(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類多能性幹（ｍＰＳ）細胞を、背側前脳同一性を有する神経前駆細胞に分化させる方法であって、該背側前脳同一性を有する神経前駆細胞が少なくともネスチン、並びにｏｒｔｈｏｄｅｎｔｉｃｌｅホメオボックス１（ＯＴＸ１）、ペアードボックスタンパク質ＰＡＸ６、ｅｍｐｔｙ  ｓｐｉｒａｃｌｅｓホモログ１（Ｅｍｘ１）、ｅｍｐｔｙ  ｓｐｉｒａｃｌｅｓホモログ２（Ｅｍｘ２）、及びフォークヘッドボックスタンパク質Ｇ１（ＦｏｘＧ１）のいずれか又は全てに対して陽性であり、該方法は、  ａ）未分化ｍＰＳ細胞を、細胞を接着することが可能な基質上にプレーティングする工程、及び  ｂ）前記基質に接着した前記ａ）のｍＰＳ細胞を、該ｍＰＳ細胞の分化を許容する培地中で培養する工程を含み、該培養する工程ｂ）の少なくとも一部において、前記細胞をソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナルのアンタゴニストに曝露することを特徴とする、方法。
【請求項２】
ｍＰＳ細胞を皮質錐体ニューロン様細胞に分化させる方法であって、  ａ）未分化ｍＰＳ細胞を、細胞を接着することが可能な基質上にプレーティングする工程、及び、  ｂ）前記基質に接着した前記ａ）のｍＰＳ細胞を、該ｍＰＳ細胞の分化を許容する培地中で培養する工程を含み、該培養する工程ｂ）の少なくとも一部において、前記細胞をＳＨＨシグナルのアンタゴニストに曝露することを特徴とする、方法。
【請求項３】
前記皮質錐体ニューロン様細胞が、少なくともβ−チューブリンＩＩＩ（ＴＵＪ１）及び／又は微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）に対して、並びに小胞性グルタミン酸輸送体ＶＧｌｕＴ１及びＶＧｌｕＴ２のいずれか一方又は両方に対して陽性である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＳＨＨシグナルのアンタゴニストが、ＳＳＨ蛋白質若しくはその受容体のアンタゴニストである、請求項１〜３のいずれか一に記載の方法。
【請求項５】
前記ＳＨＨシグナルのアンタゴニストが、ＳＳＨ蛋白質若しくはその受容体の、発現若しくは活性を減少させる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ｍＰＳ細胞を、腹側前脳同一性を有する神経前駆細胞に分化させる方法であって、該腹側前脳同一性を有する神経前駆細胞が、少なくともネスチン、並びにホメオボックスタンパク質ＧＳＨ２、ホメオドメイン転写因子ＮＫＸ２．１及びＮＫＸ２．２、及びホメオボックスタンパク質Ｄｌｘ１及びＤｌｘ２のいずれか又は全てに対して陽性であり、該方法は、  ａ）未分化ｍＰＳ細胞を、細胞を接着することが可能な基質上にプレーティングする工程、及び、  ｂ）前記基質に接着した前記ａ）のｍＰＳ細胞を、該ｍＰＳ細胞の分化を許容する培地中で培養する工程を含み、該培養する工程ｂ）の少なくとも一部において、前記細胞を、ＳＨＨシグナルのアゴニスト及びＷｎｔシグナルのアンタゴニストに曝露することを特徴とする、方法。
【請求項７】
ｍＰＳ細胞を、皮質又は線条体抑制性介在ニューロン又は線条体投射ニューロン様細胞に分化させる方法であって、  ａ）未分化ｍＰＳ細胞を、細胞を接着することが可能な基質上にプレーティングする工程、及び  ｂ）前記基質に接着した前記ａ）のｍＰＳ細胞を、該ｍＰＳ細胞の分化を許容する培地中で培養する工程を含み、該培養する工程ｂ）の少なくとも一部において、前記細胞を、ＳＨＨシグナルのアゴニスト及びＷｎｔシグナルのアンタゴニストに曝露することを特徴とする、方法。
【請求項８】
前記皮質／線条体抑制性介在ニューロン又は投射ニューロン様細胞が、少なくともβ−チューブリンＩＩＩ（ＴＵＪ１）及び／又はＭＡＰ２、並びに小胞性ＧＡＢＡ輸送体ＶＧＡＴに対して陽性である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＳＨＨシグナルのアゴニストが、ＳＳＨ蛋白質若しくはその受容体のアゴニストである、請求項６〜８のいずれか一に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＳＨＨシグナルのアゴニストが、ＳＳＨ蛋白質若しくはその受容体の、発現を上昇させる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｗｎｔシグナルのアンタゴニストが、Ｗｎｔ蛋白質若しくはその受容体のアンタゴニストである、請求項６〜８のいずれか一に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｗｎｔシグナルのアンタゴニストが、Ｗｎｔ蛋白質若しくはその受容体の、発現を減少させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｍＰＳ細胞が非ヒト細胞である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｍＰＳ細胞が哺乳類胚性幹（ＥＳ）細胞である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記培地がインスリンを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記培地が、１）外部誘導モルフォゲンを欠く、              ２）神経前駆細胞の尾方化を誘導し得る成分を欠く、及び              ３）血清又は血漿、レチノイン酸（ＲＡ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）タンパク質ファミリーの任意の成員、及びＷｎｔタンパク質ファミリーの任意の成員のいずれか又は全てを欠く、から選択される請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記培養する工程ｂ）の期間が１０日間〜１４日間である、請求項１又は６に記載の方法。
【請求項１８】
前記培養する工程ｂ）の期間が少なくとも２１日間である、請求項２、３、７又は８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナルのアンタゴニストが、シクロパミン又はその機能的誘導体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｗｎｔシグナルのアンタゴニストが、ＤＫＫ又はその機能的断片若しくは誘導体である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
得られた前記皮質錐体ニューロン様細胞から、リーリン、ＴＢＲ１、ＣＴＩＰ２、ＯＴＸ１、ＳＡＴＢ２、ＣＵＸ１から選択される１つ又は複数のマーカーに対して陽性の細胞、又はリーリン、ＴＢＲ１、カルレチニンと、ｐ７３とのマーカーの組み合わせを含む細胞、又はリーリンとＣＴＩＰ２とのマーカーの組み合わせを含む細胞、又はＴｂｒ１とＣＴＩＰ２とのマーカーの組み合わせを含む細胞、又はＣｕｘ１とＳＡＴＢ２とのマーカーの組み合わせを含む細胞の亜集団を富化又は単離することをさらに含む、請求項２又は３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類多能性幹細胞を、ニューロン表現型を呈する細胞、より具体的には、特に錐体ニューロン及び皮質抑制性介在ニューロンを含む皮質型ニューロンに分化させるｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。本発明は、上記方法により得られるニューロン細胞及び細胞集団、該ニューロン細胞及び細胞集団を含む組成物、さらには該ニューロン細胞及び細胞集団の使用をさらに包含する。
【背景技術】
【０００２】
所要の同一性を有する、容易に入手可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏニューロン細胞及び細胞集団は、例えば各種ニューロン型の正常な生理的挙動の研究、神経障害又は神経精神障害の病因学の研究、神経疾患のニューロン補充療法、又は薬物（pharmacological）、毒物（toxicological）若しくは他の薬剤の様々なセルベースアッセイ等、多数の用途において極めて重要である。
【０００３】
特に、培養した皮質ニューロン及び線条体ニューロンは、大脳皮質及び大脳基底核の正常な発達、構造、及び生理の解明に役立ち、アルツハイマー病、ハンチントン病、脳卒中、又は癲癇を含む広範な皮質の病気の代表的なモデル、及びそれらに対する細胞スクリーニングプラットフォームを作り出すことを可能にする。しかしながら、これまで、皮質ニューロンを他の細胞源からではなく、成熟又は胚性脳組織から容易に且つ一貫して誘導する確固とした単純な方法は利用可能ではなかった。
【０００４】
したがって、当該技術分野では、大脳皮質又は線条体の典型となるニューロン集団を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて再現可能に生成することのできる直接的方法を提供する必要性がある。好ましくは、上記方法は、比較的よく特徴付けられた入手可能な細胞源とは離れたものであり得る。得られたｉｎ  ｖｉｔｒｏニューロン培養物は、錐体ニューロン及び抑制性介在ニューロンを含む基本的な皮質ニューロン型のいずれか一方又は両方を含んでいてもよく、好ましくはそれについて有意に富化されていてもよい。より具体的には、上記ニューロン培養物はまた、上記基本的な皮質ニューロン型のいずれかにおいて、例えば形態、マーカー発現、電気生理等における差異から明らかなように、さらなるニューロン特殊化又は分化レベルを示し得る。
【０００５】
非特許文献１は、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞の接着単培養（すなわち浮遊培養における胚様体の形成、及びＥＳ細胞と非ＥＳ細胞との共培養は行なわれない）において、選択的細胞運命に関する誘導シグナルの除去が、ＥＳ細胞の大部分を神経前駆体に発達させるのに十分であったことを報告している。しかしながら、非特許文献１は、上記神経前駆体が錐体細胞若しくは介在ニューロン、又は線条体ニューロン等の皮質ニューロンサブタイプを生成すること、又は皮質細胞型の発達を模倣することが可能であるか否かについて述べておらず、したがってかかる皮質分化を達成するためのいかなる条件も開示していない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ying et al. 2003 (Nat Biotechnol 21: 183-6)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記で述べた当該技術分野における必要性の１つ又は複数に取り組むものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
特に、非特許文献１（上掲）の接着ＥＳ細胞単培養法を調整したところ、本発明者らは驚くべきことに、その方法を用いて得られた神経前駆体の大部分が、前部神経外胚葉のマーカー（例えばホメオボックスタンパク質ＯＴＸ１、ＯＴＸ２及びＦｏｘＧ１等）を発現したことを認めたが、これは上記神経前駆細胞が有望な前脳同一性を有していたことを示唆している。また、本発明者らは、これらの神経前駆細胞の一部分が初期背側前脳原基のマーカー（例えばＯＴＸ１、ＰＡＸ６、Ｅｍｘ１、及びＥｍｘ２等）を発現し、別の部分が初期最吻側（rostral-most）前脳の腹側部に特有のマーカー（例えばＧＳＨ２、ＮＫＸ２．１又はＮＫＸ２．２、及びＤｌｘ１又はＤｌｘ２等）を発現したことも見出している。総合すると、これにより驚くべきことに、外部誘導モルフォゲンシグナルの非存在下での多能性幹細胞の接着単培養によって、腹側表現型及び背側表現型を含む、有望な前脳同一性を有する神経前駆体の集団がもたらされることが確立された。
【０００９】
この認識を広げることにより、本発明者らは、上記前脳神経前駆細胞における腹側表現型と背側表現型とのバランスを操作することにさらに成功した。特に、本発明者らは、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達に拮抗することで、神経前駆細胞における背側表現型の蔓延が劇的に増大されることを見出した。さらに特筆すべきは、ＳＨＨを拮抗した場合、神経前駆細胞が、神経伝達表現型、遺伝子発現、形態、電気生理学的挙動、及び天然大脳皮質組織と一体化する能力に関して、皮質錐体ニューロンの重要な特色を呈するニューロンに最終的に分化したことである。さらには、そのように得られた錐体ニューロンには、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて異なる皮質層に見られる錐体細胞サブタイプによく似た亜集団が含まれていた。これに対し、ＳＨＨシグナル伝達の刺激及び／又はＷｎｔシグナル伝達の阻害は、神経前駆細胞において腹側表現型の発生を増加させ、皮質及び線条体のＧＡＢＡ作動性抑制性介在ニューロン、又は線条体（中型有棘）投射ニューロンへの分化を推進した。
【００１０】
したがって、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで多能性幹細胞から、規定のタイプの神経前駆細胞又は成熟ニューロンについて高度に富化された、又は実質的に均一な細胞集団を生成することを可能にする方法を実現した。本発明の方法では、多能性幹細胞の接着単培養、並びにＳＨＨ及び／又はＷｎｔシグナル伝達の適切な調節を使用する。
【００１１】
したがって、一態様（本明細書中では態様「Ａ１」と称する）では、本発明は、哺乳類多能性幹（ｍＰＳ）細胞を、背側前脳同一性を有する神経前駆細胞に分化させる方法であって、ａ）未分化ｍＰＳ細胞を、細胞を接着させ得る基質上にプレーティングする工程、及びｂ）ａ）上記基質に接着したａ）のｍＰＳ細胞を、ｍＰＳ細胞の分化を許容する培地中で培養する工程を含み、該培養する工程ｂ）の少なくとも一部において、細胞をソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル経路のアンタゴニストに曝露することを特徴とする、方法を提供する。
【００１２】
一実施の形態では、背側前脳同一性を有する神経前駆細胞は、少なくともネスチン、並びにオルソデンティクル（ｏｒｔｈｏｄｅｎｔｉｃｌｅ）ホメオボックス１（ＯＴＸ１）、ペアードボックスタンパク質ＰＡＸ６、エンプティースピラクルス（ｅｍｐｔｙ  ｓｐｉｒａｃｌｅｓ）ホモログ１（Ｅｍｘ１）、ｅｍｐｔｙ  ｓｐｉｒａｃｌｅｓホモログ２（Ｅｍｘ２）、及びフォークヘッドボックスタンパク質Ｇ１（ＦｏｘＧ１）のいずれか１つ、好ましくは２つ以上、より好ましくは全てに対して陽性である。
【００１３】
さらなる態様（本明細書中では態様「Ａ２」と称する）では、本発明は、ｍＰＳ細胞を皮質錐体ニューロン様細胞に分化させる方法であって、ａ）未分化ｍＰＳ細胞を、細胞を接着させ得る基質上にプレーティングする工程、及びｂ）上記基質に接着したａ）のｍＰＳ細胞を、ｍＰＳ細胞の分化を許容する培地中で培養する工程を含み、該培養する工程ｂ）の少なくとも一部において、細胞をＳＨＨシグナル経路のアンタゴニストに曝露することを特徴とする、方法を提供する。
【００１４】
一実施の形態では、皮質錐体ニューロン様細胞は、少なくともβ−チューブリンＩＩＩ（ＴＵＪ１）及び／又は微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）、並びに小胞性グルタミン酸輸送体ＶＧｌｕＴ１及びＶＧｌｕＴ２のいずれか一方又は両方に対して陽性である。さらなる実施の形態では、皮質錐体ニューロン様細胞は、自発的グルタミン酸作動性興奮性シナプス後電流（ｅＰＳＣ）を示す。さらなる実施の形態では、皮質錐体ニューロン様細胞は、１．２μｍ超の錐体指数（ＰＭＩ）値を示し、さらには１．８μｍ超、２．４μｍ超、３．０μｍ超、又はさらには３．６μｍ超のＰＭＩ値を示し得る。
【００１５】
またさらなる態様（本明細書中では態様「Ａ３」と称する）では、本発明は、ｍＰＳ細胞を、腹側前脳同一性を有する神経前駆細胞に分化させる方法であって、ａ）未分化ｍＰＳ細胞を、細胞を接着させ得る基質上にプレーティングする工程、及びｂ）上記基質に接着したａ）のｍＰＳ細胞を、ｍＰＳ細胞の分化を許容する培地中で培養する工程を含み、該培養する工程ｂ）の少なくとも一部において、細胞をＳＨＨシグナル経路のアゴニスト、及び／又はＷｎｔシグナル経路のアンタゴニストに曝露することを特徴とする、方法を提供する。好ましくは、細胞をそのようにＳＨＨ経路のアゴニスト及びＷｎｔ経路のアンタゴニストの両方に曝露してもよく、それにより特に成功した分化を達成することができる。
【００１６】
一実施の形態では、腹側前脳同一性を有する神経前駆細胞は、少なくともネスチン、並びにホメオボックスタンパク質ＧＳＨ２、ホメオドメイン転写因子ＮＫＸ２．１及びＮＫＸ２．２、並びにホメオボックスタンパク質Ｄｌｘ１及びＤｌｘ２のいずれか１つ、好ましくは２つ以上、又は全てに対して陽性である。
【００１７】
別の態様（本明細書中では態様「Ａ４」と称する）では、本発明は、ｍＰＳ細胞を、皮質抑制性介在ニューロン若しくは線条体抑制性介在ニューロン又は線条体投射（中型有棘）ニューロン様細胞に分化させる方法であって、ａ）未分化ｍＰＳ細胞を、細胞を接着させ得る基質上にプレーティングする工程、及びｂ）上記基質に接着したａ）のｍＰＳ細胞を、ｍＰＳ細胞の分化を許容する培地中で培養する工程を含み、該培養する工程ｂ）の少なくとも一部において、細胞をＳＨＨシグナル経路のアゴニスト、及び／又はＷｎｔシグナル経路のアンタゴニストに曝露することを特徴とする、方法を提供する。好ましくは、細胞をそのようにＳＨＨ経路のアゴニスト及びＷｎｔ経路のアンタゴニストの両方に曝露してもよく、それにより特に成功した分化を達成することができる。
【００１８】
一実施の形態では、皮質抑制性介在ニューロン様細胞は、少なくともβ−チューブリンＩＩＩ（ＴＵＪ１）及び／又はＭＡＰ２、並びに小胞性ＧＡＢＡ輸送体ＶＧＡＴに対して陽性である。さらなる実施の形態では、皮質抑制性介在ニューロン様細胞は、自発的ＧＡＢＡ作動性抑制性シナプス後電流（ｉＰＳＣ）を示す。またさらなる実施の形態では、皮質抑制性介在ニューロン様細胞は、１．２μｍ以下の（smaller than and up to）ＰＭＩ値を示し、さらには０．６μｍ未満のＰＭＩ値を示し得る。
【００１９】
上記態様Ａ１及び態様Ａ２の方法の工程はしたがって、ｍＰＳ細胞を、背側前脳同一性を有する神経前駆細胞の形成を経て、成熟皮質錐体ニューロン様細胞へと進行させる。一方、上記態様Ａ３及び態様Ａ４の方法の工程は、ｍＰＳ細胞を、腹側前脳同一性を有する神経前駆細胞を経て、成熟皮質又は線条体抑制性介在ニューロン又は線条体投射（中型有棘）ニューロン様細胞へと誘導する。結果として、所望の細胞型は、実質的に個々の方法の培養する工程ｂ）の全体にわたって生じ得るが、神経前駆細胞は大抵は分化過程の初期に現れ、成熟ニューロン様細胞は主に分化過程の後期に生じる。
【００２０】
したがって、上記態様Ａ１又は態様Ａ３のいずれかの方法において、培養する工程ｂ）の期間は、得られた細胞培養物における個々の所望の神経前駆体の割合を最大限にする等のためには、好ましくは３日間〜２１日間、より好ましくは４日間〜１８日間、さらに好ましくは７日間〜１６日間又は７日間〜１４日間、さらにより好ましくは１０日間〜１４日間であり得る。反対に、上記態様Ａ２又は態様Ａ４のいずれかの方法においては、培養する工程ｂ）の期間は、好ましくは少なくとも１６日間、より好ましくは少なくとも１８日間、さらに好ましくは少なくとも２１日間又は少なくとも２４日間、例えば１８日間〜４０日間、より好ましくは２１日間〜３５日間、さらに好ましくは２１日間〜３０日間、例えば約２１日間、約２３日間、約２５日間、約２８日間、又は約３０日間であり得る。これにより、得られた細胞培養物における個々の成熟ニューロン様細胞の割合が最大限となり得る。培養する工程ｂ）の開始、言い換えると０日目（ｔ＝０日）に相当する時点は、本明細書全体を通して、ｍＰＳ細胞をそれらの分化を許容する培地に最初に曝露した瞬間であると見なされる。
【００２１】
言及したように、本発明の方法は、外因的誘導モルフォゲンシグナルがほとんど存在しない分化条件を採用する。特に、上記態様の工程ｂ）においてｍＰＳ細胞を培養する培地は、培地に含まれる場合に神経前駆細胞の尾方化（caudalisation）を誘導する可能性のあるいずれの成分も欠いているのが好ましい。例えば、一実施の形態では、培地は以下のいずれか１つ、好ましくは任意の２つ以上、最も好ましくは全てを欠いていてもよい：動物（例えば哺乳類）血清又は血漿、レチノイン酸（ＲＡ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）タンパク質ファミリーの任意の成員、及びＷｎｔタンパク質ファミリーの任意の成員。培地はかかる因子を完全に欠いていてもよく、又はｍＰＳ細胞に対して効果を示す濃度未満の微量のかかる因子を含んでいてもよいことを理解されたい。
【００２２】
理解され得るように、上記態様の方法は通常、所望の神経前駆細胞又は成熟ニューロン様細胞について富化された、又は実質的に均一な細胞集団を獲得するものであり得る。必要に応じて、かかる細胞集団を回収又は採取してもよく、上記神経前駆細胞又は成熟ニューロン様細胞を、それらの顕著な特性（例えば、上記で規定したようなそれらのマーカー発現等）に基づき、当該技術分野において一般に知られる方法（例えばＦＡＣＳ、クローン培養）を用いてそこから（there from）さらに富化又は単離してもよい。
【００２３】
また、本発明の方法により生成される神経前駆細胞又は成熟ニューロン様細胞は、顕著な特性を有する亜集団を包含し得る。本発明の方法により、かかる亜集団の細胞を所望の細胞の一般集団からさらに富化又は単離してもよい。
【００２４】
例えば、本発明者らは、本発明によって作製された皮質錐体ニューロン様細胞が、異なる皮質層に由来するニューロンに起因するマーカー、例えばリーリン（カハール・レチウス（Cajal-Retzius）ニューロンに特有）；ＴＢＲ１（Ｔ−ｂｏｘ  ｂｒａｉｎ  １；カハール・レチウスニューロン及び第ＶＩ層ニューロンに特有）；ＣＴＩＰ２（トリ卵白アルブミン上流プロモータ転写因子（ＣＯＵＰ−ＴＦ）相互作用タンパク質２）及びＯＴＸ１（第Ｖ層ニューロン及びそれほど著しくはないが第ＶＩ層ニューロンの両方に特有）；又はＳＡＴＢ２（ＳＡＴＢホメオボックス２；第ＩＩ層ニューロン、第ＩＩＩ層ニューロン、及び第ＩＶ層ニューロンに特有）；又はＣＵＸ１（ｃｕｔ−ｌｉｋｅホメオボックス１；第ＩＩ層ニューロン、第ＩＩＩ層ニューロン、及び第ＩＶ層ニューロンに特有）；又は例えばリーリン、ＴＢＲ１、カルレチニンと、ｐ７３とのマーカーの組み合わせ（カハール・レチウスニューロンに特有）、又はリーリンとＣＴＩＰ２とのマーカーの組み合わせ、又はＴｂｒ１とＣＴＩＰ２とのマーカーの組み合わせ、又はＣｕｘ１とＳＡＴＢ２とのマーカーの組み合わせ等を含む上記マーカーの組み合わせ等を示す細胞の亜集団を含むことを予期せず見出した。したがって、態様Ａ２の方法は、得られた皮質錐体ニューロン様細胞から、リーリン、ＴＢＲ１、ＣＴＩＰ２、ＯＴＸ１、ＳＡＴＢ２、ＣＵＸ１から選択される１つ又は複数のマーカーに対して陽性の細胞、又はリーリン、ＴＢＲ１、カルレチニンと、ｐ７３とのマーカーの組み合わせを含む細胞、又はリーリンとＣＴＩＰ２とのマーカーの組み合わせを含む細胞、又はＴｂｒ１とＣＴＩＰ２とのマーカーの組み合わせを含む細胞、又はＣｕｘ１とＳＡＴＢ２とのマーカーの組み合わせを含む細胞の亜集団を富化又は単離することをさらに含み得る。
【００２５】
本発明者らは、実施例において証明されるように、本発明によって作製された皮質錐体ニューロン様細胞の集団において、皮質ニューロンの様々なサブタイプが再現可能な形で順に現れる傾向があることをさらに認めた。したがって、実施の形態では、所望の割合の皮質ニューロン型を有するニューロン集団を獲得するために、態様Ａ２の方法の培養する工程ｂ）の期間を適切に調節することができる。
【００２６】
例えば、一実施の形態では、態様Ａ２の方法における培養する工程ｂ）の期間は、リーリン及び／又はＴｂｒ１の発現を有する（comprising）細胞において、特に富化された皮質錐体ニューロン様細胞の集団を獲得するためには、６日間〜２０日間、好ましくは８日間〜１８日間、より好ましくは９日間〜１６日間、さらに好ましくは１０日間〜１４日間、最も好ましくは１０日間〜１２日間であり得る。
【００２７】
別の実施の形態では、態様Ａ２の方法における培養する工程ｂ）の期間は、ＣＴＩＰ２の発現を有する細胞において、特に富化された皮質錐体ニューロン様細胞の集団を獲得するためには、６日間〜２０日間、好ましくは８日間〜１８日間、より好ましくは９日間〜１６日間、さらに好ましくは１０日間〜１４日間、最も好ましくは１２日間〜１４日間であり得る。
【００２８】
さらなる実施の形態では、態様Ａ２の方法における培養する工程ｂ）の期間は、ＣＵＸ１及び／又はＳＡＴＢ２の発現を有する細胞において、特に富化された皮質錐体ニューロン様細胞の集団を獲得するためには、８日間〜２０日間、好ましくは１０日間〜１８日間、より好ましくは１２日間〜１６日間、さらに好ましくは１４日間〜１６日間であり得る。
【００２９】
さらに、広範なｉｎ  ｖｉｖｏ実験により、本発明によって作製された皮質錐体ニューロン様細胞は主として、後頭皮質又は視覚皮質に属するニューロンの同一性を示すことが明らかとなった。したがって、一実施の形態では、皮質錐体ニューロン様細胞はさらに、胚性後頭皮質又は視覚皮質に特有のＣｏｕｐＴＦ１転写因子及び／又はＣｏｕｐＴＦ２転写因子に対しても陽性であり得る。したがって、本発明の方法は、後頭皮質又は視覚皮質同一性を有するニューロンを得ることを可能にする。
【００３０】
本発明の方法はしたがって、単純且つ確固な条件を用いて、前部前脳神経前駆細胞及び成熟皮質錐体、又は皮質／線条体抑制性介在ニューロン若しくは投射（中型有棘）ニューロン細胞の著しく大きな、富化された集団を生成することを初めて可能にする。かかる細胞は、薬理学的、毒物学的又は遺伝学的スクリーニングアッセイ、正常な脳の発達及び機能、並びに神経疾患又は神経精神疾患の細胞モデル、かかる疾患のニューロン補充療法等におけるような様々な用途に採用され得る。
【００３１】
したがって、さらなる態様では、本発明は、本発明の方法を用いて、特に上記態様Ａ１〜態様Ａ４のいずれかの方法を用いて得ることのできる、又は直接得た神経前駆細胞及び成熟ニューロン様細胞、並びにかかる細胞を含む細胞培養物及び細胞集団を提供する。
【００３２】
本発明はまた、神経前駆細胞又は成熟ニューロン様細胞、又はかかる細胞を含む細胞培養物及び細胞集団を非ヒト実験動物に導入する、例えば注入又は移植する方法を提供し、またその方法により改変した動物を提供する。
【００３３】
本発明の方法はまた、ニューロン分化、特に本明細書中で詳述したニューロン運命へ向かう分化の進行のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実行及び解析、並びに該分化の調節因子のスクリーニングアッセイに好適である。
【００３４】
関連の態様では、本発明は、本発明の神経前駆細胞又は成熟ニューロン様細胞、又はかかる細胞を含む細胞集団を含む組成物（医薬製剤を含む）を提供する。
【００３５】
他の態様では、本発明は、本発明の神経前駆細胞又は成熟ニューロン様細胞、又はかかる細胞を含む細胞集団の予防的使用及び治療的使用、又は非医療的使用を提供する。
【００３６】
本発明のこれらの態様及びさらなる態様、並びに好ましい実施形態は、以下の項及び添付の特許請求の範囲に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ】ＥＳ細胞の皮質前駆細胞への分化を示す図である。ＤＤＭ条件における分化がもたらす、神経前駆細胞（ネスチンを発現する、黒色のヒストグラム）、ニューロン（β−チューブリンＩＩＩを発現する、白色のヒストグラム）、及び星状膠細胞（ＧＦＡＰを発現する、灰色のヒストグラム）の逐次生成を示す。Ｘ軸は分化の日数を表し、Ｙ軸はヘキスト染色により視覚化された全ての細胞のうち、所与のマーカーを発現する細胞の割合を表す。
【図１Ｂ】ＥＳ細胞の皮質前駆細胞への分化を示す図である。ＤＤＭ（白色のヒストグラム）又はＤＤＭ＋シクロパミン（黒色のヒストグラム）における１４日間の分化がもたらす特定の神経領域化マーカーを発現するネスチン陽性神経前駆細胞の割合を示すが、ＤＤＭ＋シクロパミンにおいては腹側前脳同一性から背側前脳同一性への変換が示される。データは平均±標準誤差として表す。Ｘ軸は試験したマーカー（１：Ｏｔｘ１＋２、２：Ｐａｘ６、３：Ｏｔｘ１、４：Ｇｓｈ２、５：Ｎｋｘ２．１、６：Ｎｋｘ２．２、７：Ｅｎ１、８：Ｍａｔｈ１、９：ＨｏｘＢ１）を表す。Ｙ軸は所与のマーカーを発現するネスチン陽性細胞の割合を表す。
【図１Ｃ】ＥＳ細胞の皮質前駆細胞への分化を示す図である。ＤＤＭにおける４日目〜１４日目の細胞培養物に由来する、終脳（ａ：ＦｏｘＧ１）、背側前脳（ｂ：Ｅｍｘ２、ｃ：Ｅｍｘ１）、及び腹側前脳（ｄ：Ｄｌｘ１、ｅ：Ｄｌｘ５、ｆ：Ｎｋｘ２．１、ｇ：Ｌｈｘ６）、並びにＳＨＨ（ｈ）の特定のマーカー遺伝子のＲＴ−ＰＣＲを示す。
【図１Ｄ】ＥＳ細胞の皮質前駆細胞への分化を示す図である。ＤＤＭ＋シクロパミンにおける４日目〜１４日目の細胞培養物に由来する、終脳（ａ：ＦｏｘＧ１）、背側前脳（ｂ：Ｅｍｘ２、ｃ：Ｅｍｘ１）、及び腹側前脳（ｄ：Ｄｌｘ１、ｅ：Ｄｌｘ５、ｆ：Ｎｋｘ２．１、ｇ：Ｌｈｘ６）、並びにＳＨＨ（ｈ）の特定のマーカー遺伝子のＲＴ−ＰＣＲを示す。
【図１Ｅ】ＥＳ細胞の皮質前駆細胞への分化を示す図である。ＤＤＭ＋シクロパミン条件における分化がもたらす、神経前駆細胞（ネスチンを発現する、黒色のヒストグラム）、ニューロン（β−チューブリンＩＩＩを発現する、白色のヒストグラム）、及び星状膠細胞（ＧＦＡＰを発現する、灰色のヒストグラム）の逐次生成を示す。Ｘ軸は分化の日数を表し、Ｙ軸はヘキスト染色により視覚化された全ての細胞のうち、所与のマーカーを発現する細胞の割合を表す。
【図２Ａ】ＤＤＭ＋シクロパミンにおける、ＥＳ細胞からの機能的皮質ニューロンの生成を示す図である。ＤＤＭ又はＤＤＭ＋シクロパミン分化がもたらす、２８日間の培養後のＴｕｊ１陽性ニューロンにおける、ＶＧｌｕＴ１（黒色のヒストグラム）、ＶＧｌｕＴ２（灰色のヒストグラム）、及びＶＧＡＴ（白色のヒストグラム）の発現の割合を示すが、ＤＤＭ＋シクロパミンにおいてはグルタミン酸作動性ニューロン運命への変換が示される。Ｙ軸は個々のマーカーを発現するＴｕｊ１陽性ニューロンの割合を表す。
【図２Ｂ】ＤＤＭ＋シクロパミンにおける、ＥＳ細胞からの機能的皮質ニューロンの生成を示す図である。ＤＤＭにおける分化がもたらす、２８日後のニューロンに由来するｉＰＳＣの記録であり、それはピクロトキシン（ＧＡＢＡＡ阻害物質）及びＡＰＶ／ＮＢＱＸ（ＮＭＤＡ受容体阻害物質及びＡＭＰＡ受容体阻害物質）による選択的阻害を示す。
【図２Ｃ】ＤＤＭ＋シクロパミンにおける、ＥＳ細胞からの機能的皮質ニューロンの生成を示す図である。ＤＤＭにおける分化がもたらす、２８日後のニューロンに由来するｅＰＳＣの記録であり、それはピクロトキシン（ＧＡＢＡＡ阻害物質）及びＡＰＶ／ＮＢＱＸ（ＮＭＤＡ受容体阻害物質及びＡＭＰＡ受容体阻害物質）による選択的阻害を示す。
【図２Ｄ】ＤＤＭ＋シクロパミンにおける、ＥＳ細胞からの機能的皮質ニューロンの生成を示す図である。各条件のニューロンにおいて記録されたｉＰＳＣ（白色のヒストグラム）及びｅＰＳＣ（黒色のヒストグラム）の割合であるが、ＤＤＭ＋シクロパミンにおいては、はるかに高いｅＰＳＣの蔓延及びはるかに低いｉＰＳＣの発生が示される。
【図３Ａ】ＤＤＭ＋シクロパミンにおける、ＥＳ細胞からの錐体ニューロンの生成を示す図である。ＤＤＭにおける分化がもたらす、２８日間培養したＭＡＰ２＋成熟ニューロンに観察される典型的な形態を示す。矢印は、錐体ニューロンに特有の大きな「先端様」樹状突起を指している。
【図３Ｂ】ＤＤＭ＋シクロパミンにおける、ＥＳ細胞からの錐体ニューロンの生成を示す図である。ＤＤＭ＋シクロパミンにおける分化がもたらす、２８日間培養したＭＡＰ２＋成熟ニューロンに観察される典型的な形態を示す。矢印は、錐体ニューロンに特有の大きな「先端様」樹状突起を指している。
【図３Ｃ】ＤＤＭ＋シクロパミンにおける、ＥＳ細胞からの錐体ニューロンの生成を示す図である。錐体（黒色のヒストグラム）、双極（灰色のヒストグラム）又は多極（白色のヒストグラム）形態を呈するニューロンの半定量的目視スコア付けを示す。データは平均±標準誤差として表す。Ｙ軸は、個々の形態を呈するＭＡＰ−２陽性ニューロンの割合を表す。
【図３Ｄ】ＤＤＭ＋シクロパミンにおける、ＥＳ細胞からの錐体ニューロンの生成を示す図である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１日培養し、グルタミン酸作動性マーカー（ＶＧｌｕＴ；黒色のバー）及びＧＡＢＡ作動性マーカー（ＧＡＢＡ；白色のバー）について染色した、天然皮質ニューロン（生後２日目に分離した）におけるＰＭＩ分布を示す。１．２というカットオフ値は２つの集団を効果的に区別するのを可能にするが、グルタミン酸作動性ニューロンはより高い値を示し、ＧＡＢＡ作動性ニューロンはより低い値を示す。Ｙ軸は、個々のＰＭＩ値を有する細胞の割合を表す。
【図３Ｅ】ＤＤＭ＋シクロパミンにおける、ＥＳ細胞からの錐体ニューロンの生成を示す図である。ＤＤＭ（白色のバー）又はＤＤＭ＋シクロパミン（黒色のバー）条件におけるＥＳ細胞から誘導されたニューロンのＰＭＩ分布を示す。ＤＤＭ＋シクロパミン条件における、より高いＰＭＩへの分布の変動（ｓｈｉｆｔ）に注目されたい。Ｙ軸は、個々のＰＭＩ値を有する細胞の割合を表す。
【図３Ｆ】ＤＤＭ＋シクロパミンにおける、ＥＳ細胞からの錐体ニューロンの生成を示す図である。ＤＤＭ（白色のバー）又はＤＤＭ＋シクロパミン（黒色のバー）条件における分化の後、１．２のカットオフ値を超えるＰＭＩを示すニューロンの割合を示すが、ＤＤＭ＋シクロパミンにおいては錐体形態への変換が示される。Ｙ軸は、カットオフ値を超えるＰＭＩ値を有するＭＡＰ２陽性ニューロンの割合を表す。
【図４】ＤＤＭ＋シクロパミンにおいてＥＳ細胞から誘導されたニューロンが、生後皮質に移植した場合に皮質ニューロンのように振る舞うことを示す図である。ＤＤＭ（Ａ、Ｂ）又はＤＤＭ＋シクロパミン（Ｃ〜Ｇ）条件において２８日間分化させ、そして生後皮質切片上で３日間培養したｅＧＦＰ＋ＥＳ細胞から誘導されたニューロンの配向パターンを示す。ＧＦＰはバックグラウンドＭＡＰ２染色より強いシグナルを示す（Ｂ、Ｄ、Ｇ）。皮質切片の先端面が上である。先端に位置し、放射状に配向する（矢印により示す）樹状突起は、ＤＤＭ＋シクロパミン条件においてはるかに多く見られる。放射状に広がる基底軸索は小矢印で示す（Ｅ〜Ｇ）。ＤＤＭ（白色のバー）又はＤＤＭ＋シクロパミン（黒色のバー）条件において誘導されたニューロンに関する、放射状の配向（皮質の半径と比較して４５度未満の配向角として規定される）を示すニューロンの割合の定量化して示す（Ｈ、Ｉ）。データは平均±標準誤差として表す。
【図５】本明細書中で使用される様々な皮質マーカー、それらの内因性層特異的パターン、及びそれらのｉｎ  ｖｉｖｏ生成の時期を示す概略図である（出典：Hevner et al. 2003. Dev Neurosci 25: 139-151、及びvon Economo C & Koskinas G 1925. The Cytoarchitectonics Of TheAdult Human Cortex. Julius Springer Verlag, Vienna）。
【図６Ａ】ＤＤＭ＋シクロパミンにおいて分化させた、ＥＳ細胞からの皮質ニューロンの種々のサブタイプの生成の時間的パターンが、ｉｎ  ｖｉｖｏ状況と同様であることを示す図である。ＤＤＭ＋シクロパミン分化がもたらす皮質ニューロンの別個のサブタイプの層特異的マーカーを発現するＴｕｊ１＋ニューロン集団の経時進化を示す。矢印は、分化の過程でニューロンにおいて各々のマーカーが出現した初日を示す。リーリン＋／Ｔｂｒ１＋カハール・レチウスニューロンの生成の初期の波から、リーリン−／Ｔｂｒ１＋予定ＶＩ層ニューロン、ＣＩＴＰ２＋又はＯｔｘ１＋予定Ｖ層ニューロン、Ｓａｔｂ２＋予定ＩＩ層／ＩＩＩ層／ＩＶ層ニューロンまでのニューロン生成の別個の波に注目されたい。データは平均±標準誤差として表す（Ｎ＝３の実験）。Ｘ軸は分化の日数を表す。Ｙ軸は個々のマーカーに対して陽性のニューロンの割合を表す。
【図６Ｂ】ＤＤＭ＋シクロパミンにおいて分化させた、ＥＳ細胞からの皮質ニューロンの種々のサブタイプの生成の時間的パターンが、ｉｎ  ｖｉｖｏ状況と同様であることを示す図である。ＤＤＭ＋シクロパミン条件においてＥＳ細胞から誘導された一部のニューロンは、生後皮質の辺縁帯に移植した場合にカハール・レチウスニューロンのように振る舞う。ＧＦＰはバックグラウンドＭＡＰ２染色より強い。皮質切片の先端面が上である。
【図７】発生日決定（birthdating）解析を示す図である。培養物を様々な時点（Ｘ軸）で２４時間ＢｒｄＵでパルス標識し、培養を２１日目に停止し、各々の特定のマーカー（リーリン、Ｔｂｒ１、ＣＴＩＰ２、Ｃｕｘ１、又はＳａｔｂ２）を発現するＴｕｊ１＋ニューロンにおいて、ＢｒｄＵで完全に標識された核の割合を定量化した。各々のニューロン集団に関する神経発生の開始及びピークの段階的な時間的変動に注目されたい。データは平均±標準誤差として表す（Ｎ＝３の実験）。Ｘ軸はＢｒｄＵパルスの日数を表す。Ｙ軸はＢｒｄＵ標識ニューロンの割合を表す。
【図８Ａ】ＥＳ細胞から皮質ニューロンへの神経発生の時間的パターンが、単一系統の神経前駆細胞内にコードされることを明らかにするクローン解析を示す図である。ＥＳ細胞から生成した神経前駆細胞を、１０日間の分化の後分離し、続いてクローン密度で２日間、６日間、又は８日間培養した。次にリーリン、ＣＴＩＰ２、Ｃｕｘ１、及びＳａｔｂ２を発現するＴｕｊ１＋ニューロンの割合を定量化した。データは平均±標準誤差として表す（Ｎ＝３の実験）。Ｘ軸は分化の日数を表す。Ｙ軸は個々のマーカーに対して陽性のニューロンの割合を表す。
【図８Ｂ】個々の神経前駆細胞の反応能における変動を明らかにするクローン解析を示す図である。ＥＳ細胞から誘導された神経前駆細胞を、別個の時点（分化１０日目、１２日目、１４日目、及び１６日目）で分離した後、クローン密度（ｃｌｏｎａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）で６日間培養したが、主にリーリン＋ニューロンを生成する初期前駆細胞のクローンから、主にＣＴＩＰ２＋ニューロンを生成する後期前駆細胞のクローンへの、反応能における変動が明らかとなった。値は少なくとも１つの顕著なニューロンを含有するクローンの平均数を表す。Ｘ軸は分化の日数を表す。Ｙ軸は、個々のマーカーを発現するクローンの割合を表す。
【図９−１】ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１２日間〜１７日間分化させた後、新生仔マウスの前頭皮質に移植した、Ｔａｕプロモータの下でＧＦＰを発現するＥＳ細胞を示す図である。移植プロトコルの概略図である（Ａ）。ＥＳ細胞から誘導されたニューロン及び前駆細胞を運動皮質下に注入した。幾つかの散在ニューロンにより囲まれた、線条体及び側脳室（ＬＶ）に隣接する運動皮質に位置する移植片の代表的なケースを示す（ｂ、ｃ）。細胞の大部分はＧＦＰ陽性（ｂ）及びＭＡＰ−２陽性（ｃ）である。皮質中に見られる単一のＧＦＰ陽性ニューロンの代表的なケースを示す（ｄ）。典型的な錐体形態及び放射状配向に注目されたい。
【図９−２】ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１２日間〜１７日間分化させた後、新生仔マウスの前頭皮質に移植した、Ｔａｕプロモータの下でＧＦＰを発現するＥＳ細胞を示す図である。運動野（Ｍ）、体性感覚野（Ｓ）、聴覚野（Ａ）、及び視覚野（Ｖ）に由来する第ＶＩ層ニューロン（ｅ）及び第Ｖ層ニューロン（ｆ）の結合性の層特異的及び領域特異的な内因性パターンの概略図を示す。第ＶＩ層ニューロンは全領域において主に視床核へと投射するが、領域依存的な視床内結合特異性を示す（ｅ）：運動野から腹外側（ＶＬ）核、体性感覚野から基底腹側（ＶＢ）核、聴覚野から内側膝状（ＭＧ）核、及び視覚野から外側膝状（ＬＧ）核（他の目視標的ＬＤ／ＬＰは示さない）。第Ｖ層ニューロンは全領域において、より尾側の構造に投射し、同様に領域依存的な結合特異性を示す（ｆ）：運動野から尾側橋脚被蓋（pediculopontine）核（ＰＰＮ）及び脊髄、聴覚野から下丘、並びに視覚野から上丘及び頭側ＰＰＮ。
【図９−３】ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１２日間〜１７日間分化させた後、新生仔マウスの前頭皮質に移植した、Ｔａｕプロモータの下でＧＦＰを発現するＥＳ細胞を示す図である。移植の１ヶ月後のＧＦＰ染色により決定される移植ニューロンの投射パターンを示す（ｇ〜ｌ）。投射は脳梁（ｇ）、視覚皮質（ｈ）、内包、線条体（ｉ）、視床（ｊ）において見られ、繊維はｄＬＧ及びｖＬＧにほぼ排他的に位置するが、ごく少数がＶＢ（ｊ中の矢印）、大脳脚（ｋ）、及び最終的に上丘（その最浅層（superfical）部（矢印）を含む）（ｌ）に存在する。図９中のスケールバーは、（ｄ）：２０μｍ、（ｂ、ｃ、ｉ、ｋ）：５０μｍ、（ｇ、ｈ、ｊ、ｌ）：１００μｍである。全てのパネルにおいて背側が上であり、内側が左である。
【図１０Ａ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１２日間〜１７日間分化させた後、新生仔マウスの前頭皮質に移植した、Ｔａｕプロモータの下でＧＦＰを発現するＥＳ細胞を示す図である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで異なる期間（１２日間、１４日間、１７日間）分化させた移植細胞から放射される、層特異的標的において見られる繊維の割合の定量化を示す。分化時間の増加によって、より多くの皮質−皮質繊維及び皮質−視蓋（tectal）繊維が生じたが、皮質−視床繊維は減少した（＊＊＊は各々の標的についての３つの時点の比較に関するｐ＜０．００１である、Ｎ＝３０）。Ｙ軸は軸索投射の割合を表す。
【図１０Ｂ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１２日間〜１７日間分化させた後、新生仔マウスの前頭皮質に移植した、Ｔａｕプロモータの下でＧＦＰを発現するＥＳ細胞を示す図である。移植ニューロンの投射の領域特異性の定量化を示す。異なる皮質領域及び皮質下標的においてＧＦＰ＋繊維を示す移植動物（Ｎ＝３０）の割合の定量化を示す：視覚皮質（Ｖ１）、運動皮質（Ｍ１）、体性感覚皮質（Ｓ１）、及び辺縁皮質、中脳／後脳：上丘及び下丘（ＳＣ及びＩＣ）、橋脚被蓋核（ＰＰＮ）、中脳水道周囲灰白質（ＰＡＧＭ）、錐体路（Ｐｙｒ）、並びに脊髄（ＳｐＣ）。Ｙ軸は軸索成長を示す動物の割合を表す。
【図１０Ｃ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１２日間〜１７日間分化させた後、新生仔マウスの前頭皮質に移植した、Ｔａｕプロモータの下でＧＦＰを発現するＥＳ細胞を示す図である。移植ニューロンの投射の領域特異性の定量化を示す。視床核において選択的に見られる繊維数の定量化を示す：外側膝状（ＬＧ）核、内側膝状（ＭＧ）核、基底腹側核、腹外側核及び腹内側核（ＶＢ／ＶＬ／ＶＭ）、背外側（ＬＤ）核、後外側（lateroposterior）（ＬＰ）核、視床前核群（Ａｎｔ）、背内側核群（ＭＤ）。値は平均±標準誤差として示す（Ｎ＝３０の動物）。視覚皮質の標的は、特にＶ１／Ｖ２、ＳＣ、ＬＧ、及びＬＰであり、運動野／体性感覚野／聴覚野の標的は、特にＭＧ、ＶＢ／ＶＬ／ＶＭにより表し、び漫性／辺縁皮質標的は黒色に表示する。値は計数した繊維の平均±標準誤差として示す（Ｎ＝２８の動物；＊＊＊はｐ＜０．００１である）。Ｙ軸は軸索の平均数を表す。
【図１１】ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１２日間〜１７日間分化させた後、新生仔マウスの前頭皮質に移植した、Ｔａｕプロモータの下でＧＦＰを発現するＥＳ細胞を示す図である。ＥＳ細胞から誘導されたニューロンが、ｉｎ  ｖｉｖｏで移植した場合に、ニューロン投射の層特異的及び領域特異的なパターンを示すことを示す。Ｔａｕプロモータの下でＧＦＰを発現するＥＳ細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１２日間〜１７日間分化させた後、新生仔マウスの前頭皮質に移植した。投射パターンを１ヶ月後にＧＦＰ染色により決定した。写真は外胞（ａ）を介した、辺縁皮質：嗅周皮質（ｂ）及び脳梁膨大後皮質（ｃ）、視床の下にある内包（ｄ）及び橋脚被蓋核（ｅ）までの投射を示す。スケールバーは１００μｍ（ａ〜ｃ）又は５０μｍ（ｄ、ｅ）を表す。全ての図において背側が上であり、内側が左である。
【図１２Ａ】腹側終脳同一性を有する神経前駆細胞及びニューロン（皮質介在ニューロン、線条体介在ニューロン、線条体投射ニューロンを含む）が、ＤＤＭ＋Ｓｈｈ（１μＭ〜１０μＭ）又はＤＤＭ＋ＤＤＫ  Ｗｎｔ阻害物質（１００ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌ）、又は両方の組み合わせ（それぞれ１μＭ及び１００ｎｇ／ｍｌ）によってＥＳ細胞から生成され得ることを示す図である。ＤＤＭ又はＤＤＭ＋Ｓｈｈ又はＤＤＭ＋ＤＫＫにおける１４日間の分化の後、特定の神経領域化マーカーを発現するネスチン陽性神経前駆細胞の割合を示す。
【図１２Ｂ】腹側終脳同一性を有する神経前駆細胞及びニューロン（皮質介在ニューロン、線条体介在ニューロン、線条体投射ニューロンを含む）が、ＤＤＭ＋Ｓｈｈ（１μＭ〜１０μＭ）又はＤＤＭ＋ＤＤＫ  Ｗｎｔ阻害物質（１００ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌ）、又は両方の組み合わせ（それぞれ１μＭ及び１００ｎｇ／ｍｌ）によってＥＳ細胞から生成され得ることを示す図である。ＤＤＭ単独又はＤＤＭ＋Ｓｈｈ又はＤＤＭ＋ＤＫＫ、又はＤＤＭ＋Ｓｈｈ／ＤＫＫにおける２１日間の分化の後の、Ｔｕｊ１陽性ニューロンにおける、ＶｇｌｕＴ１、ＶｇｌｕＴ２及びｖＧＡＴ、並びにリーリン、Ｔｂｒ１、Ｉｓｌ１の割合を示す。
【図１２Ｃ】腹側終脳同一性を有する神経前駆細胞及びニューロン（皮質介在ニューロン、線条体介在ニューロン、線条体投射ニューロンを含む）が、ＤＤＭ＋Ｓｈｈ（１μＭ〜１０μＭ）又はＤＤＭ＋ＤＤＫ  Ｗｎｔ阻害物質（１００ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌ）、又は両方の組み合わせ（それぞれ１μＭ及び１００ｎｇ／ｍｌ）によってＥＳ細胞から生成され得ることを示す図である。ＤＤＭ単独又はＤＤＭ＋Ｓｈｈ又はＤＤＭ＋ＤＫＫ、又はＤＤＭ＋Ｓｈｈ／ＤＫＫにおける２１日間の分化の後の、Ｔｕｊ１陽性ニューロンにおける、ＶｇｌｕＴ１、ＶｇｌｕＴ２及びｖＧＡＴ、並びにリーリン、Ｔｂｒ１、Ｉｓｌ１の割合を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本明細書中で使用される場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」は、文脈上別段の明らかな指示がない限り、単数及び複数両方の指示対象を含む。
【００３９】
本明細書中で使用される「含む（comprising）」、「含む（comprises）」、及び「から成る（comprised of）」という用語は、「含む（including）」、「含む（includes）」、又は「含有する（containing）」、「含有する（contains）」と同義であり、包括的又は無制限であり、追加の列挙していない成員、要素、又は方法工程を除外するものではない。
【００４０】
端点による数値範囲の列挙には、個々の範囲に含まれる全ての数値及び少数、並びに列挙した端点が含まれる。
【００４１】
本明細書中で使用される「約」という用語は、パラメータ、量、期間（temporal duration）等の測定可能な値に言及する場合、指定の値から（ofand from）±１０％以下、好ましくは±５％以下、より好ましくは±１％以下、さらにより好ましくは±０．１％以下の変動を、かかる変動が開示の発明において実施するのに適当である限りにおいて包含することを意図される。修飾語「約」が指す値は、それ自体も具体的に、好ましくは開示されることが理解されよう。
【００４２】
本明細書中に引用される全ての文献は、その全体が参照により本明細書中に援用される。特に、本明細書中で具体的に言及される全ての文献の教示が参照により援用される。
【００４３】
本明細書における本発明の背景に関する考察は、本発明の内容を説明するために含まれる。これは、参照されるそれらの資料のいずれも、いずれかの請求項の優先日の時点で、どの国においても公開されている、既知である、又は共通の一般知識の一部であることを認めるものであるとは見なされない。
【００４４】
特に規定のない限り、本発明を開示するにあたって使用される全ての用語（技術用語及び科学用語を含む）は、本発明が属する技術分野において通常の技術を有する者（当業者）によって一般に理解される意味を有する。用語の定義は、さらなる指針によって、本発明の教示をより良く理解するために含まれる。特定の用語が特定の態様又は実施形態に関連して規定される場合、かかる含意が本明細書全体を通して、すなわち、特に規定のない限り、他の態様又は実施形態に関しても適用されることが意図される。
【００４５】
本発明に関する一般的方法については、特に、例えば"Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed."(Sambrook et al., 1989)、Animal Cell Culture (R. I.Freshney, ed., 1987)、the series Methods in Enzymology(Academic Press)、Gene Transfer Vectors for MammalianCells (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987)、"CurrentProtocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3rdEd." (F. M. Ausubel et al., eds., 1987 & 1995)、Recombinant DNA Methodology II (R. Wu ed., Academic Press 1995)を含む既知の教科書を参照されたい。
【００４６】
細胞培養及び培地の使用における一般的技法は、特に、Large Scale Mammalian Cell Culture (Hu et al. 1997. Curr OpinBiotechnol 8: 148)、Serum-free Media (K. Kitano. 1991.Biotechnology 17: 73)、又はLarge Scale Mammalian CellCulture (Curr Opin Biotechnol 2: 375, 1991)（参照により本明細書中に援用される）に概説される。
【００４７】
本発明の実施において有用な一般的技法のさらなる詳細については、実践者は細胞生物学、組織培養、及び発生学における標準的な教科書及び総説を参照することができる。特に、"Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practicalapproach" (E. J. Robertson, ed., IRL Press Ltd. 1987)、"Guide to Techniques in Mouse Development" (P. M.Wasserman et al. eds., Academic Press 1993)、"EmbryonicStem Cells: Methods and Protocols" (Kursad Turksen, ed., Humana Press,Totowa N. J., 2001)、"Embryonic Stem CellDifferentiation in Vitro" (M. V. Wiles, Meth. Enzymol. 225: 900, 1993)、"Properties and uses of Embryonic Stem Cells: Prospects forApplication to Human Biology and Gene Therapy" (P. D. Rathjen et al.,al.,1993)が挙げられる。幹細胞の分化は、例えば、Robertson. 1997. Meth CellBiol 75: 173、Roach and McNeish. 2002. Methods Mol Biol185: 1-16、及びPedersen. 1998. Reprod Fertil Dev 10: 31（参照により本明細書中に援用される）に概説される。
【００４８】
言及したように、本発明の方法によって、神経前駆細胞又は成熟ニューロン様細胞を、未分化哺乳類多能性幹（ｍＰＳ）細胞とは離れて生成することができる。
【００４９】
「前駆細胞」又は「前駆体」という用語は概して、適当な条件下で少なくとも１つの比較的より特殊化した細胞型、特に、比較的より特殊化した前駆細胞又は最終的に（eventually to terminally）分化した細胞、すなわち、有糸分裂後であり得る完全に特殊化した細胞を生じさせることのできる、特殊化していない又は比較的特殊化していない細胞、及び増殖能を有する細胞を指す。
【００５０】
「神経前駆細胞」又は「神経前駆体」という用語は、適当な条件下で、排他的に又は大部分が１つ又は複数の細胞型の神経系（ニューロン及び／又はグリア等）を生じさせることのできる前駆細胞を指す。
【００５１】
「幹細胞」という用語は、自己複製がさらに可能な、すなわち適当な条件下で分化することなく増殖することができる、本明細書中で規定されるような前駆細胞を指す。該用語は、実質的に無制限の自己複製が可能な幹細胞、すなわち、子孫の少なくとも一部が、母幹細胞の特殊化していない又は比較的特殊化していない表現型、分化能、及び増殖能を実質的に保持する幹細胞、並びに制限された自己複製を示す幹細胞、すなわち、子孫のさらなる増殖及び／又は分化に関する能力が、母細胞と比較して明らかに低下した幹細胞を包含する。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、修飾語「多能性」は、生物の３つの胚葉全て、すなわち中胚葉、内胚葉、及び外胚葉に由来する細胞型を生じさせることの可能な幹細胞、並びに全生物へと成長することは可能ではないが、生物のいずれか及び全ての細胞型を生じさせることが潜在的に可能な幹細胞を表す。
【００５３】
前駆細胞又は幹細胞は、別の比較的より特殊化した細胞を、例えば前駆細胞又は幹細胞が、先に細胞分裂を受けることなく分化して、上記他の細胞となる場合、又は上記他の細胞が１回又は複数回の細胞分裂、及び／又は前駆細胞又は幹細胞の分化の後に産生される場合に「生じさせる」と言われる。
【００５４】
「哺乳類多能性幹細胞」又は「ｍＰＳ細胞」という用語は概して、哺乳類起源の多能性幹細胞を指す。「哺乳類」という用語は、ヒト、家畜（domestic and farm animals）、動物園の動物、競技用の動物、愛玩動物、コンパニオンアニマル、及び実験動物、例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、畜牛（cattle）、乳牛（cows）、ヒツジ、ウマ、ブタ、及び霊長類（例えばサル及び類人猿）を含む（これらに限定されない）哺乳類に分類される任意の動物を指す。
【００５５】
一実施形態では、ｍＰＳ細胞は非ヒト哺乳類に由来し得る。例えば、一実施形態では、ｍＰＳ細胞は実験動物、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、又はウサギ、より好ましくはマウスに由来し得る。別の好ましい実施形態では、ｍＰＳ細胞はブタに由来し得る。さらに別の好ましい実施形態では、ｍＰＳ細胞は非ヒト霊長類等の霊長類に由来し得る。さらに別の好ましい実施形態では、ｍＰＳ細胞はヒトに由来し得る。
【００５６】
原型ｍＰＳ細胞は、任意の種類の哺乳類胚性組織、例えば胚組織、胎生組織、又は胎生前（pre-foetal）組織に由来する多能性幹細胞であり、細胞は、標準的な当該技術分野で認められた試験、特にＳＣＩＤマウスにおいて奇形腫を形成する能力、又は組織培養において３つの胚葉全ての同定可能な細胞を形成する能力等によって、適当な条件下で３つの胚葉全て、すなわち内胚葉、中胚葉、及び外胚葉の誘導体である異なる細胞型の子孫を産生することが可能である。
【００５７】
したがって、例えばEvans & Kaufman 1981 (Nature 292: 154-6)及びMartin 1981 (PNAS 78: 7634-8)により記載されるマウス胚性幹細胞；例えばIannaccone et al. 1994 (Dev Biol 163: 288-292)により記載されるラット多能性幹細胞；例えばDoetschman et al. 1988 (Dev Biol 127: 224-227)により記載されるハムスター胚性幹細胞；例えばGraves et al. 1993 (Mol Reprod Dev 36: 424-433)により記載されるウサギ胚性幹細胞；例えばNotarianni et al. 1991 (J Reprod Fertil Suppl 43: 255-60)及びWheeler 1994 (Reprod Fertil Dev 6: 563-8)により記載されるブタ多能性幹細胞；例えばNotarianni et al. 1991（上掲）により記載されるヒツジ胚性幹細胞；例えばRoach et al. 2006 (Methods Enzymol 418: 21-37)により記載されるウシ胚性幹細胞；例えばThomson et al. 1998 (Science 282: 1145-1147)により記載されるヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞；例えばShamblott et al. 1998 (PNAS 95: 13726)により記載されるヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞；例えばThomson et al. 1995 (PNAS 92:7844-7848)により記載されるアカゲザル幹細胞、又は例えばThomson et al. 1996 (Biol Reprod 55: 254-259)により記載されるマーモセット幹細胞等の他の霊長類に由来する胚性幹細胞により例示される（これらに限定されない）、様々なタイプの胚性幹細胞がｍＰＳ細胞の定義に含まれる。
【００５８】
上記用語には、それが胚性組織、胎生組織、又は他の起源のいずれに由来するかにかかわらず、３つの胚葉全ての誘導体を含む子孫を産生することが可能な哺乳類起源の任意の細胞のような他のタイプのｍＰＳ細胞も含まれる。ｍＰＳ細胞は、悪性起源に由来しない。細胞又は細胞株は、それが癌性でない一次組織から樹立され、且つ既知の癌遺伝子によって変性されていない場合に「非悪性起源」に由来する。ｍＰＳが、適当な条件下での長期培養にわたって正常な核型を維持することは必ずしも必要ではないが、望ましい場合もある。また、ｍＰＳが適当なｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下で、実質的に無限の自己複製能を維持することは必ずしも必要ではないが、望ましい場合もある。
【００５９】
言及したように、原型「ヒトＥＳ細胞」は、Thomson et al. 1998（上掲）及び米国特許第６，２００，８０６号明細書に記載されている。該用語の範囲は、胞胚期、又は細胞が３つの胚葉に実質的に分化する前のヒト胚に由来する多能性幹細胞に及ぶ。ＥＳ細胞、特にｈＥＳ細胞は典型的には、胚盤胞の内細胞塊又は全胚盤胞に由来する。桑実胚期からのｈＥＳ細胞株の誘導が報告されており、そのように得られたＥＳ細胞も本発明において使用することができる（Strelchenko et al. 2004. Reproductive BioMedicine Online 9: 623-629）。言及したように、原型「ヒトＥＧ細胞」はShamblott et al. 1998（上掲）により記載されている。かかる細胞は、例えば胎児から得た始原生殖細胞を含有する生殖隆起及び隔膜から誘導され得る。ヒトにおいては、胎児は典型的には受精後５週〜１１週であり得る。
【００６０】
「ｍＰＳ細胞」という用語は、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、個々の細胞の表現型の特性を有する一次組織細胞及び樹立株、並びに依然として３つの胚葉各々の子孫を産生する能力を有している、かかる初代細胞又は細胞株の誘導体を含み得ることが当業者には理解される。
【００６１】
ヒトＥＳ細胞の樹立株の非限定的な例としては、米国国立衛生研究所のヒト胚性幹細胞レジストリ（http://stemcells.nih.gov/research/registry）に挙げられる株、並びにその亜株、例えばBresagen Inc.（Athens，GA）からのｈＥＳＢＧＮ−０１株、ｈＥＳＢＧＮ−０２株、ｈＥＳＢＧＮ−０３株、及びｈＥＳＢＧＮ−０４株、Cellartis AB（Goeteborg，Sweden）からのＳａｈｌｇｒｅｎｓｋａ  １株及びＳａｈｌｇｒｅｎｓｋａ  ２株、ESCell International（Singapore）からのＨＥＳ−１株、ＨＥＳ−２株、ＨＥＳ−３株、ＨＥＳ−４株、ＨＥＳ−５株、及びＨＥＳ−６株、MizMedi Hospital（Seoul，Korea）からのＭｉｚ−ｈＥＳ１株、Technion - Israel Instituteof Technology（Haifa，Israel）からのＩ  ３株、Ｉ  ３．２株、Ｉ  ３．３株、Ｉ  ４株、Ｉ  ６株、Ｉ  ６．２株、Ｊ  ３株、及びＪ  ３．２株、University of California（San Francisco，CA）からのＨＳＦ−１株及びＨＳＦ−６株、Wisconsin AlumniResearch Foundation / WiCell Research Institute（Madison，WI）からのＨ１株、Ｈ７株、Ｈ９株、Ｈ１３株、Ｈ１４株、Cell & GeneTherapy Research Institute / Pochon CHA University College of Medicine（Seoul，Korea）からのＣＨＡ−ｈＥＳ−１株及びＣＨＡ−ｈＥＳ−２株、Geron Corporation（Menlo Park，CA）からのＨ１株、Ｈ７株、Ｈ９株、Ｈ１３株、Ｈ１４株、Ｈ９．１株、及びＨ９．２株、GoeteborgUniversity（Goeteborg，Sweden）からのＳａｈｌｇｒｅｎｓｋａ  ４株〜Ｓａｈｌｇｒｅｎｓｋａ  １９株、Maria Biotech Co. Ltd.（Seoul，Korea）からのＭＢ０１株、ＭＢ０２株、ＭＢ０３株、National Centrefor Biological Sciences（Bangalore，India）からのＦＣＮＣＢＳ１株、ＦＣＮＣＢＳ２株、及びＦＣＮＣＢＳ３株、並びにRelianceLife Sciences（Mumbai，India）からのＲＬＳ  ＥＳ  ０５株、ＲＬＳ  ＥＳ  ０７株、ＲＬＳ  ＥＳ  １０株、ＲＬＳ  ＥＳ  １３株、ＲＬＳ  ＥＳ  １５株、ＲＬＳ  ＥＳ  ２０株、及びＲＬＳ  ＥＳ  ２１株が挙げられる。樹立ｈＥＳ細胞株の他の例としては、英国幹細胞バンク（http://www.ukstemcellbank.org.uk/）に寄託される株、並びにその亜株、例えばKing's College London（London，UK）からのＷＴ３株、及びUniversity of Newcastle（Newcastle，UK）からのｈＥＳ−ＮＣＬ１株が挙げられる（Strojkovic et al. 2004. Stem Cells 22: 790-7）。ＥＳ細胞株のさらなる例としては、Cellartis AB（Goeteborg，Sweden）からのＦＣ０１８株、ＡＳ０３４株、ＡＳ０３４．１株、ＡＳ０３８株、ＳＡ１１１株、ＳＡ１２１株、ＳＡ１４２株、ＳＡ１６７株、ＳＡ１８１株、ＳＡ１９１株、ＳＡ１９６株、ＳＡ２０３株、及びＳＡ２０４、並びにその亜株が挙げられる。
【００６２】
「哺乳類多能性幹細胞」という用語にはさらに、特にYamanaka et al. 2006 (Cell 126: 663-676)及びYamanakaet al. 2007 (Cell 131: 861-872)によって教示されるような誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞の使用を含む操作、特に体細胞、特に哺乳類成体体細胞等の非多能性哺乳類細胞の遺伝学的及び／又は増殖因子を介して行なわれる操作等によって得ることのできるｍＰＳ細胞が含まれる。
【００６３】
哺乳類、特にマウス又はヒトの多能性細胞の特性を有するさらなる細胞株、特にＥＳ細胞又はＥＧ細胞が将来樹立され、これらも本発明に適切であり得ることが当業者には理解される。当業者はまた、当該技術分野において既知の技法を使用して、任意の樹立された又は未だ樹立されていないｍＰＳ細胞株又はその亜株が、未分化状態でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ増大、好ましくは正常な核型及び分化多能性等、望ましい細胞特性を示すことを検証することができる。
【００６４】
ｍＰＳ細胞若しくは細胞株又はその培養物は、幹細胞集団においてかなりの割合（例えば少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最大１００％）の細胞が、分化を受けている細胞から明らかに区別される未分化ｍＰＳ細胞の特性（例えば形態学的特徴又は弁別的特徴（markers））を示す場合に、「未分化である」として記載される。未分化ｍＰＳ細胞は概して、当業者により容易に認識され、顕微鏡の視界の二次元において、高い核／細胞質比で、顕著な核小体とともに見ることができる。集団内の未分化細胞のコロニーが、より分化した隣接細胞に囲まれている場合もあることが理解される。それにもかかわらず、集団をそれ自体が既知の適当な条件下で培養又は継代培養した（passaged）場合でも、未分化コロニーは残存し、個々の未分化細胞は細胞集団において実質的な割合を占める。未分化ｍＰＳ細胞は段階特異的な胚抗原（ＳＳＥＡ）３及び４、並びにＴｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１と称される抗体を用いて検出可能なマーカーを発現し得る（Thomson et al. 1998、上掲）。未分化ｍＰＳ細胞はまた、典型的にはＯｃｔ−４及びＴＥＲＴを発現し得る。
【００６５】
本明細書において、「分化」、「分化させる」、又は「その誘導体」という用語は、特殊化していない又は比較的特殊化していない細胞、例えばｍＰＳ細胞又はその子孫を、比較的より特殊化しているようにするプロセスを表す。細胞個体発生との関連においては、形容詞「分化した」は相対的な用語である。したがって、「分化した細胞」は、或る特定の発生経路が、それが比較される細胞よりさらに前進した細胞である。分化した細胞は、例えば最終分化した細胞、すなわち、生物の様々な組織又は器官において特殊化した機能を利用することが可能な完全に特殊化した細胞（有糸分裂後である必要はない）であるか、又は分化した細胞それ自体が、特定の分化系統においてさらに増殖及び／又は分化することができる前駆細胞であり得る。比較的より特殊化した細胞は、特殊化していない又は比較的特殊化していない細胞とは、１つ又は複数の明らかな表現型の特性、例えば特定の細胞成分又は産物、例えばＲＮＡ、タンパク質、又は他の物質の存在、非存在又は発現レベル、或る特定の生化学的経路の活性、形態的外観、増殖能及び／又は動態、分化能及び／又は分化シグナルへの応答、電気生理学的挙動等の点で異なる場合があり、かかる特性は、比較的より特殊化した細胞の上記発生経路に沿ったさらなる進行を表す。
【００６６】
本発明の方法の最初の工程、特に上記態様Ａ１〜態様Ａ４の工程ａ）は、未分化ｍＰＳ細胞を、細胞を接着することが可能な基質上にプレーティングすることを含む。したがって、本発明の方法は、細胞を最初に胚様体を介して分化させること（浮遊培養）ではなく、接着培養におけるｍＰＳ細胞の直接分化を含む。
【００６７】
「プレーティングする」、「播種する」又は「接種する」という用語は概して、細胞集団を、導入した細胞の生存及び／又は成長を促進することが可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境に導入することを指す。典型的には、上記環境は、適切に周囲と区切られた系、例えばそれ自体が既知の培養容器、例えば細胞培養フラスコ、ウェルプレート又は皿等において提供され得る。上記環境は少なくとも、細胞の生存及び／又は成長を助ける培地、典型的には液体培地を含む。培地は新鮮な培地、すなわち、以前に細胞の培養に使用していない培地であるか、又は細胞をその中で前培養すること、例えばプレーティングされる細胞若しくはその前駆物質を培養すること、又はプレーティングされる細胞と無関係の細胞を培養することにより調節された部分を少なくとも含み得る。
【００６８】
分化させることなく成長させたｍＰＳ細胞は典型的には、接着基質上でコロニーを形成する。そのように成長させたｍＰＳ細胞のプレーティングを可能にするために、上記基質から分離して、少なくとも部分的に互いに解離して、通常は等張緩衝液（例えばＰＢＳ又はハンクス平衡塩溶液）又は培地中のｍＰＳ細胞及び／又はその塊若しくは集合の分散液を得てもよい。接着ｍＰＳ培養物を分離及び解離する適当な方法は、当該技術分野において一般に知られており、タンパク質分解酵素、二価イオンのキレート化、機械的分解、又は上記のいずれかの組み合わせによる処理を含み得るが、これらに限定されない。
【００６９】
例示的なタンパク質分解酵素には、例えばトリプシン、コラゲナーゼ（例えばコラゲナーゼタイプＩ、コラゲナーゼタイプＩＩ、コラゲナーゼタイプＩＩＩ、又はコラゲナーゼタイプＩＶ）、エラスターゼ、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）（Innovative Cell Technologies）、ディスパーゼ、プロナーゼ、パパイン、プラスミン、又はプラスミノーゲン（国際公開第１９９４／０３５８６号パンフレット）が包含され、これらは当該技術分野においてそれ自体が既知の量及び条件で使用され得る。トリプシン又はコラゲナーゼが好適であり得る。二価イオン、主にＣａ２＋及びＭｇ２＋のキレート化は、キレート剤、例えばＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）若しくはそのジナトリウム塩、又はＥＧＴＡ（エチレングリコール（ethyleneglycerol）四酢酸）若しくはそのジナトリウム塩を使用し、それ自体が既知の濃度及び条件を用いて達成することができる。ＥＤＴＡが好適であり得る。例示的な細胞の機械的解離は、細胞コロニー、塊又は集合を小口径ピペット（例えば１０００μｌマイクロピペットチップ）に繰返し通し、細胞の結合を切断することを含み得る。機械的細胞解離は、単離において使用する場合、細胞損傷をもたらすため、タンパク質分解酵素及び／又はキレート剤による前処理と有利に組み合わせられ得る。細胞分離及び解離の適切な方法は、細胞の生存能力を保存するものでなくてはならない。好ましくは、分離及び解離の後得られる細胞懸濁液は、生細胞の少なくとも６０％、例えば生細胞の７０％以上、より好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上、又は最大１００％を含み得る。
【００７０】
続くプレーティングのためのｍＰＳ細胞の分離及び解離は、個別のｍＰＳ細胞及び／又はｍＰＳ細胞の塊若しくは集合を含む細胞懸濁液を生じさせ得る。例えば、分離及び解離の条件は、少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は最大１００％のｍＰＳ細胞を個別の細胞として含む細胞懸濁液を提供するもの等であり得る。かかる細胞懸濁液中に存在するｍＰＳ細胞の塊又は集合は平均で、例えば１個超〜１０００個の細胞、１個〜５００個の細胞、１個〜１００個の細胞、１個〜５０個の細胞、又は１個〜２０個の細胞、例えば約５個の細胞、約１０個の細胞、又は約１５個の細胞を含有し得る。
【００７１】
好ましくは、未分化ｍＰＳ細胞は、比較的低い密度、例えば約１×１０１細胞／ｃｍ２〜約１×１０５細胞／ｃｍ２、より好ましくは約１×１０２細胞／ｃｍ２〜約５×１０４細胞／ｃｍ２、さらに好ましくは約１×１０３細胞／ｃｍ２〜約１×１０４細胞／ｃｍ２、例えば約１×１０３細胞／ｃｍ２、約２×１０３細胞／ｃｍ２、約３×１０３細胞／ｃｍ２、約４×１０３細胞／ｃｍ２、約５×１０３細胞／ｃｍ２、約６×１０３細胞／ｃｍ２、約７×１０３細胞／ｃｍ２、約８×１０３細胞／ｃｍ２、又は約９×１０３細胞／ｃｍ２でプレーティングしてもよい。
【００７２】
言及したように、未分化ｍＰＳ細胞は、細胞を接着することが可能な基質上にプレーティングされる。したがって、ｍＰＳ細胞をプレーティングする培養系は、細胞接着に適合する表面を含み、それによりそのようにプレーティングしたｍＰＳ細胞が上記基質表面に接触及び付着し得る。
【００７３】
概して、細胞を接着することが可能な基質は、実質的に親水性の任意の基質であり得る。一実施形態では、適切な接着基質は、典型的には極性及び／又は親水性の化学的部分、例えばアミン、アミド、カルボニル、カルボキシレート、エステル、ヒドロキシル、スルフヒドリル等を呈し得る、表面処理済みの（例えば、当該技術分野において既知の大気圧コロナ放電、高周波真空プラズマ処理、又はＤＣグロー放電若しくはプラズマ処理により処理した）組織培養プラスチックであり得る。代替的な実施形態では、適切な接着基質は、上記で挙げられるような官能基を導入して、親水性を高めるように任意で表面処理したガラスであり得る。さらなる接着基質は、例えば組織培養プラスチック又はガラスを、親水性の物質で表面コーティングすることにより作製され得る。一例では、上記コーティングは適切なポリカチオン、例えばポリオルニチン又はポリリシンを含み得る。他の例では、好ましいコーティングは、細胞外基質の１つ又は複数の成分、例えばＥＣＭタンパク質のフィブリン、ラミニン、コラーゲン（好ましくは１型コラーゲン）、ゼラチン、グリコサミノグリカン（例えばヘパリン又はヘパラン硫酸）、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、アグリカン、アグリン、骨シアロタンパク質、軟骨基質タンパク質、フィブリノーゲン、ファイブリン（fibulin）、ムチン、エンタクチン、オステオポンチン、プラスミノーゲン、レストリクチン（restrictin）、セルグリシン、ＳＰＡＲＣ／オステオネクチン、バーシカン、トロンボスポンジン１、又はカドヘリン、コネキシン、セレクチンを含む細胞接着分子を、単独又は様々な組み合わせで含み得る。
【００７４】
本発明による未分化ｍＰＳ細胞をプレーティングするための接着基質表面の特に好ましい例は、ゼラチンを含むか、又はゼラチンから成る。本明細書中で使用される「ゼラチン」という用語は、皮膚、骨及び骨質等の動物のコラーゲン含有部位から加水分解作用、通常は酸加水分解又はアルカリ加水分解のいずれかによって得られた、平均分子量の高い水溶性タンパク質の不均一混合物を指す。「ゼラチン」という用語はまた、アセチル化ゼラチン又は架橋ゼラチン等、その適切な化学的誘導体を包含する。組織培養表面のゼラチンによる表面処理のプロトコルは、当該技術分野において既知である。例示としては、限定されるものではないが、培養容器は、例えば蒸留水、好ましくは滅菌水中、０．０２％〜１％（ｗ／ｖ）、典型的には約０．１％（ｗ／ｖ）のゼラチンで２時間以上、例えば２４時間処理され得る。
【００７５】
典型的には、未分化ｍＰＳ細胞をプレーティングした後、細胞懸濁液を接着表面と接触させたままにし、プレーティングした細胞集団からｍＰＳ細胞を上記基質に接着させる。
【００７６】
実施形態では、ｍＰＳ細胞懸濁液は、少なくとも約０．５時間、例えば約１時間以上、好ましくは約２時間以上、約４時間以上、より好ましくは約８時間以上、例えば約１２時間以上、さらに好ましくは約１６時間以上、例えば約２０時間以上、最も好ましくは約２４時間以上、又はそれ以上、例えば少なくとも約２８時間、３２時間、３６時間、４０時間、４４時間又は４８時間接着表面と接触させることができる。さらに好ましい実施形態では、ｍＰＳ細胞懸濁液は約２時間〜約４８時間、例えば約１２時間、約２４時間、約３６時間又は約４８時間接着表面と接触させることができる。より長い接触時間（非接着物質の除去の前に）が可能であるが、一般に必要ではない。
【００７７】
ｍＰＳ細胞を接着基質に付着させた後、典型的には非接着物質を培養系から除去する。非接着物質は、例えば接着基質に付着していない細胞、非生細胞又は死細胞、細胞片等を含み得る。非接着物質は、培養系内の培地の交換（任意で付着した細胞を適切な培地又は等張緩衝液で１回又は複数回洗浄することを含む）により適切に除去することができる。これによって、基質表面に接着した細胞が、さらなる培養のために未分化ｍＰＳ懸濁液から選択される。
【００７８】
本発明の方法のさらなる工程、特に上記態様Ａ１〜態様Ａ４の工程ｂ）は、接着基質に付着したｍＰＳ細胞を、ｍＰＳ細胞の分化を許容する培地中で培養することを含む。「培養する」という用語は通常、細胞を維持すること及び／又は成長させることを指す。
【００７９】
「ｍＰＳ細胞の分化を許容する培地」という用語は、培地が、ｍＰＳ分化を抑制するか、又は未分化状態若しくは実質的に未分化の状態でのｍＰＳの維持及び／又は増殖を引き起こす可能性のある成分を、十分な量で含有しないことを意味する。例示としては、培地に含まれないかかる成分として、特定のｍＰＳ細胞型に応じて、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）、及び／又は胚性線維芽細胞支持細胞（feeders）、又はかかる支持細胞の調節培地が挙げられ得る。
【００８０】
実施形態では、培地は、当該技術分野において一般に知られる基本培地製剤を含み得る。適切な基本培地製剤としては、市販の（例えばInvitrogen，Carlsbad，California）最小必須培地（ＭＥＭ）、α改良最小必須培地（α−ＭＥＭ）、基本必須培地（Basal Medium Essential）（ＢＭＥ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｆ−１２  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｈａｍ；例えばHam 1965. PNAS 53: 288を参照）、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（ＮＭ；例えばBrewer et al. 1993. J Neurosci Res 35: 567-76）等が挙げられるが、これらに限定されない。上記のような基本培地の組成はそれ自体が既知であり、哺乳類細胞発生に必要とされる成分を含有する。例えば、かかる成分は無機塩（好ましくは少なくとも、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｃｌ、Ｐ、場合によってはＣｕ、Ｆｅ、Ｓｅ、及びＺｎを含有する塩）、生理的緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ、重炭酸塩緩衝液、又はリン酸緩衝液）、アミノ酸、ビタミン、及び炭素源（例えばグルコース、又はピルビン酸塩、例えばピルビン酸ナトリウム）を含有し、任意で還元剤（例えばグルタチオン）、ヌクレオチド、ヌクレオシド、及び／又は核酸塩基、リボース、デオキシリボース等も含み得る。また、培地には、さらなるＬ−グルタミン、非必須アミノ酸、β−メルカプトエタノール、タンパク因子、例えばインスリン、トランスフェリン、若しくはウシ血清アルブミン、抗菌性成分及び／又は抗真菌性成分、例えばペニシリン、ストレプトマイシン、及び／又はアムホテリシン、又は他の成分を含む（これらに限定されない）１つ又は複数の関心の化合物がさらに添加され得る。
【００８１】
本発明の方法により、ｍＰＳ細胞の神経前駆細胞又は成熟ニューロン様細胞への分化が達成される。したがって、本発明者らが最適化した培地は、特にｍＰＳ細胞及び得られた神経細胞、特にニューロンの両方の生存及び／又は成長を助けるものである。
【００８２】
したがって、好ましい実施形態では、ｍＰＳ細胞の分化に採用される基本培地は、ＤＭＥＭ、Ｆ１２、又はＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（ＮＭ）、又はそれらの任意の混合物、より好ましくはＤＭＥＭ又はＦ１２又はそれらの混合物から選択され得る。特に好ましい実施形態では、ｍＰＳ細胞を分化するために採用される基本培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２混合物、より好ましくは１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の混合物である。
【００８３】
好ましい実施形態では、適切な基本培地は、神経細胞の生存を助けるさらなる成分、より好ましくはインスリン、トランスフェリン、プロゲステロン、プトレシン、及び亜セレン酸塩から選択されるいずれか１つ、さらに好ましくは任意の２つ以上、最も好ましくは全ての成分を含み得る。好ましくは、培地はインスリンを含み、本発明者らにより実現されるように、特にｍＰＳ細胞の所望の分化を促進し得る。
【００８４】
かかる成分は、好ましくは以下のように存在し得る：インスリン：通常は約０．１μＭ〜約５．０μＭ、好ましくは約０．５μＭ〜約１．５μＭ、より好ましくは約０．８μＭ〜約１．０μＭ、例えば約０．８５μＭ、約０．９μＭ、又は約０．９５μＭ、例えば、０．８６１μＭの最終濃度、トランスフェリン：通常は約１μＭ〜約１００μＭ、好ましくは約２μＭ〜約５０μＭ、より好ましくは約５μＭ〜約２０μＭ、例えば約１０μＭの最終濃度、プロゲステロン：通常は約１ｎＭ〜１００ｎＭ、好ましくは約５ｎＭ〜約５０ｎＭ、より好ましくは約１０ｎＭ〜約３０ｎＭ、例えば約２０ｎＭの最終濃度、プトレシン：通常は約１０μＭ〜１ｍＭ、好ましくは約５０μＭ〜約５００μＭ、より好ましくは約５０μＭ〜約２００μＭ、さらに好ましくは約８０μＭ〜約１２０μＭ、例えば約９０μＭ、約１００μＭ、又は約１１０μＭ、例えば１００．１μＭの最終濃度、亜セレン酸塩：通常は約３ｎＭ〜約３００ｎＭ、好ましくは約１０ｎＭ〜約１００ｎＭ、より好ましくは約２０ｎＭ〜約５０ｎＭ、例えば約３０ｎＭ又は約４０ｎＭ、例えば３０．１ｎＭの最終濃度。
【００８５】
さらに好ましい実施形態では、適切な基本培地は、神経細胞の生存を助けるさらなる成分、より好ましくはＬ−グルタミン、ＭＥＭ−非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、β−メルカプトエタノール、及びウシ血清アルブミン（好ましくはフラクションＶ）から選択されるいずれか１つ、さらに好ましくは任意の２つ以上、最も好ましくは全ての成分を含み得る。かかる成分は、好ましくは以下のように存在し得る：Ｌ−グルタミン：通常は約０．５ｍＭ〜約１０ｍＭ、好ましくは約１ｍＭ〜約５ｍＭ、より好ましくは約２ｍＭの最終濃度、ＭＥＭ−非必須アミノ酸：通常は１×の最終濃度、ピルビン酸ナトリウム：通常は約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、好ましくは約０．５ｍＭ〜約５ｍＭ、より好ましくは約０．８ｍＭ〜約１．２ｍＭ、例えば約１ｍＭの最終濃度、β−メルカプトエタノール：通常は約１０μＭ〜約１ｍＭ、好ましくは約５０μＭ〜約５００μＭ、より好ましくは約８０μＭ〜約１２０μＭ、例えば約１００μＭ又は約１１０μＭの最終濃度、ＢＳＡ：通常は約５０μｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１００μｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約２５０μｇ／ｍｌ〜約７５０μｇ／ｍｌ、例えば約５００μｇ／ｍｌの最終濃度。
【００８６】
したがって、適切な基本培地、好ましくはＤＭＥＭ／Ｆ１２等は、インスリン、トランスフェリン、プロゲステロン、プトレシン、亜セレン酸塩、Ｌ−グルタミン、ＭＥＭ−非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、β−メルカプトエタノール、及びＢＳＡから選択されるいずれか１つ、好ましくは任意の２つ以上、より好ましくは全ての成分をさらに含み得る。好ましくは、上記培地はインスリンを含む。
【００８７】
さらなる成分がニューロン生存を促進することが知られており、ｍＰＳ細胞のニューロン分化の誘導の間、又は該分化が開始若しくは少なくとも部分的に前進した後に、本発明の培地に供給され得る（例えば、好ましくはｔ＝１０日〜ｔ＝１４日；ここで、ｔ＝０日は本明細書全体を通して、ｍＰＳ細胞が、それらの分化を許容する培地に最初に曝露された瞬間であると見なされる）。かかる成分は、Ｄ−ビオチン、カタラーゼ、Ｌ−カルニチン、コルチコステロン、エタノールアミン、Ｄ−ガラクトース、グルタチオン（還元型）、リノール酸、リノレン酸、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｔ３−アルブミン複合体、ＤＬ−トコフェロール、又はＤＬ−酢酸トコフェロール；例えばＢ２７サプリメントの成分（Brewer 1997. J Neurosci Methods 71: 143-55を参照）のうち１つ又は複数を含み得るが、これらに限定されない。
【００８８】
特に成功した実施形態では、ｍＰＳ細胞を最初に、少なくともインスリン、好ましくはさらにトランスフェリン、プロゲステロン、プトレシン、亜セレン酸塩、Ｌ−グルタミン、ＭＥＭ−非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、β−メルカプトエタノール、及びＢＳＡのいずれか１つ又は好ましくは全て添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で、培地を好ましくはＮ２Ｂ２７培地等のニューロン生存を助けることが可能な富栄養培地に交換した後（任意で細胞の継代培養時に）、最大でｔ＝２０日、好ましくは最大でｔ＝１６日、より好ましくは最大でｔ＝７日〜ｔ＝１４日、さらに好ましくは最大でｔ＝７日〜ｔ＝１４日の間分化させる。
【００８９】
言及したように、本態様の方法は、分化を許容する条件における培養（工程ｂ）の少なくとも一部において、ｍＰＳ細胞をＳＨＨシグナル経路のアンタゴニスト、又はＳＨＨアゴニスト及び／又はＷｎｔシグナル経路のアンタゴニストのいずれかに曝露することを含む。
【００９０】
本明細書中で使用される場合、「ソニックヘッジホッグアンタゴニスト」は、ＳＨＨシグナル経路の活性を、好ましくはＳＨＨ又はその受容体Ｐａｔｃｈｅｄ（Ｐｔｃ）、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）及び／又はＧｌｉを含むＳＨＨシグナル経路中のタンパク質に直接作用するか、又はＳＨＨシグナル伝達の下流メディエータに作用することにより低下させる、阻害する、又はなくす任意の天然又は合成の物質を指す。
【００９１】
限定されるものではないが、ＳＨＨ経路アンタゴニストは、中和抗体若しくはアンタゴニスト抗体、核酸分子若しくはオリゴヌクレオチド、又はＳＨＨ経路タンパク質のドミナントネガティブ断片若しくは変異体、例えばＳＨＨ又はその受容体等の、化学的又は生物学的物質、医薬品又は薬物、特異的結合剤の形をとり得る。例えば、ＳＨＨ経路アンタゴニストは、好ましくは最大約５０００Ｄａ、例えば最大約４０００Ｄａ、好ましくは最大３０００Ｄａ、より好ましくは最大２０００Ｄａ、さらに好ましくは最大約１０００Ｄａ、例えば最大約９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、又は最大約５００Ｄａの大きさを有する小有機分子阻害物質であり得る。
【００９２】
一実施形態では、ｍＰＳ細胞において、ＳＨＨ経路はそれに関与するタンパク質、好ましくはＳＨＨ又はその受容体、特にＰｔｃ、Ｓｍｏ、及び／又はＧｌｉ、より好ましくはＳｍｏの発現を低減することにより拮抗することができる。これは、それ自体が既知の定量化法、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、免疫沈降、ウエスタンブロット法等を用いて決定される、任意の程度、例えばｍＰＳ細胞における個々のタンパク質の基礎発現レベルに対して例えば１０％以上、例えば２０％以上、より好ましくは３０％以上、例えば４０％以上、さらにより好ましくは５０％以上、例えば６０％以上、さらにより好ましくは７０％以上、例えば８０％以上、最も好ましくは９０％以上、例えば９５％以上、又はさらには約１００％の発現の低減を包含し得る。所望の遺伝子産物の発現レベルの低下は、当該技術分野において既知の方法、例えば細胞に、アンチセンス物質、例えばアンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡオリゴヌクレオチド、アンチセンス転写産物をコードする構築物、又はｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等のＲＮＡｉ物質、又はそれらをコードするベクター等を形質移入（例えば電気穿孔法、リポフェクション等）又は形質導入（例えばウイルスベクターを用いる）することにより達成することができる。
【００９３】
一実施形態では、ＳＨＨ経路は、それに関与するタンパク質、例えばＳＨＨ又はＰｔｃ、Ｓｍｏ、及び／又はＧｌｉ等のその受容体の活性を低減すること、又はＳＨＨとその同種受容体（複数可）との間の結合を低減することにより拮抗することができる。ＳＨＨシグナル伝達の阻害は、ＳＨＨシグナル伝達の第一標的であるＰａｔｃｈｅｄ（Ｐｔｃ）遺伝子の発現を測定すること（例えばＲＴＰＣＲ、又は任意の他の転写産物検出法）により適切に決定及び／又は定量化され得る（Erickson et al. 1996. Cell 87: 661-73）。
【００９４】
例示的な実施形態では、ＳＨＨ経路のアンタゴニストは、植物性アルカロイドシクロパミン等の天然産物（Incardona et al. 1998. Development 125: 3553-3562）、シクロパミン類似体（例えば米国特許第２００６／０７４０３０号明細書に開示される）、国際公開第２００６／０２８９５８号パンフレットに開示されるピリジルＳＨＨ阻害物質、５Ｅ１等の（such s）抗ＳＨＨ抗体（Erickson et al. 1996. Cell 87:661-73）、及びＣｕｒ６１４１４等の小分子阻害物質（Williams et al. 2003. PNAS100: 4616-4621）を含むか、又はそれらから成る群から選択され得る。
【００９５】
特に好ましい実施形態では、ＳＨＨアンタゴニストはシクロパミン又はその機能的誘導体である。
【００９６】
本明細書中で使用される場合、「ソニックヘッジホッグアゴニスト」は、ＳＨＨシグナル経路を増進又は刺激する任意の天然又は合成の物質を指す。
【００９７】
限定されるものではないが、ＳＨＨ経路アゴニストは、化学的又は生物学的物質、医薬品又は薬物、ＳＨＨ受容体の特異的リガンド、核酸分子又はオリゴヌクレオチド等の形をとり得る。例えば、ＳＨＨ経路アゴニストは、好ましくは最大約５０００Ｄａ、例えば最大約４０００Ｄａ、好ましくは最大３０００Ｄａ、より好ましくは最大２０００Ｄａ、さらに好ましくは最大約１０００Ｄａ、例えば最大約９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、又は最大約５００Ｄａの大きさを有する小有機分子阻害物質であり得る。ＳＨＨシグナル伝達の活性化は、ＳＨＨシグナル伝達の第一標的であるＰａｔｃｈｅｄ（Ｐｔｃ）遺伝子の発現を測定すること（例えばＲＴＰＣＲ、又は任意の他の転写産物検出法）により適切に決定及び／又は定量化され得る（Erickson et al. 1996. Cell 87: 661-73）。
【００９８】
一実施形態では、ｍＰＳ細胞において、ＳＨＨ経路はそれに関与するタンパク質、例えばＳＨＨ又はＰｔｃ、Ｓｍｏ、及び／又はＧｌｉ等のその受容体、好ましくはＳｍｏ、例えばその構成的活性化形態（Xie et al. 1998. Nature 391: 90-92）の発現を増大することにより刺激され得る。細胞におけるタンパク質発現レベルの増大は、当該技術分野において既知の方法、例えば細胞に、該細胞において適切な発現レベルをもたらすプロモータの制御下で上記タンパク質をコードする組み換え核酸を形質移入（例えば電気穿孔法、リポフェクション等）又は形質導入（例えばウイルスベクターを用いる）することにより達成することができる。
【００９９】
特に好ましい実施形態では、ＳＨＨ経路アゴニストは、ＳＨＨ又はその機能的断片若しくは誘導体、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生されたＳＨＨ又は合成ＳＨＨ、又は断片若しくは誘導体である。上記ＳＨＨは好ましくは哺乳類起源であり、さらに好ましくは、使用されるｍＰＳ細胞と同じ起源であり得る。
【０１００】
別の好ましい実施形態では、ＳＨＨ経路アゴニストはＳＨＨのペプチド模倣体である。
【０１０１】
別の実施形態では、ＳＨＨ経路アゴニストは、Ｈｈ−Ａｇ等の合成非ペプチジル小分子である（Frank-Kamenetsky, et al. 2002. J Biol 1: 10）。
【０１０２】
本明細書中で使用される場合、「Ｗｎｔアンタゴニスト」は、Ｗｎｔシグナル経路の活性を、Ｗｎｔシグナル経路中のタンパク質に直接作用するか、又はＷｎｔシグナル伝達の下流メディエータに間接的に作用することにより低下させる、阻害する、又はなくす任意の天然又は合成の物質を指す。Ｗｎｔシグナル伝達の阻害は、Ｗｎｔシグナル伝達の一次産物（output）であるＴＣＦ遺伝子の発現を測定すること（例えばＲＴ−ＰＣＲ、又は任意の他の転写産物検出法）により適切に決定及び／又は定量化され得る（Nature 1997, vol. 385(6619): 829-33）。
【０１０３】
限定されるものではないが、Ｗｎｔ経路アンタゴニストは、中和抗体若しくはアンタゴニスト抗体、核酸分子若しくはオリゴヌクレオチド、又はＷｎｔのドミナントネガティブ断片若しくは変異体又はその受容体等の、化学的又は生物学的物質、医薬品又は薬物、特異的結合剤の形をとり得る。例えば、Ｗｎｔ経路アンタゴニストは、好ましくは最大約５０００Ｄａ、例えば最大約４０００Ｄａ、好ましくは最大３０００Ｄａ、より好ましくは最大２０００Ｄａ、さらに好ましくは最大約１０００Ｄａ、例えば最大約９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、又は最大約５００Ｄａの大きさを有する小有機分子阻害物質であり得る。
【０１０４】
一実施形態では、ｍＰＳ細胞において、Ｗｎｔ経路はそれに関与するタンパク質の発現を低減することにより拮抗することができる。これは、それ自体が既知の定量化法、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、免疫沈降、ウエスタンブロット法等を用いて決定される、任意の程度、例えばｍＰＳ細胞における個々のタンパク質の基礎発現レベルに対して例えば１０％以上、例えば２０％以上、より好ましくは３０％以上、例えば４０％以上、さらにより好ましくは５０％以上、例えば６０％以上、さらにより好ましくは７０％以上、例えば８０％以上、最も好ましくは９０％以上、例えば９５％以上、又はさらには約１００％の発現の低減を包含し得る。
【０１０５】
例示的な実施形態では、Ｗｎｔ経路のアンタゴニストは、ＤＫＫポリペプチド（Glinka et al. 1998. Nature 391: 357-62、Niehrs1999. Trends Genet 15: 314-9）、ｃｒｅｓｃｅｎｔポリペプチド（Marvin etal. 2001. Genes & Dev 15: 316-327）、ｃｅｒｂｅｒｕｓポリペプチド（米国特許第６，１３３，２３２号明細書）、ａｘｉｎポリペプチド（Zeng et al. 1997. Cell 90: 181-92、Itoh etal. 1998. Curr Biol 8: 591-4、Willert et al. 1999.Development 126: 4165-73）、Ｆｒｚｂポリペプチド（Cadigan et al.1998. Cell 93: 767-77、米国特許第６，１３３，２３２号明細書、米国特許第６，４８５，９７２号明細書）、グリコーゲン合成酵素キナーゼ（ＧＳＫ）ポリペプチド（He et al. 1995 Nature 374: 617-22）、Ｔ細胞因子（ＴＣＦ）ポリペプチド（Molenaar et al. 1996. Cell 86: 391-9）、ドミナントネガティブｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄポリペプチド（Wallingford et al. 2000. Nature 405: 81-5）、ドミナントネガティブＮ−カドヘリンポリペプチド（米国特許第６，４８５，９７２号明細書）、ドミナントネガティブβ−カテニンポリペプチド（米国特許第６，４８５，９７２号明細書）、下流転写因子（例えばＴＣＦ等）のドミナントネガティブ変異体（dominant negatives）、Ｗｎｔポリペプチドのドミナントネガティブ変異体、ＬＲＰ−ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｗｎｔ複合体を破壊する作用物質、並びにＷｎｔを捕捉する作用物質（例えばｃｒｅｓｃｅｎｔ、及びＷｎｔに対する抗体）を含むか、又はそれらから成る群から選択され得る。Ｗｎｔアンタゴニストはまた、ＤＫＫポリペプチド、ｃｒｅｓｃｅｎｔポリペプチド、ｃｅｒｂｅｒｕｓポリペプチド、ａｘｉｎポリペプチド、Ｆｒｚｂポリペプチド、ＧＳＫポリペプチド、ＴＣＦポリペプチド、ドミナントネガティブｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄポリペプチド、ドミナントネガティブＮ−カドヘリンポリペプチド、及びドミナントネガティブβ−カテニンポリペプチドを含む（これらに限定されない）様々なポリペプチドの断片、ホモログ、誘導体、対立遺伝子変異体、及びペプチド模倣体を包含する。Ｗｎｔアンタゴニストポリペプチドは、好ましくは哺乳類起源であり、さらに好ましくは、使用されるｍＰＳ細胞と同じ起源である。
【０１０６】
特に好ましい実施形態では、Ｗｎｔ経路アンタゴニストはＤＫＫ又はその機能的断片若しくは誘導体、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生されたＤＫＫ又は合成ＤＫＫ、又は断片若しくは誘導体である。
【０１０７】
一実施形態では、ｍＰＳ細胞は、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）シグナル経路の阻害物質と組み合わせた、ＳＨＨシグナル経路のアンタゴニストに曝露され得る。一実施形態では、ｍＰＳ細胞は、ＢＭＰシグナル経路の阻害物質、例えばノギン、コーディン、フォリスタチン、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ／ＤＡＮタンパク質ファミリー、ｇｒｅｍｌｉｎ、スクレロスチン又はその機能的断片若しくは誘導体、又はそのペプチド模倣体（これらに限定されない）と組み合わせた、ＳＨＨ経路アゴニスト及び／又はＷｎｔシグナル経路アンタゴニストに曝露され得る。ＢＭＰ阻害物質を含めることにより、ｍＰＳ細胞の所望の分化経路がさらに確実なものとなる。
【０１０８】
本発明の態様において、ＳＨＨシグナル経路のアンタゴニスト若しくはＳＨＨアゴニストのいずれか、及び／又はＷｎｔシグナル経路のアンタゴニストに対する分化許容条件下でのｍＰＳ細胞の曝露は、好ましくはｔ＝０日〜ｔ＝１０日、より好ましくはｔ＝０日〜ｔ＝７日、さらに好ましくはｔ＝０日〜ｔ＝５日、さらにより好ましくはｔ＝０日〜ｔ＝３日、例えば約ｔ＝０日、ｔ＝１日又はｔ＝２日に開始され得る（ここで、ｔ＝０日の時点は上記で規定されるようなものである）。
【０１０９】
上記曝露は、分化された神経前駆細胞又はニューロン様細胞が採取又は回収されるまで（すなわち、培養工程）ｂの終了時まで）維持されるか、又は該曝露は、時間内に限定されていてもよい。例えば、該曝露は、最大ｔ＝２５日〜ｔ＝２８日、又は最大ｔ＝２１日〜ｔ＝２５日、又は最大ｔ＝１６日〜ｔ＝２１日、又は最大ｔ＝１０日〜ｔ＝１６日、又は最大ｔ＝１０日〜ｔ＝１４日、又は最大ｔ＝７日〜ｔ＝１０日、例えば、最大約ｔ＝８日、ｔ＝９日、ｔ＝１０日、ｔ＝１１日、ｔ＝１２日、ｔ＝１３日、又はｔ＝１４日、好ましくは最大約ｔ＝１０日まで継続することができる。特に効果的な実施形態では、上記曝露が、ｔ＝０日〜ｔ＝１４日、より好ましくはｔ＝０日〜ｔ＝１２日、さらにより好ましくはｔ＝０日〜ｔ＝１０日、例えば、ｔ＝１日〜ｔ＝１０日、又はｔ＝２日〜ｔ＝１０日継続し得る。
【０１１０】
既に言及したように、上記の態様Ａ１又は態様Ａ３のいずれかの方法では、培養工程ｂ）の期間全体が、好ましくは３日間〜２１日間、より好ましくは４日間〜１８日間、さらに好ましくは７日間〜１６日間又は７日間〜１４日間、さらにより好ましくは１０日間〜１４日間、例えば、約１０日間、１１日間、１２日間、１３日間又は１４日間、例えば獲得細胞培養物においてそれぞれの所望の神経前駆体の割合を最大にするようなものであり得る。上記の態様Ａ２又は態様Ａ４のいずれかの方法では、培養工程ｂ）の期間は、好ましくは少なくとも１６日間、より好ましくは少なくとも１８日間、さらに好ましくは少なくとも２１日間又は少なくとも２４日間、例えば、１８日間〜４０日間、より好ましくは２１日間〜３５日間、さらに好ましくは２１日間〜３０日間、例えば、約２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間又は３０日間、例えば獲得細胞培養物においてそれぞれの成熟ニューロン様細胞の割合を最大にするようなものであり得る。
【０１１１】
また言及したように、工程ｂ）で発現的に（expressly）用いられるモルフォゲン又はモルフォゲン阻害物質とは異なり、他の外部誘導モルフォゲンシグナルは、培地にはないと考えられる。特に、上記の態様Ａ１〜態様Ａ４の工程ｂ）においてｍＰＳ細胞を培養する培地は、培地に含まれる場合に神経前駆細胞の尾方化を誘導する可能性のある任意の成分を欠いていてもよい。例えば、一実施形態では、培地は、以下のいずれか１つ、好ましくは任意の２つ以上、最も好ましくは全てを欠いていてもよい：動物（例えば、哺乳類）血清又は血漿、レチノイン酸（ＲＡ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）タンパク質ファミリーの任意の成員、特にＦＧＦ−１〜ＦＧＦ−１０、及びＷｎｔタンパク質ファミリーの任意の成員、例えばＷＮＴ１〜ＷＮＴ１６。
【０１１２】
上記で説明した態様の方法により、所望の型の神経前駆体若しくは成熟ニューロン表現型について富化された、又は実質的に均一である細胞集団が得られる。例えば、本発明の方法に従って得られた又は得ることのできる富化又は実質的に均一な細胞集団は、所定の所望の表現型を有する細胞を少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％又はそれ以上含み得る。理解され得るように、所定の所望の細胞型は、上記の方法に従って得られた又は得ることのできる細胞集団からさらに富化又は単離し、それにより該所定の所望の細胞型の実質的に純粋な（例えば、８５％以上純粋な、好ましくは９０％以上純粋な、より好ましくは９５％以上純粋な又はさらには９９％以上純粋な）調製物を得ることができる。かかる富化又は単離は、所望の細胞型の特異的な特徴、例えば、当該技術分野で知られるような該所望の細胞型に特異的な１つ又は複数の表面マーカーを用い得る（例えば、ＦＡＣＳ、パニング、免疫磁性細胞分離等）。
【０１１３】
したがって一態様において、本発明は、背側前脳同一性を有する神経前駆細胞、又は態様Ａ１の方法に従って直接得られた若しくは得ることのできるその富化又は実質的に均一な集団と、１つ又は複数の下流単離プロセスによって得られた又は得ることのできる該神経前駆細胞の実質的に純粋な集団とを提供する。
【０１１４】
一態様において、本発明は、皮質錐体ニューロン様細胞、又は態様Ａ２の方法に従って直接得られた又は得ることのできるその富化又は実質的に均一な集団と、１つ又は複数の下流単離プロセスによって得られた若しくは得ることのできる該皮質錐体ニューロン様細胞の実質的に純粋な集団とを提供する。
【０１１５】
一態様において、本発明は、腹側前脳同一性を有する神経前駆細胞、又は態様Ａ３の方法に従って直接得られた又は得ることのできるその富化又は実質的に均一な集団と、１つ又は複数の下流単離プロセスによって得られた若しくは得ることのできる該神経前駆細胞の実質的に純粋な集団とを提供する。
【０１１６】
一態様において、本発明は、皮質抑制性介在ニューロン様細胞、又は態様Ａ４の方法に従って直接得られた又は得ることのできるその富化又は実質的に均一な集団と、１つ又は複数の下流単離プロセスによって得られた若しくは得ることのできる該皮質抑制性介在ニューロン様細胞の実質的に純粋な集団とを提供する。
【０１１７】
発明の概要の項で言及したように、本発明に従って得ることができる神経前駆細胞又はニューロン様細胞は、表面マーカー等の特異的なタンパク質の発現によって識別することができる。該発現は、当該技術分野で既知の任意の好適な免疫学的技法、例えば免疫組織化学又はアフィニティ吸着、ウェスタンブロット解析、ＥＬＩＳＡ等を使用して、又は酵素活性の任意の好適な生化学アッセイ若しくはマーカーｍＲＮＡの量を測定するのに好適な任意の技法、例えば、ノーザンブロット解析、半定量若しくは定量ＲＴ−ＰＣＲ等によって検出することができる。本開示で挙げられるマーカーに関する配列データが既知であり、またＧｅｎＢａｎｋ等の公開データベースから得ることができる。
【０１１８】
細胞が特定のマーカーに対して陽性であるという場合、これは、当業者が適切な測定を行うと、好適な対照と比較して、このマーカーに対して異なるシグナルの存在又は痕跡を結論付けるであろうことを意味する。この方法が、マーカーの定量的評価を可能にする場合、陽性細胞は平均して、対照とは有意に異なる、例えば、これらに限定されないが、対照細胞によって発生されるかかるシグナルの少なくとも１．５倍、例えば、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍又はさらにそれ以上のシグナルを発生し得る。
【０１１９】
また、発明の概要の項で言及したように、本発明ではさらに、態様Ａ１〜態様Ａ４に従って得ることができる細胞集団から、神経細胞又は成熟ニューロン様細胞、例えば、皮質錐体ニューロン様細胞の亜集団を単離することが予測される。
【０１２０】
さらなる態様において、本発明は、以下のものを含む（が、これらに限定されない）上記のように得られた又は得ることのできる細胞及び集団由来の下流誘導体を提供する：単離核酸（例えば、ＤＮＡ、総ＲＮＡ又はｍＲＮＡ）、単離若しくはクローンＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ、単離タンパク質若しくは抗原、単離脂質、又は該細胞若しくは細胞集団由来の単離抽出物（例えば、核、ミトコンドリア、ミクロソーム等の抽出物）。
【０１２１】
本発明は、神経前駆体又は成熟ニューロン様細胞と、本発明に従って得られた又は得ることのできるそれらの集団又は亜集団とを含む組成物、好ましくは医薬組成物も提供する。
【０１２２】
医薬組成物は、その中で細胞を生存させるさらなる成分を含有し得る。特に細胞は、ヒト投与のために十分無菌な条件下で調製した等張賦形剤を含む医薬組成物の形態で供給することができる。医薬製剤における一般原理に関しては、読者には、Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and CellularImmunotherapy, by G. Morstyn & W. Sheridan eds, Cambridge University Press,1996を参照されたい。細胞賦形剤及び組成物の任意の付随要素の選択は、投与に用いられる装置によって変わる。例えば組成物は、好適なｐＨ、例えば中性ｐＨ付近に対して好適な緩衝系（例えば、リン酸緩衝系又は炭酸緩衝系）を含んでいてもよく、また細胞に対して等浸透圧条件にさせる、すなわち浸透圧を抑えるのに十分な塩を含んでいてもよい。例えば、当該技術分野で知られているように、これらの目的に好適な溶液はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）であり得る。さらに組成物は、細胞の生存率を増大させ得るキャリアタンパク質、例えばアルブミンを含んでいてもよい。好ましくは、非ヒト動物材料を排除するために、アルブミンはヒト起源であってもよい（例えば、ヒト材料から単離してもよく、又は組み換えて産生してもよい）。アルブミンの好適な濃度は一般的に既知である。
【０１２３】
したがって、本発明による、且つ本発明に従って使用される医薬組成物は、神経前駆細胞又はニューロン様細胞の他に、薬学的に許容可能な賦形剤、キャリア、緩衝液、保存料、安定剤、抗酸化剤又は当業者にとって既知の他の材料を含んでいてもよい。かかる材料は非毒性でなくてはならず、且つ細胞の活性を妨げてはいけない。キャリア又は他の材料の正確な性質は、投与経路によって変わる。組成物は、神経保護分子、神経再生分子、レチノイド、成長因子、星状膠細胞／グリア細胞、抗アポトーシス因子、又は本発明の細胞において遺伝子発現を調節する因子の１つ又は複数を含み得る。かかる物質は、細胞をその環境から独立させ得る。本発明は、上記のように、本発明の細胞を１つ又は複数の付加的成分と混ぜることによって上記医薬組成物を生成する方法も包含する。
【０１２４】
液体医薬組成物は一般的に水、石油、動物油若しくは植物油、鉱油又は合成油等の液体キャリアを含む。生理食塩溶液、組織若しくは細胞培養培地、デキストロース若しくは他の糖溶液、又はエチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコール等のグリコール類が含まれ得る。
【０１２５】
組成物は、ピロゲンを含まず、且つ好適なｐＨ、等張性及び安定性を有する、非経口的に許容可能な水溶液形態であり得る。関連技術分野における当業者は、例えば塩化ナトリウム、リンガー液、又は乳酸リンガー液等の等張ビヒクルを用いて、好適な溶液を調製することができる。人工脳脊髄液を用いて組成物を調製してもよい。
【０１２６】
さらなる態様では、本発明は、組織機能障害又は損傷（lesion）の部位に組成物を投与するための外科用機器を含み、且つ上記で規定のように医薬組成物をさらに含む配置であって、組織機能障害又は損傷の部位への医薬組成物の投与に適合している、配置に関する。例えば、好適な外科用機器は、神経機能障害又は損傷の部位に本発明の細胞を含む液体組成物を注入することができ得る。細胞を当該技術分野で既知の任意の技法によって患者に移植してもよい（例えば、Freed et al. 1997. Cell Transplant 6: 201-202、Kordower et al. 1995. N Engl J Med 332: 1118-1124、Freed et al. 1992. N Engl J Med 327: 1549-1555）。
【０１２７】
神経前駆体又は成熟ニューロン様細胞の患者への投与を考慮すると、患者と投与細胞との間の組織適合性を最大にし、それにより患者の免疫系による投与細胞の拒絶（移植片対宿主拒絶）の機会を低減するように、本発明の方法を施されるｍＰＳ細胞、例えばヒトＥＳ細胞又はＥＧ細胞が選択され得るのが好ましい。例えば、有益には患者に対して同一のＨＬＡハプロタイプ（１つ又は好ましくは複数のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｄ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ及びＨＬＡ−ＤＱ、好ましくは１つ又は好ましくは全てのＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃを含む）を有する、又は患者に共通のほとんどのＨＬＡ抗原対立遺伝子を有し、且つＨＬＡ抗原（患者は先在的に抗ＨＬＡ抗体を含有している）を全く若しくは最小限しか有しない、ｍＰＳ細胞又は細胞株が典型的に選択され得る。
【０１２８】
さらに本発明は、治療における使用、又は神経疾患若しくは神経精神疾患の治療用の薬物の製造に対する使用のために、本発明に従って得られた又は得ることのできる神経前駆体又は成熟ニューロン様細胞及び集団を考慮する。本発明は、神経疾患若しくは神経精神疾患の治療における使用のために、本発明に従って得られた又は得ることのできる神経前駆体又は成熟ニューロン様細胞及び集団も考慮する。したがって本発明は、治療が必要な患者において神経疾患又は神経精神疾患を治療する方法であって、本発明に従って得られた又は得ることのできる神経前駆体又は成熟ニューロン様細胞及び集団を治療的に有効な量（すなわち、所望の局所効果又は全身効果を引き起こすのに十分な量）該患者に投与することを含む、方法も提供する。例えば、上記単離細胞を患者に移植又は注入することができる。本発明の細胞及び細胞集団を用いて治療される神経疾患又は神経精神疾患は、特に皮質領域（これらに限定されない）におけるニューロンの機能障害及び／又は変性、損傷又は欠損を伴い、特に１種類又は複数種類の皮質錐体ニューロン又は皮質抑制性介在ニューロンに影響を及ぼし得る。かかる病気としては、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、認知症、ＨＩＶ認知症、脳卒中、癲癇、多発性硬化症、外傷性脳損傷、脳虚血、脳出血等が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１２９】
一実施形態において、本発明に従って得られた又は得ることのできる神経前駆体又は成熟ニューロン様細胞及び集団は、ニューロン疾患、神経疾患又は神経精神疾患、特にヒト疾患、例えばこれまでの段落で挙げられた疾患に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを提示し得る。該神経前駆体又は成熟ニューロン様細胞又は集団は、対象となるニューロン疾患を有する被験者由来であってもよく、又はその細胞又は集団は、健常な被験者由来で、対象となる病理学的表現型を呈するようにさらに操作してもよい。例えば、かかる操作は、該細胞又は集団を、対象となる病理学的表現型を引き起こすことが知られる又はその疑いがある作用物質、例えば化学的な作用物質又は生物学的な作用物質に接触させることを含み得る。例示的な作用物質としては、神経毒素、神経伝達を調整する作用物質、代謝産物、薬物、抗血清、ウイルス剤等が挙げられ得るが、これらに限定されない。他の例では、かかる操作は、細胞を（例えば、当該技術分野で既知のように形質移入又は形質導入によって）対象となる病理学的表現型を引き起こすことが知られる若しくはその疑いがあるＲＮＡ若しくはタンパク物質、又は対象となる疾患に寄与することが知られる若しくはその疑いがある内因性遺伝子の発現を抑制することができる作用物質（例えば、ＲＮＡｉ物質又はドミナントネガティブ突然変異体）をコードする組み換え構築物で一次的に又は安定して形質転換することを含み得る。発現する例示的な作用物質としては、突然変異型ハンチンギン（huntingin）、突然変異型プレセニリン又はＡＰＰ等の疾患原因タンパク質が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１３０】
別の態様において、本発明は、本発明に従って得られた又は得ることのできる神経前駆体又は成熟ニューロン様細胞及び集団の使用であって、任意に及び好ましくは、該細胞又は集団が、任意の様々なスクリーニングアッセイ、特にｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイ、例えば、候補となる薬理学的物質及び組成物の生物学的効果のアッセイ、化学的物質又は生物学的物質の細胞毒性、遺伝毒性又は発癌性のアッセイ、正常なニューロン機能、及び神経疾患又は神経精神疾患の病因の研究を可能にするアッセイ等において、ニューロン疾患、神経疾患又は神経精神疾患、特にヒト疾患に関するモデルを提示する、使用を提供する。
【０１３１】
セルベースのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイを当該技術分野において一般的に知られるように実施することができる。例えば、好適なアッセイフォーマットで（例えば、マルチウェルプレートで又はカバースリップ上で）成長させた細胞を候補となる薬剤（例えば、潜在的な薬剤）に接触させ、１つ又は複数の関連の読み出しパラメータに対する該薬剤の効果を求め、対照と比較する。関連の読み出しパラメータは、アッセイの種類によって大きく変化する可能性があり、このパラメータには、ニューロン生存、アポトーシス又は壊死の発生、形態の変化（例えば、神経投射の数、長さ及び／又は樹枝状分岐）、電気生理学的挙動（elecrophysiological behavriour）、遺伝子発現等が含まれ得るが、これらに限定されない。したがって一実施形態では、本発明は、ニューロン疾患、神経疾患又は神経精神疾患表現型の治療に関する薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイであって、該疾患表現型を呈する、本発明に従って得られた又は得ることのできる神経前駆体又は成熟ニューロン様細胞及び集団を、候補となる薬剤と接触させること、並びに該薬剤を投与する際の該疾患表現型の軽減を求めることを含む、スクリーニングアッセイを提供する。本発明は、そのように同定された薬剤にも関する。
【０１３２】
したがって本発明は、スクリーニングアッセイ、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイ、特に薬学的、遺伝学的又は毒物学的なスクリーニングアッセイに対して、上記のようなこのようなものを含む神経前駆細胞又はニューロン様細胞若しくは集団の使用も提供する。一実施形態では、該神経前駆細胞又はニューロン様細胞若しくは集団は、ニューロン疾患、神経疾患又は神経精神疾患、好ましくはヒト疾患に対するモデルを提示し得る（例えばこのように操作している、上記を参照されたい）。
【０１３３】
本発明において、これらから得られたｍＰＳ細胞若しくは細胞株、又は神経前駆細胞若しくは成熟ニューロン様細胞は、例えば、治療、スクリーニング又は調査におけるさらなる使用の前に、対象となる核酸で安定して又は一次的に形質移入又は形質転換し得る。対象となる核酸配列としては例えば、神経向性因子（例えば、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ又はＧＤＮＦ）、抗アポトーシス分子（例えば、Ｂｃｌ２）、軸索再生、伸長又は誘導分子（例えば、エフィリン）等（これらに限定されない）の神経前駆細胞又はニューロン様細胞の生存、成長、分化及び／又は機能化（functioning）を高める遺伝子産物をコードするものが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【実施例】
【０１３４】
実施例１：デフォルト経路に従ったＥＳ細胞からのニューロン新生が前脳様前駆細胞を生成する
実験手順
特に規定がない限り、全ての化学物質は、Sigma-Aldrich（Bornem, Belgium）から入手した。
【０１３５】
ＥＳ細胞培養
胚性幹細胞（Ｅ１４Ｔｇ２ａ（Baygenomicsから入手）、及びその誘導体であるＥ１４Ｔｇ２ａ−ＧＦＰ）を、ゼラチン被覆細胞培養プラスチック皿（０．１％ゼラチン、Sigma）上の１０％  ＥＳ認定ウシ胎児血清（Invitrogen-Gibco）、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸（Invitrogen-Gibco）、２ｍＭのグルタミン（Invitrogen-Gibco）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Invitrogen-Gibco）、５５μＭのβ−メルカプトエタノール（Sigma）及び１０３Ｕ／ｍｌの白血球阻害因子（ＬＩＦ）（ESGRO）を添加したＧＭＥＭ（Invitrogen-Gibco）中で、又は有糸分裂で不活性化するマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ：Ｔａｕ−ＧＦＰ  ＫＩ細胞株）で通常通り繁殖させた。
【０１３６】
神経分化
同様の結果が、Ｅ１４細胞及びＪ１細胞の異なる誘導体を含む幾つかのＥＳ細胞株で得られた。ＥＳ細胞をトリプシン処理し、解離させ、ＥＳ培地の入ったゼラチン被覆細胞培養プラスチック皿で、５×１０３細胞／ｃｍ２の密度にプレーティングした。必要であれば、細胞を１５分間〜３０分間ゼラチン被覆皿上にプレーティングし、ＭＥＦＳを付着させ、ＥＳ細胞を含有する上清のみを回収した後、ゼラチン被覆皿上で再びプレーティングした。付着後、培地を「デフォルト分化培地（Default Differentiation Medium）」（ＤＤＭ）に交換した。ＤＤＭは、１×Ｎ２サプリメント（１００×Ｎ２サプリメントは、８．６１μＭのインスリン、１ｍＭのトランスフェリン、２μＭのプロゲステロン、１０．０１ｍＭのプロレッシン及び３．０１μＭのセレナイトから成る、Invitrogen-Gibco）、２ｍＭのグルタミン（Invitrogen-Gibco）、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸（Invitrogen-Gibco）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Invitrogen-Gibco）、１１０μＭのβ−メルカプトエタノール（Sigma）及び０．５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、フラクションＶ（Invitrogen-Gibco）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Invitrogen-Gibco）から成る。培地を２日ごとに交換した。
【０１３７】
分化の１０日後又は１４日後、ほとんどの細胞が神経と同一に変換された時点で、細胞をトリプシン処理し、解離させ、ポリリシン（２時間、３７℃でＰＢＳ中、３０μｇ／ｍｌ、Beckton-Dickinson）及びラミニン（２時間、３７℃でＰＢＳ中、３μｇ／ｍｌ、Becton-Dickinson）被覆無菌ガラスカバースリップ（Menkl）上にプレーティングし、それぞれＮ２Ｂ２７培地中で４日間又は７日間〜１４日間成長させ、ＤＤＭ単独のものよりもニューロンの生存率を改善させた。Ｎ２Ｂ２７培地は、１×Ｎ２、２ｍＭのグルタミン、０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、フラクションＶ及び１１０μＭのβ−メルカプトエタノールを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２と、Ｂ２７（ビタミンＡ無含有、Invitrogen-Gibco）及び２ｍＭのグルタミンを添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（Invitrogen-Gibco）との１：１混合物から成る。Ｂ２７サプリメント（Invitrogen-Gibco）は、Ｄ−ビオチン、ＢＳＡ（脂肪酸無含有、フラクションＶ）、カタラーゼ、Ｌ−カルニチンＨＣｌ、コルチコステロン、エタノールアミンＨＣｌ、Ｄ−ガラクトース（無水）、グルタチオン（還元型）、インスリン（ヒト、組み換え型）、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プロレッシン２．ＨＣｌ、亜セレン酸ナトリウム、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｔ３−アルブミン複合体、ＤＬ−トコフェロール、酢酸ＤＬ−トコフェロール及びトランスフェリン（ヒト、鉄欠乏）を含有する（Yao et al. 2006. PNAS 103: 6907-6912）。培地を２日ごとに交換した。
【０１３８】
顕微鏡検査
ZeissのＡｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡又はZeissのＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡を用いて画像を撮影した。
【０１３９】
免疫蛍光及び定量
培地を取り除き、細胞をＰＢＳで洗い流した後、３０分間、４℃でＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した。ＰＦＡを取り除き、細胞をＰＢＳで３回洗い流した。非特異的な抗体活性の遮断及び透過化を、５％ウマ血清（Invitrogen-Gibco）、３％ウシ血清アルブミン（Sigma）及び０．３％トリトンＸ−１００（Sigma）を添加したＰＢＳ中で行った。一次抗体とのインキュベーションを、１％ウマ血清、３％ウシ血清アルブミン及び０．１％トリトンＸ−１００を添加したＰＢＳ中で、４℃で一晩行った。細胞をＰＢＳで３回洗い流し、１％ウマ血清、３％ウシ血清アルブミン及び０．１％トリトンＸ−１００を添加したＰＢＳ中で室温で１時間、二次抗体とインキュベートした後、再びＰＢＳで３回洗い流した。二重又は多重の免疫染色のために、このプロセスを繰り返した。核をビスベンジミド（ヘキスト番号３３２５８、Sigma）で染色し、グリセロゲル（DAKO）を用いてカバースリップを乗せた。幾つかの抗体に関して、遮断の前に、抗原回復を用いた：細胞を１０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で４×５分間煮沸し、２０分間室温に冷ました。
【０１４０】
実施例で用いられる一次抗体は、マウスモノクローナル抗β−チューブリンＩＩＩ（Ｔｕｊ１、１／１０００、Covance）、抗微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２、クローンＡＰ２０、１／５００、Sigma）、抗リーリン（クローンＧ１０、１／３００、A. Goffinetから）、抗Ｍａｓｈ１（１／５００、Pharmingen）、抗ｐ７３（ＥＲ−１５、１／１５０、Labvision／Neomarkers）、抗ＨＮＦ４（１／５０、Abcam）、抗汎サイトケラチン（１／５０、Sigma）及び抗ロドプシン（ＲＥＴ−Ｐ１、１／１００、Abcam）、ウサギポリクローナル抗Ｐａｘ６（１／２５００、Covance）、抗Ｏｔｘ１＋２（１／２０００、Chemicon）、抗Ｎｋｘ２．１（１／５０００、R. Di Lauroから）、抗Ｇｓｈ２（１／２０００、Y. Sasaiから）、抗Ｏｃｔ４（１／５００、Abcam）、抗カスパーゼ３（１／５００、Promega）、抗Ｋｉ６７（１／２００、Novocastra）、抗Ｔｂｒ１（１／２００００、R. Hevner及びChemiconから）、抗Ｔｂｒ２（１／２５００、R. Hevner及びChemiconから）、抗ネスチン（ロングテール、１／５０００、Covance）、抗β−チューブリンＩＩＩ（１／２０００、Covance）、抗ＧＦＡＰ（１／５００、Sigma）、抗カルレチニン（１／１００００、Swant）、抗ＶＧｌｕＴ１（１／２０００、Synaptic Systems）、抗ＶＧｌｕＴ２（１／２５００、SynapticSystems）、抗ＶＧＡＴ（１／３０００、Synaptic Systems）、抗チロシンヒドロキシラーゼ（１／５００、Chemicon）、抗コリンアセチルトランスフェラーゼ（１／５００、Chemicon）、抗ＧＡＢＡ−Ａ  α−６受容体（１／１０００、Chemicon）、抗ＦｏｘＰ２（１／１０００、Abcam）、抗Ｓａｔｂ２（１／２０００、V. Tarabykinから）、抗ＥＲ８１（１／１０００、S. Arberから）、抗Ｃｕｘ１（１／１０００、Santa Cruz）、抗Ｔｌｅ４（１／３０００、S. Stifaniから）、抗ＣＯＵＰ−ＴＦＩ及び抗ＣＯＵＰ−ＴＦＩＩ（１／１０００、M. Studerから）、及びラットモノクローナル抗ＣＴＩＰ２（１／１０００、Abcam）、及び抗ＰＥＣＡＭ（１／１０００、Beckton-Dickinson）、及びニワトリ抗β−チューブリンＩＩＩ（１／３００、Chemicon）であった。S. Hockfieldによって開発されたＲＡＴ−４０１抗体（抗ネスチン、１／５）、T. M. Jessellによって開発された７４−５Ａ５抗体（抗Ｎｋｘ２．２、１／２０）、J. Johnson によって開発された抗Ｍａｔｈ１（１／１０）、S. K.McConnellによって開発されたＯｔｘ−５Ｆ５（抗Ｏｔｘ１、１／１０）、T. M. Jessell及びS. Mortonによって開発された４Ｇ１１抗体（抗エングレイルド−１、１／５０）、並びにD. A. Fischmanによって開発されたＭＦ−２０（抗ミオシン、１／２０）は、ＮＩＣＨＤの援助下で展開されたＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋから入手し、アイオワ大学、生物科学学部（Iowa City、IA 52242）で維持された。二次抗体は、シアニン３又はシアニン５（１／１０００、Jackson Immunoresearch）又はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８（１／１０００、Molecular Probes）と連結した、ロバ抗マウス抗体、抗ウサギ抗体、抗ラット抗体、抗ヤギ抗体又は抗ニワトリ抗体であった。
【０１４１】
特異的なマーカー（分化マーカー、領域特異的マーカー、神経伝達物質輸送体タンパク質又は層特異的マーカー）を発現する細胞の割合を定量するために、３つの独立した実験から少なくとも３００個の細胞（各実験から少なくとも１００個の細胞）を、試験した各時点で計測した。
【０１４２】
ＲＴ−ＰＣＲ
総ＲＮＡ調製のために、細胞をトリプシン処理し、解離させ、遠心分離して、ＰＢＳ中で１回洗い流した後、液体窒素で急速冷凍した。ＲＮＡの調製物は、ＲＮｅａｓｙ  ＲＮＡ調製ミニキット（Qiagen）を用いて作製した。逆転写は、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩキット及びプロトコル（Invitrogen）を用いて行った。使用するＰＣＲプライマーを表１に要約する。
【０１４３】
【表１】
0005631210.tif 000002
【０１４４】
Ｔａｑポリメラーゼキット及びプロトコル（Invitrogen-Gibco）を用いて、１μｌのＲＴを各ＰＣＲ反応に組み込んだ。試験した各時点で各遺伝子に対して少なくとも３回、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【０１４５】
結果
本発明者らは、低密度でＥＳ細胞を培養し、血清又は任意の既知のモルフォゲンを欠くが、特に（inter alia and in particular）インスリンによるＥＳ細胞及び神経前駆体の生存を可能にする、化学的に規定された血清無含有培地（ＤＤＭ）を用いて最小条件下でそれらの生存を最適化した。
【０１４６】
ＥＳ細胞は、効率的なニューロン新生プロセスを受けた：ネスチン陽性神経前駆細胞は、ＤＤＭ中、７日後〜１４日後で総細胞集団の７０％超を構成していた（図１Ａ）。その後、ほとんどの神経前駆細胞は、分化の２１日後〜２８日後で総細胞集団の７０％超を構成したβ−チューブリン−ＩＩＩ陽性ニューロン及びＭＡＰ２陽性ニューロンに分化した（図１Ａ）。星状膠細胞の産生は、分化の２１日後のみに現れ（図１Ａ）、このようにニューロン−グリアの順序をたどり、これは培養物における皮質幹細胞に関して説明されているものを強く連想させる（Qian et al. 2000. Neuron 28: 69-80）。これらのデータにより、任意の添加したモルフォゲンの非存在下で培養されたＥＳ細胞が自発的且つ効果的に神経細胞に分化することが示される。
【０１４７】
次に本発明者らは、神経管の局所同一性を有する一連のマーカーを用いて、これらのデフォルト条件下で生成した神経前駆細胞の同一性を調べた。本発明者らは、分化の１４日後、ほとんどのネスチン陽性神経前駆体（７１．３８±１．３２％）が、前部神経外肺葉の初期マーカーであるＯｔｘ１−２  ＴＦを発現することを見出した（図１Ｂ（１）、白色カラム）。これらの前駆細胞のサブセットが、初期段階での背側前脳原基の一部分を示す（Inoue et al. 2000. Dev Biol 219: 373-383、Walther& Gruss 1991. Development 113：1435-1449）Ｏｔｘ１及びＰａｘ６を発現することを見出し（それぞれ、１２．５０±１．８５％及び２７．９３±２．４７％、図１Ｂ（３）及び図１Ｂ（２）、白色カラム）、これらの中でより多くの割合のサブセットが、最吻側前脳の腹側部を特徴付ける３つのマーカーであるＧｓｈ２、Ｎｋｘ２．１又はＮｋｘ２．２を発現した（それぞれ、１１．３１±２．０３％、２５．８６±３．０７％及び３４．２７±２．６５％）（図１Ｂ（４）、図１Ｂ（５）及び図１Ｂ（６）、白色カラム）（Puelles & Rubenstein 2003. Trends Neurosci 26: 469-476）。これに対して、ごくわずか（１％未満）の神経前駆細胞が、エングレイルド−１（中脳）、Ｍａｔｈ１（小脳）及びＨｏｘＢ１（後脳）等のより大きい尾側同一性の指標となるマーカーを発現した（図１Ｂ（７）、図１Ｂ（８）及び図１Ｂ（９）、白色カラム）。
【０１４８】
大部分のＥＳ細胞由来の神経前駆細胞の前脳様の同一性が、ＲＴ−ＰＣＲ実験によってさらに確認され、ｉｎ  ｖｉｖｏで発生中の前脳に制限される全てのマーカー、ｆｏｘｇ１、ｅｍｘ１−２、ｄｌｘ１−５及びｌｈｘ６  ＴＦの発現が示された（図１Ｃ）。
【０１４９】
まとめると、これらの結果により、ＤＤＭ中のＥＳ細胞の分化が、前脳同一性が見込まれる神経前駆細胞集団の効率的な生成をもたらすことが示される。興味深いことに、この集団は、背側同一性がより大きい細胞と共に、主に前部前脳及び腹側前脳の表現型に対応する細胞を含むと考えられる。
【０１５０】
実施例２：デフォルトニューロン新生中にＳＨＨ経路を拮抗させることが、ほとんどの神経前駆細胞を皮質同一性に変換させる
実験手順
実験手順は、実施例１に記載した通りであった。神経分化中であると予測されたら、２日目〜１０日目にシクロパミン（Calbiochem、１００％エタノール中で溶解）を１μＭの最終濃度で分化培地（ＤＤＭ）中に添加した。エタノールは対照として使用した。
【０１５１】
結果
本発明者らは、ＤＤＭ培養物中で腹側前脳のマーカーを発現する大部分の神経前駆細胞の存在が、ＳＨＨ活性によるものであり得ると仮説を立てた。この仮説に一致して、本発明者らは、ＳｈｈがＤＤＭ培養の２日後に誘導されることを見出した（図１Ｃ（ｈ））。
【０１５２】
ＳＨＨシグナル伝達がこの系で実際に活性であったか否かを調べるために、本発明者らは、２日目〜１０日目に、神経誘導及び神経前駆細胞分化プロセス中、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ受容体（Chen et al. 2002. Genes Dev 16: 2743-2748）と結合するＳＨＨ経路の特異的なアンタゴニストであるシクロパミンを使用することによって、分化中のＳＨＨシグナル伝達を遮断しようとした（本明細書中でＤＤＭ＋シクロパミン条件とも称される）。
【０１５３】
重要なことに、シクロパミンは、様々な時点での総神経（pan-neural）マーカーのパターン発現によって実証されるように、神経誘導プロセス自体をほとんど変えず、このことは、シクロパミンなしで観察されたものと同様であった（シクロパミンなしの図１Ａと比較した図１Ｅ）。シクロパミンは、高い割合のＯｔｘ１−２陽性神経前駆細胞によって実証されるように、神経前駆細胞の前部同一性も変えなかった（７５．５７±１．２１％、図１Ｂ（１）、黒色カラム）。しかしながら、シクロパミンは、神経前駆細胞の背腹側パターン化に対する劇的な効果を有しており、腹側から背側までの前脳同一性の広範な移動を引き起こし、神経前駆細胞の大部分を背側の前脳様の同一性に適合するように変換させた。シクロパミン添加の際に、神経前駆細胞内のＧｓｈ２、Ｎｋｘ２．１及びＮｋｘ２．２の発現はほとんど破壊されたが（それぞれ、ネスチン陽性細胞の１．３７±０．６１％、１．８７±１．１０％、及び４．０５±１．１０％、３つ全てのマーカーでｐ＜０．００１）（図１Ｂ（４）、図１Ｂ（５）及び図１Ｂ（６）、黒色カラム）、Ｐａｘ６及びＯｔｘ１の発現は大きく増大した（それぞれ、ネスチン陽性細胞の７３．０３±２．４４％及び７１．２１±２．５２％、両方のマーカーでｐ＜０．００１）（図１Ｂ（２）、図１Ｂ（３）、黒色カラム）。
【０１５４】
ＲＴ−ＰＣＲ実験は、ＳＨＨシグナル伝達の遮断により、背側マーカー、特に皮質原基の最も特異的なマーカーであるｅｍｘ１の潜在的誘導（図１Ｄ（ｃ））、及び調べた腹側マーカー全ての抑制（図１Ｄ）が起こることを示すこれらの見解を確認した。
【０１５５】
まとめると、これらの結果により、ＤＤＭ培養物におけるＳＨＨシグナル伝達の阻害後に、ＥＳ細胞を、推定大脳皮質に対応するマーカーを発現する神経前駆細胞の大部分が均一な集団に変換することができることが示される（Inoue et al. 2000、上掲）。重要なことに、本発明者らは、ＤＤＭ＋シクロパミン条件下で生成した、神経前駆細胞、ニューロン又はグリア（その全てが同じ時系列に従って現れた（図１Ａ、図１Ｅ））の割合では明らかな差異を全く検出しなかったが、１０日目及び１４日目の短いＢｒｄＵパルス標識によって評価されたように、神経前駆細胞の成長パターンは変わらないように見えた（１０日目のＤＤＭ：４７．９８±３．３５％、１０日目のシクロパミン：４２．１１±３．４２％、１４日目のＤＤＭ：３１．６１±２．０７％、１４日目のシクロパミン：２８．５７±２．００％、両方の場合でｐ＞０．０５）。したがってシクロパミンの添加は、神経系列の増殖率又は生存率に対して主な効果を全く有しないと考えられ、これにより、ＳＨＨの阻害が神経前駆細胞の特定の集団に対する選択的効果ではなく、細胞運命選択に対する直接的な有益な効果を有することが示唆されている。
【０１５６】
実施例３：ＤＤＭ＋シクロパミン中でＥＳ細胞から生成されたニューロンは、皮質錐体ニューロンに特徴的な分子性質、細胞性質及び機能的性質を呈する
実験手順
実験手順は、実施例１及び実施例２に記載した通りであった。
【０１５７】
電気生理学的記録
電気生理学的記録を、２９０ｍＯｓｍの浸透圧で、１２０ｍＭのＮａＣｌ、２６ｍＭのＮａＨＣＯ３、１１ｍＭのＤ−グルコース、２ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１．２ｍＭのＭｇＳＯ４及び１．２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４を含有する外部溶液（ＡＣＳＦ）中、室温（２０℃〜２５℃）で実施した。記録室を１ｍｌ／分の流速で一定して表面灌流させた。記録パッチピペットは、Ｐ−２０００マイクロピペットプラー（Sutter Instrument Co, Novato, CA, USA）で引っ張ったボロシリケートＧＣ１００ＴＦ−１０キャピラリー管（Clark Electrical Instruments, Reading, UK）で作られ、１５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、４．６ｍＭのＭｇＣｌ２、４ｍＭのＮａ２ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）及び０．４ｍＭのＮａ３ＧＴＰ（グアノシン三リン酸）、又は１１０ｍＭのＣｓＦ、０．１ｍＭのビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−四酢酸エチレングリコール（ＥＧＴＡ）、０．０３５ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤ−グルコース及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳのいずれかを含有するパッチピペット溶液で満たされると、４ＭΩ〜６ＭΩの抵抗を示し、この後者の溶液は自発性阻害シナプス後電流（ｓＩＰＳＣ）の記録に用いられる。両方のピペット溶液をｐＨ７．３及び３００ｍＯｓｍ／ｌ〜３３０ｍＯｓｍ／ｌに調整した。全細胞パッチ−クランプ法（patch clamp recordings）を、ＥＰＣ１０増幅器（HEKA, Elektronik,Lambrecht/Pfalz, Germany）を用いて電圧固定モードで行った。２．５ｋＨｚでフィルターにかけ、５ｋＨｚでデジタル抽出した自発性のシナプス後電流シグナルを除いて、シグナルを、ＥＰＣ１０のビルトインフィルタを用いて４ｋＨｚでフィルターにかけ、２０ｋＨｚでデジタル抽出した。電圧プロトコル発生、データの獲得及び解析を、パルス８．６５（HEKA, Elektronik, Lambrecht/Pfalz, Germany）で行った。自発性興奮シナプス後電流（ｓＥＰＳＣ）の存在を、１００μＭのピクロトキシンの存在下でニューロンを−６０ｍＶに固定することによって評価した。自発性阻害シナプス後電流（ｓＩＰＳＣ）の存在を、１μＭのＴＴＸ、５μＭの２,３−ジオキソ−６−ニトロ−１，２，３，４−テトラヒドロベンゾ［ｆ］キノキサリン−７−スルホンアミド二ナトリウム塩（ＮＢＱＸ）及び５０μＭのＤ−（−）−２−アミノ−５−ホスホンホスホノペンタン酸（ＡＰＶ）の存在下でニューロンを−２０ｍＶに固定することによって評価した。自発性シナプス後電流の性質をさらに確認するために、ＮＢＱＸ（５μＭ）及びＡＰＶ（５０μＭ）を用いて、それぞれＡＭＰＡ受容体及びＮＭＤＡ受容体を遮断し、ピクロトキシン（１００μＭ）を用いて、ＧＡＢＡＡ受容体を遮断した。それぞれの型のＰＳＣ、及び各条件（ＤＤＭ又はＤＤＭ＋シクロパミン）で、１５個のニューロンを記録した。
【０１５８】
形態
形態研究のために、本発明者らは、Hand et al. 2005（Neuron 48: 45-62）で記載の錐体指数（Pyramidal Morphology Index）（ＰＭＩ）を用いた。ＭＡＰ２に関して染色した少なくとも１００個のニューロンの画像を、各条件で、及び２つの異なる実験から無作為に撮影し、重畳層上に示された（drawn on）２５μｍ円を用いて、AdobeのＰｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェアで盲検で定量を行った。
【０１５９】
結果
本発明者らは、分子性質、細胞性質、及び機能的性質に関してＤＤＭ＋シクロパミン条件下で、神経前駆細胞から生成されたニューロンの運命を特徴付けて、ＤＤＭ条件下で生成されたニューロンのものと比較した。
【０１６０】
本発明者らは、ＤＤＭ＋シクロパミン中で生成された神経前駆細胞に由来するほとんどのニューロンが、大脳皮質の興奮グルタミン酸作動性ニューロンのマーカーである小胞性グルタミン酸輸送体ＶＧｌｕＴ１（分化の２８日後のＴｕｊ１陽性細胞の７０．０４±２．９８％）又はＶＧｌｕＴ２（１５．４６±２．５２％）を発現し、それらのほんのわずか（Ｔｕｊ１陽性ニューロンの１１．３０±３．３１％）がＧＡＢＡ作動性阻害ニューロンのマーカーである小胞性ＧＡＢＡ輸送体ＶＧＡＴを発現したことを見出した（図２Ａ）。
【０１６１】
この表現型は、ＤＤＭ単独で得られた前駆細胞由来のニューロンで観察されたものとは顕著に異なっていた（図２Ａ）。この場合、本発明者らは、かなり高い割合のＧＡＢＡ作動性ニューロン（３９．３８±２．７３％、ｐ＜０．００１、比率に関してはｚ検定）、及びかなり低い割合のグルタミン酸作動性ニューロン（ＶＧｌｕＴ１発現ニューロンの３６．２９±２．６０％及びＶＧｌｕＴ２発現ニューロンの１２．２９±１．７５％）、それぞれｐ＜０．００１及びｐ＞０．０５）を観察した。この実験では、本発明者らは、ＤＤＭ条件又はＤＤＭ＋シクロパミン条件下でのモノアミン作動性ニューロン又はコリン作動性ニューロンの存在に関する痕跡も、ロドプシン又はＧＡＢＡ−α６−受容体等の他の特異的なニューロン運命のマーカー（それぞれ光受容体及び小脳顆粒細胞）も見出さなかった（図示せず）。
【０１６２】
神経伝達分子マーカーの差次的発現が特定の機能的性質と相関関係があったか否かを求めるために、本発明者らは、パッチ−クランプ法を実施した。
【０１６３】
初めに本発明者らは、２８日目付近の最適な電気活性に対応する成熟時間窓を求めた。この時、ニューロンは、ＤＤＭ条件及びＤＤＭ＋シクロパミン条件下の両方で自然作用電位とシナプス電流とを含む、正常且つロバストな興奮性を示した（図２Ｂ−ｉＰＳＣ、図２Ｃ−ｅＰＳＣ）。しかしながら、ＤＤＭ条件下では、本発明者らは、ニューロンの３８．４６±１３．４９％及び６．６７±６．４４％がそれぞれ、自発性ＧＡＢＡ作動性阻害電流（ｉＰＳＣ）及びグルタミン酸作動性興奮シナプス後電流（ｅＰＳＣ）を呈したので、阻害シナプス活性と興奮シナプス活性との混合を記録したが、ＤＤＭ＋シクロパミン条件に従って、ニューロンの３８．８９±１１．４９％がｅＰＳＣを呈し、ｉＰＳＣを全く又はほとんど記録することができなかったので、ほとんどの活性は、グルタミン酸作動性興奮シナプス活性に対応していた（図２Ｄ、ｅＰＳＣ及びｉＰＳＣの両方でｐ＜０．０５、フィッシャーの直接確率検定）。
【０１６４】
したがって、ＤＤＭ条件対ＤＤＭ＋シクロパミン条件に由来するニューロン間の神経伝達マーカーの発現で観察された差異は、シナプス活性における同様の機能的差異に相関していた。
【０１６５】
皮質ニューロンは、それらの形態的性質によっても識別することができる。皮質興奮ニューロンは、他のものよりも広範な一樹状突起の存在を特徴とする錐体形態又は単極性形態を示し、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンは多極性形態を示す。
【０１６６】
したがって本発明者らは、各条件下で生成したニューロンの形態を比較し、各条件下での形態における重要な質的移行が観察され、ＤＤＭ＋シクロパミン中でのより多くのニューロンが錐体型の突き出た樹状突起を有する単極性形態を呈した（図３Ａ、図３Ｂ）。ＥＳ細胞由来ニューロンの形態の半定量的スコア付けにより、ＤＤＭ＋シクロパミン中でのＥＳ細胞由来のニューロンの大部分（６１．３９±４．８４％）が単極性形態を示し、これらの一部分（１６．９８±３．６５％）だけがＤＤＭ条件下でこのような形態を示した（図３Ｃ、ｐ＜０．０１、カイ二乗検定）。
【０１６７】
これらのデータを定量的に解析するために、本発明者らは、最も大きい樹状突起の幅と、同じニューロンから広がる神経突起の数との間の比に対応する、最近記載のあった錐体指数（ＰＭＩ）を用いた（Hand et al. 2005、上掲）。出生後早期皮質から解離し、２日間培養したニューロンでのＰＭＩの定量を用いて、本発明者らは、グルタミン酸作動性ニューロンが、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンよりも非常に高いＰＭＩスコアを呈することを見出し、それらの樹状突起の形態に基づき、皮質の興奮ニューロンと阻害ニューロンとの客観的な識別を可能にするカットオフ値を求めることができる（１．２μｍ）（図３Ｄ）。
【０１６８】
ＤＤＭ＋シクロパミン中でのＥＳ細胞由来のほとんどのニューロンは、以下のＤＤＭ条件よりも有意に高いＰＭＩを呈した（図３Ｅ、図３Ｆ、ｐ＜０．００１、マンホイットニー検定)。ＤＤＭ＋シクロパミン中で誘導されるニューロンの大部分（分化の２８日後のＭＡＰ２陽性ニューロンの７７．２３±４．１７％）は、カットオフ値を超えるＰＭＩを呈し、したがってこれは推定錐体ニューロンに対応していたが（図３Ｆ）、ＤＤＭ条件下では、この割合は２９．２５±４．４２％だけであった（ｐ＜０．００１、割合に関してはｚ検定）。
【０１６９】
まとめると、これらのデータにより、ＤＤＭ＋シクロパミン条件下でＥＳ細胞から生成されたニューロンの大部分は、錐体ニューロンに特有の形態的性質及び機能的性質を呈し、ＤＤＭ中で生成された神経前駆細胞は、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンと錐体ニューロンとの混合体を生成した。
【０１７０】
実施例４：ＤＤＭ＋シクロパミン中でＥＳ細胞から誘導されたニューロンは皮質移植片で錐体ニューロンのように挙動する
実験手順
実験手順は、実施例１〜実施例３に記載した通りであった。
【０１７１】
オーバーレイアッセイ
出生後２日（Ｐ２）のマウス脳を、グルコースを添加した冷Ｌ１５緩衝液中で解剖し、Ｌ１５中の３％低融点アガロースに埋め込み、３００μｍのビブラートム上で（冠状）分割した。Ｎ２Ｂ２７培地を含有する３５ｍｍウェルにおいて透明な多孔質膜（孔径１μｍ、Greiner）で切片を培養した。２１日後に、トリプシン処理及び機械的粉砕によって、ＧＦＰ発現ＥＳ細胞由来のニューロンを単細胞懸濁液に解離し、洗浄し、１ｍｌ当たり１×１０６細胞で再懸濁した後、皮質切片上にプレーティングした（１つの切片当たり５０μｌの細胞懸濁液）。プレーティングした後、切片を４日間培養し、それから４℃で一晩４％ＰＦＡを用いて固定し、免疫蛍光のために処理した。ＰＦＡを取り除き、切片をＰＢＳで３回洗い流した。非特異的な抗体活性の遮断及び透過化を、３％ＢＳＡ（Sigma）及び０．３％トリトンＸ−１００（Sigma）を添加したＰＢＳ中で行った。一次抗体とのインキュベーションを、３％ＢＳＡ及び０．３％トリトンＸ−１００を添加したＰＢＳ中で、４℃で一晩行った。細胞をＰＢＳで３回洗い流し、５％ウマ血清（Invitrogen-Gibco）、３％ＢＳＡ（Sigma）及び０．３％トリトンＸ−１００（Sigma）を添加したＰＢＳ中で４℃で一晩、二次抗体とインキュベートした後、再びＰＢＳで３回洗い流した。二重免疫染色のために、このプロセスを繰り返した。核をビスベンジミド（ヘキスト番号３３２５８、Sigma）で染色し、グリセロゲル（DAKO）を用いてカバースリップを乗せた。AdobeのＰｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェアを用いて、Polleux et al. 2000（Nature 404: 567-573）に従って放射状樹状突起の配向性（orientation）の定量を盲検で行った。３つの独立した実験に由来する少なくとも９つの異なる切片上での少なくとも３００個の細胞を評価した（各実験から少なくとも１００個の細胞）。
【０１７２】
結果
皮質内で、グルタミン酸作動性の錐体ニューロンは、偏向され、放射状に配向して、皮質表面の方を向いた先端樹状突起である１つの大きい樹状突起と、腹側表面の方を向いた軸索とを有する。定義上は、ほとんどの皮質抑制性介在ニューロンが、非錐体形態であり、したがってその軸索及び樹状突起の成長は放射軸に制約されない。
【０１７３】
切片オーバーレイアッセイを用いて（Polleux & Ghosh 2002. Sci. STKE. 2002, L9）、胚性皮質から新たに解離したニューロンが、一部セマホリン及びＳｌｉｔシグナル伝達に対して反応することによって、皮質切片の上部に移植する際、この放射配向が容易に再び採用されることがこれまでに示されている（Whitford et al. 2002. Neuron 33, 47-61、Polleuxet al. 2000. Nature 404, 567-573）。重要なことに、視床ニューロン又は腹側終脳由来のニューロン（皮質介在ニューロンを含む）は、このような成長の放射配向パターンを示さない。
【０１７４】
本発明者らは、ＤＤＭ＋シクロパミン条件及びＤＤＭ条件に従ってｅＧＦＰ標識ＥＳ細胞由来のニューロンが、樹状突起の伸長を偏向させる細胞外の合図（cues）に反応することにより、錐体ニューロンのように放射配向することができるか否かを調べるために、切片オーバーレイアッセイを採用した。初めにニューロンを、構造的にｅＧＦＰを発現するＥＳ細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成し、分化の２１日後、このニューロンを、マウスの出生後皮質切片の上部で解離した。プレーティング後４日目、錐体形態のｅＧＦＰ＋ニューロンは皮質を統合していた（図４）。顕著に、これらのニューロンの大部分（６４．９８±２．４０％）が、皮質軟膜表面の方を向いた先端樹状突起と共に放射配向を呈した（図４Ｃ、図４Ｄ、図４Ｈ、図４Ｉ）。場合によっては、放射配向したニューロンから出る軸索を見ることができ、通常腹側の方を向いていた（図４Ｅ〜図４Ｇ）。これに対して、ＤＤＭ中でＥＳ細胞から生成されるニューロンを用いて、同様の実験を実施した場合、これらのニューロンのごくわずか（図４１、２６．０５±２．３２％、ｐ＜０．００１）しか放射配向を採用しなかった。この場合、ニューロンは接線（tangential）配向、多極性形態を呈したか、又は目に見える樹状突起を伸ばさなかった（図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｉ）。
【０１７５】
これらの結果により、ＤＤＭ＋シクロパミン条件下でＥＳ細胞から誘導された後、皮質切片へと向かうニューロンが、末梢分化プログラムに対する特異性が高い放射配向挙動を示した後、ｉｎ  ｖｉｖｏで錐体ニューロンになることが示される。これにより、錐体ニューロンの重要且つ特異的な性質、すなわち樹状突起がそれらの伸長をパターン化する細胞外の合図に適切に反応することにより、天然皮質組織において適当な皮質の統合を可能にする能力が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＥＳ細胞由来のニューロンにおいて正確に特定される。
【０１７６】
実施例５：正確な時間的パターンに従った、皮質ニューロンの包括的なレパートリの生成
実験手順
実験手順は、実施例１〜実施例４に記載した通りであった。
【０１７７】
ＢｒｄＵ標識
長期間のパルス・チェイス実験のために、ＢｒｄＵ（Becton Dickinson）を、１０μＭの最終濃度で２４時間、様々な日に分化培地に添加した。細胞を分化の２１日後に解離し、さらに１日、被覆カバースリップ上にプレーティングした。短期間のＢｒｄＵ取り込み実験のために、ＢｒｄＵを１時間、分化培地に添加した後、細胞を解離させ、再びプレーティングした。
【０１７８】
ＢｒｄＵ検出のために、培地を取り除き、細胞をＰＢＳで洗い流した後、４℃で、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で３０分間固定した。ＰＦＡを取り除き、細胞をＰＢＳで３回洗い流した。抗原回復法を用いて、ＢｒｄＵをアンマスキングした（unmasked）：細胞を１０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で４×５分間煮沸し、２０分間、室温に冷ました。マウス抗ＢｒｄＵ抗体（１／５０、Becton Dickinson）又はラット抗ＢｒｄＵ抗体（１／２５０、Abcam）を用いて、上記のように免疫染色を実施した。その後、上記の様に多重標識を実施した。
【０１７９】
クローン解析
Qianet al. 2000（Neuron 28: 69-80）に記載の皮質前駆細胞のクローン培養に関するプロトコルからプロトコルを採用した。要するに、１０日目、１２日目、１４日目又は１６日目のＥＳ由来神経前駆細胞をトリプシン処理し、パスツールピペット、及びその後２００μｌチップを用いて、単細胞懸濁液に完全に解離させた。明視野の顕微鏡下で解離を確認し、通常９９％を超える単細胞が得られる。細胞を、クローン密度（３〜５細胞／ｍｍ２）でポリリシン／ラミニン被覆カバースリップ上のＦＧＦ２を添加したクローン培地にプレーティングした。クローン培地は、Qian et al. 2000（上掲）から採用し、１×Ｎ２、１×Ｂ２７、２ｍＭのグルタミン及び１×ペニシリン−ストレプトマイシン（Gibco）を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌから成る。培地の半分を３日ごとに交換した。ＦＧＦ２を、単一の皮質前駆細胞からのクローン性増殖を維持し、その後のこれらの前駆細胞からの異なる皮質ニューロン集団の生成を可能にすることが示されている濃度（０．１ｎｇ／ｍｌ又は１０ｎｇ／ｍｌ）で培地に添加した（Qian et al. 2000（上掲）及びShen et al. 2006. NatNeurosci 9: 743-751）。
【０１８０】
結果
錐体ニューロンを多くのサブタイプに細分し、異なる層特異的なニューロン集団を同定する分子マーカーのレパートリによってｉｎ  ｖｉｖｏで規定することができる（Hevner et al. 2003. Dev. Neurosci. 25: 139-151）。本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏで観察されたのと同様に、ＤＤＭ＋シクロパミン中でＥＳ細胞から誘導されたニューロンが天然大脳皮質で見出されるニューロンのレパートリをｉｎ  ｖｉｔｒｏでどの程度生成することができるか、かかるレパートリが規定の時間的パターンに従って生成されるか否かについて調べた。
【０１８１】
本発明者らは、マウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで生成された主要サブタイプの皮質ニューロンに対応する以下の層特異的なマーカーの発現を試験した：プレプレート（preplate：原始網状層）ニューロン及びカハール・レチウス細胞に対するＴｂｒ１及びリーリン、深（Ｖ／ＶＩ）層ニューロンに対するＴｌｅ４、Ｔｂｒ１、ＣＴＩＰ２、Ｏｔｘ１、Ｅｒ８１、ＦｏｘＰ２、上（ＩＩ／ＩＩＩ／ＩＶ）層ニューロン及び第5層の脳梁投射ニューロンに対するＳａｔｂ２及びＣｕｘ１（図５を参照されたい）。例えばリーリンは、Ｅ９．５で現れ、最も早くから生成される皮質ニューロンであるカハール・レチウス（Ｃ−Ｒ）ニューロンのマーカーであり（Ikeda & Terashima 1997. Dev Dyn 210: 157-172）、Ｔｂｒ１は、Ｅ１０．５で現れ、ほとんどが第ＶＩ層のニューロンであり、幾つかが第Ｖ層のニューロンであるカハール・レチウスニューロンで発現され（Bulfone et al. 1995. Neuron 15: 63-78）、ＣＴＩＰ２は、Ｅ１２．５で現れ、ほとんどが第Ｖ層であり、幾つかが第ＶＩ層であるニューロンで発現され（Leid et al. 2004. Gene Expr Patterns 4: 733-739）、Ｏｔｘ１は、ラットにおいてＥ１６で現れ、第Ｖ層のニューロンの亜集団で発現され（Frantz et al. 1994. J Neurosci 14: 5725-5740）、Ｓａｔｂ２はＥ１４．５で現れ、第ＩＩ／ＩＩＩ／ＩＶ層のニューロンで発現される（Britanova et al. 2005. Eur J Neurosci 21: 658-668）。
【０１８２】
初めに本発明者らは、ニューロン生成のピークである１６日目〜２１日目のＤＤＭ＋シクロパミン処理細胞に注目した。本発明者らは、これらのマーカーのそれぞれがニューロンのサブセットで発現されることを見出した：リーリン（全Ｔｕｊ１＋ニューロンの２１．１８±１．２８％）、Ｔｂｒ１（３８．１４±１．５４％）、ＣＴＩＰ２（３６．０１±１．５２％）、Ｏｔｘ１（１５．４２±１．０６％）、Ｓａｔｂ２（７．６０±０．７８％）、及びＣｕｘ１（１０．５６±０．８０％）（図６Ａ、表２）。これらの結果により、これらのマーカーの幾つかが少なくとも初期の発生段階での皮質同一性に特異的であるので、生成されたニューロンの皮質同一性がさらに確認される。またこれらの結果により、深層及び上層の皮質層を含むそれぞれの皮質層に対応する、異なるサブタイプの皮質ニューロンの包括的レパートリが、ＤＤＭ＋シクロパミン条件下でＥＳ細胞から生成されることが示される。本発明者らは幾つかの興味深い定量的な差異にも言及した。特にこの実験では、本発明者らは、或る程度の初期ニューロンサブタイプの過剰提示（representation）と、上層ニューロンサブタイプの提示不足とを観察した（表２）。
【０１８３】
表２は層特異的なマーカーの発現と、ｅｘ  ｖｉｖｏ（本試験）で又はｉｎ  ｖｉｖｏで記載のように（参照）培養したＥＳ細胞由来のニューロン及び皮質ニューロンにおけるそれらの同時発現とを比較する免疫蛍光データの概要を示す。Ｎ＝３の独立実験、及びそれぞれ２１日目又は１４日目でのＥＳ細胞由来のニューロン及び前駆細胞で計測したｎ＞３００の細胞に関する。Ｎ＝２の独立実験、及びＰ０で急性的に解離されたニューロンで計測したｎ＞２００の細胞に関する。値は、標識細胞の割合の平均±標準誤差として示す。
【０１８４】
【表２】
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【０１８５】
次に本発明者らは、分化の６日目〜２１日目の時点で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏニューロン新生プロセスを通して、これらのマーカーの正確な発現開始点を調べた（図６Ａ）。
【０１８６】
ニューロンに現れる初めに検出可能なマーカーはリーリンであり、分化の６日後には既に検出可能であった。リーリン＋ニューロンの初期の出現により、これらのニューロンがリーリンを特異的に発現し、皮質で最も早く生成されたニューロンを構成するので、これらがカハール・レチウスニューロンに対応し得る可能性が高まった。この仮説を確認するために、本発明者らは、ｐ７３、Ｔｂｒ１、Ｔｂｒ２及びカルレチニンを含む、カハール・レチウスニューロンの他のマーカーに対する複合染色を実施し、初期リーリン＋ニューロンがさらにこれらのマーカーを同時発現することを見出した。これにより、ＤＤＭ＋シクロパミン条件下でＥＳ細胞から最も早く生成されたニューロンは実際、分子マーカーに関して、カハール・レチウスニューロンに対応することが強く示唆される。さらに、これらのＴｂｒ１／カルレチニン／リーリン／ｐ７３＋ニューロンは、真正（bona fide）カハール・レチウスニューロンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ挙動を強く連想させる自発性移動挙動を呈する（データ図示せず）。その上、オーバーレイアッセイ試験により、皮質の表面辺縁帯におけるそれらの天然位置でのカハール・レチウスニューロンを連想させる配向及び形態を呈するｅＧＦＰ＋ニューロンの存在が示された（図６Ｂ）。
【０１８７】
次に本発明者らは、カハール・レチウスニューロンだけでなく、後に第ＶＩ層のニューロンでも発現されるＴｂｒ１を調べた。本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏ状況に一致して、分化の７日後、したがってリーリンの１日後に発現し始めることを見出した。興味深いことに、分化の８日後に、Ｔｂｒ１＋ニューロンの割合が、リーリン＋ニューロンの割合よりも大きく増大し（図６Ａ）、これによりこの時点で、生成されたＴｂｒ１＋ニューロンの大部分がリーリンを発現せず、そのため第ＶＩ層〜第Ｖ層のニューロンに対応し得ることが示唆された。
【０１８８】
したがって本発明者らは、主に第Ｖ層のニューロンで、及び幾つかが第ＶＩ層のニューロンで発現されるＣＴＩＰ２及びＯｔｘ１を調べた。これらの発現の開始は、リーリン及びＴｂｒ１の発現開始から一貫して遅れ（図６Ａ）、Ｏｔｘ１はわずか８日後で幾つかのニューロンで現れ始めたが、ＣＴＩＰ２は９日後〜１０日後でようやく検出可能になり始めた。これにより、ＤＤＭ＋シクロパミン条件に従って、ｉｎ  ｖｉｖｏと同じように、第Ｖ層のニューロンのマーカーが、第ＶＩ層のニューロン又はカハール・レチウスニューロンのマーカーよりも後に発現され始めることが示される。
【０１８９】
最後に本発明者は、最も表面にある第ＩＩ／ＩＩＩ／ＩＶ層の皮質層の最も遅く生成された皮質ニューロンで選択的に発現されるＳａｔｂ２を調べた。Ｓａｔｂ２発現のｉｎ  ｖｉｖｏ時機に一致して、Ｓａｔｂ２は分化の１２日後にようやくニューロンで現れた（図６Ａ）。またＣｕｘ１は分化の１２日後にニューロンで現れた。
【０１９０】
したがって、異なるサブタイプの皮質ニューロンに対応するニューロンは、ＤＤＭ＋シクロパミン条件に従って同時には生成されないが、代わりに連続して且つ高度に組織的に現れると考えられ、このことはｉｎ  ｖｉｖｏでの大脳皮質で観察される順番を厳密に連想させる。まとめると、これらのデータにより、神経分化のデフォルト条件下では、ＥＳ細胞が皮質ニューロンのかなり広範なレパートリを生成する内在能力を呈し、このようなことが正常なｉｎ  ｖｉｖｏ皮質発生の主要な指標（milestones）をまとめる（recapitulates）特性化経路に従って起こることが示される。
【０１９１】
次に本発明者らは、ＥＳ系におけるそれぞれのニューロンサブタイプの実際の発生日を求めるために、ニューロンマーカーの染色と組み合わせたＢｒｄＵパルス・チェイス実験を実施した（図７）。この解析により、層特異的なマーカーを発現するニューロンが、連続した重複波で生成されることが示された：初めにリーリン及びＴｂｒ１＋ニューロン（１０日目〜１１日目でピーク）、その後のＣＴＩＰ２＋ニューロン（１２日目〜１３日目にピーク）、その後のＣｕｘ１＋ニューロン及びＳａｔｂ２＋ニューロン（１４日目〜１６日目にピーク）（図７）。これらのデータにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで観察されたように、異なる皮質サブタイプに対応するＥＳ由来のニューロンが、組織的な順番に従って現れることが実証された（Bayer & Altman 1991. Neocortical Development. Raven Press, NewYork、Hevner 2006. Mol Neurobiol 33: 33-50）。
【０１９２】
関与する細胞機構を探求するために、本発明者らは、クローン細胞解析に基づき細胞系列実験を行った（Shen et al. 2006. Nat Neurosci 9: 743-751）。初めに本発明者らは、固定した開始点（分化１０日目）でＥＳ細胞由来の神経前駆細胞のクローン希釈を行い、連続した時点（２日目、６日目及び８日目）に従ってニューロン子孫を特徴付けた（図８Ａ）。初期段階で（１０＋２日目）、神経前駆細胞のかかるクローンが、ほとんどのリーリン＋ニューロンと、幾つかのＣＴＩＰ２＋ニューロンとを生成した。経時的に、リーリン＋ニューロンの割合が大幅に低減したが、ＣＴＩＰ２＋ニューロンの割合は増大した。Ｓａｔｂ２＋ニューロン及びＣｕｘ１＋ニューロンが、後にこのクローンで現れ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１０＋８日後に最大に達した。
【０１９３】
次に本発明者らは、様々な時点（１０日目〜１６日目）でＥＳ細胞から神経培養物を解離し、６日後にｉｎ  ｖｉｔｒｏでその子孫を調べた（図８Ｂ）。これまでのデータと一致して、本発明者らは、初期前駆細胞から得られたクローン（１０日目に解離）が、６日後にほとんどのリーリン＋ニューロンと、幾つかのＣＴＩＰ２＋ニューロンとを生成したが、後期前駆細胞から得られたクローン（１２日目、１４日目、１６日目で解離）は徐々に少なくなる（fewer and fewer）リーリン＋ニューロンと、さらにより多くのＣＴＩＰ２＋ニューロンとを含有したことを観察した。これらの実験により、単一の神経前駆細胞は、初期細胞型を生成する能力を徐々に失うので、この神経前駆細胞の適性が経時的に変わることが示される。これらの実験は、異なる型のニューロン、例えばリーリン及びＣＴＩＰ２単一標識ニューロン（１４＋６日目で最大になる）、及びリーリン及びＳａｔｂ２単一標識ニューロン（図示せず）を含有するクローンの実質的な割合の検出も可能にした。
【０１９４】
まとめると、これらの結果により、真性の（genuine）皮質幹細胞で示唆されるように、ＥＳ細胞の内在経路が、個々の前駆細胞系列内でコードされ、且つ経時的に適性を変える多能性の皮質前駆細胞の生成をもたらすという直接的な証拠が与えられる（Shen et al. 2006、上掲、Noctor et al. 2004. NatNeurosci 7: 136-144）。
【０１９５】
実施例６：ＥＳ由来のニューロンが、広範な層特異的であるが、選択的な領域特異的なパターンの軸索投射を呈する
実験手順
ｉｎ  ｖｉｖｏ移植実験
ＥＳ細胞由来の皮質ニューロンのｉｎ  ｖｉｖｏ移植を、以下の修正を加えて、真性の胚性皮質ニューロンに関してこれまでに記載されたように実施した。細胞をトリプシン処理し、パスツールピペットを用いて完全に解離した後、３分間、１２００ｒｐｍで遠心分離した。上清を慎重に廃棄し、ペレットを５０×１０３の最終密度で２００μｌチップを用いて氷冷ＰＢＳ中に再懸濁し、氷上に置いた。
【０１９６】
Ｐ０〜Ｐ１仔マウスを氷上で麻酔した。運動野の真上で皮膚を通して頭蓋骨をブレグマに対して吻側方に１ｍｍ小切開した。２５ゲージニードルのチップを用いて小皮質損傷を作製し、細胞懸濁液１μｌを損傷の吻側にハミルトンシリンジで注入した。３週間〜４週間後、レシピエント動物をケタミン及びキシラジンで麻酔し、氷冷４％ＰＦＡで灌流させた。脳を採取し、ビブラートムを用いて１００μｍ切片を得た。ウサギ抗緑色蛍光タンパク質（１／３０００、Molecular Probes）を用いて上記のように免疫染色を実施した。
【０１９７】
免疫染色後、それぞれの移植動物（Ｎ＝３０の動物）由来の全ての切片を系統的に検査した。移植片の位置を書き留め、ＧＦＰ＋軸索の存在を以下の構造全てにおいて系統的に確認した：原皮質及び古皮質を含む皮質、脳梁、外皮及び内皮、帯状束、中隔、線条体、視床（一次中継核（primary）及び連合核（associative nuclei））、大脳脚、上丘及び下丘、中脳中心灰白質核及び大脳脚橋核（pediculopontine nuclei）を含む中脳核及び後脳核、並びに頸髄に至るまでの錐体路。視覚野及び上丘におけるそれぞれの視床核（ＬＧ、ＬＰ、ＬＤ、ＭＧ、ＶＢ、ＶＬ、ＶＭ）中の軸索線維を、視床への軸索成長を示す移植動物において手動でスコア付けした（Ｎ＝２８の移植動物）。視床が存在したそれぞれの切片において、従来の顕微鏡検査（Zeiss Axioplan）でスコア付けを行い、それぞれの核に関して、それぞれの切片でスコア付けした線維の合計数を１つの核当たりの線維の総数と見なした。様々な時点（ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１２日目、１４日目、１７日目）で分化した細胞から生じる移植片由来の投射の比較のために、それぞれの解析構造（同側視覚野及び対側視覚野、視床ＬＧＮ、中脳上丘）における線維の数を、同じ脳における４つの構造全てで計測された線維の総数に正規化し、それによりｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化の時機に応じて、それぞれの構造に占める線維の割合が与えられた。カイ二乗検定を用いて、様々な時点から生じる様々な集団の投射パターンを比較した。
【０１９８】
結果
ニューロン同一性の最終規定は連結性に依存する。皮質では、錐体ニューロンは層特異的且つ領域特異的な投射パターンを呈する（図９Ｅ、図９Ｆ）。例えば、第ＶＩ層のニューロンは、視床にその主投射を送達したが、中脳、後脳及び脊髄を含む脳の他の部分へのほとんどの投射は、第Ｖ層のニューロンから現れる。第Ｖ層及び第ＩＩ／ＩＩＩ層由来のニューロンは、対側大脳半球への脳梁投射を含む皮質内投射のほとんどに寄与する（Hevner et al. 2003、上掲）。
【０１９９】
この顕著な態様の皮質ニューロンの特性化を調べるために、本発明者らは、新生児マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ移植実験を行った。この系では、胚性皮質から新生児の皮質に移植した神経前駆細胞及びニューロンは、残りの宿主脳に正確に接続される（O'Leary et al. 2007. Neuron 56: 252-269、Gaillardet al. 1998. Adv Anat Embryol Cell Biol 148: 1-86）。
【０２００】
ニューロン及びそれらの軸索投射を非常に正確に選択的に同定することを可能にするＴａｕ−ＧＦＰノックインＥＳ細胞株を用いてこれらの実験を実施した（Wernig et al. 2002. J Neurosci Res 69: 918-924）。初めに、本明細書中で教示されたように、１２日間〜１７日間、ＥＳ細胞を神経前駆細胞及びニューロンに分化した後、解離させ、Ｐ０−Ｐ１仔マウスの前頭皮質に移植した。それから、動物をさらに発育させ、１ヵ月後に屠殺し、移植細胞の分化及び投射パターンを解析した（図９〜図１１）。全ての場合で（Ｎ＝３０）、移植片は、運動皮質及び体性感覚皮質の下の白質、又はより表面的には皮質灰白質自体のいずれかに位置していたが、幾つかの場合では、移植ニューロンが脳室系に隣接する構造で見出されたものもあった（図９〜図１１）。
【０２０１】
移植片の細胞組成の解析により、移植片における細胞の大部分（９０％超）がＴａｕ−ＧＦＰ＋ニューロン及びＭＡＰ２＋ニューロンから成り、ほんのわずか（５％未満）がネスチン＋細胞及びＧＦＡＰ＋細胞であり、幾つかが、宿主による移植片の血管新生を反映すると考えられているＰＥＣＡＭ＋血管様構造であることが示された（表３）。
【０２０２】
表３は新生児皮質での移植後の移植片の細胞組成及び移植ニューロンの同一性に関する免疫蛍光データの概要を示す。Ｎ＝１１の動物に関する。
【０２０３】
【表３】
0005631210.tif 000004
【０２０４】
ほんのわずかのＫｉ６７＋増殖細胞（１％未満）を移植片内で見出し、内胚葉、中胚葉、表皮又はＥＳ細胞系列のマーカーを全く検出することができず、これにより移植後少なくとも１ヵ月では、奇形腫の形成は起こらないことが示唆される。活性化カスパーゼ３に関して標識されたほんのわずかの細胞（１％未満）による１ヶ月でのニューロンの生存率は非常に高かった。移植ニューロンの中では、本発明者らは、ＦｏｘＰ２、Ｔｌｅ４、Ｔｂｒ１、ＣＴＩＰ２、Ｃｕｘ１、Ｓａｔｂ２、及びＣＯＵＰＴＦ１／２を含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ状況と同じ皮質ニューロンのマーカーが存在することを見出した。
【０２０５】
また移植ニューロンの形態を評価して、移植片周りの単一ニューロンに注目した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで見出されたものに一致して、これらのニューロンの大部分（８９±３．１３％）が、真性錐体皮質ニューロンと同程度の錐体指数（ＰＭＩ）で単極性であった（図９ｄ）。まとめると、これらのデータにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ状況と同様に、大部分の移植細胞が実際に、完全に分化した皮質錐体ニューロンに対応するという重要な結論が導かれる。
【０２０６】
次に本発明者らは、移植ニューロン投射のＧＦＰ＋パターンを調べた。ほどんどの移植動物では、本発明者らは、外包及び脳梁を通って、同側皮質及び対側皮質に至るまでの、したがって皮質−皮質投射に対応する有意な投射を見出した（図９ｅ、図９ｆ、図１１ａ〜図１１ｃ、表４）。
【０２０７】
表４は新生児皮質における移植後の幾つかの皮質構造及び皮質下構造でのＥＳ由来のニューロンの軸索投射の半定量的スコア付けを示す。用いられるスコア：（−）は軸索なし、（＋）は１個〜１０個の軸索、（＋＋）は１１個〜１００個の軸索、及び（＋＋＋）は１００個を超える軸索を意味する。Ｎ＝３０の動物に関する。
【０２０８】
【表４】
0005631210.tif 000005
【０２０９】
それから、皮質遠心路に対応する投射を残りの脳で調べた。ＧＦＰ＋線維は、後脳における橋核に至るまでの全ての通り道である、線条体、内包、視床、大脳脚、中脳で見出された（図９ｇ〜図９ｌ、図１１、表４）。このパターン全体が、皮質−遠心路のパターンに顕著に類似し、これによりＥＳ細胞から生成されたほとんどのニューロンが皮質同一性を有するというさらなる証拠が与えられる。またこれらの結果により、視床（第ＶＩ層）、中脳及び後脳（第Ｖ層）、並びに大脳皮質の同側領域及び対側領域（第ＩＩ／ＩＩＩ層及び第Ｖ層）への投射を含む、投射パターンが、皮質ニューロンの多様なレパートリによって生成されることが実証される。
【０２１０】
これらの所見は、本発明者に、異なる期間（それぞれ１２日、１４日及び１７日）後に分化し、これにより特異的な層運命で富化されると考えられる、ＥＳ由来の神経前駆細胞及びニューロンの移植が、ｉｎ  ｖｉｖｏでの様々な層特異的な投射パターンを生成し得るか否かについて調べることを促した。この解析により、それぞれの集団が全ての皮質標的に投射を送達したと見なされたが、視床、中脳、及び皮質の標的で見出された投射の割合は分化の時機に応じて異なることが示された。短期間（１２日間）分化した細胞から生じる移植片は、より長期間（１４日間〜１７日間）分化した細胞から生じる移植片よりも高い割合の視床への投射を呈した。反対に、より遅い時点（１４日目〜１７日目）から生じる移植片は、より早い時点（１２日目）から生じる移植片よりも高い割合の皮質への投射を呈したが、中脳への投射の割合は中間の時間的パターンに従っていた（図１０Ａ、ｐ＜０．００１、カイ二乗検定）。したがってこれらのデータにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察された層特異的な分化の時間的パターンは、同様の時間的パターンの層特異的な投射に相関していることが顕著に示される。
【０２１１】
層特異的なパターンに加えて、それぞれの皮質領域が残りの脳において選択的な標的に投射されるために、皮質ニューロンは領域特異的な連結性を呈する（Paxinos, 1995. The Rat Nervous System. Acadmic Press, San Diego （1995）。（図９ｅ、図９ｆ）。
【０２１２】
この極めて重要な態様の皮質連結性を調べるために、本発明者らは、ＥＳ由来の移植ニューロンの投射パターンのより詳細な解析を実施した。驚くべきことにこの実験では、本発明者らは、皮質、視床及び中脳／後脳に投射される移植ニューロンが、拡散するが正確に、視覚皮質及び後頭辺縁皮質に対応するこれらの構造に神経を分布しなかったことを見出した（図９〜図１１、表４）。皮質では、ＧＦＰ＋軸索は、ほとんど（９０％超）の移植動物の視覚野、及び辺縁皮質で見ることができたが、運動野又は体性感覚野への投射は移植動物では全く観察されなかった（図１０Ｂ、表４）。視床において（図９ｊ、図１０Ｃ、表４）、ＧＦＰ＋軸索はほとんどの動物で観察され、視覚視床に神経を分布させたが（ＬＧ及びＬＰ）、視床の他の一次中継核では稀なことであった（ＶＬ、ＶＢ及びＭＧ）。それぞれの主な視床核におけるＧＦＰ＋線維の分布の定量により（図１０Ｃ）、わずかしか線維が検出されなかった任意の他の一次中継視床核よりも視覚視床核でより密度の高い神経分布が示された。同様に、中脳及び後脳への投射を調べると、ほとんどの場合で（８０％超）ｅＧＦＰ＋軸索が、視野皮質の中脳標的である上丘（ＳＣ）に投射されたが（図９Ｉ、図１０Ｂ）、運動投射に対応する錐体路若しくは脊髄では線維を全く検出することができず、又は聴覚下丘（ＩＣ）には投射されなかった。さらにほとんどの移植動物が、新皮質及び辺縁皮質から拡散投射を受ける構造に対応する、辺縁皮質、内側視床核、及び中脳中心灰白質に投射を送達した（図１０Ｂ、図１１、表４）。
【０２１３】
様々な日数のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化（１２日、１４日、１７日）の後、同様の領域特異的なパターンの投射が見出され、これによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで少なくとも１２日後には、細胞はこれらの特異的な領域運命に関連付けられた（committed）。
【０２１４】
ＥＳ細胞由来のニューロンの投射は、主に視覚的同一性を呈するが、前頭皮質に移植した胚性前頭皮質で報告されたパターンとはかなり異なる、新生児の前頭皮質に移植した後期胚性後頭皮質で記載のものと顕著に類似して見え、この投射が主に運動様投射を展開する（Gaillard et al. 1998、上掲、Pinaudeau et al. 2000.Eur J Neurosci 12: 2486-2496、Ebrahimi-Gaillard et al. 1994． Brain Res Dev Brain Res 77: 271-283）。重要なことに、本発明者らの結果は全て、前頭皮質における移植片で得られ、これにより観察されたパターンが、宿主の影響を介した移植ニューロンの再特性化によるものではないことが示唆された（O'Leary et al. 2007、上掲、Pinaudeau et al. 2000、上掲、Barbe & Levitt 1995. J Neurosci 15: 1819-1834）。したがって、本発明者らのデータにより、ＥＳ細胞系においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成された前駆細胞及びニューロンが、主に後頭／視野皮質に対応する、驚くべき特異的な同一性をもたらす領域特異的な分化プロセスを受けることが示唆され得る。この仮説に従って、本発明者らは、１４日目でＥＳ細胞から生成されたネスチン＋前駆細胞の大部分が胚性後頭／視野皮質で優先的に発現されるＣｏｕｐＴＦＩ及びＣｏｕｐＴＦＩＩ転写因子を発現したことを見出した（ＣｏｕｐＴＦＩでは８１．６４±２．２２％、ＣｏｕｐＴＦＩＩでは９５．１±１．２３％）（Armentano et al. 2007. Nat Neurosci 10: 1277-1286、Sansom et al. 2005. Development 132: 3947-3961）。
【０２１５】
実施例７：デフォルトニューロン新生中のＳＨＨ経路の刺激及び／又はＷｎｔ経路の拮抗がほとんどの神経前駆細胞を抑制性介在ニューロンと同一に変換させる
腹側特性を有するＥＳ細胞由来の神経前駆細胞の割合を増大させるために、本発明者らは、ＤＤＭに可溶性組み換えＳｈｈを添加することによってＳｈｈシグナル伝達を増大するか、又はＷｎｔ経路の可溶性アンタゴニストであるＤｉｃｋｋｏｐｆ−１（Ｄｋｋ）を添加することによって背側化Ｗｎｔシグナル伝達に拮抗するように選択した。
【０２１６】
１μＭ及びさらに多くは１０μＭでのＳｈｈの添加により、神経前駆細胞と同一の背側から腹側にわたる再特性化に一致して、Ｎｋｘ２．１陽性前駆細胞の割合が増大し（ＤＤＭ中での１７．０±１．５％から１０μＭのＳｈｈでの６２．８±２．２％、ｐ＜０．００１、割合に関してｚ検定、図１２Ａ）、Ｐａｘ６の発現が低減した（ＤＤＭ中での４０．１±１．８％から１０μＭのＳｈｈでの２０．４±１．４％、ｐ＜０．００１、図１２Ａ）。ＤＫＫの添加による正準Ｗｎｔシグナル伝達の阻害により主として、より小さい尺度でＳｈｈ添加と同じ結果が生じた：Ｎｋｘ２．１は、ＤＤＭ中の全てのネスチン陽性細胞の１７．０±１．５％から３００ｎｇ／ｍｌのＤｋｋでの２９．０±２．０％で誘導され（ｐ＜０．００１、図１２Ａ）、Ｐａｘ６は、ＤＤＭ中の４０．１±１．８％から（from from）Ｄｋｋ３００での２３．７±１．４％まで減少した（ｐ＜０．００１、図１２Ａ）。同様の効果が、Ｇｓｈ２、Ｎｋｘ２．２、Ｄｌｘ１−２で観察された（データ図示せず）。
【０２１７】
ニューロンが生成された場合、同一性に対するＳｈｈ及びＤｋｋの効果を求めるために、本発明者らは、培養の２１日後に、この系でのニューロン新生のピークに対応する、腹側有糸分裂後ニューロンと背側有糸分裂後ニューロンとを識別することができるマーカーの発現を調べた。神経前駆細胞における本発明者らの観察と良好に相関して、漸増用量のＳｈｈが、背側ニューロンマーカーの全体的な減少と、腹側ニューロンマーカーの増加とを引き起こした（図１２Ｂ、図１２Ｃ）。皮質発生中に主にカハール・レチウス細胞によって生成された分泌糖タンパク質であるリーリンに対して陽性のニューロンの割合は、ＤＤＭ中の２８．０±２．７％からＳｈｈ１０での１６．６±１．８％に減少し（ｐ＜０．００１、図１２）、第ＶＩ層及び第Ｖ層に存在するＴＦであるＴｂｒ１を発現するニューロンが、ＤＤＭ中の２３．８±２．７％からＳｈｈ１０での０．７±０．５％に下がり（ｐ＜０．００１、図１２）、大脳皮質及び小脳のグルタミン酸作動性投射ニューロンに制限される小胞性グルタミン酸輸送体であるＶＧｌｕＴ１がこれらの条件下で、５８．２±３．６％から３３．７±２．６％に減少し（ｐ＜０．００１、図１２）、腹側終脳ニューロンのマーカーであるｖＧＡＴに対して陽性のニューロン（ＧＡＢＡ作動性線条体ニューロン及び皮質介在ニューロンを含む）が、１５．１±２．７％から３７．９±２．６％に増大し（ｐ＜０．００１、図１２）、線条体介在ニューロン及び投射ニューロンを含む腹側前脳のニューロンによって発現されたＴＦであるＩｓｌｅｔ−１によってマーク付けされる（marked）ニューロンが、９．７±１．８％から２４．３±２．４％に増大した（ｐ＜０．００１、図１２）。また、ＤｋｋによるＷｎｔシグナル伝達の阻害の際（図１２Ｃ）、及びさらにＳｈｈ及びＤＫＫの複合添加に従って（図１２Ｂ）、同様の効果が観察された。
【０２１８】
これらの結果により、皮質及び線条体の介在ニューロン及び線条体投射ニューロンを含む前脳様ＥＳ細胞由来の神経前駆細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏで前脳の背腹同一性の特性化を伴う経路に作用することによって腹側の特性を効率的に特定することができることが示される。これにより、前脳分化の本発明者らのｉｎ  ｖｉｔｒｏＥＳ細胞に基づくモデルが、これに関してｉｎ  ｖｉｖｏ状況と類似し、高い効率性で、臨床的重要性が高いニューロン群であるＧＡＢＡ作動性皮質／線条体介在ニューロン又は線条体投射ニューロンのいずれかを生成するために使用することができることが示唆される。
【図１Ａ】
0005631210.tif 000006
【図１Ｂ】
0005631210.tif 000007
【図１Ｃ】
0005631210.tif 000008
【図１Ｄ】
0005631210.tif 000009
【図１Ｅ】
0005631210.tif 000010
【図２Ａ】
0005631210.tif 000011
【図２Ｂ】
0005631210.tif 000012
【図２Ｃ】
0005631210.tif 000013
【図２Ｄ】
0005631210.tif 000014
【図３Ａ】
0005631210.tif 000015
【図３Ｂ】
0005631210.tif 000016
【図３Ｃ】
0005631210.tif 000017
【図３Ｄ】
0005631210.tif 000018
【図３Ｅ】
0005631210.tif 000019
【図３Ｆ】
0005631210.tif 000020
【図４】
0005631210.tif 000021
【図５】
0005631210.tif 000022
【図６Ａ】
0005631210.tif 000023
【図６Ｂ】
0005631210.tif 000024
【図７】
0005631210.tif 000025
【図８Ａ】
0005631210.tif 000026
【図８Ｂ】
0005631210.tif 000027
【図９−１】
0005631210.tif 000028
【図９−２】
0005631210.tif 000029
【図９−３】
0005631210.tif 000030
【図１０Ａ】
0005631210.tif 000031
【図１０Ｂ】
0005631210.tif 000032
【図１０Ｃ】
0005631210.tif 000033
【図１１】
0005631210.tif 000034
【図１２Ａ】
0005631210.tif 000035
【図１２Ｂ】
0005631210.tif 000036
【図１２Ｃ】
0005631210.tif 000037
【配列表】
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