(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のカルシウムイオンの濃度を決定するための方法であって、以下：
ａ）その試料を式Ｉ
【化１】
0005631480.tif 000012
ここでＲ１は水素、ハロゲン、カルボキシ、アルキルおよびホルミルから選択され、Ｒ２は水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、モルホリノ、ＣＮ、カルボキシおよびホルミルから独立して選択され、Ｒ３は水素、ハロゲン、Ｎ−アルキルサルフェート、カルボキシ、アルコキシ、フェニル、ＣＮ、ＣＦ３、および第三級ブチルから独立して選択され、Ｒ４は水素、ハロゲンまたはアルキルから独立して選択され、Ｒ５およびＲ７は独立して水素またはアルキルであり、Ｒ６は水素、アルキル、アルコキシおよびハロゲンから選択され、またはここでＲ３およびＲ４は芳香族架橋を形成しており、そしてＸ＋は正に荷電した対イオンである；
の化合物を含む溶液と混合し、それによりカルシウムイオンをその化合物に結合させ；
ｂ）カルシウムイオンをその化合物から放出させ、ここで前記の放出がその化合物の吸光度の変化を引き起こし；
ｃ）その吸光度の変化を測定し；
ｄ）（ｃ）において測定された吸光度の変化をカルシウムイオンの濃度を決定するために用いる；
の工程を含む、前記方法。
【請求項２】
式Ｉの化合物を含む溶液がｐＨ８．５からｐＨ１１．５の範囲のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
式Ｉの化合物を含む溶液がｐＨ９．０からｐＨ１０．５の範囲のｐＨを有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
式ＩのＲ１が水素またはハロゲンのどちらかである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
式ＩのＲ２が水素、ハロゲンまたはアルキルである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
式ＩのＲ３が水素、ハロゲン、カルボキシまたはアルコキシである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
請求項１の工程（ｂ）におけるカルシウムイオンの放出が、２０℃において７．０以上のｌｏｇ  ｋのカルシウムイオンに対する結合定数を有するカルシウムキレート剤により誘発される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
請求項１の工程（ｂ）におけるカルシウムイオンの放出が、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＧＴＡ、ＤＴＰＭＰおよび／またはＥＤＰＭＰにより誘発される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ｐＨ８．５からｐＨ１１．５の範囲のｐＨを有し、請求項１に定義された式Ｉの化合物を含有する、カルシウムの測定のための試薬。
【請求項１０】
０．１０ｍＭから５０ｍＭの範囲の濃度の式Ｉの化合物を含む、請求項９に記載の試薬。
【請求項１１】
緩衝系を含み、その緩衝系がＡＭＰＤ（＝２−アミノ−２−メチル−１．３−プロパンジオール）、ＣＨＥＳ（＝２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）−エタンスルホン酸）、ＡＭＰＳＯ（＝３−［ジメチル（ヒドロキシルメチル）−メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＣＡＰＳＯ（＝３−シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸）、ＣＡＰＳ（＝３−シクロヘキシルアミノ）−２−プロパンスルホン酸）、グリシン緩衝系、または炭酸緩衝系から選択される、請求項９に記載の試薬。
【請求項１２】
式ＩのＲ１が水素またはハロゲンのどちらかである、請求項９〜１１のいずれかに記載の試薬。
【請求項１３】
式ＩのＲ２が水素、ハロゲンまたはアルキルである、請求項９〜１１のいずれかに記載の試薬。
【請求項１４】
式ＩのＲ３が水素、ハロゲン、カルボキシまたはアルコキシである、請求項９〜１１のいずれかに記載の試薬。
【請求項１５】
カルシウムの測定のための検査キットであって、請求項９〜１４のいずれかに記載の試薬を含む検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルシウムの決定のための試薬に、およびその試薬を用いる決定法に関する。より詳細には、それはモノニトロ置換されたＢＡＰＴＡ型キレート剤（ＢＡＰＴＡ＝１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）を含むカルシウムの決定のための試薬に関する。試料、例えば血液試料（例えば全血、血漿または血清）またはあらゆる他の水性液体試料（例えば脳脊髄液、リンパ液、唾液または尿）中のカルシウムの正確な決定を可能にする決定法は、従って記述されたような臨床診断に特に有用である。
【発明の概要】
【０００２】
血液または血清のカルシウムレベルはそれぞれ重要な診断値であり、重要な処置上の意味を有する可能性がある。
カルシウムイオンに関する基準範囲は２．２０〜２．２５ｍｍｏｌ／Ｌと非常に狭く、これらのレベルより上または下へのわずかな逸脱は、いくつかの生理障害の症状を示す。高カルシウム血症（高い血清カルシウム）と関係する２つの最も一般的な疾患は、副甲状腺機能亢進症および悪性腫瘍であり、特に悪性腫瘍が骨に転移して骨吸収（すなわち転移巣の部位からのカルシウムの放出を伴う骨の局所的な破壊）を引き起こした場合である。減少した血清カルシウムレベル（低カルシウム血症）は一般に副甲状腺機能低下症と関係している。新生児の約１％は、即時の医療介入を必要とする被刺激性、攣縮および痙攣のような症状を伴う重大な低カルシウム血症（血清カルシウム＜１．７５ｍｍｏｌ／Ｌ）を有する。
【０００３】
マグネシウムはカルシウムと同様に体内で見付かる主要な元素の１つである。マグネシウムのレベルにおける障害も臨床症状につながり、そのいくつかはカルシウムのレベルの障害で見られる臨床症状と非常に似ている。低い血清カルシウムおよび低い血清マグネシウムのほとんど同じ臨床症状を考慮すると、どの元素がその臨床症状を引き起こしているのかを明示する（ｄｅｌｉｎｅａｔｅ）のは必須である。どの元素が正常な範囲から外れているのか、または場合により両方の元素が正常な範囲から外れているのかどうかを決定するために、しばしば血清カルシウムおよびマグネシウムの両方の測定が必要であり、マグネシウムがカルシウムの定量化を妨げないことは必須である。
【０００４】
カルシウムおよびマグネシウムをそれぞれ測定するための参照法は、原子吸光である。日常的な測定に関して、原子吸光はいくらか不便であり、十分な正確さおよび再現性を達成するためには、そのアッセイを実施するために高価な機器および相当に熟練した操作者を必要とする。
【０００５】
特定の酵素の触媒活性はカルシウムイオンの存在に強く依存し、それによりカルシウム依存性酵素活性の測定によりカルシウムを定量化することを可能にする。酵素的手順に基づくカルシウムイオンの測定に関する方法は、例えば米国特許第６，０６８，９７１号において記述されている。
【０００６】
臨床検査室の日常の仕事においてカルシウムを測定するために頻繁に用いられる現在の方法は、オルトクレゾールフタレインコンプレキソン（ｏ−ＣＰＣ）、アルセナゾＩＩＩ、ホスホナゾまたはクロロホスホナゾのようなキレート性の色を生じる薬剤を用いる手順に基づいている。これらの方法の少なくとも１種類が検査室の臨床的な日常の仕事においてしばしば用いられ、それぞれが欠点を有する。
【０００７】
ｏ−ＣＰＣ法の感度はｐＨに非常に大きく依存する。最大感度のために、その反応は約１０，７のｐＨで実施される。しかし、これらのアルカリ性のｐＨの値では、その試薬はすぐに周囲の二酸化炭素を吸収する。水と化合して炭酸を形成する二酸化炭素の吸収は徐々にその試薬のｐＨを低下させ、最終的にはその試薬をカルシウム測定に関して機能しないものにする。ｐＨの徐々の変化は、正確な測定を保証するためにより頻繁な較正運転も必要とする。また、ｏ−ＣＰＣはある程度非選択的であり、マグネシウムおよびガドリニウムのような他の金属に結合する。血清において通常遭遇するレベルでのマグネシウムの干渉を排除するため、マグネシウムをキレートするために８−ヒドロキシキノリンが添加される。
【０００８】
アルセナゾＩＩＩに基づくカルシウム検出のための方法は、ｏ−ＣＰＣ法に付き物である高ｐＨおよびマグネシウムの干渉（測定ｐＨに依存する）の問題に悩まされない。アルセナゾＩＩＩは弱酸性条件、例えばｐＨ５〜６の下でカルシウムに結合し、そのカルシウム測定が７未満のｐＨで行われる場合、マグネシウムの結合は無視できる。アルセナゾＩＩＩはｏ−ＣＰＣ法の不都合な点の多くを排除するが、それは幾分低い感度および環境的懸念に悩まされる。１モルのアルセナゾＩＩＩにつき２モルのヒ素を含有し、アルセナゾＩＩＩ試薬の廃棄は、上水道のヒ素による汚染の懸念のため、多くの国において重大な問題である。
【０００９】
ＪＰ−Ａ−０４−１２０４６４は、クロロホスホナゾＩＩＩをキレート性の色を生じる薬剤として用いることによりカルシウムおよびマグネシウムを同時に定量化することができることを開示している。クロロホスホナゾＩＩＩの場合、その色の変化に最も適したｐＨ範囲は弱酸性であり、クロロホスホナゾＩＩＩはヒ素を含有しない試薬である。従って、クロロホスホナゾＩＩＩは高ｐＨおよび毒性により引き起こされる問題に関して好都合である。しかし、クロロホスホナゾＩＩＩを用いるマグネシウムおよびカルシウムの同時定量化は問題を引き起こす。このキレート剤は通常試料に添加されてマグネシウムおよびカルシウムの両方に結合し、それにより呈色を引き起こす。その後ＥＧＴＡを添加して結合したカルシウムのみを放出させ、この放出が色の変化を引き起こす。次いでその色の変化に基づいてカルシウムを定量化する。クロロホスホナゾＩＩＩは高いブランク値を与える傾向もあり、この事実がカルシウムイオンの決定が可能である濃度範囲を制限している。
【００１０】
ＢＡＰＴＡ型カルシウムキレート剤が記述されており、例えば細胞内カルシウムイオンの濃度を制御するための緩衝系として用いられている。Pethig, R. et al., (Cell Calcium 10 (1989) 491-498)は、７種類の異なるＢＡＰＴＡ型カルシウム緩衝剤の解離定数を決定した。彼らはカルシウムに関する生理学的研究においてジブロモ−ＢＡＰＴＡを用いることを提案している。
【００１１】
上記で論じたように、カルシウムイオンの測定のための様々なアッセイ法が臨床の日常の仕事において既知である。キレート性の色を生じる薬剤の使用に基づくカルシウムの決定のためのいくつかの試薬が利用可能であり、それぞれがさらなる改善の余地を残している。
【００１２】
従って、分析試料中のカルシウムを定量的に測定するための試薬に関して、および方法に関して満たされていない必要性が存在する。理想的な方法は、ａ）貯蔵条件下および分析器のボードの上で安定であり、ｂ）例えばヒ素のような毒性元素を含有せず、ｃ）比較的低い試薬ブランク吸光度を有し、ｄ）マグネシウムイオンまたはガドリニウムのような他の金属イオンに結合せず、ｅ）迅速な決定および高い試料処理能力を可能にし、そしてｆ）広い測定範囲にわたる正確なカルシウムイオンの測定につながるキレート剤に基づくべきである。
【００１３】
驚くべきことに、ＢＡＰＴＡ型キレート剤のモノニトロ誘導体は、それらをカルシウムイオンの測定に非常に適したものにする極めて好都合な特性を示す。
発明の概要
本発明は、カルシウムイオンの測定において非常に有用であり、数あるプラスの面の中でも、優れた貯蔵安定性を有し、ヒ素による環境汚染の問題がなく、マグネシウムまたはガドリニウムによる干渉を示さず、広い濃度範囲にわたる迅速かつ正確なカルシウムの決定を可能にする試薬を提供する。
【００１４】
本発明は試料中のカルシウムイオンの濃度を決定するための方法に関し、その方法は、その試料をモノ−ニトロ−ＢＡＰＴＡ型キレート剤を含む溶液と混合し、それによりカルシウムイオンをそのモノ−ニトロ−ＢＡＰＴＡ型キレート剤に結合させ、そのモノ−ニトロ−ＢＡＰＴＡ型キレート剤からカルシウムイオンを放出させることを含み、ここで前記の放出がそのモノ−ニトロ−ＢＡＰＴＡ型キレート剤の吸光度の変化を引き起こし、その吸光度の変化を測定し、そしてその測定された吸光度の変化をカルシウムイオンの濃度を決定するために用いる工程を含む。
【００１５】
モノ−ニトロ−ＢＡＰＴＡ型キレート剤を含有し、ｐＨ８．５からｐＨ１１．５の範囲のｐＨを有する、カルシウムの測定のための安定な試薬組成物も開示する。
さらに、本発明は、ｐＨ８．５からｐＨ１１．５の範囲のｐＨを有し、モノ−ニトロ−ＢＡＰＴＡ型キレート剤を含有する、カルシウムの測定のための試薬組成物を含むキットに向けられている。
【００１６】
発明を実施するための形態
好ましい態様において、本発明は試料中のカルシウムイオンの濃度を決定するための方法に関し、その方法は、その試料をモノ−ニトロ−ＢＡＰＴＡ型キレート剤を含む溶液と混合し、それによりカルシウムイオンをそのモノ−ニトロ−ＢＡＰＴＡ型キレート剤に結合させ、そのモノ−ニトロ−ＢＡＰＴＡ型キレート剤からカルシウムイオンを放出させることを含み、ここで前記の放出がそのモノ−ニトロ−ＢＡＰＴＡ型キレート剤の吸光度の変化を引き起こし、その吸光度の変化を測定し、そしてその測定された吸光度の変化をカルシウムイオンの濃度を決定するために用いる工程を含む。
【００１７】
試料中のカルシウムイオンの濃度を決定するための方法を開示し、その方法は、ａ）その試料を式Ｉ
【００１８】
【化１】
0005631480.tif 000002
【００１９】
ここでＲ１は水素、ハロゲン、カルボキシ、アルキルおよびホルミルから選択され、Ｒ２は水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、モルホリノ、ＣＮ、カルボキシおよびホルミルから独立して選択され、Ｒ３は水素、ハロゲン、Ｎ−アルキルサルフェート、カルボキシ、アルコキシ、フェニル、ＣＮ、ＣＦ３、および第三級ブチルから独立して選択され、Ｒ４は水素、ハロゲンまたはアルキルから独立して選択され、Ｒ５およびＲ７は独立して水素またはアルキルであり、Ｒ６は水素、アルキル、アルコキシおよびハロゲンから選択され、またはここでＲ３およびＲ４は芳香族架橋を形成しており、そしてＸ＋は正に荷電した対イオンである；
の化合物を含む溶液と混合し、それによりカルシウムイオンをその化合物に結合させ、ｂ）カルシウムイオンをその化合物から放出させ、ここで前記の放出がその化合物の吸光度の変化を引き起こし、ｃ）その吸光度の変化を測定し、そしてｄ）（ｃ）において測定された吸光度の変化をカルシウムイオンの濃度を決定するために用いる工程を含む。
【００２０】
候補置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４および／またはＲ６として言及されたハロゲンは、好ましくはＣｌ−、Ｂｒ−およびＦ−から選択される。
１つの好ましい態様において、その置換基Ｒ１および／またはＲ２、および／またはＲ３はカルボキシである。
【００２１】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、および／またはＲ７に関して言及されたアルキルは、好ましくはＣ１〜Ｃ３−アルキルである。
Ｒ２、Ｒ３、および／またはＲ６に関して言及されたアルコキシは、好ましくはメトキシまたはエトキシである。
【００２２】
Ｒ３およびＲ４の間の芳香族架橋は、好ましくはベンゼン環系の一部である。
対イオンＸ＋は好ましくはＮａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋およびＣｓ＋からなるグループから選択される。また、好ましいＸ＋はＫ＋またはＮａ＋である。
【００２３】
本明細書で用いられる際、以下の用語のそれぞれはこの節においてそれと関係する意味を有する。
冠詞“ａ”および“ａｎ”は、本明細書において、その冠詞の文法上の目的語の１個を、または１個より多くを（すなわち少なくとも１個を）指して用いられる。例として、“マーカー（ａ  ｍａｒｋｅｒ）”は１個のマーカーまたは１個より多くのマーカーを意味する。用語“少なくとも”は、場合により１個以上のさらなる対象が存在していてよいことを示すために用いられる。
【００２４】
表現“１以上”は、１〜５０、好ましくは１〜２０を意味し、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、または１５も好ましい。
式Ｉに従う化合物は、カルシウムイオンに結合することができる。カルシウムの結合の際または放出の際に、そのスペクトル特性において変化が起こる。このスペクトル特性における変化は容易に測定することができ、試料中に存在するカルシウムイオンの濃度に直接相関している。
【００２５】
まず分析する試料中に存在する全てのカルシウムイオンを式Ｉの化合物に結合させるのが好都合であることが分かっている。それにより安定したベースラインが得られる。そのような安定したベースラインは、低濃度のカルシウムイオンを測定するために特に価値がある。式Ｉに従う化合物からのカルシウムイオンの放出の際に、そのスペクトル特性における測定可能な変化が誘導され、それを用いて試料中に存在するカルシウムイオンの濃度を正確に決定することができる。
【００２６】
式Ｉの化合物は、広いｐＨ範囲にわたって効率的にカルシウムイオンを結合することができる。効率的なカルシウムの結合は、約ｐＨ５．０から約ｐＨ１１．０までにおいて観察することができる。１態様において、本発明に従う方法は、式Ｉに従う化合物およびその試料を含むアッセイ混合物中のｐＨがｐＨ５．０〜ｐＨ１１．０である条件の下で実施される。その反応混合物は、少なくとも試料の分割量（ａｌｉｑｕｏｔ）および式Ｉに従う化合物を含有する。さらなる好ましい態様において、その反応混合物中のｐＨはｐＨ５．０以上から、ｐＨ５．５以上から、ｐＨ６．０以上から、ｐＨ６．５から、またはｐＨ１１以下、また、ｐＨ１０以下、ｐＨ９．０以下、ｐＨ８．０以下までであろう。
【００２７】
式Ｉに従う化合物に関する終濃度は、試料中のカルシウムイオンの信頼できる測定のために十分に高いように調節される。式Ｉの化合物を用いてカルシウムイオンを測定することにより達成される高い感度により、血清または血漿のような臨床試料を例えば約１００倍希釈してなお信頼できる測定を行うことができる。当業者には明らかであるように、アッセイ混合物中の式Ｉに従う化合物の終濃度はそのようなアッセイ混合物中のカルシウムイオンの終濃度と釣り合っていなければならない。好ましい態様において、開示される方法は、カルシウムイオンの終濃度に関して予想される上限の少なくとも１．５倍である終濃度の式Ｉに従う化合物を用いて実施されるであろう。
【００２８】
言及したように、５ｍｍｏｌ／Ｌのカルシウムイオンを有する試料は信頼できる測定が行われるはずであり、これが予想される上限である。そのような試料を１：１００希釈した場合、そのアッセイ混合物中のカルシウムイオンの終濃度は０．０５ｍｍｏｌ／Ｌであろう。式Ｉに従う化合物の終濃度は、この濃度の少なくとも１．５倍、すなわち０．０７５ｍｍｏｌ／Ｌであるべきである。アッセイ混合物中の式Ｉに従う化合物のやはり好ましい終濃度は、５ｍｍｏｌ／Ｌの予想される上限を有する試料に関して計算されるようなカルシウムイオン濃度の少なくとも２倍、２．５倍、３倍および最大で２０倍、１５倍または１０倍であろう。好ましくは、アッセイ混合物中の式Ｉに従う化合物の終濃度は、５ｍｍｏｌ／Ｌにその試料に関する希釈比を掛けることにより得られるモル濃度の少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍および最大で２０倍、１５倍または１０倍であろう。
【００２９】
式Ｉに従う化合物の溶液中での長期安定性は、８．５以上のｐＨにおいて最もよく保存されることが分かっている。新しく作る、またはその機能性に関して頻繁に点検する必要がない式Ｉに従う化合物を含む試薬を用いるのが好ましく、従って１態様において、本発明の特許請求の範囲に従う方法はｐＨ８．５からｐＨ１１．５の範囲のｐＨを有する式Ｉの化合物を含む溶液を用いて実施される。
【００３０】
代わりの好ましい態様において、本発明に従う方法は、ｐＨ８．５からｐＨ１１．０まで、またはｐＨ９．０からｐＨ１０．５の範囲のｐＨを有する式Ｉの化合物を含む溶液を用いて実施される。
【００３１】
好ましい態様において、本発明に従う方法は、Ｒ１が水素またはハロゲンのどちらかである式Ｉに従う化合物を用いて実施される。
好ましい態様において、本発明に従う方法は、Ｒ２が水素、ハロゲン、カルボキシ、モルホリノまたはアルキルである式Ｉに従う化合物を用いて実施される。
【００３２】
好ましい態様において、本発明に従う方法は、Ｒ３が水素、ハロゲン、カルボキシまたはアルキルである式Ｉに従う化合物を用いて実施される。
１態様において、本発明で開示されるような方法における使用のための式Ｉに従う化合物は、好ましくは９．０以下のｌｏｇ  ｋの結合定数でカルシウムイオンに結合するべきである。一方で、ｌｏｇ  ｋとして記述したカルシウムイオンに対する結合定数は少なくとも４．０以上であるべきである。好ましくは、ｌｏｇ  ｋで与えられたカルシウムイオンに対する結合定数は４．５〜８．５であるべきであり、５．０〜８．０のｌｏｇ  ｋも好ましいであろう。
【００３３】
そのｌｏｇ  ｋは、Harrison, S.M. and Bers, D.M., Biochimica et Biophysica Acta 925 (1987) 133 - 143において記述されている手順に従って測定される。簡潔には、そのカルシウムに結合する化合物を２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液中でｐＨ７．０に緩衝する。温度を２０℃で一定に保つ。様々な濃度のカルシウムイオンを一定量のカルシウム結合化合物と共にインキュベートする。遊離の、および結合したカルシウムイオンの画分を決定し、その親和定数をスキャッチャードプロットの助けにより計算する。
【００３４】
当業者が理解しているであろうように、置換基の様々な組み合わせが可能である。その置換基は、式Ｉに従う化合物の結合定数に影響を及ぼす、またはそれを調節するように選択し、用いることができる。電子吸引基は低減した結合定数をもたらすと考えられ、一方で電子供与基は一般に結果としてカルシウムイオンのより強い結合をもたらすであろう。
【００３５】
好ましくは、式Ｉの化合物への置換基は結果として７．０以下のｌｏｇ  ｋとして与えられた結合定数をもたらすように選択され、４．０〜７．０、４．５〜６．５、または５．０〜６．０のｌｏｇ  ｋとして与えられた結合定数をもたらすように選択されるのも好ましい。
【００３６】
本発明に従う方法を実施するために２種類以上の式Ｉに従う化合物を組み合わせることは、十分に可能である可能性がある。好ましい態様において、単一の式Ｉに従う化合物が用いられる。
【００３７】
本発明に従う方法は逆滴定に基づいており、すなわちまずカルシウムイオンを式Ｉの化合物に結合させ、その後放出させる。式Ｉに従う化合物からのカルシウムイオンの放出は、式Ｉに従う化合物よりも強くカルシウムイオンに結合するキレート剤の使用により最も容易に達成される。好ましい態様において、本明細書において上記で開示した方法の工程ｂ）においてカルシウムイオンの放出のために用いられるキレート剤は、カルシウム検出の方法において用いられる式Ｉの化合物と比較した場合に１０倍高い結合定数を有する。
【００３８】
例えば、５．０のｌｏｇ  ｋを有する式Ｉに従うカルシウム結合化合物を６．０のｌｏｇ  ｋを有するキレート剤と組み合わせることは可能であるが、少なくとも７．０以上のｌｏｇ  ｋを有するキレート剤を用いるのが好ましい。当業者には明らかであるように、式Ｉに従う化合物からカルシウムイオンを放出させるために用いられる試薬は、目的のスペクトル特性に、例えば式Ｉに従う化合物の吸収または発光スペクトルに干渉しないスペクトル特性を有するように選択されるのが最もよい。
【００３９】
好ましくは、本明細書で開示するような方法において式Ｉに従う化合物からのカルシウムの放出のために用いられる試薬／キレート剤は、以下のものから選択される：二、三、四酢酸誘導体、ポリホスホン酸類またはリン酸誘導体、４，４’−ジフルオロ−ＢＡＰＴＡ、５，５’−ジブロモ−ＢＡＰＴＡ、５，５’−ジフルオロ−ＢＡＰＴＡ、５−メチル−５’−ホルミル−ＢＡＰＴＡ、５，５’−ジメチル−ＢＡＰＴＡ、（１，２−シクロヘキシレンジニトリロ）四酢酸（ＣＥＴＡ）、クエン酸、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸（＝ＨＥＤＴＡ；ＣＡＳ  １５０−３９−０、ｌｏｇ  ｋ  ＝  ８．１４）、ＣｙＤＴＡ（＝ＣＡＳ  １２５５７２−９５−４、ｌｏｇ  ｋ  ＝  １２．５０）、ＴＴＨＡ（＝ＣＡＳ  ８６９−５２−３、ｌｏｇ  ｋ  ＝  １０．０６）、Ｍｅ−ＥＤＴＡ（＝ｌ，２−プロパンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、ｌｏｇ  ｋ  ＝  １０．４）、ＢＡＰＴＡ（＝ＣＡＳ  ７３６３０−０８−７、ｌｏｇ  Ｋ  ６．９７）、ＤＴＰＡ（＝ジエチレントリアミノ五酢酸（Ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｔｒｉａｍｉｎｏｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）；ＣＡＳ−Ｎｒ．：６７−４３−６、ｌｏｇ  ｋ  ＝１０．８）、ＥＧＴＡ（＝エチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−四酢酸；ＣＡＳ−Ｎｒ．：６７−４２−５、ｌｏｇ  ｋ  ＝１０．９）、ＤＴＰＭＰ（＝ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）（Ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｔｒｉａｍｉｎｐｅｎｔａ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ  ａｃｉｄ））；ＣＡＳ−Ｎｒ．：１５８２７−６０−８、ｌｏｇ  ｋ  ＝１０．７）およびＥＤＰＭＰ（＝エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）（Ｅｔｈｙｌｅｎｄｉａｍｉｎｔｅｔｒａ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ  ａｃｉｄ））；ＣＡＳ−Ｎｒ．：１４２９−５０−１，  ｌｏｇ  ｋ  ＝１０．２）。
【００４０】
本発明に従う方法は、カルシウムイオンの放出がＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＧＴＡ、ＤＴＰＭＰおよび／またはＥＤＰＭＰにより誘発されるように実施されるのも好ましい。
式Ｉに従う化合物からカルシウムイオンを放出させるために用いられるキレート剤の選択は、式Ｉの化合物に結合したカルシウムイオンがそのようなキレート剤の添加後に放出されるのであれば、重要ではない。最終反応混合物中のそのキレート剤の濃度は、好ましくは少なくとも等モル濃度であるがこの混合物中の式Ｉに従う化合物の濃度の１００倍よりは高くないであろう。例えばピペット操作における微量の誤差を埋め合わせることにより、十分に余裕を持つため、過剰量のキレート剤を用いてよい。１態様において、本明細書で開示するような方法を実施する際、最終反応混合物中のそのキレート剤の濃度は式Ｉの化合物に関する終濃度よりも例えば１．５倍〜５０倍高く、または２倍〜１０倍高いのも好ましい。
【００４１】
カルシウムイオンの測定のための日常的な臨床化学において用いられる試薬は、輸送および長期保管条件下で安定であるべきである。式Ｉに従う化合物は、酸性または中性ｐＨでは、それがアルカリ性緩衝条件下にある場合ほど安定ではないことが分かっている。式Ｉに従う化合物を含む試薬組成物は少なくとも８．５のｐＨを有するべきであり、またはそのｐＨはより高いべきである。好ましい態様において、本発明は、ｐＨ８．５からｐＨ１１．５の範囲のｐＨを有し、請求項１で定めたような式Ｉの化合物を含有する、カルシウムイオンの測定のための試薬を開示する。
【００４２】
代わりの好ましい態様において、本発明に従う試薬はｐＨ８．５からｐＨ１１．０まで、またはｐＨ９．０からｐＨ１０．５の範囲のｐＨを有する。
８．５および／またはより高いｐＨの溶液を緩衝するのに適した緩衝系は、当業者には周知である。好ましくは、そのような緩衝系はＡＭＰＤ（＝２−アミノ−２−メチル−１．３−プロパンジオール）、ＣＨＥＳ（＝２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）−エタンスルホン酸）、ＡＭＰＳＯ（＝３−［ジメチル（ヒドロキシルメチル）−メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＣＡＰＳＯ（＝３−シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸）、ＣＡＰＳ（＝３−シクロヘキシルアミノ）−２−プロパンスルホン酸）、グリシン緩衝系、または炭酸緩衝系から選択されるであろう。本発明に従うカルシウムイオンの測定のための試薬がＣＡＰＳまたはＣＡＰＳＯから選択される緩衝系を含むのも好ましいであろう。
【００４３】
上記でさらに言及したように、循環中のカルシウム濃度はきつく制御されており、生理的濃度は通常は２．２０〜２．５５ｍｍｏｌ／Ｌである。循環中のカルシウムイオンの高いレベルは、非常に稀に４ｍｍｏｌ／Ｌを上回る。この理由のため、循環中のカルシウムイオンを測定するのに適合された試薬は通常は５ｍｍｏｌ／Ｌまでの測定範囲をカバーするように製造される。カルシウムの測定のための試薬は、生理的に関係のある濃度と釣り合うべきである。しかし、尿中ではカルシウムの濃度は大きな程度まで異なり得る。これは、カルシウムの測定のためのアッセイが大きな測定範囲もカバーするべきであることを要求する。
【００４４】
好ましい態様において、カルシウムの測定のための試薬は０．１０ｍｍｏｌ／Ｌから５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲の濃度の式Ｉの化合物を含む。
当業者が理解しているであろうように、測定する試料を含むそのアッセイ混合物中の式Ｉの化合物の終濃度は、その試料中のカルシウムイオンの濃度と釣り合っていなければならない。１態様において、式Ｉに従う化合物の濃度は０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ〜２ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であろう。代わりの態様において、式Ｉに従う化合物の濃度は０．１、０．１２５、０．１５、または０．２から２．０、１．５または１ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であろう。この試薬は、さらなる希釈なしで用いられる測定する試料と混合することができる。
【００４５】
別の態様において、式Ｉの化合物に基づくカルシウムの測定のためのより濃縮された試薬が提供される。そのようなより濃縮された試薬は、試料の測定のために適宜希釈することができる。本発明に従う試薬の濃縮された形は、０．５から５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲の式Ｉに従う化合物を含むであろう。代わりの態様において、カルシウムイオンの検出のためのより濃縮された試薬中の式Ｉに従う化合物の濃度は、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１ｍｍｏｌ／Ｌから５０、４０、３０、２０、１５、または１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であろう。
【００４６】
さらなる好ましい態様において、本発明で開示するようなカルシウムの測定のための試薬は式Ｉに従う化合物を含み、ここでＲ１は水素またはハロゲンのどちらかである。
さらなる好ましい態様において、本発明で開示するようなカルシウムの測定のための試薬は式Ｉに従う化合物を含み、ここでＲ２は水素、ハロゲン、カルボキシ、モルホリノまたはアルキルである。
【００４７】
さらなる好ましい態様において、本発明で開示するようなカルシウムの測定のための試薬は式Ｉに従う化合物を含み、ここで式ＩのＲ３は水素、ハロゲン、カルボキシまたはアルキルである。
【００４８】
カルシウムイオンの測定のための試薬に界面活性剤を添加することも好都合であることが分かっており、これは干渉する非特異的結合の低減、泡および気泡の低減、または他のプラスの影響によるものである可能性がある。さらなる好ましい態様において、本発明は、ｐＨ８．５からｐＨ１１．５の範囲のｐＨを有し、請求項１で定めたような式Ｉの化合物および界面活性剤を含有する、カルシウムイオンの測定のための試薬に関する。
【００４９】
本明細書で用いられる際、用語“界面活性剤”はイオン性または非イオン性界面活性剤を意味する。界面活性剤の例には以下のものが含まれるが、それらに限定されない：ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、脂肪酸塩類、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）ファミリー、オクチルグリコシド（ｏｃｔｙｌ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチル−アンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、ナトリウムドデシルマルトシド（ＤＭ）、ラウリルジエチルアミンオキシド（ｌａｕｒｙｌｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ  ｏｘｉｄｅ）（ＬＤＡＯ）、ＮＰ−４０およびＴｗｅｅｎ（登録商標）ファミリー、第一級アミン類、アミンアセテート類および塩酸塩類、第四級アンモニウム塩類、トリメチルエチルアンモニウムブロミド、置換されたジアミン類のアミド類、ジエタノールアミノプロピルアミン（ｄｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ）またはジエチルアミノプロピルアミド（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌａｍｉｄｅ）、環化されたジエチレントリアミンのアミド類、アルキルアリールスルホネート類、石油スルホネート類、スルホン化グリセリド類、コラミド類（ｃｈｏｌａｍｉｄｅｓ）、スルホベタイン類、アルキルグリコシド類、サポニン類、アルキル−ポリエチレングリコールエーテル類。
【００５０】
１態様において、その界面活性剤は非イオン性界面活性剤である。非イオン性界面活性剤の限定的でない例は、Ｉｍｂｅｎｔｉｎ  Ｖ４１３／９１、Ｔｈｅｓｉｔ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、Ｂｒｉｊ（登録商標）５８、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０、オクチルβグルコシドおよびＭＥＧＡ  ８−オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミドである。１態様において、その非イオン性界面活性剤は、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、およびＮｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０から選択される。
【００５１】
上記でさらに言及したように、カルシウムイオンの濃度は臨床の日常的な診断において重要なパラメーターである。カルシウムの測定のための試薬は、好ましくは、現在用いられている化合物またはこの発明において記述した式Ｉに従う化合物のようなカルシウム指示薬を含有する少なくとも１種類の試薬を含むキットの形で組み立てられる。さらなる好ましい態様において、本発明はカルシウムの測定のための検査キットに関し、その検査キットは式Ｉに従う化合物を含みｐＨ８．５からｐＨ１１．５の範囲のｐＨを有する試薬を含有する。
【００５２】
多くの場合において、カルシウムイオンを測定するように仕立てられたキットの中に少なくとも２種類の試薬を含ませるのが好都合であると考えられ、第１の試薬は式Ｉに従う化合物を含みｐＨ８．５からｐＨ１１．５．０の範囲のｐＨを有し、第２の試薬はキレート剤を含む。さらなる好ましい態様において、本発明は、式Ｉに従う化合物を含みｐＨ８．５からｐＨ１１．５．０の範囲のｐＨを有する第１の試薬およびカルシウムイオンのためのキレート剤を含む第２の試薬を含有するキットに関する。そのキットは場合により添付文書および／または１種類以上の追加の試薬も含んでいてよい。
【００５３】
以下の実施例および図は本発明の理解を助けるために提供されており、その真の範囲は添付された特許請求の範囲において述べられている。本発明の精神から逸脱することなく述べられた手順において修正を行うことができることは理解されている。
【００５４】
図の説明
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】ＭＮ−ＢＡＰＴＡの合成を図１において図式的に示す。
【図２】実施例２の最後の段で示す手順に従う、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ドイツ）のＭｏｄｕｌａｒ  Ｐ分析器上でのカルシウムイオンの測定。上部（Ａ）において、理論値および実際に測定された値を互いに対してプロットする。下部（Ｂ）において、％回収率を示し、すなわち実際に測定された値を期待（理論）値の百分率として示す。
【図３】実施例２の中央の段で示す手順に従う、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ドイツ）のｃｏｂａｓ  ｃ５０１分析器上でのカルシウムイオンの測定。上部（Ａ）において、理論値および実際に測定された値を互いに対してプロットする。下部（Ｂ）において、％回収率を示し、すなわち実際に測定された値を期待（理論）値の百分率として示す。
【図４】実施例２の最後の段で示す手順に従う、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ドイツ）のＭｏｄｕｌａｒ  Ｐ分析器上でのカルシウムイオンの測定。ＭＮ−ＢＡＰＴＡの濃度を標準濃度の９０％まで低減させた。上部（Ａ）において、理論値および実際に測定された値を互いに対してプロットする。下部（Ｂ）において、％回収率を示し、すなわち実際に測定された値を期待（理論）値の百分率として示す。
【図５】実施例２の最後の段で示す手順に従う、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ドイツ）のＭｏｄｕｌａｒ  Ｐ分析器上でのカルシウムイオンの測定。ＭＮ−ＢＡＰＴＡの濃度を標準濃度の８０％まで低減させた。上部（Ａ）において、理論値および実際に測定された値を互いに対してプロットする。下部（Ｂ）において、％回収率を示し、すなわち実際に測定された値を期待（理論）値の百分率として示す。
【図６】ＮＦ−ＢＡＰＴＡの合成を図６において図式的に示す。
【図７】ＭＮ−ＢＡＰＴＡおよびＮＦ−ＢＡＰＴＡそれぞれに関する吸収スペクトルを、それぞれカルシウムイオンの存在下および非存在下の両方で示す。４つのスペクトルについての一覧（ｋｅｙ）をその図の下に示す。
【実施例】
【００５６】
実施例１
ＭＮ−ＢＡＰＴＡの合成
ＭＮ−ＢＡＰＴＡの合成を図１において図式的に示す。
【００５７】
ａ）１−（２−クロロ−エトキシ）−２−ニトロ−ベンゼン
２−ニトロ−フェノール（１６８，７ｇ）およびトルエン−４−スルホン酸２−クロロエチルエステル（１００ｇ）を５００ｍｌのＤＭＦ中で溶解させ、１９９ｇの炭酸カリウムを注意深く添加した後１１０〜１２０℃で１時間攪拌した。その反応混合物を砕いた氷および水の混合物（８  ｌ）中に注ぎ、それを強く攪拌した。残留物を濾過して分離し、水で数回洗浄し、乾燥させた。
【００５８】
収量：１００〜１２０ｇ
ｂ）４−メチル−１−ニトロ−２−（２−（２−ニトロ−フェノキシ）−エトキシ）−ベンゼン
１−（２−クロロ−エトキシ）−２−ニトロ−ベンゼン（１１６ｇ）および５−メチル−２−ニトロ−フェノール（８８ｇ）を５００ｍｌのＤＭＦ中で溶解させ、１６０ｇの炭酸カリウムを注意深く添加した後９０〜１１０℃で４時間攪拌した。その反応混合物を砕いた氷および水の混合物（８  ｌ）中に注ぎ、それを強く攪拌した。残留物を濾過して分離し、水で数回洗浄し、乾燥させた。その粗生成物をメタノール中で懸濁し、淡黄色の残留物を再度濾過して分離し、メタノールで洗浄し、乾燥させた。
【００５９】
収量：１５０〜１６５ｇ
ｃ）２−（２−（２−アミノ−フェノキシ）−エトキシ）−４−メチル−フェニルアミン
１００ｇの４−メチル−１−ニトロ−２−（２−（２−ニトロ−フェノキシ）−エトキシ）−ベンゼンおよび１０ｇの木炭上パラジウムを３，５  ｌのジオキサン中で懸濁し、室温で５，５ｂａｒの水素圧の下で水素化した。窒素で３回フラッシュした後、窒素雰囲気下で触媒を濾過して除き、残った溶液を蒸発させ、生成物を真空下で乾燥させた。
【００６０】
収量：８０ｇ
ｄ）（（２−（２−（２−（ビス−メトキシカルボニルメチル−アミノ）−フェノキシ）−エトキシ）−４−メチル−フェニル）−メトキシカルボニルメチル−アミノ）−酢酸メチルエステル
２−（２−（２−アミノ−フェノキシ）−エトキシ）−４−メチル−フェニルアミン（８０ｇ）を２，５  ｌのＤＭＦ中で溶解させ、２８５ｍｌのブロモ酢酸メチルエステル、４２９ｇの炭酸カリウム、および３６，８ｇのヨウ化ナトリウムを添加した。その反応混合物を８０℃まで２時間加熱した。蒸発後、残ったブロモ酢酸メチルエステルをヘキサンを用いて生成物から除去した。その粗生成物をメタノール中での結晶化によりさらに精製した。
【００６１】
収量：９３ｇ
ｅ）（（２−（２−（２−（ビス−メトキシカルボニルメチル−アミノ）−５−ニトロ−フェノキシ）−エトキシ）−４−メチル−フェニル）−メトキシカルボニルメチル−アミノ）−酢酸メチルエステル
５０ｇの（（２−（２−（２−（ビス−メトキシカルボニルメチル−アミノ）−フェノキシ）−エトキシ）−４−メチル−フェニル）−メトキシカルボニルメチル−アミノ）−酢酸メチルエステルを６００ｍｌの氷酢酸中で溶解させた。強い攪拌の下で９１，５ｍｌの氷酢酸中１モル濃度の硝酸を添加し、第２工程において２８ｍｌの濃硫酸を添加した。温度を３０℃まで上昇させた。その反応混合物を１０  ｌの氷／水混合物の中に直接注いだ。その残留物を濾過して分離し、水で水回洗浄し、真空下で乾燥させた。その粗生成物をさらに、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより、まずヘキサン／酢酸エチルエステル（１：１）を溶離液として用いて、２回目にトルエン／アセトニトリル（１：１）を溶離液として用いて精製した。その生成物を最後にプロパン−２−オールから結晶化した。
【００６２】
収量：２０ｇ
ｆ）ＮＭ−ＢＡＰＴＡ；（（２−（２−（２−（ビス−カルボキシメチル−アミノ）−５−ニトロ−フェノキシ）−エトキシ）−４−メチル−フェニル）−カルボキシメチル−アミノ）−酢酸のカリウム塩
９，５ｇの（（２−（２−（２−（ビス−メトキシカルボニルメチル−アミノ）−５−ニトロ−フェノキシ）−エトキシ）−４−メチル−フェニル）−メトキシカルボニルメチル−アミノ）−酢酸メチルエステルを、水／メタノールの混合物（それぞれ２３０ｍｌ）中で溶解させ、１６０ｍｌの１モル濃度の水酸化カリウム溶液を添加した。その反応混合物を１時間還流させた。冷却して室温まで下げて２５０ｍｌの水を添加した後、その溶液のｐＨをｐＨ３に調節し、メタノールを蒸発させた。その生成物を、酸性酸エチルエステルを用いた溶媒抽出により単離した。蒸発後、その生成物を真空下で乾燥させた。
【００６３】
その（（２−（２−（２−（ビス−カルボキシメチル−アミノ）−５−ニトロ−フェノキシ）−エトキシ）−４−メチル−フェニル）−カルボキシメチル−アミノ）−酢酸をメタノール中で溶解させ、等モルのメタノール中水酸化カリウムを添加した。蒸発および乾燥の後、その適切なカリウム塩を単離することができた。
【００６４】
収量：９ｇ
実施例２
ＮＭ−ＢＡＰＴＡを用いるカルシウムイオンの測定に関する一般的な手順
式Ｉに従うモノ−ニトロ−ＢＡＰＴＡ型化合物を用いるカルシウムイオンの測定を、逆滴定法で実施した。
【００６５】
目的の試料の分割量をモノ−ニトロ−ＢＡＰＴＡ型化合物を含む溶液と混合し、インキュベートした。Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ドイツ）の自動分析器上で、この試薬はＲ１と呼ばれる。安定したベースラインシグナルが得られるまでインキュベーションを実施した。通常は１０未満で安定したベースラインシグナルが得られ、ほとんどは２〜５分以内に得られる。
【００６６】
次いで試料およびＲ１（場合により、例えば蒸留水で希釈される）の混合物を分析し、すなわち最も適切な波長（単数または複数）における吸光度の値を、またはスペクトルを測定する。
【００６７】
次いで式Ｉに従う化合物に結合したカルシウムイオンを、放出剤、例えばＥＤＴＡの添加により放出させる。この第２の試薬はＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ドイツ）の自動分析器上でＲ２と呼ばれる。必要な場合、その混合物を蒸留水でさらに希釈することができる。
【００６８】
次いで試料の最後の混合物、Ｒ１およびＲ２（場合により、例えば蒸留水で希釈される）を分析し、すなわち最も適切な波長（単数または複数）における吸光度の値を、またはスペクトルを測定する。
【００６９】
吸光度の変化は目的の試料中のカルシウムイオンの濃度に直接相関しており、そのカルシウムイオンの濃度は標準的な手順に従って計算される。
表Ｉにおいて、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ドイツ）の５種類の異なる自動分析器上でのカルシウムイオンの測定に推奨される適用に関する概観を示す。Ｍｏｄｕｌａｒ  ＰおよびＭｏｄｕｌａｒ  Ｄ分析器に関する推奨される適用は同じである。
【００７０】
【表１】
0005631480.tif 000003
【００７１】
【表２】
0005631480.tif 000004
【００７２】
実施例３
ＮＭ−ＢＡＰＴＡを用いるカルシウム測定の線形性
本発明で開示するカルシウムイオンの測定のための方法は技術的に優れており、例えばそれは非常に高い精度を示す。これは例えば理論的に予想された値および実際に測定された値を比較した場合に明らかになる。
【００７３】
カルシウムイオンの異なる濃度（→理論値）を、新規の方法で実際に測定された値と比較する。
２種類の異なる分析器であるＭｏｄｕｌａｒ  Ｐおよびｃｏｂａｓ  ｃ５０１（共にＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓにより供給されている）上でそれぞれ測定した値による２つのみの代表的な実施例を、図２および３として示す。これらの２つの図は、その測定の顕著な技術的質／精度を実証している。図２および３から明らかであるように、実際に測定された全ての値は対応する予想された理論値の９５〜１０５％の範囲内にあり、それは調べた全濃度範囲にわたるカルシウムイオンの相当に正確な測定へと変換される。
【００７４】
実施例４
ＮＭ−ＢＡＰＴＡの最小濃度の決定
循環中のカルシウムイオンの濃度はごく稀に４ｍｍｏｌ／Ｌを超える。５ｍｍｏｌ／Ｌまでのカルシウムを信頼できる方法で測定することができる試薬は、循環中のカルシウムイオンを決定するのに最も適しているはずである。
【００７５】
様々な濃度のカルシウムイオン（図４および５において予想された値）を、Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｐ機器上で、表１の最後の段において記述した適用により測定した。しかし、正規の濃度のそれぞれ９０％または８０％のＮＭ−ＢＡＰＴＡしか用いなかった。それぞれ図４および５から分かるように、たとえ検出混合物中に実施例２で示した標準的な手順と比較して８０％のＮＭ−ＢＡＰＴＡしか存在していなくても、５ｍｍｏｌ／Ｌまでのカルシウムイオンはなお９５〜１０５％で回収される（ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ）。図５から明らかであるように、ＮＭ−ＢＡＰＴＡの濃度を８０％まで低減させた場合、５ｍＭより上の値は低すぎる値で回収される傾向がある。これは、一部の病的試料中に存在するようなカルシウムの高い濃度の測定のためには（そのような試料が上記の実施例におけるように約１：７０で希釈される場合）、それらの試料中のカルシウムイオンの正確な測定を保証するために、ＮＭ−ＢＡＰＴＡの終濃度は約０．２ｍｍｏｌ／Ｌであるべきであることを意味する。
【００７６】
実施例５
ＮＭ−ＢＡＰＴＡのｐＨに依存する安定性
カルシウムの測定のための試薬は、輸送条件下および分析器のボードの上の両方で可能な限り安定であるべきである。
【００７７】
その安定性を調べるため、ＮＭ−ＢＡＰＴＡを異なるｐＨの値で保管した。短期ストレスモデルを適用し、ＮＭ−ＢＡＰＴＡを含有する試薬を３５℃で保管した。その“ストレスをかけた”試薬を、同じ試料の分割量を用いたその他の点では同じ条件の下でのカルシウムイオンの測定において用いた。その試薬にストレスをかけた後に測定した値を、０日目（すなわちその試薬への温度ストレスが開始された日）におけるストレスをかけていない試薬を用いて測定した値と比較した。
【００７８】
用いた緩衝系は、それぞれｐＨ７．４における１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０における５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ１０．０における５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．８における５０ｍｍｏｌ／Ｌグリシン、およびｐＨ１０における４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣＡＰＳＯであった。対応するデータを表３〜７において要約する。
【００７９】
【表３】
0005631480.tif 000005
【００８０】
表３から明らかであるように、ＮＭ−ＢＡＰＴＡを含有する試薬はｐＨ７．４では安定ではない。カルシウムイオンの回収率は８０％以下の範囲内にのみある。
表４：
３５℃における５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＲＩＳ  ｐＨ８．０中でのＮＭ−ＢＡＰＴＡの安定性
表４から明らかであるように、ＮＭ−ＢＡＰＴＡを含有する試薬は、ｐＨ８．０においてきわどいがまだ許容可能な安定性を有する。カルシウムイオンの回収率は大部分が８０％〜９０％の範囲内である。
【００８１】
【表４】
0005631480.tif 000006
【００８２】
【表５】
0005631480.tif 000007
【００８３】
【表６】
0005631480.tif 000008
【００８４】
【表７】
0005631480.tif 000009
【００８５】
表５〜７から明らかであるように、本出願で開示した試薬はｐＨ約１０で優れた安定性を有する。そのような試薬に３５℃で１週間ストレスをかけた後のカルシウムイオンの回収率は優れており、全体として（ｂｙ  ｌａｒｇｅ）９０％〜１１０％の望ましい範囲内であり、ほとんどが９５％〜１０５％でさえあった。この高い安定性は、用いられる緩衝系に関わらず達成することができる。
【００８６】
実施例６
ＮＭ−ＢＡＰＴＡを用いるカルシウムの測定にはマグネシウムによる干渉がない
カルシウムイオンを２．５３ｍｍｏｌ／Ｌの生理的濃度で含む試料に、０〜１５ｍｍｏｌ／Ｌのマグネシウムイオンを加えた（ｓｐｉｋｅｄ）。その加えた試料を、Ｒｏｃｈｅ／Ｈｉｔａｃｈｉ  ９１７分析器上で、実施例２においてＭｏｄｕｌａｒ  Ｐに関して示したような適用で測定した。３回の決定の結果の中央値を下記の表８において示す。
【００８７】
【表８】
0005631480.tif 000010
【００８８】
表８で示した回収率の値から明らかであるように、上記の実験において、マグネシウムイオンはカルシウムイオンの測定に干渉しない。
実施例７
ＮＭ−ＢＡＰＴＡを用いるカルシウムの測定にはガドリニウムによる干渉がない
カルシウムイオンを約２，３５ｍｍｏｌ／Ｌの生理的濃度で含む１つの試料および約３．４０ｍｍｏｌ／Ｌの高いレベルのカルシウムイオンを含む１つの試料に、異なるレベルのＯｍｎｉｓｃａｎ（登録商標）を加えた（Ｃ１：１４μＬを９８６μＬに添加、Ｃ２：２，８を９９７μＬに添加）。Ｏｍｎｉｓｃａｎ（登録商標）は頻繁に用いられるガドリニウムを含む造影剤である。その加えた試料を、Ｈｉｔａｃｈｉ  ９１７分析器上で、実施例２においてＭｏｄｕｌａｒ  Ｐに関して示したような適用で測定した。３回の決定の結果の中央値を下記の表９において示す。
【００８９】
【表９】
0005631480.tif 000011
【００９０】
表９で示した回収率の値から明らかであるように、測定された全ての値は十分に９５〜１０５％の回収率の範囲であったため、上記の実験においてガドリニウムイオンはカルシウムイオンの測定に干渉しない。
【００９１】
実施例８
ＮＦ−ＢＡＰＴＡの合成
ＮＦ−ＢＡＰＴＡの合成を図６において図式的に示す。
【００９２】
ａ）  １−（２−クロロ−エトキシ）−２−ニトロ−ベンゼン
実施例１参照
ｂ）４−フルオロ−１−ニトロ−２−（２−（２−ニトロ−フェノキシ）−エトキシ）−ベンゼン
１−（２−クロロ−エトキシ）−２−ニトロ−ベンゼン（１０ｇ）および５−フルオロ−２−ニトロ−フェノール（７，８６ｇ）を５０ｍｌのＤＭＦ中で溶解させ、１３，８２ｇの炭酸カリウムを注意深く添加した後９０〜１１０℃で１９時間攪拌した。その反応混合物を砕いた氷および水の混合物（５００ｍｌ）中に注ぎ、それを強く攪拌した。残留物を濾過して分離し、水で数回洗浄し、乾燥させた。その粗生成物をメタノール中で懸濁し、淡黄色の残留物を再度濾過して分離し、メタノールで洗浄し、乾燥させた。
【００９３】
収量：９，５ｇ。
ｃ）２−（２−（２−アミノ−フェノキシ）−エトキシ）−４−フルオロ−フェニルアミン
９，４８ｇの４−フルオロ−１−ニトロ−２−（２−（２−ニトロ−フェノキシ）−エトキシ）−ベンゼンおよび１，５ｇの木炭上パラジウムを５００ｍｌのジオキサンおよび６０ｍｌの氷酢酸中で懸濁し、室温で水素化した。窒素で３回フラッシュした後、窒素雰囲気下で触媒を濾過して除き、残った溶液を蒸発させ、生成物を真空下で乾燥させた。
【００９４】
収量：７，５２ｇ
ｄ）（（２−（２−（２−（ビス−メトキシカルボニルメチル−アミノ）−フェノキシ）−エトキシ）−４−フルオロ−フェニル）−メトキシカルボニルメチル−アミノ）−酢酸メチルエステル
２−（２−（２−アミノ−フェノキシ）−エトキシ）−４−フルオロ−フェニルアミン（７，５２ｇ）を２５０ｍｌのＤＭＦ中で溶解させ、３８，４ｍｌのブロモ酢酸メチルエステル、５６ｇの炭酸カリウム、および２，１３ｇのヨウ化ナトリウムを添加した。その反応混合物を８０℃まで２１時間加熱した。蒸発後、残ったブロモ酢酸メチルエステルをヘキサンを用いて生成物から除去した。その粗生成物をメタノール中での結晶化によりさらに精製した。
【００９５】
収量：４，１４ｇ
ｅ）（（２−（２−（２−（ビス−メトキシカルボニルメチル−アミノ）−５−ニトロ−フェノキシ）−エトキシ）−４−フルオロ−フェニル）−メトキシカルボニルメチル−アミノ）−酢酸メチルエステル
２，５ｇの（（２−（２−（２−（ビス−メトキシカルボニルメチル−アミノ）−フェノキシ）−エトキシ）−４−フルオロ−フェニル）−メトキシカルボニルメチル−アミノ）−酢酸メチルエステルを、３０ｍｌの氷酢酸中で溶解させた。強い攪拌の下で４，５４ｍｌの氷酢酸中１モル濃度の硝酸を添加し、第２工程において１１，３５ｍｌの濃硫酸を添加した。温度を３０℃まで上昇させた。その反応混合物を２５０ｍｌの氷／水混合物の中に直接注いだ。その残留物を濾過して分離し、水で水回洗浄し、真空下で乾燥させた。その粗生成物をさらに、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより、まずヘキサン／酢酸エチルエステル（１：１）を溶離液として用いて、２回目にトルエン／アセトニトリル（１：１）を溶離液として用いて精製した。収量：０，８２ｇ
ｆ）ＮＭ−ＢＡＰＴＡ；（（２−（２−（２−（ビス−カルボキシメチル−アミノ）−５−ニトロ−フェノキシ）−エトキシ）−４−フルオロ−フェニル）−カルボキシメチル−アミノ）−酢酸のカリウム塩
０，８２ｇの（（２−（２−（２−（ビス−メトキシカルボニルメチル−アミノ）−５−ニトロ−フェノキシ）−エトキシ）−４−ｍフルオロ−フェニル）−メトキシカルボニルメチル−アミノ）−酢酸メチルエステル（((2-(2-(2-(Bis-methoxycarbonylmethyl-amino)-5-nitro-phenoxy)-ethoxy)-4-mfluoro-phenyl)-methoxycabonylmethyl-amino)-acetic acid methyl ester）を、水／メタノールの混合物（それぞれ２０ｍｌ）中で溶解させ、１３，７７ｍｌの１モル濃度の水酸化カリウム溶液を添加した。その反応混合物を１時間還流させた。冷却して室温まで下げて２５０ｍｌの水を添加した後、その溶液のｐＨをｐＨ３に調節し、メタノールを蒸発させた。その生成物を、酸性酸エチルエステルを用いた溶媒抽出により単離した。蒸発後、その生成物を真空下で乾燥させた。
【００９６】
その（（２−（２−（２−（ビス−カルボキシメチル−アミノ）−５−ニトロ−フェノキシ）−エトキシ）−４−フルオロ−フェニル）−カルボキシメチル−アミノ）−酢酸をメタノール中で溶解させ、等モルのメタノール中水酸化カリウムを添加した。蒸発および乾燥の後、その適切なカリウム塩を単離することができた。
【００９７】
収量：０，７５ｇ
実施例９
カルシウムイオンのＮＦ−ＢＡＰＴＡへの結合
カルシウムイオンの存在下および非存在下でのＮＦ−ＢＡＰＴＡの吸光度特性を、Ｕｖｉｋｏｎ  ９３０光度計を用いて分析した。吸収スペクトルを、０．１５ｍｍｏｌ／ＬのＭＮ−ＢＡＰＴＡまたはＮＦ−ＢＡＰＴＡそれぞれに関して、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣＡＰＳＯ（ｐＨ  ７における）、０．９％  ＮａＣｌおよび０．０１％  Ｂｒｉｊ−３５中で、それぞれ０．０９ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｃａ２＋の非存在下または存在下のどちらかで得た。
【００９８】
図７に示すように、ＭＮ−ＢＡＰＴＡまたはＮＦ−ＢＡＰＴＡそれぞれに関する吸収スペクトルは非常によく似ており、これはこれらの化合物の両方、すなわち一般に式Ｉに従う化合物を、カルシウムイオンの測定において用いることができることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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