(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性物質又は磁化可能物質と結合されてなる、マイクロ流体又はナノ流体システム中のサンプルからアナライトを分離、精製及び／又は単離するための標識であって、
（ａ）前記アナライトと結合する認識部分と、
（ｂ）前記磁性物質又は磁化可能物質の結合乃至内封部分とを含み、
前記磁性物質又は磁化可能物質の結合乃至内封部分が金属結合タンパク質、及びタンパク質の金属結合ドメインのいずれかを含み、前記タンパク質がフェリチンであり、前記磁性物質又は磁化可能物質がマグネタイトを含むことを特徴とする標識。
【請求項２】
認識部分と磁性物質又は磁化可能物質の結合乃至内封部分とを含む融合タンパク質を含有する請求項１に記載の標識。
【請求項３】
磁性物質又は磁化可能物質の結合乃至内封部分が１×１０５ｎｍ３以下の体積を有する物質を結合乃至内封する請求項１及び２のいずれかに記載の標識。
【請求項４】
磁性物質又は磁化可能物質の結合乃至内封部分が１×１０３ｎｍ３以下の体積を有する物質を結合乃至内封する請求項３に記載の標識。
【請求項５】
磁性物質又は磁化可能物質の結合乃至内封部分が１００ｎｍ３以下の体積を有する物質を結合乃至内封する請求項４に記載の標識。
【請求項６】
複数の磁性物質又は磁化可能物質の結合乃至内封部分及び複数の認識部分の少なくともいずれかを含む請求項１から５のいずれかに記載の標識。
【請求項７】
認識部分が、天然生体分子又は合成生体分子、感染性因子又は感染性因子成分、細胞又は細胞成分、及び小分子のいずれかから選択されるアナライトを結合可能である請求項１から６のいずれかに記載の標識。
【請求項８】
アナライトがウイルス、ウイルス粒子又はウイルス成分、タンパク質、ポリペプチド、糖タンパク質、ＤＮＡ又はＲＮＡのような核酸、オリゴヌクレオチド、代謝産物、複合糖質のような炭水化物、脂質、脂肪、及び医薬又は薬物のような内因性乃至外因性の小分子のいずれかを含む請求項７に記載の標識。
【請求項９】
認識部分が抗体又は抗体断片、受容体又は受容体断片、タンパク質、ポリペプチド、核酸、及びアプタマーのいずれかから選択される請求項７及び８のいずれかに記載の標識。
【請求項１０】
認識部分が抗体の可変ポリペプチド鎖（Ｆｖ）、Ｔ細胞受容体又はＴ細胞受容体断片、アビジン、ストレプトアビジン、及びへパリンのいずれかから選択される請求項９に記載の標識。
【請求項１１】
認識部分が抗体の可変部の一本鎖（ｓｃ−Ｆｖ）である請求項１０に記載の標識。
【請求項１２】
標識が、フェリチンから水和酸化鉄の鉄水酸化物をチオグリコール酸を使用して取り除きアポフェリチンを生成する工程と、Ｆｅ（II）溶液を不活性ガスの雰囲気下で加え制御された酸化を行うことによって前記鉄水酸化物をマグネタイトで置き換える工程とにより調製される請求項１から１１のいずれかに記載の標識。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれかに規定した標識にアナライトが結合されたことを特徴とするアナライトに結合された標識。
【請求項１４】
アナライトが、天然生体分子又は合成生体分子、感染性因子又は感染性因子成分、細胞又は細胞成分、及び小分子のいずれかから選択される請求項１３に記載のアナライトに結合された標識。
【請求項１５】
アナライトが、ウイルス、ウイルス粒子、又はウイルス成分、タンパク質、ポリペプチド、糖タンパク質、ＤＮＡ又はＲＮＡのような核酸、オリゴヌクレオチド、代謝産物、複合糖質のような炭水化物、脂質、脂肪、及び医薬又は薬物のような内因性又は外因性の小分子のいずれかを含む請求項１４に記載のアナライトに結合された標識。
【請求項１６】
請求項１から１２のいずれかに規定の標識を形成する方法であって、アナライトを標識に結合する認識部分と、磁性物質又は磁化可能物質の結合乃至内封部分とを連結することを含み、前記磁性物質又は磁化可能物質がマグネタイトを含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
サンプルを調査分析する方法であって、
（Ａ）マグネタイトを含む磁性物質又は磁化可能物質に結合されるアナライト用の標識とサンプルとを接触させることと、
（Ｂ）前記標識に磁場を印加し前記サンプル中の１種以上の更なる物質から、前記標識及び前記標識に結合し得るアナライトの少なくともいずれかを、分離、精製乃至単離することと、
（Ｃ）任意に、前記標識及び前記アナライトの少なくともいずれかを分析し、前記標識に結合し得る前記アナライトの情報を得ることとを含み、
前記標識は、（ａ）前記アナライトに結合する認識部分と、（ｂ）金属結合タンパク質、又はタンパク質の金属結合ドメインからなり、前記タンパク質がフェリチンであり、前記磁性物質又は磁化可能物質の結合乃至内封部分とを含み、前記標識がマイクロ流体又はナノ流体システムの中での使用に適していることを特徴とする方法。
【請求項１８】
標識が請求項１から１２のいずれかに記載の標識を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
標識及びアナライトの少なくともいずれかに対する分析が、前記標識及び前記アナライトの少なくともいずれかの存在、欠如、同一性、及び量の少なくともいずれかを検出することを含む請求項１７から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
流体素子を使用することによって実施される請求項１７から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
流体素子が、マイクロ流体素子及びナノ流体素子のいずれかである請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
マイクロ流体素子及びナノ流体素子のいずれかを使用することによって実施される方法における前記磁性物質又は磁化可能物質の結合乃至内封部分の使用であって、
前記磁性物質又は磁化可能物質の結合乃至内封部分が、金属結合タンパク質、又はタンパク質の金属結合ドメインからなり、前記タンパク質がフェリチンであり、
前記磁性物質又は磁化可能物質の結合乃至内封部分が、アナライトのための標識からなり、前記磁性物質又は磁化可能物質がマグネタイトを含むことを特徴とする使用。
【請求項２３】
磁性物質又は磁化可能物質の結合乃至内封部分が、請求項１から１２のいずれかに記載のアナライト用の標識に含まれている請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
磁性物質又は磁化可能物質と結合される、複数のアナライトを標識するための標識のセットであって、前記セットの前記標識のそれぞれが、
（ａ）前記アナライトと結合する認識部分と、
（ｂ）前記磁性物質又は磁化可能物質の結合乃至内封部分とを含み、
前記磁性物質又は磁化可能物質の結合乃至内封部分が金属結合タンパク質、又はタンパク質の金属結合ドメインからなり、前記タンパク質がフェリチンであり、
前記磁性物質又は磁化可能物質の結合乃至内封部分が、アナライトのための標識からなり、前記磁性物質又は磁化可能物質がマグネタイトを含み、
前記セットの前記標識が、それぞれ特有の数の金属結合部分を有し、
前記標識が、マイクロ流体又はナノ流体システム中のサンプルからアナライトを分離、精製及び／又は単離するための標識であることを特徴とする標識のセット。
【請求項２５】
各標識が請求項１から１２のいずれかに記載の標識を含む請求項２４に記載の標識のセット。
【請求項２６】
磁性物質又は磁化可能物質と結合されるアナライト用の標識を含むマイクロ流体又はナノ流体素子であって、前記標識が、
（ａ）前記アナライトと結合する認識部分と、
（ｂ）金属結合タンパク質、又はタンパク質の金属結合ドメインからなり、前記タンパク質がフェリチンであり、
前記磁性物質又は磁化可能物質がマグネタイトを含み、
前記標識が、マイクロ流体又はナノ流体システム中のサンプルからアナライトを分離、精製及び／又は単離するための標識である、前記磁性物質又は磁化可能物質の結合乃至内封部分とを含むことを特徴とするマイクロ流体又はナノ流体素子。
【請求項２７】
標識が請求項１から１２のいずれかに記載の標識、又は請求項２４から２５のいずれかに記載の標識のセットを含む請求項２６に記載のマイクロ流体又はナノ流体素子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アナライトのための認識因子を介して少量の磁性（或いは磁化可能）物質をアナライトに結合できる磁気認識標識に関する。この標識は、アナライトを非常に小体積の磁性物質に結合し、アナライトにマイクロ流体システムなどのような閉ざされた空間においてでさえも磁場による影響を与えることができる点で著しく有利である。磁性物質が存在することによってアナライトのより複雑な空間操作が可能になり、これはマイクロ流体システムにおいて特に有益である。本発明は、この標識に関係した製品、方法、及び使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
アッセイ方法に関与する分子を制御するために磁性ビーズが使用できることは周知である（例えば、特許文献１参照）。通常このようなビーズは、アナライトを認識し結合できる分子（例えば抗体）に結合させられる。ビーズの磁気特性が、例えばアナライトをサンプル中の他の分子から分離するためなど、アナライトを制御及び空間的に操作するためのいずれかに使用される。
【０００３】
しかし、磁性ビーズがすべてのシステムについて適当なわけではない。最近になって、マイクロ流体素子及びナノ流体素子のいずれかを使用することによって遥かに少ないサンプル量で作業することが可能になった。このような素子は、刺し跡からの一滴の血液のような非常に少量のサンプルにおいても特定の物質をアッセイすることができる。たとえこのようなビーズをマイクロメートルのスケールで作製できたとしても、このような素子における導管の大きさはしばしば小さ過ぎて磁性ビーズを満足に収容できない場合がある。これは、ビーズが導管よりも大きいか、ビーズが導管内で目詰まり或いは閉塞を引き起こすからである。これは、更に非特許文献１に記載されている。小さなビーズは、表面積／体積の比が大きいが(表１)、特に小さいビーズ又は粒子は、結合したタンパク質が別のタンパク質の結合を妨害する立体障害を被り得る。これは、抗体又は他の認識実体が粒子に結合する際に現れる該抗体又は他の認識実体のランダムな空間的構成によって特に問題となる。この問題は、タンパク質を磁性ビーズ又は磁性粒子の表面に連結する際にタンパク質に必要とされる配向が最適ではない場合があるので、更に悪化させられる（図３参照）。
【０００４】
【表１】
0005453095.tif 000002
（３μｍ及び５０ｎｍビーズの表面積の体積に対する比の比較）
【０００５】
マイクロ流体素子用途及びナノ流体素子用途のためには、まだそれ程注目を集めていないものの、より小さい磁性粒子をタンパク質に結合する試みが行われている。例えば特許文献２が、液体サンプルにおけるアナライトを検出するアレイにおいて使用できる磁性タンパク質ナノセンサーについて記載している。この系では、典型的には常磁性ナノ粒子を結合する更なる官能基(例えばペプチドディスプレーリガンド)を含むように修飾されたＴ４テールファイバー遺伝子から得られる融合タンパク質が使用される。
【０００６】
同様に特許文献３は、細胞内磁気イメージングのための磁性ナノ粒子プローブを開示している。このプローブは、典型的にはミセル、リポソーム、及びデンドリマーのいずれかなどの磁性材料を取り囲む自己組織化被覆材料から形成される。封じ込められた磁性粒子の表面は、ペプチドなどの送達リガンドに結合し得る。類似の系が、有機膜(例えばホスホリピド膜など)内に封じ込められ、膜タンパク質に結合した磁性粒子に関する特許文献４に開示されている。非特許文献２では、細菌磁性粒子上でタンパク質ディスプレーを行う方法が開示されている。また、該磁性粒子は、脂質二分子膜で被覆され新規なｍｍｓ１３タンパク質が粒子に結合する。
【０００７】
また、ウイルスによる磁性ナノ粒子の封じ込めに関して、幾つかの研究が行われている。特許文献５は、Ｔ７バクテリオファージのウイルスカプシドタンパク質シェル内での磁性コバルトの封じ込めについて開示している。
【０００８】
別の展開において、いくつかのタンパク質が金属イオンを直接結合する能力を有することが発見されていた。非特許文献３は、このようなタンパク質を報告している。この分野の他の研究としては、非特許文献４が挙げられる。より以前の研究としては、以下のものが挙げられる：
【０００９】
非特許文献５は、各種細胞標的に対するビオチン化抗体とビオチン化マグネトフェリチンとがアビジン橋を使用することによって連結されたことを開示している。
【００１０】
この分野での更なる開示としては、以下のものが挙げられる：非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；及び非特許文献１７。この最後の論文では、小イオン結合タンパク質メタロチオネイン‐２（ＭＴ）を操作して、亜鉛よりもカドミウムとマグネシウムを結合するようにさせ、それによってタンパク質に磁気を帯びさせている。
【００１１】
更なる背景開示としては、以下のものが挙げられる：非特許文献１８；非特許文献１９；及び非特許文献２０。
【００１２】
特許文献６は、溶液から汚染物質イオンを取り除くためのフェリチンの使用を開示している。フェリチンは他のイオン交換種(例えば、ポルフィリン及びクラウンエーテルのいずれかなど)も含むより大きな構造物の部分をなす。該他のイオン交換種は、汚染物質を取り除くように設計され、同時にフェリチンの磁気特性が汚染物質を溶液から取り除くのに使用される。
【００１３】
特許文献７は、他の用途の中でもワクチンに使用するフェリチン融合タンパク質を開示している。
【００１４】
上述したように磁性粒子及び磁性ナノ粒子に関して広範囲な開示が行われているにも拘わらず、マイクロ流体システム及びナノ流体システムにおける使用のためのより単純で効果的な磁性粒子標識が依然として要求されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／０８４０８９号明細書
【特許文献２】国際公開第２００６／１０４７００号
【特許文献３】国際公開第２００４／０８３９０２号
【特許文献４】米国特許第５，９５８，７０６号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００６／０２４０４５６号明細書
【特許文献６】加国特許第２，５２１，６３９号明細書
【特許文献７】米国特許第７，０９７，８４１号明細書
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】[online]、インターネット〈ＵＲＬ：http://www.deas.harvard.edu/projects/weitzlab/wyss.preprint.2006.pdf〉
【非特許文献２】Tomoko  Yoshinoら、“Efficient  and  stable  display    of  functional  proteins  on  bacterial  magnetic  particles  using  mms13  as  a  novel  anchor  molecule”、Applied  and  Environmental  Microbiology、Jan.  2006、p.465-471
【非特許文献３】Meldrum  F.C.ら、“Magnetoferritin:  in  vitro  synthesis  of  a  novel  magnetic  protein”、Science、1992、257巻(5069号)  p.522-3．
【非特許文献４】Martinez,J.S.ら、“Self-Assembling  Amphiphilic  Siderophores  from  Marine  Bacteria.”、Science、2000、287巻、ｐ．1245-47
【非特許文献５】Zborowskiら、“Immunomagnetic  isolation  of  magnetoferritin-labelled  cells  in  a  modified  ferrograph.”、Cytometry、1996、24巻、ｐ．251-259
【非特許文献６】Inglisら、“Continuous  microfluidic  immunomagnetic  cell  separation.”、Applied  physics  letters.  2004、85巻(21号)、ｐ．5093-5
【非特許文献７】Inglisら、“Microfluidic  high  gradient  magnetic  cell  separation.”、Journal  of  Applied  Physics、2006、99巻
【非特許文献８】Lambertら、“Evolution  of  the  transferrin  family:  Conservation  of  residues  associated  with  iron  and  anion  binding.”、Comparative  Biochem  and  Physiol、2005、(B)142巻、ｐ．129‐141
【非特許文献９】Giderら、“Classical  and  quantum  magnetic  phenomena  in  natural  and  artificial  ferritin  proteins.”、Science、1995、268巻、ｐ．77-80
【非特許文献１０】Haukanes,B.I.及びKvam,C.、“Application  of  magnetic  beads  in  bioassays.”、Biotechnology(NY)、1993、11巻(1号)、ｐ．60-3
【非特許文献１１】Olsvik,O.ら、“Magnetic  separation  techniques  in  diagnostic  microbiology.”、Clin  Microbiol  Rev.、1994、7巻(1号)、ｐ．43-54
【非特許文献１２】Archer,M.J.ら、“Magnetic  bead-based  solid  phase  for  selective  extraction  of  genomic  DNA.”、Anal  Biochem.  2006  doi:10.1016/j.ab.2006.05.005
【非特許文献１３】Schneider,T.ら、“Continuous  flow  magnetic  cell  fractionation  based  on  antigen  expression  level.”、J  Biochem  Biophys  Methods.  2006、68巻(1号)、ｐ．1-21
【非特許文献１４】Ramadan,Q.ら、“An  integrated  microfluidic  platform  for  magnetic  microbeads  separation  and  confinement.”、Biosens  Bioelectron.  2006、21巻(9号)、ｐ．1693-702
【非特許文献１５】Cotter,M.J.ら、“A  novel  method  for  isolation  of  neutrophils  from  murine  blood  using  negative  immunomagnetic  separation.”、Am  J  Pathol.、2001、159巻(2号)、ｐ．473-81．
【非特許文献１６】[online]、インターネット〈ＵＲＬ：http://www.newscientist.com/article.ns?id=dn3664〉
【非特許文献１７】Chang,C.C.ら、“Mn,Cd-metallothionein-2:  a  room  temperature  magnetic  protein.”、Biochem  Biophys  Res  Commun.  2006、340巻(4号)、ｐ．1134-8.
【非特許文献１８】Odetteら、“Ferritin  conjugates  as  specific  magnetic  labels.”、Biophys.J.、1984、45巻、ｐ．1219-22
【非特許文献１９】Yamamotoら、“An  iron-binding  protein,  Dpr,  from  Streptococcus  mutans  prevents  iron-dependent  hydroxyl  radical  formation  in  vitro.”、J  Bacteriol.  2002、184巻(11号)    2931-9
【非特許文献２０】Ishikawaら、“The  iron-binding  protein  Dps  confers  hydrogen  peroxide  stress  resistance  to  Campylobacter  jejuni.”、J  Bacteriol.  2003、185巻(3号)、ｐ．1010-17
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、上述の問題を解決し例えば上述したような公知の製品及び方法を改良することにある。本発明の更なる目的は、例えばマイクロ流体素子又はナノ流体素子において有利に使用できるであろう改良されたアナライト用標識を提供することにある。本発明の更なる目的は、このような標識を使用する方法、キット、及び使用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
従って本発明は、
磁性物質又は磁化可能物質に結合されるアナライト用の標識において、
（ａ）前記アナライトを結合する認識部分と、
（ｂ）前記磁性物質又は磁化可能物質の結合乃至内封部分とを含み、
前記磁性物質又は磁化可能物質の結合乃至内封部分が金属結合タンパク質、金属結合ポリペプチド、及び金属結合ペプチドのいずれかを含むことを特徴とする標識を提供する。
【００１９】
驚くべきことに本発明者らは、十分に小さくてマイクロ流体素子及びナノ流体素子の少なくともいずれかにおいて有用である多量の磁性物質又は磁化可能物質が、アナライトに結合できる認識因子に結合した、金属結合タンパク質、金属結合ポリペプチド、及び金属結合ペプチドのいずれかの中に金属原子及び金属イオン（又はこれらを含有する化合物）のいずれかを組み込むことによって、最適なアナライトに結合できるように決定した。このように本発明の標識は少なくとも２つの部分、即ち、所望のアナライトに標識を結合させるための認識部分と、磁性物質又は磁化可能物質を結合するための部分とを含む。標識は、例えばアフィニティー精製、及び磁場精製のいずれかなどの確立された技術を使用して容易に精製される。
【００２０】
認識部分が１価の場合、これらの認識部分は、（抗体の場合とは異なり）細胞表面上の受容体を架橋することに起因する問題を伴わない。本発明者らは、確立された分子生物学的ストラテジーを使用し目標に向けられるタンパク質を直接（又は間接的に）磁化可能タンパク質に連結することで、公知の方法において遭遇される「目詰まり」の問題も克服している。
【００２１】
本発明の標識は、簡単な化学的手順を使用することによって、磁化及び消磁のいずれかを行うことができるという更なる利点を有する。
【００２２】
特に好ましくは標識は、融合タンパク質である。本発明の説明において、融合タンパク質は、単一体組換えタンパク質として発現されているタンパク質である。融合タンパク質は、多数の更なる利点を有する。本発明における融合タンパク質の認識アーム(例えばｓｃＦｖなど)の配向は、制御でき、それゆえその標的により結合しやすくなる。融合タンパク質は、単一融合タンパク質中に複数の認識部分を組み込める可能性も高める。これらの認識部位は、同一の標的及び異なる標的のいずれかに対して向けることができる。２個以上の認識部分が存在する場合、磁性物質上での認識部分の空間的構成を規定及び制御することができ、立体障害及び従来のビーズへのランダム結合によって引き起こされる問題が低減される。融合タンパク質内でそれぞれの認識部分を注意深く間隔をあけて設置することで(例えば、発現系に核酸スペーサを組み込むことによって)、最終タンパク質の三次構造を制御してこのタンパク質表面の空間的に選択された区域に認識部分を配置することができる。融合タンパク質を使用することの更なる利点は、各標識内の認識部分の数を指定でき、そして標識の全ての分子について同一にできることである。これは、結合がランダムに行われるため、認識部分の数を指定することが遥かに困難であると共に、各磁性ビーズに結合される認識部分の数に大きな変動がある認識部分を、磁性ビーズに結合する従来の手段とは対照的である。
【００２３】
本明細書の説明において「結合する（‘ａｔｔａｃｈｅｄ  ｔｏ’）」とは、特異的結合及び非特異的結合並びに内封も含むあらゆる種類の結合を意味する。従って、磁性物質又は磁化可能物質を結合する部分は、粒子又は集合体などの形態の物質を結合すること若しくは内封すること（又は特異的若しくは非特異的に結合すること）ができる。これらの粒子又は集合体は、従来の磁性ビーズよりも遥かに小さく、磁性物質又は磁化可能物質の結合乃至内封部分（又はそれぞれの磁性物質又は磁化可能物質の結合乃至内封部分）に結合乃至内封される合計で通常１００，０００個未満の原子、イオン、及び分子のいずれかを有し、より好ましくは１０，０００個未満の原子、イオン、及び分子のいずれかを有し、最も好ましくは５，０００個未満の原子、イオン、及び分子のいずれかを有する。最も好ましい物質は３，０００個までの原子、イオン、及び分子のいずれかを結合することができ、特に約２，０００個以下、及び約５００個以下のいずれかのこのような種を結合することができる。
【００２４】
本発明において用いられる１つの具体例では、フェリチン（２４サブユニットタンパク質シェル）の金属成分は、８ｎｍ（８×１０−９ｍ）の無機コアからなる。それぞれのコアは、約２，０００個のＦｅ原子を含有する。別の例では、ストレプトコッカス  ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）由来のＤｐｒ（１２サブユニットシェル）が４８０個のＦｅ原子を含有する９ｎｍのシェルからなる。更なる例では、ラクトフェリンが２個のＦｅ原子を結合し、（コア内に鉄分子を結合するフェリチンとは対照的に）ヘムに結合した鉄を含有する。メタロチオネイン−２(ＭＴ）は、７個の２価遷移金属を結合する。ＭＴ内の亜鉛イオンを、Ｍｎ２＋及びＣｄ２＋とで置き代えることにより、室温磁性タンパク質が得られる。ＭＴは、１個以上の更なる金属結合部位が組み込まれるように修飾されてもよく、これによりＭｎ、Ｃｄ  ＭＴタンパク質の磁性が強められる。
【００２５】
これらの結合環境に従い、単一部分中に結合乃至内封される物質の合計体積は、通常は１×１０５ｎｍ３以下である（平均約５８ｎｍ以下の物質粒子又は物質集合体を表す）。より好ましくは、物質は１×１０４ｎｍ３以下の合計体積を有し得る（約２７ｎｍ以下の平均直径を有する物質粒子又は物質集合体を表す）。更により好ましくは、物質は１×１０３ｎｍ３以下の合計体積を有し得る（約１３ｎｍ以下の平均直径を有する物質粒子又は物質集合体を示す）。最も好ましくは、物質は１００ｎｍ３以下の合計体積を有し得る（６ｎｍ以下の平均直径を有する物質粒子又は物質集合体を示す）。しかし、粒子サイズは、体積に代えて平均直径に基づいて測定することができる。それゆえ本発明では好ましくは、結合粒子の平均直径が５０ｎｍ以下、４０ｎｍ以下、３０ｎｍ以下、２０ｎｍ以下、又は最も好ましくは１０ｎｍ以下でもある。本説明において、平均は、ある数の粒子の直径の合計をその粒子の数で割ったものを意味する。
【００２６】
磁性物質又は磁化可能物質を結合する部分は、そのような物質を結合することができアナライトの結合に干渉しない限り、特に限定されない。磁性物質又は磁化可能物質を結合する部分は、金属結合タンパク質、金属結合ポリペプチド、及び金属結合ペプチドのいずれか（又はこのようなタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドのいずれかの金属結合ドメイン）を含む。典型的には、この部分は、遷移金属及びランタニド金属の少なくともいずれかの原子及びイオンの少なくともいずれかの１種以上、及びこのようなイオンを含むいずれかの化合物のいずれかを結合可能であるか又は結合している。このようなイオンとしては、限定はされないが、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｃｒ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｃｄ、Ｙ、Ｇｄ、Ｄｙ、及びＥｕのいずれか１種以上のイオンが挙げられる。
【００２７】
本発明のより好ましい実施形態では、１種以上の金属イオンは、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｏ２＋、Ｃｏ３＋、Ｍｎ２＋、Ｍｎ３＋、Ｍｎ４＋、Ｃｄ２＋、及びＮｉ２＋のいずれか１種以上を含む。本発明における使用のための最も好ましいイオンは、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｄ２＋、及びＭｎ２＋イオンである。通常はこのようなイオンは、鉄の場合はラクトフェリン、トランスフェリン、及びフェリチンに、カドミウム及びマンガンの場合はメタロチオネイン−２に結合される。Ｆｅ２＋の結合は、好ましくは酸性条件を使用することによって促進され、一方Ｆｅ３＋の結合の場合は好ましくは中性及びアルカリ性条件のいずれかを使用することによって促進される。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態においては、金属結合部分は、ラクトフェリン、トランスフェリン、フェリチン（アポフェリチン）、メタロチオネイン（ＭＴ１及びＭＴ２のいずれか）、第二鉄結合性タンパク質（ＦＢＰ、例えばＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来の）、フラタキシン、及びシデロホア（細菌膜を横切って鉄を輸送する機能を担う非常に小さいペプチド）から選択されるタンパク質、及びタンパク質の金属結合ドメインのいずれかを含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本発明の標識は、磁性物質又は磁化可能物質を結合する部分を複数含み得る。このような部分の数を制御して標識の磁気特性を制御することができる。通常このような実施形態においては、標識は、磁性物質又は磁化可能物質を結合するためにこのような部分を２個から１００個、好ましくは２個から５０個、及び最も好ましくは２個から２０個含み得る。最終キメラタンパク質においては、金属結合タンパク質のそれぞれのコピーは、柔軟性のための非荷電アミノ酸リンカー配列を介して隣接するコピーに結合し得る。
【００３０】
各セットの標識がそれぞれ異なる（特有の）数の金属結合部分を有する標識セットも、本発明に含まれる。これらの標識セットは、１つ以上のサンプルから同時に複数のアナライトを調査分析することを可能にするので有利である。
【００３１】
関心のあるアナライトを結合可能である限り、認識部分は特に限定されない。通常、この部分が結合するアナライトは、生体分子（天然及び合成のいずれか）、感染性因子及び感染性因子成分（例えばウイルス、ウイルス粒子、及びウイルス成分のいずれかなど）のいずれか、細胞及び細胞成分のいずれか、及び内因性小分子及び外因性小分子などの小分子のいずれか（例えば代謝産物、医薬、及び薬物のいずれかなど）から選択される。本説明では、小分子は、例えば代謝産物、医薬、薬物、炭水化物、脂質、脂肪などの、ポリマーでもオリゴマーでもない生物学的に活性な分子などの分子状化学物質（タンパク質、核酸、ポリペプチド、及び他の生体オリゴマー及び生体ポリマーのいずれとも異なる）を意味する。通常、小分子は２，０００ダルトン以下の質量を有する。より具体的には、好ましくは、この部分が結合するアナライトは、ウイルス及びウイルス粒子及びウイルス成分のいずれか、タンパク質、ポリペプチド、糖タンパク質、例えばＤＮＡ若しくはＲＮＡなどの核酸、オリゴヌクレオチド、代謝産物、複合糖質などの炭水化物、脂質、脂肪、及び医薬又は薬物のいずれかを含む。これらのアナライトは、細菌によって生成される糖残基(例えばシアル酸)及び多くの細菌／ウイルス上の糖被膜、並びにいくつかの腫瘍に存在する糖タンパク質上の改変糖を含む。好ましくはこれらのアナライトのいずれか１つ以上を本発明の方法で使用する。
【００３２】
上記のアナライトに結合可能な認識部分は、関心のあるアナライトへの結合に適しているならば、それ自体はいずれの種類の物質及び分子のいずれかでもよい。一般に、認識部分は抗体及び抗体断片のいずれか、受容体及び受容体断片のいずれか、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド類似物、核酸、オリゴヌクレオチド、及びアプタマーから選択される。本発明のより好ましい実施形態においては、認識部分は抗体(Ｆｖ)の可変ポリペプチド鎖、Ｔ細胞受容体及びＴ細胞受容体断片のいずれか、アビジン、及びストレプトアビジンから選択される。最も好ましくは、認識部分は、抗体の一本鎖の可変部（ｓｃＦｖ）から選択される。
【００３３】
抗体は、外来抗原の認識に関与し、脊椎動物によって発現されるイムノグロブリン分子である。抗体は、Ｂ−リンパ球及びＢ細胞のいずれかとして知られる特殊化した細胞種によって産生される。個々のＢ細胞は抗体を１種類のみ産生し、これは単一エピトープを標的とする。Ｂ細胞が抗原に遭遇すると、これは、抗原を認識し、分裂し、そして抗体産生細胞(プラズマ細胞)に分化する。
【００３４】
大部分の抗体の基本構造は、異なる２種類のポリペプチド鎖４本からなる（図４）。より小さい（軽）鎖は、２５キロダルトン（ｋＤａ）の分子量を有し、より大きい（重）鎖は、５０〜７０ｋＤａの分子量を有する。軽鎖は、１個の可変部（ＶＬ）と１個の不変部（ＣＬ）とを有する。重鎖は、抗体のクラスにより、１個の可変部（ＶＨ）と３〜４個の不変部（ＣＨ）とを有する。重鎖の第１の不変部及び第２の不変部は、様々な長さのヒンジ部によって分けられる。２個の重鎖は、ジスルフィド架橋を介してヒンジ部で相互に連結される。ヒンジ部の後の重鎖部は、Ｆｃ領域（結晶化可能断片）としても知られる。ヒンジ部の前の軽鎖及び重鎖複合体は、Ｆａｂ（抗体断片）領域としても知られ、２つの抗体の結合部位は併せてＦ（ａｂ）２領域として知られる。重鎖の不変領域は、補体カスケードの分子及び細胞表面の抗体受容体を含む免疫システムの他の成分を結合できる。抗体の重鎖及び軽鎖は、しばしばジスルフィド架橋によって連結されて複合体を形成し、これは可変端で所定のエピトープを結合することができる（図４）。
【００３５】
抗体の可変部遺伝子は、突然変異、体細胞組み換え（遺伝子シャッフリングとしても知られる）、遺伝子変換、及びヌクレオチド付加事象によって形成される。
【００３６】
ｓｃＦｖ抗体は、
１．ウイルス:（Torranceら、“Oriented  immobilisation  of  engineered  single-chain  antibodies  to  develop  biosensors  for  virus  detection.”、J  Virol  Methods.、2006、134巻(1-2号)ｐ．164-70）
２．Ｃ型肝炎ウイルス:（Gal-Tanamyら、“HCV  NS3  serine  protease-neutralizing  single-chain  antibodies  isolated  by  a  novel  genetic  screen.”、J  Mol  Biol.、2005、347巻(5号)、ｐ．991-1003；Li及びAllain、“Chimeric  monoclonal  antibodies  to  hypervariable  region  1  of  hepatitis  C  virus.”J  Gen  Virol、2005、86巻(6号)、ｐ．1709-16）
３．癌:Holliger及びHudson、“Engineered  antibody  fragments  and  the  rise  of  single  domains.”Nat  Biotechnol.、23巻(9号)、ｐ．1126-36
を含む非常に多数の標的に対して発生させることができ、プロテオミクス等の様々な用途に使用することができる(Visintinら、“Intracellular  antibodies  for  proteomics.  J  Immunol  Methods.”、2004、290巻(1-2号)、ｐ．135-53)。
【００３７】
それゆえその最も好ましい実施形態においては、本発明は、典型的には１種以上のアナライトを認識するための１種以上の抗体の１つ以上の抗原結合アームと、抗原結合アームに結合した金属結合タンパク質の１つ以上のコピーとから形成される多部分標識を使用する。通常は、使用される抗体断片は、柔軟なリンカーによって連結された重鎖及び軽鎖の可変領域、ＶＨ及びＶＬからなる、通例ｓｃＦｖと呼ばれる一本鎖ペプチド（ｓｃ）である。標識中の両方の部分がタンパク質及びポリペプチドの少なくともいずれかから形成される場合（即ち、標識がキメラタンパク質をなす場合）、標識は、当技術分野において周知の組み換え技術を使用して形成し得る。これを図１に示す。しかし、部分のいずれかが他の物質種から形成される場合、標識は、一方の物質種を他の物質種に単純に結合することによって作られてもよい。
【００３８】
このように、本発明はまた、上述のアナライトのための標識を形成する方法であって、アナライトに標識を結合するための認識部分と磁性物質又は磁化可能物質を結合するための部分とを併せて連結することを含む方法を提供する。
【００３９】
更に本発明は、
サンプルを調査分析する方法であって、
（ａ）アナライトを結合する認識部分と、
磁性物質又は磁化可能物質の結合乃至内封部分とを
含む前記磁性物質又は磁化可能物質を結合するアナライト用の標識とサンプルとを接触させることと、
（ｂ）標識に磁場を印加し磁場の影響を与えることと、
（ｃ）任意に、前記標識及び前記アナライトの少なくともいずれかを分析し、標識に結合し得るアナライトの情報を得ることとを含み、
前記磁性物質又は磁化可能物質の結合乃至内封部分が金属結合タンパク質、金属結合ポリペプチド、及び金属結合ペプチドのいずれかを含むことを特徴とする方法を提供する。
【００４０】
上記の方法の１つの好ましい例においては、サンプル中の１種以上の更なる物質から標識及び標識に結合し得るいずれかのアナライトの少なくともいずれかを分離、精製乃至単離するために、磁場を使用し得る。精製の目的は、分析無しでも達成し得るので、この場合に分析工程は、必須ではない。他の好ましい方法においては、分析工程が実施され、通常、分析工程は、標識に結合するアナライトの存在、欠如、同一性、及び量の少なくともいずれかを検出する工程を含む。
【００４１】
本発明は、上記の標識の、核酸精製方法、オリゴヌクレオチド精製方法、タンパク質精製方法、ポリペプチド精製方法、感染性因子（例えば、ウイルス、ウイルス粒子、及びウイルス成分のいずれかなど）精製方法、及び細胞精製方法のいずれかにおける使用も提供する。好ましくはこれらの標識は、マイクロ流体素子及びバイオセンサーの少なくともいずれかで実施されるもののようなサンドイッチ分析において使用できる。
【００４２】
なお更に本発明は、磁性物質又は磁化可能物質を結合する部分の使用であって、前記部分が金属結合タンパク質、金属結合ポリペプチド、及び金属結合ペプチドのいずれかを含み、前記使用がマイクロ流体素子及びナノ流体素子のいずれかを使用して実施される使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
次に本発明を、以下の図面を参照してより詳細に説明するが、これはほんの一例に過ぎない。
【図１】本発明の標識を生成するために行う適切な遺伝子をベクターにクローン化する方法について示す。最終標識中の磁化可能タンパク質のユニット数は、適切な遺伝子のコピーを必要な数だけ組み込むことで制御できる。また、この例では、抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域の遺伝子のみが組み込まれ、抗体全体ではなく抗体のｓｃＦｖ部分が最終の好ましいキメラタンパク質に含有される。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、モノクローナルハイブリドーマクローン及び（ファージディスプレー）遺伝子ライブラリーのいずれかから、適切な遺伝子(メッセンジャーＲＮＡ)を逆転写及びこれに続くポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を使用して増幅することによって、適切な発現ベクター中にクローン化できる。遺伝子は、一続きの小アミノ酸（例えば、４個のグリシン及び１個のセリン残基など）によってリンクされポリペプチドが互いに対し正しく配列されて、リンカー部分からの干渉なしにその結合部位を形成することが可能になる。磁化可能タンパク質の遺伝子は、次にｓｃＦｖの後に直接又は上述のアミノ酸リンカーによって分離されてクローン化される。必要に応じて、精製タグ（例えば、ヘキサヒスチジン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ヘマグルチニン、緑色蛍光タンパク質など）を組み込み、融合タンパク質の単離に役立てることができる。融合タンパク質遺伝子の終端に終止コドンを組み込み、その後にポリアデニル化部位を続けた。選択された磁化可能タンパク質が複数のサブユニットからなる場合（例えばフェリチン又はＤｐｒなど）、これらのサブユニットをコードする遺伝子がｓｃＦｖに続く又は先行することが考えられる。また、ｓｃＦｖ遺伝子を磁化可能タンパク質の遺伝子内に組み込み、アミノ末端でもカルボキシル末端でもない磁化可能タンパク質の都合のよい部分にｓｃＦｖアミノ酸配列を位置させることも望ましい。モノマータンパク質（例えばＭＴなど）を選択する場合、ｓｃＦｖ及び又は金属結合部分遺伝子の複数のコピーを発現ベクター中に並べてクローン化することができる（図１参照）。ｓｃＦｖ及び金属結合部分の発現融合タンパク質内の位置は、遺伝子配列によって規定及び制御できる。多量体タンパク質については、ｓｃＦｖ遺伝子を磁化可能タンパク質の遺伝子内に組み込み、ｓｃＦｖアミノ酸配列を磁化可能タンパク質のアミノ末端でもカルボキシル末端でもない都合のよい部分に位置させることが望ましい。次にベクターは、例えば哺乳類細胞系若しくは昆虫細胞系、及び発現のための酵母宿主若しくは細菌宿主などの発現系のいずれかに導入される。融合タンパク質は適切な方法（沈降、免疫沈降、アフィニティー精製、高速液体クロマトグラフィー、及び高速タンパク質液体クロマトグラフィーのいずれかなど）によって採取される。次に精製融合タンパク質は、確立された方法を使用して修飾され、タンパク質が磁化される（Changら；Meldrumら）。
【図２】本発明の標識を使用した精製方法の概略を示す。関心のあるアナライトが、イオンに結合した本発明の標識を用いて標識される。磁場が印加され、結合したアナライトが洗い流されるのが防がれる一方、全ての汚染物質が取り除かれる。精製サンプルが残存し、所望によりこれを分析できる(例えば検出できる)。
【図３】現在利用可能な市販の抗体−被覆ビーズは、ビーズに抗体を共有結合させて作るので、抗体が不適切に配向しそれによって結合効率が低下する可能性があることを示す。
【図４ａ】ＩｇＧなどの抗体の単純化した構造を示した略図である。パパインなどの酵素を使用したプロテアーゼ処理の後に、抗体は、ヒンジ部近くで３部分に分かれる。抗体のエフェクター機能部分（ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３）は、Ｘ線回折分析のために比較的容易に結晶化できるので、この部分は、結晶化可能断片（Ｆｃ）領域として知られている。抗体の抗原結合部分は、抗体断片（Ｆａｂ）として知られる。酵素消化の後に、Ｆａｂ断片を、ヒンジ部でリンクしＦ（ａｂ）２断片を形成することができる。他の抗体は、Ｆｃ領域のドメインの数及びヒンジ部が変動する点で異なり得る。
【図４ｂ】ＩｇＧなどの抗体の単純化した構造を示した他の略図である。パパインなどの酵素を使用したプロテアーゼ処理の後に、抗体は、ヒンジ部近くで３部分に分かれる。抗体のエフェクター機能部分（ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３）は、Ｘ線回折分析のために比較的に容易に結晶化できるので、この部分は、結晶化可能断片（Ｆｃ）領域として知られている。抗体の抗原結合部分は、抗体断片（Ｆａｂ）として知られる。酵素消化の後に、Ｆａｂ断片を、ヒンジ部でリンクしＦ（ａｂ）２断片を形成することができる。他の抗体は、Ｆｃ領域のドメインの数及びヒンジ部の変動の点で異なり得る。
【図５ａ】ｓｃＦｖ−フェリチン融合タンパク質の構造を示す図である。
【図５ｂ】ｓｃＦｖ−フェリチン融合タンパク質の構造を示す他の図である。
【図６ａ】ｓｃＦｖ−ＭＴ２融合タンパク質の構造を示す図である。
【図６ｂ】ｓｃＦｖ−ＭＴ２融合タンパク質の構造を示す他の図である。
【図７】ｓｃＦｖ断片の構造を示す図である。
【図８】ｃＤＮＡライブラリーの作製を示す図である。組織サンプルからｃＤＮＡライブラリーを作製するために、ｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写し、プラスミドベクターに連結する。次にこれらのベクターを使用して細菌細胞を形質転換する。形質転換細胞は、使用時まで凍結保存される。凍結細胞を適切な培地で培養して増殖し、プラスミドを精製することができる。次に関心のある遺伝子を更なる分析のために特異的プライマーペアを使用してＰＣＲ増幅する。
【図９ａ】フェリチン重（Ｈ）鎖遺伝子及びフェリチン軽（Ｌ）鎖遺伝子のＰＣＲアンプリコンを示す写真データを示す図である。
【図９ｂ】フェリチン重鎖遺伝子及びフェリチン軽鎖遺伝子のオーバーラッピングＰＣＲ産物を示す写真データを示す図である。
【図９ｃ】コロニーＰＣＲの結果を示す写真データを示す図である。クローン１、クローン３、及びクローン４を配列決定のために選択した。
【図１０ａ】抗フィブロネクチンｓｃＦｖ並びにフェリチン重鎖及びフェリチン軽鎖のポリジーン（矢印）のＰＣＲ増幅産物を示すゲルを示す写真データを示す図である。
【図１０ｂ】抗フィブロネクチンｓｃＦｖ並びにフェリチン重鎖及びフェリチン軽鎖のポリジーンのオーバーラッピングＰＣＲ産物を示すゲルを示す写真データを示す図である。
【図１１】ｓｃＦｖ：フェリチン融合構築物を連結したプラスミドを用いて形質転換した多数のクローンのＰＣＲスクリーニングの結果を示すゲルを示す写真データを示す図である。
【図１２】細胞溶解物のクマシーブルー染色ゲル及びウエスタンブロットを示す写真データを示す図である。キー：１．フェリチン、誘導２時間後；２．フェリチン、誘導３時間後；３．フェリチン、誘導４時間後；４．Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ(商標)（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ．
【図１３】ヒト肝臓ライブラリーからのＭＴ２のＰＣＲ増幅産物を示すゲルを示す写真データを示す図である。
【図１４】ｓｃＦｖ：ＭＴ２構築物を含むプラスミドで形質転換したクローンのコロニー分析を示す写真データを示す図である。
【図１５】それぞれｓｃＦｖ：ＭＴ２（矢印）のクマシーゲル及びウエスタンブロットを示す写真データを示す図である。
【図１６】再溶解ｓｃＦｖ：フェリチン融合タンパク質及び再溶解ｓｃＦｖ：ＭＴ２融合タンパク質の（それぞれ）クマシーブルー染色ゲル及びウエスタンブロットの写真データを示す図である。融合タンパク質は円で囲んであり、両ゲルともフェリチンがレーン２、ＭＴ２がレーン３である。タンパク質分子量ラダーがレーン１である。
【図１７ａ】ＭＴ２融合タンパク質の結合のＳＰＲ分析からの重ね書きしたセンソグラムを示す図である。
【図１７ｂ】フェリチン融合タンパク質の結合のＳＰＲ分析からの重ね書きしたセンソグラムを示す図である。
【図１８】本発明において使用するために生成されたマグネトフェリチンの磁気特性を示す写真データを示す図である。
【図１９】マグネトフェリチンの生成と濃縮の過程の間のフェリチンの濃度を示す図である。キーは、ＭＦがマグネトフェリチン、ｆｔが流出画分、ｐｒｅが透析前Ｍａｃｓ（登録商標）カラム濃縮マグネトフェリチン、ｐｏｓｔが透析後Ｍａｃｓ（登録商標）カラム濃縮マグネトフェリチンである。
【図２０】ｓｃＦｖ：フェリチン及び加熱処理ｓｃＦｖ：フェリチンのフィブロネクチンへの結合を示す図である。
【図２１ａ】Ｖａｒｉｏｓｋａｎ  Ｆｌａｓｈ機器を使用して記録される磁化融合タンパク質の吸光度測定値を示す図である。濃縮後も依然として、このタンパク質はモノクローナル抗フェリチン抗体によって認識される。
【図２１ｂ】Ｖａｒｉｏｓｋａｎ  Ｆｌａｓｈ機器を使用して記録される磁化融合タンパク質の吸光度測定値を示す図である。濃縮後も依然として、このタンパク質はモノクローナル抗フェリチン抗体によって認識され、磁化抗フィブロネクチンフェリチン融合タンパク質は、標的抗原に対する結合能力を保持している。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明において使用される、金属結合タンパク質、抗体及び融合タンパク質を含む様々な部分について、次に詳細に説明する。
【００４５】
本発明を更に説明するためのよい例として、２種の金属結合タンパク質を選択した。それはフェリチンとメタルチオネインII(ＭＴ２)である。好ましい融合タンパク質は、これらの金属結合タンパク質の内のどちらかを用いて形成され、遺伝子工学的にフェリチン及びメタロチオネインIIのどちらかに融合されて組換えタンパク質を与える一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として発現されるネズミ抗体の可変ドメインを含む。
【００４６】
（金属結合タンパク質）
文献中に記載される金属結合タンパク質の種類数は、なお増加し続けている。多くのタンパク質が鉄（Ｆｅ）をオキシ水酸化物−リン酸第２鉄（ｏｘｙｈｙｄｒｏｘｉｄｅ−ｆｅｒｒｉｃ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）又はヘムとして有するため、その磁化方法が複雑になっている。フェリチンなどのタンパク質は、ケージ様の構築物内に何千もの鉄イオンを収容できる。
【００４７】
フェリチン内の内在性鉄は常磁性ではないので、通常これを取り除き、タンパク質を破損しないようにして常磁性形態の鉄と置き換える必要がある。例えばメタロチオネインII（ＭＴ２）などの他の金属結合タンパク質は、より少ない数の金属イオンを緩い格子配列として保持するので、フェリチンよりもこれらを取り除きそして置き換えるのが容易であり得る。
【００４８】
（フェリチン）
フェリチンは、直径１２ｎｍの大型タンパク質で、４８０ｋＤａの分子量を有する。このタンパク質は、鉄を包み込む大きな空洞（直径８ｎｍ）からなる。この空洞は、非共有結合によって保持される４へリックスバンドルの形に折りたたまれた２４本のフェリチンポリペプチドの自発的集合によって形成される。鉄及び酸素は、生理条件下で不溶性の錆及び可溶性のラジカルを形成する。鉄イオンの溶解度は、１０−１８Ｍである。フェリチンは、細胞内に鉄イオンを１０−４Ｍの濃度で貯蔵することができる。
【００４９】
フェリチンのアミノ酸配列、従ってフェリチンの二次構造及び三次構造は、動物と植物の間で保存されている。この配列は、細菌で見られるものと異なるが、細菌におけるこのタンパク質の構造とは異ならない。フェリチンの遺伝子欠損変異マウスを使用した研究ではマウスが胚死する結果となっているように、フェリチンはマウスの生存に必須の役割を有する。フェリチンは、嫌気性細菌においても発見されている。
【００５０】
フェリチンは、８個のＦｅ輸送孔隙、１２個のミネラル核形成部位、並びに第１鉄及び酸素からミネラル前駆体を生成する２４個に及ぶオキシダーゼ部位を有する大型の多機能性タンパク質である。脊椎動物におけるフェリチンは、２種のサブユニット（重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ））で形成され、それぞれが触媒活性を有する（Ｈ）又は触媒活性を有しない（Ｌ）オキシダーゼ部位を有する。重鎖及び軽鎖の比は、必要条件に応じて異なる。４，０００個に及ぶ鉄原子を、フェリチンタンパク質の中心に配置することができる。
【００５１】
通常、フェリチン内に収容される鉄は、水和酸化鉄の鉄水酸化物（５Ｆｅ２Ｏ３・９Ｈ２Ｏ）の形態をとる。鉄水酸化物コアは、フェリ磁性酸化鉄のマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）で置き換えることが可能である。これは、チオグリコール酸を使用して鉄を取り除きアポフェリチンを生成することで達成し得る。次にアルゴンガス雰囲気下及び他の不活性ガスの雰囲気下のいずれかにおいて、Ｆｅ（II）溶液を徐々に加える一方、空気及びその他の酸化剤のいずれかの導入によって穏やかに制御された酸化を行う。
【００５２】
（メタロチオネインII）
メタロチオネインは、細胞内の、低分子量の、システインに富むタンパク質である。このタンパク質は、全ての真核生物に見られ、強力な金属結合能及び酸化還元能を有する。ＭＴ−１及びＭＴ−２は、肝臓において様々な金属、薬物、及び炎症性メディエータによって迅速に誘導される。ＭＴ−２の機能としては、亜鉛（Ｚｎ）恒常性維持、重金属（特にカドミウム）及び酸化的損傷からの保護、及び代謝調節が挙げられる。
【００５３】
ＭＴ２は、７個の２価遷移金属をカルボキシル（αドメイン）末端及びアミノ（βドメイン）末端で２つの金属結合クラスターを介して結合する。２０個のシステイン残基が結合過程に関与する。
【００５４】
Changらは、この７個の亜鉛イオン（Ｚｎ２+）をマンガンイオン（Ｍｎ２+）及びカドミウムイオン（Ｃｄ２+）で置き換える方法を記載している。結果として生じるタンパク質は、室温で磁気ヒステリシスループを示すことが明らかにされている。これは、このタンパク質が常磁性であることを潜在的に意味している。
【００５５】
Toyamaらは、ヒトＭＴ２を遺伝子工学的に改変することにより更なる金属結合部位を構築している。これは、ＭＴ２の常磁性機能を潜在的に増加することができるとともに、本発明に用いることができる。
【００５６】
フェリチン及びＭＴ２は潜在的に磁化可能であり、現在利用可能な磁性ビーズの代替物となる。分子生物学の技術を使用することによって、フェリチン及びＭＴ２のいずれかをコードする遺伝子に抗体の可変部を連結し磁性抗体様タンパク質を生成することができる（図５a及び図５ｂ参照）。これは、例えば抗フィブロネクチンｓｃＦｖ遺伝子などの利用可能なｓｃＦｖを使用することによって示すことができる。フィブロネクチンは、結合組織中、細胞表面上、並びに血漿及び他の体液中に見られる。フィブロネクチン遺伝子の過剰発現が多数の肝臓癌において見られ、また、このタンパク質は創傷治癒にかかわることが示されているので、フィブロネクチンに関する診断は潜在的な「テラノスティック」上の価値を有する。それゆえ、本発明の１つの好ましい実施形態は、抗フィブロネクチンｓｃＦｖ遺伝子並びにフェリチン重鎖遺伝子及びフェリチン軽鎖遺伝子を使用して大型多価融合タンパク質を生成することである。このｓｃＦｖをヒトＭＴ２遺伝子に連結してより小型の融合タンパク質を生成することもできる。
【００５７】
単一タンパク質上で遺伝子工学的に融合した認識ドメイン及び常磁性ドメインの使用は、化学的結合の必要性及び化学的操作によって引き起こされるタンパク質機能活性に対する潜在的損傷を排除する。ｓｃＦｖ又は磁化可能ドメインは、比較的容易に自由に置き換え得る。
【００５８】
このｓｃＦｖは、グリシン残基及びセリン残基の短鎖によってリンクされた抗フィブロネクチン重鎖及び抗フィブロネクチン軽鎖を含んでいてもよい。ＶＨ−リンカー−ＶＬ構築物は、頑丈であり、結合を維持することが見出されているので、これらが好ましい。
【００５９】
Leeらは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、フェリチン重鎖をフェリチン軽鎖のアミノ末端へ遺伝子工学的に融合させると、遺伝子組換えフェリチンの細胞質溶解度を著しく増加させることができることを見出している。このアプローチは、本発明においても使用できる。このｓｃＦｖ遺伝子及びフェリチン遺伝子は、セリンと４つのグリシン残基とからなる短鎖リンカー領域を介して連結される。それは、ｓｃＦｖ断片に対して上述した理由と同一であり、これらの残基が小さく、柔軟性を有し、そして他の必須残基と干渉する可能性が低いからである。
【００６０】
Ahnらは、フェリチンンの重鎖及び軽鎖のＣ末端に融合した遺伝子が、フェリチン分子表面ではなくフェリチン分子内で発現される可能性があることを見出している。このため、好ましいｓｃＦｖフェリチン融合構築物は、ｓｃＦｖがフェリチン重鎖のＮ末端に位置するように設計される。
【００６１】
（抗体）
本発明において使用し得る抗体について論じる場合、以下の略記が使用される。
ＣＨ  抗体重鎖不変部
ＣＬ  抗体軽鎖不変部
ＣＤＲ  （抗体の）相補性決定領域
Ｆａｂ  （パパインによる開裂後得られる）可変ドメイン並びに軽鎖不変部及びＣＨ１からなる抗体の単一の認識断片
Ｆ（ａｂ）２  （パパインによる開裂後得られる）抗体の認識断片
Ｆｃ  （パパインによる開裂後得られる）抗体の結晶化可能断片（通常、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン）
Ｆｒ  （抗体の可変部の）フレームワーク領域
Ｆｖ  （抗体の）可変断片
Ｉｇ  イムノグロブリン
ＭＴ  メタロチオネイン
ＭＴ１  メタロチオネインI
ＭＴ２  メタロチオネインII
ｓｃＦｖ  一本鎖可変断片
ＶＨ  抗体重鎖可変ドメイン
ＶＬ  抗体軽鎖可変ドメイン
【００６２】
本発明は、磁性抗体様キメラタンパク質を提供する。このタンパク質の磁性部分は、上記したような鉄結合タンパク質の１つ以上のコピーからなる。このタンパク質の認識アームは、関心のある抗原を結合する抗体断片及び受容体のいずれかからなり、以下に詳細に論じられる。抗体の供給源は、特に限定されず、抗体は、いずれの生物種、ファージディスプレーライブラリー、及び他の組換え体システムのいずれかに由来させることができる。
【００６３】
本発明のタンパク質の典型的抗体部分は、フィブロネクチンに結合するネズミモノクローナルＩｇＧ１抗体の抗原結合部位（以下、抗フィブロネクチンｓｃＦｖドメインと呼ぶ）からなる。
【００６４】
抗体は、特異的適応免疫反応に関与するイムノグロブリンタンパク質である。それぞれのイムノグロブリンは、２つの異なる役割を有する。１つの役割が抗原を結合することであり、そしてもう１つの役割が免疫（エフェクター）機能を媒介することである。これらのエフェクター機能としては、イムノグロブリンを宿主組織、免疫細胞、及び他の免疫タンパク質に結合することが挙げられる。抗体は、４つのポリペプチド鎖からなる（図４）。２つの同一のより長い鎖（重鎖として知られる）が、互いにヒンジとして知られる領域でジスルフィド架橋によって共有結合的にリンクする。それぞれの重鎖は、ジスルフィド架橋によって同一のより短い鎖（軽鎖として知られる）にも共有結合的にリンクされる。それぞれのポリペプチド鎖は、数個のドメイン（図４では、軽鎖に対するＶＬ及びＣＬ並びにＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３に分類される）を含み、これらはそれぞれ遺伝子内のエクソンによってコードされる。それぞれのドメインは、およそ１２．５ｋＤａの分子量を有する。ヒトでは５つの主要な抗体クラスが存在する；即ち、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥであり、これらもサブクラスを有し得る。それぞれの抗体クラスは特徴的エフェクター領域を有し、それゆえに免疫システムを異なった方法で調節する。抗原結合ドメインは、イムノグロブリンのアミノ末端の可変重鎖（ＶＨ）ドメイン及び可変軽鎖（ＶＬ）ドメインとして知られる領域に位置する。エフェクタードメインは、抗体の残りの部分である（不変部）。
【００６５】
脊椎動物免疫システムは、無数の抗原を認識及び結合することができる。これは、１つには抗体が抗原に対応して著しい多様性を示すことに起因する。抗体の可変ドメインは、可変性を示すためにシャッフルできる遺伝子のセットによってコードされる。加えて、体細胞突然変異として知られる遺伝子の更なる変更が生じる。抗原と直接接触する抗体の領域（認識配列）は、最も可変な領域である。これらの領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られる。図４ｂでは、それぞれのポリペプチド鎖上にこれらの領域が３つあり、これらはより薄い線で表してある。ＣＤＲ間のアミノ酸残基は、抗原と直接は接触しないが、抗原結合領域が正しい構造をなすためには最優先の重要性を有する。このため、これらはフレームワーク領域として知られる。
【００６６】
抗体は、Ｂ細胞として知られる分化した細胞において産生される。Ｂ細胞は、特異的抗原を結合できる抗体をその表面上に有する。言い換えると、単一のＢ細胞はその表面抗体によって単一種の抗原を「認識する」ことができる。この膜結合抗体が抗原に遭遇すると、Ｂ細胞は、成熟過程に入り最終的に細胞の分裂及び増殖がもたらされる。起源細胞からの娘細胞（又は知られている所ではクローン）は、起源細胞の膜結合抗体と同一の特異性を有する可溶性（非膜結合）形態の抗体を生成できる。これらの娘細胞から生成される抗体はいずれも、細胞が単一クローンに由来することから、モノクローナル抗体として知られる。
【００６７】
インビトロで使用する抗体が、長年にわたり生成されている。当初は、免疫された動物からポリクローナル血清を採取するのが抗体を得る最も簡単な方法であった。１９７５年のケンブリッジ大学（Cambridge  University）のGeorges  J.F.Koehler及びCesar  Milsteinの先駆的な仕事が、実験室で生成されるモノクローナル抗体の開発をもたらした。彼らの仕事では、マウス脾臓からのＢ細胞を骨髄腫細胞と融合しハイブリドーマとして知られる不死化Ｂ細胞株を生成している。
【００６８】
抗体の抗原結合部分は、不変部無しで単離した状態でも使用できる。これは、例えば固形癌に浸透させるのにより適合した抗体様分子を設計する過程などにおいて、幾らかの役に立ち得る。ＶＨ及びＶＬドメインを、Ｆｖ断片として細胞中で発現させることができる。又は、この２つのドメインを小アミノ酸の短鎖によってリンクし、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）として知られる約２５ｋＤａの分子量を有する（図７参照）単一ポリペプチドを形成することができる。リンカーは、セリン及びグリシンなどの若干の小アミノ酸からなり、ｓｃＦｖの結合領域及び骨格領域への干渉はない。
【００６９】
（融合タンパク質の設計）
本発明において、融合タンパク質は、抗フィブロネクチンネズミモノクローナルＩｇＧ１抗体からの可変部を使用することによって設計でき、ｓｃＦｖドメインを有することができる。フェリチン遺伝子又はＭＴ２遺伝子の重鎖及び軽鎖が、抗体の磁性ドメインを生成するのに使用できる。抗フィブロネクチン抗体の可変ドメインの遺伝子が市販されており、これらは通常プラスミドベクターにクローン化されｓｃＦｖとして発現される。このｓｃＦｖは、以下の順番で翻訳し得る：
ＡＴＧ開始コドン：（発現のための）リーダー配列：重鎖：グリシン  セリン  リンカー：軽鎖
【００７０】
（プラスミド生成）
ヒトフェリチンの重鎖及び軽鎖の遺伝子又はヒトＭＴ２の遺伝子は、ヒトライブラリーから入手でき、適切に設計されたプライマーを使用してクローン化され、そして末端終止コドンと共に抗体軽鎖３′末端で抗フィブロネクチンｓｃＦｖプラスミドベクターに挿入される。フェリチンの重鎖及び軽鎖の３′末端に融合した遺伝子は、フェリチン分子の表面ではなく分子内で発現され得る。従って、ｓｃＦｖフェリチン融合構築物は、フェリチン重鎖のＮ末端（５′末端に対応）にｓｃＦｖを有する。通常はｓｃＦｖとフェリチンとの融合タンパク質又はｓｃＦｖとＭＴ２との融合タンパク質は、ヒスチジン標識（６個のヒスチジン残基からなる）をタンパク質のＣ末端の終止コドンの前に有する。これは、ウエスタンブロット法などの用途におけるタンパク質の検出、及び金属アフィニティーカラム（例えばニッケルカラムなど）を使用した又は金属結合機能が妨害する場合は他の標識（例えばＧＳＴ、βガラクトシダーゼ、ＨＡ、及びＧＦＰなど）を使用した可能な精製を考慮する。遺伝子の配列を、プラスミド生成の後にチェックして突然変異が導入されていないか確かめてもよい。
【００７１】
図５ｂは、フェリチン融合タンパク質の例の概念図である。ｓｃＦｖの重鎖及び軽鎖は、それぞれ最初の２つの矢印によって示される。
【００７２】
使用される配列は、以下に示される配列番号１である：
配列番号１
0005453095.tif 000003
【００７３】
このアミノ酸配列では、ｓｃＦｖの重鎖及び軽鎖がイタリック体で示され、重鎖に下線が施してある。このアミノ酸配列の太字テキストが、可変ドメインのＣＤＲ領域を示す。２つのグリシン／セリンリンカーが小文字で示され、これらの内の第２のリンカーに続いてフェリチンの重鎖と軽鎖の配列が普通テキストで示され、再度これらの内の重鎖配列には下線が施される。
【００７４】
図６ｂは、ＭＴ２融合タンパク質の例の概念図である。その配列が、以下の配列番号２によって示される。
配列番号２
0005453095.tif 000004
【００７５】
ｓｃＦｖ配列がイタリック体で示され、その重鎖には下線が施され、太字テキストでＣＤＲが強調される。２つのリンカー配列が小文字で示され、その内の２番目の後に普通テキストで与えられるメタロチオネイン配列が続く。
【００７６】
ｓｃＦｖ−フェリチン融合タンパク質及びｓｃＦｖ−ＭＴ２融合タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ株で発現し得る。通常これは、融合タンパク質のどちらかをコードするプラスミドで感受性Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換することによって達成される。通常発現プラスミドは、細菌の翻訳及び発現のための成分並びに発現量を増加させるエンハンサー配列を含む。
【００７７】
このプラスミドは、好ましくは抗生物質耐性の配列も含有する。この細菌細胞を抗生物質を含む寒天栄養平板上に塗沫した場合、このプラスミドを含まない細胞は分裂しない。このプラスミドを含む細胞は、分離したコロニーとして成長できる。コロニーのそれぞれの細胞は、単一細胞及び‘クローン’のいずれかからの子孫である（それゆえこの過程は、クローニングとして知られる）。
【００７８】
クローンは、この平板から採取し抗生物質を含む液体培地中で培養してもよい。融合タンパク質の発現は、一般に誘導物質（例えば、イソプロピル  β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド及びＩＰＴＧのいずれか）の添加によって開始される。細胞は、回収するまで限られた時間培養してもよい。細胞は、尿素を使用して溶解することができ、この溶解物を例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法によって分析してもよい。
【００７９】
（タンパク質検出及び精製）
クローンのタンパク質発現プロファイルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）及びウエスタンブロット法を使用することによって評価することができる。これらのアッセイでは、タンパク質を化学的に変性させる（β−メルカプトエタノールなどの化学物質を使用して硫黄間結合を切断すること、及び結合内帯電を取り除くＳＤＳを添加することの少なくともいずれかによって変性させる）。細胞溶解物は、ゲルの上端のウェルに添加される。次に電流（ＤＣ）がゲルに印加され、タンパク質は、そのサイズに従いゲル中を移動する。次にタンパク質は、染料でゲルを染色することによって可視化される。分離されたタンパク質をニトロセルロース膜に移すこと（再度電流を使用して）によって特異的タンパク質が、プローブされる。特異的酵素結合抗体がシート上でインキュベートされ、そして基質（比色分析の化学物質、発光用の化学物質、及び蛍光化学物質のいずれか）が添加されタンパク質が可視化される。
【００８０】
最高レベルの発現をするクローンを、通常、大規模で（１Ｌ）拡大培養し増殖する。細胞は、上記のように誘導し回収する。
【００８１】
採取した細胞が溶解され、タンパク質が例えば金属アフィニティークロマトグラフィーを使用することで精製される。必要に応じて、フィブロネクチンアフィニティーカラムを含む他の精製方法を使用してもよい。
【００８２】
（タンパク質特徴づけアッセイ）
（サイズ分析）
タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット分析、及びクロマトグラフィー技術を使用してそのサイズを測定することができる。
【００８３】
（表面プラズモン共鳴）
融合タンパク質のフィブロネクチンへの結合は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して評価することができる。ＳＰＲは、分子が金属薄膜に結合するときの光の屈折率の変化を測定できる技術である。フィブロネクチンが、ＳＰＲチップの金属表面に固定され、融合タンパク質がチップの表面上を流される。融合タンパク質が結合するとき、結合の動力学（結合、解離、及び親和性）を、ＳＰＲを使用して評価することができる。通常、ＳＰＲを使用して得られる結果は、センソグラムの形で与えられる。
【００８４】
融合タンパク質の結合は、ＥＬＩＳＡによっても評価し得る。結合を測定するためのアッセイでは、マイクロタイタープレートがフィブロネクチン及び抗フェリチン抗体のいずれかで被覆される。プレートの未被覆部位を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いてブロッキングする。次に融合タンパク質を、プレート上でインキュベートする。次にこのプレートを洗浄し、抗フェリチン抗体とインキュベートし、そして再度洗浄する。酵素結合抗体を次にプレート上でインキュベートし、プレートを洗浄し、そして基質を加える。
【００８５】
（フェリチン及びｓｃＦｖ−フェリチンの磁化）
フェリチン内の鉄は、常磁性ではない。通常、鉄は、Ｆｅ（III）の形態である。常磁性フェリチンを生成するためには、フェリチンの（そして究極的には融合タンパク質の）鉄を、タンパク質を損傷することなく取り出し；次に常磁性形態の鉄（Ｆｅ（II））と置き換える。
【００８６】
鉄酸化物にはいくつかの形態があり、これらの形態の全てが等しく磁性を有する訳ではない。例えば、ＦｅＯ、Ｆｅ２Ｏ３、及びＦｅ３Ｏ４が挙げられる。マグネタイト或いは天然磁石（ｌｏｄｅｓｔｏｎｅ）としても知られる、酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）或いは酸化第一・第二鉄が、最も磁性を帯びうる形態である。
【００８７】
（ｓｃＦｖ−フェリチン及びｓｃＦｖ−ＭＴ２融合タンパク質の特徴づけ）
処理されたタンパク質の物理的特徴づけが、典型的には電子顕微鏡、回折（Ｘ線及び電子線の少なくともいずれか）、及びメスバウアー分光法の組み合わせを含むいくつかの技術によってなされ得る。
【実施例】
【００８８】
以下、本発明を具体的実施形態を参照して詳細に説明するが、これはほんの一例に過ぎない。
【００８９】
（実施例１−融合タンパク質の設計と製造）
本発明を例証するために、市販のネズミ抗フィブロネクチン抗体を使用して、融合タンパク質を設計した。ＭＴ２とフェリチンのいずれかに柔軟な短リンカーを用いて遺伝子工学的に連結させた抗フィブロネクチンｓｃＦｖからなる融合タンパク質を製造した。本実施例においては、融合タンパク質の生成、その特徴づけ、及び単離について詳述する。
【００９０】
抗フィブロネクチンフェリチン融合タンパク質又は抗フィブロネクチンＭＴ２融合タンパク質の設計は、マウス抗フィブロネクチン抗体からのＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子のベクターへのクローン化に基づいて行った。両遺伝子は、非荷電小アミノ酸からなる短い柔軟なリンカーによって連結させた。ＶＬ遺伝子の３′末端のすぐ下流に、別の短い柔軟なリンカーを接続し、その後にフェリチン遺伝子かＭＴ２遺伝子のいずれかを接続した。両融合タンパク質は、ニッケルカラムでの精製のために６ヒスチジン領域を有するようにした。融合タンパク質の翻訳は、フェリチン軽鎖遺伝子及びＭＴ２遺伝子のいずれかの３′末端に挿入した終止コドンで終了させた。これらの要素を全て含むプラスミドベクターを使用して、発現のための細菌を形質転換させた。
【００９１】
フェリチン及びＭＴ２の遺伝子は、ｃＤＮＡライブラリーから取得した。ｃＤＮＡライブラリーは、細胞及び組織のいずれかからｍＲＮＡを採取し、このＲＮＡを逆転写酵素として知られる酵素を使用してｃＤＮＡに逆転写し、そして個々のｃＤＮＡをプラスミドベクターへクローン化することで生成した（図８参照）。
【００９２】
（抗フィブロネクチン：フェリチン融合タンパク質の生成）
（背景）
フェリチンは、直径１２ｎｍのタンパク質で、およそ４８０ｋＤａの分子量を有する。このタンパク質は、鉄を包み込む大きな空洞（直径８ｎｍ）からなる。この空洞は、非共有結合によって保持される４へリックスバンドルの形に折りたたまれた２４本のフェリチンポリペプチドの自発的集合によって形成される。フェリチンのアミノ酸配列、従ってフェリチンの二次構造及び三次構造は、動物と植物の間で保存されている。細菌におけるこのタンパク質の構造は真核生物と同じであるが、配列は異なる。脊椎動物におけるフェリチンは、２種のサブユニット（重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ））から形成され、それぞれが触媒活性を有する（Ｈ）オキシダーゼ部位及び触媒活性を有しない（Ｌ）オキシダーゼ部位のいずれかを有する。重鎖及び軽鎖の比は、必要条件に従い異なる。融合タンパク質の生成において使用されるフェリチン重鎖及びフェリチン軽鎖のアミノ酸配列を以下に示す：
【００９３】
（フェリチン重鎖（分子量２１０９６．５Ｄａ））（配列番号３）：
0005453095.tif 000005
【００９４】
（フェリチン軽鎖（分子量２００１９．６Ｄａ））（配列番号４）：
0005453095.tif 000006
【００９５】
抗フィブロネクチンｓｃＦｖアミノ酸配列と共に示す融合タンパク質の一本鎖ポリペプチドの予測配列を（抗体重鎖遺伝子及び抗体軽鎖遺伝子の間のリンカー配列並びに抗体軽鎖遺伝子及びフェリチン重鎖遺伝子の間のリンカー配列は、小文字で強調されている）以下に示す（配列番号５）：
0005453095.tif 000007
このポリペプチド成分の分子量は、６５．５５０ｋＤａであった。
【００９６】
（抗フィブロネクチン：フェリチン融合タンパク質遺伝子の組立）
フェリチン重鎖遺伝子及びフェリチン軽鎖遺伝子は、ＰＣＲによってヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーから増幅した（図９ａ参照）。このＰＣＲ産物は、期待されたサイズ（〜５４０ｂｐ）のものであった。これらのＰＣＲ産物は、オーバーラッピングＰＣＲによって結合させた（図９ｂ−産物は期待されるサイズである）。
【００９７】
このオーバーラッピングＰＣＲ産物をゲル精製し、配列分析用ベクターに組み込み、配列分析した。このため、フェリチン重鎖遺伝子とフェリチン軽鎖遺伝子のオーバーラッピングＰＣＲ遺伝子を含む配列分析用ベクターで細菌を形質転換した。次に、クローンを分離するために、形質転換細菌を抗生物質含有プレート上に薄く広げた。細胞を一晩培養し、コロニーを形成させた。次に個々のコロニーを平板から採取し、液体培地中で培養した。それぞれのクローンからプラスミドを単離し、ＰＣＲを使用して分析した（図９ｃ）。クローン４が、期待された配列を含むことが見出された。従って、このクローンからのＤＮＡをその後の全ての更なる研究において使用した。
【００９８】
モノクローナルハイブリドーマからのネズミ抗ヒトフィブロネクチン抗体の重鎖可変部遺伝子及び軽鎖可変部遺伝子を、ＰＣＲ増幅した。これらの遺伝子は、予め柔軟なリンカー領域によって連結されてｓｃＦｖを形成しており、このｓｃＦｖ遺伝子融合物がＰＣＲによって増幅された。この増幅物のＤＮＡゲルは、フェリチンポリジーンオーバーラッピングＰＣＲ産物と並んで、図１０ａ中に見られる。関係するバンドをゲルから切り取り、ＤＮＡを精製した。次にこれを、更なるオーバーラッピングＰＣＲにおいて使用し、ｓｃＦｖ及びフェリチンポリジーンを連結させた（図１０ｂ）。矢印を施したバンドが、ｓｃＦｖ：フェリチン融合物に期待されるサイズを有する。これを、切り取り、そのＤＮＡを更なる使用のために精製した。
【００９９】
これを行うために使用されたプライマーは、プラスミドに組み込むためのＤＮＡのエンドヌクレアーゼ（二本鎖ＤＮＡの特異的配列を切断することができる酵素）による制限的切断を可能とする配列を含んでいた。
【０１００】
ゲル精製の後、ｓｃＦｖ：フェリチンＰＣＲ産物を、制限酵素（エンドヌクレアーゼ）のＢａｍ  Ｈ１及びＥｃｏＲ１を使用して制限的に切断した。精製された制限酵素切断を受けた産物を、次にｐＲＳＥＴ及びｐＥＴ２６ｂの２つの発現ベクターへクローン化した。クローンは、前と同様にして単離した。陽性のクローンを同定するために行ったＰＣＲの結果は、図１１に見ることができる。
【０１０１】
プラスミドｐＲＳＥＴを含むセットからコロニー３〜５及び７を、プラスミドｐＥＴ２６ｂを含むセットからコロニー６を選択して配列を分析した。
【０１０２】
その結果としてのデータが示すところによれば、クローンｐＲＳＥＴ４及びクローンｐＲＳＥＴ５並びにｐＥＴ２６ｂクローン６が、ｓｃＦｖ：フェリチン構築物を含んでいた。クローンｐＲＳＥＴ４をタンパク質発現のために使用した。
【０１０３】
（抗フィブロネクチンｓｃＦｖ：フェリチン融合タンパク質の発現）
融合タンパク質の発現を実証するために、ＬＢ培養液（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ  培養液：トリプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ（１リットル当り））で５ｍｌの培養物を３培養物培養した。細胞は、ＩＰＴＧ（イソプロピル  β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）を時期を変えて使用し、タンパク質の発現を誘導した。次に、培養物を８Ｍ尿素中で溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分析した。タンパク質含有量を求めるためにクマシーブルーを使用してゲルを染色した（結果を図１２に示す）。抗ポリヒスチジン抗体を使用したウエスタンブロットを実施し、融合タンパク質を特異的に同定した（図１２）。
【０１０４】
誘導した時点は、接種後２時間、３時間、及び４時間であった。
【０１０５】
ブロットに見られるバンドには、融合タンパク質が発現されており、これは、抗ヒスチジン抗体を使用して検出できることを示している。このポリペプチドのサイズは、およそ７５ｋＤａ〜８５ｋＤａであった。発現量は、比較的高く、融合タンパク質のバンドがクマシーブルー染色ゲル中に見られる非常に濃いバンドと対応することから過剰発現しているのは明白であった。接種後３時間に誘導することで、比較的高レベルの発現が得られたので、接種後３時間での誘導という条件をその後の発現のためにも使用した。
【０１０６】
（抗フィブロネクチン：ＭＴ２融合タンパク質の生成）
（背景）
メタロチオネインは、細胞内の、低分子量の、システインに富むタンパク質である。このタンパク質は、全ての真核生物に見られ、強力な金属結合能力及び酸化還元能力を有する。ＭＴ−１及びＭＴ−２は、肝臓において様々な金属、薬物、及び炎症性メディエータによって迅速に誘導される。ＭＴ２は、７個の２価遷移金属を、カルボキシル（αドメイン）末端及びアミノ（βドメイン）末端で２つの金属結合クラスターを介して結合する。２０個のシステイン残基が結合過程に関与する。
【０１０７】
ＭＴ２の配列を以下に示す（配列番号６）：
0005453095.tif 000008
【０１０８】
抗フィブロネクチンｓｃＦｖアミノ酸配列と共に示す融合タンパク質の一本鎖ポリペプチドの予測配列を（抗体重鎖遺伝子及び抗体軽鎖遺伝子の間のリンカー配列並びに抗体軽鎖遺伝子及びＭＴ２重鎖遺伝子の間のリンカー配列は、小文字で強調されている）以下に示す（配列番号７）：
0005453095.tif 000009
【０１０９】
（抗フィブロネクチン：ＭＴ２融合タンパク質遺伝子の組立て）
メタロチオネインII遺伝子は、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲを使用して増幅された（図１３）。このＰＣＲ産物は、期待されるサイズ（〜２００ｂｐ）であった。
【０１１０】
このＰＣＲ産物を、ＢｇｌII制限酵素を使用して制限的に切断し、予め切断したプラスミド（Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａベクター）に組み込んだ。
【０１１１】
選択されたクローンのコロニーＰＣＲによって、選択されたクローン全てについてバンドが見出された（図１４）。クローン２、クローン４、及びクローン９を配列分析のために選択した。クローン９を、更なる研究で使用した。
【０１１２】
（抗フィブロネクチンｓｃＦｖ：ＭＴ２融合タンパク質の発現）
ｓｃＦｖ：ＭＴ２融合タンパク質の発現を実証するために、ＬＢ培養液で５ｍｌの培養物を３培養物培養し、フェリチン融合タンパク質の場合と同様にして培養物を様々な時点で誘導した（ＩＰＴＧ）。培養物を８Ｍ尿素中で溶解し、クマシーブルーで染色され且つ抗ヒスチジン抗体を用いてブロットされるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して分析した（図１５）。接種後４時間に誘導した細胞が、僅かながらより多くのタンパク質を生成した（両ゲルともレーン３）。これらの培養条件を、その後のタンパク質発現のために使用した。
【０１１３】
（融合タンパク質の精製）
封入体を単離、洗浄、再可溶化する方法を用いて可溶性タンパク質を単離した。
【０１１４】
このプロトコルは、完了するのに約１週間かかった。再可溶化したｓｃＦｖ：フェリチン融合タンパク質及びｓｃＦｖ：ＭＴ２融合タンパク質のクマシーブルー染色ゲル及びウエスタンブロットの写真は、図１６に見ることができる。融合タンパク質は、円で囲んであり、両ゲルともレーン２がフェリチンで、レーン３がＭＴ２である。タンパク質分子量ラダーがレーン１である。
【０１１５】
これから、融合タンパク質の発現及び濃縮に成功したことがわかる。これらのタンパク質は、磁化プロトコル及び更なる実験において使用される。
【０１１６】
（実施例２−ＳＰＲ分析）
抗フィブロネクチンフェリチン融合タンパク質封入体調製物及び抗フィブロネクチンＭＴ２融合タンパク質封入体調製物を、ＳｅｎｓｉＱ機器（ＩＣＸ  Ｎｏｍａｄｉｃｓ）を使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイにおいて使用した。
【０１１７】
これらの実験のために、フィブロネクチンペプチドをカルボキシルチップの表面に結合した。次に融合タンパク質調製物をチップ上に流し、結合動力学（Ｋａ）及び解離動力学（Ｋｄ）を測定した。
【０１１８】
（分析のための融合タンパク質サンプル）
以下の表２及び表３に示されるように、０．００１３μＭから０．１３３μＭの範囲で異なる濃度を有するそれぞれの融合タンパク質の６サンプルを、ランニング緩衝液を使用して調製した。
【表２】
0005453095.tif 000010
（75kDaのメタロチオネイン融合タンパク質を使用：
40μlの100μg/ml  75kDaタンパク質に360μlのランニング緩衝液を加え、400μlの10μg/mlタンパク質(0.133μM)を調製した）
【表３】
0005453095.tif 000011
（270kDaのフェリチンED-B融合タンパク質を使用：
144μlの100μg/ml  270kDaタンパク質に256μlのランニング緩衝液を加え、400μlの36μg/mlのタンパク質(0.133μM)を調製した）
【０１１９】
（メタロチオネイン）
サンプル（サイクル１〜サイクル６）：２０μｌの０．００１３μＭから０．１３３μＭのメタロチオネイン融合タンパク質
アッセイラン：ＭＡｂ＆Ｇｌｙアッセイサイクル（上述）
【０１２０】
上記のサイクルからのセンソグラムを、ＳｅｎｓｉＱ  Ｑｄａｔ分析ソフトウェアを使用して重ね書きし、データにモデルを当てはめ動力学パラメータ（Ｋａ、Ｋｄ）を計算した。Ｋｄの最良推定値は、モデルをデータの解離部分にのみ当てはめることによって得られた。結果を図１７ａに示す。これは、０．００５０３ｓ−１のＫｄに関係づけられ、２．２８９×１０−９ＭのＫｄ（２．１９７×１０６Ｍ−１ｓ−１のＫａ）を与える。
【０１２１】
（フェリチン）
サンプル（サイクル１〜サイクル６）：２０μｌの０．００１３μＭから０．１３３μＭのフェリチン融合タンパク質
アッセイラン：ＭＡｂ＆Ｇｌｙアッセイサイクル（上述）
【０１２２】
上記のサイクルからのセンソグラムを、ＳｅｎｓｉＱ  Ｑｄａｔ分析ソフトウェアを使用して重ね書きし、データにモデルを当てはめ動力学パラメータ（Ｋａ、Ｋｄ）を計算した。Ｋｄの最良推定値は、モデルをデータの解離部分にのみ当てはめることによって達成された。結果を図１７ｂに示す。これは、０．００５３５ｓ−１のＫｄに関係づけられ、６．５３８×１０−１０ＭのＫｄ（８．１８３×１０６Ｍ−１ｓ−１のＫａ）を与える。
【０１２３】
（結果）
上記の実験データから、フィブロネクチンエクストラドメインＢ（アミノ酸１６−４２）抗原がＳｅｎｓｉＱチップ上に首尾よく被覆されることが示された。期待されるように、７５ｋＤａメタロチオネイン融合タンパク質及び２７０ｋＤａフェリチン融合タンパク質の両方が、特異的に抗原を認識しこれに結合した。融合タンパク質と抗原との相互作用の動力学データを推定したところ、両融合タンパク質で類似しており、期待される範囲にあることが見出された。即ち、殆どの抗体／抗原相互作用のＫｄが１０−８Ｍから１０−１０Ｍの範囲にあるのに対して、これらのＫｄは、１０−９Ｍの範囲にあることが見出された。
【０１２４】
このように、この機器を使用して得られる値は、比較的高アフィニティーの抗体の結合アフィニティーに十分匹敵する結合アフィニティーを示唆するものである。加えて、得られたデータは、融合タンパク質が抗原に対して複数の結合部位を有することを示唆する。これは、フェリチン融合タンパク質に対して期待される。しかし、これはＭＴ２融合タンパク質については期待されず、融合タンパク質が、結合の親和力を増加させる二量体及びより高次の多量体タンパク質を形成していることを示唆する。
【０１２５】
（実施例３−フェリチンの磁化）
通常フェリチンは、水和酸化鉄（III）を含む。常磁性フェリチンを生成するために、これらのイオンはより強い磁性特性を有するマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）で置き換えられる。この実験のために使用される方法には、アポフェリチンへの鉄イオンの添加及びこれらのイオンの制御された条件下での酸化が関与する。
【０１２６】
（材料）
逆浸透水（ＲＯ水）
５０ｍＭ  Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳＯ）緩衝液、ｐＨ８．６（Ｓｉｇｍａ  Ａ６６５９）
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．５
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（リン酸１０ｍＭ、ＮａＣｌ１４０ｍＭ、ｐＨ７．４）
トリメチルアミン−Ｎ−酸化物（ＴＭＡ）（Ｓｉｇｍａ  ３１７５９４）
０．１Ｍ硫酸アンモニウム鉄（II）
ウマ脾臓アポフェリチン（Ｓｉｇｍａ  Ａ３６４１）
【０１２７】
（方法）
トリメチルアミン−Ｎ−酸化物（ＴＭＡ）をオーブンで８０℃まで３０分かけて加熱してＭｅ３Ｎを除去し、その後室温まで冷却した。１１４ｍｇのＴＭＡを１５ｍｌのＲＯ水に加え、０．０７Ｍ溶液を調製した。鉄及びＴＭＡ溶液は、使用前に１５分間Ｎ２で不純物を取り除いた。
【０１２８】
ＡＭＰＳＯ緩衝液（１リットル）は、Ｎ２で１時間脱気した。３．０ｍｌのアポフェリチン（６６ｍｇ／ｍｌ）をＡＭＰＳＯ緩衝液に添加し、そして溶液を更に３０分間脱気した。１リットル容器中にＡＭＰＳＯ／アポフェリチン溶液を入れ、予熱した６５℃の水槽へ設置した。Ｎ２供給管を溶液内から取り出し、溶液の表面上に懸架し、溶液を嫌気条件化に保持した。最初に硫酸アンモニウム鉄を添加し、溶液に存在し得るいかなる残留酸素も取り除いた。
【０１２９】
０．１Ｍ硫酸アンモニウム鉄及びＴＭＡ緩衝液のアリコートを以下のようにして１５分毎に加えた：
第１添加  ６００μｌの０．１Ｍ硫酸アンモニウム鉄
第２添加  ６００μｌの０．１Ｍ硫酸アンモニウム鉄及び４００μｌのＴＭＡ
第３添加  ６００μｌの０．１Ｍ硫酸アンモニウム鉄及び４００μｌのＴＭＡ
第４添加  ６００μｌの０．１Ｍ硫酸アンモニウム鉄及び４００μｌのＴＭＡ
第５添加  ９００μｌの０．１Ｍ硫酸アンモニウム鉄及び６００μｌのＴＭＡ
第６添加  ９００μｌの０．１Ｍ硫酸アンモニウム鉄及び６００μｌのＴＭＡ
第７添加  ９００μｌの０．１Ｍ硫酸アンモニウム鉄及び６００μｌのＴＭＡ
第８添加  ９００μｌの０．１Ｍ硫酸アンモニウム鉄及び６００μｌのＴＭＡ
【０１３０】
Ｆｅ及びＴＭＡの最後の添加で、溶液は淡黄色から黒色微粒子が溶液全体に分散する暗褐色に変化する。この溶液を、これ以降、「マグネトフェリチン」と呼ぶ。
【０１３１】
このマグネトフェリチン溶液は、室温で一晩、ボトルに対して保持された強力なネオジウム環磁石と共に、インキュベートされた。翌日、図１８の写真に見られるように、黒色の固体物質が磁石に引き付けられていた。
【０１３２】
（マグネトフェリチンの濃縮）
このマグネトフェリチン溶液５００ｍｌを、磁石に接触させた５本のＭａｃｓ（登録商標）ＬＳカラムに通した（およそ１００ｍｌのマグネトフェリチンをそれぞれのカラムに通した）。カラムを通った溶液（「フロースルー」と呼ぶ）を、デュランボトル（Ｄｕｒａｎ  ｂｏｔｔｌｅｓ）に回収した。それぞれのカラムに捕捉された物質を、磁石からカラムを外すことによって３ｍｌのＰＢＳで溶出し、この３ｍｌのＰＢＳを加え、供給されるプランジャーを使用することで各カラムからおよそ４．５ｍの溶液として溶出した。およそ１ｍｌを２℃〜８℃で保存し後の分析に使用した（これを「透析前濃縮マグネトフェリチン」と呼ぶ）。溶出溶液の残り（〜２０ｍｌ）を５リットルのＰＢＳに対して４℃で一晩透析し（これを「透析後濃縮マグネトフェリチン」と呼ぶ）、過剰のＦｅ及びＴＭＡを取り除き、溶液の色の変化を注目した。元のマグネトフェリチンは暗褐色であり、フロースルーは淡黄色であり、Ｍａｃｓ（登録商標）カラム濃縮物質は、暗褐色から黒色であった。
【０１３３】
透析チューブ（Ｍｅｄｉｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ．、分子量カットオフ１２−１４０００ダルトン、〜１５ｃｍ）を１０分間ＲＯ水にインキュベートしチューブを軟化させた。磁気的に単離し濃縮したマグネトフェリチンを透析チューブに移し、５リットルのＰＢＳで２℃〜８℃で一晩攪拌しインキュベートした。翌日ＰＢＳ溶液を、２時間間隔で３回取替え、透析を２℃〜８℃で続けた。
【０１３４】
（マグネトフェリチンの分析）
磁石を使用して単離した磁性タンパク質の量を比較するため、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）分析を行った。
【０１３５】
（材料）
炭酸塩緩衝液（０．１５９ｇ炭酸ナトリウム及び０．３ｇ重炭酸ナトリウムを１００ｍｌのＲＯ水に溶解）
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（リン酸１０ｍＭ、ＮａＣｌ１４０ｍＭ、ｐＨ７．４）
ＰＢＳに溶解した１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ（Ｃｅｌｌｉａｎｃｅ  ８２−０４５−２））
ウマ脾臓アポフェリチン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ａ３６４１）
ウサギ抗ウマフェリチン抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｆ６１３６）
ヤギ抗ウサギ抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａ３６８７）
基質の液体安定性フェノールフタレインリン酸
停止液（２１２ｇの炭酸ナトリウム、１１０．５ｇの３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、２１７ｇエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、８０ｇ水酸化ナトリウム、水を合わせて５リットルにする）
Ｍａｘｉｓｏｒｂマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ  Ｃａｔ：４６８６６７）
【０１３６】
（方法）
マグネトフェリチンの定量のために、アポフェリチンの希釈を行った（５０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、６．２５μｇ／ｍｌ、３．１２５μｇ／ｍｌ、及び１．５６２５μｇ／ｍｌ）。
【０１３７】
マグネトフェリチン（未精製）、透析前濃縮マグネトフェリチン、透析後マグネトフェリチン、及びフロースルーを炭酸塩緩衝液で以下のように希釈した。
【０１３８】
マグネトフェリチン、透析前マグネトフェリチン、及び透析後マグネトフェリチンの希釈：１００倍希釈、２００倍希釈、４００倍希釈、８００倍希釈、１６００倍希釈、３２００倍希釈、６４００倍希釈、及び１２８００倍希釈。
フロースルー：１０倍希釈、２０倍希釈、４０倍希釈、８０倍希釈、１６０倍希釈、３２０倍希釈、６４０倍希釈、及び１２８０倍希釈。
【０１３９】
それぞれの溶液１００μｌを、マイクロタイタープレートのウェルに、２連で加えた。炭酸塩緩衝液１００μｌを２つのウェルに陰性対照として加えた。このプレートを一晩４℃でインキュベートした。翌日、溶液をはじき出し、ウェルを２００μｌの１％ＢＳＡを使用して室温で１時間かけてブロッキングした。ウェル当たり３００μｌのＰＢＳで３回洗浄した後、ウェルを軽くたたいて乾かし、次に１００μｌの１０μｇ／ｍｌ抗ウマフェリチン抗体を加えた。これを、室温で１時間インキュベートした後、取り除きウェルを前記のようにして洗浄した。ＡＰを結合した抗ウサギ抗体を、７．４３μｇ／ｍｌの濃度が得られるように３５００のＰＢＳに対して１の割合で加え希釈し、室温で１時間インキュベートした。結合抗体を取り除き、ウェルを前記のようにして洗浄した。ＡＰの基質（１００μｌ）をそれぞれのウェルに加え、１５分間展開し、停止液を加えた。Ｖａｒｉｏｓｋａｎ  Ｆｌａｓｈ機器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、吸光度を測定した。
【０１４０】
Ｍａｃｓ（登録商標）カラムは、フロースルーに見られる量の３５倍を超えて多い量のマグネトフェリチンを保持しており、タンパク質の磁化が成功していることが示された。
【０１４１】
（アポフェリチンの生成／ウマ脾臓フェリチンの脱塩）
（材料）
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５
チオグリコール酸（Ｓｉｇｍａ  Ｔ６７５０）
ウマ脾臓フェリチン（Ｓｉｇｍａ  ９６７０１）
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（リン酸１０ｍＭ、ＮａＣｌ１４０ｍＭ、ｐＨ７．４）
【０１４２】
（方法）
透析チューブを１０分間ＲＯ水中で軟化させた。１０ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液を、両端をクリップで留めた透析チューブ中に入れた１ｍｌウマ脾臓フェリチン（１２５ｍｇ／ｍｌ）に加えた。透析バッグを、Ｎ２で１時間不純物を取り除いた０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（〜８００ｍｌ）に移した。チオグリコール酸（２ｍｌ）をこの緩衝液に添加し、続けて２時間Ｎ２で不純物を取り除いた。更に１ｍｌのチオグリコール酸を酢酸ナトリウム緩衝液に加え、続いて更に３０分間Ｎ２で不純物を取り除いた。酢酸ナトリウム緩衝液（８００ｍｌ）を、取替え、続けて不純物を取り除いた。フェリチン溶液が無色になるまで前記脱塩手順を繰り返した。Ｎ２による不純物の除去を終了し、アポフェリチン溶液をＰＢＳ（２Ｌ）で１時間攪拌下に透析した。ＰＢＳを取替え（３リットル）、アポフェリチン溶液をＰＢＳで２℃〜８℃で一晩透析した。
【０１４３】
フェリチン溶液は、この手順の間淡褐色から無色に変色し、鉄が除去されていることが示された。
【０１４４】
（加熱処理した抗フィブロネクチン：フェリチン融合タンパク質の分析）
（材料）
炭酸塩緩衝液（０．１５９ｇ炭酸ナトリウム及び０．３ｇ重炭酸ナトリウムを１００ｍｌの水に溶解）
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
ＰＢＳに溶解した１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ（Ｃｅｌｌｉａｎｃｅ  ８２−０４５−２））
フィブロネクチンペプチド
抗フィブロネクチン：フェリチン融合タンパク質（ｓｃＦｖ：フェリチン）
抗ヒトフェリチンネズミモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ＳＣ５１８８７）
抗マウスアルカリホスファターゼ抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａ３５６２）
基質の液体安定性フェノールフタレインリン酸
停止液（２１２ｇの炭酸ナトリウム、１１０．５ｇの３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、２１７ｇのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、８０ｇの水酸化ナトリウム、水を合わせて５リットルにする）
Ｍａｘｉｓｏｒｂマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ  Ｃａｔ：４６８６６７）
【０１４５】
（方法）
１００μｌ（１００μｇ／ｍｌ）のｓｃＦｖ：フェリチンを薄壁ＰＣＲチューブへ移し、サーモサイクラーで６０℃、３０分間加熱した。
【０１４６】
マイクロタイタープレートのウェルを、１５μｇ／ｍｌに炭酸塩緩衝液で希釈したフィブロネクチンペプチド（１．５ｍｇ／ｍｌで供給されている）で被覆し、４℃で一晩インキュベートした。過剰の溶液をはじき出し、プレートをＰＢＳに溶解した１％ＢＳＡで室温にて１時間かけてブロッキングした。これを、はじき出し、プレートをＰＢＳを使用して３回洗った。ｓｃＦｖ：フェリチン融合タンパク質及び加熱処理ｓｃＦｖ：フェリチン融合タンパク質を、３３μｇ／ｍｌ（それぞれ１００μｌ）の濃度でウェルに添加した。フェリチン融合タンパク質を室温で２時間インキュベートし、次に取り除きそしてウェルを前記のようにして洗浄した。マウス抗フェリチン抗体を２０μｇ／ｍｌの濃度で１００μｌずつそれぞれのウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。次にこれを除去し、ウェルを前記のようにして洗浄した。ヤギ抗マウスＡＰ結合抗体を希釈し（５０μｌ＋ＰＢＳ９５０μｌ）、そして全ウェルに１００μｌずつ加えた。これを室温で１時間インキュベートし、前記のようにして除去した。全ウェルに基質を加え、室温で４５分間インキュベートし、停止液で反応を停止させた。Ｖａｒｉｏｓｋａｎ  Ｆｌａｓｈ機器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）を使用して吸光度を記録した。
【０１４７】
ｓｃＦｖ：フェリチンは、３０分かけて６０℃まで加熱した後も、フィブロネクチンへの結合能を維持し、抗ヒトフェリチンモノクローナル抗体によって検出可能であった（図２０）。
【０１４８】
（抗フィブロネクチン：フェリチン融合タンパク質の脱塩）
（材料）
抗フィブロネクチン：フェリチン融合タンパク質（ｓｃＦｖ：フェリチン）
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液
チオグリコール酸（７０％  Ｗ／Ｗ  Ｓｉｇｍａ  Ｔ６７５０）
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（リン酸１０ｍＭ、ＮａＣｌ１４０ｍＭ、ｐＨ７．４）
【０１４９】
（方法）
ｓｃＦｖ：フェリチン融合タンパク質を−２０℃下から室温下に移して解凍した。１００μｇ／ｍｌを９ｍｌ溶液として軟化させた透析チューブに分注した。融合タンパク質を含むチューブを全部で１ｍｌの酢酸ナトリウム緩衝液ですすぎ、９ｍｌのタンパク質溶液に１ｍｌ添加することで０．９ｍｇ／ｍｌの溶液を得た。８００ｍｌ酢酸ナトリウム緩衝液からＮ２で１５分かけて不純物を取り除き、次に透析バッグを入れた。次に、溶液から更に２時間かけて不純物を取り除いた。２ｍｌのチオグリコール酸を緩衝液に加え、これの不純物を続けてＮ２を使用して取り除いた。更に２時間後、もう１ｍｌのチオグリコール酸を加えた。緩衝液を取替え（３ｍｌのチオグリコール酸を含む８００ｍｌの予め不純物を取り除いた酢酸ナトリウム緩衝液）、Ｎ２下で１時間透析を続けた。次に透析バッグを２リットルのＰＢＳに移して室温で（Ｎ２非存在下に）保持し、更に３リットルのＰＢＳ中に４℃で一晩保持した。次にこの脱塩済み融合タンパク質を使って、以下の鉄添加及び制御された酸化を実施することによって常磁性融合タンパク質を生成した。
【０１５０】
（磁性ｓｃＦｖ：フェリチンの生成）
（材料）
逆浸透水（ＲＯ水）
５０ｍＭ  Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳＯ）緩衝液ｐＨ８．６（Ｓｉｇｍａ  Ａ６６５９）
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（リン酸１０ｍＭ、ＮａＣｌ１４０ｍＭ、ｐＨ７．４）
トリメチルアミン−Ｎ−酸化物（ＴＭＡ）（Ｓｉｇｍａ  ３１７５９４）
０．１Ｍ硫酸アンモニウム鉄（II）
【０１５１】
（方法）
トリメチルアミン−Ｎ−酸化物（ＴＭＡ）をオーブンで８０℃まで３０分かけて加熱してＭｅ３Ｎを除去し、その後室温まで冷却した。１１４ｍｇのＴＭＡを１５ｍｌのＲＯ水に加え、０．０７Ｍ溶液を生成した。鉄及びＴＭＡ溶液は、使用前に１５分間Ｎ２で不純物を取り除いた。
【０１５２】
透析バッグ（上記した）内に含有される脱塩融合タンパク質を、室温で攪拌しながら窒素存在下で２時間かけて１リットルのＡＭＰＳＯ緩衝液で透析した。脱塩ｓｃＦｖ：フェリチン（〜１０ｍｌ）を三角フラスコに移した。１８μｌの鉄溶液を脱塩タンパク質溶液に添加し、一方でＮ２で不純物を取り除きいかなる残余の酸素も除去した。２５分後、１５μｌの鉄及び１０μｌのＴＭＡを加えた。
【０１５３】
以下の更なる量の鉄及びＴＭＡ緩衝液を、次に１５分間隔で加えた：
第３添加  ３０μｌの鉄及び２０μｌのＴＭＡ
第４添加  １５μｌの鉄及び１０μｌのＴＭＡ
第５添加  １５μｌの鉄及び１０μｌのＴＭＡ
第６添加  １５μｌの鉄及び１０μｌのＴＭＡ
【０１５４】
磁化タンパク質をＭａｃｓ（登録商標）ＬＳカラムに通した。フロースルーを、２回目の試行として通し、捕捉効率を促進させた。磁化タンパク質を、磁石からカラムを外すことでカラムから溶出し、１ｍｌのＰＢＳを加え、プランジャーを使用しておよそ２ｍｌの溶出液を得た。これは、カラムでのタンパク質の２倍希釈となる。
【０１５５】
溶出タンパク質及び対照を、以下に詳述するように分析のためにマイクロタイタープレート上に被覆した。
【０１５６】
（ＥＬＩＳＡによるｓｃＦｖ：マグネトフェリチン融合タンパク質の分析）
磁化融合タンパク質が抗フェリチンモノクローナル抗体に対する結合能を保持しているかどうかを確かめるために、酵素免疫測定法を実施した。
【０１５７】
（材料）
炭酸塩緩衝液（０．１５９ｇ炭酸ナトリウム及び０．３ｇ重炭酸ナトリウムを１００ｍｌの水に溶解）ｐＨ９．６
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（リン酸１０ｍＭ、ＮａＣｌ１４０ｍＭ、ｐＨ７．４）
フィブロネクチンペプチド
抗フィブロネクチン：フェリチン融合タンパク質（ｓｃＦｖ：フェリチン）
抗ヒトフェリチンネズミモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ＳＣ５１８８７）
抗マウスアルカリホスファターゼ抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａ３５６２）
基質の液体安定性フェノールフタレインリン酸
停止液（２１２ｇの炭酸ナトリウム、１１０．５ｇの３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、２１７ｇのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、８０ｇの水酸化ナトリウム、水を合わせて５リットルにする）
Ｍａｘｉｓｏｒｂマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ  Ｃａｔ：４６８６６７）
【０１５８】
（方法）
（融合タンパク質被覆ウェル）
ウェルを、ｓｃＦｖ：フェリチン（未処理）、ｓｃＦｖ：マグネトフェリチン、Ｍａｃｓ（登録商標）カラムから溶出したｓｃＦｖ：マグネトフェリチン、及び炭酸塩緩衝液３に１の割合の濃度のフロースルーで被覆した。プレートを週末をかけて４℃でインキュベートした。過剰の溶液をはじき出し、プレートをＰＢＳに溶解した１％ＢＳＡを使用して室温で１時間かけて封鎖した。これを、はじき出し、プレートをＰＢＳを使用して３回洗浄した（１回の洗浄にウェル当たり３００μｌを使用した）。２０μｇ／ｍｌの濃度のマウス抗フェリチン抗体をそれぞれのウェルへ１００μｌ加え、室温で１時間インキュベートした。これを除去し、ウェルを前記と同様にして洗った。ヤギ抗マウスＡＰ結合抗体を１０μｇ／ｍｌに希釈し、全てのウェルに１００μｌずつ添加した。これを室温で１時間インキュベートし、前記のように除去した。基質を全てのウェルに添加し、１時間室温でインキュベートし、反応は停止液を使用して終了した。Ｖａｒｉｏｓｋａｎ  Ｆｌａｓｈ機器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）を使用して吸光度を記録した（図２１ａ参照）。
【０１５９】
（フィブロネクチン被覆ウェル）
マイクロタイタープレートのウェルを、炭酸塩緩衝液で１５μｇ／ｍｌに希釈したフィブロネクチンペプチド（１．５ｍｇ／ｍｌで供給される）１００μｌで被覆した。プレートは、２℃〜８℃で一晩インキュベートした。過剰な溶液は、はじき出し、ウェルは３００μｌＰＢＳで３回洗った。ｓｃＦｖ：フェリチン融合タンパク質を、適切なウェル（１００μｌ）に、希釈せずに２連で加えた。次にプレートを１時間室温でインキュベートした。溶液をはじき出し、ウェルを３００μｌＰＢＳで３回洗浄した。２０μｇ／ｍｌの濃度のマウス抗フェリチン抗体を、それぞれのウェルに１００μｌずつ加え、室温で１時間インキュベートした。次にこれを除去し、ウェルを前記のようにして洗った。ヤギ抗マウスＡＰ結合抗体を１０μｇ／ｍｌに希釈し、全てのウェルに１００μｌで加えた。これを室温で１時間インキュベートし、前記のようにして除去した。基質を全てのウェルに加え、室温で４５分間インキュベートし、反応は停止液を使用して終了した。Ｖａｒｉｏｓｋａｎ  Ｆｌａｓｈ機器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）を使用して吸光度を記録した（図２１ｂ参照）。
【０１６０】
Ｍａｃｓ（登録商標）カラムで磁化融合タンパク質を濃縮したが、これは依然としてモノクローナル抗フェリチン抗体によって認識された。これは、抗フィブロネクチンフェリチン融合タンパク質は磁化された一方、構造上の完全性を維持していたことを示している。このデータは、磁化抗フィブロネクチンフェリチン融合タンパク質が標的抗原に対する結合能力を維持していることも示し、それゆえ磁化可能かつ標的に選択的に結合できる二機能性の一本鎖融合タンパク質が生成したことを示す。
【０１６１】
（実施例４−更なるプロトコル）
（ｓｃＦｖＭＴ２融合タンパク質の磁化）
ｓｃＦｖ−ＭＴ２融合タンパク質は、亜鉛イオンをマンガンイオン及びカドミウムイオンで置き換えることによって磁化できる。これを実施する方法は、必要に応じて最適化することができる。これを達成する方法は、必要に応じて公開されているプロトコルの適合形態の透析法も使用して、透析によって亜鉛を減少させ、続いて置き換える工程を含む。
【０１６２】
詳細には、これらのプロトコルは以下の通りである：
１．ＭＴ２（５ｍｇ）を５ｍｌの緩衝液（尿素４．５Ｍ、トリス塩基１０ｍＭ、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）０．１Ｍ、マンニトール０．１％、及びＰｅｆａｂｌｏｃ０．５ｍＭ、ｐＨ１１）に溶解し、タンパク質から金属イオンを除去する。
２．同緩衝液で１時間透析する。
３．タンパク質を緩衝液１（トリス塩基１０ｍＭ、尿素２Ｍ、ＤＴＴ０．１Ｍ、マンニトール０．１％、Ｐｅｆａｂｌｏｃ０．５ｕＭ、及びＣｄ２＋／Ｍｎ２＋１ｍＭ、ｐＨ１１）で７２時間透析することによって再度折りたたませる。
４．透析緩衝液を緩衝液２（同上だが尿素の濃度が１Ｍである点だけが異なる）に変え、２４時間透析する。
５．透析緩衝液を同上だが尿素を含まない点だけが異なる緩衝液に変える。２４時間透析する。
６．工程５の透析緩衝液をｐＨ８．８の緩衝液に変え、２４時間透析する。
７．工程６の緩衝液をマンニトールを含まない緩衝液に変え、前記のように透析する。
８．工程７の緩衝液をＣｄ２＋／Ｍｎ２＋を含まない緩衝液に変え、２４時間透析する。
結合の特性は、上記のように実施例２でフェリチン融合タンパク質について行ったようにして評価できる。
【０１６３】
（融合タンパク質を使用して、マイクロ流体素子でアナライトをアッセイするプロトコル）
所望の量の融合タンパク質をマイクロ流体素子内で、関心のあるアナライトを含有する粗血漿サンプルに混合する。
【０１６４】
関心のあるアナライトが、マイクロ流体素子の磁化側に捕捉され、汚染物質が洗い流される。磁石は切り離され、精製タンパク質が検出システムに移される。
【図２】
0005453095.tif 000012
【図３】
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【図４ａ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図８】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１ａ】
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【図２１ｂ】
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【図１】
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【図４ｂ】
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【図７】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
0005453095.tif 000030
【図９ｃ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
0005453095.tif 000034
【図１２】
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【図１３】
0005453095.tif 000036
【図１４】
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【図１５】
0005453095.tif 000038
【図１６】
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【図１８】
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【配列表】
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