(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＥｒｂＢ２に特異的に結合し、ヘレグリンによって誘導されたＥｒｂＢ２のリン酸化をＭＣＦ７細胞において５０ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０で抑制する、ヒト抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
以下の(i)〜(vii)：
（ｉ）配列番号６の重鎖アミノ酸配列、および配列番号８の軽鎖アミノ酸配列を含む抗体；
（ii）配列番号１４の重鎖アミノ酸配列、および配列番号１６の軽鎖アミノ酸配列を含む抗体；
（iii）配列番号１８の重鎖アミノ酸配列、および配列番号２０の軽鎖アミノ酸配列を含む抗体；
（iv）配列番号２２の重鎖アミノ酸配列、および配列番号２４の軽鎖アミノ酸配列を含む抗体；
（v）配列番号２６の重鎖アミノ酸配列、および配列番号２８の軽鎖アミノ酸配列を含む抗体；
（vi）配列番号３０の重鎖アミノ酸配列、および配列番号３２の軽鎖アミノ酸配列を含む抗体；または
（vii）配列番号３４の重鎖アミノ酸配列、および配列番号３６の軽鎖アミノ酸配列を含む抗体
からなる群から選択される抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、前記抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
ヒトＥｒｂＢ２に特異的に結合し、ヘレグリンによって誘導されたＥｒｂＢ２のリン酸化をＭＣＦ７細胞において５０ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０で抑制する、ヒト抗体またはその抗原結合フラグメントであって、該抗体は以下の(i)〜(vii)：
（i）配列番号６と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有する重鎖アミノ酸配列、および配列番号８と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗体；
（ii）配列番号１４と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有する重鎖アミノ酸配列、および配列番号１６と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗体；
（iii）配列番号１８と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有する重鎖アミノ酸配列、および配列番号２０と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗体；
（iv）配列番号２２と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有する重鎖アミノ酸配列、および配列番号２４と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗体；
（v）配列番号２６と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有する重鎖アミノ酸配列、および配列番号２８と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗体；
（vi）配列番号３０と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有する重鎖アミノ酸配列、および配列番号３２と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗体；または
（vii）配列番号３４と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有する重鎖アミノ酸配列、および配列番号３６と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗体
からなる群より選択される、前記ヒト抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、および、製薬上許容できるキャリアーを含む組成物。
【請求項４】
請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸分子。
【請求項５】
請求項４の核酸分子を含むベクターであって、該核酸分子に作動可能に連結した発現制御配列を含んでいてもよい、前記ベクター。
【請求項６】
請求項５のベクターを含む宿主細胞。
【請求項７】
請求項６に記載の宿主細胞を適切な条件下で培養し、そして、抗体またはその抗原結合フラグメントを回収する工程を含む、前記抗体またはその抗原結合フラグメントの生産方法。
【請求項８】
癌の治療に使用される、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなる治療剤、または請求項３に記載の組成物。
【請求項９】
前記癌が、乳房癌、膀胱癌、肺癌、頭部癌、頚部癌、前立腺癌、胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、結腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、および、グリア芽腫からなる群より選択される、請求項８の治療剤または組成物。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[001] 本願は、合衆国法典第３５巻１１９条に従って、２００６年８月４日付けで出願された米国仮出願第６０／８３５，５１４号に基づき優先権を主張し、その全体は参照により本発明に含める。
【０００２】
発明の分野
[002] 本発明は、抗ＥｒｂＢ２抗体、具体的にはヒト抗体、および、抗ＥｒｂＢ２抗体の製造方法、および、例えば癌を治療するための抗ＥｒｂＢ２抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
[003] 受容体チロシンキナーゼのＥｒｂＢファミリーは、細胞増殖、分化および生存の重要な媒介物質である。この受容体ファミリーには、４種の別個の種類、すなわち上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲまたはＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２またはｐ１８５ｎｅｕ）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、および、ＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）などが含まれる。
【０００４】
[004] ＥＧＦＲはｅｒｂＢ１遺伝子によってコードされており、これは、ヒト悪性疾患に因果的に関与している。具体的には、ＥＧＦＲ発現の増加が、乳癌、膀胱癌、肺癌、頭部癌、頚部癌および胃癌で観察されており、加えてグリア芽腫でも観察されている。ＥＧＦＲ受容体発現の増加は、同じ腫瘍細胞によるＥＧＦＲリガンド、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦ−α）生産の増加に関連している場合が多く、それによって自己分泌を刺激する経路によって受容体の活性化が起こる（ＢａｓｅｌｇａおよびＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．６４：１２７〜１５４（１９９４））。ＥＧＦＲまたはそのリガンド、ＴＧＦ−αおよびＥＧＦに対して向けられたモノクローナル抗体は、このような悪性疾患の治療における治療剤として評価されている。例えば、Ｂａｓｅｌｇａ  ａｎｄ  Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ，同上；Ｍａｓｕｉ等．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４４：１００２〜１００７（１９８４）；および、Ｗｕ等．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：１８９７〜１９０５（１９９５）を参照。
【０００５】
[005] ＥｒｂＢファミリーの第二の種類であるｐ１８５ｎｅｕは元々、化学的に処理したラットの神経芽細胞腫由来の形質転換遺伝子の産物として同定された。ｎｅｕ癌原遺伝子の活性型は、コードされたタンパク質の膜貫通領域における（バリンからグルタミン酸への）点変異によるものである。ｎｅｕのヒト同族体の増幅は、乳癌および卵巣癌で観察されており、予後不良と互いに関係がある（Ｓｌａｍｏｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：１７７〜１８２（１９８７）；Ｓｌａｍｏｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：７０７〜７１２（１９８９）；および、米国特許第４，９６８，６０３号）。これまで、ｎｅｕ癌原遺伝子における点変異に類似した点変異は、ヒト腫瘍で報告されていない。また、ＥｒｂＢ２の過剰発現（これは、全てではないが、遺伝子増幅によることが多い）も、例えば胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、甲状腺、膵臓および膀胱の癌腫などその他の癌腫で観察されている。参考文献として、特に、Ｋｉｎｇ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：９７４（１９８５）；Ｙｏｋｏｔａ等，Ｌａｎｃｅｔ：１：７６５〜７６７（１９８６）；Ｆｕｋｕｓｈｉｇｅ等，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６：９５５〜９５８（１９８６）；Ｇｕｅｒｉｎ等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓ．，３：２１〜３１（１９８８）；Ｃｏｈｅｎ等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，４：８１〜８８（１９８９）；Ｙｏｎｅｍｕｒａ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５１：１０３４（１９９１）；Ｂｏｒｓｔ等，Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，３８：３６４（１９９０）；Ｗｅｉｎｅｒ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５０：４２１〜４２５（１９９０）；Ｋｅｒｎ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５０：５１８４（１９９０）；Ｐａｒｋ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４９：６６０５（１９８９）；Ｚｈａｕ等，Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．，３：２５４〜２５７（１９９０）；Ａａｓｌａｎｄ等  Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５７：３５８〜３６３（１９８８）；Ｗｉｌｌｉａｍｓ等  Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５９：４６〜５２（１９９１）;および、ＭｃＣａｎｎ等，Ｃａｎｃｅｒ，６５：８８〜９２（１９９０）を参照、。
【０００６】
[006] ＥｒｂＢ２は、前立腺癌で過剰発現している可能性がある（Ｇｕ等．Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．９９：１８５〜９（１９９６）；Ｒｏｓｓ等．Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．２８：８２７〜３３（１９９７）；Ｒｏｓｓ等．Ｃａｎｃｅｒ  ７９：２１６２〜７０（１９９７）;および、Ｓａｄａｓｉｖａｎ等．Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５０：１２６〜３１（１９９３））。
【０００７】
[007] ラットｐ１８５ｎｅｕおよびヒトＥｒｂＢ２タンパク質産物に対して向けられた抗体が記載されている。Ｄｒｅｂｉｎおよびその共同研究者は、ラットｎｅｕ遺伝子産物、ｐ１８５ｎｅｕに対する抗体を生成させている。例えば、Ｄｒｅｂｉｎ等，Ｃｅｌｌ  ４１：６９５〜７０６（１９８５）；Ｍｙｅｒｓ等，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１９８：２７７〜２９０（１９９１）；および、ＷＯ９４／２２４７８を参照。Ｄｒｅｂｉｎ等．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２：２７３〜２７７（１９８８）は、ｐ１８５ｎｅｕの２種の別個の領域と反応性を有する抗体の混合物により、ヌードマウスに埋め込まれたｎｅｕで形質転換したＮＩＨ−３Ｔ３細胞において相乗的な抗腫瘍効果が生じることを報告している。１９９８年１０月２０日に発行された米国特許第５，８２４，３１１号も参照。
【０００８】
[008] Ｈｕｄｚｉａｋ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９（３）：１１６５〜１１７２（１９８９）は、ヒト乳房腫瘍細胞系ＳＫ−ＢＲ−３を用いることを特徴とする抗ＥｒｂＢ２抗体のパネルの生成を説明している。このような抗体に曝露した後のＳＫ−ＢＲ−３  細胞の相対的な細胞増殖を、７２時間後の単分子層をクリスタルバイオレット染色することによって決定した。この分析を用いて、４Ｄ５と呼ばれる抗体での最大の抑制が得られ、細胞増殖の５６％が抑制された。この分析において、パネル中のその他の抗体も、それほどではないにせよ細胞増殖を減少させた。さらに抗体４Ｄ５は、ＥｒｂＢ２を過剰発現する乳房腫瘍細胞系を、ＴＮＦ−αの細胞傷害効果に対して敏感にすることも見出された。さらに、１９９７年１０月１４日に発行された米国特許第５，６７７，１７１号も参照。Ｈｕｄｚｉａｋ等によって考察された抗ＥｒｂＢ２抗体はさらに、Ｆｅｎｄｌｙ等．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０：１５５０〜１５５８（１９９０）；Ｋｏｔｔｓ等．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ２６（３）：５９Ａ（１９９０）；Ｓａｒｕｐ等．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  １：７２〜８２（１９９１）；Ｓｈｅｐａｒｄ等．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１（３）：１１７〜１２７（１９９１）；Ｋｕｍａｒ等．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１（２）：９７９〜９８６（１９９１）；Ｌｅｗｉｓ等．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３７：２５５〜２６３（１９９３）；Ｐｉｅｔｒａｓ等．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ９：１８２９〜１８３８（１９９４）；Ｖｉｔｅｔｔａ等．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５４：５３０１〜５３０９（１９９４）；Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ等．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（２０）：１４６６１〜１４６６５（１９９４）；Ｓｃｏｔｔ等．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１４３００〜５（１９９１）；Ｄ'ｓｏｕｚａ等．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：７２０２〜７２０６（１９９４）；Ｌｅｗｉｓ等．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５６：１４５７〜１４６５（１９９６）；および、Ｓｃｈａｅｆｅｒ等．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：１３８５〜１３９４（１９９７）で特徴付けられている。
【０００９】
[009] ヒト化型の組換えマウス抗ＥｒｂＢ２抗体４Ｄ５（ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８、ｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２、または、ハーセプチン（登録商標）；米国特許第５，８２１，３３７号）は、以前に大規模な抗癌治療を受けたＥｒｂＢ２を過剰発現する転移性乳癌を有する患者において臨床効果がある（Ｂａｓｅｌｇａ等，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１４：７３７〜７４４（１９９６））。ハーセプチン（登録商標）は、１９９８年９月２５日に、腫瘍でＥｒｂＢ２タンパク質が過剰発現されている転移性乳癌を有する患者を治療することに関して食品医薬品局から市販の認可を受けている。
【００１０】
[010] 様々な特性を有するその他の抗ＥｒｂＢ２抗体は、Ｔａｇｌｉａｂｕｅ等．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４７：９３３〜９３７（１９９１）；ＭｃＫｅｎｚｉｅ等．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ４：５４３〜５４８（１９８９）；Ｍａｉｅｒ等．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：５３６１〜５３６９（１９９１）；Ｂａｃｕｓ等．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ３：３５０〜３６２（１９９０）；Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉ等．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８８：８６９１〜８６９５（１９９１）；Ｂａｃｕｓ等．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：２５８０〜２５８９（１９９２）；Ｘｕ等．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５３：４０１〜４０８（１９９３）；ＷＯ９４／００１３６；Ｋａｓｐｒｚｙｋ等．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：２７７１〜２７７６（１９９２）；Ｈａｎｃｏｃｋ等．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：４５７５〜４５８０（１９９１）；Ｓｈａｗｖｅｒ等．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１３６７〜１３７３（１９９４）；Ａｒｔｅａｇａ等．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：３７５８〜３７６５（１９９４）；Ｈａｒｗｅｒｔｈ等．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５１６０〜１５１６７（１９９２）；米国特許第５，７８３，１８６号；および、Ｋｌａｐｐｅｒ等．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４：２０９９〜２１０９（１９９７）で説明されている。
【００１１】
[011] 相同性スクリーニングによって、２種のその他のＥｒｂＢ受容体ファミリーの種類、すなわち；ＥｒｂＢ３（米国特許第５，１８３，８８４号、および、５，４８０，９６８号、加えて、Ｋｒａｕｓ等．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８６：９１９３〜９１９７（１９８９））、および、ＥｒｂＢ４（欧州特許第５９９，２７４号；Ｐｌｏｗｍａｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：１７４６〜１７５０（１９９３）；および、Ｐｌｏｗｍａｎ等，Ｎａｔｕｒｅ，３６６：４７３〜４７５（１９９３））が同定されている。これらの受容体はいずれも、少なくともいくつかの乳癌細胞系において高い発現を示している。
【００１２】
[012] ＥｒｂＢ受容体は、一般的に、細胞中で様々な組み合わせで見出されており、ヘテロ二量体化が、様々なＥｒｂＢリガンドに対する細胞の反応の多様性を高めていると考えられる（Ｅａｒｐ等．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ３５：１１５〜１３２（１９９５））。ＥＧＦＲには、少なくとも６種の異なるリガンド、すなわち；上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦ−α）、アンフィレグリン、ヘパリン結合性上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、ベータセルリン、および、エピレグリンが結合する（Ｇｒｏｅｎｅｎ等．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  １１：２３５〜２５７（１９９４））。単一の遺伝子のオルタナティブスプライシングによって生じたヘレグリンタンパク質ファミリーは、ＥｒｂＢ３、および、ＥｒｂＢ４に関するリガンドである。ヘレグリンファミリーとしては、アルファ、ベータおよびガンマヘレグリン（Ｈｏｌｍｅｓ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：１２０５〜１２１０（１９９２）；米国特許第５，６４１，８６９号；および、Ｓｃｈａｅｆｅｒ等．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：１３８５〜１３９４（１９９７））；ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）、グリア細胞増殖因子（ＧＧＦｓ）；アセチルコリン受容体誘導活性（ＡＲＩＡ）；および、感覚および運動ニューロン誘導因子（ＳＭＤＦ）が挙げられる。総説としては、Ｇｒｏｅｎｅｎ等．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  １１：２３５〜２５７（１９９４）；Ｌｅｍｋｅ，Ｇ．Ｍｏｌｅｃ．＆  Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２４７〜２６２（１９９６）および  Ｌｅｅ等．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｖ．４７：５１〜８５（１９９５）を参照。近年、３種の追加のＥｒｂＢリガンドが同定されており、ニューレグリン−２（ＮＲＧ−２）は、ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４のいずれかに結合し（Ｃｈａｎｇ等．Ｎａｔｕｒｅ  ３８７  ５０９〜５１２（１９９７）；および、Ｃａｒｒａｗａｙ等  Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：５１２〜５１６（１９９７））；ニューレグリン−３は、ＥｒｂＢ４と結合し（Ｚｈａｎｇ等．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９４（１８）：９５６２〜７（１９９７））；および、ニューレグリン−４、これは、ＥｒｂＢ４と結合する（Ｈａｒａｒｉ等．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：２６８１〜８９（１９９９））ことが報告されており、また、ＨＢ−ＥＧＦ、ベータセルリンおよびエピレグリンもＥｒｂＢ４に結合する。ＥＧＦおよびＴＧＦαはＥｒｂＢ２と結合しないが、ＥＧＦはＥＧＦＲとＥｒｂＢ２を刺激してヘテロ二量体を形成し、この二量体がＥＧＦＲを活性化し、ヘテロ二量体においてＥｒｂＢ２のリン酸基転移反応が起こる。二量体化および／またはリン酸基転移反応は、ＥｒｂＢ２チロシンキナーゼを活性化するようである。上記のＥａｒｐ等を参照。同様に、ＥｒｂＢ３がＥｒｂＢ２と共に発現される場合、活性なシグナル伝達複合体が形成され、この複合体は、ＥｒｂＢ２に対して向けられた抗体によって崩壊させることができる（Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（２０）：１４６６１〜１４６６５（１９９４））。加えて、ＥｒｂＢ２と共に発現されると、ＥｒｂＢ３のヘレグリン（ＨＲＧ）に対する親和性も増加してよ���高い親和性状態になる。ＥｒｂＢ２−ＥｒｂＢ３タンパク質複合体に関しては、Ｌｅｖｉ等，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １５：１３２９〜１３４０（１９９５）；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１４３１〜１４３５（１９９５）；および、Ｌｅｗｉｓ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６：１４５７〜１４６５（１９９６）も参照。ＥｒｂＢ４は、ＥｒｂＢ３のように、ＥｒｂＢ２と共に活性なシグナル伝達複合体を形成する（ＣａｒｒａｗａｙおよびＣａｎｔｌｅｙ，Ｃｅｌｌ  ７８：５〜８（１９９４））。
【００１３】
[013] ＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌原遺伝子の生成物であるＨＥＲ２は、チロシンキナーゼ受容体のヒト上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ）ファミリーの第二の構成要素であり、リガンドのオーファン受容体であることが示唆されている。ＨＥＲ２とその他のＨＥＲファミリーの種類、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４とのリガンド依存性のヘテロ二量体化は、ＨＥＲ２のシグナル伝達経路を活性化する。ＨＥＲ２の細胞内シグナル伝達経路は、ｒａｓ−ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ経路に関与すると考えられており、加えて、ＭＡＰＫ−非依存性の  Ｓ６キナーゼ、および、ホスホリパーゼＣ−ガンマシグナル伝達経路にも関与すると考えられている（Ｇｒａｕｓ−Ｐｏｒｔａ等，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９５  Ｍａｒｃｈ；１５（３）：１１８２〜１１９１；Ｇｒａｎｔ等，Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．２００２年２月１日；７：ｄ３７６〜８９）。
【００１４】
[014] またＨＥＲ２のシグナル伝達は、血管新生促進因子、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、および、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、ならびに、血管新生抑制因子、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）ももたらす。低レベルのＨＥＲ２を内因的に発現するＭＣＦ−７およびＴ−４７Ｄ乳癌細胞においてＨＥＲ２が再発現することによって、ＶＥＧＦとＩＬ−８の高い発現、および、ＴＳＰ−１の低い発現が起こる。ヒト化抗ＨＥＲ２抗体（トラスツズマブまたはハーセプチン（登録商標））、または、レトロウイルスが介在するＨＥＲ２に対する短鎖干渉（ｓｉＨＥＲ２）によるＨＥＲ２の抑制により、ＶＥＧＦおよびＩＬ−８発現は減少するが、高レベルのＨＥＲ２を発現するＢＴ４７４乳癌細胞におけるＴＳＰ−１発現は増加する。それゆえにＨＥＲ２のシグナル伝達は、別個のシグナル伝達経路を介した血管新生促進因子と血管新生抑制因子との間の平衡に影響を与える。トラスツズマブは、ＨＥＲ２−ｐ３８−ＴＳＰ−１経路の活性化、および、ＨＥＲ２−ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ＶＥＧＦ／ＩＬ−８経路の抑制を介して、血管新生と腫瘍増殖を少なくとも部分的に抑制する（Ｗｅｎ等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００６年５月２２日；電子出版）。加えて、ＥｒｂＢ２膜ＲＴＫは、Ｃｄｃ２を直接リン酸化することによって、タキソールによって誘導されたアポトーシスに対する耐性を付与することができる（Ｔａｎ等，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００２年５月；９（５）：９９３〜１００４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第４，９６８，６０３号
【特許文献２】ＷＯ９４／２２４７８
【特許文献３】米国特許第５，８２４，３１１号
【特許文献４】米国特許第５，６７７，１７１号
【特許文献５】米国特許第５，８２１，３３７号
【特許文献６】ＷＯ９４／００１３６
【特許文献７】米国特許第５，７８３，１８６号
【特許文献８】米国特許第５，１８３，８８４号、
【特許文献９】５，４８０，９６８号
【特許文献１０】欧州特許第５９９，２７４号
【特許文献１１】米国特許第５，６４１，８６９号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】ＢａｓｅｌｇａおよびＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．６４：１２７〜１５４（１９９４）
【非特許文献２】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４４：１００２〜１００７（１９８４）
【非特許文献３】Ｗｕ等．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：１８９７〜１９０５（１９９５）
【非特許文献４】Ｓｌａｍｏｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：１７７〜１８２（１９８７）
【非特許文献５】Ｓｌａｍｏｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：７０７〜７１２（１９８９）
【非特許文献６】Ｋｉｎｇ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：９７４（１９８５）
【非特許文献７】Ｙｏｋｏｔａ等，Ｌａｎｃｅｔ：１：７６５〜７６７（１９８６）
【非特許文献８】Ｆｕｋｕｓｈｉｇｅ等，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６：９５５〜９５８（１９８６）
【非特許文献９】Ｇｕｅｒｉｎ等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓ．，３：２１〜３１（１９８８）
【非特許文献１０】Ｃｏｈｅｎ等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，４：８１〜８８（１９８９）
【非特許文献１１】Ｙｏｎｅｍｕｒａ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５１：１０３４（１９９１）
【非特許文献１２】Ｂｏｒｓｔ等，Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，３８：３６４（１９９０）
【非特許文献１３】Ｗｅｉｎｅｒ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５０：４２１〜４２５（１９９０）
【非特許文献１４】Ｋｅｒｎ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５０：５１８４（１９９０）
【非特許文献１５】Ｐａｒｋ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４９：６６０５（１９８９）
【非特許文献１６】Ｚｈａｕ等，Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．，３：２５４〜２５７（１９９０）
【非特許文献１７】Ａａｓｌａｎｄ等  Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５７：３５８〜３６３（１９８８）
【非特許文献１８】Ｗｉｌｌｉａｍｓ等  Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５９：４６〜５２（１９９１）
【非特許文献１９】ＭｃＣａｎｎ等，Ｃａｎｃｅｒ，６５：８８〜９２（１９９０）
【非特許文献２０】Ｇｕ等．Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．９９：１８５〜９（１９９６）
【非特許文献２１】Ｒｏｓｓ等．Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．２８：８２７〜３３（１９９７）
【非特許文献２２】Ｒｏｓｓ等．Ｃａｎｃｅｒ  ７９：２１６２〜７０（１９９７）
【非特許文献２３】Ｓａｄａｓｉｖａｎ等．Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５０：１２６〜３１（１９９３）
【非特許文献２４】Ｄｒｅｂｉｎ等，Ｃｅｌｌ  ４１：６９５〜７０６（１９８５）
【非特許文献２５】Ｍｙｅｒｓ等，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１９８：２７７〜２９０（１９９１）
【非特許文献２６】Ｄｒｅｂｉｎ等．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２：２７３〜２７７（１９８８）
【非特許文献２７】Ｈｕｄｚｉａｋ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９（３）：１１６５〜１１７２（１９８９）
【非特許文献２８】Ｆｅｎｄｌｙ等．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０：１５５０〜１５５８（１９９０）
【非特許文献２９】Ｋｏｔｔｓ等．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ２６（３）：５９Ａ（１９９０）
【非特許文献３０】Ｓａｒｕｐ等．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  １：７２〜８２（１９９１）
【非特許文献３１】Ｓｈｅｐａｒｄ等．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１（３）：１１７〜１２７（１９９１）
【非特許文献３２】Ｋｕｍａｒ等．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１（２）：９７９〜９８６（１９９１）
【非特許文献３３】Ｌｅｗｉｓ等．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３７：２５５〜２６３（１９９３）
【非特許文献３４】Ｐｉｅｔｒａｓ等．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ９：１８２９〜１８３８（１９９４）
【非特許文献３５】Ｖｉｔｅｔｔａ等．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５４：５３０１〜５３０９（１９９４）
【非特許文献３６】Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ等．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（２０）：１４６６１〜１４６６５（１９９４）
【非特許文献３７】Ｓｃｏｔｔ等．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１４３００〜５（１９９１）
【非特許文献３８】Ｄ'ｓｏｕｚａ等．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：７２０２〜７２０６（１９９４）
【非特許文献３９】Ｌｅｗｉｓ等．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５６：１４５７〜１４６５（１９９６）
【非特許文献４０】Ｓｃｈａｅｆｅｒ等．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：１３８５〜１３９４（１９９７）
【非特許文献４１】Ｂａｓｅｌｇａ等，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１４：７３７〜７４４（１９９６）
【非特許文献４２】Ｔａｇｌｉａｂｕｅ等．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４７：９３３〜９３７（１９９１）
【非特許文献４３】ＭｃＫｅｎｚｉｅ等．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ４：５４３〜５４８（１９８９）
【非特許文献４４】Ｍａｉｅｒ等．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：５３６１〜５３６９（１９９１）
【非特許文献４５】Ｂａｃｕｓ等．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ３：３５０〜３６２（１９９０）
【非特許文献４６】Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉ等．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８８：８６９１〜８６９５（１９９１）
【非特許文献４７】Ｂａｃｕｓ等．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：２５８０〜２５８９（１９９２）
【非特許文献４８】Ｘｕ等．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５３：４０１〜４０８（１９９３）
【非特許文献４９】Ｋａｓｐｒｚｙｋ等．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：２７７１〜２７７６（１９９２）
【非特許文献５０】Ｈａｎｃｏｃｋ等．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：４５７５〜４５８０（１９９１）
【非特許文献５１】Ｓｈａｗｖｅｒ等．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１３６７〜１３７３（１９９４）
【非特許文献５２】Ａｒｔｅａｇａ等．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：３７５８〜３７６５（１９９４）
【非特許文献５３】Ｈａｒｗｅｒｔｈ等．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５１６０〜１５１６７（１９９２）
【非特許文献５４】Ｋｌａｐｐｅｒ等．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４：２０９９〜２１０９（１９９７）
【非特許文献５５】Ｋｒａｕｓ等．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８６：９１９３〜９１９７（１９８９）
【非特許文献５６】Ｐｌｏｗｍａｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：１７４６〜１７５０（１９９３）
【非特許文献５７】Ｐｌｏｗｍａｎ等，Ｎａｔｕｒｅ，３６６：４７３〜４７５（１９９３）
【非特許文献５８】Ｅａｒｐ等．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ３５：１１５〜１３２（１９９５）
【非特許文献５９】Ｇｒｏｅｎｅｎ等．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  １１：２３５〜２５７（１９９４）
【非特許文献６０】Ｈｏｌｍｅｓ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：１２０５〜１２１０（１９９２）
【非特許文献６１】Ｓｃｈａｅｆｅｒ等．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：１３８５〜１３９４（１９９７）
【非特許文献６２】Ｇｒｏｅｎｅｎ等．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  １１：２３５〜２５７（１９９４）
【非特許文献６３】Ｌｅｍｋｅ，Ｇ．Ｍｏｌｅｃ．＆  Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２４７〜２６２（１９９６）
【非特許文献６４】Ｌｅｅ等．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｖ．４７：５１〜８５（１９９５）
【非特許文献６５】Ｃｈａｎｇ等．Ｎａｔｕｒｅ  ３８７  ５０９〜５１２（１９９７）
【非特許文献６６】Ｃａｒｒａｗａｙ等  Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：５１２〜５１６（１９９７））
【非特許文献６７】Ｚｈａｎｇ等．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９４（１８）：９５６２〜７（１９９７））
【非特許文献６８】Ｈａｒａｒｉ等．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：２６８１〜８９（１９９９）
【非特許文献６９】Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（２０）：１４６６１〜１４６６５（１９９４）
【非特許文献７０】Ｌｅｖｉ等，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １５：１３２９〜１３４０（１９９５）
【非特許文献７１】Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１４３１〜１４３５（１９９５）
【非特許文献７２】Ｌｅｗｉｓ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６：１４５７〜１４６５（１９９６）
【非特許文献７３】ＣａｒｒａｗａｙおよびＣａｎｔｌｅｙ，Ｃｅｌｌ  ７８：５〜８（１９９４）
【非特許文献７４】Ｇｒａｕｓ−Ｐｏｒｔａ等，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９５  Ｍａｒｃｈ；１５（３）：１１８２〜１１９１
【非特許文献７５】Ｇｒａｎｔ等，Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．２００２年２月１日；７：ｄ３７６〜８９
【非特許文献７６】Ｗｅｎ等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００６年５月２２日；電子出版
【非特許文献７７】Ｔａｎ等，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００２年５月；９（５）：９９３〜１００４
【発明の概要】
【００１７】
[015] 以下で、本発明の所定の実施態様を説明する。
[016] 一実施態様において、本発明は、ＥｒｂＢ２に特異的に結合する標的化結合物質、例えばヒトモノクローナル抗体またはそれらの抗原結合部位を含む。標的化結合物質は、以下の特性のうち少なくとも１種を有することができる：
（ａ）ヒト細胞に結合する特性；
（ｂ）カニクイザルＥｒｂＢ２を発現する細胞に結合する特性；
（ｃ）ハーセプチン（登録商標）と部分的に競合するが、２Ｃ４とは競合しない特性；
（ｄ）ＭＣＦ７細胞においてＥｒｂＢ２のリン酸化を５０ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０で抑制する特性；
（ｅ）ＳＫＢＲ３細胞において細胞増殖を５０ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０で抑制する特性；
（ｆ）ＥｒｂＢ２に１３．５ｎＭまたはそれ未満のＫＤで結合する特性；または、
（ｇ）ＥｒｂＢ２に関して、２．１４×１０−４ｓ−１またはそれより小さい解離速度（ｋｏｆｆ）を有する特性。
【００１８】
その他の実施態様において、標的化結合物質は、ＥｒｂＢ２に１３．５ｎＭまたはそれ未満のＫＤで結合し、ＥｒｂＢの活性化を抑制する。その他の実施態様において、前記標的化結合物質は、抗体である。一実施態様において、前記抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、または、ヒトモノクローナル抗体またはそれらの抗原結合部位である。
【００１９】
[017] その他の実施態様において、本発明は、ヒトＥｒｂＢ２に特異的に結合してそれらを抑制する標的化結合物質、例えばヒト化抗体、キメラ抗体、または、ヒトモノクローナル抗体またはそれらの抗原結合部位を含み、ここでこの標的化結合物質は、以下からなる群より選択される少なくとも１つの特性を有する：
[018] （ａ）ＥｒｂＢ２への結合に関して、１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３からなる群より選択される抗体と競合する特性；
[019] （ｂ）ＥｒｂＢ２への結合に関して、１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３からなる群より選択される抗体と競合する特性；
[020] （ｃ）１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３からなる群より選択される抗体と同じＥｒｂＢ２のエピトープに結合する特性；
[021] （ｄ）１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３からなる群より選択される抗体と実質的に同じＫＤでＥｒｂＢ２に結合する特性；および、
[022] （ｅ）１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３からなる群より選択される抗体と実質的に同じ解離速度でＥｒｂＢ２に結合する特性。
【００２０】
[023] その他の実施態様において、前記標的化結合物質は、抗体である。その他の実施態様において、前記抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、または、ヒトモノクローナル抗体またはそれらの抗原結合部位である。
【００２１】
その他の実施態様において、本発明は、ＥｒｂＢ２に特異的に結合する標的化結合物質、例えばモノクローナル抗体またはそれらの抗原結合部位を含み、ここで：
（ａ）該標的化結合物質は、１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３からなる群より選択される抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸の配列を含み；
（ｂ）該標的化結合物質は、１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３からなる群より選択される抗体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸の配列を含み；および、
（ｃ）該標的化結合物質は、（ａ）の重鎖および（ｂ）の軽鎖を含み；または、
重鎖および軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列が同じ抗体から選択される（ｃ）の標的化結合物質を含む。
【００２２】
その他の実施態様において、前記標的化結合物質は、抗体である。その他の実施態様において、前記抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、または、ヒトモノクローナル抗体またはそれらの抗原結合部位である。その他の実施態様において、このようなモノクローナル抗体またはそれらの抗原結合部位はさらに、配列番号４６に記載の重鎖アミノ酸配列、配列番号４７に記載の軽鎖アミノ酸配列、またはその両方を含む。
【００２３】
[024] その他の実施態様において、本発明のモノクローナル抗体またはそれらの抗原結合部位は、あらゆるアイソタイプ由来のものであってもよい。
[025] その他の実施態様において、本発明のヒトモノクローナル抗体またはそれらの抗原結合部位は、ヒトＶＨ３−２１遺伝子、ヒトＶＨ３−７遺伝子、ヒトＶＨ４−３１遺伝子、または、ヒトＶＨ３−１３遺伝子を利用する重鎖を含む。
【００２４】
[026] その他の実施態様において、本発明のヒトモノクローナル抗体またはそれらの抗原結合部位は、ヒトＶＨ３−２１遺伝子、ヒトＶＨ３−７遺伝子、ヒトＶＨ４−３１遺伝子、または、ヒトＶＨ３−１３遺伝子を利用する重鎖を含む。
【００２５】
[027] その他の実施態様において、本発明のヒトモノクローナル抗体またはそれらの抗原結合部位は、ヒトＶＫＢ３遺伝子、ヒトＶＫＬ１遺伝子、ヒトＶＫＡ２遺伝子、または、ヒトＶＫＡ１遺伝子を利用する軽鎖を含む。
【００２６】
[028] その他の実施態様において、本発明のヒトモノクローナル抗体またはそれらの抗原結合部位としては、ヒトＶＫＢ３遺伝子、ヒトＶＫＬ１遺伝子、ヒトＶＫＡ２遺伝子、または、ヒトＶＫＡ１遺伝子を利用する軽鎖をさらに含む抗体または部位が挙げられる。
【００２７】
[029] その他の実施態様において、本発明のヒトモノクローナル抗体またはそれらの抗原結合部位のＶＬドメイン、ＶＨドメインまたはその両方は、アミノ酸配列において、それぞれモノクローナル抗体１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３のＶＬドメイン、ＶＨドメイン、または、その両方と少なくとも９０％同一である。
【００２８】
[030] その他の実施態様において、本発明は、ＥｒｂＢ２に特異的に結合するモノクローナル抗体またはそれらの抗原結合部位を含み、ここで該抗体は、１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３からなる群より選択される抗体のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４のアミノ酸の配列の１種またはそれより多くを含む。
【００２９】
[031] その他の実施態様において、本発明は、ヒトモノクローナル抗体または抗原結合部位を含み、ここで該抗体は、以下を含む：
（ａ）モノクローナル抗体１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３の重鎖アミノ酸配列に少なくとも９０％同一な重鎖アミノ酸配列；
（ｂ）モノクローナル抗体１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３の軽鎖アミノ酸配列に少なくとも９０％同一な軽鎖アミノ酸配列；または、
（ａ）および（ｂ）の両方。
【００３０】
[032] その他の実施態様において、本発明は、本明細書において説明されるヒトモノクローナル抗体または抗原結合部位を含み、ここで前記抗原結合部位は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、および、相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、単鎖抗体（ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ２）、キメラ抗体、二重特異性抗体（ダイアボディ：ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、二重特異性抗体（ｄｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、および、少なくともポリペプチドへの特異的な抗原結合を付与するのに十分な抗体部分を含むポリペプチドからなる群より選択される。
【００３１】
[033] さらにその他の実施態様において、本発明は、標的化結合物質、例えば本明細書において説明される抗体または抗原結合部位、および、製薬上許容できるキャリアーを含む組成物を含む。本組成物はさらに、追加の治療薬または診断薬を含んでいてもよい。一実施態様において、本組成物はさらに、ＥｒｂＢ２に特異的に結合する二次抗体を含み、ここで前記二次抗体は、ＥｒｂＢ２への結合に関して、１．１４．１、１．１８．１、１．２０．１、１．２４．３、１．３９．１、１．７１．３、１．９６．２、１．１００．１、および、１．１４０．１からなる群より選択される抗体と競合しない。
【００３２】
[034] さらにその他の実施態様において、本発明は、本明細書において説明される標的化結合物質、抗体もしくは抗原結合部位、または、前記抗体または前記部分の重鎖もしくは軽鎖を生産する、単離された細胞系を含む。
【００３３】
[035] さらにその他の実施態様において、本発明は、前記重鎖もしくはそれらの抗原結合部位、前記軽鎖もしくはそれらの抗原結合部位、または、その両方をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を含む。この単離された核酸は、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含んでいてもよい：
（ａ）配列番号１のヌクレオチドの配列；
（ｂ）配列番号２をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号３のヌクレオチドの配列；
（ｄ）配列番号４をコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号５のヌクレオチドの配列；
（ｆ）配列番号６をコードするヌクレオチド配列；
（ｇ）配列番号７のヌクレオチドの配列；
（ｈ）配列番号８をコードするヌクレオチド配列；
（ｉ）配列番号９のヌクレオチドの配列；
（ｊ）配列番号１０をコードするヌクレオチド配列；
（ｋ）配列番号１１のヌクレオチドの配列；
（ｌ）配列番号１２をコードするヌクレオチド配列；
（ｍ）配列番号１３のヌクレオチドの配列；
（ｎ）配列番号１４をコードするヌクレオチド配列；
（ｏ）配列番号１５のヌクレオチドの配列；
（ｐ）配列番号１６をコードするヌクレオチド配列；
（ｑ）配列番号１７のヌクレオチドの配列；
（ｒ）配列番号１８をコードするヌクレオチド配列；
（ｓ）配列番号１９のヌクレオチドの配列；
（ｔ）配列番号２０をコードするヌクレオチド配列；
（ｕ）配列番号２１のヌクレオチドの配列；
（ｖ）配列番号２２をコードするヌクレオチド配列；
（ｗ）配列番号２３のヌクレオチドの配列；
（ｘ）配列番号２４をコードするヌクレオチド配列；
（ｙ）配列番号２５のヌクレオチドの配列；
（ｚ）配列番号２６をコードするヌクレオチド配列；
（ａａ）配列番号２７のヌクレオチドの配列；
（ｂｂ）配列番号２８をコードするヌクレオチド配列；
（ｃｃ）配列番号２９のヌクレオチドの配列；
（ｄｄ）配列番号３０をコードするヌクレオチド配列；
（ｅｅ）配列番号３１のヌクレオチドの配列；
（ｆｆ）配列番号３２をコードするヌクレオチド配列；
（ｇｇ）配列番号３３のヌクレオチドの配列；
（ｈｈ）配列番号３４をコードするヌクレオチド配列；
（ｉｉ）配列番号３５のヌクレオチドの配列；
（ｊｊ）配列番号３６をコードするヌクレオチド配列；
（ｋｋ）配列番号３７のヌクレオチドの配列；
（ｌｌ）配列番号３８をコードするヌクレオチド配列；
（ｍｍ）配列番号３９のヌクレオチドの配列；
（ｎｎ）配列番号４０をコードするヌクレオチド配列；
（ｏｏ）配列番号４１のヌクレオチドの配列；
（ｐｐ）配列番号４２をコードするヌクレオチド配列；
（ｑｑ）配列番号４３のヌクレオチドの配列；および、
（ｒｒ）配列番号４４をコードするヌクレオチド配列。
【００３４】
[036] 本発明は、本明細書において説明される核酸分子を含むベクターをさらに含み、ここで本ベクターは、任意に、上記核酸分子に作動可能に連結した発現制御配列を含んでいてもよい。その他の実施態様において、本発明は、本明細書において説明されるベクターまたは核酸分子を含む宿主細胞を含む。
【００３５】
[037] その他の実施態様において、本発明は、本明細書において説明される標的化結合物質、モノクローナル抗体または抗原結合部位の生産方法を含み、本方法は、本明細書において説明される宿主細胞または細胞系を適切な条件下で培養する工程、および、前記抗体、または、抗原結合部位を回収する工程を含む。
【００３６】
[038] 本発明は、本明細書において説明される核酸を含むヒト以外のトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物をさらに含み、ここでこれらヒト以外のトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物は、前記核酸を発現する。本発明はまた、ヒトＥｒｂＢ２に特異的に結合する抗体またはそれらの抗原結合部位を単離する方法も含む。本方法は、これらヒト以外のトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物から上記抗体を単離する工程を含む。
【００３７】
[039] その他の実施態様において、本発明は、ＥｒｂＢ２に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体の製造方法を含み、本方法は：
（ｉ）ヒト抗体を生産することができるヒト以外のトランスジェニック動物を、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ２の免疫原性部位、または、ＥｒｂＢ２を発現する細胞もしくは組織で免疫化する工程；
（ｉｉ）該トランスジェニック動物にＥｒｂＢ２に対する免疫反応を起こさせる工程；および、
（ｉｉｉ）該抗体を回収する工程、
を含む。
【００３８】
[040] その他の実施態様において、本発明は、ＥｒｂＢ２が介在する障害の症状の治療、予防または緩和を必要とする被検者におけるＥｒｂＢ２が介在する障害の症状を治療、予防または緩和する方法を含み、本方法は、前記被検者に、本明細書において説明される標的化結合物質、抗体もしくは抗原結合部位、または組成物を投与する工程を含み、ここで前記標的化結合物質、抗体または抗原結合部位は、ＥｒｂＢ２を抑制する。
【００３９】
[041] さらにその他の形態において、本発明は、ＥｒｂＢ２が介在する障害（例えば癌）の症状の治療、予防または緩和を必要とする被検者において、ＥｒｂＢ２が介在する障害（例えば癌）の症状を、ＥｒｂＢ２に特異的に結合する標的化結合物質、例えば抗体またはそれらの抗原結合部位を用いて治療、予防または緩和する方法を含み、本方法は、
（ｉ）重鎖またはそれらの抗原結合部位をコードする単離された核酸分子、標的化結合物質、例えば抗体の軽鎖またはそれらの抗原結合部位をコードする単離された核酸分子、または、抗体の軽鎖および重鎖またはそれらの抗原結合部位の両方をコードする核酸分子の有効量を投与する工程；および、
（ｉｉ）これらの核酸分子を発現させる工程、
を含む。
【００４０】
[042] ＥｒｂＢ２が介在する障害は、乳房癌、膀胱癌、肺癌、頭部癌、頚部癌、前立腺癌、胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎臓癌、結腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、および、グリア芽腫からなる群より選択することができる。
【００４１】
[043] その他の実施態様において、本発明は、ＥｒｂＢ２を発現する癌細胞増殖の抑制を必要とする被検者において、ＥｒｂＢ２を発現する癌細胞増殖の抑制方法を含み、本方法は、前記被検者に、本明細書において説明される標的化結合物質、例えば抗体もしくは抗原結合部位、または組成物を投与する工程を含み、ここで前記標的化結合物質は、ＥｒｂＢ２を抑制する。その他の実施態様において、前記標的化結合物質は、抗体である。その他の実施態様において、前記抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、または、ヒトモノクローナル抗体またはそれらの抗原結合部位である。
【００４２】
[044] その他の実施態様において、本発明は、例えば被検者の細胞、または、ＥｒｂＢ２を発現する癌細胞におけるＥｒｂＢ２活性の抑制方法を含み、本方法は、これら細胞と、標的化結合物質、または、本明細書において説明される組成物とを接触させることを含み、ここでこれら細胞におけるＥｒｂＢ２活性は：
（ａ）ＥｒｂＢ２のリン酸化；
（ｂ）ＭＡＰＫ経路の活性化；
（ｃ）ＰＩ３Ｋ経路の活性化；
（ｄ）ＣＤＣ２の抑制；および、
（ｅ）それらの組み合わせ、
からなる群より選択される。
【００４３】
一実施態様において、ＥｒｂＢ２のリン酸化は、４８時間抑制される。その他の実施態様において、前記標的化結合物質は、抗体である。その他の実施態様において、前記抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、または、ヒトモノクローナル抗体またはそれらの抗原結合部位である。
【００４４】
[045] その他の実施態様において、本発明は、ＥｒｂＢ２を発現する細胞におけるＥｒｂＢ２活性の調節方法を含み、本方法は、これら細胞と、抗体または抗原結合部位、または、本明細書において説明される組成物とを接触させることを含み、ここでこれら細胞におけるＥｒｂＢ２活性は、ｐ３８−ＴＳＰ−１経路の活性化である。
【００４５】
[046] 一実施態様において、抗原結合部位は、抗体１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３のうちいずれかの重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、および、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含んでいてもよく、ここで開示されたＣＤＲ内に、２０、１６、１０、９またはそれ未満の、例えば１、２、３、４または５個のアミノ酸付加、置換、欠失および／または挿入を有する。このような修飾は、ＣＤＲ内のどの残基になされていてもよい。
【００４６】
[047] その他の実施態様において、標的化結合物質または抗体は、表４、４（ａ）、および／または、表５で示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列の１、２、３、４、５または６のうちいずれかを含む配列を含んでもよい。その他の実施態様において、標的化結合物質または抗体は、表４、および／または、４（ａ）で示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含んでもよい。その他の実施態様において、標的化結合物質または抗体は、表５で示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含んでもよい。その他の実施態様において、標的化結合物質または抗体は、表４または３（ａ）で示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、および、表５で示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含んでもよい。当然ながら、当業者であればＣＤＲの決定を容易に達成することができる。例えばＫａｂａｔ等，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１〜３２４２，メリーランド州ベセスダ（１９９１），第１〜３巻を参照、または、本明細書において定義された通り。
【００４７】
[048] その他の実施態様において、標的化結合物質または抗体は、表４、４（ａ）、または、表５で示される完全なヒトモノクローナル抗体１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３のいずれか１種のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列の１、２、３、４、５または６のうちいずれかを含む配列を含んでもよい。一実施態様において、標的化結合物質または抗体は、表４および４（ａ）で示される完全なヒトモノクローナル抗体１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含んでもよい。その他の実施態様において、標的化結合物質または抗体は、表５で示される完全なヒトモノクローナル抗体１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含んでもよい。その他の実施態様において、標的化結合物質または抗体は、表４および４（ａ）で示される完全なヒトモノクローナル抗体１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列、ならびに、表５で示される完全なヒトモノクローナル抗体１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】[049] 図１は、１時間（Ｙ軸）および２４時間（Ｘ軸）プレインキュベートした後の、ＭＣＦ７細胞における、１５２ハイブリドーマの上清の、ヘレグリンによって誘導されたＥｒｂＢ２のリン酸化への作用の相関を示すグラフである。
【図２】[050] 図２は、ＬＡ／ＨＡ  ＥＬＩＳＡ解析のデータプロットである。Ｙ軸は、３１ｎｇ／ｍｌのｈＥｒｂＢ２（ＥＣＤ）／ｃＭｙｃ−ＨｉｓをＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした場合の結合シグナル（ＯＤ値）を示す。Ｘ軸は、１０μｇ／ｍｌのＥｒｂＢ２（ＥＣＤ）／ｃＭｙｃ−ＨｉｓをＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした場合の、ＨＡ  ＥＬＩＳＡから誘導されたハイブリドーマの上清中のＥｒｂＢ２特異的な抗体の濃度を示す。
【図３】[051] 図３Ａ〜３Ｃは、ＭＣＦ７細胞において、ヘレグリンによって誘導されたＥｒｂＢ２のリン酸化における１０種の本発明の抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体（ＢおよびＣ）、および、コントロール抗体（Ａ）に関する用量反応曲線を示す。
【図４】[052] 図４Ａ〜４Ｃは、ヘレグリンによって誘導されたＭＣＦ７細胞の増殖における１０種の本発明の抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体（ＢおよびＣ）、および、コントロール抗体（Ａ）に関する用量反応曲線を示す。
【図５】[053] 図５Ａおよび５Ｂは、ＢＴ４７４細胞増殖分析における８種の本発明の抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体（Ｂ）、および、コントロール抗体（Ａ）に関する用量反応曲線を示す。
【図６】[054] 図６Ａおよび６Ｂは、ＳＫＢＲ３細胞増殖分析における、８種の本発明の抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体（Ｂ）、および、コントロール抗体（Ａ）に関する用量反応曲線を示す。
【図７】[055] 図７Ａ〜７Ｃは、細胞をｍＡｂと２４、４８、７２または９６時間インキュベートした後の、ｍＡｂ１．１８．１（Ａ）、ハーセプチン（登録商標）（Ｂ）、および、２Ｃ４（Ｃ）に対する合計のＥｒｂＢ２のリン酸化の用量依存性の応答を示す。
【図８】[056] 図８Ａ〜８Ｃは、細胞をｍＡｂと２４、４８、７２または９６時間インキュベートした後のｍＡｂ１．１８．１（Ａ）、ハーセプチン（登録商標）（Ｂ）、および、２Ｃ４（Ｃ）に対する標準化したＥｒｂＢ２のリン酸化の用量依存性の応答を示す。
【図９】[057] 図９Ａおよび９Ｂは、ＥＬＩＳＡにおいて、試験された本発明の抗体は、ＥｒｂＢ２の結合に関して２Ｃ４（Ｂ）、または、ハーセプチン（登録商標）（Ａ）と競合しないことを示す競合の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
（発明の詳細な説明）
定義および一般的な技術
[058] 本明細書において特に他の定義がない限り、本発明と関連して用いられる科学用語および専門用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈中で別の要求がなされない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、さらに、複数形の用語は、単数形を含むものとする。一般的に、本明細書において説明される細胞および組織培養、細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸化学、および、ハイブリダイゼーションに関連して用いられる学術名、および、それらの技術で用いられる学術名はよく知られており、当業界において一般的に使用されているものである。
【００５０】
[059] 本発明の方法および技術は、一般的に、従来の当業界公知の方法に従って、および、特に他の指定がない限り、本明細書中で引用されて考察されている様々な一般的な参考文献やより具体的な参考文献で説明されているようにして行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ），コールドスプリングハーバー，ニューヨーク州（１９８９）、および、Ａｕｓｕｂｅｌ等，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２），ａｎｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，コールドスプリングハーバーラボラトリープレス，コールドスプリングハーバー，ニューヨーク州（１９９０）を参照（これらは援用により開示に含まれる）。酵素反応および精製技術は、製造元の説明書に従って、当業界で一般的に行われるようにして、または、本明細書において説明されているようにして行われる。本明細書において説明される分析化学、合成有機化学、および、医薬および製薬化学と関連して用いられる学術名、および、それらの実験手順および技術は、よく知られており、当業界において般的に使用されているものである。化学合成、化学分析、医薬配合物、製剤および送達、ならびに被検者の治療のために、標準的な技術が用いられる。
【００５１】
[060] 各抗体には、１または２個の小数点で区切られた２または３個いずれかの数字を含む識別番号が付与されている。場合によっては、１種の抗体の数種のクローンを製造した。多数のクローンは、親配列と同一な核酸およびアミノ酸配列を有するが、異なる識別番号を有しており、それらは別々に列挙することもある。従って、例えば、以下に示す核酸およびアミノ酸配列：
１．４４．１＝１．４４．２＝１．４４．３＝１．４４；
１．１２４＝１．１４８＝１．１４０＝１．１４０．１；
１．４１＝１．４３＝１４３．１＝１４３．２＝１．２２．１；
１．１４．１＝１．１４．２＝１．１４．３＝１．１４；
１．１００．１＝１．１００．２＝１．１００．３＝１．１００；
１．１０７＝１．１０４＝１．１２８＝１．９６＝１．９９＝１．９６．２；
１．１８．１＝１．１８．２＝１．１８．３＝１．１８；
１．２０＝１．１９＝１．２０．１；
１．３９＝１．３９．１＝１．３９．２＝１．３９．３；
１．２４＝１．２２．２＝１．７１．１＝１．２４．３；
１．７１．２＝１．７１．３；
は、同一である。
【００５２】
[061] 以下の用語は、特に他の指定がない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする：
[062] 用語「ポリペプチド」は、天然または人工タンパク質、タンパク質フラグメント、および、タンパク質配列のポリペプチド類似体を包含する。ポリペプチドは、単量体でもよいし、または、高分子でもよい。
【００５３】
[063] 用語「単離されたタンパク質」、「単離されたポリペプチド」または「単離された抗体」とは、その由来または起源に基づき（１）天然の状態でそれらに付随する天然関連成分が混在していない、（２）同じ種由来のその他のタンパク質を含まない、（３）異なる種の細胞によって発現される、または、（４）自然に発生しないタンパク質、ポリペプチドまたは抗体である。従って、化学合成された、または、天然の状態においてそれらの由来となる細胞とは異なる細胞系で合成されたポリペプチドは、その天然関連成分から「単離された」状態になると予想される。またタンパク質も、当業界公知のタンパク質精製技術を用いた単離によって、天然関連成分を実質的に含まない状態になり得る。
【００５４】
[064] 単離された抗体の例としては、ＥｒｂＢ２を用いて親和性によって精製された抗ＥｒｂＢ２抗体、インビトロでハイブリドーマまたはその他の細胞系によって合成された抗ＥｒｂＢ２抗体、および、トランスジェニックマウスから誘導されたヒト抗ＥｒｂＢ２抗体が挙げられる。また標的化結合物質も、本明細書において説明される類似の技術を用いて精製することができる。
【００５５】
[065] 本明細書で用いられる用語「ポリペプチドフラグメント」は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端が欠失しているが、残りのアミノ酸配列が、天然に存在する配列中のそれに対応する位置と同一であるポリペプチドを意味する。いくつかの実施態様において、このようなフラグメントは、少なくとも５、６、８または１０個のアミノ酸長さを有する。その他の実施態様において、このようなフラグメントは、少なくとも１４、少なくとも２０、少なくとも５０、または、少なくとも７０、８０、９０、１００、１５０または２００個のアミノ酸長さを有する。
【００５６】
[066] 本明細書で用いられる用語「〜を調節する（こと）」は、あらゆるレベルの経路の抑制または活性化を意味する。
[067] 具体的な実施態様において、抗ＥｒｂＢ２抗体またはそれらの抗原結合部位に対するアミノ酸置換は：（１）タンパク質分解に対する感受性を減少させるもの、（２）酸化に対する感受性を減少させるもの、（３）タンパク質複合体形成に関する結合親和性を変更するもの、および、（４）ＥｒｂＢ２への特異的結合を依然として保持しながら、このような類似体のその他の物理化学特性または機能特性を付与または改変するもの、である。類似体は、天然に発生するペプチド配列以外の配列の様々な突然変異タンパク質を含んでいてもよい。例えば、単一または複数のアミノ酸置換、好ましくは保存的アミノ酸置換は、天然に発生する配列になされていてもよく、好ましくは分子間の接触を形成するドメインの外側のポリペプチド部分になされていてもよい。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的な特徴を実質的に変化させないと予想される；例えば、置換されたアミノ酸は、親配列に生じる免疫グロブリンの結合ドメインを構築する逆平行β−シートを変性させたり、または、親配列を特徴付けるその他のタイプの二次構造を崩壊させたりしないと予想される。一般的に、逆平行β−シートでは、グリシンおよびプロリンは用いられないと予想される。当業界で認識されるポリペプチドの二次および三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編集．，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎおよびＣｏｍｐａｎｙ，ニューヨーク（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｔｏｏｚｅ編集，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，ニューヨーク，ニューヨーク州（１９９１））；および、Ｔｈｏｒｎｔｏｎ等，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５（１９９１）で説明されており、これらは援用により開示に含まれる。
【００５７】
[068] 非ペプチド類似体は、医薬産業において、鋳型のペプチドの特性に類似した特性を有する薬物として一般的に使用されている。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチドミメティクス（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」または「ペプチドミメティクス（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」と名付けられている。Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）；Ｖｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，ＴＩＮＳ  ｐ．３９２（１９８５）；および、Ｅｖａｎｓ等，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７）は、援用により本明細書の開示に含まれる。このような化合物は、コンピューターを用いた分子モデリングの支援によって開発されることが多い。治療上有用なペプチドに構造的に類似したペプチドミメティクスを用いて、同等な治療または予防作用を発生させることもできる。一般的に、ペプチドミメティクスは、典型的なポリペプチド（すなわち、望ましい生化学的特性または薬理活性を有するポリペプチド）、例えばヒト抗体に構造的に類似しているが、当業界公知の方法によって、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス、および、トランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−および−ＣＨ２ＳＯ−からなる群より選択される連結で任意に置換された１種またはそれより多くのペプチド結合を有する。また、コンセンサス配列の１個またはそれより多くのアミノ酸を、同種のＤ−アミノ酸（例えば、Ｌ−リシンの代わりにＤ−リシン）で系統的に置換して、より安定なペプチドを生成してもよい。加えて、コンセンサス配列、または、実質的に同一なコンセンサス配列の変形型を含む非天然のペプチドを、当業界既知の方法で生成してもよく（ＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２）、援用により本明細書の開示に含まれる）；例えば、これは、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部のシステイン残基を付加することによってなされる。
【００５８】
[069] 本明細書で「抗体」が本発明に関して述べられる場合、一般的にそれは、それらの抗原結合部位も使用される場合があることと理解される。抗原結合部位は、特異的な結合に関して無傷の抗体と競合する。一般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．編集，第２版．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照（参照によりその全体が全ての目的について開示に含まれる）。抗原結合部位は、組換えＤＮＡ技術によって生産されたものでもよいし、または、無傷の抗体の酵素的または化学的な切断によって生産されたものでもよい。いくつかの実施態様において、抗原結合部位としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、および、相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、単鎖抗体（ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ２）、キメラ抗体、二重特異性抗体、および、少なくともポリペプチドへの特異的な抗原結合を付与するのに十分な抗体部分を含むポリペプチドが挙げられる。
【００５９】
[070] 成熟した軽鎖および重鎖両方の可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端の方向で、領域ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、および、ＦＲ４を含む。ここでのアミノ酸の各ドメインへの割り当ては、Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（国立健康研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ），ベセスダ，メリーランド州（１９８７および１９９１）），Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７（１９８７）、または、Ｃｈｏｔｈｉａ等，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８〜８８３（１９８９）に記載の定義に従っている。
【００６０】
[071] 本明細書で用いられるように、抗体が番号で示される場合、それと同じ番号のハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体と同じである。例えば、モノクローナル抗体１．１８は、ハイブリドーマ１＊１８から得られたものと同じ抗体であるか、またはそれらのサブクローンである。サブクローンはさらなる小数点で識別され、例えば１．１８．１と記される。
【００６１】
[072] 本明細書で用いられるように、Ｆｄフラグメントは、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなる抗体フラグメントを意味し；Ｆｖフラグメントは、抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなり；および、ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ等，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４〜５４６（１９８９））は、ＶＨドメインからなる。
【００６２】
[073] いくつかの実施態様において、抗体は単鎖抗体（ｓｃＦｖ）であり、この場合、ＶＬおよびＶＨドメインが、それらを単一のタンパク質鎖にすることを可能にする合成リンカーを介して対になり１価の分子を形成している。（Ｂｉｒｄ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６（１９８８）、および、Ｈｕｓｔｏｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３（１９８８））。いくつかの実施態様において、抗体は、二重特異性抗体（ダイアボディ）、すなわち単一のポリペプチド鎖においてＶＨおよびＶＬドメインが出現している２価の抗体であり、ただしこの場合、同じ鎖で上記２つのドメイン間で対を形成させるには短すぎるリンカーが用いられており、それによってこれらのドメインと、その他の鎖の相補的なドメインとで対を形成させ、２つの抗原結合部位を形成することができる。（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８（１９９３）、および、Ｐｏｌｊａｋ  Ｒ．Ｊ．等，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１〜１１２３（１９９４）を参照）。いくつかの実施態様において、本発明の抗体由来の１種またはそれより多くのＣＤＲが、共有結合または非共有結合のいずれかで分子に包含されていてもよく、それによりその分子をＥｒｂＢ２に特異的に結合するイムノアドヘシンにすることができる。このような実施態様において、ＣＤＲは、より大きいポリペプチド鎖の一部として包含されていてもよいし、共有結合でその他のポリペプチド鎖に連結されていてもよいし、または、非共有結合で包含されていてもよい。
【００６３】
[074] １個またはそれより多くの結合部位を有する実施態様において、結合部位は互いに同一でもよいし、または、異なっていてもよい。
[075] 本明細書で用いられる用語「ヒト抗体」は、可変および定常ドメイン配列がヒト配列であるあらゆる抗体を意味する。この用語は、ヒト遺伝子から誘導された配列を有するが、例えば可能性のある免疫原性を低減させ、親和性を高めるように改変されており、望ましくないフォールディングなどを引き起こす可能性があるシステインが除去された抗体を包含する。この用語は、ヒト細胞において典型的ではない糖付加を付与する可能性があるヒト以外の細胞で、組換えによって生産された抗体を包含する。これらの抗体は、以下で説明されるような様々な方法で製造することができる。
【００６４】
[076] 用語「キメラ抗体」は、本明細書で用いられる場合、２種またはそれより多くの異なる抗体由来の領域を含む抗体を意味する。一実施態様において、キメラ抗体の１種またはそれより多くのＣＤＲは、ヒト抗ＥｒｂＢ２抗体から誘導される。その他の実施態様において、全てのＣＤＲは、ヒト抗ＥｒｂＢ２抗体から誘導される。その他の実施態様において、１種より多くのヒト抗ＥｒｂＢ２抗体由来のＣＤＲが、キメラ抗体に連結されている。例えば、キメラ抗体は、第一のヒト抗ＥｒｂＢ２抗体の軽鎖ＣＤＲ１、第二のヒト抗ＥｒｂＢ２抗体の軽鎖由来のＣＤＲ２、および、第三のヒト抗ＥｒｂＢ２抗体の軽鎖由来のＣＤＲ３を含んでもよく、さらに、重鎖由来のＣＤＲは、１種またはそれより多くのその他の抗ＥｒｂＢ２抗体から誘導されてもよい。さらに、フレームワーク領域は、１種またはそれより多くのＣＤＲの元となった抗ＥｒｂＢ２抗体の１種、または、１種またはそれより多くの異なるヒト抗体から誘導されてもよい。
【００６５】
[077] いくつかの実施態様において、本発明のキメラ抗体は、ヒト化抗ＥｒｂＢ２抗体である。本発明のヒト化抗ＥｒｂＢ２抗体は、１種またはそれより多くのフレームワーク領域のアミノ酸配列、および／または、１種またはそれより多くの本発明のヒト抗ＥｒｂＢ２抗体の定常領域の少なくとも一部からのアミノ酸配列、および、ヒト以外の抗ＥｒｂＢ２抗体から誘導されたＣＤＲを含む。
【００６６】
[078] 本明細書で用いられる「抑制抗体」  （また本明細書においては、「アンタゴニスト抗体」とも言う）は、ＥｒｂＢ２を発現する細胞、組織または有機体に添加すると、１種またはそれより多くのＥｒｂＢ２活性を少なくとも約３０％抑制する抗体を意味する。いくつかの実施態様において、このような抗体は、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、または、１００％より多くＥｒｂＢ２活性を抑制する。いくつかの実施態様において、このような抑制抗体は、ヘレグリンのようなリガンドの存在下で添加される。いくつかの実施態様において、本発明のアンタゴニスト抗体は、少なくとも１種のＥｒｂＢ２活性を５倍減少させる。
【００６７】
[079] 抗体の「結合フラグメント」は、組換えＤＮＡ技術によって、または、酵素的に、または、無傷の抗体の化学的な切断によって生産される。結合フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、および、単鎖抗体が挙げられる。「二重特異性」または「二官能性」抗体以外の抗体は、それぞれ同一な結合部位を有するものと理解される。過量の抗体が、対する受容体に結合した受容体の量を、（インビトロでの競合結合分析で測定した場合に）少なくとも約２０％、４０％、６０％または８０％、および、より一般的には約８５％より高い割合で減少させる場合、抗体は、受容体の対する受容体への付着が実質的に抑制される。
【００６８】
[080] 抗体または免疫グロブリン分子のフラグメントまたは類似体は、当業者であれば本明細書の教示に従って容易に製造することができる。フラグメントまたは類似体の好ましいアミノおよびカルボキシ末端は、機能性ドメインの境界付近に存在する。構造および機能性ドメインは、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データを、公開の配列データベース、または、私有の配列データベースと比較することによって同定することができる。好ましくは、既知の構造および／または機能を有するその他のタンパク質に存在する配列モチーフ、または、予想されたタンパク質コンフォメーションドメインを同定するために、コンピューターによる比較方法が用いられる。既知の三次元構造にフォールディングされるタンパク質配列を同定する方法は、既知である。Ｂｏｗｉｅ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１６４（１９９１）を参照。
【００６９】
[081] 全抗体のフラグメントは、抗原を結合させる機能を達成することができることが示されている。結合フラグメントの例は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．等，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４〜５４６）；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８，５５２〜５５４）；単一の抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント（Ｈｏｌｔ等（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１，４８４〜４９０）；（ｉｖ）ＶＨまたはＶＬドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．等，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４〜５４６（１９８９），ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８，５５２〜５５４，Ｈｏｌｔ等（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１，４８４〜４９０］；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、２つの連結されたＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメント（ｖｉｉ）単一鎖のＦｖ分子（ｓｃＦｖ）（ここでＶＨドメインおよびＶＬドメインはペプチドリンカーで連結されており、それにより２つのドメインが接触して抗原結合部位を形成することが可能である）（Ｂｉｒｄ等，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３〜４２６，，Ｈｕｓｔｏｎ等，（１９８８）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８５，５８７９〜５８８３）；（ｖｉｉｉ）二重特異性の単一鎖のＦｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）および（ｉｘ）「二重特異性抗体（ダイアボディ）」、遺伝子融合によって構築された多価または多重特異性を有するフラグメント（ＷＯ９４／１３８０４；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．（１９９３）ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０  ６４４４〜６４４８）である。Ｆｖ、ｓｃＦｖまたは二重特異性抗体分子は、ＶＨとＶＬドメインとを連結させるジスルフィド架橋の取り込みによって安定化されていてもよい（Ｒｅｉｔｅｒ，Ｙ．等，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１４，１２３９〜１２４５，１９９６）。また、ＣＨ３ドメインに結合したｓｃＦｖを含むミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）を形成してもよい（Ｈｕ，Ｓ．等，（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６，３０５５〜３０６１）。結合フラグメントのその他の例としては、Ｆａｂ’が挙げられる、これは、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に、数個の残基（例えば抗体のヒンジ領域からの１個またはそれより多くのシステインなど）が付加されている点でＦａｂフラグメントとは異なるものであり、さらに、Ｆａｂ’−ＳＨが挙げられ、これは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を有するＦａｂ’フラグメントである。
【００７０】
[082] 「抑制性の標的化結合物質」は、本明細書で用いられる場合、ＥｒｂＢ２を発現する細胞、組織または有機体に添加した場合、１種またはそれより多くのＥｒｂＢ２活性を少なくとも約３０％抑制する標的化結合物質を意味する。いくつかの実施態様において、標的化結合物質は、ＥｒｂＢ２活性を、少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、または、１００％より多く抑制する。いくつかの実施態様において、抑制性の標的化結合物質は、ヘレグリンのようなリガンドの存在下で添加される。いくつかの実施態様において、本発明の標的化結合物質は、ＥｒｂＢ２の少なくとも１つの活性を５倍減少させる。
【００７１】
[083] 本明細書で用いられる用語「表面プラズモン共鳴」は、リアルタイムの生体特異的な相互作用の解析を可能にする光学現象を意味し、これは例えば、ビアコア（ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ）システム（ファルマシア・バイオセンサー社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ），スウェーデン国ウプサラ、および、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いて、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによってなされる。さらなる説明に関しては、Ｊｏｎｓｓｏｎ  Ｕ．等，Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９〜２６（１９９３）；Ｊｏｎｓｓｏｎ  Ｕ．等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：６２０〜６２７（１９９１）；Ｊｏｎｓｓｏｎ  Ｂ．等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５〜１３１（１９９５）;および、Ｊｏｈｎｓｓｏｎ  Ｂ．等，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８〜２７７（１９９１）を参照。
【００７２】
[084] 用語「ＫＤ」は、特定の抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を意味する。
[085] 用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合できる、または、別の方法で分子と相互作用することができるあらゆるタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、一般的に、アミノ酸、または、炭水化物もしくは糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面の配置からなり、一般的に、特異的な３次元構造の特徴、加えて特異的な電荷の特徴を有する。エピトープは、「リニア」エピトープでもよいし、または「コンフォメーショナル」エピトープでもよい。リニアエピトープにおいて、タンパク質とそれと相互作用する分子（例えば抗体）間の相互作用地点全てが、タンパク質の一次アミノ酸配列にそって直線的に発生する。コンフォメーショナルエピトープにおいて、その相互作用地点は、互いに離れたタンパク質のアミノ酸残基にわたって発生する。抗体は、解離定数が≦１ｍＭ、好ましくは≦１００ｎＭ、最も好ましくは≦１０ｎＭの場合に特異的に抗原と結合すると言われている。具体的な実施態様において、ＫＤは、１ｐＭ〜５００ｐＭである。その他の実施態様において、ＫＤは、５００ｐＭ〜１μＭである。その他の実施態様において、ＫＤは、１μＭ〜１００ｎＭである。その他の実施態様において、ＫＤは、１００ｍＭ〜１０ｎＭである。抗原上の望ましいエピトープが決定されたら、例えば本発明において説明される技術を用いて、そのエピトープに対する抗体を生成することが可能である。あるいは、それらを発見する工程中に、抗体の生成および特徴付けによって望ましいエピトープに関する情報が解明される可能性がある。続いてこの情報から、抗体を同じエピトープへの結合に関して競合的にスクリーニングすることが可能である。これを達成するアプローチは、互いに競合的に結合する抗体、例えば抗原への結合に関して競合する抗体を発見するための交差競合研究を行うことである。抗体の交差競合に基づき抗体を「結合させる」ためのハイスループットプロセスは、国際特許出願番号ＷＯ０３／４８７３１で説明されている。
【００７３】
[086] 本明細書で用いられるように、２０種の一般的なアミノ酸およびそれらの略語は、慣例的用法に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版，Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編集，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））を参照（これは援用により開示に含まれる）。
【００７４】
[087] 用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書で用いられるように、少なくとも１０個の塩基の長さを有するヌクレオチドの多量体型を意味し、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのいずれか、または、いずれかのタイプのヌクレオチドの改変された形態である。この用語には、一本鎖および二本鎖の形態が含まれる。
【００７５】
[088] 用語「単離されたポリヌクレオチド」は、本明細書で用いられる場合、ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成由来のポリヌクレオチド、または、それらのある種の組み合わせを意味しており、この「単離されたポリヌクレオチド」は、その由来に基づいて、（１）天然において「単離されたポリヌクレオチド」と一緒に見出されるポリヌクレオチド全部または一部に結合していないか、（２）は、天然において「単離されたポリヌクレオチド」と連結されていないポリヌクレオチドに作動可能なように連結しているか、または、（３）天然では、より大きい配列の一部として存在していない。
【００７６】
[089] 本明細書で用いられる用語「天然に存在するヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチド、および、リボヌクレオチドを含む。本明細書で用いられる用語「改変されたヌクレオチド」は、改変された、または、置換された糖基等を有するヌクレオチドを含む。本明細書で述べられている用語「オリゴヌクレオチドの連結」は、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロジセレノアート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロアニロチオアート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロアニラダート（ｐｈｏｓｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）、ホスホロアミダート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）などのようなオリゴヌクレオチドの連結を含む。例えば、ＬａＰｌａｎｃｈｅ等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：９０８１（１９８６）；Ｓｔｅｃ等，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６：６０７７（１９８４）；Ｓｔｅｉｎ等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８）；Ｚｏｎ等，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ６：５３９（１９９１）；Ｚｏｎ等，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｐｐ．８７〜１０８（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編集．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９１））；米国特許第５，１５１，５１０号；Ｕｈｌｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：５４３（１９９０）を参照（これらの開示は参照により本発明に含める）。オリゴヌクレオチドは、必要に応じて検出のための標識を含んでいてもよい。
【００７７】
[090] 「作動可能に連結した（operably linked）」配列は、対象の遺伝子と連続して存在する発現制御配列、および、トランス位で作用するか、または対象の遺伝子を制御するような距離で作用する発現制御配列の両方を含む。用語「発現制御配列」は、本明細書で用いられる場合、それらにライゲーションしているコード配列の発現およびプロセシングを作動させるのに必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列は、適切な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列、および、エンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニル化シグナル；細胞質内のｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を高める配列；および、望ましい場合、タンパク質の分泌を高める配列を含む。このような制御配列の性質は、宿主生物に応じて様々であり；原核生物の場合、このような制御配列は、一般的に、プロモーター、リボゾーム結合部位、および、転写終結配列を含み；真核生物の場合、このような制御配列は、一般的に、プロモーター、および、転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、少なくとも、発現およびプロセシングにとって存在している必要がある全ての成分を含むものとし、さらに、存在が有利である追加の成分、例えばリーダー配列および融合パートナー配列が含まれていてもよい。
【００７８】
[091] 用語「ベクター」は、本明細書で用いられるように、それらに連結された他の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。いくつかの実施態様において、本ベクターはプラスミドであり、すなわち追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされた環状の二本鎖のＤＮＡ断片である。いくつかの実施態様において、本ベクターは非ウイルスベクターであり、ここで、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲーションしていてもよい。いくつかの実施態様において、本ベクターは、導入される宿主細胞中で自律複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌性のベクター、および、エピソームの哺乳動物ベクター）。その他の実施態様において、本ベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入する際に宿主細胞のゲノムに統合させることもでき、それによって宿主ゲノムと一緒に複製される。その上、所定のベクターは、それらの作動可能に結合した遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と述べられる。
【００７９】
[092] 本明細書で用いられる用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入された細胞を意味する。当然ながら、「組換え宿主細胞」および「宿主細胞」は、特定の対象の細胞を意味するだけでなく、このような細胞の後代も意味する。突然変異または環境の影響のいずれかのために所定の改変が次の世代で起こる可能性もあるため、このような後代は親の細胞とは実際に同一ではない可能性があるが、それでもなお本明細書で用いられる用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。
【００８０】
[093] 本明細書で述べられている用語「選択的にハイブリダイズする」とは、検出可能に、かつ特異的に結合することを意味する。本発明に係るポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびそれらのフラグメントは、あまりにも多量の検出可能な非特異的核酸への結合を最小化するようなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、核酸鎖に選択的にハイブリダイズする。「高いストリンジェンシー」または「高度にストリンジェントな」条件を用いて、当業界で知られており、さらに本明細書において考察されているような選択的なハイブリダイゼーション条件を達成することができる。「高いストリンジェンシー」または「高度にストリンジェントな」条件の一例は、ポリヌクレオチドとその他のポリヌクレオチドとを、６×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、５０％ホルムアミド、５×デンハルト試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの断片化した変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション緩衝液中で、４２℃のハイブリダイゼーション温度で１２〜１６時間インキュベートすること（ここで一方のポリヌクレオチドが、膜のような固体表面に付着させてあってもよい）それに続いて、１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを含む洗浄緩衝液を用いて５５℃で２回洗浄することである。さらに、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ等，９．５０〜９．５５頁も参照。
【００８１】
[094] 用語「ＣＤＲ領域」または「ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔ等．１９９１（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．等．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ，ワシントン）およびその後の版で定義されるような、または、本明細書において定義されるような、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の高度可変領域を示すこととする。抗体は、典型的には、３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲを含む。本明細書において、ＣＤＲまたはＣＤＲｓという用語は、状況に応じて、これらの領域のうち１個または数個を示す目的で用いられており、または、これらの領域の全体（ここに、抗体が認識する抗原またはエピトープに対する抗体の親和性結合に関与するアミノ酸残基の大部分が含まれる）を示すでも用いられる。
【００８２】
[095] ６個の短いＣＤＲ配列のなかでも、重鎖（ＨＣＤＲ３）の第三のＣＤＲは、より大きいサイズ変動性（実質的にはそれを引き起こす遺伝子の配置のメカニズムによる、より大きい多様性）を有する。既知の最長のサイズは２６であるが、２個もの短いアミノ酸も可能である。またＣＤＲの長さは、特定の基礎となるフレームワークに適合できる長さに応じて様々であってよい。機能的に言えば、ＨＣＤＲ３は、抗体の特異性の決定において部分的に役割を果たす（Ｓｅｇａｌ等，ＰＮＡＳ，７１：４２９８〜４３０２，１９７４，Ａｍｉｔ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：７４７〜７５３，１９８６，Ｃｈｏｔｈｉａ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１〜９１７，１９８７，Ｃｈｏｔｈｉａ等，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７〜８８３，１９８９，Ｃａｔｏｎ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４：１９６５〜１９６８，１９９０，Ｓｈａｒｏｎ等，ＰＮＡＳ，８７：４８１４〜４８１７，１９９０，Ｓｈａｒｏｎ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４：４８６３〜４８６９，１９９０，Ｋａｂａｔ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：１７０９〜１７１９，１９９１）。
【００８３】
[096] 本明細書で述べられている用語「一連のＣＤＲ」は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。従って、一連のＨＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、および、ＨＣＤＲ３を意味し、一連のＬＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、および、ＬＣＤＲ３を意味する。特に他の指定がない限り、「一連のＣＤＲ」は、ＨＣＤＲ、および、ＬＣＤＲを含む。
【００８４】
[097] 用語「配列同一性パーセント」は、ヌクレオチド配列に関しては、２つの配列を最大限一致するように並べた場合、それらにおいて同じ残基を意味する。配列同一性によって比較される長さは、少なくとも約９個のヌクレオチド、一般的には少なくとも約１８個のヌクレオチド、より一般的には少なくとも約２４個のヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８個のヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６、４８、または、それより多くのヌクレオチドを含むストレッチであり得る。ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用できる当業界既知の多数の異なるアルゴリズムがある。例えば、ポリヌクレオチド配列は、ＦＡＳＴＡ、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔを用いて比較することができ、これらは、ウィスコンシン・パッケージ・バージョン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ）１０．０、ジェネティックス・コンピューター・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）（ＧＣＧ）（ウィスコンシン州マディソン）中のプログラムである。ＦＡＳＴＡは、例えば、プログラムＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３を含むが、これは、クエリー配列と検索配列との間の最良のオーバーラップの領域のアライメントおよび配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３〜９８（１９９０）；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３２：１８５〜２１９（２０００）；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２２７〜２５８（１９９６）；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７６：７１〜８４（１９９８）；これらは援用により開示に含まれる）。特に他の規定がない限り、特定のプログラムまたはアルゴリズムに関してデフォルトパラメーターが用いられる。例えば、ヌクレオチド配列間の配列同一性パーセントは、ＦＡＳＴＡをそのデフォルトパラメーターで用いて（６の文字サイズ、および、スコアリングマトリックスに関するＮＯＰＡＭファクター）、または、ＧＣＧバージョン６．１で提供されているようなＧａｐをそのデフォルトパラメーターで用いて決定することができる（これらは援用により開示に含まれる）。
【００８５】
[098] ヌクレオチド配列と言う場合は、特に他の規定がない限りその相補物も包含する。従って、具体的な配列を有する核酸と言う場合は、その相補配列を有するその相補鎖を包含すると理解することとする。
【００８６】
[099] 本明細書で用いられる用語「配列同一性パーセント」および「パーセント配列相同性」は、同じ意味で用いられる。
[0100] 用語「実質的な類似性」または「実質的な配列類似性」は、核酸またはそれらのフラグメントに対して述べられる場合、ヌクレオチド配列がその他の核酸（またはその相補鎖）を用いた適切なヌクレオチド挿入または欠失によって最適に並べられた場合に、上記で考察されたＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐのようなあらゆる周知の配列同一性のアルゴリズムによって測定した場合、ヌクレオチド塩基の少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、および、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％が同一であることを意味する。
【００８７】
[0101] ポリペプチドに適用する場合、用語「実質的な同一性」は、２つのペプチド配列が、例えばＧａｐまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムで、プログラムと共に同梱された状態のデフォルトのＧａｐウェイトを用いることによって最適に並べられた場合、これらペプチド配列が少なくとも７０％、７５％または８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％または９５％の配列同一性、および、より好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％の配列同一性を共有することを意味する。具体的な実施態様において、同一ではない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なっている。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖Ｒ基を有するその他のアミノ酸残基で置換されている置換である。一般的に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させないと予想される。２個またはそれより多くのアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なるような場合において、配列同一性パーセントを上方調整して、置換の保存的性質に関して修正することもある。この調節を行う手段は当業者周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４３：３０７〜３１（１９９４）を参照。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸グループの例としては、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、および、イソロイシン；２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリン、および、スレオニン；３）アミドを含む側鎖：アスパラギン、および、グルタミン；４）芳香族の側鎖：フェニルアラニン、チロシン、および、トリプトファン；５）塩基性側鎖：リシン、アルギニン、および、ヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸、および、グルタミン酸；および、７）硫黄を含む側鎖：システイン、および、メチオニンが挙げられる。保存的アミノ酸置換のグループは、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタメート−アスパラギン酸、および、アスパラギン−グルタミンである。
【００８８】
[0102] あるいは、保存的置換は、Ｇｏｎｎｅｔ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３〜４５（１９９２）（これは援用により開示に含まれる）で開示されたＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有するあらゆる変化である。「中等度に保存的な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負ではない値を有するあらゆる変化である。
【００８９】
[0103] ポリペプチドに関する配列同一性は、典型的には、配列解析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、様々な置換、欠失、および、保存的アミノ酸置換などのその他の修飾に割り当てられた類似性の尺度を用いて配列をマッチさせる。例えば、ＧＣＧは、「Ｇａｐ」および「Ｂｅｓｔｆｉｔ」のようなプログラムを含んでおり、これらは、それぞれのプログラムによって特定されたデフォルトパラメーターで用いて、密接に関連したポリペプチド（例えば異なる生物種由来相同ポリペプチド）間、または、野生型タンパク質とそれらの突然変異タンパク質の間の配列相同性または配列同一性を決定することができる。例えば、ＧＣＧバージョン６．１（ウィスコンシン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ），ウィスコンシン州）を参照。またポリペプチド配列は、デフォルトまたは推奨されたパラメーターを利用したＦＡＳＴＡを用いて比較することもできる（ＧＣＧバージョン６．１を参照）。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、クエリー配列と検索配列との間の最良のオーバーラップ領域のアライメントおよび配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３〜９８（１９９０）；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３２：１８５〜２１９（２０００））。本発明の配列を異なる生物由来の多数の配列を含むデータベースと比較する場合のその他の好ましいアルゴリズムは、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴ、特にｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎであり、これらはプログラムと共に供給された状態のデフォルトパラメーターを用いられる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜４０２（１９９７）を参照。
【００９０】
[0104] 相同性に関して比較されるポリペプチド配列の長さは、一般的に、少なくとも約１６個のアミノ酸残基、一般的には少なくとも約２０残基、より一般的には少なくとも約２４残基、典型的には少なくとも約２８残基、および、好ましくは約３５残基より多くと予想される。多数の異なる生物由来の配列を含むデータベースを検索する場合、アミノ酸配列を比較することが好ましい。
【００９１】
[0105] 本明細書で考察されるように、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列におけるわずかな変化は、本発明に包含されるものであり、このようなアミノ酸配列における変化は、少本明細書において説明される抗体または免疫グロブリン分子に対してなくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、最も好ましくは９９％の配列同一性を維持するものとして考慮される。具体的には、保存的アミノ酸置換が考慮される。保存的置換は、関連する側鎖を有するアミノ酸のファミリー内で起こる置換である。遺伝学的にコードされたアミノ酸は、一般的に、以下のファミリーに分類される：（１）酸性＝アスパルテート、グルタメート；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および、（４）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。より好ましいファミリーは、以下の通りである：セリン、および、スレオニンは、脂肪族−ヒドロキシファミリーであり；アスパラギン、および、グルタミンは、アミドを含むファミリーであり；アラニン、バリン、ロイシン、および、イソロイシンは、脂肪族ファミリーであり；および、フェニルアラニン、トリプトファン、および、チロシンは、芳香族ファミリーである。例えば、当然ながら、ロイシンをイソロイシンまたはバリンで、アスパルテートをグルタメートで、スレオニンをセリンで孤立して置換したり、または、類似のアミノ酸を構造的に関連するアミノ酸で置換したりしても、特に置換がフレームワーク部位内のアミノ酸に関与しない場合、得られた分子の結合機能または特性にたいした影響はないと予想される。アミノ酸の変化によって機能的なペプチドが得られるかどうかは、ポリペプチド誘導体の特異的な活性を分析することによって容易に決定することができる。分析は、本明細書において詳細に説明されている。抗体または免疫グロブリン分子のフラグメントまたは類似体は、当業者であれば容易に製造することができる。フラグメントまたは類似体の好ましいアミノおよびカルボキシ末端は、機能性ドメインの境界付近に存在する。構造および機能性ドメインは、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データを、公開の配列データベース、または、私有の配列データベースと比較することによって同定することができる。好ましくは、既知の構造および／または機能を有するその他のタンパク質に存在する配列モチーフ、または、予想されたタンパク質コンフォメーションドメインを同定するために、コンピューターによる比較方法が用いられる。既知の三次元構造にフォールディングされるタンパク質配列を同定する方法は、既知である。Ｂｏｗｉｅ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１６４（１９９１）。従って、前述の実施例は、当業者であれば、本明細書において説明される抗体に従って構造および機能性ドメインを定義するのに用いることができる配列モチーフおよび構造的なコンフォメーションを確認可能であることを示している。
【００９２】
[0106] 抗原結合部位は、一般的に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と名付けられた６個の表面ポリペプチドループによって形成された抗原が結合する境界面を有する可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）免疫グロブリンドメインによって形成される。各ＶＨには、フレームワーク領域（ＦＲ）と共に３つのＣＤＲがあり（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）、各ＶＬには、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３がある。
【００９３】
[0107] 典型的には、ＶＨドメインはＶＬドメインと対を形成し、抗体抗原−結合部位を提供しているが、ＶＨまたはＶＬドメインが単独で用いられて抗原と結合することもできる。ＶＨおよびＶＬドメインの両方を含む抗体抗原−結合部位が形成されるように、ＶＨドメイン（表４を参照）はＶＬドメイン（表５を参照）と対を形成することもある。本明細書において開示されたその他のＶＨおよびＶＬドメインについても類似の実施態様が提供される。その他の実施態様において、表４に記載のＶＨ鎖は、表５に記載の異種ＶＬドメインと対を形成する。軽鎖の無差別性は、当業界において十分に確立されている。ここでも、本明細書において開示されたその他のＶＨおよびＶＬドメインについても類似の実施態様が本発明によって提供される。従って、親のＶＨ、または、表４に記載の抗体鎖のうちいずれかのＶＨは、親のＶＬ、または、表５に記載の抗体のうちいずれかまたはその他の抗体のＶＬと対を形成する可能性がある。
【００９４】
[0108] 抗原結合部位は、開示された一連のＨおよび／またはＬＣＤＲ内に２０、１６、１０、９個またはそれ未満の、例えば１、２、３、４または５個のアミノ酸付加、置換、欠失および／または挿入を含む、親の抗体、または、表１に記載の抗体のいずれかの一連のＨおよび／またはＬＣＤＲを含んでもよい。あるいは、抗原結合部位は、開示された一連のＨおよび／またはＬＣＤＲ内に２０、１６、１０、９個またはそれ未満の、例えば１、２、３、４または５個のアミノ酸置換を含む、親の抗体、または、表１に記載の抗体のいずれかの一連のＨおよび／またはＬＣＤＲを含んでもよい。このような修飾は、場合によって一連のＣＤＲ内のどの残基になされていてもよい。
【００９５】
[0109] 好ましいアミノ酸置換は、：（１）タンパク質分解に対する感受性を減少させるもの、（２）酸化に対する感受性を減少させるもの、（３）タンパク質複合体形成に関する結合親和性を変更するもの、（４）結合親和性を変更するもの、および、（４）このような類似体のその他の物理化学特性または機能特性を付与または改変するものである。類似体は、天然に存在するペプチド配列以外の配列の様々な突然変異タンパク質を含んでいてもよい。例えば、単一または複数のアミノ酸置換（好ましくは保存的アミノ酸置換）が、天然に存在する配列に（好ましくは分子間の接触を形成するドメインの外側のポリペプチドの一部に）形成されていてもよい。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的な特徴を実質的に変化させないと予想される（例えば、アミノ酸置換によって、親配列に存在するへリックスを破壊したり、または、親配列を特徴付けるその他のタイプの二次構造を崩壊させたりする傾向がないと予想される）。当業界で認められているポリペプチドの二次および三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編集．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｔｏｏｚｅ編集，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，ニューヨーク，ニューヨーク州（１９９１））;および、Ｔｈｏｒｎｔｏｎ等，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５（１９９１）（これらはそれぞれ援用により開示に含まれる）で説明されている。
【００９６】
[0110] 本発明のさらなる形態は、表１に列挙された抗体、添付の配列表、本明細書において説明される抗体のうちいずれかのＶＨドメインと、または、表４または表４（ａ）に示されるＨＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２またはＨＣＤＲ３）と、少なくとも約６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８、または、約９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインを含む抗体分子である。本抗体分子はまた、任意に、表１で列挙された抗体、添付の配列表、本明細書において説明される抗体のうちいずれかのＶＬドメインと、または、表５に示されるＬＣＤＲ（例えば、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２またはＬＣＤＲ３）と、少なくとも約６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８、または、約９９％アミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインを含んでいてもよい。２つのアミノ酸配列の同一性（％）を計算するのに使用できるアルゴリズムとしては、例えばＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０５〜４１０）、ＦＡＳＴＡ（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：２４４４〜２４４８）、または、スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズム（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１４７：１９５〜１９７）が挙げられ、例えばデフォルトパラメーターを用いられる。
【００９７】
[0111] その上、本発明のＶＨおよびＶＬドメインおよびＣＤＲの変異体、例えばそのアミノ酸配列が本明細書において記載されているもの、および、ＥｒｂＢ２に関する標的化結合物質および抗体において用いることができるものは、配列を変更したりまたは突然変異させたりする方法、および、望ましい特徴で標的化する抗原に関してスクリーニングする方法を用いて得ることができる。望ましい特徴の例としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：抗原に特異的な既知の抗体に比べて高い抗原に関する結合親和性；抗原活性を有することが知られている場合、抗原に特異的な既知の抗体に比べて高い抗原活性の中和；特異的なモル比での既知の抗体またはリガンドとの抗原に対する特定の競合能力；複合体を免疫沈降させる能力；特定のエピトープに結合する能力；リニアエピトープ、例えば、本明細書において説明されているようなペプチド結合スキャンを用いて、例えば、直鎖状および／または不自然なコンフォメーションでスクリーニングされたペプチドを用いて同定されたペプチド配列；非連続的な残基によって形成されたコンフォメーショナルエピトープ；ＥＲＢｂ２または下流の分子の新しい生物活性を調節する能力。またこのような方法も、本明細書で示される。
【００９８】
[0112] 本発明において、本明細書において開示された抗体分子の変異体を生産して用いる場合もある。多変数のデータ解析技術を構造／特性と活性との関係に適用することにおける計算機化学の前例に従って（Ｗｏｌｄ，等．Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃｓ−Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｅｄ．：Ｂ．Ｋｏｗａｌｓｋｉ），Ｄ．Ｒｅｉｄｅｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，Ｈｏｌｌａｎｄ，１９８４）、抗体の定量的な活性と特性との関係は、周知の数学的な技術を用いて誘導することができ、例えば統計的回帰、パターン認識および分類を用いて誘導することができる（Ｎｏｒｍａｎ等．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．ワイリー−インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）；第３版（１９９８年４月）；Ｋａｎｄｅｌ，Ａｂｒａｈａｍ＆Ｂａｃｋｅｒ，Ｅｒｉｃ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｒｅａｓｏｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ  ＰＴＲ，（１９９５年５月１１日）；Ｋｒｚａｎｏｗｓｋｉ，Ｗｏｊｔｅｋ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｎｏ  ２２（Ｐａｐｅｒ）。オックスフォード・ユニバーシティ・プレス（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）；（２０００年１２月）；Ｗｉｔｔｅｎ，Ｉａｎ  Ｈ．＆  Ｆｒａｎｋ，Ｅｉｂｅ．Ｄａｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｔｏｏｌｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｊａｖａ  Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ．Ｍｏｒｇａｎ  Ｋａｕｆｍａｎｎ；（１９９９年１０月１１日）；Ｄｅｎｉｓｏｎ  Ｄａｖｉｄ  Ｇ．Ｔ．（編集者），Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｃ．Ｈｏｌｍｅｓ，Ｂａｎｉ  Ｋ．Ｍａｌｌｉｃｋ，Ａｄｒｉａｎ  Ｆ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈ．Ｂａｙｅｓｉａｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）．ジョン・ワイリー＆サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）；（２００２年７月）；Ｇｈｏｓｅ，Ａｒｕｐ  Ｋ．＆  Ｖｉｓｗａｎａｄｈａｎ，Ｖｅｌｌａｒｋａｄ  Ｎ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｔｏｏｌｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）。抗体の特性は、抗体配列の経験的および理論モデル（例えば、接触する可能性がある残基の解析、または、計算された物理化学的な特性）、機能的な三次元構造から誘導することができ、さらにこれらの特性は、単独で考察してもよいし、組み合わせて考察してもよい。
【００９９】
[0113] この配列と構造との関係研究を用いて、配列が既知であるが三次元構造が未知の抗体における、ＣＤＲループの三次元構造の維持、すなわち結合特異性の維持に重要な残基を予測することができる。これらの予測は、予測値をリードの最適化実験からの出力値と比較することによって裏付けることができる。構造面に関するアプローチにおいて、本抗体分子のモデルは、自由に利用できる、または、市販のあらゆるパッケージ（例えばＷＡＭ）を用いて作製することができるできる。続いて、タンパク質の可視化および解析ソフトウェアのパッケージ、例えばインサイトＩＩ（Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ）（アクセルリス社（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．））、または、ディープビュー（Ｄｅｅｐ  Ｖｉｅｗ）を用いて、ＣＤＲ中の各位置における可能性のある置換を評価することもできる。続いてこの情報を用いて、活性に最小の作用または有益な作用を与える可能性が高い置換を作製することもできる。
【０１００】
[0114] 一般的には、ＣＤＲ、抗体ＶＨまたはＶＬドメイン、および／または、標的化結合物質のアミノ酸配列内に置換を作製するのに必要な技術が、当業界において利用可能である。変異体の配列は、活性に最小の作用または有益な作用をもたらすと予想される置換、または、そうでない置換を用いて作製され、標的に結合する、および／または、標的を中和する能力、および／または、その他のあらゆる望ましい特性に関して試験されることがある。
【０１０１】
[0115] 配列が本明細書において具体的に開示されているＶＨおよびＶＬドメインのいずれかの可変ドメインのアミノ酸配列の変異体が、本発明に従って考察したようにして用いられることもある。
【０１０２】
[0116] 本明細書で用いられる用語「標識」または「標識された」は、抗体または標的化結合物質へのその他の分子の取り込みを意味する。一実施態様において、このような標識は、検出可能なマーカーであり、例えば、放射標識したアミノ酸の取り込み、または、マーカーを有するアビジン（例えば、蛍光マーカーを含むストレプトアビジン、または、光学的な方法または比色方法によって検出することができる酵素活性）によって検出することができるビオチニル部分のポリペプチドへの付着である。その他の実施態様において、標識またはマーカーは、治療剤、例えば薬物複合体、または、毒素であってもよい。ポリペプチドおよび糖タンパク質に標識を付ける様々な方法が当業界既知であり、使用可能である。ポリペプチド用の標識の例としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：放射性同位体、または、放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドの蛍光）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光のマーカー、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される既定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対の配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）、磁気性の物質、例えばガドリニウムキレート、毒素、例えば百日咳毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−ジヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、および、ピューロマイシン、および、それらの類似体または相同体。いくつかの実施態様において、標識を様々な長さのスペーサーアームによって取り付けることによって、起こり得る立体障害を減少させることができる。
【０１０３】
[0117] 本明細書で用いられる「標的化結合物質」は、例えば標的部位に選択的に結合する抗体またはそれらの結合フラグメントのような物質である。一実施態様において、標的化結合物質は、１つの標的部位にのみ特異的である。その他の実施態様において、標的化結合物質は、１個より多くの標的部位に特異的である。一実施態様において、標的化結合物質は、モノクローナル抗体あってもよく、その標的部位はエピトープであり得る。以下で説明されているように、標的化結合物質は、抗体の少なくとも１つの抗原結合ドメインを含んでもよく、ここで前記ドメインは、異種タンパク質の足場、例えば非抗体タンパク質の足場に融合しているか、または、それらに含まれている。
【０１０４】
[0118] 本明細書および請求項にわたって、「〜を含む」という文言、または「〜を含む」または「〜を含むこと」などのその変化形は、そこで述べられている整数またはその整数群を包含するが、その他のあらゆる整数または整数群を排除しないことを意味するものとする。
【０１０５】
ヒト抗ＥｒｂＢ２抗体およびそれらの特徴付け
[0119] 一実施態様において、本発明は、抗ＥｒｂＢ２標的化結合物質を提供する。その他の実施態様において、本発明は、抗ＥｒｂＢ２抗体を提供する。いくつかの実施態様において、抗ＥｒｂＢ２抗体は、ヒト抗体である。いくつかの実施態様において、本発明は、シグナル配列、アミノ酸１〜２２を含まない（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：Ｐ０４６２６）（配列番号４５）ヒトＥｒｂＢ２に結合する抗ＥｒｂＢ２抗体を提供する。いくつかの実施態様において、ヒト抗ＥｒｂＢ２抗体は、トランスジェニック動物がヒト抗体を生産するように、ゲノムにヒト免疫グロブリン遺伝子が含まれるヒト以外のトランスジェニック動物（例えばげっ歯類）を免疫化することによって生産される。
【０１０６】
[0120] 本発明の抗ＥｒｂＢ２抗体は、ヒトカッパ、または、ヒトラムダ軽鎖、または、それらから誘導されたアミノ酸配列を含んでいてもよい。カッパ軽鎖を含むいくつかの実施態様において、軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインは、ヒトＶＫ１、ＶＫ２またはＶＫ４ファミリーの遺伝子によって部分的にコードされている。具体的な実施態様において、このような軽鎖は、ヒトＶＫＡ１、ＶＫＡ２、ＶＫＢ３、または、ＶＫＬ１遺伝子を利用する。
【０１０７】
[0121] 様々な実施態様において、このような軽鎖の可変ドメインは、ヒトＡ２遺伝子、および、ヒトＪＫ１遺伝子；ヒトＬ１遺伝子、および、ヒトＪＫ５遺伝子；ヒトＢ３遺伝子、および、ヒトＪＫ３遺伝子；または、ヒトＡ１遺伝子、および、ヒトＪＫ４遺伝子を利用する。
【０１０８】
[0122] いくつかの実施態様において、ＥｒｂＢ２抗体のＶＬは、ヒト遺伝子の生殖細胞系のアミノ酸配列と比較して１個またはそれより多くのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様において、抗ＥｒｂＢ２抗体のＶＬは、生殖細胞系のアミノ酸配列と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３個のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様において、抗ＥｒｂＢ２抗体のＶＬは、生殖細胞系のアミノ酸配列と比較して０、１または２個のアミノ酸挿入を含む。いくつかの実施態様において、このような生殖細胞系からの１個またはそれより多くの置換は、軽鎖のＣＤＲ領域中である。いくつかの実施態様において、生殖細胞系と比較した場合のアミノ酸置換は、抗体１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３のＶＬのいずれか１種またはそれより多くにおいて、生殖細胞系と比較した場合の置換と同じ位置の１種またはそれより多くに存在する。例えば、本発明の抗ＥｒｂＢ２抗体のＶＬは、生殖細胞系と比較して１個またはそれより多くの、抗体１．１４のＶＬにおいて見出されるアミノ酸置換を含んでいてもよいし、または、生殖細胞系と比較して１個またはそれより多くの、抗体１．１８のＶＬにおいて見出されるアミノ酸置換が存在していてもよい。いくつかの実施態様において、このようなアミノ酸の変化は、参照の抗体に存在する置換と、１個またはそれより多くの同じ位置に存在するが、参照の抗体に存在する置換とは異なる置換を含む。
【０１０９】
[0123] いくつかの実施態様において、生殖細胞系と比較した場合のアミノ酸の変化は、抗体１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３のＶＬのいずれかにおける位置と、１個またはそれより多くの同じ位置に発生するが、このような変化は、参照の抗体におけるアミノ酸と比較した場合、このような位置において保存的アミノ酸置換を示す可能性がある。例えば、これらの抗体の１種における特定の位置が、生殖細胞系と比較して変化しておりグルタメートである場合、その位置においてグルタメートはアスパルテートで置換される可能性がある。同様に、生殖細胞系と比較した場合のアミノ酸置換がセリンである場合、その位置において、セリンはスレオニンで保存的に置換される可能性がある。保存的アミノ酸置換は、上記で考察されている。
【０１１０】
[0124] いくつかの実施態様において、ヒト抗ＥｒｂＢ２抗体の軽鎖は、抗体１．４４．１（配列番号４）、１．１４０（配列番号８）、１．４３．１（配列番号１２）、１．１４．１（配列番号１６）、１．１００．１（配列番号２０）、１．９６．２（配列番号２４）、１．１８．１（配列番号２８）、１．２０．１（配列番号３２）、１．３９．１（配列番号３６）、１．２４．３（配列番号４０）、１．７１．３（配列番号４４）のＶＬアミノ酸配列、または、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３個までの保存的アミノ酸置換、および／または、合計３個までの非保存的アミノ酸置換を有する前記アミノ酸配列を含む。
【０１１１】
[0125] 具体的な実施態様において、抗ＥｒｂＢ２抗体の軽鎖は、抗体１．４４．１（配列番号４）、１．１４０（配列番号８）、１．４３．１（配列番号１２）、１．１４．１（配列番号１６）、１．１００．１（配列番号２０）、１．９６．２（配列番号２４）、１．１８．１（配列番号２８）、１．２０．１（配列番号３２）、１．３９．１（配列番号３６）、１．２４．３（配列番号４０）、１．７１．３（配列番号４４）から選択される抗体のＶＬ領域のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域、または、それぞれ４個未満または３個未満の保存的アミノ酸置換、および／または、合計３個またはそれより少ない非保存的アミノ酸置換を有する前記ＣＤＲ領域を含む。
【０１１２】
[0126] 重鎖に関して、いくつかの実施態様において、可変ドメイン（ＶＨ）は、ヒトＶＨ３、または、ＶＨ４ファミリーの遺伝子によって部分的にコードされている。具体的な実施態様において、重鎖ＶＨは、ヒトＶＨ３−２１、ＶＨ３−１３、ＶＨ４−３１、または、ＶＨ３−７遺伝子を利用する。様々な実施態様において、重鎖ＶＨは、ヒトＶＨ３−２１遺伝子、ヒトＤ５−２４遺伝子、および、ヒトＪＨ４Ｂ遺伝子を利用する。その他の実施態様において、重鎖ＶＨは、ヒトＶＨ３−７遺伝子、および、ヒトＪＨ６；ヒトＶＨ４−３１遺伝子、ヒトＤ３−１０遺伝子、および、ヒトＪＨ６Ｂ遺伝子；または、ヒトＶＨ３−１３遺伝子、ヒトＤ６−１９遺伝子、および、ヒトＪＨ６Ｂ遺伝子を利用する。いくつかの実施態様において、抗ＥｒｂＢ２抗体のＶＨ配列は、生殖細胞系のアミノ酸配列と比較して１個またはそれより多くのアミノ酸置換、欠失または挿入（付加）を含む。
【０１１３】
[0127] いくつかの実施態様において、重鎖の可変ドメインは、生殖細胞系のアミノ酸配列と比較して１、２、３、４、５、６または７個の突然変異を含み、そのうち０、１、２または３個は置換の可能性がある。いくつかの実施態様において、重鎖の可変ドメインは、生殖細胞系のアミノ酸配列と比較して０、１、２または３個の付加を含む。いくつかの実施態様において、このような突然変異は、生殖細胞系のアミノ酸配列と比較した場合、非保存的置換である。いくつかの実施態様において、このような突然変異は、重鎖のＣＤＲ領域中にある。いくつかの実施態様において、このようなアミノ酸の変化は、抗体１．１４．１、１．１８．１、１．１９、１．２０．１、１．２２．１、１．２２．２、１．２４．３、１．４１、１．４３．１、１４３．２、１．４４．１、１．３９．１、１．７１．１、１．７１．３、１．９６．２、１．９９、１．１００．１、１．１０４、１．１０７、１．１２４、１．１２８、１．１４０．１または１．１４８のＶＨのいずれか１種またはそれより多くにおいて、１個またはそれより多くの生殖細胞系からの突然変異と同じ位置に形成される。その他の実施態様において、このようなアミノ酸の変化は、１個またはそれより多くの参照の抗体に存在する突然変異と同じ位置に存在するが、参照の抗体に存在する突然変異とは異なる突然変異を含む。
【０１１４】
[0128] いくつかの実施態様において、重鎖は、抗体１．４４．１（配列番号２）、１．１４０．１（配列番号６）、１．４３．１（配列番号１０）、１．１４．１（配列番号１４）、１．１００．１（配列番号１８）、１．９６．２（配列番号２２）、１．１８．１（配列番号２６）、１．２０．１（配列番号３０）、１．３９．１（配列番号３４）、１．２４．３（配列番号３８）、１．７１．３（配列番号４２）のＶＨのアミノ酸配列；または、１、２、３、４、６、８または１０個までの保存的アミノ酸置換、および／または、合計３個までの非保存的アミノ酸置換を有する前記ＶＨのアミノ酸配列を含む。
【０１１５】
[0129] いくつかの実施態様において、重鎖は、抗体１．１４．１、１．１８．１、１．１９、１．２０．１、１．２２．１、１．２２．２、１．２４．３、１．４１、１．４３．１、１４３．２、１．４４．１、１．３９．１、１．７１．１、１．７１．３、１．９６．２、１．９９、１．１００．１、１．１０４、１．１０７、１．１２４、１．１２８、１．１４０．１または１．１４８の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域、または、それぞれ５個未満、４個未満、３個未満、または、２個未満の保存的アミノ酸置換、および／または、合計３個またはそれより少ない非保存的アミノ酸置換を有する前記ＣＤＲ領域を含む。
【０１１６】
[0130] その他の実施態様において、本抗体は、上記で開示された軽鎖、および、上記で開示された重鎖を含む。さらなる実施態様において、軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲは、同じ抗体由来である。
【０１１７】
[0131] 抗体中のシステインを１個またはそれより多く変化させるために形成され得るアミノ酸置換のうちいくつかのタイプは、これらに限定されないが、例えばアラニンまたはセリンなどのその他の残基に対して化学的に反応性を有する可能性がある。一実施態様において、非標準的なシステインの置換が存在する。このような置換は、可変ドメインのＣＤＲまたはフレームワーク領域中に、または、抗体の定常ドメイン中に形成される可能性がある。いくつかの実施態様において、システインが、標準的である。
【０１１８】
[0132] 形成され得るアミノ酸置換のその他のタイプは、抗体中の可能性のあるあらゆるタンパク質分解部位を変化させるためのものである。このような部位は、可変ドメインのＣＤＲまたはフレームワーク領域中に、または、抗体の定常ドメイン中に存在する可能性がある。システイン残基の置換、および、タンパク質分解部位の除去は、抗体製品において不均質性が生じるあらゆる危険を減少させる可能性があるため、その均一性を高める。その他のタイプのアミノ酸置換はアスパラギン−グリシン対を除去することであり、これは、このアスパラギン−グリシン対が、残基の一方またはその両方を改変することによって可能性のある脱アミド部位を形成するためである。さらにその他のタイプのアミノ酸置換はメチオニン残基に存在し、これは、酸化部位を除去するためである。
【０１１９】
[0133] いくつかの実施態様において、本発明の抗ＥｒｂＢ２抗体の重鎖のＣ末端におけるリシンが切断される。本発明の様々な実施態様において、抗ＥｒｂＢ２抗体の重鎖および軽鎖は、任意にシグナル配列を含んでいてもよい。
【０１２０】
[0134] 一形態において、本発明は、ヒト抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体、および、それらを生産するハイブリドーマ細胞系を抑制することに関する。表１に、重鎖および軽鎖の可変ドメインをコードする核酸配列の識別子（配列番号）、および、それに応じて推測されたアミノ酸配列を列挙する。
【０１２１】
【表１】
0005638804.tif 000002
【０１２２】
抗ＥｒｂＢ２抗体のクラスおよびサブクラス
[0135] 抗ＥｒｂＢ２抗体のクラスおよびサブクラスは、当業界既知のどのような方法で決定してもよい。一般的に、抗体のクラスおよびサブクラスは、抗体の特定のクラスおよびサブクラスに特異的な抗体を用いて決定してもよい。このような抗体は、市販されている。このようなクラスおよびサブクラスは、ＥＬＩＳＡ、または、ウェスタンブロットによって決定することができ、加えてその他の技術によって決定することもできる。あるいは、このようなクラスおよびサブクラスは、抗体の重鎖および／または軽鎖の定常ドメインの全部または一部を配列解析し、それらのアミノ酸配列と、免疫グロブリンの様々なクラスおよびサブクラスの既知のアミノ酸配列とを比較し、抗体のクラスおよびサブクラスを決定することによって決定してもよい。
【０１２３】
[0136] いくつかの実施態様において、抗ＥｒｂＢ２抗体は、モノクローナル抗体である。抗ＥｒｂＢ２抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、または、ＩｇＤ分子であってもよい。その他の実施態様において、抗ＥｒｂＢ２抗体は、ＩｇＧであり、さらにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４サブクラスである。その他の好ましい実施態様において、本抗体は、サブクラスＩｇＧ２である（Ｋａｂａｔ等（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．米国保健社会福祉省（ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ），ワシントンＤＣを参照）。
【０１２４】
抗ＥｒｂＢ２標的化結合物質および抗体のＥｒｂＢ２に対する結合親和性
[0137] 本発明のいくつかの実施態様において、標的化結合物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体は、ＥｒｂＢ２に高親和性で結合する。いくつかの実施態様において、高分解能のバイオコア（ｂｉｏｃｏｒｅ）解析を用いたところ、標的化結合物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体は、１３．５×１０−９Ｍまたはそれ未満のＫＤでＥｒｂＢ２に結合する。さらにその他の実施態様において、標的化結合物質および／または抗体は、高分解能のバイオコア（ｂｉｏｃｏｒｅ）解析を用いたところ、１３．×１０−９Ｍ、１３．×１０−９Ｍ、１１．×１０−９Ｍ、１２．×１０−９Ｍ、１０．×１０−９Ｍ、５．×１０−９Ｍ、３×１０−９、２×１０−９、１×１０−９Ｍ、または、５×１０−１０Ｍまたはそれ未満のＫＤでＥｒｂＢ２に結合する。具体的な実施態様において、標的化結合物質および／または抗体は、１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３から選択される抗体と実質的に同じＫＤでＥｒｂＢ２に結合する。さらにその他の好ましい実施態様において、標的化結合物質および／または抗体は、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８または４２において見出されるＶＨ領域のアミノ酸配列を有する重鎖の可変ドメイン、配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４において見出されるＶＬ領域のアミノ酸配列を有する軽鎖の可変ドメイン、または、その両方を含む抗体と実質的に同じＫＤでＥｒｂＢ２に結合する。その他の好ましい実施態様において、本抗体は、配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４において見出されるＶＬ領域のアミノ酸配列を有する軽鎖の可変ドメインのＣＤＲ領域を含む標的化結合物質および／または抗体、または、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８または４２において見出されるＶＨ領域のアミノ酸配列を有する重鎖の可変ドメインのＣＤＲ領域を含む標的化結合物質および／または抗体、または、その両方を含む標的化結合物質および／または抗体と実質的に同じＫＤでＥｒｂＢ２に結合する。
【０１２５】
[0138] いくつかの実施態様において、標的化結合物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体は、低い解離速度定数（ｋｏｆｆ）を有する。いくつかの実施態様において、標的化結合物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体は、１．０×１０−３ｓ−１もしくはそれより低いｋｏｆｆ、または、５．０×１０−４ｓ−１もしくはそれより低いｋｏｆｆを有する。その他の好ましい実施態様において、本抗体は、２×１０−４ｓ−１またはそれより低いｋｏｆｆでＥｒｂＢ２に結合する。いくつかの実施態様において、ｋｏｆｆは、本明細書において説明される抗体、例えば１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３から選択される抗体と実質的に同じである。いくつかの実施態様において、標的化結合物質および／または抗体は、１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３から選択される抗体由来の重鎖のＣＤＲ領域、または、軽鎖のＣＤＲ領域、または、その両方を含む抗体と実質的に同じｋｏｆｆでＥｒｂＢ２に結合する。いくつかの実施態様において、標的化結合物質および／または抗体は、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８または４２において見出されるＶＨ領域のアミノ酸配列を有する重鎖の可変ドメイン、配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４において見出されるＶＬ領域のアミノ酸配列を有する軽鎖の可変ドメイン、または、その両方を含む抗体と実質的に同じｋｏｆｆでＥｒｂＢ２に結合する。
【０１２６】
[0139] 標的化結合物質および抗ＥｒｂＢ２抗体のＥｒｂＢ２に対する結合親和性および解離速度は、当業界既知の方法で決定することができる。結合親和性は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、フローサイトメトリー、表面プラズモン共鳴、例えばビアコア（ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ）によって測定することができる。解離速度は、表面プラズモン共鳴によって測定することができる。好ましくは、結合親和性および解離速度は、表面プラズモン共鳴によって測定される。より好ましくは、結合親和性および解離速度は、ビアコアＴＭを用いて測定される。当業界既知の方法を用いることによって、抗体が、抗ＥｒｂＢ２抗体と実質的に同じＫＤを有するかどうかを決定することができる。実施例１２は、フローサイトメトリーによって抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体の親和定数を決定する方法を例示する。
【０１２７】
抗ＥｒｂＢ２抗体によって認識されるＥｒｂＢ２エピトープの同定
[0140] 本発明は、標的化結合物質および／またはヒト抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体を提供するものであり、上記結合物質および／またはヒト抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体は、ＥｒｂＢ２に結合し、（ａ）１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４、および、１．７１．３から選択される抗体；（ｂ）配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８または４２において見出される可変ドメインのアミノ酸配列を有する重鎖の可変ドメインを含む抗体；（ｃ）配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４の可変ドメインのアミノ酸配列を有する軽鎖の可変ドメインを含む抗体；または、（ｄ）（ｂ）で定義された重鎖の可変ドメインと（ｃ）で定義された軽鎖の可変ドメインとの両方を含む抗体と同じエピトープと競合する、または、それらと競合および／または結合する。２種の抗体が互いにＥｒｂＢ２への結合に関して同等に競合する場合、これらの抗体は、競合すると言われる。
【０１２８】
[0141] 当業界既知の方法を用いることによって、標的化結合物質および／または抗体が、同じエピトープに結合するかどうか、または、抗ＥｒｂＢ２抗体との結合に関して競合するかどうかを決定することができる。一実施態様において、本発明の抗ＥｒｂＢ２抗体を飽和条件下でＥｒｂＢ２に結合させ、続いて試験抗体のＥｒｂＢ２に結合する能力が測定される。試験抗体が、抗ＥｒｂＢ２抗体と同時にＥｒｂＢ２に結合することができる場合、この試験抗体は、抗ＥｒｂＢ２抗体とは異なるエピトープに結合する。しかしながら、試験抗体が同時にＥｒｂＢ２に結合できない場合、この試験抗体は、同じエピトープ、オーバーラップするエピトープ、または、ヒト抗ＥｒｂＢ２抗体に結合したエピトープに近接しているエピトープに結合する。この実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ、または、フローサイトメトリーを用いて行うことができる。
【０１２９】
[0142] 標的化結合物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体が、その他の抗ＥｒｂＢ２抗体と競合するかどうかを試験するために、２つの方針で、すなわち参照の抗体が試験抗体をブロックするかどうか、および、それとは反対のケースであるかどうかを決定する方針で、上述の競合方法を用いてもよい。その他の実施態様において、この実験はＥＬＩＳＡを用いて行われる。以下でＫＤを決定する方法をさらに考察する。
【０１３０】
抗ＥｒｂＢ２抗体によるＥｒｂＢ２活性の抑制
[0143] 様々な実施態様において、本発明は、ＥｒｂＢ２によってシグナル伝達を抑制する標的化結合物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体を提供する。一実施態様において、標的化結合物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体は、ＥｒｂＢ２のリガンドによって誘導されたシグナル伝達を抑制する。一実施態様において、標的化結合物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体は、ＥｒｂＢ２のリガンドによって誘導されたシグナル伝達を、リガンドのＥｒｂＢ２への結合をブロックしないで抑制する。その他の実施態様において、ＥｒｂＢ２は、ヒトＥｒｂＢ２である。その他の実施態様において、抗ＥｒｂＢ２抗体は、ヒト抗体である。いくつかの実施態様において、リガンドは、ヘレグリン−βである。標的化結合物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体のＥＣ５０は、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡで、または、以下で説明されている分析のような細胞ベースの分析によってモニターされる直接の結合分析で、抗体の抗原への結合を検出することによって測定することができる。一実施態様において、標的化結合物質および／または抗体またはそれらの部分は、ＥｒｂＢ２受容体によってリガンドによって誘導されたシグナル伝達を、５０ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは２５ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ以下、さらにより好ましくは５ｎｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０で抑制する。いくつかの実施態様において、標的化結合物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体は、ＥｒｂＢ２のリガンドによって誘導されたシグナル伝達を、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％抑制する。抑制の測定は、当業界既知のあらゆる手段によって達成することができる。
【０１３１】
[0144] その他の実施態様において、本発明は、ＥｒｂＢ２のリン酸化を抑制する標的化結合物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体を提供する。様々な実施態様において、標的化結合物質および／または抗体のＥＣ５０は、５０ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは２５ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ以下、さらにより好ましくは５ｎｇ／ｍｌ以下である。いくつかの実施態様において、標的化結合物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体は、ＥｒｂＢ２のリン酸化を、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％抑制する。実施例４、９および１１は、ＥｒｂＢ２のリン酸化分析を例示する。
【０１３２】
[0145] その他の実施態様において、本発明は、ＭＡＰＫ経路の活性化を抑制する標的化結合物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体を提供する。様々な実施態様において、標的化結合物質および／または抗体のＥＣ５０は、５０ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは２５ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ以下、さらにより好ましくは５ｎｇ／ｍｌ以下である。いくつかの実施態様において、標的化結合物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体は、ＥｒｂＢ２のリン酸化を、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％抑制する。細胞中のＭＡＰＫ経路の活性化をモニターする分析は、当業界既知である（米国特許出願第２００３０１８６３８２号および２００３００９６３３３号を参照、参照によりそれらの全体をあらゆる目的において本発明に含める）。
【０１３３】
[0146] その他の実施態様において、本発明は、ｐ３８−ＴＳＰ−１経路の活性を調節する標的化結合物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体を提供する。いくつかの実施態様において、標的化結合物質および／または抗体は、ｐ３８−ＴＳＰ−１経路を活性化する。その他の実施態様において、標的化結合物質および／または抗体は、ｐ３８−ＴＳＰ−１経路を抑制する。様々な実施態様において、標的化結合物質および／または抗体のＥＣ５０は、５０ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは２５ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ以下、さらにより好ましくは５ｎｇ／ｍｌ以下である。いくつかの実施態様において、標的化結合物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体は、ＥｒｂＢ２のリン酸化を、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％抑制する。細胞中のｐ３８−ＴＳＰ−１経路の活性化をモニターする分析は、当業界既知である（米国特許出願第２００６００８９３９３号および２００２０１０３２５３号を参照、参照によりそれらの全体をあらゆる目的において本発明に含める）。
【０１３４】
[0147] その他の実施態様において、本発明は、ＰＩ３Ｋ経路の活性化を抑制する標的化結合物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体を提供する。様々な実施態様において、標的化結合物質および／または抗体のＥＣ５０は、５０ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは２５ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ以下、さらにより好ましくは５ｎｇ／ｍｌ以下である。いくつかの実施態様において、標的化結合物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体は、ＥｒｂＢ２のリン酸化を、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％抑制する。細胞中のＰＩ３Ｋ経路の活性化をモニターする分析は、当業界既知である（米国特許出願第２００２００３７２７６号および２００４０１７６３８５号を参照、援用によりそれらの全体をあらゆる目的において本発明に含める）。
【０１３５】
[0148] その他の実施態様において、本発明は、ＣＤＣ２の抑制を抑制する標的化結合物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体を提供する。様々な実施態様において、標的化結合物質および／または抗体のＥＣ５０は、５０ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは２５ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ以下、さらにより好ましくは５ｎｇ／ｍｌ以下である。いくつかの実施態様において、標的化結合物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体は、ＥｒｂＢ２のリン酸化を、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％抑制する。細胞中のＣＤＣ２の抑制をモニターする分析は、当業界既知である（米国特許出願第２００３０２２５０９８号および２００４０１１０７７５号を参照、援用によりそれらの全体をあらゆる目的において本発明に含める）。
【０１３６】
抗ＥｒｂＢ２抗体を用いた細胞増殖の抑制
[0149] いくつかの実施態様によれば、本発明は、癌の増殖、または、インビボまたはインビトロで形質転換した細胞の増殖、または、その両方を抑制する標的化結合物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体を提供する。その他の実施態様において、標的化結合物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体は、増殖を、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％抑制する。一実施態様において、リン酸化は、動物が本抗体で処理されてから少なくとも１日後に測定され、増殖は、動物が本抗体で処理されてから３日後に測定される。その他の実施態様において、抑制は、動物が本抗体で処理されてから少なくとも１時間後に測定される。様々な実施態様において、標的化結合物質および／または抗体のＥＣ５０は、セルタイター（ｃｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ）または増殖マーカーによって測定した場合、３．５μｇ／ｍｌ以下、好ましくは３００ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ以下、さらにより好ましくは５０ｎｇ／ｍｌ以下である。実施例９および１０は、増殖分析を例示する。
【０１３７】
種および分子選択性
[0150] 本発明のその他の形態において、標的化結合物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体は、種および分子選択性の両方を示す。いくつかの実施態様において、標的化結合物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体は、ヒト（配列番号４５）、および、カニクイザルＥｒｂＢ２に結合する。本明細書の教示に従って、当業界公知の方法を用いて、標的化結合物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体に関する種選択性を決定することができる。例えば、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、または、ＲＩＡを用いて種選択性を決定することができる。その他の実施態様において、フローサイトメトリーを用いて種選択性を決定することができる。
【０１３８】
[0151] いくつかの実施態様において、標的化結合物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体は、ＥｒｂＢ２以外のその他のあらゆるタンパク質への明らかな特異的結合をまったく示さない。本明細書の教示に従って、当業界公知の方法を用いて、標的化結合物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体のＥｒｂＢ２に関する選択性を決定することができる。例えば、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、または、ＲＩＡを用いて選択性を決定することができる。
【０１３９】
抗体の生産方法、および、抗体を生産する細胞系
[0152] いくつかの実施態様において、ヒト抗体は、そのゲノム内にヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の遺伝子座のいくつかまたは全部を含むヒト以外のトランスジェニック動物をＥｒｂＢ２抗原で免疫化することによって生産される。その他の実施態様において、ヒト以外の動物は、キセノマウス（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ）動物（アムジェン・フレモント社（Ａｍｇｅｎ  Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｉｎｃ．），フレモント，カリフォルニア州）である。
【０１４０】
[0153] キセノマウス（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ）マウスは、ヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の遺伝子座の大きいフラグメントを含む人工的に作り出されたマウスの系統であり、マウス抗体産生能がない。例えば、Ｇｒｅｅｎ等，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３〜２１（１９９４）、および、米国特許第５，９１６，７７１号、５，９３９，５９８号、５，９８５，６１５号、５，９９８，２０９号、６，０７５，１８１号、６，０９１，００１号、６，１１４，５９８号、６，１３０，３６４号、６，１６２，９６３号、および、６，１５０，５８４号を参照。さらに、ＷＯ９１／１０７４１、ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９９／４５０３１、ＷＯ９９／５３０４９、ＷＯ００／０９５６０、および、ＷＯ００／０３７５０４も参照。
【０１４１】
[0154] その他の形態において、本発明は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むヒト以外のトランスジェニック動物をＥｒｂＢ２抗原で免疫化することによる、ヒト以外のマウス以外の動物から抗ＥｒｂＢ２抗体の製造方法を提供する。このような動物は、上記で引用された文書で説明されている方法を用いて生産することができる。これらの文書で開示された方法は、米国特許第５，９９４，６１９号（参照により本発明に含める）で説明されているようにして改変することができる。米国特許第５，９９４，６１９号は、ブタおよびウシから誘導された新規の培養した内部細胞塊（ＣＩＣＭ）の細胞および細胞系、および、異種ＤＮＡが挿入されたトランスジェニックＣＩＣＭ細胞を生産する方法を説明している。このＣＩＣＭトランスジェニック細胞を用いて、クローニングされたトランスジェニック胎芽、胎児および子孫を生産することができる。また、この５，９９４，６１９号特許は、異種ＤＮＡをそれらの後代に遺伝させることができるできるトランスジェニック動物の生産方法も説明している。本発明の好ましい実施態様において、ヒト以外の動物は、哺乳動物であり、具体的にはラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、または、ウマである。
【０１４２】
[0155] キセノマウス（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ）マウスは、完全ヒト抗体の成人と同様のヒト抗体群を生産し、抗原特異的なヒト抗体を生成する。いくつかの実施態様において、キセノマウス（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ）マウスは、酵母人工染色体（ＹＡＣ）に、ヒト重鎖の遺伝子座およびカッパ軽鎖の遺伝子座の生殖細胞系配置のフラグメントを導入することによって、ヒト抗体のＶ遺伝子群の約８０％を含む。その他の実施態様において、キセノマウス（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ）マウスはさらに、ほぼ全てのヒトラムダ軽鎖の遺伝子座を含む。Ｍｅｎｄｅｚ等，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６〜１５６（１９９７），ＧｒｅｅｎおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３〜４９５（１９９８）、および、ＷＯ９８／２４８９３を参照（これらの開示は参照により本発明に含める）。その他の実施態様において、本抗体は、ヒトトランスクロモソミックマウスで生産される（ＷＯ０２／４３４７８、および、ＷＯ０２／０９２８１２を参照、参照により本発明に含める）。
【０１４３】
[0156] いくつかの実施態様において、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むヒト以外の動物は、ヒト免疫グロブリンの「ミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）」を有する動物である。このミニ遺伝子座アプローチにおいて、外因性Ｉｇ遺伝子座は、Ｉｇ遺伝子座由来の個々の遺伝子を包含させることによって模擬される。従って、動物へ挿入するためのコンストラクトに、１種またはそれより多くのＶＨ遺伝子、１種またはそれより多くのＤＨ遺伝子、１種またはそれより多くのＪＨ遺伝子、ｍｕ定常ドメイン、および、第二の定常ドメイン（好ましくはガンマ定常ドメイン）が形成される。このアプローチは、特に、米国特許第５，５４５，８０７号、５，５４５，８０６号、５，５６９，８２５号、５，６２５，１２６号、５，６３３，４２５号、５，６６１，０１６号、５，７７０，４２９号、５，７８９，６５０号、５，８１４，３１８号、５，５９１，６６９号、５，６１２，２０５号、５，７２１，３６７号、５，７８９，２１５号、および、５，６４３，７６３（参照により本発明に含める）で説明されている。
【０１４４】
[0157] その他の形態において、本発明は、ヒト化抗ＥｒｂＢ２抗体の製造方法を提供する。いくつかの実施態様において、ヒト以外の動物は、以下で説明されているようにして、抗体産生を許容する条件下でＥｒｂＢ２抗原で免疫化される。その動物から抗体産生細胞を単離し、ハイブリドーマを生産させるための骨髄腫と融合させ、対象の抗ＥｒｂＢ２抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸が単離される。その後、これらの核酸を、当業者既知の技術を用いて、さらに以下でさらに説明されているようにして加工して、ヒト以外の配列の量を減少させることができ、すなわち、抗体をヒト化して、ヒトにおける免疫反応を減少させることができる。
【０１４５】
[0158] いくつかの実施態様において、ＥｒｂＢ２抗原は、単離された、および／または、精製されたＥｒｂＢ２である。その他の実施態様において、ＥｒｂＢ２抗原は、ヒトＥｒｂＢ２である。いくつかの実施態様において、ＥｒｂＢ２抗原は、ＥｒｂＢ２のフラグメントである。いくつかの実施態様において、ＥｒｂＢ２フラグメントは、ＥｒｂＢ２の細胞外ドメインである。いくつかの実施態様において、ＥｒｂＢ２フラグメントは、ＥｒｂＢ２の細胞外ループである（Ｃｈｏ等，Ｎａｔｕｒｅ．２００３年２月１３日；４２１（６９２４）：７５６〜６０を参照、参照により本発明に含める）。いくつかの実施態様において、ＥｒｂＢ２フラグメントは、ＥｒｂＢ２の少なくとも１つのエピトープを含む。その他の実施態様において、ＥｒｂＢ２抗原は、細胞表面で、ＥｒｂＢ２またはそれらの免疫原性フラグメントを発現する、または、過剰発現する細胞である。いくつかの実施態様において、ＥｒｂＢ２抗原は、ＥｒｂＢ２融合タンパク質である。いくつかの実施態様において、ＥｒｂＢ２は、合成ペプチド免疫原である。
【０１４６】
[0159] 動物の免疫化は、当業界既知のあらゆる方法によって行うことができる。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，コールドスプリングハーバープレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ），１９９０を参照。ヒト以外の動物、例えばマウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、および、ウマを免疫化する方法は当業界公知である。例えば、上記のＨａｒｌｏｗおよびレーン、および、米国特許第５，９９４，６１９号を参照。その他の実施態様において、ＥｒｂＢ２抗原は、免疫反応を刺激するためにアジュバントと共に投与される。典型的なアジュバントとしては、完全または不完全フロインドアジュバント、ＲＩＢＩ（ムラミールジペプチド）、または、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）が挙げられる。このようなアジュバントは、局所的な堆積物中にポリペプチドを隔離することによって、ポリペプチドを急速な分散から保護することができ、または、このようなアジュバントは、宿主がマクロファージおよびその他の免疫系の成分に対して遊走性を示す因子を分泌するように刺激する物質を含んでいてもよい。好ましくは、ポリペプチドが投与されている場合、免疫化スケジュールは、２回またはそれより多くのポリペプチド投与、数週間にわたる拡散を含むと予想される。実施例１は、キセノマウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅＴＭ）マウスにおける抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体の生産方法を例示する。
【０１４７】
抗体および抗体産生細胞系の生産
[0160] ＥｒｂＢ２抗原で動物を免疫化した後、その動物から、抗体、および／または、抗体産生細胞を得ることができる。いくつかの実施態様において、抗ＥｒｂＢ２抗体を含む血清は、動物から採血するかか、または、動物を殺すことによって動物から得られる。このような血清は、動物から得られた血清と同様にして使用することができ、血清から免疫グロブリン分画を得てもよいし、または、血清から抗ＥｒｂＢ２抗体を精製してもよい。
【０１４８】
[0161] いくつかの実施態様において、免疫動物から単離された細胞から抗体産生不死化細胞系が製造される。免疫化後、動物を殺し、当業界既知のあらゆる手段によってリンパ節および／または脾臓のＢ細胞を不死化する。不死化細胞の方法としては、これらに限定されないが、それらを腫瘍遺伝子でトランスフェクトすること、それらを腫瘍形成性のウイルスに感染させること、および、それらを不死化細胞が選択される条件下で培養すること、それらを発癌性化合物または突然変異を誘発する化合物に晒すこと、それらを不死化細胞（例えば骨髄腫細胞）と融合させること、および、腫瘍抑制遺伝子を不活性化することが挙げられる。例えば、上記のＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅを参照。骨髄腫細胞との融合が用いられる場合、骨髄腫細胞は、好ましくは、免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない（非分泌細胞系）。不死化細胞は、ＥｒｂＢ２、それらの部分、または、ＥｒｂＢ２を発現する細胞を用いてスクリーニングされる。その他の実施態様において、最初のスクリーニングは、酵素結合免疫検査法（ＥＬＩＳＡ）、または、ラジオイムノアッセイを用いて行われる。ＥＬＩＳＡスクリーニングの例は、ＷＯ００／３７５０４（これは援用により開示に含まれる）に示されている。
【０１４９】
[0162] 抗ＥｒｂＢ２抗体産生細胞（例えばハイブリドーマ）を選択し、クローニングし、および、さらに盛んな増殖、高い抗体産生などの望ましい特徴、および、以下でさらに考察されるような望ましい抗体の特徴に関してスクリーニングする。ハイブリドーマは、インビボで同一遺伝子型の動物で、免疫系が欠如した動物（例えばヌードマウス）で増殖させてもよいし、または、インビトロでの細胞培養で増殖させてもよい。ハイブリドーマの選択、クローニングおよび増殖方法は当業者周知である。
【０１５０】
[0163] 一実施態様において、免疫動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するヒト以外の動物であり、さらに脾臓のＢ細胞は、ヒト以外の動物と同じ種由来の骨髄腫細胞系に融合している。より好ましい実施態様において、免疫動物は、キセノマウス（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ）マウスであり、骨髄腫細胞系は、非分泌性のマウス骨髄腫である。さらにより好ましい実施態様において、骨髄腫細胞系は、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ））である。例えば、実施例２を参照。
【０１５１】
[0164] 従って、一実施態様において、本発明は、ＥｒｂＢ２に向けられたヒトモノクローナル抗体、または、それらのフラグメントを生産する細胞系を生産する方法を提供し、本方法は、（ａ）本明細書において説明されるヒト以外のトランスジェニック動物を、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ２の一部、または、ＥｒｂＢ２を発現する細胞もしくは組織で免疫化すること；（ｂ）該トランスジェニック動物にＥｒｂＢ２に対する免疫反応を起こさせること；（ｃ）トランスジェニック動物から抗体産生細胞を単離すること；（ｄ）該抗体産生細胞を不死化すること；（ｅ）不死化した抗体産生細胞それぞれのモノクローナル群を形成すること；および、（ｆ）不死化した抗体産生細胞をスクリーニングして、ＥｒｂＢ２に向けられた抗体を同定することを含む。
【０１５２】
[0165] その他の形態において、本発明は、ヒト抗ＥｒｂＢ２抗体を生産するハイブリドーマを提供する。その他の実施態様において、本ハイブリドーマは、上述したようなマウスハイブリドーマである。その他の実施態様において、本ハイブリドーマは、ヒト以外マウス以外の種、例えばラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、または、ウマ中で生産される。その他の実施態様において、本ハイブリドーマは、ヒトハイブリドーマである。
【０１５３】
[0166] 本発明の一実施態様において、抗体産生細胞を単離し、宿主細胞中で、例えば骨髄腫細胞中で発現させる。その他の好ましい実施態様において、トランスジェニック動物をＥｒｂＢ２で免疫化し、その初代細胞、例えば脾臓または末梢血液細胞を、免疫化されたトランスジェニック動物から単離し、望ましい抗原に特異的なそれぞれの抗体産生細胞を同定する。それぞれ個々の細胞由来のポリアデニル化されたｍＲＮＡを単離し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を、可変領域の配列にアニールするセンスプライマー、例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域の遺伝子のほとんど、または全てのＦＲ１領域を認識するディジェネレートプライマー、および、定常または連結領域の配列にアニールするアンチセンスプライマーを用いて行う。続いて、重鎖および軽鎖の可変ドメインのｃＤＮＡをクローニングし、あらゆる適切な宿主細胞で、それぞれの免疫グロブリン定常領域（例えば重鎖およびκまたはλ軽鎖の定常ドメイン）を有するキメラ抗体として発現させる。Ｂａｂｃｏｏｋ，Ｊ．Ｓ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７８４３〜４８，１９９６を参照（これは援用により開示に含まれる）。続いて、本明細書において説明されているようにして、抗ＥｒｂＢ２抗体を同定し、単離してもよい。
【０１５４】
[0167] その他の実施態様において、ファージディスプレイ技術を用いて、ＥｒｂＢ２への多様な親和性を有する抗体群を含むライブラリーを提供することができる。このような群を生産するために、免疫動物由来のＢ細胞を不死化することは不必要である。それよりも、ＤＮＡ源として一次Ｂ細胞を直接用いてもよい。Ｂ細胞から得られたｃＤＮＡの混合物、例えば血液または脾臓から誘導されたｃＤＮＡの混合物を用いて、発現ライブラリー、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにトランスフェクションさせたヒトファージディスプレイライブラリーを製造することができる。得られた細胞は、ＥｒｂＢ２に対する免疫反応性に関して試験される。このようなライブラリーから高親和性のヒト抗体を同定するための技術は、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ等，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１３：３２４５〜３２６０（１９９４）；Ｎｉｓｓｉｍ等，同書中，ｐｐ．６９２〜６９８、および、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ等，同書中，１２：７２５〜７３４（これらは参照により開示に含まれる）で説明されている。最終的に、ライブラリーから、抗原に関して望ましい規模の結合親和性を生産するクローンを同定し、このような結合に関与する生成物をコードするＤＮＡを回収し、標準的な組換え発現用に操作する。また、予め操作されたヌクレオチド配列を用いてファージディスプレイライブラリーを構築し、類似の様式でスクリーニングしてもよい。一般的に、重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡは、独立して供給されるか、または、ファージライブラリー中での生産のためにＦｖ類似体が形成されるように連結させる。具体的な実施態様において、鎖のシャッフリングを利用してもよい（Ｋａｎｇ等，ＰＮＡＳ（１９９１）Ｄｅｃ  １５；８８（２４）：１１１２０〜３を参照、参照により本発明に含める）。
【０１５５】
[0168] 続いてこのようなファージライブラリーを、ＥｒｂＢ２への親和性が最高の抗体、および、適切なクローンから回収された遺伝物質に関してスクリーニングする。さらに追加でスクリーニングを行うことによって、単離された元の抗体の親和性を高めることができる。
【０１５６】
抗体を作製するための核酸、ベクター、宿主細胞および組換え方法
核酸
[0169] 本発明はまた、抗ＥｒｂＢ２抗体またはそれらの抗原結合部位をコードする核酸分子も包含する。いくつかの実施態様において、異なる核酸分子が、抗ＥｒｂＢ２免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードする。その他の実施態様において、同じ核酸分子が、抗ＥｒｂＢ２免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードする。一実施態様において、このような核酸は、本発明のＥｒｂＢ２抗体をコードする。
【０１５７】
[0170] いくつかの実施態様において、軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインをコードする核酸分子は、生殖細胞系からの突然変異を含む、または、それらを含まない、ヒトＶκＢ３、ＶκＬ１、ＶκＡ２、または、ＶκＡ１遺伝子、および、Ｊκ１、Ｊκ３、Ｊκ４、または、Ｊｋ５遺伝子を利用する。
【０１５８】
[0171] いくつかの実施態様において、軽鎖をコードする核酸分子は、生殖細胞系のアミノ酸配列と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３個の置換、および／または、０、１または２個の挿入を含むアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施態様において、このような核酸分子は、生殖細胞系のＶＫおよびＪＫ配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３個の保存的アミノ酸置換、および／または、合計３個までの非保存的置換を含むＶＬアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。置換は、ＣＤＲ領域、フレームワーク領域、または、定常ドメイン中であり得る。
【０１５９】
[0172] いくつかの実施態様において、このような核酸分子は、抗体１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４および１．７１．３１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４および１．７１．３のいずれか１種のＶＬにおいて見出される変異型と同一な生殖細胞系の配列と比較して１種またはそれより多くの変異体を含むＶＬアミノ酸配列をコードする。
【０１６０】
[0173] いくつかの実施態様において、このような核酸分子は、抗体１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４および１．７１．３１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４および１．７１．３の１種のＶＬにおいて見出される生殖細胞系の配列と比較して少なくとも３個のアミノ酸置換をコードする。
【０１６１】
[0174] いくつかの実施態様において、このような核酸分子は、モノクローナル抗体１．４４．１（配列番号４）、１．１４０（配列番号８）、１．４３．１（配列番号１２）、１．１４．１（配列番号１６）、１．１００．１（配列番号２０）、１．９６．２（配列番号２４）、１．１８．１（配列番号２８）、１．２０．１（配列番号３２）、１．３９．１（配列番号３６）、１．２４．３（配列番号４０）、１．７１．３（配列番号４４）のＶＬアミノ酸配列、または、それらの変異体または一部をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施態様において、このような核酸は、上記で列挙した抗体のうち１つの軽鎖ＣＤＲを含むアミノ酸配列をコードする。
【０１６２】
[0175] いくつかの実施態様において、このような核酸分子は、配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０または４４のうち１つのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの好ましい実施態様において、このような核酸分子は、配列番号３、７、１１、１５、１９、２３、２７、３１、３５、３９、４３のヌクレオチドの配列、または、それらの部分を含む。
【０１６３】
[0176] いくつかの実施態様において、このような核酸は、前記抗体の軽鎖のＣＤＲのアミノ酸配列をコードする。
[0177] いくつかの実施態様において、このような核酸分子は、抗体１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４および１．７１．３１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４および１．７１．３のいずれか１つのＶＬ領域のＶＬアミノ酸配列、または、配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０または４４のいずれか１つのアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一なＶＬアミノ酸配列をコードする。本発明の核酸分子としては、上述した条件のような高度にストリンジェントな条件下で、配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４において見出されるＶＬ領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸、または、配列番号３、７、１１、１５、１９、２３、２７、３１、３５、３９または４３において見出されるＶＬ領域をコードする核酸分子のヌクレオチド配列を有する核酸が挙げられる。
【０１６４】
[0178] その他の実施態様において、このような核酸は、１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４および１．７１．３１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４および１．７１．３から選択される抗体の全長軽鎖をコードする。
【０１６５】
[0179] その他の好ましい実施態様において、このような核酸分子は、ヒトＶＨ３−２１、ヒトＶＨ３−７、ヒトＶＨ４−３１、または、ヒトＶＨ３−１３遺伝子配列、または、それらから誘導された配列を含む重鎖（ＶＨ）の可変ドメインをコードする。様々な実施態様において、このような核酸分子は、ヒトＶＨ３−７遺伝子、および、ヒトＪＨ６；ヒトＶＨ４−３１遺伝子、ヒトＤ３−１０遺伝子、および、ヒトＪＨ６Ｂ遺伝子；または、ヒトＶＨ３−１３遺伝子、ヒトＤ６−１９遺伝子、および、ヒトＪＨ６Ｂ遺伝子を利用する。
【０１６６】
[0180] いくつかの実施態様において、このような核酸分子は、ヒトＶ、ＤおよびＪ遺伝子の生殖細胞系のアミノ酸配列と比較して１、２、３、４、５、６または７個の突然変異（そのうち０、１、２または３個は置換されている可能性がある）を含むアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施態様において、前記突然変異は、ＶＨ領域中である。いくつかの実施態様において、前記突然変異は、ＣＤＲ領域中である。
【０１６７】
[0181] いくつかの実施態様において、このような核酸分子は、モノクローナル抗体１．１４．１、１．１８．１、１．１９、１．２０．１、１．２２．１、１．２２．２、１．２４．３、１．４１、１．４３．１、１４３．２、１．４４．１、１．３９．１、１．７１．１、１．７１．３、１．９６．２、１．９９、１．１００．１、１．１０４、１．１０７、１．１２４、１．１２８、１．１４０．１または１．１４８のＶＨにおいて見出されるアミノ酸の突然変異と同一な、生殖細胞系の配列と比較して１種またはそれより多くのアミノ酸の突然変異をコードする。いくつかの実施態様において、このような核酸は、上記で列挙した列挙したモノクローナル抗体のいずれか１種において見出される少なくとも３個のアミノ酸の突然変異と同一な、生殖細胞系の配列と比較して少なくとも３個のアミノ酸の突然変異をコードする。
【０１６８】
[0182] いくつかの実施態様において、このような核酸分子は、１．４４．１（配列番号２）、１．１４０．１（配列番号６）、１．４３．１（配列番号１０）、１．１４．１（配列番号１４）、１．１００．１（配列番号１８）、１．９６．２（配列番号２２）、１．１８．１（配列番号２６）、１．２０．１（配列番号３０）、１．３９．１（配列番号３４）、１．２４．３（配列番号３８）、１．７１．３（配列番号４２）から選択される抗体のＶＨアミノ酸配列、それらの変異体、または、保存的なアミノ酸の突然変異、および／または、合計３個またはそれより少ない非保存的アミノ酸置換を有する前記配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含む。様々な実施態様において、このような配列は、１種またはそれより多くのＣＤＲ領域、好ましくはＣＤＲ３領域、３種全てのＣＤＲ領域、または、ＶＨ領域全体をコードする。
【０１６９】
[0183] いくつかの実施態様において、このような核酸分子は、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８および４２のうち１つのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの好ましい実施態様において、このような核酸分子は、配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、３７または４１のヌクレオチド配列の少なくとも一部を含む。いくつかの実施態様において、前記部分は、ＶＨ領域、ＣＤＲ３領域、または、３種全てのＣＤＲ領域をコードする。
【０１７０】
[0184] いくつかの実施態様において、このような核酸分子は、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８または４２のいずれか１種のＶＨアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一なＶＨのアミノ酸配列をコードする。本発明の核酸分子としては、上述した条件のような高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、３７または４１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列もしくはそれらのＶＨ領域にハイブリダイズする核酸、または、配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、３７または４１のヌクレオチドの配列を有する核酸、またはそれらのＶＨ領域をコードする核酸が挙げられる。
【０１７１】
[0185] その他の実施態様において、このような核酸は、１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４および１．７１．３から選択される抗体の全長重鎖をコードする。
【０１７２】
[0186] 抗ＥｒｂＢ２抗体またはそれらの部分の重鎖または軽鎖をコードする核酸分子は、このような抗体を生産するあらゆる源から単離することができる。様々な実施態様において、このような核酸分子は、ＥｒｂＢ２で免疫化された動物から単離されたＢ細胞、抗ＥｒｂＢ２抗体を発現するこのようなＢ細胞から誘導された不死化細胞、または、バクテリオファージから単離される。抗体をコードするｍＲＮＡを単離する方法は当業界公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等を参照。このようなｍＲＮＡを用いて、抗体遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、または、ｃＤＮＡクローニングに使用するためのｃＤＮＡを生産してもよい。一実施態様において、このような核酸分子は、その融合パートナーの１種として、ヒト以外のトランスジェニック動物からのヒト免疫グロブリン産生細胞を有するハイブリドーマから単離される。その他の実施態様において、ヒト免疫グロブリン産生細胞は、キセノマウス（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ）動物から単離される。その他の実施態様において、ヒト免疫グロブリン産生細胞は、上述したようなヒト以外マウス以外のトランスジェニック動物由来である。その他の実施態様において、このような核酸は、ヒト以外の非トランスジェニック動物から単離される。このようなヒト以外の非トランスジェニック動物から単離された核酸分子は、例えばヒト化抗体のために用いてもよい。その他の実施態様において、このような核酸は、細菌またはファージから単離される。
【０１７３】
[0187] いくつかの実施態様において、本発明の抗ＥｒｂＢ２抗体の重鎖をコードする核酸は、フレーム内であらゆる源からの重鎖の定常ドメインをコードするヌクレオチド配列に連結された本発明のＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよい。同様に、本発明の抗ＥｒｂＢ２抗体の軽鎖をコードする核酸分子は、フレーム内であらゆる源からの軽鎖の定常ドメインをコードするヌクレオチド配列に連結された本発明のＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
【０１７４】
[0188] 本発明のさらなる形態において、重鎖（ＶＨ）および／または軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインをコードする核酸分子は、全長抗体遺伝子に「変換される」。一実施態様において、ＶＨセグメントがベクター内でＣＨセグメントに作動可能に結合されるように、および／または、ＶＬセグメントがベクター内のでＣＬセグメントに作動可能に結合されるように、ＶＨまたはＶＬドメインをコードする核酸分子は、重鎖の定常（ＣＨ）または軽鎖の定常（ＣＬ）ドメインそれぞれが予めコードされている発現ベクターに挿入することによって全長抗体遺伝子に変換される。その他の実施態様において、ＶＨおよび／またはＶＬドメインをコードする核酸分子は、標準的な分子生物学的な技術を用いて、ＶＨおよび／またはＶＬドメインをコードする核酸分子を、ＣＨおよび／またはＣＬドメインをコードする核酸分子に結合させること、例えばライゲーションすることによって全長抗体遺伝子に変換される。ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン定常ドメイン遺伝子のヌクレオチド配列は、当業界既知である。例えば、Ｋａｂａｔ等，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１〜３２４２，１９９１を参照。続いて、全長の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸分子が導入された細胞から、それら核酸分子を発現させることができ、さらに抗ＥｒｂＢ２抗体を単離することができる。
【０１７５】
[0189] このような核酸分子を用いて、組換えによって多量の抗ＥｒｂＢ２抗体を発現させてもよい。またこのような核酸分子を用いて、以下でさらに説明されているようなキメラ抗体、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、単鎖抗体、イムノアドヘシン、二重特異性抗体（ダイアボディ）、変異した抗体、および、抗体誘導体を生産させてもよい。核酸分子がヒト以外の非トランスジェニック動物から誘導される場合、以下でも説明されているように、その核酸分子を抗体のヒト化に用いてもよい。
【０１７６】
[0190] その他の実施態様において、本発明の核酸分子は、特異的な抗体配列のためのプローブまたはＰＣＲプライマーとして用いられる。例えば、本核酸は、診断方法においてプローブとして、または、特に抗ＥｒｂＢ２抗体の可変ドメインをコードする追加の核酸分子を単離するのに用いることができる、ＤＮＡ領域を増幅するためのＰＣＲプライマーとして用いることができる。いくつかの実施態様において、このような核酸分子は、オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施態様において、このようなオリゴヌクレオチドは、対象の抗体の重鎖および軽鎖の高度な可変性を有するドメイン由来のものである。いくつかの実施態様において、このようなオリゴヌクレオチドは、抗体１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４および１．７１．３（または本明細書において説明されているようなそれらの変異体）のＣＤＲの１種またはそれより多くの全部または一部をコードする。
【０１７７】
ベクター
[0191] 本発明は、本発明の抗ＥｒｂＢ２抗体の重鎖またはそれらの抗原結合部位をコードする核酸分子、このような抗体またはそれらの抗原結合部位の軽鎖をコードする核酸分子、または、その両方、または、標的化結合物質を含むベクターを提供する。本発明はさらに、融合タンパク質、改変された抗体、抗体フラグメント、および、それらのプローブをコードする核酸分子を含むベクターを提供する。
【０１７８】
[0192] いくつかの実施態様において、本発明の抗ＥｒｂＢ２抗体または抗原結合部位は、遺伝子が、必要な発現制御配列（例えば転写および翻訳制御配列）に作動可能に結合するように、上述したようにして得られた部分的な、または、全長の軽鎖および／または重鎖をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入することによって発現される。発現ベクターとしては、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、植物ウイルス、例えばカリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶによって誘導されたエピソームなどが挙げられる。抗体遺伝子は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が、それらが目的とする抗体遺伝子の転写および翻訳を調節する機能に役立つようにベクターにライゲーションされる。発現ベクターおよび発現制御配列は、用いられる発現宿主細胞に適合するように選択される。抗体の軽鎖遺伝子、および、抗体の重鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入してもよい。いくつかの実施態様において、両方の遺伝子が、同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子のフラグメントの相補的な制限部位とベクターとのライゲーション、または、制限部位が存在しない場合は平滑末端ライゲーション）によって発現ベクターに挿入される。
【０１７９】
[0193] 便利なベクターは、あらゆるＶＨまたはＶＬ配列が、上述したようにして容易に挿入され、発現することができるように加工された適切な制限部位を有する、機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬ免疫グロブリン配列をコードするベクターである。このようなベクターにおいて、スプライシングは通常、挿入されたＪ領域におけるドナーのスプライス部位と、ヒトＣドメインの前にあるアクセプターのスプライス部位との間で起こるか、または、ヒトＣＨエキソン内で発生するするスプライス領域でも起こる。ポリアデニル化および転写終結は、天然型の染色体のコード領域下流の部位に発生する。また、組換え発現ベクターも、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を容易にするシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖の遺伝子は、このようなシグナルペプチドがフレーム内で免疫グロブリン鎖のアミノ末端に連結されるようにベクターにクローニングしてもよい。このようなシグナルペプチドは、免疫グロブリンのシグナルペプチドでもよいし、または、異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）でもよい。
【０１８０】
[0194] 抗体鎖の遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中で抗体鎖の遺伝子の発現を制御する調節配列を有する。当業者であれば、調節配列の選択などの発現ベクターの設計は、形質転換しようとする宿主細胞の選択、望ましいタンパク質の発現のレベルなどの要因に依存する場合があることは理解しているものと思われる。哺乳動物の宿主細胞の発現に関して好ましい調節配列としては、哺乳動物細胞中で高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス性の構成要素が挙げられ、例えば、レトロウイルスのＬＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）から誘導されたプロモーターおよび／またはエンハンサー（例えば、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）から誘導されたプロモーターおよび／またはエンハンサー（例えば、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルスから誘導されたプロモーターおよび／またはエンハンサー（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマ、および、強い哺乳動物プロモーター、例えば天然型の免疫グロブリン、および、アクチンプロモーターである。さらなるウイルス調節因子およびそれらの配列の説明のために、例えば、米国特許第５，１６８，０６２号、米国特許第４，５１０，２４５号、および、米国特許第４，９６８，６１５号を参照。植物中で抗体を発現させる方法（プロモーターおよびベクターの説明も含む）、加えて植物の形質転換は、当業界既知である。例えば、米国特許第６，５１７，５２９号を参照（これは援用により開示に含まれる）。また、細菌細胞または真菌細胞（例えば酵母細胞）中でのポリペプチドの発現方法も当業界公知である。
【０１８１】
[0195] 抗体鎖の遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、追加の配列を有していてもよく、例えば宿主細胞中でのベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）、および、選択マーカー遺伝子を有していてもよい。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入される宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、４，６３４，６６５号、および、５，１７９，０１７号を参照、これらは援用により開示に含まれる）。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞において、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、または、メトトレキセートのような薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅を示すｄｈｆｒ−宿主細胞に使用するため）、ｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）、および、グルタメートシンセターゼ遺伝子が挙げられる。
【０１８２】
非ハイブリドーマ宿主細胞、および、組換えによってタンパク質を生産する方法
[0196] 標的化結合物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体をコードする核酸分子、および、これらの核酸分子を含むベクターは、適切な哺乳動物、植物、細菌または酵母宿主細胞のトランスフェクションに用いることができる。形質転換は、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するためのあらゆる既知の方法によって行うことができる。哺乳動物細胞への異種ポリヌクレオチドの導入方法は当業界公知であり、例えば、デキストラン介在トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン介在トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソーム封入、および、ＤＮＡの核への直接的なマイクロインジェクションが挙げられる。加えて、核酸分子は、非ウイルスベクターによって哺乳動物細胞に導入されてもよい。細胞を形質転換させる方法は当業界公知である。例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、４，９１２，０４０号、４，７４０，４６１号、および、４，９５９，４５５号（これらは援用により開示に含まれるを参照）。植物細胞を形質転換させる方法は当業界公知であり、例えば、アグロバクテリウム介在の形質転換、遺伝子銃による形質転換、直接注入、エレクトロポレーション、および、ウイルス形質転換が挙げられる。また、細菌および酵母細胞を形質転換させる方法もは当業界公知である。
【０１８３】
[0197] 発現用の宿主として利用可能な哺乳動物細胞系は当業界公知であり、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）より入手可能な多くの不死化細胞系が挙げられる。それらの例としては、特に、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｎ５０細胞、ＳＰ２細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、乳児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、アフリカミドリザル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）、Ａ５４９細胞、および、多数のその他の細胞系が挙げられる。特に好ましい細胞系は、細胞系が高い発現レベルを有すること決定するかどうかによって選択される。使用可能なその他の細胞系は、昆虫細胞系であり、例えばＳｆ９、または、Ｓｆ２１細胞である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物の宿主細胞に導入される場合、本抗体は、宿主細胞中で抗体が発現されるのに十分な期間、宿主細胞を培養すること、または、より好ましくは、宿主細胞を増殖させる培地へ抗体を分泌させることによって生産される。抗体は、標準的なタンパク質精製法を用いて培地から回収することができる。植物の宿主細胞としては、例えば、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ウキクサ（ｄｕｃｋｗｅｅｄ）、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモなどが挙げられる。細菌の宿主細胞としては、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、および、ストレプトマイセス属が挙げられる。酵母の宿主細胞としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、および、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が挙げられる。
【０１８４】
[0198] さらに、産生細胞系からの本発明の抗体の発現は、多数の既知の技術を用いて強化することができる。例えば、グルタミンシンセターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）は、所定の条件下で発現を強化する一般的なアプローチである。ＧＳ系は、欧州特許第０２１６８４６号、０２５６０５５号、０３２３９９７号および０３３８８４１号に関して全体または一部で考察されている。
【０１８５】
[0199] 異なる細胞系で、または、トランスジェニック動物中で発現された抗体は、互いに異なる糖付加を有する可能性がある。しかしながら、本明細書で示された核酸分子によってコードされた全ての抗体、または、本明細書で示されたアミノ酸配列を含む全ての抗体は、抗体の糖付加に関係なく本発明の一部である。
【０１８６】
トランスジェニック動物および植物
[0200] また本発明の抗ＥｒｂＢ２抗体は、対象の免疫グロブリンの重鎖および軽鎖配列に関してトランスジェニックである哺乳動物または植物の作製、および、それらから回収できる形態での抗体の生産によって、遺伝子導入により生産することもできる。哺乳動物での遺伝子導入による生産に関して、抗ＥｒｂＢ２抗体をヤギ、ウシまたはその他の哺乳動物の乳汁中で生産し、それらから回収することができる。例えば、米国特許第５，８２７，６９０号、５，７５６，６８７号、５，７５０，１７２号、および、５，７４１，９５７号（これらは援用により開示に含まれる）を参照。いくつかの実施態様において、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むヒト以外のトランスジェニック動物は、上述のように、ＥｒｂＢ２またはそれらの免疫原性部位で免疫化される。植物中での抗体の製造方法は、例えば、米国特許第６，０４６，０３７号、および、５，９５９，１７７号（これらは援用により開示に含まれる）で説明されている。
【０１８７】
[0201] いくつかの実施態様において、ヒト以外のトランスジェニック動物または植物は、標準的なトランスジェニック技術によって動物または植物に、１種またはそれより多くの本発明の抗ＥｒｂＢ２抗体をコードする核酸分子を導入することによって生産される。上記のＨｏｇａｎおよび米国特許第６，４１７，４２９号を参照。トランスジェニック動物の作製に用いられるトランスジェニック細胞は、胚幹細胞、または、体細胞、または、受精卵であり得る。ヒト以外のトランスジェニック生物は、キメラ、非キメラの異型接合体、および、非キメラの同型接合体であり得る。例えば、Ｈｏｇａｎ等，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，コールドスプリングハーバープレス（１９９９）；Ｊａｃｋｓｏｎ等，Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，オックスフォード・ユニバーシティ・プレス（２０００）；および、Ｐｉｎｋｅｒｔ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）（１９９９）を参照（全て援用により開示に含まれる）。いくつかの実施態様において、ヒト以外のトランスジェニック動物は、対象の重鎖および／または軽鎖をコードする標的となるコンストラクトによる、標的化された破壊および置換を有する。その他の実施態様において、このようなトランスジェニック動物は、ＥｒｂＢ２、好ましくはヒトＥｒｂＢ２に特異的に結合する重鎖および軽鎖をコードする核酸分子を含み、それらを発現する。いくつかの実施態様において、このようなトランスジェニック動物は、単鎖抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体のような改変された抗体をコードする核酸分子を含む。抗ＥｒｂＢ２抗体は、どのようなトランスジェニック動物中で作製してもよい。その他の実施態様において、ヒト以外の動物は、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、または、ウマである。ヒト以外のトランスジェニック動物は、前記のコードされたポリペプチドを、血液、乳汁、尿、唾液、涙、粘液およびその他の体液中で発現する。
【０１８８】
ファージディスプレイライブラリー
[0202] 本発明は、抗ＥｒｂＢ２抗体、またはそれらの抗原結合部位の生産方法を提供し、本方法は、ファージ上にヒト抗体のライブラリーを合成する工程、このライブラリーをＥｒｂＢ２またはそれらの部分でスクリーニングする工程、ＥｒｂＢ２に結合するファージを単離する工程、および、そのファージから抗体を得る工程を含む。一例として、このようなファージディスプレイ技術に使用するための抗体のライブラリーを製造する方法の１つは、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むヒト以外の動物をＥｒｂＢ２、または、それらの抗原性の部分で免疫化して免疫反応を起こす工程、この免疫動物から抗体産生細胞を抽出する工程、抽出された細胞から本発明の抗体の重鎖および軽鎖をコードするＲＮＡを単離する工程、ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを生産する工程、プライマーを用いてｃＤＮＡを増幅する工程、および、ファージで抗体が発現されるようにｃＤＮＡをファージディスプレイベクターに挿入する工程を含む。この方法で、本発明の組換え抗ＥｒｂＢ２抗体を得ることもできる。
【０１８９】
[0203] 本発明の組換え抗ＥｒｂＢ２ヒト抗体は、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。好ましくは、このようなライブラリーは、Ｂ細胞から単離されたｍＲＮＡから製造されたヒトＶＬおよびＶＨのｃＤＮＡを用いて生成したｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーである。このようなライブラリーを製造し、スクリーニングする方法は、当業界既知である。ファージディスプレイライブラリーを生成するためのキットは、市販されている（例えば、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の組換えファージ抗体システム，カタログ番号２７−９４００−０１；および、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＳｕｒｆＺＡＰＴＭファージディスプレイキット（カタログ番号２４０６１２）。また、抗体提示ライブラリーを作製しスクリーニングするのに用いることができるその他の方法および試薬もある（例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；ＰＣＴ公報番号ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９１／１７２７１、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９２／１５６７９、ＷＯ９３／０１２８８、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／０９６９０；Ｆｕｃｈｓ等，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０〜１３７２（１９９１）；Ｈａｙ等，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１〜８５（１９９２）；Ｈｕｓｅ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５〜１２８１（１９８９）；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２〜５５４（１９９０）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ等，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５〜７３４（１９９３）；Ｈａｗｋｉｎｓ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９〜８９６（１９９２）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ等，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４〜６２８（１９９１）；Ｇｒａｍ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３５７６〜３５８０（１９９２）；Ｇａｒｒａｄ等，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３〜１３７７（１９９１）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ等，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：４１３３〜４１３７（１９９１）；ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７９７８〜７９８２（１９９１）を参照、全て援用により開示に含まれる）。
【０１９０】
[0204] 一実施態様において、望ましい特徴を有するヒト抗ＥｒｂＢ２抗体を単離して生産するために、ＰＣＴ公報番号ＷＯ９３／０６２１３で説明されているエピトープを刻印する（ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ）方法（これらは援用により開示に含まれる）を用いて、ＥｒｂＢ２に対して類似の結合活性を有するヒト重鎖および軽鎖配列を選択するために、本明細書で説明されているようなヒト抗ＥｒｂＢ２抗体が最初に用いられる。この方法で用いられる抗体ライブラリーは、好ましくは、ＰＣＴ公報番号ＷＯ９２／０１０４７、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２〜５５４（１９９０）；および、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ等，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５〜７３４（１９９３）（全て援用により開示に含まれる）で説明されているように製造され、スクリーニングされたｓｃＦｖライブラリーである。ｓｃＦｖ抗体ライブラリーは、好ましくは、抗原としてヒトＥｒｂＢ２を用いてスクリーニングされる。
【０１９１】
[0205] 最初のヒトＶＬおよびＶＨドメインが選択されたら、「混合およびマッチング」実験が行われ、ここにおいて、好ましいＶＬ／ＶＨ対の組み合わせを選択するために、最初に選択されたＶＬおよびＶＨセグメントの様々な対がＥｒｂＢ２結合に関してスクリーニングされる。加えて、抗体の品質をさらに改善するために、天然の免疫反応中の抗体の親和性の成熟に関するインビボでの体細胞変異プロセスに類似したプロセスで、好ましいＶＬ／ＶＨ対のＶＬおよびＶＨセグメントを、好ましくはＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３領域内でランダムに突然変異させることができる。このインビトロでの親和性の成熟は、それぞれＶＨのＣＤＲ３またはＶＬのＣＤＲ３に相補的なＰＣＲプライマーを用いてＶＨおよびＶＬドメインを増幅することによって達成することができ、これらのプライマーは、得られたＰＣＲ産物が、ランダム突然変異がＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３領域に導入されたＶＨおよびＶＬセグメントをコードするように、所定の位置において４種のヌクレオチド塩基のランダム混合物で「スパイク」されている。これらのランダムに突然変異したＶＨおよびＶＬセグメントは、ＥｒｂＢ２への結合に関して再度スクリーニングしてもよい。
【０１９２】
[0206] 本発明の抗ＥｒｂＢ２抗体を組換え免疫グロブリンディスプレイライブラリーからスクリーニングし単離した後、選択された抗体をコードする核酸は、ディスプレイパッケージから（例えば、ファージゲノムから）回収し、標準的な組換えＤＮＡ技術によってその他の発現ベクターにサブクローニングすることができる。必要に応じて、このような核酸は、以下で説明されているような本発明のその他の抗体の形態にするようにさらに操作してもよい。コンビナトリアルライブラリーのスクリーニングによって単離された組換えヒト抗体を発現させるために、上述したようにして本抗体をコードするＤＮＡを組換え発現ベクターにクローニングし、哺乳動物の宿主細胞に導入する。
【０１９３】
クラススイッチ
[0207] 本発明のその他の形態は、抗ＥｒｂＢ２抗体のクラスまたはサブクラスをその他のクラスまたはサブクラスに変換する方法を提供する。いくつかの実施態様において、ＣＬまたはＣＨをコードする配列を含まないＶＬまたはＶＨをコードする核酸分子は、当業界公知の方法を用いて単離される。続いてこのような核酸分子を、望ましい免疫グロブリンクラスまたはサブクラス由来のＣＬまたはＣＨをコードするヌクレオチド配列に作動可能に結合させる。これは、上述したようなＣＬまたはＣＨ鎖を含むベクターまたは核酸分子を用いて達成できる。例えば、元はＩｇＭである抗ＥｒｂＢ２抗体を、ＩｇＧにクラススイッチすることができる。さらに、クラススイッチを用いて、ある種のＩｇＧサブクラスをその他のサブクラスに変換してもよく、例えばＩｇＧ１をＩｇＧ２に変換してもよい。望ましいアイソタイプを含むその他の本発明の抗体を生産する方法は、抗ＥｒｂＢ２抗体の重鎖をコードする核酸、および、抗ＥｒｂＢ２抗体の軽鎖をコードする核酸を単離する工程、ＶＨ領域をコードする配列を単離する工程、ＶＨ配列を望ましいアイソタイプの重鎖の定常ドメインをコードする配列にライゲーションする工程、細胞中で軽鎖の遺伝子および重鎖のコンストラクトを発現させる工程、および、望ましいアイソタイプを有する抗ＥｒｂＢ２抗体を回収する工程を含む。
【０１９４】
脱免疫化抗体
[0208] 本発明のその他の形態において、本抗体は、例えばＰＣＴ公報番号ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７（援用により開示に含まれる）で説明されている技術を用いて脱免疫化させて、その免疫原性を減少させてもよい。
【０１９５】
突然変異抗体
[0209] その他の実施態様において、本核酸分子、ベクターおよび宿主細胞を用いて、抗ＥｒｂＢ２抗体を突然変異させてもよい。本抗体は、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインにおいて突然変異していてもよく、それにより、例えば抗体の結合特性を変更することができる。例えば、ＥｒｂＢ２に対する抗体のＫＤを増加させたり、または、減少させたりするために、ｋｏｆｆを増加させたり、または、減少させたりするために、または、抗体の結合特異性を変更するために、突然変異を１種またはそれより多くのＣＤＲ領域内に作製してもよい。部位特異的変異誘発の技術は当業界公知である。例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ等およびＡｕｓｕｂｅｌ等を参照。その他の実施態様において、１個またはそれより多くの突然変異が、抗体１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４および１．７１．３における、生殖細胞系と比較して変化することが既知であるアミノ酸残基に作製される。このような突然変異は、可変ドメインのＣＤＲ領域またはフレームワーク領域内に作製されてもよいし、または、定常ドメイン内に作製されてもよい。その他の実施態様において、このような突然変異は、可変ドメイン内に作製される。いくつかの実施態様において、１個またはそれより多くの突然変異は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２および４４から選択されるアミノ酸配列、または、ヌクレオチド配列が配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１または４３で記載されているアミノ酸配列の可変ドメインのＣＤＲ領域またはフレームワーク領域内に、生殖細胞系と比較して変化することが既知であるアミノ酸残基に作製される。
【０１９６】
[0210] その他の実施態様において、フレームワーク領域に、得られたフレームワーク領域が、それに対応する生殖細胞系の遺伝子のアミノ酸配列を有するように突然変異が作製される。突然変異は、抗ＥｒｂＢ２抗体の半減期を高めるために、フレームワーク領域または定常ドメイン内に作製されてもよい。例えば、ＰＣＴ公報番号ＷＯ００／０９５６０を参照（これらは援用により開示に含まれる）。また、フレームワーク領域または定常ドメイン内の突然変異は、抗体の免疫原性を変更するために、その他の分子へ共有結合または非共有結合するための部位を提供するために、または、補体結合、ＦｃＲ結合、および、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のような特性を変更するために作製することもできる。本発明によれば、単一抗体が、可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域、または、定常ドメイン中のいずれか１種またはそれより多くに突然変異を有していてもよい。
【０１９７】
[0211] いくつかの実施態様において、突然変異した抗ＥｒｂＢ２抗体のＶＨまたはＶＬドメインのいずれかに、突然変異前の抗ＥｒｂＢ２抗体と比較して１〜８（その間の全ての数値を含む）個のアミノ酸の突然変異が存在する。上述の突然変異のいずれかにおいて、このような突然変異は、１個またはそれより多くのＣＤＲ領域に生じたものでもよい。さらに、このような突然変異のいずれかは、保存的アミノ酸置換であってもよい。いくつかの実施態様において、定常ドメイン中に、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下または１個のアミノ酸の変化が存在する。
【０１９８】
改変された抗体
[0212] その他の実施態様において、その他のポリペプチドに連結した本発明の抗ＥｒｂＢ２抗体の全部または一部を含む融合抗体またはイムノアドヘシンを作製してもよい。その他の実施態様において、抗ＥｒｂＢ２抗体の可変ドメインだけが、上記ポリペプチドに連結している。その他の好ましい実施態様において、抗ＥｒｂＢ２抗体のＶＨドメインは、第一のポリペプチドに連結しており、抗ＥｒｂＢ２抗体のＶＬドメインは、第二のポリペプチドに連結しており、ここで第二のポリペプチドは、ＶＨおよびＶＬドメインが互いに相互作用して抗原結合部位を形成することができるような方式で第一のポリペプチドと接触している。その他の好ましい実施態様において、ＶＨおよびＶＬドメインが互いに相互作用することができるように、ＶＨドメインはリンカーによってＶＬドメインと分離している（以下の単鎖抗体を参照）。続いてＶＨ−リンカー−ＶＬ抗体は、対象のポリペプチドに連結している。このような融合抗体は、ポリペプチドをＥｒｂＢ２を発現する細胞もしくは組織に導くのに有用である。このようなポリペプチドは、毒素、増殖因子またはその他の調節タンパク質のような治療剤であってもよいし、または、容易に可視化することができる酵素（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ）のような診断薬であってもよい。加えて、２つ（またはそれより多く）の単鎖抗体が互いに連結している融合抗体を作製することもできる。これは、単一のポリペプチド鎖で２価または多価の抗体を作製したい場合、または、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を作製したい場合に有用である。
【０１９９】
[0213] 単鎖抗体（ｓｃＦｖ）を作製するために、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡフラグメントを、フレキシブルなリンカーをコードするその他のフラグメントに、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードするその他のフラグメントに作動可能に結合させ、それにより、ＶＨおよびＶＬ配列を、ＶＬおよびＶＨドメインがフレキシブルなリンカーによって結合した連続した単鎖タンパク質として発現させることができる。例えば、Ｂｉｒｄ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３（１９８８）；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２〜５５４（１９９０）を参照。このような単鎖抗体は、単一のＶＨおよびＶＬのみが用いられる場合は１価となる可能性があり、２種のＶＨおよびＶＬが用いられる場合は２価となる可能性があり、または、２種より多いＶＨおよびＶＬが用いられる場合は多価となる可能性がある。ＥｒｂＢ２に、および、その他の分子に特異的に結合する二重特異性または多価抗体を作製してもよい。
【０２００】
[0214] その他の実施態様において、抗ＥｒｂＢ２抗体をコードする核酸分子を用いてその他の改変された抗体を製造してもよい。例えば、「カッパ抗体（ｋａｐｐａ  ｂｏｄｙ）」（Ｉｌｌ等，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０：９４９〜５７（１９９７））、「ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）」  （Ｍａｒｔｉｎ等，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：５３０３〜９（１９９４））、「二重特異性抗体（ダイアボディ）」（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８（１９９３））、または、「ジャヌシン（Ｊａｎｕｓｉｎ）ｓ」（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ等，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５〜３６５９（１９９１）、および、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ等，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（Ｓｕｐｐｌ．）７：５１〜５２（１９９２））を、本明細書の教示に従って標準的な分子生物学的な技術を用いて製造してもよい。
【０２０１】
[0215] 二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）または抗原結合フラグメントは、様々な方法によって生産することができ、例えば、ハイブリドーマの融合、または、Ｆａｂ’フラグメントの連結などによって生産することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ＆Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５〜３２１（１９９０），Ｋｏｓｔｅｌｎｙ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７〜１５５３（１９９２）を参照。加えて、二重特異性抗体は、「ダイアボディ」または「ジャヌシン（Ｊａｎｕｓｉｎ）」として形成してもよい。いくつかの実施態様において、このような二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２の２種の異なるエピトープに結合する。いくつかの実施態様において、このような二重特異性抗体は、抗体１．４４．１、１．１４０、１．４３、１．１４．１、１．１００．１、１．９６、１．１８．１、１．２０、１．３９、１．２４および１．７１．３由来の第一の重鎖および第一の軽鎖、ならびに、追加の抗体の重鎖および軽鎖を有する。いくつかの実施態様において、追加の軽鎖および重鎖も上記で同定されたモノクローナル抗体のうちの１種由来であるが、第一の重鎖および軽鎖とは異なる。
【０２０２】
[0216] いくつかの実施態様において、上述の改変された抗体は、本明細書で示されたヒト抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体由来の１種またはそれより多くの可変ドメインまたはＣＤＲ領域を用いて製造される。
【０２０３】
[0217] また本発明の抗体は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、改変されていない抗体の半減期より長い半減期（例えば血清半減期）を有する抗体を包含する。一実施態様において、前記抗体の半減期は、約１５日間より長く、約２０日より長く、約２５日より長く、約３０日より長く、約３５日より長く、約４０日より長く、約４５日より長く、約２ヶ月より長く、約３ヶ月より長く、約４ヶ月より長いか、または、約５ヶ月より長い。哺乳動物、好ましくはヒトにおける本発明の抗体またはそれらのフラグメントの長い半減期により、哺乳動物における前記抗体または抗体フラグメントの血清の抗体価がより高くなり、従って、前記抗体または抗体フラグメントの投与頻度が減少したり、および／または、投与される前記抗体または抗体フラグメントの濃度が減少したりする。インビボで高い半減期を有する抗体またはそれらのフラグメントは、当業者既知の技術によって生成することができる。例えば、インビボで高い半減期を有する抗体またはそれらのフラグメントは、ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との相互作用に関与すると同定されたアミノ酸残基を改変すること（例えば、置換、欠失または付加すること）によって生成することができる（例えば、国際公報番号ＷＯ９７／３４６３１、および、ＷＯ０２／０６０９１９を参照、これらは、援用によりそれらの全体が開示に含まれる）。インビボで高い半減期を有する抗体またはそれらのフラグメントは、高分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような前記抗体または抗体フラグメントのポリマー分子に結合させることによって生成することができる。ＰＥＧは、前記抗体または抗体フラグメントに結合させることができ、これらは、前記抗体または抗体フラグメントのＮまたはＣ末端へのＰＥＧの部位特異的な共役、または、リシン残基に存在するイプシロン−アミノ基を介した共役のいずれかによって多機能のリンカーを含んでいてもよいし、または、それらを含まなくてもよい。生物活性の損失が最小になるような直鎖状または分岐状ポリマーの誘導体化が用いられると予想される。共役の程度は、ＰＥＧ分子の抗体への適切な共役を確認するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびマススペクトロメトリーによって厳密にモニターされると予想される。未反応のＰＥＧは、例えばサイズ排除、または、イオン交換クロマトグラフィーによって抗体−ＰＥＧ結合体から分離することができる。
【０２０４】
[0218] 抗原結合部位は、例えばフィブロネクチンまたはチトクロームＢなどの抗体以外のタンパク質の足場上にＣＤＲの配置を用いることによって提供してもよいし（Ｈａａｎ＆Ｍａｇｇｏｓ（２００４）ＢｉｏＣｅｎｔｕｒｙ，１２（５）：Ａ１−Ａ６；Ｋｏｉｄｅ等．（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２８４：１１４１〜１１５１；Ｎｙｇｒｅｎ等．（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，７：４６３〜４６９）、または、望ましい標的に対する結合特異性が付与されるように、タンパク質の足場内のループのアミノ酸残基をランダム化したり、または、それらに突然変異を誘発させたりすることによって提供してもよい。タンパク質中に新規の結合部位を人為的に作製するための足場は、Ｎｙｇｒｅｎ等によって詳細に総論されている（Ｎｙｇｒｅｎ等．（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，７：４６３〜４６９）。抗体ミミックのためのタンパク質の足場は、ＷＯ／００３４７８４（これは参照によりその全体を本発明に含める）に開示されており、ここで発明者等は、少なくとも１つのランダム化されたループを有するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含むタンパク質（抗体ミミック）を説明している。１種またはそれより多くのＣＤＲ、例えば一連のＨＣＤＲがグラフト化された適切な足場は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのどのようなドメインの構成要素によっても提供することができる。このような足場は、ヒトまたはヒト以外のタンパク質であり得る。抗体以外のタンパク質の足場の利点は、このような足場は、足場分子中に、少なくとも数種の抗体分子よりも小さい、および／または、それらより製造が簡単な抗原−結合部位を提供する可能性があることである。小さいサイズの結合構成要素は、有用な生理学的な特性、例えば細胞に侵入し、組織に深く透過する能力、または、その他の構造内の標的に到達する能力、または、標的抗原のタンパク質の内部空間内で結合する能力を付与する可能性がある。抗体以外のタンパク質の足場における抗原結合部位の使用は、Ｗｅｓｓ，２００４（Ｗｅｓｓ，Ｌ．Ｉｎ：ＢｉｏＣｅｎｔｕｒｙ，Ｔｈｅ  Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  ＢｉｏＢｕｓｉｎｅｓｓ，１２（４２），Ａ１−Ａ７，２００４）に総論されている。安定な主鎖、および、１個またはそれより多くの可変ループを有するタンパク質が典型的であり、ここでループまたはループ群のアミノ酸配列は、標的の抗原と結合する抗原−結合部位を作製するために、特異的に、または、ランダムに突然変異している。このようなタンパク質としては、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のプロテインＡのＩｇＧ−結合ドメイン、トランスフェリン、アルブミン、テトラネクチン（ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎ）、フィブロネクチン（例えば、１０番目のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン）、リポカリンが挙げられ、加えて、ガンマ−結晶の、およびその他のアフィリン（ＡｆｆｉｌｉｎＴＭ）足場（Ｓｃｉｌタンパク質）も挙げられる。その他のアプローチの例としては、サイクロチドに基づく合成「ミクロボディ」、分子��ジスルフィド結合を有する低分子量タンパク質、ミクロタンパク質（バーサボディズ（Ｖｅｒｓａｂｏｄｉｅｓ）ＴＭ，アムニックス（Ａｍｕｎｉｘ））、および、アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ，モレキュラー・パートナーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ））が挙げられる。
【０２０５】
[0219] 抗体配列および／または抗原−結合部位に加えて、本発明に係る標的化結合物質は、その他のアミノ酸を含んでもよく、例えば、ペプチドまたはポリペプチド、例えば折り畳まれたドメインを形成するアミノ酸、または、抗原に結合する能力に加えて、分子にその他の機能的な特徴を付与するアミノ酸を含んでいてもよい。本発明の標的化結合物質は、検出可能な標識を有していてもよいし、または、毒素または標的部分または酵素と（例えば、ペプチジル結合、または、リンカーを介して）共役していてもよい。例えば、標的化結合物質は、触媒部位を（例えば、酵素ドメイン中に）含んでもよいし、同様に、抗原結合部位を含んでもよく、ここで抗原結合部位は抗原に結合するため、触媒部位の標的が抗原になる。このような触媒部位は、例えば切断することによって、抗原の生物学的機能を抑制する可能性がある。
【０２０６】
誘導体化された、および、標識された抗体
[0220] 本発明の抗ＥｒｂＢ２抗体または抗原結合部位は、誘導体化するか、または、その他の分子（例えば、その他のペプチドまたはタンパク質）に連結させることができる。一般的に、本抗体またはそれらの部分は、誘導体化または標識付けによってＥｒｂＢ２の結合に逆の影響を与えないように誘導体化される。従って、本発明の抗体および抗体部分は、本明細書において説明されるヒト抗ＥｒｂＢ２抗体の無傷の形態と改変された形態の両方を含むことを目的とする。例えば、本発明の抗体または抗体部分は、１種またはそれより多くのその他の分子の本体、例えばその他の抗体（例えば、二重特異性抗体、または、二重特異性抗体）、検出のための物質、細胞毒性薬、薬剤、および／または、抗体または抗体部分とその他の分子（例えば、ストレプトアビジンのコア領域、または、ポリヒスチジンタグ）との会合に介在することができるタンパク質もしくはペプチドに、機能的に連結させることができる（化学的カップリング、遺伝学的な融合体、非共有結合による会合によって、または、別の方法で）。
【０２０７】
[0221] ある種のタイプの誘導体化された抗体は、２種またはそれより多くの抗体（同じタイプの抗体、または、例えば二重特異性抗体を作製するために異なるタイプの抗体）の架橋を形成することによって生産される。適切な架橋剤としては、ヘテロ二官能性であり、適切なスペーサーで分離された２種の明確な反応性を有する基を有する架橋剤（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、または、ホモ二官能性の架橋剤（例えば、ジスクシンイミジルスべリン酸塩）が挙げられる。このようなリンカーは、ピアース・ケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ロックフォード，イリノイ州より入手可能である。
【０２０８】
[0222] その他のタイプの誘導体化された抗体は、標識された抗体である。本発明の抗体または抗原結合部位を誘導体化することができる有用な検出のための物質としては、蛍光化合物が挙げられ、例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニル塩化物、フィコエリトリン、ランタニドの蛍光などである。また抗体は、検出に有用な酵素で標識することもでき、このような酵素としては、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどが挙げられる。抗体が検出可能な酵素で標識されている場合、酵素は、識別可能な反応生成物を生産するために酵素が利用する追加の試薬を添加することによって検出される。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼという物質が存在する場合、過酸化水素とジアミノベンジジンの添加により、色の付いた検出可能な反応生成物が生じる。また抗体は、ビオチンで標識して、アビジンまたはストレプトアビジン結合の間接的な測定によって検出することもできる。また抗体は、第二のレポーター（例えば、ロイシンジッパー対の配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）によって認識される予め決められたポリペプチドエピトープで標識することもできる。いくつかの実施態様において、標識は、起こり得る立体障害を少なくするために様々な長さのスペーサーアームによって取り付けられる。
【０２０９】
[0223] また抗ＥｒｂＢ２抗体は、放射標識したアミノ酸で標識することもできる。診断と治療の両方の目的において、放射標識を用いることができる。例えば、放射標識を用いて、Ｘ線またはその他の診断技術によってＥｒｂＢ２を発現する細胞を検出することができる。さらに、放射標識は、治療の場合は、ＥｒｂＢ２を発現する細胞に対する毒素として用いることができ、例えば不要な免疫反応を引き起こす毒素として用いることができる。ポリペプチドのための標識の例としては、これらに限定されないが、以下の放射性同位体、または、放射性核種が挙げられる：３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、および、１３１Ｉ。
【０２１０】
[0224] いくつかの実施態様において、抗ＥｒｂＢ２抗体は、イメージングで検出可能な常磁性、放射性または蛍光原性イオンで標識することができる。いくつかの実施態様において、このような常磁性イオンは、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、または、エルビウム（ＩＩＩ）である。その他の実施態様において、このような放射性イオンは、ヨウ素１２３、テクネチウム９９、インジウム１１１、レニウム１８８、レニウム１８６、銅６７、ヨウ素１３１、イットリウム９０、ヨウ素１２５、アスタチン２１１、および、ガリウム６７である。その他の実施態様において、抗ＥｒｂＢ２抗体は、Ｘ線造影剤、例えばランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）鉛（ＩＩ）、および、ビスマス（ＩＩＩ）で標識されている。
【０２１１】
[0225] また抗ＥｒｂＢ２抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチルもしくはエチル基、または、炭水化物基のような化学基で誘導体化されていてもよい。これらの基は、抗体の生物学的な特徴を改善するのに有用であり、例えば、血清中半減期を高めたり、または、組織への結合を増加させたりするのに有用である。
【０２１２】
医薬組成物およびキット
[0226] 本発明は、治療手段が必要な被検者（これらに限定されないが、例えば癌に苦しむ被験者）を治療するための、標的化結合物質、および／または、アンタゴニスト特性を有するヒト抗ＥｒｂＢ２抗体を含む組成物に関する。いくつかの実施態様において、治療を受ける被検者は、ヒトである。その他の実施態様において、被検者は、獣医学の対象となる被検者である。
【０２１３】
[0227] 治療は、１種またはそれより多くの本発明の抑制性の抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体、または、それらの抗原結合フラグメントを、単独で、または、製薬上許容できるキャリアーと共に投与することを含んでいてもよい。本発明の抑制性の抗ＥｒｂＢ２抗体、および、それらを含む組成物は、１種またはそれより多くのその他の治療剤、診断剤または予防剤と組み合わせて投与することができる。
【０２１４】
[0228] 具体的な実施態様において、本開示の治療剤は、抗腫瘍薬を含んでいてもよい。抗腫瘍薬としては、これらに限定されないが、白金ベースの物質、例えばカルボプラチン、および、シスプラチン；ナイトロジェンマスタードアルキル化剤；ニトロソウレアアルキル化剤、例えばカルムスチン（ＢＣＮＵ）、およびその他のアルキル化剤；代謝拮抗物質、例えばメトトレキセート；プリン類似体代謝拮抗物質；ピリミジン類似体代謝拮抗物質、例えばフルオロウラシル（５−ＦＵ）、および、ゲムシタビン；ホルモン性の抗腫瘍薬、例えばゴセレリン、ロイプロリド、および、タモキシフェン；天然抗腫瘍薬、例えばタキサン（例えば、ドセタキセル、および、パクリタキセル）、アルデスロイキン（ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ）、インターロイキン−２、エトポシド（ＶＰ−１６）、インターフェロンアルファ、および、トレチノイン（ＡＴＲＡ）；抗生物質性の天然抗腫瘍薬、例えばブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、および、マイトマイシン；および、ビンカアルカロイドの天然抗腫瘍薬、例えばビンブラスチン、および、ビンクリスチンが挙げられる。
【０２１５】
[0229] 様々な実施態様において、抗腫瘍薬は、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、アクチノマイシン、アドリアマイシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標））、アドルシル（Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標））、アミノグルテチミド、アナストロゾール、アレディア（Ａｒｅｄｉａ（登録商標））、アリミデクス（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））、アロマシン（Ａｒｏｍａｓｉｎ（登録商標））、ボネフォス（Ｂｏｎｅｆｏｓ（登録商標））、ブレオマイシン、カルボプラチン、カクチノマイシン、カペシタビン、シスプラチン、クロドロネート、シクロホスファミド、シタドレン（Ｃｙｔａｄｒｅｎ（登録商標））、シトキサン（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標））、ダクチノマイシン、ドセタキセル、ドキシル（Ｄｏｘｙｌ（登録商標））、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、エキセメスタン、フェマラ（Ｆｅｍａｒａ（登録商標））、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、ハロテスチン（Ｈａｌｏｔｅｓｔｉｎ（登録商標））、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、レトロゾール、ロイコボリンカルシウム、メゲース（Ｍｅｇａｃｅ（登録商標））、酢酸メゲストロール、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトキサントロン、ムタマイシン（Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（登録商標））、ナベルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、ノルバデックス（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標））、ノバントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））、オンコビン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、オスタック（Ｏｓｔａｃ（登録商標））、パクリタキセル、パミドロン酸塩、ファルモルビシン（Ｐｈａｒｍｏｒｕｂｉｃｉｎ（登録商標））、プラチノール（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））、プレドニゾン、プロサイトックス（Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標））、タモフェン（Ｔａｍｏｆｅｎ（登録商標））、タモネ（Ｔａｍｏｎｅ（登録商標））、タモプレックス（Ｔａｍｏｐｌｅｘ（登録商標））、タモキシフェン、タキソール（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、タキソテール（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、トラスツズマブ、チオテパ、（Ｖｅｌｂｅ（登録商標））、ベプシド（Ｖｅｐｅｓｉｄ（登録商標））、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ゼローダ（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、または、それらの組み合わせである。
【０２１６】
[0230] いくつかの実施態様において、抗腫瘍薬は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、または、抗体のフラグメントを含む。典型的な抗体としては、これらに限定されないが、リツキサン、Ｉデカ−Ｃ２Ｂ８、抗ＣＤ２０Ｍａｂ、パノレックス（Ｐａｎｏｒｅｘ）、３６２２Ｗ９４、腺癌の抗ＥＧＰ４０（１７−１Ａ）パンカルシノーマ（ｐａｎｃａｒｃｉｎｏｍａ）抗原、ハーセプチン（登録商標）、セツキシマブ、抗Ｈｅｒ２、抗ＥＧＦｒ、ＢＥＣ２、抗イディオタイプのＧＤ３エピトープ、オバレックス（Ｏｖａｒｅｘ）、Ｂ４３．１３、抗イディオタイプのＣＡ１２５、４Ｂ５、抗ＶＥＧＦ、ＲｈｕＭＡｂ、ＭＤＸ−２１０、抗ＨＥＲ２、ＭＤＸ−２２、ＭＤＸ−２２０、ＭＤＸ−４４７、ＭＤＸ−２６０、抗ＧＤ−２、クアドラメット、ＣＹＴ−４２４、ＩＤＥＣ−Ｙ２Ｂ８、オンコリム（Ｏｎｃｏｌｙｍ）、Ｌｙｍ−１、ＳＭＡＲＴ  Ｍ１９５、ＡＴＲＡＧＥＮ、ＬＤＰ−０３、抗ＣＡＭＰＡＴＨ、ｉｏｒ  ｔ６、抗ＣＤ６、ＭＤＸ−１１、ＯＶ１０３、ゼナパックス（Ｚｅｎａｐａｘ）、抗Ｔａｃ、抗ＩＬ−２受容体、ＭＥＬＩＭＭＵＮＥ−２、ＭＥＬＩＭＭＵＮＥ−１、ＣＥＡＣＩＤＥ、プレターゲット（Ｐｒｅｔａｒｇｅｔ）、ＮｏｖｏＭＡｂ−Ｇ２、ＴＮＴ、抗ヒストン、Ｇｌｉｏｍａｂ−Ｈ、ＧＮＩ−２５０、ＥＭＤ−７２０００、リンフォサイド（ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ）、ＣＭＡ６７６、モノファーム−Ｃ（Ｍｏｎｏｐｈａｒｍ−Ｃ）、抗ＦＬＫ−２、ＳＭＡＲＴ１Ｄ１０、ＳＭＡＲＴ  ＡＢＬ３６４、ＩｍｍｕＲＡＩＴ−ＣＥＡ、または、それらの組み合わせが挙げられる。
【０２１７】
[0231] さらにその他の実施態様において、抗腫瘍薬は、追加のタイプの腫瘍細胞を含む。具体的な実施態様において、追加のタイプの腫瘍細胞は、ＭＣＦ−１０Ａ、ＭＣＦ−１０Ｆ、ＭＣＦ−１０−２Ａ、ＭＣＦ−１２Ａ、ＭＣＦ−１２Ｆ、ＺＲ−７５−１、ＺＲ−７５−３０、ＵＡＣＣ−８１２、ＵＡＣＣ−８９３、ＨＣＣ３８、ＨＣＣ７０、ＨＣＣ２０２、ＨＣＣ１００７ＢＬ、ＨＣＣ１００８、ＨＣＣ１１４３、ＨＣＣ１１８７、ＨＣＣ１１８７ＢＬ、ＨＣＣ１３９５、ＨＣＣ１５６９、ＨＣＣ１５９９、ＨＣＣ１５９９ＢＬ、ＨＣＣ１８０６、ＨＣＣ１９３７、ＨＣＣ１９３７ＢＬ、ＨＣＣ１９５４、ＨＣＣ１９５４ＢＬ、ＨＣＣ２１５７、Ｈｓ２７４．Ｔ、Ｈｓ２８１．Ｔ、Ｈｓ３４３．Ｔ、Ｈｓ３６２．Ｔ、Ｈｓ５７４．Ｔ、Ｈｓ５７９．Ｍｇ、Ｈｓ６０５．Ｔ、Ｈｓ７４２．Ｔ、Ｈｓ７４８．Ｔ、Ｈｓ８７５．Ｔ、ＭＢ１５７、ＳＷ５２７、１８４Ａ１、１８４Ｂ５、ＭＤＡ−ＭＢ−３３０、ＭＤＡ−ＭＢ−４１５、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ＲＴ４、ＢＴ−４７４、ＣＡＭＡ−１、ＭＣＦ７［ＭＣＦ−７］、ＭＤＡ−ＭＢ−１３４−ＶＩ、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩＨＴＢ−２７ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＳＫ−ＢＲ−３、または、ＭＥ−１８０細胞であり、これらはいずれもＡＴＴＣより入手可能である。
【０２１８】
[0232] さらにその他の実施態様において、抗腫瘍薬は、癌細胞で発現される遺伝子の発現または機能を低減させるアンチセンス試薬、例えばｓｉＲＮＡ、または、ヘアピンＲＮＡ分子を含む。使用可能な典型的なアンチセンス試薬としては、ムチン、Ｈａ−ｒａｓ、ＶＥＧＦＲ１、または、ＢＲＣＡ１に対して向けられたものが挙げられる。このような試薬は、米国特許第６，７１６，６２７号（ムチン）、６，７２３，７０６（Ｈａ−ｒａｓ）、６，７１０，１７４（ＶＥＧＦＲ１）、および、米国特許公報番号２００４／００１４０５１（ＢＲＣＡ１）で説明されている。
【０２１９】
[0233] さらなる実施態様において、抗腫瘍薬は、被検者にとって自己由来の細胞、例えばマクロファージ、Ｔ細胞、または、樹状突起のような免疫系の細胞を含む。いくつかの実施態様において、このような細胞は、抗原、例えばペプチド、または、癌抗原で処理されたものであるか、または、患者由来の腫瘍細胞とインキュベートしたものである。一実施態様において、自己由来の末梢血液リンパ球をＳＶ−ＢＲ−１細胞と混合して、被検者に投与してもよい。このようなリンパ球は、白血球除去法によって単離してもよい。使用可能な適切な自己細胞、それらの単離方法、前記細胞を改善するため前記細胞の改変方法、および、前記細胞を含む調合物は、米国特許第６，２７７，３６８号、６，４５１，３１６号、５，８４３，４３５号、５，９２８，６３９号、６，３６８，５９３号、および、６，２０７，１４７号、ならびに、国際ＰＣＴ公報番号ＷＯ０４／０２１９９５、および、ＷＯ００／５７７０５で説明されている。
【０２２０】
[0234] 本明細書において説明される癌治療を対象とする方法のいくつかの実施態様において、被検者は、本発明の細胞を用いた治療の前に、それと同時に、または、その後に、癌に対する補完療法、例えば外科手術、化学療法、放射線療法またはホルモン療法、または、それらの組み合わせによって治療される。
【０２２１】
[0235] 上記癌が乳癌であるような特定の実施態様において、補完治療は、乳房温存手術を含んでもよく、これはすなわち癌を除去するが乳房は除去しない手術のことであり、または、乳房温存手術（ｂｒｅａｓｔ−ｓｐａｒｉｎｇ  ｓｕｒｇｅｒｙ）、乳房温存手術（ｂｒｅａｓｔ−ｃｏｎｓｅｒｖｉｎｇ  ｓｕｒｇｅｒｙ）、腫瘍塊除去術、乳房扇状部分切除術、または、乳房部分切除術とも呼ばれている。その他の実施態様において、補完治療は、乳房切除術を含む。乳房切除術は、乳房を除去するための手術であり、または、可能な限り多くの乳房組織、さらに場合によっては腕の下のリンパ節も除去する手術である。さらにその他の実施態様において、このような外科手術は、センチネルリンパ節の生検を含み、この場合、かなり多数の腋の下のリンパ節を取り出す代わりに、１個または数個のリンパ節（センチネル節）を取り出す。また外科手術は、根治的乳房切除術の改変法を含んでいてもよく、この場合、外科医は、乳房全体と腕の下のリンパ節のほとんどまたは全部を除去し、さらに胸部筋肉を覆う内層も除去することが多い。また、２つの胸部筋肉が小さければ小さいほど、胸部筋肉を摘出することによって、リンパ節の除去もより簡単に行うことができる。
【０２２２】
[0236] 具体的な実施態様において、補完治療は、放射線療法を含む。放射線療法は、外部放射線を含んでもよく、この場合、放射線は機械から放射されるか、または、内部放射線から放射される（組織内放射線（ｉｍｐｌａｎｔ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ）、ここで放射線は、乳房に直接挿入された薄いプラスチックチューブ内に封入された放射活性物質から発生する）。
【０２２３】
[0237] その他の具体的な実施態様において、補完治療は、化学療法を含む。腫瘍抑制において役立つことが見出された化学療法剤としては、これらに限定されないが、アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード）、代謝拮抗物質（例えば、ピリミジン類似体）、放射性同位体（例えば、リンおよびヨウ素）、様々な成分からなる物質（例えば、置換された尿素）、および、天然産物（例えば、ビンカアルカロイド、および、抗生物質）具体的な実施態様において、化学療法剤、アロプリノールナトリウム、メシル酸ドラセトロン、パミドロン酸二ナトリウム、エチドロネート、フルコナゾール、エポエチンアルファ、レバミソールＨＣＬ、アミフォスチン、グラニセトロンＨＣＬ、ロイコボリンカルシウム、サルグラモスチム、ドロナビノール、メスナ、フィルグラスチム、ピロカルピンＨＣＬ、酢酸オクトレオチド、デクスラゾキサン、オンダンセトロンＨＣＬ、オンダンセトロン、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、チオテパ、メルファランＨＣＬ、メルファラン、シクロホスファミド、イフォスファミド、クロラムブシル、メクロレタミンＨＣＬ、カルムスチン、ロムスチン、ポリフェプロサン（ｐｏｌｉｆｅｐｒｏｓａｎ）２０（カルムスチンインプラントを共に用いる）、ストレプトゾシン、ドキソルビシンＨＣＬ、硫酸ブレオマイシン、ダウノルビシンＨＣＬ、ダクチノマイシン、クエン酸ダウノルビシン、イダルビシンＨＣＬ、プリマイシン（ｐｌｉｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、ペントスタチン、ミトキサントロン、バルルビシン、シタラビン、リン酸フルダラビン、フロクシウリジン、クラドリビン、メトトレキセート、メルカプトプリン、チオグアニン、カペシタビン、メチルテストステロン、ニルタミド、テストラクトン、ビカルタミド、フルタミド、アナストロゾール、クエン酸トレミフェン、リン酸エストラムスチンナトリウム、エチニルエストラジオール、エストラジオール、エステル化エストロゲン、結合型エストロゲン、酢酸ロイプロリド、酢酸ゴセレリン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、レバミソールＨＣＬ、アルデスロイキン（ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ）、イリノテカンＨＣＬ、ダカルバジン、アスパラギナーゼ、リン酸エトポシド、ゲムシタビンＨＣＬ、アルトレタミン、トポテカンＨＣＬ、ヒドロキシ尿素、インターフェロンアルファ−２ｂ、ミトタン、プロカルバジンＨＣＬ、酒石酸ビノレルビン、Ｅ．ｃｏｌｉのＬ−アスパラギナーゼ、エルウィニア属のＬ−アスパラギナーゼ、硫酸ビンクリスチン、デニロイキンディフィトックス、アルデスロイキン（ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ）、リツキシマブ、インターフェロンアルファ−２ａ、パクリタキセル、ドセタキセル、ＢＣＧライブ（ＢＣＧ  ｌｉｖｅ，膀胱内）、硫酸ビンブラスチン、エトポシド、トレチノイン、テニポシド、ポルフィマーナトリウム、フルオロウラシル、リン酸ベタメタゾンナトリウムおよび酢酸ベタメタゾン、レトロゾール、エトポシドシトロロラム因子（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ  ｃｉｔｒｏｒｏｒｕｍ  ｆａｃｔｏｒ）、フォリン酸、カルシウムロイコボリン、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、シトキサン、および、ジアミノジクロロ白金からなる群より��択され、前記化学療法剤は、前記患者における前記化学療法の副作用を減少させるのに有効な量で投与されるサイモシンα１と組み合わせされる。
【０２２４】
[0238] その他の具体的な実施態様において、補完治療は、ホルモン療法を含む。ホルモン療法は、エストロゲンのような天然ホルモンをブロックすることができるタモキシフェンのような薬物の使用を含んでもよいし、または、エストラジオールの合成を予防するアロマターゼ抑制剤を含んでもよい。その代わりに、ホルモン療法は、特に被検者がまだ閉経を経験していない女性の場合、被検者の卵巣の除去を含んでもよい。
【０２２５】
[0239] 本明細書で用いられる「製薬上許容できるキャリアー」は、生理学的に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを意味する。製薬上許容できるキャリアーのいくつかの例は、水、塩類溶液、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、加えてそれらの組み合わせである。多くの場合において、本組成物中に、等張剤、例えば糖類、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または、塩化ナトリウムを含むことが好ましいと予想される。製薬上許容できる物質のさらなる例は、湿潤剤、または、少量の補助剤、例えば湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤、または、緩衝液であり、これらは抗体の貯蔵寿命または有効性を強化するものである。
【０２２６】
[0240] 本発明の組成物は、様々な形態が可能であり、例えば、液体、半固体および固体の投薬形態、例えば溶液（例えば、注入用および不溶解性溶液）、分散液または懸濁液、錠剤、丸剤、粉末、リポソーム、および、坐剤が挙げられる。好ましい形態は、目的とする投与様式および治療用途に依存する。典型的な好ましい組成物は、注入用または不溶解性溶液の形態であり、例えばヒトの受身免疫法に用いられるものに類似した組成物である。好ましい投与様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹膜内、筋肉内）である。その他の実施態様において、本抗体は、静脈内注入または注入によって投与される。その他の好ましい実施態様において、本抗体は、筋肉内または皮下注入によって投与される。
【０２２７】
[0241] 治療用組成物は、典型的には、滅菌されていて、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならない。本組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または、その他の高い薬物濃度に適した規則正しい構造で製剤化することができる。滅菌注入用溶液は、必要に応じて上記で列挙された成分の１種またはそれらの組み合わせと共に、抗ＥｒｂＢ２抗体を必要な量で適切な溶媒中に取り込み、続いてろ過滅菌することによって製造することができる。一般的に、分散液は、活性な化合物を、上記で列挙されたものからベースとなる分散媒およびその他の必要な成分を含む滅菌媒体に取り込むことによって製造される。滅菌注入用溶液を製造するための滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は、真空乾燥および凍結乾燥によって、活性成分に加えてあらゆる追加の望ましい成分を含む予めろ過滅菌した溶液から、それらを得ることである。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散液の場合に必要とされる粒度を維持することによって、および、界面活性剤の使用によって維持することができる。注入用組成物の持続吸収は、本組成物中に吸収を遅らせる物質（例えばモノステアリン酸塩およびゼラチン）を含ませることによって起こすことができる。
【０２２８】
[0242] 本発明の抗体は、様々な当業界既知の方法によって投与することができるが、多くの治療用途について好ましい経路／投与様式は、皮下、筋肉内または静脈内注入である。当業者であればよく理解しているものと思われるが、経路および／または投与様式は、望ましい結果に応じて様々であると予想される。
【０２２９】
[0243] 具体的な実施態様において、本抗体組成物の活性化合物は、抗体の急速な放出を防ぐキャリアーを用いて製造してもよく、このようなキャリアーとしては、例えば、放出制御製剤、例えばインプラント、経皮パッチ、および、マイクロカプセル化した送達システムが挙げられる。生分解性の生体適合性ポリマーを用いてもよく、このようなポリマーとしては、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、キトサン、および、アルギン酸塩が挙げられる。このような製剤の製造方法の多くは、特許化されているか、または、一般的に当業者既知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編集．，マルセル・デッカー社（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．），ニューヨーク，１９７８を参照）。
【０２３０】
[0244] 本発明はまた、本明細書において説明される抗ＥｒｂＢ２抗体を含む、吸入法による投与に適した組成物を提供する。抗ＥｒｂＢ２抗体は、都合のよい形態としては、適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、またはその他の適切なガスを使用して、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレーによる供給の形態で被検者に送達してもよい。加圧されたエアロゾルの場合において、投与単位は、定量を送達するためのバルブを提供することによって決定することもできる。吸入器または注入器に使用するためのカプセルおよびカートリッジ（例えばゼラチン製）は、本化合物の粉末混合物と、ラクトースまたはスターチのような適切な粉末ベースとが含まれるように製剤化してもよい。Ｄｅｌｌａｍａｒｙ等，（２００４）Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．；９５（３）：４８９〜５００は、抗体の肺送達のための製剤を説明している。
【０２３１】
[0245] 本発明はまた、本明細書において説明される抗ＥｒｂＢ２抗体を含む、口腔粘膜を経由した投与に適した組成物を提供する。経口腔粘膜送達は、送達媒体を、口腔粘膜、咽頭腔または食道を通過させて送達することを意味し、これは、例えば薬物の吸収が腸で起こる従来の経口送達と比べて異なる場合がある。従って、経口腔粘膜送達という用語が本明細書において用いられている通り、抗ＥｒｂＢ２抗体が頬側、舌下、歯肉、咽頭および／または食道粘膜を経由して吸収される投与経路は全て「経口腔粘膜送達」内に包含される。経粘膜投与の場合、抗ＥｒｂＢ２抗体は、例えばチューインガム（米国特許第５，７１１，９６１号を参照）、または、口腔内パッチ（例えば、米国特許第５，２９８，２５６号を参照）に製剤化することができる。
【０２３２】
[0246] 本発明はまた、本明細書において説明される抗ＥｒｂＢ２抗体を含む、膣の粘膜を経由した投与に適した組成物を提供する。本発明の抗ＥｒｂＢ２抗体は、ペッサリー、フォーム、クリーム、錠剤、カプセル、軟膏またはゲルに製剤化することができる。
【０２３３】
[0247] 具体的な実施態様において、抗ＥｒｂＢ２抗体を含む医薬組成物は、浸透させる粘膜バリアに適切な透過体を用いて製剤化される。このような透過体は一般的に当業界既知であり、例えば、経粘膜投与の場合は、胆汁酸塩、および、フシジン酸誘導体が挙げられる。
【０２３４】
[0248] 具体的な実施態様において、本発明の抗ＥｒｂＢ２抗体は、例えば不活性希釈剤、または、消化可能な食用のキャリアーと共に経口投与される。また本化合物（および、必要に応じてその他の成分）は、ハードまたはソフトシェルゼラチンカプセルに封入してもよいし、錠剤に圧縮してもよいし、または、被検者の食物に直接包含させてもよい。治療のための経口投与の場合、抗ＥｒｂＢ２抗体は、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェーハなどに、賦形剤と共に包含させ、その形態で用いることができる。非経口投与以外の方法で本発明の化合物を投与するために、本化合物を、その不活性化を予防する材料とコーティングするか、または、本化合物をそのようなコーティングと共に投与することが必要な場合がある。
【０２３５】
[0249] さらに追加の活性化合物も本組成物に包含させることができる。具体的な実施態様において、本発明の抑制性の抗ＥｒｂＢ２抗体は、上記で列挙したものなどの追加の治療剤の１種またはそれより多くと共に製剤化されるか、および／または、と共に投与される。このような併用療法によって、抑制性の抗ＥｒｂＢ２抗体、加えて共投与された物質の投与量を低くする必要がある可能性があり、従って、様々な単剤療法で起こり得る毒性、または、それに伴う合併症を防ぐことができる。
【０２３６】
[0250] また、本発明の抑制性の抗ＥｒｂＢ２抗体およびそれらを含む組成物は、その他の治療計画と組み合わせて投与してもよく、具体的には外科的治療、放射線治療および／または化学療法治療と組み合わせて投与してもよい。
【０２３７】
[0251] 本発明の組成物は、「治療上有効な量」または「予防的に有効な量」の本発明の抗体または抗原結合部位を含んでいてもよい。「治療上有効な量」は、望ましい治療結果を達成するのに必要な投与量および期間中に効果を示す量を意味する。本抗体または抗体部分の治療上有効な量は、被検者の病状、年齢、性別および体重などの要因や、被検者において望ましい応答を惹起する本抗体または抗体部分の能力に応じて様々であってよい。また、治療上有効な量は、本抗体または抗体部分の治療上有益な作用が、それらのいかなる毒性または有害作用よりも勝っている量でもある。「予防的に有効な量」は、望ましい予防結果が達成されるのに必要な投与量および期間中に効果を示す量を意味する。典型的には、予防的な用量は、病気に罹る前か、または、病気の比較的早い段階で被検者に用いられるため、予防的に有効な量は、治療上有効な量より少なくてもよい。
【０２３８】
[0252] 用法を調節することによって、最適な望ましい応答（例えば、治療または予防的応答）を提供することができる。例えば、１回のボーラスを投与してもよいし、数回に分けられた用量を長期にわたって投与してもよいし、または、治療状況の緊急性に応じて用量を比例的に減少させてもよいし、または、増加させてもよい。投与しやすく、投与量が均一になるような投与単位の形態で非経口組成物を配合することが特に有利である。本明細書で用いられる投与単位の形態は、治療しようとする哺乳動物の被検者にとって一まとまりの投与量として適している物理的に別々の単位を意味しており、それぞれの単位は、望ましい治療効果が生産されるように計算された予め決められた量の活性化合物を必要な製薬キャリアーと共に含む。本発明の投与単位形態に関する詳細は、（ａ）抗ＥｒｂＢ２抗体のまたはそれらの部位の特有の特徴、および、達成しようとする具体的な治療または予防的な作用、ならびに、（ｂ）被検者の感受性を治療する場合に、このような抗体を調剤する分野において固有の限定は、によって決定され、それらに直接的に依存する。
【０２３９】
[0253] 治療上または予防的に有効な量の本発明の抗体または抗体部分の、典型的な、非限定的な範囲は、０．０２５〜５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１〜２５、０．１〜１０または０．１〜３ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施態様において、製剤は、２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、１４０ｍＭのＮａＣｌ、および、０．２ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０を含む緩衝液中に５ｍｇ／ｍｌの抗体を含む。投与量の値は、緩和され得る状態のタイプおよび重症度に応じて様々であり得ることに留意する。さらに当然ながら、全ての個々の被検者のために、個々の必要性や、本組成物を投与する人または本組成物の投与を管理する人の専門的な判断に従って、長期にわたり特定の用法を調節すべきであり、さらに、本明細書に記載の用量範囲は単に典型例であって、範囲または特許請求された組成物の実施を限定することは目的としない。
【０２４０】
[0254] 本発明のその他の形態は、抗ＥｒｂＢ２本発明の抗体または抗体部分、または、このような抗体を含む組成物を含むキットを提供する。キットは、本抗体または組成物に加えて、診断剤または治療剤を含んでいてもよい。またキットは、診断または治療方法に関する使用説明書を含んでいてもよい。その他の実施態様において、本キットは、本抗体またはそれらを含む組成物、および、以下で説明する方法で用いることができる診断薬を含む。その他の好ましい実施態様において、本キットは、本抗体またはそれらを含む組成物、および、以下で説明される方法で用いることができる１種またはそれより多くの治療剤を含む。
【０２４１】
有用な診断方法
[0255] その他の形態において、本発明は、診断方法を提供する。抗ＥｒｂＢ２抗体は、インビトロまたはインビボで生体サンプル中のＥｒｂＢ２を検出するのに用いることができる。一実施態様において、本発明は、それらを必要とする被検者におけるＥｒｂＢ２を発現する細胞の存在または位置を診断する方法を提供し、本方法は、本抗体を被検者に投与する工程、本抗体が結合した場所を位置決めする（ｌｏｃａｌｉｚｉｎｇ）ことによって被検者におけるＥｒｂＢ２の発現を決定する工程、被検者における発現と、正常な参照被検者または標準の発現とを比較する工程、および、上記細胞の存在または位置を診断する工程を含む。また、抗ＥｒｂＢ２抗体は、増殖のマーカーとして用いてもよい。
【０２４２】
[0256] 抗ＥｒｂＢ２抗体は、従来のイムノアッセイで用いることができ、例えば、これらに限定されないが、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、フローサイトメトリー、組織免疫組織化学法、ウェスタンブロット、または、免疫沈降で用いることができる。本発明の抗ＥｒｂＢ２抗体を用いて、ヒト由来のＥｒｂＢ２を検出することができる。その他の実施態様において、抗ＥｒｂＢ２抗体を用いて、カニクイザルまたはアカゲザル由来のＥｒｂＢ２を検出することができる。その他の実施態様において、抗ＥｒｂＢ２抗体を用いて、マウスおよびラットのような齧歯類由来のＥｒｂＢ２を検出することができる。
【０２４３】
[0257] 本発明は、生体サンプル中のＥｒｂＢ２を検出する方法を提供し、本方法は、生体サンプルと本発明の抗ＥｒｂＢ２抗体とを接触させること、および、結合した抗体を検出することを含む。一実施態様において、抗ＥｒｂＢ２抗体は、検出可能な標識で直接標識される。その他の実施態様において、抗ＥｒｂＢ２抗体（一次抗体）は標識されておらず、抗ＥｒｂＢ２抗体と結合することができる二次抗体またはその他の分子は標識されている。当業者周知であるように、一次抗体の特定の種およびクラスに特異的に結合することができる二次抗体が選択される。例えば、抗ＥｒｂＢ２抗体がヒトＩｇＧである場合、二次抗体は、抗ヒト−ＩｇＧが可能である。抗体に結合することができるその他の分子としては、これらに限定されないが、プロテインＡ、および、プロテインＧが挙げられ、これらは両方とも、例えばピアース・ケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）から市販されている。
【０２４４】
[0258] 本抗体または二次抗体に適した標識は上記で開示されており、例えば、様々な酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、および、放射活性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、または、アセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン、および、アビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、または、フィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；および、適切な放射活性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、および、３Ｈが挙げられる。
【０２４５】
[0259] その他の実施態様において、ＥｒｂＢ２は、検出可能な物質で標識されたＥｒｂＢ２標準と、非標識の抗ＥｒｂＢ２抗体とを利用した競合イムノアッセイによって生体サンプル中で分析することができる。この分析において、生体サンプル、標識されたＥｒｂＢ２標準、および、抗ＥｒｂＢ２抗体を混合し、非標識の抗体に結合した標識されたＥｒｂＢ２標準の量を決定する。生体サンプル中のＥｒｂＢ２の量は、抗ＥｒｂＢ２抗体に結合した標識されたＥｒｂＢ２標準の量に反比例する。
【０２４６】
[0260] 上記で開示されたイムノアッセイは、多数の目的で使用することができる。例えば、抗ＥｒｂＢ２抗体を用いて、培養細胞中のＥｒｂＢ２を検出することができる。その他の実施態様において、抗ＥｒｂＢ２抗体を用いて、様々な化合物で処理した細胞表面上のＥｒｂＢ２の量を決定することができる。この方法を用いて、ＥｒｂＢ２タンパク質レベルを調節する化合物を同定することができる。この方法に従って、細胞サンプルの１つを試験化合物で所定期間処理し、一方その他のサンプルを未処理のままにする。ＥｒｂＢ２の合計レベルがを測定しようとする場合、細胞を溶解させ、ＥｒｂＢ２の合計レベルを上述のイムノアッセイの１種を用いて測定する。処理細胞のＥｒｂＢ２の合計レベルと未処理細胞の合計レベルとを比較して、試験化合物の作用を決定する。
【０２４７】
[0261] 好ましいイムノアッセイＥｒｂＢ２の合計レベルを測定するためのは、フローサイトメトリー、または、免疫組織化学法である。ＥｒｂＢ２の細胞表面上のレベルを測定しようとする場合、細胞を溶解させず、上述のイムノアッセイの１種を用いてＥｒｂＢ２の細胞表面上のレベルを測定する。ＥｒｂＢ２の細胞表面のレベルを決定するための好ましいイムノアッセイは、細胞表面タンパク質に、検出可能な標識、例えばビオチンまたは１２５Ｉで標識する工程、ＥｒｂＢ２を抗ＥｒｂＢ２抗体で免疫沈降させる工程、続いて、標識されたＥｒｂＢ２を検出する工程を含む。
【０２４８】
[0262] ＥｒｂＢ２の配置（例えば細胞表面レベル）を決定するためのその他の好ましいイムノアッセイは、免疫組織化学法を用いることによるイムノアッセイである。ＥｒｂＢ２の細胞表面上のレベルを検出するための好ましいイムノアッセイは、適切なフルオロフォア（例えばフルオレセインまたはフィコエリトリン）で標識された抗ＥｒｂＢ２抗体を結合させること、および、フローサイトメトリーを用いて一次抗体を検出することを含む。その他の実施態様において、抗ＥｒｂＢ２抗体は非標識であり、抗ＥｒｂＢ２抗体と結合することができる二次抗体またはその他の分子は、標識されている方法、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、免疫組織化学法、内在性膜タンパク質の細胞表面での標識付け、および、免疫沈降は当業界公知である。例えば、上記のＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅを参照。加えて、このようなイムノアッセイは、ＥｒｂＢ２の活性化または抑制のいずれかに関して多数の化合物を試験するために、ハイスループットスクリーニングでスケールアップすることができる。
【０２４９】
[0263] また本発明の抗ＥｒｂＢ２抗体を用いて、組織中の、または、組織から誘導された細胞中のＥｒｂＢ２のレベルを決定することもできる。一実施態様において、抗ＥｒｂＢ２抗体を用いて、ＥｒｂＢ２を発現しない組織か、または、浸潤細胞と比較して低いレベルでＥｒｂＢ２を発現する組織いずれかへの、ＥｒｂＢ２を発現する細胞の浸潤を決定することができる。いくつかの実施態様において、このような組織は、罹患した組織である。いくつかの実施態様において、このような組織は、組織生検である。本方法のいくつかの実施態様において、組織またはそれらの生検は、被検者から切り出される。続いてこのような組織または生検はイムノアッセイで用いられ、上記で考察された方法によって、例えばＥｒｂＢ２の合計レベル、ＥｒｂＢ２の細胞表面におけるレベル、または、ＥｒｂＢ２の配置を決定することができる。このような方法は、組織が高レベルのＥｒｂＢ２を発現するかどうかを決定するのに用いることができ、これは、その組織が抗ＥｒｂＢ２抗体を用いた治療の標的であるという指標になり得る。
【０２５０】
[0264] また本発明の抗体をインビボで用いて、ＥｒｂＢ２を発現する組織および臓器を同定することもできる。いくつかの実施態様において、抗ＥｒｂＢ２抗体を用いて、ＥｒｂＢ２を発現する細胞を同定することができる。本発明のヒト抗ＥｒｂＢ２抗体を用いるの利点の一つは、ヒト以外の由来の抗体、または、ヒト化またはキメラ抗体を用いた場合とは異なり、これらは、投与の際に本抗体に対する相当な免疫反応を惹起することなく、インビボで安全に用いることが可能であるということである。本方法は、検出可能に標識された抗ＥｒｂＢ２抗体またはそれらを含む組成物を、このような診断テストが必要な被検者に投与する工程、および、被検者を画像解析処理して、ＥｒｂＢ２を発現する組織の位置を決定する工程を含む。画像解析は医療分野でよく知られており、例えば、これらに限定されないが、Ｘ線解析、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、または、コンピューター断層撮影（ＣＴ）が挙げられる。本抗体は、インビボでのイメージングに適したあらゆる物質で標識することができる、このような物質としては、例えば、コントラスト剤、例えばＸ線解析に用いることができるバリウム、または、磁気コントラスト剤、例えばＭＲＩまたはＣＴに用いることができるガドリニウムキレートが挙げられる。その他の標識物質としては、これらに限定されないが、９９Ｔｃのような放射性同位体が挙げられる。その他の実施態様において、抗ＥｒｂＢ２抗体は非標識であり、検出可能であり抗ＥｒｂＢ２抗体と結合することができる二次抗体またはその他の分子を投与することによって画像化することも考えられる。その他の実施態様において、生検は、対象の組織がＥｒｂＢ２を発現するかどうかを決定するための被検者から得られる。
【０２５１】
[0265] いくつかの実施態様において、検出可能に標識された抗ＥｒｂＢ２抗体は、フルオロフォアを含む。具体的な実施態様において、フルオロフォアは、近赤外線の蛍光色素、ジニトロフェニル、フルオレセインおよびそれらの誘導体、ローダミン、ローダミン誘導体、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、および、フルオレサミン、テキサスレッド、ローダミングリーン、オレゴングリーン、カスケードブルー、フィコエリトリン、ＣＹ３、ＣＹ５、ＣＹ２、ＣＹ７、クマリン、インフラレッド４０、ＭＲ２００、ＩＲＤ４０、アレクサ・フルオロ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）、カスケードブルー、テトラメチルローダミン、パシフィックブルー、SYBR、および、BODIPYから選択される。その他の実施態様において、フルオロフォアは、以下の化合物のうち１種を含む（それらの最大発光は、かっこ内にｎｍで示す）：Ｃｙ２ＴＭ（５０６）、ＧＦＰ（赤方偏移した）（５０７）、ＹＯ−ＰＲＯ（Ｒ）−１（５０９）、ＹＯＹＯ（Ｒ）−１（５０９）、カルセイン（５１７）、ＦＩＴＣ（５１８）、フルオロＸ（ＦｌｕｏｒＸ（Ｒ））（５１９）、アレクサ（Ａｌｅｘａ（Ｒ））（５２０）、ローダミン１１０（５２０）、５−ＦＡＭ（５２２）、オレゴングリーン（登録商標）５００（５２２）、オレゴングリーン（登録商標）４８８（５２４）、リボグリーン（ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（Ｒ））（５２５）、ローダミングリーン（登録商標）（５２７）、ローダミン１２３（５２９）、マグネシウムグリーン（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ（Ｒ））（５３１）、カルシウムグリーン（Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ（Ｒ））（５３３）、ＴＯ−ＰＲＯ（Ｒ）−１（５３３）、ＴＯＴＯ（Ｒ）−１（５３３）、ＪＯＥ（５４８）、ＢＯＤＩＰＹ（Ｒ）５３０／５５０（５５０）、Ｄｉｌ（５６５）、ＢＯＤＩＰＹ（Ｒ）（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ（Ｒ）５５８／５６８（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ（Ｒ）５６４／５７０（５７０）、Ｃｙ３（Ｒ）（５７０）、アレクサ（登録商標）５４６（５７０）、ＴＲＩＴＣ（５７２）、マグネシウムオレンジ（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  Ｏｒａｎｇｅ（Ｒ））（５７５）、フィコエリトリンＲ＆Ｂ（５７５）、ローダミンファロイジン（５７５）、カルシウムオレンジ（登録商標）（５７６）、ピロニンＹ（５８０）、ローダミンＢ（５８０）、ＴＡＭＲＡ（５８２）、ローダミンレッド（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ（Ｒ））（５９０）、Ｃｙ３．５（Ｒ）（５９６）、ＲＯＸ（６０８）、カルシウムクリムゾン（Ｃａｌｃｉｕｍ  ＣｒｉｍｓｏｎＴＭ）（６１５）、アレクサ（登録商標）５９４（６１５）、テキサスレッド（登録商標）（６１５）、ナイルレッド（６２８）、ＹＯ−ＰＲＯ（Ｒ）−３（６３１）、ＹＯＹＯ（Ｒ）−３（６３１）、Ｒ−フィコシアニン（６４２）、Ｃ−フィコシアニン（６４８）、ＴＯ−ＰＲＯ（Ｒ）−３（６６０）、ＴＯＴＯ（Ｒ）−３（６６０）、ＤｉＤ  ＤｉｌＣ（５）（６６５）、Ｃｙ５ＴＭ（６７０）、チアジカルボシアニン（６７１）、および、Ｃｙ５．５（６９４）。
【０２５２】
有用な治療方法
[0266] その他の実施態様において、本発明は、標的化結合物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体をそれらを必要とする被検者に投与することによる、ＥｒｂＢ２活性の抑制方法を提供する。その他の実施態様において、抗ＥｒｂＢ２抗体は、ヒト、キメラまたはヒト化抗体である。その他の好ましい実施態様において、ＥｒｂＢ２はヒトＥｒｂＢ２であり、被検者は人間の被検者である。あるいは、被検者は、ＥｒｂＢ２を発現しており、それらと標的化結合物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体とが交叉反応している哺乳動物でもよい。標的化結合物質および／または抗体は、獣医学的な目的で、または、ヒトの病気の動物モデルとして、ＥｒｂＢ２を発現しておりそれらと本抗体とが交叉反応するヒト以外の哺乳動物（すなわち、カニクイザルサル）に投与してもよい。このような動物モデルは、本発明の抗体の治療効果を評価するのに有用であり得る。
【０２５３】
[0267] 一実施態様において、本発明は、被検者に、治療有効量の本発明の標的化結合物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体を投与することによって、被検者におけるＥｒｂＢ２が介在する障害を治療または予防する方法を提供する。本明細書で用いられる用語「ＥｒｂＢ２が介在する障害」は、障害に罹った被検者における、高レベルまたは増加したレベルのＥｒｂＢ２発現または活性の存在が、障害の病態生理学、または、障害の悪化に寄与する要因のいずれかに関与することが示されているか、または、その疑いがある病気およびその他の障害を含むこととする。このような障害は、例えば、障害に罹った被検者の影響を受けた細胞または組織中の細胞表面上のＥｒｂＢ２の発現またはレベルの増加、または、障害の病理学に寄与するか、または、障害の悪化に寄与する細胞型（例えば癌細胞）における、ＥｒｂＢ２が介在する活性の増加によって証明される可能性がある。ＥｒｂＢ２レベルの増加は、例えば抗ＥｒｂＢ２抗体を用いて検出してもよい。ＥｒｂＢ２活性の増加は、増加したＥｒｂＢ２のリン酸化、ＭＡＰＫ経路の活性化、ｐ３８−ＴＳＰ−１経路の活性化、ＰＩ３Ｋ経路の活性化、ＣＤＣ２の抑制、および、それらの組み合わせによって検出してもよい。
【０２５４】
[0268] 本発明のその他の形態は、ＥｒｂＢ２を発現する癌細胞の増殖を必要とする被検者における、それらの抑制方法を提供し、本方法は、前記被検者に、標的化結合物質および／または抗ＥｒｂＢ２抗体またはそれらの抗原結合部位を投与する工程を含み、ここで前記標的化結合物質、または、抗体または部位は、ＥｒｂＢ２を抑制する。その他の形態は、ＥｒｂＢ２を発現する細胞におけるＥｒｂＢ２活性の抑制方法を提供し、本方法は、細胞と、標的化結合物質、抗ＥｒｂＢ２抗体またはそれらの抗原結合部位とを接触させることを含み、ここで細胞中のＥｒｂＢ２活性は、（ａ）ＥｒｂＢ２のリン酸化；（ｂ）ＭＡＰＫ経路の活性化；（ｃ）ｐ３８−ＴＳＰ−１経路の活性化；（ｄ）ＰＩ３Ｋ経路の活性化；（ｅ）ＣＤＣ２の抑制；および、（ｆ）それらの組み合わせからなる群より選択される。その他の実施態様において、このような細胞は、被検者に存在する細胞である。
【０２５５】
[0269] 標的化結合物質および／または抗体は１回で投与してもよいが、より好ましくは複数回投与される。標的化結合物質および／または抗体は、１日３回から、６ヶ月毎に１回、または、それより長い期間毎に１回で投与してもよい。このような投与は、予定に則って行ってもよく、例えば１日３回、１日２回、１日１回、２日毎に１回、３日毎に１回、週１回、２週間毎に１回、月１回、２ヶ月毎に１回、３ヶ月毎に１回、および、６ヶ月毎に１回投与してもよい。また、標的化結合物質および／または抗体は、ミニポンプを介して連続的に投与してもよい。標的化結合物質および／または抗体は、経口、粘膜、頬側、鼻腔内、吸入、静脈内、皮下、筋肉内、腹膜内、眼球内、脊髄内、非経口、粘膜内または局部経路を介して投与してもよい。標的化結合物質および／または抗体は、局所投与してもよいし、または、全身投与してもよい。
【０２５６】
[0270] 標的化結合物質、および／または、抗ＥｒｂＢ２抗体を含む治療用組成物は、当業者にはよく知られていると思われる様々な製薬上許容できる投与形態で、例えば経口で、経鼻で、経膣で、頬側で、直腸に、目を介して、または、肺経路を介して被検者に投与してもよい。
【０２５７】
[0271] 例えば、抗ＥｒｂＢ２抗体は、鼻用の注入装置を用いて経鼻投与してもよい。これらの例は、鼻への適用を目的とした市販の粉末系ですでに用いられている（例えば、ファイソンズ（Ｆｉｓｏｎｓ）のロムダルシステム（Ｌｏｍｕｄａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ））。その他の装置の詳細は、薬学の文献に見出すことができる（例えば、Ｂｅｌｌ，Ａ．Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｄｅｖｉｃｅｓ，ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｔｙｌｅ  Ｐ．（編集），デッカー（Ｄｅｋｋｅｒ），ニューヨーク，１９８８を参照）。
【０２５８】
[0272] 抗ＥｒｂＢ２抗体を凍結乾燥した粉末製剤中に含めて、膣に投与してもよい。抗ＥｒｂＢ２抗体を膣用アプリケーター中に含めて投与してもよく、この場合、それが膣内に入ったら、注入器型のピストンを押すことによって、または、アプリケーターにある類似の放出メカニズムによって抗ＥｒｂＢ２抗体を含む製剤が放出される。あるいは、抗ＥｒｂＢ２抗体は、粉末装置を用いて粉末として製剤化してもよいし、膣坐剤もしくはペッサリー、または、膣錠もしくは膣ジェルに製剤化してもよい。
【０２５９】
[0273] また抗ＥｒｂＢ２抗体をゲル製剤に含めて、目に投与してもよい。例えば、都合のよい形態として、抗ＥｒｂＢ２抗体を含む製剤は、投与前に、２つの区画を有する単位用量容器に含まれていてもよく、一方の区画には、凍結乾燥させた抗ＥｒｂＢ２抗体製剤が含まれ、他方の区画には、生理食塩水が含まれる。適用の前に、これら２つの区画が混合され、ゲルが形成され、続いてこれが目に投与される。
【０２６０】
[0274] 抗ＥｒｂＢ２抗体のためのその他の送達経路としては、粉末吸入器または定量吸入器を用いた肺経路による送達経路、錠剤または口腔内パッチに製剤化して、頬側経路によって、坐剤に製剤化して、直腸経路による送達経路；および、錠剤、カプセルまたはペレットの形態で経口経路による送達経路（このような組成物の場合、胃、小腸または結腸を介して物質が投与される）が挙げられ、これらはいずれも当業者周知の技術に従って製剤化することができる。
【０２６１】
[0275] 本抗体は、一般的に、上記で説明されているような医薬組成物の一部として投与されると予想される。抗体の投与量は、一般的には０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１〜２０ｍｇ／ｋｇ、および、さらにより好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲であると予想される。本抗体の血清濃度は、当業界既知のあらゆる方法によって測定することもできる。
【０２６２】
[0276] 本抗体と追加の治療剤との共投与（併用療法）は、抗ＥｒｂＢ２抗体と追加の治療剤とを含む医薬組成物を投与することを包含し、それに加えて、２種またはそれより多くの別々の医薬組成物（ここで、一方は、抗ＥｒｂＢ２抗体を含む医薬組成物であり、他方は、追加の治療剤を含む医薬組成物である）を投与することを包含する。さらに、共投与または併用療法は、一般的に、本抗体と追加の治療剤とをそれぞれ同時に投与することを意味するが、本抗体と追加の治療剤とを異なる時間に投与する例も包含する。例えば、本抗体は、３日毎に１回投与してもよく、一方で追加の治療剤は１日１回投与される。あるいは、本抗体は、追加の治療剤での上記障害の治療の前に投与してもよいし、または、その後に投与してもよく、例えば被検者の追加の治療剤での治療が不十分となった後に投与してもよい。加えて、抗ＥｒｂＢ２抗体の投与は、免疫療法などのその他の治療の前に行ってもよいし、または、その後に行ってもよい。
【０２６３】
[0277] 本抗体、および、１種またはそれより多くの追加の治療剤（併用療法）は、１回、２回投与してもよく、または、少なくとも上記の状態が、治療される、緩和される、または、治癒するまでの期間投与してもよい。好ましくは、このような併用療法は、複数回投与される。このような併用療法は、１日３回から６ヶ月毎に１回で投与してもよい。このような投与は、スケジュールに則って行ってもよく、例えば１日３回、１日２回、１日１回、２日毎に１回、３日毎に１回、週１回、２週間毎に１回、月１回、２ヶ月毎に１回、３ヶ月毎に１回、および、６ヶ月毎に１回投与してもよいし、または、ミニポンプを介して連続的に投与してもよい。このような併用療法は、経口、粘膜、頬側、鼻腔内、吸入、静脈内、皮下、眼球内、脊髄内、腹膜内、筋肉内、非経口、腫瘍内または局部経路を介して投与してもよい。
【０２６４】
[0278] さらにその他の実施態様において、抗ＥｒｂＢ２抗体は、放射標識、免疫毒素または毒素で標識されているか、または、毒性ペプチドを含む融合タンパク質である。抗ＥｒｂＢ２抗体または抗ＥｒｂＢ２抗体融合タンパク質は、放射標識、免疫毒素、毒素、または、毒性ペプチドをＥｒｂＢ２を発現する細胞に向けさせる。その他の実施態様において、放射標識、免疫毒素、毒素または毒性ペプチドは、細胞表面上で抗ＥｒｂＢ２抗体がＥｒｂＢ２に結合した後に、内在化される。
【０２６５】
遺伝子治療
[0279] 本発明の核酸分子は、遺伝子治療によってそれらを必要とする被検者に投与することができる。このような治療は、インビボでもよいし、または、エクスビボでもよい。その他の実施態様において、重鎖および軽鎖の両方をコードする核酸分子が被検者に投与される。より好ましい実施態様において、このような核酸分子は、核酸分子が、Ｂ細胞（これらの細胞は抗体生産に特殊化しているため）の染色体に安定して統合されるように投与される。その他の実施態様において、Ｂ細胞前駆体をトランスフェクションするか、または、エクスビボで感染させ、それらを必要とする被検者に再移植する。その他の実施態様において、対象の細胞型に感染することがわかっているウイルスを用いて、Ｂ細胞またはその他の細胞の前駆体をインビボで感染させる。遺伝子治療に用いられる典型的なベクターとしては、リポソーム、プラスミド、および、非ウイルスベクターが挙げられる。典型的な非ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、および、アデノ随伴ウイルスである。インビボまたはエクスビボのいずれかで感染させた後、抗体発現のレベル抗体発現は、処理した被検者からサンプルを採取し、当業界既知の、または、本明細書において考察されたあらゆるイムノアッセイを用いてモニターすることができる。
【０２６６】
[0280] その他の実施態様において、遺伝子治療の方法は、抗ＥｒｂＢ２抗体の重鎖またはそれらの抗原結合部位をコードする単離された核酸分子を投与する工程、その核酸分子を発現させる工程を含む。その他の実施態様において、遺伝子治療の方法は、抗ＥｒｂＢ２抗体の軽鎖またはそれらの抗原結合部位をコードする単離された核酸分子を投与する工程、および、その核酸分子を発現させる工程を含む。より好ましい方法において、遺伝子治療の方法は、本発明の抗ＥｒｂＢ２抗体の、重鎖またはそれらの抗原結合部位をコードする単離された核酸分子、および、軽鎖またはそれらの抗原結合部位をコードする単離された核酸分子を投与する工程、および、その核酸分子を発現させる工程を含む。また、遺伝子治療の方法は、抗癌剤のようなその他の治療剤を投与する工程を含んでいてもよい。
【０２６７】
[0281] 本発明をよりよく理解するために、以下の実施例を説明する。これらの実施例は単に説明のためであり、いかなる形でも本発明の範囲を制限するものとして解釈されないものとする。
【実施例】
【０２６８】
実施例１
免疫化および抗体価測定
免疫化
[0282] ヒトＥｒｂＢ２の細胞外ドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃ領域とを含む組換えヒトＥｒｂＢ２−ＥＣＤ／Ｆｃγ１融合タンパク質を、免疫原として使用するために、Ｒ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）（ミネソタ州ミネアポリス，カタログ番号１１２９−ＥＲ／ＣＦ）から得た。ＥｒｂＢ２に対するモノクローナル抗体は、フットバッド経路の注入によって、キセノマウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ｒ））マウス（キセノマウスＸＭ３Ｂ−３系、アアブジェニックス社（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．），カリフォルニア州フレモント）を連続的に免疫化することによって開発された。最初の注入では、マウス１匹あたり、タイターマックス・ゴールド（Ｔｉｔｅｒｍａｘ  Ｇｏｌｄ，シグマ（Ｓｉｇｍａ），カタログ番号Ｔ２６８４，ロット番号Ｋ１５９９）中の１０μｇの組換えヒトＥｒｂＢ２−ＥＣＤ／Ｆｃγ１を用いた。それに続く１０回のブーストでは、マウス１匹あたり、５μｌのＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（リン酸アルミニウムゲル，カタログ番号１４５２−２５０，ＨＣＩバイオセクター（ＨＣＩ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ））と混合したｑＣｐＧ（イミューンイージー・マウス・アジュバント（ＩｍｍｕｎＥａｓｙ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ），カタログ番号３０３１０１；キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））１５μｌ中の１０μｇの組換えヒトＥｒｂＢ２−ＥＣＤ／Ｆｃγ１を用いた。各注入の合計体積は、マウス１匹あたり５０μｌ、フットバッド１つあたり２５μｌであった。これらのマウスを、週２回、５週間にわたり免疫化し、融合を３９日目に行った。
【０２６９】
抗体価によって回収するための動物の選択
[0283] ８回目のブーストの後に、免疫化したキセノマウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ）マウスを出血させ、血清中の抗ＥｒｂＢ２抗体の抗体価を、ＦＡＣＳ（蛍光−活性化セルソーター）解析によって決定した。
【０２７０】
[0284] この目的のために、ヒトＥｒｂＢ２発現ベクターを構築し、マウスのプレ−ＢＢ３００．１９細胞にトランスフェクションして、ヒトＥｒｂＢ２タンパク質を発現させた。ヒトＥｒｂＢ２のｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲによりヒト類表皮癌Ａ４３１細胞（ＡＴＣＣ，カタログ番号ＣＲＬ−１５５５）から誘導し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩエンドヌクレアーゼ制限切断部位によって、ｐＣＲ３．１発現ベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），カタログ番号Ｋ３０００）にクローニングした。この発現ベクターは、全長ヒトＥｒｂＢ２をコードする３７６８ｂｐのインサートを含む。上記のプラスミドを、エレクトロポレーション法を用いてＢ３００．１９細胞にトランスフェクションした。ピューロマイシン（２．５ｕｇ／ｍｌ）の存在下で、ｈＥｒｂＢ２タンパク質を発現する安定なＢ３００．１９クローンを選択し、続いて、ＦＡＣＳによって、キメラ抗ｈＥｒｂＢ２抗体（これは、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ（２００６）５５：７１７〜７２７，表題「治療用のＨＥＲ二量体化抑制剤、パーツズマブを生産するための組換えモノクローナル抗体のヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ＨＥＲ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）」で詳細に述べられているようにして作製され、本明細書において２Ｃ４と称する）を用いてスクリーニングし、続いてヤギ抗マウスＩｇＧ  ＰＥ（カルタグ（Ｃａｌｔａｇ），カタログ番号Ｍ３０００４−４）を用いてスクリーニングした。Ｂ３００．１９／ｈＥｒｂＢ２クローン第４４号がＦＡＣＳで最大の相乗平均を示したため、これを血清の抗体価の決定に選択した。
【０２７１】
[0285] 免疫化され出血させたマウス由来の血清を、１：５０、１：２５０または１：１２５０の希釈率のＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ）中で抗体価を測定した。Ｂ３００．１９／ｈＥｒｂＢ２クローン第４４号細胞（陽性細胞）、および、Ｂ３００．１９親細胞（陰性細胞）を、連続希釈した血清と共に１時間インキュベートし、続いて、Ｃｙ５結合型ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ／ＪＩＲ），カタログ番号１０９−１７６−０９８）と共にさらに３０分間インキュベートした。陽性コントロールとして、抗ＥｒｂＢ２ｍＡｂ２Ｃ４を用い、社内で作製した一方で抗ＫＬＨＧ１抗体（Ｇｍｉｘ）を、Ｇ１アイソタイプコントロールとして用いた。十分に洗浄した後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＢＤ  ＦＡＣＳ装置で解析した。データ解析後に各サンプルの相乗平均を決定し、それを以下の表２に示した。ＥｒｂＢ２陰性細胞における相乗平均に対するＥｒｂＢ２陽性細胞における相乗平均の比率は、ＥｒｂＢ２への特異的な結合能力に関して互いに相関している。陰性コントロール、例えばＧ１アイソタイプコントロールの抗ＫＬＨ  Ｇｍｉｘ、コントロール二次抗体のヤギ抗マウスＩｇＧＣｙ５（ＪＩＲ，カタログ番号１１５−１７６−０７１）、および、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  ＰＥ単独は、１未満の相乗平均比率を示した。一方で陽性コントロールのｍＡｂ２Ｃ４、および、全１０匹の免疫化されたマウス由来の血清は２．９８〜７．５５の比率を示したため、全てのマウスがヒトＥｒｂＢ２に対する体液性免疫反応を発生させた。
【０２７２】
【表２】
0005638804.tif 000003
【０２７３】
実施例２
リンパ球の回収、Ｂ細胞の単離、融合およびハイブリドーマの生成
[0286] 免疫化したマウスからリンパ節（ＬＮ）を回収し、３ｍｌの滅菌ＦＡＳＣ緩衝液（ＰＢＳ，２％ＦＢＳ）を用いて処理した。このＬＮ細胞を４０μｍのセルフィルターに通過させてろ過し、４００ｇで３分間沈降させ、３ｍｌの新しいＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。細胞を計数し、続いて、ビオチン化したＣＤ９０に対する抗体（ファーミンジェン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ），カタログ番号５５３００２）、ＣＤ４（ファーミンジェン，カタログ番号５５３７２８）、ＣＤ８（ファーミンジェン，カタログ番号５５３０２９）、および、ＩｇＭ（ファーミンジェン，カタログ番号５５５７８１）を添加した。これらの細胞と上記の抗体とを穏やかに混合し、氷上で１０分間インキュベートした。細胞を再度沈降させ、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。細胞を標的とさせるために、細胞にＳＡダイナル（Ｄｙｎａｌ）ビーズ（Ｍ−２８０）をビーズ１に対して４の比率で添加し、回転させながら室温で１２分間インキュベートした。１５ｍｌのチューブ中の細胞／ビーズをダイナル磁石の磁場に２分間置いた。ＩｇＭ分画を含む上清を新しいチューブに移し、磁石の工程をもう一度繰り返した。細胞上清を最終的なチューブに移し、ＩｇＭ細胞を計数し、融合のためにアリコートにした。
【０２７４】
[0287] 上記融合は、上述の洗浄した高濃度化されたＢ細胞と、ＡＴＣＣ（カタログ番号ＣＲＬ１５８０）から購入した非分泌性の骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（Ｋｅａｒｎｅｙ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３，１９７９，１５４８〜１５５０）とを１：１の比率で混合することによって行われた。この細胞混合物を８００×ｇでの遠心分離によって穏やかにペレット化した。上清を完全に除去した後に、これらの細胞を、２〜４ｍｌのプロナーゼ溶液（カルバイオケム（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ），カタログ番号５３７０２；ＰＢＳ中に０．５ｍｇ／ｍｌで）で２分間以下で処理した。続いて、３〜５ｍｌのＦＢＳを添加して酵素活性を止めさせ、電気細胞融合用の溶液（ＥＣＦＳ：０．３Ｍのスクロース，０．１ｍＭの酢酸マグネシウム，０．１ｍＭの酢酸カルシウム，全てシグマ製）を用いて合計体積４０ｍｌになるように懸濁液を調節した。遠心分離後に上清を除去した、細胞を４０ｍｌのＥＣＦＳに再懸濁した。この洗浄工程を繰り返し、細胞を再度、２×１０６細胞／ｍｌの濃度になるまでＥＣＦＳに再懸濁した。
【０２７５】
[0288] 電気細胞融合は、融合発生装置（モデルＥＣＭ２００１，ジェネトロニック社（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃ，Ｉｎｃ．），サンディエゴ，カリフォルニア州）を標準的な機器の設定に従って用いて行った。ＥＣＦ後に、細胞懸濁液を融合チャンバーから慎重に取り出し、ＤＭＥＭ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１５％ＦＢＳ（ハイクローン（ＨｙＣｌｏｎｅ））を含み、Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、ＯＰＩ（オキザロ酢酸、ピルビン酸塩、ウシインスリン）（全てシグマ製）、および、ＩＬ−６（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ））が補足された同じ体積のハイブリドーマ培地を含む滅菌チューブに移した。細胞を３７℃で１５〜３０分間インキュベートし、続いて４００×ｇ（１０００ｒｐｍ）で５分間遠心分離した。細胞をハイブリドーマ選択培地（０．５×ＨＡ（シグマ，カタログ番号Ａ９６６６）が補足されたハイブリドーマ培地）に穏やかに再懸濁し、最終的に、９６ウェルプレートあたり合計２×１０５個、および、１ウェルあたり２００μｌのＢ細胞を平板培養した。細胞を穏やかに混合し、ピペットで９６ウェルプレートに入れ、増殖させた。７日目または１０日目に、培地の２分の１を除去し、細胞にハイブリドーマ選択培地を再度供給した。
【０２７６】
実施例３
ＦＭＡＴ／ＦＡＣＳによる抗体のスクリーニング
[0289] 培養の１４日後に、ハイブリドーマの上清を、ＦＭＡＴ（蛍光微量分析技術；Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によってＥｒｂＢ２特異的な抗体に関してスクリーニングした。簡単に言えば、Ｂ３００．１９／ｈＥｒｂＢ２（陽性細胞）、または、Ｂ３００．１９（ＥｒｂＢ２−陰性細胞）の４２７５個の細胞を、１５μｌのＦＡＣＳ緩衝液中の４００ｎｇ／ｍｌのＣｙ５ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＪＩＲ，カタログ番号１０９−１７６−０９８）と混合し、続いて、１５μｌのハイブリドーマの上清と室温で３時間インキュベートした。陽性コントロール抗体は抗ｈＥｒｂＢ２（２Ｃ４）であり、これは、Ｃｙ５ヤギ抗マウスＩｇＧガンマ（ＪＩＲ，カタログ番号１１５−１７６−０７１）、または、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｂｉｏｔ（サザン・バイオテクノロジー／ＳＢ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ／ＳＢ），カタログ番号１０３０−０８、４００ｎｇ／ｍｌ）とＳＡ−Ｃｙ５（ＪＩＲカタログ番号０１６−１７０−０８４、３５０ｎｇ／ｍｌ）との組み合わせで検出した。抗ＫＬＨ  Ｇ１抗体（Ｇｍｉｘ，社内製）を、アイソタイプコントロールとして用いた。これらのプレートを、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製のＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステムで読み取った。データ解析後に蛍光シグナルとカウントの両方が決定され、ＥｒｂＢ２に陽性の細胞への結合を示したが陰性細胞には結合しなかった３６２種の陽性ハイブリドーマが同定された。
【０２７７】
[0290] ＦＭＡＴスクリーニングで見出された３６２種の陽性上清をさらに、ＦＡＣＳによって２セットでスクリーニングし（ここにおいて１つのセットはｈＩｇＧ重鎖検出のためであり、他方のセットはヒトＩｇカッパ軽鎖検出のためである）、Ｉｇガンマ、および、Ｉｇカッパ鎖の両方が完全にヒトの組成であることを実証した。２．５×１０５個のＢ３００．１９／ｈＥｒｂＢ２細胞、または、Ｂ３００．１９親細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で１：２に希釈したハイブリドーマの上清と４℃で１時間インキュベートし、続いてＰＢＳで洗浄した。続いて細胞を、Ｉｇガンマ検出のためにヤギ抗ヒトガンマＣｙ５と４℃で１時間インキュベートするか、または、Ｉｇカッパ検出のためにヤギ抗ヒトカッパＰＥ（ＳＢ，カタログ番号２０６３−０９）と４℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ＦＡＣＳ解析の前に細胞を１％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で固定した。この分析において、１：５０に希釈したプールした血清を、陽性コントロールとして用い、一方で１：１０に希釈したＧｍｉｘ（抗ＫＬＨ  ＩｇＧ）を、陰性アイソタイプコントロールとして用いた。陽性細胞と陰性細胞との相乗平均値の比率をまとめ、１．９５を超える比率を示したハイブリドーマを標準に達したとみなした。このスクリーニングで、合計１５２種の完全にヒト化された抗ｈＥｒｂＢ２ＩｇＧ／カッパ抗体が確認された。
【０２７８】
実施例４
ＭＣＦ７細胞におけるヘレグリン−βによって誘導されたＥｒｂＢ２のリン酸化の抑制
[0291] ＥｒｂＢ２は、活性化されると、その他のＥｒｂＢファミリー種、例えばＥｒｂＢ３と二量体を形成することによってチロシンリン酸化される。ヘレグリン−βのＥｒｂＢ３への結合は、ＥｒｂＢ２とＥｒｂＢ３との両方を発現するヒト乳房腺癌ＭＣＦ７細胞においてＥｒｂＢ２のチロシンリン酸化を誘導することが可能である。ＥｒｂＢ２活性化をブロックする抗体を同定するために、我々は、細胞ベースのＥｒｂＢ２のリン酸化分析で１５２種のヒトＥｒｂＢ２に結合する抗体スクリーニングした。
【０２７９】
[0292] ＭＣＦ７細胞を２５，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに植え付け、完全増殖培地（１０％ＦＣＳ）中で一晩培養した。次の日、細胞培養プレートをＰＢＳで１回洗浄し、培地をフェノールレッド非含有で無血清の培地で交換した。細胞を一晩かけて血清飢餓にし、続いて、２５μｌのフェノールレッド非含有培地と混合された２５μｌのハイブリドーマの上清と１時間インキュベートし、その後１０ｎＭのヘレグリン−βで１０分間処理した。あるいは、細胞を血清飢餓にさせず、ヘレグリン−β処理の前にハイブリドーマの上清と一晩（〜２４時間）インキュベートした。
【０２８０】
[0293] 細胞溶解産物を製造するために、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、１００μｌ／ウェルの溶解緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）、１％トリトンＸ（Ｔｒｉｘｔｏｎ  Ｘ）−１００、１０％グリセロール、１００ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＮａＦ、４０ｕｇ／ｍｌのＰＭＳＦ、１ｕＭペプスタチン、０．５ｕｇ／ｍｌのロイペプチン、１０ｕｇ／ｍｌのダイズトリプシンインヒビター、０．２ｍＭのＮａＶＯ４、１ｍＭのＮａＭｏＯ、４、５ｍＭのｂ−グリセロリン酸塩）と４℃で３０分間インキュベートした。蛍光−ＥｒｂＢ２のレベルを、Ｒ＆Ｄシステムズ製のヒト蛍光−ＥｒｂＢ２ＥＬＩＳＡキット（ヒトホスホ−ＥｒｂＢ２  ＤｕｏＳｅｔ  ＩＣ，カタログ番号ＤＹＣ１７６８）を用いて提供されたプロトコールに従って測定した。抑制のパーセンテージを、抗体の非存在下で、刺激していない細胞およびヘレグリンで刺激した細胞におけるｐＥｒｂＢ２のレベルに基づいて計算した。
【０２８１】
[0294] 図１は、それらをＭＣＦ７細胞と共に１時間プレインキュベートした場合と、２４時間で一晩プレインキュベートした場合とにおける、試験される１５２種の抗体の中和された活性の相関を説明する。１５２種の抗体のうち５１種が、細胞を上清と共に１時間プレインキュベートした場合に３０％より大きい抑制を示した。これらの抗体は、ＥｒｂＢ２とＥｒｂＢ３との二量体化をブロックすることによってＥｒｂＢ２のリン酸化を抑制する可能性がある。それよりも有意に多くの抗体が、細胞をハイブリドーマの上清と共に一晩プレインキュベートした場合に、３０％より大きい抑制を示した。これらのうちいくつかは、ＥｒｂＢ２のダウンレギュレートの誘導のようなその他のメカニズムによってそのようになった可能性がある。
【０２８２】
実施例５
ｃｙｎｏＥｒｂＢ２に対する交叉反応性の決定
[0295] これらの抗体のヒト以外の霊長類であるカニクイザルのＥｒｂＢ２に対する種間の交叉反応性を決定するために、ＣＨＯ−Ｋ１カニクイザルＥｒｂＢ２を発現する細胞を生成した。簡単に言えば、カニクイザルの卵巣組織からカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＥｒｂＢ２のｃＤＮＡを誘導し、ｐＣＲ３．１発現ベクターのＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位の間にクローニングした。３７６７ｂｐｓのインサートを含む発現ベクターｃｙｎｏ−ＥｒｂＢ２（ＦＬ）／ｐＣｒ３．１を、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン，カタログ番号１１６６８）を用いて、提供されたプロトコールに従ってＣＨＯ−ｋ１細胞にトランスフェクションした。ｃｙｎｏ−ＥｒｂＢ２を発現するＣＨＯ−Ｋ１の安定なクローンを、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で選択した。この発現を、マウス抗ヒトｃ−ＥｒｂＢ２／ｃ−ｎｅｕ（Ａｂ−２）（オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ），カタログ番号ＯＰ１４）、および、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ（カルタグ，カタログ番号Ｍ３０００４−４）を用いたＦＡＣＳによって確認した。
【０２８３】
[0296] ＣＨＯ−Ｋ１／ｃｙｎｏＥ４ｒｂＢ２クローン第４号を用いて、ヒトＥｒｂＢ２結合抗体の交叉反応性を測定した。２００，０００個のＣＨＯ−Ｋ１細胞／ｃｙｎｏＥｒｂＢ２クローン第４号、または、親のＣＨＯ−Ｋ１細胞を、１：２に希釈したハイブリドーマの上清、または、２μｇ／ｍｌの陽性コントロール抗体Ａｂ−２（腫瘍遺伝子，カタログ番号ＯＰ１４）と４℃で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、続いて、二次検出抗体の５μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧＣｙ５、または、ヤギ抗マウスＩｇＧＣｙ５と４℃で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、１％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で固定し、続いてＦＡＣＳで解析した。それぞれ染色するために、陽性細胞と陰性細胞との相乗平均値の比率をまとめ、比率が１．９５を超えるものを陽性とみなした。８種の抗体がｃｙｎｏＥｒｂＢ２と交叉反応しないことがわかり、それらをその後の解析から排除した。
【０２８４】
実施例６
高濃度抗原および限定的な抗原のＥＬＩＳＡ
[0297] １時間または一晩のいずれかで細胞とインキュベートした場合にｃｙｎｏＥｒｂＢ２の交叉反応性を示し、加えてＥｒｂＢ２のリン酸化の３０％以上の抑制も示した１１３種の抗ＥｒｂＢ２抗体をさらに、高濃度抗原（ＨＡ）および限定的な抗原（ＬＡ）のＥＬＩＳＡによって特徴付けた。
【０２８５】
[0298] ＨＡ  ＥＬＩＳＡは、プレート上にコーティングした高濃度の抗原を用いて行われ、これは、濃度依存性反応であり；一方、ＬＡ  ＥＬＩＳＡは、プレート上にコーティングした限定的な量の抗原を用いて行われ、従って親和性依存性の反応である。抗体の相対的な親和性の順位付けは、ＨＡ／ＬＡ解析によって達成できる。
【０２８６】
[0299] 組換えヒトＥｒｂＢ２ＥＣＤ−Ｆｃγ１融合タンパク質はこの目的に用いることができないため、ヒトＥｒｂＢ２ＥＣＤ−ｍｙｃ／Ｈｉｓ融合タンパク質を社内で作製した。ヒトＥｒｂＢ２／ＥＣＤのｃＤＮＡをＡ４３１細胞から誘導し、ｐＳｅｃＴａｇ２Ｈｙｇｒｏ発現ベクター（インビトロジェン，カタログ番号Ｖ９１０−２０）のＮｈｅＩおよびＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位の間にクローニングした。発現ベクターｈｕＥｒｂＢ２（ＥＣＤ）／ｐＳｅｃＴａｇ２ＢＨｙｇｒｏは、ＥｒｂＢ２（ＥＣＤ）のみに関する１９５６ｂｐのサイズのインサート、および、ｈＥｒｂＢ２（ＥＣＤ）に関する２０３４ｂｐのサイズのインサート、それに加えてｃ−ｍｙｃ／Ｈｉｓタグを含む。このプラスミドを、２９３フェクチン（ｆｅｃｔｉｎ）（インビトロジェン，カタログ番号１２３４７−０１９）を用いて、２９３Ｔ懸濁細胞に一時的にトランスフェクションした。トランスフェクションの１日後に、この細胞を酪酸ナトリウムで処理し、発現レベルを押し上げた。トランスフェクションの４日後に、上清を、精製の前にＥｒｂＢ２（ＥＣＤ）発現に関して試験した。ＥＬＩＳＡ検出のために、１μｇ／ｍｌのヤギ抗ＥｒｂＢ２（Ｒ＆Ｄシステムズ，カタログ番号ＡＦ１１２９）を用いてプレートをコーティングし、一次検出抗体は、１μｇ／ｍｌのマウス抗ＥｒｂＢ２（Ｒ＆Ｄシステムズ，カタログ番号ＭＡＢ１１２９）であり、二次抗体は、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（カルタグ，カタログ番号Ｍ３０１０７）であった。上清を回収し、５倍に濃縮し、続いて、透析緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ８）、２００ｍＭのＮａＣｌ）で一晩透析した。上清にイミダゾールを最終濃度５ｍＭで添加し、上清を１００分の１の体積のＮｉ−ＮＴＡスーパーフロー（ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ）樹脂混合物（キアゲン，カタログ番号３０４３０）と室温で３時間インキュベートした。この樹脂を、５０ｍＭのＮａＨＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、および、２０ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液で洗浄し、続いて２５０ｍＭのイミダゾール、５０ｍＭのＮａＨＰＯ４および３００ｍＭのＮａＣｌを含む溶出緩衝液で洗浄した。最終的に精製したタンパク質をＰＢＳで透析して、活性を保存した。このようにして精製したタンパク質ｈｕＥｒｂＢ２（ＥＣＤ）／ｃ−ｍｙｃ−Ｈｉｓは、６５５個のアミノ酸を有し、理論上の分子量は７２．２ｋＤａであり、４〜２０％トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでは約１００ｋＤａの位置まで泳動される。このタンパク質の同一性を、マウスモノクローナル抗ＥｒｂＢ２（Ｒ＆Ｄシステムズ，カタログ番号ＭＡＢ１１２９）、続いて二次ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（カルタグ，カタログ番号Ｍ３０１０７）を用いたウェスタンブロットによって確認した。
【０２８７】
[0300] ＨＡに関して、ＰＢＳ中の１０μｇ／ｍｌのヒトＥｒｂＢ２ＥＣＤ−ｍｙｃ／Ｈｉｓを、ＥＬＩＳＡプレートに４℃で一晩コーティングした。ＬＡに関して、１００、５００、２５０、１２５、６２および３１ｎｇ／ｍｌのヒトＥｒｂＢ２ＥＣＤ−ｍｙｃ／Ｈｉｓをコーティングした。抗原でコーティングしたプレートを３回洗浄し、１％無脂肪のスキムミルク／ＰＢＳで室温で少なくとも３０分間ブロックし、続いて、再度３回洗浄した。それぞれのハイブリドーマ系サンプルの抗体価測定は、１：２５の希釈率から開始して、１：３の１％無脂肪のスキムミルク／ＰＢＳで７地点で行った。連続希釈したハイブリドーマサンプル、または、コントロール（ハーセプチン（登録商標））をＨＡでコーティングしたプレートに移し、１：２５で希釈したハイブリドーマサンプルをＬＡでコーティングしたプレートに移した。サンプルをプレート上で室温で一晩（１８．５時間）インキュベートした。次の日、プレートを３回洗浄し、５０μｌの４００ｎｇ／ｍｌのイムノピュア（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ）ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）−ＨＲＰ（ピアース，カタログ番号３１４１６）と室温で１時間インキュベートした。続いてこのプレートを徹底的に洗浄し、ペーパータオル上でたたくようにして乾燥させ、ウェル中に残留したＨＲＰを除去した。ＨＲＰ基質ＴＭＢ（強化されたＫ−ブルーＴＭＢ，ネオジェン（Ｎｅｏｇｅｎ），カタログ番号３０８１７７）を、各ウェルに添加し、３０分間インキュベートした。１ＮのＨＣｌの添加によって反応を止めた。４５０ｎｍにおける光学密度を、マイクロプレートリーダー（タイターテック・マルチスキャン・アセント（Ｔｉｔｅｒｔｅｃｋ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ））で読み取った。
【０２８８】
[0301] ハイブリドーマの上清中のＥｒｂＢ２特異的な抗体の濃度を、ＨＡ  ＥＬＩＳＡで既知濃度のハーセプチン（登録商標）によって作製した標準曲線から誘導した。図２で示すように、３１ｎｇ／ｍｌの抗原におけるＬＡ  ＯＤシグナルを、それぞれのハイブリドーマサンプルに関するＨＡからの抗体濃度に対してプロットした。このプロットでは、左上の隅における抗体は、右下の隅における抗体と比較して高い親和性を有する。
【０２８９】
実施例７
ハイブリドーマのクローニング
[0302] ｃｙｎｏ交叉反応性試験、ＥｒｂＢ２のリン酸化抑制の分析、および、ＬＡ／ＨＡ  ＥＬＩＳＡ、のデータに基づいて、クローニングのために３１種のハイブリドーマ系を選択した。表３にそれらの活性を要約する。
【０２９０】
【表３】
0005638804.tif 000004
【０２９１】
[0303] それぞれのハイブリドーマ系における細胞を、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（ＢＤ）で、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１種の細胞で種類分けした、約２週間培養した。ＦＭＡＴで、単一のクローンからの上清を、高レベルのＥｒｂＢ２を発現するＢＴ４７４細胞においてＥｒｂＢ２結合活性に関してスクリーニングし、さらにヒトＩｇガンマおよびカッパ鎖組成物、加えてヒトＩｇＭおよびマウスＩｇＭの存在についてもＥＬＩＳＡでスクリーニングした。
【０２９２】
[0304] ＦＭＡＴについて、ＦＭＡＴ装置８２００での読み出しの前に、３８４ウェルのＦＭＡＴプレートで、４０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中で６０００個のＢＴ４７４細胞（ＡＴＣＣ）を１５μｌの上清と室温で２時間インキュベートし、続いて、１０μｌの４．５μｇ／ｍｌのヤギ−抗ヒトＩｇＧＣｙ５と共に室温で６時間インキュベートした。蛍光と計数データの両方を解析した。このスクリーニングにおいて、ハーセプチン（登録商標）を、陽性コントロールとして用いた。
【０２９３】
[0305] ヒト抗体鎖の組成解析に関して、結合力が中程度の９６ウェルプレート（コースタ（Ｃｏａｓｔａｒ）３３６８）を、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃで４℃で一晩コーティングし、１％乳汁／ＰＢＳで室温で３０分間ブロックした。上清を１％乳汁／ＰＢＳで１：５に希釈し、これを、２種のコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。次に、１％乳汁／ＰＢＳ中の２５０ｎｇ／ｍｌのビオチン化したヤギ抗ヒトカッパ（ベクターカタログ番号ＢＡ３０６０）、または、１％乳汁／ＰＢＳ中の２５０ｎｇ／ｍｌのビオチン化したヤギ抗ヒトラムダ（サザン・バイオテック（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）カタログ番号２０７０−０８）を添加し、室温で１時間インキュベートし、続いて１％乳汁／ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌのストレプトアビジンペルオキシダーゼ結合体と室温で１時間インキュベートした。インキュベート工程の間にプレートを徹底的に洗浄した。５０μｌのペルオキシダーゼ基質ＴＭＢを添加し、室温で３０分間インキュベートし、５０μｌの１ＭのＨＣｌで酵素反応を止めた。マイクロプレートリーダー（タイターテック・マルチスキャン・アセント）で、光学密度を４５０ｎｍで読み取った。
【０２９４】
[0306] 我々は、以下のようにしてヒトＩｇＭがないことを確認した。結合力が中程度の９６ウェルプレート（コースター３３６８）を、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＭで４℃で一晩コーティングし、１％乳汁／ＰＢＳで室温で３０分間ブロックした。上清を１％乳汁／ＰＢＳで１：５に希釈し、これをコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。次に、ロバ抗ヒトＩｇＭＰＯＤ（アキュレート・ケミカル（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ），カタログ番号ＪＮＨ０３５０４３）を１％乳汁／ＰＢＳ中の６６６ｎｇ／ｍｌで添加し、室温で１時間インキュベートした。上述したようなＰＯＤ基質を添加ことによってプレートを展開した。
【０２９５】
[0307] 我々は、以下のようにしてヒトＩｇＭがないことを確認した。結合力が中程度の９６ウェルプレートを、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスラムダ（サザン・バイオテック（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）１０６０−０１）で４℃で一晩コーティングし、１％乳汁／ＰＢＳで室温で３０分間ブロックした。上清を１％乳汁／ＰＢＳで１：５に希釈し、これを、コーティングしたＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。次に、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）ＰＯＤ（ピアース，カタログ番号３１４１３）を１％乳汁／ＰＢＳ中の４００ｎｇ／ｍｌで添加し、室温で１時間インキュベートした。上記で説明されているようにしてＰＯＤ基質を添加ことによってプレートを展開した。
【０２９６】
[0308] 上述のようなＥＬＩＳＡにおいて、一次抗体非存在下のウェルからのシグナルを、バックグラウンドとして用い、バックグラウンドの３倍を超えるシグナルを生じたサンプルを陽性とみなした。
【０２９７】
[0309] ＦＭＡＴによってＥｒｂＢ２への天然の結合が実証され、さらにＥＬＩＳＡによりヒトガンマ鎖およびカッパ鎖に対して陽性であるモノクローナル抗体を、クローニングの後に２０種のハイブリドーマ系から誘導した。それぞれの親の系統からの３種のサブクローンを配列解析した。特に他の指定がない限り、３種のサブクローンは全て同一であった。例えば、親クローン１．１４のサブクローン１．１４．１、１．１４．２および１．１４．３は全て同じ配列を有しており、これらは２種の数字からなる親の名称で呼んでもよいし、または、３種の数字からなるサブクローンの名称で呼んでもよく、同じ意味で用いられる。１１種の別個のモノクローナル抗体を同定し、さらに細胞ベースの機能分析で特徴付けた。
【０２９８】
実施例８
ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体の構造的な解析
[0310] 本抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインを配列解析した。それぞれにガンマおよびカッパ鎖の組み合わせごとにヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示した配列表で、抗ＥｒｂＢ２抗体の完全な配列情報が提供される。免疫グロブリン鎖の可変（Ｖ）領域は、複数の生殖細胞系のＤＮＡセグメントによってコードされており、これらは、Ｂ細胞の個体発生中に機能的な可変領域（ＶＨＤＪＨ、または、ＶＫＪＫ）に結合する。ＶＨファミリー、Ｄ領域の配列、および、Ｊ領域の配列を決定するために、可変重鎖配列を解析した。次に、一次アミノ酸配列を決定するためにこれらの配列を翻訳し、体細胞の過剰な突然変異を評価するために、生殖細胞系ＶＨ、ＤおよびＪ領域の配列と比較した。重鎖可変および軽鎖配列を同様に解析した。
【０２９９】
[0311] 表４および表４（ａ）は、本抗体の重鎖領域と、それらと同源の生殖細胞系の重鎖領域とを比較する表である。表５は、本抗体のカッパ軽鎖領域と、それらと同源の生殖細胞系の軽鎖領域とを比較する表である。表４と４（ａ）との差は、重鎖ＣＤＲ１０を定義するのに用いられる定義である。表４（ａ）で開示された重鎖ＣＤＲ１は、カバット（Ｋａｂａｔ）の定義に基づく。あるいは、ＣＤＲ１は、表４で示されるように、ＦＲ１配列の最後の４残基が含まれるような代替の定義を用いて定義することもできる。
【０３００】
[0312] ＥｒｂＢ２に特異的な２０種の抗体の解析から、それらのうちいくつかが同一であり、すなわちクローニングによって得られた特有のモノクローナル抗体はわずか１１種であり、さらに、その１１種の抗体のうち８種は、配列が極めて類似しており、同じ生殖細胞系のＶＨおよびＶＫ遺伝子から誘導されたものであったことが示された。
【０３０１】
[0313] また当然ながら、特定の抗体が、アミノ酸レベルでそれらのそれぞれの生殖細胞系の配列とは異なっている場合、その抗体の配列は、突然変異して生殖細胞系の配列に戻っている可能性がある。このような中和作用のある突然変異は、標準的な分子生物学的な技術を用いて、１、２、３またはそれより多い位置で、または、突然変異した位置のいずれかを組み合わせた位置で起こすことができる。非限定的な実施例として、表４は、１．２４．３の重鎖配列は、アミノ酸３３位においてそれに対応する生殖細胞系の配列とは、ＣＤＲ１領域においてＴからＳである点で異なることを示す。従って、１．２４．３の重鎖のアミノ酸配列、または、それをコードするヌクレオチド配列を改変して、ＴからＳに変化させることによって、突然変異部位において生殖細胞系の配列を得ることができる。その他の例において、１．１４０．１の重鎖配列は、アミノ酸４２において、ＦＲ２領域においてＲがＧである点でそれに対応する生殖細胞系の配列とは異なる。従って、１．１４０．１の重鎖のアミノ酸配列、または、それをコードするヌクレオチド配列を改変して、ＲからＧに変化させることによって、突然変異部位において生殖細胞系の配列を得ることができる。
【０３０２】
[0314] その他の非限定的な実施例として、表５によれば、１．１４０．１の軽鎖配列は、それに対応する生殖細胞系の配列とは、ＦＲ１領域におけるＴからＮへの突然変異（突然変異１）、ＣＤＲ１領域におけるＦからＬ、ＦからＹ、および、ＣからＹへの突然変異（突然変異２、３および４）、ＦＲ２領域におけるＲからＫ、および、ＮからＫへの突然変異（突然変異５および６）、ならびに、ＣＤＲ３領域におけるＦからＹ、ＧからＳ、および、ＳからＴへの突然変異について異なっていることが示される。従って、１．１４０．１の軽鎖のアミノ酸配列またはそれをコードするヌクレオチド配列を改変すれば、突然変異１を変化させることができ、それにより、突然変異１の部位において生殖細胞系の配列が生じる。さらに、１．１４０．１の軽鎖のアミノ酸配列またはそれをコードするヌクレオチド配列を改変すれば、突然変異２を変化させることができ、それにより、突然変異２の部位において生殖細胞系の配列が生じる。さらにその上、１．１４０．１の軽鎖のアミノ酸配列またはそれをコードするヌクレオチド配列を改変すれば、突然変異３を変化させることができ、それにより、突然変異３の部位において生殖細胞系の配列が生じる。さらにその上、１．１４０．１の軽鎖のアミノ酸配列またはそれをコードするヌクレオチド配列を再度改変すれば、突然変異１、突然変異２、突然変異３、突然変異４、突然変異５、および、突然変異６を変化させることができ、それにより、これらの部位において生殖細胞系の配列が生じる。以下の表６は、このような生殖細胞系からの１．１４０に関する変異の位置を説明する。各列は、太字で示された位置で、生殖細胞系と非生殖細胞系の残基との固有な組み合わせを示す。また、抗体１．３９に関する軽鎖の解析値は、生殖細胞系の突然変異に関して１．１４０と同一であるため、表６は抗体１．３９にも適用される。その上、抗体１．９６に関する軽鎖の解析値は、生殖細胞系の突然変異に関して１．１４０と同一であるが、ただし、抗体１．９６は、ＦＲ４における抗体配列と生殖細胞系の配列との間に差があることを除く。この例において、抗体配列のＬは、突然変異して生殖細胞系の配列であるＦに戻っている可能性があり、さらにこの突然変異は、表６に示される組み合わせのいずれかと組み合わされていてもよい。
【０３０３】
[0315] 一実施態様において、本発明は、ＣＤＲ領域における、すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／または、ＣＤＲ３における１種またはそれより多くのアミノ酸を改変することを特徴とする。一例において、本明細書において説明される抗体の重鎖、軽鎖またはその両方の鎖のＣＤＲ３が改変される。典型的には、アミノ酸が類似の側鎖を有するアミノ酸で置換され（保存的アミノ酸置換）、生殖細胞系に戻るか、または、あらゆる適切なアミノ酸（例えばアラニンまたはロイシン）で置換することができる。一実施態様において、１．２４．３のＣＤＲ３、ＱＱＹＳＳＰＦＴ（配列番号４８）は、１種またはそれより多くのアミノ酸で改変して、ＣＤＲ３配列の突然変異を誘発することによって、ＱＱＹＹＳＰＦＴ（配列番号４９）に戻すことができる。
【０３０４】
[0316] その他の実施態様において、本発明は、対になっていないシステインが除去されるように抗体を改変することを特徴とする。対になっていないシステインの例は、抗体１．３９．１中に存在するようであり、抗体１．９６．１中ではアミノ酸３８に存在するようであり、抗体１．１４０．１に関しては、アミノ酸３８、および、アミノ酸３８に存在するようである。これらのシステインは、突然変異して生殖細胞系に戻っていてもよく、例えば、ＣからＹへの突然変異を誘発することによって、または、Ｃからあらゆる適切なアミノ酸（例えばセリン）への突然変異を誘発することによって生殖細胞系に戻っていてもよい。
【０３０５】
【表４−１】
0005638804.tif 000005
【０３０６】
【表４−２】
0005638804.tif 000006
【０３０７】
【表４−３】
0005638804.tif 000007
【０３０８】
【表４−４】
0005638804.tif 000008
【０３０９】
【表５】
0005638804.tif 000009
【０３１０】
表６：示された残基番号における１．１４０（配列番号８）の軽鎖からの生殖細胞系への代表的な突然変異
【０３１１】
【表６−１】
0005638804.tif 000010
【０３１２】
【表６−２】
0005638804.tif 000011
【０３１３】
【表６−３】
0005638804.tif 000012
【０３１４】
【表６−４】
0005638804.tif 000013
【０３１５】
【表６−５】
0005638804.tif 000014
【０３１６】
【表６−６】
0005638804.tif 000015
【０３１７】
【表６−７】
0005638804.tif 000016
【０３１８】
【表６−８】
0005638804.tif 000017
【０３１９】
【表６−９】
0005638804.tif 000018
【０３２０】
【表６−１０】
0005638804.tif 000019
【０３２１】
【表６−１１】
0005638804.tif 000020
【０３２２】
【表６−１２】
0005638804.tif 000021
【０３２３】
【表６−１３】
0005638804.tif 000022
【０３２４】
【表６−１４】
0005638804.tif 000023
【０３２５】
【表６−１５】
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【０３２６】
【表６−１６】
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【０３２７】
【表６−１７】
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【０３２８】
【表６−１８】
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【０３２９】
【表６−１９】
0005638804.tif 000028
【０３３０】
【表６−２０】
0005638804.tif 000029
【０３３１】
【表６−２１】
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【０３３２】
【表６−２２】
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【０３３３】
【表６−２３】
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【０３３４】
【表６−２４】
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【０３３５】
【表６−２５】
0005638804.tif 000034
【０３３６】
【表６−２６】
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【０３３７】
【表６−２７】
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【０３３８】
【表６−２８】
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【０３３９】
【表６−２９】
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【０３４０】
【表６−３０】
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【０３４１】
【表６−３１】
0005638804.tif 000040
【０３４２】
【表６−３２】
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【０３４３】
【表６−３３】
0005638804.tif 000042
【０３４４】
【表６−３４】
0005638804.tif 000043
【０３４５】
【表６−３５】
0005638804.tif 000044
【０３４６】
【表６−３６】
0005638804.tif 000045
【０３４７】
【表６−３７】
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【０３４８】
【表６−３８】
0005638804.tif 000047
【０３４９】
【表６−３９】
0005638804.tif 000048
【０３５０】
【表６−４０】
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【０３５１】
【表６−４１】
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【０３５２】
【表６−４２】
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【０３５３】
【表６−４３】
0005638804.tif 000052
【０３５４】
【表６−４４】
0005638804.tif 000053
【０３５５】
【表６−４５】
0005638804.tif 000054
【０３５６】
【表６−４６】
0005638804.tif 000055
【０３５７】
【表６−４７】
0005638804.tif 000056
【０３５８】
【表６−４８】
0005638804.tif 000057
【０３５９】
【表６−４９】
0005638804.tif 000058
【０３６０】
【表６−５０】
0005638804.tif 000059
【０３６１】
【表６−５１】
0005638804.tif 000060
【０３６２】
【表６−５２】
0005638804.tif 000061
【０３６３】
【表６−５３】
0005638804.tif 000062
【０３６４】
【表６−５４】
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【０３６５】
【表６−５５】
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【０３６６】
【表６−５６】
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【０３６７】
【表６−５７】
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【０３６８】
【表６−５８】
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【０３６９】
【表６−５９】
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【０３７０】
【表６−６０】
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【０３７１】
【表６−６１】
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【０３７２】
【表６−６２】
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【０３７３】
【表６−６３】
0005638804.tif 000072
【０３７４】
【表６−６４】
0005638804.tif 000073
【０３７５】
【表６−６５】
0005638804.tif 000074
【０３７６】
【表６−６６】
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【０３７７】
【表６−６７】
0005638804.tif 000076
【０３７８】
【表６−６８】
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【０３７９】
【表６−６９】
0005638804.tif 000078
【０３８０】
実施例９
ＥｒｂＢ２を低発現するＭＣＦ７細胞におけるヘレグリン−βによって誘導されたＥｒｂＢ２のリン酸化および細胞増殖の抑制
[0317] 実施例４で説明されているように、ハイブリドーマの上清は、ＭＣＦ７細胞におけるヘレグリンによって誘導されたＥｒｂＢ２のリン酸化を抑制することができる。精製したモノクローナル抗体を用いて、ＥｒｂＢ２抗体の効力を決定し、さらに２種の抑制抗体２Ｃ４およびハーセプチン（登録商標）とも比較した。簡単に言えば、ＭＣＦ７細胞を、９６ウェルプレート中で２０，０００細胞／ウェルでシーディングし、完全増殖培地（１０％ＦＣＳ）中で一晩培養した。次の日、細胞培養プレートをＰＢＳで１回洗浄し、培地を、フェノールレッド非含有の無血清培地で交換した。細胞を一晩血清飢餓状態にし、続いて、無血清培地中１０μｇ／ｍｌから１：５で抗体価測定したｍＡｂ、ハーセプチン（登録商標）、または、２Ｃ４と１時間インキュベートし、その後１０ｎＭヘレグリン−βで１０分間処理した。実施例４で説明されているようにして細胞溶解産物を製造し、ＲｎＤシステムズ製のＥＬＩＳＡキット（ＲｎＤシステムズ；ヒトホスホ−ＥｒｂＢ２  ＤｕｏＳｅｔ  ＩＣ，カタログ番号ＤＹＣ１７６８）を提供されたプロトコールに従って用いて蛍光−ＥｒｂＢ２レベルを測定した。抑制のパーセンテージを、抗体の非存在下で、刺激していない細胞におけるｐＥｒｂＢ２およびヘレグリンで刺激した細胞のレベルに基づいて計算した。プリズムグラフパッド（ＰｒｉｓｍＧｒａｐｈｐａｄ）ソフトウェアを用いて、各抗体ごとに用量反応曲線をプロットした。
【０３８１】
[0318] 図３は、代表的な実験からの用量反応曲線を説明する。ＥＣ５０値を非線形回帰分析から誘導し、それを表７に示した。２Ｃ４はＥｒｂＢ２のリン酸化を抑制したが、ハーセプチン（登録商標）はほとんど作用がなかった。試験された１１種の本発明のモノクローナル抗体のうち８種が、ＭＣＦ７細胞においてＥｒｂＢ２のリン酸化に対して抑制活性を示した。１．１８．１は、２Ｃ４よりも優れた効力を有するようである。
【０３８２】
【表７】
0005638804.tif 000079
【０３８３】
[0319] また、ヘレグリンによって誘導された細胞増殖に対するモノクローナル抗体の作用も試験した。９６ウェルプレート中で、６０００細胞／ウェルで、フェノールレッド非含有のＤＭＥＭ培地（１０％ＦＣＳ、ピルビン酸Ｎａ、Ｌ−グルタミンを含む）中にＭＣＦ７細胞をシーディングし、３７℃で一晩成長させた。次の日、細胞を冷ＰＢＳで１回洗浄し、培地を１００μｌのＦＣＳ／フェノールレッド非含有培地（ピルビン酸Ｎａを含む）で交換し、３７℃で４時間インキュベートした。続いて、ＦＣＳ非含有培地を除去し、５０μｌの抗体価測定したｍＡｂ、および、５０μｌの２ｎＭヘレグリン−βを、細胞に添加した。細胞を抗体およびヘレグリンと共に３７℃３日インキュベートした後、２５μｌのセルタイター−グロー（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ）発光試薬（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ），カタログ番号Ｇ７５７０）を、各ウェルに添加した。プレートを５分間撹拌し、続いて室温で１０分間インキュベートした。発光を、マイクロタイタープレートルミノメーター（テカン（Ｔｅｃａｎ）のＧＥＮｉｏｓ  Ｐｒｏ）で読み取った。抑制のパーセンテージを、抗体の非存在下で、刺激していない細胞およびヘレグリンで刺激した細胞における発光レベルに基づいて計算した。
【０３８４】
[0320] 図４で示されるように、プリズムグラフパッドソフトウェアを用いて用量反応曲線を各抗体ごとにプロットした。ＥＣ５０値を、非線形回帰分析から誘導し、表８で列挙した。ＥｒｂＢ２のリン酸化分析で示したように、ＥｒｂＢ２のリン酸化の抑制において有効な２Ｃ４および同じ８種の本発明の抗体は、ヘレグリンによって誘導されたＭＣＦ７細胞増殖の用量依存性の抑制を示したが、ＥｒｂＢ２のリン酸化のブロックには効果がないハーセプチン（登録商標）および３種の抗体は、抑制を示さなかった。
【０３８５】
【表８】
0005638804.tif 000080
【０３８６】
実施例１０
ＢＴ４７４およびＳＫＢＲ３細胞の増殖の抑制
[0321] さらに、ＥｒｂＢ２をわずかに発現する細胞（ＭＣＦ７）に有効な８種の中和抗体も、細胞増殖分析でＥｒｂＢ２を高度に発現する細胞を抑制するそれらの能力に関して４日で試験した。５０μｌの増殖培地（１０％ＦＣＳを含む）中の５，０００個の細胞（ＢＴ４７４またはＳＫＢＲ３）を９６ウェルプレートにシーディングし、それらをプレートに付着させるために３７℃で４時間インキュベートした。モノクローナル抗体は、４０μｇ／ｍｌから開始して最終濃度の２倍の増殖培地になるまで、１：５で抗体価測定した。このプレートに、５０μｌの２Ｃ４、ハーセプチン（登録商標）、および、８種の本発明の抗ＥｒｂＢ２ｍＡｂｓを添加し、細胞を抗体と共に４日間培養した。２５μｌのセルタイター−グロー（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ｇｌｏ）試薬を、各ウェルに添加した。プレートを５分撹拌し、室温で１０分間インキュベートした。マイクロタイタープレートルミノメーター（テカンのＧＥＮｉｏｓ  Ｐｒｏ）で発光を読み取った。抑制のパーセンテージを、抗体の非存在下での４日目および０日目における発光シグナルのレベルに基づいて計算した。プリズムグラフパッドソフトウェアを用いて用量反応曲線を各抗体ごとにプロットし、ＥＣ５０値を、非線形回帰分析から誘導した。
【０３８７】
[0322] 図５および６は、代表的な実験からのデータを説明する。表９および１０に、ＥＣ５０および最大の抑制のパーセンテージの両方を列挙した。報告されているように、ハーセプチン（登録商標）は、ＢＴ４７４およびＳＫＢＲ３細胞増殖の両方に対する用量依存性の抑制を示したが、２Ｃ４はほとんど作用がなかった。試験された全ての本発明のモノクローナル抗体が、ハーセプチン（登録商標）に匹敵する効力で、ＢＴ４７４およびＳＫＢＲ３細胞増殖の用量依存性の抑制を示した。
【０３８８】
【表９】
0005638804.tif 000081
【０３８９】
【表１０】
0005638804.tif 000082
【０３９０】
実施例１１
ＢＴ４７４細胞におけるＥＲｂＢ２リン酸化の抑制
[0323] ＥｒｂＢ２を高度に発現する細胞系中でのこれらの抗体の作用機序を確認するために、本発明の抗体１．１８．１を、ＢＴ４７４細胞における構成的なＥｒｂＢ２のリン酸化に対する作用に関してハーセプチン（登録商標）および２Ｃ４と共に試験した。ＢＴ４７４細胞を、完全培地中で、９６ウェルの培養プレートに、１日目は５０００細胞／ウェルで、２日目および３日目は１００００細胞／ウェルで、または、４日目は２００００細胞／ウェルでシーディングした。細胞を３７℃で３〜４時間インキュベートし、プレートに付着させた。モノクローナル抗体は、完全培地中で、１０μｇ／ｍｌから開始して（６ポイント分）、１：５で抗体価を測定し、続いて細胞に添加した。細胞を、モノクローナル抗体と１〜４日インキュベートした。５日目に、これまでに述べられたようにして、プロテアーゼおよびホスファターゼ抑制剤が補足された緩衝液中で細胞を溶解させた。細胞溶解産物中のホスホ−ＥｒｂＢ２レベルを、ＥＬＩＳＡによって決定した。細胞増殖をＣｙＱｕａｎｔ（インビトロジェン）によって測定した。抑制のパーセンテージを、抗体の非存在下でｐＥｒＢ２レベルに従って計算した。さらに、蛍光−ＥｒｂＢ２レベル細胞数に対して標準化することによって蛍光−ＥｒｂＢ２／細胞も計算した。プリズムグラフパッドソフトウェアを用いて用量反応曲線を各抗体ごとにプロットし、ＥＣ５０値を、非線形回帰分析から誘導した。
【０３９１】
[0324] 図７および８は、異なるタイムポイントにおける用量反応を説明する。表１１に、ＥＣ５０および最大の抑制のパーセンテージの両方を列挙した。モノクローナルＡｂ１．１８．１は、４８時間でｐＥｒＢ２の抑制を示すようになり、７２時間で最大の抑制に達した。しかしながら、ハーセプチン（登録商標）は７２時間まで有意な作用を示さず、２Ｃ４はほとんど作用を有していなかった。興味深いことに、蛍光−ＥｒｂＢ２レベルを細胞数で標準化した場合、１．１８．１によるＥｒｂＢ２のリン酸化の抑制は、４８時間で最大に達した；一方で、ハーセプチン（登録商標）は、予め公開されたほどにはＥｒｂＢ２のリン酸化を抑制しないようであった。
【０３９２】
[0325] 次に、４８時間後のＢＴ４７４細胞中の構成的ＥｒｂＢ２のリン酸化における本抗体のうち７種の作用を調査した。簡単に言えば、９６ウェルプレート中で、５０μｌの完全培地中の１０，０００個のＢＴ４７４細胞をシーディングし、３７℃で３〜４時間培養し、プレートに付着させた。続いて、このプレートに、５０μｌの２０μｇ／ｍｌの２Ｃ４、ハーセプチン（登録商標）、および、完全培地中で最終濃度の２倍で製造された本発明の抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体を、添加し、細胞と４８時間インキュベートした。細胞溶解産物を製造し、実施例４で説明されているようにして、蛍光−ＥｒｂＢ２レベルをＥＬＩＳＡで測定した。抑制のパーセンテージを、抗体の非存在下でｐＥｒＢ２レベルに従って計算した。表１１で列挙されたように、７種全ての本発明のｍＡｂは、ＢＴ４７４細胞において、４８時間で、ＥｒｂＢ２のリン酸化の用量依存性の抑制を示した。比較すると、ハーセプチン（登録商標）および２Ｃ４は、ほとんど作用を有していなかった。
【０３９３】
【表１１】
0005638804.tif 000083
【０３９４】
実施例１２
（Ａ）中分解能のビアコア解析を用いた抗ＥｒｂＢ２抗体の親和性の決定
[0326] ８種の抗ＥｒｂＢ２抗体の結合親和性を中分解能のビアコア法によって測定した。全ての実験を、ビアコア２０００装置を用いて行った。
【０３９５】
[0327] まず、３ＣＭ５のビアコアチップ上にわたって、通常のアミンカップリングを用いて、１２種の高密度ヤギα−ヒトＩｇＧ抗体表面を製造した。続いて、１００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、具体的にはｍＡｂ１．１８．１〜１１μｇ／ｍＬ、ｍＡｂ１．２０．１〜９．９μｇ／ｍＬ、ｍＡｂ１．１００．１〜１１μｇ／ｍＬ、ｍＡｂ１．９６．２〜９．３μｇ／ｍＬ、ｍＡｂ１．１４０．１〜９．２μｇ／ｍＬ、ｍＡｂ１．１４．１〜９．３μｇ／ｍＬ、ｍＡｂ１．３９．１〜１０μｇ／ｍＬ、および、ｍＡｂ１．２４．３〜１０μｇ／ｍＬを含むＨＢＳ−Ｐ泳動緩衝液で、ｍＡｂを希釈した。それぞれの抗原の注入サイクルの前に、それぞれのｍＡｂを１００μＬ／分の流速で６〜９秒捕捉した。２分の洗浄工程の後に、各ｍＡｂの基準を安定化させるために捕獲のための注入をそれぞれ行った。精製ヒトＥｒｂＢ２（ＥＣＤ）−ｃＭｙｃ／Ｈｉｓを９０秒かけて注入し、全てのｍＡｂに関して３０７〜４．８０ｎＭの濃度範囲で（２回の連続希釈）、続いて１５分間解離させた（ただし、ｍＡｂ１．３９．１および１．２４．３の場合は解離を２０分間にしたことを除く）。全てのサンプルに、数種のｍＡｂ捕獲をランダムに注入した／緩衝液の注入サイクルは、二重の照合のために点在させた。高密度のヤギα−ヒト抗体表面を、それぞれのサイクルの後に１４６ｍＭのリン酸（ｐＨ１．５）の１回の１２秒のパルスで再構築した。全ての注入サイクルに、１００μＬ／分の流速を用いた。ＣＬＡＭＰを用いて、データを１：１の相互作用モデルにフィッティングさせた。得られた結合定数を以下の表に列挙した。ｍＡｂは、最高の親和性から最低の親和性の順番で列挙した。
【０３９６】
【表１２−１】
0005638804.tif 000084
【０３９７】
（Ｂ）高分解能のビアコア解析
[0328] 全ての実験は、ビアコアＴ１００装置を用いて行われた。まず、２ＣＭ５のビアコアチップ上にわたって、高密度のヤギαヒトＩｇＧ抗体（カルタグＨ１０５００）表面を通常のアミンカップリングを用いて製造した。１００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＨＢＳ−Ｐ泳動緩衝液で各ｍＡｂを希釈した。ＭＡｂ１．１４０を、５μｇ／ｍＬ、ｍＡｂ１．９６．２〜５．９μｇ／ｍＬ、ｍＡｂ１．３９．１〜８．７μｇ／ｍＬ、ｍＡｂ２Ｃ４〜２μｇ／ｍＬに希釈し、ハーセプチンを４μｇ／ｍＬに希釈した。
【０３９８】
[0329] ５種全てのｍＡｂに関する捕獲レベルのプロトコールを開発した。それぞれの抗原の注入サイクルの前に、それぞれのｍＡｂを２０μＬ／分の流速で１５〜３０秒捕捉した。各ｍＡｂの基準を安定化させるために、５分の洗浄工程の後に捕獲のための注入をそれぞれ行った。抗原ｈＨｅｒ−２（ＥＣＤ）ｃＭｙｃ（ロット番号４５２）を、ｍＡｂ１．１４０、１．９６．２および１．３９．１に関して３６９〜５．７６ｎＭの濃度範囲で（２回の連続希釈）４分間注入し、続いて１５分間解離させ、ｍＡｂ２Ｃ４、および、ハーセプチンに関して６５０〜１０．２ｎＭの濃度範囲（２回の連続希釈）で注入し、続いて２５分間解離させた。これらのサンプルを上述の泳動緩衝液中で製造した。全てのサンプルに、数種のｍＡｂ捕獲をランダムに注入した／緩衝液の注入サイクルは、二重の照合のために点在させた。高密度のヤギα−ヒト抗体表面を、それぞれのサイクルの後に１４６ｍＭのリン酸（ｐＨ１．５）の１回の１５秒のパルスで再構築した。全ての注入サイクルに、５０μＬ／分の流速を用いた。
【０３９９】
[0330] ＣＬＡＭＰを用いて、全てのセンサーグラムデータを１：１の相互作用モデルにフィッティングした。得られた結合定数を以下の表に列挙した。ｍＡｂは、最高の親和性から最低の親和性の順番で列挙した。
【０４００】
【表１２−２】
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【０４０１】
実施例１３
抗体の競合結合
[0331] 報告によれば、２Ｃ４は、ＥｒｂＢ２上で二量体化ドメインに結合するが、ハーセプチン（登録商標）は、ＥｒｂＢ２の細胞外領域でＣ末端ドメインに結合する（Ｆｒａｎｋｌｉｎ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．２００４年４月；５（４）：３１７〜２８、および、Ｃｈｏ等，Ｎａｔｕｒｅ．２００３年２月１３日；４２１（６９２４）：７５６〜６０を参照、援用により本発明に含める）。８種の抗体の結合エピトープが、２Ｃ４またはハーセプチン（登録商標）に関するエピトープとオーバーラップするかどうかを決定するために、競合結合ＥＬＩＳＡが行われた。
【０４０２】
[0332] コースター（Ｃｏｓｔａｒ）３６９５メディウムバインディングの９６ウェルプレートを、ＰＢＳ中の０．５μｇ／ｍｌのハーセプチン（登録商標）、または、２μｇ／ｍｌの２Ｃ４で４℃で一晩コーティングした。コーティングしたプレートを洗浄し、続いて１％乳汁／ＰＢＳで室温で３０分間ブロックした（室温）。抗体を１０００ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、および、１０ｎｇ／ｍｌで抗体価を測定し、３０ｎｇ／ｍｌのｈＥｒｂＢ２（ＥＣＤ）と２時間プレインキュベートした。この抗体／ＥｒｂＢ２混合物を、ブロックしたプレートに移し、室温で１時間インキュベートした。結合したＥｒｂＢ２を検出するために、このプレートを洗浄し、１μｇ／ｍｌのヤギ抗ＥｒｂＢ２（Ｒ＆Ｄシステムズ，カタログ番号ＡＦ１１２９）と室温で１時間インキュベートした。このプレートに、二次抗体ウサギ抗ヤギＩｇＧ  Ｆｃ  ＰＯＤ（ピアース，カタログ番号３１４３３，４００ｎｇ／ｍｌ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。徹底的に洗浄した後、基質ＴＭＢ（ネオジェン）を添加し、プレートと室温で１０〜１８分間インキュベートした。１ＮのＨＣｌの添加によって酵素反応を止め、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍでの光学密度を読み取った。図９は、８種の本発明の抗ＥｒｂＢ２抗体、ｍＡｂ１．７１．３、または、社内で作製した無関係の同位体コントロールｍＡｂの存在下での、ＥｒｂＢ２のハーセプチン（登録商標）（Ａ）および２Ｃ４（Ｂ）に対する結合能力を説明する。本発明の抗ＥｒｂＢ２抗体はどれも、２Ｃ４またはハーセプチン（登録商標）へのＥｒｂＢ２結合をブロックしないことから、本抗体は、２Ｃ４またはハーセプチン（登録商標）とは異なる種類に属することを示唆している。
【０４０３】
[0333] 本明細書に記載された全ての出版物、特許および特許出願は、それぞれ個々の出版物または特許出願が、具体的かつ個々に参照により開示に含まれるように指定されたのと同程度に、参照により開示に含まれる。
【０４０４】
前述の詳細な説明は、単に理解を明確にするために示されたものであり、当業者であれば改変は明白と予想されるため、不必要な限定と理解すべきではない。本明細書で示されたあらゆる情報が従来技術であるか、または、ここで特許請求された発明に関連するものであることを認めていることはなく、または、具体的に述べられた、または、事実上述べられたあらゆる出版物は、従来技術であることを認めてもいない。特に他の指定がない限り、本明細書において用いられる全ての専門用語や科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同様の意味を有する。
【０４０５】
[0334] 本発明は、それらの具体的な実施態様と関連させて説明されているが、当然ながらさらなる改変が可能であり、本願は、概して本発明の原理に従っていれば、本発明のあらゆる変形型、用途または適応を包含することを目的とし、本発明が関連する分野で既知の、または、慣例的な実施の範囲内であり、上述した必須の特徴に適用可能であり、添付の請求項の範囲の範囲内であれば、本発明の開示からの逸脱も包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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