(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
スライドガラスに載せられた組織サンプルにおけるバイオマーカー発現を再現性よく定量する方法であって、
（ａ）少なくとも１つの細胞内区画および少なくとも１つのバイオマーカーの局在同定を可能にするように染色された、スライドガラスに載せられた組織サンプルを得る段階、
（ｂ）前記染色された組織サンプルの１つ以上のピクセル構成画像を得て当該１つ以上のピクセル構成画像を分析して１つ以上のデータセットを得る段階、
（ｃ）データシグナルをノイズと区別するために、前記１つ以上のデータセットを自動的に解析する段階、
（ｄ）前記少なくとも１つの細胞内区画のそれぞれに起因し得るデータシグナルを区別するために、前記１つ以上のデータセットを自動的に解析する段階、
（ｅ）前記少なくとも１つの細胞内区画のそれぞれについての前記少なくとも１つのバイオマーカーに起因し得るデータシグナルを区別するために、前記１つ以上のデータセットを場合により自動的に解析する段階、ならびに
（ｆ）前記少なくとも１つの細胞内区画のそれぞれにおいて発現されたバイオマーカーの量を定量して、生スコアと、キャリブレーション・キューブ係数、光源係数および光路係数のうち１つ以上の係数との積である標準化されたスコアを得る段階、
を含み、
それによってランは工程（ａ）から（ｆ）までからなり、同一の前記スライドガラスに載せられた組織サンプルにおける前記バイオマーカー発現を異なるランの間で再現性よく定量し、
前記自動解析段階のそれぞれが、非監視様式で行われるとともに非監視式のピクセルに基づくクラスタリングアルゴリズムを含む方法。
【請求項２】
前記１以上のデータセットの最適化されたダイナミックレンジが得られるように露光時間を自動調整する段階をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
２つ以上の細胞内区画に起因し得るデータシグナルが区別される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
２つ以上の細胞内区画のそれぞれにおいて発現されたバイオマーカーの量が定量される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
２つ以上の細胞内区画に起因し得るデータシグナルが、約９５％の信頼区間で区別される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記スライドガラスに載せられたサンプルの信号の完全性、サンプルの完全性、画像の完全性をテストすることにより、前記スライドガラスに載せられた組織サンプル１つ以上もしくは前記ピクセル構成画像１つ以上またはそれらの１つ以上の拡大部分、の画質を評価し、前記信号の完全性、サンプルの完全性および画像の完全性が不備の場合、前記画像を分析から除外する段階をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
同一のスライドガラスに載せられた組織サンプルについて、サンプル分類に関してあるランと別のランとで８５％より大きいコンコーダンスをもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
同一のスライドガラスに載せられた組織サンプルについて、サンプル分類に関してあるランと別のランとで９０％より大きいコンコーダンスをもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
同一のスライドガラスに載せられた組織サンプルについて８０パーセントより高い再現性レベルを有するバイオマーカー発現の定量測度をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
同一のスライドガラスに載せられた組織サンプルについて９０パーセントより高い再現性レベルを有するバイオマーカー発現の定量測度をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
同一のスライドガラスに載せられた組織サンプルについて９５パーセントより高い再現性レベルを有するバイオマーカータンパク質発現の定量測度をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
同一のスライドガラスに載せられた組織サンプルについて約９０から約９７パーセントの範囲に入る再現性レベルを有するバイオマーカー発現の定量測度をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
同一のスライドガラスに載せられた組織サンプルについて２０パーセントより低い変動係数（％ＣＶ）を有するバイオマーカー発現の定量測度をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
同一のスライドガラスに載せられた組織サンプルについて１０パーセントより低い変動係数（％ＣＶ）を有するバイオマーカー発現の定量測度をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
同一のスライドガラスに載せられた組織サンプルについて５パーセントより低い変動係数（％ＣＶ）を有するバイオマーカー発現の定量測度をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
同一のスライドガラスに載せられた組織サンプルについて約４から約７パーセントの範囲に入る変動係数（％ＣＶ）を有するバイオマーカー発現の定量測度をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記スライドガラスに載せられた組織サンプルが、１つ以上の試薬の最適な希釈物で染色されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記最適な希釈物が、最適なダイナミックレンジメトリックを有するピクセル構成画像１つ以上を生じさせる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
スライドガラスに載せられた組織サンプルにおけるバイオマーカー発現を再現性よく定量する方法を行うための、プロセッサによって実行されるコンピュータ可読命令を有してこれを記憶したコンピュータ可読媒体であって、
前記方法が、
（ａ）少なくとも１つの細胞内区画および少なくとも１つのバイオマーカーの局在同定を可能にするように染色された、スライドガラスに載せられた組織サンプルのピクセル構成画像１つ以上を獲得して当該1つ以上のピクセル構成画像を分析して１つ以上のデータセットを得る段階、
（ｂ）データシグナルとノイズを区別するために、前記１つ以上のデータセットを自動的に解析する段階、
（ｃ）前記少なくとも１つの細胞内区画のそれぞれに起因し得るデータシグナルを区別するために、前記１つ以上のデータセットを自動的に解析する段階、および
（ｄ）前記少なくとも１つの細胞内区画のそれぞれにおいて発現されたバイオマーカーの量を定量することにより、生スコアと、キャリブレーション・キューブ係数、光源係数および光路係数のうち1つ以上の係数の積である標準化されたスコアを得る段階、
を含み、
それによってランは工程（ａ）から（ｄ）までからなり、同一の前記スライドガラスに載せられた組織サンプルにおける前記バイオマーカー発現を異なるランの間で再現性よく定量し、
前記自動解析段階のそれぞれが、非監視様式で行われるとともに非監視のピクセルに基づくクラスター化アルゴリズムを含む
コンピュータ可読媒体。
【請求項２０】
プロセッサによって実行され該媒体に記憶された前記コンピュータ可読命令が、
前記定量段階の前に、前記少なくとも１つの細胞内区画のそれぞれについての前記少なくとも１つのバイオマーカーに起因し得るデータシグナルを区別するために前記画像ピクセルから導出される前記１つ以上のデータセットを自動的に解析する段階を場合によって含む方法を行うための命令をさらに含む、請求項１９に記載のコンピュータ可読媒体。
【請求項２１】
スライドガラスに載せられた組織サンプルにおけるバイオマーカー発現を再現性よく定量するためのシステムであって、
（ａ）少なくとも１つの細胞内区画および少なくとも１つのバイオマーカーの局在同定を可能にするように染色された、スライドガラスに載せられた組織サンプルの少なくとも一部分を拡大するように構成された１つ以上のレンズ、
（ｂ）光源と、前記１つ以上のレンズと光通信する画像センサとを含む光学システムであって、前記染色された組織サンプルのピクセル構成画像１つ以上を得る前記光学システム、ならびに
（ｃ）前記光学システムと通信するプロセッサモジュールであって、１つ以上のピクセル構成された画像を解析して１つ以上のデータセットを得たのち、（ｉ）データシグナルとノイズを区別するために、前記１つ以上のデータセットを自動的に解析し、（ｉｉ）前記少なくとも１つの細胞内区画のそれぞれに起因し得るデータシグナルを区別するために、前記１つ以上のデータセットを自動的に解析し、および（ｉｉｉ）前記少なくとも１つの細胞内区画のそれぞれにおいて発現されたバイオマーカーの量を定量することにより、生スコアと、キャリブレーション・キューブ係数、光源係数および光路係数のうち１つ以上の係数の積である標準化されたスコアを得るように構成された、前記プロセッサモジュール
を含んで構成され、
それによって、ランは工程（i）から（iii）までからなり、同一の前記スライドガラスに載せられた組織サンプルにおける前記バイオマーカー発現を異なるランの間で再現性よく定量し、
前記自動解析段階のそれぞれが、非監視様式で行われるとともに非監視のピクセルベースのクラスター化アルゴリズムを含む
システム。
【請求項２２】
前記プロセッサモジュールが、前記少なくとも１つの細胞内区画のそれぞれについての前記少なくとも１つのバイオマーカーに起因し得るデータシグナルを区別するために、前記画像ピクセルから導出される前記１つ以上のデータセットを場合により自動的に解析するようにさらに構成される、請求項２１に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に従って２００８年９月１６日出願の米国特許出願第６１／０９７，４１５号の優先権の利益を主張するものであり、前記出願の開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、オペレータに依存しない解析およびアッセイ結果の再現性を向上させて診断アッセイにおいてより高い予測値を得るためのアルゴリズムを用いる、組織サンプルのバイオマーカー発現自動解析の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
今なお、組織切片に関するバイオマーカー評価は、大規模なハイスループットアッセイが利用可能になる前に主として開発された従来の細胞化学および免疫組織化学（ＩＨＣ）技術に依存している。従来の方法の大きな欠点は、検査の主観的性質、および標準化の欠如である。ＩＨＣ検査は、臨床的有用性を示した（例えばＨｅｒ２／ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ）が、これらの検査の価値は、その検査を行う現場によって損なわれることが、最近、証明された。Ｈｅｒ２検査の再現性を調査する２つの最近の研究は、ローカル検査室の検査と中央検査室の検査の間に２０％もの誤差があり得ることを証明した（Ｐｅｒｅｚら，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃ．Ｏｎｃ．（２００６）２４：３０３２−８；Ｐａｉｋ  Ｓら，Ｂｅｎｅｆｉｔ  ｆｒｏｍ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｍａｙ  ｎｏｔ  ｂｅ  ｃｏｎｆｉｎｅｄ  ｔｏ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＩＨＣ  ３＋  ａｎｄ／ｏｒ  ＦＩＳＨ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒｓ：Ｃｅｎｔｒａｌ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ＮＳＡＢＰ  Ｂ−３１（２００７）２５：５１１−２２）。
【０００４】
組織マイクロアレイ技術は、組織サンプルのハイスループット解析の機会をもたらす（Ｋｏｎｅｎ，Ｊ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：８４４−７（１９９８）；Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ，Ｏ．Ｐ．ら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０：６５７−６２（２００１）；Ｒｉｍｍ，Ｄ．Ｌ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．７：２４−３１（２００１））。例えば、組織マイクロアレイを用いて大規模研究を迅速に行うことができることで、薬物ターゲットおよび予後診断マーカー（例えば、エストロゲン受容体（ＥＲ）およびＨＥＲ２／ｎｅｕ）ならびに候補療法を同定および検証するために重要な情報を得ることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、検査室対検査室、機械対機械、オペレータ対オペレータ、および日対日の染色変動を最小にするインサイチューバイオマーカー定量の初めての完全自動標準化を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、組織サンプル、全組織切片（ＷＴＳ）ならびに組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）からのバイオマーカー発現の再現性のある定量に関し、これによりオペレータ、機器、設備および他の要因の差に起因するラン間またはバッチ間の変動性を減少させるものである。本明細書に記載するシステムおよびプロセスは、場所、オペレータまたは計器の変動性に左右されないラン間でのより良好な再現性のためのスコアの正規化を伴うバイオマーカーの自動局在同定および定量を提供する。
【０００７】
本発明の一態様は、スライドガラスに載せられた組織サンプルにおけるバイオマーカー発現を再現性よく定量する方法であって、（ａ）少なくとも１つの細胞内区画および少なくとも１つのバイオマーカーの局在同定を可能にするように染色された、スライドガラスに載せられた組織サンプルを得る段階、（ｂ）光源を含む標準化された光学システムを使用して、前記染色された組織サンプルの１つ以上のピクセル構成画像を得る段階、（ｃ）データシグナルをノイズと区別するために、前記画像ピクセルから導出される１つ以上のデータセットを自動的に解析する段階、（ｄ）前記少なくとも１つの細胞内区画のそれぞれに起因し得るデータシグナルを区別するために、前記画像ピクセルから導出される１つ以上のデータセットを自動的に解析する段階、（ｅ）前記少なくとも１つの細胞内区画のそれぞれについての前記少なくとも１つのバイオマーカーに起因し得るデータシグナルを区別するために、前記画像ピクセルから導出される１つ以上のデータセットを場合により自動的に解析する段階、ならびに（ｆ）前記少なくとも１つの細胞内区画のそれぞれにおいて発現されたバイオマーカーの量を定量する段階を含み、それによって、前記スライドガラスに載せられた組織サンプルにおける前記バイオマーカー発現を再現性よく定量する方法に関する。
【０００８】
１つの態様において、前記標準化された光学システムは、強度および光路の変動性が正規化された光源を含む。さらなる態様において、前記標準化された光学システムにより、前記画像ピクセルにおいて取り込まれたデータの最適化されたダイナミックレンジが得られるように露光時間を自動調整することができる。
【０００９】
１つの態様において、前記自動解析段階のそれぞれは、非監視様式で行われる。
【００１０】
１つの態様において、２つ以上の細胞内区画に起因し得るデータシグナルが区別される。
【００１１】
１つの態様では、２つ以上の細胞内区画のそれぞれにおいて発現されたバイオマーカーの量が定量される。
【００１２】
１つの態様において、２つ以上の細胞内区画に起因し得るデータシグナルは、約９５％の信頼区間で区別される。
【００１３】
１つの態様において、前記方法は、スライドガラスに載せられた組織サンプル１つ以上もしくはピクセル構成画像１つ以上またはそれらの１つ以上の拡大部分の質を評価する段階をさらに含む。
【００１４】
１つの態様において、前記方法は、再現性のあるカットポイント決定を提供する。
【００１５】
１つの態様において、前記方法は、それぞれのサンプルについてサンプル分類に関してあるランと別のランとで８５％より大きいコンコーダンスを提供する。さらなる態様において、前記方法は、それぞれのサンプルについてサンプル分類に関してあるランと別のランとで９０％より大きいコンコーダンスを提供する。
【００１６】
１つの態様において、前記方法は、８０パーセントより高い再現性レベルを有するバイオマーカー発現の定量測度を提供する。さらなる態様において、前記方法は、９０パーセントより高い再現性レベルを有するバイオマーカー発現の定量測度を提供する。さらなる態様において、前記方法は、９５パーセントより高い再現性レベルを有するバイオマーカータンパク質発現の定量測度を提供する。
【００１７】
１つの態様において、前記方法は、約９０から約９７パーセントの範囲に入る再現性レベルを有するバイオマーカー発現の定量測度を提供する。
【００１８】
１つの態様において、前記方法は、２０パーセントより低い変動係数（％ＣＶ）を有するバイオマーカー発現の定量測度を提供する。さらなる態様において、前記方法は、１０パーセントより低い変動係数（％ＣＶ）を有するバイオマーカー発現の定量測度を提供する。さらなる態様において、前記方法は、５パーセントより低い変動係数（％ＣＶ）を有するバイオマーカー発現の定量測度を提供する。さらなる態様において、前記方法は、約４から約７パーセントの範囲に入る変動係数（％ＣＶ）を有するバイオマーカー発現の定量測度を提供する。
【００１９】
１つの態様において、前記スライドに載せた組織サンプルは、１つ以上の試薬の最適な希釈物で染色されたものである。さらなる態様において、前記最適な希釈物は、最適なダイナミックレンジメトリックを有するピクセル構成画像１つ以上を生じさせる。
【００２０】
１つの態様において、本発明の方法は、コンピュータによって実行される。もう１つの態様において、本発明は、コンピュータ可読媒体であって、本明細書に記載する方法を行うためのプロセッサによって実行され該媒体に記憶されたコンピュータ可読命令を備えるコンピュータ可読媒体に関する。もう１つの態様において、本発明は、本明細書に記載する方法を実行するためのコンピュータ可読命令を有する電磁気シグナルに関する。本発明は、スライドガラスに載せられた組織サンプルにおけるバイオマーカー発現を再現性よく定量する方法を行うための、プロセッサによって実行されるコンピュータ可読命令を有してこれを記憶したコンピュータ可読媒体であって、前記方法が、（ａ）光源を含む標準化された光学システムを使用して少なくとも１つの細胞内区画および少なくとも１つのバイオマーカーの局在同定を可能にするように染色された、スライドガラスに載せられた組織サンプルのピクセル構成画像１つ以上を獲得する段階、（ｂ）データシグナルとノイズを区別するために、前記画像ピクセルから導出される１つ以上のデータセットを自動的に解析する段階、（ｃ）前記少なくとも１つの細胞内区画のそれぞれに起因し得るデータシグナルを区別するために、前記画像ピクセルから導出される１つ以上のデータセットを自動的に解析する段階、ならびに（ｄ）前記少なくとも１つの細胞内区画のそれぞれにおいて発現されたバイオマーカーの量を定量する段階を含み、それによって前記スライドガラスに載せられた組織サンプルにおける前記バイオマーカー発現を再現性よく定量する、コンピュータ可読媒体に関する。コンピュータ可読媒体の好ましい態様において、プロセッサによって実行され該媒体に記憶された前記コンピュータ可読命令は、前記定量段階の前に、前記少なくとも１つの細胞内区画のそれぞれについての前記少なくとも１つのバイオマーカーに起因し得るデータシグナルを区別するために前記画像ピクセルから導出される１つ以上のデータセットを自動的に解析する段階を場合によって含む方法を行うための命令をさら含む。本発明のさらにもう１つの態様では、スライドガラスに載せられた組織サンプルにおけるバイオマーカー発現を再現性よく定量するためのシステムであって、（ａ）少なくとも１つの細胞内区画および少なくとも１つのバイオマーカーの局在同定を可能にするように染色された、スライドガラスに載せられた組織サンプルの少なくとも一部分を拡大するように構成された１つ以上のレンズ、（ｂ）光源と、前記１つ以上のレンズと光通信する画像センサとを含む標準化された光学システムであって、前記染色された組織サンプルのピクセル構成画像１つ以上を得る前記標準化された光学システム、ならびに（ｃ）前記標準化された光学システムと通信するプロセッサモジュールであって、（ｉ）データシグナルとノイズを区別するために、前記画像ピクセルから導出される１つ以上のデータセットを自動的に解析し、（ｉｉ）前記少なくとも１つの細胞内区画のそれぞれに起因し得るデータシグナルを区別するために、前記画像ピクセルから導出される１つ以上のデータセットを自動的に解析し、および（ｉｉｉ）前記少なくとも１つの細胞内区画のそれぞれにおいて発現されたバイオマーカーの量を定量するように構成された、前記プロセッサモジュールを含んで構成され、それによって、前記スライドガラスに載せられた組織サンプルにおける前記バイオマーカー発現を再現性よく定量するシステム。前記システムの好ましい態様において、前記プロセッサモジュールは、前記少なくとも１つの細胞内区画のそれぞれについての前記少なくとも１つのバイオマーカーに起因し得るデータシグナルを区別するために、前記画像ピクセルから導出される１つ以上のデータセットを場合により自動的に解析するようにさらに構成される。そのような解析は、好ましくは、定量段階（ｉｉｉ）の前に行われる。
【００２１】
本発明の他の特徴、目的および効果は、後続の図面、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、スライドガラスに載せられた細胞含有生体サンプル、例えば患者からの組織サンプルの１つ以上の細胞内区画のそれぞれにおいて発現されたバイオマーカーの量を再現性よく定量するためのプロセスの実施形態を示す図である。
【図２】図２は、スライドガラスに載せられた細胞含有生体サンプルの１つ以上の細胞内区画のそれぞれにおいて発現されたバイオマーカーの量を再現性よく定量する画像処理段階に関するプロセスの実施形態を示す図である。
【図３】図３は、ＡＱＵＡ（登録商標）スコアリング情報とＩＨＣスコアリング情報の両方を用いて５４３ケースについて従来のＩＨＣスコアリング（ｘ軸）によりカテゴリー分けしたＬｏｇ２変換ＨＥＲ２  ＡＱＵＡ（登録商標）スコア（ｙ軸）の箱ひげ図である。すべてのカテゴリーにわたる平均の比較のための一元配置ＡＮＯＶＡ解析は、有意であった（ｐ＜０．００１）。多重比較のためのＴａｍｈａｎｅのＴ２統計量を用いる後付け（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ）解析は、各カテゴリー間の有意差を示す（すべてのＰ値＜０．０５）。
【図４】図４のＡ〜Ｃは、５８３ケースについての計器（Ａ）、オペレータ（Ｂ）および染色ラン（Ｃ）にわたって正規化したＬｏｇ２変換ＨＥＲ２  ＡＱＵＡ（登録商標）スコアを比較する箱ひげ図と、すべてのケースについての平均％ＣＶとを示すものである。
【図５】図５のＡ〜Ｃは、（Ａ）７５．７〜５７．９％の累積生存率の有意な［モンテカルロ  Ｐ＜０．００１；訓練／検証Ｐ＝０．００２］１７．８％低下を示す、集団を低ＨＥＲ２（８４．５％）と高ＨＥＲ２（１５．５％）に分けて計器１  ＨＥＲ２  ＡＱＵＡ（登録商標）スコアのカットポイントを決定したＸ−ｔｉｌｅについてのカプラン−マイヤー（Ｋａｐｌａｎ−ｍｅｉｅｒ）の５年疾病特異的生存時間解析を示す図である。このカットポイントを計器２（Ｂ）および計器３（Ｃ）に適用し、それらは、有意性（それぞれ、Ｐ＜０．００１およびＰ＝０．００４）および同等の曲線形状ならびに計器２についての組成［低ＨＥＲ２（８３．６％）；高ＨＥＲ２（１６．４％）；７５．５〜６０．１％からの累積生存率の１５．４％減少］および計器３についての組成［低ＨＥＲ２（８４．９％）；高ＨＥＲ２（１４．１％）；７４．９から６１．４％への累積生存率の１３．５％減少］を有した。
【図６】図６のＡ〜Ｆは、示されている計器セット（Ａ、Ｂ）、オペレータセット（Ｃ、Ｄ）およびランセット（Ｅ、Ｆ）それぞれについての基準（例えば、計器１）について生成されたＸ−ｔｉｌｅカットポイントに基づいて陰性（ＮＥＧ）集団分離に対して陽性（ＰＯＳ）集団分離を比較する２×２分割表を示す図である。９５％信頼区間で、総合コンコーダンス、陽性一致、および陰性一致率も示す。
【図７】図７のＡ〜Ｃは、乳癌ケース集団内のどこで不一致が発生するかを立証するために（Ａ）計器１（カットポイント）に対する計器２（ＡＱＵＡ（登録商標）スコア）；（Ｂ）オペレータ１（カットポイント）に対するオペレータ２（ＡＱＵＡ（登録商標）スコア）；および（Ｃ）ラン１（カットポイント）に対するラン２（ＡＱＵＡ（登録商標）スコア）について陰性一致、陽性一致、および非一致ケースに分けた頻度分布を示す図である。不一致が、示されているカットポイント内および付近にあり、分布全体にわたらないケース。
【図８】図８のＡ〜Ｄは、ＡＱＵＡ（登録商標）解析およびＥＧＦＲアッセイの解析性能を図示する図である。（Ａ）示されている％ＣＶを有する、３染色日（Ｄ）、機械（Ｍ）およびオペレータ（Ｏ）にわたる７４８ケースについてのＨＥＲ２のｌｏｇ（２）変換ＡＱＵＡ（登録商標）スコアの箱ひげ図。（Ｂ）示されている平均Ｒ値および傾きを有する、３枚のスライドガラスおよび３染色日にわたる乳房腫瘍、正常および細胞株対照（ｎ＝１５２）の検査アレイを用いて生成されたＥＧＦＲ  ＡＱＵＡ（登録商標）スコアについての線形回帰分析。（Ｃ）示されている％ＣＶを有する（Ｂ）からの４０の腫瘍についてのＥＧＦＲのｌｏｇ２変換ＡＱＵＡ（登録商標）スコアの箱ひげ図。（Ｄ）示されている％ＣＶを有する（Ｂ）からの３５の細胞株（２×過剰）についてのＥＧＦＲのｌｏｇ２変換ＡＱＵＡ（登録商標）スコアの箱ひげ図。
【図９】図９のＡ〜Ｄは、下の実施例４からの結果を示す図である。図９のＡ〜Ｃは、同じサンプルについて生成されたＡＱＵＡ（登録商標）スコアと比較した３人の病理専門医からのＡｌｌｒｅｄスコアの箱ひげ図である。図９のＤは、それぞれの病理専門医についてのＡｌｌｒｅｄスコアリングとＡＱＵＡ（登録商標）スコアリングの間の相関関係を示す表である。
【図１０】図１０のＡ〜Ｂは、実施例４において説明するとおりの、（Ａ）ＡＱＵＡ（登録商標）スコアに基づく患者のクラスタリングおよび（Ｂ）クラスター化した群の生存時間を示す図である。
【図１１】図１１のＡ〜Ｂは、Ａｌｌｒｅｄスコアリング（Ａ）およびＡＱＵＡ（登録商標）スコアリング（Ｂ）を用いて５年の疾病特異的生存時間を比較する図である。
【図１２】図１２のＡ〜Ｂは、Ａｌｌｒｅｄスコア法を使用して同じＴＭＡスライドガラスを読み取ることによって３人の病理専門医により決定されたＥＲ発現スコアの比較（Ａ）と、３つのＰＭ−２０００計器により同じＴＭＡスライドガラスを読み取ることによって決定されたＥＲ発現ＡＱＵＡスコアの比較（Ｂ）を図示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
別途定義していない限り、本明細書において用いるすべての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野における通常の技術者により通常理解されているのと同じ意味を一般に有する。本明細書および添付の特許請求の範囲において用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その内容が明確に別途に示していない限り、複数をも含む。例えば、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」への言及は、２個以上の細胞の組み合わせなどを含む。一般に、本明細書において用いる命名法および下で説明する細胞生物学、免疫組織化学およびイメージング（例えば、細胞および組織）に関する実験法は、当分野において周知であり通常用いられているものである。
【００２４】
本明細書において示し、説明する特定の実施態様は、本発明の例示であり、いかなる点においても本発明の範囲を限定するためのものではないことは理解されるはずである。さらに、それらの技術は、遠隔地間会議、ロボットビジョン、無人車両、または任意の他の類似用途への応用に適する。
【００２５】
本発明での使用に適する技術は、２００８年５月１４日出願の同時係属米国特許出願第１２／１５３，１７１号、１００８年６月１３日出願の米国特許出願第１２／１３９，３７０号、２００８年８月５日出願の米国特許出願第１２／１８６，２９４号、２００８年８月７日出願の米国特許出願第１２／１８８，１３３号、および２００８年８月２９日出願の米国特許出願第１２／２０１，７５３号においても見つけることができ、これらのそれぞれの出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２６】
図１は、スライドガラスに載せられた細胞含有生体サンプル、例えば患者からの組織サンプル、の１つ以上の細胞内区画のそれぞれにおいて発現されたバイオマーカーの量を再現性よく定量するためのプロセスを示す。プロセス１００では、最初に、少なくとも１つの細胞内区画および少なくとも１つのバイオマーカーの局在同定を可能にするように染色剤を適用したものである、染色されスライドガラスに載せられた細胞含有生体サンプルを得る１０５。前記少なくとも１つの細胞内区画としては、細胞質、核および細胞壁が挙げられるが、これらに限定されない。前記少なくとも１つのバイオマーカーとしては、腫瘍細胞を検出するために用いられる、ＣＹ５蛍光シグナルにより標識または検出されるバイオマーカーを挙げることができる。例としては、ＨＥＲ２、ＥＲ、ＰＲ、ＥＧＦＲ、ＥＲＣＣ１、ＴＳなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
プロセス１００では、その後、染色された組織サンプルのピクセル構成画像または画像セットを得る１１０。ピクセル構成画像または画像セットは、光源を含む標準化された光学システム、例えば光学顕微鏡システムを使用して撮ることができる。ピクセル構成画像は、デジタル画像センサを使用する標準化された光学システム、例えばデジタルカメラによって得ることができる。一部の実施形態では、得られるアナログ画像またはフィルムをデジタルスキャナまたは同等の手段によってデジタル化するアナログカメラによって、デジタル画像を撮ることができる。少なくとも一部の実施形態では、前記カメラを顕微鏡に直接または間接的に搭載して、顕微鏡写真の形態のピクセル構成画像を得ることができる。あるいは、またはそれに加えて、前記カメラは、既存のイメージングシステムを用いるビデオアウトラインへの直接接続させてもよい。一部の実施形態において、前記光源は、可視スペクトル、赤外（ＩＲ）スペクトル、および紫外（ＵＶ）スペクトルのうちの１つ以上における波長を有する光を含む。前記カメラは、動的細胞活動を含む実時間および経過時間画像が得られるのであれば、ビデオカメラであってもよいし、微速度撮影シーケンスであってもよい。
【００２８】
次に、プロセス１００によって得られたピクセル構成画像を解析して、画像ピクセルから１つ以上のデータセットを導出して、データシグナルとノイズを区別する１１５。この解析は、例えばプロセッサを使用して、自動的に行うことができる。前記プロセッサは、予めプログラムされた命令セットに従って制御することができる、１つ以上のコンピュータプロセッサを含んでもよい。一部の実施形態において、データシグナルとノイズの区別は、シグナルの統計解析、例えば、シグナルを有するピクセルとノイズに起因し得るシグナルを有するピクセルとの分離を生じさせる非監視式（ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ）クラスター分析を含む。一部の実施形態において、データシグナルとノイズの区別は、スライドガラスに載せられた組織サンプルのピント外れの画像からの、スライドガラスに載せられた組織サンプルのピントの合った画像のサブトラクションを含むことがある。一部の実施形態において、ピント外れの画像は、スライドガラスに載せられた組織サンプルの真下にピントが合っている画像を含むことがある。一般に、画像のピント外れは、空間ローパスフィルタのように作用して、データシグナルを比較することができるバックグラウンド測定を可能にする。
【００２９】
次に、プロセス１００によって得られたピクセル構成画像を解析して、画像ピクセルから１つ以上のデータセットを導出して、少なくとも１つの細胞内区画のそれぞれに起因し得るデータシグナルを区別する１２０。この解析は、例えば予めプログラムされたコンピュータまたは専用の特殊用途プロセッサを使用して、自動的に行うことができる。一部の実施形態において、区別は、スライドガラスに載せられたサンプルに適用されるマーカーまたは染色剤に起因し得る蛍光によらせてもよい。一部の実施形態において、少なくとも１つの細胞内区画に関する染色剤の蛍光は、波長の点で様々である。一部の実施形態において、青色蛍光は、核受容体（ＤＡＰＩ）に関係づけることができ、緑色蛍光は、細胞原形質受容体（サイトケラチン）と関連づけることができ、および赤色蛍光は、細胞膜受容体（α−カテニン）と関連づけることができる。
【００３０】
好ましくは、染色剤は、少なくとも１つの細胞内区画および少なくとも１つのバイオマーカーの局在同定を可能にするように行われる。一部の実施形態において、前に１０５で説明した少なくとも１つのバイオマーカーは、腫瘍細胞またはターゲットタンパク質またはターゲット抗原を検出するために用いられ、およびスライドガラスに載せられた組織サンプル中の腫瘍細胞の指標になり得る。プロセス１００は、少なくとも１つの細胞内区画のそれぞれに起因し得る予め区別されたデータシグナル１２０を、検出された腫瘍細胞または腫瘍マスクと関連づける、または別様に相関させる段階を含む。その場合、画像ピクセルから導出される１つ以上のデータセットを自動的に解析して、１つ以上の細胞内区画のそれぞれについての少なくとも１つのバイオマーカーに起因し得るデータシグナルを区別する１２５。プロセス１００は、スライドガラスに載せられた組織サンプルについての少なくとも１つの細胞内区画の少なくとも１つにおいて発現されたバイオマーカーの量を再現性よく定量する１３０。
【００３１】
図２は、スライドに載せたサンプルの１つ以上の細胞内区画のそれぞれにおいて発現されたバイオマーカーの量を再現性よく定量する画像処理段階についての詳細なプロセス２００を示すものである。プロセス２００は、まず、染色された組織サンプルのデジタル画像を得る２０５。このデジタル画像は、方法１００における段階１０５、１１０で説明したものと同様にして得られる。次に、プロセス２００は、シグナルの完全性２０１、サンプルの完全性２１５、および画像完全性２２０について画質を検査する。シグナルの完全性２１０、サンプルの完全性２１５、および画像の完全性２２０のうちのいずれか１つ以上の画質検査が不合格である場合、そのデジタル画像を解析から外してもよく、またはそのデジタル画像にフラグをつけて２２５、オペレータによるデジタル画像の手動審査によってそのデジタル画像を解析に入れるかあるいは解析から外すか２２６を判断することとしてもよい。
【００３２】
シグナルの完全性２１０、サンプルの完全性２１５、および画像の完全性２２０についての画質検査の合格、またはデジタル画像の手動審査２２５の合格により、そのデジタル画像はプロセス２００におけるさらなる画像処理の候補として判断される。シグナルの完全性２１０、サンプルの完全性２１５、および画像の完全性２２０のうちの１つ以上についての画質検査の合格に失敗すること、ならびにデジタル画像の手動審査２２５の合格に失敗することにより、そのデジタル画像は低品質と判断され、そのデジタル画像は排除される。簡単に言うと、シグナルの完全性は、細胞内区画化、蛍光の完全性、および飽和ピクセル百分率評価を含む。飽和は、ピクセル構成画像内のピクセルの所定数が、最大および近最大値を含むデータおよびデータ構造によって表されることを判定することによって、評価することができる。サンプルの完全性は、対象のサンプル（例えば、腫瘍組織）が解析のために十分存在することの判定を含む。画像の完全性は、例えば、ピント外れ画像の検出、ならびにＴＭＡの場合には、分割された画像の解析および検出を含む。
【００３３】
本発明を、本発明の特定の実施形態に関連して説明してきたが、さらなる修飾が可能であることは理解されるであろう。さらに、本出願は、本発明が属する技術分野において公知のまたは通例の実践の範囲内に入るようなおよび添付の特許請求の範囲内に入るような本開示からの逸脱を含む、本発明の任意の変型、使用または適用を包含することを意図したものである。
【００３４】
本明細書において言及するすべての出版物、特許および特許出願は、各出版物、特許または特許出願について参照により援用されると具体的におよび個々に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３５】
１．サンプル
任意の細胞含有サンプルを本発明の方法によって解析することができる。例えば、患者から採集した組織からサンプルを作製することができる。あるいは、サンプルは、細胞含有生体サンプル、例えば血液サンプル、骨髄サンプル、または細胞株である場合がある。サンプルは、顕微鏡スライドガラス上の全組織またはＴＭＡ切片である場合がある。詳細には、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を使用するとき、サンプルをスライド上に「スポット」または「ヒストスポット」として配置することができ、それぞれのヒストスポットが特定のサンプルに対応する。スライドに載せた組織サンプルを作製するためのそのような方法は、当分野において周知であり、本発明での使用に適する。
【００３６】
２．バイオマーカー
本明細書において用いる場合、バイオマーカーは、生体サンプルにおいて組織タイプ、正常もしくは病原性プロセス、または治療的介入に対する応答の指標として測定することができる分子である。特定の実施形態において、バイオマーカーは、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質および炭水化物から成る群より選択される。より詳細には、バイオマーカーは、タンパク質であり得る。あるマーカーは特定の細胞に特有であるが、他のマーカーは、特定の疾病または状態に関連づけられるものとして同定されている。公知の予後診断マーカーの例としては、酵素的マーカー、例えば、ガラクトシルトランスフェラーゼＩＩ、ニューロン特異的エノラーゼ、プロトンＡＴＰアーゼ−２、および酸性ホスファターゼなどが挙げられる。ホルモンまたはホルモン受容体マーカーとしては、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、副腎皮質刺激ホルモン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、ｇＣ１ｑ−Ｒ／ｐ３３補体受容体、ＩＬ−２受容体、ｐ７５ニューロトロフィン受容体、ＰＴＨ受容体、甲状腺ホルモン受容体、およびインスリン受容体が挙げられる。
【００３７】
リンパ球マーカーとしては、α−１−アンチキモトリプシン、α−１−アンチトリプシン、Ｂ細胞マーカー、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−６、Ｂリンパ球抗原３６ｋＤ、ＢＭ１（骨髄マーカー）、ＢＭ２（骨髄マーカー）、ガレクチン−３、グランザイムＢ、ＨＬＡクラスＩ抗原、ＨＬＡクラスＩＩ（ＤＰ）抗原、ＨＬＡクラスＩＩ（ＤＱ）抗原、ＨＬＡクラスＩＩ（ＤＲ）抗原、ヒト好中球ディフェンシン、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＤ、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭ、カッパ軽鎖、カッパ軽鎖、ラムダ軽鎖、リンパ球／組織球抗原、マクロファージマーカー、ムラミダーゼ（リゾチーム）、ｐ８０未分化リンパ腫キナーゼ、形質細胞マーカー、分泌性白血球プロテアーゼ阻害剤、Ｔ細胞抗原受容体（ＪＯＶＩ１）、Ｔ細胞抗原受容体（ＪＯＶＩ３）、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、非クラスター型Ｂ細胞マーカーが挙げられる。
【００３８】
腫瘍マーカーとしては、αフェトプロテイン、アポリポタンパク質Ｄ、ＢＡＧ−１（ＲＡＰ４６タンパク質）、ＣＡ１９−９（シアリルルイス）、ＣＡ５０（癌腫関連ムチン抗原）、ＣＡ１２５（卵巣癌抗原）、ＣＡ２４２（腫瘍関連ムチン抗原）、クロモグラニンＡ、クラステリン（アポリポタンパク質Ｊ）、上皮性細胞膜抗原、上皮関連抗原、上皮特異抗原、上皮増殖因子受容体、エストロゲン受容体（ＥＲ）、大嚢胞病嚢胞液タンパク質−１５、肝細胞特異抗原、ＨＥＲ２、ヘレグリン、ヒト胃粘素、ヒト乳脂肪球、ＭＡＧＥ−１、マトリックスメタロプロテイナーゼ、メランＡ、黒色腫マーカー（ＨＭＢ４５）、メソテリン、メタロチオネイン、小眼球症転写因子（ＭＩＴＦ）、Ｍｕｃ−１コア糖タンパク質、Ｍｕｃ−１糖タンパク質、Ｍｕｃ−２糖タンパク質、Ｍｕｃ−５ＡＣ糖タンパク質、Ｍｕｃ−６糖タンパク質、ミエロペルオキシダーゼ、Ｍｙｆ−３（横紋筋肉腫マーカー）、Ｍｙｆ−４（横紋筋肉腫マーカー）、ＭｙｏＤ１（横紋筋肉腫マーカー）、ミオグロビン、ｎｍ２３タンパク質、胎盤性アルカリホスファターゼ、プレアルブミン、プロゲステロン受容体、前立腺特異抗原、前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺インヒビンペプチド、ＰＴＥＮ、腎細胞癌腫マーカー、小腸粘液抗原、テトラネクチン、甲状腺転写因子−１、マトリックスメタロプロテイナーゼ１の組織阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ２の組織阻害剤、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質−１、ビリン、フォン・ヴィレブランド因子、ＣＤ３４、ＣＤ３４、クラスＩＩ、ＣＤ５１  Ａｂ−１、ＣＤ６３、ＣＤ６９、Ｃｈｋ１、Ｃｈｋ２、クラスピンＣ−ｍｅｔ、ＣＯＸ６Ｃ、ＣＲＥＢ、サイクリンＤ１、サイトケラチン、サイトケラチン８、ＤＡＰＩ、デスミン、ＤＨＰ（１−６ジフェニル（Ｄｉｐｈｅｙｎｙｌ）−１，３，５−ヘキサトリエン）、Ｅ−カドヘリン、ＥＥＡ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＭＡ（上皮性細胞膜抗原）、ＥＲ、ＥＲＢ３、ＥＲＣＣ１、ＥＲＫ、Ｅ−セレクチン、ＦＡＫ、フィブロネクチン、ＦＯＸＰ３、ガンマ−Ｈ２ＡＸ、ＧＢ３、ＧＦＡＰ、ギアンチン（Ｇｉａｎｔｉｎ）、ＧＭ１３０、ゴルジン９７、ＧＲＢ２、ＧＲＰ７８ＢｉＰ、ＧＳＫ３β、ＨＥＲ−２、ヒストン３、ヒストン３＿Ｋ１４−Ａｃｅ［抗アセチル−ヒストンＨ３（Ｌｙｓ１４）］、ヒストン３＿Ｋ１８−Ａｃｅ［ヒストンＨ３−アセチル  Ｌｙｓ１８］、ヒストン３＿Ｋ２７−ＴｒｉＭｅ、［ヒストンＨ３（トリメチル  Ｋ２７）］、ヒストン３＿Ｋ４−ｄｉＭｅ［抗ジメチル−ヒストンＨ３（Ｌｙｓ４）］、ヒストン３＿Ｋ９−Ａｃｅ［アセチル−ヒストンＨ３（Ｌｙｓ９）］、ヒストン３＿Ｋ９−ｔｒｉＭｅ［ヒストン３−トリメチル  Ｌｙｓ９］、ヒストン３＿Ｓ１０−Ｐｈｏｓ［抗ホスホヒストンＨ３（Ｓｅｒ１０）、有糸分裂マーカー］、ヒストン４、ヒストンＨ２Ａ．Ｘ＿Ｓ１３９−Ｐｈｏｓ［ホスホヒストンＨ２Ａ．Ｘ（Ｓｅｒ１３９）抗体］、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ３＿ＤｉＭｅｔｈｙｌ  Ｋ４、ヒストンＨ４＿ＴｒｉＭｅｔｈｙｌ  Ｋ２０−Ｃｈｉｐグレード、ＨＳＰ７０、ウロキナーゼ、ＶＥＧＦ  Ｒ１、ＩＣＡＭ−１、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦ−１受容体β、ＩＧＦ−ＩＩ、Ｉ���Ｆ−ＩＩＲ、ＩＫＢ−α  ＩＫＫＥ、ＩＬ６、ＩＬ８、インテグリンαＶβ３、インテグリンαＶβ６、インテグリンαＶ／ＣＤ５１、インテグリンＢ５、インテグリンＢ６、インテグリンＢ８、インテグリンβ１（ＣＤ２９）、インテグリンβ３、インテグリンβ５、インテグリンＢ６、ＩＲＳ−１、Ｊａｇｇｅｄ  １、抗プロテインキナーゼＣβ２、ＬＡＭＰ−１、軽鎖Ａｂ−４（カクテル）、ラムダ軽鎖、カッパ軽鎖、Ｍ６Ｐ、Ｍａｃｈ  ２、ＭＡＰＫＡＰＫ−２、ＭＥＫ  １、ＭＥＫ  １／２（Ｐｓ２２２）、ＭＥＫ  ２、ＭＥＫ１／２（４７Ｅ６）、ＭＥＫ１／２ブロッキングペプチド、ＭＥＴ／ＨＧＦＲ、ＭＧＭＴ、ミトコンドリア抗原、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＦＭ、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ９、Ｅ−カドヘリン、ｍＴＯＲ、ＡＴＰアーゼ、Ｎ−カドヘリン、ネフリン、ＮＦＫＢ、ＮＦＫＢ  ｐ１０５／ｐ５０、ＮＦ−ＫＢ  Ｐ６５、Ｎｏｔｃｈ  １、Ｎｏｔｃｈ  ２、Ｎｏｔｃｈ  ３、ＯｘＰｈｏｓ複合体ＩＶ、ｐ１３０Ｃａｓ、ｐ３８  ＭＡＰＫ、ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ抗体、Ｐ５０４Ｓ、Ｐ５３、Ｐ７０、Ｐ７０  Ｓ６Ｋ、Ｐａｎ−カドヘリン、パキシリン、Ｐ−カドヘリン、ＰＤＩ、ｐＥＧＦＲ、Ｐｈｏｓｐｈｏ  ＡＫＴ、Ｐｈｏｓｐｈｏ  ＣＲＥＢ、ｐｈｏｓｐｈｏ  ＥＧＦ受容体、Ｐｈｏｓｐｈｏ  ＧＳＫ３β、Ｐｈｏｓｐｈｏ  Ｈ３、Ｐｈｏｓｐｈｏ  ＨＳＰ−７０、Ｐｈｏｓｐｈｏ  ＭＡＰＫＡＰＫ−２、Ｐｈｏｓｐｈｏ  ＭＥＫ１／２、Ｐｈｏｓｐｈｏ  ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ、Ｐｈｏｓｐｈｏ  ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ、Ｐｈｏｓｐｈｏ  ｐ５３、Ｐｈｏｓｐｈｏ  ＰＫＣ、Ｐｈｏｓｐｈｏ  Ｓ６リボソームタンパク質、Ｐｈｏｓｐｈｏ  Ｓｒｃ、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｂａｄ、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＫＢ−ａ、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｍＴＯＲ、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＮＦ−カッパＢ  ｐ６５、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ３８、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ７０  Ｓ６キナーゼ、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｒｂ、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｍａｄ２、ＰＩＭ１、ＰＩＭ２、ＰＫＣ  β、ポドカリキシン、ＰＲ、ＰＴＥＮ、Ｒ１、Ｒｂ  ４Ｈ１、Ｒ−カドヘリン、リボヌクレオチドレダクターゼ、ＲＲＭ１、ＲＲＭ１ｌ、ＳＬＣ７Ａ５、ＮＤＲＧ、ＨＴＦ９Ｃ、ＨＴＦ９Ｃ、ＣＥＡＣＡＭ、ｐ３３、Ｓ６リボソームタンパク質、Ｓｒｃ、サーバイビン、シナプトポジン（Ｓｙｎａｐｏｐｏｄｉｎ）、シンデカン４、タリン、テンシン、チミジル酸シンターゼ、ツベルリン（Ｔｕｂｅｒｌｉｎ）、ＶＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ、ビメンチン、アグルチニン、ＹＥＳ、ＺＡＰ−７０およびＺＥＢが挙げられる。
【００３９】
細胞周期関連マーカーとしては、アポトーシスプロテアーゼ活性化因子−１、ｂｃｌ−ｗ、ｂｃｌ−ｘ、ブロモデオキシウリジン、ＣＡＫ（ｃｄｋ活性化キナーゼ）、細胞アポトーシス感受性タンパク質（ＣＡＳ）、カスパーゼ２、カスパーゼ８、ＣＰＰ３２（カスパーゼ−３）、ＣＰＰ３２（カスパーゼ−３）、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリンＡ、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、サイクリンＤ２、サイクリンＤ３、サイクリンＥ、サイクリンＧ、ＤＮＡ断片化因子（Ｎ末端）、Ｆａｓ（ＣＤ９５）、Ｆａｓ関連デスドメインタンパク質、Ｆａｓリガンド、Ｆｅｎ−１、ＩＰＯ−３８、Ｍｃｌ−１、ミニ染色体維持タンパク質、ミスマッチ修復タンパク質（ＭＳＨ２）、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ、増殖性細胞核抗原、ｐ１６タンパク質、ｐ２７タンパク質、ｐ３４ｃｄｃ２、ｐ５７タンパク質（Ｋｉｐ２）、ｐ１０５タンパク質、Ｓｔａｔ  １α、トポイソメラーゼＩ、トポイソメラーゼＩＩα、トポイソメラーゼＩＩＩα、トポイソメラーゼＩＩβが挙げられる。
【００４０】
神経組織および腫瘍マーカーとしては、αＢクリスタリン、α−インターネキシン、αシヌクレイン、アミロイド前駆体タンパク質、βアミロイド、カルビンジン、コリンアセチルトランスフェラーゼ、興奮性アミノ酸輸送体１、ＧＡＰ４３、神経膠線維酸性タンパク質、グルタミン酸受容体２、ミエリン塩基性タンパク質、神経成長因子受容体（ｇｐ７５）、神経芽腫マーカー、神経フィラメント６８ｋＤ、神経フィラメント１６０ｋＤ、神経フィラメント２００ｋＤ、神経特異性エノラーゼ、ニコチン性アセチルコリン受容体α４、ニコチン性アセチルコリン受容体β２、ペリフェリン、タンパク質遺伝子産物９、Ｓ−１００タンパク質、セロトニン、ＳＮＡＰ−２５、シナプシンＩ、シナプトフィジン、タウ、トリプトファンヒドロキシラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、ユビキチンが挙げられる。
【００４１】
クラスター分化マーカーとしては、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１ｅ、ＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１５ｓ、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤｗ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｒ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤｗ６０、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ６５ｓ、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６６ｆ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤｗ９２、ＣＤｗ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤｗ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤｗ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤｗ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤｗ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤｗ１２８ａ、ＣＤｗ１２８ｂ、ＣＤ１３０、ＣＤｗ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤｗ１３６、ＣＤｗ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤｗ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤｗ１４９、ＣＤｗ１５０、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８ａ、ＣＤ１５８ｂ、ＣＤ１６１、ＣＤ１６２、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、およびＴＣＲ−ゼータが挙げられる。
【００４２】
他の細胞マーカーとしては、セントロメアタンパク質−Ｆ（ＣＥＮＰ−Ｆ）、ギアンチン（ｇｉａｎｔｉｎ）、インボルクリン、ラミンＡ＆Ｃ［ＸＢ１０］、ＬＡＰ−７０、ムチン、核膜孔複合体タンパク質、ｐ１８０層板小体タンパク質、ｒａｎ、ｒ、カテプシンＤ、Ｐｓ２タンパク質、Ｈｅｒ２−ｎｅｕ、Ｐ５３、Ｓ１００、上皮マーカー抗原（ＥＭＡ）、ＴｄＴ、ＭＢ２、ＭＢ３、ＰＣＮＡ、およびＫｉ６７が挙げられる。
【００４３】
３．組織染色
任意の試薬またはバイオマーカー標識、例えば、色素または染色剤、組織化学薬品（ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、または特定のバイオマーカーとまたは様々なタイプの細胞もしくは細胞内区画と直接反応する免疫組織化学薬品（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して、細胞含有サンプルを染色することができる。すべての染色剤／試薬が適合性であるとは限らない。従って、利用する染色剤のタイプおよびそれらの適用順序をよく考慮すべきであるが、当業者には容易に決定できる。前述の組織化学薬品は、透過顕微鏡によって検出できる発色団である場合もあり、または蛍光顕微鏡によって検出できる蛍光体である場合もある。一般に、組織含有サンプルは、ターゲットの化学基と直接反応するまたはターゲットの化学基に直接結合する少なくとも１つの組織化学薬品を含む溶液と共にインキュベートされ得る。一部の組織化学薬品は、染色を可能にするために媒染剤または金属とコインキュベートしなければならない。対象の成分を染色する少なくとも１つの組織化学薬品と、対比染色剤として作用し対象の成分以外の領域に結合する別の組織化学薬品との混合物と共に細胞含有サンプルをインキュベートしてもよい。あるいは、多数のプローブの混合物を染色の際に使用することができ、それらによって特定のプローブの位置を特定する方法を得ることができる。細胞含有サンプルを染色するための手順は、当分野において周知である。
【００４４】
以下の非限定的リストは、組織学的イメージング剤（染色剤または対比染色剤）として使用することができる例示的発色団およびそれらのターゲット細胞、細胞内区画、または細胞成分を提供するものである：エオシン（アルカリ性細胞成分、細胞質）、ヘマトキシリン（核酸）、オレンジＧ（赤血球、膵臓、および下垂体細胞）、ライトグリーンＳＦ（コラーゲン）、ロマノスキー−ギムザ（Ｒｏｍａｎｏｗｓｋｙ−Ｇｉｅｍｓａ）（全細胞形態）、メイ−グリュンヴァルト（Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ）（血球）、ブルー・カウンターステイン（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）、エチルグリーン（ＣＡＳ）（アミロイド）、フォイルゲン（Ｆｅｕｌｇｅｎ）−ナフトールイエローＳ（ＤＮＡ）、ギムザ（様々な細胞内区画を差別的に染色する）、メチルグリーン（アミロイド）、ピロニン（核酸）、ナフトール−イエロー（赤血球）、ナチュラルレッド（核）、Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ染色剤（概して、ヘマトキシリンとエオシンＹとオレンジＧとビスマルクブラウン混合物との混合物を含む）（全細胞形態）、レッド・カウンターステインＢ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）、レッド・カウンターステインＣ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）、シリウスレッド（アミロイド）、フォイルゲン試薬（パラロザニリン）（ＤＮＡ）、ガロシアニン・クロムミョウバン（ＤＮＡ）、ガロシアニン・クロムミョウバンとナフトールイエローＳ（ＤＮＡ）、メチルグリーン−ピロニンＹ（ＤＮＡ）、チオニン−フォイルゲン試薬（ＤＮＡ）、アクリジンオレンジ（ＤＮＡ）、メチレンブルー（ＲＮＡおよびＤＮＡ）、トルイジンブルー（ＲＮＡおよびＤＮＡ）、アルシアンブルー（炭水化物）、ルテニウムレッド（炭水化物）、スーダンブラック（脂質）、スーダンＩＶ（脂質）、オイルレッドＯ（脂質）、ヴァン・ギーソン（Ｖａｎ  Ｇｉｅｓｏｎ）のトリクローム染色剤（酸性フクシンとピクリン酸の混合物）（筋肉細胞）、マッソン（Ｍａｓｓｏｎ）トリクローム染色剤（ヘマトキシリンと酸性フクシンとライトグリーンの混合物）（コラーゲン、細胞質、核小体を別様に染色する）、アルデヒドフクシン（エラスチン線維）、およびワイゲルト（Ｗｅｉｇｅｒｔ）染色剤（細網線維と膠原線維とを区別する）。前述の染色剤の包括的リスト、それらの説明および一般的な使用は、Ｒ．Ｄ．Ｌｉｌｌｉｅ，「Ｃｏｎｎ’ｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｉｎｓ」，８ｔｈ  ｅｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９６９）にて得られる。前述のものの適する媒染剤および組成物は、当業者に周知である。
【００４５】
以下の非限定的リストは、例示的蛍光組織学的染色剤およびそれらのターゲット細胞、細胞内区画、または該当する場合には細胞成分を提供するものである：４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（核酸）、エオシン（アルカリ性細胞成分、細胞質）、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８およびＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（２つのビスベンズイミド）（核酸）、ヨウ化プロピジウム（核酸）、スペクトラムオレンジ（核酸）、スペクトラムグリーン（核酸）、キナクリン（核酸）、フルオレセイン−ファロイジン（アクチン線維）、クロモマイシンＡ３（核酸）、アクリフラビン−フォイルゲン反応（核酸）、オーラミンＯ−フォイルゲン反応（核酸）、臭化エチジウム（核酸）、ニッスル（Ｎｉｓｓｌ）染色剤（ニューロン）、高親和性ＤＮＡ蛍光体、例えばＰＯＰＯ、ＢＯＢＯ、ＹＯＹＯおよびＴＯＴＯならびにその他、およびヒストンなどのＤＮＡ結合タンパク質と融合した緑色蛍光タンパク質、ＡＣＭＡ、キナクリンならびにアクリジンオレンジ。
【００４６】
多種多様な有標蛍光細胞小器官特異的プローブが市販されており、それらとしては、ミトコンドリア特異的プローブ（ＭｉｔｏＦｌｕｏｒおよびＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ色素）、小胞体（ＥＲ）およびゴルジプローブ（ＥＲ−Ｔｒａｃｋｅｒおよび様々なセラミドコンジュゲート）、ならびにリソソームプローブ（ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ色素）が挙げられる。これらのプローブ、ならびに多くの非有標蛍光組織化学薬品は、オレゴン州ユージーンのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから入手でき、およびオレゴン州ユージーンのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから入手できるＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ８ｔｈ  ＥＤ．（２００１）に詳細にわたって記載されている。
【００４７】
対象の細胞成分である酵素についての適切な基質およびその酵素活性部位で着色沈殿を生じさせる適切な試薬と共に、それぞれの細胞含有サンプルをコインキュベートしてもよい。そのような酵素組織化学染色剤は、特定のターゲット酵素に特異的である。酵素組織化学染色剤での染色を用いて、細胞成分または特定のタイプの細胞を明確にすることができる。あるいは、酵素組織化学染色剤を診断的に使用して、細胞における酵素活性の量を定量することができる。多種多様な酵素基質および検出アッセイが当分野において公知であり、記載されている。
【００４８】
酸性ホスファターゼを幾つかの方法によって検出することができる。酸性ホスファターゼについてのゴモリ（Ｇｏｍｏｒｉ）法では、細胞製剤をグリセロホスファートおよび硝酸鉛と共にインキュベートする。その酵素がホスファートを遊離させ、そのホスファートが鉛と化合してリン酸鉛、無色沈殿を生成する。その後、その組織を硫化アンモニウムの溶液に浸漬し、その硫化アンモニウムがリン酸鉛と反応して硫化鉛、黒色沈殿を形成する。あるいは、パラロザニリン−ＨＣｌと、硝酸ナトリウムと、ナフトール（ｎａｐｔｈｏｌ）ＡＳＢ１ホスファート（基質）と、ベロナール酢酸塩緩衝液とを含む溶液と共に細胞をインキュベートしてもよい。この方法は、酸性ホスファターゼ活性領域で赤色沈殿を生じさせる。それらの特有の酸性ホスファターゼ含量のために、リソソームをこのアッセイの使用により他の細胞質顆粒および細胞小器官と区別することができる。
【００４９】
デヒドロゲナーゼ化学種およびテトラゾール化学種についての適切な基質と共に細胞をインキュベートすることにより、デヒドロゲナーゼを局在させることができる。前記酵素は、前記基質からテトラゾールに水素イオンを移動させ、その結果、テトラゾールをホルマザン、暗色沈殿に還元する。例えば、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼは、呼吸鎖の複合体Ｉの成分であり、主としてミトコンドリアに局在する。
【００５０】
周知の染色技術が開発されている他の酵素、およびそれらの主な細胞内位置または活性としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されない：ＡＴＰアーゼ（筋肉線維）、コハク酸デヒドロゲナーゼ（ミトコンドリア）、シトクロムｃオキシダーゼ（ミトコンドリア）、ホスホリラーゼ（ミトコンドリア）、ホスホフルクトキナーゼ（ミトコンドリア）、アセチルコリンエステラーゼ（神経細胞）、ラクターゼ（小腸）、ロイシンアミノペプチダーゼ（肝細胞）、ミオアデニル酸（ｍｙｏｄｅｎｙｌａｔｅ）デアミナーゼ（筋肉細胞）、ＮＡＤＨジアフォラーゼ（赤血球）、およびスクラーゼ（小腸）。
【００５１】
免疫組織化学は、最も感度の高い特異的な組織化学技術である。特異的に結合するプローブを含む標識された結合組成物とそれぞれのサンプルｔを結合させることができる。様々な標識、例えば、蛍光体、または光もしくは蛍光を吸収する生成物を生成する酵素を利用することができる。シグナル結合事象に関連して強いシグナルに備える多種多様な標識が公知である。染色に用いられる多数のプローブを、１つより多くの区別できる蛍光標識で標識することができる。これらの色の違いにより、特定のプローブの位置を特定する方法が得られる。蛍光体とタンパク質、例えば抗体とのコンジュゲートを調製する方法は、詳細にわたって文献に記載されており、ここで例示する必要はない。
【００５２】
少なくとも１２０，０００の市販の抗体が存在するが、細胞成分に特異的に結合することが公知である、ならびに研究のためにおよび、限られた事例では、様々な疾病の診断のために用いられる免疫組織化学染色剤における成分として現在利用されている例示的一次抗体としては、例えば、抗エストロゲン受容体抗体（乳癌）、抗プロゲステロン受容体抗体（乳癌）、抗ｐ５３抗体（多数の癌）、抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体（多数の癌）、抗ＥＧＦＲ抗体（上皮増殖因子、多数の癌）、抗カテプシンＤ抗体（乳癌および他の癌）、抗Ｂｃｌ−２抗体（アポトーシス細胞）、抗Ｅ−カドヘリン抗体、抗ＣＡ１２５抗体（卵巣癌および他の癌）、抗ＣＡ１５−３抗体（乳癌）、抗ＣＡ１９−９抗体（大腸癌）、抗ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体、抗Ｐ−糖タンパク質抗体（ＭＤＲ、多剤耐性）、抗ＣＥＡ抗体（癌胎児性抗体）、抗網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）抗体、抗ｒａｓオンコプロテイン（ｏｎｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）（ｐ２１）抗体、抗ルイスＸ（ＣＤ１５とも呼ばれる）抗体、抗Ｋｉ−６７抗体（細胞増殖）、抗ＰＣＮＡ（多数の癌）抗体、抗ＣＤ３抗体（Ｔ細胞）、抗ＣＤ４抗体（ヘルパーＴ細胞）、抗ＣＤ５抗体（Ｔ細胞）、抗ＣＤ７抗体（胸腺細胞、未成熟Ｔ細胞、ＮＫキラー細胞）、抗ＣＤ８抗体（サプレッサーＴ細胞）、抗ＣＤ９／ｐ２４抗体（ＡＬＬ）、抗ＣＤ１０（ＣＡＬＬＡとも呼ばれる）抗体（コモン急性リンパ芽球性白血病）、抗ＣＤ１１ｃ抗体（単球、顆粒球、ＡＭＬ）、抗ＣＤ１３抗体（骨髄単球細胞、ＡＭＬ）、抗ＣＤ１４抗体（成熟単球、顆粒球）、抗ＣＤ１５抗体（ホジキン病）、抗ＣＤ１９抗体（Ｂ細胞）、抗ＣＤ２０抗体（Ｂ細胞）、抗ＣＤ２２抗体（Ｂ細胞）、抗ＣＤ２３抗体（活性化Ｂ細胞、ＣＬＬ）、抗ＣＤ３０抗体（活性化ＴおよびＢ細胞、ホジキン病）、抗ＣＤ３１抗体（血管新生マーカー）、抗ＣＤ３３抗体（骨髄系細胞、ＡＭＬ）、抗ＣＤ３４抗体（内皮幹細胞、間質性腫瘍）、抗ＣＤ３５抗体（樹状細胞）、抗ＣＤ３８抗体（形質細胞、活性化Ｔ、Ｂおよび骨髄系細胞）、抗ＣＤ４１抗体（血小板、巨核球）、抗ＬＣＡ／ＣＤ４５抗体（白血球共通抗原）、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体（ヘルパー、インデューサーＴ細胞）、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体（Ｂ細胞）、抗ＣＤ３９、ＣＤ１００抗体、抗ＣＤ９５／Ｆａｓ抗体（アポトーシス）、抗ＣＤ９９抗体（ユーイング肉腫マーカー、ＭＩＣ２遺伝子産物）、抗ＣＤ１０６抗体（ＶＣＡＭ−１；活性化内皮細胞）、抗ユビキチン抗体（アルツハイマー病）、抗ＣＤ７１（トランスフェリン受容体）抗体、抗ｃ−ｍｙｃ（オンコプロテインおよびハプテン）抗体、抗サイトケラチン（トランスフェリン受容体）抗体、抗ビメンチン（内皮細胞）抗体（ＢおよびＴ細胞）、抗ＨＰＶタンパク質（ヒト乳頭腫ウイルス）抗体、抗カッパ軽鎖抗体（Ｂ細胞）、抗ラムダ軽鎖抗体（Ｂ細胞）、抗メラノソーム（ＨＭＢ４５）抗体（黒色腫）、抗前立腺特異抗原（ＰＳＡ）抗体（前立腺癌）、抗Ｓ−１００抗体（黒色腫、唾液（ｓａｌｖａｒｙ）、グリア細胞）、抗タウ抗原抗体（アルツハイマー病）、抗フィブリン抗体（上皮細胞）、抗ケラチン抗体、抗サイトケラチン抗体（腫瘍）、抗α−カテニン（細胞膜）、抗Ｔｎ−抗原抗体（結腸癌腫、腺癌、およ���膵臓癌）；抗−１，８−ＡＮＳ（１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸）抗体；抗Ｃ４抗体；抗２Ｃ４  ＣＡＳＰグレード抗体；抗２Ｃ４  ＣＡＳＰ  α抗体；抗ＨＥＲ−２抗体；抗αＢクリスタリン抗体；抗αガラクトシダーゼＡ抗体；抗α−カテニン抗体；抗ヒトＶＥＧＦ  Ｒ１（Ｆｌｔ−１）抗体；抗インテグリンＢ５抗体；抗インテグリンβ６抗体；抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＲＣ抗体；抗Ｂａｋ抗体；抗ＢＣＬ−２抗体；抗ＢＣＬ−６抗体；抗βカタニン（Ｃａｔａｎｉｎ）抗体；抗βカテニン抗体；抗インテグリンαＶβ３抗体；抗ｃ  ＥｒｂＢ−２  Ａｂ−１２抗体；抗カルネキシン抗体；抗カルレティキュリン抗体；抗カルレティキュリン抗体；抗ＣＡＭ５．２（抗サイトケラチン低分子量）抗体；抗カルジオチン（Ｃａｒｄｉｏｔｉｎ）（Ｒ２Ｇ）抗体；抗カテプシンＤ抗体；ガラクトシダーゼαに対するニワトリポリクローナル抗体；抗ｃ−Ｍｅｔ抗体；抗ＣＲＥＢ抗体；抗ＣＯＸ６Ｃ抗体；抗サイクリンＤ１  Ａｂ−４抗体；抗サイトケラチン抗体；抗デスミン抗体；抗ＤＨＰ（１−６ジフェニル（Ｄｉｐｈｅｙｎｙｌ）−１，３，５−ヘキサトリエン）抗体；ＤＳＢ−Ｘビオチンヤギ抗ニワトリ抗体；抗Ｅ−カドヘリン抗体；抗ＥＥＡ１抗体；抗ＥＧＦＲ抗体；抗ＥＭＡ（上皮性細胞膜抗原）抗体；抗ＥＲ（エストロゲン受容体）抗体；抗ＥＲＢ３抗体；抗ＥＲＣＣ１  ＥＲＫ（Ｐａｎ  ＥＲＫ）抗体；抗Ｅ−セレクチン抗体；抗ＦＡＫ抗体；抗フィブロネクチン抗体；ＦＩＴＣ−ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体；抗ＦＯＸＰ３抗体；抗ＧＢ３抗体；抗ＧＦＡＰ（神経膠原線維性酸性タンパク質）抗体；抗ギアンチン抗体；抗ＧＭ１３０抗体；抗ヤギａ  ｈ  Ｍｅｔ抗体；抗ゴルジン９７抗体；抗ＧＲＢ２抗体；抗ＧＲＰ７８ＢｉＰ抗体；抗ＧＳＫ−３β抗体；抗肝細胞抗体；抗ＨＥＲ−２抗体；抗ＨＥＲ−３抗体；抗ヒストン３抗体；抗ヒストン４抗体；抗ヒストンＨ２Ａ  Ｘ抗体；抗ヒストンＨ２Ｂ抗体；抗ＨＳＰ７０抗体；抗ＩＣＡＭ−１抗体；抗ＩＧＦ−１抗体；抗ＩＧＦ−１受容体抗体；抗ＩＧＦ−１受容体β抗体；抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体；抗ＩＫＢ−α抗体；抗ＩＬ６抗体；抗ＩＬ８抗体；抗インテグリンβ３抗体；抗インテグリンβ５抗体；抗インテグリンｂ８抗体；抗Ｊａｇｇｅｄ  １抗体；抗プロテインキナーゼＣβ２抗体；抗ＬＡＭＰ−１抗体；抗Ｍ６Ｐ（マンノース６−リン酸受容体）抗体；抗ＭＡＰＫＡＰＫ−２抗体；抗ＭＥＫ  １抗体；抗ＭＥＫ  ２抗体；抗ミトコンドリア抗原抗体；抗ミトコンドリアマーカー抗体；抗Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＦＭ抗体；抗ＭＭＰ−２抗体；抗ＭＭＰ９抗体；抗Ｎａ＋／Ｋ  ＡＴＰアーゼ抗体；抗Ｎａ＋／Ｋ  ＡＴＰアーゼα１抗体；抗Ｎａ＋／Ｋ  ＡＴＰアーゼα３抗体；抗Ｎ−カドヘリン抗体；抗ネフリン抗体；抗ＮＦ−ＫＢ  ｐ５０抗体；抗ＮＦ−ＫＢ  Ｐ６５抗体；抗Ｎｏｔｃｈ  １抗体；抗ＯｘＰｈｏｓ複合体ＩＶ−Ａｌｃｘａ４４８コンジュゲート抗体；抗ｐ１３０Ｃａｓ抗体；抗Ｐ３８  ＭＡＰＫ抗体；抗ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ抗体；抗Ｐ５０４Ｓクローン１３Ｈ４抗体；抗Ｐ５３抗体；抗Ｐ７０  Ｓ６Ｋ抗体；抗Ｐ７０ホスホキナーゼブロッキングペプチド抗体；抗Ｐａｎカドヘリン抗体；抗パキシリン抗体；抗Ｐ−カドヘリン抗体；抗ＰＤＩ抗体；抗Ｐｈｏｓｐｈｏ  ＡＫＴ抗体；抗Ｐｈｏｓｐｈｏ  ＣＲＥＢ抗体；抗Ｐｈｏｓｐｈｏ  ＧＳＫ−３−β抗体；抗Ｐｈｏｓｐｈｏ  ＧＳＫ−３β抗体；抗Ｐｈｏｓｐｈｏ  Ｈ３抗体；抗Ｐｈｏｓｐｈｏ  ＭＡＰＫＡＰＫ−２抗体；抗Ｐｈｏｓｐｈｏ  ＭＥＫ抗体；抗Ｐｈｏｓｐｈｏ  ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ抗体；抗Ｐｈｏｓｐｈｏ  ｐ５３抗体；抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＮＦ−ＫＢ  ｐ６５抗体；抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ７０  Ｓ６キナーゼ抗体；抗Ｐｈｏｓｐｈｏ  ＰＫＣ（Ｐａｎ）抗体；抗Ｐｈｏｓｐｈｏ  Ｓ６リボソームタンパク質抗体；抗Ｐｈｏｓｐｈｏ  Ｓｒｃ抗体；抗Ｐｈｏｓｐｈｏ  Ｂａｄ抗体；抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＨＳＰ２７抗体；抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＫＢ−ａ抗体；抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ抗体；抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ７０  Ｓ６キナーゼ抗体；抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｒｂ（Ｓｅｒ８０７／８１１）（網膜芽細胞腫）抗体；抗Ｐｈｏｓｐｈｏ  ＨＳＰ−７抗体；抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ３８抗体；抗Ｐｉｍ−１抗体；抗Ｐｉｍ−２抗体；抗ＰＫＣ  β抗体；抗ＰＫＣ  β１１抗体；抗ポドカリキシン抗体；抗ＰＲ抗体；抗ＰＴＥＮ抗体；抗Ｒ１抗体；抗Ｒｂ  ４Ｈ１（網膜芽細胞腫）抗体；抗Ｒ−カドヘリン抗体；抗ＲＲＭ１抗体；抗Ｓ６リボソームタンパク質抗体；抗Ｓ−１００抗体；抗シナプトポジン抗体；抗シナプトポジン抗体；抗シンデカン４抗体；抗タリン抗体；抗テンシン抗体；抗ツベルリン（Ｔｕｂｅｒｌｉｎ）抗体；抗ウロキナーゼ抗体；抗ＶＣＡＭ−１抗体；抗ＶＥＧＦ抗体；抗ビメンチン抗体；抗ＺＡＰ−７０抗体；および抗ＺＥＢが挙げられる。
【００５３】
一次抗体にコンジュゲートさせることができる蛍光体としては、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＶＥＣＴＯＲレッド、ＥＬＦ（商標）（酵素標識蛍光）、Ｃｙ０、Ｃｙ０．５、Ｃｙ１、Ｃｙ１．５、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ７、ＦｌｕｏｒＸ、カルセイン、カルセイン−ＡＭ、ＣＲＹＰＴＯＦＬＵＯＲ（商標）’Ｓ、オレンジ（４２ｋＤａ）、タンジェリン（３５ｋＤａ）、ゴールド（３１ｋＤａ）、レッド（４２ｋＤａ）、クリムゾン（４０ｋＤａ）、ＢＨＭＰ、ＢＨＤＭＡＰ、Ｂｒ−オレゴン、ルシファーイエロー、Ａｌｅｘａ色素ファミリー、Ｎ−［６−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ］カプロイル］（ＮＢＤ）、ＢＯＤＩＰＹ（商標）、ホウ素ジピロメテンジフルオリド、オレゴングリーン、ＭＩＴＯＴＲＡＣＫＥＲ（商標）レッド、ＤｉＯＣ７（３）、ＤｉＩＣ１８、フィコエリトリン、フィコビリタンパク質ＢＰＥ（２４０ｋＤａ）ＲＰＥ（２４０ｋＤａ）ＣＰＣ（２６４ｋＤａ）ＡＰＣ（１０４ｋＤａ）、スペクトラムブルー、スペクトラムアクア、スペクトラムグリーン、スペクトラムゴールド、スペクトラムオレンジ、スペクトラムレッド、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤ、赤外（ＩＲ）色素、サイクリンＧＤＰ−リボース（ｃＧＤＰＲ）、カルコフロールホワイト、リサミン、ウンベリフェロン、チロシンおよびトリプトファンが挙げられるが、これらに限定されない。多種多様な他の蛍光プローブは、オレゴン州ユージーンのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓおよび他の多くの製造業者から入手でき、ならびに／またはオレゴン州ユージーンのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから入手できるＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ８ｔｈ  ＥＤ．（２００１）に詳細にわたって記載されている。
【００５４】
抗体と抗抗体などの、特異的に結合するメンバーの組み合わせを用いることにより、シグナルのさらなる増幅を達成することができ、この場合、前記抗抗体は、ターゲット抗体プローブの保存領域に結合するものであり、特に、前記抗体は、異なる種からのものである。あるいは、ビオチン−ストレプトアビジンなどの、特定の結合リガンド−受容体ペアを用いることができ、この場合、前記一次抗体を前記ペアの一方のメンバーにコンジュゲートさせ、他方のメンバーを検出可能なプローブで標識する。したがって、最初の結合メンバーが、細胞成分に結合して第二の結合を提供し、その第二の結合メンバーは、標識を含むこともあり、または含まないこともあって、この第二のメンバーは、さらに第三の結合に備えることができ、そしてその第三の結合メンバーが標識を提供することとなる、結合メンバーのサンドイッチを有効に形成する。
【００５５】
二次抗体、アビジン、ストレプトアビジンまたはビオチンは、実質的に不溶性の有色反応生成物、蛍光色素（染色剤）、発光色素または非蛍光色素を有する基質の比色反応を指示する酵素であり得る検出可能な部分で、それぞれ独立して標識される。これらの選択肢それぞれに関する例を下に列挙する。
【００５６】
原則的には、（ｉ）一次抗体にコンジュゲートさせることができる、または一次抗体に（例えば、コンジュゲートしたアビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、二次抗体により）間接的に結合することができる、および（ｉｉ）不溶性基質を使用して、不溶性生成物（沈殿）を生じさせる、任意の酵素を使用できるだろう。
【００５７】
用いられる酵素は、例えば、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよび／またはグルコースオキシダーゼであり得；ならびにその基質は、それぞれ、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼまたはグルコースオキシダーゼ基質であり得る。
【００５８】
アルカリホスファターゼ（ＡＰ）基質としては、ＡＰ−ブルー基質（青色沈殿、Ｚｙｍｅｄカタログｐ．６１）；ＡＰ−オレンジ基質（オレンジ色、沈殿、Ｚｙｍｅｄ）、ＡＰ−レッド基質（赤色、赤色沈殿、Ｚｙｍｅｄ）、５−ブロモ，４−クロロ，３−インドリルホスファート（ＢＣＩＰ基質、青緑色沈殿）、５−ブロモ，４−クロロ，３−インドリルホスファート／ニトロブルーテトラゾリウム／ヨードニトロテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＩＮＴ基質、黄褐色沈殿、Ｂｉｏｍｅｄａ）、５−ブロモ，４−クロロ，３−インドリルホスファート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質、青色／紫色）、５−ブロモ，４−クロロ，３−インドリルホスファート／ニトロブルーテトラゾリウム／ヨードニトロテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ／ＩＮＴ、褐色沈殿、ＤＡＫＯ、Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ（赤色）、Ｍａｇｅｎｔａ−ｐｈｏｓ（マゼンタ）、ナフトールＡＳ−ＢＩ−ホスファート（ＮＡＢＰ）／Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ  ＴＲ（赤色）、ナフトールＡＳ−ＢＩ−ホスファート（ＮＡＢＰ）／Ｎｅｗ  Ｆｕｃｈｓｉｎ（赤色）、ナフトールＡＳ−ＭＸ−ホスファート（ＮＡＭＰ）／Ｎｅｗ  Ｆｕｃｈｓｉｎ（赤色）、Ｎｅｗ  Ｆｕｃｈｓｉｎ  ＡＰ基質（赤色）、ｐ−ニトロフェニルホスファート（ＰＮＰＰ、黄色、水溶性）、ＶＥＣＴＯＲＴＭブラック（黒色）、ＶＥＣＴＯＲ（商標）ブルー（青色）、ＶＥＣＴＯＲ（商標）レッド（赤色）、Ｖｅｇａ  Ｒｅｄ（ラズベリーレッド色）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、時としてＰＯと略記される）基質としては、２，２’アジノ−ジ−３−エチルベンズ−チアゾリンスルホナート（ＡＢＴＳ、緑色、水溶性）、アミノエチルカルバゾール、３−アミノ，９−エチルカルバゾール  ＡＥＣ（３Ａ９ＥＣ、赤色）、α−ナフトールピロニン（赤色）、４−クロロ−１−ナフトール（４Ｃ１Ｎ、青色、紺色）、３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ、褐色）、オルト−ジアニシジン（緑色）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ、褐色、水溶性）、ＴＡＣＳブルー（青色）、ＴＡＣＳレッド（赤色）、３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、緑色または緑色／青色）、ＴＲＵＥ  ＢＬＵＥ（商標）（青色）、ＶＥＣＴＯＲ（商標）ＶＩＰ（紫色）、ＶＥＣＴＯＲ（商標）ＳＧ（くすんだ青みがかった灰色）、およびＺｙｍｅｄ  Ｂｌｕｅ  ＨＲＰ基質（鮮やかな青色）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）基質としては、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ、紫色沈殿）、テトラニトロブルーテトラゾリウム（ＴＮＢＴ、黒色沈殿）、２−（４−ヨードフェニル）−５−（４−ニトロフェニル）−  −３−フェニルテトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ、赤色またはオレンジ色沈殿）、テトラゾリウムブルー（青色）、ニトロテトラゾリウムバイオレット（すみれ色）、および３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ、紫色）が挙げられるが、これらに限定されない。すべてのテトラゾリウム基質が補基質としてグルコースを必要とする。グルコースが酸化され、テトラゾリウム塩が還元され、有色沈殿を形成する不溶性ホルマザンを形成する。
【００６１】
β−ガラクトシダーゼ基質としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ、青色沈殿）が挙げられるが、これに限定されない。列挙した基質それぞれに関連した沈殿は、検出可能な独特のスペクトルサイン（成分）を有する。
【００６２】
前記酵素を、ルシフェラーゼおよびエクロリンなどの（しかし、これらに限定されない）基質の発光反応を触媒することに向けることもでき、その反応により、実質的に不溶性の反応生成物が得られ、この反応生成物は、発光することができ、またはルシフェリンおよびＡＴＰもしくはコエレンテラジンおよびＣａ２＋などの（しかし、これらに限定されない）第二の基質の第二の反応を命ずることができ、その第二の反応により発光性生成物が得られる。
【００６３】
それら全体が本明細書に組み込まれる以下の参考文献は、さらなる例を提供している：Ｊ．Ｍ  Ｅｌｉａｓ（１９９０）Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．ＡＳＣＰ  Ｐｒｅｓｓ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ），Ｃｈｉｃａｇｏ；Ｊ．Ｆ．ＭｃＧｉｎｔｙ，Ｆ．Ｅ．Ｂｌｏｏｍ（１９８３）Ｄｏｕｂｌｅ  ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎｓ  ａｍｏｎｇ  ｏｐｉｏｉｄｐｅｐｔｉｄｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｅｄｉａｌ  ｂａｓａｌ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．２７８：１４５−１５３；およびＴ．Ｊｏｗｅｔｔ（１９９７）Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  １９９７  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ４５（１２）：１６２９−１６４１。
【００６４】
核酸バイオマーカーは、インサイチューハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を用いて検出することができる。一般に、核酸配列プローブが合成され、蛍光プローブで標識されるか、または検出可能な部分で標識された、リガンド：受容体ペア、例えばビオチン／アビジンの一方のメンバーで標識される。例示的プローブおよび部分は、前のセクションにおいて説明した。前記配列プローブは、細胞内のターゲットヌクレオチド配列に相補的である。ターゲットヌクレオチド配列を含有するそれぞれの細胞または細胞内区画が、その標識されたプローブに結合できる。解析の際に用いられるプローブは、ＤＮＡもしくはＲＮＡオレゴヌクレオチドであってもよく、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリヌクレオチドであってもよく、および自然に存在するヌクレオチドばかりでなく、それらの類似体、例えば、ジオキシゲニン  ｄＣＴＰ、ビオチンｄｃＴＰ  ７−アザグアノシン、アジドチミジン、イノシンまたはウリジンも含有することがある。他の有用なプローブとしては、ペプチドプローブおよびそれらの類似体、分岐遺伝子ＤＮＡ、ペプチドミメティック、ペプチド核酸、および／または抗体が挙げられる。プローブは、安定した特異的な結合がターゲット核酸配列とそのプローブの間で生ずるために、対象のターゲット核酸配列に対して十分な相補性を有さなければならない。安定したハイブリダイゼーションに必要とされる相同度は、そのハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによって変わる。ＩＳＨ、ハイブリダイゼーションおよびプローブ選択の従来の方法論は、Ｌｅｉｔｃｈ，ら  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｇｕｉｄｅ，Ｏｘｆｏｒｄ  ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋｓ  ｖ．２７（１９９４）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されている。
【００６５】
１つの実施形態では、本明細書に記載する、染色またはＩＨＣ試薬などの、本アッセイにおいて用いられる試薬の最適な希釈を定量的におよび自動的に決定することができる。１つの実施形態において、希釈セットのそれぞれが、異なるそれぞれの希釈値とイムノアッセイ染色強度値のそれぞれの配列とから成る、多数の希釈セットをイメージングする。それぞれのダイナミックレンジメトリックを、イムノアッセイ染色強度値のそれぞれの配列に関連して、それらの多数の希釈セットそれぞれについて決定する。それぞれのダイナミックレンジメトリックが判明したら、数値的に最適なダイナミックレンジメトリックを有する希釈セットを選択し、その希釈セットの希釈値を、本発明において使用するための試薬の最適な希釈レベルを代表するものとして選択する。
【００６６】
例えば、スライドガラスに載せられた組織サンプルを、上で説明した一般的な免疫組織化学技術を用いて、一次抗体の希釈系列の１つで染色する。検出可能なシグナルを見て画像、例えば染色のデジタル画像を獲得するためのシステムを使用して、それらの得られた染色検体をそれぞれイメージングする。画像獲得方法は、より詳細に下で説明する。このようにして得られた画像を、その後、本発明において使用するための試薬の最適濃度を定量的に判定するための本発明の方法によって使用する。異なる組織サンプルセットが異なるそれぞれの滴定濃度希釈物を有するように、それぞれの組織サンプルセットはそれぞれの滴定濃度希釈物を用いて調製される多数の異なる組織サンプルを含む。多数の組織サンプルセットのピクセル画像について定量分析を行う。
【００６７】
多数の希釈セットのそれぞれの希釈セットについて、ダイナミックレンジメトリックおよび染色特異性をそれぞれ計算する。本発明の１つの実施形態において、ダイナミックレンジメトリックは、平均絶対偏差である。本発明のもう１つの実施形態において、データは、対数変換され、ダイナミックレンジメトリックは、標準偏差と分散と揺れ幅率（ｓｗｉｎｇ  ｒａｔｉｏ）の重み付け組み合わせである。染色の特異性は、ノイズを最少にしながら特定のシグナルを最大にするように計算される。染色特異性区画と関連づけられる１セットのイムノアッセイ染色強度値のそれぞれを合計し、その後、その染色特異性区画についての染色特異性平均値を割り出すことによって、および非染色特異性区画と関連づけられる１セットのイムノアッセイ染色強度値のそれぞれを合計し、その後、非染色特異性平均値を割り出すことによっても、染色の特異性を割り出すことができる。これら２つの平均を計算した後、染色特異性平均値を非染色特異性平均値で割って、染色の特異性、すなわち、シグナル対ノイズメトリックを生じさせることができる。そのような実施形態では、染色値の数値的に大きい感度が最適である。もう１つの実施形態では、非染色特異性平均値を染色特異性平均値で割って、染色の感度を生じさせる。そのような実施形態では、染色値の数値的に小さい感度が最適である。希釈セットそれぞれについてのダイナミックレンジメトリックおよび染色感度の計算後、そのダイナミックレンジメトリックおよび染色感度を組み合わせて、それぞれの希釈セットについての組み合わせ値を生じさせることができる。得られた組み合わせ値を用いて、最も数値的に最適な組み合わせ値を有する希釈セットを選択する。選択された希釈セットと関連づけられるのが、試薬の最適な希釈を表す希釈値である。場合により、多数の染色特異性および非染色特異性区画を特定することを企図して、このプロセスにより多重比較が行われる。
【００６８】
４．機器標準化および画像収集
サンプルを染色すると、例えば直立もしくは倒立光学顕微鏡、走査型共焦点顕微鏡、カメラ、走査型もしくはトンネル電子顕微鏡、走査型プローブ顕微鏡、およびイメージング用赤外検出器などの、任意の光学または非光学イメージング装置を使用して、染色剤またはバイオマーカー標識を検出することができる。
【００６９】
１つの実施形態において、イメージング装置は、ターゲットサンプルを照明するように設定された照明光源と、照明されたターゲットサンプルの拡大画像を生成するように構成されたレンズと、拡大画像のデジタル画像を取り込むように設定された検出器、例えばデジタルカメラとを含む、顕微鏡システムである。取り込まれたデジタル画像の操作によって定量的な結果を得ることができる。そのような画像操作は、当業者に公知の画像処理技術を含む場合がある。少なくとも一部の実施形態において、そのような画像取り込みおよび画像操作の１つ以上を、プロセッサを利用して遂行することができる。このプロセッサは、予めプログラムされた命令を実行するコンピュータを含む場合がある。
【００７０】
例えば、組織サンプルまたは組織マイクロアレイを次のようにイメージングすることができる：使用者がマイクロアレイをサンプルステージに乗せる。使用者は、対象の第一の領域または第一のヒストスポットが視野の中央になるようにサンプルステージを調整し、ＣＣＤカメラによって焦点を合わせる。対物レンズを適切な解像度に合わせなければならない。例えば、０．６ミリメートルサンプルを１０倍の倍率で見ることができる。パラフィン固定する場合、染色された組織の可視光散乱から、組織の自己蛍光、または蛍光タグから得られるシグナルをはじめとする様々な手段によって評価したとき、サンプルは、包囲するパラフィンより高い光度の領域に一般に対応する。コンピュータは、コンピュータソフトウェア（Ｓｏｆｔｗｏｒｘ  ２．５、ワシントン州イサクワのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）およびイメージングプラットフォーム（例えば、Ｄｅｌｔａｖｉｓｉｏｎ）を使用して、低解像度画像（例えば、１６ビット解像度で６４ピクセル×６４ピクセル）を獲得することができる。コンピュータは、サンプルステージを視野とほぼ等しい量まで自動的に併進させる。その後、コンピュータは、第二の低解像度画像を獲得する。このプロセスは、コンピュータが全組織サンプルまたはマイクロアレイの画像を獲得し終えるまで繰り返される。その後、市販のソフトウェアを使用して、コンピュータは全組織サンプルまたはマイクロアレイの複合画像を生成する。
【００７１】
特定のシステムを使用して得られた定量的結果を場合に応じて標準化するために、システム固有の係数を決定して、励起光源の強度の変動性、および例えば光路に沿っての装置の変動性を説明することができる。これを達成するために、例えばインラインランプ光度測定ツールを使用することにより、励起光源の強度の測定値を得ることもできる。また、特定のシステムを用いて１つ以上の光路係数を定義することにより、基準または較正サンプル、例えば較正用顕微鏡スライドガラスの測定値を得ることができる。較正用スライドガラスのサンプル蛍光領域がそれぞれのバンド幅内の放射線を放射する、そのような較正用スライドガラスの使用は、蛍光に基づくＩＨＣ用途に特に有用である。それらの蛍光放射により、１つ以上のそれぞれの波長それぞれでの光路の特性づけが可能となる。これらの測定値を同時に得ることができ、または別々に得ることができる。
【００７２】
前記システムは、標準化された照明光源サンプルを検出器に向けるように設定された較正装置を場合により含むが、本発明の方法は、そのような装置の使用を必要としないことが判明した。少なくとも一部の実施形態において、システムプロセッサは、所与の顕微鏡についての補正係数を決定するように設定される。較正装置を使用して得られる標準化された照明光源サンプルの測定値から補正係数を決定することができる。その補正係数を（例えば、前記プロセッサによって）用いて、ターゲットサンプルの検出画像の強度の任意の変動を補正することができる。例えば、国際標準キューブとの比較によりキャリブレーションキューブ係数（ＣＣ）を決定する。取り込んだ較正面画像のピクセル強度を合計することにより光源係数（ＬＳ）を決定する。光路係数（ＯＰ）は、それぞれのキューブ／サンプル組み合わせについて撮った１６の画像の平均合計光度の商である。ＣＣおよびＯＰ係数は、調査する特定のハードウェアシステムに固有のものであり、および１回、または光学機械の何らかのタイプの変更が発生したことが疑われる間隔で、計算するだけでよい。
【００７３】
標準化されたＡＱＵＡ（登録商標）スコアを下に示す：
標準化されたＡＱＵＡ（登録商標）スコア＝粗ＡＱＵＡ（登録商標）スコア＊ＣＣ係数＊ＬＳ係数＊ＯＰ係数
（式中、ＣＣおよびＯＰ係数は、システムセットアップ／構築時に定義され、ならびにＬＳ係数は、同時に測定される）。
【００７４】
一部の実施形態において、システムプロセッサは、キャリブレーション係数を得るための命令（例えば、ソフトウェア）で設定される。あるいは、または加えて、システムプロセッサは、補正係数を使用して検出画像を補正するための命令で設定される。そのような較正は、時間の経過とともに発生し得るような、同じ顕微鏡システム内の照明光源の強度の変動性、および異なる顕微鏡システムおよび／または異なる照明光源を使用して得られる定量的結果間の変動性の低減に有用である。
【００７５】
５．画像最適化
ａ．露光時間
収集された画像からのピクセル強度データのダイナミックレンジを場合により最適化して、特に、露光時間に影響を及ぼす染色強度および機器の違いによる、ラン対ランの変動をさらに低減することができる。このプロセスは、第一の露光時間でカメラの視野内の対象の画像を取り込むことを含み、それにより、それぞれのピクセルが強度値を有する、ピクセルを所定数含む取り込み画像が得られる。取り込み画像のピクセル強度の頻度分布を問い合わせて、その頻度分布のピクセル強度の最大出現頻度領域を決定する。その後、第一の露光時間から、最高頻度分布領域をその強度値範囲の中央にシフトさせるように露光時間を調整する。言い換えると、ヒストグラム、すなわち頻度分布の重心（ＣＯＭ）を決定し、そこから調整露光時間を計算して、ピクセル強度の最適化されたダイナミックレンジを実現する。その後、その対象の第二の画像をその調整露光時間で取り込み、その結果、最適なダイナミックレンジを有する画像を得ることができる。
【００７６】
本明細書に記載する方法のために露光を補正する様々な方法がある。１つの補正技術は、飽和ピクセルが最小になり、最適なダイナミックレンジが実現されるまで、前の画像のものより長いまたは短い露光時間で新たな画像を反復的に獲得する技術である。この反復プロセスは、ピクセル強度を検出範囲内に下げて露光およびダイナミックレンジを最適化する、露光時間の迅速な調整を可能にする。しかし、この極度に単純化されたアプローチは、システムに飽和ピクセルの過剰補正を引き起こす場合もあり、および新たな露光時間をあまりも低く設定する場合もある。従って、露光時間に対する補正のアグレッシブネスを、前の画像において飽和されているピクセル数に比例するように補正することが望ましい。
【００７７】
これを達成するために、次のように新たな露光時間を計算することができる：
Ｅ  ＝  Ｅ’ｘ（１−（０．５）（１＋Ｓ））
（式中、
【数１】
0005551702.tif 000002
であって、Ｅは、新たな露光時間であり、Ｅ’は、現在設定されている露光時間であり、Ａは、アグレッションレベルであり、ＳＬは、飽和限界であり、ＣＣＤｘおよびＣＣＤｙは、取り込み画像のピクセル寸法を表し、ならびにＰは、最大強度でのピクセル数である）。アグレッションレベル、Ａは、様々であり得るが、一般に、選ばれる値は、画像が過飽和になる傾向がある量に依存する。Ａについてのゼロ（０）の値は、露光時間を半減させることとなる最小値を表す。Ａについての実際の最大値は約１０であり、その後は、そのアルゴリズムが有用であるために十分に露光時間が変化しない。本発明の好ましい実施形態において、Ａについての値は、約０≦Ａ≦４．５の範囲に入り得る。さらに好ましくは、Ａは、約３．５に設定される。
【００７８】
画像が確実に過剰露光されないように露光時間を減少させる手順は、概して多段階プロセスである。例示的な実施形態では、現露光時間、Ｅ’でカメラから得られた８ビットピクセル画像について、先ず、２５６ビンのヒストグラムを生成する。飽和ピクセル数を特定し、所定の飽和閾値と比較する。その後、画像が飽和限界以下である場合には、その過剰露光手順から外れる。しかし、画像を過剰露光する場合には、露光時間を減少させる。この新たな、減少させた露光時間は、現在過剰露光されているピクセルの数に基づいて変動し得る。例示的な実施形態では、次のように値Ｓを決定することができる：
【数２】
0005551702.tif 000003
（式中、Ａは、３．５で現在定義されている「アグレッションレベル」であり、Ｍは、最大強度でのピクセル数である）。その後、次の露光時間Ｅを以下のように導出する：
Ｅ  ＝  Ｅ’−Ｅ’０．５１＋Ｓ
【００７９】
過剰露光されたピクセルの数が、飽和限界よりはるかに大きいとき、Ｅ≒Ｅ’−０．５Ｅ’（例えば、露光時間は半減される）。現露光時間への最小の変化量は、過飽和ピクセルの数が飽和限界にほぼ等しいときに発生し、この場合、Ｅ≒Ｅ’−０．０８８Ｅ’。従って、画像が飽和限界以下であるときにはアルゴリズムから外れるため、飽和ピクセル数は、決して飽和限界に等しくならない。この露光時間を減少させる手順を、過剰露光量が選択された閾値内になるまで、または最大反復数が遂行されるまで、反復的に繰り返すことができる。いずれの場合も、その後、過剰露光補正ルーチンから外れる。
【００８０】
過剰露光について補正するための代替の同等に実行できるプロセスは、最小露光時間で新たな画像を獲得し、その後、続いて、上で説明したようにＣＯＭを計算してそれを中間点の範囲内にすることにより露光時間を最適化するプロセスである。
【００８１】
ｂ．画像検証
画像の質を自動的に評価し、染色不均一性、染色品質、組織十分性（ｔｉｓｓｕｅ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）、組織サンプル位置、シグナル飽和、焦点、およびシグナル完全性から選択される１つ以上の要因に起因する変動を減少させるように最適化することができる。したがって、妥当でない画像をその後のデータ解析から除外することができるように、無サンプル、少なすぎるサンプル、破壊片、多重サンプルまたは「分割画像」（ＴＭＡ解析の場合）および焦点不良に起因する誤った読み取りについて画像を補正することができる。それぞれの染色を、同じまたは異なる画像上の他の染色とは無関係に検証することができる。そのプログラムに備えられたまたは使用者が与えた特定の閾値を伴う画像処理プログラムにより、これらの評価および最適化を自動的に行うことができる。
【００８２】
スライドガラスまたはスライドガラスの少なくともイメージングされる部分にわたって染色の均一性を場合により判定するために、縦列の画像ピクセルの強度値をそれぞれの列に沿って組み合わせ、ｘ軸にプロットする。この組み合わせは、その列に沿ったピクセル強度値の直接的加算である。あるいは、または加えて、この組み合わせは、その列の中のすべてのピクセルの平均強度値などの値に統計的に達することがある。例えば、８ビットを用いて強度を表す画像では、各ピクセルに２５６の可能なピクセル強度が存在する。ピクセル強度値は、黒色（例えば「０」）から白色（例えば、「２５５」）の範囲にわたる。黒色と白色の間の値は、様々な色調の灰色に関連づけられる。相対最大強度値、すなわちピーク値をその画像の異なる領域間で比較して、染色の均一性および位置の偏りを判定することができる。偏りが見つかった場合、その画像をさらなる解析から除外することができる。
【００８３】
染色品質を場合により判定するために、区画の一部として同定されるデジタル画像のピクセル強度を解析することにより、その区画内の区画特異的染色の染色強度を測定する。例えば、核染色剤の染色品質を測定するために、有核細胞内区画内の合計染色強度を、核を表すものとして同定されたピクセルの強度の合計などの、組み合わせとして、系統立てて表すことができる。有核細胞内区画以外の合計染色強度を、核でないと同定されたピクセルの強度の合計として、同様に系統立てて表すことができる。核および非核についての前記２つの値を比較する。例えば、前記２つの値を、比率、比較を示すその比率の単一の値で組み合わせることができる。例えば、画像処理プログラムにより、組み合わせた核強度を、組み合わせた非核強度で割って、組織染色品質比を生じさせることができる。１に迫る比のような低い比は、不良な染色品質または不良な組織完全性を示す。許容される最小染色品質閾値は固定とすることも、または使用者がそれを設定することもできる。最小染色閾値を満たすことができないと判断されたそのようなサンプルをデータセットから、および検証プログラムによるさらなる解析から除外することができる。
【００８４】
組織十分性は、閾値強度より上のシグナル強度を有する画像のピクセルをカウントし、その後、陽性ピクセルの合計数が、十分な組織についての最低基準を満たすかどうかを判定することによって解析することができる。同様に、その合計に対する陽性ピクセルパーセントを基準として用いることができる。
【００８５】
組織マイクロアレイを解析するとき、視野内の同定される多数の異なる切片のそれぞれにおける平均ピクセル強度を計算することにより、組織サンプル位置を評価することができる。個々のサンプルまたはヒストスポットを同定して、そのサンプルのエッジの位置とそのサンプルの中央とを比較することにより、用いることができる位置を決定しなければならない。長方形の面積のピクセル強度に基づいてサンプルエッジを判定して正確に中心にあるかどうかを評価し、および中心ピクセル強度を測定して、その端が１つより多くのサンプルによるものでないかどうかを判定する。サンプルエッジ検出は、独立した鑑別オペレータ、例えばＳｏｂｅｌエッジ検出器、または任意の他の数の、当分野において周知のエッジ検出器を使用して行うことができる。その後、正しい位置にないサンプル、または１つより多くのターゲットを含有する分割スポットを特定し、さらなる解析から除外することができる。
【００８６】
サンプルの焦点は、例えば、画像のピクセル強度についての尖度値を決定することにより、評価することができる。デジタル化画像におけるピクセルの染色強度値をヒストグラムにプロットすることができる。焦点の指標として分布を解析することができる。ピントの合った画像は、平坦なピーク（より低い尖度）を伴うピクセル強度分布を有するピント外れの画像に比べて、比較的鋭い、明瞭なピーク（より高い尖度）を伴うピクセル強度分布を概して有する。そのような分布の鋭さまたは平坦さを単一の値、例えば尖度値で表すことができる。より高い尖度値は、比較的鋭い明瞭なピークを示し；これに対して、より低い尖度値は、平坦なピークを示す。
【００８７】
尖度は、データが、正規分布を基準にして尖っているのか、平坦であるのかの測度である。すなわち、高い尖度を有するデータセットは、平均付近に明確なピークを有する、どちらかと言えば急に低下する、および重い裾を有する傾向がある。低い尖度値を有するデータセットは、鋭いピークではなく平均に近い平坦な頂部を有する傾向がある。一変量データＹ１、Ｙ２、．．．、ＹＮについての尖度の式は、
【数３】
0005551702.tif 000004
であり、式中、
【数４】
0005551702.tif 000005
は、平均であり、ｓは、標準偏差であり、およびＮは、データ点の数である。過剰な尖度は、標準正規分布がゼロの尖度を有するために、
【数５】
0005551702.tif 000006
と定義することができる。正の尖度は、「尖っている」分布を示し、負の尖度は、「平坦な」分布を示す。その後、負の尖度を有する画像をさらなる解析から除外することができる。
【００８８】
シグナル強度は、それぞれのヒストスポットについてそれぞれの該当チャンネルにおいて獲得された画像から測定したシグナル強度データを選別し、低い染色強度を有するサンプルの数を特定することによって、評価することができる。そのようなサンプルをさらなる解析から除外することができる。
【００８９】
６．ＡＱＵＡ（登録商標）スコアリング
画像を最適化し、検証して、任意の妥当でないヒストスポットまたは画像を除去したら、画像を仮想マスクし、サンプル中の細胞の三次元近似を生成することができ、およびバイオマーカーを個々の細胞の細胞内区画と関係づける。これらのタスクを自動的に行うための１つのそのようなアルゴリズムが、自動定量解析プラットフォーム（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＱＵａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｐｌａｔｆｏｒｍ：ＡＱＵＡ（登録商標）プラットフォーム）である。この技術は、米国特許第７，２１９，０１６号およびＣａｍｐら，２００２  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８（１１）１３２３−１３２７にも記載されており、これらの参考文献は、両方とも、それら全体が参照により本明細書に特に組み込まれる。しかし、この解析の容易さおよび再現性を増す、各段階の自動化を、初めて、本明細書に記載する。
【００９０】
１つの実施形態では、例えば対象の細胞内区画および調査する特定のターゲットを規定するマーカーで、組織サンプルを染色する。発現の区画化のためのピクセルに基づく局所割り当て（Ｐｉｘｅｌ−ｂａｓｅｄ  ｌｏｃａｌ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）：（ＰＬＡＣＥ）は、発現区画化を目的として画像ピクセルを有効にセグメント化するように機能する重要なアルゴリズムである。このアルゴリズムにおける肝要な段階は、バックグラウンドまたは非特異的ピクセルとシグナル特異的ピクセルの間に線を引くために用いられる強度閾値の設定である。このようにして「マスク」された画像を、その後、相互排除様式で、閾値より上のピクセルを特定の細胞内区画に割り当てるように組み合わせる。それぞれの区画にピクセルを割り当てたら、次に、ターゲットバイオマーカーについてのシグナルを、サンプルについてのＡＱＵＡ（登録商標）スコアである、所与の区画に割り当てられたピクセルすべてにわたって、平均することができる。
【００９１】
例えば、腫瘍を周囲の間質および／または白血球と区別するマーカー（サイトケラチン）の画像の手動閾値処理により、腫瘍特異的マスクを生成することができる。これは、二値マスク（それぞれのピクセルが、「オン」または「オフ」のいずれかである）を生じさせる。閾値処理レベルを検証し、そして必要な場合には、画像の小サンプルを確認し、次に、その決定された単一の閾値を用いて残りの画像を自動的にマスクすることにより、閾値処理レベルを調整する。その後のすべての画像操作は、マスクされた領域からの画像情報のみを含む。オフターゲット特異的画像をクラスタリングして、マスクされた非標準ターゲットのピクセル強度を反復的に調整することができる。この拡張（ｄｉｌａｔｅ）画像処理技術により、マスク内に含まれたピクセルによって包囲されている最隣接ピクセルを空間ローパスフィルタによって埋めることができる。腐食（ｅｒｏｄｅ）画像処理技術により、マスクと隣接していないピクセル、またはスライドに載せた所与の組織サンプルについて予想される構造と相いれない構造を形成するピクセルを空間ハイパスフィルタによって除去することができる。そのような調整により、そうでなければさらなる解析から除外され得る、有用だが不適格なサンプルを含めることができる。
【００９２】
次に、バックグラウンドノイズについて補正することにより、シグナル対ノイズ比を向上させることができる。例えば、区画特異的タグおよびターゲットマーカーの２つの画像（ピントが合っているもの、ピント外れのもの、例えばサンプルを６μｍ深めに撮ったもの）を撮影する。ピント外れの画像は、バックグラウンド値をもたらす空間ローパスフィルタとしての役割を果たす。例えば、ＲＥＳＡ（迅速指数関数的サブトラクションアルゴリズム（Ｒａｐｉｄ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ））と呼ばれるアルゴリズムを使用することなどにより、２つの画像のピクセル毎の解析に基づいてピント外れの画像の百分率をピントの合った画像からサブトラクトする。ＲＥＳＡアルゴリズムは、より高い染色強度領域とより低い染色強度領域の間の界面を強化し、バックグラウンドおよび近接区画へのピクセルのより容易な割り当てを可能にする。最終的に、ＰＬＡＣＥアルゴリズムは、画像内のそれぞれのピクセルを特定の細胞内区画に割り当てる。使用者が定義する信頼度内で区画に的確に割り当てることができないピクセルは、除かれる。例えば、核および細胞質のピクセル強度が似すぎていて的確に割り当てることができないピクセルは、無効にされる（例えば、全ピクセルの＜８％を構成する）。それぞれのピクセルを細胞内区画に割り当てたら（または上で説明したように除外したら）、次の等式に示すように、それぞれの位置のシグナルを合計してそのサンプルのＡＱＵＡ（登録商標）スコアを生成する：
【数６】
0005551702.tif 000007
（式中、ＡＱは、粗ＡＱＵＡ（登録商標）スコアであり、Ｔｉは、パワー密度としても公知の、ｉ番目のターゲットの強度であり、およびＣｉは、ｉ番目の細胞内区画の確率である）。
これらのデータを保管し、後に、合計シグナルの百分率としてまたは区画面積あたりの平均シグナル強度として表すことができる。
【００９３】
好ましくは、ＡＱＵＡ（登録商標）スコアを、例えばクラスタリングにより、自動的に正規化して、強度データに基づいて特定の細胞内区画にピクセルを割り当てることができる。このクラスタリングにより、バックグラウンドノイズをさらに除去することができ、特定のピクセルを所与の区画に割り当てることができ、およびオーバーラップシグナルが存在し得る場合にはそれぞれの区画にピクセルを割り当てることができる。ピクセルをそれぞれの区画に割り当てたら（またはノイズの場合には、除いたら）、割り当てられたターゲットシグナルを測定する、例えば、合計し、スコアを計算することができる。
【００９４】
割り当ては、普遍的基準を設定するのでははく、画像ごとに選択的に決定される。さらに、ピクセル割り当て（例えば、細胞質へのＣｙ３／サイトケラチンピクセル）は、他の区画画像の関数でもあるので、他の区画画像におけるピクセルの状態が考慮される。１つの実施形態において、１つの画像は、第一の区画を特異的に標識する第一の染色剤の画像（例えば、細胞質区画を表す、Ｃｙ３／サイトケラチン画像）であり、第二の画像は、第二の区画を特異的に標識する第二の染色剤の画像（例えば、核区画を表す、ＤＡＰＩ画像）であり、ピクセル割り当ては、４つの基準に基づく：
【００９５】
１．）第一の画像と第二の画像（例えば、ＤＡＰＩとＣｙ３）の両方が低強度：バックグラウンド：除去
【００９６】
２．）第一の染色剤（Ｃｙ３）強度に対して高い第二の染色剤（例えば、ＤＡＰＩ）強度：第二区画（例えば、核）
【００９７】
３．）第二の染色剤（例えば、ＤＡＰＩ）強度に対して高い第一の染色剤（例えば、Ｃｙ３）強度：第一区画（例えば、細胞質）
【００９８】
４．）高い第二の染色剤および第一染色剤（例えば、ＤＡＰＩおよびＣｙ３）強度：無関係：除去
【００９９】
クラスタリングは、データセット内の重心が、例えばユークリッドまたは対数尤度距離によって決定されるような、それぞれのデータ点の互いへの相対距離によって規定される、数学アルゴリズム機能である。理論により拘束されることを望まないが、少なくとも２つの画像（例えば、ＤＡＰＩおよびＣｙ３）からのピクセル強度のクラスタリングは、説明したように、少なくとも上述の基準により、ピクセルを規定する重心を生じさせることができると考えられる。クラスタリングは客観的であり、およびそれぞれの画像に対して個々にクラスタリングを行うことができるので、クラスタリングは、オペレータ介入に依存しない、区画にピクセルを割り当てるための信頼できる方法である。
【０１００】
もう１つの実施形態では、第一の染色剤と第二の染色剤の両方を示すシグナルを含有するピクセルを、次の方法によって区画に割り当てる。獲得した画像中のすべてのピクセルは、３つの属性、区画マーカーＡからの強度寄与、区画マーカーＢからの強度寄与、および対象のターゲットまたはバイオマーカーからの強度寄与を有する。これらの強度を実験構成ごとにそれらそれぞれの蛍光チャンネルで測定する。実験での偏りを避けるために、この最新の方法ではターゲット強度を操作しない。従って、２つの区画属性についてのデータを二次元プロットで図示することができる。
【０１０１】
いずれかの軸への強い偏りを有するピクセルをその区画に割り当てることができる（例えば、領域ＡおよびＢにおけるピクセルをそれぞれ区画ＡおよびＢに絶対的に割り当てることができる）。原点付近のピクセルは、両方のチャンネルについての低い強度を表し、それらのピクセルを、高い強度だが類似した値を有する外れ値ピクセルと共にバックグラウンドとして除くことができる。その後、領域Ａ／Ｂに残存するピクセルを確率に基づいてそれぞれの区画に割り当てることができる。この割り当てにより、それらのピクセル中のターゲットシグナルを確率特性解析に基づいて両方の区画にわたって分配することができる。
【０１０２】
上で説明した領域を定義するために、例えば、画像ごとに、クラスタリングを用いてデータにおける３つの重心を決める。この方法は、完全に自動化され、オペレータの進行決定を一切必要としない。この解析は、ユークリッド距離を用いて３つの重心に関するｋ−ｍｅａｎｓクラスタリングを行うことによって遂行される。
【０１０３】
その後、次のようにデータを解析する：（ｉ）バックグラウンドおよび外れ値ピクセルをさらなる計算から除く。ピクセルは、原点ヘのその距離が原点へのバックグラウンド重心距離の２倍未満である場合、バックグラウンドと定義される。ピクセルは、その強度が最も遠い（ｏｕｔｅｒｍｏｓｔ）重心により規定される線または平面によって規定される値を超える場合、外れ値と定義される；（ｉｉ）領域ＡおよびＢ内のピクセルをそれらの２区画に排他的に割り当てる；（ｉｉｉ）その後、三角形領域Ａ／Ｂ内のピクセルを、それらを多数の区画にほぼ完全に分配することができる確率値に割り当てる。この確率値は、２領域ＡおよびＢからの距離に基づいて計算することができ、または形状関数を用いて計算することができ、この形状関数は、重心によって与えられる３つの頂点からのそれぞれのピクセルの距離を調査することによりそれぞれのピクセルがバックグラウンド領域からの寄与を有する確率も指定する；（ｉｖ）割り当てられたすべてのピクセルに関して、それぞれの区画についての関連ターゲットスコアを合計し、標準的な方法：
【数７】
0005551702.tif 000008
（式中、Ｉｎｔは、そのピクセル（ｐｉｘｅｌ）の強度であり、Ｐは、特定の区画に割り当てられるピクセルの確率である（０から１にわたる））
を用いてスコアを計算する。
【０１０４】
カットポイントは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＭｃＣａｂｅら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．（２００５）９７（２４）：１８０８−１８１５においてより詳細に説明されているような、１つ以上のバイオマーカーについて異なるバイオマーカー発現レベルを有する組織を含有するサンプルなどの特定の特徴を有する群にサンプルを分けるためのアルゴリズムを用いて、確立される。本発明の方法を用いてサンプルバイオマーカー定量結果を減少させることにより、群内変動が最少化され、群間の差が最大化され、より容易に判断される。例えば、高いＡＱＵＡ（登録商標）スコアによって表される、バイオマーカーの高い発現レベルを、進行性疾患および生存率低減とより緊密に相関させることができるが、より低いＡＱＵＡ（登録商標）スコアはされない。２つの群を確実に区別することにより、バイオマーカーと疾病との相関関係がより明確になる。従って、本発明の方法を用いて生成されるＡＱＵＡ（登録商標）スコアは、サンプル群を比較するための信頼性のあるアッセイをもたらすので、バイオマーカーを特定の特性とより特異的に相関させることができ、その結果、個々のサンプルに関する信頼性のある診断および予後推定につながる。
【０１０５】
７．再現性
ＡＱＵＡ（登録商標）スコアの変動性は、自動計器標準化、例えば露光量最適化により、ならびにクラスタリングによる粗ＡＱＵＡ（登録商標）スコアの正規化により、ならびに場合により改善された画像検証により減少されるため、アッセイの感度および再現性は向上される。例えば、１つの実施形態では、２つ以上の細胞内区画に起因し得るデータシグナルを、より確実に区別することができる。さらなる実施形態では、データシグナルを少なくとも約９０％信頼区間で区別することができる。さらなる実施形態では、データシグナルを約９５％信頼区間で区別することができる。さらなる実施形態では、データシグナルを約９９％信頼区間で区別することができる。
【０１０６】
正規化されたＡＱＵＡ（登録商標）スコアは、より再現性の高いカットポイントの決定を提供し、それがラン間のサンプル分類のより大きな一致につながる。１つの実施形態において、アッセイは、それぞれのサンプルについてのサンプル分類に関してあるランと別のランとで８５％より大きいコンコーダンスを提供するものである。さらなる実施形態において、アッセイは、それぞれのサンプルについてのサンプル分類に関してあるランと別のランとで９０％より大きいコンコーダンスを提供するものである。さらなる実施形態において、アッセイは、それぞれのサンプルについてのサンプル分類に関してあるランと別のランとで９５％より大きいコンコーダンスを提供するものである。さらなる実施形態において、アッセイは、それぞれのサンプルについてのサンプル分類に関してあるランと別のランとで９９％より大きいコンコーダンスを提供するものである。
【０１０７】
正規化されたＡＱＵＡ（登録商標）スコアは、バイオマーカー発現のより再現性の高い定量測度をもたらす。１つの実施形態において、バイオマーカー発現レベルの定量測度は、８０％より高い再現性を有する。さらなる実施形態において、バイオマーカー発現レベルの定量測度は、９０％より高い再現性を有する。さらなる実施形態において、バイオマーカー発現レベルの定量測度は、９５％より高い再現性を有する。さらなる実施形態において、バイオマーカー発現レベルの定量測度は、９９％より高い再現性を有する。さらなる実施形態において、バイオマーカー発現レベルの定量測度は、約８５％から約９９％の再現性を有する。さらなる実施形態において、バイオマーカー発現レベルの定量測度は、約９０％から約９９％の再現性を有する。さらなる実施形態において、バイオマーカー発現レベルの定量測度は、約９０％から約９７％の再現性を有する。
【０１０８】
１つの実施形態において、正規化されたＡＱＵＡ（登録商標）スコアは、２０パーセントより低い変動係数（％ＣＶ）を有するバイオマーカー発現の定量測度を提供する。さらなる実施形態において、正規化されたＡＱＵＡ（登録商標）スコアは、１０パーセントより低い変動係数（％ＣＶ）を有するバイオマーカー発現の定量測度を提供する。さらなる実施形態において、正規化されたＡＱＵＡ（登録商標）スコアは、５パーセントより低い変動係数（％ＣＶ）を有するバイオマーカー発現の定量測度を提供する。さらなる実施形態において、正規化されたＡＱＵＡ（登録商標）スコアは、約１から約２０パーセントの変動係数（％ＣＶ）を有するバイオマーカー発現の定量測度を提供する。さらなる実施形態において、正規化されたＡＱＵＡ（登録商標）スコアは、約５から約１５パーセントの変動係数（％ＣＶ）を有するバイオマーカー発現の定量測度を提供する。さらなる実施形態において、正規化されたＡＱＵＡ（登録商標）スコアは、約４から約７パーセントの変動係数（％ＣＶ）を有するバイオマーカー発現の定量測度を提供する。
【０１０９】
このように、正規化されたＡＱＵＡ（登録商標）スコアは、サンプル群を比較するための信頼性のあるアッセイをもたらすので、バイオマーカーを特定の特性とより特異的に相関させることができ、その結果、より信頼性の高い診断および予後推定につながる。
【実施例】
【０１１０】
（実施例１）
自動化ＡＱＵＡ（登録商標）技術を用いるＨＥＲ２解析の標準化
材料および方法
コホートの説明およびＴＭＡ構築
標準化技術を検査するために、これらの研究では組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）形式での大きな乳癌コホートを用いた。Ｙａｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙからのこのコホート（ＹＴＭＡ４９）は、以前に詳細に説明されている（Ｄｏｌｌｅｄ−Ｆｉｌｈａｒｔ  Ｍら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００６）６６：５４８７−９４）。簡単に言うと、１９６１年から１９８３年までＹａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙから逐次的に収集された浸潤性管癌腫の乳房コホート（ｎ＝６６９）。このアレイ上には、正常組織および細胞株対照の選択物も存在する。平均追跡調査時間は、１２．８年であり、診断平均年齢は５８．１歳である。このコホートは、おおよそ半分のリンパ節転移陽性および半分のリンパ節転移陰性検体を含有する。このコホートについての詳細な治療情報を入手できなかった。
【０１１１】
免疫組織化学／免疫蛍光組織染色
ＹＴＭＡ４９におけるケースについてのクロマジェン（Ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）に基づく免疫組織化学染色およびスコアリングを、以前に説明されているように行った（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａｍｐ  ＲＬら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００３）６３：１４４５−１４４８）。修正間接的免疫蛍光プロトコル（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａｍｐ  ＲＬら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（２００２）８：１３２３−１３２７）を用いて、ＹＴＭＡ４９を染色した。簡単に言うと、予め切断されているパラフィン被覆組織マイクロアレイスライドガラスを脱パラフィンし、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）中での熱誘導エピトープ回復により抗原を回復させた。自動染色装置（カリフォルニア州フリーモントのＬａｂＶｉｓｉｏｎ）を使用して、スライドガラスをＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ  Ｓｎｉｐｅｒ（カリフォルニア州コンコードのＢｉｏＣａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）と共にプレインキュベートした。その後、スライドガラスを、Ｄａ  Ｖｉｎｃｉ  Ｇｒｅｅｎ（カリフォルニア州コンコードのＢｉｏＣａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）で希釈したＨＥＲ２に対する一次抗体（Ｄａｋｏ（カリフォルニア州カーピンテリア）、ウサギポリクローナル、１：８０００希釈）およびｐａｎ−サイトケラチンに対する一次抗体（ウサギポリクローナル、１：２００希釈、カリフォルニア州カーピンテリアのＤＡＫＯ）と共に１時間、室温でインキュベートした。
【０１１２】
スライドガラスを、３×５分、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１×  ＴＢＳで洗浄した。対応する二次抗体をＤａ  Ｖｉｎｃｈ  Ｇｒｅｅｎで希釈し、３０分間、室温でインキュベートした。これらは、抗サイトケラチンの蛍光体に直接コンジュゲートしている抗体（Ａｌｅｘａ  ５５５にコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ；１：１００、オレゴン州ユージーンのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、および／または抗マウスもしくは抗ウサギＥｎｖｉｓｉｏｎ（カリフォルニア州カーピンテリアのＤａｋｏ）を介してホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートしている抗体のいずれかを含んだ。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴＢＳで再びスライドガラスを３×５分、洗浄した。スライドガラスを蛍光クロマジェン増幅系（Ｃｙ−５−チラミド、マサチューセッツ州ボストンのＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）と共にインキュベートした。この系は、ＤＡＢと同様に、ＨＲＰによって活性化され、その結果、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体のすぐ付近に非常に多数の共有結合性会合型Ｃｙ−５色素を析出が生じさせる。Ｃｙ−５（赤色）を用いた。その発光ピークが組織自己蛍光の緑色−オレンジ色スペクトルの十分に外側であるからである。アンチフェードＤＡＰＩ含有マウント媒質（ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ、オレゴン州ユージーンのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて、自動解析用のスライドガラスにカバーガラスをかぶせた。
【０１１３】
顕微鏡システムおよび画像獲得
ＨｉｓｔｏＲｘ  Ｉｎｃ．（コネチカット州ニューヘーヴン）によって市販されているＰＭ２０００（商標）システムは、以前に説明されているシステム（Ｃａｍｐら，２００２、上記）に基づく。簡単に言うと、それは、対物レンズ（例えば、４倍、１０倍、２０倍、４０倍、および６０倍）の選択を制御するための電動式ノースピースが装備されている、オリンパスＢＸ５１エピ蛍光顕微鏡（ペンシルバニア州センターバレーのＯｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．）と、異なるフィルタキューブ（例えば、ＤＡＰＩ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、およびＣｙ７または等価の波長）の選択を制御するための電動式フィルタターレットと、ステージ移動を制御するための電動式ステージ（マサチューセッツ州ロックランドのＰｒｉｏｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）と、Ｘ−Ｃｉｔｅ  １２０水銀／金属ハロゲン化物光源（カナダ、オンタリオ州のＥＸＦＯ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＆  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）と、ＱＵＡＮＴＦＩＲＥモノクロデジタルカメラ（カリフォルニア州ゴレタのＯｐｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．）とを含んで構成される。
【０１１４】
ＡＱＵＡｓｉｔｉｏｎ（商標）ソフトウェアパッケージを用いてＨｉｓｔｏＲｘ  ＰＭ−２０００により自動画像取り込みを行った。Ｃｙ３で可視化されるサイトケラチン染色、ＤＡＰＩ、およびＣｙ５でのターゲット染色についての高解像度、８ビット（獲得画像１ピクセルあたり２５６の別個の強度値を生じさせる）デジタル画像を取り込み、アレイ上のヒストスポットごとに保管した。ピクセルをパワーの関数（パワー（Ｐ）＝（ピクセル強度／２５６）／露光時間）として画像ファイルに書き込んで、染色強度および露光時間の実験による変動の補償を助けた。
【０１１５】
ＡＱＵＡ（登録商標）スコア生成
画像を腫瘍面積パーセント（＜５％面積／視野を示す腫瘍を編集した）、ピント外れ、および破壊片について検証した。ＹＴＭＡ４９における６６９の腫瘍サンプルのうち、８６のサンプル（１２．８％）を編集して、後のスコアリングおよび解析に５８３のサンプルを残した。それぞれのヒストスポットに関するＨＥＲ２についての区画特異的ＡＱＵＡ（登録商標）スコアを、以前に説明されている（Ｃａｍｐら，２００２，上記）ような、ＰＬＡＣＥ（発現の区画化のためのピクセルに基づく局所割り当て（ｐｉｘｅｌ−ｂａｓｅｄ  ｌｏｃａｌｅ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）アルゴリズム）アルゴリズムに基づいて生成した。閾値設定についてのオペレータ対オペレータの偏りを除去するために、本出願の他の箇所で説明したように、最適な画像セグメント化のための非監視式のピクセルに基づくクラスタリングアルゴリズムをＰＬＡＣＥアルゴリズムで用いた。
【０１１６】
計器標準化
計器変動についてのＡＱＵＡ（登録商標）スコア標準化のために、３つの較正係数を開発した：キャリブレーションキューブ係数（ＣＣ係数）、光源係数（ＬＳ係数）、およびＣｙ５光路係数（ＯＰ係数）。これらの係数の計算は、説明した条件下で獲得される画像によって与えられるピクセル強度測定値に基づく。すべての係数が、設計された専用フィルタキューブ（較正曲線）に依存し、それにより、光は、光源から、フィルタキューブの対物レンズ端に取り付けられた白色ペーパーフィルタを介して、カメラに直接反射される。異なるキューブ構成での変動を説明するために、「金標準」キャリブレーションキューブの平均合計光度と比較した平均合計光度の百分率を計算する（ＣＣ係数を生成する）ことにより、それぞれの機械についてのキャリブレーションキューブを標準化した。これは、定数係数であって、それぞれのキューブについて、および従って、そのキューブがインストールされたそれぞれの顕微鏡システムについて計算され、維持されるものである。光源係数は、獲得されたそれぞれのヒストスポットについて計算されるものであり、およびキャリブレーションキューブによって測定され定数（１００，０００）に分割されるような合計光度である。光路係数は、測定される入光光度を基準にして特定の顕微鏡対物レンズ／フィルタの組み合わせを通過する光の量を説明するものである。これらの測定のために、異なる機械間で移し替えることができ、その構成の再現性を維持することができる標準サンプルが、必要とされる。市販の青色蛍光標準スライドガラス（バーモント州ブラトルバロのＯｍｅｇａ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）をこのために選択した。本明細書において前に説明したように標準化を行った。
【０１１７】
統計解析
解析のために、ＡＱＵＡ（登録商標）スコアをＬｏｇ２変換した。別様に述べていない限り、統計解析およびアウトプットは、ＳＰＳＳ  １５．０（イリノイ州シカゴのＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．）を用いて行った。以前に説明されている（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａｍｐ  ＲＬら，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００４）１０：７２５２−７２５９）ようにソルトウェアパッケージＸ−Ｔｉｌｅを使用して、５年疾病特異的死亡に関する継続的ＨＥＲ２  ＡＱＵＡ（登録商標）データについての最適なカットポイントを生存率の関数として生成した。Ｘ−ｔｉｌｅは、モンテカルロ・シミュレーション（例えば、交差検証（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒａｅｓｉｄｅ  ＤＥ．Ｐｈｙｓ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．（１９７６）２１：１８１−９７））を行って、補正されたＰ値を生じさせて、多数のカットポイントによって生成されるデータの統計学的有意性を評価する。このソフトウェアは、追加のＰ値推定のための訓練／検証サブセットも生成する。２×２分割表についての９５％信頼区間での一致百分率を、二元配置分割表解析用のウェブ系ツール、ＪａｖａＳｔａｔを用いて決定した。
【０１１８】
結果
ＨＥＲ２免疫蛍光染色
蛍光染色剤を多重化して、特定のバイオマーカーの発現を区画化し、測定した。ＨＥＲ２については、サイトケラチン由来の（上皮特異的）区画（Ｃｙ３）内のピクセル（Ｃｙ５）のみ解析を考え、このようにして、腫瘍からの間質性ＨＥＲ２シグナルと、膜／細胞質からの核ＨＥＲ２シグナルとを区別した。説明したように、サイトケラチンピクセルと一致するＨＥＲ２ピクセルのみを用いて、ＡＱＵＡ（登録商標）スコアを生成した。
【０１１９】
従来のＩＨＣスコアリング法とＡＱＵＡ（登録商標）スコアの相関
ＨＥＲ２  ＡＱＵＡ（登録商標）スコアは、０．４６のスペルマン（Ｓｐｅｒｍａｎ）のＲｈｏ値で、カテゴリカルＩＨＣスコアリング法（０、＋１、＋２、および＋３）との中等度の、しかし非常に有意な相関を示した（ｐ＜０．００１）。多項回帰分析（カテゴリカルデータの連続データに対する比較のため）は、０．５６の擬似Ｒ値で、非常に有意な相関を示した（Ｐ＜０．００１）。図３は、箱ひげ図を用いてＨＥＲ２  ＡＱＵＡ（登録商標）スコアをＩＨＣスコアの関数としてカテゴリー分けするものである。ＡＱＵＡ（登録商標）は連続発現スコアを提供するので、集団平均には非常に有意な差がある（ＡＮＯＶＡ  Ｐ＜０．００１）が、従来のカテゴリカルスコアリングの範囲全域でＡＱＵＡ（登録商標）スコアの有意なオーバーラップが観察された。
【０１２０】
正規化されたＨＥＲ２発現スコア
浸潤性乳癌のコホート（ｎ＝６６９）の３つの連続切片を、「材料および方法」において説明したように、ＨＥＲ２について蛍光染色した。第一の連続切片は、３つの異なる計器および３人の異なるオペレータにわたってのＡＱＵＡ（登録商標）スコア生成のために使用した。第二および第三の連続切片は、ラン対ランの変動性を評価するために別々の日に染色した。図４は、示されている各獲得パラメータ（計器（図４Ａ）、オペレータ（図４Ｂ）、および独立した染色ラン（図４Ｃ））についての正規化されたＡＱＵＡ（登録商標）スコア分布を示す箱ひげ図を与えるものである。５８３の患者サンプルについて、平均変動係数パーセント（％ＣＶ）は、計器にわたって１．８％（最小＝０．０４％；最大＝１０．７％）、オペレータにわたって２．０％（最小＝０．０６％；最大＝１５．６％）；および独立した染色ランにわたって５．１％（最小＝０．１２％；最大＝２９．７％）であった。これらの％ＣＶは、ＥＬＩＳＡなどのインビトロイムノアッセイのもの（Ｂｕｔｌｅｒら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ．（２０００）２１：１６５−２０９）と競合する。
【０１２１】
陽性／陰性コンコーダンス
臨床検査室でのＨＥＲ２検査について重要なパラメータは、患者を陽性または陰性として再現性よく分類できることである。陽性／陰性分類２２についての代用マーカーとして生存率を用いることにより、計器１、オペレータ１および染色ラン１について生成された正規化されたＨＥＲ２  ＡＱＵＡ（登録商標）スコアについて、Ｘ−ｔｉｌｅ  １９を用いて最適なＡＱＵＡ（登録商標）スコア・カットポイントを確立した。図５Ａは、計器１についての陽性／陰性ＨＥＲ２分類のカプラン−マイヤー生存分析を示すものである。「材料および方法」において説明したように、カットポイントを、モンテカルロ・シミュレーション（Ｐ＜０．００１）および訓練／検証サブセット（Ｐ＝０．００２）による有意性で検証した。この検証カットポイントを、計器２および計器３で生成されたＡＱＵＡ（登録商標）スコアに適用し、有意性はそれぞれＰ＜０．００１およびＰ＝０．００４であった（図５Ｂおよび５Ｃ）。同様の再現性が独立したオペレータおよび染色ラン獲得にわたって観察され、Ｐ値はすべて≦０．０１であった（データ示さず）。
【０１２２】
現行のＡＳＣＯ−ＣＡＰガイドラインは、現行のＨＥＲ２アッセイ方法論について９５％陽性／陰性コンコーダンスが検査室で達成されることを示唆している（Ｗｏｌｆｆ  ＡＣら，Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ．（２００７）１３１：１８）。最近の研究は、ＨＥＲ２  ＩＨＣに基づくスコアリングについて、観察者間のコンコーダンスが５４〜８５％にわたり、これらのガイダンスを下回ることを示している（Ｈａｍｅｅｄら；出版準備中；直接連絡）。正規化されたＡＱＵＡ（登録商標）スコアリングについての計器、オペレータおよび染色日にわたっての陽性／陰性コンコーダンスを、上で確立したカットポイントを用いて調査した。図６に示すように、総合コンコーダンスは、９４．５％（計器１対計器３；図６Ｂ）から９９．３％（オペレータ１対オペレータ２；図６Ｃ）にわたった。これらの解析は、不確かと考えられるものを含めて、すべてのケースを含む。
【０１２３】
正規化されたＡＱＵＡ（登録商標）スコアの分布のどこで差別的分類が発生したかを評価するために、パネル型頻度ヒストグラムを生成して、差別的に分類されるケースがどこで発生したかを調査した。図７に示すように、計器対計器、オペレータ対オペレータおよびラン対ランについて、差別的に分類されたケースがカットポイントでは発生するが、分布全体にわたっては発生しない。これらのデータは、分類誤差がカットポイント選択に関係し、正規化されたＨＥＲ２  ＡＱＵＡ（登録商標）スコアの生成および再現性には関係しないことを示唆している。考え合わせると、これらのデータは、ＡＱＵＡ（登録商標）スコアリングを用いるＨＥＲ２発現の計器間、オペレータ間、およびラン間についての患者の分類には非常に再現性があり、コンコーダンス率は、ＡＳＣＯ／ＣＡＰによって示唆されるものに、超えない場合には、ほぼ等しい。
【０１２４】
（実施例２）
ＥＧＦＲのＡＱＵＡ（登録商標）解析：解析性能データ
本発明の方法を、乳癌組織切片におけるバイオマーカーＥＧＦＲの評価に適用した。図８Ａに示すように、７４８検体のＴＭＡコホートを、４．３％の平均％ＣＶで三計器、３オペレータ、および３回の別個の染色ランにわたって正規化されたＡＱＵＡ（登録商標）解析によりＨＥＲ２発現について解析した。ＥＧＦＲ  ＰｈａｒｍＤｘ（Ｄａｋｏ）で予備的解析性能評価を行った。図８Ｂ〜Ｄが明示するように、乳房腫瘍および細胞株（ｎ＝１５２）から成るＴＭＡに関する３枚のスライドガラスおよび３染色日にわたってのＥＧＦＲ発現のＡＱＵＡ（登録商標）解析は、１．０００４７の平均傾き、０．９５の平均ピアソンＲ、腫瘍組織について３．３％の平均％ＣＶ、および細胞株について４．７％の平均％ＣＶで、高いスライド対スライドおよび日対日精度を示す。考え合わせると、これらのデータは、ＡＱＵＡ（登録商標）解析が、高い精度を有するＥＧＦＲアッセイを可能にすること、ならびに計器およびソフトウェア対照と併用して、頑強な臨床バイオマーカーアッセイの開発が可能であることを明示している。
【０１２５】
（実施例３）
ＥＲ発現のＡＱＵＡ（登録商標）解析：再現性
別のバイオマーカーでＡＱＵＡｎａｌｙｓｉｓ（商標）の再現性を立証するために、（Ａｌｌｒｅｄスコアリングによって判定して）エストロゲン受容体（ＥＲ）発現の範囲を表す４つの乳癌組織ブロックを得た。その後、これらの組織ブロック切片を使ってＨ＆Ｅスライドガラスを作製し、認定病理専門医が後のすべての解析のための腫瘍エリアに丸をつけた。同じ病理専門医が、切片の一連のセットをモノクローナルマウス抗ヒトエストロゲン受容体α、クローン１Ｄ５抗体でＤＡＢ染色し、Ａｌｌｒｅｄスコアリングについて評価した。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈａｒｖｅｙ  ＪＭら，（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２：１４７４を参照のこと。
【０１２６】
その後、上で説明した免疫蛍光染色プロトコルを用いて連続切片を染色した。ＨｉｓｔｏＲｘ  ＰＭ−２０００（商標）顕微鏡プラットフォームで画像を収集し、その後、スコアリングのためにＡＱＵＡｎａｌｙｓｉｓ（商標）に送った。すべてのスコアをｌｏｇ２スケールで変換した。
【０１２７】
４枚のスライドガラスについての画像ファイルを獲得し、その後、同じオペレータがＡＱＵＡｎａｌｙｓｉｓ（商標）ソフトウェアパッケージにｎ＝１０回通して、総合的ソフトウェア再現性を立証した。すべてのファイルについて、％ＣＶは、本質的に０（１Ｅ−７未満）であった。
【０１２８】
その後、同じ４つ画像ファイルをソフトウェア操作指示書と共に３人の異なるオペレータに与えた。ここで、オペレータは、一般的な使用を反映する、専門家画質審査について略述した方法で、画像を編集した。表１に示す結果は、スコアリングした画像の数に３０％より大きな変動性があっても（スライドガラス＃３および＃４の場合）、全スコアにおける％ＣＶは、依然として１％未満のオーダーであることを明示している。
【表１】
0005551702.tif 000009
【０１２９】
独立した現場での性能、および画像獲得のために代替ハードウェアシステムを使用したときの性能を立証するために、（オペレータズマニュアルに記載されている）必要なハードウェア仕様を満たす３つの異なるプラットフォームでＡＱＵＡｎａｌｙｓｉｓ（商標）ソフトウェアを評価した。それらのシステムを下の表２において説明する。
【表２】
0005551702.tif 000010
【０１３０】
列挙したすべてのプラットフォームに関して自動画像獲得が求められないまたは必ずしも利用できなので、均一な検査を保証するために、組織の同じ領域をそれぞれのシステムでサンプリングすることが重要であった。これを果たすために、前の再現性検査において説明した同じ４つのサンプルから、（合計２０スポットのために）それら４ブロックそれぞれからの５つのコアを用いて、ＴＭＡを構築した。その後、このマイクロアレイを免疫蛍光染色し、３つの別個のハードウェアシステムで同じ単一ＴＭＡを順次獲得した。ソフトウェア操作に関する訓練を受けた後、オペレータが、インストールされたハードウェアシステムの検査室において画像を獲得した。すべての外部検査について盲検様式で結果を維持した。下の表３に結果を与える。
【表３】
0005551702.tif 000011
【０１３１】
それぞれの「サンプル」は、（ある範囲のＡｌｌｒｅｄスコアを有する）前の検査で使用した関連全組織切片サンプルから中心を切り取った５倍過剰ＴＭＡスポットからのスコアの平均を指す。
【０１３２】
全体的に見て、平均ＡＱＵＡ（登録商標）スコア値の％ＣＶ値は、４〜６．５％の範囲内であり、ＥＲ発現の範囲にわたって有意に変動しない。単一の現場での単一のサンプル内で観察された％ＣＶ変動は、サンプル内のマーカー不均一性を示す結果であり、測定誤差ではない。ＡＮＯＶＡ分析は、予想通りサンプルスコア間に有意な変動（ｐ＜０．００１）があるが、現場間には有意差がない（ｐ＝０．５８）ことを示した。
【０１３３】
（実施例４）
ＥＲ発現のＡＱＵＡ（登録商標）解析：Ａｌｌｒｅｄスコアリングとの相関
ＡＱＵＡ（登録商標）スコアの有用性を立証するために、免疫蛍光染色し、その後、ＡＱＵＡｎａｌｙｓｉｓ（商標）を用いてスコアリングした乳房組織と、発色染色し、その後、Ａｌｌｒｅｄ法を用いてスコアリングした乳房組織との関係を調査する比較研究を行った。実施例１において論じたように、１９６１年と１９８３年の間に採集されたＹａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ組織アーカイブからのサンプルから成る患者６６９人の組織マイクロアレイコホートを、Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙから得た。
【０１３４】
マウスモノクローナル１Ｄ５抗体を使用して２つの連続切片を染色した。一方の切片は、ＤＡＢを使用して染色し、他方は、上で説明した免疫蛍光法を用いて染色した。その後、ＤＡＢ染色スライドガラスを、Ａｌｌｒｅｄスコアリングのために、３人の認定病理専門医に与えた。それぞれの病理専門医に他者の結果（および蛍光染色結果）を隠し、スコアリングする組織の性質およびバイオマーカー（ＥＲ）以外にさらなる情報を与えなかった。並行して、ＴＭＡの蛍光染色連続切片をＡＱＵＡｎａｌｙｓｉｓ（商標）ソフトウェアによってランし、ＡＱＵＡ（登録商標）スコアを生成した。下で明らかにする（図９Ａ〜Ｃ）ようにすべての病理専門医についてのＡｌｌｒｅｄスコアリングとＡＱＵＡ（登録商標）スコアリング間に明確な傾向があった。すべての病理専門医についてＡｌｌｒｅｄスコアリングおよびＡＱＵＡ（登録商標）スコアリングは、ノンパラメトリック相関解析（スペルマンのＲｈｏ、図９Ｄ）により、高相関的であった（ｐ＜０．００１）。多項ロジスティック回帰分析は、すべての病理専門医についてＡｌｌｒｅｄスコアリングとＡＱＵＡ（登録商標）スコアリング間の有意な（ｐ＜０．００１）および直接的な（擬似Ｒ２）関係を明示した（図９参照）。
【０１３５】
病理専門医によって提供された個々のスコアに変動はあったが、一般的な慣例として、カットポイントをそれらのデータに適用した。Ａｌｌｒｅｄスコアリング法については、３のカットポイントを用いたので、スコア＜３（０または２）を陰性とみなし、スコア≧３を陽性と見なした。例えば、Ｈａｖｅｙらの上記文献を参照のこと。このカットポイントを、手作業でスコアリングした病理専門医のデータセットそれぞれについての個々の結果に適用し、コンセンサススコアを生成した。少なくとも１人の病理専門医がスコアを提供できなかったサンプルは、そのコンセンサスから削除した。スコアが一致しなかった場合、多数決スコアを用いた。この結果として、病理専門医は５２３ケースに関してそのときの陽性／陰性分類９１％について普遍的一致を実証することが観察された。
【０１３６】
ＡＱＵＡ（登録商標）スコアデータについてのカットポイントを決定するために、市販のソフトウェアプログラム、ＳＰＳＳ（イリノイ州シカゴのＳＰＳＳ，Ｉｎｃ．）を使用して、対数尤度距離に基づく非監視式ベイジアン（Ｂａｙｅｓｉａｎ）クラスタリングアルゴリズムを適用した。このアルゴリズムのために、ＡＱＵＡ（登録商標）スコアのクラスターメンバーシップに基づいて患者を分類した。このクラスタリングを行ったとき、データの中で４つのクラスターが顕在化した（図１０Ａ参照）。Ａｌｌｒｅｄスコアリングに類似して、生存率を用いて、発現群間の陽性および陰性分類を決定した。図１０Ｂに示すように、３つ（クラスター２〜４）は、改善された生存率を示すが、クラスター１は、生存率減少を示す。従って、クラスター１における患者をＥＲ陰性とみなし、他のすべてをＥＲ陽性とみなした。
【０１３７】
ＡＱＵＡ（登録商標）データについて決定した陽性／陰性分類を用いて、ＡＱＵＡｎａｌｙｓｉｓ（商標）ソフトウェアの結果と手動Ａｌｌｒｅｄスコアリングから得たスコアリングコンセンサスとを比較するためのコンコーダンスマトリックスを生成した。結果は、下の表４に示すように、９６．０％の陽性一致パーセントおよび９２．５％の陰性一致パーセントで、方法間の総合コンコーダンスが９４．９％であることを示している。
【表４】
0005551702.tif 000012
【０１３８】
ＥＲ  ＡＱＵＡ（登録商標）スコアの陽性／陰性分類の確認として、図１１に示すように、ＡｌｌｒｅｄスコアリングとＡＱＵＡ（登録商標）スコアリング間で総合生存率を比較した。両方の方法が、有意な５年疾病特異的生存率を予測し、陽性／陰性分類について類似した累積生存率を示す。
【０１３９】
（実施例５）
ＡＱＵＡ（登録商標）スコアリングおよびＡｌｌｒｅｄスコアリングの再現性
実施例３および４において説明した単一ＴＭＡスライドガラスを、以前に説明されているような従来の発色免疫組織化学技術を用いてＥＲ発現について染色し、３人の病理専門医が光学顕微鏡を使用してそれらを独立して評価し、Ａｌｌｒｅｄ法によってスコアリングした（図１２Ａ）。第二の連続切片、ＴＭＡスライドガラスを、ＥＲ発現のＡＱＵＡ（登録商標）解析（蛍光免疫組織化学）のために染色し、同スライドガラスを３つの独立した計器でＡＱＵＡ（登録商標）解析により解析した（図１２Ｂ）。散布図として示すそれぞれの病理専門医により得られた結果の、他の病理専門医により得られた結果に対する考察（図１２Ａ）は、総合コンコーダンスが高いことを示す一方で、ある病理専門医より陽性とみなされるが別の病理専門医により陰性みなされるサンプルがあることも示す。これらの患者は、どの病理専門医が彼らのＥＲ結果を読むかによって、異なる治療（ホルモン療法）を受ける。
【０１４０】
Ａｌｌｒｅｄスコアの幅全体にわたるカッパ値（０から１にわたる、表５）は、それぞれの病理専門医の手動スコアリング決定に多大な相違があることを示している。
【表５】
0005551702.tif 000013
【０１４１】
ＰＭ２０００計器のそれぞれの組み合わせについて得られる結果の総合的な回帰分析を図１２Ｂに示す。強く対応する（回帰線の傾きに類似した、回帰係数は、すべて〜１．０である）、極めて高い相関関係（すべての場合、Ｒ２＞０．９９、表６）がある。さらに、データセットのＡＮＯＶＡ解析はｐ＞０．０５を生じさせ、これは、それらのデータセットが統計学的に区別できないことを示す。図１２Ａと比較して、ＡＱＵＡ解析によって得られた結果は、１．３５％の平均ＣＶで非常に再現性がある。従って、本発明の方法は、サンプルを解析する計器（および従って現場）にかかわらず、一貫した結果に備えるものである。
【表６】
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【０１４２】
本実施例は、説明のみを目的として提供するものであり、本発明の範囲を限定するために用いるべきではない。本発明の多くの他の実施形態は、本開示の内容および技術にかんがみて、通常の当業者には明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図１２】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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