(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物のライブラリーを溶液中で合成する方法であって、ここで、該化合物は機能的部分を含み、該機能的部分は、該機能的部分の構造を同定するコード化オリゴヌクレオチドに作動可能に連結する二つまたは二つより多い構成要素を含み、該方法は、
（ａ）ｍ個のイニシエーター化合物を含む溶液を提供する工程、ここでｍは１または１より大きい整数であり、該イニシエーター化合物は少なくとも１つの反応基を有する構成要素をｎ個含む元の機能的部分を含み、該元の機能的部分は、該ｎ個の構成要素を同定する元のオリゴヌクレオチドに作動可能に連結され、ここで、ｎは１または１より大きい整数であり、ここで該元の機能的部分および該元のオリゴヌクレオチドは連結部分により連結され、該元のオリゴヌクレオチドは二本鎖であり、該連結部分は該元の機能的部分および元のオリゴヌクレオチドの双方の鎖に共有結合される、工程；
（ｂ）工程（ａ）の溶液をｒ個の反応容器に分割して、該溶液のｒ個のアリコートを産生する工程であって、ここでｒは２または２より大きい整数である、工程；
（ｃ）各反応容器における該イニシエーター化合物を、工程（ａ）の反応基に相補的な少なくとも１つの相補的反応基を含むｒ個の構成要素のうちの一つと、該相補的反応基の反応に対して適切な条件下で反応させて共有結合を形成させ、それによって、該元のオリゴヌクレオチドに作動可能に連結するｎ＋１個の構成要素を含む機能的部分からなる化合物を含むｒ個のアリコートを産生する、工程；ならびに
（ｄ）各アリコートにおける該元のオリゴヌクレオチドを、ｒ個の異なる入来オリゴヌクレオチドのセットのうちの一つと、工程（ｃ）の構成要素に対応する入来オリゴヌクレオチドと該元のオリゴヌクレオチドとのライゲーションを触媒する酵素の存在下で、該入来オリゴヌクレオチドと該元のオリゴヌクレオチドとの酵素的ライゲーションに対して適切な条件下で反応させ、コード化オリゴヌクレオチドを形成させる工程であって、最後のｒ個の異なる入来オリゴヌクレオチドはキャップ配列を含み、該キャップ配列は変質したヌクレオチドを含有するヌクレオチド配列を含む、工程；
を包含し、それによりｎ＋１個の構成要素を含む機能的部分の構造を同定するコード化オリゴヌクレオチドに作動可能に連結する該ｎ＋１個の構成要素を含む機能的部分からなる分子を含むｒ個のアリコートを産生する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、該方法が、（ｅ）二個または二個より大きい前記ｒ個のアリコートを合併し、それによりｎ＋１個の構成要素を含む機能的部分からなる分子を含む溶液を生成する工程をさらに包含し、ここで該機能的部分は、該ｎ＋１個の構成要素を含む機能的部分の構造を同定するコード化オリゴヌクレオチドに作動可能に連結する、方法。
【請求項３】
ｒ個のアリコートが合併される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ａ）〜（ｅ）が一回または一回より多く行われ、サイクル１〜ｉを生成し、ここで、ｉは２または２より大きい整数であり、サイクルｓ＋１において、工程（ａ）のｍ個のイニシエーター化合物を含む溶液は、サイクルｓの工程（ｅ）の溶液であり、ここでｓはｉ−１またはｉ−１より小さい整数である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
サイクル１〜ｉのうちの少なくとも一つにおいて、工程（ｄ）が工程（ｃ）に先行する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも一つの構成要素が、アミノ酸である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記酵素がＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、またはトポイソメラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記入来オリゴヌクレオチドが、二本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
連結部分が、構成要素と結合するように適合された第一の官能基、オリゴヌクレオチドの５’末端に結合するように適合された第二の官能基、およびオリゴヌクレオチドの３’末端に結合するように適合された第三の官能基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、前記連結部分が、
【化１】
0005508711.tif 000081
の構造であり、ここで
Ａは、構成要素に結合するように適合された官能基であり；
Ｂは、オリゴヌクレオチドの５’末端に結合するように適合された官能基であり；
Ｃは、オリゴヌクレオチドの３’末端に結合するように適合された官能基であり；
Ｓは、原子または骨格であり；
Ｄは、ＡとＳを結びつける化学構造であり；
Ｅは、ＢとＳを結びつける化学構造であり；そして
Ｆは、ＣとＳを結びつける化学構造である、
方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって：
Ａが、アミノ基であり；
Ｂが、リン酸基であり；
Ｃが、リン酸基である、
方法。
【請求項１２】
Ｄ、Ｅ、およびＦが、それぞれ独立して、アルキレン基またはオリゴ（エチレングリコール）基である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
Ｓが、炭素原子、窒素原子、リン原子、ホウ素原子、または多原子骨格である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
Ｓが、リン酸基または多環式基である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記連結部分が、
【化２】
0005508711.tif 000082
の構造であり、ここで、
ｎ、ｍ、およびｐは、それぞれ独立して、１〜２０の整数である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ｎ、ｍ、およびｐが、それぞれ独立して、２〜８の整数である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ｎ、ｍ、およびｐが、それぞれ独立して、３〜６の整数である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記連結部分が、
【化３】
0005508711.tif 000083
の構造を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記反応基がアミノ基であり、および前記相補的反応基が、カルボキシル基；スルホニル基；ホスホニル基；エポキシド基；アジリジン基；およびイソシアネート基からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記反応基または前記相補的反応基が、独立して、ヒドロキシル基；カルボキシル基；スルホニル基；ホスホニル基；エポキシド基；アジリジン基；およびイソシアネート基からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記反応基がアミノ基であり、および前記相補的反応基が、アルデヒド基およびケトン基からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記反応基と前記相補的反応基との間の反応が、還元条件下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記反応基および前記相補的反応基が、リンイリド基およびアルデヒド基またはケトン基からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記反応基および前記相補的反応基が、付加環化を介して反応し環式構造を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記反応基および前記相補的反応基が、アルキンおよびアジドからなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記反応基および前記相補的反応基が、ハロゲン化されたヘテロ芳香族基および求核試薬からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記ハロゲン化されたヘテロ芳香族基が、塩素化されたピリミジン、塩素化されたトリアジン、および塩素化されたプリンからなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記求核試薬がアミノ基である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
請求項４に記載の方法であって、該方法が、サイクルｉの後に：
（ｆ）一つまたは一つより多い前記機能的部分を環化する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項３０】
工程（ｆ）の機能的部分が、アジド基およびアルキニル基を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記機能的部分が、前記アジド基および前記アルキニル基の付加環化に対して適切な条件下で維持されて、トリアゾール基を形成し、それにより環式機能的部分を形成する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記付加環化反応が、銅触媒の存在下で行われる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法であって、工程（ｆ）の一つまたは一つより多い機能的部分のうちの少なくとも一つが、少なくとも二つのスルフヒドリル基を含み、ここで、該機能的部分は、該二つのスルフヒドリル基の反応に対して適切な条件下で維持され、ジスルフィド基を形成し、それにより、該機能的部分を環化する、方法。
【請求項３４】
前記元のオリゴヌクレオチドが、ＰＣＲプライマー配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
サイクルｉの入来オリゴヌクレオチドが、ＰＣＲ近接プライマーを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項３６】
請求項４に記載の方法であって、該方法が、サイクルｉの後に、
（ｄ）近接ＰＣＲプライマー配列を含むオリゴヌクレオチドを、前記コード化オリゴヌクレオチドにライゲーションする工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項３７】
近接ＰＣＲプライマー配列を含む前記オリゴヌクレオチドが、酵素の存在下で前記コード化オリゴヌクレオチドにライゲーションされ、ここで該酵素は、該ライゲーションを触媒する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
合成した分子がポリマー化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
合成した分子が非ポリマー化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
キャップ配列が、配列：３’−ＡＡ  ＧＴＣＧＣＡＡＧＣＴ  ＮＮＮＮＮ  ＧＴＣＴＧＴＴＣＧＡＡＧＴＧＧＡＣＧ−５’を含み、ここで、Ｎは、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣのいずれかである、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
キャップ配列が、配列：３’−ＡＡ  ＧＴＣＧＣＡＡＧＣＴ  ＮＮ  Ｎ  ＮＮ  ＧＴＣＴＧＴＴＣＧＡＡＧＴＧＧＡＣＧ−５’を含み、ここで、ＢはＴ、ＧまたはＣのいずれかである、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
化合物のライブラリーを溶液中で合成する方法であって、ここで、該化合物は機能的部分を含み、該機能的部分は、該機能的部分の構造を同定するコード化オリゴヌクレオチドに作動可能に連結する二つまたは二つより多い構成要素を含み、該方法は、
（ａ）ｍ個のイニシエーター化合物を含む溶液を提供する工程、ここでｍは１または１より大きい整数であり、該イニシエーター化合物は少なくとも１つの反応基を有する構成要素をｎ個含む元の機能的部分を含み、該元の機能的部分は、該ｎ個の構成要素に対応する元のオリゴヌクレオチドに作動可能に連結され、ここで、ｎは１または１より大きい整数であり、ここで該元の機能的部分および該元のオリゴヌクレオチドは連結部分により連結され、該元のオリゴヌクレオチドは二本鎖であり、該連結部分は該元の機能的部分および元のオリゴヌクレオチドの双方の鎖に共有結合され、連結部分が、
【化４】
0005508711.tif 000084
の構造であり、ここで
Ａは、構成要素に結合するように適合された官能基であり；
Ｂは、元のオリゴヌクレオチドの５’末端に結合するように適合された官能基であり；
Ｃは、元のオリゴヌクレオチドの３’末端に結合するように適合された官能基であり；
Ｓは、原子または骨格であり；
Ｄは、ＡとＳを結びつける化学構造であり；
Ｅは、ＢとＳを結びつける化学構造であり；そして
Ｆは、ＣとＳを結びつける化学構造である、工程；
（ｂ）工程（ａ）の溶液をｒ個の反応容器に分割して、該溶液のｒ個のアリコートを産生する工程であって、ここでｒは２または２より大きい整数である、工程；
（ｃ）各反応容器における該イニシエーター化合物を、工程（ａ）の反応基に相補的な少なくとも１つの相補的反応基を含むｒ個の構成要素のうちの一つと、該相補的反応基の反応に対して適切な条件下で反応させて共有結合を形成させ、それによって、該元のオリゴヌクレオチドに作動可能に連結するｎ＋１個の構成要素を含む機能的部分からなる化合物を含むｒ個のアリコートを産生する、工程；ならびに
（ｄ）各アリコートにおける該元のオリゴヌクレオチドを、ｒ個の異なる入来オリゴヌクレオチドのセットのうちの一つと、工程（ｃ）の構成要素に対応する入来オリゴヌクレオチドと該元のオリゴヌクレオチドとのライゲーションを触媒する酵素の存在下で、該入来オリゴヌクレオチドと該元のオリゴヌクレオチドとの酵素的ライゲーションに対して適切な条件下で反応させ、コード化オリゴヌクレオチドを形成させる工程であって、最後のｒ個の異なる入来オリゴヌクレオチドはキャップ配列を含み、該キャップ配列は変質したヌクレオチドを含有するヌクレオチド配列を含む、工程；
を包含し、それによりｎ＋１個の構成要素を含む機能的部分の構造を同定するコード化オリゴヌクレオチドに作動可能に連結する該ｎ＋１個の構成要素を含む機能的部分からなる分子を含むｒ個のアリコートを産生する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００４年１２月１７日に出願された係属中の米国特許出願第１１／０１５４５８号の一部継続出願であり、その出願は、２００３年１２月１７日に出願された米国仮特許出願第６０／５３０８５４号、２００４年１月３０日に出願された米国仮特許出願第６０／５４０６８１号、２００４年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６０／５５３，７１５号、および２００４年７月１６日に出願された米国仮特許出願第６０／５８８，６７２号に関連している。本出願はまた、２００５年６月９日に出願された米国仮特許出願第６０／６８９，４６６号、および２００５年１０月２８日に出願された米国仮特許出願第６０／７３１，０４１号への優先権を主張している。それぞれの前述の出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
有用な生物学的活性を有する化合物を同定する、より効果的な方法の捜索は、コンビナトリアルライブラリーと呼ばれる収集物中に存在する、膨大な数の異なる化合物をスクリーニングするための方法の開発をもたらした。そのようなライブラリーは、１０５種またはそれより多い異なる化合物を含み得る。コンビナトリアルライブラリーを産生するための多くの方法が存在し、そしてペプチド、擬似ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）、および小さな有機分子のコンビナトリアル合成が報告されている。
【０００３】
薬物発見におけるコンビナトリアル方法の使用における二つの主要な課題は、十分な複雑性を有するライブラリーの合成、および用いられるスクリーニングにおいて活性な分子の同定である。ライブラリーの複雑性の程度（すなわち、ライブラリー中に存在する異なる構造の数）が大きくなればなるほど、ライブラリーが、関心を引く活性を有する分子を含む確率が高くなることが、一般的に認められる。したがって、ライブラリー合成において用いられる化学は、合理的な時間の枠内で、膨大な数の化合物を産生することが可能でなければならない。しかしながら、所定の形式的な、または全体の濃度に対して、ライブラリー内の異なるメンバーの数の増加は、任意の特定のライブラリーのメンバーの濃度を低下させる。このことは、高い複雑性を有するライブラリーからの活性な分子の同定を困難にしている。
【０００４】
これらの障害を克服する一つの方法は、コードされたライブラリー、特に各化合物が増幅可能なタグを含むライブラリーの開発である。そのようなライブラリーはＤＮＡでコードされたライブラリーを含み、ライブラリーのメンバーを同定しているＤＮＡタグは、分子生物学の技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）を用いて増幅され得る。しかしながら、非常に大きなライブラリーを産生するためのそのような方法の使用は、いまだに実証されておらず、そして、そのようなライブラリーを産生するための改良方法が、薬物発見に対するこの方法の可能性の実現のために必要とされることは明らかである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、コード化オリゴヌクレオチドタグを含む分子のライブラリーを合成する方法を提供する。その方法は、「分割（ｓｐｌｉｔ）および混合（ｐｏｏｌ）」ストラテジーを使用し、イニシエーター（コード化オリゴヌクレオチドに連結した第一の構成要素（ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ）を含む）を含む溶液は、多数の画分に分割（「分割（ｓｐｌｉｔ）」）される。各画分において、そのイニシエーターは、第二の独特な構成要素、およびその第二の構成要素を同定する第二の独特なオリゴヌクレオチドと反応される。これらの反応は、同時または連続的であり得、連続的である場合、一方の反応が他方の反応に先行し得る。各画分において産生される二量体分子は、合併（「混合（ｐｏｏｌ）」）され、次に多数の画分に再び分割される。次に、これらの画分はそれぞれ、第三の独特な（画分特異的な）構成要素、およびその構成要素をコードする第三の独特なオリゴヌクレオチドと反応される。生成物のライブラリー中に存在する独特な分子の数は、（１）その合成の各工程で用いられる異なる構成要素の数、および（２）混合および分割が繰り返される時間の数の関数である。
【０００６】
一つの実施形態において、本発明はコード化オリゴヌクレオチドに作動可能に連結する機能的部分を含むか、またはその機能的部分からなる分子を合成する方法を提供する。その方法は、（１）ｎ個の構成要素を含む機能的部分からなるイニシエーター化合物を提供する工程（ここでｎは１または１より大きい整数であり、その機能的部分は、少なくとも一つの反応基（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｇｒｏｕｐ）を含み、そしてその機能的部分は、元のオリゴヌクレオチドに作動可能に連結する）；（２）そのイニシエーター化合物を、少なくとも一つの相補的反応基（ここで、その少なくとも一つの相補的反応基は、工程（１）の反応基と相補的である）を含む構成要素と、その反応基およびその相補的反応基の反応に対して適切な条件下で、反応させ共有結合を形成させる工程；（３）その元のオリゴヌクレオチドを、酵素の存在下で工程（ｂ）の構成要素を同定する入来（ｉｎｃｏｍｉｎｇ）オリゴヌクレオチドと（ここで、その酵素はその元のオリゴヌクレオチドおよびその入来オリゴヌクレオチドのライゲーションを触媒する）、その入来オリゴヌクレオチドおよびその元のオリゴヌクレオチドのライゲーションに対して適切な条件下で、反応させ、それによりコード化オリゴヌクレオチドに作動可能に連結するｎ＋１個の構成要素を含む機能的部分を含むか、またはそれらからなる分子を産生する工程を包含する。工程（３）の機能的部分が、反応基を含む場合、工程１〜３は、一回または一回より多く繰り返され得、それによってサイクル１〜ｉを形成し（ここでｉは２または２より大きい整数である）、サイクルｓの工程（３）の生成物は（ここで、ｓはｉ−１またはｉ−１より小さい整数である）、サイクルｓ＋１のイニシエーター化合物となる。
【０００７】
一つの実施形態において、本発明は、化合物のライブラリーを合成する方法を提供し、ここで、その化合物は機能的部分を含み、これは、その機能的部分の構造を同定するオリゴヌクレオチドに作動可能に連結する二つまたは二つより多い構成要素を含む。その方法は、（１）ｍ個のイニシエーター化合物を含む溶液を提供する工程、ここでｍは１または１より大きい整数であり、そのイニシエーター化合物はｎ個の構成要素を含む機能的部分からなり（ここで、ｎは１または１より大きい整数である）、その機能的部分は、ｎ個の構成要素を同定する元のオリゴヌクレオチドに作動可能に連結する；（２）工程（１）の溶液をｒ個の画分に分割する工程、ここでｒは２または２より大きい整数である；（３）各画分におけるイニシエーター化合物を、ｒ個の構成要素のうちの一つと反応させ、それによって、その元のオリゴヌクレオチドに作動可能に連結するｎ＋１個の構成要素を含む機能的部分からなる化合物を含むｒ個の画分を産生する工程；（４）各画分における元のオリゴヌクレオチドを、酵素の存在下でｒ個の異なる入来オリゴヌクレオチドのセットのうちの一つと（ここで、その酵素は入来オリゴヌクレオチドおよび元のオリゴヌクレオチドのライゲーションを触媒する）、その入来オリゴヌクレオチドおよびその元のオリゴヌクレオチドの酵素的ライゲーションに対して適切な条件下で、反応させ、それによりｎ＋１個の構成要素をコードする伸長されたオリゴヌクレオチドに作動可能に連結するｎ＋１個の構成要素を含む機能的部分からなる分子を含むｒ個のアリコートを産生する工程を包含する。必要に応じて、その方法は、工程（４）で産生されたｒ個の画分を再合併し、それによりｎ＋１個の構成要素を含む機能的部分（これは、伸長されたオリゴヌクレオチドに作動可能に連結する）からなる化合物を含む溶液を生成する（５）の工程をさらに包含する。工程（１）〜（５）は、一回または一回より多く行われ得、サイクル１〜ｉを生成し得る（ここで、ｉは２または２より大きい整数である）。サイクルｓ＋１において（ここで、ｓはｉ−１またはｉ−１より小さい整数である）、工程（１）のｍ個のイニシエーター化合物を含む溶液は、サイクルｓの工程（５）の溶液である。同様に、サイクルｓ＋１の工程（１）のイニシエーター化合物は、サイクルｓの工程（５）の化合物である。
【０００８】
好ましい実施形態において、上記構成要素は、従来の化学反応を用いて各工程で結合される。その構成要素は結合され得、線状もしくは分枝状のポリマーまたはオリゴマー（例えば、ペプチド、擬似ペプチド、およびペプトイド）、あるいは非オリゴマー分子（例えば、一つまたは一つより多いさらなる化学部分に結合する骨格構造を含む分子）を産生し得る。例えば、その構成要素がアミノ酸残基である場合、その構成要素は、標準的なペプチド合成ストラテジー（例えば、当該分野で公知の、適切な保護／脱保護ストラテジーを用いる溶液相または固相合成）を用いて結合され得る。好ましくは、その構成要素は、溶液相化学を用いて結合され得る。上記コード化オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドであり、好ましくは、二本鎖のオリゴヌクレオチドである。そのコード化オリゴヌクレオチドは、一構成要素当たり、４個〜１２個の塩基または塩基対のオリゴヌクレオチドであり；そのコード化オリゴヌクレオチドは、標準的な溶液相または固相オリゴヌクレオチド合成方法論を用いて結合され得るが、好ましくは溶液相酵素的プロセスを用いて結合される。例えば、そのオリゴヌクレオチドは、トポイソメラーゼ、リガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼを用いて結合され得る（コード化オリゴヌクレオチドの配列が、これらの酵素のうちの一つによるライゲーションのための開始配列を含む場合）。コード化オリゴヌクレオチドの酵素的結合は、（１）標準的合成（非酵素）結合と比較して、より正確な付加；および（２）より簡単な保護／脱保護ストラテジーの使用の利点を提供する。
【０００９】
別の局面において、本発明は、式Ｉ：
【００１０】
【化１３】
0005508711.tif 000002
の化合物を提供し、
ここで、Ｘは、一つまたは一つより多い構成要素を含む機能的部分であり；Ｚは、その３’末端でＢに結合したオリゴヌクレオチドであり；Ｙは、その５’末端でＣに結合したオリゴヌクレオチドであり；Ａは、Ｘと共有結合を形成する官能基であり；Ｂは、Ｚの３’末端と結合を形成する官能基であり；Ｃは、Ｙの５’末端と結合を形成する官能基であり；Ｄ、Ｆ、およびＥは、それぞれ独立して、二官能性結合基であり；そして、Ｓは、原子または分子骨格である。そのような化合物は、本発明の方法を使用して合成される化合物を含む。
【００１１】
本発明はさらに、オリゴヌクレオチドに作動可能に連結した二つまたは二つより多い構成要素を含む機能的部分を含む化合物を含む化合物のライブラリーに関し、そのオリゴヌクレオチドは、その機能的部分の構造をコードする。そのようなライブラリーは、約１０２個〜約１０１２個またはそれより多い異なるメンバー（例えば、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１０１０個、１０１１個、１０１２個、またはそれより多い異なるメンバー）、すなわち異なる分子構造を含み得る。
【００１２】
一つの実施形態において、化合物のライブラリーは、それぞれが独立して式Ｉ：
【００１３】
【化１４】
0005508711.tif 000003
である化合物を含み、
ここで、Ｘは、一つまたは一つより多い構成要素を含む機能的部分であり；Ｚは、その３’末端でＢに結合したオリゴヌクレオチドであり；Ｙは、その５’末端でＣに結合したオリゴヌクレオチドであり；Ａは、Ｘと共有結合を形成する官能基であり；Ｂは、Ｚの３’末端と結合を形成する官能基であり；Ｃは、Ｙの５’末端と結合を形成する官能基であり；Ｄ、Ｆ、およびＥは、それぞれ独立して、二官能性結合基であり；そして、Ｓは、原子または分子骨格である。そのようなライブラリーは、本発明の方法を使用して合成されるライブラリーを含む。
【００１４】
別の局面において、本発明は、生物学的標的に結合する化合物を同定するための方法を提供し、上記方法は、（ａ）その生物学的標的を、本発明の化合物のライブラリーと接触させる工程（ここで、その化合物のライブラリーは、オリゴヌクレオチドに作動可能に連結した二つまたは二つより多い構成要素を含む機能的部分を含む化合物を含み、そのオリゴヌクレオチドは、その機能的部分の構造をコードする。この工程は、その標的へ結合する化合物のライブラリーの少なくとも一つのメンバーに対して適切な条件下で行われる）；（２）その標的に結合しないライブラリーのメンバーを除去する工程；（３）その標的に結合する化合物のライブラリーの少なくとも一つのメンバーのコード化オリゴヌクレオチドを増幅する工程；（４）工程（３）のコード化オリゴヌクレオチドを配列決定する工程；ならびに、工程（５）において決定された配列を用いて、その生物学的標的に結合する化合物のライブラリーのメンバーの機能的部分の構造を決定する工程を包含する。
【００１５】
本発明は、所望の特性を有する分子の同定において、種々の利点を提供する。例えば、本発明の方法は、オリゴヌクレオチドタグの存在下で、その分子を構築するためのさまざまな化学反応の使用を可能にする。本発明の方法はまた、オリゴヌクレオチドタグを、そのように産生された化学構造に組み込む、忠実度の高い手段を提供する。さらに、それらは、各メンバーの多くの複製を有するライブラリーの合成を可能にし、それにより、生物学的標的に対する多数のラウンド（ｒｏｕｎｄ）の選択を与える一方、そのオリゴヌクレオチドタグの増幅および配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）についての最後のラウンドの後に多くの数の分子を残す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、化合物およびコンビナトリアル化合物のライブラリーを産生するための方法、本発明の方法により産生される化合物およびライブラリー、ならびに所望の特性（例えば、所望の生物学的活性）を有する化合物を同定するためにこのライブラリーを使用するための方法に関する。本発明はさらに、これらの方法を用いて同定される化合物に関する。
【００１７】
コンビナトリアル化学的ライブラリーを産生およびスクリーニングするために、種々の方法が行われている。例として、そのライブラリーの個々のメンバーを互いに物理的に分離する（例えば、単一の化合物が、多数の反応容器のそれぞれにおいて合成される場合）方法が挙げられる。しかしながら、代表的にこれらのライブラリーは、一度に一つの化合物を、またはたいていは、一度に数種の化合物をスクリーニングされ、したがって、最も効率的なスクリーニングプロセスをもたらさない。他の方法において、化合物は、固体の支持体上で合成される。そのような固体の支持体としては、チップ（特定の化合物が、そのチップまたは膜（「位置特定可能（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）」）の特定の領域を占有する）が挙げられる。他の方法において、化合物はビーズ上で合成され、各ビースは異なる化学構造を含む。
【００１８】
大きなライブラリーをスクリーニングする際に生じる二つの難点は、（１）スクリーニングされ得る異なる化合物の数；および（２）そのスクリーニングにおいて活性である化合物の同定である。一つの方法において、そのスクリーニングにおいて活性である化合物は、元のライブラリーを、いっそう小さな画分および副画分（ｓｕｂｆｒａｃｔｉｏｎ）に狭め、各場合において、活性な化合物を含む画分または副画分を選択し、さらにサブセットの全てのメンバーが、個々に合成され得、そして所望の活性のために評価され得る十分に小さい化合物のセットを含む活性な副画分を達成するまで、再分割することで、同定される。これは冗長で、時間を消費する行為である。
【００１９】
コンビナトリアルライブラリーのスクリーニングの結果を解析する別の方法は、ライブラリーのメンバーが同定標識でタグ化されるライブラリーを用いることである。すなわち、ライブラリー中に存在する各標識は、その標識の同定からタグ化された分子の構造がわかるように、ライブラリー中に存在する目立たない（ｄｉｓｃｒｅｅｔ）化合物の構造と結合される。タグ化されたライブラリーへの一つの方法は、米国特許第５，５７３，９０５号；同第５，７０８，１５３号；同第５，７２３，５９８号，同第６，０６０，５９６号、公開されたＰＣＴ出願  ＷＯ  ９３／０６１２１；ＷＯ  ９３／２０２４２；ＷＯ  ９４／１３６２３；ＷＯ  ００／２３４５８；ＷＯ  ０２／０７４９２９、およびＷＯ  ０２／１０３００８で、ならびにＢｒｅｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｒｎｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，５３８１−５３８３（１９９２）；Ｎｉｅｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｊａｎｄａ（Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６，３６１−３７１（１９９４）；およびＮｉｅｌｓｅｎ，Ｂｒｅｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｊａｎｄａ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５，９８１２−９８１３（１９９３））（それぞれは、その全体が本明細書中に参考として援用される）により記載されるように、オリゴヌクレオチドタグを用いる。そのようなタグは、（例えばポリメラーゼ連鎖反応を用いて）増幅され、そのタグの多くの複製を産生し得、そして配列決定によりそのタグを同定し得る。次に、そのタグの配列は、結合分子の構造を同定し、それは純粋な形態で合成され得、そして試験され得る。本発明は、ＤＮＡでコードされた分子のライブラリーを産生するための方法における改善点、ならびに、機能的部分が溶液相合成方法を用いて合成される、ＤＮＡでコードされた分子の大きな（１０５個のメンバーまたはそれより多いメンバー）ライブラリーの最初の例を提供している。
【００２０】
本発明は、オリゴヌクレオチドでコードされたコンビナトリアルライブラリーの容易な合成を可能にし、そして、そのようなオリゴヌクレオチドタグを、分子の莫大な収集物の各メンバーに添加する、効率的で、忠実度の高い手段を可能にする方法を提供する。
【００２１】
本発明の方法は、構成要素からなる第一の部分（「機能的部分」）、ならびにその第一の部分に作動可能に連結した第二の部分を含む二官能性分子を合成するための方法を包含し、その第二の部分は、その第一の部分の構造を同定するオリゴヌクレオチドタグを含む。すなわち、そのオリゴヌクレオチドは、どの構成要素がその第一の部分の構築において用いられたか、ならびに構成要素が連結された順序を示す。一般的に、オリゴヌクレオチドタグにより提供される情報は、活性部分を構築するために用いられる構成要素を決定するために十分である。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドタグの配列は、その機能的部分における構成要素の配列（例えば、ペプチド部分に対して、アミノ酸配列）を決定するために十分である。
【００２２】
用語「機能的部分」は、本明細書中で用いられる場合、一つまたは一つより多い構成要素を含む化学的部分のことをいう。好ましくは、機能的部分における構成要素は、核酸ではない。機能的部分は、線状もしくは分枝状のもしくは環状のポリマーまたはオリゴマーまたは小さな有機分子であり得る。
【００２３】
用語「構成要素」は、本明細書中で用いられる場合、他の化学構造単位に連結されるか、または他のそのような単位に連結され得る化学構造単位である。上記機能的部分が、ポリマーまたはオリゴマーである場合、構成要素は、ポリマーまたはオリゴマーの単量体単位である。構成要素はまた、骨格構造（「骨格構成要素」）を含み得、それに、一つまたは一つより多いさらなる構造（「辺縁構成要素」）が結合されるか、または結合され得る。
【００２４】
用語「構成要素」は、機能的部分中に存在し、また機能的部分の合成のために用いられる反応形態中に存在するような化学構造単位のことをいうために、本明細書中で用いられることが理解されるべきである。機能的部分内で、構成要素は、任意の部分の構成要素（これは、その構成要素を、その機能的部分に取り込む結果として失われる）なしで存在する。例えば、結合形成反応が、小分子を放出する場合（以下を参照のこと）、機能的部分中に存在するような構成要素は、「構成要素残基」、すなわち、放出される分子をもたらす原子の損失に続く、その合成において用いられる構成要素の残りである。
【００２５】
構成要素は、相補的である任意の化合物であり得、すなわち、構成要素は、二つまたは二つより多い構成要素を含む構造を形成するために、ともに反応できなければならない。代表的に、用いられるすべての構成要素は、少なくとも二つの反応基を有するが、用いられるいくつかの構成要素（例えば、オリゴマー機能的部分における最後の構成要素）は、一つの反応基のみをそれぞれ有する。二つの異なる構成要素上の反応基は、相補的でなければならない。すなわち、ともに反応して共有結合を形成する（必要に応じて、小分子（例えば、水、ＨＣｌ、ＨＦなど）の損失を付随して）ことができなければならない。
【００２６】
本発明の目的のために、二つの反応基は、それらがともに反応して、共有結合を形成することができる場合、相補的である。好ましい実施形態において、結合形成反応は、副生成物の実質的な形成なしで、周囲の状況下で迅速に起こる。好ましくは、所定の反応基は、所定の相補的反応基とちょうど一回反応する。一つの実施形態において、二つの構成要素の相補的反応基は、例えば、求核置換を介して反応して、共有結合を形成する。一つの実施形態において、一対の相補的反応基の一方のメンバーは求電子基であり、そしてその対の他方のメンバーは求核基である。
【００２７】
相補的求電子基および求核基としては、適切な条件下で求核置換により反応して、共有結合を形成する任意の二つの基が挙げられる。種々の適切な結合形成反応が当該分野で公知である。例えば、Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４版，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９２），１０〜１６章；Ｃａｒｅｙ  ａｎｄ  Ｓｕｎｄｂｅｒｇ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐａｒｔ  Ｂ，Ｐｌｅｎｕｍ（１９９０），１〜１１章；およびＣｏｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｏｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｍｅｔａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋｓ，Ｍｉｌｌ  Ｖａｌｌｅｙ，Ｃａｌｉｆ．（１９８７），１３〜２０章（それぞれは、その全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。適切な求電子基の例としては、反応性カルボニル基（例えば、塩化アシル基）、エステル基（カルボニルペンタフルオロフェニルエステルおよびスクシンイミドエステルが挙げられる）、ケトン基、およびアルデヒド基；反応性スルホニル基（例えば、塩化スルホニル基）、ならびに反応性ホスホニル基が挙げられる。他の求電子基としては、末端エポキシド基、イソシアネート基、およびアルキルハライド基が挙げられる。適切な求核基としては、第一級アミノ基、および第二級アミノ基、およびヒドロキシル基、およびカルボキシル基が挙げられる。
【００２８】
適切な相補的反応基が以下に示される。当業者は、本方法で用いられ得る他の反応基の対を容易に決定し得、そして本明細書中で提供される例は、制限するものと意図されない。
【００２９】
第一の実施形態において、相補的反応基としては、活性化カルボキシル基、反応性スルホニル基、または反応性ホスホニル基、あるいはそれらの組み合わせ、および第一級アミノ基または第二級アミノ基が挙げられる。この実施形態において、相補的反応基は、適切な条件下で反応し、アミド結合、スルホンアミド結合、またはホスホンアミデート結合を形成する。
【００３０】
第二の実施形態において、相補的反応基としては、エポキシド基、および第一級アミノ基または第二級アミノ基が挙げられる。エポキシド基を含む構成要素は、アミンを含む構成要素と、適切な条件下で反応し、炭素−窒素結合を形成し、β−アミノアルコールをもたらす。
【００３１】
別の実施形態において、相補的反応基としては、アジリジン基、および第一級アミノ基または第二級アミノ基が挙げられる。適切な条件下で、アジリジンを含む構成要素は、アミンを含む構成要素と反応して、炭素−窒素結合を形成し、１，２−ジアミンをもたらす。第三の実施形態において、相補的反応基としては、イソシアネート基、および第一級アミノ基または第二級アミノ基が挙げられる。イソシアネートを含む構成要素は、アミノを含む構成要素と、適切な条件下で反応し、炭素−窒素結合を形成し、尿素基をもたらす。
【００３２】
第四の実施形態において、相補的反応基としては、イソシアネート基およびヒドロキシル基が挙げられる。イソシアネートを含む構成要素は、ヒドロキシルを含む構成要素と、適切な条件下で反応し、炭素−酸素結合を形成し、カルバメート基をもたらす。
【００３３】
第五の実施形態において、相補的反応基としては、アミノ基およびカルボニルを含む基（例えば、アルデヒド基またはケトン基）が挙げられる。アミンは、還元的アミノ化により、そのような基と反応して、新規の炭素−窒素結合を形成する。
【００３４】
第六の実施形態において、相補的反応基としては、リンイリド基、およびアルデヒド基またはケトン基が挙げられる。リンイリドを含む構成要素は、適切な条件下で、アルデヒドまたはケトンを含む構成要素と反応して、炭素−炭素二重結合を形成し、アルケンをもたらす。
【００３５】
第七の実施形態において、相補的反応基は、付加環化を介して反応し、環状構造を形成する。そのような相補的反応基の一つの例としては、アルキン、および有機アジドであり、それらは、適切な条件下で反応して、トリアゾール環構造を形成する。二つの構成要素を連結するこの反応の使用の例は、図８で説明される。そのような反応のための適切な条件は、当該分野で公知であり、そしてＷＯ  ０３／１０１９７２に開示されるものが挙げられる（その全体の内容は、本明細書中で参考として援用される）。
【００３６】
第八の実施形態において、相補的反応基は、アルキルハライド、および求核試薬（例えば、アミノ基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基）である。そのような基は、適切な条件下で反応し、炭素−窒素（アルキルハライドとアミン）または炭素−酸素（アルキルハライドと、ヒドロキシル基またはカルボキシル基）を形成する。
【００３７】
第九の実施形態において、相補的官能基は、ハロゲン化ヘテロ芳香族（ｈｅｔｅｒｏａｒｏｍａｔｉｃ）基および求核試薬であり、そして構成要素は、適切な条件下で、芳香族求核置換により連結される。適切なハロゲン化ヘテロ芳香族基としては、塩素化ピリミジン、塩素化トリアジン、および塩素化プリンが挙げられ、それらは水溶液中の穏和な条件下で求核試薬（例えば、アミン）と反応する。オリゴヌクレオチドでタグ化されたトリクロロトリアジンの、アミンとの反応の代表的な例は、図９および図１０に示される。適切な塩素化ヘテロ芳香族基の例は、図１１に示される。
【００３８】
本発明の分子およびライブラリーの合成における構成要素を結合するために用いられ得るさらなる結合形成反応としては、以下に示されるものが挙げられる。以下に示される反応は、反応性官能基を強調している。種々の置換基が、反応物質中に存在し得、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４と名前を付けたものが挙げられる。置換され得る可能な位置としては、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４で示される位置が挙げられるが、それらに限定されない。これらの置換基は、任意の適切な化学的部分を含み得るが、指示される反応を妨げず、そして著しくは阻害しないものに好ましくは限定される。そして、他に明記されない限り、その化学部分は、水素、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、アリールアルキル、置換されたアリールアルキル、アミノ、置換されたアミノ、および当該分野で公知である他の化学的部分を含み得る。これらの基上の適切な置換基としては、アルキル、アリール、ヘテロアリール、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、ニトロ、アミノ、メルカプト、カルボキシル、およびカルボキサミドが挙げられる。明記される場合、適切な電子求引基としては、ニトロ、カルボキシル、ハロアルキル（例えば、トリフルオロメチル）、および当該分野で公知である他の基が挙げられる。適切な電子供与基の例としては、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシル、アミノ、ハロゲン、アセトアミド、および当該分野で公知の他の基が挙げられる。
アルケンへの第一級アミンの付加：
【００３９】
【化１５】
0005508711.tif 000004
求核置換：
【００４０】
【化１６】
0005508711.tif 000005
アミンの還元的アルキル化：
【００４１】
【化１７】
0005508711.tif 000006
パラジウムで触媒された炭素−炭素結合形成反応：
【００４２】
【化１８】
0005508711.tif 000007
Ｕｇｉ縮合反応：
【００４３】
【化１９】
0005508711.tif 000008
求電子芳香族置換反応：
【００４４】
【化２０】
0005508711.tif 000009
Ｘは、電子供与基である。
イミン／イミニウム／エナミン形成反応：
【００４５】
【化２１】
0005508711.tif 000010
付加環化反応
ディールス・アルダー付加環化
【００４６】
【化２２】
0005508711.tif 000011
１，３−双極性付加環化、Ｘ−Ｙ−Ｚ＝Ｃ−Ｎ−Ｏ、Ｃ−Ｎ−Ｓ、Ｎ３、
【００４７】
【化２３】
0005508711.tif 000012
求核芳香族置換反応：
【００４８】
【化２４】
0005508711.tif 000013
Ｗは、電子求引基である。
【００４９】
【化２５】
0005508711.tif 000014
適切な置換基ＸおよびＹの例としては、置換または非置換のアミノ、置換または非置換のアルコキシ、置換または非置換のチオアルコキシ、置換または非置換のアリールオキシ、および置換または非置換のチオアリールオキシが挙げられる。
【００５０】
【化２６】
0005508711.tif 000015
ヘック（Ｈｅｃｋ）反応：
【００５１】
【化２７】
0005508711.tif 000016
アセタール形成：
【００５２】
【化２８】
0005508711.tif 000017
適切な置換基ＸおよびＹの例としては、置換または非置換のアミノ、ヒドロキシ、およびスルフヒドリル（ｓｕｌｈｙｄｒｙｌ）であり：Ｙは、ＸとＹを結合させるリンカーであり、そしてその反応の生成物中に見出される環構造を形成するために適切である。
アルドール反応：
【００５３】
【化２９】
0005508711.tif 000018
適切な置換基Ｘの例としては、Ｏ、Ｓ、およびＮＲ３が挙げられる。
【００５４】
本発明の分子およびライブラリーを形成させるために用いられ得る骨格構成要素としては、二つまたは二つより多い官能基を有するものが挙げられ、それらは、例えば、上で考察される一つまたは一つより多い結合形成反応を用いて、辺縁構成要素前駆体との結合形成反応に関与し得る。骨格部分はまた、例えば、特定の方法で反応して、中心の分子部分（辺縁官能基は、これらに付加される）を含む分子を形成し得る構成要素前駆体を用いて、本発明のライブラリーおよび分子の構築中に合成され得る。一つの実施形態において、本発明のライブラリーは、定常骨格部分（しかし、異なる辺縁部分、または辺縁部分の異なる配列）を含む分子を含む。特定のライブラリーにおいて、すべてのライブラリーのメンバーは、定常骨格部分を含み；他のライブラリーは、二つまたは二つより多い異なる骨格部分を有する分子を含み得る。本発明の分子およびライブラリーの構築において用いられ得る骨格部分形成反応の例は、表８に示される。その表において引用される文献は、その全体が本明細書中で参考として援用される。Ｒ１基、Ｒ２基、Ｒ３基、およびＲ４基は、指示される反応を妨害せず、そして著しくは阻害しないはずであるという点のみで制限され、そしてこれらは水素、アルキル、置換されたアルキル、ヘテロアルキル、置換されたヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換されたシクロアルキル、置換されたヘテロシクロアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、置換されたアリールアルキル、置換されたヘテロアリールアルキル、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、ハロゲン、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、置換されたアミノ、および当該分野で公知である他の基を含み得る。適切な置換基としては、アルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、ニトロ、ヒドロキシル、スルフヒドリル、アリールオキシ、アリール−Ｓ−、ハロゲン、カルボキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、シアノ、シアネート、ニトリル、イソシアネート、チオシアネート、カルバミル、および置換されたカルバミルが挙げられるが、それらに限定されない。
【００５５】
機能的部分の合成は、一つの特定の型のカップリング（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）反応（例えば、上で考察された反応のうちのひとつ（しかし、それに限定されない））により、あるいは二つまたは二つより多いカップリング反応の組み合わせ（例えば、上で考察された二つまたは二つより多いカップリング反応）により進行し得ることが理解されるべきである。例えば、一つの実施形態において、構成要素は、アミド結合形成（アミノおよびカルボン酸の相補的基）ならびに還元アミノ化（アミノおよびアルデヒドまたはケトンの相補的基）の組み合わせにより結合される。任意のカップリング化学が用いられ得るが、ただし、それはオリゴヌクレオチドの存在と共存できる。本発明の特定の実施形態において用いられ得るような、二本鎖（二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ））のオリゴヌクレオチドタグは、一本鎖のタグよりも化学的に頑丈であり、したがって、幅広い範囲の反応条件に耐え、一本鎖のタグでは可能でない結合形成反応の使用を可能にする。
【００５６】
構成要素は、機能的部分を形成させるために用いられる反応基（単数または複数）に加えて、一つまたは一つより多い官能基を含み得る。一つまたは一つより多いこれらのさらなる官能基は、保護されて、これらの官能基の望ましくない反応を妨げ得る。適切な保護基は、種々の官能基に対して当該分野で公知である（Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第二版，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９１）（本明細書中に参考として援用される））。特に有用な保護基としては、ｔ−ブチルエステルおよびエーテル、トリチルエーテルおよびアミン、アセチルエステル、トリメチルシリルエーテル、アセタール、トリクロロエチルエーテルおよびエステル、ならびにカルバマートが挙げられる。
【００５７】
一つの実施形態において、各構成要素は、二つの反応基を含み、それらは同じであっても異なっていてもよい。例えば、サイクルｓで加えられる各構成要素は、同じである二つの反応基を含み得るが、それらは双方とも、工程ｓ＋１およびｓ−１で加えられる構成要素の二つの反応基に対して相補的である。別の実施形態において、各構成要素は、二つの反応基を含み、これらはそれら自身が相補的である。例えば、ポリアミド分子を含むライブラリーは、二つの第一級アミノ基を含む構成要素と、二つの活性化カルボキシル基を含む構成要素との間の反応により、生成され得る。生じた化合物において、交互のアミド基が反対の方向性を有するために、Ｎ末端もＣ末端も存在しない。あるいは、ポリアミドライブラリーは、それぞれがアミノ基および活性化カルボキシル基を有する構成要素を用いて生成され得る。この実施形態において、サイクルの工程ｎで加えられる構成要素は、ｎ−１の構成要素上の利用可能な反応基に対して相補的である遊離反応基を有するが、好ましくはｎ番目の構成要素上のその他の反応基は保護される。例えば、ライブラリーのメンバーが、Ｃ方向からＮ方向へと合成される場合、加えられる構成要素は、活性化カルボキシル基および保護されたアミノ基を含む。
【００５８】
機能的部分は、ポリマー部分またはオリゴマー部分（例えば、ペプチド、擬似ペプチド、ペプチド核酸、またはペプトイド）であり得るか、あるいはそれらは小さな非ポリマー分子（例えば、中心骨格およびその骨格の辺縁部の周りに配置された構造を含む構造を有する分子）であり得る。線状のポリマーライブラリーまたはオリゴマーライブラリーは、二個の反応基を有する構成要素の使用に起因するが、一方、分枝状のポリマーライブラリーまたはオリゴマーライブラリーは、三個または三個より多い反応基を有する構成要素（必要に応じて、二個の反応基のみを有する構成要素と組み合わせて）の使用に起因する。そのような分子は、一般式Ｘ１Ｘ２…Ｘｎにより表され得、ここで、各Ｘはｎ個の単量体単位を含むポリマーの単量体単位であり、ｎは１より大きい整数である。オリゴマー化合物またはポリマー化合物の場合、末端の構成要素は、二つの官能基を含む必要はない。例えば、ポリアミドライブラリーの場合、Ｃ末端の構成要素は、アミノ基を含み得るが、カルボキシル基の存在は任意である。同様に、Ｎ末端での構成要素は、カルボキシル基を含み得るが、アミノ基含む必要はない。
【００５９】
分枝状のオリゴマー化合物またはポリマー化合物はまた、少なくとも一つの構成要素が、他の構成要素と反応性の三個の官能基を含むという条件で合成され得る。本発明のライブラリーは、線状の分子、分枝状の分子、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【００６０】
ライブラリーはまた、例えば、二個または二個より多い反応基を有する骨格構成要素を、一つの利用可能な反応基のみを有する他の構成要素と組み合わせて、用いることにより構築され得、ここで、例えば、任意のさらなる反応基は、保護されるか、またはその骨格構成要素中に存在するその他の反応基に対して反応性ではないかのいずれかである。一つの実施形態において、例えば、合成される分子は、一般式Ｘ（Ｙ）ｎにより表され得、ここで、Ｘは骨格構成要素であり；各Ｙは、Ｘに連結した構成要素であり、そしてｎは、少なくとも２である整数であり、好ましくは２〜約６の整数である。一つの好ましい実施形態において、サイクル１の元の構成要素は、骨格構成要素である。式Ｘ（Ｙ）ｎの分子において、各Ｙは、同じであっても、異なっていてもよいが、代表的なライブラリーのたいていのメンバーにおいて、各Ｙは異なっている。
【００６１】
一つの実施形態において、本発明のライブラリーは、ポリアミド化合物を含む。ポリアミド化合物は、任意のアミノ酸から誘導される構成要素で構成され得、そのアミノ酸としては、２０種類の天然に存在するα−アミノ酸（例えば、アラニン（Ａｌａ；Ａ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リシン（Ｌｙｓ；Ｋ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、バリン（Ｖａｌ；Ｖ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）およびトリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、ここで各アミノ酸に対する三文字および一文字のコードが与えられる）が挙げられる。それらの天然に存在する形態において、前述のアミノ酸はそれぞれ、Ｌ配置で存在し、他に述べられない限り、本明細書中において、そうであることを前提にする。しかしながら、本発明の方法において、これらのアミノ酸のＤ配置形態もまた用いられ得る。これらのＤアミノ酸は、本明細書中において三文字または一文字の小文字のコード（すなわち、ａｌａ（ａ）、ｇｌｙ（ｇ）、ｌｅｕ（ｌ）、ｇｌｎ（ｑ）、ｔｈｒ（ｔ）、ｓｅｒ（ｓ）など）で示される。構成要素はまた、他のα−アミノ酸（３−アリールアラニン（例えば、ナフチルアラニン）、フェニル置換されたフェニルアラニン（４−フルオロ−、４−クロロ、４−ブロモ、および４−メチルフェニルアラニンが挙げられる）；３−ヘテロアリールアラニン（例えば、３−ピリジルアラニン、３−チエニルアラニン、３−キノリルアラニン、および３−イミダゾリルアラニン）；オルニチン；シトルリン；ホモシトルリン；サルコシン；ホモプロリン；ホモシステイン；置換されたプロリン（例えば、ヒドロキシプロリンおよびフルオロプロリン）；デヒドロプロリン；ノルロイシン；Ｏ−メチルチロシン；Ｏ−メチルセリン；Ｏ−メチルトレオニン、ならびに３−シクロヘキシルアラニンが挙げられるが、それらに限定されない）から誘導され得る。その前述のアミノ酸はそれぞれ、Ｄ配置またはＬ配置のいずれかで用いられ得る。
【００６２】
構成要素はまた、α−アミノ酸ではないアミノ酸（例えば、α−アゾアミノ酸；β、γ、δ、ε−アミノ酸）；ならびにＮ置換アミノ酸（例えば、Ｎ置換グリシン）であり得、ここでＮ置換基は、例えば、置換もしくは非置換のアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、またはヘテロアリールアルキル基であり得る。一つの実施形態において、Ｎ置換基は、天然に存在するα−アミノ酸、または天然に存在しないα−アミノ酸由来の側鎖である。
【００６３】
構成要素はまた、擬似ペプチド構造（例えば、擬似ジペプチド、擬似トリペプチド、擬似テトラペプチド、または擬似ペンタペプチド）であり得る。そのような擬似ペプチド構成要素は、好ましくは、アミノアシル化合物に（増大するポリ（アミノアシル）基へのこれらの構成要素の付加の化学が、他の構成要素に対して用いられる化学と同じであるか、または類似しているように）由来する。構成要素はまた、ペプチド結合と等配電子性（ｉｓｏｓｔｅｒｉｃ）である結合を形成し、ペプチド骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）改変（例えば、ψ［ＣＨ２Ｓ］、ψ［ＣＨ２ＮＨ］、ψ［ＣＳＮＨ２］、ψ［ＮＨＣＯ］、ψ［ＣＯＣＨ２］、およびψ［（Ｅ）または（Ｚ）ＣＨ＝ＣＨ］）を含む擬似ペプチド機能的部分を形成することのできる分子であり得る。上で用いられる命名において、ψはアミド結合の非存在を示す。そのアミド基を置換する構造は、括弧内に明記される。
【００６４】
一つの実施形態において、本発明はコード化オリゴヌクレオチドに作動可能に連結する機能的部分を含むか、またはその機能的部分からなる分子を合成する方法を提供する。その方法は、（１）ｎ個の構成要素を含む元の機能的部分からなるイニシエーター化合物を提供する工程（ここでｎは１または１より大きい整数であり、その機能的部分は、少なくとも一つの反応基を含み、そしてその元の機能的部分は、ｎ個の構成要素をコードする元のオリゴヌクレオチドに作動可能に連結する）；（２）そのイニシエーター化合物を、少なくとも一つの相補的反応基（ここで、その少なくとも一つの相補的反応基は、工程（１）の反応基と相補的である）を含む構成要素と、その反応基およびその相補的反応基の反応に対して適切な条件下で、反応させ共有結合を形成させる工程；（３）元のオリゴヌクレオチドと入来オリゴヌクレオチドとを、元のオリゴヌクレオチドおよび入来オリゴヌクレオチドのライゲーションを触媒する酵素の存在下で、その入来オリゴヌクレオチドおよびその元のオリゴヌクレオチドのライゲーションに対して適切な条件下で、反応させ、それによりコード化オリゴヌクレオチドに作動可能に連結するｎ＋１個の構成要素を含む機能的部分を含むか、またはそれらからなる分子を産生する工程を包含する。工程（３）の機能的部分が、反応基を含む場合、工程１〜３は、一回または一回より多く繰り返され得、それによってサイクル１〜ｉを形成し（ここでｉは２または２より大きい整数である）、サイクルｓ−１の工程（３）の生成物は（ここで、ｓはｉまたはｉより小さい整数である）、サイクルｓの工程（１）のイニシエーター化合物となる。各サイクルにおいて、一つの構成要素は、増大する機能的部分に加えられ、新しい構成要素をコードする一つのオリゴヌクレオチド配列は、増大するコード化オリゴヌクレオチドに加えられる。
【００６５】
一つの実施形態において、上記元のイニシエーター化合物は、第一の構成要素を、オリゴヌクレオチド（例えば、ＰＣＲプライマー配列または元のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド）あるいはリンカー（そのようなオリゴヌクレオチドがそのリンカーに結合する）と反応させることにより、生成される。図５で示される実施形態において、そのリンカーは、第一の構成要素の結合のための反応基を含み、元のオリゴヌクレオチドに結合する。この実施形態において、構成要素、または多数のアリコートのそれぞれにおける、構成要素の収集物の一つの、そのリンカーの反応基との反応、そして、その元のオリゴヌクレオチドへの、その構成要素をコードするオリゴヌクレオチドの添加は、上で示されるプロセスの一つまたは一つより多い元のイニシエーター化合物を産生する。
【００６６】
好ましい実施形態において、個々の構成要素はそれぞれ、所定のサイクルで加えられるオリゴヌクレオチド中のヌクレオチド配列が、同じサイクルで加えられる構成要素を同定するように、異なるオリゴヌクレオチドと関連している。
【００６７】
構成要素のカップリングおよび、オリゴヌクレオチドのライゲーションは、出発物質および出発試薬の同様な濃度で一般的に起こる。例えば、マイクロモル濃度からミリモル濃度のオーダーの反応物質の濃度（例えば、約１０μＭ〜約１０ｍＭ）が、構成要素の効果的なカップリングを有するために好まれる。
【００６８】
特定の実施形態において、上記方法は、次の工程（２）、あらゆる未反応の元の機能的部分を捕捉（ｓｃａｖｅｎｇｅ）する工程をさらに包含する。特定のサイクルにおいて、あらゆる未反応の元の機能的部分を捕捉することは、そのサイクルの元の機能的部分が、より後のサイクルで加えられる構成要素と反応することを妨げる。そのような反応は、一つまたは一つ以上の構成要素を欠く機能的部分の生成につながり得、それは潜在的に、特定のオリゴヌクレオチド配列に対応するさまざまな機能的部分の構造につながる。そのような捕捉は、あらゆる残存する元の機能的部分を、工程（２）の反応基と反応する化合物と反応させることにより達成され得る。好ましくは、その捕捉化合物は、工程（２）の反応基と迅速に反応し、より後の工程で加えられる構成要素と反応し得るさらなる反応基を含まない。例えば、工程（２）の反応基がアミノ基である化合物の合成において、適切な捕捉化合物は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えば、酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）である。
【００６９】
別の実施形態において、本発明は、化合物のライブラリーを産生する方法を提供し、その化合物はそれぞれ、オリゴヌクレオチドに作動可能に連結した二つまたは二つより多い構成要素の残基を含む機能的部分を含む。好ましい実施形態において、各分子中に存在するオリゴヌクレオチドは、その分子中の構成要素を同定するための十分な情報、および必要に応じてその構成要素の付加の順序を提供する。この実施形態において、本発明の方法は、化合物のライブラリーを合成する方法を包含し、ここで、その化合物は機能的部分を含み、これは、その機能的部分の構造を同定するオリゴヌクレオチドに作動可能に連結する二つまたは二つより多い構成要素を含む。その方法は、（１）ｍ個のイニシエーター化合物を含む溶液を提供する工程、ここでｍは１または１より大きい整数であり、そのイニシエーター化合物はｎ個の構成要素を含む機能的部分からなり（ここで、ｎは１または１より大きい整数である）、その機能的部分は、ｎ個の構成要素を同定する元のオリゴヌクレオチドに作動可能に連結する；（２）工程（１）の溶液を、少なくともｒ個の画分に分割する工程、ここでｒは２または２より大きい整数である；（３）各画分を、ｒ個の構成要素のうちの一つと反応させ、それによって、その元のオリゴヌクレオチドに作動可能に連結するｎ＋１個の構成要素を含む機能的部分からなる化合物を含むｒ個の画分を産生する工程；（４）工程（３）のｒ個の各画分を、ｒ個の異なる入来オリゴヌクレオチドのセットのうちの一つと、その入来オリゴヌクレオチドとその元のオリゴヌクレオチドの酵素的ライゲーションに対して適切な条件下で、反応させ、それによりｎ＋１個の構成要素をコードする伸長されたオリゴヌクレオチドに作動可能に連結するｎ＋１個の構成要素を含む機能的部分からなる分子を含むｒ個の画分を産生する工程を包含する。必要に応じて、その方法は、工程（４）で産生されたｒ個の画分を再合併し、それによりｎ＋１個の構成要素を含む機能的部分（これは、そのｎ＋１個の構成要素をコードする伸長されたオリゴヌクレオチドに作動可能に連結する）からなる分子を含む溶液を生成する（５）の工程を包含し得る。工程（１）〜（５）は、一回または一回より多く行われ、サイクル１〜ｉを生成し得る（ここで、ｉは２または２より大きい整数である）。サイクルｓ＋１において（ここで、ｓはｉ−１またはｉ−１より小さい整数である）、工程（１）のｍ個のイニシエーター化合物を含む溶液は、サイクルｓの工程（５）の溶液である。同様に、サイクルｓ＋１の工程（１）のイニシエーター化合物は、サイクルｓの工程（４）の産物である。
【００７０】
好ましくは、工程（２）の溶液は、上記ライブラリーの合成の各サイクルにおいて、ｒ個の画分に分割される。この実施形態において、各画分は、独特な構成要素と反応される。
【００７１】
本発明の方法において、上記構成要素および上記入来オリゴヌクレオチドの付加の順序は、重要ではなく、そして分子の合成の工程（２）と工程（３）、ならびにそのライブラリー合成における工程（３）と（４）は、逆にされ得る（すなわち、その入来オリゴヌクレオチドは、新しい構成要素が加えられる前に、元のオリゴヌクレオチドとライゲーションされ得る。特定の実施形態において、これらの工程を同時に行うことは可能であり得る。
【００７２】
特定の実施形態において、上記方法は、次の工程（２）、あらゆる未反応の元の機能的部分を捕捉する工程をさらに包含する。特定のサイクルにおいて、あらゆる未反応の元の機能的部分を捕捉することは、あるサイクルの元の機能的部分が、より後のサイクルで加えられる構成要素と反応することを妨げる。そのような反応は、一つまたは一つ以上の構成要素を欠く機能的部分の生成につながり得、それは潜在的に、特定のオリゴヌクレオチド配列に対応するさまざまな機能的部分の構造につながる。そのような捕捉は、あらゆる残存する元の機能的部分を、工程（２）の反応基と反応する化合物と反応させることにより達成され得る。好ましくは、その捕捉化合物は、工程（２）の反応基と迅速に反応し、より後の工程で加えられる構成要素と反応し得るさらなる反応基を含まない。例えば、工程（２）の反応基がアミノ基である化合物の合成において、適切な捕捉化合物は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えば、酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）である。
【００７３】
一つの実施形態において、ライブラリーの合成で用いられる構成要素は、候補構成要素が、そのライブラリーの合成のために用いられる条件下で、適切な相補的官能基と反応する能力を評価することにより、その候補構成要素のセットから選択される。次に、そのような条件下で適切に反応性であると示される構成要素が、そのライブラリーへの取り込みのために選択され得る。所定のサイクルの産物は、必要に応じて、精製され得る。そのサイクルが中間的なサイクル（すなわち、最後のサイクルよりも前の任意のサイクル）である場合、これらの産物は中間体であり、そして次のサイクルの開始の前に精製され得る。そのサイクルが最後のサイクルである場合、そのサイクルの産物は最終的な産物であり、その化合物の任意の使用の前に精製され得る。この精製工程は、例えば、未反応の、または過剰な反応物質およびオリゴヌクレオチドのライゲーションのために用いられる酵素を除去し得る。その産物を溶液中に存在する他の種から分離するために適切な任意の方法が用いられ得、その方法としては、液体クロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、および適切な共溶媒（例えば、エタノール）による沈殿が挙げられる。精製のための適切な方法は、その産物の性質および合成のために用いられる溶媒系に依存する。
【００７４】
上記反応は、好ましくは、水溶液（例えば、緩衝水溶液）中で行われるが、構成要素、オリゴヌクレオチド、中間体、および最終産物、ならびにオリゴヌクレオチドのライゲーションを触媒するために用いられる酵素の溶解度特性と一致した、混合された水性／有機媒体中でもまた行われ得る。
【００７５】
上で記載された方法において、所定のサイクルにより産生された理論的な数の化合物は、そのサイクルで用いられる異なるイニシエーター化合物の数、ｍ、およびそのサイクルで加えられる異なる構成要素の数、ｒの積である。そのサイクルで産生される異なる化合物の実際の数は、ｒおよびｍの積（ｒ×ｍ）と同じくらい高くなり得るが、特定の構成要素の、特定の他の構成要素との反応性の差異を考慮すると、それより低くなり得る。例えば、特定のイニシエーター化合物への、特定の構成要素の付加の動力学は、その合成のサイクルの時間的尺度で、その反応の産物がほとんどまたは全く生成され得ないようなものであり得る。
【００７６】
特定の実施形態において、一般的な構成要素は、サイクル１の前、最後のサイクルの後、または任意の二つのサイクルの間に、加えられる。例えば、機能的部分がポリアミドの場合、一般的なＮ末端キャップ構成要素が、最後のサイクルの後に加えられ得る。一般的な構成要素はまた、任意の二つのサイクルの間に導入され、例えば、官能基（例えば、アルキン基またはアジド基）を付加し得、これは、ライブラリー合成の後に、機能的部分を改変する（例えば、環化により）ために用いられ得る。
【００７７】
用語「作動可能に連結される」は、本明細書中で用いられる場合、二つの化学構造が、受けることが予想される種々の操作を通して連結されたままであるような方法で、一緒になって連結されることを意味する。代表的に、機能的部分およびコード化オリゴヌクレオチドは、適切な結合基（ｌｉｎｋｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）により共有結合される。その結合基は、オリゴヌクレオチドのための結合部位、および機能的部分のための結合部位を有する、二価の部分である。例えば、機能的部分がポリアミド化合物である場合、そのポリアミド化合物は、そのＮ末端、そのＣ末端で、または、側鎖のうちの一つにある官能基により、その結合基と結合され得る。その結合基は、ポリアミド化合物とオリゴヌクレオチドを、少なくとも一個の原子により、そして好ましくは一個より多い原子（例えば、少なくとも二個の原子、少なくとも三個の原子、少なくとも四個の原子、少なくとも五個の原子、または少なくとも六個の原子）により、分離するのに十分である。好ましくは、その結合基は、ポリアミド化合物が、オリゴヌクレオチドには依存しない方法で、標的分子に結合することを可能にするほど十分に柔軟である。
【００７８】
一つの実施形態において、上記結合基は、ポリアミド化合物のＮ末端、およびオリゴヌクレオチドの５’−リン酸基と結合される。例えば、その結合基は、一方の末端に活性化カルボキシル基を、そして他方の末端に活性化エステルを含む結合基前駆体から誘導され得る。その結合基前駆体の、そのＮ末端窒素原子との反応は、その結合基を、そのポリアミド化合物またはＮ末端構成要素に結びつけるアミド結合を形成するが、一方、その結合基前駆体の、オリゴヌクレオチドの５’−ヒドロキシル基との反応は、エステル結合（ｌｉｎｋａｇｅ）によるその結合基へのオリゴヌクレオチドの結合をもたらす。その結合基は、例えば、ポリメチレン鎖、（例えば、−（ＣＨ２）ｎ−鎖）、またはポリ（エチレングリコール）鎖（例えば、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ鎖）を含み得、ここで、どちらの場合も、ｎは１〜約２０の整数である。好ましくは、ｎは２〜約１２であり、さらに好ましくは約４〜約１０である。一つの実施形態において、その結合基は、ヘキサメチレン（−（ＣＨ２）６−）基を含む。
【００７９】
構成要素が、アミノ酸残基である場合、生じる機能的部分は、ポリアミドである。アミノ酸は、アミド結合の形成のための任意の適切な化学を用いて結合され得る。好ましくはアミノ酸構成要素のカップリングは、オリゴヌクレオチドの酵素的ライゲーションと適合する条件下で（例えば、中性のｐＨまたは中性に近いｐＨで、そして水溶液中で）行われる。一つの実施形態において、ポリアミド化合物は、Ｃ末端からＮ末端の方向に合成される。この実施形態において、第一の、またはＣ末端の構成要素は、そのカルボキシル基にて、適切な結合基を通してオリゴヌクレオチドに結合される。その第一の構成要素は、第二の構成要素と反応され、これは、好ましくは、活性化カルボキシル基および保護されたアミノ基を有する。溶液相アミド結合形成に適切な任意の活性化／保護基ストラテジーが用いられ得る。例えば、適切な活性化カルボキシル種としては、フッ化アシル（米国特許第５，３６０，９２８号（その全体は、本明細書中に参考として援用される））、対称無水物（ｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが挙げられる。アシル基はまた、当該分野で公知であるように、適切な活性化化合物との反応により、原位置で（ｉｎ  ｓｉｔｕ）活性化され得る。適切な活性化化合物としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ｎ−プロパン−ホスホン酸無水物（ＰＰＡ）、塩化Ｎ，Ｎ−ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）イミド−ホスホリル（ＢＯＰ−Ｃｌ）、ブロモ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒｏｐ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、Ｃａｓｔｒｏ試薬（ＢＯＰ，ＰｙＢｏｐ）、Ｏ−ベンゾトリアゾリル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム塩（ＨＢＴＵ）、ジエチルホスホニルシアニド（ＤＥＰＣＮ）、２，５−ジフェニル−２，３−ジヒドロ−３−オキソ−４−ヒドロキシ−チオフェンジオキシド（Ｓｔｅｇｌｉｃｈ試薬；ＨＯＴＤＯ）、１，１’−カルボニル−ジイミダゾール（ＣＤＩ）、および塩化４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム（ＤＭＴ−ＭＭ）が挙げられる。カップリング試薬は、単独で、または添加物（例えば、Ｎ．Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（ＤＭＡＰ）、Ｎ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、Ｎ−ヒドロキシアザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、アザベンゾトリアゾリル−テトラメチルウロニウム塩（ＨＡＴＵ、ＨＡＰｙＵ）、または２−ヒドロキシピリジン）と組み合わせて用いられ得る。特定の実施形態において、ライブラリーの合成は、構造的に多様な構成要素のセットの使用を可能にするために、二つまたは二つより多い活性化ストラテジーの使用を必要とする。各構成要素に対して、当業者は、適切な活性化ストラテジーを決定し得る。
【００８０】
Ｎ末端保護基は、上記プロセスの条件と適合である任意の保護基（例えば、溶液相合成条件に対して適切である保護基）であり得る。好ましい保護基は、フルオレニルメトキシカルボニル（「Ｆｍｏｃ」）基である。アミノアシル構成要素の側鎖上の任意の潜在的に反応性の官能基もまた、適切に保護される必要があり得る。好ましくは、その側鎖保護基は、Ｎ末端保護基と直角であり、すなわち、その側鎖保護基は、Ｎ末端保護基の除去に必要である条件とは異なる条件下で除去される。適切な側鎖保護基としては、ニトロベラトリル基が挙げられ、それは側鎖カルボキシル基および側鎖アミノ基の双方を保護するために用いられ得る。別の適切な側鎖アミン保護基は、Ｎ−ペント−４−エノイル基である。
【００８１】
構成要素は、機能的部分への取り込みの後に、例えば、一つまたは一つより多い構成要素上の官能基を含む適切な反応により、改変され得る。構成要素の改変は、最後の構成要素の添加の後に、または機能的部分の合成における任意の中間点（例えば、合成プロセスの任意のサイクルの後）で、起こり得る。本発明の二官能性分子のライブラリーが合成される場合、構成要素の改変は、全体のライブラリー上で、またはそのライブラリーの一部分上で行われ得、それにより、ライブラリーの複雑性の程度を増加させる。適切な構成要素改変反応としては、機能的部分およびコード化オリゴヌクレオチドと適合する条件下で行われ得る反応が挙げられる。そのような反応の例としては、アミノ基またはヒドロキシル基のアシル化およびスルホン化、アミノ基のアルキル化、カルボキシル基のエステル化またはチオエステル化、カルボキシル基のアミド化、アルケンのエポキシド化、ならびに当該分野で公知の他の反応が挙げられる。機能的部分が、アルキンまたはアジド官能基を有する構成要素を含む場合、アジド／アルキン付加環化反応が、構成要素を誘導するために用いられ得る。例えば、アルキンを含む構成要素は、有機アジドと反応され得るか、またはアジドを含む構成要素は、アルケンと反応され得、いずれの場合も、トリアゾールを形成する。構成要素改変反応は、最後の構成要素付加の後で、または合成プロセスの中間点で起こり得、種々の化学構造（炭水化物、金属結合部位、および特定の生体分子または組織型を標的にするための構造が挙げられる）を、機能的部分に付加するために用いられ得る。
【００８２】
別の実施形態において、機能的部分は、構成要素の線状の連続物を含み、この線状の連続物は、適切な反応を用いて環化される。例えば、その線状の配列（ａｒｒａｙ）中の少なくとも二つの構成要素が、スルフヒドリル基を含む場合、そのスルフヒドリル基は、酸化されてジスルフィド結合を形成し得、それにより、その線状の配列を環化する。例えば、機能的部分は、二つあるいは二つより多いＬ−システインもしくはＤ−システイン、および／またはＬ−ホモシステインもしくはＤ−ホモシステイン部分を含むオリゴヌクレオチドであり得る。構成要素はまた、ともに反応して、線状の配列を環化することのできる他の官能基（例えば、カルボキシル基、およびアミノ基またはヒドロキシル基）を含み得る。
【００８３】
好ましい実施形態において、線状の配列中の構成要素のうちの一つは、アルキン基を含み、その線状の配列中の別の構成要素は、アジド基を含む。そのアジド基およびアルキン基は、付加環化により反応するように誘導され得、大環状構造をもたらす。図９で説明される例において、機能的部分は、そのＣ末端にプロパルギルグリシン構成要素を、そしてそのＮ末端にアジドアセチル基を含むポリペプチドである。適切な条件下でのアルキン基およびアジド基の反応は、環式化合物（大きな環のトリアゾール構造を含む）の形成をもたらす。ライブラリーの場合、一つの実施形態において、そのライブラリーの各メンバーは、アルキンおよびアジドを含む構成要素を含み、この方法で環化され得る。第二の実施形態において、ライブラリーのすべてのメンバーは、アルキンおよびアジドを含む構成要素を含むが、そのライブラリーの一部分のみが環化される。第三の実施形態において、特定の機能的部分のみが、アルキンおよびアジドを含む構成要素を含み、これらの分子のみが環化される。前述の第二の実施形態および第三の実施形態において、付加環化反応の後のライブラリーは、環状および線状の機能的部分の双方を含む。
【００８４】
特定の合成工程の間、同じ機能的部分（例えば、トリアジン）がライブラリーのそれぞれの、そして全ての画分に加えられる、本発明のいくつかの実施形態において、その機能的部分をコードするオリゴヌクレオチドタグを付加することは必要ではない可能性がある。
【００８５】
オリゴヌクレオチドは化学的方法または酵素的方法によりライゲーションされ得る。一つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、化学的方法によりライゲーションされる。ＤＮＡおよびＲＮＡの化学的ライゲーションは、例えば、Ｓｈａｂａｒｏｖａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９，４２４７−４２５１、Ｆｅｄｅｒｏｖａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１５，１１３７−１１４７、およびＣａｒｒｉｅｒｏ  ａｎｄ  Ｄａｍｈａ（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６８，８３２８−８３３８により教示されるように水溶性のカルボジイミドおよび臭化シアンのような試薬を用いて行われ得る。一つの実施形態において、化学的ライゲーションは、ｐＨ７．６緩衝液（１Ｍ  ＭＥＳ＋２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中の臭化シアン（アセトニトリル中５Ｍ）を、５’リン酸化オリゴヌクレオチドと１：１０ｖ／ｖの比で、０℃で１〜５分間、使用することで、行われる。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、酵素的方法を用いてライゲーションされる。いずれの実施形態においても、オリゴヌクレオチドは二本鎖であり得、好ましくは約５個〜約１４個の塩基のオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を有し得る。いずれの場合も、ライゲーションされる各オリゴヌクレオチドに、約６個の塩基のオーバーラップを有するスプリント（ｓｐｌｉｎｔ）が、反応性５’および３’部分を互いに近接するように位置を定めるために用いられる場合、オリゴヌクレオチドはまた、一本鎖であり得る。
【００８６】
一つの実施形態において、元の構成要素は、元のオリゴヌクレオチドに作動可能に連結される。第二の構成要素の元の構成要素へのカップリングの前に、または後に、第二の構成要素を同定する第二のオリゴヌクレオチド配列が、その元のオリゴヌクレオチドにライゲーションされる。元のオリゴヌクレオチド配列および入来オリゴヌクレオチド配列をライゲーションするための方法が、図１および図２に示される。図１において、元のオリゴヌクレオチドは、二本鎖であり、そして、一本の鎖は、第二のオリゴヌクレオチドの一つの末端に対して相補的であるオーバーハング配列を含み、その第二のオリゴヌクレオチドを、その元のオリゴヌクレオチドと接触させる。好ましくは、その元のオリゴヌクレオチドのオーバーハング配列、およびその第二のオリゴヌクレオチドの相補的配列は、双方とも少なくとも約４個の塩基であり；さらに好ましくは、双方の配列は、ともに同じ長さである。その元のオリゴヌクレオチドおよびその第二のオリゴヌクレオチドは、適切な酵素を用いてライゲーションされ得る。その元のオリゴヌクレオチドが、鎖のうちの一本（「トップ鎖（ｔｏｐ  ｓｔｒａｎｄ）」）の５’末端にて、第一の構成要素と連結される場合、そのトップ鎖と相補的な鎖（「ボトム鎖（ｂｏｔｔｏｍ  ｓｔｒａｎｄ）」）は、その５’末端にオーバーハング配列を含み、そして第二のオリゴヌクレオチドは、その５’末端に相補的配列を含む。第二のオリゴヌクレオチドのライゲーションの後に、第二のオリゴヌクレオチド（これは、３’にオーバーハング相補的配列を有し、さらなるオーバーハング配列を含む）の配列と相補的な鎖が加えられ得る。
【００８７】
一つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、図２に示されるように伸長される。増大する機能的部分および入来オリゴヌクレオチドに結合したオリゴヌクレオチドは、「スプリント」配列（これは、元のオリゴヌクレオチドの３’末端と相補的な領域、および入来オリゴヌクレオチドの５’末端と相補的な領域）の使用によりライゲーションのために位置付けられる。そのスプリントは、そのオリゴヌクレオチドの５’末端を、入来オリゴの３’末端に近接させ、そしてライゲーションは、酵素的ライゲーションを用いて遂行される。図２で説明される例において、元のオリゴヌクレオチドは、１６個の核酸塩基からなり、スプリントはその３’末端での６個の塩基と相補的である。入来オリゴヌクレオチドは、１２個の核酸塩基からなり、そしてスプリントはその５’末端での６個の塩基と相補的である。そのスプリントの長さおよびその相補的領域の長さは重要ではない。しかしながら、その相補的領域は、ライゲーションの条件下で、安定な二量体の形成を可能にするほど十分に長くなければならない（しかし、最後の分子において、過剰に大きなコード化ヌクレオチドを生成するほど長くなるべきではない）。好ましくは、相補的領域は、約４塩基〜約１２塩基長であり、さらに好ましくは約５塩基〜約１０塩基長であり、最も好ましくは約５塩基〜約８塩基長である。
【００８８】
本明細書中に示されるライブラリーの合成のための方法に用いられる分割および混合方法は、独特な機能的部分がそれぞれ、その機能的部分を同定する少なくとも一つの独特なオリゴヌクレオチド配列に作動可能に連結することを保証する。２つまたは２つより多い異なるオリゴヌクレオチドタグが、合成サイクルのうちの少なくとも一つで、少なくとも一つの構成要素のために用いられる場合、その構成要素を含む異なる機能的部分はそれぞれ、多数のオリゴヌクレオチドによりコードされる。例えば、２つのオリゴヌクレオチドタグが、４回のサイクルのライブラリーの合成の間、各構成要素のために用いられる場合、独特な機能的部分をそれぞれコードする１６（２４）種の配列が存在する。独特な機能的部分を、多数の配列で、それぞれコードするための数種の潜在的な利点が存在する。第一に、同じ機能的部分をコードするタグ配列の異なる組み合わせの選択は、これらの分子が独立して選択されたことを保証する。第二に、同じ機能的部分をコードするタグ配列の異なる組み合わせの選択は、その選択が、オリゴヌクレオチドの配列に基づいていた可能性を排除する。第三に、技術的人工物は、配列分析により、特定の機能的部分が高度に富んでいるが、多くの可能性からの一つの配列の組み合わせのみが現れることを示唆される場合、認識され得る。多数のタグ化は、同じ構成要素との（しかし、異なるオリゴヌクレオチドタグとの）独立した分割反応を受けることで成し遂げられ得る。あるいは、多数のタグ化は、単独のタグ化反応において、適切な割合の各タグを、個々の構成要素と混合させることで、成し遂げられ得る。
【００８９】
一つの実施形態において、元のオリゴヌクレオチドは、二本鎖であり、そして二本の鎖は共有結合される。二本の鎖を共有結合する一つの方法は、図３に示され、ここで、連結部分（例えば、リンカー）が、二本の鎖と機能的部分を連結するために用いられる。その連結部分は、構成要素と反応するように適合される第一の官能基、オリゴヌクレオチドの３’末端と反応するように適合される第二の官能基、オリゴヌクレオチドの５’末端と反応するように適合される第三の官能基を含む、任意の化学構造であり得る。好ましくは、その第二の官能基および第三の官能基は、二本のオリゴヌクレオチド鎖のハイブリッド形成を可能にする相対配向に、その二本の鎖を位置づけるように配向される。例えば、連結部分（例えば、リンカー）は、一般構造（Ｉ）：
【００９０】
【化３０】
0005508711.tif 000019
を有し得、
ここで、Ａは、構成要素と共有結合を形成し得る官能基であり、Ｂは、オリゴヌクレオチドの５’末端と結合を形成し得る官能基であり、そしてＣは、オリゴヌクレオチドの３’末端と結合を形成し得る官能基である。Ｄ、Ｆ、およびＥは、官能基Ａ、官能基Ｃ、および官能基Ｂを、核となる原子または骨格であるＳに連結する化学的基である。好ましくは、Ｄ、Ｅ、およびＦは、それぞれ独立して原子の鎖（例えば、アルキレン鎖またはオリゴ（エチレングリコール）鎖）であり、そして、Ｄ、Ｅ、およびＦは、同じであっても、異なっていてもよく、好ましくは、二本のオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成および機能的部分の合成を可能にするほど効果的である。一つの実施形態において、三価の連結部分は、構造
【００９１】
【化３１】
0005508711.tif 000020
を有するリンカーである。この実施形態において、ＮＨ基は、構成要素への結合に対して利用可能であり、一方、末端のリン酸基は、オリゴヌクレオチドへの結合に対して利用可能である。
【００９２】
元のオリゴヌクレオチドが二本鎖である実施形態において、入来オリゴヌクレオチドもまた二本鎖である。図３で示されるように、元のオリゴヌクレオチドは、他方の鎖より長い一本の鎖を有し得、これは、オーバーハング配列を提供する。この実施形態において、入来オリゴヌクレオチドは、元のオリゴヌクレオチドのオーバーハング配列に相補的であるオーバーハング配列を含む。その二本の相補的なオーバーハング配列のハイブリッド形成は、入来オリゴヌクレオチドを、元のオリゴヌクレオチドへのライゲーションのための位置に至らせる。このライゲーションは、ＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼを用いて酵素的に行われ得る。入来オリゴヌクレオチドおよび元のオリゴヌクレオチドのオーバーハング配列は、好ましくは同じ長さであり、二個または二個より多いヌクレオチド、好ましくは２個〜約１０個のヌクレオチド、さらに好ましくは２個〜約６個のヌクレオチドからなる。一つの好ましい実施形態において、入来オリゴヌクレオチドは、各末端にオーバーハング配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチドである。一方の末端でのオーバーハング配列は、元のオリゴヌクレオチドのオーバーハング配列に相補的であり、一方、入来オリゴヌクレオチドと元のオリゴヌクレオチドとのライゲーションの後、他方の末端でのオーバーハング配列は、次のサイクルの元のオリゴヌクレオチドのオーバーハング配列となる。一つの実施形態において、その三本のオーバーハング配列は、すべて２個〜６個のヌクレオチド長であり、入来オリゴヌクレオチドのコード化配列は、３個〜１０個のヌクレオチド長、好ましくは３個〜６個のヌクレオチド長である。特定の実施形態において、オーバーハング配列は、すべて２個のヌクレオチド長であり、コード化配列は５個のヌクレオチド長である。
【００９３】
図４で説明される実施形態において、入来鎖は、その３’末端に、元のオリゴヌクレオチドの３’末端と相補的である領域を有し、双方の鎖の５’末端でのオーバーハングを残す。その５’末端は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ｖｅｎｔポリメラーゼ）を用いて満たされ得、二本鎖の伸長されたオリゴヌクレオチドをもたらす。このオリゴヌクレオチドのボトム鎖は、除去され得、そしてさらなる配列が、同じ方法を用いて、トップ鎖の３’末端に加えられ得る。
【００９４】
コード化オリゴヌクレオチドタグは、連続した構成要素をそれぞれ同定する、オリゴヌクレオチドの連続した付加の結果として、形成される。本発明の方法の一つの実施形態において、連続したオリゴヌクレオチドタグは、酵素的ライゲーションにより結合されて、コード化オリゴヌクレオチドを生成し得る。
【００９５】
オリゴヌクレオチドの酵素で触媒されたライゲーションは、核酸フラグメントをライゲーションする能力を有する任意の酵素を用いて行われ得る。例示的な酵素としては、リガーゼ、ポリメラーゼ、およびトポイソメラーゼが挙げられる。本発明の特定の実施形態において、ＤＮＡリガーゼ（ＥＣ  ６．５．１．１）、ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＣ  ２．７．７．７）、ＲＮＡポリメラーゼ（ＥＣ  ２．７．７．６）、またはトポイソメラーゼ（ＥＣ  ５．９９．１．２）が、オリゴヌクレオチドをライゲーションするために用いられる。各ＥＣクラス中に含まれる酵素は、例えば、Ｂａｉｒｏｃｈ（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８：３０４−５に記載されるように、見出され得る。
【００９６】
好ましい実施形態において、本発明の方法で用いられ用いられるオリゴヌクレオチドは、オリゴデオキシヌクレオチドであり、そしてそのオリゴヌクレオチドのライゲーションを触媒するために用いられる酵素は、ＤＮＡリガーゼである。リガーゼの存在下でライゲーションが起こるために、すなわち、ホスホジエステル結合が二本のオリゴヌクレオチドの間で形成されるために、一方のオリゴヌクレオチドは、遊離５’リン酸基を有さなければならず、そして他方のオリゴヌクレオチドは、遊離３’ヒドロキシル基を有さなければならない。本発明の方法で用いられ得る例示的なＤＮＡリガーゼとしては、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（全ては、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ＭＡより入手可能）が挙げられる。
【００９７】
当業者は、ライゲーションのために用いられる各酵素は、特異的な条件（例えば、温度、緩衝液の濃度、ｐＨ、および時間）下で、最適な活性を有すことを理解する。こららの条件はぞれぞれ、例えば、製造者の指示にしたがって、オリゴヌクレオチドタグの最適なライゲーションを得るために調整され得る。
【００９８】
入来オリゴヌクレオチドは、任意の望ましい長さであり得るが、好ましくは少なくとも３個の核塩基長である。さらに好ましくは、入来オリゴヌクレオチドは、４個または４個より多い核塩基長である。一つの実施形態において、入来オリゴヌクレオチドは、３個〜約１２個の核塩基長である。本発明のライブラリー中の分子のオリゴヌクレオチドは、当該分野で公知であるような、ＰＣＲためのプライマーとして役立ち得る一般的な末端配列を有することが好ましい。そのような一般的な末端配列は、ライブラリー合成の最後のサイクルで加えられる入来オリゴヌクレオチドの末端として取り込まれ得るか、例えば、本明細書中に開示される酵素的ライゲーション方法を用いて、ライブラリー合成の後に加えられ得る。
【００９９】
本発明の方法の好ましい実施形態が、図５に示される。そのプロセスは、その５’末端で、アミノ基で終結するリンカーに結合した合成ＤＮＡ配列を用いて始まる。工程１において、この出発ＤＮＡ配列は、スプリントＤＮＡ鎖、ＤＮＡリガーゼ、およびＴｒｉｓ緩衝液中のジチオトレイトールの存在下で、入来ＤＮＡ配列にライゲーションされる。これにより、タグ化ＤＮＡ配列を生成し、これは、次の工程で直接用いられ得るか、または、次の工程に進む前に、例えば、ＨＰＬＣまたはエタノール沈殿を用いて、精製され得る。工程２において、タグ化ＤＮＡは、保護された活性化アミノ酸と反応され、この例において、Ｆｍｏｃで保護されたフッ化アミノ酸は、保護されたアミノ酸−ＤＮＡ結合体を生成する。工程３において、保護されたアミノ酸−ＤＮＡ結合体は脱保護され、例えば、ピペリジンの存在下で、生じた脱保護された結合体は、必要に応じて、例えば、ＨＰＬＣまたはエタノール沈殿により精製される。脱保護された結合体は、第一の合成サイクルの産物であり、そして第二のサイクルのための出発物質（これは、脱保護された結合体の遊離アミノ基へ、第二のアミノ基を付加する）となる。
【０１００】
ＰＣＲが、選択された分子のコード化オリゴヌクレオチドを増幅および／または配列決定するために用いられる実施形態において、コード化オリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲプライマー配列および／または配列決定プライマー（例えば、３’−ＧＡＣＴＡＣＣＧＣＧＣＴＣＣＣＴＣＣＧ−５’および３’−ＧＡＣＴＣＧＣＣＣＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧ−５’のようなプライマー）を含み得る。ＰＣＲプライマー配列は、例えば、合成の最初のサイクルの前の元のオリゴヌクレオチドに含まれ得、そして／または、最初の入来オリゴヌクレオチドとともに含まれ得、そして／または、ライブラリー合成の最後のサイクルの後に、コード化オリゴヌクレオチドにライゲーションされ得、そして／または、最後のサイクルの入来オリゴヌクレオチドに含まれ得る。ライブラリー合成の最後のサイクルの後で、および／またはその最後のサイクルの入来オリゴヌクレオチド中に加えられるＰＣＲプライマー配列は、本明細書中で「キャップ配列（ｃａｐｐｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」と言及される。
【０１０１】
一つの実施形態において、ＰＣＲプライマー配列は、コード化オリゴヌクレオチドタグ中に設計（ｄｅｓｉｇｎ）される。例えば、ＰＣＲプライマー配列は、元のオリゴヌクレオチドタグ中に取り込まれ得、そして／または最後のオリゴヌクレオチドタグ中に取り込まれ得る。一つの実施形態において、同じＰＣＲプライマー配列は、元のオリゴヌクレオチドタグおよび最後のオリゴヌクレオチドタグ中に取り込まれる。別の実施形態において、第一のプライマー配列は、元のオリゴヌクレオチドタグ中に取り込まれ、そして、第二のプライマー配列は、最後のオリゴヌクレオチドタグ中に取り込まれる。あるいは、第二のプライマー配列は、本明細書中に記載されるキャップ配列中に取り込まれ得る。好ましい実施形態において、ＰＣＲプライマー配列は、少なくとも、約５、約７、約１０、約１３、約１５、約１７、約２０、約２２、または約２５ヌクレオチド長である。
【０１０２】
本発明のライブラリーにおける使用のために適切なＰＣＲプライマー配列は、当該分野で公知であり；適切なプライマーおよび方法は、例えば、Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）（その内容は、その全体が本明細書中で参考として援用される）で説明される。本明細書中に記載されたライブラリーの構築における使用のための他の適切なプライマーは、ＰＣＴ公開  ＷＯ  ２００４／０６９８４９、およびＷＯ  ２００５／００３３７５（それらの全体の内容は、明確に本明細書中で参考として援用される）に記載されたプライマーである。
【０１０３】
プライマー伸長により合成されるプライマー、プローブ、および核酸フラグメントまたはセグメントに関する、用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書中で用いられる場合、二個または二個より多いデオキシリボヌクレオチド、好ましくは三個より多いデオキシリボヌクレオチドで構成される分子と定義される。
【０１０４】
用語「プライマー」は、本明細書中で用いられる場合、核酸制限消化物から精製されようと、または合成的に産生されようと、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が、誘発される、すなわちヌクレオチドおよび重合化のための物質（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、逆トランスクリプターゼなど）の存在下であり、そして適切な温度およびｐＨである条件下に置かれた場合、核酸合成の開始点として作用することのできるポリヌクレオチドのことをいう。プライマーは、好ましくは、最大限の効用のため一本鎖であるが、また二本鎖の形態であり得る。二本鎖の場合、プライマーは最初に、伸長産物を調製するために使用される前にその相補的鎖から分離するために、処理される。好ましくは、プライマーは、ポリデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合化のための物質の存在下で、伸長産物の合成を始めるために十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、多くの要因（温度、およびプライマーの供給源が挙げられる）に依存する。
【０１０５】
本明細書中で用いられるプライマーは、増幅される特異的な配列のそれぞれの異なる鎖に対して「著しく」相補的であるように選択される。このことは、プライマーは、その反応性テンプレート鎖と非無作為的にハイブリッド形成するように、十分に相補的でなければならない。したがって、プライマー配列は、そのテンプレートの正確な配列を反映しても、しなくてもよい。
【０１０６】
ポリヌクレオチドプライマーは、任意の適切な方法（例えば、Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６８：９０；米国特許第４，３５６，２７０号、米国特許第４，４５８，０６６号、米国特許第４，４１６，９８８号、米国特許第４，２９３，６５２号；およびＢｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６８：１０９に記載されるホスホトリエステルまたはホスホジエステル法）を用いて、調製され得る。前述の文書の内容はすべて、本明細書中に参考として援用される。
【０１０７】
ＰＣＲプライマー配列が、入来オリゴヌクレオチドに含まれる場合、これらの入来オリゴヌクレオチドは、コード化配列およびＰＣＲプライマー配列の双方を含むため、他のサイクルで加えられる入来オリゴヌクレオチドよりも十分に長い。
【０１０８】
一つの実施形態において、キャップ配列は、最後の構成要素および最後の入来オリゴヌクレオチドの付加の後に加えられ、本明細書中で示されるライブラリーの合成は、実質的にすべてのライブラリーのメンバーのオリゴヌクレオチド部分が、ＰＣＲプライマー配列を含む配列で終結するように、キャップ配列をコード化配列にライゲーションする工程を包含する。好ましくは、キャップ配列は、最後の合成サイクルの産物である混合された画分へのライゲーションにより付加される。キャップ配列は、ライブラリーの構築において用いられる酵素的プロセスを用いて加えられ得る。
【０１０９】
一つの実施形態において、同じキャップ配列は、ライブラリーのすべてのメンバーにライゲーションされる。別の実施形態において、多数のキャップ配列が用いられる。この実施形態において、可変塩基を含むオリゴヌクレオチドキャップ配列は、例えば、最後の合成サイクルの後に、ライブラリーのメンバー上へとライゲーションされる。一つの実施形態において、最後の合成サイクルに次いで、画分は混合され、次に再び画分に分割され、異なるキャップ配列を有する各画分が加えられる。あるいは、多数のキャップ配列は、最後のサイクルの後に、混合されたライブラリーに加えられ得る。双方の実施形態において、最後のライブラリーのメンバーは、二つまたは二つより多い異なるキャップ配列を含む同定（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ）オリゴヌクレオチドに連結した特異的な機能的部分を含む分子を含む。
【０１１０】
一つの実施形態において、キャッププライマー（ｃａｐｐｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ）は、可変（すなわち、変質した）ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含む。キャッププライマー内のそのような変質した塩基は、構成要素の組み合わせが、ＰＣＲ重複（同一の配列）の結果であるか、または分子の独立した出現（異なる配列）であるかどうかを決定することで、関心を引くライブラリー分子の同定を可能にする。例えば、そのような変質した塩基は、コード化ライブラリーの生物学的スクリーニングの間同定される、偽陽性の潜在的な数を減少させ得る。
【０１１１】
一つの実施形態において、変質したキャッププライマーは、次の配列を含むか、または有する：
【０１１２】
【化３２】
0005508711.tif 000021
ここで、Ｎはいずれかの４個の塩基であり得、１０２４（４５）種の異なる配列を可能にする。そのプライマーは、ライブラリー上へのライゲーションおよびプライマー伸長の後に、次の配列を有する：
【０１１３】
【化３３】
0005508711.tif 000022
別の実施形態において、キャッププライマーは、以下の配列を含むか、または有する：
【０１１４】
【化３４】
0005508711.tif 000023
ここで、ＢはＣ、Ｇ、またはＴのいずれかであり得、１９，６８３（３９）種の異なる配列を可能にする。このプライマーにおける変質した領域の設計は、変質した塩基Ｂに隣接し、そして区切りをつける（ｐｕｎｃｔｕａｔｅ）塩基Ａが、３塩基より多いのホモポリマー伸長を妨げ、配列の一直線化を促進するため、ＤＮＡ配列分析を改善させる。
【０１１５】
一つの実施形態において、変質したキャップオリゴヌクレオチドは、適切な酵素を用いて、ライブラリーのメンバーにライゲーションされ、そして変質したキャップオリゴヌクレオチドの上部の鎖は、適切な酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）を用いて、後で重合化される。
【０１１６】
別の実施形態において、ＰＣＲプライミング配列は、「ユニバーサル（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）アダプタ」または「ユニバーサルプライマー」である。本明細書中で用いられる場合、「ユニバーサルアダプタ」または「ユニバーサルプライマー」は、独特なＰＣＲプライミング領域（すなわち、例えば、長さが約５、約７、約１０、約１３、約１５、約１７、約２０、約２２、または約２５のヌクレオチド）を含み、独特な配列決定プライミング領域（すなわち、例えば、長さが約５、約７、約１０、約１３、約１５、約１７、約２０、約２２、または約２５のヌクレオチド）に隣接するように位置し、そして、４種のデオキシリボヌクレオチド（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）のそれぞれのうちの少なくとも一つからなる独特の識別可能な鍵となる配列（または試料同定因子（ｓａｍｐｌｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）配列）が、必要に応じて、後に続くオリゴヌクレオチドである。
【０１１７】
本明細書中で用いられる場合、用語「識別可能な鍵となる配列」または「試料同定因子配列」は、試料由来の分子の集団を独特にタグ化するために用いられ得る配列のことをいう。それぞれが、独特な試料同定因子配列を含む多数の試料は、個々の試料の分析のためのＤＮＡ配列決定の後に、混合、配列決定、そして再分類され得る。同じ識別可能な配列が、全体のライブラリーのために用いられ得るか、あるいは異なる識別可能な鍵となる配列が、異なるライブラリーを追跡するために、用いられ得る。一つの実施形態において、識別可能な鍵となる配列は、５’ＰＣＲプライマー上、または３’ＰＣＲプライマー上、あるいは両方のプライマー上にある。両方のＰＣＲプライマーが、試料同定因子配列を含む場合、独特な試料同定因子配列と混合され得る異なる試料の数は、各プライマー上の試料同定因子配列の数の産物である。したがって、１０種の異なる５’試料同定配列プライマーは、１０種の異なる３’試料同定因子配列プライマーと合併されて、１００種の異なる試料同定因子配列の組み合わせを生成し得る。
【０１１８】
識別可能な鍵となる配列を含む、独特な５’および３’ＰＣＲプライマーの非限定的な例としては、以下：
５’プライマー（可変位置がボールド体かつイタリック体）：
【０１１９】
【化３５】
0005508711.tif 000024
３’ＳＩＤプライマー（可変位置がボールド体かつイタリック体）：
【０１２０】
【化３６】
0005508711.tif 000025
が挙げられる。
【０１２１】
一つの実施形態において、識別可能な鍵となる配列は、長さが約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、識別可能な鍵となる配列は約１〜４個のヌクレオチドの組み合わせである。なおも別の実施形態において、各ユニバーサルアダプタは、長さが約４４ヌクレオチド長である。一つの実施形態において、ユニバーサルアダプタは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、コード化ヌクレオチドの末端上にライゲーションされる。異なるユニバーサルアダプタは、各ライブラリーの調製のために設計され得、したがって、各ライブラリーに対する独特な同定因子を提供する。ユニバーサルアダプタの大きさおよび配列は、当業者により必要であると考えられる場合、改変され得る。
【０１２２】
上で示されるように、本発明の方法の一部分としてのオリゴヌクレオチドタグは、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）の使用により決定され得る。
【０１２３】
オリゴヌクレオチドタグは、本明細書中に記載される機能的部分を作る構成要素を同定するポリヌクレオチドで構成される。オリゴヌクレオチドタグの核酸配列は、オリゴヌクレオチドタグを、以下のようにＰＣＲ反応に供することで決定される。適切な試料は、ＰＣＲプライマー対と接触され、その対のメンバーはそれぞれ、事前選択されたヌクレオチド配列を有し得る。ＰＣＲプライマーの対は、コード化オリゴヌクレオチドタグ上のＰＣＲプライマー結合部位へとハイブリッド形成することにより、プライマー伸長反応を開始することができる。ＰＣＲプライマー結合部位は、好ましくは、コード化オリゴヌクレオチドタグ中に設計される。例えば、ＰＣＲプライマー結合部位は、その元のオリゴヌクレオチドタグに取り込まれ得、そして、第二のＰＣＲプライマー結合部位は、最後のオリゴヌクレオチドタグに取り込まれ得る。あるいは、第二のＰＣＲプライマー結合部位は、本明細書中に記載されるキャップ配列に取り込まれ得る。好ましい実施形態において、ＰＣＲプライマー結合部位は、少なくとも、長さが約５、約７、約１０、約１３、約１５、約１７、約２０、約２２、または約２５ヌクレオチド長である。
【０１２４】
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲプライマーの対（好ましくは、その既定の量）を、コード化ヌクレオチドタグの核酸（好ましくは、その既定の量）と、ＰＣＲ緩衝液中で混合することで行われ、ＰＣＲ反応混合物を形成する。その混合物は、ＰＣＲ反応産物の形成のために十分な数のサイクル（これは、代表的に既定である）にわたって、熱サイクルされる。十分な量の産物は、ＤＮＡ配列決定を可能にするために十分な量で単離され得る産物のことである。
【０１２５】
ＰＣＲは代表的に、熱サイクルにより（すなわち、下限が約３０℃〜約５５℃、上限が約９０℃〜約１００℃の温度の範囲で、ＰＣＲ反応混合物の温度を上昇させ、そして下降させることを繰り返すことで）行われる。上昇および下降は連続的であり得るが、好ましくは、ポリヌクレオチドの合成、変性、およびハイブリッド形成に好都合な各温度で、相対的な温度安定性の期間に段階的に作用する。
【０１２６】
ＰＣＲ反応は、任意の適切な方法を用いて行われる。一般的にそれは、緩衝水溶液（すなわち、ＰＣＲ緩衝液）中で、好ましくは７〜９のｐＨで起こる。好ましくは、モル濃度が過剰なプライマーが望ましい。相当過剰量のモル濃度が、そのプロセスの効用を改善させるために好ましい。
【０１２７】
ＰＣＲ緩衝液は、またデオキシリボヌクレオチドトリホスフェート（ポリヌクレオチド合成基質）であるｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰならびにポリメラーゼを、すべてプライマー伸張（ポリヌクレオチド合成）反応のために十分な量で含み、代表的に熱安定である。生じた溶液（ＰＣＲ混合物）を、約１〜約１０分間、好ましくは１〜４分間にわたって、約９０℃〜１００℃まで加熱する。この加熱期間の後、その溶液を５４℃（これは、プライマーハイブリッド形成に好ましい）まで冷却させる。その合成反応は、室温から、ある温度（それより高い温度で、ポリメラーゼ（誘発物質）がもはや有効に機能しない）までの範囲の温度で起こり得る。したがって、例えば、ＤＮＡポリメラーゼが用いられる場合、温度は一般的に約４０℃以下である。熱サイクルは、所望の量のＰＣＲ産物が産生されるまで、繰り返される。例示的なＰＣＲ緩衝液は次の試薬：５０ｍＭ  ＫＣｌ；ｐＨ８．３で１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ．ｓｕｂ．２；０．００１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ゼラチン、２００μＭ  ｄＡＴＰ；２００μＭ  ｄＴＴＰ；２００μＭ  ｄＣＴＰ；２００μＭ  ｄＧＴＰ；および１００マイクロリットルの緩衝液当たり、２．５ユニットのＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼＩを含む。
【０１２８】
プライマー配列を伸長するための適切な酵素としては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、他の入手可能なＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ならびに他の酵素（熱安定性酵素を含む）（これは、適切な方法でヌクレオチドの組み合わせを促進し、核酸鎖それぞれに相補的なプライマー伸長産物を形成する）が挙げられる。一般的に、合成は、各プライマーの３’末端で開始され、合成が終結するまで、テンプレート鎖に沿って５’方向に進行し、異なる長さの分子を産生する。
【０１２９】
新しく合成されたＤＮＡ鎖およびその相補的鎖は、分析プロセスの次の工程で用いられ得る二本鎖の分子を形成する。
【０１３０】
ＰＣＲ増幅方法は、米国特許第４，６８３，１９２号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号、および同第４，９６５，１８８号で詳細に、そして少なくともＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．  Ｅｒｌｉｃｈ，ｅｄ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；およびＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。すべての前述の文書の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０１３１】
一旦、コード化オリゴヌクレオチドが増幅されると、そのタグの配列、そして最終的に選択された分子の組成物は、核酸配列分析（これは、ヌクレオチド配列の配列を決定するための周知の手順である）を用いて決定され得る。核酸配列分析は、（ａ）プローブ鎖とその相補的鎖のハイブリッド形成または変性に基づく物理化学的技術、ならびに（ｂ）ポリメラーゼとの酵素的反応により達せられる。
【０１３２】
本発明はさらに、化学構造のライブラリーを形成するために、単離された種として、または混合された種のいずれかとして、本発明の方法を用いて産生され得る化合物、およびそのような化合物の収集物に関する。本発明の化合物は、式
【０１３３】
【化３７】
0005508711.tif 000026
の化合物を含み、
ここで、Ｘは、一つまたは一つより多い構成要素を含む機能的部分であり、Ｚは、その３’末端でＢに結合したオリゴヌクレオチドであり、そしてＹは、その５’末端でＣに結合したオリゴヌクレオチドである。Ａは、Ｘと共有結合を形成する官能基であり、Ｂは、Ｚの３’末端と結合を形成する官能基であり、そしてＣは、Ｙの５’末端と結合を形成する官能基である。Ｄ、Ｆ、およびＥは、官能基Ａ、官能基Ｃ、および官能基Ｂを、核となる原子または骨格であるＳに連結させる化学的基である。好ましくは、Ｄ、Ｅ、およびＦは、それぞれ独立して原子の鎖（例えば、アルキレン鎖またはオリゴ（エチレングリコール）鎖）であり、そして、Ｄ、Ｅ、およびＦは、同じであっても、異なっていてもよく、好ましくは、二本のオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成および機能的部分の合成を可能にするほど効果的である。
【０１３４】
好ましくは、ＹおよびＺは実質的に相補的であり、適切な条件下でワトソン−クリック塩基対および二重鎖形成を可能にするような化合物中に配向される。ＹおよびＺは同じ長さまたは異なる長さである。好ましくは、ＹおよびＺは同じ長さであるか、またはＹおよびＺのうちの一つは、他方よりも１〜１０塩基長い。好ましい実施形態において、ＹおよびＺは長さがそれぞれ１０または１０より多い塩基長であり、１０または１０より多い塩基対の相補的領域を有する。さらに好ましくは、ＹおよびＺは、それの全長にわたって相補的である（すなわち、各１０塩基対あたり、わずかに一つのミスマッチを有する）。最も好ましくは、それらの全長にわたって相補的である（すなわち、ＹまたはＺ上の任意のオーバーハング領域を除いて、ワトソンクリック塩基対によりハイブリッド形成する鎖は、それらの全長にわたって、ミスマッチが一つもない）。
【０１３５】
Ｓは、単独の原子または分子骨格であり得る。例えば、Ｓは、炭素原子、ホウ素原子、窒素原子、もしくはリン原子、または多原子骨格(例えば、リン酸基、環式基（例えば、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロシクロアルケニル基、アリール基、またはヘテロアリール基）であり得る。一つの実施形態において、リンカーは、構造
【０１３６】
【化３８】
0005508711.tif 000027
の基であり、
ここで、ｎ、ｍ、およびｐはそれぞれ、独立して、約１〜約２０、好ましくは２〜８、さらに好ましくは３〜６の整数である。一つの特定の実施形態において、リンカーは以下に示される構造を有する。
【０１３７】
【化３９】
0005508711.tif 000028
一つの実施形態において、本発明のライブラリーは、構成要素で構成される機能的部分からなる分子を含み、各機能的部分は、コード化オリゴヌクレオチドに作動可能に連結する。そのコード化オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、その構成要素が、その機能的部分中に存在することを示し、いくつかの実施形態において、その構成要素の結合性（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ）または配置を示す。本発明は、その機能的部分を構築するために用いられる方法論、およびそのオリゴヌクレオチドタグを構築するために用いられる方法論は、同じ反応媒体（好ましくは、水性媒体）中で行われ得、したがって、より前の技術における方法と比較して、ライブラリーを調製する方法を簡素化するという利点を提供する。オリゴヌクレオチドのライゲーション工程および構成要素付加工程が、双方とも水性媒体中で行われ得る特定の実施形態において、各反応は、異なるｐＨ最適条件を有する。これらの実施形態において、構成要素付加反応は、適切な水性緩衝液中で、適切なｐＨおよび温度で行われ得る。次にその緩衝液は、オリゴヌクレオチドのライゲーションのために適切なｐＨを提供する水性緩衝液と交換され得る。
【０１３８】
別の実施形態において、本発明は、式ＩＩ
【０１３９】
【化４０】
0005508711.tif 000029
の化合物、およびそのような化合物を含むライブラリーを提供し、
ここで、Ｘは分子骨格であり、各Ｙは、独立して辺縁部分であり、そしてｎは１〜６の整数である。各Ｙは、独立して構成要素であり、そしてｎは０〜約５の整数である。Ｌは連結部分であり、Ｚは構造−Ａｔ−Ｘ（Ｙ）ｎを同定する一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドである。その構造Ｘ（Ｙ）ｎは、例えば、表８（以下を参照のこと）で示される骨格構造のうちの一つであり得る。一つの実施形態において、本発明は、式ＩＩＩ
【０１４０】
【化４１】
0005508711.tif 000030
の化合物、およびそのような化合物を含むライブラリーを提供し、
ここで、ｔは０〜約５、好ましくは０〜３の整数であり、そして各Ａは、独立して構成要素である。Ｌは連結部分であり、そしてＺは各ＡならびにＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４を同定する一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドである。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素、アルキル、置換されたアルキル、ヘテロアルキル、置換されたヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換されたシクロアルキル、置換されたヘテロシクロアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、置換されたアリールアルキル、置換されたヘテロアリールアルキル、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、および置換されたアミノから選択される置換基である。一つの実施形態において、各Ａはアミノ酸残基である。
【０１４１】
式ＩＩまたは式ＩＩＩの化合物を含むライブラリーは、式ＩＩまたは式ＩＩＩの少なくとも約１００；約１０００；約１０，０００；約１００，０００；約１，０００，０００；約１０，０００，０００種の化合物を含み得る。一つの実施形態において、ライブラリーは、式ＩＩまたは式ＩＩＩの少なくとも約１００；約１０００；約１０，０００；約１００，０００；約１，０００，０００；約１０，０００，０００種の化合物を含むライブラリーを産生するために設計された方法を介して調製される。
【０１４２】
【化４２】
0005508711.tif 000031
【０１４３】
【化４３】
0005508711.tif 000032
【０１４４】
【化４４】
0005508711.tif 000033
【０１４５】
【化４５】
0005508711.tif 000034
【０１４６】
【化４６】
0005508711.tif 000035
【０１４７】
【化４７】
0005508711.tif 000036
【０１４８】
【化４８】
0005508711.tif 000037
本発明の方法の一つの利点は、それらが莫大な数の化合物を含むライブラリーを調製するために用いられ得ることである。公知の方法（例えば、ポリメラーゼ鎖反応（「ＰＣＲ」））を用いてコード化オリゴヌクレオチド配列を増幅する能力は、選択された分子が、比較的わずかな複製しか回収されなくても、同定され得ることを意味する。このことは、非常に大きなライブラリーの実用的な使用を可能にし、それらの高い程度の複雑性の結果として、それらは、任意の所定のライブラリーのメンバーの比較的わずかな複製を含むか、または非常に大きな容積の使用を必要とするかのいずれかである。例えば、１０８種の独特な構造（ここで、各構造は１×１０１２個の複製を有する）からなるライブラリー（約１ピコモル）は、１μＭの効果的な濃度で約１００Ｌの溶液を必要とする。同じライブラリーに対して、各メンバーは、１，０００，０００個の複製により表される場合、必要とされる容積は、１μＭの効果的な濃度で１００μＬである。
【０１４９】
好ましい実施形態において、ライブラリーは、各ライブラリーメンバーの約１０３個〜約１０１５個の複製を含む。ライブラリーメンバーの間の合成の効率における差異を考慮すると、異なるライブラリーメンバーは、任意の所定のライブラリー中に、異なる数の複製を有する。したがって、ライブラリー中に理論的に存在する各メンバーの複製の数は、同じであり得るが、任意の所定のライブラリーメンバーの複製の実際の数は、任意の他のメンバーの複製の数と独立している。より好ましくは、本発明の化合物のライブラリーは、各ライブラリーのメンバーの、または実質的にすべてのイブラリーのメンバーの少なくとも約１０５、約１０６、または約１０７個の複製を含む。「実質的にすべての」ライブラリーのメンバーは、少なくとも約８５％のライブラリーのメンバー、好ましくは少なくとも約９０％、そしてさらに好ましくは少なくとも約９５％のライブラリーのメンバーを意味する。
【０１５０】
好ましくは、ライブラリーは、生物学的標的に対する複数の（すなわち二つまたは二つより多い）ラウンドの選択が行われ得る、各メンバーの多くの数の複製を含み、残留分子のオリゴヌクレオチドタグを増幅することを可能にする（したがって、結合分子の機能的部分を同定する）最後のラウンドの選択の後に、十分な量の結合分子を残す。そのような選択プロセスの図式的な表現は、図６で説明される。ここで、１および２は、ライブラリーメンバーを表し、Ｂは標的分子であり、ＸはＢに作動可能に連結する部分であり、選択媒体からのＢの除去を可能にする。この例において、化合物１はＢに結合し、一方、化合物２はＢに結合しない。この選択プロセスは、ラウンド１に描かれるように、（Ｉ）化合物１および２を含むライブラリーを、化合物１のＢへの結合に対して適切な条件下で、Ｂ−Ｘと接触させる工程；（ＩＩ）結合していない化合物２を除去する工程、（ＩＩＩ）化合物１をＢから分離し、その反応媒体からＢＸを除去する工程を包含する。ラウンド１の結果は、化合物２と比較して化合物１に富む分子の収集物である。工程Ｉ〜ＩＩＩを用いる次のラウンドは、化合物２と比較して化合物１のさらなる富化をもたらす。三回のラウンドの選択が図６に示されるが、実際は任意の数のラウンド（例えば、１ラウンド〜１０ラウンド）が用いられ、非結合分子と比較して、結合分子の所望の富化を達成し得る。
【０１５１】
図６に示される実施形態において、いずれかのラウンドの選択の後に、化合物の増幅（さらなる複製の合成）の余地は全くない。そのような増幅は、選択の後に残留している相対的な量の化合物に一致しない化合物の混合物をもたらし得る。この不一致は、特定の化合物は、他の化合物よりも容易に合成され得るという事実によるものであり、したがって、選択後に、それらの存在に比例しない方法で増幅され得る。例えば、化合物２は化合物１よりも容易に合成され、ラウンド２の後に残留している分子の増幅は、化合物１と比較して化合物２の比例しない増幅をもたらし、生じた化合物の混合物は、化合物２と比較して化合物１の富化が（もしあるとしても）非常に軽度である。
【０１５２】
一つの実施形態において、上記標的は、任意の公知の固定化技術により、固体の支持体上で固定化される。その固体の支持体は、例えば、クロマトグラフィーカラムまたは膜中に含まれる水に不溶のマトリクスであり得る。コード化されたライブラリーは、クロマトグラフィーカラム中に含まれる水に不溶のマトリクスに加えられ得る。次にそのカラムは、非特異的な結合剤を除去するために、洗浄される。次に標的に結合した化合物は、ｐＨ，塩濃度、有機溶媒濃度を変えることで、または他の方法（例えば、その標的への公知のリガンドとの競合）により分離され得る。
【０１５３】
別の実施形態において、上記標的は、溶液中で遊離であり、コード化されたライブラリーでインキュベートされる。その標的（また、本明細書中で「リガンド」と言及される）に結合する化合物は、サイズ分離工程（例えば、ゲル濾過、または限外濾過）により選択的に単離される。一つの実施形態において、コード化された化合物および標的生体分子の混合物は、サイズ排除クロマトグラフィーカラム（ゲル濾過）を通過し、これは、結合していない化合物から任意のリガンド標的複合体を分離する。リガンド標的複合体は、逆相クロマトグラフィーカラムに移され、これは、その標的からそのリガンドを分離する。次にその分離されたリガンドは、ＰＣＲ増幅およびコード化オリゴヌクレオチドの配列分析により分析される。この手法は、その標的の固定化が活性の損失をもたらし得る場合、特に都合がよい。
【０１５４】
本発明の特定の実施形態において、上記選択方法は、配列決定の前に標的に結合する化合物のライブラリーの少なくとも一つのメンバーのコード化オリゴヌクレオチドを増幅する工程を包含し得る。
【０１５５】
一つの実施形態において、コード化オリゴヌクレオチドを含む化合物のライブラリーは、選択されたライブラリー混合物中に存在するＤＮＡ分子の集団分布における任意の潜在的なゆがみ（ｓｋｅｗ）を最小化するために、配列分析の前に増幅される。例えば、少量のライブラリーのみが、選択工程後に回収され、配列分析の前にＰＣＲを用いて増幅される。ＰＣＲは、選択されたライブラリー混合物中に存在するＤＮＡ分子の集団分布におけるゆがみを生成する潜在力を有している。このことは、入力（ｉｎｐｕｔ）分子数が少なく、その入力分子が、不十分なＰＣＲテンプレートである場合、特に問題がある。初期の段階で産生されるＰＣＲ産物は、共有結合の二重鎖ライブラリーよりも効果的なテンプレートであり、したがって最後の増幅された集団におけるこれらの分子の頻度は、元の入力テンプレートにおける頻度よりも、ずっと高くなり得る。
【０１５６】
したがって、この潜在的なゆがみを最小化するために、本発明の一つの実施形態において、個々のライブラリーのメンバーに対応する一本鎖オリゴヌクレオチドの集団は、反応における一つのプライマーを用いて産生され、続いて、二つのプライマーを用いてＰＣＲで増幅される。そうすることで、ＰＣＲを用いる指数関数的な増加の前に、一本鎖プライマー伸長産物の線形の蓄積が生じ、そして蓄積されたプライマー伸長産物中の分子の多様性および分布は、元の入力テンプレート中に存在する分子の多様性および分布を、より正確に反映している。なぜなら、増幅の指数関数相は、存在する元の分子の多様性の多くが、プライマー伸長反応中に産生される分子の集団中に表される後にのみ起こるからである。
【０１５７】
一旦、一本鎖が上に記載されたプロセスにより同定されると、種々のレベルの分析が適応され、構造活性関係の情報を生成し得、そしてリガンドの親和性、特異性、および生物活性のさらなる最適化を導き得る。同じ骨格から誘導されるリガンドに対して、三次元分子モデリングが用いられ、そのリガンドに共通の重要な構造の特徴を同定し得、それにより、標的の生体分子上の共通の部位でおそらく結合する小分子リガンドのファミリーを産生し得る。
【０１５８】
種々のスクリーニング手法が、一つの標的に高い親和性を有するが、別の密接に関連した標的に対して弱い親和性を有するリガンドを得るために、用いられ得る。一つのスクリーニングストラテジーは、同様の実験における双方の生体分子に対するリガンドを同定し、次に相互参照比較により、共通のリガンドを連続的に除去することである。この方法において、各生体分子に対するリガンドは、上に開示されるように別々に同定され得る。この方法は、固定化された標的生体分子および溶液中で遊離の標的生体分子の双方と適合である。
【０１５９】
固定化された標的生体分子に対して、別のストラテジーは、非標的生体分子に結合するすべてのリガンドを、ライブラリーから除去する事前選択工程を加えることである。例えば、第一の生体分子は、上で記載されるように、コード化ライブラリーと接触され得る。次に、その第一の生体分子に結合しない化合物は、形成する任意の第一の生体分子−リガンド複合体から分離される。第二の生体分子に結合する化合物は、上に記載されるように同定され得、第一の生体分子よりも第二の生体分子に対して、強い親和性を有する。
【０１６０】
上で開示される方法により同定される生体分子の未知の機能に対するリガンドは、その生体分子の生物学的機能を決定するために用いられ得る。このことは、新規の遺伝子配列が引き続き同定されるが、これらの配列によりコードされるタンパク質の機能、ならびに新規の薬物の発見および開発のための標的としての、これらのタンパク質の有効性は、決定することが難しく、ゲノムの情報を疾患の処置に適用するためのおそらく最も重要な障害を表すので、都合がよい。本発明で記載されたプロセスを通して得られた標的特異的リガンドは、治療的介入のための標的タンパク質の機能および標的タンパク質の双方の機能を理解するために、全細胞生物学的アッセイで、または適切な動物モデルで用いられ得る。この手法はまた、その標的は小分子薬物発見に特異的にかなうことを確認し得る。
【０１６１】
一つの実施形態において、本発明のライブラリー中の一つまたは一つより多い化合物は、特定の生体分子のためのリガンドとして同定される。次に、これらの化合物は、その生体分子へ結合する能力に対するインビトロアッセイで評価され得る。好ましくは、結合分子の機能的部分は、オリゴヌクレオチドタグなしで合成され、これらの機能的部分は、その生体分子への結合に対する能力に対して評価される。
【０１６２】
生体分子への機能的部分の結合の、生体分子の機能への効果は、インビトロ無細胞または細胞ベースのアッセイを用いて評価され得る。公知の機能を有する生体分子に対して、アッセイは、例えば、その活性の直接的な測定（例えば、酵素活性）、あるいは間接的な方法（例えば、その生体分子により影響される細胞機能）により、リガンドの存在下、そして非存在下でのその生体分子の活性の比較を包含し得る。その生体分子が未知である場合、その生体分子を発現する細胞は、リガンドと接触され得、そのリガンドの、その細胞の生存能力、機能、表現型、および／または遺伝子発現への影響が測定される。インビトロアッセイは、例えば、細胞死アッセイ、細胞増殖アッセイ、またはウイルス複製アッセイであり得る。例えば、その生体分子がウイルスで表現されるタンパク質である場合、そのウイルスに感染した細胞は、そのタンパク質に対するリガンドと接触され得る。次に、そのタンパク質へのリガンドの結合の、ウイルス生存能力への影響（ａｆｆｅｃｔ）が評価され得る。
【０１６３】
本発明の方法により同定されるリガンドは、インビトロモデルで、またはヒトで評価され得る。例えば、動物または生体分子を産生する生体内で評価され得る。その動物または生体の健康状態の任意の生じた変化（例えば、疾患の進行）が決定され得る。
【０１６４】
未知の機能の生体分子（例えば、タンパク質、または核酸分子）に対して、生体分子に結合するリガンドの、生体分子を産生する細胞または臓器上への影響は、その生体分子の生物学的機能に関する情報を提供し得る。例えば、特定の細胞プロセスが、リガンドの存在下で阻害されるという観察は、そのプロセスが、少なくとも一部分は、その生体分子の機能に依存することを示す。
【０１６５】
本発明の方法を用いて同定されるリガンドはまた、それらが結合する生体分子に対する親和性試薬として用いられ得る。一つの実施形態において、そのようなリガンドは、例えば、一つまたは一つより多いそのようなリガンドが結合する固相を用いる、その生体分子を含む溶液のクロマトグラフィーにより、その生体分子の親和性精製に影響を与えるために用いられる。
【０１６６】
本発明は、次の実施例によりさらに説明されるが、それは制限するものと解釈されるべきではない。本出願にわたって引用されるすべての参考文献、特許、および公開された特許出願、ならびに図面および配列表は、本明細書中に参考として援用される。
【実施例】
【０１６７】
（実施例１：１０５のオーダーのメンバーでのライブラリーの合成および説明）
１０５のオーダーの異なるメンバーを含むライブラリーの合成を、以下の試薬を用いて成し遂げた：
化合物１：
【０１６８】
【化４９】
0005508711.tif 000038
デオキシリボヌクレオチドに対する一文字コード
Ａ＝アデノシン
Ｃ＝シトシン
Ｇ＝グアノシン
Ｔ＝チミジン。
【０１６９】
構成要素前駆体：
【０１７０】
【化５０】
0005508711.tif 000039
【０１７１】
【化５１】
0005508711.tif 000040
【０１７２】
【化５２】
0005508711.tif 000041
【０１７３】
【化５３】
0005508711.tif 000042
【０１７４】
【化５４】
0005508711.tif 000043
【０１７５】
【化５５】
0005508711.tif 000044
１×  リガーゼ緩衝液：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５；１０ｍＭ  ジチオトレイトール；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；２．５ｍＭ  ＡＴＰ；５０ｍＭ  ＮａＣｌ
１０×  リガーゼ緩衝液：５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５；１００ｍＭジチオトレイトール；１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２；２５ｍＭ  ＡＴＰ；５００ｍＭ  ＮａＣｌ。
【０１７６】
（サイクル１）
１２個の各ＰＣＲチューブに、５０μＬの水中の化合物１の１ｍＭ溶液；７５μＬのタグ１．１〜１．１２のうちの一つの０．８０ｍＭ溶液；１０×リガーゼ緩衝液、および１０μＬ脱イオン水を加えた。そのチューブを、９５℃まで１分間にわたって加熱し、次に１０分間にわたって１６℃まで冷却した。各チューブに５０μｌ  １×リガーゼ緩衝液中の５０００ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（２，０００，０００ユニット／ｍＬ溶液の２．５μＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，カタログ番号．Ｍ０２０２））を加え、生じた溶液を１６時間にわたって１６℃でインキュベートした。
【０１７７】
ライゲーションの後、試料を１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移し、２０μＬの５Ｍ  ＮａＣｌ水溶液および５００μＬの冷（−２０℃）エタノールで処理し、１時間にわたって２０℃に保持した。遠心分離の後、上澄みを除去し、ペレットを−２０℃で７０％エタノール水溶液で洗浄した。次にペレットはそれぞれ、１５０μＬの１５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．４）に溶解させた。
【０１７８】
各構成要素前駆体ＢＢ１〜ＢＢ１２の一つ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエタノールアミンおよびＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートを、それぞれ０．２５Ｍの濃度で含むストック溶液をＤＭＦで調製し、室温で２０分間にわたって撹拌した。その構成要素前駆体溶液を、上に記載された各ペレット溶液に加え、リンカーと比較して１０倍の過剰量の構成要素をもたらした。生じた溶液を撹拌した。さらに１０当量の構成要素前駆体を２０分後に反応混合物に加え、４０分後に別の１０当量を加えた。反応混合物中のＤＭＦの最終濃度は２２％であった。次に反応溶液を一晩中４℃で撹拌した。反応の進行を、５０ｍＭの酢酸テトラエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ＝７．５）およびアセトニトリル、ならびに１４分間にわたる２〜４６％アセトニトリルの勾配を用いて、ＲＰ−ＨＰＬＣによりモニターした。反応を、約９５％の出発物質（リンカー）がアシル化されると、中止した。アシル化の後、反応混合物を混合し、凍結乾燥して、乾燥させた。次に、凍結乾燥した物質をＨＰＬＣにより精製し、そしてライブラリー（アシル化された生成物）に対応する画分を混合し、そして凍結乾燥した。
【０１７９】
上記ライブラリーを、２．５ｍｌの０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝８．２）に溶解させ、０．１ｍｌのピペリジン（４％  ｖ／ｖ）をそれに加えた。ピペリジンの添加は、混合で溶解しない混濁をもたらす。反応混合物を室温で５０分間にわたって撹拌し、次にその混濁溶液を遠心分離し（１４０００ｒｐｍ）、上澄みを２００μｌのピペットを用いて除去し、ペレットを０．１ｍｌの水に再懸濁した。洗浄水を上澄みと合わせ、ペレットを捨てた。脱保護されたライブラリーを、その反応におけるエタノールの最終濃度が７０％ｖ／ｖとなるような、過剰量の冷氷エタノールの添加により溶液から沈殿させた。エタノール水溶液の混合物の遠心分離により、ライブラリーを含む白色のペレットを得た。そのペレットを冷７０％エタノール水溶液で一度洗浄した。溶媒の除去後、ペレットを空気中で乾燥させ（約５分）、極微量のエタノールを除去し、次にサイクル２で用いた。ラウンド１で用いたタグおよび対応する構成要素前駆体を以下の表１に示す。
【０１８０】
【化５６】
0005508711.tif 000045
（サイクル２〜５）
これらの各サイクルに対して、前のサイクルから生じた合わせた溶液を、それぞれ５０μｌの１２個の等しいアリコートに分割し、ＰＣＲチューブ内に置いた。各チューブに、異なるタグを含む溶液を加え、そしてライゲーション、精製、およびアシル化をサイクル１に関して記載される通りに（サイクル３〜５に対しては、サイクル１に関して記載されるＨＰＬＣ精製工程を省略したことを除き）行った。サイクル２〜５に関するタグおよび構成要素の対応を表２に示す。
【０１８１】
サイクル５の産物を、タグのライゲーションのために上に記載された方法を用いて、以下に示す近接（ｃｌｏｓｉｎｇ）プライマーでライゲーションした。
【０１８２】
【化５７】
0005508711.tif 000046
【０１８３】
【化５８】
0005508711.tif 000047
結果：
上で記述した合成手順は、１２５（約２４９，０００）種の異なる構造を含むライブラリーを産生する能力を有する。そのライブラリーの合成を、各サイクルの生成物のゲル電気泳動によりモニターした。５サイクルのぞれぞれ、および近接プライマーのライゲーション後の最後のライブラリーの結果を図７で説明する。「ヘッドピース（ｈｅａｄ  ｐｉｅｃｅ）」と標識される化合物は、化合物１である。その図は、各サイクルが期待された分子量の増加をもたらし、各サイクルの産物が、分子量に関して実質的に同質であることを示している。
【０１８４】
（実施例２：１０８のオーダーのメンバーでのライブラリーの合成および説明）
１０８のオーダーの異なるメンバーを含むライブラリーの合成を、以下の試薬を用いて成し遂げた：
化合物２：
【０１８５】
【化５９】
0005508711.tif 000048
デオキシリボヌクレオチドに対する一文字コード
Ａ＝アデノシン
Ｃ＝シトシン
Ｇ＝グアノシン
Ｔ＝チミジン
構成要素前駆体：
【０１８６】
【化６０】
0005508711.tif 000049
【０１８７】
【化６１】
0005508711.tif 000050
【０１８８】
【化６２】
0005508711.tif 000051
【０１８９】
【化６３】
0005508711.tif 000052
【０１９０】
【化６４】
0005508711.tif 000053
【０１９１】
【化６５】
0005508711.tif 000054
【０１９２】
【化６６】
0005508711.tif 000055
【０１９３】
【化６７】
0005508711.tif 000056
【０１９４】
【化６８】
0005508711.tif 000057
【０１９５】
【化６９】
0005508711.tif 000058
【０１９６】
【化７０】
0005508711.tif 000059
【０１９７】
【化７１】
0005508711.tif 000060
【０１９８】
【化７２】
0005508711.tif 000061
【０１９９】
【化７３】
0005508711.tif 000062
【０２００】
【化７４】
0005508711.tif 000063
【０２０１】
【化７５】
0005508711.tif 000064
【０２０２】
【化７６】
0005508711.tif 000065
【０２０３】
【化７７】
0005508711.tif 000066
【０２０４】
【化７８】
0005508711.tif 000067
【０２０５】
【化７９】
0005508711.tif 000068
【０２０６】
【化８０】
0005508711.tif 000069
【０２０７】
【化８１】
0005508711.tif 000070
【０２０８】
【化８２】
0005508711.tif 000071
【０２０９】
【化８３】
0005508711.tif 000072
【０２１０】
【化８４】
0005508711.tif 000073
【０２１１】
【化８５】
0005508711.tif 000074
１×  リガーゼ緩衝液：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５；１０ｍＭ  ジチオトレイトール；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；２ｍＭ  ＡＴＰ；５０ｍＭ  ＮａＣｌ
１０×  リガーゼ緩衝液：５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５；１００ｍＭ  ジチオトレイトール；１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２；２０ｍＭＡＴＰ；５００ｍＭ  ＮａＣｌ。
【０２１２】
（水溶性スペーサーの化合物２への結合）
４℃まで冷やしたホウ酸ナトリウム（１５０ｍＭ、ｐＨ９．４）中の化合物２の溶液（６０ｍＬ、１ｍＭ）に、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の、４０当量のＮ−Ｆｍｏｃ−１５−アミノ−４，７，１０，１３−テトラオキサオクタデカン酸（Ｓ−Ａｄｏ）（１６ｍＬ、０．１５Ｍ）、続いて４０当量の、水中の塩化４−（４，６−ジメトキシ［１．３．５］トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム水和物（ＤＭＴＭＭ）（９．６ｍＬ、０．２５Ｍ）を加えた。混合物を２時間にわたって４℃で穏やかに振とうし、その後さらに４０当量のＳ−ＡｄｏおよびＤＭＴＭＭを加え、そして１６時間にわたって４℃でさらに振とうした。
【０２１３】
アシル化の後、０．１×容量の５ＭのＮａＣｌ水溶液および２．５×容量の冷（−２０℃）エタノールを加え、混合物を−２０℃で少なくとも１時間にわたって放置した。次に混合物を４℃の遠心機中で、１５分間にわたって１４，０００ｒｐｍで遠心分離し、白色のペレットを得た。それを、冷ＥｔＯＨで洗浄し、次に室温で３０分間にわたって凍結乾燥機で乾燥させた。固形物を４０ｍＬの水に溶解させ、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｔｅｒｒａ  ＲＰ１８カラムを用いる逆相ＨＰＬＣにより精製した。二元移動相勾配（ｂｉｎａｒｙ  ｍｏｂｉｌｅ  ｐｈａｓｅ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）プロフィルを用いて、５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝水溶液（ｐＨ７．５）および９９％アセトニトリル／１％水の溶液を使用し、生成物を溶出した。精製した物質を凍結乾燥により濃縮し、生じた残渣を５ｍＬの水に溶解させた。０．１×容積のピペリジンを溶液に加え、混合物を室温で４５分間にわたって穏やかに振とうした。次に、生成物を上に記載したようにエタノール沈殿により精製し、遠心分離により単離した。生じたペレットを冷ＥｔＯＨで２回洗浄し、凍結乾燥により乾燥させ、精製化合物３を得た。
【０２１４】
（サイクル１）
９６ウェルプレートの各ウェルに、１２．５μＬの、化合物３の４ｍＭ水溶液；１００μＬの、表３に示されるオリゴヌクレオチドタグ１．１〜１．９６のうちの一つの１ｍＭ溶液（化合物３とタグのモル比は１：２であった）に加えた。プレートを１分間にわたって９５℃まで加熱し、次に１０分間にわたって１６℃まで冷却した。各ウェルに１０μＬの１０×リガーゼ緩衝液、３０ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（３０ユニット／μＬ溶液の１μＬ（ＦｅｒｍｅｎｔａｓＬｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号ＥＬ００１３））。７６．５μＬの水を加え、生じた溶液を１６℃で１６時間にわたってインキュベートした。
【０２１５】
ライゲーション反応の後、２０μＬの５Ｍ  ＮａＣｌ水溶液、続いて５００μＬの冷（−２０℃）エタノールを各ウェルに直接加え、−２０℃で１時間にわたって保持した。プレートをＢｅｃｋｍａｎ  Ｍｉｃｒｏｐｌｕｓ  Ｃａｒｒｉｅｒｓを用いて、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａｌｌｅｇｒａ  ６Ｒ遠心分離機中で、３２００ｇで１時間にわたって遠心分離した。上澄みを、プレートを逆さまにすることで注意深く除去し、ペレットを、−２０℃で７０％の冷エタノール水溶液で洗浄した。次に各ペレットを、ホウ酸ナトリウム緩衝液（５０μＬ、１５０ｍＭ、ｐＨ９．４）に、１ｍＭの濃度まで溶解させ、４℃まで冷やした。
【０２１６】
各溶液に、４０当量の、ＤＭＦ中の９６個の構成要素前駆体のうちの一つ（１３μＬ、０．１５Ｍ）、続いて４０当量の、水中のＤＭＴ−ＭＭ（８μＬ、０．２５Ｍ）を加え、そして溶液を４℃で緩やかに振とうした。２時間後に、さらに４０当量の各構成要素前駆体のうちの一つおよびＤＭＴＭＭを加え、溶液を１６時間にわたって４℃で緩やかに振とうした。アシル化の後、１０当量の、ＤＭＦ中の酢酸−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル（２μＬ、０．２５Ｍ）を各溶液に加え、緩やかに１０分間にわたって振とうした。
【０２１７】
アシル化の後、９６種の反応混合物を混合し、０．１容量の５Ｍ  ＮａＣｌ水溶液および２．５容量の無水冷エタノールを加え、溶液を−２０℃で少なくとも１時間にわたって放置した。次に混合物を遠心分離した。遠心分離の後、上澄みを可能な限りマイクロピペットで除去し、ペレットを冷エタノールで洗浄し、再び遠心分離した。上澄みを２００マμＬピペットで除去した。冷７０％エタノールを上記チューブに加え、そして生じた混合物を４℃で５分間にわたって遠心分離した。
【０２１８】
上澄みを除去し、残留エタノールを室温で１０分間にわたって凍結乾燥により除去した。次にペレットを２ｍＬの水に溶解させ、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｔｅｒｒａ  ＲＰ１８カラムを用いる逆相ＨＰＬＣにより精製した。二元移動相勾配プロフィルを用いて、５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝水溶液（ｐＨ７．５）および９９％アセトニトリル／１％水の溶液を使用し、ライブラリーを溶出した。ライブラリーを含む画分を収集し、混合し、そして凍結乾燥した。生じた残渣を２．５ｍＬの水に溶解させ、２５０μＬのピペリジンを加えた。溶液を室温で４５分間にわたって穏やかに振とうし、前述の通りにエタノールで沈殿させた。生じたペレットを凍結乾燥により乾燥させ、ホウ酸ナトリウム緩衝水溶液（４．８ｍＬ、１５０ｍＭ、ｐＨ９．４）に、１ｍＭの濃度まで溶解させた。
【０２１９】
溶液を４℃まで冷やし、４０当量の、ＤＭＦ（１．２ｍＬ、０．１５Ｍ）中のＮ−Ｆｍｏｃ−プロパルギルグリシン（１．２ｍＬ、０．１５Ｍ）および水中のＤＭＴ−ＭＭ（７．７ｍＬ、０．２５Ｍ）をそれぞれ加えた。混合物を２時間にわたって４℃で緩やかに振とうし、その後、さらに４０当量のＮ−Ｆｍｏｃ−プロパルギルグリシンおよび４０当量のＤＭＴ−ＭＭをそれぞれ加え、溶液をさらに１６時間にわたって振とうした。その後、混合物をＥｔＯＨ沈殿および上で記載した逆相ＨＰＬＣにより精製し、Ｎ−Ｆｍｏｃ基を、前述の通りにピペリジンを用いる処理により除去した。ＥｔＯＨ沈殿による最終精製後、生じたペレットを凍結乾燥により乾燥させ、合成の次のサイクルに移した。
【０２２０】
サイクル２〜４
これらのサイクルのそれぞれに対して、前のサイクルからの乾燥させたペレットを水に溶解させ、そしてライブラリーの濃度を、ライブラリーのＤＮＡ成分の消衰係数に基づいて、分光測定法により測定した。ここで、化合物２の元の消衰係数は、１３１，５００Ｌ／（モル．ｃｍ）である。ライブラリーの濃度は、次のライゲーション反応における最終濃度が０．２５ｍＭとなるように水で調整した。ライブラリーを９６ウェルプレート中の９６個の等量のアリコートに分割した。各ウェルに、異なるタグを含む溶液を加え（そのライブラリーとタグのモル比は１：２であった）、ライゲーションをサイクル１に関して記述した通りに行った。サイクル２、サイクル３、およびサイクル４で用いたオリゴヌクレオチドタグは、それぞれ表４、表５、および表６に示される。サイクル１〜４のそれぞれに対するタグと構成要素前駆体との間の対応を、表７に提供する。ライブラリーは、サイクル１に関して上で記述した通りに、さらなるエタノールの添加により沈殿させ、ホウ酸ナトリウム緩衝液（１５０ｍＭ、ｐＨ９．４）に、１ｍＭの濃度まで溶解させた。次にアシル化および精製を、サイクル１に関して記述したように（サイクル３の間、ＨＰＬＣ精製は省略した点を除いて）行った。
【０２２１】
サイクル４の生成物を、タグのライゲーションに関して上に記述した方法を用いて、以下に示される近接プライマーでライゲーションした。
【０２２２】
【化８６】
0005508711.tif 000075
結果：
上で記述した合成手順は、９６４（約１０８）種の異なる構造を含むライブラリーを産生する能力を有する。そのライブラリーの合成を、各サイクルの生成物のゲル電気泳動およびＬＣ／ＭＳによりモニターした。完成後、ライブラリーを種々の技術を用いて分析した。図１３ａは、近接プライマーのライゲーションの前から、サイクル４の後のライブラリーのクロマトグラフであり；図１３ｂは、同じ合成段階での、ライブラリーのマススペクトルである。平均分子量を、負イオンＬＣ／ＭＳ分析により決定した。イオンシグナルをＰｒｏＭａｓｓソフトウェアを用いて解析した。この結果は、予測されたライブラリーの平均分子量と一致する。
【０２２３】
ライブラリーのＤＮＡ成分を、アガロースゲル電気泳動により分析し、これによりライブラリー物質の大多数は、正しいサイズのライゲーションされた生成物に対応することが示された。ライブラリーのサンプリングから得られるＰＣＲ生成物の分子クローンのＤＮＡ配列分析は、ＤＮＡのライゲーションが高い忠実度で、そして完成に近い程度まで起まで起こったことを示す。
【０２２４】
（ライブラリーの環化）
サイクル４の完了時に、ライブラリーの一部を、通常のアシル化条件下で、アジド酢酸を用いてＮ末端をキャップした。ＥｔＯＨ沈殿による精製後の生成物を、１ｍＭの濃度まで、リン酸ナトリウム緩衝液（１５０ｍＭ、ｐＨ８）中に溶解させ、４当量の水中のＣｕＳＯ４（２００ｍＭ）、４当量の水中のアスコルビン酸（２００ｍＭ）をそれぞれ、そしてＤＭＦ中の溶液（２００ｍＭ）として以下に示される触媒量の化合物を加えた。反応混合物を２時間にわたって室温で緩やかに振とうした。
【０２２５】
【化８７】
0005508711.tif 000076
環化の程度をアッセイするため、ライブラリー環化反応からの５μＬのアリコートを取り出し、実施例４で記述する通りに調製した蛍光標識されたアジドまたはアルケン（１００ｍＭ  ＤＭＦストックの１μＬ）で処理した。１６時間後、アルキン標識およびアジド標識のいずれも、５００ｎｍでのＨＰＬＣ分析により、ライブラリー中に取り込まれなかった。この結果により、ライブラリーはもはや、付加環化可能なアジド基またはアルキン基を含まず、したがってライブラリーは環化または分子間反応のいずれかによりそれら自身と反応したにちがいないことが示された。環化されたライブラリーは、前述の通りに逆相ＨＰＬＣにより精製した。環化されていないライブラリーを用いる対照実験は、上に述べた蛍光タグの完全な取り込みを示した。
【０２２６】
（実施例４：環化アッセイに対する蛍光タグの調製）
別々のチューブで、プロパルギルグリシンまたは２−アミノ−３−フェニルプロピルアジド（それぞれ８μｍｏｌ）を、ｐＨ９．４のホウ酸緩衝液（２５０μＬ）中のＦＡＭ−ＯＳｕ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．）（１．２当量）と合わせた。反応を３時間にわたって室温で続け、次に一晩中凍結乾燥した。ＨＰＬＣによる精製は、定量可能な収率で所望の蛍光アルキンおよびアジドをもたらした。
【０２２７】
【化８８】
0005508711.tif 000077
（実施例５：アジド／アルキン付加環化を用いる個々の化合物の環化）
アジドアセチル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒａ−ＮＨ２の調製
０．３ｍｍｏｌのＲｉｎｋ−アミド樹脂を用いて、示された配列を標準固相合成技術を用いて、Ｆｍｏｃで保護されたアミノ酸および活性化物質としてのＨＡＴＵ（Ｐｒａ＝Ｃ−プロパルギルグリシン）を用いて、合成した。アジド酢酸を用いて、テトラペプチドをキャップした。そのペプチドを、２０％  ＴＦＡ／ＤＣＭを用いて、４時間にわたってその樹脂から切断した。ＲＰ  ＨＰＬＣによる精製により、白色の固形物（７５ｍｇ、５１％）としての生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：８．４−７．８（ｍ，３Ｈ）、７．４−７．１（ｍ，７Ｈ）、４．６−４．４（ｍ，１Ｈ）、４．４−４．２（ｍ，２Ｈ）、４．０−３．９（ｍ，２Ｈ）、３．７４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６Ｈｚ，１７Ｈｚ）、３．５−３．３（ｍ，２Ｈ）、３．０７（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝５Ｈｚ，１４Ｈｚ）、２．９２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５Ｈｚ，１６Ｈｚ）、２．８６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝２Ｈｚ）、２．８５−２．７５（ｍ，１Ｈ）、２．６−２．４（ｍ，２Ｈ）、２．２−１．６（ｍ，４Ｈ）。ＩＲ（ｍｕｌｌ）２９００，２１００，１４５０，１３００ｃｍ−１。ＥＳＩＭＳ  ４９７．４（［Ｍ＋Ｈ］，１００％）、９９３．４（［２Ｍ＋Ｈ］，５０％）。イオン源フラグメンテーションを用いるＥＳＩＭＳ：５１９．３（［Ｍ＋Ｎａ］，１００％）、４９１．３（１００％）、４８０．１（［Ｍ−ＮＨ２］，９０％）、４５２．２（［Ｍ−ＮＨ２−ＣＯ］，２０％）、４２４．２（２０％）、３８５．１（［Ｍ−Ｐｒａ］，５０％）、３５７．１（［Ｍ−Ｐｒａ−ＣＯ］，４０％），２３８．０（［Ｍ−Ｐｒａ−Ｐｈｅ］，１００％）。
【０２２８】
アジドアセチル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒａ−ＮＨ２の環化
【０２２９】
【化８９】
0005508711.tif 000078
アジドアセチルペプチド（３１ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）をＭｅＣＮ（３０ｍＬ）に溶解させた。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、１ｍＬ）およびＣｕ（ＭｅＣＮ）４ＰＦ６（１ｍｇ）を加えた。１．５時間にわたって撹拌した後、溶液をエバポレートし、生じた残渣を２０％ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏに採った。不溶の塩を除去するための遠心分離の後、溶液を分取用逆相ＨＰＬＣに供した。所望の環式ペプチドを、白色の固形物（１０ｍｇ、３２％）として単離した。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：８．２８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５Ｈｚ）、７．７７（ｓ，１Ｈ）、７．２−６．９（ｍ，９Ｈ）、４．９８（ｍ，２Ｈ）、４．４８（ｍ，１Ｈ）、４．２８（ｍ，１Ｈ）、４．１−３．９（ｍ，２Ｈ）、３．６３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５Ｈｚ，１６Ｈｚ）、３．３３（ｍ，２Ｈ），３．０（ｍ，３Ｈ），２．４８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ，１４Ｈｚ）、１．７５（ｍ，１Ｈ０，１．５５（ｍ，１Ｈ）、１．３２（ｍ，１Ｈ）、１．０５（ｍ，１Ｈ）。ＩＲ（ｍｕｌｌ）２９００，１４７５，１４００ｃｍ−１。ＥＳＩＭＳ  ４９７．２（［Ｍ＋Ｈ］，１００％）、９９３．２（［２Ｍ＋Ｈ］，３０％）、１０１５．２（［２Ｍ＋Ｎａ］，１５％）。イオン源フラグメンテーションを用いるＥＳＩＭＳ：５３５．２（７０％）、５１９．３（［Ｍ＋Ｎａ］，１００％），４９７．２（［Ｍ＋Ｈ］，８０％），４８０．１（［Ｍ−ＮＨ２］，３０％），４５２．２（［Ｍ−ＮＨ２−ＣＯ］，４０％），２０８．１（６０％）。
【０２３０】
アジドアセチル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒａ−Ｇｌｙ−ＯＨの調製：
０．３ｍｍｏｌのグリシン−Ｗａｎｇ樹脂を用いて、示された配列を、Ｆｍｏｃで保護されたアミノ酸および活性化物質としてのＨＡＴＵを用いて合成した。アジド酢酸を最後のカップリング工程で用いて、ペンタペプチドをキャップした。そのペプチドの切断を、５０％  ＴＦＡ／ＤＣＭを用いて、２時間に達成した。ＲＰ  ＨＰＬＣによる精製により、白色の固形物（８３ｍｇ、５０％）としてのペプチドを得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：８．４−７．９（ｍ，４Ｈ）、７．２（ｍ，５Ｈ）、４．７−４．２（ｍ，３Ｈ）、４．０−３．７（ｍ，４Ｈ）、３．５−３．３（ｍ，２Ｈ）、３．１（ｍ，１Ｈ）、２．９１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４Ｈｚ，１６Ｈｚ）、２．８４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝２．５Ｈｚ）、２．７８（ｍ，１Ｈ）、２．６−２．４（ｍ，２Ｈ）、２．２−１．６（ｍ，４Ｈ）。ＩＲ（ｍｕｌｌ）２９００，２１００，１４５０，１３５０ｃｍ−１。ＥＳＩＭＳ  ５５５．３（［Ｍ＋Ｈ］，１００％）。イオン源フラグメンテーションを用いるＥＳＩＭＳ：５７７．１（［Ｍ＋Ｎａ］，９０％）、５５５．３（［Ｍ＋Ｈ］，８０％）、４８０．１（［Ｍ−Ｇｌｙ］，１００％）、３８５．１（［Ｍ−Ｇｌｙ−Ｐｒａ］，７０％）、３５７．１（［Ｍ−Ｇｌｙ−Ｐｒａ−ＣＯ］，４０％）、２３８．０（［Ｍ−Ｇｌｙ−Ｐｒａ−Ｐｈｅ］，８０％）。
【０２３１】
アジドアセチル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒａ−Ｇｌｙ−ＯＨの環化：
ペプチド（３２ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）をＭｅＣＮ（６０ｍＬ）に溶解させた。ジイソプロピルエチルアミン（１ｍＬ）およびＣｕ（ＭｅＣＮ）４ＰＦ６（１ｍｇ）を加え、溶液を２時間にわたって撹拌した。溶媒をエバポレートし、粗生成物をＲＰ  ＨＰＬＣに供し、二量体および三量体を除去した。環式の単量体を無色のガラス（６ｍｇ、２０％）として単離した。ＥＳＩＭＳ  ５５５．６（［Ｍ＋Ｈ］，１００％）、１１０９．３（［２Ｍ＋Ｈ］，２０％）、１１３１．２（［２Ｍ＋Ｎａ］，１５％）。イオン源フラグメンテーションを用いるＥＳＩＭＳ：５５５．３（［Ｍ＋Ｈ］，１００％）、４８０．４（［Ｍ−Ｇｌｙ］，３０％）、４５２．２（［Ｍ−Ｇｌｙ−ＣＯ］，２５％）、４２４．５（［Ｍ−Ｇｌｙ−２ＣＯ］，１０％，環式構造でのみ可能）。
【０２３２】
線状のペプチドのＤＮＡへの結合体化：
化合物２（４５ｎｍｏｌ）を４５μＬのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．４；１５０ｍＭ）に溶解させた。４℃で線状ペプチド（ＤＭＦ中、１８μＬの１００ｍＭストック；１８０ｎｍｏｌ；４０当量）、続いて、ＤＭＴ−ＭＭ（水中、３．６μＬの５００ｍＭストック；１８０ｎｍｏｌ；４０当量）を加えた。２時間にわたって撹拌した後、ＬＣＭＳは反応の完了、および生成物がエタノール沈殿により単離されたことを示した。ＥＳＩＭＳ  １８２３．０（［Ｍ−３Ｈ］／３，２０％）、１３６７．２（［Ｍ−４Ｈ］／４，２０％）、１０９３．７（［Ｍ−５Ｈ］／５，４０％），９１１．４（［Ｍ−６Ｈ］／６，１００％）。
【０２３３】
環式ペプチドのＤＮＡへの結合体化：
化合物２（２０ｎｍｏｌ）を２０μＬのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．４；１５０ｍＭ）に溶解させた。４℃で線状ペプチド（ＤＭＦ中、８μＬの１００ｍＭストック；８０ｎｍｏｌ；４０当量）、続いて、ＤＭＴ−ＭＭ（水中、１．６μＬの５００ｍＭストック；８０ｎｍｏｌ；４０当量）を加えた。２時間にわたって撹拌した後、ＬＣＭＳは反応の完了、および生成物がエタノール沈殿により単離されたことを示した。ＥＳＩＭＳ  １８２３．０（［Ｍ−３Ｈ］／３，２０％）、１３６７．２（［Ｍ−４Ｈ］／４，２０％）、１０９３．７（［Ｍ−５Ｈ］／５，４０％）、９１１．４（［Ｍ−６Ｈ］／６，１００％）。
【０２３４】
ＤＮＡで連結されたペプチドの環化：
線状のペプチド−ＤＮＡ結合体（１０ｎｍｏｌ）を、ｐＨ８のリン酸ナトリウム緩衝液（１０μＬ、１５０ｍｍ）に溶解させた。室温で、各々４当量のＣｕＳＯ４、アスコルビン酸、およびＳｈａｒｐｌｅｓｓリガンドをすべて加えた（０．２μＬの２００ｍＭストック）。反応を一晩中続けた。ＲＰ  ＨＰＬＣは、線状のペプチド−ＤＮＡは存在せず、そして生成物は、真の環状ペプチド−ＤＮＡとともに溶出されたことを示した。二量体および他のオリゴマーの痕跡は全く観察されなかった。
【０２３５】
【化９０】
0005508711.tif 000079
（実施例６：芳香族求核置換反応の機能的部分の合成への適用）
塩化シアヌルを用いる化合物３のアリール化のための一般的手順
化合物２を、濃度１ｍＭで、ｐＨ９．４のホウ酸ナトリウム緩衝液に溶解させた。溶液を４℃まで冷却し、次に２０当量の塩化シアヌルを、ＭｅＣＮ中５００ｍＭ溶液として加えた。２時間後、反応の完了をＬＣＭＳにより確認し、生じたジクロロトリアジン−ＤＮＡ結合体をエタノール沈殿により単離する。
【０２３６】
ジクロロトリアジン−ＤＮＡのアミン置換のための手順
ジクロロトリアジン−ＤＮＡ結合体を、１ｍＭの濃度で、ｐＨ９．５のホウ酸緩衝液に溶解させる。室温で、４０当量の脂肪族アミンをＤＭＦ溶液として加える。反応をＬＣＭＳにより追跡し、通常は２時間後に完了する。生じたアルキルアミノ−モノクロロトリアジン−ＤＮＡ結合体を、エタノール沈殿により単離する。
【０２３７】
モノクロロトリアジン−ＤＮＡのアミン置換のための手順
アルキルアミノ−モノクロロトリアジン−ＤＮＡ結合体を、１ｍＭの濃度で、ｐＨ９．５のホウ酸緩衝液に溶解させる。４２℃で、４０当量の第二級脂肪族アミンを、ＤＭＦ溶液として加える。反応をＬＣＭＳにより追跡し、通常は２時間後に完了する。生じたジアミノトリアジン−ＤＮＡ結合体を、エタノール沈殿により単離する。
【０２３８】
（実施例７：還元アミノ化反応の機能的部分合成への適用）
アルデヒド構成要素による第二級アミンを含むＤＮＡ−リンカーの還元アミノ化の一般的手順：
化合物２をＮ末端プロリン残基に結合させた。生じた化合物をリン酸ナトリウム緩衝液(５０μＬ、１５０ｍＭ、ｐＨ５．５)に、１ｍＭの濃度で溶解させた。この溶液に、４０当量の、ＤＭＦ中アルデヒド構成要素（８μＬ、０．２５Ｍ）およびＤＭＦ中ナトリウムシアノボロヒドリド（８μＬ、０．２５Ｍ）をそれぞれ加え、溶液を２時間にわたって８０℃で加熱した。アルキル化の後、溶液をエタノール沈殿により精製した。
【０２３９】
アミン構成要素によるアルデヒドを含むＤＮＡ−リンカーの還元アミノ化の一般的手順：
アルデヒド基を含む構成要素に結合させた化合物２を、リン酸ナトリウム緩衝液(５０μＬ、２５０ｍＭ、ｐＨ５．５)に、１ｍＭの濃度で溶解させた。この溶液に、４０当量の、ＤＭＦ中アミン構成要素（８μＬ、０．２５Ｍ）およびＤＭＦ中ナトリウムシアノボロヒドリド（８μＬ、０．２５Ｍ）をそれぞれ加え、溶液を２時間にわたって８０℃で加熱した。アルキル化の後、溶液をエタノール沈殿により精製した。
【０２４０】
（実施例８：ペプトイド構築反応の機能的部分合成への適用）
ＤＮＡ−リンカー上のペプトイド合成に関する一般的手順
【０２４１】
【化９１】
0005508711.tif 000080
化合物２を、ホウ酸ナトリウム緩衝液(５０μＬ、１５０ｍＭ、ｐＨ９．４)に、１ｍＭの濃度で溶解させ、４℃まで冷やした。この溶液に、４０当量の、ＤＭＦ中Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルブロモアセテート(１３μＬ、０．１５Ｍ)を加え、溶液を４℃で２時間にわたって緩やかに振とうした。アシル化の後、ＤＮＡ−リンカーをエタノール沈殿により精製し、ホウ酸ナトリウム緩衝液(５０μＬ、１５０ｍＭ、ｐＨ９．４)に、１ｍＭの濃度で再溶解させ、４℃まで冷やした。この溶液に、４０当量のＤＭＦ中アミン構成要素（１３μＬ、０．１５Ｍ）を加え、溶液を４℃で１６時間にわたって緩やかに振とうした。アルキル化の後に、そのＤＮＡ−リンカーをエタノール沈殿により精製し、ホウ酸ナトリウム緩衝液(５０μＬ、１５０ｍＭ、ｐＨ９．４)に、１ｍＭの濃度で再溶解させ、４℃まで冷やした。ペプトイド合成を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルブロモアセテートの段階的な添加により続け、その後アミン構成要素を添加する。
【０２４２】
（実施例９：アジド−アルキン付加環化反応の機能的部分合成への適用）
一般的手順
アルキンを含むＤＮＡ結合体を、約１ｍＭの濃度で、ｐＨ８．０のリン酸緩衝液に溶解させる。この混合物に、１０当量の有機アジドおよび５当量の硫酸銅（ＩＩ）、５当量のアスコルビン酸、および５当量のリガンド（トリス−（（１−ベンジルトリアゾール−４−イル）メチル）アミンをそれぞれ、すべて室温で加える。反応をＬＣＭＳにより追跡し、通常は１〜２時間後に完了する。生じたトリアゾール−ＤＮＡ結合体は、エタノール沈殿により単離され得る。
【０２４３】
（実施例１０：コード化ライブラリー内からのＡＢ１キナーゼに対するリガンドの同定）
望ましくないライブラリーメンバーを超えて、ＤＮＡでコードされたライブラリー中で、関心を引く分子を富化する能力は、関心を引く治療標的に対する定められた特性を有する化合物を同定することに卓越する。この富化能力を証明するために、ｒｈＡｂ１キナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ０７５６３）への公知の結合分子（Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５，３９９−４０１（２００４）（本明細書中に参考として援用される）に記載される）を合成した。この化合物を、実施例１および実施例２に記述した方法により生成される分子と類似の分子（オリゴヌクレオチドに連結した機能的部分）を生成するために、標準化学方法を用いて、前述の実施例に記述したリンカーにより、二本鎖オリゴヌクレオチドに結合させた。実施例２に記述した通りに一般的に生成されるライブラリーおよび、ＤＮＡと連結したＡｂ１キナーゼ結合剤は、両方の種のｑＰＣＲ分析を可能にする独特のＤＮＡ配列で設計した。そのＤＮＡと連結したＡｂ１キナーゼを、ライブラリーと１：１０００の比で混合した。この混合物をｒｈＡｂｌｅキナーゼと平衡化させ、酵素を固相上に捕捉し、結合していないライブラリーのメンバーを除去するために洗浄し、結合分子を溶出した。溶出液中のライブラリー分子とＤＮＡで連結されたＡｂ１キナーゼの比は、１：１であった。これは、１０００倍過剰なライブラリー分子中で、ＤＮＡで結合されたＡｂ１キナーゼ結合剤の５００倍より大きい富化を示している。
【０２４４】
（等価物）
当業者は、定型にすぎない実験を用いて、本明細書中に記載された本発明の特定の実施形態への多くの等価物を認識するか、または確かめることができる。そのような等価物は、上記の特許請求の範囲内に包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２４５】
【図１】図１は、二本鎖オリゴヌクレオチドのライゲーションの図式的な表現であり、ここで、元のオリゴヌクレオチドは、入来オリゴヌクレオチドのオーバーハングと相補的であるオーバーハングを有する。元の鎖は、遊離であるか、アミノヘキシルリンカーに結合体化されるか、アミノヘキシルリンカーを介してフェニルアラニン残基に結合体化されるかのいずれかとして表現される。
【図２】図２は、スプリント鎖を用いるオリゴヌクレオチドのライゲーションの図式的な表現である。この実施形態において、スプリントは、一本鎖の元のオリゴヌクレオチドおよび一本鎖の入来オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する１２マーのオリゴヌクレオチドである。
【図３】図３は、元のオリゴヌクレオチドが共有結合された鎖を有する二本鎖であり、入来オリゴヌクレオチドが二本鎖である場合、元のオリゴヌクレオチドおよび入来オリゴヌクレオチドのライゲーションの図式的な表現である。
【図４】図４は、ポリメラーゼを用いるオリゴヌクレオチド伸長の図式的な表現である。元の鎖は、遊離であるか、アミノヘキシルリンカーに結合体化されるか、アミノヘキシルリンカーを介してフェニルアラニン残基に結合体化されるかのいずれかとして表現される。
【図５】図５は、本発明の一つの実施形態の合成サイクルの図式的な表現である。
【図６】図６は、本発明のライブラリーを用いる多数のラウンドの選択プロセスの図式的な表現である。
【図７】図７は、実施例１で記述されたサイクル１〜５のそれぞれ、および次の近接プライマーのライゲーションの産物の電気泳動から得られるゲルである。分子量の標準がレーン１に示され、ＤＮＡ定量のためのＨｙｐｅｒｌａｄｄｅｒの表示される量が、レーン９〜１２に示される。
【図８】図８は、アジド−アルキン付加環化を用いる構成要素のカップリングの描写である。
【図９】図９は、芳香族求核置換を介する、塩素化トリアジンへ上への構成要素のカップリングを説明している。
【図１０】図１０は、芳香族求核置換を介する、塩素化トリアジンへ上への構成要素のカップリングを説明している。
【図１１】図１１は、機能的部分の合成に使用するために適切な塩素化されたヘテロ芳香族の構造を示す。
【図１２】図１２は、アジド／アルキン付加環化反応を用いる線状のペプチドの環化を示す。
【図１３】図１３ａは、サイクル４の後の実施例２で記述される通りに産生されたライブラリーのクロマトグラフである。図１３ｂは、サイクル４の後の実施例２で記述される通りに産生されたライブラリーのマススペクトルである。
【図１】
0005508711.tif 000085
【図２】
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【図３】
0005508711.tif 000087
【図４】
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【図５】
0005508711.tif 000089
【図６】
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【図７】
0005508711.tif 000091
【図８】
0005508711.tif 000092
【図９】
0005508711.tif 000093
【図１０】
0005508711.tif 000094
【図１１】
0005508711.tif 000095
【図１２】
0005508711.tif 000096
【図１３】
0005508711.tif 000097
【配列表】
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