(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐ．  ＹＩＴ  １１８６１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２３１）。
【請求項２】
Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐ．  ＹＩＴ  １１８６１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２３１）を含有することを特徴とする飲食用又は医薬用組成物。
【請求項３】
さらにアドニトール、アラビノース、エリスリトール、ガラクトース、ラクチトール、メレチトース、トレハロース、リボース、ソルボース、キシロース、イノシトール及びソルビトールから選ばれる１以上を含有することを特徴とする請求項２記載の組成物。
【請求項４】
さらにダイゼインを含有することを特徴とする請求項２又は３記載の組成物。
【請求項５】
Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐ．  ＹＩＴ  １１８６１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２３１）をダイゼインに作用させることを特徴とするエコールの製造方法。
【請求項６】
配列番号１又は２記載の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列からなる核酸断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エコール産生細菌及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
大豆食品に多く含まれるイソフラボンは、不定愁訴等の更年期障害の改善や骨粗鬆症の予防、高脂血症や動脈硬化の予防、乳がんや前立腺がんの予防等に効果がある機能性成分として知られている。近年の研究により、イソフラボンの一つであるダイゼイン（Ｄａｉｄｚｅｉｎ）は、体内の腸内細菌によってエストロゲン作用や抗酸化作用がより強力なエコール（Ｅｑｕｏｌ）に代謝されることが明らかになり、エコールは体内で上記の作用を奏する主要な有効成分の一つとして注目されている。【０００３】
体内でのダイゼインからエコールへの産生は全てのヒトで一律に行われるのではなく、その産生能には個人差があり、３０〜５０％のヒトがエコール産生能を有することが報告されている（非特許文献１）。そこで、エコール産生能を有する腸内細菌の探索が精力的に行われており、エコール産生能を有する微生物として、バクテロイデス・オバタス、ストレプトコッカス・インターメディアス、ストレプトコッカス・コンステラータス（特許文献１）、ラクトコッカス・ガルビエ（特許文献２）、Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐｐ．ＴＭ−３０株、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス  ＴＭ−１株、ビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＪＣＭ  １２７３（特許文献３）、プロプリオノバクテリア・フレウンデレッキ、ビフィドバクテリウム・ラクチス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトコッカス・ラクチス、エンテロコッカス・フェシウム、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・サリバリウス（特許文献４）、ＳＮＵ−Ｊｕｌｏｎｇ７３２（非特許文献２）、ｇｒａｍ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｏ０３（非特許文献３）が報告されている。【０００４】
しかしながら、上記で報告されている微生物はいずれも基質となるダイゼインからのエコール変換能が低いため、微生物を用いたヒト体内でのエコール産生や微生物を用いたエコールの工業的生産といった用途に用いることはできなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開９９／７３９２号パンフレット
【特許文献２】国際公開２００５／４２号パンフレット
【特許文献３】特開２００６−２０４２９６号公報
【特許文献４】特表２００６−５０４４０９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ、Ｖｏｌ．２１７、Ｎｏ．３、ｐ３３５−３３９（１９９８）
【非特許文献２】Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｖｏｌ．７１、ｐ２１４−２１９（２００５）
【非特許文献３】Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｅｎｇ、Ｖｏｌ．１０２、ｐ２４７−２５０（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って本発明は、エコール変換効率が高い微生物、該微生物を利用した飲食用・医薬用組成物、該微生物を利用したエコールの製造方法、及び該微生物を特異的に検出できる核酸断片を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討した結果、本発明者らが先に発明したエコール変換能を有する微生物の選択培地を用いてエコール産生能を有するヒトの糞便を継代培養することでエコール変換効率が非常に高い微生物を見出すことに成功し、本発明を完成した。【０００９】
すなわち、本発明は、ダイゼインからのエコール変換能が２４時間で５０％以上である微生物を提供するものである。【００１０】
また、本発明は、上記のエコール変換能を有する微生物を含有する飲食用又は医薬用組成物を提供するものである。【００１１】
また、本発明は、上記のエコール変換能を有する微生物をダイゼインに作用させることを特徴とするエコールの製造方法を提供するものである。【００１２】
さらに、本発明は、上記のエコール変換能を有する微生物を特異的に検出しうる核酸断片を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の微生物はエコール変換効率が非常に高いことから、ヒト体内でのエコール産生を企図した飲食品や医薬品に利用することができ、エコールが関与する不定愁訴等の更年期障害、骨粗鬆症、高脂血症、動脈硬化、乳がん、前立腺がん、月経前症候群等の様々な疾病の治療や改善、或いはその予防等の目的に利用できる。また、エコールの工業的生産に利用した場合は、エコールを高濃度で回収できることから、その後の分離精製等の作業が容易となり極めて効率的にエコールを生産することが可能となる。さらに、本発明の核酸断片を用いることで糞便や消化管内容物からエコール変換能を有する微生物を検出することができ、核酸断片を用いてエコール変換能を有する微生物を定量化することで、各個人が元来有するエコール産生能を簡便に調べることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐ．  ＹＩＴ  １１８６１の分子系統樹を示す図である。図中［  ］はアクセッションナンバーを、数値はＢｏｏｔ  ｓｔｒａｐ値を示した。
【図２】作製したプライマーの検出感度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明において、エコール変換能とは、エコールの基質となるダイゼインを最終濃度１００μＭとなるように添加した培地に、対象となる微生物を１０７個／培地・ｍＬとなるように接種し、３７℃で一定時間保温して培地中のエコール濃度を測定し、ダイゼインの初発濃度と比較して、次式に当てはめることにより調べることができる。
【００１６】
エコール変換能（％）＝（対象とする微生物を含む培養液中のエコール濃度）／（培養液中のダイゼインの初発濃度）×１００
【００１７】
ここで培養は、ヒト腸管内の状態を再現するために嫌気培養で行うことが好ましく、培地としてはＧＡＭ培地が好ましい。
また、エコール濃度は、液体クロマトグラフィー、ＬＣ−ＭＳ等の常法に従って測定することができる。
本発明の「ダイゼインからのエコール変換能が２４時間で５０％以上である微生物」とは上記のエコール変換能が２４時間の保温により５０％以上である微生物を指す。さらに、２４時間の保温で８０％以上、より好ましくは１００％である微生物を好適に利用することができる。また、より短時間の保温、例えば８時間の保温で５０％以上である微生物も好適に利用することができる。これらの一例としてＳｌａｃｋｉａ属細菌を挙げることができる。
【００１８】
具体的に、本発明のエコール変換能を有する微生物は、エコール変換能を有する微生物が存在する可能性のある検体を用いて、本発明者らが先に発明したエコール変換能を有する微生物の選択培地（国際公開２００７／５２７４０号パンフレット）を用いてダイゼインからのエコール変換能を確認しながら、糞便等の検体を継代培養していくことで、エコール変換能を有する微生物をスクリーニングすることができる。エコール変換能を有する微生物が存在する可能性のある検体としては、エコール産生能を有するヒト（エコールプロデューサー）の糞便や消化管内容物等が好適に用いられ、糞便は遠心洗浄処理したものを用いることが好ましい。
【００１９】
上記方法により得られたエコール変換能を有するＳｌａｃｋｉａ属細菌の一つを、Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐ．  ＹＩＴ  １１８６１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２３１）として、平成２１年２月３日付で、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託した。このＳｌａｃｋｉａ  ｓｐ．  ＹＩＴ  １１８６１の系統分類、生化学性状を次に示す。
【００２０】
Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐ．  ＹＩＴ  １１８６１の１４００ｂｐ以上の１６Ｓ  ｒＲＮＡ塩基配列を定法に従い決定し、公共ＤＮＡデータベース（ＤＤＢＪ）にてＦＡＳＴＡプログラムを用いて相同性検索を行った。その結果、既知のＳｌａｃｋｉａ属細菌株Ｓｌａｃｋｉａｅｘｉｇｕａ  ＡＴＣＣ  ７００１２２Ｔ（アクセッションナンバー：ＡＦ１０１２４０）と本菌株の１６ＳｒＲＮＡの相同性は９２．４％であった。また、ＤＮＡデータベースより入手した他の細菌の塩基配列を多重整列後、ＮＪ法により分子系統解析を行った結果、本菌株はコリオバクテリア科Ｓｌａｃｋｉａ属に属していた。また、特許文献３に記載のＳｌａｃｋｉａ  ｓｐｐ．ＴＭ−３０および３種の人由来の未培養菌（アクセッションナンバー；ＥＦ０７１２７１，ＤＱ７９７１５２，ＡＹ９１６２３４）と９９％以上の相同性を有しており、一群のクラスターを形成していた。
【００２１】
生化学的性状は、アルカリホスファターゼが陽性を示した点、アルギニンアリルアミダーゼ、プロリンアリルアミダーゼ、フェニルアラニンアリルアミダーゼ、ロイシンアリルアミダーゼ、チロシンアリルアミダーゼ、アラニンアリルアミダーゼ、グリシンアリルアミダーゼ、ヒスチジンアリルアミダーゼ、セリンアリルアミダーゼが陰性を示した点でＳ． ｅｘｉｇｕａ  ＡＴＣＣ  ７００１２２Ｔと異なっていた。また、Ｄ−マンノース、Ｄ−ラフィノースの資化性、アルカリホスファターゼが陽性を示した点においてＳｌａｃｋｉａｓｐｐ．  ＴＭ−３０と異なっていた。以上のことから、Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐ．  ＹＩＴ  １１８６１は既報の株とは異なることが判明した。
【００２２】
本発明のエコール変換能を有する微生物を含有する飲食用又は医薬用組成物は、体内、血中、大腸内等の腸内等におけるエコール濃度上昇剤として利用でき、不定愁訴等の更年期障害、骨粗鬆症、高脂血症、動脈硬化、乳がん、前立腺がん、月経前症候群等のイソフラボンが関与する様々な疾病の治療や改善、或いはその予防等の目的に利用できる。特に、エコール産生能を有さないヒト（エコール非プロデューサー）やエコール産生能が低いヒトに使用することでイソフラボンが関与する様々な疾病を日常的に予防することができる。また、不定愁訴等の更年期障害や骨粗鬆症、発がんのリスクが高まる中年期や老年期のヒトに好適に利用することができる。
【００２３】
ここで、本発明のエコール変換能を有する微生物の利用形態は特に制限されず、生菌又は加熱菌体（死菌体）のいずれでもよく、また凍結乾燥したものであってもよく、培養上清等の培養物、菌体処理物等を利用することもできる。なお、エコール変換能は細菌由来の酵素により発揮されると考えられるので、酵素の活性を失活させない状態で利用することが望ましい。
【００２４】
本発明の組成物には、アドニトール、アラビノース、エリスリトール、ガラクトース、ラクチトール、メレチトース、トレハロース、リボース、ソルボース、キシロース、イノシトール、ソルビトールを含有させてもよい。これら糖類は、エコール変換能を有する微生物を選択的に維持・増殖させたり、或いは微生物のエコール変換能を亢進する作用を有し、エコール濃度上昇作用を有するため、本発明のエコール変換能を有する微生物と併用することでより優れたエコール濃度上昇剤として利用できる。糖類は、単独で用いてもよく、又は２種類以上組み合わせて用いてもよい。これらの糖類は、Ｄ体Ｌ体のいずれを用いてもよいが、好ましくは、Ｄ体である。また、無水物、５水和物等の水和物を用いることもできる。
【００２５】
トレハロースには、２分子のグルコースの結合様式の相違により、α，α体、α，β体及びβ，β体の異性体が存在し、いずれの異性体も用いることができるが、好ましくはα，α体である。イノシトールには、９種類の立体異性体（ｍｙｏ−イノシトール、Ｄ（＋）−イノシトール、Ｌ−（−）イノシトール、ｍｕｃｏ−イノシトール、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール、ｃｉｓ−イノシトール、ｅｐｉ−イノシトール、ａｌｌｏ−イノシトール、ｎｅｏ−イノシトール）が存在する。天然にはｍｙｏ−イノシトール、Ｄ（＋）−イノシトール、Ｌ−（−）イノシトール、ｍｕｃｏ−イノシトール、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールが存在するが、入手し易さの観点から、ｍｙｏ−イノシトールを使用することが好ましい。当該イノシトールは２種以上の立体異性体を併用することができる。
【００２６】
糖類は、合成品や天然由来抽出物等の市販品を使用してもよく、また、これらの糖類を多く含む天然由来素材として使用してもよい。具体的に、アドニトールを多く含む素材としては、植物の根やリボフラビン含有素材が挙げられ、ソルボースを多く含む素材としては植物の果実などが挙げられ、メレチトースを多く含む素材としては植物の蜜や分泌液が挙げられ、トレハロースを多く含む素材としてはキノコ類が挙げられる。
【００２７】
本発明の組成物にダイゼインを含有させてもよい。ダイゼインはエコールの基質となるため、本発明のエコール変換能を有する微生物や上記の糖類と併用することでさらに優れたエコール濃度上昇剤として利用できる。ダイゼインは合成品や天然由来抽出物等の市販品を使用してもよく、ダイゼインを多く含む天然由来素材やその加工品を使用してもよい。具体的に、ダイゼインを多く含む素材としては大豆、えんどう豆、葛、クローバー等が挙げられ、これらの加工品としては例えば、豆腐、豆乳、油揚げ、納豆、醤油、味噌、テンペ等が挙げられる。イソフラボン配糖体は体内の腸内細菌の働きによりアグリコン化されるため、ダイゼインは、その配糖体化合物であるダイジン、マロニルダイジン、アセチルダイジン等の形態として使用することもできる。また、ダイゼインからのエコール変換における中間代謝物であるジヒドロダイゼイン等を使用することもでき、本明細書の「ダイゼイン」にはこれらの配糖体や中間代謝物も含まれる。
【００２８】
本発明のエコール変換能を有する微生物を含有する飲食用又は医薬用組成物を使用する場合の投与量に厳格な制限はなく、対象者や適用疾患等の様々な使用態様によって得られる効果が異なるため、適宜投与量を設定することが望ましい。微生物量としては生菌換算で１日当たり１０５個〜１０１０個の投与が好ましく、特に１０６個〜１０９個が好ましい。また組成物における糖類の含量は０．５〜５０質量％、さらに１〜１０質量％、ダイゼインの含量はダイゼイン換算で５〜２０００μＭ、さらに１００〜８００μＭとするのが好ましい。
【００２９】
本発明の組成物は、経口投与又は非経口投与のいずれも使用できるが、経口投与が好ましい。投与に際しては、有効成分であるエコール変換能を有する微生物を含有する組成物を経口投与、直腸内投与、注射等の投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬品製剤の形態で投与することができる。
【００３０】
このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散在、カプセル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥剤等が挙げられる。これらの製剤は製剤上の常法により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、澱粉、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
【００３１】
また、本発明の飲食用組成物は、そのまま、又は種々の栄養成分を加えて、飲食品中に含有せしめればよい。本発明の飲食用組成物は、体内のエコール濃度を上昇させる目的、或いは不定愁訴等の更年期障害、骨粗鬆症、高脂血症、動脈硬化、乳がん、前立腺がん、月経前症候群等の改善、予防等に有用な保健用食品又は食品素材として利用でき、これらの飲食品又はその容器には前記の効果を有する旨の表示を付してもよい。具体的に本発明の組成物を飲食品とする場合は、飲食可能な添加剤を適宜使用し、慣用の手段を用いて食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペースト等に成形してもよく、また種々の食品、例えば、ハム、ソーセージ等の食肉加工食品、かまぼこ、ちくわ等の水産加工食品、パン、菓子、バター、粉乳、発酵乳製品に添加して使用したり、水、果汁、牛乳、清涼飲料、茶飲料等の飲料に添加して使用してもよい。なお、飲食品には動物の飼料も含まれる。
【００３２】
本発明のエコール変換能を有する微生物をダイゼインに作用させることで、効率的にエコールを製造することができる。エコール変換能を有する微生物の形態は特に制限されず、生菌又は加熱菌体（死菌体）のいずれでもよく、また凍結乾燥したものであってもよく、培養上清等の培養物、菌体処理物等を利用することができるが、エコール変換能は細菌由来の酵素により発揮されると考えられるので、酵素の活性を失活させない状態で利用することが望ましい。本発明の微生物は、従来公知のエコール産生菌と比較してエコール変換能が非常に高いため、収率よく低コストでエコールを製造することができる。
【００３３】
具体的には、培地にダイゼインを１０〜１０００μＭとなるように添加し、本発明のエコール変換能を有する微生物を１０６〜１０１０個／培地・ｍＬとなるように接種し、３７℃で８時間以上、嫌気培養することで、エコールを製造することができる。この培地には、アドニトール、アラビノース、エリスリトール、ガラクトース、ラクチトール、メレチトース、トレハロース、リボース、ソルボース、キシロース、イノシトール及びソルビトールから選ばれる１以上のエコール濃度上昇作用を有する糖類を１〜１０質量％添加するのが好ましく、その他の窒素源等の適当な成分を加えて使用してもよいが、本発明のエコール変換能を有する微生物の増殖を阻害したり、エコール変換能を阻害する成分の使用は好ましくない。加えることができる成分としては、例えば、ペプトン、トリプチケースペプトン、イーストエキス、ヘミン、ビタミンＫ１等のビタミン、Ｌ−システイン塩酸塩、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ＮａＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＣａＣｌ２、ＭｇＳＯ４等が挙げられる。本発明の培地中に含まれる成分のうち、エコール濃度上昇作用を有する糖類やダイゼイン以外の成分の組成は、例えば、ＰＹ培地、ＧＡＭ培地、ＢＨＩ培地などの組成とすることができる。
【００３４】
基質となるダイゼインは合成品や天然由来抽出物等の市販品を使用してもよく、ダイゼインを多く含む天然由来素材やその加工品を使用してもよい。また、ダイゼインは、その配糖体化合物であるダイジン、マロニルダイジン、アセチルダイジン等の形態で使用することもでき、この場合はイソフラボン配糖体をアグリコン化する作用を有する公知の微生物（ビフィドバクテリウム等）や酵素（β−グルコシダーゼ等）を本発明の微生物と併用すればよい。
【００３５】
本発明のエコール変換能を有する微生物による培養以外に、微生物由来のエコール変換能を有する酵素を作用させることもできる。その使用方法に特に制限はないが、具体的には、培養物をそのまま用いる方法、培養物を遠心分離や膜処理等により濃縮して培養物濃縮液あるいはペレットとして使用する方法、静止菌体として使用する方法、乾燥菌体として使用する方法、菌体破砕物として使用する方法、粗酵素溶液として使用する方法、精製酵素溶液として使用する方法、酵素粉末として使用する方法等が挙げられる。
【００３６】
酵素の精製条件、精製度に特に制約はなく、一般的な精製手法を用いることができる。エコール変換能を有する微生物を培養した後、遠心分離、有機膜、無機膜等の分離手段で菌体を分離し、培養上清中に当該酵素が含まれる場合にはこれを回収し、粗酵素溶液とすることができる。また菌体内に当該酵素が含まれる場合は菌体をホモジナイザーや超音波処理により物理的に破砕する、もしくは細胞壁溶解酵素等を用いて酵素的に処理することにより、菌体内抽出液を得、粗酵素溶液とすることができる。これらの粗酵素溶液を硫安塩析処理、透析、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより、精製度の高い精製酵素溶液としてもよい。
【００３７】
エコール変換能を有する微生物や微生物由来のエコール変換能を有する酵素は、一般的な固定化の手法を用いて固定化したものを用いてもよい。固定化の手法としては、担体結合法、架橋法、包括法等が挙げられるが、これに制限されるものではない。担体結合法としては共有結合法、イオン結合法、物理的吸着法、架橋法してはグルタルアルデヒド法、包括法としては格子型包括法とマイクロカプセル型包括法が例として挙げられる。より具体的には、活性炭、おがくず等へ吸着させる方法、ＣＭ−セルロース、Ｐ−セルロース、ＤＥＡＥセルロース、ＥＣＴＥＯＬＡ−セルロース等へ結合させる方法、グルタルアルデヒド、トリレンジイソシアナート等により架橋する方法、アクリルアミド、κカラギーナン、アルギン酸、ゼラチン、酢酸セルロース等により包括させる方法が挙げられる。また、固定化した細菌あるいは酵素をバッチ式、カラム式等の一般的に利用される方法で使用することができ、これらは単回、繰り返し、あるいは連続使用することができる。
【００３８】
上記の方法により製造したエコールは、培養上清等のエコール含有培養物をそのまま用いてもよく、カラムクロマトグラフィー、有機溶媒抽出等の常法に従って培養物からエコールを分離精製してもよい。得られた培養物をイオン交換カラムに吸着させた後、メタノールで溶出させて、エコール精製物とすることができる。
【００３９】
本発明のエコール変換能を有する微生物のＤＮＡ及び／又はＲＮＡに特異的にハイブリダイズしうる核酸断片は、本発明者らがシークエンスを行って得たＳｌａｃｋｉａ  ｓｐ．ＹＩＴ  １１８６１の塩基配列とデータベース（ＤＤＢＪ、Ｇｅｎｂａｎｋ等）とを比較・検討することにより得た。本発明の核酸断片を作成するにあたり、そのターゲットには系統分類の指標として信頼性の高い１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を用い、分析にはＰＣＲ法等の手段が必要になるため、ＲＮＡではなくＤＮＡを用いた。
【００４０】
核酸断片の設計の際には、標的とするエコール変換能を有するＳｌａｃｋｉａ属細菌とその近縁の菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ塩基配列とでアライメントを行った。すなわち、現在の遺伝子配列を指標とした分類体系に基づいてコリオバクテリア科に属する近縁菌種（アトポビウム属、コリンセラ属など）を選択し、アライメントを行った。その結果、配列番号１又は２記載の塩基配列からなる核酸断片が得られた。目的細菌のＤＮＡ及び／又はＲＮＡに特異的にハイブリダイズしうる核酸断片としては、かくして設計された配列のみならず、公知の技術常識にのっとれば適宜想定することができ、当該塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸断片、又はそれらと相同な塩基配列からなり且つ機能的に等価である核酸断片が挙げられる。ここで、それらと相同な塩基配列からなり且つ機能的に等価である核酸断片としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）に示す核酸断片であって、目的微生物の検出や同定、定量に用いることができるものが挙げられる。
（ａ）配列番号１又は２で示される塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列からなる核酸断片において、１又は数個、好ましくは１乃至１０個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる核酸断片。
（ｂ）配列番号１又は２で示される塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸断片。
（ｃ）配列番号１又は２で示される塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる核酸断片。
【００４１】
なお、ここで塩基配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ（Ｒ）のホモロジー解析プログラムを用いることにより算出される。また、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液及び２５０ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡを含む溶液に４２℃で１６〜２４時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００４２】
上記のように設計した核酸断片は、その塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機により人工的に合成することができる。その特異性は以下の実施例に示す、核酸断片をプライマーとして用いた場合の１８株の近縁種（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｆｏｓｓｅｒ  ＪＣＭ  ９９８１Ｔ，Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｍｉｎｕｔｕｍ  ＪＣＭ  １１１８Ｔ，  Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｐａｒｖｕｌｕｍ  ＪＣＭ  １０３００Ｔ，  Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｒｉｍａｅ  ＪＣＭ  １０２９９Ｔ，  Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ  ＤＳＭ  １５８２９Ｔ，  Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ２５９８６Ｔ，  Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ  ＪＣＭ  １０６４３Ｔ，  Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ  ＪＣＭ  １０６４１Ｔ，  Ｃｒｙｐｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｕｒｔｕｍ  ＤＳＭ  １５６４１Ｔ，  Ｄｅｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｎｓ  ＣＣＵＧ  ４７０２７Ｔ，  Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ ｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓ  ＪＣＭ  １４５５２Ｔ，  Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ ｌｅｎｔａ  ＡＴＣＣ  ２５５５９Ｔ，  Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ  ＪＣＭ  １４５５１Ｔ，  Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ ｐｒｏｆｕｓａ  ＪＣＭ  １４５５３Ｔ，  Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ ｕｌｉ  ＪＣＭ  １２４９４Ｔ，  Ｓｌａｃｋｉａ ｅｘｉｇｕａ  ＪＣＭ  １１０２２Ｔ，  Ｓｌａｃｋｉａ ｆａｅｃｉｃａｎｉｓ  ＪＣＭ  １４５５５Ｔ，  Ｓｌａｃｋｉａ ｈｅｌｉｏｔｒｉｎｉｒｅｄｕｃｅｎｓ  ＪＣＭ  １４５５４Ｔ）に対するアンプリコンの有無ならびに代表的な腸内細菌種および病原菌種２７株のアンプリコンの有無を指標として確認した。結果として、特異性に問題はなかった。
【００４３】
本発明の核酸断片はエコール変換能を有する微生物に特異的であるので、ヒトや動物の糞便や消化管内容物から得たＤＮＡやＲＮＡを対象としたＰＣＲ反応、或いはＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）等を行うことで、エコール変換能を有する微生物を特異的に検出、同定、定量することができる。エコール変換能を有する微生物を定量化することで、各個人が元来有するエコール産生能を簡便に調べることが可能となり、エコールが関与する不定愁訴等の更年期障害、骨粗鬆症、高脂血症、動脈硬化、乳がん、前立腺がん、月経前症候群等の様々な疾病の罹患リスクを把握することができ、エコール産生能が無いヒトや低いヒトに対して本発明の組成物を投与する等の予防策を効果的に講じることができる。また、これら疾病に罹患しているヒトでエコール産生能が無いヒトや低いヒトに対しても、本発明の組成物を投与する等して、疾病の治療や改善に役立てることができる。
【００４４】
ＰＣＲあるいはＲＴ−ＰＣＲを用いる分析方法は、例えば（１）検体中のＤＮＡ又はＲＮＡを抽出する工程、（２）上記核酸断片の１以上を用いてＰＣＲあるいはＲＴ−ＰＣＲを行う工程、及び（３）工程（２）により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程により行うことができる。検体由来の鋳型ＤＮＡ（鋳型がＲＮＡの場合はｃＤＮＡ）に本発明の核酸断片を組み合わせ、増幅反応を行うことにより、標的とするＳｌａｃｋｉａ属細菌に特異的なＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物）を得ることができる。このようにして得られたＤＮＡを電気泳動すれば、バンドの有無から標的とするＳｌａｃｋｉａ属細菌を特異的に検出、同定することができる。
【００４５】
また、鋳型のＤＮＡ又はＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を段階希釈しＰＣＲを行えば、Ｓｌａｃｋｉａ属細菌の定量化も可能である。ＰＣＲを用いて定量を行う際は、上記方法の他、リアルタイムＰＣＲ（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を用いる方法がより好ましい。ＰＣＲにより増幅されるＰＣＲ産物量を経時的に観察し、一定のＤＮＡ量に達した時のＰＣＲサイクル数を特定することにより、検体中のＳｌａｃｋｉａ属細菌の定量が可能となる。
【００４６】
増幅されるＰＣＲ産物の経時的な観察は、ＰＣＲ産物をＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ  Ｉ等のインターカレーター性蛍光色素により標識し、各ＰＣＲ段階での蛍光強度を測定することにより行うことができる。インターカレーター性色素は二本鎖核酸にインカレーションすることで蛍光強度が増加する性質を有することから、標的細菌のＤＮＡ（ＲＮＡの場合はｃＤＮＡ）からＰＣＲ反応により生成するＰＣＲ産物を正確に測定することができ、特にＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ  Ｉが好適に用いられる。
【００４７】
任意に設定された一定の蛍光強度（ＤＮＡ量）に達した時のＰＣＲサイクル数（以下ＣＴ値とする）を特定することにより、検体中の標的細菌の定量、或いは検出・同定が可能となる。また、蛍光色素により標識したＴａｑＭａｎプローブやＭｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ｂｅａｃｏｎ等を使用することにより行うこともできる。ＴａｑＭａｎプローブやＭｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ｂｅａｃｏｎは、ＰＣＲにより増幅される領域の内部配列と相同性を有するオリゴヌクレオチドに蛍光色素とクエンチャーを結合させたプローブであり、ＰＣＲ反応に共存させて用いる。プローブに結合した蛍光色素とクエンチャーの相互作用でＰＣＲ増幅反応に応じた蛍光を発するため、各ＰＣＲ段階での蛍光強度を測定することにより増幅されるＰＣＲ産物の経時的な観察を行うことができる。
【００４８】
検体中の標的とするＳｌａｃｋｉａ属細菌の定量、或いは検出・同定は、培養法等により計測した細菌数の対数値とＣＴ値の検量線により求めることができる。すなわち、標的とする細菌数の対数値を横軸に、ＣＴ値を縦軸にプロットした検量線を予め作成し、ＰＣＲ反応の結果得られたＣＴ値を該検量線に適用して、検体中の標的とするＳｌａｃｋｉａ属細菌の定量、或いは検出・同定を行う。
【００４９】
本発明の核酸断片は、上記のＰＣＲ法においてプライマーとして用いる他、単独でもプローブとして使用でき、これらは他の公知のユニバーサルプライマー、オリゴヌクレオチド等と組み合わせて用いることもできる。
【００５０】
本発明の核酸断片をプローブとして用いる分析方法としては、例えばインサイチュハイブリダイゼーション（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、ドットブロットハイブリダイゼーション（ｄｏｔ  ｂｌｏｔ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）等が挙げられ、中でもインサイチュハイブリダイゼーションは検体中の核酸を抽出する工程を必要としないため迅速な手法として好ましく、蛍光物質により標識した核酸断片をプローブとして用いるＦＩＳＨがより好ましい。
【００５１】
ＦＩＳＨは、具体的には、（１）検体をホルムアルデヒド或いはホルマリンにより固定する工程、（２）固定した検体をスライドグラス又はメンブレンフィルターに塗抹する工程、（３）蛍光標識した核酸断片によりハイブリダイゼーションを行う工程、（４）ハイブリダイゼーション後の余分な核酸断片及び非特異的に結合した核酸断片を洗浄する上程、及び（５）ハイブリダイズ後の結果について蛍光顕微鏡を用いて肉眼的に観察、或いはＣＣＤカメラ等により画像として取得する工程により行うことができる。
【００５２】
検体中に標的とするＳｌａｃｋｉａ属細菌が存在する場合は、用いた核酸断片とハイブリダイズし、上記ハイブリダイズ後の結果におけるシグナルが陽性となるので、これらの細菌を特異的に検出し、同定することができる。また、それを計数することにより、定量化も可能となる。
【００５３】
以下、試験例及び実施例を挙げて本発明の内容をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら制約されるものではない。
【実施例】
【００５４】
試験例１  エコール変換能を有する細菌の取得
健常エコールプロデューサーの新鮮排泄便をガラスビーズ（φ３ｍｍ）存在下で１０倍容の嫌気状態の希釈液（ＫＨ２ＰＯ４  ０．００２５５％，  Ｋ２ＨＰＯ４  ０．００２５５％，  ＮａＣｌ  ０．００６％，  （ＮＨ４）２ＳＯ４  ０．００２５５％，  ＣａＣｌ２  ０．０００２５５％，  ＭｇＳＯ４  ０．０００２５５％，  ０．１％レサズリン溶液０．１％，  ８％  Ｎａ２ＣＯ３溶液２．２％，  Ｌ−システイン塩酸塩０．０５％）に良く懸濁し、滅菌ガーゼを用いて残渣を除去した。８，０００ｘｇ、１０分の遠心分離を行い、沈殿を同量の同希釈液にて懸濁した。この状態で−３０℃にて凍結保存した。使用時に解凍した糞便希釈液を８，０００ｘｇ、１０分の遠心分離を行い、得られた沈殿についてソルボースを糖源としたＰＹ培地（ペプトン０．５％、トリプチケースペプトン０．５％、イーストエキス１％、ヘミン０．００００５％、ビタミンＫ１  ０．０００１％、Ｌ−システイン塩酸塩０．０５％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．０００６％、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．０００６％、ＮａＣｌ  ０．００１２％、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ０．０００６％、ＣａＣｌ２  ０．００００６％、ＭｇＳＯ４  ０．００００６％）に懸濁した。３７℃、混合ガス（Ｎ２：Ｈ２：ＣＯ２＝８８：７：５）存在下で２４〜４８時間インキュベートした。これを７代まで継代した培養物について、同培地を用いて１０６倍希釈液を調整した。この希釈液５０μＬについて、それぞれ２０枚のＧＡＭ（１％ｇｌｕｃｏｓｅ加）寒天平板培地に塗沫した。それらを３７℃、７２ｈ、嫌気グローブボックス内でインキュベートしコロニーを形成させた。得られたコロニーについて、コロニー性状（表面性状、大きさ）およびグラム染色像から、２６種類に分類した。それぞれの代表コロニーについて終濃度１００μＭのダイゼインを含むＧＡＭ（１％ｇｌｕｃｏｓｅ加）液体培地に植菌した。３７℃、２４ｈ、混合ガス（Ｎ２：Ｈ２：ＣＯ２＝８８：７：５）存在下でインキュベートした培養液についてＨＰＬＣにてエコール濃度を測定した結果、高いダイゼイン−エコール変換能を有するグラム陽性桿菌を見出した。なお、ＨＰＬＣ条件は次の条件で行った。【００５５】
装置：ＬＣモジュール１（Ｗａｔｅｒｓ）
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＣＮ（Ｙ．Ｍ．Ｃ製）
検出：紫外吸光光度計（測定波長２８０ｎｍ）
カラム温度：４０℃
移動相：０．１％蟻酸溶液／アセトニトリル／メタノール（８７：３：１０）混液
流量：２．５ｍＬ／ｍｉｎ
サンプル注入量：１０μｌ【００５６】
試験例２  エコール変換能を有する細菌の分子系統解析、生化学性状試験
試験例１で単離した細菌ゲノムを鋳型として、プライマー２７ｆ（配列番号３）および１５５２ｒ（配列番号４）を用いて、１６Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ（１６Ｓ  ｒＲＮＡ）を標的にＰＣＲを行い、約１５００ｂｐの増幅産物を得た。それを鋳型として、シーケンシングＰＣＲを行った。シーケンシングＰＣＲには、ＢｉｇＤｙｅ（Ｒ）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、製品マニュアルに準じた方法で行った。シーケンサーには、ＡＢ  ３１３０ジェネティックアナライザ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列の分子系統解析および相同性解析には、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ  ｖ１．８３、ＴｒｅｅＶｉｅｗ  ｖ１．６．６およびＧＥＮＥＴＩＸ（Ｒ）  Ｖｅｒ．７（株式会社  ゼネティックス）を用いた。その結果、本菌株はコリオバクテリア科に属することが明らかとなった（図１）。Ｓｌａｃｋｉａ ｅｘｉｇｕａ  ＡＴＣＣ  ７００１２２Ｔが系統的に最も近縁な既存の菌種であったが、相同性は低値を示した（９２．４％）。特許文献３記載のＳｌａｃｋｉａ  ｓｐｐ．ＴＭ−３０とは９９％以上の相同性を有しており、データベース上に登録されている未培養菌株と併せて一群のクラスターを形成していた。このことから本菌株とＳｌａｃｋｉａ  ｓｐｐ．ＴＭ−３０は同種である可能性が示された。
本菌株および１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列解析より既存種で最も系統的に近いＳ． ｅｘｉｇｕａ  ＡＴＣＣ  ７００１２２Ｔについて、ラピッドＩＤ  ３２Ａ（シスメックス・ビオメリュー株式会社）を用いて生化学性状を調べた。供試菌の培養には、ＧＡＭ（１％ｇｌｕｃｏｓｅ加）寒天培地を用い、３７℃にて２４時間、嫌気条件下で培養した。なお、同定キット１つにつき２枚分のＧＡＭ（１％ｇｌｕｃｏｓｅ加）寒天培地を用いた。キットへの供試菌液の調整、反応そして判定は、キット附属のマニュアルに従った。その結果を表１に示した。エコール変換能を有する細菌は、ラピッドＩＤ  ３２Ａにおいて、Ｓ．ｅｘｉｇｕａ  ＡＴＣＣ  ７００１２２Ｔとは大きく異なる性状を示した。また、エコール変換能を有する細菌は、ラピッドＩＤ  ３２ＡでＤ−マンノース、Ｄ−ラフィノースの資化性、アルカリホスファターゼが陽性を示した点において特許文献３に記載のＳｌａｃｋｉａ  ｓｐｐ．  ＴＭ−３０の生化学性状と異なっていた。したがって、既報の株とは異なる事が明らかとなった。以上の分子生物学的および生化学性状試験結果より本菌株は、Ｓｌａｃｋｉａ属に含まれる新規な株と考えられ、Ｓｌａｃｋｉａ属細菌ＹＩＴ  １１８６１（Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐ．  ＹＩＴ  １１８６１）と命名した。【００５７】
【表１】
0005631862.tif 000002
【００５８】
試験例３  Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐ．  ＹＩＴ  １１８６１のダイゼイン−エコール変換活性  Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐ．  ＹＩＴ  １１８６１についてダイゼイン−エコール変換活性を調べた。ダイゼイン濃度を１００、４００μＭとしたＧＡＭ培地に、１０７個／培地・ｍＬとなるように本菌を接種し、３７℃で保温した。経時的に培養液中のエコール濃度をＨＰＬＣにて測定し、ダイゼイン−エコール変換活性を測定した。
結果を表２に記載した。併せて、特許あるいは論文で公表されている菌株の活性を調査し比較した。その結果、Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐ．  ＹＩＴ  １１８６１は、１００μＭのダイゼインを８時間のインキュベートで９５％、２４時間で１００％、４００μＭのダイゼインを２４時間で９４％、９６時間では１００％エコールに変換した。一方、ｇｒａｍ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｏ−０３株（非特許文献３）では１９３μＭのダイゼインを４８時間で３３％（初発菌体濃度：未記載、最終菌体濃度：ＯＤ６６０＝０．２７７、これより１０６〜１０８個／ｍＬ・培地と推定される）、ＴＭ−３０株では、３９１μＭのダイゼインを２４時間でわずか１％程度（初発菌体濃度：未記載、最終菌体濃度：１０９個／培地・ｍＬ）、またＬ．ｇａｒｉｖｉａｅ  ９２−９０株ではわずか４２μＭのダイゼインを１００％エコールに変換するのに７２時間を要し、２４時間でのエコール変換は０％であった（初発菌体濃度：１０７個／培地・ｍＬ）。以上のことから、Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐ．  ＹＩＴ  １１８６１のダイゼイン−エコール変換活性は、既存の菌株に比べ非常に高い活性を有していることが明らかとなった。【００５９】
【表２】
0005631862.tif 000003
【００６０】
試験例４  Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐ．  ＹＩＴ  １１８６１に特異的な核酸断片の設計
Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐ．  ＹＩＴ  １１８６１に特異的な配列をもとにプライマーの設計を行った。公共データベース（ＤＤＢＪ／ＧＥＮＥＢＡＮＫ／ＥＭＢＬ）よりコリオバクテリア科の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を入手し、得られた配列をもとにＣｌｕｓｔａｌ  Ｘ  ｖ１．８３を用い近縁種のｒＲＮＡ配列と併せて整列を行い、特異的な領域についてプライマーｅｑ４３０−Ｆ／ｅｑ６６５−Ｒを設計した（配列番号１及び２）。Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐ．  ＹＩＴ  １１８６１菌体（２×１０８個／ｍＬ）から抽出したＲＮＡを、２×１０６から２×１０−１個／ｍＬ相当となるように１０倍段階希釈をした。この希釈ＲＮＡを１反応あたり５μｌを鋳型として、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。定量的ＲＴ−ＰＣＲにはＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いた。反応液は５０℃で３０分間逆転写反応を行い、その後逆転写酵素を失活させるため９５℃で１５分間加熱した。続いて、９４℃２０秒、６０℃２０秒、７２℃５０秒を１サイクルとして４５サイクル行った。その結果、本プライマーによるＰＣＲ増幅は、１反応あたり１０−３から１０３個の範囲で菌数と相関を示した。糞便１ｇあたりに換算すると１０３個の菌体を定量可能であることが明らかとなった（図２）。
プライマーの特異性の検討には、表３に記載の代表的な腸内細菌、感染症起因菌およびコリオバクテリア科に属する近縁種を対象とした。ＤＡＰＩ染色法によりあらかじめ菌数を測定しておいた各菌株の純培養菌液よりＲＮＡを抽出し、２×１０８個／ｍＬ相当となるようにＲＮＡ濃度を調整した。一反応に対して、ＲＮＡを１×１０５個／ｍＬ相当供試し、上述の条件により定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。上述のプライマーについて、代表的な腸内細菌、感染症起因菌およびコリオバクテリア科に属する近縁種を対象として、その反応性を検討した。その結果を表３に記載した。表３において、＋：ＣＴ値≧４０，−：ＣＴ値＜４０を示す。
本プライマーは、Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐ．  ＹＩＴ  １１８６１に対してのみ高い特異性を有していた。一方、他の対象菌株に対する交差反応は一切確認されなかった。また、ＲＮＡサンプルの換わりにＮｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒを加えた反応における非特異的産物の増幅は認められなかった。【００６１】
【表３】
0005631862.tif 000004
【００６２】
試験例５  ヒトにおける解析
配列番号１及び２のプライマーを用いて、４０名の健常成人ボランティアの糞便ＲＮＡを対象に定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。新鮮なボランティアの糞便２０ｍｇより、ＡＧＰＣ法により全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡを適宜希釈し、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。反応は、試験例４に記載の方法に従った。あらかじめ菌数がわかっているＳｌａｃｋｉａ  ｓｐ．  ＹＩＴ  １１８６１より抽出したＲＮＡの反応性を指標として、サンプル中のＳｌａｃｋｉａ  ｓｐ．  ＹＩＴ  １１８６１の菌数を算出した。その結果、Ｓｌａｃｋｉａｓｐ．  ＹＩＴ  １１８６１は、４０名中１６名（４０％）より６．４±２．４（Ｌｏｇ１０個／ｇ・糞便）の菌数で検出された。【００６３】
実施例１  エコールの製造
１０Ｌのダイゼイン含有ソルボース−ＰＹ培地（ダイゼイン０．０２５％、ソルボース１％、ペプトン０．５％、トリプチケースペプトン０．５％、イーストエキス１％、ヘミン０．００００５％、ビタミンＫ１  ０．０００１％、Ｌ−システイン塩酸塩０．０５％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．０００６％、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．０００６％、ＮａＣｌ  ０．００１２％、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ０．０００６％、ＣａＣｌ２  ０．００００６％、ＭｇＳＯ４  ０．００００６％）に、１０８個／培地・ｍＬのＳｌａｃｋｉａ  ｓｐ．  ＹＩＴ１１８６１を添加し、３７℃、９６ｈ、混合ガス（Ｎ２：Ｈ２：ＣＯ２＝８８：７：５）存在下でインキュベートした。培養液を遠心分離（８０００ｘｇ、１５分間）し、その上清に等量のジエチルエーテルを添加した。良く攪拌後、遠心分離（１０００ｘｇ、２分間）により２層に分離し、ジエチルエーテル層のみを分取した。ジエチルエーテル層を４０℃、窒素気流下にて乾固させ、２．４ｇのエコールを得た。【００６４】
実施例２  錠剤の製造
下記表４の処方で各種成分を混合して造粒・乾燥・整粒した後に、打錠して錠剤を製造した。【００６５】
【表４】
0005631862.tif 000005
【００６６】
１）Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐ．  ＹＩＴ  １１８６１の生菌体を凍結乾燥して製造した（生菌体１０１０個／ｇを含む）。【００６７】
実施例３  清涼飲料の製造
下記表５処方により、常法に従って各成分を配合し、均質化して清涼飲料を得た。得られた清涼飲料は褐色瓶に充填後、アルミキャップにて封印し、加熱処理を施した。【００６８】
【表５】
0005631862.tif 000006
【００６９】
１）Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐ．  ＹＩＴ  １１８６１の生菌体を凍結乾燥して製造した（生菌体１０１０個／ｇを含む）。
【図１】
0005631862.tif 000007
【図２】
0005631862.tif 000008
【配列表】
0005631862000001.app