カチオン性イムノリポソームと造影剤を混合して、該抗体または抗体フラグメント標的化カチオン性イムノリポソーム複合体を形成することを含む、方法を提供する。本発明の実施に際して使用する抗体フラグメントの例は、一本鎖Ｆｖフラグメント、例えば抗トランスフェリン受容体一本鎖Ｆｖ(ＴｆＲｓｃＦｖ)および抗ＨＥＲ−２抗体または抗体フラグメントを含む。さらなる態様において、本方法は、さらに、カチオン性イムノリポソームとＫ[Ｋ(Ｈ)ＫＫＫ]５−Ｋ(Ｈ)ＫＫＣ(ＨｏＫＣ)(配列番号１)ペプチドを含むペプチドを混合することを含む。
【０００６】
適当には、本抗体または抗体フラグメントを、該カチオン性リポソームと約１：２０から約１：４０(ｗ：ｗ)の比率で混合する。適当には、本カチオン性リポソームはジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェートとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび／またはコレステロールの混合物；またはジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび／またはコレステロールの混合物を含む。
【０００７】
さらなる態様において、本カチオン性イムノリポソームを、造影剤と、約１：１０から約１：３５(mg造影剤：μgリポソーム)の範囲の比率で、適当には約１：１４から約１：２８(mg造影剤：μgリポソーム)、または約１：２１(mg造影剤：μgリポソーム)で混合する。本発明の実施に際して使用する造影剤の例は、磁気共鳴造影(ＭＲＩ)剤、例えばガドリニウム、ガドペンタテートジメグルミン、イオパミドールおよび酸化鉄を含むが、これらに限定されない。また、ＣＴのためのバリウム、ヨウ素および食塩水造影剤、ＰＥＴのための１８Ｆ−２−デオキシ−２−フルオロ−Ｄ−グルコース(ＦＤＧ)および他の造影剤も使用できる。
【０００８】
本発明はまた、本発明の方法により製造されたカチオン性イムノリポソーム複合体および、カチオン性リポソーム、抗体または抗体フラグメント、および造影剤を含む抗体または抗体フラグメント標的化カチオン性イムノリポソーム複合体（ここで、該抗体または抗体フラグメントが該カチオン性リポソームに化学的に結合していない）も提供する。
【０００９】
さらなる態様において、本発明は、患者における臓器または組織を造影するための方法、およびまた良性組織／疾患と癌性組織／疾患を区別するための方法であって、本発明のカチオン性イムノリポソーム複合体を、造影実施前に患者に投与することを含む方法を提供する。投与は任意の経路、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、眼内投与、腹腔内投与、腫瘍内投与、鼻腔内投与、脳内投与または皮下投与を介して行ってよい。適当には、本発明の方法および複合体を使用して造影する組織は、癌性転移を含む癌性組織である。
【００１０】
本発明はまた、患者における腫瘍組織を造影および処置する方法であって、腫瘍組織を造影するために本発明のカチオン性イムノリポソーム複合体を患者に投与し、そして腫瘍組織を処置するために抗癌剤を患者に投与することを含む、方法も提供する。抗癌剤の例は、核酸、遺伝子、タンパク質、ペプチド、小分子、化学療法剤、例えばドセタキセル、ミトキサントロンおよびゲムシタビン、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡを含む。
【００１１】
本発明のさらなる態様は、当業者には良く知られる。
【００１２】
図面／図の簡単な説明
図１Ａおよび１Ｂは、ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソーム−ＤＮＡナノ複合体によるＣａＰａｎ−１正所性転移モデルの腫瘍特異的ターゲティングを示す。１Ａにおいて矢印で示す肝臓中の同じ腫瘍小結節は、１Ｂにおいて強いβ−ガラクトシダーゼ発現を示す。１Ａ＝肉眼的剖検；１Ｂ＝β−ガラクトシダーゼについて染色後の組織。
【００１３】
図２Ａ−２Ｃは、ＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−Ｍａｇナノ複合体でトランスフェクションした後のＫ５６４細胞のインビトロＭＲ画像を示す。１Ａ＝時間依存的トランスフェクション。示す値は相対的強度である。１Ｂ＝は、複合体中に包含されるMagnevist(登録商標)の量による相対的強度の変化を示す(μl)。１Ｃ＝ＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−Ｍａｇ複合体対遊離Magnevist(登録商標)の比較。全ての図中の小さい丸は、サンプル位置のマーカーである。
【００１４】
図３Ａ−Ｉは、リガンド−リポソーム−Ｍａｇナノ複合体を使用した、２種の異なるモデルにおける改善されたＭＲ画像を示す。３Ａ、Ｄ、およびＧは、大きな膵臓正所性腫瘍(矢印)(腫瘍の外科的移植４ヶ月後)のＭＲＩシグナルにおけるｉ.ｖ.投与した遊離造影剤およびＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−Ｍａｇ複合体の間の差異を示す。３Ｂ、Ｅ、およびＨは、皮下膵臓腫瘍およびとかなり小さな腹部膵臓腫瘍(矢印)を有する第二のマウスにおける類似の効果を示す。３Ｃ、ＦおよびＩは、皮下前立腺腫瘍(矢印)を有する第三の動物での画像であり、同じ効果が明白である。
【００１５】
図４Ａ−Ｃは、Magnevist(登録商標)なしでの、リポソームのＳＰＭ相画像を示す。４Ａ、４Ｂおよび４Ｃに挙げる画像は、各々１.６８Ｖ、１.４５Ｖ、および１.３５Ｖの設定値で得た。不適合基質およびと機械的に対応するリポソームの間の対応する位相差は、−３.５°、＋８°、および＋４０°である。ＳＰＭチップとリポソームの相互作用は、設定値が変わるに連れて誘引性から反発まで変わる。
【００１６】
図５Ａ−Ｃは、リポソーム封入Magnevist(登録商標)(Ｌｉｐ＋Ｍａｇ)のＳＰＭおよびＳＥＭ画像を示す。５Ａは、リポソーム封入Magnevist(登録商標)粒子の原子間力顕微鏡法局所的画像である。ＳＰＭ相画像(設定値＝１.６)(５Ｂ)および１５keV  ＳＥＭ(ＴＥ)[転送方式電子検出器]画像(５Ｃ)は同様のコントラストを提供するが、完全に異なる相補的物理機構により産生される。
【００１７】
図６Ａおよび６Ｂは、ＴｆＲｓｃＦｖ＋Ｌｉｐ＋Ｍａｇナノ複合体のＳＰＭ形態学および相イメージングを示す。６Ａは、全ナノ複合体のｌ５keV  ＳＥＭ(ＴＥ)[転送方式電子検出器]画像である。６Ｂ＝その視野の低倍率画像である。四角に入っている領域が６Ａの画像である。
【００１８】
図７Ａおよび７Ｂは、２５nm高転置を使用したリフトモードのＳＰＭ形態学および磁気相画像の断面比較を示す。７Ａは、完全ＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−Ｍａｇナノ複合体のＳＰＭ形態学／磁気相画像である。誘引性および反発性面内磁気相互作用から成る７Ｂの二重双極子様シグナルの見かけは、この相互作用の原因が、ＳＥＭおよび非磁気ＳＰＭ相画像と一致して、ＮＤＳ内のMagnevistの不均一ドーナツ形分布であることを示唆する。
【００１９】
図８Ａ−８Ｈは、リガンド−ＨＫ−リポソーム−Ｍａｇナノ複合体を使用した２種のモードでの改善されたＭＲ造影を示す。ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−４３５(図８Ｅ−８Ｈ)およびヒト前立腺癌細胞株(ＤＵ１４５)(図８Ａ−８Ｄ)。
【００２０】
図９Ａ−Ｃは、ＴｆＲｓｃＦｖ−ＨＫ−リポソーム−Ｍａｇナノ複合体によるＣａＰａｎ−１皮下腫瘍および正所性転移モデルの腫瘍特異的ターゲティングを示す。
【００２１】
図１０は、遊離Ｍａｇと比較して、膵臓癌腫モデルにおいて本発明の複合体により送達されたＭａｇを使用して、強度の増加を示す、動的ＭＲＩを示す。
【００２２】
図１１Ａ−１１Ｃは、本発明のＭａｇ含有複合体による膵臓癌転移のＭＲ造影を示す。
【００２３】
図１２Ａ−１２Ｅは、本発明のＭａｇ含有複合体による、肺転移のＭＲ造影の大きな増強を示す。
【００２４】
図１３Ａ−１３Ｄは、本発明のＭａｇ含有複合体による腎臓細胞癌腫肺転移のＭＲ造影の大きな増強を示す。
【００２５】
図１４Ａ−１４Ｄは、本発明のＭａｇ含有複合体による、小腎臓細胞癌腫肺転移のＭＲ造影による、大きな検出感受性を示す。
【００２６】
図１５Ａ−１５Ｂは、本発明のＭａｇ含有複合体による非常に小さなＭＲ造影を示し、本発明の複合体の感受性を証明する。
【００２７】
図１６は、本発明のＭａｇ含有複合体を使用したＭＲＩにより見られる検出／造影を確認する、転移組織の切片を示す。
【００２８】
図１７は図１６の高倍率図を示す。
【００２９】
図１８Ａ−１８Ｆは、本発明のＭａｇ含有複合体による、肺の胸膜下における転移のＭＲ造影を示す。
【００３０】
図１９Ａ−１９Ｂは、本発明のＭａｇ含有複合体による、Ｂ１６／Ｆ１０黒色腫肺転移の検出を示す。
【００３１】
発明の詳細な記載
本発明は、造影剤、例えば磁気共鳴造影(ＭＲＩ)剤、例えばガドリニウム、ガドペンタテートジメグルミン(Magnevist(登録商標))および、イオパミドール、酸化鉄；ＣＴのためのバリウム、ヨウ素および食塩水造影剤；およびＰＥＴのための１８Ｆ−２−デオキシ−２−フルオロ−Ｄ−グルコース(ＦＤＧ)および、組織、例えば腫瘍を標的化するための他の造影剤の全身送達のためのナノ複合体を提供することにより、早期検出および腫瘍と良性組織の鑑別診断のための、増進した感受性および腫瘍細胞特異性に対する重要な要請を満たす。走査型電子顕微鏡(ＳＥＭ)および走査型プローブ顕微鏡(ＳＰＭ)(Wolfert, M.A., et al., Human Gene Therapy 7:2123-2133 (1996); Dunlap, D.D., et al., Nucleic Acids Research 25:3095-3101 (1997); Kawaura, C., et al., FEBS Letters 421:69-72 (1998); Choi, Y.H., et al., Human Gene Therapy 10:2657-2665 (1999); Diebel, C.E., et al., Nature 406:299-302 (2000); Rasa, M., et al., J. Coll. Interface Sci 250:303-315 (2002))は、こららの造影剤運搬ナノ複合体の物理的構造およびサイズを試験するために使用されている。大きな磁気モーメントを有する高原子番号元素であるガドリニウムの場合、これらの特性は、ＳＥＭおよびＳＰＭの両方においてコントラストを増強するための種々の方法に活用されている。ここに示される発見は、本発明のリポソームナノ複合体が、実際にMagnevist(登録商標)のような造影剤を封入し、そしてこれらの複合体の静脈内投与が増強された腫瘍造影をもたらすことを証明する。本発明は、肺における胸膜転移を含む非常に小さな転移の検出という予期されない、そして驚くべき結果、ならびに良性および癌性組織を鑑別する能力を提供する。
【００３２】
一つの態様において、本発明は、造影剤、例えば磁気共鳴造影(ＭＲＩ)造影剤を含む腫瘍ターゲティング送達系を提供する。米国公開特許出願２００３／００４４４０７(その開示は、その全体を引用により本明細書に包含させる)は、種々の薬剤を封入するこれらのナノサイズの、カチオン性リポソームを開示する。これらのリポソームの表面を飾るのは、フォレートまたはトランスフェリンのようなリガンド、または細胞表面受容体に対する抗体もしくは抗体フラグメントであり得るターゲティング分子である。リポソーム上へのリガンド／抗体の存在は、その受容体によるターゲティング分子の結合、続く非常に有効な内在化経路である受容体依存性エンドサイトーシスを介した結合複合体の内在化を介して、複合体の細胞内への挿入を促進する(Cristiano, R.J., and Curiel, D.T., Cancer Gene Therapy 3:49-57 (1996); Cheng, P.W., Human Gene Therapy 7:275-282 (1996))。このリポソームの修飾は、そのペイロードを腫瘍細胞に特異的に送達可能とするだけでなく、リポソームのトランスフェクション効力の増加ももたらす。トランスフェリン受容体(ＴｆＲ)レベルは、口腔、前立腺、乳房、および膵臓を含む種々の癌のタイプで増加している(Keer, H.N., et al., Journal of Urology 143:381-385(1990);Rossi, M.C., およびZetter, B.R., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)89:6197-6201(1992);Elliott, R.L., et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 698:159-166(1993);Thorstensen, K.,  and Romslo, I., Scand. J. Clin. Lab. Investig. (Supp.)215:113-120(1993);Miyamoto, T., et al., Int'l. J. Oral Maxillofacial Surg. 23:430-433(1994);Ponka, P. and Lok, C.N., Int'l. J. Biochem. Cell Biol. 31:1111-1137(1999))。さらに、ＴｆＲは、癌細胞のような急速に発育している細胞内の内在化中に再循環し(Ponka, P. and Lok, C.N., Int'l. J. Biochem. Cell Biol. 31:1111-1137(1999))、故にＴｆＲレベルが増加していない癌細胞においてさえ、これらのトランスフェリン標的化ナノ複合体の取り込みに寄与する。適当な態様において、ここに記載のナノ複合体は、ターゲティング部分として、抗トランスフェリン受容体一本鎖抗体フラグメント(ＴｆＲｓｃＦｖ)を用いる(Haynes, B.F., et al., J. Immunol. 127:347-351(1981);Batra, J.K., et al., Molecular & Cellular Biology 11:2200-2205(1991))。ＴｆＲｓｃＦｖは、モノクローナル抗体５Ｅ９により認識されるＴｆＲのエピトープのための完全抗体結合部位を含む(Batra, J.K., et al., Molecular & Cellular Biology 11:2200-2205(1991))。ＴｆＲｓｃＦｖは、増加したＴｆＲレベルを有する癌細胞へのリポソームのターゲティングにおいて、Ｔｆ分子それ自体、または完全Ｍａｂよりも有利である：１)ｓｃＦｖのサイズ(２８kDa)は、Ｔｆ分子(８０kDa)または親Ｍａｂ(１５５kDa)より遙かに小さい。ｓｃＦｖ−リポソーム−ＤＮＡ複合体は、故に、固形腫瘍の特徴である小さな毛細血管への良好な浸透性を示す。２)小さいｓｃＦｖは、臨床試験において必要なスケールアップした製造に関して実際的利点を有する。３)ｓｃＦｖは組み換え分子であり、Ｔｆのような血液産物ではなく、故に、血液起源病原体による汚染の可能性の危険がない。４)ＭａｂのＦｃ領域無しで、Ｆｃ受容体の非抗原特異的結合の発生が排除される(Jain, R.K. and Baxter, L.T., Cancer Res. 48:7022-7032(1988))。このような抗ＴｆＲ一本鎖抗体分子は、静脈内投与したカチオン性リポソーム−ＤＮＡナノ複合体を、主に腫瘍に向けることができる(米国公開特許出願２００３／００４４４０７；Xu, L., et al., Molecular Medicine 7:723-734(2001);Xu L, et al., Molecular Cancer Therapeutics 1:337-346(2002)参照)。このような腫瘍標的化ナノ複合体内へのMagnevist(登録商標)(Ｍａｇ)の封入は、腫瘍転移の増加した感受性および検出および癌の診断についての利益を提供する。ガドリニウム、ガドペンタテートジメグルミン(Magnevist(登録商標))、イオパミドール、酸化鉄；ＣＴのためのバリウム、ヨウ素および食塩水造影剤；および１８Ｆ−２−デオキシ−２−フルオロ−Ｄ−グルコース(ＦＤＧ)およびＰＥＴのための他の造影剤、ならびに当業者に既知の全ての現存する造影剤、ならびに全ての将来的な造影剤またはまだ開発すべき造影剤(例えば、ＭＲＩ、ＣＴ、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴなどのため)もまた本発明のイムノリポソーム内に封入できる。
【００３３】
本発明の抗体または抗体フラグメント標的化カチオン性リポソーム複合体は、望む複合体の要素が規定された比率および規定された順番で混合される、単純で効率的な非化学的結合方法により製造する(米国公開特許出願２００３／００４４４０７参照)。得られる複合体は、抗体または抗体フラグメントがリポソームまたはポリマーに化学的に結合している類似の複合体と同程度有効であるか、より有効である。用語“免疫複合体”、“イムノリポソーム”、“複合体”、“ナノ複合体”、“免疫ナノ複合体”、“リポソーム複合体”は、本発明のカチオン性リポソームに言及するために、全体を通して交換可能に使用される。
【００３４】
全抗体または抗体フラグメントを本発明の複合体を製造するために使用できる。適当な態様において、抗体フラグメントを使用する。好ましくは、抗体フラグメントは、抗体の一本鎖Ｆｖフラグメントである。一つの好ましい抗体は抗ＴｆＲモノクローナル抗体であり、好ましい抗体フラグメントは、抗ＴｆＲモノクローナル抗体に基づいたｓｃＦｖである。適当な抗ＴｆＲモノクローナル抗体は５Ｅ９である(例えば、Hayes, B.F., et al., “Characterization of a Monoclonal Antibody (5E9) that Defines a Human Cell Surface Antigen of Cell Activation,” J. Immunol. 127:347-352 (1981); Batra, J.K., et al., “Single-chain Immunotoxins Directed at the Human Transferring Receptor Containing Pseudomonas Exotoxin A or Diphtheria Toxin: Anti-TFR(Fv)-PE40 and DT388-Anti-TFR(Fv),” Mol. Cell. Biol. 11:2200-2205 (1991)参照；それらの内容は引用により本明細書に包含させる)。５Ｅ９抗体に基づくｓｃＦｖは、見かけの分子量２６,０００の一本ポリペプチド鎖として、このＭＡｂにより認識されるＴｆＲのエピトープのための完全抗体結合部位を含む。ｓｃＦｖは、ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨのいずれかとして整えられた第一可変領域のＣ末端と第二のＮ末端を連結する適当に設計されたリンカーペプチドで、各々重および軽鎖からの要素ＶＨおよびＶＬ可変ドメインを接続することにより形成する。他の好ましい抗体は抗ＨＥＲ−２モノクローナル抗体であり、他の好ましい抗体フラグメントは抗ＨＥＲ−２モノクローナル抗体に基づくｓｃＦｖである。
【００３５】
適当な態様において、システイン部分を、ｓｃＦｖのＣ末端に添加する。理論に縛られることを望まないが、遊離スルフヒドリル基を提供するシステインが、例えば電荷−電荷相互作用を介して、抗体とリポソームの間の複合体化を増強し得る。システイン有りまたは無しで、タンパク質を大腸菌封入体として発現し、次いで活性形の抗体フラグメントを産生するために再折り畳みできる。
【００３６】
複合体の形成において立体的に安定なイムノリポソームの使用を望まない限り、本複合体の製造の第一工程は、カチオン性リポソームまたはリポソームもしくは小ポリマーと選択した抗体または抗体フラグメントの混合を含む(本明細書の実施例および米国公開特許出願２００３／００４４４０７参照)。広範囲のカチオン性リポソームが、本発明の複合体の製造に有用である。公開ＰＣＴ出願ＷＯ９９／２５３２０は、数種のカチオン性リポソームの製造を記載する。望ましいリポソームの例は、ジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェート(ＤＯＴＡＰ)およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)および／またはコレステロール(ｃｈｏｌ)の混合物、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド(ＤＤＡＢ)およびＤＯＰＥおよび／またはｃｈｏｌの混合物を含む。脂質の比率は、特異的標的細胞型のための治療分子の取り込みの効率を最適化するために変化し得る。本リポソームは、１種以上のカチオン性脂質および１種以上の中性またはヘルパー脂質の混合物を含み得る。望ましいカチオン性脂質(複数もある)対中性またはヘルパー脂質(複数もある)の比率は、約１：(０.５−３)、好ましくは１：(１−２)である(モル比)。
【００３７】
本発明はまた、造影剤の送達のための標的化カチオン性ポリマーも提供する。適当なポリマーは、ＤＮＡコンパクションの仲介ができ、またエンドソーム放出も仲介できる、ＤＮＡ結合性カチオン性ポリマーである。好ましいポリマーはポリエチレンイミンである。他の有用なポリマーは、ポリリシン(polysine)、プロタミンおよびポリアミドアミンデンドリマーを含む。
【００３８】
抗体または抗体フラグメントは、標的細胞の表面に、好ましくは標的細胞上で異なって発現される受容体に結合するものである。抗体または抗体フラグメントをカチオン性リポソームまたはポリマーと、室温でおよび約１：２０から約１：４０(ｗ：ｗ)の範囲のタンパク質：脂質比率でまたは約０.１：１から１０：１(モル比)の範囲のタンパク質：ポリマー比率で混合する。
【００３９】
抗体または抗体フラグメントおよびリポソームまたはポリマーを、室温で短時間、典型的に約１０−１５分インキュベートし、次いで混合物を選択した治療剤または診断剤と混合する。抗体およびリポソームと複合体化できる治療分子または治療剤の例は、遺伝子、高分子量ＤＮＡ(ゲノムＤＮＡ)、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、リボザイム、核酸(ｓｉＲＮＡおよびアンチセンスを含む)、ウイルス粒子、免疫調節剤、タンパク質、小分子および化学的試薬を含む。好ましい治療分子は、ｐ５３、Ｒｂ９４またはApoptinをコードする遺伝子である。ＲＢ９４は、網膜芽腫腫瘍抑制遺伝子の変異体である。Apoptinは、腫瘍細胞のみにアポトーシスを誘発する遺伝子である。他の好ましい態様において、該薬剤はアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ分子、例えばＨＥＲ−２アンチセンスまたはｓｉＲＮＡ分子である。好ましい薬剤の第三のタイプは、診断的造影剤、例えばＧｄ−ＤＴＰＡ剤のようなＭＲＩ造影剤である。さらなる造影剤は、ガドリニウム、ガドペンタテートジメグルミン(Magnevist(登録商標))、イオパミドール、酸化鉄；ＣＴのためのバリウム、ヨウ素および食塩水造影剤；およびＰＥＴのための１８Ｆ−２−デオキシ−２−フルオロ−Ｄ−グルコース(ＦＤＧ)および他の造影剤を含むが、これらに限定されない。これらの薬剤がｐ５３のコード領域のようなＤＮＡであるとき、それはＲＳＶまたはＣＭＶプロモーターのような強い構造的プロモーターの制御下に位置し得る。
【００４０】
抗体または抗体フラグメントおよびリポソーム組合せを約１：１０から１：２０(薬剤のμg：総脂質のnmole)または１：１０から１：４０(薬剤のug：総ポリマーのnmole)の範囲の比率で治療剤または診断剤と混合し、室温で短時間、典型的に約１０から１５分インキュベートする。リポソーム複合体のサイズは、Malvern Zetasizer 3000を使用した動的光散乱で測定して、典型的に約５０−４００nmの範囲内である。
【００４１】
本発明の一つの態様において、複合体の形成に使用するリポソームは、立体的に安定化されたリポソームである。立体的に安定化されたリポソームは、親水性ポリマー、例えばＰＥＧ、ポリ（２−エチルアクリル酸)、またはポリ（ｎ−イソプロピルアクリルアミド(ＰＮＩＰＡＭ)が統合されているリポソームである。このような修飾されたリポソームは、治療剤または診断剤と複合体化するとき、それらが典型的にそのように修飾されていない同等なリポソームと同程度に速く網内系により血流から除去されないため、特に有用であり得る。本発明の立体的に安定化されたリポソーム複合体を製造するために、抗体または抗体フラグメント、リポソームおよび治療剤または診断剤を混合する順番は、上記の順番と逆になる。第一工程において、カチオン性リポソームを最初に上記の治療剤または診断剤と約１：１０から１：２０(薬剤のμg：脂質のnmole)の範囲の比率で混合する。このlipoplexに、生理学的に許容される緩衝液中のＰＥＧポリマー溶液を添加し、得られる溶液を、ポリマーがリポソーム複合体に統合されるのに十分な時間室温でインキュベートする。次いで、抗体または抗体フラグメントを安定化されたリポソーム複合体と、室温でおよび約１：５から約１：３０(ｗ：ｗ)の範囲のタンパク質：脂質比率で混合する。
【００４２】
本発明に従い製造したリポソームまたはポリマー複合体を、インビボ投与のための薬理学的に許容される製剤として製剤できる。本複合体を、薬理学的に適合性の媒体または担体と混合する。本組成物を、例えば、複合体の治療的または診断的分子の投与により利益を受けるために、ヒト患者への静脈内投与のために製剤できる。本複合体を、ｉ.ｖ.投与後に体内重に分配するように、適当な大きさにする。あるいは、本複合体を腫瘍内(ＩＴ)、病巣内(ＩＬ)、エアロゾル(aerosal)、経皮、内視鏡的、局所、筋肉内(ＩＭ)、皮内(ＩＤ)、眼内(ＩＯ)、腹腔内(ＩＰ)、鼻腔内(ＩＮ)、脳内(intracereberal)(ＩＣ)または皮下投与のような他の投与経路を介して送達できる。このような方法を介した送達のための製剤の製造、およびこのような方法を使用した送達は当分野で既知である。
【００４３】
一つの態様において、抗体または抗体フラグメント標的化リポソーム(またはポリマー)および治療剤複合体を含む組成物を、ヒト遺伝子治療を行うために投与する。複合体の治療剤成分は、適当な制御配列の制御したの治療用遺伝子を含む。ヒト癌のための種々の形態の遺伝子治療が、ｗｔ  ｐ５３またはＲＢ９４をコードする核酸を含む抗体または抗体フラグメント標的化リポソームまたはポリマー複合体の全身送達により達成できる。本複合体は、インビトロおよびインビボの両方で照射および／または化学療法のために、原発および転移腫瘍両方の腫瘍細胞を特異的に標的とし、感作できる。
【００４４】
本複合体は、脂質の選択および比率、抗体または抗体フラグメント対リポソームの比率、抗体または抗体フラグメントおよびリポソーム対治療剤または診断剤の比率、および抗体または抗体フラグメントおよび治療剤または診断剤の選択を介して、標的細胞型のために最適化できる。
【００４５】
一つの態様において、標的細胞は癌細胞である。悪性細胞増殖を有する全ての組織が標的となり得るが、頭頚部、乳房、前立腺、膵臓、脳(神経膠芽腫を含む)、子宮頚、肺、肝臓、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、絨毛癌、黒色腫、網膜芽腫、卵巣、泌尿生殖器、胃および結腸直腸癌が適当な標的である。
【００４６】
本発明の方法により製造された複合体はまた、治療分子または何らかの核酸の送達について非腫瘍細胞を標的化するためにも使用できる。全ての正常細胞が標的であり得るが、好ましい細胞は樹状細胞、血管の内皮細胞、肺細胞、乳房細胞、骨髄細胞、胸腺細胞および肝臓細胞である。望ましくない、しかし良性の細胞、例えば良性前立腺肥大細胞、過活動性甲状腺細胞、脂肪腫細胞、および関節炎、狼瘡、重症筋無力症、扁平上皮化生、黄斑変性症、心血管疾患、アルツハイマー病のような神経学的疾患、異形成などに関与する抗体を産生するＢ細胞のような自己免疫性疾患に関連する細胞を標的化できる。
【００４７】
本複合体は、照射処置または化学療法剤のいずれかのような他の治療的処置と組み合わせて投与できる。治療的処置、または治療的処置の組合せを、本複合体の投与の前にまたは後に、例えば約１２時間から約７日以内に投与できる。化学療法剤は、例えば、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル(５ＦＵ)、シスプラチン(ＣＤＤＰ)、ドセタキセル(タキソテール(登録商標))、ゲムシタビン(ＧＥＭＺＡＲ(登録商標))、パクリタキセル(pacletaxel）、ビンブラスチン、エトポシド(ＶＰ−１６)、カンプトテシン(camptothecia)、アクチノマイシン−Ｄ、ミトキサントロンおよびマイトマイシンＣを含む。照射両方／治療は、ガンマ照射(１３７Ｃｓ)、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出などを含む。さらなる治療剤は、小分子、ペプチド、タンパク質などを含む。
【００４８】
診断剤または造影剤もまた標的化細胞にリポソームまたはポリマー複合体を介して送達できる。用語“診断剤”および“造影剤”は、投与後にインビボで検出できる、可視化できる、造影できるまたは観察できる薬剤を言うために本明細書を通して交換可能に使用する。診断剤および造影剤を検出、可視化、造影または観察するための方法は当分野で既知であり、例えば、蛍光造影(蛍光光度計)または生物発光造影のような光学造影、陽電子放出断層撮影(ＰＥＴ)走査、単一光子放射型コンピュータ断層撮影(ＳＰＥＣＴ)走査、磁気共鳴造影(ＭＲＩ)、ｘ線、ラジオヌクレオチド造影(例えば、ガンマカメラ、コンピュータ断層撮影(ＣＴ)、定量的オートラジオグラフィーなど)などを含む。診断剤の例は、高電子密度物質、鉄、磁気共鳴造影剤および放射性医薬を含む。造影に有用な放射性核種は、同位体６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ、６７Ｇａまたは６８Ｇａを含む、銅、ガリウム、インジウム、レニウム、およびテクネチウムの放射性同位体を含む。Ｇｄ−ＤＴＰＡ剤、ガドリニウム、またはMagnevist(登録商標)(ガドペンタテートジメグルミン)(Ｍａｇ)(Berlex Imaging, Montville, NJ)のようなＭＲＩ剤。引用により本明細書に包含させる米国特許５,６８８,４８８においてLow et al. により開示された造影剤は本発明において有用である。さらなる造影剤は、イオパミドール(例えば、ＩＳＯＶＵＥ(登録商標)、Regional Health Limited, Aukland, AU)、酸化鉄；ＣＴのためのバリウム、ヨウ素および食塩水造影剤；およびＰＥＴのための１８Ｆ−２−デオキシ−２−フルオロ−Ｄ−グルコース(ＦＤＧ)および他の造影剤を含むが、これらに限定されない。
【００４９】
本発明の方法に従い製造された複合体は、該複合体による治療的または診断的分子の全身送達に使用するためのキットの形で提供され得る。適当なキットは、別々に、適当な複数容器(または１個の容器)中に、リポソーム、抗体または抗体フラグメント、および治療剤または診断剤を含む。これらの成分を、滅菌条件下で適当な順番で混合し、製剤後合理的な時間、一般に約３０分から約２４時間以内に患者に投与し得る。本キット成分は、好ましくは溶液としてまたは乾燥粉末として提供される。溶液形態中に提供される成分を、好ましくは、滅菌注射用水中、適当な緩衝液、浸透圧調節剤などと共に製剤する。
【００５０】
造影剤の封入および送達
ある態様において、本発明は、１種以上の造影剤がリポソームの内部に封入されている、二層の炭化水素鎖領域内に含まれる、内および／または外単層と複合体化／結合している(例えば、静的相互作用または化学的／共有結合性相互作用を介して)、またはこれらの任意のまたは全ての可能性の組合せの、カチオン性リポソーム複合体を提供する。適当には、本造影剤をリポソーム内部に封入するおよび／または内および／または該単層と結合させる。
【００５１】
ここで使用する、用語“診断剤”および“造影剤”は、投与後にインビボで検出、可視化、造影または観察できる薬剤を意味する。造影剤の例は、高電子密度物質、鉄、磁気共鳴造影剤および放射医薬を含む。造影に有用な放射性核種は、同位体６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ、６７Ｇａまたは６８Ｇａを含む、銅、ガリウム、インジウム、レニウム、およびテクネチウムの放射性同位体を含む。Ｇｄ−ＤＴＰＡ剤、ガドリニウム、またはMagnevist(登録商標)(ガドペンタテートジメグルミン)(Ｍａｇ)(Berlex Imaging, Montville, NJ)のようなＭＲＩ剤。引用により本明細書に包含させる米国特許５,６８８,４８８においてLow et al. により開示された造影剤は本発明において有用である。さらなる造影剤は、イオパミドール(例えば、ＩＳＯＶＵＥ(登録商標)、Regional Health Limited, Aukland, AU)、酸化鉄；ＣＴのためのバリウム、ヨウ素および食塩水造影剤；およびＰＥＴのための１８Ｆ−２−デオキシ−２−フルオロ−Ｄ−グルコース(ＦＤＧ)および他の造影剤を含むが、これらに限定されない。
【００５２】
ここに記載の通り、造影剤は、処理中に１種以上の造影剤とリポソームを単に混合することにより、適当には本発明のリポソーム複合体に封入されている、含まれるまたは複合体化／結合している。造影剤：リポソーム複合体の適当な比率は、当業者により容易に決定される。例えば、造影剤対リポソーム複合体の比率は、適当には約１：１０から約１：３５(mg造影剤：μgリポソーム)、より適当には約１：１４から約１：２８(mg造影剤：μgリポソーム)の範囲内、または約１：２１(mg造影剤：μgリポソーム)にある。
【００５３】
全体を通して記載されている通り、造影剤の送達／封入のための望ましいカチオン性リポソームは、ジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェート(ＤＯＴＡＰ)およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)および／またはコレステロール(ｃｈｏｌ)の混合物；およびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド(ＤＤＡＢ)およびＤＯＰＥおよび／またはｃｈｏｌの混合物を含むリポソームを含む。脂質の比率は、造影剤の取り込みの効率を最適化するために変化させ得る。本リポソームは、１種以上のカチオン性脂質および１種以上の中性またはヘルパー脂質の混合物を含み得る。カチオン性脂質(複数もある)対中性またはヘルパー脂質(複数もある)の望ましい比率は、約１：(０.５−３)、好ましくは約１：(１−２)(モル比)である。本発明の実施において有用な種々の脂質の比率の例は以下を含むが、これらに限定されない：
【表１】
0005478886.tif 000002
(ＤＯＴＡＰ＝ジオレオイルトリメチルアンモニウム(aminnonium)ホスフェート、ＤＤＡＢ＝ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド；ＤＯＰＥ＝ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン；ｃｈｏｌ＝コレステロール)。
【００５４】
一つの態様において、本発明は、抗体または抗体フラグメントを製造し；抗体または抗体フラグメントとカチオン性リポソームを混合してカチオン性イムノリポソームを形成させ（ここで、該抗体または抗体フラグメントは、該カチオン性リポソームに化学的に結合していない）；そして、カチオン性イムノリポソームと１種以上の造影剤を混合して、抗体または抗体フラグメント標的化カチオン性イムノリポソーム複合体を形成させること含む、造影剤含有抗体または抗体フラグメント標的化カチオン性イムノリポソーム複合体の製造方法を提供する。
【００５５】
適当な態様において、本抗体フラグメントは一本鎖Ｆｖフラグメント、例えば、抗トランスフェリン受容体一本鎖Ｆｖ(ＴｆＲｓｃＦｖ)または抗ＨＥＲ−２抗体または抗体フラグメントである。造影剤含有カチオン性イムノリポソームの製造において使用するための適当な脂質の例は、ここに記載されており、ジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェートとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび／またはコレステロールの混合物；およびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび／またはコレステロールの混合物を含む。適当には、抗体または抗体フラグメントを本カチオン性リポソームと、約１：２０から約１：４０(ｗ：ｗ)の範囲の比率で混合して、カチオン性イムノリポソームを形成させる。適当には、本カチオン性イムノリポソームを、造影剤と、約１：１０から約１：３５(mg造影剤：μgリポソーム)、より適当には約１：１４から約１：２８(mg造影剤：μgリポソーム)の範囲内、または約１：２１(mg造影剤：μgリポソーム)で混合する。
【００５６】
造影剤の例は、ここに記載のものおよび当分野で既知のものを含む。適当には、造影剤はＭＲＩ造影剤、例えばガドリニウム、ガドペンタテートジメグルミン、イオパミドール(例えば、ＩＳＯＶＵＥ(登録商標)、Regional Health Limited, Aukland, AU)、または酸化鉄；ＣＴのためのバリウム、ヨウ素および食塩水造影剤；およびＰＥＴのための１８Ｆ−２−デオキシ−２−フルオロ−Ｄ−グルコース(ＦＤＧ)および他の造影剤である。
【００５７】
さらなる態様において、本発明の方法およびイムノリポソーム複合体は、さらに、本カチオン性イムノリポソームと、Ｋ[Ｋ(Ｈ)ＫＫＫ]５−Ｋ(Ｈ)ＫＫＣ(ＨｏＫＣまたはＨＫ)(配列番号１)ペプチドを含むペプチドを混合することを含む。ＨｏＫＣペプチドは、末端システインを含み、マレイミド基への結合を可能とする。故に、ＨｏＫＣペプチドを使用するとき、リポソーム製剤はまた適当にはＮ−マレイミド−フェニルブチレート−ＤＯＰＥ(ＭＰＢ−ＤＯＰＥ)を、総脂質の０.１から５０モルパーセント、より好ましくは総脂質の１−１０モルパーセント、最も好ましくは総脂質の５モルパーセント含む。ＨｏＫＣリポソームを、先に記載の通り製造する(Yu, W. et al. Enhanced transfection efficiency of a systemically delivered tumor-targeting immunolipoplex by inclusion of a pH-sensitive histidylated oligolysine peptide, Nucleic Acids Research 32, e48 (2004))。
【００５８】
さらなる態様において、本発明は、カチオン性リポソーム、抗体または抗体フラグメント、および１種以上の造影剤（ここで、該抗体または抗体フラグメントは該カチオン性リポソームに化学的に結合していない）を含む、抗体または抗体フラグメント標的化カチオン性イムノリポソーム複合体を提供する。抗体または抗体フラグメントは、適当にはリポソームと、抗体または抗体フラグメントとリポソーム、適当には抗体または抗体フラグメントのシステイン残基とリポソーム表面の間の相互作用(例えば、静電気、ファンデルワールス、または他の非化学的に結合する相互作用)を介して適当に結合する。一般に、リンカーまたはスペーサー分子(例えば、ポリマーまたは他の分子)を、抗体およびリポソームの結合に使用しない。造影剤(複数もある)は、カチオン性リポソーム内に封入されてよく、カチオン性リポソームの炭化水素鎖内に含まれてよく、カチオン性リポソームの内または外単層と結合してよく、またはそれらの任意の組合せであってよい。適当には、本発明のカチオン性イムノリポソームは、単層リポソーム(すなわち一重の二層)であるが、数種の同心二層を含む多重膜リポソームも使用できる。本発明の一重の二層カチオン性イムノリポソームは、薬剤(例えば、造影剤)を封入できる内部水性容量を含む。それらはまた薬剤(例えば、造影剤)を含むことができる炭化水素鎖領域(すなわち、脂質の脂質鎖領域)を有する一重の二層を含む。加えて、薬剤(例えば、造影剤)は、リポソーム膜(すなわち、脂質の頭部基領域)の内単層および／または外単層のいずれかまたは両方と、例えば、負電荷造影剤および正電荷カチオン性リポソームの間の電荷−電荷相互作用を介して、複合体化または結合できる。さらなる態様において、薬剤(例えば、造影剤)を、本発明のカチオン性イムノリポソーム複合体のこれらの領域のいずれかまたは全てに封入でき／結合でき／複合体化できる。
【００５９】
さらに別の態様において、本発明は、造影実施前に患者に本発明の造影剤含有カチオン性イムノリポソーム複合体を投与することを含む、患者の臓器または組織を造影する方法を提供する。本イムノリポソーム複合体は、静脈内(ＩＶ)、経口、局所、吸入、筋肉内(ＩＭ)注射、腫瘍内(ＩＴ)注射、皮内(ＩＤ)注射、腹腔内(ＩＰ)注射、鼻腔内(ＩＮ)注射、眼内(ＩＯ)注射、頭蓋内(ＩＣ)注射、または他の経路を含むがこれらに限定されない任意の望む経路を介して投与できる。ここで使用する、用語患者は、動物患者(例えば、非ヒト哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ブタ、ヒツジなど)ならびにヒトの両方を含む。患者の組織を造影する方法は当分野で既知であり、ＰＥＴ走査、ＳＰＥＣＴ走査、ＭＲＩ造影などを含むが、これらに限定されない。患者における全ての組織または臓器を、本発明の方法および複合体を使用して造影できる。単にリポソーム上のターゲティングリガンドの改変により、任意の過剰発現タンパク質または分子を標的化できる。
【００６０】
適当には、本発明の方法を、癌に罹患している、またはその素因がある患者における癌性組織の造影に使用する。本発明の方法を使用して造影できる癌性組織は、固形腫瘍、ならびに転移病巣を含む。本発明の方法はまた癌性組織と非癌性(良性)組織を区別できる。
【００６１】
さらなる態様において、本発明は、腫瘍組織を造影するために本発明の造影剤含有イムノリポソーム複合体を患者に投与し、そして腫瘍組織を処置するために抗癌剤を患者に投与することを含む、癌に罹患している、またはその素因がある患者における腫瘍組織を造影および処置する方法を提供する。
【００６２】
投与できる抗癌剤の例は、ここに記載のもののような小分子、タンパク質、ペプチド、および化学療法剤、遺伝子、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡを含むが、これらに限定されない。化学療法剤の例は、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル(５ＦＵ)、シスプラチン(ＣＤＤＰ)、ドセタキセル(タキソテール(登録商標))、ゲムシタビン(ＧＥＭＺＡＲ(登録商標))、パクリタキセル(pacletaxel)、ビンブラスチン、エトポシド(ＶＰ−１６)、カンプトテシン、アクチノマイシン−Ｄ、ミトキサントロンおよびマイトマイシンＣ、および抗体治療、例えばモノクローナル抗体、例えば、HERCEPTIN(登録商標)(Genentech, San Francisco CA)を含むが、これらに限定されない。本発明の実施に際して使用するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡ分子の例は、各々の内容をその全体を引用により本明細書に包含させる米国公開特許出願２００３／００４４４０７および２００６年９月１４日出願の米国特許出願１１／５２０,７９６に記載のものを含むが、これらに限定されない。さらなる抗癌剤は、ペプチド、タンパク質および小分子(例えば、各々の内容をその全体を引用により本明細書に包含させる２００６年５月１５日出願の米国仮特許出願６０／８００,１６３、および２００６年９月１４日出願の６０／８４４,３５２を参照)を含む。抗癌剤(例えば、化学療法剤、小分子、遺伝子またはアンチセンスまたはｓｉＲＮＡなど)は、造影剤も含むカチオン性イムノリポソームと結合でき、または、それは、別に、本発明に従った異なるイムノリポソームで、または他の担体または送達系(例えば、通常の臨床標準に従った化学療法剤のＩＶ注射)を介して送達できる。
【００６３】
適当な態様において、本発明の方法は、造影剤(例えば、ＭＲＩ造影剤、例えばガドペンタテートジメグルミン)を含むイムノリポソーム複合体、および抗腫瘍剤を異なる時点で投与することを含む(すなわち、複合体および薬剤を同時にまたは異なる時点で投与できる)。適当には、抗癌剤を造影剤含有イムノリポソーム複合体の前または後に(例えば、カチオン性イムノリポソーム複合体投与の少なくとも１時間前または後に、少なくとも６時間前または後に、少なくとも１２時間前または後に、少なくとも２４時間前または後に、少なくとも４８時間前または後になど)投与する。さらに別の態様において、癌に罹患している患者における腫瘍組織を造影および処置する方法は、該患者にさらに照射処置を投与する方法を含み得る。
【００６４】
ヒトへの投与のための抗癌剤(例えば、化学療法、遺伝子、小分子、タンパク質、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡなど)の適当な投与量および時期は、ここに含まれる情報に基づいて当業者により容易に決定され、当分野において容易に利用可能である。さらに、このような量は、動物、例えば、マウス、ラット、イヌまたは他の試験において行った実験からの外挿により概算できる。
【００６５】
造影剤の封入および送達のために本発明のナノイムノリポソーム複合体(ｓｃＬおよびｓｃＬ−ＨｏＫＣ)を利用する利点の例は、該複合体の腫瘍ターゲティング特性による癌性組織でのより高い濃度を含む。該複合体が癌細胞に蓄積するため、癌特異的造影と異なる血流および間質腔への拡散(現在臨床で使用されている非複合体化遊離造影剤で見られる通り)がある。また、癌と良性過程で異なる増強がある。より長い血管および組織半減期が、本発明の複合体を使用した遅延造影を可能にする。本複合体および方法を、種々の深さで目的の組織を造影するのに使用できる。
【００６６】
故に、本発明の方法および複合体は、腫瘍におけるシグナルの増強だけでなく、また腫瘍の内部構造の大きな鮮明度ももたらす。より重要には、より小さい腫瘍が検出でき、より速い検出および故に改善した応答／生存に至る。これらの複合体はまた、良性を悪性孤在性小結節から区別するためにも使用できる。これは、いつ処置を開始すべきかの決定の推進を助ける。現在、小結節が増大するか否かの決定が、それが悪性であるか否かが確かではないため、遅れる。しかしながら、本発明の複合体が主におよび特異的に腫瘍細胞をトランスフェクトするため、これは悪性物の、例えば肺ＣＴに見られる小孤在性小結節が小悪性物であるか否かの確認として働く。この直前の２点は、肺および膵臓癌において特に顕著である。
【００６７】
本発明の造影剤含有複合体の使用により扱われる癌造影問題のタイプの例は、膵臓癌における、早期検出および慢性膵炎との区別；肺への転移疾患の早期検出；孤在性肺孤在性小結節の良性または悪性としての分類；乳房における増加したＭＲ増強の小病巣領域の良性または悪性としての分類を含む。
【００６８】
本発明の複合体はまた、この送達系を使用して、治療遺伝子が患者特異的癌細胞に入りそうであることを確認するためにも使用できる。すなわち、造影剤含有複合体が細胞に入ることができるという事実が、本発明の複合体と結合した治療遺伝子または他の薬剤のこれらの特異的癌細胞への挿入の指標を提供する。
【００６９】
関連分野の通常の技術者には、本方法への他の適当な修飾および適合が、本発明の範囲またはその全ての態様から逸脱することなくなし得ることが明らかである。以下に、本発明を詳細に記載するが、説明の目的のみでここに包含させ、本発明を限定する意図はない以下の実施例を参照して、本発明はより明瞭に理解されるであろう。
【００７０】
実施例１
Magnevist(登録商標)含有イムノリポソーム複合体
材料および方法
細胞株
ヒトリンパ芽球性白血病細胞株Ｋ５６２を、Lombardi Comprehensive Cancer Center Tissue Culture core facilityから得た。これらの懸濁液細胞を、１０％熱不活性化ＦＢＳ＋２mM  Ｌ−グルタミン、ならびにペニシリン、ストレプトマイシン(streptomycion)およびネオマイシンのそれぞれ５０μg／mlを補ったＲＰＭＩ１６４０に維持した。ヒト膵臓癌細胞株ＣａＰａｎ−１(ATCC Manassas, VAから得た)は、膵臓の転移腺肉腫由来であった。それを２０％非熱不活性化ＦＢＳ、２mM  Ｌ−グルタミンならびにペニシリン、ストレプトマイシンおよびネオマイシンのそれぞれ５０μg／mLを補った、４mM  Ｌ−グルタミンおよび重炭酸ナトリウム含有Iscov's Modified Dulbecco's Mediumに維持した。ヒト前立腺癌細胞株ＤＵ１４５(ATCC, Manassas, VA)は、元々、前立腺の広範な転移癌腫を有する患者の脳における病巣から元々由来した。それを、上記のように１０％熱不活性化ＦＢＳ＋Ｌ−グルタミンおよび抗体で補ったアール塩(ＥＭＥＭ)含有最小必須培地に維持した。
【００７１】
ナノ複合体化
カチオン性リポソーム(ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ)を、先に記載のエタノール注入法により製造した(その各々の開示を引用により本明細書に包含させる米国公開特許出願２００３／００４４４０７；Xu L, et al., Molecular Cancer Therapeutics 1:337-346 (2002)参照)。プラスミドＤＮＡを送達するとき、完全複合体を、以前に記載のものと同じ方法で形成した(米国公開特許出願２００３／００４４４０７参照)。インビトロ使用のために造影剤を封入するために、ＴｆＲｓｃＦｖをリポソームと、特異的比率で混合し、室温で１０分インキュベートした。Magnevist(登録商標)をこの溶液に添加し、混合し、再び、室温で１０分インキュベートした。２−８℃で貯蔵したとき、本複合体はMalvern Zetasizer 3000Hを使用したサイズ測定により決定して、少なくとも８日間安定である。この時間枠中の測定値のキュムラント(Ｚ平均)平均は１１２.３±４.６７(Ｓ.Ｅ.)であり、一方多分散性(反復スキャン中の値の再現性を示す)は０.４４５±０.０３である。ナノ複合体の許容されるサイズ範囲は約２０から１０００nm、適当には約５０から７００nmおよびより適当には約１００から５００nmである。インビトロトランスフェクションのために、２mlの無血清培地をトランスフェクション前に本複合体に添加した。インビボ使用のために、本複合体は、上記方法を使用して、１mg造影剤対０.３３−１.１７μg  ＴｆＲｓｃＦｖ対１０−３５μgリポソーム(適当には１mg造影剤対０.５から１.０μg  ＴｆＲＳｃＦｖ対１４−２８μgリポソーム、最も適当には１mg造影剤対０.７１μg  ＴｆＲｓｃＦｖ対２１μgリポソーム)の比率で形成した。インビボ使用のために製造するとき、デキストロースを５％の最終濃度で添加した。
【００７２】
インビトロトランスフェクション
懸濁液細胞Ｋ５６２をトランスフェクトするために、血清以外の全ての添加物を含む総容量４.０mlの培地(無血清培地培地)中の１５×１０６細胞を、１００mm２組織培養皿に置いた。種々の量のMagnevist(登録商標)を含む上記からの２mlのトランスフェクション溶液を細胞懸濁液に添加した。プレートを３７℃で、穏やかに振盪しながら結果の小で示す時間(９０分まで)インキュベートし、その後細胞を４℃で０.５ml  マイクロ遠心管中、穏やかにペレット化し(６００×ｇで７分)、１０mlの無血清培地培地で３回洗浄して全ての過剰なトランスフェクション溶液を除去し、造影するまで湿った氷上に置いた。
【００７３】
インビボ腫瘍ターゲティング
原発および転移腫瘍へのＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐナノ複合体の腫瘍選択的ターゲティングを評価するために、ヒト膵臓癌細胞株ＣａＰａｎ−１を使用した正所性転移モデルを使用した。ＣａＰａｎ−１の皮下異種移植腫瘍を、MatrigelＴＭ  コラーゲン基準膜マトリックス(BD Biosciences)に懸濁した１×１０７  ＣａＰａｎ−１細胞の注射により、雌無胸腺ヌードマウスに誘発させた。約８週間後、腫瘍を回収し、腫瘍の単一細胞懸濁液を調製した。同様にMatrigelＴＭに懸濁させた１.２−１.５×１０７細胞も、雌無胸腺ヌードマウスの外科的に暴露させた膵臓に注入した。手術５週間後、ＬａｃＺ遺伝子担持複合体を、３回、２４時間にわたりｉ.ｖ.注射した(４０μgＤＮＡ／注射)。６０時間後動物を殺し、先に記載した方法を使用してβ−ガラクトシダーゼ発現について染色された転移および臓器の存在について試験した(Xu, L., et al., Human Gene Therapy 10:2941-2952(1999))。
【００７４】
ＭＲＩ造影
インビトロＭＲＩ造影のために、マイクロ遠心管中の細胞ペレットをマグネットの中央に置いた。ＭＲ造影をHoward Universityで、4.7Thorizontal bore NMR machine(Varian Inc, Palo Alto, CA)を使用して行った。造影プロトコールは、マルチスライスＴ１強調スピンエコー造影シークエンスおよび飽和回復シークエンスから成る。Ｔ１強調造影技術のために、繰り返し時間(ＴＲ)は１０００msであり、エコー時間(ＴＥ)は１３msであった。Ｔｌ強調スピンエコー造影技術は、陽画像増強を確認するために適用した。可変エコー時間での飽和回復ＭＲシークエンスをＴ１測定のために使用した。画像のスライス厚は、０.５mmであった。用いたＲＦコイルは３０mm  単一ループコイルであった。ＲＦコイルは、ＲＦトランスミッターおよびレシーバーとして働いた。ＲＦパルスは、選択的５ms  sincパルスであった。相コード化工程の数は２５６であった。視野は１５mm×１５mmであった。試験において選択した画像領域は、ＲＦ均質性のためにＲＦコイルの中心に位置した。ＭＲ画像を、マイクロ遠心管の横断面方向で取った。細胞ペレットの高さは１２mmであった。マルチスライス画像の範囲は全ペレットをカバーした。空気−ペレット教会からの感受性効果のために、画像歪みにより影響を受けなかった中心スライス画像を、試験に使用した。画像強度を、Varian Image Browserソフトウエアを使用して測定した。シグナルを、各マイクロ遠心管からの画像の２／３をカバーするのに十分に大きい目的領域から取る。これらの試験管からのペレットの相対的画像強度を、コントラスト促進評価およびＴ１測定に適用した。
【００７５】
インビボ試験のために、ＣａＰａｎ−１正所性腫瘍またはＤＵ１４５皮下異種移植腫瘍担持マウスを使用した。ＣａＰａｎ−１腫瘍は上記の通り誘導した。ＤＵ１４５腫瘍は、Matrigel中７×１０６細胞の皮下接種により誘導した。これらの試験は、Georgetown Universityで行った。造影すべき動物を麻酔し、専有の社内設計、動物管理系に置いた。この系は、温度を３７℃に維持する温水加熱系、ならびに動物の皮膚温度、環境温度およびデバイスの壁温度をモニターするための４チャネル熱光学モニタリング系を含む。造影のために、イソフルランを４％で、６６％酸素および３０％一酸化二窒素混合物から成る残りのガスと共に使用して麻酔を誘導した。麻酔の維持は、上記の酸素および一酸化二窒素の類似ガス条件下の１.５％イソフルランにより達成した。麻酔した動物を円筒可変放射周波数共鳴アンテナ(鳥かご共鳴器容量コイル)の内側に配置させ、約３００MHzの中心周波数にチューニングした(７テスラの磁界強度を対象としたとき水分子の中心共鳴周波数)。使用した造影プロトコールは、7TBruker BioSpin(Germany/USA)造影操作卓上で行ったＴｌ強調Ｔｕｒｂｏ−ＲＡＲＥ(急速増強を伴う急速獲得)３次元造影シークエンスであった。使用した造影パラメータは：Ｔ１強調Turbo-RARE 3D(３次元)、ＴＥ  １３.３ms、ＴＲ  ２２９.５、Flipbackオン、８.０／３.５／３.５cm視野を伴う４エコーおよび２５６×２５６×２５６マトリックスであった。基準画像獲得後、動物を動物ケースに固定化したままにし、Magnevist(登録商標)のみ(４００μlに１×リン酸緩衝化食塩水ｐＨ＝７.４で希釈)またはMagnevist(登録商標)含有イムノリポソーム複合体(ＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−Ｍａｇ)(総容量４００μl)を、動物の尾静脈への静脈内注射により２７Ｇ針を使用して全身投与し、３−Ｄ造影シークエンスを直ぐに開始した。２種の溶液での造影を連続した日に行った。
【００７６】
走査型電子顕微鏡(ＳＥＭ)
リポソーム封入Magnevist(登録商標)造影剤およびリポソーム封入複合体をコーティングする腫瘍ターゲティング一本鎖トランスフェリン受容体タンパク質から成る完全ナノ複合体、ＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−Ｍａｇのサンプル溶液をＧＵＭＣで調製し、ＮＩＳＴに送り、暗所で冷蔵保存した。個々の造影操作毎に、脱イオン水で、容量比１：３の新たな希釈液を調製し、５μL液滴を、３０−６０nm  formvarおよび１５−２０nm  炭素から成る標準２００メッシュＴＥＭグリッド上にマイクロピペットで加えた。本液滴を、グリッド中で５分空気乾燥させ、その後顕微鏡のバキュームチャンバーに収納した。造影を、Hitachi S-4800電場放出顕微鏡を使用して、ＮＩＳＴで行った。ＳＥＭのＮＤＡ造影への適用の目的は、上部および下部二次電子検出器[ＳＥ(Ｕ)とＳＥ(Ｌ)]  −−  その通常のモードでＳＥＭを使用する  −−  を、装置を低電圧ＳＴＥＭに変更しながらの伝達電子(ＴＥ)の検出器の追加と、比較することである。
【００７７】
走査型プローブ顕微鏡(ＳＰＭ)
リポソーム封入Magnevist(登録商標)造影剤、および完全ナノ複合体のサンプル溶液をＧＵＭＣで調製し、ＮＩＳＴに送り、暗所および冷蔵保存した。各造影期間のために、脱イオン水で、容量で１：３の新たに希釈を調製し、５μL液滴を、天然オキシドまたはポリ−Ｌリシンコーティングと共に使用する超音波(untrasonically)洗浄したシリコン支持体にマイクロピペット輸送した。ＳＰＭ造影を、Veeco MultiMode顕微鏡をNanoscope IVコントローラーと共に使用して得た。Ｚコントロール(〜３２０−３６０kHzおよびｋ  〜  ２０−６０Ｎ／ｍのためのVeeco RTESPカンチレバー)を用いたタッピングモードによる形態学、相造影、および磁気被覆チップ(Veeco MESP 68kHz)を使用した磁気力顕微鏡を、ライフ・モードで行った。溶液が単離されたナノ粒子および塊を暴露するために蒸発するに連れた脱濡れ(dewetting)および表面エネルギー“相分離”の動的造影を、粒子安定性に対する溶媒乾燥の結果、およびＳＰＭ系で利用可能な種々のＳＰＭコントラスト機構に対する影響の理解のために使用した。
【００７８】
結果
レポーター遺伝子を担持するリガンド−リポソームナノ複合体による腫瘍特異的ターゲティング
ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡナノ複合体の、原発腫瘍および転移正所性転移モデルへの選択的ターゲティングを評価するために、ヒトＰａｎＣａ細胞株ＣａＰａｎ−１を使用して、臨床的症状のより近い近接を用いた。ＣａＰａｎ−１異種移植腫瘍切片のヌードマウスへの外科的正所性移植は、５６日以内に、肝臓および脾臓に転移を生じることが示されている(Alisauskus,R., et al., Cancer Research 55:5743s-5748s(1995))。ＣａＰａｎ−１の正所性腫瘍を、「方法」に記載の通り雌無胸腺ヌードマウスに誘発した。約５週間後、動物を殺し、膵臓および他の臓器における腫瘍を調べるために剖検した。図１Ａに示す通り、広範な腫瘍増殖が膵臓中で明白である。１Ａにおいて矢印で示した肝臓における同じ腫瘍小結節は、１Ｂにおいて強いβ−ガラクトシダーゼ発現を示す。１Ａ＝肉眼的剖検；１Ｂ＝β−ガラクトシダーゼについて染色後の組織。転移は、５匹中４匹のマウスで、脾臓、肝臓、肺、副腎および横隔膜内でさえ含む、種々の臓器に存在した。この実験を繰り返し、同様の結果であった。
【００７９】
腫瘍および転移選択的ターゲティングを確率するために、マウスを殺す前に、β−ガラクトシダーゼ発現のためのｐＳＶｂ(ＬａｃＺ)プラスミドＤＮＡを担持するＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ複合体を、２４時間にわたり３回マウスにｉ.ｖ.注射した(注射あたり４０μgのプラスミドＤＮＡ)。全５匹のマウスを注射６０時間後に殺し、肝臓、肺、脾臓、膵臓および横隔膜を含む種々の臓器を回収し、転移および腫瘍特異的染色の存在について試験した。１mmの厚さにスライスした新鮮なサンプルをＸ−ｇａｌで染色して、遺伝子が発現している場所に青色を生じさせた。複合体の腫瘍ターゲティング能および高トランスフェクション効率が、この動物からの種々の臓器におけるレポーター遺伝子の存在により証明された(図１Ｂ)。肝臓、肺、副腎および横隔膜において、レポーター遺伝子が転移においてのみ非常に発現されていて、隣接正常組織には青色が明白ではないことが明瞭に示される。図１Ａにおいて肝臓中で見ることができる転移(矢印)は、図１Ｂにおいてβ−ガラクトシダーゼを強く発現する同じ腫瘍小結節(矢印)であり、このナノ複合体の腫瘍特異的性質を確認する。マウスの幾分かで、膵臓における腫瘍増殖がまた移植に使用した元の切開部位を通して腫瘍の突出ももたらした。図１Ｂにおいて、正常非染色皮膚に囲まれたこの強く青色染色された皮下腫瘍も示され、また腫瘍細胞特異性を示す。同様の結果が残りのマウスおよび反復実験でも示された。故に、この全身投与したナノ複合体は、原発および転移の両方の腫瘍細胞を、それが体内のどこで生じようと標的とし、プラスミドＤＮＡを効率的に送達する。我々は、この送達系の可能性を拡大して、造影剤を包含させることを望んだ。そうする能力は、改善された造影および癌検出をもたらすであろう。
【００８０】
Magnevist(登録商標)を送達するためのＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ複合体を使用したインビトロ試験
Magnevist(登録商標)が臨床において最も使用されている造影剤の一つであるために、これらの試験での使用のために選択した。これらの最初の実験において、本複合体がMagnevist(登録商標)を伴って製造できるか、もしそうであるならばＭＲＩシグナルを増強するかを実験した。トリプシン処理が膜損傷および細胞からの造影剤の滲出をもたらすため、接着細胞をこれらの試験には使用しなかった。その代わり、懸濁液培養として増殖させたヒトリンパ芽球性白血病細胞株、Ｋ５６２を使用した。さらに、細胞の穏やかなペレット化および洗浄が、造影前に全ての過剰なMagnevist(登録商標)または複合体を除去し、細胞関連シグナルのみの検出を可能とした。
【００８１】
１. ＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−Ｍａｇナノ複合体による時間依存性画像増強
ＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−Magnevist(登録商標)ナノ複合体のトランスフェクションのための最適時間を試験した。Magnevist(登録商標)の示される臨床用量は０.１mMole／kgである。これらの最初の試験において、２５０μlのトランスフェクション溶液あたり、複合体中、０.３mMole／kgの用量を使用した(ヒトに対してマウスの少ない体重および血液量に関して補正)。Ｋ５６２細胞を、２０から９０分の範囲の時間トランスフェクトした。２０分は、画像強度に基づいて、非常に低いトランスフェクション活性を示した。しかしながら、図２Ａに示される通り、６０分までに、複合体でトランスフェクトされた細胞は、未処置細胞と比較して、強度の大きな増大を示した。未処置細胞の強度(２０２±４８)は、空マーカー試験管(１９４±４３)と有意差はなく、細胞それら自体が検出されるシグナルに関与しないことを示す。より重要なことに、トランスフェクトした細胞の６０および９０分の相対的強度が同一(それぞれ３１７±４６および３１７±４７)であるため、トランスフェクション効率は約６０分でプラトーになった。
【００８２】
２. Magnevist(登録商標)用量依存性画像増強
トランスフェクション時間として６０分を使用して、次いで、ＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−Ｍａｇ複合体画像増強に対するMagnevist(登録商標)の量の増加の影響を評価した。試験した用量は０.０５、０.３および０.９mMole／kgであった。マウスのサイズおよび血液量について補正して、２５０μlのトランスフェクション溶液中の複合体中で使用したMagnevist(登録商標)の量は０.２５μl、１.５μlおよび４.５μlであった。図２Ｂおよび表１に示される通り、複合体中に含まれる造影剤の量の関数として、画像強度は増加し、Ｔ１緩和時間は短くなった。
【表２】
0005478886.tif 000003
【００８３】
３. 遊離Magnevist(登録商標)と比較したＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−Ｍａｇによる画像増強
上記実験に基づき、ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームがMagnevist(登録商標)と複合体化し、それを画像増強のために細胞に送達できることが示された。複合体化造影剤の該薬剤単独と比較した増強のレベルを評価し、得られたシグナルが、非包含Magnevist(登録商標)の存在によるものではないことを証明するために、Ｋ５６２細胞を遊離Magnevist(登録商標)またはＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−Ｍａｇナノ複合体のいずれかで処理した。同一量の造影剤(０.３μM／kgまたは１.５μl／２５０μl  トランスフェクション容量)およびトランスフェクション時間(６０分)を両溶液について使用した。遊離Magnevist(登録商標)は、予測通り未処置細胞と比較して増強されたコントラストを示し、ＴｆＲｓｃｖ−Ｌｉｐ−Ｍａｇ複合体で処置された細胞は、未処置および遊離Magnevist(登録商標)処置細胞の両方と比較して、画像強度のより大きな増加および短いＴｉ緩和時間を証明した(図２Ｃ、表２)。これらの結果は、標的化ナノ複合体の手段による造影剤取り込みの効率の増加を証明するだけでなく、観察されたシグナルが非複合体化Magnevist(登録商標)によるものではないであろうことも示す。
【表３】
0005478886.tif 000004
【００８４】
ＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−Ｍａｇでのインビボ画像増強
上記試験は、本ナノ複合体が、Magnevist(登録商標)単独よりも効率的にインビトロで腫瘍細胞を造影できることを確立した。しかしながら、臨床使用の可能性を有するために、本複合体は、インビボで同様の効果を示さなければならない。レポーター遺伝子を担持する本複合体の腫瘍特異的ターゲティングを証明するために上記で使用したものと同じヒト膵臓癌正所性マウスモデル(ＣａＰａｎ−１)を、これらの試験に使用した。加えて、第二の腫瘍モデル、皮下前立腺異種移植マウスモデル(ＤＵ１４５)もまた使用した。ＣａＰａｎ−１またはＤＵ１４５腫瘍を担持するマウスを、「方法」において記載の通り7TBruker NMRで造影した。コイル中に配置されると、基準画像がＴＩ強調Turbo RARE(急速増強を伴う急速獲得)３次元造影シークエンスを使用して得られた。画像アラインメントを容易にするために、基準獲得後、動物をケース中に維持し、その間造影溶液を静脈内注射を介して投与した。シグナル獲得は、注射３分以内に開始した。遊離(臨床において行われている通り)または本複合体に包含されたいずれかでマウスに投与されたMagnevist(登録商標)の量は１０μlであった。この量は、ヒトにおいて使用される０.２mM／Kgまたは２倍と同等である。この量は、０.１mM／Kg  Magnevist(登録商標)の標準ヒト用量のみでは、マウスにおいて非常に乏しいシグナルをもたらすため選択した。遊離Magnevist(登録商標)およびＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−Ｍａｇ複合体での造影を連続２日間行った。基準スキャンもまたナノ複合体投与前に行い、前日からのMagnevist(登録商標)の全てがウォッシュアウトされていることを確認した。ＭＲ技術およびウィンドウは、スキャナーの自動ウィンドウイング特性を補正するように調節されたウィンドウを有する２セットの画像の間で同一であった。
【００８５】
３匹の別々のマウスにおけるMagnevist(登録商標)およびナノ複合体−Ｍａｇの画像を図３Ａ−Ｉに示す。図３Ａ、３Ｄおよび３Ｇにおいて、ＣａＰａｎ−１腫瘍細胞外科的移植４ヶ月後、動物は、大きな正所性腫瘍を担持する。造影剤単独と比較して増加した解像度およびシグナル強度がかなり明白である。同様の結果が、図３Ｂ、３Ｅおよび３Ｈに示す、ＣａＰａｎ−１腫瘍を有する第二のマウスでも観察される。この動物は、手術後わずか２ヶ月で、切開部位を通して目に見える皮下腫瘍増殖を有する。小さな腹部塊も触診により検出された。本複合体化Magnevist(登録商標)の投与後に皮下腫瘍のシグナルがより増強されていただけでなく、小さい正所性腫瘍らしきもの(矢印)がこのスキャンにおいて明瞭であるが遊離Magnevist(登録商標)を受けた動物では明瞭ではない。同様に、遊離Magnevist(登録商標)と比較して、増加した鮮明度およびコントラストが、ＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−Ｍａｇ複合体注射後に皮下ＤＵ１４５腫瘍(図３Ｃ、３Ｆおよび３Ｉ)で明瞭である。再構成および定量を、２種の異なる腫瘍モデル、膵臓癌(ＣａＰａｎ−１)および前立腺癌(ＤＵ１４５)を示す図３Ｂ、３Ｅおよび３Ｈならびに３Ｃ、３Ｆおよび３Ｉで行った。両方の場合、予期された通り、遊離Magnevist(登録商標)による基準を越える増加した強度(ピクセル)がある。しかしながら、腫瘍ターゲティングナノ複合体による造影剤の送達は、これらの腫瘍モデルの両方においてほぼ３倍のシグナル強度のさらなる増加をもたらす。故に、これらの試験は、Magnevist(登録商標)がＴｆＲｓｃＦｖ−リポソーム複合体に包含されたとき、インビボ状況で改善された腫瘍可視化があり、そして、臨床使用のための腫瘍検出の手段としてこれをさらに開発する利点の可能性を示唆する。
【００８６】
物理的特徴付け試験
インビトロ試験は複合体化Magnevist(登録商標)がリポソーム内に封入される証明を提供し、精密な顕微鏡技術(ＳＥＭおよびＳＰＭ)がこれを証明しているが、ＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−Ｍａｇ複合体をさらに特徴付け(例えば複合体サイズ)する。
【００８７】
１. Magnevist(登録商標)なしのリポソームの造影
高解像度造影は狭い焦点深度を意味し、故に、相対的に薄くかつ平らなサンプルを必要とする。どの程度薄いかは技術に依存するが、表面および支持体効果  −−表面エネルギーおよび対称性低下  −  がしばしばバイオマテリアルに典型的な構造力を支配する。これは、その薄い性質を考慮して、リポソームの場合特に当てはまる。(Foo, J.J., et al., Annals of Biomedical Engineering 31:1279-1286(2003))。故に、単離されたリポソームを調製するためのおよび次元的および機構的安定性特徴付けするための信頼できる方法が必須である。この特徴付けの目的は、造影剤が実際にナノ粒子に取りこまれており、リポソームと単に外的結合しているものではないことを確立するための、ナノ粒子の機械的剛性および磁気特性の直接検出を実施することである。
【００８８】
ＳＰＭは、カンチレバー共鳴周波数近くに結合しているチップおよびカンチレバーを振動させることによるタッピングモードで表面形態学を造影する。フィードバック回路が、カンチレバーの振動を、一定振幅に維持する。この一定振幅は、自由に振動するカンチレバーよりも幾分小さい接点により与えられる。ＳＰＭチップが、種々の小さい力を介して表面と相互作用するため、表面上のある点でのカンチレバー励起およびその応答の間に層シフトがある。不均質表面について、チップ−表面相互作用は、例えば表面電荷、急形態学的変化、および機械的剛性変化に従い変化する。設定点を変えることにより、そしてどのようにある種の特性が軟または硬タッピングに応答するかを観察することにより、我々は、これをリポソームのような特異的構造について予測される応答と相関させることができる。(自由振動振幅シグナルは約１.７８Ｖである。)ペイロードなしの一対の単離されたリポソームのＳＰＭ相画像のシークエンスを図４Ａ−Ｃに示す。図４Ａは、１.６８Ｖの設定点で造影し、そして支持体およびリポソームの間の対応する逆位相差は、−３.５度の相値を与えられた場合、チップ−サンプル相互作用がリポソームに対して誘引性であることを示す。誘引性相互作用および逆相の場合、リポソームの相画像は、リポソーム端での形態学的に重要な輪以外、暗く見える。図４Ｂは、１.４５Ｖに設定点を下げたときの効果を証明する：ここでは、リポソームは、チップ−サンプル相互作用が反発になったため明るく見え、そしてこの場合、リポソームおよび支持体の間の位相差は＋８度である。最後に、図４Ｃは、１.３５Ｖの設定点で記録した位相差がさらに増加し、＋３５度になることを示す。
【００８９】
２. リポソーム封入Magnevist(登録商標)の造影
図５Ａ−Ｃは、単離されたリポソーム封入Magnevist(Ｌｉｐ＋Ｍａｇ)ナノ粒子のＳＰＭおよびＳＥＭ画像を示す。単一Ｌｉｐ＋Ｍａｇ粒子のサイズ分布は、光学測定に従って１００−２００nm直径およびスケールの範囲内であり、それは、ペイロード封入リポソームが、球形状態ではリポソーム単独より約５０％大きいことを示す。
【００９０】
図５Ａに示すＳＰＭトポグラフは、Magnevist(登録商標)含有リポソームが、乾燥後にバイモダル表面形態を有し、それはペイロードを含んでいないリポソームの単純長円表面(示していない)よりもさらに複雑である。ＳＰＭ相行動は、無ペイロードリポソームのそれと非常に異なり、外環が中心に対して反発性であり、そして対応するＳＰＭ相画像は図５Ｂに示す。誘引性および反発性チップ−サンプル相互作用両方の領域が中程度の設定点値で見られる。１.６の設定点で得られるＳＰＭ相画像およびＴＥモードのＳＥＭ画像の相関は、図５Ｂおよび５Ｃから明らかである。リポソームは、ＳＥＭ画像において全粒子で均一に明るく見え(示していない)、ＳＰＭにより我々が得た均一相画像に類似する。チップおよびカンチレバーは時間および用法に応じて変化する。さらに、作成された画像が、チップ上の外来物質のために、チップ不安定性により影響を受けないことを確認することは重要である。故に、それらを頻繁に変える。各カンチレバーがその共鳴特性について幾分異なるため、図４および５において使用した設定点は異なる。
【００９１】
３. ＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−Ｍａｇナノ複合体の造影
「方法」において記載の通り、完全ＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−Ｍａｇナノ複合体を調製し、ＳＥＭおよびＳＰＭで造影した。図６Ａおよび６Ｂに示す結果は、、溶媒フィルムが相分離を起こすことを示す；しかしながら、単離されたＮＤＳの例は、乾燥フィルム上で容易に観察できる。ＳＥＭビームが明らかにフィルム上への何らかの傷の原因となるが、粒子は、ビーム傷が顕著になる前に数回繰り返し走査できることは注意すべきである。完全複合体の見かけは(Ｌｉｐ＋Ｍａｇ)のみのものと異なる。形態は規則性が低く、そして乾燥後のリポソーム表面の相当なテクスチャリングは、タンパク質変性と一致する。また、ＳＥＭ  ＴＥ画像は、(Ｌｉｐ＋Ｍａｇ)粒子で見られるリポソームの外環および中心の間の良く定義された境界が、あまり明瞭ではなく、形態がはるかに可変性であることを示す。これは、リポソーム内のタンパク質の存在が、フィルム乾燥中のリポソームを通る浸透性流出を変えるとの観察と一致する。
【００９２】
ＳＰＭ(ＭＦＭ)の磁気力顕微鏡造影性能を使用することにより、これらのＮＤＳ粒子についてさらなる情報を得ることが可能である。ガドリニウム含有Magnevist(登録商標)の磁気モーメントがかなり大きいため、磁化ＳＰＭチップを使用して、リポソーム内に濃縮されている指向性Magnevist(登録商標)と相互作用することが可能であるはずである。図７Ａおよび７Ｂにおおいて、数個の約１００−２００nm直径ナノ複合体のＭＦＭを示す。ＳＰＭのリフトモード能力を使用して、作成された画が、真に本質的に磁気であることが確立される。このモードで、通常タッピングモード下の形態学的画像を得る。次いで、参照表面情報を使用して、表面から特異的な高さを除くことによりチップを並置し、次いで、この増加した高さについて走査する。これは、シグナルに対する形態学の影響を除く。表面から１５nm以上の高さでのリフトモードで得たＭＦＭ画像は、磁気相画像により与えられる。シグナルの見かけは、本複合体内へのガドリニウム封入を確認する。図７Ａは、完全ＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−Ｍａｇナノ複合体のＳＰＭ形態学／磁気相画像である。図７Ｂの二重双極子様シグナルの見かけは誘引性および反発性面内磁気相互作用と一致し、この相互作用の原因が、ＮＤＳ内のMagnevist(登録商標)の不均一ドーナツ形分布であることを示唆し、ＳＥＭおよび非磁気ＳＰＭ相画像と一致する。
【００９３】
検討
ここに記載の結果は、我々が、一般に使用されているＭＲ造影剤Magnevist(登録商標)を封入し、インビトロおよび正所性動物モデルの両方で腫瘍細胞に送達でき、そしてそうすることにより、非複合体化Magnevist(登録商標)で見られるよりもより明確で強い画像を生じることを証明する。
【００９４】
図１に示す通り、本発明のナノ複合体は転移疾患を標的にでき、それにより転移の検出感受性を高める。ＳＥＭおよびＳＰＭを使用して、Magnevist(登録商標)が封入されたとき、ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソーム複合体がそのナノメートルサイズを維持することが証明されている(約１００−２００nmの粒子が図６および７に見られる)。ペイロード含有リポソームの構造的および機械的特性が、それを含まないものと相当に異なり、それによりMagnevist(登録商標)が実際にリポソーム内に封入されていることを証明する。これは、本複合体のＭＦＭ造影によりさらに確認された。
【００９５】
以下の理論に縛られることを望まないが、(Ｌｉｐ＋Ｍａｇ)内部構造の暫定的な説明  は、ＳＰＭ形態学画像におけるふくらみがリポソーム密閉相分離を示し、すなわち、粒子の中心での優勢な水性相を伴い粒子の末端周囲での稠密なMagnevist(登録商標)−脂質ドーナツ形分布の形成を示すことである。この応答は、恐らく、いくつかの重要な因子に帰し得る：第一に、Magnevist(登録商標)溶液の特性は製造者によると、２０℃でｐＨ〜６.５−８、１,９６０のオスモル濃度および４.９の粘性である。溶液のこの分離についてのもっともらしい化学的根拠がMagnevist(登録商標)データシートに示されている：メグルミン塩は複合体から完全に解離し、故に局所的浸透性条件が変化する。ガドリニウム複合体およびカチオン性脂質の電荷相互作用と合わさって、これらの相互作用は、リポソーム内の高張性相分離のための強い分離力を提供し得る。カチオン性脂質およびMagnevist(登録商標)溶液の間の電荷分布はリポソームの安定化に有効であり、溶液中で、そして恐らく血流中で構造的支持を提供する。この増強された構造支持が、リポソームのみの溶液で観察される相当な分解と対照的にそれがほとんど粒子がフィルム乾燥工程中に無傷で残ることを可能にし、これらの試験のための大きな利点である。
【００９６】
前記の実施例は、本発明のイムノリポソーム複合体内へのＭＲ造影剤の十分な封入を証明する。本複合体により証明された伝統的に送達させたMagnevist(登録商標)を越える画像増強は、ＭＲＩを介した癌の早期検出を改善するためのこの系の能力を示す。
【００９７】
実施例２
種々の細胞株における造影の比較
図８Ａ−８Ｈは、リガンド−ＨＫ−リポソーム−Ｍａｇナノ複合体を使用した、癌の２種のモデルにおける改善されたＭＲ造影を示す。本実施例において使用するためのナノ複合体は、実施例１に明示のものと同じ比率および方法を使用して製造した。ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−４３５(図８Ｅ−８Ｈ)またはヒト前立腺癌細胞株(ＤＵ１４５)(図８Ａ−８Ｄ)細胞を雌無胸腺ヌードマウスの背下部に皮下注射した。遊離Magnevist(登録商標)、または同量のMagnevist(登録商標)を含むＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームナノ複合体(ｓｃＬｉｐ−Ｍａｇ)もしくはＨｏＫｃペプチド含有ＴｆＲｓｃＦｖ−ＨＫ−リポソームナノ複合体(ｓｃＬｉｐ−ＨＫ−Ｍａｇ)を、連続３日間、各マウスにｉ.ｖ.注射(尾静脈を介して)した。Magnevist(登録商標)のこの量はヒト患者に投与する量の２倍に等しい。全例において投与した溶液の総容量は４００μlであった。基準スキャンを両方のナノ複合体の投与直前に実施し、前日からのMagnevist(登録商標)の全てがウォッシュアウトされていることを確認した。ＭＲ技術およびウィンドウは、スキャナーの自動ウィンドウイング特性を補正するように調節されたウィンドウを有する４セットの画像の間で同一であった。パネルは、皮下腫瘍を有するマウスにおけるＭＲＩシグナルの差異を示し、ここで、ｓｃＬｉｐ−Ｍａｇ注射後、そしてなおさらにｓｃＬｉｐ−ＨＫ−Ｍａｇ注射後に前立腺腫瘍(ＤＵ１４５)(図８Ａ−８Ｄ)および乳房腫瘍(４３５)(図８Ｅ−８Ｈ)の両方において増加した鮮明度およびコントラストが明白である。
【００９８】
図９Ａ−９Ｃは、ＴｆＲｓｃＦｖ−ＨＫ−リポソーム−Ｍａｇナノ複合体によるＣａＰａｎ−１皮下腫瘍および正所性転移モデルの腫瘍特異的ターゲティングを示す。皮下ＣａＰａｎ−１異種移植腫瘍を、実施例１の「方法」に記載の通り雌無胸腺ヌードマウスに誘発した。腫瘍を回収し、MATRIGEL(登録商標)中の単一細胞懸濁液を外科的に暴露した膵臓に注射した。注射８週間後、Magnevist(登録商標)を担持する、ＨｏＫＣ(ＨＫ)ペプチド含有または不含有ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソーム複合体を、連続２日間マウスに注射した。全例で投与した溶液の総容量は４００μlであった。基準スキャンをナノ複合体の投与直前に実施し、前日からのMagnevist(登録商標)の全てがウォッシュアウトされていることを確認した。ＭＲ技術およびウィンドウは、スキャナーの自動ウィンドウイング特性を補正するように調節されたウィンドウを有する３セットの画像の間で同一であった。図８Ａ−８Ｈと同様に、表３に示す通り、皮下腫瘍(白色矢印)および転移病巣の改善された造影解像度が観察される。
【表４】
0005478886.tif 000005
【００９９】
実施例３
遊離(非複合体化)またはＴｆＲＳｃＦｖ−Ｌｉｐ−Magnevistの全身注射の皮下ＰＡＮＣ−１腫瘍の動的ＭＲＩスキャンの比較
以下の実験を実施し、全身送達後の腫瘍における遊離(非複合体化)およびＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−Ｍａｇの取り込みおよびウォッシュアウトの速度およびレベルを比較した。ＰＡＮＣ−１の皮下異種移植腫瘍を、MatrigelＴＭコラーゲン基材膜マトリックス(BD Biosciences)に懸濁させた１から２×１０７  ＰＡＮＣ−１細胞の注射により雌無胸腺ヌードマウスに誘発させた。約２.５−３週間後、動物を造影のために使用した。カチオン性リポソーム(ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ)を、先に記載の通りエタノール注入法により調製した(その各々の開示を引用により本明細書に包含させる米国公開特許出願２００３／００４４４０７；Xu L, et al., Molecular Cancer Therapeutics 1:337-346 (2002)を参照のこと)。これらの試験で使用したターゲティング部分は抗トランスフェリン受容体一本鎖抗体フラグメント(ＴｆＲｓｃＦｖ)である。
【０１００】
造影剤をカプセル封入するために、ＴｆＲｓｃＦｖをリポソームと特異的比率で混合し、室温で１−３０分、適当には５−２０分、最も適当には１０−１２分インキュベートした。Magnevist(登録商標)をこの溶液に添加し、混合し、再び室温で１−３０分、適当には５−２０分、最も適当には１０−１２分インキュベートした。インビボ使用のために調製するとき、スクロースまたはデキストロースを０.５−５０％、適当には１−２０％、最も適当にはスクロースについて１０％およびデキストロースについて５％の最終濃度で添加し、室温で１−３０分、適当には５−２５分、最も適当には１５−２０分インキュベートした。本複合体は、上記方法を使用して、１mg造影剤対０.３３−１.１７μg  ＴｆＲｓｃＦｖ対１０−３５μgリポソーム(適当には１mg造影剤対０.５から１.０μg  ＴｆＲＳｃＦｖ対１４−２８μgリポソーム、最も適当には１mg造影剤対０.７１μg  ＴｆＲｓｃＦｖ対２１μgリポソーム)の比率で形成される。本複合体の許容されるサイズ範囲は、約２０から１０００nm、適当には約５０から７００nmおよび最も適当には約１００から５００nmである。ここで、本複合体は、４.７mg  Magnevist、９９μgリポソームおよび３.３μg  ＴｆＲｓｃＦｖと５％の最終濃度のデキストロースを使用して形成した。
【０１０１】
上記の通り誘発したＰＡＮＣ−１皮下腫瘍担持マウスを麻酔し、動物ホルダーシステムに入れた。イソフルランを４％で、６６％酸素および３０％一酸化二窒素混合物を含む残りのガスと共に使用して麻酔を誘導した。麻酔の維持は、上記の酸素および一酸化二窒素の類似ガス条件下の１.０から２.０％イソフルラン(好ましくは１.５％)により達成した。麻酔した動物を円筒可変放射周波数共鳴アンテナ(鳥かご共鳴器容量コイル)の内側に配置させ、約３００MHzの中心周波数にチューニングした(７テスラの磁界強度を対象としたとき水分子の中心共鳴周波数)。使用した造影プロトコールは、7TBruker BioSpin(Germany/USA)造影操作卓上で行ったＴ１強調２次元Turbo RARE(急速増強を伴う急速獲得)造影シークエンスであった。使用した造影パラメータは：Ｔ１強調２Ｄ(２次元)、ＴＥ  １０.２１ms、ＴＲ  ４２０.３、Flipbackオフ、５.１２／５.１２cmの視野を伴う８エコーであった。基準画像獲得後、動物を動物ケースに固定化したままにし、遊離(非複合体化)Magnevist(登録商標)(Ｍａｇ、またはここではｇａｄ−ｄ)または同量のＭａｇ(総容量５０−１０００μl、適当には１００−５００μl、最も適当には２００−４００μl)を含むＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−Ｍａｇ複合体を、動物の尾静脈への静脈内注射により２７Ｇ針を使用して全身投与し、造影シークエンスを直ぐに開始した。スキャン(２平均、１.３分)を定期的に２時間にわたり繰り返し、ピクセル強度を測定し、プロットした。遊離および複合体両方の造影について同じマウスを使用した。造影は連続した日に行い、遊離Ｍａｇが最初であった。
【０１０２】
図１０に示す通り、遊離造影剤と比較して、本複合体の静脈内注射後に、腫瘍におおける顕著に高いレベルのシグナルがある。より顕著には、この高いレベルは、実験の経過中維持される。
【０１０３】
実施例４
ＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−ＨｏＫＣ−MagnevistによるＣａＰａｎ−１肝臓転移の検出
以下の実験を行い、本発明のＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−ＨｏＫＣ−Ｍａｇ複合体が転移腫瘍を検出し、造影を増強する能力を評価する。例として、膵臓癌からの転移を試験したが、しかしながら、全てのタイプの癌からの転移の造影が、本発明の複合体および方法を使用して達成され得る(例えば前立腺、黒色腫、腎臓、乳房、胃、肝臓、卵巣、膀胱、頭頚部、脳、骨および全ての他のタイプの固形腫瘍)。ＣａＰａｎ−１の皮下異種移植腫瘍を、MatrigelＴＭコラーゲン基材膜マトリックス(BD Biosciences)に懸濁した０.５から１×１０７  ＣａＰａｎ−１細胞の注射により雌無胸腺ヌードマウスに誘発した。約８週間後  ｔｈｅ腫瘍を回収し、腫瘍の単一細胞懸濁液を調製した。MatrigelＴＭにまた懸濁させた１.２−１.５×１０７細胞を、先に記載の通り雌無胸腺ヌードマウスの外科的に暴露した膵臓に注射した(Alisauskus, R., Wong, G.Y., and Gold, D.V., Initial studies of monoclonal antibody PAM4 targeting to xenografted orthotopic pancreatic cancer, Cancer Research 55, 5743s-5748s (1995))。
【０１０４】
カチオン性リポソーム(ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ)を、先に記載の通りエタノール注入法により調製した(その各々の開示を引用により本明細書に包含させる米国公開特許出願２００３／００４４４０７；Xu L, et al., Molecular Cancer Therapeutics 1:337-346 (2002)を参照のこと)。ＨｏＫＣペプチド｛Ｋ[Ｋ(Ｈ)ＫＫＫ]５−Ｋ(Ｈ)ＫＫＣ｝(配列番号１)は、末端システインを含み、マレイミド基への結合を可能とする。故に、ＨｏＫＣペプチドを使用したとき、リポソーム製剤はまたＮ−マレイミド−フェニルブチレート−ＤＯＰＥ(ＭＰＢ−ＤＯＰＥ)を、総脂質の０.１５０モルパーセント、より好ましくは総脂質の１−１０モルパーセント、最も好ましくは総脂質の５モルパーセント含む。ＨｏＫＣリポソームＨｏＫＣリポソームを、先に記載の通り製造した(Yu, W. et al. Enhanced transfection efficiency of a systemically delivered tumor-targeting immunolipoplex by inclusion of a pH-sensitive histidylated oligolysine peptide, Nucleic Acids Research 32, e48 (2004)))。これらの試験に使用したターゲティング部分は抗トランスフェリン受容体一本鎖抗体フラグメント(ＴｆＲｓｃＦｖ)である。
【０１０５】
造影剤を封入するために、ＴｆＲｓｃＦｖをリポソームと特異的比率で混合し、室温で１−３０分、適当には５−２０分、最も適当には１０−１２分インキュベートした。Magnevist(登録商標)をこの溶液に添加し、混合し、再び室温で１−３０分、適当には５−２０分、最も適当には１０−１２分インキュベートした。インビボ使用のために調製するとき、スクロースまたはデキストロース０.５−５０％、適当には１−２０％、最も適当にはスクロースについて１０％よびデキストロースについて５％の最終濃度で添加し、および室温で１−３０分、適当には５−２５分、最も適当には１５−２０分インキュベートした。本複合体は、上記の方法を使用して１mg造影剤対０.３３−１.１７μg  ＴｆＲｓｃＦｖ対１０−３５μgリポソーム−ＨｏＫＣ(適当には１mg造影剤対０.５から１.０μg  ＴｆＲＳｃＦｖ対１４−２８μgリポソーム−ＨｏＫＣ、最も適当には１mg造影剤対０.７１μg  ＴｆＲｓｃＦｖ対２１μgリポソーム−ＨｏＫＣ)の比率で形成した。本複合体の許容されるサイズ範囲は約２０から１０００nm、適当には約５０から７００nmおよび最も好ましくは１００から５００nmである。ここで、本複合体を４.７mg Magnevist(登録商標)、９９μgリポソーム−ＨｏＫＣおよび３.３μg  ＴｆＲｓｃＦｖと、最終濃度５％のデキストロースを使用して形成させた。
【０１０６】
上記で誘発させたＣａＰａｎ−１正所性腫瘍担持マウス(腫瘍細胞の外科的移植約１２週後)を麻酔し、動物ホルダー系に置いた。イソフルランを４％で、６６％酸素および３０％一酸化二窒素混合物を含む残りのガスと共に使用して麻酔を誘導した。麻酔の維持は、上記の酸素および一酸化二窒素の類似ガス条件下の１.０から２.０％イソフルラン(好ましくは１.５％)により達成した。麻酔した動物を円筒可変放射周波数共鳴アンテナ(鳥かご共鳴器容量コイル)の内側に配置させ、約３００MHzの中心周波数にチューニングした(７テスラの磁界強度を対象としたとき水分子の中心共鳴周波数)。使用した造影プロトコールは、7TBruker BioSpin(Germany/USA)造影操作卓上で行ったＴ１強調Turbo RARE(急速増強を伴う急速獲得)３次元造影シークエンスであった。使用した造影パラメータは：Ｔ１強調Ｔｕｒｂｏ−ＲＡＲＥ  ３Ｄ(３次元)、ＴＥ  １３.３ms、ＴＲ  ２２９.５ms、Flipbackオン、８.０／３.５／３.５cmの視野を伴う４エコーおよび２５６×２５６×２５６マトリックスであった。基準画像獲得後、動物を動物ケースに固定化したままにし、ＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−ＨｏＫＣ−Ｍａｇ複合体(総容量５０−１０００μl、より好ましくは１００−５００μl、最も好ましくは２００−４００μl)を、動物の尾静脈への静脈内注射により２７Ｇ針を使用して全身投与し、３Ｄ造影シークエンスを直ぐに開始した。
【０１０７】
造影後、動物を殺し、転移の存在について視覚的に試験した。当業者に既知の標準法を使用して、肝臓を摘出し、ホルマリンに固定し、パラフィン包埋し、切断し、Ｈ＆Ｅを使用して染色した。切片を顕微鏡により試験し、観察された転移を撮像した。
【０１０８】
図１１Ａ−１１Ａ：図１１Ａ：プレ−コントラスト。図１１Ｂ：ＴｆＲｃＦｖ−Ｌｉｐ−ＨｏＫＣ−Ｍａｇ注射、図１１Ｃ：組織学。正所性膵臓癌はＴｆＲｃＦｖ−Ｌｉｐ−ＨｏＫＣ−Ｍａｇ(短白色矢印)で増強を示す。短白色矢印で示す２箇所は、より後方の切片で繋がっており、原発性で正所性に配置した腫瘍を示す。小転移(太い白色矢印)は、原発腫瘍で見られるのと同じパターンで増強される。肝臓の細い伸延部分(長くて太い矢印)は転移に隣接して存在する。剖検(示していない)および組織学(右画像)は、肝臓の長くて細い伸延部分に直接隣接した転移(黒色矢印)を示す。転移腫瘍の一つの形態とＭＲＩの観察との類似性参照。
【０１０９】
実施例５
ＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−Magnevistによる肺転移の増強された検出
以下の実験を行って、造影剤を担持する本発明の複合体を静脈内投与(または何らかの他の適当な経路、例えば、ＩＴ、ＩＤ、ＩＭ、ＩＰであるがこれに限定されない)したとき、本複合体を使用せずに造影剤を投与したときと比べて転移の検出を増強できることを証明した。肺腫瘍を雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、１から１０×１０４  ＲｅｎＣａ細胞の静脈内注射により誘発した。この方法は、ほとんど排他的に動物の肺に存在し、故に、原発または転移のいずれかとして肺腫瘍をもたらす何らかの他のタイプの癌のモデル系として働く転移をもたらす。約２−４週間後動物を造影のために使用した。
【０１１０】
カチオン性リポソーム(ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ)を、先に記載の通りエタノール注入法により調製した(その各々の開示を引用により本明細書に包含させる米国公開特許出願２００３／００４４４０７；Xu L, et al., Molecular Cancer Therapeutics 1:337-346 (2002)を参照のこと)。これらの試験に使用したターゲティング部分は抗トランスフェリン受容体一本鎖抗体フラグメント(ＴｆＲｓｃＦｖ)である。
【０１１１】
造影剤を封入するために、ＴｆＲｓｃＦｖをリポソームと特異的比率で混合し、室温で１−３０分、適当には５−２０分、最も適当には１０−１２分インキュベートした。Magnevist(登録商標)をこの溶液に添加し、混合し、再び室温で１−３０分、適当には５−２０分、最も適当には１０−１２分インキュベートした。インビボ使用のために調製するとき、スクロースまたはデキストロース０.５−５０％、適当には１−２０％、最も適当にはスクロースについて１０％よびデキストロースについて５％の最終濃度で添加し、室温で１−３０分、より適当には５−２５分、最も適当には１５−２０分インキュベートした。本複合体は、上記方法を使用して、１mg造影剤対０.３３−１.１７μg  ＴｆＲｓｃＦｖ対１０−３５μgリポソーム(適当には１mg造影剤対０.５から１.０μg  ＴｆＲＳｃＦｖ対１４−２８μgリポソーム、最も適当には１mg造影剤対０.７１μg  ＴｆＲｓｃＦｖ対２１μgリポソーム)の比率で形成した。本複合体の許容されるサイズ範囲は約２０から１０００nm、適当には約５０から７００nmおよび最も適当には約１００から５００nmであった。ここで、本複合体本複合体は、４.７mg Magnevist、９９μgリポソームおよび３.３μg  ＴｆＲｓｃＦｖと、最終濃度５％のデキストロースを使用して形成させた。
【０１１２】
上記で誘発した肺腫瘍を担持するマウスを麻酔し、動物ホルダー系に置いた。イソフルランを４％で、６６％酸素および３０％一酸化二窒素混合物を含む残りのガスと共に使用して麻酔を誘導した。麻酔の維持は、上記の酸素および一酸化二窒素の類似ガス条件下の１.０から２.０％イソフルラン(好ましくは１.５％)により達成した。麻酔した動物を円筒可変放射周波数共鳴アンテナ(鳥かご共鳴器容量コイル)の内側に配置させ、約３００MHzの中心周波数にチューニングした(７テスラの磁界強度を対象としたとき水分子の中心共鳴周波数)。使用した造影プロトコールは、7TBruker BioSpin(Germany/USA)造影操作卓上で行ったＴ１強調２次元Turbo Multislice-Multiecho造影シークエンスであった。使用した造影パラメータは：Ｔ１強調２Ｄ(２次元)、ＴＥ  １０.２１ms、ＴＲ  ４００ms、Flipbackオフ、３.８４×３.８４cmおよび２５６×２５６マトリックスの視野の８平均であった。基準画像獲得後、動物を動物ケースに固定したままにし、遊離(非複合体化)Magnevist(登録商標)(ｇａｄ−ｄ)または同量のＭａｇ(総容量５０−１０００μl、より適当には１００−５００μl、最も適当には２００−４００μl)を含むＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−Ｍａｇ複合体を、動物の尾静脈への静脈内注射により２７Ｇ針を使用して全身投与し、造影シークエンスを直ぐに開始した。画像のピクセル強度を測定し、プロットした。遊離および複合体の両方の造影のために同じマウスを使用した。本造影を連続した日に行った。
【０１１３】
図１２Ａ−１２Ｅに示す通り、遊離造影剤と比較して、本複合体の静脈内注射後に腫瘍における顕著に高いレベルのシグナルが存在する。故に、本発明の複合体はまた、遊離造影剤の投与の現在使用されている方法と比較して、肺における相対的に大きな転移の検出も増強する。
【０１１４】
実施例６
ＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−Magnevistによる小肺転移の増強された転移
以下の実験行って、造影剤を担持する本発明の複合体を静脈内投与(または何らかの他の適当な経路、例えば、ＩＴ、ＩＤ、ＩＭ、ＩＰであるがこれに限定されない)したとき、本複合体を使用せずに造影剤を投与したときには検出できない、非常に小さな転移を検出できることを証明した。肺腫瘍を１から１０×１０４  ＲｅｎＣａ細胞の静脈内注射により、雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスに誘発した。この方法は、ほとんど排他的に動物の肺に存在し、故に、原発または転移のいずれかとして肺腫瘍をもたらす何らかの他のタイプの癌のモデル系として働く転移をもたらす。約７−９日後動物を造影のために使用した。
【０１１５】
カチオン性リポソーム(ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ)を、先に記載の通りエタノール注入法により調製した(その各々の開示を引用により本明細書に包含させる米国公開特許出願２００３／００４４４０７；Xu L, et al., Molecular Cancer Therapeutics 1:337-346 (2002)を参照のこと)。これらの試験に使用したターゲティング部分は抗トランスフェリン受容体一本鎖抗体フラグメント(ＴｆＲｓｃＦｖ)である。
【０１１６】
造影剤を封入するために、ＴｆＲｓｃＦｖをリポソームと特異的比率で混合し、室温で１−３０分、適当には５−２０分、最も適当には１０−１２分インキュベートした。Magnevist(登録商標)をこの溶液に添加し、混合し、再び室温で１−３０分、適当には５−２０分、最も適当には１０−１２分インキュベートした。インビボ使用のために調製するとき、スクロースまたはデキストロース０.５−５０％、適当には１−２０％、最も適当にはスクロースについて１０％よびデキストロースについて５％の最終濃度で添加し、および室温で１−３０分、適当には５−２５分、最も適当には１５−２０分インキュベートした。本複合体は、上記の方法を使用して、１mg造影剤対０.３３−１.１７μg  ＴｆＲｓｃＦｖ対１０−３５μgリポソーム(適当には１mg造影剤対０.５から１.０μg  ＴｆＲＳｃＦｖ対１４−２８μgリポソーム、最も適当には１mg造影剤対０.７１μg  ＴｆＲｓｃＦｖ対２１μgリポソーム)の比率で形成される。本複合体の許容されるサイズ範囲は約２０から１０００nm、適当には約５０から７００nmおよび最も適当には約１００から５００nm。ここで、本複合体本複合体は、４.７mg Magnevist、９９μgリポソームおよび３.３μg  ＴｆＲｓｃＦｖと、最終濃度５％のデキストロースを使用して形成させた。
【０１１７】
上記で誘発した肺腫瘍を担持するマウスを麻酔し、動物ホルダー系に置いた。イソフルランを４％で、６６％酸素および３０％一酸化二窒素混合物を含む残りのガスと共に使用して麻酔を誘導した。麻酔の維持は、上記の酸素および一酸化二窒素の類似ガス条件下の１.０から２.０％イソフルラン(好ましくは１.５％)により達成した。麻酔した動物を円筒可変放射周波数共鳴アンテナ(鳥かご共鳴器容量コイル)の内側に配置させ、約３００MHzの中心周波数にチューニングした(７テスラの磁界強度を対象としたとき水分子の中心共鳴周波数)。使用した造影プロトコールは、7TBruker BioSpin(Germany/USA)造影操作卓上で行うＴ１強調２次元Turbo Multislice-Multiecho造影シークエンスであった。使用した造影パラメータは：Ｔ１強調２Ｄ(２次元)造影シークエンス、ＴＥ  １０.２１ms、ＴＲ  ５７２.９９ms、Flipbackオフ、２.５６×２.５６cmおよび２５６×２５６マトリックスの視野の８平均であった。基準画像獲得後、動物を動物ケースに固定したままにし、遊離(非複合体化)Magnevist(登録商標)(ｇａｄ−ｄ)または同量のＭａｇ(総容量５０−１０００μl、適当には１００−５００μl、最も適当には２００−４００μl)を含むＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−Ｍａｇ複合体を、動物の尾静脈への静脈内注射により２７Ｇ針を使用して全身投与し、造影シークエンスを直ぐに開始した。画像のピクセル強度を測定した。遊離および複合体の両方の造影のために同じマウスを使用した。本造影を連続した日に行った。この視野で５ピクセルがＣＴで検出される３mm  ヒト腫瘍とほぼ同等である。
【０１１８】
図１３Ａ−１３Ｄに示す通り、４ピクセルの転移(下部矢印)(直径約０.４mmの転移に相当)が本複合体注射後に検出可能であったが、遊離ｇａｄ−ｄの後には不可能であった。さらに、遊離ｇａｄ−ｄと比較して、第二のわずかに大きな転移(上部矢印)においてシグナルが顕著に増強された。故に、本発明の複合体はまた、遊離造影剤の投与の現在使用されている方法と比較して、肺における小転移の検出も増強する。約３ピクセル(直径約０.３mmの腫瘍に相当)のより小さな転移でさえまた本発明の複合体を使用して検出されたが、遊離ｇａｄ−ｄでは検出不可能であった(図１４Ａ−１４Ｄ)。
【０１１９】
上記と同じ腫瘍モデル系を用いて、本発明の複合体の静脈内注射後により小さなサイズの腫瘍が検出できる。ここで、使用した造影パラメータはまたＴ１強調２Ｄ(２次元)Mutltislice-Multiecho造影シークエンス、ＴＥ  １０.２１ms、同時にＴＲ＝６３０.８ms、Flipbackオフ、２.５６×２.５６cmおよび２５６×２５６マトリックスの視野の８平均であった。図１５Ａ−１５Ｂに示す通り、１−２ピクセルの孤在性小結節が本複合体により検出可能であった。孤在性小結節Ｎ１およびＮ２はＭＲＩスキャンで可視化された。それらが実際にバックグラウンドを越えるシグナルを発するかを決定するためには小さすぎるため(１−２ピクセル)、強度をImage Jソフトウエアを使用して測定し、最小、最大、平均値および標準偏差(ＳＤ)を２個の孤在性小結節について決定した。統計学的に、小結節の最大が基底の最大＋２ＳＤより大きいとき、小結節がノイズではなく、実際であるとの９５％信頼がある。小結節２は明らかにこの９５％信頼の範囲内であり、小結節１は丁度この限界であり、故にこれらは本複合体により増強された腫瘍塊でありそうである。造影後、当業者に既知の標準法を使用して、この動物から肺を摘出し、ホルマリンに固定し、パラフィン包埋し、切断し、Ｈ＆Ｅを使用して染色した。切片を顕微鏡により試験し、観察された転移を撮像した。図１６(低解像度、２×)および図１７(高解像度、１０×)に示す通り、約０.１mmの２個の腫瘍が、ＭＲＩに基づいて予測されるのと同じ葉および近い位置に見られた。２個の孤在性小結節の距離をＭＲＩ画像で測定し、組織学に基づいたものと等しい(〜６００nm)ことが判明した。故に、これらの非常に小さな組織学的に決定された腫瘍塊は、実際に、本発明の複合体を使用したＭＲＩで検出された孤在性小結節を示す。ここで見られた肺転移についての検出感受性のレベルは、肺の原発腫瘍および他の癌タイプに由来する肺転移の一般的に使用される検出法であるＣＴで現在見られるより高い。明らかに、これは予期されない、そして驚くべき結果を示す。
【０１２０】
実施例７
ＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−Magnevistによる胸膜下肺転移の検出
図１３および１４について上記実施例６において、上記した通りの腫瘍モデル系および造影パラメータを用いて、図１８Ａ−１８Ｆに示す通り、肺の胸膜下における転移を検出することも可能である。これは、現在の、実際には細胞に入らない非複合体化薬剤でのＭＲＩ造影がこの位置の転移を検出できないため、予期されず、そして驚きである。これは、肺および他のタイプの癌の早期検出および処置において顕著な利点を提供する。
【０１２１】
実施例８
ＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−Magnevistによる黒色腫肺転移の増強された検出
胸膜転移の検出／処置について、臨床コントロールは非常に達成が困難であり、利益の測定も困難である。本実施例に示す結果は、本発明の複合体が胸膜転移に到達し、トランスフェクトでき、故にそれらの治療に使用できることも示す。さらに、本発明の複合体は、このまたは何らかの他の治療の有効性を測定するために用いる造影ツールであろう。
【０１２２】
以下の実験を行って、静脈内投与(または何らかの他の適当な経路、例えば、ＩＴ、ＩＤ、ＩＭ、ＩＰであるがこれに限定されない)したとき、造影剤を担持する本発明の複合体が腎臓細胞癌腫からの転移に限定されない転移を検出できることを証明した。肺腫瘍を０.１から５×１０５  Ｂ１６／Ｆ１０  マウス黒色腫細胞の静脈内注射により雌Ｃ５７／Ｂｌ  ６マウスに誘発した。この方法は、ほとんど排他的に動物の肺に存在し、故に、原発または転移のいずれかとして肺腫瘍をもたらす何らかの他のタイプの癌のモデル系として働く転移をもたらす。約２−４週間後、動物を造影に使用した。
【０１２３】
カチオン性リポソーム(ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ)を、先に記載の通りエタノール注入法により調製した(その各々の開示を引用により本明細書に包含させる米国公開特許出願２００３／００４４４０７；Xu L, et al., Molecular Cancer Therapeutics 1:337-346 (2002)を参照のこと)。これらの試験に使用したターゲティング部分は抗トランスフェリン受容体一本鎖抗体フラグメント(ＴｆＲｓｃＦｖ)である。
【０１２４】
造影剤を封入するために、ＴｆＲｓｃＦｖをリポソームと特異的比率で混合し、室温で１−３０分、適当には５−２０分、最も適当には１０−１２分インキュベートした。Magnevist(登録商標)をこの溶液に添加し、混合し、再び室温で１−３０分、適当には５−２０分、最も適当には１０−１２分インキュベートした。インビボ使用のために調製するとき、スクロースまたはデキストロース０.５−５０％、適当には１−２０％、最も適当にはスクロースについて１０％よびデキストロースについて５％の最終濃度で添加し、および室温で１−３０分、適当には５−２５分、最も適当には１５−２０分インキュベートした。本複合体は、上記の方法を使用して、１mg造影剤対０.３３−１.１７μg  ＴｆＲｓｃＦｖ対１０−３５μgリポソーム(適当には１mg造影剤対０.５から１.０μg  ＴｆＲＳｃＦｖ対１４−２８μgリポソーム、最も適当には１mg造影剤対０.７１μg  ＴｆＲｓｃＦｖ対２１μgリポソーム)の比率で形成される。本複合体の許容されるサイズ範囲は約２０から１０００nm、適当には５０から７０nmおよび最も適当には１００から５００nm。ここで、本複合体本複合体は、４.７mg Magnevist、９９μgリポソームおよび３.３μg  ＴｆＲｓｃＦｖと、最終濃度５％のデキストロースを使用して形成させた。
【０１２５】
上記で誘発した肺腫瘍を担持するマウスを麻酔し、動物ホルダー系に置いた。イソフルランを４％で、６６％酸素および３０％一酸化二窒素混合物を含む残りのガスと共に使用して麻酔を誘導した。麻酔の維持は、上記の酸素および一酸化二窒素の類似ガス条件下の１.０から２.０％イソフルラン(好ましくは１.５％)により達成した。麻酔した動物を円筒可変放射周波数共鳴アンテナ(鳥かご共鳴器容量コイル)の内側に配置させ、約３００MHzの中心周波数にチューニングした(７テスラの磁界強度を対象としたとき水分子の中心共鳴周波数)。使用した造影プロトコールは、7TBruker BioSpin(Germany/USA)造影操作卓上で行うＴ１強調２次元Turbo Multislice-Multiecho造影シークエンスであった。使用した造影パラメータは：Ｔ１強調２Ｄ(２次元)造影シークエンス、ＴＥ  １０.２１ms、ＴＲ  １４１８.１３ms、Flipbackオフ、３.８４×３.８４cmおよび２５６×２５６マトリックスの視野の８平均であった。基準画像獲得後、動物を動物ケースに固定したままにし、遊離(非複合体化)Magnevist(登録商標)(ｇａｄ−ｄ)または同量のＭａｇ(総容量５０−１０００μl、適当には１００−５００μl、最も適当には２００−４００μl)を含むＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−Ｍａｇ複合体を、動物の尾静脈への静脈内注射により２７Ｇ針を使用して全身投与し、造影シークエンスを直ぐに開始した。画像のピクセル強度を測定した。遊離および複合体の両方の造影のために同じマウスを使用した。本造影を連続した日に行った。
【０１２６】
図１９Ａ−１９Ｂに示す通り、２個の小転移(矢印)が、本複合体化Magnevist(登録商標)(Ｍａｇ)の注射後に肺で検出された。本画像は、肺中の２種の異なるスライスを示す。
【０１２７】
上記と同一の腫瘍モデル系(Ｂ１６／Ｆ１０黒色腫)および造影パラメータを使用して、他の動物における転移のピクセル強度を、基準後、遊離Magnevist(登録商標)後およびＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−Ｍａｇ後にImage Jソフトウエアでの動的プロファイリングを使用して測定し、値を比較した。以下の表４に示す通り、本複合体は、基準値を超える最大の増強を示した。標準偏差は、複合体と基準値の間は有意であるが、遊離Magnevist(登録商標)と基準の間は有意ではないことを示す。
【表５】
0005478886.tif 000006
【０１２８】
参考文献
1. Gillies, R.J., et al., Neoplasia (New York) 2:139-451 (2000)
2. Degani, H., et al., Thrombosis & Haemostasis 89:25-33 (2003)
3. Xu, L., et al., Human Gene Therapy 10:2941-2952 (1999)
4. Xu, L., et al., Tumor Targeting 4:92-104 (1999)
5. Xu, L., et al., Molecular Medicine 7:723-734 (2001)
6. Xu L, et al., Molecular Cancer Therapeutics 1:337-346 (2002)
7. Rait, A., et al., Molecular Medicine 8:476-487 (2002)
8. Rait, A., et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 1002:1-12 (2003)
9. Cristiano, R.J., and Curiel, D.T., Cancer Gene Therapy 3:49-57 (1996)
10. Cheng, P.W., Human Gene Therapy 7:275-282 (1996)
11. Keer, H.N., et al., Journal of Urology 143:381-385 (1990)
12. Rossi, M.C., and Zetter, B.R., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89:6197-6201 (1992)
13. Elliott, R.L., et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 698:159-166 (1993)
14. Thorstensen, K., and Romslo, I., Scand. J. Clin. Lab. Investig. (Supp.) 215:113-120 (1993)
15. Miyamoto, T., et al., Int'l. J. Oral Maxillofacial Surg. 23:430-433 (1994)
16. Ponka, P. and Lok, C.N., Int'l. J. Biochem. Cell Biol. 31:1111-1137 (1999)
17. Haynes, B.F., et al., J. Immunol. 127:347-351 (1981)
18. Batra, J.K., et al., Molecular & Cellular Biology 11:2200-2205 (1991)
19. Jain, R.K. and Baxter, L.T., Cancer Res. 48:7022-7032 (1988)
20. Wolfert, M.A., et al., Human Gene Therapy 7:2123-2133 (1996)
21. Dunlap, D.D., et al., Nucleic Acids Research 25:3095-3101 (1997)
22. Kawaura, C., et al., FEBS Letters 421:69-72 (1998)
23. Choi, Y.H., et al., Human Gene Therapy 10:2657-2665 (1999)
24. Diebel, C.E., et al., Nature 406:299-302 (2000)
25. Rasa, M., et al., J. Coll. Interface Sci 250:303-315 (2002)
26. Yu, W., et al., Nucleic Acids Research, 32(5):e48(2004) 
27. Alisauskus, R., et al., Cancer Research 55:5743s-5748s (1995)
28. Foo, J.J., et al., Annals of Biomedical Engineering 31:1279-1286 (2003)
29. Xu, L, et al., Human Gene Therapy 13:469-481 (2002)
30. Freedman, M., et al., SPIE Medical Imaging: Physiology and Function from Multidimensional Images 4321:163-167 (2001)
31. Wisner, E.R., et al., Investigative Radiology 37:232-239 (2002)
32. Winter, P.M., et al., Circulation 108:2270-2274 (2003)
33. Morawski, A.M., et al., Magnetic Resonance in Medicine 51:480-486 (2004)
【０１２９】
本明細書中に記載の全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願が具体的にかつ個々に引用により包含されることが示されているのと同程度に、引用により本明細書に包含させる。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソーム−ＤＮＡナノ複合体によるＣａＰａｎ−１正所性転移モデルの腫瘍特異的ターゲティングを示す。１Ａにおいて矢印で示す肝臓中の同じ腫瘍小結節は、１Ｂにおいて強いβ−ガラクトシダーゼ発現を示す。１Ａ＝肉眼的剖検；１Ｂ＝β−ガラクトシダーゼについて染色後の組織。
【図２】図２Ａ−２Ｃは、ＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−Ｍａｇナノ複合体でトランスフェクションした後のＫ５６４細胞のインビトロＭＲ画像を示す。１Ａ＝時間依存的トランスフェクション。示す値は相対的強度である。１Ｂ＝は、複合体中に包含されるMagnevist(登録商標)の量による相対的強度の変化を示す(μl)。１Ｃ＝ＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−Ｍａｇ複合体対遊離Magnevist(登録商標)の比較。全ての図中の小さい丸は、サンプル位置のマーカーである。
【図３】図３Ａ−Ｉは、リガンド−リポソーム−Ｍａｇナノ複合体を使用した、２種の異なるモデルにおける改善されたＭＲ画像を示す。３Ａ、Ｄ、およびＧは、大きな膵臓正所性腫瘍(矢印)(腫瘍の外科的移植４ヶ月後)のＭＲＩシグナルにおけるｉ.ｖ.投与した遊離造影剤およびＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−Ｍａｇ複合体の間の差異を示す。３Ｂ、Ｅ、およびＨは、皮下膵臓腫瘍およびとかなり小さな腹部膵臓腫瘍(矢印)を有する第二のマウスにおける類似の効果を示す。３Ｃ、ＦおよびＩは、皮下前立腺腫瘍(矢印)を有する第三の動物での画像であり、同じ効果が明白である。
【図４】図４Ａ−Ｃは、Magnevist(登録商標)なしでの、リポソームのＳＰＭ相画像を示す。４Ａ、４Ｂおよび４Ｃに挙げる画像は、各々１.６８Ｖ、１.４５Ｖ、および１.３５Ｖの設定値で得た。不適合基質およびと機械的に対応するリポソームの間の対応する位相差は、−３.５°、＋８°、および＋４０°である。ＳＰＭチップとリポソームの相互作用は、設定値が変わるに連れて誘引性から反発まで変わる。
【図５】図５Ａ−Ｃは、リポソーム封入Magnevist(登録商標)(Ｌｉｐ＋Ｍａｇ)のＳＰＭおよびＳＥＭ画像を示す。５Ａは、リポソーム封入Magnevist(登録商標)粒子の原子間力顕微鏡法局所的画像である。ＳＰＭ相画像(設定値＝１.６)(５Ｂ)および１５keV  ＳＥＭ(ＴＥ)[転送方式電子検出器]画像(５Ｃ)は同様のコントラストを提供するが、完全に異なる相補的物理機構により産生される。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、ＴｆＲｓｃＦｖ＋Ｌｉｐ＋Ｍａｇナノ複合体のＳＰＭ形態学および相イメージングを示す。６Ａは、全ナノ複合体のｌ５keV  ＳＥＭ(ＴＥ)[転送方式電子検出器]画像である。６Ｂ＝その視野の低倍率画像である。四角に入っている領域が６Ａの画像である。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、２５nm高転置を使用したリフトモードのＳＰＭ形態学および磁気相画像の断面比較を示す。７Ａは、完全ＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−Ｍａｇナノ複合体のＳＰＭ形態学／磁気相画像である。誘引性および反発性面内磁気相互作用から成る７Ｂの二重双極子様シグナルの見かけは、この相互作用の原因が、ＳＥＭおよび非磁気ＳＰＭ相造影と一致して、ＮＤＳ内のMagnevistの不均一ドーナツ形分布であることを示唆する。
【図８】図８Ａ−８Ｈは、リガンド−ＨＫ−リポソーム−Ｍａｇナノ複合体を使用した２種のモードでの改善されたＭＲ造影を示す。ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−４３５(図８Ｅ−８Ｈ)およびヒト前立腺癌細胞株(ＤＵ１４５)(図８Ａ−８Ｄ)。
【図９】図９Ａ−Ｃは、ＴｆＲｓｃＦｖ−ＨＫ−リポソーム−Ｍａｇナノ複合体によるＣａＰａｎ−１皮下腫瘍および正所性転移モデルの腫瘍特異的ターゲティングを示す。
【図１０】図１０は、遊離Ｍａｇと比較して、膵臓癌腫モデルにおいて本発明の複合体により送達されたＭａｇを使用して、強度の増加を示す、動的ＭＲＩを示す。
【図１１】図１１Ａ−１１Ｃは、本発明のＭａｇ含有複合体による膵臓癌転移のＭＲ造影を示す。
【図１２】図１２Ａ−１２Ｅは、本発明のＭａｇ含有複合体による、肺転移のＭＲ造影の大きな増強を示す。
【図１３】図１３Ａ−１３Ｄは、本発明のＭａｇ含有複合体による腎臓細胞癌腫肺転移のＭＲ造影の大きな増強を示す。
【図１４】図１４Ａ−１４Ｄは、本発明のＭａｇ含有複合体による、小腎臓細胞癌腫肺転移のＭＲ造影による、大きな検出感受性を示す。
【図１５】図１５Ａ−１５Ｂは、本発明のＭａｇ含有複合体による非常に小さなＭＲ造影を示し、本発明の複合体の感受性を証明する。
【図１６】図１６は、本発明のＭａｇ含有複合体を使用したＭＲＩにより見られる検出／造影を確認する、転移組織の切片を示す。
【図１７】図１７は図１６の高倍率図を示す。
【図１８】図１８Ａ−１８Ｆは、本発明のＭａｇ含有複合体による、肺の胸膜下における転移のＭＲ造影を示す。
【図１９】図１９Ａ−１９Ｂは、本発明のＭａｇ含有複合体による、Ｂ１６／Ｆ１０黒色腫肺転移の検出を示す。
【図１】
0005478886.tif 000007
【図２】
0005478886.tif 000008
【図３】
0005478886.tif 000009
【図４】
0005478886.tif 000010
【図５Ａ】
0005478886.tif 000011
【図５Ｂ】
0005478886.tif 000012
【図５Ｃ】
0005478886.tif 000013
【図６Ａ】
0005478886.tif 000014
【図６Ｂ】
0005478886.tif 000015
【図７Ａ】
0005478886.tif 000016
【図７Ｂ】
0005478886.tif 000017
【図８−１】
0005478886.tif 000018
【図８−２】
0005478886.tif 000019
【図９】
0005478886.tif 000020
【図１０】
0005478886.tif 000021
【図１１】
0005478886.tif 000022
【図１２】
0005478886.tif 000023
【図１３】
0005478886.tif 000024
【図１４】
0005478886.tif 000025
【図１５】
0005478886.tif 000026
【図１６】
0005478886.tif 000027
【図１７】
0005478886.tif 000028
【図１８】
0005478886.tif 000029
【図１９】
0005478886.tif 000030
【配列表】
0005478886000001.app