(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(A)〜(F)のいずれかから選択される、改変アミロイドβペプチド：
(A)下記の組み合わせからなるペプチド(a)のC末端にペプチド(b)のN末端を結合させ、さらにそのC末端にシステインを結合させたペプチド；
・配列番号1のアミノ酸配列のN末から１〜9番目の配列からなるペプチド(a)と、配列番号1のアミノ酸配列のN末から28〜37番目の配列からなるペプチド(b)との組み合わせ、
・配列番号1のアミノ酸配列のN末から１〜10番目の配列からなるペプチド(a)と、配列番号1のアミノ酸配列のN末から28〜36番目、28〜37番目、28〜38番目、28〜39番目、28〜40番目、28〜41番目、または28〜42番目のいずれかの配列からなるペプチド(b)との組み合わせ、
・配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜18番目の配列からなるペプチド(a)と、配列番号1のアミノ酸配列のN末から28〜42番目の配列からなるペプチド(b)との組み合わせ、
・配列番号1のアミノ酸配列のN末から2〜9番目の配列からなるペプチド(a)と、配列番号1のアミノ酸配列のN末から28〜37番目の配列からなるペプチド(b)との組み合わせ、
・配列番号1のアミノ酸配列のN末から2〜10番目の配列からなるペプチド(a)と、配列番号1のアミノ酸配列のN末から28〜37番目の配列からなるペプチド(b)との組み合わせ、または
・配列番号1のアミノ酸配列のN末から3〜10番目の配列からなるペプチド(a)と、配列番号1のアミノ酸配列のN末から28〜37番目の配列からなるペプチド(b)との組み合わせ；
(B)配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜26番目または1〜27番目からなるペプチドの、N末から18番目と19番目のアミノ酸残基の間にシステインを挿入させたペプチド；
(C)配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜28番目からなるペプチドの、N末から18番目と19番目のアミノ酸残基の間にシステインを挿入し、さらにC末端にシステインを結合させたペプチド；
(D)配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜18番目からなるペプチドのC末端にシステインを結合させ、さらに配列番号1のアミノ酸配列のN末から28〜37番目からなるペプチドを結合させたペプチド、または選択的にさらにそのC末端にシステインを結合させたペプチド；
(E)配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜28番目からなるペプチドのC末端にシステインまたはホモシステインを結合させたペプチド；
(F)配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜28番目からなるペプチドのC末端にシステインを結合させたペプチドを、当該システインのジスルフィド結合により連結させたペプチド。
【請求項２】
当該改変アミロイドβペプチドが、
・配列番号2から19のいずれか一つのペプチド
・配列番号20からなる2個のペプチドをジスルフィド結合により結合させたペプチド
並びに
・配列番号20からなるペプチドと配列番号21からなるペプチドをジスルフィド結合により結合させたペプチド
からなる群より選択されるペプチドである請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載の改変アミロイドβペプチドを有効成分として含有することを特徴とするアルツハイマー病の予防または治療薬。
【請求項４】
請求項１または２に記載の改変アミロイドβペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子断片を含有することを特徴とするアルツハイマー病の予防または治療に有効なDNAワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミロイドβ（以下、Ａβ）ペプチドの免疫応答誘導能を増強させる方法に関する。詳細には、本発明は、アルツハイマー病の原因物質であるＡβに由来するペプチドまたはその一部にシステインまたは類似物質を付加または挿入させることを特徴とするアルツハイマー病の予防・治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病とは、脳が次第に萎縮していき認知機能の低下、人格の変化を主な症状とする痴呆性疾患の一種である。高齢化社会の到来に伴い、アルツハイマー病患者数は増加の一途をたどり、日本・アメリカ・ヨーロッパにおいては、患者数は2004年の560万人から2014年には730万人規模になることが予想されている。したがってアルツハイマー病に対する予防・治療薬の早期の開発が強く求められている。【０００３】
アルツハイマー病の病理学的所見は、神経細胞の萎縮・脱落、Ａβの凝集・沈着による老人斑の形成、さらに異常タウ蛋白からなる神経原線維変化の3つが大きな特徴である。アルツハイマー病は大きく家族性アルツハイマー病と孤発性アルツハイマー病に分類される。前者は原因遺伝子変異が同定され、その表現型が明らかにされたことによって脳内におけるアミロイドβペプチド（特に42残基のアミノ酸からなるＡβ1-42）の産生増加が根本的原因であることが解明された。ただし、厳密な意味での家族性アルツハイマー病と診断されるのは全アルツハイマー病患者の1%以下であり、もっとも原因解明が急がれるのは患者の99%以上を占める孤発性アルツハイマー病である。孤発性アルツハイマー病は未同定の遺伝的危険因子の重複、劣性遺伝子の存在、環境危険因子の存在などが原因として考えられる。現在は上述の家族性アルツハイマー病における遺伝子変異が、結果として凝集性の高いＡβ42を増加させる点で一致していることを根拠とし、病理学的に同様の経過を経る孤発性アルツハイマー病の病因もＡβ42の増加が主因であると考えられている。このような考えはアミロイド仮説と呼ばれ、現在この仮説に対する治療の研究が広く進められている。【０００４】
Ａβはその前駆体蛋白質より膜結合型アスパラギン酸プロテアーゼにより切り出され生成する。ＡβのN末端側をβ-セクレターゼが、C末端側をγ-セクレターゼが切断する。切りだされたＡβはやがて細胞外にシナプス活性に依存して分泌される。Ａβは速やかに自己凝集し、モノマーＡβは二量体、三量体から可溶性の多量体(オリゴマー)を経由し、前線維構造体であるプロトフィブル体を形成した後、不溶化したアミロイド線維を形成して蓄積する。凝集体となった可溶性Ａβオリゴマーの神経に対するネガティブな作用が、アルツハイマー病における病態の重要な部分を担っているという考え方が現在主流となっている。神経伝達を阻害する可溶性Ａβオリゴマーの形態については複数報告されており、二量体、三量体、アミロスフェロイド（53kDa凝集体）、Ａβ56（56kDa凝集体）および〜40アミノ酸長凝集体などが挙げられる。【０００５】
現在、アルツハイマー病の発症機構にきわめて重要な意義を有していると考えられるＡβをクリアランスすることによる治療のアプローチが広く行われており、その一つにＡβに対する抗体療法の研究がある。抗Ａβ抗体によるＡβをクリアランスする作用機序としては、抗体のFc受容体を介したミクログリアによる貪食、線維化Ａβの溶解促進また凝集抑制ならびに血液中Ａβに結合し、脳からの可溶性Ａβの排出を促進などが考えられており、ワクチンにより抗Ａβ抗体を誘導する能動免疫と、抗Ａβ抗体そのものを投与する受動免疫の二法が提唱されている。【０００６】
前者はＡβそのものを抗原としたワクチンAN1792が第二相臨床試験まで進んだが、治験中に6%の患者に脳髄膜炎が発症し、臨床試験が中断された。しかしながら、抗体価が上昇した患者と上昇しなかった患者の間で一部の高次機能の成績に差が認められた(非特許文献1)。また、本試験中の死亡例の脳を解析したところ、新皮質で老人班が消失していた。さらに投与前後のMRIでは脳の体積が投与群でプラセボ群に比べて減少していた。このように副作用により臨床試験は中止されたものの、Ａβそのものを抗原としたワクチンの有効性も示された。今後、より安全なワクチンの開発が期待される。【０００７】
AN1792が脳髄膜炎を引き起こした原因は、QS21という強力なアジュバントを用いたこと、またＡβ配列自体に存在するT細胞エピトープによって細胞性免疫を誘導した結果であると考えられている。Ａβ配列自体に存在するT細胞エピトープについては多くの研究がなされ、少なくともＡβの配列1〜10のN末側の配列には液性免疫を誘導するT細胞エピトープが存在し、細胞性免疫を誘導するT細胞エピトープはないことが明らかとされている(非特許文献２〜４)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Gilman S, Koller M, Black RS, Jenkins L, et al., NEUROLOGY, 2005; 64: p1553-1562
【非特許文献２】Michael G, Agadjanyan MG, et al., Journal of Immunology, 2005; 174: p1580-1586
【非特許文献３】Bard F, Barbour R, Cannon C, Carretto R, Fox M, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003; 100: p2023-2028
【非特許文献４】Wanga CY. et al., Vaccine, 2007; 25: p3041-3052
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上述べたように、Ａβの全長配列にQS21などの強力なアジュバントとの組み合わせによるアルツハイマー病のワクチン療法には副作用の発生が懸念され、より安全なＡβペプチドの形状および安全なアジュバントとの組み合わせによるより安全かつ効果的な予防並びに治療方法の開発が望まれる。したがって、本発明の目的は、Ａβペプチドの形状に工夫を加えることでより安全なアルツハイマー病のワクチン療法用のペプチドを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、これまでに生体に安全であり、しかも有効で安価な免疫方法・免疫賦活方法について鋭意検討を行った結果、蛋白質を構成する最小単位でありかつ生体の構成アミノ酸でもあるシステイン分子を、目的とする免疫原性ペプチドに直接付加または挿入させることで免疫応答増強活性があることを見出し、Ａβペプチドの全長配列を用いることなくＡβペプチドの一部の配列にシステイン分子を付加または挿入することでＡβに対する免疫応答増強活性が得られることを示した(PCT/JP2008/057612)。本発明においては更なる検討を行った結果、Ａβに対する免疫応答増強活性を得る方法および細胞性免疫誘導の軽減が期待される新たなＡβペプチドへのシステイン分子の付加形状の発見に至った。【００１１】
本発明は新規な免疫応答増強方法、詳細には免疫原性ペプチドにシステインを付加または挿入することを特徴とするもので、下記の発明を含むものである。【００１２】
(1)  以下の(A)〜(F)のいずれかから選択される、アミロイドβペプチドの一部またはアミロイドβペプチドに由来する配列にシステインまたはシステイン類似体が付加または挿入されることを特徴とするペプチド：
(A)(a)配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜18番目からなるペプチドまたはその一部からなるペプチドと、(b)配列番号1のアミノ酸配列のN末から28〜42番目のうち、28〜36番目のアミノ酸残基を含む9個以上のアミノ酸残基からなるペプチドを結合させ、さらにそのC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させたペプチド；
(B)配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜26番目または1〜27番目からなるペプチドの、N末から18番目と19番目のアミノ酸残基の間にシステインまたはシステイン類似体を挿入させたペプチド；
(C)配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその一部からなるペプチドの、N末から18番目と19番目のアミノ酸残基の間にシステインまたはシステイン類似体を挿入し、さらにC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させたペプチド；
(D)配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜18番目からなるペプチドまたはその一部からなるペプチドのC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させ、さらに配列番号1のアミノ酸配列のN末から28〜42番目からなるペプチドまたはその一部からなるペプチドを結合させたペプチド、または選択的にさらにそのC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させたペプチド；
(E)配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその一部からなるペプチドのC末端にシステイン類似体を結合させたペプチド；
(F)配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその一部からなるペプチドのC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させた2個以上のペプチドを、当該システインまたはシステイン類似体のジスルフィド結合により連結させたペプチド。【００１３】
(2)  上記(A)の(a)のペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜10番目、2〜10番目、3〜10番目、1〜9番目、2〜9番目、1〜18番目からなるペプチドより選択され、上記Ａのｂ）のペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列のN末から28〜36番目、28〜37番目、28〜38番目、28〜39番目、28〜40番目、28〜41番目、28〜42番目からなるペプチドより選択される、上記(1)に記載のペプチド。【００１４】
(3)  上記(C)のペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜28番目からなるペプチドの、N末から18番目と19番目のアミノ酸残基の間にシステインまたはシステイン類似体を挿入し、さらにC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させたペプチドである、上記(1)に記載のペプチド。【００１５】
(4)  上記(D)のペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜18番目からなるペプチドのC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させ、さらに28番目から37番目からなるペプチドを結合させたペプチド、または選択的にさらにそのC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させたペプチドである、上記(1)に記載のペプチド。【００１６】
(5)  上記(E)のペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜28番目からなるペプチドのC末端にシステイン類似体を結合させたペプチドである、上記(1)に記載のペプチド。【００１７】
(6)  上記(F)のペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜28番目からなるペプチドのC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させた2個以上のペプチドを、当該システインまたはシステイン類似体のジスルフィド結合により連結させたペプチドである、上記(1)に記載のペプチド。【００１８】
(7)  当該システイン類似体がホモシステインである上記(1)から(6)のいずれかに記載のペプチド。【００１９】
(8)  当該ペプチドが、
・配列番号2から19のいずれか一つのペプチド
・配列番号20からなる2個のペプチドをジスルフィド結合により結合させたペプチド
配列番号20からなるペプチドと配列番号21からなるペプチドをジスルフィド結合により結合させたペプチド
・配列番号21からなる2個のペプチドをジスルフィド結合により結合させたペプチド
並びに
・配列番号21からなる複数個のペプチドをジスルフィド結合により結合させたペプチド
からなる群より選択されるペプチドである上記(1)から(7)のいずれかに記載のペプチド。【００２０】
(9)   上記(1)から(8)のいずれかに記載のペプチドを用いることを特徴とするアミロイドβに対する免疫応答増強方法。【００２１】
(10)   上記(1)から(8)のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有することを特徴とするアルツハイマー病の予防または治療薬。【００２２】
(11)   上記(1)から(8)のいずれかに記載のペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子断片を含有することを特徴とするアルツハイマー病の予防または治療に有効なDNAワクチン。【００２３】
本発明はさらに、哺乳動物に対し、医薬上有効量の、本発明のペプチドを投与することを含む、当該哺乳動物におけるアルツハイマー病の予防又は治療方法、および哺乳動物に対し、医薬上有効量の、本発明のペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子断片を投与することを含む、当該哺乳動物におけるアルツハイマー病の予防又は治療方法をも提供する。【００２４】
本発明はまた、アルツハイマー病の予防または治療薬を製造するための、本発明のペプチドの使用、およびアルツハイマー病の予防または治療薬を製造するための、本発明のペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子断片の使用をも提供する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明は、アジュバントなしで単独で使用してもＡβペプチドに対して十分な免疫応答を得ることが可能な免疫応答の増強した免疫原性ペプチドを提供する。本発明に従えば、Ａβペプチドの一部または由来する配列のペプチドにシステイン分子またはその類似体を付加または挿入するだけで、免疫原性ペプチドによる抗体産生誘導を増強することができる。従って、従来のアジュバントを添加することによる制約もないため、製剤設計も行い易くなる。【００２６】
また、本発明により免疫応答の増強した免疫原性ペプチドの生体への投与により、血中においてＡβペプチドに対する特異的抗体を早期かつ大量に誘導することができる。システインの毒性は知られておらず、むしろ生体内ではシステインおよびその関連物質は抗毒的な作用をもつことが知られているため、本発明による免疫応答の増強した免疫原性ペプチドは生体において極めて安全に使用することができる。【００２７】
本発明による免疫応答の増強した免疫原性ペプチドは、化学合成による非生物学的な方法で得ることができ、従来のコンポーネントワクチンと比較して安定して均一なものを製造することが可能である。また、混入物質による毒性、感染性、品質低下の危険性が最も低く、安全なワクチンを提供することができる。【００２８】
本発明によるＡβペプチドに対して免疫応答の増強した免疫原性ペプチドを含有するペプチド製剤は、皮下、筋肉内投与といった注射による投与のみならず、経口、経鼻、経皮などの投与方法も可能である。これらの方法によれば注射によるストレスや医療事故も防ぐことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ジスルフィド結合させたシステイン付加28アミノ酸Ａβペプチドの構造を示した図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明においては、ペプチドに直接システイン分子またはその類似体を付加または挿入するか、もしくはDNA、RNA配列にシステインを発現する配列を付加または挿入する。その場合、システインの付加または挿入位置は、Ａβペプチドに対して免疫反応の増強効果を有する限り特に限定されない。導入するシステイン分子は1個以上あればよく、複数導入する場合も連続、不連続のどちらでも構わない。最も単純な構造としては、Ａβペプチドの一部の配列のN末端またはC末端に1個システインが連結した構造となる。【００３１】
本発明のアルツハイマー病の予防または治療に有効なペプチドとして、1から42番目のアミノ酸配列からなるＡβペプチド（DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA： 配列番号1）の一部または当該配列に由来するペプチドにシステイン（Cys）またはその類似体が付加されたものが挙げられる。このようなペプチドの例としては下記のようなものが挙げられる。ここで示すシステインの類似体とはシステインの前駆体及び代謝産物を意味し、その好適な一例はホモシステインである。【００３２】
(A)(a)配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜18番目からなるペプチドまたはその一部からなるペプチドと、(b)配列番号1のアミノ酸配列のN末から28〜42番目のうち、28〜36番目のアミノ酸残基を含む9個以上のアミノ酸残基からなるペプチドを結合させ、さらにそのC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させたペプチド
(1) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目〜10番目の配列のC末端に、28番目〜42番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド（1-10・28-42AACys）：
N末-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIAC（配列番号2）
(2) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目〜10番目の配列のC末端に、28番目〜41番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド（1-10・28-41AACys）：
N末-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIC（配列番号3）
(3) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目〜10番目の配列のC末端に、28番目〜40番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド（1-10・28-40AACys）：
N末-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVC（配列番号4）
(4) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目〜10番目の配列のC末端に、28番目〜39番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド（1-10・28-39AACys）：
N末-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVC（配列番号5）
(5) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目〜10番目の配列のC末端に、28番目〜38番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド（1-10・28-38AACys）：
N末-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGC（配列番号6）
(6) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目〜10番目の配列のC末端に、28番目〜37番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド（1-10・28-37AACys）：
N末-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGC（配列番号7）
(7) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目〜10番目の配列のC末端に、28番目〜36番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド（1-10・28-36AACys）：
N末-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVC（配列番号8）
(8) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目〜9番目の配列のC末端に、28番目〜37番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド（1-9・28-37AACys）：
N末-DAEFRHDSGKGAIIGLMVGC（配列番号9）
(9) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から2番目〜10番目の配列のC末端に、28番目〜37番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド（2-10・28-37AACys）：
N末-AEFRHDSGYKGAIIGLMVGC（配列番号10）
(10) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から3番目〜10番目の配列のC末端に、28番目〜37番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド（3-10・28-37AACys）：
N末-EFRHDSGYKGAIIGLMVGC（配列番号11）
(11) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から2番目〜9番目の配列のC末端に、28番目〜37番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド（2-9・28-37AACys）：
N末-AEFRHDSGKGAIIGLMVGC（配列番号12）
(12) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目〜18番目の配列のC末端に、28番目〜42番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド（1-18・28-42AACys）：
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVKGAIIGLMVGGVVIAC（配列番号13）【００３３】
(B)配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜26番目または1〜27番目からなるペプチドの、N末から18番目と19番目のアミノ酸残基の間にシステインまたはシステイン類似体を挿入させたペプチド
(1) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜27番目からなるペプチド（以下、27アミノ酸Ａβペプチド）の18番目と19番目の間にシステイン挿入したペプチド（1-18Cys19-27AA）：
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGSN（配列番号14）
(2) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜26番目からなるペプチド（以下、26アミノ酸Ａβペプチド）の18番目と19番目の間にシステイン挿入したペプチド（1-18Cys19-26AA）：
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGS（配列番号15）【００３４】
(C)配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその一部からなるペプチドの、N末から18番目と19番目のアミノ酸残基の間にシステインまたはシステイン類似体を挿入し、さらにC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させたペプチド
(1) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜28番目からなるペプチド（以下、28アミノ酸Ａβペプチド）の18番目と19番目の間にシステイン挿入し更にC末端にシステインを繋いだペプチド（1-18Cys19-28AACys）
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGSNKC（配列番号16）【００３５】
(D)配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜18番目からなるペプチドまたはその一部からなるペプチドのC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させ、さらに配列番号1のアミノ酸配列のN末から28〜42番目からなるペプチドまたはその一部からなるペプチドを結合させたペプチド、または選択的にさらにそのC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させたペプチド
(1) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目〜18番目の配列のC末端にシステインを繋ぎさらにその後ろに28番目〜37番目の配列を繋いだペプチド（1-18Cys28-37AA）：
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCKGAIIGLMVG（配列番号17）
(2) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目〜18番目の配列のC末端にシステインを繋ぎさらにその後ろに28番目〜37番目の配列を繋ぎそのC末端にシステインを付加したペプチド（1-18Cys28-37AACys）：
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCKGAIIGLMVGC （配列番号18）【００３６】
(E)配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその一部からなるペプチドのC末端にシステイン類似体を結合させたペプチド
(1) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目〜28番目の配列のC末端にホモシステインを付加したペプチド（28AA-ホモシステイン）
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKX（配列番号19）（X：ホモシステイン）【００３７】
(F)配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその一部からなるペプチドのC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させた2個以上のペプチドを、当該システインまたはシステイン類似体のジスルフィド結合により連結させたペプチド
(1) 28アミノ酸Ａβペプチドにシステインを付加したペプチド（28AAC）
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKC（配列番号20）
(2) 28アミノ酸Ａβペプチドにシステインを2個付加したペプチド（28AACC）
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKCC（配列番号21）
上記28AACと28AACをジスルフィド結合により連結したもの（28AACジスルフィド28AAC）、28AACと28AACCをジスルフィド結合により連結したもの（28AACジスルフィド28AACC）、28AACCと28AACCをジスルフィド結合により連結したもの（28AACCジスルフィド28AACC；N末側のシステイン同士がジスルフィド結合したもの、C末側のシステイン同士がジスルフィド結合したもの、C末側とN末側のシステインがジスルフィド結合したもの、C末側同士とN末側同士のシステインがジスルフィド結合したもの、および、それぞれC末側とN末側のシステインがジスルフィド結合したものを含む）、および複数の28AACCをジスルフィド結合により連結したもの（28AACC(28AAC)の結合体）で、その構造を図1に示した。【００３８】
上記のシステインを付加または挿入したＡβペプチドのうち、Ａβペプチドのアミノ酸の一部を削除したペプチドにシステインを付加した1-10・28-42AACys（配列番号2）、1-10・28-41AACys（配列番号3）、1-10・28-40AACys（配列番号4）、1-10・28-39AACys（配列番号5）、1-10・28-38AACys（配列番号6）、1-10・28-37AACys（配列番号7）、1-10・28-36AACys（配列番号8）、1-9・28-37AACys（配列番号9）、2-10・28-37AACys（配列番号10）及び1-18・28-42AACys（配列番号13）のペプチド、28アミノ酸Ａβペプチドにシステイン挿入または付加した1-18Cys19-28AACys（配列番号16）、1-18Cys19-27AA（配列番号14）、1-18Cys19-26AA（配列番号15）、1-18Cys28-37AA（配列番号17）、28アミノ酸Ａβペプチドにホモシステインを付加した28AA-ホモシステイン（配列番号19）、さらには28AACジスルフィド28AACおよび28AACジスルフィド28AACCが特に免疫応答が増強しており、アルツハイマー病の予防または治療に有効に用いることができる。【００３９】
本発明によれば、Ａβペプチドの一部またはＡβペプチドに由来する配列にシステインまたはシステイン類似体を付加または挿入することで、免疫応答の増強したペプチドを調製することが可能であるが、システインを付加または挿入後に得られたペプチドが免疫応答増強効果を有するか否かは得られたペプチドを用いて、定法に従ってマウス等を免疫した後、血中の抗ＡβIgＧ抗体価を測定することによって確認することができる。従って、本発明はさらに、Ａβペプチドの一部またはＡβペプチドに由来する配列にシステインまたはシステイン類似体を付加または挿入して得られるペプチドを用いることを特徴とする、免疫応答増強方法をも提供する。【００４０】
本発明により得られるシステインが付加されたペプチド製剤は、皮下、筋注、経口、経鼻等のいずれの方法でも投与可能である。最も好ましい方法は、皮下または筋注による投与方法である。【００４１】
本発明におけるシステイン付加免疫原性ペプチドは、アジュバントなしで単独で投与しても十分な免疫賦与効果を与えることが出来るが、アジュバントを添加するとさらに大きな免疫賦与効果を得ることが可能である。使用されるアジュバントとしては、液性免疫を活性化し、細胞性免疫を刺激しないものが好ましく、その代表としてはアルミニウム塩などが挙げられる。【００４２】
また、上記で具体的に列挙した、本発明によるＡβペプチドの一部またはＡβペプチドに由来する配列にシステインまたはシステイン類似体を付加または挿入して得られる免疫応答の増強した各免疫原性ペプチドをコードする遺伝子断片を含有するベクターは、アルツハイマー病の予防や治療に有効なDNAワクチンとして利用することができる。システインをコードする塩基配列としては例えば、tgtが挙げられるが、システインをコードする配列である限り特に制限はない。上記42アミノ酸残基からなるＡβペプチドをコードする遺伝子断片は下記の通りである。ただし、以下に示した配列は代表的なＡβペプチドの遺伝子配列であり、同じアミノ酸をコードする限りその遺伝子配列に特に制限はない。
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt gcagaagatg tgggttcaaa caaaggtgca atcattggac tcatggtggg cggtgttgtc atagcg  （配列番号22）【００４３】
上記Ａβペプチドまたは一部または配列に由来するペプチドにシステイン（Cys）が付加または挿入されたペプチドをコードする遺伝子断片の例としては下記のものが挙げられる。ただし、以下に示した配列は上記ペプチドをコードする代表的な遺伝子配列を示しており、同じアミノ酸をコードする限りその遺伝子配列に特に制限はない。
・1-10・28-42AACysをコードする遺伝子断片：
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc ggtgttgtca tagcgtgt  （配列番号23）
・1-10・28-41AACysをコードする遺伝子断片：
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc ggtgttgtca tatgt  （配列番号24）
・1-10・28-40AACysをコードする遺伝子断片：
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc ggtgttgtct gt  （配列番号25）
・1-10・28-39AACysをコードする遺伝子断片：
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc ggtgtttgt  （配列番号26）
・1-10・28-38AACysをコードする遺伝子断片：
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc ggttgt  （配列番号27）
・1-10・28-37AACysをコードする遺伝子断片：
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc tgt  （配列番号28）
・1-10・28-36AACysをコードする遺伝子断片：
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgtgt  （配列番号29）
・1-9・28-37AACysをコードする遺伝子断片：
gatgcagaat tccgacatga ctcaggaaaa ggtgcaatca ttggactcat ggtgggctgt  （配列番号30）
・2-10・28-37AACysをコードする遺伝子断片：
gcagaattcc gacatgactc aggatataaa ggtgcaatca ttggactcat ggtgggctgt  （配列番号31）
・3-10・28-37AACysをコードする遺伝子断片：
gaattccgac atgactcagg atataaaggt gcaatcattg gactcatggt gggctgt  （配列番号32）
・2-9・28-37AACysをコードする遺伝子断片：
gcagaattcc gacatgactc aggaaaaggt gcaatcattg gactcatggt gggctgt  （配列番号33）
・1-18・28-42AACysをコードする遺伝子断片：
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgaaaggt gcaatcattg gactcatggt gggcggtgtt gtcatagcgt gt  （配列番号34）
・1-18Cys19-27AAをコードする遺伝子断片：
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgtgtttc tttgcagaag atgtgggttc aaac  （配列番号35）
・1-18Cys19-26AAをコードする遺伝子断片：
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgtgtttc tttgcagaag atgtgggttc a  （配列番号36）
・1-18Cys19-28AACysをコードする遺伝子断片：
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgtgtttc tttgcagaag atgtgggttc aaacaaatgt  （配列番号37）
・1-18Cys28-37AAをコードする遺伝子断片：
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgtgtaaa ggtgcaatca ttggactcat ggtgggc   （配列番号38）
・1-18Cys28-37AACysをコードする遺伝子断片：
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgtgtaaa ggtgcaatca ttggactcat ggtgggctgt  （配列番号39）【００４４】
以下、本発明を実施例によってより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４５】
《実施例1：Ａβペプチドの1から10番目の配列に各種C末側ペプチドを繋ぎそのC末端にシステインを付加したペプチドの抗体誘導能の比較》
（1）システインを付加したＡβペプチドの調製
・システイン付加1から10＋30から42アミノ酸Ａβペプチド（1-10・30-42AACys）：
N末- DAEFRHDSGYAIIGLMVGGVVIAC（配列番号40）
・システイン付加1から10＋29から42アミノ酸Ａβペプチド（1-10・29-42AACys）：
N末- DAEFRHDSGYGAIIGLMVGGVVIAC（配列番号41）
・システイン付加1から10＋28から42アミノ酸Ａβペプチド（1-10・28-42AACys）：
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIAC（配列番号2）
・1から10＋28から42アミノ酸Ａβペプチド（1-10・28-42AA）：
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIA（配列番号42）
上記のペプチドを合成し（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、原液100μLに生理食塩液900μLを加え0.5mg/mLの濃度とし1.5ｍLチューブに分注した（免疫物）。使用時まで−80℃以下で保存した。【００４６】
（2）投与マウス
雄のC57BL/6（7週齢、SPF）を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。【００４７】
（3）免疫群構成
16匹のマウスを4匹ずつ4群に分け、第1群：1-10・30-42AACys投与群、第2群：1-10・29-42AACys投与群、第3群：1-10・28-42AACys投与群、第4群：1-10・28-42AA投与群とした。【００４８】
（4）免疫方法及びスケジュール
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1ｍLツベルクリン用注射器（テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した（一個体あたりの投与量：100μg）。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。【００４９】
（5）採血
最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム（共立製薬、ソムノペンチル）麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ（ベクトン ディッキンソン社）に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで−80℃にて保存した。【００５０】
（6）抗ＡβIgG抗体の測定
Ａβペプチド（1-40のアミノ酸配列： N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV (配列番号43)、北海道システム・サイエンス社合成）を0.1Mカルボネートバッファー、 pH9.6で10μg/mLに希釈し8ウェル ストリップス（ナルジェ ヌンク社、イモビライザーアミノ）に100μL/ウェル加え、4℃で一夜静置して固相化した。翌日、各ウェルを300μLの0.05％Tween20含有PBS（PBST）で3回洗浄し、10mM エタノールアミンを300μL/ウェルずつ添加して、室温で1時間静置した。【００５１】
1時間後、10mMエタノールアミンを十分に除き、PBSTで検体を50倍〜10000倍に希釈して100μL/ウェルにて添加した。室温で1時間の反応の後、添加した各希釈血清を捨て300μL/ウェルのPBSTで3回洗浄した。洗浄後、ウェル内の洗浄液を十分に除き、検体希釈液を用いて2000倍希釈したHRP標識抗マウスIgGヤギ抗体（アメリカン クアレックス社、A131PS）を100μL/ウェルにて添加し、室温で1時間反応した。反応後、標識抗体希釈液を捨て300μL/ウェルのPBSTで2回、同量の蒸留水で2回洗浄し、発色基質液TMB+（ダコ社）を100μL/ウェル添加して遮光下、室温で30分間反応した。その後、1N硫酸を100μL/ウェル添加して発色を停止し、450nmの吸光度（OD450値）を測定した。【００５２】
市販のＡβに対するモノクローナル抗体（ケミコン社 MAB1560)を標準血清として用いた。標準血清をPBSTにて0.156、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10ng/mLとなるように希釈し、抗体価測定時のスタンダードを調製した。各被検マウス血清の抗ＡβIgG抗体測定と同時に、各希釈検体のOD450値を測定した。得られたスタンダードの単位とOD450値の標準直線より各被検マウス血清の抗ＡβIgG抗体価を算出した。
算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Ａβ抗体価を表1に示した。表1に示すように、1-10・28-42AACys投与群及び1-10・28-42AA投与群でＡβに対する抗体誘導が認められた。またシステインを付加していないペプチド（1-10・28-42AA）で免疫した場合より、システインを付加したペプチド（1-10・28-42AACys）で免疫した場合がＡβに対する高い抗体価を示した。【００５３】
【表１】
0005474807.tif 000002
【００５４】
《実施例2：Ａβペプチドの1から10番目の配列に、28から42番目、28から41番目、28から40番目、28から39番目、28から38番目、28から37番目の配列、28番目から36番目、28番目から35番目及び28番目から34番目を繋ぎそのC末端にシステインを付加したペプチドの抗体誘導能の比較》
（1）システインを付加したＡβペプチドの調製
・システイン付加1から10＋28から42アミノ酸Ａβペプチド（1-10・28-42AACys）：
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIAC（配列番号2）
・システイン付加1から10＋28から41アミノ酸Ａβペプチド（1-10・28-41AACys）：
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIC（配列番号3）
・システイン付加1から10＋28から40アミノ酸Ａβペプチド（1-10・28-40AACys）：
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVC（配列番号4）
・システイン付加1から10＋28から39アミノ酸Ａβペプチド（1-10・28-39AACys）：
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVC（配列番号5）
・システイン付加1から10＋28から38アミノ酸Ａβペプチド（1-10・28-38AACys）：
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGC（配列番号6）
・システイン付加1から10＋28から37アミノ酸Ａβペプチド（1-10・28-37AACys）：
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGC（配列番号7）
・システイン付加1から10＋28から36アミノ酸Ａβペプチド（1-10・28-36AACys）：
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLMVC（配列番号8）
・システイン付加1から10＋28から35アミノ酸Ａβペプチド（1-10・28-35AACys）：
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLMC（配列番号44）
・システイン付加1から10＋28から34アミノ酸Ａβペプチド（1-10・28-34AACys）：
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLC（配列番号45）
上記のペプチドを合成し（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、原液100μLに生理食塩液900μLを加え0.5mg/mLの濃度とし1.5ｍLチューブに分注した（免疫物）。使用時まで−80℃以下で保存した。【００５５】
（2）投与マウス
雄のC57BL/6（7週齢、SPF）を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。【００５６】
（3）免疫群構成
36匹のマウスを4匹ずつ9群に分け、第1群：1-10・28-42AACys投与群、第2群：1-10・28-41AACys投与群、第3群：1-10・28-40AACys投与群、第4群：1-10・28-39AACys投与群、第5群：1-10・28-38AACys投与群、第6群：1-10・28-37AACys投与群、第7群：1-10・28-36AACys投与群、第8群：1-10・28-35AACys投与群及び第9群：1-10・28-34AACys投与群とした。
【００５７】
（4）免疫方法及びスケジュール
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1ｍLツベルクリン用注射器（テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した（一個体あたりの投与量：100μg）。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。【００５８】
（5）採血
最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム（共立製薬、ソムノペンチル）麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ（ベクトン ディッキンソン社）に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで−80℃にて保存した。【００５９】
（6）抗ＡβIgG抗体の測定
抗ＡβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Ａβ抗体価を表2に示した。表2に示すように、1-10・28-42AACys、1-10・28-41AACys、1-10・28-40AACys、1-10・28-39AACys、1-10・28-38AACys、1-10・28-37AACysおよび1-10・28-36AACysのペプチドでＡβに対する高い抗体価を示した。【００６０】
【表２】
0005474807.tif 000003
【００６１】
《実施例3：Ａβペプチドの各種N末側ペプチドに28番目から37番目を繋ぎそのC末端にシステインを付加したペプチドの抗体誘導能の比較》
（1）システインを付加したＡβペプチドの調製
・システイン付加1から9＋28から37アミノ酸Ａβペプチド（1-9・28-37AACys）：
N末- DAEFRHDSGKGAIIGLMVGC（配列番号9）
・システイン付加1から8＋28から37アミノ酸Ａβペプチド（1-8・28-37AACys）：
N末- DAEFRHDSKGAIIGLMVGC（配列番号46）
・システイン付加1から7＋28から37アミノ酸Ａβペプチド（1-7・28-37AACys）：
N末- DAEFRHDKGAIIGLMVGC（配列番号47）
上記のペプチドを合成し（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、原液100μLに生理食塩液900μLを加え0.5mg/mLの濃度とし1.5ｍLチューブに分注した（免疫物）。使用時まで−80℃以下で保存した。【００６２】
（2）投与マウス
雄のC57BL/6（7週齢、SPF）を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。【００６３】
（3）免疫群構成
12匹のマウスを4匹ずつ3群に分け、第1群：1-9・28-37AACys投与群、第2群：1-8・28-37AACys投与群及び第3群：1-7・28-37AACys投与群とした。【００６４】
（4）免疫方法及びスケジュール
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1ｍLツベルクリン用注射器（テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した（一個体あたりの投与量：100μg）。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。【００６５】
（5）採血
最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム（共立製薬、ソムノペンチル）麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ（ベクトン ディッキンソン社）に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで−80℃にて保存した。【００６６】
（6）抗ＡβIgG抗体の測定
抗ＡβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Ａβ抗体価を表3に示した。表3に示すように、1-9・28-37AACysのペプチドでＡβに対する抗体の誘導が認められた。【００６７】
【表３】
0005474807.tif 000004
【００６８】
《実施例4：Ａβペプチドの2から10番目または3から10番目または4から10番目の配列に28番目から37番目を繋ぎそのC末端にシステインを付加したペプチドの抗体誘導能の比較》
（1）システインを付加したＡβペプチドの調製
・システイン付加2から10＋28から37アミノ酸Ａβペプチド（2-10・28-37AACys）：
N末- AEFRHDSGYKGAIIGLMVGC（配列番号10）
・システイン付加3から10＋28から37アミノ酸Ａβペプチド（3-10・28-37AACys）：
N末- EFRHDSGYKGAIIGLMVGC（配列番号11）
・システイン付加4から10＋28から37アミノ酸Ａβペプチド（4-10・28-37AACys）：
N末- FRHDSGYKGAIIGLMVGC（配列番号48）
・システイン付加2から9＋28から37アミノ酸Ａβペプチド（2-9・28-37AACys）：
N末- AEFRHDSGKGAIIGLMVGC（配列番号12）
上記のペプチドを合成し（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、原液100μLに生理食塩液900μLを加え0.5mg/mLの濃度とし1.5ｍLチューブに分注した（免疫物）。使用時まで−80℃以下で保存した。【００６９】
（2）投与マウス
雄のC57BL/6（7週齢、SPF）を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。【００７０】
（3）免疫群構成
16匹のマウスを4匹ずつ4群に分け、第1群：2-10・28-37AACys投与群、第2群：3-10・28-37AACys投与群、第3群：4-10・28-37AACys投与群及び第4群：2-9・28-37AACys投与群とした。【００７１】
（4）免疫方法及びスケジュール
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1ｍLツベルクリン用注射器（テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した（一個体あたりの投与量：100μg）。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。【００７２】
（5）採血
最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム（共立製薬、ソムノペンチル）麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ（ベクトン ディッキンソン社）に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで−80℃にて保存した。【００７３】
（6）抗ＡβIgG抗体の測定
抗ＡβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Ａβ抗体価を表4に示した。表4に示すように、2-10・28-37AACys、3-10・28-37AACysおよび2-9・28-37AACysのペプチドでＡβに対する抗体の誘導が認められた。【００７４】
【表４】
0005474807.tif 000005
【００７５】
《実施例5：Ａβペプチドの1から10番目の配列に28番目から42番目を繋ぎそのC末端にシステインを付加したペプチドと1から18番目の配列に28番目から42番目を繋ぎそのC末端にシステインを付加したペプチドの抗体誘導能の比較》
（1）システインを付加したＡβペプチドの調製
・システイン付加1から18＋28から42アミノ酸Ａβペプチド（1-18・28-42AACys）：
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVKGAIIGLMVGGVVIAC（配列番号13）
・システイン付加1から10＋28から42アミノ酸Ａβペプチド（1-10・28-42AACys）：
N末-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIAC（配列番号2）【００７６】
上記のペプチドを合成し（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、原液100μLに生理食塩液900μLを加え0.5mg/mLの濃度とし1.5ｍLチューブに分注した（免疫物）。使用時まで−80℃以下で保存した。【００７７】
（2）投与マウス
雄のC57BL/6（7週齢、SPF）を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。【００７８】
（3）免疫群構成
8匹のマウスを4匹ずつ2群に分け、第1群：1-18・28-42AACys投与群及び第2群：1-10・28-42AACys投与群とした。【００７９】
（4）免疫方法及びスケジュール
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1ｍLツベルクリン用注射器（テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した（一個体あたりの投与量：100μg）。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。【００８０】
（5）採血
最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム（共立製薬、ソムノペンチル）麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ（ベクトン ディッキンソン社）に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで−80℃にて保存した。【００８１】
（6）抗ＡβIgG抗体の測定
抗ＡβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Ａβ抗体価を表5に示した。表5に示すように、1-18・28-42AACys投与群及び1-10・28-42AACys投与群共にＡβに対する同程度の抗体の誘導が認められた。【００８２】
【表５】
0005474807.tif 000006
【００８３】
《実施例6：Ａβペプチドの18番目と19番目の間にシステインを挿入したペプチドと当該ペプチドのC末端にシステインを付加したペプチドの抗体誘導能の比較》
・28アミノ酸Ａβペプチドの18番目と19番目の間にシステイン挿入したペプチド（1-18Cys19-28AA）：
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGSNK（配列番号49）
・28アミノ酸Ａβペプチドの18番目と19番目の間にシステイン挿入し更にC末端にシステインを繋いだペプチド（1-18Cys19-28AACys）：
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGSNKC（配列番号16）
上記のペプチドを合成し（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、原液100μLに生理食塩液900μLを加え0.5mg/mLの濃度とし1.5ｍLチューブに分注した（免疫物）。使用時まで−80℃以下で保存した。【００８４】
（2）投与マウス
雄のC57BL/6（7週齢、SPF）を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。【００８５】
（3）免疫群構成
8匹のマウスを4匹ずつ2群に分け、第1群：1-18Cys19-28AA投与群及び第2群：1-18Cys19-28AACys投与群とした。【００８６】
（4）免疫方法及びスケジュール
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1ｍLツベルクリン用注射器（テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した（一個体あたりの投与量：100μg）。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。【００８７】
（5）採血
最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム（共立製薬、ソムノペンチル）麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ（ベクトン ディッキンソン社）に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで−80℃にて保存した。【００８８】
（6）抗ＡβIgG抗体の測定
抗ＡβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Ａβ抗体価を表6に示した。表6に示すように、1-18Cys19-28AA投与群及び1-18Cys19-28AACys投与群共にＡβに対する同程度の抗体の誘導が認められた。
【００８９】
【表６】
0005474807.tif 000007
【００９０】
《実施例7：25、26、27アミノ酸Ａβペプチドの18番目と19番目の間にシステイン挿入したペプチドの抗体誘導の検討》
（1）システインを付加したＡβペプチドの調製
・27アミノ酸Ａβペプチドの18番目と19番目の間にシステイン挿入したペプチド（1-18Cys19-27AA）：
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGSN（配列番号14）
・26アミノ酸Ａβペプチドの18番目と19番目の間にシステイン挿入したペプチド（1-18Cys19-26AA）：
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGS（配列番号15）
・25アミノ酸Ａβペプチドの18番目と19番目の間にシステイン挿入したペプチド（1-18Cys19-25AA）：
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVG（配列番号50）
上記のペプチドを合成し（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、原液100μLに生理食塩液900μLを加え0.5mg/mLの濃度とし1.5ｍLチューブに分注した（免疫物）。使用時まで−80℃以下で保存した。【００９１】
（2）投与マウス
雄のC57BL/6（7週齢、SPF）を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。【００９２】
（3）免疫群構成
12匹のマウスを4匹ずつ3群に分け、第1群：1-18Cys19-27AA投与群、第2群： 1-18Cys19-26AA投与群及び第3群1-18Cys19-25AA投与群とした。
【００９３】
（4）免疫方法及びスケジュール
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1ｍLツベルクリン用注射器（テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した（一個体あたりの投与量：100μg）。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。【００９４】
（5）採血
最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム（共立製薬、ソムノペンチル）麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ（ベクトン ディッキンソン社）に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで−80℃にて保存した。【００９５】
（6）抗ＡβIgG抗体の測定
抗ＡβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Ａβ抗体価を表7に示した。表7に示すように、1-18Cys19-27AA投与群及び1-18Cys19-26AA投与群にＡβに対する抗体の誘導が認められた。また1-18Cys19-25AA投与群は4例中1例にＡβに対する抗体の誘導が認められた。
【００９６】
【表７】
0005474807.tif 000008
【００９７】
《実施例8：Ａβペプチドの1から18番目の配列へ28から37番目の配列の連結にシステインを付加したペプチドの抗体誘導の検討》
（1）システインを付加したＡβペプチドの調製
・Ａβペプチドの1番目から18番目の配列のC末端にシステインを繋ぎさらにその後ろに28番目から37番目の配列を繋いだペプチド（1-18Cys28-37AA）
N末- DAEFRHDSGYEVHHQKLVCKGAIIGLMVG（配列番号17）
・Ａβペプチドの1番目から18番目の配列のC末端にシステインを繋ぎさらにその後ろに28番目から37番目の配列を繋ぎそのC末端にシステインを付加したペプチド（1-18Cys28-37AACys）：
N末- DAEFRHDSGYEVHHQKLVCKGAIIGLMVGC（配列番号18）
・Ａβペプチドの1番目から18番目の配列のC末端に28番目から37番目の配列を繋ぎそのC末端にシステインを付加したペプチド（1-18・28-37AACys）
N末- DAEFRHDSGYEVHHQKLVKGAIIGLMVGC（配列番号51）
・Ａβペプチドの1番目から18番目の配列のC末端に28番目から37番目の配列を繋いだペプチド（1-18・28-37AA）
N末- DAEFRHDSGYEVHHQKLVKGAIIGLMVG（配列番号52）
上記のペプチドを合成し（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、原液100μLに生理食塩液900μLを加え0.5mg/mLの濃度とし1.5ｍLチューブに分注した（免疫物）。使用時まで−80℃以下で保存した。
【００９８】
（2）投与マウス
雄のC57BL/6（7週齢、SPF）を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。【００９９】
（3）免疫群構成
16匹のマウスを4匹ずつ4群に分け、第1群：1-18Cys28-37AA投与群、第2群： 1-18Cys28-37AACys投与群、第3群：1-18・28-37AACys投与群及び第4群：1-18・28-37AAとした。
【０１００】
（4）免疫方法及びスケジュール
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1ｍLツベルクリン用注射器（テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した（一個体あたりの投与量：100μg）。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。【０１０１】
（5）採血
最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム（共立製薬、ソムノペンチル）麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ（ベクトン ディッキンソン社）に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで−80℃にて保存した。【０１０２】
（6）抗ＡβIgG抗体の測定
抗ＡβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Ａβ抗体価を表8に示した。表8に示すように、1-18Cys28-37AA投与群及び1-18Cys28-37AACys投与群にＡβに対する抗体の誘導が認められた。
【０１０３】
【表８】
0005474807.tif 000009
【０１０４】
《実施例9：28アミノ酸Ａβペプチドにシステインの前駆体であるホモシステインまたは代謝産物であるグルタチオンを付加したペプチドの抗体誘導の検討》
（1）システインの前駆体または代謝産物を付加したＡβペプチドの調製
・28アミノ酸Ａβペプチドにホモシステインを付加したペプチ（28AA-ホモシステイン）：
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-Homocysteine（配列番号19）
・28アミノ酸Ａβペプチドにグルタチオンを付加したペプチ（28AA-グルタチオン）：
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-Glutathione（配列番号53）
上記のペプチドを合成し（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、使用時まで−80℃以下で保存した。【０１０５】
（2）投与マウス
雄のC57BL/6（7週齢、SPF）を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。【０１０６】
（3）免疫群構成
8匹のマウスを4匹ずつ2群に分け、第1群：28AA-ホモシステイン投与群及び第2群：28AA-グルタチオン投与群とした。【０１０７】
（4）免疫方法及びスケジュール
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1ｍLツベルクリン用注射器（テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した（一個体あたりの投与量：100μg）。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。【０１０８】
（5）採血
最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム（共立製薬、ソムノペンチル）麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ（ベクトン ディッキンソン社）に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで−80℃にて保存した。【０１０９】
（6）抗ＡβIgG抗体の測定
抗ＡβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Ａβ抗体価を表9に示した。表9に示すように、28AA-ホモシステイン投与群ではＡβに対する抗体の誘導が認められた。【０１１０】
【表９】
0005474807.tif 000010
【０１１１】
《実施例10：ジスルフィド結合させたシステイン付加28アミノ酸Ａβペプチドの抗体誘導の検討》
（1）システインを付加したＡβペプチドの調製
・28アミノ酸Ａβペプチドにシステインを付加したペプチド（28AAC）
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-C（配列番号20）
・28アミノ酸Ａβペプチドにシステインを2つ付加したペプチド（28AACC）
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-CC（配列番号21）【０１１２】
（2）ジスルフィド結合させたシステイン付加Ａβペプチドの調製
28AACと28AACをジスルフィド結合したもの（28AACジスルフィド28AAC）、および28AACと28AACCをジスルフィド結合したもの（28AACジスルフィド28AACC）を調製した。得られるペプチドの構造は、2個のペプチドがC末端のシステインを介したジスルフィド結合により連結される構造の他、N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-CCを含む二量体に更にジスルフィド結合し三量体、多量体化したものが考えられる（図1）。【０１１３】
（3）投与マウス
雄のC57BL/6（7週齢、SPF）を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。【０１１４】
（4）免疫群構成
8匹のマウスを4匹ずつ2群に分け、第1群：28AACジスルフィド28AAC投与群及び第2群：228AACジスルフィド28AACC投与群とした。【０１１５】
（5）免疫方法及びスケジュール
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1ｍLツベルクリン用注射器（テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した（一個体あたりの投与量：100μg）。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。【０１１６】
（6）採血
最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム（共立製薬、ソムノペンチル）麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ（ベクトン ディッキンソン社）に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで−80℃にて保存した。【０１１７】
（7）抗ＡβIgG抗体の測定
抗ＡβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Ａβ抗体価を表10に示した。表10に示すように、ジスルフィド結合させたシステイン付加28アミノ酸Ａβペプチドは、28AACジスルフィド28AAC投与群及び228AACジスルフィド28AACC投与群両方とも、Ａβに対する抗体の誘導が認められた。【０１１８】
【表１０】
0005474807.tif 000011
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明によるＡβペプチドまたはそれに由来する配列にシステインまたはその類似物質を付加または挿入することにより作製されるペプチドを用いた免疫応答増強方法は、アルツハイマー病の予防および治療を目的としたペプチドワクチンやDNAワクチン等における安全かつ簡便な免疫賦活方法として期待できる。
【図１】
0005474807.tif 000012
【配列表】
0005474807000001.app