(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学物質、化学物質の混合物または他の外部因子を定量するための方法であって、
前記化学物質、化学物質の混合物または他の外部因子に応答性がある遺伝子である、人工的なレポーター要素に機能的に結合した応答要素の少なくとも１つを含む組換え遺伝子を含む原核生物の細胞を、前記遺伝子の活性化の結果として転写されるレポーター要素のｍＲＮＡのレベルで変化が起きるように、前記化学物質、化学物質の混合物または他の外部因子に曝露させること、
生成された前記ｍＲＮＡの少なくとも一部分と相補的であり、アクリジニウム塩の化学発光性分子で標識されているオリゴヌクレオチドプローブを、前記転写されるｍＲＮＡと直接結合させること、および
前記プローブによって生成された化学発光性シグナルを用いて前記ｍＲＮＡを定量すること、
を含む方法。
【請求項２】
化学物質、化学物質の混合物または他の外部因子を直接定量するためのキットであって、
前記化学物質、化学物質の混合物または他の外部因子に応答性がある遺伝子である、人工的なレポーター要素に機能的に結合した応答要素の少なくとも１つを含む組換え遺伝子を、前記遺伝子の活性化の結果として転写されるレポーター要素のｍＲＮＡのレベルで変化が起きるように、含む原核生物の細胞と、
前記化学物質、化学物質の混合物または他の外部因子に応答して、前記細胞によって生成されたｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的であり、アクリジニウム塩の化学発光性分子で標識されている少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブと、
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】    （発明の分野）
本発明は、化学物質、化学物質の混合物、または物理的、化学的および／または生物学的条件（以後は外部因子と呼ぶ）の、生きている生物または細胞に対する毒性的または薬理学的影響を判定するための方法およびキット、したがって特定の化学的分析物またはその混合物を検出またはアッセイするための方法およびキットにも関する。このような化学物質、化学物質の混合物または外部因子は、直接的または間接的に動物または植物細胞の機能を改質するという点で、生物学的作用を発揮する可能性がある。本発明は、化学物質、化学物質の混合物または他の外部因子に曝露された後に、遺伝子によって仲介される応答を生み出す、生きている細胞の能力を利用するものである。したがって、生物または細胞の環境内では、１つの成分、複数の成分、または曝露されていない「正常な」状態と比較して細胞中の特定のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）配列のレベルの変化に結果としてつながる、前記成分の量の変化が存在する可能性がある。化学発光性分子または化学発光反応の成分で標識した相補的オリゴヌクレオチドプローブの結合によって、ｍＲＮＡ生成の変化が検出される。同様に、生物または細胞の、たとえば熱、紫外線、ｘ線などの他の外部因子への曝露も、転写されるｍＲＮＡのレベルの変化に結果としてつながる可能性がある。
【０００２】    （発明の背景）
環境の化学成分の変化、およびエコシステムに対するその考えられる影響の検出を、生きている生物を使用するいくつかの標準的なバイオアッセイ手順を使用して行うことができる〔OECD(1984) Guidelines for testing chemicals:Health Effects.Organisation for Economic Cooperation and Development、Paris:US Environmental Protection Agency(1985) Toxic Substances Control Act Test Guidelines:Final Rules.Fed Reg 40 CFR 798.2250、2650、2675、3260、3330、4350、4900;European Community(1985) EEC Directive 79/831.Annex V.、Part C:Commissions of the European Communities、 Doc EUR 9360 EN:Japanese Ministry of Agriculture、Forestry and Fisheries(1985) Testing Guidelines for Toxicity Studies 59 Agricultural Chemical Laws and Regulations、Japan〕。
【０００３】  生きている生物および細胞はそれらの正常な環境の変化に対して感受性があり、したがって環境のいかなる変化も、生物または細胞中の生理学的変化などの生物学的影響につながる可能性がある。このような変化は生化学的基盤を有し、しばしば特定の生化学反応の速度が増大または減少する結果となるか、所与の生物または細胞の型において正常では存在しない（すなわち活性がある）反応経路が発生する結果となることもある。これらの生理学的変化のメカニズムには遺伝的成分が含まれることが多く、環境の変化によって、生物のゲノムの一部分または関連経路が活性化または不活性化される。最終的にこのことは、たとえば酵素などのタンパク質の生合成の調節に関する生理学的変化につながる。このプロセスは、環境の変化の結果として、ＲＮＡポリメラーゼ複合体の生物または細胞のゲノムの特定の断片を転写する能力を調節するシグナル伝達経路を含む。これらのシグナル伝達経路は、化学物質、化学物質の混合物または外部因子と、細胞のゲノム中の決まった核酸配列において転写複合体の活性に影響を及ぼす特異的なタンパク質との、直接的または間接的な相互作用によって働く。遺伝子は環境的変化を感じることができる応答要素、およびｍＲＮＡの転写物をコードしているレポーター要素からなる。したがって、生物または細胞の環境中の分析物の存在および量は遺伝子の活性化に影響を及ぼすはずであり、その結果ＲＮＡポリメラーゼの影響下で、その配列の一部分が転写されてｍＲＮＡの分子が生じる。さらに分析物が、最初の遺伝子活性化に続いて起こる生化学経路の一部分において転写プロセスに影響を及ぼす可能性もある。さらに、化学物質または他の外部因子が、関連する生化学経路の正常な機能の一部として存在する可能性のあるｍＲＮＡの転写のダウンレギュレーションを引き起こす可能性がある。曝露後の特異的レギュレーションの場合、転写されるｍＲＮＡの量は、一般に化学物質、化学物質の混合物または外部因子への曝露の量または程度に依存するはずである。正常では、ｍＲＮＡが翻訳されて、生物または細胞中で生理的機能を有するかまたは有さないタンパク質が生じるが、遺伝子工学によって処理された成分を含む経路では、翻訳されたタンパク質が生成される結果にはならないｍＲＮＡが形成される可能性がある。
【０００４】  古典的に、曝露の影響の解明には、全体観的医学の観点から生物または細胞に対して考えられる全体的な影響、たとえば死を観察することを利用する。非常に最近では、翻訳されたタンパク質、酵素または酵素産物を測定することによって、生化学変化そのものが観察されている。したがって、この手段による環境的変化の検出またはアッセイは充分なものではなく使用が制限される。
【０００５】    （従来技術の説明）
生物の、たとえば重金属、農薬の残留物、可塑剤または洗剤の残留物などの環境汚染物質への曝露を観察するための、細胞または生物中での生化学的なマーカーの使用の多数の報告が文献中に存在する〔P Kille他(1992) Aquat.Toxicol.22、279〜286:W Baturo他(1996) Environmental Toxicology and Chemistry 15、771〜781:T Stahlschmid他(1997)Environmental Science and Pollution Research 4、155〜162〕。このような手法の一例は、それを使用してエストロゲン活性を有する飲料水媒介の環境汚染物質の存在を確かなものにする手法である。タンパク質ビテロゲニンは、正常ではオスの魚には存在しない。しかしながら、慢性的にエストロゲン物質に曝露されているか、またはある種の洗剤の残留物などのエストロゲン活性に似ている環境汚染物質に曝露されているオスの魚によって、このタンパク質が生成されることが知られている〔S Jobling他、(1993) Aquat.Toxicol.27、361〜372:CE Purdom(1994)Chemistry and Ecology 8、275〜285:CB Lazier他、(1993)In:Biochemistry and Molecular Biology of Fisher.Ch.19、Vol.2.Hochanchka and Mommsen (eds)、Elsevier Science Publishers〕。したがって、正常なオスの魚を汚染している疑いのある水に導入し、その後魚からの組織または体液のサンプルをビテロゲニンに関するアッセイにかけることが可能である。このような試験は、通常では血液の血漿のＳＤＳタンパク質ゲル電気泳動〔UK Laemmli(1970) Nature(London)227、680〜685〕、またはイムノアッセイ〔S Joblimg他(loc cit):CE Purdom他(loc cit):CB Lazier他(loc cit)〕を使用して行われるであろう。このようにして、ビテロゲニンの存在が、エストロゲン活性を有する汚染物質の存在を示すものとなるであろう。
【０００６】  多くの方法は遺伝子産物、すなわちタンパク質のアッセイに関係している。しかしながら、このような方法は時間がかかり、使用が制限される。このような欠点を克服しようとする試みでは、ある範囲の異なる遺伝的技法を使用して、環境または疾患の変化によって引き起こされる遺伝子転写のパターンの変化を同定する、いくつかの手段が報告されている〔CG Sagerstorm他(1997)Ann.Rev.Biochem.66、751〜783〕。細胞および生物の化学的曝露に応答性がある多くの遺伝的要素（「ストレス遺伝子」）が既に知られている。これは、たとえば重金属で汚染された土壌に曝露させたミミズを使用して証明されている〔SR Sturzenbaumn(1998) Applied Soil Ecology 9、495〜500:SR Sturzenbaumn他(1998) In:Advances in Earthworm Ecotoxicology、Sheppard他(編)、SETAC Press、p 215〜224〕。この技法は翻訳された遺伝子産物の判定を利用するものではないが、ノーザンブロッティング、ＲＮａｓｅ保護アッセイおよびＲＴ−ＰＣＲなどのｍＲＮＡレベルを分析するために日常的に使用される既存の技法のいくつかの制約を被る〔J Sambrook他(1989) Molecular Cloning:A Laboratory Manual、2nd Ed.、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、New York:CT Wittwer他(1997) Gene Quantification〕。手順を行うために必要とされる技術的知識の程度、危険な試薬、すなわち放射標識されたヌクレオチドの含有、アッセイを行うのにかかる時間、コスト、感受性、測定の特異性および精度、すなわち結果が定性的または定量的のいずれであるかを含めた、いくつかの基準を使用することによって、これらの手順の有用性を評価することができる。
【０００７】  最も広く使用されている技法はノーザンブロッティングであり、これは１）高度に訓練されたオペレーターを必要とし、２）ラジオアイソトープを使用し、３）２〜３日を必要とし、４）高価であり、５）合計１０〜２０μｇのＲＮＡを必要とする。さらに、イソ型の間で交差反応性が生じる可能性があり、この手順は定性的な結果のみを提供する。
【０００８】  ＲＮａｓｅ保護アッセイによってより高度な特異性が示され、約１０分の１の出発原料を必要とするが、このアッセイはさらに時間がかかり、放射性プローブの作製を必要とし、コストの増大を伴なう。放射性の検出は化学発光性の検出で置き換えることができるが、これらの手順ではビオチンなどの化学物質の間接的なリガンド結合を使用し、この化学物質がＤＮＡプローブに共有的に結合している。この検出の間接的な性質のために、これらの手順は余分なステップおよび試薬を必要とし、検出を行うために必要とされるシグナル増幅のためにバックグラウンドが干渉されがちである。現在の技法すべてについての使用を制限するものは、オペレーターの必要とされる高度なレベル、手順を行うためにかかる時間、コスト、および結果の低レベルの再現性である。
【０００９】  ＲＮＡの定量化に関する、直接的な化学発光標識型オリゴヌクレオチドプローブの使用が記載されている〔米国特許第5,283,174号、米国特許5,399,491号〕。しかしながら、このような方法は、感染性の疾患を引き起こす原因である細菌を検出する手段として示されているだけである。ここでは、このような方法の、細菌中に存在する多量のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を検出するための能力に信頼性が置かれる。
【００１０】  我々は新規な方法を開発し、この方法により、直接的な化学発光標識型オリゴヌクレオチドプローブの使用によって、化学物質、化学物質の混合物または他の外部因子に曝露された生物または細胞または他の転写産物のｍＲＮＡの転写のレベルの変化が観察される。本明細書で具体化する教示によって、試薬キットの開発、迅速で、感受性および再現性のある方法で、化学物質、化学物質の混合物または生きている生物の他の外部因子の考えられる毒性的または薬理学的活性を、ほぼリアルタイムで評価するための方法がはじめて可能になる。
【００１１】    （発明の概要）
本発明の一態様によれば、化学物質、化学物質の混合物また他の外部因子を検出および／または定量するための方法が提供され、この方法は以下のことを含む。
曝露されていない状態と比較して曝露によって核酸の生成が変化するように、前記化学物質、化学物質の混合物また他の外部因子に、核酸を生じさせるよう、転写することができる遺伝子を含む生物、細胞または遺伝子のアセンブリを曝露させること、
前記核酸の少なくとも一部分と相補的であり、化学発光性分子または化学発光反応の成分で標識されているオリゴヌクレオチドプローブを使用して前記核酸を検出すること。
【００１２】  本教示において、ｍＲＮＡは有用な標的転写産物として特に同定されているが、同じ方法で他の転写産物を検出および／または定量化できることが理解されるはずである。
【００１３】  化学発光性分子は、化学発光性アクリジニウムの塩であることが好ましい。化学発光性分子は、ピリジニウム、フェナントリジニウム、ベンゾアクリジニウムまたはキノリニウムの群から選択される化学発光性の塩であってよい。代替的には、前記化学発光性標識体は、化学発光性アクリダンであってよい。
【００１４】  さらに、化学発光性標識体は、化学発光性アクリジンであってよい。
【００１５】  さらに、オリゴヌクレオチドは、化学発光反応に参加することができる物質で標識されていてよい。
【００１６】  前記オリゴヌクレオチドを相補的な標的配列と結合したとき、そのように結合していないときの化学反応性と比較して、オリゴヌクレオチド標識体を含む分子の化学反応性が異なることが好ましいであろう。
【００１７】  複数の異なる標識されたオリゴヌクレオチドプローブを使用して、同じ分析用サンプル中の相補的な標的配列の存在または不在を検出することができる。
【００１８】  遺伝子は、応答要素およびレポーター要素のそれぞれを少なくとも１つ含む組換え分子であってよい。
【００１９】  他の態様では、本発明は、化学物質、化学物質の混合物また他の外部因子を検出および／または定量するためのキットを提供する。得られる特定の核酸のレベルを曝露されていない状態のレベルと比較して変化させることができるほど、化学物質、化学物質の混合物また他の外部因子に事前に曝露させた生物、細胞または遺伝子のアセンブリと共に前記キットを使用する。必要であれば、生物、細胞または遺伝子のアセンブリがキットの一部分を形成してもよい。前記キットは検出および／または定量化される核酸の少なくとも一部分と相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを含み、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブは化学発光性標識体または化学発光反応の化学発光性成分で標識されている。
【００２０】  したがって本発明は、化学物質、化学物質の混合物、または他の外部因子の生物または細胞に対する毒性的または薬理学的影響の判定、したがってこのような化学分析物の検出および／または定量化、またはこのような化学物質に曝露された生物または細胞の遺伝子によって仲介される応答の使用による状態、またはそれらの濃度の変化、または他の外部因子の状態の変化にも関する。ｍＲＮＡまたは遺伝子から転写される他の転写産物の明確な配列と相補的なオリゴヌクレオチドプローブの使用によって、この応答が観察される。前記化学物質、化学物質の混合物、または他の外部因子の存在または不在下で、遺伝子の活性または転写経路を変化させることができる。標識されたプローブからの発光がプローブとその相補的な標的配列のハイブリダイゼーションの程度の指標であるように、化学発光性分子または化学発光反応の成分でオリゴヌクレオチドプローブを事前に標識することによって、これらのオリゴヌクレオチドプローブの結合が順に観察される。このようにして、発光の強度は転写される配列の量に正比例し、したがって特定の遺伝子の活性、または生物、細胞または遺伝子のアセンブリの化学物質、化学物質の混合物、または他の外部因子への曝露に応答性がある転写経路の指標である。本発明は、たとえば以下のいくつかの適用の分野において有用性があるが、これらだけには限られない。
１）生物圏に放出される可能性のある化学物質の毒性の判定、
２）環境中の化学汚染物質の検出および／または定量化、
３）薬理学的調製物の毒性および／または治療的活性の判定、
４）パーソナルケア品の考えられる悪影響の評価。
【００２１】  本明細書で具体化する教示は、生物または細胞の所与の化学種または状態への曝露の、考えられる有害な結果の評価を特に対象とするものではあるが、有益な結果が遺伝子によって仲介される成分を有する状況において、同じ手法を使用することができることを理解することができる。さらに、無傷の生物または細胞の使用に関するいかなる要件も必要とせずに、転写されるｍＲＮＡまたは他の転写産物をｉｎ  ｖｉｔｒｏで完全に生成させることができるように、これらのメカニズムに関係がある遺伝子のアセンブリを単離および／または工学処理することができる。これらの方法を使用することによって、簡潔性およびスピードの点において他の方法に優る利点が与えられ、したがってリアルタイムの判定を行うことがはじめて可能になる。このようにして遺伝子の活性を観察するための、このような化学発光標識されたオリゴヌクレオチドの使用は新規かつ驚くべきことである。なぜなら、生物学的試料中の感染性生物の検出以外に関するこのタイプの終点の有用性を示唆する教示はないからである。
【００２２】    （好ましい実施形態の説明）
本発明の好ましい態様では、化学物質または化学物質の群などの特定の環境パラメータに応答性があり、検出または定量することが必要である遺伝子を有する、生物または細胞を同定する。当業者は、このような遺伝子の同定の手段を容易に理解する。この種の手法の一例はディファレンシャルディスプレーである。
【００２３】  当該の化学物質は、重金属（水銀、カドミウムなど）などの環境汚染物質、農薬の残留物（有機リン酸化合物など）、除草剤の残留物（トリアジン、グリフォセートなど）、ポリ芳香性炭化水素、ポリ塩化ビフェニルおよび他の合成または天然に存在する化合物によって例示されるが、これらだけには限られない。第１に、当該の１つの分析物または複数の分析物に応答性がある遺伝子を同定し、既に確立されており当業者に知られている方法を使用して特徴付けする。第２に、確立されている方法によってオリゴヌクレオチドプローブを合成し、その結果その配列は、生物または細胞系の当該の分析物への曝露に応答性がある遺伝子から転写される特定のｍＲＮＡ分子の領域と相補的である。第３に、オリゴヌクレオチドプローブを化学発光性分子で標識する。化学発光性分子からの発光は、プローブと遺伝子の活性化に応答して生成される特定のｍＲＮＡ分子のハイブリダイゼーションを指標するものである。代替的に、化学発光標識したオリゴヌクレオチドプローブを使用して、それ自体は遺伝子の調節に影響を与えないがＲＮＡポリメラーゼ活性などの転写メカニズム中の他の要素に影響を与える、化学物質、化学物質の混合物、または他の外部因子への曝露による、ｍＲＮＡレベルの変化を検出することができる。特に好ましい態様では、米国特許第5,283,174号に記載される、二本鎖核酸による化学発光性アクリジニウムの塩のハイブリダイゼーション保護の性質を使用し、その内容は参照によって本明細書に組み込まれている。ここでは、標識したオリゴヌクレオチドプローブをそれと非常に相補的な核酸標的にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしていないかまたは非特異的にハイブリダイズした標識したオリゴヌクレオチドの化学発光性が化学発光性分子の加水分解によって失われるように、次いで反応条件を変化させる（たとえば温度および／またはｐＨの上昇）。化学発光性オリゴヌクレオチドプローブが非常に相補的な標的配列にハイブリダイズするときに、この加水分解が起こることはないので、したがってその後の化学発光活性の評価は存在する標的配列の量に正比例する。米国特許第5,283,174号で開示されるこのような化学発光性の終点の使用に基づいて、化学発光性オリゴヌクレオチドプローブの設計、合成および使用の仕方を、一般に当業者は容易に理解するであろう。文献中には、たとえばピリジニウム、フェナントリジニウム、ベンゾアクリジニウムおよびキノリニウム塩、アクリダンおよびアクリジンを含む、他の化学発光系の記述も存在する。最後に、オリゴヌクレオチドプローブに関する標識体として一般的な有用性があると言われている、化学発光反応のいかなる化学発光性化合物または成分も、本発明の文脈において使用することができる。
【００２４】  本発明の教示によって、容易に行うことができる方法によって、迅速で、コスト効果があり、感受性がある広範囲の分析物の検出および／または定量化を可能にする方法が生み出されるように、遺伝子同定、ｍＲＮＡの標的化、化学発光標識したオリゴヌクレオチドプローブの検出の技法を効果的に組み合わせることができるという驚くべき発見が示される。さらにこの方法は、良くない生態学的影響を有する可能性がある生物学的に利用可能な汚染物質を評価するためには非常に望ましい。このような方法は以前に記載されておらず、記載するこのようなシステムを進展させることができるかどうかも明らかではない。
【００２５】  他の態様では、化学的または物理的刺激への曝露の結果として生物または細胞が遺伝子の応答を示すいかなる状況にも、同じ技法の原理を適用することができ、前記応答が核酸を形成する結果となることを理解することができる。
【００２６】  他の態様は、核酸濃度の変化を検出することに関するものであり、この変化は遺伝子自体の調節ではなく、転写経路の他の要素の化学的または物理的変化の影響の結果によるものである。たとえば、転写された配列の合成は特定の酵素の活性を利用するものであることが知られている。したがって、転写物の濃度の変化を観察することが、得られるこれらの酵素の活性の指標にもなる。このような酵素の活性に影響を与える疑いのある推定の薬理学的化合物の活性を評価するためには、この方法は非常に有利である。このような酵素の例は、ポリメラーゼおよび逆転写酵素である。詳細にはこのような方法は、抗細菌または抗ウイルス剤として考えられる有用性があり、その結果複製に関係のある酵素に影響を与える化合物をスクリーニングするために有用である。
【００２７】  薬理学的活性を有する化学物質の同定は、薬剤発見プログラムへの鍵である。組み合わせ型の合成の出現には、多数の少量の化学試薬の薬理学的活性および毒性に関するスクリーニングが必要である。現在の方法はこうした目的にはうまく適合しておらず、複雑で、時間の無駄であり高価である。対照的に、本明細書で開示する教示によって、細胞のｍＲＮＡ応答をほぼリアルタイムで観察することが可能であり、多数の推定治療剤の活性を同時に研究することが可能である。
【００２８】  類似の態様では、標的ではない環境中の生物に対する除草剤および農薬などの新たに開発された化学種の、考えられる並列的な毒性の影響に関する関心が非常に高い。毒性のストレスによって曝露されている生物中のｍＲＮＡ生成の調節が必ず変化する結果となるので、本明細書に記載する教示を使用して新たに開発された化学種の毒性を判定することができる。
【００２９】  実際に、生物の管理、細胞のメンテナンス、およびｍＲＮＡまたは他の転写産物が由来するｉｎ  ｖｉｔｒｏの遺伝子のアセンブリの単離および／または工学処理用に、確立された技法を使用することができる。
【００３０】  参照の目的で、タンパク質アクチンに対応するような適切な「ハウスキーピング」遺伝子に由来するｍＲＮＡに、ストレス遺伝子のｍＲＮＡと同じ手順を施す。標的とされる応答性ゲノム要素と同じ刺激に応答しない、このようなハウスキーピング遺伝子を、コントロールとしてこの方法用に選択する。したがってある特定の例では、曝露されていない（および曝露されていると推定される）生物または細胞から、生物の標的組織または細胞株の抽出物を調製することができ、化学発光標識した所望の配列のオリゴヌクレオチドプローブを使用してそこに含まれるｍＲＮＡを分析する。
【００３１】  組織相同体または細胞溶解物からの核酸の抽出は、公開されている方法に従って行うことができる。適切な条件下において適切な緩衝溶液中で、知られている量の化学発光標識したオリゴヌクレオチドプローブと抽出物のサンプルを混合させる。プローブ配列と相補的な配列を有する標的の存在によって、結果としてハイブリダイゼーションする。本発明の好ましい態様では、化学発光性アクリジニウムエステルでオリゴヌクレオチドを標識する。ここでは、ハイブリダイゼーション手順に従って、好ましくは２０℃〜８０℃、より好ましくは５５℃〜６５℃の温度で、アルカリ条件に反応混合物を曝露させる。このような条件下では、ハイブリダイズしないプローブが選択的に加水分解され、その結果その化学発光活性が失われ、したがって光度計中で測定される化学発光の発光の存在が標的の存在の指標となる。ハイブリダイゼーション反応を行うため、化学発光性を測定するための適切な手順は、当業者にはよく知られている。別々の平行した実験において、一例ではオリゴヌクレオチドプローブと選択の標的、もう１つの例ではオリゴヌクレオチドプローブとコントロールとしてのアクチンｍＲＮＡをそれぞれ使用して、これらの手順を行うことができる。生物または細胞株が推定毒性化学物質に曝露されていないと考えられるサンプルと比較して、標的が増大した曝露された生物または細胞株からのサンプル中での発見は毒性ストレスの存在を示すものである。この手法の代替方法として、サンプルおよびコントロールの実験を同じ反応環境において同時に行う可能性が存在する。ここでは、異なる化学的性質または光学的性質を有する化学発光性標識体で、異なるオリゴヌクレオチドをそれぞれ標識する能力を使用する。たとえば、その反応動態に基づく化学発光性化合物の差別化に関するこのような手順は、既に確立されている〔米国特許第5,756,709号〕。
【００３２】  本明細書に記載する教示に関しては、原核生物の細胞を使用することが非常に有利である。なぜなら、現在の分子生物学技法を使用して、所望の応答要素（プロモーター配列）および「レポーター」配列の両方を含む人工的な「遺伝子」配列または構築体を作製することができるからであり、当該の分析物のプロモーターへの結合に応答して、これらからｍＲＮＡまたは他の標的核酸が転写される。これらのアセンブリの作製は充分に確立されており、このように生成された標的核酸が天然に存在するかどうかに関係なく、翻訳したタンパク質を生成させることができるかどうかに関係なく、転写されることができる任意のヌクレオチド配列にプロモーターを結合させることができる。
【００３３】  他の態様では、無傷の細胞を必要としない生化学的アセンブリを使用することができる。たとえばｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写の使用は充分に確立されており、したがって選択される代謝経路に対応する生化学系の化学的／物理的環境の変化の影響を確立することができる。生化学系を使用して、遺伝子調節そのもののレベル、または転写に関係がある酵素などの転写経路の他のレベルでの影響を観察することができる。
【００３４】  さらに、複数の応答およびレポーター要素を有する構築体を工学処理することができる。
【００３５】  本発明をより完全に理解するために、例示目的で以下の非制限的な実施例を与える。
【００３６】    （実施例）
実施例１
マウスのアクチンのＲＮＡに対するアクリジニウム標識したオリゴヌクレオチドプローブの調製
確立されている方法を使用して、マウスのアクチンのＲＮＡに対する以下のオリゴヌクレオチドプローブ配列を合成した。５’−ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＧＣＡ  ＡＴ＊Ｇ  ＡＴＣ  ＴＴＧ  ＡＴＣ  ＴＴＣ−３’（＊はリンカーの位置を示す）
【００３７】  アミノ基中で終結しているヌクレオチドではないリンカーを、合成中にこの配列に導入した。４−（２−スクシニミジロキシカルボニルエチル）フェニル−１０−メチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルホネートでプローブを標識し、高速液体クロマトグラフィを使用して精製した。文献中に記載されるように、プローブの合成、標識および精製を行った（「Detection of acridinium esters by chemiluminescence」、NC Nelson and MA Reynolds、in「Nonisotopic Probing、Blotting and Sequencing」、(1995)Academic Press Inc.、p.391〜427:LJ Arnold and NC Nelson、米国特許第5,185,439号:LJ Arnold他 WO88/03173）。
【００３８】  実施例２
マウスのアクチンのｍＲＮＡの定量化
市販の方法（Qiagen Rneasy Midi Kit）を使用して、マウス肝臓の組織から全ＲＮＡを調製し、滅菌した純粋な水の中で溶離させた。光学吸収測定装置で決定した、回収した全ＲＮＡの濃度は常に４００〜８００ｕｇ／ｍｌであった。
【００３９】  三塩基決定を使用してアッセイを行った。ダブルストレングスハイブリダイゼーションバッファー（リチウムスクシネート０．１ｍｏｌ／ｌ、ｐＨ５．２、ＥＤＴＡ３ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＧＴＡ３ｍｍｏｌ／ｌ：１７％（ｗ／ｖ）リチウムラウリルサルフェート）、実施例１に従って作製したアクリジニウムエステル標識したオリゴヌクレオチドプローブ２０ｆｍｏｌ（マウスのβ−アクチン遺伝子と相補的である〔Ｇｅｎｅｂａｎｋ  受託番号：Ｘ０３６７２〕）、および明確な量の全ＲＮＡを含む１２×７５ｍｍのポリスチレンチューブ（Sarstedt、Cat.No.55.476）内で、ハイブリダイゼーション反応を行った。反応体積を１００ｕｌまで作成した。コントロールは以下のものからなっていた：ブランクサンプル（試薬のみ）、ネガティブコントロール（標的核酸以外のすべての成分）、ポジティブコントロール（すべての成分、ただしプローブ配列と相補的な知られている量の鎖状オリゴヌクレオチドで置き換えられている全ＲＮＡを有する）。この反応チューブを止め、６０℃で３０分間インキュベートした。
【００４０】  加水分解バッファー３００ｕｌ（ホウ酸ナトリウム１９０ｍｍｏｌ／１、ｐＨ７．６：５％  ｖ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）をそれぞれのチューブに加え、反応物を６０℃でさらに１０分間インキュベートした。インキュベーションの直後に、チューブを氷上で１分間冷却し、次いでさらに１〜２分室温で放置した。光度計（Ｓｔｒａｔｅｃ  Ｌｕｍｉｎｏ）中で５秒間、相対的光単位（ＲＬＵ）として化学発光性を測定し、その後Pace 2 Detections Reagents IおよびII(Gen Probe)それぞれを２００ｕｌ順次に注入した。その結果を以下の表１で述べ、図１において図式的に示す。
【００４１】  表１：マウスのアクチンのｍＲＮＡに関する化学発光の応答。ＲＬＵ値はブランクを差し引いた三塩基の平均値である。
RNA (ug)      RLU        標準偏差
25            25489          3065
20            20104          743
15            16991          1961
10            13258          1932
5             7618           120
【００４２】  実施例３
マウスのアクチンのｍＲＮＡに関するアッセイの特異性
前述のマウスのアクチンのアクリジニウムエステル標識したオリゴヌクレオチドプローブには、類縁のサーモンアクチン配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  受託番号：ＡＦ０１２１２５）と比較すると１つの塩基のミスマッチがあった。このミスマッチがハイブリダイゼーション動態に影響を与え、したがって系は全体の相補性に関して特異的である。存在するマウスアクチンの配列の量と均等な、一定量のサーモンアクチン配列（実施例２で記載したマウスアクチンのＲＮＡの調製に関して記載する方法でサーモン肝臓組織から調製した）を加えることによって、この特異性が証明される。マウスアクチンのＲＮＡに関するものと同じ方法でアッセイを行い、その結果を図２に図式的に示す。サーモンアクチン配列の存在によって、それを加えた反応におけるマウスアクチンのｍＲＮＡの検出において、障害が引き起こされることはないことを理解することができる。
【００４３】                                            AE
↓
プローブ                    5' -GGA GGA GCA ATG ATC TTG ATC TTC- 3'
RC-アクチン（マウス）       5' -GGA GGA GCA ATG ATC TTG ATC TTC- 3'
RC-アクチン（サーモン）     5' -GGA GGG GCG ATG ATC TTG ATC TTC- 3'
注：遺伝子配列は逆向きに相補的である。すなわちアンチセンス鎖。ＡＥ＝アクリジニウムエステル。
【００４４】  実施例４
ミミズアクチンの遺伝子
ミミズ（Lumbricus rubellus）組織全体から、全ＲＮＡを単離した。この方法は、肝臓組織から全ＲＮＡを単離するための方法とは若干異なる。なぜなら前者は非常にコラーゲン性であり、より厳格な方法を必要とするからである。ここでは確立されている方法に従いＴＲＩ試薬（Sigma Chemical Co.）を使用して、全ＲＮＡを単離した。この方法から得たＲＮＡペレットを滅菌した純粋な水中で溶解させ、製造者の指示に従ってQiagen RNeasy Maxiカラムを介して洗浄した。ミミズアクチンの遺伝子（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  受託番号：Ｙ０９６２３）と相補的であるアクリジニウム標識したプローブを使用したこと以外は、実施例２で記載したものと同じ方法で、ミミズアクチンのＲＮＡに関するアッセイを行った。その結果を以下の表２に与える。
【００４５】  表２：ミミズアクチンのＲＮＡに関する化学発光の応答。ＲＬＵ値は三塩基決定の平均値である。
RNA (ug)      RLU        標準偏差
1.5           4345          131
3.1           5125          259
6.1           7910          1221
12.3          13836         1184
18.4          19133         1474
24.6          24745         65
【００４６】  実施例５
ファットヘッドミノー（Pimephales promelas）中のビテロゲニンのｍＲＮＡの測定
エストロゲン依存性の卵黄タンパク質の前駆物質であるビテロゲニンの産物は、卵生脊椎動物中のエストロゲンへの曝露に関する貴重なバイオマーカーとして働くことができる。このバイオマーカーはｉｎ  ｖｉｔｒｏ（肝細胞の培養）およびｉｎ  ｖｉｖｏでの研究において使用することができる。ビテロゲニンは正常ではメスの魚類の血漿中のみに存在するが、オスもビテロゲニン遺伝子を有しており、オスの魚類を環境エストロゲンに曝露させることによってこの遺伝子の発現を引き起こす可能性がある。ファットヘッドミノー、Pimephales promelas は環境毒物学において最も広く使用される魚類の一種である。
【００４７】  ファットヘッドミノーのビテロゲニンのｍＲＮＡとハイブリダイズさせるために設計した、アクリジニウム標識したオリゴヌクレオチドプローブ（５’ＣＧＧ  ＧＣＡ  ＡＴ＊Ｇ  ＡＣＡ  ＧＣＡ  ＡＡＡ  ＡＣＡ  ＧＧ−３’：＊＝アクリジニウムエステル）を使用して、オス、メスおよびエストラジオール誘導型の未熟なファットヘッドミノーにおける遺伝子の発現を測定した。それぞれのサンプルに関してアクチンの発現も観察した。なぜなら、アクチンは偏在的に発現される遺伝子として広く受けられており、したがってコントロールとして使用することができるからである。
【００４８】  以下の実験手順を適用した：
１．確立されている手順を使用しＴＲＩ試薬（Sigma Chemical Co.）を用いて、以下のものから全ＲＮＡを抽出した。
成体のオスのファットヘッドミノー
成体のメスのファットヘッドミノー
未熟なエストラジオール誘導型ファットヘッドミノー
２．ＨＰＡフォーマット：
測定するそれぞれのサンプルについて、１２×７５ｍｍのSarstedtチューブ中で以下の反応混合物を調製した。それぞれの測定について、複製サンプルを調製した。
ダブルストレングスハイブリダイゼーションバッファー５０μｌ
アクリジニウム標識したプローブ１０μｌ（〜０．１ｐｍｏｌ）
全ＲＮＡをＸμｌ（〜６μｇ）
滅菌水Ｙμｌ
１００μｌという合計反応体積を与えるために、ＸおよびＹを選択する。
【００４９】  ハイブリダイゼーション：
チューブはすべて、水浴中において６０℃で３０分間インキュベートした。
【００５０】  加水分解：
加水分解バッファー３００μｌ（ホウ酸ナトリウム１９０ｍＭ、ｐＨ７．６：５％  ｖ／ｖ  Triton X-100）をそれぞれのチューブに加えた。
循環している水浴中において６０℃でさらに１０分間、すべてのチューブをインキュベートした。
次いで測定前に、氷浴中で２分間すべてのチューブを冷却し、次いで２分間室温にした。
【００５１】  検出：
Detection Reagents IおよびII（Gen Probe Inc.、San Diego、U.S.A）の２００ｕｌ注入および５秒の測定時間を使用して、光度計（Stratec Biomedical Systems）中で、それぞれの複製物の化学発光性を測定した。
【００５２】  実施例６
１７β−エストラジオールへの腹膜内（ＩＰ）曝露に従ったファットヘッドミノー中のビテロゲニンのｍＲＮＡの発現の測定
ＩＰ曝露：１７β−エストラジオール（５ｍｇ／ｋｇ）を、腹膜内注射によって０日目に投与した。１、３、５および７日目に５匹の魚をサンプル採取した。コントロールの魚（エストラジオールなし）もサンプル採取した。
【００５３】  アッセイ：実施例５に概略するように、ビテロゲニンのｍＲＮＡを抽出し測定した。各測定あたり約１５μｇの合計ＲＮＡを使用した。
標識したプローブ配列と相補的な１組の標的基準鎖と比較して、サンプルを測定した（標的の濃度＝０．１、０．５、１．０、５．０、１０および５０ｆｍｏｌ／１０μｌ）。これらの結果を図４に示す。
【００５４】  実施例７
環境１７β−エストラジオールの曝露に従った、ビテロゲニンのｍＲＮＡの誘導
環境的曝露：４０リットルの水槽中の未熟なファッドヘッドミノー（重量範囲＝０．３０〜１．０ｇ）を、フロースロー投与システムを介して１７β−エストラジオール１００ｎｇ／Ｌに曝露させた。０、７、１４および２１日目に５匹の魚をサンプル採取した。
【００５５】  アッセイ：実施例６に概略するように、ビテロゲニンのｍＲＮＡを抽出し測定した。各測定あたり約１５μｇの合計ＲＮＡを使用した。これらの結果を図５に示す。
【００５６】  実施例８
遺伝的に改変された大腸菌を使用する水銀の検出および化学発光性ハイブリダイゼーションのアッセイ
プラスミドｐＲＺ−ＥＳ１は、Ｈｇ（ＩＩ）輸送システム、Ｈｇ（ＩＩ）応答性転写調節物、およびｌａｃＺの転写を指示するその同族プロモーターをエンコードしている遺伝子を含む。その遺伝子およびｐＲＺ−ＥＳ１中に存在するプロモーターの概略図（Peter A.Lund他(1987)Gene 52、ｐ２０７〜２１４に記載される）を図６に示す。
【００５７】  以下のステップを行った：
反応能のある大腸菌の調製
大腸菌ＴＧ２のアリコート（５ｍｌ）を使用して、（バクト−トリプトン１０ｇ／ｌ、バクト−酵母菌抽出物５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ／ｌ、ｐＨ７．０（「ＬＢ」溶液、１００ｍｌ））の溶液を接種し、ＯＤ600が０．４５〜０．６０に達するまで（約３時間）、撹拌（３７℃、２２５ｒｐｍ）しながらインキュベートした。その培養物を２つの５０ｍｌの円錐形チューブに移し、遠心分離した（３，０００ｒｐｍ、５分間）。結果として生じたペレットを冷たいＣａＣｌ2（５０ｍＭ、２５ｍｌ）中で再懸濁させ、氷上で冷やし（２０分）、その後４℃で遠心分離した（３，０００ｒｐｍ、５分間）。そのペレットを冷たいＣａＣｌ2（５０ｍＭ、１０ｍｌ）中で再懸濁させ、氷上で冷やした（１〜６時間）。次いでそれらの細胞を使用する用意をし、または滅菌グリセロール（４０％、１０ｍｌ）を加えて−７０℃でアリコート（２００μｌ）中に保存することによって代替的にグリセロールストックとして保存した。細胞が必要なときは、それらを氷上でゆっくりと解凍した（１５〜３０分）。
【００５８】  反応能のある大腸菌の形質転換
反応能のあるＴＧ２細菌（２００μｌ）を、冷やした１５ｍｌの円錐形チューブに移した。ｐＲＺ−ＥＳ１のＤＮＡ（約１０〜５０ｎｇ）を細胞に加えて、ゆっくりと撹拌した。チューブを氷上で冷やし（３０分）、その後熱ショックを与えた（４２℃、３分間）。バクト−トリプトン１６ｇ／ｌ、バクト−酵母菌抽出物１０ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌの溶液（予め４２℃に加熱した「２ＴＹ」、８００μｌ）を加える前に、チューブを氷上ですぐに冷やした（２分間）。撹拌（３７℃、２２５ｒｐｍ、１時間）しながら細菌をインキュベートした。形質転換混合物のアリコート（５０〜１００μｌ）を、カナマイシン抗生物質を含む「ＬＢ」−アガー（「ＬＢ」溶液およびバクト−アガー１５ｇ／ｌ）プレート上に置き、インキュベートした（３７℃、１８時間）。必要な場合は、遠心分離（１，０００ｒｐｍ、１０分間）によって細胞を濃縮し、平板培養の前に「２ＴＹ」（５０μｌ）中で再懸濁させた。
【００５９】  Ｈｇ（ＩＩ）を用いた細菌の誘導
ｐＲＺ−ＥＳ１プラスミドを含む１つのコロニーを採取し、これを使用してを「２ＴＹ」培地（５ｍｌ）を接種した。培養物をインキュベートした（３７℃、１８時間）。「２ＴＹ」中で一晩培養したものの１０倍の希釈物を、３７℃で２時間インキュベートした。他の「２ＴＹ」中の１０倍の希釈物をさまざまなＨｇＣｌ2濃度で接種し、ＨｇＣｌ2を含まない第２の希釈物を、コントロールとして使用した。適切なタイムスケールでの誘導の後、Qiagen RNeasy kitを使用してすべてのＲＮＡを調製した。
【００６０】  細菌のすべてのＲＮＡの単離
製造者の指示に従いRNeasy kit(Qiagen)を使用して、ＲＮＡの単離を行った。
【００６１】  ハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）
その転写されたｍＲＮＡに対応するプローブを事前に決定してＬａｃＺ−２よりも良いアッセイを行ったため、より高度の感受性およびより短い加水分解時間が達成されたために、ＬａｃＺ−４を使用した。使用したｌａｃＺ  ＨＰＡのアッセイ条件は以下のものであった。
【００６２】  ミクロ遠心分離用チューブ中で以下の反応混合物を調製し、インキュベートした（６０℃、３０分）。
ダブル  ストレングス  ハイブリダイゼーション  バッファー１５μｌ
アクリジニウム標識したプローブ１μｌ（０．０５〜０．１ｐｍｏｌ：相対的光単位４〜５×１０6）
ステップ４からの標的１０μｌ（０．０５〜０．１ｐｍｏｌ）
Ｈ2Ｏ  ４μｌ
【００６３】  インキュベーション  シングル  ストレングス  ハイブリダイゼーション  バッファー（２７０μｌ）を加えた後に、希釈した混合物のアリコート（１０μｌ）を１２×７５ｍｍのＳａｒｓｔｅｄｔチューブ中に移し、水浴のラック中に置いた。タイムゼロでの測定用に、Detection Reagents I(Gen Probe)２００μｌを加え、次に加水分解バッファー１００μｌを加えた。以下に記載するように、光度計中で化学発光性を測定した。ラック中の複製物に加水分解バッファー（１００μｌ）を加え、完全に混合させた。チューブはすぐに、６０℃の水浴中に必要とされる加水分解時間（１０分間）だけ置いた。望ましいタイムポイントで、１組の複製物を水浴から取り除き、それぞれにＲｅａｇｅｎｔｓ  Ｉ（２００μｌ）を加えた。チューブを振とうさせて、完全な混合を確かなものにした。化学発光性を測定する用意ができるまで、次いでチューブを氷上に置いた。Reagents II(Gen Probe)の１回の注入を使用する光度計中での測定（２００μｌおよび５秒の測定時間）の前に、チューブを室温で約１分間置いた。これらの結果を図７に示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ネガティブコントロールを有するアクリジニウム  エステル  アクチンプローブ（「プローブ」と示す）およびさまざまな量のマウスアクチンのｍＲＮＡを使用する、マウス肝臓の全ＲＮＡに関するアッセイの結果を示す図である。
【図２】  サーモンアクチンｍＲＮＡの存在下で、マウス特異的アクリジニウム  エステルで標識したプローブを使用する、マウス肝臓の全ＲＮＡのアッセイを示す図である（プローブ＝ネガティブコントロール）。
【図３】  ファッドヘッドミノーのオス、メスおよびエストラジオールに誘導される未熟な全ＲＮＡ調製物において、ファットヘッドミノーのアクチンｍＲＮＡおよびビテロゲニンｍＲＮＡのアクリジニウム標識したプローブを用いて測定した、相対的光単位（ＲＬＵ’ｓ）を示す図である。
【図４】  １７β−エストラジオールに曝露させた後のファッドヘッドミノー中のビテロゲニンの誘導を示す図である。バーは平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝５）を示す。データはｍＲＮＡの等量のｆｍｏｌ／μｌとして表す（合成標的オリゴヌクレオチドを使用して検量曲線の直線的回帰から誘導される）。
【図５】  １７β−エストラジオールに環境的曝露させた後のファッドヘッドミノー中のビテロゲニン誘導を示す図である。バーは平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝５）を示す。データはｍＲＮＡの等量のｆｍｏｌ／μｌとして表す（合成標的オリゴヌクレオチドを使用して検量曲線の直線的回帰から誘導される）。
【図６】  ｐＲＺ−ＥＳ１構築の概略図である。
【図７】  ｌａｃＺのｍＲＮＡと相補的な化学発光性のアクリジニウム標識したオリゴヌクレオチドプローブ配列を使用する、遺伝的に改変された大腸菌中の水銀応答の検出を示す図である。
【図１】
0005551325.tif 000002
【図２】
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【図３】
0005551325.tif 000004
【図４】
0005551325.tif 000005
【図５】
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【図６】
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【図７】
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