(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスペルギルスソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｏｊａｅ）ＣＪＣＣ＿０１１０５７Ｐ（ＫＣＣＭ１１０４３Ｐ）由来の、ＮＴＧ（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ'−Ｎｉｔｒｏｓｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）を処理した後に、０．３ＫＧｙの放射線を１時間かけて照射して変異を誘発することにより、プロテアーゼの活性が強化されていることを特徴とするアスペルギルスソーヤ変異株。
【請求項２】
アスペルギルスソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｏｊａｅ）ＣＪＣＣ＿０１１０５７Ｐ（ＫＣＣＭ１１０４３Ｐ）由来の、プロテアーゼの活性が強化されているアスペルギルスソーヤ変異株であることを特徴とするアスペルギルスソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｏｊａｅ）ＣＪＣＣ＿０８０１２４Ｐ（ＫＣＣＭ１１０２６Ｐ）。
【請求項３】
（ａ）請求項１または２に記載のアスペルギルスソーヤ変異株を培養するステップと、
（ｂ）前記ステップ（ａ）における培養物をタンパク質源に添加して加水分解するステップと、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）において得られたタンパク加水分解液を濃縮・乾燥した後に粉体化させるステップと、
を含むことを特徴とする天然風味向上剤の製造方法。
【請求項４】
前記培養物に、タンパク質加水分解酵素、細胞壁分解酵素またはグルタミナーゼを含有する酵素液または酵素製剤をさらに添加することを特徴とする請求項３に記載の天然風味向上剤の製造方法。
【請求項５】
前記加水分解は、２０〜６０℃の温度条件下で６時間〜１５日間反応させることを特徴とする請求項３に記載の天然風味向上剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアーゼ活性が強化されたアスペルギルスソーヤ変異株及びこれを用いた天然風味向上剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
醤油、味噌などを製造するときに用いられる?菌であるアスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）とアスペルギルスソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｏｊａｅ）は、プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）、アミラーゼ（ａｍｙｌａｓｅ）及びグルタミナーゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）などの酵素を産生する。プロテアーゼは、タンパク質をペプチドとアミノ酸とに分解し、グルタミナーゼは、タンパク質の分解時に遊離されたグルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）を旨味のグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ）に転換して、醤油や味噌などの風味を付ける上で重要な役割を果たす。
【０００３】
このため、風味を付ける上で重要な役割を果たすプロテアーゼまたはグルタミナーゼの酵素活性を増加させるために研究がなされている。その方法としては、微生物をＵＶ照射、変異剤処理、放射線照射によって突然変異させ、高活性の変異株を分離したり（Ｈ．  Ｓｅｋｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ３３，  １４７７（１９６９），  Ｓ．  Ｎａｓｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｆｅｒｍｅｎｔ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，  ５５，  ２７３（１９７７），  Ｓ．  Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｆｅｒｍｅｎｔ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，  ５２，  ５６４（１９７４））、細胞融合技術によって２種類の酵素の活性が両方とも高い高活性菌株を製作する方法が行われてきた（Ｓｈｉｎｇｅｏｍｉ  Ｕｓｈｉｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ５１（４），  １０５１−１０５７  （１９８７），  Ｓｈｉｎｇｅｏｍｉ  Ｕｓｈｉｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ５１；２７８１−２７８６（１９８７），Ｓｈｉｎｇｅｏｍｉ  Ｕｓｈｉｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ５４；１６６７−１６７６，  （１９９０），  Ｓｈｉｇｅｏｍｉ  Ｕｓｈｉｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ５５（１），  １２９−１３６，  （１９９１））。
【０００４】
醤油、味噌は、一般に、固体培養をするため、雑菌などの汚染が避けられず、高濃度の食塩を添加するため、食品への汎用には難点があった。このため、最近には、液体培養で菌を培養して雑菌の汚染を排除した後、食塩を添加することなく、タンパク質に培養液を作用させて調味料として活用する研究がなされている（特開平８−１７３０８５号公報及び特開平８−２４２８１０号公報）。
【０００５】
このような研究がなされるに伴い、アスペルギルスオリゼーとアスペルギルスソーヤを液体培養しつつプロテアーゼまたはグルタミナーゼを産生する研究もなされている（Ｓ．  Ｕｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｐｐｌ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２６，  ２７３（１９８７）、特開平３−２７７２８９、Ｔ．  Ｙａｎｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ５５（２），  ３７９（１９９１）、特開平１０−２１０９６７）。
【０００６】
しかしながら、その活性のレベルが低い場合がほとんどであり、たとえグルタミナーゼ活性が高い場合であっても、まず、プロテアーゼの作用によってグルタミンが遊離されてこそ、これをグルタミン酸に転換して旨味を出すグルタミナーゼの効果を期待することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平８−１７３０８５号公報
【特許文献２】特開平８−２４２８１０号公報
【特許文献３】特開平３−２７７２８９号公報
【特許文献４】特開平１０−２１０９６７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈ．  Ｓｅｋｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ３３，  １４７７（１９６９）
【非特許文献２】Ｓ．  Ｎａｓｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｆｅｒｍｅｎｔ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，  ５５，  ２７３（１９７７）
【非特許文献３】Ｓ．  Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｆｅｒｍｅｎｔ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，  ５２，  ５６４（１９７４）
【非特許文献４】Ｓｈｉｎｇｅｏｍｉ  Ｕｓｈｉｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ５１（４），  １０５１−１０５７  （１９８７）
【非特許文献５】Ｓｈｉｎｇｅｏｍｉ  Ｕｓｈｉｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ５１；２７８１−２７８６（１９８７）
【非特許文献６】Ｓｈｉｎｇｅｏｍｉ  Ｕｓｈｉｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ５４；１６６７−１６７６，  （１９９０）
【非特許文献７】Ｓｈｉｇｅｏｍｉ  Ｕｓｈｉｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ５５（１），  １２９−１３６，  （１９９１）
【非特許文献８】Ｓ．  Ｕｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｐｐｌ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２６，  ２７３（１９８７）
【非特許文献９】Ｔ．  Ｙａｎｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ５５（２），  ３７９（１９９１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明者は、グルタミン酸の含量の高いタンパク加水分解物を製造するために、プロテアーゼ活性が強化されたアスペルギルスソーヤ変異株を製造し、これを用いてタンパク質を加水分解した結果、旨味に優れた天然風味向上剤を製造することができた。このため、本発明の目的は、プロテアーゼ活性が強化されたアスペルギルスソーヤ変異株を提供することにある。また、本発明の他の目的は、前記アスペルギルスソーヤ変異株を用いた天然風味向上剤の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の目的を達成するために、本発明は、アスペルギルスソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｏｊａｅ）ＣＪＣＣ＿０１１０５７Ｐ（ＫＣＣＭ１１０４３Ｐ）由来の、ＮＴＧ（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ'−Ｎｉｔｒｏｓｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）を処理した後に放射線を照射して変異を誘発することにより、プロテアーゼの活性が強化されたアスペルギルスソーヤ変異株を提供する。
【００１１】
また、本発明は、（ａ）アスペルギルスソーヤ変異株を培養するステップと、（ｂ）前記ステップ（ａ）における培養物をタンパク質源に添加して加水分解するステップと、（ｃ）前記ステップ（ｂ）において得られたタンパク加水分解液を濃縮・乾燥した後に粉体化させるステップと、を含むことを特徴とする天然風味向上剤の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係るアスペルギルスソーヤ変異株は、親株に比べて高いプロテアーゼ活性を有し、これらの培養物をタンパク質に入れて加水分解して得たタンパク加水分解物は、食品に適用したときに、従来のタンパク加水分解物よりも分解度が高く、且つ、グルタミン酸の含量が高いため、トロミと旨味に優れた天然風味向上剤として用いることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳述する。
本発明は、プロテアーゼ活性の高い菌株を選別後、ＮＴＧ（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ'−Ｎｉｔｒｏｓｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）を処理し、且つ、放射線を照射して変異を誘発することにより、プロテアーゼ活性が強化されたアスペルギルスソーヤ変異株を提供する。
【００１４】
本発明においては、全国各地から得られた大豆の麹、味噌及び醤油などの試料からタンパク質分解酵素を生成する微生物を分離し、これらのうち、タンパク質分解酵素活性の高い菌株を純粋に分離して親株として用いた。好ましくは、本発明において用いられる親株は、アスペルギルスソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｏｊａｅ）ＣＪＣＣ＿０１１０５７Ｐ（ＫＣＣＭ−１１０４３Ｐ）であってもよい。
【００１５】
本発明における突然変異の誘発方法としては、ＮＴＧ（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ'−Ｎｉｔｒｏｓｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）、ヒドロキシルアミン（ｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ）、酸化窒素（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ）、エチルメタンスルホネート（ｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ；ＥＭＳ）、ジメチルスルフェート（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）などの突然変異剤で化学的突然変異を誘発する方法、または、ＵＶ、Ｘ線及び放射線などを照射することにより突然変異を誘発する方法、または変異処理せずに得られる自然突然変異などが挙げら荒れる。
【００１６】
本発明においては、前記分離されたアスペルギルスソーヤに、突然変異剤として汎用されるＮＴＧ（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ'−Ｎｉｔｒｏｓｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）を処理し、且つ、放射線照射処理することにより、成長が良好であり、且つ、プロテアーゼの活性の高い変異株が得られる。本発明のプロテアーゼの活性の高いアスペルギルスソーヤ変異株は、親株に比べてプロテアーゼ活性が約５−８倍高い。好ましくは、本発明のアスペルギルスソーヤ変異株は、アスペルギルスソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｏｊａｅ）ＣＪＣＣ＿０８０１２４Ｐ（ＫＣＣＭ−１１０２６Ｐ）であってもよい。
【００１７】
本発明は、また、（ａ）アスペルギルスソーヤ変異株を培養するステップと、（ｂ）前記ステップ（ａ）における培養物をタンパク質源に添加して加水分解するステップと、（ｃ）前記ステップ（ｂ）において得られたタンパク加水分解液を濃縮・乾燥した後に、粉体化させるステップと、を含むことを特徴とする天然風味向上剤の製造方法を提供する。
【００１８】
前記タンパク質源としては、大豆、小麦、コン-ミール（ｃｏｒｎ ｍｅａｌ）、米、魚粉（ｆｉｓｈ ｍｅａｌ）、ミルクカゼイン、コラーゲンなどが挙げられる。また、脱脂大豆、分離大豆タンパク、小麦グルテン、トウモロコシグルテン、脱脂米糠、米タンパク、魚タンパク及び脱脂、膨化または可溶化などの工程を経た種々のタンパク質またはこれらの種々のタンパク原料から得られた分離タンパク質も使用可能である。
【００１９】
前記加水分解は、本発明のアスペルギルスソーヤ変異株を培養して得た培養物を用いて行うことができる。
【００２０】
本発明のアスペルギルスソーヤ変異株の培養物は、液状の培養液をそのまま用いることが好ましいが、培養物から、必要に応じて、酵素を分離、精製して用いてもよい。すなわち、液状の培養物を遠心分離またはろ過などして菌体を分離し、該菌体破砕液及び培養液から通常の分離手段、例えば、塩析法、等電点沈殿法、溶媒沈殿法などによってタンパク質を沈殿させ、限外ろ過法によって濃縮して酵素液にしてもよい。なお、通常の精製法によって分離・採取した精製品を単独または組み合わせて用いてもよい。
【００２１】
前記培養物に、市販の酵素製剤、例えば、タンパク質加水分解酵素、細胞壁分解酵素、グルタミナーゼなどを含有する酵素液または酵素製剤を目的に応じて添加してもよい。
【００２２】
前記加水分解反応に際しては、前記アスペルギルスソーヤ変異株の培養物を脱脂大豆、小麦グルテンなどに添加して、２０〜６０℃の温度条件下で６時間〜１５日間反応させればよい。好ましくは、３０〜５０℃の温度条件下で２４時間〜１０日間反応させればよい。
【００２３】
前記加水分解反応の終了後に、タンパク加水分解物中の加水分解が完全になされていないタンパク質及び不溶性物質は、遠心分離またはろ過などの通常の分離方法によって除去することができ、分離された液状物は濃縮・乾燥後に粉体化させる。
【００２４】
本発明の方法による前記タンパク質加水分解物に対し、遊離アミノ酸の含量、グルタミン酸の含量、総窒素の含量を測定したところ、前記タンパク質加水分解物は、分解度が高く、且つグルタミン酸の含量が高いので、トロミと旨味に優れている。
【実施例】
【００２５】
実施例１：菌株の分離と選別
韓国の各地から収集した伝統の大豆の麹、味噌、醤油などの各試料５ｇを段階的に希釈して、０．１％のｔｗｅｅｎ８０を添加した後、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する最小寒天平板培地（Ｃｚａｐｅｋ ｄｏｘ ａｇａｒ）に塗抹した。３０℃の温度条件下で３日〜４日間培養し、コロニーの周りの大きな透明帯の菌株を分離した。
【００２６】
このようにして分離した菌株をさらに最小液体培地（Ｃｚａｐｅｋ ｄｏｘ ｂｒｏｔｈ；ＮａＮＯ３０．３％、Ｋ２ＨＰＯ４０．１％、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ０．０５％、ＫＣｌ０．０５％、ＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏ０．００１％、スクロース３％）に接種し、３０℃の温度条件下で３日〜４日間培養した。遠心分離して菌体を除去した後、上澄液を取り、カゼインを基質としてタンパク質分解能を測定・比較した。
【００２７】
これらの中から、タンパク質分解能に優れた菌株を選別し、ポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ：Ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅａｇａｒ）斜面培地に接種し、３０℃の温度条件下で４日〜７日間培養した。その後、胞子懸濁液を得て（胞子数約１ｘ１０６／ｍｌ）、この胞子懸濁液０．１ｍｌをプロテアーゼ活性スクリーニング培地（２％脱脂粉乳、０．５％のＫＨ２ＰＯ４、１％の葡萄糖、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２％のａｇａｒ）に塗抹し、３０℃の温度条件下で３日〜４日間培養して、大きな透明帯の菌株を選別した。選別された菌株を１％の脱脂粉乳入りの最小液体培地に接種し、３０℃の温度条件下で３日〜４日間振蕩培養した後、菌体を除去して、プロテアーゼ活性が最も高い菌株を選別した。
【００２８】
選別された菌株を「アスペルギルスソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｏｊａｅ）ＣＪＣＣ＿０１１０５７Ｐ」と命名し、２００９年１０月８日付けで大韓民国ソウル特別市西大門区弘済１洞３６１−２２１番地所在の国際寄託機関である韓国種菌協会付設韓国微生物保存センターに受託番号ＫＣＣＭ１１０４３Ｐにて寄託した。
【００２９】
実施例２：アスペルギルスソーヤ菌株の改良
（１）ＮＴＧ変異
前記アスペルギルスソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｏｊａｅ）ＣＪＣＣ＿０１１０５７Ｐ（ＫＣＣＭ１１０４３Ｐ）をＰＤＡ斜面培地にて培養して胞子懸濁液を得、３ｍｇ／ｍｌのＮＴＧ（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ'−Ｎｉｔｒｏｓｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）溶液を前記胞子懸濁液と同量混合して、３０℃の温度条件下で１時間培養した。
【００３０】
前記胞子懸濁液をＰＤＡ培地に塗抹し、生存コロニーをＰＤＡ斜面培地にて３０℃で４日〜７日間培養した。約１、０００個以上の変異株を選別し、３０℃で４８時間をかけて液体培養（３％の脱脂大豆、０．５％のＫＨ２ＰＯ４、１．５％の酵母抽出物、１．５％の葡萄糖、０．０５％の硫酸マグネシウム）して、プロテアーゼの活性を測定した。プロテアーゼ活性の測定結果高活性を示す菌株を選別して、連続して変異を誘発した。
【００３１】
（２）放射線照射変異
前記ＮＴＧ変異後に選別された約２００個以上のプロテアーゼ高活性変異株をＰＤＡ斜面培地にて培養して胞子懸濁液を得、０．３ＫＧｙの放射線を１時間かけて照射した。前記胞子懸濁液をＰＤＡ培地に塗抹し、生存コロニーをＰＤＡ斜面培地に３０℃の温度条件下で４日〜７日間培養した。
【００３２】
約１、０００個以上の変異株を選別して、３０℃の温度条件下で４８時間かけて液体培養（３％の脱脂大豆、０．５％のＫＨ２ＰＯ４、１．５％の酵母抽出物、１．５％の葡萄糖、０．０５％の硫酸マグネシウム）してプロテアーゼの活性を測定した。
【００３３】
実施例３：選別された変異株のプロテアーゼ活性の測定     
カゼインを基質として用いるアンソン萩原変法（Ｂ．  Ｈａｇｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９５８，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ４５  （１９５８），  １８５−９４．）に従いプロテアーゼ活性を測定した。
【００３４】
０．７５％のカゼイン溶液４００μｌと、０．２４ＭのＮａ２ＨＰＯ４溶液（ｐＨ７．５）１００μｌとを３７℃の温度条件下で５分間前培養（ｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した後、１００μｌの各選別された変異株の培養液を入れ、３７℃の温度条件下で１０分間培養した。反応停止のために、（１）０．１ＭのＴＣＡ（２）０．２２Ｍのソジウムアセテート（ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）及び（３）０．３３Ｍの酢酸（ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）のそれぞれ同量混合液６００μｌを加える。この反応液の上層２００μｌを５００μｌの０．５５Ｍのソジウムカーボネート（ｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）溶液に加え、２倍希釈の市販のフェノール試薬１００〜５００μｌを添加して攪拌した。次いで、３０℃の温度条件下で３０分間培養して、６６０ｎｍの吸光度にて測定した。１分間１μｇのチロシン相当の非タンパク性フォリン（ｆｏｌｉｎ）試液呈色物質を生成する酵素力を１Ｕとした。
【００３５】
上記の方法によって変異を誘発した結果、成長が良好であり、且つ、高い酵素活性を示す変異株Ａを選別した。これを「アスペルギルスソーヤＣＪＣＣ＿０８０１２４Ｐ」と命名し、２００９年８月１４日付けで大韓民国ソウル特別市西大門区弘済１洞３６１−２２１番地所在の国際寄託機関である韓国種菌協会付設韓国微生物保存センターに受託番号ＫＣＣＭ１１０２６Ｐにて寄託した。
【００３６】
前記アスペルギルスソーヤ変異株ＣＪＣＣ−０８０１２４Ｐ（ＫＣＣＭ１１０２６Ｐ）のプロテアーゼ活性を親株と比較したところ、約６倍高い活性を示した。この結果は、既存の特開平８−２４２８１０号公報と特開平７−２７４９４４号公報において用いた高活性変異株であるアスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＦＥＲＭＰ−１４２５９のプロテアーゼ活性２００−４５０ｕｎｉｔよりも３〜８倍高く、特開平１０−２１０９６７号公報に記載のプロテアーゼ高活性変異株であるアスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）Ｊ１１７３３１（ＦＥＲＭＰ−１５９５６）のプロテアーゼ活性１０００Ｕ／ｍｌに比べて一層高いレベルであって、既存の特許若しくは論文に開示されている高活性変異株の酵素活性に比べて遥かに高いレベルを示す。
【００３７】
本発明においては、液体培養時にプロテアーゼ活性のほとんど限界値であると認められる１０００Ｕ／ｍｌを超える菌株を開発するために、菌株の改良に際して種々の変異剤処理及び種々の変異法を導入したが、既に相当のレベルまで改良されている菌株の活性を１０００Ｕ／ｍｌ以上にするには限界があった。このため、放射線照射をさらに数回行って改良を繰り返し行ったところ、１８００Ｕ／ｍｌの活性を示す変異株が得られた。
【００３８】
【表１】
0005607168.tif 000002
【００３９】
実施例４：タンパク加水分解物の製造
変異株であるアスペルギルスソーヤＣＪＣＣ＿０８０１２４Ｐ（ＫＣＣＭ１１０２６Ｐ）及び親株であるアスペルギルスソーヤＣＪＣＣ＿０１１０５７Ｐ（ＫＣＣＭ１１０４３Ｐ）の培養物２０００ｍｌをそれぞれ脱脂大豆５００ｇに蒸留水８００ｍｌを加えて、１２１℃の温度条件下で２０分間殺菌した液に混合して、４０℃の温度条件下で１０日間反応させた。反応に際し、市販の酵素グルタミナーゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ、ａｍｉｎｏｅｎｚｙｍｅ ＩＮＣ）を０．０５％添加してグルタミン酸の含量をさらに増大させた。前記ろ過液に対する分析結果を下記表２に示す。
【００４０】
反応を終了後、８５℃の温度条件下で２０分間加熱して酵素を失活させた後に冷却し、６、０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離して上澄液を得た。上澄液は、真空濃縮後に噴霧・乾燥して粉体化させた。
【００４１】
【表２】
0005607168.tif 000003
上記表２における結果から明らかなように、変異株の培養物が、親株に比べて、グルタミン酸の含量をはじめとする遊離アミノ酸の含量、総窒素の含量においていずれも高い値を示していた。結果的に、本発明によって得られたタンパク加水分解物は、分解度が高く、且つ、グルタミン酸の含量が高いので、トロミと旨味に優れており、風味向上剤としての利用価値も高く評価された。
【００４２】
国際寄託証明書  KCCM11026P
0005607168.tif 000004
国際寄託証明書  KCCM11043P
0005607168.tif 000005