(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多型を乳癌の表現型の発生についてヒトのリスクの指標とする方法であって、該方法が、
乳癌の表現型と関係がある多型またはそれと密接に連鎖している遺伝子座を該ヒト由来の生物学的サンプルにおいて検出する工程であって、該多型は、REFSNP_ID2981582（ＳＮＰ  ＩＤ  ２３１２１１６）によって同定される第１０染色体の位置123342307である、工程；および
該多型または遺伝子座を該表現型の発生のリスクと関連付ける工程であって、連鎖する該遺伝子座は、該多型から０．１ｃＭ以下にある、密接に連鎖した遺伝子座である、工程；
を含む、方法。
【請求項２】
前記ヒトが女性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記検出する工程が、前記多型、または連鎖した遺伝子座を増幅する工程、および生じたアンプリコンを検出する工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記増幅する工程が、
（ｉ）
ａ）前記多型または連鎖した遺伝子座と隣接している領域あるいは該多型または連鎖した遺伝子座を含む領域と相補的かまたは部分的に相補的であり、ポリメラーゼによる核酸鋳型に対する核酸重合を開始させることができる増幅プライマーまたは増幅プライマー対を、前記ヒトから単離した核酸鋳型と混合する工程；および
ｂ）該プライマーまたはプライマー対を、ポリメラーゼと該鋳型核酸とを含むＤＮＡ重合反応において伸長させて、前記アンプリコンを生成する工程；または
（ｉｉ）
該核酸をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）の鋳型として用いてＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲまたはＬＣＲを行う工程
を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アンプリコンが、該アンプリコンとアレイとのハイブリダイゼーション、制限酵素を用いた該アンプリコンの消化、またはリアルタイムＰＣＲ分析のうちの１つ以上を含む工程によって検出される、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記アンプリコンを部分的または完全に配列決定する工程を含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項７】
前記連鎖した遺伝子座が、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、
（ｉ）
複数の遺伝子において複数の多型または連鎖した遺伝子座を検出する工程；
（ｉｉ）
Ａ２ＢＰ１、ＴＮＲＣ９、Ｈ１９、およびＦＳＴＬ５のそれぞれにおいて少なくとも１つの多型を検出する工程；
（ｉｉｉ）
REFSNP_ID 1318703（ＳＮＰ  ＩＤ  １６２２５３０）によって同定される第１６染色体の位置7093693、REFSNP_ID12443621（ＳＮＰ  ＩＤ  ３７１２０１３）によって同定される第１６染色体の位置51105538、REFSNP_ID3857481（ＳＮＰ  ＩＤ  １５０９７１０）によって同定される第６染色体の位置87181288、およびREFSNP_ID889312（ＳＮＰ  ＩＤ  ８４３０２９）によって同定される第５染色体の位置56067641のそれぞれについて少なくとも１つの多型を検出する工程；または
（ｉｖ）
REFSNP_ID 1318703（ＳＮＰ  ＩＤ  １６２２５３０）によって同定される第１６染色体の位置7093693、REFSNP_ID12443621（ＳＮＰ  ＩＤ  ３７１２０１３）によって同定される第１６染色体の位置51105538、REFSNP_ID3857481（ＳＮＰ  ＩＤ  １５０９７１０）によって同定される第６染色体の位置87181288、REFSNP_ID 889312（ＳＮＰ  ＩＤ  ８４３０２９）によって同定される第５染色体の位置56067641、REFSNP_ID13281615（ＳＮＰ  ＩＤ  １９９０１２６）によって同定される第８染色体の位置128424800、REFSNP_ID2107425（ＳＮＰ  ＩＤ  ６０４８１９）によって同定される第１１染色体の位置1977651、REFSNP_ID 2314099（ＳＮＰ  ＩＤ  ３０２５７３４）によって同定される第４染色体の位置162587067、REFSNP_ID3817198（ＳＮＰ  ＩＤ  １１５２４９９）によって同定される第１１染色体の位置1865582、REFSNP_ID4666451（ＳＮＰ  ＩＤ  ４４１５９０９）によって同定される第２染色体の位置19208571、REFSNP_ID2049621（ＳＮＰ  ＩＤ  １７３２６８１）によって同定される第１１染色体の位置95067936、REFSNP_ID4841365（ＳＮＰ  ＩＤ  ４２８１５７９）によって同定される第８染色体の位置10425908、REFSNP_ID7313833（ＳＮＰ  ＩＤ  ４４５４４５７）によって同定される第１２染色体の位置27974463、REFSNP_ID981782（ＳＮＰ  ＩＤ  ２６１６１９９）によって同定される第５染色体の位置45321475、REFSNP_ID11235127（ＳＮＰ  ＩＤ  １７２０６９４）によって同定される第１１染色体の位置86766192、REFSNP_ID6463266（ＳＮＰ  ＩＤ  ４０７７７２３）によって同定される第７染色体の位置4926524、REFSNP_ID 8051542（ＳＮＰ  ＩＤ  ３７１１９９０）によって同定される第１６染色体の位置51091668、REFSNP_ID12658840（ＳＮＰ  ＩＤ  ３３３７８５８）によって同定される第５染色体の位置160251566、REFSNP_ID6469633（ＳＮＰ  ＩＤ  ４０９３０９５）によって同定される第８染色体の位置117205405、REFSNP_ID 7443644（ＳＮＰ  ＩＤ  ４２１３８２５）によって同定される第５染色体の位置29282566、REFSNP_ID3852789（ＳＮＰ  ＩＤ  ３４８８６１７）によって同定される第１６染色体の位置70786007、REFSNP_ID16998733（ＳＮＰ  ＩＤ  ３６１０２１０）によって同定される第４染色体の位置149695013、REFSNP_ID6843340（ＳＮＰ  ＩＤ  ３４５１２３９）によって同定される第４染色体の位置48460865、REFSNP_ID17157070（ＳＮＰ  ＩＤ  １５８２５３３）によって同定される第７染色体の位置108946886、REFSNP_ID13110927（ＳＮＰ  ＩＤ  ３４８８１５０）によって同定される第４染色体の位置169674258、REFSNP_ID30099（ＳＮＰ  ＩＤ  ２７７００５２）によって同定される第５染色体の位置52454339、REFSNP_ID 7307700（ＳＮＰ  ＩＤ  ４１４１３５１）によって同定される第１２染色体の位置124113077、REFSNP_ID4954956（ＳＮＰ  ＩＤ  １３３５０３０）によって同定される第２染色体の位置139378309、REFSNP_ID10508468（ＳＮＰ  ＩＤ  ２２１１６６５）によって同定される第１０染色体の位置13958759、およびREFSNP_ID2298075（ＳＮＰ  ＩＤ  ４５３８４１８）によって同定される第１０染色体の位置102237398のそれぞれについて少なくとも１つの多型を検出するか、またはＡ２ＢＰ１、ＴＮＲＣ９、Ｈ１９、ＦＳＴＬ５、ＬＳＰ１、ＬＯＣ３８８９２７、ＵＮＱ９３９１、ＨＣＮ１、ＬＯＣ４４１１９２、ＴＮＲＣ９、ＮＲ３Ｃ２、ＫＩＡＡ０８２６、ＦＬＪ３１０３３、ＡＡＣＳ、ＦＲＭＤ４ＡおよびＳＥＣ３１Ｌ２のそれぞれにおいて少なくとも１つの多型を検出する工程
をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記多型または連鎖した遺伝子座を前記乳癌の表現型の発生のリスクと関連付ける工程が、該多型または連鎖した遺伝子座の対立遺伝子および該乳癌の表現型の発生のリスクに関する相関関係情報を含む索引表を参照する工程を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
REFSNP_ID 2981582（ＳＮＰ  ＩＤ  ２３１２１１６）によって同定される第１０染色体の位置123342307、REFSNP_ID1318703（ＳＮＰ  ＩＤ  １６２２５３０）によって同定される第１６染色体の位置7096393、REFSNP_ID12443621（ＳＮＰ  ＩＤ  ３７１２０１３）によって同定される第１６染色体の位置51105538、REFSNP_ID3857481（ＳＮＰ  ＩＤ  １５０９７１０）によって同定される第６染色体の位置87181288、REFSNP_ID 889312（ＳＮＰ  ＩＤ  ８４３０２９）によって同定される第５染色体の位置56067641、REFSNP_ID13281615（ＳＮＰ  ＩＤ  １９９０１２６）によって同定される第８染色体の位置128424800、REFSNP_ID2107425（ＳＮＰ  ＩＤ  ６０４８１９）によって同定される第１１染色体の位置1988651、REFSNP_ID 2314099（ＳＮＰ  ＩＤ  ３０２５７３４）によって同定される第４染色体の位置162587067、REFSNP_ID3817198（ＳＮＰ  ＩＤ  １１５２４９９）によって同定される第１１染色体の位置1865582、REFSNP_ID4666451（ＳＮＰ  ＩＤ  ４４１５９０９）によって同定される第２染色体の位置19208571、REFSNP_ID2049621（ＳＮＰ  ＩＤ  １７３２６８１）によって同定される第１１染色体の位置95067936、REFSNP_ID4841365（ＳＮＰ  ＩＤ  ４２８１５７９）によって同定される第８染色体の位置10425908、REFSNP_ID 7313833（ＳＮＰ  ＩＤ  ４４５４４５７）によって同定される第１２染色体の位置27974463、REFSNP_ID981782（ＳＮＰ  ＩＤ  ２６１６１９９）によって同定される第５染色体の位置45321475、REFSNP_ID11235127（ＳＮＰ  ＩＤ  １７２０６９４）によって同定される第１１染色体の位置86766192、REFSNP_ID6463266（ＳＮＰ  ＩＤ  ４０７７７２３）によって同定される第７染色体の位置4926524、REFSNP_ID 8051542（ＳＮＰ  ＩＤ  ３７１１９９０）によって同定される第１６染色体の位置51091668、REFSNP_ID12658840（ＳＮＰ  ＩＤ  ３３３７８５８）によって同定される第５染色体の位置160251566、REFSNP_ID6469633（ＳＮＰ  ＩＤ  ４０９３０９５）によって同定される第８染色体の位置117205405、REFSNP_ID 7443644（ＳＮＰ  ＩＤ  ４２１３８２５）によって同定される第５染色体の位置29282566、REFSNP_ID3852789（ＳＮＰ  ＩＤ  ３４８８６１７）によって同定される第１６染色体の位置70786007、REFSNP_ID16998733（ＳＮＰ  ＩＤ  ３６１０２１０）によって同定される第４染色体の位置149695013、REFSNP_ID6843340（ＳＮＰ  ＩＤ  ３４５１２３９）によって同定される第４染色体の位置48460865、REFSNP_ID17157070（ＳＮＰ  ＩＤ  １５８２５３３）によって同定される第７染色体の位置108946886、REFSNP_ID13110927（ＳＮＰ  ＩＤ  ３４８８１５０）によって同定される第４染色体の位置169674258、REFSNP_ID30099（ＳＮＰ  ＩＤ  ２７７００５２）によって同定される第５染色体の位置52454339、REFSNP_ID 7307700（ＳＮＰ  ＩＤ  ４１４１３５１）によって同定される第１２染色体の位置124113077、REFSNP_ID4954956（ＳＮＰ  ＩＤ  １３３５０３０）によって同定される第２染色体の位置139378309、REFSNP_ID10508468（ＳＮＰ  ＩＤ  ２２１１６６５）によって同定される第１０染色体の位置13958759、およびREFSNP_ID2298075（ＳＮＰ  ＩＤ  ４５３８４１８）によって同定される第１０染色体の位置102237398から選択される複数の多型を検出または増幅する、複数のマーカープローブまたは増幅プライマーを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法において用いるための組成物であって、該組成物は、REFSNP_ID2981582（ＳＮＰ  ＩＤ  ２３���２１１６）によって同定される第１０染色体の位置123342307を検出または増幅するマーカープローブまたは増幅プライマーを少なくとも含む、組成物。
【請求項１１】
前記マーカープローブまたは増幅プライマーが、溶液中で遊離している、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
乳癌の表現型の発生についてヒトのリスクを同定するためのシステムであって、
ａ）REFSNP_ID 2981582（ＳＮＰ  ＩＤ  ２３１２１１６）によって同定される第１０染色体の位置123342307である多型または連鎖した遺伝子座のうちの１つの対立遺伝子を検出するように構成されたマーカープローブまたはプライマーのセットであって、連鎖した該遺伝子座は、該多型から０．１ｃＭ以下にある、密接に連鎖した遺伝子座である、マーカープローブまたはプライマーのセット；
ｂ）該マーカープローブまたはプライマーのセットからの１つ以上のシグナル出力、あるいはマーカープローブまたはプライマーのセットから生成されたアンプリコンを検出し、それによって該対立遺伝子の存在または不在を同定するように構成された検出器；および
ｃ）対立遺伝子の存在または不在と予想表現型とを関連付けるシステム指示書；
を含む、システム。
【請求項１３】
（ｉ）前記マーカープローブまたはプライマーのセットが、Ａ２ＢＰ１、ＴＮＲＣ９、Ｈ１９、ＦＳＴＬ５、ＬＳＰ１、ＬＯＣ３８８９２７、ＵＮＱ９３９１、ＨＣＮ１、ＬＯＣ４４１１９２、ＴＮＲＣ９、ＮＲ３Ｃ２、ＫＩＡＡ０８２６、ＦＬＪ３１０３３、ＡＡＣＳ、ＦＲＭＤ４ＡおよびＳＥＣ３１Ｌ２からなる群から選択される遺伝子において多型をさらに検出するか；
（ｉｉ）該マーカープローブまたはプライマーのセットが、複数の遺伝子または遺伝子座において複数の多型を検出するか；
（ｉｉｉ）該マーカープローブまたはプライマーのセットが、Ａ２ＢＰ１、ＴＮＲＣ９、Ｈ１９、およびＦＳＴＬ５のそれぞれにおいて少なくとも１つの多型をさらに検出するか、または
（ｉｖ）該マーカープローブまたはプライマーのセットが、REFSNP_ID 1318703（ＳＮＰ  ＩＤ  １６２２５３０）によって同定される第１６染色体の位置7093693、REFSNP_ID12443621（ＳＮＰ  ＩＤ  ３７１２０１３）によって同定される第１６染色体の位置51105538、REFSNP_ID3857481（ＳＮＰ  ＩＤ  １５０９７１０）によって同定される第６染色体の位置87181288、およびREFSNP_ID889312（ＳＮＰ  ＩＤ  ８４３０２９）によって同定される第５染色体の位置56067641の多型から選択される少なくとも１つの多型をさらに検出する、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
（ｉ）前記検出器が、１つ以上の発光を検出し、かつ、該発光が、前記対立遺伝子の存在または不在を示すか、および／または
（ｉｉ）前記指示書が、前記対立遺伝子の存在または不在と表現型との間の相関関係を含む少なくとも１つの索引表を含む、請求項１２または１３に記載のシステム。
【請求項１５】
多型を用いて、乳癌の表現型を処置する能力について試験される薬剤の臨床試験においてヒト個体を階層化する方法であって、該方法が、
（ｉ）乳癌の表現型と関係がある多型またはそれと密接に連鎖している遺伝子座を該ヒト由来の生物学的サンプルにおいて検出する工程であって、該多型は、REFSNP_ID2981582（ＳＮＰ  ＩＤ  ２３１２１１６）によって同定される第１０染色体の位置123342307である、工程；および
（ｉｉ）工程（ｉ）の結果に基づいて、該臨床試験における個体を階層化する工程であって、該連鎖している遺伝子座は該多型から０．１ｃＭ以下にある、密接に連鎖する遺伝子座である、工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
本願は、ＣｏｘらによるＵＳＳＮ  ６０／７４０，９７１  ＭＡＲＫＥＲＳ  ＦＯＲ  ＢＲＥＡＳＴ  ＣＡＮＣＥＲ（２００５年１１月２９日出願）に基づく優先権および利益を主張する。本願はまた、ＣｏｘらによるＵＳＳＮ  ６０／７８１，４８３  ＭＡＲＫＥＲＳ  ＦＯＲ  ＢＲＥＡＳＴ  ＣＡＮＣＥＲ（２００６年３月１０日出願）に基づく優先権および利益を主張する。先のこれらの出願の各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
乳癌は、他の一般的な癌と同様に、家族集積性を示す。多数の疫学的試験は、この疾患は概して、乳癌患者の第一度近親において約２倍一般的であることを実証している（非特許文献１）。家族の試験、および特に双子の試験は、全てではないが大部分のこの集積性は遺伝的根拠を有することを示唆する（非特許文献２、非特許文献３）。例えばＰｅｔｏおよびＭａｃｋ（非特許文献３）は、罹患した女性のＭＺ双子における乳癌のリスクは、姉妹の場合に対するリスクの約４倍を超えたと推定した。
【０００３】
幾つかの乳癌易罹患性遺伝子が既に同定されており、最も重要なのはＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２である。これらの遺伝子の突然変異は、乳癌の高いリスクを与える（７０才までそれぞれ約６５％および４５％）（非特許文献４）。集団に基づく一連の乳癌症例の突然変異スクリーニングは、乳癌の家族性リスクの約１５％のみが、これらの遺伝子の突然変異によって説明することができることを示している（非特許文献５、非特許文献６）。他の知られている乳癌易罹患性遺伝子（ＴＰ５３、ＰＴＥＮ、ＡＴＭ、ＣＨＥＫ２）は、（素因による突然変異は稀でありかつ／あるいはわずかなリスクのみを与えるので）家族性リスクにわずかにのみに頁献する。したがって全体としては、知られている乳癌易罹患性遺伝子は、家族性リスクの２０％を超えない割合を占めると推定されている（非特許文献７）。
【０００４】
リスクの遺伝的変異は、稀である浸透率の高い突然変異（ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２の突然変異など）、またはより適度なリスクを与える変異が原因である可能性がある。幾つかの系の証拠は、浸透率の高い突然変異が乳癌の残りの家族性リスクに対する主な原因ではないことを強く示唆する。第一に、多数の症例の家族の突然変異スクリーニングは、非常に強烈な家族性病歴（例えば、４人以上の罹患した近親者）を有する大部分の症例は、ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２の突然変異を有することを見出している（非特許文献８）。第二に、過去９年間にわたる徹底的な努力にもかかわらず、遺伝子連鎖の研究は、如何なる他の連鎖した遺伝子座も同定していない（非特許文献９、非特許文献１０）。第三に、多系の乳癌家族の分離分析は、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２を調節した後、他の主な優性乳癌易罹患性対立遺伝子に関する証拠が存在しなかったことを見出している（非特許文献１１、非特許文献１２）。最大のこのような分析において、Ａｎｔｏｎｉｏｕら（非特許文献１３）は、乳癌の最も極端なモデルは、倍数的に組み合わせた影響の小さい多数の遺伝子座と同等な多遺伝子モデルであったことを見出している。
【非特許文献１】Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐ  ｉｎ  Ｈｏｒｍｏｎａｌ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  （２００１）  Ｆａｍｉｌｉａｌ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：  ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  ｒｅａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｄａｔａ  ｆｒｏｍ  ５２  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ５８，２０９  ｗｏｍｅｎ  ｗｉｔｈ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  １０１，９８６  ｗｏｍｅｎ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｔｈｅ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｌａｎｃｅｔ  ３５８：１３８９−１３９９
【非特許文献２】Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ  （２０００）  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  ｈｅｒｉｔａｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃａｕｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ−ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ｃｏｈｏｒｔｓ  ｏｆ  ｔｗｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｓｗｅｄｅｎ，  Ｄｅｎｍａｒｋ，  ａｎｄ  Ｆｉｎｌａｎｄ．  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２４３：７８−８５
【非特許文献３】Ｐｅｔｏ  Ｊ，  Ｍａｃｋ  ＴＭ  （２０００）  Ｈｉｇｈ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｉｎ  ｔｗｉｎｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｒｅｌａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｗｏｍｅｎ  ｗｉｔｈ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ  ２６：４１１−４１４
【非特許文献４】Ａｎｔｏｎｉｏｕ  Ａ  ｅｔ  ａｌ  （２００３）  Ａｖｅｒａｇｅ  ｒｉｓｋｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ａｎｄ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＢＲＣＡｌ  ｏｒ  ＢＲＣＡ２  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｉｎ  ｃａｓｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ｕｎｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｆｏｒ  ｆａｍｉｌｙ  ｈｉｓｔｏｒｙ：  ａ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ２２  ｓｔｕｄｉｅｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ７２：１１１７−１１３０
【非特許文献５】Ｐｅｔｏ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ  （１９８９）  Ｔｈｅ  ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ＢＲＣＡｌ  ａｎｄ  ＢＲＣＡ２  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｍｏｎｇｓｔ  ｅａｒｌｙ  ｏｎｓｅｔ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃａｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｋ．  Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ９１：９４３−９４９
【非特許文献６】Ｔｈｅ  Ａｎｇｌｉａｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ  （２０００）  Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ＢＲＣＡｌ  ａｎｄ  ＢＲＣＡ２  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃａｓｅｓ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８３：１３０１−  １３０８
【非特許文献７】Ｅａｓｔｏｎ  ＤＦ  （１９９９）  Ｈｏｗ  ｍａｎｙ  ｍｏｒｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｇｅｎｅｓ  ａｒｅ  ｔｈｅｒｅ？  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １：１−４
【非特許文献８】Ｆｏｒｄ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ  （１９９８）  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ａｎｄ  Ｐｅｎｅｔｒａｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＢＲＣＡｌ  ａｎｄ  ＢＲＣＡ２  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｆａｍｉｌｉｅｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６２：３３４−３４５
【非特許文献９】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ  （２００２）  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ＢＲＣＡ３  ｌｏｃｕｓ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １３ｑ２１  ｉｎ  １２８  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃａｓｅ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｉｎｋａｇｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：８２７−８３１
【非特許文献１０】Ｈｕｕｓｋｏ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ  （２００３）  Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｉｎ  Ｆｉｎｎｉｓｈ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｆａｍｉｌｉｅｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ，  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ
【非特許文献１１】Ａｎｔｏｎｉｏｕ  ＡＣ  ｅｔ  ａｌ  （２００１）  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｆｕｒｔｈｅｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｔｏ  ＢＲＣＡｌ  ａｎｄ  ＢＲＣＡ２  ｉｎ  ａ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ｓｔｕｄｙ．  Ｇｅｎｅｔ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  ２１：１−１８
【非特許文献１２】Ｃｕｉ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ  （２０００）  Ａｆｔｅｒ  ＢＲＣＡｌ  ａｎｄ  ＢＲＣＡ２  −  ｗｈａｔ  ｎｅｘｔ？  Ｍｕｌｔｉｆａｃｔｏｒｉａｌ  ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｌ，  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  ｆｅｍａｌｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｆａｍｉｌｉｅｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６８：４２０−４３１
【非特許文献１３】Ａｎｔｏｎｉｏｕ  ＡＣ  ｅｔ  ａｌ  （２００２）  Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｆａｍｉｌｉａｌ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ＢＲ  ＣＡｌ，  ＢＲＣＡ２  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｇｅｎｅｓ．  Ｂｒｉｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８６：７６−８３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前述の分析が、幾つかの浸透率の低い乳癌易罹患性遺伝子が依然検出されていることを示唆する一方で、このような遺伝子の正確な数は知られていない。さらに、従来技術では、このような易罹患性対立遺伝子は集団中で一般的であるかあるいは稀であるか明らかでない。本出願は比較的一般的である（頻度が５％を超える）対立遺伝子に焦点を当て、このような遺伝子座の同定は本明細書ではゲノム全般規模で実施する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、乳癌の表現型、乳癌に対する易罹患性などと関係がある多型遺伝子座の同定を含む。図１および２は、表現型の遺伝子座の記載を提供する。図１は、好ましい表現型の遺伝子座の記載を提供する。したがって本発明は、以前に知られていなかった様々な多型と乳癌易罹患性の表現型との間の相関関係を提供する。したがって、これらの多型（またはそれと連鎖した遺伝子座）の検出は、乳癌のリスクがある患者を同定するための確実かつ正確な方法およびシステムを提供する。さらに、これらの多型の同定は、乳癌のモジュレーターを同定するための高スループットのシステムおよび方法を提供する。
【０００７】
したがって、一態様において本発明は、生物またはそれに由来する生物学的サンプルについて乳癌の表現型を同定する方法を提供する。この方法は、多型またはそれと密接に連鎖している遺伝子座を生物または生物学的サンプルにおいて検出することを含み、この多型は、図１の多型から選択され、乳癌の表現型と関係がある。この方法は、多型または遺伝子座を表現型と関連付けることをさらに含む。
【０００８】
生物は典型的には哺乳類であり、好ましくはヒト患者、最も典型的にはヒト女性患者である（しかし、乳癌は現に男性において発生し、本明細書に記す関係は男性患者にも適用することができる）。同様に、生物学的サンプルは典型的には、例えば適切なインフォームドコンセントの実施後の、哺乳類、例えばヒト患者に由来する。この方法を使用して、ヒト患者から採取したサンプルにおいて乳癌マーカーを検出することができ、またはこの方法を使用して、それに由来する生物学的サンプル（例えば、初代および培養細胞を含めた細胞）においてマーカーを検出することができる。
【０００９】
多型は、増幅、プローブまたはアレイとのハイブリダイゼーションなどを含めた任意の利用可能な方法によって検出することができる。特定の一実施形態では、検出することは、多型、連鎖した遺伝子座または遺伝子座と関係がある配列（例えば隣接配列、転写配列など）を増幅すること、および生じたアンプリコンを検出することを含む。例えば、一実施形態では、増幅することは、ａ）増幅プライマーまたは増幅プライマー対を、生物または生物学的サンプルから単離した核酸鋳型と混合することを含む。プライマーまたはプライマー対は、多型または連鎖した遺伝子座と隣接している領域あるいは多型または連鎖した遺伝子座を含む領域と相補的または部分相補的であってよく、ポリメラーゼによる核酸鋳型に対する核酸重合を開始させることができる。プライマーまたはプライマー対は、ポリメラーゼと鋳型核酸とを含むＤＮＡ重合反応において伸長させて、アンプリコンを生成する。幾つかの態様では、アンプリコンは、アンプリコンとアレイとのハイブリダイゼーション、制限酵素を用いたアンプリコンの消化、またはリアルタイムＰＣＲ分析を含む方法によって場合によっては検出される。場合によっては、アンプリコンは、例えばハイブリダイゼーションによって完全または部分的に配列決定することができる。典型的には増幅することは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を、生物または生物学的サンプルから単離した核酸をこのＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、またはＬＣＲにおける鋳型として使用して実施することを含むことができる。他の技術、例えば分岐状ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）プローブの使用を増幅の代用にすることができる。
【００１０】
典型的な実施形態では、多型または連鎖した遺伝子座はＳＮＰを含み得る。例示的な対立遺伝子は、図１および／または２中に記載した対立遺伝子を含む。関連多型は、例えば図１（最も好ましい）または図２の多型であってよい。好ましい多型は、ＳＮＰ  ＩＤ  ２３１２１１６、ＳＮＰ  ＩＤ  １６２２５３０、ＳＮＰ  ＩＤ  ３７１２０１３、ＳＮＰ  ＩＤ  １５０９７１０、ＳＮＰ  ＩＤ  ８４３０２９、ＳＮＰ  ＩＤ  １９９０１２６、ＳＮＰ  ＩＤ  ６０４８１９、ＳＮＰ  ＩＤ  ３０２５７３４、ＳＮＰ  ＩＤ  １１５２４９９、ＳＮＰ  ＩＤ  ４４１５９０９、ＳＮＰ  ＩＤ  １７３２６８１、ＳＮＰ  ＩＤ  ４２８１５７９、ＳＮＰ  ＩＤ  ４４５４４５７、ＳＮＰ  ＩＤ  ２６１６１９９、ＳＮＰ  ＩＤ  １７２０６９４、ＳＮＰ  ＩＤ  ４０７７７２３、ＳＮＰ  ＩＤ  ３７１１９９０、ＳＮＰ  ＩＤ  ３３３７８５８、ＳＮＰ  ＩＤ  ４０９３０９５、ＳＮＰ  ＩＤ  ４２１３８２５、ＳＮＰ  ＩＤ  ３４８８６１７、ＳＮＰ  ＩＤ  ３６１０２１０、ＳＮＰ  ＩＤ  ３４５１２３９、ＳＮＰ  ＩＤ  １５８２５３３、ＳＮＰ  ＩＤ  ３４８８１５０、ＳＮＰ  ＩＤ  ２７７００５２、ＳＮＰ  ＩＤ  ４１４１３５１、ＳＮＰ  ＩＤ  １３３５０３０、ＳＮＰ  ＩＤ  ２２１１６６５、およびＳＮＰ  ＩＤ  ４５３８４１８からなるＳＮＰ識別番号によって記載されるＳＮＰの群から選択されるＳＮＰを含む。これらの識別番号はＰｅｒｌｅｇｅｎのＳＮＰ識別番号であり（Ｐｅｒｌｅｇｅｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．ｉｎ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、これらは公に入手可能であり、ｇｅｎｏｍｅ（ｄｏｔ）ｐｅｒｌｅｇｅｎ（ｄｏｔ）ｃｏｍ／／ｂｒｏｗｓｅｒ／ｉｎｄｅｘ（ｄｏｔ）ｈｔｍｌ．で、この会社の利用可能なゲノムブラウザを使用することによって、Ｐｅｒｌｅｇｅｎ（ドット）コムにおける多量の関連情報によって見ることができる。例えば与えられる完全な指示書に従い、ワイルドカード文字（例えば「＊」記号）をＳＮＰ＿ＩＤの始めに加えて、ＳＮＰの全対立遺伝子に関する関連情報を識別することができる。このデータベースはＮＣＢＩゲノムデータベースとも関係があり、したがって関連遺伝子および多型に関する多量の他の情報を与える。これらのＳＮＰは、例えば以下の遺伝子：ＦＧＦＲ２、Ａ２ＢＰ１、ＴＮＲＣ９、Ｈ１９、ＦＳＴＬ５、ＬＳＰ１、ＬＯＣ３８８９２７、ＵＮＱ９３９１、ＨＣＮ１、ＬＯＣ４４１１９２、ＴＮＲＣ９、ＮＲ３Ｃ２、ＫＩＡＡ０８２６、ＦＬＪ３１０３３、ＡＡＣＳ、ＦＲＭＤ４ＡおよびＳＥＣ３１Ｌ２と関係があるＳＮＰを含む（図１も参照）。したがって、これらの遺伝子と関係がある多型も、乳癌の多型と関係し得る好ましいＳＮＰである。
【００１１】
場合によっては、および、幾つかの実施形態では、好ましくは、この方法は、２つ以上のこのような遺伝子において多型を検出することを含む（例えば、幾つかの好都合な適用例では、一患者の幾つかの多型を同時に検出して、関連表現型をより完全に決定または割り当てすることができる）。したがって、一態様では、この方法は、複数の前記遺伝子において複数の多型または連鎖した遺伝子座を検出することを含む。これは例えば、ＳＮＰ  ＩＤ  ２３１２１１６、ＳＮＰ  ＩＤ  １６２２５３０、ＳＮＰ  ＩＤ  ３７１２０１３、ＳＮＰ  ＩＤ  １５０９７１０およびＳＮＰ  ＩＤ  ８４３０２のそれぞれについて少なくとも１つの多型を検出し、そして／またはＦＧＦＲ２、Ａ２ＢＰ１、ＴＮＲＣ９、Ｈ１９、およびＦＳＴＬ５において多型を検出することを含むことができる。同様に、この方法は、ＳＮＰ  ＩＤ  ２３１２１１６、ＳＮＰ  ＩＤ  １６２２５３０、ＳＮＰ  ＩＤ  ３７１２０１３、ＳＮＰ  ＩＤ  １５０９７１０、ＳＮＰ  ＩＤ  ８４３０２９、ＳＮＰ  ＩＤ  １９９０１２６、ＳＮＰ  ＩＤ  ６０４８１９、ＳＮＰ  ＩＤ  ３０２５７３４、ＳＮＰ  ＩＤ  １１５２４９９、ＳＮＰ  ＩＤ  ４４１５９０９、ＳＮＰ  ＩＤ  １７３２６８１、ＳＮＰ  ＩＤ  ４２８１５７９、ＳＮＰ  ＩＤ  ４４５４４５７、ＳＮＰ  ＩＤ  ２６１６１９９、ＳＮＰ  ＩＤ  １７２０６９４、ＳＮＰ  ＩＤ  ４０７７７２３、ＳＮＰ  ＩＤ  ３７１１９９０、ＳＮＰ  ＩＤ  ３３３７８５８、ＳＮＰ  ＩＤ  ４０９３０９５、ＳＮＰ  ＩＤ  ４２１３８２５、ＳＮＰ  ＩＤ  ３４８８６１７、ＳＮＰ  ＩＤ  ３６１０２１０、ＳＮＰ  ＩＤ  ３４５１２３９、ＳＮＰ  ＩＤ  １５８２５３３、ＳＮＰ  ＩＤ  ３４８８１５０、ＳＮＰ  ＩＤ  ２７７００５２、ＳＮＰ  ＩＤ  ４１４１３５１、ＳＮＰ  ＩＤ  １３３５０３０、ＳＮＰ  ＩＤ  ２２１１６６５、およびＳＮＰ  ＩＤ  ４５３８４１８のそれぞれについて少なくとも１つの多型を検出するか、またはＦＧＦＲ２、Ａ２ＢＰ１、ＴＮＲＣ９、Ｈ１９、ＦＳＴＬ５、ＬＳＰ１、ＬＯＣ３８８９２７、ＵＮＱ９３９１、ＨＣＮ１、ＬＯＣ４４１１９２、ＴＮＲＣ９、ＮＲ３Ｃ２、ＫＩＡＡ０８２６、ＦＬＪ３１０３３、ＡＡＣＳ、ＦＲＭＤ４ＡおよびＳＥＣ３１Ｌ２のそれぞれにおいて少なくとも１つの多型を検出することを含むことができる。一般に、本明細書の図面中のこれらまたは任意の他の多型／遺伝子／遺伝子座の任意の組合せを検出することができ、全てのこのような組合せは、明確に列挙されていようとなかろうと、場合によっては本発明の特徴である。本明細書の多型を検出する際に有用な本発明のプローブまたはプライマーは、図１および／または２の多型のヌクレオチド配列、その隣接配列、またはその相補的核酸、またはその転写産物（例えば転写またはスプライシングによってゲノム配列から生じた、例えばｎＲＮＡまたはｍＲＮＡ形）を含むことができる。多型は、ポリペプチド配列において、例えば核酸の所与の対立遺伝子形から転写された任意のポリペプチド配列に関して検出することもできる。
【００１２】
一般に、ＱＴＬと連鎖する任意の多型をＱＴＬのマーカーとして使用することができる。したがって、図面の所与の多型と連鎖するマーカーを、その所与の多型の代理マーカーとして使用することができる。一般に、連鎖が密接であるほど、ＱＴＬ／多型の良いマーカーであるはずである。したがって、連鎖した遺伝子座は、多型から約５ｃＭ以下（および場合によっては１ｃＭ以下）である密接に連鎖した遺伝子座であり得ることが望ましい。
【００１３】
この方法は、多型または連鎖した遺伝子座の対立遺伝子および乳癌の表現型に関する相関関係情報を含む索引表を参照することによって、多型または連鎖した遺伝子座を乳癌の表現型と関連付けることを場合によっては含む。この相関関係に使用するデータベースは経験則によるものであってよく、あるいは他の場合は、マーカー形質情報を関連付けることによって得た情報に基づいて相関関係を改良することができる。
【００１４】
関連組成物、例えば本明細書に記載したように乳癌の表現型と関係がある複数の多型を検出または増幅する、例えば複数のマーカープローブまたは増幅プライマーを含む組成物は本発明の特徴である。プライマー／プローブはアレイベースであるか、あるいは溶液中で遊離状態であってよい。
【００１５】
別の態様では、乳癌の表現型のモジュレーターを同定する方法も提供する。この方法は、潜在的モジュレーターを、例えば本明細書（例えば、図１および／または２）に記載の多型を含むかまたはそれと密接に連鎖している遺伝子または遺伝子産物と接触させることを含む。遺伝子または遺伝子産物に対する潜在的モジュレーターの影響を検出し、それによって潜在的モジュレーターが表現型を調節するか否かを同定する。
【００１６】
遺伝子または遺伝子産物は、本明細書に列挙するものから選択される多型の個々の対立遺伝子を場合によっては含むが、モジュレーターを他の対立遺伝子において試験して、特異的または非特異的に対立遺伝子を調節するモジュレーターを同定することもできる。試験することができる影響は、（ａ）モジュレーターの存在下での遺伝子または遺伝子産物の発現の増大または低下、（ｂ）モジュレーターの存在下での遺伝子産物の活性の増大または低下、および（ｃ）モジュレーターの存在下での遺伝子または遺伝子産物の発現パターンの改変のいずれかを含む。
【００１７】
乳癌の表現型を処置するためのキットは、本発明の方法によって同定したモジュレーター、およびモジュレーターを患者に投与して表現型を処置するための指示書を含むことができる。
【００１８】
前に記した方法以外に、方法を実施するためのキットおよびシステムも本発明の特徴である。例えば、生物またはそれに由来する生物学的サンプルについて乳癌の表現型を同定するためのシステムは、本発明の１つの特徴である。このシステムは、例えば、本明細書、例えば図１または２に記載のいずれかの多型である１つ以上の多型または連鎖した遺伝子座のうちの少なくとも１つの対立遺伝子を検出するように構成されたマーカープローブまたはプライマーのセットを例えば含む。このシステムは、マーカープローブまたはプライマーのセットからの１つ以上のシグナル出力、あるいはマーカープローブまたはプライマーのセットから生成されたアンプリコンを検出し、それによって対立遺伝子の存在または不在を同定するように構成された検出器を場合によってはさらに含む。対立遺伝子の存在または不在を予想表現型と関連付けるシステム指示書（例えば、システムのコンピュータにおいて実施されるソフトウェア）が、システムの構成要素として典型的には含まれる。
【００１９】
モジュレーターをスクリーニングするためのシステムも本発明の特徴である。このシステムは例えば、本明細書の多型と連鎖した遺伝子、または遺伝子のコード発現産物を含むことができる。システムは、モジュレーターの存在下での遺伝子または遺伝子産物の発現の増大または低下、モジュレーターの存在下での遺伝子産物の活性の増大または低下、またはモジュレーターの存在下での遺伝子または遺伝子産物の発現パターンの改変を測定する検出器を典型的には含むはずである。システムは、モジュレーターおよび／または遺伝子または産物を混合および等分し、それらを混合し、研究操作（例えば、精製、合成、細胞培養など）を実施するための流体操作要素も含むことができる。モジュレーターの影響を記録し、および場合によってはモジュレーターを選択するためのシステム指示書もこれらのシステムの任意選択の特徴である。
【００２０】
本明細書の方法のいずれかを実施するためのキットは、本発明の他の特徴である。このようなキットは、本明細書のいずれかの多型を検出するためのプローブまたはアンプリコン、適切なパッケージ材料、および方法を実施するための指示書を含むことができる。
【００２１】
前に記載した多型および遺伝子、および対応するマーカープローブ、アンプリコンまたはプライマーは、物理的核酸またはポリペプチドの形、あるいは核酸およびポリペプチドに関する配列情報を含むシステム指示書の形のいずれかで、本明細書の任意のシステムにおいて具体化することができる。例えばシステムは、本明細書に記載する遺伝子または多型、ＳＮＰ  ＩＤ  ２３１２１１６、ＳＮＰ  ＩＤ  １６２２５３０、ＳＮＰ  ＩＤ  ３７１２０１３、ＳＮＰ  ＩＤ  １５０９７１０、ＳＮＰ  ＩＤ  ８４３０２９、ＳＮＰ  ＩＤ  １９９０１２６、ＳＮＰ  ＩＤ  ６０４８１９、ＳＮＰ  ＩＤ  ３０２５７３４、ＳＮＰ  ＩＤ  １１５２４９９、ＳＮＰ  ＩＤ  ４４１５９０９、ＳＮＰ  ＩＤ  １７３２６８１、ＳＮＰ  ＩＤ  ４２８１５７９、ＳＮＰ  ＩＤ  ４４５４４５７、ＳＮＰ  ＩＤ  ２６１６１９９、ＳＮＰ  ＩＤ  １７２０６９４、ＳＮＰ  ＩＤ  ４０７７７２３、ＳＮＰ  ＩＤ  ３７１１９９０、ＳＮＰ  ＩＤ  ３３３７８５８、ＳＮＰ  ＩＤ  ４０９３０９５、ＳＮＰ  ＩＤ  ４２１３８２５、ＳＮＰ  ＩＤ  ３４８８６１７、ＳＮＰ  ＩＤ  ３６１０２１０、ＳＮＰ  ＩＤ  ３４５１２３９、ＳＮＰ  ＩＤ  １５８２５３３、ＳＮＰ  ＩＤ  ３４８８１５０、ＳＮＰ  ＩＤ  ２７７００５２、ＳＮＰ  ＩＤ  ４１４１３５１、ＳＮＰ  ＩＤ  １３３５０３０、ＳＮＰ  ＩＤ  ２２１１６６５、およびＳＮＰ  ＩＤ  ４５３８４１８、および／またはＦＧＦＲ２、Ａ２ＢＰ１、ＴＮＲＣ９、Ｈ１９、ＦＳＴＬ５、ＬＳＰ１、ＬＯＣ３８８９２７、ＵＮＱ９３９１、ＨＣＮ１、ＬＯＣ４４１１９２、ＴＮＲＣ９、ＮＲ３Ｃ２、ＫＩＡＡ０８２６、ＦＬＪ３１０３３、ＡＡＣＳ、ＦＲＭＤ４ＡおよびＳＥＣ３１Ｌ２などに対応する（あるいはその一部分を増幅させる）プライマーまたはアンプリコンを含むことができる。前述の方法中と同様に、マーカープローブまたはプライマーのセットは、複数の前記遺伝子または遺伝子座における複数の多型を場合によっては検出する。したがって例えば、マーカープローブまたはプライマーのセットは、これらの多型または遺伝子座のそれぞれにおいて少なくとも１つの多型、または本明細書の図面中の任意の他の多型、遺伝子または遺伝子座を検出する。任意のこのようなプローブまたはプライマーは、任意のこのような多型または遺伝子のヌクレオチド配列、またはその相補的核酸、またはその転写産物（例えば転写またはスプライシングによって、ゲノム配列から生成する例えばｎＲＮＡまたはｍＲＮＡ形）を含むことができる。
【００２２】
多くの他の変形が本発明の実施形態である。例えば、検出器は典型的には、対立遺伝子の存在または不在を示す１つ以上の発光を検出する。指示書は典型的には、対立遺伝子の存在または不在と表現型との間の相関関係を含む少なくとも１つの索引表を含む。システムは、試験用のサンプル、例えばゲノムＤＮＡ、増幅されたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、増幅されたｃＤＮＡ、ＲＮＡ、または増幅されたＲＮＡを場合によっては含む。サンプルは、ヒト患者などの哺乳類に由来するか、あるいはそこから誘導してよい。
【００２３】
方法、キットおよびシステムの全ての特徴を組合せて一緒に使用することができる。例えば、モジュレーターを検出するためのシステムは、モジュレーター検出の方法を実施するために使用することができる。乳癌の表現型と多型との間の相関関係を同定するためのシステムは、本明細書の方法を実施するために使用することができる。キットは、本明細書の方法を実施するために使用することができる。したがって、システム、方法およびキットの記載した特徴は本明細書の異なるシステム、方法およびキットに適用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
（定義）
本発明は特定の実施形態に限られず、当然ながら変わる可能性があることは理解されよう。本明細書で使用する述語は単に特定の実施形態を記載する目的であり、制限することは目的としないことも理解されよう。本明細書および添付の特許請求の範囲中で使用するように、単数および単数形の用語、例えば「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明らかに他のことを述べない限り、複数の指示対象を場合によっては含む。したがって、例えば「１つのプローブ」という言及は、複数のプローブ分子を場合によっては含み、同様に、文脈に応じて、用語「核酸」の使用は実際問題として、その核酸分子の多くのコピーを場合によっては含む。遺伝子またはタンパク質に関する文字の表示は、文脈に応じて遺伝子の形および／またはタンパク質の形を指すことができる。当業者は、本明細書の配列、知られている配列および遺伝コードを参照することによって、関連生物分子の核酸とアミノ酸形を関連付けることが完全に可能である。
【００２５】
他に示さない限り、核酸は左から右に５’から３’方向で記す。本明細書内に列挙する数的範囲はその範囲を定義する数字を含み、定義した範囲内のそれぞれの整数または任意の非整数部分を含む。他に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載したものと類似または均等の任意の方法および物質は、本発明を試験するための実践において使用することができるが、好ましい物質および方法は本明細書に記載する。本発明の記載および特許請求では、以下に述べる定義に従い以下の述語を使用するはずである。
【００２６】
「表現型」は、個体または集団において観察することができる１つの形質または形質の集合である。形質は定量的（定量的形質、またはＱＴＬ）または定性的であってよい。例えば、乳癌に対する易罹患性は、本明細書の方法、組成物、キットおよびシステムによりモニタリングすることができる表現型である。
【００２７】
「乳癌の易罹患性の表現型」は、個体において乳癌を発症する素因を示す表現型である。乳癌の素因を示す表現型は、例えば所与の組の環境条件下（食生活、身体活動レジメ、地理的位置など）で関連する一般的集団のメンバーよりその表現型を有する個体において乳癌が発症する、より高い可能性を示す可能性がある。
【００２８】
「多型」は様々である遺伝子座である、すなわち集団内で、多型でのヌクレオチド配列は２つ以上の型または対立遺伝子を有する。用語「対立遺伝子」は、特定の遺伝子座に存在するかあるいはそこでコードされている２つ以上の異なるヌクレオチド配列、またはそのような遺伝子座によってコードされている２つ以上の異なるポリペプチド配列の１つを指す。例えば、第一の対立遺伝子は１つの染色体上に存在する可能性があり、一方で第二の対立遺伝子は第二の相同染色体上に存在する、例えば異型個体の異なる染色体、あるいは集団内の異なる同型または異型個体の間に存在する。多型の一例は「一塩基多型」（ＳＮＰ）であり、これはゲノム中の１つのヌクレオチド位置における多型である（特定位置におけるヌクレオチドは個体または集団間で異なる）。
【００２９】
形質と「正に」相関した対立遺伝子は、それが形質と連鎖するとき、および対立遺伝子の存在がその形質または形質形の指標であるとき、その対立遺伝子を含む個体中に存在するはずである。形質と負に相関した対立遺伝子は、それが形質と連鎖するとき、および対立遺伝子の存在がその形質または形質形の指標であるとき、その対立遺伝子を含む個体中に存在しないはずである。
【００３０】
マーカー多型または対立遺伝子は、それが表現型と統計上（正あるいは負に）連鎖する可能性があるとき、特定の表現型（乳癌易罹患性など）と「関連」または「関係」がある。すなわち特定の多型が、対照集団（例えば、乳癌を有していない個体）中よりも症例集団（例えば、乳癌患者）中により一般的に存在する。この相関関係は本来偶然であると推測されることが多いが、そうである必要はなく、表現型の根底にある形質に関する遺伝子座との単純な遺伝的連鎖（関係）が相関関係／関係を考えるのに充分である。
【００３１】
「好ましい対立遺伝子」は、望ましい表現型、例えば乳癌に対する耐性と正に相関した特定の遺伝子座における対立遺伝子、例えば乳癌の素因と負に相関した対立遺伝子である。連鎖マーカーの好ましい対立遺伝子は、好ましい対立遺伝子と共に分離するマーカー対立遺伝子である。染色体セグメントの好ましい対立遺伝子は、望ましい表現型と正に相関しているか、あるいは染色体セグメント上に物理的に位置する１つ以上の遺伝子座における好ましくない表現型と負に相関している、ヌクレオチド配列を含む染色体セグメントである。
【００３２】
「好ましくない対立遺伝子」は、望ましい表現型と負に相関しているか、あるいは望ましくない表現型と正に相関している、例えば乳癌易罹患性と正に相関している、特定の遺伝子座における対立遺伝子である。連鎖マーカーの好ましくない対立遺伝子は、好ましくない対立遺伝子と共に分離するマーカー対立遺伝子である。染色体セグメントの好ましい対立遺伝子は、望ましい表現型と負に相関しているか、あるいは染色体セグメント上に物理的に位置する１つ以上の遺伝子座における望ましくない表現型と正に相関している、ヌクレオチド配列を含む染色体セグメントである。
【００３３】
「対立遺伝子頻度」は、個体、系、または系の集団内の遺伝子座に対立遺伝子が存在する頻度（割合またはパーセンテージ）を指す。例えば、対立遺伝子「Ａ」に関して、遺伝子型「ＡＡ」、「Ａａ」、または「ａａ」の二倍体個体はそれぞれ１．０、０．５、または０．０の対立遺伝子頻度を有する。系または集団由来の個体のサンプルの対立遺伝子頻度を平均することによって、その系または集団（例えば、症例または対照）内の対立遺伝子頻度を推定することができる。同様に、集団を構成する系の対立遺伝子頻度を平均することによって、系の集団内の対立遺伝子頻度を計算することができる。
【００３４】
個体は、その個体が所与の遺伝子座に１型の対立遺伝子のみを有する場合「同型」である（例えば、二倍体個体は２つの相同染色体のそれぞれの遺伝子座に同じ対立遺伝子のコピーを有する）。個体は、２つ以上の対立遺伝子型が所与の遺伝子座に存在する場合「異型」である（例えば、２つの異なる対立遺伝子のそれぞれの１コピーを有する二倍体個体）。用語「相同性」は、一群の要素が１つ以上の特定の遺伝子座に同じ遺伝子型を有することを示す。対照的に、用語「異質性」を使用して、群内の個体が１つ以上の特定の遺伝子座における遺伝子型が異なることを示す。
【００３５】
「遺伝子座」は染色体上の位置または領域である。例えば、多型遺伝子座は、多型核酸、形質決定因子、遺伝子またはマーカーが位置する位置または領域である。他の実施例では、「遺伝子座」は、特定の遺伝子を見つけることができる種のゲノム中の染色体上の特定の位置（領域）である。同様に、用語「定量的形質の遺伝子座」または「ＱＴＬ」は、少なくとも１つの遺伝的背景において、例えば少なくとも１つの集団または子孫において、発現に示差的に影響を与えるかあるいは定量的または連続的表現型形質のバリエーションを変える、少なくとも２つの対立遺伝子を有する遺伝子座を指す。
【００３６】
「マーカー」、「分子マーカー」または「マーカー核酸」は、遺伝子座または連鎖した遺伝子座の同定時の基準点として使用する、ヌクレオチド配列またはそのコードされる産物（例えばタンパク質）を指す。マーカーはゲノムヌクレオチド配列、または発現されるヌクレオチド配列（例えばＲＮＡ、ｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなどに由来する）、またはコードされるポリペプチドに由来してよい。この用語は、マーカー配列と相補的であるかあるいはそれらに隣接する核酸配列、例えば、マーカー配列を増幅させることができるプローブまたはプライマー対として使用する核酸なども指す。「マーカープローブ」は、それを使用してマーカー遺伝子座の存在を同定することができる核酸配列または分子、例えばマーカー遺伝子座配列と相補的である核酸プローブである。核酸は、それらが例えばワトソン−クリックの塩基対形成の法則に従い、溶液中で特異的にハイブリダイズするとき「相補的」である。「マーカー遺伝子座」は、それを使用して第二の連鎖した遺伝子座の存在を追跡することができる遺伝子座、例えば、表現型形質をコードするかあるいは集団における表現型形質のバリエーションの原因である連鎖または連鎖した遺伝子座である。例えば、マーカー遺伝子座を使用して、ＱＴＬなどの遺伝子座における、マーカー遺伝子座と遺伝的または物理的に連鎖している対立遺伝子の分離をモニタリングすることができる。したがって、「マーカー対立遺伝子」、あるいは「マーカー遺伝子座の対立遺伝子」は、マーカー遺伝子座が多型である集団中のマーカー遺伝子座において見られる、複数の多型ヌクレオチド配列の１つである。一態様において本発明は、当該の表現型、例えば乳癌の易罹患性／耐性と相関関係があるマーカー遺伝子座を提供する。同定したマーカーのそれぞれが、関連表現型の原因である遺伝的エレメント、例えばＱＴＬと密接な物理的および遺伝的近似性がある（物理的および／または遺伝的連鎖をもたらす）と予想される。集団の要素間の遺伝的多型に対応するマーカーは、当技術分野において充分確立されている方法によって検出することができる。これらは例えば、ＰＣＲに基づく配列特異的増幅法、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）の検出、アイソザイムマーカーの検出、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＡＳＨ）の検出、１ヌクレオチド伸長の検出、増幅したゲノムの可変配列の検出、自律的配列複製の検出、単純配列反復単位（ＳＳＲ）の検出、一塩基多型（ＳＮＰ）の検出、または増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）の検出を含む。
【００３７】
「遺伝子マップ」は、所与の種内の１つ以上の染色体上（または連鎖群）の遺伝子座間の遺伝子連鎖（または結合）の関係を記載するものであり、一般に図または表形式で示す。「マッピング」は、遺伝子マーカー、そのマーカーに関して分離される集団、および組換え頻度の標準的な遺伝的原理を使用することによって遺伝子座の連鎖関係を定義する方法である。「マッピング位置」は、連鎖した遺伝子マーカーに対する遺伝子マップ上の割り当てられた位置であり、この場合特定のマーカーを所与の種内で発見することができる。用語「染色体セグメント」は、１つの染色体上に存在するゲノムＤＮＡの連続した直線範囲を示す。同様に、「ハプロタイプ」は、個体または集団の遺伝物質において見られる一組の遺伝子座である（その組は連続または非連続状態であってよい）。本発明の文脈では、１つ以上の本明細書の対立遺伝子、および１つ以上の連鎖したマーカー対立遺伝子などの遺伝的エレメントは染色体セグメント内に位置してよく、したがってさらに、２０センチモルガン（ｃＭ）以下、あるいはそれ未満、例えば１５ｃＭ以下、しばしば１０ｃＭ以下、例えば約９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．７５、０．５、０．２５、または０．１ＣＭ以下の、遺伝的に連鎖した、特定の遺伝子の組換え距離である。すなわち、１つの染色体セグメント内の２つの密接に連鎖した遺伝的エレメントは、互いに約２０％以下、例えば約１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．７５％、０．５％、０．２５％、または０．１％以下の頻度で、減数分裂中に組換えを経る。ひとたび表現型（例えば、乳癌の素因）と多型遺伝子座との間の相関関係／関係を、例えば症例および対照における遺伝子座の統計的頻度を比較することによって同定した後、関連遺伝子座と連鎖している任意の多型を、関連遺伝子座の代理マーカーとして使用することができる。
【００３８】
「遺伝子組換え頻度」は、２つの遺伝子座間の組換え事象の頻度である。組換え頻度は、減数分裂中のマーカーおよび／または形質の分離を追跡することによって観察することができる。本発明の文脈では、身体の染色体の関係により関連遺伝子座が同系群の一部分であり、かつ連鎖不均衡であるとき、マーカー遺伝子座は他のマーカー遺伝子座または幾つかの他の遺伝子座（例えば、乳癌易罹患性の遺伝子座）と「関係がある」。遺伝子座がランダムに分離する場合よりも頻繁に、マーカー遺伝子座と連鎖した遺伝子座が子孫において一緒に見られるとき、この事が起こる。同様に、マーカー遺伝子座が形質と連鎖不均衡であるとき、マーカー遺伝子座が形質と関係がある可能性もあり、例えばマーカー遺伝子座は、所与の形質（乳癌耐性または易罹患性）と「関係がある」可能性がある（例えば症例対対照群においてマーカーがより一般的に見られるとき、これを検出することができる）。用語「連鎖不均衡」は、遺伝子座または形質（あるいは両方）のランダムではない分離を指す。いずれかの場合、連鎖不均衡は、関連遺伝子座は染色体の長さに沿って充分物理的に近い位置にあり、したがってそれらはランダムな頻度より高い頻度で一緒に分離することを意味する（同時分離形質の場合、形質の根底にある遺伝子座は互いに充分近い位置にある）。連鎖した遺伝子座は、５０％を超える時間、例えば約５１％〜約１００％の時間同時分離する。相同染色体対間の組換えが減数分裂中に高い頻度で２つの遺伝子座間において起こらないように、例えば、密接に連鎖した遺伝子座が少なくとも約８０％の時間、より好ましくは少なくとも約８５％の時間、さらにより好ましくは少なくとも９０％の時間、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７５％、または９９．９０％あるいはそれより多くの時間同時分離するように、２つの遺伝子座は非常に接近して位置することが有利である。
【００３９】
本出願中の語句「密接に連鎖した」は、２つの連鎖した遺伝子座（例えば、図１または２中で同定したＳＮＰなどのＳＮＰ（例えば、症例集団と対照集団を比較することによって乳癌の表現型と関連付けられる）および第二の連鎖多型）間の組換えが、約２０％以下の頻度で起こることを意味する。言い換えれば、密接に（あるいは「しっかりと」）連鎖した遺伝子座は、少なくとも８０％の時間同時分離する。マーカー遺伝子座は、それらが標的遺伝子座（例えば乳癌のＱＴＬ、あるいは代替的に単なる他の乳癌マーカー遺伝子座）と密接に連鎖しているとき、本発明において特に有用である。マーカーが標的遺伝子座とより密接に連鎖しているほど、マーカーはその標的遺伝子座のより良い指標である。したがって一実施形態では、マーカー遺伝子座と第二の遺伝子座などのしっかりと連鎖した遺伝子座は、約２０％以下、例えば１５％以下、例えば１０％以下、好ましくは約９％以下、さらにより好ましくは約８％以下、さらにより好ましくは約７％以下、さらにより好ましくは約６％以下、さらにより好ましくは約５％以下、さらにより好ましくは約４％以下、さらにより好ましくは約３％以下、およびさらにより好ましくは約２％以下の遺伝子座間組換え頻度を示す。非常に好ましい実施形態では、関連遺伝子座（例えば、マーカー遺伝子座および標的遺伝子座、ＱＴＬなど）は、約１％以下、例えば約０．７５％以下、より好ましくは約０．５％以下、あるいはさらにより好ましくは約０．２５％以下、あるいはさらにより好ましくは約０．１％以下の組換え頻度を示す。同じ染色体に、２つの遺伝子座間の組換えが約２０％未満、例えば１５％、より好ましくは１０％（例えば、約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．７５％、０．５％、０．２５％、０．１％以下）の頻度で起こるような距離で位置する２つの遺伝子座も、互いに「隣接している」と言える。形質の原因である遺伝的エレメントおよび隣接マーカーなどの、２つの連鎖した遺伝的エレメント間の関係を言及するとき、「相引」相連鎖は、形質遺伝子座における「好ましい」対立遺伝子が、それぞれの連鎖したマーカー遺伝子座の「好ましい」対立遺伝子と同じ染色体鎖上で物理的に結合している状態を示す。相引相では、両方の好ましい対立遺伝子が、その染色体鎖を受け継ぐ子孫によって一緒に受け継がれる。「相反」相連鎖では、当該の遺伝子座（例えば、乳癌易罹患性に関するＱＴＬ）における「好ましい」対立遺伝子は、隣接するマーカー遺伝子座において「好ましくない」対立遺伝子と同じ染色体鎖上で物理的に結合しており、２つの「好ましい」対立遺伝子は一緒に受け継がれない（すなわち、２つの遺伝子座は互いに「不一致」である）。
【００４０】
核酸増幅の文脈における用語「増幅」は、それによって選択した核酸（またはその転写形）の他のコピーを生成する任意のプロセスである。典型的な増幅法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含めた様々なポリメラーゼによる複製法、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）などのリガーゼ介在法、およびＲＮＡポリメラーゼによる増幅（例えば転写による）方法を含む。「アンプリコン」は、増幅した核酸、例えば任意の利用可能な増幅法（例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲ、転写など）によって鋳型核酸を増幅させることによって生成する核酸である。
【００４１】
「ゲノム核酸」は、細胞中の遺伝性核酸に配列が対応する核酸である。一般例は、核ゲノムＤＮＡおよびそのアンプリコンを含む。ゲノム核酸は幾つかの場合、スプライシングＲＮＡまたはｃＤＮＡが例えばイントロンを除去するためのスプライシング機構によってプロセシングされる点で、スプライシングＲＮＡ、または対応するｃＤＮＡと異なる。ゲノム核酸は、非転写（例えば、染色体構造配列、プロモーター領域、エンハンサー領域など）および／または非翻訳配列（例えばイントロン）を場合によっては含み、一方スプライシングＲＮＡ／ｃＤＮＡは典型的にはイントロンを有していない。「鋳型ゲノム核酸」は、増幅反応（例えば、ＰＣＲなどのポリメラーゼによる増幅反応、ＬＣＲなどのリガーゼ介在増幅反応、転写反応など）において鋳型として働くゲノム核酸である。
【００４２】
「外来性核酸」は、配列、ゲノム位置、または両方に関して指定の系（例えば生殖質、細胞、個体など）に由来しない核酸である。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに適用する、本明細書で使用する用語「外来性」または「異型」は、生物系（例えば細胞、個体など）に人為的に供給されその特定の生物系に由来しない分子を典型的には指す。この用語は関連物質が本来存在した供給源以外の供給源に由来したことを示すことができ、あるいは非原型の形状、遺伝的局在またはパーツ配置を有する分子を指すことができる。
【００４３】
用語「導入した」は、細胞中への異型または外来性核酸の移動を言及するとき、任意の方法を使用する細胞中への核酸の取り込みを指す。この用語は、「トランスフェクション」、「形質転換」および「形質導入」などの核酸導入法を含む。
【００４４】
本明細書で使用する用語「ベクター」は、核酸セグメントを細胞中に移動させるポリヌクレオチドまたは他の分子に関して使用する。用語「媒介体」は、「ベクター」と時折同義的に使用する。ベクターは、ベクターの維持を仲介しその目的の使用を可能にする部分（例えば、複製に必要な配列、薬剤または抗生物質耐性を与える遺伝子、マルチクローニングサイト、クローニング遺伝子の発現を可能にする作動可能に連結したプロモーター／エンハンサーエレメントなど）を場合によっては含む。ベクターはプラスミド、バクテリオファージ、あるいは植物または動物ウイルスに由来することが多い。「クローニングベクター」または「シャトルベクター」または「サブクローニングベクター」は、サブクローニングステップを容易にする作動可能に連結した部分（例えば、多数の制限エンドヌクレアーゼ部位を含むマルチクローニングサイト）を含む。
【００４５】
本明細書で使用する用語「発現ベクター」は、特定の宿主生物におけるコード配列の発現を容易にする作動可能に連結したポリヌクレオチド配列を含むベクターを指す（例えば、細菌発現ベクターまたは哺乳動物細胞発現ベクター）。原核生物における発現を容易にするポリヌクレオチド配列は典型的には、例えばプロモーター、オペレーター（任意選択）、およびリボソーム結合部位を、しばしば他の配列と共に含む。真核生物細胞は、原核生物によって使用されるものと一般に異なる、プロモーター、エンハンサー、停止およびポリアデニル化シグナルおよび他の配列を使用することができる。任意選択の一実施形態では、本明細書の遺伝子座に対応する遺伝子を発現ベクターにクローニングし、モジュレーターを同定するための本明細書の方法およびシステムにおいて使用する遺伝子産物と共に発現させる。
【００４６】
それが所与の核酸の配列を使用して構築されるとき、あるいは特定の核酸が所与の核酸を使用して構築されるとき、特定の核酸は所与の核酸に「由来する」。
【００４７】
「遺伝子」は、１つ以上の発現分子、例えばＲＮＡ、またはポリペプチドを一緒にコードするゲノム中のヌクレオチドの１つ以上の配列である。遺伝子は、ＲＮＡに転写され次いでポリペプチド配列に翻訳され得るコード配列を含むことができ、遺伝子の複製または発現を容易にする関連構造または制御配列を含むことができる。本発明における当該の遺伝子は、図１および／または２の遺伝子座を含むかあるいはそれらと密接に連鎖した遺伝子を含む。
【００４８】
「遺伝子型」は、１つ以上の遺伝子座における個体（または個体群）の遺伝子の構成である。遺伝子型は個体の１つ以上の知られている遺伝子座の対立遺伝子、典型的にはその両親から受け継がれた対立遺伝子の集合によって定義される。「ハプロタイプ」は、１本のＤＮＡ鎖上の複数の遺伝子座における個体の遺伝子型である。典型的には、ハプロタイプによって記載される遺伝子座は物理的および遺伝的に連鎖している、すなわち同じ染色体鎖上に存在する。
【００４９】
マーカーまたはプローブの「セット」は、一般的な目的、例えば特定の表現型（例えば、乳癌の耐性または易罹患性）を有する個体の同定に使用される、マーカーまたはプローブの集合または群、あるいはそこから誘導されるデータを指す。マーカーまたはプローブに対応する、あるいはその使用から誘導されるデータは、電子媒体に保存されることが多い。セットの要素のそれぞれは特定の目的に関する有用性を有するが、マーカーの全てではないが幾つかを含むセットおよびサブセットから選択される個々のマーカーも、特定の目的を実施する際に有効である。
【００５０】
「索引表」は、１つの形のデータと他のデータ、あるいは１つ以上の形のデータとそのデータと関係がある予想結果を関連付ける表である。例えば索引表は、対立遺伝子データと、１つ以上の所与の対立遺伝子を含む個体が示す可能性がある予想形質との間の相関関係を含み得る。例えば多数の対立遺伝子を同時に考慮に入れて、および場合によっては、例えば形質を予想する際に、遺伝的背景などの他の要因も考慮に入れて、これらの表は多次元であってよく、および典型的には多次元である。
【００５１】
「コンピュータ可読媒体」は、利用可能または一般的なインターフェースを使用してコンピュータによってアクセスすることができる情報保存媒体である。例にはメモリー（例えば、ＲＯＭまたはＲＡＭ、フラッシュメモリーなど）、光学的保存媒体（例えばＣＤ−ＲＯＭ）、磁気的保存媒体（コンピュータハードドライブ、フロッピー（登録商標）ディスクなど）、パンチカード、および市販されている多くの他のものがある。保存されている情報の保存またはアクセスのために、当該のシステムとコンピュータとの間、あるいはコンピュータにまたはコンピュータから、コンピュータ可読媒体にまたはコンピュータ可読媒体から、情報は伝達され得る。この伝達は送電であってよく、あるいは他の利用可能な方法、例えばＩＲリンク、ワイヤレス接続などによって実施することができる。
【００５２】
「システム指示書」は、システムによって部分的または完全に実行することができる指示書のセットである。典型的には、指示書のセットはシステムソフトウェアとして存在する。
【００５３】
「翻訳産物」は、核酸の翻訳の結果として生成する産物（典型的にはポリペプチド）である。「転写産物」は、核酸（例えばＤＮＡ）の転写の結果として生成する、産物（例えば、ｍＲＮＡを場合によっては含めたＲＮＡ、あるいは例えば、触媒または生物活性ＲＮＡ）である。
【００５４】
「アレイ」はエレメントの集合体である。集合体は空間的に整列されている（「パターン化されたアレイ」）あるいは整列されていない（「ランダムにパターン化されたアレイ」）可能性がある。アレイは１つ以上の機能的エレメント（例えば、マイクロアレイ上のプローブ領域）を形成するか、あるいはそれらを含むことができ、あるいはそれは非機能的であってよい。
【００５５】
本明細書で使用する用語「ＳＮＰ」または「一塩基多型」は、個体間、例えば変化しやすい生物のＤＮＡ中の１つの窒素含有塩基の位置の遺伝的変異を指す。本明細書で使用する「ＳＮＰｓ」はＳＮＰの複数形である。当然ながら、本明細書でＤＮＡを言及するとき、このような言及はＤＮＡの誘導体、例えばアンプリコン、そのＲＮＡ転写産物などを含み得る。
【００５６】
（詳細な説明）
概説
本発明は、図１および２の多型（およびこれらの多型を含むかあるいはこれらと隣接する遺伝子）と乳癌の素因との間の新たな相関関係を含む。これらの遺伝子または遺伝子産物における、およびこれらと連鎖した幾つかの対立遺伝子は、関連対立遺伝子を有する個体が乳癌を発症する可能性を予示する。したがって、任意の利用可能な方法によるこれらの対立遺伝子の検出は、乳癌に対する易罹患性の初期検出、および乳癌を示す患者の予後判定などの診断目的で、および診断を容易にする際に、例えば現在の基準が明確な診断に不充分である場合に使用することができる。
【００５７】
図１または２の多型、遺伝子または遺伝子産物は乳癌の表現型と相関関係があるという同定結果は、乳癌疾患の潜在的モジュレーターのスクリーニングに関する基盤も与える。図１および２の多型に対応する任意の遺伝子またはコードされるタンパク質の活性のモジュレーターは、乳癌に対する影響を有すると予想される。したがって、スクリーニングの方法、スクリーニングのためのシステムなどは本発明の特徴である。これらのスクリーニング手法によって同定されるモジュレーターも、本発明の特徴である。
【００５８】
例えば関連対立遺伝子を同定するためのプローブ、パッケージ材料、および関連対立遺伝子の検出と乳癌を関連付けるための指示書を含む、乳癌を診断および処置するためのキットも、本発明の特徴である。これらのキットは、乳癌のモジュレーターおよび／または従来の方法を使用して患者を処置するための指示書も含むことができる。
【００５９】
乳癌の素因を同定する方法
記したように本発明は、図１および２の幾つかの遺伝子または他の遺伝子座は乳癌の表現型と連鎖するという発見を提供する。したがって、関連表現型と正または負に相関しているマーカー（例えば、図１または２中のＳＮＰあるいはそれと密接に連鎖している遺伝子座）を検出することによって、個体または集団がこれらの表現型を含む可能性があるかどうか決定することができる。これは乳癌のリスクがある患者を同定するための充分な初期検出の選択権を与え、幾つかの場合、例えば初期の予防処置（例えば、予防的外科手術、食生活、運動、利用可能な薬剤などを含めた任意の既存の療法）をとることによって、癌の実際の進行を妨げることができる。さらに、本明細書の様々なマーカーの使用も、患者が特定の形の乳癌に罹患しているか否かを同定するための既存の診断技法に確実性を加える。さらに、疾患に関する分子基盤が存在するかどうかの知識も、例えば患者が乳癌用の従来の療法にどの程度応答する可能性があるかという指標を与えることによって、患者の予後の判定を容易にすることができる。どの型の分子異常を患者が示すかに基づいて、疾患の処置を標的化することもできる。
【００６０】
関連対立遺伝子を検出するための検出法は、任意の利用可能な方法、例えば増幅技術を含むことができる。例えば検出は、多型または多型と関係がある配列を増幅させること、および生成したアンプリコンを検出することを含むことができる。これは、例えばプライマーまたはプライマー対が、遺伝子または密接に連鎖する多型の少なくとも一部分、またはそれと隣接した配列と相補的かまたは部分的に相補的である、増幅プライマーまたは増幅プライマー対と生物または生物学的サンプル（例えば、ＳＮＰまたは他の多型を含む）から単離した核酸鋳型とを混合することを含むことができる。プライマーは典型的には、核酸鋳型においてポリメラーゼによる核酸の重合を開始させることができる。プライマーまたはプライマー対は、例えばポリメラーゼと鋳型核酸とを含むＤＮＡ重合反応（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲなど）において伸長させて、アンプリコンを生成させる。アンプリコンは任意の利用可能な検出法、例えばシークエンス、アンプリコンとアレイのハイブリダイズ（またはアンプリコンのアレイへの固定およびプローブとそれとのハイブリダイズ）、制限酵素を用いたアンプリコンの消化（例えばＲＦＬＰ）、リアルタイムＰＣＲ分析、１ヌクレオチドの伸長、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションなどによって検出する。
【００６１】
検出した多型と形質との間の関連付けは、対立遺伝子と表現型との間の関係を同定することができる任意の方法によって実施することができる。最も典型的には、これらの方法は、多型の対立遺伝子と表現型との間の相関関係を含む索引表を参照することを含む。この表は多数の対立遺伝子−表現型の関係に関するデータを含むことができ、例えば主成分分析、発見的アルゴリズムなどの統計手段を使用することによって、多数の対立遺伝子−表現型の関係の追加的または他の高次影響を考慮することができる。
【００６２】
これらの方法の文脈内において、以下の考察は、マーカーと対立遺伝子がどのように連鎖しているか、およびこの現象を乳癌の表現型を同定するための方法の文脈においてどのように使用することができるかに最初に焦点を置き、次いでマーカー検出法に焦点を置く。以下の他の章でデータ分析を論じる。
【００６３】
マーカー、連鎖および対立遺伝子
伝統的な連鎖（または関連）分析では、染色体上の遺伝子の物理的関係の直接的な知識は必要とされない。メンデルの第一法則は形質の対因子が分離するということであり、二倍体形質の対立遺伝子は２つの配偶子、次いで異なる子孫に分離することを意味する。古典的な連鎖分析は、異なる形質の同時分離の相対頻度の統計的記述として考えることができる。連鎖分析は、形質が一緒に分離する頻度に基づいてそれらがどのようにして一緒に分類されるかの、充分特徴付けられた記述構成である。すなわち、２つの非対立遺伝子の形質がランダムな頻度を超える頻度で一緒に受け継がれる場合、それらは「連鎖している」と言える。形質が一緒に受け継がれる頻度は、形質がどの程度しっかり連鎖しているかの主な指標である、すなわち、高い頻度で一緒に受け継がれる形質は、低い（ただしランダムをはるかに超える）頻度で一緒に受け継がれる形質より密接に連鎖している。形質の根底にある遺伝子が同じ染色体上で互いに近くに存在するので、形質は連鎖している。相同染色体は減数分裂中に組換えを起こすので、遺伝子が染色体上で離れて存在するほど、遺伝子が一緒に分離する可能性は低くなる。したがって、遺伝子が染色体上で離れて存在するほど、２つの遺伝子の子孫への別々の分離をもたらす減数分裂中に組換え事象が存在する可能性が高くなる。
【００６４】
連鎖（または関連）の一般的な指標は、形質が同時分離する頻度である。これは同時分離の割合（組換え頻度）、あるいはさらに一般的に、実際組換え頻度の相互関係単位であるセンチモルガン（ｃＭ）として表すことができる。ｃＭは先駆的遺伝学者Ｔｈｏｍａｓ  Ｈｕｎｔ  Ｍｏｒｇａｎにちなんで命名され、遺伝的組換え頻度の測定単位である。１ｃＭは、１世代中の組換えによって、他の遺伝子座における形質から１遺伝子座における形質が分離する１％の確率に等しい（その時期の形質が９９％一緒に分離することを意味する）。染色体上の距離は形質間の組換え事象の頻度にほぼ比例するので、組換え頻度と相関するおよその物理的距離が存在する。例えばヒトにおいては、１ｃＭは平均して約１００万個の塩基対（１Ｍｂｐ）と相関する。
【００６５】
マーカー遺伝子座はそれ自体が形質であり、分離中にマーカー遺伝子座を追跡することによって標準的な連鎖分析によって評価することができる。したがって、本発明の文脈では、１ｃＭは、１世代中の組換えによって、他の遺伝子座（任意の他の形質であってよい、例えば他のマーカー遺伝子座、または乳癌のＱＴＬをコードする他の形質の遺伝子座）からマーカー遺伝子座が分離する１％の確率に等しい。本明細書のマーカー、例えば図１および２に列挙したマーカーは、乳癌と相関する可能性がある。これは、マーカーは乳癌のＱＴＬを含むかあるいはこれと充分に隣接しており、形質そのものの予測因子としてマーカーを使用することができることを意味する。これは疾患診断の文脈において非常に有用である。
【００６６】
図１および２の多型は、症例（乳癌患者）対対照集団においてより見られるとして同定している。当該の形質の遺伝子座（例えば本発明の場合、例えば図１および２中と同様の、乳癌のＱＴＬまたは同定済みの連鎖したマーカー遺伝子座）と連鎖する任意のマーカーは、その形質のマーカーとして使用することができる。したがって、図１および２中に記したマーカー以外に、これらの図面中に箇条書きしたマーカーと密接に連鎖する他のマーカーも、図面中に示したマーカー対立遺伝子の存在（およびしたがって、関連表現型形質）を有効に予測することができる。このような連鎖マーカーは、マーカーが所与の遺伝子座と充分に隣接し、したがってそれらがその所与の遺伝子座と低い組換え頻度を示すとき、特に有用である。本発明において、このような密接に連鎖するマーカーは本発明の特徴である。密接に連鎖する遺伝子座は、所与のマーカーと約２０％以下の組換え頻度を示す（所与のマーカーは所与のマーカーの２０ｃＭ以内に存在する）。言い換えると、密接に連鎖する遺伝子座はその時期の少なくとも８０％が同時分離する。より好ましくは、組換え頻度は１０％以下、例えば９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２５％、または０．１％以下である。１つの典型的なクラスの実施形態では、密接に連鎖する遺伝子座は互いに５ｃＭ以下以内に存在する。
【００６７】
当業者は理解しているはずであるが、組換え頻度（および、結果としてマッピング位置）は、使用するマップ（およびマップ上に存在するマーカー）に応じて変わる可能性がある。図１および２中で同定したマーカーと（例えば、約２０ｃＭ以内、あるいはより好ましくは約１０ｃＭ以内、さらにより好ましくは５ｃＭ以内に）密接に連鎖する他のマーカーは、乳癌の素因のＱＴＬを同定するために容易に使用することができる。
【００６８】
マーカー遺伝子座は、それらが標的遺伝子座（例えば、乳癌の表現型のＱＴＬ、あるいは代替的に、それ自体がこのようなＱＴＬと連鎖する単なる他のマーカー遺伝子座）と密接に連鎖し、したがってそれらがマーカーとして使用されるとき、本発明において特に有用である。表現型形質をコードするかあるいはそれに影響を与える標的遺伝子座とマーカーが密接に連鎖するほど、（標的遺伝子座とマーカーの間の低い交差頻度のため）マーカーは標的遺伝子座の良い指標である。したがって、一実施形態では、マーカー遺伝子座と第二の遺伝子座（例えば、図１および２の所与のマーカー遺伝子座と他の第二の遺伝子座）などの密接に連鎖する遺伝子座は、約２０％以下、例えば１５％以下、好ましくは１０％以下、より好ましくは約９％以下、さらにより好ましくは約８％以下、さらにより好ましくは約７％以下、さらにより好ましくは約６％以下、さらにより好ましくは約５％以下、さらにより好ましくは約４％以下、さらにより好ましくは約３％以下、およびさらにより好ましくは約２％以下の遺伝子座間交差頻度を示す。非常に好ましい実施形態では、関連遺伝子座（例えば、マーカー遺伝子座およびＱＴＬなどの標的遺伝子座）は、約１％以下、例えば約０．７５％以下、より好ましくは約０．５％以下、あるいはさらにより好ましくは約０．２５％または０．１％以下の組換え頻度を示す。したがって遺伝子座は、約２０ｃＭ、１９ｃＭ、１８ｃＭ、１７ｃＭ、１６ｃＭ、１５ｃＭ、１４ｃＭ、１３ｃＭ、１２ｃＭ、１１ｃＭ、１０ｃＭ、９ｃＭ、８ｃＭ、７ｃＭ、６ｃＭ、５ｃＭ、４ｃＭ、３ｃＭ、２ｃＭ、１ｃＭ、０．７５ｃＭ、０．５ｃＭ、０．２５ｃＭ、０または０．１ｃＭ以下離れている。言い換えると、同じ染色体、２遺伝子座間の組換えが２０％未満（例えば、約１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．７５％、０．５％、０．２５％、０．１％以下）の頻度で起こるような距離に局在する２つの遺伝子座は、互いに「隣接している」と言える。一態様では、連鎖マーカーは１００ｋｂ（局所の組換え率に応じて、これはヒトにおいて約０．１ｃＭと相関する）、例えば互いに５０ｋｂ、またはさらに２０ｋｂ以下以内に存在する。
【００６９】
乳癌の原因である遺伝的エレメントおよび隣接マーカーなどの、２つの連鎖した遺伝的エレメント間の関係を言及するとき、「相引」相連鎖は、形質遺伝子座における「好ましい」対立遺伝子が、それぞれの連鎖したマーカー遺伝子座の「好ましい」対立遺伝子と同じ染色体鎖上で物理的に結合している状態を示す。相引相では、両方の好ましい対立遺伝子が、その染色体鎖を受け継ぐ子孫によって一緒に受け継がれる。「相反」相連鎖では、当該の遺伝子座（例えば、乳癌のＱＴＬ）における「好ましい」対立遺伝子は、隣接するマーカー遺伝子座において「好ましくない」対立遺伝子と同じ染色体鎖上で物理的に結合しており、２つの「好ましい」対立遺伝子は一緒に受け継がれない（すなわち、２つの遺伝子座は互いに「不一致」である）。
【００７０】
ゲノム、および対応する発現核酸およびポリペプチドにおけるＳＮＰおよび他の多型の追跡以外に、ｍＲＮＡまたはタンパク質形のいずれかである図１および２の遺伝子産物に関する、個体または集団間の発現レベルの違いも乳癌と関連付けることができる。したがって、本発明のマーカーは、例えばゲノム遺伝子座、転写核酸、スプライシング核酸、発現タンパク質、転写核酸のレベル、スプライシング核酸のレベル、および発現タンパク質のレベルのいずれかを含むことができる。
【００７１】
マーカー増幅戦略
マーカー（例えば、マーカー遺伝子座）を増幅させるための増幅プライマー、および多数のマーカー対立遺伝子に関してこのようなマーカーを検出するかあるいはサンプルの遺伝子型を決定するのに適したプローブは、本発明の特徴である。図１および２中に、このようなプライマーの設計において知られている隣接配列と共に、増幅用の特定の遺伝子座を与える。例えば、長期ＰＣＲ用のプライマーの設計は、２００２年１月９日に出願されたＵＳＳＮ１０／０４２，４０６および２００２年９月５日に出願されたＵＳＳＮ１０／２３６，４８０中に記載されており、短期ＰＣＲに関しては、２００３年１月１４日に出願されたＵＳＳＮ１０／３４１，８３２が、プライマーの選択に関する指針を与える。さらに、プライマーの設計に利用可能な「オリゴ」などの、公に利用可能なプログラムが存在する。このような利用可能なプライマーの選択および設計ソフトウェア、公に利用可能なヒトゲノム配列および図１および２中に与えた多型の位置によって、当業者はプライマーを構築して、本発明のＳＮＰを増幅することができる。さらに、ＳＮＰを含む核酸（例えば、ＳＮＰを含むアンプリコン）の検出に使用されるプローブは変わる可能性があり、例えば、検出するマーカーアンプリコンの領域を同定することができる任意のプローブを、本発明と共に使用することができることは理解されるはずである。さらに、検出用プローブの形状は、当然ながら変わる可能性がある。したがって本発明は、本明細書に列挙する配列に限られない。
【００７２】
実際、増幅はマーカー検出の要件ではなく、例えば、ゲノムＤＮＡのサンプルにサザンブロットを単に実施することによって、増幅されていないゲノムＤＮＡを直接検出することができることは理解されるはずである。サザンブロッティング、標準的な増幅（ＰＣＲ、ＬＣＲなど）および多くの他の核酸検出法を実施するための手順は充分確立されており、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）、１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２０００年（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）；  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．の間の合作（２００２年中に増補）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」））およびＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら、編）  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０年）（Ｉｎｎｉｓ）中で教示されている。
【００７３】
例えば生成物への取り込み、アンプリコンへの標識ヌクレオチドの取り込み時の関連増幅プライマーの改変により生成物形成を検出するリアルタイム増幅反応を実施することによって、あるいは（例えば、蛍光偏光によって）非増幅前駆体と比較してアンプリコンの分子回転性の変化をモニタリングすることによって、増幅／検出法において別の検出用プローブを省略することもできる。
【００７４】
典型的には、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＡＳＨ）、１ヌクレオチド伸長の検出、アレイハイブリダイゼーション（場合によってはＡＳＨを含む）、または一塩基多型（ＳＮＰ）の検出、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）の検出、増幅した可変配列の検出、ランダムに増幅した多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）の検出、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）の検出、自律的配列複製の検出、単純配列反復単位（ＳＳＲ）の検出、一本鎖形状多型（ＳＳＣＰ）の検出、アイソザイムマーカーの検出、ノーザン分析（この場合、発現レベルをマーカーとして使用する）、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの定量増幅などに関する他の方法を非制限的に含めた、当技術分野で利用可能な任意の確立した方法によって分子マーカーを検出する。図面中に与える例示的なマーカーはＳＮＰマーカーであるが、任意の前述のマーカー型を本発明の文脈において使用して、乳癌の表現型と相関する連鎖した遺伝子座を同定することができる。
【００７５】
マーカー検出のための例示的な技法
本発明は、乳癌の表現型のＱＴＬを含むかあるいはそれと連鎖する分子マーカーを提供する。これらのマーカーは、疾患の素因の診断、予後判定、処置などにおいて用途が見出される。本発明がこれらのマーカーを検出するためのいずれか特定の方法に限られることは考えられない。
【００７６】
集団の要素間の遺伝的多型に対応するマーカーは、当技術分野で充分確立されている多数の方法（例えば、ＰＣＲに基づく配列特異的増幅法、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、アイソザイムマーカー、ノーザン分析、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＡＳＨ）、アレイに基づくハイブリダイゼーション、増幅したゲノムの可変配列、自律的配列複製、単純配列反復単位（ＳＳＲ）、一塩基多型（ＳＮＰ）、ランダムに増幅した多型ＤＮＡ（「ＲＡＰＤ」）または増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）によって検出することができる。他の一実施形態では、分子マーカーの存在または不在は、多型マーカー領域のヌクレオチドのシークエンシングによって容易に決定する。任意のこれらの方法を、高スループット分析に容易に適合させる。
【００７７】
遺伝子マーカーを検出するための幾つかの技法は、プローブ核酸と遺伝子マーカーに対応する核酸（例えば、鋳型としてゲノムＤＮＡを使用して生成した増幅核酸）とのハイブリダイゼーションを使用する。ハイブリダイゼーション形式には、溶液相、固体相、混合相があるが、これらだけには限られず、あるいはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイが対立遺伝子の検出に有用である。核酸のハイブリダイゼーションの広範囲の指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３年）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ中、およびＳａｍｂｒｏｏｋ、ＢｅｒｇｅｒおよびＡｕｓｕｂｅｌ中に見られる。
【００７８】
例えば、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を含むマーカーは、例えば典型的には検出する核酸の小断片（または小断片に対応する合成オリゴヌクレオチド）であるプローブと、制限酵素により消化したゲノムＤＮＡをハイブリダイズさせることによって検出する。異なる個体または集団において制限酵素を選択して、少なくとも２つの他の（または多型）長さの制限断片を与える。マーカーの各対立遺伝子に関する情報を与える断片を生成する１つ以上の制限酵素の決定は単純な手順であり、当技術分野でよく知られている。適切なマトリクス（例えば、アガロースまたはポリアクリルアミド）における長さによる分離および膜（例えば、ニトロセルロース、ナイロンなど）への移動後、標識プローブをプローブと標的の平衡結合をもたらす条件下でハイブリダイズさせ、次に過剰なプローブを洗浄によって除去する。
【００７９】
マーカー遺伝子座に対する核酸プローブは、クローニングおよび／または合成することができる。任意の適切な標識を、本発明のプローブと共に使用することができる。核酸プローブと共に使用するのに適した検出可能な標識には、例えば分光、放射性同位体、光化学、生化学、免疫化学、電気、光学または化学手段によって検出可能な任意の組成物がある。有用な標識には、標識ストレプトアビジン複合体の染色用ビオチン、磁気ビーズ、蛍光色素、放射標識、酵素、および比色分析用標識がある。他の標識には、蛍光色素分子、化学発光物質、および酵素で標識した抗体と結合したリガンドがある。プローブは、放射標識アンプリコンを作製するために使用される放射標識ＰＣＲプライマーも構成し得る。核酸を標識するための標識戦略および対応する検出戦略は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲ）によるＨａｕｇｌａｎｄ（２００３年）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ第９版中で見ることができる。マーカー検出戦略に関する他の詳細は以下で見られる。
【００８０】
増幅に基づく検出法
ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲおよびＬＣＲは、当該の核酸（例えば、マーカー遺伝子座を含む核酸）を増幅させるための増幅および増幅検出法として特に広く使用されており、当該の核酸の検出を容易にする。これらおよび他の増幅法の使用に関する詳細は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ、ＡｕｓｕｂｅｌおよびＢｅｒｇｅｒを含めた任意の様々な標準的教本中で見ることができる。多くの入手可能な生物学教本は、ＰＣＲおよび関連増幅法に関する考察も広げている。当業者は、ほぼ任意のＲＮＡを、制限酵素による消化、逆転写酵素およびポリメラーゼを使用するＰＣＲ増幅およびシークエンシング（「逆転写ＰＣＲ」、または「ＲＴ−ＰＣＲ」）に適した二本鎖ＤＮＡに転換することができることを理解しているはずである。Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、およびＢｅｒｇｅｒ、上記も参照。これらの方法を使用してｍＲＮＡまたは対応するｃＤＮＡを定量的に増幅し、個体中の図１および２の遺伝子または遺伝子産物に対応する遺伝子産物に対応するｍＲＮＡの発現レベルの指標を与えることもできる。個体、家族、系および／または集団間のこれらの遺伝子の発現レベルの違いは、乳癌の表現型のマーカーとして使用することができる。
【００８１】
リアルタイム増幅／検出法
一態様では、リアルタイムＰＣＲまたはＬＣＲを、例えば分子指標またはＴａｑＭａｎＴＭプローブを使用して、本明細書に記載する増幅混合物に実施する。分子指標（ＭＢ）は、適切なハイブリダイゼーション条件下でセルフハイブリダイズしてステムおよびループ構造を形成する、オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡである。ＭＢはオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡの末端に標識および消光物質を有し、したがって、分子間ハイブリダイゼーションを可能にする条件下では、標識は消光物質によって典型的には消光される（あるいは少なくともその蛍光が変わる）。ＭＢが分子間ハイブリダイゼーションを示さない条件下では（例えば、標的核酸、例えば増幅中のアンプリコンの領域と結合するとき）、ＭＢ標識は非消光状態である。ＭＢを作製および使用する標準的な方法に関する詳細は、文献中で充分確立されており、ＭＢは幾つかの市販の試薬供給源から入手可能である。例えば、Ｌｅｏｎｅら（１９９５年）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＮＡＳＢＡ  ｅｎａｂｌｅ  ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ．」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：２１５０〜２１５５頁；  ＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ（１９９６年）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ：  ｐｒｏｂｅｓ  ｔｈａｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ  ｕｐｏｎ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：３０３〜３０８頁；  ＢｌｏｋおよびＫｒａｍｅｒ（１９９７年）「Ａｍｐｌｉｆｉａｂｌｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｗｉｔｃｈ」Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ１１：１８７〜１９４頁；  Ｈｓｕｉｈら、（１９９７年）「Ｎｏｖｅｌ、ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ」Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ３４：５０１〜５０７頁；  Ｋｏｓｔｒｉｋｉｓら、（１９９８年）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ：  ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｌｌｅｌｅｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ２７９：１２２８〜１２２９頁；  Ｓｏｋｏｌら、（１９９８年）「Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ：ＲＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：１１５３８〜１１５４３頁；Ｔｙａｇｉら、（１９９８年）「Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｌｌｅｌｅ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１６：４９〜５３頁；  Ｂｏｎｎｅｔら、（１９９９年）「Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅｓ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：６１７１〜６１７６頁；  Ｆａｎｇら、（１９９９年）「Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ  ���ｏｒ  ｓｕｒｆａｃｅ−ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ」Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：２９２１〜２９２２頁；  Ｍａｒｒａｓら、（１９９９年）「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ」Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１４：１５１〜１５６頁；およびＶｅｔら、（１９９９年）「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｕｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：６３９４〜６３９９頁も参照。ＭＢ構築およびその使用に関する他の詳細は、特許文献、例えば、「Ｄｅｔｅｃｔａｂｌｙ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｄｕａｌ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅｓ、ａｓｓａｙｓ  ａｎｄ  ｋｉｔｓ」という表題のＴｙａｇｉらへの米国特許第５，９２５，５１７号（１９９９年７月２０日）、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｈａｖｉｎｇ  ｎｏｎ−ＦＲＥＴ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ａｎｄ  ｋｉｔｓ  ａｎｄ  ａｓｓａｙｓ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｓｕｃｈ  ｐｒｏｂｅｓ」という表題のＴｙａｇｉらへの米国特許第６，１５０，０９７号（２０００年１１月２１日）、および「Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ−ｓｈｉｆｔｉｎｇ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ａｓｓａｙｓ  ａｎｄ  ｋｉｔｓ」という表題のＴｙａｇｉらへの米国特許第６，０３７，１３０号（２０００年３月１４日）中に見られる。
【００８２】
「ＴａｑＭａｎＴＭ」プローブと一般に呼ばれる二重標識蛍光性オリゴヌクレオチドプローブを使用する、ＰＣＲによる検出および定量化も、本発明により実施することができる。これらのプローブは、２つの異なる蛍光色素で標識された短い（例えば、２０〜２５塩基の）オリゴデオキシヌクレオチドから構成される。各プローブの５’末端にはレポーター色素が存在し、各プローブの３’末端には消光色素が見られる。オリゴヌクレオチドプローブ配列は、ＰＣＲアンプリコンに存在する内部標的配列と相補的である。プローブが完全状態であるとき、２つの蛍光色素分子の間でエネルギーの移動が起こり、ＦＲＥＴにより消光物質によってレポーターからの発光が消される。ＰＣＲの伸長期中、プローブは反応中に使用されるポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって切断され、それによってオリゴヌクレオチド−消光物質からレポーターが放出され、レポーターの発光強度の増大を生み出す。したがって、ＴａｑＭａｎＴＭプローブは標識および消光物質を有するオリゴヌクレオチドであり、その標識は増幅中に使用されるポリメラーゼのエクソヌクレアーゼ作用によって増幅中に放出される。これは、合成中の増幅のリアルタイム測定をもたらす。様々なＴａｑＭａｎＴＭ試薬が、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  Ｈｅａｄｑｕａｒｔｅｒｓ  ｉｎ  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から、およびＢｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなどの様々な専門業者から市販されている（例えば、ブラックホール消光物質プローブ）。二重標識プローブ戦略に関する他の詳細は、例えばＷＯ９２／０２６３８中に見ることができる。
【００８３】
他の同様の方法には、例えば米国特許第６，１７４，６７０号中に記載された「ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）」形式を使用する、例えば２つの隣接してハイブリダイズしたプローブ間の蛍光共鳴エネルギー移動がある。
【００８４】
アレイに基づくマーカー検出
アレイに基づく検出は、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）または他の製造者からの、市販のアレイを使用して実施することができる。核酸アレイの操作に関する総説は、Ｓａｐｏｌｓｋｙら、（１９９９年）「Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ．」Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ１４：１８７〜１９２頁；  Ｌｏｃｋｈａｒｔ（１９９８年）「Ｍｕｔａｎｔ  ｙｅａｓｔ  ｏｎ  ｄｒｕｇｓ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ４：１２３５〜１２３６頁；  Ｆｏｄｏｒ（１９９７年）「Ｇｅｎｅｓ、Ｃｈｉｐｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ．」ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ１１：Ａ８７９；Ｆｏｄｏｒ（１９９７年）「Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．」Ｓｃｉｅｎｃｅ２７７：３９３〜３９５頁；およびＣｈｅｅら、（１９９６年）「Ａｃｃｅｓｓｉｎｇ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  ＤＮＡ  Ａｒｒａｙｓ．」Ｓｃｉｅｎｃｅ２７４：６１０〜６１４頁を含む。アレイに基づく検出の本質的に高いスループット性のため、アレイに基づく検出は、サンプル中の本発明のマーカーを同定するのに好ましい方法である。
【００８５】
様々なプローブアレイが文献中に記載されてきており、本明細書に記す表現型と相関し得るマーカーの検出に関する本発明の文脈において使用することができる。例えば、ＤＮＡプローブアレイチップまたはさらに大きなＤＮＡプローブアレイウエハ（そこから個々のチップが、ウエハの破壊によって他の場合得られるはずである）を、本発明の一実施形態において使用する。ＤＮＡプローブアレイウエハは一般に、その上に高密度のＤＮＡプローブ（ＤＮＡの短いセグメント）のアレイが配置しているガラスウエハを含む。これらのウエハのそれぞれは、さらに長いサンプルＤＮＡ配列（例えば、個体または集団由来の当該のマーカーを例えば含む）を認識するために使用される約６千万個のＤＮＡプローブを、例えば保持することができる。ガラスウエハ上のＤＮＡプローブのセットによるサンプルＤＮＡの認識は、ＤＮＡハイブリダイゼーションによって行う。ＤＮＡサンプルがＤＮＡプローブのアレイとハイブリダイズすると、そのサンプルはサンプルＤＮＡの配列と相補的なプローブと結合する。個体のサンプルＤＮＡがどのプローブとより強くハイブリダイズするかを評価することによって、核酸の知られている配列がサンプル中に存在するかあるいはしないかを判定することができ、したがってその核酸において見られるマーカーが存在するかどうかを判定することができる。ハイブリダイゼーション条件を調節して、例えばＳＮＰ同定用、および１つ以上のＳＮＰのサンプルの遺伝子型決定用に、単一ヌクレオチドの識別を可能にすることによって、この手法を使用してＡＳＨを実施することもできる。アレイは、多数の多型マーカーを同時に（あるいは連続して）検出するのに好都合な一実施形態を与える。例えば、本明細書に記す多型（またはそれらと連鎖する多型）のいずれかまたは全てを同時に検出して乳癌易罹患性の表現型を割り当てる、乳癌易罹患性の検出用アレイを構築することができる。当然ながら、任意の検出技術（ＰＣＲ、ＬＣＲ、リアルタイムＰＣＲなど）を、例えば、多重増幅／検出反応と共に、あるいは例えば同時にあるいは連続して単に幾つかの別の反応を実施することによって、同様に使用することができる。
【００８６】
対立遺伝子の情報を得るためのＤＮＡプローブアレイの使用は、以下の一般的なステップ：ＤＮＡプローブアレイの設計および製造、サンプルの調製、サンプルＤＮＡとアレイのハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション事象の検出および配列を決定するためのデータ分析を典型的には含む。好ましいウエハは、コスト効率および高品質を得るための半導体製造から適合させた方法を使用して製造され、これらは例えばＡｆｆｙｍｅｔｉｉｘ，  Ｉｎｃ  ｏｆ  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能である。
【００８７】
例えば、固相化学合成と半導体産業において使用されるフォトリソグラフィーによる製造技法を組合せた、光誘導型の化学合成法によって、プローブアレイを製造することができる。チップ露光部位を画定するための一連のフォトリソグラフィーマスク、次に特異的化学合成ステップを使用することによって、このプロセスは、各プローブがアレイ中の所定の位置に存在する高密度のオリゴヌクレオチドのアレイを構築する。多数のプローブアレイを、大きなガラスウエハ上で同時に合成することができる。この平行プロセスは再現性を高め、一定規模の経済利益の達成を手助けする。
【００８８】
ひとたび製造した後、ＤＮＡプローブアレイを使用して、当該のマーカーの存在および／または発現レベルに関するデータを得ることができる。標準的な生化学法によりビオチンおよび／または蛍光レポーター基を用いて、ＤＮＡサンプルをタグ化することができる。標識したサンプルはアレイと共にインキュベートし、サンプルのセグメントはアレイ上の相補的配列と結合するか、あるいはハイブリダイズする。アレイを洗浄および／または染色して、ハイブリダイゼーションパターンを生み出すことができる。次いでアレイをスキャンし、ハイブリダイゼーションのパターンは蛍光レポーター基からの発光によって検出する。これらの手順に関する他の詳細は、以下の実施例中に見られる。アレイ上の各プローブの同一性および位置は知られているので、アレイに施用するサンプル中のＤＮＡ配列の性質を決定することができる。これらのアレイを遺伝子型決定の実験に使用するとき、それらは遺伝子型決定用アレイと呼ぶことができる。既に記したように、本明細書、例えば図１および／または図２中に記す多型のいずれかまたは全ての遺伝子型を検出して、例えば乳癌素因の表現型を割り当てることができる。
【００８９】
分析する核酸サンプルは単離し、増幅させ、および典型的にはビオチンおよび／または蛍光レポーター基を用いて標識する。標識した核酸サンプルは、流動ステーションおよびハイブリダイゼーション用オーブンを使用して、次いでアレイと共にインキュベートする。検出法に応じて適切に、アレイを洗浄およびまたは染色あるいは対比染色することができる。ハイブリダイゼーション、洗浄および染色後、アレイをスキャナに挿入し、そこでハイブリダイゼーションのパターンを検出する。ハイブリダイゼーションのデータは、標識核酸中に既に取り込まれており現在プローブアレイと結合している蛍光レポーター基から発せられた光として集める。標識核酸と最も明らかに合致するプローブは、ミスマッチを有するプローブより強いシグナルを生成する。アレイ上の各プローブの配列および位置は知られているので、相補性によって、プローブアレイに施用する核酸サンプルの同一性を同定することができる。
【００９０】
一実施形態では、２つのＤＮＡサンプルを示差的に標識し、設計した遺伝子型決定用アレイの一組とハイブリダイズさせることができる。このようにして、二組のデータを同じ物理的アレイから得ることができる。使用することができる標識には、ｃｙｃｈｒｏｍｅ、フルオレセイン、またはビオチン（ハイブリダイゼーション後にフィコエリスリン−ストレプトアビジンで後に染色される）があるが、これらだけには限られない。二色標識は、その全容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，３４２，３５５号中に記載されている。各アレイは２つの標識からのシグナルを同時に検出するようにスキャンすることができ、あるいは２回スキャンして各シグナルを別々に検出することができる。
【００９１】
マーカーの存在に関して試験する各個体用の全てのマーカーに関する強度データを、スキャナによって集める。測定した強度は、所与の個体のサンプル中に存在する特定のマーカーの量を示す指標である（ゲノムまたは発現核酸を分析するかどうかに応じて、個体中に存在する対立遺伝子の発現レベルおよび／またはコピー数）。これを使用して、個体が当該のマーカーに関して同型または異型であるかどうか決定することができる。強度データを処理して、様々な強度の対応するマーカーの情報を与える。
【００９２】
増幅させた可変配列、ＳＳＲ、ＡＦＬＰＡＳＨ、ＳＮＰおよびアイソザイムマーカーに関する他の詳細
増幅させた可変配列は、同種のメンバー間で高い核酸残基の変動性を示すゲノムの増幅配列を指す。全ての生物は様々なゲノム配列を有しており、それぞれの生物（クローン、例えばクローン細胞以外）は、異なる組の可変配列を有する。ひとたび同定した後、特定の可変配列の存在を使用して表現型形質を予想することができる。ゲノムからのＤＮＡは、ＤＮＡの可変配列と隣接するプライマーを用いた増幅用の鋳型として働くことが好ましい。可変配列を増幅させ、次いで配列決定する。
【００９３】
あるいは、自律的配列複製を使用して遺伝子マーカーを同定することができる。自律的配列複製は、レトロウイルス複製と関係がある３つの酵素活性：（１）逆転写酵素、（２）ＲｎａｓｅＨ、および（３）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、（１９９０年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ８７：１８７４頁）を使用することにより、実質的に等温である条件下においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで指数関数的に複製する標的核酸配列を使用する、核酸増幅の方法を指す。ｃＤＮＡ中間体によるＲＮＡ複製のレトロウイルス戦略を模倣することによって、この反応は元の標的のｃＤＮＡおよびＲＮＡのコピーを蓄積させる。
【００９４】
増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）を、遺伝子マーカーとして使用することもできる（Ｖｏｓら、（１９９５年）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ２３：４４０７頁）。語句「増幅断片長多型」は、制限エンドヌクレアーゼによる切断前後に増幅させる選択した制限断片を指す。増幅ステップは、特異的制限断片の容易な検出を可能にする。ＡＦＬＰは多数の多型マーカーの検出を可能にし、遺伝子マッピングに使用されてきている（Ｂｅｃｋｅｒら、（１９９５年）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ２４９：６５頁；およびＭｅｋｓｅｍら、（１９９５年）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ２４９：７４頁）。
【００９５】
対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＡＳＨ）を使用して、本発明の遺伝子マーカーを同定することができる。ＡＳＨ技術は、短い一本鎖オリゴヌクレオチドプローブの完全に相補的な一本鎖標的核酸への安定したアニーリングに基づく。プローブと結合した等方性または非等方性標識によって、検出を実施することができる。
【００９６】
それぞれの多型用に、多型ヌクレオチド以外同一のＤＮＡ配列を有する、２つ以上の異なるＡＳＨプローブを設計する。それぞれのプローブは１つの対立遺伝子配列と正確な相同性を有するはずであり、したがってこの範囲のプローブは、全ての知られている他の対立遺伝子配列を識別することができる。それぞれのプローブは標的ＤＮＡとハイブリダイズする。適切なプローブ設計およびハイブリダイゼーション条件では、プローブと標的ＤＮＡとの間の一塩基のミスマッチがハイブリダイゼーションを妨げるはずである。このようにして、他のプローブの１つのみが、同型であるかあるいは対立遺伝子が同型である標的サンプルとハイブリダイズするはずである。異型であるかあるいは２つの対立遺伝子が異型であるサンプルは、２つの他のプローブの両方とハイブリダイズするはずである。
【００９７】
ＡＳＨマーカーは優性マーカーとして使用され、この場合ただ１つの対立遺伝子の存在または不在が、ただ１つのプローブによってハイブリダイゼーションまたはハイブリダイゼーションの欠如から決定される。他の対立遺伝子は、ハイブリダイゼーションの欠如から推測することができる。ＡＳＨプローブおよび標的分子は場合によってはＲＮＡまたはＤＮＡであり、標的分子はプローブと相補的である配列を超える任意の長さのヌクレオチドであり、プローブはＤＮＡ標的のいずれかの鎖とハイブリダイズするように設計されており、プローブは様々な厳しいハイブリダイゼーション条件などに適合するようにサイズが様々である。
【００９８】
ＰＣＲによって、比較的小体積で低濃度の核酸からのＡＳＨの標的配列の増幅が可能である。他の場合、ゲノムＤＮＡからの標的配列を制限エンドヌクレアーゼで消化し、ゲル電気泳動によってサイズにより分離する。膜の表面と結合した標的配列とのハイブリダイゼーションが典型的には起こり、あるいは、米国特許第５，４６８，６１３号中に記載されたのと同様に、ＡＳＨプローブ配列を膜と結合させることが可能である。
【００９９】
一実施形態では、ＰＣＲを使用してゲノムＤＮＡから核酸断片（アンプリコン）を増幅させること、ドット−ブロット形式でアンプリコン標的ＤＮＡを膜に移すこと、標識したオリゴヌクレオチドプローブとアンプリコン標的をハイブリダイズさせること、およびオートラジオグラフィーによりハイブリダイゼーションドットを観察することによって、ＡＳＨデータを典型的には得る。
【０１００】
一塩基多型（ＳＮＰ）は、単一ヌクレオチドに基づいて区別される共通の配列からなるマーカーである。典型的にはこの違いは、例えばアクリルアミドゲル上でのＳＮＰを含むアンプリコンの示差的な移動パターンによって検出する。しかしながら、他の形態の検出、ハイブリダイゼーションなど、例えばＡＳＨ、またはＲＦＬＰ分析あるいはアレイに基づく検出も適切である。
【０１０１】
アイソザイムマーカーを遺伝子マーカーとして使用して、例えば本明細書のマーカーと連鎖するアイソザイムマーカーを追跡することができる。アイソザイムは、それらのアミノ酸、したがってそれらの核酸配列が互いに異なる多形の酵素である。幾つかのアイソザイムは、わずかに異なるサブユニットを含むマルチマー酵素である。他のアイソザイムはマルチマーまたはモノマーのいずれかであるが、アミノ酸配列中の異なる部位でプロ酵素から切断されている。アイソザイムはタンパク質レベルで特徴付けおよび分析することができ、あるいは代替的に、核酸レベルで異なるアイソザイムを決定することができる。このような場合、本明細書に記載する核酸に基づく方法のいずれかを使用して、アイソザイムマーカーを分析することができる。
【０１０２】
核酸増幅に関する他の詳細
記したように、ＰＣＲおよびＬＣＲなどの核酸増幅技法は当技術分野でよく知られており、本発明に適用して、マーカー遺伝子座を含む核酸などの当該の核酸を増幅および／または検出することができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ−レプリカーゼ増幅および他のＲＮＡポリメラーゼ介在技法（例えば、ＮＡＳＢＡ）を含めたこのようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ法によって当業者が実施するのに充分な技法の例は、前に記した参照文献、例えばＩｎｎｉｓ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ａｕｓｕｂｅｌ、およびＢｅｒｇｅｒ中で見られる。他の詳細はＭｕｌｌｉｓら、（１９８７年）米国特許第４，６８３，２０２号；Ａｒｎｈｅｉｍ  ＆  Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０年１０月１日）Ｃ＆ＥＮ３６〜４７頁；Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  ＮＴＨ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１年）３、８１〜９４頁；（Ｋｗｏｈら、（１９８９年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６、１１７３頁；Ｇｕａｔｅｌｌｉら、（１９９０年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７、１８７４頁；Ｌｏｍｅｌｉら、（１９８９年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ３５、１８２６頁；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１、１０７７〜１０８０頁；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ（１９９０年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８、２９１〜２９４頁；ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ、（１９８９年）Ｇｅｎｅ４、５６０頁；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら、（１９９０年）Ｇｅｎｅ８９、１１７頁、およびＳｏｏｋｎａｎａｎおよびＭａｌｅｋ（１９９５年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１３：５６３〜５６４頁中で見られる。本明細書の多型（図１および／または２）と連鎖した遺伝子のポジショナルクローニングの文脈において有用である、ＰＣＲにより多量の核酸を増幅する改良法は、Ｃｈｅｎｇら、（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ、３６９：６８４頁、およびその中の参照文献中にさらに要約されており、その中で４０ｋｂまでのＰＣＲアンプリコンが生成する。長期ＰＣＲ用の方法は、例えば「Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ｆｏｒ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｐａｉｒｓ」という表題の２００２年１月９日に出願された米国特許出願第１０／０４２，４０６号、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」という表題の２００２年９月９日に出願された米国特許出願第１０／２３６，４８０号、および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」という表題の２００４年５月２５日に発行された米国特許第６，７４０，５１０号中に開示されている。（２００３年１月１４日に出願された）ＵＳＳＮ１０／３４１，８３２も、短期ＰＣＲを実施するためのプライマー選択法に関する詳細を与える。
【０１０３】
タンパク質発現産物の検出
図１および／または２中に記す遺伝子によってコードされるタンパク質などのタンパク質は、本明細書の当該の表現型と相関するマーカーを含む核酸を含めた核酸によってコードされる。ＲＮＡへのタンパク質へのＤＮＡの発現（転写および／または翻訳）を含めた、分子生物学の基本範例の記載に関しては、Ａｌｂｅｒｔｓら、（２００２年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、第４版、Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓ，  Ｉｎｃ．、ＩＳＢＮ：０８１５３３２１８１（「Ａｌｂｅｒｔｓ」）、およびＬｏｄｉｓｈら、（１９９９年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、Ｗ  Ｈ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ、ＩＳＢＮ：０７１６７３７０６Ｘ（「Ｌｏｄｉｓｈ」）を参照。したがって、図１および／または２中の遺伝子に対応するタンパク質は、例えば個体または集団間の異なるタンパク質イソ型を検出することによって、あるいは当該のこのようなタンパク質（例えば、図１および／または２の遺伝子産物）の示差的存在、不在または発現レベルを検出することによって、マーカーとして検出することができる。
【０１０４】
様々なタンパク質検出法が知られており、これらを使用してマーカーを区別することができる。前に記した様々な参照文献以外に、例えばＲ．Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９８２年）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８２巻：  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．  （１９９０年）；Ｓａｎｄａｎａ（１９９７年）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．；  Ｂｏｌｌａｇら、（１９９６年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、第２版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、ＮＹ；  Ｗａｌｋｅｒ（１９９６年）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ、Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ（１９９０年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ；  Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ；  Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ第３版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、ＮＹ；  Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｙｄｅｎ（１９９８年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第２版、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、ＮＹ；およびＷａｌｋｅｒ（１９９８年）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｎ  ＣＤ−ＲＯＭ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ；およびこれらの中に列挙された参照文献中に述べられた方法を含めた、様々なタンパク質の操作法および検出法が当技術分野でよく知られている。タンパク質の精製および検出法に関する他の詳細は、Ｓａｔｉｎｄｅｒ  Ａｈｕｊａ編、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２０００年）中に見ることができる。
【０１０５】
多くのタンパク質を同時に検出する「プロテオーム」検出法が記載されてきている。これらは様々な多次元電気泳動法（例えば、２次元ゲル電気泳動）、質量分析に基づく方法（例えばＳＥＬＤＩ、ＭＡＬＤＩ、エレクトロスプレーなど）、または表面プラズモン共鳴法を含み得る。例えばＭＡＬＤＩでは、サンプルは通常適切なマトリクスと混合させ、プローブの表面に置き、レーザー脱離／イオン化によって調べる。ＭＡＬＤＩの技法は当技術分野でよく知られている。例えば、米国特許第５，０４５，６９４号（Ｂｅａｖｉｓら）、米国特許第５，２０２，５６１号（Ｇｌｅｉｓｓｍａｎｎら）、および米国特許第６，１１１，２５１号（Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ）を参照。同様に、ＳＥＬＤＩに関しては、第一の等分試料を固相担体と結合した（例えば、支持体と結合した）吸着剤と接触させる。支持体は典型的には、気相イオン分光計と呼掛け信号の関係で位置することができるプローブ（例えば、バイオチップ）である。ＳＥＬＤＩもよく知られている技法であり、プロテオーム診断適用されている。例えば、Ｉｓｓａｑら、（２００３年）「ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ」  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ７５：１４９Ａ〜１５５Ａ頁を参照。
【０１０６】
一般に、前述の方法を使用してタンパク質の異なる形（対立遺伝子）を検出することができ、かつ／あるいはこれらを使用して、個体、家族、系、集団などの間の（対立遺伝子の差異が原因である可能性がある）タンパク質の異なる発現レベルを検出することができる。発現レベルの違いは、環境因子を調節するとき、コードされる示差的に発現されるタンパク質自体が同一である場合でも、当該の遺伝子のＱＴＬにおける異なる対立遺伝子を示し得る。これは例えば、非コード領域、例えば遺伝子発現を調節するプロモーターまたはエンハンサーなどの領域中に、多数の対立遺伝子形の遺伝子が存在する場合に起こる。したがって、示差的発現レベルの検出は、対立遺伝子の違いを検出する方法として使用することができる。
【０１０７】
本発明の他の態様では、乳癌の表現型と関係がある核酸を含む、それと連鎖不均衡である、あるいはその制御下にある遺伝子は、示差的な対立遺伝子の発現を示す可能性がある。本明細書で使用する「示差的な対立遺伝子の発現」は、細胞中に存在する１つの遺伝子の多数の対立遺伝子の対立遺伝子の発現の定性的差異と定量的差異の両方を指す。このように、示差的な対立遺伝子の発現を示す遺伝子は、同じ細胞／組織中の第二の対立遺伝子と比較して、異なる時間またはレベルで発現される１つの対立遺伝子を有し得る。例えば、乳癌の表現型と関係がある対立遺伝子は、両者が同じ遺伝子の対立遺伝子であり同じ細胞／組織中に存在する場合でさえ、乳癌の表現型と関係がない対立遺伝子より高いまたは低いレベルで発現される可能性がある。示差的な対立遺伝子の発現および分析法は、いずれも「Ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ」という表題である２００３年５月１３日に出願された米国特許出願第１０／４３８，１８４号および２００４年５月１２日に出願された米国特許出願第１０／８４５，３１６号中に詳細に開示されている。乳癌の表現型と関係がある１つ以上の核酸、またはその断片、誘導体、多型、変異体または相補体の示差的な対立遺伝子の発現パターンの検出は乳癌に対する易罹患性／耐性の予後判定および診断であり、同様に、乳癌の表現型と関係がある１つ以上の核酸、またはその断片、誘導体、多型、変異体または相補体の示差的な対立遺伝子の発現パターンの検出は、乳癌および乳癌処置の結果の予後判定および診断である。
【０１０８】
スクリーニングに適したマーカー型に関する他の詳細
本明細書の表現型との相関関係に関してスクリーニングされる生物学的マーカーは、スクリーニングによって検出することができる任意のマーカー型、例えば（例えばＳＮＰと同様の）遺伝子座の対立遺伝子変異体などの遺伝子マーカー、発現マーカー（例えば、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現または量）などであってよい。
【０１０９】
本発明の方法中で増幅、転写、翻訳および／または検出される当該の核酸は、ほぼ任意の核酸であってよいが、ヒト供給源由来の核酸が、疾患の診断および臨床用途と関係があるマーカーの検出と特に関係がある。図１および／または２の遺伝子／タンパク質を含めた、多くの核酸およびアミノ酸（そこから逆翻訳によって核酸配列を誘導することができる）の配列が利用可能である。知られている核酸の一般的な配列保存場所には、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪおよびＮＣＢＩがある。他の保存場所は、インターネットを検索することによって容易に同定することができる。増幅、転写、翻訳および／または検出される核酸は、ＲＮＡ（例えば増幅がＲＴ−ＰＣＲまたはＬＣＲを含む場合、Ｖａｎ−Ｇｅｌｄｅｒ  Ｅｂｅｒｗｉｎｅ反応またはＲｉｂｏ−ＳＰＩＡ）またはＤＮＡ（例えば、増幅ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、あるいはさらにその任意の類似体（例えば、合成核酸またはその類似体の検出用、例えば、当該のサンプルが人造核酸を含む、あるいは人造核酸を誘導または合成するために使用される場合）であってよい。個体または集団間の核酸配列または発現レベルの任意の変化は、マーカー、例えば突然変異、多型、一塩基多型（ＳＮＰ）、対立遺伝子、イソ型、ＲＮＡまたはタンパク質の発現などとして検出することができる。乳癌の表現型と相関する可能性があるマーカーとして、配列、発現レベルまたは遺伝子のコピー数の変化を検出することができる。
【０１１０】
例えば本発明の方法は、患者由来、例えば患者の体液（血液、唾液、尿など）、生検、組織、および／または排泄物由来のサンプルを、当該のマーカー核酸に関してスクリーニングする際に有用である。したがって、組織生検、大便、喀痰、唾液、血液、リンパ液、涙、汗、尿、膣分泌液、射精液などは、本発明の方法により核酸に関して容易にスクリーニングすることができ、適切な核酸を含むほぼ任意の当該の組織をスクリーニングすることができる。これらのサンプルは典型的には、標準的な医学的試験法によって患者から、インフォームドコンセント後に採取する。
【０１１１】
マーカーを含む核酸の増幅および／または検出前に、任意の利用可能な方法、例えばＢｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２巻  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）、１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００１年（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）；および／またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．の間の合作（２００２年中に増補）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」））中に教示された方法によって、サンプルから核酸を場合によっては精製する。細胞または他のサンプルから核酸を精製するための多量のキットも市販されている（例えば、いずれもＰｈａｒｍａｃｉａ  ＢｉｏｔｅｃｈからのＥａｓｙＰｒｅｐＴＭ、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐＴＭ；ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＳｔｒａｔａＣｌｅａｎＴＭ；およびＱｉａｇｅｎからのＱＩＡｐｒｅｐＴＭを参照）。あるいは、例えば等分および／または希釈後に、サンプルを単に増幅または検出に直接施すことができる。
【０１１２】
マーカーの例は、多型、一塩基多型、サンプル中の１つ以上の核酸の存在、サンプル中の１つ以上の核酸の不在、１つ以上のゲノムＤＮＡ配列の存在、１つ以上のゲノムＤＮＡ配列の不在、１つ以上のｍＲＮＡの存在、１つ以上のｍＲＮＡの不在、１つ以上のｍＲＮＡの発現レベル、１つ以上のタンパク質の存在、１つ以上のタンパク質の発現レベル、および／または前述のいずれかから誘導されるデータまたはこれらの組合せを含むことができる。利用可能な方法を使用して、例えば高密度、高スループットマーカーマッピングを与えるアレイ技術を使用して、ほぼ任意の数のマーカーを検出することができる。したがって、少なくとも約１０、１００、１，０００、１０，０００、あるいはさらに１００，０００以上の遺伝子マーカーを、第一および／または第二集団中の関連表現型との相関関係に関して、同時または連続形式（あるいはこれらの組合せ）で試験することができる。望ましくはマーカーの組合せを試験して、例えば表現型と相関する集団中の遺伝子の組合せまたは発現パターンの組合せを同定することもできる。
【０１１３】
記したように、検出される生物学的マーカーは、任意の検出可能な生物学的要素であってよい。一般に検出されるマーカーには、遺伝子マーカー（例えば、ゲノムＤＮＡまたはその発現産物中に存在するＤＮＡ配列マーカー）および（遺伝的にコードされる因子、環境因子、あるいは両方を反映し得る）発現マーカーがある。マーカーが発現マーカーである場合、方法は第一の個体または集団に関する第一の発現プロファイル（例えば、１つ以上の発現マーカーの、例えば一組の発現マーカー）を測定すること、および第一の発現プロファイルと第二の個体または集団に関する第二の発現プロファイルを比較することを含むことができる。この実施例では、発現マーカーと個々の表現型との関連付けは、第一または第二の発現プロファイルと当該の表現型との関連付けを含むことができる。
【０１１４】
プローブ／プライマー合成法
一般に、プローブ、プライマー、分子指標、ＰＮＡ、ＬＮＡ（固定核酸）などを含めたオリゴヌクレオチドを作製するための合成法はよく知られている。例えばＮｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒら、（１９８４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１２：６１５９〜６１６８頁中に記載されたのと同様に、例えば市販の自動合成装置を使用して、例えば、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ．、２２（２０）：１８５９〜１８６２頁により記載された固相ホスホラミダイトトリエステル法によって、オリゴヌクレオチドを化学的に合成することができる。修飾オリゴヌクレオチドを含めたオリゴヌクレオチドは、当業者に知られている様々な市販の供給元から注文することもできる。多くのオリゴ合成サービスの供給業者が存在し、したがってこれは広く利用可能な技術である。Ｔｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ｍｅｒｅ＠ｏｌｉｇｏｓ．ｃｏｍ）、Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ｗｗｗ．ｇｅｎｃｏ．ｃｏｍ）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．（ｗｗｗ．ｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍ）、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）および多くの他の供給元などの任意の様々な市販の供給元から、任意の核酸を特別注文することができる。同様に、ＰｅｐｔｉｄｏＧｅｎｉｃ（ｐｋｉｍ＠ｃｃｎｅｔ．ｃｏｍ）、ＨＴＴ  Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ｉｎｃ．（ｈｔｉｂｉｏ．ｃｏｍ）、ＢＭＡ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ（Ｕ．Ｋ．）、Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｉｎｃ．、および多くの他の供給元などの任意の様々な市販の供給元から、ＰＮＡを特別注文することができる。
【０１１５】
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏマーカー検出
幾つかの実施形態では、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ法を使用して当該のマーカー遺伝子座を検出することができる。例えば、当該のマーカー遺伝子座を含む核酸の配列はコンピュータに保存することができる。望ましいマーカー遺伝子座配列またはその相同体は、例えばＢＬＡＳＴなどの容易に利用可能なプログラムによって与えられる適切な核酸検索アルゴリズム、あるいはさらに単なるワープロを使用して同定することができる。完全なヒトゲノムがシークエンスされており、したがって、配列の情報を使用してマーカー領域、隣接核酸などを同定することができる。
【０１１６】
マーカー検出用の増幅プライマー
幾つかの好ましい実施形態では、適切なＰＣＲに基づく検出法を使用して本発明の分子マーカーを検出し、この場合ＰＣＲアンプリコンのサイズまたは配列は、マーカー（例えば、特定のマーカー対立遺伝子）の不在または存在を示す。これらの型の方法では、ＰＣＲプライマーを多型マーカー領域と隣接する保存領域とハイブリダイズさせる。
【０１１７】
本発明と共に使用するのに適したプライマーは、任意の適切な方法を使用して設計することができる。本発明が任意の特定のプライマーまたはプライマー対に限られるとは考えられない。例えば、公的に利用可能である配列情報を考慮して、例えばＬＡＳＥＲＧＥＮＥ（登録商標）などの任意の適切なソフトウェアプログラムを使用してプライマーを設計することができる。本明細書で同定した多型の隣接配列は公的に利用可能であり、したがって、適切な増幅プライマーを充分に理解されている塩基対形成の法則に基づいて構築することができる。任意のアンプリコンの配列を、例えばハイブリダイゼーション、アレイハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＬＣＲなどによって前で既に論じたのと同様に検出することができる。
【０１１８】
幾つかの実施形態では、本発明のプライマーを放射標識、あるいは（例えば、非放射性蛍光タグを使用する）任意の適切な手段により標識して、任意の他の標識ステップまたは可視化ステップ無しで、増幅反応後に異なるサイズのアンプリコンを迅速に可視化することができる。幾つかの実施形態では、プライマーは標識せず、そのサイズ解像後、例えばアガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動後に、アンプリコンを可視化する。幾つかの実施形態では、サイズ解像後のＰＣＲアンプリコンの臭化エチジウム染色は、異なるサイズのアンプリコンの可視化を可能にする。
【０１１９】
本発明のプライマーが、任意の特定サイズのアンプリコンの作製に限られるとは考えられない。例えば、本明細書のマーカー遺伝子座および対立遺伝子を増幅させるために使用するプライマーは、関連遺伝子座の全領域、またはその任意の小区域の増幅に限られない。プライマーは、検出用の任意の適切な長さのアンプリコンを生成することができる。幾つかの実施形態では、マーカー増幅によって少なくとも２０ヌクレオチド長、あるいは代替的に少なくとも５０ヌクレオチド長、あるいは代替的に少なくとも１００ヌクレオチド長、あるいは代替的に少なくとも２００ヌクレオチド長のアンプリコンが生じる。任意のサイズのアンプリコンを、本明細書に記載する様々な技術を使用して検出することができる。塩基組成またはサイズの違いは、電気泳動などの従来の方法によって検出することができる。
【０１２０】
ポジショナルクローニング用のマーカーの検出
幾つかの実施形態では、核酸プローブを使用して、マーカー配列を含む核酸を検出する。乳癌の表現型を決定する際のそれらの役割以外に、このようなプローブを例えばポジショナルクローニングにおいて使用して、マーカーヌクレオチド配列と連鎖したヌクレオチド配列を単離することもできる。本発明の核酸プローブが、任意の特定サイズに限られるとは考えられない。幾つかの実施形態では、核酸プローブは少なくとも２０ヌクレオチド長、あるいは代替的に少なくとも５０ヌクレオチド長、あるいは代替的に少なくとも１００ヌクレオチド長、あるいは代替的に少なくとも２００ヌクレオチド長である。
【０１２１】
検出する標識に応じて、例えばオートラジオグラフィー、蛍光撮影または他の同様の検出技法を使用して、ハイブリダイズしたプローブを検出する。特異的ハイブリダイゼーションのプロトコルの例は当技術分野で広く利用可能であり、例えば、いずれも本明細書中のＢｅｒｇｅｒ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、およびＡｕｓｕｂｅｌを参照。
【０１２２】
トランスジェニック細胞の作製
本発明は、本発明により同定したＱＴＬに対応する核酸で形質転換した細胞も提供する。例えば、このような核酸は、乳癌の表現型のＱＴＬに対応するかあるいはそれと連鎖する染色体部分（例えば、ゲノム断片）、遺伝子、遺伝子をコードするＯＲＦおよび／またはｃＤＮＡを含む。さらに本発明は、乳癌の表現型に影響を与えるポリペプチドの生成を提供する。これは例えば、乳癌に影響を与えるのに、かつトランスジェニック細胞を作製するのに有用である。これらの細胞は関連表現型に影響を与える明確な遺伝子を有する商業上有用な細胞系を与え、したがって表現型の潜在的モジュレーターのスクリーニング、および当該の各遺伝子に関する作用機構の基礎研究に関する基盤を与える。さらに、遺伝子療法を使用して、個体またはそれらの集団中に望ましい遺伝子を導入することができる。このような遺伝子療法を使用して、個体によって示される障害に関する処置を与えることができ、あるいは予防措置として使用して、リスクのある個体におけるこのような障害の進行を妨げることができる。
【０１２３】
核酸のクローニングおよび操作ならびにコードポリペプチドの生成に関する、分子生物学の技法を記載する一般的な教本には、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１５２巻  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）、１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００１年（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．の間の合作（２００４年以降に増補）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」））がある。これらの教本は、突然変異誘発、ベクター、プロモーターの使用、および例えば当該の核酸、例えば遺伝子、マーカー遺伝子座、マーカープローブ、マーカー遺伝子座と共に分離するＱＴＬなどを含むクローンの作製に関する、多くの他の関連する話題を記載する。
【０１２４】
宿主細胞は、例えばクローニングベクター、シャトルベクターまたは発現ベクターであってよい本発明のベクター（例えば、ＱＴＬに由来するかあるいはＱＴＬと関係がある遺伝子またはＯＲＦを含む発現ベクターなどのベクター）を用いて、遺伝子工学処理する（例えば形質導入、トランスフェクト、形質転換など）。このようなベクターは、例えばプラスミド、ファージミド、アグロバクテリウム、ウイルス、裸ポリヌクレオチド（直鎖状または環状）、または複合ポリヌクレオチドの形である。ベクターは特に伝播および増殖の目的で細菌に導入することができる。核酸導入法に関する他の詳細は、以下のＳａｍｂｒｏｏｋ、ＢｅｒｇｅｒおよびＡｕｓｕｂｅｌ中に見られる。本発明の核酸を宿主細胞中に導入する方法は本発明にとって重要でなく、本発明が外来遺伝物質を宿主細胞中に導入する任意の特定の方法に限られるとは考えられない。したがって、細胞またはプロトプラスト中への核酸の有効な導入をもたらす、例えば本明細書に与える方法だけには限らないが、これらを含めた任意の適切な方法を使用することができ、本発明と共に用途が見出される。
【０１２５】
工学処理した宿主細胞は、例えばプロモーター活性化などの活性化、または形質転換体の選択に関して必要に応じて修飾した、従来の栄養培地中で培養することができる。いずれも以下のＳａｍｂｒｏｏｋ、ＢｅｒｇｅｒおよびＡｕｓｕｂｅｌ以外に、Ａｔｌａｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ  （編）  Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３年）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬおよびＳｉｇｍａ−  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｉｎｃ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）（「Ｓｉｇｍａ−ＬＳＲＣＣＣ」）からのＬｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ（２００４年）などの市販の文献が、他の詳細を与える。
【０１２６】
マーカーと表現型との関連付け
本発明の一態様は、図１および／または２中に記した多型と乳癌の表現型との間の相関関係の記載である。これらの相関関係の理解を本発明において使用して、個体またはサンプルが有すると測定される多型のセットに関する情報とそれらがおそらく示す表現型を関連付けることができる。さらに、１つ以上の異なる遺伝子における対立遺伝子の組合せを考慮する高次の相関関係も、表現型との関連付けのために評価することができる。
【０１２７】
これらの関連付けは、対立遺伝子と表現型、あるいは対立遺伝子の組合せと表現型の組合せとの間の関係を同定することができる任意の方法によって実施することができる。例えば、図１および／または２中の遺伝子または遺伝子座における対立遺伝子は、１つ以上の乳癌の表現型と関連付けることができる。最も典型的には、これらの方法は、多型の対立遺伝子と乳癌の表現型との間の相関関係を含む索引表を参照することを含む。この表は多数の対立遺伝子−表現型の関係に関するデータを含むことができ、例えば主成分分析、発見的アルゴリズムなどの統計手段を使用することによって、多数の対立遺伝子−表現型の関係の追加的または他の高次影響を考慮することができる。
【０１２８】
マーカーと表現型との関連付けは、関連付けに関する１つ以上の統計的検定の実施を場合によっては含む。多くの統計的検定が知られており、大部分は分析を容易にするためにコンピュータにより実行される。表現型形質と生物学的マーカーとの間の関係／相関関係を測定する様々な統計法が知られており、本発明に適用することができる。話題への導入のため、Ｈａｒｔｌ（１９８１年）Ａ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｏｆ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ  ＩＳＢＮ：０−０８７８９３−２７１−２を参照。様々な適切な統計モデルが、ＬｙｎｃｈおよびＷａｌｓｈ（１９９８年）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｒａｉｔｓ．Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ  ＭＡ  ＩＳＢＮ０−０８７８９３−４８１−２中に記載されている。これらのモデルは、例えば遺伝子型の値と表現型の値との間の相関関係を与え、表現型に対する遺伝子座の影響を特徴付け、環境と遺伝子型との間の関係を選別し、遺伝子の優性または浸透性を測定し、母方および他の後成的影響を測定し、（主成分分析、即ち「ＰＣＡ」によって）分析中に主成分を測定することなどができる。これらの教本中に列挙された参照文献は、マーカーと表現型とを関連付けるための統計モデルに関する多量の他の詳細を与える。
【０１２９】
相関関係を測定するための標準的な統計法以外に、遺伝的アルゴリズムの使用などによりパターン認識およびトレーニングによって相関関係を測定する他の方法を使用して、マーカーと表現型との間の相関関係を測定することができる。多数の対立遺伝子と多数の表現型との間の高次の相関関係を同定するとき、これは特に有用である。例示のため、ニューラルネットワークアプローチを、遺伝的情報と表現型の結果との間の相関関係を測定する構造−機能データスペースモデルの発見的開発のために、遺伝的アルゴリズム型プログラミングと結びつけることができる。例えば、ＮＮＵＧＡ（Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｕｓｉｎｇ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ）は（例えば、ニューラルネットワークと遺伝的アルゴリズムが結びついたワールドワイドウエブｃｓ．ｂｇｕ．ａｃ．ｉｌ／−ｏｍｒｉ／ＮＮＵＧＡで）利用可能なプログラムである。ニューラルネットワークへの導入は、例えばＫｅｖｉｎ  Ｇｕｒｎｅｙ、Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ、ＵＣＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９年）およびワールドワイドウエブｓｈｅｆ．ａｃ．ｕｋ／ｐｓｙｃｈｏｌｏｇｙ／ｇｕｒｎｅｙ／ｎｏｔｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ中で見ることができる。他の有用なニューラルネットワークの参照文献には、遺伝的アルゴリズムに関して前に記した参照文献、および例えばＢｉｓｈｏｐ、Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５年）、およびＲｉｐｌｅｙら、Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５年）がある。幾つかの統計分析を含めた例示的なデータセットを示す２つの表を、図１および／または２中に示す。
【０１３０】
相関関係、分析の主成分、ニューラルネットワークモデリングなどを使用し確定するためのデータ分析アプリケーションを理解する際に有用である他の参照文献には、例えばＨｉｎｃｈｌｉｆｆｅ、Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９６年）、ＧｉｂａｓおよびＪａｍｂｅｃｋ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｓｋｉｌｌｓ、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ（２００１年）、Ｐｅｖｚｎｅｒ、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｔｈｅ  ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ（２０００年）、Ｄｕｒｂｉｎら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８年）、およびＲａｓｈｉｄｉおよびＢｕｅｈｌｅｒ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ  Ｂａｓｉｃｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＬＣ（２０００年）がある。
【０１３１】
如何なる場合も、標準的なプログラミング法によって、あるいは例えば多変量データ解析の遺伝的アルゴリズム、インタラクティブな視覚化、変数選択、ニューラルネットワークおよび統計モデリングなどに適用することができるパターン認識のソフトウェアを提供する（例えば、Ｐａｒｔｅｋ  Ｐｒｏ  ２０００  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを提供する）、Ｐａｒｔｅｋ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ；  ｗｗｗ．ｐａｒｔｅｋ．ｃｏｍ）から市販されている前に記したソフトウェアパッケージを例えば含めた、このような統計分析を実施するための任意の様々な「既製の」ソフトウェアパッケージを使用することによって、ほぼ任意の統計検定をコンピュータが実行するモデルに適用することができる。例えば主成分分析（ＰＣＡ）マッピングマッピングスキャタープロットおよびバイプロット、多次元スケーリング（ＭＤＳ）多次元スケーリング（ＭＤＳ）マッピングスキャタープロット、スタープロットなどによって、関係を分析することができる。相関関係分析を実施するために利用可能なソフトウェアにはＳＡＳ、ＲおよびＭａｔｈＬａｂがある。
【０１３２】
多型または発現パターンであろうとマーカーを、任意の様々な遺伝的分析に使用することができる。例えば、ひとたびマーカーを同定した後、本発明の場合と同様に、幾つかの異なるアッセイにおいて関連試験用にマーカーを使用することができる。例えば、これらのマーカーを検索するマイクロアレイ用にプローブを設計することができる。他の例示的なアッセイには、例えば前に記載したＴａｑｍａｎアッセイおよび分子指標アッセイ、ならびに従来のＰＣＲおよび／またはシークエンシング技法がある。
【０１３３】
関連試験に関する他の詳細は、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」という表題の２００２年３月２６日に出願された１０／１０６，０９７、「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」という表題の２００２年１月７日に出願された１０／０４２，８１９、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」という表題の２００２年１０月３１日に出願された１０／２８６，４１７、「Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」という表題の２００４年１月３０日に出願された１０／７６８，７８８、２００３年５月２８日に出願された「Ｌｉｖｅｒ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」という表題の１０／４４７，６８５、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ（個体の遺伝子型を決定するための方法）」という表題の２００４年１０月２０日に出願された１０／９７０，７６１、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」という表題の２００４年９月３０日に出願された１０／９５６，２２４において見ることができる。
【０１３４】
幾つかの実施形態では、マーカーのデータを使用して関連試験を実施して、マーカーと表現型との間の相関関係を示す。これは当該の表現型を有する個体（すなわち、当該の表現型を示す個体または集団）におけるマーカーの特徴を決定すること、およびこれらの個体における対立遺伝子頻度またはマーカーの他の特徴（発現レベルなど）を個体の対照群における対立遺伝子頻度または他の特徴と比較することによって実施することができる。このようなマーカーの決定はゲノム全般規模で実施することができ、あるいはゲノムの特定領域（例えば、当該のハプロタイプ群）に焦点を当てることができる。一実施形態では、図１および／または２中の遺伝子または遺伝子座と連鎖しているマーカーを、１つ以上の特定の乳癌素因の表現型との相関関係に関して評価する。
【０１３５】
本明細書に開示する本発明の方法の他の実施形態以外に、幾つかの方法は表現型の「分離」をさらに可能にする。すなわち、個々の表現型は２つ以上の異なる遺伝的基盤から生じる可能性がある（および典型的にはそうである）。例えば、一個体における易罹患性の表現型は、図１および／または２中の遺伝子の「欠陥」の結果である可能性があり（あるいは単に個々の対立遺伝子−易罹患性の表現型に関する「欠陥」は文脈依存性である、例えば、所与の環境中の個体における表現型が望ましいかあるいは望ましくないかどうか）、一方で異なる個体における同じ基盤の表現型は、図１および／または２中の多数の遺伝子の多数の「欠陥」の結果である可能性がある。したがって、（例えば、ゲノムまたはハプロタイプ群におけるスキャニングと同様の）複数のマーカーのスキャニングは、類似の（または段階的）表現型に関する様々な遺伝的基盤の分離を可能にする。
【０１３６】
前の段落中に記載したように、関連試験を実施する１つの方法は、当該の表現型を有する個体（「症例群」）におけるマーカーの対立遺伝子頻度（または発現レベル）と、個体の対照群における対立遺伝子頻度を比較することである。一方法では、情報を与えるＳＮＰを使用してＳＮＰハプロタイプパターンの比較を行う（「情報を与えるＳＮＰ」はゲノムまたはハプロタイプ群中のＳＮＰまたは（２つ以上の）ＳＮＰの小集団などの遺伝的ＳＮＰマーカーであり、これによって１つのＳＮＰまたはゲノムまたはハプロタイプパターンを他のＳＮＰ、ゲノムまたはハプロタイプパターンと区別する傾向がある）。情報を与えるＳＮＰを使用する手法は、当技術分野で知られている他の全ゲノムスキャニングまたは遺伝子型決定法に優る利点を有する、というのは各個体のゲノムの全３０億の塩基を読み取る、あるいはさらに見つけることができる３〜４百万の一般的なＳＮＰを読み取る代わりに、サンプル集団由来の情報を与えるＳＮＰのみを検出する必要がある。これらの個々の情報を与えるＳＮＰの読み取りは、前に記載したように、特定の実験集団から統計上正確な関連データを抽出することができるほど充分な情報をもたらす。
【０１３７】
したがって、遺伝的関係を測定する一方法の実施形態では、情報を与えるＳＮＰの対立遺伝子頻度を、その表現型を示さない対照集団のゲノムに関して測定する。情報を与えるＳＮＰの対立遺伝子頻度は、その表現型を示す集団のゲノムに関しても測定する。情報を与えるＳＮＰの対立遺伝子頻度を比較する。対立遺伝子頻度の比較は、例えば各集団中のそれぞれの情報を与えるＳＮＰの位置における対立遺伝子頻度（全数の対立遺伝子で割った集団中の特定の対立遺伝子の事例の数）を測定すること、およびこれらの対立遺伝子頻度を比較することによって行うことができる。対照対症例集団／群の間で発生する対立遺伝子頻度の違いを示す情報を与えるＳＮＰを、分析用に選択する。ひとたび情報を与えるＳＮＰを選択した後、情報を与えるＳＮＰを含むＳＮＰハプロタイプ群を同定し、次いで表現型と関係がある当該のゲノム領域を同定する。例えば薬剤発見標的として、あるいは診断マーカーとして使用するためのゲノム領域は、当技術分野で知られている遺伝的または任意の生物学的方法によって分析することができる。
【０１３８】
乳癌の表現型を同定するためのシステム
前述の関連付けを実施するためのシステムも本発明の特徴である。典型的にはシステムは、（直接、あるいは例えば発現レベルのいずれかによって検出した）対立遺伝子の存在または不在と予想表現型とを関連付けるシステム指示書を含むはずである。システム指示書は、対立遺伝子の配列または発現レベルに関して検出した情報と、対立遺伝子と関連表現型との間の相関関係を含むデータベースを比較することができる。前に記したように、このデータベースは多次元であってよく、したがって対立遺伝子の組合せと関連表現型との間の高次の関係を含む。これらの関係は任意の数の索引表中に、例えば集計表（例えばＥｘｃｅｌＴＭ集計表）またはＡｃｃｅｓｓＴＭ、ＳＱＬＴＭ、ＯｒａｃｌｅＴＭ、ＰａｒａｄｏｘＴＭなどのデータベース、または同様のデータベースの形をとらせて保存することができる。システムは例えば自動的またはユーザインターフェースによって、対立遺伝子の検出情報に関するサンプル特異的な情報をインプットするため、およびその情報を索引表と比較するための設備を含む。
【０１３９】
場合によっては、システム指示書は、任意の検出した対立遺伝子の情報と関係がある診断情報、例えば関連対立遺伝子を有する対象は、特定の表現型を有するという診断を受け入れるソフトウェアも含むことができる。このソフトウェアは、索引表の精度を改善するかつ／あるいはシステムにより索引表を解釈するためのこのようなインプットした関係を使用する、ヒューリスティック性であってよい。ニューラルネットワーク、マルコフモデリング、および他の統計分析を含めた様々なこのような手法は前に記載している。
【０１４０】
本発明は、１つ以上の検出可能な遺伝子マーカーを検出するためのデータ収集モジュール（例えば、１つ以上の生物分子プローブ、検出器、流体処理装置などを含む１つ以上のアレイ）を提供する。このようなデータ収集モジュールの生物分子プローブは、生物学的マーカーを検出するのに適した任意のもの、例えばオリゴヌクレオチドプローブ、タンパク質、アプタマー、抗体などを含むことができる。これらは例えばサンプルを収集するため、サンプルを希釈および等分するため、マーカー物質（例えば、核酸またはタンパク質）を精製するため、マーカー核酸を増幅するため、増幅させたマーカー核酸を検出するためなどの、サンプル処理装置（例えば、流体処理装置）、ロボット、マイクロ流体システム、核酸またはタンパク質精製モジュール、アレイ（例えば、核酸アレイ）、検出器、サーモサイクラーまたはこれらの組合せを含むことができる。
【０１４１】
例えば、本明細書のシステム中に組み込むことができる自動デバイスは、例えば選択した刺激に応答する遺伝子の発現レベル（Ｓｅｒｖｉｃｅ（１９９８年）「Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐｓ  Ａｒｒａｙｓ  Ｐｕｔ  ＤＮＡ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓｐｏｔ」Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２：３９６〜３９９頁）、高スループットＤＮＡ遺伝子型決定（Ｚｈａｎｇら、（１９９９年）「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ＤＮＡ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｆｒｏｍ  Ｂｌｏｏｄ」Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７１：１１３８〜１１４５頁）および他の多くを含めた、様々な生物現象を評価するために使用されてきている。同様に、混合実験、ＤＮＡ増幅、ＤＮＡシークエンスなどを実施するための総合システムも利用可能である。例えば、Ｓｅｒｖｉｃｅ（１９９８年）「Ｃｏｍｉｎｇ  Ｓｏｏｎ：  ｔｈｅ  Ｐｏｃｋｅｔ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ」  Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２：３９９〜４０１頁を参照。例えばロボットおよび流体処理モジュールを典型的には含む様々なＺｙｍａｔｅシステムを例えば利用する、Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）からの、様々な自動システムの構成要素が利用可能である。同様に、例えばマイクロタイタートレイ操作用に様々な実験室系において使用される、一般的なＯＲＣＡ（登録商標）ロボットも、例えばＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｉｎｃ．（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）から市販されている。同様に、本発明中のシステム構成要素として使用することができる市販のマイクロ流体システムは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓおよびＣａｌｉｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのシステムを含む。さらに、特許および技術文献は、自動流体処理に関してマイクロウエルプレートと直接調和し得るシステムを含めた、マイクロ流体システムの多数の例を含む。
【０１４２】
任意の様々な液体処理および／またはアレイ配置を、本明細書のシステムにおいて使用することができる。本明細書のシステムにおいて使用する１つの一般的な形式は、アレイまたは液体処理装置がマイクロタイタートレイを含むマイクロタイタープレートである。このようなトレイは市販されており、トレイ当たり様々なウエルサイズおよびウエル数に、およびアッセイまたはアレイ要素を結合させるための任意の様々な機能化表面で並べることができる。一般的なトレイには偏在する９６ウエルプレートがあり、３８４および１５３６ウエルプレートも一般に使用される。全ての処理ステップをトレイ中で実施しながら、サンプルをこのようなトレイ中で処理することができる。サンプルはマイクロ流体装置、またはマイクロタイター装置とマイクロ流体装置の組合せ中で処理することもできる。
【０１４３】
液相アレイ以外に、固相アレイにおいて要素を保存または分析することができる。これらのアレイは、例えば膜（例えば、ナイロンまたはニトロセルロース）、ポリマーまたはセラミック表面、ガラスまたは変性シリカ表面、金属表面などの固体支持体上に、空間的にアクセス可能な形（例えば、列および行のグリッド）で物質を固定する。例えばハイブリダイゼーションによって、（例えば、ピペットまたは他の流体処理要素を使用する）局所再水和および流体移動によって、あるいはアレイをこすることまたはアレイ上の当該の部位を切断することによって、要素を評価することができる。
【０１４４】
システムは、本明細書に記した手法のいずれかを使用して、対立遺伝子の情報を検出するために使用する検出装置も含むことができる。例えば、リアルタイムＰＣＲ産物を検出するように構成された検出器（例えば、蛍光検出器などの光検出器）またはアレイリーダーを、システム中に組み込むことができる。例えば検出器は、発光が対立遺伝子の存在または不在を示す当該の対立遺伝子を含むハイブリダイゼーションまたは増幅反応からの、発光を検出するように構成することができる。場合によっては、前に記した検出器とシステム指示書を含むコンピュータとの間の操作可能な関係を与え、検出した対立遺伝子特異的な情報のコンピュータへの自動入力を可能にし、コンピュータは例えばデータベース情報を保存することができ、かつ／あるいはシステム指示書を実行して、検出した対立遺伝子特異的な情報と索引表を比較することができる。
【０１４５】
検出器によって検出される情報を作成するために使用するプローブも、プローブを使用してアンプリコンを検出するための任意の他のハードウェアまたはソフトウェアと共に、システム中に組み込むことができる。これらは（例えば、プローブによって検出される対立遺伝子のＰＣＲまたはＬＣＲ増幅を実施するための）サーモサイクラー要素、その上にプローブが並んでいるかつ／あるいはハイブリダイズしているアレイなどを含むことができる。サンプルを処理するための前に記した流体処理要素は、サンプル物質（例えば、検出する鋳型核酸および／またはタンパク質）プライマー、プローブ、アンプリコンなどを移動させて互いに接触させるために使用することができる。例えばシステムは、表現型と関係がある１つ以上の遺伝子または連鎖した遺伝子座の少なくとも１つの対立遺伝子を検出するように構成された、マーカープローブまたはプライマーのセットを含むことができ、遺伝子は図１および／または２中の多型をコードする。検出器モジュールは、マーカープローブまたはプライマーのセットからの１つ以上のシグナル出力、あるいはマーカープローブまたはプライマーのセットから生成されたアンプリコンを検出し、それによって対立遺伝子の存在または不在を同定するように構成されている。
【０１４６】
分析するサンプルは場合によってはシステムの一部であり、あるいはシステムから分離していると考えることができる。本明細書で前に記したように、サンプルは例えばゲノムＤＮＡ、増幅されたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、増幅されたｃＤＮＡ、ＲＮＡ、増幅されたＲＮＡ、タンパク質などを場合によっては含む。一態様では、サンプルはヒト患者などの哺乳類に由来する。
【０１４７】
場合によっては、ユーザとのインターフェースのためのシステム構成要素を与える。例えばシステムは、コンピュータが実行するシステムの命令の出力を見るためのユーザが見ることができるディスプレイ、ユーザのコマンドを入力しシステムをアクティブ化するためのユーザ用入力デバイス（例えば、キーボードまたはマウスなどのポインティングデバイス）などを含むことができる。典型的には、当該のシステムはコンピュータを含み、様々なコンピュータが実行するシステムの命令をコンピュータソフトウェアで具体化し、例えばコンピュータ可読媒体に保存する。
【０１４８】
ワープロソフト（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＷｏｒｄＴＭまたはＣｏｒｅｌ  ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔＴＭ）およびデータベースソフトウェア（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌＴＭ、Ｃｏｒｅｌ  Ｑｕａｔｔｒｏ  ＰｒｏＴＭなどの集計表ソフトウェア、あるいはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＡｃｃｅｓｓＴＭまたはＳｅｑｕｅｌＴＭ、ＯｒａｃｌｅＴＭ、ＰａｒａｄｏｘＴＭなどのデータベースプログラム）などの標準的なデスクトップアプリケーションを、本明細書の対立遺伝子、または対立遺伝子と表現型との間の関係に対応する文字列を入力することによって本発明に適合させることが可能である。例えばシステムは、例えば文字列を操作するためにユーザインターフェース（例えば、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、ＭａｃｉｎｔｏｓｈまたはＬＩＮＵＸシステムなどの標準的なオペレーティングシステムにおけるＧＵＩ）と共に使用する、適切な文字列情報を有するソフトウェアを含むことができる。ＢＬＡＳＴなどの専用配列アラインメントプログラムも、例えば多数の対立遺伝子を同定および関連付けするために、核酸またはタンパク質（または対応する文字列）のアラインメント用に本発明のシステム中に組み込むことができる。
【０１４９】
記したようにシステムは、適切なデータベースを有するコンピュータ、および本発明の対立遺伝子配列または相関関係を含むことができる。配列アラインメント用ソフトウェア、および本明細書の配列のいずれかを含むソフトウェアシステムに入力するデータセットは、本発明の特徴であってよい。コンピュータは例えば、ＰＣ（Ｉｎｔｅｌｘ８６またはＰｅｎｔｉｕｍ（登録商標）チップ−互換性ＤＯＳＴＭ、ＯＳ２ＴＭ、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）ＴＭＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）  ＮＴＴＭ、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）９５ＴＭ、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）９８ＴＭ、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）２０００、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）ＭＥ、またはＬＩＮＵＸベースマシン、ＭＡＣＩＮＴＯＳＨＴＭ、Ｐｏｗｅｒ  ＰＣ、またはＵＮＩＸ（登録商標）ベース（例えば、ＳＵＮＴＭワークステーションまたはＬＩＮＵＸベースマシン）または他の当業者に知られている市販の一般的なコンピュータであってよい。入力およびアラインメントあるいは他の場合は配列操作用のソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮが利用可能であり、あるいは例えばＶｉｓｕａｌｂａｓｉｃ、Ｆｏｒｔｒａｎ、Ｂａｓｉｃ、Ｊａｖａ（登録商標）などの標準的なプログラミング言語を使用して当業者により容易に構築することができる。
【０１５０】
モジュレーターを同定する方法
乳癌の素因などを同定するための様々な診断および予後判定マーカーを提供する以外に、本発明は乳癌の表現型のモジュレーターを同定する方法も提供する。方法中、潜在的モジュレーターを図１および／または２中の遺伝子座に対応する関連タンパク質、またはこのようなタンパク質をコードする核酸と接触させる。遺伝子または遺伝子産物に対する潜在的モジュレーターの影響を検出し、それによって潜在的モジュレーターが表現型に関する根底の分子基盤を調節するか否かを同定する。
【０１５１】
さらに、方法は例えば関連表現型を示す個体に１つ以上の推定モジュレーターを投与すること、および例えば臨床試験または処置の文脈で、推定モジュレーターが個体における表現型を調節するかどうかを判定することを含むことができる。したがって、これは推定モジュレーターが臨床上有用であるかどうかを判定する。
【０１５２】
モジュレーターによって接触する遺伝子または遺伝子産物は、本明細書に記す任意の対立遺伝子形を含むことができる。望ましくない表現型と正に相関した対立遺伝子形は、遺伝子またはタンパク質であろうと、モジュレータースクリーニングの好ましい標的である。
【０１５３】
スクリーニングすることができる当該の影響には、（ａ）モジュレーターの存在下での図１および／または２中の遺伝子または遺伝子産物の増大または低下した発現、（ｂ）発現のタイミングまたは位置の変化、（ｃ）またはモジュレーターの存在下での図１および／または２の遺伝子座に対応するタンパク質の局在の変化がある。
【０１５４】
モジュレータースクリーニングの正確な形式は、検出する影響および利用可能な機器に応じて、当然ながら変わるはずである。ノーザン分析、定量的ＲＴ−ＰＣＲおよび／またはアレイに基づく検出形式を使用して、前に記した遺伝子の発現レベルを区別することができる。例えばウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ分析、抗体ハイブリダイゼーション、ＢＩＡｃｏｒｅなどの利用可能な方法を使用して、タンパク質の発現レベルを検出することもできる。任意のこれらの方法を使用して、潜在的モジュレーターに起因する発現レベルの変化を区別することができる。
【０１５５】
したがって、活性または発現に関して潜在的モジュレーターをスクリーニングすることができる。例えば、潜在的モジュレーター（小分子、有機分子、無機分子、タンパク質、ホルモン、転写因子など）を当該の対立遺伝子を含む細胞と接触させることが可能であり、図１および／または２中の遺伝子座に対応する遺伝子またはタンパク質の活性または発現（あるいは両方）に対する影響を、例えば考えられる発現モジュレーターの施用前後に、ノーザン分析または定量的（場合によってはリアルタイム）ＲＴ−ＰＣＲによって検出することができる。同様に、様々な遺伝子のプロモーター領域（例えば一般に、転写の開始部位の領域内の配列、例えば開始部位の５ｋｂ以内、例えば１ｋｂ以下、例えば開始部位の５００ｂｐまたは２５０ｂｐまたは１００ｂｐ以内）を、レポーター構築体（ＣＡＴ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたは任意の他の利用可能なレポーター）と結合させることが可能であり、潜在的モジュレーターによる発現活性調節に関して同様に試験することができる。いずれかの場合、例えば連続または平行式に自動流体処理および／または検出システムを使用して、高スループット形式でアッセイを実施することができる。同様に、検出する活性が活性調節、発現調節あるいは両方の結果であるかどうかとは無関係に、本明細書の活性検出法のいずれかを使用して適切な細胞と潜在的モジュレーターを接触させることによって、活性モジュレーターを試験することができる。
【０１５６】
モジュレーター活性検出を検出するためのバイオセンサーも本発明の特徴である。これらは、遺伝子または産物の１つ以上の活性を測定または表示する読み出し装置と結び付いた、図１および／または２の遺伝子座に対応する遺伝子または遺伝子産物を含むデバイスまたはシステムを含む。したがって、任意の前に記載したアッセイ要素は、適切なアッセイ要素と読み出し装置を動作可能に結び付けることによりバイオセンサーとして設定することができる。読み出し装置は、（例えば、細胞マーカーまたは細胞生存を検出するために）光学的、（例えば、ＦＥＴ、ＢＩＡｃｏｒｅ、または任意の様々な他のものと結び付けるために）電気的、分光的なものなどであってよく、ユーザが見ることができるディスプレイ（例えば、ＣＲＴまたは光学的表示場所）を場合によっては含むことができる。バイオセンサーは、例えば推定モジュレーター活性の自動高スループット分析のために、推定モジュレーターと本発明のタンパク質を直接接触させるロボットまたは他の自動化、例えばマイクロ流体システムと結び付けることができる。本発明のバイオセンサーと共に使用するために適合させることが可能である、非常に様々な自動システムが市販されている。例えば自動システムは、例えば選択した刺激に応答する遺伝子の発現レベル（Ｓｅｒｖｉｃｅ（１９９８年）「Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐｓ  Ａｒｒａｙｓ  Ｐｕｔ  ＤＮＡ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓｐｏｔ」Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２：３９６〜３９９頁）を含めた、様々な生物現象を評価するために作製されている。実験装置システムは、様々な自動実験法用の基本容器要素として使用されるアレイ、マイクロタイタートレイまたは他のチップトレイなどを含む試薬保存システムにあるいはそこから物質を移動させるために、例えば繰り返しの流体処理操作（例えばピペッティング）も実施することができる。同様に、システムは例えばマイクロタイタートレイを操作し、例えば温度、光または空気に対する露出などの様々な環境条件を制御する。多くのこのような自動システムは市販されており、前に記載したものを含めて本明細書に記載する。これらは様々なＺｙｍａｔｅシステム、ＯＲＣＡ（登録商標）ロボット、マイクロ流体デバイスなどを含む。例えば、Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡによるＬａｂＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃデバイス（登録商標）高スループットスクリーニングシステム（ＨＴＳ）を、本発明中での使用に適合させて、モジュレーター活性をスクリーニングすることができる。
【０１５７】
一般に、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９８２年）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８２巻：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０年）；Ｓａｎｄａｎａ（１９９７年）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．；  Ｂｏｌｌａｇら、（１９９６年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、第２版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、ＮＹ；  Ｗａｌｋｅｒ（１９９６年）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ、Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ（１９９０年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ；  Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ；  Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第３版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、ＮＹ；  Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｙｄｅｎ（１９９８年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第２版、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、ＮＹ；およびＷａｌｋｅｒ（１９９８年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｎ  ＣＤ−ＲＯＭ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ；およびＳａｔｉｎｄｅｒ  Ａｈｕｊａ編、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （２０００年）を含め前述の様々な参照文献中で教示されたものを含めた、タンパク質の発現レベルおよび活性を検出するための方法およびセンサーが利用可能である。多くのタンパク質を同時に検出する「プロテオーム」検出法は記載されており、さらに様々な多次元電気泳動法（例えば、２次元ゲル電気泳動）、質量分析に基づく方法（例えば、ＳＥＬＤＩ、ＭＡＬＤＩ、エレクトロスプレーなど）、または表面プラズモン共鳴法を含めて前に記されている。これらを使用して、タンパク質活性および／または発現レベルを追跡することもできる。
【０１５８】
同様に、核酸発現レベル（例えばｍＲＮＡ）は、ノーザン分析、定量的ＲＴ−ＰＣＲなどを含めた任意の利用可能な方法を使用して検出することができる。これらの方法によって当業者を導くのに充分な参照文献は、Ａｕｓｕｂｅｌ、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＢｅｒｇｅｒを含めて容易に入手可能である。
【０１５９】
発現および／または活性に対する影響に関してスクリーニングする、潜在的モジュレーターのライブラリーが利用可能である。これらのライブラリーはランダムであってよく、あるいは標的化することができる。
【０１６０】
標的ライブラリーは、足場または構成単位を選択してコンビナトリアルライブラリーを作製する、任意の形の合理的な設計技法を使用して設計したライブラリーを含む。これらの技法は、バイオアイソステリック変換によるモーフィング、標的特異的な特別構造の分析などを含めた、標的中心ライブラリーの設計およびコンビナトリアル合成のための幾つかの方法を含む。一般に、図１および／または２の構造遺伝子または遺伝子産物に関する情報が入手可能である場合、例えば柔軟なドッキング手法などを使用して、おそらく結合パターンを設計することができる。同様に、ランダムなライブラリーが様々な基本的化学足場に存在する。いずれかの場合、ポリペプチド、核酸、炭水化物、および他の骨格を有するものを含めた、化学ライブラリー用の数千の足場および構成単位が利用可能である。市販のライブラリーおよびライブラリー設計サービスには、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．ＬｏｕｉｓＭＯ）、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＴｉｍＴｅｃ（Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）、Ｎｕｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ／Ｓ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）および他の多くによって与えられるものがある。
【０１６１】
乳癌の表現型を処置するためのキットは、前に記したのと同様に同定したモジュレーター、および化合物を患者に投与して乳癌を処置するための指示書を含むことができる。
【０１６２】
遺伝子の遺伝子発現の制御
図１および２中の多型と連鎖した任意の遺伝子の遺伝子発現（例えば、転写および／または翻訳）は、当技術分野で知られている任意の様々な技法を使用して制御することができる。例えば、アンチセンス核酸または干渉ＲＮＡを使用して遺伝子発現を抑制することができる。個々の細胞型における発現の抑制は、これらの遺伝子のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの役割をさらに試験するため、かつ／あるいは連鎖遺伝子の過剰発現によって引き起こされる状態を処理するための機構として、かつ／あるいはこのような遺伝子の特定の対立遺伝子によって引き起こされる優性効果を処理するために使用することができる。遺伝子発現モジュレーターは、本発明により提供されるモジュレーターの１クラス、例えば乳癌の表現型を調節するために施用されるモジュレーターである。
【０１６３】
例えば、アンチセンス核酸の使用は当技術分野でよく知られている。アンチセンス核酸は、標的核酸、例えば標的遺伝子、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡと相補的な領域を有する。典型的には、内在性遺伝子のコード（センス）配列に関して相補的、アンチセンス方向にヌクレオチド配列を含む核酸を、細胞中に導入する。アンチセンス核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡまたは任意の他の適切な分子であってよい。二重鎖がアンチセンス配列とその相補的センス配列との間に形成され、遺伝子の不活性化をもたらす可能性がある。アンチセンス核酸は、遺伝子から転写されたＲＮＡと二重鎖を形成することによって、二重鎖ＤＮＡと三重鎖を形成することなどによって、遺伝子発現を抑制することができる。例えば、そのコード配列が知られているかあるいは幾つかの充分に確立された技法（例えば、アンチセンスＲＮＡまたはオリゴヌクレオチド（分解に対する耐性を増大させるかあるいは細胞による取り込みを改善する修飾ヌクレオチドおよび／または連鎖を場合によっては含む）の化学合成またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写）によって決定することができる任意の遺伝子に関して、アンチセンス核酸を生成することができる。アンチセンス核酸およびそれらの使用は、例えば「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」という表題のＨａｓｅｌｔｏｎおよびＡｌｅｘａｎｄｅｒ（２００１年６月５日）への米国特許第６，２４２，２５８号、米国特許第６，５００，６１５号、米国特許第６，４９８，０３５号、米国特許第６，３９５，５４４号、米国特許第５，５６３，０５０号、Ｅ．Ｓｃｈｕｃｈら、（１９９１年）Ｓｙｍｐ  Ｓｏｃ．Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ４５：１１７〜１２７頁；ｄｅ  Ｌａｎｇｅら、（１９９５年）Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１９７：５７〜７５頁；Ｈａｍｉｌｔｏｎら、（１９９５年）Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｒｎｕｎｏｌ１９７：７７〜８９頁；Ｆｉｎｎｅｇａｎら、（１９９６年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ９３：８４４９〜８４５４頁；ＵｈｌｍａｎｎおよびＡ．Ｐｅｐａｎ（１９９０年）、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４３頁；Ｐ．Ｄ．Ｃｏｏｋ（１９９１年）、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ６：５８５頁；Ｊ．Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１（１９９０年）１６５頁；および、Ｓ．Ｌ．ＢｅａｕｃａｇｅおよびＲ．Ｐ．Ｉｙｅｒ（１９９３年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ４９：６１２３頁；およびＦ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編（１９９１年）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ−−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ中に記載されている。
【０１６４】
遺伝子発現は、ＲＮＡサイレンシングまたは干渉によって抑制することもできる。「ＲＮＡサイレンシング」は、ＲＮＡ干渉、ｍＲＮＡの安定性を変えない標的遺伝子から転写された標的ｍＲＮＡの翻訳の抑制、および転写サイレンシング（例えば、標的ｍＲＮＡの転写の抑制をもたらすヒストンアセチル化およびヘテロクロマチン形成）だけには限られないが、これらを含めた、それによって細胞中の一本鎖、または典型的には二本鎖ＲＮＡの存在がＲＮＡのそれと同一あるいはほぼ同一である配列を含む標的遺伝子の発現の抑制をもたらす任意の機構を指す。
【０１６５】
用語「ＲＮＡ干渉」（「ＲＮＡｉ」、時折ＲＮＡ介在型干渉、転写後遺伝子サイレンシング、またはクエリング（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）と呼ばれる）は、細胞中のＲＮＡ、典型的には二本鎖ＲＮＡの存在が二本鎖ＲＮＡのそれと同一あるいはほぼ同一である配列を含む遺伝子の発現の抑制をもたらす現象を指す。ＲＮＡｉの誘導を担う二本鎖ＲＮＡは、「干渉性ＲＮＡ」と呼ばれる。遺伝子の発現は以下に記載するようにＲＮＡｉの機構によって抑制され、その中では干渉性ＲＮＡの存在が遺伝子から転写されるｍＲＮＡの分解をもたらし、したがって低下したレベルのｍＲＮＡおよび任意のコードタンパク質をもたらす。
【０１６６】
ＲＮＡｉの機構は幾つかの真核生物および細胞型において調べられてきており、現在も広く調べられている。例えば、以下の総説：ＭｃＭａｎｕｓおよびＳｈａｒｐ（２００２年）「Ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｓ  ｂｙ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ３：７３７〜７４７頁；ＨｕｔｖａｇｎｅｒおよびＺａｍｏｒｅ（２００２年）「ＲＮＡｉ：Ｎａｔｕｒｅ  ａｂｈｏｒｓ  ａ  ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ」Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  ＆  Ｄｅｖ２００：２２５〜２３２頁；Ｈａｎｎｏｎ（２００２年）「ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ」Ｎａｔｕｒｅ４１８：２４４〜２５１頁；Ａｇａｍｉ（２００２年）「ＲＮＡｉ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｕｓｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ」Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ６：８２９〜８３４頁；ＴｕｓｃｈｌおよびＢｏｒｋｈａｒｄｔ（２００２年）「Ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ：  Ａ  ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ２：１５８〜１６７頁；Ｎｉｓｈｉｋｕｒａ（２００１年）「Ａ  ｓｈｏｒｔ  ｐｒｉｍｅｒ  ｏｎ  ＲＮＡｉ：ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｓ  ａｓ  ａ  ｋｅｙ  ｃａｔａｌｙｓｔ」Ｃｅｌｌ１０７：４１５〜４１８頁；およびＺａｍｏｒｅ（２００１年）「ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：  Ｌｉｓｔｅｎｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｏｕｎｄ  ｏｆ  ｓｉｌｅｎｃｅ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ８：７４６〜７５０頁を参照。ＲＮＡｉは特許文献中にも記載されている、例えば、「Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｉｖｅｎ  ｇｅｎｅ」という表題のＫｒｅｕｔｚｅｒおよびＬｉｍｍｅｒによるＣＡ２３５９１８０、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ」という表題のＢｅａｃｈらによるＷＯ０１／６８８３６、「Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ」という表題のＧｒａｈａｍらによるＷＯ０１／７０９４９、および「ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ」という表題のＴｕｓｃｈｌらによるＷＯ０１／７５１６４を参照。
【０１６７】
簡単に言うと、細胞中（例えば、細胞質中）に導入する二本鎖ＲＮＡを、例えばＤｉｃｅｒと呼ばれるＲＮＡｓｅＩＩＩ様酵素により処理して、小さな干渉性ＲＮＡと呼ばれる（ｓｉＲＮＡ、短い干渉性ＲＮＡとも呼ばれる）さらに短い二本鎖断片にする。生成するｓｉＲＮＡの長さおよび性質は細胞の種類に依存するが、典型的にはｓｉＲＮＡは２１〜２５ヌクレオチド長である（例えば、ｓｉＲＮＡは各末端に２つのヌクレオチド３’突出部分を有する１９塩基対の二重鎖部分を有することができる）。同様のｓｉＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成することができ（例えば、化学合成またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって）、細胞中に導入してＲＮＡｉを誘導することができる。ｓｉＲＮＡはＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合した状態になる。ｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の分離、および相補的塩基対の相互作用によるｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖とその標的ｍＲＮＡの相互作用が、場合によっては生じる。最後に、ｍＲＮＡが切断および分解される。
【０１６８】
細胞中での標的遺伝子の発現は、適切に選択した二本鎖ＲＮＡを細胞中に導入することによって、このように特異的に抑制することができる。適切な干渉性ＲＮＡを設計するためのガイドラインは当業者に知られている。例えば、干渉性ＲＮＡは典型的には、イントロンまたは非翻訳領域ではなくエクソン配列に対して設計される。高性能干渉性ＲＮＡの特徴は、細胞型によって変わる可能性がある。例えば、ｓｉＲＮＡはショウジョウバエ細胞中でのＲＮＡｉの最も効率良い誘導のために３’突出部分および５’リン酸を必要とする可能性があるが、哺乳動物細胞中では、５’リン酸を欠く平滑末端ｓｉＲＮＡおよび／またはＲＮＡが、３’突出部分および／または５’リン酸を有するｓｉＲＮＡと同程度有効にＲＮＡｉを誘導することができる（例えば、Ｃｚａｕｄｅｒｎａら、（２００３年）「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｉＲＮＡｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ」Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ３１：２７０５〜２７１６頁を参照）。他の例として、３０〜８０塩基対長を超える二本鎖ＲＮＡは哺乳動物細胞中での抗ウイルス性インターフェロン応答を活性化し、非特異的サイレンシングをもたらすので、哺乳動物細胞中で使用するための干渉性ＲＮＡは典型的には３０塩基対未満である（例えば、Ｃａｐｌｅｎら、（２００１年）「Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｓｍａｌｌ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡｓ  ｉｎ  ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ａｎｄ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：９７４２〜９７４７頁、Ｅｌｂａｓｈｉｒら、（２００１年）「Ｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ２１−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＲＮＡｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ」Ｎａｔｕｒｅ４１１：４９４〜４９８頁およびＥｌｂａｓｈｉｒら、（２００２年）「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ」方法２６：１９９〜２１３頁は２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡを使用して哺乳動物細胞系における遺伝子発現を特異的に抑制することを記載しており、およびＫｉｍら、（２００５年）「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｄｓＲＮＡ  Ｄｉｃｅｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｅｎｈａｎｃｅ  ＲＮＡｉ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２３：２２２〜２２６頁は２５〜３０ヌクレオチドの二重鎖の使用を記載している）。ｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖は典型的には、必ずではないが、（任意の突出部分を除いた）ｓｉＲＮＡの二本鎖領域で互いに完全に相補的である。アンチセンス鎖は典型的には、同じ領域で標的ｍＲＮＡと完全に相補的であるが、数個のヌクレオチド置換は許容することができる（例えば、アンチセンス鎖とｍＲＮＡとの間の１個または２個のヌクレオチドのミスマッチは、低い有効性ではあるがＲＮＡｉを���らにもたらす可能性がある）。二本鎖領域の末端は典型的には中央部より置換に対する耐性があり、例えば、１９ｂｐの二本鎖領域を有する２１量体の状況でのアンチセンス鎖と標的ｍＲＮＡとの間のわずか１５ｂｐ（塩基対）の相補性は、機能性ｓｉＲＮＡをもたらすことは示されてきている（例えば、Ｃｚａｕｄｅｒｎａら、（２００３年）「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｉＲＮＡｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ」Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ３１：２７０５〜２７１６頁を参照）。任意の突出部分は、しかしながら標的ｍＲＮＡと必ずしも相補的である必要はなく、例えば、ＴＴ（２つの２’−デオキシチミジン）突出部分は合成コストを低下させるために頻繁に使用される。
【０１６９】
二本鎖ＲＮＡ（例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ）はＲＮＡｉを開始させるのに必要であると当初は考えられていたが、幾つかの近年の報告は、このようなｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖はＲＮＡｉを開始させるのに充分であることを示す。一本鎖アンチセンスｓｉＲＮＡは、（例えば、特異的ｍＲＮＡエンドヌクレアーゼ切断断片の出現によって実証されるように）二本鎖ｓｉＲＮＡと同じ経路によってＲＮＡｉを開始させることができる。二本鎖干渉性ＲＮＡと同様に、高性能一本鎖ｓｉＲＮＡの特徴は細胞型によって変わる可能性がある（例えば、５’リン酸は幾つかの細胞型におけるＲＮＡｉの効率良い誘導のためにアンチセンス鎖において必要とされる可能性があり、一方遊離５’ヒドロキシルは他の細胞型において充分ヒドロキシルをリン酸化することができる）。例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚら、（２００２年）「Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｓｉＲＮＡｓ  ｇｕｉｄｅ  ｔａｒｇｅｔ  ＲＮＡ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｉｎ  ＲＮＡｉ」Ｃｅｌｌ１１０：５６３〜５７４頁；Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉら、（２００３年）「Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｆｏｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｓｉＲＮＡ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：５８９〜５９５頁；Ｈｏｌｅｎら、（２００３年）「Ｓｉｍｉｌａｒ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ａｎｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｓｉＲＮＡｓ  ｓｕｇｇｅｓｔｓ  ｔｈａｔ  ｔｈｅｙ  ａｃｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ＲＮＡｉ  ｐａｔｈｗａｙ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１：２４０１〜２４０７頁；およびＳｃｈｗａｒｚら、（２００２年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ１０：５３７〜５４８頁を参照。
【０１７０】
所与の標的ｍＲＮＡの異なる領域に対応するｓｉＲＮＡ間の有効性の違いにより、典型的には幾つかのｓｉＲＮＡをその標的ｍＲＮＡに対して設計および試験して、どのｓｉＲＮＡが最も有効であるか決定する。干渉性ＲＮＡは小さなヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ、短いヘアピンＲＮＡとも呼ばれる）として生成することもでき、これは細胞中で処理されてＲＮＡｉを開始させるｓｉＲＮＡ様分子になる（例えば、Ｓｉｏｌａｓら、（２００５年）「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｈＲＮＡｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ＲＮＡｉ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２３：２２７〜２３１頁を参照）。
【０１７１】
細胞中のＲＮＡ、特に二本鎖ＲＮＡの存在は、ＲＮＡｉ以外の機構によって、ＲＮＡのそれと同一あるいはほぼ同一である配列を含む遺伝子の発現の抑制をもたらす可能性がある。例えば、標的ｍＲＮＡと部分的に相補的である二本鎖ＲＮＡは、その安定性に影響を与えずにｍＲＮＡの翻訳を抑制することができる。他の例として、二本鎖ＲＮＡはヒストンメチル化およびヘテロクロマチン形成を誘導し、ＲＮＡのそれと同一あるいはほぼ同一である配列を含む遺伝子の転写サイレンシングをもたらす可能性がある（例えば、Ｓｃｈｒａｍｋｅ  ａｎｄ  Ａｌｌｓｈｉｒｅ（２００３年）「Ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡｓ  ａｎｄ  ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ＬＴＲｓ  ｅｆｆｅｃｔ  ＲＮＡｉ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ」Ｓｃｉｅｎｃｅ３０１：１０６９〜１０７４頁；ＫａｗａｓａｋｉおよびＴａｉｒａ（２００４年）「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ」Ｎａｔｕｒｅ４３１：２１１〜２１７頁；およびＭｏｒｒｉｓら、（２００４年）「Ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ３０５：１２８９〜１２９２頁を参照）。
【０１７２】
ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる短いＲＮＡが、様々な種において同定されてきている。典型的には、これらの内在性ＲＮＡは長いＲＮＡとしてそれぞれ転写され、次いで不完全なヘアピン（ステムループ）構造を形成する約６０〜７５ヌクレオチドのプレｍｉＲＮＡに処理される。プレｍｉＲＮＡは典型的には、次いで例えばＤｉｃｅｒにより切断されて成熟ｍｉＲＮＡを形成する。成熟ｍｉＲＮＡは典型的には約２１〜２５ヌクレオチド長であるが、例えば約１４〜約２５以上のヌクレオチドで変わる可能性がある。全てではないが幾つかのｍｉＲＮＡは、部分的に相補的である配列を有するｍＲＮＡの翻訳を抑制することが示されてきている。このようなｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡアンチセンス鎖とｍＲＮＡの結合により形成された二重鎖の中心における隆起をもたらすと予想される、対応するｍＲＮＡとの１つ以上の内部ミスマッチを含む。ｍｉＲＮＡは典型的にはｍＲＮＡと約１４〜１７のワトソン−クリック塩基対を形成し、他の不安定な塩基対も形成される可能性がある。さらに、対応するｍＲＮＡとの中心のミスマッチを含む（例えば、ｓｉＲＮＡと類似した）短い合成二本鎖ＲＮＡは、ｍＲＮＡの翻訳を抑制する（ただし分解は開始させない）ことが示されてきている。例えば、Ｚｅｎｇら、（２００３年）「ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ａｎｄ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ｃａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｍＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１００：９７７９〜９７８４頁；Ｄｏｅｎｃｈら、（２００３年）「ｓｉＲＮＡｓ  ｃａｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｓ  ｍｉＲＮＡｓ」Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１７：４３８〜４４２頁；ＢａｒｔｅｌおよびＢａｒｔｅｌ（２００３年）「ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ：Ａｔ  ｔｈｅ  ｒｏｏｔ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ？」Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ１３２：７０９〜７１７頁；ＳｃｈｗａｒｚおよびＺａｍｏｒｅ（２００２年）「Ｗｈｙ  ｄｏ  ｍｉＲＮＡｓ  ｌｉｖｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｉＲＮＰ？」Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１６：１０２５〜１０３１頁；Ｔａｎｇら、（２００３年）「Ａ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ」Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１７：４９〜６３頁；Ｍｅｉｓｔｅｒら、（２００４年）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ−ａｎｄ  ｓｉＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＲＮＡ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ」ＲＮＡ１０：５４４〜５５０頁；Ｎｅｌｓｏｎら、（２００３年）「Ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｗｏｒｌｄ：Ｓｍａｌｌ  ｉｓ  ｍｉｇｈｔｙ」Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２８：５３４〜５４０頁；Ｓｃａｃｈｅｒｉら、（２００４年）「Ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ｃａｎ  ｉｎｄｕｃｅ  ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ  ａｎｄ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｕｎｔａｒｇｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１：１８９２〜１８９７頁；Ｓｅｍｐｅ��ｅら、（２００４年）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｕｎｃｏｖｅｒｓ  ａ  ｓｕｂｓｅｔ  ｏｆ  ｂｒａｉｎ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ」Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ５：Ｒ１３；Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎら、（２００３年）「Ｋｉｌｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ：Ｓｈｏｒｔ  ＲＮＡｓ  ｔｈａｔ  ｓｉｌｅｎｃｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４：４５７〜４６７頁；ＭｃＭａｎｕｓ（２００３年）「ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ」Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．１３：２５３〜２８８頁；およびＳｔａｒｋら、（２００３年）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｔａｒｇｅｔｓ」ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．１：Ｅ６０を参照。
【０１７３】
部分的に相補的であるＲＮＡ（例えば、幾つかのｍｉＲＮＡ）によるｍＲＮＡの翻訳抑制と関係がある細胞機構は、ＲＮＡｉと関係がある細胞機構と部分的に重複するようであるが、記したように、それらの安定性ではなくｍＲＮＡの翻訳が影響を受け、ｍＲＮＡは典型的には分解されない。
【０１７４】
ＲＮＡのアンチセンス鎖がｍＲＮＡと結合するときに形成される隆起の位置および／またはサイズは、ｍＲＮＡの翻訳を抑制するＲＮＡの能力に影響を与える可能性がある。同様に、ＲＮＡ内の任意の隆起の位置および／またはサイズ自体が、翻訳抑制の効率に影響を与える可能性もある。例えば、前の参照文献を参照。典型的には、ＲＮＡのアンチセンス鎖がｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）と相補的であるとき翻訳抑制は最も有効である。ＲＮＡのアンチセンス鎖と相補的な配列の多数の反復単位、例えばタンデムリピートも、より有効な翻訳抑制をもたらす可能性があり、例えば、内在性ｍｉＲＮＡによって翻訳抑制される幾つかのｍＲＮＡは、それらの３’ＵＴＲにｍｉＲＮＡ結合配列の７〜８個の反復単位を含む。翻訳抑制はＲＮＡ干渉よりＲＮＡの濃度に依存するらしいことは注目に値し、翻訳抑制はそれぞれの抑制ＲＮＡによる１つのｍＲＮＡの結合と関係があると考えられ、一方ＲＮＡｉは１つのｓｉＲＮＡ−ＲＩＳＣ複合体によるｍＲＮＡの多数のコピーの切断と関係があると考えられる。
【０１７５】
適切なＲＮＡを設計して所与の標的ｍＲＮＡの翻訳を抑制するためのガイダンスは、文献（例えば、前述の参照文献および数ある中で特に、ＤｏｅｎｃｈおよびＳｈａｒｐ（２００４年）「Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ」Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１８：５０４〜５１１頁；Ｒｅｈｍｓｍｅｉｅｒら、（２００４年）「Ｆａｓｔ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ／ｔａｒｇｅｔ  ｄｕｐｌｅｘｅｓ」ＲＮＡ１０：１５０７〜１５１７頁；Ｒｏｂｉｎｓら、（２００５年）「Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｔｏ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｔａｒｇｅｔｓ」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ１０２：４００６〜４００９頁；およびＭａｔｔｉｃｋおよびＭａｋｕｎｉｎ（２００５年）「Ｓｍａｌｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ＲＮＡｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｓ」Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１４：Ｒ１２１−Ｒ１３２）および本明細書中で見ることができる。しかしながら、異なる構造（例えば、隆起サイズ、配列、および／または位置）のＲＮＡと標的ｍＲＮＡの異なる領域に対応するＲＮＡとの間の翻訳抑制の有効性の違いにより、幾つかのＲＮＡをその標的ｍＲＮＡに対して場合によっては設計および試験して、標的ｍＲＮＡの翻訳を抑制する際にどれが最も有効であるか決定する。
【０１７６】
遺伝子産物に対する抗体
他のクラスのモジュレーターは、本明細書の遺伝子座と連鎖する遺伝子の産物と結合する抗体である。抗体を例えばｉｎ  ｓｉｔｕで遺伝子産物を検出および／または精製するために利用して、遺伝子産物をモニタリングすることができる。抗体を使用してｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで遺伝子産物の機能を阻害することもできる。本明細書で使用する用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化またはキメラ抗体、および抗体断片とタンパク質を結合させるのに充分な断片である生物学的に機能性がある抗体断片だけには限られないが、これらを含む。
【０１７７】
関連遺伝子産物に対する抗体を生成するために、任意の様々な宿主動物をポリペプチド、またはその一部分を用いた注射によって免疫処置することができる。このような宿主動物は、数例を挙げればウサギ、マウスおよびラットを含むことができるが、これらだけには限られない。フロインドの（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍなどのおそらく有用であるヒト用アジュバントだけには限られないが、これらを含めた様々なアジュバントを使用して、宿主の種類に応じて免疫応答を増大させることができる。
【０１７８】
ポリクローナル抗体は、標的遺伝子産物、またはその抗原機能性誘導体などの抗原で免疫処置した動物の血清に由来する異型集団の抗体分子である。ポリクローナル抗体を生成するために、前に記載した宿主動物などの宿主動物を、これも前に記載したのと同様のアジュバントを補ったコードタンパク質、またはその一部分を用いた注射によって免疫処置することができる。
【０１７９】
特定の抗原に対する同型集団の抗体であるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、培養中に連続した細胞系による抗体分子の生成をもたらす任意の技法によって得ることができる。これらはＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５〜４９７頁、１９７５年；および米国特許第４，３７６，１１０号）のハイブリドーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｓｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ４：７２頁、１９８３年；Ｃｏｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：２０２６〜２０３０頁、１９８３年）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．、７７〜９６頁、１９８５年）を含むが、これらだけには限られない。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤを含めた任意の免疫グロブリンクラス、およびその任意のサブクラスであってよい。本発明のｍＡｂを生成するハイブリドーマは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの高力価のｍＡｂの生成は、これを現在好ましい生成法にする。
【０１８０】
さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子、および適切な生物活性のヒト抗体分子由来の遺伝子をスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の生成用に開発された技法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：６８５１〜６８５５頁、１９８４年；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ３１２：６０４〜６０８頁、１９８４年；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ３１４：４５２〜４５４頁、１９８５年）を使用することができる。キメラ抗体は、ネズミｍＡｂ由来の可変または超可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体などの、異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。同様に、利用可能な技法を使用してヒト化抗体を生成することもできる。
【０１８１】
あるいは、単鎖抗体の生成に関して記載した技法（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３〜４２６頁、１９８８年；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９〜５８８３頁、１９８８年；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ３３４：５４４〜５４６頁、１９８９年）を適用して、示差的に発現する遺伝子−単鎖抗体を生成することができる。単鎖抗体はアミノ架橋を介してＦｖ領域の重鎖断片と軽鎖断片を結合させ、単鎖ポリペプチドを生成することによって形成される。
【０１８２】
一態様では、「ヒト化抗体」を生成するのに有用な技法を適用して、タンパク質、その断片または誘導体に対する抗体を生成することができる。このような技法は、米国特許第５，９３２，４４８号、同５，６９３，７６２号、同５，６９３，７６１号、同５，５８５，０８９号、同５，５３０，１０１号、同５，５６９，８２５号、同５，６２５，１２６号、同５，６３３，４２５号、同５，７８９，６５０号、同５，６６１，０１６号、および同５，７７０，４２９号中に開示されている。
【０１８３】
特異的エピトープを認識する抗体断片は、知られている技法によって作製することができる。例えば、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって生成することができるＦ（ａｂ’）２断片、およびＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋の還元によって作製することができるＦａｂ断片があるが、これらだけには限られない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５〜１２８１頁、１９８９年）、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ容易な同定を可能にすることができる。
【０１８４】
前述の抗体を使用して遺伝子産物の発現を検出および測定するためのプロトコルは、当技術分野でよく知られている。このような方法には、ドットブロッティング、ウエスタンブロッティング、競合的および非競合的タンパク質結合アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学法、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、および一般的に使用されており科学文献および特許文献中に広く記載されている他の方法、および商業的に使用されている多くの方法があるが、これらだけには限られない。
【０１８５】
検出を容易にするための１つの方法はサンドウィッチＥＬＩＳＡであり、その幾つかのバリエーションが存在し、それらはいずれも本発明によって含まれると考えられる。例えば、典型的なフォアードアッセイでは、非標識抗体を固相支持体上に固定し、試験するサンプルは結合分子と接触させ、抗体−抗原二元複合体の形成を可能にするのに充分な時間の間インキュベートする。この時点で、検出可能なシグナルを誘導することができるレポーター分子で標識した二次抗体を次いで加え、抗体−抗原−標識抗体の三元複合体の形成を可能にするのに充分な時間インキュベートする。任意の未反応物質を洗浄除去し、抗原の存在はシグナルの観察によって測定し、あるいは知られている量の抗原を含む対照サンプルと比較することによって定量化することができる。フォアードアッセイのバリエーションには、サンプルと抗体の両方を結合抗体に同時に加える同時アッセイ、または標識抗体と試験するサンプルを最初に組合せ、インキュベートし非標識表面結合抗体に加えるリバースアッセイがある。これらの技法は当業者によく知られており、わずかなバリエーションの可能性は容易に理解されるはずである。本明細書で使用する「サンドウィッチアッセイ」は、基本的な２部位技法の全てのバリエーションを含むと考えられる。本発明のイムノアッセイに関しては、唯一の制限要因は、標識抗体が当該の遺伝子によって発現されるタンパク質に特異的な抗体であることである。
【０１８６】
この型のアッセイにおいて最も一般的に使用されるレポーター分子は、酵素、フルオロフォアまたは放射性核種のいずれかを含む分子である。酵素イムノアッセイの場合、通常グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩によって酵素を二次抗体と結合させる。容易に理解されるように、しかしながら、当業者によく知られている広く様々な異なる結合技法が存在する。一般的に使用される酵素には、特にホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼがある。特異的酵素と共に使用する基質は、検出可能な色の変化の対応する酵素による加水分解時の生成に関して一般に選択される。例えば、ｐ−ニトロフェニルリン酸はアルカリホスファターゼ結合体と共に使用するのに適しており、ペルオキシダーゼ結合体に関しては、１，２−フェニレンジアミンまたはトルイジンが一般的に使用される。前に記した発色基質ではなく、蛍光産物を生成する蛍光基質を利用することもできる。適切な基質を含む溶液を、次いで三元複合体に加える。この基質は二次抗体と結合した酵素と反応し、定性的な視覚的シグナルを与え、これは通常分光光度法によってさらに定量化して、血清サンプル中に存在するＰＬＡＢの量の評価を与えることができる。
【０１８７】
あるいは、フルオレセインおよびローダミンなどの蛍光化合物は、それらの結合能力を変えずに抗体と化学的に結合させることが可能である。特定の波長の光による照射によって活性化させると、蛍光色素標識した抗体は光エネルギーを吸収し、分子において励起状態、次に特徴的な長い波長での光の発光を誘導する。発光は、光学顕微鏡を用いて肉眼で検出可能な特徴的な色として現れる。免疫蛍光およびＥＩＡ技法はいずれも当技術分野で非常に充分に確立されており、本発明の方法に特に好ましい。しかしながら、放射性同位体、化学発光または生物発光分子などの他のレポーター分子を利用することもできる。必要とされる用途に適合させるための手順の変更の仕方は、当業者には容易に理解されるはずである。
【０１８８】
細胞レスキューおよび治療投与
一態様では本発明は、図１および／または２の１つ以上の内在性遺伝子またはポリペプチド（したがって、当該の関連表現型、例えば乳癌易罹患性、耐性などを与える）の機能に欠陥がある細胞のレスキューを含む。これは単に遺伝子（または関連タンパク質を発現する異種核酸）、すなわち望まれる対立遺伝子を有する遺伝子の新たなコピーを細胞中に導入することによって実施することができる。（例えば、キメラ形成法によって）欠陥遺伝子を修復するための相同的組換えなどの他の手法も実施することができる。任意の事象において、例えば本明細書に記すアッセイのいずれかにおいて、レスキュー機能を測定することができる。実際、この方法は図１および／または２の任意の遺伝子または遺伝子産物の発現または活性に関してｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞をスクリーニングする一般的な方法として使用することができる。したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのレスキュー機能は、前に記した無数のｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング法に関するこの文脈において有用である。レスキューされる細胞は、（患者由来の初代または第二代細胞培養物、および充分樹立した細胞の培養物を含めた）培養中の細胞を含むことができる。細胞を患者から単離する場合、これは関連表現型を示す患者においてどの遺伝子または産物が欠陥性であるかを確定する際に他の診断的有用性を有する。
【０１８９】
他の態様では、細胞のレスキューは例えば欠陥を修正するために、患者、例えばヒトにおいて起こる。したがって、本発明の一態様は、欠陥を修正するための遺伝子療法である。これらの適用例では、本発明の核酸を適切な遺伝子療法用ベクターに場合によってはクローニングし（かつ／あるいは裸またはリポソーム結合核酸として単に送達し）、次いでそれらは場合によっては適切な担体または送達物質と組合せて送達する。タンパク質を直接送達することもできるが、安定した発現が望まれる適用例では核酸の送達が典型的には好ましい。同様に、本明細書の方法によって同定した任意の欠陥のモジュレーターを治療上使用することができる。
【０１９０】
投与用の組成物は、例えば治療有効量のモジュレーター、遺伝子療法用ベクターまたは他の関連核酸、および薬剤として許容される担体または賦形剤を含む。このような担体または賦形剤には、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、および／またはこれらの組合せがあるが、これらだけには限られない。製剤を作製して投与形態に適合させる。一般に、局所使用のために遺伝子療法用ベクターを投与する方法は当技術分野でよく知られており、本発明の核酸の投与に適用することができる。
【０１９１】
本発明の１つ以上のモジュレーターまたは遺伝子療法用核酸を含む治療用組成物を、１つ以上の適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏの疾患の動物モデルにおいて場合によっては試験して、当技術分野でよく知られている方法によって有効性、組織代謝を同定し、および用量を推定する。特に、製剤の活性、安定性または他の適切な指標によって用量を最初に決定することができる。
【０１９２】
投与は、分子を導入して細胞と最終的に接触させるために通常使用される経路の、いずれかによる投与である。関連配列をコードするモジュレーターおよび／または核酸を、場合によっては１つ以上の薬剤として許容される担体と共に任意の適切な方法で投与することができる。本発明の文脈で患者にこのような核酸を投与するのに適した方法が利用可能であり、２つ以上の経路を使用して個々の組成物を投与することができるが、個々の経路は他の経路より即時かつより有効な作用または反応をしばしばもたらすことができる。
【０１９３】
薬剤として許容される担体は投与する個々の組成物によって、および組成物を投与するために使用する個々の方法によって部分的に決定される。したがって、本発明の医薬組成物の広く様々な適切な製剤が存在する。経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、皮下、局所、舌下、または直腸投与だけには限られないが、これらを含めた幾つかの経路によって、組成物を投与することができる。組成物はリポソームによって（例えば局所的に）、あるいは裸ＤＮＡまたはウイルスベクターの局所送達によって投与することができる。このような投与経路および適切な製剤は、一般に当業者に知られている。
【０１９４】
組成物は、単独あるいは他の適切な要素と組合せて、吸入を介して投与するエアロゾル製剤にすることもできる（すなわち、それらは「噴霧」することができる）。エアロゾル製剤は、例えばジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧した許容される推進剤中に置くことができる。例えば関節内（関節中）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、および皮下経路などによって非経口投与するのに適した製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤を含むことができる水性および非水性、等張滅菌済み注射溶液、および製剤を目的のレシピエントの血液と等張にする溶質、ならびに懸濁剤、溶解剤、増粘剤、安定剤、および防腐剤を含むことができる水性および非水性、等張滅菌済み懸濁液がある。パッケージ核酸の製剤は、アンプルおよびバイアルなどの単位用量または多用量の密閉容器中に存在してよい。
【０１９５】
本発明の文脈で患者に投与する用量は、経時的に患者において有益な治療応答に影響を与えるのに充分である。用量は、個々のベクター、または他の製剤の有効性、および発現されるポリペプチドの活性、安定性または血清中半減期、および患者の状態、ならびに処置する患者の体重または体表面積によって決定される。用量のサイズは、特定の患者における個々のベクター、製剤などの投与に付随する任意の悪い副作用の存在、性質、および程度によっても決定される。疾患の処置において投与するベクターまたは製剤の有効量を決定する際に、医師は局所の発現、または循環血漿のレベル、製剤の毒性、関連疾患の進行、および／または関連がある場合、ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質に対する抗体の生成を評価する。例えば７０キログラムの患者に投与する用量は典型的には、現在使用されている治療用タンパク質の用量に相当する範囲内にあり、関連組成物の改変活性または血清中半減期に関して調節される。任意の知られている従来の療法によって、本発明のベクターは治療条件を補うことができる。
【０１９６】
投与に関して、本発明の製剤は、関連製剤のＬＤ−５０、および／または例えば全体または局所送達領域に施す様々な濃度での本発明のベクターの任意の副作用の観察結果、および患者の全般的な健康状態により決定した割合で投与する。投与は一回または分割用量によって実施することができる。
【０１９７】
処置を受けている患者が熱、悪寒、または筋肉の痛みを発症する場合、彼／彼女に適切な用量のアスピリン、イブプロフェン、アセトアミノフェンまたは他の痛み／熱を調節する薬剤を与える。熱、筋肉の痛み、および悪寒などの組成物に対する反応を経験する患者は、アスピリン、アセトアミノフェン、または例えばジフェニドラミンのいずれかを後に注入する前に３０分間前投与する。解熱剤および抗ヒスタミン剤にすぐに応答しないより重度の悪寒および筋肉の痛み用に、メペリジンを使用する。反応の重度に応じて処置は遅延または中断する。
【０１９８】
診断および予後判定アッセイ
本明細書の核酸、ポリペプチド、抗体および他の組成物は、乳癌表現型に対する易罹患性または耐性の予後判定および診断用に、（例えば、予めパッケージされたキットにおいて）試薬として使用することができる。他の疾患の示差的診断または予後判定の一部として、乳癌表現型の１つ以上の症状を有することが知られている対象に、これらの方法を実施することができる。乳癌表現型に対する知られている易罹患性を有する対象に、これらの方法を実施することもできる。このような個体の多型プロファイルは、易罹患性の評価を増大または低下させる可能性がある。例えば、乳癌を有する２人の兄弟がいる個人は、一般集団と比較して乳癌に対する高い易罹患性があることが知られている。易罹患性を裏付ける他の要因を発見することによってリスクは増大し、一方で耐性を裏付ける要因を発見することによってリスクは低下する。
【０１９９】
本発明は、本発明の１つ以上のＳＮＰにおける個体の多型プロファイルを測定する方法を提供する。ＳＮＰは図１および２中に示すＳＮＰ、およびこれらと連鎖不均衡状態にあるＳＮＰを含む。これらと連鎖不均衡状態にあるＳＮＰは通常、同じ遺伝子中あるいは同じ遺伝子の１００または５０または２０ｋｂ以内に存在する。本明細書の図面中のＳＮＰと連鎖不均衡状態にあるＳＮＰは、ハプロタイプマッピングによって決定することができる。異なる種由来の２倍体細胞を融合させることによってハプロタイプを決定することができる。生成する細胞は部分的に半数体であり、半数体染色体におけるハプロタイプを決定することができる（例えば、ＵＳ２００３００９９９６４を参照）。あるいは、例示したＳＮＰと連鎖不均衡状態にあるＳＮＰは、以下の実施例中に記載した試験と同様の関連試験によって決定することができる。
【０２００】
多型プロファイルは、個体中の様々な多型部位を占める多型形を構成する。２倍体ゲノムでは、互いに同じであるかあるいは異なる２つの多型形は、通常それぞれの多型部位を占める。したがって、部位ＸおよびＹにおける多型プロファイルはＸ（ｘ１、ｘ１）、およびＹ（ｙ１、ｙ２）の形で表すことができ、前式でｘ１、ｘ１は部位Ｘを占める対立遺伝子ｘの２つのコピーを表し、ｙ１、ｙ２は部位Ｙを占める異型対立遺伝子を表す。
【０２０１】
個体の多型プロファイルは、本明細書の図面中に示す各部位に存在する乳癌表現型に対する耐性または易罹患性と関係がある多型形との比較によって記録することができる。比較はこれらの多型部位、および場合によっては、これらと連鎖不均衡状態にある他の多型部位の少なくとも例えば１、２、５、１０、２５、５０個、または全てで実施することができる。多型部位は、他の多型部位と組合せて分析することができる。しかしながら、分析する多型部位の合計数は通常１０，０００、１０００、１００、５０または２５個より少なく、約１０個以下、約５個以下、あるいは約２個以下であってよい。
【０２０２】
特定の個体中に存在する耐性または易罹患性対立遺伝子の数を、付加的あるいは比として組合せて、乳癌表現型に対するその個体の遺伝的傾向に関する全体値を与えることができる（２００４年４月２８日に出願されたＵＳＳＮ６０，５６６，３０２、２００４年７月２２日に出願されたＵＳＳＮ６０／５９０，５３４、２００４年９月３０日に出願されたＵＳＳＮ１０／９５６，２２４、および２００５年３月３日に出願されたＰＣＴＵＳ０５／０７３７５を参照）。耐性対立遺伝子は＋１としてそれぞれ任意に記録することができ、易罹患性対立遺伝子は−１として記録することができる（あるいは逆も然り）。例えば、個体を本発明の１００個の多型部位で分類し、それらの全てにおいて耐性に関して同型である場合、彼は乳癌表現型に対する耐性に１００％の遺伝的傾向すなわち乳癌表現型に対する易罹患性に０％の傾向という値を割り当てることができる。個体が全ての易罹患性対立遺伝子に関して同型である場合、逆のことが当てはまる。さらに典型的には、個体は幾つかの遺伝子座における耐性対立遺伝子に関して同型であり、幾つかの遺伝子座における易罹患性対立遺伝子に関して同型であり、かつ他の遺伝子座における耐性／易罹患性対立遺伝子に関して異型である。乳癌表現型に関するこのような個体の遺伝的傾向は、全ての耐性対立遺伝子に＋１の値、および全ての易罹患性対立遺伝子に−１の値（あるいは逆も然り）を割り当てること、およびそれらの値を組合せることによって記録することができる。例えば、個体が１０２個の耐性対立遺伝子および２０４個の易罹患性対立遺伝子を有する場合、個体は耐性に対して３３％の遺伝的傾向および易罹患性に対して６７％の遺伝的傾向を有するとして記録することができる。あるいは、同型耐性対立遺伝子に＋１の値を割り当てることができ、異型対立遺伝子にはゼロの値、および同型易罹患性対立遺伝子には−１の値を割り当てることができる。耐性対立遺伝子と易罹患性対立遺伝子の相対数は、割合として表すこともできる。したがって、３０の多型部位において耐性対立遺伝子に関して同型であり、６０の多型部位において易罹患性対立遺伝子に関して同型であり、かつ残りの６３の部位において異型である個体は、耐性に関する３３％の遺伝的傾向を割り当てる。他の代替として、易罹患性に関する同型接合性は＋２として、異型接合性は＋１として、かつ耐性に関する同型接合性は０として記録することができる。
【０２０３】
個体の値、および多型プロファイルの性質は、乳癌表現型に対する個体の易罹患性の予後判定または診断において有用である。場合によっては、遺伝的プロファイルによって示される乳癌表現型に対する易罹患性を患者に知らせることができる。乳癌表現型に対する高い遺伝的傾向の存在は、予防または療法治療を開始しなければならない警告として処理することができる。例えば、乳癌表現型を発症する高いリスクを有する個体は別々にモニタリングすることができ（例えば、より頻繁なマンモグラフィー）、あるいは（例えば、１つ以上の薬剤を用いて）予防的に処置することができる。乳癌表現型に対する高い傾向の存在は、生検などの二次試験を実施する有用性も示す。
【０２０４】
多型プロファイリングは、例えば所与の個体における乳癌表現型の処置または予防に影響を与える物質を選択する際に有用である。類似した多型プロファイルを有する個体は、類似した形式で物質に応答する可能性がある。
【０２０５】
多型プロファイリングは、乳癌表現型または関連状態を処置する能力に関して試験する物質の臨床試験において個体を階層化するのにも有用である。このような試験は、類似または同一の多型プロファイル、例えば個体が乳癌表現型を発症する高いリスクを有することを示す多型プロファイルを有する処置または対照集団に実施する（ＥＰ９９９６５０９５．５を参照）。遺伝的に一致する集団の使用は、遺伝的要因による治療結果の変動を排除するかあるいは低下させ、可能性のある薬剤の有効性のより正確な評価をもたらす。コンピュータが実行するアルゴリズムを使用してより遺伝的相同性がある副次集団を同定することができ、その中で処置または予防は有意な影響を有するが、にもかかわらずより大きな異型集団中ではその処置または予防は無効である。このような方法では、物質で処置した乳癌表現型を有する第一集団、およびこれも乳癌表現型を有するがプラセボで処置した第二集団に関するデータを与える。２つの集団中の個体の多型プロファイルは、図１および／または２中に示す遺伝子から選択した遺伝子の１００ｋｂまたは５０ｋｂまたは２０ｋｂ以内で少なくとも１つの多型部位において測定する。集団中の各患者が首尾良い処置または予防を示す望ましい終点に到達するかに関してもデータを与える。第一および第二集団のそれぞれの副次集団を、副次集団中の個体が元の第一および第二集団中の個体より高い多型プロファイルの類似性を互いに有するように次いで選択する。それによって類似性を評価することができる多くの基準が存在する。例えば１つの基準は、副次集団中の個体が前述の遺伝子の少なくとも１０個のそれぞれにおいて少なくとも１個の易罹患性対立遺伝子を有することを必要とすることである。他の基準は、副次集団中の個体が多型プロファイルを測定する多型部位のそれぞれに関する少なくとも７５％の易罹患性対立遺伝子を有することである。類似性を評価するために使用する基準とは無関係に、副次集団の終点データを比較して、処置または予防が副次集団において統計的に有意な結果を得たかどうか測定する。コンピュータによる実行の結果として、類似性に関する無数の基準を分析して、統計的有意性を示す１個または数個の副次集団を同定することができる。
【０２０６】
多型プロファイリングは、臨床試験から乳癌表現型に対する素因がない個体を除外するのにも有用である。臨床試験中にこのような個体を含めることによって、統計的に有意な結果を得るのに必要とされる集団の大きさが増大する。乳癌表現型に対する素因がない個体は、前に記載したように多型プロファイルにおける耐性および易罹患性対立遺伝子の数を測定することによって同定することができる。例えば、乳癌表現型と関係がある本発明の１０個の遺伝子中の１０カ所の部位で対象を遺伝子型決定する場合、合計２０個の対立遺伝子を測定する。５０％を超える、および好ましくは６０％または７５％を超えるこれらの遺伝子が耐性遺伝子である場合、個体は乳癌表現型を発症する可能性がなく、臨床試験から除外することができる。
【０２０７】
他の実施形態では、臨床試験における個体の階層化は、家族歴、リスクモデル（例えば、Ｇａｉｌ値、Ｃｌａｕｓモデル）、臨床的表現型（例えば、異型病変および乳房密度）、および特異的候補バイオマーカー（例えば、ＩＧＦ１、ＩＦＧ２、ＩＧＦＢＰ３、Ｋｉ−６７、およびエストラジオール）だけには限られないがこれらを含めた、他の階層化法と組合せた多型プロファイリングを使用して実施することができる。例えば、多型プロファイルに基づく階層化を含む化学的予防試験における高リスクの階層化は、結果を改善することができる。特に、ＦＧＦＲ２と連鎖したマーカーを使用して抗ＶＥＧＦまたは抗血管新生療法応答を階層化することができ、ＰＫＨＤ１と連鎖したマーカーを使用して抗ＥＧＦ療法の有効性を階層化することができる（抗ＥＧＦ療法は多嚢胞性腎および肝疾患を有する患者において働く）。
【０２０８】
多型プロファイルを臨床試験の終了後に使用して、所与の処置に応じた違いを解明することもできる。例えば、多型のセットを使用して、登録患者を疾患の幾つかの亜型またはクラスに階層化することができる。多型を使用して、処置に対して異常な（高いまたは低い）応答性を有するかあるいは全く応答しない（非応答者）、類似した多型プロファイルを有する患者の小集団を同定することもできる。このようにして、処置に対する応答性に影響を与える根底にある遺伝的要因に関する情報を、治療の開発の多くの態様において使用することができる（これらは新たな標的の同定から、生成物標識および患者標的化のための新たな試験の設計に及ぶ）。さらに、多型を使用して、治療に対する悪い応答性と関係がある遺伝的要因（有害事象）を同定することができる。例えば、悪い応答性を示す患者は、偶然に予想されるより類似した多型プロファイルを有する可能性がある。これによって、初期の同定および治療からのこのような個体の除外が可能である。それは、有害事象の生物学的原因を理解するため、および治療を修正してこのような結果を回避するために使用することができる情報も与える。
【０２０９】
米国特許第６，５２５，１８５号によって記載されたのと同様に、実父確定検査および法医学的分析を含めた他の目的で、多型プロファイルを使用することもできる。法医学的分析では、犯行現場におけるサンプルからの多型プロファイルを容疑者のそれと比較する。この２つの間の一致が、容疑者が犯罪を実際に犯した証拠であり、一方で一致の欠如によって容疑者は除外される。存在する多型部位はこのような方法において使用することができ、ヒトゲノム中の他の多型部位も使用することができる。
【実施例】
【０２１０】
以下の実施例は、特許請求する本発明を制限するためではなく、例示するために与える。当業者は、本発明の範囲内で変えることができる様々な重要でないパラメータを理解しているはずである。
【０２１１】
（実施例１）
乳癌マーカーを同定するための戦略
導入：一般的な遺伝的変異の同定
乳癌マーカー対立遺伝子の同定において公衆衛生に重要な適用例が存在する。遺伝的変異が多くの遺伝子座によるものである場合、易罹患性の遺伝子座で受け継がれた高リスクの対立遺伝子の数に応じて、個体に対するリスクは広く変化する。Ａｎｔｏｎｉｏｕら１３のモデルに基づく我々の分析は、集団の上位２０％と下位２０％との間に４０倍ものリスクの違いが存在する可能性があることを示唆する。同じモデルの下で、全乳癌の半数が最大リスクの女性の１２％において発生し、これらの女性は７０才までに少なくとも８分の１のリスクを有する。対照的に、最小リスクの女性の５０％は癌のわずか１２％、および３０分の１未満の個体リスクを有する１４。乳癌のリスクと相関関係があるとして同定する遺伝子は、関連および個体リスクの推定に使用することができる。このリスク推定の実際の結果は重要である。
【０２１２】
適度のリスクをもたらす一般的な遺伝的変異は、集団レベルで個々に重要な影響を有する。例えば、個体リスクをわずか１．５倍増大させる頻度２０％での一般的な変異は、癌の集団の負担（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｂｕｒｄｅｎ）の１５％に相当するはずである。心臓血管病における血圧、またはコレステロールの適度な上昇も同様である。変異が介入に適した機構を示す場合、これは標的予防に関する新規の可能性も与える。
【０２１３】
これらの実際の結果以外に、癌易罹患性遺伝子の同定は、（例えばＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２に関して既に起こっているのと同様の）発癌の機構の解明を手助けする。知られている候補から全ゲノム検索への拡大には、全く新規の機構が生じるという大きな利点がある。これらの機構は新たな治療標的も与える。
【０２１４】
最後に、易罹患性遺伝子の知識によって我々は、ライフスタイルによるリスク因子の影響を、例えばＥＰＩＣコホートを使用して遺伝子とこれらのリスク因子を組合せた影響を試験することによって解明することができる。
【０２１５】
乳癌
多くの癌における関連試験に関して補強を行うことができるが、乳癌において試験を実施することが何故非常に適切であるかという、幾つかの理由が存在する。乳癌は女性における最も一般的な癌であり、その原因論は依然としてほとんど理解されていない。この疾患の遺伝的根拠は、任意の他の一般的な癌より徹底的に調べられてきている。結果として、多遺伝子的根拠に支持される証拠は他の癌より明らかである。長期の試験によって、確実に易罹患性遺伝子座を同定するほど充分多数の症例系を構築している。さらに、強い家族歴を有する症例は癌臨床遺伝学によって利用可能であり、関連試験中の有効性において相当な利益を与え得る（「Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｐｏｓａｌ」を参照）。最後に、高リスク状態であることが分かっている女性に対して、示される可能性がある介入が存在する。例えば予防的卵巣摘出術は、乳癌の後のリスクを実質的に低下させることができる１５。近年の試験は、ＭＲＩによるスクリーニングは著しく高いコストではあるが、マンモグラフィーよりはるかに高い感度を与える可能性があることを示唆する１６。
【０２１６】
試験設計
２００，０００の一塩基多型（ＳＮＰ）の遺伝子型を、ＥＰＩＣコホートからの４００の家族性乳癌症例と４００の対照のセットにおいて決定し、最も強い関係を示すこれらのＳＮＰの５％を、４，６００の症例と４，６００の対照の他の集団ベースの系において分析する。他の大きな症例−対照系において、このステージにおける正の関係を同定する。
【０２１７】
乳癌の終点以外に、多くの量的表現型が対照のセットにおいて入手可能であり、遺伝子分析に関する他のデータを与える。これらは癌のリスクと関係がある表現型（例えば、マンモグラフィーパターン、ホルモンレベル）を含む。
【０２１８】
収率
スキャンは、反復配列外の全ゲノム中の、頻度１０％以上（および幾つかは５〜１０％の範囲）の一塩基多型を評価する。スキャンは、乳癌の全ての受け継がれる要素の２％以上を占めるこれらの領域内の、任意の一般的な変異を検出する約８０％の能力を有する。
【０２１９】
一般的な易罹患性変異を検索するための試験の設計
一般的な低リスクの対立遺伝子を同定するのに有効な設計は、症例／対照試験である。易罹患性と関係がある変異体は、遺伝的背景が一致する対照より有意に高い頻度での、癌症例におけるそれらの発生によって同定する。この試験では、変異は一塩基多型（ＳＮＰ）である。疾患の易罹患性と関係がある可能性がある活性または機能的変異体は知られていないことが最も多く、したがってその検索は、推定（ただし知られていない）活性変異体を報告することができる「タグ化」ＳＮＰのセットに依存する。
【０２２０】
症例−対照関連試験の手法は、「候補遺伝子」規模で乳癌において既に広く使用されている。約１００遺伝子のコード領域およびイントロンの多型が、このようにして以前に試験されている。これらは例えば、性ステロイドホルモンの代謝、細胞周期の調節およびＤＮＡの修復と関係がある遺伝子を含む。幾つかの関係が一般的な変異体に関して示唆されてきているが、明確に確定しているものはない。今までの結果は、乳癌のリスクの大部分の変化は、乳癌候補としての第一選択肢である可能性がある遺伝子の遺伝子内ＤＮＡの変異によるものではないことを示唆する。さらに、候補遺伝子の手法に対する重大な制約が存在する。それは緩慢で比較的高価であり、試験する各遺伝子のＳＮＰベースによるＳＮＰに関するアッセイの開発に依存し、それは候補遺伝子の範囲内でさえ不完全であり、多くの場合、特に考えられる制御の変化を無視しており、それは疾患の生物学の現在の知識によって制限される。ゲノム全般規模の検索は対照的に、機能または位置の如何なる従来知識も無しで、活性のある一般的な変異体を同定する能力を有する。
【０２２１】
ゲノムスキャンＳＮＰ
ゲノムスキャンに関する要件は、ゲノム中の全ての他のＳＮＰＳのセットの報告において、完全性とコストとの間の最良の妥協を与えるＳＮＰのセットを定義することである。Ｐｅｒｌｅｇｅｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｐｅｒｌｅｇｅｎ（ｄｏｔ）ｃｏｍ）は、ヒト／げっ歯類体細胞ハイブリッドにおける分離した２０〜５０の１倍体ゲノム中のヒトゲノムの非反復配列をリ配列決定することによって、１１０万の一般的なＳＮＰマーカー（２ｋｂ当たり１ＳＮＰの密度）を同定している。このＳＮＰ検索は、Ｐａｔｉｌら１７により報告された染色体２１の試験において報告された戦略と同様の戦略に基づく。ここから彼らは、動的計画法アルゴリズム１８を使用して、１１０万のＳＮＰの完全なセットによって定義される明らかに８０％を超える一般的なハプロタイプを報告する、２００，０００のタグ化ＳＮＰのセットを定義している。この実施例で使用したのは、２００，０００のタグ化ＳＮＰのこのセットである。
【０２２２】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘにより開発され通常の使用において広く認められている、高密度オリゴヌクレオチドアレイでＳＮＰを分類する。簡単に言うと、このアレイ設計は、各ＳＮＰを検索するために８０の特徴（２５量体オリゴヌクレオチド）を使用する。８０の特徴は１０の重複する特徴集合を含み、各特徴集合は、参照対立遺伝子に特異的な４つの特徴（１つの完全一致および３つのミスマッチ特徴）および他の対立遺伝子の４つの同様の特徴を含む。参照対立遺伝子の完全一致特徴の蛍光強度と他の対立遺伝子の完全一致特徴の蛍光強度を比較することによって、３つの考えられるＳＮＰ遺伝子型（一般的なホモ接合体、ヘテロ接合体および稀なホモ接合体）を区別することができる。遺伝子型決定アッセイを実施するために、当該のＳＮＰを含むサンプルゲノムの領域を、マルチプレックス（７８−ｐｌｅｘ）短期ＰＣＲを使用して特異的に増幅させる。各個体からのＰＣＲ産物を集め、ビオチンで標識して標的ＤＮＡを作製する。標的ＤＮＡは、ＳＮＰにより分類した高密度オリゴヌクレオチドアレイとハイブリダイズさせる。一晩のハイブリダイゼーション後、アレイを洗浄し、染色し蛍光強度をスキャンする。
【０２２３】
この実施例では、２００，０００のＳＮＰを遺伝子型決定するための特徴は一連の６個の高密度アレイ上に配列しており、約３０，０００ＳＮＰの複雑性を有する標的ＤＮＡをハイブリダイゼーションに使用することが必要である。この複雑性の標的は９７．３％の度数を与える。高密度アレイ遺伝子型決定技術と他の技術（リアルタイムＰＣＲおよび蛍光偏光）の比較は、約２０，０００の遺伝子型および２０までの異なるＳＮＰで９９％を超える一貫した一致を示す。この技術は様々な共同臨床検査質室および研究所由来のＤＮＡと共に使用するとき確かであり、ゲノム増幅ＤＮＡと共によく働くことが証明されている。
【０２２４】
この試験で使用した２００，０００のタグ化ＳＮＰの性質は、ゲノム内の全ての他のＳＮＰ変異体を「報告する」それらの能力である。所与の能力に関して、必要とされるサンプルのサイズは１／ｒ２に比例し、この場合ｒは検索中の機能的変異体と最も密接に連鎖するタグ化ＳＮＰとの間の連鎖不均衡の係数である１９。
【０２２５】
非タグ化ＳＮＰとそれらの対応するタグ化ＳＮＰとの間のｒ２の分布を、２８の無関係な個体（５６の染色体）において、ゲノムＤＮＡの４Ｍｂ領域上に等しく位置する１６０８のＳＮＰの遺伝子型を決定することにより経験的に決定した：表１参照。全９８８の試験体ＳＮＰの平均ｒ２は、それぞれ１０％を超える低い対立遺伝子頻度で６７％であり、６９％のＳＮＰが０．５を超えるｒ２を有していた。
【０２２６】
表１
表１  ＳＮＰの発見に使用した個体と異なる２８の個体中の染色体２１の４Ｍｂセグメントにおいて測定した、４１７の選択した「タグ化」ＳＮＰと９８８の「試験体」ＳＮＰとの間のｒ２値の分布。ＳＮＰの全セットの１５％は低い対立遺伝子頻度１〜１０％を有しており、８５％は１０％を超える頻度を有しており、１０％と５０％との間で均一に分布していた。全ての試験体ＳＮＰは１０％を超える低い対立遺伝子頻度を有していた。４１７のタグ化ＳＮＰセットの平均間隔は１０ｋｂ当たり１であり、ゲノムスキャンにおいて使用した２００，０００のＳＮＰセットのそれと同様であった。
【０２２７】
【表１】
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２００，０００のタグ化ＳＮＰセットの増大によって、増大したコストではあるが、報告する全ゲノム中のＳＮＰの割合が増大する。１１０万の一般的なＳＮＰのセットでさえ全範囲はカバーしないはずである。これは、幾つかの塩基はアッセイすることができない可能性があり、調査した染色体の限られた数が原因で幾つかの一般的なＳＮＰが欠失しているからである。この２００，０００のタグ化ＳＮＰセットは対象範囲とコストとの間の妥当な妥協を与えると、我々は結論付ける。
【０２２８】
以前の試験は、低い浸透率の易罹患性に対する充分な集中を含めて癌素因の遺伝学に集中している１３、１４、２０−２３。関連トピックスには、（１）症例および対照セットの構築、（２）乳癌易罹患性の遺伝的モデルの開発、（３）関連試験の実験施設の設立がある。
【０２２９】
（１）サンプルセット
乳癌の症例−集団ベースのセット。地方のＡｎｇｌｉａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙによって同定された７０才前に診断済みの侵襲性乳癌の（現在４９００の）症例の集団ベースのセットを我々は構築した。診断から動員の終了までの平均期間は、６ヶ月（四分位範囲３〜９ヶ月）である。全ての適格症例の６５％が血液サンプルを与えた。このセットは、我々の試験のステージ１で分析する幾つかの家族症例、およびステージ２の集団ベースの一連の症例を与える。血液サンプル以外に、第二度近親との家族歴、出産歴、授乳、経口避妊薬およびＨＲＴの使用、良性乳房疾患、他の癌を含めた病歴、喫煙状態、アルコール摂取、学歴および民族を含めた質問を対象に実施する。登録データは臨床段階、病状等級および段階、単純な治療データおよび生存の追跡調査を含む。腫瘍のパラフィン切片は現在８００の症例から入手可能であり、資金が利用可能である場合は全セットの大部分に関して原則として回収することができる。
【０２３０】
乳癌の症例−家族性のセット。ケンブリッジの家族性乳癌クリニックおよび前に記載した集団ベースのセットによって、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２突然変異に関して陰性との結果が出た、乳癌または左右の初期乳癌のいずれかの強い家族歴を有する２００を超える症例のセットを構築した。これらの症例、および他のＣＲＵＫ群との共同によって得た同様の症例は、関連試験の第一ステージ用の「遺伝的に多様な」症例のセットを形成する。
【０２３１】
対照。試験のステージ１とステージ２の両方用の対照ＤＮＡは、ＥＰＩＣ−Ｎｏｒｆｏｌｋコホートから得る２４。これはＭｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒの一部であり、全血、広範囲の疫学的情報および追跡調査から動員した４５〜７０才の男性および女性の４５０，０００強の集団ベースのコホートが利用可能である。ＥＰＩＣ−Ｎｏｒｆｏｌｋの２５，０００の参加者は、乳癌の症例をそこから得る同じＡｎｇｌｉａｎ領域内のＮｏｒｆｏｌｋにおける家族歴の診療から同定したボランティアである。このプロジェクトの遺伝子発見段階の対照を与える以外に、大きなＥＰＩＣコホートは正の関係を同定するため、および追跡調査段階での遺伝子／ライフスタイルの相互作用を調べるためのサンプルおよびデータを与える。
【０２３２】
試験集団は民族的に比較的均質であり、集団の９５％より多くを白人であり英国生まれであるとして記録する。この集団における集団層化に関する証拠は、２３の非連鎖遺伝子におけるＳＮＰの１６５５の対照の遺伝子型決定によって評価している。非連鎖遺伝子間の有意な関係は見出せず、層化の証拠は示せなかった２５。
【０２３３】
ＥＰＩＣ対照セットにおける他の表現型の情報。試験と関連して、広範囲の表現型情報が（個体の小集団内で）利用可能であるか、あるいはステージ１で２００，０００のＳＮＰに関して遺伝子型決定する４００のＥＰＩＣ対照から容易に得ることができる。これらの定量的または半定量的表現型を、遺伝子型関係に関して評価する。乳癌と関係がある表現型には、マンモグラフィー密度、踵骨密度、体格指数、およびその中でこれまでエストロゲン代謝産物、ＳＨＢＧ、ＩＧＦ−１、および幾つかのサイトカインが異なるセットの個体において既に入手可能である血清中の一定範囲の測定値がある。他の表現型には、血圧、脂質プロファイル、Ｃ−反応性タンパク質、フィブリノゲン、全血球数、糖化ヘモグロビンおよび甲状腺機能がある。２００４年および２００５年に、再調査およびさらなる血液サンプリングのための限定的な改修、ならびに他の表現型決定および新たな血清および生存細胞の回収の可能性が考えられている。
【０２３４】
（２）乳癌易罹患性の遺伝的モデル。
【０２３５】
我々はＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２の突然変異に関するＡｎｇｌｉａｎ集団ベースの試験において同定した第一の１５００の乳癌を分析し、Ｐｅｔｏらと一致して、乳癌の家族集積性のわずか１５％が、これらの遺伝子の突然変異に起因することを見出した。この試験の症例の家族（他の系で後に試験した）における乳癌のパターンの我々の分離比分析は、初期に要約された多遺伝子モデルをもたらした１３。したがってこのモデルは、任意抽出症例ではなく家族症例を使用することによって与えられる関連試験に関する高い能力の予測が根底にあり、これはこの実施例で使用する示した２ステージ設計に基づく２６。
【０２３６】
（３）サンプル処理およびＳＮＰ遺伝子型決定用の実験設定。
【０２３７】
３８４ウエルのＴａｑｍａｎプラットホームをベースとする適度なスループットの遺伝子型決定用実験設定を、候補遺伝子関連試験に使用する。遺伝子型決定能力は、１週間当たりで〜１００，０００ＳＮＰである。
【０２３８】
簡単に言うと、実験設定は以下の通りである。試験の参加者には、全参加者のデータおよびその生物サンプルチューブが付いたままの状態でバーコードとしてコード番号を与える。実験室内では、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ、Ａｌｔｒｉｎｇｈａｍ  ＵＫ）を用いてサンプルを追跡する。９６対象のバッチにおいて、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｌｔｄ（Ｅｌｙ、ＵＫ）によりコードしたチューブ内の全血からＤＮＡを抽出し、コードしたアレイに戻し、ＤＮＡは４０ｎｇ／μｌに標準化する。全ゲノムの予備増幅は標準化したアレイで実施し、産物は等分試料で保存した。遺伝子型決定用の３８４ウエルの作業用ストックを、陰性対照として対照ウエルを挿入しながら等数の症例および対照から作製する。試験の３％のサンプルが複製である。したがって、（前に記載した）症例および対照は、１２の特有サンプルおよび１３番目が複製の１３プレートに保持する。遺伝子型決定は全ての試験プレートで同時に実施し、試薬はロボット（Ｍａｔｒｉｘ、ＵＫ）によって加え、ＭＪ  Ｔｅｔｒａｄｓ（ＧＲＩ、ＵＫ）で熱循環させ、および７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＡＢＩ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ）によって終点の蛍光を検出する。遺伝子型はデータベースに移し、各対象に関する表現型のデータと関連付ける。最終品質管理ステップとして、対照の遺伝子型をハーディ−ワインベルグ平衡からの逸脱に関して試験する。
【０２３９】
研究設計
試験は数ステージで編成される：
ステージ１。２００，０００のタグ化ＳＮＰのフルセットを家族歴が多様な４００の無関係な乳癌症例において分析し、４００の女性対照をＥＰＩＣ試験から抽出する。これらの乳癌症例は、ＢＲＣＡ１／２突然変異に関して陰性であるとスクリーニングされるはずである。
【０２４０】
ステージ２。ｐ＜０．０５レベルで癌系と対照系との間の有意な頻度の違いを示すＳＮＰを、他の４６００の乳癌症例および４６００の適合対照において再評価する。
【０２４１】
研究設計の合理性
リスクに対して適度な影響でＳＮＰを検出する高い能力を保ちながら、段階的設計を選択して必要とされる遺伝子型決定の量を最小にする。示した閾値で、約１０，０００のＳＮＰがステージ２に進むはずであり、一方（「真の」関係にの数に応じて）実質的に少数が、ステージ２の最後で他の試験におけるさらなる同定用に持ち出されると予想される。このような段階的設計は全ＳＮＰの全サンプルの遺伝子型決定と比較して、非常に有効であることを計算は示している２７。
【０２４２】
症例−ステージ１
症例は侵襲性乳癌を有する女性であり、その少なくとも２人の第一度近親は乳癌、あるいは等しく強い家族歴を有している（例えば、１人の第一度および２人の第二度近親が罹患している）。これらの女性は英国の癌遺伝学センターから、またはＡｎｇｌｉａｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｕｄｙから選択する。その民族が白人として記録されない女性は除外することにする。
【０２４３】
関係を検出する能力は、症例の家族歴の程度と強く関係があることを、我々は以前に実証している２６。２人の罹患した第一度近親を有する症例の使用は、任意抽出症例の使用と比較して、必要とされるサンプルの大きさを少なくとも４倍低下させる。全ての利用可能な症例から特に、我々は強い家族歴を有する４００の症例を選択する。同じ家族からの２つ以上の症例が利用可能である場合、我々はセット中の全ての症例が無関係であるように最も強い直接的な家族歴を有する症例を選択する。
【０２４４】
全ての症例をＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２突然変異に関してスクリーニングする（そしてこれらに関して陰性である）。このスクリーニングは、感受性スクリーニング技法（例えばＣＳＧＥ）による全てのエクソンおよびスプライシング接合部のスクリーニングを含む。ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２突然変異の非保因者において乳癌のリスクに影響を与える低い浸透率の対立遺伝子が、保因者におけるリスクにも影響を与えるかどうかは知られていないので、これを実施する。Ａｎｔｏｎｉｏｕら１３の分析は、保因者における同様の「多遺伝子」要素を示唆する。しかしながら、特にＢＲＣＡＩ腫瘍の独特の病状を考慮すると、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２保因者におけるリスクを変える遺伝子は異なる可能性があると考えられる。ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２突然変異は、ステージ１で使用した基準により選択した２０％を超える症例において存在するはずである。当該の多型が保因者における疾患のリスクに影響を与えない場合、保因者を含めることによって試験の能力が低下する可能性がある。したがって試験は保存状態でスクリーニングを行い、知られているＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２突然変異の保因者は除外する。この手法は、約７０％のＢＲＣＡ１突然変異および９０％のＢＲＣＡ２突然変異を除外し、したがって最終セット中の５％未満の症例が未同定の突然変異をおそらく有すると推定される。
【０２４５】
症例−ステージ２
ステージ２における症例は、集団ベースのＡｎｇｌｉａｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ（ＡＢＣ）試験から抽出した４，６００の症例からなる。
【０２４６】
ステージ１において能力を最大にしコストを最小にするための「多様な」症例の使用に関する補強が存在するが、ステージ２において症例はより細かくバランスがとれている。家族症例の使用は能力を増大させるが、能力の主な決定要因はステージ１の有効性であるので、利点はそれほど顕著ではない。同時に、集団ベースの症例−対照セットは候補遺伝子関連試験中で既に使用されており、ＤＮＡサンプルはステージ１から既に並べてある。この規模での家族症例の新たなセットの開発は、相当な遅れおよび出費を伴うはずである。第二に、症例は対照と地理的に密接に合致しており、対立遺伝子頻度の地域格差による偽陽性関係に対する一層の防御をもたらす。第三に、集団ベースの系は、それぞれのＳＮＰまたはハプロタイプと関係がある相対的リスクの直接推定値を与える。第四に、ＡＢＣ試験は、癌のライフスタイルのリスク因子および臨床結果に関する系統的情報を回収している。これは、生存との関係およびライフスタイルのリスク因子との相互作用を試験するための、さらなる分析の可能性を与える。同じ質の情報は、家族症例に関して得ることができなかった。
【０２４７】
要約すると、多様な系と集団ベースの症例系の両方の系を使用することによって、我々は真の関係を検出する能力を最適化しており、一方同時に、充分に特徴付けられている集団ベースの症例−対照試験における遺伝子型決定という付加価値を得ている。
【０２４８】
対照
ステージ１とステージ２の両方の対照は、前に記載したＥＰＩＣ試験からの女性であるはずである。対照の年齢分布は、症例のそれと同様である。進行した癌を有することが知られている女性、または白人ではない女性は除外するはずである。ステージ１の対照は、その性ステロイドホルモンおよびマンモグラフィー密度の詳細な分析を実施した、２，０００人の閉経後女性のサブコホートからサンプル採取した２８。
【０２４９】
遺伝的関係試験のための症例サンプルと対照サンプルの両方の使用を含む倫理的承認が得られている。症例と対照の両方が、このような遺伝的試験に使用するそれらのＤＮＡに関するインフォームドコンセントを与えている。
【０２５０】
統計的考察
統計分析
ステージ１とステージ２の両方における一次分析は、乳癌とそれぞれのＳＮＰの関係を個別に評価することである。疫学的試験は、おそらく非常に若い年齢以外は１、１２、症例の母親および姉妹間で乳癌の相対的リスクがほとんどあるいは全く違わないことを示唆し、（Ａｎｔｏｎｉｏｕら１３の多遺伝子モデルと同様に）最も易罹患性の対立遺伝子は劣性要素をほとんど有していないことを示す。したがって一次分析は、症例と対照との間の対立遺伝子頻度の違いに関する傾向検定に基づく２９。症例は家族歴によって重み付けして、この検定の有効性を改善する。
【０２５１】
原則として、ハプロタイプ分析または共同遺伝子型分析によってある程度の能力の改善をもたらすことができる３０。しかしながら現在の設計では、ハプロタイプ分析は大部分が冗長である。これは、ごく少数のＳＮＰがステージ２に持ち越されるはずであり、能力の計算値は推定の一回ＳＮＰ分析値をしたがって有するはずであるからである。群中の全てのタグ化ＳＮＰをステージ２に持ち越して完全なハプロタイプ分析を可能にするコストは、能力の如何なる増大より重要である可能性がある。ハプロタイプ分析は同じＬＤ群中の２つ以上の連鎖したＳＮＰをステージ２で分類する症例において使用し、追跡調査試験において広く使用するはずである。
【０２５２】
能力の計算
試験の能力は、組合せた２ステージ中のｐ＝１０−４という有意なレベルに基づいて導いている。（段階的設計を考慮して）約１２の遺伝子座が偶然このレベルで重要であると予想され、処理可能な数の遺伝子座を大きな系で再検定し、「真の」陽性と「偽」陽性の好ましい比を保つ。
【０２５３】
能力の計算によって、ステージ１の症例は２人の罹患した第一度近親という家族歴を有すると推測される。実際、これは最小基準であり症例の多くはさらに強い家族歴を有するはずなので、能力は幾分高い。タグ化セットからの推定のｒ２分布を考慮して、疾患の対立遺伝子頻度および相対的リスクの異なる値に関する、疾患易罹患性の対立遺伝子を検出する能力の例を表２中に与える（．０５の対立遺伝子頻度を有する多型に関しては、セットからランダムに選択した一般的な多型と共にＤ’＝１でＬＤ中に多型が存在すると推定することによって能力を計算している）。一般的な対立遺伝子に関しては、能力は全体の遺伝的変異に対する遺伝子座の頁献に主に依存し、１％の変異を説明する遺伝子座に関しては少なくとも５０％であり、２％の変異を説明する遺伝子座に関しては約８０％である。対照的に、５％未満の頻度を有する遺伝子座に関しては、エフェクトサイズが非常に大きくない限り能力は低い。
【０２５４】
表２
表２。以前に報告されたデータ（表１）に基づき易罹患性の遺伝子座とタグＳＮＰとの間のｒ２の分布を考慮して、所与の相対的リスクを与える所与の対立遺伝子頻度で（２ステージ後にＰ＜．０００１）優性な易罹患性の遺伝子座を検出すると推定した全体の能力。全体の遺伝的変異の割合は括弧内に説明した。
【０２５５】
【表２】
0005394069.tif 000003
対照において測定した量的形質に関して、遺伝子座を検出する能力は約５０％であり、５％の有意レベルで少なくとも５％の表現型変異を説明する。これらの遺伝子座は、ＥＰＩＣコホート内の後の大規模な試験における他の評価に利用可能であるはずである。
【０２５６】
易罹患性の遺伝子座の詳細な評価
ひとたび有意な関係を同定した後、最も強く関連する変異体またはハプロタイプを確定する目的で領域中の他の多型を評価する。一般的な手順は、候補遺伝子を調べるために使用する手順と類似しているはずである。利用可能なデータベースを、知られているＳＮＰに関して検索する。全ての利用可能なＳＮＰに関する系統的検索を実施していない場合、限られた数の個体（例えば、ｎ＝４８）の内部リシークエンスを使用する。完全ＬＤ状態であるＳＮＰを除外した後、情報を与えるＳＮＰはステージ１および２で使用する症例および対照において遺伝子型を決定する。多重ロジスティック回帰を使用して多数のＳＮＰの複合効果を調べる。さらなる調査を実施して機能性変異体を同定することができる。
【０２５７】
量的形質遺伝子座のさらなる評価
量的形質とステージ１で有意な関係を示すＳＮＰは、他の系中の反復試験に利用可能である。量的形質遺伝子座の数が多いので、関係の強度、遺伝子座の妥当性および表現型の重要性に基づいて優先順位付けを実施する。例えば、血清中の性ステロイドホルモンのレベルおよびマンモグラフィー密度との関係は優先順位付けすることが好ましい。というのは、これらは乳癌のリスクと関係があるからである。ＥＰＩＣにおいて閉経後女性由来の他の１，６００サンプル中で、これらの表現型と関係があるＳＮＰを分類する。関係が再現する場合、前と同様にそれらを追跡する。
【０２５８】
参考文献：
【０２５９】
【化１】
0005394069.tif 000004
【０２６０】
【化２】
0005394069.tif 000005
【０２６１】
【化３】
0005394069.tif 000006
（実施例２）
乳癌の素因と関係があるマーカー多型
乳癌のリスク（素因）と関係があると同定したＳＮＰを、図１および２中に述べる。図１は現在最も好ましい関係を与え、図２は他の関係を与える。
【０２６２】
所与のｄｂＳＮＰ＿ｒｓＩＤ番号（「ＲＥＦＳＮＰ＿ＩＤ」、図からの第２行を参照）の配列は、：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／で見られる。
図１および２中では、第２行は「ＲＥＦＳＮＰ＿ＩＤ」と示す。この行中の値は、ＵＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｔ  ｔｈｅ  ＵＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈのＮＣＢＩによって確立および維持されているｄｂＳＮＰデータベースによるＳＮＰ識別番号である。ＮＣＢＩのｄｂＳＮＰデータベースは公的にアクセス可能であり、図中に与えるｒｓＩＤ番号を使用してデータベースを検索し、データベース検索ウインドウ中の「ｒｓ」によって接頭辞を表す番号を入力し、および「Ｓｅａｒｃｈ」をクリックすることによって、多量の他の情報を容易に見ることができる。与えられる情報は、ＳＮＰ遺伝子座における対立遺伝子、隣接ヌクレオチド配列、および寄託情報だけには限られないが、これらを含み得る。
【０２６３】
ＳＮＰ＿ＩＤ行の番号（行１、図１および２を参照）は公的に利用可能であるＰｅｒｌｅｇｅｎのＳＮＰ識別番号を指し、与えられた指示書（Ｐｅｒｌｅｇｅｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）に従い、ｇｅｎｏｍｅ（ｄｏｔ）ｐｅｒｌｅｇｅｎ（ｄｏｔ）ｃｏｍ／ｂｒｏｗｓｅｒ／ｉｎｄｅｘ（ｄｏｔ）ｈｔｍｌで企業の利用可能なゲノムブラウザを使用して、Ｐｅｒｌｅｇｅｎ（ｄｏｔ）ｃｏｍにおいて関連情報と共にこれを見ることができる。与えられた指示書中に記されたように、ワイルドカード文字（例えば、「＊」記号）はＳＮＰ＿ＩＤの最初に加えて、ＳＮＰの全対立遺伝子に関する関連情報を同定することができる。このデータベースは、ＮＣＢＩゲノムデータベースともリンクする。
【０２６４】
図中、各ページの第１列は行名に関する見出し列である。行は以下の通りである：
【０２６５】
【表３】
0005394069.tif 000007
前述の本発明を明瞭性および理解の目的である程度詳細に記載してきたが、様々な形および詳細の変形を本発明の真の範囲から逸脱せずに作製することができることは、本開示を読むことから当業者には明らかであるはずである。例えば、前に記載した全ての技法および装置は、様々な組合せで使用することができる。本出願中に列挙した全ての刊行物、特許、特許出願、および／または他の文書は、それぞれ個々の刊行物、特許、特許出願、および／または他の文書が参照によりあらゆる目的で組み込まれることが個別に示される場合と同程度で、参照によりあらゆる目的でその全容が本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２６６】
【図１−１】図１は、乳癌と関係がある好ましい多型、多型の遺伝子および関連情報の表である。
【図１−２】図１は、乳癌と関係がある好ましい多型、多型の遺伝子および関連情報の表である。
【図２−１】図２は、乳癌と関係がある好ましい多型、多型の遺伝子および関連情報の表である。
【図２−２】図２は、乳癌と関係がある好ましい多型、多型の遺伝子および関連情報の表である。
【図２−３】図２は、乳癌と関係がある好ましい多型、多型の遺伝子および関連情報の表である。
【図２−４】図２は、乳癌と関係がある好ましい多型、多型の遺伝子および関連情報の表である。
【図２−５】図２は、乳癌と関係がある好ましい多型、多型の遺伝子および関連情報の表である。
【図２−６】図２は、乳癌と関係がある好ましい多型、多型の遺伝子および関連情報の表である。
【図２−７】図２は、乳癌と関係がある好ましい多型、多型の遺伝子および関連情報の表である。
【図２−８】図２は、乳癌と関係がある好ましい多型、多型の遺伝子および関連情報の表である。
【図２−９】図２は、乳癌と関係がある好ましい多型、多型の遺伝子および関連情報の表である。
【図２−１０】図２は、乳癌と関係がある好ましい多型、多型の遺伝子および関連情報の表である。
【図２−１１】図２は、乳癌と関係がある好ましい多型、多型の遺伝子および関連情報の表である。
【図２−１２】図２は、乳癌と関係がある好ましい多型、多型の遺伝子および関連情報の表である。
【図２−１３】図２は、乳癌と関係がある好ましい多型、多型の遺伝子および関連情報の表である。
【図２−１４】図２は、乳癌と関係がある好ましい多型、多型の遺伝子および関連情報の表である。
【図２−１５】図２は、乳癌と関係がある好ましい多型、多型の遺伝子および関連情報の表である。
【図２−１６】図２は、乳癌と関係がある好ましい多型、多型の遺伝子および関連情報の表である。
【図２−１７】図２は、乳癌と関係がある好ましい多型、多型の遺伝子および関連情報の表である。
【図２−１８】図２は、乳癌と関係がある好ましい多型、多型の遺伝子および関連情報の表である。
【図２−１９】図２は、乳癌と関係がある好ましい多型、多型の遺伝子および関連情報の表である。
【図２−２０】図２は、乳癌と関係がある好ましい多型、多型の遺伝子および関連情報の表である。
【図２−２１】図２は、乳癌と関係がある好ましい多型、多型の遺伝子および関連情報の表である。
【図２−２２】図２は、乳癌と関係がある好ましい多型、多型の遺伝子および関連情報の表である。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図２−８】
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【図２−９】
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【図２−１０】
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【図２−１１】
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【図２−１２】
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【図２−１３】
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【図２−１４】
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【図２−１５】
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【図２−１６】
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【図２−１７】
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【図２−１８】
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【図２−１９】
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【図２−２０】
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【図２−２１】
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【図２−２２】
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