(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムの中に遺伝因子を含むククミス・メロ種の植物であって、
前記遺伝因子は、少なくとも１つの分子マーカに遺伝的に関連付けられた、キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を供与する量的形質座位（ＱＴＬ）またはそのＣＶＹＶ抵抗性を供与する部位を含み、
前記マーカは、Ｅ１３／Ｍ４８−２５９．６９−Ｐ２（増幅プライマー配列番号１および２、移動度２５９〜２６０ｂｐ）、Ｅ１６／Ｍ４８−３７７．３６−Ｐ２（増幅プライマー配列番号３および４、移動度３７７〜３７８ｂｐ）、Ｅ１３／Ｍ４８−２６１．３０−Ｐ２（増幅プライマー配列番号５および６、移動度２６１〜２６２ｂｐ）およびＥ２６／Ｍ６２−０７６．８−Ｐ２（増幅プライマー配列番号７および８、移動度７６〜７７ｂｐ）からなる群から選択され、
前記ＣＶＹＶ抵抗性を供与するＱＴＬまたはその部位は、アクセッション番号がＮＣＩＭＢ  ４１５８２であるメロンＣｕｃ６４９１に由来し、
前記植物は、壊死症状を生じさせることなく、ＣＶＹＶに対して抵抗性がある、植物。
【請求項２】
前記マーカは、Ｅ１６／Ｍ４８−３７７．３６−Ｐ２（増幅プライマー配列番号３および４、移動度３７７〜３７８ｂｐ）およびＥ１３／Ｍ４８−２６１．３０−Ｐ２（増幅プライマー配列番号５および６、移動度２６１〜２６２ｂｐ）からなる群から選択される、請求項１に記載の植物。
【請求項３】
前記マーカは、Ｅ１３／Ｍ４８−２６１．３０−Ｐ２（増幅プライマー配列番号５および６、移動度２６１〜２６２ｂｐ）である、請求項１または２に記載の植物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の植物に由来する植物部位。
【請求項５】
植物部位は、種子または果実である、請求項４に記載の植物部位。
【請求項６】
ククミス・メロ種のＣＶＹＶ抵抗性の植物を取得する方法であって、
少なくとも１つの分子マーカに遺伝的に関連付けられた、キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を供与する量的形質座位（ＱＴＬ）またはそのＣＶＹＶ抵抗性を供与する部位を含む遺伝因子を、交配によって前記植物のゲノムに導入するステップを含み、
前記マーカは、Ｅ１３／Ｍ４８−２５９．６９−Ｐ２（増幅プライマー配列番号１および２、移動度２５９〜２６０ｂｐ）、Ｅ１６／Ｍ４８−３７７．３６−Ｐ２（増幅プライマー配列番号３および４、移動度３７７〜３７８ｂｐ）、Ｅ１３／Ｍ４８−２６１．３０−Ｐ２（増幅プライマー配列番号５および６、移動度２６１〜２６２ｂｐ）およびＥ２６／Ｍ６２−０７６．８−Ｐ２（増幅プライマー配列番号７および８、移動度７６〜７７ｂｐ）からなる群から選択され、
前記ＣＶＹＶ抵抗性を供与するＱＴＬまたはその部位は、アクセッション番号がＮＣＩＭＢ  ４１５８２であるメロンＣｕｃ６４９１に由来する、方法。
【請求項７】
前記マーカは、Ｅ１６／Ｍ４８−３７７．３６−Ｐ２（増幅プライマー配列番号３および４、移動度３７７〜３７８ｂｐ）およびＥ１３／Ｍ４８−２６１．３０−Ｐ２（増幅プライマー配列番号５および６、移動度２６１〜２６２ｂｐ）からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記マーカは、Ｅ１３／Ｍ４８−２６１．３０−Ｐ２（増幅プライマー配列番号５および６、移動度２６１〜２６２ｂｐ）である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれかに記載の方法によって得ることができる、ククミス・メロ種のキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性の植物。
【請求項１０】
ククミス・メロ種のキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性の植物を得るための、Ｅ１３／Ｍ４８−２５９．６９−Ｐ２（増幅プライマー配列番号１および２、移動度２５９〜２６０ｂｐ）、Ｅ１６／Ｍ４８−３７７．３６−Ｐ２（増幅プライマー配列番号３および４、移動度３７７〜３７８ｂｐ）、Ｅ１３／Ｍ４８−２６１．３０−Ｐ２（増幅プライマー配列番号５および６、移動度２６１〜２６２ｂｐ）およびＥ２６／Ｍ６２−０７６．８−Ｐ２（増幅プライマー配列番号７および８、移動度７６〜７７ｂｐ）からなる群から選択される少なくとも１つの分子マーカの使用。
【請求項１１】
マーカは、Ｅ１６／Ｍ４８−３７７．３６−Ｐ２（増幅プライマー配列番号３および４、移動度３７７〜３７８ｂｐ）およびＥ１３／Ｍ４８−２６１．３０−Ｐ２（増幅プライマー配列番号５および６、移動度２６１〜２６２ｂｐ）からなる群から選択される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記マーカは、Ｅ１３／Ｍ４８−２６１．３０−Ｐ２（増幅プライマー配列番号５および６、移動度２６１〜２６２ｂｐ）である、請求項１０または１１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キュウリ葉脈黄化ウイルス（Cucumber Vein Yellowing Virus）（ＣＶＹＶ）抵抗性のククミス・メロ（Cucumis melo）植物、およびそれに由来する植物部位に関する。この発明はさらに、上記植物の生産方法、上記方法によって得ることができるＣＶＹＶ抵抗性の植物、および上記ＣＶＹＶ抵抗性の植物に由来する植物部位に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＶＹＶは、ポティウイルス科のイポモウイルス属に属している。ＣＶＹＶは、一般に長さが７４０〜８００ｎｍであり、幅が１５〜１８ｎｍである棒状の粒子を備える、どちらかといえば不安定なウイルスである。ＣＶＹＶのウイルス核酸は二本鎖ＲＮＡからなっていると報告されている。
【０００３】
このウイルスは、ウリ科の植物に主に限定される狭い宿主域を有する。このウリ科は、キュウリ、（カボチャを含む）スクワッシュ、メロンおよびスイカのような経済的に重要な作物を含む。ＣＶＹＶ感染は一般にキュウリの生産では問題であるが、スクワッシュ、ズッキーニ、スイカおよびメロンの生産もＣＶＹＶ感染の影響を受ける。
【０００４】
ＣＶＹＶは、一般に、コナジラミ、タバココナジラミによって伝染する。ＣＶＹＶに感染したククミス・メロ（メロン）種の植物は、葉脈黄化または葉脈透化および発育阻害を示し、対応して収穫量が減少する。ＣＶＹＶ感染は、植物の枯死も引起し得る。
【０００５】
したがって、作物がＣＶＹＶに汚染されると、壊滅的な影響を受ける可能性がある。たとえばコナジラミのいない環境で苗を育てることによる感染の防止、または、たとえば殺虫剤を用いた処理は、一般に費用がかかり、および／または、環境に優しくない。さらに、これらの方法は、必ずしも満足のいく結果をもたらすとは限らない。
【０００６】
ＣＶＹＶに対する抵抗性を発見しようとするいくつかの試みがなされてきたが、これまでのところククミス・メロ種の植物ではこのような抵抗性は記述されていない。Ｃ．アフリカヌス（C. africanus）、Ｃ．ディプサケウス（C. dipsaceus）およびＣ．プロフェタルム（C. prophetarum）（ニエト（Nieto）等、BMC Plant Biology (2007)7:34）のような他のキュウリ属の種については、ＣＶＹＶに対する抵抗性が報告されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ＣＶＹＶに対して抵抗性があるククミス・メロ種の植物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この目的は、この発明によって、ゲノムの中に遺伝因子を含むククミス・メロ種の植物であって、上記遺伝因子は、少なくとも１つの分子マーカに遺伝的に関連付けられたキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を供与する量的形質座位（Quantitative Trait Locus）（ＱＴＬ）またはそのＣＶＹＶ抵抗性を供与する部位を含み、上記マーカは、Ｅ１３／Ｍ４８−２５９．６９−Ｐ２（増幅プライマー配列番号１および２、移動度２５９〜２６０ｂｐ）、Ｅ１６／Ｍ４８−３７７．３６−Ｐ２（増幅プライマー配列番号３および４、移動度３７７〜３７８ｂｐ）、Ｅ１３／Ｍ４８−２６１．３０−Ｐ２（増幅プライマー配列番号５および６、移動度２６１〜２６２ｂｐ）およびＥ２６／Ｍ６２−０７６．８−Ｐ２（増幅プライマー配列番号７および８、移動度７６〜７７ｂｐ）からなる群から選択され、上記植物はＣＶＹＶに対して抵抗性がある、植物を提供することによって、達成される。
【０００９】
本発明によれば、「ＣＶＹＶ抵抗性の」および「ＣＶＹＶ抵抗性」という用語は、類似の環境条件および害虫圧力下で、非抵抗性の、すなわち感受性の植物と比較して、その植物が、通常の病原体圧力下でのそのウイルスの成長および発育を制限する能力に関連する。
【００１０】
抵抗性の植物と感受性の植物との区別は、たとえば、機械的接種に基づく方法によって決定できる。このため、ＣＶＹＶ接種原混合物は、リン酸緩衝液（ＫＨ２ＰＯ４  ｐＨ＝７．０）中で１０グラムのＣＶＹＶに感染した新鮮なキュウリ（C. sativus L.）の葉をすりつぶすことによって準備された。その後、この混合物に活性炭およびカーボランダム粉末が添加された。接種前に、メロンの苗にカーボランダムがまかれた。
【００１１】
「ＱＴＬ」という用語は、本明細書では、当該技術分野において認識されている意味で用いられている。「ＣＶＹＶ抵抗性を供与するＱＴＬ」という用語は、ＣＶＹＶ抵抗性をコードする少なくとも１つの遺伝子に関連し、メロンの特定の染色体上に位置する領域、または少なくとも調節領域、すなわちＣＶＹＶ抵抗性に関与する１つ以上の遺伝子の発現を制御する染色体の領域を指す。
【００１２】
ＱＴＬは、たとえば、その生成物が遺伝的抵抗性を供与する１つ以上の遺伝子を、含んでいてもよい。代替的に、ＱＴＬは、たとえば、その生成物が植物のゲノムにおける他の遺伝子座の遺伝子の発現に影響を及ぼし、それによってＣＶＹＶ抵抗性を供与する調節遺伝子または調節配列を、含んでいてもよい。
【００１３】
本発明によれば、「分子マーカ」という用語は、核酸配列の特徴の違いを視覚化する方法で用いられるインジケータを指す。このようなインジケータの例は、制限断片長多型（restriction fragment length polymorphism）（ＲＦＬＰ）マーカ、増幅断片長多型（amplified fragment length polymorphism）（ＡＦＬＰ）マーカ、単一ヌクレオチド多型（single nucleotide polymorphisms）（ＳＮＰｓ）、挿入変異、マイクロサテライトマーカ、配列特徴増幅領域（sequence-characterized amplified regions）（ＳＣＡＲｓ）、開裂増幅多型配列（cleaved amplified polymorphic sequence）（ＣＡＰＳ）マーカ、またはアイソザイムマーカ、または特定の遺伝的位置および染色体位置を規定する、本明細書に記載されるマーカの組合せである。
【００１４】
したがって、本明細書で規定される「ＱＴＬに関連付けられた分子マーカ」は、ＳＮＰｓ、挿入変異、およびより通常のＡＦＬＰマーカ、または当該技術分野において用いられるその他のタイプのマーカを指してもよい。
【００１５】
この分子マーカを用いて、このキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を供与する量的形質座位（ＱＴＬ）またはそのＣＶＹＶ抵抗性を供与する部位を検出する好ましい方法は、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）である。ＡＦＬＰは、キージーン  Ｎ．Ｖ．（オランダ，ワーゲニンゲン）によって１９９０年代初頭に開発されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を基礎とする遺伝子指紋手法である。
【００１６】
ＡＦＬＰ法では、制限酵素を用いてゲノムＤＮＡを切断し、その後、制限断片の端部に相補的な二本鎖アダプタを連結させる。次いで、制限断片のサブセットは、アダプタおよび制限部位断片に相補的なプライマー対を用いて増幅される。この断片は視覚化され、標準的なＤＮＡラダーに対して移動度または断片の大きさが判断されて、その分子量を塩基対（ｂｐ）で推定する。これは、たとえば、オートラジオグラフィ法または蛍光法（ボス（Vos）等、Nucleic Acids Res. 1995 23(21):4407）によって変性ポリアクリルアミドゲル上で行うことができる。
【００１７】
上記ＡＦＬＰ法は、一般に、異なる大きさの多数の核酸増幅断片をもたらす。たとえば感受性の植物から得られた核酸増幅断片と、抵抗性の植物から得られた核酸増幅断片とを比較し、核酸増幅断片を識別し、特定の量的形質座位の存在を示し、特定の量的形質座位で分離することによって、増幅断片を特定できる。このような特定された、識別力のある増幅断片は、一般に、抵抗性の表現型などの特定の表現型を有するマーカと呼ばれている。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の発明者らは、驚くべきことに、ゲノムマーカＥ１３／Ｍ４８−２５９．６９−Ｐ２（増幅プライマー配列番号１および２、移動度２５９〜２６０ｂｐ）、Ｅ１６／Ｍ４８−３７７．３６−Ｐ２（増幅プライマー配列番号３および４、移動度３７７〜３７８ｂｐ）、Ｅ１３／Ｍ４８−２６１．３０−Ｐ２（増幅プライマー配列番号５および６、移動度２６１〜２６２ｂｐ）およびＥ２６／Ｍ６２−０７６．８−Ｐ２（増幅プライマー配列番号７および８、移動度７６〜７７ｂｐ）を含む植物はすべてキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性の表現型を有していたのに対して、これらのマーカを欠く植物はキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）感受性の表現型を有することを発見した。したがって、これらのマーカは、このＣＶＹＶ抵抗性を供与する遺伝因子に遺伝的に関連付けられ、またこのＣＶＹＶ抵抗性を供与する遺伝因子を特定することができる。
【００１９】
本発明の好ましい実施の形態によれば、この抵抗性を供与する量的形質座位に関連付けられたマーカは、Ｅ１６／Ｍ４８−３７７．３６−Ｐ２（増幅プライマー配列番号３および４、移動度３７７〜３７８ｂｐ）、Ｅ１３／Ｍ４８−２６１．３０−Ｐ２（増幅プライマー配列番号５および６、移動度２６１〜２６２ｂｐ）およびＥ２６／Ｍ６２−０７６．８−Ｐ２（増幅プライマー配列番号７および８、移動度７６〜７７ｂｐ）からなる群から選択される。
【００２０】
より好ましくは、この抵抗性を供与する量的形質座位に関連付けられたマーカは、Ｅ１３／Ｍ４８−２６１．３０−Ｐ２（増幅プライマー配列番号５および６、移動度２６１〜２６２ｂｐ）である。
【００２１】
特に好ましい実施の形態によれば、ＣＶＹＶ抵抗性を供与するＱＴＬまたはその部位は、メロン在来種Ｃｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）に由来する。
【００２２】
メロンアクセッション（accession）Ｃｕｃ６４９１という用語は、本明細書において特定されるＣＶＹＶ抵抗性を供与するＱＴＬの供給源を示すために用いられ、当業者に周知のパブリックコレクションまたは寄託機関のいずれかから入手可能なアクセッション、およびそのＣＶＹＶ抵抗性の誘導体を含む。
【００２３】
その後、上記抵抗性をククミス・メロ種の植物に導入した。この発明によって、Ｃｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）で特定されるこの抵抗性形質がＣ．メロ植物のゲノムに安定的に固定され、壊死症状を生じさせることがない、完全に抵抗性がある植物を提供できたことがわかった。適切なＣｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）セグメントを含むＣ．メロ植物は、一度ＣＶＹＶを接種されても、感受性の対照植物とは異なって、典型的なＣＶＹＶモザイク症状がない。
【００２４】
したがって、本発明は、また、ククミス・メロ種の植物であって、上記植物は、ＣＶＹＶ抵抗性を供与するＱＴＬまたはそのＣＶＹＶ抵抗性を供与する部位を含む遺伝因子、たとえば遺伝子移入断片を含み、この植物はＣＶＹＶ抵抗性がある、植物に関する。特定の実施の形態では、この発明のＣＶＹＶ抵抗性の植物は、メロンアクセッションＣｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）ではない。
【００２５】
メロンアクセッションＣｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）という用語は、本明細書において特定されるＣＶＹＶ抵抗性を供与するＱＴＬの供給源を示すために用いられ、当業者に周知のパブリックコレクションまたは寄託機関のいずれかから入手可能なアクセッション、およびそのＣＶＹＶ抵抗性の誘導体を含む。
【００２６】
本発明はさらに、上述のククミス・メロ種のＣＶＹＶ抵抗性の植物に由来する植物部位に関する。この植物部位は、植物中のままの植物細胞などの単細胞および細胞組織、メロン植物を再生できる細胞集塊および組織培養物を含むメロン植物の任意の部位であってもよい。植物部位の例は、花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、葯、花、果実、茎、芽および種子からの単細胞および組織、ならびに花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、葯、花、果実、茎、芽、若枝、根茎、種子、プロトプラスト、カルスなどを含むが、それらに限定されない。好ましくは、植物部位は、種子または果実である。
【００２７】
本発明はさらに、ククミス・メロ種のＣＶＹＶ抵抗性の植物を取得する方法であって、上記方法は、少なくとも１つの分子マーカに遺伝的に関連付けられたキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を供与する量的形質座位（ＱＴＬ）またはそのＣＶＹＶ抵抗性を供与する部位を含む遺伝因子を上記植物のゲノムに導入するステップを含み、上記マーカは、Ｅ１３／Ｍ４８−２５９．６９−Ｐ２（増幅プライマー配列番号１および２、移動度２５９〜２６０ｂｐ）、Ｅ１６／Ｍ４８−３７７．３６−Ｐ２（増幅プライマー配列番号３および４、移動度３７７〜３７８ｂｐ）、Ｅ１３／Ｍ４８−２６１．３０−Ｐ２（増幅プライマー配列番号５および６、移動度２６１〜２６２ｂｐ）およびＥ２６／Ｍ６２−０７６．８−Ｐ２（増幅プライマー配列番号７および８、移動度７６〜７７ｂｐ）からなる群から選択される、方法に関する。
【００２８】
この方法によれば、上記マーカは、好ましくは、Ｅ１６／Ｍ４８−３７７．３６−Ｐ２（増幅プライマー配列番号３および４、移動度３７７〜３７８ｂｐ）およびＥ１３／Ｍ４８−２６１．３０−Ｐ２（増幅プライマー配列番号５および６、移動度２６１〜２６２ｂｐ）からなる群から選択され、より好ましくは、上記マーカは、Ｅ１３／Ｍ４８−２６１．３０−Ｐ２（増幅プライマー配列番号５および６、移動度２６１〜２６２ｂｐ）である。
【００２９】
特に好ましい実施の形態によれば、上記ＣＶＹＶ抵抗性を供与するＱＴＬまたはその部位は、アクセッション番号がＮＣＩＭＢ  ４１５８２であるメロンＣｕｃ６４９１に由来する。
【００３０】
この方法のさらに別の好ましい実施の形態によれば、上記植物は、アクセッション番号がＮＣＩＭＢ  ４１５８２であるメロンＣｕｃ６４９１ではない。
【００３１】
本発明によれば、本発明のＱＴＬまたはそのＣＶＹＶ抵抗性を供与する部位を含む遺伝因子、すなわち核酸（好ましくはＤＮＡ）は、ＣＶＹＶ抵抗性のメロン植物の生産に用いられる。したがって、この発明は、ＣＶＹＶ抵抗性のメロン植物を生産するための本発明のＱＴＬまたはその部位の使用であって、この使用は、上記ＱＴＬを含む核酸配列を、ＣＶＹＶ感受性のレシピエントメロン植物に導入することを含む、使用を提供する。上記核酸配列は、好適なＣＶＹＶ抵抗性のドナーメロン植物に由来してもよい。
【００３２】
好ましくは、上記ＣＶＹＶ抵抗性を供与するＱＴＬまたはその部位を含む遺伝因子（核酸断片）は、メロンアクセッションＣｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）に由来する。ＣＶＹＶに対して抵抗性を示し、かつＣＶＹＶ抵抗性をコードする１つ以上の遺伝子を含む他の関連するメロン植物も、ＣＶＹＶ抵抗性のドナー植物として利用されてもよい。なぜなら、この材料を如何に特定できるかについて本発明が説明しているためである。
【００３３】
この発明のＱＴＬまたはその抵抗性を供与する部位を含む遺伝因子、すなわち（単離された）核酸をメロン植物に導入することは、当業者に公知の任意の方法によって行なわれてもよい。好ましくは、導入は、交配によって行なわれる。このような実施の形態では、本発明の方法は、メロンアクセッションＣｕｃ６４９１の植物またはそのＣＶＹＶ抵抗性の誘導体をＣＶＹＶ感受性のメロン植物と交配させるステップと、交配種から種子を採取するステップと、上記種子を成長させて、Ｆ１子孫植物を生産するステップと、上記Ｆ１子孫植物をドナーまたはレシピエント親と自殖または戻し交配して、Ｆ２種子を生産するステップと、上記Ｆ２種子を成長させて、Ｆ２子孫植物を生産するステップと、上記Ｆ２子孫植物のうちの少なくとも１つのゲノムの中にＣＶＹＶ抵抗性を供与するＱＴＬの存在を判断するステップ（ここで、上記ＱＴＬの存在は、上記少なくとも１つのＦ２子孫植物のＤＮＡの中に、上記ＱＴＬに関連付けられたマーカの存在を検出することによって確認される）とを、備えていてもよい。
【００３４】
上記遺伝因子はさらに、形質転換、プロトプラスト融合、ダブルハプロイド手法または胚救出（embryo rescue）またはその他の核酸導入システムによって導入されてもよく、その後、任意に、ＱＴＬを含みかつＣＶＹＶ抵抗性を示す子孫植物が選択されてもよい。トランスジェニック導入法では、本発明に係るＣＶＹＶ抵抗性のためのＱＴＬまたはそのＣＶＹＶ抵抗性を供与する部位を含む核酸配列は、当該技術分野において公知の方法を用いてドナー植物から単離されてもよい。このようにして単離された核酸配列は、トランスジェニック法によって、たとえばベクターを用いて、配偶子で、または上記核酸配列でコーティングされた弾道粒子（ballistic particle）などのその他の好適な導入因子で、レシピエント植物に導入してもよい。
【００３５】
植物形質転換は、一般に、植物細胞において機能することになる発現ベクターの構築を含む。本発明では、このようなベクターは、本発明のＣＶＹＶ抵抗性のためのＱＴＬまたはそのＣＶＹＶ抵抗性を供与する部位を含む核酸配列を含み、このベクターは、プロモータなどの、調節因子の制御下にあるか、または調節因子に動作可能に関連付けられるＣＶＹＶ抵抗性を供与する遺伝子を含んでいてもよい。発現ベクターは、１つ以上のこのような動作可能に関連付けられた遺伝子／調節因子の組合せに含まれる遺伝子のうちの少なくとも１つがＣＶＹＶ抵抗性をコードするという条件で、これらの組合せを含んでいてもよい。ベクターは、プラスミドの形態であってもよく、アグロバクテリウム形質転換システムなどの当該技術分野において公知の形質転換法を用いて、ＣＶＹＶ抵抗性のトランスジェニック植物を生産する方法において、単独でまたは他のプラスミドと組合せて用いることができる。
【００３６】
したがって、本発明によれば、「導入する」または「遺伝子移入する」という用語は、ある種、種類または品種の遺伝子または核酸が、別の種、種類または品種のゲノムに伝達される、自然なプロセスおよび人工的なプロセスの両方のプロセス、たとえばある種と別の種との交配などによるプロセスを指す。このプロセスは、任意に、反復親への戻し交配によって完結させてもよい。
【００３７】
本発明はさらに、上述の方法によって得ることができるククミス・メロ種のＣＶＹＶ抵抗性の植物、ならびに種子および／または果実など（ただし、それらに限定されない）の、上記植物に由来する任意の植物部位に関する。したがって、上記ＣＶＹＶ抵抗性のメロン植物またはその部位は、メロンアクセッションＣｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）に由来する、上述のＣＶＹＶ抵抗性に関連するＱＴＬまたはそのＣＶＹＶ抵抗性を供与する部位、またはそのＣＶＹＶ抵抗性の誘導体をそのゲノムの中に含む（ただし、上記ＱＴＬまたは上記そのＣＶＹＶ抵抗性を供与する部位は、自然な遺伝的バックグラウンドの中にはない）。このような植物は、当該技術分野において周知である、トランスジェニックまたは非トランスジェニックのさまざまな方法を用いることによって得てもよい。
【００３８】
本発明はさらに、発明の範囲を限定することを決して意図していない以下の実施例に示される。
【００３９】
実施例
【実施例１】
【００４０】
メロンにおけるＣＶＹＶ抵抗性のためのＱＴＬマッピング
序論
ＣＶＹＶ感受性のガリア（Galia）系統ＭＬ１００＿ＰＩと、ＣＶＹＶ抵抗性の系統Ｃｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）との交配種から、３００個のＦ２集団を構築した。３００個の植物はすべて、それらのＣＶＹＶ抵抗性レベルについて２つの植物発育段階で表現型を分類された。その後、ＱＴＬマッピングアプローチを用いて、ＣＶＹＶに対する抵抗性を制御するＱＴＬに関連付けられたマーカを特定した。
【００４１】
材料および方法
ＭＬ１００  ×  Ｃｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）集団の３００個のＦ２個体の葉材料、および両方の親系統からの葉材料を得た。
【００４２】
ＱＴＬ分析に用いられる表現型データは、Ｆ２植物当たりの抵抗性のレベルからなっている。１部位で２日にわたって（２００７年５月および６月）表現型を測定した。２つの表現型クラスを以下のように区別した：
Ｒ＝抵抗性がある
Ｓ＝感受性がある。
【００４３】
結果
ＥｃｏＲＩ／ＭｓｅＩマトリックス由来の４８個のＡＦＬＰプライマーの組合せ（ＰＣ）が、両方の親系統ＭＬ１００およびＣｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）でスクリーニングされた。ＰＣ当たりのマーカの数は、表１に示されている。
【００４４】
【表１】
0005492893.tif 000002
【００４５】
スクリーニングの結果、１７９個の共優性的に記録されたＡＦＬＰマーカを含むデータセットがもたらされた。専門のソフトウェア（CarteBlanche，キージーン  Ｎ．Ｖ．，ワーゲニンゲン，オランダ）を用いて遺伝子地図を構築した。
【００４６】
１７９個の共優性的に記録されたマーカのうち合計１５４個のマーカを、総地図長が５０５．７ｃＭである少なくとも３つのマーカを含む１５個の連鎖群に分割した。
【００４７】
ＱＴＬを特定するために、Windows QTL cartographer 2.0（ワン  Ｓ．，Ｃ．Ｊ．バステン，およびＺ．Ｂ．ツァン，ノースカロライナ州立大学統計学部，ＵＳＡ）を用いた。分析は、いくつかの統計的方法（単一マーカ分析、間隔マッピングおよび合成間隔マッピング）を用いて行なった。
【００４８】
単一マーカ分析（Single Marker Analysis）（ＳＭＡ）は、マーカ位置における個々の遺伝子型と対応する表現型の値との相関関係をスキャンする。マーカ位置毎に、尤度検定が行なわれる。宣言された閾値をピークが超えると、ＱＴＬが発見される。ＳＭＡでは、ＬＯＤの閾値３．５を選択した。
【００４９】
間隔マッピング（Interval Mapping）（ＩＭ）は、ＳＭＡ法の延長線上にある。ＩＭ法は、２つの目に見える隣接マーカを用いて、仮想のＱＴＬが配置される間隔を構築し、尤度検定を行なって、そのＱＴＬを確認または放棄する。間隔におけるインクリメントステップ毎にＬＯＤ値を計算する。また、ゲノム全体についてＬＯＤスコアプロファイルを計算する。ＩＭは、相加および優性効果、因子寄与（explained variance）、ならびに試験されている位置についてのいくつかの他のパラメータなどのパラメータを計算する。並べ替え検定を行なうことによって計算された閾値をピークが超えると、ＱＴＬの特定が宣言される。
【００５０】
合成間隔マッピング（Composite Interval Mapping）（ＣＩＭ）は、ＩＭ法と同じ分析を行なうが、ゲノムの他の領域におけるマーカからの偏回帰係数を含めることによって他のＱＴＬからの分散を考慮に入れる。理論上は、ＣＩＭは、より多くの能力および精度を与える。
【００５１】
２００７年５月に測定された表現型
ある１つのＱＴＬが検出された。ＩＭおよびＣＩＭを用いたときに、マーカスコアと表現型との関連性が検出された。並べ替え検定を行なって、表現型データのＬＯＤ有意閾値を計算した（ＩＭ：閾値ＬＯＤ＝３．９１およびＣＩＭ：閾値ＬＯＤ＝３．９７）。最良のマーカであるＥ２６／Ｍ６２−０７６．８は、Ｆ２集団のこのサブセットではＬＯＤ値が４．８１である１９．２％の分散を説明する（ＣＩＭ）。
【００５２】
２００７年６月に測定された表現型
ある１つのＱＴＬが検出された。ＩＭおよびＣＩＭを用いたときに、マーカスコアと表現型との関連性が検出された。並べ替え検定を行なって、表現型データのＬＯＤ有意閾値を計算した（ＩＭ：閾値ＬＯＤ＝３．７３およびＣＩＭ：閾値ＬＯＤ＝３．６０）。この分析は、ＣＶＹＶ抵抗性に関与する単一遺伝子座が連鎖群９に存在することをマーカＭ１を用いて確認し、マーカＭ１は、Ｆ２集団のこのサブセットではＬＯＤ値が３．８２である１０．９％の分散を説明する（ＣＩＭ）。
【００５３】
結論
ＭＬ１００（ＣＶＹＶ感受性）  ×  Ｃｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）（ＣＶＹＶ抵抗性）Ｆ２集団の９２個のＦ２個体に１７９個のＡＦＬＰマーカを記録した。総地図長が５０５．７ｃＭである、１５個の連鎖群からなる１５４個のＡＦＬＰマーカを含む遺伝子地図を構築した。
【００５４】
表現型データを用いたＱＴＬマッピングの結果、ある１つのＣＶＹＶ  ＱＴＬが特定された。このＱＴＬは、連鎖群９にマッピングされた。２００７年５月の第１の表現型の測定では、最良のマーカはＥ２６／Ｍ６２−０７６．８であり、ＬＯＤ値が４．８１である１９．２％の分散を説明する。２００７年６月の表現型の測定では、Ｍ１が最良のマーカであり、ＬＯＤ値が３．８２である１０．９％の分散を説明する。
【実施例２】
【００５５】
メロンにおけるＣＶＹＶ抵抗性遺伝子座の継続マッピング
序論
ＣＶＹＶ感受性のガリア系統ＭＬ１００とＣＶＹＶ抵抗性の系統Ｃｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）との交配種から、３００個のＦ２集団を構築した。Ｆ２植物はすべて、ＣＶＹＶ抵抗性レベルについて２つの植物発育段階で表現型を分類された。実施例１では、９２個のＦ２植物およびＦ２表現型データを用いたＱＴＬマッピングの結果、ＭＬ１００  ×  Ｃｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）遺伝子地図の連鎖群９上に１つの遺伝子座が特定され、これがＣＶＹＶ抵抗性の制御に関与すると推定される。
【００５６】
その後、Ｆ２植物のＦ３ファミリーに対して病理試験（pathotest）を行なった。これは、追加の遺伝子座をマッピングし、ＭＬ１００  ×  Ｃｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）遺伝子地図を拡張して、新たな表現型データを用いて、以前のプロジェクトにおいて特定された推定遺伝子座を実証することを目的としていた。
【００５７】
材料
このプロジェクトのために実施例１の生物材料を用いた。すなわち、ＭＬ１００  ×  Ｃｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）Ｆ２集団の３００個のＦ２個体（ボックス番号：ＳＭ０７  ３３２、ＳＭ０７  ３３３、ＳＭ０７  ３３４およびＳＭ０７  ３３５）の葉材料を用いた。また、親系統ＭＬ１００およびＣｕｃ６４９１から葉材料を得た。さらに、この実施例では、ＣＶＹＶ抵抗性について表現型を分類された生殖質パネルの生物材料（ボックスＮＭＢ０７−４９）を用いた。
【００５８】
３つの異なる表現型テストにおいて表現型データが生成された。病理試験は、以下のとおり行なわれた。
【００５９】
１）  自然感染によって感染したＦ２植物に対して第１の試験を行なった。２日にわたって（２００７年５月および６月）表現型を測定した。２つの表現型クラスを以下のように区別した：Ｒ＝抵抗性がある、およびＳ＝感受性がある。ＱＴＬマッピング分析によってＣＶＹＶ抵抗性遺伝子座を特定するために、両方の日付の表現型を別個に用いた。
【００６０】
２）  Ｆ３ファミリーに対して第２の表現型テストを行なった。入手可能な種子の数に応じて、Ｆ３ファミリー毎にファミリー当たり最大２０個のＦ３個体を自然感染によってＣＶＹＶに感染させた（ＣＶＹＶ＿Ｆ３  ｎａｔ）。２つのクラス、すなわち抵抗性のクラスおよび感受性のクラスのそれぞれにおいて、抵抗性のレベルについて各Ｆ３植物を記録した。
【００６１】
３）  Ｆ３ファミリーに対して第３の試験も行なった。入手可能な種子の数に応じて、Ｆ３ファミリー毎にファミリー当たり最大２５個のＦ３個体を機械的感染法を用いてＣＶＹＶに感染させた（ＣＶＹＶ＿Ｆ３  ｍｅｃ）。また、この試験では、２つのクラス、すなわち抵抗性のクラスおよび感受性のクラスのそれぞれにおいて、抵抗性のレベルについて各Ｆ３植物を記録した。
【００６２】
結果
連鎖群９の上部に着目するＭＬ１００  ×  Ｃｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）遺伝子地図の拡張
実施例１では、メロン連鎖群９の一部がＭＬ１００  ×  Ｃｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）遺伝子地図によってカバーされないことがわかった。さらに、ＱＴＬマッピング結果は、ＣＶＹＶ抵抗性遺伝子座がこの領域に位置決めされていることを示唆している。これを実証するために、ＭＬ１００  ×  Ｃｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）遺伝子地図を特にこの領域向けに拡張した。
【００６３】
ＢＳＡアプローチ（マイケルモア等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA., (1991) 8(21):9828）を用いることによるさらなるＡＦＬＰスクリーニングを行なって、特に連鎖群９についてマーカを特定した。このスクリーニングは、マーカＭ２およびＭ３を明らかにした。
【００６４】
その後、これらのマーカを含む２つのＰＣが、ＱＴＬマッピングのために用いられるＭＬ１００  ×  Ｃｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）Ｆ２個体でスクリーニングされた。対象の２つのマーカの他に、２６個のさらなるマーカが記録され、９２個のＦ２植物に関する全データセットが２１０個の共優性的に記録されたマーカに加えられた。
【００６５】
上述の方法に従って、新たなＭＬ１００  ×  Ｃｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）遺伝子地図を構築した。ＭＬ１００  ×  Ｃｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）遺伝子地図のこのアップグレードでは、２３１個の共優性的に記録されたマーカのうち合計１９５個のマーカを、総地図長が６９８．２ｃＭである少なくとも３つのマーカを含む１５個の連鎖群に分割した。連鎖群の数（１５）は、依然として、メロンの染色体の数（ｎ＝１２）に一致しておらず、これは、ゲノムが依然としてＭＬ１００  ×  Ｃｕｃ６４９１遺伝子地図のアップグレードバージョンによって完全にカバーされているわけではないことを示唆している。
【００６６】
また、現在の地図の大きさは、メロンゲノムの一部がこの地図によってカバーされていないことを示している。メロン地図の大きさは、通常、１０００〜１５００ｃＭである。しかしながら、このプロジェクトにとって最も重要なことは、マーカＭ２の位置を０ｃＭの位置に位置決めし、マーカＭ３の位置を１３．４ｃＭの位置に位置決めすることによって、ＭＬ１００  ×  Ｃｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）遺伝子地図の連鎖群９を２９ｃＭだけ拡張することである。
【００６７】
ＭＬ１００  ×  Ｃｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）遺伝子地図を拡張した後、ＭＬ１００  ×  Ｃｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）遺伝子地図の以前のバージョンによってカバーされていなかった特定の染色体の一部におけるＣＶＹＶ抵抗性遺伝子座の地図上の位置の仮説を検証するために、新たなＱＴＬマッピング分析を行なった。また、Ｆ３ファミリーについての新たな表現型データがこれらのＱＴＬ分析に含まれていた。
【００６８】
ＱＴＬマッピング
ＣＶＹＶ抵抗性遺伝子座を特定するために、Windows QTL cartographerソフトウェアを用いた。分析は、いくつかの統計的方法（単一マーカ分析、間隔マッピングおよび合成間隔マッピング）を用いて行なった。
【００６９】
ＱＴＬマッピングは、自然感染によって感染したＦ３ファミリー（ＣＶＹＶ＿Ｆ３  ｎａｔ）の表現型データを用いて、および、機械的感染後のＦ３ファミリー（ＣＶＹＶ＿Ｆ３  ｍｅｃ）の表現型データを用いて行なわれた。感染法毎のＦ３ファミリー当たりの平均表現型値を、ＱＴＬ分析のための入力ファイルとして用いた。
【００７０】
Ｆ２植物の自然ＣＶＹＶ感染でのＣＶＹＶ抵抗性遺伝子座のマッピング
Ｆ２表現型（実施例１）を用いた結果は、以下のように簡潔に要約される：第１の日付、すなわち２００７年５月のＦ２表現型を用いたＱＴＬマッピングの結果、ＭＬ１００  ×  Ｃｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）遺伝子地図の連鎖群９の末端部位上に推定ＣＶＹＶ抵抗性遺伝子座が特定された。最良のマーカは、ＭＬ１００  ×  Ｃｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）遺伝子地図の０ｃＭにおけるＥ２６／Ｍ６２−０７６．８であり、ＬＯＤ値が４．８１である１９．２％の分散を説明する。第２の日付のＦ２表現型を用いて同じＣＶＹＶ抵抗性遺伝子座を特定した。このＦ２表現型データを用いて他のＣＶＹＶ抵抗性遺伝子座は特定されなかった。
【００７１】
Ｆ３植物の自然ＣＶＹＶ感染でのＣＶＹＶ抵抗性遺伝子座のマッピング
自然感染後のＦ３表現型およびＭＬ１００  ×  Ｃｕｃ６４９１遺伝子地図のアップグレードバージョンを用いたＱＴＬマッピングの結果、ＭＬ１００  ×  Ｃｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）遺伝子地図の連鎖群９の末端部位上に推定ＣＶＹＶ抵抗性遺伝子座が確認された。最良のマーカは、ＭＬ１００  ×  Ｃｕｃ６４９１遺伝子地図の更新されたバージョンの位置２９．１ｃＭにおけるＥ２６／Ｍ６２−０７６．８であり、ＬＯＤ値が３．８である３９．９％の分散を説明する（なお、ｃＭ位置は、この実施例において構築されるＭＬ１００  ×  Ｃｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）遺伝子地図のアップグレードバージョンを指す）。ＱＴＬ  ＬＯＤプロットから、染色体９上のＣＶＹＶ抵抗性が現在の遺伝子地図によってカバーされていると結論付けることができる。
【００７２】
Ｆ３植物の機械的ＣＶＹＶ感染でのＣＶＹＶ抵抗性遺伝子座のマッピング
機械的感染後のＦ３表現型を用いたＱＴＬマッピングの結果、ＭＬ１００  ×  Ｃｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）遺伝子地図の連鎖群９の末端部位上にＣＶＹＶ抵抗性遺伝子座がさらに確認された。
【００７３】
機械的感染後のＦ３表現型を用いて、最良のマーカは、ＭＬ１００  ×  Ｃｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）遺伝子地図の更新されたバージョンの１３．４ｃＭにおけるＭ３であり、間隔マッピングを用いて、ＬＯＤ値が９．７である５４．１％の分散を説明する。
【００７４】
ＭＬ１００  ×  Ｃｕｃ６４９１遺伝子地図のアップグレードバージョンの１３ｃＭ〜３７ｃＭの間にＣＶＹＶ抵抗性遺伝子が位置決めされると結論付けることができる。
【００７５】
ＣＶＹＶ抵抗性遺伝子座の精細なマッピング
連鎖群９上のＣＶＹＶ抵抗性遺伝子座に関連付けられたさらなるマーカを特定するために、ＢＳＡを行なった。ＥｃｏＲＩ／ＭｓｅＩ  ＋０／＋Ａマトリックス由来の４８個のＰＣが、自然感染法および機械的感染法の両方について極めて高い平均Ｆ３表現型値を有する１０個の植物の束、および自然感染および機械的感染の両方について極めて低い平均Ｆ３表現型値を有する１０個の植物の束でスクリーニングされた。このＢＳＡの結果、１５個の関連付けられた候補マーカが特定された。
【００７６】
その後、最良の候補マーカを含む４つのＰＣが、連鎖群９のＣＶＹＶ抵抗性領域において組換えられる４８個のＦ２植物のパネル上で実証された。合計５つのマーカが連鎖群９に位置決めされる可能性があり、そのうち２つのマーカのみが１３．４ｃＭ〜３７ｃＭの間のＣＶＹＶ抵抗性領域内に位置している。
【００７７】
連鎖群９上のＣＶＹＶ抵抗性に関連付けられたＡＦＬＰマーカの実証
ＣＶＹＶ抵抗性遺伝子座に関連付けられた４つのＡＦＬＰマーカを含む２つのＰＣが、ＣＶＹＶ抵抗性について部分的に表現型を分類された生殖質パネルでスクリーニングされた。マーカＥ２６／Ｍ６２−０７６．８は、最良の予測値を有する。このマーカは、８つの抵抗性植物のうち７つの抵抗性植物についてＣｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）（＝抵抗性がある）遺伝子型「＋」を記録し、すべての感受性の系統および（感受性があると予想される）すべての表現型を分類されていない系統についてＭＬ１００（＝感受性）遺伝子型「−」を記録する。他のマーカの予測値は低い。
【００７８】
結論
供給源Ｃｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）由来のＣＶＹＶ抵抗性のための主要なＱＴＬは、ＭＬ１００（＝ＣＶＹＶ感受性）  ×  Ｃｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）遺伝子地図の連鎖群９上で１３．４ｃＭ〜３７ｃＭの間に特定された。この領域からの４つのマーカが生殖質パネル上で実証された。マーカＥ２６／Ｍ６２−０７６．８は、最良の予測値を有する。
【実施例３】
【００７９】
ＭＬ１００（＝ＣＶＹＶ感受性）  ×  Ｃｕｃ６４９１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１５８２）遺伝子地図の連鎖群９上の１３．４ｃＭ〜３７ｃＭの間の領域はさらに、１５．８ｃＭ〜６３．６ｃＭの間に設定されたマーカを用いて、精細にマッピングされた。この精細なマッピングの結果は、表２に示されている。
【００８０】
【表２】
0005492893.tif 000003
【００８１】
【表３】
0005492893.tif 000004
【００８２】
表２に見られるように、マーカＥ１３／Ｍ４８−２５９．６９−Ｐ２（増幅プライマー配列番号１および２、移動度２５９〜２６０ｂｐ）およびＥ２６／Ｍ６２−０７６．８−Ｐ２（増幅プライマー配列番号７および８、移動度７６〜７７ｂｐ）はそれぞれ８つの抵抗性の植物のうち７つの抵抗性の植物と相関性があったのに対して、マーカＥ１６／Ｍ４８−３７７．３６−Ｐ２（増幅プライマー配列番号３および４、移動度３７７〜３７８ｂｐ）およびＥ１３／Ｍ４８−２６１．３０−Ｐ２（増幅プライマー配列番号５および６、移動度２６１〜２６２ｂｐ）は抵抗性の表現型との１００％の相関関係を示した。
【００８３】
マーカＥ１３／Ｍ４８−２５９．６９−Ｐ２（増幅プライマー配列番号１および２、移動度２５９〜２６０ｂｐ）、Ｅ１６／Ｍ４８−３７７．３６−Ｐ２（増幅プライマー配列番号３および４、移動度３７７〜３７８ｂｐ）、Ｅ１３／Ｍ４８−２６１．３０−Ｐ２（増幅プライマー配列番号５および６、移動度２６１〜２６２ｂｐ）およびＥ２６／Ｍ６２−０７６．８−Ｐ２（増幅プライマー配列番号７および８、移動度７６〜７７ｂｐ）はそれぞれ、位置３２．６ｃＭ、３２．７ｃＭ、３３．４ｃＭおよび５８．５ｃＭに位置していた。これらのマーカはそれぞれ、ＬＯＤスコアが９．９、８．４、９．９および４．５であるＣＶＹＶ抵抗性遺伝子座に関連する。上述のマーカの配列は、表３に示されている。
【００８４】
【表４】
0005492893.tif 000005
【配列表】
0005492893000001.app