(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
心臓血管および脳血管の疾病の治療に対する伝統的中国医学の調合剤の製造方法であって、
上記調合剤は、
ラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエおよびラディックス・ノトギンセンを秤量する工程と；上記医薬材料の全重量に対して０．５％〜４．０％の量の水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸カリウムまたは、それらの混合物を加える工程と；生じた混合物を３〜６倍の水で２〜４回煮沸する工程と；上記混合物のろ過を行い、ろ液を集めて濃縮する工程と；十分な量の７０％以上の濃度のエタノールを加え、エタノールの含有量を６５〜７０％に調節する工程と；混合物を放置し、上清を分離する工程と；上清からエタノールを回収し、比重が１．２０−１．５になるまで、ラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエ−ラディックス・ノトギンセン抽出物である残渣を濃縮する工程と；上記抽出物と、ボルネオールまたは、リグナム・ダルベルギアエ・オドリフェラエのオイルとを混合する工程と；添加物を加えて、調合剤を得る工程と；を含む製造方法によって製造され、
２種の化合物を含み、
上記２種の化合物は、最大吸収波長が３２７ｎｍであり、
ｍ／ｚが５３７〔Ｍ−Ｈ〕−の擬分子イオン質量ピークと、ｍ／ｚが４９３〔Ｍ−Ｈ‐ＣＯ２〕−および２９５〔Ｍ−ＣＯ２−Ｒ−Ｈ２Ｏ〕−の２次フラグメントイオンと、ｍ／ｚが１５９および１０９の３次フラグメントイオンとを有し、
上記質量スペクトル分析は、（１）ＨＰＬＣ−ＭＳを、乾燥ガス流速：１０Ｌ／分；噴霧器圧力：６０ｐｓｉ；乾燥ガス温度：３５０℃；キャピラリー電圧：３５００Ｖ；およびｍ／ｚの走査範囲：１００−１２００の条件で、陰イオンを検出することにより行い、（２）ＨＰＬＣ−ＭＳｎを、乾燥ガス流速：１０Ｌ／分；噴霧器圧力：６０ｐｓｉ；乾燥ガス温度：３５０℃；キャピラリー電圧：３５００Ｖ；ｍ／ｚの走査範囲：１００−８００；およびフラグメント振幅：１．５−３．０Ｖの条件で、陰イオンを検出することにより行うものであり、
ラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエおよびラディックス・ノトギンセンを秤量する工程と；
上記医薬材料の全重量に対して０．５％〜４．０％の量の水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸カリウムまたは、それらの混合物を加える工程と；
生じた混合物を３〜６倍の水で２〜４回煮沸する工程と；
上記混合物のろ過を行い、ろ液を集めて濃縮する工程と；
十分な量の７０％以上の濃度のエタノールを加え、エタノールの含有量を６５〜７０％に調節する工程と；
混合物を放置し、上清を分離する工程と；
上清からエタノールを回収し、比重が１．２０−１．５になるまで、ラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエ−ラディックス・ノトギンセン抽出物である残渣を濃縮する工程と；
上記抽出物と、ボルネオールまたは、リグナム・ダルベルギアエ・オドリフェラエのオイルとを混合する工程と；
添加物を加えて、調合剤を得る工程と；を含む伝統的中国医学の調合剤の製造方法。
【請求項２】
上記添加物は、デンプン、デキストリン、ラクトース、微結晶性セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ステアリン酸マグネシウム、マイクロシリコンゲル、キシリトール、ラクチトール、ブドウ糖、グリシン、マンニトール、メチルスターチナトリウム、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムまたは架橋ポリビニルピロリドン、もしくは、それらが水に溶けたもの、ないしは、上記添加物の中から１種以上を含む混合物であり；上記調合剤は、注射、錠剤、持続放出性錠剤、丸薬、顆粒、注射用粉末、カプセル、微粒剤、または経口錠剤分解物質の投与形態であることを特徴とする請求項１に記載の伝統的中国医学の調合剤の製造方法。
【請求項３】
上記調合剤は、丸薬の投与形態であることを特徴とする請求項２に記載の伝統的中国医学の調合剤の製造方法。
【請求項４】
ラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエおよびラディックス・ノトギンセンを秤量する工程と；
上記医薬材料の全重量に対して１．４％〜１．９％の量の炭酸水素ナトリウムを加える工程と；
その結果生じた混合物を４〜５倍の水で２〜３時間煮沸し、その後、３〜４倍の水で１〜２時間煮沸する工程と；
上記混合物のろ過を行い、１．１６〜１．２０の比重になるまで、ろ液を集めて濃縮する工程と；
十分な量の７０％以上の濃度のエタノールを加え、エタノールの含有量を６５〜７０％に調節する工程と；
混合物を８〜１２時間放置し、上清を分離する工程と；
上清からエタノールを回収し、比重が１．３２−１．４０になるまで、ラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエ−ラディックス・ノトギンセン抽出物である残渣を濃縮する工程と；
上記抽出物と、ボルネオールまたは、リグナム・ダルベルギアエ・オドリフェラエのオイルと、ポリエチレングリコール−６０００とを均一に混合する工程と；
その混合物を加熱して溶かす工程と、
丸薬製造装置により、液体パラフィンまたはメチルシリコンオイルの冷却媒体の中へ溶解物を落とす工程と；
得られた丸薬を取り出し、当該丸薬からオイルを除去する工程と；
上記ピルを篩にかけ所望の調合剤を得る工程と；を含むことを特徴とする請求項３に記載の伝統的中国医学の調合剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、薬剤に関するものであり、特に心臓血管と脳血管との疾病の治療に対する伝統的中国医学の調合剤に関するものである。
【０００２】
〔背景技術〕
心臓血管と脳血管との疾病は人間の健康を酷く損なう疾病として共通している。近年、そのような疾病は、社会の発達と共に、仕事、生活、食事の傾向および環境等が変化したことが原因で、増加の一途を辿っている。伝統的中国医学（ＴＣＭ）は西洋医学と比べて、単一の目標に対しては活性が弱いにも拘らず、複数の経路で複数の目標に作用すること、動的で全身に対する治療が行えること、副作用が少ないことという特徴を有している。そして、上記特徴は、上記西洋医学の効果を遥かに凌ぐものである。明確な治療効果を有する上記ＴＣＭ調合剤は、西洋医学のそれよりも優れた全体的な治療効果を有している。現在のところ、心臓血管と脳血管との疾病の治療に対する複数のＴＣＭ調合剤があり、例えばダンシェン化合物の錠剤とその伝統的中国医学の調合剤と、グアンキシン・ダンシェン丸薬と、キンケシュ錠剤等とを挙げることができる。これらＴＣＭ調合剤は、すべて、ダンシェンとして知られているラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエとラディックス・ノトギンセンとを含んでいるが、調製方法、成分の割合、抽出および精製過程、または剤形が異なると異なる治療効果を示す。加えて、現在のところ、これら薬剤の生理的および化学的性質を完全に特定するために利用できるような、有効で質の高い方法がなく、そして、代わりに、ダンシェンスやタンシノンＩＩＡのような１つまたは２つの化合物だけが、これら薬剤で複雑な生物活性を示す成分を表すために用いられているので、これら伝統的中国医学の調合剤は、質の面についてほとんど管理することができない。それ故、当該伝統的中国医学の調合の抽出と精製とに関する製造方法を改善する必要がある。また、それらの質を管理する方法も改善する必要がある。
【０００３】
〔発明の要旨〕
本発明の目的は、心臓血管と脳血管との疾病の治療に対するより効果的なＴＣＭ調合剤を提供することである。また、物理的及び化学的性質に関して比較的完全で正確な特徴を検出するための方法を提供することでもある。
【０００４】
本発明の別の目的としては、上記ＴＣＭ調合剤の製造方法を提供することである。
【０００５】
本発明の目的は下記の実施の形態を経て達成される。
【０００６】
本発明に係る上記ＴＣＭ調合剤は下記の工程を有する製造方法を経て調合される：
すなわち、上記製造方法は、ラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエおよびラディックス・ノトギンセンと、その医薬材料の全重量に対して０．５％〜４．０％の量の水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸カリウムまたは、それらの混合物とを混合し、混合物を得る工程と；
上記混合物を３〜６倍の水で２〜４回煮沸する工程と；
上記混合物のろ過を行い、ろ液を集めて濃縮する工程と；
十分な量の高濃度（７０％以上）エタノールを加え、エタノールの含有量を６５〜７０％に調節する工程と；
混合物を放置し、上清を分離する工程と；
上清からエタノールを回収し、比重が１．２０−１．５０（５５−６０℃）になるまで、ラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエ−ラディックス・ノトギンセン抽出物である残渣を濃縮する工程と；
上記抽出物と、ボルネオールまたは、リグナム・ダルベルギアエ・オドリフェラエのオイルとを混合する工程と；
デンプン、デキストリン、ラクトース、微結晶性セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ステアリン酸マグネシウム、マイクロシリコンゲル、キシリトール、ラクチトール、ブドウ糖、グリシン、マンニトール、メチルスターチナトリウム、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、または架橋ポリビニルピロリドン等のような医薬品添加物を１種以上加えて、注射、錠剤、持続放出性錠剤、丸薬（ｄｒｏｐ  ｐｉｌｌ）、顆粒、注射用粉末、カプセル、微粒剤、または経口錠剤分解物質（ｏｒａｌ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｎｔ）のような様々な投与形態へと上記混合物を成型する工程と；を含む。
【０００７】
好ましくは、上記ＴＣＭ調合物は、下記の工程を含む製造方法を経て調合されることが好ましい。
【０００８】
すなわち上記製造方法は、ラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエおよびラディックス・ノトギンセンを秤量する工程と；
上記医薬材料の全重量に対して１．４％〜１．９％の量の炭酸水素ナトリウムを加え、混合物を得る工程と；
上記混合物を４〜５倍の水で２〜３時間煮沸した後、３〜４倍の水を加えてさらに１−２時間煮沸する工程と；
上記混合物のろ過を行い、集めたろ液を、１．１６〜１．２０（８０±５℃）の比重になるまで、濃縮する工程と；
十分な量の高濃度（７０％以上）エタノールを加え、エタノールの含有量を６５〜７０％（２０℃）に調節する工程と；
混合物を８〜１２時間放置し、上清を分離する工程と；
上清からエタノールを回収し、比重が１．３２−１．４０（５５−６０℃）になるまで、ラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエ−ラディックス・ノトギンセン抽出物である残渣を濃縮する工程と；
上記抽出物と、ボルネオールまたは、リグナム・ダルベルギアエ・オドリフェラエのオイルとを混合する工程と；
デンプン、デキストリン、ラクトース、微結晶性セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ステアリン酸マグネシウム、マイクロシリコンゲル、キシリトール、ラクチトール、ブドウ糖、グリシン、マンニトール、メチルスターチナトリウム、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび架橋ポリビニルピロリドン等からなる群より選ばれる医薬品添加物を１種以上加えて、錠剤、丸薬（ｄｒｏｐ  ｐｉｌｌ）、顆粒、注射用粉末、カプセル、または経口錠剤分解物質（ｏｒａｌ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｎｔ）へと上記混合物を成型する工程と；を含む。
【０００９】
本明細書において用いられている上記ボルネオールは、天然に存在するものであってもよいし、または合成されたものであってもよい。本明細書において用いられている上記リグナム・ダルベルギアエ・オドリフェラエのオイルは、リグナム・ダルベルギアエ・オドリフェラエを蒸留することで獲得することができる。
【００１０】
上記ＴＣＭ調合剤は、丸薬の投与形態であることが好ましい。
【００１１】
本発明に係る上記ＴＣＭ調合剤は、下記の物理的および化学的パラメーターを用いることで特徴付けることができる。
【００１２】
すなわち、上記パラメーターとは、ＨＰＬＣスペクトルにおいて、単一ピーク面積の全ピーク面積に対する割合が２％よりも大きい８種類のピークが存在し；これら８種のピークは、平均保持時間が、それぞれ６．０４、９．９０、１６．８９、１７．８４、２０．３１、２３．７４、２７．７３および３１．０２であり、上記保持時間のＲＳＤ％は、それぞれ０．３１、０．２５、０．６１、０．７０、０．９６、０．７６、０．５０および１．１８であり、それら平均ピーク面積は、それぞれ１６２７．９２、２５７５．５４、３６６．８９、３８１．４０、１８６．０８、５５５．３５、２８１．９１および１８５２．３３であり、上記ピーク面積のＲＳＤ％は、それぞれ５．９１、１３．５３、１０．９２、１３．８１、１２．０４、１０．４８、１８．０８および１４．８４であり；そして、単一ピーク面積の全ピーク面積に対する比は、それぞれ１９．６％−２２．０％、２８．５％−３７．４％、４．２％−５．２％、４．２％−５．５％、２．１％−２．７％、６．４％−７．８％、３．０％−４．３％および２０．２％−２７．２％である。
【００１３】
上記物理的および化学的パラメーターを、下記の検出条件の基づいて得ることができる。
【００１４】
（１）高速液体クロマトグラフィー
オクタデシルシリル−シリカゲルをフィルターとして用い、１．０００ｍｌ／分の流速で、２８０ｎｍの検出波長でクロマトグラフィーを行った。下記の条件で溶出を行った。つまり、０．０２％のリン酸水溶液である移動相Ａと、８０％アセトニトリル−０．０２％リン酸水溶液である移動相Ｂとを用いて、０−８分の間は、上記移動相Ａを９０％〜７８％に均一に変化させ、上記移動相Ｂを１０％〜２２％に均一に変化させ；８〜１５分の間は、上記移動相Ａを７８％〜７４％に変化させ、上記移動相Ｂを２２％〜２６％に変化させ、１５〜５５分の間は、上記移動相Ａを７４％〜４８％に変化させ、上記移動相Ｂを２６％〜５２％に変化させる。
【００１５】
（２）サンプル溶液の調製および決定
本発明に係るＴＣＨ調合剤の１０剤を正確に秤量し、その後１０ｍｌの計量瓶に入れた。１５分間の超音波攪拌によって上記調合剤が溶けるために十分な量の蒸留水を加えた。そして、１０ｍｌになるようにさらに蒸留水を加えた。その結果生じた溶液を遠心するか、または濾過をして、サンプル溶液を調製した。上記サンプル溶液から正確に１０μｌとり、ＨＰＬＣ装置に注入し、その後、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによってＨＰＬＣスペクトルを得た。
【００１６】
標準サンプルおよび質量スペクトルと比較するという分析法を用いて、６．０４、９．９０、１６．８９、１７．８４、２０．３１、２３．７４、２７．７３および３１．０２の平均保持時間を有する上記８ピークをそれぞれ、ダンシェンス、プロトカテクアルデヒド（Ｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕａｌｄｅｈｙｄｅ）、イソリソスペルミック酸Ａ（Ｉｓｏｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｉｃ  ａｓｉｄ  Ａ）、イソリソスペルミック酸Ｂ（Ｉｓｏｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｉｃ  ａｓｉｄ  Ｂ）、サルビアノリック酸Ｄ（Ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  Ｄ）、ロスマリニック酸（Ｒｏｓｍａｒｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、サルビアノリック酸Ｂ（Ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  Ｂ）およびサルビアノリック酸Ａ（Ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  Ａ）に一致するものであると同定した（図１参照）。
【００１７】
特定のＨＰＬＣ−ＭＳ法を用いて、本発明の上記ＴＣＭ調合剤が、ダンシェンス、プロトカテクアルデヒド、イソリソスペルミック酸Ａ、イソリソスペルミック酸Ｂ、サルビアノリック酸Ｄ、サルビアノリック酸Ｅ、ロスマリニック酸、サルビアノリック酸Ｂ、サルビアノリック酸Ｇ、サルビアノリック酸Ａ、タンシロンＩ、タンシロンＩＩＡ、ノトギンセノシドＲ１（Ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ  Ｒ１）、ギンセノシドＲｅ、ギンセノシドＲｇ１、ギンセノシドＲｂ１、ノトギンセノシドＲ２、ノトギンセノシドＲ２イソ．、ギンセノシドＲｇ２、ギンセノシドＲｈ１、ギンセノシドＲｈ１イソ．、ギンセノシドＲｄ、ギンセノシドＲｄイソ．、ギンセノシドＲｆ−Ｈ２Ｏ、ノトギンセノシドＲ２―Ｈ２Ｏ、ギンセノシドＲｇ６または、Ｆ４、ギンセノシドＲｋ３、ギンセノシド（Ｒｈ４）、ギンセノシド２０（Ｒ）−Ｒｇ３、ギンセノシド２０（Ｓ）―Ｒｇ３、ギンセノシド（Ｒｋ１）、およびギンセノシド（Ｒｇ５）等を含んでいることを決定した。
【００１８】
【化１】
0005567763.tif 000002
【００１９】
１．  ダンシェンス              ＭＷ＝１９８
２．  プロトカテクアルデヒド    ＭＷ＝１３８
３．  サルビアノリック酸Ａ      ＭＷ＝４９４
４．  サルビアノリック酸Ｂ      ＭＷ＝７１８
５．  サルビアノリック酸Ｃ      ＭＷ＝４９２
６．  サルビアノリック酸Ｄ      ＭＷ＝４１８
７．  サルビアノリック酸Ｅ      ＭＷ＝７１８
８．  サルビアノリック酸Ｇ      ＭＷ＝３４０
９．  イソリソスペルミック酸Ａ    ＭＷ＝５３８
１０．  イソリソスペルミック酸Ｂ  ＭＷ＝５３８
１１．  ロスマリニック酸        ＭＷ＝３６０
【００２０】
【化２】
0005567763.tif 000003
【００２１】
【表１】
0005567763.tif 000004
【００２２】
本発明の溶出工程と分析方法とにおいて、フィンガープリント図（ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ  ａｔｌａｓ）、を用いて、上記ＴＣＭ調合剤の上記ラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエおよびラディックス・ノトギンセンの物理的および化学的性質を完全に特徴づけた。ＴＣＭ調合剤の生物学的に活性のある複雑な成分を表すために、１または２種の化合物のみが用いられる先行技術と比べて、この特徴化の方法は、上記ＴＣＭ調合剤の質を制御することに関して、より適切である。
【００２３】
本発明のＴＣＭ調合剤における生物学的に活性のある成分は、本発明に係るＨＰＬＣ−ＭＳ分析法を用いて決定される。その結果、合計で、ラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエからは１２の成分が、そしてラディックス・ノトギンセンからは２１の成分が、同定された。上記化合物は主に、ＭＳｎデータ分析と、文献のデータとの比較とに基づいて同定された。最終的に、対照サンプルと比較することにより多くの上記成分の構造を完全に確定した。その結果、本発明のＨＰＬＣ−ＭＳ法を用いたＴＣＭ調合剤の化学組成の分析から、上記生物学的に活性のある成分の構造に関する十分な情報を得ることができるという結論に達した。そのため、これら情報による上記ラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエおよびラディックス・ノトギンセンの物理的および化学的性質の特徴化は、先行技術における方法よりも非常に効果的である。
【００２４】
下記の試験は、本発明のＴＣＭ調合剤が心臓血管と脳血管との疾病に対する処置に有効であるとを示している。
【００２５】
１．麻酔された犬におけるＴＣＭ調合剤の心筋虚血および心筋梗塞に対する効果
心外膜の電位図を、心筋虚血の程度を調べて、その範囲を表示するために用いた。定量的組織学（Ｎ−ＢＴ染色法）を用いて、心筋梗塞の面積を決定した。また、冠動脈の血流量の変化と、心筋の酸素消費量の変化と、血清のＣＫおよびＬＤＨの活性の変化と、血漿のＥＴ、ＴＸＢ２、および６ケト−ＰＧＦ１ａの活性の変化とを決定した。本発明に係るＴＣＭ調合剤の、試験犬における、急性心筋虚血、心筋梗塞、および関連する指標に対する効果を食事投与（ａｌｉｍｅｎｔａｒｙ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって調べた。
【００２６】
上記の試験の結果は、本発明に係るＴＣＭ調合剤が、犬の急性心筋虚血および心筋梗塞を改善する顕著な効果を有すること示している。本発明に係るＴＣＭ調合剤は、心外膜の電位図により示される心筋虚血（Σ―ＳＴ）の程度の減少（普通の生理食塩水を用いた対照群と比較してＰ＜０．００１）と、Ｎ−ＳＴ染色により示される心筋梗塞の面積の顕著な減少（普通の生理食塩水を用いた対照群と比較してＰ＜０．００１）と、虚血状態の心臓における冠動脈の血流量顕著な増大（普通の生理食塩水を用いた対照群と比較してＰ＜０．００１）とを引き起こすことができる。本発明に係るＴＣＭ調合剤は、心筋虚血および心筋梗塞の結果生じる血清の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出に対する抑制作用（普通の生理食塩水を用いた対照群の相対的な変動比よりも顕著に低い、Ｐ＜０．００１）と、クレアチンホスホキナーゼの活性の増加に対する抑制作用（普通の生理食塩水を用いた対照群の相対的な変動比よりも顕著に低い、Ｐ＜０．０５）とを有している。また、本発明に係るＴＣＭ調合剤は、血漿のＥＴの水準を減少する効果（普通の生理食塩水を用いた対照群と比較してＰ＜０．００１）と、血漿のＴＸＢ２の水準を減少する効果（普通の生理食塩水を用いた対照群と比較してＰ＜０．００１であり、ＴＣＭ調合剤を用いた群と比較してＰ＜０．０５）と、６―ケトＰＧＦ１ａ／ＴＸＢ２の比を改善する効果（普通の生理食塩水を用いた対照群と比較してＰ＜０．００１であり、ＴＣＭ調合剤を用いた群と比較してＰ＜０．０５）とを有している。
【００２７】
２．虚血性の再かん流により引き起こされる心筋梗塞に対するＴＣＭ調合剤の効果
心筋虚血のダメージを負ったラットのモデルを観察することにより、本発明に係るＴＣＭ調合剤が、心筋のダメージの程度を顕著に減少することと、心筋梗塞の面積を減少すること（モデル群と比較してｐ＜０．０５−０．０１）と、梗塞の部分の重さを少なくすること（モデル群と比較してｐ＜０．０５）とを引き起こすことが分かった。本発明に係るＴＣＭ調合剤、またスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の活性を顕著に増加する効果（モデル群と比較してｐ＜０．０１）も有している。
【００２８】
３．犬における心臓血流と心筋酸素消費量との動態に対するＴＣＭ調合剤の効果
麻酔された犬における、本発明のＴＣＭ調合剤の心臓血流と心筋酸素消費量との動態に対する効果を評価した。
【００２９】
本発明に係るＴＣＭ調合剤が、冠動脈の血流量を顕著に改善すること（投与前の群と比較して、ｐ＜０．０１−０．００１、普通の生理食塩水を用いた対照群と比較して、ｐ＜０．０１−０．００１）と、冠状血管を拡張することと、冠状静脈洞（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｖｅｉｎ  ｓｉｎｕｓ）における酸素含有量を増加すること（投与前の群と比較して、ｐ＜０．０５−０．００１、普通の生理食塩水を用いた対照群と比較して、ｐ＜０．０５−０．００１）と、心筋酸素消費量の指標を減少することと、心筋への血液と酸素との供給を改善することと、左心室の鼓動を増強することなく心臓の拍出量および、心拍１回あたりの拍出量を増加すること（投与前の群と比較して、ｐ＜０．０５−０．０１、普通の生理食塩水を用いた対照群と比較して、ｐ＜０．０５−０．０１）とを引き起こした。
【００３０】
本発明のＴＣＭ調合剤は、心臓の拍動を正常に（ｃａｒｄｉａｃ  ｃｏｍｐｌａｉｓａｎｃｅ）調節する効果を有している。このように本発明のＴＣＭ調合剤は、心臓血管システムを順応させて改善する効果を有している。
【００３１】
４．ウサギの血小板の凝集に対するＴＣＭ調合剤の効果
ボーン比濁計（ｂｏｒｎ  ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｅｒ）を用いて本発明のＴＣＭ調合剤のウサギの血小板の凝集に対する効果を評価した。
【００３２】
結果を以下に示す。ＴＣＭ調合剤を７日間連続で胃内投与することによって、アラキドン酸（ＡＡ）によって誘導される血小板の凝集を顕著に減少させること（蒸留水を用いた対照群と比較してｐ＜０．０５−０．０１）と、コラーゲンによって誘導される血小板の凝集を顕著に減少させること（蒸留水を用いた対照群と比較してｐ＜０．０１）とができる。このことは、本発明のＴＣＭ調合剤が血小板の凝集に対する抑制効果を有していることを示している。
【００３３】
５．ラットの血液粘性と、インビトロでの血栓形成とに対するＴＣＭ調合剤の効果
本発明のＴＣＭ調合剤のラットの血液粘性と、インビトロでの血栓形成とに対する効果を評価した。
【００３４】
結果を以下に示す。ＴＣＭ調合剤を７日間連続で胃内投与することによって、血栓を非常に縮小させること（蒸留水を用いた対照群と比較してｐ＜０．０１）と、血栓の湿潤および乾燥重量を減少させること（蒸留水を用いた対照群と比較してｐ＜０．０５）と、血漿の粘性を減少すること（蒸留水を用いた対照群と比較してｐ＜０．００１）と、種々の剪断速度における血液全体の粘性を減少させること（蒸留水を用いた対照群と比較してｐ＜０．０５）とができる。このことは、本発明に係るＴＣＭ調合剤が、血栓形成を抑制する効果と、血漿および血液全体の粘性を下げる効果とを有していることを示している。
【００３５】
６．ウサギの高脂血症およびアテローム性動脈硬化症に対するＴＣＭ調合剤の効果
高脂血症およびアテローム性動脈硬化症の試験モデルを、ウサギに高濃度のコレステロールを含む飼料を給餌することで作製することができる。本発明のＴＣＭ調合剤のこのモデルに対する効果を評価した。
【００３６】
結果を以下に示す。本発明に係るＴＣＭ調合剤を用いることで、血清中のＴＣ、ＴＧ、ＬＤＬ−ＣおよびＶＬＤＬ−Ｃの濃度を顕著に減少させること、ウサギのＴＣ／ＨＤＬ−Ｃ比を減少させること（高脂血症を患っている対照群と比較してｐ＜０．０５−０．００１）と、ＨＤＬ−Ｃの濃度を顕著に増加すること（高脂血症を患っている対照群と比較してｐ＜０．０５）と、大動脈のＴＣの含有量を減少させること（高脂血症を患っている対照群と比較してｐ＜０．０５）と、肝臓のＴＧの含有量を減少させること（高脂血症を患っている対照群と比較してｐ＜０．０５）と、肝臓のＭＤＡの含有量を減少させること（高脂血症を患っている対照群と比較してｐ＜０．００１）とができる。本発明のＴＣＭ調合剤は肝臓のＳＯＤの活性を改善する顕著な効果を有している（高脂血症を患っている対照群と比較してｐ＜０．０１）。さらに、大動脈のプラークの厚みを薄くすることと、大動脈に形成される泡沫細胞の量を減少すること（高脂血症を患っている対照群と比較してｐ＜０．０５）とができるという顕著な効果を有する。また、上記大動脈のプラークの面積を減少することもできる。これらは、本発明のＴＣＭ調合剤が、血液の脂肪を整える効果があるとともに、脂質の過剰な酸化を防ぎ、動脈硬化を防ぐ確かな効果を有していることを示している。
【００３７】
７．ラットの局所的な脳虚血に対するＴＣＭ調合剤の効果
中脳動脈血栓（ＭＣＡＴ）のあるラットモデルを用いて、本発明のＴＣＭ調合剤の、ＭＣＡＴラットの脳梗塞部位に対する効果を決定した。
【００３８】
本発明に係るＴＣＭ調合剤は、脳虚血を抑制する顕著な効果を有しているという結果を示す。
【００３９】
〔実施形態の詳しい記述〕
図１は、本発明のＴＣＭ調合剤の投与形態の１つである丸薬に含まれるラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエの成分のフィンガー図である。この図において、ピーク１は、ダンシェンスを示し；ピーク２は、プロトカテクアルデヒドを示し；ピーク３は、イソリソスペルミック酸Ａを示し；ピーク４は、イソリソスペルミック酸Ｂを示し；ピーク５は、サルビアノリック酸Ｄを示し；ピーク６は、ロスマリニック酸を示し；ピーク７は、サルビアノリック酸Ｂを示し；ピーク８は、サルビアノリック酸Ａを示す。図２は、本発明のＴＣＭ調合剤のラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエの水溶性成分のＨＰＬＣスペクトルである。この図において、ピーク１は、ダンシェンスを示し；ピーク２は、プロトカテクアルデヒドを示し；ピーク３は、イソリソスペルミック酸Ａを示し；ピーク４は、イソリソスペルミック酸Ｂを示し；ピーク５は、サルビアノリック酸Ｄを示し；ピーク６は、サルビアノリック酸Ｅを示し；ピーク７は、ロスマリニック酸を示し；ピーク８は、サルビアノリック酸Ｂを示し；ピーク９は、サルビアノリック酸Ｇを示し、；ピーク１０は、サルビアノリック酸Ａを示す。図３は、本発明のＴＣＭ調合剤のラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエの水溶性成分のＭＳ−ＴＩＣスペクトルである。図４は、本発明のＴＣＭ調合剤のラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエの脂溶性成分のＨＰＬＣスペクトルである。この図において、ピーク１は、タンシロンＩを示し；ピーク２は、タンシロンＩＩＡを示す。図５は、本発明のＴＣＭ調合剤のラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエの脂溶性成分のＭＳ−ＴＩＣスペクトルである。図６は、本発明のＴＣＭ調合剤のラディックス・ノトギンセンの成分のＭＳ−ＴＩＣスペクトルである。
【００４０】
本発明は、下記の実施例を参照することでさらに詳しく説明される。当該実施例は説明の目的のために挙げられているものであって、本発明の範囲を限定することを意図しているわけではない。
【００４１】
〔実施例〕
＜実施例１−調製例＞
４１．６ｇのラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエと８．０３ｇのラディックス・ノトギンセンとを秤量し、上記医薬材料の全重量に対して１．８％の量の炭酸水素ナトリウムを加えた。その結果生じた混合物を、４倍の水で２時間煮沸し、その後、３倍の水で、さらに１時間煮沸した。ろ過した後、ろ液を合わせて、１．１９〜１．２０（７５±１℃）の比重になるまで濃縮した。それから、エタノール（２０℃）の含有量が６５％になるまで９５％エタノールを加えた。続いて、上記混合物を１２時間放置し、上清を分離した。当該上清よりエタノールを回収し、比重が１．３７（５５〜６０℃）になるまで、ラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエ−ラディックス・ノトギンセン抽出物である残渣を濃縮した。
【００４２】
その後、上記抽出物を、０．４６ｇのボルネオールと、１８ｇのポリエチレングリコール−６０００とで均一になるよう混合した。その混合物を８５℃で８０分間溶かした。それから、溶けた液体を当該液体が８℃の流動パラフィンに滴下される丸薬製造装置の８６℃に温度が維持されているドロッピングタンクに入れた。得られた丸薬を取り出して、油分を除去し、それから所望の調合を得るために篩を通して選別した。
【００４３】
＜実施例２−調製例＞
５９．３６ｇのラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエと６．３８ｇのラディックス・ノトギンセンとを秤量し、上記医薬材料の全重量に対して１．０％の量の炭酸カリウムを加えた。その結果生じた混合物を、４倍の水で２．５時間煮沸し、その後、３倍の水で、さらに１．５時間煮沸した。ろ過した後、ろ液を合わせて、１．１９〜１．２０（７５±１℃）の比重になるまで濃縮した。それから、エタノール（２０℃）の含有量が７０％になるまで８５％エタノールを加えた。続いて、上記混合物を１０時間放置し、上清を分離した。当該上清よりエタノールを回収し、比重が１．３５（５５〜６０℃）になるまで、ラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエ−ラディックス・ノトギンセン抽出物である残渣を濃縮した。
【００４４】
その後、上記抽出物を、０．３４ｇのボルネオールと、２３ｇのポリエチレングリコール−６０００とで均一になるよう混合した。その混合物を８９℃で１００分間溶かした。それから、溶けた液体を当該液体が８℃のメチルシリコンオイルに滴下される丸薬製造装置の８６℃に温度が維持されているドロッピングタンクに入れた。得られた丸薬を取り出して、油分を除去し、それから所望の調合を得るために篩を通して選別した。
【００４５】
＜実施例３−調製例＞
１２．６０ｇのラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエと５６．１５ｇのラディックス・ノトギンセンとを秤量し、上記医薬材料の全重量に対して１．０％の量の炭酸水素カリウムを加えた。その結果生じた混合物を、４倍の水で２．５時間煮沸し、その後、３倍の水で、さらに１．５時間煮沸した。ろ過した後、ろ液を合わせて、１．１９〜１．２０（７５±１℃）の比重になるまで濃縮した。それから、エタノール（２０℃）の含有量が７０％になるまで９５％エタノールを加えた。続いて、上記混合物を１０時間放置し、上清を分離した。当該上清よりエタノールを回収し、比重が１．３５（５５〜６０℃）になるまで、ラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエ−ラディックス・ノトギンセン抽出物である残渣を濃縮した。
【００４６】
その後、上記抽出物を、０．３４ｇのボルネオールと、２３ｇのポリエチレングリコール−６０００とで均一になるよう混合した。その混合物を８９℃で１００分間溶かした。それから、溶けた液体を当該液体が８℃のメチルシリコンオイルに滴下される丸薬製造装置の８５℃に温度が維持されているドロッピングタンクに入れた。得られた丸薬を取り出して、油分を除去し、それから所望の調合剤を得るために篩を通して選別した。
【００４７】
＜実施例４−調製例＞
３１．１２ｇのラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエと９．２１ｇのラディックス・ノトギンセンとを秤量し、上記医薬材料の全重量に対して０．５％の量の水酸化ナトリウムを加えた。その結果生じた混合物を、４倍の水で１．５時間煮沸し、その後、３倍の水で、さらに１．５時間煮沸した。ろ過した後、ろ液を合わせて、１．１９〜１．２０（７５±１℃）の比重になるまで濃縮した。それから、エタノール（２０℃）の含有量が６６％になるまで８８％エタノールを加えた。続いて、上記混合物を１０時間放置し、上清を分離した。当該上清よりエタノールを回収し、比重が１．４０（５５〜６０℃）になるまで、ラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエ−ラディックス・ノトギンセン抽出物である残渣を濃縮した。
【００４８】
その後、上記抽出物を、０．５０ｇのボルネオールと、９０ｇのマンニトールと、１５ｇのエデト酸カルシウムナトリウム（ｃａｌｃｉｕｍｅｄｅｔａｔｅ  ｓｏｄｉｕｍ）と、１５ｍｌの蒸留水を加えて均一になるよう混合した。その結果生じた混合物を凍結乾燥し、最終的に注射用の粉末にした。
【００４９】
＜実施例５−調製例＞
１１６．３５ｇのラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエと５８．２１ｇのラディックス・ノトギンセンとを秤量し、上記医薬材料の全重量に対して２．０％の量の炭酸水素ナトリウムを加えた。その結果生じた混合物を、４倍の水で２時間煮沸し、その後、３倍の水で、さらに１．５時間煮沸した。ろ過した後、ろ液を合わせて、１．１９〜１．２０（７５±１℃）の比重になるまで濃縮した。それから、エタノール（２０℃）の含有量が６６％になるまで８８％エタノールを加えた。続いて、上記混合物を１０時間放置し、上清を分離した。当該上清よりエタノールを回収し、比重が１．４０（５５〜６０℃）になるまで、ラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエ−ラディックス・ノトギンセン抽出物である残渣を濃縮した。
【００５０】
その後、上記抽出物に、１．８０ｇのリグナム・ダルベルギアエ・オドリフェラエのオイルと、４０ｇの微結晶性セルロースとを加えて均一になるように混合した。凝集体を軟らかくするために３％ポリビドン・エタノール溶液を加えた。それから、軟化した当該凝集体を１８のサイズのメッシュを通して篩にかけて顆粒状にした。当該顆粒を、６０℃で３５分間乾燥し形を整えてから、４ｇの滑石粉（ｔａｌｃｕｍ  ｐｏｗｄｅｒ）を加えて均一に混合した。得られた混合物を、所望の調合剤を得るためにカプセルに包んだ。
【００５１】
＜実施例６−調製例＞
１１６．３５ｇのラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエと５８．２１ｇのラディックス・ノトギンセンとを秤量し、上記医薬材料の全重量に対して２．０％の量の炭酸水素ナトリウムを加えた。その結果生じた混合物を、４倍の水で２時間煮沸し、その後、３倍の水で、さらに１．５時間煮沸した。ろ過した後、ろ液を合わせて、１．１９〜１．２０（７５±１℃）の比重になるまで濃縮した。それから、エタノール（２０℃）の含有量が６６％になるまで８８％エタノールを加えた。続いて、上記混合物を１０時間放置し、上清を分離した。当該上清よりエタノールを回収し、比重が１．４０（５５〜６０℃）になるまで、ラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエ−ラディックス・ノトギンセン抽出物である残渣を濃縮した。
【００５２】
その後、上記抽出物に、０．９ｇのボルネオールと、１２０ｇの微結晶性セルロースと、４０ｇのヒドロキシメチルセルロースと、５ｇのキシリトールと、２ｇのステアリン酸マグネシウムとを加えて均一になるように混合した。得られた混合物を圧縮して錠剤にし、所望の調合剤を得た。
【００５３】
＜実施例７−調製例＞
１４０．３５ｇのラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエと３６．４２ｇのラディックス・ノトギンセンとを秤量し、上記医薬材料の全重量に対して２．５％の量の炭酸水素ナトリウムを加えた。その結果生じた混合物を、４倍の水で２時間煮沸し、その後、３倍の水で、さらに１．５時間煮沸した。ろ過した後、ろ液を合わせて、１．１９〜１．２０（７５±１℃）の比重になるまで濃縮した。それから、エタノール（２０℃）の含有量が６５％になるまで９０％エタノールを加えた。続いて、上記混合物を８時間放置し、上清を分離した。当該上清よりエタノールを回収し、比重が１．３５（５５〜６０℃）になるまで、ラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエ−ラディックス・ノトギンセン抽出物である残渣を濃縮した。
【００５４】
その後、上記抽出物に、１．００ｇのボルネオールと、４６ｇの微結晶性セルロースとを加えて均一になるように混合した。凝集体を軟らかくするために３％ポリビドン・エタノール溶液を加えた。それから、軟化した当該凝集体を１８のサイズのメッシュを通して篩にかけて顆粒状にした。当該顆粒を、６０℃で３０分間乾燥し形を整えてから、４ｇの滑石粉（ｔａｌｃｕｍ  ｐｏｗｄｅｒ）を加えて均一に混合した。得られた混合物を圧縮して錠剤にし所望の調合剤を得た。
【００５５】
＜実施例８−活性成分の検出例＞
１．サンプルの調製
（１）本発明のＴＣＭ調合剤におけるラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエの水溶性成分
実施例１、２および３のＴＣＭ丸薬と、実施例４のＴＣＭ注射用の粉末と、実施例５のＴＣＭカプセルと、実施例６のＴＣＭ経口錠剤分解物質と、実施例７のＴＣＭ錠剤とを各々１４８．４ｍｇ秤量した。上記調合剤を、１５分間超音波処理を行って６ｍｌの水に溶かした。それから、０．４５μｍのナイロンフィルムを通してろ過し、それぞれ黄色のサンプル溶液を得た。
【００５６】
（２）本現在のＴＣＭ調合剤におけるラディックス・ノトギンセンの成分と、ラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエの脂溶性成分
実施例１、２および３のＴＣＭ丸薬と、実施例４のＴＣＭ注射用の粉末と、実施例５のＴＣＭカプセルと、実施例６のＴＣＭ経口錠剤分解物質と、実施例７のＴＣＭ錠剤とを各々１００３．８ｍｇ秤量した。上記調合剤を、１５分間超音波処理を行って１０ｍｌの４％アンモニア水溶液に溶かした。それから、０．４５μｍのナイロンフィルムを通してろ過し、ろ過物をエクストラクト−クリーンＣ１８（Ａｌｌｔｅｃｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ，  Ｕ．Ｓ．社製）カラムで前処理を行った。当該カラム内にロードされているこのサンプルは、１０ｍｌの水で洗浄し、それから２ｍｌのメタノールで溶出することで、それぞれ黄色溶出物としての試験サンプルを得た。
【００５７】
２．サンプルの分析
（１）機器と試薬
アギレント・シリーズ−１１００・液体クロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ）；Ｇ１３１５Ａ  ダイオードアレー検出器；Ｇ１３１３Ａ  自動サンプル注入機；Ｇ１３１６Ａ  恒温器；Ｇ１３２２Ａ  脱気および複式ポンプ；ＨＰ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｗｏｒｋ  Ｓｔａｔｉｏｎ
Ｇ２４４８Ａ型・シリーズ−１１００・ＬＣ−ＭＳＤ／ｔｒａｐ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｇｒａｐｈ  （Ｂｒｕｋｅｒ）；電気スプレイ（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｓｐｒａｙ）法を用いてイオン化が、行われる。；Ｅｘｔｒａｃｔ−Ｃｌｅａｑｎ  Ｃ１８カラム  （１００ｍｇ／ｍｌ，  Ａｌｌｔｅｃｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ，  Ｕ．Ｓ．）、クロマトグラフィーに用いることができるほど純度の高いアセトニトリル  （ＴＥＤＩＡ）、再蒸留水、分析に用いることができるほど純度の高い酢酸。
【００５８】
（２）機器の検出条件
Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ１８クロマトグラフィーカラム（５μｍ、４．６ｍｍ×２５ｃｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ、ＳＮ：ＵＳＣＬ００９２９６）はＨＰＬＣ分析に用いた。各サンプルの濃度勾配溶出と質量スペクトル検出は下記の条件で行った。
【００５９】
１、各実施例からのＴＣＭ調合剤におけるラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエの水溶性成分
ＨＰＬＣ溶出条件：
【００６０】
【表２】
0005567763.tif 000005
【００６１】
ＭＳ分析条件：
【００６２】
【表３】
0005567763.tif 000006
【００６３】
２、各実施例からのＴＣＭの調合剤におけるラディックス・ノトギンセンの成分
ＨＰＬＣ溶出条件：
【００６４】
【表４】
0005567763.tif 000007
【００６５】
ＭＳ分析条件：
【００６６】
【表５】
0005567763.tif 000008
【００６７】
３、分析結果とピークの同定
成分は、次の２つの側面から同定した：（１）対照サンプルを用いること；（２）ＵＶ吸収の性質とＭＳｎによるイオン断片の情報とを文献データと照らし合わせて用いること。
【００６８】
４、同定結果
（１）本発明の各実施例からのラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエ調合剤におけるラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエの水溶性成分（表１および２と図２および３参照）。
【００６９】
【表６】
0005567763.tif 000009
【００７０】
【表７】
0005567763.tif 000010
【００７１】
ＭＳｎの結果によれば、第２と第３とのピークはリソスペルミック酸（ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｉｃ  ａｃｉｄ）の構造と非常に類似していることが分かる。しかしながら、ＵＶ吸収に関していえば、それらは、リソスペルミック酸とは相当異なるものである。リソスペルミック酸は、フェニルクマラン骨格（ｐｈｅｎｙｌ  ｃｏｕｍａｒａｎ  ｂａｃｋｂｏｎｅ）を含んでいるので、２５３ｎｍ近傍に強い吸収を持っているが、一方、上記第２と第３とのピークには、そのような吸収特性がない。これらピークの両方は、サルビアノリック酸Ｅに非常に類似したＵＶ吸収をもっている。そのことは、これら２つのピークに対応する化合物は、サルビアノリック酸Ｅと同じ骨格、すなわち、カルボキシルジフェニルエチレン骨格、を有しているであろうことを示している。それによって、それらは成分のために上記構造式で示されたイソリソスペルミック酸ＡとＢとの構造と同じを有していると結論付けることができる。これら２つの構造は、まったく報告されておらず、それ故、ここではイソリソスペルミック酸ＡとＢと名づけた。
【００７２】
（２）本発明のＴＣＭ調合剤に含まれているラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエの脂溶性成分。
【００７３】
【表８】
0005567763.tif 000011
【００７４】
（３）本発明のラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエの丸薬に含まれているラディックス・ノトギンセンの成分。
【００７５】
【表９】
0005567763.tif 000012
【００７６】
【表１０】
0005567763.tif 000013
【００７７】
上記研究に基づいて、本発明のＴＣＭ調合剤に対しての溶出工程と分析方法とを確立した。なお、上記抽出工程と分析方法とは以下を含む。
【００７８】
（１）ラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエの丸薬から、ノトギンセノシド（Ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ）成分とラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエ脂溶性成分を溶出する固相工程；
（２）各サンプルに対してＨＰＬＣ−ＭＳ分析を行う方法。
【００７９】
総計で、ラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエから１２の成分と、ラディックス・ノトギンセンから２１のサポニン成分とが同定された。それらの中で、ラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエの４の水溶性成分と、ラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエの２の脂溶性成分と、サポニンの９の成分とは、対照サンプルと比較することで同定された。一方、その他の成分は、主に、ＭＳｎデータの分析と文献からのデータの比較に基づいて同定された。
【００８０】
＜実施例９（ＴＣＭ調合剤に含まれるラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエの成分に対するフィンガープリント図解の検出例）＞
１．機器と試薬
機器：クウォッド−ポンプ（ｑｕａｄ−ｐｕｍｐ）とオンライン脱気システムと、自動サンプル注入機と、ＤＡＤ検出器と、カラム温度タンクと、ケムステーション・ワーク・ステーションとを備えるＡｇｉｌｅｎｔ  １１００液体クロマトグラフ、ＢＳ２１０Ｓ電子天秤（１／１０−４ｇ）（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ＭＥＴＴＬＥＲ  ＡＥ２４０電子天秤（１／１０−４ｇまたは１／１０−５ｇ）（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，上海）、ＬＤ４−２遠心機（４０００ｒ／分）（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  Ｆａｃｔｏｒｙ）、デジタル・サーモスタティック・水浴ポット（Ｄｉｇｉｔａｌ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｔｉｃ  ｗａｔｅｒ−ｂａｔｈ  ｋｅｔｔｌｅ）（Ｔｉａｎｊｉｎｇ  Ｃｈａｎｇｆｅｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＲＥ−５２ＡＡロータリーエバポレーター（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｙａｒｏｎｇ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒｙ）、ＳＨＥ−（ＩＩＩ）水循環吸引ポンプ（Ｇｏｎｇｙｉ  Ｙｉｎｇｙｕｙｕｈｕａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒｙ）、ＫＱ−２５０Ｂ超音波クレンザー（Ｋｕｎｓｈａｎ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＨＥＮＧＡＯ  Ｔ＆Ｄフィルター（ＨＥＮＧＡＯ  Ｔ＆Ｄ）、合成ファイバーメンブレンフィルター（ａｐｅｒｔｕｒｅ  ０．４５μｍ）（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｘｉｎｇｙａ  Ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ）。
【００８１】
試薬：アセトニトリル（クロマトグラフィーに用いることができるほど純度、Ｍｅｒｃｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ  ＵＳ）アセトニトリル、リン酸（最上級）、ワハハ（Ｗａｈａｈａ）純水。
【００８２】
２．試験サンプルの調製
実施例１の各バッチからＴＣＭ調合剤の１０ピルを正確に秤量し、その後、１０ｍｌの計量瓶に移した。１５分間の超音波攪拌によってピルが溶けるのに十分な量の蒸留水を加えた。その後、さらに１０ｍｌとなるように蒸留水を加えた。得られた溶液を遠心し、または、ろ過を行いサンプル溶液を得た。
【００８３】
３．ＨＰＬＣ分析条件
Ａｇｉｌｅｎｔ  ＺｏＲＢＡｘ  ＳＢ−Ｃ１８  （４．６×２５０μｍ，  ５μｍ）クロマトグラフィーカラム；移動相：０．０２％リン酸水溶液である移動相Ａ、８０％アセロニトリル−０．０２％リン酸水溶液である移動相Ｂ；流速：１．０００ｍｌ／分；検出波長：２８０ｎｍ、カラム温度３０℃；注入サンプル体積：１０μｌ。
【００８４】
移動相の溶出勾配：
【００８５】
【表１１】
0005567763.tif 000014
【００８６】
４．検出結果
表７参照のこと。
【００８７】
【表１２】
0005567763.tif 000015
【００８８】
表７は８ピークの相対的な位置と面積比（持続時間とピーク面積）とを示し、３ピークは、総ピーク面積に対する単一ピーク面積の割合が１０％よりも大きく、８ピーク全ては、総ピーク面積に対する単一ピーク面積の割合が２％よりも大きい。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】本発明のＴＣＭ調合剤の投与形態の１つである丸薬に含まれるラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエの成分のフィンガー図である。この図において、ピーク１は、ダンシェンスを示し；ピーク２は、プロトカテクアルデヒドを示し；ピーク３は、イソリソスペルミック酸Ａを示し；ピーク４は、イソリソスペルミック酸Ｂを示し；ピーク５は、サルビアノリック酸Ｄを示し；ピーク６は、ロスマリニック酸を示し；ピーク７は、サルビアノリック酸Ｂを示し；ピーク８は、サルビアノリック酸Ａを示す。
【図２】本発明のＴＣＭ調合剤のラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエの水溶性成分のＨＰＬＣスペクトルである。この図において、ピーク１は、ダンシェンスを示し；ピーク２は、プロトカテクアルデヒドを示し；ピーク３は、イソリソスペルミック酸Ａを示し；ピーク４は、イソリソスペルミック酸Ｂを示し；ピーク５は、サルビアノリック酸Ｄを示し；ピーク６は、サルビアノリック酸Ｅを示し；ピーク７は、ロスマリニック酸を示し；ピーク８は、サルビアノリック酸Ｂを示し；ピーク９は、サルビアノリック酸Ｇを示し、；ピーク１０は、サルビアノリック酸Ａを示す。
【図３】本発明に係るＴＣＭ調合剤のラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエの水溶性成分のＭＳ−ＴＩＣスペクトルである。
【図４】本発明のＴＣＭ調合剤のラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエの脂溶性成分のＨＰＬＣスペクトルである。この図において、ピーク１は、タンシロンＩを示し；ピーク２は、タンシロンＩＩＡを示す。
【図５】本発明のＴＣＭ調合剤のラディックス・サルビアエ・ミルチオルヒザエの脂溶性成分のＭＳ−ＴＩＣスペクトルである。
【図６】本発明のＴＣＭ調合剤のラディックス・ノトギンセンの成分のＭＳ−ＴＩＣスペクトルである。
【図１】
0005567763.tif 000016
【図２】
0005567763.tif 000017
【図３】
0005567763.tif 000018
【図４】
0005567763.tif 000019
【図５】
0005567763.tif 000020
【図６】
0005567763.tif 000021