(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）の抗血管新生変異体或いはその抗血管新生類似体、抗血管新生断片又は抗血管新生融合タンパク質であって、前記変異体は、２４位、１１４位及び２２７位の位置での３つの改変リン酸化部位を有することのみにより配列番号１のヒトＰＥＤＦと異なっており、前記位置は、配列番号１にしたがって付番され、負に帯電したアミノ酸残基であり、前記類似体、断片又は融合タンパク質は、前記３つの改変リン酸化部位を含むことにより配列番号１のヒトＰＥＤＦと異なっており、前記類似体は、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有する、上記変異体、類似体、断片又は融合タンパク質。
【請求項２】
神経栄養活性を有する、請求項１に記載のＰＥＤＦの抗血管新生変異体、その類似体、融合タンパク質又は断片。
【請求項３】
配列番号２に記載のアミノ酸配列又はその断片を含む、請求項１に記載のＰＥＤＦの抗血管新生変異体、その類似体、融合タンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載される色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）の抗血管新生変異体或いはその類似体、断片又は融合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号７又はその断片を含む、請求項４に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項４又は５に記載のＰＥＤＦの抗血管新生変異体或いはその類似体、断片又は融合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の、ＰＥＤＦの抗血管新生変異体或いはその類似体、断片又は融合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
活性成分としての請求項１〜３までのいずれか一項に記載のＰＥＤＦの抗血管新生変異体、その類似体、融合タンパク質又は断片と、医薬として許容しうる担体とを含む医薬組成物。
【請求項９】
活性成分としての請求項４又は５に記載の、ＰＥＤＦの抗血管新生変異体或いはその類似体、融合タンパク質又は断片をコードする単離ポリヌクレオチドと、医薬として許容しうる担体とを含む医薬組成物。
【請求項１０】
活性成分としての請求項６に記載の、ＰＥＤＦの抗血管新生変異体、その類似体、融合タンパク質又は断片をコードする単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、医薬として許容しうる担体とを含む医薬組成物。
【請求項１１】
活性成分としての請求項７に記載の、ＰＥＤＦの抗血管新生変異体、その類似体、融合タンパク質又は断片をコードする単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞と、医薬として許容しうる担体とを含む医薬組成物。
【請求項１２】
新血管形成を随伴する疾患及び障害を治療するための、請求項８〜１１までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記新血管形成を随伴する疾患又は障害が、癌、眼疾患及び抗血管新生因子を用いて治療される障害からなる群より選択される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記疾患又は障害が、非上皮性悪性腫瘍、上皮性悪性腫瘍、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング（Ｅｗｉｎｇ’ｓ）腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛腫、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス（Ｗｉｌｍｓ’）腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、カポジ肉腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、希突起膠腫、髄膜腫、黒色腫及び神経芽細胞腫からなる群より選択される癌である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記眼疾患が、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、網膜芽腫、水晶体後部線維増殖症、ブドウ膜炎、未熟児網膜症、黄斑変性症、角膜移植片新血管形成、網膜腫瘍及び脈絡膜腫瘍からなる群より選択される、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記抗血管新生因子により治療される障害が、血管腫、関節炎、乾癬、血管線維腫、動脈硬化性プラーク、血友病関節及び肥厚性瘢痕からなる群より選択される、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記ＰＥＤＦの変異体、その類似体、融合タンパク質又は断片が、神経栄養活性を有する、神経変性症状を治療するための、請求項８〜１１までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記神経変性症状が、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、重症筋無力症、運動神経障害、ギランバレー症候群、自己免疫性神経障害、ランバートイートン筋無力症候群、腫瘍随伴性神経疾患、腫瘍随伴性小脳委縮症、非腫瘍随伴性スティフマン症候群、進行性小脳委縮症、ラスムッセン脳炎、筋委縮性側索硬化症、シデナム舞踏病、トゥレット症候群、自己免疫性腺性内分泌障害、免疫不全性神経障害、後天性神経性筋硬直症、先天性多発性関節拘縮症、視神経炎及びスティフマン症候群からなる群より選択される、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１〜３までのいずれか一項に記載の、ＰＥＤＦの抗血管新生変異体或いはその断片又は類似体をコードする単離ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、前記変異体、断片又は類似体の発現を促進する条件下で培養すること及び前記変異体、断片又は類似体を回収することを含む、ＰＥＤＦの抗血管新生変異体の作製方法。
【請求項２０】
前記宿主細胞が真核細胞である、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の改変リン酸化部位を含む色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）の抗血管新生変異体、これらをコードするポリヌクレオチド、及びその使用に関する。特に、複数の改変リン酸化部位を含むＰＥＤＦ変異体は、優れた抗血管新生活性及び高い神経栄養活性を備え、新生血管形成症状及び神経変性症状を伴う疾患の治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）は、セリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）のスーパーファミリーの一員であるが、今日に至るまで、いずれのプロテアーゼに対しても阻害活性を示すことは見いだされなかった。色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）は、分化した網膜芽腫細胞を、分化した神経細胞に変える能力に基づき初めて単離され、したがって神経栄養因子と見なされた。後に、神経栄養作用の他に、ＰＥＤＦは、眼球における血管新生の強力な天然阻害物質であり、いくつかの強力な血管新生促進因子の刺激活性を阻害することが示された。この抗血管新生の効力は、いくつかの動物モデルにおいても示され、該モデルにおいてＰＥＤＦは眼球内で血管の成長を縮小することに関連する因子として実証された。ＰＥＤＦは元来、胎児ヒト網膜から得られた色素上皮細胞の培養培地において発見されたが、ＰＥＤＦが網膜だけでなく、成人眼球の複数の部位並びに成人の脳、脊髄、ヒト血漿において発現することが今日では明らかである。したがって、ＰＥＤＦは体内において血管新生の阻害能を有し得る。
【０００３】
タンパク質のリン酸化が大部分の細胞内プロセスの調節において主要な役割を担っていることは、十分確立されている。しかし、これらはエクトプロテインキナーゼ又はエキソプロテインキナーゼのどちらかとして細胞外に存在するので、プロテインキナーゼが更に細胞外プロセスを調節できることがますます明白になっている。エクトプロテインキナーゼは膜結合酵素であり、その触媒活性は多様な細胞の細胞外表面に位置する。エキソプロテインキナーゼは、分泌性の可溶性酵素であり、その触媒活性は細胞に直接関与せず細胞外環境に存在する。そのプロテインキナーゼは、細胞外可溶性基質並びに細胞表面タンパク質の両方をリン酸化し、その結果細胞間相互作用、分化、増殖及びイオン流出を含む多くの生理的プロセスにおいて調節的役割を担っていることが示された。
【０００４】
最近の研究において本発明者らは、ヒトの血漿から精製したＰＥＤＦ（ｐｌＰＥＤＦ）がリンタンパク質であり、カゼインキナーゼＣＫ２（ＣＫ２）及びプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）による回路においてリン酸化されることを示した（Ｍａｉｋ−Ｒａｃｈｌｉｎｅ  Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．１０５：６７０−６７８，２００５）。ＣＫ２は、ＰＥＤＦを２つの主要な残基であるＳｅｒ２４及びＳｅｒ１１４に関してリン酸化することが示され、一方ＰＫＡは、ＰＤＥＦをＳｅｒ２２７に関してリン酸化することが示された。ＰＥＤＦのリン酸形態（ＳｅｒがＧｌｕに）又は非リン酸形態（ＳｅｒがＡｌａに）のどちらかを模倣する、いくつかのリン酸化部位変異体を使用して、ＣＫ２及びＰＫＡによるＰＥＤＦのリン酸化が、それぞれその生理的作用に明らかに影響を与えることが見出された。ＣＫ２によりリン酸化されたＰＥＤＦは、神経栄養活性が減少したものの、その抗血管新生活性は有意に増加した。一方、ＰＫＡによるリン酸化は、ＰＥＤＦの抗血管新生活性を減少させたが、その神経栄養活性にはほとんど影響を与えなかった（Ｍａｉｋ−Ｒａｃｈｌｉｎｅ  Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２００５，１０５：６７０−６７８）。
【０００５】
本発明の出願者らの国際出願公開ＷＯ２００６／０５４２７８は、ＰＥＤＦのＣＫ２によるリン酸化部位の２つのセリン残基、即ちセリン２４及びセリン１１４が負に帯電したアミノ酸に置換された、組換え野生型ＰＥＤＦと比べてより高い抗血管新生活性を発揮するが神経栄養活性はより低いＰＥＤＦ変異体、並びにＰＫＡによるリン酸化部位のセリン残基、即ちセリン２２７が負に帯電したアミノ酸に置換された、組換え野生型ＰＥＤＦと比べ抗血管新生活性が低く、神経栄養活性は組換え野生型ＰＥＤＦと同様であるＰＥＤＦ変異体を開示する。ＷＯ２００６／０５４２７８は、少なくとも１つの改変リン酸化部位を含むＰＥＤＦの抗血管新生変異体を請求する。ＷＯ２００６／０５４２７８は更に、ＰＥＤＦの抗血管新生変異体をコードする単離ポリヌクレオチド及びその使用法を請求する。
【０００６】
米国特許第５，８４０，６８６号は、ＰＥＤＦ、切断型ＰＥＤＦ及び等価タンパク質をコードする核酸、組換え型ＰＥＤＦ、切断型ＰＥＤＦ及び等価タンパク質を作製する組換え方法並びに神経分化、神経細胞の生存及びグリアの阻害におけるこれらタンパク質の使用を開示する。米国特許第６，３１９，６８７号は、組換えＰＥＤＦタンパク質及びＰＥＤＦの生物活性を有するＰＥＤＦの切断形態を請求する。
【０００７】
国際出願公開ＷＯ０３／０５９２４８は、強力な抗血管新生活性及び神経栄養活性を示すヒト血漿ＰＥＤＦを開示する。
【０００８】
国際出願公開２００４／０２８５５９は、本質的にＰＥＤＦの隣接する５〜５０個のアミノ酸からなるＰＥＤＦ断片、これらを含む医薬組成物及び癌又は眼科疾患の治療のためのその使用を開示する。
【０００９】
米国特許出願第２００５／０２２２０３１号は、ＰＥＤＦ又はＰＥＤＦと機能的に等価な特性を有するＰＥＤＦ変異体を、これらを必要とする対象に投与することを含む、悪性黒色腫の予防又は治療法を開示する。米国特許出願第２００５／０２２２０３１号によれば、ＰＥＤＦ変異体はヒトＰＥＤＦのアミノ酸配列に１つ又は複数のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含み、ヒトＰＥＤＦと機能的に等価な特性を有する。しかし、米国特許出願第２００５／０２２２０３１号のどこにも改変アミノ酸残基の位置及び数は開示されておらずＰＥＤＦ生物活性についてのアミノ酸の改変がもたらす結果もまた開示されていない。
【００１０】
米国特許第６，８２１，７７５号は、ＰＥＤＦをコードする核酸配列又はその治療的断片を含む、非増殖型アデノウィルスベクターを開示する。ウィルスベクターに組み込むために適しているのは、機能的ＰＥＤＦペプチド又はその治療的断片をコードする、置換、欠失又は付加を含む核酸配列であるが、米国特許第６，８２１，７７５号はＰＥＤＦより優れた活性を発揮できる特定のＰＥＤＦ変異体を開示していない。
【００１１】
米国特許出願公開第２００３／０１５８１１２号は、治療因子又は治療因子をコードする核酸配列を眼球に直接投与し、脈絡膜の新血管形成に関与する上皮細胞のアポトーシスを、脈絡膜血管新生が治療されるように選択的に誘導することを含む、脈絡膜新血管形成の治療法を開示する。記載された治療因子は、ＰＥＤＦ又はその断片である。米国特許出願公開第２００３／０１５８１１２号において、脈絡膜新血管形成の治療に使用できる、特定の部位にアミノ酸の置換を有するＰＥＤＦ変異体の表示はない。
【００１２】
国際出願公開第ＷＯ０５／０４１８８７号は、ＰＥＤＦ又はＰＥＤＦの４４アミノ酸ペプチド又は１０１、１０３、１１２及び１１５にそれぞれアミノ酸残基グルタミン、イソロイシン、ロイシン及びセリンが位置する、帯電していないその同族体を投与することを含む、血管透過性の上昇を伴う症状の治療方法を開示する。国際出願公開第ＷＯ０５／０４１８８７号のどこにも２４、１１４及び２２７に位置する、置換セリン残基を含むＰＥＤＦ変異体が、血管透過性が上昇し、又は血管新生が増加した症状を治療するために有用であり得るとは開示していない。
【００１３】
神経栄養活性を示すＰＥＤＦの強力な抗血管新生変異体に関する必要性は、未だ満たされていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、配列番号１のヒトＰＥＤＦのアミノ酸配列と比較して改変されたアミノ酸配列を含み、改変アミノ酸配列は複数の改変リン酸化部位を含む改変アミノ酸配列である、新規な抗血管新生ＰＥＤＦ変異体を提供する。特に、本発明は配列番号１のヒトＰＥＤＦのアミノ酸配列と比較して改変されたアミノ酸配列を含み、改変アミノ酸配列はセリン２４、セリン１１４及びセリン２２７において３つの改変リン酸化部位を含む、新規な抗血管新生ＰＥＤＦ変異体を提供する。本発明は更に、新規なＰＥＤＦ変異体をコードする単離ポリヌクレオチド、これらを含む医薬組成物及びその使用方法を提供する。本発明は更に、ＰＥＤＦ変異体を対象とする、単離抗体を提供する。
【００１５】
意外なことに、２４、１１４及び２２７の位置に３つの負に帯電したアミノ酸残基を含み、その位置の天然セリン残基が置換され、したがってＣＫ２とＰＫＡとによる同時リン酸化を模倣するＰＥＤＦ変異体が、優れた抗血管新生活性を示すことをここに開示する。本明細書中で以下にＥＥＥ変異体として指定されたこの三重変異体は、２４及び１１４の位置に負に帯電したアミノ酸残基を２つのみ含み、ＣＫ２のみによるリン酸化を模倣するＰＥＤＦ変異体よりも、より強力な抗血管新生因子であり、組換え野生型のＰＥＤＦよりはるかに活性があることが示される。驚いたことに、ＥＥＥ変異体は高い神経栄養活性を示す。ＥＥＥ変異体によって得られる神経栄養活性は、組換え野生型ＰＥＤＦの神経栄養活性と同様であったが、セリン２４及びセリン１１４に負に帯電した２つのアミノ酸残基を有するＰＥＤＦ変異体の神経栄養活性は有意に高く、後者はごくわずかな神経栄養活性しか示さなかった。したがって、意外なことに新規なＰＥＤＦ  ＥＥＥ変異体は、優れた抗血管新生活性を示すが組換え野生型ＰＥＤＦの神経栄養活性を保持する。
【００１６】
セリン２４、１１４及び２２７の３つのアミノ酸の置換を含み、そのうちセリン２４及び１１４のみが負に帯電したアミノ酸残基によって置換されたＰＥＤＦ変異体は、強力な抗血管新生活性を示すことを更に開示する。この抗血管新生活性は、ＣＫ２及びＰＫＡの両方によるリン酸化を模倣する、３つの負に帯電したアミノ酸残基を含むＥＥＥ変異体によって示される抗血管新生活性より低いが、ＣＫ２よるリン酸化のみを模倣する２つの負に帯電したアミノ酸残基を含むＰＥＤＦ変異体によって示される抗血管新生活性と同様である。セリン２４、１１４及び２２７に３つのアミノ酸の置換を含み、そのうちセリン２４及び１１４のみが負に帯電したアミノ酸残基によって置換されたＰＥＤＦ変異体は、神経栄養活性をごくわずかしか発揮しなかった。
【００１７】
第一の態様によれば、本発明は色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）の抗血管新生変異体或いは配列番号１のヒトＰＥＤＦに由来する、修飾されたアミノ酸配列を含むその類似体又は融合タンパク質、或いは改変リン酸化部位がセリン２４及びセリン１１４の２つのみからなるＰＥＤＦの変異体或いはその類似体、断片又は融合タンパク質以外の、複数の改変リン酸化部位を含むその断片を提供する。
【００１８】
本発明がマウス、ウシ、ブタなどの他の哺乳動物のＰＥＤＦの変異体を包含することは、理解されるべきである。
【００１９】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、改変リン酸化部位がセリン２４及びセリン１１４の２つのみからなるＰＥＤＦの変異体或いはその類似体、断片又は融合タンパク質以外の、複数の改変リン酸化部位を含む、配列番号１のヒトＰＥＤＦに由来する修飾されたアミノ酸配列を含むＰＥＤＦの抗血管新生変異体を提供する。ＰＥＤＦの変異体の類似体、断片及び融合タンパク質は、本発明の範囲内であることは理解されるべきである。
【００２０】
別の実施形態によれば、本発明は複数の改変リン酸化部位を含む、配列番号１のヒトＰＥＤＦのアミノ酸配列の変異体を含むＰＥＤＦの抗血管新生変異体であって、該変異体は改変リン酸化部位がセリン２４及びセリン１１４の２つのみからなるＰＥＤＦの変異体或いはその類似体、断片又は融合タンパク質以外のＰＥＤＦの抗血管新生変異体を提供する。
【００２１】
いくつかの実施形態によれば、ＰＥＤＦの抗血管新生変異体、その類似体、融合タンパク質又は断片は、セリン２４及びセリン２２７とセリン１１４及びセリン２２７とからなる群より選択される２つの改変リン酸化部位を含む。
【００２２】
いくつかの好ましい実施形態によれば、ＰＥＤＦの抗血管新生変異体、その類似体、融合タンパク質又は断片は、セリン２４、セリン１１４及びセリン２２７に３つの改変リン酸化部位を含む。
【００２３】
更なる実施形態によれば、３つの改変リン酸化部位を含む、ＰＥＤＦの抗血管新生変異体、その類似体、融合タンパク質又は断片は、神経栄養活性を有する。追加の実施形態によれば、ＰＥＤＦの抗血管新生変異体、その類似体、融合タンパク質又は断片の３つの改変リン酸化部位は、負に帯電したアミノ酸残基によって置換されている。例示的な実施形態によればＰＥＤＦの抗血管新生変異体、その類似体又は融合タンパク質は、配列番号２に記述の様なアミノ酸配列又はその断片を含む。ある例示的実施形態によれば、ＰＥＤＦ変異体は配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む。
【００２４】
別の実施形態によれば、神経栄養活性を有するＰＥＤＦの抗血管新生変異体、その類似体、融合タンパク質又は断片は、３つの改変リン酸化部位を含み、セリン２４及びセリン１１４は非極性アミノ酸残基によって置換され、セリン２２７は負に帯電したアミノ酸及び非極性アミノ酸残基からなる群より選択されるアミノ酸残基によって置換されている。いくつかの例示的実施形態によれば、ＰＥＤＦの抗血管新生変異体、その類似体又は融合タンパク質は、配列番号３及び配列番号４又はその断片からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。ある例示的実施形態によれば、ＰＥＤＦ変異体は配列番号３及び配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２５】
更なる実施形態によれば、３つの改変リン酸化部位を含むＰＥＤＦの抗血管新生変異体、その類似体、融合タンパク質又は断片は、本質的に神経栄養活性が欠けている。いくつかの実施形態によれば、該ＰＥＤＦの抗血管新生変異体、その類似体、融合タンパク質又は断片のセリン２４及びセリン１１４が、負に帯電したアミノ酸残基によって置換され、セリン２２７は非極性アミノ酸残基によって置換されている。例示的実施形態によれば、ＰＥＤＦの抗血管新生変異体、その類似体又は融合タンパク質は、配列番号５に記載のアミノ酸配列又はその断片を含む。ある例示的実施形態によれば、ＰＥＤＦ変異体は配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む。
【００２６】
本発明は、３つの改変リン酸化部位が、負に帯電したアミノ酸残基によるセリン２４及びセリン２２７の置換と非極性アミノ酸残基によるセリン１１４の置換、並びにセリン１１４及びセリン２２７の負に帯電したアミノ酸残基による置換と非極性アミノ酸残基によるセリン２４の置換からなる群より選択される、ヒトのＰＥＤＦ変異体、その類似体、断片及び融合タンパク質を更に包含することが理解されるべきである。
【００２７】
別の実施形態によれば、改変リン酸化部位は化学修飾によって得られる。いくつかの実施形態によれば、化学修飾は、グリコシル化、酸化、永久リン酸化、還元、ミリスチル化、硫酸化、アシル化、アセチル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化及び遮断基による誘導体化からなる群より選択される。
【００２８】
別の態様によれば、本発明は、複数の改変リン酸化部位を含むＰＥＤＦ変異体、その類似体、断片又は融合タンパク質をコードする、配列番号６を有するヒトＰＥＤＦのヌクレオチド配列の変異体又はその断片を含む、ＰＥＤＦの抗血管新生変異体或いはその類似体又は融合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド配列であって、変異体において改変リン酸化部位がセリン２４及びセリン１１４の２つのみからなる変異体以外である、単離ポリヌクレオチド配列を提供する。
【００２９】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、複数の改変リン酸化部位を含む、ＰＥＤＦ変異体をコードする、配列番号６を有するヒトＰＥＤＦのヌクレオチド配列の変異体を含む、ＰＥＤＦの抗血管新生変異体をコードする単離ポリヌクレオチド配列であって、改変リン酸化部位がセリン２４及びセリン１１４の２つのみからなる変異体以外である、単離ポリヌクレオチド配列を提供する。
【００３０】
いくつかの実施形態によれば、単離ポリヌクレオチド配列は、セリン２４及びセリン２２７とセリン１１４及びセリン２２７とからなる群より選択される２つのリン酸化部位の改変を含む、ＰＥＤＦの抗血管新生変異体或いはその類似体、断片又は融合タンパク質をコードする。
【００３１】
いくつかの好ましい実施形態によれば、単離ポリヌクレオチド配列は、セリン２４、セリン１１４及びセリン２２７において３つの改変リン酸化部位を含む、ＰＥＤＦの抗血管新生変異体或いはその類似体、断片又は融合タンパク質をコードする。
【００３２】
いくつかの実施形態によれば、単離ポリヌクレオチド配列によってコードされる、３つの改変リン酸化部位を含む、ＰＥＤＦの抗血管新生変異体、その類似体、断片又は融合タンパク質は、神経栄養活性を有する。別の実施形態によれば、単離ポリヌクレオチド配列によってコードされる、ＰＥＤＦの抗血管新生変異体、その類似体、断片又は融合タンパク質の３つの改変リン酸化部位は、負に帯電したアミノ酸残基によって置換されている。例示的実施形態によれば、負に帯電したアミノ酸残基によって置換された３つの改変リン酸化部位を含む、ＰＥＤＦの抗血管新生変異体或いはその類似体又は融合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド配列は、配列番号７又はその断片を含む。ある例示的実施形態によれば、ＰＥＤＦ変異体をコードする単離ポリヌクレオチド配列は、配列番号７に記述のヌクレオチド配列を含む。
【００３３】
別の実施形態によれば、単離ポリヌクレオチド配列は、３つの改変リン酸化部位を含むＰＥＤＦの抗血管新生変異体、その類似体、断片又は融合タンパク質をコードし、ＰＥＤＦの抗血管新生変異体、その類似体、断片又は融合タンパク質のセリン２４及びセリン１１４は、非極性アミノ酸残基によって置換され、セリン２２７は負に帯電したアミノ酸及び非極性アミノ酸残基からなる群より選択されるアミノ酸残基によって置換されている。いくつかの例示的実施形態によれば、ＰＥＤＦの抗血管新生変異体或いはその類似体又は融合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド配列は、配列番号８及び配列番号９又はその断片からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。ある例示的実施形態によれば、ＰＥＤＦ変異体をコードする単離ポリヌクレオチド配列は、配列番号８又は配列番号９に記述のヌクレオチド配列を含む。
【００３４】
更なる実施形態によれば、単離ポリヌクレオチド配列によってコードされる、３つの改変リン酸化部位を含むＰＥＤＦの抗血管新生変異体、その類似体、断片又は融合タンパク質は、本質的に神経栄養活性を欠いている。いくつかの実施形態によれば、単離ポリヌクレオチド配列はＰＥＤＦの抗血管新生変異体、その類似体、断片又は融合タンパク質をコードし、ＰＥＤＦの抗血管新生変異体、その類似体、断片又は融合タンパク質のセリン２４及びセリン１１４が負に帯電したアミノ酸残基によって置換されており、セリン２２７は非極性アミノ酸によって置換されている。例示的実施形態によれば、ＰＥＤＦの抗血管新生変異体、その類似体又は融合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド配列は、配列番号１０に記述されるヌクレオチド配列又はその断片を含む。ある例示的実施形態によれば、ＰＥＤＦ変異体をコードする単離ポリヌクレオチド配列は、配列番号１０に記述されるヌクレオチド配列を含む。
【００３５】
更なる態様によれば、本発明は、本発明の原理に従ったＰＥＤＦの抗血管新生変異体或いはその類似体、断片又は融合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。
【００３６】
その上更なる態様によれば、本発明は、本発明の原理に従ったＰＥＤＦの抗血管新生変異体或いはその類似体、断片又は融合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００３７】
追加の態様によれば、本発明は、活性成分としての本発明の原理に従ったＰＥＤＦの抗血管新生変異体或いはその類似体、融合タンパク質又は断片と、医薬として許容しうる担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００３８】
更なる態様によれば、本発明は、活性成分としての本発明の原理に従ったＰＥＤＦの抗血管新生変異体或いはその類似体、融合タンパク質又は断片をコードする、単離ポリヌクレオチド配列と、医薬として許容しうる担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００３９】
更に別の態様によれば、本発明は活性成分としての本発明の原理に従ったＰＥＤＦの抗血管新生変異体或いはその類似体、融合タンパク質又は断片をコードする単離ポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターと、医薬として許容しうる担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００４０】
更なる態様によれば、本発明は活性成分としての本発明の原理に従ったＰＥＤＦの抗血管新生変異体或いはその類似体、融合タンパク質又は断片をコードする単離ポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞と、医薬として許容しうる担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００４１】
別の態様によれば、本発明は、本発明の原理に従った医薬組成物の治療的有効量を、治療を必要とする対象に投与することを含む、新血管形成を伴う対象の疾患又は障害の治療法を提供する。
【００４２】
いくつかの実施形態によれば、新血管形成を伴う疾患又は障害は、癌、眼疾患、及び抗新生血管因子により治療される障害からなる群より選択される。
【００４３】
追加の実施形態によれば、該新血管形成を伴う疾患又は障害は、非上皮性悪性腫瘍、上皮性悪性腫瘍、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング（Ｅｗｉｎｇ’ｓ）腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌胆管癌、絨毛腫、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス（Ｗｉｌｍｓ’）腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、カポジ肉腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、希突起膠腫、髄膜腫、黒色腫及び神経芽細胞腫からなる群より選択される癌である。
【００４４】
追加の実施形態によれば、本発明の方法により治療されるべき眼疾患は、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、網膜芽腫、水晶体後部線維増殖症、ブドウ膜炎、未熟児網膜症、黄斑変性症、角膜移植片新血管形成、網膜腫瘍及び脈絡膜腫瘍からなる群より選択される。更なる実施形態によれば、抗血管新生因子により治療される障害は、血管腫、関節炎、乾癬、血管線維腫、動脈硬化性プラーク、血友病関節及び肥厚性瘢痕からなる群より選択される。
【００４５】
更なる態様によれば、本発明は、本発明の原理に従った医薬組成物の治療的有効量を、治療を必要とする対象に投与することを含む、対象の神経変性症状の治療法を提供する。
【００４６】
いくつかの実施形態によれば、神経変性症状は、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、重症筋無力症、運動神経障害、ギランバレー症候群、自己免疫性神経障害、ランバートイートン筋無力症候群、腫瘍随伴性神経疾患、腫瘍随伴性小脳委縮症、非腫瘍随伴性スティフマン症候群、進行性小脳委縮症、ラスムッセン脳炎、筋委縮性側索硬化症、シデナム舞踏病、トゥレット症候群、自己免疫性腺性内分泌障害、免疫不全性神経障害、後天性神経性筋硬直症、先天性多発性関節拘縮症、視神経炎及びスティフマン症候群からなる群より選択される。
【００４７】
別の態様によれば、本発明は（ａ）少なくとも１つの負に帯電した改変リン酸化部位を含む、配列番号１のヒトＰＥＤＦに由来する修飾アミノ酸配列を含む、ＰＥＤＦの抗血管新生変異体；（ｂ）（ａ）の断片；及び（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の類似体から選択されるポリペプチドに特異的に結合する単離抗体又はその断片を提供し、該単離抗体は、非リン酸化セリン又は負に帯電していない改変リン酸化部位を有する配列番号１のヒトＰＥＤＦの対応するアミノ酸配列に結合しない。
【００４８】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、少なくとも１つの負に帯電した改変リン酸化部位を含む、配列番号１のヒトＰＥＤＦのアミノ酸配列の変異体と特異的に結合する単離抗体又はその断片を提供し、該単離抗体は、非リン酸化セリン又は負に帯電していない改変リン酸化部位を有する、配列番号１のヒトＰＥＤＦの対応するアミノ酸配列と結合しない。
【００４９】
別の実施形態によれば、単離抗体又はその断片は、セリン２４に１つの改変リン酸化部位を含むＰＥＤＦ変異体或いはその断片又は類似体と特異的に結合する。例示的な実施形態によれば、単離抗体又はその断片は、配列番号２、５、１１及び１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＰＥＤＦ変異体と特異的に結合する。
【００５０】
更なる実施形態によれば、単離抗体又はその断片は、セリン２２７に１つの改変リン酸化部位を含むＰＥＤＦ変異体或いはその断片又は類似体と特異的に結合する。例示的実施形態によれば、単離抗体又はその断片は、配列番号２、３及び１３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＰＥＤＦ変異体と特異的に結合する。
【００５１】
別の実施形態によれば、単離抗体又はその断片は、セリン１１４に１つの改変リン酸化部位を含むＰＥＤＦ変異体或いはその断片又は類似体と特異的に結合する。例示的実施形態によれば、単離抗体又はその断片は、配列番号２、５、１２及び１４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＰＥＤＦ変異体と特異的に結合する。
【００５２】
更なる実施形態によれば、単離抗体又はその断片は、セリン２４及びセリン１１４に２つの改変リン酸化部位を含むＰＥＤＦ変異体或いはその断片又は類似体と特異的に結合する。例示的実施形態によれば、単離抗体又はその断片は、配列番号２、５及び１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＰＥＤＦ変異体と特異的に結合する。
【００５３】
その上更なる実施形態によれば、単離抗体又はその断片は、セリン２４、セリン１１４及びセリン２２７に３つの改変リン酸化部位を含むＰＥＤＦ変異体或いはその断片又は類似体と特異的に結合する。例示的実施形態によれば、単離抗体又はその断片は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＰＥＤＦ変異体と特異的に結合する。
【００５４】
別の実施形態によれば、単離抗体又はその断片は、ポリクロナール抗体、モノクロナール抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、キメラ抗体及び一本鎖抗体からなる群より選択される。
【００５５】
更なる態様によれば、本発明は、前記変異体、断片又は類似体の発現を促進する条件下で、本発明のＰＥＤＦ変異体或いはその断片又は類似体をコードするポリヌクレオチドを含む原核宿主細胞及び／又は真核宿主細胞を培養すること及び、その後に変異体、断片又は類似体を回収することを含む、本発明のＰＥＤＦ変異体の作製方法を提供する。
【００５６】
本発明のこれら及び他の実施形態は、以下の図面、説明、実施例及び特許請求の範囲と関連させることでよりよく理解されよう。
【課題を解決するための手段】
【００５７】
本発明は、複数の改変リン酸化部位を含む、抗血管新生ＰＥＤＦ変異体、その断片、類似体及び融合タンパク質を提供する。本発明は更に、ＰＥＤＦの変異体、その断片、類似体及び融合タンパク質をコードする単離核酸を提供し、該ＰＥＤＦの変異体、その断片、類似体及び融合タンパク質は、複数の改変リン酸化部位を含み、抗血管新生活性を有する。
【００５８】
本発明によれば、配列番号１の天然のヒトＰＥＤＦは、２つのＣＫ２によるリン酸化部位及び１つのＰＫＡによるリン酸化部位を含む。ＣＫ２によるリン酸化部位は、セリン残基２４及び１１４に存在し、ＰＫＡによるリン酸化部位は２２７に位置するセリン残基に存在する。
【００５９】
一態様によれば、本発明は、複数の改変リン酸化部位を含む、配列番号１のアミノ酸配列又はその断片を含む、単離ＰＥＤＦの抗血管新生変異体、その類似体又は融合タンパク質を提供する。
【００６０】
本明細書中で「ＰＥＤＦ変異体」という用語は、天然のＰＥＤＦと比較して、少なくとも２つの好ましくは少なくとも３つのリン酸化部位が改変されている、修飾された、又は改変されたアミノ酸配列を含むＰＥＤＦタンパク質を指し、該変異体は抗血管新生活性を保持する。本発明は配列番号１のヒトＰＥＤＦ特に関するが、ヒトＰＥＤＦと他の哺乳動物種由来のＰＥＤＦとの間には高い相同性があり、本発明はマウス、ウシ、ブタなどの他の哺乳動物のＰＥＤＦも包含することは理解されるべきである。
【００６１】
ＰＥＤＦ変異体は通常単離形態で提供される。「単離」という用語は、変異体が天然に付随している天然配列、例えばタンパク質、ポリヌクレオチドなどの他の生物学的成分から分離されることを意味する。好ましくは、ＰＥＤＦ変異体は均質に精製される。
【００６２】
改変リン酸化部位の「複数」という用語は、少なくとも２つの改変リン酸化部位、好ましくは少なくとも３つの改変リン酸化部位を指す。
【００６３】
いくつかの実施形態によれば、ＰＥＤＦの抗血管新生変異体、その類似体又は融合タンパク質は、セリン２４及びセリン２２７と、セリン１１４及びセリン２２７とからなる群より選択される、２つの改変リン酸化部位を含む。セリン２４及びセリン１１４の両方に改変リン酸化部位を含むＰＥＤＦ変異体は、本発明から除外する。
【００６４】
いくつかの好ましい実施形態によれば、ＰＥＤＦの抗血管新生変異体、その類似体、断片又は融合タンパク質は、セリン２４、セリン１１４及びセリン２２７に３つの改変リン酸化部位を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態によれば、本発明は野生型の組換えＰＥＤＦと比較して神経栄養活性が減少した、ＰＥＤＦ変異体、その断片、類似体又は融合タンパク質を提供する。好ましくは、ＰＥＤＦ変異体、その断片又は類似体は神経栄養活性を有する。
【００６６】
本明細書中で使用される「ＰＥＤＦの断片」という用語は、ＰＥＤＦの完全長アミノ酸配列より短い、例えば配列番号１のヒトＰＥＤＦの４１８アミノ酸より短いアミノ酸を有する、ＰＥＤＦの完全長アミノ酸配列の任意の一部分を指し、該部分は複数の改変リン酸化部位をなお含み、抗血管新生活性をなお保持する。通常完全長タンパク質の一部分はペプチド、ポリペプチド又はタンパク質である。「ペプチド」は、５０個以下のアミノ酸からなるアミノ酸配列を意味する。「ポリペプチド」は、一般的に５０個を超えるアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を意味する。「タンパク質」は、１つ又は複数の共有結合したポリペプチド鎖を意味する。ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質という用語は、本明細書を通して同じように使用できる。
【００６７】
本明細書中で使用される「抗血管新生」活性という用語は、内皮細胞増殖を減少若しくは阻害する、及び／又は内皮細胞の遊走を減少若しくは阻害する、及び／又は内皮細胞アポトーシスを誘導する、及び／又は新血管形成を減少若しくは阻害する、ＰＥＤＦ変異体の能力の定義を意味する。抗血管新生活性は、当分野で公知の様々な方法によって検出できる。血管新生活性又は抗血管新生活性を検出するためのインビトロ又はインビボの試験の例には、マウス角膜新血管形成、ニワトリ絨毛尿膜試験、ウサギ網膜嚢試験、大動脈輪試験及びマトリゲルプラグアッセイにおける新血管形成が挙げられる（本明細書中の以下の実施例も参照されたし）。
【００６８】
本明細書中で使用される「類似体」という用語は、複数の改変リン酸化部位及び少なくとも１つのアミノ酸の置換、付加、欠失及び／又は化学修飾を含む、天然のＰＥＤＦ、好ましくは配列番号１のヒトＰＥＤＦと比較して修飾されたアミノ酸配列を有するＰＥＤＦのペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を指す。「アミノ酸の置換」は、機能的に等価なアミノ酸残基が配列内の残基と置換され、サイレント変化をもたらすことを意味する。例えば、１つ又は複数の配列内のアミノ酸残基は、機能的に等価に作用する、同様の極性の別のアミノ酸によって置換でき、サイレント変化をもたらす。配列内のアミノ酸に関する置換は、アミノ酸の属するクラスの他のメンバーから選択できる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンを含む。中立極性のアミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンを含む。正に帯電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リシン及びヒスチジンを含む。負に帯電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。このような置換は、保存的置換として公知である。更に、本発明は、非保存的置換も包含する。非保存的置換は、ＰＥＤＦ変異体、その類似体又は断片の生物活性、例えば抗血管新生活性が保持又は、或いは改善されるように為し得る。本発明が、天然ＰＥＤＦ又は野生型組換えＰＥＤＦと比較して安定性が増し、半減期が長くなったＰＥＤＦ変異体の抗血管新生類似体を作製するために、少なくとも２つのアミノ酸残基が他のアミノ酸により置換されたＰＥＤＦ類似体を包含することは理解されるべきである。
【００６９】
本発明の類似体は、配列番号１のヒトＰＥＤＦ又はその断片と少なくとも７０％の類似性を、好ましくは配列番号１のヒトＰＥＤＦ又はその断片と少なくとも８０％の相同性を、更により好ましくは配列番号１のヒトＰＥＤＦ又はその断片と少なくとも９０％の相同性を、及び最も好ましくは配列番号１のヒトＰＥＤＦ又はその断片と少なくとも９５％の相同性を有するペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を含む。２つのポリペプチドの間の「類似性」という用語は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換基と、第２のポリペプチドの配列とを比較することによって確定される。
【００７０】
本明細書中で使用される「改変リン酸化部位」という用語は、アミノ酸の置換による、及び／又は化学修飾によるリン酸化部位の改変を指す。リン酸化部位内のセリン残基又はスレオニン残基の置換は保存的置換を指すが、好ましくは非保存的置換を指すことを意味することは理解されるべきである。したがって、ＣＫ２又はＰＫＡのリン酸化部位内に存在するセリン残基の置換は、非極性アミノ酸への置換、負に帯電したアミノ酸への置換又は正に帯電したアミノ酸への置換、好ましくは負に帯電したアミノ酸への置換を含む。本明細書中で使用される「修飾されたアミノ酸」という用語は、アミノ酸置換による及び／又は化学修飾によるアミノ酸の改変を指す。改変及び修飾という用語は、本明細書及び特許請求の範囲を通して同様に使用できる。
【００７１】
タンパク質内のセリン残基のリン酸化は、負に帯電したリン酸基のセリンへの付加を伴うため、負に帯電したアミノ酸によるセリンの置換は、リン酸化セリンを模倣し、したがって該リン酸化の生物学的有意性の特性解析にとって有用である。重要なことには、リン酸化タンパク質がインビボのホスファターゼ活性を介して脱リン酸化されても、セリンを負に帯電したアミノ酸に置換することにより、該部位が永久に負に帯電したアミノ酸を有するタンパク質が生じる。
【００７２】
本明細書の以下に示すように、組換えヒトＰＥＤＦの２４、１１４及び２２７の位置のセリン残基をグルタミン酸残基に置換することは、高い抗血管新生活性及び神経栄養活性を有するＰＥＤＦ変異体をもたらす。２４及び１１４の位置のセリン残基をグルタミン酸に置換し、２２７の位置のセリン残基をアラニンに置換することにより、抗血管新生活性を有するが神経栄養活性はほとんど欠けているＰＥＤＦ変異体をもたらす。２４及び１１４の位置のセリン残基をアラニンに置換し、２２７の位置のセリン残基をグルタミン酸に置換することにより、神経栄養活性は低下したが、抗血管新生活性は組換え野生型ＰＥＤＦと同様のＰＥＤＦ変異体をもたらす。３つのセリン残基全てをアラニンに置換することにより、組換え野生型ＰＥＤＦと同様の神経栄養活性及び抗血管新生活性を有するＰＥＤＦ変異体をもたらす。
【００７３】
「神経栄養」活性という用語は、本明細書中で神経細胞の表現型に分化することを誘発する能力として定義される。例えば、培養網膜芽腫細胞において分化を誘発するＰＥＤＦの能力は、神経栄養活性と見なされる。ＰＥＤＦ変異体、その断片、類似体又は融合タンパク質は本質的に神経栄養活性を欠いていると思われる。本質的に神経栄養活性を欠いていることを指して、ＰＥＤＦ変異体、その断片、類似体又は融合タンパク質は、組換え野生型ＰＥＤＦの神経栄養活性の２０％未満、好ましくは１０％未満及びより好ましくは組換え野生型ＰＥＤＦの神経栄養活性の５％未満を有することを意味する。
【００７４】
本発明は、化学修飾されたアミノ酸残基を含むＰＥＤＦ変異体、その類似体、断片又は融合タンパク質を包含する。アミノ酸残基の修飾には、限定するものではないが、グリコシル化、酸化、永久リン酸化、還元、ミリスチル化、硫酸化、アシル化、アセチル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、環化、ジスルフィド結合形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化及び保護／遮断基による誘導体化又は当分野で公知の任意の他の誘導体化方法が挙げられる。このような修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、アミノ末端又はカルボキシ末端を含む、ＰＥＤＦ変異体、その類似体又は断片の配列のどこにでも起こり得る。
【００７５】
複数の改変リン酸化部位を含むＰＥＤＦ変異体、その断片及び類似体は、組換え作製又は合成作製を含む、当分野で公知の様々な方法で作製できる。組換え作製は、ＰＥＤＦ変異体、その断片及び類似体をコードする単離ポリヌクレオチドを使用することによって達成でき、単離ポリヌクレオチドはポリヌクレオチドの発現のためにプロモーターに操作的に連結される。場合によっては、プロモーターの調節因子、リボソーム結合部位、翻訳開始及び転写ターミネーターを加える。ＰＥＤＦ変異体、その断片及び類似体をコードするポリヌクレオチド、プロモーター及び場合により調節因子、リボソーム結合部位、翻訳開始及び転写ターミネーターを含む構成要素は、プラスミド、ウィルス又はファージベクターなどのベクター中に配置できる。ベクターは、宿主細胞、例えば細菌、酵母、昆虫又は哺乳動物細胞を形質移入又は形質転換するために使用できる。
【００７６】
本発明は、ＰＥＤＦ変異体又はその類似体を少なくとも１種の切断剤に供することによって作製されるＰＥＤＦ断片もまた包含する。切断剤は化学切断剤、例えば臭化シアン又は酵素、好ましくはエンドプロテイナーゼであってよい。ＰＥＤＦ変異体又はその類似体を切断するために使用できるエンドプロテアーゼには、トリプシン、キノトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ又はタンパク質分解断片を作製するための当分野で公知の任意の他の酵素が挙げられる。
【００７７】
ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の合成作製は当分野では周知であり、多くの会社から市販されている。複数の改変リン酸化部位を含むＰＥＤＦ変異体、その断片又は類似体は、固相合成（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４を参照されたし）を介したような標準的な直接ペプチド合成（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，１９８４，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇを参照されたし）を使用して合成できる。固相ペプチド合成法の例としては、αアミノ保護基としてｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルを利用するＢＯＣ法及びアミノ酸残基のαアミノを保護するために９−フルオレニルメチルオキシカルボニルを利用するＦＭＯＣ法が挙げられ、両方法とも当業者には周知である。更に所望であれば、非古典的アミノ酸又は化学的アミノ酸類似体を、ＰＥＤＦ変異体、その断片又は類似体に置換又は付加として導入できる。非古典的アミノ酸は、限定するものではないが、ｏｃ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニンなどを含む。
【００７８】
本発明は更に、１つ又は複数のＰＥＤＦのアミノ酸のＤ異性体を含むことができる、ＰＥＤＦ変異体、その断片又は類似体を包含する。開示したようにペプチドが同じアミノ酸を用いて作られているが、少なくとも１つのアミノ酸、おそらくすべてのアミノ酸がＤ型アミノ酸であるレトロインベルソＤアミノ酸ＰＥＤＦペプチドの作製は、本発明をもってすれば容易なことである。ペプチド内のすべてのアミノ酸がＤ型アミノ酸であり、分子のＮ末端及びＣ末端が逆転した場合、結果は分子のＬアミノ酸形態におけるように同じ位置に同じ構造の基を有する分子である。しかし、分子はタンパク質分解に対してより安定であり、したがって本明細書中に列挙する多くの出願において有用である。
【００７９】
アミノ末端又はカルボキシ末端と、或いは異なるタンパク質のアミノ酸配列にペプチド結合を介して側鎖の１つと結合するＰＥＤＦ変異体、その断片又は類似体を含むキメラタンパク質又は融合タンパク質は、本発明の範囲に含まれる。このようなキメラタンパク質は、タンパク質合成によって、例えばペプチド合成剤を使用して、又は所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を、特定のコードフレームにおいて当分野で公知の方法によって相互に連結し、当分野において一般に知られる方法によってキメラタンパク質を発現することによって作ることができる。
【００８０】
別の態様によれば、本発明は配列番号６のヒトＰＥＤＦのヌクレオチド配列に由来する修飾されたヌクレオチド配列を含み、複数の改変リン酸化部位を含む配列番号１に由来する修飾されたアミノ酸配列を含むＰＥＤＦの抗血管新生変異体或いはその断片、類似体又は融合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド配列を、該単離ポリヌクレオチド配列が、改変リン酸化部位がセリン２４及びセリン１１４の２つのみからなる、配列番号１と比較して修飾されたアミノ酸配列を含むＰＥＤＦ変異体、その断片、類似体又は融合タンパク質をコードしないことを条件に提供する。簡潔にするために、本明細書中の以下の説明において使用される「ＰＥＤＦ変異体」という用語は、複数の改変リン酸化部位を含み、抗血管新生活性を有する、類似体、断片及び融合タンパク質を含む、ＰＥＤＦ変異体の全ての形態を包含すると解釈されるべきである。
【００８１】
本明細書中で使用される、「修飾されたヌクレオチド配列」及び「ヌクレオチド配列の変異体」という用語は、好ましくはリン酸化部位内に異なるアミノ酸をもたらすヌクレオチドの置換によって、配列番号６に記述のヒトＰＥＤＦのリン酸化部位と比較して改変されたヌクレオチド配列を指すと理解されるべきである。
【００８２】
「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）のポリマーを意味し、該ポリヌクレオチドは任意の供給源に由来することができ、一本鎖又は二本鎖であり得、場合によっては合成の、天然でない又は改変されたヌクレオチドを含むことができ、ＤＮＡ又はＲＮＡのポリマー中に組み込むことができる。
【００８３】
「単離ポリヌクレオチド」という用語は、天然に存在する状態においてその側面に位置する配列から分離されたポリヌクレオチドのセグメント又は断片、例えば通常断片に隣接する配列から除去されたＤＮＡ断片、例えば天然に存在するゲノム中の断片に近接する配列を指す。該用語は更に、実質的に他の構成要素から精製され、核酸、例えばＲＮＡ又はＤＮＡ或いはタンパク質に天然に付随し、細胞内でそれに天然に付随するポリヌクレオチドにも適用できる。したがって、該用語は例えばベクターに、自己複製プラスミド又はウィルスに、或いは原核生物又は真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた組換えＤＮＡ或いは他の配列から独立した分離された分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ或いはＰＣＲ又は制限酵素での消化によって作製されたｃＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡを含む。該用語は更に、追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡ及びｍＲＮＡなどのＲＮＡも含む。
【００８４】
「コードする」という用語は、生物学的プロセスにおいて他のポリマー又は巨大分子を合成するための、ヌクレオチドの規定された配列（即ちｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）又はアミノ酸の規定された配列のどちらかを有する鋳型として機能し、そこから生物学的特性をもたらす、単離ポリヌクレオチド内の特定のヌクレオチド配列、例えば遺伝子、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡなどに固有の特性を指す。したがって、遺伝子に相当するｍＲＮＡの転写及び翻訳により、細胞内又は他の生物系においてポリペプチド又はタンパク質が産生される場合、その遺伝子はポリペプチド又はタンパク質をコードする。ｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表に載っているヌクレオチド配列であるコード鎖と、遺伝子又はｃＤＮＡの転写の鋳型として使用される非コード鎖の両方を、ポリペプチド又はタンパク質或いはその遺伝子又はｃＤＮＡの他の産物をコードすると称することができる。
【００８５】
遺伝コードの退化及びいわゆる「よろめき規則（Ｗｏｂｂｌｅ  ｒｕｌｅｓ）」によって与えられるコドンの３番目の位置の古典的塩基対に対する除外の容認を考慮して、複数の核酸が任意の所与のポリペプチド又はタンパク質をコードできることは、当業者には理解されるであろう。更に、多かれ少なかれヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、同一の又は等価のポリペプチド又はタンパク質をもたらすことができる。したがって、本発明が配列番号２から配列番号５のアミノ酸配列、並びにその類似体、断片又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを包含することを意味する。
【００８６】
本発明のポリペプチドは、本発明のポリヌクレオチドの精製を可能にするマーカー配列と、フレーム内で融合したコード配列を更に有することができる。マーカー配列は、細菌宿主の場合は６個のヒスチジンタグ又は哺乳動物の場合はヘマグルチニン（ＨＡ）タグであり得る。
【００８７】
野生型又は天然のＰＥＤＦタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は公知であり（例えば、公表国際特許出願公開ＷＯ９５／３３４８０及びＷＯ９３／２４５２９を参照されたし）、他は本明細書中で議論されたポリペプチド配列から推定できる。特定の実施形態によれば、本発明は配列番号７から配列番号１０から選択されるＰＥＤＦ変異体をコードするポリペプチド配列を提供する。
【００８８】
ＰＥＤＦポリヌクレオチドは、ＰＥＤＦ変異体がポリヌクレオチドを含む宿主細胞が成長する培地から単離される場合、輸送されたタンパク質として発現でき、或いはリーダーペプチド又は他のペプチドを欠失することによって細胞内タンパク質として発現でき、このときＰＥＤＦは宿主細胞より単離される。そのように単離されたＰＥＤＦは、当分野で公知のタンパク質精製方法によってその後精製される。
【００８９】
ＰＥＤＦ変異体、その類似体又は断片は、対象となる組織に随伴する細胞に、ＰＥＤＦ変異体、その断片又は類似体をコードする単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを運搬することによって、対象となる組織に提供できる。細胞は、対象となる組織内で抗血管新生活性又は神経栄養活性などの生物活性を発揮するために組織内の細胞に適切に提供されるように、ＰＥＤＦポリペプチド変異体を産生及び分泌する。したがって、ＰＥＤＦ変異体を含む発現ベクターは公知のＰＥＤＦ配列に相同の単離ポリヌクレオチド配列を通常含み、例えば該発現ベクターは少なくとも既知の配列の断片と、少なくとも穏やかなストリンジェント条件下で、より好ましくは中程度のストリンジェント条件下で、最も好ましくは高ストリンジェント条件下で（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓに記述の穏やかな、中程度の、高ストリンジェント条件を用いた）ハイブリッドを形成するであろう。
【００９０】
ＰＥＤＦ変異体ポリヌクレオチドをコードする単離ポリヌクレオチドに加えて、発現ベクターはプロモーターを含む。本発明の文脈において、プロモーターはＰＥＤＦポリヌクレオチドの発現を細胞内で作動できなければならない。多くのウィルス性プロモーターは、発現カセット、例えばレトロウィルスのＩＴＲ、ＬＴＲ、ヘルペスウイルスＩＥｐ（例えばＩＣＰ４−ＩＥｐ及びＩＣＰＯ−ＩＥＰ）などの即時ウィルスプロモーター（ＩＥｐ）及びサイトメガウィルス（ＣＭＶ）ＩＥｐ並びに他のウィルスプロモーター（例えば、後期ウィルスプロモーター、潜在活性プロモーター（ＬＡＰ）、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモーター及びマウス白血病ウィルス（ＭＬＶ）プロモーター）における使用に適している。他の適切なプロモーターは、真核性プロモーターであり、これはエンハンサー配列（例えば、ウサギβグロブリン調節要素）、構造的活性化プロモーター（例えば、β−アクチンプロモーターなど）、シグナル及び／又は組織特異的プロモーター（例えば、ＴＮＦ又はＲＵ４８６に応答するプロモーター、メタロチオニンプロモーターなどのような誘導性及び／又は抑制性プロモーター）及び腫瘍特異的プロモーターを含む。
【００９１】
発現ベクター内において、ＰＥＤＦ変異体或いはその類似体又は断片及びプロモーターをコードするポリヌクレオチドは、プロモーターが、ＰＥＤＦ変異体、その類似体又は断片をコードするポリヌクレオチドの発現を作動可能な様に操作的に連結される。この操作可能な連結が維持される間は、発現ベクターは、リボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）によって分離された同義遺伝子などの複数の遺伝子を含むことができる。更に、発現ベクターは場合によってはスプライス部位、ポリアデニル化配列、転写調節要素（例えば、エンハンサー、サイレンサーなど）又は他の配列などの他の要素を含むことができる。
【００９２】
発現ベクターは、それらが内部に含んだ、ＰＥＤＦ変異体、その断片又は類似体をコードする単離ポリヌクレオチドを発現できるような方法で細胞内に導入されなければならない。任意の適切なベクターをそのように用いることができ、その多くは当分野で公知である。このようなベクターの例には、裸ＤＮＡベクター（オリゴヌクレオチド又はプラスミドなど）、アデノ随伴ウィルスベクター（Ｂｅｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：９５−１０４）、アデノウィルスベクター、ヘルペスウィルスベクター（Ｆｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：２６５−２８７）、パッケージ化アンプリコン（Ｆｅｄｅｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１６３６−１６４０）、パピローマウィルス、ピコルナウィルスベクター、ポリオーマウィルスベクター、レトロウィルスベクター、ＳＶ４０ウィルスベクター、ワクシニアウィルスベクター及び他のベクターなどのウィルス性ベクターが挙げられる。対象となる発現ベクターに加えて、ベクターは、他の遺伝要素、例えば選択可能なマーカーをコードする遺伝子（例えば、β−ｇａｌ又は毒素に対する耐性を付与するマーカー）、薬理学的活性タンパク質、転写因子又は他の生物学的に活性な物質などを更に含むことができる。
【００９３】
単離ポリヌクレオチドを含むベクターの操作方法は当分野では周知であり（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、上記を参照されたし）、直接クローン化、リコンビナーゼを使用した部位特異的組換え、相同的組換え及び他の適切な組換えベクターの構築方法を含む。この方法において、発現ベクターは任意の所望の細胞において複製でき、任意の所望の細胞において発現でき、任意の所望の細胞のゲノムに統合することもできるように構築することができる。
【００９４】
ＰＥＤＦ変異体発現ベクターは、細胞内にＤＮＡを運搬するために適した任意の手段によって細胞内に導入される。このような方法の多くは当分野では周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，上記、更にＷａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９２，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １２，２ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓも参照されたし）。したがって、原核細胞の場合、ベクターの導入は例えば電気穿孔法、形質転換、形質導入、接合又は動員によって達成できる。真核細胞のためには、ベクターは例えば電気穿孔法、形質移入、感染、ＤＮＡコーティングマイクロプロジェクタイル法又は原形質融合の使用を介して導入できる。
【００９５】
ＰＥＤＦ変異体ポリヌクレオチドが必要に応じて誘導性プロモーターの調節下で運搬される細胞は、一時的形質転換細胞として使用できる。このような細胞それ自体は、その後そこにおける治療的利点のために哺乳動物内に運搬され得る。通常細胞は、その中でＰＥＤＦ変異体が発現し、そこから分泌されるような哺乳動物の部位に運搬され、所望の細胞、例えば内皮細胞に、ＰＥＤＦ活性が発揮される、例えば血管新生が阻害されるために接触する。或いは、特にインビトロでベクターが加えられた細胞の場合、細胞はまず栄養系選抜のいくつかのラウンドに供することができ、（普通ベクター内で選抜マーカー配列を使用することによって促進される）安定な形質転換のために選抜される。このような安定な形質転換細胞は、その後そこにおける治療的利点のために、哺乳動物に運搬される。
【００９６】
ＰＥＤＦ変異体は更に、他の細胞集団に本発明によるＰＥＤＦ変異体をコードする単離ポリヌクレオチドを含むベクターを形質移入することによって、細胞、例えば内皮細胞に提供され、そのためＰＥＤＦ変異体は前記他の細胞中で発現し、そこから分泌される。そのようにして形質移入された他の細胞の集団はその後、そのように分泌されたＰＥＤＦ変異体が細胞、例えば内皮細胞に接触する哺乳動物の部位に運搬され、血管新生を阻害する。他の細胞からのＰＥＤＦ変異体の発現及び分泌は、その時対象となる細胞について利点を有する。ＰＥＤＦ変異体をコードするポリヌクレオチドが安定に細胞内に統合される必要はない。ＰＥＤＦ変異体は細胞において非統合ポリヌクレオチド又は統合ポリヌクレオチドから発現及び分泌され得る。
【００９７】
細胞内において、ＰＥＤＦ変異体ポリヌクレオチドは、細胞がＰＥＤＦ変異体ポリヌクレオチドを発現及び分泌するように発現される。ポリヌクレオチドの良好な発現は、標準的分子生物学的技術を使用して評価できる（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ウェスタンブロット、免疫沈降法、酵素免疫測定法など）。ＰＥＤＦ遺伝子の発現及び運搬された細胞からのＰＥＤＦ変異体の分泌を検出する試薬は、当分野では公知である（本明細書中の以下の実施例も参照されたし）。
【００９８】
組換え技術により作製されたＰＥＤＦ変異体は、ＰＥＤＦ変異体が対象に投与したときに実質的に純粋であるように精製できる。「実質的に純粋」という用語は、天然には付随している成分から分離された化合物、例えばタンパク質又はポリヌクレオチドを指す。通常、対象となる化合物が試料中の全材料の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％及び最も好ましくは少なくとも９９％（容量で、湿潤又は乾燥重量で、或いはモル百分率又はモル分率で）の場合、化合物は実質的に純粋である。純度は、任意の適切な方法、例えばポリヌクレオチド又はタンパク質の場合カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動又はＨＰＬＣ分析によって測定できる。化合物、例えばポリペプチド又はタンパク質は、化合物が本質的に天然に随伴する成分を含んでいない場合、又は天然状態で付随する元からの混入物質から分離されている場合もまた実質的に精製されている。
【００９９】
抗体
多くの免疫原を使用して、複数の改変リン酸化部位を含むＰＥＤＦ変異体に特異的に反応する抗体を作製できる。組換え完全長ＰＥＤＦ変異体又はその断片を、抗体の作製に使用できる。本明細書中に記載したＰＥＤＦ変異体タンパク質配列に由来する合成ペプチドもまた、抗体作製のための免疫原として使用できる（本明細書中の以下の実施例８を参照されたし）。組換えタンパク質は真核細胞又は原核細胞中で発現でき、免疫原として精製及び使用できる。天然に折りたたまれたタンパク質又は変性したタンパク質を、必要に応じて抗体の作製のために使用できる。モノクロナール抗体又はポリクロナール抗体のどちらかを作ることができる。
【０１００】
「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」又は「複数の抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語を使用する場合、ポリクロナール抗体又はモノクロナール抗体（ｍＡｂ）などの無傷の抗体、並びにＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２断片などのそのタンパク質分解断片を含む意味であると理解されるべきである。更に、キメラ抗体、ヒト抗体又はヒト化抗体、組換え抗体及び改変抗体、及びその断片は、本発明の範囲内である。更に、抗体の可変領域をコードするＤＮＡを、キメラ抗体を作製するために他の抗体をコードするＤＮＡに挿入できる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７を参照されたし）。一本鎖抗体は本発明の範囲内に入る。
【０１０１】
ポリクロナール抗体の作製方法は、当業者には公知である。通常、好ましくは精製タンパク質である免疫原は補助剤と混合され、該混合物を用いて動物を免疫化する。免疫原調製品に対する動物の免疫応答は、検査血液を採取し、対象となるＰＥＤＦ変異体又はその断片に対する反応性の力価を測定することによって観察される。普通反復免疫化後に、免疫原に対する適切に高い抗体値が得られた場合、動物から血液が収集され、抗血清が調製される。更に、タンパク質に反応性の抗体を濃縮するために、所望であれば抗血清の分別ができる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓを参照されたし、この内容は、本明細書中にその全てが記載されたことと同様に、参照により組み込まれる）。
【０１０２】
モノクロナール抗体は、当業者によく知られた様々な技術により得ることができる。通常、所望の抗原で免疫化された動物由来の脾臓細胞を、一般的に骨髄腫細胞を融合することによって不死化する（参照により本明細書に組み込まれた、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１  ５１９，を参照されたし）。不死化の代替の方法は、エプスタインバーウィルス、癌遺伝子又はレトロウィルスを用いた形質転換或いは当分野で公知の他の方法を含む。単一不死化細胞から生じたコロニーを、抗原に関する所望の特異性及び親和性の抗体を作製するためにスクリーニングし、このような細胞によって作製されたモノクロナール抗体の生成は、脊椎動物宿主の腹膜腔への注射を含む様々な技術で促進できる。或いは、モノクロナール抗体又はその結合断片をコードするＤＮＡ配列を、例えばＨｕｓｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５  １２８１によって要約された一般的プロトコルに従って、ヒトＢ細胞からのＤＮＡライブラリをスクリーニングすることによって単離できる。
【０１０３】
他の適切な技術は、ファージ又は同様のベクターにおける抗体のライブラリを選択することを含む。例えば、Ｈｕｓｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５  １２８１；及びＷａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４  ５４６を参照されたし。本発明の抗体は、修飾して又は修飾せずに使用できる。しかし、抗体は検出可能なシグナルを提供する物質と、共有結合又は非共有結合のどちらかによって標識できる。多様な標識及び共役技術が公知であり、科学文献及び特許文献の両方に広範囲に報告されている。適切な標識は、放射性試薬、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光部分、化学発光部分、磁気粒子などを含む。
【０１０４】
医薬組成物及び投与経路
本発明は、抗血管新生活性を有するＰＥＤＦ変異体、その断片、類似体又は融合タンパク質の治療的有効量及び医薬として許容しうる担体を含む、医薬組成物を提供し、該ＰＥＤＦ変異体、その断片、類似体又は融合タンパク質は、複数の改変リン酸化部位を含む。
【０１０５】
本発明の医薬組成物は、本発明のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドの医薬として許容しうる塩として処方できる。「医薬として許容しうる塩」という用語は、無機又は有機の塩基及び無機及び有機の酸を含む医薬として許容しうる非毒性の塩基又は酸から調製される塩を指す。無機塩基由来の塩には、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン塩、マンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛などが挙げられる。医薬として許容しうる非毒性有機塩基由来の塩には、第一、第二、第三アミンの塩、自然発生置換アミンを含む置換アミン、環状アミン及びアルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチル−モルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リシン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなどの塩基イオン交換樹脂が挙げられる。
【０１０６】
本発明のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドが塩基性の場合、塩は、無機酸及び有機酸を含む医薬として許容しうる非毒性の酸から調製できる。このような酸には、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、硝酸、パモン酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸などが挙げられる。特に好ましいのはクエン酸、臭化水素酸、塩酸、マレイン酸、リン酸、硫酸及び酒石酸である。
【０１０７】
「医薬として許容しうる」という用語は、連邦規制機関又は州政府或いは米国薬局方又は動物への、より特には人への使用に関する他の一般的に認められた薬局方によって承認されたことを意味する。「担体」という用語は、治療用化合物と共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤又は媒体を指す。このような医薬担体は、水などの無菌の液体及びピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などの石油、動物油、植物油、合成起源の油を含む油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒であり得る。水は、医薬組成物が静脈内に投与される場合に好ましい担体である。生理食塩水及び水性デキストロース及びグリセロール溶液は液体担体、特に注射剤として用いることができる。適切な医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、乳糖、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、エタノールなどを含む。所望であれば、組成物は更に少量の湿潤剤又は乳化剤或いは酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩などのｐＨ緩衝剤を含むことができる。ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの緊張力（ｔｏｎｉｃｉｔｙ）を調整するための薬剤もまた想定される。
【０１０８】
組成物は、溶液、懸濁液、乳化液、錠剤、ピル、カプセル、散剤、持続性放出製剤などの形態をとることができる。組成物は、トリグリセライド、微結晶性セルロース、ガムトラガカント又はゼラチンなどの従来の結合剤及び担体と共に坐薬としても処方できる。経口製剤は医薬グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的担体を含み得る。適切な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。このような組成物は、抗血管新生ＰＥＤＦ変異体或いはその断片、類似体又は融合タンパク質の治療的有効量を、好ましくは、実質的純粋形態において、対象に対する適切な投与形態を提供するように、適切な量の担体と共に含むことができる。
【０１０９】
抗血管新生ＰＥＤＦ変異体、その断片、類似体又は融合タンパク質の、特定の障害又は症状の治療に有効であると思われる量は、該障害又は症状の性質に依存し、標準的臨床技術によって決定できる。更に、場合によりインビトロの検査を用い、最適な容量範囲を特定する助けとできる。処方に用いる正確な用量は、投与経路及び疾患及び障害の重篤度に依存し、施術者の判断及び各患者の状況に従って決めるべきである。有効な用量は、インビトロ又は動物モデル試験の生物検定又はモデル系に由来する用量反応曲線から推定できる。
【０１１０】
対象となる組織の位置により、ＰＥＤＦ変異体、その類似体又は断片は、対象となる組織内の内皮細胞にＰＥＤＦ変異体を提供する適切な任意の手段によって供給できる。したがって、例えばＰＥＤＦ変異体の供給源（即ち、本明細書中の上記のＰＥＤＦ変異体ポリペプチド又はＰＥＤＦ変異体をコードする単離ポリヌクレオチド又はＰＥＤＦ変異体発現ベクター又はＰＥＤＦ変異体を発現する細胞）を含む組成物を、体循環に導入でき、対象となる組織にＰＥＤＦの供給源を分配できるであろう。或いは、ＰＥＤＦ供給源を含む組成物を、対象となる組織に局所適用できる（例えば、注射又は連続注入としての大量供給、又は腫瘍内へのボーラス投与、皮膚表面の全面又は部分適用、眼球表面上への滴下など）。
【０１１１】
ＰＥＤＦ変異体の供給源を含む医薬組成物の導入方法には、限定するものではないが、局所、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、眼又は口腔の経路が挙げられる。化合物は任意の簡便な経路、例えば注射、ボーラス投与、上皮層を介した吸収（例えば、口腔粘膜、直腸お呼び腸粘膜など）により投与でき、他の治療的活性成分と一緒に投与できる。投与は局所的であることが好ましいが、全身的であってもよい。更に、本発明の医薬組成物を脳室内注射及び髄腔内注射を含む任意の適切な経路によって中枢系に導入することが望ましいと思われ、脳室内注射は脳室内カテーテル、例えばリザーバーを取り付けるにより促進できる。肺への投与もまた、例えば吸入器又は噴霧器の使用、及びエアロゾル化する薬剤と一緒に処方することにより用いることができる。
【０１１２】
本発明の医薬組成物は、治療を必要とする範囲に局所的に投与することが望ましいと思われ、このことは、例えば限定はしないが外科手術中の局所注入、局所適用、例えば外科手術後の創傷被覆材と共に、注射によって、カテーテルを用いて、坐薬を用いて、医療用パッチを用いて又は多孔性、無孔性のインプラント又はゲル状の材料を用いて達成できる。いくつかの好ましい実施形態によれば、例えば注射器を通して腫瘍又は新生物又は前新生物の組織の部位に直接注射することによって投与できる。
【０１１３】
局所適用に関しては、抗血管新生ＰＥＤＦ変異体、その類似体又は断片を、所望の活性に基づいて（即ち、例えば１．０ｐＭから１．０ｍＭの範囲の有効用量で局所血管新生を軽減する又は予防する）有効な用量が送達されるように、医薬として許容しうる担体と組み合わせることができる。担体は例えば、限定するものではないが、軟膏、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、エアロゾル、坐薬、パッド又はゲルスティックの形態であってよい。
【０１１４】
いくつかの眼疾患治療のための局所用組成物は、有効量の抗血管新生ＰＥＤＦ変異体を、緩衝食塩水、鉱物油、とうもろこし油又は落花生油などの植物油、ワセリン及びミグリオール１８２、アルコール溶液或いはリポソーム又はリポソーム様製品などの眼科学的に許容しうる賦形剤中に含む。その組成物は、また保存料、酸化防止剤、抗生物質、免疫抑制剤及び抗血管新生ＰＥＤＦ変異体については有害な効果を発揮しない他の治療的有効剤を含むことができる。
【０１１５】
対象とする内部局所適用のためには、医薬組成物は、任意の以下の同様の性質の成分又は化合物；微結晶性セルロース、トラガカントガム又はゼラチンなどの結合剤、デンプン又は乳糖などの賦形剤、アルギン酸、プリモゲル又はコーンスターチなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム又はステロートなどの滑剤或いはコロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤を含み得る錠剤又はカプセルの形態であってよい。用量単位形態がカプセルの場合、上記の型の材料に加えて、油脂などの液体担体も含むことができる。更に用量単位形態は、用量単位の物理的形態を調整する様々な他の材料、例えば糖衣、シェラック又は他の腸溶性薬剤を含むことができる。
【０１１６】
抗血管新生ＰＥＤＦ変異体、その断片又は類似体は、放出制御系で送達できる。一実施形態において、薬物注入ポンプは抗血管新生ＰＥＤＦ変異体、その断片又は類似体の投与に使用でき、例えばインシュリン送達或いは特定の臓器又は腫瘍に対する化学療法に使用される。好ましい形態において、抗血管新生ＰＥＤＦ変異体、その類似体又は断片は、制御された期間をすぎてから選択された部位で抗血管新生ＰＥＤＦ変異体を放出する、生分解性、生体適合性のポリマーインプラントと組み合わせて投与される。好ましいポリマー材料の例には、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸、ポリ酢酸、ポリエチレン酢酸ビニル、そのコポリマー及びブレンドが挙げられる（放出制御の医療への応用（Ｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）、Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），１９７４，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＩａを参照されたし）。更に別の実施形態において、放出制御系は治療標的の近くに配置でき、したがって必要量は全身性用量のうちのわずかである。
【０１１７】
ＰＥＤＦ変異体の使用
本発明は、疾患及び障害、特に新血管形成を伴う疾患又は障害の治療法を提供する。本治療法はこれらを必要とする患者に、活性成分としてのＰＥＤＦ供給源の治療有効量及び医薬として許容しうる担体を含有する医薬組成物を投与することを含む。本発明に従ったＰＥＤＦ供給源は、ＰＥＤＦ変異体ポリペプチド、即ち、抗血管新生ＰＥＤＦ変異体、その断片、類似体又は融合タンパク質、本発明のＰＥＤＦポリペプチド変異体をコードする単離ポリヌクレオチド配列、本発明のＰＥＤＦポリペプチド変異体をコードする単離ポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター、及び本発明のＰＥＤＦポリペプチド変異体をコードする単離ポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを形質移入された宿主細胞を含む。
【０１１８】
血管新生の阻害は、新しい血管が発生することによって発達しようと又は伸びることによって発達しようと、新しい血管の発達及び次いで循環する幹細胞の内皮細胞に分化することを停止させることであると一般的に考えられている。しかし、ＰＥＤＦは活性化された内皮細胞のアポトーシスの誘導を示したので、本発明の文脈において血管新生の阻害は、ＰＥＤＦ変異体による細胞、特に腫瘍の近く又は中の血管に存在する細胞を殺すことも含むと解釈されるべきである。したがって、本発明の文脈内では血管新生の阻害は、新しい血管の発達の阻害を含み、この阻害は近くに存在する血管の破壊を伴っていても、いなくてもよい。「新血管形成」及び血管新生という用語は、本明細書及び特許請求の範囲を通して同じ意味で使用する。
【０１１９】
「治療」は、病理学的兆候を示す対象に、それらの兆候を減少又は除去する目的で投与する治療である。
【０１２０】
ＰＥＤＦ供給源の「治療的有効量」は、ＰＥＤＦ供給源を投与される対象に有益な効果を提供するために十分なＰＥＤＦ供給源の量である。
【０１２１】
これらを必要とする患者は、新血管形成を伴う１種又は複数種の疾患又は障害に苦しむか、或いは新血管形成を伴う疾患又は障害に非常に罹りやすいと判断されると思われる。したがって、本発明に従った治療法は、治療的有用性及び予防的有用性の両方を含む。
【０１２２】
抗血管新生ＰＥＤＦ供給源を用いて治療できる新生血管疾患は、限定するものではないが、非上皮性悪性腫瘍、上皮性悪性腫瘍、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌胆管癌、絨毛腫、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、カポジ肉腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、希突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫及び網膜芽腫などの固形癌を含む癌である。
【０１２３】
抗血管新生ＰＥＤＦ供給源を用いて治療できる新血管形成を伴う眼障害は、限定するものではないが、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、網膜芽腫、水晶体後部線維増殖症、ブドウ膜炎、未熟児網膜症、黄斑変性症、角膜移植片新血管形成、炎症性眼疾患、網膜腫瘍及び脈絡膜腫瘍などの眼腫瘍、並びに網膜、脈絡膜又は虹彩の新血管新生を伴う疾患を含む。
【０１２４】
抗血管新生ＰＥＤＦ供給源を用いて治療できる他の障害は、限定するものではないが、血管腫、関節炎、乾癬、血管線維腫、動脈硬化性プラーク、血友病関節及び肥厚性瘢痕を含む。
【０１２５】
抗血管新生ＰＥＤＦ変異体は、インビボで所望の治療的又は予防的活性に関して、並びに治療的有効用量の決定に関して検査できる。例えば、ＰＥＤＦ供給源はヒトで検査する前に、限定するものではないが、ラット、マウス、トリ、ウシ、サル、ウサギなどを含む適切な動物モデル系において検査できる。インビボの検査には、ヒトに投与する前に当分野で公知の任意の動物モデル系が使用できる。（本明細書中の以下の実施例を参照されたし）。
【０１２６】
別の態様によれば、本発明は、本発明の原理に従った医薬組成物の治療的有効量と、医薬として許容しうる担体とを、治療を必要とする対象に投与することを含む、対象の神経変性疾患又は神経変性症状の治療法を提供する。
【０１２７】
本明細書において「神経栄養」活性は、神経細胞集団への分化を誘導する能力として定義される。例えば、培養網膜芽腫細胞において分化を誘導するＰＥＤＦの能力は、神経栄養活性と見なされる。神経栄養活性は、更に神経細胞栄養活性及びグリア静止活性を含む。「神経細胞栄養」活性は本明細書中では、神経細胞集団の生存を強化する能力として定義される。「グリア静止」活性は本明細書中ではグリア細胞の成長及び増殖を阻害する能力として定義される。
【０１２８】
多くの神経変性疾患及びＣＮＳ（脳及び網膜）に対する他の損傷は、神経細胞の死及びグリア（グリオーシス）の過剰増殖によって象徴される。ＰＥＤＦは、その症状に有効に使用でき、初代神経細胞の命と機能を引き延ばし、グリアの発達を回避できる。ＰＥＤＦ供給源は、例えばＣＮＳの損傷に対する応答においてミクログリア活性化を遮断し、並びに神経細胞の命を引き延ばし／助けることに有効であり得る。網膜において、ＰＥＤＦがミュラーグリア細胞を阻害することは予測できる。ミュラー細胞は、星状膠細胞と似ているため、ＰＥＤＦ供給源は、網膜剥離、糖尿病、網膜色素変性などの症状においてグリオーシスの遮断並びに網膜神経の命を助けることにも同様に有効であると思われる。
【０１２９】
神経細胞の移植は、特定の疾患を治癒させることができると思われる。例えばパーキンソン病において、特定の胎児脳細胞を患者に移植することにより、疾患に随伴する問題を軽減又は治癒させることができた。しかし、闘うための主要な問題の１つは、移植された細胞の命を引き延ばすことと、それらの分化を維持する、例えば特定の物質を分泌することであろう。ＰＥＤＦ変異体を用いた細胞の予備処理は、その範囲の両方において手助けとなり得る。同様に、移植前に神経細胞又は星状膠細胞のどちらかに、ＰＥＤＦ変異体をコードする単離ポリヌクレオチドを含むベクターを形質移入することにより、移植部位においてＰＥＤＦ変異体の長期供給ができる。
【０１３０】
神経網膜及び光受容細胞の移植の試みにおいて多くの活性があり、失明を治すための助けとなる。今までの試みは、非分化及び移植片の死の両方のために成果を得られなかった。ＰＥＤＦ供給源は両方の点において助けとなり得る。特に、移植されるべき光受容体神経は、外科手術前にＰＥＤＦ受容体を用いて予備処理が可能である。或いは、ＰＥＤＦ変異体をコードする単離ポリヌクレオチドを含むベクターは、近接した網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞に高レベルで形質移入可能であり、それらはタンパク質の超常的供給源として役に立つ。何人かの研究者が、現在培養ＲＰＥ細胞が実験動物の光受容体間空間に移植後順調に生存していることを示している。インビトロでＰＥＤＦ遺伝子をコードする単離ポリヌクレオチドをヒトＰＲＥ細胞に形質移入することにより、網膜移植においてその細胞の使用を可能にする。
【０１３１】
ＰＥＤＦが自然に産生された場合には、約２５０ｎＭほどの濃い濃度で存在できる。ＰＥＤＦ変異体は非毒性のため、更により濃縮した用量で組織に供給できる。しかし、所与のＰＥＤＦ変異体の有効性から、約１０ｎＭ又はそれ未満（例えば０．０１ｎＭほどに低い）といったはるかに低い濃度で用いることができる。ＰＥＤＦ供給源を含む組成物の処方に依存して、所望の組織内で血管新生を遅延させる及び／又は神経栄養活性を誘導するために十分な時間をかけて供給される。
【０１３２】
いくつかのプロトコルにおいて、反復適用によりＰＥＤＦ変異体の抗血管新生活性及び／又は神経栄養活性を強化することができ、またいくつかの適用において反復適用が必要とされる可能性がある。ＰＥＤＦ供給源がＰＥＤＦ発現ベクターである場合、ＰＥＤＦ変異体を発現する細胞は有効量のＰＥＤＦ変異体（即ち、１種又は複数種のＰＥＤＦの生物活性を発揮するために十分な）を産生できる。
【０１３３】
ＰＥＤＦ変異体は、単体で又は他の治療様式と併せて投与できる。外科手術、薬物療法、光線力学療法及び／又は放射線療法などの他の療法を含む治療計画の一部としてＰＥＤＦ変異体を投与することは妥当である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１３４】
（実施例）
材料及び方法
試薬及び抗体
組換えヒトＣＫ２（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）より購入した。ＰＫＡの触媒サブユニットは記載（Ｂｅａｖｏ  Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３８Ｃ：２９９−３０８，１９７４）のように精製した。内皮マイトジェン（ＥＣＧＳ）は、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）より購入した。組換えヒトｂＦＧＦ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現）、ポリ−Ｌ−リシン（７０〜１５０ｋＤａ）及びブタ腸由来ヘパリンは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＩ）より購入した。マトリゲルは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＭＡ，ＵＳＡ）より購入した。制限酵素は、Ｒｏｃｈｅ（Ｍａｎｈｅｍｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）より購入した。ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｒｏｍｅｇａ（ＷＩ，ＵＳＡ）より購入した。ＰＥＤＦに対するポリクロナール抗体は、Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅの抗体ユニットにより調製した。完全長ヒトＰＥＤＦ  ｃＤＮＡはＤｒ．Ｎ．Ｂｏｕｃｋ（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）により提供いただいた。
【０１３５】
細胞培養
ヒトＹ−７９網膜芽腫細胞を、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１５％の胎児ウシ血清を添加したＭＥＭで成長させた。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞は、１０％ＦＣＳを添加したＤＥＭＥ  Ｆ−１２で培養した。ＨＵＶＥＣは２０％ＦＣＳ、２５μｇ／ｍｌＥＣＧＳマイトジェン及び５Ｕ／ｍｌヘパリンを添加したＭ−１９９で成長させた。
【０１３６】
組換えＰＥＤＦ（ｒＰＥＤＦ）変異体の構築
Ｓｅｒ２４及びＳｅｒ１１４の領域並びにその変異を含み（Ｍａｉｋ−Ｒａｃｈｌｉｎｅ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ：２９９−３０８，２００５、及びＷＯ２００６／０５４２７８、この内容は参照により組み込まれる）、プラスミドの同じ断片のＳｅｒ２２７に様々な変異を含む、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＫｐｎＩ消化断片（１−３６２ｂｐ）によって、三重変異体を作製した。これにより、以下のような三重変異体がもたらされた。
ＥＥＥ変異体、Ｓ２４、１１４Ｅインサートを消化ｐｃＤＮＡ３−Ｓ２２７Ｅベクターに連結
ＡＡＥ変異体、Ｓ２４、１１４Ａインサートを消化ｐｃＤＮＡ３−Ｓ２２７Ｅベクターに連結
ＡＡＡ変異体、Ｓ２４、１１４Ａインサートを消化ｐｃＤＮＡ３−Ｓ２２７Ａベクターに連結
ＥＥＡ変異体、Ｓ２４、１１４Ｅインサートを消化ｐｃＤＮＡ３−Ｓ２２７Ａベクターに連結
【０１３７】
ｒＰＥＤＦの作製
ｒＰＥＤＦ又は変異体を担持する多様なプラスミドを、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に、リポフェクトアミン（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ）試薬を使用して導入し、分泌されたタンパク質をＮｉ＋２カラム上で記載のように精製した（Ｍａｉｋ−Ｒａｃｈｌｉｎｅ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ：２９９−３０８，２００５）。
【０１３８】
本明細書中で開示する多様なＰＥＤＦのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列の呼称及び配列番号は以下の通りである。
【表１】
0005385613.tif 000002
【０１３９】
ヒト血漿由来ＰＥＤＦの精製
ｐｌＰＥＤＦをヒトのクエン酸血漿（１Ｌ）から、９〜２０％ＰＥＧ切断、その後ＤＥＡＥ−セファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）カラム（２．９×４０ｃｍ）及びヘパリン−アガロースカラムによって先に記載のように（Ｍａｉｋ−Ｒａｃｈｌｉｎｅ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ：２９９−３０８，２００５）精製した。
【０１４０】
ＰＥＤＦのインビトロのリン酸化
リン酸化分析試料（４０μｌ）はｒＰＥＤＦ、ｐｌＰＥＤＦ又はｒＰＥＤＦ変異体（５０μｇ／ｍｌ）のどれかを含んだ。ＣＫ２用：成分はＣＫ２（４μｇ／ｍｌ）、グリセロール（２％）、ＮａＣｌ（２０ｍＭ）、β−メルカプトエタノール（０．１ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（２０ｍＭ）、［γ３２Ｐ］−ＡＴＰ（１０μＭ）、ポリ−Ｌ−リシン（２００ｎＭ）及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ（５０ｍＭ  ｐＨ７．４）である。ＰＫＡ用：ＰＫＡの純粋触媒サブユニット（２．５μｇ／ｍｌ）、ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）、ヘパリン（５０ｍｇ／ｍｌ）、［γ３２Ｐ］−ＡＴＰ（１０μＭ）及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ（５０ｍＭ  ｐＨ６．５）。反応は、３０℃で４５分間続けた。その後、煮沸したサンプルバッファーを加え、試料を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
【０１４１】
ＥＲＫのリン酸化の測定
血清飢餓ＨＵＶＥＣを多様なｒＰＥＤＦ変異体（１０ｎＭ）を用いて１５分処理した。刺激した後で、細胞を収穫し、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、リン酸化ＥＲＫ及び一般的ＥＲＫを、ウェスタンブロットにより適切な抗体を使用し、記載のように検出した（Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２４：１０，０００−１０，０１５，２００４）。
【０１４２】
内皮細胞増殖試験
増殖は、先に記載したように（Ｏｌｉｖｅｒ，Ｍ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．９２：５１３−５１８，１９８９）メチレンブルー試験によって測定した。簡潔にいえば、ＨＵＶＥＣをゼラチンで被覆した２４ウェル組織培養プレート（２０×１０３細胞／ウェル）中の２．５％ＦＣＳを添加したＭ−１９９（０．５ｍｌ／ウェル）に播種した。様々なＰＥＤＦを、播種後直ちに四重に加え（すべて１０ｎＭで）、加湿インキュベーターで４８時間インキュベートした。その後、細胞を４％緩衝化ホルムアルデヒド溶液で２時間固定化し、０．１Ｍホウ酸ナトリウムバッファーｐＨ８．５で２回洗浄し、０．１Ｍホウ酸バッファー溶液に溶解した１％メチレンブルーを用いて２０分染色した。過剰な染料を洗い流し、細胞結合染料を２００μｌ／ウェルの０．１ＭのＨＣｌで溶出した。吸光度を５９５ｎｍで、Ｗａｌｌａｃ１４２０マルチラベルカウンターで読み取った。データをマイクロソフトのエクセルで、２．５％ＦＣＳ培地における細胞増殖を対照として使用し、分析した。
【０１４３】
神経突起伸長試験
ヒトＹ−７９網膜芽腫細胞（ＡＴＣＣより入手）を神経突起伸長に関して、先に記載したように（Ｂｅｃｅｒｒａ，Ｓ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２３１４８−２３１５６，１９９３）試験した。Ｙ−７９細胞の懸濁液（２．５×１０５細胞／ｍｌ）の１ｍｌをｒＰＥＤＦ又は様々なｒＰＤＦ変異体（２０ｎＭ）と共に２ｍＭのＬ−グルタミン、抗生物質及び０．１％ＩＴＳを添加したＭＥＭ中でインキュベートした。培養７日後、細胞をポリ−Ｄ−リシン被覆プレートに移し、細胞の神経突起伸長を、様々な期間において顕微鏡により観察した。
【０１４４】
インビボのマトリゲルプラグ血管新生アッセイ
氷上に保ったマトリゲル（０．５ｍｌ／マウス）を、表示の濃度のｂＦＧＦと、ＰＥＤＦ（２０ｎＭ）と共に又はＰＥＤＦなしで混合し、記載のように８週齢のヌードマウスの脇腹に皮下注射した（Ｐａｓｓａｎｉｔｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６７：５１９−５２８，１９９２）。注射後マトリゲルは急速にプラグを形成した。７日目にマウスを屠殺し、マウスの皮膚を慎重に引き外し、無傷のプラグを露出させた。プラグを取り出し、固定し（４％ホルムアルデヒド）、パラフィンに包埋し、切片化した。切片を、ヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）を使用して染色した。マトリゲルに染み込んだ内皮細胞／微細血管を、マッソントリクローム染色によって確認した。
【０１４５】
（実施例１）
ＰＥＤＦのＣＫ２によるリン酸化変異体はＰＫＡの基質ではない。
ＣＫ２のリン酸化とＰＫＡのリン酸化との相互作用が研究されてきた。第一段階として、各リン酸化が他のプロテインキナーゼに関する気質として働くＰＥＤＦの能力を変化させるかどうかを調べた。この目的のために、リン酸化セリンの負の電荷を、負に帯電したグルタミン酸残基で置換することによって模倣し、同時にセリンの非リン酸化状態をアラニンによって模倣したが、これはリン酸受容体として機能しなかった。ＣＫ２リン酸化変異体Ｓ２４、１１４Ｅ（ＥＥ）を、ＰＫＡの純粋触媒サブユニット及びγ３２Ｐ−ＡＴＰと共にインキュベートすることによってＰＫＡによるリン酸化に供した。ＰＫＡによるリン酸化は多くの場合ｐＨ依存性なので、実験は異なるｐＨにおいて実施した。
【０１４６】
図１Ａに示すように、ｒＰＥＤＦはＰＫＡに対する良い気質として働き、リン酸化変異体Ｓ２４、１１４Ｅは使用した条件下ではＰＫＡによりリン酸化されなかった（図１Ａ）。しかし、Ｓ２４、１１４Ｅ変異体のもともとの構造をわずかに破壊するために意図された、短時間の熱処理により、ＰＫＡによるリン酸化は復元された（図１Ｂ）。この結果は、２つの部位がＰＥＤＦ分子の別の領域に位置するという事実にもかかわらずリン酸化が起こらなかったことは、リン酸化されたＣＫ２部位によってＰＫＡによるリン酸化部位が構造依存的に隠されていることを示している。更に、ＣＫ２により全くリン酸化できない変異体Ｓ２４、１１４Ａ（ＡＡ）は、試験した異なる反応条件の下で、ＰＫＡにより容易にリン酸化され（図１Ｃ）、リン酸化が起こらなかったことは、実際にＳｅｒ２４及びＳｅｒ１１４の負の電荷のためであることを示している。ＣＫ２部位の負の電荷によってＲＫＡによるリン酸化を妨げているのに反して、ＰＫＡ部位（Ｓｅｒ２２７）の負の電荷はＣＫ２によるリン酸化について有意な効果が全くない。これは、ＰＫＡによりリン酸化可能な部位の変異体及びリン酸化不可な部位の変異体（それぞれＳ２２７Ｅ及びＳ２２７Ａ）両方にとって事実であり、これらは両方ともＣＫ２によって容易にリン酸化される（図１Ｄ）。ＣＫ２による変性ＰＥＤＦの過剰リン酸化は、先に記載しており（Ｍａｉｋ−Ｒａｃｈｌｉｎｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．前掲）、追加のＣＫ２部位がＰＥＤＦの変性により露出されたことを示す。更に、先に示したように、ＣＫ２によるｐｌＰＥＤＦのリン酸化は、ｒＰＥＤＦのＣＫ２によるリン酸化より有意に低く（図１Ｄ）、これはおそらく循環するタンパク質がその部位に関して事前にリン酸化されているために起こる。したがって、Ｓｅｒ２４及びＳｅｒ１１４のＣＫ２によるリン酸化は、ＰＥＤＦの構造的変化を誘導し、それによってＳｅｒ２２７をＰＫＡでリン酸化できなくなる。しかし、Ｓｅｒ２２７のＰＫＡによるリン酸化は、ＰＥＤＦがＣＫ２によってリン酸化される能力に対して影響を与えない。
【０１４７】
（実施例２）
ＰＥＤＦの三重変異体の特性解析
本発明の発明者らは、循環血液から精製したＰＥＤＦ（ｐｌＰＥＤＦ）がＣＫ２部位にリン酸塩を含み、更にそれほどではないがＰＫＡ部位にも含むことを先に示した（Ｍａｉｋ−Ｒａｃｈｌｉｎｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．前掲；及び本明細書中の上記図１）。更に、本明細書中の上記の結果は、３つのＰＥＤＦ部位が、まずＰＫＡにより、次いでＣＫ２により同時にリン酸化できることを示す（図１）。その発見を考慮すると、これら両方のキナーゼによるＰＥＤＦの同時リン酸化の効果を特性解析することが重要になった。したがって、一連の３部位変異体は、ＣＫ２及びＰＫＡによるリン酸化部位、Ｓｅｒ２４、１１４及び２２７を、以下のようにＡｌａ又はＧｌｕに置換することによって構築された：Ｓ２４Ｅ１１４Ｅ２２７Ｅ（ＥＥＥ）は、ＣＫ２部位及びＰＫＡ部位においてリン酸化を模倣する、Ｓ２４Ｅ１１４Ｅ２２７Ａ（ＥＥＡ）は、ＣＫ２部位においてリン酸化を模倣するがＰＫＡ部位においては模倣しない、Ｓ２４Ａ１１４Ａ２２７Ｅ（ＡＡＥ）は、ＰＫＡ部位においてリン酸化を模倣するがＣＫ２部位においては模倣しない、Ｓ２４Ａ１１４Ａ２２７Ａ（ＡＡＡ）は、ＣＫ２部位もＰＫＡ部位もリン酸化されないＰＥＤＦを模倣する（図２Ａ）。関連部位において負の電荷を有する均一な分子集団を提供し、その結果リン酸化効果の正確な検出を可能にするので、部分的にリン酸化されたｐｌＰＥＤＦではなく、Ｇｌｕ変異体を使用することが重要であった。非リン酸化分子の均一な集団を得られるので、リン酸化ＳｅｒがＡｌａ残基に変異することは同様に重要であった。これは、Ｓ２４、１１４Ｅ又はＳ２４、１１４ＡのＰＫＡ部位並びにＳ２２７Ｅ及びＳ２２７Ａの変異体におけるＣＫ２部位に起こる、その分子の特性に部分的な影響を与えられるわずかなリン酸化とは異なる（Ｍａｉｋ−Ｒａｃｈｌｉｎｅ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，前掲）。その変異体を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に完全長のヒトＰＥＤＦｃＤＮＡ又は該変異体を形質移入することによって発現させ、Ｎｉ＋２カラムで精製した。
【０１４８】
変異体の特性を解析し、その生化学的完全性を確認するために、これらをそれぞれインビトロでＣＫ２又はＰＫＡによるリン酸化に供した。ＡＡＥ及びＡＡＡ変異体は、ＣＫ２によるリン酸化がほぼ完全に破壊された（図２Ｂ）。一方、三重変異体ＥＥＥ及びＥＥＡはＣＫ２により容易にリン酸化され、その変異体が、先に記載したＳ２４、１１４Ｅ（ＥＥ）変異体（Ｍａｉｋ−Ｒａｃｈｌｉｎｅ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，前掲）の過剰リン酸化に従って追加のリン酸化部位を露出することを示した。したがって、ＣＫ２変異部位にＳ２２７Ａ又はＳ２２７Ｅの変異を加えることにより、Ｓ２４、１１４Ｅ単独のリン酸化と比較してそのＣＫ２によるリン酸化のレベルに有意な影響を与えなかった（図２Ｂ）。更に、三重変異体はどれも、ＰＫＡによりリン酸化されず（図２Ｃ）、三重変異体内のＣＫ２部位のＧｌｕ又はＡｌａどちらかへの変異はＰＫＡ部位の立体配座構造に影響を与えなかったことを示した。
【０１４９】
（実施例３）
ＥＲＫ活性化に関するＰＥＤＦ変異体の効果
ＰＥＤＦの受容体はいまだ特定されていないが、この因子が、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）／マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードを含む多様な細胞内シグナル伝達プロセスを刺激できることが示された。ＰＥＤＦの様々な三重変異体を更に特性解析するために、そのＨＵＶＥＣにおけるＥＲＫ活性化効果を試験した。したがって、様々な変異体を血清飢餓ＨＵＶＥＣに加え、ＥＲＫの活性を抗リン酸化ＥＲＫ及び抗一般的ＥＲＫ抗体を使用して確定した。
【０１５０】
以前の研究において本発明者らは、ＣＫ２によるＰＥＤＦのリン酸化が明らかにＥＲＫの活性化に関するｒＰＥＤＦの効果を高めるが、ＰＫＡのリン酸化単独では本質的に効果がないことを示した（Ｍａｉｋ−Ｒａｃｈｌｉｎｅ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．前掲）。本発見は、Ｓ２４，１１４Ｅ変異体が有意なＥＲＫリン酸化を誘導することを示し（図３Ａ及び３Ｂ）、それはｒＰＥＤＦにより誘導されるリン酸化より高かった。しかし、三重リン酸化変異体ＥＥＥにより誘導されるＥＲＫのリン酸化は、更に強いリン酸化をもたらし、Ｓ２４，１１４Ｅ変異体のリン酸化より約１．５倍高かった。（図３Ａ〜Ｂ）。ＥＥＡ及びＡＡＥ変異体はＳ２４，１１４Ｅ変異体よりわずかに高くＥＲＫのリン酸化を誘導し、ＡＡＡ変異体はＰＥＤＦのＥＲＫを活性化する能力を有意に減少させた。その結果はＰＫＡ又はＣＫ２のどちらかによるＰＥＤＦのリン酸化がＥＲＫカスケードのＰＥＤＦ誘導性活性化に必要であり、そのキナーゼの３つの部位の累積的なリン酸化がこの誘導を有意に高めることを示した。
【０１５１】
（実施例４）
細胞増殖に関するＰＥＤＦの効果
ＰＥＤＦが子宮内膜癌細胞の細胞増殖を阻害し、内皮細胞のアポトーシスを誘導することは先に示した。この実験のねらいは、ＨＵＶＥＣの増殖に関するＰＥＤＦ及びそのリン酸化変異体の効果を確定することであった。この目的のために、ＨＵＶＥＣを２４ウェル組織培養プレートに播種し、２．５％ＦＣＳを添加し、様々なＰＥＤＦを添加した又はＰＥＤＦなしの培地に４８時間維持し、その後メチレンブルー試験（Ｏｌｉｖｅｒ，Ｍ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．９２：５１３−５１８，１９８９）によって増殖率を分析した。その条件の下で、ｒＰＥＤＦはＨＵＶＥＣの増殖を阻害し、中程度に伸長した（２２％、図３Ｃ）が、血漿から精製したＰＥＤＦ（ｐｌＰＥＤＦ）の阻害効果は更に多く表れた（３３％）。観察されたＨＵＶＥＣの増殖の阻害は、細胞がＳ２４、１１４Ｅ変異体を用いて処理された場合、ｐｌＰＥＤＦによって観察された阻害と実に似ており、循環血漿中のＰＥＤＦのＣＫ２部位は良好にリン酸化されることを再び示した（上記を参照されたし）。興味深いことに、細胞を、ＥＥＥ変異体を用いて処理した場合、阻害のレベルはかなり上昇する（５７％）のに対して、ＥＥＡ変異体を用いて処理した細胞はＳ２４，１１４Ｅ変異体を用いて処理した細胞と非常に似たふるまいをする（それぞれ２７％及び３３％）。一方、ＰＫＡリン酸化変異体のＳ２２７Ｅ及びＡＡＥは、ＨＵＶＥＣの増殖にほとんど効果がない。更に非リン酸化変異体、Ｓ２４，１１４Ａ及びＳ２２７Ａを用いて処理した細胞は、ｒＰＥＤＦを用いて処理した細胞と同様の増殖のレベルを示したが、ＡＡＡ変異体はＨＵＶＥＣの増殖についてわずかの効果のみ有した。したがって、その結果はＨＵＶＥＣの増殖の阻害はＰＥＤＦのリン酸化状態に依存することを示す。特に細胞増殖はＣＫ２部位がリン酸化されたＰＥＤＦによって阻害され、この阻害はＰＫＡ部位の負の電荷をＣＫ２部位の負の電荷に加えることで非常に増加する。
【０１５２】
（実施例５）
ＰＥＤＦ誘導性神経栄養活性に関する三重変異の効果
本発明者らは、ＣＫ２によるリン酸化がＰＥＤＦの神経栄養効果を有意に減少するが、ＰＥＤＦのＰＫＡによるリン酸化はＰＥＤＦの神経栄養効果に全く又は非常にわずかしか影響しないことを示した（Ｍａｉｋ−Ｒａｃｈｌｉｎｅ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．前掲）。本研究のねらいは、ＰＥＤＦのＰＫＡ及びＣＫ２部位へのリン酸塩の同時取り込みがＰＥＤＦ変異体の能力を調節し、培養ヒト網膜芽腫Ｙ−７９細胞の分化を誘導するかどうかを調べることにあった。驚いたことに、ＥＥＥ変異体を用いて処理した細胞（図４）が神経突起の伸長を示し、大型の凝集体を形成したが、ＥＥＡ変異体は非常に小型の小さなコロナ様構造の形成を誘導し、その細胞からはどのような芽も突き出ず、Ｓ２４、１１４Ｅ変異体を用いて処理した細胞と似た様式であった。Ｙ−７９細胞をＰＫＡリン酸化部位変異体の２２７Ｅ及びＡＡＥを用いて処理すると、異なる細胞表現型がもたらされ、コロニーは小型であったがそれらのプロセスは明確に観察された。その発見はＣＫ２によるリン酸化はＰＥＤＦの神経栄養効果を有意に減少させるが、ＣＫ２によるリン酸化の上あるＰＫＡ部位にリン酸塩を加えると、ＰＥＤＦの神経栄養活性が保存される。これはＰＫＡ部位のみがリン酸化されたＰＥＤＦの最小効果にかかわらず起こる。
【０１５３】
（実施例６）
インビボにおけるＰＥＤＦ誘導性抗血管新生活性に関する三重のアミノ酸置換の効果
更なる調査のために、ＰＥＤＦの機能に関するＣＫ２及びＰＫＡの両方によるリン酸化の効果、ＰＥＤＦの抗血管新生活性に関する三重変異体の影響を、マトリゲルプラグアッセイを使用して確定した。
【０１５４】
検査する因子を添加した液体マトリゲルを、ＣＤ−１ヌードマウスに皮下注射した。マトリゲルが重合し、プラグを形成し、これを１週間後に除去し、組織染色によって血管の成長及び侵入に関して分析した。マトリゲルプラグを、ｒＰＥＤＦ、ｐｌＰＥＤＦ又は様々な変異体とｂＦＧＦ（３００ｎｇ／ｍｌ）と組み合わせて用いて処理した。予想通り、ＰＢＳを用いて処理した対照のプラグは非常にわずかな血管新生応答しか示さず、ｂＦＧＦ処理プラグは強い血管新生活性を示し、ｒＰＥＤＦ、ｐｌＰＥＤＦ並びにＳ２４，１１４Ｅ及びＳ２４、１１４Ａ変異体は、先に述べた抗血管新生活性を系の中で示した（図５、またＭａｉｋ−Ｒａｃｈｌｉｎｅ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．前掲）。三重変異体ＥＥＥ又はＥＥＡは、ｂＦＧＦ誘導性血管新生をＳ２４，１１４Ｅの効果とおおよそ同程度減少し、ＡＡＡ及びＡＡＥ変異体はＳ２４、１１４Ａの効果とおおよそ同程度にわずかな効果のみ有した。興味深いことに、ＥＥＥ変異体の抗血管新生効果は、他の変異体の効果よりいくらか高いが、これは最新の実験に使用した条件下では統計的に有意ではなかった。血管を形成しなかったいくつかの増殖細胞が、ＰＥＤＦ変異体の型とは独立してすべてのプラグの周りに観察され、抗血管新生活性が増殖の阻害に関与しない機序によって部分的に仲介されることを示唆したことを述べることは、注目に値する。
【０１５５】
次いで、ＥＥＥ変異体による血管成長のわずかに優れた阻害の点から、この変異体が確かに他のリン酸化変異体より良い抗血管新生因子である可能性を調べた。この目的のために、高レベルのｂＦＧＦ（５００ｎｇ／ｍｌ）を用いて処理したマトリゲルプラグに対するその変異体の阻害効果を確定した。全体的に、５００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを用いて処理したプラグは、３００ｎｇ／ｍｌで処理したプラグより高い血管新生応答を示した（図６）。これは、プラグに侵入した細胞の数の有意な上昇、及び低い濃度のｂＦＧＦを用いて処理したプラグ内でははっきりしなかった、そのプラグ内の実際の血管が鮮明に染色されたことによって明白であった（図６）。そのより高いｂＦＧＦレベルの下で、プラグ内に血管が全く観察されなかったので、ＥＥＥ変異体はＰＥＤＦ抗血管新生活性を有意に増加させた（図６）。この阻害活性は、Ｓ２４，１１４Ｅ又はＥＥＡ変異体によって観察される抗血管新生活性と比較して、有意により多く表わされた（それぞれｐ＝０．０４及びｐ＝０．０１）。したがって、その結果は、ＣＫ２によるリン酸化と組み合わせた場合に、ＰＥＤＦのＰＫＡによるリン酸化がその強力な抗血管新生活性に必須であるが、単独で存在した場合は必須ではないことを示す。その結果は更に、ＣＫ２及びＰＫＡによるＰＥＤＦの同時リン酸化が、ＣＫ２単独によってリン酸化されたＰＥＤＦ変異体によって示される抗血管新生活性よりも高い、最も高いレベルの抗血管新生活性を有するＰＥＤＦ変異体をもたらすことを示す。
【０１５６】
したがって、ＰＥＤＦのリン酸化はその生理活性の決定において重要な役割を果たす。本発明者らの先の研究において（Ｍａｉｋ−Ｒａｃｈｌｉｎｅ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．前掲）、ＣＫ２によるＰＥＤＦの細胞外のリン酸化が、ＰＥＤＦの神経栄養活性を破壊するが、抗血管新生活性は強化し、一方ＰＫＡによるリン酸化はＰＥＤＦの抗血管新生活性を減少させ神経栄養活性には影響を与えないことを示した。本発明において、ＰＫＡ及びＣＫ２のリン酸化部位のＳｅｒをＧｌｕに複合置換することにより、神経栄養活性を保持したままＰＥＤＦを最も強力な抗血管新生形態に変化させることを示す。その観察をすべて考慮して、ＰＫＡ、ＣＫ２又は両方のキナーゼ一緒によるＰＥＤＦの細胞外リン酸化が、ＰＥＤＦ活性を調節できると結論できる。したがって、非リン酸化タンパク質は、弱い抗血管新生並びに神経活性を有し、ＰＫＡリン酸化タンパク質は強い神経栄養活性を有するが、抗血管新生活性は有さず、２つのＣＫ２部位がリン酸化されたＰＥＤＦは抗血管新生活性を示し、神経栄養効果は全く有さず、最終的に三重のリン酸化タンパク質は両方の活性を取り戻す。更に三重のリン酸化タンパク質の抗血管新生活性は非リン酸化又は１つのＰＫＡ部位がリン酸化されたＰＥＤＦの抗血管新生活性より非常に高く、更に２重にＣＫ２部位がリン酸化されたタンパク質よりも高い（図７）。
【０１５７】
（実施例７）
ＥＥＥ三重変異体はＤＵ１４５腫瘍異種移植片の成長を阻害する
ＥＥＥ変異体は、マトリゲルプラグアッセイにおいて最も高いレベルの抗血管新生活性を示し、腫瘍異種移植片モデルに関するインビボのその効果を次に試験した。このねらいのために、ＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞懸濁液（１００μｌ生理食塩水中に５×１０６細胞）を、５週齢のメスの胸腺欠損ヌードマウス（ＣＤ−１）の脇腹に皮下注射した。腫瘍を約１週間成長させ、その後マウスを腫瘍の大きさに関係なく無作為に２群に分けた。１群にＥＥＥ変異体で８μｇ／注射を皮下注射した（ｎ＝３）。他方の群は対照として使用し、ＰＢＳを皮下注射した（ｎ＝２）。腫瘍体積を、キャリパーを使用して、長さ×幅×奥行きを乗じることによって算出した。全ての処理を１週間に３回施し、腫瘍体積を週に２回観測した。結果を、各群の腫瘍体積対初めの大きさの増加倍率の平均によって表した。スチューデントｔ検定を使用して、処理群と対照群との腫瘍体積の平均増加倍率の差の統計的有意性を分析した（＊Ｐ＜０．０５）。図８Ａ〜Ｂに示したように、ＥＥＥ変異体を用いたＤＵ１４５異種移植片の処理により、腫瘍体積は有意に減少した。
【０１５８】
（実施例８）
抗ＣＫ２及び抗ＰＫＡリン酸化ＰＥＤＦポリクロナール抗体の作製
抗リン酸化Ｓｅｒ２４（α−ｐＳｅｒ２４；ＣＫ２部位）ＰＥＤＦポリクロナール抗体を、アミノ酸配列：配列番号１５に記述のＬＧＨＳＳＣＱＮＰＡＳ（リン酸化）ＰＰＥＥＧを有するヒトＰＥＤＦのアミノ酸１４〜２９に相当する、合成１６ｍｅｒ−ペプチドに対してウサギ内で作製した。抗リン酸化Ｓｅｒ２２７（α−ｐＳｅｒ２２７；ＰＫＡ部位）ＰＥＤＦポリクロナール抗体を、アミノ酸配列：配列番号１６に記述のＴＫＦＤＳＲＫＴＳ（リン酸化）ＬＥＤＦＹＬを有するヒトＰＥＤＦのアミノ酸２１９〜２３３に相当する合成１５−ｍｅｒペプチドに対して作製した。更に抗ＰＥＤＦ（α−ＰＥＤＦ）ポリクロナール抗体を、アミノ酸配列：配列番号１７に記述のＫＳＬＱＥＭＫＬＱＳＬＦＤＳＰＤＦを有するヒトＰＥＤＦのアミノ酸３２７〜３４３に相当する１７−ｍｅｒペプチドに対して作製した。ポリクロナール抗体の調製方法は、当分野では公知である（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓを参照されたし、その内容は、本明細書中に記述したことと同様に参照により組み込まれる）。
【０１５９】
ポリクロナール抗体がＰＥＤＦを認識することを確認するために、ｒＰＥＤＦ及びｐｌＰＥＤＦに、様々な抗リン酸化ＰＥＤＦ抗体を用いて免疫ブロットを行った。図９Ａに示すように、両方のタンパク質が、αｐＳｅｒ２４及びαｐＳｅｒ２２７によって認識されたが、両方の抗体ともｒＰＥＤＦと比較してｐｌＰＥＤＦのほうを非常に高く認識し、αｐＳｅｒ２４のほうがｐｌＰＥＤＦをよりよく認識した。その結果は、本明細書中の上記の、ヒト血漿中のＰＥＤＦがリン酸化タンパク質として血液循環中に存在し、主にＣＫ２部位においてリン酸化されているという観察を裏付ける。
【０１６０】
抗体が実際にリン酸化ＰＥＤＦ抗体であったことを更に検証するために、ｒＰＥＤＦ及びｐｌＰＥＤＦを以下のようにポテトの酸ホスファターゼを用いて処理した：ｒＰＥＤＦ（１μｇ）又はｐｌＰＥＤＦ（１μｇ）をポテトの酸ホスファターゼ（ＰＡＰ、０．５Ｕ）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。その後試料を、様々な抗リン酸化ＰＥＤＦ抗体を用いて免疫ブロットに供した。ｒＰＥＤＦのホスファターゼ処理は、αｐＳｅｒ２４及びαｐＳｅｒ２２７の両方による認識を完全に破壊したが、ｐｌＰＥＤＦに同じ処理するとリン酸化抗体による認識が有意に減少した（図９Ｂ）。最終的に、様々なＰＥＤＦ変異体（ＥＥＡ、ＡＡＥ、ＥＥＥ及びＡＡＡ）を、抗リン酸化ＰＥＤＦ抗体を用いた免疫ブロットに供した。図９Ｃに示したように、興味深いことにαｐＳｅｒ２４抗体はＣＫ２リン酸化変異体（ＥＥＡ又はＥＥＥ）を高度に認識し、αｐＳｅｒ２２７抗体はＰＫＡリン酸化変異体（ＡＡＥ及びＥＥＥ）を高度に認識した。
【０１６１】
本発明が、本明細書中の上部に具体的に示され、説明されたことに限定されないことは、当業者には理解されるであろう。むしろ、本発明の範囲は上記の特許請求の範囲によって規定される。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１Ａ】ＰＥＤＦのＣＫ２によるリン酸化とＰＫＡによるリン酸化との相互作用を示した図である。異なるｐＨのバッファー（表示されている）中で予備透析した、組換えＰＥＤＦ（ｒＰＥＤＦ）及びＳ２４、１１４Ｅ変異体（ＥＥ）を、ＰＫＡによりリン酸化した。ＳＤＳゲルをクマシーブルーにより染色し（下方のパネル）、オートラジオグラフィーにかけた（上方のパネル）。
【図１Ｂ】ＰＥＤＦのＣＫ２によるリン酸化とＰＫＡによるリン酸化との相互作用を示した図である。図１Ａにおける実験をリン酸化の前に熱処理に供したｒＰＥＤＦ及びＳ２４、１１４Ｅ変異体（ＥＥ）を用いて実施した。
【図１Ｃ】ＰＥＤＦのＣＫ２によるリン酸化とＰＫＡによるリン酸化との相互作用を示した図である。異なるｐＨのバッファー（表示されている）中で予備透析した、ｒＰＥＤＦ及びＳ２４、１１４Ａ変異体（ＡＡ）をリン酸化の前に熱処理して、又は熱処理せずにＰＫＡによりリン酸化した。リン酸化産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーにより（上方のパネル）又は抗ＰＥＤＦ抗体を用いた免疫ブロットにより（下方のパネル）分析した。
【図１Ｄ】ＰＥＤＦのＣＫ２によるリン酸化とＰＫＡによるリン酸化との相互作用を示した図である。血漿ＰＥＤＦ（ｐｌＰＥＤＦ）、ｒＰＥＤＦ、Ｓ２２７Ａ及びＡ２２７Ｅの変異体を、リン酸化の前に熱処理して、又は熱処理せずにＣＫ２によってリン酸化した。リン酸化産物を、図１Ａのパネルに記載したように分析した。
【図２Ａ】インビトロのＰＥＤＦのＣＫ２によるリン酸化及びＰＫＡによるリン酸化を示した図である。セリン２４、セリン１１４及び／又はセリン２２７をＡｌａ又はＧｌｕに置換したＰＥＤＦ変異体である。
【図２Ｂ】インビトロのＰＥＤＦのＣＫ２によるリン酸化及びＰＫＡによるリン酸化を示した図である。ｒＰＥＤＦ及びｒＰＥＤＦ変異体をＣＫ２によりリン酸化し、リン酸化産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ次いでオートラジオグラフィーにより（上方のパネル）及び抗ＰＥＤＦ抗体を用いた免疫ブロットにより（下方のパネル）分析した。
【図２Ｃ】インビトロのＰＥＤＦのＣＫ２によるリン酸化及びＰＫＡによるリン酸化を示した図である。ｒＰＥＤＦ及びｒＰＥＤＦ変異体をＰＫＡによりリン酸化し、リン酸化産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ次いでオートラジオグラフィーにより（上方のパネル）又は抗ＰＥＤＦ抗体を用いた免疫ブロットにより（下方のパネル）分析した。
【図３Ａ】ヒトの臍血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＥＲＫの活性化及び増殖についてのｒＰＥＤＦ変異体の効果を示した図である。ＨＵＶＥＣを表示したｒＰＥＤＦ変異体を用いて刺激した。細胞質抽出物を抗リン酸化ＥＲＫ抗体（αｐＥＲＫ、上方のパネル）又は抗一般的ＥＲＫ（αｇＥＲＫ、下方のパネル）を用いて免疫ブロットに供した。ＥＲＫ２及びＥＲＫ１の位置を表す。
【図３Ｂ】ヒトの臍血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＥＲＫの活性化及び増殖についてのｒＰＥＤＦ変異体の効果を示した図である。ＥＲＫ１及びＥＲＫ２の両方に関するＥＲＫの活性化として表した、図１Ａの結果の定量的分析である。
【図３Ｃ】ヒトの臍血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＥＲＫの活性化及び増殖についてのｒＰＥＤＦ変異体の効果を示した図である。ＨＵＶＥＣを血漿（ｐｌ）ＰＥＤＦ、ｒＰＥＤＦ又はＰＥＤＦ変異体と共にインキュベートした。４８時間後に、メチレンブルー試験により細胞数を測定した。
【図４Ａ】ＰＥＤＦ誘導性神経栄養活性についてのｒＰＥＤＦ及びその変異体の効果を示した図である。網膜芽腫Ｙ−７９細胞をｒＰＥＤＦ又はｒＰＥＤＦ変異体と共にインキュベートした。ポリ−Ｄ−リシン被覆プレート上に細胞接着して７日後に、細胞形態を倒立顕微鏡により視覚化した。
【図４Ｂ】ＰＥＤＦ誘導性神経栄養活性についてのｒＰＥＤＦ及びその変異体の効果を示した図である。図４Ａのパネルに提示した結果の定量的分析である。＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．０５は、ｒＰＥＤＦを用いて処理した細胞と、様々なＰＥＤＦ変異体を用いて処理した細胞との比較を示す。
【図５Ａ】中程度のｂＦＧＦ誘導性新血管形成についてのＰＥＤＦ変異体の抗血管新生活性を示した図である。ＣＤ−１ヌードマウスに、ｂＦＧＦ（３００ｎｇ／ｍｌ）の存在下又は不在下で、ｒＰＥＤＦ、ｐｌＰＥＤＦ又はＰＥＤＦ変異体を含む、０．５ｍｌのマトリゲルを皮下注射した。対照プラグをＰＢＳ又はｂＦＧＦのみを用いて処理した。７日後、マウスを屠殺し、プラグをＨ＆Ｅ染色に供し、光学顕微鏡下で撮影した（×４０倍）。
【図５Ｂ】中程度のｂＦＧＦ誘導性新血管形成についてのＰＥＤＦ変異体の抗血管新生活性を示した図である。血管新生を、３か所の別の断面に関して一視野当たりの血管の数を測定することによって定量化した。＊Ｐ＜０．０１は、ｂＦＧＦを用いて処理したプラグとｂＦＧＦ及びＰＥＤＦ変異体の両方を用いて処理したプラグとの差の統計的有意性を示す。
【図６Ａ】進展型ｂＦＧＦ誘発性新血管形成についてのＰＥＤＦ変異体の抗血管新生活性を示した図である。ＣＤ−１ヌードマウスに、ｂＦＧＦ（５００ｎｇ／ｍｌ）の存在下又は不在下で、ＰＥＤＦ変異体を含む、０．５ｍｌのマトリゲルを皮下注射した。対照プラグをＰＢＳ又はｂＦＧＦのみを用いて処理した。７日後、マウスを屠殺し、プラグをＨ＆Ｅ染色し、光学顕微鏡下で撮影した（×４０倍）。
【図６Ｂ】進展型ｂＦＧＦ誘発性新血管形成についてのＰＥＤＦ変異体の抗血管新生活性を示した図である。抗血管新生を、３か所の別の断面に関して一視野当たりの血管の数を測定することによって定量化した。＊＊Ｐ＜０．０５は、ｂＦＧＦ及びＥＥＥ変異体を用いて処理したプラグとｂＦＧＦ及びＥＥＡ又はＳ２４、１１４Ｅの変異体を用いて処理したプラグとの差の統計的有意性を示す。
【図７】ＰＥＤＦの異なるリン酸化状態及びそれらのＰＥＤＦの機能についての効果の概略図を示した図である。
【図８Ａ】胸腺欠損マウスにおけるＤＵ１４５異種移植片の増殖に関するＥＥＥ三重変異体の効果を示した図である。ＤＵ１４５を移植したＣＤ−１ヌードマウスをＥＥＥ変異体を用いて処理した。対照群はＰＢＳを用いて処理した、初めの大きさに対する腫瘍の体積の増加倍率を提示した。
【図８Ｂ】胸腺欠損マウスにおけるＤＵ１４５異種移植片の増殖に関するＥＥＥ三重変異体の効果を示した図である。３６日目の腫瘍の写真である。左側、ＰＢＳ処理群から摘出した腫瘍。右側、ＥＥＥ変異体処理群から摘出した腫瘍。
【図９Ａ】抗ＣＫ２リン酸化ＰＥＤＦポリクロナール抗体又は抗ＰＫＡリン酸化ＰＥＤＦポリクロナール抗体によるＰＥＤＦ変異体の認識を示す図である。組換えＰＥＤＦ（ｒ）又は血漿ＰＥＤＦ（ｐｌ）をαｐＳｅｒ２４、αｐＳｅｒ２２７又はαＰＥＤＦ抗体を用いた免疫ブロットに供した。
【図９Ｂ】抗ＣＫ２リン酸化ＰＥＤＦポリクロナール抗体又は抗ＰＫＡリン酸化ＰＥＤＦポリクロナール抗体によるＰＥＤＦ変異体の認識を示す図である。ｒＰＥＤＦ又はｐｌＰＥＤＦをポテトの酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）を用いて処理し、その後αｐＳｅｒ２４、αｐＳｅｒ２２７又はｐＰＥＤＦ抗体を用いた免疫ブロットに供した。対照試料は、左の未処理である。
【図９Ｃ】抗ＣＫ２リン酸化ＰＥＤＦポリクロナール抗体又は抗ＰＫＡリン酸化ＰＥＤＦポリクロナール抗体によるＰＥＤＦ変異体の認識を示す図である。ｒＰＥＤＦ、ＥＥＡ、ＡＡＥ、ＥＥＥ又はＡＡＡの各変異体を、αｐＳｅｒ２４、αｐＳｅｒ２２７又はαＰＥＤＦの抗体を用いた免疫ブロットに供した。
【図２Ａ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図８Ａ】
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【配列表】
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