(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取された糞便を、水溶性有機溶媒を有効成分とする溶液に混合する工程、及び
当該混合物から、腸内常在菌由来のＲＮＡと腸内常在菌以外の生物由来のＲＮＡとを同時に回収する工程、
を含み、
前記溶液中の前記水溶性有機溶媒の濃度が３０％以上、１００％以下であり、
前記水溶性有機溶媒がエタノール、プロパノール、及びメタノールからなる群より選ばれる１以上であることを特徴とするＲＮＡ回収方法。
【請求項２】
前記糞便と前記溶液の混合比率が、糞便容量１に対して当該溶液容量が１以上であることを特徴とする請求項１記載のＲＮＡ回収方法。
【請求項３】
前記腸内常在菌以外の生物由来のＲＮＡが、哺乳細胞由来のＲＮＡであることを特徴とする請求項１又は２に記載のＲＮＡ回収方法。
【請求項４】
ＲＮＡを回収する工程が、
（ａ）前記糞便試料中のタンパク質を変性させ、前記糞便試料中の腸内常在菌及び腸内常在菌以外の生物から、ＲＮＡを溶出させる工程、及び、
（ｂ）前記工程（ａ）において溶出させたＲＮＡを回収する工程、
を有することを特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載のＲＮＡ回収方法。
【請求項５】
前記工程（ａ）の後、前記工程（ｂ）の前に、
（ｃ）前記工程（ａ）により変性させたタンパク質を除去する工程、
を有することを特徴とする請求項４に記載のＲＮＡ回収方法。
【請求項６】
前記工程（ａ）におけるタンパク質の変性が、カオトロピック塩、有機溶媒、及び界面活性剤からなる群より選ばれる１以上を用いて行われることを特徴とする請求項４又は５に記載のＲＮＡ回収方法。
【請求項７】
前記有機溶媒がフェノールであることを特徴とする請求項６記載のＲＮＡ回収方法。
【請求項８】
前記工程（ｃ）における変性させたタンパク質の除去が、クロロホルムを用いて行われることを特徴とする請求項５〜７の何れか一項に記載のＲＮＡ回収方法。
【請求項９】
前記工程（ｂ）におけるＲＮＡの回収が、
（ｂ１）前記工程（ａ）において溶出させたＲＮＡを無機支持体に吸着させる工程、及び、
（ｂ２）前記工程（ｂ１）において吸着させたＲＮＡを無機支持体から溶出させる工程、
を有することを特徴とする請求項４〜８の何れか一項に記載のＲＮＡ回収方法。
【請求項１０】
前記工程（ａ）の前に、
（ｄ）前記糞便試料から固形成分を回収する工程、
を有することを特徴とする請求項４〜９の何れか一項に記載のＲＮＡ回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糞便試料中の核酸を、糞便試料から核酸を効率よく回収するための糞便試料の調製方法、糞便試料調製用溶液及び採便用キット、該調製方法により調製された糞便試料、該糞便試料からの核酸回収方法、及び該核酸回収方法により回収された核酸を用いた核酸解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
欧米と同様に日本においても、大腸がんの患者数は、年々急激に増加しており、大腸がんが、がん死亡率の上位を占めるようになってきている。これは、日本人の食生活が欧米型の肉食中心となったことに原因があると考えられている。具体的には、毎年約６万人程度が大腸がんに罹患しており、臓器別の死亡数でも、胃がん、肺がんに続く３番目の多さであり、今後更なる増加も予想されている。一方で、大腸がんは、他のがんと異なり、発症の初期に治療することにより、１００％近く治癒可能ながんである。したがって、大腸がんを早期がん検診の対象とすることは極めて有意義であり、大腸がんの早期発見のための検査方法の研究・開発が盛んに行われている。【０００３】
大腸がんの早期発見のための検査方法として、例えば、注腸検査、大腸内視鏡検査等が行われている。注腸検査とは、大腸にバリウムを注入し、大腸の粘膜面に付着させ、Ｘ線を照射しその表面の凹凸の撮影を行い、大腸の表面を観察する検査である。一方、大腸内視鏡検査とは、内視鏡により直接大腸内部を観察する検査である。特に大腸内視鏡検査は、感度や特異性が高く、ポリープや早期がんの切除も可能であるという利点も有している。
しかしながら、これらの検査方法は、コストが高い上に被験者への負担が大きく、合併症のリスクを伴うという問題がある。例えば、注腸検査には、Ｘ線被爆や腸閉塞の危険性がある。また、大腸内視鏡検査は、内視鏡を直接大腸内に投入するため侵襲的であり、かつ、内視鏡操作には熟練を要し、検査のできる施設が限られている。このため、これらの検査方法は、定期健診等の無症状の一般人を対象とした大腸がん検査に適しているとは言い難い。【０００４】
近年、大腸がんの一次スクリーニング法として、非侵襲的で低コストである便潜血検査が広く実施されている。便潜血検査は、糞便中に含まれる赤血球由来のヘモグロビンの有無を調べる検査であり、間接的に大腸がんの存在を予測する方法である。便潜血検査では、便の採取や保存を常温で行うことができ、冷蔵・冷凍等の特別な保存条件も必要としないこと、及び、一般的な家庭で簡単に行うことができ、操作が非常に簡便であることも、広く利用される要因となっている。但し、便潜血検査では、感度が２５％程度と低く、大腸がんを見落とす確率が高いという問題がある。さらに、陽性的中率も低く、便潜血検査陽性の被験者の中で実際に大腸がん患者である割合は１０％以下であり、多くの偽陽性を含んでいる。このため、より信頼性の高い新たな検査法の開発が強く望まれている。【０００５】
定期健診等にも適した、非侵襲的で簡便であり、かつ信頼性の高い新たな検査方法として、糞便中のがん細胞の有無やがん細胞由来遺伝子の有無を調べる検査が注目されている。これらの検査方法は、直接的にがん細胞やがん細胞由来遺伝子の有無を調べるため、大腸がんの罹患に伴い間接的に生じる消化管からの出血の有無を調べる便潜血検査法に比べて、より信頼性の高い検査法になり得ると考えられる。【０００６】
糞便試料中のがん細胞等を精度よく検出するためには、糞便試料中のがん細胞由来核酸を効率よく回収することが重要である。特に、がん細胞由来核酸は微量であり、かつ、糞便中には、消化残留物やバクテリアが大量に含まれているため、核酸は非常に分解され易い。このため、糞便試料から核酸、特にヒト等の哺乳細胞由来の核酸を効率よく回収するためには、糞便中の核酸の分解を防止し、検査操作時まで安定して保存し得るように糞便試料を調製することが重要である。このような糞便試料の調製方法として、例えば、採取された糞便から、大腸等の消化管から剥離したがん細胞を分離する方法がある。糞便からがん細胞を分離することにより、バクテリア等由来のプロテアーゼやＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ等の分解酵素による影響を抑えることができる。糞便からがん細胞を分離する方法として、例えば、糞便から細胞を分離する方法であって、ａ）便をそのゲル氷点未満の温度に冷却する工程と、ｂ）便が実質的に完全な状態を残すように、便をそのゲル氷点未満の温度に維持しながら便から細胞を採取する工程と、を含むことを特徴とする方法が開示されている（例えば特許文献１参照）。その他、通常周囲温度で、プロテアーゼ阻害物質、粘液溶解剤、殺細菌剤を有する輸送培地に糞便を分散させた後、大腸剥離細胞を単離する方法が開示されている（例えば特許文献２参照）。【０００７】
一方で、細胞の形態を組織学的及び細胞学的に観察する場合に、採取された細胞の形態を観察時まで維持するために、ホルマリン固定やアルコール固定等の多くの固定方法が従来行われてきている。これらの固定方法を応用した方法であって、哺乳細胞試料の長期保存及び保存後の細胞観察を可能にするための保存溶液として、例えば、哺乳細胞を定着するために充分な量の水と混和可能なアルコールと、溶液内での哺乳細胞の凝集を防ぐために充分な量の抗凝集剤と、細胞を保存する間、溶液のｐＨを４から７の範囲に保つ緩衝剤とを含む細胞溶液保存剤が開示されている（例えば特許文献３参照）。【０００８】
また、細胞の組織学的及び細胞学的観察に加え、保存後の細胞中のタンパク質や核酸等に対する分子学的解析をも可能とする保存溶液として、例えば、緩衝成分、少なくとも１つのアルコール成分、固定剤成分、並びにＲＮＡ、ＤＮＡ及びタンパク質からなる群の少なくとも１つの分解を抑制する薬剤を含む普遍的収集培地（例えば特許文献４参照）や、５〜２０％ポリエチレングリコール及び８０〜９５％メタノールを含む非水溶液（例えば特許文献５参照）等が開示されている。その他、細胞の構造及び核酸を安定化する組成物であって、（ａ）少なくとも１種のアルコール又はケトンを含む、タンパク質を沈殿又は変性させることができる第１の物質と、（ｂ）第１の物質の少なくとも１個の細胞への注入を促進する第２の促進物質とを含む組成物が開示されている（例えば特許文献６参照）。
【特許文献１】特表平１１−５１１９８２号公報
【特許文献２】特表２００４−５１９２０２号公報
【特許文献３】特開２００３−１５３６８８号公報
【特許文献４】特表２００４−５００８９７号公報
【特許文献５】特表２００５−５３２８２４号公報
【特許文献６】特開２００１−１２８６６２号公報
【特許文献７】特公平６−７２８３７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記の特許文献１に記載の、糞便から細胞を分離する方法方法においては、糞便試料を冷却しながら細胞を分離している。この分離操作を冷却せずに行うと、糞便試料の変質等により正しい検出結果を得ることができなくなってしまう。したがって糞便試料の変質を効果的に防止するためには、採便直後に冷却することが重要である。しかしながら、検診等のように家庭において採便が行われる場合には、採取後速やかに糞便試料を冷却することは非常に困難であり、現実的ではない。
また、糞便試料の変質を防ぐために、糞便試料を凍結することが考えられるが、凍結させた糞便試料は、検査前に融解しなければならず、操作が煩雑となる。【００１０】
上記の特許文献２に記載の、輸送培地に糞便を分散させる方法では、殺細菌剤等を添加することにより、冷却操作を必要とせず、室温で糞便試料の調製や保存が可能であるものの、糞便から大腸剥離細胞を分離する作業は煩雑であるという問題がある。また、殺細菌剤等により破壊されたバクテリア由来の核酸分解酵素やタンパク質分解酵素により、大腸剥離細胞及び大腸剥離細胞由来の核酸等が分解されてしまう結果、大腸がん検出の精度が低下するおそれがある。その他、細胞を生存させた状態で保存しているために、大腸剥離細胞中の遺伝子発現等の分子学的プロファイリングが培地中の抗生物質等の成分や経時的な影響を受け変化してしまうという問題もある。【００１１】
一方、上記の特許文献３、４、及び５に記載の方法のように、保存溶液を用いれば、細胞を室温で安定して保存することができる。そしてこれらの保存溶液は、ほぼ単離された細胞に対して用いられるものである。従って、糞便のような多種多様な物質が含まれている生体試料に直接用いることは困難である。糞便から単離された大腸剥離細胞に、このような保存溶液を用いることにより、細胞の遺伝子発現等の分子学的プロファイリングを変化させる事無く長期保存することができるが、糞便中の大腸剥離細胞は微量であるため、単離された細胞から解析に充分な量の核酸を抽出することは困難であった。また、上記の特許文献６に記載の細胞構造及び核酸を安定化する組成物は、主に膣スワブ試料中の主にバクテリア由来の核酸を安定して保存し得るものであるが、バクテリアとは大きく異なる構造を有し、かつバクテリアよりもはるかに微量である哺乳細胞由来の核酸も安定して保存し得るものであるかについては一切記載されていない。また、膣スワブ試料と異なり消化残留物等を多く含む糞便に用いた場合であっても核酸を安定して保存し得るかについても一切記載が無い。【００１２】
本発明は、糞便中の大腸剥離細胞等の哺乳細胞由来の核酸等を効率よく回収することが可能な糞便試料を、煩雑な操作を必要とせずに調製し得る方法、該方法に用いられる糞便試料調製用溶液及び採便用キット、並びに、該方法により調製された糞便試料を用いて糞便中の核酸を回収し解析する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、採取された糞便を、水溶性有機溶媒を有効成分とする糞便試料調製用溶液に混合させることにより、糞便中に含まれている核酸を効率よく回収することができる糞便試料を調製し得ること、及び、該方法により調製された糞便試料から、検出対象である哺乳細胞等の腸内常在菌以外の生物由来の核酸と、糞便中に大量に含まれている腸内常在菌由来の核酸を同時に回収することにより、微量である腸内常在菌以外の生物由来の核酸を非常に効率よく回収し得ることを見出し、本発明を完成させた。【００１４】
すなわち、本発明は、下記の通りの構成を有する。
（１）被験者から採取された糞便を、水溶性有機溶媒を有効成分とする溶液に混合する工程、及び
当該混合物から、腸内常在菌由来のＲＮＡと腸内常在菌以外の生物由来のＲＮＡとを同時に回収する工程、
を含み、
前記溶液中の前記水溶性有機溶媒の濃度が３０％以上、１００％以下であり、
前記水溶性有機溶媒がエタノール、プロパノール、及びメタノールからなる群より選ばれる１以上であることを特徴とするＲＮＡ回収方法。
（２）前記糞便と前記溶液の混合比率が、糞便容量１に対して当該溶液容量が１以上であることを特徴とする（１）記載のＲＮＡ回収方法。
（３）前記腸内常在菌以外の生物由来のＲＮＡが、哺乳細胞由来のＲＮＡであることを特徴とする（１）又は（２）に記載のＲＮＡ回収方法。
（４）ＲＮＡを回収する工程が、
（ａ）前記糞便試料中のタンパク質を変性させ、前記糞便試料中の腸内常在菌及び腸内常在菌以外の生物から、ＲＮＡを溶出させる工程、及び、
（ｂ）前記工程（ａ）において溶出させたＲＮＡを回収する工程、
を有することを特徴とする（１）〜（３）の何れか一つに記載のＲＮＡ回収方法。
（５）前記工程（ａ）の後、前記工程（ｂ）の前に、
（ｃ）前記工程（ａ）により変性させたタンパク質を除去する工程、
を有することを特徴とする（４）に記載のＲＮＡ回収方法。
（６）前記工程（ａ）におけるタンパク質の変性が、カオトロピック塩、有機溶媒、及び界面活性剤からなる群より選ばれる１以上を用いて行われることを特徴とする（４）又は（５）に記載のＲＮＡ回収方法。
（７）前記有機溶媒がフェノールであることを特徴とする（６）記載のＲＮＡ回収方法。
（８）前記工程（ｃ）における変性させたタンパク質の除去が、クロロホルムを用いて行われることを特徴とする（５）〜（７）の何れか一つに記載のＲＮＡ回収方法。
（９）前記工程（ｂ）におけるＲＮＡの回収が、
（ｂ１）前記工程（ａ）において溶出させたＲＮＡを無機支持体に吸着させる工程、及び、
（ｂ２）前記工程（ｂ１）において吸着させたＲＮＡを無機支持体から溶出させる工程、
を有することを特徴とする（４）〜（８）の何れか一つに記載のＲＮＡ回収方法。
（１０）前記工程（ａ）の前に、
（ｄ）前記糞便試料から固形成分を回収する工程、
を有することを特徴とする（４）〜（９）の何れか一つに記載のＲＮＡ回収方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の糞便試料の調製方法により、糞便試料から核酸を効率よく回収することができる糞便試料を調製することができる。また、本発明の糞便試料の調製方法により、糞便試料中に比較的少量含まれている哺乳細胞等の腸内常在菌以外の生物由来の核酸を、室温で長期間保存可能なほど安定的に維持することができる。特に、糞便の採取から糞便試料の調製、保存、輸送を室温で簡便に行うことができるため、検診等のスクリーニング検査のための糞便試料の調製に非常に好適である。さらに、糞便試料から、哺乳細胞等の検出の対象である生物又はその細胞等を分離するという煩雑な操作を必要としないため、多数の検体を処理する場合であっても、労力とコストを効果的に低減することができる。特に、本発明の採便用キットを用いることにより、より簡便に糞便試料を調製することが可能となる。
また、本発明の核酸回収方法においては、本発明の糞便試料の調製方法により調製した糞便試料から、哺乳細胞等の腸内常在菌以外の生物由来の核酸と腸内常在菌由来の核酸を同時に回収するため、腸内常在菌由来の核酸に比べてはるかに微量である哺乳細胞等由来の核酸を、非常に効率よく回収することができ、このように回収された核酸を用いて核酸解析を行うことにより、大腸がん等の特定の疾患マーカーを非常に高感度かつ高精度に検出することがきる。
このように、本発明の糞便試料の調製方法、該調製方法により調製された糞便試料からの核酸回収方法、及び該核酸回収方法により回収された核酸を用いた核酸解析方法を用いることにより、糞便中の核酸を高感度かつ高精度に解析することができるため、大腸がんをはじめ、様々な症状や疾患の早期発見や診断、治療経過の観察、及び他の異常な容態の病理学的研究等に資することが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の採便用キットに用いることができる採便容器の一態様を示した図である。
【図２】本発明の採便用キットに用いることができる採便容器の一態様を示した図である。
【図３】実施例５において、各濃度のエタノール溶液を用いて調製された糞便試料から回収されたＲＮＡ量を示した図である。
【図４】実施例３において、得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した後、エチジウムブロマイドで染色して得られた染色像である。図中、「３Ａ」は糞便試料（３Ａ）由来のＰＣＲ産物を泳動したレーンを、「対照」は対照試料由来のＰＣＲ産物を泳動したレーンを、「Ｍ」及び「Ｍラダー」はマーカーを泳動したレーンを、それぞれ示している。また、矢印は、２３３ｂｐのバンドを示す。
【図５】実施例１において、各糞便試料から回収されたＲＮＡ量を示した図である。
【符号の説明】
【００１７】
１…容器本体、１ａ…隆起部、２…蓋、３…採便棒、３ａ…カップ、Ｓ…糞便試料調製用溶液、１１…容器本体、１２…蓋、１３…採便棒、１３ａ…穴、１３ｂ…可動蓋、１５…袋、Ｅ…糞便
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の糞便試料の調製方法は、糞便試料から核酸を効率よく回収するための糞便試料の調製方法であって、被験者から採取された糞便を、水溶性有機溶媒を有効成分とする溶液に混合させることを特徴とする。糞便を、水溶性有機溶媒に混合させることにより、糞便中に含まれる核酸の分解等による損失を最小限に抑えることができるため、糞便試料から核酸を効率よく回収することができる。水溶性有機溶媒によるこのような核酸高回収効果、すなわち、核酸の分解等を防止し、核酸を安定して保持し、高回収し得る効果は、水溶性有機溶媒成分が有する脱水作用により、哺乳細胞やウィルス等の検出対象である核酸を有する腸内常在菌以外の生物の細胞活性、及び腸内常在菌の細胞活性が顕著に低下して経時的な変化が抑制されるため、及び、水溶性有機溶媒成分が有するタンパク質変性作用により、糞便中のプロテアーゼ、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ等の各種分解酵素の活性が顕著に低下するために得られると推察される。【００１９】
本発明の糞便試料の調製方法において用いられる前記の溶液、すなわち、本発明の糞便試料調製用溶液は、水溶性有機溶媒を有効成分とするものである。糞便等の生体試料は、通常多量の水分を含有しており、水に対する溶解度が高い溶媒や水と任意の割合で混合可能である溶媒である水溶性有機溶媒を有効成分とすることにより、本発明の糞便試料調製用溶液は、糞便試料と速やかに混合することができ、より高い核酸高回収効果を得ることができるためである。
本発明において水溶性有機溶媒とは、アルコール類、ケトン類、又はアルデヒド類、又はこれらの組み合わせであるが、これらの溶媒はそれぞれ、直鎖構造を有し、室温付近、例えば１５〜４０℃において液状である溶媒を意味する。なお、本発明における水溶性有機溶媒には、有機酸は含まれない。直鎖構造を有する水溶性有機溶媒を有効成分とすることにより、ベンゼン環等の環状構造を有する有機溶媒を有効成分とするよりも、糞便との混合を素早く行うことができる。環状構造を有する有機溶媒は、一般的に水と分離しやすいため、糞便と混合しにくく、高い核酸高回収効果を得ることは難しい。たとえ水にある程度溶解する溶媒であったとしても、糞便を均一に分散させるためには、激しく混合したり、加温する必要があることが多いためである。なお、糞便と環状構造を有する有機溶媒を混合しやすくするために、あらかじめ、有機溶媒と水の混合溶液を作製した後、糞便と該混合溶液を混合させることも考えられる。しかしながら、該混合溶液を作製するためには、環状構造を有する有機溶媒と水を激しく混合したり、加温する必要があることが多く好ましくない。【００２０】
本発明の糞便試料調製用溶液においては、水に対する溶解度が１２重量％以上の水溶性有機溶媒であることが好ましく、水に対する溶解度が２０重量％以上の水溶性有機溶媒であることがより好ましく、水に対する溶解度が９０重量％以上の水溶性有機溶媒であることがさらに好ましく、水と任意の割合で混合可能である水溶性有機溶媒であることが特に好ましい。水と任意の割合で混合可能である水溶性有機溶媒として、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール、アセトン、ホルムアルデヒド等がある。【００２１】
本発明の糞便試料調製用溶液に含まれる水溶性有機溶媒は、上記定義を充足するものであって、核酸高回収効果を奏することができる溶媒であれば特に限定されるものではない。該水溶性有機溶媒として、例えば、アルコール類としては、水溶性アルコールであるメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、メルカプトエタノール等があり、ケトン類としては、アセトン、メチルエチルケトン（水に対する溶解度９０重量％）等があり、アルデヒド類としては、アセトアルデヒド(アセチルアルデヒド)、ホルムアルデヒド（ホルマリン）、グルタールアルデヒド、パラフォルムアルデヒド、グリオキサール（ｇｌｙｏｘａｌ）等がある。プロパノールは、ｎ−プロパノールであってもよく、２−プロパノールであってもよい。また、ブタノールは、１−ブタノール（水に対する溶解度２０重量％）であってもよく、２−ブタノール（水に対する溶解度１２．５重量％）であってもよい。本発明において用いられる水溶性有機溶媒としては、水溶性アルコール、アセトン、メチルエチルケトン、ホルムアルデヒドであることが好ましい。水に対する溶解度が十分に高いためである。入手容易性、取り扱い性、安全性等の点から、水溶性アルコールであることがより好ましく、エタノール、プロパノール、メタノールであることがさらに好ましい。特にエタノールは、最も安全性が高く、家庭内でも容易に扱うことが可能であるため、定期健診等のスクリーニング検査において特に有用である。
本発明の糞便試料調製用溶液中の水溶性有機溶媒濃度は、核酸高回収効果を奏することができる濃度であれば、特に限定されるものではなく、水溶性有機溶媒の種類等を考慮して、適宜決定することができる。例えば、有効成分として、水溶性アルコールやケトン類を用いる場合には、本発明の糞便試料調製用溶液の水溶性有機溶媒濃度は３０％以上、１００％以下であることが好ましい。水溶性有機溶媒濃度が充分に高濃度であることにより、糞便と糞便試料調製用溶液を混合した場合に、糞便中の哺乳細胞等や腸内常在菌に水溶性有機溶媒成分が迅速に浸透し、核酸高回収効果を速やかに奏することができる。
なお、本発明及び本願明細書中においては、特に記載がない限り、「％」は「体積％」を意味する。【００２２】
特に、有効成分として、水溶性アルコールを用いる場合には、本発明の糞便試料調製用溶液の水溶性有機溶媒濃度は３０％以上であることが好ましく、５０％以上であることがより好ましく、５０〜８０％であることがさらに好ましく、６０〜７０％であることが特に好ましい。水溶性有機溶媒濃度が高い程、水分含量の多い糞便に対しても少量の糞便試料調製用溶液を用いることによって、充分な核酸高回収効果を得ることができる。【００２３】
また、有効成分として、アセトン、メチルエチルケトンを用いる場合には、本発明の糞便試料調製用溶液の水溶性有機溶媒濃度は３０％以上、１００％以下であることが好ましく、この範囲の中では、６０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらに好ましい。その他、有効成分として、アセトアルデヒド、ホルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、パラフォルムアルデヒド、グリオキサールを用いる場合には、本発明の糞便試料調製用溶液の水溶性有機溶媒濃度は０．０１以上、３０％以下であることが好ましく、０．０３以上、１０％以下であることがより好ましく、３以上、５％以下であることがさらに好ましい。アルデヒド類は、アルコール類やケトン類よりも低濃度においても、核酸高回収効果を奏することができる。【００２４】
その他、本発明において用いられる水溶性有機溶媒は、１種類の水溶性有機溶媒のみを含有していてもよく、２種類以上の水溶性有機溶媒の混合溶液であってもよい。例えば、２種類以上のアルコールの混合溶液であってもよく、アルコールと他種類の水溶性有機溶媒との混合溶液であってもよい。核酸回収効率がより改善されるため、アルコールとアセトンの混合溶液であることも好ましい。【００２５】
採取された糞便と混合する糞便試料調製用溶液の容量は、特に限定されるものではないが、糞便と糞便試料調製用溶液の混合比率は、糞便容量１に対して糞便試料調製用溶液容量が１以上であることが好ましい。糞便試料調製用溶液入り採便容器に糞便を入れる場合に、糞便と等量以上の糞便試料調製用溶液であれば、糞便の全周囲が糞便試料調製用溶液に浸らせることができ、本発明の効果を得られるためである。例えば、糞便と糞便試料調製用溶液が等量である場合には、糞便試料調製用溶液入り採便容器の軽量化・小型化が可能となる。一方で、糞便に対して、５倍以上の容量の糞便試料調製用溶液を混合させることにより、糞便試料調製用溶液中への糞便の分散を迅速かつ効果的に行うことができ、さらに、糞便に含有されている水分による水溶性アルコール濃度の低下の影響を抑えることもできる。糞便試料調製用溶液入り採便容器の軽量化と糞便の分散性の向上の両方の効果をバランス良く備えることが可能となるため、糞便と糞便試料調製用溶液の混合比率が、１：１〜１：２０であることがより好ましく、１：３〜１：１０であることがさらに好ましく１：５程度であることがより好ましい。
採取された糞便と混合する糞便試料調製用溶液の容量は、特に限定されるものではないが、100ul〜100mlであることがより好ましく、1ml〜10mLがより好ましい。上記容量よりも溶液量が少ないと、便と溶液が効率よく混合されず、上記容量よりも多いと、採便容器が大きくなり、扱いにくくなってしまうためである。【００２６】
なお、本発明の糞便試料の調製方法に供される糞便は、動物（被験者）のものであれば特に限定されるものではないが、哺乳動物由来のものであることが好ましく、ヒト由来のものであることがより好ましい。例えば、定期健診や診断等のために採取されたヒトの糞便であることが好ましいが、家畜や野生動物等の糞便であってもよい。また、採取後一定期間保存されたものであってもよいが、採取直後のものであることが好ましい。さらに、採取された糞便は、排泄直後のものであることが好ましいが、排泄後時間を経たものであってもよい。【００２７】
本発明の糞便試料の調製方法に供される糞便の量は、特に限定されるものではないが、１０ｍｇ〜１ｇであることが好ましい。糞便量があまりに多くなってしまうと、採取作業に手間がかかり、採便容器も大きくなってしまうため、取り扱い性等が低下するおそれがある。逆に糞便量があまりに少量である場合には、糞便中に含まれる大腸剥離細胞等の哺乳細胞数が少なくなりすぎるため、必要な核酸量を回収できず、目的の核酸解析の精度が低下するおそれがある。また、糞便はヘテロジニアスである、つまり、多種多様な成分が不均一に存在しているため、哺乳細胞の局在の影響を避けるために、採糞時には、糞便の広範囲から採取することが好ましい。【００２８】
糞便試料調製用溶液は、水溶性有機溶媒を適宜希釈し、所望の濃度に調整することにより得ることができる。希釈に用いる溶媒は特に限定されるものではないが、水又はＰＢＳ等の緩衝液であることが好ましい。また、糞便試料調製用溶液は、水溶性有機溶媒成分による核酸高回収効果を損なわない限り、水溶性有機溶媒以外にも、任意の成分を含んでいてもよい。例えば、カオトロピック塩を含有していてもよく、界面活性剤を含有していても良い。カオトロピック塩や界面活性剤を含有することにより、糞便中の細胞活性や各種分解酵素の酵素活性をより効果的に阻害することができる。糞便試料調製用溶液に含有させ得るカオトロピック塩として、例えば、塩酸グアニジン、グアニジンイソチオシアネート、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、及びトリクロロ酢酸ナトリウム等がある。
糞便試料調製用溶液に含有させ得る界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤であることが好ましい。該非イオン性界面活性剤として、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ＣＨＡＰＳ（３−［３−コラミドプロピルジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホネート）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０等がある。カオトロピック塩や界面活性剤の種類や濃度は、核酸高回収効果が得られる濃度であれば、特に限定されるものではなく、糞便量やその後の核酸回収・解析方法等を考慮して、適宜決定することができる。【００２９】
その他、糞便試料調製用溶液には、適宜着色剤を添加してもよい。糞便試料調製用溶液を着色することにより、誤飲防止、糞便の色が緩和される等の効果が得られる。該着色剤として、食品添加物として使用される着色料であることが好ましく、青色や緑色等が好ましい。例えば、ファストグリーンＦＣＦ（緑色３号）、ブリリアントブルーＦＣＦ（青色１号）、インジゴカルミン（青色２号）等が挙げられる。また、複数の着色剤を混合して添加してもよく、単独で添加しても良い。【００３０】
糞便と糞便試料調製用溶液との混合は、速やかに行われることが好ましい。糞便を速やかに糞便試料調製用溶液中に分散させることにより、糞便中の細胞に対する水溶性有機溶媒成分の浸透を迅速に行うことができ、核酸高回収効果が速やかに得られるためである。なお、糞便と糞便試料調製用溶液を混合する方法は、物理的手法により混合する方法であれば、特に限定されるものではない。例えば、予め糞便試料調製用溶液を入れておいた密閉可能な容器に、採取された糞便を投入して密閉した後、該容器を上下に転倒させることにより、混合してもよく、該容器をボルテックス等の振とう機にかけることにより混合してもよい。また、糞便と糞便試料調製用溶液を、混合用粒子の存在下で混合してもよい。
速やかに混合させることができるため、振とう機を用いる方法や、混合用粒子を用いる方法であることが好ましい。特に、予め混合用粒子を含有させた採便容器を用いることにより、家庭等の特殊な装置のない環境においても迅速に混合することができる。【００３１】
混合用粒子としては、水溶性有機溶媒成分による核酸高回収効果を損なわない組成物であって、糞便にぶつかることにより、糞便を迅速に糞便試料調製用溶液中に分散させ得る硬度や比重を有する粒子であれば、特に限定されるものではなく、１種類の材質からなる粒子であってもよく、２種類以上の材質からなる粒子であってもよい。このような混合用粒子として、例えば、ガラス、セラミックス、プラスチック、ラテックス、金属等からなる粒子がある。その他、混合用粒子は、磁性粒子であってもよく、非磁性粒子であってもよい。【００３２】
特に、腸内常在菌以外の生物由来の核酸、すなわち、糞便試料中に大量に含まれている腸内常在菌由来の核酸よりも少量しか含まれていない核酸を標的核酸として解析する場合には、本発明の糞便試料調製用溶液を用いて糞便を調製することが好ましい。排泄後時間の経過とともに、糞便中の核酸は分解等により徐々に損なわれていく。このため、標的核酸が糞便中に少量しか存在していない核酸である場合には、核酸の分解が進行した糞便試料を用いて解析を行うと、解析に充分な量の標的核酸を回収することができず、排泄直後の糞便中には該標的核酸が存在していた場合であっても陰性（糞便中に該標的核酸は存在していない）と判断されるおそれが大きい。本発明の糞便試料調製用溶液を用いて糞便を調製することにより、糞便中の核酸を安定して保存し得る結果、糞便中に少量しか存在していない核酸であっても、効率よく回収することができ、核酸解析の信頼性を向上させることができる。【００３３】
このような腸内常在菌以外の生物由来の核酸として、例えば、がん細胞由来の核酸等の哺乳細胞由来の核酸や、肝炎ウィルス等の感染症の初期または後期における該感染症の原因菌由来の核酸等がある。その他、寄生虫由来の核酸であってもよい。【００３４】
なお、本発明において、腸内常在菌とは、糞便中に比較的大量に存在するバクテリア細胞であり、通常ヒト等の動物の腸内に生息する常在菌を意味する。該腸内常在菌として、例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属等の偏性嫌気性菌や、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属等の通性嫌気性菌等がある。【００３５】
また、このような水溶性有機溶媒成分による核酸高回収効果は、充分な水溶性有機溶媒量が存在する限り、特に温度条件に影響を受けるものではない。したがって、本発明の糞便試料の調製方法は、通常糞便の採取が行われる温度において行う場合、すなわち、室温において行う場合であっても、糞便中の核酸の損失を抑えることができる。また、調製された糞便試料は、室温で保存又は輸送した場合であっても、該糞便試料中の核酸を安定して保持することができる。但し、該糞便試料の保存は、５０℃以下で行うことが好ましい。高温条件下で長期間保存することにより、揮発等により、該糞便試料中の水溶性有機溶媒の濃度が、核酸高回収効果を奏するに充分な濃度よりも低下するおそれがあるためである。【００３６】
本発明の糞便試料の調製方法により調製された糞便試料、すなわち本発明の糞便試料は、水溶性有機溶媒の脱水作用やタンパク質変性作用により、糞便中の核酸、特に哺乳細胞等由来の糞便中に比較的少量しか存在していない核酸を、より安定して維持することができる。このため、糞便試料を本発明の調製方法により調製した場合には、調製直後の糞便試料のみならず、長期保存後又は輸送後の糞便試料を用いて核酸解析を行った場合であっても、信頼性の高い解析結果を得ることが期待できる。特に、糞便に含まれている大腸剥離細胞等の哺乳細胞の分子学的プロファイリングに対する経時的な変化を最小限に抑えつつ、糞便中の核酸、特に哺乳細胞由来の核酸を長期間室温で安定して保存することができるため、採取された糞便を本発明の調製方法を用いて調製することにより、検診等のスクリーニング検査のように、糞便採取後から核酸解析時まで間がある場合や、糞便採取場所が核酸解析場所から離れているような場合であっても、核酸、特に壊れやすいＲＮＡの分解を抑制しつつ、糞便試料を保存又は輸送することが可能である。また、冷蔵や冷凍のための特別な機器や保存温度条件を設定する必要がなく、簡便かつ低コストで糞便試料を保存又は輸送することができる。【００３７】
本発明の糞便試料は、核酸を含有するその他の生体試料と同様に、様々な核酸解析に供することができる。特に、早期発見の要請の強い、がんの発症や感染症の罹患の有無を調べるための核酸解析に供されることが好ましい。また、大腸炎、小腸炎、胃炎、膵炎等の炎症性疾患の発症の有無を調べるための核酸解析に供されることも好ましい。その他、ポリープ等の隆起性病変の検査や胃潰瘍等の大腸、小腸、胃、肝臓、胆嚢、胆管の疾患の検査に供されてもよい。【００３８】
例えば、糞便試料から、がん細胞由来の核酸、すなわち、変異等が起こっている核酸を検出し解析することにより、大腸がんや膵臓がん等のがんの発症の有無を検査することができる。また、糞便試料から、感染症等の原因である病原菌由来の核酸、例えばウィルス由来の核酸や寄生虫由来の核酸等が検出されるかどうかを調べることにより、感染症の罹患の有無や寄生虫の存在の有無を調べることができる。特に、Ａ型・Ｅ型肝炎ウィルス等の糞便中に排出される病原菌の検出に糞便試料を用いることにより、非侵襲的かつ簡便に感染症検査を行うことができる。その他、腸内常在菌以外の病原バクテリア、例えば腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７等の食中毒菌や病原菌由来の核酸が検出されるかどうかを調べることにより、細菌感染症の罹患の有無を調べることもできる。【００３９】
特に、核酸解析により、新生物性転化を示すマーカーや炎症性消化器疾患を示すマーカーを検出することが好ましい。該新生物性転化を示すマーカーとして、例えば、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、シアリルＴｎ抗原（ＳＴＮ）等の公知のがんマーカーや、ＡＰＣ遺伝子、ｐ５３遺伝子、Ｋ−ｒａｓ遺伝子等の変異の有無等がある。また、ｐ１６、ｈＭＬＨＩ、ＭＧＭＴ、ｐ１４、ＡＰＣ、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＥＳＲ１、ＳＦＲＰ２等の遺伝子のメチル化の検出も、大腸疾患の診断マーカーとして有用である（例えば、Lind et al.、「A CpG island hypermethylation profile of primary colorectal carcinomas andcolon cancer cell lines」、Molecular Cancer、２００４年、第３巻第２８章参照。）。その他、糞便試料中のヘリコバクターピロリ菌由来のＤＮＡが、胃がんマーカーとして用いられ得ることが既に報告されている（例えばNilsson et al.、Journal of ClinicalMicrobiology、２００４年、第４２巻第８号、第３７８１〜８ページ参照。）。一方、炎症性消化器疾患を示すマーカーとして、例えば、Ｃｏｘ−２遺伝子由来核酸等がある。【００４０】
本発明の調製方法により調製された糞便試料からは、核酸を非常に効率よく回収することができるため、糞便中に大量に存在する腸内常在菌由来の核酸のみならず、微量に存在する哺乳細胞由来の核酸の解析に非常に好適な試料である。特に糞便であることから、大腸、小腸、胃等の消化管細胞由来の核酸を解析することが好ましく、大腸剥離細胞由来の核酸を解析することが特に好ましい。【００４１】
糞便試料中には、多種多様な物質が存在しており、核酸解析において阻害要因となり得る物質も多数存在している。このため、糞便試料から核酸を回収し、回収された核酸を用いて核酸解析を行うことにより、解析の精度をより向上させることができる。糞便試料から核酸を回収する方法は、特に限定されるものではなく、試料から核酸を回収する場合に通常用いられる方法であれば、いずれの方法によっても行うことができる。本発明の糞便試料中には、主に哺乳細胞等の腸内常在菌以外の生物（以下、哺乳細胞等ということがある。）由来の核酸と、腸内常在菌由来の核酸が含まれている。糞便試料からの核酸回収においては、哺乳細胞等由来の核酸と腸内常在菌細胞由来の核酸を別々に回収してもよいが、同時に回収することが特に好ましい。哺乳細胞等由来の核酸と腸内常在菌由来の核酸を同時に回収することにより、糞便中に大量に存在する腸内常在菌由来の核酸がキャリアーとして機能する結果、少数である哺乳細胞等由来の核酸を、哺乳細胞等を予め糞便から単離した後に核酸を回収する場合よりも、より効率的に核酸を回収し得る。なお、糞便試料から回収する核酸は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ＤＮＡとＲＮＡの両方であってもよい。【００４２】
例えば、工程（ａ）として、本発明の糞便試料中のタンパク質を変性させ、前記糞便試料中の哺乳細胞等及び腸内常在菌から、核酸を溶出させた後、工程（ｂ）として、溶出させた核酸を回収することにより、本発明の糞便試料から哺乳細胞等由来の核酸と腸内常在菌由来の核酸を同時に回収することができる。【００４３】
工程（ａ）における糞便試料中のタンパク質の変性は、公知の手法で行うことができる。例えば、糞便試料にカオトロピック塩、有機溶媒、界面活性剤等の、通常タンパク質の変性剤として用いられている化合物を添加することにより、糞便試料中のタンパク質を変性させることができる。工程（ａ）において糞便試料に添加し得るカオトロピック塩や界面活性剤は、本発明の糞便試料調製用溶液に添加し得るカオトロピック塩及び界面活性剤として挙げたものと同様のものを用いることができる。有機溶媒としては、フェノールであることが好ましい。フェノールは中性であってもよく、酸性であってもよい。酸性のフェノールを用いた場合には、ＤＮＡよりもＲＮＡを選択的に水層に抽出することができる。なお、工程（ａ）において、糞便試料にカオトロピック塩、有機溶媒、界面活性剤等を添加する場合には、１種類の化合物を添加してもよく、２種類以上の化合物を添加してもよい。【００４４】
工程（ａ）の後工程（ｂ）の前に、工程（ｃ）として、工程（ａ）により変性させたタンパク質を除去してもよい。核酸を回収する前に、予め変性させたタンパク質を除去することにより、回収される核酸の品質を向上させることができる。工程（ｃ）におけるタンパク質の除去は、公知の手法で行うことができる。例えば、遠心分離により、変性タンパク質を沈殿させて上清のみを回収することにより、変性タンパク質を除去することができる。また、クロロホルムを添加し、ボルテックス等により充分に攪拌混合させた後に遠心分離を行い、変性タンパク質を沈殿させて上清のみを回収することにより、単に遠心分離を行う場合よりも、より完全に変性タンパク質を除去することができる。【００４５】
工程（ｂ）における溶出させた核酸の回収は、エタノール沈殿法や塩化セシウム超遠心法等の公知の手法で行うことができる。また、工程（ｂ１）として、工程（ａ）において溶出させた核酸を無機支持体に吸着させた後、工程（ｂ２）として、工程（ｂ１）において吸着させた核酸を無機支持体から溶出させることにより、核酸を回収することができる。工程（ｂ１）において核酸を吸着させる無機支持体は、核酸を吸着することができる公知の無機支持体を用いることができる。また、該無機支持体の形状も特に限定されるものではなく、粒子状であってもよく、膜状であってもよい。該無機支持体として、例えば、シリカゲル、シリカ質オキシド、ガラス、珪藻土等のシリカ含有粒子（ビーズ）や、ナイロン、ポリカーボネート、ポリアクリレート、ニトロセルロース等の多孔質膜等がある。
工程（ｂ２）において吸着させた核酸を無機支持体から溶出させる溶媒は、回収する核酸の種類やその後の核酸解析方法等を考慮して、これらの公知の無機支持体から核酸を溶出するために通常用いられている溶媒を適宜用いることができる。該溶出用溶媒として、特に精製水であることが好ましい。なお、工程（ｂ１）の後、工程（ｂ２）の前に、核酸を吸着させた無機支持体を適当な洗浄バッファーを用いて洗浄することが好ましい。【００４６】
なお、糞便試料が、哺乳細胞等から核酸を溶出するために充分な濃度のカオトロピック塩や界面活性剤を含む糞便試料調製用溶液を用いて調製されている場合には、該糞便試料からの核酸の回収において、工程（ａ）を省略することもできる。【００４７】
糞便試料が、哺乳細胞等から核酸を溶出するために充分な濃度のカオトロピック塩や界面活性剤を含まない糞便試料調製用溶液を用いて調製されている場合には、工程（ａ）の前に、工程（ｄ）として、糞便試料から固形成分を回収することが好ましい。糞便試料は、糞便と糞便試料調製用溶液を迅速に混合させるために、糞便中の固形成分に対する液体成分の比率が大きい。そこで、糞便試料から糞便試料調製用溶液を除去し、哺乳細胞等や腸内常在菌を含む固形成分のみを回収することにより、核酸の回収及び解析におけるスケールを小さくすることができる。また、固形成分から水溶性有機溶媒を除去することにより、該固形成分から核酸を回収する工程における水溶性有機溶媒の影響を抑えることもできる。例えば、本発明の糞便試料を遠心分離することにより、固形成分を沈殿させ、上清を除去することにより、固形成分のみを回収することができる。その他、フィルター濾過等によっても、固形成分のみを回収することができる。さらに、回収された固形成分をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等の適当なバッファーを用いて洗浄することも好ましい。【００４８】
なお、回収された固形成分に、カオトロピック塩等のタンパク質変性剤を直接添加してもよいが、一度適当な溶出用薬剤に懸濁させた後にタンパク質変性剤を添加することが好ましい。ＤＮＡを回収する場合には、該溶出用薬剤として、例えば、リン酸バッファーやトリスバッファー等を用いることができる。高圧蒸気滅菌等により、ＤＮａｓｅを失活させた薬剤であることが好ましく、さらにプロテイナーゼＫ等のタンパク質分解酵素を含有させた薬剤であることがより好ましい。一方、ＲＮＡを回収する場合には、該溶出用薬剤として、例えば、クエン酸バッファー等を用いることができるが、ＲＮＡは非常に分解され易い物質であるため、チオシアン酸グアニジンや塩酸グアニジン等のＲＮａｓｅ阻害剤を含有したバッファーを用いることが好ましい。【００４９】
その後の解析方法によっては、糞便試料から核酸を回収しなくてもよい。具体的には、糞便試料中の哺乳細胞等や腸内常在菌から核酸を溶出させた後、そのまま核酸解析に用いることができる。例えば、糞便試料中に病原菌等が大量に存在している場合であって、該病原菌由来の核酸を解析する場合には、糞便試料から固形成分のみを回収した後、プロテイナーゼＫ等のタンパク質分解酵素を含有するＰＢＳ等の溶出用薬剤を添加して混合することにより得た均一な糞便試料溶液を、そのまま核酸解析に用いることにより、病原菌由来の遺伝子等を検出することができる。その他、糞便試料からの核酸の回収は、核酸抽出キットやウィルス検出キット等の市販のキットを用いて行うこともできる。【００５０】
本発明の糞便試料より回収された核酸は、公知の核酸解析方法を用いて解析することができる。該核酸解析方法として、例えば、核酸を定量する方法や、ＰＣＲ等を用いて特定の塩基配列領域を検出する方法等がある。その他、ＲＮＡを回収した場合には、逆転写反応（ＲＴ−ＰＣＲ：Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）によりｃＤＮＡを合成した後、該ｃＤＮＡを用いて、ＤＮＡと同様にして解析に用いることができる。例えば、がん遺伝子等がコードされている塩基配列領域や、マイクロサテライトを含む塩基配列領域等の遺伝的変異の有無を検出することにより、がんの発症の有無を調べることができる。糞便試料から回収されたＤＮＡを用いた場合には、例えば、ＤＮＡ上の変異解析やエピジェネティック変化解析を行うことができる。変異解析としては、例えば、塩基の挿入、欠失、置換、重複、又は逆位の解析等が挙げられる。また、エピジェネティック変化解析としては、例えば、メチル化や脱メチル化の解析等が挙げられる。一方、回収されたＲＮＡを用いた場合には、例えば、ＲＮＡ上の塩基の挿入、欠失、置換、重複、逆位、又はスプライシングバリアント（アイソフォーム）等の変異を検出することができる。その他、機能性ＲＮＡ（ノンコーディングＲＮＡ）解析、例えば、転移ＲＮＡ（ｔｒａｎｓｆｅｒ ＲＮＡ、ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ、ｒＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）等の解析を行うことができる。また、ＲＮＡ発現量を検出し解析することもできる。特に、ｍＲＮＡの発現解析、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の変異解析、及びＤＮＡのメチル化の解析等を行うことが好ましい。なお、これらの解析は、当該分野において公知の方法により行うことができる。また、Ｋ−ｒａｓ遺伝子変異解析キット、メチル化検出キット等の市販の解析キットを用いてもよい。【００５１】
予め本発明の糞便試料調製用溶液を含有させた採便容器に糞便を採取することにより、より簡便かつ迅速に採取された糞便を調製することができる。また、本発明の糞便試料調製用溶液と、該糞便試料調製用溶液を含有する採便容器と、を有する採便用キットを用いることにより、より簡便に本発明の効果を発揮することができる。なお、該採便用キットには、採便棒等の、該糞便試料調製用溶液及びそれを含有する採便容器以外の構成物を適宜有していてもよい。【００５２】
このような採便容器の形態や大きさ等は特に限定されるものではなく、溶媒を含有し得る公知の採便容器を用いることができる。取り扱いが簡便であるため、採便容器の蓋と採便棒が一体化している採便容器であることが好ましい。また、採便量をコントロールすることができるため、採便棒が一定量の糞便を採取し得るものであることがより好ましい。
このような公知の採便容器として、例えば、特許文献７に開示されている採便容器等がある。【００５３】
図１及び図２は、本発明の採便用キットに用いることができる採便容器の一態様をそれぞれ示した図である。なお、本発明の採便用キットに用いることができる採便容器は、これらの採便容器に限定されるものではない。【００５４】
まず図１の採便容器について説明する。採便棒３と一体化した蓋２と、容器本体１を有し、内部に本発明の糞便試料調製用溶液Ｓを含有する採便容器である。採便棒３の先端には糞便を一定量採取し得るカップ３ａがあり、かつカップ３ａには篩目がある。一方、容器本体１の底部には、カップ３ａと補足的な形状となる隆起部１ａがある。カップ３ａを隆起部１ａに勘合させることにより、カップ３ａに採取された糞便は、カップ３ａにある篩目からところてんのように押し出されるため、糞便試料調製用溶液Ｓに糞便を速やかに分散させることができる。【００５５】
図２記載の採便容器は、先端が尖っている採便棒１３と一体化した蓋１２と、容器本体１１を有し、容器本体１１内部に、本発明の糞便試料調製用溶液Ｓを含有する密封された袋１５を有する採便容器である。採便棒１３には、糞便Ｅを一定量採取し得る穴１３ａが空いている。また、採便棒１３上をスライドすることにより穴１３ａの蓋となり得る可動蓋１３ｂも付いている。図２ａのように、まず、採便棒１３を、可動蓋１３ｂを穴１３ａよりも蓋１２側に寄せて、穴１３ａが完全に開口している状態とした後に、糞便Ｅに押し付ける。すると図２ｂに示すように、穴１３ａに糞便Ｅが充填される。この状態で、可動蓋１３ｂをスライドさせて穴１３ａに蓋をすることにより、穴１３ａの容量の糞便を正確に採取することができる（図２ｃ）。その後、可動蓋１３ｂを元の位置に戻して穴１３ａが完全に開口している状態とした後に（図２ｄ）、蓋１２を容器本体１１に収納する（図２ｅ）。採便棒１３が容器本体１１に収納される際に、採便棒１３の尖った先端が糞便試料調製用溶液Ｓを含有する袋１５を破ることにより、糞便試料調製用溶液Ｓと糞便Ｅが混合される。このような採便容器は、採便棒を容器に入れて始めて溶液が容器中に満たされるため、メタノールのような人体に有害な糞便試料調製用溶液を用いる場合であっても、溶液漏れによる事故を回避することができ、家庭でも安全に取り扱うことが出来る。【００５６】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、特に記載が無い場合には、「％」は「体積％」を意味する。また、培養細胞であるＣａｃｏ−２細胞、ＳＷ６２０細胞、及びＭＫＮ４５細胞、並びにバクテリア細胞であるＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓは、常法により培養した。
【実施例１】
【００５７】
健常人１名より採取された糞便を、３本の１５ｍＬのポリプロピレンチューブにそれぞれ１ｇずつ分取した。このうち１本に対して、分取直後、速やかに液体窒素を用いて凍結処理を行い、糞便試料（１Ａ）とした。他の１本に対して、分取後、１０ｍＬの７０％エタノール溶液を加えて糞便をよく分散させた後、室温で１時間静置し、糞便試料（１Ｂ）とした。残りの１本は、分取後、溶液等を添加せずに速やかに抽出工程に移行させ、これを糞便試料（１Ｃ）とした。
その後、各糞便試料からＲＮＡを回収した。具体的には、各糞便試料に、３ｍＬのフェノール混合物「Ｔｒｉｚｏｌ」（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を添加し、３０秒以上ボモジナイザーで十分に混合した後、３ｍＬのクロロホルムを添加し、ボルテックスを用いて十分に混合した後、１２，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離処理を行った。該遠心分離処理により得た上清（水層）を、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｄｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）のＲＮＡ回収用カラムに通し、添付のプロトコールに従って該ＲＮＡ回収用カラムの洗浄操作及びＲＮＡ溶出操作を行うことにより、ＲＮＡを回収した。ナノドロップ（ナノドロップ社製）を用いて、回収したＲＮＡの定量を行った。【００５８】
図５は、各糞便試料から回収されたＲＮＡ量を示した図である。本発明の糞便試料調製用溶液であるエタノール溶液を用いて調製された糞便試料（１Ｂ）からは、採取直後に凍結処理を行った糞便試料（１Ａ）から回収されたＲＮＡ量には若干及ばないものの、採取直後速やかに核酸抽出を行った糞便試料（１Ｃ）に比べて、非常に多くのＲＮＡを回収することができた。これらの結果から、本発明の糞便試料調製用溶液を用いて調製することにより、室温での調製であっても、非常に効率よく核酸を回収し得る糞便試料が得られることが明らかである。検診等の場合のように、患者が自宅で採便する場合には、糞便試料の調製を室温付近で行えることが望まれるが、本発明の糞便試料調製用溶液は、このような要請に充分に応えることが可能である。
【実施例２】
【００５９】
健常人の糞便０．５ｇに対し、ＭＤＲ１（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  １）遺伝子を高発現しているヒト大腸がん由来培養細胞Ｃａｃｏ−２細胞を５．０×１０５ｃｅｌｌｓ混合させたものを、大腸がん患者擬似糞便とし、該糞便を本発明の糞便試料の調製方法により糞便試料を調製した。
具体的には、該大腸がん患者擬似糞便を、１５ｍＬのポリプロピレンチューブに０．５ｇずつ分取し、表１記載の糞便試料調製用溶液をそれぞれ添加して混合して、糞便試料を調製した。なお、表中、「普遍的収集培地」とは、特許文献４に記載の保存培地（５００ｍＬのＰａｃｋ食塩水Ｇ、４００ｍｇの重炭酸ナトリウム、１０ｇのＢＳＡ、５００ｕｎｉｔｓ／Ｌのｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  Ｇ、５００ｍｇ／Ｌの硫酸ストレプトマイシン、１．２５ｍｇ／Ｌのａｍｐｈｏｒｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂ、５０ｍｇ／Ｌのｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）である。調製した糞便試料を、室温（２５℃）の恒温インキュベータにおいて、１、３、７、１０日間、それぞれ保存した。【００６０】
【表１】
0005566111.tif 000002
【００６１】
保存後、各糞便試料からＲＮＡを回収し、回収されたＲＮＡに対して、ＭＤＲ１遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの検出を試みた。糞便試料調製用溶液（２Ｃ）を用いて調製した糞便試料（以下、糞便試料（２Ｃ）という。）に対しては、まず、Ｃａｃｏ−２細胞を含む哺乳細胞を分離した後、ＲＮＡの回収を行った。糞便試料調製用溶液（２Ｃ）以外の糞便試料調製用溶液を用いて調製した糞便試料に対しては、哺乳細胞を分離せず、哺乳細胞由来の核酸とバクテリア由来の核酸を同時に回収した。糞便試料（２Ｃ）からの哺乳細胞の分離は、具体的には、糞便試料（２Ｃ）に５ｍＬのヒストパック１０７７溶液（Ｓｉｇｍａ社製）を添加して混合した後、２００×ｇ、３０分間室温で遠心分離処理を行い、懸濁液とヒストパック１０７７溶液の間の界面を回収することにより行った。分離した哺乳細胞は、ＰＢＳで３回洗浄した。
糞便試料からのＲＮＡの回収は、具体的には、次のようにして行った。まず、糞便試料（糞便試料（２Ｃ）のみ分離した哺乳細胞）に、３ｍＬのフェノール混合物「Ｔｒｉｚｏｌ」（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を添加し、３０秒以上ボモジナイザーで十分に混合した後、３ｍＬのクロロホルムを添加し、１２，０００×ｇで１０分間遠心分離処理を行った。該遠心分離処理により得た上清（水層）を新しいポリプロピレンチューブに回収した。その後、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｄｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、回収された上清からＲＮＡを回収した。【００６２】
回収されたＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行い、得られたｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行った。プライマーとして、配列番号１の塩基配列を有するＭＤＲ１遺伝子増幅用のフォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列を有するＭＤＲ１遺伝子増幅用のリバースプライマーを用いた。
具体的には、０．２ｍＬのＰＣＲチューブに、１２μＬの超純水と２μＬの１０×バッファーを添加し、さらにｃＤＮＡ、該フォワードプライマー、該リバースプライマー、塩化マグネシウム、ｄＮＴＰ、及びＤＮＡポリメラーゼをそれぞれ１μＬずつ添加して混合し、ＰＣＲ反応溶液を調製した。該ＰＣＲチューブを、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間を３０サイクル、からなる反応条件によりＰＣＲを行った。この結果、得られたＰＣＲ産物を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ１０００  ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）キット（アジレント社製）を用いて泳動し、得られたバンドの強度を測定し、ＰＣＲ産物の増幅程度を調べた。【００６３】
【表２】
0005566111.tif 000003
【００６４】
表２は、各糞便試料由来のＰＣＲ産物の増幅程度を、保存期間ごとにまとめた表である。なお、表中「糞便試料（２Ａ）」は、糞便試料調製用溶液（２Ａ）を用いて調製した糞便試料を、「糞便試料（２Ｂ）」は、糞便試料調製用溶液（２Ｂ）を用いて調製した糞便試料を、「糞便試料（２Ｄ）」は、糞便試料調製用溶液（２Ｄ）を用いて調製した糞便試料を、それぞれ意味する。
この結果、糞便試料（２Ｄ）では、保存期間が１日の場合にはＰＣＲ産物の増幅が確認されたが、保存期間３日以降は、増幅が確認できなかった。これに対して、本発明の糞便試料調製用溶液である糞便試料調製用溶液（２Ａ）や糞便試料調製用溶液（２Ｂ）を用いて調製された糞便試料（２Ａ）及び（２Ｂ）では、保存期間１０日においてもＰＣＲ産物の増幅を確認することができた。一方で、特許文献４記載の糞便試料調製用溶液（２Ｃ）を用いて調製された糞便試料（２Ｃ）では、保存期間１日であってもＰＣＲ産物の増幅は確認することができなかった。
以上の結果から、本発明の調製方法により調製された糞便試料からは、糞便中に含まれている核酸を効率よく回収することができることが明らかである。また、本発明の糞便試料を用いることにより、ＲＮＡ解析の精度を向上し得ることも明らかである。これは、本発明の糞便試料用溶液を用いることにより、糞便中に含まれる哺乳細胞由来の核酸、特に分解され易いＲＮＡでさえも、室温で長期間保存可能なほど安定して保持し得るためと推察される。
一方で、糞便試料（２Ｃ）由来のＰＣＲ産物では増幅が確認されなかったことから、糞便試料調製用溶液として抗生物質を含有する溶液を用いた場合には、該抗生物質により糞便中のバクテリア細胞は殺菌されるものの、死滅したバクテリア細胞からＲＮａｓｅ等が放出される等により、却ってＲＮＡ分解が促進される可能性が示唆される。また、糞便に含まれる哺乳細胞数は少ないため、糞便から哺乳細胞を分離した場合には、バクテリア細胞由来の核酸がキャリアーとして機能し得る本発明の核酸の回収方法と比較して、充分量の核酸を回収することが困難である可能性も示唆される。
【実施例３】
【００６５】
健常人の糞便０．１ｇに対し、Ｃｌａｕｄｉｎ−１遺伝子を高発現しているヒト大腸がん由来培養細胞ＳＷ６２０細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ混合させたものを、大腸がん患者擬似糞便とし、該糞便を本発明の糞便試料の調製方法により糞便試料を調製した。
具体的には、糞便試料調製用溶液である１ｍＬの９０％エタノール溶液を予め分注した１５ｍＬのポリプロピレンチューブに、０．１ｇの該大腸がん患者擬似糞便を分取して、ボルテックスを用いて混合することにより、糞便試料（３Ａ）を調製した。該大腸がん患者擬似糞便に代えて、１．０×１０５ｃｅｌｌｓのＳＷ６２０細胞のみを用いて調製したものを対照試料とした。調製した糞便試料（３Ａ）と対照試料を、それぞれ室温（２５℃）で１日静置して保存した後、各試料からＲＮＡを回収し、回収されたＲＮＡに対して、Ｃｌａｕｄｉｎ−１遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの検出を試みた。【００６６】
各試料からのＲＮＡの回収は、具体的には、次のようにして行った。まず、糞便試料（３Ａ）と対照試料のそれぞれに、２ｍＬのフェノール混合物「ＩＳＯＧＥＮ」（ニッポンジーン社製）を添加し、３０秒以上ボモジナイザーで十分に混合した後、３ｍＬのクロロホルムを添加し、ボルテックスを用いて十分に混合した後、１２，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離処理を行った。該遠心分離処理により得た上清（水層）を、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｄｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）のＲＮＡ回収用カラムに通し、添付のプロトコールに従って該ＲＮＡ回収用カラムの洗浄操作及びＲＮＡ溶出操作を行うことにより、ＲＮＡを回収した。
なお、上記プロトコールでは、１ｍＬの９０％エタノール溶液と２ｍＬのＩＳＯＧＥＮを混合させて、クロロホルムによる疎水相と水相に分けた場合に、水相にエタノールが一部移行するため、得られた水層をそのままカラムに通すことによりＲＮＡの回収を行うことができた。通常のプロトコールでは、試料をＩＳＯＧＥＮで溶解しクロロホルムと混合して、水相を分離した後、得られた水層にさらに等量の７０％エタノールを混合したものをカラムに通す。つまり、本実施例では、通常プロトコールよりも簡便なプロトコールとなった。【００６７】
回収されたＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行い、得られたｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行った。プライマーとして、配列番号３の塩基配列を有するＣｌａｕｄｉｎ−１遺伝子増幅用のフォワードプライマーと、配列番号４の塩基配列を有するＣｌａｕｄｉｎ−１遺伝子増幅用のリバースプライマーを用いた。該フォワードプライマーと該リバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、２３３ｂｐのＰＣＲ産物を得ることができる。
具体的には、０．２ｍＬのＰＣＲチューブに、１２μＬの超純水と２μＬの１０×バッファーを添加し、さらにｃＤＮＡ、該フォワードプライマー、該リバースプライマー、塩化マグネシウム、ｄＮＴＰ、及びＤＮＡポリメラーゼをそれぞれ１μＬずつ添加して混合し、ＰＣＲ反応溶液を調製した。該ＰＣＲチューブを、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間を３２サイクル、からなる反応条件によりＰＣＲを行った。図４は、得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動した後、エチジウムブロマイドで染色して得られた染色像である。図中、「３Ａ」は糞便試料（３Ａ）由来のＰＣＲ産物を泳動したレーンを、「対照」は対照試料由来のＰＣＲ産物を泳動したレーンを、「Ｍ」及び「Ｍラダー」はマーカーを泳動したレーンを、それぞれ示している。また、矢印は、２３３ｂｐのバンドを示す。【００６８】
糞便試料（３Ａ）と対照試料は、いずれも等量のＳＷ６２０細胞を有していたにも関わらず、図４より明らかであるように、糞便試料（３Ａ）由来のＰＣＲ産物では、２３３ｂｐの増幅産物が検出されたが、対照試料由来のＰＣＲ産物では検出されなかった。糞便試料（３Ａ）では、大腸剥離細胞と仮定するＳＷ６２０細胞由来の核酸と糞便中のバクテリア細胞由来の核酸を同時に回収することにより、バクテリア細胞由来の核酸がキャリアーとして機能し、ＳＷ６２０細胞由来の核酸が効率よく回収できたと考えられる。一方、ＳＷ６２０細胞のみでは細胞数が少数のため、対照試料では、核酸解析を行うために充分量のＲＮＡを回収することができなかったと考えられる。
以上の結果から、糞便試料中の哺乳細胞由来の核酸とバクテリア細胞由来の核酸を同時に回収する本発明の核酸回収方法により、糞便試料から効率よく哺乳細胞由来の核酸を回収し得ることが明らかである。
【実施例４】
【００６９】
（参考例）
１ｍＬのＰＢＳに対し、通性嫌気性細菌Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓを１．０×１０６ｃｅｌｌｓと、ＭＫＮ４５細胞を０．５×１０６ｃｅｌｌｓとを混合させたものを擬似糞便とし、該擬似糞便を本発明の糞便試料の調製方法により糞便試料を調製した。なお、グラム陰性桿菌であるＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓは、ヒトの腸内に通常存在する腸管常在菌であり、通常は無害である。
具体的には、糞便試料調製用溶液である５ｍＬの５０％メタノール溶液を予め分注した１５ｍＬのポリプロピレンチューブに、１ｍＬの該擬似糞便を分取して、ボルテックスを用いて混合することにより、糞便試料（４Ａ）を調製した。該擬似糞便に代えて、１ｍＬのＰＢＳにＭＫＮ４５細胞を０．５×１０６ｃｅｌｌｓのみを混合させたＭＫＮ４５細胞ＰＢＳ溶液を用いて調製したものを対照試料とした。調製した糞便試料（４Ａ）と対照試料を、それぞれ室温で３日間保存した後、各試料からＤＮＡを回収し、回収されたＤＮＡに対して、ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の検出を試みた。
【００７０】
各試料からのＤＮＡの回収は、具体的には、次のようにして行った。まず、各試料を１，０００×ｇで５分間遠心分離処理し、上清を除去し、沈殿（固形成分）を回収した。その後回収された沈殿から、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてＤＮＡを回収した。
回収したＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行った。プライマーとして、配列番号５の塩基配列を有するヒトＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子増幅用のフォワードプライマーと、配列番号６の塩基配列を有するヒトＧＡＰＤＨ遺伝子増幅用のリバースプライマーを用いた。
具体的には、まず、回収したＤＮＡを９６ウェルマイクロプレートに２μＬずつそれぞれ分取した（ｎ＝３）。その後、各ウェルに６μＬの超純水と１０μＬの核酸増幅試薬「Ｇｅｎｅａｍｐ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ」（Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加し、さらに、該フォワードプライマー、該リバースプライマー、ＣＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ試薬（インビトロジェン社製）の５００倍希釈液をそれぞれ１μＬずつ添加して混合し、ＰＣＲ反応溶液を調製した。該９６ウェルマイクロプレートを、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間を３２サイクル、からなる反応条件により、経時的に蛍光強度を計測しながらＰＣＲを行った。濃度既知のラムダファージＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行ったものを、ポジティブコントロールとした。蛍光強度の計測結果を分析して、各試料から回収されたＤＮＡ中のＧＡＰＤＨ遺伝子量の平均値を算出した。この結果、糞便試料（４Ａ）から回収されたＤＮＡ中のＧＡＰＤＨ遺伝子量は、平均値が約１６０μｇ／μＬであったのに対して、対照試料から回収されたＤＮＡ中のＧＡＰＤＨ遺伝子量は、平均値が約３０μｇ／μＬであった。
以上の結果から、本発明の糞便試料の調製方法、及び、本発明の核酸回収方法により、哺乳細胞由来の核酸を効率よく回収し得ることが明らかである。
【実施例５】
【００７１】
超純水を用いて希釈することにより、０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％のエタノール溶液をそれぞれ調製した。これらのエタノール溶液を、各５ｍＬずつ１５ｍＬのポリプロピレンチューブにそれぞれ分注した。
これらのチューブに、健常人より採取した糞便０．５ｇをそれぞれ分取した後、３７℃で４８時間静置した。その後、各チューブを遠心分離処理し、上清を除去して得られた固形成分に、３ｍＬのフェノール混合物「Ｔｒｉｚｏｌ」（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を添加し、３０秒以上ボモジナイザーで十分に混合した後、３ｍＬのクロロホルムを添加し、１２，０００×ｇで１０分間遠心分離処理を行った。該遠心分離処理により得た上清（水層）を新しいポリプロピレンチューブに回収した。その後、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｄｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、回収された上清からＲＮＡを回収した。【００７２】
図３は、各濃度のエタノール溶液を用いて調製された糞便試料から回収されたＲＮＡ量を示した図である。この結果、糞便試料調製用溶液の有効成分としてエタノール等のアルコールを用いる場合には、アルコール濃度は３０％以上であることが好ましく、５０％以上であることがより好ましく、５０〜８０％であることがさらに好ましく、６０〜７０％であることが特に好ましいことが明らかである。
【実施例６】
【００７３】
（参考例）
健常人５名から採取した糞便をよく混合し、０．２ｇずつ２本の１５ｍＬのポリプロピレンチューブにそれぞれ分取した。このうち１本に対して、１ｍＬの１８％イソプロパノール含有３２％変性エタノール溶液（ｔｏｔａｌアルコール溶液として５０％）を加えてよく混合した後、２５℃で１日静置した。該糞便試料を糞便試料（６Ａ）とした。残りの１本は対照試料とし、分取後速やかに−８０℃ディープフリーザーに回収した。
両糞便試料から、糞便からのＤＮＡ抽出キット「ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ」（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてＤＡＮを回収した。回収されたＤＮＡの濃度を吸光度法により定量した結果、両糞便試料から、ほぼ同等量のＤＮＡを回収することができた。
回収されたＤＮＡを１００ｎｇ用いて、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の変異解析キット「Ｋ−ｒａｓコドン１２変異検出試薬」（湧永製薬社製）を用いて、付属のプロトコールに従い変異解析を行った。その結果、糞便試料（６Ａ）から回収されたＤＮＡの解析結果は、対照試料から回収されたＤＮＡを用いた場合と同様に、６種類の変異遺伝子は全て陰性となった。
以上の結果から、本発明の糞便試料の調製方法、及び、本発明の核酸回収方法により回収された核酸を用いることにより、遺伝子変異等の高い正確性を要求される核酸解析であっても精度よく行えることが明らかである。また今回はイソプロパノールとエタノールを混合した変性エタノールを処理溶液として使用したが、アルコール濃度としては同じである、５０％エタノール溶液を使用しても同等の結果が得られた。
【実施例７】
【００７４】
（参考例）
健常人の糞便０．５ｇに対し、ｐ１６遺伝子のプロモーター領域にメチル化部位を持つヒト結腸がん由来株化細胞ＳＷ４８０細胞を５．０×１０５ｃｅｌｌｓ混合させたものを、大腸がん患者擬似糞便とし、該糞便を本発明の糞便試料の調製方法により糞便試料を調製した。
具体的には、糞便試料調製用溶液である５ｍＬの７０％エタノール溶液を予め分注した１５ｍＬのポリプロピレンチューブに、０．５ｇの該大腸がん患者擬似糞便を分取して、ボルテックスを用いて混合することにより、糞便試料（７Ａ）を調製した。また、該擬似糞便に代えて、健常人の糞便０．５ｇを、５ｍＬの７０％エタノール溶液を予め分注した１５ｍＬのポリプロピレンチューブに分取して混合したものを対照試料とした。各試料からＤＮＡを回収し、回収されたＤＮＡに対して、ｐ１６遺伝子のプロモーター領域におけるメチル化の検出を試みた。
【００７５】
各試料からのＤＮＡの回収は、具体的には、次のようにして行った。まず、各試料を１，０００×ｇで５分間遠心分離処理し、上清を除去し、沈殿（固形成分）を回収した。その後回収された沈殿から、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてＤＡＮを回収した。回収したＤＮＡをＤＮＡメチル化検出キットであるＣｐＧｅｎｏｍｅ  Ｆａｓｔ  ＤＮＡ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）を用いて、ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅ（重亜硫酸塩）処理を行い、引き続きＣｐＧＷｉｚｐ１６  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）を用いて増幅を行い、増幅の有無をアガロースゲル電気泳動により確認した。各プロトコールは上記製品の標準プロトコールに従った。
その結果、対照試料からは検出されなかったが、糞便試料（７Ａ）からはメチル化を検出することができた。
【実施例８】
【００７６】
図１に示すような採便容器を用いて、糞便試料を調製し、核酸を回収した。該採便容器は、採便棒３と一体化した蓋２と、容器本体１を有し、内部に５ｍＬの７０％１−イソプロパノール溶液を含有する採便容器であり、採便棒３の先端には、直径３ｍｍの穴を４個有する０．５ｍＬ容量のカップ３ａがあるものである。
まず、採便棒３を用いてカップ３ａ’に約０．５ｇの糞便を採取し、該採便容器に入れて蓋２をした。すると、容器本体１の底の隆起部１ａがカップ３ａ中の糞便を押し出して、カップ３ａにある穴からところてんのように糞便が押し出され、溶液中に分散した。このようにして調製された糞便試料を糞便試料（８Ａ）とした。
一方、糞便試料（８Ａ）と同様に糞便と糞便試料調製用溶液の容量比が１：１０となるように、５ｍＬの７０％１−イソプロパノール溶液を含有する１５ｍＬのポリプロピレンチューブに約０．５ｇの糞便を採取して静置したものを、対照試料とした。
糞便試料（８Ａ）と対照試料を室温で一週間保存した後、実施例５と同様にしてＲＮＡを回収した。この結果、糞便試料（８Ａ）からは約２１０μｇのＲＮＡを、対照試料からは約１５０μｇのＲＮＡを、それぞれ回収することができた。図１に示すような採便容器を用いることにより、速やかに糞便試料調製用溶液中に糞便を分散させることができたため、より効率よく核酸を回収することができたと推察される。
【実施例９】
【００７７】
図２に示すような採便容器を用いて、糞便試料を調製し、核酸を回収した。該採便容器は、先端が尖っており、０．５ｍＬ容量の穴１３ａを有する採便棒１３と一体化した蓋１２と、容器本体１１を有し、容器本体１１内部に、５９％メタノール溶液を含有する密封された袋１５を有する採便容器である。
まず、袋１５内に５ｍＬの５９％メタノール溶液を含有している採便容器を用いて、図２の手順に従って約０．５ｇの糞便を採取し、５９％メタノール溶液と混合させることにより糞便試料（９Ａ）を調製した。一方、袋１５内に０．５ｍＬの５９％メタノール溶液を含有している採便容器を用いた以外は糞便試料（９Ａ）と同様にして、糞便試料（９Ｂ）を調製した。
糞便試料（９Ａ）と糞便試料（９Ｂ）から、実施例５と同様にしてＲＮＡを回収した。この結果、回収されたＲＮＡは、糞便試料（９Ａ）からは約１２０μｇ、糞便試料（９Ｂ）からは約８０μｇであり、いずれも従来法に比較して充分量のＲＮＡを回収することができた。糞便試料（９Ａ）の結果から、糞便に対して充分量の糞便試料調製用溶液を用いて糞便試料を調製することにより、より効率よく核酸を回収し得ることが明らかである。
一方で、糞便試料（９Ｂ）の結果からも明らかであるように、本発明の調製方法により、効率よく核酸を回収することができるため、採便用キットの軽量化、小型化を図ることが可能となる。
【実施例１０】
【００７８】
健常人１名より採取された糞便を、３本の１５ｍＬのポリプロピレンチューブにそれぞれ０．１ｇずつ分取し、このうち１本に対して、３ｍＬの７０％エタノールを加えて糞便をよく分散させ、得られた糞便試料を糞便試料（１０Ａ）とした。一方、残りの２本に対して、それぞれ２．４ｍＬの「ＩＳＯＧＥＮ」（ニッポンジーン社製）を加えて糞便をよく分散させ、得られた糞便試料を、それぞれ比較試料（Ｐ１）、比較試料（Ｐ２）とした。なお、「ＩＳＯＧＥＮ」はフェノール（水に対する溶解度約１０重量％）が４０％含有されているフェノール含有物である。
このうち、比較試料（Ｐ１）に対して、糞便分散後、速やかにＲＮＡ回収を行った。具体的には、糞便試料を３０秒以上ボモジナイザーで十分に混合した後、３ｍＬのクロロホルムを添加し、１２，０００×ｇで１０分間遠心分離処理を行った。該遠心分離処理により得た上清（水層）を新しいポリプロピレンチューブに回収した。その後、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｄｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、回収された上清からＲＮＡを回収した。
また、比較試料（Ｐ２）は、室温で５時間静置した後、比較試料（Ｐ１）と同様にして、ＲＮＡ回収を行った。
一方、糞便試料（１０Ａ）は、比較試料（Ｐ２）と同様に室温で５時間静置した後、遠心分離処理を行って上清を除去した後、得られた沈殿（固形成分）に、２．４ｍＬの「ＩＳＯＧＥＮ」を添加した後、比較試料（Ｐ１）と同様にして、ＲＮＡ回収を行った。
回収されたＲＮＡを、ナノドロップ（ナノドロップ社製）を用いて定量した。この結果、糞便試料調製直後にＲＮＡ回収を行った比較試料（Ｐ１）からは３２μｇのＲＮＡを回収することができたが、５時間室温静置後に回収操作を行った比較試料（Ｐ２）からは１４μｇしか回収することができなかった。これに対して、糞便試料（１０Ａ）からは、５時間室温静置後に回収操作を行ったにもかかわらず、５７μｇという比較試料（Ｐ１）よりも大量のＲＮＡを回収することができた。
これらの結果から、本発明の糞便試料調製用溶液を用いることにより、従来のフェノール溶液を用いた場合よりも、非常に効率よくＲＮＡを回収し得ることが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明の糞便試料の調製方法により、糞便試料中の核酸を効率よく回収し得る糞便試料を簡便に調製することができるため、特に糞便試料を用いた定期健診等の臨床検査等の分野において利用が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図４】
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【配列表】
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