(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害する必要のある被験体においてＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するための組成物であって、ある量のＭＡＳＰ−２阻害薬剤を含み、該ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、全長成熟ＭＡＳＰ−２ポリペプチドに結合するが、ＣＵＢＩ−ＥＧＦ−ＣＵＢＩＩドメインからなるＭＡＳＰ−２  Ｎ末端フラグメントに結合せず、しかもＣＣＰＩＩ−ＳＰドメインからなるＭＡＳＰ−２  Ｃ末端フラグメントに結合しないヒト抗ＭＡＳＰ−２抗体またはそのフラグメントを含み、該ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、Ｃ１ｑ依存性の補体活性化を実質的に阻害せずに、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を選択的に阻害するのに有効である、組成物。
【請求項２】
前記抗ＭＡＳＰ−２抗体またはそのフラグメントが、該抗ＭＡＳＰ−２抗体またはそのフラグメントが補体系において異なる抗原に結合するよりも少なくとも１０倍高い親和性で、全長成熟ＭＡＳＰ−２ポリペプチドに特異的に結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗ＭＡＳＰ−２抗体またはそのフラグメントがモノクローナル抗体もしくは組換え抗体であるか、または該抗体が低下したエフェクター機能を有するか、または該抗体がＭＡＳＰ−２欠損トランスジェニック動物において産生される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
治療有効量の請求項１に記載のＭＡＳＰ−２阻害薬剤および薬学的に許容可能なキャリアを含む、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するための組成物。
【請求項５】
ＭＡＳＰ−２依存性の補体媒介性状態に罹患する哺乳動物被験体においてＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化の作用の阻害において使用するための医薬を製造する方法であって、薬学的キャリア中に治療有効量の請求項１に記載のＭＡＳＰ−２阻害薬剤を組み合わせる工程を含む、方法。
【請求項６】
請求項１または請求項４に記載の組成物であって、前記ＭＡＳＰ−２阻害薬剤の量は、
（ｉ）ＭＡＳＰ−２依存性の補体媒介性血管状態に罹患している被験体を処置するため；または
（ｉｉ）虚血−再灌流損傷に関連するＭＡＳＰ−２依存性の補体媒介性状態に罹患している被験体を処置するため；または
（ｉｉｉ）アテローム性動脈硬化症を処置および／または予防する必要のある被験体においてアテローム性動脈硬化症を処置および／または予防するため；または
（ｉｖ）炎症性胃腸障害に関連するＭＡＳＰ−２依存性の補体媒介性状態に罹患している被験体を処置するため；または
（ｖ）ＭＡＳＰ−２依存性の補体媒介性の肺の状態に罹患している被験体を処置するため；または
（ｖｉ）体外再灌流手技を受けたことがあるか、受けているか、または受けることになっている被験体を処置するため；または
（ｖｉｉ）ＭＡＳＰ−２依存性の補体媒介性筋骨格状態に罹患している被験体を処置するため；または
（ｖｉｉｉ）ＭＡＳＰ−２依存性の補体媒介性腎臓状態に罹患している被験体を処置するため；または
（ｉｘ）ＭＡＳＰ−２依存性の補体媒介性皮膚状態に罹患している被験体を処置するため；または
（ｘ）臓器または組織の移植手技を受けたことがあるか、受けているか、または受けることになっている被験体を処置するため；または
（ｘｉ）神経系の障害または損傷に関連するＭＡＳＰ−２依存性の補体媒介性状態に罹患している被験体を処置するため；または
（ｘｉｉ）血液障害に関連するＭＡＳＰ−２依存性の補体媒介性状態に罹患している被験体を処置するため；または
（ｘｉｉｉ）尿生殖器状態に関連するＭＡＳＰ−２依存性の補体媒介性状態に罹患している被験体を処置するため；または
（ｘｉｖ）非肥満糖尿病（１型糖尿病またはインスリン依存性真性糖尿病）および／または１型糖尿病もしくは２型（成人発症型）糖尿病に関連する合併症に関連するＭＡＳＰ−２依存性の補体媒介性状態に罹患している被験体を処置するため；または
（ｘｖ）化学療法処置および／または放射線治療を受けたことがあるか、受けているか、または受けることになっている被験体を処置するため；または
（ｘｖｉ）悪性腫瘍に罹患している被験体を処置するため；または
（ｘｖｉｉ）内分泌障害に罹患している被験体を処置するため；または
（ｘｖｉｉｉ）加齢性黄斑変性症に罹患している被験体を処置するため、
に有効である、組成物。
【請求項７】
前記血管状態は、心臓血管状態、脳血管状態、末梢の血管状態、腎血管状態、腸間膜／腸血管状態、移植片および／または再移植片への血管再生、血管炎、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病性腎炎、全身性エリテマトーデス関連血管炎、関節リウマチに関連する血管炎、免疫複合体血管炎、高安病、拡張型心筋症、糖尿病性血管障害、川崎病（動脈炎）、静脈ガス塞栓（ＶＧＥ）ならびにステント留置後、回転性アテレクトミー後および経皮的経管的冠状動脈形成術（ＰＴＣＡ）後の再狭窄からなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記虚血−再灌流損傷は、大動脈瘤修復術、心肺バイパス術、臓器移植片と接続する血管再吻合および／または端／指の再移植、脳卒中、心筋梗塞、ならびにショック後および／または外科的手技後の血流力学的蘇生の少なくとも１つに関連する、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記炎症性胃腸障害は、膵炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群および憩室炎からなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
前記肺の状態は、急性呼吸窮迫症候群、輸血関連急性肺損傷、虚血／再灌流急性肺損傷、慢性閉塞性肺疾患、喘息、ウェゲナー肉芽腫症、抗糸球体基底膜疾患（グッドパスチャー病）、胎便吸引症候群、閉塞性細気管支炎症候群、特発性肺線維症、熱傷に続発する急性肺損傷、非心原性肺浮腫、輸血関連呼吸抑制および気腫からなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項１１】
前記体外再灌流手技は、血液透析、プラスマフェレーシス、白血球フェレーシス、体外膜型肺（ＥＣＭＯ）、ヘパリン誘導性体外膜型酸素付加ＬＤＬ沈降法（ＨＥＬＰ）および心肺バイパス術（ＣＰＢ）からなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項１２】
前記筋骨格状態は、変形性関節症、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、痛風、神経障害性関節症、乾癬性関節炎、脊椎関節症、結晶性関節症、筋ジストロフィおよび全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）からなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項１３】
前記腎臓状態は、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、膜性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎（メサンギウム毛細血管性糸球体腎炎）、急性感染後糸球体腎炎（レンサ球菌感染後糸球体腎炎）、クリオグロブリン血症性糸球体腎炎、ループス腎炎、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病性腎炎およびＩｇＡ腎症からなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項１４】
前記皮膚状態は、乾癬、自己免疫性水疱性皮膚疾患、好酸球性海綿状態、水疱性類天疱瘡、後天性表皮水疱症、妊娠性疱疹、熱傷損傷および化学的熱傷損傷からなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項１５】
前記移植手技は、臓器同種移植、臓器異種移植臓器および組織移植片からなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項１６】
前記神経系の障害または損傷は、多発性硬化症、重症筋無力症、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、ギランバレー症候群、脳卒中後の再灌流、変性円板、大脳外傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、ミラー−フィッシャー症候群、大脳外傷および／または大脳出血、脱髄ならびに髄膜炎からなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項１７】
前記血液障害は、敗血症、重篤な敗血症、敗血症性ショック、敗血症から生じる急性呼吸窮迫症候群、全身性炎症反応症候群、出血性ショック、溶血性貧血、自己免疫性の血栓性血小板減少性紫斑病および溶血性尿毒症症候群からなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記尿生殖器状態は、有痛性膀胱疾患、感覚性膀胱疾患、非細菌性慢性膀胱炎、間質性膀胱炎、不妊症、胎盤機能不全ならびに流産および子癇前症からなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記１型糖尿病もしくは２型糖尿病に関連する合併症は、血管障害、ニューロパシーおよび網膜症からなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項２０】
前記内分泌障害は、橋本甲状腺炎、ストレス、不安、下垂体からのプロラクチン、成長因子または他のインスリン様成長因子およびアドレノコルチコトロピンの制御された放出に関与するホルモン障害からなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
本願は、米国特許法の下で米国仮特許出願第６０／５７８，８４７号（２００４年６月１０日出願）の利益を主張し、米国特許法の下で優先権を主張する米国特許出願第１１／１５０，８８３号（２００５年６月９日出願）の一部継続出願であり、そしてまた米国仮特許出願６０／７８８，８７５号（２００６年４月３日出願）に基づく利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化の有害作用を阻害する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
補体系は、微生物感染および他の急性の侵襲に対する炎症性反応を開始および増幅する、初期に作用する機構をもたらす（非特許文献１）。補体活性化は、潜在的な病原体に対する重要な第１線の防御を提供するが、保護的な炎症性反応を促進する補体の活性は、宿主に対する潜在的な脅威でもあり得る（非特許文献２；非特許文献３）。例えば、Ｃ３タンパク分解産物およびＣ５タンパク分解産物は、好中球を補充し、活性化する。これらの活性化された細胞は、破壊性酵素を放出において無差別であり、臓器の損傷を引き起こし得る。さらに、補体活性化は、宿主細胞の近傍、ならびに微生物の標的上において溶解性補体成分の沈着を引き起こし得、その結果、宿主細胞が溶解される。
【０００４】
補体系は、心筋梗塞、脳卒中後の血管再生、ＡＲＤＳ、再灌流損傷、敗血症性ショック、熱傷後の毛細血管漏出、心肺バイパス術後の炎症、移植片拒絶、関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症およびアルツハイマー病を含む、多くの急性および慢性の疾患状態の病原の１つとして意味づけられている。これらの病状のほとんどすべてにおいて、補体は、原因ではないが、病原に関与するいくつかの因子のうちの１つである。それにもかかわらず、補体活性化は、主要な病理学的機構であり得、これらの疾患状態の多くにおいて、臨床上の管理に関する有効な事項である。種々の疾患状態における補体媒介性の組織損傷の重要性の認識が高まることにより、有効な補体阻害薬物に対する必要性が強調される。補体活性化を特異的に標的化して阻害する薬物のうちで、ヒトに対する使用が承認されたものはない。
【０００５】
現在、補体系が、３つの別々の経路：古典経路、レクチン経路および副経路を介して活性化され得ることは、広く認知されている。通常、古典経路は、外来性粒子（すなわち、抗原）に結合した抗体によって誘発され、したがって、特異的抗体を産生するためには抗原への事前の曝露が必要である。古典経路の活性化は、免疫応答の発展に関連するので、古典経路は、獲得免疫系の一部である。対照的に、レクチン経路と副経路の両方は、クローン免疫（ｃｌｏｎａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）とは無関係であり、先天性免疫系の一部である。
【０００６】
古典経路の活性化における第１段階は、特異的な認識分子Ｃ１ｑが、抗原と結合したＩｇＧおよびＩｇＭに結合することである。この補体系の活性化によって、セリンプロテアーゼチモーゲンの連続的な活性化がもたらされる。Ｃ１ｑは、Ｃ１と呼ばれる複合体として、Ｃ１ｒおよびＣ１ｓセリンプロテアーゼプロ酵素と会合し、そしてＣ１ｑが免疫複合体と結合すると、Ｃ１ｒのＡｒｇ−Ｉｌｅ部位が自己タンパク分解性切断され、その後、Ｃ１ｓがＣ１ｒを活性化させ、それによって、Ｃ４およびＣ２を切断する能力を獲得する。Ｃ４が２つのフラグメント（Ｃ４ａおよびＣ４ｂと命名されている）に切断されることにより、Ｃ４ｂフラグメントが、隣接するヒドロキシル基またはアミノ基と共有結合を形成することができるようになり、続いて、活性化Ｃ２のＣ２ｂフラグメントとの非共有結合性の相互作用によってＣ３コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ｂ）を生成することができるようになる。Ｃ３コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ｂ）は、Ｃ３を活性化することにより、Ｃ５コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ｂ３ｂ）の生成および微生物の溶解を引き起こし得る細胞膜傷害複合体（Ｃ５ｂ−９）の形成がもたらされる。Ｃ３およびＣ４（Ｃ３ｂおよびＣ４ｂ）の活性型は、複数の貪食細胞上の補体レセプターによって認識される外来性の標的表面上に共有結合的に沈着する。
【０００７】
上記とは無関係に、レクチン経路による補体系の活性化における第１段階もまた、特異的な認識分子の結合に続く関連するセリンプロテアーゼの活性化である。しかしながら、レクチン経路における認識分子は、Ｃ１ｑによる免疫複合体の結合ではなく、炭水化物結合タンパク質（マンナン結合レクチン（ＭＢＬ）、Ｈ−フィコリン、Ｍ−フィコリンおよびＬ−フィコリン）である（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。Ｉｋｅｄａらは、Ｃ１ｑと同様に、ＭＢＬが、酵母マンナン被覆赤血球に結合するとＣ４依存性様式において補体系を活性化することができることを初めて証明した（非特許文献７）。コレクチンタンパク質ファミリーのメンバーであるＭＢＬは、ピラノース環の赤道方向に配向した３−ヒドロキシ基および４−ヒドロキシ基によって炭水化物と結合するカルシウム依存性レクチンである。従って、ＭＢＬに対する卓越したリガンドは、Ｄ−マンノースおよびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンであるが、この立体的な要件を満たさない炭水化物は、ＭＢＬに対して検出可能な親和性を有しない（非特許文献８）。ＭＢＬと一価の糖との相互作用は、非常に弱く、解離定数は、代表的には２ｍＭ程度である。ＭＢＬは、複数の単糖残基との相互作用によってグリカンリガンドに対する堅固で特異的な結合を同時に達成する（非特許文献９）。ＭＢＬは、通常、微生物（例えば、細菌、酵母、寄生生物およびある特定のウイルス）が有する炭水化物パターンを認識する。対照的に、ＭＢＬは、哺乳動物の血漿中の糖タンパク質および細胞表面糖タンパク質の上に存在する「成熟した」複雑な複合糖質が通常有する、末端から２番目の糖ならびに末端の糖であるＤ−ガラクトースおよびシアル酸を認識しない。この結合特異性は、自己活性化からの保護を助けていると考えられている。しかしながら、ＭＢＬは、哺乳動物細胞の小胞体およびゴルジ内に隔離されたＮ結合型糖タンパク質および糖脂質の上の高マンノース「前駆体」グリカンの集団と高い親和性で結合する（非特許文献１０）。したがって、損傷した細胞は、ＭＢＬ結合を介してレクチン経路活性化に対する標的となり得る。
【０００８】
フィコリンは、フィブリノゲン様ドメインと呼ばれる、ＭＢＬとは異なるタイプのレクチンドメインを有する。フィコリンは、Ｃａ＋＋非依存性様式で糖残基と結合する。ヒトにおいては、３種類のフィコリン、すなわち、Ｌ−フィコリン、Ｍ−フィコリンおよびＨ−フィコリンが同定されている。血清フィコリンであるＬ−フィコリンおよびＨ−フィコリンの両方が、共通してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンに対する特異性を有する；しかしながら、Ｈ−フィコリンは、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンとも結合する。Ｌ−フィコリンとＨ−フィコリンとＭＢＬとの糖特異性の違いは、様々なレクチンが相補的であり得、異なるが重複する複合糖質を標的化し得ることを意味する。この概念は、Ｌ−フィコリンだけが、すべてのグラム陽性細菌上に見られる細胞壁複合糖質であるリポテイコ酸に特異的に結合するという、レクチン経路における公知のレクチンに関する最近の報告によって支持されている（非特許文献１１）。コレクチン（すなわち、ＭＢＬ）およびフィコリンは、アミノ酸配列に有意な類似性を有しない。しかしながら、この２群のタンパク質は、類似のドメイン組成を有し、そして、Ｃ１ｑと同様に、複数部位での結合の可能性を最大にするオリゴマー構造に構築されている。ＭＢＬの血清濃度は、健常集団において非常に変動するものであり、これは、ＭＢＬ遺伝子のプロモーターおよびコード領域の両方における多型／変異によって遺伝的に制御されている。急性期タンパク質として、ＭＢＬの発現は、炎症中にさらにアップレギュレートされる。Ｌ−フィコリンは、ＭＢＬと同様の濃度で血清中に存在する。したがって、レクチン経路のＬ−フィコリンアームは、潜在的にＭＢＬアームに匹敵する強度である。ＭＢＬおよびフィコリンは、オプソニンとしても機能し得るが、このオプソニンには、これらのタンパク質と貪食細胞レセプターとの相互作用が必要である（非特許文献１２；非特許文献１３）。しかしながら、食細胞上のレセプターのアイデンティティーは確立されていない。
【０００９】
ヒトＭＢＬは、そのコラーゲン様ドメインを介して、ＭＢＬ関連セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）と呼ばれる、固有のＣ１ｒ／Ｃ１ｓ様セリンプロテアーゼとの特異的かつ高親和性の相互作用を形成する。現在までに、３つのＭＡＳＰが、報告されている。初めに、単一酵素「ＭＡＳＰ」が同定され、補体カスケードの開始（すなわち、Ｃ２およびＣ４の切断）に関与する酵素として特徴付けられた（非特許文献１４）。後に、ＭＡＳＰは、２つのプロテアーゼ：ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−２の混合物であるという事実が判明した（非特許文献１５）。しかしながら、補体活性化にはＭＢＬ−ＭＡＳＰ−２複合体単独で十分であることが証明された（非特許文献１６）。さらに、ＭＡＳＰ−２のみが、高い割合でＣ２およびＣ４を切断した（非特許文献１７）。したがって、ＭＡＳＰ−２は、Ｃ３コンバターゼであるＣ４ｂ２ｂを生成するＣ４およびＣ２の活性化を担うプロテアーゼである。これは、２つの特異的なセリンプロテアーゼ（Ｃ１ｒおよびＣ１ｓ）の協調作用によって補体系の活性化がもたらされるＣ１複合体とは著しく異なるものである。近年、第３の新規プロテアーゼであるＭＡＳＰ−３が単離された（非特許文献１８）。ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−３は、同じ遺伝子が選択的スプライシングされた産物である。ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−３の生物学的機能は、依然として解明されていない。
【００１０】
ＭＡＳＰは、Ｃ１複合体の酵素成分であるＣ１ｒおよびＣ１ｓの組成と同一のドメイン組成を共有する（非特許文献１９）。これらのドメインとしては、Ｎ末端のＣ１ｒ／Ｃ１ｓ／ウニＶｅｇｆ／骨形態形成タンパク質（ＣＵＢ）ドメイン、上皮成長因子様ドメイン、第２ＣＵＢドメイン、タンデム型の補体制御タンパク質ドメインおよびセリンプロテアーゼドメインが挙げられる。Ｃ１プロテアーゼにおけるように、ＭＡＳＰ−２の活性化は、セリンプロテアーゼドメインに隣接したＡｒｇ−Ｉｌｅ結合の切断によって生じ、それにより、その酵素が、ジスルフィド結合したＡ鎖およびＢ鎖（後者は、セリンプロテアーゼドメインからなる）に分離する。最近、ＭＡＳＰ−２の遺伝的欠損が報告された（非特許文献２０）。単一のヌクレオチドの変異により、ＣＵＢ１ドメインにおけるＡｓｐ−Ｇｌｙ交換が生じ、ＭＡＳＰ−２は、ＭＢＬに結合できなくなる。
【００１１】
ＭＢＬは、１９ｋＤａのＭＢＬ関連タンパク質（ＭＡｐ１９）（非特許文献２１）または低分子ＭＢＬ関連タンパク質（ｓＭＡＰ）（非特許文献２２）と呼ばれる非酵素的タンパク質とも会合する。ＭＡｐ１９は、ＭＡＳＰ２遺伝子産物の選択的スプライシングによって形成され、ＭＡＳＰ−２の最初の２つのドメイン、続いて配列外の４つの固有アミノ酸を含む。ＭＡＳＰ１遺伝子およびＭＡＳＰ２遺伝子は、それぞれ３番染色体および１番染色体上に位置する（非特許文献２３）。
【００１２】
いくつかの一連の証拠から、異なるＭＢＬ−ＭＡＳＰ複合体が存在し、血清中の全ＭＡＳＰのうちの大画分は、ＭＢＬと複合体形成しないことが示唆されている（非特許文献２４）。Ｈ−フィコリンおよびＬ−フィコリンの両方が、ＭＡＳＰと会合し、そしてＭＢＬと同様に、レクチン補体経路を活性化する（非特許文献１８；非特許文献２５）。レクチン経路および古典経路の両方が、共通のＣ３コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ｂ）を形成し、この２つの経路は、この段階において合流する。
【００１３】
レクチン経路は、感染に対する宿主防御において主要な役割を有すると広く考えられている。宿主防御におけるＭＢＬの関与の強力な証拠は、機能的ＭＢＬの血清レベルが低い患者の解析によるものである（非特許文献２６）。そのような患者は、再発性の細菌感染および真菌感染に対して感受性を示す。これらの症状は、通常、母性由来の抗体価が衰退するが、抗体応答の完全なレパートリーが発生する前の、明らかに無防備な時期の間の生後まもなくに明らかになる。この症候群は、ＭＢＬオリゴマーの適正な形成を干渉する、ＭＢＬのコラーゲン性部分におけるいくつかの部位における変異から生じることが多い。しかしながら、ＭＢＬは、補体とは無関係のオプソニンとして機能し得るので、感染症に対する罹患率の上昇が、補体活性化の障害に起因する程度は不明である。
【００１４】
非感染性ヒト疾患の病原が、補体古典経路および補体副経路の両方と関係するという広範な証拠が存在するが、レクチン経路の役割は、評価され始めたところである。最近の研究から、レクチン経路の活性化が、虚血／再灌流損傷における補体活性化および関連する炎症に関与し得るという証拠がもたらされた。Ｃｏｌｌａｒｄら（２０００）は、酸化ストレスに供された培養内皮細胞が、ＭＢＬに結合し、ヒト血清に曝露されたときにＣ３の沈着を示すと報告した（非特許文献２７）。さらに、遮断抗ＭＢＬモノクローナル抗体によるヒト血清の処理により、ＭＢＬ結合および補体活性化が阻害された。これらの知見は、心筋虚血再灌流のラットモデルにまで拡大され、そのモデルでは、ラットＭＢＬに対して産生された遮断抗体で処置されたラットは、コントロール抗体で処置されたラットよりも冠状動脈の閉塞時における心筋の損傷が有意に小さいことを示した（非特許文献２８）。酸化ストレス後の血管内皮へのＭＢＬ結合の分子機構は、不明である；最近の研究では、酸化ストレス後のレクチン経路の活性化は、複合糖質に対してではなく血管内皮サイトケラチンへのＭＢＬ結合によって媒介され得ることが示唆されている（非特許文献２９）。他の研究は、古典経路および副経路が虚血／再灌流損傷の病原に関わり、この疾患におけるレクチン経路の役割は、未だ議論の余地があるとしている（非特許文献３０）。
【００１５】
古典経路およびレクチン経路とは対照的に、Ｃ１ｑおよびレクチンが他の２経路において行う認識機能を果たす副経路のイニシエーターは、見出されていない。現在、副経路が、外来性表面または他の異常な表面（細菌、酵母、ウイルスに感染した細胞または損傷組織）によって自発的に開始されることが広く認識されている。副経路に直接関与する４つの血漿タンパク質が存在する：Ｃ３、Ｂ因子およびＤ因子ならびにプロパージン。副経路が機能するためには、ネイティブＣ３からのＣ３ｂのタンパク分解性の生成が必要である。副経路Ｃ３コンバターゼ（Ｃ３ｂＢｂ）は、必須のサブユニットとしてＣ３ｂを含むので、副経路における最初のＣ３ｂの起源に関する疑問が、不可解な問題をもたらし、相当な研究を刺激している。
【００１６】
Ｃ３は、チオエステル結合として知られている珍しい翻訳後修飾を含むタンパク質のファミリーに属している（Ｃ４およびα−２マクログロブリンとともに）。チオエステル基は、３アミノ酸離れたシステインのスルフヒドリル基に結合した末端カルボニル基を有するグルタミンから構成される。この結合は、不安定であり、グルタミンの求電子性のカルボニル基は、ヒドロキシル基またはアミノ基を介して他の分子と共有結合を形成し得る。チオエステル結合は、インタクトなＣ３の疎水性ポケット内に隔離されるとき、当然のことながら安定である。しかしながら、Ｃ３からＣ３ａおよびＣ３ｂへのタンパク分解性切断によって、Ｃ３ｂ上の高度に反応性であるチオエステル結合が露出し、この機構によって、Ｃ３ｂは、標的と共有結合的に結合する。Ｃ３ｂと補体標的との共有結合における十分に実証されている役割に加えて、Ｃ３チオエステルは、副経路を誘発する際の中心的役割を担うとも考えられている。広く認知されている「チックオーバー理論」によれば、副経路は、流体相コンバターゼであるｉＣ３Ｂｂの生成によって開始され、このｉＣ３Ｂｂは、加水分解されたチオエステル（ｉＣ３；Ｃ３（Ｈ２Ｏ））およびＢ因子とともにＣ３から形成される（非特許文献３１）。Ｃ３ｂ様ｉＣ３は、タンパク質中の内部チオエステルのゆっくりとした自発的な加水分解によってネイティブＣ３から生成される（非特許文献３２）。ｉＣ３Ｂｂコンバターゼの活性によって、Ｃ３ｂ分子が標的表面上に沈着され、それによって副経路が開始する。
【００１７】
副経路活性化のイニシエーターについて知られていることは、非常に少ない。アクチベーターとしては、酵母の細胞壁（ザイモサン）、多くの純粋な多糖類、ウサギ赤血球、ある特定の免疫グロブリン、ウイルス、真菌、細菌、動物腫瘍細胞、寄生生物および損傷細胞が挙げられると考えられている。これらのアクチベーターに共通する唯一の特徴は、炭水化物が存在することであるが、炭水化物構造の複雑さおよび多様性が原因で、認識される共有分子決定基を確立することが困難になっている。
【００１８】
生成される任意のＣ３ｂが、さらなる副経路Ｃ３コンバターゼ（Ｃ３ｂＢｂ）を形成する際にＢ因子に関与し得るので、副経路は、レクチン／古典経路Ｃ３コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ｂ）に対する強力な増幅ループをまたもたらし得る。副経路Ｃ３コンバターゼは、プロパージンと結合することによって安定化する。プロパージンは、副経路Ｃ３コンバターゼの半減期を６〜１０倍延長する。Ｃ３ｂをＣ３コンバターゼに付加することによって、副経路Ｃ５コンバターゼが形成される。
【００１９】
３つすべての経路（すなわち、古典経路、レクチン経路および副経路）は、Ｃ５において合流すると考えられており、Ｃ５は、切断されることにより、複数の炎症促進性作用を有する生成物を形成する。合流した経路は、終末補体経路と呼ばれている。Ｃ５ａは、平滑筋の変質および血管緊張ならびに血管透過性を誘導する最も強力なアナフィラトキシンである。Ｃ５ａは、好中球および単球の両方の強力なケモタキシン（ｃｈｅｍｏｔａｘｉｎ）およびアクチベーターでもある。Ｃ５ａ媒介性細胞活性化は、サイトカイン、加水分解性酵素、アラキドン酸代謝産物および反応性酸素種を含む、複数のさらなる炎症性メディエーターの放出を誘導することによって、炎症性反応を著しく増幅し得る。Ｃ５切断によって、細胞膜傷害複合体（ＭＡＣ）としても知られるＣ５ｂ−９が形成される。現在のところ、半分解性（ｓｕｂｌｙｔｉｃ）のＭＡＣ沈着が、溶解性の孔形成複合体としての役割に加えて、炎症において重要な役割を果たし得るという強力な証拠が存在する。
【非特許文献１】Ｍ．Ｋ．ＬｉｓｚｅｗｓｋｉおよびＪ．Ｐ．Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９３年，第３版，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
【非特許文献２】Ｋ．Ｒ．Ｋａｌｌｉら、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，１９９４年，第１５巻、ｐ．４１７−４３１
【非特許文献３】Ｂ．Ｐ．Ｍｏｒｇａｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．，１９９４年，第２４巻、ｐ．２１９−２２８
【非特許文献４】Ｊ．Ｌｕら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２００２年，第１５７２巻，ｐ．３８７−４００
【非特許文献５】Ｈｏｌｍｓｋｏｖら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３年，第２１巻，ｐ．５４７−５７８
【非特許文献６】Ｔｅｈら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０００年，第１０１巻，ｐ．２２５−２３２
【非特許文献７】Ｋ．Ｉｋｅｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８７年，第２６２巻，ｐ．７４５１−７４５４
【非特許文献８】Ｗｅｉｓ，Ｗ．Ｉ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９２年，第３６０巻，ｐ．１２７−１３４
【非特許文献９】Ｌｅｅ，Ｒ．Ｔ．ら、Ａｒｃｈｉｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１９９２年，第２９９巻，ｐ．１２９−１３６
【非特許文献１０】Ｍａｙｎａｒｄ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８２年，第２５７巻，ｐ．３７８８−３７９４
【非特許文献１１】Ｌｙｎｃｈ，Ｎ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００４年，第１７２巻，ｐ．１１９８−１２０２
【非特許文献１２】Ｋｕｈｌｍａｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９８９年，第１６９巻，ｐ．１７３３
【非特許文献１３】Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６年，第２７１巻，ｐ．２４４８−５４
【非特許文献１４】Ｊｉ，Ｙ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９３年，第１５０巻，ｐ．５７１−５７８
【非特許文献１５】Ｔｈｉｅｌ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９７年，第３８６巻，ｐ．５０６−５１０
【非特許文献１６】Ｖｏｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０００年，第１６５巻，ｐ．２０９３−２１００
【非特許文献１７】Ａｍｂｒｕｓ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３年，第１７０巻，ｐ．１３７４−１３８２
【非特許文献１８】Ｄａｈｌ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００１年，第１５巻，ｐ．１２７−３５
【非特許文献１９】Ｓｉｍ，Ｒ．Ｂ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，２０００年，第２８巻，ｐ．５４５
【非特許文献２０】Ｓｔｅｎｇａａｒｄ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｋ．ら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２００３年，第３４９巻，ｐ．５５４−５６０
【非特許文献２１】Ｓｔｏｖｅｒ，Ｃ．Ｍ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９９年，第１６２巻，ｐ．３４８１−９０
【非特許文献２２】Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｍ．ら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９９年，第１１巻，ｐ．８５９−８６３
【非特許文献２３】Ｓｃｈｗａｅｂｌｅ，Ｗ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２年，第２０５巻，ｐ．４５５−４６６
【非特許文献２４】Ｔｈｉｅｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０００年，第１６５巻，ｐ．８７８−８８７
【非特許文献２５】Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００２年，第１６８巻，ｐ．３５０２−３５０６
【非特許文献２６】Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ，Ｄ．Ｃ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２００２年，第１５７２巻，ｐ．４０１−４１３
【非特許文献２７】Ｃｏｌｌａｒｄ，Ｃ．Ｄ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，２０００年，第１５６巻，ｐ．１５４９−１５５６
【非特許文献２８】Ｊｏｒｄａｎ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００１年，第１０４巻，ｐ．１４１３−１４１８
【非特許文献２９】Ｃｏｌｌａｒｄ，Ｃ．Ｄ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，２００１年，第１５９巻，ｐ．１０４５−１０５４
【非特許文献３０】Ｒｉｅｄｅｒｍａｎｎ，Ｎ．Ｃ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，２００３年，第１６２巻，ｐ．３６３−３６７
【非特許文献３１】Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，１９８４年，第７巻，ｐ．１４３−１６２
【非特許文献３２】Ｐａｎｇｂｕｒｎ，Ｍ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９８１年，第１５４巻，ｐ．８５６−８６７
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
１つの態様において、本発明は、生存被験体においてＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化の有害作用を阻害する方法を提供する。この方法は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するのに有効な、ある量のＭＡＳＰ−２阻害薬剤を、そのような阻害の必要がある被験体に投与する工程を含む。この文脈において、句「ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化」とは、レクチン依存性ＭＡＳＰ−２系を介して生じる副経路の補体活性化のことをいう。本発明の別の態様において、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、古典経路すなわちＣ１ｑ依存性の系を介した補体活性化を実質的に阻害することなく、Ｃ１ｑ依存性の系が機能的なままでレクチン依存性ＭＡＳＰ−２系を介して補体活性化を阻害する。
【００２１】
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、抗ＭＡＳＰ−２抗体またはそのフラグメントである。さらなる実施形態において、抗ＭＡＳＰ−２抗体は、低いエフェクター機能を有する。いくつかの実施形態において、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、ＭＡＳＰ−２阻害性ペプチドまたは非ペプチドＭＡＳＰ−２インヒビターである。
【００２２】
別の態様において、本発明は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化の有害作用を阻害するための組成物を提供し、その組成物は、治療有効量のＭＡＳＰ−２阻害薬剤および薬学的に許容可能なキャリアを含む。ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化の有害作用を阻害する必要がある生存被験体におけるそのような阻害に使用するための医薬を製造するための方法もまた提供され、その方法は、薬学的キャリア中に治療有効量のＭＡＳＰ−２阻害薬剤を含む。本明細書中の以下に記載される状態、疾患および障害の各々を処置するために、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化の阻害において使用するための医薬を製造するための方法もまた提供される。
【００２３】
本発明の方法、組成物および薬物は、本明細書中にさらに記載されるような急性または慢性の病理学的な状態または損傷に罹患しているヒトを含む哺乳動物被験体においてインビボでのＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化の有害作用の阻害に有用である。そのような状態および損傷としては、関連する自己免疫障害および／または炎症状態におけるＭＡＳＰ−２媒介性の補体活性化が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
本発明の１つの態様において、虚血性再灌流（大動脈瘤修復術後、心肺バイパス術後、例えば、臓器移植片（例えば、心臓、肺、肝臓、腎臓）と接続する血管再吻合後および／または端／指の再移植後、脳卒中後、心筋梗塞後、ショック後および／または外科的手技後の血流力学的蘇生後の再灌流が挙げられるが、これらに限定されない）を経験している被験体を、薬学的キャリア中の治療有効量のＭＡＳＰ−２阻害薬剤で処置することによって、虚血再灌流損傷を処置するための方法が提供される。
【００２５】
本発明の１つの態様において、アテローム性動脈硬化症に罹患しているか、またはその傾向がある被験体を、薬学的キャリア中の治療有効量のＭＡＳＰ−２阻害薬剤で処置することによって、アテローム性動脈硬化症を阻害するための方法が提供される。
【００２６】
本発明の１つの態様において、血管状態（心臓血管状態、脳血管状態、末梢の（例えば、筋骨格の）血管状態、腎血管状態、腸間膜／腸血管状態ならびに移植片および／または再移植片への血管再生が挙げられるが、これらに限定されない）を経験している患者を治療有効量のＭＡＳＰ−２阻害薬剤で処置することによって、そのような被験体において、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するための方法が提供される。そのような状態としては、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病性腎炎、全身性エリテマトーデス関連血管炎、関節リウマチ（悪性関節リウマチとも呼ばれる）に関連する血管炎、免疫複合体血管炎および高安病を含む血管炎；拡張型心筋症；糖尿病性血管障害；川崎病（動脈炎）；静脈ガス塞栓（ｖｅｎｏｕｓ  ｇａｓ  ｅｍｂｏｌｕｓ）（ＶＧＥ）；および／またはステント留置後、回転性アテレクトミー後および／または経皮的経管的冠状動脈形成術（ＰＴＣＡ）後の再狭窄の処置が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
本発明の別の態様において、炎症性胃腸障害（膵炎、憩室炎および腸障害（クローン病、潰瘍性大腸炎および過敏性腸症候群を含む）が挙げられるが、これらに限定されない）に罹患している被験体において、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するための方法が提供される。
【００２８】
本発明の別の態様において、肺の状態（急性呼吸窮迫症候群、輸血関連急性肺損傷、虚血／再灌流急性肺損傷、慢性閉塞性肺疾患、喘息、ウェゲナー肉芽腫症、抗糸球体基底膜疾患（グッドパスチャー病）、胎便吸引症候群、閉塞性細気管支炎症候群、特発性肺線維症、熱傷に続発する急性肺損傷、非心原性肺浮腫、輸血関連呼吸抑制および気腫が挙げられるが、これらに限定されない）に罹患している被験体において、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するための方法が提供される。
【００２９】
本発明の別の態様において、体外再灌流手技（血液透析、プラスマフェレーシス、白血球フェレーシス（ｌｅｕｋｏｐｈｅｒｅｓｉｓ）、体外膜型肺（ＥＣＭＯ）、ヘパリン誘導性体外膜型酸素付加ＬＤＬ沈降法（ｈｅｐａｒｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｘｔｒａｃｏｒｐｏｒｅａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ  ＬＤＬ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）（ＨＥＬＰ）および心肺バイパス術（ＣＰＢ）が挙げられるが、これらに限定されない）を受けたことがあるか、受けているか、または受けることになっている被験体において、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するための方法が提供される。
【００３０】
本発明の別の態様において、筋骨格状態（変形性関節症、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、痛風、神経障害性関節症、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎もしくは他の脊椎関節症および結晶性関節症、筋ジストロフィまたは全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）が挙げられるが、これらに限定されない）に罹患している被験体において、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するための方法が提供される。
【００３１】
本発明の別の態様において、腎臓状態（メサンギウム増殖性糸球体腎炎、膜性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎（メサンギウム毛細血管性（ｍｅｓａｎｇｉｏｃａｐｉｌｌａｒｙ）糸球体腎炎）、急性感染後糸球体腎炎（レンサ球菌感染後糸球体腎炎）、クリオグロブリン血症性糸球体腎炎、ループス腎炎、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病性腎炎またはＩｇＡ腎症）が挙げられるが、これらに限定されない）に罹患している被験体において、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するための方法が提供される。
【００３２】
本発明の別の態様において、皮膚状態（乾癬、自己免疫性水疱性皮膚疾患、好酸球性海綿状態、水疱性類天疱瘡、後天性表皮水疱症および妊娠性疱疹ならびに他の皮膚障害が挙げられるが、これらに限定されない）または毛細血管漏出に関与する熱傷損傷もしくは化学的熱傷損傷からの皮膚障害に罹患している被験体において、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するための方法が提供される。
【００３３】
本発明の別の態様において、臓器移植または他の組織移植（全臓器（例えば、腎臓、心臓、肝臓、膵臓、肺、角膜など）もしくは移植片（例えば、弁、腱、骨髄など）の同種移植または異種移植が挙げられるが、これらに限定されない）を受けたことがある被験体において、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するための方法が提供される。
【００３４】
本発明の別の態様において、中枢神経系の障害もしくは損傷または末梢神経系の障害もしくは損傷（多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症（ＭＧ）、ハンチントン病（ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ギランバレー症候群、脳卒中後の再灌流、変性円板（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｃｓ）、大脳外傷、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、ミラー−フィッシャー症候群、大脳外傷および／または大脳出血、脱髄ならびに髄膜炎が挙げられるが、これらに限定されない）に罹患している被験体において、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するための方法が提供される。
【００３５】
本発明の別の態様において、血液障害（敗血症または敗血症から生じる状態（重篤な敗血症、敗血症性ショック、敗血症から生じる急性呼吸窮迫症候群および全身性炎症反応症候群が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない）に罹患している被験体において、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するための方法が提供される。出血性ショック、溶血性貧血、自己免疫性の血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）または他の骨髄／血液破壊性状態を含む他の血液障害を処置するための関連方法が提供される。
【００３６】
本発明の別の態様において、尿生殖器状態（有痛性膀胱疾患、感覚性（ｓｅｎｓｏｒｙ）膀胱疾患、非細菌性慢性膀胱炎および間質性膀胱炎、男性および女性の不妊症、胎盤機能不全ならびに流産および子癇前症が挙げられるが、これらに限定されない）に罹患している被験体において、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するための方法が提供される。
【００３７】
本発明の別の態様において、非肥満糖尿病（１型糖尿病またはインスリン依存性糖尿病）あるいは１型糖尿病または２型（成人発症型）糖尿病の血管障害、ニューロパシーまたは網膜症合併症に罹患している被験体において、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するための方法が提供される。
【００３８】
本発明の別の態様において、化学療法および／または放射線治療（癌の状態を処置するためが挙げられるが、これに限定されない）によって処置されている被験体に、化学療法付近で（ｐｅｒｉｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ）または放射線治療付近で（ｐｅｒｉｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）、すなわち、化学療法剤の投与および／もしくは放射線治療の前ならびに／または最中ならびに／または後に、ＭＡＳＰ−２インヒビターを投与することによって、そのような被験体においてＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するための方法が提供される。ＭＡＳＰ−２インヒビターの化学療法付近（ｐｅｒｉｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）または放射線治療付近（ｐｅｒｉｒａｄｉａｔｉｏｎ）での投与は、化学療法または放射線治療の副作用の低減に有用であり得る。本発明のなおもさらなる態様において、悪性腫瘍に罹患している患者に薬学的に許容可能なキャリア中のＭＡＳＰ−２阻害薬剤を投与することによって悪性腫瘍を処置するための方法が提供される。
【００３９】
本発明の別の態様において、内分泌障害に罹患している被験体に薬学的キャリア中の治療有効量のＭＡＳＰ−２阻害薬剤を投与することによって、そのような被験体においてＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するための方法が提供される。本発明の処置に供される状態としては、橋本甲状腺炎、ストレス、不安、ならびに、下垂体からのプロラクチン、成長因子またはインスリン様成長因子およびアドレノコルチコトロピンの制御された放出に関与する他の潜在的なホルモン障害が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
本発明の別の態様において、加齢性黄斑変性症または他の補体媒介性の眼科学的状態に罹患している被験体に薬学的キャリア中の治療有効量のＭＡＳＰ−２阻害薬剤を投与することによって、そのような状態に罹患している被験体において、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するための方法が提供される。
【００４１】
本発明の前述の態様および本発明に付随する利点の多くは、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を参照することによってより良好に理解されるとき、それらは、より容易に理解されるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
（配列表の説明）
配列番号１  ヒトＭＡｐ１９ｃＤＮＡ
配列番号２  ヒトＭＡｐ１９タンパク質（リーダー配列を含む）
配列番号３  ヒトＭＡｐ１９タンパク質（成熟）
配列番号４  ヒトＭＡＳＰ−２ｃＤＮＡ
配列番号５  ヒトＭＡＳＰ−２タンパク質（リーダー配列を含む）
配列番号６  ヒトＭＡＳＰ−２タンパク質（成熟）
配列番号７  ヒトＭＡＳＰ−２ｇＤＮＡ（エキソン１−６）
抗原：（ＭＡＳＰ−２成熟タンパク質を参照）
配列番号８  ＣＵＢＩ配列（ａａ１−１２１）
配列番号９  ＣＵＢＥＧＦ配列（ａａ１−１６６）
配列番号１０  ＣＵＢＥＧＦＣＵＢＩＩ（ａａ１−２９３）
配列番号１１  ＥＧＦ領域（ａａ１２２−１６６）
配列番号１２  セリンプロテアーゼドメイン（ａａ４２９−６７１）
配列番号１３  不活性型セリンプロテアーゼドメイン（Ｓｅｒ６１８がＡｌａに変異しているａａ６１０−６２５）
配列番号１４  ＴＰＬＧＰＫＷＰＥＰＶＦＧＲＬ（ＣＵＢ１ペプチド）
配列番号１５  ＴＡＰＰＧＹＲＬＲＬＹＦＴＨＦＤＬＥＬＳＨＬＣＥＹＤＦＶＫＬＳＳＧＡＫＶＬＡＴＬＣＧＱ（ＣＵＢＩペプチド）
配列番号１６  ＴＦＲＳＤＹＳＮ（ＭＢＬ結合領域コア）
配列番号１７  ＦＹＳＬＧＳＳＬＤＩＴＦＲＳＤＹＳＮＥＫＰＦＴＧＦ（ＭＢＬ結合領域）
配列番号１８  ＩＤＥＣＱＶＡＰＧ（ＥＧＦペプチド）
配列番号１９  ＡＮＭＬＣＡＧＬＥＳＧＧＫＤＳＣＲＧＤＳＧＧＡＬＶ（セリンプロテアーゼ結合コア）詳細な説明
ペプチドインヒビター：
配列番号２０  ＭＢＬ完全長ｃＤＮＡ
配列番号２１  ＭＢＬ完全長タンパク質
配列番号２２  ＯＧＫ−Ｘ−ＧＰ（コンセンサス結合）
配列番号２３  ＯＧＫＬＧ
配列番号２４  ＧＬＲＧＬＱＧＰＯＧＫＬＧＰＯＧ
配列番号２５  ＧＰＯＧＰＯＧＬＲＧＬＱＧＰＯＧＫＬＧＰＯＧＰＯＧＰＯ
配列番号２６  ＧＫＤＧＲＤＧＴＫＧＥＫＧＥＰＧＱＧＬＲＧＬＱＧＰＯＧＫＬＧＰＯＧ
配列番号２７  ＧＡＯＧＳＯＧＥＫＧＡＯＧＰＱＧＰＯＧＰＯＧＫＭＧＰＫＧＥＯＧＤＯ（ヒトｈ−フィコリン）
配列番号２８  ＧＣＯＧＬＯＧＡＯＧＤＫＧＥＡＧＴＮＧＫＲＧＥＲＧＰＯＧＰＯＧＫＡＧＰＯＧＰＮＧＡＯＧＥＯ（ヒトフィコリンｐ３５）
配列番号２９  ＬＱＲＡＬＥＩＬＰＮＲＶＴＩＫＡＮＲＰＦＬＶＦＩ（Ｃ４切断部位）
発現インヒビター：
配列番号３０  ＣＵＢＩ−ＥＧＦドメインのｃＤＮＡ（配列番号４のヌクレオチド２２〜６８０）
配列番号３１  ５’ＣＧＧＧＣＡＣＡＣＣＡＴＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣ３’  ＭＡＳＰ−２翻訳開始部位（センス）を含む、配列番号４のヌクレオチド１２〜４５
配列番号３２  ５’ＧＡＣＡＴＴＡＣＣＴＴＣＣＧＣＴＣＣＧＡＣＴＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧ３’  ＭＡＳＰ−２  ＭＢＬ結合部位（センス）を含む領域をコードする、配列番号４のヌクレオチド３６１〜３９６
配列番号３３  ５’ＡＧＣＡＧＣＣＣＴＧＡＡＴＡＣＣＣＡＣＧＧＣＣＧＴＡＴＣＣＣＡＡＡ３’  ＣＵＢＩＩドメインを含む領域をコードする、配列番号４のヌクレオチド６１０〜６４２
クローニングプライマー：
配列番号３４  ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＣ（ＣＵＢ用の５’ＰＣＲ）
配列番号３５  ＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＧＧＣＴＧＣＡＴＡ（ＣＵＢ用の３’ＰＣＲ）
配列番号３６  ＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＣＡＧＧＧＣＧＣＴ（ＣＵＢＩＥＧＦ用の３’ＰＣＲ）
配列番号３７  ＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＧＴＡＧＴＧＧＡＴ（ＣＵＢＩＥＧＦＣＵＢＩＩ用の３’ＰＣＲ）
配列番号３８〜４７は、ヒト化抗体用のクローニングプライマーである。
【００４３】
配列番号４８は、９ａａペプチド結合である：
発現ベクター
配列番号４９は、ＭＡＳＰ−２ミニ遺伝子挿入断片である
配列番号５０は、マウスＭＡＳＰ−２  ｃＤＮＡである
配列番号５１は、マウスＭＡＳＰ−２タンパク質（リーダー配列を含む）である
配列番号５２は、成熟マウスＭＡＳＰ−２タンパク質である
配列番号５３は、ラットＭＡＳＰ−２ｃＤＮＡである
配列番号５４は、ラットＭＡＳＰ−２タンパク質（リーダー配列を含む）である
配列番号５５は、成熟ラットＭＡＳＰ−２タンパク質である
配列番号５６〜５９は、ヒトＭＡＳＰ−２Ａを作製するために使用したヒトＭＡＳＰ−２の部位特異的突然変異誘発用のオリゴヌクレオチドである
配列番号６０〜６３は、マウスＭＡＳＰ−２Ａを作製するために使用したマウスＭＡＳＰ−２の部位特異的突然変異誘発用のオリゴヌクレオチドである
配列番号６４〜６５は、ラットＭＡＳＰ−２Ａを作製するために使用したラットＭＡＳＰ−２の部位特異的突然変異誘発用のオリゴヌクレオチドである
（詳細な説明）
本発明は、ＭＡＳＰ−２が補体の副経路活性化を開始するために必要であるという、本発明者らによる驚くべき発見に基づく。ＭＡＳＰ−２−／−のノックアウトマウスモデルを使用することによって、本発明者らは、古典経路を損なわないままで、レクチン媒介性ＭＡＳＰ−２経路を介して補体の副経路活性化を阻害することができることを示し、それによって、古典経路を除外したときの補体副経路の活性化に対する必要条件としてレクチン依存性のＭＡＳＰ−２活性化が確立された。本発明はまた、免疫系の古典（Ｃ１ｑ依存性）経路の成分を損なわないままで、レクチン媒介性の補体の副経路活性化に関連する細胞の損傷を阻害するための治療的な標的としてＭＡＳＰ−２を使用することについても記載する。
【００４４】
（Ｉ．定義）
本明細書中で特に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての用語は、本発明の分野における当業者が理解する意味と同じ意味を有する。以下の定義は、本発明を説明する明細書および特許請求の範囲において使用される用語に関して明確にするために提供される。
【００４５】
本明細書中で使用されるとき、用語「ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化」とは、レクチン依存性ＭＡＳＰ−２活性化を介して生じる補体副経路の活性化のことをいう。
【００４６】
本明細書中で使用されるとき、用語「副経路」とは、例えば、真菌および酵母の細胞壁由来のザイモサン、グラム陰性外膜由来のリポ多糖（ＬＰＳ）およびウサギ赤血球によって、ならびに、多くの純粋な多糖類、ウサギ赤血球、ウイルス、細菌、動物腫瘍細胞、寄生生物および損傷細胞から引き起こされる補体活性化、および、従来、補体因子Ｃ３からの自発的なタンパク分解性の生成によるＣ３ｂから生じると考えられている、補体活性化のことをいう。
【００４７】
本明細書中で使用されるとき、用語「レクチン経路」とは、マンナン結合レクチン（ＭＢＬ）およびフィコリンを含む、血清および非血清の炭水化物結合タンパク質の特異的な結合を介して生じる補体活性化のことをいう。
【００４８】
本明細書中で使用されるとき、用語「古典経路」とは、外来性粒子に結合した抗体によって引き起こされ、認識分子Ｃ１ｑの結合を必要とする補体活性化のことをいう。
【００４９】
本明細書中で使用されるとき、用語「ＭＡＳＰ−２阻害薬剤」とは、ＭＡＳＰ−２に結合するか、またはＭＡＳＰ−２と直接相互作用し、そして、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を効果的に阻害する任意の薬剤のことをいい、そのような薬剤としては、抗ＭＡＳＰ−２抗体およびそのＭＡＳＰ−２結合フラグメント、天然ペプチドおよび合成ペプチド、低分子、可溶性ＭＡＳＰ−２レセプター、発現インヒビターならびに単離された天然インヒビターが挙げられ、レクチン経路において別の認識分子（例えば、ＭＢＬ、Ｈ−フィコリン、Ｍ−フィコリンまたはＬ−フィコリン）への結合についてＭＡＳＰ−２と競合するペプチドも包含するが、そのような他の認識分子に結合する抗体を包含しない。本発明の方法において有用なＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を２０％よりも大きく（例えば、５０％よりも大きく（例えば、９０％よりも大きく））低下させ得る。１つの実施形態において、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を９０％よりも大きく低下させる（すなわち、１０％以下のＭＡＳＰ−２補体活性化しかもたらさない）。
【００５０】
本明細書中で使用されるとき、用語「抗体」は、任意の抗体産生哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギおよび霊長類（ヒトを含む））由来の、ＭＡＳＰ−２ポリペプチドまたはその部分に特異的に結合する抗体およびその抗体フラグメントを包含する。代表的な抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および組換え抗体；多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）；ヒト化抗体；マウス抗体；キメラモノクローナル抗体、マウス−ヒトモノクローナル抗体、マウス−霊長類モノクローナル抗体、霊長類−ヒトモノクローナル抗体；および抗イディオタイプ抗体が挙げられ、それらは、任意のインタクトな分子またはそのフラグメントであり得る。
【００５１】
本明細書中で使用されるとき、用語「抗体フラグメント」とは、完全長抗ＭＡＳＰ−２抗体（一般に、抗原結合領域またはその可変領域を含む）から得られた部分またはそれらに関連する部分のことをいう。抗体フラグメントの実例としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、鎖状抗体、一本鎖抗体分子および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【００５２】
本明細書中で使用されるとき、「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含み、このポリペプチドリンカーは、ｓｃＦｖが、抗原に結合するのに望ましい構造を形成することができる。
【００５３】
本明細書中で使用されるとき、「キメラ抗体」は、非ヒト種（例えば、げっ歯類）抗体由来の可変ドメインおよび相補性決定領域を含み、その抗体分子の残りの部分は、ヒト抗体由来である、組換えタンパク質である。
【００５４】
本明細書中で使用されるとき、「ヒト化抗体」は、ヒト抗体フレームワークに移植される、非ヒト免疫グロブリン由来の特異的な相補性決定領域と一致する最小配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は、代表的には、その抗体の相補性決定領域だけが非ヒト起源である組換えタンパク質である。
【００５５】
本明細書中で使用されるとき、用語「マンナン結合レクチン」（「ＭＢＬ」）は、マンナン結合タンパク質（「ＭＢＰ」）と等価である。
【００５６】
本明細書中で使用されるとき、「細胞膜傷害複合体」（「ＭＡＣ」）とは、膜に挿入し、膜を破壊する、最後の５つの補体成分（Ｃ５−Ｃ９）の複合体のことをいう。Ｃ５ｂ−９とも呼ばれる。
【００５７】
本明細書中で使用されるとき、「被験体」には、すべての哺乳動物（ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウサギ、ブタおよびげっ歯類が挙げられるが、これらに限定されない）が含まれる。
【００５８】
本明細書中で使用されるとき、アミノ酸残基は、以下のとおり省略して記載される：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リシン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）およびバリン（Ｖａｌ；Ｖ）。
【００５９】
最も広い意味において、天然に存在するアミノ酸は、各アミノ酸の側鎖の化学的特性に基づいて群に分けることができる。「疎水性」アミノ酸とは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、ＣｙｓまたはＰｒｏのいずれかを意味する。「親水性」アミノ酸とは、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓのいずれかを意味する。この群のアミノ酸は、さらに以下のとおり分類され得る。「電荷を有しない親水性」アミノ酸とは、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎまたはＧｌｎのいずれかを意味する。「酸性」アミノ酸とは、ＧｌｕまたはＡｓｐのいずれかを意味する。「塩基性」アミノ酸とは、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓのいずれかを意味する。
【００６０】
本明細書中で使用されるとき、用語「保存的アミノ酸置換」は、以下の各群内におけるアミノ酸間の置換と説明される：（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン、（３）セリンおよびトレオニン、（４）アスパラギン酸およびグルタミン酸、（５）グルタミンおよびアスパラギンならびに（６）リシン、アルギニンおよびヒスチジン。
【００６１】
用語「オリゴヌクレオチド」とは、本明細書中で使用されるとき、リボ核酸（ＲＮＡ）もしくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはそれらの模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃ）のオリゴマーまたはポリマーのことをいう。この用語は、天然に存在するヌクレオチド、糖およびヌクレオシド間の共有結合（骨格）から構成されるオリゴ核酸塩基ならびに天然に存在しない修飾を有するオリゴヌクレオチドも網羅する。
【００６２】
（ＩＩ．副経路：新しい知見）
補体の副経路は、酵母細胞壁から生成されたザイモサンを使用して補体を活性化させる研究に基づいて、１９５０年代初めにＬｏｕｉｓ  Ｐｉｌｌｅｍｅｒおよびその共同研究者らによって初めて記載された（Ｐｉｌｌｅｍｅｒ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１０３：１−１３，１９５６；Ｌｅｐｏｗ，Ｉ．Ｈ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５：４７１−４７８，１９８０）。それ以後、ザイモサンは、ヒト血清およびげっ歯類血清における副経路の特異的なアクチベーターの基準の例と考えられている（Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．７：１４３−１６２，１９８４；Ｖａｎ  Ｄｉｊｋ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８５：２３３−２４３，１９８５；Ｐａｎｇｂｕｒｎ，Ｍ．Ｋ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１６２：６３９−６５３，１９８８）。副経路活性化のための便利で広く使用されているアッセイは、プラスチックウェル上にコーティングされたザイモサンと血清とをインキュベートして、インキュベート後に固相上のＣ３ｂ沈着の量を測定するものである。予想されるように、正常マウス血清とのインキュベート後に、ザイモサンでコーティングされたウェル上にはかなりのＣ３ｂ沈着がみられる（図７Ｂ）。しかしながら、ザイモサンでコーティングされたウェルと、ホモ接合性のＭＡＳＰ−２欠損マウス由来の血清とをインキュベートすると、正常な血清の場合と比べてＣ３ｂ沈着がかなり減少する。さらに、このアッセイにおいてＭＡＳＰ２遺伝子がヘテロ接合性で欠損しているマウス由来の血清を使用することにより、ホモ接合性のＭＡＳＰ−２欠損マウス由来の血清で得られたレベルと正常マウス血清で得られたレベルの中間のＣ３ｂ沈着レベルがもたらされる。副経路を活性化することが知られている別の多糖であるマンナンでコーティングされたウェルを使用することにより、対応する結果も得られる（図７Ａ）。正常マウスとＭＡＳＰ−２欠損マウスは、ＭＡＳＰ２遺伝子を除いては同じ遺伝的背景を共有するので、これらの予期しない結果から、ＭＡＳＰ−２が、副経路の活性化に不可欠な役割を果たすことが証明される。
【００６３】
これらの結果は、本質的にすべての現在の医学分野の教科書および補体に関する最近の総論において説明されているように副経路が補体活性化の独立したスタンドアロンの経路ではないという強力な証明をもたらす。現在の広く支持されている科学的観点は、副経路は、自発的な「チックオーバー」Ｃ３活性化の増幅によって、ある特定の粒上の標的（微生物、ザイモサン、ウサギ赤血球）の表面上で活性化されるということである。しかしながら、ＭＡＳＰ−２ノックアウトマウス由来の血清では副経路の周知の２つの「アクチベーター」による重要な副経路活性化が起きないことによって、「チックオーバー理論」が補体活性化にとって重要な生理学的機構であるとの説明は見込みがなくなる。
【００６４】
ＭＡＳＰ−２プロテアーゼは、レクチン補体カスケードの開始に関与する酵素として特異的かつ詳細に明らかにされた役割を有することが知られているので、これらの結果は、当然、その後に続く副経路の活性化のための決定的な第１段階としてザイモサンおよびマンナンによるレクチン経路の活性化を意味する。Ｃ４ｂは、副経路ではなくレクチン経路によって生成される活性化産物である。この概念と一致して、ザイモサンまたはマンナンでコーティングされたウェルと正常マウス血清とのインキュベートによって、そのウェル上へのＣ４ｂ沈着がもたらされ、このＣ４ｂ沈着は、そのコーティングされたウェルがＭＡＳＰ−２欠損マウス由来の血清とインキュベートされるとき実質的に減少する（図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃ）。
【００６５】
副経路は、補体活性化のための独立した経路としてその広く認知されている役割に加えて、最初に古典経路およびレクチン経路を介して引き起こされる補体活性化のための増幅ループももたらし得る（Ｌｉｓｚｅｗｓｋｉ，Ｍ．Ｋ．ａｎｄ  Ｊ．Ｐ．Ａｔｋｉｎｓｏｎ，１９９３，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｓｃｈｗｅｉｎｉｅ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１８２１−１８２９，１９８９）。この副経路媒介性増幅機構では、古典補体カスケードまたはレクチン補体カスケードのいずれかの活性化によって生成されるＣ３コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ｂ）が、Ｃ３をＣ３ａおよびＣ３ｂに切断し、それによって、副経路のＣ３コンバターゼであるＣ３ｂＢｂの形成に関与し得るＣ３ｂをもたらす。ＭＡＳＰ−２ノックアウト血清において副経路が活性化されないことについての可能性のある説明は、レクチン経路が、ザイモサン、マンナンおよび副経路の他の推定「アクチベーター」による最初の補体活性化に必要である一方で、副経路は、補体活性化を増幅するために重大な役割を果たすということである。換言すれば、副経路は、独立した直線的なカスケードではなく、活性化のためにレクチン補体経路および古典補体経路に依存したフィードフォワード増幅ループである。
【００６６】
補体カスケードが、以前に構想されていたような３つの別々の経路（古典経路、副経路およびレクチン経路）を介して活性化されるのではなく、補体とは、第１近似として、補体免疫防御系の先天性（レクチン）部門および後天性（古典）部門に相当する２つの主要な系から構成されると考えることがより正確であると、本発明者らの結果は示唆している。レクチン（ＭＢＰ、Ｍ−フィコリン、Ｈ−フィコリンおよびＬ−フィコリン）は、先天性の補体系を引き起こす特異的な認識分子であり、この系は、レクチン経路および関連する副経路増幅ループを含む。Ｃ１ｑは、後天性の補体系を引き起こす特異的な認識分子であり、この系は、古典経路および関連する副経路増幅ループを含む。本発明者らは、これらの２つの主要な補体活性化の系を、それぞれレクチン依存性補体系およびＣ１ｑ依存性補体系と呼ぶ。
【００６７】
補体系は、免疫防御におけるその不可欠な役割に加えて、多くの臨床的な状態における組織損傷に関与する。従って、これらの有害作用を予防する治療的に有効な補体インヒビターを開発することが急務である。補体が２つの主要な補体活性化の系から構成されるという認識とともに、補体の免疫防御能力を完全に停止することなく、特定の病態を引き起こす補体活性化の系だけを特異的に阻害することが、非常に望ましいと理解される。例えば、補体活性化がレクチン依存性の補体系によって主に媒介される疾患状態では、この系だけを特異的に阻害することが有益であり得る。このことは、Ｃ１ｑ依存性補体活性化の系を損なわずに、免疫複合体のプロセシングを取り扱い、そして感染症に対する宿主防御に役立ち得る。
【００６８】
レクチン依存性の補体系を特異的に阻害する治療薬の開発の際に標的化するのに好ましいタンパク質成分は、ＭＡＳＰ−２である。レクチン依存性の補体系のすべてのタンパク質（ＭＢＬ、Ｈ−フィコリン、Ｍ−フィコリン、Ｌ−フィコリン、ＭＡＳＰ−２、Ｃ２−Ｃ９、Ｂ因子、Ｄ因子およびプロパージン）のうち、ＭＡＳＰ−２だけが、レクチン依存性の補体系に固有であり、かつ、その系が機能するために必要である。レクチン（ＭＢＬ、Ｈ−フィコリン、Ｍ−フィコリンおよびＬ−フィコリン）もまた、レクチン依存性の補体系における固有の成分である。しかしながら、レクチン成分のいずれか１つが喪失することによっては、レクチン重複性に起因して、必ずしもその系の活性化を阻害しない。レクチン依存性の補体活性化の系の阻害を保証するためには、４種すべてのレクチンを阻害する必要がある。さらに、ＭＢＬおよびフィコリンは、補体とは無関係のオプソニン活性を有することが知られているので、レクチン機能の阻害によって、感染に対するこの有益な宿主防御機構の喪失がもたらされ得る。対照的に、この補体非依存性レクチンオプソニン活性は、ＭＡＳＰ−２が阻害性標的であったとしても、損なわれないままであり得る。レクチン依存性の補体活性化の系を阻害する治療的な標的としてのＭＡＳＰ−２に加えられる利点は、ＭＡＳＰ−２の血漿濃度が、任意の補体タンパク質のうち最も低い（約５００ｎｇ／ｍｌ）ことである；したがって、このことに対応して、完全な阻害をもたらすために必要なＭＡＳＰ−２の高親和性インヒビターは、低濃度であり得る（Ｍｏｌｌｅｒ−Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８２：１５９−１６７，２００３）。
【００６９】
（ＩＩＩ．様々な疾患および状態におけるＭＡＳＰ−２の役割ならびにＭＡＳＰ−２阻害薬剤を使用した治療的な方法）
虚血再灌流損傷
虚血再灌流損傷（Ｉ／Ｒ）は、長期間にわたる虚血の後に血流が元に戻るときに生じる。これは、幅広い疾患における罹患率および死亡率の共通の起源である。外科の患者は、大動脈瘤修復術、心肺バイパス術、例えば、臓器移植片（例えば、心臓、肺、肝臓、腎臓）と接続する血管再吻合および端／指の再移植、脳卒中、心筋梗塞ならびにショック後および／または外科的手技後の血流力学的蘇生の後、無防備である。アテローム硬化性疾患を有する患者は、心筋梗塞、脳卒中ならびに塞栓誘発性の腸管虚血および下肢虚血になる傾向がある。外傷を有する患者は、一時的に肢が虚血になることが多い。さらに、任意の原因の大量の血液の喪失により、全身のＩ／Ｒ反応がもたらされる。
【００７０】
Ｉ／Ｒ損傷の病態生理学は、複雑であり、少なくとも２つの主要な因子：酸素ラジカル媒介性損傷に付随する補体活性化および好中球刺激が、このプロセスに関与している。Ｉ／Ｒ損傷において、補体活性化は、３０年以上前に心筋梗塞において初めて報告され、補体系のＩ／Ｒ組織損傷への関与について数多くの研究がなされている（Ｈｉｌｌ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３３：８８５−９００，１９７１）。集積された証拠は、現在、Ｉ／Ｒ損傷における中心的なメディエーターとして補体を指摘している。補体を阻害することによって、Ｉ／Ｒのいくつかの動物モデルにおける損傷を制限することに成功した。最近の研究では、コブラ毒因子の注入後にＣ３枯渇が達成され、これは、腎臓および心臓でのＩ／Ｒにおいて有益であると報告された（Ｍａｒｏｋｏ，Ｐ．Ｒ．ら、１９７８，Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．６１：６６１−６７０，１９７８；Ｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｈ．ら、Ｍｉｎｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  Ｍｅｔａｂ．１１：２５６−６１，１９８５）。しかしながら、可溶型の補体レセプター１（ｓＣＲ１）は、心筋のＩ／Ｒ損傷の予防に利用される第１の補体特異的インヒビターであった（Ｗｅｉｓｍａｎ，Ｈ．Ｆ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１４６−５１，１９９０）。心筋のＩ／ＲにおけるｓＣＲ１処置によって、冠状動脈内皮に沿ったＣ５ｂ−９複合体沈着の減少および再灌流後の白血球浸潤の減少に関連する梗塞が減弱される。
【００７１】
実験的な心筋のＩ／Ｒでは、再灌流の前に投与されるＣ１エステラーゼインヒビター（Ｃ１  ＩＮＨ）が、Ｃ１ｑの沈着を予防し、心筋壊死の領域が有意に減少した（Ｂｕｅｒｋｅ，Ｍ．ら、１９９５，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９１：３９３−４０２，１９９５）。遺伝的にＣ３が欠損した動物は、骨格筋または腸管の虚血後の局所的な組織壊死が少ない（Ｗｅｉｓｅｒ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２３４３−４８，１９９６）。
【００７２】
細胞膜傷害複合体は、補体特異的損傷の最終的なビヒクルであり、Ｃ５欠損動物における研究により、Ｉ／Ｒ損傷モデルにおいて局所的な損傷および離れた損傷を低減した（Ａｕｓｔｅｎ，Ｗ．Ｇ．Ｊｒ．ら、Ｓｕｒｇｅｒｙ  １２６：３４３−４８，１９９９）。可溶性Ｃｒｒｙ（補体レセプター関連遺伝子Ｙ）である補体活性化のインヒビターは、マウスの腸管再灌流の開始の前後において投与するとき、そのインヒビターは、損傷に対して有効であることが示されている（Ｒｅｈｒｉｇ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：５９２１−２７，２００１）。骨格筋虚血モデルでは、可溶性補体レセプター１（ｓＣＲ１）を再灌流の開始後に投与して、ｓＣＲ１を使用することによってもまた、筋肉損傷が低減した（Ｋｙｒｉａｋｉｄｅｓ，Ｃら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８１：Ｃ２４４−３０，２００１）。心筋のＩ／Ｒのブタモデルでは、再灌流の前にアナフィラトキシンＣ５ａに対するモノクローナル抗体（「ＭｏＡｂ」）で処置した動物では、梗塞が減弱したことが示された（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｅ．Ａ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６８：Ｈ４４８−５７，１９９５）。Ｃ５  ＭｏＡｂで処置されたラットによって、心筋層における梗塞サイズ、好中球浸潤およびアポトーシスが減弱したことが証明された（Ｖａｋｅｖａ，Ａ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９７：２２５９−６７，１９９８）。これらの実験的な結果は、Ｉ／Ｒ損傷の病原における補体活性化の重要性を強調するものである。
【００７３】
どの補体経路（古典経路、レクチン経路または副経路）が、Ｉ／Ｒ損傷における補体活性化に主に関与するかは不明である。Ｗｅｉｓｅｒらは、Ｃ３ノックアウトマウスまたはＣ４ノックアウトマウスが、血管透過性の有意な低下に基づいてＩ／Ｒ損傷から保護されていたことを示すことによって骨格のＩ／Ｒにおけるレクチン経路および／または古典経路の重要な役割を証明した（Ｗｅｉｓｅｒ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２３４３−４８，１９９６）。対照的に、Ｃ４ノックアウトマウスを用いた腎臓のＩ／Ｒ実験により、有意な組織保護は認められなかったのに対し、Ｃ３−、Ｃ５−およびＣ６−ノックアウトマウスは、損傷から保護されたことから、腎臓のＩ／Ｒ損傷における補体活性化が副経路を介して生じることが示唆される（Ｚｈｏｕ，Ｗ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５：１３６３−７１，２０００）。Ｓｔａｈｌらは、最近、Ｄ因子欠損マウスを使用して、マウスの腸管のＩ／Ｒにおける副経路の重要な役割についての証拠を示した（Ｓｔａｈｌ，Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６２：４４９−５５，２００３）。対照的に、Ｗｉｌｌｉａｍｓらは、Ｃ４およびＩｇＭ（Ｒａｇｌ−／−）欠損マウスにおけるＣ３に対する臓器の染色の減少および損傷からの保護を示すことによって、マウスの腸におけるＩ／Ｒ損傷の開始に対する古典経路の主な役割を示唆した（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ｐ．ら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．８６：９３８−４２，１９９９）。
【００７４】
心筋のＩ／Ｒモデルにおいて、ラットマンナン結合レクチン（ＭＢＬ）に対するモノクローナル抗体によるラットの処置によって、虚血後の再灌流損傷の低下がもたらされた（Ｊｏｒｄａｎ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０４：１４１３−１８，２００１）。ＭＢＬ抗体もまた、酸化ストレス後のインビトロにおいて内皮細胞上への補体沈着を減少させたことから、心筋のＩ／Ｒ損傷におけるレクチン経路の役割が示唆される（Ｃｏｌｌａｒｄ，Ｃ．Ｄ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５６：１５４９−５６，２０００）。いくつかの臓器において、Ｉ／Ｒ損傷は、自然抗体と呼ばれるＩｇＭの特定のカテゴリーおよび古典経路の活性化によって媒介され得るという証拠も存在する（Ｆｌｅｍｉｎｇ，Ｓ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：２１２６−３３，２００２；Ｒｅｉｄ，Ｒ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５４３３−４０，２００２）。
【００７５】
補体活性化のいくつかのインヒビターは、心筋のＩ／Ｒ合併症から生じる罹患率および死亡率を予防する潜在的な治療薬として開発されている。これらの２つのインヒビター、ｓＣＲ１（ＴＰ１０）およびヒト化抗Ｃ５ｓｃＦｖ（パキセリズマブ（Ｐａｘａｌｉｚｕｍａｂ））は、第ＩＩ相臨床試験を完了している。パキセリズマブは、さらに第ＩＩＩ相臨床試験を完了している。ＴＰ１０は、初期の第Ｉ／ＩＩ相治験において患者に十分に許容され、有益であったが、２００２年２月に終了した第ＩＩ相治験からの結果は、その主要エンドポイントを満たさなかった。しかしながら、開心術を経験している高リスク集団における男性患者からのデータのサブグループ解析によって、死亡率および梗塞サイズが有意に低下したことが証明された。ヒト化抗Ｃ５ｓｃＦｖの投与によって、ＣＯＭＡおよびＣＯＭＰＬＹの第ＩＩ相治験において急性心筋梗塞に関連する患者の死亡率全体が低下したが、主要エンドポイントを満たさなかった（Ｍａｈａｆｆｅｙ，Ｋ．Ｗ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０８：１１７６−８３，２００３）。冠状動脈バイパス術後に外科的に誘導される結果を改善するための、最近の第ＩＩＩ相抗Ｃ５ｓｃＦｖ臨床試験（ＰＲＩＭＯ−ＣＡＢＧ）の結果は、最近公開された。この研究に対する主要エンドポイントは、到達されなかったが、この研究から、手術後の患者の罹患率および死亡率の全体的な低下が証明された。
【００７６】
Ｗａｌｓｈ博士および共同研究者らは、ＭＢＬが欠損し、ゆえにＭＢＬ依存性レクチン経路活性化を欠いているが、完全に活性な古典補体経路を有するマウスが、心臓の再灌流損傷から保護され、その結果、心機能が保存されることを証明した（Ｗａｌｓｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：５４１−４６，２００５）。重大なことには、古典補体経路の認識成分であるＣ１ｑを欠くが、インタクトなＭＢＬ補体経路を有するマウスは、損傷から保護されない。これらの結果から、レクチン経路が、心筋の再灌流虚血性損傷の病原において主要な役割を果たすことが示唆される。
【００７７】
補体活性化は、胃腸の虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）に関連する組織損傷において重要な役割を果たすことが知られている。ＧＩ／Ｒのマウスモデルを使用した、Ｈａｒｔおよび共同研究者らによる最近の研究では、ＭＢＬが遺伝的に欠損したマウスは、胃腸のＩ／Ｒ後の腸の損傷から保護されることを報告している（Ｈａｒｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：６３７３−８０，２００５）。ＭＢＬ欠損マウスに対して組換えＭＢＬを加えることにより、胃腸のＩ／Ｒ後、未処置のＭＢＬ欠損マウスよりも有意に損傷が増大した。対照的に、古典経路の認識成分であるＣ１ｑを遺伝的に欠くマウスは、胃腸のＩ／Ｒ後の組織損傷から保護されない。
【００７８】
腎臓のＩ／Ｒは、急性腎不全の重要な原因である。補体系は、腎臓のＩ／Ｒ損傷に本質的に関与するとみられる。最近の研究において、ｄｅ  Ｖｒｉｅｓおよび共同研究者は、実験的ならびに臨床上の腎臓のＩ／Ｒ損傷の過程において、レクチン経路が活性化されることを報告している（ｄｅ  Ｖｒｉｅｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１６５：１６７７−８８，２００４）。さらに、腎臓のＩ／Ｒの過程において、レクチン経路の後に、補体Ｃ３、Ｃ６およびＣ９の沈着が生じ、レクチン経路は、それらの沈着と共存する。これらの結果は、補体活性化のレクチン経路が、腎臓のＩ／Ｒ損傷に関与することを示唆する。
【００７９】
従って、本発明の１つの態様は、虚血性再灌流を経験している被験体を、薬学的キャリア中の治療有効量のＭＡＳＰ−２阻害薬剤で処置することによる、虚血再灌流損傷の処置に関する。ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、動脈内、静脈内、頭蓋内、筋肉内、皮下または他の非経口投与によって、そして、潜在的には、非ペプチド作動性インヒビターについては経口的に、上記被験体に投与され得るが、動脈内投与または静脈内投与が最も適している。本発明のＭＡＳＰ−２阻害性組成物の投与は、虚血再灌流事象の直後またはできるだけすぐに適当に開始する。再灌流が、制御された環境において起きる場合（例えば、大動脈瘤修復術、臓器移植または切断されたかもしくは傷つけられた肢もしくは指の再付着の後）、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、再灌流の前および／または最中および／または後に投与され得る。投与は、最適な治療的効果のために医師が決定するとおりに定期的に繰り返され得る。
【００８０】
アテローム性動脈硬化症
補体活性化が、ヒトにおいてアテローム発生に関与するというかなりの証拠がある。多くの研究が、著しい補体活性化は、正常な動脈において生じないが、補体は、アテローム硬化性病変において大規模に活性化され、脆弱性かつ破裂性のプラークにおいて特に強いということを、説得力をもって示している。補体経路の最後の成分は、しばしばヒトアテロームにおいて見られる（Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ，Ｆ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：９４９−５５．１０−１２，１９９９；Ｒｕｓ，Ｈ．Ｇ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２０：３０５−３１０，１９８９；Ｔｏｒｚｅｗｓｋｉ，Ｍ．ら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１８：３６９−３７８，１９９８）。動脈の病変におけるＣ３およびＣ４の沈着もまた証明されている（Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｇ．Ｋ．ら、Ａｃｔａ  Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｓｃａｎｄ．（Ａ）９２：４２９−３５，１９８４）。Ｃ５ｂ−９沈着の程度は、その病変の重症度と相関することが見出されている（Ｖｌａｉｃｕ，Ｒ．ら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ５７：１６３−７７，１９８５）。Ｃ５ｂ−９ではなく補体ｉＣ３ｂの沈着は、破裂性でありかつ脆弱なプラークにおいて特に強かったことから、補体活性化が、急性冠動脈症候群における因子であり得ることが示唆される（Ｔａｓｋｉｎｅｎ  Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３６７：４０３−１２，２００２）。ウサギにおける実験的なアテロームでは、補体活性化が病変の進行を進めることが見出されている（Ｓｅｉｆｅｒ，Ｐ．Ｓ．ら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．６０：７４７−５４，１９８９）。
【００８１】
アテローム硬化性病変において、補体は、古典経路および副経路を介して活性化されるが、今のところ、レクチン経路を介した補体活性化の証拠はほとんどない。動脈壁のいくつかの成分は、補体活性化を引き起こし得る。補体の古典経路は、酵素的に分解されたＬＤＬに結合しているＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）によって活性化され得る（Ｂｈａｋｄｉ，Ｓ．ら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１９：２３４８−５４，１９９９）。この観点と一致するものは、最後の補体タンパク質が、初期のヒト病変の内膜においてＣＲＰと共存するという知見である（Ｔｏｒｚｅｗｓｋｉ，Ｊ．ら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１８：１３８６−９２，１９９８）。同様に、病変内の酸化型ＬＤＬに特異的な免疫グロブリンＭまたはＩｇＧ抗体は、古典経路を活性化し得る（Ｗｉｔｚｔｕｍ，Ｊ．Ｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３４４：７９３−９５，１９９４）。ヒトアテローム硬化性病変から単離された脂質は、高含有量の非エステル化コレステロールを有し、副経路を活性化することができる（Ｓｅｉｆｅｒｔ  Ｐ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：５４７−５７，１９９０）。アテローム硬化性病変に関与することが多いグラム陰性菌であるＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅもまた、補体の副経路を活性化し得る（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｌ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７２：５８５−８，１９９５）。アテローム硬化性病変中に存在する他の潜在的な補体アクチベーターとしては、コレステロール結晶および細胞片が挙げられ、その両方が、副経路を活性化し得る（Ｓｅｉｆｅｒｔ，Ｐ．Ｓ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：１３０３−０８，１９８７）。
【００８２】
補体活性化の副産物は、アテローム硬化性病変の進行に影響し得る多くの生物学的特性を有することが知られている。局所的な補体活性化は、細胞溶解を誘導し得、そして進行した病変の壊死性のコアに見られる少なくともいくらかの細胞片を生成し得る（Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ，Ｆ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：９４９−５５．１０−１２，１９９９）。半分解性の補体活性化は、平滑筋細胞増殖およびアテローム発生中の動脈内膜への単球浸潤に関与する重大な因子であり得る（Ｔｏｒｚｅｗｓｋｉ  Ｊ．ら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１８：６７３−７７，１９９６）。持続的な補体活性化は、炎症を引き起こし得、また、炎症を維持し得るので、有害であり得る。血漿からの補体成分の浸潤に加えて、動脈細胞は、補体タンパク質に対するメッセンジャーＲＮＡを発現し、様々な補体成分の発現が、アテローム硬化性病変においてアップレギュレートされる（Ｙａｓｏｊｉｍａ，Ｋ．ら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２１：１２１４−１９，２００１）。
【００８３】
アテローム発生に対する補体タンパク質欠損の影響に関する限られた数の研究が報告されている。実験動物モデルにおける結果は、矛盾している。ラットでは、補体枯渇動物において、中毒量のビタミンＤによって誘導されるアテローム硬化様病変の形成は減少した（Ｇｅｅｒｔｉｎｇｅｒ  Ｐ．ら、Ａｃｔａ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．（Ａ）７８：２８４−８８，１９７０）。さらに、コレステロール食が給餌されたウサギでは、遺伝的Ｃ６欠損（Ｇｅｅｒｔｉｎｇｅｒ，Ｐ．ら、Ａｒｔｅｒｙ  １：１７７−８４，１９７７；Ｓｃｈｍｉｅｄｔ，Ｗ．ら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１８：１７９０−１７９５，１９９８）または抗補体薬剤Ｋ−７６ＣＯＯＮａ（Ｓａｉｔｏ，Ｅ．ら、Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．３：１４７−５４，１９９０）のいずれかによる補体阻害によって、血清コレステロールレベルに影響を及ぼさずにアテローム性動脈硬化症の発生が抑制された。対照的に、最近の研究では、Ｃ５欠損が、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）欠損マウスにおいてアテローム硬化性病変の発生を低下させないと報告されている（Ｐａｔｅｌ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８６：１６４−７０，２００１）。しかしながら、別の研究において、Ｃ３欠損があってもなくてもＬＤＬＲ欠損（Ｉｄｌｒ−）マウスにおけるアテローム硬化性病変の発生が評価された（Ｂｕｏｎｏ，Ｃら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０５：３０２５−３１，２００２）。その研究者らは、アテローム硬化様病変へのアテロームの成熟が、インタクトな補体系の存在の一部に依存することを見出した。
【００８４】
従って、本発明の１つの態様は、アテローム性動脈硬化症に罹患しているか、またはその傾向がある被験体を、薬学的キャリア中の治療有効量のＭＡＳＰ−２阻害薬剤で処置することによって、アテローム性動脈硬化症を処置または予防することに関する。ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、動脈内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、頭蓋内投与、筋肉内投与、皮下投与または他の非経口投与によって、そして、潜在的には、非ペプチド作動性インヒビターについては経口的に、被験体に投与され得る。ＭＡＳＰ−２阻害性組成物の投与は、アテローム性動脈硬化症の診断後に被験体において開始し得るか、またはそのような状態を発症するリスクの高い被験体において予防的に開始され得る。投与は、最適な治療的効果のために医師が決定するとおりに定期的に繰り返され得る。
【００８５】
他の血管性の疾患および状態
内皮は、たいてい免疫系に曝露されており、血漿中に存在する補体タンパク質に対して特に脆弱である。補体媒介性の血管の損傷は、心臓血管系のいくつかの疾患（アテローム性動脈硬化症（Ｓｅｉｆｅｒｔ，Ｐ．Ｓ．ら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ７３：９１−１０４，１９８８）、虚血−再灌流損傷（Ｗｅｉｓｍａｎ，Ｈ．Ｆ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１４６−５１，１９９０）および心筋梗塞（Ｔａｄａ，Ｔ．ら、Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ  ４３０：３２７−３３２，１９９７）を含む）の病態生理学に関与することが示されている。証拠は、補体活性化が、他の血管状態にまで及び得ることを示唆する。
【００８６】
例えば、補体活性化は、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病性腎炎、全身性エリテマトーデス関連血管炎、関節リウマチ（悪性関節リウマチとも呼ばれる）に関連する血管炎、免疫複合体血管炎および高安病を含む多くの形態の血管炎の病原に寄与するという証拠がある。ヘノッホ−シェーンライン紫斑病性腎炎は、病原が免疫である小血管の全身性血管炎の１形態であり、ここで、Ｃ５ｂ−９誘導性の内皮損傷をもたらす、レクチン経路を介した補体活性化は、重要な機構として認識されている（Ｋａｗａｎａ，Ｓ．ら、Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．２８２：１８３−７，１９９０；Ｅｎｄｏ，Ｍ．ら、Ａｍ  Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ．３５：４０１−７，２０００）。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、皮膚、腎臓、関節、漿膜表面および中枢神経系を含む複数の臓器に影響を及ぼす全身性自己免疫疾患の例であり、重篤な血管炎に関連することが多い。内皮細胞に結合することができるＩｇＧ抗内皮抗体およびＩｇＧ複合体は、活性なＳＬＥを有する患者の血清中に存在し、ＩｇＧ免疫複合体および補体の沈着は、ＳＬＥ血管炎を有する患者の血管壁において見られる（Ｃｉｎｅｓ，Ｄ．Ｂ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７３：６１１−２５，１９８４）。血管炎に関連する関節リウマチ（悪性関節リウマチとも呼ばれる）（Ｔｏｍｏｏｋａ，Ｋ．，Ｆｕｋｕｏｋａ  Ｉｇａｋｕ  Ｚａｓｓｈｉ  ８０：４５６−６６，１９８９）、免疫複合体血管炎、肝炎Ａに関連する血管炎、白血球破砕性血管炎および高安病として知られる動脈炎は、内皮および他の細胞型に対する補体依存性細胞傷害性が、証明された役割を果たすヒト疾患の別の多形性群を形成する（Ｔｒｉｐａｔｈｙ，Ｎ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２８：８０５−８，２００１）。
【００８７】
証拠はまた、補体活性化が拡張型心筋症に関与することも示唆する。拡張型心筋症は、心拡大および心臓の収縮機能の障害を特徴とする症候群である。最近のデータから、心筋層における進行中の炎症がこの疾患の発症に関与し得ることが示唆されている。補体の最後の細胞膜傷害複合体であるＣ５ｂ−９は、免疫グロブリン沈着および心筋でのＴＮＦ−アルファの発現と有意に相関することが知られている。２８人の拡張型心筋症を有する患者由来の心筋バイオプシーにおいて、心筋へのＣ５ｂ−９の蓄積が証明されたことから、心筋層における慢性的な免疫グロブリン媒介性の補体活性化が拡張型心筋症の進行に部分的に関与し得ることが示唆される（Ｚｗａｋａ，Ｔ．Ｐ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６１（２）：４４９−５７，２００２）。
【００８８】
従って、本発明の１つの態様は、心臓血管状態、脳血管状態、末梢の（例えば、筋骨格の）血管状態、腎血管状態および腸間膜／腸管の血管状態を含む血管状態を、薬学的キャリア中の治療有効量のＭＡＳＰ−２阻害薬剤を含む組成物を投与することによって処置することに関する。本発明が適していると考えられる状態としては：血管炎（ヘノッホ−シェーンライン紫斑病性腎炎、全身性エリテマトーデス関連血管炎、関節リウマチ（悪性関節リウマチとも呼ばれる）に関連する血管炎、免疫複合体血管炎および高安病を含む）；拡張型心筋症；糖尿病性血管障害；川崎病（動脈炎）；および静脈ガス塞栓（ＶＧＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。また、補体活性化が、心血管介入性手技に関連する、管腔の外傷および異物炎症性反応の結果として生じる場合、本発明のＭＡＳＰ−２阻害性組成物は、単独か、または他の再狭窄阻害薬剤（例えば、Ｄｅｍｏｐｕｌｏｓに対する米国特許第６，４９２，３３２号に開示されている薬剤）と併用して、ステント留置後、回転性アテレクトミー後および／または経皮的経管的冠状動脈形成術（ＰＴＣＡ）後の再狭窄の阻害においても使用され得ると考えられる。
【００８９】
ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、動脈内、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内、頭蓋内、皮下または他の非経口投与によって、そして、潜在的には、非ペプチド作動性インヒビターについては経口的に、被験体に投与され得る。投与は、最適な治療的効果のために医師が決定するとおりに定期的に繰り返され得る。再狭窄を阻害するために、ＭＡＳＰ−２阻害性組成物は、ステント留置もしくはアテレクトミーもしくは血管形成術の前および／または最中および／または後に投与され得る。あるいは、ＭＡＳＰ−２阻害性組成物は、ステント上にコーティングされ得るか、またはステントの中に組み込まれ得る。
【００９０】
胃腸障害
潰瘍性大腸炎およびクローン病は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に該当する腸の慢性炎症性障害である。ＩＢＤは、起源が不明な、自然発症型で慢性の再発性の炎症を特徴とする。ヒトと実験動物の両方においてこの疾患に対する広範囲の研究がなされているにもかかわらず、正確な病理機構は、いまだ解明されていない。しかしながら、補体系が、ＩＢＤを有する患者において活性化されていると考えられており、また、疾患の病原に関与していると考えられている（Ｋｏｌｉｏｓ，Ｇ．ら、Ｈｅｐａｔｏ−Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ４５：１６０１−９，１９９８；Ｅｌｍｇｒｅｅｎ，Ｊ．，Ｄａｎ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．３３：２２２，１９８６）。
【００９１】
Ｃ３ｂおよび他の活性化された補体産物が、ＩＢＤ患者の管腔面の表面の上皮細胞ならびに筋粘膜および粘膜下の血管において見られると示されている（Ｈａｌｓｔｅｎｓｅｎ，Ｔ．Ｓ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．１０：４８５−９２，１９９１；Ｈａｌｓｔｅｎｓｅｎ，Ｔ．Ｓ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ９８：１２６４，１９９０）。さらに、通常Ｃ５ａ生成の結果である多形核細胞浸潤は、炎症性の腸において特徴的に見られる（Ｋｏｈｌ，Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：１７５，２００１）。多機能性の補体インヒビターＫ−７６はまた、小規模な臨床研究（Ｋｉｔａｎｏ，Ａ．ら、Ｄｉｓ．Ｃｏｌｏｎ  Ｒｅｃｔｕｍ  ３５：５６０，１９９２）ならびにカラギナン誘発性大腸炎ウサギモデル（Ｋｉｔａｎｏ，Ａ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９４：３４８−５３，１９９３）において潰瘍性大腸炎の症候性の改善がもたらされると報告されている。
【００９２】
新規ヒトＣ５ａレセプターアンタゴニストは、ＩＢＤのラットモデルにおいて疾患病状から保護することが示されている（Ｗｏｏｄｒｕｆｆ，Ｔ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：５５１４−２０，２００３）。膜補体制御タンパク質である崩壊促進因子（ＤＡＦ）を遺伝的に欠損したマウスをＩＢＤのモデルに使用することにより、ＤＡＦ欠損が、組織損傷の顕著な増加および炎症促進性サイトカイン産生の増加をもたらすことが証明された（Ｌｉｎ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：３８３６−４１，２００４）。したがって、補体の調節は、腸のホメオスタシスの制御において重要であり、ＩＢＤの発症に関与する主要な病原機構であり得る。
【００９３】
従って、本発明は、薬学的キャリア中に治療有効量のＭＡＳＰ−２阻害薬剤を含む組成物を、炎症性胃腸障害（膵炎、憩室炎および腸障害（クローン病、潰瘍性大腸炎および過敏性腸症候群を含む）が挙げられるが、これらに限定されない）に罹患している患者に投与することによって、そのような障害に罹患している被験体において、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するための方法を提供する。ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、動脈内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、くも膜下腔内投与、頭蓋内投与または他の非経口投与によって、そして、潜在的には、非ペプチド作動性インヒビターについては経口的に、上記被験体に投与され得る。投与は、処置される障害の症状を管理するために医師が決定するとおりに定期的に繰り返され得る。
【００９４】
肺の状態
補体は、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）（Ｗａｒｅ，Ｉ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：１３３４−４９，２０００）；輸血関連急性肺損傷（ＴＲＡＬＩ）（Ｓｅｅｇｅｒ，Ｗ．ら、Ｂｌｏｏｄ  ７６：１４３８−４４，１９９０）；虚血／再灌流急性肺損傷（Ｘｉａｏ，Ｆ．ら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．８２：１４５９−６５，１９９７）；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）（Ｍａｒｃ，Ｍ．Ｍ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（印刷に先行した電子出版），Ｍａｒｃｈ  ２３，２００４）；喘息（Ｋｒｕｇ，Ｎ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１６４：１８４１−４３，２００１）；ウェゲナー肉芽腫症（Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．８：１７９５−８００，１９９７）；および抗糸球体基底膜疾患（グッドパスチャー病（Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ））（Ｋｏｎｄｏ，Ｃら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４：３２３−９，２００１）を含む多くの肺の炎症性障害の病原に関わっている。
【００９５】
ＡＲＤＳのほとんどの病態生理学が、感染または他の誘発事象に対する正常な応答として開始するが、究極的には宿主に対して著しい自己傷害（ａｕｔｏｉｎｊｕｒｙ）を引き起こす調節不全の炎症性カスケードを含むことが、現在、十分に認知されている（Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｔ．Ｐ．，Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ２：１−１６，１９９８）。ＡＲＤＳを有する患者は、広範な補体活性化（補体成分Ｃ３ａおよびＣ５ａの血漿レベルの上昇）のエビデンスをほぼ例外なく示し、補体活性化の程度は、ＡＲＤＳの発症および結果と相関する（Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ，Ｄ．Ｆ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  １：９４７−４９，１９８０；Ｓｏｌｏｍｋｉｎ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｓｕｒｇｅｒｙ  ９７：６６８−７８，１９８５）。
【００９６】
様々な実験データおよび臨床データから、ＡＲＤＳの病態生理学における補体活性化の役割が示唆される。動物モデルでは、補体の全身性の活性化により、ヒトＡＲＤＳにおいて見られる組織病理と同様の組織病理を有する急性肺損傷がもたらされる（Ｔｉｌｌ，Ｇ．Ｏ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１２９：４４−５３，１９８７；Ｗａｒｄ，Ｐ．Ａ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４９：１０８１−８６，１９９６）。全般的な補体枯渇によってまたはＣ５ａの特異的な阻害によって補体カスケードを阻害することは、急性肺損傷の動物モデルにおいて保護をもたらす（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：５０３−５１２，１９９６）。ラットモデルでは、ｓＣＲ１は、補体媒介性および好中球媒介性の肺損傷において保護作用を有する（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｙｅｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１４７９−８５，１９９２）。さらに、実質的にすべての補体成分が、ＩＩ型肺胞細胞、肺胞マクロファージおよび肺線維芽細胞によって肺において局所的に生成され得る（Ｈｅｔｌａｎｄ，Ｇ．ら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：６０３−８，１９８６；Ｒｏｔｈｍａｎ，Ｂ．Ｉ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：５９２−９８，１９９０）。従って、補体カスケードは、肺の炎症およびその結果としてＡＲＤＳにおける肺損傷に対して有意に関与すると十分に位置づけられている。
【００９７】
喘息は、本質的には炎症性疾患である。アレルギー性喘息の主要な特徴としては、種々の特異的および非特異的な刺激に対する気道の反応性亢進、過剰な気道の粘液産生、肺好酸球増加症および血清ＩｇＥ濃度の上昇が挙げられる。喘息は、起源が多因子性であるが、一般に、遺伝的に感受性の個体において、通常の環境抗原に対する不適当な免疫学的応答の結果として生じると認識されている。補体系がヒト喘息肺において高度に活性化されているという事実は、十分に実証されている（Ｈｕｍｂｌｅｓ，Ａ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：９９８−０１，２００２；ｖａｎ  ｄｅ  Ｇｒａｆ，Ｅ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４７：２４１−５０，１９９２）。さらに、動物モデルおよびヒトからの最近のデータは、補体活性化が、疾患の病原に関与する重要な機構であるという証拠をもたらしている（Ｋａｒｐ，Ｃ．Ｌ．ら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：２２１−２６，２０００；Ｂａｕｔｓｃｈ，Ｗ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：５４０１−５，２０００；Ｄｒｏｕｉｎ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５９２６−３３，２００２；Ｗａｌｔｅｒｓ，Ｄ．Ｍ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７：４１３−１８，２００２）。喘息におけるレクチン経路の役割は、慢性真菌喘息のマウスモデルを使用した研究によって支持されている。この喘息モデルにおいて、マンナン結合レクチンが遺伝的に欠損したマウスは、正常な動物と比べて、変化した気道の反応性亢進を示す（Ｈｏｇａｂｏａｍ，Ｃ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．７５：８０５−１４，２００４）。
【００９８】
補体は、（ａ）アレルゲン−抗体複合体形成の結果としての古典経路を介した活性化；（ｂ）アレルゲン表面上での副経路の活性化；（ｃ）アレルゲン上の炭水化物構造の関与を介したレクチン経路の活性化；および（ｄ）炎症細胞から放出されたプロテアーゼによるＣ３およびＣ５の切断を含むいくつかの経路を介して喘息において活性化され得る。喘息において補体によって果たされる複合体の役割についての多くがいまだ突き止められないままであるが、アレルギー性喘息の発症に関与する補体活性化経路の特定は、このますます重要な疾患に対する新規の治療的ストラテジーの発展に対する焦点を提供し得る。
【００９９】
動物モデルを使用した多くの研究は、アレルギー性表現型の発症において、Ｃ３およびその切断産物であるＣ３ａに対する重大な役割を証明した。Ｄｒｏｕｉｎおよび共同研究者は、オバルブミン（ＯＶＡ）／Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ喘息モデルにおいてＣ３欠損マウスを使用した（Ｄｒｏｕｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：４１４１−４５，２００１）。Ｄｒｏｕｉｎらは、Ｃ３欠損マウスは、アレルゲンに曝露されるとき、対応する野生型コントロールマウスと比べてＡＨＲおよび肺好酸球増加症の著しい低減を示すことを見出した。さらに、これらのＣ３欠損マウスにおいて、ＩＬ−４産生細胞の数が劇的に減少し、Ａｇ特異的なＩｇＥおよびＩｇＧ１の応答が減弱した。Ｔａｕｂｅおよび共同研究者は、マウス補体レセプターＣｒｒｙの可溶性組換え型を使用し、Ｃ３およびＣ４のレベルにおいて補体活性化を遮断することによって、喘息のＯＶＡモデルにおいて同様の結果を得た（Ｔａｕｂｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１６８：１３３３−４１，２００３）。Ｈｕｍｂｌｅｓおよび共同研究者は、好酸球機能におけるＣ３ａの役割を検証するためにマウスにおいてＣ３ａＲを欠失させた（Ｈｕｍｂｌｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：９９８−１００１，２０００）。Ｈｕｍｂｌｅｓらは、喘息のＯＶＡモデルを使用してエアロゾル化メタコリンに対するＡＨＲの発症のほぼ完全な保護を観察した。Ｄｒｏｕｉｎおよび共同研究者（２００２）は、ＯＶＡ／Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ喘息モデルにおいてＣ３ａＲ欠損マウスを使用し、そしてＡＨＲ、好酸球補充、ＴＨ２サイトカイン産生および肺における粘液分泌が低下し、ならびにＡｇ特異的なＩｇＥおよびＩｇＧ１の応答が減少したＣ３欠損動物と非常に類似したアレルギー性応答の減弱を証明した（Ｄｒｏｕｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５９２６−３３，２００２）。Ｂａｕｔｓｃｈおよび共同研究者は、Ｃ３ａＲが天然に欠失しているモルモットの１系統を使用して研究を行った（Ｂａｕｔｓｃｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：５４０１−０５，２０００）。Ｂａｕｔｓｃｈらは、アレルギー性喘息のＯＶＡモデルを使用して抗原曝露後の気道の気管支収縮からの著しい保護を観察した。
【０１００】
動物モデルを使用した多くの最近の研究から、アレルギー性表現型の発症におけるＣ５およびその切断産物であるＣ５ａに対する重大な役割が実証されている。Ａｂｅおよび共同研究者は、Ｃ５ａＲ活性化と、気道の炎症、サイトカイン産生および気道の反応性とを結びつける証拠を報告した（Ａｂｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：４６５１−６０，２００１）。Ａｂｅらの研究では、可溶性ＣＲ１、フサン（ｆｕｔｈａｎ）（補体活性化のインヒビター）または合成ヘキサペプチドのＣ５ａアンタゴニストによる補体活性化の阻害が、メタコリンに対する炎症性反応および気道の反応性を阻止した。遮断抗Ｃ５モノクローナル抗体を使用した研究において、Ｐｅｎｇおよび共同研究者は、Ｃ５活性化が、喘息のＯＶＡモデルにおいて気道の炎症とＡＨＲの両方に対して実質的に関与することを見出した（Ｐｅｎｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：１５９０−１６００，２００５）。また、Ｂａｅｌｄｅｒおよび共同研究者は、Ｃ５ａＲの遮断によって、喘息のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓモデルにおけるＡＨＲが実質的に減少することを報告した（Ｂａｅｌｄｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：７８３−８９，２００５）。さらに、Ｃ３ａＲとＣ５ａＲの両方を遮断することにより、ＢＡＬにおける好中球数および好酸球数の減少によって証明されるように、気道の炎症が有意に低下した。
【０１０１】
先に列挙した研究は、実験的なアレルギー性喘息の病原における補体因子Ｃ３およびＣ５ならびにそれらの切断産物の重要性を強調するものであるが、Ｃ３およびＣ５は、３つすべての活性化経路に共通するので、これらの研究は、３つの補体活性化経路の各々の関与についての情報を提供していない。しかしながら、Ｈｏｇａｂｏａｍおよび共同研究者による最近の研究は、レクチン経路が、喘息の病原において主要な役割を有し得ることを示唆している（Ｈｏｇａｂｏａｍら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｙｅ  Ｂｉｏｌ．７５：８０５−８１４，２００４）。これらの研究では、レクチン補体経路の活性化に対する認識成分として機能する炭水化物結合タンパク質であるマンナン結合レクチン−Ａ（ＭＢＬ−Ａ）が遺伝的に欠損したマウスを使用していた。慢性真菌喘息のモデルでは、ＭＢＬ−Ａ（＋／＋）およびＭＢＬ−Ａ（−／−）のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ感作マウスを、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子によるｉ．ｔ．曝露の４日後および２８日後に調べた。感作ＭＢＬ−Ａ（−／−）マウスにおけるＡＨＲは、分生子曝露後の両方の時点において、感作ＭＢＬ−Ａ（＋／＋）群と比べて有意に減弱した。Ｈｏｇａｂｏａｍらは、肺のＴＨ２サイトカインレベル（ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３）が、分生子曝露の４日後における野生型群よりも、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ感作ＭＢＬ−Ａ（−／−）マウスにおけるレベルのようが有意に低いことを見出した。Ｈｏｇａｂｏａｍらの結果は、ＭＢＬ−Ａおよびレクチン経路が、慢性真菌喘息におけるＡＨＲの発症および維持において主要な役割を有することを示唆する。
【０１０２】
最近の臨床研究からの結果によって、特異的なＭＢＬ多型と喘息の発症との関連から、レクチン経路が、この疾患において重要な病理学的な役割を果たし得るというさらなる証拠がもたらされる（Ｋａｕｒら、，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：４１４−１９，２００６）。ＭＢＬの血漿濃度は、個体ごとに大きく異なり、このことは、第１にＭＢＬ遺伝子内の遺伝的多型に寄与し得る。彼らは、ＭＢＬ発現を２倍から４倍アップレギュレートする特異的なＭＢＬ多型を少なくとも１コピー有する個体では、気管支喘息の発症のリスクがほぼ５倍高いことを見出した。このＭＢＬ多型を有する気管支喘息患者における疾患マーカーの重症度もまた増大した。
【０１０３】
従って、本発明の１つの態様は、肺の障害（急性呼吸窮迫症候群、輸血関連急性肺損傷、虚血／再灌流急性肺損傷、慢性閉塞性肺疾患、喘息、ウェゲナー肉芽腫症、抗糸球体基底膜疾患（グッドパスチャー病）、胎便吸引症候群、閉塞性細気管支炎症候群、特発性肺線維症、熱傷に続発する急性肺損傷、非心原性肺浮腫、輸血関連呼吸抑制および気腫が挙げられるが、これらに限定されない）に罹患している被験体に、薬学的キャリア中の治療有効量のＭＡＳＰ−２阻害薬剤を含む組成物を投与することによって、肺の障害を処置するための方法を提供する。ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、全身的に（例えば、動脈内、静脈内、筋肉内、吸入、経鼻、皮下または他の非経口投与によって）または、潜在的には非ペプチド作動性薬剤については経口投与によって、上記被験体に投与され得る。ＭＡＳＰ−２阻害薬剤組成物は、抗炎症剤、抗ヒスタミン剤、コルチコステロイドまたは抗菌剤を含む１つ以上のさらなる治療薬と併用してもよい。投与は、その状態が回復するまで、医師が決定するとおりに定期的に繰り返され得る。
【０１０４】
体外循環
患者の循環器系から血液を迂回させる数多くの医学的手技（体外循環システムまたはＥＣＣ）が存在する。そのような手技としては、血液透析、プラスマフェレーシス、白血球フェレーシス、体外膜型肺（ＥＣＭＯ）、ヘパリン誘導性体外膜型肺ＬＤＬ沈降法（ＨＥＬＰ）および心肺バイパス術（ＣＰＢ）が挙げられる。これらの手技では、血液または血液製剤を、正常な細胞機能および止血を変化させ得る異質の表面に曝露する。先駆的な研究において、Ｃｒａｄｄｏｃｋらは、補体活性化を血液透析中の顆粒球減少症の考えられる原因と同定した（Ｃｒａｄｄｏｃｋ，Ｐ．Ｒ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２９６：７６９−７４，１９７７）。１９７７年から現在に至るまでの数多くの研究の結果から、血液透析またはＣＰＢを受けている患者が経験する有害事象の多くは、補体系の活性化によって引き起こされることが示唆されている（Ｃｈｅｎｏｗｅｔｈ，Ｄ．Ｅ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１６：３０６−３１３，１９８７；Ｈｕｇｌｉ，Ｔ．Ｅ．，Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ３：１１１−１２７，１９８６；Ｃｈｅｕｎｇ，Ａ．Ｋ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１：１５０−１６１，１９９０；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ９：３６−４５  １９９４）。例えば、補体を活性化させる可能性は、腎不全を有する患者の腎機能の回復、感染症に対する感受性、肺の機能不全、罹患率および生存率について、血液透析器の生体適合性の決定における重要な判定基準であることが示されている（Ｈａｋｉｍ，Ｒ．Ｍ．，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．４４：４８４−４９４６，１９９３）。
【０１０５】
血液透析膜による補体活性化は、弱いＣ４ａ生成に起因して副経路の機構によって生じると広く考えられている（Ｋｉｒｋｌｉｎ，Ｊ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．８６：８４５−５７，１９８３；Ｖａｌｌｈｏｎｒａｔ，Ｈ．ら、ＡＳＡＩＯ  Ｊ．４５：１１３−４，１９９９）が、最近の研究では、古典経路も関与し得ると示唆されている（Ｗａｃｈｔｆｏｇｅｌ，Ｙ．Ｔ．ら、Ｂｌｏｏｄ  ７３：４６８−４７１，１９８９）。しかしながら、医用高分子を含む人工物の表面上において補体活性化を開始および制御する因子について未だ不適当な見解が存在する。例えば、血液透析に使用されるＣｕｐｒｏｐｈａｎ膜は、非常に強力な補体アクチベーターとして分類されている。理論に拘束するつもりはないが、本発明者らは、このことは、おそらくその多糖の性質によって部分的に説明され得るとの理論を立てている。本特許において同定されるＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化の系は、レクチン経路の活性化によって副経路活性化が引き起こされる機構を提供する。
【０１０６】
ＣＰＢ中にＥＣＣを受けている患者は、全身性の炎症性反応を受け、その反応は、体外循環路の人工物の表面に血液が曝露されることによってだけでなく、外科的外傷および虚血−再灌流損傷のような、その表面とは無関係の因子によっても部分的に引き起こされる（Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．ら、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．５５：５５２−９，１９９３；Ｅｄｍｕｎｄｓ，Ｌ．Ｈ．，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．６６（Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ１２−６，１９９８；Ａｓｉｍａｋｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．，Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  １４：２６９−７７，１９９９）。ＣＰＢが誘発する炎症性反応によって、一般に「体外循環後症候群」と呼ばれる手術後の合併症が生じ得る。これらの術後の事象は、認知障害（Ｆｉｔｃｈ，Ｊ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １００（２５）：２４９９−２５０６，１９９９）、呼吸不全、出血性障害、腎機能障害および最も重篤な場合は多臓器不全（Ｗａｎ，Ｓ．ら、Ｃｈｅｓｔ  １１２：６７６−６９２，１９９７）である。ＣＰＢを用いた冠状動脈バイパス手術によって、ＣＰＢは用いないが同程度の外科的外傷を伴う外科術と対照的に、補体の著明な活性化がもたらされる（Ｅ．Ｆｏｓｓｅ，１９８７）。したがって、これらのＣＰＢ関連の問題の主に疑われる原因は、バイパス手技中の補体の不適当な活性化である（Ｃｈｅｎｏｗｅｔｈ，Ｋ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０４：４９７−５０３，１９８１；Ｐ．Ｈａｓｌａｍら、Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉａ  ２５：２２−２６，１９８０；Ｊ．Ｋ．Ｋｉｒｋｌｉｎら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．８６：８４５−８５７，１９８３；Ｍｏｏｒｅ，Ｆ．Ｄ．ら、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ  ２０８：９５−１０３，１９８８；Ｊ．Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ  １０６：１９０１−１９１８，１９９３）。ＣＰＢ回路では、補体副経路は、血液とＣＰＢ回路の人工物の表面との相互作用から生じる、補体活性化において主な役割を果たす（Ｋｉｒｋｌｉｎ，Ｊ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．，８６：８４５−５７，１９８３；Ｋｉｒｋｌｉｎ，Ｊ．Ｋ．ら、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．４１：１９３−１９９，１９８６；Ｖａｌｌｈｏｎｒａｔ  Ｈ．ら、ＡＳＡＩＯ  Ｊ．４５：１１３−４，１９９９）。しかしながら、ＣＰＢ中に補体古典経路が活性化されるという証拠も存在する（Ｗａｃｈｔｆｏｇｅｌ，Ｙ．Ｔ．ら、Ｂｌｏｏｄ  ７３：４６８−４７１，１９８９）。
【０１０７】
アナフィラトキシンＣ３ａおよびＣ５ａ、オプソニンＣ３ｂおよび細胞膜傷害複合体Ｃ５ｂ−９を含む主な炎症性物質は、補体系の活性化後に生成される。Ｃ３ａおよびＣ５ａは、好中球、単球および血小板の強力な刺激物質である（Ｈａｅｆｆｎｅｒ−Ｃａｖａｉｌｌｏｎ，Ｎ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３９：７９４−９，１９８７；Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６５：Ｈ１７５０−６１，１９９３；Ｒｉｎｄｅｒ，Ｃ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６：１５６４−７２，１９９５；Ｒｉｎｄｅｒ，Ｃ．Ｓ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １００：５５３−８，１９９９）。これらの細胞の活性化によって、炎症促進性サイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦアルファ）、酸化性フリーラジカルおよびプロテアーゼの放出がもたらされる（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ，Ｒ．ら、Ｂｌｏｏｄ  ７６：１６３１−８，１９９０；Ｃｒｕｉｃｋｓｈａｎｋ，Ａ．Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ．（Ｌｏｎｄ）７９：１６１−５，１９９０；Ｋａｗａｍｕｒａ，Ｔ．ら、Ｃａｎ．Ｊ．Ａｎａｅｓｔｈ．４０：１０１６−２１，１９９３；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｂ．ら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１０６：１００８−１，１９９３；Ｆｉｎｎ，Ａ．ら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１０５：２３４−４１，１９９３；Ａｓｈｒａｆ，Ｓ．Ｓ．ら、Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ．Ｖａｓｃ．Ａｎｅｓｔｈ．１１：７１８−２２，１９９７）。Ｃ５ａは、多形核細胞（ＰＭＮ）においてＭａｃ−１の接着分子ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１８をアップレギュレートすることおよびＰＭＮの脱顆粒を誘導することにより炎症促進性酵素を放出することが示されている。Ｒｉｎｄｅｒ，Ｃら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２７（Ｓｕｐｐｌ  １）：Ｓ６−１２，１９９６；Ｅｖａｎｇｅｌｉｓｔａ，Ｖ．ら、Ｂｌｏｏｄ  ９３：８７６−８５，１９９９；Ｋｉｎｋａｄｅ，Ｊ．Ｍ．，Ｊｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１４：２９６−３０３，１９８３；Ｌａｍｂ，Ｎ．Ｊ．ら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２７：１７３８−４４，１９９９；Ｆｕｊｉｅ，Ｋ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３７４：１１７−２５，１９９９。Ｃ５ｂ−９は、血小板上での接着分子Ｐ−セレクチン（ＣＤ６２Ｐ）の発現を誘導する（Ｒｉｎｄｅｒ，Ｃ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１１８：４６０−６，１９９９）のに対し、Ｃ５ａとＣ５ｂ−９の両方は、内皮細胞上でＰ−セレクチンの表面発現を誘導する（Ｆｏｒｅｍａｎ，Ｋ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１１４７−５５，１９９４）。これらの接着分子は、白血球と血小板と内皮細胞との相互作用に関与する。活性化された内皮細胞上での接着分子の発現は、活性化された白血球の隔離に関与し、その白血球は、組織の炎症および損傷を媒介する（Ｅｖａｎｇｅｌｉｓｔａ，Ｖ．，Ｂｌｏｏｄ  １９９９；Ｆｏｒｅｍａｎ，Ｋ．Ｅ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９４；Ｌｅｎｔｓｃｈ，Ａ．Ｂ．ら、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９０：３４３−８，２０００）。それは、ＣＰＢ後に��じる様々な問題をもたらし得る、好中球上、単球上、血小板上および他の循環細胞上における、これらの補体活性化産物の作用である。
【０１０８】
いくつかの補体インヒビターは、ＣＰＢにおける潜在的な応用法について研究されている。それらの補体インヒビターとしては、組換え可溶性補体レセプター１（ｓＣＲ１）（Ｃｈａｉ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０１：５４１−６，２０００）、ヒト化一本鎖抗Ｃ５抗体（ｈ５Ｇ１．１−ｓｃＦｖまたはパキセリズマブ）（Ｆｉｔｃｈ，Ｊ．Ｃ．Ｋ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １００：３４９９−５０６，１９９９）、ヒトメンブレンコファクタープロテインとヒト崩壊促進因子との組換え融合ハイブリッド（ＣＡＢ−２）（Ｒｉｎｄｅｒ，Ｃ．Ｓ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １００：５５３−８，１９９９）、１３残基のＣ３結合環状ペプチド（コンプスタチン（Ｃｏｍｐｓｔａｔｉｎ））（Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｂ．ら、Ｂｌｏｏｄ  ９２：１６６１−７，１９９８）および抗Ｄ因子ＭｏＡｂ（Ｆｕｎｇ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１２２：１１３−２２，２００１）が挙げられる。ＳＣＲ１およびＣＡＢ−２は、Ｃ３およびＣ５の活性化の工程において古典経路および補体副経路を阻害する。コンプスタチンは、Ｃ３活性化の工程において両方の補体経路を阻害するのに対し、ｈ５Ｇ１．１−ｓｃＦｖは、Ｃ５活性化の工程においてのみ両方の補体経路を阻害する。抗Ｄ因子ＭｏＡｂは、Ｃ３およびＣ５の活性化の工程において副経路を阻害する。しかしながら、これらの補体インヒビターは、本特許において同定されたＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化の系を特異的に阻害しないだろう。
【０１０９】
冠状動脈バイパス術（ＣＡＢＧ）において周術期のＭＩおよび死亡率を低下させる際のヒト化一本鎖抗Ｃ５抗体（ｈ５Ｇ１．１−ｓｃＦｖ、パキセリズマブ）の有効性および安全性を調べる大規模な前向き第３相臨床研究からの結果が報告されている（Ｖｅｒｒｉｅｒ，Ｅ．Ｄ．ら、ＪＡＭＡ  ２９１：２３１９−２７，２００４）。プラセボと比べて、パキセリズマブは、ＣＡＢＧ外科術を受けていた２７４６人の患者において死亡またはＭＩの複合エンドポイントのリスクの有意な低下に関与しなかった。しかしながら、弁外科術を伴うかまたは伴わないＣＡＢＧ外科術を受けている３０９９人すべての患者の間においてその手技の３０日後に統計学的に有意な低下が認められた。パキセリズマブは、Ｃ５活性化の工程において阻害するので、パキセリズマブは、Ｃ５ａおよびｓＣ５ｂ−９の生成を阻害するが、Ｃ３ａおよびオプソニンＣ３ｂ（他の２つの強力な補体炎症性物質であり、ＣＰＢを引き起こす炎症性反応に関与することも知られている）の生成に影響しない。
【０１１０】
従って、本発明の１つの態様は、血液透析、プラスマフェレーシス、白血球フェレーシス、体外膜型肺（ＥＣＭＯ）、ヘパリン誘導性体外膜型肺ＬＤＬ沈降法（ＨＥＬＰ）および心肺バイパス術（ＣＰＢ）を受けている患者を含む、体外循環手技を受けている被験体を、薬学的キャリア中の治療有効量のＭＡＳＰ−２阻害薬剤を含む組成物で処置することによって、体外曝露によって引き起こされる炎症性反応を予防または処置することに関する。本発明の方法に従うＭＡＳＰ−２阻害薬剤処置は、ＣＰＢ手技によって時折もたらされる認知性の機能不全の低減または予防に有用であると考えられている。ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、手技前におよび／または手技中におよび／または手技後に、例えば、動脈内、静脈内、筋肉内、皮下または他の非経口投与によって上記被験体に投与され得る。あるいは、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、例えば、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤を、血液が循環する管組織もしくは膜に注射することによって、または、血液をＭＡＳＰ−２阻害薬剤でコーティングされた表面（例えば、管組織の内壁、膜またはＣＰＢデバイスなどのその他の表面）に接触させることによって、体外循環中に被験体の血流に導入され得る。
【０１１１】
炎症性および非炎症性の関節炎ならびにその他の筋骨格疾患
補体系の活性化は、関節リウマチ（Ｌｉｎｔｏｎ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：９０５−１４，１９９９）、若年性関節リウマチ（Ｍｏｌｌｎｅｓ，Ｔ．Ｅ．ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２９：１３５９−６４，１９８６）、変形性関節症（Ｋｅｍｐ，Ｐ．Ａ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７：１４７−６２，１９９２）、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｉｓ）（ＳＬＥ）（Ｍｏｌｉｎａ，Ｈ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１４：４９２−４９７，２００２）、ベーチェット症候群（Ｒｕｍｆｅｌｄ，Ｗ．Ｒ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２５：２６６−７０，１９８６）およびシェーグレン症候群（Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｍ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：２０９５−９，１９８７）を含む多岐にわたるリウマチ学的疾患の病原に関わっている。
【０１１２】
免疫複合体が引き起こす補体活性化が、関節リウマチ（ＲＡ）における組織の損傷に関与する主要な病理学的な機構であるという有力な証拠がある。補体活性化産物が、ＲＡ患者の血漿中で上昇すると実証している数多くの刊行物が存在する（Ｍｏｒｇａｎ，Ｂ．Ｐ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，７３：４７３−４７８，１９８８；Ａｕｄａ，Ｇ．ら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｉｎｔ．１０：１８５−１８９，１９９０；Ｒｕｍｆｅｌｄ，Ｗ．Ｒ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２５：２６６−２７０，１９８６）。補体活性化産物（例えば、Ｃ３ａ、Ｃ５ａおよびｓＣ５ｂ−９）もまた、炎症性のリウマチ性の関節内で認められ、そして補体活性化の程度とＲＡの重症度との間に正の相関が証明されている（Ｍａｋｉｎｄｅ，Ｖ．Ａ．ら、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．４８：３０２−３０６，１９８９；Ｂｒｏｄｅｕｒ，Ｊ．Ｐ．ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ３４：１５３１−１５３７，１９９１）。成人性と若年性の両方の関節リウマチにおいて、Ｃ４ｄ（古典経路活性化についてのマーカー）よりも、副経路の補体活性化産物Ｂｂの血清レベルおよび滑液レベルが高いことから、補体活性化は、主に副経路によって媒介されることが示唆される（Ｅｌ−Ｇｈｏｂａｒｅｙ，Ａ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ７：４５３−４６０，１９８０；Ａｇａｒｗａｌ，Ａ．ら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ３９：１８９−１９２，２０００）。補体活性化産物は、直接、組織を損傷し得る（Ｃ５ｂ−９を介して）か、またはアナフィラトキシンのＣ３ａおよびＣ５ａによって炎症細胞の補充を介して炎症を間接的に媒介し得る。
【０１１３】
実験的な関節炎の動物モデルは、ＲＡの病原における補体の役割を調べるために広く使用されている。ＲＡの動物モデルにおけるコブラ毒因子による補体枯渇は、関節炎の発症を予防する（Ｍｏｒｇａｎ，Ｋ．ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍａｔ．２４：１３５６−１３６２，１９８１；Ｖａｎ  Ｌｅｎｔ，Ｐ．Ｌ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４０：１４５１−１４６１，１９９２）。ＲＡのラットモデルにおいて、補体インヒビターである可溶型の補体レセプター１（ｓＣＲ１）の関節内注射によって炎症が抑制された（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１０：４５−５２，１９９７）。さらに、ｓＣＲ１は、ラットコラーゲン誘発性関節炎の発症および進行を阻害する（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１９：２１０−２１６，２０００）。可溶性ＣＲ１は、副経路と古典経路の両方におけるＣ３およびＣ５の活性化の工程において古典経路および補体副経路を阻害し、それによって、Ｃ３ａ、Ｃ５ａおよびｓＣ５ｂ−９の生成が阻害される。
【０１１４】
１９７０年代後半に、異種性のＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ；ヒト関節軟骨の主要なコラーゲン成分）でげっ歯類を免役することによって、ヒトＲＡに著しく類似した自己免疫性関節炎（コラーゲン誘発性関節炎またはＣＩＡ）が発症することが認識された（Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８３：６６６−６８（１９８０），Ｂａｎｄａら、Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：２１０９−２１１５（２００３））。感受性の動物における自己免疫性応答は、特異的な主要組織適合遺伝子複合体（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔａｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＭＨＣ）分子、サイトカインならびにＣＩＩ特異的なＢ細胞およびＴ細胞の応答を含む因子の複雑な組み合わせに関与する（Ｍｙｅｒｓ，Ｌ．Ｋ．ら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ６１：１８６１−７８，１９９７によって概説されている）。ほぼ４０％の近交系マウスが補体成分Ｃ５を完全に欠失しているという観察結果（Ｃｉｎａｄｅｒ，Ｂ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２０：８９７−９０２，１９６４）から、Ｃ５欠損系統とＣ５が十分な系統とのＣＩＡを比較することによってこの関節炎モデルにおける補体の役割を探索する間接的な機会がもたらされた。そのような研究からの結果は、Ｃ５が十分な状態は、ＣＩＡの発症に絶対必要条件であることを示唆する（Ｗａｔｓｏｎら、１９８７；Ｗａｎｇ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４３４０−４３４７，２０００）。ＲＡにおけるＣ５および補体の重要性のさらなる証拠は、抗Ｃ５モノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）を使用することによってもたらされた。ＣＩＡのマウスモデルにおける抗Ｃ５  ＭｏＡｂの予防的な腹腔内投与によって、疾患の発症がほぼ完全に予防され、活性な関節炎中の処置によって、有意な臨床上の利点と、より軽度の組織学的疾患の両方がもたらされた（Ｗａｎｇ，Ｙ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：８９５５−５９，１９９５）。
【０１１５】
疾患の病原における補体活性化の潜在的な役割に関するさらなる見識は、最近開発された炎症性関節炎のモデルであるＫ／ＢｘＮ  Ｔ細胞レセプタートランスジェニックマウスを使用した研究によってもたらされた（Ｋｏｒｇａｎｏｗ，Ａ．Ｓ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０：４５１−４６１，１９９９）。すべてのＫ／ＢｘＮ動物は、ヒトにおけるＲＡのほとんどの（すべてではないが）臨床的、組織学的および免疫学的な特徴を有する自己免疫疾患を自然発症的に発症する。さらに、関節炎のＫ／ＢｘＮマウス由来の血清を健常な動物に移すことにより、関節炎を発症させる免疫グロブリンの移入によって数日以内に関節炎が誘発される。疾患の発症に必要な特異的な補体活性化工程を同定するために、関節炎のＫ／ＢｘＮマウス由来の血清を、特定の補体経路産物が遺伝的に欠損した様々なマウスに移入した（Ｊｉ，Ｈ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １６：１５７−６８，２００２）。興味深いことに、この研究の結果は、副経路の活性化が重大であるのに対し、古典経路の活性化は無くても済むことを証明した。さらに、Ｃ５欠損マウスとＣ５ａＲ欠損マウスの両方が、疾患の発症から保護されたので、Ｃ５ａの生成は、重大である。これらの結果と一致して、以前の研究では、Ｃ５ａレセプター発現の遺伝的除去によって、関節炎からマウスが保護されると報告された（Ｇｒａｎｔ，Ｅ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６：１４６１−１４７１，２００２）。
【０１１６】
ヒト補体成分Ｃ５がその炎症促進性成分に切断されることを妨害するヒト化抗Ｃ５  ＭｏＡｂ（５Ｇ１．１）が、ＲＡ用の潜在的な処置としてＡｌｅｘｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔによって開発中である。
【０１１７】
２つの研究グループは、独立して、レクチン経路が、ＭＢＬと特定のＩｇＧグリコフォームとの相互作用を介してＲＡ患者における炎症を促進すると提案している（Ｍａｌｈｏｔｒａら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：２３７−２４３，１９９５；Ｃｕｃｈａｃｏｖｉｃｈら、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２３：４４−５１，１９９６）。ＲＡは、ＩｇＧ分子のＦｃ領域においてガラクトースを欠くＩｇＧグリコフォーム（ＩｇＧ０グリコフォームとも呼ばれる）の著明な増加に関連する（Ｒｕｄｄら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２：５２４−３０，２００４）。ＩｇＧ０グリコフォームのパーセンテージは、疾患の進行とともに増加し、患者が緩解の状態に入ると正常値に戻る。インビボにおいて、ＩｇＧ０は、滑膜組織上に沈着し、ＭＢＬは、ＲＡを有する個体の滑液中に高レベルで存在する。ＲＡに関連する、密集したＩｇＧ上に凝集した無ガラクトシル（ａｇａｌａｃｔｏｓｙｌ）ＩｇＧ（ＩｇＧ０）は、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）に結合し得、補体のレクチン経路を活性化し得る。さらに、ＲＡ患者におけるＭＢＬの対立遺伝子改変体を調べた最近の臨床研究からの結果は、ＭＢＬが、その疾患において炎症を促進する役割を有し得ることを示唆している（Ｇａｒｒｅｄら、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２７：２６−３４，２０００）。したがって、レクチン経路は、ＲＡの病原において重要な役割を有し得る。
【０１１８】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、自己抗体の産生、循環免疫複合体の生成および制御されていない一時的な補体系の活性化をもたらす、病因が不明確な自己免疫疾患である。ＳＬＥにおける自己免疫の起源は、わかりにくいままであるが、現在、この疾患における血管の損傷に関与する重要な機構として補体活性化を関連づけるかなりの情報が、入手可能である（Ａｂｒａｍｓｏｎ，Ｓ．Ｂ．ら、Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ３３：１０７−１２２，１９９８）。補体の古典経路と副経路の両方の活性化が、この疾患に関与し、また、Ｃ４ｄとＢｂの両方が、中等度から重篤な狼瘡疾患活性の感受性マーカーである（Ｍａｎｚｉ，Ｓ．ら、Ａｒｔｈｒｉｔ．Ｒｈｅｕｍａｔ．３９：１１７８−１１８８，１９９６）。補体副経路の活性化は、妊娠中の全身性エリテマトーデスにおける疾患発赤を併発する（Ｂｕｙｏｎ，Ｊ．Ｐ．ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．３５：５５−６１，１９９２）。さらに、最近、ＭＢＬに対する自己抗体が、ＳＬＥ患者由来の血清中で同定されたので、レクチン経路は、疾患の発症に関与し得る（Ｓｅｅｌｅｎ，Ｍ．Ａ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４：３３５−３４３，２００３）。
【０１１９】
古典経路を介した免疫複合体媒介性の補体活性化は、ＳＬＥ患者において組織損傷が起きる１つの機構であると考えられている。しかしながら、古典経路の補体成分の遺伝的な欠損によって、狼瘡および狼瘡様疾患のリスクが増加する（Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ，Ｍ．Ｃ．ら、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７６：２２７−３２４，２０００）。Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ／Ｃ１ｓ、Ｃ４またはＣ３が完全に欠損している人のうち８０％を超える人において、ＳＬＥまたは関連症候群が起きる。これは、狼瘡における補体の有害な作用と保護的な作用とを調和させる際の明らかな逆説を表している。
【０１２０】
古典経路の重要な活性は、単核の食細胞系によって循環および組織からの免疫複合体の除去を促進することであるとみられる（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｐ．Ｆ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．５６：４０６−１１，１９７４）。さらに、補体は、アポトーシス小体の除去および処分において重要な役割を有すると最近見出された（Ｍｅｖｏｒａｒｃｈ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：２３１３−２３２０，１９９８）。古典経路機能の欠損により、免疫複合体またはアポトーシス細胞が組織に蓄積し、炎症および自己抗原の放出を引き起こす（その後、自己抗体およびより多くの免疫複合体の産生を刺激し、それによって自己免疫性応答を惹起する）サイクルが開始するのを可能にすることによって、被験体がＳＬＥを発症しやすくなり得る（Ｂｏｔｔｏ，Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：５６−５９，１９９８；Ｂｏｔｔｏ，Ｍ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．３：２０１−１０，２００１）。しかしながら、これらの古典経路成分の「完全な」欠損状態は、ＳＬＥを有する患者１００人のうち約１人に存在するだけである。したがって、圧倒的多数のＳＬＥ患者では、古典経路成分における補体の欠損は、この疾患の病因に関与せず、また、補体活性化は、ＳＬＥ病原に関与する重要な機構であり得る。古典経路成分が永続して遺伝的に欠損した珍しい個体が、生存中の同じ時点においてしばしばＳＬＥを発症するという事実は、この疾患を引き起こすことができる機構の冗長性を証明する。
【０１２１】
ＳＬＥの動物モデルからの結果は、この疾患の病原における補体活性化の重要な役割を支持する。遮断抗Ｃ５  ＭｏＡｂを使用してＣ５の活性化を阻害することによって、ＳＬＥのマウスモデルであるＮＺＢ／ＮＺＷ  Ｆ１マウスにおいて、タンパク尿および腎臓の疾患が低減した（Ｗａｎｇ  Ｙ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８５６３−８，１９９６）。さらに、抗ＤＮＡ抗体を分泌する細胞が移植された重症複合免疫不全疾患を有するマウスの抗Ｃ５  ＭｏＡｂを用いて処置することによって、未処置コントロールと比べて、生存に関連する利点とともにタンパク尿および腎臓の組織像の改善がもたらされる（Ｒａｖｉｒａｊａｎ，Ｃ．Ｔ．ら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ４３：４４２−７，２００４）。Ｂ因子欠損マウスをＳＬＥのＭＲＬ／ｌｐｒモデルに戻し交雑させることによって、Ｂ因子の欠損が、他の自己抗体のレベルは変化させずに、このモデルにおいて代表的に見られる血管炎、糸球体疾患、Ｃ３消費およびＩｇＧ３  ＲＦレベルを低下させるということが明らかになったので、副経路はまた、自己免疫疾患のＳＬＥの症状発現において重要な役割を有する（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：７８６−７９４，２０００）。ヒト化抗Ｃ５  ＭｏＡｂは、ＳＬＥに対する潜在的な処置として研究中である。この抗体は、Ｃ５のＣ５ａおよびＣ５ｂへの切断を妨害する。第Ｉ相臨床試験において、重篤な有害作用は示されず、ＳＬＥにおける有効性を判定するために、さらなるヒトでの治験が進行中である（Ｓｔｒａｎｄ，Ｖ．，Ｌｕｐｕｓ  １０：２１６−２２１，２００１）。
【０１２２】
ヒトと動物での試験の両方からの結果は、補体系が、筋ジストロフィの病原に直接関与するという可能性を支持する。ヒトのジストロフィバイオプシーの研究から、ジストロフィの筋肉における壊死性と非壊死性の両方の線維上にＣ３およびＣ９が沈着することが示された（Ｃｏｒｎｅｌｉｏ  ａｎｄ  Ｄｏｎｅｓ，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１６：６９４−７０１，１９８４；Ｓｐｕｌｅｒ  ａｎｄ  Ｅｎｇｅｌ，Ａ．Ｇ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５０：４１−４６，１９９８）。ＤＮＡマイクロアレイ法を使用して、Ｐｏｒｔｅｒおよび共同研究者は、ジストロフィン欠損（ｍｄｘ）マウスにおいて、ジストロフィの疾患の発症と一致して数多くの補体関連ｍＲＮＡの遺伝子発現が著明に増大していることを見出した（Ｐｏｒｔｅｒら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１１：２６３−７２，２００２）。
【０１２３】
膜貫通型筋肉タンパク質であるジスフェリン（ｄｙｓｆｅｒｌｉｎ）をコードするヒト遺伝子の変異は、２つの型の骨格筋疾患、すなわち、肢帯筋ジストロフィ（ＬＧＭＤ）および三好ミオパチーに対する主要な危険因子として同定されている（Ｌｉｕら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０：３１−６，１９９８）。ジスフェリンの変異を有するいくつかのマウスモデルが開発されており、また、そのマウスモデルは、進行性の筋ジストロフィも発症する。補体カスケードの活性化は、ＬＧＭＤを有する数人の患者において非壊死性筋肉線維の表面上で同定されている（Ｓｐｕｌｅｒ  ａｎｄ  Ｅｎｇｅｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５０：４１−４６，１９９８）。最近の研究において、Ｗｅｎｚｅｌおよび共同研究者は、マウスとヒトの両方のジスフェリン欠損筋肉線維が、Ｃ５ｂ−９  ＭＡＣ（細胞膜傷害複合体）の特異的なインヒビターである補体阻害性因子ＣＤ３３／ＤＡＦを有しないことを示した（Ｗｅｎｚｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：６２１９−２５，２００５）。結果として、ジスフェリン欠損非壊死性筋細胞は、補体媒介性の細胞溶解に対してより感受性である。Ｗｅｎｚｅｌおよび共同研究者は、骨格筋細胞の補体媒介性溶解が、患者におけるＬＧＭＤおよび三好ミオパチーの発症に関与する主要な病理学的な機構であり得ることを示唆している。Ｃｏｎｎｏｌｌｙおよび共同研究者は、先天性のジストロフィの重篤なモデル（ラミニンα２欠損であるｄｙ−／−マウス）の病原における補体Ｃ３の役割について研究した（Ｃｏｎｎｏｌｌｙら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：８０−７，２００２）。Ｃｏｎｎｏｌｌｙらは、Ｃ３とラミニンα２の両方が遺伝的に欠損した動物を作製し、そして筋ジストロフィのｄｙ−／−モデルにおいてＣ３が長く残存しないことを見出した。さらに、ダブルノックアウト（Ｃ３−／−、ｄｙ−／−）マウスは、ｄｙ−／−マウスよりも高い筋力を示した。この研究から、補体系が、この型の先天性のジストロフィの病原に直接関与し得ることが示唆される。
【０１２４】
従って、本発明の１つの態様は、炎症性および非炎症性の関節炎ならびに他の筋骨格障害（変形性関節症、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、痛風、神経障害性関節症、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎もしくは他の脊椎関節症および結晶性関節症、筋ジストロフィまたは全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）が挙げられるが、これらに限定されない）に罹患している被験体に、薬学的キャリア中の治療有効量のＭＡＳＰ−２阻害薬剤を含む組成物を投与することによって、そのような障害を予防または処置することに関する。ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、全身的に（例えば、動脈内、静脈内、筋肉内、皮下または他の非経口投与によって）または、潜在的には非ペプチド作動性薬剤については経口投与によって、上記被験体に投与され得る。あるいは、投与は、局所送達（例えば、関節内注射）によってであり得る。ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、慢性状態の処置または管理に対して長期間にわたって定期的に投与され得るか、または関節に対して行われる外科的手技を含む急性の外傷または損傷の前、最中および／もしくは後の時期において、単回投与または反復投与によってであり得る。
【０１２５】
腎臓の状態
補体系の活性化は、メサンギウム増殖性糸球体腎炎（ＩｇＡ−腎症、ベルガー病）（Ｅｎｄｏ，Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  ５５：１８５−１９１，２００１）、膜性糸球体腎炎（Ｋｅｒｊａｓｈｋｉ，Ｄ．，Ａｒｃｈ  Ｂ  Ｃｅｌｌ  Ｐａｔｈｏｌ．５８：２５３−７１，１９９０；Ｂｒｅｎｃｈｌｅｙ，Ｐ．Ｅ．ら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．，４１：９３３−７，１９９２；Ｓａｌａｎｔ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．３５：９７６−８４，１９８９）、膜性増殖性糸球体腎炎（メサンギウム毛細血管性糸球体腎炎）（Ｂａｒｔｌｏｗ，Ｂ．Ｇ．ら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．１５：２９４−３００，１９７９；Ｍｅｒｉ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：９３９−５０，１９９２）、急性感染後糸球体腎炎（レンサ球菌感染後糸球体腎炎）、クリオグロブリン血症性糸球体腎炎（Ｏｈｓａｗａ，Ｉ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０１：５９−６６，２００１）、ループス腎炎（Ｇａｔｅｎｂｙ，Ｐ．Ａ．，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  １１：６１−６，１９９１）およびヘノッホ−シェーンライン紫斑病性腎炎（Ｅｎｄｏ，Ｍ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ．３５：４０１−４０７，２０００）を含む多岐にわたる腎臓の疾患の病原に関わる。腎臓の疾患における補体の関与は、数十年間にわたって理解されてきたが、腎臓の疾患の発症、進行および回復相における正確な役割について、未だ大きな議論の余地がある。正常な条件下では、補体の寄与は、宿主にとって有益であるが、補体の不適当な活性化および沈着は、組織損傷の一因となり得る。
【０１２６】
糸球体の炎症である糸球体腎炎は、糸球体または尿細管構造上への免疫複合体の沈着によって開始することが多く、その後、補体活性化、炎症および組織の損傷が引き起こされるという実質的な証拠がある。ＫａｈｎおよびＳｉｎｎｉａｈは、様々な型の糸球体腎炎を有する患者から採取したバイオプシーの尿細管基底膜においてＣ５ｂ−９の沈着が増大していたことを証明した（Ｋａｈｎ，Ｔ．Ｎ．ら、Ｈｉｓｔｏｐａｔｈ．２６：３５１−６，１９９５）。ＩｇＡ腎臓病学による患者の研究において（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ａ．ら、Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １０：１１６６−１１７２，１９９５）、尿細管上皮／基底膜構造におけるＣ５ｂ−９沈着は、血漿クレアチニンレベルと相関した。膜性腎症の別の研究からは、臨床成績と尿中ｓＣ５ｂ−９レベルとの関係性が証明された（Ｋｏｎ，Ｓ．Ｐ．ら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．４８：１９５３−５８，１９９５）。ｓＣ５ｂ−９レベルの上昇は、不良な予後と正の相関を示した。Ｌｅｈｔｏらは、膜性糸球体腎炎を有する患者由来の原形質膜における細胞膜傷害複合体を阻害する補体制御因子であるＣＤ５９のレベルならびに尿中のＣ５ｂ−９のレベルの上昇を測定した（Ｌｅｈｔｏ，Ｔ．ら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．４７：１４０３−１１，１９９５）。これらの同じ患者から採取したバイオプシーサンプルの病理組織学的解析から、糸球体におけるＣ３およびＣ９タンパク質の沈着が証明されたのに対し、これらの組織のＣＤ５９の発現は、正常な腎臓組織のＣＤ５９の発現よりも低かった。これらの様々な研究から、進行中の補体媒介性の糸球体腎炎が、組織損傷および疾患予後の程度と相関する補体タンパク質の尿中排出をもたらすことが示唆される。
【０１２７】
糸球体腎炎の様々な動物モデルにおける補体活性化の阻害によってもまた、この疾患の病因における補体活性化の重要性が証明された。膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）のモデルにおいて、Ｃ６欠損ラット（Ｃ５ｂ−９を形成することができない）に抗Ｔｈｙ１抗血清を注入することによって、糸球体細胞の増殖が９０％少なくなり、血小板およびマクロファージ浸潤が８０％低下し、ＩＶ型コラーゲン合成（メサンギウム基質の増殖についてのマーカー）が減少し、そしてタンパク尿がＣ６＋正常ラットよりも５０％少なくなった（Ｂｒａｎｄｔ，Ｊ．ら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．４９：３３５−３４３，１９９６）。これらの結果は、Ｃ５ｂ−９を、このラット抗胸腺細胞血清モデルにおける補体による組織の損傷の主要なメディエーターとして関係づける。糸球体腎炎の別のモデルにおいて、ウサギ抗ラット糸球体基底膜の段階的用量の注入によって、コブラ毒因子（補体を消費する）による前処置によって減弱した多形核白血球（ＰＭＮ）の用量依存的流入がもたらされた（Ｓｃａｎｄｒｅｔｔ，Ａ．Ｌ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６８：Ｆ２５６−Ｆ２６５，１９９５）。コブラ毒因子で処置したラットは、組織病理の低下、長期間にわたるタンパク尿の減少およびコントロールラットよりも低いクレアチニンレベルも示した。ラットにおけるＧＮの３つのモデル（抗胸腺細胞血清、ＣｏｎＡ抗ＣｏｎＡおよび受動（ｐａｓｓｉｖｅ）ヘイマン腎炎）を使用して、Ｃｏｕｓｅｒらは、組換えｓＣＲ１タンパク質を使用することによって補体を阻害するアプローチの潜在的な治療的有効性を証明した（Ｃｏｕｓｅｒ，Ｗ．Ｇ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．５：１８８８−９４，１９９５）。ｓＣＲ１で処置したラットは、コントロールラットに対して、ＰＭＮの有意な減少、血小板およびマクロファージ流入、メサンギウム融解およびタンパク尿の減少を示した。糸球体腎炎における補体活性化の重要性のさらなる証拠は、ＮＺＢ／Ｗ  Ｆ１マウスモデルにおける抗Ｃ５  ＭｏＡｂの使用によって提供されている。抗Ｃ５  ＭｏＡｂは、Ｃ５の切断を阻害するので、Ｃ５ａおよびＣ５ｂ−９の生成を遮断する。６ヶ月間にわたる継続的な抗Ｃ５  ＭｏＡｂによる治療によって、糸球体腎炎の経過の有意な回復がもたらされた。ヒト補体成分Ｃ５をその炎症促進性成分に切断することを妨害するヒト化抗Ｃ５  ＭｏＡｂモノクローナル抗体（５Ｇ１．１）が、糸球体腎炎に対する潜在的な処置としてＡｌｅｘｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔによって開発中である。
【０１２８】
腎臓の損傷における補体の病理学的な役割についての直接的な証拠は、特定の補体成分が遺伝的に欠損した患者の研究によってもたらされる。多くの報告が、腎臓の疾患と補体制御因子Ｈの欠損との関連を実証している（Ａｕｌｔ，Ｂ．Ｈ．，Ｎｅｐｈｒｏｌ．１４：１０４５−１０５３，２０００；Ｌｅｖｙ，Ｍ．ら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．３０：９４９−５６，１９８６；Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ，Ｍ．Ｃ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３１：４２４−８，２００２）。Ｈ因子の欠損により、血漿中の低レベルのＢ因子およびＣ３ならびにＣ５ｂ−９の消費がもたらされる。非定型膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）と特発性溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）の両方が、Ｈ因子欠損に関連する。Ｈ因子欠損ブタ（Ｊａｎｓｅｎ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５３：３３１−４９，１９９８）およびＨ因子ノックアウトマウス（Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ，Ｍ．Ｃ，２００２）は、ＭＰＧＮ様症状を示すことから、補体制御におけるＨ因子の重要性が確認される。他の補体成分の欠損は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の進行に続発する腎臓の疾患に関連する（Ｗａｌｐｏｒｔ，Ｍ．Ｊ．，Ｄａｖｉｅｓら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１５：２６７−８１，１９９７）。Ｃ１ｑ、Ｃ４およびＣ２に対する欠損は、免疫複合体およびアポトーシス材料の不完全なクリアランスに関係する機構を介してＳＬＥに進行しやすくする。これらのＳＬＥ患者の多くにおいて、糸球体全体への免疫複合体の沈着を特徴とするループス腎炎が起きる。
【０１２９】
補体活性化と腎臓の疾患とを結び付けるさらなる証拠は、補体成分に対して産生された自己抗体の、患者における同定によってもたらされ、その自己抗体の一部は、腎臓の疾患に直接関係している（Ｔｒｏｕｗ，Ｌ．Ａ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：１９９−２０６，２００１）。多くのこれらの自己抗体は、腎臓の疾患と非常に高い程度の相関を示すので、この活性を指摘するために腎炎因子（ＮｅＦ）という用語を導入した。臨床研究では、腎炎因子が陽性である患者の約５０％がＭＰＧＮを発症した（Ｓｐｉｔｚｅｒ，Ｒ．Ｅ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．６４：１７７−８３，１９９２）。Ｃ３ＮｅＦは、副経路Ｃ３コンバターゼ（Ｃ３ｂＢｂ）に対して産生された自己抗体であり、このコンバターゼを安定化することによって、副経路の活性化を促進する（Ｄａｈａ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：１−７，１９７６）。同様に、Ｃ４ＮｅＦと呼ばれる古典経路Ｃ３コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ａ）に対する特異性を有する自己抗体は、このコンバターゼを安定化することによって、古典経路の活性化を促進する（Ｄａｈａ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５：２０５１−２０５４，１９８０；Ｈａｌｂｗａｃｈｓ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６５：１２４９−５６，１９８０）。抗Ｃ１ｑ自己抗体は、ＳＬＥ患者における腎炎に関係することが報告されており（Ｈｏｖａｔｈ，Ｌ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１９：６６７−７２，２００１；Ｓｉｅｇｅｒｔ，Ｃら、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１８：２３０−３４，１９９１；Ｓｉｅｇｅｒｔ，Ｃら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１０：１９−２３，１９９２）、また、これらの抗Ｃ１ｑ自己抗体の力価の上昇が、腎炎の発赤を予測すると報告された（Ｃｏｒｅｍａｎｓ，Ｉ．Ｅ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ．２６：５９５−６０１，１９９５）。ＳＬＥ患者の死後の腎臓から溶出された免疫沈着物は、これらの抗Ｃ１ｑ自己抗体の蓄積を明らかにした（Ｍａｎｎｉｃｋ，Ｍ．ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．４０：１５０４−１１，１９９７）。これらすべての事実は、これらの自己抗体に対する病理学的な役割を指摘するものである。しかしながら、抗Ｃ１ｑ自己抗体を有するすべての患者が、腎臓の疾患を発症するわけではなく、一部の健常な個体も低力価の抗Ｃ１ｑ自己抗体を有する（Ｓｉｅｇｅｒｔ，Ｃ．Ｅ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．６７：２０４−９，１９９３）。
【０１３０】
補体活性化の副経路および古典経路に加えて、レクチン経路も、腎臓の疾患における重要な病理学的な役割を有し得る。ヘノッホ−シェーンライン紫斑病性腎炎（Ｅｎｄｏ，Ｍ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ．３５：４０１−４０７，２０００）、クリオグロブリン血症性糸球体腎炎（Ｏｈｓａｗａ，Ｉ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０１：５９−６６，２００１）およびＩｇＡニューロパシー（Ｅｎｄｏ，Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  ５５：１８５−１９１，２００１）を含むいくつかの異なる腎臓の疾患と診断された患者から得られた腎臓のバイオプシー材料上において、ＭＢＬ、ＭＢＬ関連セリンプロテアーゼおよび補体活性化産物のレベルの上昇が免疫組織化学的手法によって検出されている。したがって、数十年間、補体と腎臓疾患との関連が知られていたという事実があるにもかかわらず、正確には補体がこれらの腎臓の疾患にどのように影響するのかに関するデータは、完全には程遠い。
【０１３１】
従って、本発明の１つの態様は、腎臓状態（メサンギウム増殖性糸球体腎炎、膜性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎（メサンギウム毛細血管性糸球体腎炎）、急性感染後糸球体腎炎（レンサ球菌感染後糸球体腎炎）、クリオグロブリン血症性糸球体腎炎、ループス腎炎、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病性腎炎またはＩｇＡ腎症が挙げられるが、これらに限定されない）に罹患している被験体に、薬学的キャリア中の治療有効量のＭＡＳＰ−２阻害薬剤を含む組成物を投与することによって、そのような障害を処置することに関する。ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、全身的に（例えば、動脈内、静脈内、筋肉内、皮下または他の非経口投与によって）または、潜在的には非ペプチド作動性薬剤については経口投与によって、上記被験体に投与され得る。ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、慢性状態の処置もしくは管理のために長期間にわたって定期的に投与され得るか、または急性の外傷もしくは損傷の前、最中または後の時期において、単回投与もしくは反復投与によってであり得る。
【０１３２】
皮膚障害
乾癬は、何百万人もが発症し、遺伝的要因と環境要因の両方が原因である、慢性で消耗性の皮膚状態である。一般に、局所的な薬剤ならびにＵＶＢおよびＰＵＶＡ光線療法が、乾癬に対して最も重要な処置であると考えられている。しかしながら、全身的またはより広範な疾患に対しては、全身性治療が、主要な処置であるか、またはいくつかの場合においては、ＵＶＢおよびＰＵＶＡ治療を強化すると示唆されている。
【０１３３】
乾癬などの様々な皮膚疾患の根底にある病因は、補体系の関与を含む免疫および炎症促進性のプロセスに対する役割を支持する。さらに、補体系の役割は、重要な非特異的皮膚防御機構として証明されている。その活性化によって、正常な宿主防御の維持を補助するだけでなく、炎症および組織損傷を媒介する産物が生成される。補体の炎症促進性産物としては、オプソニン活性および細胞刺激活性を有するＣ３の大フラグメント（Ｃ３ｂおよびＣ３ｂｉ）、低分子量アナフィラトキシン（Ｃ３ａ、Ｃ４ａおよびＣ５ａ）および細胞膜傷害複合体が挙げられる。それらのうち、Ｃ５ａまたはその分解産物であるＣ５ａ  ｄｅｓ  Ａｒｇは、炎症細胞に対して強力な走化性作用を発揮するので、最も重要なメディエーターであるとみられる。Ｃ５ａアナフィラトキシンの皮内投与により、免疫複合体媒介性の補体活性化によって起きる皮膚の過敏性血管炎において観察されるものとかなり類似した、皮膚の変化が誘導される。補体活性化は、自己免疫性水疱性皮膚疾患における炎症性変化の病原に関与する。表皮における天疱瘡抗体による補体活性化は、好酸球性海綿状態と呼ばれる特徴的な炎症性変化の発症に関与するとみられる。水疱性類天疱瘡（ＢＰ）では、基底膜領域の抗原とＢＰ抗体との相互作用によって、真皮表皮接合部に並ぶ白血球に関連するとみられる補体活性化がもたらされる。結果として生じるアナフィラトキシンは、浸潤性の白血球を活性化するだけでなく、マスト細胞の脱顆粒を誘導し、それによって、真皮表皮の分離および好酸球浸潤が促進される。同様に、補体活性化は、後天性表皮水疱症および妊娠性疱疹における著明な真皮表皮の分離において、より直接的な役割を果たすとみられる。
【０１３４】
乾癬における補体の関与についての証拠は、乾癬および関連疾患における炎症性変化についての病態生理学的機構に関連する文献に記載されている最近の実験による知見によってもたらされる。ますます多くの証拠によって、Ｔ細胞性免疫が、乾癬性病変を引き起こし、そして維持する際の重要な役割を果たすことが示唆されている。乾癬性病変における活性化Ｔ細胞によって産生されるリンフォカインは、表皮の増殖に対して強い影響を有することが明らかにされている。角質層の下への特徴的な好中球の蓄積が、乾癬性病変の炎症の強い領域において観察され得る。好中球は、刺激されたケラチノサイトによって放出されるケモカインとＩＬ−８とＧｒｏ−アルファとの相乗作用によって、および、特に補体の副経路活性化を介して生成されるＣ５ａ／Ｃ５ａ  ｄｅｓ−ａｒｇによって、走化的に誘引され、そして活性化される（Ｔｅｒｕｉ，Ｔ．，Ｔａｈｏｋｕ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０：２３９−２４８，２０００；Ｔｅｒｕｉ，Ｔ．，Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．９：１−１０，２０００）。
【０１３５】
乾癬性板状鱗屑抽出物は、周期的な表皮を通過する白血球走化性の誘導に関与する可能性がある固有の走化性ペプチド画分を含む。最近の研究では、この画分中の２つの無関係な走化性ペプチド、すなわち、Ｃ５ａ／Ｃ５ａ  ｄｅｓ  Ａｒｇおよびインターロイキン８（ＩＬ−８）ならびにその関連サイトカインの存在が同定された。表皮を通過する白血球遊走ならびに乾癬性病変におけるそれらの相互関係に対するそれらの相対的な関与を調べるために、乾癬性損傷性板状鱗屑抽出物における免疫反応性Ｃ５ａ／Ｃ５ａ  ｄｅｓＡｒｇおよびＩＬ−８の濃度ならびに関連する無菌性膿疱性皮膚疾患からのそれらの濃度を定量した。Ｃ５ａ／Ｃ５ａ  ｄｅｓＡｒｇおよびＩＬ−８の濃度は、非炎症性正常角化皮膚からの角質組織抽出物における濃度よりも損傷性皮膚からの角質組織抽出物における濃度のほうが著しく高いことが見出された。Ｃ５ａ／Ｃ５ａ  ｄｅｓＡｒｇ濃度の上昇は、損傷性板状鱗屑抽出物に特異的であった。これらの結果に基づいて、Ｃ５ａ／Ｃ５ａ  ｄｅｓＡｒｇは、補体活性化を優先的に支持する特定の状況下の炎症性の損傷性皮膚においてのみ産生されるとみられる。このことから、乾癬性病変を寛解させるために補体活性化のインヒビターを使用することの理論的根拠がもたらされる。
【０１３６】
補体系の古典経路が、乾癬において活性化されることが示されているが、乾癬における炎症性反応において副経路の関与に関する報告は少ない。補体活性化経路の従来の見解では、補体フラグメントであるＣ４ｄおよびＢｂは、それぞれ古典経路および副経路が活性化されるときに放出される。したがって、Ｃ４ｄまたはＢｂフラグメントの存在は、古典経路および／または副経路を介して進む補体活性化を示す。１つの研究では、酵素免疫測定法を使用して、乾癬性板状鱗屑抽出物中のＣ４ｄおよびＢｂのレベルを測定した。これらの皮膚疾患の板状鱗屑は、非炎症性皮膚の角質層におけるレベルよりも高いレベルの、酵素免疫測定法によって検出可能なＣ４ｄおよびＢｂを含んでいた（Ｔａｋｅｍａｔｓｕ，Ｈ．ら、Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  １８１：２８９−２９２，１９９０）。これらの結果は、副経路が、補体の古典経路に加えて、乾癬性損傷性皮膚において活性化されることを示唆する。
【０１３７】
乾癬およびアトピー性皮膚炎における補体の関与についてのさらなる証拠は、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）を有する３５人の患者および軽度から中等度の段階における乾癬を有する２４人の患者の末梢血中の正常な補体成分および活性化産物を測定することによって得られた。Ｃ３、Ｃ４およびＣ１不活性化因子（Ｃ１  ＩＮＡ）のレベルは、放射状免疫拡散法によって血清において測定されたのに対して、Ｃ３ａおよびＣ５ａのレベルは、ラジオイムノアッセイによって測定された。健常な非アトピー性コントロールとの比較において、Ｃ３、Ｃ４およびＣ１  ＩＮＡのレベルは、両方の疾患において有意に増加していたことが見出された。ＡＤでは、Ｃ３ａレベルの上昇の傾向があったのに対し、乾癬では、Ｃ３ａレベルは、有意に上昇した。この結果は、ＡＤと乾癬の両方において、補体系が炎症性プロセスに関与することを示唆する（Ｏｈｋｏｎｏｈｃｈｉ，Ｋ．ら、Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  １７９：３０−３４，１９８９）。
【０１３８】
乾癬性損傷性皮膚における補体活性化もまた、表皮内への最後の補体複合体の沈着をもたらし、その沈着は、乾癬性患者の血漿および角質の組織におけるＳＣ５ｂ−９のレベルを測定することによって定義される。乾癬性血漿中のＳＣ５ｂ−９のレベルは、コントロール患者またはアトピー性皮膚炎を有する患者のレベルよりも有意に高いことが見出された。損傷性皮膚からの全タンパク質抽出物の研究から、ＳＣ５ｂ−９は、非炎症性角質の組織において検出され得ないが、乾癬の損傷性角質の組織において高レベルのＳＣ５ｂ−９が存在することが示された。Ｃ５ｂ−９新抗原に対するモノクローナル抗体を使用した免疫蛍光法によって、乾癬性皮膚の角質層にのみ、Ｃ５ｂ−９の沈着が観察された要約すれば、乾癬性損傷性皮膚において、補体系が活性化され、そしてその補体活性化は、細胞膜傷害複合体を生成する最後の工程まで進む。
【０１３９】
免疫系を選択的に標的化する新規の生物学的薬物が、最近、乾癬を処置するために利用可能になった。現在ＦＤＡが承認しているか、または第３相試験中である４つの生物学的薬物は：アレファセプト（ａｌｅｆａｃｅｐｔ）（Ａｍｅｖｉｖｅ（登録商標））およびエファリツ（ｅｆａｌｉｚｕ）ＭｏＡｂ（Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標））（これら２つはＴ細胞調節因子（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）である）；可溶性ＴＮＦ−レセプターであるエタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））；および抗ＴＮＦモノクローナル抗体であるインフリキ（ｉｎｆｌｉｘｉ）ＭｏＡｂ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））である。Ｒａｐｔｉｖａは、免疫応答修飾因子（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）であり、ここで、標的化される作用機構は、リンパ球上のＬＦＡ−１と抗原提示細胞上および血管内皮細胞上のＩＣＡＭ−１との相互作用の遮断である。ＲａｐｔｉｖａがＣＤ１１ａに結合することによって、リンパ球上の利用可能なＣＤ１１ａの結合部位が飽和し、そして、リンパ球上の細胞表面でのＣＤ１１ａ発現が抑制的に調節される。この作用機構は、Ｔ細胞の活性化、真皮および表皮への細胞の輸送ならびにＴ細胞の再活性化を阻害する。従って、複数の科学的証拠から、皮膚の炎症性疾患状態における補体の役割が示唆され、最近の薬学的アプローチから、免疫系または特定の炎症性プロセスが標的化される。しかしながら、誰もＭＡＳＰ−２を標的アプローチとして同定していない。補体活性化におけるＭＡＳＰ−２の役割に関する本発明者らの新しい知見に基づいて、本発明者らは、ＭＡＳＰ−２が、乾癬および他の皮膚障害の処置に対する有効な標的であると考えている。
【０１４０】
従って、本発明の１つの態様は、乾癬、自己免疫性水疱性皮膚疾患、好酸球性海綿状態、水疱性類天疱瘡、後天性表皮水疱症、アトピー性皮膚炎、妊娠性疱疹および他の皮膚障害、ならびに、熱的および化学的熱傷によって引き起こされる毛細血管漏出に罹患している被験体に、薬学的キャリア中の治療有効量のＭＡＳＰ−２阻害薬剤を含む組成物を投与することによって、そのような皮膚障害を処置することに関する。ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤を含むスプレー、ローション、ゲル、ペースト、軟膏（ｓａｌｖｅ）もしくは洗浄溶液の適用によって局所的に、または、全身的に（例えば、動脈内、静脈内、筋肉内、皮下または他の非経口投与によって）、あるいは、潜在的には非ペプチド作動性薬剤については経口投与によって、上記被験体に投与され得る。処置は、急性状態に対しては単回投与または反復適用もしくは反復投薬、または、慢性状態の管理に対しては定期的な適用もしくは投薬を含み得る。
【０１４１】
移植
補体系の活性化は、固形臓器移植後の炎症性反応に大いに関与する。同種移植では、補体系は、虚血／再灌流およびおそらくは移植片に対して産生された抗体によって活性化され得る（Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｗ．Ｍ．ら、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２５：１８１−１９７，２００３）。非霊長類から霊長類への異種移植では、補体に対する主要なアクチベーターは、既存の抗体である。動物モデルにおける研究から、補体インヒビターの使用によって、移植片の生存が有意に延長し得ることが示されている（以下を参照のこと）。このように、臓器移植後の臓器損傷における補体系の役割が確立されており、したがって、本発明者らは、ＭＡＳＰ−２に対する補体インヒビターの使用によって、同種移植後または異種移植後の移植片への損傷が予防され得ると考えている。
【０１４２】
先天性免疫機構、特に補体は、移植片に対する炎症性応答および免疫応答において、これまで認識されていたよりも大きな役割を果たす。例えば、補体の副経路活性化は、腎虚血／再灌流損傷を媒介すると見られ、また、近位尿細管細胞は、この場合における補体成分の攻撃起源と攻撃部位の両方であり得る。腎臓において局所的に産生される補体はまた、移植片に対する細胞媒介性と抗体媒介性の両方の免疫応答の発生に関与する。
【０１４３】
Ｃ４ｄは、古典経路およびレクチン依存性経路の成分である、活性化された補体因子Ｃ４の分解産物である。Ｃ４ｄ染色は、急性と慢性の両方の設定における液性拒絶の有用なマーカーとして出現し、それによって、新たに抗ドナー抗体形成の重要性が興味深くなった。Ｃ４ｄと急性細胞性拒絶の形態学的徴候との関連は、統計学的に有意である。２４〜４３％のＩ型エピソード、４５％のＩＩ型拒絶および５０％のＩＩＩ型拒絶において、Ｃ４ｄが見られる（Ｎｉｃｋｅｌｅｉｔ，Ｖ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１３：２４２−２５１，２００２；Ｎｉｃｋｅｌｅｉｔ，Ｖ．ら、Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １８：２２３２−２２３９，２００３）。移植後の臨床成績の改善を達成する手段として、補体を阻害するか、または補体の局所的な合成を減少させる多くの治療が、開発中である。
【０１４４】
補体カスケードの活性化は、移植中の多くのプロセスの結果として生じる。現在の治療は、細胞性拒絶を制限することにおいて有効であるが、直面するすべての障壁に完全に対処していない。これらとしては、液性拒絶および慢性同種移植片の腎症または機能不全が挙げられる。移植された臓器に対するすべての応答が、宿主の一部分における多くのエフェクター機構の結果であるが、補体は、これらのうちのいくつかにおいて重要な役割を果たし得る。腎臓の移植の場合は、近位尿細管細胞による補体の局所的な合成が、特に重要であるとみられる。
【０１４５】
補体の特定のインヒビターの有効性によって、臓器移植後の臨床成績を改善するための機会が提供され得る。補体の攻撃を遮断する機構によって作用するインヒビターは、すでに免疫無防備状態のレシピエントにおいて、有効性が高いと見込まれ、全身性の補体枯渇を回避するので、特に有用であり得る。
【０１４６】
補体はまた、異種移植片拒絶において重大な役割を果たす。したがって、有効な補体インヒビターは、潜在的な治療薬として非常に興味深い。ブタから霊長類への臓器移植では、抗体の沈着および補体活性化が原因で超急性拒絶（ＨＡＲ）がもたらされる。ブタと霊長類との組み合わせにおいて、超急性異種移植片拒絶を予防するために複数のストラテジーおよび標的が試験されてきた。これらのアプローチは、自然抗体の除去、コブラ毒因子を用いた補体枯渇または可溶性補体インヒビターｓＣＲ１を用いたＣ３活性化の予防によって達成された。さらに、ヒト崩壊促進因子（ＤＡＦ）およびメンブレンコファクタープロテインから得られた組換え可溶性キメラタンパク質である補体活性化遮断物−２（ＣＡＢ−２）は、古典経路と副経路の両方のＣ３およびＣ５コンバターゼを阻害する。ＣＡＢ−２は、ヒト血液によるエキソビボでのブタ心臓灌流の補体媒介性組織損傷を減少させる。ＣＡＢ−２の有効性に関する研究において、ブタの心臓が、免疫抑制を受けていないアカゲザルに異所性移植されるとき、移植片の生存は、ＣＡＢ−２を投与されたサルにおいて著明に延長することが示された（Ｓａｌｅｒｎｏ，Ｃ．Ｔ．ら、Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ９：１２５−１３４，２００２）。ＣＡＢ−２は、Ｃ３ａおよびＳＣ５ｂ−９の生成を大きく減少させたことによって示されるように、補体活性化を著明に阻害した。移植片拒絶において、ｉＣ３ｂ、Ｃ４およびＣ９の組織沈着は、コントロールと同様であったか、またはわずかに減少し、ＩｇＧ、ＩｇＭ、Ｃ１ｑおよびフィブリンの沈着は、変わらなかった。このように、補体阻害に対するこのアプローチは、アカゲザルに移植されたブタ心臓の超急性拒絶を排除した。これらの研究から、生存に対する補体阻害の有益な作用が証明され、本発明者らは、ＭＡＳＰ−２阻害は、異種移植においても有用であり得ると考えている。
【０１４７】
別のアプローチは、抗補体５（Ｃ５）モノクローナル抗体が、ラットから前感作マウスへの心臓移植モデルにおいて超急性拒絶（ＨＡＲ）を予防し得るか否か、およびこれらのＭｏＡｂが、シクロスポリンおよびシクロホスファミドと併用して、長期間にわたって移植片生存を達成し得るか否かの判定に焦点を当てている。抗Ｃ５  ＭｏＡｂは、ＨＡＲを予防することが見出された（Ｗａｎｇ，Ｈ．ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６８：１６４３−１６５１，１９９９）。従って、本発明者らは、補体カスケードにおける他の標的（例えば、ＭＡＳＰ−２）もまた、将来の臨床での異種移植においてＨＡＲおよび急性血管性拒絶の予防に役立ち得ると考えている。
【０１４８】
異種移植片において見られる超急性拒絶における補体の中心的役割は、十分に確立されているが、より細かい役割が同種移植において明らかになってきている。補体と獲得免疫応答との関連は、補体枯渇動物が、抗原性の刺激の後に正常以下の抗体応答を開始するという知見とともに、長い間知られている。補体分割産物Ｃ３ｄによる抗原のオプソニン化は、Ｂ細胞に対する抗原提示の効率を大きく上昇させると示されており、また、ある特定のＢ細胞上の２型補体レセプターの関与を介して作用すると示されている。この研究は、マウスの皮膚移植片モデルにおける移植の設定にまで拡張されており、ここで、Ｃ３欠損およびＣ４欠損マウスは、高親和性ＩｇＧにクラススイッチできないために、同種抗体産生を著しく欠いていた。抗ドナー抗体および液性拒絶が重大であるので、腎臓の移植におけるこれらの機構の重要性は、大きくなっている。
【０１４９】
以前の研究において、腎臓の移植後の同種移植片拒絶中の近位尿細管細胞によるＣ３合成のアップレギュレーションがすでに実証されている。局所的に合成される補体の役割は、マウスの腎臓移植モデルにおいて調べられた。Ｃ３が十分なレシピエントに移植されたＣ３陰性ドナーからの移植片は、Ｃ３陽性ドナーからのコントロール移植片（１４日以内に拒絶された）と比べて、生存が延びた（１００日超）ことが証明された。さらに、Ｃ３陰性移植片のレシピエントにおける抗ドナーＴ細胞の増殖応答は、コントロールの応答と比べて著明に減少したことから、Ｔ細胞プライミングに対する、局所的に合成されるＣ３の影響が示唆される。
【０１５０】
これらの観察結果から、ドナー抗原のオプソニン化、または、抗原提示細胞とＴ細胞の両方に対するさらなるシグナルの提供のいずれかによって、移植片において初めてＴ細胞にドナー抗原が曝露される可能性、および、局所的に合成された補体が、抗原提示を増大する可能性が示唆される。腎臓の移植の場合、補体を産生する尿細管細胞は、それらの細胞表面上への補体沈着も証明する。
【０１５１】
従って、本発明の１つの態様は、全臓器（例えば、腎臓、心臓、肝臓、膵臓、肺、角膜など）または移植片（例えば、弁、腱、骨髄など）の同種移植または異種移植を受けたことがある被験体を含む移植レシピエントに、薬学的キャリア中の治療有効量のＭＡＳＰ−２阻害薬剤を含む組成物を投与することによって、組織または固形臓器の移植から生じる炎症性反応の予防は処置することに関する。ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、動脈内、静脈内、筋肉内、皮下もしくは他の非経口投与によって、または、潜在的には非ペプチド作動性薬剤については経口投与によって、上記被験体に投与され得る。投与は、移植後の急性期の間および／または長期間にわたる移植後の治療の間に行われ得る。さらに、または、移植後投与の代わりに、被験体は、移植の前および／もしくは移植手技中にＭＡＳＰ−２阻害薬剤で処置され得、そして／または、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤とともに移植するために臓器または組織を前処理することによって処置され得る。臓器または組織の前処理は、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤を含んでいる溶液、ゲルまたはペーストを臓器または組織の表面に噴霧または灌注することによって、その表面への適用が必要であり得るものであるか、またはその臓器もしくは組織を、ＭＡＳＰ−２インヒビターを含んでいる溶液中に浸漬し得るものである。
【０１５２】
中枢神経系および末梢神経系の障害および損傷
補体系の活性化は、種々の中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）の疾患または損傷（多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症（ＭＧ）、ハンチントン病（ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ギランバレー症候群、脳卒中後の再灌流、変性円板、大脳外傷、パーキンソン病（ＰＤ）およびアルツハイマー病（ＡＤ）が挙げられるが、これらに限定されない）の病原に関わっている。補体タンパク質が、ニューロン、アストロサイトおよびミクログリアを含むＣＮＳ細胞において合成されるという最初の判定、ならびに、補体活性化後にＣＮＳにおいて生成されるアナフィラトキシンが、神経機能を変化させ得るという認識が、ＣＮＳ障害における補体の潜在的な役割を解明するきっかけになった（Ｍｏｒｇａｎ，Ｂ．Ｐ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １７：１０：４６１−４６６，１９９６）。現在、Ｃ３ａレセプターおよびＣ５ａレセプターは、ニューロン上において見出されており、感覚系、運動系および脳辺縁系の異なる部分において広範な分布を示すことが示されている（Ｂａｒｕｍ，Ｓ．Ｒ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２６：７−１３，２００２）。さらに、アナフィラトキシンＣ５ａおよびＣ３ａは、げっ歯類において飲食行動を変化させると示されており、また、ミクログリアおよびニューロンにおけるカルシウムシグナル伝達を誘導し得る。これらの知見から、大脳外傷、脱髄、髄膜炎、脳卒中およびアルツハイマー病を含む種々のＣＮＳ炎症性疾患において補体活性化を阻害する治療的な有用性に関する可能性が生じる。
【０１５３】
脳の外傷または出血は、よくある臨床上の問題であり、それによって補体活性化が起き得、結果として生じる炎症および浮腫を悪化させ得る。補体を阻害する効果は、ラットにおける脳外傷モデルにおいて研究された（Ｋａｃｚｏｒｏｗｓｋｉら、Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．１５：８６０−８６４，１９９５）。脳損傷の直前にｓＣＲ１を投与することによって、損傷領域への好中球浸潤が著明に阻害されたことから、補体が、食細胞の補充にとって重要であることが示唆された。同様に、血漿と脳脊髄液（ＣＳＦ）の両方において複数の補体活性化産物が高レベルで存在することから、大脳出血後の患者における補体活性化が、明らかに関連付けられる。補体活性化およびＣ５ｂ−９複合体の染色の増大が、隔絶された椎間板組織において証明されており、また、椎間板ヘルニア組織誘発性坐骨神経痛の一因であると示唆され得る（Ｇｒｏｎｂｌａｄ，Ｍ．ら、Ｓｐｉｎｅ  ２８（２）：１１４−１１８，２００３）。
【０１５４】
ＭＳは、ＣＮＳ内の軸索を鞘で覆い、絶縁しているミエリンの進行性の喪失を特徴とする。一次的原因は不明であるが、免疫系が関係している証拠が多く存在する（Ｐｒｉｎｅａｓ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．３８：４０９−４２１，１９７８；Ｒｙｂｅｒｇ，Ｂ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．５４：２３９−２６１，１９８２）。ＭＳ、ギランバレー症候群およびミラー−フィッシャー症候群を含むＣＮＳまたはＰＮＳの脱髄性疾患の病態生理学において、補体が顕著な役割を果たすという明らかな証拠もある（Ｇａｓｑｕｅ，Ｐ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４９：１７１−１８６，２０００；Ｂｏｎｄｙ  Ｓ．ら（ｅｄｓ．）中のＢａｒｎｕｍ，Ｓ．Ｒ．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｅｖｅｎｔｓ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｍｉｎｅｎｔ  Ｐｒｅｓｓ  １３９−１５６，２００１）。補体は、組織の破壊、炎症、ミエリン残骸のクリアランスおよび軸索の再ミエリン化までにも関与する。補体が関与するという明らかな証拠があるにもかかわらず、現在のところ、補体の治療的標的の同定は、多発性硬化症の動物モデルである実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）において評価されるだけである。Ｃ３またはＢ因子が欠損したＥＡＥマウスが、ＥＡＥコントロールマウスと比べて脱髄の減弱を示したという研究が証明された（Ｂａｒｎｕｍ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２６：７−１３，２００２）。「ｓＣｒｒｙ」という新しく作った名称の可溶型の補体インヒビターならびにＣ３−／−およびＢ因子−／−を使用したＥＡＥマウスの研究によって、補体が、いくらかのレベルで疾患モデルの発症および進行に関与することが証明された。さらに、Ｂ因子−／−マウスにおけるＥＡＥの重症度の著明な低下から、ＥＡＥにおける補体副経路の役割に対するさらなる証明がもたらされる（Ｎａｔａｆら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６５：５８６７−５８７３，２０００）。
【０１５５】
ＭＧは、アセチルコリンレセプターを喪失していて、終板が破壊された神経筋接合部の疾患である。ｓＣＲ１は、ＭＧの動物モデルにおいて非常に有効であることから、この疾患における補体の役割がさらに示唆される（Ｐｉｄｄｅｌｅｓｄｅｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７）。
【０１５６】
神経変性疾患であるＡＤの組織学的な特徴は、老人斑および神経原線維変化である（ＭｃＧｅｅｒら、Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：６２１−６３０，１９９２）。これらの病理学的なマーカーもまた、補体系の成分に対して強く染色する。証拠は、神経細胞死および認知性の機能不全をもたらす局所的な神経炎症性状態を示す。老人斑は、異常なアミロイド−βペプチド（Ａβ、アミロイド前駆体タンパク質から得られるペプチドを含む。Ａβは、Ｃ１と結合すると示されており、補体活性化を引き起こし得る（Ｒｏｇｅｒｓら、Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：６２４−６３０，１９９２）。さらに、ＡＤの顕著な特徴は、老人斑に高度に局在すると見出されている、Ｃ１ｑからＣ５ｂ−９までの補体古典経路の活性化されたタンパク質との関連性である（Ｓｈｅｎ，Ｙ．ら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７６９：３９１−３９５，１９９７；Ｓｈｅｎ，Ｙ．ら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３０５（３）：１６５−１６８，２００１）。従って、Ａβは、古典経路を開始するだけでなく、結果として生じる継続的な炎症性状態は、神経細胞死にも関与し得る。さらに、ＡＤにおける補体活性化が、最後のＣ５ｂ−９相に進行するという事実から、補体系の制御機構は、補体活性化プロセスを停止することができていないことが示唆される。
【０１５７】
Ｃ１Ｑ結合のインヒビターとしてのプロテオグリカン、Ｃ３コンバターゼのインヒビターとしてのＮａｆａｍｓｔａｔおよびＣ５ａレセプターのＣ５活性化の遮断剤またはインヒビターを含む、補体経路のいくつかのインヒビターが、ＡＤに対する潜在的な治療的なアプローチとして提案されている（Ｓｈｅｎ，Ｙ．ら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７０：４６３−４７２，２００３）。先天的な補体経路の最初の段階としてのＭＡＳＰ−２の役割ならびに副経路活性化に対するＭＡＳＰ−２の役割は、潜在的な新規治療的アプローチを提供し、また、ＡＤにおける補体経路の関与を示唆する大量のデータによって支持される。
【０１５８】
他のＣＮＳ変性疾患と同様にＰＤ患者の脳における損傷した領域において、グリア反応（特にミクログリア）ならびにＨＬＡ−ＤＲ抗原、サイトカインおよび補体成分の発現の増加を特徴とする炎症の証拠がある。これらの観察結果から、免疫系機構が、ＰＤにおける神経損傷の病原に関与することが示唆される。ＰＤにおける主な損傷の細胞機構は、明らかにされていないが、ミトコンドリアの変異、酸化ストレスおよびアポトーシスが一因となる可能性がある。さらに、ＰＤにおける線条体および実質的な黒質（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｎｉｇｒａ）における神経損傷によって開始される炎症は、疾患の経過を悪化させ得る。これらの観察結果は、補体阻害薬物による処置が、ＰＤの進行を遅延させるように作用し得ることを示唆する（Ｃｚｌｏｎｋｏｗｓｋａ，Ａ．ら、Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｍｏｎｉｔ．８：１６５−１７７，２００２）。
【０１５９】
従って、本発明の１つの態様は、末梢神経系（ＰＮＳ）および／もしくは中枢神経系（ＣＮＳ）の障害または損傷に罹患している被験体を、薬学的キャリア中の治療有効量のＭＡＳＰ−２阻害薬剤を含む組成物で処置することによって、そのような障害または損傷を処置することに関する。本発明に従って処置され得るＣＮＳおよびＰＮＳの障害および損傷としては、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症（ＭＧ）、ハンチントン病（ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ギランバレー症候群、脳卒中後の再灌流、変性円板、大脳外傷、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、ミラー−フィッシャー症候群、大脳の外傷および／または出血、脱髄ならびにおそらく髄膜炎が挙げられると考えられるが、これらに限定されない。
【０１６０】
ＣＮＳ状態および大脳外傷の処置のために、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、くも膜下腔内、頭蓋内、脳室内、動脈内、静脈内、筋肉内、皮下または他の非経口投与によって、および、潜在的には非ペプチド作動性薬剤については経口投与によって、上記被験体に投与され得る。ＰＮＳ状態および大脳外傷は、全身性の投与経路によって、あるいは、機能不全部位または外傷部位への局所投与によって処置され得る。本発明のＭＡＳＰ−２阻害性組成物の投与は、有効な軽減または症状の管理が達成されるまで、医師が決定するとおりに定期的に繰り返され得る。
【０１６１】
血液障害
敗血症は、侵入微生物に対する患者の極度の反応によって引き起こされる。補体系の主な機能は、侵入してくる細菌および他の病原体に対する炎症性反応を調整することである。この生理学的役割と一致して、補体活性化は、敗血症の病原における主な役割を有すると数多くの研究において示されている（Ｂｏｎｅ，Ｒ．Ｃ．，Ａｎｎａｌｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｌ．Ｍｅｄ．１１５：４５７−４６９，１９９１）。敗血症の臨床症状の定義は、は、絶えず発展している。敗血症は、通常、感染に対する全身性の宿主応答として定義される。しかしながら、多くの場合において、感染に対する臨床上の証拠（例えば、細菌が陽性である血液培養物）が、敗血症の症状を有する患者において見られない。この矛盾は、１９９２年のＣｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅにおいて初めて着眼され、そのときに細菌感染を定義できる存在を必要としない用語「全身性炎症反応症候群」（ＳＩＲＳ）が確立された（Ｂｏｎｅ，Ｒ．Ｃ．ら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２０：７２４−７２６，１９９２）。現在、敗血症およびＳＩＲＳは、炎症性反応を制御することができないことを伴うと一般に認識されている。この簡単な概説の目的で、本発明者らは、敗血症の臨床上の定義に、重篤な敗血症、敗血症性ショックおよびＳＩＲＳも含むとみなす。
【０１６２】
１９８０年代後半より前は、敗血症の患者における感染の主な起源は、グラム陰性菌であった。グラム陰性菌の細胞壁の主成分であるリポ多糖（ＬＰＳ）は、動物に注射されると、様々な細胞型からの炎症性メディエーターの放出を刺激し、急性の感染性の症状を誘導することが知られていた（Ｈａｅｎｅｙ，Ｍ．Ｒ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ４１（Ｓｕｐｐｌ．Ａ）：４１−６，１９９８）。興味深いことに、関与する微生物の範囲が、１９７０年代後半および１９８０年代は主にグラム陰性細菌であったのが、現在では主にグラム陽性細菌に変化したとみられており、その理由は現在のところ明らかではない（Ｍａｒｔｉｎ，Ｇ．Ｓ．ら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：１５４６−５４，２００３）。
【０１６３】
多くの研究が、炎症の媒介ならびにショック、特に敗血性および出血性のショックの特徴への関与における補体活性化の重要性を示している。グラム陰性生物とグラム陽性生物の両方が、一般に敗血症性ショックを誘発する。ＬＰＳは、主に副経路を介した補体の強力なアクチベーターであるが、抗体によって媒介される古典経路の活性化も起こす（Ｆｅａｒｏｎ，Ｄ．Ｔ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２９２：９３７−４００，１９７５）。グラム陽性細胞壁の主成分は、ペプチドグリカンおよびリポテイコ酸であり、この両方の成分が、補体副経路の強力なアクチベーターであるが、特定の抗体の存在下では、それらは、補体古典経路も活性化し得る（Ｊｏｉｎｅｒ，Ｋ．Ａ．ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：４６１−２，１９８４）。
【０１６４】
補体系が初めて敗血症の病原と結びつけられたのは、アナフィラトキシンＣ３ａおよびＣ５ａが、敗血症の間に生じ得る種々の炎症性反応を媒介することが研究者によって記述されたときである。これらのアナフィラトキシンは、敗血症性ショックにおける中心的役割を果たす事象である血管拡張および微小血管透過性の増大を誘起する（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｗ．Ａ．ら、Ａｇｅｎｔｓ  Ａｃｔｉｏｎｓ  ３４：３４５−３４９，１９９１）。さらに、アナフィラトキシンは、気管支痙攣、マスト細胞からのヒスタミン放出および血小板の凝集を誘導する。さらに、アナフィラトキシンは、顆粒球上で数多くの作用（例えば、走化性、凝集、接着、リソソーム酵素の放出、有毒なスーパーオキシドアニオンの生成およびロイコトリエンの形成）を発揮する（Ｓｈｉｎ，Ｈ．Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６２：３６１−３６３，１９６８；Ｖｏｇｔ，Ｗ．，Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ３：１７７−８６，１９８６）。これらの生物学的作用は、敗血症の合併症（例えば、ショックまたは急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ））の発症の一因であると考えられている（Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ，Ｄ．Ｅ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  １：９４７−９４９，１９８０；Ｓｌｏｔｍａｎ，Ｇ．Ｔ．ら、Ｓｕｒｇｅｒｙ  ９９：７４４−５０，１９８６）。さらに、高レベルのアナフィラトキシンＣ３ａは、敗血症における致命的な結果と関連する（Ｈａｃｋ，Ｃ．Ｅ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．８６：２０−２６，１９８９）。ショックのいくつかの動物モデルにおいて、ある特定の補体欠損系統（例えば、Ｃ５欠損系統）が、ＬＰＳ注入の作用に対してより抵抗性である（Ｈｓｅｕｈ，Ｗ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．７０：３０９−１４，１９９０）。
【０１６５】
げっ歯類での敗血症の発症中における抗体によるＣ５ａ生成の遮断は、生存を大きく改善すると示されている（Ｃｚｅｒｍａｋ，Ｂ．Ｊ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：７８８−７９２，１９９９）。抗体または低分子インヒビターのいずれかを用いてＣ５ａレセプター（Ｃ５ａＲ）を遮断するときに、同様の知見がもたらされた（Ｈｕｂｅｒ−Ｌａｎｇ，Ｍ．Ｓ．ら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１６：１５６７−７４，２００２；Ｒｉｅｄｅｍａｎｎ，Ｎ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１０：１０１−８，２００２）。サルにおける初期の実験的研究から、Ｃ５ａの抗体遮断によって、Ｅ．ｃｏｌｉ誘発性敗血症性ショックおよび成人呼吸窮迫症候群が減弱されると示唆される（Ｈａｎｇｅｎ，Ｄ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．４６：１９５−９，１９８９；Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７７：１８１２−１６，１９８６）。敗血症を有するヒトでは、重症度の低い敗血症の患者および生存者と比べて、Ｃ５ａは、上昇し、そして多臓器不全を伴う有意に低い生存率と関連する（Ｎａｋａｅ，Ｈ．ら、Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｃｈｅｍ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８４：１８９−９５，１９９４；Ｎａｋａｅら、Ｓｕｒｇ．Ｔｏｄａｙ  ２６：２２５−２９，１９９６；Ｂｅｎｇｔｓｏｎ，Ａ．ら、Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．１２３：６４５−６４９，１９８８）。Ｃ５ａが敗血症中に有害な作用を発揮する機構は、まだ詳細には研究されていないが、最近のデータでは、敗血症中のＣ５ａの生成によって、血中の好中球の先天性免疫機能（Ｈｕｂｅｒ−Ｌａｎｇ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３２２３−３１，２００２）、呼吸バーストを現す能力およびサイトカインを生成する能力（Ｒｉｅｄｅｍａｎｎ，Ｎ．Ｃ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９：１９３−２０２，２００３）が有意に損なわれることが示唆されている。さらに、敗血症中のＣ５ａ生成は、凝血促進作用を有するとみられる（Ｌａｕｄｅｓ，Ｉ．Ｊ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６０：１８６７−７５，２００２）。補体調節タンパク質ＣＩ  ＩＮＨはまた、敗血症およびＡＲＤＳの動物モデルにおいても有効性が示された（Ｄｉｃｋｎｅｉｔｅ，Ｇ．，Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓ．Ｍｉｔｔ．９３：２９９−３０５，１９９３）。
【０１６６】
レクチン経路もまた、敗血症の病原の一因であり得る。ＭＢＬは、グラム陰性細菌とグラム陽性細菌の両方を含む一連の臨床的に重要な微生物に結合することおよびレクチン経路を活性化することが示されている（Ｎｅｔｈ，Ｏ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８：６８８，２０００）。リポテイコ酸（ＬＴＡ）は、次第にＬＰＳのグラム陽性の対応物としてみなされてきている。リポテイコ酸は、単核食細胞および全血からのサイトカインの放出を誘導する強力な免疫賦活剤である（Ｍｏｒａｔｈ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５：１６３５，２００２；Ｍｏｒａｔｈ，Ｓ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７０：９３８，２００２）。最近、Ｌ−フィコリンが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを含む数多くのグラム陽性細菌種から単離されたＬＴＡに特異的に結合することおよびレクチン経路を活性化することが証明された（Ｌｙｎｃｈ，Ｎ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：１１９８−０２，２００４）。ＭＢＬはまた、ポリグリセロホスフェート鎖がグリコシル基で置換されている）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ由来のＬＴＡに結合するが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含む９つの他の種由来のＬＴＡには結合しないことも示された（Ｐｏｌｏｔｓｋｙ，Ｖ．Ｙ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４：３８０，１９９６）。
【０１６７】
従って、本発明の１つの態様は、敗血症または敗血症から生じる状態（重篤な敗血症、敗血症性ショック、敗血症から生じる急性呼吸窮迫症候群および全身性炎症反応症候群が挙げられるが、これらに限定されない）に罹患している被験体に、薬学的キャリア中の治療有効量のＭＡＳＰ−２阻害薬剤を含む組成物を投与することによって、敗血症または敗血症から生じる状態を処置するための方法を提供する。出血性ショック、溶血性貧血、自己免疫性の血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）または他の骨髄／血液破壊性状態を含む他の血液障害に罹患している被験体に、薬学的キャリア中の治療有効量のＭＡＳＰ−２阻害薬剤を含む組成物を投与することによって、そのような状態を処置するための関連方法が提供される。ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、全身的に（例えば、動脈内、静脈内、筋肉内、吸入（特にＡＲＤＳの場合）、皮下または他の非経口投与によって）または、潜在的には非ペプチド作動性薬剤については経口投与によって、上記被験体に投与される。ＭＡＳＰ−２阻害薬剤組成物は、敗血症および／またはショックの続発症に対抗するために１つ以上のさらなる治療薬と併用され得る。進行した敗血症もしくはショックまたはそれらから生じる苦痛状態に対して、ＭＡＳＰ−２阻害性組成物は、速効性の剤形で（例えば、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤組成物を含む溶液のボーラスの静脈内送達または動脈内送達によって）適当に投与され得る。その状態が回復するまで医師が判断するとおりに、反復投与が行われ得る。
【０１６８】
泌尿生殖器状態
補体系は、有痛性膀胱疾患、感覚性膀胱疾患、非細菌性慢性膀胱炎および間質性膀胱炎（Ｈｏｌｍ−Ｂｅｎｔｚｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１３８：５０３−５０７，１９８７）、不妊症（Ｃｒｕｚら、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５４：１２１７−１２２８，１９９６）、妊娠（Ｘｕ，Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：４９８−５０７，２０００）、胎児母体間寛容（ｆｅｔｏｍａｔｅｒｎａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）（Ｘｕ，Ｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：４９８−５０７，２０００）および子癇前症（Ｈａｅｇｅｒ，Ｍ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｂｓｔｅｔ．４３：１１３−１２１，１９９３）を含むいくつかの異なる泌尿生殖器障害に関わっている。
【０１６９】
有痛性膀胱疾患、感覚性膀胱疾患、非細菌性慢性膀胱炎および間質性膀胱炎は、病因および病原が不明である明確に定義されていない状態であり、したがって、それらは、いかなる合理的な治療もない。膀胱を覆っている上皮および／または粘膜表面における欠陥に関する病原論および免疫学的障害に関する理論が優勢である（Ｈｏｌｍ−Ｂｅｎｔｚｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１３８：５０３−５０７，１９８７）。間質性膀胱炎を有する患者を免疫グロブリン（ＩｇＡ、Ｇ、Ｍ）、補体成分（Ｃ１ｑ、Ｃ３、Ｃ４）およびＣ１−エステラーゼインヒビターに対して試験したことが報告された。補体成分Ｃ４の血清レベルが非常に有意に枯渇し（０．００１未満のｐ）、免疫グロブリンＧは、著明に上昇した（０．００１未満のｐ）。この研究から、補体系の古典経路の活性化が示唆され、慢性の局所的な免疫学的プロセスがこの疾患の病原に関与する可能性が支持される（Ｍａｔｔｉｌａ，Ｊ．ら、Ｅｕｒ．Ｕｒｏｌ．９：３５０−３５２，１９８３）。さらに、膀胱の粘膜における抗原に自己抗体が結合した後、補体活性化は、組織傷害の発生およびこの疾患に特有である慢性の自己永続的な炎症に関与し得る（Ｈｅｌｉｎ，Ｈ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．４３：８８−９６，１９８７）。
【０１７０】
泌尿生殖器の炎症性疾患における補体の役割に加えて、生殖機能も補体経路の局所的な制御によって影響を受け得る。天然に存在する補体インヒビターは、身体の補体系を管理する必要がある宿主細胞を保護するように進化した。ヒト補体インヒビターであるＭＣＰおよびＤＡＦに構造的に類似した、天然に存在するげっ歯類の補体インヒビターであるＣｒｒｙを研究することにより、胎仔の発育における補体の制御管理が明らかになった。興味深いことに、Ｃｒｒｙ−／−マウスを作製する試みは失敗に終わった。その代わり、ホモ接合性のＣｒｒｙ−／−マウスは、子宮内で死亡することが発見された。Ｃｒｒｙ−／−胚は、交尾の約１０日後まで生存したが、生存時間は急激に低下し、死亡は発育停止からもたらされるものであった。Ｃｒｒｙ−／−胚の胎盤組織への炎症細胞の著明な侵入もみとめられた。対照的に、Ｃｒｒｙ＋／＋胚では、胎盤上にＣ３が沈着するとみられた。このことから、補体活性化は、胎盤レベルで生じ、そして補体が制御されない状況においては、胚が死亡することが示唆される。確認の研究では、Ｃ３欠損のバックグラウンドにＣｒｒｙ変異の導入について調べた。このレスキューストラテジーは成功した。それとともに、これらのデータから、胎仔母体間の補体相互作用は、制御されなければならないことが証明された。胎盤内での補体制御におけるわずかな変更は、胎盤機能不全および流産に関与し得る（Ｘｕ，Ｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：４９８−５０７，２０００）。
【０１７１】
子癇前症は、補体系の活性化が関わるが、未だ議論の余地のある妊娠誘発性の高血圧性障害である（Ｈａｅｇｅｒ，Ｍ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｂｓｔｅｔ．４３：１１３−１２７，１９９３）。体循環における補体活性化は、子癇前症における確立された疾患に緊密に関連するが、臨床上の症状が現れる前には上昇は見られず、したがって、補体成分を子癇前症の前兆として使用することができない（Ｈａｅｇｅｒら、Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．７８：４６，１９９１）。しかしながら、胎盤床の局所的な環境における補体活性化の増大によって、局所的な管理機構が克服され得、それにより、高レベルのアナフィラトキシンおよびＣ５ｂ−９が生じる（Ｈａｅｇｅｒら、Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．７３：５５１，１９８９）。
【０１７２】
抗精子抗体（ＡＳＡ）に関係する不妊症の提案されている１つの機構は、生殖管における補体活性化の役割を介するものである。補体レセプターを介した食細胞による精子の結合ならびに精子表面上での最後のＣ５ｂ−９複合体の形成を増強し得ることによって、精子の運動性を低下させるＣ３ｂおよびｉＣ３ｂオプソニンの生成は、受胎能の低下に関連する潜在的な原因である。Ｃ５ｂ−９レベルの上昇もまた、不妊の女性の卵巣卵胞液中で証明されている（Ｄ’Ｃｒｕｚ，Ｏ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：３８４１−３８４８，１９９０）。他の研究では、補体が関連し得る精子の遊走の障害および精子／卵の相互作用の低下が示されている（Ｄ’Ｃｒｕｚ，Ｏ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：６１１−６２０，１９９１；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｎ．Ｊ．，Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．４１：４３３−４３９，１９８４）。最後に、ｓＣＲ１を用いた研究からは、ヒト精子に対するＡＳＡ媒介性および補体媒介性の損傷に対する保護的な作用が証明された（Ｄ’Ｃｒｕｚ，Ｏ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５４：１２１７−１２２８，１９９６）。これらのデータから、泌尿生殖器の疾患および障害の処置における補体インヒビターの使用についてのいくつかの一連の証拠がもたらされる。
【０１７３】
従って、本発明の１つの態様は、泌尿生殖器の障害に罹患している被験体に、薬学的キャリア中の治療有効量のＭＡＳＰ−２阻害薬剤を含む組成物を投与することによって、そのような障害に罹患している患者においてＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するための方法を提供する。本発明の方法および組成物を用いた治療的な処置に供されるべきであると考えられる泌尿生殖器の障害としては、有痛性膀胱疾患、感覚性膀胱疾患、非細菌性慢性膀胱炎および間質性膀胱炎、男性および女性の不妊症、胎盤機能不全ならびに流産および子癇前症が挙げられるが、これらに限定されない。ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、全身的に（例えば、動脈内、静脈内、筋肉内、吸入、皮下または他の非経口投与によって）または、潜在的には非ペプチド作動性薬剤については経口投与によって、上記被験体に投与され得る。あるいは、ＭＡＳＰ−２阻害性組成物は、泌尿生殖管に局所的に（例えば、液体の溶液またはゲル組成物を用いて膀胱内への灌注または点滴注入によって）送達され得る。反復投与は、その状態を管理または回復させるように医師が決定するとおりに行われ得る。
【０１７４】
糖尿病および糖尿病性状態
糖尿病性の網膜微小血管障害は、毛細血管細胞の透過性、白血球停滞、微小血栓症およびアポトーシスの増大（これらすべてが、補体活性化によって引き起こされ得るか、または促進され得る）を特徴とする。糖尿病を有する患者の糸球体構造および神経内膜の微小血管は、補体活性化の徴候を示す。インビトロでの高グルコースが、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型膜タンパク質である２つのインヒビターＣＤ５５およびＣＤ５９の内皮細胞表面での発現を選択的に低下させるという知見、ならびに、ＣＤ５９が、その補体阻害性機能を妨げる非酵素的なグリケーションを起こすという知見によって、糖尿病における補体インヒビターの利用能または有効性の低下が示唆されている。
【０１７５】
Ｚｈａｎｇらによる研究（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５１：３４９９−３５０４，２００２）では、ヒトの非増殖性の糖尿病性網膜症の特徴としての補体活性化および阻害性分子の変化と補体活性化との関連が調べられた。補体活性化の最後の生成物であるＣ５ｂ−９の沈着が、２型糖尿病を有するヒトの眼のドナーの網膜血管壁において生じるが、同年齢の非糖尿病性のドナーの血管では生じないことが見出された。古典経路に固有の補体成分であるＣ１ｑおよびＣ４は、糖尿病性網膜において検出されなかったことから、Ｃ５ｂ−９は、副経路を介して生成されたことが示唆される。糖尿病性ドナーは、ＧＰＩアンカーによって原形質膜に結合した２つの補体インヒビターであるＣＤ５５およびＣＤ５９の網膜のレベルの顕著な低下を示した。網膜血管における同様の補体活性化ならびに網膜でのＣＤ５５およびＣＤ５９のレベルの選択的な低下が、ストレプトゾトシン誘発性の糖尿病が１０週間持続したラットにおいて観察された。従って、糖尿病は、糖尿病性の網膜微小血管障害の他の症状発現に最も先行する、補体インヒビターの不完全な制御および補体活性化が原因であるとみられる。
【０１７６】
Ｇｅｒｌら（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４３：１１０４−０８，２０００）は、糖尿病性網膜症に罹患した眼において活性化された補体成分の存在を確定した。免疫組織化学的研究により、５０個すべての糖尿病性網膜症検体において、ブルッフ膜のすぐ下に位置し、毛細血管を高密度に包囲する脈絡毛細管板において検出される補体Ｃ５ｂ−９複合体の広範な沈着が見出された。Ｃ３ｄに対する染色が、Ｃ５ｂ−９染色と正の相関を示したことは、補体活性化が、インサイチュで起きたという事実を示す。さらに、ポジティブ染色は、細胞外のＣ５ｂ−９と安定な複合体を形成するビトロネクチンに対して見出された。対照的に、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、マンナン結合レクチン（ＭＢＬ）、Ｃ１ｑまたはＣ４に対するポジティブ染色は見られなかったことから、補体活性化が、Ｃ４依存性経路を介して生じなかったことが示唆される。従って、Ｃ３ｄ、Ｃ５ｂ−９およびビトロネクチンの存在は、補体活性化が、おそらく、糖尿病性網膜症に罹患している眼の脈絡毛細管板における副経路を介して、完了するまで起きることを示唆する。補体活性化は、眼球組織の疾患および視覚的障害に関与し得る病理的な続発症において原因となる因子であり得る。したがって、補体インヒビターの使用は、糖尿病を起こす微小血管に対する損傷を低減するか、または阻止するために有効な治療法であり得る。
【０１７７】
インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ、Ｉ型糖尿病とも呼ばれる）は、様々なタイプの自己抗体の存在と関連する自己免疫疾患である（Ｎｉｃｏｌｏｆｆら、Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：６１−６６，２００４）。循環中にこれらの抗体および対応する抗原が存在することによって、長期間にわたって血液中に残存することが知られている循環免疫複合体（ＣＩＣ）が形成される。小血管にＣＩＣが沈着することによって、消耗性の臨床的結果とともに微小血管障害をもたらす可能性がある。糖尿病性の小児では、ＣＩＣと微小血管の合併症の発症との間に相関がある。これらの知見から、高レベルのＣＩＣ  ＩｇＧが、初期の糖尿病性腎症の発症に関連すること、および補体経路のインヒビターが、糖尿病性腎症の阻止に有効であり得ることが示唆される（Ｋｏｔｎｉｋら、Ｃｒｏａｔ．Ｍｅｄ．Ｊ．４４：７０７−１１，２００３）。さらに、下流の補体タンパク質の形成および副経路の関与は、ＩＤＤＭにおける膵島細胞の機能全体において関与する因子である可能性があり、また、潜在的な損傷を低下するか、または細胞死を制限するために補体インヒビターを使用することが考えられる（Ｃａｒａｈｅｒら、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１６２：１４３−５３，１９９９）。
【０１７８】
１型糖尿病を有する患者における循環ＭＢＬ濃度は、健常コントロールと比べて有意に高く、これらのＭＢＬ濃度は、尿中アルブミン排出と正の相関を有する（Ｈａｎｓｅｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８８：４８５７−６１，２００３）。最近の臨床研究では、高発現および低発現のＭＢＬ遺伝子型の頻度は、１型糖尿病を有する患者と健常コントロールとの間で類似することが見出された（Ｈａｎｓｅｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３：１５７０−７６，２００４）。しかしながら、糖尿病患者間で腎症を有するリスクは、高ＭＢＬ遺伝子型を有する場合に有意に高かった。このことから、高ＭＢＬレベルおよびレクチン経路の補体活性化は、糖尿病性腎症の発症に関与し得ることが示唆される。この結論は、新しく診断された１型糖尿病患者のコホートにおけるＭＢＬレベルとアルブミン尿の発生との関連を調べた最近の前向きな研究によって支持されている（Ｈｏｖｉｎｄら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５４：１５２３−２７，２００５）。１型糖尿病の経過の初期における高レベルのＭＢＬが、後期における持続性のアルブミン尿の発生と有意に関連することが見出された。これらの結果は、ＭＢＬおよびレクチン経路が、単に既存の変化の加速をもたらすだけでなく、糖尿病性の血管合併症の特異的な病原に関与し得ることを示唆する。最近の臨床研究（Ｈａｎｓｅｎら、Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１６６：２００７−１３，２００６）では、１５年超にわたって経過観察を受けている２型糖尿病を有する患者の十分特徴付けられたコホートのＭＢＬレベルをベースラインにおいて測定した。ＭＢＬレベルが低い（＜１０００μｇ／Ｌ）患者よりもＭＢＬ血漿レベルが高い（＞１０００μｇ／Ｌ）患者のほうが公知の交絡因子について調整した後でさえも、死亡リスクは、有意に高いことが見出された。
【０１７９】
本発明の別の態様において、非肥満糖尿病（ＩＤＤＭ）あるいはＩＤＤＭまたは成人発症型（２型）糖尿病の血管障害、ニューロパシーもしくは網膜症合併症に罹患している被験体において、薬学的キャリア中に治療有効量のＭＡＳＰ−２インヒビターを含んでいる組成物を投与することによってＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するための方法が提供される。ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、全身的に（例えば、動脈内、静脈内、筋肉内、皮下または他の非経口投与によって）または、潜在的には非ペプチド作動性薬剤については経口投与によって、上記被験体に投与され得る。あるいは、投与は、血管障害、神経障害または網膜障害の症状の部位への局所送達であり得る。ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、慢性状態の処置または管理に対して長期間にわたって定期的に投与され得るか、または急性状態の処置のために、単回投与または一連の投与によってであり得る。
【０１８０】
化学療法付近での投与および悪性腫瘍の処置
補体系の活性化はまた、悪性腫瘍の病原に関わり得る。最近、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体およびストレプトアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ手法を用いて、Ｃ５ｂ−９補体複合体、ＩｇＧ、Ｃ３、Ｃ４、Ｓ−タンパク質／ビトロネクチン、フィブロネクチンおよびマクロファージの新抗原を、乳癌の１７個のサンプル上および良性の乳房腫瘍の６つのサンプル上に局在化させた。各ＴＮＭステージの癌腫を有する組織サンプルすべてにおいて、腫瘍細胞の膜上にＣ５ｂ−９沈着、細胞レムナント上にまばらな顆粒および壊死領域に広汎性の沈着が存在した（Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ，Ｆ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４０：１０３９−１０４３，１９９２）。
【０１８１】
さらに、補体活性化は、化学療法または放射線治療の結果であり得るので、補体活性化の阻害は、医原性の炎症を低減するために悪性腫瘍の処置における補助として有用であり得る。化学療法および放射線治療が外科術の前に行われるとき、Ｃ５ｂ−９沈着は、より強く、広範であった。良性の病変では、すべてのサンプルにおいてＣ５ｂ−９沈着が無かった。Ｓ−タンパク質／ビトロネクチンは、結合組織マトリックスにおける線維性沈着として、および腫瘍細胞の周辺に広汎性の沈着として、フィブロネクチンよりも強くなく、かつ広範に存在した。ＩｇＧ、Ｃ３およびＣ４沈着は、癌腫サンプルにおいてのみ認められた。Ｃ５ｂ−９沈着の存在は、乳癌において補体活性化およびそれに続く病原的な作用を示唆する（Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ，Ｆ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４０：１０３９−１０４３，１９９２）。
【０１８２】
パルスチューナブルダイレーザー（Ｐｕｌｓｅｄ  ｔｕｎａｂｌｅ  ｄｙｅ  ｌａｓｅｒ）（５７７ｎｍ）（ＰＴＤＬ）治療は、ヘモグロビンの凝集および組織壊死を誘導し、これは、主に血管に限定される。ＰＴＤＬ照射された正常皮膚の研究における主な知見は以下のとおりであった：１）Ｃ３フラグメント、Ｃ８、Ｃ９およびＭＡＣは、血管壁に沈着した；２）これらの沈着は、赤血球の凝集の部位におけるトランスフェリンの即時的な沈着とは違って、照射の７分後にのみ明らかとなっていたので、その沈着は、それらのタンパク質の変性に起因するものではなかった；３）組織壊死自体が、特異的な反応である副経路による補体活性化の増幅をもたらさなかったので、Ｃ３沈着が、そのような増幅をもたらすと示された；および４）これらの反応は、多形核の白血球の局所的な蓄積より前に起きた。組織壊死は、血管腫においてより顕著であった。壊死の中心におけるより大きな血管腫の血管は、補体を有意に固定しなかった。対照的に、末梢に位置している血管における補体沈着は、１つの例外（ＭＡＣの構築が、Ｃ５コンバターゼの形成なしに直接生じるということと一致する知見である、Ｃ８、Ｃ９およびＭＡＣが、レーザー処置の直後にいくつかの血管において検出されたこと）とともに、正常な皮膚において観察されたものと同様であった。これらの結果は、補体が、ＰＴＤＬ誘発性の血管壊死において活性化され、そしてその後の炎症性反応に関与し得ることを示唆する。
【０１８３】
腫瘍の光線力学的療法（ＰＤＴ）は、強い宿主免疫応答を誘発し、その症状発現の１つは、著明な好中球増加である。ＰＤＴ誘発性の補体活性化の結果として放出される補体フラグメント（直接的なメディエーター）に加えて、少なくとも１２種の二次メディエーター（これらはすべて補体活性の結果として生じる）が存在する。後者としては、サイトカインＩＬ−１ベータ、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、Ｇ−ＣＳＦおよびＫＣ、トロンボキサン、プロスタグランジン、ロイコトリエン、ヒスタミンならびに凝固因子が挙げられる（Ｃｅｃｉｃ，Ｉ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．１８３：４３−５１，２００２）。
【０１８４】
最終的には、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化のインヒビターの使用は、癌の処置のための標準的な治療的レジメンと組み合わせて構想され得る。例えば、キメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であるリツキシマブによる処置は、特に循環腫瘍細胞数が多い患者において、中等度から重篤な初回投与副作用に関連し得る。リツキシマブの最初の注入における最近の研究では、５人の再発した低悪性度の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）患者において、補体活性化産物（Ｃ３ｂ／ｃおよびＣ４ｂ／ｃ）およびサイトカイン（腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）およびＩＬ−８）を測定した。リツキシマブの注入によって、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−６およびＩＬ−８の放出の前に迅速な補体活性化が誘導された。研究群は、小さかったが、補体活性化のレベルは、注入前の循環Ｂ細胞数と副作用の重症度の両方と相関したとみられる（ｒ＝０．８５；Ｐ＝０．０７）。これらの結果から、補体が、リツキシマブ処置の副作用の病原において中心的役割を果たすことが示唆される。補体活性化が、コルチコステロイドによって予防され得ないので、リツキシマブの初回投与における補体インヒビターの可能性のある役割を研究することが、今日的な意味があり得る（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｏｌｋ，Ｌ．Ｅ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１１５：８０７−８１１，２００１）。
【０１８５】
本発明の別の態様において、化学療法および／または放射線治療（癌の状態を処置するためが挙げられるが、これらに限定されない）を用いて処置されている被験体において、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するための方法が提供される。この方法は、化学療法付近で、すなわち、化学療法および／または放射線治療の適用の前および／または最中および／または後に、薬学的キャリア中に治療有効量のＭＡＳＰ−２インヒビターを含んでいる組成物を患者に投与する工程を含む。例えば、標的化されていない健常な組織における化学療法および／または放射線治療の有害な作用を低減するために、本発明のＭＡＳＰ−２インヒビター組成物の投与を、化学療法または放射線治療の適用前または適用と同時に開始し得、そして、治療の適用中の全期間にわたって継続し得る。さらに、ＭＡＳＰ−２インヒビター組成物は、化学療法および／または放射線治療の後に投与され得る。化学療法および放射線治療のレジメンが、反復処置を必要とすることが多いので、ＭＡＳＰ−２インヒビター組成物の投与もまた、繰り返され、化学療法および放射線照射処置と相対的に一致させることが可能であることが理解される。ＭＡＳＰ−２阻害薬剤が、悪性腫瘍に罹患している患者を処置するために、化学療法剤として単独で、または、他の化学療法剤および／または放射線治療と併用して使用され得ることも考えられる。投与は、経口的に（非ペプチド作動性薬剤の場合）、静脈内、筋肉内または他の非経口経路によって適切に行われ得る。
【０１８６】
内分泌障害
補体系はまた、最近、下垂体からのプロラクチン、成長因子またはインスリン様成長因子およびアドレノコルチコトロピンの制御された放出に関与する、橋本甲状腺炎（Ｂｌａｎｃｈｉｎ，Ｓ．ら、Ｅｘｐ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．７３（６）：８８７−９６，２００１）、ストレス、不安および他の潜在的なホルモン障害（Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｋ．ら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１７：２２６６−２２６８，２００３；Ｈａｎｓｅｎ，Ｔ．Ｋ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４４（１２）：５４２２−９，２００３）を含むいくつかの内分泌の状態または障害と関連している。
【０１８７】
ホルモンおよびサイトカインなどの分子を用いた２方向コミュニケーションが、内分泌系と免疫系との間に存在する。最近、補体由来のサイトカインであるＣ３ａが、前下垂体のホルモン放出を刺激し、そしてストレス応答および炎症の調節の中心となる反射である視床下部−下垂体−副腎軸を活性化する新しい経路が解明された。Ｃ３ａレセプターは、下垂体のホルモン分泌細胞および非ホルモン分泌（濾胞星状）細胞において発現する。Ｃ３ａおよびＣ３ａｄｅｓＡｒｇ（非炎症性代謝産物）は、下垂体の細胞培養物を刺激することにより、プロラクチン、成長ホルモンおよびアドレノコルチコトロピンを放出する。副腎性コルチコステロンとともにこれらのホルモンの血清レベルは、インビボにおける組換えＣ３ａおよびＣ３ａｄｅｓＡｒｇ投与によって用量依存的に増加する。これは、補体経路が、内分泌脳下垂体とのコミュニケーションによって組織特異的および全身性の炎症性反応を調節することを意味する（Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｋ．ら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１７：２２６６−２２６８，２００３）。
【０１８８】
動物およびヒトにおける多くの研究から、成長ホルモン（ＧＨ）およびインスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）が、免疫機能を調節することが示唆される。ＧＨ治療は、危篤状態の患者において死亡率を上昇させた。過度の死亡率は、ほぼ完全に敗血症性ショックまたは多臓器不全に起因し、これは、免疫および補体の機能のＧＨ誘発性の調節が関与することを示唆し得る。マンナン結合レクチン（ＭＢＬ）は、炭水化物構造に結合した後の、補体カスケードの活性化および炎症を介した先天免疫において重要な役割を果たす血漿タンパク質である。証拠から、ＭＢＬレベルに対する成長ホルモンからの著しい影響が支持されるので、潜在的にレクチン依存性補体活性化に対する影響も支持される（Ｈａｎｓｅｎ，Ｔ．Ｋ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４４（１２）：５４２２−９，２００３）。
【０１８９】
甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）は、自己免疫性の甲状腺疾患に関与する主要な自己抗原の１つである。ＴＰＯは、大きなＮ末端のミエロペルオキシダーゼ様モジュールそして補体制御タンパク質（ＣＣＰ）様モジュールおよび上皮成長因子様モジュールからなる。ＣＣＰモジュールは、Ｃ４補体成分の活性化に関与する分子の構成要素であり、Ｃ４が、自己免疫性状態においてＴＰＯに結合し、補体経路を活性し得るか否かを調べる研究が行われた。Ｉｇによるいかなる媒介も無く、ＴＰＯは、ＣＣＰモジュールを介して補体を直接活性化する。さらに、橋本甲状腺炎を有する患者において、甲状腺細胞は、Ｃ４および補体経路の下流の成分のすべてを過剰発現する。これらの結果から、補体経路の活性化に関係する他の機構とともにＴＰＯが、橋本甲状腺炎において観察された広範な細胞破壊に関与し得ることが示唆される（Ｂｌａｎｃｈｉｎ，Ｓ．ら、２００１）。
【０１９０】
従って、本発明の１つの態様は、内分泌障害に罹患している被験体に、薬学的キャリア中の治療有効量のＭＡＳＰ−２阻害薬剤を含む組成物を投与することによって、内分泌障害を処置するために、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するための方法を提供する。本発明に従って処置に供される状態としては、下垂体からのプロラクチン、成長因子またはインスリン様成長因子およびアドレノコルチコトロピンの制御された放出に関与する、橋本甲状腺炎、ストレス、不安および他の可能性のあるホルモン障害が挙げられるが、これらに限定されない。ＭＡＳ−２阻害薬剤は、全身的に（例えば、動脈内、静脈内、筋肉内、吸入、経鼻、皮下または他の非経口投与によって）または、潜在的には非ペプチド作動性薬剤については経口投与によって、上記被験体に投与され得る。ＭＡＳＰ−２阻害薬剤組成物は、１つ以上のさらなる治療薬と併用され得る。投与は、その状態が回復するまで医師が決定するとおりに反復され得る。
【０１９１】
眼科学的状態
加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）は、何百万人もの成人を悩ます失明に至る疾患であるが、ＡＭＤの発症をもたらす生化学的な、細胞性および／または分子性のイベントの続発症は、あまり理解されていない。ＡＭＤによって、黄斑、黄斑周辺、網膜の後ろおよび網膜色素上皮（ＲＰＥ）と脈絡膜との間に位置する、ドルーゼンと呼ばれる細胞外沈着の形成と相関する、黄斑の進行性の破壊がもたらされる。最近の研究によって、炎症と関連するタンパク質および免疫媒介性プロセスが、ドルーゼン関連成分の間で優勢であることが明らかになった。多くのこれらの分子をコードする転写物は、網膜細胞、ＲＰＥ細胞および脈絡膜細胞において検出されている。これらのデータはまた、強力な抗原提示細胞である樹状細胞が、ドルーゼンの発生に本質的に関連すること、および補体活性化が、ドルーゼン内とＲＰＥ−脈絡膜界面沿いの両方において活性である重要な経路であることを証明している（Ｈａｇｅｍａｎ，Ｇ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｇ．Ｒｅｔｉｎ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．，２０：７０５−７３２，２００１）。
【０１９２】
いくつかの独立した研究によって、ＡＭＤと補体Ｈ因子（ＣＦＨ）についての遺伝子の遺伝的多型との間に強い関連が示されており、リスク対立遺伝子は、ホモ接合性の個体においてＡＭＤの可能性を７．４倍増加させる（Ｋｌｅｉｎ，Ｒ．Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０８：３６２−３６４，２００５；Ｈａｉｎｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０８：３６２−３６４．２００５；Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０８：２６３−２６４，２００５）。ＣＦＨ遺伝子は、６つの独立した連鎖スキャンによってＡＭＤに関わっている領域である染色体１ｑ３１にマッピングされた（例えば、Ｄ．Ｗ．Ｓｃｈｕｌｔｚら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２：３３１５，２００３を参照のこと）。ＣＦＨは、補体系の重要な制御因子であることが知られている。細胞上および循環中のＣＦＨは、Ｃ３をＣ３ａおよびＣ３ｂに活性化することを阻害することによって、および既存のＣ３ｂを不活性化させることによって補体活性を制御していることが示されている。Ｃ５ｂ−９の沈着は、ＡＭＤを有する患者におけるブルッフ（Ｂｒｕｓｃｈ’ｓ）膜、毛細血管間の柱（ｉｎｔｅｒｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｐｉｌｌａｒ）およびドルーゼン内において観察されている（Ｋｌｅｉｎら）。免疫蛍光法実験から、ＡＭＤにおいて、ＣＦＨの多型は、脈絡膜の（ｃｈｏｒｏｄｉａｌ）毛細血管および脈絡膜の血管において補体沈着を生じさせ得ることが示唆される（Ｋｌｅｉｎら）。
【０１９３】
補体レセプター１である膜関連補体インヒビターも、ドルーゼンに局在するが、免疫組織化学的にはＲＰＥ細胞において検出されていない。対照的に、メンブレンコファクタープロテインである第２の膜関連補体インヒビターは、ドルーゼン関連ＲＰＥ細胞ならびにドルーゼン内の小さい球状の下部構造のエレメントに存在する。これらのこれまで同定されていないエレメントもまた、補体活性化の部位に特徴的に沈着する補体成分Ｃ３のタンパク分解性フラグメントに対して強い免疫反応性を示す。これらの構造は、補体攻撃の標的である変性ＲＰＥ細胞からの残留残骸に相当すると提案されている（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｌ．Ｖ．ら、Ｅｘｐ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．７３：８８７−８９６，２００１）。
【０１９４】
これらの複数の補体制御因子ならびに補体活性化産物（Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ｂ−９）の同定および局在性から、研究者らは、慢性の補体活性化が、ドルーゼン発生のプロセスおよびＡＭＤの病因において重要な役割を果たすと結論づけている（Ｈａｇｅｍａｎら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．２０：７０５−３２，２００１）。ドルーゼンにおいてＣ３およびＣ５の活性化産物が同定されても、Ｃ３とＣ５の両方が、３つすべての経路に共通であるので、本発明に従って理解されるとき、補体が、古典経路、レクチン経路または副経路の増幅ループを介して活性化されているか否かについての見識はもたらされない。しかしながら、２つの研究では、古典経路の活性化に必須の認識成分であるＣ１ｑに特異的な抗体を使用してドルーゼン免疫標識が探された（Ｍｕｌｌｉｎｓら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１４：８３５−８４６，２０００；Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｅｘｐ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．７０：４４１−４４９，２０００）。両方の研究は、ドルーゼンにおけるＣ１ｑ免疫標識は、広く観察されないと結論付けた。Ｃ１ｑを用いたこれらの否定的な結果から、ドルーゼンにおける補体活性化は、古典経路を介して起こっていないことが示唆される。さらに、免疫複合体成分（ＩｇＧ軽鎖、ＩｇＭ）に対するドルーゼンの免疫標識は、Ｍｕｌｌｉｎｓらの２０００年の研究において、弱く、変わりやすいと報告されており、このことから、古典経路が、この疾患プロセスにおいて生じる補体活性化において小さい役割を果たすことがさらに示唆される。
【０１９５】
２つの最近の公開された研究では、ヒトＣＮＶのモデルであるマウスのレーザー誘発脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）の発生において補体の役割が評価された。免疫組織学的な方法を用いて、Ｂｏｒａおよび共同研究者ら（２００５）は、レーザー処置後の新生血管複合体において補体活性化産物Ｃ３ｂおよびＣ５ｂ−９（ＭＡＣ）の有意な沈着を見出した（Ｂｏｒａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：４９１−７，２００５）。重要なことには、ＣＮＶは、すべての補体活性化経路において必要とされる必須の成分であるＣ３が遺伝的に欠損したマウス（Ｃ３−／−マウス）において発症しなかった。ＣＮＶに関わる３つの血管新生因子であるＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β２およびβ−ＦＧＦに対するＲＮＡメッセージレベルは、レーザー誘発ＣＮＶ後のマウス由来の眼組織において上昇していた。重大なことには、補体枯渇によって、これらの血管新生因子のＲＮＡレベルの著明な低下がもたらされた。
【０１９６】
Ｎｏｚａｋｉおよび共同研究者らは、強力なアナフィラトキシンＣ３ａおよびＣ５ａが、レーザー誘発ＣＮＶの経過の早期において生成されることを、ＥＬＩＳＡ法を用いて証明した（Ｎｏｚａｋｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０３：２３２８−３３，２００６）。さらに、Ｃ３およびＣ５のこれらの２つの生物活性のフラグメントは、野生型マウスにおける硝子体内注射後にＶＥＧＦ発現を誘導した。これらの結果と一致して、Ｎｏｚａｋｉおよび共同研究者らはまた、Ｃ３ａおよびＣ５ａに対するレセプターの遺伝子の除去によって、レーザー損傷後にＶＥＧＦ発現およびＣＮＶ形成が低減すること、ならびに、Ｃ３ａもしくはＣ５ａの抗体媒介性の中和またはそれらのレセプターの薬理学的遮断もまた、ＣＮＶを低減することを示した。以前の研究から、白血球の補充およびマクロファージが、特に、レーザー誘発ＣＮＶにおいて中心的役割を果たすことが確立されている（Ｓａｋｕｒａｉら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｔｈｏｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４４：３５７８−８５，２００３；Ｅｓｐｉｎｏｓａ−Ｈｅｉｄｍａｎｎら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｔｈｏｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４４：３５８６−９２，２００３）。Ｎｏｚａｋｉおよび共同研究者は、２００６年の論文において、Ｃ３ａＲ（−／−）マウスおよびＣ５ａＲ（−／−）マウスにおいてレーザー損傷後に白血球補充が著明に低下することを報告している。
【０１９７】
従って、本発明の１つの態様は、加齢性黄斑変性症または他の補体媒介性眼科学的状態に罹患している被験体に、薬学的キャリア中の治療有効量のＭＡＳＰ−２阻害薬剤を含む組成物を投与することによって、そのような状態または他の補体媒介性眼科学的状態を処置するために、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するための方法を提供する。ＭＡＳＰ−２阻害性組成物は、眼に対して局所的に（例えば、ゲル、軟膏または点眼剤の形態の組成物の灌注または塗布によって）投与され得る。あるいは、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、全身的に（例えば、動脈内、静脈内、筋肉内、吸入、経鼻、皮下または他の非経口投与によって）または、潜在的には非ペプチド作動性薬剤については経口投与によって、上記被験体に投与され得る。ＭＡＳＰ−２阻害薬剤組成物は、１つ以上のさらなる治療薬（例えば、米国特許出願公開番号２００４−００７２８０９−Ａ１に開示されているもの）と併用され得る。投与は、その状態が回復するまで、または管理されるまで、医師が決定するとおりに反復され得る。
【０１９８】
（ＩＶ．ＭＡＳＰ−２阻害薬剤）
１つの態様において、本発明は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化の有害作用を阻害する方法を提供する。ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、生存被験体においてＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するのに有効な量で投与される。本発明のこの態様の実施において、代表的なＭＡＳＰ−２阻害薬剤としては：ＭＡＳＰ−２の生物学的活性を阻害する分子（例えば、低分子インヒビター、抗ＭＡＳＰ−２抗体、または、ＭＡＳＰ−２と相互作用するか、もしくはタンパク質−タンパク質相互作用を干渉する遮断ペプチド）およびＭＡＳＰ−２の発現を低下させる分子（例えば、ＭＡＳＰ−２アンチセンス核酸分子、ＭＡＳＰ−２特異的ＲＮＡｉ分子およびＭＡＳＰ−２リボザイム）が挙げられ、これらによって、ＭＡＳＰ−２が補体副経路の活性化を妨害する。ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、一次療法として単独で、または他の医学的処置の治療的な利点を強める補助療法として他の治療法と併用しても使用され得る。
【０１９９】
ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化の阻害は、本発明の方法に従ってＭＡＳＰ−２阻害薬剤が投与された結果として生じる補体系の成分のその後の変化のうちの少なくとも１つ：ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化の系の産物であるＣ４ｂ、Ｃ３ａ、Ｃ５ａおよび／もしくはＣ５ｂ−９（ＭＡＣ）の生成または産生の阻害（例えば、実施例２に記載される通りに測定される）、非感作のウサギまたはモルモットの赤血球を使用する溶血アッセイにおいて評価される副補体活性化の低下、Ｃ４切断およびＣ４ｂ沈着の減少（例えば、実施例２に記載される通りに測定される）あるいはＣ３切断およびＣ３ｂ沈着の減少（例えば、実施例２に記載されている通りに測定される）を特徴とする。
【０２００】
本発明によれば、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化の系を阻害する際に有効であるＭＡＳＰ−２阻害薬剤を利用する。本発明のこの態様の実施において有用なＭＡＳＰ−２阻害薬剤としては、例えば、抗ＭＡＳＰ−２抗体およびそのフラグメント、ＭＡＳＰ−２阻害性ペプチド、低分子、ＭＡＳＰ−２可溶性レセプターならびに発現インヒビターが挙げられる。ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、ＭＡＳＰ−２の生物学的機能を遮断することによってＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化の系を阻害し得る。例えば、阻害薬剤は、ＭＡＳＰ−２タンパク質とタンパク質との相互作用を効果的に遮断し得るか、ＭＡＳＰ−２の二量体化または構築を干渉するか、Ｃａ２＋結合を遮断するか、ＭＡＳＰ−２セリンプロテアーゼ活性部位を干渉するか、または、ＭＡＳＰ−２タンパク質発現を低下させ得る。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、ＭＡＳＰ−２の補体活性化を選択的に阻害することによって、Ｃ１ｑ依存性の補体活性化の系を機能的に損なわないままにする。
【０２０２】
１つの実施形態において、本発明の方法において有用なＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、補体系における他の抗原に対する親和性よりも少なくとも１０倍高い親和性で、配列番号６を含むポリペプチドに特異的に結合する特異的なＭＡＳＰ−２阻害薬剤である。別の実施形態において、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、補体系における他の抗原に対する結合親和性よりも少なくとも１００倍高い結合親和性で配列番号６を含むポリペプチドに特異的に結合する。ＭＡＳＰ−２阻害薬剤の結合親和性は、適当な結合アッセイを用いて測定され得る。
【０２０３】
ＭＡＳＰ−２ポリペプチドは、ＭＡＳＰ−１、ＭＡＳＰ−３ならびにＣ１補体系のプロテアーゼであるＣ１ｒおよびＣ１ｓに類似の分子構造を示す。配列番号４に示されるｃＤＮＡ分子は、ＭＡＳＰ−２の代表例（配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる）をコードし、そして分泌後に切断されてヒトＭＡＳＰ−２の成熟型（配列番号６）がもたらされる、リーダー配列を有するヒトＭＡＳＰ−２ポリペプチド（ａａ１−１５）を提供する。図２に示される通りに、ヒトＭＡＳＰ２遺伝子は、１２個のエキソンを包含する。ヒトＭＡＳＰ−２  ｃＤＮＡは、エキソンＢ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、ＫおよびＬによってコードされる。選択的スプライシングによって、図２に示される通りに、エキソンＢ、Ｃ、ＤおよびＥから生じる（配列番号１）によってコードされるＭＢＬ関連タンパク質１９（「ＭＡｐ１９」、「ｓＭＡＰ」とも呼ばれる）（配列番号２）と呼ばれる２０ｋＤａのタンパク質がもたらされる。配列番号５０に示されるｃＤＮＡ分子は、マウスＭＡＳＰ−２（配列番号５１に示されるアミノ酸配列からなる）をコードし、分泌後に切断されて、マウスＭＡＳＰ−２の成熟型（配列番号５２）をもたらす、リーダー配列を含むマウスＭＡＳＰ−２ポリペプチドを提供する。配列番号５３に示されるｃＤＮＡ分子は、ラットＭＡＳＰ−２（配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなる）をコードし、分泌後に切断されて、ラットＭＡＳＰ−２の成熟型（配列番号５５）をもたらす、リーダー配列を含むラットＭＡＳＰ−２ポリペプチドを提供する。
【０２０４】
当業者は、配列番号４、配列番号５０および配列番号５３に開示される配列が、それぞれヒト、マウスおよびラットのＭＡＳＰ−２の単一の対立遺伝子であること、ならびに、対立遺伝子バリエーションおよび選択的スプライシングが生じると予想されることを認識するだろう。サイレント変異を含む配列および変異によってアミノ酸配列が変化する配列を含む、配列番号４、配列番号５０および配列番号５３に示されるヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体は、本発明の範囲内である。ＭＡＳＰ−２配列の対立遺伝子改変体は、標準的な手順に従って、様々な個体由来のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーを探索することによってクローニングされ得る。
【０２０５】
ヒトＭＡＳＰ−２タンパク質のドメイン（配列番号６）を、図３Ａに示し、そのドメインとしては、Ｎ末端のＣ１ｒ／Ｃ１ｓ／ウニＶｅｇｆ／骨形態形成タンパク質（ＣＵＢＩ）ドメイン（配列番号６のａａ１−１２１）、上皮成長因子様ドメイン（ａａ１２２−１６６）、第２のＣＵＢＩドメイン（ａａ１６７−２９３）ならびにタンデム型の補体制御タンパク質ドメインおよびセリンプロテアーゼドメインが挙げられる。ＭＡＳＰ２遺伝子の選択的スプライシングによって、図３Ｂに示されるＭＡｐ１９がもたらされる。ＭＡｐ１９は、図２に示される通りにエキソンＥ由来の４つのさらなる残基（ＥＱＳＬ）を有するＭＡＳＰ−２のＮ末端のＣＵＢ１−ＥＧＦ領域を含む非酵素的なタンパク質である。
【０２０６】
いくつかのタンパク質は、ＭＡＳＰ−２に結合するか、またはタンパク質とタンパク質との相互作用によってＭＡＳＰ−２を干渉することが示されている。例えば、ＭＡＳＰ−２は、レクチンタンパク質であるＭＢＬ、Ｈ−フィコリンおよびＬ−フィコリンに結合し、そしてそれらとＣａ２＋依存性複合体を形成することが知られている。各ＭＡＳＰ−２／レクチン複合体は、タンパク質Ｃ４およびＣ２のＭＡＳＰ−２依存性切断によって補体を活性化することが示されている（Ｉｋｅｄａ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：７４５１−７４５４，１９８７；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１４９７−２２８４，２０００；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：３５０２−３５０６，２００２）。研究によって、ＭＡＳＰ−２のＣＵＢ１−ＥＧＦドメインは、ＭＡＳＰ−２とＭＢＬとの会合に不可欠であることが示されている（Ｔｈｉｅｌｅｎｓ，Ｎ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５０６８，２００１）。ＣＵＢ１ＥＧＦＣＵＢＩＩドメインが、活性なＭＢＬ複合体の形成に必要なＭＡＳＰ−２の二量体化を媒介することも示されている（Ｗａｌｌｉｓ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３０９６２−３０９６９，２０００）。したがって、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化にとって重要であることが知られているＭＡＳＰ−２標的領域に結合するか、または、それを干渉するＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、同定され得る。
【０２０７】
抗ＭＡＳＰ−２抗体
本発明のこの態様のいくつかの実施形態において、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化の系を阻害する抗ＭＡＳＰ−２抗体を含む。本発明のこの態様において有用な抗ＭＡＳＰ−２抗体としては、任意の抗体産生哺乳動物から得られるポリクローナル抗体、モノクローナル抗体または組換え抗体が挙げられ、そして、多特異的抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体および抗体フラグメントであり得る。抗体フラグメントとしては、本明細書中でさらに記載するような、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメントおよび一本鎖抗体が挙げられる。
【０２０８】
いくつかの抗ＭＡＳＰ−２抗体は、文献に記載されており、そのうちのいくつかを以下の表１に列挙する。これらの以前に報告された抗ＭＡＳＰ−２抗体は、本明細書中に記載されるアッセイを用いて、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化の系を阻害する能力についてスクリーニングされ得る。例えば、本明細書中の実施例２４および２５に詳細に記載するように、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を遮断する抗ラットＭＡＳＰ−２  Ｆａｂ２抗体が同定された。一旦、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤として機能する抗ＭＡＳＰ−２抗体が同定されると、それを用いて、抗イディオタイプ抗体を作製することができ、また、以下にさらに記載されるような他のＭＡＳＰ−２結合分子を同定することができる。
【０２０９】
【表１】
0005567328.tif 000002
エフェクター機能の低い抗ＭＡＳＰ−２抗体
本発明のこの態様のいくつかの実施形態において、補体古典経路の活性化から生じ得る炎症を低減するために、抗ＭＡＳＰ−２抗体は、低いエフェクター機能を有する。ＩｇＧ分子が補体古典経路を開始する能力は、その分子のＦｃ部の内部に存在することが知られている（Ｄｕｎｃａｎ，Ａ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：７３８−７４０  １９８８）。その分子のＦｃ部が酵素的切断によって除去されたＩｇＧ分子は、このエフェクター機能を欠いている（Ｈａｒｌｏｗ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８を参照のこと）。従って、エフェクター機能の低い抗体は、エフェクター機能を最小限にする遺伝的に操作されたＦｃ配列を有することによって、その分子のＦｃ部を有しない結果として生成され得るか、または、ヒトＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４アイソタイプのいずれかである結果として生成され得る。
【０２１０】
エフェクター機能の低い抗体は、本明細書中の実施例９に記載される通りに、そしてＪｏｌｌｉｆｆｅら、Ｉｎｔ’ｌ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：２４１−２５０，１１９９３およびＲｏｄｒｉｇｕｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：６９５４−６９６１，１９９８にも記載されている通りに、ＩｇＧ重鎖のＦｃ部の標準的な分子生物学的操作によって作製され得る。エフェクター機能の低い抗体はまた、補体を活性化する能力および／またはＦｃレセプターと相互作用する能力が低いヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４アイソタイプを含む（Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２，１９９１；Ｉｓａａｃｓ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：３０６２−３０７１，１９９２；ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １４：２１５−２２１，１９９３）。ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプを含む、ヒトＭＡＳＰ−２に特異的であるヒト化抗体または完全なヒト抗体は、Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  １６：５３５−５３９，１９９８に記載されている通りに、当業者に公知のいくつかの方法のうちの１つによって作製され得る。
【０２１１】
抗ＭＡＳＰ−２抗体の作製
抗ＭＡＳＰ−２抗体は、ＭＡＳＰ−２ポリペプチド（例えば、完全長ＭＡＳＰ−２）を使用するか、または抗原性のＭＡＳＰ−２エピトープを有するペプチド（例えば、ＭＡＳＰ−２ポリペプチドの一部）を使用して作製され得る。免疫原性のペプチドは、５アミノ酸残基くらい小さくてもよい。例えば、配列番号６のアミノ酸配列全体を含むＭＡＳＰ−２ポリペプチドを使用して、本発明の方法に有用な抗ＭＡＳＰ−２抗体を誘導し得る。タンパク質−タンパク質相互作用に関与することが知られている特定のＭＡＳＰ−２ドメイン（例えば、ＣＵＢＩおよびＣＵＢＩＥＧＦドメインならびにセリン−プロテアーゼ活性部位を包含する領域）は、実施例５に記載される通りに組換えポリペプチドとして発現され得、そして抗原として使用され得る。さらに、ＭＡＳＰ−２ポリペプチド（配列番号６）の一部の少なくとも６アミノ酸を含むペプチドもまた、ＭＡＳＰ−２抗体を誘導するのに有用である。ＭＡＳＰ−２抗体を誘導するのに有用なＭＡＳＰ−２由来の抗原のさらなる例を、以下の表２に提供する。抗体を産生するために使用されるＭＡＳＰ−２ペプチドおよびポリペプチドは、天然のポリペプチドまたは組換えペプチドもしくは合成ペプチドおよび触媒的に不活性な組換えポリペプチド（例えば、実施例５〜７にさらに記載するようなＭＡＳＰ−２Ａ）として単離され得る。本発明のこの態様のいくつかの実施形態において、抗ＭＡＳＰ−２抗体は、実施例８および９ならびに以下にさらに記載される通りに、トランスジェニックマウス系統を使用して得られる。
【０２１２】
抗ＭＡＳＰ−２抗体を作製するために有用な抗原としては、融合ポリペプチド（例えば、ＭＡＳＰ−２またはその一部と、免疫グロブリンポリペプチドまたはマルトース結合タンパク質との融合物）もまた挙げられる。そのポリペプチド免疫原は、完全長分子であってもよいし、その一部であってもよい。上記ポリペプチドの一部が、ハプテン様である場合、そのような一部は、免疫化のために高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または破傷風トキソイド）と有利に結合され得るか、または連結され得る。
【０２１３】
【表２】
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ポリクローナル抗体
ＭＡＳＰ−２に対するポリクローナル抗体は、当業者に周知の方法を使用して、ＭＡＳＰ−２ポリペプチドまたはその免疫原性部分を用いて動物を免役することによって調製され得る。例えば、Ｇｒｅｅｎら、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｓｅｒａ」Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍａｎｓｏｎ，ｅｄ．），ｐａｇｅ  １０５および実施例６にさらに記載される部分を参照のこと。ＭＡＳＰ−２ポリペプチドの免疫原性は、無機物のゲル（例えば、水酸化アルミニウムまたはフロイントアジュバント（完全または不完全））を含むアジュバント、リゾレシチンなどの表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニンおよびジニトロフェノールを使用することによって増大され得る。ポリクローナル抗体は、代表的には、動物（例えば、ウマ、ウシ、イヌ、ニワトリ、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ヤギまたはヒツジ）において産生される。あるいは、本発明において有用な抗ＭＡＳＰ−２抗体は、ヒトに近い霊長類に由来してもよい。ヒヒにおいて診断的かつ治療的に有用な抗体を産生するための通常の手法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら、国際特許公開番号ＷＯ９１／１１４６５およびＬｏｓｍａｎ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４６：３１０，１９９０に見出され得る。次いで、免疫学的に活性な抗体を含む血清を、当該分野で周知の標準的な手順を使用して、そのような免役された動物の血液から得る。
【０２１４】
モノクローナル抗体
いくつかの実施形態において、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル抗体である。抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一のＭＡＳＰ−２エピトープに対して産生されたものである。本明細書中で使用されるとき、修飾語「モノクローナル」とは、実質的に同種の抗体集団から得られた抗体の特性のことを示し、任意の特定の方法による抗体の作製を必要とすると解釈されるべきでない。モノクローナル抗体は、継続的に培養中の細胞株による抗体分子の産生をもたらす任意の手法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５，１９７５に記載されているハイブリドーマ法）を使用して得ることができるか、または組換えＤＮＡ法（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙに対する米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）によって作製され得る。モノクローナル抗体はまた、Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８，１９９１およびＭａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７，１９９１に記載されている手法を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそれらの任意のサブクラスを含む任意の免疫グロブリンクラスであり得る。
【０２１５】
例えば、モノクローナル抗体は、適当な哺乳動物（例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス）に、ＭＡＳＰ−２ポリペプチドまたはその一部を含む組成物を注射することによって得ることができる。所定の期間が経過した後、脾細胞をそのマウスから取り出し、そして細胞培養培地中に懸濁する。次いで、その脾細胞を不死細胞株と融合することにより、ハイブリドーマを形成する。形成されたハイブリドーマを細胞培養で増殖させ、ＭＡＳＰ−２に対するモノクローナル抗体を産生する能力についてスクリーニングする。抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル抗体の作製をさらに説明している例を実施例７に提供する。（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ｐａｇｅｓ  ２．５．１−２．６．７，１９９１もまた参照のこと）。
【０２１６】
ヒトモノクローナル抗体は、抗原チャレンジに応答して特異的なヒト抗体を産生するように操作されたトランスジェニックマウスを使用することによって得てもよい。この手法では、内在性の免疫グロブリン重鎖および軽鎖の遺伝子座が標的破壊されている胚性幹細胞系統由来のマウスの系統にヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖の遺伝子座のエレメントを導入する。そのトランスジェニックマウスは、ヒト抗原（例えば、本明細書中に記載されるＭＡＳＰ−２抗原）に特異的なヒト抗体を合成することができ、実施例７にさらに記載される通りに従来のＫｏｈｌｅｒ−Ｍｉｌｓｔｅｉｎ技術を使用して、そのマウスを使用することにより、そのような動物由来のＢ細胞と適当な骨髄腫細胞株とを融合することによって、ヒトＭＡＳＰ−２抗体分泌ハイブリドーマを作製することができる。ヒト免疫グロブリンゲノムを有するトランスジェニックマウスは、市販されている（例えば、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡおよびＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎａｎｄａｌｅ，Ｎ．Ｊから）。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、例えば、Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３，１９９４；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６，１９９４；およびＴａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．ら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９，１９９４に記載されている。
【０２１７】
モノクローナル抗体は、種々の十分に確立された手法によってハイブリドーマ培養物から単離および精製され得る。そのような単離手法としては、プロテインＡセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィおよびイオン交換クロマトグラフィが挙げられる（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ  ２．７．１−２．７．１２頁および２．９．１−２．９．３頁；Ｂａｉｎｅｓら、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ（ＩｇＧ），」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｖｏｌ．１０，ｐａｇｅｓ  ７９−１０４，１９９２を参照のこと）。
【０２１８】
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはファージ由来抗体は、一旦作製されると、まず、特異的なＭＡＳＰ−２結合性について試験される。当業者に公知の種々のアッセイが、ＭＡＳＰ−２に特異的に結合する抗体を検出するために利用され得る。代表的なアッセイとしては、標準的な方法によるウエスタンブロットまたは免疫沈降解析（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌらに記載されているような）、免疫電気泳動、酵素結合免疫吸着測定法、ドットブロット、阻害アッセイもしくは競合アッセイおよびサンドイッチアッセイが挙げられる（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｄ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８に記載されているような）。一旦、ＭＡＳＰ−２に特異的に結合する抗体が同定されると、その抗ＭＡＳＰ−２抗体は、いくつかのアッセイのうちの１つ（例えば、レクチン特異的Ｃ４切断アッセイ（実施例２に記載）、Ｃ３ｂ沈着アッセイ（実施例２に記載）またはＣ４ｂ沈着アッセイ（実施例２に記載））においてＭＡＳＰ−２阻害薬剤として機能する能力について試験される。
【０２１９】
抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル抗体の親和性は、当業者によって容易に決定され得る（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａ．，ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０−６７２，１９４９を参照のこと）。１つの実施形態において、本発明の方法に有用な抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル抗体は、１００ｎＭ未満、好ましくは１０ｎＭ未満および最も好ましくは２ｎＭ未満の結合親和性でＭＡＳＰ−２に結合する。
【０２２０】
キメラ／ヒト化抗体
本発明の方法において有用なモノクローナル抗体としては、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種由来の抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応配列と同一あるいは同種であり、それらの鎖の残りの部分が、別の種由来かまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応配列と同一または同種であるキメラ抗体ならびにそのような抗体のフラグメントが挙げられる（Ｃａｂｉｌｌｙに対する米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６８５１−６８５５，１９８４）。
【０２２１】
本発明において有用なキメラ抗体の１つの形態は、ヒト化モノクローナル抗ＭＡＳＰ−２抗体である。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化型は、キメラ抗体であり、それは非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む。ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの可変重鎖および可変軽鎖からヒト可変ドメインに非ヒト（例えば、マウス）相補性決定領域（ＣＤＲ）を移植することによって作製される。そして、ヒト抗体の残りの部分を、代表的には非ヒト対応物のフレームワーク領域で置換する。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見られない残りの部分を含み得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練させるためになされる。通常、ヒト化抗体は、少なくとも１つの可変ドメインおよび代表的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここで、超可変ループのすべてまたは実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、そしてＦｖフレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべては、ヒト免疫グロブリン配列のＦｖフレームワーク領域である。ヒト化抗体はまた、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、代表的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５，１９８６；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９，１９８８；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６，１９９２を参照のこと。
【０２２２】
本発明において有用なヒト化抗体としては、少なくともＭＡＳＰ−２結合ＣＤＲ３領域を含むヒトモノクローナル抗体が挙げられる。さらに、Ｆｃ部は、ＩｇＡまたはＩｇＭならびにヒトＩｇＧ抗体を作製するために置換され得る。そのようなヒト化抗体は、ヒトＭＡＳＰ−２を特異的に認識するが、ヒトにおいてその抗体自体に対して免疫応答を誘発しないので、特定の臨床的有用性を有する。その結果として、そのようなヒト化抗体は、特に、反復投与または長期間にわたる投与が必要なときに、ヒトにおけるインビボ投与により適している。
【０２２３】
マウス抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル抗体からのヒト化抗ＭＡＳＰ−２抗体の作製の例は、本明細書中の実施例１０に提供される。ヒト化モノクローナル抗体を作製するための手法は、例えば、Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２，１９８６；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２８５，１９９２；Ｓａｎｄｈｕ，Ｊ．Ｓ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４３７，１９９２；Ｓｉｎｇｅｒ，Ｉ．Ｉ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５０：２８４４，１９９３；Ｓｕｄｈｉｒ（ｅｄ．），Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９５；Ｋｅｌｌｅｙ，「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，」Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｃｌｅｌａｎｄら（ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｐａｇｅｓ  ３９９−４３４，１９９６；およびＱｕｅｅｎに対する米国特許第５，６９３，７６２号，１９９７にも記載されている。さらに、特定のマウス抗体領域からヒト化抗体を合成する商業的団体が存在する（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ））。
【０２２４】
組換え抗体
抗ＭＡＳＰ−２抗体は、組換え法を使用しても作製することができる。例えば、ヒト免疫グロブリン発現ライブラリー（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃｏｒｐ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡから入手可能）を用いてヒト抗体を作製することにより、ヒト抗体のフラグメント（ＶＨ、ＶＬ、ＦＶ、Ｆｄ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）を作製することができる。次いで、これらのフラグメントは、キメラ抗体を作製するための手法と同様の手法を用いてヒト抗体全体を構築するために使用される。
【０２２５】
抗イディオタイプ抗体
一旦、所望の阻害性活性を有する抗ＭＡＳＰ−２抗体が同定されると、これらの抗体を使用することにより、当該分野で周知の手法を用いてＭＡＳＰ−２の一部に似た抗イディオタイプ抗体を作製することができる。例えば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ，Ｎ．Ｓ．ら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７：４３７，１９９３を参照のこと。例えば、ＭＡＳＰ−２に結合し、そして補体活性化に必要なＭＡＳＰ−２タンパク質相互作用を競合的に阻害する抗体を使用して、ＭＡＳＰ−２タンパク質上のＭＢＬ結合部位に似ているがゆえに、ＭＡＳＰ−２の結合リガンド（例えば、ＭＢＬ）に結合して中和する抗イディオタイプを作製することができる。
【０２２６】
免疫グロブリンフラグメント
本発明の方法において有用なＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、インタクトな免疫グロブリン分子だけでなく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、ダイアボディ、鎖状抗体、一本鎖抗体分子ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体を含む周知のフラグメントも包含する。
【０２２７】
抗体分子のほんの小さな一部であるパラトープが、エピトープに対する抗体の結合性に関与することは、当該分野で周知である（例えば、Ｃｌａｒｋ，Ｗ．Ｒ．，Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９８６を参照のこと）。抗体のｐＦｃ’およびＦｃ領域は、補体古典経路のエフェクターであるが、抗原の結合性には関与しない。ｐＦｃ’領域が酵素的に切断されているか、またはｐＦｃ’領域なしに作製された抗体は、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントと命名され、インタクトな抗体の抗原結合部位の両方を保持する。単離されたＦ（ａｂ’）２フラグメントは、２つの抗原結合部位を有するので、二価モノクローナルフラグメントと呼ばれる。同様に、Ｆｃ領域が、酵素的にされているか、またはＦｃ領域なしに作製された抗体は、Ｆａｂフラグメントと命名され、インタクトな抗体分子の抗原結合部位のうちの１つを保持する。
【０２２８】
抗体フラグメントは、タンパク分解性の加水分解（例えば、従来の方法によって抗体全体をペプシン消化またはパパイン消化することによって）得ることができる。例えば、抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２という５Ｓフラグメントをもたらすために、ペプシンによる抗体の酵素的切断によって作製され得る。このフラグメントを、チオール還元剤を用いてさらに切断することにより、３．５ＳＦａｂ’一価フラグメントが作製され得る。必要に応じて、この切断反応は、ジスルフィド結合の切断によって生じるスルフヒドリル基に対する保護基を用いて行われ得る。別の方法として、ペプシンを用いた酵素的切断によって、２つの一価ＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメントが直接生成される。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇに対する米国特許第４，３３１，６４７号；Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，Ａ．ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０，１９６０；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９，１９５９；Ｅｄｅｌｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１：４２２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９６７；およびＣｏｌｉｇａｎによる２．８．１−２．８．１０ページおよび２．１０．−２．１０．４記載されている。
【０２２９】
いくつかの実施形態において、ＦｃがＦｃγレセプターに結合することによって開始される補体古典経路の活性化を回避するために、Ｆｃ領域を有しない抗体フラグメントを使用することが好ましい。Ｆｃγレセプター相互作用を回避するＭｏＡｂを作製することができるいくつかの方法が存在する。例えば、モノクローナル抗体のＦｃ領域を、タンパク分解性酵素（例えば、フィシン消化）による部分的な消化を用いて化学的に除去することによって、例えば、抗原結合抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）２フラグメント）が生成され得る（Ｍａｒｉａｎｉ，Ｍ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：６９−７１，１９９１）。あるいは、本明細書中に記載されるようなヒト化抗体の構築において、Ｆｃγレセプターに結合しないヒトγ４  ＩｇＧアイソタイプが使用され得る。Ｆｃドメインを有しない抗体、一本鎖抗体および抗原結合ドメインは、本明細書中に記載される組換え手法を用いることによっても操作され得る。
【０２３０】
一本鎖抗体フラグメント
あるいは、重鎖および軽鎖のＦｖ領域が連結された、ＭＡＳＰ−２に特異的な分子に結合する一本鎖ペプチドを作製することができる。Ｆｖフラグメントを、ペプチドリンカーによって連結することにより、一本鎖抗原結合タンパク質（ｓｃＦｖ）が形成され得る。これらの一本鎖抗原結合タンパク質は、オリゴヌクレオチドによって連結された、ＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。その構造遺伝子を発現ベクターに挿入し、それを続いてＥ．ｃｏｌｉなどの宿主細胞に導入する。組換え宿主細胞は、２つのＶドメインを繋ぐリンカーペプチドを有する一本鎖ポリペプチドを合成する。ｓｃＦｖを作製するための方法は、例えば、Ｗｈｉｔｌｏｗら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」２：９７，１９９１；Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３，１９８８；Ｌａｄｎｅｒに対する米国特許第４，９４６，７７８号；Ｐａｃｋ，Ｐ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１２７１，１９９３に記載されている。
【０２３１】
代表例としては、ＭＡＳＰ−２に特異的なｓｃＦｖは、インビトロにおいてリンパ球をＭＡＳＰ−２ポリペプチドに曝露し、そしてファージまたは類似のベクターにおける抗体ディスプレイライブラリーを選択することによって（例えば、固定化または標識されたＭＡＳＰ−２タンパク質またはペプチドを使用することによって）得ることができる。潜在的なＭＡＳＰ−２ポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ上またはＥ．ｃｏｌｉなどの細菌上にディスプレイされるランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。これらのランダムペプチドディスプレイライブラリーを使用することにより、ＭＡＳＰ−２と相互作用するペプチドについてスクリーニングすることができる。そのようなランダムペプチドディスプレイライブラリーを作製およびスクリーニングするための手法は、当該分野で周知であり（Ｌａｒｄｎｅｒに対する米国特許第５，２２３，４０９号；Ｌａｄｎｅｒに対する米国特許第４，９４６，７７８号；Ｌａｒｄｎｅｒに対する米国特許第５，４０３，４８４号；Ｌａｒｄｎｅｒに対する米国特許第５，５７１，６９８号；およびＫａｙら、Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９６）、ランダムペプチドディスプレイライブラリーおよびそのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えばＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびＰｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）から市販されている。
【０２３２】
本発明のこの態様において有用な抗ＭＡＳＰ−２抗体フラグメントの別の形態は、ＭＡＳＰ−２抗原上のエピトープに結合し、そしてＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害する単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、例えば、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成するポリメラーゼ連鎖反応を使用することによって調製される（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：１０６，１９９１；Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ−Ｌｕｃｋ，「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒら、（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ  １６６，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５；およびＷａｒｄら、「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｒｃｈら（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ  １３７，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９５を参照のこと）。
【０２３３】
本明細書中に記載されるＭＡＳＰ−２抗体は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するために、そのような必要がある被験体に投与される。いくつかの実施形態において、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、エフェクター機能が低い、高親和性のヒトモノクローナル抗ＭＡＳＰ−２抗体またはヒト化モノクローナル抗ＭＡＳＰ−２抗体である。
【０２３４】
ペプチドインヒビター
本発明のこの態様のいくつかの実施形態において、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化の系を阻害する単離天然ペプチドインヒビターおよび合成ペプチドインヒビターを含む単離ＭＡＳＰ−２ペプチドインヒビターを含む。本明細書中で使用されるとき、用語「単離ＭＡＳＰ−２ペプチドインヒビター」とは、ＭＡＳＰ−２に結合することによって、および／または、レクチン経路における別の認識分子（例えば、ＭＢＬ、Ｈ−フィコリン、Ｍ−フィコリンまたはＬ−フィコリン）に対する結合性に対してＭＡＳＰ−２と競合することによって、および／またはＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するようにＭＡＳＰ−２と直接相互作用することによって、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するペプチドであって、実質的に純粋であり、実際的かつ意図される用途に適切な、天然において見られ得る程度で本質的には他の物質を含まないペプチドのことをいう。
【０２３５】
ペプチドインヒビターは、タンパク質−タンパク質相互作用および触媒部位を干渉するためにインビボにおいて首尾よく使用されている。例えば、ＬＦＡ−１と構造的に関係する接着分子に対するペプチドインヒビターが、最近、凝固障害における臨床上の使用が承認された（Ｏｈｍａｎ，Ｅ．Ｍ．ら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ．１６：５０−５５，１９９５）。短い直鎖状ペプチド（＜３０アミノ酸）が、インテグリン依存性接着を妨害または干渉すると報告されている（Ｍｕｒａｙａｍａ，Ｏ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０：４４５−５１，１９９６）。２５〜２００アミノ酸残基の長さの範囲の長いペプチドもまた、インテグリン依存性接着を遮断するために首尾よく使用されている（Ｚｈａｎｇ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（４７）：２９９５３−５７，１９９６）。通常、長いペプチドインヒビターは、短いペプチドよりも高い親和性および／または遅い分解速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を有し、それゆえより強力なインヒビターであり得る。環状ペプチドインヒビターはまた、ヒト炎症性疾患を処置するためのインビボにおけるインテグリンの有効なインヒビターであることが示されている（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｄ．Ｙ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０：３３５９−６８，１９９７）。環状ペプチドを作製する１つの方法は、ペプチドの末端のアミノ酸がシステインであり、それによって、末端のアミノ酸の間をジスルフィド結合させることによって、そのペプチドを環状の形態にすることが可能であるペプチドの合成を含み、その環状ペプチドは、造血性新生物を処置するためにインビボでの親和性および半減期が改善されることが示されている（例えば、Ｌａｒｓｏｎに対する米国特許第６，６４９，５９２号）。
【０２３６】
合成ＭＡＳＰ−２ペプチドインヒビター
本発明のこの態様の方法において有用なＭＡＳＰ−２阻害性ペプチドは、ＭＡＳＰ−２機能にとって重要な標的領域を模倣するアミノ酸配列によって例示される。本発明の方法の実施において有用な阻害性ペプチドは、約５アミノ酸〜約３００アミノ酸の範囲の大きさである。表３は、本発明のこの態様の実施において有用であり得る代表的な阻害性ペプチドのリストである。ＭＡＳＰ−２阻害性ペプチド候補は、例えば、レクチン特異的Ｃ４切断アッセイ（実施例２に記載）およびＣ３ｂ沈着アッセイ（実施例２に記載）を含むいくつかのアッセイのうちの１つにおいてＭＡＳＰ−２阻害薬剤として機能する能力について試験され得る。
【０２３７】
いくつかの実施形態において、ＭＡＳＰ−２阻害性ペプチドは、ＭＡＳＰ−２ポリペプチドから得られ、そして、完全長成熟ＭＡＳＰ−２タンパク質（配列番号６）またはＭＡＳＰ−２タンパク質の特定のドメイン（例えば、ＣＵＢＩドメイン（配列番号８）、ＣＵＢＩＥＧＦドメイン（配列番号９）、ＥＧＦドメイン（配列番号１１）およびセリンプロテアーゼドメイン（配列番号１２））から選択される。先に記載した通りに、ＣＵＢＥＧＦＣＵＢＩＩ領域は、二量体化およびＭＢＬとの結合に必要であることが示されている（Ｔｈｉｅｌｅｎｓら、，前出）。特に、ＭＡＳＰ−２のＣＵＢＩドメインにおけるペプチド配列ＴＦＲＳＤＹＮ（配列番号１６）は、Ａｓｐ１０５がＧｌｙ１０５になったホモ接合性の変異を有する結果、ＭＢＬ複合体からＭＡＳＰ−２が喪失しているヒトを同定した研究においてＭＢＬとの結合に関与することが示されている（Ｓｔｅｎｇａａｒｄ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｋ．ら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．Ｍｅｄ．３４９：５５４−５６０，２００３）。
【０２３８】
ＭＡＳＰ−２阻害性ペプチドは、ＭＡｐ１９（配列番号３）から得てもよい。実施例３０に記載するように、ＭＡｐ１９（配列番号３）（ｓＭＡＰとも呼ばれる）は、ＭＢＬ複合体によって活性化されるレクチン経路をダウンレギュレートする能力を有する。Ｉｗａｋｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：８６２６−８６３２，２００６。理論に拘束する意図はないが、ｓＭＡＰは、ＭＢＬにおけるＭＡＳＰ−２／ｓＭＡＰ結合部位をふさぎ、ＭＡＳＰ−２がＭＢＬに結合するのを妨害することができる可能性がある。ｓＭＡＰが、フィコリンＡに会合してＭＡＳＰ−２と競合し、フィコリンＡ／ＭＡＳＰ−２複合体による補体活性化を阻害することも報告されている。Ｅｎｄｏ  Ｙ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５７：８３７−８４４（２００５）。
【０２３９】
いくつかの実施形態において、ＭＡＳＰ−２阻害性ペプチドは、ＭＡＳＰ−２に結合し、レクチン補体経路に関与するレクチンタンパク質から得られる。マンナン結合レクチン（ＭＢＬ）、Ｌ−フィコリン、Ｍ−フィコリンおよびＨ−フィコリンを含むこの経路に関与するいくつかの異なるレクチンが同定されている。（Ｉｋｅｄａ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：７４５１−７４５４，１９８７；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１４９７−２２８４，２０００；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：３５０２−３５０６，２００２）。これらのレクチンは、ホモ三量体のサブユニット（各々が、炭水化物認識ドメインを含むＮ末端にコラーゲン様繊維を有する）のオリゴマーとして血清中に存在する。これらの様々なレクチンがＭＡＳＰ−２に結合することおよびレクチン／ＭＡＳＰ−２複合体がタンパク質Ｃ４およびＣ２の切断によって補体を活性化することが示されている。Ｈ−フィコリンは、２４アミノ酸のアミノ末端領域、１１個のＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａリピートを含むコラーゲン様ドメイン、１２アミノ酸のｎｅｃｋドメインおよび２０７アミノ酸のフィブリノゲン様ドメインを有する（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：３５０２−３５０６，２００２）。Ｈ−フィコリンは、ＧｌｃＮＡｃに結合し、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓ．ｍｉｎｎｅｓｏｔａおよびＥ．ｃｏｌｉ由来のＬＰＳで被覆されたヒト赤血球を凝集させる。Ｈ−フィコリンは、ＭＡＳＰ−２およびＭＡｐ  １９と関連し、レクチン経路を活性化させることが示されている。同文献。Ｌ−フィコリン／Ｐ３５はまた、ＧｌｃＮＡｃに結合し、そして、ヒト血清中でＭＡＳＰ−２およびＭＡｐ１９と会合すると示されており、この複合体は、レクチン経路を活性化することが示されている（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：２２８１，２０００）。従って、本発明において有用なＭＡＳＰ−２阻害性ペプチドは、ＭＢＬタンパク質（配列番号２１）、Ｈ−フィコリンタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１７３４５２）、Ｍ−フィコリンタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｏ００６０２）およびＬ−フィコリンタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１５８３８）から選択される少なくとも５アミノ酸の領域を含み得る。
【０２４０】
より詳細には、科学者らは、ＭＢＬに対するＭＡＳＰ−２結合部位がＭＢＰのコラーゲン様ドメインのＣ末端部におけるヒンジと首状部分（ｎｅｃｋ）との間に存在する１２個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙトリプレット「ＧＫＤＧＲＤＧＴＫＧＥＫＧＥＰＧＱＧＬＲＧＬＱＧＰＯＧＫＬＧＰＯＧＮＯＧＰＳＧＳＯＧＰＫＧＱＫＧＤＯＧＫＳ」（配列番号２６）内に存在すると同定した（Ｗａｌｌｉｓ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１４０６５，２００４）。このＭＡＳＰ−２結合部位領域はまた、ヒトＨ−フィコリンおよびヒト  Ｌ−フィコリンにおいて高度に保存されている。アミノ酸配列「ＯＧＫ−Ｘ−ＧＰ」（配列番号２２）（ここで、文字「Ｏ」はヒドロキシプロリンを表し、文字「Ｘ」は疎水性残基である）を含む、３つすべてのレクチンタンパク質において存在するコンセンサス結合部位が報告されている（Ｗａｌｌｉｓら、２００４，前出）。従って、いくつかの実施形態において、本発明のこの態様において有用なＭＡＳＰ−２阻害性ペプチドは、少なくとも６アミノ酸長であり、配列番号２２を含む。アミノ酸配列「ＧＬＲＧＬＱＧＰＯＧＫＬＧＰＯＧ」（配列番号２４）を含むＭＢＬから得られるペプチドは、インビトロにおいてＭＡＳＰ−２に結合することが示されている（Ｗａｌｌｉｓら、２００４，前出）。ＭＡＳＰ−２への結合性を増大させるために、ネイティブＭＢＬタンパク質において見られるような三重らせんの形成を向上させる、各末端において２つのＧＰＯトリプレットに隣接するペプチド（「ＧＰＯＧＰＯＧＬＲＧＬＱＧＰＯＧＫＬＧＰＯＧＧＰＯＧＰＯ」配列番号２５）を合成することができる（Ｗａｌｌｉｓ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１４０６５，２００４にさらに記載されている）。
【０２４１】
ＭＡＳＰ−２阻害性ペプチドはまた、Ｈ−フィコリンにおけるコンセンサスＭＡＳＰ−２結合領域からの配列「ＧＡＯＧＳＯＧＥＫＧＡＯＧＰＱＧＰＯＧＰＯＧＫＭＧＰＫＧＥＯＧＤＯ」（配列番号２７）を含むヒトＨ−フィコリンから得てもよい。Ｌ−フィコリンにおけるコンセンサスＭＡＳＰ−２結合領域からの配列「ＧＣＯＧＬＯＧＡＯＧＤＫＧＥＡＧＴＮＧＫＲＧＥＲＧＰＯＧＰＯＧＫＡＧＰＯＧＰＮＧＡＯＧＥＯ」（配列番号２８）を含むヒトＬ−フィコリンから得られるペプチドもまた含まれる。
【０２４２】
ＭＡＳＰ−２阻害性ペプチドはまた、Ｃ４切断部位（例えば、アンチトロンビンＩＩＩのＣ末端部分に連結されたＣ４切断部位である「ＬＱＲＡＬＥＩＬＰＮＲＶＴＩＫＡＮＲＰＦＬＶＦＩ」（配列番号２９））（Ｇｌｏｖｅｒ，Ｇ．Ｉ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：１２６１（１９８８））から得てもよい。
【０２４３】
【表３−１】
0005567328.tif 000004
【０２４４】
【表３−２】
0005567328.tif 000005
Ｃ４切断部位ならびにＭＡＳＰ−２セリンプロテアーゼ部位を阻害する他のペプチドから得られるペプチドは、不可逆性のプロテアーゼインヒビターとなるように化学的に修飾され得る。例えば、適切な修飾としては、Ｃ末端、ＡｓｐもしくはＧｌｕにおけるまたは機能性側鎖に付加されたハロメチルケトン（Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、Ｆ）；アミノ基もしくは他の機能性側鎖上のハロアセチル（または他のα−ハロアセチル）基；アミノ末端上もしくはカルボキシ末端上または機能性側鎖上のエポキシドあるいはイミン含有基；あるいは、アミノ末端上もしくはカルボキシ末端上または機能性側鎖上のイミデートエステルが挙げられ得るが、必ずしもこれらに限定されない。そのような修飾は、そのペプチドとの共有結合によって上記酵素を持続的に阻害するという利点をもたらし得る。このことから、そのペプチドインヒビターがより少ない有効用量で済み得、そして／または、必要とされるそのペプチドインヒビターの投与頻度が低くて済み得る。
【０２４５】
上に記載された阻害性ペプチドに加えて、本発明の方法において有用なＭＡＳＰ−２阻害性ペプチドとしては、本明細書中に記載される通りに得られる抗ＭＡＳＰ−２  ＭｏＡｂの、ＭＡＳＰ−２に結合するＣＤＲ３領域を含むペプチドが挙げられる。そのペプチドを合成する際に使用するためのＣＤＲ領域の配列は、当該分野で公知の方法によって決定され得る。重鎖可変領域は、一般に１００〜１５０アミノ酸長のペプチドである。軽鎖可変領域は、一般に８０〜１３０アミノ酸長のペプチドである。重鎖および軽鎖の可変領域内のＣＤＲ配列は、当業者によって容易に配列決定され得る約３〜２５アミノ酸配列だけを含む。
【０２４６】
当業者は、上に記載されたＭＡＳＰ−２阻害性ペプチドの実質的に相同性のバリエーションもまた、ＭＡＳＰ−２阻害性活性を示すことを認識するだろう。代表的なバリエーションとしては、対象ペプチドのカルボキシ末端部上またはアミノ末端部上においてアミノ酸の挿入、欠失、置換および／または付加を有するペプチドならびにそれらの混合物が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。従って、ＭＡＳＰ−２阻害性活性を有するそれらの相同性ペプチドは、本発明の方法において有用であると考えられる。記載されたペプチドはまた、二重のモチーフおよび保存的に置換された他の修飾を含み得る。保存的改変体は、本明細書中の別の部分に記載されており、その保存的改変体としては、電荷、大きさまたは疎水性などが類似した別のアミノ酸で交換したものが挙げられる。
【０２４７】
ＭＡＳＰ−２阻害性ペプチドは、インタクトなタンパク質におけるセグメントにより近く似せるために、溶解性を増大させ、そして／または正電荷もしくは負電荷を最大にするように修飾され得る。その派生物が、ＭＡＳＰ−２阻害の所望の特性を機能的に保持する限り、その派生物は、本明細書中に開示されるペプチドの正確な１次アミノ酸構造を有していてもよいし、有していなくてもよい。上記修飾としては、通常知られている２０個のアミノ酸のうちの１つもしくは別のアミノ酸によるアミノ酸置換、補助的な望ましい特徴（例えば、酵素的分解に対する抵抗性）を有する誘導体化アミノ酸もしくは置換アミノ酸によるアミノ酸置換またはＤ−アミノ酸によるアミノ酸置換、あるいは、上記アミノ酸（単数または複数）またはペプチドの天然の確証および機能に類似している別の分子または化合物（例えば、炭水化物）による置換；アミノ酸欠失；通常知られている２０個のアミノ酸のうちの１つもしくは別のアミノ酸によるアミノ酸挿入、補助的な望ましい特徴（例えば、酵素的分解に対する抵抗性）を有する誘導体化アミノ酸もしくは置換アミノ酸によるアミノ酸挿入またはＤ−アミノ酸によるアミノ酸挿入、あるいは、上記アミノ酸（単数または複数）またはペプチドの天然の確証および機能に類似している別の分子または化合物（例えば、炭水化物）による置換；あるいは親ペプチドの天然の立体配座、電荷分布および機能に類似している別の分子または化合物（例えば、炭水化物または核酸モノマー）による置換が挙げられ得る。ペプチドはまた、アセチル化またはアミド化によって修飾されてもよい。
【０２４８】
派生的な阻害性ペプチドの合成は、ペプチド生合成、炭水化物生合成などの公知の手法に頼り得る。出発点として、当業者は、目的のペプチドの立体配座を決定するために適当なコンピュータプログラムに頼り得る。一旦、本明細書中に開示されるペプチドの立体配座がわかると、次に、当業者は、親ペプチドの基本的な立体配座および電荷分布を保持するが、親ペプチドに存在しないか、または親ペプチドに見られる特徴よりも向上した特徴を有し得る派生物を形成するために、１つ以上の部位においてどのような置換を行うことができるかを合理的設計様式で決定することができる。一旦、派生的分子の候補が同定されると、その派生物は、本明細書中に記載されるアッセイを用いてＭＡＳＰ−２阻害薬剤として機能するか否かを判定するために試験され得る。
【０２４９】
ＭＡＳＰ−２阻害性ペプチドに対するスクリーニング
ＭＡＳＰ−２の重要な結合領域の分子構造を模倣していて、ＭＡＳＰ−２の補体活性を阻害するペプチドを作製およびスクリーニングするために、分子モデリングおよび合理的な分子設計を使用してもよい。モデリングに使用される分子構造としては、抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル抗体のＣＤＲ領域、ならびに、二量体化に必要な領域、ＭＢＬとの結合に関与する領域および先に記載したようなセリンプロテアーゼ活性部位を含むＭＡＳＰ−２機能にとって重要であると知られている標的領域が挙げられる。特定の標的に結合するペプチドを同定するための方法は、当該分野で周知である。例えば、分子インプリンティングが、高分子構造（例えば、特定の分子に結合するペプチド）のデノボ構築に使用され得る。例えば、Ｓｈｅａ，Ｋ．Ｊ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ：Ｔｈｅ  Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｓｔｉｅｓ」ＴＲＩＰ  ２：（５）１９９４を参照のこと。
【０２５０】
代表例として、ＭＡＳＰ−２結合ペプチドの模倣物を調製する１つの方法は、以下のとおりである。ＭＡＳＰ−２阻害を示す、公知のＭＡＳＰ−２結合ペプチドの機能的モノマーまたは抗ＭＡＳＰ−２抗体の結合領域（鋳型）を重合させる。次いで、鋳型を除去した後、その鋳型によって残された空隙において第２のクラスのモノマーを重合させることにより、鋳型と類似の１つ以上の所望の特性を示す新しい分子がもたらされる。この様式でのペプチドの調製に加えて、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤である他のＭＡＳＰ−２結合分子（例えば、多糖類、ヌクレオシド、薬物、核タンパク質、リポタンパク質、炭水化物、糖タンパク質、ステロイド、脂質および他の生物学的に活性な材料）もまた調製され得る。天然の対応物よりも安定な多岐にわたる生物学的模倣物が、代表的には、機能モノマーのフリーラジカル重合によって調製され、非生物分解性骨格を有する化合物がもたらされるので、この方法は、それらを設計するために有用である。
【０２５１】
ペプチド合成
ＭＡＳＰ−２阻害性ペプチドは、当該分野で周知の手法（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４，１９６３によって初めて報告された固相合成法）を使用して調製され得る。自動化された合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）を製造業者が提供する指示書に従って使用することによって達成され得る。他の手法は、例えば、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．ら、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９７６ならびに当業者に公知の他の参考資料に見られ得る。
【０２５２】
上記ペプチドは、当業者に公知の標準的な遺伝子操作手法を使用して調製することもできる。例えば、上記ペプチドは、そのペプチドをコードする核酸を発現ベクターに挿入して、そのＤＮＡを発現させ、そして、必要なアミノ酸の存在下でそのＤＮＡをペプチドに翻訳させることによって酵素的に生成され得る。次いで、そのペプチドは、クロマトグラフィ的手法もしくは電気泳動的手法を使用するか、または、キャリアタンパク質をコードする核酸配列をペプチドコード配列とともに一致して発現ベクターに挿入することによって、そのペプチドに融合され得、後にそのペプチドから切断され得るキャリアタンパク質を用いて、精製される。融合タンパク質−ペプチドは、クロマトグラフィ的手法、電気泳動的手法または免疫学的手法（例えば、キャリアタンパク質に対する抗体を介して樹脂に結合すること）を使用して単離され得る。そのペプチドは、化学的方法を使用するか、または酵素的に、例えば、加水分解酵素によって、切断され得る。
【０２５３】
本発明の方法において有用なＭＡＳＰ−２阻害性ペプチドはまた、従来の手法に従って組換え宿主細胞において産生され得る。ＭＡＳＰ−２阻害性ペプチドのコード配列を発現させるためには、そのペプチドをコードする核酸分子を、発現ベクターにおいて転写性の発現を制御する制御配列に作動可能に連結しなければならないし、次いで、宿主細胞に導入しなければならない。転写制御性の配列（例えば、プロモーターおよびエンハンサー）に加えて、発現ベクターは、発現ベクターを有する細胞のセレクションに適した翻訳の制御配列およびマーカー遺伝子を含み得る。
【０２５４】
ＭＡＳＰ−２阻害性ペプチドをコードする核酸分子は、プロトコル（例えば、ホスホルアミダイト法）を使用して「遺伝子機械（ｇｅｎｅ  ｍａｃｈｉｎｅ）」を用いて合成され得る。化学的に合成された二本鎖ＤＮＡが、ある適用（例えば、遺伝子または遺伝子フラグメントの合成）に必要とされる場合、各相補鎖は、別々に作製される。短い遺伝子（６０〜８０塩基対）の作製は、技術的に容易であり、相補鎖を合成し、次いで、それらをアニーリングすることによって達成され得る。それよりも長い遺伝子の作製については、合成遺伝子（二本鎖）を、２０〜１００ヌクレオチド長である一本鎖フラグメントからモジュール形式で組み立てる。ポリヌクレオチド合成に関する概説については、例えば、Ｇｌｉｃｋ  ａｎｄ  Ｐａｓｔｅｒｎａｋ，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４；Ｉｔａｋｕｒａ，Ｋ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３，１９８４；およびＣｌｉｍｉｅ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６３３，１９９０を参照のこと。
【０２５５】
低分子インヒビター
いくつかの実施形態において、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、低分子量を有する天然物質および合成物質（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物および非ペプチドインヒビター（オリゴヌクレオチドおよび有機化合物を含む））を含む低分子インヒビターである。ＭＡＳＰ−２の低分子インヒビターは、抗ＭＡＳＰ−２抗体の可変領域の分子構造に基づいて作製され得る。
【０２５６】
低分子インヒビターはまた、コンピュータによるドラッグデザインを用いてＭＡＳＰ−２結晶構造に基づいて設計および作製され得る（Ｋｕｎｔｚ  Ｉ．Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１０７８，１９９２）。ラットＭＡＳＰ−２の結晶構造が報告されている（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，Ｈ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２２：２３４８−２３５９，２００３）。Ｋｕｎｔｚらによって報告されている方法を使用して、ＭＡＳＰ−２結晶構造座標を、ＭＡＳＰ−２に結合すると予想される低分子構造のリストを出力するコンピュータプログラム（例えば、ＤＯＣＫ）に対する入力として使用する。そのようなコンピュータプログラムの使用は、当業者に周知である。例えば、ＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビターの結晶構造を使用することにより、プログラムＤＯＣＫを使用して、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃデータベース中に見られる化合物とその酵素の結合部位との適合を評価することによってＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビターである、特有の非ペプチドリガンドが同定された（Ｋｕｎｔｚ，Ｉ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６１：２６９−２８８，１９８２；ＤｅｓＪａｒｌａｉｓ，Ｒ．Ｌ．ら、ＰＮＡＳ  ８７：６６４４−６６４８，１９９０）。
【０２５７】
コンピュータによる方法によって潜在的なＭＡＳＰ−２インヒビターと同定される低分子構造のリストを、実施例７に記載されるようなＭＡＳＰ−２結合アッセイを使用してスクリーニングする。次いで、ＭＡＳＰ−２に結合すると見出された低分子が、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するか否かを判定するために、実施例２に記載されるような機能的なアッセイにおいて上記低分子をアッセイされる。
【０２５８】
ＭＡＳＰ−２可溶性レセプター
他の適当なＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、当業者に公知の手法を使用して作製され得るＭＡＳＰ−２可溶性レセプターを含むと考えられる。
【０２５９】
ＭＡＳＰ−２の発現インヒビター
本発明のこの態様の別の実施形態において、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害することができるＭＡＳＰ−２発現インヒビターである。本発明のこの態様の実施において、代表的なＭＡＳＰ−２発現インヒビターとしては、ＭＡＳＰ−２アンチセンス核酸分子（例えば、アンチセンスｍＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド）、ＭＡＳＰ−２リボザイムおよびＭＡＳＰ−２  ＲＮＡｉ分子が挙げられる。
【０２６０】
アンチセンスＲＮＡ分子およびアンチセンスＤＮＡ分子は、ＭＡＳＰ−２  ｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてＭＡＳＰ−２タンパク質の翻訳を妨害することによって、ＭＡＳＰ−２  ｍＲＮＡの翻訳を直接遮断するように作用する。アンチセンス核酸分子は、ＭＡＳＰ−２の発現を干渉することができるならば、様々な多くの方法において構築してもよい。例えば、アンチセンス核酸分子は、ＭＡＳＰ−２  ｃＤＮＡのコード領域（またはその一部）（配列番号４）の相補体の転写を可能にするために、正常な転写方向に対して、それを反転することによって構築され得る。
【０２６１】
そのアンチセンス核酸分子は、通常、標的遺伝子（単数または複数）の少なくとも一部と実質的に同一である。しかしながら、その核酸は、発現を阻害するために完全に同一である必要はない。一般に、相同性が高いことを用いて、より短いアンチセンス核酸分子の使用を補償することができる。最小の同一性パーセントは、代表的には、約６５％を超えるが、より高い同一性パーセントによって、内在性配列の発現の一層有効な抑制が発揮され得る。約８０％を超える実質的に高い同一性パーセントが代表的には好ましいが、約９５％から完全に同一であることが、代表的には最も好ましい。
【０２６２】
上記のアンチセンス核酸分子は、標的遺伝子と同じイントロンまたはエキソンのパターンを有する必要はなく、標的遺伝子の非コーディングセグメントは、標的遺伝子発現のアンチセンス抑制を達成する際に、コーディングセグメントと同等に有効であり得る。少なくとも約８またはそれくらいのヌクレオチドのＤＮＡ配列は、アンチセンス核酸分子として使用され得るが、もっと長い配列が好ましい。本発明において、ＭＡＳＰ−２の有用な阻害薬剤の代表例は、配列番号４に示される核酸配列からなるＭＡＳＰ−２  ｃＤＮＡの相補体に少なくとも９０パーセント同一であるアンチセンスＭＡＳＰ−２核酸分子である。配列番号４に示される核酸配列は、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＭＡＳＰ−２タンパク質をコードする。
【０２６３】
ＭＡＳＰ−２  ｍＲＮＡに結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的化は、ＭＡＳＰ−２タンパク質合成のレベルを低下させるために使用され得る別の機構である。例えば、ポリガラクツロナーゼおよびムスカリン２型アセチルコリンレセプターの合成は、それらの各々のｍＲＮＡ配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害される（Ｃｈｅｎｇに対する米国特許第５，７３９，１１９号およびＳｈｅｗｍａｋｅｒに対するに対する米国特許第５，７５９，８２９号）。さらに、アンチセンス阻害の例は、核タンパク質サイクリン、多剤耐性遺伝子（ＭＤＧ１）、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、ＳＴＫ−１、線条体ＧＡＢＡＡレセプターおよびヒトＥＧＦを用いて証明されている（例えば、Ｂａｒａｃｃｈｉｎｉに対する米国特許第５，８０１，１５４号；Ｂａｋｅｒに対する米国特許第５，７８９，５７３号；Ｃｏｎｓｉｄｉｎｅに対する米国特許第５，７１８，７０９号；およびＲｅｕｂｅｎｓｔｅｉｎに対する米国特許第５，６１０，２８８号を参照のこと）。
【０２６４】
どのオリゴヌクレオチドが本発明において有用であるかを当業者が判定することを可能にする系が報告されており、その系は、転写物内の配列の到達性についての指標としてＲｎａｓｅ  Ｈ切断を用いた標的ｍＲＮＡにおける適当な部位についての探索を含む。Ｓｃｈｅｒｒ，Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：５０７９−５０８５，１９９８；Ｌｌｏｙｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：３６６５−３６７３，２００１。ＲＮＡｓｅＨに対して脆弱な部位を作製するために、ＭＡＳＰ−２転写物のある特定の領域に相補性であるアンチセンスオリゴヌクレオチドの混合物を、ＭＡＳＰ−２を発現する細胞（例えば、肝細胞）抽出物に加え、ハイブリダイズさせる。この方法は、宿主細胞における標的ｍＲＮＡに対する特異的な結合を低減し得るか、または妨げ得る、二量体、ヘアピンまたは他の二次構造を形成する相対的な能力に基づいて、アンチセンス組成物に対する最適な配列選択を予測することができるコンピュータ支援配列選択と併用され得る。これらの二次構造解析および標的部位選択についての検討は、ＯＬＩＧＯプライマー解析ソフトウェア（Ｒｙｃｈｌｉｋ，Ｉ．，１９９７）およびＢＬＡＳＴＮ２．０．５アルゴリズムソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）を用いて行われ得る。標的配列に対するアンチセンス化合物は、好ましくは、約８〜約５０ヌクレオチド長を含む。約９〜約３５またはそれくらいのヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが特に好ましい。本発明者らは、９〜３５ヌクレオチドの範囲のすべてのオリゴヌクレオチド組成物（すなわち、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４もしくは３５またはそれくらいの塩基長のオリゴヌクレオチド組成物）が、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドベースの方法を実施するために非常に好ましいことを企図している。ＭＡＳＰ−２  ｍＲＮＡの非常に好ましい標的領域は、ＡＵＧ翻訳開始コドンにおける領域またはその付近における領域であり、そのｍＲＮＡの５’領域に実質的に相補的な配列（例えば、ＭＡＳＰ−２遺伝子ヌクレオチド配列（配列番号４）の−１０と＋１０領域の間）である。代表的なＭＡＳＰ−２発現インヒビターを表４に示す。
【０２６５】
【表４】
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上で述べたように、用語「オリゴヌクレオチド」とは、本明細書中で使用されるとき、リボ核酸（ＲＮＡ）もしくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはそれらの模倣物のオリゴマーまたはポリマーのことをいう。この用語は、天然に存在するヌクレオチド、糖および共有結合性のヌクレオシド間（ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）（骨格）結合ならびに天然に存在しない修飾を有するオリゴヌクレオチドから構成されるオリゴ核酸塩基も網羅する。これらの修飾によって、天然に存在するオリゴヌクレオチドによってはもたらされないある特定の望ましい特性（例えば、毒性特性の低下、ヌクレアーゼ分解に対する安定性の増大および細胞の取り込みの向上）を導入することができる。例示的な実施形態において、本発明のアンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの寿命を延長するホスホジエステル骨格の修飾（リン酸置換基が、ホスホロチオエートで置換されている）によってネイティブＤＮＡと異なる。同様に、オリゴヌクレオチドの一方または両方の末端を、１本の核酸内で隣接する塩基対間に入り込む１つ以上のアクリジン誘導体で置換してもよい。
【０２６６】
アンチセンスとは別の選択肢は、「ＲＮＡ干渉」（ＲＮＡｉ）の使用である。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、哺乳動物のインビボにおいて遺伝子サイレンシングを誘発し得る。ＲＮＡｉおよびコサプレッションの天然の機能は、可動性遺伝因子（ｍｏｂｉｌｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｌｅｍｅｎｔ）（例えば、レトロトランスポゾン）および活性になるとき宿主細胞において異所性のＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを生成するウイルスによる侵入に対するゲノムの保護であるとみられる（例えば、Ｊｅｎｓｅｎ，Ｊ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１：２０９−１２，１９９９を参照のこと）。この二本鎖ＲＮＡ分子は、二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができる２本のＲＮＡ鎖（各々が約１９〜２５（例えば、１９〜２３ヌクレオチド）の長さを有する）を合成することによって調製され得る。例えば、本発明の方法において有用なｄｓＲＮＡ分子は、表４に列挙される配列およびその相補体に対応するＲＮＡを含み得る。好ましくは、ＲＮＡの少なくとも１本の鎖が、１〜５ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する。合成されたＲＮＡ鎖は、二本鎖分子を形成する条件下で組み合わされる。そのＲＮＡ配列は、配列番号４の少なくとも８ヌクレオチドの部分を含み、全体で２５ヌクレオチド以下の長さを有し得る。所与の標的に対するｓｉＲＮＡ配列の設計は、当業者の範囲内である。ｓｉＲＮＡ配列を設計し、少なくとも７０％の発現ノックダウンを保証する商業的サービス（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ）が利用可能である。
【０２６７】
ｄｓＲＮＡは、薬学的組成物として投与され得、それは公知の方法によって行われ得るが、ここで、核酸は、所望の標的細胞に導入される。通常使用される遺伝子導入法としては、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションおよびウイルスを用いた方法が挙げられる。そのような方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９３において教示されている。
【０２６８】
リボザイムもまた、ＭＡＳＰ−２の量および／または生物学的活性を低下させるために利用され得る（例えば、ＭＡＳＰ−２  ｍＲＮＡを標的化するリボザイム）。リボザイムは、そのリボザイムの配列に完全にまたは部分的に相同である配列を有する核酸分子を切断することができる触媒性のＲＮＡ分子である。標的ＲＮＡと特異的に対をなし、そして特異的な位置でホスホジエステル骨格を切断することによって、標的ＲＮＡを機能的に不活性化するＲＮＡリボザイムをコードするリボザイム導入遺伝子を設計することが可能である。この切断を行うとき、そのリボザイムは、それ自体は変化しないので、再利用することができ、また、他の分子を切断することができる。アンチセンスＲＮＡ内にリボザイム配列を含めることにより、そのアンチセンスＲＮＡに対してＲＮＡ切断活性が付与され、それによって、アンチセンス構築物の活性が増加する。
【０２６９】
本発明の実施において有用なリボザイムは、代表的には、少なくとも約９ヌクレオチドのハイブリダイズ領域（ヌクレオチド配列において標的ＭＡＳＰ−２  ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的な領域）および標的ＭＡＳＰ−２  ｍＲＮＡを切断するように適応されている触媒性領域を含む（一般に、ＥＰＡ  Ｎｏ．０３２１２０１；ＷＯ８８／０４３００；Ｈａｓｅｌｏｆｆ，Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１，１９８８；Ｆｅｄｏｒ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１６６８−１６７２，１９９０；Ｃｅｃｈ，Ｔ．Ｒ．ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：５９９−６２９，１９８６を参照のこと）。
【０２７０】
リボザイムは、リボザイム配列を組み込んだＲＮＡオリゴヌクレオチドの形態で細胞に対して直接標的化され得るか、または所望のリボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍａｌ）ＲＮＡをコードする発現ベクターとして細胞に導入され得る。リボザイムは、アンチセンスポリヌクレオチドについて説明した方法とほぼ同じ方法で使用および適用され得る。
【０２７１】
本発明の方法において有用なアンチセンスＲＮＡおよびアンチセンスＤＮＡ、リボザイムおよびＲＮＡｉ分子は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を合成するための当該分野で公知の任意の方法によって調製され得る。これらとしては、当該分野で周知のオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成するための手法（例えば、固相ホスホルアミダイト化学合成）が挙げられる。あるいは、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボにおける転写によってＲＮＡ分子が生成され得る。そのようなＤＮＡ配列は、適当なＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーター）を組み込んだ多岐にわたるベクターに組み込まれ得る。あるいは、使用するプロモーターに応じて、アンチセンスＲＮＡを構成的または誘導的に合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物を細胞株に安定的に導入し得る。
【０２７２】
ＤＮＡ分子の様々な周知の修飾が、安定性および半減期を増大させる手段として導入され得る。有用な修飾としては、その分子の５’末端および／もしくは３’末端へのリボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列の付加、または、オリゴデオキシリボヌクレオチド骨格内のホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートもしくは２’Ｏ−メチルの使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７３】
Ｖ．薬学的組成物および送達方法
投薬
別の態様において、本発明は、治療有効量のＭＡＳＰ−２阻害薬剤および薬学的に許容可能なキャリアを含む、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化の有害作用を阻害するための組成物を提供する。そのＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化に関連する状態を処置または寛解させるために、治療的に有効な用量で、そのような必要がある被験体に投与され得る。治療的に有効な用量とは、その状態の症状の回復がもたらされるのに十分なＭＡＳＰ−２阻害薬剤の量のことをいう。
【０２７４】
ＭＡＳＰ−２阻害薬剤の毒性および治療的な有効性は、実験動物モデル（例えば、実施例３に記載されるヒトＭＡＳＰ−２トランスジーンを発現するマウスＭＡＳＰ−２−／−マウスモデル）を使用して、標準的な薬学的手順によって測定され得る。そのような動物モデルを使用し、標準的な方法を用いて、ＮＯＡＥＬ（無毒性量）およびＭＥＤ（最小有効用量）が測定され得る。ＮＯＡＥＬ効果とＭＥＤ効果との用量比は、比ＮＯＡＥＬ／ＭＥＤとして表される治癒比である。大きな治癒比または指標を示すＭＡＳＰ−２阻害薬剤が、最も好ましい。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータは、ヒトにおいて使用するための一連の投与量を製剤化する際に使用することができる。ＭＡＳＰ−２阻害薬剤の投与量は、好ましくは、少し毒性があるかまたは毒性がないＭＥＤを含む一連の循環濃度内に設定する。その投与量は、使用する剤形および利用する投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。
【０２７５】
任意の化合物の製剤化のために、動物モデルを使用して、治療的に有効な用量を推定することができる。例えば、用量は、ＭＥＤを含む循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて製剤化され得る。ＭＡＳＰ−２阻害薬剤の血漿中の量的レベルを、例えば、高速液体クロマトグラフィによって測定してもよい。
【０２７６】
毒性研究に加えて、有効な投与量もまた、生存被験体中に存在するＭＡＳＰ−２タンパク質の量およびＭＡＳＰ−２阻害薬剤の結合親和性に基づいて推定され得る。正常なヒト被験体におけるＭＡＳＰ−２レベルが、５００ｎｇ／ｍｌの範囲の低レベルで血清中に存在すること、および、特定の被験体におけるＭＡＳＰ−２レベルが、Ｍｏｌｌｅｒ−Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８２：１５９−１６７，２００３に記載されているＭＡＳＰ−２に対する定量的アッセイを用いて測定され得ることが示されている。
【０２７７】
一般に、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤を含む投与組成物の投与量は、被験体の年齢、体重、身長、性別、全般的な病状およびそれまでの病歴などの因子に応じて変動する。実例として、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤（例えば、抗ＭＡＳＰ−２抗体）は、約０．０１０〜１０．０ｍｇ／ｋｇ被験体体重、好ましくは０．０１０〜１．０ｍｇ／ｋｇ被験体体重、より好ましくは０．０１０〜０．１ｍｇ／ｋｇ被験体体重の範囲の投与量で投与され得る。いくつかの実施形態において、組成物は、抗ＭＡＳＰ−２抗体およびＭＡＳＰ−２阻害性ペプチドとの併用物を含む。
【０２７８】
所与の被験体における本発明のＭＡＳＰ−２阻害性組成物およびＭＡＳＰ−２阻害性方法の治療的な有効性ならびに適切な投与量は、当業者に周知の補体アッセイに従って決定され得る。補体は、数多くの特異的な産物を生成する。最近１０年間で、感度が高く、かつ特異的なアッセイが開発され、また、小さな活性化フラグメントＣ３ａ、Ｃ４ａおよびＣ５ａならびに大きな活性化フラグメントｉＣ３ｂ、Ｃ４ｄ、ＢｂおよびｓＣ５ｂ−９を含む、これらの活性化産物のほとんどに対して市販されている。これらのアッセイのほとんどは、新しい抗原（新抗原）を形成するネイティブタンパク質上には露出していないが上記フラグメント上に露出しているその新抗原と反応するモノクローナル抗体を利用するものであり、それにより、これらのアッセイが非常に単純かつ特異的になる。これらのほとんどが、ＥＬＩＳＡ技術に依存しているが、なおも時折Ｃ３ａおよびＣ５ａに対してラジオイムノアッセイが使用される。これらの後者のアッセイは、プロセシングされていないフラグメントと循環中に見られる主要な形態であるそれらの「ｄｅｓＡｒｇ」フラグメントの両方を測定する。プロセシングされていないフラグメントおよびＣ５ａｄｅｓＡｒｇは、細胞表面レセプターに結合することによって迅速に浄化され、それゆえ非常に低濃度で存在するのに対し、Ｃ３ａｄｅｓＡｒｇは、細胞に結合せず、血漿中に蓄積する。Ｃ３ａの測定は、感度が高く経路に依存しない、補体活性化の指標をもたらす。副経路の活性化は、Ｂｂフラグメントを測定することによって評価され得る。膜攻撃経路の活性化の流体相産物ｓＣ５ｂ−９の検出は、補体活性化が完了している証拠をもたらす。レクチン経路および古典経路の両方が、Ｃ４ａおよびＣ４ｄという同じ活性化産物を生成するので、これらの２つのフラグメントを測定しても、これらの２つの経路のうちのどちらがその活性化産物を生成したのかについて何の情報ももたらさない。
【０２７９】
さらなる薬剤
ＭＡＳＰ−２阻害薬剤を含む組成物および方法は、必要に応じて、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤の活性を増強し得るか、または付加的または相乗的な様式で関連する治療的機能をもたらす１つ以上のさらなる治療薬を含み得る。例えば、１つ以上のＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、１つ以上の抗炎症薬および／または鎮痛剤と併用して投与され得る。さらなる薬剤を含めることおよび選択することは、所望の治療的な結果を達成するように決定される。適当な抗炎症薬および／または鎮痛剤としては：セロトニンレセプターアンタゴニスト；セロトニンレセプターアゴニスト；ヒスタミンレセプターアンタゴニスト；ブラジキニンレセプターアンタゴニスト；カリクレインインヒビター；ニューロキニン１およびニューロキニン２レセプターサブタイプアンタゴニストを含むタキキニンレセプターアンタゴニスト；カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）レセプターアンタゴニスト；インターロイキンレセプターアンタゴニスト；ＰＬＡ２アイソフォームインヒビターおよびＰＬＣγアイソフォームインヒビターを含むホスホリパーゼインヒビター、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）インヒビター（ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２または非選択的なＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２インヒビターのいずれかであり得る）、リポキシゲナーゼ（ｌｉｐｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）インヒビターを含むアラキドン酸代謝産物に対する合成経路において活性な酵素のインヒビター；エイコサノイドＥＰ−１レセプターサブタイプアンタゴニストおよびエイコサノイドＥＰ−４レセプターサブタイプアンタゴニストならびにトロンボキサンレセプターサブタイプアンタゴニストを含むプロスタノイドレセプターアンタゴニスト；ロイコトリエンＢ４レセプターサブタイプアンタゴニストおよびロイコトリエンＤ４レセプターサブタイプアンタゴニストを含むロイコトリエンレセプターアンタゴニスト；μ−オピオイド、δ−オピオイドおよびκ−オピオイドレセプターサブタイプアゴニストを含むオピオイドレセプターアゴニスト；Ｐ２ＸレセプターアンタゴニストおよびＰ２Ｙレセプターアゴニストを含むプリン受容体アゴニストならびにプリン受容体アンタゴニスト；アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）感受性カリウムチャネルオープナー；ＭＡＰキナーゼインヒビター；ニコチン性アセチルコリンインヒビター；ならびに、アルファアドレナリン作動性レセプターアゴニスト（アルファ−１、アルファ−２ならびに非選択的なアルファ−１アゴニストおよび非選択的なアルファ−２アゴニストを含む）が挙げられる。
【０２８０】
再狭窄の予防または処置において使用されるとき、本発明のＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、同時投与のために１つ以上の抗再狭窄剤と併用され得る。適当な抗再狭窄剤としては：トロンビンインヒビターおよびトロンビンレセプターアンタゴニスト、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）レセプターアンタゴニスト（プリン受容体１レセプターアンタゴニストとしても知られる）、トロンボキサンインヒビターおよびトロンボキサンレセプターアンタゴニストおよび血小板膜糖タンパク質レセプターアンタゴニストを含む抗血小板薬；セレクチンインヒビターおよびインテグリンインヒビターを含む、細胞接着分子のインヒビター；抗走化性剤；インターロイキンレセプターアンタゴニスト；ならびに、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）インヒビターおよびタンパク質チロシンホスファターゼ、細胞内のタンパク質チロシンキナーゼインヒビターの調節因子、ｓｒｃホモロジー２（ＳＨ２）ドメインのインヒビターおよびカルシウムチャネルアンタゴニストを含む細胞内シグナル伝達インヒビターが挙げられる。
【０２８１】
本発明のＭＡＳＰ−２阻害薬剤はまた、１つ以上の他の補体インヒビターと併用して投与され得る。現在、補体インヒビターは、ヒトにおける使用は承認されていないが、いくつかの薬理学的物質が、インビボにおいて補体を遮断することが示されている。これらの薬剤の多くは、有毒であるか、または部分的なインヒビターであるだけで（Ａｓｇｈａｒ，Ｓ．Ｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．３６：２２３−４４，１９８４）、これらを研究ツールとして使用するための用途は、限られている。Ｋ７６ＣＯＯＨおよびメシル酸ナファモスタット（ｎａｆａｍｓｔａｔ  ｍｅｓｉｌａｔｅ）は、移植の動物モデルにおいていくらかの有効性を示す２つの薬剤である（Ｍｉｙａｇａｗａ，Ｓ．ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．２４：４８３−４８４，１９９２）。低分子量ヘパリンもまた、補体活性の制御に有効であることが示されている（Ｅｄｅｎｓ，Ｒ．Ｅ．ら、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｔｏｄａｙ，ｐｐ．９６−１２０，Ｂａｓｅｌ：Ｋａｒｇｅｒ，１９９３）。これらの低分子インヒビターは、本発明のＭＡＳＰ−２阻害薬剤と併用して使用する薬剤として有用であり得ると考えられている。
【０２８２】
他の天然に存在する補体インヒビターは、本発明のＭＡＳＰ−２阻害薬剤と併用して有用であり得る。補体の生物学的インヒビターとしては、可溶性補体因子１（ｓＣＲ１）が挙げられる。これは、ヒト細胞の外膜上に見ることができる、天然に存在するインヒビターである。他の膜インヒビターとしては、ＤＡＦ、ＭＣＰおよびＣＤ５９が挙げられる。インビトロおよびインビボにおいて、組換え型を抗補体活性について試験した。ｓＣＲ１は、異種移植（ｘｅｎｏｔｒａｎｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）において有効であることが示されており、ここで、補体系（副経路および古典経路の両方）は、新しく移植された臓器を通る血液灌流の数分以内に機能亢進性拒絶症候群に対する誘発をもたらす（Ｐｌａｔｔ  Ｊ．Ｌ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １１：４５０−６，１９９０；Ｍａｒｉｎｏ  Ｉ．Ｒ．ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．１０７１：６，１９９０；Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ，Ｐ．Ｓ．ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５４：５７３−６，１９９２）。ｓＣＲ１を使用することによって、移植された臓器が保護され、その生存時間が延長することから、補体経路は、臓器生存の病原と関係づけられる（Ｌｅｖｅｎｔｈａｌ，Ｊ．Ｒ．ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５５：８５７−６６，１９９３；Ｐｒｕｉｔｔ，Ｓ．Ｋ．ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５７：３６３−７０，１９９４）。
【０２８３】
本発明の組成物と併用して使用するのに適したさらなる補体インヒビターとしては、例としては、ＭｏＡｂ（例えば、Ａｌｅｘｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔによって開発されたもの）および抗プロパージンＭｏＡｂも挙げられる。
【０２８４】
本発明のＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、関節炎（例えば、変形性関節症および関節リウマチ）の処置において使用されるとき、１つ以上の軟骨保護剤（軟骨同化の１つ以上の促進剤および／または軟骨異化の１つ以上のインヒビターならびに同時投与に適した同化剤と異化阻害薬剤の両方が挙げられ得る）と併用され得る。適当な同化促進軟骨保護剤としては、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ｒｈＩＬ−４、ｒｈＩＬ−１０およびｒｈＩＬ−１３ならびにキメラＩＬ−４、ＩＬ−１０またはＩＬ−１３を含むインターロイキン（ＩＬ）レセプターアゴニスト；ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３を含むトランスフォーミング成長因子−βスーパーファミリーアゴニスト、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）およびＯＰ−２／ＢＭＰ−８を含む骨形態形成タンパク質、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６およびＧＤＦ−７を含む成長分化因子、組換えＴＧＦ−βおよびＢＭＰならびにキメラＴＧＦ−βおよびＢＭＰ；ＩＧＦ−Ｉを含むインスリン様成長因子；およびｂＦＧＦを含む線維芽細胞成長因子が挙げられる。適当な異化阻害性軟骨保護剤としては、可溶性ヒトＩＬ−１レセプター（ｓｈｕＩＬ−１Ｒ）、ｒｓｈｕＩＬ−１Ｒ、ｒｈＩＬ−１ｒａ、抗ＩＬ１−抗体、ＡＦ１１５６７およびＡＦ１２１９８を含むインターロイキン−１（ＩＬ−１）レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）；ｓＴＮＦＲ１およびｓＴＮＦＲＩＩ、組換えＴＮＦ可溶性レセプターを含む可溶性レセプターならびにキメラｒｈＴＮＦＲを含むキメラＴＮＦ可溶性レセプターを含む腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプターアンタゴニスト（ＴＮＦ−α）：Ｆｃ、Ｆｃ融合可溶性レセプターおよび抗ＴＮＦ抗体；ＤｕＰ６９７、ＳＣ−５８４５１、セレコキシブ、ロフェコキシブ、ニメスリド、ジクロフェナク、メロキシカム、ピロキシカム、ＮＳ−３９８、ＲＳ−５７０６７、ＳＣ−５７６６６、ＳＣ−５８１２５、フロスリド（ｆｌｏｓｕｌｉｄｅ）、エトドラク、Ｌ−７４５，３３７およびＤＦＵ−Ｔ−６１４を含むシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２特異的）インヒビター；ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＳＡＰＫ１、ＳＡＰＫ２ａ、ＳＡＰＫ２ｂ、ＳＡＰＫ２ｄ、ＳＡＰＫ３のインヒビターを含み、ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２０３５８０ｉｏｄｏ、ＳＢ２０２１９０、ＳＢ２４２２３５、ＳＢ２２００２５、ＲＷＪ６７６５７、ＲＷＪ６８３５４、ＦＲ１３３６０５、Ｌ−１６７３０７、ＰＤ９８０５９、ＰＤ１６９３１６を含む、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）インヒビター；コーヒー酸フェニルエチルエステル（ＣＡＰＥ）、ＤＭ−ＣＡＰＥ、ＳＮ−５０ペプチド、ヒメニアルジシン（ｈｙｍｅｎｉａｌｄｉｓｉｎｅ）およびピロリドンジチオカルバメートを含む核因子κＢ（ＮＦκＢ）のインヒビター；ＮＧ−モノメチル−Ｌ−アルギニン、１４００Ｗ、ジフェニレンヨージウム、Ｓ−メチルイソチオ尿素、Ｓ−（アミノエチル）イソチオ尿素、Ｌ−Ｎ６−（１−イミノエチル）リシン、１，３−ＰＢＩＴＵ、２−エチル−２−チオプソイド尿素、アミノグアニジン、Ｎω−ニトロ−Ｌ−アルギニンおよびＮω−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステルを含む一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）インヒビター、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４およびＭＭＰ−１５のインヒビターを含むマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）のインヒビターならびにＵ−２４５２２、ミノサイクリン、４−Ａｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨＯＨ、Ａｃ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−ＮＨ２、ｒｈｕｍａｎ  ＴＩＭＰ１、ｒｈｕｍａｎ  ＴＩＭＰ２およびホスホラミドン；αＶβ３  ＭｏＡｂ  ＬＭ６０９およびエキスタチンを含むインテグリンアゴニストおよびインテグリンアンタゴニストを含む細胞接着分子；Ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅレセプター、ＩＬ−８レセプター、ＭＣＰ−１レセプターおよびＭＩＰ１−Ｉ／ＲＡＮＴＥＳレセプターを含む抗走化性剤；（ａ）（ｉ）カルフォスチンＣ、Ｇ−６２０３およびＧＦ１０９２０３Ｘを含むタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）インヒビター（アイソザイム）と（ｉｉ）タンパク質チロシンキナーゼインヒビターの両方を含むタンパク質キナーゼインヒビター；（ｂ）細胞内タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰアーゼ）の調節因子；および（ｃ）ＳＨ２ドメイン（ｓｒｃホモロジー２ドメイン）のインヒビターを含む細胞内シグナル伝達インヒビターが挙げられる。
【０２８５】
いくつかの適用については、痙攣阻害薬剤と併用して本発明のＭＡＳＰ−２阻害薬剤を投与することが有益である場合がある。例えば、泌尿生殖器への適用に対しては、少なくとも１つの平滑筋痙攣阻害薬剤および／または少なくとも１つの抗炎症剤を含めることが有益であり得、血管の手技に対しては、少なくとも１つの血管痙攣インヒビターならびに／または少なくとも１つの抗炎症剤および／もしくは少なくとも１つの抗再狭窄剤を含めることが有用であり得る。痙攣阻害薬剤の適当な例としては：セロトニン２レセプターサブタイプアンタゴニスト；タキキニンレセプターアンタゴニスト；一酸化窒素供与体；ＡＴＰ感受性カリウムチャネルオープナー；カルシウムチャネルアンタゴニスト；およびエンドセリンレセプターアンタゴニストが挙げられる。
【０２８６】
薬学的キャリアおよび送達ビヒクル
通常、他の任意の選択された治療薬と併用する本発明のＭＡＳＰ−２阻害薬剤組成物は、薬学的に許容可能なキャリア中に適当に含まれる。そのキャリアは、無毒性で、生体適合性であり、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤（およびそれと併用される他の任意の治療薬）の生物学的活性に悪影響を及ぼさないように選択される。ペプチドに対する代表的な薬学的に許容可能なキャリアは、Ｙａｍａｄａに対する米国特許第５，２１１，６５７号に記載されている。本発明において有用な抗ＭＡＳＰ−２抗体および阻害性ペプチドは、固体、半固体、ゲル、液体またはガス状の形態（例えば、錠剤、カプセル、散剤、顆粒剤、軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、溶液、堆積物（ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ）、吸入剤および経口、非経口または外科的投与用の注射）の調製物に製剤化され得る。本発明はまた、医療デバイスなどをコーティングすることによる本組成物の局所投与も企図する。
【０２８７】
注射可能物質を介する非経口送達、注射または注入および局所的送達に適したキャリアとしては、蒸留水、生理学的リン酸緩衝化食塩水、通常のリンガー溶液もしくは乳酸加リンガー溶液、デキストロース溶液、ハンクス溶液またはプロパンジオールが挙げられる。さらに、無菌不揮発性油が溶媒または懸濁媒質として使用され得る。この目的で、合成モノグリセリドまたは合成ジグリセリドを含む任意の生体適合性の油が使用され得る。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注射可能物質の調製における用途が見出される。上記のキャリアおよび薬剤は、液体、懸濁液、重合可能ゲルもしくは非重合可能ゲル、ペーストまたは軟膏として調合され得る。
【０２８８】
上記キャリアはまた、上記薬剤の送達を保持する（すなわち、延長するか、遅延させるか、または制御する）ためか、またはその治療薬の送達、取り込み、安定性または薬物動態を向上させるために、送達ビヒクルを含み得る。そのような送達ビヒクルとしては、タンパク質、リポソーム、炭水化物、合成の有機化合物、無機化合物、重合体のヒドロゲルまたは共重合体のヒドロゲルおよび重合体のミセルから構成される、微小粒子、ミクロスフェア、ナノスフェアまたはナノ粒子が挙げられ得るが、これらに限定されない。適当なヒドロゲル送達系およびミセル送達系としては、ＷＯ２００４／００９６６４Ａ２に開示されている、ＰＥＯ：ＰＨＢ：ＰＥＯ共重合体および共重合体／シクロデキストリン複合体ならびにＵＳ２００２／００１９３６９Ａ１に開示されているＰＥＯおよびＰＥＯ／シクロデキストリン複合体が挙げられる。そのようなヒドロゲルを、意図される作用部位に局所的に、または皮下にもしくは筋肉内に注射することにより、徐放デポーが形成され得る。
【０２８９】
関節内送達については、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、注射可能な上記の液体もしくはゲルキャリア、注射可能な上記の徐放送達ビヒクル、または、ヒアルロン酸もしくはヒアルロン酸誘導体中に保持され得る。
【０２９０】
非ペプチド作動性薬剤の経口投与については、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、不活性な充填剤もしくは希釈剤（例えば、スクロース、コーンスターチまたはセルロース）中に保持され得る。
【０２９１】
局所的投与については、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、軟膏剤、ローション、クリーム、ゲル、点眼剤、坐剤、スプレー剤、液体もしくは散剤中に、または、経皮的パッチを介するゲル送達系もしくはマイクロカプセル送達系中に保持され得る。
【０２９２】
エアロゾル、定量吸入器、乾燥粉末吸入器および噴霧器を含む様々な経鼻送達系および肺送達系が、開発中であり、それらは、それぞれエアロゾル送達ビヒクル、吸入送達ビヒクルまたは噴霧送達ビヒクルでの本発明の送達に適当に適応され得る。
【０２９３】
くも膜下腔内（ＩＴ）送達または脳室内（ＩＣＶ）送達については、適切に滅菌された送達系（例えば、液体；ゲル、懸濁液など）を使用して、本発明を投与することができる。
【０２９４】
本発明の組成物は、生体適合性の賦形剤（例えば、分散剤または湿潤剤、懸濁剤、希釈剤、緩衝液、浸透促進剤、乳化剤、結合剤、増粘剤、着香料（経口投与用））も含み得る。
【０２９５】
抗体用およびペプチド用の薬学的キャリア
抗ＭＡＳＰ−２抗体および阻害性ペプチドに関してより詳細には、代表的な製剤は、滅菌液体（例えば、水、油、食塩水、グリセロールまたはエタノール）であり得る薬学的キャリアを含む生理的に許容可能な希釈剤中の本化合物の溶液または懸濁液の注射可能な投与量として非経口的に投与され得る。さらに、補助剤（例えば、湿潤剤または乳化剤、界面活性物質、ｐＨ緩衝物質など）が、抗ＭＡＳＰ−２抗体および阻害性ペプチドを含む組成物中に存在し得る。薬学的組成物のさらなる成分としては、石油（例えば、動物起源、植物起源または合成起源のもの）、例えば、ダイズ油および鉱油が挙げられる。通常、グリコール（例えば、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）は、注射可能な溶液にとって好ましい液体キャリアである。
【０２９６】
抗ＭＡＳＰ−２抗体および阻害性ペプチドはまた、活性な薬剤の持続性放出または拍動性放出を可能にするように、そのような様式で製剤化され得る、蓄積注射または埋込調製物の形態で投与され得る。
【０２９７】
発現インヒビター用の薬学的に許容可能なキャリア
本発明の方法において有用な発現インヒビターに関してより詳細には、上で記載したような発現インヒビターおよび薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤を含む組成物が提供される。この組成物は、コロイド分散系をさらに含み得る。
【０２９８】
発現インヒビターを含む薬学的組成物としては、溶液、エマルジョンおよびリポソーム含有製剤が挙げられ得るが、これらに限定されない。これらの組成物は、種々の成分（予め形成された液体、自己乳化固体および自己乳化半固体が挙げられるが、これらに限定されない）から作製され得る。そのような組成物の調製は、代表的には、発現インヒビターと以下の１つ以上との組み合わせを含む：緩衝液、酸化防止剤、低分子量ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物（グルコース、スクロースまたはデキストリンを含む）、ＥＤＴＡなどのキレート剤、グルタチオンならびに他の安定剤および賦形剤。中性緩衝食塩水または非特異的な血清アルブミンと混合した食塩水は、適当な希釈剤の例である。
【０２９９】
いくつかの実施形態において、上記組成物は、代表的には、液滴の形態で別の液体に分散された１つの液体の不均一な系であるエマルジョンとして調製および製剤化され得る（Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｖｏｌ．１，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｋ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，１９８８を参照のこと）。エマルジョン製剤において使用される天然に存在する乳化剤の例としては、アラビアゴム、蜜ろう、ラノリン、レシチンおよびホスファチドが挙げられる。
【０３００】
１つの実施形態において、核酸を含む組成物は、マイクロエマルジョンとして製剤化され得る。マイクロエマルジョンとは、本明細書中で使用されるとき、単一の光学的等方で、熱力学的に安定な液体の溶液である、水、油および両親媒性物質の系のことをいう（Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｖｏｌ．１を参照のこと）。本発明の方法はまた、所望の部位にアンチセンスオリゴヌクレオチドを運搬および送達するためにリポソームを使用し得る。
【０３０１】
局所的投与用の発現インヒビターの薬学的組成物および製剤は、経皮的パッチ、軟膏剤、ローション、クリーム、ゲル、点眼剤、坐剤、スプレー、液体および散剤を含み得る。従来の薬学的キャリアならびに水性、粉末または油状の基剤および増粘剤などを使用してもよい。
【０３０２】
投与様式
ＭＡＳＰ−２阻害薬剤を含む薬学的組成物は、局所的または全身性の投与様式が、処置される状態に最も適しているか否かに応じて、多くの方法で投与され得る。また、体外再灌流手技に関して、本明細書の上で記載した通りに、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、再循環血液または血漿への本発明の組成物の導入を介して投与され得る。さらに、本発明の組成物は、埋込可能な医療デバイス上または医療デバイス中に本組成物をコーティングまたは組み込むことによって送達され得る。
【０３０３】
全身性送達
本明細書中で使用されるとき、用語「全身性送達」および「全身性投与」は、治療的効果が意図される単一の部位または複数の部位に送達される薬剤の分散を効率的にもたらす、筋肉内（ＩＭ）、皮下、静脈内（ＩＶ）、動脈内、吸入、舌下、頬側、局所的、経皮的、経鼻、直腸、膣および他の投与経路を含む、経口経路および非経口経路を含むがこれらに限定されないことを意図する。本組成物に対する全身性送達の好ましい経路としては、静脈内、筋肉内、皮下および吸入が挙げられる。本発明の特定の組成物において利用される選択された薬剤にとって的確な全身性投与経路は、所与の投与経路に関連する代謝変換経路に対するその薬剤の感受性を明らかにするために部分的に決定されることが理解されるだろう。例えば、ペプチド作動性薬剤は、経口以外の経路によって最も適当に投与され得る。
【０３０４】
ＭＡＳＰ−２阻害性抗体およびＭＡＳＰ−２阻害性ポリペプチドは、任意の適当な手段によって、そのような阻害の必要がある被験体に送達され得る。ＭＡＳＰ−２抗体およびポリペプチドの送達方法としては、経口、肺、非経口（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）または皮下注射）、吸入（例えば、微粉製剤を介する吸入）、経皮的、経鼻、膣、直腸または舌下の投与経路による投与が挙げられ、各投与経路に適した剤形に製剤化され得る。
【０３０５】
例示目的で、ＭＡＳＰ−２阻害性抗体およびＭＡＳＰ−２阻害性ペプチドは、そのポリペプチドを吸収することができる身体の膜（ｂｏｄｉｌｙ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）、例えば、鼻、消化管および直腸の膜への適用によって生存中の身体に導入され得る。そのポリペプチドは、代表的には、透過促進剤と組み合わせて吸収性の膜に適用される（例えば、Ｌｅｅ，Ｖ．Ｈ．Ｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．５：６９，１９８８；Ｌｅｅ，Ｖ．Ｈ．Ｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １３：２１３，１９９０；Ｌｅｅ，Ｖ．Ｈ．Ｌ．，Ｅｄ．，Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）；ＤｅＢｏｅｒ，Ａ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１３：２４１，１９９０を参照のこと）。例えば、ＳＴＤＨＦは、胆汁酸塩の構造に類似しているステロイド性の界面活性物質であるフシジン酸の合成誘導体であり、経鼻送達のための透過促進剤として使用されている（Ｌｅｅ，Ｗ．Ａ．，Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２２，Ｎｏｖ．／Ｄｅｃ．１９９０．）
ＭＡＳＰ−２阻害性抗体およびＭＡＳＰ−２阻害性ポリペプチドは、酵素的分解からそのポリペプチドを保護する脂質などの別の分子と併せて導入され得る。例えば、共有結合のポリマー（特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ））は、身体における酵素的加水分解からある特定のタンパク質を保護し、それにより半減期を延長するために使用されている（Ｆｕｅｒｔｇｅｓ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １１：１３９，１９９０）。多くのポリマー系が、タンパク質送達のために報告されている（Ｂａｅ，Ｙ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ９：２７１，１９８９；Ｈｏｒｉ，Ｒ．ら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．６：８１３，１９８９；Ｙａｍａｋａｗａ，Ｉ．ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．７９：５０５，１９９０；Ｙｏｓｈｉｈｉｒｏ，Ｉ．ら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０：１９５，１９８９；Ａｓａｎｏ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ９：１１１，１９８９；Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ９：１９５，１９８９；Ｍａｋｉｎｏ，Ｋ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １２：２３５，１９９０；Ｔａｋａｋｕｒａ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．７８：１１７，１９８９；Ｔａｋａｋｕｒａ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．７８：２１９，１９８９）。
【０３０６】
近年、血清中の安定性および循環中の半減時間が改善されたリポソームが開発されている（例えば、Ｗｅｂｂに対する米国特許第５，７４１，５１６号を参照のこと）。さらに、潜在的な薬物キャリアとしてのリポソームおよびリポソーム様の調製物の様々な方法が、概説されている（例えば、Ｓｚｏｋａに対する米国特許第５，５６７，４３４号；Ｙａｇｉに対する米国特許第５，５５２，１５７号；Ｎａｋａｍｏｒｉに対する米国特許第５，５６５，２１３号；Ｓｈｉｎｋａｒｅｎｋｏに対する米国特許第５，７３８，８６８号；およびＧａｏに対する米国特許第５，７９５，５８７号を参照のこと）。
【０３０７】
経皮的適用については、ＭＡＳＰ−２阻害性抗体およびＭＡＳＰ−２阻害性ポリペプチドは、他の適当な成分（例えば、キャリアおよび／または補助剤）と併用され得る。意図される投与に対して薬学的に許容可能でなければならないこと、および組成物の活性成分の活性を低下させ得ないことを除いては、そのような他の成分の性質に関して制限はない。適当なビヒクルの例としては、精製コラーゲンを含むかまたは含まない、軟膏剤、クリーム、ゲルまたは懸濁液が挙げられる。ＭＡＳＰ−２阻害性抗体およびＭＡＳＰ−２阻害性ポリペプチドはまた、好ましくは、液体または半液体の形態で、経皮的パッチ、硬膏剤および包帯に浸透され得る。
【０３０８】
本発明の組成物は、所望のレベルの治療的効果を維持するように決定された間隔で周期的に全身性に投与され得る。例えば、組成物は、例えば、２〜４週間ごとまたはそれよりも少ない間隔で皮下注射によって投与され得る。その投与レジメンは、併用する薬剤の作用に影響を及ぼし得る様々な因子を考慮して医師が決定する。これらの因子としては、処置される状態の進行の程度、患者の年齢、性別および体重ならびにその他の臨床上の因子が挙げられる。個別の薬剤についての投与量は、組成物中に含まれるＭＡＳＰ−２阻害薬剤ならびに任意の薬物送達ビヒクル（例えば、徐放送達ビヒクル）の存在および性質の関数として変動し得る。さらに、投与量は、送達される薬剤の投与の頻度および薬物動態学的な挙動における変動を埋め合わせるように調整され得る。
【０３０９】
局所送達
本明細書中で使用されるとき、用語「局所」は、意図される局在化作用の部位におけるかまたはその部位周辺における薬物の適用を包含し、例えば、皮膚または他の罹患組織への局所的送達、眼への送達、くも膜下腔内（ＩＴ）、脳室内（ＩＣＶ）、関節内、腔内、頭蓋内もしくは小嚢内（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃｕｌａｒ）への投与、留置または灌注が挙げられ得る。局所投与は、低用量の投与によって、全身性副作用を回避することを可能にするために、ならびに、局所送達の部位における活性薬剤の送達のタイミングおよび濃度をより正確に管理するために、好ましい場合がある。局所投与によって、代謝、血流などにおける患者間変動にかかわらず、標的部位において既知の濃度がもたらされる。直接的な送達様式によって、投与量管理の改善もまた、もたらされる。
【０３１０】
ＭＡＳＰ−２阻害薬剤の局所送達は、疾患または状態を処置するための外科的方法という状況（例えば、手技（例えば、動脈のバイパス手術、アテレクトミー、レーザー手技、超音波手技、バルーン血管形成術およびステント留置）中）において達成され得る。例えば、ＭＡＳＰ−２インヒビターは、バルーン血管形成術手技と組み合わせて被験体に投与され得る。バルーン血管形成術手技は、収縮したバルーンを有するカテーテルの動脈への挿入を含む。その収縮したバルーンは、動脈硬化巣の近位に置かれ、そしてプラークが血管壁に対して圧縮されるようにそのバルーンを膨らませる。結果として、そのバルーンの表面は、血管の表面上で血管内皮細胞層と接触する。ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、動脈硬化巣の部位においてその薬剤を放出できる様式でバルーン血管形成術カテーテルに付着され得る。その薬剤は、当該分野で公知の標準的な手順に従って、バルーンカテーテルに付着され得る。例えば、その薬剤が局所的な環境に放出される位置においてそのバルーンを膨らませるまで、その薬剤は、バルーンカテーテルのコンパートメント内に保存され得る。あるいは、バルーンを膨らませるときに、その薬剤が動脈壁の細胞に接触するように、その薬剤をバルーン表面上に含浸させてもよい。その薬剤はまた、Ｆｌｕｇｅｌｍａｎ，Ｍ．Ｙ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８５：１１１０−１１１７，１９９２に開示されているような穴のあるバルーンカテーテルにおいて送達され得る。治療的タンパク質をバルーン血管形成術用カテーテルに付着させるための代表的な手順については、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９５／２３１６１も参照のこと。同様に、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、ステントに塗布されるゲルまたは重合体コーティング中に含められてもよいし、ステントが血管に留置された後にＭＡＳＰ−２阻害薬剤を溶出するようにステントの材料中に組み込まれてもよい。
【０３１１】
関節炎および他の筋骨格障害の処置において使用されるＭＡＳＰ−２阻害性組成物は、関節内注射によって局所的に送達され得る。そのような組成物は、徐放送達ビヒクルを適当に含み得る。局所送達が望まれ得る場合のさらなる例として、尿生殖器状態の処置において使用されるＭＡＳＰ−２阻害性組成物は、膀胱内または別の泌尿生殖器の構造内に適当に点滴注入され得る。
【０３１２】
医療デバイス上のコーティング
ＭＡＳＰ−２阻害薬剤（例えば、抗体および阻害性ペプチド）は、埋込可能または取付可能な医療デバイスの表面上（またはその内部）に固定化され得る。その改変された表面は、代表的には、動物の体内に埋め込まれた後に生存組織と接触する。「埋込可能または取付可能な医療デバイス」とは、デバイス（例えば、ステントおよび埋込可能な薬物送達デバイス）の通常の手術の間に、動物の身体の組織内に埋め込まれるか、または組織に付着される任意のデバイスのことを意図する。そのような埋込可能または取付可能な医療デバイスは、例えば、ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、セファロース、寒天、デンプン、ナイロン、ステンレス鋼、チタンならびに生分解性および／または生体適合性のポリマーから作製され得る。デバイスとのタンパク質の結合は、例えば、そのタンパク質のＮ−Ｃ−末端残基の一方または両方をそのデバイスに付着させることによって、その結合されるタンパク質の生物学的活性を破壊しない任意の手法によって達成され得る。付着は、そのタンパク質における１つ以上の内部部位においても行われ得る。複数の付着（そのタンパク質の内部と末端の両方）もまた使用され得る。埋込可能または取付可能な医療デバイスの表面は、その表面へのタンパク質固定化のための官能基（例えば、カルボキシル、アミド、アミノ、エーテル、ヒドロキシル、シアノ、ニトリド、スルファンアミド、アセチリン性（ａｃｅｔｙｌｉｎｉｃ）、エポキシド、シラン性（ｓｉｌａｎｉｃ）、無水性（ａｎｈｙｄｒｉｃ）、スクシニム性（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｃ）、アジド）を含むように改変され得る。カップリング化学としては、ＭＡＳＰ−２抗体またはＭＡＳＰ−２阻害性ペプチド上で利用可能な官能基に対する、エステル、エーテル、アミド、アジドおよびスルファンアミド誘導体、シアネートならびに他の結合の形成が挙げられるが、これらに限定されない。ＭＡＳＰ−２抗体またはＭＡＳＰ−２阻害性フラグメントはまた、そのタンパク質への親和性タグ配列（例えば、ＧＳＴ（Ｄ．Ｂ．Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｋ．Ｓ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ  ６７：３１，１９８８）、ポリヒスチジン（Ｅ．Ｈｏｃｈｕｌｉら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．４１１：７７，１９８７）またはビオチン）の付加によって非共有結合的に付着され得る。そのような親和性タグは、デバイスへのタンパク質の可逆的な付着に使用され得る。
【０３１３】
タンパク質はまた、例えば、医療デバイスの表面の共有結合性の活性化によって、デバイス本体の表面に共有結合的に付着され得る。代表例として、マトリクス細胞のタンパク質が、以下の反応基対（その対の一方のメンバーは、デバイス本体の表面上に存在し、その対のもう一方のメンバーは、マトリクス細胞のタンパク質上に存在する）：エステル結合をもたらすヒドロキシル／カルボン酸；エステル結合をもたらすヒドロキシル／無水物；ウレタン結合をもたらすヒドロキシル／イソシアネートのいずれかによってデバイス本体に付着され得る。有用な反応基を有しないデバイス本体の表面は、マトリクス細胞のタンパク質の沈着を可能にするために、高周波放電プラズマ（ＲＦＧＤ）エッチングを用いて処理されること（例えば、酸素含有基を導入するための酸素プラズマを用いた処理；アミン基を導入するためのプロピルアミノプラズマを用いた処理）により、反応基が生成され得る。
【０３１４】
核酸分子（例えば、アンチセンス、ＲＮＡｉをコードするかまたはＤＮＡをコードするペプチドインヒビター）を含むＭＡＳＰ−２阻害薬剤は、デバイス本体に付着している多孔性マトリックス内に包埋され得る。表面の層を形成するために有用な代表的な多孔性マトリックスは、種々の商業的供給源（例えば、ＳｉｇｍａおよびＣｏｌｌａｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から入手され得るような、腱もしくは皮膚のコラーゲンから調製された多孔性マトリックス、または、Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓに対する米国特許第４，３９４，３７０号およびＫｏｅｚｕｋａに対する同第４，９７５，５２７号に記載されている通りに調製されたコラーゲンマトリックスである。１つのコラーゲン性材料は、ＵｌｔｒａＦｉｂｅｒＴＭという名称のものであり、Ｎｏｒｉａｎ  Ｃｏｒｐ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から入手可能である。
【０３１５】
ある特定の重合体マトリックスもまた、所望であれば使用してもよく、それらとしては、例えば、Ｕｒｉｓｔに対する米国特許第４，５２６，９０９号およびＵｒｉｓｔに対する同第４，５６３，４８９号に開示されるような、アクリルエステルポリマーおよび乳酸ポリマーが挙げられる。有用なポリマーの特定の例は、オルトエステル、無水物、プロピレン−コフマレート（ｃｏｆｕｍａｒａｔｅ）のポリマーまたは１つ以上のα−ヒドロキシカルボン酸モノマー（例えば、α−ヒドロキシ酢酸（グリコール酸）および／またはα−ヒドロキシプロピオン酸（乳酸））のポリマーである。
【０３１６】
処置レジメン
予防的な適用では、上記薬学的組成物は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化に関連する状態に感受性であるかまたは別途その状態の危険性のある被験体に、その状態の症状を排除するかまたはその症状の発症の危険性を低下させるのに十分な量で投与される。治療的な適用では、上記薬学的組成物は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化に関連する状態の疑いがあるか、またはその状態にすでに罹患している被験体に、その状態の症状を軽減するかまたは少なくとも部分的に減少させるのに十分な治療有効量で投与される。予防的レジメンと治療的レジメンの両方において、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤を含む組成物は、その被験体において十分な治療結果が達成されるまでいくつかの投与量で投与され得る。本発明のＭＡＳＰ−２阻害性組成物の適用は、急性状態、例えば、再灌流損傷または他の外傷性の損傷を処置するために、その組成物の単回投与または限られた一連の投与によって行われ得る。あるいは、その組成物は、慢性状態、例えば、関節炎または乾癬を処置するために、長期間にわたって周期的な間隔で投与され得る。
【０３１７】
本発明の方法および組成物は、代表的には診断的および治療的な医学的手技および外科的手技からもたらされる炎症および関連プロセスを阻害するために使用され得る。そのようなプロセスを阻害するために、本発明のＭＡＳＰ−２阻害性組成物は、手技付近で（ｐｅｒｉｐｒｏｃｅｄｕｒａｌｌｙ）適用され得る。本明細書中で使用されるとき、「手技付近で」とは、手技前および／または手技中および／または手技後に、すなわち、手技前、手技前および手技中、手技前および手技後、手技前、手技中および手技後、手技中、手技中および手技後、または手技後に、阻害性組成物を投与することをいう。手技付近での適用は、外科的部位または手技的部位にその組成物の局所投与によって（例えば、その部位の注射またはその部位の連続的もしくは間欠的な灌注によって、あるいは全身性投与によって）行われ得る。ＭＡＳＰ−２阻害薬剤溶液の局所的な周術期の送達に適した方法は、Ｄｅｍｏｐｕｌｏｓに対する米国特許第６，４２０，４３２号およびＤｅｍｏｐｕｌｏｓに対する同第６，６４５，１６８号に開示されている。ＭＡＳＰ−２阻害薬剤を含む軟骨保護性組成物の局所送達に適した方法は、国際ＰＣＴ特許出願ＷＯ０１／０７０６７Ａ２に開示されている。ＭＡＳＰ−２阻害薬剤を含む軟骨保護性組成物の標的化全身性送達に適した方法および組成物は、国際ＰＣＴ特許出願ＷＯ０３／０６３７９９Ａ２に開示されている。
【実施例】
【０３１８】
ＶＩ．実施例
以下の実施例は、本発明を実施するために企図される最良の形態を単に例示したものであり、本発明を限定すると解釈されるべきでない。本明細書中のすべての引用文献は、参考として明示的に援用される。
【０３１９】
（実施例１）
この実施例では、ＭＡＳＰ−２が欠損している（ＭＡＳＰ−２−／−）がＭＡｐ１９は十分である（ＭＡｐ１９＋／＋）マウス系統の作製を説明する。
【０３２０】
材料および方法：図４に示されるようなセリンプロテアーゼドメインをコードするエキソンを含む、マウスＭＡＳＰ−２のＣ末端をコードする３つのエキソンを破壊する標的化ベクターｐＫＯ−ＮＴＫＶ１９０１を設計した。ＰＫＯ−ＮＴＫＶ１９０１を使用して、マウスＥＳ細胞株Ｅ１４．１ａ（ＳＶ１２９  Ｏｌａ）をトランスフェクトした。ネオマイシン耐性かつチミジンキナーゼ感受性のクローンを選抜した。６００個のＥＳクローンをスクリーニングし、これらのうちの４つの異なるクローンを同定し、図４に示されるような、予想される選択的標的事象および組換え事象を含んでいることをサザンブロットによって確認した。これらの４つのポジティブクローンから胚移植によってキメラを作製した。次いで、このキメラを遺伝的背景Ｃ５７／ＢＬ６に戻し交雑させることにより、トランスジェニック雄を作製した。そのトランスジェニック雄を雌と交雑させることにより、Ｆ１が作製された（子孫の５０％は、破壊されたＭＡＳＰ−２遺伝子がヘテロ接合性を示した）。そのヘテロ接合性マウスを相互に交雑させることにより、ホモ接合性のＭＡＳＰ−２欠損子孫が作製された（ホモ接合性とヘテロ接合性と野生型のマウスは１：２：１の比）。
【０３２１】
結果および表現型：得られたホモ接合性のＭＡＳＰ−２−／−欠損マウスは、生存可能であり、繁殖可能であることが見出され、また、妥当な標的化事象を確証するサザンブロットによって、ＭＡＳＰ−２  ｍＲＮＡが存在しないことを確証するノーザンブロットによって、そしてＭＡＳＰ−２タンパク質が存在しないことを確証するウエスタンブロットによって、ＭＡＳＰ−２欠損であることが確認された（データ示さず）。ＭＡｐ１９  ｍＲＮＡが存在することおよびＭＡＳＰ−２  ｍＲＮＡが存在しないことが、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ機における時間分解型（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ）ＲＴ−ＰＣＲを用いてさらに確認された。ＭＡＳＰ−２−／−マウスは、予想されるとおり、ＭＡｐ１９、ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−３のｍＲＮＡおよびタンパク質を発現し続ける（データ示さず）。ＭＡＳＰ−２−／−マウスにおける、プロパージン、Ｂ因子、Ｄ因子、Ｃ４、Ｃ２およびＣ３についてのｍＲＮＡの存在および存在量が、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ解析によって評価され、野生型同腹仔コントロールの結果と同一であることが見出された（データ示さず）。実施例２にさらに記載するように、ホモ接合性のＭＡＳＰ−２−／−マウス由来の血漿は、レクチン経路媒介性の補体の活性化および副経路の補体の活性化が完全に無くなる。
【０３２２】
純粋なＣ５７ＢＬ６バックグラウンドのＭＡＳＰ−２−／−系統の作製：ＭＡＳＰ−２−／−系統を実験動物モデルとして使用する前に、９世代にわたってＭＡＳＰ−２−／−マウスを純粋なＣ５７ＢＬ６系統と戻し交雑させる。
（実施例２）
この実施例では、ＭＡＳＰ−２が、副経路およびレクチン経路を介した補体の活性化に必要であることを説明する。
【０３２３】
方法および材料：
レクチン経路特異的Ｃ４切断アッセイ：Ｌ−フィコリンに結合するＳ．ａｕｒｅｕｓ由来のリポテイコ酸（ＬＴＡ）から生じるレクチン経路活性化を測定するＣ４切断アッセイは、Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５７：１０７（２００１）によって報告されている。以下に記載するように、ＭＡＳＰ−２−／−マウス由来の血清を加える前に、ＬＰＳおよびマンナンまたはザイモサンでプレートをコーティングすることによってＭＢＬを介するレクチン経路活性化を測定するために、実施例１１に記載されるアッセイを適応させた。また、このアッセイを、古典経路によるＣ４切断の可能性を排除するために改変した。これは、レクチン経路認識成分とそれらのリガンドとの高親和性の結合を可能にするが、内在性のＣ４の活性化を妨害する１Ｍ  ＮａＣｌを含むサンプル希釈緩衝液を使用することにより、Ｃ１複合体を解離することによって古典経路の関与を排除することによって達成された。簡潔に説明すると、改変アッセイでは、血清サンプル（高塩（１Ｍ  ＮａＣｌ）緩衝液中に希釈されたもの）を、リガンドでコーティングされたプレートに加え、その後、生理学的塩濃度の緩衝液中の一定量の精製Ｃ４を加える。ＭＡＳＰ−２を含む結合した認識複合体は、Ｃ４を切断し、その結果、Ｃ４ｂ沈着が生じる。
【０３２４】
アッセイ方法：
１）Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ，Ｎｕｎｃ，Ｃａｔ．Ｎｏ．４４２４０４，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、コーティング緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，ｐＨ９．６）中に希釈された１μｇ／ｍｌのマンナン（Ｍ７５０４  Ｓｉｇｍａ）または他の任意のリガンド（例えば、以下に列挙するリガンド）でコーティングした。
【０３２５】
以下の試薬をこのアッセイに使用した：
ａ．マンナン（１００μ１コーティング緩衝液中の１μｇ／ウェルのマンナン（Ｍ７５０４  Ｓｉｇｍａ））：
ｂ．ザイモサン（１００μｌコーティング緩衝液中の１μｇ／ウェルのザイモサン（Ｓｉｇｍａ））；
ｃ．ＬＴＡ（１００μｌコーティング緩衝液中の１μｇ／ウェルまたは２０μｌメタノール中の２μｇ／ウェル）
ｄ．コーティング緩衝液中の１μｇのＨ−フィコリン特異的Ｍａｂ  ４Ｈ５
ｅ．Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ由来のＰＳＡ（１００μｌコーティング緩衝液中の２μｇ／ウェル）
ｆ．コーティング緩衝液中の、１００μｌ／ウェルのホルマリン固定されたＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＤＳＭ２０２３３（ＯＤ５５０＝０．５）。
【０３２６】
２）上記プレートを４℃で一晩インキュベートした。
【０３２７】
３）一晩インキュベートした後、そのプレートを０．１％ＨＳＡ−ＴＢＳブロッキング緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＣＬ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＮａＮ３，ｐＨ７．４中の０．１％（ｗ／ｖ）ＨＳＡ）と１〜３時間インキュベートすることによって、残余タンパク質結合部位を飽和させた。次いで、そのプレートをＴＢＳ／ｔｗｅｅｎ／Ｃａ２＋（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０および５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むＴＢＳ，ｐＨ７．４）で３回洗浄した。
【０３２８】
４）試験される血清サンプルをＭＢＬ結合緩衝液（１Ｍ  ＮａＣｌ）中に希釈し、そして、その希釈したサンプルを上記プレートに加え、４℃で一晩インキュベートした。緩衝液のみが加えられるウェルをネガティブコントロールとして使用した。
【０３２９】
５）４℃で一晩インキュベートした後、そのプレートをＴＢＳ／ｔｗｅｅｎ／Ｃａ２＋で３回洗浄した。次いで、ヒトＣ４（ＢＢＳ（４ｍＭバルビタール、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，ｐＨ７．４））中に希釈された１μｇ／ｍｌの１００μｌ／ウェル）をそのプレートに加え、３７℃で９０分間インキュベートした。そのプレートを再度、ＴＢＳ／ｔｗｅｅｎ／Ｃａ２＋で３回洗浄した。
【０３３０】
６）アルカリホスファターゼ結合体化ニワトリ抗ヒトＣ４ｃ（ＴＢＳ／ｔｗｅｅｎ／Ｃａ２＋中に１：１０００希釈）をそのプレートに加え、室温で９０分間インキュベートしてＣ４ｂ沈着を検出した。次いで、そのプレートを再度、ＴＢＳ／ｔｗｅｅｎ／Ｃａ２＋で３回洗浄した。
【０３３１】
７）１００μｌのｐ−ニトロフェニルリン酸基質溶液を加え、室温で２０分間インキュベートし、そして、マイクロタイタープレートリーダーにおいてＯＤ４０５を読むことによって、アルカリホスファターゼを検出した。
【０３３２】
結果：図６Ａ〜Ｂは、ＭＡＳＰ−２＋／＋（十字）、ＭＡＳＰ−２＋／−（黒丸）およびＭＡＳＰ−２−／−（黒三角）由来の血清希釈物中のマンナン（図６Ａ）上およびザイモサン（図６Ｂ）上のＣ４ｂ沈着の量を示している。図６Ｃは、野生型血清に対して正規化された、Ｃ４ｂ沈着の量の測定値に基づいて、野生型マウス（ｎ＝５）に対する、ＭＡＳＰ−２−／＋マウス（ｎ＝５）およびＭＡＳＰ−２−／−マウス（ｎ＝４）由来のザイモサン（白柱）またはマンナン（斜線柱）でコーティングされたプレート上での相対的なＣ４コンバターゼ活性を示している。エラーバーは、標準偏差を表している。図６Ａ〜Ｃに示される通りに、ＭＡＳＰ−２−／−マウス由来の血漿は、マンナンでコーティングされたプレートおよびザイモサンでコーティングされたプレート上においてレクチン経路媒介性の補体活性化が完全になくなっている。これらの結果から、ＭＡＳＰ−１またはＭＡＳＰ−３ではなくＭＡＳＰ−２が、レクチン経路のエフェクター成分であることが明らかに証明される。
【０３３３】
Ｃ３ｂ沈着アッセイ：
１）Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ，Ｎｕｎｃ，ｃａｔ．Ｎｏ．４４２４０４，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、コーティング緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，ｐＨ９．６）中に希釈された１μｇ／ウェルのマンナン（Ｍ７５０４  Ｓｉｇｍａ）または他の任意のリガンドでコーティングし、そして４℃で一晩インキュベートする。
【０３３４】
２）そのプレートを、０．１％  ＨＳＡ−ＴＢＳブロッキング緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＣＬ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＮａＮ３中の０．１％（ｗ／ｖ）ＨＳＡ、ｐＨ７．４）と１〜３時間インキュベートすることによって、残余タンパク質結合部位を飽和させる。
【０３３５】
３）プレートをＴＢＳ／ｔｗ／Ｃａ＋＋（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０および５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むＴＢＳ）中で洗浄し、希釈したＢＢＳを血清サンプルに加える（４ｍＭバルビタール、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，ｐＨ７．４）。緩衝液のみが加えられるウェルをネガティブコントロールとして使用する。野生型またはＭＡＳＰ−２−／−マウス由来の血清サンプルのコントロールセットを、アッセイにおいて使用する前にＣ１ｑ枯渇させる。供給業者の指示書に従ってウサギ抗ヒトＣ１ｑ  ＩｇＧ（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）でコーティングされたプロテインＡ結合Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を使用して、Ｃ１ｑ枯渇マウス血清を調製した。
【０３３６】
４）４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳ／ｔｗ／Ｃａ＋＋でさらに洗浄した後、１：１０００でＴＢＳ／ｔｗ／Ｃａ＋＋中に希釈されたポリクローナル抗ヒトＣ３ｃ抗体（Ｄａｋｏ  Ａ０６２）を用いて、転換され、結合したＣ３を検出する。２次抗体は、ＴＢＳ／ｔｗ／Ｃａ＋＋中に１：１０，０００希釈された、アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ａ−３８１２）に結合体化されたヤギ抗ウサギＩｇＧ（全分子）である。補体副経路（ＡＰ）の存在は、１００μｌの基質溶液（Ｓｉｇｍａ  Ｆａｓｔ  ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｔａｂｌｅｔ  ｓｅｔｓ，Ｓｉｇｍａ）を加えて、室温にてインキュベートすることによって判定する。マイクロタイタープレートリーダーにおいて４０５ｎｍにおける吸収を測定することによって、加水分解を定量的にモニターする。血漿／血清サンプルの段階希釈を使用して各解析について、検量線を作成する。
【０３３７】
結果：図７Ａおよび７Ｂに示される結果は、数匹のマウス由来のプールされた血清からのものである。十字は、ＭＡＳＰ−２＋／＋血清を表し、黒丸は、Ｃ１ｑ枯渇ＭＡＳＰ−２＋／＋血清を表し、白四角は、ＭＡＳＰ−２−／−血清を表し、そして白三角は、Ｃ１ｑ枯渇ＭＡＳＰ−２−／−血清を表す。図７Ａ〜Ｂに示される通りに、Ｃ３ｂ沈着アッセイにおいて試験されたＭＡＳＰ−２−／−マウス由来の血清は、マンナン（図７Ａ）およびザイモサン（図７Ｂ）でコーティングされたプレート上で、非常に低いレベルのＣ３活性化を示す。この結果から、ＭＡＳＰ−２が、Ｃ３から最初にＣ３ｂが生成されて、補体副経路を開始することに関与するために必要であることが明らかに証明される。これは、補体因子Ｃ３、Ｂ因子、Ｄ因子およびプロパージンが、独立した機能的副経路を形成し、その経路では、Ｃ３が、自発的に「Ｃ３ｂ様」型に立体配座変化を起こし、次いで、その「Ｃ３ｂ様」型は、流体相コンバターゼｉＣ３Ｂｂを生成し、そして活性化表面（例えば、ザイモサン）上にＣ３ｂ分子を沈着させ得るという広く受け入れられている観点に照らすと、驚くべき結果である。
【０３３８】
組換えＭＡＳＰ−２は、ＭＡＳＰ−２−／−マウス由来の血清中でレクチン経路依存性Ｃ４活性化を再構成する
ＭＡＳＰ−２が存在しないことが、ＭＡＳＰ−２−／−マウスにおけるレクチン経路依存性Ｃ４活性化の喪失の直接原因であることを立証するために、組換えＭＡＳＰ−２タンパク質を血清サンプルに加えることの効果を、上に記載したＣ４切断アッセイにおいて調べた。機能的に活性なマウスＭＡＳＰ−２および触媒的に不活性なマウスＭＡＳＰ−２Ａ（セリンプロテアーゼドメインにおける活性部位のセリン残基が、アラニン残基で置換されている）組換えタンパク質を、以下の実施例５に記載するように作製し、精製した。４匹のＭＡＳＰ−２−／−マウス由来のプールされた血清を、段階的に上げたタンパク質濃度の組換えマウスＭＡＳＰ−２または不活性な組換えマウスＭＡＳＰ−２Ａと予めインキュベートし、Ｃ４コンバターゼ活性を上に記載した通りにアッセイした。
【０３３９】
結果：図８に示される通りに、機能的に活性なマウス組換えＭＡＳＰ−２タンパク質（白三角として示す）をＭＡＳＰ−２−／−マウスから得られた血清に加えることによって、タンパク質濃度依存性様式でレクチン経路依存性Ｃ４活性化が回復したのに対し、触媒的に不活性なマウスＭＡＳＰ−２Ａタンパク質（星印として示す）は、Ｃ４活性化を回復させなかった。図８に示される結果は、プールされた野生型マウス血清（点線で示される）において観察されたＣ４活性化に対して正規化されている。
【０３４０】
（実施例３）
この実施例では、マウスＭＡＳＰ−２−／−、ＭＡｐ１９＋／＋であり、ヒトＭＡＳＰ−２トランスジーンを発現するトランスジェニックマウス系統（マウスＭＡＳＰ−２ノックアウトおよびヒトＭＡＳＰ−２ノックイン）の作製を説明する。
【０３４１】
材料および方法：図５に示されるような、ヒトＭＡＳＰ２遺伝子のプロモーター領域を含み、第１の３つのエキソン（エキソン１〜エキソン３）に続いて、その後の８つのエキソンのコード配列を表すｃＤＮＡ配列を含むことにより、その内在性プロモーターによって駆動される完全長ＭＡＳＰ−２タンパク質をコードするヒトＭＡＳＰ−２をコードするミニ遺伝子（「ミニｈＭＡＳＰ−２」と呼ばれる）（配列番号４９）を構築した。欠損マウスのＭＡＳＰ２遺伝子を、遺伝子導入的に発現されるヒトＭＡＳＰ−２で置換するために、このミニｈＭＡＳＰ−２構築物をＭＡＳＰ−２−／−の受精卵に注入した。
【０３４２】
（実施例４）
この実施例では、ヒト血清からのプロ酵素型としてのヒトＭＡＳＰ−２タンパク質の単離を説明する。
【０３４３】
ヒトＭＡＳＰ−２単離の方法：ヒト血清からＭＡＳＰ−２を単離するための方法は、Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：２６３７−２６４２，２０００に記載されている。簡潔には、ヒト血清を、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．２ｍＭ  ＮＰＧＢ、２０μＭ  ｐ−ＡＰＭＳＦおよび２％マンニトールを含む１０ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ６．０）を使用して、酵母マンナン−セファロースカラムに通す。ＭＡＳＰ−１プロ酵素およびＭＡＳＰ−２プロ酵素は、ＭＢＬと複合体を形成し、０．３Ｍマンノースを含む上記緩衝液で溶出される。ＭＢＬからプロ酵素ＭＡＳＰ−１およびプロ酵素ＭＡＳＰ−２を分離するために、上記複合体を含む調製物を抗ＭＢＬ−セファロースに適用し、次いで、ＭＡＳＰを、２０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１Ｍ  ＮａＣｌを含むイミダゾール緩衝液で溶出する。最後に、抗ＭＢＬ−セファロースに使用したものと同じ緩衝液中の抗ＭＡＳＰ−１−セファロースに通すことによって、プロ酵素ＭＡＳＰ−１およびプロ酵素ＭＡＳＰ−２を互いから分離する。ＭＡＳＰ−２は、溶出物中に回収されるのに対し、ＭＡＳＰ−１は、０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ２．２）で溶出される。
【０３４４】
（実施例５）
この実施例では、組換え完全長のヒト、ラットおよびマウスのＭＡＳＰ−２、ＭＡＳＰ−２由来ポリペプチドおよび触媒的に不活性化された変異型のＭＡＳＰ−２の組換え発現およびタンパク質生成を説明する。
【０３４５】
完全長ヒト、マウスおよびラットのＭＡＳＰ−２の発現：
ヒトＭＡＳＰ−２（配列番号４）の完全長ｃＤＮＡ配列を、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター領域の制御下で真核生物発現を駆動する哺乳動物発現ベクターｐＣＩ−Ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）内にサブクローニングした（Ｋａｕｆｍａｎ  Ｒ．Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９：４４８５−９０，１９９１；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５：５３７−６６（１９９１）に記載）。完全長マウスｃＤＮＡ（配列番号５０）およびラットＭＡＳＰ−２  ｃＤＮＡ（配列番号５３）を各々ｐＥＤ発現ベクター内にサブクローニングした。次いで、ＭＡＳＰ−２発現ベクターを、Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９に記載されている標準的なリン酸カルシウムトランスフェクション手順を使用して、付着性チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＤＸＢ１にトランスフェクトした。これらの構築物でトランスフェクトした細胞は、非常にゆっくりと増殖したことから、コードされたプロテアーゼが細胞傷害性であることが意味される。
【０３４６】
別のアプローチでは、その内在性プロモーターによって駆動されるＭＡＳＰ−２のヒトｃＤＮＡを含む上記ミニ遺伝子構築物（配列番号４９）を、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）に一過性にトランスフェクトする。ヒトＭＡＳＰ−２タンパク質は、培養培地中に分泌され、そのタンパク質を以下に記載するように単離する。
【０３４７】
触媒的に不活性な完全長ＭＡＳＰ−２の発現：
論理的根拠：認識小成分のＭＢＬまたはフィコリン（Ｌ−フィコリン、Ｈ−フィコリンまたはＭ−フィコリンのいずれか）が各々の炭水化物パターンに結合した後、ＭＡＳＰ−２は、自己触媒的切断によって活性化される。ＭＡＳＰ−２の活性化をもたらす自己触媒的切断が、血清からのＭＡＳＰ−２の単離手順中または組換え発現後の精製中に起きることが多い。抗原として使用するために、より安定なタンパク質調製物を得るために、プロテアーゼドメインの触媒的な三つ組中に存在するセリン残基を、ラット（配列番号５５  Ｓｅｒ６１７をＡｌａ６１７に置換）；マウス（配列番号５２  Ｓｅｒ６１７をＡｌａ６１７に置換）；またはヒト（配列番号３  Ｓｅｒ６１８をＡｌａ６１８に置換）においてアラニン残基で置換することによって、ＭＡＳＰ−２Ａと称される触媒的に不活性な形態のＭＡＳＰ−２を作製した。
【０３４８】
触媒的に不活性なヒトおよびマウスのＭＡＳＰ−２Ａタンパク質を作製するために、表５に示すオリゴヌクレオチドを使用して、部位特異的突然変異誘発を行った。表５中のオリゴヌクレオチドは、酵素的に活性なセリンをコードするヒトおよびマウスのｃＤＮＡの領域にアニールするように、および、セリンコドンをアラニンコドンに変化させるためにオリゴヌクレオチドがミスマッチを含むように設計した。例えば、ＰＣＲオリゴヌクレオチド配列番号５６〜５９を、ヒトＭＡＳＰ−２  ｃＤＮＡ（配列番号４）と組み合わせて使用することにより、開始コドンから酵素的に活性なセリンまでの領域およびそのセリンから終止コドンまでの領域を増幅し、Ｓｅｒ６１８からＡｌａ６１８への変異を含む変異ＭＡＳＰ−２Ａから完全なオープンリーディングを作製した。アガロースゲル電気泳動およびバンド調製後に、そのＰＣＲ産物を精製し、そして標準的なテイリング（ｔａｉｌｉｎｇ）手順を使用して単一のアデノシンオーバーラップを作製した。次いで、アデノシンテイル化ＭＡＳＰ−２ＡをｐＧＥＭ−Ｔイージーベクターにクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換した。
【０３４９】
配列番号６４および配列番号６５を等モル量で混合して、これらの２つのオリゴヌクレオチドをリン酸化（ｋｉｎａｓｉｎｇ）し、アニールし、２分間１００℃に加熱し、そしてゆっくりと室温まで冷却することによって、触媒的に不活性なラットＭＡＳＰ−２Ａタンパク質を作製した。生じたアニールしたフラグメントは、Ｐｓｔ１およびＸｂａ１に適合性の末端を有し、野生型ラットＭＡＳＰ−２  ｃＤＮＡ（配列番号５３）のＰｓｔ１−Ｘｂａ１フラグメントの代わりに挿入することにより、ラットＭＡＳＰ−２Ａを作製した。
【０３５０】
５’ＧＡＧＧＴＧＡＣＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＡＴＴＡＧＴＧＴＴＴ３’（配列番号６４）
５’ＣＴＡＧＡＡＡＣＡＣＴＡＡＴＧＣＣＣＣＴＣＣＴＧＣＧＴＣＡＣＣＴＣＴＧＣＡ３’（配列番号６５）
ヒト、マウスおよびラットのＭＡＳＰ−２Ａの各々を、哺乳動物発現ベクターｐＥＤまたはｐＣＩ−Ｎｅｏのいずれかにさらにサブクローニングし、以下に記載するようにチャイニーズハムスター卵巣細胞株ＤＸＢ１にトランスフェクトした。
【０３５１】
別のアプローチでは、Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（２８）：２５８９４−２５９０２，２００１に記載されている方法を使用して、触媒的に不活性な形態のＭＡＳＰ−２を構築する。簡潔には、完全長ヒトＭＡＳＰ−２  ｃＤＮＡを含むプラスミド（Ｔｈｉｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：５０６，１９９７に記載されているもの）をＸｈｏ１およびＥｃｏＲ１で消化し、そしてＭＡＳＰ−２  ｃＤＮＡ（本明細書中に配列番号４として記載されるもの）を、ｐＦａｓｔＢａｃ１バキュロウイルストランスファーベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＮＹ）の対応する制限酵素認識部位にクローニングする。次いで、Ｓｅｒ６１８におけるＭＡＳＰ−２セリンプロテアーゼ活性部位を、ペプチド領域アミノ酸６１０〜６２５をコードする二本鎖オリゴヌクレオチド（配列番号１３）をネイティブ領域アミノ酸６１０〜６２５で置換することによって、Ａｌａ６１８に変更することにより、不活性なプロテアーゼドメインを有するＭＡＳＰ−２完全長ポリペプチドを作製する。ヒトＭａｓｐ−２由来のポリペプチド領域を含む発現プラスミドの構築。
【０３５２】
ＭＡＳＰ−２の様々なドメインを分泌させるために、ＭＡＳＰ−２シグナルペプチド（配列番号５の残基１〜１５）を使用して以下の構築物を作製する。ヒトＭＡＳＰ−２  ＣＵＢＩドメイン（配列番号８）を発現する構築物を、ＭＡＳＰ−２（配列番号６）の残基１〜１２１をコードする領域（Ｎ末端のＣＵＢ１ドメインに対応する）を増幅するＰＣＲによって作製する。ヒトＭＡＳＰ−２  ＣＵＢＩＥＧＦドメイン（配列番号９）を発現する構築物を、ＭＡＳＰ−２（配列番号６）の残基１〜１６６をコードする領域（Ｎ末端のＣＵＢ１ＥＧＦドメインに対応する）を増幅するＰＣＲによって作製する。ヒトＭＡＳＰ−２  ＣＵＢＩＥＧＦＣＵＢＩＩドメイン（配列番号１０）を発現する構築物を、ＭＡＳＰ−２（配列番号６）の残基１〜２９３をコードする領域（Ｎ末端のＣＵＢＩＥＧＦＣＵＢＩＩドメインに対応する）を増幅するＰＣＲによって作製する。上記のドメインを、ＶｅｎｔＲポリメラーゼおよび鋳型としてのｐＢＳ−ＭＡＳＰ−２を使用して、確立されたＰＣＲ方法に従ってＰＣＲによって増幅する。センスプライマーの５’プライマー配列（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＣ−３’  配列番号３４）を、ＰＣＲ産物の５’末端におけるＢａｍＨＩ制限酵素認識部位（下線部）に導入する。以下の表５に示されるＭＡＳＰ−２ドメインの各々に対するアンチセンスプライマーを、各ＰＣＲ産物の末端において終止コドン（太字）の後ろにＥｃｏＲＩ部位（下線部）を導入するように設計する。増幅した後に、そのＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ｐＦａｓｔＢａｃｌベクターの対応する部位にクローニングする。得られた構築物は、制限マッピングによって特徴づけられ、ｄｓＤＮＡ配列決定によって確かめられる。
【０３５３】
【表５】
0005567328.tif 000007
ＭＡＳＰ−２の組換え真核生物発現ならびに酵素的に不活性なマウス、ラットおよびヒトのＭＡＳＰ−２Ａのタンパク質生成。
【０３５４】
上に記載したＭＡＳＰ−２発現構築物およびＭＡＳＰ−２Ａ発現構築物を、標準的なリン酸カルシウムトランスフェクション手順（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９）を使用して、ＤＸＢ１細胞にトランスフェクトした。調製物中に他の血清タンパク質が混入しないことを確実にするために、ＭＡＳＰ−２Ａを、無血清培地中で生成した。２日毎に培地をコンフルエントな細胞から回収した（合計４回）。３つの種の各々についての組換えＭＡＳＰ−２Ａのレベルは、培養培地１リットルあたり平均約１．５ｍｇであった。
【０３５５】
ＭＡＳＰ−２Ａタンパク質の精製：ＭＡＳＰ−２Ａ（上に記載したＳｅｒ−Ａｌａ変異体）を、ＭＢＰ−Ａ−アガロースカラム上でのアフィニティークロマトグラフィによって精製した。このストラテジーによって、外来性のタグを使用することなく迅速な精製が可能になった。ＭＡＳＰ−２Ａ（等体積の充填緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ７．５）で希釈した１００〜２００ｍｌの培地）を、１０ｍｌの充填緩衝液で予め平衡化しておいたＭＢＰ−アガロースアフィニティーカラム（４ｍｌ）上に充填した。さらに１０ｍｌの充填緩衝液で洗浄した後、タンパク質を、１．２５Ｍ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ７．５を用いて１ｍｌずつの画分に溶出した。ＭＡＳＰ−２Ａを含む画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって同定した。必要であれば、ＭＡＳＰ−２Ａを、ＭｏｎｏＱカラム（ＨＲ５／５）におけるイオン交換クロマトグラフィによってさらに精製した。タンパク質を、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５で透析し、そして同じ緩衝液で平衡化したカラムに充填した。洗浄後、０．０５〜１ＭのＮａＣｌ勾配を用いて１０ｍｌにわたって、結合したＭＡＳＰ−２Ａを溶出した。
【０３５６】
結果：２００ｍｌの培地から０．２５〜０．５ｍｇのＭＡＳＰ−２Ａタンパク質の収量が得られた。ＭＡＬＤＩ−ＭＳによって測定された７７．５ｋＤａという分子量は、グリコシル化に起因して、無修飾ポリペプチドの計算値（７３．５ｋＤａ）よりも大きい。Ｎ−グリコシル化部位の各々におけるグリカンの結合によって、観察された質量が説明される。ＭＡＳＰ−２Ａは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上を単一のバンドとして移動することから、生合成中にタンパク分解性にプロセシングされないことが示される。平衡超遠心分離によって測定される重量平均分子量は、グリコシル化されたポリペプチドのホモ二量体に対する計算値と一致する。
【０３５７】
組換えヒトＭＡＳＰ−２ポリペプチドの生成
組換えＭＡＳＰ−２由来ポリペプチドおよび組換えＭＡＳＰ２Ａ由来ポリペプチドを作製するための別の方法は、Ｔｈｉｅｌｅｎｓ，Ｎ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５０６８−５０７７，２００１に記載されている。簡潔には、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ昆虫細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手したＲｅａｄｙ−Ｐｌａｑｕｅ  Ｓｆ９細胞）を、５０ＩＵ／ｍｌペニシリンおよび５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＳｆ９００ＩＩ無血清培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で増殖させ、維持する。Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ）昆虫細胞（Ｊａｄｗｉｇａ  Ｃｈｒｏｂｏｃｚｅｋ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｅ，Ｇｒｅｎｏｂｌｅ，Ｆｒａｎｃｅから提供）を、５０ＩＵ／ｍｌペニシリンおよび５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充した１０％ＦＣＳ（Ｄｏｍｉｎｉｑｕｅ  Ｄｕｔｓｃｈｅｒ，Ｂｒｕｍａｔｈ，Ｆｒａｎｃｅ）含有ＴＣ１００培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で維持する。Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して組換えバキュロウイルスを作製する。Ｑｉａｇｅｎミニプレップ精製システム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してバクミドＤＮＡを精製し、それを、製造業者のプロトコルに記載されている通りにＳｆ９００ＩＩ  ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中のセルフェクチン（ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ）を用いるＳｆ９昆虫細胞のトランスフェクトに使用する。組換えウイルス粒子を４日後に回収し、ウイルスプラークアッセイによって力価測定し、そしてＫｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｏｓｓｅｅ，Ｔｈｅ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ  Ｌｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐｐ．１１１−１１４，１９９２によって記載されている通りに増幅する。
【０３５８】
Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞（１．７５×１０７細胞／１７５ｃｍ２組織培養フラスコ）を、２８℃において９６時間、Ｓｆ９００ＩＩ  ＳＦＭ培地中にて２感染効率で、ＭＡＳＰ−２ポリペプチドを含む組換えウイルスで感染させる。遠心分離により上清を回収し、ジイソプロピルホスホロフルオリデートを最終濃度１ｍＭとなるように加える。
【０３５９】
ＭＡＳＰ−２ポリペプチドは、培養培地中に分泌される。培養上清を５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０ｍＭトリエタノールアミン塩酸塩，ｐＨ８．１に対して透析し、同じ緩衝液で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）（２．８×１２ｃｍ）に１．５ｍｌ／分で充填する。１．２リットルの線形勾配を同じ緩衝液中の３５０ｍＭ  ＮａＣｌに適用することによって溶出を行う。組換えＭＡＳＰ−２ポリペプチドを含む画分を、ウエスタンブロット解析によって同定し、（ＮＨ４）２ＳＯ４を６０％（ｗ／ｖ）まで加えることによって沈殿させ、そして４℃で一晩放置する。ペレットを１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０ｍＭトリエタノールアミン塩酸塩，ｐＨ７．４中に再懸濁し、そして同じ緩衝液で平衡化したＴＳＫ  Ｇ３０００  ＳＷＧカラム（７．５×６００ｍｍ）（Ｔｏｓｏｈａａｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）に適用する。次いで、精製されたポリペプチドを、Ｍｉｃｒｏｓｅｐ微量濃縮器（ｍ．ｗ．カットオフ＝１０，０００）（Ｆｉｌｔｒｏｎ，Ｋａｒｌｓｔｅｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いる限外濾過によって０．３ｍｇ／ｍｌに濃縮する。
【０３６０】
（実施例６）
この実施例では、ＭＡＳＰ−２ポリペプチドに対するポリクローナル抗体を作製する方法を説明する。
【０３６１】
材料および方法：
ＭＡＳＰ−２抗原：ウサギを以下の単離ＭＡＳＰ−２ポリペプチドで免疫することによってポリクローナル抗ヒトＭＡＳＰ−２抗血清が産生される：実施例４に記載されるような血清から単離されるヒトＭＡＳＰ−２（配列番号６）；実施例４〜５に記載されるような、組換えヒトＭＡＳＰ−２（配列番号６）、不活性なプロテアーゼドメインを含むＭＡＳＰ−２Ａ（配列番号１３）；ならびに上の実施例５において記載されたように発現される、組換えＣＵＢ１（配列番号８）、ＣＵＢＥＧＦＩ（配列番号９）およびＣＵＢＥＧＦＣＵＢＩＩ（配列番号１０）。
【０３６２】
ポリクローナル抗体：ＢＣＧ（カルメットゲラン菌ワクチン）で初回刺激を受けた６週齢のウサギを、滅菌食塩水溶液中１００μｇ／ｍｌのＭＡＳＰ−２ポリペプチド１００μｇを注射することによって免疫する。注射を４週毎に行い、実施例７に記載される通りに、抗体価をＥＬＩＳＡアッセイによってモニターする。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィによる抗体精製のために、培養上清を回収する。
【０３６３】
（実施例７）
この実施例では、ラットまたはヒトのＭＡＳＰ−２ポリペプチドに対するマウスモノクローナル抗体を作製するための方法を説明する。
【０３６４】
材料および方法：
８〜１２週齢の雄Ａ／Ｊマウス（Ｈａｒｌａｎ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘ．）の皮下に、２００μｌのリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４中のフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈ．）における１００μｇのヒトまたはラットのｒＭＡＳＰ−２ポリペプチドまたはｒＭＡＳＰ−２Ａポリペプチド（実施例４または実施例５に記載される通りに作製したもの）を注射する。２週間の間隔で、そのマウスの皮下に、フロイント不完全アジュバントにおける５０μｇのヒトまたはラットのｒＭＡＳＰ−２ポリペプチドまたはｒＭＡＳＰ−２Ａポリペプチドを２回注射する。第４週目に、マウスに、ＰＢＳ中の５０μｇのヒトまたはラットのｒＭＡＳＰ−２ポリペプチドまたはｒＭＡＳＰ−２Ａポリペプチドを注射し、４日後に融合する。
【０３６５】
各融合のために、免疫マウスの脾臓から単一の細胞懸濁液を調製し、Ｓｐ２／０骨髄腫細胞との融合に使用する。５×１０８個のＳｐ２／０細胞および５×１０８個の脾臓細胞を、５０％ポリエチレングリコール（Ｍ．Ｗ．１４５０）（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，Ｎ．Ｙ．）および５％ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）を含む培地中で融合する。次いで、１０％ウシ胎仔血清、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．１ｍＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリンおよび１６μＭチミジンを補充したＩｓｃｏｖｅ培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．）中の懸濁液２００μｌあたり１．５×１０５個の脾臓細胞の濃度となるように細胞を調整する。２００マイクロリットルの上記細胞懸濁液を、約２０枚の９６ウェルマイクロ培養プレートの各ウェルに加える。約１０日後に、精製された因子ＭＡＳＰ−２との反応性について、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてスクリーニングするために培養上清を取り出す。
【０３６６】
ＥＬＩＳＡアッセイ：Ｉｍｍｕｌｏｎ２（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，Ｖａ．）マイクロ試験プレートのウェルを、５０ｎｇ／ｍｌにおける５０μｌの精製ｈＭＡＳＰ−２または５０μｌのラットｒＭＡＳＰ−２（またはｒＭＡＳＰ−２Ａ）を加えることによって室温で一晩コーティングする。コーティングのための低濃度のＭＡＳＰ−２によって、高親和性抗体の選択が可能になる。プレートをはじく（ｆｌｉｃｋ）ことによってコーティング溶液を除去した後、ＰＢＳ中のＢＬＯＴＴＯ（脱脂粉乳）２００μｌを１時間各ウェルに加えて、非特異的な部位をブロッキングする。１時間後、ウェルを緩衝液ＰＢＳＴ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ）で洗浄する。各融合ウェルの５０マイクロリットルの培養上清を回収し、５０μｌのＢＬＯＴＴＯと混合し、次いで、マイクロ試験プレートの個別のウェルに加える。インキュベートの１時間後、ウェルをＰＢＳＴで洗浄する。次いで、ＢＬＯＴＴＯ中に１：２，０００で希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，Ｐａ．）と反応させることによって、結合したマウス抗体を検出する。発色展開のために、０．１％の３，３，５，５テトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）および０．０００３％の過酸化水素（Ｓｉｇｍａ）を含むペルオキシダーゼ基質溶液を３０分間ウェルに加える。１ウェルあたり５０μｌの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えることによって反応を終結させる。反応混合物の４５０ｎｍにおける光学濃度を、ＢｉｏＴｅｋ  ＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，Ｖｔ．）を用いて読む。
【０３６７】
ＭＡＳＰ−２結合アッセイ：
ＭＡＳＰ−２阻害薬剤がＭＡＳＰ−２に対して有する結合親和性を測定するために、上に記載したＭＡＳＰ−２  ＥＬＩＳＡアッセイにおいて陽性と判定される培養上清を、結合アッセイにおいて試験することができる。同様のアッセイを使用して、その阻害薬剤が補体系における他の抗原に結合するか否かを判定することもできる。
【０３６８】
ポリスチレンマイクロタイタープレートウェル（９６ウェル中型結合プレート、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４中のＭＡＳＰ−２（２０ｎｇ／１００μｌ／ウェル，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で、４℃にて一晩コーティングする。ＭＡＳＰ−２溶液を吸引した後、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を含むＰＢＳを用いて室温で２時間、ウェルをブロッキングする。ＭＡＳＰ−２コーティングされていないウェルは、バックグラウンドコントロールとして作用する。ハイブリドーマ上清のアリコートまたはブロッキング溶液中の様々な濃度における精製抗ＭＡＳＰ−２  ＭｏＡｂをウェルに加える。室温にて２時間インキュベートした後、ウェルを大規模にＰＢＳですすぐ。ブロッキング溶液中のペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を加えて、それを室温で１時間インキュベートすることによって、ＭＡＳＰ−２に結合した抗ＭＡＳＰ−２  ＭｏＡｂを検出する。そのプレートをＰＢＳで再び徹底的にすすぎ、１００μｌの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を加える。ＴＭＢの反応を１００μｌの１Ｍリン酸を加えることによってクエンチし、そのプレートを、マイクロプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ  ２５０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）において４５０ｎｍにて読む。
【０３６９】
次いで、陽性ウェルからの培養上清を、機能的アッセイ（例えば、実施例２に記載したようなＣ４切断アッセイ）において、補体の活性化を阻害する能力について試験する。次いで、陽性ウェル中の細胞を限界希釈によってクローニングする。ＭｏＡｂを、上で記載したようなＥＬＩＳＡアッセイにおいてｈＭＡＳＰ−２との反応性について再度試験する。選択したハイブリドーマをスピナーフラスコ中で増殖させ、そして時間が経過した培養上清を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィによる抗体精製のために回収する。
【０３７０】
（実施例８）
この実施例では、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤についてスクリーニングするためのモデルとして使用するための、ヒトＭＡＳＰ−２を発現するＭＡＳＰ−２−／−ノックアウトマウスの作製を説明する。
【０３７１】
材料および方法：実施例１に記載したようなＭＡＳＰ−２−／−マウスと、実施例３に記載したようなヒトＭＡＳＰ−２トランスジーン構築物を発現するＭＡＳＰ−２−／−マウス（ヒトＭＡＳＰ−２ノックイン）を交雑させ、そしてマウスＭＡＳＰ−２−／−、マウスＭＡｐ１９＋、ヒトＭＡＳＰ−２＋である子孫を使用して、ヒトＭＡＳＰ−２阻害薬剤を同定する。
【０３７２】
そのような動物モデルは、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤（例えば、ヒト抗ＭＡＳＰ−２抗体、ＭＡＳＰ−２阻害性ペプチドおよびＭＡＳＰ−２阻害性非ペプチドならびにＭＡＳＰ−２阻害薬剤を含む組成物）の同定および有効性についての被験物（ｔｅｓｔ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）として使用され得る。例えば、この動物モデルを、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を引き起こすことが知られている化合物または薬剤に曝露し、そしてＭＡＳＰ−２阻害薬剤を、曝露動物において疾患症状の低減を誘発するのに十分な回数および濃度でこの動物モデルに投与する。
【０３７３】
さらに、マウスＭＡＳＰ−２−／−マウス、マウスＭＡｐ１９＋マウス、ヒトＭＡＳＰ−２＋マウスは、ＭＡＳＰ−２関連疾患に関与する１つ以上の細胞型を含む細胞株（その障害に対する細胞培養モデルとして使用され得る）を作製するために使用され得る。トランスジェニック動物からの持続的な細胞株の作製は、当該分野で周知であり、例えば、Ｓｍａｌｌ，Ｊ．Ａ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，５：６４２−４８，１９８５を参照のこと。
【０３７４】
（実施例９）
この実施例では、ヒトＭＡＳＰ−２およびヒト免疫グロブリンを発現するＭＡＳＰ−２ノックアウトマウスにおいて、ヒトＭＡＳＰ−２に対するヒト抗体を作製する方法を説明する。
【０３７５】
材料および方法：
実施例１に記載した通りに、ＭＡＳＰ−２−／−マウスを作製した。次いで、実施例３に記載した通りに、ヒトＭＡＳＰ−２を発現するマウスを構築した。ホモ接合性のＭＡＳＰ−２−／−マウスおよびヒトＭＡＳＰ−２を発現するＭＡＳＰ−２−／−マウスを各々、内在性の免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の遺伝子座が標的化破壊され、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１セグメントが発現するように操作された胚性幹細胞株由来のマウスと交雑させる。好ましくは、ヒト免疫グロブリン遺伝子座のセグメントは、重鎖成分および軽鎖成分の再構成されていない配列を含む。内在性免疫グロブリン遺伝子の不活性化と外来性免疫グロブリン遺伝子の導入の両方が、標的化された相同組換えによって達成され得る。このプロセスから生じるトランスジェニック哺乳動物は、免疫グロブリン成分配列を機能的に再構成することができ、また、内在性免疫グロブリン遺伝子を発現することなく、ヒト免疫グロブリン遺伝子によってコードされる様々なアイソタイプの抗体のレパートリーを発現することができる。これらの特性を有する哺乳動物の作製および特性は、記載されており、例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ａ．Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ  １４８：１５４７−１５５３，１９９４およびＳｌｏａｎｅ，Ｂ．Ｆ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８２６，１９９６を参照のこと。マウス抗体遺伝子が不活性化され、かつ、ヒト抗体遺伝子で機能的に置き換えられている遺伝的に操作されたマウスの系統は、市販されている（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｆｒｅｍｏｎｔ  ＣＡから入手可能）。得られるマウスの子孫は、ヒト治療における使用に適したヒトＭＡＳＰ−２に対するヒトＭｏＡｂを産生することができる。
【０３７６】
（実施例１０）
この実施例では、ヒト化マウス抗ＭＡＳＰ−２抗体およびヒト化マウス抗ＭＡＳＰ−２抗体フラグメントの作製および産生を説明する。
【０３７７】
マウス抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル抗体は、実施例７に記載した通りに、雄Ａ／Ｊマウスにおいて産生される。次いで、その免疫原性を低下させるために以下に記載する通りに、マウス定常領域をそれらのヒト対応物で置換することによってこのマウス抗体をヒト化して、その抗体のキメラＩｇＧおよびキメラＦａｂフラグメントを作製し、本発明によれば、そのフラグメントは、ヒト被験体におけるＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化の有害作用の阻害に有用である。
【０３７８】
１．マウスハイブリドーマ細胞からの抗ＭＡＳＰ−２可変領域遺伝子のクローニング。
【０３７９】
抗ＭＡＳＰ−２  ＭｏＡｂを分泌するハイブリドーマ細胞（実施例７に記載した通りに得たもの）から、製造業者（Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘ．）のプロトコルに従ってＲＮＡｚｏｌを使用して全ＲＮＡを単離する。オリゴｄＴをプライマーとして使用して全ＲＮＡから第１鎖（Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ）ｃＤＮＡを合成する。免疫グロブリン定常Ｃ領域由来３’プライマーおよび５’プライマーとしてマウスＶＨ遺伝子もしくはマウスＶＫ遺伝子のリーダーペプチド由来または第１フレームワーク領域由来の縮重プライマーセットを使用してＰＣＲを行う。ＣｈｅｎおよびＰｌａｔｓｕｃａｓ（Ｃｈｅｎ，Ｐ．Ｆ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５：５３９−５４９，１９９２）によって記載されているようなアンカーＰＣＲを行う。ＶＫ遺伝子をクローニングするために、Ｎｏｔ１−ＭＡＫ１プライマー（５’−ＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＴＡＧＧＴＧＣＴＧＴＣＴＴＴ−３’  配列番号３８）を使用して二本鎖ｃＤＮＡを調製する。アニールしたアダプターであるＡＤ１（５’−ＧＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＧＴＴＡＴＴＣＴＣＧＧＡ−３’  配列番号３９）およびＡＤ２（５’−ＴＣＣＧＡＧＡＡＴＡＡＣＧＡＧＴＧ−３’  配列番号４０）をその二本鎖ｃＤＮＡの５’末端および３’末端の両方に連結する。３’末端におけるアダプターをＮｏｔ１消化によって除去する。次いで、その消化された生成物を、５’プライマーとしてＡＤ１オリゴヌクレオチドおよび３’プライマーとしてＭＡＫ２（５’−ＣＡＴＴＧＡＡＡＧＣＴＴＴＧＧＧＧＴＡＧＡＡＧＴＴＧＴＴＣ−３’  配列番号４１）を用いるＰＣＲにおいて鋳型として使用する。約５００ｂｐのＤＮＡフラグメントをｐＵＣ１９にクローニングする。クローニングされた配列が予想されるマウス免疫グロブリン定常領域を包含することを確認する配列解析のために、いくつかのクローンを選択する。Ｎｏｔ１−ＭＡＫ１オリゴヌクレオチドおよびＭＡＫ２オリゴヌクレオチドは、ＶＫ領域から得られ、Ｃκ遺伝子の第１塩基対から下流のそれぞれ１８２ｂｐおよび８４ｂである。完全なＶＫおよびリーダーペプチドを含むクローンを選択する。
【０３８０】
ＶＨ遺伝子をクローニングするために、Ｎｏｔ１  ＭＡＧ１プライマー（５’−ＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＴＧＣＴＣＡＧＡＧＴＧＴＡＧＡ−３’  配列番号４２）を使用して二本鎖ｃＤＮＡを調製する。アニールしたアダプターのＡＤ１およびＡＤ２をその二本鎖ｃＤＮＡの５’末端および３’末端の両方に連結する。３’末端におけるアダプターをＮｏｔ１消化によって除去する。その消化された生成物を、プライマーとしてＡＤ１オリゴヌクレオチドおよびＭＡＧ２（５’−ＣＧＧＴＡＡＧＣＴＴＣＡＣＴＧＧＣＴＣＡＧＧＧＡＡＡＴＡ−３’  配列番号４３）を用いるＰＣＲにおいて鋳型として使用する。５００〜６００ｂｐ長のＤＮＡフラグメントをｐＵＣ１９にクローニングする。Ｎｏｔ１−ＭＡＧ１オリゴヌクレオチドおよびＭＡＧ２オリゴヌクレオチドは、マウスＣγ．７．１領域から得られ、マウスＣγ．７．１遺伝子の第１ｂｐから下流のそれぞれ１８０ｂｐおよび９３ｂｐである。完全なＶＨおよびリーダーペプチドを含むクローンを選択する。
【０３８１】
２．キメラＭＡＳＰ−２  ＩｇＧおよびキメラＭＡＳＰ−２  Ｆａｂのための発現ベクターの構築。上に記載した、クローニングされたＶＨ遺伝子およびＶＫ遺伝子を、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列をそのヌクレオチド配列の５’末端に付加し、かつ、スプライスドナーを３’末端に付加するためのＰＣＲ反応における鋳型として使用する。配列を解析してＰＣＲエラーが存在しないことを確認した後に、ＶＨ遺伝子およびＶＫ遺伝子を、それぞれヒトＣ．γ１およびＣ．κを含む発現ベクターカセットに挿入してｐＳＶ２ｎｅｏＶＨ−ｈｕＣγ１およびｐＳＶ２ｎｅｏＶ−ｈｕＣγを得る。重鎖ベクターおよび軽鎖ベクターのＣｓＣｌ勾配精製されたプラスミドＤＮＡを使用して、エレクトロポレーションによってＣＯＳ細胞をトランスフェクトする。４８時間後に、培養上清をＥＬＩＳＡによって試験して、約２００ｎｇ／ｍｌのキメラＩｇＧが存在することを確認する。その細胞を回収し、全ＲＮＡを調製する。その全ＲＮＡから、プライマーとしてオリゴｄＴを使用して第１鎖ｃＤＮＡを合成する。このｃＤＮＡを、ＦｄおよびκＤＮＡフラグメントを作製するＰＣＲにおいて鋳型として使用する。Ｆｄ遺伝子に対しては、５’プライマーとして５’−ＡＡＧＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＴＧＧＡＡＣＴ−３’（配列番号４４）およびＣＨ１由来３’プライマー（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＡＣＴＴＴＣＴＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧ−３’  配列番号４５）を使用してＰＣＲを行う。そのＤＮＡ配列は、ヒトＩｇＧ１の完全なＶＨおよびＣＨ１ドメインを含むと確認される。適正な酵素を用いた消化の後、Ｆｄ  ＤＮＡフラグメントを発現ベクターカセットｐＳＶ２ｄｈｆｒ−ＴＵＳのＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位およびＢａｍＨＩ制限酵素認識部位に挿入して、ｐＳＶ２ｄｈｆｒＦｄを得る。ｐＳＶ２プラスミドは、市販されており、様々な起源由来のＤＮＡセグメントからなる：ｐＢＲ３２２  ＤＮＡ（細線）は、ｐＢＲ３２２起源のＤＮＡ複製（ｐＢＲ  ｏｒｉ）およびラクタマーゼアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ）を含み；広い網掛けおよび標識によって表わされるＳＶ４０  ＤＮＡは、ＳＶ４０起源のＤＮＡ複製（ＳＶ４０  ｏｒｉ）、初期プロモーター（ｄｈｆｒおよびｎｅｏ遺伝子に対して５’）およびポリアデニル化シグナル（ｄｈｆｒおよびｎｅｏ遺伝子に対して３’）を含む。ＳＶ４０由来ポリアデニル化シグナル（ｐＡ）はまた、Ｆｄ遺伝子の３’末端に配置される。
【０３８２】
κ遺伝子については、ＰＣＲを、５’プライマーとして５’−ＡＡＧＡＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＴＣＴＣＡＣＴＡＧＣＴＣＴ−３’（配列番号４６）およびＣＫ由来３’プライマー（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴ−３’  配列番号４７）を使用して行う。ＤＮＡ配列は、完全なＶＫ領域およびヒトＣＫ領域を含むと確認される。適正な制限酵素を用いて消化した後、κＤＮＡフラグメントを発現ベクターカセットｐＳＶ２ｎｅｏ−ＴＵＳのＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位およびＢａｍＨＩ制限酵素認識部位に挿入して、ｐＳＶ２ｎｅｏＫを得る。Ｆｄ遺伝子およびκ遺伝子の両方の発現は、ＨＣＭＶ由来のエンハンサーエレメントおよびプロモーターエレメントによって駆動される。Ｆｄ遺伝子は鎖内ジスルフィド結合に関与するシステインアミノ酸残基を含まないので、この組換えキメラＦａｂは、非共有結合的に結合した重鎖および軽鎖を含む。このキメラＦａｂは、ｃＦａｂと命名される。
【０３８３】
重鎖内および軽鎖内のジスルフィド結合を有する組換えＦａｂを得るために、上記Ｆｄ遺伝子を、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域由来のさらなる９アミノ酸（ＥＰＫＳＣＤＫＴＨ  配列番号４８）に対するコード配列を含むように延長してもよい。Ｆｄ遺伝子の３’末端における３０アミノ酸をコードするＢｓｔＥＩＩ−ＢａｍＨＩ  ＤＮＡセグメントは、延長されたＦｄをコードするＤＮＡセグメントで置換され得、その結果、ｐＳＶ２ｄｈｆｒＦｄ／９ａａがもたらされる。
【０３８４】
３．キメラ抗ＭＡＳＰ−２  ＩｇＧの発現および精製
キメラ抗ＭＡＳＰ−２  ＩｇＧを分泌する細胞株を作製するために、ｐＳＶ２ｎｅｏＶＨ−ｈｕＣ．γ１およびｐＳＶ２ｎｅｏＶ−ｈｕＣκの精製プラスミドＤＮＡを用いるエレクトロポレーションにより、ＮＳＯ細胞をトランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞を０．７ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で選抜する。細胞を２５０ｍｌのスピナーフラスコ内で血清含有培地を使用して増殖させる。
【０３８５】
１００ｍｌの撹拌培養物の培養上清を１０ｍｌのＰＲＯＳＥＰ−Ａカラム（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）に充填する。そのカラムを１０総容積のＰＢＳで洗浄する。結合した抗体を、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を用いて溶出する。等容積の１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ８．０）を、精製された抗体を含む画分に加えて、ｐＨを７．０に調整する。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ膜限外濾過（Ｍ．Ｗ．カットオフ：３，０００）によって緩衝液をＰＢＳに交換することによって、残留塩を除去する。精製された抗体のタンパク質濃度をＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ）によって測定する。
【０３８６】
４．キメラ抗ＭＡＳＰ−２  Ｆａｂの発現および精製
キメラ抗ＭＡＳＰ−２  Ｆａｂを分泌する細胞株を作製するために、ｐＳＶ２ｄｈｆｒＦｄ（またはｐＳＶ２ｄｈｆｒＦｄ／９ａａ）およびｐＳＶ２ｎｅｏκの精製プラスミドＤＮＡを用いるエレクトロポレーションによりＣＨＯ細胞をトランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞を、Ｇ４１８およびメトトレキサートの存在下で選抜する。漸増濃度のメトトレキサートにおいて、選抜された細胞株を増幅する。限界希釈によって、細胞を単一細胞サブクローニングする。次いで、高産生性の単一細胞サブクローニング細胞株を、無血清培地を使用して１００ｍｌの撹拌培養において増殖させる。
【０３８７】
キメラ抗ＭＡＳＰ−２  Ｆａｂを、ＭＡＳＰ−２  ＭｏＡｂに対するマウス抗イディオタイプＭｏＡｂを使用するアフィニティークロマトグラフィによって精製する。抗イディオタイプＭＡＳＰ−２  ＭｏＡｂは、マウスをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）結合体化マウス抗ＭＡＳＰ−２  ＭｏＡｂで免疫し、そして、ヒトＭＡＳＰ−２と競合し得る特異的なＭｏＡｂ結合性についてスクリーニングすることによって、作製することができる。精製のために、ｃＦａｂまたはｃＦａｂ／９ａａを産生するＣＨＯ細胞の撹拌培養物からの１００ｍｌの上清を、抗イディオタイプＭＡＳＰ−２  ＭｏＡｂと結合したアフィニティーカラムに充填する。次いで、そのカラムをＰＢＳで徹底的に洗浄した後、結合しているＦａｂを５０ｍＭジエチルアミン（ｐＨ１１．５）を用いて溶出する。上に記載した通りに緩衝液を交換することによって残留塩を除去する。精製されたＦａｂのタンパク質濃度をＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ）によって測定する。
【０３８８】
キメラＭＡＳＰ−２  ＩｇＧ、ｃＦａｂおよびｃＦＡｂ／９ａａがＭＡＳＰ−２依存性の補体経路を阻害する能力は、実施例２に記載した阻害性アッセイを使用することによって測定され得る。
【０３８９】
（実施例１１）
この実施例では、Ｌ−フィコリン／Ｐ３５、Ｈ−フィコリン、Ｍ−フィコリンまたはマンナンを介するＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻止することができるＭＡＳＰ−２阻害薬剤を同定するための機能的スクリーニングとして使用されるインビトロＣ４切断アッセイを説明する。
【０３９０】
Ｃ４切断アッセイ：Ｃ４切断アッセイは、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｓ．Ｖ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５７：１０７，２００１によって記載されており、このアッセイでは、Ｌ−フィコリンに結合するＳ．ａｕｒｅｕｓ由来のリポテイコ酸（ＬＴＡ）から生じるレクチン経路活性化を測定する。
【０３９１】
試薬：ホルマリン固定されたＳ．ａｕｒｅｏｕｓ（ＤＳＭ２０２３３）を以下の通りに調製する：細菌をトリプシンダイズ（ｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ）血液培地中で３７℃にて一晩増殖させ、ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ＰＢＳ／０．５％ホルマリン中で室温にて１時間固定し、そしてＰＢＳでさらに３回洗浄し、その後、コーティング緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）中に再懸濁する。
【０３９２】
アッセイ：Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｂマイクロタイタープレート（Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）のウェルを、コーティング緩衝液中に１μｇのＬ−フィコリンを含むコーティング緩衝液中の１００μｌのホルマリン固定されたＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＤＳＭ２０２３３（ＯＤ５５０＝０．５）でコーティングする。一晩インキュベートした後、ＴＢＳ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中の０．１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）でウェルをブロッキングし、次いで、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０および５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むＴＢＳ（洗浄緩衝液）で洗浄する。内在性Ｃ４の活性化を妨害し、Ｃ１複合体（Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒおよびＣ１ｓから構成される）を解離する２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１％ＨＳＡ、ｐＨ７．４中にヒト血清サンプルを希釈する。抗ＭＡＳＰ−２  ＭｏＡｂおよび阻害性ペプチドを含むＭＡＳＰ−２阻害薬剤を、様々な濃度でその血清サンプルに加える。希釈したサンプルをプレートに加え、４℃で一晩インキュベートする。２４時間後、そのプレートを洗浄緩衝液で徹底的に洗浄し、次いで、１００μｌの４ｍＭバルビタール、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４中の０．１μｇの精製されたヒトＣ４（Ｄｏｄｄｓ，Ａ．Ｗ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２３：４６，１９９３に記載されているように得るもの）を各ウェルに加える。３７℃にて１．５時間後、そのプレートを再度洗浄し、アルカリホスファターゼ結合体化ニワトリ抗ヒトＣ４ｃ（Ｉｍｍｕｎｓｙｓｔｅｍ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎから入手）を使用してＣ４ｂ沈着を検出し、そして比色定量の基質ｐ−ニトロフェニルリン酸を使用して測定する。
【０３９３】
マンナンに対するＣ４アッセイ：プレートをＬＳＰおよびマンナンでコーティングした後、様々なＭＡＳＰ−２阻害薬剤と混合した血清を加えることによって、ＭＢＬを介するレクチン経路活性化を測定するために上に記載したアッセイを適合させる。
【０３９４】
Ｈ−フィコリン（Ｈａｋａｔａ  Ａｇ）に対するＣ４アッセイ：プレートをＬＳＰおよびＨ−フィコリンでコーティングした後、様々なＭＡＳＰ−２阻害薬剤と混合した血清を加えることによって、Ｈ−フィコリンを介するレクチン経路活性化を測定するために上に記載したアッセイを適合させる。
【０３９５】
（実施例１２）
以下のアッセイによって、野生型マウスおよびＭＡＳＰ−２−／−マウスにおける古典経路の活性化の存在が示される。
【０３９６】
方法：マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ，Ｎｕｎｃ，ｃａｔ．Ｎｏ．４４２４０４，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中の０．１％ヒト血清アルブミンで室温にて１時間コーティングし、その後、ＴＢＳ／ｔｗｅｅｎ／Ｃａ２＋中に１：１０００希釈したヒツジ抗全血清抗血清（Ｓｃｏｔｔｉｓｈ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｕｎｉｔ，Ｃａｒｌｕｋｅ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）と４℃で一晩インキュベートすることによって、免疫複合体をインサイチュにおいて作製した。血清サンプルを野生型マウスおよびＭＡＳＰ−２−／−マウスから得て、上記コーティングプレートに加えた。野生型およびＭＡＳＰ−２−／−の血清サンプルからＣ１ｑが枯渇したコントロールサンプルを調製した。供給業者の指示書に従って、ウサギ抗ヒトＣ１ｑ  ＩｇＧ（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）でコーティングされたプロテインＡ結合Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を使用して、Ｃ１ｑ枯渇マウス血清を調製した。そのプレートを３７℃で９０分間インキュベートした。１：１０００でＴＢＳ／ｔｗ／Ｃａ＋＋中に希釈したポリクローナル抗ヒトＣ３ｃ抗体（Ｄａｋｏ  Ａ０６２）を用いて、結合しているＣ３ｂを検出した。２次抗体は、ヤギ抗ウサギＩｇＧである。
【０３９７】
結果：図９は、野生型血清、ＭＡＳＰ−２−／−血清、Ｃ１ｑ枯渇野生型血清およびＣ１ｑ枯渇ＭＡＳＰ−２−／−血清中のＩｇＧでコーティングされたプレート上の相対的なＣ３ｂ沈着レベルを示している。これらの結果は、古典経路が、ＭＡＳＰ−２−／−マウス系統においてインタクトであることを示す。
【０３９８】
（実施例１３）
以下のアッセイを使用して、古典経路が免疫複合体によって開始される条件下でＭＡＳＰ−２阻害薬剤の作用を解析することによって、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤が古典経路を遮断するか否かを試験する。
【０３９９】
方法：補体活性化の状態（古典経路は、免疫複合体によって開始される）に対するＭＡＳＰ−２阻害薬剤の作用を試験するために、９０％ＮＨＳを含む３つ組の５０μｌサンプルを１０μｇ／ｍｌの免疫複合体（ＩＣ）またはＰＢＳの存在下で３７℃にてインキュベートし、そしてまた、３７℃インキュベート中に２００ｎＭ抗プロパージンモノクローナル抗体を含む対応する３つ組サンプル（＋／−ＩＣ）を、含める。３７℃で２時間インキュベートした後、１３ｍＭ  ＥＤＴＡをすべてのサンプルに加えることにより、さらなる補体活性化を停止させ、そのサンプルを直ちに５℃に冷却する。次いで、製造業者の指示書に従ってＥＬＩＳＡキット（Ｑｕｉｄｅｌ，カタログ番号Ａ０１５およびＡ００９）を使用して補体活性化産物（Ｃ３ａおよびｓＣ５ｂ−９）についてアッセイするまで、そのサンプルを−７０℃で保存する。
【０４００】
（実施例１４）
この実施例では、レクチン依存性のＭＡＳＰ−２補体活性化系が、腹大動脈瘤修復術後の虚血／再灌流期において活性化されることを説明する。
【０４０１】
実験の理論的根拠および設計：腹大動脈瘤（ＡＡＡ）修復術を経験している患者を、補体活性化によって広く媒介される虚血−再灌流損傷に供する。本発明者らは、ＡＡＡ修復術を経験している患者において虚血−再灌流損傷における補体活性化のＭＡＳＰ−２依存性レクチン経路の役割を調べた。血清中のマンナン結合レクチン（ＭＢＬ）の消費を使用して、再灌流中に起きたＭＡＳＰ−２依存性のレクチン経路活性化の量を測定した。
【０４０２】
患者の血清サンプルの単離：選択的な腎臓下ＡＡＡ修復術を経験している合計２３人の患者および主要な腹部の外科術を経験している８人のコントロール患者を、この研究に含めた。
【０４０３】
ＡＡＡ修復術を経験している患者については、その手技中の４つの規定された時点において各患者の橈骨動脈から全身の血液サンプルを採取した（動脈ラインを介して）：時点１：麻酔導入時；時点２：大動脈クランピングの直前；時点３：大動脈クランプ除去の直前；および時点４：再灌流中。
【０４０４】
主要な腹部の外科術を経験しているコントロール患者については、全身の血液サンプルを、麻酔の導入時および手技開始の２時間後に採取した。
【０４０５】
ＭＢＬレベルについてのアッセイ：マンナン結合レクチン（ＭＢＬ）のレベルについてＥＬＩＳＡ技術を使用して各患者の血漿サンプルをアッセイした。
【０４０６】
結果：この研究の結果を図１０に示し、図１０は、様々な時点（ｘ軸）の各々におけるＭＢＬレベルの変化パーセンテージの平均値（ｙ軸）を示すグラフを表している。ＭＢＬについての出発値を１００％とし、その後の相対的な低下を示す。図１０に示される通りに、ＡＡＡ患者（ｎ＝２３）は、血漿ＭＢＬレベルの有意な低下を示し、ＡＡＡ後の虚血／再灌流時において平均で約４１％低下した。対照的に、主要な腹部の外科術を経験しているコントロール患者（ｎ＝８）においては、血漿サンプル中のＭＢＬの僅かばかりの消費が観察された。
【０４０７】
示されるデータは、補体系のＭＡＳＰ−２依存性レクチン経路がＡＡＡ修復術後の虚血／再灌流期において活性化されることを強く示唆する。クランプされた主要血管が手術終了後に再灌流されると、ＭＢＬレベルが有意かつ迅速に低下するので、ＭＢＬレベルの低下は、虚血−再灌流損傷と関連するようである。対照的に、主な虚血−再灌流傷害を伴わない、主要な腹部の外科術を経験している患者のコントロール血清は、わずかなＭＢＬ血漿レベルの低下を示すだけである。再灌流損傷における補体活性化の十分に確立された関与を考慮して、本発明者らは、虚血性内皮細胞上でのＭＡＳＰ−２依存性レクチン経路の活性化が、虚血／再灌流損傷の病理における主要な因子であると結論づける。したがって、補体活性化のＭＡＳＰ−２依存性レクチン経路の特異的で一過性の遮断または低下が、臨床的手技の結果ならびに一過性の虚血性傷害、例えば、心筋梗塞、腸の梗塞、熱傷、移植および脳卒中を含む疾患を改善するために著しく有益な治療的影響を有すると期待される。
【０４０８】
（実施例１５）
この実施例では、関節リウマチの処置に有用なＭＡＳＰ−２阻害薬剤を試験するための動物モデルとしてのＭＡＳＰ−２−／−系統の使用を説明する。
【０４０９】
背景および理論的根拠：マウスの関節炎モデル：Ｋ／ＢｘＮ  Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）トランスジェニック（ｔｇ）マウスは、近年開発された炎症性関節炎のモデルである（Ｋｏｕｓｋｏｆｆ，Ｖ．ら、Ｃｅｌｌ  ８７：８１１−８２２，１９９６；Ｋｏｒｇａｎｏｗ，Ａ．Ｓ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０：４５１−４６１，１９９９；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｉ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：１７３２−１７３５，１９９９；Ｍａｃｃｉｏｎｉ  Ｍ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５（８）：１０７１−１０７７，２００２）。このＫ／ＢｘＮマウスは、ヒトにおけるＲＡの臨床的、組織学的および免疫学的な特徴のほとんどを有する自己免疫疾患を自然発症的に発症する（Ｊｉ，Ｈ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １６：１５７−１６８，２００２）。このマウスの障害は、関節特異的であるが、惹起されると、遍在的に発現されている抗原であるグルコース−６−リン酸イソメラーゼ（「ＧＰＩ」）に対するＴ細胞自己反応性およびＢ細胞自己反応性によって永続される。さらに、関節炎Ｋ／ＢｘＮマウス由来の血清（または精製された抗ＧＰＩ  Ｉｇ）の健常な動物への移入は、数日以内に関節炎を誘発する。ポリクローナル抗ＧＰＩ抗体またはＩｇＧ１アイソタイプの抗ＧＰＩモノクローナル抗体のプールが、健常なレシピエントに注射されると関節炎を誘発することも示されている（Ｍａｃｃｉｏｎｉら、２００２）。ＲＡ患者由来の血清もまた、正常な個体には見られない抗ＧＰＩ抗体を含むことが見出されているので、このマウスモデルは、ヒトＲＡに関連する。この系においてＣ５欠損マウスが試験され、関節炎の発症を阻止することが見出された（Ｊｉ，Ｈ．ら、２００２，前出）。副経路が関係しているＣ３ヌルマウスにおける関節炎の強力な阻害もまた存在したが、ＭＢＰ−Ａヌルマウスは、関節炎を発症しなかった。しかしながら、マウスにおいては、ＭＢＰ−Ｃの存在が、ＭＢＰ−Ａの喪失を補い得る。
【０４１０】
ＭＡＳＰ−２がレクチン経路と副経路の両方の開始に不可欠な役割を果たすという本明細書中に記載される観察結果に基づいて、Ｋ／ＢｘＮ関節炎モデルは、ＲＡを処置する治療薬として使用するために有効であるＭＡＳＰ−２阻害薬剤のスクリーニングに有用である。
【０４１１】
方法：関節炎Ｋ／ＢｘＮマウス由来の血清を生後６０日に得て、プールし、そしてＭＡＳＰ−２−／−レシピエント（実施例１に記載される通りに得たもの）；およびＭＡＳＰ−２阻害薬剤（本明細書中に記載されるようなＭｏＡｂ、阻害性ペプチドなど）を０日目および２日目に投与されているか、または投与されていないコントロール同腹仔に注射する（１５０〜２００μｌ  ｉ．ｐ．）。正常マウスの群はまた、血清の注射を受ける前の２日間、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤で前処置される。マウスのさらなる群は、０日目に血清の注射を受け、その後、６日目にＭＡＳＰ−２阻害薬剤を受ける。臨床上の指標を経時的に評価し、罹患した各足に対しては、１点のスコアを付け、わずかに軽度の腫脹を有する足に対しては、１／２点のスコアを付ける。足首の厚さもまた、カリパスによって測定する（厚さは、０日目の測定値との差として定義する）。
【０４１２】
（実施例１６）
この実施例では、ヒト血漿で灌流されたウサギ心臓のエキソビボモデルにおける補体媒介性の組織損傷の阻害についてのアッセイを説明する。
【０４１３】
背景および理論的根拠：補体系の活性化は、異種移植片の超急性拒絶に関与する。以前の研究は、超急性拒絶が副経路の活性化を介する抗ドナー抗体の欠如において起こり得ることを示した（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｐ．Ｓ．ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．２３：８７７−８７９，１９９１）。
【０４１４】
方法：単離された抗ＭＡＳＰ−２阻害薬剤（例えば、実施例７に記載される通りに得られた抗ＭＡＳＰ−２抗体）が組織の損傷において補体経路を阻害し得るか否かを判定するために、単離されたウサギ心臓を希釈ヒト血漿で灌流するエキソビボモデルを使用して、抗ＭＡＳＰ−２  ＭｏＡｂおよび抗体フラグメントを試験することができる。このモデルは、補体副経路の活性化に起因してウサギ心筋層に対する損傷を引き起こすことが以前に示された（Ｇｒａｌｉｎｓｋｉ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３４：７９−８８，１９９６）。
【０４１５】
（実施例１７）
この実施例では、本発明の方法に従ってレクチン依存性経路と関連する状態を処置するためのＭＡＳＰ−２阻害薬剤の有効な用量の尺度として有用である好中球活性化を測定するアッセイを説明する。
【０４１６】
方法：好中球エラスターゼを測定するための方法は、Ｇｕｐｔａ−Ｂａｎｓａｌ，Ｒ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７：１９１−２０１，２０００に記載されている。簡潔には、エラスターゼおよびα１−抗トリプシンの両方に対する抗体を利用する２部位サンドイッチアッセイを用いて、エラスターゼと血清α１−抗トリプシンとの複合体を測定する。ポリスチレンマイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中の１：５００希釈の抗ヒトエラスターゼ抗体（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）で、４℃にて一晩コーティングする。抗体溶液を吸引した後、０．４％  ＨＡＳを含むＰＢＳでウェルを室温にて２時間ブロッキングする。ＭＡＳＰ−２阻害薬剤で処理されたかまたは処理されていない血漿サンプルのアリコート（１００μｌ）を上記ウェルに加える。室温にて２時間インキュベートした後、ウェルをＰＢＳで広範にすすぐ。ブロッキング溶液中の１：５００希釈のペルオキシダーゼ結合体化α１−抗トリプシン抗体を加えて、室温にて１時間インキュベートすることによって、結合しているエラスターゼ−α１−抗トリプシン複合体を検出する。そのプレートをＰＢＳで洗浄した後、ＴＭＢ基質の１００μｌアリコートを加える。１００μｌのリン酸を加えることによってＴＭＢの反応をクエンチし、そしてマイクロプレートリーダーにおいて、そのプレートを４５０ｎｍにおいて読む。
【０４１７】
（実施例１８）
この実施例では、心筋の虚血／再灌流の処置に有用なＭＡＳＰ−２阻害薬剤を試験するための動物モデルを説明する。
【０４１８】
方法：心筋の虚血−再灌流モデルは、Ｖａｋｅｖａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９７：２２５９−２２６７，１９９８およびＪｏｒｄａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０４（１２）：１４１３−１４１８，２００１によって記載されている。この記載されているモデルを、以下の通りに、ＭＡＳＰ−２−／−マウスおよびＭＡＳＰ−２＋／＋マウスにおいて使用するために改変し得る。簡潔には、成体の雄マウスを麻酔する。頸静脈および気管にカニューレ挿入し、そして吐き出されるＣＯ２が３．５％〜５％を維持するように調節されたげっ歯類用換気装置を用いて、換気を１００％酸素で維持する。左開胸術を行い、左冠状動脈の起点から３〜４ｍｍに縫合糸を配置する。虚血の５分前に、動物にＭＡＳＰ−２阻害薬剤（例えば、抗ＭＡＳＰ−２抗体（例えば、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇの投与量の範囲））を投与する。次いで、冠状動脈の周りを縫合糸で締めることによって虚血を開始し、３０分間維持し、その後、４時間再灌流する。縫合糸を締めずに等しく偽手術された動物を用意する。
【０４１９】
補体Ｃ３沈着の解析：再灌流後、免疫組織化学用のサンプルを、左心室の中央の領域から得て、固定し、そして処理するまで−８０℃で保存する。組織切片をＨＲＰ結合体化ヤギ抗ラットＣ３抗体とインキュベートする。組織切片を、抗ＭＡＳＰ−２阻害薬剤の存在下で染色して、偽手術されたコントロール動物およびＭＡＳＰ−２−／−動物と比較してＣ３の存在について解析して、インビボにおいてＣ３沈着を低下させるＭＡＳＰ−２阻害薬剤を同定する。
【０４２０】
（実施例１９）
この実施例では、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤が移植された組織を虚血／再灌流損傷から保護する能力について試験するための動物モデルとしてのＭＡＳＰ−２−／−系統の使用を説明する。
【０４２１】
背景／理論的根拠：移植中のドナー臓器に虚血／再灌流損傷が起きることが公知である。組織の損傷の程度は、虚血の長さに関係し、そして虚血の様々なモデルにおいて証明されているように補体、および、補体阻害薬剤（例えば、可溶性レセプター１型（ＣＲ１））の使用によって媒介される（Ｗｅｉｓｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１４６−１５１，１９９０；Ｍｕｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１４７９−１４８６，１９９２；Ｐｒａｔｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１６３（４）：１４５７−１４６５，２００３）。移植についての動物モデルは、Ｐｒａｔｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１６３（４）：１４５７−１４６５によって記載されており、このモデルは、ＭＡＳＰ−２−／−マウスモデルとともに使用するため、および／または、移植された組織を虚血／再灌流損傷から保護する能力についてＭＡＳＰ−２阻害薬剤をスクリーニングするためにＭＡＳＰ−２＋／＋モデル系として使用するために、改変され得る。移植する前にドナー腎臓を灌流液で洗うことは、抗ＭＡＳＰ−２阻害薬剤をドナー腎臓に導入する機会を提供する。
【０４２２】
方法：ＭＡＳＰ−２−／−マウスおよび／またはＭＡＳＰ−２＋／＋マウスを麻酔する。ドナーの左腎臓を切開し、大動脈を腎臓の動脈に対して頭側および尾方に結紮する。ｐｏｒｔｅｘチューブカテーテル（Ｐｏｒｔｅｘ  Ｌｔｄ，Ｈｙｔｈｅ，ＵＫ）を結紮間に挿入し、少なくとも５分間にわたって、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤（例えば、抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル抗体（０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの投与量の範囲））を含む５ｍｌのＳｏｌｔｒａｎ腎臓灌流液（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ，ＵＫ）でその腎臓を灌流する。次いで、腎臓移植を行い、マウスを経時的にモニターする。
【０４２３】
移植レシピエントの解析：腎臓移植片を様々な時間間隔で回収し、Ｃ３沈着の程度を測定するために抗Ｃ３を使用して組織切片を解析する。
【０４２４】
（実施例２０）
この実施例では、関節リウマチ（ＲＡ）の処置に有用なＭＡＳＰ−２阻害薬剤を試験するためのコラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）動物モデルの使用を説明する。
【０４２５】
背景および理論的根拠：コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）は、ネイティブＩＩ型コラーゲンを用いた免疫後に、げっ歯類および霊長類の感受性系統において誘導可能な自己免疫性の多発性関節炎を示し、ヒト関節リウマチ（ＲＡ）に対して関連性のあるモデルとして認識される（Ｃｏｕｒｔｎｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８３：６６６（１９８０）；Ｔｒｅｎｔｈａｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４６：８５７（１９７７）を参照のこと）。ＲＡおよびＣＩＡの両方は、関節の炎症、パンヌス形成ならびに軟骨および骨のびらんによって特徴付けられる。ＣＩＡ感受性マウス系統ＤＢＡ／１ＬａｃＪは、マウスがウシのＩＩ型コラーゲンで免疫された後に臨床的に重篤な関節炎を発症する、ＣＩＡの開発モデルである（Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４３４０−４３４７（２０００））。Ｃ５欠損マウス系統をＤＢＡ／１ＬａｃＪと交雑させ、得られた系統は、ＣＩＡ関節炎の発症に抵抗性であることが見出された（Ｗａｎｇら、２０００，前出）。
【０４２６】
ＭＡＳＰ−２が、レクチン経路および副経路の両方の開始に不可欠な役割を果たすという本明細書中に記載される観察結果に基づいて、ＣＩＡ関節炎モデルは、ＲＡを処置する治療薬として使用するのに有効なＭＡＳＰ−２阻害薬剤のスクリーニングに有用である。
【０４２７】
方法：ＭＡＳＰ−２−／−マウスを、実施例１に記載される通りに作製する。次いで、ＭＡＳＰ−２−／−マウスを、ＤＢＡ／１ＬａｃＪ系統由来のマウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）と交雑させる。Ｆ１およびその後の子孫を相互に交雑させて、ＤＢＡ／１ＬａｃＪ系統におけるホモ接合性ＭＡＳＰ−２−／−を産生する。
【０４２８】
Ｗａｎｇら、２０００，前出に記載されている通りにコラーゲン免疫を行う。簡潔には、４ｍｇ／ｍｌの濃度で０．０１Ｍ酢酸中に溶解された、ウシＩＩ型コラーゲン（ＢＣＩＩ）またはマウスＩＩ型コラーゲン（ＭＣＩＩ）（Ｅｌａｓｔｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｏｗｅｎｓｖｉｌｌｅ，ＭＯから入手）を用いて、野生型ＤＢＡ／１ＬａｃＪマウスおよびＭＡＳＰ−２−／−ＤＢＡ／１ＬａｃＪマウスを免疫する。各マウスの尾の基部の皮内に、２００μｇのＣＩＩおよび１００μｇのミコバクテリアを注射する。２１日後に再度マウスを免疫し、関節炎の出現について毎日調べる。関節炎の指標を、罹患した各足において関節炎の重症度に関して経時的に評価する。
【０４２９】
コラーゲン免疫する時点において、ＭＡＳＰ−２阻害薬剤（例えば、抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル抗体（０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの投与量の範囲））を全身的かまたは１つ以上の関節において局所的に注射することによって、野生型ＤＢＡ／１ＬａｃＪ  ＣＩＡマウスにおいてＭＡＳＰ−２阻害薬剤をスクリーニングし、そして関節炎の指標を上に記載した通りに経時的に評価する。治療薬としての抗ｈＭＡＳＰ−２モノクローナル抗体は、ＭＡＳＰ−２−／−、ｈＭＡＳＰ−＋／＋ノックインＤＢＡ／１ＬａｃＪ  ＣＩＡマウスモデルにおいて容易に評価され得る。
【０４３０】
（実施例２１）
この実施例では、免疫複合体媒介性の糸球体腎炎の処置に有用なＭＡＳＰ−２阻害薬剤を試験するための（ＮＺＢ／Ｗ）Ｆ１動物モデルの使用を説明する。
【０４３１】
背景および理論的根拠：ニュージーランドブラック×ニュージーランドホワイト（ＮＺＢ／Ｗ）Ｆ１マウスは、ヒト免疫複合体媒介性の糸球体腎炎と顕著に類似した自己免疫性症候群を自然発症的に発症する。ＮＺＢ／Ｗ  Ｆ１マウスは、必ず１２月齢までに糸球体腎炎によって死亡する。上で述べたように、補体活性化が、免疫複合体媒介性の糸球体腎炎の病原において重大な役割を果たすことが示されている。さらに、ＮＺＢ／Ｗ  Ｆ１マウスモデルにおける抗Ｃ５  ＭｏＡｂの投与は糸球体腎炎（ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｔｈｒｉｔｉｓ）の経過の著しい回復をもたらしたことが、示されている（Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：８５６３−８５６８（１９９６））。ＭＡＳＰ−２が、レクチン経路および副経路の両方の開始において不可欠な役割を果たすという本明細書中に記載される観察結果に基づいて、ＮＺＢ／Ｗ  Ｆ１動物モデルは、糸球体腎炎を処置する治療薬として使用するのに有効なＭＡＳＰ−２阻害薬剤のスクリーニングに有用である。
【０４３２】
方法：ＭＡＳＰ−２−／−マウスを、実施例１に記載される通りに作製する。次いで、ＭＡＳＰ−２−／−マウスを、ＮＺＢ系統由来のマウスとＮＺＷ系統由来のマウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の両方と別々に交雑させる。Ｆ１およびその後の子孫を相互に交雑させて、ＮＺＢおよびＮＺＷの両方の遺伝的背景におけるホモ接合性ＭＡＳＰ−２−／−を産生する。このモデルにおいて糸球体腎炎の病原におけるＭＡＳＰ−２の役割を決定するために、野生型ＮＺＢ×ＮＺＷマウスまたはＭＡＳＰ−２−／−ＮＺＢ×ＭＡＳＰ−２−／−ＮＺＷマウスのいずれかの交雑から得られるＦ１個体におけるこの疾患の発症を比較する。１週間間隔で、ＭＡＳＰ−２＋／＋Ｆ１マウスおよびＭＡＳＰ−２−／−Ｆ１マウスから尿サンプルを採取し、抗ＤＮＡ抗体の存在について尿タンパク質レベルをモニターする（Ｗａｎｇら、１９９６，前出に記載されている通りに）。メサンギウム基質沈着の量および糸球体腎炎の発症をモニターするために、腎臓の病理組織学的解析も行う。
【０４３３】
ＮＺＢ／Ｗ  Ｆ１動物モデルもまた、糸球体腎炎を処置するための治療薬として使用するのに有効なＭＡＳＰ−２阻害薬剤のスクリーニングに有用である。１８週齢の野生型ＮＺＢ／Ｗ  Ｆ１マウスの腹腔内に抗ＭＡＳＰ−２阻害薬剤（例えば、抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル抗体（０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの投与量の範囲））を毎週または隔週の頻度で注射する。上で述べた糸球体腎炎の病理組織学的および生化学的なマーカーを使用して、マウスにおける疾患の発症を評価し、そして、この疾患の処置に有用なＭＡＳＰ−２阻害薬剤を同定する。
【０４３４】
（実施例２２）
この実施例では、体外循環（ＥＣＣ）（例えば、心肺バイパス（ＣＰＢ）回路）から生じる組織の損傷の予防に有用なＭＡＳＰ−２阻害薬剤を試験するためのモデルとしてのチュービングループ（ｔｕｂｉｎｇ  ｌｏｏｐ）の使用を説明する。
【０４３５】
背景および理論的根拠：上で述べたように、ＣＰＢ中にＥＣＣを経験している患者は、体外循環路の人工物表面への血液の曝露だけでなく、外科的外傷および虚血−再灌流損傷のような表面とは無関係の因子によっても部分的に引き起こされる全身性炎症反応に罹患する（Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．ら、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．５５：５５２−９，１９９３；Ｅｄｍｕｎｄｓ，Ｌ．Ｈ．，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．６６（Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ１２−６，１９９８；Ａｓｉｍａｋｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．，Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  １４：２６９−７７，１９９９）。さらに補体副経路が、血液とＣＰＢ回路の人工物表面との相互作用から生じる、ＣＰＢ回路における補体活性化において優勢な役割を果たすことが示されている（Ｋｉｒｋｌｉｎら、１９８３，１９８６，前に記載を参照のこと）。したがって、ＭＡＳＰ−２が、レクチン経路および副経路の両方の開始において不可欠な役割を果たすという本明細書中に記載される観察結果に基づいて、チュービングループモデルは、体外曝露によって引き起こされる炎症性反応を予防または処置する治療薬として使用するのに有効なＭＡＳＰ−２阻害薬剤のスクリーニングに有用である。
【０４３６】
方法：Ｇｕｐｔａ−Ｂａｎｓａｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７：１９１−２０１（２０００）に記載されている通りに、心肺バイパス回路用の先に記載されたチュービングループモデルの改変を、利用する（Ｇｏｎｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６（４）：２２２−２２９（１９９６）を参照のこと）。簡潔には、７ｍｌヴァキュテーナー（ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）管（全血１ｍｌあたり７単位のヘパリンを含む）中に健常な被験体から血液を新鮮に回収する。ＣＰＢ手技中に使用されるものと類似のポリエチレン管状物（例えば、Ｉ．Ｄ．２．９２ｍｍ；Ｏ．Ｄ．３．７３ｍｍ、長さ：４５ｃｍ）を１ｍｌの血液で満たし、そして短いシリコーン管状物を備えたループに接続する。１０ｍＭ  ＥＤＴＡとともにヘパリン処理された血液を含むコントロール管状物を、バックグラウンドコントロールとして研究に含めた。サンプルおよびコントロール管状物を３７℃で１時間、水浴中において垂直に回転させた。インキュベートした後、血液サンプルを、ＥＤＴＡを含む１．７ｍｌのマイクロチューブに移し、最終濃度２０ｍＭ  ＥＤＴＡを得る。そのサンプルを遠心分離し、そして血漿を回収した。ＭＡＳＰ−２阻害薬剤（例えば、抗ＭＡＳＰ−２抗体）を、ヘパリン処理した血液に遠心分離の直前に加える。次いで、Ｇｕｐｔａ−Ｂａｎｓａｌら、２０００，前出に記載されている通りにＣ３ａおよび可溶性Ｃ５ｂ−９の濃度を測定するために、その血漿サンプルをアッセイに供する。
【０４３７】
（実施例２３）
この実施例では、敗血症または敗血症から生じる状態（重篤な敗血症、敗血症性ショック、敗血症から生じる急性呼吸窮迫症候群および全身性炎症反応症候群を含む）の処置に有用なＭＡＳＰ−２阻害薬剤を試験するためのげっ歯類盲腸の結紮および穿刺（ＣＬＰ）モデル系の使用を説明する。
【０４３８】
背景および理論的根拠：上で述べたように、補体活性化が、敗血症の病原において主要な役割を有することは数多くの研究において示されている（Ｂｏｎｅ，Ｒ．Ｃ．，Ａｎｎａｌｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｌ．Ｍｅｄ．１１５：４５７−４６９，１９９１を参照のこと）。ＣＬＰげっ歯類モデルは、ヒトにおける敗血症の臨床経過に類似し、そして、ヒトにおける敗血症に対する合理的な代理モデルであると見なされる、認められたモデルである（Ｗａｒｄ，Ｐ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ  ４：１３３−１４２（２００４）を参照のこと）。最近の研究は、抗Ｃ５ａ抗体によるＣＬＰ動物の処置が菌血症の減少および生存の大幅な改善をもたらしたことが示された。Ｈｕｂｅｒ−Ｌａｎｇら、Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３２２３−３２３１（２００２）。故に、ＭＡＳＰ−２がレクチン経路および副経路の両方の開始において不可欠な役割を果たすという本明細書中に記載される観察結果に基づいて、ＣＬＰげっ歯類モデルは、敗血症または敗血症から生じる状態を予防または処置する治療薬として使用するのに有効なＭＡＳＰ−２阻害薬剤のスクリーニングに有用である。
【０４３９】
方法：以下の通り、Ｈｕｂｅｒ−Ｌａｎｇら、２００４，前出に記載されているモデルをＣＬＰモデルに適合させる。ＭＡＳＰ−２−／−動物およびＭＡＳＰ−２＋／＋動物を麻酔する。腹部正中を２ｃｍ切開し、盲腸を回盲弁の下できつく結紮することにより、腸閉塞を回避する。次いで、その盲腸を２１ゲージ針で穿刺する。次いで、腹部切開を絹縫合糸およびスキンクリップ（Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｓｕｍｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＮＪ）を用いて層状に閉じた。ＣＬＰの直後に、動物にＭＡＳＰ−２阻害薬剤（例えば、抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル抗体（０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの投与量の範囲））の注射を行う。治療薬としての抗ｈＭＡＳＰ−２モノクローナル抗体は、ＭＡＳＰ−２−／−、ｈＭＡＳＰ−＋／＋ノックインＣＬＰマウスモデルにおいて容易に評価され得る。次いで、Ｈｕｂｅｒ−Ｌａｎｇら、２００４，前出に記載されているアッセイを使用して、マウスの血漿を補体由来のアナフィラトキシンおよび呼吸バーストのレベルについて解析する。
【０４４０】
（実施例２４）
この実施例では、ＭＡＳＰ−２活性を遮断する高親和性の抗ＭＡＳＰ−２  Ｆａｂ２抗体フラグメントの同定を説明する。
【０４４１】
背景および理論的根拠：ＭＡＳＰ−２は、多くの別個の機能的ドメインを有する複合体タンパク質であり、その機能的ドメインとしては、ＭＢＬおよびフィコリンに対する結合部位、セリンプロテアーゼ触媒性部位、タンパク分解性基質Ｃ２に対する結合部位、タンパク分解性基質Ｃ４に対する結合部位、ＭＡＳＰ−２チモーゲンの自己活性化に対するＭＡＳＰ−２切断部位および２つのＣａ＋＋結合部位が挙げられる。高親和性でＭＡＳＰ−２に結合するＦａｂ２抗体フラグメントを同定し、それらがＭＡＳＰ−２機能活性を遮断することができるか否かを判定するためにその同定されたＦａｂ２フラグメントを機能的アッセイにおいて試験した。
【０４４２】
ＭＡＳＰ−２機能活性を遮断するために、抗体またはＦａｂ２抗体フラグメントは、ＭＡＳＰ−２機能活性に必要なＭＡＳＰ−２上の構造的エピトープに結合しなければならず、かつその構造的エピトープを干渉しなければならない。したがって、高親和性で結合する抗ＭＡＳＰ−２  Ｆａｂ２の多くまたはすべてが、ＭＡＳＰ−２機能活性に直接関与するＭＡＳＰ−２上の構造的エピトープに結合しない限り、それらは、ＭＡＳＰ−２機能活性を阻害しないかもしれない。
【０４４３】
レクチン経路Ｃ３コンバターゼ形成の阻害を測定する機能的アッセイを使用して、抗ＭＡＳＰ−２  Ｆａｂ２の「遮断活性」を評価した。レクチン経路におけるＭＡＳＰ−２の主要な生理学的役割は、レクチン媒介性補体経路の次なる機能的成分、すなわち、レクチン経路Ｃ３コンバターゼを生成することが公知である。レクチン経路Ｃ３コンバターゼは、Ｃ３をタンパク分解性にＣ３ａおよびＣ３ｂに切断する重要な酵素的複合体（Ｃ４ｂＣ２ａ）である。ＭＡＳＰ−２は、レクチン経路Ｃ３コンバターゼ（Ｃ４ｂＣ２ａ）の構造的成分ではない；しかしながら、ＭＡＳＰ−２機能活性は、レクチン経路Ｃ３コンバターゼを含む２つのタンパク質成分（Ｃ４ｂ、Ｃ２ａ）を生成するために必要とされる。さらに、上に列挙したＭＡＳＰ−２の別個の機能活性のすべては、ＭＡＳＰ−２がレクチン経路Ｃ３コンバターゼを生成するために必要とされるようである。これらの理由のために、抗ＭＡＳＰ−２  Ｆａｂ２の「遮断活性」を評価する際に使用するのに好ましいアッセイは、レクチン経路Ｃ３コンバターゼ形成の阻害を測定する機能的アッセイであると考えられる。
【０４４４】
高親和性Ｆａｂ２の作製：ヒト可変軽鎖抗体配列およびヒト可変重鎖抗体配列のファージディスプレイライブラリーならびに目的の選択されたリガンドと反応するＦａｂ２を同定するための自動化された抗体選択技術を使用して、ラットＭＡＳＰ−２タンパク質（配列番号５５）に対する高親和性Ｆａｂ２を作製した。既知量のラットＭＡＳＰ−２（約１ｍｇ、＞８５％の純度）タンパク質を抗体スクリーニングに利用した。最善の親和性を有する抗体を選択するために３回の増幅を利用した。抗体フラグメントを発現する約２５０種の異なるヒットをＥＬＩＳＡスクリーニングのために選定した。次いで、高親和性ヒットを配列決定して、様々な抗体の特有性を決定した。
【０４４５】
５０種の特有な抗ＭＡＳＰ−２抗体を精製し、２５０μｇの精製された各Ｆａｂ２抗体を、以下に詳細に記載するようにＭＡＳＰ−２結合親和性の特徴付けおよび補体経路の機能性試験に使用した。
【０４４６】
抗ＭＡＳＰ−２  Ｆａｂ２の阻害（遮断）活性を評価するために使用したアッセイ
１．レクチン経路Ｃ３コンバターゼ形成の阻害を測定するアッセイ：
背景：レクチン経路Ｃ３コンバターゼは、Ｃ３を２つの強力な炎症促進性フラグメント（アナフィラトキシンＣ３ａおよびオプソニンのＣ３ｂ）へとタンパク分解性に切断する酵素的複合体（Ｃ４ｂＣ２ａ）である。Ｃ３コンバターゼの形成は、炎症の媒介に関してレクチン経路における重要な工程であるらしい。ＭＡＳＰ−２は、レクチン経路Ｃ３コンバターゼ（Ｃ４ｂＣ２ａ）の構造的成分ではない；したがって、抗ＭＡＳＰ−２抗体（またはＦａｂ２）は、既存のＣ３コンバターゼの活性を直接阻害しない。しかしながら、ＭＡＳＰ−２セリンプロテアーゼ活性は、レクチン経路Ｃ３コンバターゼを含む２つのタンパク質成分（Ｃ４ｂ、Ｃ２ａ）を生成するために必要とされる。したがって、ＭＡＳＰ−２機能活性を阻害する抗ＭＡＳＰ−２  Ｆａｂ２（すなわち、遮断抗ＭＡＳＰ−２  Ｆａｂ２）は、レクチン経路Ｃ３コンバターゼのデノボ形成を阻害する。Ｃ３は、その構造の一部として、反応性の高い独特のチオエステル基を含む。このアッセイにおいてＣ３コンバターゼがＣ３を切断する際に、Ｃ３ｂ上のチオエステル基は、プラスチックウェルの底面上に固定化された高分子上のヒドロキシル基またはアミノ基とエステル結合またはアミド結合を介して共有結合を形成することができ、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるＣ３ｂの検出を容易にし得る。
【０４４７】
酵母マンナンは、レクチン経路の公知のアクチベーターである。Ｃ３コンバターゼの形成を測定する以下の方法において、マンナンでコーティングされたプラスチックウェルを、希釈ラット血清と一緒に３７℃にて３０分間インキュベートしてレクチン経路を活性化した。次いで、そのウェルを洗浄し、ウェル上に固定化されたＣ３ｂについて標準的なＥＬＩＳＡ法を使用してアッセイする。このアッセイにおいて生成されたＣ３ｂの量は、レクチン経路Ｃ３コンバターゼのデノボ形成を直接反映するものである。選択された濃度における抗ＭＡＳＰ−２  Ｆａｂ２を、Ｃ３コンバターゼ形成およびそれに続くＣ３ｂ生成を阻害する能力についてこのアッセイにおいて試験した。
【０４４８】
方法：
９６ウェルＣｏｓｔａｒ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｂｉｎｄｉｎｇプレートを、５０ｍＭ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）に希釈されたマンナンと一緒に１μｇ／５０μｌ／ウェルで５℃にて一晩インキュベートした。一晩インキュベートした後、各ウェルを２００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。次いで、そのウェルを、１００μｌ／ウェルのＰＢＳ中１％ウシ血清アルブミンを用いてブロッキングし、そして穏やかに混合しながら室温にて１時間インキュベートした。次いで、各ウェルを２００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。５℃において、抗ＭＡＳＰ−２  Ｆａｂ２サンプルを、Ｃａ＋＋とＭｇ＋＋とを含むＧＶＢ緩衝液（４．０ｍＭバルビタール、１４１ｍＭ  ＮａＣｌ、１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％ゼラチン，ｐＨ７．４）中に選択された濃度まで希釈した。５℃において、０．５％ラット血清を上記サンプルに加え、そして１００μｌを各ウェルに移した。プレートに蓋をし、３７℃の水浴において３０分間インキュベートして補体を活性化させた。そのプレートを３７℃の水浴から氷水混合物を含む容器に移すことによって、反応を停止させた。各ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０）２００μｌで５回洗浄し、次いで、２００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。２．０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ中の１次抗体（ウサギ抗ヒトＣ３ｃ、ＤＡＫＯ  Ａ００６２）の１：１０，０００希釈物を、１００μｌ／ウェルで加え、穏やかに混合しながら室温で１時間インキュベートした。各ウェルを２００μｌのＰＢＳで５回洗浄した。２．０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ中の２次抗体（ペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ  Ａ１０２ＰＵ）の１：１０，０００希釈物を、１００μｌ／ウェルで加え、振盪機上で穏やかに混合しながら室温で１時間インキュベートした。各ウェルを２００μｌのＰＢＳで５回洗浄した。１００μｌ／ウェルのペルオキシダーゼ基質ＴＭＢ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温で１０分間インキュベートした。１００μｌ／ウェルの１．０Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を加えることによって、ペルオキシダーゼ反応を停止させ、そしてＯＤ４５０を測定した。
【０４４９】
２．ＭＡＳＰ−２依存性Ｃ４切断の阻害を測定するアッセイ
背景：ＭＡＳＰ−２のセリンプロテアーゼ活性は、非常に特異的であり、ＭＡＳＰ−２に対する２つのタンパク質基質；Ｃ２およびＣ４だけが同定されている。Ｃ４の切断は、Ｃ４ａおよびＣ４ｂを生成する。抗ＭＡＳＰ−２  Ｆａｂ２は、Ｃ４切断に直接関与するＭＡＳＰ−２上の構造的エピトープ（例えば、Ｃ４に対するＭＡＳＰ−２結合部位；ＭＡＳＰ−２セリンプロテアーゼ触媒部位）に結合し得、したがってＭＡＳＰ−２のＣ４切断機能活性を阻害する。
【０４５０】
酵母マンナンは、レクチン経路の公知のアクチベーターである。ＭＡＳＰ−２のＣ４切断活性を測定する以下の方法において、レクチン経路を活性化するために、マンナンでコーティングされたプラスチックウェルを希釈ラット血清と一緒に３７℃で３０分間インキュベートした。このＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用される１次抗体は、ヒトＣ４のみを認識するので、希釈ラット血清にヒトＣ４（１．０μｇ／ｍｌ）を補充した。次いで、そのウェルを洗浄し、ウェル上に固定化されたヒトＣ４ｂについて標準的なＥＬＩＳＡ法を使用してアッセイした。このアッセイにおいて生成されるＣ４ｂの量は、ＭＡＳＰ−２依存性Ｃ４切断活性の尺度である。このアッセイでは、選択された濃度における抗ＭＡＳＰ−２  Ｆａｂ２を、それがＣ４切断を阻害する能力について試験した。
【０４５１】
方法：９６ウェルＣｏｓｔａｒ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｂｉｎｄｉｎｇプレートを、５０ｍＭ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）中に希釈されたマンナンと１．０μｇ／５０μｌ／ウェルで５℃にて一晩インキュベートした。各ウェルを２００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。次いで、そのウェルを、１００μｌ／ウェルのＰＢＳ中１％ウシ血清アルブミンを用いてブロッキングし、そして穏やかに混合しながら室温にて１時間インキュベートした。各ウェルを２００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。５℃において、抗ＭＡＳＰ−２  Ｆａｂ２サンプルを、Ｃａ＋＋とＭｇ＋＋とを含むＧＶＢ緩衝液（４．０ｍＭバルビタール、１４１ｍＭ  ＮａＣｌ、１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％ゼラチン，ｐＨ７．４）中に選択された濃度まで希釈した。１．０μｇ／ｍｌヒトＣ４（Ｑｕｉｄｅｌ）をまた、これらのサンプル中に含めた。５℃において、０．５％ラット血清を上のサンプルに加え、そして１００μｌを各ウェルに移した。プレートに蓋をして、３７℃の水浴において３０分間インキュベートして補体を活性化させた。そのプレートを３７℃の水浴から氷水混合物を含む容器に移すことによって、反応を停止させた。各ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０）２００μｌで５回洗浄し、次いで、各ウェルを２００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。２．０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ中のビオチン結合体化ニワトリ抗ヒトＣ４ｃ（Ｉｍｍｕｎｓｙｓｔｅｍ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）の１：７００希釈物を、１００μｌ／ウェルで加え、穏やかに混合しながら室温で１時間インキュベートした。各ウェルを２００μｌのＰＢＳで５回洗浄した。２．０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含むＰＢＳ中の０．１μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ＃２１１２６）を、１００μｌ／ウェルで加え、振盪機上で穏やかに混合しながら室温で１時間インキュベートした。各ウェルを２００μｌのＰＢＳで５回洗浄した。１００μｌ／ウェルのペルオキシダーゼ基質ＴＭＢ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温で１６分間インキュベートした。１００μｌ／ウェルの１．０Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を加えることによってペルオキシダーゼ反応を停止させ、そしてＯＤ４５０を測定した。
【０４５２】
３．「ネイティブ」ラットＭＡＳＰ−２に対する抗ラットＭＡＳＰ−２  Ｆａｂ２の結合アッセイ
背景：ＭＡＳＰ−２は、通常、特異的なレクチン分子（マンノース結合タンパク質（ＭＢＬ）およびフィコリン）も含むＭＡＳＰ−２二量体複合体として血漿中に存在する。したがって、ＭＡＳＰ−２の生理的に関連性のある形態に対する抗ＭＡＳＰ−２  Ｆａｂ２の結合性の研究を目的とする場合、Ｆａｂ２と、精製された組換えＭＡＳＰ−２ではなく血漿中の「ネイティブ」ＭＡＳＰ−２との相互作用を使用する結合アッセイを開発することが重要である。この結合アッセイでは、最初に、１０％ラット血清由来の「ネイティブ」ＭＡＳＰ−２−ＭＢＬ複合体をマンナンコーティングされたウェル上に固定化する。次いで、その固定化された「ネイティブ」ＭＡＳＰ−２に対する様々な抗ＭＡＳＰ−２  Ｆａｂ２の結合親和性を、標準的なＥＬＩＳＡ法を用いて研究した。
【０４５３】
方法：９６ウェルＣｏｓｔａｒ  Ｈｉｇｈ  Ｂｉｎｄｉｎｇプレートを、５０ｍＭ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）中に希釈されたマンナンと１μｇ／５０μｌ／ウェルで５℃にて一晩インキュベートした。各ウェルを２００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。そのウェルを、１００μｌ／ウェルのＰＢＳＴ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ）中０．５％脱脂粉乳を用いてブロッキングし、そして穏やかに混合しながら室温にて１時間インキュベートした。各ウェルを、２００μｌのＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／Ｃａ＋＋洗浄緩衝液（Ｔｒｉｓ緩衝化食塩水、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、５．０ｍＭ  ＣａＣｌ２，ｐＨ７．４を含む）で３回洗浄した。高塩結合緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００，０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４）中の１０％ラット血清を氷上で調製した。１００μｌ／ウェルを加え、そして５℃において一晩インキュベートした。ウェルを、２００μｌのＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／Ｃａ＋＋洗浄緩衝液で３回洗浄した。次いで、ウェルを、２００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含むＧＶＢ緩衝液（４．０ｍＭバルビタール、１４１ｍＭ  ＮａＣｌ、１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％ゼラチン、ｐＨ７．４）中に希釈された、選択された濃度の抗ＭＡＳＰ−２  Ｆａｂ２を、１００μｌ／ウェルで加え、穏やかに混合しながら室温で１時間インキュベートした。各ウェルを２００μｌのＰＢＳで５回洗浄した。ＰＢＳ中２．０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンに１：５０００希釈したＨＲＰ結合体化ヤギ抗Ｆａｂ２（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｃａｔ  Ｎｏ  ０５００−００９９）を、１００μｌ／ウェルで加え、穏やかに混合しながら室温で１時間インキュベートした。各ウェルを２００μｌのＰＢＳで５回洗浄した。１００μｌ／ウェルのペルオキシダーゼ基質ＴＭＢ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温で７０分間インキュベートした。１００μｌ／ウェルの１．０Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を加えることによってペルオキシダーゼ反応を停止させ、そしてＯＤ４５０を測定した。
【０４５４】
結果：
ラットＭＡＳＰ−２タンパク質と高親和性で反応する約２５０種の異なるＦａｂ２を、ＥＬＩＳＡスクリーニングのために選定した。これらの高親和性Ｆａｂ２を配列決定して、様々な抗体の特有性を判定し、５０種の独特の抗ＭＡＳＰ−２抗体をさらなる解析のために精製した。２５０μｇの各精製Ｆａｂ２抗体をＭＡＳＰ−２結合親和性の特徴付けおよび補体経路の機能性試験に使用した。この解析の結果を下記の表６に示す。
【０４５５】
【表６】
0005567328.tif 000008
上の表６に示される通りに、試験された５０種の抗ＭＡＳＰ−２  Ｆａｂ２のうち、１０ｎＭ  Ｆａｂ２以下のＩＣ５０でＣ３コンバターゼ形成を強力に阻害するＭＡＳＰ−２遮断Ｆａｂ２として１７種のＦａｂ２を同定した（３４％の陽性ヒット率）。同定された１７種のＦａｂ２のうち８種は、ｎＭ以下の範囲のＩＣ５０を有する。さらに、表６に示されるＭＡＳＰ−２遮断Ｆａｂ２の１７種すべてが、レクチン経路Ｃ３コンバターゼアッセイにおいてＣ３コンバターゼ形成の本質的に完全な阻害をもたらした。図１１Ａは、Ｆａｂ２抗体＃１１についてのＣ３コンバターゼ形成アッセイの結果をグラフで図示しており、Ｆａｂ２抗体＃１１は、試験された他のＦａｂ２抗体の代表例であり、その結果は、表６に示されている。これは、各ＭＡＳＰ−２分子が「遮断」Ｆａｂ２に結合しているときでさえも、そのＦａｂ２がわずかしかＭＡＳＰ−２機能を阻害することができないことが理論的にあり得るので、重要な検討材料である。
【０４５６】
マンナンは、レクチン経路の公知のアクチベーターであるが、ラット血清中に抗マンナン抗体が存在することによってもまた、古典経路が活性化され得、そして、古典経路Ｃ３コンバターゼを介してＣ３ｂを生成し得ることが理論的にあり得る。しかしながら、この実施例において列挙された１７種の遮断抗ＭＡＳＰ−２  Ｆａｂ２の各々は、Ｃ３ｂ生成を強力に阻害する（＞９５％）ので、このアッセイのレクチン経路Ｃ３コンバターゼに対する特異性を示す。
【０４５７】
各々に対する見かけのＫｄを計算するために、結合アッセイをまた遮断Ｆａｂ２の１７種すべてを用いて行った。その遮断Ｆａｂ２のうちの６種については、ネイティブラットＭＡＳＰ−２に対する抗ラットＭＡＳＰ−２  Ｆａｂ２の結合アッセイの結果をまた、表６に示す。図１１Ｂは、Ｆａｂ２抗体＃１１を用いた結合アッセイの結果をグラフで図示している。他のＦａｂ２に対して同様の結合アッセイをまた行い、その結果を表６に示す。概して、「ネイティブ」ＭＡＳＰ−２に対する６種のＦａｂ２の各々の結合性について得られた見かけのＫｄは、Ｃ３コンバターゼ機能的アッセイにおけるＦａｂ２に対するＩＣ５０と合理的に十分対応する。ＭＡＳＰ−２が、そのプロテアーゼ活性の活性化時に「不活性型」から「活性型」に変化する立体配座の変化を起こすという証拠がある（Ｆｅｉｎｂｅｒｇら、ＥＭＢＯ  Ｊ  ２２：２３４８−５９（２００３）；Ｇａｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：３３４３５−４４（２００５））。Ｃ３コンバターゼ形成アッセイに使用される正常なラット血漿では、ＭＡＳＰ−２は、主に「不活性な」チモーゲン立体配座で存在する。対照的に、結合アッセイにおいて、ＭＡＳＰ−２は、固定化マンナンに結合したＭＢＬとの複合体の一部として存在する；したがって、ＭＡＳＰ−２は、「活性な」立体配座であり得る（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５７：１０７−１６，２００１）。その結果として、Ｆａｂ２は、各アッセイにおいて異なる立体配座の形態のＭＡＳＰ−２に結合性であり得るので、これらの２つの機能的アッセイにおいて試験された１７種の遮断Ｆａｂ２の各々についてのＩＣ５０とＫｄとの正確な対応は、必ずしも予想されない。それにもかかわらず、Ｆａｂ２＃８８を除いては、２つのアッセイにおいて試験された他の１６種のＦａｂ２の各々についてのＩＣ５０と見かけのＫｄとの間において合理的に近い対応が存在するようである（表６を参照のこと）。
【０４５８】
ＭＡＳＰ−２媒介性のＣ４切断の阻害について、遮断Ｆａｂ２のいくつかを評価した。図１１Ｃは、ＩＣ５０＝０．８１ｎＭでＦａｂ２＃４１を用いた阻害を示すＣ４切断アッセイの結果をグラフで図示している（表６を参照のこと）。図１２に示される通りに、試験されたＦａｂ２のすべては、Ｃ３コンバターゼアッセイにおいて得られるものと同様のＩＣ５０でＣ４切断を阻害することが見出された（表６を参照のこと）。
【０４５９】
マンナンは、レクチン経路の公知のアクチベーターであるが、ラット血清中に抗マンナン抗体が存在することによってもまた、古典経路が活性化され得、それによって、Ｃ４のＣ１ｓ媒介性切断によってＣ４ｂが生成されることが理論的にあり得る。しかしながら、Ｃ４ｂ生成を強力に阻害（＞９５％）するいくつかの抗ＭＡＳＰ−２  Ｆａｂ２が同定され、したがってこのアッセイのＭＡＳＰ−２媒介性Ｃ４切断に対する特異性が示される。Ｃ３と同様にＣ４は、その構造の一部として、反応性の高い独特のチオエステル基を含む。このアッセイにおいてＭＡＳＰ−２がＣ４を切断するとき、Ｃ４ｂ上のチオエステル基は、プラスチックウェルの底面上に固定化された高分子上のヒドロキシル基またはアミノ基とエステル結合またはアミド結合を介して共有結合を形成することができ、したがってＥＬＩＳＡアッセイにおけるＣ４ｂの検出を容易にし得る。
【０４６０】
これらの研究によって、Ｃ４とＣ３の両方のコンバターゼ活性を機能的に遮断するラットＭＡＳＰ−２タンパク質に対する高親和性ＦＡＢ２が生成され、それによって、レクチン経路の活性化が妨害されることが明らかに証明された。
【０４６１】
（実施例２５）
この実施例では、実施例２４に記載されている通りに作製された遮断抗ラットＭＡＳＰ−２  Ｆａｂ２抗体のいくつかに対するエピトープマッピングを説明する。
【０４６２】
方法：
図１３に示される通りに、ｐＥＤ４ベクターを使用して、以下のタンパク質（すべてがＮ末端に６×Ｈｉｓタグを有する）をＣＨＯ細胞において発現させた：
活性中心におけるセリンをアラニンに変化させる（Ｓ６１３Ａ）ことによって不活性化された完全長ＭＡＳＰ−２タンパク質であるラットＭＡＳＰ−２Ａ；
自己活性化を減少させるように変化させた（Ｒ４２４Ｋ）完全長ＭＡＳＰ−２タンパク質であるラットＭＡＳＰ−２Ｋ；
ＣＵＢＩドメイン、ＥＧＦ様ドメインおよびＣＵＢＩＩドメインのみを含むラットＭＡＳＰ−２のＮ末端フラグメントであるＣＵＢ１−ＩＩ；ならびに
ＣＵＢＩおよびＥＧＦ様ドメインのみを含むラットＭＡＳＰ−２のＮ末端フラグメントであるＣＵＢＩ／ＥＧＦ様。
【０４６３】
先に報告されているように（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２５８９４−０２（２００１））ニッケルアフィニティークロマトグラフィによって、これらのタンパク質を培養上清から精製した。
【０４６４】
ラットＭＡＳＰ−２のＣＣＰＩＩおよびセリンプロテアーゼドメインを含むＣ末端ポリペプチド（ＣＣＰＩＩ−ＳＰ）を、ｐＴｒｘＦｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、チオレドキシン融合タンパク質としてＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。Ｔｈｉｏｂｏｎｄ親和性樹脂を使用して、タンパク質を細胞可溶化物から精製した。ネガティブコントロールとして空のｐＴｒｘＦｕｓからチオレドキシン融合パートナーを発現させた。
【０４６５】
すべての組換えタンパク質をＴＢＳ緩衝液に透析し、それらの濃度を、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することによって決定した。
【０４６６】
ドットブロット解析：
上に記載し、そして図１３に示される５つの組換えＭＡＳＰ−２ポリペプチド（およびＣＣＰＩＩ−セリンプロテアーゼポリペプチドに対するネガティブコントロールとしてのチオレドキシンポリペプチド）の段階希釈物をニトロセルロース膜上にスポットした。スポットしたタンパク質の量は、５倍の段階で１００ｎｇ〜６．４ｐｇの範囲であった。後の実験では、スポットしたタンパク質の量は、５０ｎｇに低下させた量から再度５倍の段階で１６ｐｇまでの範囲であった。膜をＴＢＳ中の５％スキムミルク粉末（ブロッキング緩衝液）でブロッキングし、次いで、ブロッキング緩衝液（５．０ｍＭ  Ｃａ２＋を含む）中１．０μｇ／ｍｌ抗ＭＡＳＰ−２  Ｆａｂ２とともにインキュベートした。ＨＲＰ結合体化抗ヒトＦａｂ（ＡｂＤ／Ｓｅｒｏｔｅｃ；１／１０，０００希釈）およびＥＣＬ検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、結合しているＦａｂ２を検出した。１枚の膜を、ポジティブコントロールとしてポリクローナルウサギ抗ヒトＭＡＳＰ−２Ａｂ（Ｓｔｏｖｅｒら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６３：６８４８−５９（１９９９）に記載されているもの）とインキュベートした。この場合、ＨＲＰ結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｄａｋｏ；１／２，０００希釈）を使用して、結合しているＡｂを検出した。
【０４６７】
ＭＡＳＰ−２結合アッセイ
ＥＬＩＳＡプレートを、炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）中の組換えＭＡＳＰ−２ＡまたはＣＵＢＩ−ＩＩポリペプチドを１．０μｇ／ウェルで４℃において一晩コーティングした。ウェルをＴＢＳ中１％ＢＳＡでブロッキングし、次いで、５．０ｍＭ  Ｃａ２＋を含むＴＢＳ中の抗ＭＡＳＰ−２  Ｆａｂ２の段階希釈物を加えた。そのプレートを室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳ／ｔｗｅｅｎ／Ｃａ２＋で３回洗浄した後、ＴＢＳ／Ｃａ２＋中に１／１０，０００希釈したＨＲＰ結合体化抗ヒトＦａｂ（ＡｂＤ／Ｓｅｒｏｔｅｃ）を加え、そのプレートを室温でさらに１時間インキュベートした。ＴＭＢペルオキシダーゼ基質キット（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して、結合している抗体を検出した。
【０４６８】
結果：
様々なＭＡＳＰ−２ポリペプチドとＦａｂ２との反応性を証明するドットブロット解析の結果を、以下の表７に提供する。表７に提供される数値は、最大半量のおよそのシグナル強度を得るのに必要とされる、スポットされたタンパク質の量を示す。示されるように、これらのポリペプチドのすべて（チオレドキシン融合パートナーのみを除く）は、ポジティブコントロールＡｂ（ウサギにおいて産生されたポリクローナル抗ヒトＭＡＳＰ−２血清）によって認識された。
【０４６９】
【表７】
0005567328.tif 000009
ＮＲ＝無反応。ポジティブコントロール抗体は、ウサギにおいて産生されたポリクローナル抗ヒトＭＡＳＰ−２血清である。
【０４７０】
上記のＦａｂ２のすべてが、ＭＡＳＰ−２ＡならびにＭＡＳＰ−２Ｋ（データ示さず）と反応した。大部分のＦａｂ２が、ＣＣＰＩＩ−ＳＰポリペプチドを認識したが、そのＮ末端フラグメントを認識しなかった。２つの例外は、Ｆａｂ２＃６０およびＦａｂ２＃５７である。Ｆａｂ２＃６０は、ＭＡＳＰ−２ＡおよびＣＵＢＩ−ＩＩフラグメントを認識するが、ＣＵＢＩ／ＥＧＦ様ポリペプチドまたはＣＣＰＩＩ−ＳＰポリペプチドを認識しないことから、Ｆａｂ２＃６０が、ＣＵＢＩＩにおけるエピトープに結合するか、またはＣＵＢＩＩとＥＧＦ様ドメインとにわたるエピトープに結合することが示唆される。Ｆａｂ２＃５７は、ＭＡＳＰ−２Ａを認識するが、試験されたＭＡＳＰ−２フラグメントのいずれも認識せず、このことは、おそらく、このＦａｂ２がＣＣＰＩにおけるエピトープを認識することが示唆される。Ｆａｂ２＃４０および＃４９は、完全なＭＡＳＰ−２Ａにのみ結合した。図１４に示されるＥＬＩＳＡ結合アッセイでは、Ｆａｂ２＃６０もまた、わずかに低い明らかな親和性ではあるがＣＵＢＩ−ＩＩポリペプチドに結合した。
【０４７１】
これらの知見は、ＭＡＳＰ−２タンパク質の複数の領域に対する独特の遮断Ｆａｂ２の同定を示す。
【０４７２】
（実施例２６）
この実施例では、マウス腎虚血／再灌流モデルにおけるＭＡＳＰ−２−／−マウスの解析を説明する。
【０４７３】
背景／理論的根拠：体温での腎臓における虚血−再灌流（Ｉ／Ｒ）損傷は、血液量減少性ショック、腎臓の動脈閉塞およびクロスクランピング（ｃｒｏｓｓ−ｃｌａｍｐｉｎｇ）手技を含む多くの臨床的状態との関連性を有する。
【０４７４】
腎臓虚血−再灌流（Ｉ／Ｒ）は、最大５０％の死亡率に関連する急性腎不全の重要な原因である（Ｌｅｖｙら、ＪＡＭＡ  ２７５：１４８９−９４，１９９６；Ｔｈａｄｈａｎｉら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３４：１４４８−６０，１９９６）。移植後の腎不全は、腎臓の移植後によくある脅威の合併症である（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５８：２５８５−９１，２０００）。腎臓のＩ／Ｒ損傷に対する有効な処置は、現在、利用できず、血液透析が、利用できる唯一の処置である。腎臓のＩ／Ｒ損傷の病態生理学は、複雑である。最近の研究では、補体活性化のレクチン経路が、腎臓のＩ／Ｒ損傷の病原において重要な役割を有し得ると示されている（ｄｅ  Ｖｒｉｅｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１６５：１６７７−８８，２００４）。
【０４７５】
方法：
ＭＡＳＰ−２（−／−）マウスを、実施例１に記載される通りに作製し、少なくとも１０世代にわたってＣ５７Ｂｌ／６と戻し交雑させた。体重が２２〜２５ｇの６匹の雄ＭＡＳＰ−２（−／−）および６匹の野生型（＋／＋）マウスに、Ｈｙｐｎｏｖｅｌ（６．６４ｍｇ／ｋｇ；Ｒｏｃｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌｔｄ．Ｗｅｌｗｙｎ  Ｇａｒｄｅｎ  Ｃｉｔｙ，ＵＫ）を腹腔内注射により投与し、続いてイソフルラン（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．，Ｋｅｎｔ，ＵＫ）の吸入により麻酔した。イソフルランは、最も低い肝臓毒性を有する穏やかな吸入麻酔薬であり；濃度が正確に生産されており、長時間の麻酔の後でさえも動物が迅速に回復するので、イソフルランを選択した。Ｈｙｐｎｏｖｅｌは、動物において神経遮断性鎮痛の状態をもたらし、投与する必要があるイソフルランがより少なくて済むので、Ｈｙｐｎｏｖｅｌを投与した。体温を一定に保つために、温かいパッドを動物の真下に敷いた。次に、腹部正中切開を行い、そして１対の開創器を用いて体腔を開いたままで保持した。結合組織を左右の両方の腎臓の静脈および動脈の上下にずらし、微細動脈瘤クランプを適用することによって、５５分間にわたって腎臓の茎をクランプで締めた。この虚血の時間は、まず、本研究室において行った以前の研究に基づいた（Ｚｈｏｕら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５：１３６３−７１（２０００））。さらに、虚血の力価測定の後、５５分間という標準的な虚血の時間を選択し、５５分間の虚血によって、低死亡率（５％未満）かつ可逆的な一貫した損傷をもたらすことが見出された。閉塞後、０．４ｍｌの温かい食塩水（３７℃）を腹腔内に入れ、次いで、虚血の時間の間、腹部を閉じた。微細動脈瘤クランプを除去した後、血液が腎臓に再度流れることを示唆する色の変化が生じるまで腎臓を観察した。さらなる０．４ｍｌの温かい食塩水を腹腔内に入れ、開口部を縫合したうえで、動物をケージに戻した。尾血液サンプルをクランプ除去の２４時間後に採取し、４８時間後にマウスを屠殺して、さらなる血液サンプルを回収した。
【０４７６】
腎臓損傷の評価：６匹の雄ＭＡＳＰ−２（−／−）マウスおよび６匹のＷＴ（＋／＋）マウスにおいて、再灌流の２４時間および４８時間後に腎機能を評価した。血中クレアチニン測定値を、腎機能の再現性のある指標をもたらす質量分析（感度＜１．０μｍｏｌ／Ｌ）によって測定した。図１５は、再灌流の２４時間後および４８時間後の、野生型Ｃ５７Ｂｌ／６コントロールおよびＭＡＳＰ−２（−／−）に対する血中尿素窒素クリアランスをグラフで図示している。図１５に示される通りに、ＭＡＳＰ−２（−／−）マウスが、野生型コントロールマウスと比較して、２４時間および４８時間において、血中尿素の量の有意な低下を示し、このことは、虚血再灌流損傷モデルにおいて腎臓の損傷から保護する機能的作用を示唆する。
【０４７７】
全般的に見れば、外科的手技および虚血性傷害の２４時間および４８時間後に、ＷＴ（＋／＋）マウスとＭＡＳＰ−２（−／−）マウスの両方において血中尿素の増加が見られた。非虚血性ＷＴ（＋／＋）外科手術動物における血中尿素のレベルは、５．８ｍｍｏｌ／Ｌであると単独で測定された。図１５に示されるデータに加えて、１匹のＭＡＳＰ−２（−／−）動物は、虚血性傷害からのほぼ完全な保護を示し、２４時間および４８時間においてそれぞれ６．８ｍｍｏｌ／Ｌおよび９．６ｍｍｏｌ／Ｌの値であった。この動物を虚血性損傷が存在しなかったかもしれない潜在的な域外値としてこの群の解析から除外した。ゆえに、図１５に示される最終的な解析には、５匹のＭＡＳＰ−２（−／−）マウスおよび６匹のＷＴ（＋／＋）マウスが含まれ、ＭＡＳＰ−２（−／−）マウスにおいて血中尿素の統計学的に有意な低下が２４時間および４８時間において見られた（スチューデントのｔ検定ｐ＜０．０５）。これらの知見から、ＭＡＳＰ−２活性の阻害が、虚血性損傷が原因の腎臓の損傷からの保護的または治療的な効果を有すると予想され得ることが示唆される。
【０４７８】
（実施例２７）
この実施例では、マウス心筋虚血／再灌流モデルにおけるＭＡＳＰ−２（−／−）マウスの解析を説明する。
【０４７９】
背景／理論的根拠：
マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）は、多岐にわたる炭水化物構造に応答して、免疫複合体とは無関係の様式において補体活性化を開始する循環分子である。これらの構造物は、感染性物質または特に壊死細胞、腫脹細胞もしくはアポトーシス細胞の内部の変化した内在性炭水化物部分の成分であり得る。これらの細胞死の形態は、再灌流された心筋層において生じ、補体の活性化は、虚血が再灌流によって終結するときに存在する境界を越えて損傷を広げ得る。補体の活性化が、心筋の再灌流を悪化させるという有力な証拠が存在するが、そのような活性化の機構は、十分に理解されておらず、すべての公知の経路の阻害が、容認し得ない有害作用を有し得る。最近の研究では、梗塞が、ＭＢＬ（Ａ／Ｃ）ヌルマウスにおいて減少したが、Ｃ１ｑヌルマウスでは減少しなかったので、活性化は、古典経路または副経路の増幅ループ（本発明において定義されるような）ではなくＭＢＬに関与し得ることが示唆されている（Ｗａｌｓｈ  Ｍ．Ｃ．ら、Ｊｏｕｒ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：５４１−５４６（２００５））。しかしながら、これらのマウスは、有望ではあるが、レクチン経路を介して補体を活性化できる循環成分（例えば、フィコリンＡ）を依然として有する。
【０４８０】
この研究では、ＭＡＳＰ−２（−／−）は、心筋の虚血および再灌流損傷に対する感受性が低いか否かを判定するために、野生型（＋／＋）コントロールに対してＭＡＳＰ−２（−／−）マウスを調べた。ＭＡＳＰ−２（−／−）マウスを領域性の虚血に供し、そして梗塞のサイズをその野生型同腹仔と比較した。
【０４８１】
方法：以下のプロトコルは、Ｍａｒｂｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．９５：１４４６−１４５６（１９９５））によって先に記載された、虚血／再灌流損傷を誘導するための手順に基づくものであった。
【０４８２】
ＭＡＳＰ−２（−／−）マウスを、実施例１に記載される通りに作製し、少なくとも１０世代にわたってＣ５７Ｂｌ／６と戻し交雑させた。７匹のＭＡＳＰ−２（−／−）マウスおよび７匹の野生型（＋／＋）マウスを、ケタミン／メデトミジン（それぞれ１００ｍｇ／ｋｇおよび０．２ｍｇ／ｋｇ）を用いて麻酔し、直腸温度を３７±０．３℃に保つために自動温度制御の加温パッド上に仰臥位で配置した。そのマウスを直視下で挿管し、呼吸数１１０／分および一回換気量２２５μｌ／分で室内空気により換気した（Ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒ−Ｈｕｇｏ  Ｓａｃｈｓ  Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｃ  ＭｉｎｉＶｅｎｔ  Ｔｙｐｅ  ８４５，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【０４８３】
剃毛し、前外側の皮膚切開を左腋窩から剣状突起まで行った。大胸筋を、切開し、胸骨の縁にて切断し、腋窩に移動させた。小胸筋を、その頭側の縁にて切断し、尾側に移動させた。その後、その筋肉を、冠状動脈閉塞中に心臓を覆う筋肉弁として使用した。第５肋間腔および壁側胸膜の筋肉を、左肺の縁に対してわずかに中央の位置においてピンセットを用いて穿通することにより、肺または心臓の損傷を回避した。胸膜の穿通の後、ピンセットを、心臓に触れることなく慎重に胸骨のほうに胸膜の上に向け、電池式焼灼機（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，ＵＫ）を用いて胸膜および肋間筋を切開した。いかなる出血も回避するために特に注意した。同じ手法を使用して、腋窩中線まで開胸を延長した。胸骨の縁において第４肋骨を切断することによって、心臓全体が基部から尖まで露出するまで肋間腔を広げた。２つの小さい動脈鉗子を用いて、心膜を開き、心臓がわずかに前に移動するように心臓周囲に離被架を適合させた。左前下行枝（ＬＡＤ）を露出させ、次いで、丸針を備えた８−０モノフィラメント縫合糸をＬＡＤの下に通した。ＬＡＤの結紮部位は、房室性の稜（ａｔｒｉｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｃｒｅｓｔ）から左心室の先端にかけての線に沿って約１／４だけ左心房の先端の尾側である。
【０４８４】
すべての実験を盲検様式で行い、研究者は、各動物の遺伝子型を知らなかった。器具使用および外科的手技の終了後、マウスに１５分間の平衡時間を与えた。次いで、マウスを３０分間の冠状動脈閉塞および１２０分間の再灌流時間に供した。
【０４８５】
冠状動脈閉塞および再灌流モデル
冠状動脈閉塞は、以前に報告されているように（Ｅｃｋｌｅら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９１：Ｈ２５３３−Ｈ２５４０，２００６）懸垂加重（ｈａｎｇｉｎｇ  ｗｅｉｇｈｔ）系を使用して達成された。モノフィラメント結紮糸の両端をポリテンＰＥ−１０管状物の２ｍｍ長の片に通し、そしてシアノアクリレート接着剤を用いてある長さの５−０縫合糸に接着させた。次いで、その縫合糸を水平に載せられた２本の可動性金属棒の上に置き、各１ｇの塊をその縫合糸の両端に接着させた。その棒を持ち上げることによって、その塊が吊され、規定された定圧でＬＡＤを閉塞させるように制御された張力のもとで縫合糸が配置した。危険領域（ａｒｅａ  ａｔ  ｒｉｓｋ）が蒼白になること、すなわち、ＬＡＤ灌流帯域の色が鮮赤色から紫色に変化し、血流の中断が示唆されることによって、ＬＡＤ閉塞を確かめた。上記塊が手術パッド上に置かれ、そして結紮糸の張力が解放されるまでその棒を下げることによって、再灌流を達成した。閉塞を確かめるのに使用したのと同じ３つの基準によって再灌流を確かめた。それぞれ冠状動脈閉塞の開始時または再灌流の１５分以内に３つすべての基準が満たされない場合は、マウスをさらなる解析から排除した。冠状動脈閉塞中は、心臓を小胸筋弁で覆い、そして０．９％食塩水に湿られたガーゼで開胸を塞ぐことによって、心臓表面の温度および湿度を維持した。
【０４８６】
心筋の梗塞サイズの測定：
梗塞サイズ（ＩＮＦ）および危険領域（ＡＡＲ）をプラノメトリー（ｐｌａｎｏｍｅｔｒｙ）によって測定した。５００Ｉ．Ｕ．ヘパリンをｉ．ｖ．注射した後、ＬＡＤを再度閉塞し、３００μｌの５％（ｗ／ｖｏｌ）Ｅｖａｎｓ  Ｂｌｕｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）をゆっくりと頸静脈に注射することによって、危険領域（ＡＡＲ）を明確にした。これは、左心室の非虚血性領域に色素が入ることによって生じ、虚血性ＡＡＲは染色されないままである。マウスを頸椎脱臼によって安楽死させた後、心臓を迅速に取り出す。その心臓を氷上で冷却し、５％アガロースの塊の上に載せ、次いで、８枚の８００μｍ厚の横断切片に切断する。ｐＨ７．４に調節された０．１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液中に溶解した３％２，３，５−塩化トリフェニルテトラゾリウム（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）とともに３７℃で２０分間、すべての切片をインキュベートした。切片を１０％ホルムアルデヒド中で一晩固定した。切片を２枚のカバーガラスの間に置き、各切片の側面を、高分解能の光学的スキャナーを用いて、デジタル方式で撮像した。次いで、そのデジタル画像を、ＳｉｇｍａＳｃａｎソフトウェア（ＳＰＳＳ，ＵＳ）を用いて解析した。梗塞領域（蒼白色）、左心室（ＬＶ）危険領域（赤色）および正常に灌流されていたＬＶ領域（青色）のサイズの概要を、それらの色の外観および色の境界を同定することによって、各切片において概説した。面積を各切片の両側面において数値化し、研究者が平均した。各動物の危険帯域の％として梗塞サイズを計算した。
【０４８７】
結果：梗塞領域（蒼白色）、ＬＶ危険領域（赤色）および正常に灌流されていたＬＶ帯域（青色）のサイズの概要を、それらの色の外観および色の境界を同定することによって、各切片においてとらえた。面積を各切片の両側面において数値化し、研究者が平均した。各動物の危険帯域の％として梗塞サイズを計算した。図１６Ａは、上に記載した冠状動脈閉塞および再灌流手法を経験した後の７匹のＷＴ（＋／＋）マウスおよび７匹のＭＡＳＰ−２（−／−）マウスの梗塞サイズの測定についての評価を示している。図１６Ａに示される通りに、ＭＡＳＰ−２（−／−）マウスは、野生型（＋／＋）マウスに対して、梗塞サイズの統計学的に有意な減少（ｐ＜０．０５）を示したことから、虚血再灌流損傷モデルにおける損傷からの保護的な心筋の作用が示唆される。図１６Ｂは、試験された個別の動物の分布を示しており、ＭＡＳＰ−２（−／−）マウスに対しての明らかな保護的作用が示唆される。
【０４８８】
（実施例２８）
この実施例では、マウス黄斑変性症モデルにおけるＭＡＳＰ−２−／−の結果を説明する。
【０４８９】
背景／理論的根拠：加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）は、工業世界において５５歳を超えた後の失明の主要な原因である。ＡＭＤには、血管新生（滲出型）ＡＭＤおよび萎縮性（非滲出型）ＡＭＤという２つの主な形態がある。血管新生型（滲出型）は、ＡＭＤに関連する重篤な視力喪失の９０％を占めるが、ＡＭＤを有する個体の約２０％だけが滲出型を発症する。ＡＭＤの臨床上の顕著な特徴としては、複数のドルーゼン、地図状萎縮および脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）が挙げられる。２００４年１２月に、ＦＤＡは、滲出型（血管新生）のＡＭＤを処置するための、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を特異的に標的化し、その作用を遮断する新しいクラスの眼科薬物であるＭａｃｕｇｅｎ（ペガプタニブ（ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ））を承認した（Ｎｇら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ５：１２３−３２（２００６））。Ｍａｃｕｇｅｎは、ＡＭＤ患者サブグループに対する有望な新しい治療的な選択肢であるが、この複雑な疾患に対するさらなる処置を開発することが急務である。複数の独立した系統の研究が、ＡＭＤの病原における補体の活性化に対する中心的な役割を関係付けている。ＡＭＤの最も重篤な形態である脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）の病原は、補体経路の活性化に関与し得る。
【０４９０】
２５年前に、Ｒｙａｎは、動物におけるＣＮＶのレーザー誘発損傷モデルを報告した（Ｒｙａｎ，Ｓ．Ｊ．，Ｔｒ．Ａｍ．Ｏｐｔｈ．Ｓｏｃ．ＬＸＸＶＩＩ：７０７−７４５，１９７９）。このモデルは、最初にアカゲザルを使用して開発されたが、マウスを含む種々の研究動物において同様のＣＮＶのモデルを開発するために同じ技術が使用された（Ｔｏｂｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５３：１６４１−４６，１９９８）。このモデルでは、ＣＮＶ様膜の形成をもたらす作用であるレーザー光凝固術を使用して、ブルッフ膜を破壊する。レーザー誘発モデルは、ヒトの状態の重要な特徴の多くを捕らえる（最近の概説については、Ａｍｂａｔｉら、Ｓｕｒｖｅｙ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ４８：２５７−２９３，２００３を参照のこと）。このレーザー誘発マウスモデルは、現在、十分に確立されており、大規模かつますます多くの研究プロジェクトにおいて実験的基礎として使用されている。このレーザー誘発モデルは、このモデルを使用した病原および薬物阻害に関する前臨床試験が、ヒトにおけるＣＮＶと関連するのに十分な程度でヒトにおけるＣＮＶと生物学的類似性を共有することが一般に認められている。
【０４９１】
方法：
ＭＡＳＰ−２−／−マウスを、実施例１に記載される通りに作製し、１０世代にわたってＣ５７Ｂｌ／６と戻し交雑させた。現在の研究では、ＭＡＳＰ−２（−／−）およびＭＡＳＰ−２（＋／＋）の雄マウスをレーザー誘発ＣＮＶの経過において評価するときの結果（組織損傷の尺度として走査型レーザー共焦点顕微鏡によるレーザー誘発ＣＮＶの体積に注目した血管新生ＡＭＤの加速されたモデル、および、レーザー損傷後の網膜色素上皮（ＲＰＥ）／脈絡膜における、ＣＮＶに関わる強力な血管新生因子であるＶＥＧＦのレベルのＥＬＩＳＡによる測定）を比較した。
【０４９２】
脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）の誘発：レーザー光凝固術（５３２ｎｍ、２００ｍＷ、１００ｍｓ、７５μｍ；Ｏｃｕｌｉｇｈｔ  ＧＬ，Ｉｒｉｄｅｘ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を、薬物群の割り当てについてマスクされた１人の人物が０日目に各動物の両眼に対して行った。細隙灯送達系およびコンタクトレンズとしてカバーガラスを使用して、視神経の周辺において標準化された様式でレーザースポットを適用した。レーザー損傷の形態的なエンドポイントは、ブルッフ膜の破壊と相関すると考えられている徴候であるキャビテーション気泡の出現であった。詳細な方法および評価したエンドポイントは、以下のとおりである。
【０４９３】
フルオレセイン血管造影法：レーザー光凝固術の１週間後に、カメラおよび結像系（ＴＲＣ  ５０  １Ａカメラ；ＩｍａｇｅＮｅｔ  ２．０１システム；Ｔｏｐｃｏｎ，Ｐａｒａｍｕｓ，ＮＪ）を用いてフルオレセイン血管造影法を行った。０．１ｍｌの２．５％フルオレセインナトリウムを腹腔内注射した後に、眼底カメラレンズと接触した２０−Ｄレンズを用いて写真を捕捉した。レーザー光凝固術または血管造影法に関係のない網膜の専門家が、マスク化様式で単一の着座時間（ｓｉｔｔｉｎｇ  ｔｉｍｅ）においてそのフルオレセイン血管造影図を評価した。
【０４９４】
脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）の体積：レーザー損傷の１週間後に、眼を摘出し、そして４℃で３０分間，４％パラホルムアルデヒドを用いて固定した。前側セグメントを除去することによってアイカップを得て、ＰＢＳ中で３回洗浄した後、メタノール系列に通して脱水および再水和した。室温において３０分間、緩衝液（１％ウシ血清アルブミンおよび０．５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ）で２回ブロッキングした後、０．２％ＢＳＡおよび０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳで希釈した０．５％ＦＩＴＣ−イソレクチンＢ４（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）（内皮細胞の表面上の末端のβ−Ｄ−ガラクトース残基に結合し、マウスの脈管構造を選択的に標識する）とともにアイカップを４℃で一晩インキュベートした。０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳで２回洗浄した後、感覚神経の網膜を丁寧に剥離し、そして視神経から切断した。４つの弛緩させる放射状の切開を行い、残ったＲＰＥ−脈絡膜−強膜複合体を退色防止剤（ａｎｔｉｆａｄｅ  ｍｅｄｉｕｍ）（Ｉｍｍｕ−Ｍｏｕｎｔ  Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中に平らに載せ、そしてカバーガラスを載せた。
【０４９５】
走査型共焦点レーザー顕微鏡（ＴＣＳ  ＳＰ；Ｌｅｉｃａ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて平らに載せたものを調べた。青色のアルゴン波長（４８８ｎｍ）で励起させ、そして５１５〜５４５ｎｍの発光を捕捉することによって血管を可視化した。すべての撮像研究について、４０×油浸対物レンズを使用した。ＲＰＥ−脈絡膜−強膜複合体の表面から水平な光学切片（１μｍ段階）を得た。病変に接続されている周囲の脈絡膜の血管網を同定することができる最も深い焦平面を、病変の底であると判断した。この参照平面の表面にある、レーザーが標的化する領域における任意の血管をＣＮＶと判断した。各切片の像をデジタル的に保存した。ＣＮＶに関連した蛍光の領域を、顕微鏡ソフトウェア（ＴＣＳ  ＳＰ；Ｌｅｉｃａ）を用いて、コンピュータ化された画像解析によって測定した。各水平切片における蛍光の領域全体の総和をＣＮＶの体積についての指標として使用した。処置群の割り当てについてマスクされた操作者が撮像を行った。
【０４９６】
ＣＮＶを発症する各レーザー病変を起こす確率は、それが属する群（マウス、眼およびレーザースポット）によって影響を受けるので、分割プロット反復測定デザインを用いる線形混合モデルを使用して平均病変体積を比較した。全体のプロット因子は、その動物が属する遺伝群であったのに対し、分割プロット因子は、眼であった。０．０５水準で統計的有意性を決定した。多重比較に対するボンフェローニの調整を用いて、平均値の事後比較を構築した。
【０４９７】
ＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡ。１２個のレーザースポットによる損傷の３日後に、溶解緩衝液（プロテアーゼインヒビターを含む、２０ｍＭイミダゾールＨＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣＬ２、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭモリブデン酸Ｎａおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中において、氷上で１５分間、ＲＰＥ−脈絡膜複合体を超音波処理した。４５０〜５７０ｎｍ（Ｅｍａｘ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）においてすべてのスプライス改変体を認識するＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）によって、上清中のＶＥＧＦタンパク質レベルを測定し、そして全タンパク質に対して正規化した。光凝固術、撮像または血管造影法に関係のない操作者が、マスク化様式で２つ組の測定を行った。ＶＥＧＦの数値を、少なくとも３回の独立した実験の平均値＋／−ＳＥＭとして表し、マン・ホイットニーＵ検定を使用して比較した。帰無仮説は、Ｐ＜０．０５において棄却された。
【０４９８】
結果：
ＶＥＧＦレベルの評価：
図１７Ａは、０日目のＣ５７Ｂｌ６野生型マウスおよびＭＡＳＰ−２（−／−）マウスから単離されたＲＰＥ−脈絡膜複合体におけるＶＥＧＦタンパク質レベルをグラフで図示している。図１７Ａに示される通りに、ＶＥＧＦレベルの評価は、Ｃ５７ｂｌ野生型コントロールマウスに対してＭＡＳＰ−２（−／−）マウスにおけるＶＥＧＦに対するベースラインレベルの低下を示唆する。図１７Ｂは、レーザー誘発性損傷の３日後に測定されたＶＥＧＦタンパク質レベルをグラフで図示している。図１７Ｂに示される通りに、ＶＥＧＦレベルは、レーザー誘発性損傷の３日後に、野生型（＋／＋）マウスにおいて有意に上昇し、このことは、公開されている研究（Ｎｏｚａｋｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３：２３２８−３３（２００６））と一致する。しかしながら、驚いたことに、ＭＡＳＰ−２（−／−）マウスにおいて非常に低いレベルのＶＥＧＦが見られた。
【０４９９】
脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）の評価：
レーザー誘発性黄斑変性症の後のＶＥＧＦレベルの低下に加えて、レーザー損傷の前後においてＣＮＶ領域を測定した。図１８は、レーザー誘発性損傷の７日後にＣ５７ｂｌ野生型マウスおよびＭＡＳＰ−２（−／−）マウスにおいて測定されたＣＮＶ体積をグラフで図示している。図１８に示される通りに、ＭＡＳＰ−２（−／−）マウスは、野生型コントロールマウスと比較して、レーザー誘発性損傷の７日後にＣＮＶ領域の約３０％の減少を示した。
【０５００】
これらの知見から、野生型（＋／＋）コントロールに対してＭＡＳＰ（−／−）マウスにおいて見られたようなＶＥＧＦおよびＣＮＶの減少、ならびに、インヒビターを用いたＭＡＳＰ−２の遮断が黄斑変性症の処置において予防的または治療的な効果を有し得ることが示唆される。
【０５０１】
（実施例２９）
この実施例では、マウスモノクローナル抗体誘導性関節リウマチモデルにおけるＭＡＳＰ−２（−／−）の結果を説明する。
【０５０２】
背景／理論的根拠：関節リウマチ（ＲＡ）で最もよく使用される動物モデルは、コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）である（最近の概説については、Ｌｉｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｍｏｒｇａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：９０５−１４，１９９９を参照のこと）。ＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）は、関節の基質タンパク質の主な構成要素の１つであり、アジュバント中のネイティブＣＩＩで免疫すると、関節軟骨におけるＣＩＩに対する交差反応性の自己免疫性応答によって自己免疫性の多発性関節炎が誘導される。ＲＡにおいてみられるように、ＣＩＡに対する感受性は、ある特定のクラスＩＩ  ＭＨＣ対立遺伝子の発現と関連付けられている。Ｃ５７Ｂｌ／６系統を含むマウスのいくつかの系統は、適切なＭＨＣハプロタイプを欠いており、故に、高い抗ＣＩＩ抗体価をもたらさないので、従来のＣＩＡに抵抗性である。しかしながら、ＩＩ型コラーゲンに対する４つの特異的なモノクローナル抗体の混合物をマウスにｉ．ｖ．投与またはｉ．ｐ．投与することによって、すべてのマウスの系統において一貫した関節炎が誘導され得ることが見出されている。これらの関節炎惹起（ａｒｔｈｒｉｄｏｇｅｎｉｃ）モノクローナル抗体は、市販されている（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）。ＣＩＡのこの受動伝達モデルは、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス系統を用いた、多くの最近公開された報告において首尾よく使用されている（Ｋａｇａｒｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１４５９−６６，２００２；Ｋａｔｏら、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．３０：２４７−５５，２００３；Ｂａｎｄａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：１９０４−１２，２００６）。以下の研究では、ＣＩＡの受身伝達モデルを使用した関節炎の発症に対する野生型（＋／＋）（ＷＴ）マウスおよびＭＡＳＰ−２（−／−）マウス（両方が、Ｃ５７Ｂｌ／６遺伝的背景を共有する）の感度を比較した。
【０５０３】
方法：
動物：ＭＡＳＰ−２（−／−）マウスを、実施例１に記載される通りに作製し、１０世代にわたってＣ５７Ｂｌ／６と戻し交雑させた。抗体注射の時点で７〜８週齢であった１４匹の雄および雌のＣ５７ＢＬ／６野生型マウス、ならびに、抗体注射の時点で７〜８週齢であった１０匹の雄および雌のＭＡＳＰ−２（−／−）および野生型（＋／＋）のＣ５７Ｂｌ／６マウスをこの研究に使用した。２０匹のマウスにモノクローナル抗体混合物を注射し、２０匹の確かな反応体（１０匹の２群）を得た。その動物（１０匹／群）を５匹／ケージで収容し、研究を開始する前に５〜７日間順化させた。
【０５０４】
０日目および１日目にモノクローナル抗体混合物（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ，Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＷＡ）（５ｍｇ）をマウスの静脈内に注射した。その試験薬剤は、モノクローナル抗体＋Ｃｈｏｎｄｒｅｘ製のＬＰＳであった。２日目に、マウスにＬＰＳをｉｐ投薬した。０日目、２日目、４日目、６日目、８日目、１０日目、１２日目および１４日目の終了前にマウスの体重を測定した。１４日目に、マウスをイソフルランで麻酔し、そして最後に血清を得るために出血させた。血液を回収した後、マウスを安楽死させ、膝を含む前肢と後肢の両方を取り出し、それを今後の処理のためにホルマリン中に入れた。
【０５０５】
処置群：
群１（コントロール）：系統Ｃ５７／ＢＬ／６  ＷＴ（＋／＋）の４匹のマウス；
群２（試験）：系統Ｃ５７／ＢＬ／６  ＷＴ（＋／＋）の１０匹のマウス（ｍＡｂ混合物＋ＬＰＳが投与された）；および
群３（試験）：系統Ｃ５７／ＢＬ／ＭＡＳＰ−２ＫＯ／６Ａｉ（−／−）の１０匹のマウス（ｍＡｂ混合物＋ＬＰＳが投与された）
以下のスコア付けシステムを用いて、臨床上の関節炎のスコアを毎日評価した：０＝正常；１＝後足または前足のうちの１つの関節が罹患；２＝後足または前足のうちの２つの関節が罹患；３＝後足または前足のうちの３つの関節が罹患；４＝中等度（紅斑および中等度の腫脹または４つの指関節が罹患）；５＝重篤（びまん性紅斑および足全体の重篤な腫脹、指を曲げることができない）。
【０５０６】
結果：
図１９は、２週間までにわたって毎日の臨床上の関節炎スコアの平均値についてプロットした群データを示す。ＣｏＬ２  ＭｏＡｂ処置を受けなかったコントロール群において臨床上の関節炎スコアは、見られなかった。ＭＡＳＰ（−／−）マウスは、９日目〜１４日目において、より低い臨床上の関節炎スコアを有した。曲線下面積解析（ＡＵＣ）による臨床上の関節炎スコア全体は、ＭＡＳＰ−２（−／−）群において、ＷＴ（＋／＋）マウスに対して２１％の減少を示した。しかしながら、先に述べたようなＣ５７Ｂｌ６マウスのバックグラウンドは、全体的に頑健な関節炎臨床スコアをもたらさなかった。発生率が低く、群のサイズが小さいことに起因して、もたらされたデータは、正の傾向を示したが、僅かな傾向を示すだけで（ｐ＝０．１）、ｐ＜０．０５レベルにおいて統計学的に有意ではなかった。統計的有意性を示すためには、処置群のさらなる動物が必要であった。関節炎の発生率が低かったので、罹患した足のスコアを重症度に対して評価した。３より大きい臨床上の関節炎スコアの単一発生は、ＭＡＳＰ−２（−／−）マウスのいずれにおいても見られなかったが、ＷＴ（＋／＋）マウスの３０％に見られたことから、（１）関節炎の重症度が、補体経路の活性化に関連し得ること、および（２）ＭＡＳＰ−２の遮断によって、関節炎における有益な効果がもたらされ得ることがさらに示唆される。
【０５０７】
（実施例３０）
この実施例では、低分子マンノース結合レクチン関連タンパク質（Ｍａｐ  １９またはｓＭＡＰ）が、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化のインヒビターであることを説明する。
【０５０８】
背景／理論的根拠：
要約：
マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）およびフィコリンは、先天免疫において作用するパターン認識タンパク質であり、ＭＢＬ関連セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）を介してレクチン補体経路の活性化を引き起こす。レクチン経路の活性化の際に、ＭＡＳＰ−２は、Ｃ４およびＣ２を切断する。ＭＡＳＰ−２の切断型である低分子ＭＢＬ関連タンパク質（ｓＭＡＰ）は、ＭＢＬ／フィコリン−ＭＡＳＰ複合体とも関連する。ｓＭＡＰの役割を明らかにするために、本発明者らは、ｓＭＡＰ特異的エキソンの標的破壊によってｓＭＡＰ欠損（ｓＭＡＰ−／−）マウスを作製した。遺伝子破壊に起因して、ＭＡＳＰ−２の発現レベルは、ｓＭＡＰ−／−マウスにおいて低下した。組換えｓＭＡＰ（ｒｓＭＡＰ）および組換えＭＡＳＰ−２（ｒＭＡＳＰ−２）が、欠損血清中でＭＢＬ−ＭＡＳＰ−ｓＭＡＰ複合体を再構成するとき、ＭＢＬに対するこれらの組換え体の結合性は、競合し、そしてｒＭＡＳＰ−２を加えることによってＭＢＬ−ＭＡＳＰ−ｓＭＡＰ複合体のＣ４切断活性が回復したのに対し、ｒｓＭＡＰを加えることによってその活性は減弱した。したがって、Ｃ４およびｓＭＡＰの活性化にとって不可欠であるＭＡＳＰ−２は、レクチン経路の活性化において調節性の役割を果たす。
【０５０９】
導入：
補体系は、タンパク質複合体のタンパク質分解および構築の連鎖反応を媒介し、先天免疫系と適応性免疫系の両方の一部として生体防御において主要な役割を果たしている。哺乳動物の補体系は、３つの活性化経路、すなわち、古典経路、副経路およびレクチン経路からなる（Ｆｕｊｉｔａ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３４６−３５３（２００２）；Ｗａｌｐｏｒｔ，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４４：１０５８−１０６６（２００１））。レクチン経路は、侵入病原体に対する防御の主要な第１線を提供する。この経路の病原体認識成分であるマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）およびフィコリンは、細菌、ウイルスおよび寄生生物の表面上の炭水化物の配列に結合し、ＭＢＬ関連血清プロテアーゼ（ＭＡＳＰ）を活性化することにより、下流の反応カスケードを誘発する。先天性の免疫防御に対するレクチン経路の重要性は、ＭＢＬ欠損と、特に適応性免疫系が確立される前の幼児期において種々の感染症に対する高い感受性とを関連づける多くの臨床研究によって強調されている（Ｊａｃｋら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  １８０：８６−９９（２００１）；Ｎｅｔｈら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６８：６８８−６９３（２０００）；Ｓｕｍｍｅｒｆｉｅｌｄら、Ｌａｎｃｅｔ  ３４５：８８６−８８９（１９９５）；Ｓｕｐｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ  ２：１２３６−１２３９（１９８９））。しかしながら、レクチン経路は、心臓および腎臓における虚血／灌流損傷を含む多くの病理学的な状態における炎症および組織の損傷に関与する補体の望ましくない活性化にも関与する（ｄｅ  Ｖｒｉｅｓら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １６５：１６７７−１６８８（２００４）；Ｆｉａｎｅら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０８：８４９−８５６（２００３）；Ｊｏｒｄａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０４：１４１３−１４１８（２００１）；Ｗａｌｓｈら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７５：５４１−５４６（２００５））。
【０５１０】
上で述べたように、レクチン経路は、ＭＢＬおよびフィコリンによる炭水化物認識を含み（Ｆｕｊｉｔａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  １９８：１８５−２０２（２００４）；Ｈｏｌｍｓｋｏｖら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１：５４７−５７８（２００３）；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  ａｎｄ  Ｆｕｊｉｔａ，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０５：４９０−４９７（２００２））、そして、これらのレクチンは、ＭＡＳＰ−１（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  ａｎｄ  Ｆｕｊｉｔａ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７６：１４９７−１５０２（１９９２）；Ｓａｔｏら、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６：６６５−６６９（１９９４）；Ｔａｋａｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９６：１００３−１００９（１９９３））、ＭＡＳＰ−２（Ｔｈｉｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：５０６−５１０（１９９７））、ＭＡＳＰ−３（Ｄａｈｌら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １５：１２７−１３５（２００１））およびＭＡＳＰ−２の切断型タンパク質（低分子ＭＢＬ関連タンパク質；ｓＭＡＰまたはＭＡｐ１９）（Ｓｔｏｖｅｒら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６２：３４８１−３４９０（１９９９）；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１：８５９０８６３（１９９９））と複合体を形成する。ＭＡＳＰファミリーメンバーは、６つのドメイン；２つのＣ１ｒ／Ｃ１ｓ／Ｕｅｇｆ／骨形態形成タンパク質（ＣＵＢ）ドメイン、上皮成長因子（ＥＧＦ）様ドメイン、２つの補体制御タンパク質（ＣＣＰ）ドメインまたは短いコンセンサスリピート（ＳＣＲ）ドメインおよびセリンプロテアーゼドメインからなる（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０：２９−３５（１９９８））。ＭＡＳＰ−２およびｓＭＡＰは、単一の構造遺伝子から選択的スプライシングによって生成され、ｓＭＡＰは、第１のＣＵＢ（ＣＵＢ１）ドメイン、ＥＧＦ様ドメインおよびｓＭＡＰ特異的エキソンによってコードされるＣ末端における追加の４アミノ酸からなる。ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−３もまた、単一遺伝子から選択的スプライシングによって生成される（Ｓｃｈｗａｅｂｌｅら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０５：４５５−４６６（２００２））。ＭＢＬおよびフィコリンが、微生物の表面上の炭水化物に結合すると、ＭＡＳＰのプロ酵素型が、第２のＣＣＰとプロテアーゼドメインとの間で切断され、重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）と呼ばれる２つのポリペプチドからなる活性型が生じ、補体成分に対するタンパク分解活性を獲得する。ＭＡＳＰ−２が、Ｃ４およびＣ２を切断し（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６５：２６３７−２６４２（２０００））、それによってＣ３コンバターゼ（Ｃ４ｂＣ２ａ）の形成がもたらされることを、蓄積された証拠は示している。本発明者らは、ＭＡＳＰ−１が、Ｃ３を直接切断し、続いて増幅ループを活性化すると提案した（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  ａｎｄ  Ｆｕｊｉｔａ，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９４：４４３−４４８（１９９５））が、この機能は、議論の余地がある（Ａｍｂｒｕｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０：１３７４−１３８２（２００３））。ＭＡＳＰ−３も、Ｌ鎖においてセリンプロテアーゼドメイン���含み、合成の基質に対してタンパク分解活性を示す（Ｚｕｎｄｅｌら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２：４３４２−４３５０（２００４））が、その生理学的基質は、同定されていない。セリンプロテアーゼドメインを有しないｓＭＡＰの機能は、不明なままである。
【０５１１】
本研究では、補体レクチン経路の活性化におけるｓＭＡＰの役割を明らかにするために、本発明者らは、ｓＭＡＰのＣ末端において４アミノ酸残基（ＥＱＳＬ）をコードするｓＭＡＰ特異的エキソンを破壊し、そしてｓＭＡＰ−／−マウスを作製した。本発明者らは、ここで、ｓＭＡＰがレクチン経路の活性化をダウンレギュレートする能力を初めて報告する。
【０５１２】
材料および方法
マウス
１２９／ＳｖマウスＭＡＳＰ−２遺伝子のエキソン１〜４およびエキソン６の一部ならびにエキソン５の代わりにネオマイシン耐性遺伝子カセットを含む標的化ベクターを構築した（図２０Ａ）。このベクターの３’末端にＤＴ−Ａ遺伝子を挿入し、後でネオマイシンカセットおよびプロモーター領域を除去するために３つのｌｏｘ  ｐ部位を挿入することにより、条件的な標的化を行った。この標的化ベクターを１２９／Ｓｖ  ＥＳ細胞にエレクトロポレーションした。標的化されたＥＳクローンをＣ５７ＢＬ／６Ｊ胚盤胞にマイクロインジェクションし、それを子宮に移植し、ＩＣＲ母体を育成した。雄キメラマウスを雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交雑させて、ヘテロ接合性（＋／−）マウスを産生した。図２０Ａに示されるプローブを用いた、ＢａｍＨＩで消化したテイルＤＮＡのサザンブロット解析によって、ヘテロ接合性（＋／−）マウスをスクリーニングした。サザンブロット解析は、ヘテロ接合性（＋／−）マウス由来のＤＮＡにおいて６．５ｋｂｐおよび１１ｋｂｐのバンドを示した（図２０Ｂ）。ヘテロ接合性（＋／−）マウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと戻し交雑させた。ホモ接合性（−／−）マウスを得るために、ヘテロ接合性（＋／−）マウスを相互に交雑させた。テイルＤＮＡのＰＣＲベースの遺伝子型分類（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）によって、ホモ接合性（−／−）マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンド）を同定した。エキソン４特異的センスプライマーおよびｎｅｏ遺伝子特異的センスプライマーの混合物ならびにエキソン６特異的アンチセンスプライマーを使用して、ＰＣＲ解析を行った。ホモ接合性（−／−）マウス由来のＤＮＡにおいて、単一の１．８ｋｂｐバンドが得られた（図２０Ｃ）。すべての実験において、福島県立医科大学の動物実験の指針に従って８〜１２週齢のマウスを使用した。
【０５１３】
ノーザンブロット解析
野生型（＋／＋）マウスおよびホモ接合性（−／−）マウスの肝臓由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（１μｇ）を電気泳動により分離し、ナイロン膜に転写し、そして、ｓＭＡＰ、ＭＡＳＰ−２  Ｈ鎖、ＭＡＳＰ−２  Ｌ鎖またはｎｅｏ遺伝子に特異的な３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。その同じ膜をストリップし、そしてグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）に特異的なプローブと再度ハイブリダイズさせた。
【０５１４】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。野生型（＋／＋）マウスおよびホモ接合性（−／−）マウスの肝臓由来の６０ｎｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを、リアルタイムＰＣＲの鋳型として使用し、そしてＭＡＳＰ−２  Ｈ鎖およびＭＡＳＰ−２  Ｌ鎖およびｓＭＡＰのｃＤＮＡフラグメントを増幅し、モニターした。
【０５１５】
免疫ブロット法
そのサンプルを１０％または１２％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおいて還元性条件下で電気泳動し、そしてタンパク質をポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写した。その膜上のタンパク質を、ＭＡＳＰ−１のＬ鎖に対して産生された抗ＭＡＳＰ−１抗血清またはＭＡＳＰ−２のＨ鎖由来のペプチドに対して産生された抗ＭＡＳＰ−２／ｓＭＡＰ抗血清を用いて検出した。
【０５１６】
ＭＢＬ−ＭＡＳＰ−ｓＭＡＰ複合体におけるＭＡＳＰおよびｓＭＡＰの検出
０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（ＴＢＳ−Ｃａ２＋／ＢＳＡ）を含む４８０μｌのＴＢＳ−Ｃａ２＋緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび５ｍＭ  ＣａＣ１２）にマウス血清（２０μｌ）を加え、ＴＢＳ−Ｃａ２＋／ＢＳＡ緩衝液中の４０μｌの５０％マンナン−アガロースゲルスラリー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とともに４℃で３０分間インキュベートした。インキュベートした後、各ゲルをＴＢＳ−Ｃａ２＋緩衝液で洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプリング緩衝液をそのゲルに加えた。そのゲルを煮沸し、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、その後、免疫ブロット法を行って、ＭＢＬ複合体中のＭＡＳＰ−１、ＭＡＳＰ−２およびｓＭＡＰを検出した。
【０５１７】
Ｃ４沈着アッセイ
マウス血清を、ＴＢＳ−Ｃａ２＋／ＢＳＡ緩衝液を用いて１００μｌまで希釈した。その希釈サンプルをマンナンでコーティングされたマイクロタイターウェルに加え、室温で３０分間インキュベートした。そのウェルを、冷却した洗浄緩衝液（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＴＢＳ−Ｃａ２＋緩衝液）で洗浄した。洗浄後、ヒトＣ４を各ウェルに加え、氷上で３０分間インキュベートした。そのウェルを、冷却した洗浄緩衝液で洗浄し、そしてＨＲＰ結合体化抗ヒトＣ４ポリクローナル抗体（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｐｏｏｌｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を各ウェルに加えた。３７℃で３０分間インキュベートした後、そのウェルを洗浄緩衝液で洗浄し、そして３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液を各ウェルに加えた。現像後、１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を加えて、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０５１８】
Ｃ３沈着アッセイ
マウス血清を、０．１％（ｗ／ｖ）ＨＳＡを含むＢＢＳ緩衝液（４ｍＭバルビタール、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣ１２および１ｍＭ  ＭｇＣ１２，ｐＨ７．４）を用いて１００μｌまで希釈した。その希釈サンプルをマンナンでコーティングされたマイクロタイターウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。そのウェルを洗浄緩衝液で洗浄した。洗浄後、ＨＲＰ結合体化抗ヒトＣ３ｃポリクローナル抗体（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を各ウェルに加えた。室温で１時間インキュベートした後、そのウェルを洗浄緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ溶液を各ウェルに加えた。上に記載した通りに、色を測定した。
【０５１９】
組換え体
組換えマウスｓＭＡＰ（ｒｓＭＡＰ）、ｒＭＡＳＰ−２およびセリンプロテアーゼドメインにおける活性部位のセリン残基がアラニン残基で置換されている不活性なマウスＭＡＳＰ−２変異体（ＭＡＳＰ−２ｉ）を、先に記載されている（Ｉｗａｋｉ  ａｎｄ  Ｆｕｊｉｔａ，２００５）ように調製した。
【０５２０】
ＭＢＬ−ＭＡＳＰ−ｓＭＡＰ複合体の再構成
ホモ接合性（−／−）マウス血清（２０μｌ）ならびに様々な量のＭＡＳＰ−２ｉおよび／またはｒｓＭＡＰを、ＴＢＳ−Ｃａ２＋緩衝液中で総容積４０μｌにおいて、氷上で一晩インキュベートした。その混合物をマンナン−アガロースゲルスラリーとインキュベートし、そしてゲルに結合しているＭＢＬ−ＭＡＳＰ複合体におけるＭＡＳＰ−２ｉおよびｒｓＭＡＰを、「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＡＳＰｓ  ａｎｄ  ｓＭＡＰ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＭＢＬ−ＭＡＳＰ−ｓＭＡＰ  ｃｏｍｐｌｅｘ」に記載されている通りに検出した。
【０５２１】
Ｃ４沈着活性の再構成
ホモ接合性（−／−）マウス血清（０．５μｌ）ならびに様々な量のｒＭＡＳＰ−２および／またはｒｓＭＡＰを、ＴＢＳ−Ｃａ２＋中で総容積２０μｌにおいて、氷上で一晩インキュベートした。その混合物を８０μｌのＴＢＳ−Ｃａ２＋／ＢＳＡ緩衝液で希釈し、マンナンコーティングされたウェルに加えた。この後のすべての手順は、「Ｃ４沈着アッセイ」に記載した通りに行った。
【０５２２】
結果
図２０：ｓＭＡＰ遺伝子の標的破壊。（Ａ）ＭＡＳＰ−２／ｓＭＡＰ遺伝子、標的化ベクターおよび標的化された対立遺伝子の部分的な制限酵素地図。ｓＭＡＰ特異的エキソン（エキソン５）をｎｅｏ遺伝子カセットで置換した。（Ｂ）雄キメラマウスを雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交雑させることによって得られた子孫由来のゲノムＤＮＡのサザンブロット解析。テイルＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、（Ａ）に示されたプローブとハイブリダイズさせた。野生型対立遺伝子から１１ｋｂｐのバンドが得られ、標的化された対立遺伝子から６．５ｋｂｐのバンドが得られた。（Ｃ）ＰＣＲ遺伝子型分類解析。エキソン４特異的センスプライマーおよびｎｅｏ遺伝子特異的センスプライマーの混合物ならびにエキソン６特異的アンチセンスプライマーを使用して、テイルＤＮＡを解析した。野生型対立遺伝子からは２．５ｋｂｐのバンドが得られ、標的化された対立遺伝子からは１．８ｋｂのバンドが得られた。
【０５２３】
図２１：ホモ接合性（−／−）マウスにおけるｓＭＡＰおよびＭＡＳＰ−２のｍＲＮＡの発現。（Ａ）ノーザンブロット解析。野生型（＋／＋）マウスおよびホモ接合性（−／−）マウスの肝臓由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡを電気泳動し、ナイロン膜に転写し、そしてｓＭＡＰ、ＭＡＳＰ−２  Ｈ鎖、ＭＡＳＰ−２  Ｌ鎖またはｎｅｏ遺伝子に特異的な３２Ｐ標識プローブとハイブリダイズさせた。ホモ接合性（−／−）マウスにおいてｎｅｏに特異的なバンド（２．２ｋｂ）が観察された。（Ｂ）定量的ＲＴ−ＰＣＲ。ＭＡＳＰ−２  Ｈ鎖およびＭＡＳＰ−２  Ｌ鎖およびｓＭＡＰのｃＤＮＡフラグメントを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ装置（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）において、リアルタイムＰＣＲによって増幅した。野生型（＋／＋）マウスおよびホモ接合性（−／−）マウスの肝臓由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを鋳型として使用した。示されているデータは、２回の実験の平均値である。
【０５２４】
図２２：ホモ接合性（−／−）マウス血清におけるＭＡＳＰ−２の欠損。（Ａ）マウス血清におけるＭＡＳＰ−２およびｓＭＡＰの免疫ブロット法。野生型（＋／＋）マウス血清またはホモ接合性（−／−）マウス血清（２μｌ）を免疫ブロット法に供し、抗ＭＡＳＰ−２／ｓＭＡＰ抗血清を用いて検出した。（Ｂ）ＭＢＬ−ＭＡＳＰ−ｓＭＡＰ複合体におけるＭＡＳＰおよびｓＭＡＰの検出。マウス血清をマンナン−アガロースゲルとともにインキュベートし、そしてゲルに結合したＭＢＬ複合体におけるｓＭＡＰ、ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−２を、材料および方法に記載した通りに検出した。
【０５２５】
図２３：ホモ接合性（−／−）マウス血清におけるＣ４およびＣ３の切断の減少。（Ａ）マンナンコーティングされたウェル上でのＣ４の沈着。マウス血清を２倍希釈し、マンナンコーティングされたウェル中において、室温で３０分間インキュベートした。ウェルを洗浄した後、ヒトＣ４を各ウェルに加え、氷上で３０分間インキュベートした。ＨＲＰ結合体化抗ヒトＣ４ポリクローナル抗体を使用して、ウェル上に沈着したヒトＣ４の量を測定した。（Ｂ）マンナンコーティングされたウェル上でのＣ３の沈着。希釈されたマウス血清をマンナンコーティングされたウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。ウェル上での内在性Ｃ３の沈着を、ＨＲＰ結合体化抗ヒトＣ３ｃポリクローナル抗体を用いて検出した。
【０５２６】
図２４：ＭＢＬに対するｓＭＡＰおよびＭＡＳＰ−２の競合的結合。（Ａ）ホモ接合性（−／−）マウス血清中でのＭＢＬ−ＭＡＳＰ−ｓＭＡＰ複合体の再構成。ＭＡＳＰ−２ｉおよび／またはｒｓＭＡＰ（４μｇ）をホモ接合性（−／−）マウス血清（２０μｌ）とインキュベートした。その混合物をマンナン−アガロースゲルとさらにインキュベートし、そのゲルに結合しているその画分中のｒｓＭＡＰおよびＭＡＳＰ−２ｉを免疫ブロット法によって検出した。（Ｂ）様々な量のＭＡＳＰ−２ｉ（０〜５μｇ）および一定量のｒｓＭＡＰ（５μｇ）をホモ接合性（−／−）マウス血清（２０μｌ）とインキュベートし、マンナン−アガロースゲルとさらにインキュベートした。（Ｃ）一定量のＭＡＳＰ−２ｉ（０．５μｇ）および様々な量のｒｓＭＡＰ（０〜２０μｇ）をホモ接合性（−／−）マウス血清（２０μｌ）とインキュベートした。（Ｄ）様々な量のｒｓＭＡＰ（０〜２０μｇ）を野生型（＋／＋）マウス血清（２０μｌ）とインキュベートした。
【０５２７】
図２５：ｒＭＡＳＰ−２の添加によるＣ４沈着活性の回復。様々な量のｒｓＭＡＰ（０〜５μｇ）（Ａ）またはｒＭＡＳＰ−２（０〜１．５μｇ）（Ｂ）を、ＴＢＳ−Ｃａ２＋緩衝液中で総容積２０μｌにおいて０．５μｌのホモ接合性（−／−）マウス血清と氷上で一晩インキュベートした。次いで、その混合物を８０μｌのＴＢＳ−Ｃａ２＋／ＢＳＡ緩衝液で希釈し、マンナンコーティングされたウェルに加え、そして、ウェル上に沈着したＣ４の量を測定した。
【０５２８】
図２６：ｓＭＡＰの添加によるＣ４沈着活性の低下。（Ａ）ｒＭＡＳＰ−２（１μｇ）および様々な量のｒｓＭＡＰ（０〜０．５μｇ）を０．５μｌのホモ接合性（−／−）マウス血清とインキュベートした。その混合物をマンナンコーティングされたウェルに加え、ウェル上に沈着したＣ４の量を測定した。（Ｂ）ｒｓＭＡＰ（０〜０．７μｇ）を野生型血清（０．５μｌ）とインキュベートし、マンナンコーティングされたウェル上に沈着したＣ４の量を測定した。
【０５２９】
結果：
ホモ接合性（−／−）マウスにおけるｓＭＡＰおよびＭＡＳＰ−２の発現
インビボにおけるｓＭＡＰの役割を明らかにするために、本発明者らは、ｓＭＡＰを欠く標的化されたマウスの遺伝子を確立した。標的化ベクターを、ｓＭＡＰ（エキソン５）に特異的なエキソンをネオマイシン耐性遺伝子カセットで置換するために構築した（図２０Ａ）。陽性ＥＳクローンをＣ５７ＢＬ／６胚盤胞に注入し、創始者キメラをＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌と繁殖させた。アグーチ色の仔由来のテイルＤＮＡのサザンブロット解析は、標的化された対立遺伝子の胚の伝達を示した（図２０Ｂ）。図２０Ａに示されるプローブを使用した、ＢａｍＨＩで消化されたテイルＤＮＡのサザンブロット解析によって、ヘテロ接合性（＋／−）マウスをスクリーニングした。サザンブロット解析は、ヘテロ接合性（＋／−）マウス由来のＤＮＡにおいて６．５ｋｂｐおよび１１ｋｂｐのバンドを示した（図２０Ｂ）。ヘテロ接合性（＋／−）マウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと戻し交雑させた。ホモ接合性（−／−）マウスを得るために、ヘテロ接合性（＋／−）マウスを相互交雑させた。テイルＤＮＡのＰＣＲベースの遺伝子型分類によって、単一の１．８ｋｂｐのバンドをもたらすホモ接合性（−／−）マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンド）を同定した（図２０Ｃ）。
【０５３０】
ホモ接合性（−／−）マウスは、正常に発達し、野生型（＋／＋）マウスと体重の有意差は示さなかった。それらの間で形態学的な差はなかった。ノーザンブロット解析において、ｓＭＡＰに特異的なプローブが、野生型（＋／＋）マウスにおいて単一の０．９ｋｂのバンドを検出したのに対し、ホモ接合性（−／−）マウスでは、特異的なバンドは検出されなかった（図２１Ａ）。ＭＡＳＰ−２  Ｈ鎖またはＭＡＳＰ−２  Ｌ鎖に特異的なプローブを使用するとき、先に報告されているように（Ｓｔｏｖｅｒら、１９９９）、野生型（＋／＋）マウスにおいていくつかの特異的なバンドが検出され、Ｈ鎖特異的プローブはまた、ｓＭＡＰ特異的なバンドを検出した。しかしながら、ホモ接合性（−／−）マウスでは、対応するバンドは、非常に弱く、いくつかの余分なバンドが検出された。本発明者らは、ｓＭＡＰおよびＭＡＳＰ−２のｍＲＮＡの発現レベルを確認するために定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析も行った。ホモ接合性（−／−）マウスでは、ｓＭＡＰ  ｍＲＮＡの発現は、完全に無くなっており、ＭＡＳＰ−２の発現もまた、顕著に減少していた：それは、リアルタイムＰＣＲにより、Ｈ鎖およびＬ鎖の両方において野生型（＋／＋）マウスの発現の約２％と定量された（図２１Ｂ）。さらに、本発明者らは、ＭＡＳＰ−２の発現をタンパク質レベルで調べた。免疫ブロット法（図２２Ａ）によって、ｓＭＡＰおよびＭＡＳＰ−２の両方が、ホモ接合性（−／−）マウス血清において検出不可能であった。ホモ接合性（−／−）マウス血清をマンナン−アガロースゲルとインキュベートした後、ゲルに結合した画分中においてｓＭＡＰおよびＭＡＳＰ−２の両方が検出不可能であったが、ＭＡＳＰ−１は、その複合体において検出された（図２２Ｂ）。
【０５３１】
ホモ接合性（−／−）マウス血清におけるレクチン経路を介したＣ４およびＣ３の切断活性
マンナンコーティングされたウェルにおいてホモ接合性（−／−）マウス血清をインキュベートするとき、そのウェル上に沈着したヒトＣ４の量は、１／４００〜１／５０の範囲の希釈において、正常な血清中における量の約２０％であった（図２３Ａ）。本発明者らは、ホモ接合性（−／−）マウス血清におけるレクチン経路のＣ３沈着活性も調べた。マウス血清をマンナンコーティングされたウェルに加え、そのウェル上に沈着した内在性Ｃ３の量を測定した。その量は、欠損血清において減少しており、１／１０の希釈において正常な血清における量の２１％であった（図２３Ｂ）。
【０５３２】
ホモ接合性（−／−）マウス血清におけるＭＢＬ−ＭＡＳＰ−ｓＭＡＰ複合体の再構成
組換えマウスｓＭＡＰ（ｒｓＭＡＰ）または不活性なマウスＭＡＳＰ−２変異体（ＭＡＳＰ−２ｉ）をホモ接合性（−／−）マウス血清に加えるとき、両方の組換え体が、ＭＢＬに結合することができた（図２４Ａ，レーン３および４）。ｒｓＭＡＰおよびＭＡＳＰ−２ｉを上記血清と同時にインキュベートするとき（図２４Ａ、レーン５）、両方の組換え体がＭＢＬ−ＭＡＳＰ−ｓＭＡＰ複合体において検出された。しかしながら、その複合体に結合したｓＭＡＰの量は、ｒｓＭＡＰのみをその血清とインキュベートしたときの量よりも少なかった。次いで、本発明者らは、ＭＢＬに対するｓＭＡＰおよびＭＡＳＰ−２の競合的結合性をさらに調査した。一定量のｒｓＭＡＰおよび様々な量のＭＡＳＰ−２ｉを欠損血清に加えた。ｒｓＭＡＰの結合性は、ＭＡＳＰ−２ｉの量が増えるにつれて用量依存的様式で低下した（図２４Ｂ）。逆に、ＭＢＬに結合したＭＡＳＰ−２ｉの量は、ｒｓＭＡＰを加えることによって減少した（図２４Ｃ）。ｒｓＭＡＰを野生型血清に加えるとき、ＭＢＬに対する内在性ｓＭＡＰとＭＡＳＰ−２の両方の結合性は、用量依存的様式で低下した（図２４Ｄ）。
【０５３３】
ホモ接合性（−／−）マウス血清におけるＣ４沈着活性の再構成
本発明者らは、組換え体を使用して、マンナンコーティングされたウェル上でＣ４の沈着の再構成実験を行った。ｒｓＭＡＰを欠損血清に加えるとき、沈着したＣ４の量は、実際に用量依存的様式で基礎的なレベルまで減少した（図２５Ａ）。ｒＭＡＳＰ−２を上記血清に加えるとき、Ｃ４の量は、用量依存的様式で野生型血清の量の４６％まで回復し、プラトーに達した（図２５Ｂ）。次に、本発明者らは、Ｃ４沈着に対するｓＭＡＰの効果を調査した。一定量のｒＭＡＳＰ−２および様々な量のｒｓＭＡＰを欠損血清に加えるとき、沈着したＣ４の量は、用量依存的様式でｒｓＭＡＰの添加によって減少し（図２６Ａ）、野生型血清にｒｓＭＡＰを加えることによっても、沈着するＣ４の量が減少した（図２６Ｂ）ことから、ｓＭＡＰが、レクチン経路の活性化において調節性の役割を果たすことが示唆される。
【０５３４】
考察
本発明者らは、ｓＭＡＰ特異的エキソンの標的破壊によってｓＭＡＰ−／−マウスを作製した。これらのマウスにおいては、ＭＡＳＰ−２の発現レベルも、ｍＲＮＡレベルとタンパク質レベルの両方において極度に減少した（図２１および２２）。ＭＡＳＰ−２プローブを用いたノーザンブロット解析では、ｓＭＡＰ−／−マウス由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡにおいて余分なバンドのみが示されたことから、ＭＡＳＰ−２遺伝子の正常なスプライシングが、ｓＭＡＰ遺伝子の標的化によって変化し、したがって、ＭＡＳＰ−２の発現レベルが著明に低下することが示唆された。結果として、欠損血清中のＭＢＬ−ＭＡＳＰ複合体によるＣ４の切断は、正常な血清における切断と比べて８０％減少した（図２３Ａ）。再構成実験では、ｒＭＡＳＰ−２を加えることによってＣ４切断活性が回復したが、ｒｓＭＡＰを加えても回復しなかった（図２５）。欠損血清中で観察されたＣ４の沈着の減少は、ＭＢＬ−ＭＡＳＰ複合体におけるＭＡＳＰ−２の欠損が原因であるはずである（図２２Ｂ）。したがって、ＭＡＳＰ−２が、ＭＢＬ−ＭＡＳＰ複合体によるＣ４の活性化に不可欠であることが明らかである。しかしながら、ｒＭＡＳＰ−２を加えても切断活性は完全に回復せず、Ｃ４の沈着は、プラトーに達した。以前に報告されているように（Ｃｓｅｈら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：５７３５−５７４３（２００２）；Ｉｗａｋｉ  ａｎｄ  Ｆｕｊｉｔａ，Ｊ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｓ  １１：４７−５０（２００５））、ほとんどのｒＭＡＳＰ−２は、精製手順中に自己活性化によって活性型に変換され、いくつかは、そのプロテアーゼ活性を喪失していた。ＭＡＳＰ−２の活性な状態または不活性な状態が、ＭＢＬとの会合に有意な影響を有しないので（Ｚｕｎｄｅｌら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２：４３４２−４３５０（２００４））、そのプロテアーゼ活性を喪失したｒＭＡＳＰ−２は、ＭＢＬに結合し、活性型の会合を競合的に妨害することによって、Ｃ４沈着の不完全な回復をもたらすことがあり得る。欠損血清では、レクチン経路のＣ３切断活性も減弱した（図２３Ｂ）。沈着したＣ３の量の低下は、おそらく、ＭＡＳＰ−２によって生成されるＣ４ｂおよびＣ２ａフラグメントからなるＣ３コンバターゼの非常に低い活性レベルに起因するものである。
【０５３５】
ＭＡＳＰおよびｓＭＡＰは、各々、ホモ二量体として会合し、それらのＮ末端のＣＵＢドメインおよびＥＧＦ様ドメインを介してＭＢＬまたはＬ−フィコリンと複合体を形成した（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｗａｌｌｉｓ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：２５８９４−２５９０２（２００１）；Ｃｓｅｈら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：５７３５−５７４３（２００２）；Ｔｈｉｅｌｅｎｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６：５０６８−５０７７（２００１）；Ｚｕｎｄｅｌら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２：４３４２−４３５０（２００４））。ｓＭＡＰおよびＭＡＳＰ−２のＣＵＢ１−ＥＧＦ−ＣＵＢ２セグメントの結晶構造によって、それらのホモ二量体構造が明らかになっている（Ｆｅｉｎｂｅｒｇら、ＥＭＢＯ  Ｊ  ２２：２３４８−２３５９（２００３）；Ｇｒｅｇｏｒｙら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３２１５７−３２１６４（２００３））。ＭＢＬのコラーゲン様ドメインは、ＭＡＳＰとの会合に関与し（Ｗａｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎｇ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６３：４９５３−４９５９（１９９９）；Ｗａｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：１４０６５−１４０７３（１９９９））、また、そのドメインに導入されるいくつかの変異によって、ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−２のＣＵＢ１−ＥＧＦ−ＣＵＢ２セグメントに対するＭＢＬの結合性が低下した（Ｗａｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｄｏｄｄ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：３０９６２−３０９６９（２０００））。ＭＡＳＰ−２およびＭＡＳＰ−１／３に対する結合部位は、重複しているが、同一ではない（Ｗａｌｌｉｓら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：１４０６５−１３０７３（２００４））。ＭＢＬのｓＭＡＰ結合部位は、まだ同定されていないが、ｓＭＡＰおよびＭＡＳＰ−２においてＣＵＢ１−ＥＧＦ領域が同じであるので、ｓＭＡＰおよびＭＡＳＰ−２に対する結合部位は、おそらく同一である。従って、ｓＭＡＰおよびＭＡＳＰ−２が、ＭＢＬ−ＭＡＳＰ−ｓＭＡＰ複合体の再構成において、ＭＢＬに結合するのに互いに競合することは、妥当なことである（図２４）。ＭＢＬに対するｓＭＡＰの親和性は、ＭＡＳＰ−２の親和性よりも低い（Ｃｓｅｈら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：５７３５−５７４３（２００２）；Ｔｈｉｅｌｅｎｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６：５０６８−５０７７（２００１））。マウス血清中のｓＭＡＰの濃度は、測定されていない。しかしながら、図２２Ａに示される通りに、野生型血清中のｓＭＡＰの量は、ＭＡＳＰ−２の量よりもかなり多い。ゆえに、ｓＭＡＰは、ＭＡＳＰ−２／ｓＭＡＰ結合部位を占領することができ、また、ＭＡＳＰ−２がＭＢＬと結合するのを妨害でき、その結果として、ＭＢＬ−ＭＡＳＰ複合体のＣ４切断活性が、低下する。レクチン経路におけるｓＭＡＰの調節機構は、まだ研究されていない。ｓＭＡＰが、その調節性の役割を果たすのが補体の活性化の前なのか後なのかは、未だ不明である。ｓＭＡＰは、微生物の感染の前のＭＢＬ−ＭＡＳＰ複合体の偶然の活性化を妨害し得るか、または、活性化された後のレクチン経路の過剰な活性化を抑制し得る。レクチン経路には、別の潜在的な制御因子が存在する。ＭＡＳＰ−３も、ＭＢＬ���の結合におけるＭＡＳＰ−２の競合相手であり、ＭＡＳＰ−２のＣ４およびＣ２切断活性をダウンレギュレートする（Ｄａｈｌら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １５：１２７−１３５（２００１））。ｓＭＡＰとＭＡＳＰ−３との相互作用は、研究されていないが、それらが協同的にレクチン経路の活性化をダウンレギュレートすることが可能であることはあり得ることである。
【０５３６】
この報告において、本発明者らは、ｓＭＡＰとＭＡＳＰ−２とが、ＭＢＬへの結合に対して競合し、ｓＭＡＰが、ＭＢＬ−ＭＡＳＰ複合体によって活性化されるレクチン経路をダウンレギュレートする能力を有することを証明した。ｓＭＡＰが、フィコリン−ＭＡＳＰ複合体によって活性化されるレクチン経路の他の経路も制御することは、妥当なことである。ＭＡＳＰ−２およびｓＭＡＰは、マウスフィコリンＡへの結合に対しても競合し、そして、フィコリンＡ−ＭＡＳＰ複合体のＣ４切断活性をダウンレギュレートする（Ｙ  Ｅｎｄｏら、出版準備中）。ＭＢＬヌルマウスの研究が、最近報告された（Ｓｈｉら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９：１３７９−１３９０（２００４））。ＭＢＬヌルマウスは、ＭＢＬレクチン経路においてＣ４切断活性を有さず、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染に対して感受性である。本研究において、ＭＡＳＰ−２も欠損しているｓＭＡＰ−／−マウスは、レクチン経路におけるＣ４切断活性に加えて、Ｃ３切断活性の低下を示した。それらのオプソニン化活性が損なわれるために、ｓＭＡＰ欠損マウスは、細菌感染に対して感受性であり得る。ｓＭＡＰ欠損マウスのさらなる研究によって、感染症に対する保護におけるレクチン経路の機能が明らかになるだろう。
【０５３７】
別の重要な知見は、ｒｓＭＡＰを正常な血清に加えることによって、Ｃ４の活性化が低下することである（図２６Ｂ）。レクチン経路は、いくつかの臓器において炎症および組織の損傷を制御するとも証明されている（ｄｅ  Ｖｒｉｅｓら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １６５：１６７７−１６８８（２００４）；Ｆｉａｎｅら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０８：８４９−８５６（２００３）；Ｊｏｒｄａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０４：１４１３−１４１８（２００１）；Ｗａｌｓｈら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７５：５４１−５４６（２００５））。胸部腹部大動脈瘤に対する処置を経験しているＭＢＬ欠損患者では、補体は、活性化されず、炎症促進性マーカーのレベルは、外科術後に低下した（Ｆｉａｎｅら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０８：８４９−８５６（２００３））。蓄積された証拠が、種々の血管床における虚血および再灌流の状態中のＭＢＬの潜在的な病態生理学的役割を証明している。ゆえに、ＭＢＬの特異的な遮断またはレクチン補体経路の阻害は、虚血／灌流関連損傷を予防するための、治療的に関連があるストラテジーであり得る。従って、ｓＭＡＰが、レクチン経路の活性化を減弱させるものとして作用するので、ｓＭＡＰは、そのようなインヒビターの候補の１つであり得る。
（実施例３１）
この実施例では、ＭＡＳＰ−２が、Ｃ３のＣ４バイパス活性化に関与することを説明する。
【０５３８】
背景／理論的根拠：最近、副経路の阻害によって、虚血性急性不全から腎臓が保護されることが証明された（Ｔｈｕｒｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０：１５１７−１５２３（２００３））。本明細書中に記載されるデータは、レクチン経路が、副経路の活性化を指示し、その後、補体の活性化を相乗的に増幅することを意味している。本発明者らは、レクチン経路の一過性の阻害によっても、副経路の活性化が影響を受け得るので、補体媒介性の移植片の損傷および炎症を制限すると、臓器移植において長期間にわたる結果が改善され、また、移植片に対する適応性免疫応答の望まれない誘導が緩和され得、そして適応性免疫系を介する２次的な移植片拒絶のリスクが低下し得るという仮説を立てている。このことは、遺伝性ＭＢＬ欠損（ヒト集団の約３０％に存在する）から生じる、レクチン経路の部分的な障害が、ヒトにおける腎臓の同種移植片の生存時間の延長に関与することを示す最近の臨床データによって支持されている（Ｂｅｒｇｅｒ，Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ５：１３６１−１３６６（２００５））。
【０５３９】
虚血−再灌流（Ｉ／Ｒ）損傷における補体成分Ｃ３およびＣ４の関与は、遺伝子標的化マウス系統を用いる一過性の腸管および筋肉の虚血モデルにおいて十分に確立されたものである（Ｗｅｉｓｅｒら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８３：２３４２−２３４８（１９９６）；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ８６：９３８−４２，（１９９９））。Ｃ３が、腎臓のＩ／Ｒ損傷および２次的な移植片拒絶において顕著な役割を有することは、十分確立されたことである（Ｚｈｏｕら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０５：１３６３−１３７１（２０００）；Ｐｒａｔｔら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ８：５８２−５８７（２００２）；Ｆａｒｒａｒら、Ａｍ  Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ  １６４：１３３−１４１（２００４））。ゆえに、Ｃ４欠損に対する表現型が、マウス腎臓同種移植片拒絶の公開されたモデルにおいて観察されなかったことは、驚くべきことであった（Ｌｉｎ，２００５  印刷中）。しかしながら、これらのＣ４欠損マウスの血清および血漿のその後の解析から、これらのマウスが、残留した機能活性を保持しており、それによって、Ｃ３のＬＰ依存性切断およびさらに下流の補体の活性化が示されることが示唆された（図２７Ｃを参照のこと）。
【０５４０】
機能的なＣ４バイパス（およびＣ２バイパス）の存在は、数人の研究者によって以前に報告された（しかし、完全には特徴付けられていない）現象であり（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ７２：４１８−２２（１９７５）；Ｋｎｕｔｚｅｎ  Ｓｔｅｕｅｒら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４３（７）：２２５６−６１（１９８９）；Ｗａｇｎｅｒら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６３：３５４９−３５５８（１９９９））、Ｃ４（およびＣ２）欠損血清中で副経路とは無関係のＣ３代謝と関連する。
【０５４１】
方法：Ｃ３沈着に対するレクチン経路および古典経路の作用。マウス血漿（抗凝血剤としてＥＧＴＡ／Ｍｇ２＋を含む）を希釈し、４．０ｍＭバルビタール、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，ｐＨ７．４中で再石灰化し、次いで、マンナン（図２７Ａおよび２７Ｃに示される通りに）またはザイモサン（図２７Ｂに示される通りに）でコーティングされたマイクロタイタープレートに加え、そして、３７℃で９０分間インキュベートした。そのプレートを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５．０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０，ｐＨ７．４で３回洗浄し、次いで、抗マウスＣ３ｃ抗体を使用して、Ｃ３ｂ沈着を測定した。
【０５４２】
結果：図２７Ａ〜Ｃに示される結果は、３回の独立した実験の代表例である。マンナンまたはザイモサンの代わりに免疫グロブリン複合体でコーティングされたウェルにおいて同じ血清を使用するとき、ＷＴ（＋／＋）マウス血清およびプールされたＭＡＳＰ−２（−／−）血清においてＣ３ｂ沈着およびＢ因子切断が見られるが、Ｃ１ｑ枯渇血清においては見られない（データ示さず）。このことは、最初のＣ３ｂがＣＰ活性を介して提供されるとき、副経路の活性化がＭＡＳＰ−２−／−血清中で回復され得ることを示唆している。図２７Ｃは、Ｃ３が、Ｃ４（−／−）欠損血漿においてレクチン経路依存性の様式で効率的に活性化され得るという驚くべき知見を表している。この「Ｃ４バイパス」は、血漿を予め可溶性マンナンまたはマンノースとインキュベートすることによるレクチン経路活性化の阻害によって無くなる。
【０５４３】
副経路の活性化に関する以前に公開された多くの論文によれば、３つすべての経路に対して許容的であるはずの実験条件下でさえも、マンナン上およびザイモサン上のＣ３ｂ沈着は、ＭＡＳＰ−２（−／−）欠損マウスにおいて激しく損なわれると理解され得る。図２７Ａ〜Ｃに示される通りに、ＭＡＳＰ−２（−／−）欠損マウス血漿は、レクチン経路を介してＣ４を活性化せず、また、レクチン経路を介しても、副経路を介しても、Ｃ３を切断しない。ゆえに、本発明者らは、ＭＡＳＰ−２が、このＣ４バイパスに必要であるという仮説を立てている。レクチン経路依存性Ｃ４バイパスに関与する可能性がある成分の同定のさらなる進歩が、Ｔｅｉｚｏ  Ｆｕｊｉｔａ教授によって最近報告された。ＦｕｊｉｔａのＭＡＳＰ−１／３欠損マウス系統と交雑させたＣ４マウスの血漿は、残っていた、Ｃ４欠損血漿がレクチン経路を介してＣ３を切断する能力を喪失している。これは、組換えＭＡＳＰ−１をＣ４とＭＡＳＰ−１／３欠損血漿との混合物に加えることによって回復した（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４３：１５３（２００６））ことから、ＭＡＳＰ−１が、Ｃ４の非存在下でＣ３を切断するレクチン経路由来の複合体の形成に関与することが示唆される（組換えＭＡＳＰ−１は、Ｃ３を切断しないが、Ｃ２を切断する；Ｒｏｓｓｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：４０８８０−７（２００１）；Ｃｈｅｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：２６０５８−６５（２００４））。本発明者らは、ＭＡＳＰ−２が、形成されるこのバイパスに必要であることを見出した。
【０５４４】
より機能的および定量的なパラメータおよび組織診断が、このパイロット研究を強化するのに必要であるが、その予備的な結果から、ＭＡＳＰ−２−／−マウスが一層迅速な腎機能の回復を示すので、レクチン経路を介する補体の活性化が、腎臓のＩ／Ｒ損傷の病態生理学に有意に寄与するという仮説に対して強力な支持を与える。
【０５４５】
本発明の好ましい実施形態を、図示および説明してきたが、様々な変更が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく本明細書中でなされ得ることが理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【０５４６】
【図１】図１は、補体副経路が補体活性化にレクチン経路依存性のＭＡＳＰ−２活性化を必要とするという新しい発見を図示しているフローチャートである。
【図２】図２は、ヒトＭＡＳＰ−２のゲノム構造を図示している図である。
【図３】図３Ａは、ヒトＭＡＳＰ−２タンパク質のドメイン構造を図示している模式図である。図３Ｂは、ヒトＭＡｐ１９タンパク質のドメイン構造を図示している模式図である。
【図４】図４は、マウスのＭＡＳＰ−２ノックアウトストラテジーを図示している図である。
【図５】図５は、ヒトＭＡＳＰ−２ミニ遺伝子構築物を図示している図である。
【図６Ａ】図６Ａは、ＭＡＳＰ−２欠損によって、レクチン経路媒介性のＣ４活性化が喪失するということを実証する結果を表しており、その喪失は、マンナン上にＣ４ｂ沈着が無いことによって判定される。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＭＡＳＰ−２欠損によって、レクチン経路媒介性のＣ４活性化が喪失するということを実証する結果を表しており、その喪失は、ザイモサン上にＣ４ｂ沈着が無いことによって判定される。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＭＡＳＰ−２＋／−；ＭＡＳＰ−２−／−および野生型系統から得られた血清サンプルの相対的なＣ４活性化レベルを実証する結果を表しており、そのレベルは、マンナン上およびザイモサン上のＣ４ｂ沈着によって測定される。
【図７Ａ】図７Ａは、ＭＡＳＰ−２欠損によって、レクチン経路媒介性および副経路媒介性のＣ３活性化の両方が喪失するということを実証する結果を表しており、その喪失は、マンナン上のＣ３ｂ沈着が無いことによって判定される。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＭＡＳＰ−２欠損によって、レクチン経路媒介性と副経路媒介性のＣ３活性化の両方が喪失するということを実証する結果を表しており、その喪失は、ザイモサン上のＣ３ｂ沈着が無いことによって判定される。
【図８】図８は、ＭＡＳＰ−２−／−血清サンプルにマウス組換えＭＡＳＰ−２を添加することによって、タンパク質濃度依存性様式でレクチン経路媒介性のＣ４活性化が回復されることを実証する結果を表しており、その回復は、マンナン上のＣ４ｂ沈着によって判定される。
【図９】図９は、古典経路が、ＭＡＳＰ−２−／−系統において機能的であることを実証する結果を表している。
【図１０】図１０は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化の系が、腹大動脈瘤修復術後の虚血／再灌流相において活性化されることを実証する結果を表している。
【図１１Ａ】図１１Ａは、抗ＭＡＳＰ−２  Ｆａｂ２抗体＃１１が、実施例２４に記載されるようにＣ３コンバターゼ形成を阻害するということを実証する結果を表している。。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、実施例２４に記載されるように、抗ＭＡＳＰ−２  Ｆａｂ２抗体＃１１が、ネイティブラットＭＡＳＰ−２に結合するということを実証する結果を表している。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、実施例２４に記載されるように、抗ＭＡＳＰ−２  Ｆａｂ２抗体＃４１が、Ｃ４切断を阻害するということを実証する結果を表している。
【図１２】図１２は、実施例２４に記載されるように、Ｃ３コンバターゼ形成を阻害した、試験された抗ＭＡＳＰ−２  Ｆａｂ２抗体のすべてが、Ｃ４切断も阻害することが見出されたということを実証する結果を表している。
【図１３】図１３は、実施例２５に記載されるように、抗ＭＡＳＰ−２遮断Ｆａｂ２抗体のエピトープマッピングに使用した、ラットＭＡＳＰ−２から得られた組換えポリペプチドを図示している図である。
【図１４】図１４は、実施例２５に記載されるように、抗ＭＡＳＰ−２  Ｆａｂ２＃４０および＃６０と、ラットＭＡＳＰ−２ポリペプチドとの結合を実証する結果を表している。
【図１５】図１５は、実施例２６に記載されるように、腎虚血／再灌流損傷モデルにおける再灌流の２４時間および４８時間後の野生型（＋／＋）マウスおよびＭＡＳＰ−２（−／−）マウスについての血中尿素窒素クリアランスを示す結果を表している。
【図１６】図１６Ａは、実施例２７に記載されるように、冠状動脈閉塞および再灌流モデルにおける損傷後の、野生型（＋／＋）についての梗塞のサイズおよびＭＡＳＰ−２（−／−）マウスにおける縮小した梗塞のサイズを示す結果を表している。図１６Ｂは、実施例２７に記載されるように、冠状動脈閉塞および再灌流モデルにおいて試験された個別の動物の分布を示す結果を表している。
【図１７Ａ】図１７Ａは、実施例２８に記載されるように、野生型（＋／＋）マウスおよびＭＡＳＰ−２（−／−）マウスから単離されたＲＰＥ−脈絡膜複合体におけるベースラインＶＥＧＦタンパク質レベルを示す結果を表している。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、実施例２８に記載されるように、黄斑変性症モデルにおけるレーザー誘発性損傷の３日後の野生型（＋／＋）マウスおよびＭＡＳＰ−２（−／−）マウスのＲＰＥ−脈絡膜複合体におけるＶＥＧＦタンパク質レベルを示す結果を表している。
【図１８】図１８は、実施例２８に記載されるように、野生型（＋／＋）マウスおよびＭＡＳＰ−２（−／−）マウスにおけるレーザー誘発性損傷の７日後の脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）の体積の平均値を示す結果を表している。
【図１９】図１９は、実施例２９に記載されるように、Ｃｏｌ２  ｍＡｂ誘導性関節リウマチ後の経時的な野生型（＋／＋）マウスおよびＭＡＳＰ−２（−／−）マウスの関節炎の平均臨床スコアを示す結果を表している。
【図２０Ａ】図２０Ａは、実施例３０に記載されるように、ｓＭＡＰ（Ｍａｐ１９）遺伝子の標的破壊を示している図である。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、実施例３０に記載されるように、雄ｓＭＡＰ（−／−）キメラマウスと雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスとを交雑させて得られた子孫から単離されたゲノムＤＮＡのサザンブロット解析を表している。
【図２０Ｃ】図２０Ｃは、実施例３０に記載されるように、野生型（＋／＋）マウスおよびｓＭＡＰ（−／−）マウスのＰＣＲ遺伝子型分類解析を表している。
【図２１Ａ】図２１Ａは、実施例３０に記載されるように、ｓＭＡＰ（−／−）マウスにおけるｓＭＡＰおよびＭＡＳＰ−２のｍＲＮＡのノーザンブロット解析を表している。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、実施例３０に記載されるように、野生型（＋／＋）マウスおよびｓＭＡＰ（−／−）マウスにおいてＭＡＳＰ−２  Ｈ鎖、ＭＡＳＰ−２  Ｌ鎖およびｓＭＡＰをコードしているｃＤＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析を表している。
【図２２Ａ】図２２Ａは、実施例３０に記載されるように、ｓＭＡＰ（−／−）、すなわち、ＭＡｐ１９（−／−）の免疫ブロットを表しており、これは、マウス血清中のＭＡＳＰ−２およびｓＭＡＰの欠損を実証している。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、実施例３０に記載されるように、ＭＡＳＰ−２およびｓＭＡＰが、ＭＢＬ−ＭＡＳＰ−ｓＭＡＰ複合体において検出されたということを実証する結果を表している。
【図２３】図２３Ａは、実施例３０に記載されるように、野生型（＋／＋）マウス血清およびｓＭＡＰ（−／−）マウス血清においてマンナンコーティングされたウェル上のＣ４沈着を示している結果を表している。図２３Ｂは、実施例３０に記載されるように、野生型（＋／＋）マウス血清およびｓＭＡＰ（−／−）マウス血清においてマンナンコーティングされたウェル上のＣ３沈着を示している結果を表している。
【図２４Ａ】図２４Ａは、実施例３０に記載されるように、ｓＭＡＰ（−／−）血清におけるＭＢＬ−ＭＡＳＰ−ｓＭＡＰ複合体の再構成を示している結果を表している。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、実施例３０に記載されるように、ＭＢＬに対するｒｓＭＡＰとＭＡＳＰ−２ｉとの競合的結合を示す結果を表している。
【図２４Ｃ】図２４Ｃは、実施例３０に記載されるように、ＭＢＬに対するｒｓＭＡＰとＭＡＳＰ−２ｉとの競合的結合を示す結果を表している。
【図２４Ｄ】図２４Ｄは、実施例３０に記載されるように、ＭＢＬに対するｒｓＭＡＰとＭＡＳＰ−２ｉとの競合的結合を示す結果を表している。
【図２５】図２５Ａ〜Ｂは、実施例３０に記載されるように、ｒｓＭＡＰではなくｒＭＡＳＰ−２の添加によってＣ４沈着活性の回復を示す結果を表している。
【図２６】図２６Ａ〜Ｂは、実施例３０に記載されるように、ｒｓＭＡＰの添加によるＣ４沈着活性の低下を示す結果を表している。そして
【図２７Ａ】図２７Ａは、実施例３１に記載されるように、ＭＡＳＰ−２がＣ３のＣ４バイパス活性化に関与することを示している結果を表している。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、実施例３１に記載されるように、ＭＡＳＰ−２がＣ３のＣ４バイパス活性化に関与することを示している結果を表している。
【図２７Ｃ】図２７Ｃは、実施例３１に記載されるように、ＭＡＳＰ−２がＣ３のＣ４バイパス活性化に関与することを示している結果を表している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【配列表】
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