(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇであるペプチド配列を、リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素のＮ末端に付与した合成物で、ＳＮ−３８を溶解した薬剤運搬体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、難水溶性の薬剤を、目的となる生体内の場所や部位、細胞に選択的に運搬する薬剤運搬体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム創薬研究により発見された標的受容体へ作用する医薬候補化合物は、総じて分子量が大きく、水に対する溶解度が低い。また、現在使用されている薬剤の中にも疎水性が高く、難水溶性であるものが少なくない。化学修飾法により水溶性は高められるが、薬剤活性が減じられる場合が多い。薬剤活性の高い難水溶性薬剤を効率的に疾患部に輸送できれば、難水溶性薬剤の臨床応用例を拡大し、製薬企業で困難を極めていた薬剤溶解度に対する問題を解決することができる。
【０００３】
この課題に対して技術面で鍵を握っているのが、難水溶性薬剤を可溶化し標的まで輸送するとともに、その薬剤を細胞内で効率的に機能発現させることのできるドラッグ・デリバリー・システム（ＤＤＳ）の開発である。
【０００４】
このようなＤＤＳのアイデアはすでに開示されているものがある。特許文献１では、標的結合成分と腔形成成分と薬理学的化合物を含む複合体であって、薬理学的化合物が腔形成成分の腔中に存在する複合体が開示されている。ここで開示されている複合体の使い方は、対象が発現するレセプター等の標的に対して、特異的に結合する腔を有するたんぱく質（特にＮＧＦファミリーやインターロイキン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、バルナーゼ、Ｔ４リゾチーム、ＴＧＦｂ、ＩｇＧ等）を選定し、その腔中に対象に対して薬剤効果を有する薬剤の中から実際に吸蔵させることのできる薬剤を選択する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−５０７２１０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１では、神経芽細胞腫を対象とし、対象が過剰に発現する標的をｔｒｋＡレセプターとし、標的結合成分と腔形成成分を有するたんぱく質としてＮＧＦを示してあるものの、それ以上の具体的な開示がなく、ＮＧＦに何をどのように吸蔵させるのかという点については、概念が示されているに過ぎない。
【０００７】
従って、難水溶性の薬剤を可溶化し、疾患部に郵送し薬剤の効力を発揮させるＤＤＳシステムについては、依然として提供されたものとは言えない。本発明は、このような状況に鑑み、より具体的に難水溶性の薬剤を可溶化して疾患部に郵送するＤＤＳシステムを開発する目的で想到されたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、難水溶性薬剤運搬機能、及びがん細胞認識機能を併せ持つ薬剤運搬体（インテリジェント人工蛋白質（ｉＡＰ）とも呼ぶ）を創製し、臨床応用化を提案するものである。そして、薬剤運搬体の本体部の鋳型蛋白質として、生体内輸送蛋白質であるリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ−ＰＧＤＳ）を用いる。すなわち、リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素のＮ末端若しくはＣ末端に、標的への結合部分を連結した蛋白質を提供する。
【０００９】
リポカリン蛋白質は、レチノイド、甲状腺ホルモン、性ホルモンやヘム代謝産物などの疎水性生理活性物質を結合し運搬する輸送蛋白質であり、疎水性低分子に対する結合親和性が高く、薬剤等の人工的な難水溶性低分子の輸送体となり得る。
【００１０】
薬剤の運搬性としては、Ｌ−ＰＧＤＳの疎水性ポケット内のアミノ酸に変異を導入することにより、使用する薬剤に対するテーラメード化を行い、結合親和性の差を利用し、薬剤毎にポケット内への保持特性を調整することができる。
【００１１】
一方、結合部については、癌などの細胞をターゲットとする場合は、新生血管内皮細胞に発現する膜蛋白質（ＣＤ１３）に対して、特異的に結合するペプチド配列（Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ  （ＮＧＲ）−ｍｏｔｉｆ）をＬ−ＰＧＤＳのＮ末端に導入し、がん組織に対する標的化を行う。
【発明の効果】
【００１２】
リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素は、体内産生物であり、拒絶反応や毒性といった一般的にＤＤＳが有する課題を容易に乗り越えることができる。また、すでにアミノ酸配列も解析されており、ターゲットに対する標的結合部を含めて組み換え合成を行うことで、容易に産生することができる。このように本発明の薬剤運搬体は、分子選択的認識機能を持ち、がん組織を狙い撃つ「ナノキャリア蛋白質」の創製が可能となり、医薬品開発分野における新しい方向性を与えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の薬剤運搬体を示す概念図である。
【図２】リポカリンファミリーの例示である。
【図３】リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の詳細構造を示す図である。
【図４】ＳＮ−３８をＬ−ＰＧＤＳに溶解させて抗がん活性を調べたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
図１には、本発明の薬剤運搬体（インテリジェント人口蛋白質）の概念図を示す。薬剤運搬体１は、本体となるリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素部分２と、標的結合部４を含む。本体であるリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素部分２は、リポカリンファミリーとして知られるリポカリン蛋白質を利用することができる。
【００１５】
リポカリンファミリーは後述するようにバレル構造によってポケットを有しており、いわばコップのような形状をしている。ここに、難水溶性の薬剤６を収納することができる。またリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素部分２には標的結合部４を有しており、この部分が標的と結合することで薬剤６を目的とする部位に運搬する。
【００１６】
リポカリンファミリーに属するリポカリン蛋白質は、アミノ酸残基が１６０〜２００個からなり、分子量が約２万程度の蛋白質である。また、アミノ酸配列の相同性が、２０％程度であるにもかかわらず、その構造上の類似性は非常に高いことが知られている。
【００１７】
図２には、リポカリンファミリーの一部を示す。レチノール結合蛋白質、主要尿蛋白質、ビリン結合蛋白質、β−ラクトグロブリン、ロブスタークラストシアニン、臭物質結合蛋白質などがリポカリンファミリーのメンバーである。
【００１８】
これら、リポカリン蛋白質の折りたたみ構造は、連続的に水素結合した８本の逆平行のβシートからなり、疎水性低分子（リガンド）結合部を囲むようなバレル（樽）型になっている。８本のβシートをつなぐ７箇所のループは、６箇所が短いヘヤピンで、１箇所がオメガループであり、このオメガループがリガンド結合部の蓋の役割をすると考えられている。また、１つのαヘリックスを有する。すなわち、８本のバレル構造と１本のオメガループと、１つのαヘリックスを有する点がこれらリポカリンファミリーの構造上の類似点である。
【００１９】
図３にこの構造をより詳細に示す。図３は、リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ−ＰＧＤＳ）の結晶構造の模式図である。８本のバレル構造（１１乃至１８）と１つのαへリックス（１９）と１本のオメガループ（Ｈ２へリックス）（２０）を有している。
【００２０】
そもそも、Ｌ−ＰＧＤＳは、シクロオキシゲナーゼの働きによりアラキドン酸から合成されたＰＧＨ２を基質として、ＰＧＤ２を合成する酵素である。ＰＧＤ２は、中枢神経系において、睡眠誘発、体温低下、黄体ホルモン分泌の抑制、痛みや匂いの応答調節などの作用を示し、末梢神経では、肥満細胞からアレルギーのメディエーターとして放出され、血管拡張、気管支収縮、血小板凝集阻害などの作用を示す物質である。
【００２１】
そして、Ｌ−ＰＧＤＳはリポカリンファミリーにも属しており、８本のバレル構造によって形成されるポケット部分は内側には疎水基が配置された構成になっているので、難水溶性の薬物をこのポケットに収容することで、水に溶解することができる。
【００２２】
難水溶性の薬剤の水溶可能性については、ポケットの内側のアミノ酸に変異を導入して薬剤毎にポケット内への薬剤の保持特性を調整してもよい。なお、Ｌ−ＰＧＤＳはそもそも酵素であるため、ＤＤＳとして使用する際には、酵素活性を失活させる必要がある。そのためには、Ｎ末端から４３番目のシステイン（活性中心）を、アラニンに置換し、酵素活性を失活させる。
【００２３】
標的結合部については、ターゲットに合わせて設計することができる。例えば、癌細胞の場合は、新生血管内皮細胞に発現する膜蛋白質（ＣＤ１３）に対して特異的に結合するペプチド配列ＮＧＲを選択することができる。また、αｖβ３インテグリンを認識するｉｓｏＡｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ  （ｉｓｏＤＧＲ）モチーフを遺伝子組換えによりＬ−ＰＧＤＳのＮ末端、あるいはＣ末端に導入してもよい。
【００２４】
また、胃がんの腹膜腫瘍を認識するＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ（ＫＬＰ）−モチーフ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ９７，  １０７５−８１，  ２００６）、転移性がん細胞を認識するＡｓｎ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ  （ＮＶＶＲＱ）モチーフ（Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  １４，  ５４９４−５０２，  ２００８）、肝がん細胞を認識するＰｈｅ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ（ＦＱＨＰＳＦＩ）モチーフ（Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，  １３，  ２４６−５４，  ２００７）等も好適に利用できる。
【００２５】
この標的結合部は本体であるリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素部分の末端に導入するのが好ましい。また、Ｎ末端であれば、組み換え体を作製する際により簡単であるので、より好ましい。
【００２６】
本発明の薬剤運搬体に運搬させることのできる薬剤は、市販されている難水溶性抗がん剤が好適に利用できる。例えば、プロカルバジン（脳腫瘍）、ロムスチン（脳腫瘍）、  イリノテカン（大腸がん）、クロラムブシル（卵巣がん）、パクリタキセル（乳がん）、タモキシフェン（乳がん）等が挙げられる。
【００２７】
本発明の薬剤運搬体は、標的結合部とともに組み換え体として得ることができる。組み換え体の作り方は、通常の方法に従ってよい。すなわち、Ｌ−ＰＧＤＳをコードするｃＤＮＡをクローニングで得て、それを増幅し、インサートを調製する。このインサートと別途調製したベクターとをライゲーションする。
【００２８】
こうして得たベクターを大腸菌に形質転換し、大腸菌を形質転換する。この大腸菌を培養して、本発明の薬剤運搬体を得ることができる。
【実施例】
【００２９】
難溶性薬剤に対するＬ−ＰＧＤＳの効果を確認した。７−エチル−１０−ヒドロキシ−カンプトテシン（７−Ｅｔｈｙｌ−１０−ｈｉｄｒｏｘｙ−ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ：以後「ＳＮ−３８」という。）は、中国原産のカンレンボクの樹皮と幹から単離されたキノリンアルカロイドであり、ＤＮＡトポイソメラーゼＩ阻害剤として知られている。トポイソメラーゼＩが阻害されると、ＤＮＡの再結合反応が妨げられ、細胞はアポトーシスに至る。このため、ＳＮ−３８は抗がん活性を有する。ところが、ＳＮ−３８は、難溶性であるため、その類似物質であるイリノテカン塩酸塩（ＣＰＴ−１１）が、臨床的に用いられている。イリノテカンは、加水分解されることでＳＮ−３８となり活性する、いわゆるプロドラッグである。
【００３０】
しかし、イリノテカンの代謝変換効率は投与された量の１０％以下であり効率は低い。ＳＮ−３８が直接溶解でき、患部に投与することができれば、癌治療を大いに促進する有用な手段であると考えられる。そこで、ＳＮ−３８をＬ−ＰＧＤＳを用いて可溶化し、その抗腫瘍効果を調べた。
【００３１】
＜薬液の調製＞
２ｍＭのＬ−ＰＧＤＳを含むＰＢＳに大過剰のＳＮ−３８を充分に懸濁し、０．２μｍフィルターに通して不溶性粒子を除去したものをＳＮ−３８／Ｌ−ＰＧＤＳ溶液（４９０μＭ  ＳＮ−３８）とした。なお、Ｌ−ＰＧＤＳは、酵素活性を消滅させた。
【００３２】
＜抗腫瘍活性測定＞
７週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの脇腹に、ヒト大腸癌の細胞株ＤＬＤ−１を５×１０６ｃｅｌｌｓ皮下投与した。腫瘍体積は、腫瘍体積＝（長径×短径２）／２の式から計算した。腫瘍体積が２００ｍｍ３に達したとき、ＳＮ−３８／Ｌ−ＰＧＤＳ溶液（２匹）、または対照としてＬ−ＰＧＤＳ溶液（１匹、１回につき１５０μｌ）を０、３、６、９日目に腫瘍に直接投与した。
【００３３】
図４に結果を示す。横軸は投与を開始してからの日数（日）であり、縦軸は上記の計算式から求めた腫瘍体積（ｍｍ３）である。縦長の三角印は、ＳＮ−３８／Ｌ−ＰＧＤＳ溶液、またはＬ−ＰＧＤＳ溶液を投与した日である。また、ＳＮ−３８／Ｌ−ＰＧＤＳを投与したマウスの腫瘍体積は黒三角と黒四角で示し、Ｌ−ＰＧＤＳだけを投与したマウスは黒丸で示した。
【００３４】
同じ腫瘍体積から始めて、投与後１日目ですでに、ＳＮ−３８／Ｌ−ＰＧＤＳを投与したマウスの腫瘍体積はＬ−ＰＧＤＳだけを投与したマウスの腫瘍体積より小さかった。その後も、Ｎ−３８／Ｌ−ＰＧＤＳを投与したマウスの腫瘍体積はほとんど増加せず、９日目まで２匹の腫瘍体積は同程度の低い増加であった。一方、Ｌ−ＰＧＤＳだけを投与したマウスは、２日目から４日目まではわずかな増加しかしなかったものの、その後日増しに腫瘍体積は増加した。
【００３５】
以上のように、Ｌ−ＰＧＤＳ溶液を投与したマウス（黒丸）と比較して、ＳＮ−３８／Ｌ−ＰＧＤＳ溶液を投与したマウス（黒三角、黒四角）は腫瘍体積の成長が抑制された。この結果から、Ｌ−ＰＧＤＳがＳＮ−３８を可溶化すること、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、Ｌ−ＰＧＤＳによって可溶化したＳＮ−３８が抗腫瘍効果を発揮することが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明の薬剤運搬体は、生体内で薬剤を標的細胞へ運搬するという利用だけでなく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの利用も可能である。
【符号の説明】
【００３７】
１  薬剤運搬体
２  本体
４  標的結合部
６  薬剤
１１〜１８  バレル
１９  αヘリオックス
２０  オメガループ（Ｈ２へリックス）
【図１】
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【図２】
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【図３】
0005529609.tif 000004
【図４】
0005529609.tif 000005