(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリホサート耐性テンサイ植物において、
ａ）テンサイ植物が、ＮＣＩＭＢに、受託番号ＮＣＩＭＢ４１１５８またはＮＣＩＭＢ４１１５９で寄託された種子から得られるか、および／または
ｂ）６３０〜７００ｂｐのＤＮＡフラグメントを、配列番号１のヌクレオチド配列を示す第１プライマーと、配列番号２のヌクレオチド配列を示す第２プライマーとを用いて、テンサイ植物、その部分または種子のゲノムＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させることができ、その際、前記ＤＮＡフラグメントは配列番号１３のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を示すか、および／または
ｃ）３５００〜３９００ｂｐのＤＮＡフラグメントを、配列番号３のヌクレオチド配列を示す第１プライマーと、配列番号４のヌクレオチド配列を示す第２プライマーとを用いて、テンサイ植物、その部分または種子のゲノムＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させることができ、その際、前記ＤＮＡフラグメントは配列番号６のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を示すか、および／または
ｄ）２７０〜３００ｂｐのＤＮＡフラグメントを、配列番号７のヌクレオチド配列を示す第１プライマーと、配列番号８のヌクレオチド配列を示す第２プライマーとを用いて、テンサイ植物、その部分または種子のゲノムＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させることができ、その際、前記ＤＮＡフラグメントは配列番号１１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を示すか、および／または
ｅ）７１０〜７９０ｂｐのＤＮＡフラグメントを、配列番号９のヌクレオチド配列を示す第１プライマーと、配列番号１０のヌクレオチド配列を示す第２プライマーとを用いて、テンサイ植物、その部分または種子のゲノムＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させることができ、その際、前記ＤＮＡフラグメントは配列番号１２のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を示すか、および／または
ｆ）９９０〜１１００ｂｐのＤＮＡフラグメントを、配列番号１４のヌクレオチド配列を示す第１プライマーと、配列番号１６のヌクレオチド配列を示す第２プライマーとを用いて、テンサイ植物、その一部または種子のゲノムＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させることができ、その際、前記ＤＮＡフラグメントは配列番号１７のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を示すことにより特徴付けられる、グリホサート耐性テンサイ植物。
【請求項２】
請求項１に記載の植物の種子。
【請求項３】
請求項１に記載の植物の細胞、組織または部分。
【請求項４】
方法が、
ａ）６３０〜７００ｂｐのＤＮＡフラグメントを、テンサイ植物、その一部または種子のゲノムＤＮＡから、配列番号１のヌクレオチド配列を示す第１プライマーと、配列番号２のヌクレオチド配列を示す第２プライマーとを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させ、その際、前記ＤＮＡフラグメントは配列番号１３のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を示すか、および／または
ｂ）３５００〜３９００ｂｐのＤＮＡフラグメントを、テンサイ植物、その一部または種子のゲノムＤＮＡから、配列番号３のヌクレオチド配列を示す第１プライマーと、配列番号４のヌクレオチド配列を示す第２プライマーとを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させ、その際、前記ＤＮＡフラグメントは配列番号６のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を示すか、および／または
ｃ）２７０〜３００ｂｐのＤＮＡフラグメントを、テンサイ植物、その一部または種子のゲノムＤＮＡから、配列番号７のヌクレオチド配列を示す第１プライマーと、配列番号８のヌクレオチド配列を示す第２プライマーとを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させ、その際、前記ＤＮＡフラグメントは配列番号１１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を示すか、および／または
ｄ）７１０〜７９０ｂｐのＤＮＡフラグメントを、テンサイ植物、その一部または種子のゲノムＤＮＡから、配列番号９のヌクレオチド配列を示す第１プライマーと、配列番号１０のヌクレオチド配列を示す第２プライマーとを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させ、その際、前記ＤＮＡフラグメントは配列番号１２のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を示すか、および／または
ｅ）９９０〜１１００ｂｐのＤＮＡフラグメントを、テンサイ植物、その一部または種子のゲノムＤＮＡから、配列番号１４のヌクレオチド配列を示す第１プライマーと、配列番号１６のヌクレオチド配列を示す第２プライマーとを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させ、その際、前記ＤＮＡフラグメントは配列番号１７のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を示すことを特徴とする、１個または複数個の工程を含む、グリホサート耐性テンサイ植物を同定するための方法。
【請求項５】
形質転換されたグリホサート耐性テンサイ植物、その細胞、組織または一部を同定するための試験キットにおいて、この試験キットが、ポリメラーゼ連鎖反応のための第１プライマーおよび第２プライマーを有する少なくとも１個のプライマー対を含み、その際、第１プライマーは、前記植物ゲノム中に組み込まれた外来ＤＮＡ中の配列を認識するものであって、かつ第２プライマーは、前記ＤＮＡの３’−または５’−フランキング領域中の配列を認識するものであり、その際、植物は、請求項１に記載の植物であることを特徴とする、試験キット。
【請求項６】
ポリメラーゼ連鎖反応のための第１プライマーおよび第２プライマーを含む少なくとも１個のプライマー対を含み、その際、第１プライマーは、植物ゲノム中に組み込まれた外来ＤＮＡ中の配列を認識するものであり、かつ第２プライマーは、ＤＮＡの３’−または５’−フランキング領域中の配列を認識するものである、形質転換されたグリホサート耐性テンサイ植物、その細胞、組織または一部を同定するための試験キットにおいて、
ａ）第１プライマーが、配列番号１のヌクレオチド配列を示し、かつ第２プライマーが、配列番号２のヌクレオチド配列を示し、その際、前記プライマー対は、テンサイ植物、その部分または種子のゲノムＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応によって、配列番号１３のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を示す６３０〜７００ｂｐのＤＮＡフラグメントを増幅させることができるものであり、および／または
ｂ）第１プライマーが、配列番号７のヌクレオチド配列を示し、かつ第２プライマーが、配列番号８のヌクレオチド配列を示し、その際、前記プライマー対は、テンサイ植物、その部分または種子のゲノムＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応によって、配列番号１１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を示す２７０〜３００ｂｐのＤＮＡフラグメントを増幅させることができるものであり、および／または
ｃ）第１プライマーが、配列番号９のヌクレオチド配列を示し、かつ第２プライマーが、配列番号１０のヌクレオチド配列を示し、その際、前記プライマー対は、テンサイ植物、その部分または種子のゲノムＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応によって配列番号１２のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を示す７１０〜７９０ｂｐのＤＮＡフラグメントを増幅させることができるものであり、および／または
ｄ）第１プライマーが、配列番号１４のヌクレオチド配列を示し、かつ第２プライマーが、配列番号１６のヌクレオチド配列を示し、その際、前記プライマー対は、テンサイ植物、その部分または種子のゲノムＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応によって配列番号１７のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を示す９９０〜１１００ｂｐからのＤＮＡフラグメントを増幅させることができるものである、ことを特徴とする、試験キット。
【請求項７】
第１プライマーおよび第２プライマーが、配列番号５のヌクレオチド配列の一部を形成するヌクレオチド配列を認識する、請求項５または６に記載の試験キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリホサート耐性テンサイ植物、植物性材料および種子に関する。
【０００２】
テンサイ（Beta vulgaris）は、多くの国において商業的に有用な栽培植物として栽培され、その全収穫高は、２４０ミリオンメートルトンを上廻る。
【０００３】
一般にグリホサートとして呼称されるＮ−（ホスホノメチル）−グリシンは、広域除草剤であり、この場合、これらは、その高い効果、生分解性および動物およびヒトに対する少ない毒性により、広範囲の適用が見出されている。グリホサートは、アミノ酸およびビタミンを含む芳香族化合物の生合成を導くシキミ酸経路を阻害する。特にグリホサートは、酵素５−エノールピルビル−シキメート−３−ホスフェート−シンターゼ（ＥＰＳＰ−シンターゼまたはＥＰＳＰＳ）を阻害することによって、ホスホエノールピルビン酸およびシミメート−３−ホスフェートを５−エノールピルビル−シキメート−３−ホスフェートへの変換を阻害する。通常の植物をグリホサートで処理した場合には、植物は、成長および生育に必要不可欠な芳香族アミノ酸（たとえばフェニルアラニンおよびチロシン）を製造することができない。ＥＰＳＰＳは、すべての植物、細菌およびカビにおいて存在するが、動物ではその芳香族アミノ酸自体を合成することはないために存在しない。哺乳類、鳥類、魚類等において芳香族アミノ酸のための生合成経路は存在しないことから、一般に、グリホサートは、これらの生物に関しては専ら少ない毒性によって特徴付けられる。ＥＰＳＰＳ酵素は、通常は、植物性および微生物性由来の食品において含有されるものである。
【０００４】
グリホサートは、除草剤、たとえばＲｏｕｎｄｕｐ（Ｒ）の有効成分であり、Ｍｏｎｓａｎｔｏ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ＵＳＡ）によって製造されている。通常は、これは水溶性の塩として、たとえばアンモニウム塩、アルキルアミン塩、アルカリ金属塩またはトリメチルスルホニウム塩として配合される。常用の配合物は、グリホサートのイソプロピルアミン塩であり、この場合、これらは、Ｒｏｕｎｄｕｐ（Ｒ）除草剤中で用いられている形である。
【０００５】
グリホサート耐性植物は、グリホサート耐性のＥＰＳＰ−シンターゼを製造する能力を有する、たとえば、アグロバクテリウム種、ＣＰ４菌株からの形成されるＣＰ４−ＥＰＳＰＳを、植物ゲノム中に導入することによって、製造可能であることが見出された。
【０００６】
グリホサート−耐性テンサイ植物は、アグロバクテリウム介在形質転換法によって、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳ、たとえばＣＰ４−ＥＰＳＰＳをコードする遺伝子を、植物ゲノム中に導入することによって製造することができる。ＣＰ４−ＥＰＳＰＳを発現するこのようなテンサイ植物は、ＷＯ９９／２３２３２に記載されている。しかしながら、これらの方法を用いて、ＣＰ４−ＥＰＳＰＳに関する遺伝子を用いて形質転換された細胞に由来するテンサイ植物は、その性質において極めて多様であり、それというのも、遺伝子が、植物ゲノム中の任意の箇所でインサートされるといった事実に帰因するためである。染色体上の定められた箇所への特定の形質転換遺伝子のインサートは、しばしば「偶発的」に生じる。「偶発的（event）」の用語はさらに、遺伝子技術により改変された栽培植物の変種と区別するために使用される。好ましい偶発性は極めて稀である。多くの偶発性は全く好ましくないものであり、それというのも、植物遺伝子中に導入された成長に対して重要な形質転換遺伝子は、遺伝子の分断を生じるか、あるいは、発現されることがないか、あるいは染色体の一部分に導入された形質転換遺伝子は、発現はされないかまたは発現されたとしても極めて低いためである。これらの理由から、導入遺伝子の十分な発現によって特徴付けられる偶発性を同定するために、より多くの数の偶然の事象（event）がスクリーニングされた。これらの方法は、極めて時間およびコスト消費的なものであって、かつ、十分な性質を有する植物を見出しうることを保証するものではなかった。
【０００７】
したがって、本発明の課題は、グリホサートに対して高い耐性を示すが、他の重要な作物特性、たとえば成長、収穫高、品質、病原菌耐性等についての欠点を示すことがない、テンサイ植物を提供することである。
【０００８】
本発明によるグリホサート耐性テンサイ植物は、
ａ）テンサイ植物が、ＮＣＩＭＢ、Ａｂｅｒｄｅｅｎ（Schottland, V.K.）で寄託されたものであって、かつ、受託番号（accession number）ＮＣＩＭＢ４１１５８またはＮＣＩＭＢ４１１５９を有する種子から得られ、および／または
ｂ）６３０〜７００ｂｐ、好ましくは６６４ｂｐのＤＮＡフラグメントが、テンサイ植物、その一部またはその種子のゲノムＤＮＡから、配列番号１のヌクレオチド配列を有する第１プライマーと配列番号２のヌクレオチド配列を有する第２プライマーとを用いてのポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することができ、および／または
ｃ）３５００〜３９００ｂｐ、好ましくは３７０６ｂｐのＤＮＡフラグメントが、テンサイ植物、その一部またはその種子のゲノムＤＮＡから、配列番号３のヌクレオチド配列を有する第１プライマーと配列番号４のヌクレオチド配列を有する第２プライマーとを用いてのポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することができ、および／または
ｄ）２７０〜３００ｂｐ、好ましくは２８８ｂｐのＤＮＡフラグメントが、テンサイ植物、その一部またはその種子のゲノムＤＮＡから、配列番号７のヌクレオチド配列を有する第１プライマーと配列番号８のヌクレオチド配列を有する第２プライマーとを用いてのポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することができ、および／または
ｅ）７１０〜７９０ｂｐ、好ましくは７５１ｂｐのＤＮＡフラグメントが、テンサイ植物、その一部またはその種子のゲノムＤＮＡから、配列番号９のヌクレオチド配列を有する第１プライマーと配列番号１０のヌクレオチド配列を有する第２プライマーとを用いてのポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することができ、および／または
ｆ）９９０〜１１００ｂｐ、好ましくは１０４２ｂｐのＤＮＡフラグメントが、テンサイ植物、その一部またはその種子のゲノムＤＮＡから、配列番号１４のヌクレオチド配列を有する第１プライマーと配列番号１６のヌクレオチド配列を有する第２プライマーとを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することができることを特徴とする。
【０００９】
ポリマラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、核酸分子を増幅するために使用されるよく知られた標準的方法である（たとえばＵＳ４６８３２０２０参照）。
【００１０】
本発明によるテンサイ植物（以下、“Event H7-1”とする）は、グリホサート除草剤に対して高い耐性を示す。さらに、Ｅｖｅｎｔ  Ｈ７−１の成長特性および他の作物特性は、形質転換工程によって影響を受けるものではない。ＥｖｅｎｔＨ７−１は、アグロバクテリウム−ＣＰ４−ＥＰＳＰＳ遺伝子を高いレベルで発現し、植物ゲノム中に安定に組み込むものであり、かつ植物にグリホサート耐性を付与するものである。植物は、アグロバクテリウム介在形質転換法によって、バイナリーベクターＰＶ−ＢＮＧＴ０８を用いて製造される。このベクターは、左と右とのボーダー領域間に以下の配列を含む：ＣＰ４−ＥＰＳＰＳコーディング配列と結合するシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＥＰＳＰＳからの配列からの葉緑体−移行ペプチドコード配列から構成され、ゴマノハグサ−モザイクウイルス（Figwort mosaic virus）−プロモーター（ｐＦＭＶ）およびエンドウ（Pisum sativum）からのＥ９−ｐ３’−転写終結配列で調節する。
【００１１】
本発明の好ましい実施態様では、３７０６ｂｐ、６６４ｂｐ、２８８ｂｐ、７５１ｂｐおよび１０２４ｂｐ−ＤＮＡフラグメントが、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％、特に好ましくは少なくとも９９．９％の、配列番号６、配列番号１３、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１７それぞれとの同一性を有する。たとえば、９５％の同一性とは、たとえば、提供された配列のヌクレオチドの９５％が、比較される配列と同一であることを意味する。この目的のために、配列は、ＢＬＡＳＴプログラムを用いて整列され、かつ比較される（たとえば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html）。最も好ましくは、３７０６ｂｐのＤＮＡフラグメントが配列番号６のヌクレオチド配列を有し、６６４ｂｐのＤＮＡフラグメントが配列番号１３のヌクレオチド配列を有し、２８８ｂｐのＤＮＡフラグメントが配列番号１１のヌクレオチド配列を有し、７５１ｂｐのＤＮＡフラグメントが配列番号１２のヌクレオチド配列を有し、および／または、１０４２ｂｐのＤＮＡフラグメントが配列番号１７のヌクレオチド配列を有する。
【００１２】
さらに本発明は、ＮＣＩＭＢで、Ａｂｅｒｄｅｅｎ（Schottland V.K.）で寄託され、かつＮＣＩＭＢ４１１５８またはＮＣＩＭＢ４１１５９の受託番号を有する種子に関する。このような種子は、グリホサート耐性テンサイ植物を得るために使用することができる。種子を播くことができ、かつ成長した植物はグリホサート耐性である。
【００１３】
さらに本発明は、グリホサート耐性テンサイ植物の細胞、組織または一部に関する。
【００１４】
本発明の他の対象は、グリホサート耐性テンサイ植物を同定するための方法に関し、この場合、これらの方法は、以下の工程
ａ）テンサイ植物、その一部またはその種子のゲノムＤＮＡから、配列番号１のヌクレオチド配列を有する第１プライマーと配列番号２のヌクレオチド配列を有する第２プライマーとを用いてのポリメラーゼ連鎖反応によって、６３０〜７００ｂｐ、好ましくは６６４ｂｐのＤＮＡフラグメントを増幅し、および／または
ｂ）テンサイ植物、その一部またはその種子のゲノムＤＮＡから、配列番号３のヌクレオチド配列を有する第１プライマーと配列番号４のヌクレオチド配列を有する第２プライマーとを用いてのポリメラーゼ連鎖反応によって、３５００〜３９００ｂｐ、好ましくは３７０６ｂｐのＤＮＡフラグメントを増幅し、および／または
ｃ）テンサイ植物、その一部またはその種子のゲノムＤＮＡから、配列番号７のヌクレオチド配列を有する第１プライマーと配列番号８のヌクレオチド配列を有する第２プライマーとを用いてのポリメラーゼ連鎖反応によって、２７０〜３００ｂｐ、好ましくは２８８ｂｐのＤＮＡフラグメントを増幅し、および／または
ｄ）テンサイ植物、その一部またはその種子のゲノムＤＮＡから、配列番号９のヌクレオチド配列を有する第１プライマーと配列番号１０のヌクレオチド配列を有する第２プライマーとを用いてのポリメラーゼ連鎖反応によって、７１０〜７９０ｂｐ、好ましくは７５１ｂｐのＤＮＡフラグメントを増幅し、および／または
ｅ）テンサイ植物、その一部またはその種子のゲノムＤＮＡから、配列番号１４のヌクレオチド配列を有する第１プライマーと配列番号１６のヌクレオチド配列を有する第２プライマーとを用いてのポリメラーゼ連鎖反応によって、９９０〜１１００ｂｐ、好ましくは１０４２ｂｐのＤＮＡフラグメントを増幅する、
を含む方法によって特徴付けられる。
【００１５】
この方法は、形質転換されたグリホサート耐性テンサイ植物の、分子生物学の標準的方法を用いての容易な検出を可能にする。
【００１６】
さらに本発明は、形質転換されたグリホサート耐性テンサイ植物またはその細胞、組織または一部を同定するために試験キットに関する。このキットは、ポリメラーゼ連鎖反応のための第１プライマーおよび第２プライマーのプライマー対を少なくとも１個含み、ＥｖｅｎｔＨ７−１、その細胞、組織または部分を特異的に検出することを可能にする。
【００１７】
好ましくは、第１プライマーは、配列番号１または配列番号７または配列番号９または配列番号１４のヌクレオチド配列を有し、かつ第２プライマーは、配列番号２または配列番号８または配列番号１０または配列番号１６のヌクレオチド配列を有する。
【００１８】
本発明の他の実施態様において、第１および第２プライマーは、それぞれ、配列番号５のヌクレオチド配列の一部分を形成するヌクレオチド配列を認識する。
【００１９】
以下の図は、本発明を説明するのに役立つものである：
図１  バイナリーベクターＰＶ−ＢＶＧＴ０８を示すマップ。
図２  ＰＣＲ分析によるＨ７−１の同定を示す図。１８個の植物からのＤＮＡ−試料を分析した。ネガティブコントロール＝形質転換していないテンサイからのＤＮＡ、ポジティブコントロール＝Ｈ７−１形質転換体からのＤＮＡ。
図３  マルチプレックスＰＣＲによるＥｖｅｎｔＨ７−１の同定および遺伝子導入されたＥｖｅｎｔＨ７−１と非形質転換植物との差異を示す図。５４個の植物からのＤＮＡ試料を分析した。
図４  制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ、ＣｌａＩ、ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩの制限酵素部位を有するｐＦＭＶ−ｃｔｐ２−ＣＰ４−ＥＰＳＰＳ−Ｅ９−３’−インサートを示す図。
図５  ＥｖｅｎｔＨ７−１のインサート／コピー数分析を示す図。サザンブロッティングのために、Ｈ７−１ゲノムＤＮＡ１０μｇを、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ、ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで消化した（レーン３〜７）。ネガティブコントロールとしての形質転換されていないゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩで消化した（レーン８）。ポジティブコントロールとしてのプラスミドＰＶ−ＢＶＧＴ０８をＢａｍＨＩで消化した。レーン２および９はサイズマーカーである。ブロットは、３２Ｐ−標識ＣＰ４−ＥＰＳＰＳのコーディング配列でプローブした。このプローブは、４７７〜１５５５ｂｐを含むＣＰ４−ＥＰＳＰＳ−遺伝子の内在配列である。
図６  完全なｃｔｐ２−ＣＰ４−ＥＰＳＰＳのコーディング領域を評価するためのＨ７−１のサザンブロッティング分析を示す図。１０μｇのＨ７−１ゲノムＤＮＡ、形質転換されていないコントロールＤＮＡおよび形質転換されていないコントロールＤＮＡとＰＶ−ＢＶＧＴ０８との混合物を、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＩＩＩで消化した。ブロットは、３２Ｐ−標識ＣＰ４−ＥＰＳＰＳ−ＰＣＲ−フラグメントをプローブした。
図７  完全なプロモーター領域を評価するためのＥｖｅｎｔＨ７−１のサザンブロッティング分析を示す図。１０μｇのＨ７−１ゲノムＤＮＡ、形質転換されていないコントロールＤＮＡおよび形質転換されていないコントロールＤＮＡとＰＶ−ＢＶＧＴ０８との混合物を、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩおよび／またはＳａｃＩ／ＸｈｏＩで消化した。ブロットは、３２Ｐ−標識プロモーター−フラグメント（ＨｉｎｄＩＩＩ）（＝ＰＶ−ＢＶＧＴ０８−配列、ｂｐ７９７２−８５８３）または完全なプロモーター−ｃｔｐ２−ＣＰ４−ＥＰＳＰＳ−Ｅ９−３’−カセット（ＰｍｅＩ／ＸｈｏＩ）（＝ＰＶ−ＢＶＧＴ０８−配列、ｂｐ７９８５−２３８９）をプローブした。
図８  完全なポリアデニル化（ポリ−Ａ）領域を評価するためのＥｖｅｎｔＨ７−１のサザンブロッティング分析を示す図。１０μｇのＨ７−１ゲノムＤＮＡ、形質転換されていないコントロールＤＮＡおよび形質転換されていないコントロールＤＮＡとＰＶ−ＢＶＧＴ０８との混合物を、ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ、ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩで消化した。ブロットは、３２Ｐ−標識Ｅ９−３’ポリ−Ａ−フラグメント（ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ）（＝ＰＶ−ＢＶＧＴ０８−配列、Ｂｐ１７０２−２３８９）でプローブした。
図９  ＥｖｅｎｔＨ７−１中の「骨格」−ベクターＤＮＡを含まないことについて評価するための、プローブとして使用したフラグメントを示す図。
図１０  ＥｖｅｎｔＨ７−１中の「骨格」−ベクターＤＮＡを含まないことについて評価するためのサザンブロット分析を示す図。１０μｇのＨ７−１ゲノムＤＮＡ、形質転換されていないコントロールＤＮＡおよび形質転換されていないコントロールＤＮＡとＰＶ−ＢＶＧＴ０８との混合物を、ＸｂａＩで消化した。ブロットは、ＰＶ−ＢＶＧＴ０８の完全な「骨格」を含む３２Ｐ−標識フラグメントでプローブした。
図１１  ＰＣＲ−配列とＰＶ−ＢＶＧＴ０８−配列との左ボーダー領域（ＬＢ）上での比較を示す図。
図１２  ＰＣＲ−配列とＰＶ−ＢＶＧＴ０８−配列との右ボーダー領域（ＲＢ）上での比較を示す図。
図１３  インサートの右結合部位外側のゲノムＤＮＡ分析を示す図。それぞれ約５０ｎｇの、ＥｖｅｎｔＨ７−１ゲノムＤＮＡ、形質転換されていないコントロールＤＮＡまたは水をＰＣＲ−反応のために使用し、その際、２個のプライマーがインサートの外側に存在するプライマーの組合せＰ１、および一方のプライマーがインサートの内側に存在し、かつもう一方のプライマーがインサートの外側に存在するプライマーの組合せＰ３を使用した。
図１４  インサートの左結合部位の外側のゲノムＤＮＡの分析を示す図。約５０ｎｇのＨ７−１ゲノムＤＮＡ、形質転換されていないコントロールＤＮＡおよび水をＰＣＲ反応のために使用し、その際、２個のプライマーがインサートの外側に存在するプライマーの組合せＰ２、および一方のプライマーがインサートの内側に存在し、かつもう一方のプライマーがインサートの外側に存在するプライマーの組合せＰ４のプライマーを使用した。
図１５  Ｈ７−１播種培養のための系統図。
図１６  ゲノム中に挿入されたＤＮＡが安定に組み込まれているかについて検出するための、Ｅｖｅｎｔ  Ｈ７−１のサザンブロット分析を示す図。Ｈ７−１のゲノムＤＮＡ  １０μｇ（起源となるＨ７−１−１９９５形質転換体および３個の後代、Ｈ７−１−１９９６〜１９９８）および種々の由来からの形質転換されていないコントロールＤＮＡｓを、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。プロットを、ＰＶ−ＢＶＧＴ０８（＝４４７〜１５５５ｂｐ）の３２Ｐ−標識ＣＰ４−ＥＰＳＰＳ−プローブを用いておこなった。
【００２０】
本発明は、以下の実施例に基づいてさらに説明される。
【００２１】
略語のリストは以下に示す：
〜      約
℃      摂氏度
ｂｉｎｄｅｓｔ      ２回に亘って蒸留された滅菌水
ｂｐ      塩基対
ＣＴＡＢ      セチルトリメチルアンモニウムブロミド
ＤＮＡ      デオキシリボ核酸
Ｅ．Ｃｏｌｉ      大腸菌
ＥＤＴＡ      エチレンジアミンテトラ酢酸
Ｆｉｇ．      図
ｈ      時間
ＨＣｌ      塩酸
ｋｂ      キロ塩基対
Ｋｇ      キログラム
Ｍ、ｍＭ      モル、ミリモル
ｍｉｎ      分
Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４      リン酸ナトリウム
ＮａＣｌ      塩化ナトリウム
ＮａＯＨ      水酸化ナトリウム
ｎｔ      ヌクレオチド
ＰＣＲ      ポリメラーゼ連鎖反応
ｐｍｏｌ      ピコモル
ＲＮａｓｅ      リボ核酸−ヌクレアーゼ
ＲＰＭ      回転数／分
ＲＲ      Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ（Ｒ）
ＲＴ      室温
ＳＤＳ      ドデシル硫酸ナトリウム
ｓｅｋ      秒
ＳＥＶＡＧ      クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）
ＳＳＣ      クエン酸塩標準液
ＴＥ      トリス−ＥＤＴＡ−緩衝液
ＴＲＩＳ      トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン。
【００２２】
例１：ＥｖｅｎｔＨ７−１の同定
遺伝子型３Ｓ００５７のテンサイ（Beta vulgaris）は遺伝的に改変され、ＣＰ４−５−エノル−ピルビル−シキメート−３−ホスフェート−シンターゼまたはＣＰ４−ＥＰＳＰＳを発現し、これは、除草剤グリホサートに対する耐性を付与するものであって、さらに選択マーカーとしても使用されるものである。これらの形質転換系は、アグロバクテリウム−ツメファシエンス（Agrobacterium-tumefaciens）介在形質転換技術によって、バイナリーベクター  ＰＶ−ＢＶＧＴ０８を用いて製造した。テンサイ−形質転換に使用されたベクターのＴ−ＤＮＡは、以下の配列を左右ボーダー領域間に含む：ＣＰ４−ＥＰＳＰＳコーディング配列と結合するシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＥＰＳＰＳからの配列からの葉緑体−移行ペプチドコード配列から構成されるコーディング配列、およびゴマノハグサ−モザイクウイルス（Figwort mosaic virus）−プロモーター（ｐＦＭＶ）およびエンドウ（Pisum sativum）からのＥ９−ｐ３’−転写終結配列。
【００２３】
以下の方法を使用する。
Ｉ．ＤＮＡ−抽出：
方法１：
新鮮な葉の組織または他の組織を捕集し（１．５ｍｌ容器中２０〜１００ｍｇ）、かつ４００μｌ抽出バッファー（以下に示す）を添加した。この組織を、小さい乳鉢を用いて粉砕した。混合物を５秒間に亘ってボルテックスし、かつ室温で３０〜６０分に亘ってインキュベートした。その後に１３０００ＲＰＭで、１分間に亘って遠心分離をおこなった。ＤＮＡを含有する上清を、別の１．５ｍｌ反応容器中に注ぎ入れ、かつ３２０μｌのイソプロパノールと一緒に混合した。混合物を、室温で２分間に亘ってインキュベートした。ＤＮＡ−沈殿物がエタノールの添加によって形成された。１３０００ＲＰＭで、５分に亘っての遠心分離の後に、エタノールをデカントした。試料を空気乾燥させた。沈殿物を４００μｌのＨ２ＯまたはＴＥ−バッファー（以下に示す）中で再懸濁させた。
抽出バッファー（１００ｍｌ）：
２０ｍｌ  １Ｍ  トリス（ｐＨ７．５）
５ｍｌ  ５Ｍ  ＮａＣｌ
５ｍｌ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ
２．５ｍｌ  ２０％ＳＤＳ
６７．５ｍｌ  Ｈ２Ｏ
ＴＥ−バッファー：
１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１ｍＭ  ＥＤＴＡ
方法２：
新鮮な植物材料（２０〜１００ｍｇ）を、１．５ｍｌ−エッペンドルフ容器中に捕集し、かつ５００μｌのＣＴＡＢ−バッファー（６５℃）（以下に示す）を添加した。混合物を１〜１．５時間に亘って、６５℃でインキュベートし、その後に５秒間に亘って遠心分離した。２００μｌのＳＥＶＡＧを添加した。混合および１３０００ＲＰＭで１０分に亘っての遠心分離の後に、上清を別の１．５ｍｌ容器に移した。イソプロパノール１回量（約４００μｌ）を慎重に上清と混合した。その後に、１３０００ＲＰＭで１０分に亘っての遠心分離をおこなった。７０％エタノール  ６００μｌを添加した。沈殿物を、反応容器を複数回反転させることによって洗浄した。再度、混合物を１３０００ＲＰＭで、２分間に亘って洗浄した。エタノールを慎重に取り除いた。反応容器を反転させ、かつ清浄な紙上で水切りをおこなった。試料を１５分に亘って空気乾燥させた。沈殿物を５０μｌのＨ２Ｏ（以下に示す）中で再懸濁した。
ＣＴＡＢ−バッファー：
１．４Ｍ  ＮａＣｌ
２０ｍＭ  ＥＤＴＡ
１００ｍＭ  トリス−ＨＣｌ
２％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ
ＳＥＶＡＧ：
クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）
ＲＮａｓｅ−バッファー：
１０ｍＭトリス、１５ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５
ＲＮａｓｅＡ：
１０ｍｇ  ＲＮａｓｅ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ−バッファー
（５ｍｌ  ｂｉｄｅｓｔ＋５０ｍｇ  ＲＮａｓｅＡ、アリコートを１．５ｍｌ容器中に入れ、この容器を１００℃で３０分に亘って加熱し、−２０℃で保存した）
通常は方法１を使用した。これらの方法を用いて、一日当たり、多くの数のＤＮＡ試料を抽出することが可能になり、かつＤＮＡの質は許容可能なものであった。方法２は、葉の材料が古い場合か、あるいは、試料のＤＮＡの質に問題がある場合に使用される。方法２は複雑であって、長時間に亘って実施され、かつ少ないＤＮＡ収量であるが、高い品質を得ることができるものである。
【００２４】
通常、ＤＮＡの定量化は実施されず、かつ典型的にはＰＣＲ−反応で０．５〜１μｌの濃縮されたＤＮＡ溶液を使用した。
【００２５】
ＩＩ：ＰＣＲ反応：
ＰＣＲ−反応のために、バッファー＋ｄＮＴＰｓの１０ｘバッファー混合物を製造した。方法は以下の通りである：
【００２６】
【表１】
0005586122.tif 000002
ＰＣＲ反応（２５μｌ）：
ＤＮＡ      ０．５μｌ
プライマー１      １μｌ（２０ｐｍｏｌ）
プライマー２      １μｌ（２０ｐｍｏｌ）
Ｔａｑ−ポリメラーゼ１      ０．２μｌ（１Ｕ、Oncor Appligene S. A., heidelberg, Deutschland）
バッファー１０ｘ濃縮液      ２．５μｌ
水      １８．８μｌ
ＩＩＩ．ＰＣＲによるＨ７−１の同定
Ｈ７−１の同定は、ＰＣＲによりＥｖｅｎｔ特異的プライマーを用いておこなった：
【００２７】
【化１】
0005586122.tif 000003
【００２８】
上のプライマーは、インサートの外側に位置し、かつテンサイゲノムＤＮＡの一部分である。下のプライマーは、導入されたＣＰ４−ＥＰＳＰＳ−遺伝子の内側に位置するものである。
ＰＣＲ条件：
９４℃、４分      工程１
９５℃、３０秒      工程２ａ
５５℃、３０秒      工程２ｂ
７２℃、２分      工程２ｃ
７２℃、５分      工程３
４℃、一晩      工程４
反応完了
工程２ａ〜ｃについては、３４回に亘って繰り返した。
【００２９】
目的とするＰＣＲ産物は、６６４ｂｐのＤＮＡフラグメントである（配列番号１３、図２参照）。
【００３０】
ＩＶ．マルチプレックスＰＣＲによるＨ７−１の同定
形質転換植物と非形質転換植物とを識別するために、ホモ接合体であるか、あるいはヘミ／ヘテロ接合体であるかを、３個の異なるプライマーを用いてマルチプレックスＰＣＲで試験した。以下のプライマーを使用した。
【００３１】
【化２】
0005586122.tif 000004
ＰＣＲ条件；
９４℃、２分      工程１
９４℃、１秒      工程２ａ
６０℃、４５秒      工程２ｂ
７２℃、９０秒      工程２ｃ
７２℃、５分      工程３
４℃、一晩      工程４
反応完了
工程２ａ〜ｃについては、３４回に亘って繰り返した。
【００３２】
非形質転換植物は、約３５０ｂｐの１つのＰＣＲフラグメントのみを示した。ホモ接合体の形質転換植物は、約１０４２ｋｂの１つのフラグメントのみを示した。ヘテロ接合体植物は双方のフラグメントを示した（図３参照）。
【００３３】
例２：ＥｖｅｎｔＨ７−１の特徴付け
Ｈ７−１中に存在する組込まれたＤＮＡを特徴付けするために、分子学的分析をおこなった。特に、インサートの数（テンサイゲノム内部の組込み箇所の数）、コピー数（１箇所でのＤＮＡフラグメントの数）、挿入されたコーディング領域およびこれらの調節要素の完全性、ｐＦＭＶ−プロモーターおよびＥ９−３’−転写終結配列、形質転換に使用されたベクターの「骨格」配列不含であることおよびインサートの安定な遺伝性について測定した。さらに、ＤＮＡ−インサートのフランキング配列を同定した。
【００３４】
テンサイ−形質転換体−ＥｖｅｎｔｓＨ７−１のインサートＤＮＡを、サザンブロット、ＰＣＲおよび逆ＰＣＲ−技術を用いて特徴付けした。ポジティブおよびネガティブコントロール（ＰＶ−ＢＶＧＴ０８、非形質転換植物からのＤＮＡ）が含まれ、かつ試験物質（Ｈ７−１）と同様の方法で処理した。
【００３５】
ＤＮＡは、１９９７年に成長させたＥｖｅｎｔ−Ｈ７−１植物からのバッチ番号７４９０３Ｈからのものを単離した。さらに、１９９５年の起源となる形質転換体Ｈ７−１／３Ｓ００５７（＝６４０１ＶＨ）および１９９６年、１９９７年および１９９８年のこれらの３つの後代から製造されたもの（Ｈ７−１／６４８０１Ｈ、Ｈ７−１／７４９２２ＨおよびＨ７−１／８３００２Ｓ）からＤＮＡを単離した。
【００３６】
非形質転換テンサイ系３Ｓ００５７をコントロール群として使用した。さらに、テンサイ系５Ｒ７１５０、８Ｋ１１８０および６Ｓ００８５をネガティブコントロールとして使用した。これらの系は、通常のテンサイを栽培に使用される一般的な遺伝子導入されていない系である。
【００３７】
対照物質は、形質転換に使用されたプラスミドＰＶ−ＢＶＧＴ０８に相当する。プラスミドＤＮＡおよびコントロール群のテンサイ系からのＤＮＡを一緒に混合し、制限酵素で消化し、かつアガロースゲル上での電気泳動によって、試験物質と平行な形で分離した。プラスミドは、目的とするフラグメントのためのサイズマーカーとして、かつポジティブなハイブリダイゼーションコントロールとして役立った。プラスミドＤＮＡを、植物ゲノムＤＮＡと、サザンブロッティング法の感度を試験するために分析されるべき要素の１コピー未満を示す濃度で混合した（〜１０μｇゲノムＤＮＡおよび〜２８ｐｇ  ＰＶ−ＢＶＧＴ０８−ＤＮＡ）。サイズを確認するために、分子量マーカーＲＡＯＵＬＴＭ（ONCOR／Appligene、カタログ＃１６０６７３）を使用した。
【００３８】
ＤＮＡ−単離：
ＥｖｅｎｔｓＨ７−１のバッチ番号７４９０３Ｈからの植物組織（１〜３ｇ湿分重量）を、粉砕器および乳鉢を使用して、液体窒素中で、微細な粉末に粉砕した。この粉末を、５０ｍｌ−オークリッジチューブに移し、かつ７．５ｍｌの予め温められた（６０℃）ＣＴＡＢ−バッファー（２％ＣＴＡＢ、１００ｍＭトリス−Ｈｃｌ、２０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１．４Ｍ  ＮａＣｌおよび０．２％メルカプトエタノール）を添加した。試料を、約３０分に亘って６５℃でインキュベートし、かつ断続的に混合した。クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１  ｖ／ｖ）からの混合物の同量（８ｍｌ）を、ＲＴで、試料に添加した。この懸濁液を逆混合し、かつ２個の相を遠心分離（１０分、９０００ｒｐｍ）によって分離した。水相を、別の５０ｍｌのオークリッジチューブ中に移し、その後にＤＮＡを５ｍｌのイソプロパノールを添加することによって沈殿させた。ＤＮＡを、遠心分離（２分、９０００ｒｐｍ）によって沈殿し、かつ上清を除去した。沈殿したＤＮＡを、７６％エタノールおよび１０ｍＭ酢酸アンモニウムからの洗浄溶液を用いて、約２０分に亘ってインキュベートした。遠心分離および上清のデカント後に、ＤＮＡを真空乾燥させ、かつＴＥ中にｐＨ８．０で、４℃で一晩に亘って再懸濁した。
【００３９】
二者択一的に、ＤＮＡは、ＤＮｅａｓｙプラントマキシキット（Qiqgen, Dusseldorf, Deutschland, Katalog # 68163）を用いて単離した。ＤＮＡの単離は、製造装置を用いて実施した。
【００４０】
付加的な二者択一的な方法として、ＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙプラントミニキット（Qiqgen, Dusseldorf, Deutschland, Katalog # 69103）を用いて単離した。ＤＮＡ−単離は、製品マニュアルにしたがっておこなった。
【００４１】
ＤＮＡの定量化および制限酵素による消化：
ＤＮＡの定量化は、ＬＫＢ  ＢｉｏｃｈｒｏｍＵＶ／可視光スペクトルフォトメータ（Amersham Pharmacia, Freibung, Deutschland）を使用するか、あるいは、二者択一的に、アガロース−ゲル電気泳動後にプログラムＲＦＬＰスキャンプログラム（MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland）を用いておこなった。キャリブレーションスタンダードとして、高ＤＮＡ質量ラダー（Gibco/Life Technologies （Karlsruhe, Deutschland）（Katalog# 10496-016））を使用した。制限酵素は、Boehringer Mannheim (Mannheim, Deutchland)、Stratagene (Amsterdam, Niederlande) または New England Biolabs (Frankfurt, Deutschland) のものを使用し、かつ製品マニュアルにしたがって使用した。
【００４２】
ＤＮＡプローブの製造：
ＰＶ−ＢＶＧＴ０８−ＤＮＡは、Ｅ．Ｃｏｌｉ−カルチャーから単離した。ＣＰ４−ＥＰＳＰＳのコーディング領域と相同的なプローブテンプレート、３５Ｓ−プロモーター、Ｅ９−３’−ポリ−Ａ−領域、３５Ｓ−ｃｔｐ２−ＣＰ４−ＥＰＳＰＳ−Ｅ９−３’−カセットおよび“骨格”−領域を、相当する制限酵素で消化し、その後に、アガロース−ゲル電気泳動による分離またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって製造した。生成物を、ＢＩＯ  １０１からのＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩ  キットを用いて精製した（La Jolla, CA）。プローブ（２５ｐｇ）の３２Ｐ−ｄＣＴＰまたは３２Ｐ−ｄＡＴＰでのラベリングは、ＭｅｇａｐｒｉｍＴＭ−ＤＮＡ−ラベリング系を使用しておこなった（Amerscham-Pharmacia Biotech Europe (Freiburg, Deutschland)）。
【００４３】
サザン−ブロッティング−分析：
制限酵素を用いて処理したＤＮＡ−プローブは、アガロース−ゲル電気泳動によって、〜１５時間に亘って、〜３５ボルトで分離した。ゲルの撮影後に、ＤＮＡは、０．２５Ｍ  ＨＣｌ−溶液中に１５分に亘ってゲルを浸漬することによって清浄化し、０．５Ｍ  ＮａＯＨ、１．５Ｍ  ＮａＣｌからの変性溶液中で、３０分に亘って穏やかに振とうさせながら変性させ、その後に２時間に亘って、２Ｍ  ＮａＣｌおよび１Ｍ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ５．５から成る種々の容量の溶液中に浸漬することによって中和した。アガロースゲルからのＤＮＡｓは、StratageneからのPosiBlot Pressure Blotterを用いて、製品マニュアルにしたがって、Ｈｙｂｏｎｄ−ＮＴＭ−ナイロンメンブレン（Amerscham Pharmacia Biotech Eurrope, Freiburg, Duetschland）に転写した。フィルターを１５分に亘って、２ｘＳＳＰＥ（２０ｘＳＳＰＥ；３．６Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４）中で浸漬させた後に、ＤＮＡを、ＵＶ光を用いて（トランスイルミネーター、Pharmacia, Freiburg, Deuschland）、１分に亘って露光し、かつ８０℃で１時間に亘って、メンブレンを真空オーブン中でベーキングすることによって固定化した。ブロットは、４時間に亘って、５０％ホルムアルデヒド、５ｘＳＳＣ、０．１％ラウリルサルコシン、０．０２％ＳＤＳおよび２％ブロッキング剤（Boehringer Mannheim, Deutschland, Katalog # 1096176）中でプレハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションは、放射性標識したプローブを用いて、新鮮なハイブリダイゼーション溶液中で、１６〜１８時間に亘って４２℃で実施した。ハイブリダイゼーション後にメンブレンを２ｘＳＳＣ中で４２℃で５分に亘って、２ｘＳＳＣ中で１％ＳＤＳで６５℃で２０分に亘って、かつ、０．２ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６８℃で１５分間ｘ２回に亘って洗浄した。ブロットからのオートラジオグラフィー画像は、ブロットを、Ｂｉｏｍａｘ−ＭＳＴＭ−フィルムを使用して、Ｋｏｄａｋ  Ｂｉｏｍａｘ  ＭＳＴＭ増感フィルターとの組合せで得られた。
【００４４】
５’−および３’−ゲノムフランキング配列の同定
動物−および植物ＤＮＡの間の結合箇所は、逆ＰＣＲ−技術を使用することによって同定した。ゲノムＤＮＡは、前記のようにして精製した。ＤＮＡ約１μｇは、別個の反応中で制限エンドヌクレアーゼＴａｑＩ、ＡｌｕＩ、ＮｄｅＩＩＩまたはＲｓａＩで消化した。消化したＤＮＡ−フラグメントを、Ｔ４−リガーゼによって一晩に亘って再度ライゲートし、その後にＰＣＲ−反応をおこなった。種々の逆プライマーの組合せは、Primer-Analysesoftware OLIGO（Ｒ）（NBI National Biosciences, Inc., Plymouth Michigan）を使用することによって達成された。
【００４５】
これらの逆−ＰＣＲ−適用により得られたフラグメントは、ゲル電気泳動によって分離され、ゲルを切り出し、かつＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩＴＭキットを使用して精製した。精製したフラグメントは、ＴＯＰＯＴＭＴＡ  クローニング（Ｒ）キット（Invitrogen, Groningen, Niederlande）を用いて、ベクターｐＣＲ（Ｒ）２．１中にクローニングした。インサートを、MWG-Biotech（Ebersberg, Deutchland）を用いてシークエンシングした。得られたシークエンシングデータの分析は、DNA-Analysesoftware Mac Molly （Ｒ） Tetra（Soft Gene GmbH, Bochold, Deutschland）を使用しておこなった。
【００４６】
ＰＣＲ−分析：
ゲノムＤＮＡは、DNAeasy Plant Mini kit (Qiagen, Duesseldoef, deutschland)を用いて、製品マニュアルにしたがって製造した。約５０ｎｇのゲノムＤＮＡを、ＰＣＲに使用した。反応を３０秒に亘って９５℃で、３０秒に亘って５５℃で、かつ２分に亘って７２℃で、３５サイクルに亘っておこなった。ＰＣＲは、ＰＴＣ２００−サイクラー（Biozym, Oldendorf, Deutschland）中で実施した。ＰＣＲ生成物は、アガロースゲル電気泳動によって分析した。
【００４７】
１．インサート数：
インサートの数は、テンサイゲノム中への導入ＤＮＡの組み込み部位の数を、Ｈ７−１について測定した。インサートの数を測定するために、ゲノムＤＮＡを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化した。形質転換されていないコントロール植物からのＤＮＡはネガティブコントロールとして、この場合、これは、同様の遺伝的背景を有するものであるが、ＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化した。ポジティブコントロールとして、形質転換ベクターのＤＮＡ（ＰＶ−ＢＶＧＴ０８）を使用した。
【００４８】
ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩは、ＰＶ−ＢＶＧＴ０８中で１箇所のみ切断し、かつ使用された標識ＣＰ４−ＥＰＳＰＳ−プローブ内を切断するものではなかった（図４参照）。ＨｉｎｄＩＩＩは、ＰＶ−ＢＶＧＴ０８中を３箇所に亘って切断するものであるが、しかしながら、３箇所すべてはプローブの外側に位置し、かつプローブに対して同様の側、５’側に位置する。したがって、それぞれの酵素は、ＣＰ４−ＥＰＳＰＳ−プローブとハイブリダイズしうる単一のＤＮＡ−フラグメントを放出し、かつ、導入されたＤＮＡの一部分および隣接するゲノム植物−ＤＮＡを含む。検出されたフラグメントの数は、この場合に存在するインサートの数を示した。結果は図５に示した。
【００４９】
酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩまたはＢａｍＨＩを用いての消化の後に、単一のハイブリダイゼーションフラグメントのみがそれぞれ見出された。ＨｉｎｄＩＩＩ−消化からの５．２ｋｂのフラグメント（レーン４）、ＸｂａＩ−消化からの４ｋｂ（レーン５）およびＢａｍＨＩ−消化からの約１１ｋｂ（レーン７）のフラグメントは、形質転換体Ｈ７−１が単一の組み込みを有することを示した（図４）。レーン１中の強力なシグナルは、直鎖ＰＶ−ＢＶＧＴ０８−プラスミドを示した。付加的な弱いシグナルは、未消化のＰＶ−ＢＶＧＴ０８のわずかな量および非特異的バックグランド−ハイブリダーゼーション−シグナルを示した。
【００５０】
２．コピー数
理論的には、１個の組み込み部位は、挿入されたＤＮＡの１コピー以上から構成されうる。しかしながら、制限酵素分析のフラグメントの大きさに基づいて、これら不可能である。挿入されたＤＮＡの１コピー以上がＨ７−１中に存在する場合には、付加的なフラフメントを検出することができる。これらは、さらに制限酵素ＰｓｔＩで消化することによって確認される。ＰｓｔＩは、２回に亘って左右ボーダー配列内部を切断する。制限酵素切断部位の一つは、ＣＰ４−ＥＰＳＰＳコーディング領域内部に存在し、したがって消化後に、ＣＰ４−ＥＰＳＰＳ−プローブ含む２個のハイブリダイゼーションフラグメントが予測された。見込まれるフラグメントの一つは、約１．２ｋｂの内部フラグメントに相当する。第２のフラグメントは、ボーダーフラグメントであってもよい。さらにここでは、１コピー以上存在する場合には、付加的なフラグメントが確認可能であってもよい。しかしながら、結果は、予測したようにＰｓｔＩがＤＮＡを切断した。この内部フラグメント１．２ｋｂおよび付加的なフラグメント１個のみ４．９ｋｂが検出された（図５、レーン３、図４）。
【００５１】
付加的な内部コントロールとして、ＤＮＡはＣｌａＩを用いて切断した（図５、レーン６、図４）。予想したように、２．４ｋｂの単一フラグメントはハイブリダイズし、それというのもＣｌａＩは２回に亘って、使用されたＣＰ４−ＥＰＳＰＳフラグメントの右および左側を切断するためである。これらの結果は、さらに組み込まれたＤＮＡ−フラグメントの完全性を証明し、かつ、以下の結果と合致することが明らかとなった。
【００５２】
プラスミドＰＶ−ＢＶＧＴ０８と、ＣＰ４−ＥＰＳＰＳ−フラグメントとのハイブリダイゼーションは、予測どおり８．６ｋｂのシグナルを示した（図５、レーン１（ＰＶ−ＢＶＧＴ０８＝８５９０ｂｐ））。第２の小さい極めて弱いバンドは、ＰＶ−ＢＶＧＴ０８の不完全な制限酵素反応によって導かれたものである。
【００５３】
要するに、形質転換されたテンサイ系Ｈ７−１は、植物ゲノム中でＰＶ−ＢＶＧＴ０８のＴ−ＤＮＡの単一コピーの組み込みを包含するものである。
【００５４】
３．コーディング領域の完全性
個々の構成要素（Ｐ−ＦＭＶ−プロモーター、ｃｔｐ２−ＣＰ４−ＥＰＳＰＳのコーディング領域およびＥ９−３’−非翻訳領域）に対してのＣＰ４−ＥＰＳＰＳ−遺伝子カセットの完全性は、Ｐ−ＦＭＶに関しては酵素ＨｉｎｄＩＩＩで、ｃｔｐ２−ＣＰ４−ＥＰＳＰＳに関してはＨｉｎｄＩＩＩ＋ＢａｍＨＩで、およびＥ９−３’−非翻訳領域に関してはＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩを用いて消化することによって測定した。付加的な試験は、ＳａｃＩおよびＸｈｏＩを用いて、Ｐ−ＦＭＶ−ｃｔｐ２−ＣＰ４−ＥＰＳＰＳ−領域およびＥ９−ｐ３’−領域に関して実施した。プラスミド−ＤＮＡは、形質転換されていないテンサイ植物−ＤＮＡと一緒に混合し、かつ形質転換されていないテンサイ−ＤＮＡを単独で、ポジティブまたはネガティブコントロールとして、同様の酵素を用いて消化した。
【００５５】
これらの酵素は、左右のＴ−ＤＮＡ−ボーダー（プラスミドマップ、図１参照）間に、存在するＤＮＡインサートの内部で切断し、それぞれの構成要素が完全である場合には、ハイブリダイズしたフラグメントの大きさは、Ｈ７−１−ＤＮＡおよびＰＶ−ＢＶＧＴ０８−ＤＮＡ中で同一である。
【００５６】
付加的なコントロールとして、ＤＮＡｓはＸｂａＩを用いて消化した。ＸｂａＩは、プロモーターとｃｔｐ２−ＣＰ４−ＥＰＳＰＳコーディング領域との間で１回切断した。したがって、ＰＶ−ＢＶＧＴ０８−ＤＮＡを含み、かつＨ７−１の場合には、ＰＶ−ＢＶＧＴ０８−フラグメントと比較して異なる大きさを有するボーダーフラグメントを含む、８．６ｋｂのフラグメントが予測された。この結果は、図６、７および８に示した。
【００５７】
図６：ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩでの消化は、ＣＰ４−ＥＰＳＰＳ−遺伝子を放出し、かつブロットは、ＰＣＲによって得られたＣＰ４−ＥＰＳＰＳ−フラグメントを用いてプローブした。ネガティブコントロール（レーン６）は、ハイブリダイゼーションバンドを示すことはなかった。ＥｖｅｎｔＨ７−１からのゲノムＤＮＡおよび非形質転換ＤＮＡと混合されたプラスミドＰＶ−ＢＶＧＴ０８の双方は、予測されるものに相当する約１．７ｋｂ−フラグメントを生じた。ＸｂａＩでの消化によって、線状ＰＶ−ＢＶＧＴ０８の予測される８．６ｋｂ−フラグメントが得られた。ＥｖｅｎｔＨ７−１に関しては、消化によって約４．０ｋｂ−ボーダーフラグメントが得られた（図４および図５参照）。また、ネガティブコントロールは、全くシグナルを示すことはなかった。
【００５８】
図７：ＨｉｎｄＩＩＩでの消化は、ゴマノハグサ−モザイクウイルス−プロモーターを放出し、かつブロットを、ＰＣＲによって得られたプロモーターフラグメントを用いてプローブした。このネガティブコントロール（レーン５）は、まったくハイブリダイゼーションシグナルを示すことはなかった。ＥｖｅｎｔＨ７−１からのゲノムＤＮＡおよび非形質転換ＤＮＡと混合したプラスミドＰＶ−ＢＶＧＴ０８の双方は、約０．６ｋｂの大きさのハイブリダイゼーションフラグメントを生じた。このフラグメントは、プロモーターの予測された大きさに相当する（レーン４および６）。
【００５９】
ＸｂａＩでの消化によって、線状化ＰＶ−ＢＶＧＴ０８の予測される８．６ｋｂ−フラグメントが得られ、かつ、約１．３ｋｂの大きさのＥｖｅｎｔＨ７−１からの左ボーダーフラグメントが得られた（レーン１および３）。これらの１．３−ｋｂ−フラグメントは、ＥｎｅｎｔＨ７−１が導入遺伝子の単一のコピーのみを含有するといった付加的な証拠である。さらに、ネガティブコントロール（レーン２）はシグナルを示すことはない。
【００６０】
ＳｃａＩ／ＸｈｏＩでの消化によって、ＣＰ４−ＥＰＳＰＳコーディング領域およびポリアデニル化領域と一緒に、プロモーターを放出した。完全長のプロモーター−ｃｔｐ２−ＣＰ４−ＥＰＳＰＳ−ポリ−Ａ−シグナルカセット（ＰｍｅＩ／ＸｈｏＩ−フラグメント）でのハイブリダイゼーションは、予測される２．３−ｋｂ−プロモーター−ｃｔｐ２−ＣＰ４−ＥＰＳＰＳ−および０．７ｋｂ−ポリ−Ａ−シグナル−フラグメントの双方を生じ、その際、ＰＶ−ＢＶＧＴ０８−ＤＮＡは、非形質転換ＤＮＡおよびＨ７−１ゲノムＤＮＡと一緒に混合する（レーン９および１１）。
【００６１】
図８：ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩでの消化によって、Ｅ９−３’−ポリアデニル化シグナルを放出し、かつブロットを、ポリアデニル化シグナルフラグメントを用いてプローブした。ネガティブコントロール（レーン３）は、全くハイブリダイゼーションバンドを示さなかった。非形質転換ＤＮＡと混合したプラスミドＰＶ−ＢＶＧＴ０８およびＥｖｅｎｔＨ７−１からのゲノムＤＮＡの双方は、予測された大きさに相当する約０．６ｋｂのフラグメントを生じる。ＸｂａＩでの消化によって、線状化されたＰＶ−ＢＶＧＴ０８の予測された８．６ｋｂ−フラグメントおよびＥｖｅｎｔＨ７−１を含む、約４．０ｋｂのボーダーフラグメントが得られた。
【００６２】
ＰｓｔＩでの消化によって、Ｅ９−３’−ポリアデニル化シグナルを放出するが、この場合、これらは０．５ｋｂの大きさのＣＰ４−ＥＰＳＰＳコーディング領域の３’−末端と結合している。得られた１．２−ｋｂフラグメントは、予測されたようにＨ７−１−ゲノムＤＮＡおよびＰＶ−ＢＶＧＴ０８−ＤＮＡの双方を含んで検出可能である。
【００６３】
ＨｉｎｄＩＩＩでの消化によって、プロモーターフラグメントを差し引いた、線状化ＰＶ−ＢＶＧＴ０８の８．０ｋｂ−フラグメント（レーン１３）およびＨ７−１を含む５．２−ｋｂ−ボーダーフラグメント（レーン１１）が得られた。ＨｉｎｄＩＩＩ−消化による単一の５．２ｋｂ−フラグメントおよびＸｂａＩ−消化による単一の４．０ｋｂ−フラグメントにより、ＥｖｅｎｔＨ７−１が、挿入されたＤＮＡの１つのコピーのみを含有するといった付加的な証拠を示した。また、ネガティブコントロールはいかなるシグナルも示さなかった。
【００６４】
要するに、ブロットの結果によって、トランスファーされたＤＮＡのすべの構成要素が完全であり、かつＥｖｅｎｔＨ７−１が、その調節要素、ｐＦＭＶ−プロモーターおよびＥ９−３’−転写終結配列と一緒に、単一の完全なＣＴＰ２−ＣＰ４−ＥＰＳＰＳコーディング配列を含むことが確認された。
【００６５】
４．「骨格」−フラグメントを測定するための分析
Ｔｉ−プラスミドの「骨格」−領域は、Ｔ−ＤＮＡの外側領域として、左右のボーダー配列によって定められ、この場合、これらは、細菌増殖および細菌選択のためのｏｒｉ−遺伝子および選択遺伝子から構成され、かつアグロバクテリウム−介在形質転換によって、通常の方法で植物ゲノム中にトランスファーされる。「骨格」−ベクターＤＮＡが、ＥｖｅｎｔＨ７−１中に存在しないことを確認するために、Ｈ７−１からのゲノムＤＮＡ、形質転換されていないコントロールからのＤＮＡ、およびＰＶ−ＢＶＧＴ０８−ＤＮＡと混合したＨ７−１からのゲノムＤＮＡを、制限酵素ＸｂａＩで消化し、かつ３個重複ＰＣＲで得られたプローブを用いて試験し、この場合、これらは、完全な「骨格」−配列を包含するものである。四分の一のプローブは、１個のフラグメント中で完全な「骨格」を構成するものである。
【００６６】
使用されたプローブは、「骨格」配列を示すものである（図９参照のこと）：
１：ｂｐ２７３０−５３７０
２：ｂｐ５２７８−６４１９
３：ｂｐ６３０２−７８５１
４：ｂｐ２７３０−７８５１
図１０は、サザンブロット分析の結果を示す。レーン６、１０、１４および１８：完全骨格の骨格フラグメントでプローブされたＨ７−１ゲノムＤＮＡの消化では、ハイブリダイゼーションバンドを示すことはなかった。レーン４、８、１２、１６および２０のみ；ＰＶ−ＢＶＧＴ０８−ＤＮＡと混合したＨ７−１ゲノムＤＮＡは、予測したように８．６ｋｂのバンドを示した。バンドは、線状化ＰＶ−ＢＶＧＴ０８−ＤＮＡを示した。
【００６７】
レーン２および４：Ｈ７−１からのゲノムＤＮＡ、およびＰＶ−ＢＶＧＴ０８と混合されたＨ７−１ゲノムＤＮＡを、ＣＰ４−ＥＰＳＰＳ−フラグメントと一緒にハイブリダイズすることによって、ハイブリダイゼーションシグナルを生じた。レーン２中の４ｋｂバンドは、右ボーダーフラグメントを示し、レーン４の２個のバンドは、また４．０ｋｂの右ボーダーフラグメントおよび８．６ｋｂの線状化ＰＶ−ＢＶＧＴ０８プラスミドを示した。双方のバンドは同じ強さを示した。これらは、添加されたＰＶ−ＢＶＧＴ０８−ＤＮＡの濃度が、Ｈ７−１  ＤＮＡ中でのＣＰ４−ＥＰＳＰＳ−要素の濃度に匹敵することを明らかに示すものである。使用されたプラスミド−ＤＮＡの濃度は、０．５コピーに相当する。「骨格」−配列が、Ｈ７−１−ゲノム中に組み込まれる場合には、明瞭なシグナルが検出可能であった。
【００６８】
これらの結果は、Ｈ７−１が、形質転換のために使用されたプラスミドの任意の検出可能な「骨格」−配列を含有しないことを証明するものである。これらの結果は、５’−および３’−ゲノムフランキング領域の分析データによってサポートされる（以下、参照）。
【００６９】
５．５’−および３’−ゲノムフランキング配列の同定
アグロバクテリウム−介在形質転換体は、通常の方法で、植物ゲノム中に左右ボーダー間のすべての配列の組み込みを導くものである。組み込まれたプラスミド−ＤＮＡの５’−末端および３’−末端は、それぞれ、左または右ボーダー配列の内部または近くに存在する。したがって逆−ＰＣＲ−技術を使用し、これらの領域を同定する。クローニングされたＰＣＲ産物はシークエンシングされ、かつ配列データをＰＶ−ＢＶＧＴ０８−配列と比較する。
【００７０】
図１１は、クローニングした逆−ＰＣＲフラグメント（Ｄ１Ｕ．ＲＰＴ）（＝ゲノムＨ７−１、上の配列）からの配列のためのアライメントを示し、この場合、これらは、左ボーダー領域の分析のためのプライマーを用いて、ＰＶ−ＢＶＧＴ０８−配列（下の配列）に対して得られたものである。双方の配列の比較は、ホモロジーが正確にボーダー配列の内部に停止することを示した。
【００７１】
図１２は、クローニングした逆ＰＣＲ−フラグメント（Ｂ３ＵＮＩ．ＲＰＴ）（＝ゲノムＨ７−１、上の配列）からの配列に対するアライメントを示し、この場合、これらは、ＰＶ−ＢＶＧＴ０８−配列（下の配列）に対して、右ボーダー領域を分析するためのプライマーを用いて得られた。双方の配列の比較によって、ホモロジーはボーダー配列の前で、すでに１８ヌクレオチドで停止することが示された。
【００７２】
全部で、Ｔｉ−プラスミドＰＶ−ＢＶＧＴ０８の左右ボーダー領域間の配列が正確に組み込まれた。この配列は、ボーダーの内部かまたは直前で停止する。これらのデータは、「骨格」−分析の結果を指示するものであって、ボーダー領域外側の「骨格」の配列は、Ｈ７−１−ゲノム中に組み込まれない。
【００７３】
テンサイ−ＥｖｅｎｔＨ７−１中の、インサートの右または左側のフランキング配列が、完全な植物のゲノム配列であるか否かについて測定するために、逆−ＰＣＲ分析を、プライマーの組合せＰ１、Ｐ２、Ｐ３およびＰ４を用いて実施した。
【００７４】
プライマーの組合せＰ１およびＰ２のプライマーは、インサート外側に位置する。ＥｖｅｎｔＨ７−１内部の挿入された位置のＤＮＡが、形質転換されていないコントロールのＤＮＡと同一である場合には、ＰＣＲによって２個のＰＣＲ−フラグメントが生じ、この場合、これらは、２個のプライマーの組合せからの合成を示すものである。プライマーＰ３およびＰ４のプライマーは、相当するプライマーの一つが、ＣＰ４−ＥＰＳＰＳ−インサート内部に位置し、かつ他のプライマーがインサート外部、植物のゲノムＤＮＡの内部に存在するようにデザインされる。したがって、ＰＣＲは、ＥｖｅｎｔＨ７−１のＤＮＡからのフラグメントのみを生じる。
【００７５】
逆−ＰＣＲ−技術からの配列データは、ＰＶ−ＢＶＧＴ０８−ベクターからのデータと一緒に組み合わせて、Ｈ７−１−インサート（ＰＶ−ＢＶＧＴ０８配列）、右および左の結合領域および付加的なテンサイゲノムＤＮＡを含む配列を生じる（配列番号５）。
【００７６】
植物ゲノム−ＤＮＡ−結合位置に対する形質転換遺伝子の同定（Ｅｖｅｎｔ−特異性の同定）およびインサートの左および右側位置でのゲノム−ＤＮＡ−配列に関しては、以下のプライマーの組合わせを使用した：
Ｐ１−組合わせ（右ボーダー領域外側のゲノムＤＮＡを分析するためのプライマー、配列番号１８、配列番号１９）：
【００７７】
【化３】
0005586122.tif 000005
Ｐ２−組合せ（左ボーダー領域外側のゲノムＤＮＡを分析するためのプライマー、配列番号２０、配列番号２１）：
【００７８】
【化４】
0005586122.tif 000006
Ｐ３−組合わせ（植物ゲノムＤＮＡ−結合箇所に対する形質転換遺伝子を分析するためのプライマー、配列番号７、配列番号８）
【００７９】
【化５】
0005586122.tif 000007
Ｐ４−組合せ（植物ゲノムＤＮＡ−結合箇所に対する形質転換遺伝子を分析するためのプライマー、配列番号９、配列番号１０）
【００８０】
【化６】
0005586122.tif 000008
【００８１】
ＥｖｅｎｔＨ７−１および形質転換されていないコントロール植物からのＤＮＡを用いてのＰＣＲ試験は、プライマーの組合せＰ３を用いておこない、この場合、このプライマーは、Ｈ７−１インサート内部に位置するものであって、ＥｖｅｎｔｓＨ７−１のＤＮＡのみを含むフラグメントを生じうる。対照的に、ＰＣＲ−試験は、インサートの外部の配列に対して同一遺伝子であるプライマー組合せＰ１を用いて、ＥｖｅｎｔＨ７−１および形質転換されていないコントロールＤＮＡを生じる。これらの結果については図１３参照のこと。
【００８２】
結果は、形質転換されたＥｖｅｎｔＨ７−１ＤＮＡ中および形質転換されていない植物からのＤＮＡ中で、インサートの右側結合部位の隣に配列が存在することを示す。これは、ＥｖｅｎｔＨ７−１インサートの外側のこれらのＤＮＡが、形質転換されていないゲノムＤＮＡであると考察されてもよい。
【００８３】
ＰＣＲ試験は、Ｅｖｅｎｔ−Ｈ７−１ＤＮＡおよび形質転換されていないコントロール植物からのＤＮＡで、プライマー組合せ物Ｐ４を用いて実施し、この場合、これらのプライマーは、ＣＰ４−ＥＰＳＰＳ−インサートの内部に位置するプライマーの一つを有し、ＥｖｅｎｔＨ７−１ＤＮＡのみを含むフラグメントを生じた。対照的に、プライマーの組合せＰ２を用いてのＰＣＲ試験は、インサートの外側の配列に対して同一遺伝子であり、Ｅｖｅｎｔ  Ｈ７−１および形質転換されていないコントロールＤＮＡを含むフラグメントを生じる（図１４）。
【００８４】
結果は、インサートの左結合部位隣の配列が、形質転換されたＥｖｅｎｔＨ７−１のＤＮＡ中および形質転換されていない植物のＤＮＡ中の双方に存在することを示した。これから、左結合部位外側のＤＮＡが、非形質転換ゲノムＤＮＡであることが考えられうる。
【００８５】
要するに、テンサイ−ＥｖｅｎｔＨ７−１のインサート外側の配列が、非形質転換植物中に存在する配列と同一であることが示された。これによって、これらの配列が、形質転換のために使用された親系統および他の通常のテンサイ系において存在する、植物ゲノム配列であると考えられる。
【００８６】
６．世代を超えての安定性
組み込まれたＤＮＡの安定化を試験するために、起源となる形質転換体−ＥｖｅｎｔＨ７−１を、非形質転換テンサイ形との自己受粉により得られた系のその３つの後代（６４８０１Ｈ、７４９２２Ｈおよび８３００２Ｓ；図１５参照）と比較した。この起源となる形質転換系および後代は、１９９５、１９９６、１９９７および１９９８年に製造されたものである。
【００８７】
コントロールとしては、４個の異なる非形質転換テンサイ系（３Ｓ００５７、５Ｒ７１５０、８Ｋ１１８０、６Ｓ００８５）を分析した。すべてのＤＮＡｓは、ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩまたはＢａｍＨＩでそれぞれ消化し、かつ標識化されたＣＰ４−ＥＰＳＰＳ−フラグメントとハイブリダイズした。Ｔ−ＤＮＡが、植物ゲノム中で安定に組み込まれることが示され、同様の制限酵素を用いて消化したＨ７−１後代のすべてのレーンは、正確に同様の大きさのバンドを示した。
【００８８】
Ｈ７−１後代からのＤＮＡｓレーン３〜６は、予測されたフラグメントを示し：ＢａｍＨＩを用いて消化されたＤＮＡは、約１１ｋｂのバンドを生じ、ＸｂａＩでの消化により得られたフラグメント４．０ｋｂおよびＨｉｎｄＩＩＩ−制限酵素反応によって得られたバンド５．２ｋｂを示した。同様の制限からのすべてのバンドは、異なる年代のものであるが、その大きさにおいて同一である。すべての形質転換されていない系は、全くシグナルを示すことがなかった（図１６）。
【００８９】
これらの結果は、挿入された配列が、ゲノムＤＮＡ中に安定に組み込まれ、かつ安定に後代に受け継がれることを示す。
【００９０】
配列表（フリーテキスト）
配列番号５
＜２２３＞：３’−および５’−フランキング配列を有する挿入ＤＮＡ
配列番号６
＜２２３＞：ＰＣＲ産物
配列番号１１
＜２２３＞：ＰＣＲ産物
配列番号１２
＜２２３＞：ＰＣＲ産物
配列番号１３
＜２２３＞：ＰＣＲ産物
配列番号１７
＜２２３＞：ＰＣＲ産物
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】バイナリーベクターＰＶ−ＢＶＧＴ０８を示す図
【図２】ＰＣＲ分析によるＨ７−１の同定を示す図
【図３】マルチプレックスＰＣＲによるＥｖｅｎｔＨ７−１の同定および遺伝子導入されたＥｖｅｎｔＨ７−１と非形質転換植物との差異を示す図
【図４】制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ、ＣｌａＩ、ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩの制限酵素部位を有するｐＦＭＶ−ｃｔｐ２−ＣＰ４−ＥＰＳＰＳ−Ｅ９−３’−インサートを示す図
【図５】ＥｖｅｎｔＨ７−１のインサート／コピー数分析を示す図
【図６】完全なｃｔｐ２−ＣＰ４−ＥＰＳＰＳのコーディング領域を評価するためのＨ７−１のサザンブロッティング分析を示す図
【図７】完全なプロモーター領域を評価するためのＥｖｅｎｔＨ７−１のサザンブロッティング分析を示す図
【図８】完全なポリアデニル化（ポリ−Ａ）領域を評価するためのＥｖｅｎｔＨ７−１のサザンブロッティング分析を示す図
【図９】ＥｖｅｎｔＨ７−１中の「骨格」−ベクターＤＮＡが存在しないことについて評価するための、プローブとして使用したフラグメントを示す図
【図１０】ＥｖｅｎｔＨ７−１中の「骨格」−ベクターＤＮＡが存在しないことについて評価するためのサザンブロット分析を示す図
【図１１】ＰＣＲ−配列とＰＶ−ＢＶＧＴ０８−配列との左ボーダー領域（ＬＢ）上での比較を示す図
【図１２】ＰＣＲ−配列とＰＶ−ＢＶＧＴ０８−配列との右ボーダー領域（ＲＢ）上での比較を示す図
【図１３】インサートの右結合部位外側のゲノムＤＮＡ分析を示す図
【図１４】インサートの左結合部位の外側のゲノムＤＮＡの分析を示す図
【図１５】Ｈ７−１播種培養のための系統図
【図１６】ゲノム中に挿入されたＤＮＡが安定に組み込まれているかについて検出するための、Ｅｖｅｎｔ  Ｈ７−１のサザンブロット分析を示す図
【図１】
0005586122.tif 000009
【図２】
0005586122.tif 000010
【図３】
0005586122.tif 000011
【図４】
0005586122.tif 000012
【図５】
0005586122.tif 000013
【図６】
0005586122.tif 000014
【図７】
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【図８】
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【図９】
0005586122.tif 000017
【図１０】
0005586122.tif 000018
【図１１】
0005586122.tif 000019
【図１２】
0005586122.tif 000020
【図１３】
0005586122.tif 000021
【図１４】
0005586122.tif 000022
【図１５】
0005586122.tif 000023
【図１６】
0005586122.tif 000024
【配列表】
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0005586122000002.xml