(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する分子量５，９００のペプチド（５．９ｋＤａペプチド）に、５．９ｋＤａペプチドのＮ末端領域を認識する抗体またはその抗体断片と、５．９ｋＤａペプチドのＣ末端領域を認識する抗体またはその抗体断片とを接触させて、５．９ｋＤａペプチドと該２つの抗体またはそれらの抗体断片との免疫複合体を生成させ、得られた免疫複合体を測定することを特徴とする、５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法。
【請求項２】
５．９ｋＤａペプチドのＮ末端領域を認識する抗体が５．９ｋＤａペプチドのＮ末端から１〜３９番目のアミノ酸領域に存在するいずれかのエピトープを認識する抗体であり、５．９ｋＤａペプチドのＣ末端領域を認識する抗体が、５．９ｋＤａペプチドのＮ末端から１８〜５４番目のアミノ酸領域に存在しかつ前記Ｎ末端領域を認識する抗体が認識するエピトープよりもＣ末端側に位置するいずれかのエピトープを認識する抗体であって、これら２つの抗体が認識するエピトープは互いに重複せず、かつ、これら２つの抗体が互いに５．９ｋＤａペプチドとの結合を妨げない、請求項１記載の免疫学的測定方法。
【請求項３】
５．９ｋＤａペプチドのＮ末端領域を認識する抗体が、５．９ｋＤａペプチドのＮ末端から１〜１７番目のアミノ酸領域に存在するエピトープを認識する抗体である、請求項１または２に記載の免疫学的測定方法。
【請求項４】
５．９ｋＤａペプチドのＣ末端領域を認識する抗体が、５．９ｋＤａペプチドのＮ末端から４０〜５４番目のアミノ酸領域に存在するエピトープを認識する抗体である、請求項１から３のいずれかに記載の免疫学的測定方法。
【請求項５】
免疫複合体を、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定する、請求項１から４のいずれかに記載の免疫学的測定方法。
【請求項６】
免疫複合体を、ラテックス免疫凝集測定法により測定する、請求項１から４のいずれかに記載の免疫学的測定方法。
【請求項７】
検体が、全血、血清、血漿、尿、唾液、脳脊髄液、胸水、腹水、心嚢水、関節液、または、リンパ液であって、５．９ｋＤａペプチドを含む可能性がある、請求項１から６のいずれかに記載の免疫学的測定方法。
【請求項８】
５．９ｋＤａペプチドのＮ末端領域を認識する抗体またはその抗体断片と５．９ｋＤａペプチドのＣ末端領域を認識する抗体またはその抗体断片とを含む、５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定用キット。
【請求項９】
５．９ｋＤａペプチドのＮ末端領域を認識する抗体またはその抗体断片と５．９ｋＤａペプチドのＣ末端領域を認識する抗体またはその抗体断片とを含み、いずれか一方の抗体またはその抗体断片が標識された標識抗体または標識抗体断片であり、他方の抗体またはその抗体断片が固相に結合された固相結合抗体または固相結合抗体断片であって、サンドイッチＥＬＩＳＡ法による５．９ｋＤａペプチドを測定するための請求項８に記載の免疫学的測定用キット。
【請求項１０】
不溶性担体粒子に感作した５．９ｋＤａペプチドのＮ末端領域を認識する抗体またはその抗体断片と、不溶性担体粒子に感作した５．９ｋＤａペプチドのＣ末端領域を認識する抗体またはその抗体断片とを含み、ラテックス免疫凝集測定法による５．９ｋＤａペプチドを測定するための請求項８に記載の免疫学的測定用キット。
【請求項１１】
５．９ｋＤａペプチドのＮ末端領域を認識する抗体またはその抗体断片と、５．９ｋＤａペプチドのＣ末端領域を認識する抗体またはその抗体断片の２つの抗体またはそれらの抗体断片の両方を１つの不溶性担体粒子に感作し得られた１種類の不溶性担体粒子；該２つの抗体またはその抗体断片をそれぞれ別の不溶性担体粒子に感作し得られた２種類の不溶性担体粒子；または、これら３種類の不溶性担体粒子の混合物を含む、請求項１０に記載の免疫学的測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテオーム解析によって肝臓疾患用ペプチドマーカーとして利用できることが見出された、ヒトフィブリノーゲンα−Ｅ鎖、または、ヒトフィブリノーゲンα鎖の分解産物であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する分子量５，９００のペプチド（以下、５．９ｋＤａペプチドという）を検体から検出、あるいは、検体中の５．９ｋＤａペプチド濃度を定量するための免疫学的測定方法、および、免疫学的測定用キットに関する。また、本発明は、５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法に用いられる、５．９ｋＤａペプチドのＮ末端領域を認識する抗体およびＣ末端領域を認識する抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、網羅的なプロテオーム解析が世界規模で進行しており、プロテオーム解析を用いた疾患マーカーの探索も広く行われている（特許文献１−２、非特許文献１−３）。プロテオーム解析では、一般的に、生体由来試料中に含まれるタンパク質またはその分解産物であるペプチドをそれぞれ分離し、分離されたタンパク質またはペプチドのアミノ酸配列を質量分析装置により解析し、得られたアミノ酸配列とデータベース中のアミノ酸配列とを照合することで、試料中に含まれるタンパク質またはペプチドが同定される。疾患の有無によって生体内で発現するタンパク質は異なるため、プロテオーム解析により疾患特異的に発現量が増減することが見出されたタンパク質またはペプチドは、その疾患マーカーとして利用できる可能性を有する。
プロテオーム解析を通じて、本発明者らは、断酒目的に入院したアルコール依存症患者において経時的に採取された血清検体から、習慣飲酒に伴って増減する新規の血清ペプチドの一つとして５．９ｋＤａペプチドを同定し、これが肝臓疾患診断マーカーとして利用できることを見出した（特許文献１、非特許文献１−２）。
また、本発明者らは、５４残基からなる５．９ｋＤａペプチドの全長ペプチドを抗原として得られた二種類のモノクローナル抗体を用いて、単離された５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定が可能なことを示した（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００４／０５８９６６号
【特許文献２】国際公開第２００４／０９０５５０号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Nomura, F. et al., Proteomics, 4, 1187-1194, 2004
【非特許文献２】Nomura, F. et al., J. Chromatogr. B., 855, 35-41, 2007
【非特許文献３】Hanash, S. M. et al., Nature, 452, 571-579, 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
今日までに、プロテオーム解析を用いて、臨床的に有用なペプチドが多数報告されている。しかし、本発明者らの知る限りにおいて、これらの疾患マーカー候補ペプチドが、臨床診断の分野で広く一般的に使用されている免疫学的な検出方法を用いて定量測定されている報告はほとんど見受けられない。この免疫学的測定方法の確立が困難な点が、プロテオーム解析により発見されたペプチドマーカーの普及を妨げてきた。
免疫学的測定方法の確立が困難である原因として、第一に、ペプチドに対する特異的抗体の作出が困難であることが挙げられる。第二に、プロテオーム解析により発見されているペプチドは、生体由来試料に存在しているマチュアなタンパク質の分解産物であることも多く、目的とするペプチドの配列を含む目的ペプチド以外の多くの分解産物が試料中に混在していることが挙げられる。このような場合、目的とするペプチドを免疫原として抗体を作出しても、混在した分解産物との非特異的な反応が生じ、目的ペプチドを正確に定量分析ができない。【０００６】
特に、本発明が測定対象とする５．９ｋＤａペプチドを分解により産生するヒトフィブリノーゲンは、凝固・線溶系に関わるタンパク質であり、生体内にその分解物が多数存在する。具体的には、フィブリノーゲンは、凝固系においては、トロンビンによって分解され、フィブリンモノマーを生じる。線溶系においては、フィブリンモノマーから構成されるフィブリンポリマーがプラスミンにより複数の部位で分解されるため、必然的に、多数のフィブリノーゲン分解産物を生じる。
例えば、データベースＰｅｐｔｉｄｅＡｔｌａｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｅｐｔｉｄｅａｔｌａｓ．ｏｒｇ／）中のビルドＨｕｍａｎ  Ｐｌａｓｍａ  ＰｅｐｔｉｄｅＡｔｌａｓ  ２００９−０５によれば、ヒトフィブリノーゲンα−Ｅ鎖（データベース内タンパク質名：ＥＮＳＰ０００００３０６３６１）の分解産物として２３９種類のペプチドが観測されている。
本発明者らは、前述したように５４残基からなる５．９ｋＤａペプチドの全長ペプチドを抗原とした５．９ｋＤａペプチドに対する二種類のモノクローナル抗体の作成、および、単離された５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定には成功した（特許文献１）。しかし、これらのモノクローナル抗体を用いても、多数のヒトフィブリノーゲン分解産物を含む可能性のある検体中の５．９ｋＤａペプチドの定量を十分に正確に測定するには更に改良の余地があるものである。【０００７】
この実状に鑑み、本発明の課題は、多数のヒトフィブリノーゲンα−Ｅ鎖／α鎖分解産物を含む可能性のある検体から、５．９ｋＤａペプチドを特異的に検出し、定量する免疫学的測定方法を提供することにある。更には、本発明の課題は、該免疫学的測定方法に用いるためのキット並びに該免疫学的測定方法および該キットに用いる５．９ｋＤａペプチドのＮ末端領域を認識する抗体およびＣ末端領域を認識する抗体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
５．９ｋＤａペプチドのアミノ酸配列を含むフィブリノーゲン鎖は、２種類が知られている。すなわち、ヒトフィブリノーゲンα−Ｅ鎖（以下、Ｆα−Ｅ鎖ということもある）と、ヒトフィブリノーゲンα鎖（以下、Ｆα鎖ということもある）である。Ｆα−Ｅ鎖とＦα鎖とは、５．９ｋＤａペプチドの配列を基準にしてＮ末端側上流領域のアミノ酸配列は完全に一致しているが、Ｃ末端側下流領域のアミノ酸配列が異なる。Ｆα−Ｅ鎖とＦα鎖の分解産物は、前述したように５．９ｋＤａ以外にも血液試料中に少なくとも２００種類以上の夾雑ペプチドが存在する。
そのため、本発明者らは、当初、Ｆα−Ｅ鎖とＦα鎖中のいくつかのアミノ酸配列を有する複数のペプチドを抗原とする複数の抗体を製造し、それらの中で５．９kＤａペプチドの配列の最近傍領域を抗原とする抗体を夾雑ペプチド除去用抗体とし、残りを５．９ｋＤａペプチド測定用抗体として用いて、５．９ｋＤａペプチドを測定することを試みた。すなわち、複数の夾雑ペプチド除去用抗体を用いて夾雑ペプチドを除去する操作の後に、５．９ｋＤａペプチド測定用抗体を用いて試料中の５．９ｋＤａペプチドを測定することを試みた。
具体的には、夾雑ペプチド除去用抗体を作成するために用いる抗原ペプチドは、（ａ１）Ｆα−Ｅ鎖またはＦα鎖中の５．９ｋＤａペプチドのＮ末端側上流領域７個のアミノ酸配列（アミノ酸配列ＥＦＰＳＲＧＫ）、（ａ２）Ｆα−Ｅ鎖中の５．９ｋＤａペプチド領域のＣ末端側下流領域の１３個のアミノ酸配列（アミノ酸配列ＲＤＣＤＤＶＬＱＴＨＰＳＧ）を認識する抗体、および、（ａ３）Ｆα鎖中の５．９ｋＤａペプチド領域のＣ末端側下流領域１３個のアミノ酸配列（アミノ酸配列ＲＧＩＨＴＳＰＬＧＫＰＳＬ）とした。また、５．９ｋＤａペプチド測定用抗体として、最終的には、（ｂ１）５．９ｋＤａペプチドのＮ末端領域を認識する抗体、（ｂ２）５．９ｋＤａペプチドのＣ末端領域を認識する抗体、を用いることが良好であった。【０００９】
しかし、驚くべきことに、前述した夾雑ペプチドの除去操作を経ず、５．９ｋＤａペプチドに５．９ｋＤａペプチドのＮ末端領域を認識する抗体と５．９ｋＤａペプチドのＣ末端領域を認識する抗体とを接触させて得られる、５．９ｋＤａペプチドと二つの抗体との免疫複合体を免疫学的に測定するだけで、通常のウエスタンブロッティング法では検体中にこれら二つの抗体が結合する夾雑ペプチドが検出されるにもかかわらず、前述した夾雑ペプチド除去操作で除去されるべき夾雑ペプチドの影響を受けず、多数のヒトフィブリノーゲンα−Ｅ鎖／α鎖分解産物を含む可能性のある検体から実質的に５．９ｋＤａペプチドのみを測定することが可能なことを本発明者らは見出し、本発明を完成させるに至った。【００１０】
従って、本発明は、以下に挙げる検体中の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法、免疫学的測定用キットおよびそれらに用いる抗体に関する。
［１］．検体中の配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する分子量５，９００のペプチド（５．９ｋＤａペプチド）に、５．９ｋＤａペプチドのＮ末端領域を認識する抗体またはその抗体断片と、５．９ｋＤａペプチドのＣ末端領域を認識する抗体またはその抗体断片とを接触させて、５．９ｋＤａペプチドと該２つの抗体またはそれらの抗体断片との免疫複合体を生成させ、得られた免疫複合体を測定することを特徴とする、５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法。
［２］．５．９ｋＤａペプチドのＮ末端領域を認識する抗体が５．９ｋＤａペプチドのＮ末端から１〜３９番目のアミノ酸領域に存在するいずれかのエピトープを認識する抗体であり、５．９ｋＤａペプチドのＣ末端領域を認識する抗体が、５．９ｋＤａペプチドのＮ末端から１８〜５４番目のアミノ酸領域に存在しかつ前記Ｎ末端領域を認識する抗体が認識するエピトープよりもＣ末端側に位置するいずれかのエピトープを認識する抗体であって、これら２つの抗体が認識するエピトープは互いに重複せず、かつ、これら２つの抗体が互いに５．９ｋＤａペプチドとの結合を妨げない、上記［１］記載の免疫学的測定方法。
［３］．５．９ｋＤａペプチドのＮ末端領域を認識する抗体が、５．９ｋＤａペプチドのＮ末端から１〜１７番目のアミノ酸領域に存在するエピトープを認識する抗体である、上記［１］または［２］に記載の免疫学的測定方法。
［４］．５．９ｋＤａペプチドのＣ末端領域を認識する抗体が、５．９ｋＤａペプチドのＮ末端から４０〜５４番目のアミノ酸領域に存在するエピトープを認識する抗体である、上記［１］から［３］のいずれかに記載の免疫学的測定方法。
［５］．免疫複合体を、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定する、上記［１］から［４］のいずれかに記載の免疫学的測定方法。
［６］．免疫複合体を、ラテックス免疫凝集測定法により測定する、上記［１］から［４］のいずれかに記載の免疫学的測定方法。
［７］．検体が、全血、血清、血漿、尿、唾液、脳脊髄液、胸水、腹水、心嚢水、関節液、または、リンパ液であって、５．９ｋＤａペプチドを含む可能性がある、上記［１］から［６］のいずれかに記載の免疫学的測定方法。
［８］．５．９ｋＤａペプチドのＮ末端領域を認識する抗体またはその抗体断片と５．９ｋＤａペプチドのＣ末端領域を認識する抗体またはその抗体断片とを含む、５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定用キット。
［９］．５．９ｋＤａペプチドのＮ末端領域を認識する抗体またはその抗体断片と５．９ｋＤａペプチドのＣ末端領域を認識する抗体またはその抗体断片とを含み、いずれか一方の抗体またはその抗体断片が標識された標識抗体または標識抗体断片であり、他方の抗体またはその抗体断片が固相に結合された固相結合抗体または固相結合抗体断片であって、サンドイッチＥＬＩＳＡ法による５．９ｋＤａペプチドを測定するための上記［８］に記載の免疫学的測定用キット。
［１０］．不溶性担体粒子に感作した５．９ｋＤａペプチドのＮ末端領域を認識する抗体またはその抗体断片と、不溶性担体粒子に感作した５．９ｋＤａペプチドのＣ末端領域を認識する抗体またはその抗体断片とを含み、ラテックス免疫凝集測定法による５．９ｋＤａペプチドを測定するための上記［８］に記載の免疫学的測定用キット。
［１１］．５．９ｋＤａペプチドのＮ末端領域を認識する抗体またはその抗体断片と、５．９ｋＤａペプチドのＣ末端領域を認識する抗体またはその抗体断片の２つの抗体またはそれらの抗体断片の両方を１つの不溶性担体粒子に感作し得られた１種類の不溶性担体粒子；該２つの抗体またはそれらの抗体断片をそれぞれ別の不溶性担体粒子に感作し得られた２種類の不溶性担体粒子；または、これら３種類の不溶性担体粒子の混合物を含む、上記［１０］に記載の免疫学的測定用キット。
［１２］．５．９ｋＤａペプチドのＮ末端から１〜１７番目のアミノ酸領域に存在するエピトープを認識する抗体またはその抗体断片。
［１３］．５．９ｋＤａペプチドのＮ末端から４０〜５４番目のアミノ酸領域に存在するエピトープを認識する抗体またはその抗体断片。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法により、多数の夾雑ペプチドを含む可能性のある検体から、簡便かつ正確に５．９ｋＤａペプチドを特異的に測定することが可能である。質量分析装置を用いた５．９ｋＤａペプチドの定量測定も可能であるが、より簡便で同等の精度を有し、かつ、スループットの高い本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法を用いて、肝臓疾患診断用ペプチドマーカーである５．９ｋＤａペプチドを定量することで、習慣飲酒者や問題飲酒者が肝臓疾患を発症する可能性や、飲酒以外が原因の肝臓疾患、例えば、肝炎、肝硬変、または、脂肪肝の診断を容易に行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例２で作成された、一次抗体にａｎｔｉ−５．９Ｃを用い、二次抗体にａｎｔｉ−５．９Ｎを用いた本発明のサンドイッチＥＬＩＳＡ測定系と、比較例１で作成された、一次抗体にａｎｔｉ−５．９Ｗ１を用い、二次抗体にａｎｔｉ−５．９Ｗ２を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ測定系を用いて、血清中の５．９ｋＤａペプチド濃度を測定したときの検量線を示した図である。縦軸が、波長４５０ｎｍにおける吸光度を表し、横軸が、試料を１／３３３に希釈する前の５．９ｋＤａペプチド濃度（μｇ／ｍｌ）を表している。
【図２】同一の血清試料中の５．９ｋＤａペプチド濃度を、本発明のＥＬＩＳＡ測定で定量した結果とＳＩ−ＭＳ法を用いて定量した結果との相関を示した図である。縦軸が、本発明のＥＬＩＳＡ測定により測定された５．９ｋＤａペプチド濃度（μｇ／ｍｌ）、横軸が、ＳＩ−ＭＳ法により算出された５．９ｋＤａペプチド濃度（μｇ／ｍｌ）を表している。白丸は健常者から得られた血清８検体、黒丸はアルコール依存症患者から得られた血清８検体を表している。
【図３】同一の血清試料中の５．９ｋＤａペプチド濃度を、本発明のラテックス免疫凝集測定（ＬＡＴＥＸ測定）で定量した結果と本発明のＥＬＩＳＡ測定で定量した結果との相関を示した図である。縦軸が、本発明のＬＡＴＥＸ測定により測定された５．９ｋＤａペプチド濃度（μｇ／ｍｌ）、横軸が、本発明のＥＬＩＳＡ測定により測定された５．９ｋＤａペプチド濃度（μｇ／ｍｌ）を表している。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法および免疫学的測定用キットにより測定される５．９ｋＤａペプチドは、配列番号１に示される５４アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有し、その理論分子量が５９０４．２であるペプチドである。該ペプチドは、ヒトフィブリノーゲンα−Ｅ鎖およびヒトフィブリノーゲンα鎖のＮ末端から５７６〜６２９番目のアミノ酸領域に存在し、ヒトフィブリノーゲンα−Ｅ鎖およびヒトフィブリノーゲンα鎖が分解されることによって産生される。
本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法および免疫学的測定用キットにより測定される５．９ｋＤａペプチドは、習慣飲酒などの要因に伴って生体由来試料からの検出量が減少する肝臓疾患診断用ペプチドマーカーである。
【００１４】
本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法の対象となる検体としては、５．９ｋＤａペプチドを含む可能性がある生体由来試料であれば特に制限されず、各種体液や細胞組織抽出液等が挙げられ、５．９ｋＤの臨床マーカーとしての機能および試料採取の簡便性の観点から、肝臓疾患が疑われる患者から採取された体液が好ましい。ここで、体液としては、全血、血清、血漿、尿、唾液、リンパ液、脳脊髄液、または、腹水・胸水・心嚢水・関節液を含む穿刺液などを挙げられ、中でも、凝固線溶系に関わるフィブリノーゲンおよびフィブリンと、これらから産生される５．９ｋＤａペプチドを含む多種の分解産物とを含有する可能性の高い血液由来試料、つまり、全血、血漿、血清が特に好ましい。とりわけ、本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法により測定される検体としては、肝臓疾患が疑われる患者から採取された血清が好適である。
【００１５】
本発明の５．９ｋＤペプチドの免疫学的測定方法および免疫学的測定用キットに用いられる５．９ｋＤａペプチドのＮ末端領域を認識する抗体および５．９ｋＤａペプチドのＣ末端領域を認識する抗体は、５．９ｋＤａペプチド中に存在し得るいくつかのエピトープのうち、互いに重複しないエピトープを認識し、かつ、互いに５．９ｋＤａペプチドとの結合を妨げない抗体である。ここで、本発明において用いられる５．９ｋＤａペプチドのＮ末端領域を認識する抗体の認識するエピトープは、本発明において用いられる５．９ｋＤａペプチドのＣ末端領域を認識する抗体の認識するエピトープよりもＮ末端側に存在する。
ここで、本発明の５．９ｋＤａペプチド免疫学的測定方法および免疫学的測定用キットに用いられる５．９ｋＤａペプチドのＮ末端領域を認識する抗体および５．９ｋＤａペプチドのＣ末端領域を認識する抗体は、５．９ｋＤａペプチドに特異的な免疫学的測定が可能な限りにおいて、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。また、該抗体のアイソタイプは特に限定されず、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭのアイソタイプの抗体が挙げられ、抗体精製の容易さの観点からは、ＩｇＧ型の抗体が好ましい。そして、該抗体を得るための製造方法・産生生物についても特に限定されず、例えば、マウス由来ハイブリドーマ細胞株を用いた該抗体の製造が挙げられる。
【００１６】
本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法および免疫学的測定用キットに用いられる５．９ｋＤａペプチドのＮ末端領域を認識する抗体および５．９ｋＤａペプチドのＣ末端領域を認識する抗体に関して、エピトープとは、通常６〜１１個程度のアミノ酸残基からなる抗原の分子表面に存在するアミノ酸領域であって、抗体が認識して結合する抗原の特定の構造単位を指す。通常、１つの抗原は複数のエピトープを有する。
【００１７】
本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法および免疫学的測定用キットに用いられる５．９ｋＤａペプチドのＮ末端領域を認識する抗体および５．９ｋＤａペプチドのＣ末端領域を認識する抗体に関して、２つの抗体が互いに５．９ｋＤａペプチドとの結合を妨げないとは、例えば、一方の抗体が５．９ｋＤａペプチド中のエピトープを認識し結合した場合に、その抗体が他方の抗体が認識するエピトープの全部または一部を立体的に覆うことで他方の抗体のエピトープ認識を阻害する、あるいは、他方の抗体がエピトープを認識して結合する際に２つの抗体が接触するなどの態様で、一方の抗体の５．９ｋＤａペプチドへの結合が他方の抗体の結合にとって障害となることがないことをいう。
ここで、抗原中の重複しないエピトープを認識する抗体が互いに一方の抗原との結合を妨げないために２つの重複しないエピトープが有すべき間隔は、抗原が取りうる立体構造に依存するが、好ましくは２つのエピトープ間に６残基以上のアミノ酸領域、より好ましくは２０残基以上のアミノ酸領域が存在し、さらに好ましくは２つのエピトープ間のアミノ酸領域中にβターン構造をとるアミノ酸領域が含まれる。２つのエピトープ間にある程度の間隔が存在することにより、２つの抗体が互いの立体障害になる可能性が減少する。さらに、４つのアミノ酸残基により形成されペプチド鎖が急激にターンするβターン構造が重複しない２つのエピトープ間に存在することで、それぞれのエピトープを認識する抗体が互いに接触する可能性が減少する。
【００１８】
実施例において詳述するが、配列番号１に示される５．９ｋＤａペプチドのアミノ酸配列のＮ末端から１〜１７番目または４０〜５４番目のアミノ酸領域にエピトープが存在することが確認されたことから、本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法および免疫学的測定用キットに用いられる５．９ｋＤａペプチドのＮ末端領域を認識する抗体は、好ましくは、配列番号１に示される５．９ｋＤａペプチドのアミノ酸配列のＮ末端から１〜３９番目のアミノ酸領域に存在するいずれかのエピトープを認識する抗体であり、より好ましくは、配列番号１に示される５．９ｋＤａペプチドのアミノ酸配列のＮ末端から１〜１７番目のアミノ酸領域に存在するエピトープを認識する抗体である。
一方、本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法および免疫学的測定用キットに用いられる５．９ｋＤａペプチドのＣ末端領域を認識する抗体は、好ましくは、配列番号１に示される５．９ｋＤａペプチドのアミノ酸配列のＮ末端から１８〜５４番目のアミノ酸領域に存在するいずれかに存在し、かつ、前記５．９ｋＤａペプチドのＮ末端領域を認識する抗体が認識するエピトープよりもＣ末端側に位置するエピトープを認識する抗体であり、より好ましくは、配列番号１に示される５．９ｋＤａペプチドのアミノ酸配列のＮ末端から４０〜５４番目のアミノ酸領域に存在するエピトープを認識する抗体である。
【００１９】
本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法および免疫学的測定用キットに用いられる、もしくは、本発明で提供される５．９ｋＤａペプチドのＮ末端から１〜１７番目または４０〜５４番目のアミノ酸領域に存在するエピトープを認識する抗体としては、配列番号１に示される５．９ｋＤａペプチドのアミノ酸配列のＮ末端から１〜１７番目または４０〜５４番目のアミノ酸配列を含むペプチド、または、該アミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加あるいは挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該アミノ酸配列の連続した９０％以上を含むアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として得られる抗体、もしくは、該抗原とするペプチドと担体とを結合させて得られる複合体を免疫原として得られる抗体が挙げられる。
ここで、抗原とするペプチドは、例えば、公知のペプチド合成技術を用いて、化学合成して入手することができる。
また、上記担体としては、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ニワトリ血清アルブミン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリアラニルリジン、ジパルミチルリジン、破傷風トキソイドまたは多糖類等の担体として公知なものを用いることができる。ここで、担体と抗原とするペプチドを結合させる手法としては、例えば、抗原とするペプチドに含まれる、あるいは、抗原とするペプチドを人工的に導入したＣｙｓ残基のＳＨ基を利用して担体と抗原とするペプチドとを結合させるＭＢＳ（マレイミドベンゾイルオキシコハク酸イミド）法を挙げることができる。
本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法および免疫学的測定用キットに用いられる、もしくは、本発明で提供される５．９ｋＤａペプチドのＮ末端から１〜１７番目および４０〜５４番目のアミノ酸領域に存在するエピトープを認識する抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。
【００２０】
本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法および免疫学的測定用キットに用いられる、もしくは、本発明で提供される５．９ｋＤａペプチドのＮ末端から１〜１７番目のアミノ酸領域に存在するエピトープを認識する抗体として、好ましくは、配列番号１に示される５．９ｋＤａペプチドのアミノ酸配列のＮ末端から１〜１７番目のアミノ酸配列を含む抗原ペプチドのＮ末端またはＣ末端に、抗原ペプチドと上記担体とを結合させるために用いられるＣｙｓ残基を導入したペプチドと上記担体との複合体を免疫原として得られる抗体、より好ましくは、その抗原ペプチドのＣ末端に、抗原ペプチドと担体との結合のために用いられるＣｙｓ残基を導入したペプチド、すなわち配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドと、担体であるＫＬＨとの複合体を免疫原として得られる抗体、特に好ましくは、本発明者らが樹立したハイブリドーマ５．９Ｎ−０６（国際受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−７９７）により産生されるモノクローナル抗体が挙げられる。
【００２１】
一方、本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法および免疫学的測定用キットに用いられる、もしくは、本発明で提供される５．９ｋＤａペプチドのＮ末端から４０〜５４番目のアミノ酸領域に存在するエピトープを認識する抗体として、好ましくは、配列番号１に示される５．９ｋＤａペプチドのアミノ酸配列のＮ末端から４０〜５４番目のアミノ酸配列を含む抗原ペプチドのＮ末端またはＣ末端に、抗原ペプチドと上記担体とを結合させるために用いられるＣｙｓ残基を導入したペプチドと上記担体との複合体を免疫原として得られる抗体、より好ましくは、その抗原ペプチドのＮ末端に、抗原ペプチドと担体との結合のために用いられるＣｙｓ残基を導入したペプチド、すなわち配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドと、担体であるＫＬＨとの複合体を免疫原として得られる抗体、特に好ましくは、本発明者らが樹立したハイブリドーマ５．９Ｃ−０２（国際受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−７９８）により産生されるモノクローナル抗体が挙げられる。
【００２２】
本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法および免疫学的測定用キットにおいては、５．９ｋＤａペプチドのＮ末端領域を認識する抗体の抗体断片、および、５．９ｋＤａペプチドのＣ末端領域を認識する抗体の抗体断片を、それぞれの抗体が認識するエピトープを認識する限りにおいて同様に用いることができる。また、本発明で提供される５．９ｋＤａペプチドのＮ末端から１〜１７番目のアミノ酸領域に存在するエピトープを認識する抗体または５．９ｋＤａペプチドのＮ末端から４０〜５４番目のアミノ酸領域に存在するエピトープを認識する抗体についても、それぞれの抗体が認識するエピトープを認識する限りにおいて、それらの抗体断片も同様に提供される。
これらの抗体断片としては、特に限定されない。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦＶ、相補性決定領域（以下、ＣＤＲということもある）を含むペプチドが挙げられる。
Ｆａｂは、ＩｇＧ型抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合で結合した分子量約５万Ｄａの抗原に対する特異的結合能力を有する抗体断片である。本発明において、Ｆａｂは、例えば、本発明で提供される５．９ｋＤａペプチドのＮ末端から１〜１７番目のアミノ酸領域に存在するエピトープを認識する抗体または５．９ｋＤａペプチドのＮ末端から４０〜５４番目のアミノ酸領域に存在するエピトープを認識する抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理して得ることができる。
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧ型抗体をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、Ｆａｂがヒンジ領域のＳ−Ｓ結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万Ｄａの抗原に対する特異的結合能力を有する抗体断片である。本発明において、Ｆ（ａｂ’）２は、例えば、本発明で提供される５．９ｋＤａペプチドのＮ末端から１〜１７番目のアミノ酸領域に存在するエピトープを認識する抗体または５．９ｋＤａペプチドのＮ末端から４０〜５４番目のアミノ酸領域に存在するエピトープを認識する抗体をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合あるいはＳ−Ｓ結合させ、作成することができる。
Ｆａｂ’は、前記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のＳ−Ｓ結合を切断した分子量約５万Ｄａの抗原に対する特異的結合能力を有する抗体断片である。本発明において、Ｆ（ａｂ’）２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。
ｓｃＦｖは、１本のＨ鎖可変領域（ＶＨ）と１本のＬ鎖可変領域（ＶＬ）とを１２残基以上の適当なペプチドリンカー（Ｐ）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドで、抗原に対する特異的結合能力を有する抗体断片である。
Ｄｉａｂｏｄｙは、抗原結合特異性の同じまたは異なるｓｃＦｖが２量体を形成した抗体断片で、同じ抗原に対してｓｃＦＶを上回る反応性を有する、もしくは、異なる抗原に対して同様の特異的結合能力を有する抗体断片である。
ｄｓＦｖは、Ｈ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域中のそれぞれ１アミノ酸残基をＣｙｓ残基に置換したポリペプチドを該Ｃｙｓ残基間のＳ−Ｓ結合を介して結合させたものである。
ＣＤＲを含むペプチドは、Ｈ鎖可変領域またはＬ鎖可変領域のＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることにより製造することができる。
【００２３】
本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法および免疫学的測定用キットに用いられる、もしくは、本発明で提供される種々の抗体は、それぞれの抗原、例えば、それぞれの抗体が認識するエピトープを含んだ５．９ｋＤａペプチド断片、その変異体、５．９ｋＤａペプチドの全長ペプチド、５．９ｋＤａペプチドの全長ペプチドの変異体、もしくはこれらのペプチドと上記担体との複合体を免疫原として動物を免疫した後、ポリクローナル抗体に関しては、その動物の血清から公知の方法で調製可能であり、モノクローナル抗体に関しては、その動物の脾臓等に由来する抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させることにより得られるハイブリドーマから回収および精製を経て入手することができる。
ここで、免疫原とされるペプチドは、ヒト血液等の生体由来試料から精製して入手してもよいが、公知のペプチド合成技術を用い、化学合成して入手してもよい。これに限らずリコンビナントにより産生したペプチドも抗原として用いることができる。
【００２４】
本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法および免疫学的測定用キットに用いられる、もしくは、本発明で提供される種々の抗体を産生するハイブリドーマは、公知の方法、例えば、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Kohler, G. & Milstein, C. Nature, 256, 495-497, 1975）により作成することができる。即ち、前記免疫原を公知のアジュバントと共に混和した後、作成したアジュバント液をマウス、ラット、ハムスター、ヤギ等の各種免疫動物に時間を空けて必要回数免疫し、抗体価の上昇を確認後、その動物の脾臓等に由来する抗体産生細胞とマウス、ラット等の哺乳動物の骨髄腫細胞とを細胞融合してハイブリドーマが作成される。
本発明者らが作成し樹立した、前述した本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法および免疫学的測定用キットに用いられる、もしくは、本発明で提供される５．９ｋＤａペプチドのＮ末端から１〜１７番目のアミノ酸領域に存在するエピトープを認識する抗体を産生するハイブリドーマ５．９Ｎ−０６、および、前述した本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法および免疫学的測定キットに用いられる、もしくは、本発明で提供される５．９ｋＤａペプチドのＣ末端から４０〜５４番目のアミノ酸領域に存在するエピトープを認識する抗体を産生するハイブリドーマ５．９Ｃ−０２は、〒２９２−０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、２００９年８月１９日に国内寄託され、受託番号として、それぞれＮＩＴＥ  Ｐ−７９７およびＮＩＴＥ  Ｐ−７９８が付与されている。その後に、これらの国内寄託は、２０１０年８月２０日付でブダペスト条約に基づく国際寄託への移管請求がなされ、２０１０年９月１３日付で国際受託番号として、それぞれＮＩＴＥ  ＢＰ−７９７およびＮＩＴＥ  ＢＰ−７９８が付与されている。
【００２５】
本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法および免疫学的測定用キットに用いられる、もしくは、本発明で提供される種々のモノクローナル抗体をハイブリドーマから得るためには、まず、作成されたハイブリドーマに対して選択培地を用いた選択を行い、選択されたハイブリドーマの培養上清をＥＬＩＳＡ法のような適当な免疫測定法で分析し、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する。次いで、選択したクローンを限界希釈法等のような方法でクローニングを行い、モノクローナル化する。続いて、クローニングされたハイブリドーマを通常細胞培養に用いられる培地、例えばα−ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＳＦ、Ｓ−ｃｌｏｎｅなどで培養し、その培養上清よりモノクローナル抗体を回収することができる。ハイブリドーマが由来する動物、ヌードマウスをあらかじめプリスタン処理しておき、その動物に細胞を腹腔内注射することによって腹水を貯留させ、その腹水からモノクローナル抗体を回収することもできる。最後に、上清、腹水よりモノクローナル抗体を回収する方法としては、通常の方法を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法やクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、一般的にプロテインＧなどによるアフィニティークロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００２６】
本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法および免疫学的測定用キットに用いられる、もしくは、本発明で提供される種々の抗体またはその抗体断片は、これらをコードするＤＮＡ配列を公知の方法で解析した後、そのＤＮＡ配列を含む遺伝子組換えベクターを作成し、作成された遺伝子組換えベクターを適当な宿主、例えば、大腸菌や酵母、に導入し、得られた遺伝子組換え体から該抗体またはその抗体断片を回収し、精製することによっても入手することができる。
【００２７】
本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法において生成する免疫複合体は、前述した本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法および免疫学的測定用キットに用いられる、もしくは、本発明で提供される５．９ｋＤａペプチドのＮ末端を認識する抗体またはその抗体断片および５．９ｋＤａペプチドのＣ末端を認識する抗体またはその抗体断片がそれぞれ同時に５．９ｋＤａペプチドに接触・結合することによって、あるいは、一方の抗体またはその抗体断片が５．９ｋＤａペプチドに接触・結合して形成された５．９ｋＤａペプチドと抗体またはその抗体断片との複合体にさらに他方の抗体またはその抗体断片が接触・結合することによって形成される、５．９ｋＤａペプチドと２つの抗体またはそれらの抗体断片との複合体である。ここで、形成される複合体は、３量体であってもそれ以上の多量体であってもよい。
本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法において生成する免疫複合体において、複合体を形成する前述した本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法および免疫学的測定用キットに用いられる、もしくは、本発明で提供される５．９ｋＤａペプチドのＮ末端を認識する抗体またはその抗体断片および５．９ｋＤａペプチドのＣ末端を認識する抗体またはその抗体断片のうち一方が、その抗原認識能を維持する態様で、固相、即ち、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ナイロン、ポリメタクリレートなどを素材とする基材、例えば、プラスチックチューブやマイクロタイタープレートに、直接または間接的に物理結合や化学結合、アフィニティーなどを利用して結合していてもよい。また、上記固相に結合していないもう一方の抗体またはその抗体断片が、その抗原認識能を維持する態様で、標識物質、例えば、ＨＲＰ等の標識酵素、金コロイド、ユーロピウム等の標識金属、ＦＴＴＣ、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ、ＧＦＰ等の化学的、生物的各種蛍光物質、３２Ｐ、５１Ｃｒ等の放射性物質などで標識されていてもよい。
あるいは、本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法において生成する免疫複合体において、前述した本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法および免疫学的測定用キットに用いられる、もしくは、本発明で提供される５．９ｋＤａペプチドのＮ末端を認識する抗体またはその抗体断片および５．９ｋＤａペプチドのＣ末端を認識する抗体またはその抗体断片の両方が、その抗原認識能を維持する態様で、不溶性担体粒子、例えば、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体のような有機高分子のラテックスやシリカ、アルミナのような無機酸化物等に直接または間接的に物理結合や化学結合、アフィニティーなどを利用して結合されていてもよい。
【００２８】
本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法において生成する免疫複合体を測定する手段としては、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、免疫比濁測定法（ＴＩＡ法）、ラテックス免疫凝集測定法（ＬＡＴＥＸ法）、電気化学発光法、蛍光法などを例示することができる。またイムノクロマト法、試験紙を利用した方法も有効である。
優れた感度および定量性を有する点からは、本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法において生成する免疫複合体を測定する手段としては、ＥＬＩＳＡ法が好ましく、サンドイッチＥＬＩＳＡ法がより好ましい。
また、測定が簡便かつ迅速である点からは、本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法において生成する免疫複合体を測定する手段としては、ラテックス免疫凝集測定法が好ましい。
【００２９】
本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法において行われるサンドイッチＥＬＩＳＡ法による測定は、前述した本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法および免疫学的測定用キットに用いられる、もしくは、本発明で提供される５．９ｋＤａペプチドのＮ末端を認識する抗体またはその抗体断片および５．９ｋＤａペプチドのＣ末端を認識する抗体またはその抗体断片のうち一方が、その抗原認識能を維持する態様で、標識物質、例えば、ＨＲＰ等の標識酵素、金コロイド、ユーロピウム等の標識金属、ＦＴＴＣ、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ、ＧＦＰ等の化学的、生物的各種蛍光物質、３２Ｐ、５１Ｃｒ等の放射性物質などで標識された標識抗体または標識抗体断片を用いる。さらに、本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法において行われるサンドイッチＥＬＩＳＡ法による測定は、上記標識抗体または標識抗体断片に用いられなかったもう一方の抗体またはその抗体断片が、その抗原認識能を維持する態様で、固相、即ち、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ナイロン、ポリメタクリレートなどを素材とする基材、例えば、プラスチックチューブやマイクロタイタープレートに、直接または間接的に物理結合や化学結合、アフィニティーなどを利用して結合された固相結合抗体または固相結合抗体断片を用いる。
本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法において行われるサンドイッチＥＬＩＳＡ法による測定は、前記標識抗体または標識抗体断片と固相結合抗体または固相結合抗体断片とを用いて、公知の方法で行うことができる。即ち、先ず、固相結合抗体または固相結合抗体断片に検体を加えて反応させ、一定時間反応させた後、固相を洗浄し、標識抗体または標識抗体断片を加えてさらに２次反応させる。次に、固相を再度洗浄し、発色基質などを加えて反応させる。ここで、発色基質としては、標識抗体または標識抗体断片の標識物質としてＨＲＰを用いた場合、既知のＤＡＢ、ＴＭＢなどを用いることができる。
【００３０】
本発明で提供されるサンドイッチＥＬＩＳＡ法による５．９ｋＤａペプチド免疫学的測定用キットは、前述した本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法において行われるサンドイッチＥＬＩＳＡ法による測定で用いられる標識抗体または標識抗体断片および固相結合抗体または固相結合抗体断片を具備する。さらに、本発明で提供されるサンドイッチＥＬＩＳＡ法による５．９ｋＤａペプチド免疫学的測定用キットは、基質、検体希釈液、洗浄液、陽性コントロール、陰性コントロール等を含んでもよい。ここで、多検体を簡便かつ迅速に測定するために、自動ＥＬＩＳＡ装置で測定可能な免疫学的測定キットとして構成することが好ましい。
【００３１】
本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法において行われるラテックス免疫凝集測定法による測定は、不溶性担体粒子に感作した前述の本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法および免疫学的測定用キットに用いられる、もしくは、本発明で提供される５．９ｋＤａペプチドのＮ末端を認識する抗体またはその抗体断片と５．９ｋＤａペプチドのＣ末端を認識する抗体またはその抗体断片とを用いる。ここで、不溶性担体粒子への抗体またはその抗体断片の感作とは、その抗原認識能を維持する態様で、直接または間接的に物理結合や化学結合、アフィニティーなどを利用して不溶性担体粒子に抗体またはその抗体断片を結合させることをいう。不溶性担体粒子としては、例えば、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体のような有機高分子のラテックスやシリカ、アルミナのような無機酸化物などが挙げられる。
不溶性担体粒子に感作した前記２つの抗体またはそれらの抗体断片の使用態様としては、前記２つの抗体またはそれらの抗体断片の両方を１つの不溶性担体粒子に感作し得られた１種類の不溶性担体粒子のみを用いても、前記２つの抗体またはそれらの抗体断片をそれぞれ別の不溶性担体粒子に感作し得られた２種類の不溶性担体粒子を混合して用いても、これら３種類の不溶性担体粒子を混合して用いてもよい。
本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法において行われるラテックス免疫凝集測定法による測定は、前記２種類の不溶性担体粒子を用いて、公知の方法で行うことができる。即ち、検体に前記２種類の不溶性担体粒子を加えて反応させ、一定時間反応させた後、形成された凝集を測定する。
【００３２】
本発明で提供されるラテックス免疫凝集測定法による５．９ｋＤａペプチド免疫学的測定用キットは、前述した本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法において行われるラテックス免疫凝集測定法による測定で用いられる不溶性担体粒子に感作した５．９ｋＤａペプチドのＮ末端を認識する抗体またはその抗体断片と５．９ｋＤａペプチドのＣ末端を認識する抗体またはその抗体断片とを具備する。さらに、本発明で提供されるラテックス免疫凝集測定法による５．９ｋＤａペプチド免疫学的測定キットは、検体希釈液、陽性コントロール、陰性コントロール等を含んでもよい。ここで、多検体を簡便かつ迅速に測定するために、自動ラテックス免疫凝集測定装置で測定可能な免疫学的測定キットとして構成することが好ましい。
【００３３】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３４】
５．９ｋＤａペプチドのＮ末端領域を認識する抗体、および、５．９ｋＤａペプチドのＣ末端領域を認識する抗体の作成およびその特性の同定
（１）免疫原の作成
５．９ｋＤａペプチドのＮ末端領域を認識する抗体、および、５．９ｋＤａペプチドのＣ末端領域を認識する抗体を作成するために、５．９ｋＤａペプチドのＮ末端またはＣ末端のアミノ酸配列を含むペプチドを含む免疫原を作成した。
具体的には、まず、配列番号１に示される５．９ｋＤａペプチドのアミノ酸配列のＮ末端から１〜１７番目の１７アミノ酸残基からなる抗原ペプチド（以下、５．９Ｎという）のＣ末端に、抗原ペプチドと担体とを結合するために用いられるＣｙｓ残基を導入したペプチド、すなわち配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを合成した。また、５．９ｋＤａペプチドのＣ末端からの１５残基、すなわち、配列番号１に示される５．９ｋＤａペプチドのアミノ酸配列のＮ末端から４０〜５４番目の１５アミノ酸残基からなる抗原ペプチド（以下、５．９Ｃという）のＮ末端に、抗原ペプチドと担体とを結合するために用いられるＣｙｓ残基を導入したペプチド、すなわち配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを合成した。
次に、これらのペプチドのＮ末端Ｃｙｓ残基またはＣ末端Ｃｙｓ残基に担体であるスカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）を、ＭＢＳ（マレイミドベンゾイルオキシコハク酸イミド）法によりコンジュゲートし、免疫原として用いる複合体を作成した。【００３５】
（２）マウスへの免疫
上記（１）で得られた免疫原をマウスに投与し、免疫マウスを得た。
具体的には、まず、上記（１）で作成した５．９Ｎ、もしくは、５．９Ｃを含む免疫原をそれぞれ１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで溶解した。次に、５０μｌ（５０μｇ）を取ってフロインド完全アジュバンド（和光純薬工業）５０μｌと乳化するまでよく混和した。続いて、調製した懸濁液をＢａｌｂ／ｃ６週齢雌マウス（日本クレアー）にジエチルエーテル麻酔科にてそれぞれ腹腔内投与した。２週間後には同量の５．９Ｎ、もしくは、５．９Ｃを含む免疫原をフロインド不完全アジュバンド（和光純薬工業）と混和し、フロインド完全アジュバンドのときと全く同様の操作により乳化懸濁液とし、それぞれマウスに投与した。以降２週間毎に同様の操作を行ない、４回目には最終免疫として５．９Ｎ、もしくは、５．９Ｃを含む免疫原５０μｌ（５０μｇ）をマウス尾静脈注射により投与した。【００３６】
（３）ハイブリドーマの確立
上記（２）で得られた免疫マウスの脾臓細胞と骨髄腫細胞を融合してハイブリドーマを作成した。
具体的には、まず、５．９Ｎ、または、５．９Ｃを含む免疫原を最終免疫した３日後、それぞれのマウスよりジエチルエーテル麻酔下に外科的摘出された脾臓を無菌的に分散し、脾臓細胞を調製した。細胞融合はケーラーとミルスタインの方法（Kohler, G. & Milstein, C. Nature, 256, 495-497, 1975）に従って行われ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００）（メルク）を用いて脾臓細胞と骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）を融合した。融合比率は脾臓細胞数８×１０７個に対して骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）２×１０７個で、約４：１であった。融合細胞は１０％ＦＣＳ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）α−ＭＥＭ（ＩＲＶＩＮＥ）ＨＡＴ（コスモバイオ）培地に分散し９６穴マイクロタイターカルチャープレート（住友ベークライト）に分注して３７℃、５％ＣＯ２条件にて培養した。【００３７】
（４）コロニーのスクリーニング
上記（３）のハイブリドーマ確立の約２週間後にコロニーの生育を確認して、抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングした。
具体的には、まず、スクリーニング用プレートを作成するために上記（１）にて合成した５．９Ｎ、または、５．９ＣをＰＢＳ中に溶解させ、２μｇ／１００μｌ／ｗｅｌｌとなるように９６穴マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）に分注した。次に、プレートを４℃で２晩静置した後に０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）（和光純薬工業）を含むＰＢＳで３回洗浄し、非特異的反応を抑えるためにＰＢＳにて４倍希釈したＮ−１０２（日本油脂）溶液を２００μｌ分注して、更に４℃で１晩静置した。続いて、完成したプレートをＰＢＳ−Ｔで１回洗浄した後に、上記（３）で得られたハイブリドーマの培養上清１００μｌを反応させ、更に洗浄を行った後に二次抗体であるＨＲＰ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（Ｚｙｍｅｄ）を加えて反応させた。洗浄後にＨＲＰの発色基質である、ＴＭＢ溶液（カイノス）を１００μｌ加えて一定時間の発色後、１Ｎ硫酸（和光純薬工業）を停止液として更に１００μｌ添加し、測定波長４５０ｎｍにて吸光度を測定した。
前記スクリーニングにより、陽性と判定されたクローンについて、限界希釈法によって再クローニングを行い、上清を再度確認した。
結果として、５．９Ｎを感作したプレートと反応するハイブリドーマ５．９Ｎ−０６、および、５．９Ｃを感作したプレートと反応するハイブリドーマ５．９Ｃ−０２を得た。なお、得られたハイブリドーマの培養上清はコントロールのＢＳＡプレートとは全く反応しなかった。
ハイブリドーマ５．９Ｎ−０６および５．９Ｃ−０２は、〒２９２−０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、２００９年８月１９日に国内寄託し、受託番号として、それぞれＮＩＴＥ  Ｐ−７９７およびＮＩＴＥ  Ｐ−７９８が付与された。その後に、これらの国内寄託を、２０１０年８月２０日付でブダペスト条約に基づく国際寄託への移管請求を行い、２０１０年９月１３日付で国際受託番号として、それぞれＮＩＴＥ  ＢＰ−７９７およびＮＩＴＥ  ＢＰ−７９８が付与された。【００３８】
（５）抗体のアイソタイプ同定
上記（４）で得られたハイブリドーマ５．９Ｎ−０６、および、ハイブリドーマ５．９Ｃ−０２がそれぞれ産生するモノクローナル抗体ａｎｔｉ−５．９Ｎ、および、ａｎｔｉ−５．９Ｃのアイソタイプを同定した。
具体的には、モノクローナル抗体タイピングキット（アマシャムファルマシア）を用いて、添付の使用説明書に従い、それぞれのハイブリドーマが産生する抗体のアイソタイプを検定した。
結果として、モノクローナル抗体ａｎｔｉ−５．９Ｎ、および、ａｎｔｉ−５．９Ｃは、表１に示すアイソタイプに属することを確認した。
【表１】
0005585587.tif 000002
【００３９】
（６）抗体の精製
ハイブリドーマ５．９Ｎ−０６、および、ハイブリドーマ５．９Ｃ−０２の培養上清を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア）を用いて、添付の使用説明書に従い精製し、モノクローナル抗体ａｎｔｉ−５．９Ｎ、および、ａｎｔｉ−５．９Ｃを得た。
【実施例２】
【００４０】
ＥＬＩＳＡ法を用いた５．９ｋＤａペプチド測定系の構築と検体中の５．９ｋＤａペプチド測定
（１）ウエスタンブロッティング法による抗体の５．９ｋＤａペプチドとの反応性確認
ウエスタンブロッティング法を用いて、実施例１で作成した２種類の５．９ｋＤａペプチドのＮ末端またはＣ末端に結合する抗体が、５．９ｋＤａペプチドの全長ペプチドに結合することを、以下に具体的に記載する方法により確認した。【００４１】
（１−１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ・ブロッティング
合成した５．９ｋＤａペプチドを０．５μｇずつ非還元下にてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その後、ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア）へ転写し、１時間ブロッキングを行った。【００４２】
（１−２）一次抗体反応
実施例１の（６）で精製した２種の抗体（ａｎｔｉ−５．９Ｎを０．０５ｍｇ／ｍｌ含むＰＢＳ−Ｔ、ａｎｔｉ−５．９Ｃを０．００５ｍｇ／ｍｌ含むＰＢＳ−Ｔ）をそれぞれ上記（１−１）で作成した５．９ｋＤａペプチドを転写したメンブレンに１時間反応させた。【００４３】
（１−３）二次抗体反応
メンブレンをＰＢＳ−Ｔにて洗浄後、二次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（Ｚｙｍｅｄ）を、それぞれ３０分間反応させた。【００４４】
（１−４）発色
ＰＢＳ−Ｔにて洗浄後、メンブレン用ＴＭＢ溶液（和光純薬工業）にて検出を行なった。【００４５】
（１−５）結果
作成した２種類の抗体はいずれも５．９ｋＤａペプチドを認識することを確認した。【００４６】
（２）ＥＬＩＳＡ法を用いた５．９ｋＤａペプチド測定系の構築
実施例１で作成した抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ測定系を作成し、作成されたＥＬＩＳＡ測定系で抗原抗体反応が濃度依存的に測定されることを、以下に具体的に記載する方法により確認した。【００４７】
（２−１）抗体結合プレートの作成
実施例１の（６）で精製したモノクローナル抗体ａｎｔｉ−５．９Ｃを０．５μｇ／１００μｌ／ｗｅｌｌの濃度でマキシソーププレート（Ｎｕｎｃ）に一晩感作した。ＰＢＳで３回洗浄後、蒸留水で５倍希釈したＮ−１０２（日本油脂）にてブロッキングを行なった。【００４８】
（２−２）ＨＲＰ標識抗体の作成
実施例１の（６）で精製したモノクローナル抗体ａｎｔｉ−５．９Ｎに、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＨＲＰ標識をした。ここで、標識抗体濃度は１μｇ／μｌとした。【００４９】
（２−３）ＥＬＩＳＡ測定系の評価
上記（２−２）で作成したプレートと標識抗体を使用し、サンドイッチＥＬＩＳＡ測定系の有効性を評価した。
なお、試料として用いた血清はインフォームドコンセントを得た後、連結不可能匿名化し使用した。また、試料中の５．９ｋＤａペプチド濃度は以下に示すＳＩ−ＭＳ法により算出した。
ＳＩ−ＭＳ法を用いて含有５．９ｋＤａペプチド濃度を算出した血清を試料として、サンドイッチ測定系を用いて測定したところ、５．９ｋＤａペプチドの濃度依存的に吸光度が上昇することを確認した。【００５０】
ＳＩ−ＭＳ法：
磁性ビーズとＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＭＳを組み合わせたＣｌｉｎＰｒｏｔＴＭシステム（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用いて試料中の５．９ｋＤａペプチド濃度を算出した。
具体的には、まず、血清に５．９ｋＤａペプチドに対する安定同位体ペプチド（ＳＩ−５．９ｋＤａ）を内部標準として一定量添加した。次に、陽イオン交換磁気ビーズ（ＷＣＸ）（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）に結合させ溶出させた。続いて、溶出させた試料をそのままＡｎｃｈｏｒＣｈｉｐ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）に調整後、ＡｕｔｏＦｌｅｘ（登録商標）  ＩＩ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ）により測定を行った。
ここで、解析はＦｌｅｘＡｎａｌｙｓｉｓＴＭ  ｓｏｆｔｗａｒｅ２．４（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用いてベースライン補正とスムージング処理を行い、ＳＩ−５．９ｋＤａに対応するピーク強度と血清中の５．９ｋＤａペプチドに対応するピーク強度との比から、添加したＳＩ−５．９ｋＤａ量を基準に血清中の５．９ｋＤａペプチド濃度を算出した。【００５１】
（３）ヒト血清中の５．９ｋＤａペプチドの測定
上記（２）で作成したサンドイッチＥＬＩＳＡ測定系を用いて、ヒト血清中の５．９ｋＤａペプチドを測定し、抗原抗体反応が５．９ｋＤａペプチド濃度依存的に観測されることを、以下に具体的に記載する方法により確認した。
なお、用いた血清はインフォームドコンセントを得た後、連結不可能匿名化し使用した。【００５２】
（３−１）一次抗体反応
ＳＩ−ＭＳ法を用いて含有５．９ｋＤａペプチド濃度を算出したヒト血清をＰＢＳにて希釈し、５．９ＫＤａペプチド濃度が、それぞれ、０μｇ／ｍｌ、０．６５μｇ／ｍｌ、１．３０μｇ／ｍｌ、３．８９μｇ／ｍｌ、７．１２μｇ／ｍｌ、１０．３６μｇ／ｍｌの試料を調製した。これらの試料をＰＢＳで１／３３３に希釈し、１００μｌずつ上記（２−１）で作成した抗体結合プレートに１時間反応させた。【００５３】
（３−２）二次抗体反応
プレートをＰＢＳ−Ｔにて３回洗浄した後、上記（２−２）で作成したＨＲＰ標識抗体（ＰＢＳ−Ｔを用いて１／４０００に希釈したもの）を３０分間反応させた。【００５４】
（３−３）発色
プレートの洗浄後にＨＲＰの発色基質である、ＴＭＢ溶液（カイノス）を１００μｌ加えて一定時間の発色後、１Ｎ硫酸（和光純薬工業）を停止液として更に１００μｌ添加し、測定波長４５０ｎｍにて吸光度を測定した。【００５５】
（３−４）測定
測定マイクロプレートリーダーにて波長４５０ｎｍの吸光度測定を行なった。吸光度測定により得られた検量線を図１に示した。
図１に示すように、ａｎｔｉ−５．９Ｎ、および、ａｎｔｉ−５．９Ｃを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ測定系は、血清中に含まれる５．９ｋＤａペプチドを高感度で検出し、５．９ｋＤａペプチド濃度依存的な吸光度上昇が確認された。【００５６】
比較例１
５．９ｋＤａペプチドの全長ペプチドを認識する抗体を用いたＥＬＩＳＡ測定系によるヒト血清中の５．９ｋＤａペプチドの測定
実施例２の（２−１）において、ａｎｔｉ−５．９Ｃに代えて５．９ｋＤａペプチドの全長ペプチドを認識する抗体ａｎｔｉ−５．９Ｗ１（国際公開第２００４／０５８９６６号に記載のハイブリドーマＣＮ−２（受託番号：ＩＰＯＤ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５６５）より抽出精製）を、実施例２の（２−２）においてａｎｔｉ−５．９Ｎに代えて５．９ｋＤａペプチドの全長ペプチドを認識する抗体ａｎｔｉ−５．９Ｗ２（国際公開第２００４／０５８９６６号に記載のハイブリドーマＣＮ−１（受託番号：ＩＰＯＤ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５６４）より抽出精製）を用いて構築されたサンドイッチＥＬＩＳＡ測定系を用いて、実施例２の（３）と同様の測定を行った。測定により得られた検量線を図１に示した。
図１に示すように、一次抗体にａｎｔｉ−５．９Ｗ１、２次抗体にａｎｔｉ−５．９Ｗ２を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ測定系は、血清中に低濃度で含まれる５．９ｋＤａペプチド濃度依存的な吸光度上昇を示さなかった。
さらに、一次抗体にａｎｔｉ−５．９Ｗ１、二次抗体に本発明のモノクローナル抗体ａｎｔｉ−５．９Ｃを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ測定系、一次抗体にａｎｔｉ−５．９Ｗ１、二次抗体に本発明のモノクローナル抗体ａｎｔｉ−５．９Ｎを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ測定系、および、一次抗体に本発明のモノクローナル抗体ａｎｔｉ−５．９Ｃ、二次抗体に５．９Ｗ２を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ測定系においても同様の挙動が確認された。
【実施例３】
【００５７】
ＳＩ−ＭＳ法とＥＬＩＳＡ測定の相関性の確認
ＳＩ−ＭＳ法を用いた定量的測定法によるヒト血清中の５．９ｋＤａペプチド濃度測定結果と実施例２で作成したＥＬＩＳＡ測定系を用いた場合の定量測定結果との相関性を確認し、ＥＬＩＳＡ測定系が血清中に多く含まれるフィブリノーゲン関連ペプチドの中で５．９ｋＤａペプチドの全長ペプチドを特異的に定量していることを確認した。
なお、用いた試料は、健常者から得られた血清８検体とアルコール依存症患者から得られた血清８検体であり、インフォームドコンセントを得た後、連結不可能匿名化し使用した。
具体的には、実施例２の（３）の測定結果をもとに作成した検量線に基づいて、実施例２の（３）で作成したＥＬＩＳＡ測定系を用いて、ＳＩ−ＭＳ法により含有５．９ｋＤａペプチド濃度を算出した血清１６検体中の５．９ｋＤａペプチド濃度を定量した。
同一の試料に対するＳＩ−ＭＳ法に基づく５．９ｋＤａペプチド定量結果とＥＬＩＳＡ測定に基づく定量結果を比較した結果を図２に示した。
図２に示すように、ＳＩ−ＭＳ法による定量結果とＥＬＩＳＡ測定による定量結果は明確な相関性を示した。この結果は、実施例２で作成したサンドイッチＥＬＩＳＡ系が、血清中に多数存在するペプチドの中で、５．９ｋＤａペプチドを特異的に定量していることを示唆している。
健常者から得られた血清８検体とアルコール依存症患者から得られた血清８検体は、ＥＬＩＳＡ測定による５．９ｋＤａペプチド定量結果に対して、閾値６．８μｇ／ｍｌを適用することで完全に分離可能であった。また、健常者から得られた血清８検体からなる群とアルコール依存症患者から得られた血清８検体からなる群とは、ＥＬＩＳＡ測定による５．９ｋＤａペプチド定量結果に関して、分散分析による危険率１％以下の有意差を示した。
【実施例４】
【００５８】
ラテックス粒子を用いた５．９ｋＤａペプチド測定系の構築と検体中の５．９ｋＤａペプチド測定
（１）抗５．９ｋＤａ抗体感作ラテックス粒子の調製
実施例１において作成した二種類のモノクローナル抗体（ａｎｔｉ−５．９Ｎ、および、ａｎｔｉ−５．９Ｃ）がそれぞれ結合した二種類のラテックス粒子を作成し、これらを混合した抗５．９ｋＤａ抗体感作ラテックス粒子を、以下に具体的に記載する方法により作成した。
なお、ここで用いられた試薬組成は以下の通りである。
ＢＳＡコート溶液；
ＨＥＰＥＳ  ２−「４−（２−ヒドロキシエチル）
−１−ピペラジニル」エタンスルホン酸      ２５ｍＭ  ｐＨ７．５
塩化ナトリウム                            １５０ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸・２ナトリウム      １．０ｍＭ
アジ化ナトリウム                          ０．０５％
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）              １．０％
希釈用緩衝液；
ＨＥＰＥＳ                                ２５ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸・２ナトリウム      １．０ｍＭ
アジ化ナトリウム                          ０．０５％
分散用緩衝液；
ＨＥＰＥＳ                                ２５ｍＭ  ｐＨ７．５
塩化ナトリウム                            １５０ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸・２ナトリウム      １．０ｍＭ
アジ化ナトリウム                          ０．０５％【００５９】
（１−１）ａｎｔｉ−５．９Ｎ感作ラテックス粒子の調製
希釈用緩衝液で１％濃度とした、粒径１２０ｎｍのラテックス粒子溶液１００ｍｌに、ａｎｔｉ−５．９Ｎを希釈用緩衝液に３ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した溶液１００ｍｌを加え室温にて１時間攪拌した。その後、２０，０００ｒｐｍで１時間遠心分離を行い、上清を廃棄し沈殿物を回収した。この沈殿物にＢＳＡコート溶液を１００ｍｌ加え沈殿物を懸濁し、超音波処理を行い完全に分散させた後、室温で１時間攪拌した。次いで遠心分離を行い得られた沈殿物に分散用緩衝液を５００ｍｌ加えて懸濁し、超音波処理を行い完全に分散させ０．２％濃度ａｎｔｉ−５．９Ｎ感作ラテックス粒子を得た。【００６０】
（１−２）ａｎｔｉ−５．９Ｃ感作ラテックス粒子の調製
希釈用緩衝液で１％濃度とした、粒径１２０ｎｍのラテックス粒子溶液１００ｍｌに、ａｎｔｉ−５．９Ｃを希釈用緩衝液に３ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した溶液１００ｍｌを加え室温にて１時間攪拌した。その後、２０，０００ｒｐｍで１時間遠心分離を行い、上清を廃棄し沈殿物を回収した。この沈殿物にＢＳＡコート溶液を１００ｍｌ加え沈殿物を懸濁し、超音波処理を行い完全に分散させた後、室温で１時間攪拌した。次いで遠心分離を行い得られた沈殿物に分散用緩衝液を５００ｍｌ加えて懸濁し、超音波処理を行い完全に分散させ０．２％濃度ａｎｔｉ−５．９Ｃ感作ラテックス粒子を得た。【００６１】
（１−３）抗５．９ｋＤａ抗体感作ラテックス粒子（ＬＡ試薬）の調製
上記（１−１）および（１−２）で調製されたラテックス粒子溶液を１：１の割合で混合したものを、ラテックス法の第二試薬として調製した。
なお、ラテックス法の第一試薬として分散用緩衝液を用いた。【００６２】
（２）ヒト血清中の５．９ｋＤａペプチドの測定
上記（１−３）で調製したＬＡ試薬を用いて、ラテックス免疫凝集測定（ＬＡＴＥＸ測定）によりヒト血清中の５．９ｋＤＡペプチドを定量可能なことを確認した。
具体的には、ＳＩ−ＭＳ法を用いて含有５．９ｋＤａペプチド濃度を算出したヒト血清試料１０μｌに対し第一試薬１００μｌ、第二試薬１００μｌを反応させ、日立７１８０型自動分析装置を用いて、主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍにて１９−３４測光ポイント間（第二試薬添加後約１分後から５分後に相当）において、２ポイントエンド法による吸光度変化量を測定した。
結果として、表２に示すように、５．９ｋＤａペプチド濃度依存的な吸光度上昇が確認された。
【表２】
0005585587.tif 000003
【００６３】
（３）ＥＬＩＳＡ測定とＬＡＴＥＸ測定の相関性の確認
実施例３におけるＳＩ−ＭＳ法との相関性より血清中の５．９ｋＤａペプチドを特異的に検出することが示唆されたＥＬＩＳＡ測定とＬＡＴＥＸ測定との相関性を確認し、ＬＡＴＥＸ測定が血清中の５．９ｋＤａペプチドを特異的に検出することを確認した。
具体的には、上記（２）の測定結果をもとに作成された検量線に基づいて、血清中の５．９ｋＤａペプチド濃度を定量した。同一の試料について、実施例３の（２−３）と同様にＥＬＩＳＡ測定により５．９ｋＤａペプチド濃度を定量し、ＬＡＴＥＸ測定による定量結果との相関性を図３に示した。
結果として、図３に示すように、ＬＡＴＥＸ測定とＥＬＩＳＡ測定は高い相関性を示し、ＬＡＴＥＸ測定によっても血清中の５．９ｋＤａペプチドを特異的に検出していることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法は、肝臓疾患診断用ペプチドマーカーである５．９ｋＤａペプチドの簡便かつ正確な検体からの定量を可能にする。５．９ｋＤａペプチドは、習慣飲酒者や問題飲酒者が肝臓疾患を発症する可能性の診断や、飲酒以外が原因の肝臓疾患、例えば、肝炎、肝硬変、脂肪肝などの肝臓疾患の診断に利用することが可能であり、本発明の５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法は、これらの疾患の臨床診断方法として、現在の肝疾患人口から考えても今後の予防医学的見地から意義が大きいものと考えられる。
【配列表フリーテキスト】
【００６５】
配列番号２−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号３−人工配列の説明：合成ペプチド
【図１】
0005585587.tif 000004
【図２】
0005585587.tif 000005
【図３】
0005585587.tif 000006
【配列表】
0005585587000001.app