(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
気管支肺癌の指標を検出するためのインビトロ方法であって、該方法は、
前記気管支肺癌を患っていることが疑われる患者に由来する生物試料においてカリクレイン８をコードするＫＬＫ８遺伝子の主要選択的転写産物のうちの少なくとも１つを検出する工程を含んでなり、前記主要選択的転写産物はそれぞれ配列番号５及び６に記載の核酸配列からなる転写産物ＮＴ３及びＮＴ４であり、転写産物ＮＴ３又はＮＴ４の陽性検出は前記患者の気管支肺癌を示す、方法。
【請求項２】
気管支肺癌を患っている患者の生存予測の指標を検出するためのインビトロ方法であって、該方法は、
患者に由来する生物試料において、それぞれ配列番号５又は６に記載の核酸配列からなるＫＬＫ８遺伝子の主要選択的転写産物ＮＴ３又はＮＴ４の量を決定する工程を含んでなり、
前記指標は主要選択的転写産物ＮＴ３又はＮＴ４の量であり、患者の生存予測のために使用される、方法。
【請求項３】
更に、配列番号３に記載の核酸配列からなるＫＬＫ８遺伝子の他の転写産物ＮＴ１の量を決定する工程を含む、請求項２に記載の方法であって、
前記転写産物ＮＴ１の量は患者の生存予測のために使用される、方法。
【請求項４】
請求項２で検出した主要選択的転写産物以外の、それぞれ配列番号３、４、５、６、７及び８に記載の核酸配列からなる転写産物ＮＴ１、２、３、４、５及び６から選択される少なくとも一の、ＫＬＫ８遺伝子の他の転写産物の量を決定する工程を更に含む、請求項２に記載の方法であって、
前記少なくとも一の、他の転写産物ＮＴ１、２、３、４、５又は６の量は患者の生存予測のために使用される、方法。
【請求項５】
気管支肺癌を患っている患者の生存予測の指標を検出するためのインビトロ方法であって、該方法は、
ｉ）患者に由来する生物試料中の、それぞれ配列番号５又は６に記載の核酸配列からなるＫＬＫ８遺伝子の主要選択的転写産物ＮＴ３又はＮＴ４の量（Ｑ１）を決定する工程、
ｉｉ）同じ試料中の、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３又はＫＬＫ１４遺伝子の転写産物の量（Ｑ２）を決定する工程、及び
ｉｉｉ）比率Ｑ１／Ｑ２を算出する工程を含み、
前記指標は比率Ｑ１／Ｑ２であり、患者の生存予測のために使用される、方法。
【請求項６】
気管支肺癌を患っている患者の生存予測の指標を検出するためのインビトロ方法であって、該方法は、
ｉ）（ａ）患者に由来する生物試料中の、配列番号５に記載の核酸配列からなるＫＬＫ８遺伝子の主要選択的転写産物ＮＴ３及び、それぞれ配列番号３、４、６、７及び８に記載の核酸配列からなる転写産物ＮＴ１、２、４、５及び６から選択される少なくとも一のＫＬＫ８遺伝子の他の転写産物の量（Ｑ１）を決定するか、あるいは
（ｂ）患者に由来する生物試料中の、配列番号６に記載の核酸配列からなるＫＬＫ８遺伝子の主要選択的転写産物ＮＴ４及び、それぞれ配列番号３、４、５、７及び８に記載の核酸配列からなる転写産物ＮＴ１、２、３、５及び６から選択される少なくとも一のＫＬＫ８遺伝子の他の転写産物の量（Ｑ１）を決定する工程、
ｉｉ）同じ試料中の、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３又はＫＬＫ１４の転写産物の量（Ｑ２）を決定する工程、及び
ｉｉｉ）比率Ｑ１／Ｑ２を算出する工程を含み、前記指標は比率Ｑ１／Ｑ２であり、患者の生存予測のために使用される、方法。
【請求項７】
前記気管支肺癌は非小細胞気管支癌腫である、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１から７の何れか一項に記載の方法を実施するための診断キットであって、
それぞれ配列番号５又は６に記載の核酸配列からなるＫＬＫ８遺伝子の主要選択的転写産物ＮＴ３又はＮＴ４の結合パートナーを含んでなる、キット。
【請求項９】
前記結合パートナーは核酸プローブ又は増幅プライマーである、請求項８に記載の診断キット。
【請求項１０】
配列番号７に記載の配列を有することを特徴とする、カリクレイン８をコードするＫＬＫ８遺伝子の選択的転写産物ＮＴ５。
【請求項１１】
配列番号８に記載の配列を有することを特徴とする、カリクレイン８をコードするＫＬＫ８遺伝子の選択的転写産物ＮＴ６。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌腫学の分野に関する。より詳しくは、本発明の目的は、ヒト患者に由来する生物試料中のカリクレイン８のＫＬＫ８遺伝子の主要転写産物の、所定の限界値を越えた存在の決定による、その患者の原発性気管支肺癌のインビトロ診断の方法である。
【０００２】
原発性気管支肺癌は、人の癌による死の主な原因であり、これは全ての先進諸国においてである。最近のデータは、女性でのその発生率のはっきりした増加を示す。年ごとの新規症例の数は、フランスでは２５０００件及び米国では１６００００件と推定され、フランスでは年ごとに約２２０００件及び米国では１５５０００件の死亡に結果としてなっている。全世界で、気管支肺癌は毎年約９０００００件の死亡原因であると考えられ、これは癌による死亡の約１８％に相当する。気管支肺癌の主な病因は、タバコ中毒である。男性の約９０％と女性の約５０％の気管支癌は、タバコに起因している。また、気管支の発癌では、他の環境要因又は職業要因も認められている。
【０００３】
世界保健機構（ＷＨＯ）は、約２０％の症例に相当する小細胞気管支癌腫（ＳＣＢＣ）と、約８０％の症例に相当する非小細胞気管支癌腫（ＮＳＣＢＣ）であって、とりわけ類表皮癌、腺癌及び大細胞癌を含むものとを区別する。類表皮癌と腺癌は、最も広範囲にわたる癌腫である。
【０００４】
現時点で、気管支肺癌の診断は、基本的に肺のＸ線撮影と胸部のスキャニングによってされる。そして、生検を実施することが可能な内視鏡検査により、診断を確認する。残念なことに、指標的な症状は後発性で且つあまり特異的でなく、遅い段階で診断が及び、従って、既存の治療の有効性及び実施可能性は非常に減少する。加えて、このタイプの診断は、精巧な機器と資格のあるスタッフを必要とし、高価である。
【０００５】
様々な治療方法、すなわち手術、化学療法及び放射線療法が、現在利用可能である。これらの治療は、分離して、又は連続して、又は組合せて、実施することができる。  
【０００６】
肺癌の生存率は、診断時の腫瘍の転移の程度に非常に依存する。全体の５年生存率は、ほぼ１５％程度である。しかしながら、この率はかなりの差異を覆い隠している。診断時に遠隔転移を伴う癌腫を有する患者の生存率は５％未満であるが、一方で「非小細胞癌」（ＮＳＣＢＣ）がその発見時に局在化している患者は５０％の近くの生存率を呈する（文献１）。これらの後者は、差し当たりはこのタイプの癌腫の唯一の治癒的解決法に相当する方法である腫瘍の外科的切除によって、基本的に治療される。しかしながら、この治療を受けることができるのは３人に１人より少ない患者であり、外科的に治療された２人に１人の患者は、手術の後の数ヶ月間に、腫瘍再発に続いて死亡する。ＮＳＣＢＣの現代の化学療法の分野における最近の進歩により、アジュバントまたはネオアジュバント治療が外科手術を受けた患者の平均余命を改善していると予想することができる（文献２）。しかしながら、この治療は、無視することのできない付随する死亡率に関して、些細なものではない。これに関連して、ネオアジュバント又はアジュバント化学療法を行うべきか否かの判断を容易にするために、再発による死亡の高いリスクを呈する手術可能な患者を同定できることが重要である。
【０００７】
腫瘍細胞と正常細胞を区別することを可能にするマーカーは、全ての癌腫、特に気管支肺癌のために、長年探し求められ研究されてきた。それらは、初期段階で疾患を診断して、その予後と治療に対する感受性を決めて、その進行を監視することを可能にする。近年、１００以上の候補が、気管支肺癌の診断用分子マーカーとして提案された。従って、研究は、プロトオンコジーン、細胞周期、アポトーシスまたは脈管形成に関係する因子の診断上の役割を想定したものである。しかしながら、異なる技術によって得られた結果間にはわずかな相互関係を得ることが可能であり、患者の様々なコホート間の検証は使用する技術（免疫組織化学、免疫学的分析、さまざまなアルゴリズムを使用しているＤＮＡチップ）及び腫瘍の大きな多様性（組織学的タイプ、ステージ、分化の程度）に依存している。
また、セリンプロテアーゼのサブファミリーに属する他のマーカーであるカリクレイン類は１５あり、試験された。そして、ＤＮＡチップを使用する研究において、ｈＫＬＫ１１遺伝子は、Ｃ２型の内分泌腺癌のマーカーとして確認された（文献３）。類似する研究は、ｈＫＬＫ５とｈＫＬＫ１０遺伝子が類表皮癌において過剰発現することを示した（文献４）。同様に、それぞれタンパク質ｈＫ５とｈＫ７をコードするｈＫＬＫ５とｈＫＬＫ７遺伝子が、類表皮癌の腫瘍組織において過剰発現したことが示されたが、その一方で、腫瘍組織のｈＫＬＫ７遺伝子の低発現は多くの場合、腺癌を呈している患者において観察される（文献５）。しかしながら、これらのｈＫＬＫ遺伝子の発現差異と気管支肺癌を患っている患者の生存予後の何らかの関連を確かめることは可能ではなかった。
【０００８】
１５のカリクレインの遺伝子は、それらの間に共通して、同じ遺伝子に対する複数の転写産物が存在するという特徴を呈する。また、これらの遺伝子の転写産物はマーカーとして研究された。例えば、ｈＫＬＫ４（文献６）とｈＫＬＫ５（文献７）遺伝子の３つの選択的転写産物、及びｈＫＬＫ７（文献７）遺伝子の１つの転写産物が、非癌性組織と比較すると、腫瘍においておよび／または卵巣細胞株系で過剰発現することが示された。
【０００９】
ｈＫＬＫ８遺伝子の発現プロファイルが、ＮＴ１からＮＴ４と呼ばれている少なくとも４つの異なる転写産物を生じることは知られている。Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｓ．等（文献８）によって同定された転写産物ＮＴ１または「ニューロプシン・タイプ１（neuropsin type1）」は、２８アミノ酸の分泌シグナルペプチドを含んでなる２６０アミノ酸のプリプロ酵素とカリクレイン８の活性型を作用させるために離れて切断されなければならない４残基の非常に短いプロセグメントをコードする。ＮＴ１は、遺伝子の通常の発現型と考えられる。Ｍｉｔｓｕｉ  Ｓ．等（文献９）によって同定された転写産物ＮＴ２または「ニューロプシンＴ２」は、４５の追加のアミノ酸をコードする配列の、シグナルペプチドのカルボキシル末端領域における挿入によって、ＮＴ１型と区別される。転写産物ＮＴ３及びＮＴ４はＭａｇｋｌａｒａ  Ａ．等（文献１０）によって同定され、それぞれ１１９残基及び３２残基を含むタンパク質をコードする。ＮＴ３から予測されるタンパク質形態は、カリクレイン８のシグナルペプチドの一部分のみを有し、後者の切断ゾーンを保存していない。ＮＴ４から予測されるタンパク質は、カリクレイン８のシグナルペプチドの最初の２３残基とカリクレイン８と同一性のない９つの追加の残基から構成される。Ｍａｇｋｌａｒａ  Ａ．等（文献１０）は、ＫＬＫ８遺伝子の通常の発現型であるＮＴ１は卵巣の癌腫において予後値がありうるにもかかわらず、ＮＴ３型とＮＴ４型は価値がないことを示した。
【００１０】
出願人は、今回驚くべきことに、ＮＴ３及びＮＴ４から選択されるカリクレイン８をコードするＫＬＫ８遺伝子の主要な選択的転写産物が、気管支肺癌腫、特に非小細胞気管支癌腫において、高レベルで、良好な診断マーカー、特に悪化の予後マーカーであることを示した。
【００１１】
したがって、本発明の第１の対象は、気管支肺癌、特に非小細胞気管支癌のインビトロ診断の方法であって、前記気管支肺癌を患っていることが疑われる患者に由来する生物試料において、カリクレイン８のＫＬＫ８遺伝子の主要な選択的転写産物のうちの少なくとも１つの検出の工程を含むか又はそれからなることを特徴とする方法である。
【００１２】
従って、本発明の方法により、特に高レベルで、ＫＬＫ８遺伝子の主要選択的転写産物を検出することを含む簡単な試験によって気管支肺癌において診断を確立することを可能にする。
【００１３】
ＫＬＫ８遺伝子の選択的転写産物は、ＫＬＫ８遺伝子の転写産物を意味すると理解される。例えば上記のこの転写産物は、ＮＴ１、ＮＴ２、ＮＴ３及びＮＴ４と特に呼ばれている。後述するように、出願人は、ＮＴ５及びＮＴ６と名付けられた２つの新規な転写産物を発見した。
【００１４】
主要転写産物は、主にカリクレイン８の発現のための遺伝子から産生される転写産物を意味すると理解される。ある実施態様によれば、ＫＬＫ８遺伝子の主要選択的転写産物は、転写産物ＮＴ３とＮＴ４から選択される。
主要転写産物の高レベルは、定義された限界値より大きいレベルを意味すると理解される。
【００１５】
一般に、検体の検出に対する検査の結果の大部分は、使用する結合パートナーの特徴に依存することが知られている。したがって、例えば、ヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションによるＲＮＡの検出の場合、特に結果がプローブのサイズ、組成及び相補性パーセンテージの特徴に依存し、これらの特徴はこれらのプローブによって測定した値に影響する。したがって、正確な限界値を与えることが可能でないことになり、使用する各々の結合パートナーに適した限界値がいずれの場合においても簡単なルーチンの実験で決定されてもよい。
【００１６】
離散値または不確定ゾーンに対応する値の範囲のどちらかを本願明細書において限界値と呼ぶことは明確に理解されなければならない。非常に明らかに、計測値が不確定性区間内に位置するか、または限界値にあまりに近いときは、明確な結論に達せずともよく、更なる検討が行われなければならない。
【００１７】
本発明の方法が実施される生物試料は、ＫＬＫ８遺伝子の主要選択的転写産物を含むことが可能な任意の生物試料である。このような試料の例として、患者の転移ガン、リンパ節ガングリオン、腫瘍の生検に由来する組織などの固体試料、血液、血清、血漿及び喀出のような生体液体、及びこれらの固体又は液体試料から精製された細胞が、挙げられてもよい。
【００１８】
転写産物の検出、特に主要選択的転写産物は、転写産物の直接的検出、または転写産物の間接的検出、または当業者に知られている、試料中のＲＮＡの存在の決定のための他の任意の方法を意味すると理解される。  
【００１９】
転写産物、特に主要選択的転写産物の直接的検出は、生物試料での前記転写産物自体の検出を意味すると理解される。
生物試料の主要選択的転写産物の直接的検出は、ＰＣＲまたはＮＡＳＢＡ技術によって増幅の後、必要に応じて、当業者に知られている任意の手段によって、例えば主要選択的転写産物の特異的な結合パートナーとのハイブリダイゼーションによって実施されてもよい。
【００２０】
ハイブリダイゼーションは、適切な状況下で、２つのヌクレオチド断片が二本鎖複合体を形成するために、安定で特異的な水素結合によって、共に結合する過程の方法を意味すると理解される。これらの水素結合は、相補的塩基のアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）（またはウラシル（Ｕ））（Ａ−Ｔ結合と呼ばれる）間の、又は相補的塩基のグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）（Ｇ−Ｃ結合と呼ばれる）間に生じる。２つのヌクレオチド断片のハイブリダイゼーションは完全であってもよく（従って、相補的ヌクレオチド断片または配列と呼ばれる）、言換えれば、二本鎖複合体が、ＡーＴ結合とＣーＧ結合のみを含むこのハイブリダイゼーションで得られる。このハイブリダイゼーションは部分的あってもよく（従って、十分に相補的ヌクレオチド断片または配列と呼ばれる）、言換えれば、生じた二本鎖複合体は、二本鎖複合体の形成を可能にするＡーＴ結合とＣーＧ結合だけでなく、相補的な塩基に結合しない塩基もまた含む。２つのヌクレオチド断片間のハイブリダイゼーションは、使用する操作条件、特にストリンジェンシーに依存する。ストリンジェンシーは、２つのヌクレオチド断片の塩基組成の観点から、加えて２つのヌクレオチド断片間のミスマッチの程度によって、特に定められる。また、ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション溶液中に存在するイオン種の濃度及びタイプ、変性化剤の性質と濃度及び／又はハイブリダイゼーション温度のような反応パラメーターの機能であってもよい。全てのこれらのデータは周知であり、当業者は適切な条件を決定することができる。一般に、ハイブリダイゼーション温度は、ハイブリダイズすることが求められるヌクレオチド断片の長さに従って、約０．５から１Ｍの濃度の食塩水中で、約２０と７０℃の間、特に３５と６５℃の間にある。配列、又はヌクレオチド断片、又はオリゴヌクレオチド、又はポリヌクレオチドは、リン酸エステル結合によって結びつけられるヌクレオチド単位の鎖であって、天然核酸の情報配列によって特徴づけられ、ヌクレオチド断片とハイブリダイズすることが可能であり、鎖が異なる構造のモノマーを含むこと、及び核酸の天然分子からおよび／または遺伝子組換えによっておよび／または化学合成によって得ることができる。単位は天然核酸ヌクレオチドであってもよいモノマーに由来し，その構成要素は糖、リン酸基と窒素含有塩基であり；ＤＮＡでは糖はデソキシ−２−リボースであり、ＲＮＡでは糖はリボースである；ＤＮＡ又はＲＮＡが含まれるかどうかに依存して、窒素含有塩基は、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン及びチミンから選択される；又は、モノマーは３つの構成要素のうちの少なくとも１つにおいて修飾されるヌクレオチドである；例えば、修飾は、塩基のレベルで、イノシン、メチル−５−デソキシシチジン、デソキシウリジン、ジメチルアミノ−５−デソキシウリジン、ジアミノ−２，６−プリン、ブロモ−５−デソキシウリジンまたはハイブリダイゼーション可能な任意の他の修飾された塩基のような修飾塩基で生じてもよく、糖のレベルで、例えば、ポリアミドによる少なくとも一つのデソキシリボースの置換（文献１１）で生じてもよく、再度リン酸基のレベルで、例えば、特にジホスフェート、アルキル及びアリール・ホスホナート、及びホスホロチオネートから選択されるエステルによるその置換で生じてもよい。
【００２１】
主要選択的転写産物の特異的な結合パートナーは、主要選択的転写産物と結合できる任意のパートナーである。例として、核酸プローブ、増幅プライマー、主要選択的転写産物と結合できると他の任意の分子を、挙げることができる。
【００２２】
ハイブリダイゼーションプローブは、５から１００の核酸単位、特に１０から３５の核酸単位を含むヌクレオチド断片であって、標的遺伝子の特異的な物質とハイブリダイゼーション複合体を形成するために、所定の条件下で、ハイブリダイゼーション特異性を有することを特徴とするものを意味すると理解される。本発明において、標的遺伝子の特異的な物質は、標的遺伝子に由来するメッセンジャーＲＮＡに含まれるヌクレオチド配列（それ故、標的遺伝子の特異的なｍＲＮＡと呼ばれる）、前記メッセンジャーＲＮＡの逆転写によって得られた相補ＤＮＡに含まれるヌクレオチド配列（それ故、標的遺伝子の特異的なｃＤＮＡと呼ばれる）、又は、上記のように、前記ｃＤＮＡの転写によって得られた相補ＲＮＡに含まれるヌクレオチド配列（それ故、標的遺伝子の特異的なｃＲＮＡと呼ばれる）であってもよい。ハイブリダイゼーションプローブは、その検出を可能にするマーカーを含んでもよい。
【００２３】
本発明の意味において、増幅プライマーは、５から１００核酸単位、好ましくは１５から３０核酸単位を含むヌクレオチド断片であって、酵素によるポリメリゼーション、特に酵素による増幅反応の開始を可能するものを意味すると理解される。酵素による増幅反応は、少なくとも一つの酵素の作用によってヌクレオチド断片の多数のコピーを生成する方法を意味すると理解される。この増幅反応は当業者にとって周知であり、以下の技術を特に挙げることができる：
−ＵＳ特許第４６８３１９５号、ＵＳ４６８３２０２、及びＵＳ４８００１５９に記載されているような、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）
−特許出願ＥＰ０２０１１８４の実施例に開示されている、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）
−特許出願ＷＯ９０／０１０６９に記載されている、ＲＣＲ（修理連鎖反応）
−特許出願ＷＯ９０／０６９９５の、３ＳＲ（自己支持配列複製（Self Sustained Sequence Replication）
−特許出願ＷＯ９１／０２８１８の、ＮＡＳＢＡ（核酸配列ベース増幅）、及び
−ＵＳ特許第５３９９４９１号の、ＴＭＡ（転写媒介増幅）。
【００２４】
酵素による増幅がＰＣＲであるときに、特異試薬は標的遺伝子に特異的で且つ標的遺伝子の特異的な物質の増幅を可能にする、少なくとも２つの増幅プライマーを含む。そして、標的遺伝子の特異的な物質は、標的遺伝子から誘導されたメッセンジャーＲＮＡの逆転写によって得られた相補ＤＮＡ（それ故、標的遺伝子の特異的ｃＤＮＡと呼ばれる）または標的遺伝子の特異的ｃＤＮＡの転写によって得られた相補ＲＮＡ（それ故、標的遺伝子の特異的ｃＲＮＡと呼ばれる）を含むことが好ましい。酵素による増幅が逆転写反応後に実施されるＰＣＲであるときに、それはＲＴ−ＰＣＲと呼ばれる。
【００２５】
検出は、物理的方法又はＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩ、エチジウムブロマイドのようなインターカレーター色素による化学的方法、又はマーカーによる検出方法を意味すると理解される。多数の検出方法が、核酸の検出用に存在する（文献１２、１３）。  
【００２６】
マーカーは、検出可能なシグナルを生じることができるトレーサーを意味すると理解される。これらのトレーサーの非限定的なリストは、比色法、蛍光または発光によって検出可能なシグナルを生じる酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β‐ガラクトシダーゼまたはグルコース‐６‐リン酸デヒドロゲナーゼ；蛍光化合物、発光化合物、着色化合物のような発色団；電子顕微鏡法によってまたは伝導率のようなその電気的性質によって、電流測定または電圧測定（voltametry）の方法によって、またはインピーダンス計測によって、検出可能な電子密度を有する基；回折、表面プラスモン共鳴、接触角の変化のような光学的方法によって、または原子力分光学、トンネル効果などのような物理的な方法によって検出可能な基；または３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉのような放射性分子を含む。
【００２７】
本発明の意味において、ハイブリダイゼーションプローブは、いわゆる検出プローブであってもよい。この場合、いわゆる検出プローブは、上記のようなマーカーで標識する。このマーカーの存在のおかげで、所与の検出プローブと検出される転写産物の間のハイブリダイゼーション反応の存在が検出できる。
【００２８】
検出プローブは、特に「分子ビーコン」検出プローブであってもよい（文献１４）。これらの「分子ビーコン」は、ハイブリダイゼーションの間、蛍光性になる。それらは、ステムとループ型の構造を有しており、フルオロフォアとクエンチャー基を含む。特異的なループ配列とその相補的な標的核酸配列との結合によって、ステムの巻き戻しと、適切な波長での励起において蛍光シグナルの放出が生じる。
【００２９】
また、ハイブリダイゼーションプローブは、いわゆるキャプチャープローブであってもよい。この場合、いわゆるキャプチャープローブは、適切な手段で、言換えれば直接的に又は間接的に、例えば共有結合又は吸着によって、固体支持体上に固定されるか固定可能である。固体支持体として、合成物質または天然物質は、おそらく化学的修飾されたもの、特にセルロースを基とした物質、例えば紙、酢酸セルロース及びニトロセルロースのようなセルロースの誘導体またはデキストラン、ポリマー、コポリマー、特にスチレンタイプのモノマーを基礎としたもの、綿のような天然繊維、ナイロンのような合成繊維などの多糖類；シリカ、クォーツ、ガラスまたはセラミックのような無機物質；ラテックス；磁性粒子；金属誘導体、ゲル類などを使用することができる。固体支持体は、微量滴定プレート、特許出願ＷＯ−Ａ−９４／１２６７０に記載されているようなメンブレン、粒子の形態であってもよい。また、複数の異なるキャプチャープローブは、各々が１つの標的転写産物に特異的である支持体に固定されてもよい。特に、多数のプローブを固定することができるバイオチップを、支持体として使用してもよい。バイオチップは、多数のキャプチャープローブが所定の位置で固定される小型の固体支持体を意味すると理解される。バイオチップまたはＤＮＡバイオチップの発想は１９９０年代の初めに始まった。それは、マイクロエレクトロニクス、核酸化学、画像分析及びデータ処理を統合した集学的な技術に基づく。操作の原理は、分子生物学の基本原理であるハイブリダイゼーションの現象、言換えれば、塩基の相補性を介したＤＮＡおよび／またはＲＮＡの２つの配列の組合せに基づく。バイオチップ方法は、直接的にまたは間接的に蛍光色素で標識された標的ヌクレオチド断片の試料の作用を受ける固体支持体に固定されるキャプチャープローブの使用に基づく。キャプチャープローブは支持体またはチップ上に特別な方法で置かれ、各々のハイブリダイゼーションは標的ヌクレオチド断片に関連する情報の特定の部分を与える。得られた情報は累積的で、例えば標的遺伝子／転写産物のまたは複数の標的遺伝子／転写産物の発現レベルを定量化することを可能にする。ハイブリダイゼーションの後、支持体またはチップは洗浄され、標識化ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡ／キャプチャープローブ複合体は例えば蛍光色素タイプのマーカーへの高親和性リガンド結合によって明らかにされる。蛍光は、例えばスキャナーで読み込まれ、蛍光の分析はデータプロセッシングによって処理される。例として、分子診断のためにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社によって開発されたＤＮＡチップ（「高密度ＤＮＡアレイによる遺伝情報のアクセッシング」）（文献１５、１６）を挙げることができる。この技術において、キャプチャープローブは通常、小型で約２５ヌクレオチドである。バイオチップの他の例は、多数の出版物（文献１７、１８、１９、２０、２１）又は特許ＵＳ−Ａ−４９８１７８３、ＵＳ−Ａ−５７００６３７、ＵＳ−Ａ−５４４５９３４、ＵＳ−Ａ−５７４４３０５とＵＳ−Ａ−５８０７５２２に挙げられている。固体支持体の主な特徴は、検出法のために最小のバックグラウンドノイズを生じる一方で、標的ヌクレオチド断片に対するキャプチャープローブのハイブリダイゼーション特性を保存しなければならない。  
【００３０】
支持体上のプローブの固定化のために、３つの主要な製造方法が識別される。
まず初めに、第１の技術は予め合成されたプローブの付着（deposition）を含む。プローブの固定化は、直接移動によって、マイクロピペット、マイクロポイントの手段によって、インクジェットタイプの装置によって遂行される。この技術は、わずかな塩基（５から１０）から６０塩基の比較的大きなサイズまで（プリンティング）、数百塩基まで（マイクロデポジション）の範囲にわたるサイズのプローブの固定化を可能にする：
・プリンティングは、インクジェットプリンターによって使用される方法の適応である。流体の非常に小さい球体の推進力（体積＜１ｎｌ）と４０００滴／秒に達しうる速度に基づく。プリンティングは、流体を放出するシステムと付着される表層との接触を含まない。
・マイクロデポジションは、ガラススライドの表面に数十から数百塩基長のプローブを固定することを含む。これらのプローブは、通常、データベースから引き出され、増幅され精製された産物の形態である。この技術は、４ｃｍ２未満の面積にＤＮＡの約１万のスポット、いわゆる認識ゾーンを有するマイクロアレイと呼ばれるチップを作製することを可能にする。しかしながら、ＰＣＲによる増幅産物を有するナイロンメンブランで、直径０．５から１ｍｍ、最大密度は２５スポット／ｃｍ２である、いわゆる「マイクロアレイ」の使用を忘れてはならない。この非常にフレキシブルな技術は、多くの研究室で使用されている。本発明において、この後者の技術は、バイオチップ型のものであると考えられる。しかしながら、特許出願ＷＯ−Ａ−００／７１７５０及びＦＲ００／１４８９６の場合のように、試料のいくらかの量をマイクロタイトレーションプレートの各ウェルの底に沈着させてもよく、または、他の特許出願ＦＲ００／１４６９１に従って、いくらかの滴数を、単一のシャーレの底で互いに離して沈着させてもよい。
【００３１】
支持体またはチップの上へのプローブの固定化のための第２の技術は、インサイツ合成と呼ばれている。この技術は、直接、チップの表層上で短いプローブの作成を生じる。オリゴヌクレオチドのインサイツ合成（特に特許出願ＷＯ８９／１０９７７とＷＯ９０／０３３８２を参照）に基づき、及びオリゴヌクレオチドシンセサイザーの方法に基づく。それは反応チャンバーの移動を含み、ガラス表面に沿って、オリゴヌクレオチド鎖伸長反応が起こる。
【００３２】
最後に、第３の技術はフォトリソグラフィーと呼ばれおり、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社によって開発されたバイオチップの背景にある方法である。また、これもインサイツ合成である。フォトリソグラフィーは、マイクロプロセッサ技術に由来する。チップの表層は、光によって作動させることができる光解離性化学基のアッタチメントによって修正される。一旦光にさらされると、これらの基はオリゴヌクレオチドの３’末端と反応することができる。決められた形状のマスクでこの表層を保護することによって、それが４つのヌクレオチドの１つ又は他のものを取り付けることが求められるチップのゾーンを選択的に照らして、作動させることができる。異なるマスクの連続した使用により、保護／反応のサイクルを交互におこない、従って約数十平方マイクロメートル（μｍ２）のスポット上にオリゴヌクレオチドプローブを作成することを可能にする。この解像度により、数平方センチメートル（ｃｍ２）の領域上に数十万までのスポットをつくることが可能である。フォトリソグラフィーは、大規模並列処理で、４×ＮサイクルだけでＮ−ｍｅｒのチップを作ることを可能にするという利点がある。全てのこれらの技術は、当然ながら本発明によって使用できる。  
【００３３】
主要選択的転写産物の直接検出のために使用する生物試料であって、主要選択的転写産物を含むことができるものは、例えば、問題の患者からの腫瘍のリンパ節ガングリオンの又は転移ガンの生検に由来する体液または組織から成ってもよい。  
生物試料から転写産物を検出するために、通常、抽出工程が必要である。また、インサイツハイブリダイゼーション技術によって組織切片における抽出なしに検出することができる。抽出は、当業者によく知られている核酸の抽出及び精製のための任意のプロトコルによって実施する。例として、核酸の抽出は、次の方法によって実行してもよい：
＊患者の細胞に含まれる核酸を自由にするために、生物試料に存在する細胞の溶解の工程。例えば、以下の特許出願に記載されているような溶解方法が、使用されてもよい：
・ＷＯ００／０５３３８の混合磁気及び機械機械的溶解、
・ＷＯ９９／５３３０４の電気的溶解、
・ＷＯ９９／１５３２１の機械的溶解。
【００３４】
当業者は、熱的な溶解、または浸透圧ショックによる溶解、またはグアニジニウム塩のようなカオトロピック試薬による化学的溶解のような他の周知の溶解方法を使用することが可能である（ＵＳ５２３４８０９）。
＊溶解工程において放出される他の細胞成分から核酸の分離を可能にする、精製工程。通常、この工程によって核酸を濃縮することが可能であり、ＲＮＡの精製に適応できる。例えば、磁性粒子、場合により吸着又は共有結合によってオリゴヌクレオチドでコードされたもの（この件に関しては、特許ＵＳ４６７２０４０とＵＳ５７５０３３８を参照）を使用してもよく、従ってこれらの磁性粒子に付着している核酸は、洗浄工程により精製することができる。前記核酸を増幅することがその後要求される場合、この核酸精製工程は特に有益である。これらの磁性粒子の特に有益な実施態様は、特許出願ＷＯ−Ａ−９７／４５２０２及びＷＯ−Ａ−９９／３５５００に記載されている。これらの磁性粒子の特に有益な実施態様は、特許出願に記載されているカラムの形態かまたは不活性（文献２２）又は常磁性粒子の形態のシリカである（メルク：ＭａｇＰｒｅｐＴＭＳｉｌｉｃａ、プロメガ：ＭａｇｎｅＳｉｌＴＭＰａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）。他の非常に広く使われている方法は、カラム又は磁性粒子形状のイオン交換樹脂に基づく（ワットマン：ＤＥＡＥ−Ｍａｇａｒｏｓｅ）（文献２３）。本発明で限定的ではないが非常に適切な他の方法は、金属酸化物支持体上の吸着の方法である（Ｘｔｒａｎａ社：Ｘｔｒａ−ＢｉｎｄＴＭ  ｍａｔｒｉｘ）。
【００３５】
ＲＮＡを生物試料から抽出することが特に求められるときに、タンパク質を除去するために、フェノール、クロロホルムおよびアルコールによる抽出を実施し、１００％のエチルアルコールでＲＮＡを沈澱させることを、特に実施してもよい。それから、ＲＮＡは遠心によってスピンダウンし、洗浄し、再溶解することができる。
【００３６】
体液は、特別な処置を必要とする可能性がある。主要選択的転写産物は、溶液中にあるか又は循環腫瘍細胞に含まれる可能性がある。選択的転写産物のための試験が腫瘍細胞に含まれる画分を目的とする場合、そのとき、体液は前記流体に含まれる循環腫瘍細胞を分離するために前もって処理される。
【００３７】
循環腫瘍細胞を分離することは、循環腫瘍細胞に富む細胞分画を得ることを意味すると理解される。
【００３８】
循環腫瘍細胞を分離するための流体の処理は、フローサイトメータの細胞選別によって、フィコールにおける濃縮によって、特異的抗体でコートされた磁気ビーズを使用する濃縮によって、または当業者に知られている他の任意の濃縮方法にもよって遂行することができる。
【００３９】
循環腫瘍細胞は、磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＳＡ，ノルウェー）に結合した抗ＣＤ４５抗体を使用する血液細胞の除去と組合わされたフィコールよる細胞分離の技術によって分離することができる。
【００４０】
次に、主要選択的転写産物の直接的検出は、体液から分離される循環腫瘍細胞から直接、実施できる。例えば、サイトスピンによってスライド上に置かれた循環腫瘍細胞は、インサイツハイブリダイゼーションを遂行するために、主要選択的転写産物に特異的なプローブと接触させて配置してもよい。  
【００４１】
間接的な方法の１つの例は、例えば大腸菌のような発現系によって、試料から抽出したＲＮＡをタンパク質にインビトロで翻訳すること、そして、「サンドイッチ」試験、例えばＥＬＩＳＡまたは競合試験のような免疫学的試験によって選択的ＲＮＡの特異的な翻訳産物を検出することを含む。これらの方法は当業者に広く知られており、特にＲＮＡから翻訳されたペプチドの特異的な結合パートナーとして、モノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体を使用する。
【００４２】
本発明の方法は、
ｉ）生物試料の主要選択的転写産物の量を決定すること、
ｉｉ）生物試料の主要選択的転写産物の量を、使用する分析の種類及び病理学の検出限界の代表例に従い選択された所定の限界値と比較すること、及び
ｉｉｉ）診断を確立すること
を含む工程によって実施されてもよい。
【００４３】
例えば、上記のようにハイブリダイゼーション試験を使用することによって、主要選択的転写産物の濃度の定量は、生物試料のマーカーを定量するための当業者に知られている任意の方法によって実施することができる。
【００４４】
また、上記のように、通常、核酸検出試験の結果が、大部分は、使用する結合パートナーの特徴に依存することは知られており、その結果、明確な限界値を与えることは可能でなく、使用する各々の結合パートナーに適した限界値は個々の場合で簡単なルーチンの実験により決定できる。
【００４５】
また、本発明の診断方法はＫＬＫ８遺伝子の少なくとも一つの他の転写産物を検出する追加の工程を含むことによって向上させることができるものであり、それは本発明の特定の実施態様を構成する。
【００４６】
ＫＬＫ８遺伝子の他の転写産物は、
−ＫＬＫ８遺伝子の他の選択的転写産物：マイナー転写産物と呼ばれており、ＮＴ２、ＮＴ３とＮＴ４として既知ものと、加えてＮＴ５とＮＴ６と呼ばれる本出願人によって新規転写産物として発見されたもの、
−また、ＮＴ１と呼ばれるカリクレインＫＬＫ８をコードする転写産物
を意味すると理解される。
【００４７】
それぞれ配列番号７と配列番号８の新規転写産物ＮＴ５とＮＴ６は新規で、本発明の別の目的を構成する。
ＫＬＫ８遺伝子の別の選択的転写産物の検出の追加工程を含む診断方法は、
ｉ）同じ生物試料中の、ＫＬＫ８遺伝子の主要選択的転写産物及びＫＬＫ８遺伝子の他の転写産物であって場合により選択的であるものの量を決定すること、
ｉｉ）得られた量を、使用する分析の種類及び病理学の検出限界の代表例に従い選択された所定の限界値と比較すること、及び
ｉｉｉ）診断を確立すること
を含む工程によって実施されてもよい。
【００４８】
ＫＬＫ８の主要選択的転写産物及び同じＫＬＫ８遺伝子の他の転写産物であって場合により選択的であるものの量の決定は、当業者に慣習的に知られている方法によって、連続的にまたは同時に実施されてもよい。
【００４９】
同じ生物試料は、同じ患者から取られる同じ性質の試料、すなわち同じ試料採取からのいずれの２つの画分、又は２つの異なる試料採取に由来する２つの試料であっても、例えば癌組織の同じ性質のものでなければならないことを意味すると理解される。同じ試料採取からの２つの試料を使用することが好ましい。
【００５０】
また、本発明の診断方法は他のカリクレインの遺伝子の少なくとも一つの転写産物を検出する追加の工程を含んでもよく、本発明の別の実施態様を構成する。
【００５１】
したがって、この方法は、他のカリクレインの遺伝子の少なくとも一つの転写産物に加えて、
（ａ）ＫＬＫ８遺伝子の少なくとも一つの主要選択的転写産物、または
（ｂ）ＫＬＫ８遺伝子の主要選択的転写産物とＫＬＫ８遺伝子の他のマイナーな転写産物であって場合により選択的であるもの、のどちらかを検出する。
この方法は、
ｉ）生物試料中の、ＫＬＫ８遺伝子の主要選択的転写産物、及び場合によっては、ＫＬＫ８遺伝子の他の転写産物であって場合により選択的であるものの量Ｑ１を決定すること、
ｉｉ）同じ試料中の、他のカリクレイン遺伝子の転写産物の量Ｑ２を決定すること、
ｉｉｉ）比率Ｑ１／Ｑ２またはＱ２／Ｑ１を算出すること、
ｉｖ）前記比率と、使用する分析の種類及び病理学の検出限界の代表例に従い選択された所定の限界値とを比較すること、及び
ｖ）診断を確立すること
を含む工程によって実施されてもよい。
【００５２】
本発明の目的に適しているカリクレインの他の遺伝子の例として、肺で発現するカリクレインの遺伝子、例えばＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３及びＫＬＫ１４を挙げることができる。カリクレインのこれらの遺伝子は文献に広く記載されており、そのためそれらは当業者に知られている。カリクレインの遺伝子、ＫＬＫ５、ＫＬＫ１１とＫＬＫ１３が好ましく、ＫＬＫ１１が特に好ましい。
異なる性質の転写産物の量の決定は、上記の通りに当業者に慣習的に知られている方法によって、連続してまたは同時に行われてもよく、同じ生物試料は、同じ患者から採取された同じ性質の試料を意味すると理解される。
【００５３】
ＫＬＫ８遺伝子の主要選択的転写産物の検出に加えて、本発明の診断方法はまた、カリクレインをコードする遺伝子と異なると理解される、肺で発現する他の遺伝子の少なくとも一つの転写産物を検出する工程を含んでもよい。
【００５４】
肺で発現する他の遺伝子の例として、デスモコリン２又はＤｓｃ２及びデスモグレイン２又はＤｓｇ２のようなデスモソームカドヘリンをコードする遺伝子を挙げることができる。
【００５５】
肺で発現する別の遺伝子の少なくとも一つの転写産物を検出する工程を更に含む方法は、
ｉ）生物試料中の、ＫＬＫ８遺伝子の主要選択的転写産物の量Ｑ１を決定すること、
ｉｉ）同じ生物試料中の、肺で発現する他の遺伝子の転写産物の量Ｑ４を決定すること、
ｉｉｉ）比率Ｑ１／Ｑ４またはＱ２／Ｑ４を算出すること、
ｉｖ）前記比率と、使用する分析の種類及び病理学の検出限界の代表例に従い選択された所定の限界値とを比較すること、及び
ｖ）診断を確立すること
を含む工程によって実施されてもよい。
異なる性質の転写産物の量の決定は、上記の通りに当業者に慣習的に知られている方法によって、連続してまたは同時に行われてもよく、同じ生物試料は、同じ患者から採取された同じ性質の試料を意味すると理解される。
【００５６】
本発明の各々の実施態様において、最後の工程は、診断を確立することにある。
診断は、診断とこの用語の広義の両方、すなわち早期診断とスクリーニング、治療モニタリング、予後診断および再発の診断の両方を意味すると理解される。
診断の種類は、本発明の方法が実施される生物試料の性質に依存する。したがって、体液は、早期診断、スクリーニング、再発の診断、及び場合によっては治療モニタリングに関して、使用されることが好ましい。癌組織、リンパ節ガングリオンまたは転移ガンのような固体試料の場合は、癌腫は、すでに存在することがわかっている。それ故、本発明の方法は、予後診断と、場合によっては治療モニタリングにおいて有用である。
【００５７】
本発明の方法は、特に気管支肺癌を患っている患者の生存予測に適している。実際に、出願人は、特にＮＳＣＢＣで、高いレベルのＫＬＫ８遺伝子の主要選択的転写産物、特にＮＴ３とＮＴ４が、癌の悪化の予後因子であることを示した。
【００５８】
従って、別の目的は、気管支肺癌を患っている患者の生存予測における本発明の診断方法の使用を含む。
前に記載したように、予測は、以下の工程の１つを包含することによって向上する：  
−少なくとも一つの他の、場合によっては選択的である、ＫＬＫ８遺伝子の転写産物を検出する工程、  
−場合によってはＫＬＫ８遺伝子の少なくとも一つの他の選択的転写産物の検出と組合わせて、カリクレインの他の遺伝子の少なくとも一つの転写産物、好ましくはＫＬＫ５、ＫＬＫ１１及びＫＬＫ１３、特に好ましくはＫＬＫ１１を検出する工程、
−肺で発現する他の遺伝子の少なくとも一つの転写産物を検出する工程。
【００５９】
本発明の診断方法の実施のために、本発明の別の目的は、ＫＬＫ８遺伝子の主要選択的転写産物の検出のために必要なツールを含む診断キットである。
ＫＬＫ８遺伝子の主要選択的転写産物の検出のために必要なツールの非限定的例として、前記主要転写産物の結合パートナー、例えばハイブリダイゼーションプローブと検出プローブを挙げることができる。
【００６０】
また、本発明は、気管支肺癌、特に非小細胞気管支癌に関する検出方法に使用される薬剤の産生における、カリクレイン８をコードするＫＬＫ８遺伝子の少なくとも１つの主要選択的転写産物の使用であって、前記方法が前記気管支肺癌を患っていることが疑われる患者に由来する生物試料に、ＫＬＫ８遺伝子の前記少なくとも一つの主要選択的転写産物を接触させることにより特徴づけられている、使用に関する。
【００６１】
（参考文献）
文献1: Etzioni R. 等, 2003, Nature Reviews Cancer, 3: 1-10.
文献2: Pisters KM 等, 2005, J Clin Oncol, 23:3270-3278.
文献3: Bhattacharjee A. 等, 2001, Proc Natl Acad Sci USA, 98: 13790-13795.
文献4: Garber M.E.等, 2001, Proc Natl Acad Sci USA, 98: 13784-13789.
文献5: Planque C.等, 2005, Biochemical and Biophysical Research Communications, 329: 1260-1266.
文献6: Dong Y. 等, 2001, Clin Cancer Res, 7: 2363-2371.
文献7: Dong Y. 等, 2003, Clin Cancer Res, 9: 1710-1720.
文献8: Yoshida S. 等, 1998, Gene, 213: 9-16.
文献9: Mitsui S. 等, 1999, Eur J Biochem, 260: 627-634.
文献10: Magklara A.等, 2001, Clin Cancer Res, 7: 806-811.
文献11: P.E. Nielsen 等, 1991, Science, 254: 1497-1500.
文献12: Kricka 等, 1999, Clinical Chemistry, no. 45(4): 453-458.
文献13: Keller G.H.等, 1993, DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, sections 5 and 6, p.173-249.
文献14: Tyagi及びKramer, 1996, Nature biotech, 14:303-308.
文献15: M. Chee等, 1996, Science, 274: 610-614.
文献16: A. Caviani Pease等, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 5022-5026.
文献17: G. Ramsay, 1998, Nature Biotechnology, 16: 40-44.
文献18: F. Ginot, 1997, Human Mutation, 10: 1-10.
文献19: J. Cheng 等, 1996, Molecular diagnosis, 1(3): 183-200.
文献20: T. Livache 等, 1994, Nucleic Acids Research, 22(15): 2915-2921.
文献21: J. Cheng等, 1998, Nature Biotechnology, 16: 541-546.
文献22: Boom R.等, 1990, J. Clin. Microbiol., 28(3): 495-503.
文献23: Levison PR等, 1998, J. Chromatography, p. 337-344.
文献24: Mountain, C.F., 1997, Chest, 111: 1710-1717.
【００６２】
本発明は、例示的に及び非限定的に示される以下の実施例を用いて、添付の図１及び２を用いて、よりよく理解される。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】腺癌（Ａｄ）または類表皮癌（Ｃ．ＥＰＩ）を患っている患者の癌組織から得られたＫＬＫ８遺伝子のさまざまな選択的転写産物ＮＴ１からＮＴ６を示す電気泳動ゲルの写真。左側のレーンは分子量マーカーのレーンに対応する。
【図２】癌腫を患っている患者の血液中の転写産物ＮＴ４の存在を示す電気泳動ゲルの写真。左側のレーンは分子量マーカーのレーン（ＭＭ）に対応する。
【実施例】
【００６４】
実施例１：ＫＬＫ８遺伝子の主要肺転写産物と新規転写産物の実証
全ＲＮＡは、「ＲＮＡｅａｓｙ  Ｍｉｄｉ  ｋｉｔ」システム（Ｑｉａｇｅｎ社、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、フランス）を使用して、製造業者の推奨に従って、腺癌または類表皮癌を患っている患者の癌組織から抽出した。全ＲＮＡは、ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）によって、ｃＤＮＡにレトロ転写した。  
サンプルごとに、逆転写反応は、２０μｌの最終量で、１時間、４２℃において実施した。反応媒体は、２μｇの全ＲＮＡ、５μＭの非特異的なデカマーオリゴヌクレオチド（Ｒａｎｄｏｍ  ｄｅｃａｍｅｒｓ  ＲＥＴＲＯｓｃｒｉｐｔ，Ａｍｂｉｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ）、及び各１ｍＭの濃度のｄＮＴＰ、２０ＵのＲＮａｓｅインヒビター（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍｅｙｌａｎ）、１ｘ濃度の反応バッファー及び１ユニットのＰｏｗｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から構成された。  
ｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。２５μｌの反応混合物は、以下を含んでいた：５０ｎｇの全ＲＮＡレトロ転写産物、１ユニットのＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍｅｙｌａｎ）、１ｘ濃度の反応バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ  ｐＨ８．３、１０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭのＭｇＣｌ２）、０．３ｍＭの濃度のｄＮＴＰ及び０．２μＭの特異的なプライマー。  
これらのプライマーは、配列をコードするカリクレインＫＬＫ８（ＮＴ１）の両側に選択され、制限酵素切断部位（Ｎｏｔ１又はＥｃｏＲＶ）を含む。これらのプライマーは、以下の通りであった。  
−Ｋ８Ｎｏｔ_ｆｏｒ：ＴＧＧ  ＡＧＧ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＡ  ＴＧＧ  ＧＡＣ  ＧＣＣ  ＣＣＣ  ＧＡＣ（配列番号１）及び
−Ｋ８Ｅｃｏ_ｒｅｖ：ＴＣＣ  ＴＡＧ  ＡＴＡ  ＴＣＧ  ＣＣＣ  ＴＴＧ  ＣＴＧ  ＣＣＴ  ＡＴＧ（配列番号２）。  
ＰＣＲ反応は、ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｍａｓｔｅｒ  ｃｙｃｌｅｒ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ，  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で実施した。増幅条件は、以下の通りだった：９５℃で５分間の変性サイクルに続いて、９５℃２０秒の変性段階、５６℃２０秒のハイブリダイゼーション段階及び７２℃１分３０秒の伸長段階を含む４５サイクル。反応は、７２℃で１分３０秒の追加の伸長サイクルによって終了した。
反応液からの１０マイクロリットルを、０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドを含む０．８％のアガロースゲルに置いた。産物を電気泳動によって分離し、ＵＶ下で調べた。使用したサイズマーカー（遺伝子定規ＤＮＡラダー混合物混合物）は、ＭＢＩ-Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社によって供給されている。  
図１に示す電気泳動ゲルの写真は、ＫＬＫ８遺伝子の肺の発現に由来するさまざまな転写産物、及びＮＴ３とＮＴ４の主要転写産物の特徴を示す。これらの転写産物は、ヌクレオチド配列決定（実施例２を参照）によって、ニューロプシンタイプ１から４（ＮＴ１からＮＴ４）という名前のもとに既に記載されている転写産物として同定されたこと、２つの新しい転写産物が同定されＮＴ５及びＮＴ６と名付けられたことに留意する必要がある。
【００６５】
実施例２：ＫＬＫ８遺伝子の肺の転写産物と特異的なプライマーの設計の構造的特徴付け
実施例１において得られたＰＣＲ生成物は、製造業者の推奨に従って、ベクターｐｃＤＮＡ５-ＦＲＴ-Ｖ５-ＨｉｓＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｅｒｇｙ  Ｐｏｎｔｏｉｓｅ）にクローニングした。プラスミドＤＮＡの調製は、「Ｑｉａｐｒｅｐミニプレップ」システム（Ｑｉａｇｅｎ  Ｓ．Ａ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ）を使用して、さまざまなクローンから実施した。精製したプラスミドＤＮＡは２６０ｎｍで吸光度測定法によって定量し、それからプライマー対Ｔ７とｐＣＲ３．１（ＢＧＨ_ｒｅｖ）によって両方向において配列決定した。以下に示した得られた配列をデータベースにある配列と比較した。クローニングした転写産物の構造は、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗソフトウェアを使用して、ＫＬＫ８遺伝子の配列とのアライメントによって決定した（表１に示す）。
−肺のｃＤＮＡ  ＹＣ１７０３１０．０３配列は転写産物ＮＴ１（ＮＭ_００７１９６）と同一：配列番号３
−肺のｃＤＮＡ  ＹＣ１４０７１０．０３配列は転写産物ＮＴ２（ＮＭ_１４４５０５）と同一：配列番号４
−肺のｃＤＮＡ  ＹＣ０９０３１０．０３配列は転写産物ＮＴ３  （ＮＭ_１４４５０６）と同一：配列番号５
−肺のｃＤＮＡ  ＹＣ１００３１０．０３配列は転写産物ＮＴ４  （ＮＭ_１４４５０７）と同一：配列番号６
−肺のｃＤＮＡ  ＹＣ２１０７１０．０３配列は新規転写産物（ＮＴ５）に相当する：配列番号７
−肺のｃＤＮＡ  ＹＣ０５０７１０．０３配列は新規転写産物（ＮＴ６）に相当する：配列番号８
【００６６】
表１
0005394241.tif 000002
【００６７】
表１に示すように、肺の転写産物は同一のエキソンの異なる組合せだけによって互いに異なる。従って、個々に新規配列を利用することによって、それらを標的にすることは可能でない（エキソン２の５’に付加的な配列を有するＮＴ２を除く）。表２に示すように、ＫＬＫ８遺伝子の肺のトランスクリプトームについての知識により、各々の転写産物について、この組織に存在する他の転写産物からそれを区別するエキソンの組合せを決定することが可能である。  
【００６８】
表２
0005394241.tif 000003
【００６９】
従って、これらの組合せに存在するエキソンの結合配列のハイブリダイゼーションプローブまたは検出プローブの使用は、特異的に及び個々に肺の転写産物を標的とする唯一の手段である。これは、この器官の主要転写産物ＮＴ３及びＮＴ４の定量に特異性を与える増幅プライマーの作成に利用した（表３を参照）。  
【００７０】
表３
0005394241.tif 000004
【００７１】
実施例３：肺癌を患っている患者の腫瘍組織の転写産物ＮＴ３及びＮＴ４の定量
転写産物ＮＴ３とＮＴ４は、ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ  （Ｂｉｏｒａｄ，Ｍａｒｎｅｓ  ｌａ  Ｃｏｑｕｅｔｔｅ）で、インターカレティングフルオロフォア「ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ」の存在下で、定量的リアルタイムＰＣＲによってアッセイした。各アッセイは肺腫瘍試料に由来するｃＤＮＡの定量のための２つの測定及びＤＮＡ無しのコントロールの２つの測定を含み、クローンＹＣ０９０３１０．０３（ＮＴ３）とＹＣ１００３１０．０３（ＮＴ４）（実施例２を参照）から単離された標準プラスミドＤＮＡのさまざまな希釈を使用して較正曲線を構築した。各サンプルで得られた値は、リボソーム１８Ｓサブユニットをコードする転写産物の定量において決定した値で正規化した。この後者の場合、較正曲線は、通常のＰＣＲによって増幅し、製造業者の推奨に従ってマシュレネーゲルキットを使用して直接精製したこの遺伝子（８５３ｂｐ）の配列の異なる希釈から作成した。この配列を得るために使用したオリゴヌクレオチドは、以下の通りであった  
−ｏｌｉｇｏ１８Ｓ_ｆｏｒ：ＣＴＡ  ＣＣＡ  ＣＡＴ  ＣＣＡ  ＡＧＧ  ＡＡＧ  ＧＣＡ  ＧＣＡ（配列番号１１）、及び
−ｏｌｉｇｏ１８Ｓ_ｒｅｖ：ＧＣＴ  ＡＴＣ  ＡＡＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＡＴＣ  ＣＴＧ  ＴＣＣ（配列番号１２）。
ＮＴ３及びＮＴ４の定量的増幅のための反応混合物は、以下を含んでいた：１００ｎｇの全ＲＮＡレトロ転写産物（実施例１を参照）、１ユニットのＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、０．２ｘ濃度のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｍｅｙｌａｎ）、１ｘ濃度の反応液（５０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ  ｐＨ８．３、１０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭのＭｇＣｌ２）、各０．２ｍＭの濃度のｄＮＴＰ、及び０．２μＭの調べた転写産物の各センス（表ＩＩＩ、実施例２）とアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマー。転写産物ＮＴ３とＮＴ４のアンチセンスプライマーはそれぞれ、エキソン５と６の結合配列にハイブリダイズするプライマーＮＴ３＿ｒｅｖ（ＣＣＴ  ＣＣＡ  ＧＡＡ  ＴＣＧ  ＣＣＣ  Ｔ−配列番号１３）、及びエキソン６に位置する標的配列プライマーＮＴ４＿ｒｅｖ（ＣＡＧ  ＴＣＣ  ＡＧＧ  ＴＡＧ  ＣＧＧ  ＣＡＧ−配列番号１４）であった。
リボソーム１８Ｓサブユニットをコードするハウスキーピング遺伝子の定量のための計測は、以下の反応媒体中で実施された：０．５ｎｇの全ＲＮＡレトロ転写産物、１ユニットのＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、２ｍＭのＭｇＣｌ２を添加した１ｘ濃度の反応液（５０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌｐＨ８．３、１０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭの（ＮＨ４）２Ｓ０４、２ｍＭのＭｇＣｌ２）、各０．２ｍＭの濃度のｄＮＴＰ、及び０．５６μＭの各センス（ＣＧＣ  ＧＧＴ  ＴＣＴ  ＡＴＴ  ＴＴＧ  ＴＴＧ  ＧＴＴ  ＴＴ−配列番号１５）及びアンチセンス（ＴＴＣ  ＧＣＴ  ＣＴＧ  ＧＴＣ  ＣＧＴ  ＣＴＴ  ＧＣ−配列番号１６）プライマー。
さまざまな転写産物の定量的ＰＣＲの増幅条件を表４に示す。
【００７２】
表４
0005394241.tif 000005
定量は、２００２年１月と２００４年６月の間に、気管支肺癌の手術を受けた患者から外科的に切除された部分から採取した腫瘍組織の試料において実施した。調べたコホートは、４５から８３才にわたる、中央値が６５才となる、６０人の患者を含んでいた（表５を参照）。  
【００７３】
表５
0005394241.tif 000006
【００７４】
３８人の患者はｐＴＮＭ分類（文献２４）によるステージ１又は２の癌腫、２４人の患者はステージ３または４の癌腫を有していた。生存率分析は、２００６年１月に彼らの健康状態に関する情報を集めることによって実施した。研究期間に２６症例の死亡を記録した。  
任意単位（ＡＵ）で表わすＮＴ３とＮＴ４の正規化した値のために、χ２検定によって、集団の全体の生存を最もよく予測できる限界値を決定した。限界値は、ＮＴ３では５０ＡＵ（χ２＝７．５４；Ｐ＝０．００６）及びＮＴ４では１０００ＡＵ（χ２＝７．５４；Ｐ＝０．００６）である。第４５及び第４６パーセンタイルであるこれらの値は次の分析に使用した。  
患者を２つのグループに分類した：１グループは、決定した限界値より低い発現量を呈する個人に対応する（弱い発現；弱ＮＴ３またはＮＴ４と示す）、及び１グループはより高い発現レベルを有する（強い発現；弱ＮＴ３またはＮＴ３と示す）。各グループごとに、生存曲線はカプランマイヤー方法によって構築し、カーブ間の差の有意性はログランク検定によって評価した。患者の全体の生存における転写産物の発現の影響（強い発現対弱い発現の比較）は、Ｃｏｘモデル（Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデル）を使用して算出したＨＲ（死亡の相対リスク）によって評価した。分析は一変量で実施した。また、この変数は患者の生存と強い関連があるので、腫瘍ステージの補正（それは、変数「ステージ」を除外することを可能にする）の後に実施した（それ故、補正後の強ＮＴ３またはＮＴ４と呼ばれる）。
結果を表６に示す。
【００７５】
表６
0005394241.tif 000007
カプランマイアー生存曲線は、ＮＴ３またはＮＴ４を強く発現している患者（強ＮＴ３またはＮＴ４）とこれらの転写産物を弱く発現している患者（弱ＮＴ３またはＮＴ４に関して算出したＰ）との間に、生存について有意差を示す（ログランク検定、表６）。  
Ｃｏｘモデルにより、転写産物を強く発現している患者は他の患者より生存が有意に低いと結論づけることができる。
実際に、Ｃｏｘ分析法は、ＮＴ３の（表６、ＨＲ、３．６０８倍に増加）又はＮＴ４の（表６、ＨＲ、２．８６０倍に増加）強い発現に関連する死亡のリスクの増加が統計学的に有意であることを示す。従って、これらの転写産物の発現レベルは、肺の癌腫に対する患者生存の予後指標を構成する。
腫瘍ステージの補正の後は（補正後の強ＮＴ３またはＮＴ４）、「強ＮＴ３」に関連する死亡のリスクの増加は統計的有意性が減少した（Ｐ＝０．０７７９）。これは、２つの変数（ＮＴ３の発現と腫瘍ステージ）がこの研究においてリンクしているように見えることを示す。
それにもかかわらず、「補正後の強ＮＴ３」の有意性の強い傾向は、より大きな数の事象を含んでなるより堅固な研究においては、２つの変数は独立しているという結果になるであろうことを示唆する。  
腫瘍ステージの補正が死亡リスクの増加の統計的有意性を変えなかったので、変数「強ＮＴ４」で状況は異なる。この結果は、変数ＮＴ４が腫瘍ステージから独立している予後指標であるということを証明する。  
【００７６】
実施例４：カリクレインの他の遺伝子の転写産物の分析と組合わせた転写産物ＮＴ３又はＮＴ４の分析
肺で発現するカリクレインの他の遺伝子の転写産物（ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３及びＫＬＫ１４）の分析のためのストラテジーは、実施例３に記載されているものと同一である。まとめると、ｃＤＮＡとコントロールの増幅に由来する産物の定量は、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎの取り込みによって、各サイクルの後、決定された。標準曲線は、異なる遺伝子のｃＤＮＡのクローンに由来するプラスミドＤＮＡを基礎として作成された。患者ごと及び遺伝子ごとに得られた値は、１８Ｓリボソームの値で正規化し、任意単位で表した。反応条件は、ＮＴ３及びＮＴ４のために記載したもの（実施例３）と同一だった。使用したＰＣＲプライマーを、表７に記載した。
【００７７】
表７
0005394241.tif 000008
【００７８】
表８
0005394241.tif 000009
さまざまな遺伝子の転写産物の分析のために使用したコホートは、実施例３で調査した集団に由来する。調査したコホート内の腫瘍組織学的な種類の分布を表９に示す。
【００７９】
表９
0005394241.tif 000010
患者ごとに、異なる転写産物の発現レベルを決定し、そしてＮＴ３又はＮＴ４との比率を算出するために用いた（表１０のＮＴ３及び表１１のＮＴ４）。そして、比率ごとに、実施例３に記載の方法によって、集団の全体の生存を最も良く予測することを可能にする限界値を決定した。  
【００８０】
表１０
0005394241.tif 000011
【００８１】
表１１
0005394241.tif 000012
実施例３の通りに、患者は２つのグループに分類された：１グループは、決定した限界値より低い発現レベルを呈している個体に（弱い発現）、１グループはより高い発現レベルを有するもの（強い発現）に対応する。グループごとに、生存曲線をカプランマイヤー方法によって構築し、カーブ間の差の有意性はログランク検定によって評価した。死亡の相対リスク（ＨＲ）は、Ｃｏｘモデル（Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデル）を使用して算出した。この変数は強く患者の生存と関連があったので、分析は腫瘍ステージの補正の後に行った。
ＮＴ３の結果を表１２に示す。
【００８２】
表１２
0005394241.tif 000013
表１２続き
0005394241.tif 000014
【００８３】
この研究は、比率の値が限界値より低いものと比較して、限界値より大きいＮＴ３／ＫＬＫｘ比率を有する患者が有意に減少した生存率を呈することを確かめる（ＮＴ３／ＫＬＫ７を除く；ログランク検定）。  
Ｃｏｘ検定の結果は、比率ＮＴ３／ＫＬＫ５、ＮＴ３／ＫＬＫ１１及びＮＴ３／ＫＬＫ１３が腫瘍ステージから独立している予後指標であることを示す（補正後変数  Ｐ＜０．０５）。調査した集団において、この変数は単独で変数「腫瘍ステージ」から独立しているので、したがって、ＫＬＫ５、ＫＬＫ１１及びＫＬＫ１３遺伝子の発現に対するＮＴ３の発現の比率の作成は、ＮＴ３の予測力を向上させる（実施例３を参照）。
ＮＴ４の結果を表１３に示す。
【００８４】
表１３
0005394241.tif 000015
表１３続き
0005394241.tif 000016
【００８５】
表１３に示す通り、限界値より大きいＮＴ４／ＫＬＫｘ比率を有する患者は比率の値が限界値より低いそれらと比較してかなり減少した生存率を呈する（ＮＴ３／ＫＬＫ６を除く；ログランク検定）。Ｃｏｘ検定の結果は、ＮＴ３／ＫＬＫ６比率は別にして、全ての他の比率は腫瘍ステージから独立した予後指標を構成することを示す（補正後変数Ｐ＜０．０５）。この研究において、ＮＴ４／ＫＬＫ１１比率は特に有効に見える。それは、この変数で算出した死亡の相対リスクは腫瘍ステージで得られたものよりも大きいからである。  
【００８６】
実施例５：遺伝子ＫＬＫ８の他の転写産物（ＮＴ１、ＮＴ２、ＮＴ５とＮＴ６）と組合せた、場合によりカリクレインの他の転写産物と組合せた、転写産物ＮＴ３の定量
前の実施例において、転写産物ＮＴ３とＮＴ４は、特異的ＰＣＲプライマーの使用で別々にアッセイした。この実施例は、それらが非特異的ＰＣＲプライマーによってアッセイするときの、これらの転写産物の予後値を評価することを意図する。エキソン５と６を標的とし、従って転写産物ＮＴ１、ＮＴ２、ＮＴ３、ＮＴ５及びＮＴ６の全体の定量を可能にするオリゴヌクレオチドを使用した。測定する変数を「ＫＬＫ８」と呼ぶ。これらのプライマーの配列は、以下の通りである  
−７１９.Ｋ８_ｆｏｒ：ＣＣＡ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＧＴＧ  ＴＧＡ  ＧＧＡ  ＴＧ（配列番号３１）と
−８９０.Ｋ８_ｒｅｖ：ＧＧＴ  ＡＴＡ  ＧＡＣ  ＧＣＣ  ＡＧＧ  ＴＴＴ  Ｇ（配列番号３２）。  
使用した反応混合物は、実施例３のものと同一だった。増幅条件は、９５℃で５分間の１サイクル、次に９５℃２０秒の変性段階、６０℃２０秒のハイブリダイゼーション段階、７２℃２０秒の伸長段階及び８４℃１５秒の蛍光獲得段階を含む５０サイクルである。
手順は、前の実施例のものと同一だった。すなわち、（１）標準曲線による変数の定量、（２）発現レベルまたは１８ＳリボソームＲＮＡによる正規化、（３）任意単位の形での表示、場合により他の遺伝子の発現との比較、（４）カイ二乗検定による限界値の定義（表１４）、（５）集団の２値化（強い発現＞限界値；弱い発現＜限界値）、（６）統計的検定（表１５）である。  
調査したコホートは、変数「ＫＬＫ８」に対しては実施例３に記載したものと同じであり、他のカリクレイン遺伝子に対する比率の形での表示のためには実施例４に記載したものと同じであった。
【００８７】
表１４
0005394241.tif 000017
【００８８】
表１５
0005394241.tif 000018
表１５続き
0005394241.tif 000019
【００８９】
変数「ＫＬＫ８」の高い値を有する患者は、他の患者より生存が低い（ログランク検定、Ｐ＝０．０３５３）；しかしながら、補正後の変数の非有意性Ｐによって示されているように、この変数は変数「腫瘍ステージ」にリンクする（表１７）。  
他のカリクレイン遺伝子の発現レベルの比率の形と組合わされるときに、変数「ＫＬＫ８」は独立となる（Ｐ＜０．０５；表１７）。これは、比率ＫＬＫ８／ＫＬＫ１０、ＫＬＫ８／ＫＬＫ１１及びＫＬＫ８／ＫＬＫ１３を有する場合である。したがって、これらの変数は、肺の癌腫のための悪化の及び独立の予後指標を構成する。
【００９０】
実施例６：肺の癌腫を患っている患者の血液中の転写産物ＮＴ４の存在の実証
癌腫を有する患者の末しょう血液を基にした潜在的な癌腫の検出の感度の高さは、重要な予後または治療的な意味を有するはずである。従って、血液中のＮＴ４転写産物の存在の検出が可能であること及びその検出が肺の癌腫とリンクすることを確認するために、この実験を実施した。  
健康者と肺癌を患っている患者からの血液は「ＰＡＸｇｅｎｅＴＭ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ」チューブ（Ｅｕｒｏｐｅ  ＢＤ）中に採取し、そして全ＲＮＡは供給元の推奨に従ってＰＡＸｇｅｎｅＴＭ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡシステム（Ｑｉａｇｅｎ、フランス）によって調製した。実施例１に記載されている手順に従って、これらの全ＲＮＡをｃＤＮＡにレトロ転写した。ＮＴ４転写産物のためのテストは、「ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ」（２つの連続的なＰＣＲ）によって実施した。第１のＰＣＲにおいて、実施例１に記載されているプライマーＫ８Ｎｏｔ_ｆｏｒとＫ８Ｅｃｏ_ｒｅｖを使用した。反応媒体はその実施例のものと同一であり、ＰＣＲ条件も同一であった。しかしながら、増幅サイクルは３０回だけ実施した。第２のＰＣＲでは、それぞれ実施例２と３に記載されているプライマーＮＴ４-２／６とＮＴ４_ｒｅｖを使用した。反応媒体（１μｌの第１ＰＣＲを含む）及び増幅プログラムは、プライマーハイブリダイゼーション段階を６２℃で実施したことは別にして、実施例１と同一であった。５０サイクルを実施し、ＰＣＲ媒体の１０μｌをエチジウムブロマイドで染色したアガロースゲル上へ置いた。
結果を図２に示す。したがって、それは癌を患っている２人の患者及び２人の正常患者から得られた電気泳動ゲルの写真である。
図２で示すように、正常患者の血液中に転写産物ＮＴ４を検出することは可能でない。この所見は、正常な血液細胞における転写産物の欠如を示す。転写産物ＮＴ４は、肺の癌腫を患っている患者のうちの１人に認められた。したがって、この方法により、肺の癌腫を有するある程度の患者で循環腫瘍細胞の存在を検出することができる。
【図１】
0005394241.tif 000020
【図２】
0005394241.tif 000021
【配列表】
0005394241000001.app