(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液、血漿又は血清、又は組織試料の上清又は細胞培養試料の上清から選択された試料中の細胞外インターフェロン誘導性タンパク質１６（ＩＦＩ１６）を決定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項２】
前記決定が
（ａ）前記試料を、ＩＦＩ１６に特異的に結合する少なくとも１のレセプターと結合させ、そして
（ｂ）ＩＦＩ１６に対する前記レセプターの特異的結合を検出する
ことを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記試料を、ＩＦＩ１６に特異的に結合する少なくとも２つのレセプターと接触させ、その際、前記レセプターの１つが検出可能なレセプターであり、この他のレセプターが固相に固定化されているか又は固相結合基を有する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つのレセプターが、抗体又はその抗原結合断片である請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
前記検出可能なレセプターが、検出可能なラベル化基を有する請求項３又は４記載の方法。
【請求項６】
前記検出可能なラベル化基が、酵素の、蛍光の、放射性の、又は核酸ラベル化基である請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記試料が、ヒト試料である請求項１から６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
細胞外ＩＦＩ１６の存在及び／又は増加した量が、病理学的状態の指標である請求項１から７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
細胞外ＩＦＩ１６の存在及び／又は増加した量が、自己免疫及び／又は炎症性疾患の指標である請求項１から７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記自己免疫疾患が、全身性硬化症（ＳＳｃ）、全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）及びシェーグレン症候群（ＳｊＳ）から選択される請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記疾患が関節リウマチから選択される請求項９記載の方法。
【請求項１２】
細胞外ＩＦＩ６の存在及び／又は増加した量が、感染性疾患の指標である請求項１から７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記感染性疾患がＨＣＶ感染である請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
さらに、少なくとも１つの付加的な診断マーカーの決定を含む請求項１から１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの付加的な診断マーカーが抗−ＩＦＩ１６−自己抗体である請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の詳細な説明
本発明は、細胞外形態にあるインターフェロン誘導性タンパク質１６（ＩＦＩ１６）の定性的及び／又は定量的決定のための方法に関する。
【０００２】
インターフェロン誘導性タンパク質ＩＦＩ１６は、インターフェロン（ＩＦＮ）−活性化可能な遺伝子のファミリーに属し、ヒトにおいてＨＩＮ２００と、そしてマウス種においてＩｆｉ２００と命名される。ＩＦＩ１６は、細胞周期進行の阻害、及び炎症性プロセスの関与に参加する、核リンタンパク質であることが実証された。
【０００３】
正常ヒト組織におけるＩＦＩ１６発現の免疫組織化学的分析は、これが特定の器官内の選択された細胞において高度に制限されたパターンにおいて発現していることを明らかにした。ＩＦＩ１６は、ＣＤ３４＋脊髄前駆体細胞において発現し、モノサイト前駆体、末梢血液モノサイト内で、そしてリンパ球発達を通じて、強力に発現されたままである。ＩＦＩ１６は、皮膚の上皮細胞、消化管、尿生殖路及び胸部組織の腺及び導管において見出された。さらに、血管及びリンパ管両方からの全ての血管内皮細胞は、強力にＩＦＩ１６を発現した。
【０００４】
ＩＦＩ１６発現はインターフェロンにより、同様に、多くのサイトカイン及び分化剤によっても誘導されることができる。ＨＬ−６０細胞において、ＩＦＩ１６はジメチルスルホキシド、レチノイン酸及び１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３により誘導された。ＩＦＩ１６はＨＵＶＥＣ内皮細胞において酸化ストレスにより、そして、炎症促進性分子、例えばＴＮＦ−α及びインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）により刺激される。
【０００５】
幾つかの一連の証拠が、インターフェロン（ＩＦＮｓ）を自己免疫疾患、特にＳＳｃ及び全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）へとリンク付けている。多くの観察は、慢性炎症が関連する全身性自己免疫疾病におけるＩＦＩ１６についての役割を示唆する。ＩＦＩ１６発現は、極めて増加し、ＳＳｃ及びＳＬＥの患者両方からの損傷性皮膚中の表皮の全ての層において遍在的に検出された。さらに、皮膚炎症性浸潤物はＩＦＩ１６ポジティブ染色を示し、これが高レベルでリンパ球、繊維芽細胞及びＥＣ中で発現することを示唆する。
【０００６】
さらに、ＩＦＩ１６に対する自己抗体が、全身性硬化症（ＳＳｃ）、全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）及びシェーグレン症候群（ＳｊＳ）を患う患者の血清中で見出された。
【０００７】
分子マーカーとしてのＩＦＩ１６の可能性のある使用は、しかし、固形組織試料に限定されるように見え、というのも、以前に説明された結果は、タンパク質ＩＦＩ１６が細胞内局在化を有することを示すからである。したがって、以前の検出手順は、患者からの固形組織試料を用いて実施された。しかし、損傷性組織から固形組織試料を取り出すことは、患者にとって不利な作用を有し、かつ困難である。さらに、健康な被験体から固形組織試料を獲得することは困難であるため、ＩＦＩ１６の分子マーカーとしての使用は、損傷性ｖｓ．健康な試料中のＩＦＩ１６発現を比較するための困難性により制限されている。
【０００８】
現在まで、病理学的状態における可能性のあるＩＦＩ１６調節不全を評価するための実験が、固形組織試料又は培養した細胞で、そして組織、循環するか又は培養した細胞からの抽出物に対して実施され、というのも、先行技術においてはＩＦＩ１６が、この細胞内で活性があり、かつ、ヒト細胞の核小体及び核質中に局在するタンパク質であることが想定されていたからである（核タンパク質の共焦点顕微鏡及びイムノブロッティング両方により示されるとおり）。
【０００９】
抗ＩＦＩ１６自己抗体の作成のための機構として、ＩＦＩ１６が死細胞（dying cell）から放出されることができることが文献中で仮定されていた（Mondini M. et al., 2006）。細胞死のプロセスは、幾つかの自己抗原の可能性のある供給源として認識され、この最も認められている放出機構は、アポトーシスブレブ中の核抗原の再局在化（このようにしてこの膜バリヤー内に制限される）及び／又は細胞膜レベルでの免疫エフェクターに対するその曝露である。この現象は、幾つかの自己抗原、例えばＲｏ／ＳＳａ、Ｌａ／ＳＳＢ及び酸化された核抗原について実証されている（すなわち、LeFeber et al., 1984; Casciola-Rosen L. et al., 1994; Saegusa et al. 2002参考のこと）。細胞外ＩＦＩ１６タンパク質と病理学的状態との関係は、発表されていない。
【００１０】
しかしながら、この知識状況に基づいて、検出可能な量の細胞外形態のＩＦＩ１６が細胞外環境中で存在する可能性があること、及び、このような量の細胞外ＩＦＩ１６が病理学的状態と関係していることは予期できないはずである。
【００１１】
しかし、意外なことに、本発明者らは、細胞外ＩＦＩ１６が、簡易かつ直接的な分析法により適した試料中で決定されてよいことを見出された。
【００１２】
このようにして、第１の観点において、本発明は、試料中の細胞外インターフェロン誘導可能なタンパク質１６（ＩＦＩ１６）を決定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法に関する。
【００１３】
特に、本発明者らは、細胞外ＩＦＩ１６の存在及び／又は増加した量が、病理学的状態の指標であることを見出した。このようにして、本発明は、正常、すなわち、健康なコントロールに比較して、ＩＦＩ１６の増加した存在と関連する任意の病理学的状態のための診断方法として適している。
【００１４】
本願で使用される場合に「試料」との用語は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価の目的から獲得された生物学的試料を指す。本発明の方法において、細胞外ＩＦＩ１６について試験される試料は、好ましくは体液試料、例えば、血液、血漿、血清、尿、唾液その他である。代わりに、組織試料の上清又は細胞培養試料の上清が試験されてよい。好ましくは、この試料調製は、細胞のいかなる溶解も伴わず、特に、ＩＦＩ１６を発現することが知られている細胞、例えば上皮又は内皮細胞の溶解は伴わない。この試料は哺乳類生物、例えばヒト生物又は哺乳類、例えば既知の方法によるヒト細胞培養物由来であってよい。
【００１５】
本発明の文脈において、「体液」との用語は、全ての種類の体液を含み、これは任意に希釈又は濃縮されている。例は、血液、血清、血漿、羊水、脳／脊髄液、髄液（liquor）、脳脊髄液、喀痰、喉及び咽頭分泌物及び他の粘膜分泌物、滑液、腹水、涙液、リンパ液及び尿である。好ましくは、前記体液は血液、血漿又は血清である。
【００１６】
本発明によれば、ＩＦＩ１６の検出は、完全長ＩＦＩ１６、又はその断片、特に、ＩＦＩ１６の免疫学的活性を有する断片の検出を含んでよく、例えばこれは免疫学的に検出可能であり、かつ、開裂、例えば酵素開裂により生産されてよく、かつ、病理学的状態、例えば炎症性疾病の指標となってよい。
【００１７】
「決定」及び／又は「検出」との用語は、試料中の細胞外ＩＦＩ１６の定性的又は定量的な決定を含む。好ましい一実施態様において、この決定は定性又は半定量的な決定であり、すなわち、ＩＦＩ１６が存在するか存在しないかが決定されるか、又は、ＩＦＩ１６の濃度がカットオフ値の上又は下であるかが決定される。当業者が理解するように、イエス−（存在）又はノー（非存在）アッセイにおいて、このアッセイ感受性がこのカットオフ値に適合するよう通常は設定される。カットオフ値は、例えば、一群の健康な個人の試験から決定されることができる。好ましくは、このカットオフは、９０％の特異性を生じるように設定され、このカットオフが９５％の特異性を生じるように決定されることも好ましく、又はこのカットオフが９８％の特異性を生じるように設定されることも好ましい。カットオフ値の上の値の存在は、例えば、病理学的状態の存在について指標となってよく、特に例えば自己免疫及び／又は炎症性疾患の存在について指標となってよい。更なる好ましい一実施態様において、この決定は定量的決定である。この実施態様において、細胞外ＩＦＩ１６の濃度は、根底をなす診断的質問、例えば、疾病段階、疾病進行又は療法に対する応答に相関している。
【００１８】
好ましくは、細胞外ＩＦＩ１６の前記決定が
（ａ）前記試料を、ＩＦＩ１６に特異的に結合する少なくとも１のレセプターと結合させ、そして
（ｂ）ＩＦＩ１６に対するこのレセプター特異的結合を検出する
ことを含む。
【００１９】
本発明によれば、「特異的結合」との用語は、レセプター及びＩＦＩ１６又はその断片の間の特異的相互作用を説明する。この特異的相互作用は、「鍵−鍵穴−原理」でもって特徴付けられることができる。前記レセプター及びＩＦＩ１６は、相互に特異的にフィットする構造又はモチーフを有し、例えば、抗体の抗原結合部位と相互作用する抗原決定基（エピトープ）である。
【００２０】
ＩＦＩ１６に特異的に結合するレセプターは、少なくとも１０6ｌ／ｍｏｌの親和性をＩＦＩ１６に対して有し、好ましくはＩＦＩ１６に対して少なくとも１０7ｌ／ｍｏｌ、より好ましくはＩＦＩ１６に対して少なくとも１０8ｌ／ｍｏｌの親和性を有し、少なくとも１０9ｌ／ｍｏｌも好ましい。当業者であれば、特異的との用語は特に、この試料中に存在する他の生体分子が、ＩＦＩ１６について特異的なレセプターに有意に結合しないことを示すために使用されることを理解するだろう。好ましくは、標的ＩＦＩ１６の他の生体分子への結合レベルは、それぞれ、多くともたった１０％以下、たった５％以下又はたった２％以下又はたった１％以下の、標的ＩＦＩ１６への親和性である結合親和性を生じる。ＩＦＩ１６に特異的に結合する好ましいレセプターは、親和性また同様に特異性についての上述の最小基準の両方を満たすものである。
【００２１】
本発明による方法の更に好ましい一実施態様において、工程（ａ）におけるＩＦＩ１６と第１のレセプターとの特異的結合の検出は、前記試料はＩＦＩ１６についての第２のレセプター（これは、ＩＦＩ１６のエピトープと結合し、かつ、第１のレセプターとＩＦＩ１６の結合後に到達可能である）と接触させる。
【００２２】
特に好ましい一実施態様において、本発明の方法は、ＩＦＩ１６に特異的に結合する少なくとも２のレセプターの使用を伴い、その際、１つのレセプターは検出可能なレセプターであり、この他のレセプターは固相に固定化されているか、又は固相への固定化を可能にする基を有し、例えばこれは、この表面上の結合対の相補的メンバーへの特異的結合を介してである。
【００２３】
この好ましい実施態様は、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡの機構的原理の利点を伴う方法に関する。この原理は当業者に一般的に知られている。さらに、相応する方法は実施例１及び３に説明されている。
【００２４】
この検出可能なレセプターは、検出可能なラベル化基を有してよい。レセプターのラベル化を可能にする方法はこの分野において知られている。代わりに、検出可能な基は、他の、第３のレセプターであって検出可能なラベル化基を含むものを利用して特異的に認識されてよい。
【００２５】
このようなラベル化基の好ましい例は、放射性又は蛍光のラベル化基である。
【００２６】
更なる好ましいラベル化基は、酵素ラベル化基、例えばアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、［ベータ］ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、ウレアーゼ及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを含む。酵素反応を利用した検出のために適した例及び必要な基質の使用は当業者に知られており、特に、市販されている検出キットのパッケージ冊子から知られている。このような市販のキットはしばしば抗体を含み、これは特異的な種の抗体、例えば抗マウスを認識し、かつ、これにシグナルを放出する酵素が連結している。このようにして、相応する抗体は第３のレセプターの例であり、これはそのＦｃ部分である、第２のレセプターの特異的ラベル化を認識する。
【００２７】
このレセプターは、ペプチド、ポリペプチド、低分子物質、抗体又はその断片又は誘導体及びアプタマーからなる群から選択されてよい。好ましい一実施態様において、前記レセプターは抗体又はその抗原結合断片である。
【００２８】
「ペプチド」との用語は通常は、３０個までのアミノ酸を有するアミノ酸鎖を指す。
【００２９】
「ポリペプチド」との用語は、通常３０個を超えるアミノ酸を含むペプチドを指し、タンパク質を含む。
【００３０】
「低分子物質」又は小分子との用語は、上で定義した通りのマクロ分子に比較してより低い分子複雑性の分子を指す。文献においては、「低分子物質」との用語は一様には使用されない。WO 89/03041及びWO 89/03042には、７０００ｇ／ｍｏｌまでの分子量を有する分子が小分子と説明されている。しかし、通常は、５０〜３０００ｇ／ｍｏｌ、しかししばしば７５〜２０００ｇ／ｍｏｌ、大抵は１００〜１０００ｇ／ｍｏｌの範囲内にある分子量が言及される。例が文献（WO86/02736, WO97/31269, U.S. Pat.No. 5,928,868, U.S. Pat. No. 5,242,902, U.S. Pat. No. 5,468,651 , U.S. Pat.No. 5,547,853, U.S. Pat. No. 5,616,562, U.S. Pat. No. 5,641 ,690, U.S. Pat.No. 4,956,303及びU.S. Pat. No. 5,928,643）から当業者に知られている。低分子物質は、有機又は無機の性質を有してよい。
【００３１】
本発明によれば、「抗体」との用語は、ポリクローナル血清また同様にモノクローナル抗体を含む。
【００３２】
モノクローナル抗体及びこの生産方法は当業者に知られている。これらはKoehler and Milstein (1975) により最初に説明された方法を基礎とする。この方法は、特に、Harlow and Lane (Antibodies, A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory; (1988); Chapter 6) による実験室マニュアルにおいて詳細に説明されている。この定義によれば、二重特異性抗体、合成抗体及びこれら抗体の断片又は誘導体も含まれる。これらは断片、例えばＦａｂ、Ｆｖ又はｓｃＦｖ及びこれら抗体又は抗体断片の化学的に改変された誘導体を含む。
【００３３】
アプタマーは、原則的に、先行技術から当業者に知られている。
【００３４】
好ましくは、本発明の方法は、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ又はＲＩＡである。適当な方法は、原則的に、Harlow and Lane, loc. cit.及びRehm, loc. citから当業者に知られている。
【００３５】
これまでは細胞内タンパク質として知られていたＩＦＩ１６が、細胞外環境で見出されるというこの意外な結果により、ＩＦＩ１６を、組織試料の培養上清、体液試料又は細胞培養上清の試料中で分析することが可能になる。本発明の方法により、ＩＦＩ１６は、単純かつ迅速に検出されることができ、このようにして、診断的パラメーターとして機能する。
【００３６】
細胞外ＩＦＩ１６と病理学的状態との関係は、いまだ発表されていない。したがって、体液中の細胞外ＩＦＩ１６の決定により病理学的状態の評価が可能になることについて示唆はない。意外なことに、本発明においては、体液試料中の細胞外ＩＦＩ１６の存在及び／又は量の決定が、病理学的状態、特に自己免疫及び／又は炎症性疾患の評価を可能にすることが見出された。特に、本発明者らは、これら病理学的状態の信頼性のある評価が、個人からの細胞外液体試料内のＩＦＩ１６を測定することにより可能であることを見出し、すなわち、組織又はバイオプシー試料は、細胞外ＩＦＩ１６タンパク質をマーカーとして使用する場合に、この疾病の診断において必要とされない。さらにいっそう予期できないことに、個人の体液から測定した場合に増加したレベルの細胞外ＩＦＩ１６が、自己免疫又は炎症性疾患に関連していることが見出された。
【００３７】
ＩＦＩ１６が、ＳＳｃ、ＳＬＥ、ＳｊＳ及び関節リウマチ（ＲＡ）患者からの体液中に有意に（significantly）存在するが、その一方で、健康な被験体からの体液中ではこれはほとんど検出できない、というこの意外な結果を基礎として、自己免疫疾患のための診断ツールとしての特定の有用性が、本発明による方法に割り当てられる。
【００３８】
炎症の開始における特定の役割がＩＦＩ１６に割り当てられており、これは、内皮細胞中で過剰発現する場合に、幾つかの炎症促進性サイトカインの発現を上方調節し、かつＴＮＦ−α及びＩＦＮシグナリングに関連しているというものである。
【００３９】
このようにして、本発明の方法を利用した患者体液中のＩＦＩ１６の検出は、自己免疫疾患を含めた炎症性疾病に関して、そしてことによると細菌及びウィルス感染性疾病（ＡＩＤＳ、髄膜炎、ＨＣＶ感染）、アレルギー、移植反応、循環器及び腫瘍疾病などに関して、特に重要でもある。さらに、これらは、炎症性サイトカイン（例えば、インターフェロン−α）を用いた処置下の患者を用いた応答反応の決定のために重要である。
【００４０】
患者の体液の試料中のＩＦＩ１６の検出又は定量化は、患者のいくつかの臨床的特徴に関し結論付けることを可能にする。
【００４１】
言及した試料獲得方法は当業者に知られている。任意に、本発明による方法は、さらに、１又は複数の洗浄工程を、各方法工程前又は後に含んでいる。これら洗浄工程は、非特異的反応（誤ったポジティブ検出又は誤ったネガティブ検出）を最小限にすることに役立ち、かつ、この方法の感受性を改善できる。適した洗浄緩衝液及びその組成は、原則的に、当業者に知られている。生理学的緩衝溶液が好ましい。
【００４２】
本発明による好ましい一実施態様は、さらに、第１のレセプターとの接触前に工程（ａ′）又は（ａ″）を含む：（ａ′）前記試料中に含まれるタンパク質のラベル化；又は（ａ″）第１のレセプターのラベル化。
【００４３】
前記試料中に含まれるタンパク質及び／又は第１のレセプターは、例えば、化学的にラベル化されていてよく、これは例えば、ラベル化した化学基又はマーカーを、このタンパク質中に含まれるシステインの遊離アミノ基へと連結させることにより行われる。このようなマーキングされた化学基は、特殊な、検出可能なラジオアイソトープを含む基である。例えば、蛍光染料は、マーカーとしても機能する。適当なマーカーの更なる例は、核酸である。このようにしてラベル化された試料中のタンパク質又はレセプターの存在は、次いで、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において適したプライマーを用いて検出されることができる。
【００４４】
さらに、タンパク質を生理学的にラベル化することが可能であり、すなわち、ラベル化した分子の代謝による組み込みによる。この目的のため、細胞は、例えば、放射性ラベル化された代謝産物でインキュベーションされる。このインキュベーション期間の間にこれら細胞の生合成から生じ、ラベル化された代謝産物が組み込まれたタンパク質はマーク付けされる。この方法は、例えば、抗体を生産する細胞により分泌される抗体をラベル化するのに適している。
【００４５】
本発明による方法の更に好ましい一実施態様において、このレセプターは、ＩＦＩ１６を含むことが疑われる試料と接触させる前に表面上に固定化される。
【００４６】
本発明による方法の別の一実施態様によれば、このレセプターは、ＩＦＩ１６を含むことが疑われる試料と接触させた後に表面上に固定化される。
【００４７】
レセプターは様々な様式で固定化されることができる。適した方法は、様々な因子、例えば、レセプター又はこの表面の材料の種類に依存する。固定化は、共有により又は吸着により行われることができる。本発明による方法の好ましい一実施態様によれば、このレセプターはタンパク質、特に好ましくは抗体である。同様に好ましいのは、ペプチド又は有機分子のレセプターとしての使用である。
【００４８】
タンパク質であるレセプターの固定化のために、レセプターが受動吸着の手段により表面上に直接的に固定化される方法が説明される。通常は、適当な表面がポリマープラスチック材料（例えば、ポリスチレン、ポリビニル、ラテックス）からなり、かつ、例えばマイクロタイタープレート又はマルチウェルプレートの形に存在し、膜又は球状「ビーズ」（粒子の形にある架橋したポリマー）がこの目的のために使用される（Lowman, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26 (1997), 401-24）。
【００４９】
本発明による方法の更に好ましい一実施態様において、この表面の材料は、セファロース、ラテックス、ガラス、ポリスチレン、ポリビニル、ニトロセルロース及びシリコンからなる群から選択される。さらに好ましいのは、本発明による方法における表面が膜、ビーズ、チップ又はプレートであることである。
【００５０】
ビーズの例はセファロースビーズ又はラテックスビーズであり、これには任意にリガンドが結合され、これは、この表面に対するレセプターの固定化を促進する。このようなリガンドは、例えば、抗体のＦｃ部分を介してこの抗体を表面に結合させることを促進するタンパク質Ａ又はタンパク質Ｇである。キャリアー材料へのこのレセプターの結合は、共有的化学カップリング反応（例えば、ヒドラジンカップリング）により達成されることもできる。リガンドを用いたこの表面へのレセプターの固定化の別の例は、ビオチン及びアビジン又はストレオプトアビジンの使用である。
【００５１】
チップの例は、シリコンプレートであり、この上には複数の異なる又は同じレセプターが規則正しく固定化されていることができる。これにより、試料中の複数の異なるパラメーターの分析又は１又は複数のパラメーターに対する複数の異なる試料の分析が可能になり、例えば、異なる組織試料、体液の試料又は細胞培養上清の試料中のＩＦＩ１６又はこのタンパク質の断片の同定及び／又は定量化である。
【００５２】
言及されたプレートの例は、マイクロタイタープレート又はマルチウェルプレートである。好ましくは、これらは６、１２、２４、４８、９６、１２８、３５６、１０２４又はそれ以上のウェルを有する。実施例１において、９６ウェルプレートが使用される方法が説明される。
【００５３】
この方法の更に好ましい一実施態様によれば、これは更に、工程（ｂ′）を、特異的結合の検出工程前に含む：（ｂ′）第１のレセプター及びＩＦＩ１６の複合体と一緒の前記ビーズの沈殿。
【００５４】
ビーズは、例えば重量的に、試料から沈殿されることができる。これは、例えば遠心分離により、加速されることができる。適した方法は、当業者に知られており、特にRehm, Der Experimentator: Proteinbiochemie/Proteomics, Spektrum Akademischer Verlag, 2002から知られている。
【００５５】
本発明による方法の更に好ましい一実施態様において、レセプター及びＩＦＩ１６の間の特異的結合の検出は、試料のゲル電気泳動による分離、及び任意に、さらにウェスタンブロット分析を含む。適した方法は、当業者に知られており、特に、Rehm, loc. citから知られている。さらに、相応する方法が実施例２及び４に説明されている。
【００５６】
本発明による方法は好ましくは自動的に実施される。これは、特に、ピペッティングロボットの使用により、かつ、最適化プロセスの自動化分析のために可能である。
【００５７】
さらに、本発明は、体液又は細胞培養上清の試料（上で定義したとおり）の、細胞外ＩＦＩ１６の検出のための使用に関する。好ましくは、このポジティブ検出は、病理学的状態、特に炎症性及び／又は自己免疫疾病の存在についての指標である。
【００５８】
さらに、本発明の方法は、少なくとも１の付加的な診断マーカーの決定も含み、例えば、診断マーカーは、自己免疫及び／又は炎症性疾患の指標である。好ましい一実施態様において、この少なくとも１の付加的な診断マーカーは、抗ＩＦＩ１６−自己抗体である。
【００５９】
幾つかの診断マーカーの決定は、単独の試料又は単独の試料の異なるアリコート又は異なる試料に対して、並行して実施されてよい。診断マーカーの濃度は次いで、例えば、各マーカーのための個々のカットオフ値を使用して独立して解釈されるか、又はこれらは解釈のために組み合わせられる。
【００６０】
最後に、本発明は、
（ｉ）ＩＦＩ１６に特異的に結合する少なくとも１つのレセプター、及び
（ｉｉ）更なるキット成分、例えば、緩衝液、塩、試薬及び／又は使用説明書
を含む、診断用途のための試薬キットに関する。
【００６１】
試薬キットの好ましい実施態様は、２つのレセプターを含み、その際、１のレセプターは、検出可能なレセプターであり、他方のレセプターは固定化したか又は固定化可能なレセプターである。
【００６２】
さらに、本発明は、以下の図面及び実施例により、これに限定されることなく、より詳細に説明される。
【００６３】
図面
図１：ＩＦＩ１６サンドイッチＥＬＩＳＡの図示
【００６４】
図２：ＩＦＩ１６サンドイッチＥＬＩＳＡの感受性及び線形性
ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを、ポリクローナルウサギ抗−ＩＦＩ１６抗体を用いてコーティングした。引き続き、このプレートをＰＢＳ−Ｔｒｉｔｏｎ（ＰＢＳ−Ｔ；０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、ＰＢＳ中）で洗浄し、３０分間にわたり、自由結合部（free binding site）をＰＢＳ−Ｔ／ＢＳＡ  ３％（ＰＢＳ−ＴＢ）で３７℃で飽和させた。ＰＢＳ−Ｔでの洗浄後に、精製した６Ｈｉｓ−ＩＦＩ１６タンパク質を用いたインキュベーションが引き続き（１ｈ）、これはＰＢＳ−Ｔ中に５％ ＦＣＳに希釈され、標準として使用された。ＢＳＡはネガティブコントロールとして働く。この試料をＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄し、それぞれの場合にモノクローナルマウス抗ＩＦＩ１６抗体を添加し、１時間室温でインキュベーションした。ＰＢＳ−Ｔを用いた４回の洗浄後に、それぞれの場合に、ＰＢＳ−ＴＢ中に希釈したＨＲＰ−コンジュゲートした抗マウス抗体１００μｌを用いてインキュベーションが引き続いた（１ｈ、室温）。３回の洗浄工程後に、このＩＦＩ１６タンパク質／抗体複合体を、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いたインキュベーションにより可視化し、ストップ溶液（Stop Solution）でもって停止した。この吸収を、マイクロプレートリーダー中で４５０ｎｍで測定した。この濃度の決定を、図２の標準曲線を使用して実施し、これについては、精製した６Ｈｉｓ−ＩＦＩ１６の増加する濃度を使用した。この測定の線形性を、１〜１５．６ｎｇ／ｍｌの範囲内で示す。
【００６５】
図３：自己免疫患者及び健康な被験体中の循環するＩＦＩ１６の測定
血清中を循環するＩＦＩ１６の濃度を、ＥＬＩＳＡを利用して、ＳＳｃ（９９）、ＳＬＥ（３０）、ＳｊＳ（２０）、ＲＡ（３０）を患う患者及びＣ型肝炎ウィルス感染（ＨＣＶ）を有する患者中で、健康な被験体（ＣＴＲＬＳ，５４）中で決定した。
【００６６】
ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを、ポリクローナルウサギ抗−ＩＦＩ１６抗体を用いてコーティングした。引き続き、このプレートをＰＢＳ−Ｔｒｉｔｏｎ（ＰＢＳ−Ｔ；０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、ＰＢＳ中）で洗浄し、３０分間にわたり、自由結合部をＰＢＳ−Ｔ／ＢＳＡ  ３％（ＰＢＳ−ＴＢ）で３７℃で飽和させた。ＰＢＳ−Ｔを用いた洗浄後に、終容積１００μｌにおいて５μｌの異なる血清試料を用いたインキュベーションが引き続いた（１ｈ）。精製した６Ｈｉｓ−ＩＦＩ１６タンパク質（ＰＢＳ−Ｔ中に５％ＦＣＳに希釈）を標準として使用した。ＢＳＡはネガティブコントロールとして働いた。この試料をＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄し、それぞれの場合にモノクローナルマウス抗ＩＦＩ１６抗体を添加し、１時間室温でインキュベーションした。ＰＢＳ−Ｔを用いた４回の洗浄後に、それぞれの場合に、ＰＢＳ−ＴＢ中に希釈したＨＲＰ−コンジュゲートした抗マウス抗体１００μｌを用いたインキュベーションが引き続いた（１ｈ、室温）。３回の洗浄工程後に、このＩＦＩ１６タンパク質／抗体複合体を、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いたインキュベーションにより可視化し、ストップ溶液でもって停止した。この吸収を、マイクロプレートリーダー中で４５０ｎｍで測定した。この濃度の決定を、図２の標準曲線を使用して実施し、これについては、精製した６Ｈｉｓ−ＩＦＩ１６の増加する濃度を使用した。測定の線形性は血清中の２０〜４００ｎｇ／ｍｌ  ＩＦＩ１６にわたった。線形性の範囲外の濃度（＜２０ｎｇ／ｍｌ又は＞４００ｎｇ／ｍｌ）を有する血清を、０ｎｇ／ｍｌ又は４００ｎｇ／ｍｌそれぞれを有するものとしてプロットする。
【００６７】
ＩＦＩ１６血清タンパク質が患者血清の分画（５４％〜８４％にわたる）中で検出可能であり、その一方で、ＩＦＩ１６血清濃度は、全ての健康な被験体中でアッセイの検出限度より下であった。
【００６８】
図４：細胞上清中の細胞外ＩＦＩ１６の同定
ヒトのケラチノサイトを、２００、４００又は８００Ｊ／ｍ2の線量（それぞれＵＶ２００、ＵＶ４００又はＵＶ８００）でもってＵＶＢ照射に曝露するか、又は偽照射（ＮＴ）し、次いで１６又２４時間（それぞれ１６ｈ又は２４ｈ）インキュベーションした。上清を回収し、実施例２に説明したとおりにＴＣＡにより細胞外タンパク質を沈殿させた。抗ＩＦＩ１６ポリクローナル抗体を使用したイムノブロット分析は、細胞外ＩＦＩ１６の存在を、４００及び８００Ｊ／ｍ2のＵＶＢ照射線量に曝露した細胞の上清中に明らかにした。細胞内ＩＦＩ１６を発現するヒトケラチノサイト（ＴＥ）から抽出された全細胞タンパク質を、ＩＦＩ１６イムノブロットについてポジティブコントロールとして使用した。
【００６９】
図５：改善された線形性を有するＩＦＩ１６サンドイッチＥＬＩＳＡの感受性及び線形性
ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを、ポリクローナルウサギ抗−ＩＦＩ１６抗体を用いてコーティングした。引き続き、このプレートを洗浄し、自由結合部をＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０／３％  ＢＳＡ（ＰＢＳ−ＴＢ）で室温で１時間飽和させた。洗浄後に、標準として使用された、ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０／１％  ＢＳＡ（ＰＢＳ−ＴＤ）中の５％ＦＢＳ中に希釈した、精製した６Ｈｉｓ−ＩＦＩ１６タンパク質を用いたインキュベーションが引き続いた（１ｈ、室温）。ＢＳＡはネガティブコントロールとして働いた。この試料を洗浄し、それぞれの場合にモノクローナルマウス抗ＩＦＩ１６抗体を添加し、１時間室温でインキュベーションした。洗浄後に、ＨＲＰ−コンジュゲートした抗マウス抗体を用いてインキュベーションが引き続いた（１ｈ、室温）。洗浄後に、このＩＦＩ１６タンパク質／抗体複合体を、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いたインキュベーションにより可視化し、ストップ溶液でもって停止した。この吸収を、マイクロプレートリーダー中で４５０ｎｍで測定した。この濃度の決定を、図５の標準曲線を使用して実施し、これについては精製した６Ｈｉｓ−ＩＦＩ１６の増加する濃度を使用した。この測定の線形性を、１〜３２ｎｇ／ｍｌの範囲内で示す。
【００７０】
図６：改善した線形性を有するＩＦＩ１６  ＥＬＩＳＡを使用する自己免疫患者及び健康な被験体中の循環するＩＦＩ１６の測定
血清中を循環するＩＦＩ１６の濃度を、ＥＬＩＳＡを利用して、ＳＳｃ（５０）、ＳＬＥ（５０）、ＳｊＳ（５１）、ＲＡ（５０）、抗リン脂質症候群（ｐＡＰＳ、８０）を患う患者及びＣ型肝炎ウィルス感染（ＨＣＶ、８２）を有する患者中で、健康な被験体（ＣＴＲＬ，５０）中で決定した。この試験したコホートは、図３で試験されるものとは異なる患者を表す。
【００７１】
ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを、ポリクローナルウサギ抗−ＩＦＩ１６抗体を用いてコーティングした。引き続き、このプレートを洗浄し、自由結合部をＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０／３％  ＢＳＡ（ＰＢＳ−ＴＢ）で室温で１時間飽和させた。洗浄後に、終容積１００μｌのＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０／１％  ＢＳＡ（ＰＢＳ−ＴＤ）中で異なる血清試料５μｌを用いてインキュベーションが引き続いた（１ｈ、室温）。精製した６Ｈｉｓ−ＩＦＩ１６タンパク質（ＰＢＳ−ＴＤ中に５％ＦＢＳに希釈）を標準として使用した。ＢＳＡはネガティブコントロールとして働いた。この試料を洗浄し、それぞれの場合にモノクローナルマウス抗ＩＦＩ１６抗体を添加し、１時間室温でインキュベーションした。洗浄後に、ＰＢＳ−ＴＤ中に希釈したＨＲＰ−コンジュゲートした抗マウス抗体を用いてインキュベーションが引き続いた（１ｈ、室温）。洗浄後に、このＩＦＩ１６タンパク質／抗体複合体を、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いたインキュベーションにより可視化し、ストップ溶液でもって停止した。この吸収を、マイクロプレートリーダー中で４５０ｎｍで測定した。この濃度の決定を、図５の標準曲線を使用して実施し、これについては精製した６Ｈｉｓ−ＩＦＩ１６の増加する濃度を使用した。測定の線形性は血清中の２０〜６４０ｎｇ／ｍｌ  ＩＦＩ１６にわたった。線形性の範囲外の濃度（＜２０ｎｇ／ｍｌ又は＞６４０ｎｇ／ｍｌ）を有する血清を、０．１ｎｇ／ｍｌ又は６４０ｎｇ／ｍｌそれぞれを有するものとしてプロットする。この一本の灰色水平線は、各群についての平均ＩＦＩ１６濃度を示す。
【００７２】
ＩＦＩ１６ポジティブ性についてのカットオフ値を、コントロール集団の９５°のパーセンタイル（１１７ｎｇ／ｍｌ）に設定し、薄い灰色の連続的水平線により示す。Ｘ軸より下の数は各群中のカットオフ値よりも高いＩＦＩ１６血清濃度を有する患者のパーセンテージを示す。ＩＦＩ１６血清タンパク質は、ＳＳｃ、ＳＬＥ、ＳｊＳ、ＲＡ及びＨＣＶ患者血清の分画中でカットオフよりも高いレベルで検出可能であり、２０〜８０％にわたっていたが、その一方で健康な被験体中ではたった６％であった。ｐＡＰＳを患うたった１％の患者が、循環するＩＦＩ１６についてポジティブであった。
【００７３】
図７：細胞死を経る細胞の上清中の細胞外ＩＦＩ１６の同定
ヒトのケラチノサイト単層を、異なる線量（２００、４００及び８００Ｊ／ｍ2、それぞれ）でＵＶＢ照射し、２μＭのドキソルビシン（Doxo）及び８０μＭのエトポシド（VP-16）で処置したか、または未処置のままにした。処置１６時間後に、細胞外ＩＦＩ１６の決定のためにこの上清を回収し、分離し、その一方で、この残りの細胞を、ＰＡＲＰの細胞内開裂形態の決定（細胞死の経過の決定）のために溶解した。回収した上清を、実施例４に説明したとおりにＴＣＡ  ２５％を用いて濃縮した。試料につき等しい量の全細胞タンパク質を、そして、等しい容積の濃縮した上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（NEXT GEL Amresco, OH, USA、７．５％）で分画化し、ニトロセルロース膜（Biorad, CA, USA）に移した。抗ＩＦＩ１６ポリクローナル抗体を使用するイムノブロット分析は、ＵＶＢ照射線量４００及び８００Ｊ／ｍ2に曝露された細胞の上清中の細胞外ＩＦＩ１６の存在を明らかにした。この現象は、細胞損傷に一般的に関連せず、というのも、ドキソルビシン及びエトポシドのような薬理学的に細胞毒性の薬物への曝露の場合に化学的に誘導された細胞死を経るケラチノサイト中ではこれは観察されなかったからである（ＰＡＲＰ開裂により実証されるとおり、ネクローシス及びアポトーシスの細胞死の認識されたマーカー（Cepeda V. et al., Recent Pat Anticancer Drug Discov. 2006 Jan;1(1):39-53））。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、ＩＦＩ１６サンドイッチＥＬＩＳＡの図示を示す図である。
【図２】図２は、ＩＦＩ１６サンドイッチＥＬＩＳＡの感受性及び線形性を示す図である。
【図３】図３は、自己免疫患者及び健康な被験体中の循環するＩＦＩ１６の測定を示す図である。
【図４】図４は、細胞上清中の細胞外ＩＦＩ１６の同定を示す図である。
【図５】図５は、改善された線形性を有するＩＦＩ１６サンドイッチＥＬＩＳＡの感受性及び線形性を示す図である。
【図６】図６は、改善した線形性を有するＩＦＩ１６  ＥＬＩＳＡを使用する自己免疫患者及び健康な被験体中の循環するＩＦＩ１６の測定を示す図である。
【図７】図７は、細胞死を経る細胞の上清中の細胞外ＩＦＩ１６の同定を示す図である。
【００７５】
実施例１
ＩＦＩ１６  ＥＬＩＳＡ
発達したＩＦＩ１６  ＥＬＩＳＡのために以下の緩衝液を使用した：ＰＢＳ−Ｔ（０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、ＰＢＳ中）；及びＰＢＳ−ＴＢ（０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００及び３％ＢＳＡ、ＰＢＳ中）。
【００７６】
９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Nunc-Maxisorb Plates）を、１００μｌ／ウェルの抗ＩＦＩ１６ポリクローナル抗体を用いてコーティングした（インキュベーション、４℃で１６ｈ）。このプレートを、ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、少なくとも３０分間室温でＰＢＳ−ＴＢでブロッキングした。このウェルを吸引し、デュプリケート（duplicate）として１時間３７℃の温度で１００μｌの標準（６Ｈｉｓ−ＩＦＩ１６）（ＰＢＳ−ＴＢ中で５％ＦＢＳに希釈）を用いて、又は１００μｌの試料を用いて適した希釈（ＰＢＳ−ＴＢで希釈）で、それぞれインキュベーションした。このウェルを４回ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ＰＢＳ−ＴＢ中に希釈した、ＩＦＩ１６に対するモノクローナルマウス抗体１００μｌで１ｈ３７℃でインキュベーションした。引き続き、このウェルを３回ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、１００μｌのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で１ｈ３７℃でインキュベーションし、これは、ウサギ抗マウス抗体（GE HealthCare, USA）にコンジュゲートされ、１：５００にＰＢＳ−ＴＢ中で希釈されている。引き続き、このウェルを３回ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、１００μｌのテトラ−メチルベンジジン（SureBlue-TMB, KPL, USA）でインキュベーションし、次にストップ溶液（TMB StopSolution, KPL, USA）１００μｌで停止させた。この吸収を、マイクロプレートリーダー（Tecan）中で４５０ｎｍで決定し、この場合に６２０ｎｍを参照として使用した。この試料中のＩＦＩ１６の濃度を、この標準曲線を用いて計算した。この方法は、１〜１５．６ｎｇ／ｍｌのＩＦＩ１６／ウェルの線形性を示した。異なるアッセイにおけるこの結果の変動性は９．７％であった（インターアッセイＣＶ％＝９．７％）。
【００７７】
実施例２
細胞上清中のＩＦＩ１６のウェスタンブロット分析
血清不含培地（Epilife, Cascade Biologies, USA）中で培養したヒト初代ケラチノサイトの上清を、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）での沈殿にかけた。沈殿したタンパク質をイムノブロットにより分析した。
【００７８】
細胞を血清不含培地（Epilife, Cascade Biologies, USA）中で培養し、次いで、異なる線量（２００〜８００Ｊ／ｍ2）の紫外線Ｂ照射（ＵＶＢ）に曝露したか又は偽照射した。照射１６及び２４時間後に、上清を回収し、細胞デブリを取り除くために５０００ｇで１０分間遠心分離した。ＴＣＡを次いで、終濃度２５％  ｖ／ｖでこの上清に添加し、試料を１０分間氷上でインキュベーションし、４℃で１４０００ｇで１０分間遠心分離した。このタンパク質ペレットを３回１００％アセトンで洗浄し、空気乾燥し、Laemmli Sample緩衝液中に再懸濁した。９５℃での５分間の変性に続き、この試料を７．５％のポリアクリルアミドゲル上に負荷し、ゲル電気泳動にかけた。
【００７９】
移動したタンパク質をニトロセルロースに移した。この膜をＴＢＳ−５％  ＢＳＡ中でブロッキングし、細胞外ＩＦＩ１６を、抗ＩＦＩ１６ウサギポリクローナル抗体を用いて４℃で一晩の膜インキュベーションにより検出した。ＴＢＳ−０．０５％−Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳ−Ｔ）での３回の洗浄後に、この膜を、１時間室温でＨＲＰ−コンジュゲートした抗ウサギ二次抗体（GE Healthcare, USA）でインキュベーションした。ＴＢＳ−Ｔでの洗浄後に、この膜をＥＣＬ（GE Healthcare）を用いてインキュベーションし、GelDoc image analyzer（BioRad, USA）によりこの化学発光シグナルを獲得した。
【００８０】
実施例３
改善した線形性を有するＩＦＩ１６  ＥＬＩＳＡ
発達したＩＦＩ１６  ＥＬＩＳＡのために以下の緩衝液を使用した：ＰＢＳ−ＴＢ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０及び３％ＢＳＡ、ＰＢＳ中）及びＰＢＳ−ＴＤ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０及び１％ＢＳＡ、ＰＢＳ中）。
【００８１】
９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Nunc-Maxisorb Plates）を、１００μｌ／ウェルの抗体ＩＦＩ１６ポリクローナル抗抗体を用いてコーティングした（インキュベーション、４℃で１６ｈ）。このプレートを洗浄緩衝液（Wash Solution Concentrate, KPL, USA）で洗浄し、少なくとも１時間室温でＰＢＳ−ＴＢでブロッキングした。このウェルを洗浄し、デュプリケートとして１時間室温で１００μｌの標準（６Ｈｉｓ−ＩＦＩ１６）（ＰＢＳ−ＴＤ中で５％ＦＢＳに希釈）を用いて、又は１００μｌの試料を用いて適した希釈（ＰＢＳ−ＴＤで希釈）で、それぞれインキュベーションした。このウェルを洗浄し、１時間室温で、ＰＢＳ−ＴＤ中に希釈した、ＩＦＩ１６に対するモノクローナルマウス抗体１００μｌでインキュベーションした。引き続き、このウェルを洗浄し、１００μｌのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で１時間室温でインキュベーションし、これはウサギ抗マウス抗体（GE HealthCare, USA）にコンジュゲートされており、ＰＢＳ−ＴＤ中で１：５００に希釈されている。引き続き、このウェルを洗浄し、１００μｌのテトラメチルベンジジン（SureBlue-TMB, KPL, USA）でインキュベーションし、次いで、１００μｌのストップ溶液（０．６Ｎ  Ｈ2ＳＯ4）で停止させた。この吸収を、マイクロプレートリーダー（Tecan）中で４５０ｎｍで決定し、この場合に６２０ｎｍを参照として使用した。この試料中のＩＦＩ１６の濃度を、この標準曲線を用いて計算した。この方法は、１〜３２ｎｇ／ｍｌのＩＦＩ１６／ウェルの線形性を示した。カットオフ値をこのコントロール集団の９５°パーセンタイルに設定した。このカットオフ値よりも高いＩＦＩ１６濃度を示す被験体は、循環するＩＦＩ１６の存在についてポジティブであると考慮された。
【００８２】
実施例４
細胞死を経る細胞の上清中のＩＦＩ１６のウェスタンブロット分析
血清不含培地（Epilife, Cascade Biologies, USA）中で培養したヒト初代ケラチノサイトの上清を、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）での沈殿にかけた。沈殿したタンパク質をイムノブロットにより分析した。
【００８３】
細胞を血清不含培地（Epilife, Cascade Biologies, USA）中で培養し、次いで、異なる線量（２００〜８００Ｊ／ｍ2）の紫外線Ｂ照射（ＵＶＢ）に曝露したか、又は２μＭドキソルビシン（Doxo）又は８０μＭエトポシド（ＶＰ−１６）で処置したか、又は偽照射した。処置１６時間後に、上清を回収し、細胞デブリを取り除くために５０００ｇで１０分間遠心分離した。ＴＣＡを次いで、終濃度２５％  ｖ／ｖでこの上清に添加し、試料を１０分間氷上でインキュベーションし、４℃で１４０００ｇで１０分間遠心分離した。このタンパク質ペレットを３回１００％アセトンで洗浄し、空気乾燥し、Laemmli Sample緩衝液中に再懸濁した。
【００８４】
ＵＶＢ照射及びDoxo又はVP-16を用いた処置により誘導された経過する細胞死のコントロールとして、細胞内ＰＡＲＰ開裂もまたこの曝露されたケラチノサイト中に決定した。このために提案されたのはこの付着細胞をＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ｃｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ４０、０．２５％  Ｎａ−デオキシコール、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１Ｘコンプリートミニプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）、１Ｘホスファターゼ阻害剤（Pierce））中で溶解した。
【００８５】
９５℃での５分間の変性に続き、この試料を７．５％のポリアクリルアミドゲル上に負荷し、ゲル電気泳動にかけた。
【００８６】
移動したタンパク質をニトロセルロースに移した。この膜をＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／５％ＢＳＡ中でブロッキングし、細胞外ＩＦＩ１６を抗ＩＦＩ１６マウスモノクローナル抗体（clone 1G7, Santa Cruz, CA, USA）を用いた上清試料を有するこの膜のインキュベーションにより検出した。ＰＡＲＰの細胞内開裂した形態を、ウサギ抗ＰＡＲＰ開裂した抗体（GTX24830, GeneTex, CA, USA）により細胞抽出物試料を有する膜のインキュベーションにより検出した。ＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳ−Ｔ）での３回の洗浄後に、この膜を、ＨＲＰ−コンジュゲートした抗マウス又は抗ウサギ二次抗体（GE Healthcare, USA）でもってそれぞれ１時間室温でインキュベーションした。ＴＢＳ−Ｔでの洗浄後に、この膜をＥＣＬ（GE HealtCare）を用いてインキュベーションし、GelDoc image analyzer（BioRad, USA）によりこの化学発光シグナルを獲得した。
【図１】
0005456056.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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