(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
５５歳を超える患者における肺炎の予防のための医薬の製造における、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）タンパク質抗原とともにニューモコッカル多糖−担体タンパク質コンジュゲートを含むワクチンの使用であって、該ストレプトコッカス・ニューモニエタンパク質抗原はニューモリジン（pneumolysin）であり、該ワクチンは、アジュバント化されており、該担体タンパク質は、ジフテリア毒素（Diphtheria toxid）、破傷風毒素（Tetanus toxid）、ＣＲＭ１９７、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（Keyhole Limpet Haemocyanin (ＫＬＨ)）、ツベルクリン（Tuberculin）のタンパク質誘導体（ＰＰＤ）、及びＨ．インフルエンザ（H. influenzae）由来のプロテインＤから成る群から選ばれる、前記使用。
【請求項２】
前記ワクチンは、異なる血清型からの少なくとも４つのニューモコッカル（pneumococcal）多糖抗原を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ワクチンは、アジュバントをさらに含む、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記アジュバントは、アルミニウム塩を含む、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記アジュバントは、ＴＨ１応答の優先的誘導物質である、請求項３に記載の使用。
【請求項６】
前記アジュバントは、３Ｄ−ＭＰＬ、サポニン免疫刺激剤、又は免疫刺激性ＣｐＧオリゴヌクレオチドの内の少なくとも１を含む、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記アジュバントは、油／水エマルジョン、リポソーム、及びアルミニウム塩を含む群から選ばれる担体を含む、請求項５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
産業上の利用分野
本発明は、細菌多糖抗原ワクチン、それらの製造および医療におけるこのような多糖の使用に関する。
【０００２】
特に本発明は、以下の３つの相互関連局面に関する：Ａ−肺炎球菌多糖抗原、典型的には肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）からのタンパク質抗原および任意にＴｈ１誘導性アジュバントを用いて処方された肺炎球菌多糖複合体抗原を含むワクチン；Ｂ−Ｔｈ１アジュバントで活性調節された特異的有益肺炎球菌多糖複合体；ならびにＣ−概してインフルエンザ菌からのプロテインＤと連結された細菌多糖複合体。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
肺炎連鎖球菌は、少なからぬ罹患率および死亡率（特に若年および老齢者における）に関与するグラム陽性細菌であって、侵襲性疾患、例えば肺炎、菌血症および髄膜炎、ならびに集落形成に関連した疾患、例えば急性中耳炎を引き起こす。60歳より上の人々に関する米国での肺炎球菌性肺炎率は、100,000人に3〜8人であると見積もられる。症例の20％において、これは菌血症およびその他の症状発現、例えば髄膜炎を引き起こし、死亡率は、抗生物質治療を用いた場合でも30％近くである。
【０００４】
肺炎球菌は、血清型特異性を付与する化学的結合多糖に被包されている。肺炎球菌の90の既知の血清型が存在し、莢膜は、補体から細菌の内面を防御するだけでなく、それ自体免疫原性に乏しいので、肺炎球菌に関する素因ビルレンス決定基である。多糖はＴ非依存性抗原であり、Ｔ細胞と相互作用するためにＭＨＣ分子上で処理加工または提示され得ない。しかしながら、それらは、Ｂ細胞上の表面受容体の架橋を包含する代替的メカニズムにより免疫系を刺激し得る。
【０００５】
侵襲性肺炎球菌性疾患は莢膜に特異的な抗体と最も強く相関し、防御は血清型特異的である、ということがいくつかの実験で示された。
【０００６】
多糖抗原ベースのワクチンは、当業界で周知である。ヒト使用に関して登録されている４つとしては、腸チフス菌のＶｉ多糖、インフルエンザ菌からのＰＲＰ多糖、血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹから成る四価髄膜炎菌ワクチン、ならびに血清型１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３に対応する多糖から成る23価肺炎球菌ワクチン（肺炎球菌血液単離物の少なくとも９０％を占める）が挙げられる。
【０００７】
後者３つのワクチンは、呼吸器感染を引き起こして乳児における重度罹患率および死亡率を生じる細菌に対する防御を付与するが、これらのワクチンは２歳未満の小児における使用に関しては、この年齢群では免疫原性が不十分であるために、未だ認可されていない［Peltola et al.（1984）, N. Engl. J. Med. 310:1561-1566］。肺炎連鎖球菌は、乳児および幼児における侵襲性細菌性疾患および中耳炎の最も一般的な原因である。同様に、老齢者は肺炎球菌ワクチンに対して不十分な応答を増し［Roghmann et al.（1987）, J. Gerontol.42:265-270］、それゆえこの集団における細菌性肺炎の発生数が増大する［Verghese and Berk, （1983）Medicine（Baltimore）62:271-285］。
【０００８】
乳児における免疫原性のこの欠如を克服するよう意図された戦略としては、大型免疫原性タンパク質との多糖の連結が挙げられるが、これは、バイスタンダーＴ細胞援助を提供し、それが連結される多糖抗原に対する免疫記憶を誘導する。肺炎球菌糖タンパク質複合体ワクチンは、種々の年齢群における安全性、免疫原性および効能に関して一般に評価されつつある。
【０００９】
Ａ）肺炎球菌多糖ワクチン
23価非複合肺炎球菌ワクチンは、0％から81％までの臨床的効能の広範な変異を示している（Fedson et al.（1994）Arch Intern Med. 154:2531-2535）。効能は、免疫感作されつつある危険群、例えば老齢者、ホジキン病、脾摘出、鎌状赤血球症および無γグロブリン血症患者に（Fine et al.（1994）Arch Intern Med. 154:2666-2677）、そして疾患発現にも関連していると思われる。23価ワクチンは、肺炎球菌性肺炎（いくつかの高危険群、例えば老齢者において）および中耳炎に対する防御を実証しない。
【００１０】
したがって、改良型肺炎球菌ワクチン組成物、特に老齢者および幼児における肺炎球菌性疾患（特に肺炎）の予防または改善により有効であるものが必要とされている。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、このような改良型ワクチンを提供する。
【００１２】
Ｂ）選定肺炎球菌多糖複合体＋３Ｄ−ＭＰＬ組成物
商業化非複合肺炎球菌ワクチンの防御効力がワクチン接種時に誘導される抗体の濃度に多少関連するということは、一般に容認される。実際、23の多糖が、専ら各構成成分多糖の免疫原性に関して商業的許可を容認された（Ed. Williams et al. New York Academy of Sciences 1995 pp. 241-249）。したがって、肺炎球菌多糖に対する抗体応答のさらなる強化は、多糖または多糖複合体の初回注射に対する防御レベルの抗体を有して応答する乳児および老齢者のパーセンテージを増大し得たし、肺炎連鎖球菌により引き起こされる感染に対する防御免疫を誘導するのに必要な注射の投与量および回数を低減し得た。
【００１３】
20世紀初頭以来、研究者達は、ワクチン組成物におけるそれらの免疫原性を改善するために抗原に付加され得る厖大な数の化合物を用いて実験してきた［M.F. Powell & M.J. Newman, Plenum Press, NY, "Vaccine Design-the Subunit and Adjuvant Approach"（1995）Chapter 7"A Compendium of Vaccine Ajuvants and Excipients"で再検討された］。多くは非常に効率的であるが、しかしヒトワクチン組成物におけるそれらの使用を妨げる有意の局所性および全身性悪反応を引き起こす。1926年に最初に記載されたアルミニウムベースのアジュバント（例えばアルム、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム）は、依然として米国で認可されたヒトワクチン中に用いられる唯一の免疫アジュバントである。
【００１４】
アルミニウムベースのアジュバントは、それが誘導する「デポー製剤作用」を介して働く担体類のアジュバントの例である。抗原はその表面に吸着され、組成物が注入された場合、アジュバントおよび抗原は血流中に直ちに消散されない。その代わりに、組成物は注入の局所環境中に存続し、より顕著な免疫応答が結果として生じる。このような担体アジュバントは、例えばいくつかの多糖抗原を分解する傾向がある抗原を安定化するのに適しているという付加的な既知の利点を有する。
【００１５】
３Ｄ−ＭＰＬは、非担体アジュバントの一例である。そのフルネームは３−Ｏ−デアシル化モノホスホリル脂質Ａ（または３デ−Ｏ−アシル化ものホスホリル脂質Ａまたは３−Ｏ−デスアシル−４’モノホスホリル脂質Ａ）であり、還元末端グルコサミンの位置３がデ−Ｏ−アシル化されることを示すために３Ｄ−ＭＰＬと呼ばれる。その調製のためには、英国特許出願第2220211号を参照されたい。化学的には、それは３−デアシル化モノホスホリル脂質Ａの４、５または６アシル化鎖との混合物である。それは最初は、脂質Ａの４’−モノホスホリル誘導体（ＭＰＬ）を３−Ｏ−デアシル化するための方法が、免疫刺激活性の変化を伴わずにさらなる弱毒化毒性を有する分子をもたらした1990年代初頭に製造された。
【００１６】
３Ｄ−ＭＰＬは、単独で、または優先的にはデポー製剤型担体アジュバント、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは水中油型エマルションと組合せて、アジュバントとして用いられてきた。この溶暗組成物中では、抗原および３Ｄ−ＭＰＬは同一粒子構造中に含入されて、抗原性および免疫刺激性シグナルのより効率的送達を可能にする。複数の研究が、３Ｄ−ＭＰＬはアルム吸着化抗原の免疫原性をさらに増強し得る、ということを示している［Thoelen et al. Vaccine（1998）16:708-14; EP 689454-B1］。このような組合せも、吸着傾向がある抗原に関しては当業界で選択される（例えば、細菌多糖複合体）が、この場合、アルムへの吸着は、抗原を安定化する傾向がある。沈降アルミニウムベースのアジュバントは、それらは認可ヒトワクチンに一般に用いられる唯一のアジュバントであるので、主として用いられる。したがって、アルミニウムベースのアジュバントと組合せて３Ｄ−ＭＰＬを含有するワクチンは、それらの易開発性およびマーカー上への導入速度のために、当業界で好まれる。
【００１７】
ＭＰＬ（非３−デアシル化）は、いくつかの一価多糖複合体ワクチン抗原に関するアジュバントとして評価されてきた。生理食塩水中のＭＰＬの同時注入は、４つの一価多糖複合体：肺炎球菌ＰＳ６Ｂ破傷風毒素、肺炎球菌ＰＳ  １２−ジフテリア毒素、ならびに緑膿菌外毒素Ａに連結された５型黄色ブドウ球菌および８型黄色ブドウ球菌に対する血清抗体応答を増強する［Schneerson et al. J. Immunology（1991）147:2136-2140］。応答増強は、抗原特異的であると教示された。水中油型エマルション中のＭＰＬ（担体型アジュバント）は、同一粒子構造中のＭＰＬおよび抗原の存在のために、生理食塩水中のＭＰＬの作用を一貫して増強し、そして他の多糖複合体ワクチンの最適供給のために選択さるべきアジュバント系であると考えられた。
【００１８】
Devi等［Infect. Immun.（1991）59:3700-7］は、クリプトコックス属のCryptococcus neoformans莢膜多糖のＴＴ複合体に対するネズミ抗体応答に及ぼす生理食塩水中のＭＰＬ（非３−デアシル化）のアジュバント作用を評価した。ＭＰＬが複合体と同時に用いられた場合、ＰＳに対するＩｇＭ−およびＩｇＧ−特異的応答の両方において限界増大のみが認められた。しかしながら、ＭＰＬは、複合体の２日後に投与された場合、非常に大きい効果を示した。特に乳児において、抗原と比較してＭＰＬの投与の遅延をようする免疫感作計画を用いることの実用性は疑問である。多糖および多糖−タンパク質複合体に関するＭＰＬのアジュバント効果は、組成物依存性であると思われる。さらに、適切な徐放性送達系（例えば、担体アジュバント使用）中のＭＰＬの混入は、より永続的なアジュバント効果を提供し、調時および遅延投与の問題を免れる。
【００１９】
要するに、当業界の状態は、特に多糖または多糖複合体抗原に関しては、ＭＰＬまたは３Ｄ−ＭＰＬがアジュバントとして用いられる場合、その免疫刺激作用を最大にするために、それは、担体アジュバント（例えば、アルミニウムベースのアジュバント）とともに有益に用いられる、ということを教示している。
【００２０】
意外なことに、ある種の肺炎球菌多糖複合体に関しては、ワクチン組成物の免疫原性は、担体アジュバント（例えばアルミニウムベースのアジュバント）とともに用いられる３Ｄ−ＭＰＬよりむしろ３Ｄ−ＭＰＬ単独を用いて抗原が処方される場合に有意に大きい、ということを本発明は見出した。さらに、観察された改善は、用いた３Ｄ−ＭＰＬの濃度とは、そして特定の複合体が一価組成物中に存在するか否か、あるいはそれらが併用されて多価組成物を形成するか否かとは無関係である。
【００２１】
Ｃ）細菌多糖−プロテインＤ複合体
前記のように、多糖抗原ベースのワクチンは、当業界で周知である。前記の認可多糖ワクチンは、異なる実証済み臨床効能を有する。Ｖｉ多糖ワクチンは、培養確証腸チフスの防止に際して55％〜77％の効能を有すると概算されている（Plotkin and Cam,（1995）Arch Intern Med 155:2293-99）。髄膜炎菌Ｃ多糖ワクチンは、流行条件下で79％の効能を有することが示された（De Wals P, et al.（1996）Bull World Health Organ. 74:407-411）。23価肺炎球菌ワクチンは、0％〜81％の臨床効能の広範な変動を示した（Fedson et al.（1994）Arch Intern Med.154:2531-2535）。前記のように、肺炎球菌ワクチンの防御効能は、ワクチン接種時に誘導される抗体の濃度に多少関連する、ということが容認される。
【００２２】
ワクチン接種への多糖アプローチに関連した問題の１つは、多糖それ自体が貧免疫原性であるという事実である。免疫原性のこの欠如を克服するよう意図された戦略としては、大型高免疫原性タンパク質との多糖の連結が挙げられるが、これは、バイスタンダーＴ細胞援助を提供する。
【００２３】
多糖免疫原の産生のために今日一般に用いられるこれらの高免疫原性担体の例としては、ジフテリア毒素（ＣＴまたはＣＲＭ１９７突然変異体）、破傷風毒素（ＴＴ）、カギアナカサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）およびツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）が挙げられる。
【００２４】
一般的に用いられる担体に関連した問題
多数の問題が、例えばＧＭＰ複合体の産生におけるならびに複合体の免疫学的特徴における、これらの一般的に用いられる担体の各々に関連している。
【００２５】
これらの担体の一般的使用および抗多糖抗体応答の誘導におけるそれらの成功例にもかかわらず、それらはいくつかの欠点に関連する。例えば、抗原特異的免疫応答は、担体（この場合、破傷風毒素）に対して向けられる先在する抗体の存在により抑制され得る（エピトープ抑制）ということが知られている（Di John et al;（1989）Lancet, 2:1415-8）。集団全般では、人々はこれらの抗原でルーチンにワクチン接種されるので、非常に高パーセンテージの人々がＤＴおよびＴＴの両方に対する先在免疫を有する。英国では、例えば95％の小児がＤＴおよびＴＴの両方を含むＤＴＰワクチンを接種されている。他の著者等は、動物モデルにおけるペプチドワクチンに対するエピトープ抑制の問題を記載している（Sad et al, Immunology, 1991; 74:223-227; Schutze et al, J. Immunol. 135:4, 1985; 2319-2322）。
【００２６】
さらに、定期的追加免疫を要するワクチンに関しては、高免疫原性担体、例えばＴＴおよびＤＴの使用は、数回注射後の多糖抗体応答を抑制すると思われる。これらの多数回予防接種は、遅延型過応答性（ＤＴＨ）のような望ましくない反応によっても成し遂げられ得る。
【００２７】
ＫＬＨは、効力のある免疫原として既知であり、ヒト臨床試験におけるＩｇＥペプチドのための担体としてすでに用いられている。しかしながら、いくつかの悪反応（ＤＴＨ様反応またはＩｇＥ感作）ならびに抗体に対する抗体応答が観察されている。
【００２８】
したがって、多糖ベースのワクチンのための担体タンパク質の選択は、すべての患者において作用する（広範なＭＨＣ認識）担体に対する必要性、高レベルの抗多糖抗体応答の誘導および担体に対する低抗体応答の間の平衡を必要とする。
【００２９】
したがって、多糖ベースのワクチンのために予め用いられる担体は、多数の欠点を有する。これは、種々の多糖抗原に関して同一担体が用いられる場合に、エピトープ抑制が特に問題となる組合せワクチンにおいて特にそうである。WO 98/51339では、組合せワクチン中の多担体は、この作用を乗り越えようとするために用いられた。
【００３０】
本発明は、前記の欠点を蒙らない多糖／多ペプチドベースの免疫原性複合体の調製に際して用いるための新規の担体を提供する。
【００３１】
本発明は、ワクチンを含めた多糖ベースの免疫原性組成物のための担体として、インフルエンザ菌からのプロテインＤ（EP 0 594 610 B1）またはその断片を提供する。この担体の使用は、組合せワクチンにおいて特に有益である。
【００３２】
発明の要約
Ａ）肺炎球菌多糖ワクチン
したがって、本発明は、少なくとも１つの肺炎連鎖球菌多糖抗原（好ましくは複合化）および肺炎連鎖球菌タンパク質抗原またはその免疫学的機能等価物を、任意にＴｈ１アジュバント（Ｔｈ１免疫応答を誘導するアジュバント）とともに含むワクチンを提供する。好ましくは、肺炎球菌タンパク質およびＴｈ１アジュバントがともに含まれる。本発明の組成物は、老齢者肺炎の治療に特に適している。
【００３３】
肺炎球菌多糖ワクチン（複合化または非複合化）は、この疾患の発生数が非常に高い老齢者集団における肺炎に対して防御し得ない。肺炎球菌に対する重要な防衛メカニズムはオプソニン食菌作用（肺炎球菌多糖に対する抗体の産生により引き起こされるヒトＢ細胞／好中球媒介性事象。細菌は最終的には食菌されるようになる）であるが、しかしながら、関与するオプソニン性メカニズムの一部、即ちＰＭＮ（多形核球）によるスーパーオキシド産生、その他の反応性酸素種産生、ＰＭＮの可動化、ＰＭＮのアポトーシス、ＰＭＮの変形能が、老齢者では損傷される。
【００３４】
普通に容認された教義と反対に、正常レベルの抗莢膜多糖抗体は、肺炎球菌が宿主細胞に侵襲して免疫系のこの部門を回避し得るので、細菌の完全クリアランスには有効でない可能性がある。
【００３５】
意外にも、免疫系の体液性部門（Ｂ細胞媒介性免疫）の他に、免疫系の細胞媒介性部門（例えば、Ｔ細胞媒介性免疫）を同時刺激することにより、宿主からの肺炎球菌のクリアランスを増強し得る相乗作用（または協同作用）を結果として生じる、ということを本発明は見出した。これは、概して肺炎球菌感染の予防（または治療）に役立つ発見であるが、しかし多糖ベースのワクチンが効能を示さない老齢者における肺炎の予防（または治療）に特に重要である。
【００３６】
肺炎球菌多糖（好ましくは複合化）が肺炎球菌タンパク質（好ましくは肺炎球菌の表面で発現され、あるいは分泌または放出されるタンパク質で、これは感染哺乳類細胞の表面で暮らすＩＩおよびＭＨＣクラスＩの情況においてプロセッシングされ、提示され得る）とともに投与される場合、免疫系の両部門はこのように共働し得る、ということを本発明は見出した。肺炎球菌タンパク質はそれ自体で細胞媒介性免疫の引き金となり得るが、しかし、ワクチン処方物中のＴｈ１誘導性アジュバントの存在が免疫系のこの部門の役に立ち、そして意外にも、免疫系の両部門間の相乗作用をさらに増強する、ということを本発明人等は見出した。
【００３７】
Ｂ）選定肺炎球菌多糖複合体＋３Ｄ−ＭＰＬ組成物
したがって、本発明は、３Ｄ−ＭＰＬで活性調節され、実質的にアルミニウムベースのアジュバントを欠く１つ又はそれ以上の肺炎球菌多糖複合体を含む抗原性組成物も提供するが、この場合、少なくとも１つの肺炎球菌多糖複合体は、アルミニウムベースのアジュバントとともに３Ｄ−ＭＰＬを含む組成物と比較して、３Ｄ−ＭＰＬを含む組成物中で有意により免疫原性である。
【００３８】
提供される好ましい実施態様は、１つ又はそれ以上の以下の肺炎球菌莢膜多糖：血清型４、６Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆの複合体を含む抗原性組成物である。このような組成物中では、多糖は各々、意外にも、３Ｄ−ＭＰＬおよびアルミニウムベースのアジュバントを含む組成物と比較して、３Ｄ−ＭＰＬ単独を含む組成物中でより免疫原性である。
【００３９】
したがって、本発明の一実施態様においては、免疫原性タンパク質および３Ｄ−ＭＰＬアジュバントに連結された肺炎連鎖球菌莢膜多糖血清型４、６Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆまたは２３Ｆを含む抗原性組成物が提供され、この場合、組成物は実質的にはアルミニウムベースのアジュバントを欠く。
【００４０】
第二の実施態様では、本発明は、アルミニウムベースのアジュバントを実質的に欠き、そして血清型４、血清型６Ｂ、血清型１８Ｃ、血清型１９Ｆおよび血清型２３Ｆから成る群から選択される３Ｄ−ＭＰＬおよび２つまたはそれ以上の肺炎球菌多糖複合体を含む組合せ抗原性組成物を提供する。
【００４１】
Ｃ）細菌多糖−プロテインＤ複合体
したがって、本発明は、インフルエンザ菌からのプロテインＤまたはそのプロテインＤ断片に連結された病原性細菌から得られる多糖抗原を含む多糖複合体抗原を提供する。さらに、本発明は、１つ又はそれ以上の多糖抗原がプロテインＤに連結される多価ワクチン組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１Ａ】マウスにおけるニューモリジンに対する血清ＩｇＧ。
【図１Ｂ】ニューモリジンで免疫化されたマウスにおける血清溶解阻害力価。
【図１Ｃ】血清型６Ｂによる鼻内感染後６時間目におけるＯＦ１マウスにおけるニューモコッカル肺コロニー形成。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
発明の詳細な説明
Ａ）肺炎球菌多糖ワクチン
本発明は、特に老齢者（および／または乳児および幼児）の肺炎球菌感染の予防または改善のための改良型ワクチンを提供する。
【００４４】
本発明の情況では、患者は、年齢が55歳以上、典型的には60歳以上、さらに一般的には65歳以上であれば、老齢者であると考えられる。
【００４５】
したがって、本発明の一実施態様では、少なくとも１つの肺炎連鎖球菌多糖抗原および少なくとも１つの肺炎連鎖球菌タンパク質抗原を含む、老齢者（および／または小児、乳児（Infants）および幼児）において用いるのに適したワクチン組成物が提供される。
【００４６】
第二の好ましい実施態様では、本発明は、少なくとも１つの肺炎連鎖球菌多糖抗原および少なくとも１つの肺炎連鎖球菌タンパク質抗原およびＴｈ１アジュバントを含む（老齢者における肺炎の予防に適した）ワクチンを提供する。
【００４７】
このようなワクチンは、例えば乳児または幼児のような集団の他の高度危険群における肺炎球菌感染（例えば中耳炎）を治療するのにも有用であることが意図される。
【００４８】
第三の実施態様では、肺炎球菌多糖抗原およびＴｈ１アジュバントを含むワクチン組成物が提供される。
【００４９】
本発明の肺炎連鎖球菌多糖抗原
典型的には、本発明の肺炎連鎖球菌ワクチンは、多糖抗原（好ましくは複合化）を含み、この場合、多糖は少なくとも４つの血清型の肺炎球菌から得られる。好ましくは、４つの血清型としては、６Ｂ、１４、１９Ｆおよび２３Ｆが挙げられる。さらに好ましくは少なくとも７つの血清型、例えば４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆから得られるものが組成物中に含まれる。さらに好ましくは、少なくとも１１の血清型が組成物に含まれ、例えば一実施態様における組成物は、血清型１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆから得られる莢膜多糖（好ましくは複合化（conjugated））を含む。本発明の好ましい実施態様では、少なくとも１３の多糖抗原（好ましくは複合化）が含まれるが、しかしさらなる多糖抗原、例えば23価（例えば血清型１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ）も本発明により意図される。
【００５０】
老齢者予防接種（例えば、肺炎予防のための）に関しては、血清型８および１２Ｆ（そして最も好ましくはさらに１５および２２）を前記の11価抗原性組成物に含入して、15価ワクチンを生成するのが有益であるが、一方、乳児または幼児用（中耳炎がより問題である）には、血清型６Ａおよび１９Ａが含入されて、13価ワクチンを生成するのが有益である。
【００５１】
老齢者（＋55歳）集団における肺炎ならびに乳児（18ヶ月まで）および幼児（典型的には18ヶ月〜5歳）における中耳炎の予防／改善のためには、本明細書に記載したような多価肺炎連鎖球菌多糖を肺炎連鎖球菌タンパク質またはその免疫学的機能等価物と併用することが、本発明の好ましい実施態様である。
【００５２】
本発明の肺炎球菌タンパク質
本発明の目的のために、「免疫学的機能等価物」とは、本発明のタンパク質からの少なくとも１つの防御的エピトープを含むタンパク質のペプチドと定義される。このようなエピトープは、特徴的には、表面露呈され、高度保存され、そして宿主における殺細菌性抗体応答を引き出し、あるいは毒性作用を阻止し得る。好ましくは、機能的等価物は、本発明のタンパク質からの少なくとも15、好ましくは30またはそれ以上の連続アミノ酸を有する。最も好ましくは、タンパク質の断片、欠失、例えばその膜貫通欠失変異体（即ち、タンパク質の細胞外ドメインの使用）、融合、化学的または遺伝的脱毒素化誘導体などが用いられ得るが、但し、それらはネイティブタンパク質と同一免疫応答を実質的に生じ得る。
【００５３】
本発明の好ましいタンパク質は、肺炎球菌の外表面上に露呈される肺炎球菌タンパク質（肺炎球菌の少なくとも一部のライフサイクル中に宿主の免疫系により認識され得る）であるか、あるいは肺炎球菌により分泌または放出されるタンパク質である。最も好ましくは、タンパク質は毒素、粘着素、２−成分シグナル変換体または肺炎連鎖球菌のリポタンパク質、あるいはそれらの免疫学的機能等価物である。
【００５４】
このような組合せワクチン中に含入される特に好ましいタンパク質としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ニューモリジン（好ましくは、化学処理または突然変異により脱毒素化）［Mitchell et al. Nucleic Acids Res. 1990 Jul 11;18（3）:4010 "Comparison of pneumolysin genes and proteins from Steptococcus pneumoniae types 1 and 2.", Mitchell et al. Biochim Biophys Acta 1989 Jan 23; 1007（1）:67-72 "Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties.", WO 96/05859（A. Cyanamid）, WO 90/06951（Paton et al）, WO 99/03884（NAVA）］；ＰｓｐＡおよびその膜貫通欠失変異体（米国特許第5804193号−Briles等）；ＰｓｐＣおよびその膜貫通欠失変異体（WO 97/09994−Briles等）；ＰｓａＡおよびその膜貫通欠失変異体（Berry & Paton, Infect Immun 1996 Dec; 64（12）:5255-62 "Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae"）；肺炎球菌コリン結合タンパク質およびその膜貫通欠失変異体；ＣｂｐＡおよびその膜貫通欠失変異体（WO 97/41151; WO 99/51266）；グリセルアルデヒド−３−ホスフェート−デヒドロゲナーゼ（Infect. Immun. 1996, 64:3544）；ＨＳＰ７０（WO 96/40928）；ＰｃｐＡ（Sanchez-Beato et al. FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14）；Ｍ様タンパク質（ＳＢ特許出願EP 0837130）；および粘着素18627（ＳＢ特許出願EP 0834568）。
【００５５】
本発明に用いられるタンパク質は、好ましくは、ニューモリジン群ＰｓａＡ、ＰｓｐＡ、ＰｓｐＣ、ＣｂｐＡ、あるいは２またはそれ以上のこのようなタンパク質の組合せから選択される。本発明は、このようなタンパク質の免疫学的機能等価物も包含する（前記）。
【００５６】
組成物中では、タンパク質は、肺炎球菌性疾患に対するＴ細胞媒介性応答を誘導するのに役立ち、特に肺炎に対する防御に必要とされ、これは肺炎球菌による侵襲を阻止するために、そしてオプソニン食菌作用を刺激するために免疫系の体液性部門と協同する。
【００５７】
タンパク質抗原を含入することのさらなる利点は、オプソニン食菌作用過程のためのさらなる抗原の提示、および細菌付着の抑制（粘着素（adhesin）が用いられる場合）または毒素の中和（毒素が用いられる場合）である。
【００５８】
本発明の一実施態様によれば、少なくとも４つの血清型、好ましくは少なくとも７つの血清型、さらに好ましくは少なくとも11の血清型から得られる多糖抗原、ならびに少なくとも１つの、しかし好ましくは２つの肺炎連鎖球菌タンパク質を含む肺炎球菌多糖複合体ワクチンを包含する肺炎連鎖球菌ワクチンが提供される。好ましくは、タンパク質の１つは、ニューモリジン（Pneumolysin）あるいはＰｓａＡまたはＰｓｐＡまたはＣｂｐＡ（最も好ましくは脱毒素化ニューモリジン）である。好ましい組合せは、少なくともニューモリジンまたはその誘導体およびＰｓｐＡを含有する。
【００５９】
前記のように、予防接種への多糖アプローチに関連した問題は、多糖それ自体が貧免疫原性であるという事実である。これを克服するために、多糖は、バイスタンダーＴ細胞援助を提供するタンパク質担体に連結され得る。したがって、本発明に利用される多糖はこのようなタンパク質担体に結合されるのが好ましい。多糖免疫原の産生のために現在一般的に用いられるこのような担体の例としては、ジフテリアおよび破傷風毒素（それぞれＤＴ、ＤＴ  ＣＲＭ１９７およびＴＴ）、カギアナカサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、髄膜炎菌からのＯＭＰＣ、ならびにツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）が挙げられる。
【００６０】
しかしながら多数の問題が、これらの一般的に用いられる担体の各々に関連している（前記の「一般的に用いられる担体に関連した問題」の節参照）。
【００６１】
本発明は、好ましい実施態様において、これらの欠点を蒙らない多糖ベースの免疫原構築物の調製に際して用いるための新規の担体を提供する。肺炎球菌多糖ベースの免疫原性組成物（またはワクチン）のための好ましい担体は、インフルエンザ菌からのプロテインＤ（EP 594610-B）またはその断片である。用いるのに適した断片としては、Ｔ−ヘルパーエピトープを包含する断片が挙げられる。特に、プロテインＤ断片は、好ましくはタンパク質のＮ末端1/3を含有する。
【００６２】
肺炎球菌多糖のためのさらに好ましい担体は、肺炎球菌タンパク質それ自体である（「本発明の肺炎球菌タンパク質」の節に前記）。
【００６３】
本発明のワクチンは、好ましくは活性調節される。適切なアジュバントとしては、水酸化アルミニウムゲル（アルム）またはリン酸アルミニウムのようなアルミニウム塩が挙げられるが、しかしカルシウム、鉄または亜鉛の塩でもあり得るし、あるいはアシル化チロシンまたはアシル化糖、陽イオン的または陰イオン的誘導化多糖またはポリホスファゼンの不溶性懸濁液であり得る。
【００６４】
アジュバントは、免疫応答の細胞媒介性部門を活性調節するためにＴＨ１型の応答の優先的誘導物質であるよう選択されるのが好ましい。
【００６５】
本発明のＴＨ１アジュバント
高レベルのＴｈ１型サイトカインは、所定の抗原に対する細胞媒介性免疫応答の誘導を援助する傾向があるが、一方、高レベルのＴｈ２型サイトカインは、抗原に対する体液性免疫応答の誘導を援助する傾向がある。
【００６６】
Ｔｈ１およびＴｈ２型免疫応答の区別は絶対的であるというわけではない、ということを思い起こすことは重要である。実際は、個体は主としてＴｈ１または主としてＴｈ２であると説明される免疫応答を支持する。しかしながら、MosmannとCoffiman（Mosmann, T.R. and Coffiman, R.L.（1989）TH1 and TH2 cell: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p145-173）によりネズミＣＤ４＋ｖｅ  Ｔ細胞クローンで説明されたことに関してサイトカイン族を考えるのがしばしば便利である。伝統的に、Ｔｈ１型応答は、Ｔリンパ球によるＩＮＦ−γおよびＩＬ−２サイトカインの産生に関連する。Ｔｈ１型免疫応答の誘導にしばしば直接関連するその他のサイトカインは、ＩＬ−１２のように、Ｔ細胞により産生されない。これに対比して、Ｔｈ２型応答は、Ｉｌ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０の分泌に関連する。主要Ｔｈ１応答を促す適切なアジュバント系としては、モノホスホリル脂質Ａ、ならびにモノホスホリル脂質Ａ、好ましくは３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）とアルミニウム塩の組合せが挙げられる。
【００６７】
増強系は、モノホスホリル脂質Ａおよびサポニン誘導体の組合せ、特にWO 94/00153に開示されたようなＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬの組合せ、またはWO 96/33739に開示されているようにＱＳ２１がコレステロールで抑制される低反応原性組成物を包含する。
【００６８】
水中油型エマルション中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを包含する特に強力なアジュバント処方物は、WO 95/17210に記載されており、好ましい処方物である。
【００６９】
好ましくは、ワクチンは、サポニンを、さらに好ましくはＱＳ２１を付加的に含む。処方物は、水中油型エマルションおよびトコフェロールも含み得る（WO 95/17210）。
【００７０】
本発明は、ワクチン処方物の製造方法であって、本発明のタンパク質を製薬上許容可能な賦形剤、例えば３Ｄ−ＭＰＬと一緒に混合することを包含する方法も提供する。
【００７１】
オリゴヌクレオチドを含有する非メチル化ＣｐＧ（WO 96/02555）もＴＨ応答の選択的誘導物質であり、本発明に用いるのに適している。
【００７２】
本発明の特に好ましい組成物は、１つ又はそれ以上の複合肺炎球菌多糖、１つ又はそれ以上の肺炎球菌タンパク質およびＴｈ１アジュバントを含む。肺炎球菌タンパク質による細胞媒介性応答の誘導（前記）および免疫系の両部門の間の協同は、このようなアジュバントを用いて活性調節されて、概して肺炎球菌性疾患に対する、そして重要なのは老齢者における肺炎球菌性肺炎に対して特に有効なワクチンを生じる。
【００７３】
本発明のさらなる局面において、医療に用いるための本明細書中に記載したような免疫原またはワクチンが提供される。
【００７４】
本発明のさらに別の局面では、不応答者の集団内で多糖抗原に対する体液性抗体応答を血清変換または誘導し得る、肺炎球菌多糖複合体およびＴｈ１アジュバント（好ましくは３Ｄ−ＭＰＬ）を含む組成物が提供される。
【００７５】
集団の10〜30％は、多糖免疫感作に対する不応答者（ワクチン中の50％より多い血清型に応答しない）であることが知られている（Konradsen et al., Scand. J. Immun 40:251（1994）; Rodriguez et al., JID, 173:1347（1996））。これも、複合化ワクチンに関する症例であり得る（Musher et al. Clin. Inf. Dis. 27:1487（1998））。これは、高危険域の集団（乳児、幼児および老齢者）に関しては特に重大である。
【００７６】
複合肺炎球菌多糖（これは特定の集団において低応答傾向がある）のＴｈ１アジュバント（前記の「本発明のＴｈ１アジュバント」参照）との組合せは、意外にもこの不応答性を克服し得る、ということを本発明は見出した。好ましくは３Ｄ−ＭＰＬが用いられるべきであり、最も好ましくは３Ｄ−ＭＰＬはアルミニウムベースのアジュバントを欠く（依然として良好な応答を提供する）。したがって本発明はこのような組成物を提供し、さらにこのような組成物を投与することにより肺炎球菌多糖に対する不応答者を治療する方法を提供し、そしてその上さらに、多糖抗原に不応答性である個体における肺炎球菌性疾患に対する治療（または防御）における複合肺炎球菌多糖抗原を含む薬剤の製造に際してのＴｈ１アジュバントの使用を提供する。
【００７７】
一実施態様では、老齢者における肺炎の予防または改善方法であって、肺炎連鎖球菌多糖抗原およびＴｈ１アジュバントまたは肺炎球菌タンパク質（好ましくは両方）を含む本明細書に記載したような安全且つ有効量のワクチンを前記の老齢患者に投与することを包含する方法がある。
【００７８】
さらに別の実施態様では、乳児または幼児における中耳炎の予防または改善方法であって、肺炎連鎖球菌多糖抗原および肺炎連鎖球菌タンパク質抗原またはＴｈ１アジュバント（好ましくは両方）を含む安全且つ有効量のワクチンを前記の乳児または幼児に投与することを包含する方法が提供される。
【００７９】
好ましくは、前記のような本発明の方法においては、多糖抗原は多糖タンパク質複合体として存在する。
【００８０】
本発明のワクチン製剤
本発明のワクチン製剤は、全身または粘膜経路により前記のワクチンを投与することにより、感染に感受性の哺乳類を防御または治療するために用いられ得る。これらの投与は、筋内、腹腔内、皮内または皮下経路による、あるいは口腔／栄養管、気道、尿生殖路への粘膜性糖よによる注入を含み得る。肺炎または中耳炎の治療のためのワクチンの鼻腔内投与は好ましい（肺炎球菌の鼻咽頭運搬はより有効に予防され得るので、したがって、その最初期段階で感染を減衰し得る）。
【００８１】
各ワクチン中の複合抗原の量は、典型的ワクチンにおいて有意の副作用を伴わずに免疫防御応答を誘導する量として選択される。このような量は、どの特異的免疫原が用いられるか、そしてそれがどのように存在するかによって変わる。一般的に、各用量は、0.1〜100μg、好ましくは0.1〜50μg、好ましくは0.1〜10μgの多糖を含むと予測され、1〜5μgが最も好ましい範囲である。
【００８２】
ワクチン中のタンパク質抗原の含量は、典型的には1〜100μg、好ましくは5〜50μg、最も典型的には5〜25μgの範囲である。
【００８３】
特定のワクチンに関する構成成分の最適量は、被験者における適切な免疫応答の観察を含めた標準試験により確かめられ得る。初回予防接種後、適当な間隔で１回または数回の追加免疫感作を被験者に施し得る。
【００８４】
ワクチン製剤は、Vaccine Design（"The subunit and adjuvant approach"）（eds Powell M.F. & Newman M.J.（1995）Plenum Press New York）に一般的に記載されている。リポソーム内封入は、米国特許第4,235,877号（Fullerton）に記載されている。
【００８５】
Ｂ）選定肺炎球菌多糖複合体＋３Ｄ−ＭＰＬ組成物
本発明の目的のために、「本発明の肺炎球菌多糖複合体」という用語は、アルミニウムベースのアジュバントとともに３Ｄ−ＭＰＬを含む組成物と比較して、３Ｄ−ＭＰＬを含む組成物中でより免疫原性である肺炎連鎖球菌莢膜多糖の複合体（例えば、血清型４、血清型６Ｂ、血清型１８Ｃ、血清型１９Ｆおよび血清型２３Ｆの複合体）を記述する。
【００８６】
本発明の目的のために、「アルミニウムベースのアジュバントを実質的に欠く」という用語は、付加的アルミニウムベースのアジュバントを伴わずに３Ｄ−ＭＰＬを含む等価組成物と比較した場合の本発明の肺炎球菌多糖複合体の免疫原性の任意の低減を引き起こスクリーニング十分なアルミニウムベースのアジュバント（例えば水酸化アルミニウムおよび、特にリン酸アルミニウム）を含有しない組成物を記述する。好ましくは、抗原性組成物は、本質的に３Ｄ−ＭＰＬから成るアジュバントを含有すべきである。用量当たりで付加されるアルミニウムベースのアジュバントの量は、好ましくは50μg未満、さらに好ましくは30μg未満、さらに好ましくは10μg未満であるべきであり、最も好ましくは本発明の抗原性組成物に付加されるアルミニウムベースのアジュバントは存在しない。
【００８７】
本発明の目的のために、アルミニウムベースのアジュバントとともに３Ｄ−ＭＰＬを含む組成物と比較して、３Ｄ−ＭＰＬを含む組成物中で肺炎球菌多糖複合体が十分により免疫原性であるか否かの決定は、実施例２に記載されているように確定されるべきである。３Ｄ−ＭＰＬ単独を含む場合に組成物が有意により免疫原性であるか否かの指標として、３Ｄ−ＭＰＬ単独を含む組成物対リン酸アルミニウムアジュバントとともに３Ｄ−ＭＰＬを含む等価組成物間のＧＭＣ  ＩｇＧ濃度（実施例２で確定されるような）の比は、２より大きい、好ましくは５より大きい、さらに好ましくは７より大きい、さらに好ましくは９より大きい、最も好ましくは14より大きい値であるべきである。
【００８８】
予防接種への多糖アプローチに関連した問題の１つは、多糖それ自体が貧免疫原性であるという事実である。免疫原性のこの欠如を克服するよう意図された戦略としては、大型免疫原性タンパク質担体との多糖の結合（連結（conjugating））が挙げられるが、これは、バイスタンダーＴ細胞援助を提供する。本発明の肺炎球菌多糖がバイスタンダーＴ細胞援助を提供するタンパク質担体に結合されるのが好ましい。用いられ得るこのような担体の例としては、ジフテリア、ジフテリア突然変異体および破傷風毒素（それぞれＤＴ、ＤＴ  ＣＲＭ１９７およびＴＴ）、カギアナカサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）ならびに髄膜炎菌からのＯＭＰＣが挙げられる。
【００８９】
最も好ましくは、インフルエンザ菌からのプロテインＤ（EP 0 594 610-B）またはその断片（節Ｃ参照）は、本発明の肺炎球菌多糖のための免疫原性タンパク質担体として用いられる。
【００９０】
一実施態様では、本発明の抗原性組成物は、免疫原性タンパク質に連結され、３Ｄ−ＭＰＬアジュバントを処方された肺炎球菌多糖血清型（ＰＳ）４を含むが、この場合、組成物はアルミニウムベースのアジュバントを実質的に欠く。さらなる実施態様では、抗原性組成物は、免疫原性タンパク質に連結され、３Ｄ−ＭＰＬアジュバントを処方されたそれぞれＰＳ６Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆまたは２３Ｆを含むが、この場合、組成物はアルミニウムベースのアジュバントを実質的に欠く。
【００９１】
本発明のさらに別の実施態様では、３Ｄ−ＭＰＬアジュバントを処方されたＰＳ４、ＰＳ６Ｂ、ＰＳ１８Ｃ、ＰＳ１９ＦおよびＰＳ２３Ｆ群からの２つまたはそれ以上の肺炎球菌多糖複合体を含む組合せ抗原性組成物が提供されるが、この場合、組成物はアルミニウムベースのアジュバントを実質的に欠く。
【００９２】
本発明の肺炎球菌多糖複合体の免疫原性は、他の肺炎球菌多糖複合体との組合せにより有意に影響されない（実施例３）。したがって、本発明の好ましい局面は、本発明の１つ又はそれ以上の肺炎球菌多糖複合体を、１つ又はそれ以上のさらに別の肺炎球菌多糖複合体と組合せて含む組合せ抗原性組成物を提供するが、この場合、組成物は３Ｄ−ＭＰＬアジュバントを処方されるが、しかしアルミニウムベースのアジュバントを実質的に欠いている。
【００９３】
本発明のさらなる好ましい実施態様では、少なくとも１つの、好ましくは２、３、４または５つすべてのＰＳ４、６Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆまたは２３Ｆ肺炎球菌多糖複合体を、さらに３Ｄ−ＭＰＬアジュバントを処方されるがしかしアルミニウムベースのアジュバントを実質的に欠いているその他の肺炎球菌多糖複合体の任意の組合せを含有する組合せ抗原性組成物が提供される。
【００９４】
典型的には、本発明の肺炎連鎖球菌組合せ抗原性組成物は多糖複合体抗原を含むが、この場合、多糖は、少なくとも４つ、７つ、11、13、15または23の血清型から得られる（治療される疾患による血清型の好ましい組合せに関する前記の「本発明の肺炎連鎖球菌多糖抗原」参照）。
【００９５】
本発明の抗原性組成物は、好ましくは、特に老齢者および乳児および幼児における肺炎球菌感染を予防（または治療）するためのワクチン組成物として用いられる。
【００９６】
本発明のさらなる実施態様は、薬剤中に用いるための前記の抗原性組成物の提供；肺炎連鎖球菌莢膜多糖複合体に対する免疫応答の誘導方法であって、安全且つ有効量の前記の抗原性組成物の１つを患者に投与する過程を含む方法；ならびに肺炎球菌性疾患の予防（または治療）のための薬剤の製造における前記の抗原性組成物の１つの使用を包含する。
【００９７】
老齢者（＋55歳）集団における肺炎ならびに乳児（18ヶ月まで）および幼児（典型的には18ヶ月〜5歳）における中耳炎の予防／改善のためには、本明細書に記載したように処方される多価肺炎連鎖球菌多糖複合体を肺炎連鎖球菌タンパク質またはその免疫学的機能等価物と併用することが、本発明のさらなる好ましい実施態様である。好ましいタンパク質／タンパク質組合せに関しては、前節「本発明の肺炎球菌タンパク質」を参照されたい。
【００９８】
好ましくは、本明細書中に前記した抗原性組成物（およびワクチン）は、それらが用いられるまで凍結乾燥され、使用時点で、それらは希釈剤を用いて即座に再構築される。さらに好ましくは、それらは３Ｄ−ＭＰＬの存在下で凍結乾燥され、食塩溶液で即座に再構築される。
【００９９】
組成物を凍結乾燥すると、より安定な組成物が結果的に生じる（例えば、それは多糖抗原の分解を防止する）。その過程は、意外にも、肺炎球菌多糖に対するより高い抗体力価にも関与する。これは、ＰＳ６Ｂ複合体に関して特に有意であることが示されている。したがって、本発明の別の局面は、３Ｄ−ＭＰＬで活性調節され、アルミニウムベースのアジュバントを実質的に欠くＰＳ６Ｂ複合体を含む凍結乾燥抗原性組成物である。
【０１００】
ワクチンの調製に関しては、前記の「本発明のワクチン製剤」の節を参照されたい。
【０１０１】
Ｃ）細菌多糖−プロテインＤ複合体
組合せワクチンに対する傾向は、レシピエントへの不快を軽減し、予定を立て易くし、レジメンの完了を保証するという利点を有するが、しかしワクチンの効能を低減するという付随する危険性も存在する（担体タンパク質の過剰使用によるエピトープ抑制における考察に関する前記を参照）。したがって、ある集団の要求を満たし、さらにそれらの構成成分間の免疫原性干渉を示さないワクチン組合せを製造することは有益である。これらの利点は、乳児、幼児または老齢者のような高危険群への組合せワクチンの投与に対して特別な利点を有する本発明の免疫原性組成物（またはワクチン）により実現され得る。
【０１０２】
本発明は、多糖ベースの免疫原性組成物、例えばワクチンのための担体として、インフルエンザ菌からのプロテインＤまたはそのだＰＷを提供する。使用に適した断片としては、Ｔヘルパーエピトープを包含する断片が挙げられる。特に、プロテインＤ断片は、好ましくはタンパク質のＮ末端1/3を含有する。
【０１０３】
プロテインＤは、インフルエンザ菌からのＩｇＤ結合タンパク質であり（EP  0 594 610 B1）、潜在的免疫原である。
【０１０４】
本発明により意図されるプロテインＤに連結される多糖としては、腸チフス菌Salmonella typhiに対するＶｉ多糖抗原、髄膜炎菌多糖（Ａ、Ｃ、Ｗ135およびＹ型、ならびにＢ群髄膜炎菌の多糖および修飾多糖を含む）、黄色ブドウ球菌からの多糖、連鎖球菌属のStreptococcus agalactiaeからの多糖、肺炎連鎖球菌からの多糖、ミコバクテリウム属、例えばヒト結核菌Mycobacterium tuberculosisからの多糖（例えば、マンノホスホイニシチドトレハロース、ミコール酸、マンノース面冠アラビノマンナン、それからの莢膜およびアラビノガラクタンス）、クリプトコックス属のCryptococcus neoformansからの多糖、非分類可能インフルエンザ菌のリポ多糖、ｂ型インフルエンザ菌からの莢膜多糖、モラクセラ属のMoraxella catharralisのリポ多糖、ゾンネ赤痢菌のリポ多糖、クルーズトリパノソーマのリポペプチドホスホグリカン（ＬＰＰＧ）、癌関連ガングリオシドＧＤ３、ＧＤ２、腫瘍関連ムチン、特にＴ−Ｆ抗原およびシアリルＴ−Ｆ抗原、ならびにＴ−Ｆ抗原に構造的に関連するＨＩＶ関連多糖が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０５】
多糖は、既知の方法により、担体タンパク質に結合され得る（例えば、Likhite（米国特許第4,372,945号）およびArmor等（米国特許第4,474,757号）による）。好ましくは、ＣＤＡＰ複合が実行される（WO 95/08348）。
【０１０６】
ＣＤＡＰでは、シアニル化試薬１−シアノ−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）は、好ましくは多糖−タンパク質複合体の合成のために用いられる。シアニル化反応は、アルカリ性感受性多糖の加水分解を回避する相対的に低刺激性条件下で実施され得る。この合成は、担体タンパク質との直接結合を可能にする。
【０１０７】
多糖は、水または食塩溶液中に可溶化される。ＣＤＡＰは、アセトニトリル中に溶解されて、多糖溶液に直接付加される。ＣＤＡＰは多糖のヒドロキシル基と反応して、シアネートエステルを生成する。活性化工程後、担体タンパク質が付加される。しリンのアミノ基は、活性化多糖と反応して、イソウレア共有結合を生成する。
【０１０８】
カップリング反応後、大余分量のグリシンが次に付加されて、残留活性化官能基をクエンチングさせる。次に生成物をゲル浸透に通して見反応担体タンパク質および残留試薬を除去する。したがって、本発明は、多糖プロテインＤ複合体の製造方法であって、多糖を活性化し、多糖をプロテインＤと結合する工程を包含する方法を提供する。
【０１０９】
本発明の好ましい実施態様では、肺炎連鎖球菌感染の予防のための免疫原性組成物（またはワクチン）処方物が提供される。
【０１１０】
肺炎球菌が肺、脳脊髄液および血液に拡がるメカニズムは、十分には分かっていない。正常肺胞に達する細菌の増殖は、それらの相対的乾燥により、そして肺胞マクロファージの食菌活性により抑制される。これらの等位防衛のあらゆる解剖学的または生理学的変化は、感染に対する肺の感受性を増大する傾向がある。肺炎連鎖球菌の細胞壁は、肺の肺胞における炎症性応答の発生において重要な役割を有する（Gillespie et al.（1997）, I&I 65:3936）。
【０１１１】
典型的には、本発明の肺炎連鎖球菌ワクチンはプロテインＤ多糖複合体を含むが、この場合、多糖は少なくとも４、７、11、13、15または23の血清型から得られる。治療される疾患による血清型の好ましい組合せに関する前記の「本発明の肺炎連鎖球菌多糖抗原」を参照されたい。
【０１１２】
本発明のさらなる実施態様では、特に血清型Ａ、Ｃ、Ｗ-135およびＹから、髄膜炎菌ワクチンが提供される。髄膜炎菌は、細菌性髄膜炎の最も重要な原因の１つである。これらの生物の炭水化物莢膜は、ビルレンス決定基および防御抗体のための標的として作用する。それにもかかわらず、炭水化物は、低年齢小児において貧免疫原性であることが周知である。本発明は、これらの多糖に特に適したタンパク質担体であるプロテインＤを提供するが、これは、多糖抗原特異的Ｂ細胞増殖および成熟、ならびに免疫記憶の誘導を補佐するためにＴ細胞応答を活性化し得るＴ細胞エピトープを提供する。
【０１１３】
本発明の代替的実施態様では、ｂ型インフルエンザ菌の莢膜多糖（ＰＲＰ）−プロテインＤ複合体が提供される。
【０１１４】
本発明は、一連の異なる病原体に対する防御を提供する組合せワクチンも意図する。プロテインＤ担体は、意外にも、多重多糖抗原が連結された組合せワクチン中の担体として有用である。前記のように、エピトープ抑制は、各多糖に関して同一担体が用いられる場合に起こると思われる。WO 98/51339は、ＤＴに関する組成物中のある比率の多糖とＴＴに関する残りの比率のものを連結することによりこの妨害を最小限にしようとするための組成物を示した。
【０１１５】
意外なことに、組合せワクチンにおけるこのようなエピトープ抑制作用を最小限にするのにプロテインＤは特に適していることを、本発明は見出した。組合せにおける１つ又はそれ以上の多糖は、プロテインＤと連結されるのが有益であり、好ましくは、抗原はすべて、このような組合せワクチン内でプロテインＤに連結される。
【０１１６】
好ましい組合せとしては、髄膜炎菌ＣおよびＹ（そして好ましくはＡ）に対する防御をもたらすワクチンが挙げられるが、この場合、１つ又はそれ以上の血清型ＹおよびＣ（そして最も好ましくはＡ）からの多糖抗原はプロテインＤに結合される。
【０１１７】
インフルエンザ菌多糖ベースのワクチン（好ましくはＴＴ、ＤＴまたはＣＲＭ197と、あるいは最も好ましくはプロテインＤと連結されたＰＲＰ）は、前記の組合せワクチンを用いて処方され得る。
【０１１８】
多数の小児科ワクチンは、目下、小児が受ける注射の回数を低減するために組合せワクチンとして投与されている。したがって、小児科ワクチンに関しては、他の抗原は、本発明のワクチンを用いて処方され得る。例えば本発明のワクチンは、ジフテリア毒素（ＤＴ）、破傷風毒素（ＴＴ）および百日咳構成成分［典型的には脱毒素価百日咳毒素（ＰＴ）、ならびに任意のペルタクチン（ＰＲＮ）および／またはアグルチニン１＋２を有する糸状赤血球凝集素（ＦＨＡ）］を含む周知の「三価」組合せワクチン、例えばＤＴ、ＴＴ、ＰＴ、ＦＨＡおよびＰＲＮ抗原を含有する市販のワクチンINFANRIX-DTPa（SmithKlineBeecham Biologicals）を用いて、あるいは、例えばTritanrixとしてこれもSmithKlineBeecham Biologicalsにより市販されているような全細胞百日咳菌構成成分を用いて処方され、あるいは別々に、しかし同時に投与され得る。組合せワクチンは、その他の抗原、例えばＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ポリオウイルス抗原（例えば、不活性化三価ポリオウイルス−ＩＰＶ）、モラクセラ属のMoraxella catarrhalis外膜タンパク質、非分類可能インフルエンザ菌タンパク質、Ｂ型髄膜炎菌外膜タンパク質も含み得る。
【０１１９】
組合せワクチン（特に中耳炎の予防用）中に含入され得る好ましいMoraxella catarrhalisタンパク質抗原の例を以下に示す：ＯＭＰ106［WO 97/41731（Antex）およびWO 96/34960（ＰＭＣ）］；ＯＭＰ21；ＬｂｐＡおよびＬｂｐＢ［WO 98/55606（ＰＭＣ）］；ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢ［WO 97/13785およびWO 97/32980（ＰＭＣ）］；ＣｏｐＢ［Helminen ME, et al.（1993）Infect. Immun. 61:2003-2010］；ＵｓｐＡ１／２［WO 93/03761（テキサス大学）］；ならびにＯｍｐＣＤ。組合せワクチン（特に中耳炎予防用）中に含入され得る非分類可能インフルエンザ菌抗原の例としては以下のものが挙げられる：フィンブリンタンパク質［（米国特許第5766608号-Ohio State Research Foundation）］およびそれからのペプチドを含む融合物［例えば、ＬＢ１（ｆ）ペプチド融合物；米国特許第5843464号（ＯＳＵ）またはWO 99/64067］；ＯＭＰ26［WO 97/01638（Cortecs）］；Ｐ６［EP 281673（ニューヨーク州立大学）］；ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢ；Ｈｉａ；Ｈｍｗ１、２；Ｈａｐ；ならびにＤ15。
【０１２０】
本発明により意図される好ましい小児科ワクチンを以下に示す：
ａ）Ｃ型髄膜炎菌多糖複合体およびｂ型インフルエンザ菌多糖複合体。任意にＡおよび／またはＹ型髄膜炎菌多糖複合体を有するが、但し、少なくとも１つの、好ましくはすべての多糖抗原がプロテインＤに連結される。
【０１２１】
ｂ）ＤＴ、ＴＴ、百日咳構成成分（望ましいＰＴ、ＦＨＡおよびＰＲＮ）、Ｂ型肝炎表面抗原およびＩＰＶ（不活性化三価ポリオウイルスワクチン）を有するａ）のワクチン。
【０１２２】
ｃ）プロテインＤに連結された肺炎連鎖球菌多糖抗原。
【０１２３】
ｄ）モラクセラ属のMoraxella catarrhalisおよび／または非分類可能インフルエンザ菌からの１つ又はそれ以上の抗原を有するｃ）のワクチン。
【０１２４】
前記の組合せワクチンはすべて、担体としてのプロテインＤの含入により利益を蒙り得る。明らかに、組合せワクチン（例えばエピトープ抑制を克服するために）中に包含される担体が多いほど、最終ワクチンはより高価で複雑になる。したがって、プロテインＤに連結される組合せワクチンの多糖抗原のすべてのまたは大多数を有ると、かなりの利点を提供する。
【０１２５】
老齢者（＋55歳）集団における肺炎ならびに乳児または幼児における中耳炎の予防のためには、本明細書に記載したような多価肺炎球菌多糖−プロテインＤ抗原を肺炎連鎖球菌タンパク質またはその免疫学的機能等価物と併用することが、本発明の好ましい実施態様である。このような組合せ中に含入され得る好ましいタンパク質／タンパク質組合せに関しては、前記の「本発明の肺炎球菌タンパク質」の節を参照されたい。
【０１２６】
したがって、本発明は、肺炎連鎖球菌多糖−プロテインＤ複合体および肺炎連鎖球菌タンパク質抗原を含む免疫原性組成物を提供する。
【０１２７】
本発明の多糖−プロテインＤ複合体抗原は、好ましくは、本発明のワクチン処方物中で活性調節される。適切なアジュバントとしては、水酸化アルミニウムゲル（アルム）またはリン酸アルミニウムのようなアルミニウム塩が挙げられるが、しかしカルシウム、鉄または亜鉛の塩でもあり得るし、あるいはアシル化チロシンまたはアシル化糖、陽イオン的または陰イオン的誘導化多糖またはポリホスファゼンの不溶性懸濁液であり得る。
【０１２８】
老齢者ワクチンに関しては、アジュバントはＴＨ１型の応答の望ましい誘導物質であるよう選択されるのが好ましい。
【０１２９】
特定のＴｈ１アジュバントに関しては、前記の「本発明のＴｈ１アジュバント」を参照されたい。
【０１３０】
本発明のさらなる局面では、医療に用いるための本明細書中に記載したような免疫原またはワクチンが提供される。
【０１３１】
ワクチン製剤／複合体の投与に関しては、前記の「本発明のワクチン製剤」を参照されたい。
【０１３２】
プロテインＤは、基本的には、非分類可能インフルエンザ菌（ｎｔＨｉ）に対するＢ細胞媒介性防御を生じ得る免疫原であるので、中耳炎に対するワクチン中にも有益に用いられる。ｎｔＨｉは、宿主細胞を侵襲し、タンパク質抗原により誘導されるＢ細胞媒介性作用を回避する。中耳炎ワクチンのための抗原としてのプロテインＤの有効性（それ自体または多糖のための担体としての）を増大する方法を、本発明は意外にも見出した。これは、免疫系の細胞媒介性部門がプロテインＤに対して最適化されるよう、強力なＴｈ１応答が被験者において誘発されるようにプロテインＤを活性調節することによりなされる。これは、意外にも、投与直前に再構築される、プロテインＤおよびＴｈ１アジュバント（好ましくは３Ｄ−ＭＰＬ）を含む凍結乾燥化組成物を用いて成し遂げられる。したがって、本発明は、このような組成物、このような組成物の製造方法（プロテインＤおよびＴｈ１アジュバントを含む混合物を凍結乾燥することによる）、ならびに中耳炎の治療におけるこのような組成物の使用も提供する。
【０１３３】
広義では、本発明は、Ｔｈ１アジュバント（「本発明のＴｈ１アジュバント」参照）、好ましくは３Ｄ−ＭＰＬの存在下での免疫原の凍結乾燥は、一般に、免疫原に対するＴｈ１免疫応答を増大する、ということを意図する。したがって、本発明は、より強力なＴｈ１免疫応答が必要とされるあらゆる免疫原に適用可能である。このような免疫原は、細菌、ウイルスおよび腫瘍タンパク質抗原、ならびに自己タンパク質およびペプチドを包含する。
【実施例】
【０１３４】
実施例
実施例で本発明を説明するが、本発明はそれらに限定されない。
【０１３５】
実施例１
肺炎連鎖球菌莢膜多糖：
11価候補ワクチンとしては、本質的にはEP 72513に記載されたように作製された莢膜多糖血清型１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆが挙げられる。各多糖は、ＣＤＡＰ化学作用を用いて活性化され、誘導されて（WO 95/08348）、タンパク質担体と連結される。多糖はすべて、血清型３（その粘度を減少させるためにサイズ低減される）以外は、それらのネイティブ形態で連結される。
【０１３６】
タンパク質担体：
選択されるタンパク質担体は、大腸菌中で発現された非分類可能インフルエンザ菌からの組換え体プロテインＤ（ＰＤ）である。
【０１３７】
プロテインＤの発現
インフルエンザ菌プロテインＤ
プロテインＤ発現のための遺伝子構築
出発物質
プロテインＤコードＤＮＡ
プロテインＤは、すべての血清型および非分類可能菌株のインフルエンザ菌の間で高度に保存される。全プロテインＤ遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含有するベクターｐＨＩＣ348は、A. Forsgren博士（Department of Medical Microbiology, University of Lund, Malmo General Hospital, Malmo, Sweden）から入手した。プロテインＤのＤＮＡ配列は、Janson et al.（1991）Infect. Immun. 59:119-125により発表されている。
【０１３８】
発現ベクターｐＭＧ１
発現ベクターｐＭＧ１は、外来挿入遺伝子の転写および翻訳のためのバクテリオファージλ由来対照素子が導入されたｐＢＲ322（Gross et al., 1985）の誘導体である（Shatzman et al., 1983）。さらに、アンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子と交換した。
【０１３９】
大腸菌ＡＲ58菌株
ＳＡ500誘導体（ｇａｌＥ：：ＴＮ10, λＫｉｌ-ｃＩ857△Ｈ１）上で予め増殖させたＰ１ファージストックを用いたＮ99の形質導入により、大腸菌ＡＲ58菌株を生成した。Ｎ99およびＳＡ500は、Martin Rosenberg博士の実験室（National Institute of Health）から得られた大腸菌Ｋ12菌株である。
【０１４０】
発現ベクターｐＭＧ１
プロテインＤの製造のために、そのタンパク質をコードするＤＮＡを発現ベクターｐＭＧ  １中でクローン化した。このプラスミドは、λファージＤＮＡからのシグナルを利用して挿入外来遺伝子の転写および翻訳を駆動する。ベクターは、プロモーターＰＬ、オペレーターＯＬおよび２つの利用部位（ＮｕｔＬおよびＮｕｔＲ）を含有して、Ｎタンパク質が提供された場合の転写性極性作用を軽減する（Gross et al., 1985）。ＰＬプロモーターを含有するベクターを大腸菌溶原性宿主中に°にして、プラスミドＤＮＡを安定化する。溶原性宿主菌株は、ゲノム中に組み込まれる複製欠陥λファージＤＮＡを含有する（Shatzman et al., 1983）。染色体λファージＤＮＡは、ベクターのＯＬリプレッサーと結合し、ＰＬプロモーターとのＲＮＡポリメラーゼの結合を阻止し、それにより挿入遺伝子の転写を阻止するｃＩリプレッサータンパク質の合成を指図する。発現菌株ＡＲ58のｃＩ遺伝子は、ＰＬ特異的転写が温度シフトにより調節され得るように、即ち、培養温度の増大がリプレッサーを不活性化し、外来タンパク質の合成が開始されるように、温度感受性突然変異体を含有する。この発現系は、特に細胞に対して毒性であり得るものの外来タンパク質の合成の制御を可能にする（Shimataka & Rosenberg, 1981 ）。
【０１４１】
大腸菌ＡＲ58菌株
プロテインＤ担体の産生に用いられるＡＲ58溶原性大腸菌株は、標準ＮＩＨ大腸菌Ｋ12株Ｎ99の誘導体（Ｆ-ｓｕ-ｇａｌＫ２、ｌａｃＺ-ｔｈｒ-）である。それは、欠陥溶原性λファージ（ｇａｌＥ：：ＴＮ10、λＫｉｌ-ｃＩ857△Ｈ１）を含有する。Ｋｉｌ-表現型は、宿主高分子合成の遮断を阻止する。ｃＩ857突然変異は、ｃＩリプレッサーに温度感受性損傷を付与する。△Ｈ１欠失は、λファージ正当オペロンおよび宿主ｂｉｏ、ｕｖｒ３およびｃｈｌＡ遺伝子座を除去する。ＳＡ500誘導体（ｇａｌＥ：：ＴＮ10, λＫｉｌ-ｃＩ857△Ｈ１）上で予め増殖させたＰ１ファージストックを用いたＮ99の形質導入により、大腸菌ＡＲ58菌株を生成した。隣接ｇａｌＥ遺伝子中のエト等サイクリン耐性をコードするＴＮ10トランスポゾンの存在によりテトラサイクリンを用いて、欠陥リソゲンのＮ99中への導入を選択した。
【０１４２】
ベクターｐＭＧＭＤＰＰｒＤの構築
インフルエンザウイルスの非構造Ｓ１タンパク質をコードする遺伝子を含有するｐＭＧ１ベクター（ｐＭＧＮＳＩ）を用いて、ｐＭＧＭＤＰＰｒＤを構築した。それぞれ５‘および３’末端にＮｃｏＩおよびＸｂａＩ制限部位を含有するＰＣＲプライマーを用いて、ｐＨＩＣ348ベクター（Janson et al. 1991）からのＰＣＲにより、プロテインＤ遺伝子を増幅した。次に、 ＮｃｏＩおよびＸｂａＩ間のｐＭＧＮＳ１中にＮｃｏＩ／ＸｂａＩ断片を導入し、したがってＮＳ１タンパク質のＮ末端81アミノ酸を含有する融合タンパク質を、その後、ＰＤタンパク質を作製した。このベクターを、ｐＭＧＮＳ１ＰｒＤと名付けた。
【０１４３】
前記の構築物に基づいて、プロテインＤ発現のための最終構築物を生成した。ｐＭＧＮＳ１ＰｒＤからＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩ断片を除去した。このＤＮＡ加水分解は、最初の３つのＮ末端残基以外のＮＳ１コード領域を除去する。ベクターの再結紮時に、その後のＮ末端アミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードする遺伝子が生成された。
‐‐‐‐ＭＤＰ  ＳＳＨＳＳＮＭＡＮＴ‐‐‐‐
ＮＳ１                              プロテインＤ
プロテインＤは、普通は脂質鎖が結合されるリーダーペプチドまたはＮ末端システインを含有しない。したがって、そのタンパク質は、ペリプラズムに排出されないし、脂質化もされず、可溶性形態で細胞質中に残存する。
【０１４４】
37℃での熱ショックにより、ＡＲ58宿主菌株中に最終構築物ｐＭＧ−ＭＤＰＰｒＤを導入した。カナマイシンの存在下で、プラスミド含有細菌を選択した。選定エンドヌクレアーゼによる単離プラスミドＤＮＡの消化によって、プロテインＤコードＤＮＡ挿入物の存在を実証した。組換え体大腸菌株をＥＣＤ４と呼ぶ。
【０１４５】
プロテインＤの発現は、λＰLプロモーター／ＯLオペレーターの制御下にある。宿主菌株ＡＲ58は、ＯLとの結合により低温でλＰLからの発現を遮断するゲノム内の温度感受性ｃＩ遺伝子を含有する。温度を上げると、ｃＩはＯLから放出され、プロテインＤが発現される。発酵終了時に、細胞を濃縮し、凍結する。
【０１４６】
収穫細胞からの抽出およびプロテインＤの精製を、以下のように実施した。凍結細胞培養ペレットを解氷し、細胞崩壊溶液（クエン酸塩緩衝液、ｐＨ6.0）中に再懸濁して、最終ＯＤ650＝60とする。Ｐ=1000 barで高圧ホモジナイザーに懸濁液を２回通す。遠心分離により細胞培養ホモジネートを清澄化し、濾過により細胞破砕屑を除去する。一次精製過程において、濾過溶解物を陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（SP Sepharose Fast Flow）に適用する。ＰＤはイオン相互作用によりゲルマトリックスと結合するが、それを、溶離緩衝液のイオン強度の段階的増大により溶離する。
【０１４７】
二次精製過程では、不純物を陰イオン交換マトリックス（Q Sepharose Fast Flow）上に保持する。ＰＤはゲル上に結合せず、フロースルーで収集され得る。
【０１４８】
両カラムクロマトグラフィー過程においては、ＯＤにより分画収集をモニタリングする。精製プロテインＤを含有する陰イオン交換カラムクロマトグラフィーのフロースルーを、限外濾過により濃縮する。
【０１４９】
プロテインＤ含有限外濾過保持物を最後に0.2μm膜に通す。
【０１５０】
化学的性質：
活性化およびカップリング化学作用：
活性化およびカップリング条件は、各多糖に特異的である。これらを表１に示す。注射のために、ネイティブ多糖（ＰＳ３以外）を2 MのＮａＣｌ中または水中に溶解した。すべての血清型に関して、最適多糖濃度を評価した。
【０１５１】
アセトニトリル中の100 mg/mlストック溶液から、ＣＤＡＰ（ＣＤＡＰ／ＰＳ比0.75 mg/mg ＰＳ）を多糖溶液に付加した。1.5分後、0.2 Mのトリエチルアミンを付加して、特異的活性化ｐＨを得た。25℃で2分間、このｐＨで多糖の活性化を実施した。プロテインＤ（量は初期ＰＳ／ＰＤ比によっている）を活性化多糖に付加し、特異的ｐＨで１時間、カップリング反応を実施した。次に、25℃で30分間そして4℃で一夜、グリシンを用いて反応を止めた。
【０１５２】
0.2 MＮａＣｌで平衡させたセファクリル500ＨＲゲル濾過カラムを用いてゲル濾過により、複合体を精製した。
【０１５３】
溶離分画の炭水化物およびタンパク質の含量を確定した。複合体をプールし、0.22μm滅菌膜上で滅菌濾過した。複合体調製物中のＰＳ／タンパク質比を確定した。
【０１５４】
特性化：
各複合体を特性化して、表２に記載した内訳に合した。レソルシノール検定により多糖含量（μg/ml）を、Lowry検定によりタンパク質含量（μg/ml）を測定した。その濃度比により、最終ＰＳ／ＰＤ比（w/w）を確定する。
【０１５５】
残留ＤＭＡＰ含量（ng/μgＰＳ）：
ＣＤＡＰによる多糖の活性化は、多糖中にシアネート基を導入し、ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノ−ピリジン）を遊離する。SBで開発された特異的検定により、残留ＤＭＡＰ含量を確定した。
【０１５６】
遊離多糖含量（％）：
α−ＰＤ抗体および飽和硫酸アンモニウムを用いたインキュベーションおよびその後の遠心分離後に得られた上清に関して、4℃に保持するかまたは37℃で7日間貯蔵した複合体の遊離多糖含量を確定した。
【０１５７】
上清中の遊離多糖の定量のために、α−ＰＳ／α−ＰＳ  ＥＬＩＳＡを用いた。α−ＰＤ／αＰＳＥＬＩＳＡにより、複合体の非存在も制御した。遊離多糖の量の低減は、改良型複合ワクチンをもたらした。
【０１５８】
抗原性：
同一複合体上の抗原性を、サンドイッチ型ＥＬＩＳＡで分析したが、この場合、抗体の捕獲および検出は、それぞれα−ＰＳおよびα−ＰＤであった。
【０１５９】
遊離タンパク質含量（％）：
試料のＳＤＳ処理による方法を用いて、「遊離」残留プロテインＤのレベルを確定した。0.1％ＳＤＳの存在下で100℃で10分間、複合体を加熱し、ＳＥＣ−ＨＰＬＣゲル濾過カラム（ＴＳＫ3000−ＰＷＸＬ）上に注入した。プロテインＤは二量体であるので、ＳＤＳでの構造の解離により「遊離」プロテインＤのレベルを過剰刺激する危険性がある。
【０１６０】
分子サイズ（Ｋav）：
ＳＥＣ−ＨＰＬＣゲル濾過カラム（ＴＳＫ5000−ＰＷＸＬ）上で、分子サイズ分類を実施した。
【０１６１】
安定性：
4℃に保持するかまたは37℃で7日間貯蔵した複合体に関して、 ＨＰＬＣ−ＳＥＣゲル濾過カラム（ＴＳＫ6000−ＰＷＸＬ）上で安定性を測定した。
【０１６２】
11価特性化を表２に示す。
【０１６３】
タンパク質複合体をリン酸アルミニウム上に吸着させて、プールし、最終ワクチンを生成し得る。
【０１６４】
結論：
有望なワクチンの構成成分であることが示されている免疫原性複合体を生成した。最良品質最終複合肺炎球菌多糖生成物に関する最適ＣＤＡＰ条件を、11価物の各々に関して発見した。前記の改良型（最適化）ＣＤＡＰ法により得られるこれらの肺炎球菌多糖の複合体は（担体タンパク質にかかわらず、しかし好ましくはプロテインＤ）、したがって、本発明のさらなる局面である。
【０１６５】
実施例２−乳児ラットにおける11価肺炎球菌ＰＳ−ＰＤ複合体ワクチンの免疫原性に及ぼす先進アジュバントの作用の研究
0.1μgの各多糖の用量の11価肺炎球菌ＰＳ−ＰＤ複合体ワクチン（実施例１の方法にしたがって製造）で、以下のアジュバント処方物：なし、ＡｌＰＯ4、３Ｄ−ＭＰＬ、ＡｌＰＯ4上の３Ｄ−ＭＰＬを用いて、乳児ラットを免疫感作した。
【０１６６】
３Ｄ−ＭＰＬのみを有する処方物は、11の抗原のうち５つに関して、他の処方物より統計学的に（そして意外にも）より免疫原性（最大ＧＭＣ  ＩｇＧ）であった。
【０１６７】
オプソニン食菌作用は、ＧＭＣ結果を確証した。
【０１６８】
材料と方法
免疫感作プロトコール
乳児ＯＦＡラットを異なる母親に対して無作為化し、それらが初回免疫感作を施されたときは7日齢であった。それらには、14および28日後にさらに２回の免疫感作を施した。56日目に（第３回免疫感作後28日目）、採血を実施した。ワクチンを皮下注射した。ラットは、10匹／ワクチン群であった。
【０１６９】
プロテインＤ上に以下の多糖血清型：１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆを連結させたものを含む11価肺炎球菌複合ワクチンで、ラットを免疫感作した。
【０１７０】
処方物
異なる先進アジュバントの作用を調べるために、複合体の用量を0.1μgの各多糖に一定に保持し、アジュバントＡｌＰＯ4および３Ｄ−ＭＰＬを、アジュバントを全く含まないものを含めて、異なる用量および組合せで処方した。これらを参考のために表３に数値で列挙する。
【０１７１】
ＡｌＰＯ4上の吸着
以下の手法により、濃縮吸着一価物を調製した。50μgのＡｌＰＯ4（ｐＨ5.1）を5μgの複合多糖と2時間混合した。ｐＨをｐＨ5.1に調整し、混合物をさらに16時間放置した。1500mMのＮａＣｌを付加して、塩濃度を150mMにした。5分後、5 mg/mlの２−フェノキシエタノールを付加した。さらに30分後、ｐＨを6.1に調整して、4℃で3日以上放置した。
【０１７２】
希釈剤の調製
ＮａＣｌ150mM／5 mg/mLフェノキシエタノール中で３つの希釈剤を調製した。
【０１７３】
Ａ：ＡｌＰＯ4、1mg/mlで。
【０１７４】
Ｂ：ＡｌＰＯ4上の３Ｄ−ＭＰＬ、それぞれ1000および250μg/ml。重量比は、３Ｄ−ＭＰＬ／ＡｌＰＯ4＝5/20。
【０１７５】
Ｃ：ＡｌＰＯ4上の３Ｄ−ＭＰＬ、それぞれ1000および561μg/ml。重量比は、３Ｄ−ＭＰＬ／ＡｌＰＯ4＝50/89。
【０１７６】
吸着11価物の調製
11の濃縮吸着ＰＳ−ＰＤ一価物を適切な比率で混合した。ＡｌＰＯ4の補体を希釈剤Ａとして付加した。必要な場合、水性溶液（非吸着価。下記の方法１参照）として、あるいは希釈剤ＢまたはＣ（ＡｌＰＯ4上に２用量で吸着された３Ｄ−ＭＰＬ。下記参照）として、３Ｄ−ＭＰＬを付加した。
【０１７７】
方法１
３Ｄ−ＭＰＬを、水性懸濁液として併合吸着複合体に付加した。それを室温で10分間、11価物に混合して、投与まで4℃で貯蔵した。
【０１７８】
方法２
３Ｄ−ＭＰＬをＡｌＰＯ4上に予備吸着させた後、併合吸着複合体に付加した（希釈剤ＢおよびＣ）。1 mlの希釈剤を調製するために、３Ｄ−ＭＰＬ（250または561 μg）の水性懸濁液を、室温で5分間、150 mMのＮａＣｌ、ｐＨ6.3中の1 mgのＡｌＰＯ4と混合した。この溶液をＮａＣｌ、ｐＨ6.1／フェノキシ中に稀釈し、4℃で一夜インキュベートした。
【０１７９】
非吸着化11価物の調製
11のＰＳ−ＰＤ複合体を混合し、正しい比率で150 mMのＮａＣｌ、ｐＨ6.1、フェノキシ中に稀釈した。必要な場合には、３Ｄ−ＭＰＬを溶液（非吸着化）として付加した。
【０１８０】
すべての注射用の処方物は、初回投与の18日前に調製した。
【０１８１】
ＥＬＩＳＡ
ヒト血清中の肺炎連鎖球菌莢膜多糖に対するＩｇＧ抗体の定量のためのＥＬＩＳＡ手法に関してＷＨＯワークショップから得られたプロトコールを用いて、ＥＬＩＳＡを実施し、ラットＩｇＧを測定した。基本的に、精製莢膜多糖は微小滴定プレート上に直接被覆される。血清試料を、すべての肺炎球菌に共通の、そして開示（EP 72513 B1）にしたがって精製される肺炎球菌多糖中に焼く0.5％で存在する細胞壁多糖（物質Ｃ）とともに予備インキュベートする。Jackson ImmunoLaboratories Inc.試薬を用いて、結合ネズミＩｇＧを検出した。滴定曲線を、数学論理的対数方程式によりモデル化された内部標準（モノクローナル抗体）に参照した。SoftMax Proソフトウェアを用いて計算を実施した。これらの結果に関する最大絶対誤差は、2の因数内であると予測した。相対誤差は30％未満である。
【０１８２】
オプソニン食菌作用
精製ヒトＰＭＮおよび嬰児ウサギ補体を用いたＣＤＣプロトコール（分化ＨＬ60細胞を用いた肺炎連鎖球菌オプソニン食菌作用。バージョン11）を用いて、血清型３、６Ｂ、７Ｆ、１４、１９Ｆおよび２３Ｆに関してオプソニン力価を決定した。修正は社内肺炎球菌株の使用を含み、食菌性ＨＬ60細胞を精製ヒト好中球ＰＭＮに置き換えた（これらの食菌性細胞間には高度の相関が認められる）。さらに、3 mmガラスビーズを微小滴定ウエルに付加して、混合を増大し、これは、400であるべきと推奨された食細胞：細菌比の低減を可能にした。
【０１８３】
結果
ＩｇＧ濃度
すべての血清型およびＰＤに関して確定されたゲノム平均ＩｇＧ濃度を表４〜１０に示す。血清型６Ｂ、１４、１９Ｆおよび２３Ｆに関しては、４価処方物を用いて得られた前の結果を比較のために含める。
【０１８４】
最高ＩｇＧ濃度を、表４〜１０で強調した。３Ｄ−ＭＰＬ組成物体３Ｄ−ＭＰＬ／ＡｌＰＯ4組成物に関する統計的ｐ値は、表１１に示してある。アジュバント処方物４（高用量３Ｄ−ＭＰＬを有する非吸着化複合体）は、11例中9例で最高ＧＭＣを示す。5/11例では、低用量のＭＰＬは、第二の最大免疫原性物である。さらに、アジュバント活性化は、全血清型に関して用量の修正によるより高いＧＭＣを示し（データは示されていない）、これは血清型４、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃおよび２３Ｆに関しては統計学的に有意である（p＜0.05。95％ＣＩから）。
【０１８５】
オプソニン食菌作用
プール化血清に関するオプソニン食菌作用結果を、血清型３、６Ｂ、７Ｆ、１４、１９Ｆおよび２３Ｆに関して表４〜８に示す。ほとんどの部分に関して、これらのオプソニン力価は、ＧＭＣ  ＩｇＧを確証する。実際、ＩｇＧ濃度との相関は、血清型６Ｂ、１９Ｆ、２３Ｆに関しては85％より大きい（データは示されていない）。血清型３に関しては、３Ｄ−ＭＰＬ群のみがオプソニン活性を閾値より上に誘導した、ということに留意することは重要である。
【０１８６】
結論
この実験では、３Ｄ−ＭＰＬ単独の使用は最高ＩｇＧ濃度を誘導する、ということは予測されなかった。
【０１８７】
アジュバントを修正することにより得られた最大ＧＭＣを、ＰＳ用量を修正することにより得られた最大ＧＭＣと比較し、３Ｄ−ＭＰＬが、5/11血清型で有意に高い応答を誘導し得た、ということを見出した。
【０１８８】
表１１は、３Ｄ−ＭＰＬおよび３Ｄ−ＭＰＬ／ＡｌＰＯ4組成物を比較した場合（処方過程および３Ｄ−ＭＰＬの用量を比較）、３Ｄ−ＭＰＬ＋ＡｌＰＯ4よりむしろ３Ｄ−ＭＰＬだけを用いて処方した場合、免疫原性に関して、多糖複合体のうちの５つが有意に改良されるということを示す：ＰＳ４、ＰＳ６Ｂ、ＰＳ１８Ｃ、ＰＳ１９ＦおよびＰＳ２３Ｆ。
【０１８９】
実施例３−成体ラットにおけるＰＳ４、ＰＳ６Ｂ、ＰＳ１８Ｃ、ＰＳ１９ＦおよびＰＳ２３Ｆ複合体の免疫原性に及ぼす組合せの作用の研究
別々に、または多価組成物（４−、５−、７−または10価物）中に併合した肺炎球菌多糖−プロテインＤ複合体ワクチンを用いて、成体ラットを免疫感作した。ラット10匹の群を28日置いて2回免疫感作して、28日目および42日目（２回目投与の14日後）に被験血液を採取した。
【０１９０】
肺炎球菌多糖に対するＩｇＧ抗体に関して、ＥＬＩＳＡにより血清を検査した。ＥＬＩＳＡにより測定した場合、複合体はすべて、特異的ＩｇＧ抗体を誘導した。表１２は、２回目投与後14日目にＩｇＧ濃度により測定した場合の、成体ラットにおけるそれらの免疫原性に及ぼす１価ＰＳ６Ｂ、ＰＳ１８Ｃ、ＰＳ１９ＦおよびＰＳ２３Ｆの組合せの作用を示す。
【０１９１】
すべての試料に関して統計分析を実施して、組合せ時の抗体濃度の差が有意であるか否かを確定した。多価ワクチン中の血清型ＰＳ６Ｂ、ＰＳ１８Ｃ、ＰＳ１９ＦおよびＰＳ２３ＦプロテインＤ複合体の組合せはいずれも、それらの免疫原性を有意に変えなかった。
【０１９２】
【表１】
0005551579.tif 000002
【０１９３】
【表２】
0005551579.tif 000003
【０１９４】
【表３】
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【０１９５】
【表４】
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【０１９６】
【表５】
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【０１９７】
【表６】
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【０１９８】
【表７】
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【０１９９】
【表８】
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【０２００】
【表９】
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【０２０１】
【表１０】
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【０２０２】
【表１１】
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【０２０３】
【表１２】
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【０２０４】
実施例４−マウスにおける肺炎球菌肺コロニー形成に対するＰＤ−複合11価多糖ワクチンの防御的有効性に及ぼすニューモリジンおよび３Ｄ−ＭＰＬの付加の有益な影響
免疫学的解読
ニューモリジン特異的血清ＩｇＧのＥＬＩＳＡ投与
ＰＢＳ中に稀釈した100μl／ウエルの2μg/ml組換え体ネイティブニューモリジン（ＰＬＹ）を用いて、37℃で2時間、Maxisorp Nuncイムノプレートを被覆した。プレートを0.9％ＮａＣｌ、0.05％トゥイーン20緩衝液で3回洗浄した。次に、標準曲線として付加された（670 ng/mlＩｇＧで出発）抗ＰＬＹ血清参照の連続２倍稀釈液（ＰＢＳ／0.05％トゥイーン20、100μl／ウエル）および血清試料（1/10稀釈液で出発）を、撹拌しながら20℃で30分間インキュベートした。前記と同様に洗浄後、 ＰＢＳ／0.05％トゥイーン20中に5000ｘ稀釈したペルオキシダーゼ−複合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Jackson）を、撹拌しながら20℃で30分間インキュベートした（100μl／ウエル）。洗浄後、100μl／ウエルの再ベール化緩衝液（100mM、ｐＨ4.5クエン酸塩緩衝液中ＯＰＤＡ0.4 mg/mlおよびＨ2Ｏ20.05％）とともに、室温で15分間、プレートをインキュベートした。50μl／ウエルの1 NＨＣｌを付加することにより、再ベール化を停止した。Emaxイムノリーダー（Molecular Devices）を用いて、490および620 nmで光学濃度を読み取った。SoftMaxProソフトウェアを用いた４パラメーター数学法により、抗体力価を算定した。
【０２０５】
溶血抑制
ニューモリジン（ＰＬＹ）溶血活性を抑制する血清抗体の能力を測定するために、この検定を実行した。コレステロール（ＰＬＹとの相互作用に感受性）を排除するために、血清試料に以下の処置を２回施した：それらを１等容量のクロロホルムと混合し、次に撹拌しながら45分間インキュベートした。1000 rpmで10分間遠心分離後に上清を収集した。コレステロール消去血清を、96ウエル微小プレート（Nunc）中で稀釈した（1 mMジチオトレイトール、0.01％ＢＳＡ、15 mMトリス、150 mMＮａＣｌ、ｐＨ7.5中の連続２倍稀釈液）。4 HU（溶血単位）のＰＬＹを含有する50μl溶液を各ウエル中に付加し、37℃で15分間インキュベートした。次に、100μlのヒツジ赤血球（1％溶液）を、37℃で30分間、付加した。1000 rpmで10分間遠心分離後、上清（150μl）を収集し、405 nmでの光学密度読み取りのために別の96ウエル微小プレート中に入れた。結果は、中点稀釈力価として表した。
【０２０６】
ニューモリジン化学的脱毒素化
組換え体ネイティブニューモリジン（ＰＬＹ）を50 mMリン酸塩、500 mMＮａＣｌ、ｐＨ7.6緩衝液に対して透析した。時々撹拌しながら、39.5℃で以下の全工程を実行した。１日目に、10％トゥイーン80（1/250 v/v）、57.4 mMのＮ−アセチルトリプトファン、ｐＨ7.6（3/100 v/v）、リン酸塩緩衝液中の2.2 Mグリシン（1/100 v/v）およびリン酸塩緩衝液中の10％ホルムアルデヒド（3/100 v/v）をＰＬＹ溶液中に付加した。２および３日目に、10％ホルムアミドを、それぞれ3/100および2/100 v/v比で再び付加した。時々撹拌しながら、７日目まで、39.5℃でインキュベーションを持続した。最後に、50 mMリン酸塩、500 mMＮａＣｌ、ｐＨ7.6緩衝液に対してＰＬＹを透析した。溶血検定において、ＰＬＹの完全不活性化を実証した。
【０２０７】
ＯＦ１マウスにおける肺炎球菌鼻腔内チャレンジ
5.105 CFUのマウス適合化肺炎連鎖球菌血清型６Ｂを、麻酔下で7週齢ＯＦ１雌マウスに鼻腔内接種した。接種後６時間目に肺を切除し、Todd Hewithブロス（ＴＨＢ、Gibco）培地中で均質化した（Ultramax, 24000 rpm、4℃）。肺ホモジネートの連続10倍稀釈液を、37℃で一夜、酵母菌抽出物補充ＴＨＢ寒天を含入するペトリ皿上にプレート化した。肺炎球菌肺感染をCFU数／マウスとして確定し、対数計量平均として表した。検出限界は2.14 log CFU／マウスであった。
【０２０８】
実施例４Ａ．抗ニューモリジン免疫応答に及ぼす３Ｄ−ＭＰＬアジュバント作用
本実施例では、ネイティブ組換え体ニューモリジン（ＰＬＹ、J. Paton, Children's Hospital, North Adelaide, Australiaにより提供された）およびその化学的脱毒素化対応物（ＤＰＬＹ）に対する免疫応答に及ぼす３Ｄ−ＭＰＬアジュバント活性化の影響を、我々は評価した。前記と同様に化学的脱毒素化を実行した。
【０２０９】
0、14および21日目に、Ａ：100μgのＡｌＰＯ；またはＢ：100μgのＡｌＰＯ ＋5μgの３Ｄ−ＭＰＬ（３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ、供給元Ribi Immunochem）中に含入された1μgのＰＬＹまたはＤＰＬＹを用いて、10匹の雌６週齢Balb/cマウスの群を筋肉内免疫感作した。図１Ａおよび１Ｂは、第３回血清後に測定したＥＬＩＳＡ  ＩｇＧおよび溶血抑制力価（ＨＬＩ）
どの抗原でも、３Ｄ−ＭＰＬ補充処方物を接種した動物において最良免疫応答を誘導した。興味深いことに、ＤＰＬＹは、ＡｌＰＯ4＋３Ｄ−ＭＰＬとともに投与した場合、ＰＬＹと同様に免疫原性であったが、一方、ＡＬＰＯ4処方物中では免疫原であった。これは、脱毒素化ニューモリジンに対する抗体応答を改良する３Ｄ−ＭＰＬの有益な能力を示した。
【０２１０】
ニューモリジンを含有する組成物では、突然変異的脱毒素化ニューモリジンよりむしろ化学的脱毒素化ニューモリジンを用いるのが望ましい。これは、今日までに得られた脱毒素化突然変異体が依然として残留毒素活性を有するためであり、化学的脱毒素化ニューモリジンは残留毒素活性を有さない。したがって、本発明の別の局面では、概して、ワクチン中に用いるために化学的脱毒素化されたニューモリジンを含む組成物は、Ｔｈ１アジュバント、好ましくは３Ｄ−ＭＰＬで活性調節されるべきである、と考えられる。本発明は、このような組成物を提供する。組成物にＴｈ１アジュバント（好ましくは３Ｄ−ＭＰＬ）を付加する過程を包含する免疫原性組成物内の化学的脱毒素化ニューモリジンの免疫応答の増大方法も意図される。
【０２１１】
実施例４Ｂ．血清型６Ｂを鼻腔内チャレンジさせたＯＦ１マウスにおける肺炎球菌肺コロニー形成に対するＰＤ−複合11価多糖ワクチンの防御的有効性に及ぼすニューモリジンおよび３Ｄ−ＭＰＬアジュバントの弱毒化突然変異体の付加の有益な影響
本実施例では、11価多糖−プロテインＤ複合体、弱毒化突然変異体ニューモリジン抗原（ＰｄＢ、WO 90/06951）およびＡｌＰＯ4＋３Ｄ−ＭＰＬアジュバントを含有するワクチンの予防的効能を、古典的ＡｌＰＯ4吸着11価多糖−プロテインＤ複合体処方物と比較して、我々は評価した。
【０２１２】
0および14日目に、Ａ：50μgのＡｌＰＯ；Ｂ：0.1μgＰＳ／血清型のＰＤ複合11価多糖ワクチン＋50μgのＡｌＰＯ4；またはＣ：0.1μgＰＳ／血清型のＰＤ複合11価多糖ワクチン＋10μgのＰｄＢ（J. Paton, Children's Hospital, North Adelaide, Australia提供）＋50μgのＡｌＰＯ4＋5μgの３Ｄ−ＭＰＬ（供給元Ribi Immunochem）を含有する処方物を用いて、12匹の雌4週齢ＯＦ１マウスの群を皮下免疫感作した。21日目に、前記と同様にチャレンジを実行した。
【０２１３】
図１Ｃに示したように、ＰｄＢを補充し、ＡｌＰＯ4＋ＭＰＬで活性調節した11価多糖複合ワクチンにより、非常に有意の防御（p＜0.007）が付与された（黒棒は算術平均を表す）。これに反して、11価多糖複合体／ＡｌＰＯ4処方物で免疫感作した動物においては、有意の防御は観察されなかった。この結果は、ニューモリジン抗原（弱毒化されていても）および３Ｄ−ＭＰＬアジュバントの付加が肺炎に対する11価多糖複合ワクチンの有効性を増大することを立証した。
【０２１４】
実施例４Ｃ．実施例４Ｂに示した防御の免疫相関物
弱毒価突然変異体ニューモリジン（ＰｄＢ）および３Ｄ−ＭＰＬを補充した11価多糖複合体ワクチンにより、実施例４Ｂで付与された防御の免疫相関物を確立するために、多糖６ＢおよびＰｄＢに対するプレチャレンジ血清学的抗体応答を前記と同様に測定した。
【０２１５】
次に、抗体力価を、チャレンジ後６時間目に収集した対応する動物の肺で測定された細菌コロニー数と比較した。Log/Log線状回帰に関してＲ2を算定した。
【０２１６】
算定Ｒ2は、抗ＰｄＢおよび抗６Ｂ抗体応答に関してそれぞれ0.18および0.02であった。これは、体液性免疫応答と両抗原に対する防御との間の相関の非存在を示した。抗６Ｂ抗体力価は、11価複合体ワクチン（ＧＭＴ＝0.318 ng/ml）で免疫感作した群またはＰｄＤおよび３Ｄ−ＭＰＬを補充した同一ワクチン（ＧＭＴ＝0.458 ng/ml）で免疫感作した群において有意に異ならなかった。したがって、処方物Ｃで観察された防御改善は、単に多糖６Ｂに対する高抗体応答によるものではなかった。
【０２１７】
合わせて考えると、防御は体液性免疫応答単独により媒介されるだけでなく、むしろ３Ｄ−ＭＰＬの存在下でＰｄＢにより誘導された細胞媒介性免疫によっても媒介された、ということを結果は示唆する。これは、最適防御のための免疫系の両部門を対等にするよう、肺炎球菌多糖複合体ワクチン中のタンパク質抗原（単数または複数）および効力のあるアジュバント（単数または複数）の付加に対してさらなる支持を与えた。
【０２１８】
実施例５−ニューモリジンで能動的免疫感作され、肺炎球菌ＰＳに対する抗体で受動的免疫感作されたマウスにおける免疫系の両部門の共働
実施例５Ａ−肺炎に対して防御する受動的投与抗６Ｂ多糖（抗ＰＳ）抗体の濃度を見出す
方法
ワクチン群：下記に詳述した群により（マウス計64匹）、マウス16匹の４群を、−１日目に100μlの非稀釈ラット抗多糖抗血清で受動的免疫感作（腹腔内）させた。
【０２１９】
【表１３】
0005551579.tif 000014
【０２２０】
動物：Charles River, Canadaからの体重約35 gの64匹の雄ＣＤ−１マウス（約10週齢）。
【０２２１】
麻酔：イソフルラン（3％）＋Ｏ2（1 L／分）でマウスを麻酔した。
【０２２２】
生物：肺炎連鎖球菌Ｎ1387（血清型６）を、5％ウマ血液を補充したトリプチカーゼ大豆寒天プレート（ＴＳＡ）から収穫し、ＰＢＳ6 ml中に懸濁した。感染直前に、1 ml細菌懸濁液を9 mlの冷却溶融栄養寒天（ＢＢＬ）中に稀釈して、41℃に保持した。マウスに容量50 ul中の約6.0 log10 cfu／マウスを投与した。
【０２２３】
感染：0日目に、前記のようにマウスを麻酔して、非外科的気管内挿管による気管支内点滴注入により、肺炎連鎖球菌Ｎ1387（50μl冷却細菌懸濁液）を感染させた。この方法は、WoodnutとBerry（Antimicrob. Ag. Chemotherap. 43:29（1999））により記載された。
【０２２４】
試料：感染後3日目に、マウス8匹／群をＣＯ2過剰投与により屠殺して、肺を切除し、1 mlＰＢＳ中で均質化した。10倍連続稀釈液をＰＢＳ中で調製して、生育可能細菌数を数え上げた。5％ウマ血液を補充したＴＳＡプレート上に３通り、試料を接種（20μl）し、評価前に37℃で一夜インキュベートした。さらに別の組のマウスを7日目に屠殺して、前記と同様に試料採取した。
【０２２５】
結果：
【０２２６】
【表１４】
0005551579.tif 000015
【０２２７】
結論：概して、あらゆる処置群から単離した細菌数に有意差は認められなかった。これは、測定可能防御が5μg/ml以下の濃度の抗多糖によりもたらされたことを示す。
【０２２８】
これは、いくつかのヒト臨床試験で観察されるものと同様であり、即ち、抗多糖体はいくつかの集団においては肺炎球菌性肺炎に対して防御するのに不十分である。
【０２２９】
実施例５Ｂ−アジュバントを用いた場合と用いない場合とのＰｌｙ（ニューモリジン）の能動的投与および亜最適抗ＰＳ抗体との共働作用によりもたらされる肺炎からの防御を確定する
方法
動物：6週齢時体重約20 g、10週齢時約38 gの、Charles River, St. Quebec, Constant, Canadaからの128匹の雄ＣＤ−１マウス（免疫感作時6週齢、感染時10週齢）。
【０２３０】
免疫感作：マウス16匹の６群を、-22日目および-14日目に皮下注射により下記に詳述するワクチン100 ulで免疫感作した（マウス計128匹）。ＰｄＢ（WO 90/06951）は、オーストラリアのJames Paton博士の御好意により入手した。３Ｄ−ＭＰＬは、Ribi/Corixaから入手した。
【０２３１】
-1日目に、特定群（下記の表参照）を、濃度4.26μg/ml（4 mlの5μg/ml＋1.3 mlの2μg/ml）のマウス抗多糖抗体で受動的免疫感作（腹腔内100 μl）した。
【０２３２】
【表１５】
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【０２３３】
感染：0日目に、マウスを麻酔した（3％イソフルラン＋1 L／分Ｏ2）。肺炎連鎖球菌Ｎ1387（血清型６）の増殖物を、5％ウマ血液を補充したトリプチカーゼ大豆寒天プレート（ＴＳＡ）から収穫し、ＰＢＳ6 ml中に懸濁することにより細菌接種物を調製した。感染直前に、10倍稀釈液（1 ml＋9 ml）を冷却溶融栄養寒天（41℃に保持）中に調製した。気管内挿管による気管支内点滴注入によりマウスを感染させて、容量50 ul中の約6.0 log10 cfu／マウスを投与した。この方法は、WoodnutとBerry（Antimicrob. Ag. Chemotherap. 43:29（1999））により記載されていた。
【０２３４】
試料：感染後72時間目に、マウス8匹／群をＣＯ2過剰投与により屠殺して、肺を切除し、1 mlＰＢＳ中で均質化した。10倍連続稀釈液をＰＢＳ中で調製して、生育可能細菌数を数え上げた。5％ウマ血液を補充したＴＳＡプレート上に３通り、試料を接種（20μl）し、評価前に37℃で一夜インキュベートした。さらに別の組のマウスを感染後8日目に屠殺して、前記と同様に試料採取した。
【０２３５】
データ分析
処置の比較のための結果測定値は、感染後3および7日目の肺中の細菌数であった。結果は、群平均＋標準偏差として示される。スチューデントｔ検定を用いて統計分析を実施したが、この場合、＜0.05のＰ値を、有意であるとみなした。
【０２３６】
結果：
感染後72時間
群１−４からの細菌数は、群１−３の場合よりも有意に低かった（ｐ＜0.05）。
【０２３７】
群１−４からの細菌数は、群１−5の場合よりも有意に低かった（ｐ＜0.05）。
【０２３８】
感染後168時間
全群の細菌数は、8日目では3日目より約2 log低かったが、これは感染が消散したことを示す。
【０２３９】
群１−２からの細菌数は、群１−５の場合よりも有意に低かった（ｐ＜0.05）。
【０２４０】
【表１６】
0005551579.tif 000017
【０２４１】
前記で実証されたように、抗多糖抗体単独（群１−５）は、肺中の肺炎球菌の増殖に対する防御をもたらさない。ＡｌＰＯ4で活性調節したＰｄＢはいずれも防御を付与しないが、しかし8日目に、ＰｄＢを３Ｄ−ＭＰＬと組合せた場合（群１−２）に、防御傾向が認められる。
【０２４２】
3日目に、群は最も有意に防御し、群１−４は３つの要素、即ちＰｄＢ、３Ｄ−ＭＰＬおよび受動的投与抗多糖抗体をすべて有した。この結論は、死亡率により支持される。群１−４は死亡は2/8だけであったが、これに比して群１−５および１−３に関しては5/10であった。
【０２４３】
結論：
受動的免疫感作動物を用いて実験を実施したので、ニューモリジンおよびＭＰＬでの能動的免疫感作の共働作用も、多糖抗原に対する抗体レベルの増大によるとは言えない。
【０２４４】
肺炎球菌多糖に対して動物を受動的免疫感作しただけであったので、8日目までに、このような抗体のレベルは宿主から大いに消散していた。
【０２４５】
そのような場合でも、肺炎球菌性肺炎に対する有意の防御は、ニューモリジン＋３Ｄ−ＭＰＬで免疫感作した群において、特に濡森＋３Ｄ−ＭＰＬ＋受動的投与抗多糖抗体で免疫感作した群において認められたが、これは、この組合せの共働作用を示す。
【０２４６】
能動的（好ましくは、複合多糖を用いて）に抗多糖免疫感作を実行していた場合、Ｂ細胞記憶の作用および一定レベルの抗ＰＳ抗体が免疫応答協同作用に寄与していたので、作用はさらに顕著であったと思われる（例えば、図１Ｃ参照。この場合、多糖およびタンパク質で能動的免疫感作された動物は、チャレンジ後の肺中に細菌が認められなかったことが示された）。
【０２４７】
実施例６−３Ｄ−ＭＰＬで活性調節した11価肺炎球菌多糖プロテインＤ複合体ワクチンの1年齢Balb/Cマウスにおける免疫原性
序論および対象（単数または複数）：
肺炎球菌感染に対する防御は、オプソニン食菌作用を介した血清型特異的抗体により媒介される。抗体濃度の増大はより大きい防御を生じ、したがって体液性応答を増大するための方法の発見に多大の努力が費やされてきた、と推測され得る。前臨床試験においてワクチンを連結するために首尾よく適用されてきた一戦略は、免疫刺激性アジュバントの使用である（Poolman et al. 1998, Carbohydrate-Based Bacterial Vaccines. In:Handbook of Experimental Pharmacology eds. P. Perlmann and H. Wigsell. Springer-Verlag, Heidelberg, Dで再検討されている）。
【０２４８】
この節に提示したデータは、臨床試験を模倣するよう意図されたプロトコールにおける臨床ロットを用いた最新実験結果を示す。
【０２４９】
プロトコール：
1/10回のヒト投与量の肺炎球菌多糖プロテインＤ複合体ワクチン、または23価純多糖ワクチンで、1年齢Balb/Cマウスを免疫感作した。用いたワクチンは、それぞれ1 mcg用量の血清型６Ｂおよび２３Ｆならびに5 mcgの11価複合ワクチンの残りの血清型、0.1 mdg用量の11価複合ワクチン、または5 mcg３Ｄ−ＭＰＬで活性調節した0.1 mcg用量の11価複合ワクチンに対応する臨床ロットＤＳＰ009、ＤＳＰ013またはＤＳＰ014であった。11価複合ワクチンはすべて、50μgのＡｌＰＯ4でも活性調節した。
【０２５０】
マウス20匹の群を筋内免疫感作した。下記の表に列挙した群の注射は、0および21日目に実施した。35日目（第２回投与後14日目）に被験血液を採取した。
【０２５１】
【表１７】
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【０２５２】
ＣＤＣ／ＷＨＯ合意プロトコール後、即ち細胞壁多糖による血清の中和後、肺炎球菌多糖に対するＩｇＧ抗体に関してＥＬＩＳＡにより、血清を検査した。血清型特異的ＩｇＧ１モノクローナル抗体を用いてＥＬＩＳＡを較正して、抗体濃度をmcg/mlで得た。
【０２５３】
ＵＮＩＳＴＡＴバージョン5.0βを用いて、比較の統計分析を算定した。log形質転換化ＩｇＧ濃度に関して、Tukey-HSD法によるＡＮＯＶＡを実施した。Fisherの精度検定を用いて、血清変換の対方式比較を実施した。
【０２５４】
結果：
第２回免疫感作（投与２）後14日で誘導された11の血清型およびプロテインＤに対するＧＭＣ  ＩｇＧおよび95％信頼区間を、下記の表に示す。血清変換率を示すが、この場合、95％信頼区間は算定され得なかった。
【０２５５】
群１は、普通は動物においてＩｇＭのみを誘導する純多糖による免疫感作の効果を示す。ほとんどのＩｇＧレベルは検出の閾値より下であった。それにもかかわらず、balb/cマウスは少数の肺炎球菌多糖、特に血清型３、１９Ｆおよび１４に対してＩｇＧを作り得た。
【０２５６】
複合体ワクチンによる免疫感作は、２３Ｆ以外の全血清型に対して高血清変換率でＩｇＧ抗体を誘導した。
【０２５７】
血清型７Ｆおよび１９Ｆに関してのみ用量依存性応答（群４対群２）を観察したが、しかしこれらの観察は統計学的に有意でなかった。血清型３、６Ｂ、７Ｆおよび１９ＦならびにＰＤに関して２回の投与後により大きい応答を観察し、これらの観察は、３つの処方物すべてを有する多くの場合に、統計学的に有意であった。
【０２５８】
最も興味深いのは、３Ｄ−ＭＰＬの作用である。３Ｄ−ＭＰＬ処方ワクチン（群３ｂ）の2回の投与は、特異的ＩｇＧの最高ＧＭＣを誘導し、これは、すべての血清型に関して統計的に有意であったが、但し、２３Ｆの場合は、有意に高い血清変換率を示した（ｐ＝0.02，群３ｂ対２ｂ。Fisher精度）。
【０２５９】
【表１８】
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【０２６０】
群の定義に関しては、前記の表を参照されたい。
【０２６１】
結論：
ここに提示したデータは、11価肺炎球菌多糖プロテインＤ複合体ワクチンへの３Ｄ−ＭＰＬの付加が、試験したすべての血清型に対する老齢balb/cマウスにおける免疫応答を増大した、ということを実証する。
【０２６２】
ほとんどの場合、ワクチンの２回投与は、1回投与より高い幾何学平均ＩｇＧ濃度を誘導した。これは、ヒトにおいてさえ、純多糖ワクチンを用いて観察されないため、Ｔ細胞依存性免疫応答および免疫記憶の誘導の指標とみなされる。
【０２６３】
これらのデータは、アジュバント（好ましくは３Ｄ−ＭＰＬ）で活性調節した複合肺炎球菌多糖を用いるワクチン投与計画を支持し、それにより、少なくとも２回用量の活性調節化ワクチンが、好ましくは1〜12週おきに、最も好ましくは3週間置きに投与される。このような投与計画は、本発明のさらなる局面とみなされる。
【０２６４】
実験に用いたマウスは、ＰＳ２３（純または複合）に対して非応答性であった。興味深いことに、用いたワクチン組成物にかかわらず多糖に対する抗体レベルは低いままであったが、しかし３Ｄ−ＭＰＬをアジュバントとして用いた場合（血清変換は有意に高い）には、より多数のマウスがＰＳ  ２３に応答した。ワクチン中の肺炎球菌多糖に対する非応答性を軽減するための複合肺炎球菌多糖を含むワクチン組成物中のＴｈ１アジュバント、特に３Ｄ−ＭＰＬの使用は、本発明のさらに別の局面である。前記の２回投与計画を用いた前記の組成物による非応答性の軽減方法は、さらに別の局面である。
【０２６５】
実施例７−Ｃ型髄膜炎菌多糖−プロテインＤ複合体（ＰＳＣ−ＰＤ）
Ａ：プロテインＤの発現
実施例１と同様。
【０２６６】
Ｂ：多糖Ｃの製造
Ｃ群多糖の供給源は、髄膜炎菌のＣ11菌株である。これを、古典的発酵技術（EP 72513）を用いて発酵させる。複合過程に用いられる乾燥粉末多糖は、Mencevax（SB Biologicalsも参照）と同一である。
【０２６７】
Ｃ11菌株のアリコートを解氷し、0.1 mlの懸濁液を、酵母菌抽出透析物（10％、v/v）を補充したMueller Hinton培地ペトリ皿上に画線し、水飽和空気インキュベーター中で36℃で23〜25時間インキュベートする。
【０２６８】
次に、表面増殖物を滅菌発酵培地中に再懸濁して、この懸濁液を、酵母菌抽出透析物（10％、v/v）を補充したMueller Hinton培地および滅菌ビーズガラスを含入する１つのRouxボトル上に接種する。水飽和空気インキュベーター中で36℃で23〜25時間のRouxボトルのインキュベーション後、表面増殖物を10 mlの滅菌発酵培地中に再懸濁して、0.2〜0.3 mlのこの懸濁液を12の他のMueller Hinton培地Rouxボトル上に接種する。
【０２６９】
水飽和空気インキュベーター中で36℃で23〜25時間のインキュベーション後、表面増殖物を10 mlの滅菌発酵培地中に再懸濁する。細菌懸濁液を円錐フラスコ中にプールする。
【０２７０】
次にこの懸濁液を、滅菌注射器を用いて無菌的に発酵器に移す。
【０２７１】
陰圧下で清浄室中に入れた発酵器中で髄膜炎菌の発酵を実施する。発酵は一般に、約1010個の細菌／mlに対応して約10〜12時間後（即ち早期定常期）に完了され、ｐＨ増大により検出される。
【０２７２】
この段階で、全ブロスを熱不活性化（56℃で12分）した後、遠心分離する。不活性化の前後に、ブロスの試料を採取し、Mueller Hinton培地ペトリ皿上に画線する。
【０２７３】
Ｃ：ＰＳ精製
精製方法は、全発酵ブロス上で実施される多段階手法である。精製の第一段階では、遠心分離により不活性培養を清澄化して、上清を回収する。
【０２７４】
多糖精製は、第四級アンモニウム塩（セチルトリメチルアンモニウムブロミド／ＣＴＡＢ、CETAVLON R）による沈降に基づいている。ＣＴＡＢは、それらのｐＩによって、多糖、核酸およびタンパク質のような多陰イオンと不溶性複合体を形成する。イオン制御条件後、この方法を用いて、不純物（低導電率）または多糖（高導電率）を沈降させ得る。
【０２７５】
清澄化上清に含有される多糖を、マトリックスとして珪藻土（セライト（商標）545）を用いて沈降させて、異なる沈降／精製中の不溶性不活性塊の形成を回避する。
【０２７６】
髄膜炎菌多糖Ｃに関する精製計画：
工程１：セライト（商標）545上でのＰＳＣ−ＣＴＡＢ複合体固定および0.05％ＣＴＡＢを用いた洗浄による細胞破砕屑、核酸およびタンパク質の除去。
【０２７７】
工程２：50％ＥｔＯＨによるＰＳの溶離。混濁した、そして不純物およびＬＰＳを含有する第一分画を廃棄する。以後の分画中のＰＳの存在を、凝集検定により立証する。
【０２７８】
工程３：セライト（商標）545上でのＰＳＣ−ＣＴＡＢ複合体再固定および0.05％ＣＴＡＢ洗浄による小型核酸およびタンパク質の除去。
【０２７９】
工程４：50％ＥｔＯＨによるＰＳの溶離。第一混濁分画を廃棄する。以後の分画中のＰＳの存在を、凝集検定により立証する。
【０２８０】
溶離液を濾過し、粗製多糖を含有する濾液を収集する。エタノールを付加して最終濃度を80％とすることにより、多糖を濾液から沈降させる。次に、多糖を白色粉末として回収し、真空乾燥して、-20℃で貯蔵する。
【０２８１】
Ｄ：ＣＤＡＰ複合化（conjugation）
ＰＳＣおよびＰＤの複合化
ＰＳＣおよびＰＤの複合化のためには、古典的ＣＮＢｒ活性化およびスペーサーを介した担体タンパク質との結合よりＣＤＡＰ複合技法が好まれる。１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）を用いたシアニル化により、多糖を先ず活性化する。ＣＤＡＰは水溶性シアニル化試薬であって、この場合、シアノ基の求電子性はＣＮＢｒの場合を上回って増大され、シアニル化反応を相対的に低刺激性条件下で実施させる。活性化後、多糖は、いかなるスペーサー分子も導入せずに、そのアミノ基により担体タンパク質に直接結合され得る。未反応エステルシアネート基は、グリシンとの広範な反応によりクエンチングされる。複合体ワクチンの調製に関与する工程の総数は低減され、最も重要なのは、免疫原性である可能性を有するスペーサー分子が最終生成物中に存在しないことである。
【０２８２】
ＣＤＡＰによる多糖の活性化は、多糖中にシアネート基を導入し、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）が遊離される。シアネート基は、その後のカップリング手法中にタンパク質中のＮＨ2基と反応して、カルバメートに転換される。
【０２８３】
ＰＳＣ活性化およびＰＳＣ−ＰＤカップリング
活性化およびカップリングは+25℃で実施する。
【０２８４】
120 mgのＰＳを、少なくとも4時間、ＷＦＩ中に溶解する。
【０２８５】
ＣＤＡＰ溶液（アセトニトリル中に新たに調製した100 mg/ml）を付加して、ＣＤＡＰ／ＰＳ（w/w）比を0.75とする。
【０２８６】
1分30秒後、トリエチルアミンの付加によりｐＨを活性化ｐＨまで上げ、ＰＤ付加まで安定化させる。
【０２８７】
3分30秒時点で、ＮａＣｌを付加して、最終濃度を2 Mとする。
【０２８８】
4分時点で、精製ＰＤを付加して、ＰＤ／ＰＳ比を1.5/1とする。ｐＨを直ちにカップリングｐＨ（ｐＨ10）に調整する。溶液を、ｐＨ調節下で1時間放置する。
【０２８９】
クエンチング
6 mlの2 Mグリシン溶液をＰＳ／ＰＤ／ＣＤＡＰ混合物に付加する。ｐＨをクエンチングｐＨ（ｐＨ8.8）に調整する。溶液を作用温度で30分間撹拌した後、連続的にゆっくり撹拌しながら、+2〜8℃で一夜置く。
【０２９０】
ＰＳ−ＰＤ精製
濾過（5μm）後、S400HR Sephacrylゲル上でのゲル浸透クロマトグラフィーにより冷室中でＰＳ−ＰＤ複合体を精製して、小型分子（ＤＭＡＰを含む）を除去し、ＰＤ：溶離−150 mMＮａＣｌ、ｐＨ6.5を再複合化して、ＵＶ280 nm、ｐＨおよび導電率をモニタリングする。
【０２９１】
異なる分子サイズの反応構成成分を基礎にして、ＰＳ−ＰＤ複合体を先ず溶離し、その後遊離ＰＤを、そして最後にＤＭＡＰを溶離する。ＤＭＡＢ（ＰＳ）およびμＢＣＡ（タンパク質）により検出されるような複合体を含有する分画をプールする。プール分画を滅菌濾過（0.2μm）する。
【０２９２】
Ｅ：ＰＳＣ−ＰＤ吸着複合体ワクチンの処方
ＡｌＰＯ4の洗浄
ＡｌＰＯ4上のＰＳＣ−ＰＤ複合体の吸着を最適化するために、ＡｌＰＯ4を洗浄して、ＰＯ43-濃度を低減する。
【０２９３】
−ＡｌＰＯ4を150mMＮａＣｌで洗浄して、遠心分離（4ｘ）する。
【０２９４】
−次にペレットを150 mMのＮａＣｌ中に再懸濁した後、濾過（100μm）する。そして
濾液を加熱滅菌する。
【０２９５】
この洗浄ＡｌＰＯ4は、ＷＡＰ（洗浄オートクレーブ処理リン酸塩）と呼ばれる。
【０２９６】
配合方法
ＰＳＣ−ＰＤ複合体本体をＡｌＰＯ4  ＷＡＰ上に吸着させた後、完成品を最終処方する。ＡｌＰＯ4  ＷＡＰをＰＳＣ−ＰＤとともに室温で5分間撹拌する。ｐＨを5.1に調整し、混合物を室温で18時間撹拌する。ＮａＣｌ溶液を付加して150 mMとし、混合物を室温で5分間撹拌する。２−フェノキシエタノールを付加して、5 mg/mlとし、混合物を室温で15分間撹拌した後、ｐＨ6.1に調整する。
【０２９７】
最終組成物／用量
ＰＳＣ−ＰＤ：              10μgＰＳ
ＡｌＰＯ4  ＷＡＰ：        0.25 mgＡｌ3+
ＮａＣｌ：                  150 mM
２−フェノキシエタノール：  2.5 mg
注射用水：                  0.5 mlにする
ｐＨ：                      6.1
Ｆ：前臨床情報
マウスにおける他糖複合体の免疫原性
ＰＳＣ−ＰＤ複合体の免疫原性を、６〜８週齢Balb/cマウスで査定した。純（非吸着）複合体またはＡｌＰＯ4上に吸着した複合体を、一価ワクチンとして注入した。誘導された抗ＰＳＣ抗体をＥＬＩＳＡにより測定し、一方、殺細菌試験により機能性抗体を分析した。両方法は、ＣＤＣ（Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, USA）プロトコールを基礎にしている。応答対用量およびアジュバント（ＡｌＰＯ4）作用を査定するために実施した２つの異なる実験からの結果を示す。
【０２９８】
用量範囲実験
この実験では、Balb/CマウスにＰＳＣ−ＰＤを２回（2週間間隔）注射した。４つの異なる用量：0.1；0.5；2.5および9.6μg／動物のＡｌＰＯ4上処方複合体を用いた。14日目（第１回後14日目）、28日目（第２回目後14日目）および42日目（第２回後28日目）に、マウス（10匹／群）を採血した。ＥＬＩＳＡにより測定した多糖Ｃ特異的抗体の幾何学平均濃度（ＧＭＣ）を、参照としてＩｇＧを用いて、μgＩｇＧ／mlで表した。殺細菌抗体をプール血清に関して測定し、嬰児ウサギ補体の存在下で髄膜炎菌Ｃ11菌株を用いて、細菌の50％を殺害し得る稀釈液の逆数として力価を表した。
【０２９９】
得られた用量−応答曲線は、2.5μgからプラトーを示す。結果は、第１回後14日目と第2回後14日目の間に良好な追加免疫応答が認められるということを示す。第２回後28日目の抗体レベルは、第２回後14日目のレベルと少なくとも同等である。殺細菌抗体力価はＥＬＩＳＡ濃度と一致し、ＰＳＣ−ＰＤ複合体の免疫原性を確証する。
【０３００】
アジュバントの効果
この実験では、ＡｌＰＯ4上に処方された１ロットのＰＳＣ−ＰＤ複合体を査定し、純（非吸着）複合体を比較のために注射した。2μgの複合体を用いて、皮下経路により、2週間間隔で、マウス10匹／群に2回注射した。14日目（第１回後14日目）、28日目（第２回目後14日目）および42日目（第２回後28日目）にマウスを採血し、そしてＥＬＩＳＡおよび機能性抗体力価を測定した（殺細菌検定に関しては第２回後14日目および第２回後28日目のみ）。ＡｌＰＯ4処方物は、非活性調節処方物と比較した場合、10倍までの抗体力価を誘導する。
【０３０１】
結論：
前記の実験結果から、以下の全般的結論が得られた：
−ＰＳＣ−ＰＤ複合体は、連結された場合に、ＰＳＣがＴ細胞依存性抗原になるということを実証する既往性応答を誘導する。
【０３０２】
−ＥＬＩＳＡにより測定された抗ＰＳＣ抗体濃度は殺細菌性抗体力価とよく相関し、このことは、ＰＳＣ−ＰＤ複合体により誘導された抗体が髄膜炎菌血清型Ｃに対して機能的であることを示す。
【０３０３】
−ＡｌＰＯ4上に吸着された複合体約2.5μgは、マウスにおいて最適抗体応答を引き出すと思われる。
【０３０４】
−ＣＤＡＰ化学作用は、免疫原性ＰＳＣ−ＰＤ複合体を製造するための適切な方法であると思われる。
【０３０５】
実施例８−髄膜炎菌血清型Ａ−ＰＤ複合体からの多糖の調製
多糖Ａ（ＰＳＡ）の乾燥粉末を0.2 MＮａＣｌ溶液中に1時間溶解して、最終濃度を8 mg/mlとする。次に、ＨＣｌまたはＮａＯＨを用いてｐＨ値を6に固定し、溶液を25℃に熱調節する。0.75 mgＣＤＡＰ／mgＰＳＡ（調製物を100 mg/mlアセトニトリルとする）をＰＳＡ溶液に付加する。ｐＨ調節せずに1.5分後、0.2 MＮａＯＨを付加して、ｐＨを10とする。2.5分後、約1のＰＤ／ＰＳＡ比にしたがって、プロテインＤ（5 mg/mlに濃縮）を付加する。１時間のカップリング反応時間中は、ｐＨを10に保持する。次に、10 mgのグリシン（2 M、ｐＨ9.0）／mgＰＳＡを付加し、25℃で30分間、ｐＨ値を9.0に調節する。次に混合物を4℃で一夜保存した後、排除カラムクロマトグラフィー（Sephacryl S400HR, Pharmacia）により精製する。先ず複合体が、その後未反応ＰＤおよび副産物（ＤＭＡＰ、グリシン、塩）が溶離する。複合体を収集し、Sartopore膜（Sartorius）上での0.2μm濾過により滅菌する。
【０３０６】
実施例９−実施例７および８の生成物のin vitro特性化
【０３０７】
【表１９】
0005551579.tif 000020
【０３０８】
in vivo結果
Balb/Cマウスを動物モデルとして用いて、複合体の免疫原性を調べた。複合体をＡｌＰＯ4またはＡｌ（ＯＨ）3上に吸着させる（500μGのＡｌ3+上に10μgのＰＳ）か、あるいは吸着させなかった。マウスに以下のように注射した：２週間間隔で２回注射（2μgＰＳ／注射）。
【０３０９】
これらの結果から、遊離ＰＳは免疫応答に大いに影響を及ぼす、と先ず結論し得る。10％未満の遊離ＰＳを有する複合体を用いて、より良好な結果を得た。したがって、ＣＤＡＰ法に対する前記の改良は、本発明のさらなる局面である。
【０３１０】
処方物も重要である。ＡｌＰＯ4は、このモデルにおいて最も適切なアジュバントであると思われる。複合体は、多糖を単独で注射した場合には観察されない追加免疫作用を誘導する。
【０３１１】
結論
それぞれ1および0.6〜0.7（w/w）の最終ＰＳ／タンパク質比を有する髄膜炎菌ＡおよびＣの複合体を得た。遊離ＰＳおよび遊離担体タンパク質は、それぞれ10％および15％以下であった。多糖回収率は、70％より高い。前記の改良型（最適化）ＣＤＡＰ法により得られるＰＳＡおよびＰＳＣの複合体（担体タンパク質にかかわらず、しかし好ましくはプロテインＤ）は、したがって、本発明のさらなる局面である。
【０３１２】
実施例１０−ｂ型インフルエンザ菌は、２歳以下の小児における髄膜炎の主因の１つである。破傷風毒素上の複合体としてのインフルエンザ菌の莢膜多糖（ＰＲＰ）が周知である（J. Robbinsにより開発された化学作用により連結される）。ＣＤＡＰは、改良型化学である。好ましくはＰＤにＰＲＰを連結するために見出された最適ＣＤＡＰ条件について、以下に説明する。
【０３１３】
複合化の反応に影響を及ぼすパラメーターを以下に示す：
・多糖の初期濃度（遊離多糖の最終レベルにおよび滅菌濾過工程に二重の影響を及ぼし得る）
・担体タンパク質の初期濃度
・多糖対タンパク質の初期比（遊離多糖の最終レベルにおよび滅菌濾過工程に二重の影響を及ぼし得る）
・用いられるＣＤＡＰの量（通常は大余分量で）
・反応温度（多糖の分解、反応の速度論、および反応性基の分解に影響を及ぼし得る）
・活性化およびカップリングのｐＨ
・クエンチングのｐＨ（残留ＤＭＡＰのレベルに影響を及ぼす）
・活性化、カップリングおよびクエンチングの時間
最終生成物の量を最適化するための３つの最も重要なパラメーターは、多糖／タンパク質の初期比、多糖の初期濃度およびカップリングｐＨである、ということを本発明人等は見出した。
【０３１４】
したがって、前記の３つの条件を３つの軸として用いて、反応立方体を設計した。これらの軸に関する中心点（および実験値範囲）は、ＰＳ／タンパク質比−1/1（±0.3/1）；［ＰＳ］＝5 mg/ml（±2 mg/ml）；およびカップリングｐＨ＝8.0（±1.0ｐＨ単位）であった。
【０３１５】
あまり必須でないパラメーターは以下のように固定した：30 mgの多糖を用いた；温度25℃；［ＣＤＡＰ］＝0.75 mg/mgＰＳ；ｐＨは0.2 MＮａＯＨで滴定；活性化ｐＨ＝9.5；活性化温度＝1.5分間；カップリング温度＝１時間；［タンパク質］＝10 mg/ml；クエンチングｐＨ＝9.0；クエンチング温度＝1時間；溶媒中にＰＳを溶解する温度＝2 MＮａＣｌ中で１時間；12 cm／時間で150 mMＮａＣｌで用利したSephacryl S-400HR上での精製；ならびに5ml／分でのSARTOLAB P20によるフィルター滅菌。
【０３１６】
前記の反応立方体内で製品を製造する場合の最適化条件を確立するために考察されたデータを以下に示す：工程データ−濾過後の最大収率、今夕されるタンパク質の最大レベル；ならびに生成物の品質データ−最終ＰＳ／タンパク質比、遊離ＰＳレベル、遊離タンパク質レベル、残留ＤＭＡＰ（ＣＤＡＰの分解生成物）の最小レベル。
【０３１７】
濾過からの結果
濾過後の結果を左右する因子は、初期［ＰＳ］およびカップリングｐＨおよび初期ＰＳ／タンパク質比間の相互作用である。低［ＰＳ］では、後者２つの因子との相互作用はほとんど認められず、良好な濾過可能性が常に結果的に生じる（全生成物に関して約95％）。しかしながら、高濃度では、ｐＨおよび初期比が増大すれば、濾過可能性は減少する（高［ＰＳ］、最低比、最低ｐＨ＝99％濾過；しかし高［ＰＳ］、最高比およびｐＨ＝19％濾過）。
【０３１８】
タンパク質混入レベル
最終ＰＳ／タンパク質比の、初期比に関する比は、カップリングの効率の測定値である。高［ＰＳ］では、ｐＨは両比の比に影響しない。しかしながら、初期比は影響する（低初期比で1.75、高初期比で1.26）。低［ＰＳ］では、両比の比は、ほとんどの部分に関しては、より低いが、しかしながら、ｐＨは、ここではより大きい影響を有する（低ｐＨ、低比＝0.96；低ｐＨ、高比＝0.8；高ｐＨ、低比＝1.4；および高ｐＨ、高比＝0.92）。
【０３１９】
最終ＰＳ／タンパク質比
最終比は、初期比および［ＰＳ］によっている。大多数のかなり大きい最終比は、組合せ高初期比および高［ＰＳ］を用いて得られる。最終比に及ぼすｐＨの影響は、弱［ＰＳ］と同じくらい有意ではない。
【０３２０】
遊離プロテインＤのレベル
最小量の遊離プロテインＤは、高ｐＨおよび高［ＰＳ］で観察される（0.0に近似のレベル）。高［ＰＳ］の作用は、ｐＨが低い場合に特に顕著になる。初期比の上昇は、遊離プロテインＤの増大にわずかに寄与する。
【０３２１】
残留ＤＭＡＰ
初期比は、有意の作用を有さない。これに対比して、ＤＭＡＰのレベルは、［ＰＳ］に伴って増大し、ｐＨが上昇すると低減する。
【０３２２】
結論
したがって、最も好ましい複合化条件は、以下の通りである：カップリングｐＨ＝9.0；［ＰＳ］＝3 mg/ml；および初期比＝1/1。このような条件を用いた場合の、最終生成物の特徴を以下に示す：
【０３２３】
【表２０】
0005551579.tif 000021
【０３２４】
前記の改良型（最適化）ＣＤＡＰ法により得られるＰＲＰの複合体は（担体タンパク質にかかわらず、しかし好ましくはプロテインＤ）、したがって、本発明のさらなる局面である。
【０３２５】
実施例１１：抗原としてのプロテインＤ−非分類可能インフルエンザ菌に対するその防御効力は３Ｄ−ＭＰＬを用いてそれを処方することにより以下に改善され得るか
11価肺炎球菌多糖−プロテインＤ複合体ワクチンを用いて、雌Balb/cマウス（10匹／群）を、20週齢で初回（Ｄ0）の免疫感作（筋内）し、2週間後（14日目）に２回目の免疫感作を施した。２回目免疫感作後７日目に、血液を収集した。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ型抗体の量に関して、プロテインＤに対する抗体力価を測定した。
【０３２６】
室温で15分間撹拌しながら複合体を15.75％のラクトースと併合し、ｐＨを6.1±0.1に調整し、凍結乾燥することにより、凍結乾燥11価ワクチン（ＡｌＰＯ4を含有しない）を調製した（当該サイクルは通常は、-69℃で出発し、漸次3時間に亘って-24℃に調整し、次にこの温度を18時間保持した後、漸次１時間に亘って-16℃に調整し、この温度を6時間保持して、その後漸次３時間に亘って+34℃に調整し、最後にこの温度を9時間保持する）。
【０３２７】
凍結乾燥物のための処方物および再構築物の組成を表１３に示す。
【０３２８】
Ｔｈ１型細胞媒介性免疫応答が起きたか否かに関する大多数の特徴的測定値は、ＩｇＧ２ａのレベルと相関することが知られている。データから分かるように、ＩｇＧ２ａの意外にも大きい増大は、プロテインＤがＴｈ１アジュバント（この場合は３Ｄ−ＭＰＬ）とともに凍結乾燥された場合に、結果的に生じる。
【０３２９】
【表２１】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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