(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする患者において、血糖管理を維持するシステムであって、
グルコース結合部分に結合するグルコースの量およびｐＨに関連する光学的シグナルを即時に発生するように構成された、蛍光色素体とグルコース結合部分を含む化学的指示システムを含む、患者の体内に配置されるように構成された光学的グルコースセンサーと、
該グルコースセンサーに操作可能的に連結され、光学的シグナルを検知し、光学的シグナルから血液グルコース濃度を計算し、計算された血液グルコース濃度を表示するように構成されたモニターと、
表示された血液グルコース濃度が所定の濃度範囲外に変化する場合に、血液グルコース調節剤を投与するための送達装置と
を含み、
該送達装置は、血液グルコース濃度を所定の濃度範囲内に戻すのに十分な量の血液グルコース調節剤を送達し、それにより血糖管理を維持するように構成されているシステム。
【請求項２】
該モニターは、さらに、血液グルコース濃度が所定の濃度範囲外に変化する場合、可視警報、可聴警報、または、その両方を発生するように構成されている請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
該モニターは、さらに、血液グルコース濃度が所定の濃度範囲外に変化する前に、血液グルコース調節剤を血液グルコース濃度の上昇または低下の傾向を反転するのに十分な量で投与できるように、血液グルコース濃度における変化の速度および方向を決定し、表示するように構成されている請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
該モニターは、さらに、血液グルコース濃度の変化の速度が所定の値を超えた場合、警報を発生するように構成されている請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
該所定の濃度範囲は、約６０〜約１３０ｍｇ／ｄｌグルコースである請求項１〜４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項６】
該所定の濃度範囲は、約８０〜約１１０ｍｇ／ｄｌである請求項１〜５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項７】
該血液グルコース調節剤は、インシュリン、グルコース、またはそれらの類似体または誘導体である請求項１〜６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項８】
該蛍光色素体は、蛍光色素、有機金属化合物、金属キレート、蛍光共役ポリマー、量子ドットまたはナノ粒子、および上記のものの組み合わせから成る群より選択される請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
該蛍光色素は、約４００ｎｍ以上の波長の光によって励起できる請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
該蛍光色素は、光酸化、加水分解および生分解に対して安定である請求項８または９に記載のシステム。
【請求項１１】
該蛍光色素はＨＰＴＳ−ＴｒｉＣｙｓＭＡを含む請求項８に記載のシステム。
【請求項１２】
該グルコース結合部分は３，３’−ｏＢＢＶを含む請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
該蛍光色素体および該グルコース結合部分は、半透膜中に固定されている請求項１に記載のシステム。
【請求項１４】
該蛍光色素体および該グルコース結合部分は、ヒドロゲルマトリックス中に固定されている請求項１に記載のシステム。
【請求項１５】
該グルコースセンサーは光ファイバーを含む請求項１に記載のシステム。
【請求項１６】
さらに、光源を含む請求項１に記載のシステム。
【請求項１７】
グルコースのグルコース結合部分への結合は、血液グルコース濃度に関連した蛍光寿命の変化を引き起こす請求項１〜１６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１８】
該化学的指示システムは、さらに、グルコース結合部分に結合するグルコースの量および血液ｐＨに関連する光学的シグナルを即時に同時に発生するように構成されている請求項１〜１６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１９】
該モニターは、さらに、血液グルコース濃度を表示する前に、血液ｐＨの変化に合わせて血液グルコース濃度を補正するように構成されている請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
それを必要とする患者において、血糖管理を維持するシステムであって、
光ファイバーの遠位端部分に沿って配置された指示システムを含み、血液グルコース濃度と血液ｐＨとを同時に測定できるグルコースセンサーを含み、
該指示システムは、ｐＨによって少なくとも第１および第２の異なる形態で存在し、この異なる形態は各々の第１および第２の発光に基づいて識別できる蛍光色素と、蛍光色素に操作可能的に結合したグルコース結合部分とを含み、
グルコース結合は、蛍光発光強度または蛍光発光寿命の光学的変化を引き起こし、この光学的変化は血液グルコース濃度に関連したものであり、
第１および第２の発光の比率は血液グルコース濃度に依存しないものであり、
該グルコースセンサーに操作可能的に連結され、発光シグナルをモニターし、光学的変化に基づいて血液グルコース濃度を決定し、酸型および塩基型の発光の比率に基づいて血液ｐＨを決定し、血液ｐＨの変化に合わせて血液グルコース濃度を即時に補正するように構成された制御装置を含むシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２００７年１１月２１日出願の米国仮特許出願第６０／９８９，７３２号の利益を主張するものであり、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれ、本明細書の一部と考えられなければならない。本出願は２００７年２月６日出願の米国特許出願第１１／６７１，８８０号に関連し、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれ、本明細書の一部と考えられなければならない。
【０００２】
本発明の実施形態は被分析物センサーに関する。特に、本発明のある実施形態は、厳密な血糖管理を達成するための非消費的血管内グルコースセンサーの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
特定のタイプの多発性神経障害は、数日から数週間にわたって集中治療室（これ以降ＩＣＵとも称する）内で、種々の一次損傷または疾患のために治療される患者において発症する。この多発性神経障害は、「重症疾患多発性神経障害」（これ以降ＣＩＰＮＰとも称する）として知られ、全身性炎症性応答症候群（ＳＩＲＳ）に罹患する患者の約７０％で発症する（Ｚｏｃｈｏｄｎｅ  ＤＷら、１９８７年、Ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｉｌｌｎｅｓｓ：  ａ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｐｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｒｇａｎ  ｆａｉｌｕｒｅ．Ｂｒａｉｎ、１１０巻：８１９〜８４２頁（非特許文献１））；（Ｌｅｉｊｔｅｎ  ＦＳＳおよびＤｅ  Ｗｅｅｒｄｔ  ＡＷ、１９９４年、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｉｌｌｎｅｓｓ  ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ，  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ、９６巻：１０〜１９頁（非特許文献２））。しかしながら、臨床上の兆候がしばしば見られず、世界的に多くのＩＣＵにおいて症状が肉眼で発見できないという問題がある。いずれにせよ、そのために患者の人工呼吸器を外すことがしばしば困難となり、急性疾患を治療および治癒した後のリハビリテーションの問題につながるため、多発性神経障害は重要な病型である。
【０００４】
ＣＩＰＮＰがかなり重症である場合、四肢衰弱および腱反射の低下を引き起こす。感覚障害が後発するが、ＩＣＵ患者で検査するのは困難である。診断をするためには電気生理学的検査（ＥＭＧ）が必要である（Ｂｏｌｔｏｎ  ＣＦ．、１９９９年、Ａｃｕｔｅ  Ｗｅａｋｎｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ；Ｗｅｂｂ  ＡＲ、Ｓｈａｐｉｒｏ  ＭＪ、Ｓｉｎｇｅｒ  Ｍ、Ｓｕｔｅｒ  ＰＭ編；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  英国；４９０〜４９５頁（非特許文献３））。この検査は、最初に運動神経線維、次いで感覚神経線維の初期の軸索変性を明らかにするものである。横隔神経が多くの場合関係している。急性および慢性の脱神経が、この症状の筋肉バイオプシーで確認されている。基礎症状（敗血症もしくはＳＩＲＳ）を成功裏に治療できるのであれば、ＣＩＰＮＰからの回復および／または予防を期待できる。これは、軽症の場合で数週間、より重症の場合で数ヶ月以内に起こるものである。換言すれば、ＣＩＰＮＰが存在すると、人工呼吸器の取り外し、およびリハビリテーションが数週間または数ヶ月遅れることがある。
【０００５】
このタイプの神経障害の病態生理学は明らかにされていない（Ｂｏｌｔｏｎ  ＣＦ、１９９６年、Ｓｅｐｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：  ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ．Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２４巻：１４０８〜１４１６頁（非特許文献４））。敗血症およびそのメディエーターに直接関連していることが推測されている。実際、敗血症で放出されるサイトカインは、微小血管の透過性を増大させる場合があるヒスタミン様特性を有する。結果として生じる神経内浮腫は低酸素症を誘発し、重篤なエネルギー不足、これによる初期の軸索変性に至る場合がある。あるいは、サイトカインがニューロンに対して直接的な細胞毒性効果を有する場合があることが示唆されている。微小循環の障害に寄与するファクターは、神経筋阻害剤およびステロイドの使用である。更に、毒性およびＣＩＰＮＰの誘導におけるアミノグルコシドの役割が示唆されている。しかしながら、ＣＩＰＮＰの発症機序の真の原因となるファクターについては、これらの機構の何れについても統計的証拠が依然として存在していない。
【０００６】
重篤な疾患の多発性神経障害は、３人の異なる研究者、一人はカナダ人、一人はアメリカ人、一人はフランス人により１９８５年に初めて報告されたが、重篤疾患の多発性神経障害を予防または食い止めるための効果的な治療は今日まで存在しない。
【０００７】
とりわけ重篤疾患の患者の治療実務の現行標準は、今日まで、良好な臨床上のＩＣＵ実務の状況において血液グルコースレベルが２５０ｍｇ／ｄＬまたはそれ以上まで増加することが許容されるものであった。この許容的な態勢の理由は、高レベルの血液グルコースが適応ストレス応答の役割を果たし、よって、過度に上昇しないのであれば治療の必要はないという考えからである（Ｍｉｚｏｃｋ  ＢＡ．、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ、１９９５年；９８巻：７５〜８４頁（非特許文献５））。また、ストレスの間の相対的低血糖症は、免疫系および治癒に対して潜在的に有害であると考えられている（Ｍｉｚｏｃｋ  ＢＡ．、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ、１９９５年；９８巻：７５〜８４頁（非特許文献５））。
【０００８】
Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈｅ、米国特許出願公開第２００２／０１０７１７８号明細書（特許文献１）には、血液グルコース制御器による集中治療を行って前記重篤疾患の際にグルコース代謝を厳密に制御することで、例えば、インシュリン治療で、血液グルコースレベルを、下限は約６０、約７０または約８０ｍｇ／ｄＬと選択でき、上限は約１１０、約１２０または約１３０ｍｇ／ｄＬと選択できる範囲、より具体的には正常範囲（即ち、約８０〜約１１０ｍｇ／ｄＬ）に固定することにより、患者の重篤な疾患および／またはＣＩＰＮＰを少なくともある程度まで予防、治療または治癒できることが開示されている。当業者、例えば医師は、使用する上限および下限を正確に決定できるはずである。あるいは、その範囲は、約６０〜約１３０、好ましくは約７０〜約１２０、より好ましくは約８０〜約１１０ｍｇ／ｄＬである。
【０００９】
残念ながら、ＩＣＵ患者における厳密な血糖管理の恩恵にも関わらず、一つには正確な即時応答の留置グルコースセンサーで入手可能なものが存在していないために、実施が困難であった。その結果として、従来の体外での血液グルコースモニタリングのために頻繁に採血を行うことが、患者およびＩＣＵスタッフの著しい負担であった。
【００１０】
体液中のポリヒドロキシル化合物（例えば、グルコース）濃度を測定するために、平衡化学を使用する努力が長年にわたり継続してなされている。例えば、ボロン酸基を伴う色素を使用する蛍光によりグルコースを検出する幾つかの試みがなされてきた。ボロン酸部分はグルコースと可逆的に結合する。ボロン酸で機能化された蛍光色素がグルコースに結合すると、色素の特性が影響を受け、グルコース濃度に依存する信号が発生および検出される。
【００１１】
Ｒｕｓｓｅｌｌ（米国特許第５，１３７，８３３号明細書（特許文献２）および米国特許第５，５１２，２４６号明細書（特許文献３））は、グルコースに結合し、グルコース濃度に依存する信号を発生するボロン酸で機能化された色素を使用した。Ｊａｍｅｓら（米国特許第５，５０３，７７０号明細書（特許文献４））は、同じ原理を用いたが、単一の複合体において、蛍光色素、アミン消光機能およびボロン酸を組み合わせた。複合体からの蛍光発光は、結合しているグルコースの量により変化した。Ｖａｎ  Ａｎｔｗｅｒｐら（米国特許第６，００２，９５４号明細書（特許文献５）および米国特許第６，０１１，９８４号明細書（特許文献６））は、先に引用した文献の特徴を組み合わせ、埋め込み可能であるという装置も開示した。また、Ａ．Ｅ．Ｃｏｌｖｉｎ，Ｊｒ．（米国特許第６，３０４，７６６号明細書（特許文献７））も、ボロン酸機能化色素を用いた、ヒトにおける生体内検知用の光学的検知装置を開示した。しかしながら、その努力にも関わらず、生体内モニタリングのための実用的な血管内システムは開発されておらず、商業化されていない。
【００１２】
ｐＨおよびＯ２、ＣＯ２、Ｎａ＋、Ｋ＋およびグルコースなどのポリヒドロキシル化合物の濃度などの血液または体液を使用して測定可能な、ある種のパラメータが生体内で決定されている。患者をモニターする際には、そのような被分析物を頻繁に決定する必要があるため、これらの生体内測定を行えることは重要である。多くの場合、センサーは被分析物に特異的であり、従って、数種類の被分析物を測定するには複数のセンサーが必要となることがあり、これは患者に不便をもたらし、電子モニタリング機器を更に複雑にする場合がある。
【００１３】
生体内モニタリングには物理的な大きさが制約されるために引き起こされる設計上の問題を解決しようとして、他者は、２種類のパラメータを同時に読み込むために、異なる色素を１つの装置に組み込んできた。例えば、Ａｌｄｅｒら（米国特許第５，９２２，６１２号明細書（特許文献８））は、１つのセンサー上の２種類の異なる色素を使用して、水性試料のｐＨおよびイオン強度を光学的に決定する方法を開示した。Ｇｒａｙら（米国特許第５，１７６，８８２号明細書（特許文献９））は、ｐＨと併せて被分析物の濃度を測定するために、固定化ｐＨ感受性色素およびカリウムまたはカルシウム感受性蛍光色素を親水性ポリマーに組み込んだファイバー光学装置の使用を開示した。米国特許第４，７８５，８１４号明細書（特許文献１０）において、Ｋａｎｅも、血液中のｐＨおよび酸素含有量を同時測定するために、複合材料膜中に組み込まれた２種類の色素を使用することを開示した。しかしながら、単一のセンサーに複数の色素を組み込むことにより、そのようなセンサーの製造は複雑となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２／０１０７１７８号明細書
【特許文献２】米国特許第５，１３７，８３３号明細書
【特許文献３】米国特許第５，５１２，２４６号明細書
【特許文献４】米国特許第５，５０３，７７０号明細書
【特許文献５】米国特許第６，００２，９５４号明細書
【特許文献６】米国特許第６，０１１，９８４号明細書
【特許文献７】米国特許第６，３０４，７６６号明細書
【特許文献８】米国特許第５，９２２，６１２号明細書
【特許文献９】米国特許第５，１７６，８８２号明細書
【特許文献１０】米国特許第４，７８５，８１４号明細書
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｚｏｃｈｏｄｎｅ  ＤＷら  １９８７年  Ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｉｌｌｎｅｓｓ：  ａ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｐｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｒｇａｎ  ｆａｉｌｕｒｅ．Ｂｒａｉｎ、１１０巻：８１９〜８４２頁
【非特許文献２】Ｌｅｉｊｔｅｎ  ＦＳＳおよびＤｅ  Ｗｅｅｒｄｔ  ＡＷ  １９９４年  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｉｌｌｎｅｓｓ  ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ，  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ、９６巻：１０〜１９頁
【非特許文献３】Ｂｏｌｔｏｎ  ＣＦ．１９９９年  Ａｃｕｔｅ  Ｗｅａｋｎｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ；Ｗｅｂｂ  ＡＲ、Ｓｈａｐｉｒｏ  ＭＪ、Ｓｉｎｇｅｒ  Ｍ、Ｓｕｔｅｒ  ＰＭ編；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  英国；４９０〜４９５頁
【非特許文献４】Ｂｏｌｔｏｎ  ＣＦ  １９９６年  Ｓｅｐｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：  ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ．Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２４巻：１４０８〜１４１６頁
【非特許文献５】Ｍｉｚｏｃｋ  ＢＡ．Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  １９９５年；９８巻：７５〜８４頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
特に集中治療の状況においてモニターされる被分析物それぞれのための個別の留置センサー、および、複数色素センサーに伴う前述の問題に加え、多くの色素系被分析物センサーに伴うもう一つの問題はｐＨ感受性である。ｐＨの僅かな変化が指示体の発光を変更または減衰させることがあり、不正確な読み取りを引き起こすことがある。この問題は、血液のｐＨが急速に変動することのある糖尿病の、および糖尿病でないＩＣＵ患者における血液グルコースのレベルをモニターする際に特に深刻である。これらの患者の治療には正確な血液グルコースレベルの測定が不可欠であるため、個別の留置ｐＨおよび被分析物センサー、または複数の色素を有するセンサーを必要とせず、ｐＨの影響を即時に補正できるグルコースセンサーに対する要求が強くある。従って、ＩＣＵの状況にある急性疾患患者が厳密な血糖管理の恩恵を享受するためには、センサーが非消費的に平衡化学を利用し、モニターされ、同時に血液ｐＨの変動のために補正されるグルコースレベルを正確に即時に与える、血管内配置用に構成されたグルコースセンサーに対して重要な、満たされていない要求がある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
厳密な血糖管理を、それを必要とする患者において達成する方法が開示される。該方法は、患者の血管内に平衡グルコースセンサーを配置することと、血液グルコース濃度を表示するモニターに該センサーを連結することと、血液グルコース濃度が所定の濃度範囲外に変化する場合、血液グルコース調節剤を投与することとを含む。血液グルコース調節剤は血液グルコース濃度を所定の濃度範囲内に戻すのに十分な量で投与され、それにより、厳密な血糖管理を達成する。
【００１８】
ある実施形態では、モニターは、血液グルコース濃度における変化の速度および方向を表示する。他の実施形態においては、血液グルコース濃度は上昇または低下の傾向を有しており、血液グルコース調節剤は血液グルコース濃度の上昇または低下の傾向を反転するのに十分な量で投与される。更に他の実施形態においては、血液グルコース濃度が所定の濃度範囲外に変化する場合、または、血液グルコース濃度における変化の速度および方向が所定の範囲外に変化する場合、警報信号を発生する。
【００１９】
所定の濃度範囲は、約６０〜約１８０ｍｇ／ｄｌグルコース、約６０〜約１３０ｍｇ／ｄｌグルコース、または、約８０〜約１１０ｍｇ／ｄｌであることができる。ある実施形態では、血液グルコース調節剤は、グルコース、インシュリン、またはそれらの類似体または誘導体から成る群より選択される。
【００２０】
ある実施形態では、平衡グルコースセンサーは、蛍光色素および被分析物結合部分を含む。蛍光色素および被分析物結合部分は、ヒドロゲルマトリクスに共有結合されていてもよい。蛍光色素および被分析物結合部分は、互いに共有結合されていてもよい。蛍光色素はＨＰＴＳ−ＴｒｉＣｙｓＭＡ色素を含むことができる。
【００２１】
ある実施形態では、被分析物結合部分はボロン酸機能化消光体を含む。ボロン酸機能化消光体は３，３’−ｏＢＢＶ消光体を含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の１つの実施形態の検知機構を示すフローチャートである。
【図２】本発明の１つの実施形態に従い、２個の励起光源および２個の検出器を含むグルコースおよびｐＨセンサー、および光学システムを示す。
【図３】本発明の幾つかの実施形態に従い、異なるｐＨレベルにおけるＨＰＴＳの吸収スペクトルを示す。
【図４】ＨＰＴＳ／ＭＡＢＰ４およびＩ（塩基）／Ｉ（等吸収点）比を使用して、比例的ｐＨ検知はグルコース濃度に依存しないことを示す図である。このデータは、本発明の幾つかの実施形態に従い、種々のグルコース濃度について、４５４ｎｍ（塩基）および４２２ｎｍ（等吸収点）における励起に対応する蛍光発光の比対ｐＨとしてプロットされている。
【図５】本発明の幾つかの実施形態に従い、異なるｐＨレベルについて、４２２ｎｍ（等吸収点）において励起されたＨＰＴＳ／ＭＡＢＰ４のグルコース応答曲線を示す。
【図６】本発明の幾つかの実施形態に従い、溶液中での異なるＰｈレベルにおけるＳＮＡＲＦ−１の吸収スペクトルを示す。
【図７】本発明の幾つかの実施形態に従い、溶液中で、異なるｐＨレベルについて、５１４ｎｍにおいて励起された、５８７ｎｍにおいて発光を有するＳＮＡＲＦ−１／３，３’−ｏＢＢＶのグルコース応答曲線を示す。
【図８】本発明の幾つかの実施形態に従い、溶液中で、異なるｐＨレベルについて、５１４ｎｍにおいて励起された、６２５ｎｍにおいて発光を有するＳＮＡＲＦ−１／３，３’−ｏＢＢＶのグルコース応答曲線を示す。
【図９】本発明の幾つかの実施形態に従い、Ｉ（塩基）／Ｉ（酸）比を使用して、溶液中でＳＮＡＲＦ−１／３，３’−ｏＢＢＶにより異なるグルコース濃度におけるｐＨの比例的検知を示す。
【図１０】本発明の幾つかの実施形態に従い、異なるｐＨレベルにおける、ＨＰＴＳ−ＴｒｉＬｙｓＭＡ／３，３’−ｏＢＢＶを含むＤＭＡＡヒドロゲルのグルコース応答曲線を示す。
【図１１】本発明の幾つかの実施形態に従い、Ｉ（塩基）／Ｉ（酸）比を使用して、ＨＰＴＳ−ＴｒｉＬｙｓＭＡ／３，３’−ｏＢＢＶを含むＤＭＡＡヒドロゲルを使用して、異なるグルコース濃度におけるｐＨの比例的検知を示す。
【図１２】本発明の幾つかの実施形態に従い、Ｉ（塩基）／Ｉ（酸）比を使用して、指示体システムが光ファイバーの末端に固定化されており、ＨＰＴＳ−ＴｒｉＣｙｓＭＡ／３，３’−ｏＢＢＶを含むＤＭＡＡヒドロゲルを使用して、異なるグルコース濃度におけるｐＨの比例的検知を示す。
【図１３】本発明の幾つかの実施形態に従い、蛍光色素体を励起光パルスに曝した後の蛍光強度の経時減衰のグラフを示す。
【図１４】周波数変調された励起信号から生じる発光信号のグラフを示す。
【図１５Ａ】本発明の幾つかの実施形態に従い、蛍光色素体に連結したグルコース結合分子と、受容体に連結したグルコース類似体と、グルコース分子との相互作用を示す。
【図１５Ｂ】本発明の幾つかの実施形態に従い、蛍光色素体に連結したグルコース結合分子と、受容体に連結したグルコース類似体と、グルコース分子との相互作用を示す。
【図１５Ｃ】本発明の幾つかの実施形態に従い、蛍光色素体に連結したグルコース結合分子と、受容体に連結したグルコース類似体と、グルコース分子との相互作用を示す。
【図１６Ａ】Ｍａｄｅｒら、２００７年、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、サンフランシスコによる研究における内科的および外科的ＩＣＵ患者集団の血液グルコース濃度を示す。
【図１６Ｂ】Ｍａｄｅｒら、２００７年、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、サンフランシスコによる研究における内科的および外科的ＩＣＵ患者集団の血液グルコース濃度を示す。
【図１７Ａ】循環血液ループにおける生体外の血液グルコースのＧｌｕＣａｔｈおよびＹＳＩ検出方法の比較を示す。
【図１７Ｂ】循環血液ループにおける生体外の血液グルコースのＧｌｕＣａｔｈおよびＹＳＩ検出方法の比較を示す。
【図１８Ａ】ＳｕｒｅＳｔｅｐ  Ｐｒｏ  Ｆｉｎｇｅｒｓｔｉｃｋのラボ（実験室）対照と、ＧｌｕＣａｔｈ平衡蛍光グルコースセンサーとを比較するＢｌａｎｄ−Ａｌｔｍａｎ差分値プロットを示す。ＧｌｕＣａｔｈセンサーはヒツジの右頸静脈に位置している。
【図１８Ｂ】ＳｕｒｅＳｔｅｐ  Ｐｒｏ  Ｆｉｎｇｅｒｓｔｉｃｋのラボ（実験室）対照と、ＧｌｕＣａｔｈ平衡蛍光グルコースセンサーとを比較するＢｌａｎｄ−Ａｌｔｍａｎ差分値プロットを示す。ＧｌｕＣａｔｈセンサーはヒツジの右頸静脈に位置している。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
好ましい実施形態において、本発明は、単一の指示体システムで２種類の被分析物を測定できる光学的センサーを指向している。好ましいセンサーは、例えば、消光体および蛍光色素体の結合および解離などの平衡過程に応じてグルコース信号が発生する平衡化学を用いる。ある実施形態においては、単一の蛍光色素体（例えば、蛍光色素）を使用して：（１）比例的な方法により、第１の被分析物、例えば、Ｈ＋（ｐＨ）の濃度を決定し、ただし、そのような決定は蛍光色素体の濃度に依存していない、および、（２）見掛けの蛍光色素体濃度（例えば、励起時の蛍光色素体の発光強度）を測定することによって、第２の被分析物、例えば、ポリヒドロキシル化合物（例えば、好ましくは、グルコース）の濃度を決定し、ただし、見掛けの蛍光色素体濃度は第２の被分析物の濃度に依存する。更に、第２の被分析物濃度の測定が第１の被分析物の濃度に依存する場合（例えば、この分野における一般的な問題であるが、グルコースの測定がｐＨによって変化する光学システムにおいて）、本発明の１つの実施形態によれば、測定された第２の被分析物濃度を第１の被分析物濃度の寄与により補正できる。センサーは、好ましくは、水性媒体（例えば、生理学的媒体、血液、間質液など）中で安定であり、更に好ましくは、センサーは、血管中に挿入され、一定期間そこで留置できるよう構成される。よって、本発明の好ましい実施形態によれば、血管内に配置されるように構成された光学的センサーが開示され、このセンサーは単一の指示体システムで２種類の被分析物（好ましくは、ｐＨおよびグルコース）を測定でき、ｐＨの、あらゆる寄与に関してグルコースの測定を補正できる。
【００２４】
センサーの好ましい実施形態は、とりわけ、比例的ｐＨ検知を指向しているが、その濃度が第１の被分析物の濃度と関連し、その発光比が指示体濃度に依存しない少なくとも２つの形態で存在する指示体を指示体システムが含む限り、本発明の更に広い範囲によれば、他の第１の被分析物濃度も決定できる。同様に、本明細書においては、グルコースを第２の被分析物例として用いているが、第２の被分析物に結合する結合部分と操作可能的に連結されている指示体を指示体システムが含み、指示体の信号強度が第２の被分析物の濃度に伴って変化する限り、溶液中の他のポリヒドロキシル含有有機化合物（炭水化物、１，２−ジオール、１，３−ジオールなど）の濃度を本発明の実施形態を使用して決定できると理解される。ある実施形態では、第２の被分析物として非炭水化物が挙げられる。
【００２５】
＜指示体システム＞
指示体は、調べられている媒体中で起きていることについて伝える。指示体システムは、指示体を含む検知システムの特定のタイプである。可動式指示体システムの例はプローブであり、一方、固定式指示体システムはセンサーであることができる。本発明のある実施形態によって使用される指示体システムは、被分析物結合部分と操作可能的に結合される蛍光色素体を含み、被分析物の結合によって蛍光色素体濃度における見掛けの光学的変化（例えば、発光強度）が引き起こされる。更に、比例的ｐＨ検知が可能となるように、蛍光色素体はスペクトル特性において検出可能な差を示す異なる酸形態および塩基形態を有することが望ましい。例えば、ＨＰＴＳ−ＴｒｉＬｙｓＭＡ（下で詳細に記載する）などの蛍光色素と操作可能的に結合される３，３’−ｏＢＢＶ（下で詳細に記載する）などのグルコース結合部分は、蛍光色素の発光強度を消光させ、その消光の程度はグルコースが結合すると低減され、グルコース濃度に関連して発光強度が増大することになる。好ましい実施形態において、指示体システムは、少なくとも２個のアニオン基を有する色素と、少なくとも２個のボロン酸を有する消光体とを含む。更に好ましい実施形態において、指示体システムは、互いに反応（消光）するために検知部分が物理的に十分近いままであるように、検知部分（例えば、色素−消光体）を固定するための手段も含む。生体内検知が望ましいので、そのような固定化手段は好ましくは水性環境（例えば、血管内）において不溶性であり、標的被分析物に対して透過性であり、検知部分に対して非透過性である。典型的には、固定化手段は非水溶性有機ポリマーマトリックスを含む。例えば、ＨＰＴＳ−ＴｒｉＬｙｓＭＡ色素および３，３’−ｏＢＢＶ消光体がＤＭＡＡ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）ヒドロゲルマトリックス（下で詳細に記載する）中に有効に固定され、それによって生体内においてｐＨおよびグルコースを検知することができる。
【００２６】
蛍光色素体、被分析物結合部分および固定化手段の幾つかの実施形態を、下に更に詳細に記載する。蛍光色素体およびボロン酸が付加された消光体を含む指示体システムを下に更に詳細に記載するが、厳密な血糖管理を達成するために血管内で使用される平衡化学の原理を基礎とする他の指示体システムも本発明の範囲内であることを当業者は理解するであろう。
【００２７】
＜蛍光色素体＞
「蛍光色素体」は、特定波長の光を当てると、より長い波長での光を放出する、即ち、それが蛍光発光する物質を指す。蛍光色素体としては、これらに限定されないが、蛍光有機色素、有機金属化合物、金属キレート、蛍光共役ポリマー、量子ドットまたはナノ粒子、および上記のものの組み合わせが挙げられる。場合によっては、蛍光有機色素を単に蛍光色素と呼ぶ。蛍光色素体は、ポリマーに結合している別個の部分または置換基であってもよい。
【００２８】
ある実施形態で使用できる蛍光色素体は、約４００ｎｍ以上の波長の光によって励起でき、励起および発光波長が少なくとも１０ｎｍ離れるのに十分な大きさのストークスシフトを有する。ある実施形態では、励起および発光波長間の間隔は約３０ｎｍ以上であることができる。これらの蛍光色素体は、好ましくは、ビオロゲンなどの電子受容体分子による消光に対して感受性が強く、光退色に対して耐性がある。また、それらは、好ましくは、光酸化、加水分解および生分解に対して安定である。
【００２９】
ある実施形態では、蛍光色素体は分離した化合物である。
【００３０】
ある実施形態では、蛍光色素体は、約１０，０００ダルトン以上の分子量を有し、色素−ポリマー単位を形成する水溶性または水分散性ポリマー中のペンダント基または鎖単位である。ある実施形態において、そのような色素−ポリマー単位は、非水溶性ポリマーマトリックスＭ１と非共有結合的に結合しており、ポリマーマトリックスＭ１内に物理的に固定されており、ここで、Ｍ１は被分析物溶液に対して透過性であるか接触している。他の実施形態においては、色素−ポリマー単位上の色素は負に帯電しており、色素−ポリマー単位はカチオン性の水溶性ポリマーとの複合体として固定されており、この複合体は非分析物溶液に対して透過性であるか接触していることがある。ある実施形態において、色素はヒドロキシピレントリスルホン酸の高分子誘導体の１種類である。高分子色素は、水溶性、水膨潤性または水分散性であることができる。ある実施形態では、高分子色素は架橋されていてもよい。好ましい実施形態において、色素は負の電荷を有する。
【００３１】
他の実施形態において、色素分子は非水溶性ポリマーマトリックスＭ１に共有結合していてもよく、ここで、Ｍ１は被分析物溶液に対して透過性であるか接触している。色素分子はＭ１に結合して、構造Ｍ１−Ｌ１−色素を形成する。Ｌ１は、検知部分をポリマーまたはマトリックスに共有結合的に結合させる、加水分解に対して安定な共有結合リンカーである。Ｌ１の例としては、スルホンアミド［−ＳＯ２ＮＨ−］、アミド［−（Ｃ＝Ｏ）Ｎ−］、エステル［−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−］、エーテル［−Ｏ−］、スルフィド［−Ｓ−］、スルホン［−ＳＯ２−］、フェニレン［−Ｃ６Ｈ４−］、ウレタン［−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−］、尿素［−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−］、チオ尿素［−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ−］、アミド［−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−］、アミン［−ＮＲ−（式中、Ｒは１〜６個の炭素原子を有するアルキルと定義される）］など、または、それらの組み合わせより選択される１個以上の２価の結合基を末端に有するか、炭素鎖中に有していてもよい低級アルキレン（例えば、Ｃ１〜Ｃ８アルキレン）が挙げられる。ある実施形態において、色素は、スルホンアミド官能基を介してポリマーマトリックスに結合している。
【００３２】
ある実施形態では、有用な色素としては、ピラニン誘導体（例えば、ヒドロキシピレントリスルホンアミド誘導体など）が挙げられ、これは以下の式を有する。
【００３３】
【化１】
0005631215.tif 000002
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ−ＮＨＲ４であり、Ｒ４は−ＣＨ２ＣＨ２（−ＯＣＨ２ＣＨ２−）ｎＸ１であり；ただし、Ｘ１は−ＯＨ、−ＯＣＨ３ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨ２またはＯＭｅであり；ｎは約７０〜１０，０００である。
【００３４】
他の実施形態において、蛍光色素は８−ヒドロキシ−ピレン−１，３，６−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリス−（メトキシポリエトキシエチル（約１２５）スルホンアミド）（ＨＰＴＳ−ＰＥＧ）である。
【００３５】
【化２】
0005631215.tif 000003
ビオロゲン消光体、特に、ボロン酸部分を１つのみ有するビオロゲン消光体に操作可能的に結合している場合、一部イオン化した−ＯＨ基以外にアニオン性基を有さないＨＰＴＳ−ＰＥＧ（上）などの色素は非常に強いグルコース応答を与えないことがあることを付記する。
【００３６】
ある実施形態では、蛍光色素は８−ヒドロキシピレン−１，３，６−トリスルホネート（ＨＰＴＳ）である。対イオンはＨ＋、または、色素が生理学的流体を含む水性媒体と相溶性であるという条件で任意の他のカチオンであることができる。ＨＰＴＳは、約４５０ｎｍおよび約４０５ｎｍにおいて２つの励起波長を示し、これらは酸およびその共役塩基の吸収波長に対応する。励起波長のシフトは、ＨＰＴＳ上のヒドロキシル基のｐＨに依存するイオン化のためである。ｐＨが増大すると、ＨＰＴＳは、約４５０ｎｍにおける吸光度が増大し、約４２０ｎｍより低い吸光度が減少する。ｐＨに依存する吸収極大のシフトは、生理学的範囲内において二重励起の比例的検出を可能にする。この色素は５００ダルトン未満の分子量を有し、よって、それはポリマーマトリックス内に留まらないが、それはアニオン排除膜を用いて使用することができる。
【００３７】
【化３】
0005631215.tif 000004
他の実施形態において、蛍光色素は、その後加水分解してアセトキシ保護基を取り除く８−アセトキシ−ピレン−１，３，６−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリス−（メタクリルプロピルアミドスルホンアミド）（アセトキシ−ＨＰＴＳ−ＭＡ）のポリマーである。
【００３８】
【化４】
0005631215.tif 000005
ビオロゲン消光体、特に、ボロン酸部分を１つのみ有するビオロゲン消光体に操作可能的に結合している場合、ＨＰＴＳ−ＭＡなどの色素、および一部イオン化した−ＯＨ基以外にアニオン性基を有さない前記色素を含むポリマーは非常に強いグルコース応答を与えないことがあることを付記する。
【００３９】
他の実施形態において、蛍光色素は８−ヒドロキシ−ピレン−１，３，６−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリス−（カルボキシプロピルスルホンアミド）（ＨＰＴＳ−ＣＯ２）である。
【００４０】
【化５】
0005631215.tif 000006
代表的な分離した化合物である色素は、８−アセトキシピレン−１，３，６−トリスルホニルクロリド（ＨＰＴＳ−Ｃｌ）とアミノ酪酸などのアミノ酸とを反応させ、続いて加水分解してアセトキシ基を除去して形成されるトリス付加物である。ある実施形態において、この色素は、スルホンアミド官能基を介してポリマーに結合されていてもよい。他の実施形態において、色素は、ヒドロキシピレントリスルホン酸の高分子誘導体の１つであることができる。８−ヒドロキシピレン−１−Ｎ−（メタクリルアミドプロピルスルホンアミド）−Ｎ’，Ｎ”−３，６−ビス（カルボキシプロピルスルホンアミド）ＨＰＴＳ−ＣＯ２−ＭＡと、ＨＥＭＡ、ＰＥＧＭＡなどとのコポリマーなどの、ポリマーに結合し、１個以上のアニオン性基を有するヒドロキシピレントリスルホンアミド色素が最も好ましい。
【００４１】
他の実施形態において、蛍光色素はＨＰＴＳ−ＴｒｉＣｙｓ−ＭＡであることができる。
【００４２】
【化６】
0005631215.tif 000007
この色素は、３，３’−ｏＢＢＶなどのボロン酸を含む消光体と共に使用することができる。ある実施形態では重合性基または他の反応性基で置換された色素を使用できるが、好ましくは、色素はポリマーまたはマトリクスに結合している。好ましい実施形態において、ＨＰＴＳ−ＴｒｉＣｙｓ−ＭＡを含むポリマーを、本発明の検知システムにおいて使用する。
【００４３】
もちろん、ある実施形態では、ＨＰＴＳコア上のＣｙｓ−ＭＡ以外の置換は、置換基が負に帯電し、反応性基、好ましくは重合性基を含む限り、本発明の態様と一致する。システインのＬ立体異性体またはＤ立体異性体のいずれも使用することができる。ある実施形態では、スルホン酸の１個または２個のみが置換されていてもよい。同様に、上に示されるＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡの変形体において、ＮＢｕ４＋の他に、正に帯電した金属イオン、例えばＮａ＋などの他の対イオンも使用することができる。他の変形例において、スルホン酸基を他の酸性イオン性官能基、例えば、リン酸基、カルボン酸基などで置換することもできる。
【００４４】
他の適切な色素はＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡである。この色素は、モノマーの形態で使用できるが、この色素を含むポリマーが好ましい。ＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡの構造を下に図示する。
【００４５】
【化７】
0005631215.tif 000008
他の例としては、８−アセトキシピレン−１，３，６−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリス（メタクリルアミドプロピルスルホンアミド）と、ＨＥＭＡ、ＰＥＧＭＡまたは他の親水性コモノマーとの可溶性コポリマーが挙げられる。色素中のフェノール置換基は、重合中、重合完了後に加水分解によって除去できる保護基により保護される。例えば、アセトキシ、トリフルオロアセトキシなどの適切な保護基は当該技術分野においてよく知られている。
【００４６】
ＨＰＴＳおよびその誘導体を含む蛍光色素は既知であり、多数が被分析物検出において使用されている。例えば、米国特許第６，６５３，１４１号明細書、同第６，６２７，１７７号明細書、同第５，５１２，２４６号明細書、同第５，１３７，８３３号明細書、同第６，８００，４５１号明細書、同第６，７９４，１９５号明細書、同第６，８０４，５４４号明細書、同第６，００２，９５４号明細書、同第６，３１９，５４０号明細書、同第６，７６６，１８３号明細書、同第５，５０３，７７０号明細書および同第５，７６３，２３８号明細書；および同時係属中の米国特許出願第１１／２９６，８９８号明細書；同第１１／７８２，５５３号明細書；および同第６０／９５４，２０４号明細書を参照のこと。それらは、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４７】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製のＳＮＡＲＦおよびＳＮＡＦＬ色素も、本発明の態様において有用な蛍光色素体であることがある。ＳＮＡＲＦ−１およびＳＮＡＦＬ−１の構造を下に示す。
【００４８】
【化８】
0005631215.tif 000009
さらに、波長比例的および比色的にｐＨに伴うスペクトルシフトおよび強度の変化を示す６−メチルキノリンおよび６−メトキシキノリンのＮ−ボロノベンジル誘導体の両方をベースとする一連の異性体水溶性蛍光プローブが、本発明の幾つかの実施形態において有用なことがある。（例えば、Ｂａｄｕｇｕ，Ｒ．ら、２００５年、Ｔａｌａｎｔａ、６５巻（３号）、７６２〜７６８頁；およびＢａｄｕｇｕ，Ｒ．ら、２００５年、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１３巻（１号）、１１３〜１１９頁を参照のこと。）その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４９】
ｐＨおよび糖類感受性であることがある蛍光色素の他の例は、下に示すテトラキス（４−スルホフェニル）ポルフィン（ＴＳＰＰ）である。ポルフィリン環が第二鉄イオンなどの特定の金属イオンと反応し、光学的特性が変化することがある場合、ＴＳＰＰは血液中では最適に働かないことがある。
【００５０】
【化９】
0005631215.tif 000010
本発明のセンサーにおけるｐＨおよびグルコースの同時測定のために有用なことがあるｐＨ感受性蛍光指示体の更なる例は、米国特許出願公開第２００５／０２３３４６５号明細書および同第２００５／００９００１４号明細書に記載されており、それらは、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５１】
＜被分析物結合部分−消光体＞
本発明の広範な態様に従って、被分析物結合部分は、被分析物結合の量に関連した形で、被分析物に結合でき、（例えば、発光信号強度の変化として）蛍光色素体の濃度を測定できる少なくとも２つの機能性を提供する。ある実施形態においては、被分析物結合部分は消光体と会合する。「消光体」は、それが存在する場合、色素の発光を低減する化合物を指す。消光体（Ｑ）は、分離した化合物、第２の分離した化合物または重合性化合物に転化可能な反応中間体より選択されるか、または、Ｑは、前記反応中間体または重合性化合物より調製されるポリマー中のペンダント基または鎖単位であって、そのポリマーは水溶性または水分散性であるか、または、不溶性ポリマーであり、このポリマーは架橋されていてもよい。
【００５２】
一例では、実施形態におけるグルコース認識をする部分は、芳香族ボロン酸である。ボロン酸は、共役窒素含有ヘテロ環式芳香族ビス−オニウム構造（例えば、ビオロゲン）に共有結合している。「ビオロゲン」は、一般的に、例えば２，２’−、３，３’−または４，４’−Ｎ，Ｎ’ビス−（ベンジル）ビピリジウム二ハロゲン化物（即ち、二塩化物、臭化塩化物）などの、窒素含有共役Ｎ−置換ヘテロ環式芳香族ビス−オニウム塩の基本構造を有する化合物を指す。ビオロゲンとしては、置換フェナントロリン化合物も挙げられる。ボロン酸置換消光体は、好ましくは、約４〜９のｐＫａを有し、約６．８〜７．８のｐＨの水性媒体中でグルコースと可逆的に反応して、ボロン酸エステルを形成する。反応の程度は、媒体中のグルコース濃度に関係する。ボロン酸エステルの形成によりビオロゲンによる色素（例えば、蛍光色素体）の消光が減少し、グルコース濃度に依存して信号発光（例えば、蛍光）が増加する結果となる。有用なビス−オニウム塩は被分析物溶液と相溶性であり、検出されるべき被分析物の存在下で色素の信号発光の検出可能な変化を生じることができるものである。
【００５３】
本発明の実施形態におけるビス−オニウム塩は、共役ヘテロ環式芳香族二窒素化合物から調製される。共役ヘテロ環式芳香族二窒素化合物は、ジピリジル類、ジピリジルエチレン類、ジピリジルフェニレン類、フェナントロリン類およびジアザフルオレン類より選択され、ここで、窒素原子は異なる芳香環中にあり、オニウム塩を形成できる。両方の窒素を置換できる前記共役ヘテロ環式芳香族二窒素化合物の異性体は全て本発明において有用であると理解される。ある実施形態において、消光体は、３，３’−ジピリジル、４，４’−ジピリジルおよび４，７−フェナントロリンから誘導されるビス−オニウム塩の１つであることができる。
【００５４】
ある実施形態では、ビオロゲン−ボロン酸付加物は、約４００ダルトン以上の分子量を有する、分離した化合物である。他の実施形態において、それは、約１０，０００ダルトンより大きい分子量を有する水溶性または水分散性ポリマーのペンダント基または鎖単位である。ある実施形態においては、消光体−ポリマー単位は、ポリマーマトリックスと非共有結合的に会合しており、その中で物理的に固定されている。更に他の実施形態においては、消光体−ポリマー単位は、負電荷の水溶性ポリマーとの複合体として固定されている。
【００５５】
他の実施形態において、ビオロゲン−ボロン酸部分は、平衡を確立させるために被分析物（例えば、グルコース）に対して十分に透過性である架橋された親水性ポリマーまたはヒドロゲル中のペンダント基または鎖単位である。
【００５６】
他の実施形態において、消光体は、構造Ｍ２−Ｌ２−Ｑで表すことのできる第２の非水溶性ポリマーマトリックスＭ２に共有結合している。Ｌ２は、低級アルキレン（例えば、Ｃ１〜Ｃ８アルキレン）、スルホンアミド、アミド、第四級アンモニウム、ピリジニウム、エステル、エーテル、スルフィド、スルホン、フェニレン、尿素、チオ尿素、ウレタン、アミンおよびそれらの組み合わせから成る群より選択されるリンカーである。消光体は、ある実施形態では、１ヵ所または２ヵ所の部位でＭ２に連結されていてもよい。
【００５７】
高分子消光体前駆体について、ヘテロ芳香族核中の２個の異なる窒素に、ボロン酸部分、および重合性基またはカップリング基であることができる反応性基を結合させるためには、多くの選択肢を利用することができる。これらは、以下のものである。
【００５８】
ａ）第１の芳香族部分上の反応性基が一方の窒素に結合し、少なくとも１個の−Ｂ（ＯＨ）２基を含有する第２の芳香族基が第２の窒素に結合する；
ｂ）１個以上のボロン酸基が１個の窒素に結合している第１の芳香族部分に結合し、１個のボロン酸および反応性基が第２の芳香族基に結合し、その第２の芳香族基は第２の窒素に結合している；
ｃ）１個のボロン酸基および反応性基が１個の窒素に結合している第１の芳香族基の第１の芳香族部分に結合し、ボロン酸基および反応性基が第２の窒素に結合している第２の芳香族部分に結合する；および
ｄ）１個のボロン酸がそれぞれの窒素に結合し、反応性基がヘテロ芳香環に結合する。
【００５９】
好ましい実施形態は、２個のボロン酸部分および１個の重合性基またはカップリング基を含み、ここで、芳香族基は窒素に結合しているベンジル置換基であり、ボロン酸基はベンジル環に結合しており、オルト、メタまたはパラ位のいずれであってもよい。
【００６０】
ある実施形態では、生体外検知のために有用な、分離した化合物であるボロン酸置換ビオロゲンは、以下の式の１つで表すことができる。
【００６１】
【化１０】
0005631215.tif 000011
式中、ｎは１〜３であり、Ｘはハロゲンであり、Ｙ１およびＹ２は、独立して、フェニルボロン酸（ｏ−、ｍ−またはｐ−異性体）およびナフチルボロン酸より選択される。他の実施形態において、消光体は、ビオロゲンのヘテロ環上の置換基としてボロン酸基を含んでいてもよい。
【００６２】
センサーの作製に適する消光体前駆体は、以下より選択することができる。
【００６３】
【化１１】
0005631215.tif 000012
【００６４】
【化１２】
0005631215.tif 000013
本発明のある態様に従って、消光体前駆体３，３’−ｏＢＢＶはＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡまたはＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡと共に使用してヒドロゲルを作製することができる。
【００６５】
ある実施形態において、ベンジルボロン酸基で窒素が置換され、他の位置において重合性基またはカップリング基でジピリジル環上が置換されている３，３’−ジピリジルから誘導されるビオロゲンを含む前駆体より消光体が調製される。代表的なビオロゲンとしては、下記のものが挙げられる。
【００６６】
【化１３】
0005631215.tif 000014
式中、ＬはＬ１またはＬ２であり、連結基であり、
Ｚは反応性基であり、
Ｒ’はベンジル環上のオルト、メタまたはパラ位の−Ｂ（ＯＨ）２であり、
Ｒ”はＨ−であり、あるいは、Ｒ”は本明細書中で定義される通りのカップリング基、または、フルオロ−またはメトキシ−などのボロン酸の酸性度を変えるために特に使用される置換基であり、
Ｌは、ビオロゲンをポリマーまたはマトリックスに結合するために使用される反応性基に検知部分を共有結合する２価部分である。Ｌの例としては、直接結合、または１〜８個の炭素原子を有し、スルホンアミド［−ＳＯ２ＮＨ−］、アミド［−（Ｃ＝Ｏ）Ｎ−］、エステル［−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−］、エーテル［−Ｏ−］、スルフィド［−Ｓ−］、スルホン［−ＳＯ２−］、フェニレン［−Ｃ６Ｈ４−］、ウレタン［−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−］、尿素［−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−］、チオ尿素［−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ−］、アミド［−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−］、アミン［−ＮＲ−（式中、Ｒは１〜６個の炭素原子を有するアルキルと定義される）］などより選択される１個以上の２価の結合基を末端に有するか、炭素鎖中に有していてもよい低級アルキレンから、それぞれ独立に、選択されるものが挙げられる。
【００６７】
Ｚとしては、これらに限定されないが、メタクリルアミド−、アクリルアミド−、メタクリロイル−、アクリロイル−、またはスチリル−より選択される重合性エチレン性不飽和基であるか、または、Ｚは、ポリマーまたはマトリックスと共有結合を形成できる反応性官能基である。そのような基としては、これらに限定されないが、−Ｂｒ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯ２Ｈおよび−ＮＨ２が挙げられる。
【００６８】
ボロン酸置換ポリビオロゲンは、好ましい消光体のもう一つの種類である。用語ポリビオロゲンとしては、連結基により互いに共有結合している２個以上のビオロゲンを含む分離した化合物、鎖中のビオロゲン繰り返し単位から成るポリマー、鎖にペンダント基として結合しているビオロゲン基を有するポリマー、ビオロゲン末端基を含むビオロゲン単位から成るデンドリマー、ビオロゲン末端基を含むビオロゲン単位から成るオリゴマー、およびそれらの組み合わせが挙げられる。モノ−ビオロゲン基が少量成分を形成するポリマーは含まれない。ある実施形態において、消光体は、センサーの一部として機能するのに十分な程度までグルコースに対して透過性である水溶性または水分散性ポリマー、または架橋された親水性ポリマーまたはヒドロゲルである。あるいは、ポリビオロゲンボロン酸が不活性基体に直接結合されていてもよい。
【００６９】
ビオロゲン繰り返し単位から成るポリマーであるポリビオロゲン消光体は、次式を有する。
【００７０】
【化１４】
0005631215.tif 000015
他の実施形態では、ポリビオロゲンボロン酸付加物は、２個以上のビオロゲン／ボロン酸中間体を共有結合させることにより形成される。架橋基は、典型的には、それぞれのビオロゲン中の１つの窒素に、または、それぞれのビオロゲンの芳香環中の炭素に結合される小さい２価の基であるか、または、１つの結合は１つのビオロゲン中の環炭素と、もう１つのビオロゲン中の窒素に対するものであってもよい。２個以上のボロン酸基は、ポリビオロゲンに結合している。ポリビオロゲンボロン酸付加物は、ビオロゲンまたは架橋基に直接結合した重合性基またはカップリング基で置換されていてもよい。ポリビオロゲン部分は、このような基を１つだけ含むものであってもよい。架橋基は、グルコースに対するボロン酸の協同的結合を強めるように選択することができる。
【００７１】
カップリング部分は、先に定義した通りの連結基であり、ただし、この連結基は、ボロン酸、重合性基、追加のカップリング基で更に置換されていてもよく、または、ビオロゲンが鎖単位、ペンダント基またはそれらの任意の組み合わせであるポリマー鎖中の１つのセグメントであってもよい。
【００７２】
他の実施形態において、消光体は、同時係属中の米国特許出願第１１／２９６，８９８号明細書；同第１１／７８２，５５３号明細書；同第１１／６７１，８８０号明細書；同第１２／１１３，８７６号明細書；同第６０／９１５，３７２号明細書および同第６０／９４９，１４５号明細書に記載されるもの全てより任意に選択することができる。それらは、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７３】
＜固定化手段＞
ある実施形態では、流体が移動しない生体外で用いるために、検知成分は個々の（分離した）成分として使用される。色素および消光体は液体溶液中で一緒に混合され、被分析物が加えられ、蛍光強度の変化が測定され、そして、これらの成分は廃棄される。滲出を防止するために検知成分を捕捉するために使用できるポリマーマトリックスは存在する必要がない。検知成分は固定されていてもよく、これによって、移動流中の被分析物を測定するために使用することが可能になる。
【００７４】
生体内で適用するためには、センサーは、１種類以上のポリヒドロキシル有機化合物を含有する生理学的流体の移動流中で用いられるか、または、前記化合物を含有する筋肉などの組織中に埋め込まれる。従って、センサー部分は全くセンサーアセンブリーから漏れ出さないことが好ましい。よって、生体内で使用するための特定の実施形態において、検知成分は有機ポリマー検知アセンブリーの一部である。可溶性色素および消光体は、被分析物の通過を可能にするが検知部分の通過を遮断する半透膜によって閉じ込めることができる。これは、検知部分として、被分析物分子より大きい可溶性分子（被分析物の分子量より少なくとも２倍の、または１０００より大きい、好ましくは５０００より大きい分子量）を使用し、検知部分が量的に保持されるように、２つの間の特定の分子量を遮断する透析または限外濾過膜などの選択的な半透膜を用いることにより実現できる。
【００７５】
ある実施形態では、検知部分は、グルコースが自由に透過できる不溶性ポリマーマトリックス中に固定される。ポリマーマトリックスは、有機、無機またはそれらのポリマーの組み合わせから成る。マトリックスは、生体適合性物質で構成されていてもよい。あるいは、マトリックスは、対象の被分析物に対して透過性である第２の生体適合性ポリマーで被覆されている。
【００７６】
ポリマーマトリックスの機能は、色素および消光体部分を一緒に保持し、固定する一方で、同時に、被分析物（例えば、ポリヒドロキシル化合物、Ｈ＋およびＯＨ−）と接触させ、ポリヒドロキシル化合物を消光体に結合させることである。この作用を達成するために、マトリックスは媒体中で不溶でなければならず、マトリックスおよび被分析物溶液間に高表面積の界面を確立することによって、媒体と密接に関連していなければならない。例えば、超薄フィルムまたは微孔質の支持マトリックスを使用する。あるいは、マトリックスは被分析物溶液中で膨潤性であり、例えば、ヒドロゲルマトリックスを水系のために使用する。場合によっては、検知ポリマーは光導管の表面などの表面に結合されているか、または、微孔質膜中に含浸されている。全ての場合において、２つの相の間で平衡を確立できるように、マトリックスは結合部位への被分析物の輸送を妨げてはならない。超薄フィルム、微孔質ポリマー、微孔質ゾル−ゲルおよびヒドロゲルを調製するための技術は、当該技術分野において確立されている。有用なマトリックスは全て、被分析物透過性であると定義される。
【００７７】
ある実施形態では、ヒドロゲルポリマーを使用する。用語ヒドロゲルは、本明細書中で使用する場合、水中で膨潤するが、溶解しないポリマーを指す。そのようなヒドロゲルは、直鎖、分枝鎖または網状ポリマー、または高分子電解質複合体であることができ、ただし、それらは可溶性または滲出性フラクションを含有しない。典型的には、ヒドロゲル網状構造は架橋工程により得られ、その架橋工程は、水溶性ポリマーに対して、それらが水性媒体中で膨潤するが、溶解しないように実施される。あるいは、ヒドロゲルポリマーは、水膨潤性網状ポリマーを得るために、親水性および架橋モノマーの混合物を共重合することにより得られる。そのようなポリマーは、付加重合または縮合重合のどちらかにより、または、組み合わせプロセスにより形成される。これらの場合、検知部分は、網状構造形成モノマーと組み合わせてモノマー誘導体を使用する共重合により、ポリマー中に組み込まれる。あるいは、反応性部分は、重合後の反応によって、既に調製されたマトリックスに結合させる。前記検知部分は、ポリマー鎖中の単位、または鎖に結合したペンダント基である。
【００７８】
また、本発明において有用なヒドロゲルは、色素および消光体の両者が共有結合している単一の網状構造などのモノリス型ポリマー、または多成分ヒドロゲルである。多成分ヒドロゲルとしては、相互侵入網状ポリマー、高分子電解質複合体、および水膨潤性複合体を得るための２種類以上のポリマーの種々の他の配合物が挙げられ、ヒドロゲルマトリックス中に第２のポリマーが分散しているもの、および交互ミクロ層アセンブリーを含む。
【００７９】
モノリス型ヒドロゲルは、典型的には、親水性モノマーの混合物のラジカル共重合により形成され、親水性モノマーとしては、これらに限定されないが、ＨＥＭＡ、ＰＥＧＭＡ、メタクリル酸、ヒドロキシエチルアクリレート、Ｎ−ビニルピロリドン、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミドなどが挙げられ、イオン性モノマーとしては、メタクリロイルアミノプロピルトリメチルアンモニウムクロリド、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド、ナトリウムスルホプロピルメタクリレートなどが挙げられ、架橋剤としては、メチレンビスアクリルアミド、エチレンジメタクリレート、ＰＥＧＤＭＡ、トリメチロールプロパントリアクリレートなどが挙げられる。モノマーの比は、当該技術分野で十分に確立された原則を用いて、透過性、膨潤指数およびゲル強度などの網状ポリマー特性を最適化するように選択される。ある実施形態において、色素部分は、８−アセトキシピレン−１，３，６−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリス（メタクリルアミドプロピルスルホンアミド）などの色素分子のエチレン性不飽和誘導体から誘導され、消光体部分は、４−Ｎ−（ベンジル−３−ボロン酸）−４’−Ｎ’−（ベンジル−４エテニル）−ジピリジニウム二ハロゲン化物（ｍ−ＳＢＢＶ）などのエチレン性不飽和ビオロゲンから誘導され、マトリックスはＨＥＭＡおよびＰＥＧＤＭＡから作製される。色素の濃度は、発光強度を最適化するように選択される。色素に対する消光体の比は、所望の測定可能な信号を生じるのに十分な消光を与えるように調整される。
【００８０】
ある実施形態では、モノリス型ヒドロゲルは縮合重合により形成される。例えば、アセトキシピレントリスルホニルクロリドを過剰のＰＥＧジアミンと反応させて、未反応のジアミン中に溶解したトリス−（アミノＰＥＧ）付加物を得る。過剰のトリメソイルクロリドおよび酸受容体の溶液を４−Ｎ−（ベンジル−３−ボロン酸）−４’−Ｎ’−（２ヒドロキシエチル）ビピリジニウム二ハロゲン化物と反応させて、ビオロゲンの酸塩化物機能性エステルを得る。２つの反応性混合物を互いに接触させて反応させ、例えば、一方の混合物の薄膜をキャストし、それを他方の混合物に浸漬することにより、ヒドロゲルを形成する。
【００８１】
他の実施形態において、色素が一方の成分中に組み入れられ、消光体がもう一つの成分中に組み入れられている多成分ヒドロゲルが、本発明のセンサーを製造するために好ましい。更に、これらの系は、成分間の相互作用を高め、他のポリヒドロキシ被分析物を上回るグルコース選択性を得るために、分子インプリントされていてもよい。好ましくは、多成分系は、相互侵入ポリマー網目（ＩＰＮ）または半相互侵入ポリマー網目（ｓｅｍｉ−ＩＰＮ）である。
【００８２】
ＩＰＮポリマーは、典型的には、逐次重合により製造される。まず、消光体を含む網目ポリマーが形成される。次いで、網目ポリマーは色素モノマーを含むモノマーの混合物で膨潤され、第２の重合が行われ、ＩＰＮヒドロゲルが得られる。
【００８３】
ｓｅｍｉ−ＩＰＮヒドロゲルは、消光体モノマーを含むモノマーの混合物中に色素部分を含有する可溶性ポリマーを溶解し、この混合物を重合することによって形成される。ある実施形態では、ポリヒドロキシル化合物が自由に透過できる不溶性ポリマーマトリックスにより、検知部分を固定する。ヒドロゲル系についての更なる詳細は、米国特許出願公開第２００４／００２８６１２号明細書および同第２００６／００８３６８８号明細書に開示されている。それらは、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８４】
ある実施形態において、ボロン酸置換ビオロゲンは、蛍光色素に共有結合していてもよい。この付加物は、重合性化合物、またはポリマー中の単位であることができる。そのような付加物の１つは、例えば、まず、ベンジル−３−ボロン酸基を一方の窒素に結合し、アミノエチル基を他方の窒素原子に結合することによって、４，４’−ジピリジルから非対称ビオロゲンを形成することにより調製することができる。ビオロゲンは、最初に、１：１のモル比で８−アセトキシ−ピレン−１，３，６−トリスルホニルクロリドと逐次縮合し、続いて、過剰のＰＥＧジアミンと反応して、プレポリマー混合物を得る。副生物の酸を除去するために、酸受容体が両方の工程に含まれる。ポリイソシアネートとの反応によりプレポリマー混合物を架橋して、ヒドロゲルを得る。生成物を塩基で処理して、アセトキシ保護基を除去する。更なる使用の前に、徹底的な脱イオン水を用いた抽出により、不完全な反応生成物および未反応出発原料をヒドロゲルから抽出する。生成物は、本明細書中で記載するように、検知成分として使用する場合、グルコースに対して応答性である。
【００８５】
あるいは、そのような付加物は、エチレン性不飽和モノマー誘導体である。例えば、ジメチルビスブロモメチルベンゼンボロネートを過剰の４，４’−ジピリジルと反応させて、半ビオロゲン付加物を形成する。過剰のジピリジルを除去後、付加物を過剰のブロモエチルアミン塩酸塩と更に反応させて、ビス−ビオロゲン付加物を形成する。この付加物を、酸受容体の存在下で１：１のモル比で８−アセトキシピレン−トリススルホニルクロリドと反応させ、続いて、過剰のアミノプロピルメタクリルアミドと反応させることにより、ピラニン色素に結合させる。最後に、残存するアミノ基をメタクリロールクロリドと反応させてもよい。精製後、色素／ビオロゲンモノマーをＨＥＭＡおよびＰＥＧＤＭＡと共重合させて、ヒドロゲルを得ることができる。
【００８６】
＜比例的ｐＨ検知＞
比例的ｐＨ検知は知られている。例えば、米国特許出願公開第２００６／０１０５１７４号明細書；同第２００５／００９００１４号明細書を参照のこと。それらは、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態において、指示体システムは２つの形態（酸型および塩基型）で存在する蛍光色素体（例えば、蛍光指示色素）を含む。２つの波長での発光強度の比は、蛍光色素体濃度から独立に、ｐＨを測定するために使用することができる。比例的ｐＨ検知に適する蛍光指示色素は（１）２つの励起波長（酸型および共役塩基型に対応する）および単一の発光波長を示す色素（例えば、ＨＰＴＳ色素）；（２）単一の励起波長および２つの発光波長（酸型および塩基型）；または（３）２つの励起−２つの発光色素であることができる。幾つかの色素、例えばＳＮＡＲＦまたはＳＮＡＦＬ色素などは、２つの発光特性および２つの励起特性の両方を有する場合がある。しかしながら、二重−二重色素、例えば、ＳＮＡＲＦは、単一−二重、または二重−単一として使用できる。
【００８７】
迅速に、信頼性高く、強度比をｐＨと相関させる、セミナフトフルオレセインおよびカルボキシナフトフルオレセインをベースとする二重発光・光ファイバーセンサーが開示されている。例えば、それぞれ、Ｘｕ，Ｚ．、Ａ．Ｒｏｌｌｉｎｓら（１９９８年）「Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆｉｂｅｒ−ｏｐｔｉｃ  ｐＨ  ｓｅｎｓｏｒ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ｃａｒｂｏｘｙ  ＳＮＡＦＬ−２  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ−ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３９巻：９〜１５頁、およびＳｏｎｇ，Ａ．、Ｓ．Ｐａｒｕｓら（１９９７年）「Ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｆｉｂｅｒ−ｏｐｔｉｃ  ｐＨ  ｍｉｃｒｏｓｅｎｓｏｒｓ  ｆｏｒ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｄｕａｌ−ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｄｙｅ」Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６９巻：８６３〜８６７頁を参照のこと。これらの色素に関して観察される広範な光退色は比例的なアプローチにより説明できるが、それは依然としてセンサーの有効寿命を制限する。
【００８８】
蛍光色素８−ヒドロキシ−１，３，６−ピレントリスルホン酸三ナトリウム塩（ＨＰＴＳ）は、ｐＫａ約７．３近傍でｐＨ感受性を付与する、３つのスルホン酸基および１つのヒドロキシル基を有するピレン核から成る（Ｗｏｌｆｂｅｉｓ，Ｏ．Ｓ．、Ｅ．Ｆｕｅｒｌｉｎｇｅｒら（１９８３年）「Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｉ．Ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｎｅａｒ  ｎｅｕｔｒａｌ（「ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ」）ｐＨ  ｖａｌｕｅｓ．」Ｆｒｅｓｎｅｉｕｓ’Ｚ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．３１４巻（２号）：１１９〜１２４頁）。Ｗｏｌｆｂｅｉｓらは、固定化ＨＰＴＳに関する幾つかの特許も有する。ＹａｆｕｓｏおよびＨｕｉは、米国特許第４，８８６，３３８号明細書において、他の固定化蛍光色素ｐＨセンサーを開示している。それらは、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれる。ＨＰＴＳは、酸およびその共役塩基に対応し、１つは４０５ｎｍ、１つは４５７ｎｍで２つの励起波長を示す（Ａｇａｙｎ，Ｖ．Ｉ．およびＤｒ．Ｒ．Ｗａｌｔ（１９９３年）「Ｆｉｂｅｒ−ｏｐｔｉｃ  ｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｐＨ．」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７２巻（６号）：６〜９頁）。その後の、約７．３のｐＫａの励起極大のｐＨに依存するシフトは、生理学的範囲における二重励起／単一発光の比例的検出を可能にする。これと、低毒性（Ｌｕｔｔｙ，Ｇ．Ａ．（１９７８年）「Ｔｈｅ  ａｃｕｔｅ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｓｔａｉｎｓ，ｄｙｅｓ，ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ．」Ｔｏｘｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４４巻：２２５〜２２９頁）および酸素濃度に対する非感受性（Ｚｈｕｊｕｎ，Ｚ．およびＷ．Ｒ．Ｓｅｉｔｚ（１９８４年）「Ａ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｐＨ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｎｇｅ  ｆｒｏｍ  ６．５  ｔｏ  ８．５．」Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  １６０巻：４７〜５５頁）によって、ＨＰＴＳは生理学的およびバイオプロセスｐＨ測定に適するプローブとなっている。
【００８９】
３つの強いアニオン性スルホン酸基が存在するため、ＨＰＴＳがイオン結合によりカチオン性支持体に固定される。現在まで、ＨＰＴＳの共有結合は、スルホンアミド結合によるものであった（米国特許第４，７９８，７３８号明細書）。色素を固定し、ｐＨ感受性を保つのに有効である一方、ポリマー基体は、第一級アミンを含有するものに限定される。加えて、カップリング後に基体上に残存するアミン基は、ポリマーマトリックス内部の局所的ｐＨに影響を及ぼすこととなる。色素は、中性および酸性環境、ならびに、ｐＨおよびｐＣＯ２両方の検出のために使用される血管内血液ガスモニタリングシステムで作動する蛍光系ｐＨセンサー（Ｇｅｈｒｉｃｈ，Ｊ．Ｌ．、Ｄ．Ｗ．Ｌｕｂｂｅｒｓら（１９８６年）「Ｏｐｔｉｃａｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ａｎ  ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  ｂｌｏｏｄ  ｇａｓ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ．」ＩＥＥ  ＴＢｉｏ−ｍｅｄ  Ｅｎｇ  ＢＭＥ−３３巻：１１７〜１３２頁）の開発において、制御細孔ガラス（Ｏｆｆｅｎｂａｃｈｅｒ，Ｈ．、Ｏ．Ｓ．Ｗｏｌｆｂｅｉｓら（１９８６年）「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｅｎｓｏｒｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅａｒ−ｎｅｕｔｒａｌ  ｐＨ  ｖａｌｕｅｓ．」Ｓｅｎｓｏｒ  Ａｃｔｕａｔｏｒ  ９巻：７３〜８４頁）およびアミノエチルセルロース（Ｓｃｈｕｌｍａｎ，Ｓ．Ｇ．、Ｓ．Ｃｈｅｎら（１９９５年）「Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  １−ｈｙｄｒｏｘｙｐｙｒｅｎｅ−３，６，８−ｔｒｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ  ｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐＨ：ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒａｎｇｅ  ｏｆ  ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｐＨ  ｆｌｕｏｒｏｓｅｎｓｏｒ．」Ａｎａｌ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ３０４巻：１６５〜１７０頁）に共有結合されていた。アニオン交換膜（Ｚｈｕｊｕｎ，Ｚ．およびＷ．Ｒ．Ｓｅｉｔｚ（１９８４年））または樹脂（Ｚｈａｎｇ，Ｓ．、Ｓ．Ｔａｎａｋａら（１９９５年）「Ｆｉｂｒｅ−ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｅｎｓｏｒ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｆｏｒ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐＨ  ｖａｌｕｅｓ．」Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  Ｅｎｇ  Ｃｏｍｐｕｔ  ３３巻：１５２〜１５６頁）に結合し、光ファイバーの先端に固定されたＨＰＴＳを有する光ファイバーｐＨセンサーが開示されている。
【００９０】
例えば、米国特許第５，１１４，６７６号明細書（その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれる。）は、粒子または微晶質セルロース繊維に共有結合されていてもよい蛍光指示体を有するｐＨセンサーを開示している。このセンサーは、光学的に透明な基体、熱可塑性層およびヒドロゲルを含む。それに結合している指示体を有する粒子の一部は、基体を被覆し、熱および圧力を使用して機械的に付着されている熱可塑性層中に埋め込まれる。粒子／指示体の大部分は、熱可塑性層上に塗工されるヒドロゲル層中に埋め込まれる。ｐＨセンサーは、光導波路の先端に適用される。
【００９１】
更に、近年、低コストＵＶ  ＬＥＤを利用できることに伴い、ＵＶおよび青色ＬＥＤおよびフォトダイオードモジュールを組み合わせた比較的安価な計器により色素を測定できる。発酵媒体中に直接溶解したＨＰＴＳにより高スループットのマイクロバイオリアクター系のｐＨを検出するための、そのような装置セットが開示されている（Ｋｏｓｔｏｖ，Ｙ．、Ｐ．Ｈａｒｍｓら（２００１年）「Ｌｏｗ−ｃｏｓｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ７２巻：３４６〜３５２頁）。
【００９２】
ＨＰＴＳおよびその誘導体などの色素上にヒドロキシル（−ＯＨ）基が存在するため、これらの色素は環境のｐＨ変化に対する感受性が高い。ｐＨに依存するヒドロキシル基のイオン化により、これらの色素は、その酸型および塩基型で異なる吸収極大を有するｐＨ依存性吸収スペクトルを有する。第１の吸収極大が第１の励起波長であり、第２の吸収極大が第２の励起波長である。第１の励起波長および第２の励起波長において蛍光色素により吸収される光の量は、蛍光色素が接触している媒体のｐＨに依存、または関係している。発光波長において色素により発光される光（例えば、蛍光発光）の量は、色素が励起波長で照射される時の光吸収の量に依存する。吸収は媒体のｐＨの影響を受けるため、蛍光発光もｐＨの影響を受ける。これがｐＨ決定のための基礎となり、ポリヒドロキシル化合物濃度を同時に測定できる。
【００９３】
本発明のある実施形態において、比例的ｐＨ検知は、光ファイバーの近位端領域に操作可能的に連結された少なくとも１つの励起光源を含み、ファイバーはファイバーの光路内のその遠位端領域に沿って配置され、指示体システムは励起光に応じて検出可能な発光信号を発生するよう構成されている光学的センサーを使用して達成される。センサーの好ましい実施形態は、発光信号を検出器に送るための光学的手段を更に含む。そのような光学的手段は当該技術分野でよく知られており、例えば、光を反射するための鏡、フィルター、レンズ、ビームスプリッター、および光ファイバー束、および分割構成を含むことができる。
【００９４】
ある実施形態では、指示体システムは、少なくとも２つの異なる形態を有し、これらの異なる形態間でｐＨ依存性のシフトを示す蛍光色素体を含み、ここで、このシフトは単一波長での、または２つの異なる波長での発光強度の変化として検出できる。例えば、比例的ｐＨ検知のための指示体システムの１つは、色素が酸型であるか、または塩基型であるかによって２つの異なる極大波長（λ酸およびλ塩基）で光を吸収する蛍光色素（例えば、ＨＰＴＳ）を含み、それは単一でより長い発光波長で光を発光する。更に特には、ｐＨの増加に伴い、ＨＰＴＳは、λ塩基に対応する吸光度の増加、およびλ酸に対応する吸光度の減少を示す。これらの変化は、ｐＨ依存性のヒドロキシル基のイオン化に起因する。ＨＰＴＳの発光スペクトルはｐＨと無関係であり、約５１１ｎｍのピーク発光波長を有するが、発光の強度は吸収される光の量に依存する（これはｐＨおよび励起波長によって変化する）。よって、例えば、所定のｐＨにおいて、第１の波長（例えば、λ酸）の光でＨＰＴＳを励起する場合、単一の発光波長で発光強度を測定できるが、その強度は、色素の形態（即ち、イオン化の程度−これはｐＨに依存する）に依存することとなる。第２の波長（例えば、λ塩基）で励起し、同一の所定のｐＨにおいて、発光強度を測定することもできる。発光強度の比はｐＨに関係し、色素および系中の光学的人工産物の量には依存しない。任意の励起波長を比例的検知のために使用できるが、λ酸およびλ塩基が本発明のある実施形態において好ましいことに留意を要する。吸収が色素の酸型および塩基型で同一である波長は等吸収点と呼ぶ。この波長（λ等吸収点）での励起も、本発明の他の好ましい変形例において、比例的検知において使用することができる。発光強度の比（例えば、Ｉ塩基／Ｉ等吸収点またはＩ塩基／Ｉ酸）がｐＨに対してプロットされる場合、標準曲線または較正曲線が得られる（例えば、図３、図５および図９参照）。使用される色素が二重励起体−単一発光体（例えば、ＨＰＴＳ）であるか、単一励起体−二重発光体であるか、または二重励起体−二重発光体であるかに関わらず、スペクトル特性における検出可能な変化を生じる形態でのｐＨ感受性シフトを色素が受ける限り、比例的方法は同様のものである。
【００９５】
＜ｐＨおよびグルコースの血管内測定のための装置および方法＞
本発明のある実施形態では、検知装置は、少なくとも１つの光源と、検出器と、蛍光レポーター色素システムを含むセンサーとを含む。ある実施形態では、蛍光レポーター色素システムは、被分析物結合消光体と操作可能的に結合している蛍光色素を含む。色素は消光体と共有結合していても、単に消光体と会合していてもよい。色素および消光体は操作可能的に結合しており、このことは、操作中、消光体が色素と相互作用し、色素の蛍光を変えるのに十分なほどに色素に近接していることを意味する。ある実施形態では、色素および消光体は、被分析物透過性ヒドロゲルまたは他のポリマーマトリックス内に一緒に閉じ込められていてよい。適切な波長の光により励起される場合、蛍光色素は光（例えば、蛍光）を発光する。光の強度は、被分析物結合の量によって変わる消光の程度に依存する。他の実施形態において、蛍光色素および消光体は、互いに共有結合する代わりに、ヒドロゲルまたは他のポリマーマトリックスに共有結合していてもよい。
【００９６】
ある実施形態では、本発明の方法は、生体外で媒体のｐＨおよび被分析物の濃度をモニターするセンサーを使用する。別の実施形態において、本発明の方法は、生体内でｐＨおよび被分析物濃度をモニターするセンサーを使用する。更に別の実施形態においては、測定されたｐＨ値を、生体外または生体内でグルコース濃度をより正確に決定するために使用することもできる。具体的には、ｐＨ値およびグルコース濃度の同時測定により、グルコース応答の信号の即時補正が可能となる。ある実施形態による装置は、ｐＨまたは被分析物濃度の一方のみを決定するために使用されるセンサーを含むと理解されるが、ｐＨに関するその補正は、従来の２つのセンサーの技術により、または、生体外で血液のｐＨを試験することにより行うことができる。
【００９７】
ｐＨおよびポリヒドロキシル化合物の濃度を同時に決定するための装置を提供する実施形態の１つは、消光体と操作可能的に結合する蛍光色素を有するセンサーと、１つ以上の励起波長をセンサーに照射する手段と、センサーからの蛍光発光を検出する手段とを含む。
【００９８】
他の実施形態は、生理学的流体中のｐＨおよびポリヒドロキシル化合物濃度を決定するための装置を提供する。この装置は非水溶性ポリマーマトリックスを含み、このポリマーマトリックスはポリヒドロキシル化合物に対して透過性である。蛍光色素はポリマーマトリックスに結合している。蛍光色素は第１の励起波長および第２の励起波長で光を吸収し、発光波長で光を発光するように構成されている。この装置は、更に、ポリヒドロキシル化合物濃度に依存する量のポリヒドロキシル化合物と可逆的に結合するようになっている芳香族ボロン酸置換ビオロゲンを含む消光体を含む。消光体はポリマーマトリックスに結合しており、蛍光色素に操作可能的に結合される。消光体は、結合したポリヒドロキシル化合物の量に対応する蛍光色素により発光される光の強度を低減するように構成されている。また、装置は、少なくとも１つの励起光源および発光検出器をも有する。
【００９９】
ある実施形態において、装置は、その中に配置されたキャビティを含み、キャビティ内に固定された上記の通りの指示体システム（例えば、グルコース結合部分／消光体に操作可能的に結合した蛍光色素体、および固定化ポリマーマトリックス）を有する光ファイバーを含む。装置は、更に、光源および検出器を含む。
【０１００】
ある実施形態は、蛍光色素によってｐＨおよびポリヒドロキシル化合物濃度を決定するための方法を提供する。その方法は、消光体と操作可能的に結合している蛍光色素を有するセンサーを提供することと、分析される媒体にセンサーを接触させることと、第１の励起波長でセンサーに放射線を照射することと、発光波長においてセンサーの第１の蛍光発光を検出することと、第２の励起波長でセンサーに放射線を照射することと、発光波長においてセンサーの第２の蛍光発光を測定することと、第１および第２の発光の比をｐＨ較正曲線と比較して、試料のｐＨを決定することと、発光消光を既知のｐＨにおける標準曲線と相関させて、媒体中のポリヒドロキシル化合物濃度を決定することとを含む。
【０１０１】
比例的ｐＨ検知のための他のアルゴリズムは既知であり、本発明の実施形態において使用することができる。ある実施形態では、コンピューターまたは専用装置などの制御装置を、励起光の印加、検出器信号のモニタリング、比の決定、比を較正曲線と相関させること、グルコース信号を標準曲線と相関させること、ｐＨ変化に関して補正すること、所定のセンサー較正操作を実行すること、作業者に実行を促すこと、正確性を保持するためにプログラムされた通りのユーザーデータ入力を組み込むこと（例えば、指先穿刺グルコース測定）および他の機能を含む操作を制御するために使用することができる。
【０１０２】
図１に関して、本発明のある実施形態による検知装置１００は、少なくとも１つの光源１１（例えば、励起光源）、検出器１５（例えば、発光検出器）、および、消光体と任意選択でポリマーマトリックスに操作可能的に結合している蛍光色素を含むセンサー１３を含む。ある実施形態では、光源１１は、蛍光色素の励起のために２つ以上の異なる波長を選択的に出力するように構成することができる。このタイプの光源は、調節可能な光源であることができる。他の実施形態では、波長を減衰させるために、１つ以上の光源を光学フィルター１２と共に使用することができる。他の実施形態では、１つより多い光源１１を用いて、異なる励起波長を出力することができる。そのような光源は、第１および第２の励起波長をセンサーに照射する手段でもある。
【０１０３】
センサー１３は、色素が消光体に操作可能的に結合している場合、媒体のｐＨおよびポリヒドロキシル化合物（例えば、糖またはグルコース）濃度の両方に感受性である蛍光色素を含む。そのような蛍光色素は、対応する蛍光色素の局所的環境のｐＨのシフトと共に、極大励起波長のシフトを示す。局所的環境のｐＨが変わると、第１の励起波長での吸収が増大し、第２の励起波長での吸収は低減する、または、その逆である。選択された波長での吸収の変化は蛍光発光のレベルに影響を及ぼすことができ、従って、最終的にはｐＨ検出を可能にする。ｐＨ検出は、環境中のポリヒドロキシル化合物の濃度には依存しない。適切な蛍光色素は、ビオロゲンなどの分子による消光にも感受性である。蛍光色素が消光体（例えば、ビオロゲン）と操作可能的に結合している場合、蛍光発光は減衰する。消光体は、グルコース認識をすることができる芳香族ボロン酸部分で置換されていてもよい。ボロン酸は、水性媒体中で、グルコースと可逆的に反応してボロン酸エステルを形成し、そのような反応の程度は媒体中のグルコース濃度に関係する。より多くのグルコースを利用できるほど、消光の程度は低下する。その結果、消光体による蛍光発光の減衰は、検出されるポリヒドロキシル化合物（例えば、グルコース）の濃度に依存する。
【０１０４】
検出器１５は蛍光発光を検出するために使用され、好ましい実施形態では、分析のために電子制御装置２０に連結されていてもよい。光学フィルター、例えば１４は、波長選択のために、センサー１３と検出器１５の間に配置できる。他の光学部品、例えば、鏡、照準および／または焦点レンズ、ビームスプリッターなども利用できる。光ファイバーは、選択された波長をセンサーに送るために、および、センサーからの蛍光発光を検出器に送るために使用することができる。光源および検出器は、コンピューターなどの電子制御装置２０により制御できる。
【０１０５】
本発明のある実施形態は、単一の蛍光色素を用いてｐＨおよびポリヒドロキシル化合物濃度を測定するための方法を提供する。測定は、生体外または生体内で実施することができる。第１の測定を実施する前に、センサーの較正が必要なことがある。これは、まず、種々のｐＨレベルでセンサーの吸光度スペクトルを求め、等吸収点、および、酸型および塩基型に対する吸収極大が生じる波長を決定し、次いで、少なくとも１つの既知のｐＨおよびグルコース濃度において、これらの波長の少なくとも２つから発光信号を得ることにより行うことができる。
【０１０６】
ｐＨおよびポリヒドロキシル濃度測定のために、まず、センサー１３を試料と接触させて配置する。次いで、センサー１３に、第１の励起波長、続いて、第２の励起波長で照射する。第１および第２の励起波長は、典型的には、酸型の蛍光色素の吸収極大の波長（λ酸）、塩基型の蛍光色素の吸収極大の波長（λ塩基）、または、等吸収点の波長（λ等吸収点）、または他の選択された波長の近くで選択される。第１および第２の励起波長からの発光の比を使用して、試料のｐＨを決定する。第１または第２の発光は、一旦ｐＨに関して補正されれば、試料のグルコース濃度を決定するために使用できる。
【０１０７】
図１に示した検知装置の変形例において、検出器は、標準的なフォトダイオード検出器であってよい。２つのダイオード検出器、参照信号用のものと発光信号用のものがあってもよい。ダイオード検出器の代わりに、光ファイバー送達センサー出力（蛍光発光および／または反射励起光）は、分光光度計またはマイクロ分光計に直接入力できる。好ましい実施形態では、検出器は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ社製、ＵＶ／ＶＩＳマイクロ分光計モジュールなどのマイクロ分光計を含む。
【０１０８】
図２は、本発明の好ましい態様に従って使用することができる光学システムの一実施形態を示す。図２を参照すると、特定の実施形態は、少なくとも２つの光源３０１Ａおよび３０１Ｂを含む。光源は励起光を発生し、この励起光はコリメーターレンズ３０２Ａおよび３０２Ｂを通して送ることができる（図示される通り）。ある実施形態では、コリメーターレンズからの光を干渉フィルター３０３Ａおよび３０３Ｂに送ることができる（図示される通り）。ある実施形態では、干渉フィルターからの光を、焦点レンズ３０４Ａおよび３０４Ｂにより、光ファイバーライン３０５Ａおよび３０５Ｂに集めることができる（図示される通り）。ある実施形態では、これらの光ファイバーラインは合わさり、埋め込み指示体システム３０７Ａを有するセンサー３０７に続く単一ファイバー３０６に続く。ファイバーの横断面を、中心光ファイバーを取り囲むファイバーの束３０６Ａから、単一ファイバー３０７Ａに変えることもできる（図示される通り）。
【０１０９】
ある実施形態では（図示される通り）、指示体システム３０７Ａが発生する発光信号、および励起光信号は、鏡３０８により反射されて、センサーから光ファイバー出口ライン３０９および３０９Ａに送り返される。図示されるシステムでは、出口ラインは２つの干渉フィルター３１２Ａ、３１２Ｂおよび２つの検出器３１３Ａ、３１３Ｂを含むことによって増強される。好ましい実施形態では、干渉フィルター３１２Ａは、励起光を遮断し、発光を検出器３１３Ａに送り、ここで発光が検出されるように構成される。ある実施形態では、検出器３１３Ａが発生する信号は、増幅器３１４Ａにより増幅され、アナログ−デジタル変換器３１５Ａによりデジタル信号に変換されて、コンピューター３１６に送られる。ある実施形態では、干渉フィルター３１２Ｂは、発光を遮断し、励起光を検出器３１３Ｂに送り、ここで励起光が測定されるように構成される。ある実施形態では、検出器３１３Ｂが発生する信号は、増幅器３１４Ｂにより増幅され、アナログ−デジタル変換器３１５Ｂによりデジタル信号に変換されて、コンピューター３１６に送られる。比例計算を用いて、発光の強度に影響を及ぼすグルコースと関係がないファクターを除去または低減することができる。これらの方法は、本出願と同日に出願された、「Ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｕｓｉｎｇ  ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ  ｓｅｎｓｏｒｓ」という名称の同時係属中の米国仮特許出願第６０／８８８，４７７号に詳細に開示されている。それは、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１１０】
＜実施例１＞
図３は、蛍光色素（この場合はＨＰＴＳ）の励起／吸収スペクトルの一例を示す。異なるｐＨで得られた蛍光色素の吸収スペクトルから、λ酸、λ塩基およびλ等吸収点を決定することができる。より低いｐＨ（例えば、より酸性の条件）では、約４０５ｎｍのピークは約４６０ｎｍのピークより高く、従って、酸型の蛍光色素の吸収極大である。より高いｐＨ（例えば、より塩基性の条件）では、約４６０ｎｍのピークは約４０５ｎｍのピークより高く、従って、塩基型の蛍光色素の吸収極大である。λ等吸収点は、吸収がｐＨに依存しない波長であり、例えば、ＨＰＴＳでは約４２２ｎｍである。
【０１１１】
第１の励起波長（例えば、λ酸、λ塩基またはλ等吸収点）での照射の結果として生じる発光波長での第１の蛍光発光強度（Ｉｘ、これはＩ酸、Ｉ塩基またはＩ等吸収点であることができる）は、次いで、検出器により測定され、その結果は電子制御装置に保存される。次いで、センサーは、再び、第２の励起波長で照射される。第２の励起波長は第１の励起波長とは異なり、λ酸、λ塩基またはλ等吸収点から選択することもできる。検出器は、次いで、第２の励起波長（例えば、λ酸、λ塩基またはλ等吸収点）での照射の結果として生じる第２の蛍光発光強度（Ｉｙ、これはＩ酸、Ｉ塩基またはＩ等吸収点であることができる）を検出／測定する。次いで、第１および第２の蛍光発光の比（Ｉｘ／Ｉｙ）をコンピューターで計算できる。Ｉｘ／Ｉｙはポリヒドロキシル濃度に依存しないため、ポリヒドロキシル濃度の影響を考慮することなく、ｐＨ標準曲線（Ｉｘ／Ｉｙ対ｐＨ）をプロットできる。
【０１１２】
＜実施例２（ＨＰＴＳ／ＭＡＢＰ４）＞
図４は、ＨＰＴＳ／ＭＡＢＰ４を使用する比例的ｐＨ検知とＩ（塩基）／Ｉ（等吸収点）比の、グルコース濃度に依存しない関係を示す。ＭＡＢＰ４の構造は以下の通りである。
【０１１３】
【化１５】
0005631215.tif 000016
データを、種々のグルコース濃度での４５４ｎｍ（塩基）および４２２ｎｍ（等吸収点）での励起に対応する蛍光発光の比として、ｐＨに対してプロットする。グルコース濃度の変化は、それぞれ特定のｐＨでのＩ塩基／Ｉ等吸収点の値に認識可能な影響を及ぼさない。よって、試料中のポリヒドロキシル化合物濃度に関わらず、ｐＨに対するＩｘ／Ｉｙの標準曲線を使用して、試料のｐＨを測定できる。測定されたＩｘ／Ｉｙを標準曲線と相関させる、または比較することにより、測定中の試料のｐＨを決定できる。
【０１１４】
図５は、異なるｐＨで、４２２ｎｍ（等吸収点）で励起されたＨＰＴＳ／ＭＡＢＰ４のグルコース応答曲線を示す。グルコース濃度が０におけるＩｘ／Ｉｙ（Ｉ０）に対する種々のグルコースレベルにおけるＩｘ／Ｉｙ（Ｉ）の比をグルコース濃度に対してプロットすることにより、標準ポリヒドロキシル応答曲線を使用して、測定されたＩ／Ｉ０値より試料中のグルコース濃度を決定できる。しかしながら、Ｉ／Ｉ０値は試料のｐＨに依存するため、標準グルコース応答曲線は異なるｐＨにより影響を受けることがある。これを回避するために、生理学的範囲内の異なるｐＨでのいくつかの標準グルコース応答曲線をプロットでき、電子制御装置またはセンサー装置のオペレーターによる選択のために利用できる。試料のＩｘ／Ｉｙ測定が利用可能である場合、電子制御装置またはオペレーターはｐＨに対する標準Ｉｘ／Ｉｙ曲線から試料のｐＨを知り、正しい標準ポリヒドロキシル応答曲線（例えば、グルコース応答曲線）を正確なグルコース濃度を決定するために使用できる。図に示された例はグルコース濃度の決定に関するものであるが、本発明の方法および装置の用途はグルコース濃度を検出することに限定されない。蛍光系は、それがグルコースに応答するのと同様に、幾つかのポリヒドロキシル化合物に応答するため、これらのポリヒドロキシル化合物の濃度およびｐＨを同時に検出するためにセンサー装置を使用できる。
【０１１５】
＜実施例３（ＳＮＡＲＦ−１）＞
図６は、溶液中の異なるｐＨでのＳＮＡＲＦ−１の吸収スペクトルを示す。ＳＮＡＲＦは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社からの市販の色素の商標名である。これらの実験は、ＳＮＡＲＦ−１を使用して行った。図７および図８は、５１４ｎｍ励起／５８７ｎｍ発光（図７）または５１４ｎｍ励起／６２５ｎｍ発光（図８）で決定された異なるｐＨの溶液中のＳＮＡＲＦ−１／３，３’−ｏＢＢＶのグルコース応答曲線を示す。図９は、５１４ｎｍの単一励起波長および５８７ｎｍおよび６２５ｎｍの発光波長で決定されたＩ（塩基）／Ｉ（酸）比を使用して、溶液中、ＳＮＡＲＦ−１／３，３’−ｏＢＢＶを用いた、異なるグルコース濃度でのｐＨの比例的検知を示す。よって、消光体３，３’−ｏＢＢＶ（溶液中）と操作可能的に結合した二重−二重色素ＳＮＡＲＦ−１を単一励起体−二重発光体の蛍光色素体として使用し、比例的にｐＨを、そしてグルコースの両者を決定することができる。
【０１１６】
＜実施例４（ＨＰＴＳ−ｔｒｉＬｙｓＭＡ／３，３’−ｏＢＢＶ／ＤＭＡＡ）＞
図１０は、異なるｐＨでのＨＰＴＳ−ｔｒｉＬｙｓＭＡ／３，３’−ｏＢＢＶを含むＤＭＡＡヒドロゲル指示体システムのグルコース応答を示す。図１１は、Ｉ（塩基）／Ｉ（酸）比を使用して、同一のヒドロゲルを用いた、異なるグルコース濃度でのｐＨの比例的検知を示す。この指示体システムは、生理学的ｐＨ範囲に渡って、線形のｐＨ曲線を与えることが分かる。この例では、ヒドロゲルを光ファイバーの端部に埋め込んだ。酸および塩基発光信号は、手持ち式の検出器を使用して測定した。
【０１１７】
＜実施例５（ＨＰＴＳ−ｔｒｉＣｙｓＭＡ／３，３’−ｏＢＢＶ／ＤＭＭＡ）＞
図１２は、Ｉ（塩基）／Ｉ（酸）比を使用して、ＨＰＴＳ−ｔｒｉＣｙｓＭＡ／３，３’−ｏＢＢＶを含むＤＭＡＡヒドロゲル指示体システムを用いた、異なるグルコース濃度でのｐＨの比例的検知を示す。この指示体システムは、生理学的ｐＨ範囲に渡って、線形のｐＨ曲線を与えることが分かる。この例では、ヒドロゲルを光ファイバーの端部に埋め込んだ。酸および塩基発光信号は、手持ち式の検出器を使用して測定した。
【０１１８】
＜寿命化学＞
他の実施形態において、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の現象を利用することにより、グルコース濃度を決定することができる。ＦＲＥＴは、供与体蛍光色素体から受容体分子へのエネルギーの移動である。分子間相互作用によって供与体蛍光色素体が受容体にエネルギーを移動できるように、受容体分子が少なくとも一部を吸収する波長において蛍光を発する供与体蛍光色素体が受容体に近接している場合に、ＦＲＥＴが起きる。蛍光色素体の蛍光寿命は、ここで、蛍光寿命は蛍光色素体が励起状態のままである時間であるが、ＦＲＥＴによって変化する。よって、蛍光色素体の蛍光寿命を測定することよって、蛍光色素体が受容体に結合しているかどうかを決定することが可能になる。
【０１１９】
蛍光色素体を励起光の短いパルスで励起し、時間の経過に従って蛍光強度を測定する時間領域法を使用して、寿命を測定できる。励起パルスは、ピコ秒の範囲の持続時間から約数ナノ秒の持続時間までのレーザーからのパルスであることができる。他の実施形態においては、パルスの持続時間は、約数ナノ秒より長くてもよい。時間の関数としての蛍光色素体の蛍光強度は下式で与えられる。
【０１２０】
【数１】
0005631215.tif 000017
Ｉ（ｔ）は時間（ｔ）における蛍光強度であり、Ｉ０は励起後の初期強度であり、τは蛍光寿命であって、Ｉ（ｔ）がＩ０／ｅに減衰するのに必要な時間として定義される。蛍光が単一の指数関数的に減衰し、寿命が励起パルスより長い蛍光色素体に式１を適用することができる。図１３は、励起光４０２のパルス後、時間の経過に従って蛍光発光４００が減衰するグラフを示す。初期強度Ｉ０がＩ０／ｅに低下するのにかかる時間は、寿命τに等しい。
【０１２１】
寿命を測定する他の方法は、周波数変調励起光によって蛍光色素体を励起する周波数領域法である。励起光を基準として蛍光色素体からの発光の位相シフトを測定することにより、または、以下の式を使用して変調比を測定することにより蛍光寿命τを決定することができる。
【０１２２】
【数２】
0005631215.tif 000018
τφは、位相シフトφを測定することにより決定される寿命である。ωは周波数変調された励起光の角振動数であり、ｆは線形周波数である。τＭは、変調比Ｍを測定することにより決定される寿命である。ＡＣは信号の交流部分の大きさ、または波の振幅であり、一方、ＤＣは信号のＤＣ部分の振幅である。ＥＭは発光信号を指し、ＥＸは励起信号を指す。図１４は、発光信号５００と励起信号５０２の関係、および式２〜５に記載される変数を示すグラフである。
【０１２３】
ある実施形態において、平衡センサーにおいて使用するための結合アッセイの構成としては、可逆性競争的試薬限定結合アッセイが挙げられ、その構成要素は、被分析物類似体と、対象の被分析物および被分析物類似体の両者と可逆的に結合できる被分析物結合剤を含む。対象の被分析物および被分析物類似体は、競争的に、被分析物結合剤の同一結合部位に結合する。そのような競争的結合アッセイの構成は臨床診断の分野においてよく知られており、一例として、Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｄａｖｉｄ  Ｗｉｌｄ編、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｒｅｓｓ、１９９４年に記載されている。本アッセイにおける使用に適切な被分析物結合剤としては、被分析物結合部位を保持している抗体または抗体断片（例えば、Ｆａｂ断片など）、レクチン類（例えば、コンカナバリンＡ）、ホルモン受容体、薬物受容体、アプタマーおよび分子インプリントポリマーが挙げられる。好ましくは、被分析物類似体は、それがセンサー外に自由に拡散できないように、被分析物より高分子量の物質でなければならない。例えば、グルコースのためのアッセイでは、デキストランなどの高分子量グルコースポリマーを被分析物類似体として用いることができる。
【０１２４】
本発明に従ってアッセイ読取りとして使用できる適当な光信号としては、近接アッセイによって生じることができる任意の光信号が挙げられ、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動、蛍光偏光、蛍光消光、リン光技術、発光増強、発光消光、回折またはプラズモン共鳴によって生じるものなどである。
【０１２５】
本発明のセンサーのある実施形態では、蛍光共鳴エネルギー移動の技術を使用して光学的な読取りを生じる競争的試薬限定結合アッセイを組み込む。このアッセイ方式では、第１の発色団で被分析物類似体をラベルし、第２の発色団で被分析物結合剤をラベルする。第１および第２の発色団の一方は供与体発色団として働き、他方は受容体発色団として働く。結合剤により供与体発色団と受容体発色団が近接すると、通常は（供与体発色団によって吸収される波長の入射放射線の照射に続いて）供与体発色団が発光する蛍光を生成するはずのエネルギーの一部が隣接する受容体発色団に非放射的に移動することになり（当該技術分野においてＦＲＥＴとして知られているプロセス）、その結果、供与体発色団が発光する蛍光信号の一部が消光し、場合によっては、受容体発色団が蛍光を発光するように、供与体発色団の蛍光発光スペクトルが受容体発色団の吸収スペクトルと重なることが本アッセイの重要な特徴である。蛍光共鳴エネルギー移動は、一般に、被分析物類似体が被分析物結合剤に結合することによって供与体発色団と受容体発色団が近接するときにのみ起こる。よって、被分析物類似体と競争的に被分析物結合剤に結合する被分析物の存在下において、ラベルされた被分析物類似体が被分析物結合剤との結合から外れると、消光量が減少する（結果として、供与体発色団が発光する蛍光信号の強度が測定可能に増加するか、または、受容体発色団が発光する信号の強度が減少する）。よって、供与体発色団から発光される蛍光信号の強度または寿命は、センサーが浸漬されている流体中の被分析物の濃度と相関する。
【０１２６】
蛍光共鳴エネルギー移動アッセイ方式の追加の有利な特徴は、受容体発色団の吸収スペクトル内の波長の入射放射線ビームによる励起後の受容体発色団が発光する蛍光信号は、蛍光共鳴エネルギー移動のプロセスの影響を受けないという事実に起因する。従って、例えば、センサーを継続的に較正する、またはセンサーの劣化の程度をモニターし、それによって、センサーの交換が必要であることを示すための内部参照信号として、受容体発色団が発光する蛍光信号の強度を使用することが可能である。センサーが劣化すると、センサー内に存在する受容体発色団の量が減少し、よって、受容体発色団の励起の際に検出される蛍光信号強度も減少することになる。この信号が許容可能な基準レベル未満に低下することは、新しいセンサーの植込みまたは注入が必要であることを示す。本発明のセンサーにおいて使用するために適合させることができる蛍光共鳴エネルギー移動技術を使用する競争的結合アッセイは、当該技術分野で知られている。米国特許第３，９９６，３４５号明細書には、抗体と、蛍光体−消光体発色団一対の間の蛍光共鳴エネルギー移動を用いるイムノアッセイが開示されている。ＭｅａｄｏｗｓおよびＳｃｈｕｌｔｚ（Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ（１９９３年、２８０巻：２１〜３０頁）には、ラベルされたグルコース類似体（ＦＩＴＣでラベルされたデキストラン）とラベルされたグルコース結合剤（ローダミンでラベルされたコンカナバリンＡ）の間の蛍光共鳴エネルギー移動に基づいてグルコースを測定する均質アッセイ法が開示されている。これら全ての構成で、受容体および供与体発色団／消光体は、結合剤または被分析物類似体のいずれかに結合することができる。
【０１２７】
蛍光寿命または蛍光強度の測定を行うことができる。Ｌａｋｏｗｉｔｚら、Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、２７１巻、１９９３年、１５５〜１６４頁に記載されているように、位相変調技術によって蛍光寿命を測定できる。
【０１２８】
図１５Ａ、１５Ｂおよび１５Ｃにおいて示される実施形態では、ＦＲＥＴを用いてグルコースを測定するための競争的結合系は、供与体蛍光色素体６０２に結合したグルコース結合分子６００と、受容体分子６０６に結合したグルコース類似体６０４を含む。グルコース結合分子６００は、グルコース６０８およびグルコース類似体６０４の両者と結合できる。図１５Ａに示す通り、グルコース類似体６０４がグルコース結合分子６００に結合すると、蛍光色素体５０２が受容体６０６に近接するため、蛍光色素体６０２からの蛍光発光５００の大きさが低下し、ＦＲＥＴ６１０による位相および寿命がシフトする。他の実施形態においては、蛍光色素体６０２がグルコース類似体６０４に結合しており、受容体６０６がグルコース結合分子６００に結合している。
【０１２９】
図１５Ｂに示す通り、グルコース６０８は、グルコース類似体６０４と競争的にグルコース結合分子６００の結合部位に結合する。図１５Ｃに示す通り、ＦＲＥＴ６１０によって蛍光色素体６０２の発光寿命５００を受容体６０６が変えないように、グルコース分子６０８がグルコース結合分子６００からグルコース類似体６０４に取って代わることができる。
【０１３０】
ある濃度のグルコース結合分子、グルコース類似体およびグルコース分子が存在する系において、結合しているグルコース分子の数と、結合しているグルコース類似体の数との間に平衡が存在することになる。系中のグルコース分子の数が変化すると、結合しているグルコース分子と結合しているグルコース類似体との間の平衡が変化する。これにより、蛍光色素体発光の平均寿命が変化することになる。
【０１３１】
好ましい実施形態では、約１ＭＨｚ未満、約１〜２００ＭＨｚの間、または、約２００ＭＨｚより大きい周波数変調励起光により系を励起する。ある実施形態では、周波数は、約０．０５、０．１、１、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００ＭＨｚである。系の位相シフトの程度を測定することにより、上記の式２および式３によって定義される系の平均寿命値に対応する、系の平均ＦＲＥＴ誘発位相シフトを決定できる。位相シフトおよび寿命値の両者をグルコース濃度に相関させることができる。位相シフトの大きさは発光の振幅には依存しない。
【０１３２】
他の実施形態においては、パルスによって系を励起し、蛍光の経時減衰を測定する。上記の式１を使用して寿命を決定でき、グルコース濃度を寿命値に相関させることができる。
【０１３３】
ある実施形態では、グルコース結合分子およびグルコース類似体のヒドロゲル外への拡散が低減されるように、供与体蛍光色素体と共にグルコース結合分子と、受容体と共にグルコース類似体とを上記のヒドロゲル中に固定できる。加えて、上記の通り供与体蛍光色素体によって吸収される波長の励起光を与えるようにセンサーを構成する。ある実施形態では、レーザーまたは発光ダイオード（ＬＥＤ）からの短いパルスとして励起光を与える。他の実施形態においては、励起光は周波数変調される。ある実施形態では、レーザーによって、周波数変調励起光を与える。ある実施形態では、ＬＥＤによって、周波数変調励起光を与える。また、センサーは、経時における発光の振幅、および／または、発光の位相シフト、および／または、発光および励起光のＡＣおよびＤＣ部分の振幅を検出する検出器も有する。検出器は、１つの光検出器、または複数の光検出器であることができる。光ファイバーを介して、センサーを通して、励起光および発光を送ることができる。
【０１３４】
ある実施形態では、患者の血液中の被分析物の血管内濃度を測定するために、静脈、動脈または毛細血管などの患者の血管内にセンサーを導入することができる。ある実施形態では、上で更に詳細に記載したように、被分析物の濃度を測定するために使用される化学は、被分析物濃度に対する蛍光色素体の蛍光強度の相関に基づいている。ある実施形態では、上で更に詳細に記載したように、被分析物の濃度を測定するために使用される化学は、被分析物濃度に対する蛍光色素体の蛍光寿命の相関に基づいている。ある実施形態では、グルコースの濃度を測定するためにセンサーを使用する。
【０１３５】
＜厳密な血糖管理−Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈｅの研究＞
将来的な臨床研究において、Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈｅ（米国特許出願公開第２００２／０１０７１７８号明細書）は、入院以降に集中的なインシュリン治療を使用して、より厳密な代謝によってＣＩＰＮＰの罹患率を低減できるという仮説を検証した。２０００年２月２日から４月２５日の間で、４００人の患者がこの研究に含められた。彼らを、２つのインシュリン（Ｎｏｖｏ  ＮｏｒｄｉｓｋのＡｃｔｒａｐｉｄ  Ｈ  Ｍ  ＮｏｖｏＬｅｔ）治療計画の一方に無作為に割り当てた。
【０１３６】
（１）血液グルコースが２３０ｍｇ／ｄＬ（１３ｍｍｏｌ／Ｌ）より高い場合のみ、インシュリン注入を１Ｕ／時の用量で開始し、０．５〜１Ｕ／時の増加量で徐々に増量（血液グルコースレベルは２〜４時間ごとに制御）して、血液グルコースをこのレベル［１８０〜２００ｍｇ／ｄＬ（１０．３〜１１．２ｍｍｏｌ／Ｌ）］より低く保った。血液グルコースレベルが１８０ｍｇ／ｄＬに達したときに、インシュリン注入を停止する。
【０１３７】
（２）血液グルコースが１２０ｍｇ／ｄＬ（６．８ｍｍｏｌ／Ｌ）より高い場合、インシュリン注入を２Ｕ／時の用量で開始し、適当な増加量で徐々に増量（血液グルコースレベルは２〜４時間ごとに制御）して、血液グルコースレベルを正常に、従って、このレベル［８０〜１１０ｍｇ／ｄＬ（４．６〜６．１ｍｍｏｌ／Ｌ）］より低く保った。最大の１時間当たりのインシュリンの用量を、１時間当たり６０Ｕに設定する。血液グルコースレベルが８０ｍｇ／ｄＬに達すると、正常なレベルに再び達するまで、インシュリン注入を次第に少なくし、最終的に停止する。残存する胃の内容物を決定するために経腸チューブ栄養を中断している間は、カロリー摂取の減少に比例してインシュリン注入を低減する。
【０１３８】
（３）付随して、入院日には２０％グルコース注入を使用し、２日目以降は、通常のカロリー摂取（２５〜３５カロリー／ｋｇ体重／２４時間）、完全非経口、非経口／経腸の組み合わせ、または完全経腸栄養法のいずれかのバランスのとれた配合物（脂質として２０％〜４０％の非タンパク質カロリーおよび１〜２ｇ／ｋｇ体重／２４時間のタンパク質）とから成る標準化した摂食計画を使用して、患者を摂食させた。栄養の投与経路は、主治医による初期の経腸栄養法の実現可能性の評価に依存する。摂食法を含む他の全ての処置は、ＩＣＵ内で現在適用されている規則に従った。
【０１３９】
除外基準は、入院時に年齢が１８才未満であること、妊娠していること、および挿管されていないことであった。
【０１４０】
７日後も患者がＩＣＵ内で引き続き治療されている場合、週１回ＥＭＧ検査を行い、ＣＩＰＮＰの存在についてスクリーニングした。ＥＭＧは、常に同じ電気生理学の専門家によって判断された。患者の健康状態以外のファクター−例えば、病棟のベッドの利用可能性−によりしばしば決定されるＩＣＵ滞在期間を正確に評価するために、「ＩＣＵ滞在の最後」は、主治医が患者を「ＩＣＵから退室可能」と考えた日と定義した。
【０１４１】
合計８３人の患者が、最終的には、ＩＣＵで少なくとも１週間治療を受け、ＣＩＰＮＰの存在についてＥＭＧによりスクリーニングされた。「集中インシュリン計画」に無作為に割り当てられた群では、３８人の患者が７日間より長く滞在し、「制限的インシュリン計画」に無作為に割り当てられた群では、４５人の患者が７日間より長く滞在した。集中インシュリン群の３８人の長期滞在ＩＣＵ患者のうち１５人（または、長期滞在患者の３９％）はＩＣＵ滞在中のいずれの時にもＣＩＰＮＰについて陽性ＥＭＧを示したのに対し、制限的インシュリン群では４５人のうち３０人（または、６７％）であった（χ２乗検定でＰ＝０．０１）。集中インシュリン群では、患者１人当たりのＣＩＰＮＰについての陽性ＥＭＧの平均値±ＳＤ値は、０．９±１．８（中央値０）であったのに対し、制限的インシュリン群では１．８±２．１（中央値１）であった（マン−ホイットニーＵ検定でＰ＝０．０１５）。
【０１４２】
集中インシュリン群の長期滞在患者は、ＩＣＵでのＣＩＰＮＰなしの期間が２．１±１．８週であったのに対し、制限的インシュリン群では１．１±１．２週であった（不対スチューデントｔ検定でＰ＝０．００４）。
【０１４３】
ＩＣＵ死亡率は、２つの治療群の間で差は認められなかった（Ｐ＝０．４）。
【０１４４】
Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈｅは、本研究により、集中インシュリン治療による厳密な代謝制御、および血液グルコースレベルの正常範囲内での固定が、この障害を発症する患者においてＣＩＰＮＰの罹患率を著しく低下させ、ＣＩＰＮＰでない期間を長くすることが明らかになったと結論付けた。これは、ＩＣＵ患者において頻繁に発生し、重要なこの問題に対処する予防戦略を示す初めての研究であった。ＥＭＧで証明されるＣＩＰＮＰの存在はＩＣＵサポートの必要性を延長し、リハビリテーションに必要な期間を長期化することが示されているため、この治療は、ＩＣＵサポートの必要性を減らし、リハビリテーションの期間を短くすることになり、大幅なコストの削減をもたらすことができる。
【０１４５】
また、Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈｅは、将来性のある、無作為で、制御された研究も行った。集中治療室（ＩＣＵ）に入院し、機械的に換気されている成人患者のすべてが、研究の参加に適格であった。別の試験に参加している５人の患者、およびＩＣＵ入院時に瀕死の状態にあるか、あるいはＤＮＲ（蘇生不要）とされた９人の患者だけが除外された。入院時に、患者を、集中治療の間、間断なくインシュリンを注入して血糖の厳密な正常化（４．５〜６．１ｍｍｏｌ／Ｌ）を図る「集中インシュリン計画」（ＩＩＳ）、または血液グルコースが１２ｍｍｏｌ／Ｌを超えたときにインシュリンを開始し、血糖を１０〜１２ｍｍｏｌ／Ｌに保つ、現在使用されている「制限的インシュリン計画」（ＲＩＳ）のどちらかに無作為に割り当てた。暫定的な安全分析によって死亡率に違いがあることが明らかになり、本研究は倫理的な理由のために終了した。
【０１４６】
合計１５４８人の患者が含められ、ＩＩＳ群の７６５人、ＲＩＳ群の７８３人が参加に充分に適合していた。ＩＩＳにより、ＩＣＵ死亡率は４３％低下し（Ｐ＝０．００５）［ＲＩＳ群では６３人の死亡に対して、ＩＩＳ群では３５人。ＩＩＳについての死亡オッズ比は、ＩＣＵ死亡のすべての基準単変量予測因子について補正し、０．５２（０．３３〜０．８２）、Ｐ＝０．００４であった］、病院死亡率は３４％低下した（Ｐ＝０．０１）。死亡率の低下は、長期滞在のＩＣＵ患者でのみ起こり、敗血症を伴う多発性器官不全による死亡の防止のためであった。また、ＩＩＳにより、血流感染、腎不全、貧血および重症疾患多発性神経障害の罹患率、および透析または血液濾過、赤血球輸血、長期にわたる機械的換気補助および集中治療の必要性が減少した。本臨床的研究の更なる詳細は米国特許出願公開第２００２／０１０７１７８号明細書に開示されている。それは、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４７】
Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈｅによれば、外因性インシュリンによる厳密な代謝制御が罹患率および死亡率を低下させるため、重症疾患の間のグルコース代謝障害は「適応性があり、有益である」ことはないことがデータより示唆された。
【０１４８】
Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈｅの研究における第一の結果指標は、集中治療中の全ての原因による死亡であった。第二の結果指標は、院内死亡率、長期間の集中治療依存の発生率およびＩＣＵ再入院の必要性、機械的換気補助を含む生命維持に必要な器官系補助の必要性、腎代替療法（持続的または間欠的血液濾過または透析）、変力（筋肉収縮力増減）または昇圧（血管収縮）補助、重症疾患多発性神経障害の罹患率、炎症の程度、血流感染の罹患率および抗生物質の使用、輸血の必要、高ビリルビン血症の罹患率であった。更に、集中治療資源の使用を累積ＴＩＳＳスコアにより分析した。一般病棟のベッドの利用可能性など、患者とは無関係のファクターの影響をしばしば受けるＩＣＵ滞在期間を正確かつ客観的に評価するために、患者がもはや生命維持に必要な器官系の補助を必要とせず、カロリー要求量の少なくとも２／３を正常な経腸経路により投与されるようになった時、または実際に病棟に移される前の時に、その患者を「ＩＣＵから退室可能」と定義した。
【０１４９】
Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈｅは、１５４８人の患者が関与した別の研究を報告しており、ＲＩＳ群の７８３人およびＩＩＳ群の７６５人が無作為化に充分に適合していたが、ＩＩＳ患者は、ＲＩＳ患者と比較して、僅かに年齢が高く、肥満の傾向があった。患者の１３．２％は糖尿病歴があり、４．６％がインシュリン皮下注射による治療を受けており、８．６％が経口抗糖尿病剤の治療を受けていた。ＩＣＵ入院時に、７４．６％の患者が、一晩絶食した参照値と比較して、正常より高い血糖値を示し（６．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上）、５６％が、絶食した糖尿病の閾値より高い血液グルコースレベルを有していた（７ｍｍｏｌ／Ｌ以上）。しかしながら、１１．７％の患者だけは、入院時の血糖が非絶食の糖尿病の範囲内を示した（１１ｍｍｏｌ／Ｌ以上）。ＩＣＵ入院時における非絶食「糖尿病」血糖症は、糖尿病歴を有することとあまり相関がなく、糖尿病患者と分かっている人の１９．６％だけが、ＩＣＵ入院時の血液グルコースレベルが１１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であった。２つの研究群は、ＩＣＵ入院前に糖尿病と診断された率、および入院時の高血糖症の罹患率に関して同等であった。
【０１５０】
患者１人当たりの非タンパク質カロリーの平均および最大量（ＩＣＵ滞在の最初および最後の日は含まない）は、それぞれ、１９±７ｋｃａｌ／ｋｇ／２４時間および２４±１０ｋｃａｌ／ｋｇ／２４時間であった。食事中の窒素の平均および最大量は、それぞれ、０．１４±０．０６ｇＮ／ｋｇ／２４時間および０．１９±０．０８ｇＮ／ｋｇ／２４時間であった。摂食法の１日当たりの量および組成は、２つの群で同等であった。
【０１５１】
ＩＩＳ群において、９９％の患者が外因性インシュリンを必要とし、ＩＣＵ滞在の全期間、必要とした。血糖を、５．８±１．０ｍｍｏｌ／Ｌの平均午前レベルで、充分に抑制した。ＩＩＳ患者の０．１％だけは、４８時間以内に血液グルコースレベルが６．１ｍｍｏｌ／Ｌより下がらず、４８％は治療開始後に６．１ｍｍｏｌ／Ｌを超えず、１７％だけは時折８．４ｍｍｏｌ／Ｌを超えた。ＲＩＳ群における平均午前血糖は、８．５±１．８ｍｍｏｌ／Ｌであった。ＲＩＳ患者の３９％だけが実際にインシュリンを投与され、９．６±１．８ｍｍｏｌ／Ｌの平均午前血糖を示したのに対し、インシュリンを必要としないＲＩＳ患者では７．８±１．４ｍｍｏｌ／Ｌであった。
【０１５２】
ＩＩＳ治療を受けた３９人の患者では、血糖は一時的に２．３ｍｍｏｌ／Ｌより低下したが、ＲＩＳ群では６人の患者であった。そのような低血糖症の発症は常に速やかに処置され、血行動態の悪化または癲癇などの重篤な症状を誘発しなかった。
【０１５３】
ＩＩＳ群では、３５人の患者（４．６％）が集中治療の間に死亡したのに対し、ＲＩＳ群では６３人（８．１％）であり（Ｐ＝０．００５）、相対リスク減少率（ＲＲＲ）は４３％であった。集中治療の間に救命のために「治療必要例数」（ＮＮＴ）は２９であった。ＩＣＵ死亡率に対するＩＩＳの影響は、最初の２４時間のＡＰＡＣＨＥ  ＩＩおよびＴＩＳＳスコアとは無関係であった。また、治療介入効果は、心臓手術後の患者と、他のタイプの重症疾患に罹患している患者とで同様であった。実際にインシュリンを投与されているＲＩＳ患者のＩＣＵ死亡率は１２．４％であったのに対し、１２ｍｍｏｌ／Ｌより低く血糖を維持するためにインシュリンを必要としないＲＩＳ患者では５．２％であった（Ｐ＝０．０００３）。
【０１５４】
長期滞在ＩＣＵ患者の間で死亡率に差があるとの仮説が立てられたので、Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈｅのグループは、５日以下のＩＣＵ滞在患者および５日を超えるＩＣＵ滞在患者において、その効果をサブ分析した。５日以下のＩＣＵ滞在患者の最初の２４時間のＡＰＡＣＨＥ  ＩＩスコアは、中央値９（ＩＱＲ６〜１２）であり、患者の７５％は心臓手術後の患者であった。５日を超えるＩＣＵ滞在患者の最初の２４時間のＡＰＡＣＨＥ  ＩＩスコアは、中央値１２（８〜１５）であり、患者の６８％は心臓手術以外のタイプの重症疾患に罹患していた。５日を超えるＩＣＵ滞在患者の数は、ＩＩＳ群（２７％）とＲＩＳ群（３１％）において統計学的に差はなかった（Ｐ＝０．１）。５日以下のＩＣＵ滞在患者の死亡率は、ＩＩＳ群とＲＩＳ群で同等であった。よって、ＩＩＳによるＩＣＵ死亡率の低下は長期重症疾患コホートで選択的に起こり、絶対リスク減少率および相対リスク減少率は、それぞれ、９．６％および４７％であり、治療を受けた長期滞在患者の１１人に１人が命を救われた。
【０１５５】
ＩＣＵ死亡率に対する入院時のリスク因子すべてを、単変量分析を使用して決定した。これらには、最初の２４時間のＡＰＡＣＨＥ  ＩＩスコア、年齢、心臓手術以外のタイプの重症疾患、第三次紹介、悪性疾患歴および入院時の１１ｍｍｏｌ／Ｌ以上の血液グルコースレベルが含まれていた。引き続き、これらの因子を、無作為化インシュリン計画とともに、多変量ロジスティック回帰モデルに入れた。これにより、死亡率に対する独立のリスク因子は、最初の２４時間のＡＰＡＣＨＥ  ＩＩスコア、年齢、心臓手術以外のタイプの重症疾患、第三次紹介、およびインシュリン治療計画であることが明らかになった。ＩＣＵ死亡の他の基準単変量予測因子について補正した、ＩＩＳについての死亡オッズ比は、０．５２であった（９５％信頼区間０．３３〜０．８２）。集中治療中の死亡の原因の分析により、ＩＩＳは、特に、死後検査で判明した敗血症性病巣を伴う多発性器官不全による死亡のリスクを低減することが明らかになった。
【０１５６】
また、ＩＩＳは、全院内死亡率を１０．８％から７．１％にまで著しく低下させ（Ｐ＝０．０１）、相対リスク減少率は３４％であった。再度、この効果は、長期重症疾患コホートに限定された。
【０１５７】
ＩＩＳはＩＣＵ滞在期間を短くしたが、一方で、病院滞在期間は、２つの研究群の間で差は認められなかった。ＩＣＵ再入院率は２．１％であり、両群で同等であった。ＩＩＳ群において、長期間の機械的換気補助および腎代替療法を必要とする患者は、ＲＩＳ群と比較して、著しく少なかったが、一方で、変力または昇圧補助の必要性は同等であった。腎代替療法とは無関係に、ＲＩＳ群では腎機能パラメータがより阻害された。高ビリルビン血症の罹患率は、ＩＩＳ群で著しく低かった。
【０１５８】
血流感染においては４６％の減少があった。更に、炎症マーカーはより阻害されず、ＩＩＳ群で、抗生物質の長期間の使用（１０日を超える）が必要とされることが減少した。後者は、菌血症に対する効果に主として起因した（７５％の菌血症患者が１０日を超えて抗生物質で治療されたのに対し、非菌血症患者では１０％であった；Ｐ＜０．０００１）。死亡率は、菌血症ＩＩＳ患者（１２．５％）において、菌血症ＲＩＳ患者（２９．５％；Ｐ＝０．０６７）と比較して、より低い傾向にあった。インシュリンまたは抗生物質以外の薬物のＩＣＵでの使用においては、２つの群の間で差はなかった。
【０１５９】
１週間を超えるＩＣＵ滞在の患者を、重症疾患多発性神経障害について毎週スクリーニングした。第一に、ＩＣＵ滞在に対する効果により、より少ないＩＩＳ患者をスクリーニングした。第二に、ＩＩＳ群のスクリーニングした患者のうち、ＲＩＳ群と比較して、より少数が陽性ＥＭＧと判明した。スクリーニングした患者のうち、１人の患者における重症疾患多発性神経障害を予防するためのＮＮＴは４であった。更に、毎週のスクリーニングで繰り返し陽性ＥＭＧである患者の部分がより少ないことで示されるように、重症疾患多発性神経障害はＩＩＳ群でより急速に消散した。
【０１６０】
アミノグリコシドおよびグルココルチコイドの使用は、単変量分析による重症疾患多発性神経障害の決定要因であった。しかしながら、他の単変量予測因子とともに多変量ロジスティック回帰モデルに入ると、重症疾患多発性神経障害の独立した決定要因だけが残り、制限的インシュリン計画［または、２．６（１．６〜４．２）；Ｐ＝０．０００２］、３日を超える昇圧治療［または、２．５（１．４〜４．２）；Ｐ＝０．００１］、血流感染の獲得［または、２．３（１．３〜４．１）；Ｐ＝０．００６］および腎代替療法の受容［１．９（１．０〜３．８）；Ｐ＝０．０５］であった。
【０１６１】
重症疾患多発性神経障害のリスクを、患者１人当たりの実際の平均血糖の関数として両研究群で評価したとき、正の線形相関が得られた。
【０１６２】
ＩＩＳ患者における赤血球輸血の量は、ＲＩＳ患者のわずか半分であった。これは、彼らの更に低いレベルのヘモグロビンおよびヘマトクリットにより示されるように、ＲＩＳ患者における、より自由な輸血計画のためではなかった。
【０１６３】
累積ＴＩＳＳスコアは、患者１人当たり、およびＩＣＵ滞在当たりの治療介入数の指標である。長期滞在患者において選択的に、累積ＴＩＳＳスコア中央値の２０％の低下があった。研究の最終日における同等のＴＩＳＳスコアを考慮すると［両研究群において中央値３０（２６〜３８）］、この差は、長期ＩＣＵ滞在患者１人当たり２０％のコスト削減をもたらす。
【０１６４】
この大規模で、将来性のある、集中治療に依存する重症疾患患者の無作為化比較研究において、インシュリンを用いた６．１ｍｍｏｌ／Ｌ未満の厳密な血糖制御により、ＩＣＵ死亡率は４３％低下し、病院死亡率は３４％低下した。また、厳密な代謝制御は、血流感染、腎不全、貧血、重症疾患多発性神経障害および生命維持に必要な器官系障害の長期補助の必要性を予防することにより、罹患率を改善した。これらの顕著な利益は、潜在的な疾患のタイプおよび重篤度とは無関係であった。
【０１６５】
罹患率に対する有益な効果は、集中治療における幾つかの重要な問題のリスクを低減することと要約することができる。これらとしては、重症感染の感染と、その後の炎症性応答、腎不全の発症、胆汁鬱帯、貧血、重症疾患多発性神経障害、および筋肉の衰弱が挙げられる。これらの問題により、長期重症疾患の高い死亡率を考慮すると、しばしば無益なものとなる集中治療の必要性が持続する。
【０１６６】
結論として、集中治療中の厳密な血糖制御が罹患率および死亡率を低下させるため、重症疾患患者におけるグルコース代謝障害は「適応性があり、有益である」ことはないことがデータより示唆された。
【０１６７】
＜厳密な血糖管理を達成するための血管内平衡センサーの使用＞
上記のＶａｎ  Ｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈｅのデータと結論、およびＦｕｒｎａｒｙと同僚らによる先行刊行物（例えば、Ｚｅｒｒら、Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ、１９９７年、６３巻：３５６〜３６１頁参照）は、厳密な血糖管理によって、著しく合併症を低減でき、ＩＣＵ滞在を短縮でき、結果を改善できることを示唆している。残念ながら、著しい利益にも関わらず、介入前に血液グルコースレベルを２５０ｍｇ／ｄＬ以上にまで増加させることは、許容できる臨床ＩＣＵの実務だと依然考えられている。医療およびＩＣＵ従事者が、重症疾患患者において、血液グルコースを、例えば、好ましい目標濃度の約８０〜１１０ｍｇ／ｄｌ内で厳密に管理しようとしたくない理由は幾つかある。第一に、高レベルの血液グルコースは適応ストレス応答の一部である場合があり、ストレス中の低い血液グルコースレベルは免疫系および治癒に対して潜在的に有害であると一部の開業医は信じている（Ｍｉｚｏｃｋ  Ｂ、Ａ．Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ、１９９５年、９８巻：７５〜８４頁）。実際問題として、インシュリン投与後の連続的なグルコースのモニタリング、および血液グルコース濃度の変化の速度および方向（上昇、または低下）の信頼できる指示がなければ、ＩＣＵスタッフは、インシュリンによって誘発される急性低血糖症のリスクよりもむしろ、比較的高い血糖を許容して失敗する傾向がある。前述に鑑み、血液グルコース濃度がｐＨの変化について補正され、血液グルコースにおける変化の速度および方向を表示できるモニターにセンサーが操作可能的に連結されており、正確で連続的なグルコースのモニタリングが可能である血管内グルコースセンサーを使用することにより、重症疾患ＩＣＵ患者における厳密な血糖管理の臨床的利益を促進および増加できると本出願人は仮定した。
【０１６８】
よって、本発明の好ましい実施形態によれば、厳密な血糖管理を、それを必要とする患者において（好ましくは、集中治療室において治療を受けている患者において）達成するための方法が開示される。ただし、この厳密な血糖管理は、重症疾患多発性神経障害または他の合併症の少なくとも１つの罹患率および／または重篤性を低減するのに十分なものである。本方法は、患者の血管内に平衡グルコースセンサーを配置することと、血液グルコース濃度および血液グルコース濃度における変化の速度および方向を表示するモニターにセンサーを操作可能的に連結することと、任意選択で、血液グルコース濃度および／または変化の速度および方向が所定の範囲外に変化する場合、警報信号を発生することと、血液グルコース濃度が所定の範囲外に変化する場合、血液グルコース調節剤を投与することとを含み、ただし、血液グルコース調節剤は血液グルコース濃度を所定の濃度範囲内に戻す、および／または、上昇または低下の傾向を反転するのに十分な量で投与され、それにより、厳密血糖管理を達成する。所定の濃度範囲は約６０〜約１８０ｍｇ／ｄｌグルコースであることができ、より好ましくは約６０〜約１３０ｍｇ／ｄｌグルコース、更により好ましくは約８０〜約１１０ｍｇ／ｄｌであることができる。血液グルコース調節剤は、グルコース、またはインシュリン、またはインシュリン類似体あるいは誘導体、または他の血糖降下剤、または血液グルコースを調節する任意の既知の薬剤あるいは組み合わせであることができる。
【０１６９】
図１６Ａおよび図１６Ｂを参照し、内科的ＩＣＵおよび外科的ＩＣＵにおける典型的な血液グルコース濃度を示す。これらのデータは、Ｍａｄｅｒら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、サンフランシスコ、カリフォルニア州（２００７年）からである。網掛けバーは、目標血液グルコース範囲（８０〜１１０ｍｇ／ｄｌ）を示す。より太い線は、計算された平均を表し、多くの線は、個々の患者からのものである。明らかに、これらの患者集団において、時間の経過と共に血液グルコースは著しく変動しており、厳密な血糖管理を達成する試みには大きな課題がある。
【０１７０】
図１７Ａおよび図１７Ｂを参照し、本発明の好ましい実施形態による連続グルコースセンサー（−ＧｌｕＣａｔｈ）および血液グルコース測定の代表格であるＹｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製グルコース酸化酵素ラボ分析装置（●ＹＳＩ）について、生体外循環血液ループにおけるグルコース注入のグルコース経時測定の結果を比較する。この実験で使用されたＧｌｕＣａｔｈ平衡蛍光グルコースセンサーは、ＨＰＴＳ−ｔｒｉＣｙｓＭＡ色素および３，３’−ｏＢＢＶ消光体を含んでいた。図１７Ａは、循環グルコースの変化が５０〜４００ｍｇ／ｄｌの範囲内である８時間の経時変化を示す。図１７Ｂは、２時間の１０ｍｇ／ｄｌボーラス段階的投与の拡大図である。データは、平衡蛍光グルコースセンサーが、ＹＳＩラボ分析装置と同じ精度で、血液グルコースを連続的にモニタリングできることを示す。図１７Ｂの拡大図は、非常に低いレベルの血液グルコース（５０〜１００ｍｇ／ｄｌ）においてでさえも、迅速および正確に検知することを示す。このことは、他の検出装置では、そのような低い範囲における正確な検出を達成することが非常に困難であったため、驚くべきことである。１００ｍｇ／ｄｌ未満の正確で、確実な血液グルコース検知がなかったことにより、低くなり過ぎる臨床上のリスクが著しいので、目標血液グルコースレベルを維持するＩＣＵでの試みが妨げられてきた。
【０１７１】
図１８Ａおよび図１８Ｂを参照し、Ｂｌａｎｄ−Ａｌｔｍａｎプロットは、生体内血液グルコースモニタリングに関する、ラボ（実験室）対照と、指先穿刺ＰＯＣ（図１８Ａ）またはＧｌｕＣａｔｈ留置平衡蛍光グルコースセンサー（図１８Ｂ）のいずれかとの間の差を示す。図１８Ａは、臨床化学系と比較して、標準的な指先穿刺試験を使用する血液グルコース検出の結果を示す。２．１ｍｇ／ｄｌのバイアスで、９５％信頼限界は−２２．７から２８．４ｍｇ／ｄｌまで変化している。１００ｍｇ／ｄｌ未満の非常に小さな読み取りを見ることができることは注目すべきことである。図１８Ｂは、ＹＳＩラボ分析装置と比較して、ヒツジの血管内に配置されたＧｌｕＣａｔｈ連続平衡蛍光グルコースセンサーを使用する血液グルコース検出の結果を示す。その差は更に小さく、−１１．７〜１４．１ｍｇ／ｄｌの９５％信頼限界、および、わずか１．２ｍｇ／ｄｌのバイアスである。１００ｍｇ／ｄｌ未満の更に多数のデータ点がある。
【０１７２】
＜例＞
６５歳の男性が、開胸手術の後、集中治療室に入院する。彼が落ち着いた後、ＧｌｕＣａｔｈ光ファイバーセンサーを血管内に配置する。センサーは、この光ファイバーセンサーの遠位領域に沿って配置されたヒドロゲル内に固定され、３，３’−ｏＢＢＶ消光体に操作可能的に結合したＨＰＴＳ−ｔｒｉＣｙｓＭＡ色素を含む。センサーの近位端は、光源と、グルコース濃度、および血液グルコースレベルにおける変化の速度および方向を連続的に、かつ即時に表示するように構成されたプログラム化可能なモニターとに連結される。モニターは、血液グルコースが目標範囲外（８０ｍｇ／ｄｌ未満または１１０ｍｇ／ｄｌを超える）になった場合、警報を発するようにプログラムされている。血液グルコース動向の速度および方向と、血液グルコース濃度の連続読み取りにより、ＩＣＵ従事者は、介入が必要であるかを決定することができる。センサーがオンラインになると、直ちに、血液グルコース濃度がモニター上に３００ｍｇ／ｄｌと読み取られ、上昇していく。ＩＣＵ看護師は、血液グルコースレベルを目標範囲内にまで下げるために計算された用量で、インシュリンを投与する。数分以内に、血液グルコースは低下し始める。グルコースの低下が速過ぎて、目標の低濃度である８０ｍｇ／ｄｌを通り越してしまうことを医師は危惧する。２時間以内に、血液グルコース濃度は１００ｍｇ／ｄｌとなり、安定する。数時間の通常の看護の後、血液グルコース濃度が上昇し始める。グルコース濃度が１１０ｍｇ／ｄｌを超えると、ＩＣＵ従事者に、グルコースレベルが上昇していることをモニターの警報が警告する。ＩＣＵ看護師は、血液グルコースを所定の範囲内にまで低下させるのに十分な量のインシュリンを投与する。ＩＣＵ内において、その後の７日間、患者の血液グルコース濃度の厳密な管理をＩＣＵ従事者は維持することができる。回復は順調で、重症疾患多発性神経障害または他の合併症は観察されない。
【０１７３】
多数の本発明の好ましい実施形態およびそれの変形例を詳細に記載してきたが、他の改変、それの使用方法および医学的応用は当業者には明らかであろう。従って、本発明の精神または特許請求の範囲を逸脱することなく、種々の用途、改変および置換が均等であることが理解されるべきである。
【図１】
0005631215.tif 000019
【図２】
0005631215.tif 000020
【図３】
0005631215.tif 000021
【図４】
0005631215.tif 000022
【図５】
0005631215.tif 000023
【図６】
0005631215.tif 000024
【図７】
0005631215.tif 000025
【図８】
0005631215.tif 000026
【図９】
0005631215.tif 000027
【図１０】
0005631215.tif 000028
【図１１】
0005631215.tif 000029
【図１２】
0005631215.tif 000030
【図１３】
0005631215.tif 000031
【図１４】
0005631215.tif 000032
【図１５Ａ】
0005631215.tif 000033
【図１５Ｂ】
0005631215.tif 000034
【図１５Ｃ】
0005631215.tif 000035
【図１６Ａ】
0005631215.tif 000036
【図１６Ｂ】
0005631215.tif 000037
【図１７】
0005631215.tif 000038
【図１８Ａ】
0005631215.tif 000039
【図１８Ｂ】
0005631215.tif 000040