(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のＬ４１７Ｒ／Ｖ、Ｔ４３０Ａ／Ｍ、Ａ４３１Ｌ／Ｑ、Ｅ５０３Ａ／Ｖ、 Ｑ５１１Ｈ、Ａ５３５Ｒ、Ａ５３９ＲもしくはＮ５６３Ｉ／Ｋの変異から選択される２以上のアミノ酸置換、または親グルコアミラーゼ中の同等の変異に対応する２以上のアミノ酸置換を含んでいるグルコアミラーゼ変異体であって、配列番号１、２、３、５、６、７、８または９と少なくとも９０％の配列同一性を有するとともに、グルコアミラーゼ活性を有する、前記変異体。
【請求項２】
親グルコアミラーゼが、配列番号１、２、３、５、６、７、８もしくは９と少なくとも９０％の配列同一性を有する触媒ドメイン、または配列番号１もしくは２と少なくとも９０％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを有する、請求項１に記載されたグルコアミラーゼ変異体。
【請求項３】
配列番号１、２、３、５、６、７、８または９と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載されたグルコアミラーゼ変異体。
【請求項４】
配列番号１、２、３、５、６、７、８または９と少なくとも９９．５％の配列同一性を有する、請求項１に記載されたグルコアミラーゼ変異体。
【請求項５】
親グルコアミラーゼが、配列番号１または２である、請求項１に記載されたグルコアミラーゼ変異体。
【請求項６】
配列番号２の７０、１３７、１４１、１４３、１４６、１４８、１６９、２９７、３２１、３５０、３７５、３７６、４１５、４１８、４２１、４３３もしくは４３６の位置、または親グルコアミラーゼ中の同等の位置に対応する１以上のアミノ酸置換をさらに含んでなる、請求項１に記載されたグルコアミラーゼ変異体。
【請求項７】
配列番号２の７０、１３７、１４６、１４８、１６９、２９７、３５０、３７６、４３３もしくは４３６の位置、または親グルコアミラーゼ中の同等の位置に対応する１以上のアミノ酸置換をさらに含んでなる、請求項１に記載されたグルコアミラーゼ変異体。
【請求項８】
配列番号２の7０、１４１、１４６、１４８もしくは３７５の位置、または親グルコアミラーゼ中の同等の位置に対応する１以上のアミノ酸置換をさらに含んでなる、請求項１に記載されたグルコアミラーゼ変異体。
【請求項９】
以下の置換、すなわち配列番号２のＹ７０Ｒ／Ｋ／Ｍ／Ｐ／Ｇ／Ｌ／Ｆ、Ｎ１４６Ｓ／Ｇ／Ｃ／Ｈ／Ｅ／Ｄ／Ｔ／Ｗ／Ｌ／Ｆ／Ｍ、Ｑ１４８Ｖ／Ｙ／Ｈ／Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｇ／Ｍ／Ｒ／Ｓ／Ｔ、Ｙ１６９Ｄ／Ｆ、Ｔ３５０Ｓ／Ｅ／Ａ／Ｎ、Ｎ３７６Ｑ／Ｔ／Ｈ／Ｓ／Ｖ、Ｒ４３３Ｈ／ＱもしくはＩ４３６Ａ／Ｔの置換、または親グルコアミラーゼ中の同等の位置の置換のうちの１以上をさらに含んでなる、請求項１に記載されたグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１０】
親グルコアミラーゼが、トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、フミコーラ種（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｓｐｐ．）、ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、タラロミセス種（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓｅ ｓｐｐ．）またはシゾサッカロミセス種（ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒoｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）から得られたグルコアミラーゼから選択されてなる、請求項１〜９のいずれか１項に記載されたグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１１】
親グルコアミラーゼが、トリコデルマ種またはアスペルギルス種から得られてなる、請求項１０に記載されたグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１２】
親グルコアミラーゼと比較して変更された熱安定性を示してなる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載されたグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１３】
親グルコアミラーゼと比較して高められた熱安定性を示してなる、請求項１２に記載されたグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１４】
親グルコアミラーゼと比較して変更された比活性を示してなる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載されたグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１５】
親グルコアミラーゼと比較して高められた比活性を示してなる、請求項１４に記載されたグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１６】
親グルコアミラーゼと比較して高められた熱安定性および高められた比活性の双方を示してなる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載されたグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載された変異体をコードしてなるポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１７に記載されたポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載されたベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載されたグルコアミラーゼ変異体を含んでなる酵素組成物。
【請求項２１】
デンプン転化プロセスに用いられてなる、請求項２０に記載された酵素組成物。
【請求項２２】
アルコール発酵プロセスに用いられてなる、請求項２０に記載された酵素組成物。
【請求項２３】
前記グルコアミラーゼ変異体の発現および産生に適した条件下に請求項１９に記載された宿主細胞を培養する工程、および該グルコアミラーゼ変異体を産生する工程を含む、宿主細胞中のグルコアミラーゼ変異体を生産する方法。
【請求項２４】
前記培養物からグルコアミラーゼ変異体を回収する工程をさらに含む、請求項２３に記載された方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２００７年１１月２０日に出願された米国仮特許出願第６０／９８９，４２６号の利益を主張する。
［配列表］
また、同米国仮特許出願には配列番号１〜１６７を含む配列表が添付されており、これは参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。
【０００２】
グルコアミラーゼ変異体は、有利なことに、変更された性質（たとえば、改良された熱安定性および／または比活性）を有する。変異体グルコアミラーゼを含んでいる組成物、該変異体をコードするＤＮＡ構築体、および宿主細胞中でグルコアミラーゼ変異体を産生する方法が提供される。
【背景技術】
【０００３】
グルコアミラーゼ酵素（グルカン１，４−α−グルコヒドロラーゼ、ＥＣ  ３．２．１．３）は、デンプン加水分解性エキソ作用型カルボヒドラーゼであり、これはデンプンまたは関連するオリゴ糖および多糖の分子の非還元性末端からグルコース単位を連続的に除去する反応を触媒する。グルコアミラーゼは、デンプンの直鎖状および分枝鎖状のグルコシド結合の双方（たとえば、アミロースおよびアミロペクチン）を加水分解することができる。
【０００４】
グルコアミラーゼは、非常に多くの細菌、真菌、酵母菌および植物の株によって産生される。とりわけ関心が高く、かつ商業的に重要なグルコアミラーゼは、細胞外に産生される真菌酵素、たとえばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（非特許文献１〜３および特許文献１〜３）、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）（特許文献４〜６）、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）（非特許文献４、５および特許文献７）、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）（特許文献８および９）およびムコール属（Ｍｕｃｏｒ）（非特許文献６）の菌株から産生される真菌酵素である。これらの酵素をコードする遺伝子の多くはすでにクローニングされており、酵母菌、真菌および／または細菌の細胞に発現されている。
【０００５】
グルコアミラーゼは商業的に非常に重要な酵素であり、デンプンの加水分解を必要とする多種多様な（たとえば、デンプンからグルコースおよび他の単糖を生産するための）用途に用いられている。グルコアミラーゼは、高フルクトースのトウモロコシ甘味料を製造するために用いられており、これは米国における甘味料市場の５０％超を構成する。一般に、グルコアミラーゼはデンプン加水分解プロセスにアルファアミラーゼとともに用いられることができ、かつ通常、用いられており、デンプンをデキストリンへ、そしてそれからグルコースへ加水分解する。グルコースは次に他の酵素（たとえば、グルコースイソメラーゼ）によってフルクトースに転化され、結晶化され、または発酵に用いられて、非常に多くの最終製品（たとえば、エタノール、クエン酸、乳酸、サクシネート、アスコルビン酸中間体、グルタミン酸、グリセロールおよび１，３−プロパンジオール）を生産することができる。デンプンおよび／またはセルロース含有物質の発酵にグルコアミラーゼを用いることによって生産されたエタノールは、燃料源としてまたはアルコールとしての消費のために使用されることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，０２４，９４１号明細書
【特許文献２】米国特許第４，７９４，１７５号明細書
【特許文献３】国際公開第８８／０９７９５号パンフレット
【特許文献４】米国特許第４，２４７，６３７号明細書
【特許文献５】米国特許第６，２５５，０８４号明細書
【特許文献６】米国特許第６，６２０，９２４号明細書
【特許文献７】米国特許第４，８６３，８６４号明細書
【特許文献８】国際公開第０５／０５２１４８号パンフレット
【特許文献９】米国特許第４，６１８，５７９号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｖｅｎｓｓｏｎら、Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９８３年、第４８巻、ｐ．５２９−５４４
【非特許文献２】Ｂｏｅｌら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９８４年、第３巻、ｐ．１０９７−１１０２
【非特許文献３】Ｈａｙａｓｈｉｄａら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８９年、第５３巻、ｐ．９２３−９２９
【非特許文献４】Ａｓｈｉｋａｒｉら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８６年、第５０巻、ｐ．９５７−９６４
【非特許文献５】Ａｓｈｉｋａｒｉら、Ａｐｐ．Ｍｉｃｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１９８９年、第３２巻、ｐ．１２９−１３３
【非特許文献６】Ｈｏｕｇｈｔｏｎ−Ｌａｒｓｅｎら、Ａｐｐ．Ｍｉｃｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００３年、第６２巻、ｐ．２１０−２１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
グルコアミラーゼは、商業用途に長年成功裡に使用されてきたけれども、変更された性質、たとえば改良された比活性および高められた熱安定性を有する新規なグルコアミラーゼの必要が依然として存在する。
【０００９】
熱安定性および比活性を高める種々の変異が、アスペルギルス属のグルコアミラーゼに行われている。米国特許第６，５３７，７９２号、米国特許第６，３５２，８５１号、Ｃｈｅｎら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．、１９９６年、第９巻、ｐ．４９９−５０５、Ｃｈｅｎら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．、１９９５年、第８巻、ｐ．５７５−５８２、Ｆｉｅｒｏｂｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９６年、第３５巻、ｐ．８６９８−８７０４、およびＬｉら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．、１９９７年、第１０巻、ｐ．１１９９−１２０４が参照される。親グルコアミラーゼに対して変更された性質を有するグルコアミラーゼ変異体を提供する必要が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示発明は、親グルコアミラーゼのグルコアミラーゼ変異体に関する。該グルコアミラーゼ変異体は、触媒ドメインおよび／またはデンプン結合ドメイン内にアミノ酸置換を有する。
【発明の効果】
【００１１】
該変異体は変更された性質、たとえば改良された熱安定性および／または比活性を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１Ａは、６３２のアミノ酸を有するトリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ）である親グルコアミラーゼ（配列番号１）を示す図である。シグナルペプチドは下線で、アミノ酸残基ＳＶＤＤＦＩ（配列番号１６０）から始まりかつ４５３のアミノ酸残基を有する触媒領域（配列番号３）は太字で示される。リンカー領域はイタリック体で、デンプン結合ドメイン（配列番号１６１）はイタリック体かつ下線で示される。触媒ドメイン（配列番号３）、リンカー領域、およびデンプン結合ドメイン（配列番号１６１）を含む成熟タンパク質は配列番号２によって表される。図１Ｂは、ＴｒＧＡをコードするｃＤＮＡ（配列番号４）を示す図である。
【図２】親ＴｒＧＡのｃＤＮＡ（配列番号４）を含むプラスミドｐＤＯＮＲ−ＴｒＧＡを示す図である。
【図３】図３ＡはプラスミドｐＲＥＰ３Ｙ−ＤＥＳＴを、および図３ＢはｐＲＥＰ３Ｙ−ＴｒＧＡを示す図である。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、アスペルギルスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）（ＡａＧＡ）（配列番号５）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）（ＡｎＧＡ）（配列番号６）、アスペルギルスオリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）（ＡｏＧＡ）（配列番号７）、トリコデルマレーシ（ＴｒＧＡ）（配列番号３）、フミコーラグリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）（ＨｇＧＡ）（配列番号８）、およびハイポクレアビノサ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｖｉｎｏｓａ）（ＨｖＧＡ）（配列番号９）に由来するグルコアミラーゼを含む親グルコアミラーゼの触媒ドメインのアラインメント比較を示す図である。同一のアミノ酸はアスタリスク（＊）によって示される。図４Ｃおよび４Ｄは、トリコデルマレーシ（ＴｒＧＡ）（配列番号１６１）、フミコーラグリセア（ＨｇＧＡ）（配列番号１６２）、シエラビアテレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）（ＴｔＧＡ）（配列番号１６３）、テルモミセスラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）（ＴｈＧＡ）（配列番号１６４）、タラロミセスエメルソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）（ＴｅＧＡ）（配列番号１６５）、アスペルギルスニガー（ＡｎＧＡ）（配列番号１６６）およびアスペルギルスアワモリ（ＡａＧＡ）（配列番号１６７）を含む親グルコアミラーゼのデンプン結合ドメイン（ＳＢＤ）を比較するアラインメントを示す図である。同一のアミノ酸はドット（．）によって示される。
【図５】図５ＡはプラスミドｐＴｒｅｘ３ｇ−ＤＥＳＴを示す図である。図５ＢはプラスミドｐＴｒｅｘ３ｇ−ＴｒＧＡを示す図である。これらのプラスミドは、トリコデルマレーシ宿主中の変異体グルコアミラーゼの発現および産生のための発現ベクターとして用いられた。
【図６】実施例８でさらに検討されるように、６０℃および３２℃における、親（野生型）ＴｒＧＡと変異体であるＶ３１４、Ｓ２１１Ｒ、Ｑ１７２ＦおよびＱ２０８Ｎとの間のＶｍａｘ（グルコースμＭ／秒）の比較を示すグラフである。
【図７】デンプン基質上での組み合わせ変異体の活性を示すグラフである。本図に記載された組み合わせ変異体は、ＥＴ７−１（Ｄ２４Ｙ／Ｖ１８１Ｌ／Ｑ２０８Ｃ／Ｇ２９４Ａ／Ｔ３５３Ｒ／Ｎ３７５Ｎ／Ｎ４０９Ｗ）、ＬＲ８（Ｑ１７２Ｆ／Ｑ２０８Ｎ）、ＬＲ１２（Ｑ１７２Ｆ／Ｓ２１１Ｒ）、ＬＲ６（Ｑ１７２Ｆ／Ｑ２０８Ｎ／Ｖ３１４Ｈ）、ＥＴ８−１（Ｄ２４Ｅ／Ｖ１８１Ｋ／Ｅ２４３Ｙ／Ｉ２９２Ｖ／Ｇ２９４Ｑ／Ｎ４０９Ｋ）およびＥＴ７−２（Ｑ２４Ｌ／Ｖ１８１Ｌ／Ｑ２０８Ｃ／Ｇ２９４Ａ／Ｔ３５３Ｒ／Ｎ３７５Ｑ／Ｎ４０９Ｗ)を含む。示されたグルコアミラーゼ変異体ｎｇの関数としての３４０ｎｍにおける吸光度の単位で、活性は表される。
【図８】コーンスターチ基質上での単一部位変異体の活性を示すグラフである。本図に記載された単一部位変異体は、Ｖ３１４Ｈ、Ｇ２９４Ｑ、Ｓ２１１Ｒ、Ｑ２０８Ｎ、Ｑ１７２Ｆ、Ｇ２９４ＩおよびＰ９４Ｎを含む。示されたグルコアミラーゼ変異体ｎｇの関数としての３４０ｎｍにおける吸光度の単位で、活性は表される。
【図９】液化コーンマッシュ（ＮＥ）のサンプル上でのＴｒＧＡおよびＴｒＧＡ変異体ＬＲ８（Ｑ１７２Ｆ／Ｑ２０８Ｎ）のグルコアミラーゼ活性を示すグラフである。
【図１０】液化コーンマッシュ（ＢＳＥ）のサンプル上でのＴｒＧＡおよびＴｒＧＡ変異体ＬＲ８（Ｑ１７２Ｆ／Ｑ２０８Ｎ）の活性プロフィールを示すグラフである。
【図１１】可溶性コーンスターチ基質サンプル上でのＴｒＧＡおよびＴｒＧＡ変異体ＬＲ８（Ｑ１７２Ｆ／Ｑ２０８Ｎ）の活性プロフィールを示すグラフである。
【図１２】側面から見たトリコデルマレーシグルコアミラーゼ（黒色）（配列番号２）およびアスペルギルスアワモリグルコアミラーゼ（灰色）の三次元構造の比較を示す図である。
【図１３】上面から見たトリコデルマレーシグルコアミラーゼ（黒色）およびアスペルギルスアワモリグルコアミラーゼ（灰色）の三次元構造の比較を示す図である。
【図１４】図１４ＡはプラスミドｐＴＴＴ−Ｄｅｓｔを示す図である。図１４ＢはプラスミドｐＴＴＴ−ＴｒＧＡ（Ｂ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１の側面では、本開示発明は、配列番号２の６１、７３、４１７、４３０、４３１、５０３、５１１、５３５、５３９もしくは５６３の位置、または親グルコアミラーゼ中の同等の位置に対応する２以上のアミノ酸置換を含んでいるグルコアミラーゼ変異体に関する。他の実施態様では、本開示発明は、配列番号１、２、３、５、６、７、８または９の親グルコアミラーゼと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９．５％の配列同一性を有するグルコアミラーゼ変異体に関する。１の実施態様では、親グルコアミラーゼは、配列番号１、２、３、５、６、７、８もしくは９と少なくとも８０％の配列同一性を有する触媒ドメイン、または配列番号１もしくは２と少なくとも８０％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを有する。他の側面では、親グルコアミラーゼは配列番号１または２である。本開示発明のさらなる側面は、配列番号２の４、５、１２、２４、４３、４４、４５、４６、４７、４９、５１、７０、７５、６、９４、１００、１０８、１１４、１１６、１１９、１２２、１２４、１２５、１３７、１４１、１４３、１４６、１４８、１６９、１７１、１７２、１７５、１７８、１８０、１８１、２０８、２１１、２２８、２４２、２４３、２４５、２９２、２９４、１９７、３０９、３１０、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３２１、３４０、３４１、３５０、３５３、３５６、３６３、３６８、３６９、３７５、３７６、３９５、３９８、４０１、４０８、４０９、４１２、４１５、４１８、４２１、４３３、４３６もしくは４５１の位置、または親グルコアミラーゼ中の同等の位置に対応する１以上のアミノ酸置換をさらに含んでいるグルコアミラーゼ変異体に関する。ある側面では、グルコアミラーゼ変異体は、配列番号２の４、５、２４、２９、４３、４４、４９、７０、７５、７６、１００、１０８、１１９、１２４、１３７、１４６、１４８、１６９、１７１、１７２、１７５、１７８、１８１、２０８、２１１、２４３、２９２、２９４、２９７、３１４、３１６、３１７、３４０、３４１、３５０、３５６、３６３、３６８、３６９、３７６、３９５、４０１、４１２、４３３、４３６もしくは４５１の位置、または親グルコアミラーゼ中の同等の位置に対応する１以上のアミノ酸置換をさらに含んでいる。ある側面では、該グルコアミラーゼは、配列番号２の５、２４、４３、４４、４９、7０、７５、７６、９４、１１９、１４１、１４６、１４８、１７２、１７５、１７８、１８０、1８１、２０８、２１１、２４３、２９４、３０９、３１４、３５３、３６９、３７５もしくは４０９の位置、または親グルコアミラーゼ中の同等の位置に対応する１以上のアミノ酸置換をさらに含んでいる。ある側面では、該グルコアミラーゼは、配列番号２の４３、４４もしくは２９４の位置、または親グルコアミラーゼ中の同等の位置に対応する１以上のアミノ酸置換をさらに含んでいる。
【００１４】
本発明のさらなる側面では、グルコアミラーゼ変異体は、配列番号２のＮ６１Ｉ、Ｇ７３Ｆ、Ｌ４１７Ｒ／Ｖ、Ｔ４３０Ａ／Ｍ、Ａ４３１Ｌ／Ｑ、Ｅ５０３Ａ／Ｖ、 Ｑ５１１Ｈ、Ａ５３５Ｒ、Ａ５３９ＲもしくはＮ５６３Ｉ／Ｋの位置、または親グルコアミラーゼ中の同等の位置に対応する２以上のアミノ酸置換を含んでいる。ある側面では、グルコアミラーゼ変異体は、以下の置換、すなわち配列番号２のＤ４Ｌ／Ｅ／Ｒ／Ｓ／Ｃ／Ａ／Ｑ／Ｗ、Ｆ５Ｃ／Ｍ／Ｎ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ、Ｉ１２Ｌ／Ｒ、Ｄ２４Ｅ／Ｌ／Ｙ／Ｔ、Ｆ２９Ｌ／Ｉ／Ｄ／Ｃ／Ｓ／Ｖ／Ｗ、Ｉ４３Ｆ／Ｒ／Ｄ／Ｙ／Ｓ／Ｑ、Ｄ４４Ｅ／Ｈ／Ｋ／Ｓ／Ｎ／Ｙ／Ｆ／Ｒ／Ｃ、Ｙ４７Ｗ、Ｙ４９Ｎ、Ｑ７０Ｒ／Ｋ／Ｍ／Ｐ／Ｇ／Ｌ／Ｆ、Ｑ７５Ｒ／Ｋ／Ａ、Ｒ７６Ｌ／Ｍ／Ｋ／Ｔ／Ｐ、Ｐ９４Ｌ、Ｄ１００Ｗ／Ｉ／Ｑ／Ｍ／Ｐ／Ａ／Ｎ、Ｎ１１９Ｐ／Ｔ／Ｙ／Ｄ／Ｅ、Ｎ１４６Ｓ／Ｇ／Ｃ／Ｈ／Ｅ／Ｄ／Ｔ／Ｗ／Ｌ／Ｆ／Ｍ、Ｑ１４８Ｖ／Ｙ／Ｈ／Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｇ／Ｍ／Ｒ／Ｓ／Ｔ、Ｙ１６９Ｄ／Ｆ、Ｑ１７２Ｃ／Ａ／Ｄ／Ｒ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｖ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、Ｆ１７５Ｈ／Ａ／Ｇ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｃ／Ｗ／Ｙ、Ｗ１７８Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｋ／Ｎ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ、Ｅ１８０Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ、Ｖ１８１Ｅ／Ｃ／Ｄ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｐ／Ｔ／Ｙ／Ｓ／Ｌ／Ｋ／Ｆ／Ａ、Ｑ２０８Ｌ／Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｎ／Ｆ／Ｈ／Ｔ、Ｓ２１１Ｃ／Ｒ／Ｅ／Ａ／Ｙ／Ｗ／Ｍ／Ｈ／Ｌ／Ｉ／Ｒ／Ｑ／Ｔ、Ｅ２４３Ｓ／Ｒ／Ｎ／Ｍ／Ｙ／Ａ／Ｌ、Ｒ２４５Ａ／Ｅ／Ｍ／Ｉ／Ｐ／Ｖ、Ｉ２９２Ｄ／Ｈ／Ｐ／Ｒ／Ｔ／Ｎ／Ｖ／Ｆ／Ｌ、Ｇ２９４Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｔ／Ｑ／Ｉ／Ａ、Ｋ２９７Ｆ／Ｌ／Ｐ／Ｔ／Ｍ／Ｄ／Ｎ／Ｑ／Ａ／Ｙ／Ｈ／Ｓ／Ｒ／Ｗ、Ｒ３０９Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｌ、Ｙ３１０Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｐ／Ｓ／Ｗ／Ｒ／Ｑ、Ｄ３１３Ｑ、Ｖ３１４Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｅ／Ｑ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｆ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ、Ｙ３１５Ｆ、Ｙ３１６Ｑ／Ｒ、Ｎ３１７Ｔ／Ｈ、Ｋ３４０Ｄ／Ｔ、Ｋ３４１Ｆ／Ｄ／Ｐ／Ｖ／Ｇ／Ｓ、Ｔ３５０Ｓ／Ｅ／Ａ／Ｎ、Ｑ３５６Ｈ／Ｄ／Ｅ、Ｔ３６３Ｌ／Ｒ／Ｃ／Ｈ／Ｗ、Ｓ３６８Ｗ／Ｄ／Ｆ／Ｌ、Ｓ３６９Ｆ、Ｎ３７６Ｑ／Ｔ／Ｈ／Ｓ／Ｖ、Ｙ３９５Ｑ／Ｒ／Ｓ、Ａ３９８Ｓ／Ｉ／Ｔ、Ｓ４０１Ｃ／Ｖ、Ｒ４０８Ｓ、Ｎ４０９Ｗ／Ｔ／Ｋ、Ｔ４１２Ａ／Ｈ／Ｋ／Ｇ、Ｒ４３３Ｈ／Ｑ、Ｉ４３６Ａ／ＴもしくはＳ４５１Ｍ／Ｔ／Ｈの置換、または親グルコアミラーゼ中の同等の位置の置換のうちの１以上をさらに含んでいる。ある側面では、グルコアミラーゼ変異体は、以下の置換、すなわち配列番号２のＩ４３Ｆ／Ｒ／Ｄ／Ｙ／Ｓ／Ｑ、Ｄ４４Ｅ／Ｈ／Ｋ／Ｓ／Ｎ／Ｙ／Ｆ／Ｒ／ＣもしくはＧ２９４Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｔ／Ｑ／Ｉ／Ａの置換、または親グルコアミラーゼ中の同等の位置の置換のうちの１以上をさらに含んでいる。
【００１５】
１の側面では、本開示発明は、配列番号２のＩ４３Ｑ／Ｄ４４Ｃ、Ｄ４４Ｃ／Ｇ２９４Ｃ、Ｉ４３Ｑ／Ｇ２９４ＣもしくはＩ４３Ｑ／Ｄ４４Ｃ／Ｇ２９４の位置、または親グルコアミラーゼ中の同等の位置に対応するアミノ酸置換を含んでいる変異体グルコアミラーゼに関する。該グルコアミラーゼ変異体は、配列番号１、２、３、５、６、７、８または９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９．５％の配列同一性を有する。１の実施態様では、親グルコアミラーゼは、配列番号１、２、３、５、６、７、８もしくは９と少なくとも８０％の配列同一性を有する触媒ドメイン、または配列番号１もしくは２と少なくとも８０％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを有する。
【００１６】
親グルコアミラーゼは、トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、フミコーラ種（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｓｐｐ．）、ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）、タラロミセス種（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓｅ  ｓｐｐ．）またはシゾサッカロミセス種（ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒoｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）のうちのいずれかから得られた酵素であることができる。ある側面では、親グルコアミラーゼは、トリコデルマ種またはアスペルギルス種からのものであることができる。
【００１７】
１の側面では、変異体グルコアミラーゼは、親グルコアミラーゼと比較して変更された熱安定性を示す。変更された熱安定性とは高められた熱安定性であることができる。これに代わり、またはこれに加えて、該変異体は、親グルコアミラーゼと比較して変更された比活性を示す。変更された比活性とは高められた比活性であることができる。
【００１８】
本開示発明のさらなる側面は、上記の変異体をコードするポリヌクレオチドである。さらなる態様は該ポリヌクレオチドを含んでいるベクターである。さらなる態様は該ベクターを含んでいる宿主細胞である。
【００１９】
本開示発明のさらなる側面は、グルコアミラーゼ変異体を含んでいる酵素組成物である。１の側面では、該酵素組成物はデンプン転化プロセスまたはアルコール発酵プロセスに用いられる。
【００２０】
本発明のさらなる側面は、グルコアミラーゼ変異体の発現および産生に適した条件下に該ポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を培養する工程、および該変異体を産生する工程によって変異体グルコアミラーゼを産生する方法である。該方法は該培養物からグルコアミラーゼ変異体を回収する工程も含むことができる。
【００２１】
グルコアミラーゼは、デンプンの加水分解を必要とする多種多様な用途において商業的に重要な酵素である。本明細書に記載されたグルコアミラーゼ変異体は、触媒ドメインまたはデンプン結合ドメイン内にアミノ酸置換を有している。該変異体は、変更された性質、たとえば改良された熱安定性および／または比活性を示すことができる。改良された熱安定性および／または比活性を有する変異体は、たとえばコーンスターチからのグルコースおよび燃料エタノールの生産の効率を有意に改良することができる。
【００２２】
１．定義
他様に定義されない限り、本明細書で用いられるすべての技術的および科学的用語は、本開示発明の属する分野の当業者によって普通に理解されるのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、「微生物学および分子生物学辞典（ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ）」、第２版、１９９４年、米国、ニューヨーク州、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ社、ならびにＨａｌｅおよびＭａｒｋｈａｍ、「ハーパーコリンズ生物学辞典（ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ）」、１９９１年、米国、ニューヨーク州、Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ社は、本明細書で用いられた用語の多くの一般的な意味を当業者に提供する。明確化および参照の容易のために特定の用語が以下に定義される。
【００２３】
本明細書で用いられる「グルコアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３）」の語は、デンプンならびに関連するオリゴ糖および多糖の非還元末端からＤ−グルコースを切り離す反応を触媒する酵素をいう。
【００２４】
「親」または「親配列」の語は、天然の、すなわち宿主細胞中で自然に生じる配列をいう。親配列は、配列番号１、２、３、５、６、７、８および９に記述されたグルコアミラーゼ配列を含むが、これらに限定されない。
【００２５】
本明細書で用いられる「同等の位置」とは２の親配列に共通である位置を意味し、これは問題にしている親グルコアミラーゼのアミノ酸配列とＴｒＧＡ参照グルコアミラーゼのアミノ酸配列（配列番号２）とのアラインメント、ならびに問題にしている親グルコアミラーゼの三次元構造とＴｒＧＡ参照グルコアミラーゼの三次元配列とのアラインメントに基づいている。
【００２６】
「ＴｒＧＡ」の語は、配列番号２で示される成熟タンパク質配列を有する親トリコデルマレーシグルコアミラーゼ配列をいい、この配列は配列番号３で示される配列を有する触媒ドメインを含む。ＴｒＧＡの単離、クローニングおよび発現は米国特許第７，４１３，８８７号に記載されており、その内容は参照によって本明細書に取り込まれる。ある実施態様では、親配列とはタンパク質工学の出発点となるグルコアミラーゼをいう。本明細書におけるグルコアミラーゼのアミノ酸の付番は、ＴｒＧＡ（配列番号２および配列番号３）とグルコアミラーゼとの配列アラインメントに基づいている。
【００２７】
「タンパク質またはポリペプチドの成熟型」の語句は、タンパク質またはポリペプチドの最終的な機能的な形態をいう。例示すると、ＴｒＧＡの成熟型は、配列番号２のアミノ酸配列を有する、触媒ドメイン、リンカー領域およびデンプン結合ドメインを含む。
【００２８】
本明細書で用いられる「グルコアミラーゼ変異体」および「変異体」の語は、親グルコアミラーゼ配列と、ある程度のアミノ酸配列同一性を有しかつグルコアミラーゼの機能的特性を保持することができるグルコアミラーゼに関して用いられる。変異体は親配列に類似しているが、そのアミノ酸配列中に少なくとも１の置換、欠失または挿入を有し、これはその変異体を親グルコアミラーゼとは配列において異なるものにする。ある場合には、変異体はそのアミノ酸配列中に少なくとも１の置換、欠失または挿入を含むように操作されおよび／または設計されたものであり、これはその変異体を親とは配列において異なるものにしている。
【００２９】
「変異体」は、比較のため最適にアラインメントされると、ポリペプチド配列と少なくとも９９．５％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８８％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、少なくとも５０％または少なくとも４５％の配列同一性を有することができる。ある実施態様では、グルコアミラーゼ変異体は、親グルコアミラーゼの触媒ドメインと少なくとも９９．５％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８８％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、少なくとも５０％または少なくとも４５％の配列同一性を有することができる。ある実施態様では、グルコアミラーゼ変異体は、親グルコアミラーゼのデンプン結合ドメインと少なくとも９９．５％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８８％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、少なくとも５０％または少なくとも４５％の配列同一性を有することができる。配列同一性は、親配列または変異体配列の全長にわたって測定されることができる。
【００３０】
配列同一性は、従来技術で知られた標準的な手法を用いて測定される（たとえば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、１９８１年、第２巻、ｐ．４８２；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７０年、第４８巻、ｐ．４４３；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８８年、第８５巻、ｐ．２４４４；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（米国、ウィスコンシン州、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ社）中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＨＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡのようなプログラム参照）。
【００３１】
「核酸配列同一性パーセント（％）」または「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、出発配列（たとえば、ＴｒＧＡ）のヌクレオチド残基またはアミノ酸残基と同一である、候補配列中のヌクレオチド残基またはアミノ酸残基のパーセントと定義される。配列同一性は、出発配列（たとえば、配列番号２）の全長にわたって測定されることができる。
【００３２】
配列同一性は、配列アラインメントの公知の方法によって決定される。普通に用いられるアラインメント方法はＡｌｔｓｃｈｕｌらによって記載されたＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０年、第２１５巻、ｐ．４０３−４１０；およびＫａｒｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９３年、第９０巻、ｐ．５８７３−５７８７）である。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムはＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９９６年、第２６６巻、ｐ．４６０−４８０を参照せよ。）である。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２はいくつかの検索パラメータを用い、そのほとんどは初期値に設定される。調節可能なパラメータは以下の値に設定される、すなわちオーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１である。ＨＳＰ  ＳおよびＨＳＰ  Ｓ２パラメータは動的値であり、特定の配列の構成および関心の対象である配列が検索される特定のデータベースの構成に応じて、プログラム自体によって確立される。しかし、これらの値は感度を高めるように調節されてもよい。アミノ酸配列同一性％値は、アラインメントされる領域中の一致する同一残基の数を「より長い」配列の残基の合計数で割ることによって決定される。「より長い」配列とは、アラインメントされる領域中の大部分の実在残基を有する配列である（アラインメントスコアを最大にするためにＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２によって導入されるギャップは無視される）。
【００３３】
他の方法も、配列をアラインメントするのに用いられる。有用なアルゴリズムの１の例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、累進法ペアワイズアラインメントを用いて、関連した配列群から多重配列アラインメントを作製する。この方法はアラインメントを作製するために用いられたクラスター関係を示す系統樹もプロットすることができる。ＰＩＬＥＵＰは、ＦｅｎｇおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅの累進的アラインメント法（ＦｅｎｇおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．、１９８７年、第３５巻、ｐ．３５１−３６０）の簡易化手法を用いる。この方法は、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐによって記載された方法（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ、１９８９年、第５、ｐ．１５１−１５３）に類似している。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータは、３.００の初期設定ギャップウェイト、０.１０の初期設定ギャップ長さウェイトおよび加重エンドギャップを含む。
【００３４】
「最適アラインメント」の語は、最高の同一性スコアパーセントを与えるアラインメントをいう。
【００３５】
本明細書で用いられる「触媒ドメイン」の語はポリペプチドの１の構造領域をいい、そこは基質の加水分解のための活性部位を有する。
【００３６】
「リンカー」の語は、一般に３〜４０のアミノ酸残基を有する短いアミノ酸配列をいい、これはデンプン結合ドメインを含んでいるアミノ酸配列と、触媒ドメインを含んでいるアミノ酸配列とを共有結合で結合させる。
【００３７】
「デンプン結合ドメイン」の語は、デンプン基質に優先的に結合するアミノ酸配列をいう。
【００３８】
本明細書で用いられる「変異体配列」および「変異体遺伝子」の語は互換的に用いられ、宿主細胞の親配列の中に生じる、少なくとも１のコドンにおける変更を有するポリヌクレオチド配列をいう。変異体配列の発現生成物は、親タンパク質に対して変更されたアミノ酸配列を有する変異体タンパク質である。該発現生成物は変更された機能的能力（たとえば、高められた酵素活性）を有することができる。
【００３９】
ポリペプチドの文脈において本明細書で用いられる「性質」の語またはその同義語は、選択されまたは見出されることができるポリペプチドの任意の特性または属性をいう。これらの性質は、以下に限定されることなく、酸化安定性、基質特異性、触媒活性、熱安定性、ｐＨ活性プロフィール、耐タンパク質分解性、ＫＭ、ＫＣＡＴ、ＫＣＡＴ／ＫＭ比、タンパク質の折りたたみ、基質結合能および分泌能を含む。
【００４０】
核酸の文脈において本明細書で用いられる「性質」の語またはその同義語は、選択されまたは検出されることができる核酸の任意の特性または属性をいう。これらの性質は、以下に限定されることなく、遺伝子転写に影響する性質（たとえば、プロモーター強度またはプロモーター認識）、ＲＮＡプロセッシングに影響する性質（たとえば、ＲＮＡスプライシングおよびＲＮＡ安定性）、翻訳に影響する性質（たとえば、調節、リボソームタンパク質へのｍＲＮＡの結合）を含む。
【００４１】
「熱的に安定な」および「熱安定性の」の語は、デンプン基質の加水分解の間に広く用いられている条件下に所与の時間にわたって、ある温度に曝露された後に、たとえば変更された温度に曝露される間に、特定のレベルの酵素活性を保持する本開示発明のグルコアミラーゼ変異体をいう。
【００４２】
性質、たとえば熱安定性の文脈における「高められた安定性」の語は、デンプン加水分解活性が他の参照（すなわち、親）グルコアミラーゼと比較して長期間にわたってより高く保持されることをいう。
【００４３】
性質、たとえば熱安定性の文脈における「低められた安定性」の語は、デンプン加水分解活性が他の参照グルコアミラーゼと比較して長期間にわたってより低く保持されることをいう。
【００４４】
「比活性」の語は、グルコアミラーゼタンパク質１ｍｇ当たりの活性と定義される。ある実施態様では、グルコアミラーゼの活性は、本明細書に記載されるエタノールアッセイによって測定されデンプン基質から産生されるグルコースの量として表される。ある実施態様では、タンパク質濃度は本明細書に記載されるキャリパー（Ｃａｌｉｐｅｒ）アッセイを用いて測定されることができる。
【００４５】
「活性な」および「生物学的に活性な」の語は、特定のタンパク質に関連付けられた生物学的活性をいう。所与のタンパク質の生物学的活性とは、当業者によってそのタンパク質に典型的に帰属される任意の生物学的活性をいうことになる。たとえば、グルコアミラーゼに関連付けられる酵素活性は加水分解作用であり、したがって活性なグルコアミラーゼは加水分解活性を有する。
【００４６】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」の語は本明細書において互換的に用いられ、任意の長さのヌクレオチドのポリマー状の形態をいい、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかである。これらの語は、一本鎖、二本鎖もしくは三本鎖のＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基、もしくは他の天然の、化学的、生物学的に修飾された、非天然の、もしくは誘導されたヌクレオチド塩基を含んでいるポリマーを包含するが、これらに限定されない。
【００４７】
本明細書で用いられる「ＤＮＡ構築体」、「形質転換ＤＮＡ」および「発現ベクター」の語は互換的に用いられて、宿主細胞または有機体中に配列を導入するために用いられるＤＮＡをいう。該ＤＮＡは、ＰＣＲまたは当業者に知られた任意の他の好適な技術によってｉｎ  ｖｉｔｒｏに生成されることができる。ＤＮＡ構築体、形質転換ＤＮＡまたは組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、色素体ＤＮＡ、ウイルスまたは核酸断片中に取り込まれることができる。典型的には、発現ベクター、ＤＮＡ構築体または形質転換ＤＮＡの中の組換え発現カセットの部分は、他の配列とともに、転写されるべき核酸配列およびプロモーターを含む。ある実施態様では、発現ベクターは、宿主細胞中に非相同のＤＮＡ断片を導入しそして発現する能力を有する。
【００４８】
本明細書で用いられる「ベクター」の語は、１以上の細胞の型の中に核酸を導入するように設計されたポリヌクレオチド構築体をいう。ベクターは、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、カセット等を包含する。
【００４９】
細胞中に核酸配列を導入するとの文脈において本明細書で用いられる「導入された」の語は、細胞中に核酸配列を移すのに適した任意の方法をいう。導入のためのかかる方法は、プロトプラスト融合、トランスフェクション、形質転換、接合および形質導入を含むがこれらに限定されない。
【００５０】
本明細書で用いられる「形質転換された」および「安定的に形質転換された」の語は、非天然の（非相同の）ポリヌクレオチド配列をそのゲノム中に組み込ませた細胞、または少なくとも２世代の間維持されているエピソームプラスミドとしてそれを有する細胞をいう。
【００５１】
本明細書で用いられる「選択可能マーカー」および「選択マーカー」の語は、ベクターを含有する宿主を選び出すことを容易にする、宿主細胞中で発現する能力がある核酸（たとえば、遺伝子）をいう。典型的には、選択可能マーカーとは、宿主細胞に抗菌薬耐性または代謝上の利点を与えて、外因性ＤＮＡを含有する細胞が、形質転換の間に何らかの外因性配列を受け取らなかった細胞とは区別できるようにする遺伝子である。
【００５２】
本明細書で用いられる「プロモーター」の語は、下流の遺伝子の転写を指令するように機能する核酸配列をいう。プロモーターは、他の転写および翻訳調節核酸配列（「調節配列」とも呼ばれる。）とともに、所与の遺伝子を発現するために必要である。一般に、転写および翻訳調節配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列を含むがこれらに限定されない。
【００５３】
核酸は、他の核酸配列と機能的関係を持つように置かれたときに「機能し得るように結合されている」。たとえば、分泌先導配列をコードするＤＮＡ（すなわち、シグナルペプチド）は、ポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体として発現されるならば、ポリペプチドを表すＤＮＡに機能し得るように結合されている。一般に、「機能し得るように結合され」とは、結合されているＤＮＡ配列が連続しており、分泌先導配列の場合には、連続しかつ読み取り相（ｒｅａｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）内にあることを意味する。
【００５４】
本明細書で用いられる「遺伝子」の語はポリヌクレオチド（たとえば、ＤＮＡセグメント）をいい、これはポリペプチドをコードし、コード領域の前および後に続く領域、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）の間の介在配列（イントロン）を含む。
【００５５】
本明細書で用いられる「オーソログ」および「オーソログ遺伝子」とは、スペシエーション（種分化）によって共通の祖先遺伝子（すなわち、相同遺伝子）から進化した異なった種の中の遺伝子をいう。典型的には、オーソログは進化の過程において同じ機能を保持している。オーソログの同定は、新たに配列決定されたゲノムにおける遺伝子機能の信頼できる予測をするのに有用である。
【００５６】
本明細書で用いられる「パラログ」および「パラログ遺伝子」とは、ゲノム内の複製によって関連付けられた遺伝子をいう。オーソログは進化の過程を通して同じ機能を保持しているのに対し、パラログは新たな機能を進化させる。もっとも、いくつかの機能はしばしば元のものに関連している。パラログ遺伝子の例は、以下に限定されることなくトリプシン、キモトリプシン、エラスターゼおよびトロンビンをコードする遺伝子を含むが、これらはすべてセリンプロテイナーゼであり、同じ種内で同時に発生する。
【００５７】
本明細書で用いられる「ハイブリダイゼーション」の語は、従来技術で知られているように、核酸の鎖が塩基対合によって相補的な鎖と一緒になる過程をいう。
【００５８】
核酸配列は、参照核酸配列に、中程度から高度に緊縮性のハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件下にこれら２の配列が互いに特異的にハイブリダイズするならば、「選択的にハイブリダイズ可能」とみなされる。ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体またはプローブの融解温度（Ｔｍ）を基準とする。たとえば、「最大緊縮性」は典型的には約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃下）で、「高度緊縮性」はＴｍより約５〜１０℃下で、「中程度緊縮性」はプローブのＴｍより約１０〜２０℃下で、「低度緊縮性」はＴｍより約２０〜２５℃下で行われる。機能的には、最大緊縮性条件は、ハイブリダイゼーションプローブとの厳密な同一性または準厳密な同一性を有する配列を同定するために用いられることができ、他方、中程度または低度の緊縮性ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチド配列相同体を同定しまたは見つけるために用いられることができる。
【００５９】
中程度および高度緊縮性ハイブリダイゼーション条件は従来技術で周知である。高度緊縮性条件の例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハード溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性されたキャリアーＤＮＡ中で約４２℃におけるハイブリダイゼーションと、それに引き続き室温において２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中で２回洗浄すること、ならびに４２℃において０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中でさらに２回洗浄することを含む。中程度緊縮性条件の例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハード溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０ｍｇ／ｍｌの変性され剪断されたサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中で３７℃における一晩の温置と、それに引き続き約３７〜５０℃で１×ＳＳＣでフィルターを洗浄することを含む。当業者は、プローブ長さ等のような要因を調整するために必要な温度、イオン強度等の調節方法を知っている。
【００６０】
本明細書で用いられる「組換え」とは、非相同もしくは相同の核酸配列の導入によって修飾された細胞もしくはベクターをいう、または細胞がそのように修飾された細胞に由来することをいうことが含まれる。したがって、たとえば、組換え細胞は、その細胞の天然（非組換え）型の中に同一の型が見出されない遺伝子を発現し、またはそうでなければ、意図的な人の介入の結果として、異常に発現された、不十分に発現された、またはまったく発現されない天然の遺伝子を発現する。
【００６１】
本開示発明の１の実施態様では、変異されたＤＮＡ配列は、少なくとも１のコドンにおける部位飽和変異誘発を用いて生成される。他の実施態様では、部位飽和変異誘発は２以上のコドンについて実施される。さらなる実施態様では、変異体ＤＮＡ配列は親配列と、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超または９８％超の相同性を有する。これに代わる実施態様では、変異体ＤＮＡは、たとえば、放射線、ニトロソグアニジン等のような公知の変異方法を用いてｉｎ  ｖｉｖｏで生成される。所望のＤＮＡ配列はその後単離され、本明細書に示された方法に用いられる。
【００６２】
本明細書で用いられる「非相同タンパク質」とは、宿主細胞中に天然には生じないタンパク質またはポリペプチドをいう。
【００６３】
酵素が、対応する野生型細胞中に発現されているレベルよりも高いレベルで細胞中に発現されているならば、その酵素は「過剰発現されている」。
【００６４】
「タンパク質」および「ポリペプチド」の語は、本明細書では互換的に用いられる。本明細書および特許請求の範囲において、アミノ酸残基を表す慣用の１文字コードおよび３文字コードが用いられる。アミノ酸を表す３文字コードは、生化学命名法についてのＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ合同委員会（ＪＣＢＮ）に準拠して定義された通りである。遺伝子コードの縮重の故に、ポリペプチドは２以上のヌクレオチド配列によってコードされることができることも理解されている。
【００６５】
本開示発明の変異体は以下の命名法によって記載される、すなわち［元のアミノ酸残基／位置／置換するアミノ酸残基］。たとえば、位置７６におけるアルギニンのロイシンによる置換は、Ｒ／７６／Ｌと表される。１の所与の位置において２以上のアミノ酸で置換されるときは、該置換は１）Ｑ１７２Ｃ、Ｑ１７２ＤもしくはＱ１７２Ｒ；２）Ｑ１７２Ｃ、ＤもしくはＲ、または３）Ｑ１７２Ｃ／Ｄ／Ｒと表される。本明細書において置換に適した位置が、特定のアミノ酸が示されずに特定されるときは、その位置に存在するアミノ酸残基の代わりに任意のアミノ酸残基で置換されることができることと理解されなければならない。変異体グルコアミラーゼが他のグルコアミラーゼと比較して欠失を有するときは、該欠失は“＊”で示される。たとえば、位置Ｒ７６における欠失はＲ７６＊と表される。２以上の連続したアミノ酸の欠失は、たとえば（７６−７８）＊と示される。
【００６６】
「プロ配列」とは、シグナル配列と成熟タンパク質との間のアミノ酸配列であり、これはそのタンパク質の分泌のために必要である。プロ配列の切断は、成熟活性タンパク質をもたらすことになる。
【００６７】
「シグナル配列」または「シグナルペプチド」の語は、成熟型もしくは前駆体型タンパク質の分泌に関与することができるヌクレオチドおよび／またはアミノ酸の任意の配列をいう。シグナル配列の定義は機能的なものであり、タンパク質遺伝子のＮ末端部分によってコードされるようなすべてのアミノ酸配列を含むことが意図されており、これらはタンパク質の分泌の遂行に関与する。これらのアミノ酸配列はしばしば、タンパク質のＮ末端部分または前駆体タンパク質のＮ末端部分に結合されているが、普遍的にそうであるわけではない。シグナル配列は内因性または外因性であることができる。シグナル配列は、通常、そのタンパク質（たとえば、グルコアミラーゼ）に関連付けられたものであることができ、または他の分泌タンパク質をコードする遺伝子に由来するものであってもよい。
【００６８】
「前駆体」型のタンパク質またはペプチドの語は、該タンパク質のアミノまたはカルボニル末端に機能し得るように結合されているプロ配列を有するタンパク質の成熟型をいう。この前駆体は、プロ配列のアミノ末端に機能し得るように結合された「シグナル」配列を有することもできる。該前駆体は、翻訳後活性に関わっている追加的なポリヌクレオチド（たとえば、前駆体から切断されてタンパク質またはペプチドの成熟型を残すポリヌクレオチド）を有することもできる。
【００６９】
「宿主株」または「宿主細胞」とは、本開示発明に従うＤＮＡを含んでいる発現ベクターに適した宿主をいう。
【００７０】
「に由来する」および「から得られた」の語は、問題にしている有機体の株によって産生されたまたは産生可能なグルコアミラーゼだけでなく、かかる株から単離されそしてかかるＤＮＡ配列を含む宿主有機体中で産生されたＤＮＡ配列によってコードされたグルコアミラーゼをもいう。さらに、この語は、合成的なおよび／またはｃＤＮＡ起源のＤＮＡ配列によってコードされ、かつ問題にしているグルコアミラーゼであることを確認できる特性を有するグルコアミラーゼをいう。
【００７１】
この定義の範囲内の「誘導体」は一般に、該誘導体が野生型、天然のまたは親の型として同じような目的に有用である限度において、該野生型、天然のまたは親の型において観察される特徴的な加水分解活性を保持する。グルコアミラーゼの機能的誘導体は、本開示発明のグルコアミラーゼの一般的な特性を有する、自然発生的な、合成的にもしくは組換え技術によって産生された、ペプチドまたはペプチド断片を包含する。
【００７２】
「単離された」の語は、その物質が自然発生したものであれば、自然環境から取り出された物質をいう。
【００７３】
「精製された」タンパク質とは、均質にまで少なくとも部分的に精製されたタンパク質をいう。ある実施態様では、精製されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって測定されて１０％超の純度、任意的に２０％超の純度、および任意的に３０％超の純度である。本開示発明のさらなる側面は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定されて高度に精製された形態をしているタンパク質（すなわち、４０％超の純度、６０％超の純度、８０％超の純度、９０％超の純度、９５％超の純度、９７％超の純度、さらに９９％超の純度）を包含する。
【００７４】
本明細書で用いられる「組み合わせ変異誘発」の語は、開始配列の変異体のライブラリーが作製される方法をいう。これらのライブラリーにおいて、変異体は、所定の一組の変異から選択された１またはいくつかの変異を有している。さらに、該方法は、該所定の一組の変異の構成員ではなかったランダムな変異を導入する手段を提供する。ある実施態様では、該方法は米国特許第６，５８２，９１４号に記載されたものを含み、その内容は参照によって本明細書に取り込まれる。他の実施態様では、組み合わせ変異誘発法は商業的に入手可能なキット（たとえばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）複数部位（Ｍｕｌｔｉ-Ｓｉｔｅ）法、米国、カルフォルニア州、サンジエゴ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を含む。
【００７５】
本明細書で用いられる「変異体のライブラリー」の語は、そのゲノムの大部分において同一ではあるが、１以上の遺伝子が異なっている相同体を含む細胞の集団をいう。かかるライブラリーは、たとえば改良された特性を有する遺伝子またはオペロンを同定するために用いられることができる。
【００７６】
本明細書で用いられる「乾燥固形分含量（ＤＳまたはｄｓ）」の語は、乾燥重量基準の％単位でのスラリーの総固形分をいう。
【００７７】
本明細書で用いられる「初期ヒット（ｉｎｉｔｉａｌ ｈｉｔ）」の語は、組み合わせコンセンサス変異ライブラリーをスクリーニングすることによって同定された変異体をいう。ある実施態様では、初期ヒットは、開始遺伝子と比較して改良された性能特性を有する。
【００７８】
本明細書で用いられる「改良されたヒット（ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｈｉｔ）」の語は、改良された組み合わせコンセンサス変異ライブラリーをスクリーニングすることによって同定された変異体をいう。
【００７９】
本明細書で用いられる「標的性質」の語は、開始遺伝子の変更されるべき性質をいう。本開示発明は、何らかの特定の標的性質に限定されるべきことは意図されていない。しかし、ある実施態様では、標的性質は遺伝子生成物の安定性（たとえば、変性、タンパク質分解または他の分解因子に対する耐性）であり、他方において他の実施態様では、産生宿主における産生のレベルが変更される。実際に、開始遺伝子の任意の性質が本開示発明の対象となることが意図されている。この他の用語の定義は、本明細書全体を通して登場することがある。
【００８０】
数値の範囲が提示されている場合、その文脈が明確に他様に指示していない限り、その範囲の上限値および下限値の間にある各中間の値も、下限値の１０分の１の単位まで具体的に開示されていると理解される。記載された範囲中の任意の記載された数値または中間の数値と、その記載された範囲中の他の任意の記載された数値または中間の数値との間の、より小さい各範囲も本開示内に包含される。これらのより小さい範囲の上限値および下限値は、独立にその範囲に含まれまたはそこから除かれることができ、また、そのより小さい範囲中に上限値および下限値のいずれかが含まれる、いずれも含まれない、または双方とも含まれるような各範囲も本開示内に包含されるが、ただし該記載された範囲中の何らかの特別に除外された限定に従う。記載された範囲が限界値の一方または双方を含む場合には、これらの含められた限界値の一方または双方を除く範囲も、本開示に含まれる。
【００８１】
例示的な実施態様がより詳細に記載される前に、本開示発明は、それ自体当然に変動することがあるものだから、記載された特定の実施態様に限定されないことが理解されなければならない。本明細書に記載された方法および物質と類似のまたは同等の任意の方法および物質が、本開示発明の実施または試験に用いられることができるけれども、例示的な方法および物質がこれから記載される。
【００８２】
本明細書および添付された特許請求の範囲で用いられる単数形、「１の（ａ、ａｎ）」および「該（ｔｈｅ）」は、その文脈が明確に他様に指示していない限り、複数の指示対象も含む。従って、たとえば「１の遺伝子」への言及は複数のかかる候補遺伝子を含み、「該細胞」への言及は、１以上の細胞および当業者に知られたその等価物への言及を含む、等々である。
【００８３】
本明細書で検討された刊行物は、本出願の出願日の前にそれらが開示されたがためにのみ提示される。本明細書のいかなる記載も、かかる刊行物の先行発明の理由によって、本開示発明がそれらに先行する権利を有しないことを承認するものと解釈されてはならない。
【００８４】
２．親グルコアミラーゼ
ある実施態様では、本開示発明はグルコアミラーゼ変異体を提供する。グルコアミラーゼ変異体は親グルコアミラーゼの変異体であり、これは触媒ドメインおよびデンプン結合ドメインの双方を含んでいることができる。ある実施態様では、親グルコアミラーゼは配列番号１、２、３、５、６、７、８もしくは９で示されるアミノ酸配列を有する、または配列番号１、２、３、５、６、７、８もしくは９で示されるアミノ酸配列のうちの１以上と少なくとも８０％の配列同一性を示すアミノ酸配列を有する触媒ドメインを含んでいる。さらに他の実施態様では、親グルコアミラーゼは、配列番号１、２または３のアミノ酸配列のうちの１を有するグルコアミラーゼの触媒ドメインをコードするＤＮＡと、中程度、高度または緊縮性の条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列によってコードされた触媒ドメインを含んでいる。
【００８５】
ある実施態様では、親グルコアミラーゼは配列番号１、２、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６もしくは１６７で示されるアミノ酸配列を有する、または配列番号１、２、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６もしくは１６７で示されるアミノ酸配列のうちの１以上と少なくとも８０％の配列同一性を示すアミノ酸配列を有するデンプン結合ドメインを含んでいる。さらに他の実施態様では、親グルコアミラーゼは、配列番号１または２のアミノ酸配列のうちの１を有するグルコアミラーゼのデンプン結合ドメインをコードするＤＮＡと、中程度、高度または緊縮性の条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列によってコードされたデンプン結合ドメインを含んでいる。
【００８６】
グルコアミラーゼの予測される構造および既知の配列は真菌種の間で保存されている（Ｃｏｕｔｉｎｈｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、１９９４年、第７巻、ｐ．３９３−４００、およびＣｏｕｔｉｎｈｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、１９９年、第７巻、ｐ．７４９−７６０）。ある実施態様では、親グルコアミラーゼは糸状菌グルコアミラーゼである。ある実施態様では、親グルコアミラーゼは、トリコデルマ株（たとえば、トリコデルマレーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）、Ｔ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、Ｔ．ｓｔｒｉｃｔｉｐｉｌｉｓ、Ｔ．ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ、Ｔ．ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａおよびＴ．ｈａｚｉａｎｕｍ）、アスペルギルス株（たとえば、アスペルギルスニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルスニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルスカワチ（Ａ．ｋａｗａｃｈｉ）、アスペルギルスアワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）およびアスペルギルスオリザエ（Ａ．ｏｒｚｙａｅ））、タラロミセス株（たとえば、タラロミセスエメルソニイ（Ｔ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、タラロミセステルモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）およびＴ．ｄｕｐｏｎｔｉ）、ハイポクレア株（たとえば、Ｈ．ｇｅｌａｔｉｎｏｓａ 、Ｈ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、ハイポクレアビノサ（Ｈ．ｖｉｎｏｓａ）およびＨ．ｃｉｔｒｉｎａ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）株（たとえば、Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｆ．ｒｏｓｅｕｍおよびＦ．ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）株（たとえば、Ｎ．ｃｒａｓｓａ）およびフミコーラ株（たとえば、フミコーラグリセア（Ｈ．ｇｒｉｓｅａ）、Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＨ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｅ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）株（たとえば、Ｐ．ｎｏｔａｔｕｍまたはペニシリウムクリソゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ））またはサッカロミコプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）株（たとえば、Ｓ．ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ）から得られる。
【００８７】
ある実施態様では、親グルコアミラーゼは細菌グルコアミラーゼであることができる。たとえば、該ポリペプチドはグラム陽性菌株、たとえばバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（たとえば、Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）またはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ）株（たとえば、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）から得られることができる。
【００８８】
ある実施態様では、親グルコアミラーゼは、配列番号３のＴｒＧＡアミノ酸配列の触媒ドメインと少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性およびまた少なくとも９８％の配列同一性を有する触媒ドメインを含んでいる。
【００８９】
他の実施態様では、親グルコアミラーゼは、配列番号５または配列番号６のアスペルギルス親グルコアミラーゼの触媒ドメインと少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性およびまた少なくとも９９％の配列同一性を有する触媒ドメインを含んでいる。
【００９０】
さらに他の実施態様では、親グルコアミラーゼは、配列番号８のフミコーラグリセア（ＨｇＧＡ）親グルコアミラーゼの触媒ドメインと少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性およびまた少なくとも９９％の配列同一性を有する触媒ドメインを含んでいる。
【００９１】
ある実施態様では、親グルコアミラーゼは、配列番号１、２または１６１のＴｒＧＡアミノ酸配列のデンプン結合ドメインと少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性およびまた少なくとも９８％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを含んでいる。
【００９２】
他の実施態様では、親グルコアミラーゼは、配列番号１６２のフミコーラグリセア（ＨｇＧＡ）グルコアミラーゼの触媒ドメインと少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性およびまた少なくとも９９％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを含んでいる。
【００９３】
他の実施態様では、親グルコアミラーゼは、配列番号１６３のシエラビアテレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）（ＴｔＧＡ）グルコアミラーゼの触媒ドメインと少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性およびまた少なくとも９９％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを含んでいる。
【００９４】
他の実施態様では、親グルコアミラーゼは、配列番号１６４のテルモミセスラヌギノスス（ＴｈＧＡ）グルコアミラーゼの触媒ドメインと少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性およびまた少なくとも９９％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを含んでいる。
【００９５】
他の実施態様では、親グルコアミラーゼは、配列番号１６５のタラロミセスエメルソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉｔ）（ＴｅＧＡ）グルコアミラーゼの触媒ドメインと少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性およびまた少なくとも９９％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを含んでいる。
【００９６】
さらに他の実施態様では、親グルコアミラーゼは、配列番号１６６または１６７のアスペルギルス親グルコアミラーゼのデンプン結合ドメインと少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性およびまた少なくとも９９％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを含んでいるだろう。
【００９７】
ある実施態様では、親グルコアミラーゼは、配列番号２のＴｒＧＡアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも８８％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性およびまた少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００９８】
さらなる実施態様では、トリコデルマグルコアミラーゼ相同体はトリコデルマまたはハイポクレア株から得られる。いくつかの典型的なトリコデルマグルコアミラーゼ相同体は米国特許第７，４１３，８８７号に記載され、この参照文献の配列番号１７〜２２および４３〜４７に規定されたアミノ酸配列が特に参照される。
【００９９】
ある実施態様では、親グルコアミラーゼは、配列番号２のアミノ酸配列を含んでいるＴｒＧＡ、またはＴｒＧＡ配列（配列番号２）と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するトリコデルマグルコアミラーゼ相同体である。
【０１００】
親グルコアミラーゼは、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて単離されおよび／または同定されることができる。当業者に知られた任意の標準的な技術が用いられることができる。たとえば、グルコアミラーゼの保存領域に特異的なプローブおよび／またはプライマーが、細菌または真菌細胞中の相同体（触媒ドメイン、活性部位等）を同定するために用いられることができる。あるいは、縮重ＰＣＲ法が、細菌または真菌細胞中の相同体を同定するために用いられることができる。ある場合には、公知の配列、たとえばデータベース中の配列が、既知のグルコアミラーゼ、たとえば配列番号２もしくは既知のデンプン結合ドメイン、たとえば配列番号１６１のうちの１との配列および／または構造の同一性の有無を分析されることができる。機能アッセイも、細菌または真菌細胞中のグルコアミラーゼ活性を特定するために用いられることができる。グルコアミラーゼ活性を有するタンパク質が単離されそして逆配列解析されて、対応するＤＮＡ配列が単離されることができる。かかる方法は当業者に知られている。
【０１０１】
３．グルコアミラーゼ構造の相同性
分子生物学のセントラルドグマは、特定の酵素のための遺伝子をコードするＤＮＡの配列がタンパク質のアミノ酸配列を決定し、この配列が次に該酵素の三次元の折りたたみを決定するというものである。この折りたたみは、触媒中心および基質結合表面を形成する異種の残基を寄せ近づけ、そしてこのことが、問題の酵素の高い特異性および活性をもたらす。
【０１０２】
グルコアミラーゼは、三つもの数のはっきり区別できる構造ドメインからなる、すなわちすべてのグルコアミラーゼに構造的に保存されている約４５０の残基の触媒ドメイン、一般的にそれに続く３０〜８０の残基からなるリンカー領域、およびそれに結合されている約１００の残基のデンプン結合ドメインである。３の領域がすべてインタクトな状態のトリコデルマレーシグルコアミラーゼの構造が、本開示において１．８オングストロームの分解能まで測定された（表２０および実施例１３参照）。原子座標（表２０参照）を用いて、該構造が、すでに測定されているアスペルギルスアワモリ株Ｘ１００由来の触媒ドメインの原子座標（Ａｌｅｓｈｉｎ，Ａ．Ｅ．、Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｃ、Ｆｉｒｓｏｖ，Ｌ．Ｍ．およびＨｏｎｚａｔｋｏ，Ｒ．Ｂ．、「アスペルギルスアワモリ変異体Ｘ１００由来のグルコアミラーゼの精密化された結晶構造（Ｒｅｆｉｎｅｄ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ ｖａｒ．Ｘｌ００．）」、 Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１９９４年、第２３８巻、ｐ．５７５−５９１）とアラインメントされた。アスペルギルスアワモリの結晶構造は触媒ドメインのみを含んでいた。図１２および図１３に見られるように、これらの触媒ドメインの構造は非常にぴったりと重なり合っており、この構造の重ね合わせに基づいて同等の残基を同定することが可能となる。すべてのグルコアミラーゼは、図１２および図１３に示された基本構造を共有すると考えられる。
【０１０３】
図１２は、側面から見た、配列番号１のトリコデルマグルコアミラーゼ（黒色）（アミノ酸配列については図１参照）とアスペルギルスアワモリ（灰色）との三次元構造の比較である。この図を見ると、触媒ドメインとリンカー領域とデンプン結合ドメインとの間の関係がよくわかる。
【０１０４】
図１３は、上から見た、トリコデルマグルコアミラーゼ（黒色）とアスペルギルスアワモリ（灰色）との三次元構造の比較である。ここに示されたグルコアミラーゼおよび今までに知られている実際にすべてのグルコアミラーゼは、この構造相同性を共有している。すべてのグルコアミラーゼについて、構造の保存は、活性の保存および保存された作用機構と相関している。この高い相同性を考慮すると、トリコデルマグルコアミラーゼの部位特異性変異体からもたらされ変更された機能をもたらす変化は、他のグルコアミラーゼにおいても、同じような構造上およびしたがって機能上の帰結を与えるだろう。それゆえ、どの変異体が望ましい利益をもたらすかという教示は、他のグルコアミラーゼにも適用されることができる。
【０１０５】
さらなる結晶構造が、表２０の原子座標を用いてデンプン結合ドメイン（ＳＢＤ）について作製された。ＴｒＧａについてのＳＢＤが、アスペルギルスニガーについてのＳＢＤとアラインメントされた。図１３に示されたように、アスペルギルスニガーのＳＢＤおよびＴｒＧａのＳＢＤの構造は極めてぴったりと重なり合う。すべてのデンプン結合ドメインは図１３に示された基本構造の少なくとも一部を共有するけれども、他方において、いくつかのＳＢＤは他のものよりも構造的に類似していると考えられる。たとえば、ＴｒＧａのＳＢＤは、ＣＡＺＹデータベース（ｃａｚｙ．ｏｒｇ）内のファミリー２０の炭水化物結合モジュール内に分類されることができる。ＣＡＺＹデータベースは、グリコシド結合を分解し、修飾しまたは生成する酵素の構造的に関連した触媒モジュールおよび炭水化物結合モジュール（または機能ドメイン）のファミリーについて記載している。高い構造相同性を考慮すると、変更された機能をもたらすＴｒＧａのＳＢＤの部位特異性変異体は、ＴｒＧａのＳＢＤの構造に類似した構造を有するＳＢＤを有する他のグルコアミラーゼ、とりわけファミリー２０の炭水化物結合モジュール内に分類されるものにおいても、同じような構造上およびしたがって機能上の帰結を与えるだろう。したがって、どの変異体が望ましい利益をもたらすかという教示は、構造上の類似性を有する他のＳＢＤにも適用されることができる。
【０１０６】
かくして、本明細書で検討されるアミノ酸位置番号は、図１に提示された成熟トリコデルマレーシグルコアミラーゼの配列に割り当てられたものをいう。しかし、本開示発明はトリコデルマグルコアミラーゼの変異体に限定されないで、トリコデルマレーシグルコアミラーゼ（配列番号２）中の特別に同定された残基と「同等」である位置にアミノ酸残基を有するグルコアミラーゼにまで及ぶ。本開示発明の１の実施態様では、親グルコアミラーゼはタレロミセス（Ｔａｌｅｒｏｍｙｃｅｓ）グルコアミラーゼであり、置換は、本明細書に記載されたものとタレロミセスグルコアミラーゼ中の同等のアミノ酸残基の位置で行われる。他の実施態様では、親グルコアミラーゼは、表１に列挙されたもののうちの１である。さらなる実施態様では、親グルコアミラーゼはペニシリウムグルコアミラーゼ、たとえばペニシリウムクリソゲヌムである。
【０１０７】
構造の同一性は、アミノ酸残基が同等であるかどうかを決定する。構造の同一性とは、２の構造（３次元構造およびアミノ酸構造）がアラインメントされたときの１対１の位相的な同等である。グルコアミラーゼの残基（アミノ酸）の位置は、それがトリコデルマレーシグルコアミラーゼ中の特定の残基またはその残基の一部と相同である（すなわち、一次構造または三次構造のいずれかにおける位置において対応している）か、あるいは相似である（同じまたは類似の機能的能力を有して、結合し、反応し、または化学的相互作用をする）ならば、トリコデルマレーシグルコアミラーゼの残基と同等である。
【０１０８】
一次構造の同一性を確立するために、グルコアミラーゼのアミノ酸配列は、トリコデルマレーシグルコアミラーゼの１次配列と、およびとりわけ配列が既知であるグルコアミラーゼ中で不変であるとわかっている残基の組と直接に比較されることができる。たとえば、本明細書中の図４Ａおよび４Ｂは、グルコアミラーゼ間で保存された残基を示す。図４Ｃおよび４Ｄは、種々のグルコアミラーゼからのデンプン結合ドメインのアラインメントを示す。保存残基をアラインメントした後、アラインメントを維持するために必要な挿入および欠失を許し（すなわち、任意的な欠失および挿入によって保存残基が削除されるのを防ぎ）、トリコデルマレーシグルコアミラーゼの１次配列中の特定のアミノ酸と同等の残基が明確にされる。保存残基のアラインメントは、典型的にはかかる残基の１００％を保存しなければならない。しかし、保存残基の７５％超または５０％という少なさのアラインメントも、同等の残基を規定するのに適当である。さらに、構造の同一性が配列の同一性とともに用いられて、同等の残基が同定されることができる。
【０１０９】
たとえば、図４Ａおよび４Ｂにおいて、６の有機体からのグルコアミラーゼの触媒ドメインがアラインメントされて、アミノ酸配列間の最大量の相同性がもたらされる。これらの配列を比較すると、アスタリスクによって示された多数の保存残基が各配列中に含まれていることがわかる。これらの保存残基は、このようにして他のグルコアミラーゼ、たとえばアスペルギルスニガーからのグルコアミラーゼ中の、トリコデルマレーシグルコアミラーゼの対応する同等のアミノ酸残基を規定するのに用いられることができる。同様に、図４Ｃおよび４Ｄは、同等の残基を同定するためにアラインメントされた、７の有機体からのグルコアミラーゼのデンプン結合ドメインを示す。
【０１１０】
構造の同一性は、２の構造間の同等の残基の同定を含む。「同等の残基」は、その三次構造がＸ線結晶解析法によってすでに決定されている酵素について、三次構造のレベルにおける相同性（構造の同一性）を決定することによって定義されることができる。同等の残基は、トリコデルマレーシグルコアミラーゼの特定のアミノ酸残基の２以上の主鎖原子（ＮとＮ、ＣＡとＣＡ、ＣとＣおよびＯとＯ）の原子座標が、アラインメント後に０．１３ｎｍ以内、好ましくは０．１ｎｍ以内にあるものと定義される。アラインメントは、問題のグルコアミラーゼの水素以外のタンパク質原子の原子座標がトリコデルマレーシグルコアミラーゼの原子座標と最大の重なり合いを示すように、最良のモデルが配向され位置合わせされて初めて達成される。該最良のモデルとは、利用できる最も高い分解能における実験的回析データについて最も低いＲ因子を与える結晶学的モデルである。
【数１】
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【０１１１】
トリコデルマレーシグルコアミラーゼの特定の残基に機能的に相似している同等の残基は、トリコデルマレーシグルコアミラーゼの特定の残基に規定され帰属されるような様式で、タンパク質の構造、基質の結合または触媒作用を変更し修飾するか、あるいはこれらに貢献するような立体配座をとることができる酵素のアミノ酸と定義される。さらに、これらの残基は、該残基の主鎖原子は相同の位置を占めていることを基準とする同等の判断基準を満たさないかもしれないけれども、該残基の側鎖原子のうちの少なくとも２の原子の座標がトリコデルマレーシグルコアミラーゼの対応する側鎖原子の０．１３ｎｍ以内にある程度まで相似の位置を占めているような酵素（その三次構造がＸ線結晶解析法によってすでに得られている酵素）の残基である。トリコデルマレーシグルコアミラーゼの三次元構造の座標は表３に記載され、上で概略示されたように用いられて、三次構造のレベルで同等の残基を決定することができる。
【０１１２】
置換と特定された残基のうちのあるものは保存残基であるが、他方でそうでないものもある。保存されていない残基の場合、１以上のアミノ酸の置換は、天然に見出されるアミノ酸配列に対応しないアミノ酸配列を有する変異体を生成する置換に限定される。保存残基の場合、かかる置換は自然発生配列とは当然にならない。
【０１１３】
４．変異体
本開示発明に従う変異体は、親グルコアミラーゼのアミノ酸配列中に少なくとも１の置換、欠失または挿入を含み、これは該変異体を親グルコアミラーゼと配列において異なったものにする。ある実施態様では、本開示発明の変異体は、配列番号２のＴｒＧＡ活性の少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％のグルコアミラーゼ活性を有する。
【０１１４】
ある実施態様では、本開示発明に従う変異体は、親ＴｒＧＡ（配列番号２）の少なくとも１のアミノ酸の位置において、または該ＴｒＧＡ配列と少なくとも８０％の、たとえば以下に限定されることなく少なくとも９０％の、少なくとも９３％の、少なくとも９５％の、少なくとも９７％のおよび少なくとも９９％の配列同一性を有する他の親グルコアミラーゼの配列中の同等の位置において、置換、欠失または挿入を含んでいる。
【０１１５】
他の実施態様では、本開示発明に従う変異体は、親ＴｒＧＡの断片であって、ＴｒＧＡ配列（配列番号３）の触媒ドメインを含んでいる断片の少なくとも１のアミノ酸の位置において、または該ＴｒＧａ配列の断片と少なくとも８０％の、たとえば以下に限定されることなく少なくとも９０％の、少なくとも９５％の、少なくとも９７％のおよび少なくとも９９％の配列同一性を有する親グルコアミラーゼの触媒ドメインを含んでいる断片中の同等の位置において、置換、欠失または挿入を含んでいる。ある実施態様では、該断片は少なくとも４００、４２５、４５０および／または５００のアミノ酸残基を含んでいる。
【０１１６】
他の実施態様では、本開示発明に従う変異体は、親ＴｒＧＡの断片であって、ＴｒＧＡ配列（配列番号１６１）のデンプン結合ドメインを含んでいる断片の少なくとも１のアミノ酸の位置において、または該ＴｒＧａ配列の断片と少なくとも８０％の、たとえば以下に限定されることなく少なくとも９０％の、少なくとも９５％の、少なくとも９７％のおよび少なくとも９９％の配列同一性を有する親グルコアミラーゼのデンプン結合ドメインを含んでいる断片中の同等の位置において、置換、欠失または挿入を含んでいる。ある実施態様では、該断片は、ＴｒＧＡデンプン結合ドメイン（配列番号１６１）の少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００および／または１０９のアミノ酸残基を含んでいる。
【０１１７】
ある実施態様では、親グルコアミラーゼが触媒ドメイン、リンカー領域およびデンプン結合ドメインを含むときは、変異体は、該リンカー領域の一部を含んでいる断片の少なくとも１のアミノ酸の位置において置換、欠失または挿入を含んでいる。ある実施態様では、変異体は、ＴｒＧＡ配列（配列番号２）の断片のアミノ酸配列中に、置換、欠失または挿入を含んでいる。
【０１１８】
アミノ酸置換に関する構造の同一性とは、相同のグルコアミラーゼまたは親グルコアミラーゼ中の同等のアミノ酸の位置において置換が生じることを意味する。同等の位置の語は、問題の親グルコアミラーゼのアミノ酸配列とＴｒＧＡ参照グルコアミラーゼのアミノ酸配列とのアラインメント、ならびに問題の親グルコアミラーゼの三次元構造とＴｒＧＡ参照グルコアミラーゼの三次元配列とのアラインメントに基づいて、２の親配列に共通である位置を意味する。たとえば、図５を参照すると、ＴｒＧＡ（配列番号２または３）中の位置２４はＤ２４であり、アスペルギルスニガー（配列番号６）の同等の位置は位置Ｄ２５であり、アスペルギルスオリザエ（配列番号７）の同等の位置は位置Ｄ２６である。三次元配列の例示的なアラインメントについては、図１２および１３を参照せよ。
【０１１９】
ある実施態様では、グルコアミラーゼ変異体は、親のアミノ酸配列中に少なくとも１の置換を含む。さらなる実施態様では、該変異体は２以上の置換（たとえば、２、３または４の置換）を有してもよい。
【０１２０】
ある実施態様では、グルコアミラーゼ変異体は置換、欠失または挿入を含んでおり、典型的には図５に示された保存されていないアミノ酸の領域に対応する位置中の少なくとも１のアミノ酸の位置（たとえば、図５中に「＊」によって指定されていない諸位置に対応するアミノ酸の位置）において置換を含んでいる。
【０１２１】
変異は成熟タンパク質配列（配列番号２）中の任意の位置にあることができるけれども、１の実施態様では、グルコアミラーゼ変異体は、配列番号２に規定されたアミノ酸配列中の以下の位置、すなわち４、５、１２、２４、２９、４３、４４、４５、４６、４７、４９、５１、６１、７０、７３、７５、７６、９４、１００、１０８、１１４、１１６、１１９、１２２、１２４、１２５、１３７、１４３、１４６、１４８、１６９、１７１、１７２、１７５、１７８、１８０、１８１、２０８、２１１、２２８、２４２、２４３、２４５、２９２、２９４、２９７、３０９、３１０、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３２１、３４０、３４１、３５０、３５３、３５６、３６３、３６８、３６９、３７５、３７６、３９５、３９８、４０１、４０８、４０９、４１２、４１５、４１７、４１８、４２１、４３０、４３１、４３３、４３６、４５１、５０３、５１１、５３５，５３９もしくは５６３、または親グルコアミラーゼ中の同等の位置に１以上の置換を含んでいる。ある実施態様では、親グルコアミラーゼは、配列番号２と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％および少なくとも９９％の同一性を有する。他の実施態様では、親グルコアミラーゼはトリコデルマグルコアミラーゼ相同体である。
【０１２２】
ある実施態様では、グルコアミラーゼ変異体は、配列番号２に規定されたアミノ酸配列中の以下の位置、すなわちＤ４、Ｆ５、Ｉ１２、Ｄ２４、Ｆ２９、Ｉ４３、Ｄ４４、Ｐ４５、Ｄ４６、Ｙ４７、Ｙ４９、Ｗ５１、Ｎ６１、Ｙ７０、Ｇ７３、Ｑ７５、Ｒ７６、Ｐ９４、Ｄ１００、Ｋ１０８、Ｋ１１４、Ｆ１１６、Ｎ１１９、Ｒ１２２、Ｑ１２４、Ｒ１２５、Ｇ１３７、Ｎ１４６、Ｑ１４８、Ｙ１６９、Ｎ１７１、Ｑ１７２、Ｆ１７５、Ｗ１７８、Ｅ１８０、Ｖ１８１、Ｑ２０８、Ｓ２１１、Ｗ２２８、Ｎ２４２、Ｅ２４３、Ｒ２４５、Ｉ２９２、Ｇ２９４、Ｋ２９７、Ｒ３０９、Ｙ３１０、Ｄ３１３、Ｖ３１４、Ｙ３１５、Ｙ３１６、Ｎ３１７、Ｗ３２１、Ｋ３４０、Ｋ３４１、Ｔ３５０、Ｑ３５６、Ｔ３６３、Ｓ３６８、Ｓ３６９、Ｎ３７６、Ｙ３９５、Ａ３９８、Ｓ４０１、Ｒ４０８、Ｎ４０９、Ｔ４１２、Ｌ４１７、Ｈ４１８、Ｗ４２１、Ｔ４３０、Ａ４３１、Ｒ４３３、１４３６、Ｓ４５１、Ｅ５０３、Ｑ５１１、Ａ５３５、Ａ５３９もしくはＮ５６３、または親グルコアミラーゼ（たとえば、トリコデルマグルコアミラーゼ相同体）中の同等の位置において、１以上の置換を含んでいる。
【０１２３】
他の実施態様では、親グルコアミラーゼの変異体は、配列番号２に規定されたアミノ酸配列中の以下の位置、すなわち４、５、２４、２９、４３、４４、４９、６１、７０、７３、７５、７６、１００、１０８、１１９、１２４、１３７、１４６、１４８、１６９、１７１、１７２、１７５、１７８、１８１、２０８、２１１、２４３、２９２、２９４、２９７、３１４、３１６、３１７、３４０、３４１、３５０、３５６、３６３、３６８、３６９、３７６、３９５、４０１、４０９、４１２、４１７、４３０、４３１、４３３、４３６、４５１、５０３、５１１、５３５、５３９もしくは５６３、または親グルコアミラーゼ（たとえば、トリコデルマグルコアミラーゼ相同体）中の同等の位置において、１以上の置換を含んでいる。
【０１２４】
さらなる実施態様では、親グルコアミラーゼの変異体は、配列番号２に規定されたアミノ酸配列中の以下の位置における以下の置換、すなわちＤ４Ｌ／Ｅ／Ｒ／Ｓ／Ｃ／Ａ／Ｑ／Ｗ、Ｆ５Ｃ／Ｍ／Ｎ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ、Ｉ１２Ｌ／Ｒ、Ｄ２４Ｅ／Ｌ／Ｙ／Ｔ、Ｆ２９Ｌ／Ｉ／Ｄ／Ｃ／Ｓ／Ｖ／Ｗ、Ｉ４３Ｆ／Ｒ／Ｄ／Ｙ／Ｓ／Ｑ、Ｄ４４Ｅ／Ｈ／Ｋ／Ｓ／Ｎ／Ｙ／Ｆ／Ｒ／Ｃ、Ｙ４７Ｗ、Ｙ４９Ｎ、Ｎ６１Ｄ／Ｉ／Ｌ／Ｑ／Ｖ／Ｗ、Ｑ７０Ｒ／Ｋ／Ｍ／Ｐ／Ｇ／Ｌ／Ｆ、Ｇ７３Ｆ／Ｃ／Ｌ／Ｗ、Ｑ７５Ｒ／Ｋ／Ａ、Ｒ７６Ｌ／Ｍ／Ｋ／Ｔ／Ｐ、Ｐ９４Ｌ、Ｄ１００Ｗ／Ｉ／Ｑ／Ｍ／Ｐ／Ａ／Ｎ、Ｎ１１９Ｐ／Ｔ／Ｙ／Ｄ／Ｅ、Ｎ１４６Ｓ／Ｇ／Ｃ／Ｈ／Ｅ／Ｄ／Ｔ／Ｗ／Ｌ／Ｆ／Ｍ、Ｑ１４８Ｖ／Ｙ／Ｈ／Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｇ／Ｍ／Ｒ／Ｓ／Ｔ、Ｙ１６９Ｄ／Ｆ、Ｑ１７２Ｃ／Ａ／Ｄ／Ｒ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｖ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、Ｆ１７５Ｈ／Ａ／Ｇ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｃ／Ｗ／Ｙ、Ｗ１７８Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｋ／Ｎ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ、Ｅ１８０Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ、Ｖ１８１Ｅ／Ｃ／Ｄ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｐ／Ｔ／Ｙ／Ｓ／Ｌ／Ｋ／Ｆ／Ａ、Ｑ２０８Ｌ／Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｎ／Ｆ／Ｈ／Ｔ、Ｓ２１１Ｃ／Ｒ／Ｅ／Ａ／Ｙ／Ｗ／Ｍ／Ｈ／Ｌ／Ｉ／Ｒ／Ｑ／Ｔ、Ｅ２４３Ｓ／Ｒ／Ｎ／Ｍ／Ｙ／Ａ／Ｌ、Ｒ２４５Ａ／Ｅ／Ｍ／Ｉ／Ｐ／Ｖ、Ｉ２９２Ｄ／Ｈ／Ｐ／Ｒ／Ｔ／Ｎ／Ｖ／Ｆ／Ｌ、Ｇ２９４Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｔ／Ｑ／Ｉ／Ａ、Ｋ２９７Ｆ／Ｌ／Ｐ／Ｔ／Ｍ／Ｄ／Ｎ／Ｑ／Ａ／Ｙ／Ｈ／Ｓ／Ｒ／Ｗ、Ｒ３０９Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｌ、Ｙ３１０Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｐ／Ｓ／Ｗ／Ｒ／Ｑ、Ｄ３１３Ｑ、Ｖ３１４Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｅ／Ｑ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｆ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ、Ｙ３１５Ｆ、Ｙ３１６Ｑ／Ｒ、Ｎ３１７Ｔ／Ｈ、Ｋ３４０Ｄ／Ｔ、Ｋ３４１Ｆ／Ｄ／Ｐ／Ｖ／Ｇ／Ｓ、Ｔ３５０Ｓ／Ｅ／Ａ／Ｎ、Ｑ３５６Ｈ／Ｄ／Ｅ、Ｔ３６３Ｌ／Ｒ／Ｃ／Ｈ／Ｗ、Ｓ３６８Ｗ／Ｄ／Ｆ／Ｌ、Ｓ３６９Ｆ、Ｎ３７６Ｑ／Ｔ／Ｈ／Ｓ／Ｖ、Ｙ３９５Ｑ／Ｒ／Ｓ、Ａ３９８Ｓ／Ｉ／Ｔ、Ｓ４０１Ｃ／Ｖ、Ｒ４０８Ｓ、Ｎ４０９Ｗ／Ｔ／Ｋ、Ｔ４１２Ａ／Ｈ／Ｋ／Ｇ、Ｌ４１７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｉ／Ｋ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ｔ４３０Ａ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ａ４３１Ｃ／Ｅ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｗ／Ｙ、Ｒ４３３Ｈ／Ｑ、Ｉ４３６Ａ／Ｔ、Ｓ４５１Ｍ／Ｔ／Ｈ、Ｅ５０３Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｈ／Ｓ／Ｖ／Ｗ、Ｑ５１１Ｃ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｔ／Ｖ、Ａ５３５Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｋ／Ｌ／Ｎ／Ｐ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ａ５３９Ｅ／Ｈ／Ｍ／Ｒ／Ｓ／ＷもしくはＮ５６３／Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｑ／Ｔ／Ｖ、または親グルコアミラーゼ相同体中の同等の位置における置換のうちの少なくとも１を含んでいる。
【０１２５】
ある実施態様では、グルコアミラーゼ変異体は、配列番号２に規定されたアミノ酸残基の位置に対応する位置、すなわち５、２４、４３、４４、４９、６１、７０、７３、７５、７６、９４、１１９、１４６、１４８、１７２、１７５、１７８、１８０、１８１、２０８、２１１、２４５、２９４、３５３、３１５、３７５、４０９、３０９、３１４、３６９、４１２、４１７、４３０、４３１、５０３、５１１、５３５、５３９もしくは５６３、または相同の親グルコアミラーゼ中の同等の位置において、少なくとも１の置換を含んでいる。
【０１２６】
ある代表的な実施態様では、グルコアミラーゼ変異体は、配列番号２に規定された位置、または相同の親グルコアミラーゼ中の同等の位置に対応するＦ５Ｗ、Ｄ２４Ｅ、Ｉ４３Ｒ、Ｉ４３Ｙ、Ｉ４３Ｑ、Ｉ４３Ｓ、Ｉ４３Ｆ、Ｄ４４Ｃ、Ｄ４４Ｒ、Ｙ４７Ｗ、Ｙ４９Ｎ、Ｎ６１Ｉ、Ｑ７０Ｋ、Ｇ７３Ｆ、Ｑ７５Ｒ、Ｒ７６Ｌ、Ｐ９４Ｌ、Ｎ１１９Ｐ／Ｔ／Ｙ／Ｄ、Ｎ１４６Ｓ／Ｄ／Ｔ／Ｅ／Ｗ／Ｌ、Ｑ１４８Ｖ、Ｎ１７１Ｄ、Ｑ１７２Ｃ／Ｄ／Ｒ／Ｅ／Ｆ／Ｖ／Ｌ／Ｔ、Ｆ１７５Ｒ／Ｗ／Ｙ、Ｗ１７８Ｋ／Ｎ／Ｙ、Ｅ１８０Ｈ／Ｎ／Ｖ／Ｒ、Ｖ１８１Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｉ／Ｈ、Ｑ２０８Ａ／Ｔ／Ｎ、Ｓ２１１Ｈ／Ｍ／Ｌ／Ｒ、Ｒ２４５Ｅ、Ｒ２４５Ｍ、Ｇ２９４Ｃ、Ｒ３０９Ｗ、Ｖ３１４Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｋ／Ｐ／Ｒ／Ｙ、Ｙ３１５Ｆ、Ｓ３６９Ｆ、Ｔ４１２Ｋ、Ｌ４１７Ｒ、Ｌ４１７Ｖ、Ｔ４３０Ａ、Ｔ４３０Ｍ、Ａ４３１Ｌ、Ａ４３１Ｑ、Ｅ５０３Ａ、Ｅ５０３Ｖ、Ｑ５１１Ｈ、Ａ５３５Ｒ、Ａ５３９Ｒ、Ｎ５６３ＩおよびＮ５６３Ｋからなる群から選択された少なくとも１の置換を含んでいる。
【０１２７】
さらなる特定の実施態様では、グルコアミラーゼ変異体は、配列番号２の位置５、４３、４４、６１、７３、７５、７６、９４、１０８、１１９、１２４、１４６、１４８、１７１、１７２、１７５、１７８、１８０、１８１、２０８、２１１、２９４、２９７、３１４、３１６、４１２、４１７、４３０、４３１、５０３、５１１、５３５、５３９もしくは５６３に対応する位置、またはトリコデルマグルコアミラーゼ相同体中の同等の位置から選択されたアミノ酸残基の少なくとも１の置換を含んでいる。ある実施態様では、該置換は、配列番号２の位置数４３、４４、６１、７３、１４８、１７２、１７５、１７８、１８０、２０８、２１１、２９４、２９７、３１４、４１２、４１７、４３０、４３１、５０３、５１１、５３５、５３９もしくは５６３に対応する位置、またはトリコデルマグルコアミラーゼ相同体中の同等の位置におけるものである。
【０１２８】
ある代表的な実施態様では、該置換は、配列番号２の位置数４３、４４、６１、７３、１０８、１２４、１７１、１７２、２０８、２１１、２９４、３１４、３１６、４１７、４３０、４３１、５０３、５１１、５３５、５３９もしくは５６３に対応する位置、または相同の親グルコアミラーゼ（たとえば、トリコデルマグルコアミラーゼ相同体）におけるものである。
【０１２９】
ある実施態様では、グルコアミラーゼ変異体は複数の置換を含んでいる。複数の置換のうちのあるものは、配列番号２の位置２４、４３、４４、１０８、１２４、１７１、１７５、１８１、２０８、２４３、２９２、２９４、２９７、３１０、３１４、３６３、４１７、４３０、４３１、５０３、５１１、５３５、５３９もしくは５６３と同等の位置およびこれらを含む位置のうちの１以上における置換を含む。ある典型的な複数の置換は、配列番号２の位置４３、４４、６１、７３、０８、１２４、１７１、２０８、２１１、２９４、３１４、４１７、４３０、４３１、５０３、５１１、５３５、５３９もしくは５６３と同等の位置およびこれらに対応する位置のうちの１以上を含む。
【０１３０】
複数の置換を有する変異体のいくつかの例は、配列番号２の位置
Ｄ２４／Ｉ４３／Ｄ４４／Ｆ１７５／Ｖ１８１／Ｖ３１４／Ｔ３６３、
Ｄ２４／Ｑ２０８／Ｉ２９２／Ｇ２９４／Ｋ２９７／Ｙ３１０、
Ｖ１８１／Ｅ２４３／Ｉ２９２／Ｋ２９７／Ｎ３１７／Ｙ３９５、
Ｄ２４／Ｖ１８１／Ｑ２０８／Ｇ２９４／Ｔ３６３／Ｎ３７６／Ｎ４０９、
Ｄ２４／Ｖ１８１／Ｉ２９２／Ｇ２９４／Ｅ２４３／Ｎ４０９、
Ｉ４３Ｒ／Ｅ２４３／Ｉ２９２／Ｇ２９４／Ｋ２９７、
Ｉ４３／Ｄ４４／Ｎ６１／Ｌ４１７／Ｅ５０３／Ｑ５１１／Ａ５３９、
Ｉ４３／Ｄ４４／Ｌ４１７／Ｅ５０３／Ｑ５１１／Ａ５３９、
Ｉ４３／Ｎ６１／Ｌ４１７／Ｔ４３０／Ｑ５１１／Ａ５３９、
Ｉ４３／Ｎ６１／Ｌ４１７／Ｅ５０３／Ｑ５１１／Ａ５３９、
Ｉ４３／Ｎ６１／Ｔ４３０／Ａ４３１／Ｑ５１１／Ａ５３９、
Ｉ４３／Ｎ６１／Ｔ４３０／Ｑ５１１、
Ｉ４３／Ｎ６１／Ｔ４３０／Ｑ５１１／Ａ５３９、
Ｉ４３／Ｎ６１／Ｑ５１１、
Ｉ４３／Ｎ６１／Ｑ５１１／Ａ５３９、
Ｉ４３／Ｇ７３／Ｔ４３０、
Ｉ４３／Ｌ４１７／Ｅ５０３／Ｑ５１１／Ａ５３９、
Ｉ４３／Ｌ４１７／Ｑ５１１、
Ｉ４３／Ｌ４１７／Ｔ４３０／Ａ４３１／Ｑ５１１／Ａ５３９、
Ｉ４３／Ｌ４１７／Ｔ４３０／Ｑ５１１、
Ｉ４３／Ｌ４１７／Ｔ４３０／Ｑ５１１／Ａ５３９、
Ｉ４３／Ｌ４１７／Ｅ５０３／Ａ５３９、
Ｉ４３／Ｌ４１７／Ｅ５０３／Ｑ５１１／Ａ５３９、
Ｉ４３／Ｔ４３０、
Ｉ４３／Ｔ４３０／Ａ４３１／Ｅ５Ｏ３／Ｑ５１１、
Ｉ４３／Ｔ４３０／Ａ４３１／Ｑ５１１、
Ｉ４３／Ｔ４３０／Ａ４３１／Ｑ５１１／Ａ５３９、
Ｉ４３／Ｔ４３０／Ｅ５０３／Ｑ５１１、
Ｉ４３／Ｔ４３０／Ｑ５１１、
Ｉ４３Ｑ／Ｔ４３０／Ｑ５１１／Ａ５３９、
Ｉ４３／Ａ４３１／Ｑ５１１、
Ｉ４３／Ｔ４３０／Ｅ５０３／Ｑ５１１／Ｎ５６３、
Ｉ４３／Ｔ４３０／Ｅ５０３／Ａ５３５／Ｎ５６３、
Ｉ４３／Ｅ５０３／Ｑ５１１／Ａ５３９、
Ｉ４３／Ｑ５１１／Ａ５３９、
Ｄ４４／Ｇ７３／Ｌ４１７／Ｎ５６３、
Ｄ４４／Ｇ７３／Ｅ５０３／Ｑ５１１、
Ｄ４４／Ｇ７３／Ｎ５６３、
Ｄ４４／Ｌ４１７／Ｎ５６３、
Ｄ４４／Ｔ４３０／Ｑ５１１／Ａ５３５、
Ｄ４４／Ｅ５０３／Ｑ５１１／Ｎ５６３、
Ｇ７３／Ｔ４３０／Ｅ５０３／Ｑ５１１、
Ｇ７３／Ｔ４３０／Ｑ５１１、
Ｇ２９４／Ｌ４１７／Ａ４３１、
Ｇ２９４／Ｌ４１７／Ａ４３１、
Ｇ２９４／Ｌ４１７／Ａ４３１／Ｑ５１１、
Ｌ４１７／Ｔ４３０／Ａ４３１／Ｑ５１１／Ａ５３５／Ａ５３９／Ｎ５６３、
Ｌ４１７／Ａ４３１／Ｑ５１１、
Ｌ４１７／Ｔ４３０／Ｑ５１１／Ａ５３５／Ｎ５６３、
Ｌ４１７／Ｔ４３０／Ｑ５１１／Ａ５３９／Ｎ５６３および
Ｅ５０３／Ｎ５６３、
または親グルコアミラーゼ、とりわけトリコデルマグルコアミラーゼ相同体中の同等の位置における置換を含んでいる。
【０１３１】
複数の置換を有するある変異体は、配列番号２の位置
Ｙ４７Ｆ／Ｗ、Ｙ３１５Ｆ／Ｗ；
Ｄ２４Ｅ、Ｌ／Ｉ４３Ｆ、Ｒ／Ｄ４４Ｈ、Ｎ／Ｆ１７５Ｈ／Ｖ１８１Ｋ、Ｌ／Ｖ３１４Ｄ、Ｈ、Ｋ／Ｔ３６３Ｒ；
Ｄ２４Ｌ、Ｗ、Ｙ／Ｑ２０８Ｆ／Ｉ２９２Ｆ、Ｎ、Ｖ／Ｇ２９４Ａ、Ｉ、Ｑ／Ｋ２９７Ａ／Ｙ３１ＯＦ、Ｑ、Ｒ；
Ｖ１８１Ｆ、Ｋ、Ｌ／Ｅ２４３Ａ、Ｎ、Ｍ、Ｒ、Ｙ／Ｉ２９２Ｆ、Ｌ、Ｎ、Ｖ／Ｋ２９７Ａ、Ｄ、Ｈ、Ｍ、Ｎ、Ｑ／Ｎ３１７Ｈ／Ｙ３９５Ｑ、Ｒ；
Ｄ２４Ｅ、Ｌ、Ｙ／Ｖ１８１Ｆ、Ｋ、Ｌ／Ｑ２０８Ｃ、Ｆ／Ｇ２９４Ａ、Ｉ、Ｑ／Ｔ３６３Ｒ／Ｎ３７６Ｑ／Ｎ４０９Ｋ、Ｗ；
Ｄ２４Ｅ、Ｌ、Ｙ／Ｖ１８１Ｆ、Ｋ、Ｌ／Ｉ２９２Ｆ、Ｌ、Ｎ、Ｖ／Ｇ２９４Ａ、Ｉ、Ｑ／Ｅ２４３Ａ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｙ／Ｎ４０９Ｋ、Ｗ；
Ｉ４３Ｒ／Ｅ２４３Ａ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｙ／Ｉ２９２Ｆ、L、Ｎ、Ｖ／G２９４A／K２９７Ａ、Ｄ、Ｈ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｒ、Ｗ、Ｙ；
Ｉ４３Q／Ｄ４４Ｃ／Ｎ６１Ｉ／Ｌ４１７Ｖ／Ｅ５０３Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｄ４４Ｃ／Ｌ４１７Ｖ／Ｅ５０３Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｎ６１Ｉ／Ｌ４１７Ｖ／Ｅ５０３Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｎ６１Ｉ／Ｌ４１７Ｖ／Ｔ４３０Ｍ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｒ／Ｎ６１Ｉ／Ｌ４１７Ｒ、Ｖ／Ｅ５０３Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｎ６１Ｉ／Ｔ４３０Ａ／Ａ４３１Ｌ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｎ６１Ｉ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ；
Ｉ４３Ｑ／Ｎ６１Ｉ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｎ６１Ｉ／Ｔ４３０Ｍ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ  Ｉ４３Ｑ／Ｎ６１Ｉ／Ｑ５１１Ｈ；
Ｉ４３Ｑ／Ｎ６１Ｉ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｒ／Ｇ７３Ｆ／Ｔ４３０Ａ；
Ｉ４３Ｑ／Ｌ４１７Ｖ／Ｔ４３０Ａ／Ａ４３１Ｌ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｌ４１７Ｖ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ；
Ｉ４３Ｑ／Ｌ４１７Ｖ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｒ／Ｌ４１７Ｒ／Ｅ５０３Ａ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｒ、Ｑ／Ｌ４１７Ｖ／Ｅ５０３Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｌ４１７Ｖ／Ｑ５１１Ｈ；
Ｉ４３Ｒ、Ｑ／Ｔ４３０Ａ：
Ｉ４３Ｑ／Ｔ４３０Ａ／Ａ４３１Ｌ／Ｅ５０３Ａ／Ｑ５１１Ｈ；
Ｉ４３Ｑ／Ｔ４３０Ａ／Ａ４３１Ｌ／Ｑ５１１Ｈ；
Ｉ４３Ｑ／Ｔ４３０Ａ／Ａ４３１Ｌ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｑ／Ｔ４３０Ａ／Ｅ５０３Ａ／Ｑ５１１Ｈ；
Ｉ４３Ｑ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ；
Ｉ４３Ｑ／Ｔ４３０Ａ、Ｍ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Ｒ／Ｔ４３０Ａ／Ｅ５０３A、V／Ｑ５１１Ｈ／N５６３Ｋ；
Ｉ４３Q／A４３１L／Ｑ５１１Ｈ；
Ｉ４３Q／Ｅ５０３A／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ；
Ｉ４３Q／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ； 
Ｄ４４Ｃ／Ｇ７３F／Ｅ５０３Ｖ／Ｑ５１１Ｈ；
Ｄ４４Ｃ／Ｇ７３Ｆ／Ｌ４１７Ｒ／Ｎ５６３Ｋ；
Ｄ４４Ｃ／Ｇ７３Ｆ／Ｎ５６３Ｋ；
Ｄ４４Ｃ／Ｌ４１７Ｒ／Ｎ５６３Ｋ；
Ｄ４４Ｒ／Ｅ５０３Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ｎ５６３Ｉ；
Ｄ４４Ｒ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３５Ｒ；
Ｇ７３Ｆ／Ｔ４３０Ａ／Ｅ５０３Ｖ／Ｑ５１１Ｈ；
Ｇ７３Ｆ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ；
Ｇ２９４Ｃ／Ｌ４１７Ｒ／Ａ４３１Ｌ；
Ｇ２９４Ｃ／Ｌ４１７Ｒ／Ａ４３１Ｌ、Ｑ／Ｑ５１１Ｈ；
Ｇ２９４Ｃ／Ｌ４１７Ｖ／Ａ４３１Ｑ；
Ｌ４１７Ｒ、Ｖ／Ａ４３１Ｌ、Ｑ／Ｑ５１１Ｈ；
Ｌ４１７Ｖ／Ｔ４３０Ａ／Ａ４３１Ｌ、Ｑ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３５Ｒ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ５６３Ｉ；
Ｌ４１７Ｖ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３５Ｒ／Ｎ５６３Ｉ；
Ｌ４１７Ｖ／Ｔ４３０Ａ／Ｑ５１１Ｈ／Ａ５３９Ｒ／Ｎ５６３Ｉ；および
Ｅ５０３Ａ／Ｎ５６３Ｉ、
または親グルコアミラーゼ、とりわけトリコデルマグルコアミラーゼ相同体中の同等の位置における置換を含んでいることができる。
【０１３２】
多数の親グルコアミラーゼが、ＴｒＧＡのアミノ酸配列とアラインメントされた。図４Ａおよび４Ｂは以下の親グルコアミラーゼ、すなわちアスペルギルスアワモリ（ＡａＧＡ）（配列番号５）、アスペルギルスニガー（ＡｎＧＡ）（配列番号６）、アスペルギルスオリザエ（ＡｏＧＡ）（配列番号７）、フミコーラグリセア（ＨｇＧＡ）（配列番号８）およびハイポクレアビノサ（ＨｖＧＡ）（配列番号９）の触媒ドメインを含む。これらの触媒ドメインの同一性％が以下の表１に示される。図４Ｃおよび４Ｄは以下の親グルコアミラーゼ、すなわちトリコデルマレーシ（ＴｒＧＡ）（配列番号１６１）、フミコーラグリセア（ＨｇＧＡ）（配列番号１６２）、シエラビアテルレストリス（ＴｔＧＡ）（配列番号１６３）、テルモミセスラヌギノスス（ＴｈＧＡ）（配列番号１６４）、タラロミセスエメルソニイ（ＴｅＧＡ）（配列番号１６５）、アスペルギルスニガー（ＡｎＧＡ）（配列番号１６６）およびアスペルギルスアワモリ（ＡａＧＡ）（配列番号１６７）のデンプン結合ドメインを含む。ある実施態様では、たとえば、変異体グルコアミラーゼはアスペルギルスグルコアミラーゼである親グルコアミラーゼに由来し、該変異体は、配列番号２に規定された位置と同等の位置において、とりわけＤ４、Ｆ５、Ｉ１２、Ｄ２４、Ｆ２９、Ｉ４３、Ｄ４４、Ｐ４５、Ｄ４６、Ｙ４７、Ｙ４９、Ｗ５１、Ｎ６１、Ｙ７０、Ｇ７３、Ｑ７５、Ｒ７６、Ｐ９４、Ｄ１００、Ｋ１０８、Ｋ１１４、Ｆ１１６、Ｎ１１９、Ｒ１２２、Ｑ１２４、Ｒ１２５、Ｇ１３７、Ｎ１４６、Ｑ１４８、Ｙ１６９、Ｎ１７１、Ｑ１７２、Ｆ１７５、Ｗ１７８、Ｅ１８０、Ｖ１８１、Ｑ２０８、Ｓ２１１、Ｗ２２８、Ｎ２４２、Ｅ２４３、Ｒ２４５、Ｉ２９２、Ｇ２９４、Ｋ２９７、Ｒ３０９、Ｙ３１０、Ｄ３１３、Ｖ３１４、Ｙ３１５、Ｙ３１６、Ｎ３１７、Ｗ３２１、Ｋ３４０、Ｋ３４１、Ｔ３５０、Ｑ３５６、Ｔ３６３、Ｓ３６８、Ｓ３６９、Ｎ３７６、Ｙ３９５、Ａ３９８、Ｓ４０１、Ｒ４０８、Ｎ４０９、Ｔ４１２、Ｌ４１７、Ｈ４１８、Ｗ４２１、Ｔ４３０、Ａ４３１、Ｒ４３３、Ｉ４３６、Ｓ４５１、Ｅ５０３、Ｑ５１１、Ａ５３５、Ａ５３９またはＮ５６３に対応する位置において、少なくとも１の置換を含む。
【０１３３】
トリコデルマレーシグルコアミラーゼ中のＮ結合型糖のエンド型水素の除去は、（Ｔｍから判断すると）安定化効果を有していた。したがって、Ｎ１７１Ｄの置換を有する変異体は、野生型の親と比較して高められた熱安定性を有することができる。ある実施態様では、Ｎ結合型糖を有する部位、たとえばトリコデルマレーシ（配列番号２）中のＮ１７１Ｄの部位等における置換を１以上有する変異体が提供される。
【表１】
0005594899.tif 000003
【０１３４】
本開示発明はまた、親グルコアミラーゼ、とりわけＴｒＧＡと比較して少なくとも１の変更された性質（たとえば、改良された性質）を有するグルコアミラーゼ変異体も提供する。ある実施態様では、少なくとも１の変更された性質（たとえば、改良された性質）は、酸安定性、熱安定性および比活性からなる群から選択される。典型的には、変更された性質は、高められた酸安定性、高められた熱安定性よび／または高められた比活性である。高められた熱安定性は、典型的にはより高温度における熱安定性である。１の実施態様では、高められたｐＨ安定性は、高ｐＨにおけるｐＨ安定性である。さらなる実施態様では、高められたｐＨ安定性は、低ｐＨにおけるｐＨ安定性である。
【０１３５】
本開示発明のグルコアミラーゼ変異体はまた、親グルコアミラーゼと比較して低基質濃度においてデンプン加水分解のより高い速度も提供する。該変異体は、同じ条件下で試験されたときに親グルコアミラーゼよりも高いＶｍａｘまたは低いＫｍを有することができる。たとえば、変異体グルコアミラーゼは、２５℃〜７０℃の温度範囲において（たとえば、２５℃〜３５℃、３０℃〜３５℃、４０℃〜５０℃において、５０℃〜５５℃においておよび５５℃〜６２℃において）より高いＶｍａｘを有することができる。ミカエリス・メンテン定数ＫｍおよびＶｍａｘの値は、標準的な公知の手順を用いて容易に決定されることができる。
【０１３６】
５．熱安定性（熱安定な変異体）
１の側面では、本開示発明は、変更された温度において親または野生型と比較して変更された熱安定性を有する変異体グルコアミラーゼに関する。変更された温度とは、上げられたまたは下げられた温度を含む。ある実施態様では、該グルコアミラーゼ変異体は、所与の時間、たとえば少なくとも６０分間、１２０分間、１８０分間、２４０分間、３００分間等にわたって、変更された温度に曝露された後に、改良された熱安定性、たとえば少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の酵素活性を保持する熱安定性を有する。ある実施態様では、変異体は、４０℃〜８０℃の範囲、また５０℃〜７５℃の範囲、および６０℃〜７０℃の範囲の中の選択された温度において、ならびに典型的には４．０〜６．０のｐＨ範囲において親グルコアミラーゼと比較して高められた熱安定性を有する。ある実施態様では、熱安定性は実施例に記載されたように測定される。
【０１３７】
ある実施態様では、熱安定性の改良に関連してとりわけ興味深い変異体は、１以上の欠失、置換または挿入を含み、とりわけ配列番号２に規定されたアミノ酸配列中の以下の位置、すなわちＤ４、Ｆ５、Ｉ１２、Ｄ２４、Ｆ２９、Ｉ４３、Ｄ４４、Ｐ４５、Ｄ４６、Ｙ４７、Ｙ４９、Ｗ５１、Ｎ６１、Ｙ７０、Ｇ７３、Ｑ７５、Ｒ７６、Ｐ９４、Ｄ１００、Ｋ１０８、Ｋ１１４、Ｆ１１６、Ｎ１１９、Ｒ１２２、Ｑ１２４、Ｒ１２５、Ｇ１３７、Ｎ１４６、Ｑ１４８、Ｙ１６９、Ｎ１７１、Ｑ１７２、Ｆ１７５、Ｗ１７８、Ｅ１８０、Ｖ１８１、Ｑ２０８、Ｓ２１１、Ｗ２２８、Ｎ２４２、Ｅ２４３、Ｒ２４５、Ｉ２９２、Ｇ２９４、Ｋ２９７、Ｒ３０９、Ｙ３１０、Ｄ３１３、Ｖ３１４、Ｙ３１５、Ｙ３１６、Ｎ３１７、Ｗ３２１、Ｋ３４０、Ｋ３４１、Ｔ３５０、Ｑ３５６、Ｔ３６３、Ｓ３６８、Ｓ３６９、Ｎ３７６、Ｙ３９５、Ａ３９８、Ｓ４０１、Ｒ４０８、Ｎ４０９、Ｔ４１２、Ｌ４１７、Ｈ４１８、Ｗ４２１、Ｔ４３０、Ａ４３１、Ｒ４３３、Ｉ４３６、Ｓ４５１、Ｅ５０３、Ｑ５１１、Ａ５３５、Ａ５３９もしくはＮ５６３、または親グルコアミラーゼ中の同等の位置における置換を含む。ある実施態様では、親グルコアミラーゼはトリコデルマグルコアミラーゼ相同体であり、典型的な実施態様では、親グルコアミラーゼは配列番号２と少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％の配列同一性を有する。
【０１３８】
６．キメラ型グルコアミラーゼ
本開示発明のグルコアミラーゼ変異体は、たとえば１のグルコアミラーゼからのデンプン結合ドメイン（ＳＢＤ）ならびに別のグルコアミラーゼからの触媒ドメインおよびリンカーを有するキメラまたはハイブリッドのグルコアミラーゼを含むこともできる。たとえば、ＡｎＧＡからのＳＢＤとＴｒＧＡからのＳＢＤとを交換して、ＡｎＧＡのＳＢＤならびにＴｒＧＡの触媒ドメインおよびリンカーを有するハイブリッドを作ることによって、ハイブリッドグルコアミラーゼが作られることができる。あるいは、ＡｎＧＡからのＳＢＤおよびリンカーが、ＴｒＧＡからのＳＢＤおよびリンカーと交換されることができる。
【０１３９】
７．比活性
他の側面では、本開示発明は、親または野生型グルコアミラーゼと比較して変更された比活性を有する変異体グルコアミラーゼに関する。
【０１４０】
ある実施態様では、比活性の改良に関連してとりわけ興味深い変異体は、１以上の欠失、置換または挿入を含み、とりわけ配列番号２に規定されたアミノ酸配列中の以下の位置、すなわちＤ４、Ｆ５、Ｉ１２、Ｄ２４、Ｆ２９、Ｉ４３、Ｄ４４、Ｐ４５、Ｄ４６、Ｙ４７、Ｙ４９、Ｗ５１、Ｎ６１、Ｙ７０、Ｇ７３、Ｑ７５、Ｒ７６、Ｐ９４、Ｄ１００、Ｋ１０８、Ｋ１１４、Ｆ１１６、Ｎ１１９、Ｒ１２２、Ｑ１２４、Ｒ１２５、Ｇ１３７、Ｎ１４６、Ｑ１４８、Ｙ１６９、Ｎ１７１、Ｑ１７２、Ｆ１７５、Ｗ１７８、Ｅ１８０、Ｖ１８１、Ｑ２０８、Ｓ２１１、Ｗ２２８、Ｎ２４２、Ｅ２４３、Ｒ２４５、Ｉ２９２、Ｇ２９４、Ｋ２９７、Ｒ３０９、Ｙ３１０、Ｄ３１３、Ｖ３１４、Ｙ３１５、Ｙ３１６、Ｎ３１７、Ｗ３２１、Ｋ３４０、Ｋ３４１、Ｔ３５０、Ｑ３５６、Ｔ３６３、Ｓ３６８、Ｓ３６９、Ｎ３７６、Ｙ３９５、Ａ３９８、Ｓ４０１、Ｒ４０８、Ｎ４０９、Ｔ４１２、Ｌ４１７、Ｔ４３０、Ａ４３１、Ｈ４１８、Ｗ４２１、Ｒ４３３、Ｉ４３６、Ｓ４５１、Ｅ５０３、Ｑ５１１、Ａ５３５、Ａ５３９もしくはＮ５６３、または親グルコアミラーゼ中の同等の位置における置換を含む。ある実施態様では、改良された比活性を有する本開示発明の変異体は、配列番号２に規定されたアミノ酸配列中の以下の位置、すなわちＤ４、Ｄ２４、Ｉ４３、Ｄ４４、Ｎ６１、Ｙ７０、Ｇ７３、Ｑ７５、Ｒ７６、Ｄ１００、Ｋ１０８、Ｎ１１９、Ｑ１２４、Ｎ１４６、Ｑ１４８、Ｎ１７１、Ｑ１７２、Ｆ１７５、Ｖ１８１、Ｑ２０８、Ｓ２１１、Ｅ２４３、Ｒ２４５、Ｉ２９２、Ｇ２９４、Ｋ２９７、Ｖ３１４、Ｙ３１６、Ｎ３１７、Ｋ３４０、Ｋ３４１、Ｔ３５０、Ｑ３５６、Ｔ３６３、Ｓ３６８、Ｎ３７６、Ｙ３９５、Ａ３９８、Ｓ４０１、Ｎ４０９、Ｔ４１２、Ｌ４１７、Ｔ４３０、Ａ４３１、Ｉ４３６、Ｓ４５１、Ｅ５０３、Ｑ５１１、Ａ５３５、Ａ５３９もしくはＮ５６３、または親グルコアミラーゼ中の同等の位置における置換を含む。ある実施態様では、親グルコアミラーゼは配列番号２の配列と、少なくとも９０％または９５％の配列同一性を有する配列を含んでいる。
【０１４１】
８．ポリヌクレオチド
本開示発明は、本開示発明の変異体グルコアミラーゼをコードする単離されたポリヌクレオチドにも関する。変異体グルコアミラーゼをコードするポリヌクレオチドは、従来技術で知られた確立された手法によって調製されることができる。該ポリヌクレオチドは合成的に、たとえば自動ＤＮＡ合成機によって調製されることができる。該ＤＮＡ配列は、断片を一緒に結合することによって調製された、ゲノム（またはｃＤＮＡ）起源と合成起源との混合されたものであってもよい。ポリヌクレオチドは、特定のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって調製されることもできる。一般的に、Ｍｉｎｓｈｕｌｌ Ｊ．ら、「選択的アミノ酸多様化によって変更されたタンパク質の機能（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｙ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００４年、第３２巻（第４号）、ｐ．４１６−４２７が参照される。また、多数の会社、たとえば独国、レーゲンスブルク、Ｇｅｎｅａｒｔ社が、現在ＤＮＡを合成している。
【０１４２】
本開示発明は、（ｉ）配列番号４と少なくとも７０％の同一性を有する、または（ｉｉ）中程度〜高度の緊縮性の条件下に、配列番号４に規定されたヌクレオチド配列に由来するプローブとハイブリダイズする能力のある、または（ｉｉｉ）配列番号４に規定された配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列に相補的な、ヌクレオチド配列を含んでいる単離されたポリヌクレオチドも提供する。本開示発明に照らして有用なプローブは、配列番号４の少なくとも５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個またはそれ以上の連続するヌクレオチドを含むことができる。
【０１４３】
本開示発明は、さらに配列番号２と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を含むアミノ酸配列を含んでいる変異体グルコアミラーゼをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。ある実施態様では、変異体グルコアミラーゼは配列番号２と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する。ある実施態様では、変異体グルコアミラーゼは配列番号２と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。ある実施態様では、変異体グルコアミラーゼは配列番号２と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有する。ある実施態様では、変異体グルコアミラーゼは配列番号２と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。ある実施態様では、変異体グルコアミラーゼは配列番号２と少なくとも９７％のアミノ酸配列同一性を有する。ある実施態様では、変異体グルコアミラーゼは配列番号２と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有する。ある実施態様では、変異体グルコアミラーゼは配列番号２と少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する。本開示発明は、上に挙げられたポリヌクレオチドのいずれかを含んでいる発現ベクターも提供する。
【０１４４】
本開示発明はまた、本明細書で提供された変異体グルコアミラーゼをコードするＤＮＡの断片（すなわち、一部分）も提供する。糸状菌細胞（たとえば、トリコデルマ、アスペルギルス、フサリウム、ペニシリウム、シゾサッカロミセスおよびフミコーラ）またはグルコアミラーゼ活性を有するこれらの断片から、本明細書に記載された成熟グルコアミラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを単離しまたは同定するために用いられることができる部分的長さのＤＮＡ断片を得るのに、これらの断片は有用である。ある実施態様では、該ＤＮＡの断片は少なくとも５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個またはそれ以上の連続するヌクレオチドを含んでいることができる。ある実施態様では、配列番号４中に用意されているＤＮＡの部分は、親グルコアミラーゼ、とりわけトリコデルマグルコアミラーゼ相同体を他の種、たとえばグルコアミラーゼをコードする糸状菌から得るのに用いられることができる。
【０１４５】
９．ＤＮＡ構築体およびベクター
本開示発明の１の実施態様に従うと、本開示発明に包含される変異体グルコアミラーゼをコードしており、かつプロモーター配列に機能し得るように結合されている上記のポリヌクレオチドを含んでいるＤＮＡ構築体は、構築されて宿主細胞中に導入される。
【０１４６】
ＤＮＡ構築体は、ベクターを用いて宿主細胞中に導入されることができる。ベクターは、宿主細胞中に導入されたときに、典型的には宿主細胞のゲノム内に統合されそして複製される任意のベクターであることができる。ベクターは、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセット等を含む。ある実施態様では、ベクターは、グルコアミラーゼをコードする配列に機能し得るように結合されている調節配列を含んでいる発現ベクターである。
【０１４７】
好適な発現ベクターおよび／またはインテグレーションベクターの例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、上記参照、およびＡｕｓｕｂｅｌ、１９８７年、上記参照、およびｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌら、「真菌におけるもっと多くの遺伝子操作（ＭＯＲＥ ＧＥＮＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮＳ ＩＮ ＦＵＮＧＩ）」、ＢｅｎｎｅｔｔおよびＬａｓｕｒｅ（編）、１９９１年、ｐ．３９６−４２８、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社、および米国特許第５，８７４，２７６号に示されている。「真菌遺伝子ストックセンター・菌株のカタログ（Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｓｔｒａｉｎｓ）」（ＦＧＳＣ、＜ｗｗｗ.ｆｇｓｃ.ｎｅｔ＞）も有用なベクターを開示している。特に有用なベクターは、たとえばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社およびＰｒｏｍｅｇａ社から得られるベクターを含む。
【０１４８】
真菌宿主細胞に用いるのに適した特定のベクターは、ｐＦＢ６、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣｌ００、ｐＤＯＮＲ（商標）２０１、ｐＤＯＮＲ（商標）２２１、ｐＥＮＴＲ（商標）、ｐＧＥＭ（商標）３ＺおよびｐＧＥＭ（商標）４Ｚのようなベクターを含む。アスペルギルスに有用な汎用発現ベクターは、ｇｌａＡプロモーター付きｐＲＡＸを含み、ハイポクレア／トリコデルマに有用なものは、ｃｂｈ１プロモーター付きｐＴｒｅｘ３ｇを含む。
【０１４９】
細菌細胞に用いるのに適したプラスミドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内における複製を許すｐＢＲ３２２およびｐＵＣ１９、ならびに、たとえばバチルス属細菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）内における複製を許すｐＥ１９４を含む。
【０１５０】
ある実施態様では、プロモーターは、細菌または真菌宿主細胞中で転写活性を示し、該宿主細胞と相同性か、あるいは非相同性のタンパク質をコードする遺伝子に由来することができる。プロモーターは、変異体プロモーター、短縮プロモーターおよび／またはハイブリッドプロモーターであることができる。これらのプロモーターは技術従来で知られている。
【０１５１】
真菌細胞、とりわけ糸状菌細胞、たとえばトリコデルマまたはアスペルギルス細胞に用いるのに適したプロモーターの例は、トリコデルマレーシプロモーターｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｅｇ５、ｘｌｎ１およびｘｌｎ２のような典型的プロモーターを含む。有用なプロモーターの他の例は、アスペルギルスアワモリおよびアスペルギルスニガーグルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＡ）（Ｎｕｎｂｅｒｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１９８４年、第４巻、ｐ．２３０６−２３１５およびＢｏｅｌら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９８４年、第３巻、ｐ．１５８１−１５８５参照）、アスペルギルスオリザエＴＡＫＡアミラーゼプロモーター、サッカロミセスセレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＴＰＩ（トリオースリン酸イソメラーゼ）プロモーター、アスペルギルスニデュランス（Ａｓｐｒｅｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ遺伝子由来のプロモーターおよびリゾムコルミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ遺伝子を含む。
【０１５２】
細菌細胞に用いるのに適したプロモーターの例は、大腸菌ラクトースオペロン、バチルスリケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、バチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、ベータラクタマーゼ遺伝子ならびにｔａｃプロモーターから得られたものを含む。
【０１５３】
１の実施態様では、プロモーターは宿主細胞に生来のものである。たとえば、トリコデルマレーシが宿主であるときは、プロモーターは天然のトリコデルマレーシプロモーターである。他の実施態様では、プロモーターは真菌宿主細胞に対して非相同であるものである。ある実施態様では、プロモーターは親グルコアミラーゼプロモーター、たとえばＴｒＧＡプロモーターである。
【０１５４】
ある実施態様では、ＤＮＡ構築体は、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列であるシグナル配列をコードする核酸を含み、このシグナル配列はコードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に誘導する。核酸配列のコード配列の５’末端は、翻訳読み取り枠内において、分泌されるグルコアミラーゼをコードするグルコアミラーゼコード配列のセグメントと生来的に連結されたシグナルペプチドコード領域を生来的に含むことができ、または該核酸配列のコード配列の５’末端は、該コード配列に対して外来であるシグナルペプチドを含むことができる。ある実施態様では、ＤＮＡ構築体は、それから変異体グルコアミラーゼが得られた親グルコアミラーゼ遺伝子に本来的に関係付けられるシグナル配列を含む。ある実施態様では、シグナル配列は、配列番号１に示された配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９４％および少なくとも９８％の配列同一性を有する配列である。有効なシグナル配列は、他の糸状菌酵素のグルコアミラーゼから、たとえばトリコデルマ（トリコデルマレーシグルコアミラーゼ）、フミコーラ（フミコーラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）セルラーゼまたはフミコーラグリセアグルコアミラーゼ）、アスペルギルス（アスペルギルスニガーグルコアミラーゼおよびアスペルギルスオリザエＴＡＫＡアミラーゼ）およびリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）から得られたシグナル配列を含むことができる。
【０１５５】
追加的な実施態様では、宿主細胞中に導入されるべきシグナル配列およびプロモーター配列を含んでいるＤＮＡ構築体またはベクターは、同じ源に由来する。ある実施態様では、トリコデルマグルコアミラーゼ相同体の天然グルコアミラーゼシグナル配列、たとえばハイポクレア株由来のシグナル配列が用いられることができる。
【０１５６】
ある実施態様では、発現ベクターは終止配列も含む。宿主細胞中で機能する任意の終止配列が、本開示発明に用いられることができる。１の実施態様では、終止配列およびプロモーター配列は同じ源に由来する。他の実施態様では、終止配列は宿主細胞に相同である。有用な終止配列は、トリコデルマレーシｃｂｈ１、アスペルギルスニガーもしくはアスペルギルスアワモリグルコアミラーゼ（Ｎｕｎｂｅｒｇら、１９８４年、上記参照およびＢｏｅｌら、１９８４年、上記参照）、アスペルギルスニデュランスアントラニル酸シンターゼ、アスペルギルスオリザエＴＡＫＡアミラーゼまたはアスペルギルスニデュランスｔｒｐＣ（Ｐｕｎｔら、Ｇｅｎｅ、１９８７年、第５６巻、ｐ．１１７−１２４）の遺伝子から得られた終止配列を含む。
【０１５７】
ある実施態様では、発現ベクターは選択可能なマーカーを含む。典型的な選択可能マーカーの例は、抗菌薬耐性（たとえば、ハイグロマイシンおよびフレオマイシン）を付与するものを含む。栄養選択マーカーも本発明に用いられ、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）およびｐｙｒＧ（オロチジン−５’フォスフェートデカルボキシラーゼ）のような従来技術で知られているようなマーカーを含む。トリコデルマの形質転換のためのベクター系に有用なマーカーは、従来技術で知られている（たとえば、Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ、「糸状菌のバイオテクノロジー（ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＯＦ ＦＩＬＡＭＥＮＴＯＵＳ ＦＵＮＧＩ）」の第６章、Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎら編、１９９２年、米国、マサチューセッツ州、ボストン、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ社、Ｋｉｎｇｈｏｒｎら、「糸状菌の応用分子遺伝学（ＡＰＰＬＩＥＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＧＥＮＥＴＩＣＳ ＯＦ ＦＩＬＡＭＥＮＴＯＵＳ ＦＵＮＧＩ）」、１９９２年、英国、ロンドン、Ｂｌａｃｋｉｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ ａｎｄ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ、Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ社、ＢｅｒｇｅｓおよびＢａｒｒｅａｕ、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９１年、第１９巻、ｐ．３５９−３６５およびｖａｎ Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、１９８７年、第２０６巻、ｐ．７１−７５参照）。典型的な実施態様では、選択可能マーカーはａｍｄＳ遺伝子であり、これはアセトアミダーゼ酵素をコードし、形質転換された細胞が窒素源としてのアセトアミド上で育成されるのを可能にする。選択マーカーとしてのアスペルギルスニデュランスａｍｄＳ遺伝子の使用は、Ｋｅｌｌｅｙら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９８５年、第４巻、ｐ．４７５−４７９およびＰｅｎｔｔｉｌａら、Ｇｅｎｅ、１９８７年、第６１巻、ｐ．１５５−１６４に記載されている。
【０１５８】
変異体グルコアミラーゼ、プロモーター、ターミネーターおよび他の配列をコードする核酸配列を含んでいるＤＮＡ構築体を結合し、そしてこれらを好適なベクター中に挿入するために用いられる方法は、従来技術で周知である。連結は、一般に好都合な制限部位において結合することによって達成される。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドリンカーが慣用に従って用いられる（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９年、上記、ならびにＢｅｎｎｅｔｔおよびＬａｓｕｒｅ、「真菌におけるもっと多くの遺伝子操作」、１９９１年、ｐ．７０−７６、米国、サンジエゴ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社参照）。さらに、ベクターは公知の組換え技術を用いて構築されることができる（たとえば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｔｅｗａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。
【０１５９】
１０．宿主細胞
本開示発明は、また本開示発明の変異体グルコアミラーゼをコードするポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞にも関し、該宿主細胞は本開示発明のグルコアミラーゼを産生するために用いられる。ある実施態様では、宿主細胞は、細菌、真菌、植物および酵母の細胞から選択される。宿主細胞の語は、本開示発明に従う変異体グルコアミラーゼを産生するために用いられる細胞、該細胞の子孫および該細胞から生成されたプロトプラストの双方を含む。
【０１６０】
ある実施態様では、宿主細胞は真菌細胞、典型的には糸状菌宿主細胞である。「糸状菌」の語は、ユーミコチナ（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門の全ての糸状型をいう（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．、「入門細菌学（ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＯＲＹ ＭＹＣＯＬＯＧＹ）」、１９６２年、米国、ニューヨーク州、Ｗｉｌｅｙ社参照）。これらの真菌は、キチン、セルロースおよび他の複合多糖からなる細胞壁を有する栄養菌糸を特徴とする。本開示発明の糸状菌は、形態学的、生理学的および遺伝学的に酵母とははっきり区別される。糸状菌による栄養増殖は菌糸伸長によるものであり、また炭素異化は偏性好気性である。本開示発明では、糸状菌親細胞は、以下に限定されることなく、トリコデルマ、（たとえば、トリコデルマレーシ、無性型のハイポクレアジェコリーナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ）、これは以前はトリコデルマロンギブラキアタム（Ｔ． ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）と分類されていたもの、トリコデルマヴィリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマコニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）（Ｓｈｅｉｒ-Ｎｅｉｒｓら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１９８４年、第２０巻、ｐ．４６−５３；ＡＴＣＣ Ｎｏ．５６７６５およびＡＴＣＣ Ｎｏ．２６９２１）、ペニシリウム種、フミコーラ種（たとえば、フミコーラインソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコーララヌギノサ（Ｈ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）およびフミコーラグリセア）、クリソスポリウム種（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐ．）（たとえば、クリソスポリウムルクノエンス（Ｃ．ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ））、グリオクラジウム種（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｓｐ．）、アスペルギルス種（たとえば、アスペルギルスオリザエ、アスペルギルスニガー、アスペルギルスソジアエ（Ａ．ｓｏｊａｅ）、アスペルギルスジャポニカス（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルスニデュランス、およびアスペルギルスアワモリ）（Ｗａｒｄら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９３年、第３９巻、ｐ．７３８−７４３およびＧｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒら、Ｇｅｎｅｔ、２００２年、第４１巻、ｐ．８９−９８）、フサリウム種（たとえば、フサリウムロセウム、フサリウムグラミナス（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フサリウムセレアリス（Ｆ．ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フサリウムオキシスポリウム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｉｍ）およびフサリウムベネナタム（Ｆ．ｖｅｎｅｎａｔｕｍ））、ニューロスポラ種（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐ．）、（ニューロスポラクラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ））、ハイポクレア種、ムコール種（ムコールミエヘイ）、リゾプス種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ）およびエメリセラ種（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ ｓｐ．）（Ｉｎｎｉｓら、Ｓｃｉ．、１９８５年、第２２８巻、ｐ．２１−２６も参照）の種の細胞であることができる。「トリコデルマ」または「トリコデルマ種（ｓｐ．）」または「トリコデルマ種（ｓｐｐ．）」の語は、従来または現在トリコデルマに分類される任意の真菌属をいう。
【０１６１】
ある実施態様では、宿主細胞はグラム陽性の細菌細胞である。非限定的な例は、ストレプトマイセス（たとえば、ストレプトマイセスリビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセスコエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）およびストレプトマイセスグリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ））およびバチルスの株を含む。本明細書で用いられる「バチルス属」は、当業者に知られた「バチルス」属内のすべての種を含み、たとえば、以下に限定されることなく、バチルスサブチリス、バチルスリケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスレンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチスルブレビス、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルスハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルスメガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルスコアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルスサーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスラウタス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）およびバチルスツリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）である。バチルス属は分類学上の再編成を受け続けていることが認識されている。従って、該属は再分類された種、たとえば以下に限定されることなく、現在はゲオバチルスステアロテルモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）と命名されているバチルスステアロテレモフィルスのような有機体も含むことが意図される。
【０１６２】
ある実施態様では、宿主細胞はグラム陰性の細菌株、たとえば大腸菌またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種である。他の実施態様では、宿主細胞は酵母細胞、たとえばサッカロミセス種、シゾサッカロミセス種、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）種またはカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種であってもよい。
【０１６３】
他の実施態様では、宿主細胞は、遺伝子操作において、たとえば細菌または真菌細胞中の欠失によって、天然の遺伝子が不活性化されている宿主細胞である。１以上の不活性化された遺伝子を有する真菌宿主細胞を得ることが望まれるときは、公知の方法（たとえば、米国特許第５，２４６，８５３号、米国特許第５，４７５，１０１号および国際公開第９２／０６２０９号に開示された方法）が用いられることができる。完全なもしくは部分的な欠失によって、挿入不活性化によって、または遺伝子をその意図された目的に対して非機能化する任意の他の（遺伝子が機能タンパク質の発現を妨げられるような）手段によって、遺伝子の不活性化は達成されることができる。ある実施態様では、宿主細胞がトリコデルマ細胞、とりわけトリコデルマレーシ宿主細胞であるときは、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１およびｅｇｌ２の遺伝子が不活性化されおよび／または典型的には欠失される。典型的には、４個欠失されたタンパク質を有するトリコデルマレーシ宿主細胞が、米国特許第５，８４７，２７６号および国際公開第０５／００１０３６号に提示され記載されている。他の実施態様では、宿主細胞は、プロテアーゼの不足したまたはプロテアーゼの欠損した株である。
【０１６４】
１１．宿主細胞の形質転換
宿主細胞中へのＤＮＡ構築体またはベクターの導入は、形質転換、エレクトロポレーション、核マイクロインジェクション、形質導入、トランスフェクション（たとえば、リポフェクション仲介性およびＤＥＡＥ−デキストリン仲介性トランスフェクション）、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿を用いる培養、ＤＮＡ被覆マイクロプロジェクタイルを用いる高速発射およびプロトプラスト融合のような手法を含む。一般的な形質転換手法は従来技術で知られている（たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌら、上記、１９８７年、第９章およびＳａｍｂｒｏｏｋ、上記、１９８９年およびＣａｍｐｂｅｌｌら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、１９８９年、第１６巻、ｐ．５３−５６参照）。
【０１６５】
バチルスの形質転換方法は、多数の文献、たとえばＡｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ  ＣおよびＪ．Ｓｐｉｚｉｚｅｎ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９６１年、第８１巻、ｐ．７４１−７４６および国際公開第０２／１４４９０号に開示されている。
【０１６６】
アスペルギルスの形質転換方法は、Ｙｅｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８４年、第８１巻、ｐ．１４７０−１４７４、Ｂｅｒｋａら、「酵素バイオテクノロジーの応用（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」中の記載、ＫｅｌｌｙおよびＢａｌｄｗｉｎ編、１９９１年、米国、ニューヨーク州、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ社、Ｃａｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００年、第９巻、ｐ．９９１−１００１、Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、１９８９年、第１６巻、ｐ．５３−５６および欧州特許出願公開第２３８０２３号に記載されている。トリコデルマ中の非相同タンパク質の発現は、米国特許第６，０２２，７２５号、米国特許第６，２６８，３２８号、Ｈａｒｋｋｉら、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９１年、第３巻、ｐ．２２７−２３３、Ｈａｒｋｋｉら、Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１９８９年、第７巻、ｐ．５９６−６０３、欧州特許出願公開第２４４，２３４号、欧州特許出願公開第２１５，５９４号およびＮｅｖａｌａｉｎｅｎら、「トリコデルマの分子生物学ならびに相同および非相同遺伝子の双方の発現へのその適用（Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｔｈ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅｓ）」、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ  ＭＹＣＯＬＯＧＹ、ＬｅｏｎｇおよびＢｅｒｋａ編、１９９２年、ｐ．１２９−１４８、米国、ニューヨーク州、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ社に記載されている。フサリウム株の形質転換については、国際公開第９６／００７８７号およびＢａｊａｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９１年、第８８巻、ｐ．８２０２−８２１２も参照される。
【０１６７】
１の特定の実施態様では、形質転換のためのトリコデルマ種の調製は、真菌の菌糸体からプロトプラストを調製することを含む（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、１９８９年、第１６巻、ｐ．５３−５６、Ｐｅｎｔｉｌｌａら、Ｇｅｎｅ、１９８７年、第６１巻、ｐ．１５５−１６４参照）。アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を媒体とした糸状菌の形質転換は知られている（ｄｅ  Ｇｒｏｏｔら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９８年。第１６巻、ｐ．８３９−８４２参照）。糸状菌宿主に用いられる形質転換方法については、米国特許第６，０２２，７２５号および米国特許第６，２６８，３２８号も参照される。
【０１６８】
典型的には、遺伝的に安定な形質転換体は、それによって変異体グルコアミラーゼをコードする核酸が宿主株染色体中に安定に取り込まれるようなベクターシステムを用いて構築される。形質転換体はその後公知の方法によって精製される。
【０１６９】
さらなるある実施態様では、宿主細胞は植物細胞、たとえば単子葉植物（たとえば、トウモロコシ、小麦およびソルガム）からの細胞または双子葉植物（たとえば、大豆）からの細胞である。植物の形質転換に有用なＤＮＡ構築体を作る方法および植物の形質転換の方法は知られている。これらの方法のいくつかは、アグロバクテリウムツメファシエンス媒体遺伝子導入、マイクロプロジェクタイル発射、プロトプラストのＰＥＧ仲介性形質転換、エレクトロポレーション等を含む。米国特許第６，８０３，４９９号、米国特許第６，７７７，５８９号、Ｆｒｏｍｍら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９０年、第８巻、ｐ．８３３−８３９、Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、ＭｏＬ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、１９８５年、第１９９巻、ｐ．１６９−１７７が参照される。
【０１７０】
１２．タンパク質の産生
本開示発明はさらに、本開示発明に従う変異体グルコアミラーゼをコードするポリヌクレオチドを含んでいる発現ベクターを有する宿主細胞を形質転換する工程を含む、変異体グルコアミラーゼを産生する方法に関し、任意的に、該方法は変異体グルコアミラーゼの産生に適した条件下に宿主細胞を培養する工程、および任意的に、該グルコアミラーゼを回収する工程を含む。
【０１７１】
本開示発明の発現および産生方法では、宿主細胞は、生理的塩および栄養を含有する適当な培地を用いて、振とうフラスコ培養、実験室もしくは工業的発酵槽中の小規模または大規模の発酵（たとえば、連続式、回分式および流加回分式発酵）において、好適な条件下に培養される（たとえば、Ｐｏｕｒｑｕｉｅ，Ｊ．ら、「セルロース分解の生化学および遺伝学（ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ  ＯＦ  ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ  ＤＥＧＲＡＤＡＴＩＯＮ）」、Ａｕｂｅｒｔ、Ｊ．Ｐら編、１９８８年、ｐ．７１−８６、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社およびＩｌｍｅｎ，Ｍら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９７年、第６３巻、ｐ．１２９８−１３０６参照）。一般的な商業的に調製された培地（たとえば、酵母モルト抽出物（ＹＭ）ブロス、Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロスおよびサブローデキストロース（ＳＤ）ブロス）が本開示発明に用いられる。細菌および糸状菌細胞のための代表的な培養条件は従来技術で知られており、科学文献ならびに／またはアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）および真菌遺伝子ストックセンター（Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ）のような真菌供給源において見出されることができる。グルコアミラーゼをコードする配列が誘発プロモーターの制御下にある場合、誘発剤（たとえば、糖、金属塩または抗菌剤）がグルコアミラーゼの発現を誘発するのに有効な濃度で培地に添加される。
【０１７２】
ある実施態様では、本開示発明は、本開示発明に従う変異体グルコアミラーゼをコードするポリヌクレオチドを含んでいる植物または植物細胞を該変異体の産生に適した条件下に培養する工程を含む、変異体グルコアミラーゼを産生する方法に関し、任意的に、該方法は該グルコアミラーゼを回収する工程を含む。
【０１７３】
ある実施態様では、本開示発明に包含される変異体グルコアミラーゼをコードするポリヌクレオチドで形質転換された細胞系による変異体グルコアミラーゼの発現を評価するために、タンパク質のレベル、ＲＮＡのレベルにおいて、ならびに／またはグルコアミラーゼ活性および／もしくは産生に特有の機能バイオアッセイを用いることによって、アッセイが実施される。これらのアッセイのいくつかは、ノーザンブロット法、ドットブロット法（ＤＮＡまたはＲＮＡ分析）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法）または（核酸コード配列に基づいて）適切に標識されたプローブを用いるｉｎ  ｓｉｔｕのハイブリダイゼーションならびに慣用のサザンブロット法およびオートラジオグラフィーを含む。
【０１７４】
さらに、変異体グルコアミラーゼの産生および／または発現は、たとえば培地中のグルコースのような還元糖を直接測定するアッセイによって、ならびにグルコアミラーゼの活性、発現および／または産生を測定するためのアッセイによって、サンプル中で直接、測定されることができる。とりわけ、グルコアアミラーゼ活性は、３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法によって分析されることができる（Ｇｏｔｏら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９４年、第５８巻、ｐ．４９−５４参照）。さらなる実施態様では、タンパク質の発現は、免疫学的方法、たとえば細胞、組織切片の免疫組織化学的染色または（たとえば、ウエスタンブロット法またはＥＬＩＳＡ法による）組織培養培地のイムノアッセイによって評価される。このようなイムノアッセイは、グルコアミラーゼの発現を定性的および定量的に評価するために用いられることができる。かかる方法の詳細は当業者に知られており、かかる方法を実施するための多くの試薬が商業的に入手可能である。
【０１７５】
本開示発明のグルコアミラーゼは、従来技術で知られている様々の方法、たとえば遠心、ろ過、抽出、沈殿等によって培地から回収されまたは精製されることができる。
【０１７６】
１３．組成物
本開示発明の変異体グルコアミラーゼは、酵素組成物に、たとえば以下に限定されることなく、デンプン加水分解および糖化組成物、洗浄および洗剤組成物（たとえば、洗濯用洗剤、食器洗い機洗剤および硬表面洗浄組成物）、アルコール発酵組成物に、ならびに動物飼料組成物中に用いられることができる。さらに、該変異体グルコアミラーゼは、ベーキング用途品、たとえばパンおよびケーキの生産、醸造、ヘルスケア、繊維、環境廃棄物転換プロセス、バイオパルプ処理プロセスおよびバイオマス転換用途品に用いられることができる。
【０１７７】
ある実施態様では、培養培地中で得られたまたは培地から回収され精製された本開示発明に包含される変異体グルコアミラーゼを含む酵素組成物は、任意的に、以下の酵素、すなわちアルファアミラーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、シクロデキストリングリコトランスフェラーゼ、リパーゼ、フィターゼ、ラッカーゼ、オキシダーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、キシラナーゼ、顆粒デンプン加水分解酵素および他のグルコアミラーゼのうちの任意の１またはこれらの組み合わせと組み合わされて用いられる。１の実施態様では、プロテアーゼは酸性真菌プロテアーゼ（ＡＦＰ）である。さらなる実施態様では、酸性真菌プロテアーゼはトリコデルマ由来（たとえば、ＮＳＰ−２４、また２００６年７月１３日に公開された米国特許出願公開第２００６／０１５４３５３号も参照。この内容は参照によって本明細書に取り込まれる。）である。さらなる実施態様では、フィターゼはブチオキシエラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｉｅｌｌａ）種由来（たとえば、ＢＰ−１７、また国際公開第２００６／０４３１７８号に開示された変異体も参照）である。
【０１７８】
代表的なある組成物では、本開示発明の変異体グルコアミラーゼは、アルファアミラーゼ、たとえば真菌アルファアミラーゼ（たとえば、アスペルギルス種）または細菌アルファアミラーゼ（たとえば、バチルス種、たとえばバチルスステアロセレモフィルス、バチルスアミロリケファシエンスおよびバチルスリケニフォルミス）ならびにこれらの変異体およびハイブリッドと組み合わされる。１の実施態様では、アルファアミラーゼは酸安定性アルファアミラーゼである。１の実施態様では、アルファアミラーゼは顆粒デンプン加水分解酵素（ＧＳＨＥ）である。１の実施態様では、アルファアミラーゼはアスペルギルスカワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉ）アルファアミラーゼ（ＡＫＡＡ）（米国特許第７，０３７，７０４号参照）である。本開示発明の組成物への使用が意図されている商業的に入手可能なアルファアミラーゼは知られたものであり、ＧＺＹＭＥ  Ｇ９９７、ＳＰＥＺＹＭＥ  ＦＲＥＤ、ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ、ＳＴＡＲＧＥＮ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社部門のＤａｎｉｓｃｏ  ＵＳ社）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ  １２０−ＬおよびＳＵＰＲＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社Ｂｉｏｔｅｃｈ部門）ならびにＶＩＲＩＤＩＵＭ（Ｄｉｖｅｒｓａ社）を含む。
【０１７９】
他の実施態様では、本開示発明の変異体グルコアミラーゼは、他のグルコアミラーゼと組み合わされることができる。ある実施態様では、本開示発明のグルコアミラーゼは、１以上の、アスペルギルスまたはその変異体の株に由来するグルコアミラーゼ、たとえばアスペルギルスオリザエ、アスペルギルスニガー、アスペルギルスカワチおよびアスペルギルスアワモリ；フミコーラまたはその変異体の株に由来するグルコアミラーゼ、とりわけフミコーラグリセア、たとえば国際公開第０５／０５２１４８号に開示された配列番号３と少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％の配列同一性を有するグルコアミラーゼ；タラロミセスまたはその変異体の株に由来するグルコアミラーゼ、とりわけタラロミセスエメルソニイ；アセリア（Ａｔｈｅｌｉａ）の株に由来するグルコアミラーゼ、とりわけアセリアロルフシ（Ａｔｈｅｌｉａ  ｒｏｌｆｓｉｉ；ペニシリウムの株に由来するグルコアミラーゼ、とりわけペニシリウムクリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）と組み合わされる。
【０１８０】
１４．用途
特に、変異体グルコアミラーゼは、デンプン転化プロセスのために、とりわけフルクトースシロップ、特にショ糖用のデキストロースの生産に、およびデンプン含有基質の発酵によるアルコールおよび他の最終製品（たとえば、有機酸、アスコルビン酸およびアミノ酸）に使用されることができる（Ｇ．Ｍ．Ａ  ｖａｎ  Ｂｅｙｎｕｍら編、「デンプン転化技術（ＳＴＡＲＣＨ  ＣＯＮＶＥＲＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）」、１９８５年、米国、ニューヨーク州、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ社）。本開示発明の変異体グルコアミラーゼ組成物を用いて産生されたデキストリンは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％および少なくとも９５％のグルコース収率をもたらすことができる。本開示発明に包含されるグルコアミラーゼを用いるデンプン基質の発酵からのアルコールの生産は、燃料アルコールまたはポータブルアルコールの生産を含むことができる。ある実施態様では、アルコールの産生量は、変異体グルコアミラーゼが親グルコアミラーゼと同じ条件下に用いられるとより大きくなる。ある実施態様では、アルコールの産生量は、親グルコアミラーゼよりも約０．５％〜２．５％優れており、たとえば以下に限定されることなく、親グルコアミラーゼよりも０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％および２．４％多いアルコールである。
【０１８１】
１の代表的な実施態様では、本開示発明の変異体グルコアミラーゼは、植物に基づいた様々な基質からのデンプンの加水分解に用いられ、これはアルコールの生産に使用される。ある実施態様では、植物に基づいた基質は、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦、ミロ、米、トウキビ、ジャガイモおよびこれらの組合せを含む。ある実施態様では、植物に基づいた基質は、分画された植物物質、たとえば、トウモロコシのような穀物顆粒であり、これは繊維、胚芽、タンパク質およびデンプン（胚乳）のような成分に分画される（米国特許第６，２５４，９１４号および米国特許第６，８９９，９１０号）。アルコール発酵の方法は、「アルコール教科書、飲料・燃料および工業アルコール産業のための参照文献（ＴＨＥ  ＡＬＣＯＨＯＬ  ＴＥＸＴＢＯＯＫ、Ａ  ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＢＥＶＥＲＡＧＥ，ＦＵＥＬ  ＡＮＤ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ  ＡＬＣＯＨＯＬ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ）」、第３版、１９９９年、Ｋ．Ａ．Ｊａｃｑｕｅｓら編、英国、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ社に記載されている。特定の実施態様では、アルコールはエタノールである。とりわけ、アルコール発酵生産プロセスは、湿式製粉または乾式製粉プロセスが特徴である。ある実施態様では、本発明の変異体グルコアミラーゼは湿式製粉発酵プロセスに用いられ、別の実施態様では、変異体グルコアミラーゼは乾燥製粉プロセスに用いられる。
【０１８２】
乾燥顆粒製粉は多くの基本的な工程が関わり、これは一般に粉砕、焼成、液化、糖化、発酵ならびに液体および固形物の分離をしてアルコールおよび他の副生成物を生産する工程を含む。植物物質、とりわけ丸ごとの穀物顆粒、たとえばトウモロコシ、小麦またはライ麦は粉砕される。ある場合には、穀物顆粒はまず部分成分に分画される。粉砕された植物物質は、磨砕されて粗また微細粒子を得ることができる。粉砕された植物材料は、スラリー槽中で液体（たとえば、水および／または希薄スチレッジ）と混合される。このスラリーは液化酵素（たとえば、アルファアミラーゼ）とともにジェットクッカー中で高温度（たとえば、９０℃〜１０５℃またはそれ以上）に付されて、顆粒中のデンプンを可溶化し加水分解してデキストリンにする。この混合物は冷却され、さらに糖化酵素、たとえば本開示発明に包含されるグルコアミラーゼで処理されて、グルコースを生成する。グルコースを含むマッシュは次に、発酵微生物、たとえばエタノール産生微生物、とりわけ酵母菌（サッカロミセス種）の存在下に約２４〜１２０時間、発酵されることができる。マッシュ中の固形物が液相から分離され、アルコール、たとえばエタノールおよび有用な副生成物、たとえばディスティラーズ・グレインが得られる。
【０１８３】
ある実施態様では、糖化工程および発酵工程は一緒にされ、このプロセスは同時糖化・発酵プロセスまたは同時糖化・酵母増殖・発酵プロセスと呼ばれる。
【０１８４】
他の実施態様では、本発明の変異体グルコアミラーゼは、デンプン加水分解プロセスに用いられ、該プロセスの温度は、ｐＨ３．０〜６．５のｐＨ範囲で、３０℃〜７５℃の温度、また４０℃〜６５℃の温度で実施される。ある実施態様における発酵プロセスは、穀物顆粒または分画された顆粒の磨砕工程、およびこの粉砕された穀物顆粒を液体と一緒にしてスラリーを形成する工程、次に該スラリーを単一槽中で、本開示発明に従う変異体グルコアミラーゼならびに任意的な他の酵素、たとえば以下に限定されることなくアルファアミラーゼ、他のグルコアミラーゼ、フィターゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼまたは顆粒デンプン加水分解活性を有する他の酵素、および酵母と混合して、エタノールおよび他の副生成物を生成する工程を含む（米国特許第４，５１４，４９６号、国際公開第０４／０８１１９３号および国際公開第０４／０８０９２３号）。
【０１８５】
ある実施態様では、本開示発明は、本開示発明の変異体グルコアミラーゼを用いる酵素糖化工程を含む、液体デンプン溶液を糖化する方法に関する。
【０１８６】
本開示発明は、本開示発明に包含される少なくとも１の変異体グルコアミラーゼを含んでいる動物飼料も提供する。デンプンを含んでいる飼料の生産にグルコアミラーゼ酵素を用いる方法は、２００２年１２月１３日に出願された国際公開第０３／０４９５５０号に提示されている（その内容は、その全体が参照によって本明細書に取り込まれる）。手短にいうと、本発明のグルコアミラーゼ変異体が、デンプンを含んでいる飼料に付加混合される。該グルコアミラーゼは、動物によって利用されにくいデンプンを分解する能力がある。
【０１８７】
本開示発明の他の目的および利点は、本明細書から明らかである。
【０１８８】
実施例
以下の実施例は、本開示発明の特定の代表的な実施態様および側面を実証しさらに説明するために提供され、その範囲を限定するものと解釈されてはならない。
【０１８９】
以下に続く開示および実験の部では、以下の略語が適用される。すなわち、ＧＡ（グルコアミラーゼ）、ＧＡＵ（グルコアミラーゼ単位）、ｗｔ％（重量パーセント）、℃（摂氏度）、ｒｐｍ（１分間当たりの回転数）、Ｈ２Ｏ（水）、ｄＨ２Ｏ（脱イオン水）、ｄｌＨ２Ｏ（脱イオン水、ミリＱろ過）、ａａまたはＡＡ（アミノ酸）、ｂｐ（塩基対）、ｋｂ（キロ塩基対）、ｋＤ（キロダルトン）、ｇまたはｇｍ（グラム）、μｇ（マイクログラム）、ｍｇ（ミリグラム）、μＬ（マイクロリットル）、ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）、ｍｍ（ミリメートル）、μｍ（マイクロメートル）、Ｍ（モル）、ｍＭ（ミリモル）、μＭ（マイクロモル）、Ｕ（単位）、Ｖ（ボルト）、ＭＷ（分子量）、ｓｅｃ（ｓ）またはｓ（ｓ）（秒）、ｍｉｎ（ｓ）またはｍ（ｓ）（分）、ｈｒ（ｓ）またはｈ（ｓ）（時間）、ＤＯ（溶存酸素）、ＡＢＳ（吸光度）、ＥｔＯＨ（エタノール）、ＰＳＳ（生理的塩溶液）、ｍ／ｖ（質量／体積）、ＭＴＰ（マイクロタイタープレート）、Ｎ（規定）、ＤＰ１（単糖）、ＤＰ２（二糖）、ＤＰ＞３（オリゴ糖、３超の重合度を有する糖）、ｐｐｍ（１００万分の部）。
【０１９０】
変異体を提供するために用いられる方法が、以下に説明される。しかし、異なる方法が親分子の変異体を提供するために用いられることができ、本開示発明は実施例で用いられた方法に限定されないことに注意しなければならない。変異体を作るためのおよび変異体を選択するための任意の適当な手段が用いられることができることが意図される。
【０１９１】
９６ウェルマイクロタイタープレートのためのｐＮＰＧグルコアミラーゼ活性のアッセイ
試薬溶液は、ＮａＡｃ緩衝液：２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５、基質：ＮａＡｃ緩衝液中５０ｍＭのｐ−ニトロフェニル−α−Ｄグルコピラノシド（シグマ社Ｎ−１３７７）（０．３ｇ／２０ｍｌ）、および停止溶液：８００ｍＭのグリシン−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ１０であった。３０μＬのろ過上清が、新鮮な９６ウェル平底ＭＴＰに入れられた。各ウェルに５０μＬのＮａＡｃ緩衝液および１２０μＬの基質が添加され、５０℃で３０分間温置された（Ｔｈｅｒｍｏ  ＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ社ｉＥＭＳインキュベーター／シェーカーＨＴ）。１００μＬの停止溶液を添加することによって、反応が停止された。４０５ｎｍの吸光度がＭＴＰリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ３８４  ｐｌｕｓ）で測定され、活性が０．０１１μＭ／ｃｍのモル吸光係数を用いて計算された。
【０１９２】
熱安定性アッセイ
粗上清（１００μｌ）が、１００μＬの５０ｍＭのＮａＡｃ緩衝液ｐＨ４．５に添加された。このサンプルが２つのＭＴＰ上に等量に分割された。一方のＭＴＰ（初期のプレート）は４℃で１時間温置され、他方のＭＴＰ（残存のプレート）は６０℃で（Ｔｈｅｒｍｏ  ＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ社ｉＥＭＳインキュベーター／シェーカーＨＴ）１時間温置された。残存のプレートが氷上で１５分間冷却された。下記のエタノール生産適用アッセイに以下の変更、すなわち熱安定性アッセイのために採取されたサンプルの量が２５μＬであり、３０ｍＭのＮａＡｃ緩衝液ｐＨ４．０の量が３５μＬであるという変更を加えて用いて、両方のプレートについて活性が測定される。
【０１９３】
熱安定性は、以下のように残存活性％として計算される。
（ＡＢＳ（３４０）残存−ブランク）／（ＡＢＳ（３４０）初期−ブランク）×１００
【０１９４】
育成期間後の培養培地中に残っているグルコースの有無について、粗上清物質が試験される。残存グルコースが認められれば、その吸光度値が、初期活性および残存活性の双方の吸光度測定値から差し引かれる。
【０１９５】
９６ウェルマイクロタイタープレート中のタンパク質定量のためのブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイ
試薬溶液はブラッドフォードＱｕｉｃｋｓｔａｒｔ試験溶液（Ｂｉｏｒａｄ社カタログ番号５００−０２０５）であった。１００μＬの１０ｋＤでろ過された上清が、新鮮な９６ウェル平底プレートに入れられた。各ウェルに２００μＬの試薬が添加され、室温で５分間温置された。５９５ｎｍの吸光度がＭＴＰリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ３８４  ｐｌｕｓ）で測定された。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（０〜５０μｇ／ｍｌ）標準曲線に従って、タンパク質濃度が計算された。
【０１９６】
ヘキソキナーゼ活性アッセイ
ヘキソキナーゼカクテル（混合物）：使用の１０〜１５分間前に、９０ｍｌの水が、ＢｏａｔＩＬコンテナのグルコースＨＫ  Ｒ１（ＩＬ社試験グルコース（ＨＫ）キット、Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社番号１８２５０７−４０）に添加され、穏やかに混合された。８５μＬのヘキソキナーゼカクテルが１００μＬのｄＨ２Ｏに添加された。１５μＬのサンプルがこの混合物に添加され、室温で暗室中５分間温置された。３４０ｎｍの吸光度がＭＴＰリーダーで読み取られた。グルコース（０〜１ｍｇ／ｍｌ）標準曲線に従って、グルコース濃度が計算された。
【０１９７】
エタノール生産適用のアッセイ条件
８％ストック溶液を調製するために、８ｇの可溶性コーンスターチ（Ｓｉｇｍａ社番号Ｓ４１８０）が室温で４０ｍｌのｄＨ２Ｏ中に懸濁された。５０ミリリットルの沸騰ｄＨ２Ｏが２５０ｍｌのフラスコ中でこのスラリーに添加され、５分間加熱された。このデンプン溶液が２５℃まで冷却され、体積がｄＨ２Ｏで１００ｍｌに調節された。このストック溶液を１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．７で希釈（1：1）することによって、４（質量／体積）％の可溶性デンプン試験溶液が調製された。
【０１９８】
スクリーニングアッセイのために、５μＬの粗上清が平底９６ウェルＭＴＰ中で１７５μＬの５０ｍＭのＮａＡｃ緩衝液ｐＨ４．５で希釈された。６０マイクロリットルのこの希釈溶液が１２０μＬの４％可溶性コーンスターチに添加され、３２℃で２時間、９００ｒｐｍにて温置された（Ｔｈｅｒｍｏ  ＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ社ｉＥＭＳインキュベーター／シェーカーＨＴ）。９０μＬの４℃に冷却された停止溶液（８００ｍＭのグリシン−ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ１０）を添加することによって、反応が停止された。サンプルは氷上に置かれた。デンプンが１５℃で５分間、１１１８Ｇで遠沈され（ＳＩＧＭＡ社６Ｋ１５）、そして１５μＬの上清が上記のヘキソキナーゼ活性アッセイに用いられてグルコース含有量が測定された。
【０１９９】
育成期間後の培養培地中の残存グルコースの有無について、粗上清が試験される。残留グルコースが認められれば、グルコアミラーゼによって産生されたグルコースの量は計算されなかった。
【０２００】
甘味料生産適用のアッセイ条件
８％ストック溶液を調製するために、８ｇの可溶性デンプン（Ｓｉｇｍａ社番号Ｓ４１８０）が室温で４０ｍｌの水中に懸濁された。次に、５０ｍｌの沸騰ｄＨ２Ｏが２５０ｍｌのフラスコ中でこのスラリーに添加され、５分間加熱された。このデンプン溶液が２５℃まで冷却され、体積がｄＨ２Ｏで１００ｍｌに調節された。このストック溶液を１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５で希釈（1：1）することによって、４（質量／体積）％の可溶性デンプン試験溶液が調製された。
【０２０１】
５０マイクロリットルの８０ｍＭのＮａＡｃ緩衝液ｐＨ４．５が、新鮮な９６ウェル平底プレートに入れられた。各ウェルに、１２０μＬの４％可溶性コーンスターチおよび５μＬの１０ｋＤでろ過された上清が添加され、６０℃で１時間温置された。９０μＬの４℃に冷却された停止溶液（８００ｍＭのグリシン−ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ１０）を添加することによって、反応が停止された。サンプルが氷上に３０分間置かれた。デンプンが１５℃で５分間、７１６ｒｐｍで遠沈され（Ｓｉｇｍａ社６Ｋ１５遠心分離機）、そして１５μＬの上清が上記のヘキソキナーゼ活性アッセイに用いられてグルコース含有量が測定された。
【実施例１】
【０２０２】
ｐＲＥＰ３Ｙ−ＴｒＧＡベクターの構築
ＴｒＧＡシグナルペプチド、プロ配列、ならびに触媒ドメイン、リンカー領域およびデンプン結合ドメインを含む成熟タンパク質をコードするＤＮＡ配列（配列番号４）からなるＴｒＧＡ発現カセットが、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）エントリーベクターであるｐＤＯＮＲ（商標）２０１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国、カルフォルニア州、Ｃａｒｌｓｂａｄ）中にクローニングされた。このＴｒＧＡ発現カセットが、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）ＬＲ組換え反応によって、Ｇａｔｅｗａｙの適合性デスティネーションベクターであるｐＲＥＰ３Ｙ−ＤＥＳＴ（図３）中にクローニングされた。
【０２０３】
ｐＲｅｐ３Ｙ−ＴｒＧＡ発現ベクター（図３Ｂ）は、シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）中にＴｒＧＡタンパク質（配列番号２）の発現を可能にした。
【０２０４】
６５のＴｒＧＡ部位飽和変異（ＳＳＭ）ライブラリーが、テンプレートとしてｐＤＯＮＲ−ＴｒＧＡエントリーベクター（図２）を、および表２に列挙されたプライマーを用いて構築された。実験に用いられた変異誘発プライマーは全て、３個のＤＮＡの配列コードＮＮＳ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ、およびＳ＝ＣまたはＧ）を、変異されることになるＴｒＧＡ配列（配列番号２）のコドンに対応する位置に含んでおり、その位置でヌクレオチドのランダムな導入を開始した。各ＳＭＭライブラリーの構築は、Ｇａｔａｗａｙフォワードプライマー（ｐＤＯＮＲ２０１−ＦＷ）および特定のリバース変異誘発プライマー（表３）、ならびにＧａｔａｗａｙリバースプライマー（ｐＤＯＮＲ２０１−ＲＶ）および特定のフォワード変異誘発プライマー（表２）（変異誘発プライマーに対して同等の位置）を用いた二つのＰＣＲ増幅によって開始された。Ｐｈｕｓｉｏｎ高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（フィンランド国、Ｅｓｐｏｏ、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ社）が、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ社によって提供された実験方法に従ってＰＣＲ増幅に用いられた（０．２μＬプライマー、２５サイクル）。手短に言うと、１μＬの、両方とも同じコドンを標的とする両方の特定のＰＣＲ混合物のＤＮＡ断片（配列番号１）が、ＧａｔｅｗａｙフォワードおよびＧａｔｅｗａｙリバースプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とともに４８μＬの新鮮なＰＣＲ反応溶液に添加され、混合された。この融合ＰＣＲ増幅（２２サイクル）は、特定のＴｒＧＡコドンがランダムに変異されおよび両末端に独特のＧａｔｅｗａｙ組換え部位を有する直鎖状発現カセットＤＮＡ断片をもたらした。このＤＮＡ断片を精製（ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐキット、米国、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）し、およびｐＤＯＮＲ２０１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてＢＰ組換え反応（米国、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をすると、環状多量体ＤＮＡ（エントリーベクター）が生成され、これは引き続いて大腸菌最高効率（Ｍａｘ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）ＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に形質転換され、そして５０μｇ／ｍＬのカナマイシンが加えられた２×ＴＹ培地（Ｂａｃｔｏトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社）１６ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社）１０ｇ／Ｌ、ＮａＣＬ５ｇ／Ｌ）上で平板培養された。
【表２】
0005594899.tif 000004
0005594899.tif 000005
0005594899.tif 000006
0005594899.tif 000007
【表３】
0005594899.tif 000008
0005594899.tif 000009
0005594899.tif 000010
【０２０５】
各ライブラリーについて、３７℃で一晩の温置後、ＰＳＳ中にクローンを再懸濁することによって、コロニーが貯められた。貯められた大腸菌形質転換体から、標準的な方法（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてプラスミドの全体が単離された。手短に言うと、１μＬのプラスミド溶液が１μＬのｐＲｅｐ３Ｙデスティネーションベクター（図１Ａ）溶液に添加され、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社によって提供された実験方法に従って、ＬＲ  ＣＬＯＮＡＳＥ（商標）ＩＩ酵素混合物に添加された。環状多量体ＤＮＡが生成され、供給業者による説明書に従って大腸菌最高効率ＤＨ５αに形質転換された。
【０２０６】
３７℃で一晩の温置後、各ライブラリーの９６個の単一コロニーが１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＴＹ寒天プレートから採取され、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２００μＬの２×ＴＹ培地を含むＭＴＰ中で３７℃において２４時間育成された。培養物が配列解析（蘭国、Ｌｅｉｄｅｎ、ＢａｓｅＣｌｅａｒ社）に用いられた。
【０２０７】
ライブラリーの数は１〜６５の範囲にあり、ランダムに変異されたＴｒＧＡ配列のコドンを示す付記があった。選定後に、各ライブラリーは最大で１９個のＴｒＧＡ変異体を含んでいた。これらの変異体は、個別にシゾサッカロミセスポンベにその製造業者（米国、カリフォルニア州、Ｏｒａｎｇｅ、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）の説明書に従って導入された。
【０２０８】
シゾサッカロミセスポンベ形質転換体は、選択培地（ＥＭＭ寒天培地、米国、Ｉｒｖｉｎｅ、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社、カタログ番号４１１０−２３２）上で平板培養され、そして２８℃で４日間温置された。ＥＭＭ寒天培地上のコロニーをストリークすることによって、形質転換プレートから形質転換体が精製された。
【実施例２】
【０２０９】
育成条件およびサンプルの前処理の説明
シゾサッカロミセスポンベ形質転換体が、選択培地（２×ＥＭＭ−Ｃ）［６４．４ｇ／ＬのＥＭＭブロス（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社カタログ番号４１１０−０３２）、０．６２ｇ／Ｌのコンプリートサプリメント混合物（ＣＳＭ−ＨＩＳ−ＬＥＵ−ＴＲＰ、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社カタログ番号４５３０−１２２）］を含む９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）中に接種され、２８℃で一晩温置された。一晩温置されたマイクロタイタープレートから、１００ｍｌの振とうフラスコ内の２０ｍｌの２×ＥＭＭ−Ｃ液体培地に、２００μＬの育成されたシゾサッカロミセスポンベ培養物が接種され、Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ振とうインキュベーター（スイス国、Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ、Ｉｎｆｏｒｓ社）中２８０ｒｐｍ、２６℃で４日間温置された。この育成された培養物から、２ｍｌのシゾサッカロミセスポンベ培養物がサンプリングされ、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離（Ｓｉｇｍａ社）された。この上清が１０ｋＤ級Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ５００ＨＴフィルター装置（独国、Ｈａｎｎｏｖｅｒ、ＶｉｖａＳｃｉｅｎｃｅ社）中に移され、１０００Ｇで２５分間遠心分離された。分離残余物が、０．０１５％のＴｗｅｅｎ−８０が加えられた５０ｍＭのＮａＡｃ  ｐＨ４．５で元の出発体積に戻るまで希釈された。この溶液は別のアッセイに用いられた。
【実施例３】
【０２１０】
ＴｒＧＡの４変異体の組み合わせライブラリーの構築
（Ａ）以下の単一部位変異Ｑ１７２Ｆ、Q２０８Ｎ、Ｓ２１１ＲおよびＶ３１４Ｈの組み合わせを有するＴｒＧＡ変異体の構築のための実験が実施された。これらの変異体の通覧が以下に示される。
ａ） Ｑ１７２Ｆ、Ｑ２０８Ｎ 
ｂ） Ｑ１７２Ｆ、Ｓ２１１Ｒ 
ｃ） Ｑ１７２Ｆ、Ｖ３１４Ｈ 
ｄ） Ｑ２０８Ｎ、Ｓ２１１Ｒ 
ｅ） Ｑ２０８Ｎ、Ｖ３１４Ｈ 
ｆ） Ｓ２１１Ｒ、Ｖ３１４Ｈ 
ｇ） Ｑ１７２Ｆ、Ｑ２０８Ｎ、Ｓ２１１Ｒ 
ｈ） Ｑ１７２Ｆ、Ｑ２０８Ｎ、Ｖ３１４Ｈ 
ｉ） Ｑ１７２Ｆ、Ｓ２１１Ｒ、Ｖ３１４Ｈ
ｊ） Ｑ２０８Ｎ、Ｓ２１１Ｒ、Ｖ３１４Ｈ 
ｋ） Ｑ１７２Ｆ、Ｑ２０８Ｎ、Ｓ２１１Ｒ、Ｖ３１４Ｈ
【０２１１】
Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ（商標）複数部位変異誘発（ＱＣＭＳ）キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）が、ライブラリーを構築するために用いられた。ライブラリーを作製するために用いられた５’リン酸化プライマーが表４に示される。完全な長さのプライマーの取り込みならびにプライマーに起因するエラーの有意な低減の観点から最適な結果が、ＨＰＬＣ、ＰＡＧＥまたは任意の他の種類の精製されたプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用することによって得られた。
【表４】
0005594899.tif 000011
【０２１２】
テンプレートプラスミドｐＤＯＮＲ−ＴｒＧＡ（図２）が、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱＣＭＡキットを用いて組合せライブラリーを構築するために使用された。反応に用いたプライマーの濃度を変更した以外は供給業者の説明書に従って、ライブラリーが構築された。具体的には、４μｌのｐＤＯＮＲ−ＴｒＧＡ（２５〜５０ｎｇ）が、各反応において１１μｌの滅菌蒸留水、１．５μｌのｄＮＴＰ、２．５μｌの１０×ＱＣＭＳ緩衝液、１μｌの酵素ブレンドおよび１μｌの各変異体プライマー混合物であって合計１００ｎｇのプライマーとなるものと混合された。ＰＣＲ条件は０．２ｍｌの薄肉ＰＣＲ管を用いるＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社サーモサイクラー中で、９５℃で１分間であり、引き続いて９５℃で１分間、５５℃で１分間および６５℃で６分間の３０サイクルであった。反応生成物は３７℃で一晩温置することによって、ＱＣＭＳキットからの１μｌのＤｐｎｌで消化された。ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社）がサンプルの精製に用いられ、また３７℃で１時間、Ｄｐｎｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて第二回の消化が実施された。
【０２１３】
この反応混合物が、大腸菌最高効率ＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中に形質転換され、選択寒天培地（カナマイシン５０μｇ／ｍｌが加えられた２×ＴＹ）上で平板培養された。３７℃で一晩温置された後、９６個の単一コロニーが配列解析（蘭国、Ｌｅｉｄｅｎ、ＢａｓｅＣｌｅａｒ社）のために採取された。この組合せ変異体が、以下および国際公開第０６／０６００６２号に記載されたようにトリコデルマレーシ宿主株中にクローニングされ、発現された。
【０２１４】
（Ｂ）さらに６の組み合わせライブラリー（表５）が、Ｇｅｎｅａｒｔ社（独国、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ）によって合成的に作られ、本明細書に記載されたように、熱安定性についてならびにエタノールおよび甘味料生産適用アッセイにおいて試験された。
【表５】
0005594899.tif 000012
【実施例４】
【０２１５】
改良された熱安定性を有する変異体
親ＴｒＧＡ分子は、上記の条件の下で１５〜４４％（日差変動）の間の残存活性を有していた。同じバッチのＴｒＧＡ熱安定性に基づいて、性能指数が計算された。性能指数は、変異体残存活性をＴｒＧＡ残存活性で割った商であるＰＩ＝（変異体残存活性）／（ＴｒＧＡ残存活性）である。１より大きい性能指数は安定性が改良されたことを示す。１．０より大きい熱安定性性能指数を有する変異体が以下の表６に示される。
【表６】
0005594899.tif 000013
0005594899.tif 000014
0005594899.tif 000015
0005594899.tif 000016
0005594899.tif 000017
【実施例５】
【０２１６】
エタノールスクリーニングアッセイからの高性能変異体
上記のアッセイを用いたエタノールスクリーニングアッセイにおいて、変異体が試験された。表７は、親ＴｒＧＡの性能指数（ＰＩ）と比較して１．０よりも大きいＰＩを有する変異体についてのスクリーニングアッセイの結果を示す。ＰＩは比活性（活性／酵素ｍｇ）の尺度である。比活性のＰＩは、変異体比活性を野生型比活性で割った商である「変異体比活性／野生型比活性」である。比活性のＰＩは１．０であり、１．０より大きいＰＩを有する変異体は親ＴｒＧＡよりも大きい比活性を有する。この比活性は、エタノールスクリーニングアッセイによって測定された活性を上記のブラッドフォードアッセイで得られた結果で割ったものである。
【表７】
0005594899.tif 000018
0005594899.tif 000019
0005594899.tif 000020
0005594899.tif 000021
0005594899.tif 000022
【実施例６】
【０２１７】
甘味料スクリーニングアッセイからの高性能変異体
上記の甘味料スクリーニングアッセイにおいて、変異体が試験された。表８は該スクリーニングアッセイの結果を示し、親ＴｒＧＡの性能指数（ＰＩ）と比較して１．００よりも大きいＰＩを有する変異体が示されている。ＰＩは比活性（活性／酵素ｍｇ）の尺度である。比活性のＰＩは、変異体比活性を野生型比活性で割った商である「変異体比活性／野生型比活性」である。比活性のＰＩは１．０であり、１．０より大きいＰＩを有する変異体は親ＴｒＧＡよりも大きい比活性を有する。
【表８】
0005594899.tif 000023
0005594899.tif 000024
0005594899.tif 000025
【実施例７】
【０２１８】
ベクターの構築およびトリコデルマレーシ宿主細胞中への形質転換
Ａ．変異体ＧＡをコードするポリヌクレオチドを含んでいる発現ベクターの構築
ＤＮＡ配列である配列番号４を含んでいるＴｒＧＡ発現カセットが、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）エントリーベクターであるｐＤＯＮＲ（商標）２０１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国、カリフォルニア州、Ｃａｒｌｓｂａｄ）中にクローニングされた。このＴｒＧＡ発現カセットは、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）ＬＲ組換え反応によって、国際公開第０６／０６００６２号に同様に記載されているＧａｔｅｗａｙの適合性デスティネーションベクターであるｐＴｒｅｘ３ｇ−ＤＥＳＴ（図５）中にクローニングされた。ｐＴｒｅｘ３ｇ−ＴｒＧＡ発現ベクター（図５）は、トリコデルマレーシ宿主中にＴｒＧＡタンパク質（配列番号２）の発現を可能にした。ベクターは、少なくとも以下の変異体、すなわち（１）Ｖ３１４Ｈ、（２）Ｓ２１１Ｒ、（３）Ｑ２０８Ｎおよび（４）Ｑ１７２Ｆをコードする、変更されたＴｒＧＡのｃＤＮＡを含むように構築された。
【０２１９】
Ｂ．形質転換
変異体ＧＡを含んでいる発現ベクターが、ＲＬ−Ｐ３７（ＩＡ５２）に由来し各種の遺伝子欠失（Δｃｂｈ１、Δｃｂｈ２、Δｅｇｌ１、Δｅｇｌ２）を有するトリコデルマレーシ宿主株中に、ＰＤＳ−１０００／ヘリウムシステム（ＢｉｏＲａｄ社、カタログ番号１６５−０２２５７）による粒子ボンバードメント法を用いて形質転換された。実験手順は以下に概説され、また国際公開第０５／００１０３６号の実施例６および１１が参照される。
【０２２０】
トリコデルマレーシの株から胞子の懸濁物（約５ｘ１０８胞子／ｍｌ）が調製された。１００〜２００マイクロリットルの胞子懸濁物が、最少培地（ＭＭ）アセトアミド培地のプレートの中心上に広げられた。ＭＭアセトアミド培地は以下の成分を有していた、すなわち０．６ｇ／Ｌのアセトアミド、１．６８ｇ／ＬのＣｓＣｌ、２０ｇ／Ｌのグルコース、２０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．６ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１ｍｌ／Ｌの１０００×微量元素溶液、２０ｇ／Ｌの寒天培地およびｐＨ５．５、１ｍｌ／Ｌの４００×微量元素塩溶液（クエン酸１７５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２００ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １６ｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ３．２ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ  １．４ｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３  ０．８ｇ／Ｌ）。胞子懸濁物はＭＭアセトアミド培地の表面上で放置乾燥された。
【０２２１】
形質転換は、製造業者の説明書に従った。手短に言うと、６０ｍｇのＭ１０タングステン粒子がマイクロ遠心管に入れられた。１ｍＬのエタノールが添加され、１５分間静置された。該粒子が１５，０００ｒｐｍで１５秒間遠心分離された。エタノールが除かれ、粒子が滅菌ｄＨ２Ｏで３回洗われ、次いで１ｍＬの５０（体積／体積）％の滅菌グリセロールが添加された。２５μｌのタングステン粒子懸濁物がマイクロ遠心管中に入れられた。連続的に渦撹拌しながら、以下のもの、すなわち０．５〜５μｌ（１００〜２００ｎｇ／μｌ）のプラスミドＤＮＡ、２５μｌの２．５ＭのＣａＣｌ２および１０μｌの０．１Ｍのスペルミジンが添加された。粒子が３秒間遠心分離された。上清が除かれ、粒子が２００μｌの７０（体積／体積）％のエタノールで洗われ、そして３秒間遠心分離された。上清が除かれ、２４μｌの１００％エタノールが添加され、ピペッティングで混合され、そしてこの管が超音波浴中に入れられ、粒子の８μｌのアリコートが取り出され、デシケーター中に保持されたマクロキャリアーディスクの中心上に置かれた。タングステン／ＤＮＡ懸濁物が乾燥し終わったら、マクロキャリアーディスクが、胞子を含むＭＭアセトアミドのプレートと一緒にボンバードメント室内に入れられ、そしてボンバードメント工程が製造業者の説明書に従って実施された。タングステン／ＤＮＡ粒子による平板上の胞子のボンバードメントの後、このプレートが２８℃で温置された。４日後に、形質転換されたコロニーがＭＭアセトアミド培地の新鮮なプレートに採取された（Ｐｅｎｔｉｌｌａら、Ｇｅｎｅ、１９８７年、第６１巻、ｐ．１５５−１６４）。
【０２２２】
Ｃ．形質転換された細胞中で発現された変異体ＴｒＧＡからのＧＡ活性の実証
ＭＭアセトアミドプレート上で５日間の育成後、安定な形態（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）を示す形質転換体が、３０ｍｌのＰｒｏｆｌｏ培地を含んでいる２５０ｍｌの振とうフラスコ中に植菌された。Ｐｒｏｆｌｏ培地は、３０ｇ／Ｌのα−ラクトース、６．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）ＳＯ４、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．３ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１ｍｌ／Ｌの４００×微量元素塩溶液（クエン酸１７５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２００ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １６ｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ３．２ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ  １．４ｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３  ０．８ｇ／Ｌ、１０％Ｔｗｅｅｎ８０  ２ｍｌ／Ｌ、ＰｒｏＦｌｏ綿実粉２２．５ｇ／Ｌ（米国、テネシー州、メンフィス、Ｔｒａｄｅｒｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ社）、ＣａＣＯ３  ０．７２ｇ／Ｌ）を含有していた。２８℃および１４０ｒｐｍで２日間の育成後、Ｐｒｏｆｌｏ培養物の１０％が、３０ｍｌのラクトース規定量培地を含有する２５０ｍｌの振とうフラスコに移された。ラクトース規定量培地の組成は以下の通りであった、すなわち５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、３３ｇ／Ｌの１，４−ピペラジンビス（プロパンスルホン酸）緩衝液、９ｇ／Ｌのカサミノ酸、４．５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５ｍｌ／ＬのＭａｚｕ ＤＦ６０−Ｐ消泡剤（米国、イリノイ州、Ｍａｚｕｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）、１０００×微量元素溶液、ｐＨ５．５であり、４０ｍｌ／Ｌの４０（重量／体積）％ラクトース溶液が滅菌後にこの培地に添加された。ラクトース規定量培地を含有する振とうフラスコが２８℃、１４０ｒｐｍで４〜５日間温置された。
【０２２３】
この培養物上清のサンプルが、還元剤を含んでいる適当量の２×サンプルローディングバッファーと混合された。菌糸体が遠心分離によって除かれ、上清が総タンパク質量について分析された（ＢＣＡタンパク質アッセイキット、ピアス社カタログ番号２３２２５）。
【０２２４】
ＧＡ活性が、ｐ−ニトロフェニル−アルファ−Ｄ−グルコピラノシド（ｐＮＰＧ）（Ｓｉｇｍａ社、Ｎ−１３７７）を基質としてｐＮＰＧアッセイを用いて測定された。このアッセイにおいては、ｐ−ニトロフェニル−アルファ−Ｄ−グルコピラノシド（ｐＮＰＧ）からグルコースおよびｐ−ニトロフェノールへの加水分解を触媒するグルコアミラーゼの能力が測定される。アルカリ性のｐＨでは、ニトロフェノールが黄色を呈し、これはグルコアミラーゼ活性に比例し、４０５ｎｍにおいて監視され、ＧＡＵ単位で測定される標準酵素に対して比較される（Ｅｌｄｅｒ，Ｍ． Ｔ．およびＭｏｎｔｇｏｍｅｒｙ Ｒ． Ｓ．、「酵素比色分析法を用いる、工業的酵素生産におけるグルコアミラーゼ活性（Ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄ）」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＡＯＡＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、１９９５年、第７８巻、第２号）。１ＧＡＵは、ｐＨ４．２および６０℃において可溶性デンプン基質（乾燥固形分４％）から１時間当たりグルコース換算で１ｇの還元糖を産生する酵素の量と定義される。
【０２２５】
ＮｕＰＡＧＥ（商標）のＮｏｖｅｘ  １０％  Ｂｉｓ−ＴｒｉｓゲルおよびＭＥＳ ＳＤＳランニングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国、カリフォルニア州、Ｃａｒｌｓｂａｄ）を用いてＰＡＧＥ電気泳動法によって、タンパク質プロフィールが測定された。
【実施例８】
【０２２６】
選択された変異体の可溶性デンプン上での小規模生産適用試験
単一変異の変異体ａ）Ｖ３１４Ｈ、ｂ）Ｓ２１１Ｒ、ｃ）Ｑ１７２Ｆおよびｄ）Ｑ２０８Ｎを発現するトリコデルマレーシ宿主株が、３４℃、ｐＨ３．５における流加回分式１４Ｌ発酵槽において、グルコース（Ｃｅｒｅｌｏｓｅ ＤＥ９９）、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、微量元素およびＭａｚｕ消泡剤（ＤＦ６０００Ｋ）を含む栄養培地中で育成された。グルコースが消費し終わると、育成温度およびｐＨが、それぞれ２８℃および４．０まで変えられた。細胞物質がろ過によって除かれ、培養物上清が集められ、総タンパク質量として９０％超のグルコアミラーゼを含有するように濃縮された。
【０２２７】
ｐＨ４．３で、３２℃および６０℃における可溶性ポテトデンプン上でのグルコース産生について、各種の動的性質が測定され、野生型ＴｒＧＡと比較された。４つの変異体のそれぞれが、野生型（ＴｒＧＡ）と比較して高められたＶｍａｘ（グルコースμＭ／秒）値を実証し、これは高められた触媒反応速度（ｋｃａｔ（秒−１））を示している。図６は、各温度について２回繰り返し試験されたＶｍａｘを示す。
【実施例９】
【０２２８】
変異体のＥｔＯＨ産生の性能を測定する方法
親ＴｒＧＡと比較してより高い性能指数を有すると、新規な小規模エタノール生産適用試験を用いて認定された変異体（表７／８参照）について、該スクリーニングの検証が実施された。部位の評価および組み合わせのライブラリー（表９）から得られた２４の変異体が選択され、より大規模での発現および試験のためにトリコデルマレーシ中に直接、形質転換された。これらの変異体は、示差走査熱量計法（ＤＳＣ解析は本明細書で以下に記載される。）を用いて熱変性について、および新規な第二の小規模エタノール生産適用アッセイを用いて性能について試験された。この方法は、２の工程、すなわち１）変異体をアニオン交換カラム中に注入してタンパク質濃度を正確に測定する工程、および２）野生型分子と比較したエタノール産生についての性能を計算するために、３の異なったＴｒＧＡ濃度（乾燥固形分０．３−０．１５−０．０７５ｇ／２８ｇ）で変異体を滴定する工程からなっていた。
【表９】
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【０２２９】
タンパク質の精製および測定
粗酵素調製物が、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００  ＦＰＬＣ装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国、ニュジャージー州、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）を用いて精製された。β−シクロデキストリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、蘭国、Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ、８５．６０８−８）が、エポキシ活性化セファロースビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ベルギー国、Ｄｉｅｇｅｍ、１７−０４８０−０１）に固定された。このカラムが酵素調製物からグルコアミラーゼを捕集するのに用いられた。２５ｍＭのトリス緩衝液ｐＨ７．５または１０ｍＭのα−シクロデキストリン（Ｓｉｇｍａ社、２８７０５）を含有する５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．３を用いて、酵素がビーズから溶出された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、精製されたサンプルが分析された。変異体のタンパク質濃度を正確に測定するために、ＦＰＬＣに基づいたタンパク質測定方法が開発された。精製されたマーカーＴｒＧＡ分子のタンパク質濃度が、まず標準ブラッドフォード試験方法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社カタログ番号５００−０２０５）を用いて測定された。続いて、精製されたサンプルがＲｅｓｏｕｒｃｅＱ＿１ｍｌカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）中に注入され、酵素が５００ｍＭのＮａＣｌを有する２５ｍＭのトリスｐＨ緩衝液で溶出された。ピーク面積が測定され、既知濃度の標準ＴｒＧＡのピーク面積と比較してタンパク質濃度が計算された。
【０２３０】
小規模ＥｔＯＨ生産適用
表１０は、種々の組み合わせ変異体によるエタノールおよび糖（ＤＰ１、ＤＰ２、およびＤＰ＞３）の産生をまとめたものである。液化コーンマッシュのサンプルが得られ、希薄スチレッジを用いて乾燥固形分２６％まで希釈された。このスラリーのｐＨが、４Ｎ硫酸を用いてｐＨ４．３に調整された。マッシュの１００ｍｇのアリコートが３２℃の水浴中に置かれ、放置平衡化された。１００μｌの４００ｐｐｍの尿素の添加後、１ｍｌの精製された変異体ＴｒＧＡ酵素サンプル（１５０μｇ／ｍｌ）または精製されたＴｒＧＡ（３００、１５０、７５μｇ／ｍｌ）が各コーンマッシュサンプルに添加された。最後に、４５ｍｌの脱イオン水中に３０分間水和させた１５ｇのＲｅｄ Ｓｔａｒ Ｒｅｄ酵母（Ｌｅｓａｆｆｒｅ Ｙｅａｓｔ社、米国、ウィスコンシン州、ミルウォーキー）の溶液３３３μｌが、各サンプルに添加された。サンプルが５、２１、２８、４８および５２時間後に採取され、Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈカラム９（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いたＨＰＬＣによって分析された。
【０２３１】
エタノールおよび炭水化物の測定
２ｍｌのエッペンドルフ遠心分離管に発酵槽液が入れられ、氷上で１０分間冷却された。このサンプルが１４，０００Ｇで３分間遠心分離され、５００μｌの上清が５０μｌのキル（ｋｉｌｌ）溶液（１．１Ｎ硫酸）を含む試験管に移され、５分間静置された。５．０ｍｌの水が試験管に添加され、次いで０．２２μｍのフィルタープレート（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、蘭国、アムステルダム）でろ過され、そしてＨＰＬＣにかけられた。カラム温度：６０℃、移動相：０．０１Ｎ硫酸、流速０．６ｍｌ／分、検出器：ＲＩ、注入量：２０μＬであった。該カラムは電荷および分子量に基づいて分子、すなわちＤＰ１（単糖）、ＤＰ２（二糖）、ＤＰ３（三糖）、ＤＰ＞３（３超の重合度を有するオリゴ糖）、コハク酸、乳酸、グリセロール、メタノール、エタノールを分離する。
【０２３２】
ＤＳＣ分析
精製された酵素サンプル（０．２〜０．４ｍｇ／ｍｌ）の融解温度が、示差走査熱量計法（ＤＳＣ）を用いて測定された。
【表１０】
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【０２３３】
表１１は、０．１５ｍｇの変異体投入量における最終エタノール収率および該変異体の性能を示す。性能は、ＴｒＧＡの０．３ｍｇおよび０．１５ｍｇの値を変異体の値によって補間することによって計算された。
【表１１】
0005594899.tif 000028
【０２３４】
ＥＴ７−２を除くすべての組み合わせ変異体が、ＴｒＧＡ野生型よりも優れた性能を示した。ＬＲ８は、１．５６倍の改良された性能を有し、最良の性能を示した。
【０２３５】
表１２は、小規模エタノール生産適用アッセイを用いて試験されたすべての単一部位変異体および組み合わせ変異体の通覧である。表１２において網かけで示された変異体は、ＴｒＧＡよりも優れた性能を有し、かつまたＴｒＧＡよりも高い（ｄＴｍ）熱変性温度を有していた。
【表１２】
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【０２３６】
この結果は、クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）がタンパク質濃度を正確に測定するための有用なツールであることを示した。この結果はまた、３のＴｒＧＡ濃度における変異体の滴定分析が、小規模で変異体の性能を測定するための有益な方法であることを示した。７の変異体が、ＴｒＧＡ野生型よりも優れた性能を示し（表１２参照）、またＴｒＧＡ野生型よりも高い熱変性温度を有し、かつＴｒＧＡと同等の性能を示さなかった変異体でもＴｒＧＡより低いＴｍを有していた。
【実施例１０】
【０２３７】
選択された一組の組み合わせ変異体および単一部位変異体の比活性測定ならびにＬＲ８の基質特異性
一組の組み合わせ変異体および組み合わせ変異体を構築するのに用いられたいくつかの単一部位変異体の比活性が、分析された（表１３）。ＬＲ８（小規模生産適用アッセイで測定されたＰＩが１．５６）が、さらに基質特異性に関して検討された。これは、ＧＡ変異体のグルコース産生速度を測定するためおよびＬＲ８変異体の基質特異性を測定するためのＭＴＰアッセイを確立することによって行われた。ＭＴＰアッセイは変異体の違いを見分けられることが見出され、ＥＴ７−１を除くすべての変異体が野生型（ｗｔ）トリコデルマレーシグルコアミラーゼよりも高い産生速度を示した。さらに、いくつかの変異体（ＬＲ８／ＥＴ８／Ｑ１７２Ｆ）はＴｒＧＡよりも２０〜３０％優れた性能を示した。ＬＲ８は、可溶性コーンスターチおよび２の異なった液化コーンマッシュサンプル上で野生型と比較してより優れた性能を示した。
【０２３８】
以下の実験に用いられた基質は、以下のように調製された可溶性コーンスターチのストック溶液であった。すなわち、８ｇの可溶性コーンスターチ（Ｓｉｇｍａ社、番号Ｓ４１８０）が１００ｍｌのミリＱ水に溶解され、電子レンジ中で１分間加熱された。この分散物が５分間沸騰され、冷却後、量が１００ｍｌに調整された。このストック溶液を１００ｍＭのＮａＡｃ緩衝液ｐＨ４で１：１に希釈することによって、４％の可溶性コーンスターチが調製された。１の実験において、液化コーン基質（ＮＥ）が、乾燥固形分％を測定する水分分析計を用いて調製され、次いで基質が５０ｍＭのＮａＡｃで７．５×に希釈されて、最終的に乾燥固形分４％のものが得られた。この基質が２０００Ｇで５分間遠心分離され、上清が０．２２μｍのフィルターでろ過された。他の実験では、液化コーン基質（ＢＳＥ）が、遠心分離の前に１０×に希釈されたことを除いて同じように調製された。
【０２３９】
酵素１５０μｇ／ｍｌのストック溶液を用いて、酵素が希釈された（３μｇ／反応混合物１８０μｌ）。５０ｍＭのＮａＡｃ  ｐＨ４．０で、溶液はさらに以下のように希釈された、すなわち３００ｎｇ（１０×）、２００ｎｇ、１５０ｎｇ、１００ｎｇ、７５ｎｇ、５０ｎｇ、２５ｎｇ、１０ｎｇ／反応混合物１８０μｌ。
【０２４０】
アッセイは以下のように実施された。４０μｌの５０ｍＭのＮａＡｃ  ｐＨ４．０、１２０μｌの４％の可溶性コーンスターチおよび２０μｌの酵素が、各ウェルに加えられた。サンプルは３２℃、９００ｒｐｍで２時間温置され、氷上で９０μｌの８００ｍＭのグリシン−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ１０を５分間添加された後停止された。このプレートが１５℃、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離された。新鮮なプレートに、８５μｌのミリＱ水および１００μｌのヘキソキナーゼカクテル（Iｌ試験グルコース（ＨＫ）キット、Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、番号１８２５０７−４０）および２０μｌの上清が添加された。グルコースの検量線（０〜１ｍｇ／ｍｌ）については、２０μｌのグルコースのストック溶液が代わりに添加された。暗室中室温で１０分間、プレートが温置され、引き続いてＳｐｅｃｔｒａｍａｘを用いて３４０ｎｍの吸光度測定がされた。
【表１３】
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【０２４１】
ＧＡ変異体によるグルコース産生速度を測定する該アッセイの結果が、図７および８に示される。これらの図では、ＴｒＧＡに対する相対性能が、添加された酵素の量当たりで計算された。グラフの１５０ｎｇの酵素のところの直線領域から、結論が導かれた。図７、８および表１３の結果は、この直線領域全体にわたってＬＲ８、ＥＴ８、ＥＴ７−２、Ｓ２１１Ｒ、Ｑ１７２ＦおよびＰ９４Ｎが野生型よりも優れた性能を示した。
【０２４２】
ＬＲ８の基質特異性を測定するために、ＬＲ８およびＴｒＧＡ野生型の性能が、スクリーニングおよび生産適用において用いられた基質（可溶性コーンスターチおよび実施例１０で調製された２のコーンマッシュ基質）上で試験された。ＨＰＬＣによって分析すると、これらの基質は重合度（ＤＰ）パターンの差異を示した（図９〜１１参照）。ＮＥおよびＢＳＥでは、ＤＰ１からＤＰ４以上までが存在し、他方、可溶性コーンスターチは少なくとも４以上のグルコース分子からなる。すべての基質上でＬＲ８は野生型よりも優れた性能を示した（図９、１０および１１参照）。
【実施例１１】
【０２４３】
ｐＴＴＴベクター中のＴｒＧＡ部位評価ライブラリー（ＳＥＬ）を用いてトリコデルマレーシ中で発現された変異体のスクリーニングおよび特性解析
追加のＴｒＧＡ変異体、とりわけＳＢＤ内に置換を有する変異体が作製され、トリコデルマレーシ中で直接スクリーニングされた。実施例１と同じようにして、別の１０のＴｒＧＡ部位飽和変異（ＳＳＭ）ライブラリーが、テンプレートとしてｐＤＯＮＲ−ＴｒＧＡエントリーベクターを用いて、および表１４に列挙されたプライマーを用いて構築された。該部位は、Ｎ６１、Ｇ７３、Ｌ４１７、Ｔ４３０、Ａ４３１、Ｅ５０３、Ｑ５１１、Ａ５３５、Ａ５３９およびＮ５６３を含んでいる。これらの部位の中で、Ｅ５０３、Ｑ５１１、Ａ５３５、Ａ５３９およびＮ５６３は、ＴｒＧＡのデンプン結合ドメイン内に位置している。その後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社によって提供された実験方法に従ってＬＲ  ＣＬＯＮＡＳＥ（商標）II酵素混合物を用いてｐＴＴＴ−Ｄｅｓｔベクター（図１４）によって、組換えが実施された。組換え生成物は大腸菌最高効率ＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中に形質転換され、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンが加えられた２×ＴＹ培地［Ｂａｃｔｏトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社）１６ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社）１０ｇ／Ｌ、ＮａＣＬ５ｇ／Ｌ］上で平板培養された。３７℃で一晩の温置後、各ライブラリーの９６の単一コロニーが、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＴＹ寒天平板培地から採取され、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２００μＬの２×ＴＹ培地を含むＭＴＰ中で３７℃で２４時間育成された。培養物が配列解析（ＡＢＩ３１００シーケンスアナライザー、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）に用いられた。各ライブラリーは、最終発現ベクター中に１５〜１９の異なったＴｒＧＡ変異体を含んでいた。これらの変異体はトリコデルマレーシ中に個別に形質転換された。
【表１４】
0005594899.tif 000031
【０２４４】
ＳＥＬは、ＰＥＧプロトプラスト方法（たとえば、Ｐｅｎｔｉｌｌａら、Ｇｅｎｅ、１９８７年、第６１巻、ｐ．１５５−１６４参照）を用いてトリコデルマレーシ中に形質転換された。トリコデルマレーシ宿主は、ＲＬ−Ｐ３７（ＩＡ５２）に由来しかつ４の遺伝子欠失（Δｃｂｈ１、Δｃｂｈ２、Δｅｇｌ１、Δｅｇｌ２、すなわち「４欠失型」、米国特許第５，８４７，２７６号、国際公開第９２／０６１８４号および国際公開第０５／００１０３６号参照）を有する株である。２５μｌの総量中に６００ｎｇまでのＤＮＡおよび１〜５×１０５のプロトプラストを含有する形質転換混合物が、２００ｍｌの２５％ＰＥＧ溶液で処理され、２倍量の１．２Ｍのソルビトール溶液で希釈され、アセトアミドを含む３％の精選最良アガロースＭＭを混合され、そして２４ウェルマイクロタイタープレートのいずれも中にあるアセトアミドを含む２％の精選アガロース上に注がれた。該プレートは２８℃で５〜８日間温置された。各個別のウェル上に再生された形質転換体の全集団からの胞子が、０．８５％のＮａＣｌ、０．０１５％のＴｗｅｅｎ  ８０の溶液を用いてプレートから採取された。胞子懸濁物は、９６ウェルＭＴＰ中に発酵物を接種するために用いられた。２４ウェルＭＴＰの場合には、精選アセトアミドＭＭを含む新鮮な２４ウェルＭＴＰ上への追加のプレート接種工程が、胞子数を高めるために導入された。
【０２４５】
形質転換体がＭＴＰ中で発酵され、発現されたタンパク質変異体を含有する培養物の上清がアッセイに用いられた。手短に言うと、２００μｌのＬＤ−ＧＳＭ培地を含むＭＴＰが、ＴｒＧＡ変異体を発現するトリコデルマレーシ形質転換体の胞子懸濁物（１ウェル当たり１０４超の胞子）を正副４通りに接種された。このプレートが、２８℃、２３０ｒｐｍの振とうおよび８０％の湿度で６日間温置された。培養物上清が真空ろ過によって採取された。該上清が、改良された性質を有する変異体のスクリーニングのための別のアッセイに用いられた。
【０２４６】
熱安定性、比活性、ならびに熱安定性および比活性の双方について１．０より大きい性能指数を示す変異体が、表１５〜１７に示される。
【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【実施例１２】
【０２４７】
選択された一組の単一部位変異体および組み合わせ変異体の特性解析
実施例４〜６および１１の結果に基づいて、選択された一組の組み合わせ変異体および単一部位変異体が、さらにこれらの変更された性質について特性解析された。この選択された一組は、Ｉ４３、Ｄ４４、Ｎ６１、Ｇ７３、Ｇ２９４、Ｌ４１７、Ｔ４３０、Ａ４３１、Ｅ５０３、Ｑ５１１、Ａ５３５、Ａ５３９および／またはＮ５６３に１または複数の置換を有する単一部位変異体および組み合わせ変異体を含む。変異体は、大規模発酵物から精製され、熱安定性および比活性のＰＩが測定された。具体的には、様々な基質、たとえばＤＰ７、コーンスターチおよび液化物を用いて、比活性が測定された。結果が表１８および１９に示される。
【表１８】
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【表１９】
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【実施例１３】
【０２４８】
ＴｒＧＡの結晶構造
トリコデルマレーシ（ハイポクレアジェコリーナ）グルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ）の完全な３次元構造が、１．９Åの分解能で測定された。表２０は、トリコデルマレーシグルコアミラーゼの結晶構造を表す座標を示す。ＴｒＧＡは、５９９の残基および野生型宿主において通常起きるであろうすべての翻訳後修飾を含むインタクトな形態で結晶化された。この結晶構造は、以下のように作製され分析された。
【０２４９】
タンパク質の発現および精製については、ハイポクレアジェコリーナＧＡをコードする遺伝子が、米国特許第７，４１３，８８７号に記載された実験方法に従ってクローニングされ、そして発現された。
【０２５０】
すべての結晶化実験に用いられたＴｒＧＡタンパク質物質は、最初に以下のアニオン交換クロマトグラフィーによって１段階で精製された。すなわち、１８０ｍｇ／ｍｌの総タンパク質からなる発現されたＴｒＧＡの濃縮された培養物上清が、サンプルを２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０緩衝液中で１：１０に希釈することによって調製された。ＨｉＰｒｅｐ  １６／１０Ｑ  セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）がアニオン交換精製に用いられた。ＨｉＰｒｅｐカラムは、４カラム容量（ＣＶ）分の出発緩衝液（２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で平衡化され、引き続いて１０ｍｌの希釈されたタンパク質サンプルが注入された。ランニング緩衝液（２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）中０〜１４０ｍＭのＮａＣｌの８ＣＶ分の直線勾配物が、結合されたタンパク質を溶出するために注入された。結合されたＴｒＧＡは、約８０ｍＭのＮａＣｌの塩濃度においてＨｉＰｒｅｐ  Ｑ  セファロースカラムから溶出した。純粋なＴｒＧＡタンパク質を含有する画分が貯められ、１０ｋＤの分画分子量（ＭＷＣＯ）を持つ２５ｍｌのＶｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濃縮管（Ｖｉｖａ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて５０ｍｇ／ｍｌまで濃縮された。精製され濃縮されたＴｒＧＡ物質は、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．３で平衡化されたＤＧ−１０脱塩カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて緩衝液交換された。タンパク質濃度が、２８０ｎｍの吸光度を測定することによって測定された。この最初に精製され濃縮されたＴｒＧＡタンパク質ストックは、この後−２０℃で貯蔵された。
【０２５１】
追加のアニオン交換精製およびサイズ排除精製に基づく、２のさらなる精製工程が導入されて、ＴｒＧＡタンパク質物質の結晶可能性が高められた。これらの２のさらなる精製工程は以下のように実施された。第一のアニオン交換精製工程では、１０ｍｌのＭｏｎｏＱカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）が用いられた。最初に精製され凍結されたＴｒＧＡ物質（５０ｍｇのタンパク質）の１ｍｌのサンプルが解凍され、該サンプルを２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８中６ｍｌまで繰返し希釈することによって、緩衝液がこの新しい緩衝液に変えられ、引き続いて６ｍｌの５ｋＤのＭＷＣＯ濃縮管を用いてサンプルが再び０．５ｍｌまで濃縮された。このＴｒＧａサンプルは、最後の濃縮工程後に、該タンパク質サンプルの電導度がアニオン精製の出発緩衝液、すなわち２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０の電導度に対応する電導度に達するまで蒸留水中に希釈された。ＭｏｎｏＱカラムが、最初に４カラム容量（ＣＶ）分の出発緩衝液で平衡化され、引き続いて希釈されたタンパク質サンプルがカラムに注入された。結合されたタンパク質は、２の異なった勾配物によってＭｏｎｏＱカラムから溶出された。最初に４ＣＶ分の直線ｐＨ勾配物がかけられ、この場合出発緩衝液のｐＨは８．０から６．０まで減少された。第二の勾配物では、８ＣＶ分の長い勾配物がかけられ、この場合塩濃度がランニング緩衝液（２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．０）中０から３５０ｍＭのＮａＣｌまで増加された。結合されたＴｒＧＡは、第二の塩勾配物の間に約１５０ｍＭのＮａＣｌ濃度においてカラムから溶出することが見出された。ＴｒＧＡを含有する画分が貯められ、６ｍｌの５ｋＤのＭＷＣＯ  Ｖｉｖａｓｐｉｎ濃縮管を用いて２ｍｌまで濃縮された。濃縮されたＴｒＧＡサンプルは、この後４ＣＶ分の２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０および５０ｍＭのＮａＣｌで平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １６／６０サイズ排除カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にかけられ、この溶液はランニング緩衝液としても用いられた。サイズ排除精製後の主溶出ピークの画分が貯められ、６ｍｌの５ｋＤのＭＷＣＯ  Ｖｉｖａｓｐｉｎ濃縮管を用いて約７．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度まで濃縮された。
【０２５２】
タンパク質の結晶化においては、ＴｒＧＡの最初の結晶化条件を発見するために用いられたタンパク質サンプルは、アニオン交換精製によって一度精製され、その後−２０℃で貯蔵されたＴｒＧＡ物質のサンプルであった。このＴｒＧＡタンパク質サンプルは、最初の結晶化実験の前に解凍され、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．３で約１２ｍｇ／ｍｌまで希釈された。斜方晶系Ｘ線データセットが分子置換法（ＭＲ）によってＴｒＧＡ構造を解明するために用いられ、高分解能斜方晶系データセットが最終的な斜方晶系空間群のＴｒＧＡ構造モデルのために用いられた。斜方晶系ＴｒＧＡ結晶は、２０℃において、懸滴法による蒸気拡散方法（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、１９８２年）を用いて、２５％のＰＥＧ３３５０、０．２０Ｍの酢酸アンモニウム、０．１０Ｍのビス−トリスｐＨ５．５からなる溶液（リザーバー溶液）中で成長することが見出された。結晶化液滴は、等量のタンパク質溶液（１２ｍｇ／ｍｌ）およびリザーバー溶液を混合して１０μｌの最終量にすることによって調製された。該ＴｒＧＡ結晶は、おおよその格子寸法ａ＝５２．２Å、ｂ＝９９．２Å、ｃ＝１２１．２Åを有する斜方晶系空間群Ｐ２１２１２１に属し、かつ非対称単位中に１の分子を持つ２．３のＶｍ（Ｍａｔｔｈｅｗｓ  １９６８年）計算値を有することが見出された。
【０２５３】
Ｘ線データ収集では、２の斜方晶系ＴｒＧＡデータセットが、室温において、密封された毛細管中に標本化された単結晶から収集された。分子置換法（ＭＲ）によって構造を解明するのに用いられた最初の低分解能斜方晶系ＴｒＧＡのＸ線データセットが、実験室Ｘ線源である、Ｒｉｇａｋｕ  ＲＵ２００回転陽極Ｘ線発生装置からのＣｕＫα放射を用いた集束ミラーを備えたＭＳＣ／Ｒｉｇａｋｕ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ社、米国、テキサス州、Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ）Ｒａｘｉｓ  ＩＶ＋＋イメージプレート検出器によって収集された。このデータセットは、ＭＳＣ／Ｒｉｇａｋｕによって提供されたｄ＊ｔｒｅｋソフトウェアを用いて処理され、縮尺比設定され、そして平均化された。凍結保護物質として２５％のＰＥＧ３３５０、１５％のグリセロール、５０ｍＭのＣａＣｌ２および０．１Ｍのビス−トリス  ｐＨ５．５からなる凍結保護剤中で平衡化され、レーヨン繊維ループ中に標本化され、シンクロトロンに移す前に液体窒素中に投入凍結された、１００Ｋにおける凍結ＴｒＧＡ単結晶から、Ｃ底面心の単斜晶系データセットが収集された。高分解能斜方晶系データセット（１．９Å）およびＣ底面心の単斜晶系データセット（１．８Å）は双方とも、スウェーデン国、ＬｕｎｄのＭＡＸ  ＬＡＢ社にあるシンクロトロン源、ビームライン９１１：５において収集された。シンクロトロン源で収集された双方のデータセットは、ＭＯＳＦＬＭで処理され、ＣＣＰ４プログラムパッケージ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ４  １９９４）に含まれるＳＣＡＬＡプログラムで縮尺比設定された。特に明記しない限り、以降のすべてのデータ処理はＣＣＰ４プログラムパッケージ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ４  １９９４）を用いて実施された。各データセットからの反射像の５％の一組は上記処理とは別にされ、Ｒフリー（Ｂｒｕｎｇｅｒ，Ａ、Ｎａｔｕｒｅ、１９９２年、第３５５巻、ｐ．４７２−４７５）を評価するために用いられた。
【０２５４】
ＴｒＧＡ構造は、最初の低分解能斜方晶系データセットを用い、および探索モデルとしてアスペルギルスアワモリＧＡ（ＡａＧＡ）変異体Ｘ１００（ｐｄｂエントリー１ＧＬＭ）（Ａｌｅｓｈｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９４年、第２３８巻、ｐ．５７５−５９１）の座標を用いて、最初にＣＣＰ４プログラムパッケージに含まれている自動置換プログラムＭＯＬＲＥＰ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ４  １９９４）を用いるＭＲ法によって解明された。このアスペルギルスアワモリＧＡ探索モデルは、ＭＲ実験を実施する前に、Ｎ−及びＯ−グリコシル化としてタンパク質分子に結合されたすべてのグリコシル化部分、およびすべての溶媒分子を除くように修正された。最初の低分解能ＴｒＧＡデータセットからの３６．８〜２．８Åの間の分解能のすべての反射像が、ＭＲ解法のために用いられた。このＭＲプログラムは、バックグラウンドを差し引いて１１．１σの極大値を持つ単一回転関数解を見出し、次の最大極大値はバックグラウンドを差し引いて３．８σであった。並進関数解は４８．７％のＲ因子を与え、１７．４のコントラスト因子を有していた。ＭＲ解は、Ｒｅｆｍａｃ５．０プログラム（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、１９９７年、第Ｄ５３巻、ｐ．２４０−２５５）を用いた拘束最小自乗精密化の１０サイクルの間に精密化された。これは結晶学的Ｒ因子を３１．１％まで下げ、他方、Ｒフリー値は４２．２％から４１．１％まで落ちた。
【０２５５】
精密化されたＭＲ解法モデルが、低分解能斜方晶系ＴｒＧＡデータセットから最初の密度マップを計算するのに用いられた。ＴｒＧＡの残基１９と２６との間のジスルフィド架橋を表す電子密度は、アスペルギルスアワモリ変異体Ｘ１００構造モデル中にジスルフィド結合は存在しないので、この電子密度マップにおいて容易に同定されることができた。このことは、この電子密度マップがＴｒＧＡのアミノ酸配列からＴｒＧＡの構造モデルを構築するために用いられるのに十分な品質を有することの表れと解釈された。低分解能データセットに基づく最初のＴｒＧＡ構造モデルは、Ｃｏｏｔ（ＥｍｓｌｅｙおよびＣｏｗｔａｎ、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ  ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２００４年、第６０巻、ｐ．２１２６−２１３２）を用いるモデル構築およびＲｅｆｍａｃ５．０を用いる最大尤度精密化の交互サイクルによって精密化された。
【０２５６】
最初のＴｒＧＡ構造モデルの分解能は、高分解能斜方晶系データセットに対して該最初のＴｒＧＡ構造モデルをＲｅｆｍａｃ５．０プログラムを用いる拘束精密化の１０サイクルの間に精密化することによって、高分解能斜方晶系データセットの分解能（１．９Å）まで拡張された。構造モデル中のほとんどの水分子は、精密化プログラム中の水摘み取り手順を用いることによって自動的に位置確認され、そしてそれから目視検査によって手入力で選別されまたは排除された。全構造比較は、Ｃｏｏｔ（ＥｍｓｌｅｙおよびＣｏｗｔａｎ、２００４年、上記）またはＯ（Ｊｏｎｅｓら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、１９９１年、第Ａ４１巻、ｐ．１１０−１１９）のいずれかを用いて行われ、ＰｙＭＯＬ（ＤｅＬａｎｏ  Ｗ．Ｌ．、Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ．、２００２年、米国、カルフォルニア州、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて図が作製された。
【０２５７】
これらの結果から、外側へリックスのＣ末端が内側へリックスのＮ末端につながっていく、アルファへリックスのダブルバレルからなる、ＡａＧＡについてＡｌｅｓｈｉｎら（１９９２年）によって記載されたのと同じ（α／α）６−バレルトポロジーに、ＴｒＧＡ触媒コアセグメントが従っていることがわかる。ＡａＧＡと比較した電子密度における重要な差異、たとえば残基１９と２６との間のジスルフィド架橋および挿入（残基２５７〜２６０）を特定することが可能であった。８０〜１００を含んでいるセグメントも大幅なモデル再構築を受けた。１の重要なグリコシル化部位がＡｓｎ１７１に特定され、これは４までのグリコシド部分を結合させていた。類似したグリコシル化部位がＡａＧＡ中に特定された。さらに、残基２２〜２３、４４〜４５および１２２〜１２３の間に３のシスペプチドを含む触媒コアが、ＴｒＧＡおよびＡａＧＡの間で保存されていた。全体としては、ＴｒＧＡおよびＡａＧＡの触媒コアの座標を比較すると、４５３のＣα原子のうち４０９のＣα原子間に０．５３５Åの二乗平均平方根変動があった。
【実施例１４】
【０２５８】
ＴｒＧＡとＡａＧＡとの間の相同性
実施例１３で同定されたＴｒＧＡの結晶構造が、アスペルギルスアワモリＧＡ（ＡａＧＡ）のすでに同定されている結晶構造の上に重ね合わされた。ＡａＧＡ結晶構造はタンパク質データベース（ＰＤＢ）から得られ、結晶化されたＡａＧＡの形態は触媒ドメインのみを含む形態であった。すべての３の領域がインタクトな状態のトリコデルマレーシグルコアミラーゼの構造が、本明細書において１．８オングストロームの分解能まで測定された（表１５および実施例１２参照）。座標を用いて（表２０参照）、この構造が、すでに測定されているアスペルギルスアワモリ株Ｘ１００の触媒ドメインの座標（Ａｌｅｓｈｉｎ，Ａ．Ｅ．、Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｃ、Ｆｉｒｓｏｖ，Ｌ．Ｍ．およびＨｏｎｚａｔｋｏ，Ｒ．Ｂ．、「アスペルギルスアワモリ変異体Ｘ１００からのグルコアミラーゼの精密化結晶構造（Ｒｅｆｉｎｅｄ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ ｖａｒ．Ｘｌ００）」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９４年、第２３８巻、ｐ．５７５−５９１、およびＰＤＢ）とアラインメントされた。図１２および１３に見られるように、触媒ドメインの構造は非常にぴったりと重ね合わされ、この構造の重ね合わせに基づいて同等の残基の同定が可能となった。
【０２５９】
この解析に基づいて、ＴｒＧＡ中で変異され得る部位が同定され、高められた安定性および／または比活性がもたらされた。これらの部位は、活性部位として１０８、１２４、１７５および３１６を含む。また、特定の２部位変異体であるＹ４７Ｗ／Ｙ３１５ＦおよびＹ４７Ｆ／Ｙ３１５Ｗが同定された。同定された他の部位は、Ｉ４３、Ｄ４４、Ｐ４５、Ｄ４６、Ｒ１２２、Ｒ１２５、Ｖ１８１、Ｅ２４２、Ｙ３１０、Ｄ３１３、Ｖ３１４、Ｎ３１７、Ｒ４０８およびＮ４０９であった。高い構造上の相同性の故に、ＴｒＧＡ中の諸部位において発見された有益な変異体は、アスペルギルスアワモリおよび他の相同なグルコアミラーゼにおいても同様な結果をもたらすであろうと期待される。
【０２６０】
本明細書に記載された方法およびシステムの各種の変更および変法が、本開示発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者には容易にわかるだろう。本開示発明は特定の代表的な実施態様と関連して記載されてきたけれども、特許請求された通りの発明の主題は、かかる特定の実施態様に不当に限定されるべきでないことが理解されなければならない。実際に、当業者には明らかである、本開示発明を実施するための記載された様式の各種の変更は、以下の特許請求の範囲内にあることが意図されている。
【表２０】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｃ−１】
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【図４Ｃ−２】
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【図４Ｄ】
0005594899.tif 000171
【図４Ｄ−１】
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【図４Ｄ−２】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【配列表】
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