(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコールおよびオリゴヌクレオチドを含む接合体または化合物であって、
少なくとも一つのポリエチレングリコールが、前記オリゴヌクレオチドの5′末端に連結されており、かつ、少なくとも一つのポリエチレングリコールが、前記オリゴヌクレオチドの3′末端に連結されており、
前記オリゴヌクレオチドの5′-末端および3′-末端にそれぞれ連結されるポリエチレングリコールの分子量は異なり、
前記オリゴヌクレオチドの5′末端に連結されるポリエチレングリコールの分子量が、200、400、600、800、1000、1500、2000、5000、20000または50000 Daであり、かつ前記オリゴヌクレオチドの3′末端に連結されるポリエチレングリコールの分子量が、200、400、600、800、1000、1500、2000、5000、20000または50000 Daである、
前記接合体または化合物。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドの5′末端に連結されるポリエチレングリコールが、前記オリゴヌクレオチドの3′末端に連結されるポリエチレングリコールの、1.5倍から100倍の分子量を有するか、または、前記オリゴヌクレオチドの3′末端に連結されるポリエチレングリコールが、前記オリゴヌクレオチドの5′末端に連結されるポリエチレングリコールの、1.5倍から100倍の分子量を有する、請求項１に記載の接合体または化合物。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、スピーゲルマー、shRNA、miRNA、RNAi、および／またはCpG-オリゴヌクレオチドである、請求項１又は２に記載の接合体または化合物。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドが、細胞において生理学的および／または生化学的作用に否定的な影響を及ぼす分子のmRNAとハイブリダイズするか、または、該分子の受容体のmRNAとハイブリダイズする、請求項１から３の何れか１項に記載の接合体または化合物。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドが、TGF-ベータ1、TGF-ベータ2、TGF-ベータ3、VEGF、IL-10、c-jun、c-fos、c-erbb2（Her-2）、MIA、および／または、その受容体の、ｍRNAとハイブリダイズし、かつ、配列番号1（ヌクレオチド配列：CGGCATGTCTATTTTGTA）、および／または配列番号28（ヌクレオチド配列：CTGATGTGTTGAAGAACA）である、請求項１から４の何れか１項に記載の接合体または化合物。
【請求項６】
一つより多いオリゴヌクレオチドを含む、請求項１から５の何れか１項に記載の接合体または化合物。
【請求項７】
少なくとも一つのリンカーおよび／またはスペーサーを含む、請求項１から６の何れか１項に記載の接合体または化合物。
【請求項８】
前記リンカーが、ゼロ長リンカー、ホモ二官能基リンカー、および／またはヘテロ二官能基リンカーである、請求項７に記載の接合体または化合物。
【請求項９】
請求項１から８の何れか１項に記載の接合体または化合物を生産する方法であって、下記の工程：
a)オリゴヌクレオチドを単離または合成すること、
b)該オリゴヌクレオチドの5′末端または3′末端、および／または、該オリゴヌクレオチドのリン酸基、糖成分、および／または塩基を保護すること、
c)少なくとも一つのポリエチレングリコールを、該オリゴヌクレオチドの、未保護の3′末端または5′末端に連結すること、
を含む前記方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、工程：
d)保護された、前記オリゴヌクレオチドの5′末端または3′末端、および／または、該オリゴヌクレオチドのリン酸基、糖成分、および／または塩基を脱保護すること、
e)少なくとも一つのポリエチレングリコールを、該オリゴヌクレオチドの、脱保護された5′末端または3′末端、および／または、該オリゴヌクレオチドの脱保護されたリン酸基、糖成分、および／または塩基に連結すること、
をさらに含む前記方法。
【請求項１１】
請求項１から８の何れか１項に記載の接合体または化合物を含む医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の医薬組成物を生産する方法であって、前記接合体または化合物が、請求項９または１０の方法にしたがって生産され、かつ、当該接合体または化合物に薬学的に許容可能な担体を加える、方法。
【請求項１３】
疾患または障害をコントロール、予防、および／または治療に用いるための、請求項１から８の何れか１項に記載の接合体または化合物、または請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記疾患または障害が、癌、線維症、およびウィルス性疾患または障害の群から選ばれる、請求項１３に記載の接合体もしくは化合物または医薬組成物。
【請求項１５】
前記癌が、固体腫瘍、血液起源腫瘍、白血病、腫瘍転移、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、化膿性肉芽腫、乾癬、星状細胞腫、聴神経腫、芽細胞腫、ユーイング腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、グリオーマ、血管芽細胞腫、ホジキンリンパ腫、髄芽腫、白血病、中皮腫、神経芽細胞腫、神経線維腫、非ホジキンリンパ腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、肉腫、セミノーマ、トラコーマ、ウィルムス腫瘍から成る群から選ばれるか、または、胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、気管支原性癌、腎臓の癌、頸部癌、絨毛癌、嚢胞腺癌、胎生期癌、上皮癌、食道癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、胆嚢癌、胃癌、頭部癌、肝癌、肺癌、髄様癌、頸部癌、非小細胞気管支原性／肺癌、卵巣癌、すい臓癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、前立腺癌、小腸癌、前立腺上皮癌、直腸癌、腎細胞癌、皮膚癌、小細胞気管支原性／肺癌、扁平上皮細胞癌、皮脂腺癌、睾丸癌、および子宮癌から成る群から選ばれる、請求項１４に記載の接合体もしくは化合物または医薬組成物。
【請求項１６】
前記ウィルス性疾患または障害が、A型肝炎（HVA）、B型肝炎(HVB)、およびC型肝炎(HVC)から成る群から選ばれるか、または、単純ヘルペスウィルス（HSV）、HIV、FIV、ポリオウィルス、インフルエンザウィルス、アデノウィルス、パピローマウィルス、エプスタインバーウィルス、および痘瘡ウィルスからなる群から選択されるウイルスによって引き起こされる、請求項１５に記載の接合体もしくは化合物または医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチド・ポリマー接合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリマーは、主に非免疫原性で水溶性であるという理由で、生体材料、生物工学、および医学において広く使用されている（非特許文献1）。薬剤送達の分野では、免疫原性、タンパク質分解、腎クリアランスを下げるために、かつ、可溶性を高めるために、タンパクに対する共有的付着にポリマー誘導体が広く使用されている。同様に、可溶性を高め、毒性を下げ、かつ、生体分布を変えるために、ポリエチレングリコールが、低分子量の、比較的疎水性薬剤に対して結合されている。
【０００３】
ポリエチレングリコールは、細胞の取り込みを高めるために、種々の治療剤に対し担体として使用されるか、または、それらに共有的に連結される。治療剤にポリマーを連結するもう一つの目的は、分子量を増し、生体における半減期を延長することである。この連結の理由は、これらの接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）が、免疫原性の低下などの利点を示すことが記載されることにある（非特許文献2）。
【０００４】
特許文献1は、高分子量PEG-核酸接合体であって、送達アプタマー、および、治療的オリゴヌクレオチド配列、例えば、CpGオリゴヌクレオチド、siRNAオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアプタマーを含む前記接合体を記載する。この出願に記載される接合体は、10から80 kDaの分子量を持ち、治療的オリゴヌクレオチドを特異的細胞型に向けて標的することが意図される。
【０００５】
非特許文献3は、オリゴヌクレオチド接合体であって、オリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドの3′末端、5′末端、および／または内部位置に結合する多分散性PEGとを含み、該オリゴヌクレオチドがフォスフォルアミダイト化学によって合成される前記接合体を開示する。この接合体は、様々な数のPEG単位を含み、そのため、PEGの重合度は、3′末端結合では5から120の範囲、5′末端および内部結合では5から32の範囲を有する。
【０００６】
さらに特許文献2は、特に、iRNAであって、2′修飾リボース単位、および／または、フォスフォロチオエート結合を含むiRNA、例えば、2′ヒドロキシル基がPEGによって修飾されるiRNAを記載する。PEGの分子量は、明記されていない。
【０００７】
5′末端においてPEGによって接合されるアプタマーは、アトピー性疾患の治療、予防、および／または緩和に好適である。PEGの分子量は、20、30、40、および60 kDaから成る群から選ばれ、PEGは、アプタマーの3′-および／または5′-末端に結合する（特許文献3を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO 2005/111238 A2
【特許文献２】WO 2007/109097 A1
【特許文献３】WO 2006/096222 A2
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Zhao, 1997.
【非特許文献２】Chirila, 2001.
【非特許文献３】Jaeschke et al. (1994)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来技術において記載されるPEG接合体についてはいくつかの利点があるが、ポリマーが、治療剤の活性を高める可能性のある点については教示がない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
驚くべきことに、ある重量のポリマー、特に、低分子量ポリマー、または低および高分子量ポリマーの組み合わせに連結される、免疫刺激因子などのオリゴヌクレオチド、タンパク質、および／またはペプチドは、それらが比較的高い分子量を有するにも拘わらず、薬理学的利点ばかりでなく、活性の増大も示す。本発明の一態様は、少なくとも一つのポリマーに連結される、例えば、免疫刺激因子としてのオリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドである。
【００１２】
本発明の、もう一つの態様は、これらの化合物の合成、および、医薬組成物の調製のためのそれらの使用、および、この接合体または化合物による、癌、線維症、緑内障などの眼疾患、および／または、HIV、FIV、HVA、HVB、HVC、またはインフルエンザなどのウィルス感染症の治療法である。
【００１３】
少なくとも一つのポリマーと連結される、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチド（本発明の主旨（ｃｏｎｔｅｘｔ）では「接合体」または「化合物」とも呼ばれる）、特に、免疫刺激因子は、特に腎臓および肝臓において、例えば、毒性を低下させる可能性がある。この化合物は、さらなる利点、例えば、未接合オリゴヌクレオチドと比較して、リンパ球減少症の緩和、白血球減少症の緩和、血液凝固低下の再活性化、血小板減少症の緩和、免疫原性、抗原性の低下、循環半減期の延長、腎臓排泄の低下、器官取り込みの修飾、網内皮系器官における取り込みの低下、血漿タンパク結合の低下、または薬剤安定性の増加の少なくとも一種を示す場合がある。この接合体または化合物の、さらに別の利点として、例えば、血液凝固低下、補体活性の低下、特に、C5補体活性の低下、CH50濃度低下の回復、または、より高度の循環系およびZNS安全性、の内の少なくとも一つがある。
【００１４】
本接合体または化合物のさらに別の利点としては、例えば、細胞取り込みの上昇、核酸標的に対する親和性の強化、細胞内局在の変化、安全性の向上、効力の向上、または、ヌクレアーゼ存在下における安定性の増大、の少なくとも一つがある。
【００１５】
ポリマー、例えば、非免疫原性ポリマーによる、オリゴヌクレオチド、タンパク、またはペプチドの誘導体形成は、該オリゴヌクレオチド、タンパク、またはペプチドの薬物動態学的および薬力学的特性を変え、それによって該薬剤をより効果的な治療剤とする潜在能力を有する。特に、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドに連結されるポリエチレングリコールは、例えば、水性または有機性溶媒における可溶性の変化、免疫反応の修飾、溶液におけるオリゴヌクレオチドの安定性の増大、すなわち、例えば、エキソ、またはエンドヌクレアーゼに対する耐性の増大、タンパクまたはペプチドの安定性の増大、インビボおよびインビトロにおける物質の半減期の延長と、それによる細胞膜浸透の助長、薬理学的特性の変化、生体適合性の増大、または、表面に対する、オリゴヌクレオチド、タンパク、またはペプチド吸着の阻止、に好適である。
【００１６】
例えば、免疫刺激因子としてのオリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチド修飾体の、これらの有利な特性のために、それらは、種々の治療用途においてきわめて有用である。
【００１７】
特に、少なくとも二つのポリマーに連結されるオリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドは、有利な作用、例えば、半減期の延長、分解の低下、活性の増大などを示す。それによって、これらのポリマーは、ポリマーの分子量および／または種類において同一であるか、または異なる。好ましくは、ポリエチレングリコール（PEG）などの、二つ以上のポリマーと組み合わされる、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドは、特に、酵素安定性、例えば、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、またはプロテイナーゼ安定性の増加、および、細胞取り込みの向上によって、より長い半減期を示す。ポリマーの大きさおよび構造に応じて、例えば、ポリアルキレンオキシド、例えば、PEGの、高または低分子量(MW)を有するポリマーが、または、高および低分子量ポリマーの組み合わせがより有効である。
【００１８】
特に、ポリマー、例えば、ポリアルキレンオキシド、例えば、PEGは、分子サイズを増し、多くの場合分子電荷を変え、通常、受容体結合能を縮小するので、クリアランス速度の低下をもたらす。酵素の攻撃に対して感受性を有する、オリゴヌクレオチド、タンパク、またはペプチドのドメインを立体化学的に遮蔽することによって、ＰＥＧは分解され、生物学的に不活性化されるオリゴヌクレオチド、タンパク、またはペプチドの量を下げる。平行して、治療的オリゴヌクレオチド、タンパク、またはペプチドの免疫原性または抗原決定基を立体化学的に隠蔽することによって、ポリマー付着は、非免疫原性、および非抗原性接合体をもたらす。
【００１９】
下記の図面は、本発明をさらに十分に例示するためのものであるが、ただし、本発明は、図面に示される例証態様に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】種々の濃度の、免疫刺激因子である各ヌクレオチドとインキュベートした細胞培養体における免疫サプレッサーTGF-ベータ2の阻害を示す。ここでは免疫刺激因子である各ヌクレオチドは、5′-または3′-末端において一つのポリマーに連結されるか、または、一つは5′末端、一つは3′末端に連結される二つのポリマーに連結される。実験は例13の記載にしたがって実施された。図示の結果は、一つまたは二つのポリエチレングリコールに連結したフォスフォルアミダイトと比較した、配列番号1のフォスフォルチオエートのオリゴヌクレオチド（コントロール）を指す。垂直軸は、免疫サプレッサーTGF-ベータ2の抑制に対する阻害パーセント（pg/Mio細胞を未処置細胞の%で表したもの）を示す。黒色カラム(1)は、100%に調整されたコントロール（阻害無し）である。灰色カラムは、配列番号1のフォスフォロチオエートによる、TGF-ベータ2の相対的抑制を示す。白色カラムは、少なくとも一つのポリエチレングリコールと連結される、配列番号1のフォスフォロチオエートによる、TGF-ベータ2の阻害を示す。
【図２】種々の濃度の各オリゴヌクレオチドとインキュベートした細胞培養体における、免疫サプレッサーTGF-ベータ2の阻害を示す。各オリゴヌクレオチドは、少なくとも一つのポリマーに連結される。実験は例13の記載にしたがって実施された。結果は、一つまたは二つのポリエチレングリコール（PEG）分子に連結した配列番号1のフォスフォロチオエート（SEQ1）と比べて、配列番号1フォスフォロチオエート付きオリゴヌクレオチド（コントロール）から得られた。垂直軸は、免疫サプレッサーTGF-ベータ2の抑制に対する阻害パーセント（pg/Mio細胞を未処置コントロールの%で表したもの）を示す。水平軸は、μMで表したオリゴヌクレオチドの濃度を示す。コントロールサンプルでは、オリゴヌクレオチドを加えなかった（0μM；コントロール、チェッカーカラム）。これは、垂直軸に示される阻害％を計算するための参照値を形成するTGF-ベータ2の基礎値を決める。他のサンプルでは、1μMまたは2.5μMの濃度のオリゴヌクレオチドが加えられた。下記のオリゴヌクレオチドが試験された：PEG無しの、配列番号1のオリゴヌクレオチド（黒色カラム）、オリゴヌクレオチドの5′-末端にPEG-2000を有する、配列番号1のオリゴヌクレオチド（白色カラム）、オリゴヌクレオチドの5′-末端にPEG-400、および3′-末端にPEG-2000を有する配列番号1のオリゴヌクレオチド（縞状カラム）、および、オリゴヌクレオチドの5′末端にPEG-2000、3′-末端にPEG-400を有する配列番号1のオリゴヌクレオチド（点状カラム）である。このデータは、PEGに連結されるオリゴヌクレオチドは、PEG無しのオリゴヌクレオチドに比べ、阻害作用が増加すること、および、オリゴヌクレオチドに連結される第2のPEGは、該オリゴヌクレオチドの阻害作用を増すことをはっきりと示す。
【図３−１】例示の遺伝子、TGF-ベータ1、TGF-ベータ2、TGF-ベータ3、PGE-rec、VEGF、IL-10、c-erbb2（Her-2）、c-jun、c-fos、およびMIAのオリゴヌクレオチド配列の例を示す。
【図３−２】例示の遺伝子、TGF-ベータ1、TGF-ベータ2、TGF-ベータ3、PGE-rec、VEGF、IL-10、c-erbb2（Her-2）、c-jun、c-fos、およびMIAのオリゴヌクレオチド配列の例を示す。
【図３−３】例示の遺伝子、TGF-ベータ1、TGF-ベータ2、TGF-ベータ3、PGE-rec、VEGF、IL-10、c-erbb2（Her-2）、c-jun、c-fos、およびMIAのオリゴヌクレオチド配列の例を示す。
【図３−４】例示の遺伝子、TGF-ベータ1、TGF-ベータ2、TGF-ベータ3、PGE-rec、VEGF、IL-10、c-erbb2（Her-2）、c-jun、c-fos、およびMIAのオリゴヌクレオチド配列の例を示す。
【図３−５】例示の遺伝子、TGF-ベータ1、TGF-ベータ2、TGF-ベータ3、PGE-rec、VEGF、IL-10、c-erbb2（Her-2）、c-jun、c-fos、およびMIAのオリゴヌクレオチド配列の例を示す。
【図４Ａ】MIA（「メラノーマ阻害活性」、図4A）、TGF-ベータ1（図4B）、TGF-ベータ2（図4C）、およびTGF-ベータ3（図4D）のアミノ酸配列の例を示す。完全長タンパク質のペプチドまたはタンパク断片を形成する、4Aから4Dの各アミノ酸配列は、少なくとも一つのポリマーに連結されて、それぞれ、ポリマー-ペプチド接合体および化合物、または、薬学的に許容可能な担体においてそれらの接合体または化合物の少なくとも一つを含む、または該少なくとも一つから成る医薬組成物を形成するのに好適である。図4Eは、MIA、フィブロネクチン由来ペプチド、および、本発明のその他のペプチドの例を示す。
【図４Ｂ】MIA（「メラノーマ阻害活性」、図4A）、TGF-ベータ1（図4B）、TGF-ベータ2（図4C）、およびTGF-ベータ3（図4D）のアミノ酸配列の例を示す。完全長タンパク質のペプチドまたはタンパク断片を形成する、4Aから4Dの各アミノ酸配列は、少なくとも一つのポリマーに連結されて、それぞれ、ポリマー-ペプチド接合体および化合物、または、薬学的に許容可能な担体においてそれらの接合体または化合物の少なくとも一つを含む、または該少なくとも一つから成る医薬組成物を形成するのに好適である。図4Eは、MIA、フィブロネクチン由来ペプチド、および、本発明のその他のペプチドの例を示す。
【図４Ｃ】MIA（「メラノーマ阻害活性」、図4A）、TGF-ベータ1（図4B）、TGF-ベータ2（図4C）、およびTGF-ベータ3（図4D）のアミノ酸配列の例を示す。完全長タンパク質のペプチドまたはタンパク断片を形成する、4Aから4Dの各アミノ酸配列は、少なくとも一つのポリマーに連結されて、それぞれ、ポリマー-ペプチド接合体および化合物、または、薬学的に許容可能な担体においてそれらの接合体または化合物の少なくとも一つを含む、または該少なくとも一つから成る医薬組成物を形成するのに好適である。図4Eは、MIA、フィブロネクチン由来ペプチド、および、本発明のその他のペプチドの例を示す。
【図４Ｄ】MIA（「メラノーマ阻害活性」、図4A）、TGF-ベータ1（図4B）、TGF-ベータ2（図4C）、およびTGF-ベータ3（図4D）のアミノ酸配列の例を示す。完全長タンパク質のペプチドまたはタンパク断片を形成する、4Aから4Dの各アミノ酸配列は、少なくとも一つのポリマーに連結されて、それぞれ、ポリマー-ペプチド接合体および化合物、または、薬学的に許容可能な担体においてそれらの接合体または化合物の少なくとも一つを含む、または該少なくとも一つから成る医薬組成物を形成するのに好適である。図4Eは、MIA、フィブロネクチン由来ペプチド、および、本発明のその他のペプチドの例を示す。
【図４Ｅ】MIA（「メラノーマ阻害活性」、図4A）、TGF-ベータ1（図4B）、TGF-ベータ2（図4C）、およびTGF-ベータ3（図4D）のアミノ酸配列の例を示す。完全長タンパク質のペプチドまたはタンパク断片を形成する、4Aから4Dの各アミノ酸配列は、少なくとも一つのポリマーに連結されて、それぞれ、ポリマー-ペプチド接合体および化合物、または、薬学的に許容可能な担体においてそれらの接合体または化合物の少なくとも一つを含む、または該少なくとも一つから成る医薬組成物を形成するのに好適である。図4Eは、MIA、フィブロネクチン由来ペプチド、および、本発明のその他のペプチドの例を示す。
【図５Ａ】配列番号1の、非PEG化オリゴヌクレオチド（図5A）、3′-PEG化オリゴヌクレオチド（PEG-400、（図5B））、5′-PEG化オリゴヌクレオチド（PEG-400、（図5C）、またはPEG-2000、（図5D））、および、5′、3′-PEG化オリゴヌクレオチドであって、PEG-400が3′-および5′-末端にあるもの（図5E）、PEG-400が5′-末端に、PEG-2000が3′-末端にあるもの（図5F）、または、PEG-2000が5′-末端にあり、PEG-400が3′-末端にあるもの（図5G）の、3′-エキソヌクレアーゼ安定性試験を示す。オリゴヌクレオチドは、3′-エキソヌクレアーゼと37℃でインキュベートし、0、1、3、6、24、48、72、および144時間後に試験した。図5Aから図5Gは、72時間後のオリゴヌクレオチドの分解を示す。分解は、インキュベーション時間と共に増す（不純物のピーク面積(%)の増加）が、3′-末端、または両端においてPEGに連結されるオリゴヌクレオチドは、3′-エキソヌクレアーゼに対しはるかに大きな耐性を持ち、分解は緩和される。
【図５Ｂ】配列番号1の、非PEG化オリゴヌクレオチド（図5A）、3′-PEG化オリゴヌクレオチド（PEG-400、（図5B））、5′-PEG化オリゴヌクレオチド（PEG-400、（図5C）、またはPEG-2000、（図5D））、および、5′、3′-PEG化オリゴヌクレオチドであって、PEG-400が3′-および5′-末端にあるもの（図5E）、PEG-400が5′-末端に、PEG-2000が3′-末端にあるもの（図5F）、または、PEG-2000が5′-末端にあり、PEG-400が3′-末端にあるもの（図5G）の、3′-エキソヌクレアーゼ安定性試験を示す。オリゴヌクレオチドは、3′-エキソヌクレアーゼと37℃でインキュベートし、0、1、3、6、24、48、72、および144時間後に試験した。図5Aから図5Gは、72時間後のオリゴヌクレオチドの分解を示す。分解は、インキュベーション時間と共に増す（不純物のピーク面積(%)の増加）が、3′-末端、または両端においてPEGに連結されるオリゴヌクレオチドは、3′-エキソヌクレアーゼに対しはるかに大きな耐性を持ち、分解は緩和される。
【図５Ｃ】配列番号1の、非PEG化オリゴヌクレオチド（図5A）、3′-PEG化オリゴヌクレオチド（PEG-400、（図5B））、5′-PEG化オリゴヌクレオチド（PEG-400、（図5C）、またはPEG-2000、（図5D））、および、5′、3′-PEG化オリゴヌクレオチドであって、PEG-400が3′-および5′-末端にあるもの（図5E）、PEG-400が5′-末端に、PEG-2000が3′-末端にあるもの（図5F）、または、PEG-2000が5′-末端にあり、PEG-400が3′-末端にあるもの（図5G）の、3′-エキソヌクレアーゼ安定性試験を示す。オリゴヌクレオチドは、3′-エキソヌクレアーゼと37℃でインキュベートし、0、1、3、6、24、48、72、および144時間後に試験した。図5Aから図5Gは、72時間後のオリゴヌクレオチドの分解を示す。分解は、インキュベーション時間と共に増す（不純物のピーク面積(%)の増加）が、3′-末端、または両端においてPEGに連結されるオリゴヌクレオチドは、3′-エキソヌクレアーゼに対しはるかに大きな耐性を持ち、分解は緩和される。
【図５Ｄ】配列番号1の、非PEG化オリゴヌクレオチド（図5A）、3′-PEG化オリゴヌクレオチド（PEG-400、（図5B））、5′-PEG化オリゴヌクレオチド（PEG-400、（図5C）、またはPEG-2000、（図5D））、および、5′、3′-PEG化オリゴヌクレオチドであって、PEG-400が3′-および5′-末端にあるもの（図5E）、PEG-400が5′-末端に、PEG-2000が3′-末端にあるもの（図5F）、または、PEG-2000が5′-末端にあり、PEG-400が3′-末端にあるもの（図5G）の、3′-エキソヌクレアーゼ安定性試験を示す。オリゴヌクレオチドは、3′-エキソヌクレアーゼと37℃でインキュベートし、0、1、3、6、24、48、72、および144時間後に試験した。図5Aから図5Gは、72時間後のオリゴヌクレオチドの分解を示す。分解は、インキュベーション時間と共に増す（不純物のピーク面積(%)の増加）が、3′-末端、または両端においてPEGに連結されるオリゴヌクレオチドは、3′-エキソヌクレアーゼに対しはるかに大きな耐性を持ち、分解は緩和される。
【図５Ｅ】配列番号1の、非PEG化オリゴヌクレオチド（図5A）、3′-PEG化オリゴヌクレオチド（PEG-400、（図5B））、5′-PEG化オリゴヌクレオチド（PEG-400、（図5C）、またはPEG-2000、（図5D））、および、5′、3′-PEG化オリゴヌクレオチドであって、PEG-400が3′-および5′-末端にあるもの（図5E）、PEG-400が5′-末端に、PEG-2000が3′-末端にあるもの（図5F）、または、PEG-2000が5′-末端にあり、PEG-400が3′-末端にあるもの（図5G）の、3′-エキソヌクレアーゼ安定性試験を示す。オリゴヌクレオチドは、3′-エキソヌクレアーゼと37℃でインキュベートし、0、1、3、6、24、48、72、および144時間後に試験した。図5Aから図5Gは、72時間後のオリゴヌクレオチドの分解を示す。分解は、インキュベーション時間と共に増す（不純物のピーク面積(%)の増加）が、3′-末端、または両端においてPEGに連結されるオリゴヌクレオチドは、3′-エキソヌクレアーゼに対しはるかに大きな耐性を持ち、分解は緩和される。
【図５Ｆ】配列番号1の、非PEG化オリゴヌクレオチド（図5A）、3′-PEG化オリゴヌクレオチド（PEG-400、（図5B））、5′-PEG化オリゴヌクレオチド（PEG-400、（図5C）、またはPEG-2000、（図5D））、および、5′、3′-PEG化オリゴヌクレオチドであって、PEG-400が3′-および5′-末端にあるもの（図5E）、PEG-400が5′-末端に、PEG-2000が3′-末端にあるもの（図5F）、または、PEG-2000が5′-末端にあり、PEG-400が3′-末端にあるもの（図5G）の、3′-エキソヌクレアーゼ安定性試験を示す。オリゴヌクレオチドは、3′-エキソヌクレアーゼと37℃でインキュベートし、0、1、3、6、24、48、72、および144時間後に試験した。図5Aから図5Gは、72時間後のオリゴヌクレオチドの分解を示す。分解は、インキュベーション時間と共に増す（不純物のピーク面積(%)の増加）が、3′-末端、または両端においてPEGに連結されるオリゴヌクレオチドは、3′-エキソヌクレアーゼに対しはるかに大きな耐性を持ち、分解は緩和される。
【図５Ｇ】配列番号1の、非PEG化オリゴヌクレオチド（図5A）、3′-PEG化オリゴヌクレオチド（PEG-400、（図5B））、5′-PEG化オリゴヌクレオチド（PEG-400、（図5C）、またはPEG-2000、（図5D））、および、5′、3′-PEG化オリゴヌクレオチドであって、PEG-400が3′-および5′-末端にあるもの（図5E）、PEG-400が5′-末端に、PEG-2000が3′-末端にあるもの（図5F）、または、PEG-2000が5′-末端にあり、PEG-400が3′-末端にあるもの（図5G）の、3′-エキソヌクレアーゼ安定性試験を示す。オリゴヌクレオチドは、3′-エキソヌクレアーゼと37℃でインキュベートし、0、1、3、6、24、48、72、および144時間後に試験した。図5Aから図5Gは、72時間後のオリゴヌクレオチドの分解を示す。分解は、インキュベーション時間と共に増す（不純物のピーク面積(%)の増加）が、3′-末端、または両端においてPEGに連結されるオリゴヌクレオチドは、3′-エキソヌクレアーゼに対しはるかに大きな耐性を持ち、分解は緩和される。
【図６Ａ】配列番号1の、非PEG化オリゴヌクレオチド（図6A）、5′-PEG化オリゴヌクレオチド（PEG-2000、（図6B）およびPEG-400（図6D））、3′-PEG化オリゴヌクレオチド（PEG-400、（図6C））、および、5′、3′-PEG化オリゴヌクレオチドであって、PEG-400が3′-および5′-末端にあるもの（図6E）、PEG-400が5′-末端にあり、PEG-2000が3′-末端にあるもの（図6F）、または、PEG-2000が5′-末端にあり、PEG-400が3′-末端にあるもの（図6G）の、5′-エキソヌクレアーゼ安定性試験を示す。オリゴヌクレオチドは、5′-エキソヌクレアーゼと37℃でインキュベートし、0、1、3、6、24、48、72、および144時間後に試験した。図6Aから図6Gは、72時間後のオリゴヌクレオチドの分解を示す。分解は、インキュベーション時間と共に増す（不純物のピーク面積(%)の増加）が、両末端においてPEGに連結されるオリゴヌクレオチドは、5′-エキソヌクレアーゼに対しはるかに大きな耐性を持ち、分解は緩和される。
【図６Ｂ】配列番号1の、非PEG化オリゴヌクレオチド（図6A）、5′-PEG化オリゴヌクレオチド（PEG-2000、（図6B）およびPEG-400（図6D））、3′-PEG化オリゴヌクレオチド（PEG-400、（図6C））、および、5′、3′-PEG化オリゴヌクレオチドであって、PEG-400が3′-および5′-末端にあるもの（図6E）、PEG-400が5′-末端にあり、PEG-2000が3′-末端にあるもの（図6F）、または、PEG-2000が5′-末端にあり、PEG-400が3′-末端にあるもの（図6G）の、5′-エキソヌクレアーゼ安定性試験を示す。オリゴヌクレオチドは、5′-エキソヌクレアーゼと37℃でインキュベートし、0、1、3、6、24、48、72、および144時間後に試験した。図6Aから図6Gは、72時間後のオリゴヌクレオチドの分解を示す。分解は、インキュベーション時間と共に増す（不純物のピーク面積(%)の増加）が、両末端においてPEGに連結されるオリゴヌクレオチドは、5′-エキソヌクレアーゼに対しはるかに大きな耐性を持ち、分解は緩和される。
【図６Ｃ】配列番号1の、非PEG化オリゴヌクレオチド（図6A）、5′-PEG化オリゴヌクレオチド（PEG-2000、（図6B）およびPEG-400（図6D））、3′-PEG化オリゴヌクレオチド（PEG-400、（図6C））、および、5′、3′-PEG化オリゴヌクレオチドであって、PEG-400が3′-および5′-末端にあるもの（図6E）、PEG-400が5′-末端にあり、PEG-2000が3′-末端にあるもの（図6F）、または、PEG-2000が5′-末端にあり、PEG-400が3′-末端にあるもの（図6G）の、5′-エキソヌクレアーゼ安定性試験を示す。オリゴヌクレオチドは、5′-エキソヌクレアーゼと37℃でインキュベートし、0、1、3、6、24、48、72、および144時間後に試験した。図6Aから図6Gは、72時間後のオリゴヌクレオチドの分解を示す。分解は、インキュベーション時間と共に増す（不純物のピーク面積(%)の増加）が、両末端においてPEGに連結されるオリゴヌクレオチドは、5′-エキソヌクレアーゼに対しはるかに大きな耐性を持ち、分解は緩和される。
【図６Ｄ】配列番号1の、非PEG化オリゴヌクレオチド（図6A）、5′-PEG化オリゴヌクレオチド（PEG-2000、（図6B）およびPEG-400（図6D））、3′-PEG化オリゴヌクレオチド（PEG-400、（図6C））、および、5′、3′-PEG化オリゴヌクレオチドであって、PEG-400が3′-および5′-末端にあるもの（図6E）、PEG-400が5′-末端にあり、PEG-2000が3′-末端にあるもの（図6F）、または、PEG-2000が5′-末端にあり、PEG-400が3′-末端にあるもの（図6G）の、5′-エキソヌクレアーゼ安定性試験を示す。オリゴヌクレオチドは、5′-エキソヌクレアーゼと37℃でインキュベートし、0、1、3、6、24、48、72、および144時間後に試験した。図6Aから図6Gは、72時間後のオリゴヌクレオチドの分解を示す。分解は、インキュベーション時間と共に増す（不純物のピーク面積(%)の増加）が、両末端においてPEGに連結されるオリゴヌクレオチドは、5′-エキソヌクレアーゼに対しはるかに大きな耐性を持ち、分解は緩和される。
【図６Ｅ】配列番号1の、非PEG化オリゴヌクレオチド（図6A）、5′-PEG化オリゴヌクレオチド（PEG-2000、（図6B）およびPEG-400（図6D））、3′-PEG化オリゴヌクレオチド（PEG-400、（図6C））、および、5′、3′-PEG化オリゴヌクレオチドであって、PEG-400が3′-および5′-末端にあるもの（図6E）、PEG-400が5′-末端にあり、PEG-2000が3′-末端にあるもの（図6F）、または、PEG-2000が5′-末端にあり、PEG-400が3′-末端にあるもの（図6G）の、5′-エキソヌクレアーゼ安定性試験を示す。オリゴヌクレオチドは、5′-エキソヌクレアーゼと37℃でインキュベートし、0、1、3、6、24、48、72、および144時間後に試験した。図6Aから図6Gは、72時間後のオリゴヌクレオチドの分解を示す。分解は、インキュベーション時間と共に増す（不純物のピーク面積(%)の増加）が、両末端においてPEGに連結されるオリゴヌクレオチドは、5′-エキソヌクレアーゼに対しはるかに大きな耐性を持ち、分解は緩和される。
【図６Ｆ】配列番号1の、非PEG化オリゴヌクレオチド（図6A）、5′-PEG化オリゴヌクレオチド（PEG-2000、（図6B）およびPEG-400（図6D））、3′-PEG化オリゴヌクレオチド（PEG-400、（図6C））、および、5′、3′-PEG化オリゴヌクレオチドであって、PEG-400が3′-および5′-末端にあるもの（図6E）、PEG-400が5′-末端にあり、PEG-2000が3′-末端にあるもの（図6F）、または、PEG-2000が5′-末端にあり、PEG-400が3′-末端にあるもの（図6G）の、5′-エキソヌクレアーゼ安定性試験を示す。オリゴヌクレオチドは、5′-エキソヌクレアーゼと37℃でインキュベートし、0、1、3、6、24、48、72、および144時間後に試験した。図6Aから図6Gは、72時間後のオリゴヌクレオチドの分解を示す。分解は、インキュベーション時間と共に増す（不純物のピーク面積(%)の増加）が、両末端においてPEGに連結されるオリゴヌクレオチドは、5′-エキソヌクレアーゼに対しはるかに大きな耐性を持ち、分解は緩和される。
【図６Ｇ】配列番号1の、非PEG化オリゴヌクレオチド（図6A）、5′-PEG化オリゴヌクレオチド（PEG-2000、（図6B）およびPEG-400（図6D））、3′-PEG化オリゴヌクレオチド（PEG-400、（図6C））、および、5′、3′-PEG化オリゴヌクレオチドであって、PEG-400が3′-および5′-末端にあるもの（図6E）、PEG-400が5′-末端にあり、PEG-2000が3′-末端にあるもの（図6F）、または、PEG-2000が5′-末端にあり、PEG-400が3′-末端にあるもの（図6G）の、5′-エキソヌクレアーゼ安定性試験を示す。オリゴヌクレオチドは、5′-エキソヌクレアーゼと37℃でインキュベートし、0、1、3、6、24、48、72、および144時間後に試験した。図6Aから図6Gは、72時間後のオリゴヌクレオチドの分解を示す。分解は、インキュベーション時間と共に増す（不純物のピーク面積(%)の増加）が、両末端においてPEGに連結されるオリゴヌクレオチドは、5′-エキソヌクレアーゼに対しはるかに大きな耐性を持ち、分解は緩和される。
【図７Ａ】図5および6に示した、PEG有り、またはPEG無しのオリゴヌクレオチドの、それぞれ、3′エキソヌクレアーゼおよび5′エキソヌクレアーゼによる分解に関する評価を示す。図7Aおよび7Bは、配列番号1のオリゴヌクレオチド（SEQ1）が、3′エキソヌクレアーゼと37℃で72時間インキュベート後の分解を示す。図7Aは、3′PEG化オリゴヌクレオチド（3' 400 SEQ1）、または、3′400-および5' 400-PEG化オリゴヌクレオチド(3' 400 + 5' 400 SEQ1)の分解がほぼ完全に抑えられることを示す（図5B、5C、5E参照）。図7Bは、3′末端ではPEG2000に連結され、5′末端ではPEG400に連結される、配列番号1のオリゴヌクレオチド(3' 2000 + 5' 400 SEQ1)、または、3′末端ではPEG400に、5′末端ではPEG2000に連結される配列番号1のオリゴヌクレオチド(3' 400 + 5' 2000 SEQ1)では、PEG無しのオリゴヌクレオチド(SEQ1)よりも、分解率がはるかに低いことを示す（図5D、5F、5Gを参照）。図7Cおよび7Dは、配列番号1のオリゴヌクレオチド（SEQ1）が、5′エキソヌクレアーゼと37℃で72時間インキュベート後の分解を示す。図7Cでは、オリゴヌクレオチドの3′末端においてPEG400に連結される、配列番号1のオリゴヌクレオチド(3' 400 SEQ1)においても、オリゴヌクレオチドの3′末端および5′末端においてPEG400に連結される同じオリゴヌクレオチド(3' 400 + 5' 400 SEQ1)同様、PEG無しの配列番号１のオリゴヌクレオチド(SEQ1)に比べ、分解率がはっきりと低下することが示される（図6C、6D、6E参照）。図7Dは、5′末端においてPEG2000に連結されるオリゴヌクレオチド（5' 2000 SEQ1）、3′末端でPEG2000に5′末端でPEG400に連結されるオリゴヌクレオチド(3' 2000 + 5' 400 SEQ1)、または、3′末端でPEG400に5′末端でPEG2000に連結されるオリゴヌクレオチド(3' 400 + 5' 2000 SEQ1)の結果を示す（図6B、6F、6G参照）。
【図７Ｂ】図5および6に示した、PEG有り、またはPEG無しのオリゴヌクレオチドの、それぞれ、3′エキソヌクレアーゼおよび5′エキソヌクレアーゼによる分解に関する評価を示す。図7Aおよび7Bは、配列番号1のオリゴヌクレオチド（SEQ1）が、3′エキソヌクレアーゼと37℃で72時間インキュベート後の分解を示す。図7Aは、3′PEG化オリゴヌクレオチド（3' 400 SEQ1）、または、3′400-および5' 400-PEG化オリゴヌクレオチド(3' 400 + 5' 400 SEQ1)の分解がほぼ完全に抑えられることを示す（図5B、5C、5E参照）。図7Bは、3′末端ではPEG2000に連結され、5′末端ではPEG400に連結される、配列番号1のオリゴヌクレオチド(3' 2000 + 5' 400 SEQ1)、または、3′末端ではPEG400に、5′末端ではPEG2000に連結される配列番号1のオリゴヌクレオチド(3' 400 + 5' 2000 SEQ1)では、PEG無しのオリゴヌクレオチド(SEQ1)よりも、分解率がはるかに低いことを示す（図5D、5F、5Gを参照）。図7Cおよび7Dは、配列番号1のオリゴヌクレオチド（SEQ1）が、5′エキソヌクレアーゼと37℃で72時間インキュベート後の分解を示す。図7Cでは、オリゴヌクレオチドの3′末端においてPEG400に連結される、配列番号1のオリゴヌクレオチド(3' 400 SEQ1)においても、オリゴヌクレオチドの3′末端および5′末端においてPEG400に連結される同じオリゴヌクレオチド(3' 400 + 5' 400 SEQ1)同様、PEG無しの配列番号１のオリゴヌクレオチド(SEQ1)に比べ、分解率がはっきりと低下することが示される（図6C、6D、6E参照）。図7Dは、5′末端においてPEG2000に連結されるオリゴヌクレオチド（5' 2000 SEQ1）、3′末端でPEG2000に5′末端でPEG400に連結されるオリゴヌクレオチド(3' 2000 + 5' 400 SEQ1)、または、3′末端でPEG400に5′末端でPEG2000に連結されるオリゴヌクレオチド(3' 400 + 5' 2000 SEQ1)の結果を示す（図6B、6F、6G参照）。
【図７Ｃ】図5および6に示した、PEG有り、またはPEG無しのオリゴヌクレオチドの、それぞれ、3′エキソヌクレアーゼおよび5′エキソヌクレアーゼによる分解に関する評価を示す。図7Aおよび7Bは、配列番号1のオリゴヌクレオチド（SEQ1）が、3′エキソヌクレアーゼと37℃で72時間インキュベート後の分解を示す。図7Aは、3′PEG化オリゴヌクレオチド（3' 400 SEQ1）、または、3′400-および5' 400-PEG化オリゴヌクレオチド(3' 400 + 5' 400 SEQ1)の分解がほぼ完全に抑えられることを示す（図5B、5C、5E参照）。図7Bは、3′末端ではPEG2000に連結され、5′末端ではPEG400に連結される、配列番号1のオリゴヌクレオチド(3' 2000 + 5' 400 SEQ1)、または、3′末端ではPEG400に、5′末端ではPEG2000に連結される配列番号1のオリゴヌクレオチド(3' 400 + 5' 2000 SEQ1)では、PEG無しのオリゴヌクレオチド(SEQ1)よりも、分解率がはるかに低いことを示す（図5D、5F、5Gを参照）。図7Cおよび7Dは、配列番号1のオリゴヌクレオチド（SEQ1）が、5′エキソヌクレアーゼと37℃で72時間インキュベート後の分解を示す。図7Cでは、オリゴヌクレオチドの3′末端においてPEG400に連結される、配列番号1のオリゴヌクレオチド(3' 400 SEQ1)においても、オリゴヌクレオチドの3′末端および5′末端においてPEG400に連結される同じオリゴヌクレオチド(3' 400 + 5' 400 SEQ1)同様、PEG無しの配列番号１のオリゴヌクレオチド(SEQ1)に比べ、分解率がはっきりと低下することが示される（図6C、6D、6E参照）。図7Dは、5′末端においてPEG2000に連結されるオリゴヌクレオチド（5' 2000 SEQ1）、3′末端でPEG2000に5′末端でPEG400に連結されるオリゴヌクレオチド(3' 2000 + 5' 400 SEQ1)、または、3′末端でPEG400に5′末端でPEG2000に連結されるオリゴヌクレオチド(3' 400 + 5' 2000 SEQ1)の結果を示す（図6B、6F、6G参照）。
【図７Ｄ】図5および6に示した、PEG有り、またはPEG無しのオリゴヌクレオチドの、それぞれ、3′エキソヌクレアーゼおよび5′エキソヌクレアーゼによる分解に関する評価を示す。図7Aおよび7Bは、配列番号1のオリゴヌクレオチド（SEQ1）が、3′エキソヌクレアーゼと37℃で72時間インキュベート後の分解を示す。図7Aは、3′PEG化オリゴヌクレオチド（3' 400 SEQ1）、または、3′400-および5' 400-PEG化オリゴヌクレオチド(3' 400 + 5' 400 SEQ1)の分解がほぼ完全に抑えられることを示す（図5B、5C、5E参照）。図7Bは、3′末端ではPEG2000に連結され、5′末端ではPEG400に連結される、配列番号1のオリゴヌクレオチド(3' 2000 + 5' 400 SEQ1)、または、3′末端ではPEG400に、5′末端ではPEG2000に連結される配列番号1のオリゴヌクレオチド(3' 400 + 5' 2000 SEQ1)では、PEG無しのオリゴヌクレオチド(SEQ1)よりも、分解率がはるかに低いことを示す（図5D、5F、5Gを参照）。図7Cおよび7Dは、配列番号1のオリゴヌクレオチド（SEQ1）が、5′エキソヌクレアーゼと37℃で72時間インキュベート後の分解を示す。図7Cでは、オリゴヌクレオチドの3′末端においてPEG400に連結される、配列番号1のオリゴヌクレオチド(3' 400 SEQ1)においても、オリゴヌクレオチドの3′末端および5′末端においてPEG400に連結される同じオリゴヌクレオチド(3' 400 + 5' 400 SEQ1)同様、PEG無しの配列番号１のオリゴヌクレオチド(SEQ1)に比べ、分解率がはっきりと低下することが示される（図6C、6D、6E参照）。図7Dは、5′末端においてPEG2000に連結されるオリゴヌクレオチド（5' 2000 SEQ1）、3′末端でPEG2000に5′末端でPEG400に連結されるオリゴヌクレオチド(3' 2000 + 5' 400 SEQ1)、または、3′末端でPEG400に5′末端でPEG2000に連結されるオリゴヌクレオチド(3' 400 + 5' 2000 SEQ1)の結果を示す（図6B、6F、6G参照）。
【図８】アミノ官能化5′末端（リンカー）を有するオリゴヌクレオチドとPEG-NHSエステルとの化学的反応が、5′末端においてPEGに連結されるオリゴヌクレオチドを形成することを示す。
【図９】Fmocを含む3′-アミノ修飾体、例えば、例8に記載のC7 CPGによる、3′5′-PEG化オリゴヌクレオチド生産のための化学的反応を示す。
【図１０】5′-および3′-アミノ修飾因子によって、3′5′-PEG化オリゴヌクレオチドを生産するための別法、例えば、例10に記載される、5′-アミノ修飾因子および3′-アミノ修飾因子C6 CPGを用いる別の方法の化学反応を示す。
【図１１】3′5′-PEG化オリゴヌクレオチドの生産のための、例11に記載されるように、オリゴヌクレオチドの5′末端が、5′-フォスフォルアミダイト建築ブロックを用いて支持体に連結される、化学反応を示す。
【００２１】
図１における連結ポリマーの濃度および重量は、下記の表に示す。一つのポリマー、または二つのポリマーに連結されるオリゴヌクレオチドでは、ポリマーに連結されないオリゴヌクレオチドに比べて、TGF-ベータ2の阻害が増加することがはっきりと認められる。
［表１］
0005401323.tif 000002
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明をさらに詳細に記載する前に、本発明は、後述の本発明の特定実施態様には限定されないことを理解すべきである。なぜなら、これらの特定実施態様の変異形の作製は可能であり、かつ、それらが依然として、従属する特許請求項の範囲内に納まることが可能だからである。さらに、用いる専門用語は、特定実施態様を記載するためのものであること、限定的であることを意図するものではないことを理解されるべきである。そうではなく、本発明の範囲は従属する特許請求項によって定められる。
【００２３】
定義
分枝鎖
少なくとも一つのポリマー、より好ましくはポリアルキレンオキシド、さらに好ましくはポリエチレングリコールは、一実施態様では直鎖であるが、別の実施態様では分枝鎖である。分枝鎖とは、分子の中にいくつかの分枝のある場合を含めて、それぞれのポリマーに少なくとも一つの分枝があることを意味する。ポリマーにおける分枝は、該分子がよりコンパクトになり、かつ、オリゴヌクレオチドの隠蔽など、長い直鎖ポリマーの欠点を補償するという利点を有する。
【００２４】
「分枝鎖」という用語はさらに、リンカー、例えば、Lysコアを介して結合されて「擬似分枝」ポリマーを形成する、PEGなどのポリマーを含む。この場合、ポリマーは、複数ポリマー複合体のモノマーを表す。
【００２５】
疾患および障害
本発明の接合体または組成物は、一つ以上の細胞増殖性および／または分化性疾患または障害、骨代謝関連性疾患または障害、免疫、造血、循環、肝臓、腎臓、筋肉、血清学的、ウィルス性、疼痛、神経学的、および／または代謝性疾患または障害、特に、有害なTGF-ベータシグナル伝達に関連する疾患または障害を、コントロール、治療、および／または予防するための新規治療剤として作用する。細胞増殖性および／または分化性疾患または障害としては、例えば、癌、例えば、上皮癌、肉腫、転移性または造血性腫瘍性疾患または障害、例えば、白血病が挙げられる。本明細書で使用する「癌("cancer")」または「上皮癌("carcinoma")」という用語は、ある生物体における組織および／または血球の、新規の、異常な増殖または形成を意味するが、この増殖または形成は、「新生物("neoplasm")」という用語によっても包含される。「癌」、「上皮癌」、および「新生物」という用語は、種々の器官系の悪性腫瘍、例えば、脳、眼、肺、乳房、甲状腺、リンパ系、消化器、および生殖泌尿管を冒す腫瘍を含む。本発明の接合体または組成物は、特に、特定疾患または障害に関連する遺伝子を標的するように設計される。
【００２６】
接合体
本出願の主旨における接合体または化合物は、少なくとも一つのポリマーに連結される、例えば、免疫刺激因子である、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドを指す。例えば、ポリアルキレンオキシド、および、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドを、該ポリアルキレンオキシドが、該オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドに連結された状態で含む接合体または化合物では、ポリアルキレンオキシドの分子量は、少なくとも200 Daである。好ましくは、少なくとも一つのポリアルキレンオキシドは、これらの接合体または化合物中のオリゴヌクレオチドの5′末端に連結されるか、および／または、少なくとも一つのポリアルキレンオキシドは、該オリゴヌクレオチドの3′末端に連結されるか、および／または、少なくとも一つのポリアルキレンオキシドは、該オリゴヌクレオチドのリン酸基、糖成分、および／または塩基に連結される。
【００２７】
PEG化とは、少なくとも一つのポリエチレングリコール(PEG)を、別の分子に、本発明の主旨では、免疫刺激因子などの、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドに連結することを意味する。好ましくは、このポリエチレングリコールはメチル化される（mPEG）。
【００２８】
連結
二つの分子、例えば、ポリマーと、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドの間のリンクとも呼ばれる結合は、少なくとも二つの分子の間の、いずれの種類のものであってもよい、共有的結合である。この共有結合は、接合体を形成する分子同士のさらに別の相互作用、例えば、非共有的分子間力、例えば、ファンデルワールス力によって補強されることが好ましい。接合体の分子同士、すなわち、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチド、およびポリマーは、好ましくは、連結される、すなわち、リンカーによって連結される。
【００２９】
リンカー
本発明の主旨では架橋リンカーと同義的に参照されるリンカーは、少なくとも二つの分子、例えば、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドを、少なくとも一つのポリマーに結合させることが可能な、任意の化学物質を指す。リンカーとしては、ゼロ長リンカー、二つのホモ官能架橋リンカー、ヘテロ官能架橋リンカーなどが挙げられる。本発明の接合体または化合物ではそれぞれ異なるリンカーの使用、および組み合わせが可能である、すなわち、異なるリンカーが直接組み合わされるか、または、一つ以上のオリゴヌクレオチド、および／または、一つ以上のタンパク、および／または、一つ以上のペプチドを連結するために、異なるリンカーが使用される。好ましくは、リンカーは、スペーサーの機能を有する。特に、ポリマーは、オリゴヌクレオチド同士を互いに、オリゴヌクレオチドを、受容体などのタンパクに、および／または、受容体断片などのペプチドに、結合させるリンカーである。この「リンカー」という用語はさらに、リンカー、およびオリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドを、含むか、または、から成るリンカーを含むか、あるいは、リンカー、および、PEGなどのポリアルキレンオキシドを、含むか、または、から成るリンカーを含む。
【００３０】
スペーサー
本発明の主旨におけるスペーサーとは、二つ以上の分子を、ある距離を隔てて互いに連結する任意の分子である。ある実施態様では、本発明において使用されるリンカーはスペーサーでもあるが、このスペーサーはさらに、該分子におけるリンカーと共に使用されてもよい。ある実施態様では、スペーサーは、少なくとも一つのヌクレオチド建築ブロック、または、ヌクレオチド建築ブロックの部分を置換する。別の実施態様では、スペーサーは、ポリマーブロックの少なくとも一つのモノマー、または、該モノマーの部分を置換する。5′-アミノ修飾基C3、-C5、-C6、-C7などのスペーサーを含む化合物も、本発明の範囲内にある。好ましくは、本発明の接合体または化合物は、一つ以上の、そのタイプが同一か、または異なるスペーサーを含む。このようなスペーサーは、例えば、マレイミドスペーサー、アルキルスペーサー、ペプチドスペーサー、グルクロニドスペーサー、非イオン性またはポリイオン性スペーサーなどである。
【００３１】
オリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチドのサイズは、少なくとも5ヌクレオチド、好ましくは5から70ヌクレオチド、好ましくは10から60ヌクレオチド、より好ましくは10から40ヌクレオチド、さらに好ましくは12から25ヌクレオチド、もっとも好ましくは12から20ヌクレオチドである。特に、オリゴヌクレオチドは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、任意の方法で、好ましくは、化学的合成、DNA複製、逆転写、またはそれらの組み合わせによって生成される。
【００３２】
好ましくは、本発明の主旨におけるオリゴヌクレオチドは、一つ以上の修飾体を有するオリゴヌクレオチド、例えば、該オリゴヌクレオチドの一端または両端に、さらに別の官能基、例えば、アミノ基またはヒドロキシ基を有するオリゴヌクレオチドを含む任意のタイプのオリゴヌクレオチドを含む。これらの基は、例えば、ポリマーとの反応を可能とするので、オリゴヌクレオチド・ポリマー接合体、例えば、PEG化オリゴヌクレオチドが生成させる。
【００３３】
本発明の主旨では、「オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド建築ブロックポリマーとも呼ばれる、リボ核酸（RNA）、または、デオキシリボ核酸（DNA）、または、それらの擬似体のオリゴマーである。「オリゴヌクレオチド」という用語は、1本鎖および2本鎖RNAまたはDNAを含む。2本鎖RNAまたはDNAの場合、これらの鎖は、平滑末端または突出末端を有し、その際、一方鎖は、他方鎖の一側、または両側に突出部を有するか、または、一方鎖は一側に突出部を有し、他方鎖は他側に突出部を有する。
【００３４】
「オリゴヌクレオチド」という用語はさらにアプタマーおよび／またはスピーゲルマー(Spiegelmer)を含む。アプタマーは、古典的なワトソン・クリックの塩基対形成以外の相互作用を介して分子に対して特異的結合を有する、少なくとも25ヌクレオチド、好ましくは10から100ヌクレオチド、より好ましくは25から75ヌクレオチド、さらに好ましくは30から70ヌクレオチド、もっとも好ましくは40から60ヌクレオチドを含む核酸分子である。アプタマーは、種々の分子標的、例えば、小型分子、タンパク、核酸、場合によっては細胞、組織、および生物体に対し、好ましくはナノモルからピコモル範囲において親和性をもって結合するように、インビトロ選択を繰り返すか、または、それと等価的である、SELEX（systemic evolution of ligands by exponential enrichment（指数関数濃縮による、リガンドの体系的進化））によって製造される。アプタマーは例えば、完全に試験管において製造されるか、化学合成によって簡単に生産され、所望の保存特性を有し、治療応用においてほとんど、または全く免疫原性を惹起しない。さらに、アプタマーは、標的分子の存在下に自己切断が可能となるように、リボザイムと結合することが可能である。
【００３５】
スピーゲルマーは、アプタマーに基づいて開発される；これらは、L型を有するヌクレオチドから成り、そのためヌクレアーゼに対する高い耐性が得られる。したがって、スピーゲルマーは、好ましくは低ナノモルからピコモル範囲において、アプタマーの全ての多様性および結合性のみならず、酵素分解を阻止する構造をも所有する。アプタマーおよびスピーゲルマーは、受容体またはそのリガンドなどの、細胞外および細胞内分子の両方に、転写因子、または脂質含有分子に結合する。
【００３６】
「オリゴヌクレオチド」という用語はさらに、RNAi、shRNA、およびミクロRNA(miRNA)を含む。RNAiは、RNA誘導による、遺伝子発現調節機構であって、2本鎖リボ核酸が、好ましくは、相補的ヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現を阻害する機構である。このRNAi経路は、酵素ダイサーによって起動される。すなわち、ダイサーは、2本鎖RNAを切断して、好ましくは15から35塩基対、より好ましくは20から30塩基対、もっとも好ましくは20から25塩基対の、短い、2本鎖断片を生成する。各断片の2本鎖の内の一方は、「ガイド鎖」となり、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）、および相補的配列を有する塩基対の中に取り込まれる。もっともよく調べられているRNAiの作用は、転写後の遺伝子サイレンシングであって、これは、ガイド鎖がmRNAと塩基対を形成すると起こり、例えば、RISC複合体の触媒成分であるアルゴノート(argonaute)によって該mRNAの分解を誘発する。この短い断片は、小型干渉性またはサイレンシングRNA（siRNA）と呼ばれるが、抑制されるべき遺伝子に対し完全に相補的であることが好ましい。siRNAは、RNAi経路におけるその役割以外にに、RNAi関連経路においても、例えば、抗ウィルス機構として、または、ゲノムのクロマチン構造を形成するのに作用する。siRNA同様、ミクロRNA(miRNA)も、15から30ヌクレオチド、好ましくは20から30ヌクレオチド、もっとも好ましくは21から23ヌクレオチドの1本鎖RNA分子であり、好ましくは遺伝子発現を調節する。miRNAは、DNAから転写される遺伝子によってコードされるが、タンパクには翻訳されない（非コードRNA）。代わりに、miRNAは、プレmRNAと呼ばれる一次転写物から、好ましくはプレmiRNAなどの、短いステムループ構造に、最終的には機能的miRNAに処理される。好ましくは遺伝子サイレンシングに関与する、もう一つのタイプのRNAは、短いヘアピンRNA(shRNA)である。shRNAは、好ましくは、RNAiを介して遺伝子発現を沈黙化するのに好適な、緊密なヘアピン曲線を作るRNAiである。shRNAは、細胞の中に導入されるベクターを使用し、該shRNAの発現を確保するために、プロモーター、好ましくはU6プロモーターを利用する。このベクターは、好ましくは娘細胞に継代され、遺伝子サイレンシングが遺伝されるようになる。このshRNAヘアピン構造は、好ましくは、細胞機構によって切断され、好ましくはsiRNAに変換され、次にこれが、RISCに結合して、前述の機構を起動する。
【００３７】
さらに、オリゴヌクレオチドという用語は、CpGオリゴヌクレオチドを含む。CpGモチーフは、細菌DNAを刺激することによって、Toll様受容体介在性免疫反応を誘発する。CpGオリゴヌクレオチドは、好ましくは、樹状細胞およびBリンパ球などの免疫細胞を活性化し、NF-κBを刺激する。CpGオリゴヌクレオチドは、一般に、標的配列特異的探求法ではない。
【００３８】
さらに、オリゴヌクレオチドという用語は、「デコイ」とも呼ばれるデコイオリゴヌクレオチドであって、好ましくは、遺伝子発現を操作するために、例えば、特異的転写因子の共通結合配列を担持する2本鎖オリゴヌクレオチドである。
【００３９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、ある分子のmRNAとハイブリダイズして、細胞における生理学的および／または生化学的作用に否定的な影響を及ぼすか、または、該分子の受容体のmRNAとハイブリダイズする。より好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、TGF-ベータ1、TGF-ベータ2、TGF-ベータ3、VEGF、IL-10、c-jun、c-fos、Her-2、MIA、および／または、その受容体の、ｍRNAとハイブリダイズする。
【００４０】
ヌクレオチド建築ブロック修飾
オリゴヌクレオチドは、塩基、糖、およびリン酸成分から構成されるヌクレオチド建築ブロックを含む。オリゴヌクレオチドは、同様の機能を有する、非天然性オリゴヌクレオチド建築ブロックを有するオリゴヌクレオチドを含む。天然のヌクレオチドだけでなく、非天然性ヌクレオチド、少なくとも一つのヌクレオチドの代わりに、塩基、糖、またはバックボーンにおけるこれらのヌクレオチドおよびスペーサーの修飾体も、ヌクレオチド建築ブロックと呼ばれる。オリゴヌクレオチドの修飾体は、例えば、フォスフォロチオエート、メチルフォスフォネート、フォスフォルアミデート、または、糖の2′-修飾体（例えば、2′-O-メチルオリゴヌクレオチド、2′-O-メトキシ-エチルオリゴヌクレオチド、または2′-デオキシ-2′-フルオロオリゴヌクレオチド）である。
【００４１】
好ましくは、オリゴヌクレオチドは、少なくとも5個のヌクレオチド建築ブロック、好ましくは5から120個のヌクレオチド建築ブロック、より好ましくは8から30個のヌクレオチド建築ブロック、さらに好ましくは10から28個のヌクレオチド建築ブロック、さらに好ましくは12から26個のヌクレオチド建築ブロック、もっとも好ましくは10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、または26個のヌクレオチド建築ブロックを含む。
【００４２】
ヌクレオチド建築ブロックという用語は、それぞれが部分と呼ばれる、天然の核酸塩基、糖、およびヌクレオシド間（バックボーン）共有結合から構成されるヌクレオチドだけではなく、同様に機能する、例えば、選ばれた標的の同じmRNAとハイブリダイズする非天然性部分を有するオリゴヌクレオチドをも含む。一実施態様では、塩基は、類似分子によって修飾、または置換される。類似塩基とは、mRNAに対するハイブリダイゼーションを支持することが可能であるか、または、該ハイブリダイゼーションに少なくとも否定的なやり方で作用を及ぼさない分子である。ある実施態様では、少なくとも一つの塩基部分は、スペーサーによって置換される。
【００４３】
別の実施態様では、ヌクレオチド建築ブロックの糖成分は、別の基、構造体、または成分によって修飾、または置換される。糖の例としては、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、または、これらの糖の安定化修飾体がある。ある実施態様では、糖はスペーサーによって置換される。
【００４４】
別の実施態様では、2個のヌクレオチド建築ブロック間結合とも呼ばれる、ヌクレオシド間結合は、フォスフォジエステルではなく、別の基、構造体、または成分である。
【００４５】
このようなオリゴヌクレオチドで、少なくとも一つのヌクレオチド建築ブロック修飾体を有するものは、好ましい特性、例えば、細胞取り込みの上昇、核酸標的に対する親和性の向上、ヌクレアーゼ存在下における安定の増大、および／または治療効果の上昇などのため、天然型よりも好まれることが多い。
【００４６】
ヌクレオチド建築ブロック修飾体を有するオリゴヌクレオチドは、さらに例えば、下記に示すように、ペプチド核酸(PNA)、ロック核酸(LNA)、およびモルフォリノを含む。
【００４７】
【化１】
0005401323.tif 000003
【化２】
0005401323.tif 000004
【化３】
0005401323.tif 000005
【００４８】
PNAは、DNAおよびRNAに類似の化学物質であるが、一般に人工的に合成される。PNAのバックボーンは、例えば、ペプチド結合によって連結される、反復性N-(2-アミノエチル)-グリシン単位から構成される。種々のプリンおよびピリミジン塩基が、メチルカルボニル結合によってこのバックボーンに連結されることが好ましい。PNAのバックボーンは、荷電リン酸基を含まないために、PNA/DNA鎖間の結合は、一般にDNA/DNA間よりも強い。
【００４９】
LNAは、LNAヌクレオチドのリボース成分が、2′および4′炭素を連結する余分の架橋を有するように修飾されている、RNA修飾体である。この架橋は、DNAまたはRNAのA形にしばしば見られる、3′末端構造立体配座においてリボースを「ロック」する。
【００５０】
モルフォリノオリゴヌクレオチドは、核酸における特異的配列に対する、他の分子の接触を阻止するために使用されるアンチセンス技法である。モルフォリノは、RNAまたはDNAの塩基対形成面の、小（約25塩基）領域をブロックする。
【００５１】
タンパク
タンパクは、少なくとも120個のアミノ酸から成り、その際、「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸だけでなく、化学的に修飾されたアミノ酸も含む。このアミノ酸は、天然供給源からか、または、生物工学的に修飾された微生物から単離される。このタンパクは、単離されるか、または、例えば、メリフィールド法によって合成される。このタンパクは、例えば、酵素、抗体、または受容体、またはその断片である。
【００５２】
本発明によるタンパクという用語は、糖タンパク、すなわち、そのポリペプチドバックボーンにオリゴサッカリド鎖（グリカン）を共有的に付着させたタンパクを含む。好ましくは、オリゴサッカリドは、Aspの側鎖のアミド窒素に連結されるか（N-グリコシル化）、または、ヒドロキシリシン、ヒドロキシプロリン、セリン、またはトレオニンの側鎖のヒドロキシル酸素に連結される（O-グリコシル化）。
【００５３】
ペプチド
「ペプチド」という用語は、ジペプチド、オリゴペプチド、およびポリペプチドを含む。二つのアミノ酸を含むジペプチドは、例えば、カルノシン、アンセリン、ホモアンセリン、キョートルフィン、バレニン、アスパルタム、グロリン、バレチン、またはシュードプロリンである。オリゴペプチドは、ほんの少数のアミノ酸を含み、例えば、3から15個のアミノ酸、好ましくは5から15個のアミノ酸、より好ましくは8から15個のアミノ酸を含む。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15個のアミノ酸を含む。ポリペプチドは、15から120個のアミノ酸を含み、好ましくは30から100個のアミノ酸、より好ましくは60から120個のアミノ酸、もっとも好ましくは90から100個のアミノ酸を含む。特に、ペプチドは、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、または120アミノ酸を含む。このタンパクは、例えば、酵素、抗体、または受容体、またはその断片である。
【００５４】
アプタマーとは、前述の通りの核酸分子である。それとは別に、アプタマーは、ペプチドまたはタンパク分子である。典型的アプタマーは、そのサイズが、少なくとも5 kDa、好ましくは5から25 kDa、より好ましくは10から20 kDa、もっとも好ましくは10から15 kDaである。アプタマーは、好ましくは、高度の特異性および親和性、生物学的効力、および優れた薬理学的特性によって特徴づけられる。アプタマーは、例えば、「シャペロン」分子として好適であり、対象標的に対する別分子の特異性は、該分子を標的に対して高い結合親和性を有するアプタマーに結合することによって増大される。この分子は、例えば、細胞傷害剤、例えば、ケモトキシン、例えば、チューブリン安定剤／不安定剤、抗代謝剤、プリン合成阻害剤、ヌクレオシド類縁体、DNA修飾剤、トキシン、例えば、放射性同位元素、受容体チロシンキナーゼ、EGFR、Her2 new、PSMAおよびMuc1、または、化学療法剤である。
【００５５】
保護する基（保護的基）
本発明の好ましい実施態様では、一つ以上の保護する基、保護基とも呼ばれるが、接合体または化合物の生産において使用される。一般に、保護基は、化学的官能基を、特異的反応条件に対し不活性にするが、分子の残余部分を事実上損なうことなく、分子における官能基に付着され、および／または、除去される。「保護される」という用語は、指示の成分が、その上に保護基を付着させることを意味する。
【００５６】
ヒドロキシ保護基としては、例えば、t-ブチル、t-ブトキシメチル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、1-エトキシエチル、1-(2-クロロエトキシ)エチル、2-トリメチルシリルエチル、p-クロロフェニル、2,4-ジニトロフェニル、ベンジル、2,6-ジクロロベンジル、ジフェニルメチル、p,p′-ジニトロベンジルヒドリル、トリフェニルメチル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、t-ブチルジメチルシリル、t-ブチルジフェニルシリル、トリフェニルシリル、ベンゾイルフォルメート、酢酸塩、クロロアセテート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、ピバル酸塩、安息香酸塩、p-フェニルベンゾエート、9-フルオレニルメチルカーボネート、メシル酸塩、およびトシル酸塩がある。
【００５７】
アミノ保護基としては、例えば、モノメトキシトリチル(MMT)、2-トリメチルシリルエトキシカルボニル（Teoc）、1-メチル-1-(4-ビフェニルイル)エトキシカルボニル(Bpoc)、t-ブトキシカルボニル(BOC)、アリルオキシカルボニル(Alloc)、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）、ベンジルオキシカルボニル(Cbz)；アミド保護基、例えば、フォルミル、アセチル、トリハロアセチル、ベンゾイル、およびニトロフェニルアセチル；スルフォンアミド保護基、例えば、2-ニトロベンゼンスルフォニル、または、イミンおよび環状イミド保護基、例えば、フタールイミドおよびジチアスクシノイルがある。
【００５８】
カルボニル保護基としては、例えば、アセタール類、ケタール類、アシラール類、またはジチアン類がある。カルボン酸保護基としては、例えば、メチルエステル類、ベンジルエステル類、tert-ブチルエステル類、またはシリルエステル類がある。
【００５９】
上記保護基、例えば、ヒドロキシ保護基、アミノ保護基、カルボニル保護基、カルボン酸保護基、またはアミノ保護基の等価物も、本接合体または化合物、およびそれらの生産方法の中に包含される。
【００６０】
本発明によるオリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチド接合体の生産は、直交保護、すなわち、他者に影響を及ぼすことなく、それぞれを一組の反応条件によって一時に複数の保護基の脱保護を可能とする戦略となる保護を含む。特に、直交保護は、タンパクおよびペプチドばかりでなく、本発明の接合体の生産のために使用される。好ましくは、直交保護は、ポリマー、特に、ポリアルキレンオキシド、例えば、PEGによる、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドの高度に選択的な接合のために使用される。保護基に応じて、例えば、比較的酸性、または比較的塩基性の条件を用いることによって、該オリゴヌクレオチド、タンパク、またはペプチドからその保護基を除去することが可能である。
【００６１】
固相
本発明の主旨では、固相とは、もし実施可能であれば、任意のポリマーから成る、その上でオリゴヌクレオチド、タンパク、ペプチドの合成が実施される、任意の不活性材料である。固相の好ましい実施態様は、調節孔性ガラスである。例えば、調節とは、固相の反応基が中和されることを意味する。
【００６２】
免疫刺激因子
本発明による免疫刺激因子とは、薬学的に許容可能な担体において、免疫細胞および／または免疫系の機能を誘発し、腫瘍細胞増殖を低減または阻害する、および／または、有害な新生物の細胞死を誘発する、能力を直接的または間接的に強化する任意の物質である。
【００６３】
一実施態様では、免疫刺激因子としての、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドは、これらに限定されないが、リンフォタクチン、インターロイキン1、インターロイキン2、インターロイキン6、インターロイキン12、インターフェロンガンマを含むケモカイン類の群、および／または、免疫細胞誘引物質から選ばれる。
【００６４】
さらに別の実施態様では、免疫刺激因子としての、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドは、ウィルス、例えば、レトロウィルス、アデノウィルス、パピローマウィルス、エプスタインバーウィルスなど、および、非病原性ウィルス、例えば、ニューカッスル病ウィルス、牛痘ウィルスなど、および／またはウィルスの部分の群から選ばれる。
【００６５】
別の実施態様では、例えば、免疫刺激因子である、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドは、自己、異種MHC-分子、抗原処理に関与する分子、抗原提示に関与する分子、免疫細胞作用の仲介に関与する分子、免疫細胞の細胞傷害作用の仲介に関与する分子、抗原輸送に関与する分子、共働刺激分子、免疫細胞による認識および／または免疫細胞の細胞傷害作用を強化するペプチドの群から選ばれる。
【００６６】
さらに別の実施態様では、例えば、免疫刺激因子である、タンパクまたはペプチドは、rasタンパク、p53タンパク、EGF-受容体タンパク、融合ペプチドおよび／または融合タンパク、網膜芽細胞腫タンパク、癌遺伝子および／または前癌遺伝子によってコードされるタンパク、および／または、抗癌遺伝子および／または癌抑制遺伝子によってコードされるタンパクのアミノ酸置換、および／または、一つ以上の突然変異を含む、免疫細胞による不要な新生物の認識、および／または、免疫細胞の細胞傷害作用を強化するタンパクまたはペプチドである。
【００６７】
さらに別の実施態様では、免疫刺激因子としてのタンパクまたはペプチドは、遺伝子再編成および／または遺伝子転位によって引き起こされる、一つ以上の突然変異および／またはアミノ酸置換を含む免疫細胞による不要な新生物の認識、および／または、免疫細胞の細胞傷害作用を強化するタンパクまたはペプチドである。
【００６８】
さらに別の実施態様では、免疫刺激因子としてのタンパクまたはペプチドは、同じ生物体において、他の細胞によって発現されるタンパクとは一つ以上のアミノ酸において異なる、標的細胞内のタンパクに由来する免疫細胞による不要な新生物の認識、および／または、免疫細胞の細胞傷害作用を強化するタンパクまたはペプチドである。
【００６９】
さらに別の実施態様では、免疫刺激因子としてのタンパクまたはペプチドは、ウィルス抗原に由来するか、および／または、ウィルス核酸によってコードされる免疫細胞による不要な新生物の認識、および／または、免疫細胞の細胞傷害作用を強化するタンパクまたはペプチドである。
【００７０】
さらに別の実施態様では、免疫刺激因子としてのタンパクまたはペプチドは、病気に冒された器官では発現されるが、神経系、筋肉、造血系、または、生存に必須の他の器官では発現されないタンパクに由来するタンパクまたはペプチドである。病気に冒された器官とは、例えば前立腺、卵巣、乳房、メラニン生産細胞等である。
【００７１】
さらに別の実施態様では、例えば、免疫刺激因子であるタンパクまたはペプチドは、標的細胞におけるタンパクと、生物体、腫瘍細胞抽出物、腫瘍細胞分解物および／またはアジュバントにおける他の細胞におけるタンパクとの間で異なる、一つ以上のアミノ酸を含むタンパクまたはペプチドである。
【００７２】
さらに別の実施態様では、免疫刺激因子は、樹状細胞と腫瘍細胞の融合細胞、または樹状細胞である。これらの融合細胞は、樹状細胞および腫瘍細胞の混合物に由来するハイブリドーマ細胞である。樹状細胞は、例えば、PBMCを、GM-CSFおよびIL-4、または、GM-CSF、IL-4、およびIFN-γの混合物、またはFLT-3リガンドで処理することによって得られる。樹状細胞の、腫瘍細胞との融合は、例えば、PEG（ポリエチレングリコール）または電気穿孔(Hayashi, T., et al. 2002, Parkhurst, M.R. 2003, Phan, V. 2003)を用いて実現することが可能である。
【００７３】
さらに別の実施態様では、例えば、免疫刺激因子であるタンパクまたはペプチドは、免疫系の機能に対し否定的に影響する因子の拮抗因子である。これらの因子は、例えば、TGF-ベータ1、2、または3（腫瘍化増殖因子1、-2、または-3）、VEGF（血管内皮増殖因子）、PGE2（プロスタグランジンE2）、IL-10（インターロイキン10）、またはMIA、またはその断片である。
【００７４】
さらに別の実施態様では、免疫刺激因子としてのオリゴヌクレオチド、タンパクおよび／またはペプチドはワクチンである。
【００７５】
本発明によるワクチンは、下記の物質、ただしこれに限定されないが、全体（放射線被爆）腫瘍細胞、例えば、ニューカッスル病ウィルス(NDV)修飾腫瘍細胞ワクチン（Schneider, T. et al. 2001）によるASI（活性特異的免疫化）、腫瘍細胞分解物の群から選ばれる薬学的に許容可能な担体における物質を含む。
【００７６】
好ましい一実施態様では、ワクチンは、サイトカイン（例えば、IL-2、IL-12、GM-CSF）と組み合わせたペプチド、またはアジュバント（例えば、フロインドの不完全アジュバント、QS21）と組み合わせたペプチドである。
【００７７】
ワクチンの、さらに別の実施態様では、癌抗原（単数または複数）をコードする、組み換えウィルスコンストラクトは、例えば、アデノウィルス、ワクシニア、鶏痘、および／または鳥ポックスウィルスの一部である。
【００７８】
さらに別の実施態様では、ワクチンは、癌抗原（単数または複数）をコードする、天然DNAまたはRNAである。
【００７９】
さらに別の実施態様では、ワクチンは、樹状細胞、癌抗原由来のペプチドを負荷させた樹状細胞、組み換えウィルス、または、種々の腫瘍抗原をコードするRNA、DNA、および／またはｃDNAによってトランスフェクトされる樹状細胞、腫瘍分解物をパルス導入させた樹状細胞、および／または、全体腫瘍細胞と融合した樹状細胞を含むか、またはそのような樹状細胞から成る。さらに別のワクチンについては、Jager, E. et al. 2003を参照されたい。
【００８０】
本発明のある好ましい実施態様では、例えば、免疫刺激因子であるオリゴヌクレオチド、タンパクおよび／またはペプチドは、免疫系の機能に対し否定的に影響する因子の拮抗因子である。
【００８１】
本発明において用いられる拮抗因子は、任意の生理学的および／または生化学的作用、例えば、サイトカインの生産および／またはサイトカインの作用を阻害する、任意の物質である。免疫系に否定的に作用するサイトカインの例としては、例えば、TGF-ベータ、例えば、TGF-ベータ1、TGF-ベータ2、またはTGF-ベータ3、VEGF、IL-10、PGE-E2、またはMIAがある。一実施態様における阻害は、サイトカインを、結合タンパク、受容体、またはその受容体の一部に結合することによって、サイトカインを、抗体、サイトカインまたはその生産を阻害する低分子量物質と結合することによって、または、前記サイトカインのシグナル伝達経路を阻害することによって、例えば、これらのサイトカインの受容体、または、サイトカインの活性化カスケードにおいて下流にある、任意の他の連結を阻害することによって働く。
【００８２】
本発明の主旨におけるTGF-ベータ（腫瘍化増殖因子ベータ）は、TGF-ベータの全てのサブクラスを含むが、好ましいサブクラスは、TGF-ベータ1、TGF-ベータ2、およびTGF-ベータ3である。
【００８３】
さらに詳細な説明が、例えば、TGF-ベータ拮抗因子の好ましい実施態様について、例えば、前述のサイトカインに転換が可能な、TGF-ベータ1、TGF-ベータ2、TGF-ベータ3拮抗因子について示される。
【００８４】
好ましくは、本発明で用いられる免疫系の拮抗因子は、免疫系の活性を阻害する任意の物質または方法である。
【００８５】
本発明における「低分子量物質」または「小型分子」とは、分子量が約10 kg/mol未満で、約1 g/molを超える、好ましくは約1 kg/mol未満である、有機または無機起源の物質である。
【００８６】
ある好ましい実施態様では、本発明の医薬組成物の免疫刺激因子は、TGF-ベータ拮抗因子、好ましくは、TGF-ベータ1、TGF-ベータ2、またはTGF-ベータ3拮抗因子である。
【００８７】
本発明の主旨においては、TGF-ベータ拮抗因子とは、TGF-ベータによって誘発される作用が阻害されるという意味で、TGF-ベータの機能を阻害する、任意のオリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチド、または任意の物質である。
【００８８】
好ましい実施態様では、TGF-ベータ拮抗因子は、TGF-ベータの生産を阻害するオリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチド、または別の物質であるか、TGF-ベータに結合するオリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチド、または別の物質であるか、および／または、その活性化カスケードの下流においてTGF-ベータの機能を阻害するオリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチド、または別の物質である。TGF-ベータ拮抗因子は、例えば、抗TGF-ベータ抗体、TGF-ベータの、小型分子阻害因子、または、Wojtowicz-Praga (2003)に記載されるSmad阻害因子である。なお、この文献は参照により本開示に含められる。
【００８９】
TGF-ベータ拮抗因子の例は、例15に示される。
【００９０】
TGF-ベータ拮抗因子、または、TGF-ベータの生産を阻害する阻害因子の一実施態様では、該拮抗因子または阻害因子は、好ましくは、TGF-ベータのメッセンジャーRNA(mRNA)、および／または、TGF-ベータをコードするDNAの特定領域とハイブリダイズし、そうすることによってTGF-ベータの生産を阻害する、オリゴヌクレオチドおよび／またはその活性誘導体である。
【００９１】
さらに別の実施態様では、TGF-ベータ拮抗因子または阻害因子、例えば、TGF-ベータ１、TGF-ベータ2、またはTGF-ベータ3の拮抗因子または阻害因子は、TGF-ベータの機能を阻害するやり方でTGF-ベータに結合する受容体、および／またはその部分である。
【００９２】
さらに別の実施態様では、TGF-ベータ拮抗因子または阻害因子は、TGF-ベータに結合し、それによってTGF-ベータ、特に、TGF-ベータ1、TGF-ベータ2、またはTGF-ベータ3の機能を阻害する、抗体および／またはその部分、またはその断片である。これらの抗体は市販されている。例えば、R & D Systems, Inc.を参照。このような抗体の生産は当該技術分野で公知である。動物、例えば、ニワトリ、マウス、ウサギ、ヤギを、精製されたヒトのTGF-ベータ、特にTGF-ベータ1、TGF-ベータ2、またはTGF-ベータ3によって免疫化する。免疫化後、IgYを、例えば、Cooper, H.M. (1995)によって記載される通りアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。さらに別の実施態様では、TGF-ベータ抗体は、修飾され、例えば、ビオチニル化される。
【００９３】
より好ましい実施態様では、TGF-ベータ抗体はヒト化抗体である。例えば、ヒト化TGF-ベータ1およびTGF-ベータ2抗体は、Carrington et al. (2000および2006)に記載される。
【００９４】
さらに別の実施態様では、TGF-ベータ拮抗因子または阻害因子は、TGF-ベータに結合し、それによってTGF-ベータの機能を阻害する、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドである。このペプチドの好ましい実施態様は、例えば、TGF-ベータの全てのアイソフォーム、例えば、TGF-ベータ1、TGF-ベータ2、およびTGF-ベータ3を阻害するのに好適な潜伏期関連ペプチド(latency-associated peptides)である。
【００９５】
別の実施態様では、TGF-ベータ阻害因子は、細胞外、または細胞内で作用してTGF-ベータ受容体の機能を阻害する、オリゴヌクレオチド、タンパク、ペプチド、または小型分子である。
【００９６】
さらに別の実施態様では、TGF-ベータ拮抗因子または阻害因子は、TGF-ベータの活性化カスケードの下流における任意のリンクを阻害することによってTGF-ベータ活性を阻害する、オリゴヌクレオチド、タンパク、ペプチド、抗体、および／または小型分子を含む。
【００９７】
本発明の好ましい実施態様では、ペプチド、サイトカイン、および／または受容体の拮抗因子または阻害因子は、本発明によるオリゴヌクレオチドである。
【００９８】
さらに別の実施態様では、TGF-ベータの生産を阻害する拮抗因子または阻害因子は、例えば、ペプチド、100 kg/mol未満のペプチド、TGF-ベータの部分であるペプチド、タンパク、抗体ではないタンパク、および／または、小型分子、例えば、tranilast（N-[3,4-ジメトキシシナモイル]-アントラニル酸）(Wilkenson, K.A. 2000)である。
【００９９】
一実施態様では、TGF-ベータの一部であるタンパクまたはペプチドは、TGF-ベータ1、TGF-ベータ2、および／またはTGF-ベータ3のアミノ酸配列であって、これは、例えば、Mittl (1996)において公刊される。なお、この文献は参照により本開示に含められる。
【０１００】
好ましい一実施態様では、ペプチドは、TGF-ベータ1、TGF-ベータ2、またはTGF-ベータ3タンパクの末端から数えて112個のアミノ酸、すなわち、これらのタンパクの内の一つの、最後の112アミノ酸を含む。これらのペプチドの開始は、TGF-ベータ1、TGF-ベータ2、またはTGF-ベータ3タンパクの末端前の113アミノ酸において終止するRXXRモチーフの後にあり、該モチーフにおいて、Rはアミノ酸アルギニンであり、XXは、任意のアミノ酸、または場合によってはアミノ酸無しを表す。
【０１０１】
さらに別の実施態様では、TGF-ベータの一部であるペプチドは、例9に提示される配列の一つ以上の部分であってまたは含み、このペプチドの1個から全てのアミノ酸を含む。別の実施態様では、好ましいペプチド、例えば、TGF-ベータペプチドは、約1-100アミノ酸、約2-50アミノ酸、約3-30アミノ酸、または約5-20アミノ酸を含むか、または、上記アミノ酸から成る。さらに別の好ましい実施態様では、ペプチドは、前述の、TGF-ベータタンパクのアミノ酸配列のいずれかの部分であって、約1-50アミノ酸、約1-40、約2-30、約3-25、約4-18、約5-15、または約6-12アミノ酸を含むか、または、上記アミノ酸から成る部分である。
【０１０２】
さらに別の実施態様では、好ましいアミノ酸配列、すなわちペプチドは、例9においてTGF-ベータ1、TGF-ベータ2、およびTGF-ベータ3についてそれぞれ数字1-21によって表示されるものである。
【０１０３】
保存的に置換されるアミノ酸は、本発明の主旨におけるペプチドの保存的類縁体、または、活性誘導体とも呼ばれ、ペプチドまたはタンパクの少なくとも一つのアミノ酸を置換することを意味する。好ましくは、少なくとも一つの酸性アミノ酸（例えば、グルタミン酸(E)、アスパラギン酸（D））は、それぞれ別のアミノ酸によって置換され、したがって、少なくとも一つの塩基性アミノ酸は、別の塩基性アミノ酸によって置換され、極性基（-OH、-SH、-CONH2）を有する少なくとも一つのアミノ酸は、極性基を有する別のアミノ酸によって置換され、および／または、純粋な炭素側鎖、例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、純粋な炭素側鎖を有する別のアミノ酸によって置換される。アミノ酸によって保存的に置換されるペプチドおよび／またはタンパクも、依然として本発明の範囲内にある。
【０１０４】
本発明のタンパクまたはペプチドのさらに別の実施態様では、ヒスチジン(H)、リシン(K)、およびアルギニン(R)から成る群から選ばれる塩基性アミノ酸の少なくとも一つは、そのTGF-ベータ拮抗作用を失うことなく、この群から選ばれる別の塩基性アミノ酸によって置換される。
【０１０５】
本発明のタンパクまたはペプチドのさらに別の実施態様では、グルタミン酸(E)およびアスパラギン酸(D)から成る群から選ばれる酸性アミノ酸の少なくとも一つは、そのTGF-ベータ拮抗作用を失うことなく、この群の他者によって置換される。
【０１０６】
TGF-ベータの一部であるペプチドであって、例9に提示される配列に比べていくつかのアミノ酸が保存的に置換されるペプチドは、TGF-ベータ1、TGF-ベータ2、および／またはTGF-ベータ3の類縁体とも呼ばれる。
【０１０７】
TGFベータ1、TGF-ベータ2、またはTGF-ベータ3の類縁体のいくつかの実施態様では、そのアミノ酸の、1から約30%、約2%から約20%、約3%から約15%、4%から約12%、または約5%から約10%が保存的に置換される。
【０１０８】
別の実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドは、単独で使用されるか、または、化学療法剤と組み合わせて使用される。さらに別の実施態様では、該オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドは、薬学的に許容可能な担体を備える医薬組成物を調製するために使用される。さらに別の実施態様では、該オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドは、新生物または固体腫瘍の治療のための医薬組成物によって構成され、さらに別の実施態様では、これらのペプチドは、本発明にしたがって新生物、または固体腫瘍、より好ましくは、グリオーマ、星状細胞種、および／またはグリア芽細胞腫を治療する方法のために使用される。
【０１０９】
一実施態様では、免疫刺激因子としての、該オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドは、少なくとも一つのポリマー、より好ましくはポリアルキレンオキシド、もっとも好ましくはポリエチレングリコールと連結される、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドである。
【０１１０】
本発明のさらに別の態様は、それぞれ、前述のように、少なくとも一つのポリマーに連結されるオリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドを含む、接合体および化合物である。
【０１１１】
ポリマーとの接合は、分子、すなわち、オリゴヌクレオチド、タンパク、またはペプチド内のどこであってもよい。オリゴヌクレオチドに関しては、連結は、オリゴヌクレオチドの3′および／または5′末端であるのが好ましい。好ましい実施態様では、同じまたは異なるタイプおよび／または分子量の複数のポリマーが、オリゴヌクレオチドの3′または／および5′末端に連結される。この3′および5′末端の用語は、それぞれ、オリゴヌクレオチドの糖成分、または、ヌクレオチド建築ブロックの炭素原子を指す。糖が他の分子によって置換される場合、この用語は類似の方法で使用され、糖成分が存在する場合と同様に、オリゴヌクレオチド、またはヌクレオチド建築ブロックと見なされることを意味する。好ましくは、オリゴヌクレオチドの5′末端に連結されるポリマー、例えば、ポリアルキレンオキシド、例えば、PEGは、該オリゴヌクレオチドの3′末端に連結されるポリアルキレンオキシドの1.5から100倍の分子量を有するか、または、オリゴヌクレオチドの3′末端に連結されるポリアルキレンオキシドは、該オリゴヌクレオチドの5′末端に連結されるポリアルキレンオキシドの1.5から100倍の分子量を有するか、または、オリゴヌクレオチドの5′末端または3′末端に連結されるポリアルキレンオキシドは、該オリゴヌクレオチドのリン酸基、糖成分、および／または任意の塩基に連結されるポリアルキレンオキシドの1.5から100倍の分子量を有するか、または、オリゴヌクレオチドのリン酸基、糖成分、および／または任意の塩基に連結されるポリアルキレンオキシドは、該オリゴヌクレオチドの5′末端または3′末端に連結されるポリアルキレンオキシドの1.5から100倍の分子量を有する。より好ましくは、オリゴヌクレオチドの5′末端に連結される、ポリマー、例えば、ポリアルキレンオキシド、例えば、PEGの分子量は、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500または4750、5000、10000、20000、50000、または1000000 Daであり、かつ、オリゴヌクレオチドの3′末端に連結されるポリアルキレンオキシドの分子量は、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500または4750、5000、10000、20000、50000、または1000000 Daであり、または、オリゴヌクレオチドの3′末端に連結される、ポリアルキレンオキシドの分子量は、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500または4750、5000、10000、20000、50000、または1000000 Daであり、かつ、該オリゴヌクレオチドの5′末端に連結されるポリアルキレンオキシドの分子量は、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500または4750、5000、10000、20000、50000、または1000000 Daであり、または、オリゴヌクレオチドの5′末端および／または3′末端に連結される、ポリアルキレンオキシドの分子量は、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500または4750、5000、10000、20000、50000、または1000000 Daであり、かつ、該オリゴヌクレオチドのリン酸基、糖成分、および／または任意の���基に連結されるポリアルキレンオキシドの分子量は、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500または4750、5000、10000、20000、50000、または1000000 Daであり、または、リン酸基、糖成分、および／または任意の塩基に連結されるポリアルキレンオキシドの分子量は、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500または4750、5000、10000、20000、50000、または1000000 Daであり、かつ、オリゴヌクレオチドの5′末端および／または3′末端に連結される、ポリアルキレンオキシドの分子量は、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500または4750、5000、10000、20000、50000、または1000000 Daである。
【０１１２】
少なくとも一つのポリマーをオリゴヌクレオチドに連結するさらに別の可能性は、例えば、フォスフォジエステル基、糖成分の他の任意のO-原子、または、各置換基の活性基に対して該ポリマーを連結することである。別の実施態様では、ポリマーは、塩基、その修飾体、その置換体の活性基に、または、リンカーおよび／またはスペーサーに連結される。ポリマーはさらに、化合物内のスペーサーに連結することも可能である。
【０１１３】
好ましくは、一接合体または化合物は、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドに連結される、一つ以上のポリマーを含む。いくつかのポリマーを連結することによって、例えば、薬理学的活性の向上、副作用の低下、細胞取り込みの向上、ハイブリダイゼーションの改善、半減期の向上、および／または毒性の低下が誘起される。
【０１１４】
前記少なくとも一つのポリマーによって連結されるオリゴヌクレオチドまたはヌクレオチド建築ブロックは、約8から約30個のヌクレオチドから成るか、または、そのようなヌクレオチドを含む。好ましいオリゴヌクレオチドは、細胞過程、特に免疫反応を抑えるか、および／または、下方調節するか、および／または否定的に作用する分子の合成および／または機能を阻害する過程に好ましくは関与する分子をコードするmRNAにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。
【０１１５】
好ましい実施態様では、これらの分子は、TGF-ベータ1、TGF-ベータ2、TGF-ベータ3、VEGF、インターロイキン-10、c-jun、c-fos、c-erbB2、それぞれの受容体、および／またはプロスタグランジンE2受容体である。オリゴヌクレオチドの、好ましいさらに別の実施態様は、例6および7の配列表に示されるか、または、WO 94/25588、WO 95/17507、WO 95/02051、WO 98/33904、WO 99/63975、WO 01/68146、WO 01/68122、WO 03/06445、WO 2005/014812、WO 2005/059133、WO 2005/084712に公刊されるオリゴヌクレオチドである。なお、これらの文書は参照により本開示に含められる。
【０１１６】
少なくとも一つのポリマーによって連結される好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号1から435の少なくとも一つを含むか、またはそれから成るか、または、例7および8の配列の少なくとも一つを含むか、またはそれから成る。
【０１１７】
特に好ましいのは、配列番号1、2、3、28、および37である。もっとも好ましいのは、配列番号：1(CGGCATGTCTATTTTGTA)および／または配列番号：28(CTGATGTGTTGAAGAACA)を含むか、または、その番号から成る。
【０１１８】
さらに別の実施態様では、オリゴヌクレオチドは、「キメラ」オリゴヌクレオチドである。本発明の主旨では、キメラオリゴヌクレオチドは、そのヌクレオチド建築ブロックの少なくとも一部が修飾される、少なくとも一つの化学的領域を含むオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、例えば、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増大、細胞取り込みの増大、および／または、標的核酸に対する結合親和性の増大を示す。
【０１１９】
一実施態様では、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオチド建築ブロックは、例えば、3′および／または2′位ではヒドロキシル基以外の、および5′位ではリン酸基以外の、低分子量有機基に共有的に結合させた糖成分を含む。この修飾された核酸は、2′-O-アルキル化糖、より好ましくはリボース基を含んでもよい。このアルキル基は、R1-R2と記載される。R1は、1から20個の炭素原子を有するアルキルであり、R2は、O-アルキル、S-アルキル、NH-アルキル、N-ジアルキル、O-アリール、S-アリール、NH-アリール、O-アラルキル、S-アラルキル、NH-アラルキルである。2′-O-アルキル基の好ましい実施態様は、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、メトキシ-エトキシ、または、他の、任意の組み合わせのアルキル基である。
【０１２０】
オリゴヌクレオチドまたはヌクレオチド建築ブロックのさらなる領域が、RNA:DNAまたはRNA:RNAハイブリッドを解離することが可能な酵素の基質として役立ってもよい。例として挙げると、RNアーゼHは、RNA:DNA2本鎖のRNA鎖を解離する、細胞内エンドヌクレアーゼである。したがって、RNアーゼHの活性化によってRNA標的の解離が実現され、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率が大きく向上する。RNA標的の解離は、通例にしたがって、ゲル電気泳動、および、要すれば、当該技術分野で既知の、関連する核酸ハイブリダイゼーション技術によって検出することが可能である。
【０１２１】
本発明の、キメラアンチセンス接合体または化合物は、前述のように、二つ以上のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド修飾体、オリゴヌクレオシド、および／または、オリゴヌクレオチド擬似体の複合構造体として形成されてもよい。このような化合物は、当該技術分野では、例えば、ハイブリッドまたはギャップマーと呼ばれている。このようなハイブリッド構造体の調製を教示する、代表的米国特許としては、これらに限定されないが、U.S. Pat. Nos.: 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; および5,700,922が挙げられる。なお、これらの文書は参照により本開示に含められる。
【０１２２】
本発明の核酸分子は、天然または合成の、プリンまたはピリミジンヘテロ環塩基を含んでもよい。プリンまたはピリミジンヘテロ環塩基としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、およびイノシンが挙げられる。他の代表的ヘテロ環塩基は、U.S. Pat. No. 3,687,808に開示される。本明細書で使用される「プリン」、または「ピリミジン」、または「塩基」という用語は、天然または合成両方のプリン、ピリミジン、または塩基を指す。
【０１２３】
別の実施態様では、オリゴヌクレオチドは、非イオン性DNA類縁体、例えば、アルキル-およびアリールリン酸塩（フォスフォン酸基の荷電酸素が、アルキルまたはアリール基によって置換される）、荷電酸素部がアルキル化される、フォスフォジエステルおよびアルキルフォスフォトリエステルが挙げられる。いずれかの末端、または両末端にジオール、例えば、テトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコールを含む核酸は、ヌクレアーゼ分解に対し実質的耐性を有することが示された。
【０１２４】
さらに別の実施態様では、塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。このような一つのオリゴマー化合物、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されるオリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸(PNA)と呼ばれる。PNA化合物では、オリゴヌクレオチドの糖バックボーンは、アミド含有バックボーン、特に、アミノエチレンバックボーンによって置換される。核酸塩基は、このバックボーンのアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する。PNA化合物の調製を教示する、代表的米国特許としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、U.S. Pat. Nos.: 5,539,082, 5,714,331, および5,719,262が挙げられる。なお、これらの文書のそれぞれは参照により本開示に含められる。PNA化合物のさらに詳細な教示は、Nielsen et al. (1994)の中に見出すことができる。
【０１２５】
別の実施態様では、デオキシリボースリン酸バックボーンは、アキラルな、ポリアミドバックボーンによって置換される。例えば、チミン連結アミノチオグリコールが調製される。これらのオリゴヌクレオチドのハイブリッドは、誘導体を形成しないオリゴヌクレオチドと比べてきわめて高度の安定性を有する。さらに詳細についてはNielsen (1991)を参照されたい。
【０１２６】
ある実施態様では、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドまたはヌクレオチド建築ブロックが、前述の修飾体の一つにおいて記載されたように修飾される。この修飾は、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオチド建築ブロックを連続的にカバーしてもよいし、不規則にカバーしてもよい。
【０１２７】
さらに別の実施態様では、前述の、少なくとも二つの修飾は、一つのオリゴヌクレオチドの内部で組み合わされる。
【０１２８】
本発明は、ポリマーおよびリンカー、スペーサー、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドの任意の組み合わせを含む。好ましい実施態様では、本接合体または化合物は、任意に少なくとも一つのリンカーおよび／またはスペーサーを介して連結される、一つの、または一つ以上のオリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチド、または、一つ以上のタンパクおよび／またはペプチドと組み合わされる、一つ以上のオリゴヌクレオチドからなる。特に、本発明による接合体は、一つ以上のポリマー、および、一つ以上のオリゴヌクレオチド、一つ以上のタンパク、一つ以上のペプチド、一つ以上のリンカー、および／または一つ以上のスペーサーを含むか、または、上記から成る。この接合体は、好ましくは、オリゴヌクレオチドおよびポリマー、または、オリゴヌクレオチド、リンカー、およびポリマー、または、オリゴヌクレオチド、および、タンパクおよび／またはペプチド、およびポリマー、または、オリゴヌクレオチド、リンカー、および、タンパクおよび／またはペプチド、およびポリマー、タンパクおよび／またはペプチド、およびポリマー、タンパクおよび／またはペプチド、リンカー、ポリマー、タンパクおよび／またはペプチド、リンカー、スペーサー、およびポリマーを含むか、上記から成る。このような接合体は、好ましくは、一つ以上のオリゴヌクレオチド、および／または、一つ以上のタンパクおよび／またはペプチド、および／または、一つ以上のリンカー、および／または、一つ以上のスペーサー、および一つ以上のポリマー、ただし該ポリマーは好ましくはポリアルキレンオキシド、より好ましくはPEGを含むか、またはそれらから成る。接合体の例は、下記に例示されるが、これらの例に本発明が限定されることを表すものではない。
【０１２９】
a)ポリマー−（オリゴヌクレオチド、タンパクまたはペプチド）n
b)（オリゴヌクレオチド、タンパクまたはペプチド）n−ポリマー
c)ポリマー−（オリゴヌクレオチド、タンパクまたはペプチド）n−ポリマー
d)ポリマー−（ポリマー、リンカーおよび／またはスペーサー−（オリゴヌクレオチド、タンパクまたはペプチド）n）x
e)（リンカーおよび／またはスペーサー−（オリゴヌクレオチド、タンパクまたはペプチド）n）x−ポリマー
f)ポリマー−（ポリマー、リンカーおよび／またはスペーサー−（オリゴヌクレオチド、タンパクまたはペプチド）n）x−ポリマー
g)ポリマー−（ポリマー、リンカーおよび／またはスペーサー−（オリゴヌクレオチド、タンパクまたはペプチド）n）x−リンカーおよび／またはスペーサー−ポリマー
h)ポリマー−（オリゴヌクレオチド）n−（タンパクおよび／またはペプチド）m
i)（オリゴヌクレオチド）n−（タンパクおよび／またはペプチド）m−ポリマー
j)ポリマー−（オリゴヌクレオチド）n−（タンパクおよび／またはペプチド）m−ポリマー
k)（リンカーおよび／またはスペーサー−（オリゴヌクレオチド）n−（タンパクおよび／またはペプチド）m）x−ポリマー
l)（リンカーおよび／またはスペーサー−（オリゴヌクレオチド）n−（タンパクおよび／またはペプチド）m）x−リンカーおよび／またはスペーサー−ポリマー
m)ポリマー−（ポリマー、リンカーおよび／またはスペーサー−（オリゴヌクレオチド）n−（タンパクおよび／またはペプチド）m）x−リンカーおよび／またはスペーサー−ポリマー
n)ポリマー−（（オリゴヌクレオチド）n−リンカー、スペーサー、および／またはポリマー−（タンパクおよび／またはペプチド）m）x
o)（（オリゴヌクレオチド）n−リンカー、スペーサー、および／またはポリマー−（タンパクおよび／またはペプチド）m）x−ポリマー
p)ポリマー（（オリゴヌクレオチド）n−リンカー、スペーサー、および／またはポリマー−（タンパクおよび／またはペプチド）m）x−ポリマー
q)ポリマー−（タンパクおよび／またはペプチド）m−（オリゴヌクレオチド）n
r)（タンパクおよび／またはペプチド）m−（オリゴヌクレオチド）n−ポリマー
s)ポリマー−（タンパクおよび／またはペプチド）m−（オリゴヌクレオチド）n−ポリマー
t)ポリマー−（ポリマー、リンカーおよび／またはスペーサー−（タンパクおよび／またはペプチド）m−（オリゴヌクレオチド）n）x
u)（リンカーおよび／またはスペーサー−（タンパクおよび／またはペプチド）m−（オリゴヌクレオチド）n）x−ポリマー
v)ポリマー−（ポリマー、リンカーおよび／またはスペーサー−（タンパクおよび／またはペプチド）m−（オリゴヌクレオチド）n）x−ポリマー
w)ポリマー−（（タンパクおよび／またはペプチド）m−ポリマー、リンカーおよび／またはスペーサー−（オリゴヌクレオチド）n）x
x)（（タンパクおよび／またはペプチド）m−ポリマー、リンカーおよび／またはスペーサー−（オリゴヌクレオチド）n）x−ポリマー
y)ポリマー−（（タンパクおよび／またはペプチド）m−ポリマー、リンカーおよび／またはスペーサー−（オリゴヌクレオチド）n）x−ポリマー
z)ポリマー−リンカーおよび／またはスペーサー−（（タンパクおよび／またはペプチド）m−ポリマー、リンカーおよび／またはスペーサー−（オリゴヌクレオチド）n）x−リンカーおよび／またはスペーサー−ポリマー
であって、上式において、m、n、およびxは、それぞれ独立に、1から20、好ましくは1から15、より好ましくは1から10、さらに好ましくは1から5、もっとも好ましくは1から3である。上記例における「ポリマー」という用語は、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドの一端、または、他の任意の部分に連結される、一つ以上のポリマーを意味する。
【０１３０】
さらに別の実施態様では、接合体または化合物は、生物学的または化学的担体と複合体を形成するか、または、組織型または細胞型指向のリガンドまたは抗体に結合される。
【０１３１】
本発明のある実施態様では、接合体または化合物の活性修飾体は、さらに別のヌクレオチド建築ブロックを有する、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドを含む。これらのヌクレオチド建築ブロックは、標的領域とのハイブリダイゼーションを支持するように、または、ハイブリダイゼーションに対し少なくとも否定的影響を及ぼさないように選ばれる。前記標的のｍRNAに対しそれぞれアンチセンス構造を有する、接合体または化合物も、本発明の範囲内にある。一実施態様では、この付加的ヌクレオチドは、mRNAのコード領域に一致し、別の実施態様では、付加的ヌクレオチドは、イントロンとエキソンを含む、mRNAの非コード部分から得られる。付加的ヌクレオチドは、3′および／または5′末端の内の少なくとも一つ、別の実施態様では、2′または5′末端の少なくとも一つに結合する、少なくとも一つのヌクレオチド、好ましくは約1から約10,000のヌクレオチド、約1から約5,000のヌクレオチド、約1から約3000のヌクレオチド、約1から約1,000のヌクレオチド、約1から約500のヌクレオチド、約1から約100のヌクレオチド、約1から約50のヌクレオチド、約1から約25のヌクレオチド、約1から約10のヌクレオチド、約1から約5のヌクレオチド、または約1から約2のヌクレオチドを含む。さらに別の実施態様では、それぞれポリヌクレオチドである、これらオリゴヌクレオチドのいくつかのヌクレオチド建築ブロックは、本明細書に記載される通りスペーサーによって修飾または置換されてもよい。
【０１３２】
誘導体形成のさらに詳細については、例えば、Gualtieri (2000)、R. Schlingensiepen (1997)、またはHecht (1997)を参照されたい。なお、これらの文献は参照により本開示に含められる。
【０１３３】
本出願の主旨におけるポリマーは、生体適合性物質、例えば、ポリアルキレンオキシド、より好ましくはポリエチレングリコール、例えば、アルファ-、オメガ-ジヒドロキシルポリエチレングリコール、生物分解性ラクトン系ポリマー、例えば、ポリアクリル酸、ポリラク酸(PLA)、ポリ（グリコール酸）（PGA）、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリシアノアクリレート、ポリイミド、ポリエチレンテレフタラート（PET、PETG）、ポリエチレンテレフタラート（PETE）、ポリテトラメチレングリコール（PTG）、またはポリウレタン、および、それらの混合物を含む。混合物とは、同じ化合物内において種々のポリマーを使用することを指し、およびブロックコポリマーも指す。ブロックコポリマーとは、ポリマーの少なくとも一セクションが、別のポリマーのモノマーから構築されるポリマーである。
【０１３４】
このような材料の選択は、ポリマーの安定性および毒性を含む、いくつかの要因に依存する。
【０１３５】
一実施態様では、免疫刺激因子などのオリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドは、少なくとも一つのポリマー、より好ましくはポリアルキレンオキシド、さらに好ましくはポリエチレングコールに連結され、ポリマーは、約0.05 kg/molから約50 kg/mol、より好ましい実施態様では約0.05 kg/molから約5 kg/mol、または約5 kg/molから約20 kg/mol、または約20 kg/molから約50 kg/molの平均重量を有する。別の実施態様では、ポリマーは、約0.05 kg/molから約1 kg/mol、約1 kg/molから約10 kg/mol、約10 kg/molから約25 kg/mol、約25 kg/molから約50 kg/molの重量を有する。さらに別の実施態様では、ポリマーは、約0.05 kg/molから約0.15 kg/mol、約0.15 kg/molから約0.25 kg/mol、約0.25 kg/molから約0.35 kg/mol、約0.35 kg/molから約0.45 kg/mol、約0.45 kg/molから約0.55 kg/mol、約0.55 kg/molから約0.65 kg/mol、約0.65 kg/molから約0.75 kg/mol、約0.75 kg/molから約0.85 kg/mol、約0.85 kg/molから約0.95 kg/mol、約0.95 kg/molから約1.05 kg/mol、約1.05 kg/molから約1150 kg/mol、約1.15 kg/molから約1.25 kg/mol、約1.25 kg/molから約1.55 kg/mol、約1.55 kg/molから約1.85 kg/mol、約1.85 kg/molから約2.15 kg/mol、約2.15 kg/molから約2.45 kg/mol、約2.45 kg/molから約2.75 kg/mol、約2.75 kg/molから約3.05 kg/mol、約3.05 kg/molから約3.35 kg/mol、約3.35 kg/molから約3.65 kg/mol、約3.65 kg/molから約4.3 kg/mol、約4.3 kg/molから約4.6 kg/mol、約4.6 kg/molから約5.5 kg/mol、約5.5 kg/molから約6.5 kg/mol、6.5 kg/molから7.5 kg/mol、7.5 kg/molから約8.5 kg/mol、8.5 kg/molから約9.5 kg/mol、9.5 kg/molから約10.5 kg/mol、10.5 kg/molから約11.5 kg/mol、11.5 kg/molから約12.5 kg/mol、12.5 kg/molから約13.5 kg/mol、13.5 kg/molから約14.5 kg/mol、14.5 kg/molから約15.5 kg/mol、15.5 kg/molから約16.5 kg/mol、16.5 kg/molから約17.5 kg/mol、17.5 kg/molから約18.5 kg/mol、18.5 kg/molから約19.5 kg/mol、19.5 kg/molから約20.5 kg/mol、20.5 kg/molから約21.5 kg/mol、21.5 kg/molから約22.5 kg/mol、22.5 kg/molから約23.5 kg/mol、23.5 kg/molから約24.5 kg/mol、24.5 kg/molから約25.5 kg/mol、25.5 kg/molから約26.5 kg/mol、26.5 kg/molから約27.5 kg/mol、27.5 kg/molから約28.5 kg/mol、28.5 kg/molから約29.5 kg/mol、29.5 kg/molから約30.5 kg/mol、30.5 kg/molから約31.5 kg/mol、30.5 kg/molから約31.5 kg/mol、30.5 kg/molから約31.5 kg/mol、31.5 kg/molから約32.5 kg/mol、32.5 kg/molから約33.5 kg/mol、33.5 kg/molから約34.5 kg/mol、34.5 kg/molから約35.5 kg/mol、35.5 kg/molから約36.5 kg/mol、36.5 kg/molから約36.5 kg/mol、36.5 kg/molから約37.5 kg/mol、37.5 kg/molから約38.5 kg/mol、38.5 kg/molから約39.5 kg/mol、39.5 kg/molから約40.5 kg/mol、40.5 kg/molから約41.5 kg/mol、41.5 kg/molから約42.5 kg/mol、42.5 kg/molから約43.5 kg/mol、43.5 kg/molから約44.5 kg/mol、44.5 kg/molから約45.5 kg/mol、45.5 kg/molから約46.5 kg/mol、46.5 kg/molから約46.5 kg/mol、46.5 kg/molから約47.5 kg/mol 47.5 kg/molから約48.5 kg/mol、48.5 kg/molから約49.5 kg/mol、49.5 kg/molから約50.5 kg/molの重量を有する。
【０１３６】
別の好ましい実施態様では、ポリマーの平均分子量は、約0.1 kg/mol、約0.2 kg/mol、約0.3 kg/mol、約0.4 kg/mol、約0.5 kg/mol、約0.6 kg/mol、約0.7 kg/mol、約0.8 kg/mol、約0.9 kg/mol、約1 kg/mol、約1.1 kg/mol、約1.2 kg/mol、約1.3 kg/mol、約1.4 kg/mol、約1.5 kg/mol、約1.5 kg/mol、約1.6 kg/mol、約1.7 kg/mol、約1.8 kg/mol、約1.9 kg/mol、約2 kg/mol、約2.2 kg/mol、約2.4 kg/mol、約2.6 kg/mol、約2.8 kg/mol、約3 kg/mol、約3.1 kg/mol、約3.2 kg/mol、約3.3 kg/mol、約3.4 kg/mol、約3.5 kg/mol、約3.6 kg/mol、約3.7 kg/mol、約3.8 kg/mol、約3.9 kg/mol、約4 kg/mol、約4.1 kg/mol、約4.2 kg/mol、約4.3 kg/mol、約4.4 kg/mol、約4.5 kg/mol、約4.6 kg/mol、約4.7 kg/mol、約4.8 kg/mol、約4.9 kg/mol、約5 kg/mol、約5.5 kg/mol、約6 kg/mol、約6.5 kg/mol、約7 kg/mol、約7.5 kg/mol、約8 kg/mol、約8.5 kg/mol、約9 kg/mol、約9.5 kg/mol、約10 kg/mol、約11 kg/mol、約12 kg/mol、約13 kg/mol、約14 kg/mol、約15 kg/mol、約16 kg/mol、約17 kg/mol、約18 kg/mol、約19 kg/mol、約20 kg/mol、約21 kg/mol、約22 kg/mol、約23 kg/mol、約24 kg/mol、約25 kg/mol、約26 kg/mol、約27 kg/mol、約28 kg/mol、約29 kg/mol、約30 kg/mol、約31 kg/mol、約32 kg/mol、約33 kg/mol、約34 kg/mol、約35 kg/mol、約36 kg/mol、約37 kg/mol、約38 kg/mol、約39 kg/mol、約40 kg/mol、約41 kg/mol、約42 kg/mol、約43 kg/mol、約44 kg/mol、約45 kg/mol、約46 kg/mol、約47 kg/mol、約48 kg/mol、約49 kg/mol、約50 kg/molである。
【０１３７】
約という用語は、市販のポリマーは、重量において完全には均一ではなく、質量によって正確には定義されないある重量を有するポリマー分画があり、これは、絶対質量、および合成および／または精製法に依存して、上記の平均質量／重量付近にて異なることを意味する。平均分子量とは、重量平均分子量を指す。一実施態様では、二つのポリマーの一方は、オリゴヌクレオチドの3′末端に連結され、第2ポリマーは、5′末端に連結されるか、または該オリゴヌクレオチドのヌクレオチド建築ブロックのそれぞれの部分に連結される。
【０１３８】
さらに別の好ましい実施態様では、3′末端に連結されるポリマーは、5′末端に連結されるポリマーと比べ、より大きな重量を有する。さらに別の好ましい実施態様では、3′-ポリマーは、5′末端に連結されるポリマーに対し1.5から100倍の分子量を有する。
【０１３９】
別の好ましい実施態様では、5′末端に連結されるポリマーは、3′末端に連結されるポリマーと比べ、より大きな分子量を有する。さらに別の好ましい実施態様では、3′-ポリマーは、5′末端に連結されるポリマーに対し1.5から100倍の分子量を有する。
【０１４０】
さらに別の好ましい実施態様では、これらのポリマーの重量比は、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:7、1:7.5、1:8、1:8.5、1:9、1:9.5、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:22、1:24、1:26、1:28、1:30、1:32、1:34、1:36、1:38、1:40、1:42、1:44、1:46、1:48、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100である。
【０１４１】
さらに別の好ましい実施態様では、小さい方のポリマーは、0.4 kg/mol、0.6 kg/mol、または0.8 kg/molの平均分子量を持ち、他方のポリマーは、0.8 kg/mol、1 kg/mol、1.2 kg/mol、1.4 kg/mol、1.6 kg/mol、1.8 kg/mol、2 kg/mol、3 kg/mol、4 kg/mol、または5 kg/molの平均分子量を有する。
【０１４２】
さらに好ましい実施態様では、ポリマーの分子量は、200 Daから50000 Da、好ましくは400 Daから40000 Da、より好ましくは400 Daから20000 Da、さらに好ましくは400 Daから10000 Daである。特にポリマーの分子量は、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、25000、26000、27000、28000、29000、30000、31000、32000、33000、34000、35000、36000、37000、38000、39000、40000、41000、42000、43000、44000、45000、460000、47000、48000、49000、50000、75000、または1000000 Daである。
【０１４３】
好ましくは、タンパクおよび／またはペプチドは、ポリマーの分子量において同じか、または異なる、少なくとも二つのポリマーに連結される。さらに好ましくは、本発明の接合体または化合物は、ポリマー、例えば、ポリアルキレンオキシド、例えば、PEG、およびオリゴヌクレオチドを含み、その際、少なくとも一つのPEGが、オリゴヌクレオチドの5′末端に連結され、少なくとも一つのPEGが、オリゴヌクレオチドの3′末端に連結され、オリゴヌクレオチドの5′-および3′-末端に連結されるPEGの分子量は同じで、かつ、<5000 Daであるか、または、オリゴヌクレオチドの5′-および3′-末端に連結されるPEGの分子量は異なる。オリゴヌクレオチドの5′-および3′-末端に連結されるPEGの分子量が同じである場合、該PEGの分子量は、好ましくは、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、または4750 Daである。オリゴヌクレオチドの5′-および3′-末端に連結されるPEGの分子量が異なる場合、5′末端に連結されるポリエチレングリコールの分子量は、好ましくは、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500または4750、5000、10000、20000、50000、または1000000 Daであり、オリゴヌクレオチドの3′末端に連結されるポリエチレングリコールの分子量は、好ましくは、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500または4750、5000、10000、20000、50000、または1000000 Daである。
【０１４４】
2本鎖RNAまたはDNAの場合、1鎖の一端がポリマーに連結されるか、1鎖の両端または両鎖の両端がポリマーに連結されるか、または、一方鎖の両端がポリマーに連結され、かつ、他方鎖の一端がポリマーに連結される。
【０１４５】
さらに、一つ以上のポリマーが、オリゴヌクレオチドの5′-および3′-末端に連結されるか、または、タンパクまたはペプチドのN-およびC-末端に連結される。それとは別に、一つ以上のポリマーが、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドの一端、および、該オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドにおける、任意の他の可能な連結点に連結される。さらに別の実施態様では、一つ以上のポリマーが、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドの両端、および、該オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドにおける、任意の他の連結点に連結される。好ましくは、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドは、該オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドの選ばれた位置において一つ以上のポリマーと特異的に連結される。
【０１４６】
好ましい実施態様では、ポリマーは、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドの各端に連結され、その際、これらのポリマーはサイズが同じであり、例えば、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、25000、26000、27000、28000、29000、30000、31000、32000、33000、34000、35000、36000、37000、38000、39000、40000、41000、42000、43000、44000、45000、460000、47000、48000、49000、50000、75000または1000000 Daの分子量を有する。特定タイプのポリマーは、単離、合成、分解の時間経過に応じてサイズが幾分異なる可能性があるので、表示の分子量は、平均分子量を表す。さらに、「同一」という用語は、ポリマーの分子量における、1から50%、好ましくは1から30%、より好ましくは1から20%、さらに好ましくは1から10%の差を含む。
【０１４７】
オリゴヌクレオチドの5′末端および3′末端、および／または、タンパクおよび／またはペプチドのN末端およびC末端に連結される、同じ分子量のポリマーは、好ましくは、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、または4750 Daの分子量を有する。
【０１４８】
さらに好ましい実施態様では、ポリマーは、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドの各端に連結され、その際、これらのポリマーはサイズが異なる。オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドに連結されるポリマーの分子量の好ましい組み合わせは、例えば、200または300、400または500、600または700、800または900、1000または1250、1500または1750、2000または2250、2500または2750、3000または3250、3500または3750、4000または4250、4500または4750または5000、および、1000または1250または1500または1750または2000または2250または2500または2750または3000または3250、3500または3750または4000または4250または4500または4750または5000または5500または6000または6500または7000または7500または8000または8500または9000または9500または10000または11000または12000または13000または14000または15000または16000または17000または18000または19000または20000または21000または22000または23000または24000または25000または26000または27000または28000または29000または30000または31000または32000または33000または34000または35000または36000または37000または38000または 39000または40000または41000または42000または43000または44000または45000または460000または47000または48000または49000または50000または75000または100000 Daのポリマーである。好ましくは、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドと連結される、ポリマーの分子量の組み合わせは、400 Daおよび800 Da、400 Daおよび2000 Da、400 Daおよび5000 Da、または、400 Daおよび20000 Daのポリマーである。
【０１４９】
一実施態様では、接合体または化合物の少なくとも一つのポリマーは、直鎖（1本鎖）である。さらに別の実施態様では、ポリマーは分枝鎖である。ポリマーの中に1本または数本の分枝があってもよく、一実施態様におけるポリマーは、ポリオキシアルキレン、より好ましくはポリエチレングリコールである。好ましくは、少なくとも二つ、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のポリマーが、リンカー、例えば、Lysコアを介して互いに連結され、分枝鎖ポリマーをもたらす。
【０１５０】
オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドと、少なくとも一つのポリマーとの間の結合は、任意に少なくとも一つのリンカーによる。ある実施態様では、リンカーは、酵素、pH値、および／または他のパラメータに対して感受性を持ち、そのため、オリゴヌクレオチドは、特異的条件下でポリマーから分断することが可能である。リンカーは、当該技術分野において公知である。さらに詳細については、Hermanson (1996)を参照されたい。ホモ二官能性リンカーの例としては、Loman試薬ジチオビス（スクシニミドプロピオネート）DSP、3′3′-ジチオビス（スルフォスクシニミジルプロピオネート（DTSSP）、ジスクシニミジルスベレート（DSS）、ビス（スルフォスクシニミジル）スベレート（BS）、ジスクシニミジルタルトレート（DST）、ジスルフォスクシニミジルタルトレート（スルフォDST）、エチレングリコビス（スクシニミジルスクシネート）(EGS)、ジスクシニミジルグルタレート(DSG)、N,N′-ジスクシニミジルカーボネート(DSC)、ジメチルアジピミデート（DMA）、ジメチルピメリミデート（DMP）、ジメチルスベリミデート(DMS)、ジメチ-3,3′-ジチオビスプロピオニミデート(DTBP)、1,4-ジ-3′-(2′-ピリジルジチオ)プロピオンアミド）ブタン(DPDPB)、ビスマレイミドヘキサン（BMH）、アリールハロゲン化物含有化合物（DFDNB、例えば、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン、または1,3-ジフルオロ-4,6-ジニトロベンゼン、4,4′-ジフルオロ-3,3′-ジニトロフェニルスルフォン（DFDNPS）、ビス-[β-(4-アジドサリチルアミド)エチル]ジスルフィド(BASED)、フォルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル、アジピン酸ジヒドラジド、カルボジヒドラジド、o-トルイジン、3,3′-ジメチルベンジジン、ベンジジン、α,α′-p-ジアミノジフェニル、ジイオド-p-キシレンスルフォン酸、N,N′-エチレン-ビス（イオドアセタミド）、N,N′-ヘキサメチレン-ビス（イオドアセタミド）がある。
【０１５１】
ヘテロ二官能性リンカーによる結合の方が、結合調節がより優れるので好ましい。ヘテロ二官能性リンカーの例としては、アミン反応性およびスルフヒドリル架橋リンカー、例えば、N-スクシニミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート（sPDP）、長鎖N-スクシニミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(LC-sPDP)、水溶性長鎖N-スクシニミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート（スルフォ-LC-sPDP）、スクシニミジルオキシカルボニル-α-メチル-α-(2-ピリジルジチオ)トルエン(sMPT)、スルフォスクシニミジル-6-[α-メチル-α-(2-ピリジルジチオ)トルアミド]ヘキサノエート（スルフォ-LC-sMPT）、スクシニミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(sMCC)、スルフォスクシニミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（スルフォ-ｓMCC）、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシニミドエステル(MBs)、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスルフォスクシニミドエステル（スルフォ-MBs）、N-スクシニミジル(4-イオドアセチル)アミノベンゾエート(sIAB)、スルフォスクシニミジル(4-イオドアセチル)アミドベンゾエート（スルフォ-sIAB）、スクシニミジル-4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート(sMPB)、スルフォスクシニミジル-4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート（スルフォ-sMBP）、N-(γ-マレイミドブチリルオキシ)スクシニミドエステル(GMBs)、N-(γ-マレイミドブチリルオキシ)スルフォスクシニミドエステル（スルフォ-GMBs）、スクシニミジル6-((イオドアセチル)アミノ)ヘキサノエート(sIAX)、スクシニミジル6-[6-(((イオドアセチル)アミノ)ヘキサノイル)アミノ]ヘキサノエート(sIAXX)、スクシニジミル4-(((イオドアセチル)アミノ)メチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(sIAC)、スクシニミジル6-((((4-イオドアセチル)アミノ)メチル)シクロヘキサン-1-カルボニル)アミノ)ヘキサノエート（sIACX）、p-ニトロフェニルイオドアセテート(NPIA)など、カルボニル-反応性およびスルフヒドリル反応性架橋リンカー、例えば、4-(4-N-マレイミドフェニル)ブチル酸ヒドラジド（MPBH）、4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシ-ヒドラジド-8（M2C2H）、3-(2-ピリジルジチオ)プロピオニルヒドラジド（PDPH）など、アミン-反応性および光反応性架橋リンカー、例えば、N-ヒドロキシスクシニミジル-4-アジドサリチル酸（NHs-AsA）、N-ヒドロキシスルフォスクシニミジル-4-アジドサリチル酸（スルフォ-NHs-AsA）、スルフォスクシニミジル-(4-アジドサリチルアミド)ヘキサノエート（スルフォ-NHs-LC-AsA）、スルフォスクシニミジル-2-(ρ-アジドサリチルアミド)エチル-1,3′-ジチオプロピオネート（sAsD）、N-ヒドロキシスクシニミジル-4-アジドベンゾエート（HsAB）、N-ヒドロキシスルフォスクシニミジル-4-アジドベンゾエート（スルフォ-HsAB）、N-スクシニミジル-6-(4′-アジド-2′-ニトロフェニルアミノ)ヘキサノエート(sANPAH)、スルフォスクシニミジル-6-(4′-アジド-2′-ニトロフェニルアミノ)ヘキサノエート（スルフォ-sANPAH）、N-5-アジド-2-ニトロベンゾイルオキシスクシニミド（ANB-NOs）、スルフォスクシニミジル-2-(m-アジド-o-ニトロベンズアミド)-エチル-1,3′-ジチオプロピオネート(sAND)、N-スクシニミジル-4(4-アジドフェニル)1,3′-ジチオプロピオネート(sADP)、N-スルフォスクシニミジル(4-アジドフェニル)-1,3′-ジチオプロピオネート（スルフォ-sADP）、スルフォスクシニミジル4-(ρ-アジドフェニル)ブチレート（スルフォ-sAPB）、スルフォスクシニミジル2-(7-アジド-4-メチルクマリン-3-アセタミド)エチル-1,3′-ジチオプロピオネート(sAED)、スルフォスクシニミジル7-アジド-4-メチルクマリン-3-アセテート（スルフォ-sAMCA）、ρ-ニトロフェニルジアゾピルベート（ρNPDP）、ρ-ニトロフェニル-2-ジアゾ-3,3,3-トリフルオロプロピオネート(PNP-DTP)など、スルフヒドリル-反応性および光反応性架橋リンカー、例えば、1-(ρ-アジドサリチルアミド)-4-(イオドアセトアミド)ブタン(AsIB)、N-[4-(ρ-アジドサリチルアミド)ブチル]-3′-(2′-ピリジルジチオ)プロピオンアミド(APDP)、ベンゾフェノン-4-イオドアセタミド、ベンゾフェノン-4-マレイミドなど、カルボニル反応性および光反応性架橋リンカー、例えば、ρ-アジドベンゾイルヒドラジド(ABH)など、カルボキシレート反応性および光反応性架橋リンカー、例えば、4-(ρ-アジドサリチルアミド)ブチルアミン（AsBA）など、および、アルギニン反応性および光反応性架橋リンカー、例えば、ρ-アジドフェニルグリオキサール（APG）などがある。
【０１５２】
好ましい実施態様では、このポリエチレンオキシドは、カルボジイミド結合を用いてオリゴヌクレオチドに連結される。さらに詳細については、Hermanson (1996)を参照されたい。
【０１５３】
合成
例えば、免疫刺激因子である、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドそれぞれの合成および精製は、当該技術分野において公知である。さらに詳細については、例えば、Gualtieri (2000)、R. Schlingensiepen (1997)、またはHecht (1997)を参照されたい。なお、これらの文献は参照により本開示に含められる。
【０１５４】
本発明において使用するために、核酸またはアミノ酸は、例えば、当該技術分野において公知のいくつかの手順の内のいずれかを用いて新たに合成される。この化合物は、合成核酸、例えば、シアノエチルフォスフォルアミダイト法(Beaucage, S.L., and Caruthers, M.H., Tet. Let. 22:1859, 1981)；またはヌクレオシド、H-フォスフォネート法(Garegg et al.、Tet. Let. 27:4051 4054、1986; Froehler et al.、Nucl. Acid. Res. 14: 5399 5407、1986、Garegg et al、Tet. Let. 27:4055 4058、1986、Gaffney et al.、Tet. Let. 29: 2619 2622、1988)を参照される。これらの化学法は、例えば、市販の、種々の自動化オリゴヌクレオチド合成機によって実施される。
【０１５５】
それとは別に、核酸またはアミノ酸、すなわち、オリゴヌクレオチド、またはタンパクまたはペプチドは、例えば、プラスミドにおいて大規模に生産され（例えば、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989参照）、例えば、小片に分割されるか、または、全体として投与される。核酸は、既知の技術、例えば、制限酵素、エキソヌクレアーゼ、またはエンドヌクレアーゼを用いる技術を用いて、例えば、既存の核酸配列（例えば、ゲノムまたはcDNA）から調製され、アミノ酸は、例えば、既存のアミノ酸配列から調製される。このようにして調製される核酸およびアミノ酸は、それぞれ、単離核酸および単離アミノ酸と呼ばれる。オリゴヌクレオチドという用語は、合成および単離核酸の両方を包含する。タンパクまたはペプチドという用語は、合成および単離アミノ酸の両方を包含する。
【０１５６】
オリゴヌクレオチド接合体合成のための一つの好ましい実施態様は、固相支持体、例えば、調節孔ガラス(CPG)に結合させた第1ヌクレオチド、およびヌクレオチドフォスフォルアミダイトを用いる固相合成法である。ヌクレオチドフォスフォルアミダイトの5′-ヒドロキシ基は、ジメトキシトリチル(DMT)によって保護され、および、塩基の環外窒素原子は、例えば、アデノシンおよびシチジンについては好ましくはベノゾイルで、および、グアノシンについては好ましくはイソブチリルによって保護される。合成サイクルは下記のように実施される。
【０１５７】
支持体結合ヌクレオチド鎖の末端5′-ヒドロキシ基のDMT保護基が除かれ、ヒドロキシ官能基は、添加ヌクレオチドのフォスフォルアミダイト基と反応させられ、亜リン酸トリエステル結合を生成する。これは酸化によって安定化してリン酸結合となる。好ましい実施態様では、この酸化は、硫化試薬、例えば、3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン、1,1-ジオキシド（Beaucage試薬）によって実施され、チオリン酸結合をもたらす。未反応5-ヒドロキシ基はキャップされ、誤った配列の合成を阻止する。この手順を、所望の数のヌクレオチドが添加されるまで繰り返す。
【０１５８】
一実施態様では、ポリマーは、該ポリマーのDMT保護フォスフォルアミダイト誘導体を、最終合成サイクルの反応添加物として用いることによってオリゴヌクレオチドの5′末端に連結される。支持体からの解離によって、塩基の脱保護が実現され、それぞれ、5′-DMT-保護オリゴヌクレオチドまたは接合体が得られる。このDMT付着産物は、好ましくは、脱トリチル化前に精製される。
【０１５９】
タンパクは、好ましくは、特に大規模生産に関しては液相で、あるいは、より好ましくは固相合成によって合成される。固相合成(SPPS)、例えば、メリフィールドによる合成は、天然のものだけではなく、場合によっては、細菌では困難であるか、または発現不可能な、非天然タンパクまたはペプチドの合成、非天然アミノ酸、ペプチド／タンパクバックボーン修飾の取り込み、および、D-アミノ酸から成るD-タンパクの合成を可能にする。不溶であるが多孔性の、小型固相ビーズ（例えば、ポリスチレン樹脂またはポリアミド樹脂）を、その上にタンパクまたはペプチド鎖を構築することが可能な、官能単位（「リンカー」）と処理する。タンパクまたはペプチドは、ビーズに対し、トリフルオロ酢酸などの試薬によってそれから解離されるまで、共有的付着を維持する。タンパクまたはペプチドは、固相に「固定」され、例えば、ろ過過程の際にも保持される。SPPSの一般原理は、結合と脱保護の反復サイクルの一つである。固相付着タンパクまたはペプチドの、遊離N-末端アミンは、N-保護単一アミノ酸単位に結合される。これは次に脱保護され、さらに別のアミノ酸の付着が可能な、新規N-末端アミンを露呈する。各工程における重要な考慮点は、各工程において高い収量を生産することで、そのため、各工程において各アミノ酸は大量に過剰に添加される（例えば、2から10x）。固相タンパク／ペプチド合成は、C末端からN末端方式で進行する。アミノ酸を結合するために、カルボキシル基は、好ましくは、例えば、カルボジイミド、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)またはジイソプロピルカルボジイミド（DIC）など、または、芳香族オキシム、例えば、1-ヒドロキシ-ベンゾトリアゾール（HOBt）、1-ヒドロキシ-7-アザ-ベンゾトリアゾール（HOAt）、HBTU、HATU、またはPyBOPなどによって活性化される。アミノ酸モノマーのN-末端は、例えば、Fmoc（9-フルオレニルメチルカルバメート）、またはt-Boc（tert-ブチルオキシルカルボニル）によって保護され、脱保護アミノ酸鎖に加えられる。成長するタンパクまたはペプチド鎖からt-Bocを取り除くには、酸性条件が用いられる（例えば、生のトリフルオロ酢酸（TFA））。側鎖保護基の除去、および、合成終了時における樹脂からのタンパクまたはペプチドの解離は、例えば、フッ化水素酸中でインキュベートすることによって実施される。成長するペプチド鎖からのFmocの除去には、塩基性条件（例えば、ピペリジンのDMF液）が用いられる。側鎖保護基の除去、および、樹脂からのタンパクまたはペプチドの解離は、例えば、TFA、脱イオン水、およびトリイソプロピルシランと共にインキュベートすることによって実施される。もう一つの保護基は、例えば、ベンジルオキシ-カルボニル(Z)基である。これは、好ましくは、側鎖保護のために使用され、例えば、HBr／酢酸、または水素添加によって除去される。もう一つの保護基は、alloc保護基で、これは、好ましくは、直交脱保護スキームが必要とされる場合、カルボン酸、ヒドロキシル、またはアミノ基を保護するために使用される。alloc保護基は、好ましくは、例えば、クロロフォルム、酢酸、およびN-メチルモルフォリンの混合液（例えば、37:2:1）と共に、テトラキス（トリフェニルフォスフィン）-パラジウムを用いることによって除去する。さらに、固相合成によって環状タンパクまたはペプチドが合成される。好ましくは、側鎖は、pHなどの反応条件に応じて、ある側鎖の特異的脱保護を可能とする、異なる保護基によって保護される。好ましくは、下記のアミノ酸が修飾のための標的とされる：Glu、Asp、Cys、Lys、Arg、Ser、Tyr、およびHis、すなわち、例えば、SerおよびThrのアルコール官能基、Tyrのフェノール基、アルギニンのグアニジン、またはCysのチオールである。
【０１６０】
好ましくは、タンパクまたはペプチドのNH2基は、ポリマー、例えば、PEGの特異的結合のために選択的に保護される。例えば、保護基Aは、タンパクまたはペプチドのN末端を保護し、保護基Bは、割り当てられたLys側鎖NH基を保護し、保護基Cは、ポリマーに連結されてはならない、側鎖の全てのNH2基に連結される。例えば、保護基A、B、およびCは、タンパクまたはペプチドの合成およびポリマーの連結のために使用され、基Aは、第1工程で選択的に脱保護され、該タンパクまたはペプチドは、部位Xにおいてポリマーに選択的に連結される。第2工程において、保護基Bが選択的に除かれ、該タンパクまたはペプチドは、部位Yにおいてさらに別のPEGに選択的に連結される。最終工程において、該タンパクまたはペプチドは支持体から解離され、ポリマーに対する連結が意図されない、残りの保護基Cが除去される。
【０１６１】
さらに、タンパクまたはペプチド合成は、マイクロ波技術であって、各単一工程が、単一方式マイクロ波装置において、例えば、30秒以内に実施される技術によって実現される。
【０１６２】
それとは別に、より大きなタンパクまたはペプチドは、二つ以上の、より小さいペプチドまたはタンパクの未修飾化学的連結によって構築される。未修飾化学的連結では、C末端チオエステルを含むペプチドまたはタンパクは、例えば、外来のチオール触媒の存在下に、N-末端システインを含む別のタンパクまたはペプチドと反応する。第1工程では、交差性チオエステル化が起こる。第2工程では、産物は、通常の反応条件下で非可逆的に再編されてアミド結合を形成する。未修飾化学的連結に使用が可能なタンパクまたはペプチドチオエステルは、例えば、BOC化学SPPSによって調製される。さらに、組み換えDNA技術によって生産される、タンパクまたはポリペプチドのC末端チオエステルは、未修飾連結化学によって、N末端Cys含有タンパクまたはポリペプチドと反応して、大型の半合成タンパクまたはポリペプチドを与える。
【０１６３】
さらに別の実施態様では、少なくとも一つのポリマーが、溶液中のオリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドに連結される。オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドに対する、少なくとも一つのポリマーの連結は、該オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチド、および／またはポリマーの特定の基を活性化し、次いでこれらの分子を連結することによって実施される。ポリマーの結合のために好ましいのは、オリゴヌクレオチドの3′-および／または5′-末端、または、タンパクおよび／またはペプチドのN末端および／またはC末端である。別の実施態様では、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドを含む、またはそれらから成る接合体において、一つ以上のポリマーは、好ましくは、オリゴヌクレオチドの5′末端に連結され、一つ以上のポリマーは、タンパクおよび／またはペプチドのC末端に連結され；または、一つ以上のポリマーは、好ましくは、タンパクおよび／またはペプチドのN末端に連結され、一つ以上のポリマーは、オリゴヌクレオチドの3′末端に連結され；または、一つ以上のポリマーは、好ましくは、オリゴヌクレオチドの5′末端に連結され、かつ、一つ以上のポリマーは、タンパクおよび／またはペプチドのN末端に連結され；または、一つ以上のポリマーは、好ましくは、オリゴヌクレオチドの3′末端に連結され、かつ、一つ以上のポリマーは、C末端に連結され、その際、ポリマーは、特に、ポリアルキレンオキシド、より好ましくはPEGである。好ましくは、それらのポリマーは、オリゴヌクレオチドおよび／またはペプチドに直接連結されるか、またはより好ましくは、一つ以上のリンカーおよび／またはスペーサーを介して連結される。
【０１６４】
さらに別の実施態様では、少なくとも一つのポリマーは、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドの別部分に結合する。ある実施態様では、オリゴヌクレオチドのこの別部分は、リン酸基であり、別の実施態様では、一つ以上のポリマーは、ヌクレオチドの糖成分、または、ヌクレオチド建築ブロックの各成分の2′-Oに結合する。さらに別の実施態様では、ポリマーは、ヌクレオチド塩基の活性基に結合する。別の実施態様では、少なくとも一つのヌクレオチドまたは一アミノ酸ではなく、スペーサーが使用される。スペーサーは、リンカー、またはリンカーの代わりとなるものと一緒に使用されることが好ましい。この少なくとも一つのポリマーは、このスペーサーに対しても同様に結合することが可能である。オリゴヌクレオチドに対し、そのオリゴヌクレオチドの前述の部分の異なる部位において、いくつかのポリマーを結合させることが可能である。
【０１６５】
別の実施態様では、一つ以上のポリマーは、タンパクまたはペプチドの任意のアミノ酸に対し、特に、一つ以上のアミノ酸のSH-、OH-、またはNH-基に対して結合する。タンパクおよびペプチドは、それぞれ、好ましくは、そのN末端（アルファ-アミン）、およびリシン側鎖（イプシロン-アミン）の官能基を介して結合する。さらに、タンパクまたはペプチドの遊離システイン残基がPEG化されるか、または、遊離システインが無い場合は、そのようなシステイン残基を、タンパクまたはペプチド中に、部位指定突然変異によるＰＥＧ化のための特定部位を作製する遺伝子工学によって、または、イミノチオランによるアミノ基の修飾によって導入することが可能である。オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドを含む接合体に関する好ましい実施態様では、一つ以上のポリマーは、好ましくは、該オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドの一端または両端に連結され；または、一つ以上のポリマーは、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドの一端または両端に連結され、および／または、オリゴヌクレオチドの別部分、例えば、オリゴヌクレオチドの糖成分のリン酸基および／または2′-O、および／または、タンパクおよび／またはペプチドの別部分、例えば、一つ以上のアミノ酸のSH-またはNH-基に連結される。ポリマーは、好ましくは、リンカーおよび／またはスペーサーを介して、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドに連結され、その際、一つ以上のポリマーは、該リンカーおよび／または該スペーサーの末端および／または別部分に連結されるか、および／または、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドが、該リンカーおよび／または該スペーサーの末端および／または別部分に連結される。
【０１６６】
任意に、リンカーおよび／またはスペーサーは、オリゴヌクレオチド、またはその任意の誘導体の、塩基、糖、リン酸成分に連結されるが、その際、該リンカーおよび／またはスペーサーは、ポリマー、例えば、ポリアルキレンオキシド、例えば、PEGと反応するのに好適な官能基を担持する。好ましくは、官能基は、保護基によって保護され、この保護基は、ポリマーとの反応前に除去される。同じことがタンパクまたはペプチドにも当てはまる、すなわち、リンカーおよび／またはスペーサーは、糖タンパクの任意のアミノ酸、または糖成分と結合させることが可能である。
【０１６７】
ポリマーは、天然供給源から合成または単離される、それぞれのモノマーの重合によって合成される。それらの多くは、市販されているか、または、標準合成法によって実現され、例えば、Braun (2005)が参照される。
【０１６８】
オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドに対する、ポリマー、より好ましくはポリオキシアルキレン、さらに好ましくはポリエチレングリコールの共有的付着は、既知の化学合成技術によって達成される。さらに詳細についてはHermanson (1996)を参照されたい。
【０１６９】
例えば、免疫刺激因子としてのオリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドを、少なくとも一つの、または少なくとも二つのポリマーと連結するのは、COOH、CHO、OH、NH2、SHなどの分子の活性基の反応性によって実現される。一般に、一つの活性基が活性化され、次いで、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドの別の活性基に連結される。
【０１７０】
ある好ましい実施態様では、好ましい官能基の選択的誘導体形成は、連結されてはならない他の官能基を保護基によって保護することによって実現される。例えば、免疫刺激因子としてのオリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドの、少なくとも一つのポリマーとの連結後、これらの保護基は除去される。
【０１７１】
ある実施態様では、少なくとも一つのポリマーに対する、例えば、免疫刺激因子としてのオリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドの連結は、固相上で実施され、さらに別の実施態様では、この連結は溶液中で実施される。
【０１７２】
本発明の接合体または化合物生産のための好ましい方法は、下記の工程：a)オリゴヌクレオチド、タンパク、またはペプチド修飾体を含む、オリゴヌクレオチド、タンパク、またはペプチドを単離または合成すること、b)オリゴヌクレオチドの5′末端または3′末端、および／または、タンパクまたはペプチドのN末端またはC末端、および／または、タンパクまたはペプチドを形成するアミノ酸の他の反応基、および／または、オリゴヌクレオチドのリン酸基、糖成分、および／または塩基、および／または、タンパクまたはペプチドのSH-、OH-、および／またはNH-基、または他の任意の官能基、例えば、チロシン-OH、または環状タンパク、または、糖タンパクのペプチドおよび／または糖成分を保護すること、および、c)少なくとも一つのポリマー、例えば、ポリアルキレンオキシド、例えば、PEGを、オリゴヌクレオチドの、未保護の3′末端または5′末端、および／または、タンパクまたはペプチドの未保護のC末端またはN末端に連結すること、を含む。任意に、方法はさらに、工程：d)保護された、オリゴヌクレオチドの5′末端または3′末端、および／または、タンパクまたはペプチドのN末端またはC末端、および／または、オリゴヌクレオチドのリン酸基、糖成分、および／または塩基、および／または、タンパクまたはペプチドのSH-および／またはNH-基を脱保護すること、およびe)少なくとも一つのポリマー、例えば、ポリアルキレンオキシド、例えば、PEGを、オリゴヌクレオチドの、脱保護された5′末端または3′末端、および／または、オリゴヌクレオチドの脱保護されたリン酸基、糖成分、および／または塩基、および／または、タンパクまたはペプチドの、脱保護されたN末端またはC末端、および／または、タンパクまたはペプチドの、脱保護されたSH-および／またはNH-基に連結することを含む。一旦、少なくとも一つのポリマー、例えば、ポリアルキレンオキシド、例えば、PEGが、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドに連結されたならば、この接合体は、任意に、一つ以上の精製工程、例えば、FPLC、例えば、イオン交換FPLC、逆相HPLC、限外ろ過などによって精製される。一般に、好ましくは、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドは、ポリマー、例えば、ポリアルキレンオキシド、例えば、PEGに接合され、次いで、この接合体は、例えば、FPLCまたはHPLCによって精製され、例えば、SpeedVacにおいて乾燥され、例えば、限外ろ過によって脱塩され、再び乾燥される。さらに別のポリマー、例えば、ポリアルキレンオキシド、例えば、PEGを接合させる場合、サンプルは水またはバッファーに溶解され、ポリマーとインキュベートされ、精製、乾燥、脱塩、および再乾燥される。
【０１７３】
接合体は、好ましくは、乾燥形で保存されるか、水、または、TEAAまたはTEAなどのバッファーに溶解される。
【０１７４】
オリゴヌクレオチドの5′-PEG化
5′ポリマー連結のための好ましい一実施態様、より好ましくはオリゴヌクレオチドにポリマーを連結する（例えば、PEG化）実施態様では、ポリマー（例えば、PEG）は、フォスフォルアミダイトとして活性化される。この実施態様では、例えば、トリエタノールアミン(TEA)および4-ジメチルアミノピリジン(DMAP)の存在下に過剰のポリマーをジメトキシトリフェニルメチルクロリドと反応させることによって、DMT保護PEGが調製される。ジイソプロピルエチルアミンの存在下にDMT-PEGを2-シアノエチル-ジイソプロピルクロロフォスフォルアミダイトと反応させることによって、DMT-ポリマー-フォスフォルアミダイトが得られ、これは次いで、好ましくは、CPG固相支持体における標準的オリゴヌクレオチド合成の最終サイクルにおける反応剤として使用される。
【０１７５】
一実施態様では、中間産物が、カラムクロマトグラフィーによって精製される。接合体は、好ましくは、例えば、RP-HPLCによってDMT付着産物として精製される。酢酸による脱トリチル化後、最終産物は、好ましくは、限外ろ過によって脱塩される。
【０１７６】
オリゴヌクレオチドの5′-ポリマー連結
別の好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドは、5′末端において、少なくとも一つのポリマー（例えば、ポリオキシエチレン、PEG）に連結される。このオリゴヌクレオチドは、例えば、最終サイクルにフォスフォルアミダイトを用いる、通例のオリゴヌクレオチド合成によって調製され、例えば、5′-アミノ基（5′-アミノ修飾因子）、または5′-チオール基（5′チオール修飾因子）の形成をもたらす。5′-アミノ修飾因子、5′-チオール修飾因子は、それぞれ、ヌクレオチド建築ブロック糖成分の5′-ヒドロキシ基に共有的に結合するリンカーとなり、それぞれ、ポリマーとの連結のための活性基としてSH基にNH2を付加する。修飾因子のこの基は、脱保護後に、例えば、Hermanson(1996)によって記載される標準手順にしたがって、市販の、または、特注合成の、官能基付きPEGに連結される。
【０１７７】
オリゴヌクレオチドの官能基がNH2である好ましい一実施態様では、好適な官能化ポリマー（例えば、PEG）は、例えば、NHS-エステル、NHS-カルバメートまたはNHS-カルボン酸塩、4-ニトロフェニルエステル、または、別様に活性化されるカルボン酸である。
【０１７８】
例えば、免疫刺激因子としてのオリゴヌクレオチドの官能基がSH基である、さらに別の実施態様では、ポリマー、より好ましくはPEGの官能基は、例えば、マレイミド、またはジチオジピリジル-活性化スルフヒドリルである。
【０１７９】
オリゴヌクレオチドの3′-PEG化
オリゴヌクレオチドの3′末端にポリマーを連結する（例えば、3′-PEG化）ための、別の好ましい実施態様では、ポリマーは、カルボキシ官能基を形成させたCPG-支持体に連結される。一実施態様では、これは、DMAPの存在下に無水コハク酸を用いてアミノプロピル化CPG支持体をコハク酸化することによって調製される。コハク酸化CPGのカルボキシル基は、例えば、DMAPおよびジイソプロピルエチルアミンの存在下に、O-ベンゾトリアゾール-N,N,N′,N′-テトラメチルウロニウム-ヘキサフルオロリン酸(HBTU)によって活性化し、次いで、ポリマー（例えば、PEG）と反応させる。得られたポリマー修飾支持体を、標準的オリゴヌクレオチド合成における固相支持体として使用すると、その3-末端を介してポリマーに連結されるオリゴヌクレオチドが得られる。例えば、32% NH3による、支持体からの解離によって、脱保護、PEG修飾、DMT付着産物が得られ、これは次に、例えば、酢酸によって脱トリチル化される。
【０１８０】
オリゴヌクレオチドの3′-PEG化
さらに別の好ましい実施態様では、3′-修飾オリゴヌクレオチドは、市販の、または特注合成の支持体、例えば、3′-アミノ修飾剤、または3′-チオール修飾剤を使用した標準的固相オリゴヌクレオチド化学によって調製される。この主旨における3′-アミノ修飾剤、3′-チオール修飾剤は、それぞれ、固相支持体であって、ヌクレオチドの3′末端が、直鎖によって該固相支持体に連結され、そのため、オリゴヌクレオチドがカラムから解離されると、3′末端NH2またはSH官能基が得られる。一実施態様では、この得られる3′-修飾オリゴヌクレオチドは、市販の、または特注合成の官能化PEGに対し、例えば、Hermanson (1996)に記載されるような標準的手順にしたがって連結される。
【０１８１】
さらに別の好ましい実施態様では、アミノ修飾オリゴヌクレオチドに対しポリマー（例えば、PEG）を連結するための官能基は、例えば、NHS-エステル、NHS-カルバメートまたはNHS-カルボネート、4-ニトロフェニルエステル、またはその他のやり方で活性化されるカルボン酸である。スルフヒドリルに対するポリマー連結（PEG接合）のために好適な官能基としては、マレイミド、またはジチオジピリジル活性化スルフヒドリルがある。
【０１８２】
オリゴヌクレオチドの3′,5′-ジポリマー連結
さらに好ましい実施態様では、ポリマー（例えば、PEG）は、オリゴヌクレオチドの3′-および5′-末端に連結される。一実施態様では、二つのポリマーによって連結されるこれらのオリゴヌクレオチドは、ポリマー修飾CPG支持体におけるオリゴヌクレオチド合成の最終サイクルにおいて、例えば、DMT-ポリマー-フォスフォルアミダイトを用いて、前述の実施態様を組み合わせることによって調製される。
【０１８３】
オリゴヌクレオチドの3′,5′-ジPEG化
さらに別の好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドの両端、3′-および5′-末端に結合する少なくとも一つのポリマー（例えば、PEG）を含む化合物は、3′-修飾剤および5′-修飾剤を用いて、前述の溶液相化学の実施態様を組み合わせることによって調製される。さらに別の実施態様では、少なくとも二つのポリマーに対するオリゴヌクレオチドの連結は、固相化学および液相化学の組み合わせによって実施される。
【０１８４】
さらに別の実施態様では、例えば、免疫刺激因子としてのオリゴヌクレオチドは、同じ二つの官能基（例えば、SH、OH、NH2）を有する。このオリゴヌクレオチドは、同じポリマーを接合させるのに好適である。
【０１８５】
別のさらに好ましい実施態様では、例えば、免疫刺激因子としてのオリゴヌクレオチドは、少なくとも二つの異なる官能基（例えば、SH、OH、NH2）を有する。このオリゴヌクレオチドは、異なるポリマーを接合させるのに好適である。好ましいポリマーの組み合わせとしては、例えば、PEGおよびポリアクリル酸、ポリ乳酸、ポリ（グリコール酸）、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリシアノアクリレート、ポリイミド、ポリエチレンテレフタラート（PET、PETG）、ポリエチレンテレフタレート（PETE）、ポリテトラメチレングリコール（PTG）、またはポリウレタン、およびそれらの混合物が挙げられる。
【０１８６】
タンパクまたはペプチドのPEG化
好ましくは、タンパクまたはペプチドは、タンパクまたはペプチドのN-末端ばかりでなく、アミノ酸側鎖も使用される、メリフィールド法にしたがって合成される。
【０１８７】
タンパクPEG化の好ましい実施態様では、PEGは、例えば、トリクロロ-s-トリアジン（TsT；シヌアル酸）によって活性化される。TsTとPEGの反応は、例えば、該ポリマーのヒドロキシル基に対するエーテル結合を有する活性化誘導体の形成をもたらす。TsT-活性化PEGにより、例えば、タンパクまたはペプチドのスルフヒドリルおよびアミン基に対する連結、または、それぞれ、チロシンのフェノレートおよびフェニール環への連結が得られる。
【０１８８】
別の実施態様では、PEGは、第1工程において、好ましくは、無水物、例えば、無水コハク酸または無水グルタール酸によって活性化され、一端または両端にカルボキシレートを有するPEGを形成する；それとは別に、PEGの末端ヒドロキシル基は、フォスゲンによって処理するか、酸化してカルボキシレートとする。その後、このカルボキシレート基は、例えば、スルフヒドリルおよび／またはヒドロキシル基、および、一次および二次アミンと反応させて、活性化NHSエステルとする。NHSエステル基は、好ましくは、タンパクまたはペプチドのN-末端においてアルファアミンと反応する。好ましい別態様では、PEGは、N-ヒドロキシスクシニミジルクロロフォルメート、またはN,N′-ジスクシニミジルカルボネートによって活性化される。タンパクの場合、さらに別のアミン結合部位の利用が可能である。
【０１８９】
さらに別の実施態様では、無水コハク酸または無水グルタール酸によるPEGのアシル化によって、両端にカルボキシレートを有するbis-修飾産物が得られる。mPEGを修飾することによって、単一カルボキシレートを含む、モノ置換誘導体が得られる。一旦カルボキシレート-PEG修飾が形成されたならば、これは、例えば、カルボジイミド活性化を用いて、アミン含有分子に結合させるのに好適である。
【０１９０】
別の実施態様では、PEGは、N,N′-カルボニルジイミダゾール(CDI)によって活性化され、次いで、タンパクまたはペプチドに結合する。このようなCDI活性化PEGは、乾燥状態、または、水を含まない有機溶媒において数年間安定である。
【０１９１】
PEGの活性化、および、タンパクまたはペプチドへの結合のための、さらに別の実施態様は、アルカリ条件下においてPEGをエピクロールヒドリンと反応させ、PEGのエポキシ誘導体を形成すること、または、活性エステル-マレイミドヘテロ二官能性架橋リンカーを介してスルフヒドリル反応性PEGを創製すること、または、1-ヒドロキシ-2-ニトロ-4-ベンゼンスルフォン酸のN-マレイミド-6-アミノカプロイルエステル、すなわちMoffat酸化、を創製することである。
【０１９２】
この新規合成タンパクまたはペプチドは、選択的条件、例えば、酸性または塩基性条件下において、または水素添加によって除去することが可能な保護基を含む。割り当てられた結合部の選択的脱保護の後、固相支持体結合タンパクまたはペプチドは、ポリマー、活性化ポリマー、例えば、活性化ポリアルキレンオキシド、例えば、PEGとインキュベートされ、該ポリマーは、タンパクまたはペプチドの反応基に結合する。その後、タンパクまたはペプチドは、支持体から解離され、脱保護された、特に、選択的に脱保護されたタンパクまたはペプチド、例えば、アミノ酸側鎖においてPEG化されたタンパクまたはペプチドは、任意に、別の時間に、ポリマー、例えば、PEG、好ましくは、活性化PEGとインキュベートされる。この第2インキュベーションによって、例えば、別の結合部位、例えば、該タンパクまたはペプチドのN-末端において、さらに別のPEG化が得られる。それとは別に、固相支持体に結合され、側鎖保護されたタンパクまたはペプチドのN-末端保護基が、特定条件、例えば、酸性または塩基性条件下に除去され、該タンパクまたはペプチドは、ポリマー、好ましくは活性化ポリマーとインキュベートされ、それによって、N-末端においてポリマーに連結されるタンパクまたはペプチドが得られる。このタンパクまたはペプチドは、支持体から解離され、任意に再び、ポリマーと第２の時間にインキュベートされ、ポリマーをＣ末端に、好ましくは活性化されるC-末端に連結される。その後、側鎖の保護基は除去される。それとは別に、側鎖の保護基は、ポリマーがN末端に連結された後除去され、最終工程で、タンパクまたはペプチドは、支持体から解離される。さらに別の実施態様では、保護されたN末端および側鎖を有するタンパクまたはペプチドは、支持体から解離され、ポリマー、好ましくは活性化ポリマーとインキュベートされる。一旦ポリマーがC-末端に連結されたならば、側鎖およびN-末端の保護基は、任意に、特異的に、例えば、酸性および／または塩基性条件下に除去され、タンパクは、任意に、別時間にポリマーとインキュベートされる。さらに別の実施態様では、ポリマーは、糖タンパクの糖成分、および、任意に、タンパクのN末端、C末端、および／または側鎖に連結される。好ましくは、糖タンパクの糖成分は、過ヨウ素酸ナトリウムを用いた酸化により特異的に修飾可能となり、反応性アルデヒド官能基を生成する。これらの官能基は、直接接合か、または、ヘテロ二官能性リンカー、例えば、PDPHまたはMPBHを介する結合のために使用するのに好適であり、いずれの場合も、SH反応性官能基が得られる。このスルフヒドリル基は、最終的に、直接ポリマーと、または、リンカーおよび／またはスペーサーを介してポリマーと反応する。
【０１９３】
応用
ヒトの治療に有用であるだけでなく、本発明はさらに、他の対象、例えば、獣医学対象動物、爬虫類、鳥類、外来動物など、および農場動物、例えば、哺乳類、げっ歯類などにも有用である。哺乳類としては、ウマ、イヌ、ブタ、ネコ、または霊長類（例えば、サル、チンパンジー、またはキツネザル）が挙げられる。げっ歯類としては、ラット、ウサギ、マウス、リス、またはモルモットが挙げられる。
【０１９４】
本発明にしたがって少なくとも一つのポリマーと連結されるオリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドは、種々のルートを通じて投与するのに好適である。これらの投与ルートとしては、例えば、ただしこれらに限定されないが、電気穿孔、表皮、皮膚への圧入、動脈内、関節内、頭蓋内、硬膜下腔内、脳内、皮内、病巣内、筋肉内、鼻腔内、眼球内、腹腔内、前立腺内、肺内、脊髄内、気管内、腫瘍内、静脈内、生体腔内の嚢内設置、鼻腔吸引、経口、肺吸引（例えば、噴霧器による粉末またはエロゾルの吸引または吸い込みによる）、皮下、真皮下、経皮、または局所（眼内を含む、および、膣および直腸送達など粘膜への）ルートが挙げられる。局所投与はさらに、皮膚、眼球、および耳への投与を含む。
【０１９５】
投与は、治療される病状の重度および反応性に依存し、治療コースは、数日から数ヶ月、または、治癒が実現されるか、または、病状の緩和が達成されるまで持続する。最適投与スケジュールは、例えば、患者の体内における薬剤蓄積の測定から計算される。当業者なら、最適用量、投与法、および反復率を簡単に決定する。最適用量は、少なくとも一つのポリマーを有する個々のオリゴヌクレオチドの相対的効力に応じて変動してもよいが、一般に、インビトロおよびインビボ動物モデルにおいて有効と認められるEC50値に基づいて推定される。一般に、例えば用量は、体重kg当たり0.01 μgから100 gであり、毎日、毎週、毎月、または毎年、または場合によっては2年から20年毎に、1回以上、例えば、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、または10回与えられてもよい。当業者なら、例えば、体液または組織における薬剤の、滞在時間および濃度の測定値に基づいて投与の反復率を推定する。効果的治療の後で、病状の再発を阻止するために、少なくとも一つのポリマーを有するオリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドを、体重kg当たり0.01μgから100 gの範囲で、毎日、毎週、毎月、または毎年、または場合によっては2年から20年毎に、1回以上、例えば、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、または10回維持用量として投与する、維持治療を患者に受けさせることが望ましい場合がある。
【０１９６】
一実施態様では、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドに連結される少なくとも一つのポリマーは、薬学的に許容可能な担体内にある。薬学的に許容可能な担体内にある接合体または化合物は、医薬組成物、または組成物とも呼ばれる。
【０１９７】
薬学的に許容可能な担体（賦形剤）とは、薬学的に許容可能な溶媒、縣濁性乳化剤、または、動物に化合物を送達するための、他の任意の、薬学的に不活性なベヒクルである。薬学的に許容可能な担体は、例えば、液体または固体であり、核酸、および、その医薬組成物の他の成分と組み合わされた時に、所望の容量、質感などを提示するように、思い描く投与方式に基づいて選ばれる。典型的な、薬学的に許容可能な担体としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、結合剤（例えば、あらかじめゼラチン化されたトウモロコシでん粉、ポリビニールピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖類、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、または、リン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルカム、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素添加植物油、トウモロコシでん粉、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えば、でん粉、グリコール酸でん粉ナトリウムなど）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられる。持続放出経口送達システム、および／または、経口投与剤形用腸融解コーティングが、米国特許第4,704,295号；4,556,552号；4,309,406号；および4,309,404号に記載される。アジュバントは、これらの言説の中に含まれる。
【０１９８】
局所投与用の医薬組成物および処方としては、例えば、経皮パッチ、ペースト、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴剤、坐剤、グロブリ（globuli）、スプレー、液剤およびパウダーが挙げられる。従前の薬学的キャリヤー、水性、パウダー性または油性を基礎とするもの、増粘剤などが必要とされるか、または所望されることがある。コート被覆コンドーム、グローブなどが有用である場合もある。
【０１９９】
経口投与用の組成物および処方としては、散剤または顆粒剤、縣濁液、乳液、または、水または非水性媒体における溶液、カプセル、粉末剤、または錠剤が挙げられる。ある実施態様では、増粘剤、芳香剤、希釈剤、乳化剤、分散補助、または結合剤が用いられる。
【０２００】
別の実施態様では、非経口、硬膜下腔内、脳内（i.c.）、または静脈内投与のための医薬組成物としては、例えば、滅菌水溶液が挙げられ、ある実施態様では、これは、バッファー、希釈剤、および、浸透強化剤などの、他の適切な添加剤、担体化合物、および他の、薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む。
【０２０１】
他の実施態様では、医薬組成物はさらに、例えば、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／または、ペプチドの消化器送達を強化するために浸透強化剤を含む。浸透強化剤は分類されて、例えば、五つの広い範疇、すなわち、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、界面活性剤、および非界面活性剤（Lee (1991), Maruhashi (1990)の内の一つに帰属される。これらの広い範疇の内の一つ以上から選ばれる、一つ以上の浸透強化剤は、例えば、本発明による組成物の中に含まれる。
【０２０２】
浸透強化剤として作用する、各種脂肪酸およびその誘導体としては、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸塩、トリカプリン酸塩、リシオレート（ricioleate）、モノオレイン(1-モノオレオイル-rac-グリセロール)、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセル1-モノカプリン酸塩、1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、アシルカルニチン、アシルコリン、モノ-およびジ-グリセリド、および生理学的に許容可能な、その塩（例えば、オレイン酸塩、ラウリル酸塩、カプリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、リノール酸塩など）(Lee (1991), Muranishi (1990), El-Harini (1992))が挙げられる。いくつかの現在好まれる脂肪酸の例としては、0.5から5%の濃度で単独または組み合わせて使用される、カプリン酸ナトリウムおよびラウリン酸ナトリウムがある。
【０２０３】
胆汁の生理的役割としては、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が含まれる（Burton 1996）。各種の天然胆汁酸塩およびその合成誘導体は、浸透強化剤として作用する。したがって、「胆汁酸塩」という用語は、胆汁の天然成分の任意のもの以外に、その合成誘導体の任意のものを含む。現在好まれる胆汁酸塩は、一般に0.5から2%の濃度で使用される、ケノデオキシコール酸(CDCA)(Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.)である。
【０２０４】
特に、一つ以上の浸透強化剤を含む複合処方が使用される。複合処方を製造するために、例えば、胆汁酸塩が、脂肪酸と組み合わせて使用される。好ましい組み合わせとしては、カプリン酸ナトリウムまたはラウリン酸ナトリウムと組み合わせた（一般に、0.5から5%）CDCAが挙げられる。
【０２０５】
キレート剤としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、ジナトリウムエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、クエン酸、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナトリウム、5-メトキシサリチレート、およびホモバニレート）、コラーゲンのN-アシル誘導体、および、ベータジケトン類のラウレト-9およびN-アミノアシル誘導体（Lee (1991)）, Muranishi (1990), Buur (1990)が挙げられる。キレート剤は、例えば、RNアーゼ阻害剤としても作用するという、別の利点を有する。
【０２０６】
界面活性剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン-9-エーテル、およびポリオキシエチレン-20-セチルエーテル(Lee (1991))、および、過フッ化化学乳液、例えば、FC-43(Takahashi (1988))が挙げられる。
【０２０７】
非界面活性剤としては、例えば、不飽和環状尿素、1-アルキル、および1-アルケニルアザシクロ-アルカノン誘導体(Lee (1991)、および、非ステロイド性抗炎症剤、例えば、ジクロフェナックナトリウム、インドメタシン、およびフェニルブタゾン(Yamashita (1987))が挙げられる。
【０２０８】
本発明の化合物を患者の体内に導入するための方法とは無関係に、該化合物のインビボでの安定性を強化するための、および／または、特定の器官、組織、または細胞型に向けて該化合物を標的するための送達ベヒクルとして、コロイド分散システムを用いてもよい。コロイド分散システムとしては、例えば、ただしこれらに限定されないが、巨大分子複合体、ナノカプセル、ナノ小球、マイクロカプセル、微小球、ビーズ、および脂質系システム、例えば、水中油乳液、ミセル、混合ミセル、リポソーム、および、非定型構造を有する脂質化合物複合体などが挙げられる。好ましいコロイド分散システムは、複数のリポソームである。リポソームは、顕微鏡的小球であって、二層形状に配置される脂質から構成される一つ以上の外層（単数または複数）によって囲まれる水性コアを有する球である(Chonn (1995))。
【０２０９】
本発明の医薬組成物の、酸性形態が存在する、ある実施態様では、好ましくは、該酸から、塩およびエステル形態が形成されるが、そのような形態は全て、本発明において使用される、接合体、化合物、またはオリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドという用語の意味の中に含まれる。薬学的に許容可能な塩は、本発明において採用される化合物の非毒性塩を意味し、一般に、遊離酸を、適切な有機または無機の塩基と反応させることによって調製されるもの、特に、陽イオン、例えば、ナトリウム、カリウム、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、亜鉛、およびテトラメチルアンモニウムから形成されるもの以外に、アミン類、例えば、アンモニア、エチレンジアミン、N-メチルグルカミン、リシン、アルギニン、オルニチン、コリン、N,N′-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、プロカイン、N-ベンジルフェネチルアミン、1-p-クロロベンジル-2-ピロリジン-1′-メチルベンジミダゾール、ジエチルアミン、ピペラジン、およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンから形成される塩である。
【０２１０】
治療法
本発明の、少なくとも一つのポリマーと連結される、例えば、免疫刺激因子としてのオリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチド、または、一つ以上の接合体または化合物を含む医薬組成物は、疾病または障害をコントロール、予防、および／または治療するのに好適である。好ましい実施態様では、この接合体および化合物は、それぞれ、または医薬組成物は、不要新生物、例えば、癌、上皮癌、線維症、および／または眼病または障害のコントロール、予防、および／または治療以外に、HIVなどのウィルス性疾患または障害のコントロール、予防、および／または治療に好適である。さらに、本発明は、癌、線維症、およびウィルス性疾患または障害の群から選ばれる疾患または障害のコントロール、予防、および／または治療のための、本発明による接合体または化合物、または医薬組成物の使用をその主題とする。
【０２１１】
好ましい例では、医薬組成物は、少なくとも一つのポリマーに連結される、例えば、免疫刺激因子としての、少なくとも一つのオリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドを含む。好ましくは、この医薬組成物は、接合体または化合物が本発明の方法によって生産され、薬学的に許容可能な担体が添加される方法によって生産される。任意に、本医薬組成物はさらに、活性物質、キレート剤、界面活性剤、脂肪酸、浸透強化剤、乳化剤、潤滑剤などを含む。
【０２１２】
少なくとも一つのポリマーに連結される、例えば、免疫刺激因子としての、少なくとも一つのオリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドを含む、例えば、免疫刺激因子としての、オリゴヌクレオチド、タンパク、および／またはペプチドによって、または、そのような接合体を含む、またはそのような接合体から成る医薬組成物によって、コントロール、予防、および／または治療が可能な新生物、癌、または上皮癌としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、固体腫瘍、血液起源腫瘍、例えば、白血病、急性または慢性骨髄性、またはリンパ芽球白血病、腫瘍転移、良性腫瘍、例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、化膿性肉芽腫、前悪性段階腫瘍、慢性関節リューマチ、乾癬、星状細胞腫、聴神経腫、芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、ユーイング腫瘍、髄芽細胞腫、グリオーマ、血管芽細胞腫、ホジキンリンパ腫、髄芽腫、白血病、中皮腫、神経芽細胞腫、神経線維腫、非ホジキンリンパ腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、肉腫（血管肉腫、軟骨肉腫、内皮肉腫、線維肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管内皮肉腫、リンパ管肉腫、メラノーマ、髄膜腫、筋肉腫、オリゴデンドログリオーマ、骨原性肉腫、骨肉腫など）、セミノーマ、トラコーマ、ウィルムス腫瘍が挙げられ、または、胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、気管支原性癌、腎臓の癌、頸部癌、絨毛癌、嚢胞腺癌、胎生期癌、上皮癌、食道癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、胆嚢癌、胃癌、頭部癌、肝癌、肺癌、髄様癌、頸部癌、非小細胞気管支原性／肺癌、卵巣癌、すい臓癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、前立腺癌、小腸癌、前立腺上皮癌、直腸癌、腎細胞癌、皮膚癌、小細胞気管支原性／肺癌、扁平上皮細胞癌、皮脂腺癌、睾丸癌、子宮癌の群から選ばれる。
【０２１３】
本発明の接合体、および、一つ以上のそのような接合体を含む医薬組成物は、種々の免疫障害、例えば、自己免疫疾患または障害、例えば、糖尿病、関節炎、例えば、慢性関節リューマチ、若年性関節リューマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎など；多発性硬化症、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス（erythematosus）、自己免疫甲状腺炎、皮膚炎、例えば、アトピー性皮膚炎、湿疹性皮膚炎など；乾癬、シェーグレン症候群、クローン病、アフタ様潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、らい病逆転反応、らい性結節性紅斑、自己免疫ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳障害、特発性両側性進行性感覚神経性聴力損失、再生不良貧血、赤芽球貧血、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ウェーゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スチーブンス-ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーブス病、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後ブドウ膜炎、および間質性肺線維症、移植片対宿主病、移植症例、および、アレルギー、例えば、アトピー性アレルギーなどの疾患のコントロール、予防、および／または治療に好適である。この接合体または医薬組成物はさらに、循環器病または障害、例えば、高血圧、アテローム硬化症、冠状動脈痙縮、うっ血性心不全、冠状動脈疾患、弁膜病、不整脈、および心筋症；またはウィルス疾患または障害、例えば、A型肝炎(HVA)、B型肝炎（HVB）、C型肝炎（HVC）、または、単純ヘルペスウィルス（HSV）、HIV、FIV、ポリオウィルス、インフルエンザウィルス、アデノウィルス、パピローマウィルス、エプスタインバーウィルス、および痘瘡ウィルスによって引き起こされる疾患または障害、または、ウィルス関連癌、例えば、肝細胞癌のコントロール、予防、および／または治療にも好適である。
【０２１４】
本発明の接合体、および、一つ以上のそのような接合体を含む医薬組成物はさらに、例えば、不要なTGF-ベータシグナル伝達に関連する線維症または障害、例えば、ただしこれらに限定されないが、腎臓障害、および（過度の）線維症および／または硬化症、例えば、全ての病因による糸球体腎炎(GN)、例えば、メサンギウム増殖性GN、免疫GN、三日月型GN；糖尿病腎症、腎間質性線維症、腎間質性線維症の全ての原因、例えば、高血圧、薬剤被爆の合併症、例えば、移植片レシピエントのシクロスポリン治療から生じる腎線維症、HIV-関連腎症、または移植腎症；（過度の）肉芽形成および（進行性）硬化症に関連する肝臓病、例えば、全ての病因による肝硬変、胆管分枝の障害、および肝機能不全；肺線維症、それによるガス交換の低下、または、肺の効率的換気能の低下、例えば、成人呼吸困難症候群（ARDS）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、特発性肺線維症(IPF)、急性肺傷害(ALI)、または、感染性病原体、または有毒因子、例えば、煙、薬品、アレルゲン、または自己免疫疾患などによる肺線維症；線維増殖状態を伴う眼病または障害、例えば、全ての病因による線維増殖性硝子体網膜症、または、眼科手術、例えば、緑内障治療、剥離網膜整復、白内障抽出、または、任意の種類の排水処置；例えば、外傷または手術創による外傷治癒の際に起こる、真皮の、過度のまたは肥大的肉芽形成などの、線維症または障害のコントロール、予防、および／または治療に好適である。
【０２１５】
下記の例は、本発明をさらに具体的に説明するのに役立つものではあるが、同時に、それに対する何らの限定を構成するものではない。むしろ、本明細書の記載の読了後、本発明の概念から逸脱することなく、当業者にとっては自ずから明らかにされる、他の、様々な実施態様、本発明の改変および等価物の援用が可能となる筈であることをはっきりと理解しなければならない。特に、オリゴヌクレオチドの5′-または3′-末端、タンパクおよび／またはペプチドのN末端またはC末端の修飾に関して記載される方法は、両端において修飾される接合体の生産のために組み合わせることが可能である。さらに、5′3′-、またはN-/C-末端修飾接合体に関して開示される方法は、一端のみが修飾されるか、または、一端と、糖成分、塩基、NH-またはSH-基などが修飾されるように変更することが可能である。
【実施例】
【０２１６】
例１
5′-PEG化オリゴヌクレオチドの合成
1) DMT-PEG 200、-300、-400、-500、-600、-700、-800、-900、-1000、-1250、-1500、-1750、-2000、-2250、-2500、-2750、-3000、-3250、-3500、-3750、-4000、-4250、-4500、-4750、-5000、-10000、-20000、-50000または-1000000の合成
DMT=ジメトキシトリチル
PEG 200、-300、-400、-500、-600、-700、-800、-900、-1000、-1250、-1500、-1750、-2000、-2250、-2500、-2750、-3000、-3250、-3500、-3750、-4000、-4250、-4500、-4750または-5000、-10000、-20000、-50000または-1000000(20.0 mmol)は、5 mlのピリジン（分子篩いで乾燥）から2度蒸発させ、P4O10上で4日間真空乾燥した。このPEG 200、-300、-400、-500、-600、-700、-800、-900、-1000、-1250、-1500、-1750、-2000、-2250、-2500、-2750、-3000、-3250、-3500、-3750、-4000、-4250、-4500、-4750、- 5000、-10000、-20000、-50000または-1000000は、ジクロロメタン(5 ml、還流し、CaH2によって蒸留)およびトリエチルアミン(7.21 mmol、還流し、CaH2によって蒸留)に溶解し、4-ジメチル-アミノピリジン(0.21 mmol)を加えた。次いで、1時間以内に4,4′-ジメトキシトリフェニルメチルクロリド(4.5 mmol)を加え、混合物を暗所中で24時間攪拌した。この混合物を、50 mlのジクロロメタンで希釈し、25 mlの5%炭酸水素ナトリウムで2度、25 mlの水で1度抽出した。有機相を乾燥し（Na2SO4）、回転蒸発によって濃縮した。
【０２１７】
混合物は、シリカゲル60（直径0.063-0.100 mm）のカラムクロマトグラフィーにおいて、溶媒、クロロフォルム：メチルアルコール：トリエチルアミン(96.5:3:0.5)によって精製した。産物は、NMRによって特定した。
【０２１８】
2) DMT-PEG 200、-300、-400、-500、-600、-700、-800、-900、-1000、-1250、-1500、-1750、-2000、-2250、-2500、-2750、-3000、-3250、-3500、-3750、-4000、-4250、-4500、-4750、-5000、-10000、-20000、-50000または-1000000-フォスフォルアミダイトの合成
DMT-PEG 200、-300、-400、-500、-600、-700、-800、-900、-1000、-1250、-1500、-1750、-2000、-2250、-2500、-2750、-3000、-3250、-3500、-3750、-4000、-4250、-4500、-4750、-5000、-10000、-20000、-50000、または-1000000 (0.41 mmol)は、1:10比において、30 mlのピリジン（分子篩いで乾燥）／ジクロロメタン（還流し、CaH2によって蒸留)から2度蒸発させ、P4O10上で6日間真空乾燥した。このDMT-PEG 200、-300、-400、-500、-600、-700、-800、-900、-1000、-1250、-1500、-1750、-2000、-2250、-2500、-2750、-3000、-3250、-3500、-3750、-4000、-4250、-4500、-4750、-5000、-10000、-20000、-50000、または-1000000は、ジクロロメタン(970μl、還流し、CaH2によって蒸留)、およびジイソプロピルエチルアミン(1.65 mmol、還流し、およびCaH2によって蒸留)に溶解し、2-シアノエチル-ジイソプロピルクロロフォスフォルアミダイト(0.63 mmol)を加えた。混合物を暗所中で30分攪拌した（薄層クロマトグラフィー(TLC)：シリカゲル60 F254、ジクロロメタン／酢酸エチル／トリエチルアミン、45/45/10によって反応検出）。メチルアルコール(20μl、マグネシウムと共に蒸留)を加えた。この混合物を、6 mlのジクロロメタンで希釈し、10 mlの5%炭酸水素ナトリウムで2度、10 mlの蒸留水で2度抽出した。有機相を乾燥し（Na2SO4）、回転蒸発によって濃縮した。
【０２１９】
混合物は、クロマトグラフィー（シリカゲル60（直径0.040-0.063 mm）；ジクロロメタン：酢酸エチル：トリエチルアミン、45/45/10)によって精製した。産物は、NMRによって特定した。
【０２２０】
3) 5´-PEG 200、-300、-400、-500、-600、-700、-800、-900、-1000、-1250、-1500、-1750、-2000、-2250、-2500、-2750、-3000、-3250、-3500、-3750、-4000、-4250、-4500、-4750、-5000、-10000、-20000、-50000、または-1000000-オリゴヌクレオチド接合体の合成
オリゴヌクレオチドは、1000Åアデノシン-CPG（10マイクロモル、Expedite Synthesizer (PerSeptive Biosystems)を用い、g支持体当たり38マイクロモルを負荷）による標準的フォスフォルアミダイト化学によって合成した。オリゴヌクレオチドの5′-OHは、該SynthesizerにおいてDMT-PEG 400-フォスフォルアミダイト（mlアセトニトリル当たり50 mg）を用いてPEG化した。DMT基の負荷を計算するために、分液を取り、0.1 Mトルエン-4-スルフォン酸を加え、解離DMT-陽イオンの吸光度を、260 nmにおいて定量した（負荷：11.2μmol）。産物を、支持体から解離し、55℃で16時間32% NH3を用いることによって脱保護した。この未精製産物を乾燥し、逆相HPLCによって精製した（TOSOHAAS, Amberchrom CG-300S （逆相）、35μm; 125 x 4.7 mm；アセトニトリル／0.1M酢酸トリエチルアンモニウム pH7.5）。室温で15分80%酢酸を用いて、このオリゴヌクレオチドを脱トリチル化し、NAP-10-カラム(Amersham Bioscicences)を用いて脱塩し、凍結乾燥した。
【０２２１】
各種の実験で得られた接合体は：PEG 400-オリゴヌクレオチド、PEG 600-オリゴヌクレオチド、PEG 800-オリゴヌクレオチド、PEG 1000-オリゴヌクレオチド、PEG 1500-オリゴヌクレオチド、PEG 2000-オリゴヌクレオチド、PEG 5000-オリゴヌクレオチド、PEG 20000-オリゴヌクレオチド、PEG 50000-オリゴヌクレオチドであった。
【０２２２】
分析
a)MALDI-TOF：マトリックス：3-ヒドロキシピコリン酸、リフレクターモード、分子量を定量した。
b)キャピラリーゲル電気泳動：キャピラリー：融合シリカキャピラリー、40 cm；内径、100μm；外径、360μm；バッファー、10%バッファー液、pH2.5、HPCE用（0.1 Mリン酸ナトリウムバッファー）、および、0.1%（ヒドロキシプロピル）メチルセルロースの90%水溶液；サンプル、10 pmolオリゴヌクレオチド／μl（水溶液）；電圧、8 kV；極性、−から＋まで；動作時間、30分；動作、キャピラリーを、加圧下に、0.1M NaOH (0.2μmろ過)で60秒、バッファーで120秒流通させ、サンプル注入した（加圧下に5秒）；結果、20.5分に広汎なピーク。
【０２２３】
例２
5′-PEG化オリゴヌクレオチドの合成（図8）
1)オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドは、フォスフォルアミダイト化学によって合成した。この方法では、オリゴヌクレオチドの5′末端は、アミノ官能化される、すなわち、5′末端は、アミノ基である官能基を含む。
【０２２４】
2)NHSエステル- PEG 200、-300、-400、-500、-600、-700、-800、-900、-1000、-1250、-1500、-1750、-2000、-2250、-2500、-2750、-3000、-3250、-3500、-3750、-4000、-4250、-4500、-4750、-5000、-10000、-20000、-50000、または-1000000の合成
NHSエステル- PEG 200、-300、-400、-500、-600、-700、-800、-900、-1000、-1250、-1500、-1750、-2000、-2250、-2500、-2750、-3000、-3250、-3500、-3750、-4000、-4250、-4500、-4750、-5000、-10000、-20000、-50000、または-1000000は、当該技術分野で既知の任意の方法によって生産することが可能である。
【０２２５】
3) 5´-PEG 200、-300、-400、-500、-600、-700、-800、-900、-1000、-1250、-1500、-1750、-2000、-2250、-2500、-2750、-3000、-3250、-3500、-3750、-4000、-4250、-4500、-4750、-5000、-10000、-20000、-50000、または-1000000-オリゴヌクレオチド接合体の合成
5′-末端アミノ官能基形成オリゴヌクレオチドを、反応バッファー（60% 0.3M NaHCO3, pH8.5/40% DMF）に溶解し、例えば、1μmolオリゴヌクレオチドを1.6 ml反応バッファーに溶解し(0.625μmol/ml)、37℃まで温める。次いで、この37℃のオリゴヌクレオチドに、28μmolの、NHSエステル- PEG 200、-300、-400、-500、-600、-700、-800、-900、-1000、-1250、-1500、-1750、-2000、-2250、-2500、-2750、-3000、-3250、-3500、-3750、-4000、-4250、-4500、-4750、-5000、-10000、-20000、-50000、または-1000000を2時間以内に順次加える。オリゴヌクレオチドに全てのNHS-エステルを加えた後、サンプルを、振とう器(100 rpm)の上で37℃で16時間インキュベートする。次いで、サンプルを、SpeedVacで乾燥する。
【０２２６】
a)別態様I：乾燥サンプルは、1 mlの0.01M TEAA pH7.5に溶解し、イオン交換FPLC (IE-FPLC)において精製し、加水分解NHSおよびPEG 200、-300、-400、-500、-600、-700、-800、-900、-1000、-1250、-1500、-1750、-2000、-2250、-2500、-2750、-3000、-3250、-3500、-3750、-4000、-4250、-4500、-4750、-5000、-10000、-20000、-50000、または-1000000を除去する。適切なイオン交換カラムは、例えば、Toyopearl SuperQ-650M 150x16 mmであり、溶出バッファーは、0.01 M TEAA + 2M NaCl pH7.5であり、流速は4 ml/分である。その後、サンプルは、MWCO 1000 Daの限外ろ過膜使用の限外ろ過によって脱塩し、4バーのN2の加圧によってNaCl濃度を下げるか、除去する。この脱塩サンプルを、室温でSpeedVacで乾燥する。
【０２２７】
b)別態様II：乾燥サンプルは、1 mlの0.01M TEAA pH7.5に溶解し、逆相HPLCによって精製して、加水分解NHSおよびPEG 200、-300、-400、-500、-600、-700、-800、-900、-1000、-1250、-1500、-1750、-2000、-2250、-2500、-2750、-3000、-3250、-3500、-3750、-4000、-4250、-4500、-4750、-5000、-10000、-20000、-50000、または-1000000を除去する。使用されるカラムは、0.1M TEAA pH7.5で平衡される、Phenomenex Polymerx RP1 100A 10x25 mmであり、サンプルは、アセトニトリルによって溶出される。PEG接合オリゴヌクレオチドを含むサンプルは、SpeedVacにおいて乾燥され、その後、乾燥サンプルは、100 μlの1M酢酸ナトリウム液、および1.9 mlの水に溶解される。サンプルは、最終的に再びSpeedVacにおいて乾燥される。
【０２２８】
c)別態様III：オリゴヌクレオチドに全てのNHS-エステルを加えた後、サンプルを、振とう器(100 rpm)の上で37℃で16時間インキュベートする。次いで、SpeedVac内で、サンプルの容量を0.5 mlに減少し、DMF含量を下げる。2.5 mlの水を、0.5 mlのサンプルに加え、次にこれを、IE-EPLCによって精製する（別態様Iを参照）。別態様IIIのために使用されるバッファーシステムは、バッファーA：0.01M NaHCO3 pH8.5、およびバッファーB：0.001M NaHCO3 + 2M NaCl pH8.5であり、4 ml／分の流速を使用する。その後、PEG接合オリゴヌクレオチドを含むサンプルは、MWCO 1000 Daの限外ろ過膜使用の限外ろ過によって脱塩し、3.2バーのArの加圧によってNaClおよびNaHCO3濃度を下げるか、除去する。最終的に、このサンプルはSpeedVac内で乾燥する。
【０２２９】
分析
MALDI-TOF：マトリックス：3-ヒドロキシピコリン酸、リフレクターモード、分子量を定量した。
【０２３０】
例３
PEG-アミダイトによる5′-PEG化オリゴヌクレオチドの合成
1)オリゴヌクレオチド合成：
オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの5′末端がDMT保護される、フォスフォルアミダイト化学によって合成される。
【０２３１】
2) PEG-200、-300、-400、-500、-600、-700、-800、-900、-1000、-1250、-1500、-1750、-2000、-2250、-2500、-2750、-3000、-3250、-3500、-3750、-4000、-4250、-4500、-4750、-5000、-10000、-20000、-50000、または-1000000-アミダイトの合成
PEG-アミダイトは市販されている。
【０２３２】
3) 5′-PEG 200、-300、-400、-500、-600、-700、-800、-900、-1000、-1250、-1500、-1750、-2000、-2250、-2500、-2750、-3000、-3250、-3500、-3750、-4000、-4250、-4500、-4750、-5000、-10000、-20000、-50000、または-1000000-オリゴヌクレオチド接合体の合成
一旦オリゴヌクレオチドが、CPG支持体の上で合成されたならば、PEG-アミダイトを加え、オリゴヌクレオチド合成機の上でさらに別の結合サイクルを実施する。その後、PEG化オリゴヌクレオチドを、該接合体を40℃で16時間700μlのアンモニアとインキュベートすることによって、支持体から解離する。次いで、接合体をSpeedVacで乾燥し、ペレットを、200 μlの0.1M TEAA pH7.5に溶解し、最終的に、逆相HPLC（Phenomenex Jupiter 5μ C18カラム 300Å 4.6x250 mm；バッファーA、0.1M TEAA pH7.5；バッファーB、アセトニトリル）によって精製する。接合体は、SpeedVacにおいて乾燥し、脱塩し、再び乾燥する。
【０２３３】
例４
3′-PEG化オリゴヌクレオチドの合成
1)調節孔ガラス（CPG）支持体のコハク酸形成
無水コハク酸(44μmol)および4-ジメチルアミノピリジン(22μmol)を、ピリジン(440μl)に溶解した。この混合物を、アミノプロピル化CPG支持体に加え(4.4μmol)、室温で混ぜ合わせた。20時間後、溶媒を除去し、CPG支持体を、1 mlのジクロロメタンで5度、1 mlのアセトニトリルで3度洗浄した。未反応アミノ基を調べるため、CPG支持体の分画（約1 mg）を取り、50μlのニンヒドリン液（エタノールml当たり50 mgのニンヒドリン）を加えた。55℃で10分後、色はまったく検出されなかった。
【０２３４】
2)コハク酸形成CPG支持体のPEG化
2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート（HBTU、1.5 mmol）、4-ジメチルアミノピリジン(1.5 mmol)、およびジイソプロピルエチルアミン(1.5 mmol)をアセトニトリル(11.25 ml)に溶解した。この混合液を、コハク酸形成CPG支持体に加えた（結合、1参照）；約13.2μmol）。次いで、PEG 200、-300、-400、-500、-600、-700、-800、-900、-1000、-1250、-1500、-1750、-2000、-2250、-2500、-2750、-3000、-3250、-3500、-3750、-4000、-4250、-4500、-4750、-5000、-10000、-20000、-50000、または-1000000 (6.36 mmol)を加え、その混合物を室温で混ぜ合わせた。20時間後、溶液を除去し、CPG支持体を、15 mlのジクロロメタンで3度、15 mlのアセトニトリルで3度洗浄した。
【０２３５】
3)オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチドは、Expedite Synthesizerを用いてPEG化CPG支持体について、標準的フォスフォルアミダイト化学によって合成した。産物を、支持体から解離し、55℃で16時間32% NH3を用いることによって脱保護した。この未精製産物を乾燥し、逆相HPLCによって精製した（TOSOHAAS, Amberchrom CG-300S （逆相）、35μm; 125 x 4.7 mm；アセトニトリル／0.1M酢酸トリエチルアンモニウムpH7.5）。室温で15分80%酢酸を用いて、このオリゴヌクレオチドを脱トリチル化し、NAP-10-カラム(Amersham Bioscicences)を用いて脱塩し、凍結乾燥した。
【０２３６】
各種の実験で得られた接合体は：3′-PEG 400-オリゴヌクレオチド、3′-PEG 600-オリゴヌクレオチド、3′-PEG 800-オリゴヌクレオチド、3′-PEG 1000-オリゴヌクレオチド、3′-PEG 1500-オリゴヌクレオチド、3′-PEG 2000-オリゴヌクレオチド、3′-PEG 5000-オリゴヌクレオチド、3′-PEG 20000-オリゴヌクレオチド、および3′-PEG 50000-オリゴヌクレオチドであった。
【０２３７】
分析
a)MALDI-TOF：マトリックス：3-ヒドロキシピコリン酸、リフレクターモード、分子量を定量した。
b)キャピラリーゲル電気泳動：キャピラリー：融合シリカキャピラリー、40 cm；内径、100μm；外径、360μm；バッファー、10%バッファー液、pH2.5、HPCE用（0.1 Mリン酸ナトリウムバッファー）、0.1%（ヒドロキシプロピル）メチルセルロースの90%水溶液；電圧、8 kV；極性、−から＋まで；動作時間、30分；サンプル濃度、約10 pmolオリゴヌクレオチド／μl（水溶液）。方法：I)キャピラリーの準備：キャピラリーを、加圧下に還流：水（蒸留水、孔直径0.2μmでろ過)で360秒；0.1M NaOH（孔直径0.2μmでろ過)で120秒；水（蒸留水、孔直径0.2μmでろ過)で360秒、
II)動作：キャピラリーを、加圧下で、0.1M NaOH (0.2μmろ過)で60秒、バッファーで120秒リンスした；サンプル注入（加圧下に5秒）；結果、20分に広汎なピーク。
【０２３８】
例５
3′-PEG化オリゴヌクレオチドの合成
1) オリゴヌクレオチド合成:
オリゴヌクレオチドを、例えば、Glenの、PT 3′-アミノ修飾因子C6 CPG、または3′-アミノ修飾因子C7 CPG、または、例えば、ProligoのAmino On CPGにおいて合成される（全て、アミノリンカーを含む）。合成プロトコールは、チオエートに対する標準的塩基結合プロトコールである。一旦オリゴヌクレオチドが合成されたならば、接合体を、40℃で12時間700 μlのアンモニアとインキュベートすることによって、支持体から解離する。その後、サンプルはSpeedVacで乾燥し、ペレットを、100μlの水に溶解する。次に、サンプルを、逆相HPLC（Phenomenex Jupiter 5μ C18カラム 300Å 4.6x250 mm；バッファーA、0.1M TEAA pH7.5；バッファーB、アセトニトリル）によって精製し、再び乾燥する。次に、サンプルを、再び、200 μlの80%酢酸に溶解し、NAPカラムによって脱塩し、SpeedVacにおいて乾燥する。
【０２３９】
2) 3′-PEG 200、-300、-400、-500、-600、-700、-800、-900、-1000、-1250、-1500、-1750、-2000、-2250、-2500、-2750、-3000、-3250、-3500、-3750、-4000、-4250、-4500、-4750、-5000、-10000、-20000、-50000、または-1000000-オリゴヌクレオチド接合体の合成
精製3′-アミノ修飾オリゴヌクレオチドを、反応バッファー(DMF/NaHCO3 pH8.5, 40:60)、または20μl DMF/1μl DIEAに溶解した、12.5xモル過剰の、PEG 200、-300、-400、-500、-600、-700、-800、-900、-1000、-1250、-1500、-1750、-2000、-2250、-2500、-2750、-3000、-3250、-3500、-3750、-4000、-4250、-4500、-4750、または-5000、-10000、-20000、-50000、または-1000000-NHSとインキュベートする。180μlの水を加えて反応を停止させ、サンプルを、逆相HPLC（Phenomenex Jupiter 5μ C18カラム 300A 4.6x250 mm；バッファーA、0.1M TEAA pH7.5；バッファーB、アセトニトリル）によって精製する。最終的に、サンプルは凍結乾燥する。
【０２４０】
例６
3′5′-PEG化オリゴヌクレオチドの合成
1)調節孔ガラス（CPG）支持体のコハク酸形成
無水コハク酸(44μmol)および4-ジメチルアミノピリジン(22μmol)を、ピリジン(440μl)に溶解した。この混合物を、アミノプロピル化CPG支持体に加え(4.4μmol、負荷：440μl)、室温で混ぜ合わせた。22時間後、溶液を除去し、CPG支持体を、1 mlのジクロロメタンで5度、1 mlのアセトニトリルで3度洗浄した。未反応アミノ基を調べるため、CPG支持体の分画（約1 mg）を取り、50μlのニンヒドリン液（エタノールml当たり50 mgのニンヒドリン）を加えた。55℃で10分後、色はまったく検出されず、遊離アミノ基の存在しないことを示した。
【０２４１】
2)コハク酸形成CPG支持体のPEG化
2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート（HBTU、3.0 mmol）、4-ジ（メチル）アミノピリジン(3.0 mmol)、およびジイソプロピルエチルアミン(3.0 mmol)をアセトニトリル(22.5 ml)に溶解した。この混合液を、コハク酸形成CPG支持体に加えた（約26.4 μmol）。次いで、PEG 200、-300、-400、-500、-600、-700、-800、-900、-1000、-1250、-1500、-1750、-2000、-2250、-2500、-2750、-3000、-3250、-3500、-3750、-4000、-4250、-4500、-4750、-5000、-10000、-20000、-50000、または-1000000 (12.7 mmol)を加え、その混合物を室温で混ぜ合わせた。24時間後、溶媒を除去し、CPG支持体を、10 mlのジクロロメタンで3度、10 mlのアセトニトリルで3度洗浄した。
【０２４２】
3)3′-PEG化オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチドを、Expedite Synthesizerを用いてPEG化CPG支持体について、フォスフォルアミダイト化学によって合成した。さらに詳細については、R. Schlingensiepen (1997)を参照されたい。DMT基の負荷を計算するために、分液を取り、0.1 Mトルエン-4-スルフォン酸を加え、解離DMT-陽イオンの吸光度を、260 nmにおいて定量した（負荷：16.8 μmol）。
【０２４３】
4)オリゴヌクレオチドの5′-PEG化
アセトニトリル（乾燥）に溶解した、DMT-PEG 200、-300、-400、-500、-600、-700、-800、-900、-1000、-1250、-1500、-1750、-2000、-2250、-2500、-2750、-3000、-3250、-3500、-3750、-4000、-4250、-4500、-4750、-5000、-10000、-20000、-50000、または-1000000-フォスフォルアミダイトをExpediate Synthesizerにおいて用いることによってオリゴヌクレオチドをPEG化した。DMT基の負荷を計算するために、分液を取り、0.1 Mトルエン-4-スルフォン酸を加え、解離DMT-陽イオンの吸光度を、260 nmにおいて定量した（負荷：6.3μmol）。
【０２４４】
産物を、支持体から解離し、55℃で16時間32% NH3を用いることによって脱保護した。この未精製産物を乾燥し、逆相HPLCによって精製した（TOSOHAAS, Amberchrom CG-300S （逆相）、35μm; 125 x 4.7 mm；アセトニトリル／0.1M酢酸トリエチルアンモニウムアセテート pH7.5）。室温で15分80%酢酸を用いて、このオリゴヌクレオチドを脱トリチル化し、NAP-10-カラム(Amersham Bioscicences)を用いて脱塩し、凍結乾燥した。
【０２４５】
種々の実験における好ましい最終産物は、下記の構造を有する、3′5′-、または5′3′-PEG化オリゴヌクレオチドである、すなわち：PEG 200-オリゴヌクレオチド-PEG 200、PEG 300-オリゴヌクレオチド-PEG 300、PEG 400-オリゴヌクレオチド-PEG 400、PEG 500-オリゴヌクレオチド-PEG 500、PEG 600-オリゴヌクレオチド-PEG 600、PEG 700-オリゴヌクレオチド-PEG 700、PEG 800-オリゴヌクレオチド-PEG 800、PEG 900-オリゴヌクレオチド-PEG 900、PEG 1000-オリゴヌクレオチド-PEG 1000、PEG 1250-オリゴヌクレオチド-PEG 1250、PEG 1500-オリゴヌクレオチド-PEG 1500、PEG 1750-オリゴヌクレオチド-PEG 1750、PEG 2000-オリゴヌクレオチド-PEG 2000、PEG 2250-オリゴヌクレオチド-PEG 2250、PEG 2500-オリゴヌクレオチド-PEG 2500、PEG 2750-オリゴヌクレオチド-PEG 2750、PEG 3000-オリゴヌクレオチド-PEG 3000、PEG 3250-オリゴヌクレオチド-PEG 3250、PEG 3500-オリゴヌクレオチド-PEG 3500、PEG 3750-オリゴヌクレオチド-PEG 3750、PEG 4000-オリゴヌクレオチド-PEG 4000、PEG 4250-オリゴヌクレオチド-PEG 4250、PEG 4500-オリゴヌクレオチド-PEG 4500、PEG 4750-オリゴヌクレオチド-PEG 4750、PEG 5000-オリゴヌクレオチド-PEG 5000、PEG 200-オリゴヌクレオチド-PEG 500、PEG 200-オリゴヌクレオチド-PEG 600、PEG 200-オリゴヌクレオチド-PEG 700、PEG 200-オリゴヌクレオチド-PEG 800、PEG 200-オリゴヌクレオチド-PEG 900、PEG 200-オリゴヌクレオチド-PEG 1000、PEG 300-オリゴヌクレオチド-PEG 500、PEG 300-オリゴヌクレオチド-PEG 600、PEG 300-オリゴヌクレオチド-PEG 800、PEG 300-オリゴヌクレオチド-PEG 1000、PEG 300-オリゴヌクレオチド-PEG 1500、PEG 300-オリゴヌクレオチド-PEG 2000、PEG 400-オリゴヌクレオチド-PEG 600、PEG 400-オリゴヌクレオチド-PEG 800、PEG 400-オリゴヌクレオチド-PEG 1000、PEG 400-オリゴヌクレオチド-PEG 1500、PEG 400-オリゴヌクレオチド-PEG 2000、PEG 400-オリゴヌクレオチド-PEG 5000、PEG 400-オリゴヌクレオチド-PEG 20000、PEG 400-オリゴヌクレオチド-PEG 50000、PEG 500-オリゴヌクレオチド-PEG 800、PEG 500-オリゴヌクレオチド-PEG 1000、PEG 500-オリゴヌクレオチド-PEG 1250、PEG 500-オリゴヌクレオチド-PEG 1500、PEG 500-オリゴヌクレオチド-PEG 1750、PEG 500-オリゴヌクレオチド-PEG 2000、PEG 500-オリゴヌクレオチド-PEG 2250、PEG 500-オリゴヌクレオチド-PEG 2500、PEG 500-オリゴヌクレオチド-PEG 5000、PEG 600-オリゴヌクレオチド-PEG 800、PEG 600-オリゴヌクレオチド-PEG 1500、PEG 600-オリゴヌクレオチド-PEG 2000、PEG 600-オリゴヌクレオチド-PEG 5000、PEG 600-オリゴヌクレオチド-PEG 20000、PEG 600-オリゴヌクレオチド-PEG 50000、PEG 800-オリゴヌクレオチド-PEG 1500、PEG 800-オリゴヌクレオチド-PEG 2000、PEG 800-オリゴヌクレオチド-PEG 5000、PEG 800-オリゴヌクレオチド-PEG 20000、PEG 800-オリゴヌクレオチド-PEG 50000、PEG 1000-オリゴヌクレオチド-PEG 2000、PEG 1000-オリゴヌクレオチド-PEG 5000、PEG 1000-オリゴヌクレオチド-PEG 20000、PEG 1000-オリゴヌクレオチド-PEG 50000、PEG 1000-オリゴヌクレオチド-PEG 5000、PEG 1500-オリゴヌクレオチド-PEG 20000、PEG 1500-オリゴヌクレオチド-PEG 50000、PEG 2000-オリゴヌクレオチド-PEG 5000、PEG 2000-オリゴヌクレオチド-PEG 20000、PEG 2000-オリゴヌクレオチド-PEG 50000、PEG 2000-オリゴヌクレオチド-PEG 75000、PEG 2000-オリゴヌクレオチド-PEG 100000、PEG 5000-オリゴヌクレオチド-PEG 20000、PEG 5000-オリゴヌクレオチド-PEG 50000、PEG 5000-オリゴヌクレオチド-PEG 75000、またはPEG 5000-オリゴヌクレオチド-PEG 1000000。
【０２４６】
分析
a)MALDI-TOF：マトリックス：3-ヒドロキシピコリン酸、リフレクターモード、分子量を定量した。
b)キャピラリーゲル電気泳動：キャピラリー：融合シリカキャピラリー、40 cm；内径、100μm；外径、360μm；バッファー、10%バッファー液、pH2.5、HPCE用（0.1 Mリン酸ナトリウムバッファー）、および、0.1%（ヒドロキシプロピル）メチルセルロースの90%水溶液；サンプル、10 pmolオリゴヌクレオチド／μl（水溶液）；電圧、8 kV；極性、−から＋まで；動作時間、30分；動作、キャピラリーを、加圧下において、0.1M NaOH (0.2μmろ過)で60秒、バッファーで120秒リンスし、サンプル注入した（加圧下で5秒）；結果、21分に広汎なピーク。
【０２４７】
例７
溶液中の接合による3′5′-PEG化オリゴヌクレオチドの合成
1)オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチドを、フォスフォルアミダイト化学、すなわち、オリゴヌクレオチドの3′-および5′-末端がアミノ官能基を形成する方法、すなわち、5′末端が、アミノ基である官能基を含む、標準的CPG法によって合成した。5′末端にアミノリンカーを含む、オリゴヌクレオチドのアミノ官能化5′末端は、トリチル基、例えば、モノメトキシトリチル(MMT)によって一時的に保護される。
【０２４８】
2)NHSエステル- PEG 200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000、10000、20000、50000、または1000000の合成
NHS-エステル PEG 200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000、10000、20000、50000、または1000000は、当該技術分野で既知の任意の方法によって生産することが可能である。
【０２４９】
3) 3′-PEG 200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000、10000、20000、50000、または1000000-オリゴヌクレオチド接合体の合成
5′-末端保護オリゴヌクレオチド(21 nmol)を、100μlの反応バッファー（60% 0.3M NaHCO3, pH8.5/40% DMF）において、24倍過剰のNHS-エステル PEG 200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500または4750、5000、10000、20000、50000、または1000000とインキュベートする。サンプルを、振とう器(200 rpm)の上で37℃で17時間インキュベートする。次いで、サンプルを、任意に脱保護し、SpeedVacで乾燥し、60μlの水に溶解する。その後、サンプルをHPLCによって精製する。最後に、この接合体を、限外ろ過によって脱塩し、SpeedVacで乾燥する。
【０２５０】
4) 3′-PEG化オリゴヌクレオチドの5′-PEG化
工程3において保護基が除去されなかった場合、5′末端の保護基が除かれ、精製される。この3′-PEG化オリゴヌクレオチドを水に溶解し、過剰なPEG 200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000、10000、20000、50000、または1000000-NHS-エステルと40℃で17時間インキュベートする。その後、サンプルをHPLCおよびFPLCによって精製する。次いで、サンプルを、限外ろ過によって脱塩し、SpeedVacで乾燥する。
【０２５１】
例８
3′5′-PEG化オリゴヌクレオチドの合成：支持体における3′-PEG化（図9）
1)NHS-エステル- PEG 200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000、10000、20000、50000、または1000000の合成
NHS-エステル PEG 200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000、10000、20000、50000、または1000000は、当該技術分野で既知の任意の方法によって生産することが可能である。
【０２５２】
2) 3′-PEG 200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000、10000、20000、50000、または1000000-オリゴヌクレオチド接合体の合成
オリゴヌクレオチドを3′-および5′-末端において修飾するもう一つの方法は、Glen Researchのアミノ修飾体C7 CPGの使用である。この修飾体は、オリゴヌクレオチド合成用の2官能性支持体であり、5′-方向にトリチル基、例えば、DMTを、3′-方向にFmoc保護アミノ基を含む。二つの官能基は、C6リンカーを介して連結され、リンカーは、最終的にコハク酸架橋を介してCPG支持体に連結される。Fmoc保護アミノ基は、オリゴヌクレオチドの合成前に修飾される、すなわち、NHS-エステル PEG 200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000、10000、20000、50000、または1000000に連結される。C7 CPGを、DMFに溶解した20%ピペリジン3 mlと、2x10分および2x15分インキュベートすることによって、GlenのC7 CPG支持体の3′末端からFmoc保護基を除去する。その後、サンプルを、3 ml DMFによって6x、3 ml ACNによって3x洗浄する。一旦Fmocが除去されたならば、支持体をAr下に乾燥し、乾燥DMFに溶解した、15xから30x過剰なNHS-エステル PEG 200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000、10000、20000、50000、または1000000を該支持体に加える。ジイソプロピルエチルアミン(10μl; DIEA)をサンプルに加える。このサンプルを、振とう器(200 rpm)において37℃で2時間インキュベートする。インキュベーション後、サンプルを1 ml DMFで3x、1 ml ACNで3x、1 ml DCMで3x洗浄する。最後にサンプルを室温で乾燥する。オリゴヌクレオチド合成に対する否定的作用を避けるために、残存する可能性のある遊離3′-アミノ基を、支持体を室温で5分間、オリゴヌクレオチド合成機の「キャッピング試薬」（例えば、無水酢酸）と共にインキュベートすることによってキャッピングする。次いで、支持体を1 ml ACNで3x洗浄し、最後に室温で乾燥する。その後、オリゴヌクレオチドが合成される。これは、チオエートの塩基性結合用標準プロトコールにしたがって最終サイクルにおいて5′-アミノリンカーを含み、その際、支持体のトリチル基（DMT）は保存される。この3′-PEG 200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000、10000、20000、50000、または1000000接合オリゴヌクレオチドは、200μlの濃縮アンモニアに55℃で20時間インキュベートすることによって、支持体から解離される。最後に、サンプルをSpeedVacで乾燥し、アンモニアを除去する。このペレットを、50μlの0.1M TEAA pH7.5に溶解し、逆相HPLCによって精製し、不完全なオリゴヌクレオチド断片を除去する（カラム：Amberchrom CG-300S、バッファーA：0.1M TEAA pH7.5、バッファーB：アセトニトリル）。最後に、サンプルを、200μlの80%酢酸と室温で2時間インキュベートすることによって、オリゴヌクレオチドの5′末端からDMT保護基を除去する。この酢酸および除去DMT基は、NAPカラムによってサンプルから分離される。サンプルをSpeedVacで乾燥し、再び200 μlの水に溶解する。サンプルを、Phenomenex PolymerX RP1 カラム 100Å 10x250 mm（バッファーA、0.1M TEAA pH7.5；バッファーB、アセトニトリル）によって精製する。最終的に、サンプルは、限外ろ過によって濃縮し(MWCO=1000 Da；4バーArの加圧)、SpeedVacで乾燥する。
【０２５３】
3)3′-PEG化オリゴヌクレオチドの、5′-PEG化
3′-PEG化オリゴヌクレオチドは、次工程において、NHS-エステル PEG 200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000、10000、20000、50000、または1000000に連結される。
【０２５４】
工程2)の産物を、150 μlの反応バッファー（60% 0.3M NaHCO3, pH8.5/40% DMF）に溶解し、30x過剰のNHS-エステル P PEG 200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、 4750、5000、10000、20000、50000、または1000000を加え、サンプルを、振とう器(200 rpm)の上で37℃で2時間インキュベートする。その後、サンプルを、SpeedVacで乾燥し、200μlの水に溶解する。次いで、サンプルを、Phenomenex Jupiter 5μ C18カラム 300Å 4.6x250 mm（バッファーA：0.1M NaHCO3 pH8.5、バッファーB：アセトニトリル）によって精製する。サンプルを、限外ろ過(MWCO=1000 Da；4バーArの加圧)によって濃縮、脱塩し、再びSpeedVacで乾燥する。
【０２５５】
例９
修飾支持体における、PEG-アミダイトによる3′5′-PEG化オリゴヌクレオチドの合成
1) 3′-PEG 200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000、10000、20000、50000、または1000000-オリゴヌクレオチド接合体の合成
オリゴヌクレオチドの3′末端は、それぞれ、例5および8に記載される方法にしたがって修飾される。
【０２５６】
2)3′-PEG化オリゴヌクレオチドの5′-PEG化
一旦3′-PEG化オリゴヌクレオチドが合成されたならば、PEG 200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000、10000、20000、50000、または1000000-アミダイトが、例3の方法にしたがって最終結合サイクルに使用される。
【０２５７】
例１０
3′5′-PEG化オリゴヌクレオチドの合成：支持体における5′-PEG化（図10）
1)オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチドは、例えば、Glenの、PT 3′-アミノ修飾因子C6 CPG、または3′-アミノ修飾因子C7 CPG、または、例えば、Proligoの、Amino On CPGにおいて合成される（全て、アミノリンカーを含む、例5を参照）。合成プロトコールは、チオエートに対する標準的塩基結合プロトコールである。合成の最終サイクルにおいて、結合プロトコールは、オリゴヌクレオチドの5′末端に5′-アミノ修飾因子を結合するために拡張され、この5′-アミノ修飾因子（リンカー）は、例えば、DMS(O)MT-アミノ修飾因子C6、または5′-MMT-修飾因子C5である。5′-アミノ修飾因子の結合を含むオリゴヌクレオチド合成の後、合成機において、DMFに溶解した3%TFA、30サイクルによってトリチル基を除去する。
【０２５８】
2)5′-5´-PEG 200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000、10000、20000、50000または1000000-オリゴヌクレオチド接合体の合成
この脱トリチルサンプルを乾燥し、30 μl DMFまたはACN + 1.5 μl DIEAに溶解した、110 nmolのPEG 200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000、10000、20000、50000、または1000000-NHSを加える。サンプルを37℃で4時間インキュベートする。その後、サンプルを、100μl DMFで2x、100μl ACNで2x洗浄し、乾燥する。次に、5′-PEG化オリゴヌクレオチドを、サンプルを40℃で17時間200μlの濃縮アンモニアとインキュベートすることによって、支持体から解離する。次いで、SpeedVacにおいてアンモニアを除去し、PEG化オリゴヌクレオチドを、200μlの水に溶解する。最後に、逆相HPLC（Amberchrom CG-300S、バッファーA：0.1M TEAA pH7.5、バッファーB：アセトニトリル）において精製する。
【０２５９】
3)5′-PEG化オリゴヌクレオチドの3′-PEG化
150から350 nmolのPEG 200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000、10000、20000、50000、または1000000-NHS、30から50 μlのDMFまたはACN、1.5から2.5μlのDIEAを、3′-末端アミノリンカー（PT 3′-アミノ修飾因子C6、3′-アミノ修飾因子C7、またはAmino On CPG）を有する、5 - 35 nmolの5′-PEG化オリゴヌクレオチドに加え、この混合物を、37℃で1時間インキュベートする。最後に、接合体を、逆相HPLC（Phenomenex Jupiter 5μ C18カラム 300Å 4.6x250 mm、バッファーA：0.1M TEAA pH7.5、バッファーB：アセトニトリル）によって精製する。任意に、接合体はさらに、NaHCO3バッファーおよびNaHCO3+NaClバッファーによって精製する。最後に、接合体を、限外ろ過(MWCO=1000 Da；4バーArの加圧)によって脱塩し、SpeedVacで乾燥する。
【０２６０】
分析
MALDI-TOF：マトリックス：3-ヒドロキシピコリン酸、リフレクターモード、分子量を定量した。
【０２６１】
例１１
5′-フォスフォルアミダイトによる5′3′-PEG化オリゴヌクレオチドの合成（図11）
1)オリゴヌクレオチド合成
本例によって合成されるオリゴヌクレオチドは、5′末端にPEG 1500、-2000、-5000、-20000、または-50000、3′-末端にPEG 200 -400 -600、または-800を含む。このオリゴヌクレオチドは、特異的5′-リン酸エステルアミドを用いて合成されるが、その際、DMT保護基の位置およびリン酸エステルアミドの位置は、一般的オリゴヌクレオチド合成法において使用されるリン酸エステルアミドとは反対側である。合成機におけるオリゴヌクレオチド合成の一般的方向は3′から5′であるが、5′-フォスフォルアミダイトは、5′から3′への合成方向をもたらし、したがって、5′末端が支持体に連結される。オリゴヌクレオチドは、フォスフォロチオエート形として合成される。最終工程において、アミノ修飾因子（アミノリンカー）は、オリゴヌクレオチドの3′末端に連結される（例5および10の反応条件を参照）。一旦オリゴヌクレオチドが合成され、アミノ修飾因子が連結されたならば（逆向きリンカー）、サンプルは、ジクロールメタンに溶解した3%トリクロロ酢酸によって脱トリチル化され、3′末端からMMT-またはDMS(O)MT-基が除去される。最後に、支持体に連結されるオリゴヌクレオチドを乾燥する。
【０２６２】
2)3′-PEG 200、-400、-600、または-800-オリゴヌクレオチド接合体の合成
70μmolのPEG 200、-400、-600、または-800-NHSを、560μlの乾燥DMFにおいて、14 μmolの乾燥サンプルに加える。DIEAを支持体基盤として使用し、そこに、オリゴヌクレオチド-PEG-混合物μl当たり0.1μlのDIEAを加える。サンプルを、振とう器(100 rpm)において37℃で90分インキュベートする。その後、サンプルを、1 mlのアセトニトリルで5x洗浄し、PEG-NHSを除去する。3′-PEG化オリゴヌクレオチドを、55℃で10時間1 mlの濃縮アンモニアとインキュベートすることによって、支持体から解離する。次いで、サンプルをSpeedVacで乾燥してアンモニアを除去し、50μlの水に溶解する。このサンプルを逆相HPLC（Phenomenex Jupiter 5μ C18カラム 300Å 4.6x250 mm、バッファーA：0.1M TEAA pH7.5、バッファーB：アセトニトリル）によって精製する。
【０２６３】
3)3′-PEG化オリゴヌクレオチドの5′-PEG化
精製された3′-PEG化オリゴヌクレオチドを、DMF/0.3M NaHCO3, pH8.5 (40:60)を含むか、または上記から成る反応バッファーにおいて、10xモル過剰のPEG 1500、-2000、-5000、-20000、または-50000とインキュベートする。この混合物を、振とう器(200 rpm)において37℃で1時間インキュベートする。その後、サンプルを、逆相HPLC（Phenomenex Jupiter 5μ C18カラム 300Å 4.6x250 mm、バッファーA：0.1M TEAA pH7.5、バッファーB：アセトニトリル）によって精製する。次に、サンプルの容量をSpeedVacにおいて減らし、サンプルを200μlの水で洗浄する。最後に、サンプルをさらに、IE-FPLC（Toyopearl SuperQ-650M 150x16 mm、バッファーA：0.01 M NaHCO3, pH8.5、バッファーB: 0.01 M NaHCO3, pH 8.5 + 2M NaCl）によって精製する。サンプルを、限外ろ過(MWCO=1000 Da；4バーArの加圧)によって脱塩し、SpeedVacで乾燥する。
【０２６４】
分析
MALDI-TOF：マトリックス：3-ヒドロキシピコリン酸、リフレクターモード、分子量を定量した。
【０２６５】
例１２
単一リアクターユニットにおけるオリゴヌクレオチド-PEG接合体の合成
オリゴヌクレオチドは、Expedite Synthesizer (Perspective Biosystems)を用いる、1000Å-CPG支持体における、標準的フォスフォルアミダイト化学によって合成した。Synthesizerにおいてオリゴヌクレオチドの5′-OHを、2-[2-(4-モノメトキシトリチル)アミノエトキシ]エチル-(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピル)-フォスフォルアミダイト（5′-アミノ修飾因子5、Glen Research、0.067Mのアセトニトリル溶液）によってアミノ修飾した。この産物を、支持体から解離し、40℃で17時間32% NH3を用いることによって脱保護した。この未精製産物を乾燥し、逆相HPLC（Phenomenex, Polymerx, 10μm, RP-1, 100Å, 250x10 mm、0.1M 酢酸トリエチルアンモニウム pH7.5／アセトニトリル）によって精製した。このオリゴヌクレオチドを、室温で1時間80%酢酸を用いて脱トリチル化し、NAP-10-カラム(Amersham Bioscicences)において溶出した。
【０２６６】
5′-アミノ修飾オリゴヌクレオチドを、0.3M NaHCO3, pH8.5、40% DMFに溶解し、37℃に加熱した。MPEG-SPA-5K（NEKTAR、24当量）を滴下した。18時間後、混合物を乾燥し、未精製産物を、イオン交換クロマトグラフィー（TOSOHAAS、Toyopearl SuperQ-650S 250x4 mm、0.01M酢酸トリエチルアンモニウムpH7.5／0.01M酢酸トリエチルアンモニウムpH7.5、2M NaCl）によって過剰なPEGから分離した。次いで、塩化ナトリウムを、Amicon Ultra Centrifugal Filter Devices (Millipore)を用いて除去した。未反応オリゴヌクレオチドは、逆相HPLC（Phenomenex, Polymerx, 10μm, RP-1, 100A, 250x10 mm、0.1M 酢酸トリエチルアンモニウム pH7.5／アセトニトリル）によって除去した。精製産物は、NAP 10カラム（Amersham Biosciences）を用いて脱塩し、凍結乾燥した。
【０２６７】
分析
MALDI-TOF：マトリックス：3-ヒドロキシピコリン酸、リフレクターモード、約11.5 kg/molにピーク。
【０２６８】
例１３
細胞培養実験：TGF-ベータ2分泌の抑制
細胞培養
グリア芽細胞腫を抱える53歳の男性から、ヒトグリア芽細胞腫細胞系統A-172（アクセス番号CRL-1620）を樹立した。これらの細胞を単層で増殖した。A-172腫瘍細胞を、37℃、5%CO2、および95%相対湿度の下で、4.5 g/lグルコースおよび10%(v/v)FCSを添加したDMEM培地において培養した。TGF-ベータ2抑制、および腫瘍細胞増殖を調べるため、ウェル当たり104個のA-172細胞を、12ウェル組織培養プレートに撒いた。細胞接種の24時間後、上清を除去し、それぞれの量の、少なくとも一つのポリマーを有するリンカーを有するオリゴヌクレオチドを含む細胞培養培地から成る処理液と交換した。培養液の交換は、3日後に繰り返した（スケジュールは、2*3日と表示した）。陰性コントロール（=未処理細胞）の培養液、および培養液コントロール（=細胞無しの培養液のみ）は、オリゴヌクレオチドを添加することなく交換した。処理の6日後上清を回収し、R&D Systemsの固相酵素免疫測定法（ELISA）を用いて、分泌されたTGF-ベータを定量した。平行して、腫瘍細胞の数を、電子式細胞カウンターによる細胞計数によって調べた。
【０２６９】
方法：
細胞培養上清におけるTGF-ベータ2は、Quantikine（登録商標） Human TGF-beta2 Immunoassayをメーカー(R&D Systems)の指示にしたがって用いることによって定量した。上清から、遠心(850 g、5分)によって細胞成分を除去した。光学的濁度（OD）の定量および計算は、4パラメータロジスティックを用い、Multiskan Ascent Type 354, 200-240Vプレートリーダーによって実施した。
【０２７０】
腫瘍細胞増殖は、BeckmannのCoulter Counter Z2を用いた細胞計数により調べた。この方法は、電場を通過する粒子（電解質の中に再縣濁される細胞）は、電気抵抗を変えるという原理に基づく。細胞数は、メーカーの指示にしたがって分析した。簡単に言うと、細胞縣濁液（すなわち、トリプシン処理腫瘍細胞）は、ある定められた容量（9.5 mlのカウンター液Isotone II（登録商標）、および500μlのサンプル、希釈係数20）においてカウンター液（Isotone II（登録商標））と混ぜ合わせ、Coulter Counter Z2において3回カウントした。
【０２７１】
例１４
オリゴヌクレオチドの酵素安定性試験
3′-エキソヌクレアーゼ消化
オリゴヌクレオチド(1 OD)を、98μlの0.05M Tris-HClバッファーpH8.5に溶解した。2μl (0.083 U)のフォスフォジエステラーゼI（Crotalus adamanteus venom（ダイヤガラガラ蛇毒）由来、42 U/mg, 1 mg/mlで、110 mM Tris-HCl, 110 mM NaCl, 15 mM MgCl2, 50%グリセロールに溶解、pH8.9）を加えた。この混合物を37℃でインキュベートした（Thermocycler, Hybaid, PCR Sprint）。
【０２７２】
未修飾フォスフォジエステルオリゴヌクレオチドは、0分、5分、10分、20分、30分、1時間、3時間、6時間、および24時間に分析した。未修飾チオリン酸オリゴヌクレオチド、3′-PEG化チオリン酸、5′-PEG化チオリン酸、および3′-5′-PEG化チオリン酸オリゴヌクレオチドは、0分、10分、30分、1時間、3時間、6時間、24時間、48時間、および72時間に分析した。
【０２７３】
分析のために、10μl分液を抽出し、95℃に10分加熱してフォスフォジエステラーゼを破壊し、および遠心した（5分、16060 g、室温）。10μl分液から9μl分液を取り出し、11μlの0.04M KH2PO4, 0.002% H3PO4, pH3.6で希釈し、Waters 600 Pump, Waters 600 Controller, および、Waters 2487 Dual Absorbance Detector (254 nm)使用のHPLCによって分析した。分離は、Merck LiChrospher 100逆相C18カラム（内部キャップ、孔径：100Å、粒径：5 μm、125x4 mm）、流速1 ml/分、勾配が、それぞれ、0、13.5、および50%アセトニトリル／100、86.5、および50% 0.04M KH2PO4, 0.002% H3PO4, pH3.6によって実施した。
【０２７４】
5′-エキソヌクレアーゼ消化
オリゴヌクレオチド(1 OD)を、50μlの0.2M 酢酸トリメチルアンモニウムバッファーpH6.5に溶解した。50μl (0.22 U)のフォスフォジエステラーゼII（ウシすい臓からのI-SA型、水に溶解(4.4 U/ml)）を加えた。この混合物を37℃でインキュベートした（Thermocycler, Hybaid, PCR Sprint）。未修飾フォスフォジエステルオリゴヌクレオチドは、0分、5分、10分、20分、30分、1時間、3時間、6時間、および24時間に分析した。未修飾チオリン酸オリゴヌクレオチド、3′-PEG化チオリン酸、5′-PEG化チオリン酸、および3′-5′-PEG化チオリン酸オリゴヌクレオチドは、0分、10分、30分、1時間、3時間、6時間、24時間、48時間、および72時間に分析した。
【０２７５】
分析のために、10μl分液を抽出し、95℃に10分加熱してフォスフォジエステラーゼを破壊し、および遠心した（5分、16060 g、室温）。10μl分液から9μl分液を取り出し、11μlの0.04M KH2PO4, 0.002% H3PO4, pH3.6で希釈し、Waters 600 Pump, Waters 600 Controller, Waters 2487 Dual Absorbance Detector (254 nm)使用のHPLCによって分析した。分離は、Merck LiChrospher 100逆相C18カラム（内部キャップ、孔径：100A、粒径：5μm、125x4 mm）、流速1 ml/分、勾配が、それぞれ、0、13.5、および50%アセトニトリル／100、86.5、および50% 0.04M KH2PO4, 0.002% H3PO4, pH3.6によって実施した。
【０２７６】
結果：
驚くべきことに、少なくとも一つのポリマーに連結した免疫刺激因子は、ポリマーに連結しないものを上回るヌクレアーゼ安定性を示した。3′-および5′-末端においてポリマーに連結されるオリゴヌクレオチドは、その二つのポリマーと同じ大きさ／重量を有するポリマーと連結したものに対し、そのオリゴヌクレオチドの3′-末端または5′-末端だけにおいて連結されるものより驚くほど優っていた。
【０２７７】
例１５
オリゴヌクレオチド配列
少なくとも一つのポリマーに連結される、本例のTGF-ベータ1、TGF-ベータ2、およびTGF-ベータ3オリゴヌクレオチドも、本発明の一部である。「インビトロ」および「インビボ」においてTGF-ベータ1、2、および／または3の形成を阻害する、ポリマー-オリゴヌクレオチド接合体、および、それぞれ、少なくとも一つの、これらの接合体および化合物についてはさらに実施態様があり、または、少なくとも一つの、そのような接合体または化合物を含む医薬組成物は、本発明に記載される、不要新生物、線維症、または、HIVなどのウィルス性疾患または障害のコントロール、予防、および／または治療に好適である。
【０２７８】
TGF-ベータ1、-2、および-3アンチンセンス・オリゴヌクレオチドは：
【０２７９】
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【０２８０】
例１６
その他のオリゴヌクレオチド配列
少なくとも一つのポリマーに連結される、本例のオリゴヌクレオチドは、それぞれ、ポリマー-オリゴヌクレオチド接合体および化合物、または、不要新生物、線維症、または、HIVなどのウィルス性疾患または障害のコントロール、予防、および／または治療に好適な、薬学的に許容可能な担体の中に、少なくとも一つの、上記接合体または化合物を含む、または該接合体または化合物から成る医薬組成物に関する、その他の実施態様である。
【０２８１】
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【０２８２】
例１７
TGF-ベータタンパク
TGF-ベータ1、TGF-ベータ2、およびTGF-ベータ3のアミノ酸配列を、アミノ酸の、国際アミノ酸一文字略号で表す。
RXXR：成熟（活性）部分の切断部位（XXはいずれのものでもよい）
ASPC：このモチーフのCは、二つのモノマーを連結して機能的ダイマーとする、分子間システイン架橋を表すCである。
CCC：分子間システイン架橋（システインノットモチーフ）
TGF-ベータ1、2、および3の成熟タンパクは、このTGF-ベータ1リストの末端から112アミノ酸を含む。
【０２８３】
TGF-ベータ 1
MPPSGLRLLLLLLPLLWLLVLTPGRPAAGLSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSAHCSCDSRDNTLQVDINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMATPLERAQHLQSSRHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS
【０２８４】
TGF-ベータ1の好ましいアミノ酸配列は：
1)            ALDTNYCFSSTEKNCCVRQL
2)            YIDFRKDLGWKWIHEPKGYH
3)            ANFCLGPCPYIWSLDTQYSK
4)            VLALYNQHNPGASAAPCCVP
5)            QALEPLPIVYYVGRKPKVEQ
6)            LSNMIVRSCKCS
7)            TEKNCCVRQLYIDFRKDLGW
8)            KWIHEPKGYHANFCLGPCPY
9)            WSLDTQYSKVLALYNQHNP
10)           GASAAPCCVPQALEPLPIVY
11)           YVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS
12)           QYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKP
13)           QYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKP
I
QYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKP
(AAPCモチーフのシトシンにおけるS-S架橋によって結合される、TGF-ベータ1アミノ酸配列番号12のダイマー)
14)ALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS
15)           ALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGW
16)           KWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSK
17)           VLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVY
18)           YVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS
19)           CVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCL
20)           GPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAA
21)           PCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMI
【０２８５】
TGF-ベータ 2
MHYCVLSAFLILHLVTVALSLSTCSTLDMDQFMRKRIEAIRGQILSKLKLTSPPEDYPEPEEVPPEVISIYNSTRDLLQEKASRRAAACERERSDEEYYAKEVYKIDMPPFFPSENAIPPTFYRPYFRIVRFDVSAMEKNASNLVKAEFRVFRLQNPKARVPEQRIELYQILKSKDLTSPTQRYIDSKVVKTRAEGEWLSFDVTDAVHEWLHHKDRNLGFKISLHCPCCTFVPSNNYIIPNKSEELEARFAGIDGTSTYTSGDQKTIKSTRKKNSGKTPHLLLMLLPSYRLESQQTNRRKRALDAAYCFRNVQDNCCLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKGYNANFCAGACPYLWSSDTQHSRVLSLYNTINPEASASPCCVSQDLEPLTILYYIGKTPKIEQLSNMIVKSCKCS
【０２８６】
TGF-ベータ2の好ましいアミノ酸配列は：
1)            ALDAAYCFRNVQDNCCLRPL
2)            YIDFKRDLGWKWIHEPKGYN
3)            ANFCAGACPYLWSSDTQHSR
4)            VLSLYNTINPEASASPCCVS
5)            QDLEPLTILYYIGKTPKIEQ
6)            LSNMIVKSCKCS
7)            VQDNCCLRPLYIDFKRDLGW
8)            KWIHEPKGYNANFCAGACPY
9)            LWSSDTQHSRVLSLYNTINP
10)           EASASPCCVSQDLEPLTILY
11)           YIGKTPKIEQLSNMIVKSCKCS
12)           QHSRVLSLYNTINPEASASPCCVSQDLEPLTILYYIGKTPK
13)           QHSRVLSLYNTINPEASASPCCVSQDLEPLTILYYIGKTPK
I
QHSRVLSLYNTINPEASASPCCVSQDLEPLTILYYIGKTPK
(ASPCモチーフのシトシンにおけるS-S架橋によって結合される、TGF-    ベータ2アミノ酸配列番号12のダイマー)
14)ALDAAYCFRNVQDNCCLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKGYNANFCAGACPYLWSSDTQHSRVLSLYNTINPEASASPCCVSQDLEPLTILYYIGKTPKIEQLSNMIVKSCKCS
15)           ALDAAYCFRNVQDNCCLRPLYIDFKRDLGW
16)           KWIHEPKGYNANFCAGACPYLWSSDTQHSR
17)           VLSLYNTINPEASASPCCVSQDLEPLTILY
18)           YIGKTPKIEQLSNMIVKSCKCS
19)           CLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKGYNANFCA
20)           GACPYLWSSDTQHSRVLSLYNTINPEASAS
21)           PCCVSQDLEPLTILYYIGKTPKIEQLSNMI
【０２８７】
TGF-ベータ3
MKMHLQRALVVLALLNFATVSLSLSTCTTLDFGHIKKKRVEAIRGQILSKLRLTSPPEPTVMTHVPYQVLALYNSTRELLEEMHGEREEGCTQENTESEYYAKEIHKFDMIQGLAEHNELAVCPKGITSKVFRFNVSSVEKNRTNLFRAEFRVLRVPNPSSKRNEQRIELFQILRPDEHIAKQRYIGGKNLPTRGTAEWLSFDVTDTVREWLLRRESNLGLEISIHCPCHTFQPNGDILENIHEVMEIKFKGVDNEDDHGRGDLGRLKKQKDHHNPHLILMMIPPHRLDNPGQGGQRKKR
ALDAAYCFRNVQDNCCLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKGYNANFCAGACPYLWSSDTQHSRVLSLYNTINPEASASPCCVSQDLEPLTILYYIGKTPKIEQLSNMIVKSCKCS
【０２８８】
TGF-ベータ3の好ましいアミノ酸配列は：
1)            ALDTNYCFRNLEENCCVRPL
2)            YIDFRQDLGWKWVHEPKGYY
3)            ANFCSGPCPYLRSADTTHST
4)            VLGLYNTLNPEASASPCCVP
5)            QDLEPLTILYYVGRTPKVEQ
6)            LSNMVVKSCKCS
7             NLEENCCVRPLYIDFRQDLG
8             WKWVHEPKGYYANFCSGPCP
9)            YLRSADTTHSTVLGLYNTLN
10)           PEASASPCCVPQDLEPLTIL
11)           YYVGRTPKVEQLSNMVVKSCKCS
12)           THSTVLGLYNTLNPEASASPCCVPQDLEPLTILYYVGRTPK
13)           THSTVLGLYNTLNPEASASPCCVPQDLEPLTILYYVGRTPK
I
THSTVLGLYNTLNPEASASPCCVPQDLEPLTILYYVGRTPK
(ASPCモチーフのシトシンにおけるS-S架橋によって結合される、TGF-    ベータ3アミノ酸配列番号12のダイマー)
14)ALDAAYCFRNVQDNCCLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKGYNANFCAGACPYLWSSDTQHSRVLSLY    NTINPEASASPCCVSQDLEPLTILYYIGKTPKIEQLSNMIVKSCKCS
15)           ALDAAYCFRNVQDNCCLRPLYIDFKRDLGW
16)           KWIHEPKGYNANFCAGACPYLWSSDTQHSR
17)           VLSLYNTINPEASASPCCVSQDLEPLTILY
18)           YIGKTPKIEQLSNMIVKSCKCS
19)           CLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKGYNANFCA
20)           GACPYLWSSDTQHSRVLSLYNTINPEASAS
21)           PCCVSQDLEPLTILYYIGKTPKIEQLSNMI
【０２８９】
例１８
タンパクまたはペプチドのN末端のPEG化
タンパクまたはペプチドは、Merrifield法、すなわち、側鎖の官能基がt-BOCによって保護され、N末端がFmocによって保護される方法にしたがって合成される。Fmocは、DMFに溶解した20%ピペリジンと共にインキュベートすることによって除去される。数回の洗浄工程の後、該タンパクまたはペプチドを、PEG 400、-600、-800、-1000、-1500、-2000、-5000、-20000、または-50000-NHSエステルと、30℃で24時間インキュベートする。その後、アミノ酸側鎖のt-BOC保護基が除去され、N末端のPEG化タンパクまたはペプチドが、フッ化水素酸とのインキュベーションによって支持体から解離され、FPLCによって精製される。
【０２９０】
例１９
タンパクまたはペプチドのN-およびC-末端のPEG化
タンパクまたはペプチドは、Merrifield法、すなわち、側鎖の官能基がベンゾイル-カルボニルによって保護され、N末端がFmocによって保護される方法にしたがって合成される。タンパクまたはペプチドの合成後、このタンパクまたはペプチドは、支持体から解離され、精製される。C末端は、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)によって活性化し、PEG-200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500または4750、5000、10000、20000、50000、または1000000-アミン（PEG-NH2）と、30℃で15時間インキュベートする。C末端PEG化タンパクまたはペプチドは精製され、N末端保護基Fmocは、DMFに溶解した20%ピペリジンと共にＰＥＧ化タンパクまたはペプチドをインキュベートすることによって除去される。数回の洗浄工程の後、該タンパクまたはペプチドを、PEG 200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500または4750、5000、10000、20000、50000、または1000000-NHSエステルと、30℃で24時間インキュベートする。次いで、C-およびN-末端PEG化タンパクまたはペプチドはFPLCにおいて精製され、その後、側鎖が、HBｒ／酢酸におけるインキュベーションによって脱保護される。最後に、接合体は再び精製される。
【０２９１】
例２０
タンパクまたはペプチドのC末端および側鎖のPEG化
タンパクまたはペプチドは、Merrifield法、すなわち、側鎖の官能基がalloc保護基によって保護され、N末端がFmocによって保護される方法にしたがって合成される。タンパクまたはペプチドの合成後、このタンパクまたはペプチドは、支持体から解離され、C末端は活性化され、例19に記載されるように、PEG-NH2とインキュベートされる。次いで、このPEG化タンパクまたはペプチドを精製し、側鎖のalloc保護基は、該タンパクまたはペプチドを、テトラキス（トリフェニルフォスフィン）パラジウムと、クロロフォルム、酢酸、およびN-メチルモルフォリンの37:2:1混合物と一緒に2時間インキュベートすることによって除去する。その後、PEG化タンパクまたはペプチドのC末端を、DMFに溶解した0.5%DIPEA、DMFに溶解した0.5%ジエチルチオカルバミン酸ナトリウム3 x 10 ml、次いで、1:1 DCM:DMF 5 x 10 mlによって洗浄する。次いで、タンパクまたはペプチドを、PEG 200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500または4750、5000、10000、20000、50000、または1000000-NHSエステルと、30℃で15時間インキュベートする。最後に、接合体はFPLCにおいて精製され、N末端は、DMFに溶解した20%ピペリジンにおいてインキュベートすることによって脱保護され、次いで再び精製される。
【０２９２】
本明細書および添付の特許請求項において使用する、単数形の「ある（a, an）」および「該(the)」は、文脈から明瞭に別様に指示されない限り、複数参照を含むことに注意しなければならない。別様に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および学術用語は全て、本発明の属する技術分野において通常の技能を有する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【０２９３】
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【０２９４】
特許および文献:
U.S. Pat. No.: 5,719,262
U.S. Pat. No.: 5,714,331
U.S. Pat. No.: 5,700,922
U.S. Pat. No.: 5,652,356
U.S. Pat. No.: 5,652,355
U.S. Pat. No.: 5,623,065
U.S. Pat. No.: 5,565,350
U.S. Pat. No.: 5,491,133
U.S. Pat. No.: 5,403,711
U.S. Pat. No.: 5,366,878
U.S. Pat. No.: 5,539,082
U.S. Pat. No.: 5,256,775
U.S. Pat. No.: 5,220,007
U.S. Pat. No.: 5,149,797
U.S. Pat. No.: 5,013,830
U.S. Pat. No.: 3,687,808
【０２９５】
WO 2007 / 109097
WO 2006 / 096222
WO 2005 / 111238
WO 2005 / 084712
WO 2005 / 059133
WO 2005 / 014812
WO 03 / 06445
WO 01 / 68122
WO 01 / 68146
WO 99 / 63975
WO 98 / 33904
WO 95 / 17507
WO 95 / 02051
WO 94 / 25588
【０２９６】
好ましい実施態様：
１．少なくとも一つのポリマーに連結される免疫刺激因子を含む化合物。
２．前記ポリマーが分枝鎖または直鎖である、請求項1に記載の化合物。
３．前記少なくとも一つのポリマーが、0.05 kg/molから約50 kg/molの平均分子量を有する、請求項1または2に記載の化合物。
４．前記少なくとも一つのポリマーが、約0.05 kg/molから約5 kg/molの平均分子量を有する、請求項1から3のいずれか1項に記載の化合物。
５．前記少なくとも一つのポリマーが、約0.1 kg/molから約1 kg/molの分子量を有する、請求項4に記載の化合物。
６．前記免疫刺激因子が、免疫細胞および／または免疫系の機能を誘発し、腫瘍細胞増殖の減退または阻害、および／または、癌または線維症などの不要新生物の細胞死の誘発、を直接的または間接的に強化する物質であるか、または、HIVの治療において有用である、請求項1から5のいずれか1項に記載の化合物。
７．前記免疫刺激因子が、ケモカイン、免疫細胞誘引物質、ウィルス、ウィルスの部分、自己MHC-分子、異種MHC-分子、抗原処理に関与する分子、抗原提示に関与する分子、免疫細胞作用の仲介に関与する分子、免疫細胞の細胞傷害作用の仲介に関与する分子、抗原輸送に関与する分子、共刺激分子、免疫細胞による認識を強化するペプチド、免疫細胞の細胞傷害作用を強化するペプチド、免疫細胞による不要新生物の認識を強化するペプチド、免疫細胞の細胞傷害作用を強化するペプチドで、融合ペプチド、融合タンパク、網膜芽細胞腫タンパク、癌遺伝子によってコードされるタンパク、原癌遺伝子によってコードされるタンパク、抗癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子によってコードされるタンパク、病的器官では発現されるが、神経系、筋肉、造血系、またはその他の、生存に必須の器官では発現されないタンパクに由来するペプチドを含むペプチド、から選ばれる、請求項1から6のいずれか1項に記載の化合物。
８．前記免疫刺激因子がオリゴヌクレオチドである、請求項1から7のいずれか1項に記載の化合物。
９．前記オリゴヌクレオチドが、8から30個のヌクレオチド建築ブロックを有する、請求項8に記載の化合物。
１０．前記オリゴヌクレオチドが、免疫反応および／または免疫系に否定的に影響する分子のmRNAにハイブリダイズするか、または、免疫反応および／または免疫系に否定的に影響する分子の受容体のmRNAにハイブリダイズする、請求項8または9に記載の化合物。
１１．前記オリゴヌクレオチドが、TGF-ベータ1、TGF-ベータ2、TGF-ベータ3、VEGF、IL-10、c-jun、c-fos、Her-2、それらの各受容体の、ｍRNAとハイブリダイズするか、または、ＰＧＥ-受容体のmRNAとハイブリダイズする、請求項10に記載の化合物。
１２．前記オリゴヌクレオチドが、例7または例8における配列番号1から435の配列リストにおいて特定される、請求項8から11のいずれか1項に記載の化合物。
１３．前記少なくとも一つのポリマーが、3′末端または5′末端において前記オリゴヌクレオチドに連結されるか、または、該少なくとも一つのポリマーは、3′および5′末端に連結されるか、または、該少なくとも一つのポリマーは3′末端に連結され、一ポリマーが5′末端に連結される、請求項8から12のいずれか1項に記載の化合物。
１４．一ポリマーが、前記オリゴヌクレオチドの3′末端に連結され、別のポリマーが、該ポリマーの5′末端に連結され、3′末端のポリマーが、5′末端に連結されるポリマーの、1.5から100倍の重量を有する、請求項13に記載の化合物。
１５．一ポリマーが、前記オリゴヌクレオチドの3′末端に連結され、別のポリマーが、該ポリマーの5′末端に連結され、5′末端のポリマーが、3′末端に連結されるポリマーの、1.5から100倍の重量を有する、請求項13に記載の化合物。
１６．前記ポリマーがポリアルキレンオキシドである、請求項1から15のいずれか1項に記載の化合物。
１７．前記ポリマーオキシドがポリエチレングリコールである、請求項16に記載の化合物。
１８．−前記免疫刺激因子が、内容的に既知の方法で合成され、
−前記少なくとも一つのポリマーが、内容的に既知の方法で合成され、
−該少なくとも一つのポリマーおよび該免疫刺激因子が、官能基の活性化によって、および／または、リンカーによって連結される、
、請求項1から17のいずれか1項に記載の化合物の合成法。
１９．請求項1から17のいずれか1項に記載の化合物を含む医薬組成物。
２０．癌、線維症、および／またはHIV治療用医薬組成物の調製のための、請求項1から17のいずれか1項に記載の化合物の使用。
２１．前記癌が、固体腫瘍、血液起源腫瘍、白血病、腫瘍転移、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、化膿性肉芽腫、乾癬、星状細胞腫、聴神経腫、芽細胞腫、ユーイング腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、グリオーマ、血管芽細胞腫、ホジキンリンパ腫、髄芽腫、白血病、中皮腫、神経芽細胞腫、神経線維腫、非ホジキンリンパ腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、肉腫、セミノーマ、トラコーマ、ウィルムス腫瘍から成る群から選ばれるか、または、胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、気管支原性癌、腎臓の癌、頸部癌、絨毛癌、嚢胞腺癌、胎生期癌、上皮癌、食道癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、胆嚢癌、胃癌、頭部癌、肝癌、肺癌、髄様癌、頸部癌、非小細胞気管支原性／肺癌、卵巣癌、すい臓癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、前立腺癌、小腸癌、前立腺上皮癌、直腸癌、腎細胞癌、皮膚癌、小細胞気管支原性／肺癌、扁平上皮細胞癌、皮脂腺癌、睾丸癌、および子宮癌から成る群から選ばれる、請求項20に記載の使用。
２２．癌、線維症、および／またはHIVの治療法であって、薬学的に許容可能な担体に溶解した、請求項1から17のいずれか1項に記載の化合物の投与を含む方法。
２３．前記癌が、固体腫瘍、血液起源腫瘍、白血病、腫瘍転移、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、化膿性肉芽腫、乾癬、星状細胞腫、聴神経腫、芽細胞腫、ユーイング腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、グリオーマ、血管芽細胞腫、ホジキンリンパ腫、髄芽腫、白血病、中皮腫、神経芽細胞腫、神経線維腫、非ホジキンリンパ腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、肉腫、セミノーマ、トラコーマ、ウィルムス腫瘍から成る群から選ばれるか、または、胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、気管支原性癌、腎臓の癌、頸部癌、絨毛癌、嚢胞腺癌、胎生期癌、上皮癌、食道癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、胆嚢癌、胃癌、頭部癌、肝癌、肺癌、髄様癌、頸部癌、非小細胞気管支原性／肺癌、卵巣癌、すい臓癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、前立腺癌、小腸癌、前立腺上皮癌、直腸癌、腎細胞癌、皮膚癌、小細胞気管支原性／肺癌、扁平上皮細胞癌、皮脂腺癌、睾丸癌、および子宮癌から成る群から選ばれる、請求項22に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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