(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的濃度のペルオキシカルボン酸を生産する方法であって、
ａ.標的濃度のペルオキシカルボン酸を生産させるための一式の反応成分を選択すること、ここで該反応成分は、
１）下記の化合物の少なくとも１つ又はそれらの混合物：
ｉ）以下の構造
［Ｘ］mＲ5
［式中、
Ｘは式Ｒ6Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ6は、場合によりヒドロキシル基又はＣ１〜Ｃ４のアルコキシ基で置換される、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖状、分枝鎖状又は環状のヒドロカルビル部分であり、ここでＲ6は、場合により、Ｒ6がＣ２〜Ｃ７の場合１つ又はそれ以上のエーテル結合を含み；
Ｒ5は、場合によりヒドロキシル基で置換される、Ｃ１〜Ｃ６の直鎖状、分枝鎖状又は環状のヒドロカルビル部分であり、ここでＲ5中の各炭素原子はそれぞれ最大で１つのヒドロキシル基又は最大で１つのエステル基を含み、ここでＲ5は、場合により、１つ又はそれ以上のエーテル結合を含み；
ｍは１からＲ5中の炭素数までの整数である］
を有するエステルであって、
２５℃で水に対して少なくとも５ｐｐｍの溶解度を有する、上記エステル；又は
ii）以下の構造
【化１】
0005504268.tif 000030
［式中、Ｒ1は場合によりヒドロキシル基又はＣ１〜Ｃ４のアルコキシ基で置換される、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖又は分岐鎖のアルキルであり、そしてＲ3及びＲ4はそれぞれＨ又はＲ1Ｃ（Ｏ）である］を有するグリセリド；又は
iii）アセチル化単糖、アセチル化二糖、又はアセチル化多糖；
２）過酸素源；
３）ペルヒドロリシス活性を有する酵素触媒、ここで該酵素触媒は、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いると参照配列の配列番号２にアラインするＣＥ−７シグネチャーモチーフを有する酵素を含み、該シグネチャーモチーフは、
ｉ）配列番号２のアミノ酸の位置１１８〜１２０におけるＲＧＱモチーフ；
ii）配列番号２のアミノ酸の位置１７９〜１８３におけるＧＸＳＱＧモチーフ；及び
iii）配列番号２のアミノ酸の位置２９８〜２９９におけるＨＥモチーフ；を含み、ここで該酵素は、配列番号２と少なくとも３０％のアミノ酸同一性を含む；そして
４）場合により、少なくとも１つの緩衝液；
を含み；そして
ｂ．選択された一式の反応成分を水性の反応条件下で混合して反応混合物を形成させ；それによって、ペルオキシカルボン酸を含む反応生産物を形成させること；ここで、ペルオキシカルボン酸を含む反応生産物により、反応混合物のｐＨが、反応成分を混合して約1分〜約１０分以内に約６未満に低下し、そして標的濃度のペルオキシカルボン酸が生産され、ここで反応混合物のｐＨ低下を、生産される標的濃度のペルオキシカルボン酸を制御するために使用する；
を含む、上記方法。
【請求項２】
少なくとも１つの緩衝液が約０．０１ｍＭ〜約２００ｍＭの範囲の濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
反応生産物により、反応混合物のｐＨが、反応成分を混合した後約１分〜約１０分以内に約５に低下する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ペルオキシカルボン酸の標的濃度が約２００ｐｐｍ〜約２５００ｐｐｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ペルオキシカルボン酸の標的濃度が約４００ｐｐｍ〜約１２００ｐｐｍである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ペルオキシカルボン酸の標的濃度が約４００ｐｐｍ〜約６００ｐｐｍである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ペルオキシカルボン酸の標的濃度が、反応成分を混合した後約１〜約１０分以内に達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ペルオキシカルボン酸の標的濃度が、反応成分を混合した後約５分以内に達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ペルオキシカルボン酸の標的濃度が、反応成分を混合した後約１分以内に達成される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ペルオキシカルボン酸の濃度は、一旦ペルオキシカルボン酸の標的濃度に達すると、該標的濃度の約２０％未満で変動する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
緩衝液が約８．０〜約６．０のｐＫａを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
初期反応混合物の初期ｐＨが、６．５、７．２、７．５、８．１、及び８．５を含むグループから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ペルヒドロリシス活性を有する酵素触媒が、サーモトガ・ネアポリタナ由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ペルヒドロリシス活性を有する酵素触媒が、サーモトガ・マリチマＭＳＢ８由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ｐＨの低下により、反応成分を混合した後１０分以内に、ペルヒドロリシス活性が約８０％以上減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
酵素触媒が、微生物細胞、透過性微生物細胞、微生物細胞抽出物、部分的精製酵素、精製酵素の形態にあるか、又は部分的精製酵素若しくは精製酵素の固定化形態である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ペルオキシカルボン酸が、過酢酸、過プロピオン酸、過酪酸、過乳酸、過グリコール酸、過メトキシ酢酸、過β−ヒドロキシ酪酸、及びこれらの混合物から成るグループから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
酵素触媒がカタラーゼ活性を欠乏する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
標的濃度のペルオキシカルボン酸を生産させることによって硬表面又は無生物を消毒する方法であって、
ａ．標的濃度のペルオキシカルボン酸を生産させるための一式の反応成分を選択すること、ここで該反応成分は、
１）下記の化合物の少なくとも１つ又はそれらの混合物：
ｉ）以下の構造
［Ｘ］mＲ5
［式中、
Ｘは式Ｒ6Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ6は、場合によりヒドロキシル基又はＣ１〜Ｃ４のアルコキシ基で置換される、Ｃ１
〜Ｃ７の直鎖状、分枝鎖状又は環状のヒドロカルビル部分であり、ここでＲ6は、場合に
より、Ｒ6がＣ２〜Ｃ７の場合１つ又はそれ以上のエーテル結合を含み；
Ｒ5は、場合によりヒドロキシル基で置換される、Ｃ１〜Ｃ６の直鎖状、分枝鎖状又は
環状のヒドロカルビル部分であり、ここでＲ5中の各炭素原子はそれぞれ最大で１つのヒ
ドロキシル基又は最大で１つのエステル基を含み、ここでＲ5は、場合により、１つ又は
それ以上のエーテル結合を含み；
ｍは１からＲ5中の炭素数までの整数である］
を有するエステルであって
２５℃で水に対して少なくとも５ｐｐｍの溶解度を有する、上記エステル；又は
ii）以下の構造
【化２】
0005504268.tif 000031
［式中、Ｒ1は場合によりヒドロキシル基又はＣ１〜Ｃ４のアルコキシ基で置換される、
Ｃ１〜Ｃ７の直鎖又は分岐鎖のアルキルであり、そしてＲ3及びＲ4はそれぞれＨ又はＲ1
Ｃ（Ｏ）である］を有するグリセリド；又は
iii）アセチル化単糖、アセチル化二糖、又はアセチル化多糖；
２）過酸素源；
３）ペルヒドロリシス活性を有する酵素触媒、ここで該酵素触媒は、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いると参照配列の配列番号２にアラインするＣＥ−７シグネチャーモチーフを有する酵素を含み、該シグネチャーモチーフは、
ｉ）配列番号２のアミノ酸の位置１１８〜１２０におけるＲＧＱモチーフ；
ii）配列番号２のアミノ酸の位置１７９〜１８３におけるＧＸＳＱＧモチーフ；及び
iii）配列番号２のアミノ酸の位置２９８〜２９９におけるＨＥモチーフ；を含み、ここで該酵素は、配列番号2と少なくとも３０％のアミノ酸同一性を含む；そして
４）場合により、少なくとも1つの緩衝液；
を含み；そして
ｂ．選択された一式の反応成分を水性の反応条件下で混合して反応混合物を形成させ；それによって、ペルオキシカルボン酸を含む反応生産物を形成させること；ここで、ペルオキシカルボン酸を含む反応生成物により、反応混合物のｐＨが、反応成分を混合して約１分〜約１０分以内に約６未満に低下し、そして標的濃度のペルオキシカルボン酸が生産され、ここで反応混合物のｐＨ低下を、生産される標的濃度のペルオキシカルボン酸を制御するために使用し；そして
ｃ．工程（ｂ）で生産されるペルオキシカルボン酸を硬表面又は無生物に適用すること；
を含む、上記方法。
【請求項２０】
少なくとも１つの緩衝液が約０．０１ｍＭ〜約２００ｍＭの範囲の濃度で存在する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
反応生産物により、反応混合物のｐＨが、反応成分を混合した後約１分〜約１０分以内
に約５に低下する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ペルオキシカルボン酸の標的濃度が約２００ｐｐｍ〜約２５００ｐｐｍである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
ペルオキシカルボン酸の標的濃度が約４００ｐｐｍ〜約１２００ｐｐｍである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ペルオキシカルボン酸の標的濃度が約４００ｐｐｍ〜約６００ｐｐｍである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ペルオキシカルボン酸の標的濃度が、反応成分を混合した後約１〜約１０分以内に達成される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
ペルオキシカルボン酸の標的濃度が、反応成分を混合した後約５分以内に達成される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
ペルオキシカルボン酸の標的濃度が、反応成分を混合した後約１分以内に達成される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ペルオキシカルボン酸の濃度は、一旦ペルオキシカルボン酸の標的濃度に達すると該標的濃度の約２０％未満で変動する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
緩衝液が約８．０〜約６．０のｐＫａを有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
初期反応混合物の初期ｐＨが、６．５、７．２、７．５、８．１、及び８．５を含むグループから選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
ペルヒドロリシス活性を有する酵素触媒がサーモトガ・ネアポリタナ由来である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３２】
ペルヒドロリシス活性を有する酵素触媒がサーモトガ・マリチマＭＳＢ８由来である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
ｐＨの低下により、反応成分を混合した後１０分以内に、ペルヒドロリシス活性が約８０％以上減少する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３４】
酵素触媒が、微生物細胞、透過性微生物細胞、微生物細胞抽出物、部分的精製酵素、精製酵素の形態にあるか、又は部分的精製酵素若しくは精製酵素の固定化形態である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３５】
ペルオキシカルボン酸が、過酢酸、過プロピオン酸、過酪酸、過乳酸、過グリコール酸、過メトキシ酢酸、過β−ヒドロキシ酪酸、及びこれらの混合物から成るグループから選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３６】
酵素触媒がカタラーゼ活性を欠乏する、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００８年８月１３日付けで出願された米国仮出願第６１／０８８６７３号及び２００８年１０月３日付けで出願された米国仮出願第６１／１０２５２０号の便益を主張するものであり、その両者の全文は、参照することによって本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本発明は、過酸の生合成及びその場（in situ）での酵素触媒作用の分野に関する。具体的には、セファロスポリンアセチルヒドロラーゼ（ＣＡＨ；Ｅ．Ｃ．３．１．１．４１）及びアセチルキシランエステラーゼ（ＡＸＥ；Ｅ.Ｃ．３．１．１．７２）を含む、構造的に炭水化物エステラーゼのＣＥ−７ファミリーに属するものとして同定されている酵素のペルヒドロリシス（perhydrolysis）活性によって生成する過酸の生産を制御する方法を提供する。酵素的なプロセスによって、カルボン酸エステル基質から過カルボン酸が生産される。反応の比活性対ｐＨプロファイルの解明が、緩衝液濃度及びｐＨを含むパラメーターを変えることによる反応の制御を可能にする。本明細書で説明される方法によって生産される過酸を含む消毒製剤を提供する。
【背景技術】
【０００３】
過酸組成物は、有効な抗菌剤であることが報告されている。硬表面、肉製品、生きた植物組織、及び医療用デバイスを、望ましくない微生物の増殖に関して清浄にする、消毒する、及び／又は衛生的にする方法が記載されている（特許文献１、２、３、４及び５）。また過酸は、洗濯用洗剤用途の漂白組成物の製造に有用であることも報告されている（特許文献６、７及び８）。
【０００４】
過酸は、カルボン酸と過酸化水素との化学反応によって製造することができる（非特許文献１を参照）。反応は通常、濃硫酸のような強い無機酸によって触媒される。過酸化水素とカルボン酸との反応は平衡反応であり、過酸の生産では、過剰な濃度の過酸化物及び／又はカルボン酸の使用、又は水の除去が好ましい。
【０００５】
酵素触媒も、また、使用時及び／又は適用時の迅速な過酸の生産を可能にし、過酸濃度の経時的な低下を起こす可能性がある過酸溶液の貯蔵の必要性を回避することができる。過酸化水素との直接の化学反応による過酸の生産に一般的に用いられる高いカルボン酸濃度は酵素的な過酸の生産には必要なく、酵素触媒による反応では、化学反応で一般に用いられる濃度よりもかなり低い濃度のカルボン酸エステルを基質として使用することができる。酵素触媒による反応は、広範なｐＨにわたって行うことができるが、所定のｐＨでの酵素活性及び安定性、並びに所定のｐＨでのペルヒドロリシスに対する基質特異性に依存する。
【０００６】
エステラーゼ、リパーゼ及びいくつかのプロテアーゼは、アルキルエステルの加水分解を触媒して、それに対応するカルボン酸を生産する能力を有する（式１）。
【数１】
0005504268.tif 000002
【０００７】
また、いくつかのエステラーゼ、リパーゼ及びプロテアーゼは、ペルヒドロリシス活性も示し、アルキルエステルからの過酸の合成を触媒する（式２）。
【数２】
0005504268.tif 000003
【０００８】
炭水化物エステラーゼのＣＥ−７類（class）は、エステル、特にアルコール、ジオール及びグリセロールのアセチルエステルのペルヒドロリシスに対して高い比活性を有することが見出されている。特許文献９、１０、１１及び１２は、消毒剤及び／又は漂白剤として使用するのに十分な濃度でカルボン酸エステルを（過酸化水素などの好適な過酸素源の存在下で）ペルオキシカルボン酸に変換する、顕著なペルヒドロリシス活性を特徴とする炭水化物エステラーゼ（例えば、セファロスポリンＣデアセチラーゼ［ＣＡＩＩ］及びアセチルキシランエステラーゼ［ＡＸＥ］）のＣＥ−７ファミリーのメンバーとして構造的に分類される酵素を開示している。特定の反応条件下で、ＣＥ−７エステラーゼは、過酸濃度の生産を１分間に少なくとも４０００〜５０００ｐｐｍの高さに、そして５分から３０分間に少なくとも最大９０００ｐｐｍまで触媒することができる（特許文献１２）。ペルオキシカルボン酸は、しかしながら、ある金属表面を腐食する可能性があり、従って、結果として生じる溶液の腐食作用を防止する又は最小限にするために、反応中に生産される過酸の総量を制限することが望ましい。例えば、１分間に僅か２００ｐｐｍ〜１０００ｐｐｍの過酸の生産を必要とする適用には、しばしばこれらの制限を優に上回る過酸の最終濃度を生じる反応条件が使用される。硬表面消毒用の過酸のその場発生の適用では、上限の有効消毒剤濃度を著しく超過することなく目的の濃度の過酸を迅速に発生する能力を有することが望ましく、それによって表面の或る成分の腐食を制限又は防止する。洗濯物又は布地の漂白用の過酸のその場発生の適用では、上記の漂白に必要な生成される過酸の濃度に対しても同様な制限が望ましい。
【０００９】
過酸の生産を触媒することに加え、ＣＥ−７エステラーゼは、また、過酸の加水分解を触媒してカルボン酸と過酸化水素を生成させる。従って、酵素が長時間活性を保持する反応条件下では、エステルと過酸化物との最初の酵素触媒反応で生産された過酸を壊し、消毒剤溶液に嫌な臭いを付け得る副産物としてのカルボン酸（例えば、酢酸）を生じさせる。また、酵素のこの過酸加水分解活性は、ＣＥ−７エステラーゼによって生産された過酸含有製剤の長期安定性を、数時間で、又は消毒剤製剤中の過酸の安定性によっては数日若しくは数週間で、損なわせかねない。
【００１０】
過酸溶液は、多様な用途を有する。過酸溶液を生産するための効率的且つ有効な方法の考案は進展されたものの、改良された方法が必要である。酵素触媒による過酸生産を過酸濃度依存的に制限する、過酸生産のその場的方法は、タスク適切（task-appropriate）な方法で標的濃度の過酸の生産を可能にする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第６，５４５，０４７号
【特許文献２】国特許第６，１８３，８０７号
【特許文献３】米国特許第６，５１８，３０７号
【特許文献４】米国公開特許公報第２００３００２６８４６号
【特許文献５】米国特許第５，６８３，７２４号
【特許文献６】米国特許第３，９７４，０８２号
【特許文献７】米国特許第５，２９６，１６１号
【特許文献８】米国特許第５，３６４，５５４号
【特許文献９】米国特許出願第１１／６３８，６３５号
【特許文献１０】米国特許出願第１１／７４３，３５４号
【特許文献１１】米国特許出願第１１／９４３，８７２号
【特許文献１２】米国特許出願第１２／１４３，３７５号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】「有機過酸化物」（Organic Peroxides）, Daniel Swern, ed., Vol. 1, pp 313-516; Wiley Interscience, New York, 1971
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本明細書は、標的濃度の過酸を生産する酵素触媒による方法を開示する。酵素触媒による過酸の生産は、過酸濃度依存的に制限される。また、本明細書は、標的濃度の過酸を供給する過酸含有溶液を利用して、表面又は無生物を消毒する方法、及び布地又は洗濯物を漂白する方法を開示する。本明細書で説明される方法は、ＣＥ−７エステラーゼの構造ファミリーに属する酵素（例えば、セファロスポリンＣデアセチラーゼ［ＣＡＨ］及びアセチルキシランエステラーゼ［ＡＸＥ］）が、カルボン酸エステルを過酸に変換する顕著なペルヒドロリシス活性を示す第１の発見によって、並びに前記酵素のエステルから過酸を生産するペルヒドロリシス活性、及び過酸からカルボン酸と過酸化水素を生産する加水分解活性の両者の活性が、過酸及び／又はカルボン酸を生産する反応の間に反応のｐＨが低下するのに伴って著しく低下する又は不活性化されるという第２の発見によって可能になる。過酸を生産する、及び場合により、過酸を加水分解するＣＥ−７エステラーゼの活性は、標的濃度の過酸又は標的濃度範囲の過酸が生産されるように、これらに限定されないが、反応の初期ｐＨの選択、又はペルヒドロリシス反応の緩衝液及び緩衝液濃度の選択、又は初期ｐＨと緩衝液並びに緩衝液濃度の組み合わせの選択を含む、多くの方法によって制御することができる。
【００１４】
１つの実施態様では、その方法は、表面又は無生物を消毒するのに十分な、並びに溶液の高過酸濃度に伴う腐食作用を減少若しくは防止するのに十分な過酸濃度を有する、酵素触媒による過酸溶液の生産手段を提供する。第２の実施態様では、その方法は、消毒する、又は布地若しくは洗濯物から染みを除くのに十分な、そしてまた、溶液中のより高い過酸濃度に伴う染色した布地若しくは衣類に対する損傷作用、又は織物の品位に関わる損傷作用を軽減若しくは防止するのに十分な過酸濃度を有する、酵素触媒による過酸溶液の生産手段を提供する。いくつかの実施態様では、その方法は、酵素活性の持続期間が、第２の酵素触媒による過酸の加水分解がカルボン酸（例えば、酢酸）を生産する場合の、最初の酵素触媒反応で生産された過酸の第２の酵素触媒による実質的な加水分解を仲介するのには十分でない、表面若しくは無生物を消毒するのに好適な酵素触媒による過酸溶液の生産手段を提供する。
【００１５】
酵素触媒反応によって生産される過酸の量を制御する１つの方法は、酵素の触媒機能を選択的に低下させる又は不活性化するという反応条件を使用することである。ペルヒドロラーゼ酵素の触媒活性は、反応混合物のｐＨを変化させるなど、多くの方法で制御できる。従って、反応混合物の初期ｐＨは、過酸が生産されるのにつれて反応物のｐＨが低下し、最終的に酵素活性が著しく低下するか又は不活性化されるようなｐＨを有する反応混合物を生じるように調整すればよい。あるいは、低濃度の過酸しか望まない場合、反応の初期ｐＨは、実質的に酵素活性を低下させ、ほんの短時間の酵素触媒による過酸生産を起こさせるのに十分なだけ低くすることができる。酵素触媒反応によって生産される過酸の量を制御する別の方法は、緩衝能力が制限され、過酸及び他の反応生産物（例えば、カルボン酸）が生産されるにつれて緩衝能が迅速に消耗され、それによって反応混合物のｐＨが低下し、そして、酵素活性を低下又は不活性化させるような、反応混合物中の緩衝液の濃度を使用することである。酵素触媒反応によって生産される過酸の量を制御する１つの方法は、反応混合物の初期ｐＨの選択、及び反応混合物のｐＨが、目的の量の過酸が生産されるのにつれて反応の酵素活性が低下又は不活性化されるように、反応混合物のｐＨ低下を起こさせるｐＫａを持つ緩衝液を選択することである。別のアプローチは、触媒活性が著しく低下するか又は不活性化されるポイントまで、反応混合液のｐＨ低下を起こさせる過酸の高い初期生産力の反応を生み出す高い触媒反応速度を持つｐＨ感受性酵素を使用することである。しかし、これらのそれぞれのアプローチは、反応に用いるために、反応混合物が所望のｐＨに到達した時、過酸の生産を触媒する酵素の能力が無くなる又は実質的に低下するような、ｐＨ感受性触媒活性を有する酵素を選択する必要がある。また、目標量の過酸を生産するペルヒドロリシス反応をデザインするためには、酵素の比活性対反応ｐＨプロファイルを理解しなければならない。本明細書では、ｐＨ感受性ペルヒドロラーゼ酵素及び一定時間に標的濃度の過酸を生産する方法を説明する。
【００１６】
比較的安定な過酸濃度、即ち、酵素触媒活性のｐＨが介在する低下又は不活化の後、目標過酸濃度の約２０％以内を保持する過酸水溶液を説明する。いくつかの好ましい実施態様では、酵素触媒活性のｐＨが介在する低下又は不活化の後、目標過酸濃度の約１５％以内、そしてより好ましくは目標過酸濃度の約１０％以内の過酸濃度を保持する過酸水溶液が提供される。過酸濃度の安定性は、過酸の酵素触媒生産の低下又は不活化の後、数時間持続することができる。１つの実施態様では、過酸濃度は、過酸の酵素触媒生産を停止した後、約３時間、約６時間、約９時間、約１２時間、約１５時間、約１８時間、約２１時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間又は約４８時間安定である。
【００１７】
ペルヒドロラーゼの具体的な例としては、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）（ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標））、Ｂ.ズブチリスＢＥ１０１０（Payne and Jackson, J. Bacteriol. 173:2278-2282 (1991)）、Ｂ.ズブチリスＡＴＣＣ（登録商標）６６３３（商標）（米国特許第６，４６５，２３３号）、Ｂ.ズブチリスＡＴＣＣ（登録商標）２９２３３（商標）；Ｂ.リケニフォルミスＡＴＣＣ（登録商標）１４５８０（商標）（Rey et al., Genome Biol., 5(10):article 77 (2004)）、クロストリジウム・テルモセルム（Clostridium thermocellum）ＡＴＣＣ（登録商標）２７４０５（商標）（Copeland et al., ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＺＰ＿００５０４９９１）, Ｂ.プミルスＰＳ２１３（Degrassi et al., Microbiology, 146:1585-1591 (2000)）、サーモトガ・ネアポリタナ（Thermotoga neapolitana）(ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＡＡＢ７０８６９．１)、バチルス・クラウシイ（clausii）ＫＳＭ−Ｋ１６（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＹＰ＿１７５２６５）、バチルス属ＮＲＲＬ Ｂ−１４９１１（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＺＰ＿０１１６８６７４）、バチルス・ハロデュランス（Bacillus halodurans）Ｃ−１２５(ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＮＰ＿２４４１９２)、サーモアナエロバクテリウム属（Thermoanaerobacterium sp.）ＪＷ／ＳＬ ＹＳ４８５（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＡＡＢ６８８２１）、バチルス・ズブチリス亜種ズブチリス株１６８（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＮＰ＿３８８２００）、サーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）ＭＳＢ８（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＮＰ＿２２７８９３．１）、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリチカム（Thermoanaerobacterium saccharolyticum）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）Ｓ４１８５８)、サーモトガ・レティンガエ（Thermotoga lettingae）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＣＰ０００８１２）、サーモトガ・ペトロフィラ（Thermotoga petrophila）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＣＰ０００７０２）及びサーモトガ属（Thermotoga sp.）ＲＱ２（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＣＰ０００９６９）が挙げられる。
【００１８】
本明細書において説明されるそれぞれの本発明のペルヒドロラーゼ酵素は、保存された構造的特徴（即ち、保存されたシグネチャーモチーフ）を共通して保持しており、それに加えて、他のα／β−加水分解酵素と比較した場合、優れたペルヒドロリシス活性も保持しており、このために、この酵素ファミリーは、過酸を消毒剤及び／又は漂白剤として使用するのに十分な濃度でその場生成するのに特に適したものとなっている。本発明の方法において有用な好適なペルヒドロラーゼは、炭水化物エステラーゼのＣＥ−７ファミリー内で見出された、保存されたシグネチャーモチーフによって同定することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本明細書において提供されるものは、標的濃度のペルオキシカルボン酸を生産する方法であって、
ａ．標的濃度のペルオキシカルボン酸を生産させるための一式の反応成分を選択すること、ここで該反応成分は、
１）下記の化合物の少なくとも１つ又はそれらの混合物：
ｉ）以下の構造
［Ｘ］mＲ5
［式中、
Ｘは式Ｒ6Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ6は、場合によりヒドロキシル基又はＣ１〜Ｃ４のアルコキシ基で置換される、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖状、分枝鎖状又は環状のヒドロカルビル部分であり、ここでＲ6は、場合により、Ｒ6がＣ２〜Ｃ７の場合１つ又はそれ以上のエーテル結合を含み；
Ｒ5は、場合によりヒドロキシル基で置換される、Ｃ１〜Ｃ６の直鎖状、分枝鎖状又は環状のヒドロカルビル部分であり、ここでＲ5中の各炭素原子はそれぞれ最大で１つのヒドロキシル基又は最大で１つのエステル基を含み、ここでＲ5は、場合により、１つ又はそれ以上のエーテル結合を含み；
ｍは１からＲ5中の炭素数までの整数である］
を有するエステルであって、
２５℃で水に対して少なくとも５ｐｐｍの溶解度を有する、上記エステル；又は
ｉｉ）以下の構造
【化１】
0005504268.tif 000004
［式中、Ｒ1は、場合によりヒドロキシル基又はＣ１〜Ｃ４のアルコキシ基で置換される、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖又は分岐鎖のアルキルであり、そしてＲ3及びＲ4はそれぞれＨ又はＲ1Ｃ（Ｏ）である］を有するグリセリド；又は
ｉｉｉ）アセチル化単糖、アセチル化二糖、又はアセチル化多糖；
２）過酸素源；
３）ペルヒドロリシス活性を有する酵素触媒、ここで該酵素触媒は、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いると参照配列の配列番号２にアラインするＣＥ−７シグネチャーモチーフを有する酵素を含み、該シグネチャーモチーフは、
ｉ）配列番号２のアミノ酸の位置１１８〜１２０におけるＲＧＱモチーフ；
ｉｉ）配列番号２のアミノ酸の位置１７９〜１８３におけるＧＸＳＱＧモチーフ；及び
ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸の位置２９８〜２９９におけるＨＥモチーフ；を含み、ここで該酵素は、配列番号２と少なくとも３０％のアミノ酸同一性を含む；そして
４）場合により、少なくとも１つの緩衝液；
を含み；そして
ｂ．選択された一式の反応成分を水性の反応条件下で混合して反応混合物を形成させ；それによって、ペルオキシカルボン酸を含む反応生産物を形成させること；ここで、ペルオキシカルボン酸を含む反応生産物により、反応混合物のｐＨが、反応成分を混合して約１分〜約１０分以内に約６未満に低下し、そして標的濃度のペルオキシカルボン酸が生産され、ここで反応混合物のｐＨ低下を、生産される標的濃度のペルオキシカルボン酸を制御するために使用する；
を含む方法である。
【００２０】
また、本明細書において提供されるものは、標的濃度のペルオキシカルボン酸を生産することによって硬表面又は無生物を消毒する方法であって、
ａ．標的濃度のペルオキシカルボン酸を生産させるための一式の反応成分を選択すること、ここで、該反応成分は、
１）下記の化合物の少なくとも１つ又はそれらの混合物：
ｉ）以下の構造
［Ｘ］mＲ5
［式中、
Ｘは式Ｒ6Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ6は、場合によりヒドロキシル基又はＣ１〜Ｃ４のアルコキシ基で置換される、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖状、分枝鎖状又は環状のヒドロカルビル部分であり、ここでＲ6は、場合により、Ｒ6がＣ２〜Ｃ７の場合１つ又はそれ以上のエーテル結合を含み；
Ｒ5は、場合によりヒドロキシル基で置換される、Ｃ１〜Ｃ６の直鎖状、分枝鎖状又は環状のヒドロカルビル部分であり、ここでＲ5中の各炭素原子はそれぞれ最大で１つのヒドロキシル基又は最大で１つのエステル基を含み、ここでＲ5は、場合により、１つ又はそれ以上のエーテル結合を含み；
ｍは１からＲ5中の炭素数までの整数である］
を有するエステルであって、
２５℃で水に対して少なくとも５ｐｐｍの溶解度を有する、上記エステル；又は
ｉｉ）以下の構造
【化２】
0005504268.tif 000005
［式中、Ｒ1は場合によりヒドロキシル基又はＣ１〜Ｃ４のアルコキシ基で置換される、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖又は分岐鎖のアルキルであり、そしてＲ3及びＲ4はそれぞれＨ又はＲ1Ｃ（Ｏ）である］を有するグリセリド；又は
ｉｉｉ）アセチル化単糖、アセチル化二糖、又はアセチル化多糖；
２）過酸素源；
３）ペルヒドロリシス活性を有する酵素触媒、ここで該酵素触媒は、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いると参照配列の配列番号２にアラインするＣＥ−７シグネチャーモチーフを有する酵素を含み、該シグネチャーモチーフは、
ｉ）配列番号２のアミノ酸の位置１１８〜１２０におけるＲＧＱモチーフ；
ｉｉ）配列番号２のアミノ酸の位置１７９〜１８３におけるＧＸＳＱＧモチーフ；及び
ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸の位置２９８〜２９９におけるＨＥモチーフ；を含み、ここで該酵素は、配列番号２と少なくとも３０％のアミノ酸同一性を含む；そして
４）場合により、少なくとも１つの緩衝液；
を含み；そして
ｂ．選択された一式の反応成分を水性の反応条件下で混合して反応混合物を形成させ；
それによって、ペルオキシカルボン酸を含む反応生産物を形成させること；ここで、ペルオキシカルボン酸を含む反応生産物により、反応混合物のｐＨが、反応成分を混合して約１分〜約１０分以内に約６未満に低下し、そして標的濃度のペルオキシカルボン酸が生産され、ここで反応混合物のｐＨ低下を、生産される標的濃度のペルオキシカルボン酸を制御するために使用し；そして
ｃ．工程（ｂ）で生産されるペルオキシカルボン酸を硬表面又は無生物に適用すること；
を含む方法である。
【００２１】
いくつかの実施態様では、生産されたペルオキシカルボン酸は希釈される。
【００２２】
別の実施態様では、触媒は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３０、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、及び配列番号６２から成るグループから選択される１つ又はそれ以上のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なアミノ酸配列を有する、実質的に類似した酵素である。
【００２３】
別の実施態様では、ペルヒドロラーゼ触媒は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２９、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、及び配列番号６１から成るグループから選択される１つ又はそれ以上の核酸配列と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされたアミノ酸配列を有する酵素を含む。好ましい実施態様では、本発明は、配列番号１、配列番号９、配列番号１３、及び配列番号１５から成るグループから選択される核酸配列を有する核酸分子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする分離された核酸分子によってコードされたペルヒドロラーゼ活性を有する酵素を包含する。
【００２４】
別の実施態様では、ペルヒドロラーゼ触媒は、配列番号６９、７０、７１、７２、又は７３と比較した場合、配列番号６９、７０、７１、７２、又は７３のアミノ酸２７７への置換が、セリン、スレオニン、バリン及びアラニンから成るグループから選択されるという条件で、ペアワイズアラインメントデフォルトパラメーター（pairwise alignment default parameter）のＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５及びＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５を用いた、ＣＬＵＳＴＡＬのアラインメント法（ＣＬＵＳＴＡＬＷなど）に基づくと、少なくとも９５％アミノ酸配列の同一性（又は、様々な実施態様では、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性）を有する変異型サーモトガ酵素を包含する。
【００２５】
別の実施態様では、ペルヒドロラーゼ触媒は、アミノ酸残基２７７がセリン、スレオニン、バリン及びアラニンから成るグループから選択されるなら、配列番号６９、７０、７１、７２、及び７３から成るグループから選択されるアミノ酸配列を含む変異型サーモトガ酵素を包含する。
【００２６】
１つの特定の実施態様では、ペルヒドロラーゼ触媒は、配列番号６９のアミノ酸残基２７７がセリン、スレオニン、バリン及びアラニンから成るグループから選択されるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含む、変異型サーモトガ・ネアポリタナ酵素を包含する。
【００２７】
更なる特定の実施態様では、ペルヒドロラーゼ触媒は、配列番号７０のアミノ酸残基２７７がセリン、スレオニン、バリン及びアラニンから成るグループから選択されるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含む、変異型サーモトガ・マリチマ酵素を包含する。
【００２８】
いくつかの態様では、反応混合物水溶液は緩衝液を含有し、特定の初期ｐＨを有する。緩衝液は、目的のｐＨで酵素的ペルヒドロリシス反応を行うのに好適な任意の緩衝液でよい。いくつかの態様では、緩衝液は、ナトリウム塩、カリウム塩又はナトリウムとカリウムの混合塩の重炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、メチルホスホン酸緩衝液、ピロリン酸緩衝液及びリン酸塩緩衝液から成るグループから選択される。いくつかの態様では、緩衝液は、重炭酸緩衝液又はクエン酸緩衝液である。いくつかの態様では、緩衝液を含む反応混合物は、約５．５〜約８．５の初期ｐＨを有する。いくつかの態様では、緩衝液を含む反応混合物は、約８．５の初期ｐＨを有する。いくつかの態様では、緩衝液を含む反応混合物は、約８．１の初期ｐＨを有する。いくつかの態様では、緩衝液を含む反応混合物は、約７．２の初期ｐＨを有する。いくつかの態様では、緩衝液を含む反応混合物は、約６．５の初期ｐＨを有する。いくつかの態様では、緩衝液を含む反応混合物は、約６．０の初期ｐＨを有する。いくつかの態様では、緩衝液を含む反応混合物は、約５．５の初期ｐＨを有する。
【００２９】
いくつかの態様では、反応混合物水溶液に含まれる緩衝液が混合物の初期ｐＨを規定することができる。いくつかの態様では、緩衝液は、反応混合物水溶液に約５．５〜約８．５の初期ｐＨを出現させる。いくつかの態様では、緩衝液は、反応混合物水溶液に約８．１の初期ｐＨを出現させる。いくつかの態様では、緩衝液は、反応混合物水溶液に約７．２の初期ｐＨを出現させる。いくつかの態様では、緩衝液は、反応混合物水溶液に約６．５の初期ｐＨを出現させる。いくつかの態様では、緩衝液は、反応混合物水溶液に約６の初期ｐＨを出現させる。いくつかの態様では、緩衝液は、反応混合物水溶液に約５．５の初期ｐＨを出現させる。
【００３０】
いくつかの態様では、反応混合物水溶液は、特定の濃度を有する少なくとも１つの緩衝液を含んでもよい。緩衝液は、酵素的ペルヒドロリシス反応を行うのに好適な任意の緩衝液でよい。いくつかの態様では、反応混合物は、緩衝液を約０．０１ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度で含む。いくつかの態様では、反応混合物は、緩衝液を約５０ｍＭの濃度で含む。いくつかの態様では、反応混合物は、約２５ｍＭ〜約０．１ｍＭの濃度を有する緩衝液を含む。いくつかの態様では、反応混合物は、約２５ｍＭ〜約０．１ｍＭの濃度を有する重炭酸緩衝液を含む。いくつかの態様では、反応混合物は、約５ｍＭ未満の濃度を有する緩衝液を含む。いくつかの態様では、反応混合物は、約５ｍＭ未満の濃度を有する重炭酸緩衝液を含む。
【００３１】
好ましい実施態様では、基質は、以下から成るグループから選択される:モノアセチン；ジアセチン；トリアセチン；モノプロピオニン；ジプロピオニン；トリプロピオニン；モノブチリン；ジブチリン；トリブチリン；グルコースペンタアセテート；キシローステトラアセテート；アセチル化キシラン；アセチル化キシランフラグメント；β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート；トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール；トリ−Ｏ−アセチル−グルカール；１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、２，５−ペンタンジオール、１，６−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、２，５−ヘキサンジオール、１，６−ヘキサンジオールのモノエステル又はジエステル；及びそれらの混合物。
【００３２】
生物学的配列の簡単な説明
以下の配列は、３７Ｃ.Ｆ.Ｒ.１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則（“Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures - the Sequence Rules”）」）に準拠し、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）、並びに欧州特許条約（ＥＰＣ）及び特許協力条約（ＰＣＴ）の規則５．２及び４９．５（ａ−ｂｉｓ）並びに細則２０８及び実施細則の付属書Ｃに記載の配列表の要件に従う。ヌクレオチド及びアミノ酸配列データで用いられる記号及び様式は３７Ｃ.Ｆ.Ｒ.§１．８２２に記載されている規則に準拠する。
【００３３】
配列番号１は、バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）由来のセファロスポリンＣデアセチラーゼ（ｃａｈ）のコード領域の核酸配列である。
【００３４】
配列番号２は、バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）由来のセファロスポリンＣデアセチラーゼの推測のアミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号３は、Ｂ．ズブチリス亜種のズブチリス株１６８由来のセファロスポリンＣデアセチラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００３６】
配列番号４は、Ｂ．ズブチリス亜種のズブチリス株１６８由来のセファロスポリンＣデアセチラーゼの推測のアミノ酸配列であり、Ｂ．ズブチリスＢＥ１０１０由来のセファロスポリンＣデアセチラーゼの推測のアミノ酸配列と同一である。
【００３７】
配列番号５は、Ｂ．ズブチリスＡＴＣＣ（登録商標）６６３３（商標）由来のセファロスポリンアセチルエステラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００３８】
配列番号６は、Ｂ．ズブチリスＡＴＣＣ（登録商標）６６３３（商標）由来のセファロスポリンアセチルエステラーゼの推測のアミノ酸配列である。
【００３９】
配列番号７は、Ｂ.リケニフォルミスＡＴＣＣ（登録商標）１４５８０（商標）由来のセファロスポリンＣデアセチラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００４０】
配列番号８は、Ｂ.リケニフォルミスＡＴＣＣ（登録商標）１４５８０（商標）由来のセファロスポリンＣデアセチラーゼの推測のアミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号９は、Ｂ．プミルスＰＳ２１３由来のアセチルキシランエステラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００４２】
配列番号１０は、Ｂ．プミルスＰＳ２１３由来のアセチルキシランエステラーゼの推測のアミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号１１は、クロストリジウム・テルモセルムＡＴＣＣ（登録商標）２７４０５（商標）由来のアセチルキシランエステラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００４４】
配列番号１２は、クロストリジウム・テルモセルムＡＴＣＣ（登録商標）２７４０５（商標）由来のアセチルキシランエステラーゼの推測のアミノ酸配列である。
【００４５】
配列番号１３は、サーモトガ・ネアポリタナ由来のアセチルキシランエステラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００４６】
配列番号１４は、サーモトガ・ネアポリタナ由来のアセチルキシランエステラーゼの推測のアミノ酸配列である。
【００４７】
配列番号１５は、サーモトガ・マリチマＭＳＢ８由来のアセチルキシランエステラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００４８】
配列番号１６は、サーモトガ・マリチマＭＳＢ８由来のアセチルキシランエステラーゼの推測のアミノ酸配列である。
【００４９】
配列番号１７は、サーモアナエロバクテリウム属ＪＷ／ＳＬ ＹＳ４８５由来のアセチルキシランエステラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００５０】
配列番号１８は、サーモアナエロバクテリウム属ＪＷ／ＳＬ ＹＳ４８５由来のアセチルキシランエステラーゼの推測のアミノ酸配列である。
【００５１】
配列番号１９は、バチルス属ＮＲＲＬ Ｂ−１４９１１由来のセファロスポリンＣデアセチラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００５２】
配列番号２０は、バチルス属ＮＲＲＬ Ｂ−１４９１１由来のセファロスポリンＣデアセチラーゼの推測のアミノ酸配列である。
【００５３】
配列番号２１は、バチルス・ハロデュランスＣ−１２５由来のセファロスポリンＣデアセチラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００５４】
配列番号２２は、バチルス・ハロデュランスＣ−１２５由来のセファロスポリンＣデアセチラーゼの推測のアミノ酸配列である。
【００５５】
配列番号２３は、バチルス・クラウシイＫＳＭ−Ｋ１６由来のセファロスポリンＣデアセチラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００５６】
配列番号２４は、バチルス・クラウシイＫＳＭ−Ｋ１６由来のセファロスポリンＣデアセチラーゼの推測のアミノ酸配列である。
【００５７】
配列番号２５及び２６は、ｐＳＷ１９４及びｐＳＷ１８９を構築するためにバチルス・ズブチリス種由来のペルヒドロラーゼ遺伝子をＰＣＲで増幅するために用いられるプライマーである。
【００５８】
配列番号２７は、ｐＳＷ１９４にクローニングしたＰＣＲ産物の核酸配列である。
【００５９】
配列番号２８は、ｐＳＷ１８９にクローニングしたＰＣＲ産物の核酸配列である。
【００６０】
配列番号２９は、バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ（登録商標）２９２３３（商標）セファロスポリンＣデアセチラーゼ（ｃａｈ）遺伝子の核酸配列である。
【００６１】
配列番号３０は、バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ（登録商標）２９２３３（商標）セファロスポリンＣデアセチラーゼ（ＣＡＨ）の推測のアミノ酸配列である。
【００６２】
配列番号３１及び３２は、ｐＳＷ１９１を構築するためにバチルス・リケニフォルミスＡＴＣＣ（登録商標）１４５８０（商標）セファロスポリンＣデアセチラーゼ遺伝子をＰＣＲで増幅するために用いられるプライマーである。
【００６３】
配列番号３３及び３４は、ｐＳＷ１９５を構築するためにバチルス・プミルスＰＳ２１３アセチルキシランエステラーゼのコード配列（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）AJ249957）をＰＣＲで増幅するために用いられるプライマーである。
【００６４】
配列番号３５は、カナマイシン耐性遺伝子の核酸配列である。
【００６５】
配列番号３６は、プラスミドｐＫＤ１３の核酸配列である。
【００６６】
配列番号３７及び３８は、Ｅ．コリＭＧ１６５５中で、ｋａｔＧカタラーゼ遺伝子に相同性を有する領域に隣接したカナマイシン遺伝子をコードするＰＣＲ産物を生成するために使用されるプライマーである。この産物は、内因性ｋａｔＧ遺伝子を破壊するために用いられた。
【００６７】
配列番号３９は、Ｅ．コリＭＧ１６５５中でｋａｔＧカタラーゼ遺伝子に相同性を有する領域に隣接したカナマイシン耐性遺伝子をコードするＰＣＲ産物の核酸配列である。この産物は、内因性ｋａｔＧ遺伝子を破壊するために用いられた。
【００６８】
配列番号４０は、Ｅ．コリＭＧ１６５５におけるｋａｔＧカタラーゼ遺伝子の核酸配列である。
【００６９】
配列番号４１は、Ｅ．コリＭＧ１６５５におけるｋａｔＧカタラーゼの推測のアミノ酸配列である。
【００７０】
配列番号４２は、プラスミドｐＫＤ４６の核酸配列である。
【００７１】
配列番号４３及び４４は、ｋａｔＧ遺伝子の破壊を確認するために使用されるプライマーである。
【００７２】
配列番号４５は、プラスミドｐＣＰ２０の核酸配列である。
【００７３】
配列番号４６及び４７は、Ｅ.コリＭＧ１６５５中でｋａｔＥカタラーゼ遺伝子に相同性を有する領域に隣接したカナマイシン遺伝子をコードするＰＣＲ産物を生成するために使用されるプライマーである。この産物は、内因性ｋａｔＥ遺伝子を破壊するのに用いられた。
【００７４】
配列番号４８は、Ｅ.コリＭＧ１６５５中で、ｋａｔＥカタラーゼ遺伝子に相同性を有する領域に隣接したカナマイシン遺伝子をコードするＰＣＲ産物の核酸配列である。この産物は、内因性ｋａｔＥ遺伝子を破壊するのに用いられた。
【００７５】
配列番号４９は、Ｅ.コリＭＧ１６５５中でのｋａｔＥカタラーゼ遺伝子の核酸配列である。
【００７６】
配列番号５０は、Ｅ.コリＭＧ１６５５中でのｋａｔＥカタラーゼの推測のアミノ酸配列である。
【００７７】
配列番号５１及び５２は、単一ノックアウト株Ｅ.コリＭＧ１６５５ΔｋａｔＥ、及び二重ノックアウト株Ｅ.コリＭＧ１６５５ΔｋａｔＧΔｋａｔＥにおけるｋａｔＥ遺伝子の破壊を確認するのに用いられるプライマーであり、本明細書においてＥ.コリＫＬＰ１８と称される。
【００７８】
配列番号５３は、配列番号２のアミノ酸残基１１８〜２９９を包含する領域のアミノ酸配列である。
【００７９】
配列番号５４は、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリチカム（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号Ｓ４１８５８)由来のアセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００８０】
配列番号５５は、サーモトガ・レティンガエ由来のアセチルキシランエステラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００８１】
配列番号５６は、サーモトガ・レティンガエ由来のアセチルキシランエステラーゼの推測のアミノ酸配列である。
【００８２】
配列番号５７は、サーモトガ・ペトロフィラ由来のアセチルキシランエステラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００８３】
配列番号５８は、サーモトガ・ペトロフィラ由来のアセチルキシランエステラーゼの推測のアミノ酸配列である。
【００８４】
配列番号５９は、本明細書で「ＲＱ２（ａ）」として識別されるサーモトガ属ＲＱ２由来のアセチルキシランエステラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００８５】
配列番号６０は、本明細書で「ＲＱ２（ａ）」として識別されるサーモトガ属ＲＱ２由来のアセチルキシランエステラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＡＣＢ０９２２２)の推測のアミノ酸配列である。
【００８６】
配列番号６１は、本明細書で「ＲＱ２（ｂ）」として識別されるサーモトガ属ＲＱ２由来のアセチルキシランエステラーゼのコード領域の核酸配列である。
【００８７】
配列番号６２は、本明細書で「ＲＱ２（ｂ）」として識別されるサーモトガ属ＲＱ２由来のアセチルキシランエステラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＡＣＢ０８８６０)の推測のアミノ酸配列である。
【００８８】
配列番号６３及び６４は、サーモトガ・マリチマＭＳＢ８のアセチルキシランエステラーゼ遺伝子（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＮＰ＿２２７８９３．１）をＰＣＲ増幅するために用いたプライマーである。
【００８９】
配列番号６５は、ｐＳＷ２０７を生成するために使用した、サーモトガ・マリチマＭＳＢ８アセチルキシランエステラーゼのＰＣＲで増幅した遺伝子配列である。
【００９０】
配列番号６６及び６７は、ｐＳＷ１９６を構築するためにサーモトガ・ネアポリタナのアセチルキシランエステラーゼ遺伝子(ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）５８６３２)をＰＣＲで増幅するために用いたプライマーである。
【００９１】
配列番号６８は、プラスミドｐＳＷ１９６中の、サーモトガ・ネアポリタナのアセチルキシランエステラーゼ遺伝子のコドン最適化バージョンの核酸配列である。
【００９２】
配列番号６９は、サーモトガ・ネアポリタナ由来のアセチルキシランエステラーゼの野生型配列から誘導される、２７７番目のＸａａ残基がＡｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒであるアセチルキシランエステラーゼ変異体の推測のアミノ酸配列を示す。
【００９３】
配列番号７０は、サーモトガ・マリチマＭＳＢ８由来のアセチルキシランエステラーゼの野生型配列から誘導される、２７７番目のＸａａ残基がＡｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒであるアセチルキシランエステラーゼ変異体の推測のアミノ酸配列を示す。
【００９４】
配列番号７１は、サーモトガ・レティンガエ由来のアセチルキシランエステラーゼの野生型配列から誘導される、２７７番目のＸａａ残基がＡｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒであるアセチルキシランエステラーゼ変異体の推測のアミノ酸配列を示す。
【００９５】
配列番号７２は、サーモトガ・ペトロフィラ由来のアセチルキシランエステラーゼの野生型配列から誘導される、２７７番目のＸａａ残基がＡｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒであるアセチルキシランエステラーゼ変異体の推測のアミノ酸配列を示す。
【００９６】
配列番号７３は、本明細書で「ＲＱ２（ａ）」として識別されるサーモトガ属ＲＱ２由来のアセチルキシランエステラーゼの野生型配列から誘導される、２７７番目のＸａａ残基がＡｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒであるアセチルキシランエステラーゼ変異体の推測のアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００９７】
上記した課題は、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーに属する酵素が、カルボン酸エステル基質を過酸に変換する有意なペルヒドロリシス活性を示すこと、そしてそれは反応混合物のｐＨのコントロールによって制御できるという発見によって解決している。ＣＥ−７炭水化物エステラーゼの比活性対ｐＨプロファイルの解明は、緩衝液濃度及びｐＨを含む反応パラメーターを変えることによって、酵素駆動の過酸生産の制御を可能にする。これを理解すれば、この構造的に関連する酵素ファミリーは、消毒及び／又は漂白用途のための、安定した標的濃度の過酸を生産させるために使うことができる。
【００９８】
この開示では、多くの用語及び略語が使用される。特に他の規定がない限り、以下の定義が適用される。
【００９９】
本明細書で用いられる用語「〜を含む」は、述べられた特徴、整数、工程又は構成要素が請求項で述べられるように存在することを意味するが、１つ又はそれ以上の他の特徴、整数、工程、構成要素又はそれらのグループの存在若しくは付加を排除するものではない。用語「〜を含む」は、「基本的に〜から成る」及び「〜から成る」によって包含される具体的表現を含むことを意図する。同様に、用語「基本的に〜を含む」は、用語「〜から成る」によって包含される具体的表現を含むことを意図する。
【０１００】
本明細書で用いられる、本発明の成分若しくは反応物、又は用いられた成分若しくは反応物の量を修飾する「約」という用語は、例えば、現実での濃縮物又は使用溶液を作成するのに用いられる典型的な測定手順及び液体の取り扱い手順を通して；これらの手順中での意図しないエラーを通して;本組成物を作成したり、又は本方法を実施したりするのに用いられる成分の製造、供給源又は純度の相違を通して発生し得る数量の変動を意味する。また用語「約」は、特定の最初の混合物から得られた組成物の種々の平衡状態に起因して相違する量も包含する。用語「約」で修飾されているかどうかにかかわらず、請求項は、その量の等量も含む。
【０１０１】
本明細書で用いられる用語「過酸」は、ペルオキシ酸（peroxyacid）、ペルオキシカルボン酸、ペルオキシ酸（peroxy acid）、過カルボン酸、及びペルオキソ酸（peroxic acid）と同義語である。
【０１０２】
本明細書で用いられる用語「過酢酸」は「ＰＡＡ」のように略記され、ペルオキシ酢酸、エタンペルオキシ酸、及びＣＡＳ登録番号７９−２１−０の全てのその他の同義語と同義である。
【０１０３】
本明細書で用いられる用語「モノアセチン」は、グリセロールモノアセテート、グリセリンジアセテート、グリセリルジアセテートと同義である。
【０１０４】
本明細書で用いられる用語「ジアセチン」は、グリセロールジアセテート；グリセリンジアセテート、グリセリルジアセテート、及びＣＡＳ登録番号２５３９５−３１−７の全てのその他の同義語と同義である。
【０１０５】
本明細書で用いられる用語「トリアセチン」は、グリセリントリアセテート；グリセロールトリアセテート；グリセリルトリアセテート、１，２，３−トリアセトキシプロパン、１，２，３−プロパントリオールトリアセテート、及びＣＡＳ登録番号１０２−７６−１の全てのその他の同義語と同義である。
【０１０６】
本明細書で用いられる用語「モノブチリン」は、グリセロールモノブチラート、グリセリンモノブチラート、及びグリセリルモノブチラートと同義である。
【０１０７】
本明細書で用いられる用語「ジブチリン」は、グリセロールジブチラート及びグリセリルジブチラートと同義である。
【０１０８】
本明細書で用いられる用語「トリブチリン」は、グリセロールトリブチラート及び１，２，３−トリブチルグリセロール、及びＣＡＳ登録番号６０−０１−５の全てのその他の同義語と同義である。
【０１０９】
本明細書で用いられる用語「モノプロピオニン」は、グリセロールモノプロピオナート、グリセリンモノプロピオナート、及びグリセリルモノプロピオナートと同義である。
【０１１０】
本明細書で用いられる用語「ジプロピオニン」は、グリセロールジプロピオナート及びグリセリルジプロピオナートと同義である。
【０１１１】
本明細書で用いられる用語「トリプロピオニン」は、グリセリルトリプロピオナート、グリセロールトリプロピオナート、１，２，３−トリプロピオニルグリセロール、及びＣＡＳ登録番号１３９−４５−７の全てのその他の同義語と同義である。
【０１１２】
本明細書で用いられる用語「酢酸エチル」は、酢酸エチル（acetic ether）、アセトキシエタン、エチルエタノアート、酢酸エチルエステル、エタン酸エチルエステル、エチル酢酸エステル、及びＣＡＳ登録番号１４１−７８−６の全てのその他の同義語と同義である。
【０１１３】
本明細書で用いられる用語「乳酸エチル」は、乳酸エチルエステル及びＣＡＳ登録番号９７−６４−３の全てのその他の同義語と同義である。
【０１１４】
本明細書で用いられる用語「アセチル化糖（acetylated sugar）」及び「アセチル化糖（acetylated saccharide）」は、少なくとも１個のアセチル基を含む単糖、二糖及び多糖を意味する。例えば、このようなものとして、これらに限定されないが、グルコースペンタアセテート、キシローステトラアセテート、アセチル化キシラン、アセチル化キシランフラグメント、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、及びトリ−Ｏ−アセチル−グルカールが挙げられる。
【０１１５】
本明細書で用いられる用語「ヒドロカルビル」、「ヒドロカルビル基」及び「ヒドロカルビル部分」は、一重、二重又は三重の炭素・炭素結合によって及び／又はエーテル結合によって接続される、そしてそれ相応に水素原子で置換される炭素原子の直鎖状、分枝鎖状又は環状配置を意味する。そのようなヒドロカルビル基は、脂肪族及び/又は芳香族であってもよい。ヒドロカルビル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、シクロプロピル、シクロブチル、ペンチル、シクロペンチル、メチルシクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル、ベンジル及びフェニルが挙げられる。好ましい実施態様では、ヒドロカルビル部分は、一重の炭素・炭素結合及び／又はエーテル結合によって接続される、そしてそれ相応に水素原子で置換される炭素原子の直鎖状、分枝鎖状又は環状配置である。
【０１１６】
本明細書で用いられる用語の、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、２，５−ペンタンジオール、１，６−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、２，５−ヘキサンジオール、１，６−ヘキサンジオールの「モノエステル」及び「ジエステル」は、少なくとも１つの、式ＲＣ（Ｏ）Ｏ、式中、ＲはＣ１〜Ｃ７の直鎖状のヒドロカルビル部分である、のエステル基を含む該化合物を意味する。
【０１１７】
本明細書で用いられる用語「好適な酵素反応混合物」、「過酸のその場生成に好適な成分」、「好適な反応成分」、「選択された一式の反応成分」及び「好適な反応混合物水溶液」は、反応物質及び酵素触媒が接触するようになる材料及び水を意味する。反応成分は、酵素触媒のペルヒドロリシス活性を低下及び／又は不活性化することによってペルオキシカルボン酸の必要な標的濃度の生産を制御するために、反応混合物のｐＨが使われるように選択される。
【０１１８】
本明細書で用いられる用語「反応生産物」は、選択した反応成分を混ぜ合わせた後、反応混合物の中で形成される化合物の混合物を意味する。反応生産物は、酵素的に生成されたペルオキシカルボン酸（例えば、過酢酸）並びに対応するカルボン酸（例えば、酢酸）のような１つ又はそれ以上の加水分解生成物（酵素的及び／又は化学的な加水分解生成物）から構成される。１つの実施態様では、選択された一式の反応成分を混ぜ合わせると、反応混合物のｐＨを低下させ、それによって反応成分を混合してから１０分以内に、好ましくは約１分〜１０分以内に酵素触媒のペルヒドロリシス活性を実質的に低下及び／又は不活性化させる反応生産物を形成できる反応混合物が生成される。１つの実施態様では、酵素触媒のペルヒドロリシス活性は、反応成分を混ぜ合わせてから１０分又はそれ以下で少なくとも８０％低下する。反応生産物は、酵素的に生成されたペルオキシカルボン酸の量を制御するのに好適なｐＨを反応混合物にもたらす。初期の反応ｐＨは、反応成分の濃度、反応温度、緩衝液の有無、緩衝液のｐＫａ及び緩衝液の濃度を含めた多くの変数に依存する。１つの実施態様では、反応混合物のｐＨは、選択された一式の反応成分を混ぜ合わせてから１０分以内に約６．０以下に下がる。別の実施態様では、反応生産物は、反応成分を混ぜ合わせてから約１分〜約１０分以内に反応混合物のｐＨを約６未満に低下させる。
【０１１９】
好適な反応混合物水溶液の成分は本明細書に提供されており、当然ながら、当業者は本方法に好適な成分の変動範囲について理解している。１つの実施態様において、好適な酵素反応混合物は、反応成分を混ぜ合わせた際に過酸をその場生成する。そのようなものとして、反応成分は、反応成分の１種又はそれ以上が使用するまで別々になったままの多成分系として提供されてもよい。複数の活性成分を分離し、それらを組み合わせるための系及び手段の設計は当該分野でよく知られており、一般的には、個々の反応成分の物理的形態に依存することになる。例えば、複数の活性流体（液体−液体）系は、典型的にはマルチチャンバー式のディスペンサーボトル、又は二相系（米国特許出願第２００５／０１３９６０８号；米国特許第５，３９８，８４６号；米国特許第５，６２４，６３４号；米国特許第６，３９１，８４０号；欧州特許第０８０７１５６号Ｂ１；米国特許出願第２００５／０００８５２６号；及びＰＣＴ公報ＷＯ００／１１７１３Ａ１）を使用しており、これらは、例えば、反応性の流体を混合した際に望ましい漂白剤が生産されるようなある種の漂白用途で見られる。過酸を生成するために使用される多成分系のその他の形態としては、これらに限定されないが、１種又はそれ以上の固形成分、固体−液体成分の組み合わせ、例えば、粉末（例えば、多くの市販の漂白組成物、米国特許第５，１１６，５７５号）、多層錠（米国特許第６，２１０，６３９号）、複数のコンパートメントを有する水溶性のパケット（米国特許第６，９９５，１２５号）、及び水を添加すると反応する固体の凝集体（米国特許第６，３１９，８８８号）として設計されたものが挙げられる。
【０１２０】
１つの実施態様では、酵素の触媒活性を制御することによって標的濃度のペルオキシカルボン酸を生産する方法であって、
標的濃度のペルオキシカルボン酸を生産させるために、好適な水性反応条件下で、選択された反応成分を混ぜ合わせること、ここで、該反応成分は、
以下を含む第１の混合物：
ｉ）ペルヒドロラーゼ活性を有する酵素触媒、ここで、該酵素触媒はＣＥ−７シグネチャーモチーフを有する酵素を含む；及び
ｉｉ）カルボン酸エステル基質；
ここで、該第１の混合物は、場合により、無機又は有機緩衝液、腐食防止剤、湿潤剤、及びそれらの組み合わせから成るグループから選択される成分を含む；並びに
過酸素源及び水を含む第２の混合物、ここで、該第２の混合物は、場合によりキレート剤を含む；
を含む；
を含む方法が提供される。
【０１２１】
更なる関連する実施態様では、該処方の第１の混合物におけるカルボン酸エステル基質は、
ｉ）以下の構造
［Ｘ］mＲ5
［式中、
Ｘ＝式Ｒ6Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ6は、場合によりヒドロキシル基又はＣ１〜Ｃ４のアルコキシ基で置換される、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖状、分枝鎖状又は環状のヒドロカルビル部分であり、ここでＲ6は、場合により、Ｒ6がＣ２〜Ｃ７の場合１つ又はそれ以上のエーテル結合を含み；
Ｒ5＝場合によりヒドロキシル基で置換される、Ｃ１〜Ｃ６の直鎖状、分枝鎖状又は環状のヒドロカルビル部分であり、ここでＲ5中の各炭素原子はそれぞれ最大で１つのヒドロキシル基又は最大で１つのエステル基を含み、ここでＲ5は、場合により、１つ又はそれ以上のエーテル結合を含み；
ｍ＝１からＲ5中の炭素数までの整数である］
を有するエステルであって、
２５℃で水に対して少なくとも５ｐｐｍの溶解度を有する、上記エステル；
ｉｉ）以下の構造
【化３】
0005504268.tif 000006
［式中、場合によりヒドロキシル基又はＣ１〜Ｃ４のアルコキシ基で置換される、Ｒ1はＣ１〜Ｃ７の直鎖又は分岐鎖のアルキルであり、そしてＲ3及びＲ4はそれぞれ独立にＨ又はＲ1Ｃ（Ｏ）である］を有するグリセリド；そして
ｉｉｉ）アセチル化単糖、アセチル化二糖、又はアセチル化多糖から成るグループから選択されるアセチル化糖；
から成るグループから選択される。
【０１２２】
別の実施態様において、該処方の第１の混合物中のカルボン酸エステル基質は、以下の式：
【化４】
0005504268.tif 000007
式中、Ｒ1＝Ｃ１〜Ｃ７の直鎖状又は分枝鎖状のアルキルであり、場合によりヒドロキシル基若しくはＣ１〜Ｃ４のアルコキシ基で置換され、Ｒ2＝Ｃ１〜Ｃ１０の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ）nＨ、又は（ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）−Ｏ）nＨであり、そしてｎ＝１〜１０である；
によって定義される。
【０１２３】
１つの好ましい実施態様では、Ｒ6は、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖状のヒドロカルビル部分であり、場合によりヒドロキシル基若しくはＣ１〜Ｃ４のアルコキシ基で置換され、場合により１つ又はそれ以上のエーテル結合を含む。更に好ましい実施態様では、Ｒ6は、Ｃ２〜Ｃ７の直鎖状のヒドロカルビル部分であり、場合によりヒドロキシル基で置換され、及び／又は場合により１つ又はそれ以上のエーテル結合を含む。
【０１２４】
別の実施態様において、カルボン酸エステル基質は、以下から成るグループから選択される:モノアセチン；ジアセチン；トリアセチン；モノプロピオニン；ジプロピオニン；トリプロピオニン；モノブチリン；ジブチリン；トリブチリン；グルコースペンタアセテート；キシローステトラアセテート；アセチル化キシラン；アセチル化キシランフラグメント；β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート；トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール；トリ−Ｏ−アセチル−グルカール；１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、２，５−ペンタンジオール、１，６−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、２，５−ヘキサンジオール、及び１，６−ヘキサンジオールのモノエステル又はジエステル；及びそれらの混合物。
【０１２５】
別の実施態様において、カルボン酸エステルは、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン及びそれらの組み合わせから成るグループから選択される。別の実施態様において、カルボン酸エステルは、アセチル化糖である。別の実施態様において、基質は、１つ又はそれ以上のエステル基を含むＣ１〜Ｃ７ポリオールである。好ましい実施態様では、Ｃ１〜Ｃ６の１つ又はそれ以上のヒドロキシル基は、１つ又はそれ以上のアセトキシ基（例えば、１，３−プロパンジオールジアセテート、１，４−ブタンジオールジアセテートなど）で置換される。別の実施態様において、酵素触媒は粒子状固体である。別の実施態様において、上記に記載の第１の反応混合物は、固形錠剤又は粉末である。
【０１２６】
本明細書で用いられる用語「ペルヒドロリシス」は、選択された基質と過酸化物から過酸を形成する反応と定義される。典型的には、無機過酸化物は、触媒の存在下で選択された基質と反応して、過酸を生産する。あるいは、過酸化水素は、オキシダーゼ活性を有する酵素（例えば、グルコースオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ）によって触媒される基質と酸素の反応によって、その場生成させることができる。本明細書で用いられる用語「化学的なペルヒドロリシス」は、基質（過酸前駆体）を過酸化水素源と組み合わせるペルヒドロリシス反応を含み、ここで、過酸は酵素触媒の非存在下で形成される。
【０１２７】
本明細書で用いられる用語「ペルヒドロラーゼ活性」は、タンパク質の単位質量（例えば、ミリグラム）、乾燥細胞質量、又は固定化触媒質量当たりの触媒活性を意味する。
【０１２８】
本明細書で用いられる、「酵素活性の１単位」又は「活性の１単位」又は「Ｕ」は、特定の温度で、１分当たり１μｍｏｌの過酸生成物の生産に必要なペルヒドロラーゼ活性の量と定義される。
【０１２９】
本明細書で用いられる用語「酵素触媒」及び「ペルヒドロラーゼ触媒」は、ペルヒドロリシス活性を有する酵素を含む触媒を意味し、これは、微生物の全細胞、透過性微生物細胞、微生物細胞抽出物、部分的に精製酵素又は精製酵素の１種又はそれ以上の細胞の成分の形態であってもよい。また、その酵素触媒は、化学修飾されていてもよい（例えば、ペグ化によって、又は架橋試薬との反応による）。また、ペルヒドロラーゼ触媒は、当業者によく知られた方法を用いて可溶性又は不溶性支持体に固定化されていてもよい；例えば、酵素及び細胞の固定化（Immobilization of Enzymes and Cells）；Gordon F. Bickerstaff, Editor; Humana Press, Totowa, NJ, USA; 1997を参照。本明細書において説明されているように、本発明のペルヒドロリシス活性を有する酵素はいずれも、構造的に炭水化物ファミリーのエステラ−ゼファミリー７（ＣＥ−７）に属する酵素である（Coutinho, P.M., Henrissat, B. 最近の炭水化物生物工学の進展「炭水化物−活性酵素：統合データベース入門」（“Carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach” in Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering）, H.J. Gilbert, G. Davies, B. Henrissat and B. Svensson eds., (1999) The Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 3-12を参照）。
【０１３０】
ＣＥ−７ファミリーに属するものとしては、セファロスポリンＣデアセチラーゼ（ＣＡＨ；Ｅ．Ｃ．３．１．１．４１）、及びアセチルキシランエステラーゼ（ＡＸＥ；Ｅ．Ｃ．３．１．１．７２）が挙げられる。ＣＥ−７エステラーゼファミリーに属するものは、保存されたシグネチャーモチーフを共有する（Vincent et al., J. Mol. Biol., 330:593-606 (2003)）。ＣＥ−７シグネチャーモチーフ及び／又は実質的に類似の構造を含むペルヒドロラーゼは、本発明で使用するのに適している。実質的に類似した生体分子を同定する手段は当該分野で公知である（例えば、配列アラインメントプロトコール、核酸ハイブリダイゼーション、保存されたシグネチャーモチーフの存在など）。１つの態様において、このような本発明の方法における酵素触媒は、本明細書で示された配列と、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３３％、より好ましくは少なくとも４０％、更により好ましくは少なくとも５０％、なおより好ましくは少なくとも６０％、その上なおより好ましくは少なくとも７０％、その上なおより好ましくは少なくとも８０％、その上なおより好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸同一性を有する実質的に類似した酵素を含む。本明細書では、本発明のＣＥ−７炭水化物エステラ−ゼをコードする核酸分子も提供する。更なる実施態様では、本発明の方法において有用なペルヒドロラーゼ触媒は、ストリンジェントな条件下で本発明の核酸分子の何れか１つにハイブリダイズする核酸分子によってコードされている。
【０１３１】
本明細書で用いられる用語「セファロスポリンＣデアセチラーゼ」及び「セファロスポリンＣアセチルヒドロラーゼ」は、セファロスポリンＣ及び７−アミノセファロスポラン酸のようなセファロスポリンの脱アセチル化を触媒する酵素（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４１）を意味する（Mitsushima et al., Appl. Environ. Microbiol. 61(6): 2224-2229 (1995); 米国特許第５，５２８，１５２号；及び米国特許第５，３３８，６７６号）。本明細書で説明されているように、有意なペルヒドロリシス活性を有するいくつかのセファロスポリンＣデアセチラーゼが提供される。
【０１３２】
本明細書で用いられる「アセチルキシランエステラーゼ」は、アセチル化キシラン及びその他のアセチル化糖の脱アセチル化を触媒する酵素（Ｅ．Ｃ．３．１．１．７２；ＡＸＥ）を意味する。本明細書で説明されているように、有意なペルヒドロラーゼ活性を有するアセチルキシランエステラーゼとして分類される数種の酵素が提供される。
【０１３３】
本明細書で用いられる用語「バチルス・ズブチリス（ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標））」は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection;ＡＴＣＣ）に寄託された、国際寄託の受託番号ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）を有する細菌細胞を意味する。バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）は、２〜８個の炭素アシル基を有するグリセロールエステル、特にジアセチンを加水分解することができるエステルヒドロラーゼ（「ジアセチナーゼ」）活性を有することが報告されている（米国特許第４，４４４，８８６号；参照によりその全文が本明細書に組み込まれている）。本明細書において説明されているように、有意なペルヒドロラーゼ活性を有する酵素は既にＢ．ブチリスＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）から単離されており、これは、配列番号２として示される。単離された酵素のアミノ酸配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＢＡＡ０１７２９．１によって提供されたセファロスポリンＣデアセチラーゼと１００％のアミノ酸同一性を有する。
【０１３４】
本明細書で用いられる用語「バチルス・ズブチリスＢＥ１０１０」は、Payne及びJackson（J. Bacteriol. 173:2278-2282 (1991)）によって報告されているようなバチルス・ズブチリス株を意味する。バチルス・ズブチリスＢＥ１０１０は、染色体のズブチリシン及び中性プロテアーゼをコードする遺伝子に欠損を有する、派生的なバチルス・ズブチリス亜種のズブチリス株ＢＲ１５１（ＡＴＣＣ（登録商標）３３６７７（商標））である。本明細書において説明されているように、有意なペルヒドロラーゼ活性を有する酵素は既にＢ．ブチリスＢＥ１０１０から単離されており、これは、配列番号４として示される。単離された酵素のアミノ酸配列は、バチルス・ズブチリス亜種のズブチリス株ＢＲ１６８で報告されているセファロスポリンＣデアセチラーゼと１００％のアミノ酸同一性を有する（Kunst et al., Nature, 390:249-256 (1997)）。
【０１３５】
本明細書で用いられる用語「バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ（登録商標）２９２３３（商標）」は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された、国際寄託の受託番号ＡＴＣＣ（登録商標）２９２３３（商標）を有するバチルス・ズブチリス株を意味する。本明細書において説明されているように、有意なペルヒドロラーゼ活性を有する酵素は、Ｂ．ズブチリスＡＴＣＣ（登録商標）２９２３３（商標）から単離され、配列が決定されており、これは、配列番号３０として示される。
【０１３６】
本明細書で用いられる用語「クロストリジウム・テルモセルムＡＴＣＣ（登録商標）２７４０５（商標）」は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された、国際寄託の受託番号ＡＴＣＣ（登録商標）２７４０５（商標）を有するクロストリジウム・テルモセルム株を意味する。Ｃ．テルモセルムＡＴＣＣ（登録商標）２７４０５（商標）由来のペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号１２として示される。
【０１３７】
本明細書で用いられる用語「バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ（登録商標）６６３３（商標）」は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された、国際寄託の受託番号ＡＴＣＣ（登録商標）６６３３（商標）を有する細菌細胞を意味する。バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ（登録商標）６６３３（商標）は、セファロスポリンのアセチルヒドロラーゼ活性を有することが報告されている（米国特許第６，４６５，２３３号）。Ｂ.ズブチリスＡＴＣＣ（登録商標）６６３３（商標）由来のペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号６として示される。
【０１３８】
本明細書で用いられる用語「バチルス・リケニフォルミスＡＴＣＣ（登録商標）１４５８０（商標）」は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された、国際寄託の受託番号ＡＴＣＣ（登録商標）１４５８０（商標）を有する細菌細胞を意味する。バチルス・リケニフォルミスＡＴＣＣ（登録商標）１４５８０（商標）は、セファロスポリンのアセチルヒドロラーゼ活性を有することが報告されている（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＹＰ＿０７７６２１）。Ｂ.リケニフォルミスＡＴＣＣ（登録商標）１４５８０（商標）由来のペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号８として示される。
【０１３９】
本明細書で用いられる用語「バチルス・プミルスＰＳ２１３」は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有することが報告されている細菌細胞を意味する（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＡＪ２４９９５７）。バチルス・プミルスＰＳ２１３由来のペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号１０として示される。
【０１４０】
本明細書で用いられる用語「サーモトガ・ネアポリタナ」は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有することが報告されているサーモトガ・ネアポリタナ株を意味する（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＡＡＢ７０８６９）。サーモトガ・ネアポリタナ由来のペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号１４として示される。
【０１４１】
本明細書で用いられる用語「サーモトガ・マリチマＭＳＢ８」は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有することが報告されている細菌細胞を意味する（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＮＰ＿２２７８９３．１）。サーモトガ・マリチマＭＳＢ８由来のペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号１６として示される。
【０１４２】
本明細書で用いられる用語「バチルス・クラウシイＫＳＭ−Ｋ１６」は、セファロスポリンＣデアセチラーゼ活性を有することが報告されている細菌細胞を意味する（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＹＰ＿１７５２６５）。バチルス・クラウシイＫＳＭ−Ｋ１６由来のペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号２４として示される。
【０１４３】
本明細書で用いられる用語「サーモアナエロバクテリウム・サッカロリチカム」は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有することが報告されている細菌の菌株を意味する（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）Ｓ４１８５８）。サーモアナエロバクテリウム・サッカロリチカム由来のペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号５４として示される。
【０１４４】
本明細書で用いられる用語「サーモトガ・レティンガエ」は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有することが報告されている細菌細胞を意味する（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＣＰ０００８１２）。サーモトガ・レティンガエ由来のペルヒドロラーゼ活性を有する酵素の推測したアミノ酸配列は、配列番号５６として示される。
【０１４５】
本明細書で用いられる用語「サーモトガ・ペトロフィラ」は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有することが報告されている細菌細胞を意味する（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＣＰ０００７０２）。サーモトガ・ペトロフィラ由来のペルヒドロラーゼ活性を有する酵素の推測したアミノ酸配列は、配列番号５８として示される。
【０１４６】
本明細書で用いられる用語「サーモトガ属ＲＱ２」は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有することが報告されている細菌細胞を意味する（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＣＰ０００９６９）。サーモトガ属ＲＱ２から異なる２つのアセチルキシランエステラーゼが同定されており、それらは本明細書において「ＲＱ２（ａ）」（推測されるアミノ酸配列は配列番号６０として示される）及び「ＲＱ２（ｂ）」（推測されるアミノ酸配列は配列番号６２として示される）を意味する。
【０１４７】
本明細書で用いられる用語「単離された核酸分子」及び「単離された核酸フラグメント」は、交換可能に用いられることになり、一本鎖又は二本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡの高分子を意味し、場合により合成、非天然又は改変されたヌクレオチド塩基を含む。ＤＮＡの高分子の形態で単離された核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又は合成ＤＮＡの１種又はそれ以上のセグメントで構成されていてもよい。
【０１４８】
用語「アミノ酸」は、タンパク質又はポリペプチドの基礎となる化学的な構造単位を意味する。本明細書において、特定のアミノ酸を示すのに以下の略語が用いられる：
【表１】
0005504268.tif 000008
【０１４９】
本明細書で用いられる「実質的に類似した」は、核酸分子において、１個又はそれ以上のヌクレオチド塩基における変化によって１個又はそれ以上のアミノ酸の付加、置換又は欠失がおこるが、そのＤＮＡ配列によってコードされたタンパク質の機能特性（即ち、ペルヒドロリシス活性）に影響を与えないことを意味する。また本明細書で用いられる「実質的に類似した」は、本明細書において報告された配列に対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３３％、より好ましくは少なくとも４０％、更により好ましくは少なくとも５０％、なおより好ましくは少なくとも６０％、その上なおより好ましくは少なくとも７０％、その上なおより好ましくは少なくとも８０％、その上なおより好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なアミノ酸配列を有する酵素も意味しており、その中で、生じた酵素は本発明の機能特性（即ち、ペルヒドロリシス活性）を保持する。また、「実質的に類似した」は、ストリンジェントな条件下で本明細書において報告された核酸分子にハイブリダイズする核酸分子によってコードされた、ペルヒドロリシス活性を有する酵素を意味する場合もある。従って、当然ながら、本発明は、特定の例示された配列よりも多くのものを包含する。
【０１５０】
例えば、当該分野でよく知られているように、所定の部位で化学的に等価なアミノ酸の生産をもたらすが、コードされたタンパク質の機能特性に影響を与えない遺伝子の変更は一般的である。本発明の目的に対して、置換は、以下の５グループのうちいずれか１つの範囲内の変換と定義される：
１．小さい脂肪族の非極性の又はわずかに極性を有する残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）；
２．極性の負電荷を有する残基及びそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
３．極性の正電荷を有する残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
４．大きい脂肪族の非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）；及び
５．大きい芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。
【０１５１】
従って、疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンに対応するコドンが、その他のより低い疎水性の残基（例えば、グリシン）、又はより高い疎水性の残基（例えば、バリン、ロイシン又はイソロイシン）をコードするコドンで置換されていてもよい。同様に、ある負電荷を有する残基のその他の残基での置換（例えば、グルタミン酸をアスパラギン酸で置換）、又はある正電荷を有する残基のその他の残基での置換（例えば、アルギニンをリジンで置換）が起こる変化も、また、機能的に等価な生成物を生産することが予測できる。多くの場合において、タンパク質分子のＮ末端及びＣ末端部分の変更をもたらすヌクレオチドの変化も、また、タンパク質活性を変更しないと予測される。
【０１５２】
提案されたそれぞれの改変は、十分に当該分野における決まりきった技術の範囲内であり、コードされた生成物の生物活性が保持されているかどうかの決定も同様である。更に、当業者は、実質的に類似した配列も本発明に包含されることを認識している。１つの実施態様において、実質的に類似した配列は、ストリンジェントな条件下（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、及び２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄、続いて０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃）で、本明細書において例示された配列とハイブリダイズするそれらの能力によって定義される。１つの実施態様において、本発明は、ストリンジェントな条件下で、本明細書において報告された核酸分子にハイブリダイズする単離された核酸分子によってコードされた、ペルヒドロラーゼ活性を有する酵素を含む。好ましい実施態様において、本発明は、ストリンジェントな条件下で配列番号１、配列番号９、配列番号１３、及び配列番号１５から成るグループから選択される核酸配列を有する核酸分子にハイブリダイズする、単離された核酸分子によってコードされたペルヒドロラーゼ活性を有する酵素を含む。
【０１５３】
本明細書で用いられるように、温度及び溶液のイオン強度の適切な条件下で、第１の核酸分子の一本鎖がその他の核酸分子にアニールすることができる場合、その核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡのような他の核酸分子に「ハイブリダイゼーション可能」である。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件はよく知られており、Sambrook, J. 及び Russell, D., T.の、分子クローニング：実験室マニュアル、第３版（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition）, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2001)に例が示されている。ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定するのは、温度及びイオン強度の条件である。ストリンジェンシー条件を調節することによって、中程度に類似した分子、例えば、関連性の遠い生物由来の相同配列から、高度に類似した分子、例えば、密接に関連した生物由来の機能的な酵素を複製する遺伝子までスクリーニングすることができる。典型的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄がストリンジェンシー条件を決定する。好ましい条件の構成は、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを用いた室温で１５分間の洗浄から開始し、続いて２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを用いた４５℃で３０分間の洗浄を繰り返し、続いて０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを用いた５０℃で３０分間の洗浄を２回繰り返す一連の洗浄を使用するものである。より好ましい構成は、より高い温度を使用するものであり、この場合、最後の０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを用いた２回の３０分間の洗浄の温度が、６０℃に高められることを除いて、洗浄は上記の洗浄と同じである。その他の好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件の構成は、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、及び２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄、続いて最後に本明細書において例示された順序を用いた、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃での洗浄である。
【０１５４】
ハイブリダイゼーションは、２種の核酸が相補配列を含むことが必要であるが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが生じる可能性がある。ハイブリダイゼーションする核酸にとって適切なストリンジェンシーは、核酸の長さ、及び相補性の程度、当該分野で公知の可変値に依存する。２種のヌクレオチド配列間の類似性又は相同性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのためのＴｍ値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定性（より高いＴｍに対応する）は、以下の順番で低くなる：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００個より長いヌクレオチドのために、Ｔｍを計算する方程式が導かれている（Sambrook 及び Russell、上記）。比較的短い核酸、即ち、オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのためには、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Sambrook 及び Russell、上記）。１つの態様では、ハイブリダイゼーション可能な核酸は、少なくとも約１０個のヌクレオチドの長さを有する。好ましくはハイブリダイゼーション可能な核酸の最短の長さは、少なくとも約１５個のヌクレオチドの長さ、より好ましくは少なくとも約２０個のヌクレオチドの長さ、更により好ましくは少なくとも３０個のヌクレオチドの長さ、更により好ましくは少なくとも３００個のヌクレオチドの長さ、及び最も好ましくは少なくとも８００個のヌクレオチドの長さである。更に、当然のことながら、当業者は、プローブの長さのような要素に応じて、温度及び洗浄溶液の塩濃度を調節することが可能であることを認識している。
【０１５５】
本明細書で用いられる用語「パーセント同一性」は、配列の比較によって決められるような、２種又はそれ以上のポリペプチド配列間、又は２種又はそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当業界において、「同一性」は、また、ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列間の配列の関連性の程度も意味し、これは、場合によっては、このような配列のストリング間のマッチングによって決定されることもある。「同一性」及び「類似性」は、既知の方法によって容易に計算することができ、このような方法としては、これらに限定されないが、以下で説明されるものが挙げられる：Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing:  Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); and Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, NY (1991)。同一性及び類似性を決定する方法は、公に利用可能なコンピュータープログラムにおいて体系化されている。配列アラインメント及びパーセント同一性の計算は、Megalign program of the LASERGENE bioinformatics computing suite (DNASTAR Inc., Madison, WI), the AlignX program of Vector NTI v. 7.0 (Informax, Inc., Bethesda, MD), 又は the EMBOSS Open Software Suite (EMBL-EBI; Rice et al., Trends in Genetics 16, (6) pp276-277 (2000)) を用いて行ってもよい。アラインメントのクラスタル（Clustal）法（即ち、ＣＬＵＳＴＡＬＷ；例えば、バージョン１．８３）（Higgins and Sharp, CABIOS, 5:151153 (1989); Higgins et al., Nucleic Acids Res., 22:4673-4680 (1994); and Chenna et al., Nucleic Acids Res., 31 (13):3497-500 (2003)； the European Bioinformatics Institute経由でthe European Molecular Biology Laboratoryから入手可能）を用いて、デフォルトパラメーターにより配列のマルチプルアラインメントを行うことができる。ＣＬＵＳＴＡＬＷタンパク質アラインメントの好適なパラメーターは、ＧＡＰ存在ペナルティー＝１５、ＧＡＰ伸長＝０．２、マトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ（例えば、Ｇｏｎｎｅｔ２５０）、タンパク質ＥＮＤＧＡＰ＝−１、タンパク質ＧＡＰＤＩＳＴ＝４、及びＫＴＵＰＬＥ＝１を含む。１つの実施態様において、速い又は遅いアラインメントがデフォルト設定で用いられ、この場合遅いアラインメントが好ましい。あるいは、ＣＬＵＳＴＡＬＷ法（バージョン１．８３）を用いるパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ存在ペナルティー＝１０、ＧＡＰ伸長＝１、マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６４）、ウィンドウ＝５、保存された頂点対角（TOP DIAGONAL SAVED）＝５も使用できるように改変してもよい。
【０１５６】
本発明の１つの態様において、好適な単離された核酸分子（本発明の単離されたポリヌクレオチド）は、本明細書において報告されたアミノ酸配列に、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３３％、より好ましくは少なくとも４０％、更により好ましくは少なくとも５０％、なおより好ましくは少なくとも６０％、その上なおより好ましくは少なくとも７０％、その上なおより好ましくは少なくとも８０％、その上なおより好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。本発明の好適な核酸分子は、上記の相同性を有するだけでなく、典型的には、約３１０〜約３４０個のアミノ酸、より好ましくは約３１０〜約３３０個のアミノ酸、及び最も好ましくは約３１８個のアミノ酸を有するポリペプチドもコードする。
【０１５７】
本明細書で用いられる用語「シグネチャーモチーフ」、「ＣＥ−７シグネチャーモチーフ」及び「診断モチーフ」は、定義された活性を有する酵素ファミリーの間で共通の保存された構造を意味する。このようなシグネチャーモチーフを用いて、定義された基質グループに対して類似した酵素活性を有する構造的に関連する酵素のファミリーを特徴付け及び／又は同定することができる。シグネチャーモチーフは、単一の連続したアミノ酸配列でもよいし、又は一緒になってシグネチャーモチーフを形成する隣接していない保存されたモチーフの集合であってもよい。典型的には、保存されたモチーフは、アミノ酸配列で示される。本明細書において説明されているように、本発明のペルヒドロラーゼは、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーに属する。この酵素ファミリーは、シグネチャーモチーフの存在によって特徴付けることができる（Vincent et al.、上記）。
【０１５８】
本明細書で用いられる「コドンの縮退」は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えることなく、ヌクレオチド配列の変化が可能な遺伝子コードの性質を意味する。従って、本発明は、本発明の微生物のポリペプチドをコードする、アミノ酸配列の全部又はかなりの部分をコードするあらゆる核酸分子に関する。当業者であれば、所定のアミノ酸を指定するためのヌクレオチドコドンの使用において、特定の宿主細胞によって示される「コドン偏位」のことはよく認識している。従って、宿主細胞における発現を改善するための遺伝子を合成する場合、そのコドンの使用頻度が宿主細胞の好ましいコドンの使用頻度に近くなるように遺伝子を設計することが望ましい。
【０１５９】
本明細書で用いられる「合成遺伝子」は、当業者によく知られた手法を用いて化学合成されたオリゴヌクレオチドの部分構造から構築することができる。これらの部分構造をライゲーションし、アニールして遺伝子のセグメントを形成することができ、続いてこれを酵素的に組み立てて遺伝子全体を構築することができる。「化学合成された」は、ＤＮＡ配列に関する場合、ヌクレオチド成分が生体外で構築されたことを意味する。十分に確立された手法を用いて、ＤＮＡの手作業による化学合成を達成してもよいし、又は多数の市販の機械のいずれか１種を用いて自動化学合成を行ってもよい。従って、このような遺伝子は、宿主細胞のコドン偏位を反映するヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現が行われるように適合させることができる。当業者は、コドンの使用が、宿主にとって好ましいコドンに偏っている場合、遺伝子発現の成功の見込みについてよく理解している。好ましいコドンの決定は、配列情報が入手可能な宿主細胞由来の遺伝子の調査に基づいて行うことができる。
【０１６０】
本明細書で用いられる「遺伝子」は、特定のタンパク質を発現する核酸分子を意味し、これには、コード配列の前に存在する調節配列（５’の非コード配列）、及びコード配列の後に存在する調節配列（３’の非コード配列）も含まれる。「天然型の遺伝子」は、天然に見出されるような遺伝子（それら自身の調節配列も共に含む）を意味する。「キメラ遺伝子」は、天然に一緒に見出されない調節及びコード配列を含む非天然型遺伝子であるあらゆる遺伝子を意味する。従って、キメラ遺伝子は、異なる供給源から誘導された調節配列及びコード配列を含んでもよいし、又は同じ供給源から誘導されたが、天然に見出されるものとは異なる形態で配置された調節配列及びコード配列を含んでもよい。「内因性遺伝子」は、生物のゲノムの中でそれらの天然の位置に存在する天然型遺伝子を意味する。「外来」遺伝子は、通常では宿主生物中に見出されないが、遺伝子移入によって宿主生物に導入される遺伝子を意味する。外来遺伝子は、非天然型の生物に挿入された天然型遺伝子を含んでいてもよいし、又はキメラ遺伝子を含んでいてもよい。「導入遺伝子」は、形質転換によってゲノムに導入された遺伝子である。
【０１６１】
本明細書で用いられる「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を意味する。「好適な調節配列」は、コード配列の上流（５’の非コード配列）、コード配列内、又はその下流（３’の非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセッシング、又は連結したコード配列の安定性若しくは翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を意味する。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位、及びステム−ループ構造を含んでいてもよい。
【０１６２】
本明細書で用いられる「プロモーター」は、コード配列又は機能的なＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を意味する。一般に、コード配列は、プロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、それらの全体が天然型遺伝子から誘導されたものでもよいし、又は天然に見出される異なるプロモーターから誘導された異なる要素で構成されていてもよいし、又は合成ＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。当業者は、様々なプロモーターが、発生の様々な段階で、又は様々な環境又は生理学的条件に応答して、遺伝子の発現を指示する可能性があることを理解する。最も多くの場合、遺伝子を発現させるプロモーターは、一般的に「構成的プロモーター」と呼ばれる。更に、ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完全に決められていないため、異なる長さのＤＮＡフラグメントが、同一のプロモーター活性を有する可能性があることが認められている。
【０１６３】
本明細書で用いられる「３’非コード配列」は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を意味し、このような配列としては、ポリアデニル化認識配列（一般的には、真核生物に限定される）、及びｍＲＮＡプロセッシング又は遺伝子発現に影響を与えることができる調節シグナルをコードするその他の配列が挙げられる。ポリアデニル化シグナルは、通常は、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸領域（一般的には、真核生物に限定される）に影響を与えることを特徴とする。
【０１６４】
本明細書で用いられる用語「機能するように連結した」は、一方の機能が他方の影響を受けるように、単一の核酸分子へ核酸配列が連結していることを意味する。例えば、プロモーターがそのコード配列の発現に影響を与えることができる場合、そのプロモーターはコード配列と機能する様に連結しており、即ち、そのコード配列は、プロモーターの転写制御下にある。コード配列は、センス方向で調節配列に機能するように連結していてもよいし、又はアンチセンス方向で連結していてもよい。
【０１６５】
本明細書で用いられる用語「発現」は、本発明の核酸分子から誘導されたセンス（ｍＲＮＡ）又はアンチセンスＲＮＡの転写及び安定な蓄積を意味する。また、発現は、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を意味することもある。
【０１６６】
本明細書で用いられる「形質転換」は、宿主生物のゲノムに核酸分子が移入することによって、遺伝学的に安定な遺伝が起こることを意味する。本発明において宿主細胞のゲノムは、染色体遺伝子、及び染色体外遺伝子（例えば、プラスミド）を含む。形質転換した核酸分子を含む宿主生物は、「トランスジェニック」又は「組み換え」又は「形質転換した」生物と呼ばれる。
【０１６７】
本明細書で用いられる用語「プラスミド」、「ベクター」及び「カセット」は、多くの場合に細胞の中の中心的な代謝の一部ではない遺伝子を有する染色体外要素を意味し、通常は環状の二本鎖ＤＮＡ分子の形態である。このような要素は、自律複製型の配列、ゲノムを統合させる配列、ファージ又はヌクレオチド配列であってもよく、直鎖状又は環状でもよく、あらゆる供給源から誘導された一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡでもよく、ここで、多数のヌクレオチド配列が統合されるか又は組み換えられて、選択された遺伝子産物のためのプロモーターフラグメント及びＤＮＡ配列を、適切な３’非翻訳配列と共に細胞に導入することができる特有の構造になる。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にするエレメントを有する特定のベクターを意味する。「発現カセット」は、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて、その遺伝子の外来宿主中での発現を強化することができるエレメントを有する特定のベクターを意味する。
【０１６８】
本明細書で用いられる用語「配列解析ソフトウェア」は、ヌクレオチド又はアミノ酸配列の解析に有用な、あらゆるコンピューターアルゴリズム又はソフトウェアプログラムを意味する。「配列解析ソフトウェア」は、市販のものでもよいし、又は個別に開発したものでもよい。典型的な配列解析ソフトウェアとしては、これらに限定されないが、一式のＧＣＧプログラム（Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Altschul etal., J.Mol. Biol. 215:403410 (1990)、及びＤＡＮＳＴＡＲ（DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Madison, WI 53715 USA）、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（例えば、バージョン１．８３；Thompson et al., Nucleic Acids Research, 22(22):4673-4680 (1994)、及びSmith-Waterman アルゴリズムを内包したＦＡＳＴＡプログラム（W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 11120.  Editor(s):  Suhai, Sandor. Publisher:  Plenum, New York, NY）、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（Informax, Bethesda, MD）、及びＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ  ｖ．４．０５が挙げられる。本出願に関して、解析に配列解析ソフトウェアが用いられる場合、解析結果は、特に他の規定がない限り指定されたプログラムの「デフォルト値」に基づくこととする。本明細書で用いられる「デフォルト値」は、ソフトウェアの製造元によって設定されたあらゆる値又はパラメーターのセットを意味することとし、このようなデフォルト値は、最初に初期設定した際にソフトウェアでもともとローディングされるものである。
【０１６９】
本明細書で用いられる用語「生物学的な汚染物質」は、１種又はそれ以上の不要な、及び／又は病原性の生物学的な物体を意味し、例えば、これらに限定されないが、微生物、胞子、ウイルス、プリオン、及びそれらの混合物が挙げられる。本方法は、生存可能な生物学的な汚染物質の存在を減少及び／又は除去するのに有用な有効濃度の少なくとも１種の過カルボン酸を生産する。好ましい実施態様において、微生物汚染物質は、生きた病原性の微生物である。
【０１７０】
本明細書で用いられる用語「消毒する」は、生物学的な汚染物質を破壊したり、又はその増殖を予防したりするプロセスを意味する。本明細書で用いられる用語「消毒剤」は、生物学的な汚染物質を破壊したり、中和したり、又はその増殖を阻害することによって消毒作用を示す物質を意味する。典型的には、消毒剤は、無生物又は表面を処理するのに用いられる。本明細書で用いられる用語「防腐剤」は、病気を運搬する微生物の増殖を阻害する化学物質を意味する。実施態様の１つの態様では、生物学的な汚染物質は病原微生物である。
【０１７１】
本明細書で用いられる用語「殺ウイルス剤」は、ウイルスを阻害又は破壊する物質を意味し、「ｖｉｒｉｃｉｄｅ」と同義語である。ウイルスを阻害又は破壊する能力を示す物質は、「殺ウイルス」活性を有すると説明される。過酸は、殺ウイルス活性を有する可能性がある。本発明と共に使用するのに好適な、当該分野で既知の典型的な代替えの殺ウイルス剤としては、例えば、アルコール、エーテル、クロロホルム、ホルムアルデヒド、フェノール、β−プロピオラクトン、ヨウ素、塩素、水銀塩、ヒドロキシルアミン、エチレンオキシド、エチレングリコール、第四級アンモニウム化合物、酵素、及び洗剤が挙げられる。
【０１７２】
本明細書で用いられる用語「殺生物剤」は、微生物を不活化又は破壊する化学物質を意味し、典型的には広範囲抗菌スペクトルを有するものである。微生物を不活化又は破壊する能力を示す化学物質は、「殺菌」活性を有すると説明される。過酸は、殺菌活性を有する可能性がある。本発明で使用するのに好適な、当該分野で既知の典型的な代わりの殺生物剤としては、例えば、塩素、二酸化塩素、クロロイソシアヌレート、次亜塩素酸塩、オゾン、アクロレイン、アミン、塩素化フェノール、銅塩、有機硫黄化合物、及び第四級アンモニウム塩が挙げられる。
【０１７３】
本明細書で用いられる語句「最少殺菌濃度」は、一定の接触時間で、標的微生物の生存する集団に、所望の致死性で不可逆的な減少を引き起こす殺菌性の物質の最少濃度を意味する。この有効性は、処理後の生存する微生物数のｌｏｇ10の減少によって測定することができる。１つの態様において、標的とする生存微生物における処理後の減少は、少なくとも３ｌｏｇの減少、より好ましくは少なくとも４ｌｏｇの減少、及び最も好ましくは少なくとも５ｌｏｇの減少である。別の態様において、最少殺菌濃度は、生存微生物細胞で少なくとも６ｌｏｇの減少である。
【０１７４】
本明細書で用いられる用語「過酸素源」及び「過酸素の源」は、水溶液にした場合、約１ｍＭ又はそれ以上の濃度で過酸化水素を与えることができる化合物を意味し、例えば、それらに限定されないが、過酸化水素、過酸化水素付加物（例えば、尿素の過酸化水素付加物（カルバミドペルオキシド））、ペルボーレート、及びペルカルボネートが挙げられる。本明細書において説明されているように、反応混合物水溶液中で過酸素化合物によって提供される過酸化水素の濃度は、反応成分を混ぜ合わせた際に、最初のうちは少なくとも１ｍＭ又はそれより高い濃度である。１つの実施態様において、反応混合物水溶液中の過酸化水素の濃度は、少なくとも１０ｍＭである。別の実施態様において、反応混合物水溶液中の過酸化水素の濃度は、少なくとも１００ｍＭである。別の実施態様において、反応混合物水溶液中の過酸化水素の濃度は、少なくとも２００ｍＭである。別の実施態様において、反応混合物水溶液中の過酸化水素の濃度は、少なくとも５００ｍＭ又はそれより高い濃度である。更に別の実施態様において、反応混合物水溶液中の過酸化水素の濃度は、少なくとも１０００ｍＭ又はそれより高い濃度である。反応混合物水溶液中の過酸化水素と酵素基質（例えば、トリグリセリド）とのモル比（Ｈ2Ｏ2：基質）は、約０．００２〜２０であってもよく、好ましくは約０．１〜１０、最も好ましくは０．５〜５である。あるいは、過酸素源（例えば、過酸化水素）は、オキシダーゼ活性を有する酵素（例えば、グルコースオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ）によって触媒された基質と酸素の反応によって、その場生成させることができる。
【０１７５】
カルボン酸エステル及び過酸化水素からの酵素触媒による、過酸の製造を制御するための好適な反応条件
１つの態様において、ｐＨ感受性ペルヒドロリシス活性を有する酵素触媒の存在下で、カルボン酸エステルと、無機過酸化物、例えば、これらに限定されないが、過酸化水素、過ホウ酸ナトリウム又は過炭酸ナトリウムとを反応させることによって標的濃度の過酸を含む水性混合物の製造方法が提供される。１つの実施態様において、このような酵素触媒は、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーに属する構造を有するペルヒドロラーゼを含む。別の実施態様において、ペルヒドロラーゼ触媒は、構造的にセファロスポリンＣデアセチラーゼと分類される。別の実施態様において、ペルヒドロラーゼ触媒は、構造的にアセチルキシランエステラーゼと分類される。
【０１７６】
１つの実施態様では、ペルヒドロラーゼ触媒は、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いると参照配列の配列番号２と合致するＣＥ−７シグネチャーモチーフを有する酵素を含み、該シグネチャーモチーフは以下を含む：
ｉ）配列番号２のアミノ酸位置１１８〜１２０にＲＧＱモチーフ；
ｉｉ）配列番号２のアミノ酸位置１７９〜１８３にＳＥＱモチーフ；及び
ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸位置２９８〜２９９にＨＥモチーフ；
ここで、該酵素は、配列番号２に対して少なくとも３０％のアミノ酸同一性を有する。
【０１７７】
更なる実施態様において、シグネチャーモチーフは、更にＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて参照配列の配列番号２に合致した場合、アミノ酸残基２６７〜２６９にＬＸＤモチーフと定義された第４の保存されたモチーフを含む。
【０１７８】
別の実施態様において、ペルヒドロラーゼ触媒は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３０、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、及び配列番号６２から成るグループから選択されるアミノ酸配列を有する酵素、又は前記アミノ酸配列に１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加によって誘導されたペルヒドロラーゼ活性を有する実質的に類似した酵素を含む。
【０１７９】
別の実施態様において、ペルヒドロラーゼ触媒は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３０、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、及び配列番号６２から成るグループから選択される１つ又はそれ以上のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を有する、実質的に類似した酵素を含む。
【０１８０】
別の実施態様において、ペルヒドロラーゼ触媒は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２９、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、及び配列番号６１から成るグループから選択される核酸配列にハイブリダイズする核酸分子によってコードされたアミノ酸配列を有する酵素を含む。
【０１８１】
別の実施態様において、ペルヒドロラーゼ触媒は、配列番号６１として定義され、上記の保存されたモチーフ（例えば、ＲＧＱ、ＧＸＳＱＧ、及びＨＥ、並びに場合によりＬＸＤ）が保存されている連続的なシグネチャーモチーフと、少なくとも３０％、好ましくは３６％のアミノ酸同一性を有する酵素が含まれる。
【０１８２】
１つの実施態様において、好適な基質は以下の式：
［Ｘ］mＲ5
式中、
Ｘ＝式Ｒ6Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基、Ｒ6＝Ｃ１〜Ｃ７の直鎖状、分枝鎖状又は環状のヒドロカルビル部分であり、場合によりヒドロキシル基若しくはＣ１〜Ｃ４のアルコキシ基で置換され、ここで、Ｒ6は、場合により、Ｒ6がＣ２〜Ｃ７の場合は１つ又はそれ以上のエーテル結合を含み；
Ｒ5＝Ｃ１〜Ｃ６の直鎖状、分枝鎖状又は環状のヒドロカルビル部分であり、場合によりヒドロキシル基で置換され、ここで、Ｒ5中のそれぞれの炭素原子は単独に最大で１つのヒドロキシル基又は最大で１つのエステル基を含み、且つ、Ｒ5は、場合により１つ又はそれ以上のエーテル結合を含み；
ｍ＝１からＲ5中の炭素数までの整数であり；
ここで、２５℃における水に対する該エステルの溶解度は、少なくとも５ｐｐｍである；で示されるエステルを含む。
【０１８３】
別の実施態様において、好適な基質は、また、以下の式：
【化５】
0005504268.tif 000009
式中、
Ｒ1＝Ｃ１〜Ｃ７の直鎖状又は分枝鎖状のアルキルであり、場合によりヒドロキシル基若しくはＣ１〜Ｃ４のアルコキシ基で置換され；そして
Ｒ2＝Ｃ１〜Ｃ１０の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ）nＨ、又は（ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）−Ｏ）nＨであり；そして
ｎ＝１〜１０である；
のエステルを含む。
【０１８４】
別の実施態様において、好適な基質は、以下の式：
【化６】
0005504268.tif 000010
式中、
Ｒ1＝Ｃ１〜Ｃ７の直鎖状又は分枝鎖状のアルキルであり、場合によりヒドロキシル基若しくはＣ１〜Ｃ４のアルコキシ基で置換され；
Ｒ3及びＲ4は、それぞれＨ又はＲ1Ｃ（Ｏ）である；
のグリセリド含む。
【０１８５】
別の実施態様において、Ｒ6は、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖状のヒドロカルビル部分であり、場合によりヒドロキシル基若しくはＣ１〜Ｃ４のアルコキシ基で置換され、場合により、１つ又はそれ以上のエーテル結合を含む。更なる好ましい実施態様では、Ｒ6は、Ｃ２〜Ｃ７の直鎖状のヒドロカルビル部分であり、場合によりヒドロキシル基で置換され、及び／又は場合により、１つ又はそれ以上のエーテル結合を含む。
【０１８６】
別の実施態様において、好適な基質は、また、アセチル化単糖、アセチル化二糖、及びアセチル化多糖から成るグループから選択されるアセチル化糖も含む。好ましい実施態様では、アセチル化糖としては、アセチル化単糖、アセチル化二糖、及びアセチル化多糖が挙げられる。別の実施態様において、アセチル化糖は、アセチル化キシラン、アセチル化キシランフラグメント、アセチル化キシロース（例えば、キシローステトラアセテート）、アセチル化グルコース（例えば、グルコースペンタアセテート）、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、及びトリ−Ｏ−アセチル−グルカール、及びアセチル化セルロースから成るグループから選択される。好ましい実施態様において、アセチル化糖は、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、及びトリ−Ｏ−アセチル−グルカール、及びアセチル化セルロースから成るグループから選択される。そのようなものとして、アセチル化炭水化物は、本発明の方法を用いて（即ち、過酸素源の存在下で）過カルボン酸を生成するのに好適な基質の可能性がある。
【０１８７】
１つの実施態様において、基質は、モノアセチン；ジアセチン；トリアセチン；モノプロピオニン；ジプロピオニン；トリプロピオニン；モノブチリン；ジブチリン；トリブチリン；グルコースペンタアセテート；キシローステトラアセテート；アセチル化キシラン；アセチル化キシランフラグメント；β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート；トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール；トリ−Ｏ−アセチル−グルカール；１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、２，５−ペンタンジオール、１，６−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、２，５−ヘキサンジオール、及び１，６−ヘキサンジオールのモノエステル又はジエステル；及びそれらの混合物から成るグループから選択される。
【０１８８】
好ましい実施態様において、基質は、酢酸エチル、乳酸メチル、乳酸エチル、グリコール酸メチル、グリコール酸エチル、メトキシ酢酸メチル、メトキシ酢酸エチル、３−ヒドロキシ酪酸メチル、３−ヒドロキシ酪酸エチル、２−アセチルクエン酸トリエチル、グルコースペンタアセテート、グルコノラクトン、グリセリド（モノ、ジ及びトリグリセリド）、例えばモノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、モノプロピオニン、ジプロピオニン（グリセリルジプロピオナート）、トリプロピオニン（１，２，３−トリプロピオニルグリセロール）、モノブチリン；ジブチリン（グリセリルジブチラート）、トリブチリン（１，２，３−トリブチニルグリセロール）、アセチル化糖、及びそれらの混合物から成るグループから選択される。
【０１８９】
更なる好ましい態様において、カルボン酸エステル基質は、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、モノプロピオニン、ジプロピオニン；トリプロピオニン；モノブチリン；ジブチリン；トリブチリン、酢酸エチル、及び乳酸エチルから成るグループから選択される。なお別の態様では、カルボン酸エステル基質は、ジアセチン、トリアセチン、酢酸エチル、及び乳酸エチルから成るグループから選択される。好ましい態様では、カルボン酸エステルは、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、及びそれらの混合物から成るグループから選択されるグリセリドである。
【０１９０】
カルボン酸エステルは、酵素触媒によるペルヒドロリシスの際に目的の濃度の過酸を生産するのに十分な濃度で反応混合物中に存在する。カルボン酸エステルは、反応混合物中において完全に可溶性でなくてもよいが、ペルヒドロラーゼ触媒によるエステルの対応する過酸への変換を許容する程度の溶解性を有する。カルボン酸エステルは、反応混合物の０．０００５質量％〜４０質量％の濃度で、好ましくは反応混合物の０．１質量％〜２０質量％の濃度で、そしてより好ましくは反応混合物の０．５質量％〜１０質量％の濃度で反応混合物中に存在する。カルボン酸エステルの質量％は、場合によりカルボン酸エステルの溶解度限界より大きくてもよく、その結果、例えば、カルボン酸エステルの濃度は、水、酵素触媒、及び過酸素源を含む反応混合物中の少なくとも０．０００５質量％であり、その場合、カルボン酸エステルの残りは、水／有機の２相反応混合物の第２の分離相として残る。添加されたカルボン酸エステルの全部が直ちに反応混合物水溶液に溶ける必要はなく、最初の全ての反応成分を混合した後、追加の連続的又は断続的な混和は任意である。
【０１９１】
過酸素源としては、過酸化水素、過酸化水素付加物（例えば、尿素の過酸化水素付加物（カルバミドペルオキシド））、ペルボーレート、及びペルカルボネートが挙げられるが、これらに限定されない。反応混合物中の過酸素化合物の濃度は、０．００３３質量％〜約５０質量％の範囲、好ましくは０．０３３質量％〜約４０質量％、より好ましくは０．３３質量％〜約３０質量％の範囲であればよい。
【０１９２】
多くのペルヒドロラーゼ触媒（全細胞、透過性の全細胞、及び部分精製した全細胞抽出物；それぞれがペルヒドロラーゼ活性を有する酵素を含む）は、また、１種又はそれ以上のカタラーゼ活性を有する酵素（ＥＣ１．１１．１．６）を有することが報告されている。カタラーゼは、過酸化水素の酸素と水への変換を触媒する。１つの態様では、ペルヒドロリシス触媒は、カタラーゼ活性がない。別の態様では、カタラーゼ阻害剤が、反応混合物に添加される。カタラーゼ阻害剤としては、アジ化ナトリウム、及び硫酸ヒドロキシルアミンが挙げられるが、これらに限定されないが。当業者は、必要に応じてカタラーゼ阻害剤の濃度を調節することができる。カタラーゼ阻害剤の濃度は、典型的には０．１ｍＭ〜約１Ｍ；好ましくは約１ｍＭ〜約５０ｍＭ；より好ましくは約１ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲である。１つの態様では、アジ化ナトリウムの濃度は、典型的には約２０ｍＭ〜約６０ｍＭの範囲であり、硫酸ヒドロキシルアミンの濃度は、典型的には約０．５ｍＭ〜約３０ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭである。
【０１９３】
別の実施態様において、ペルヒドロラーゼは有意なカタラーゼ活性がないか、又はカタラーゼ活性を減少若しくは除去する様に操作される。宿主細胞中におけるカタラーゼ活性は、よく知られた技術を用いてカタラーゼ活性に関与する遺伝子の発現を破壊することによってダウンレギュレーションしてもよいし、又は除去してもよく、このような技術としては、これらに限定されないが、トランスポゾン変異誘発、ＲＮＡアンチセンス発現、標的変異誘発、及びランダム変異誘発が挙げられる。好ましい実施態様において、内因性カタラーゼ活性をコードする遺伝子は、ダウンレギュレーションされるか、又は破壊される（即ち、ノックアウトされる）。本明細書で用いられるように、「破壊された」遺伝子は、改変された遺伝子によってコードされるタンパク質の活性及び／又は機能がもはや存在しない遺伝子である。遺伝子を破壊する手段は、当該分野で公知であり、例えば、これらに限定されないが、対応するタンパク質の活性及び／又は機能がもはや存在しなくなる限りにおいて、遺伝子に対する挿入、欠失又は突然変異が挙げられる。更なる好ましい実施態様において、生産宿主は、ｋａｔＧ（配列番号４０）、及びｋａｔＥ（配列番号４９）から成るグループから選択される破壊されたカタラーゼ遺伝子を含むＥ．コリ生産宿主である。別の実施態様において、生産宿主は、ｋａｔＧ１及びｋａｔＥカタラーゼ遺伝子の両者のダウンレギュレーション及び／又は破壊を含むＥ．コリ株である。本明細書では、ｋａｔＧ１及びｋａｔＥの二重ノックアウトを含むＥ．コリ株が提供される（実施例３；Ｅ．コリ株ＫＬＰ１８を参照）。
【０１９４】
構築されたカタラーゼ陰性のＥ．コリ株ＫＬＰ１８（ｋａｔＧ１及びｋａｔＥの二重ノックアウト）（実施例３）は、発酵槽条件での増殖によって測定すると、カタラーゼ陰性株ＵＭ２（E. coli Genetic Stock Center #7156, Yale University, New Haven CT）と比較して、ラージスケール（１０Ｌ以上）のペルヒドロラーゼ酵素生産のための優れた宿主であることが実証された。ＫＬＰ１８及びＵＭ２は両者ともカタラーゼ陰性株であるにもかかわらず、ＵＭ２は、多数の栄養要求を示すことが知られており、従って、高濃度の酵母抽出物及びペプトンを含む培地を必要とする。たとえ発酵のための強化培地を用いても、ＵＭ２の増殖は不十分であり、限定的な最大細胞密度（ＯＤ）にしかならない。それに対してＫＬＰ１８は特殊な栄養必要条件を有さず、無機培地単独、又は追加の酵母抽出物を含む培地でも高い細胞密度に増殖した。
【０１９５】
反応混合物水溶液中のペルヒドロラーゼ触媒の濃度は、触媒の特定の触媒活性に依存し、所望の反応速度が得られるように選択される。ペルヒドロリシス反応中の触媒の質量は、典型的には、総反応体積当たり０．０００１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲であり、好ましくは０．００１ｍｇ〜１．０ｍｇ／ｍＬの範囲である。また、触媒は当業者によく知られた方法を用いて、可溶性又は不溶性支持体に固定化されてもよい；例えば、酵素及び細胞の固定化（Immobilization of Enzymes and Cells）; Gordon F. Bickerstaff, Editor; Humana Press, Totowa, NJ, USA; 1997を参照。固定化触媒の使用により、その後の反応における触媒の回収及び再利用が可能になる。酵素触媒は微生物全細胞、透過性微生物細胞、微生物細胞抽出物、部分精製又は精製酵素、及びそれらの混合物の形態であってもよい。
【０１９６】
１つの態様において、カルボン酸エステルの化学的な加水分解と酵素的な加水分解の組み合わせによって生成した過酸の濃度は、望ましいｐＨでの漂白又は消毒にとって有効な濃度の過酸を提供するのに十分な濃度である。別の態様において、本発明の方法は、所望の有効な濃度の過酸を生産するための酵素と酵素基質との組み合わせを提供し、その場合、添加された酵素が存在しない場合、それよりも有意に低い濃度の過酸しか生成されない。場合によっては無機過酸化物と酵素基質との直接的な化学反応によって実質的な酵素基質の化学的なペルヒドロリシスは起こり得るが、望ましい用途において有効な濃度の過酸を提供するために十分な濃度の過酸は生成されない可能性があり、総過酸濃度の有意な増加は、反応混合物に適切なペルオキシダーゼ触媒を添加することによって達成される。
【０１９７】
過酸は、ある種の金属表面に対する腐食性、使用者に対して苛性又は有害である可能性があり、従って腐食作用を防止又は最小化するために、反応中に生産される過酸の総量を制限することが望ましい。例えば、約１分〜約５分までに僅か約１００〜約１０００ｐｐｍの過酸の生産を必要とする用途では、しばしばこの制限をかなり上回った過酸の最終濃度を生む反応条件が用いられる。そのような場合には、生産される過酸の量を制御する、そしてある場合には、過酸が生産される速度を制御することが望ましい。
【０１９８】
本明細書で説明されるように、適切な反応条件を使用すれば、反応混合物水溶液は制限された量の過酸を生産することができる。これに関して重要な反応混合物の成分は、緩衝液であり、具体的には緩衝液のｐＫａ及び濃度である。緩衝液のこれらの特性は、過酸が生産されるときに反応混合物のｐＨを制御することができ、その場合過酸からカルボン酸と過酸化水素への酵素触媒による加水分解によって副生成物のカルボン酸も生産される；従って、適切な特性を持つ緩衝液を選択することは、標的濃度の過酸を生産するために、ｐＨ感受性の酵素触媒の触媒活性をコントロール又は不活性化するための１つの方法である。緩衝液は、目的のｐＨで酵素的ペルヒドロリシス反応を実施するのに好適な、いかなる緩衝液であってもよい。いくつかの態様では、緩衝液は、ナトリウム塩、カリウム塩又はナトリウムとカリウムの複合塩の重炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、メチルホスホン酸緩衝液、ピロリン酸緩衝液及びリン酸塩緩衝液から成るグループから選択される。いくつかの態様では、緩衝液は、重炭酸緩衝液又はクエン酸緩衝液である。いくつかの態様では、特定の初期ｐＨを有する反応混合物水溶液は緩衝液を含む。
【０１９９】
酵素駆動の反応によって生産される過酸の量を制御する１つの方法は、酵素の触媒機能を選択的に削減又は不活性化する反応条件を使用することである。従って、反応混合物の初期ｐＨは、過酸が生産されるにつれて反応のｐＨが下がり、最終的に有効な又は実質的な酵素活性を抑制するｐＨの反応混合物にするように調節すればよい。１つの実施態様において、反応混合物の初期ｐＨは、約５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４又は約８．５である。
【０２００】
いくつかの態様において、反応混合物水溶液に含まれる緩衝液は、反応混合物の初期ｐＨを規定することができる。いくつかの態様において、緩衝液は、反応混合物水溶液に約４．０〜約１０．０の初期ｐＨを生みだす。いくつかの態様において、緩衝液は、反応混合物水溶液に約５．０〜約９．０の初期ｐＨを生みだす。いくつかの態様において、緩衝液は、反応混合物水溶液に約６．０〜約８．５の初期ｐＨを生みだす。いくつかの態様において、緩衝液は、反応混合物水溶液に約５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４又は約８．５の初期ｐＨを生みだす。いくつかの態様において、緩衝液を含む反応混合物は約８．１の初期ｐＨを有する。いくつかの態様において、約８．１の初期ｐＨを有する反応混合物中の緩衝液は、重炭酸塩緩衝液である。いくつかの態様において、緩衝液を含む反応混合物は約７．２の初期ｐＨを有する。いくつかの態様において、約７．２の初期ｐＨを有する反応混合物中の緩衝液は、クエン酸塩緩衝液である。いくつかの態様において、約７．２の初期ｐＨを有する反応混合物中の緩衝液は、重炭酸塩緩衝液である。いくつかの態様において、約７．２の初期ｐＨを有する反応混合物中の緩衝液は、リン酸塩緩衝液である。いくつかの態様において、緩衝液を含む反応混合物は約６．５の初期ｐＨを有する。いくつかの態様において、約６．５の初期ｐＨを有する反応混合物中の緩衝液は、クエン酸塩緩衝液である。いくつかの態様において、約６．５の初期ｐＨを有する反応混合物中の緩衝液は、重炭酸塩緩衝液である。いくつかの態様において、約６．５の初期ｐＨを有する反応混合物中の緩衝液は、リン酸塩緩衝液である。いくつかの態様において、緩衝液を含む反応混合物は約６．０の初期ｐＨを有する。いくつかの態様において、約６．０の初期ｐＨを有する反応混合物中の緩衝液は、クエン酸塩緩衝液である。いくつかの態様において、約６．０の初期ｐＨを有する反応混合物中の緩衝液は、重炭酸塩緩衝液である。いくつかの態様において、約６．０の初期ｐＨを有する反応混合物中の緩衝液は、リン酸塩緩衝液である。いくつかの態様において、緩衝液を含む反応混合物は約５．５の初期ｐＨを有する。いくつかの態様において、約５．５の初期ｐＨを有する反応混合物中の緩衝液は、クエン酸緩衝液である。いくつかの態様において、約５．５の初期ｐＨを有する反応混合物中の緩衝液は、重炭酸塩緩衝液である。
【０２０１】
本明細書で説明されるように、反応混合物水溶液は、適切な反応条件を用いれば、制限された量の過酸を生産することができる。例えば、低濃度の緩衝液は、過酸が生産されるにつれて反応混合物を緩衝する能力が制限されてしまい、それによって反応混合物のｐＨが低下する、即ち、酵素活性が不活性化する。緩衝液の濃度は、過酸の生産に伴う反応混合物のｐＨを制御することができる；従って、適切な濃度の緩衝液を選択することは、標的濃度の過酸を生産するために、ｐＨ感受性の酵素触媒の触媒活性を制御又は不活性化するための１つの方法である。従って、いくつかの態様において、反応混合物水溶液は、特定の濃度を有する緩衝液を含む。緩衝液は、酵素的ペルヒドロリシス反応を実施するのに好適な、いかなる緩衝液であってもよい。いくつかの態様では、緩衝液は、これらに限定されないが、ナトリウム塩、カリウム塩又はナトリウムとカリウムの複合塩の重炭酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、ピロリン酸塩緩衝液及びメチルホスホン酸塩緩衝液から成るグループから選択される。いくつかの態様では、緩衝液は、重炭酸ナトリウム塩緩衝液又はクエン酸ナトリウム緩衝液である。いくつかの態様では、緩衝液は、約０．０１ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度を有する。いくつかの態様では、緩衝液は、約０．０１ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度を有する。いくつかの態様では、緩衝液は、約０．０１ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度を有する。いくつかの態様では、緩衝液は、約１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、 ２．５、１、０．５又は約０．１ｍＭの濃度を有する。いくつかの態様では、緩衝液は、約５０ｍＭの濃度を有する。いくつかの態様において、約５０ｍＭの初期濃度を有する反応混合物中の緩衝液は、クエン酸塩緩衝液である。いくつかの態様において、約５０ｍＭの初期濃度を有する反応混合物中の緩衝液は、重炭酸塩緩衝液である。いくつかの態様では、緩衝液は、約２５ｍＭ〜約１ｍＭの濃度を有する。いくつかの態様において、約２５ｍＭ〜約１ｍＭの初期濃度を有する反応混合物中の緩衝液は、クエン酸塩緩衝液である。いくつかの態様において、約２５ｍＭ〜約１ｍＭの初期濃度を有する反応混合物中の緩衝液は、重炭酸塩緩衝液である。
【０２０２】
酵素駆動の反応によって生産される過酸の量は、また、反応混合物の初期ｐＨ、及び一旦目的の濃度の過酸が生産されると、反応の酵素活性が削減されるか又は不活性化されるような、反応混合物のｐＨ低下を起こすｐＫａの緩衝液を選択することによって制御することができる。１つの態様において、反応混合物の初期ｐＨは、約５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４又は約８．５であり、緩衝液のｐＫａは約５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０又は約８．１である。
【０２０３】
別の実施態様において、ｐＨが低下すると酵素活性が著しく減少する酸性ｐＨ感受性の酵素触媒は、過酸の生産が触媒活性を著しく低減する又は不活性化する点まで反応混合物のｐＨを低下させ得るので、酵素で触媒される反応を制御するために使用することができる。酵素活性が過酸からカルボン酸及び過酸化水素への加水分解を触媒する反応では、カルボン酸の生産が同様に触媒活性を著しく低減する又は不活性化する点まで反応混合物のｐＨを低下させる可能性がある。例えば、１つの実施態様では、Ｂ．ズブチリスＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）の総タンパク質抽出物を触媒として使用することができた。別の実施態様において、ペルヒドロリシス活性を有するＢ．ズブチリスＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）由来の特定の酵素を触媒として使用することができた。１つの実施態様において、Ｂ.プミルスの総タンパク質抽出物を触媒として使用することができた。別の実施態様において、ペルヒドロリシス活性を有するＢ．プミルス由来の特定の酵素を触媒として使用することができた。１つの実施態様において、Ｔ. ネアポリタナの総タンパク質抽出物を触媒として使用することができた。別の実施態様において、ペルヒドロリシス活性を有するＴ. ネアポリタナ由来の特定のタンパク質を触媒として使用することができた。１つの実施態様において、Ｔ. マリチマの総タンパク質抽出物を触媒として使用することができた。別の実施態様において、ペルヒドロリシス活性を有するＴ. マリチマ由来の特定のタンパク質を触媒として使用することができた。
【０２０４】
反応混合物水溶液における過酸の生産は、過酸の生成を触媒する酵素の酵素活性を変化させることができる。例えば、過酸の生産は、反応混合物のｐＨを下げることができ、そしてそれは、酵素触媒の活性を低減させる又は不活性化することができる。また、酵素活性が過酸からカルボン酸及び過酸化水素への加水分解を触媒することができる反応では、カルボン酸の生産が同様に触媒活性を著しく低減する又は不活性化する点まで反応混合物のｐＨを低下させる可能性がある。従って、いくつかの態様では、過酸又は過酸及びカルボン酸の生産が酵素触媒の活性を約２５％〜約１００％低減する。いくつかの態様では、過酸又は過酸及びカルボン酸の生産が酵素触媒の活性を約４０％〜約９０％低減する。いくつかの態様では、過酸又は過酸及びカルボン酸の生産が酵素触媒の活性を約６０％〜約８０％低減する。いくつかの態様では、過酸又は過酸及びカルボン酸の生産が酵素触媒の活性を約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は約１００％低減する。いくつかの態様では、過酸又は過酸及びカルボン酸の生産は、反応混合物のｐＨを、酵素触媒の活性が少なくとも約７５％低減されるほど低下させる。いくつかの態様では、過酸又は過酸及びカルボン酸の生産は、反応混合物のｐＨを、酵素触媒の活性が少なくとも約８５％低減されるほど低下させる。過酸を含む最終反応混合物のｐＨは、約２〜約９である。いくつかの態様では、過酸を含む最終反応混合物のｐＨは、約３〜約８、より好ましくは約４〜約７である。いくつかの態様では、過酸を含む最終反応混合物のｐＨは、約５〜約６である。いくつかの態様では、過酸を含む最終反応混合物のｐＨは、約５〜約５．５である。いくつかの態様では、過酸を含む最終反応混合物のｐＨは、約４．５〜約５である。
【０２０５】
少なくとも１つのカルボン酸エステルのペルヒドロリシスによって生成される過酸（例えば、過酢酸）の濃度は、ペルヒドロリシス反応開始から１０分以内に、好ましくは５分以内に、そして最も好ましくは１分以内に、少なくとも約２ｐｐｍ、好ましくは少なくとも約２０ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも約１００ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも約２００ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも約３００ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも約５００ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも約８００ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも約１０００ｐｐｍである。いくつかの態様では、少なくとも１つのカルボン酸エステルのペルヒドロリシスによって生成される過酸（例えば、過酢酸）の濃度は、ペルヒドロリシス反応開始から１０分以内に、好ましくは５分以内に、そして最も好ましくは１分以内に、約１００ｐｐｍ〜約１２００ｐｐｍであるが、約２５００ｐｐｍ未満である。より好ましくは、少なくとも１つのカルボン酸エステルのペルヒドロリシスによって生成される過酸の濃度は、ペルヒドロリシス反応開始から１０分以内に、好ましくは５分以内に、そして最も好ましくは１分以内に、約４００ｐｐｍ〜約６００ｐｐｍである。過酸を含む生成物の混合物は、目的の低濃度の過酸の混合物を作るために、水又は圧倒的に水を含む溶液で任意に希釈してもよい。１つの態様では、目的の濃度の過酸を生産するために必要な反応時間は、約２時間以下、好ましくは約３０分以下、より好ましくは約１０分以下、なおより好ましくは約５分以下、そして最も好ましくは約１分以下である。別の態様では、微生物個体群の濃度に汚染された硬表面又は無生物は、本明細書で説明される方法に従って形成される過酸と、前記反応成分を混ぜ合わせてから約１分〜約１６８時間の範囲で、又は約１分〜約４８時間の範囲で、又は約１分〜２時間の範囲で、又は任意のそれらの時間の中で接触する。
【０２０６】
硬表面の消毒のために過酢酸をその場生成させる用途では、硬表面を消毒するのに十分な量の過酸を、有効濃度の上域を大幅に超えることなく迅速に生成させることが望ましく、それによってその表面の腐食を制限又は防止する。過酸は、このように、適切な緩衝液、ｐＨ及び酵素濃度を有する酵素触媒反応を用いて、並びにｐＨの低下によって、有意に活性が低下する又は不活性化する酵素を用いて製造することができる。従って、１つの態様では、酵素触媒の反応混合物には、約５００ｐｐｍ〜約６００ｐｐｍの過酸の生産の後に、目的の量の過酸が生産された時点で反応混合物のｐＨが酸性であるため、活性を失う触媒酵素が組み込まれる。この種類の反応混合物は、別の実施態様においては、特定の用途に基づく必要に応じて、約１００ｐｐｍ〜約２００ｐｐｍの過酸、約２００ｐｐｍ〜約３００ｐｐｍの過酸、約３００ｐｐｍ〜約４００ｐｐｍの過酸、約４００ｐｐｍ〜約５００ｐｐｍの過酸、約６００ｐｐｍ〜約７００ｐｐｍの過酸、約７００ｐｐｍ〜約８００ｐｐｍの過酸、約８００ｐｐｍ〜約９００ｐｐｍの過酸、約９００ｐｐｍ〜約１０００ｐｐｍの過酸、又は約１００ｐｐｍ〜約５００ｐｐｍの過酸、約５００ｐｐｍ〜約１０００ｐｐｍの過酸、又は約１０００ｐｐｍ〜約２０００ｐｐｍの過酸の生産の後に触媒酵素が活性を失うように変更することができる。
【０２０７】
いくつかの態様では、短時間に過酸を生産することも、また、重要である；しかし、また、これらの用途の多くは、単に一定量の過酸の生産だけを必要としている。例えば、過酸に基づいた消毒溶液を生じさせる混合物のためには、生産の最初の１分の後は実質的な量の過酸は生産されないような、約１分で約１００ｐｐｍ〜約１２００ｐｐｍの過酸だけを生産するのが望ましい。従って、本明細書で提供されるものは、約１００ｐｐｍ〜約１２００ｐｐｍの濃度の過酸が約１分で生産され、その後過酸の有意な生産がない、過酸を生成する酵素触媒反応である。
【０２０８】
もちろん、当然のことながら、当業者は、ｐＨ、ｐＫａ、緩衝液の濃度、及び触媒活性／ｐＨ感受性に関連する他の反応条件が、本明細書で説明される方法による過酸生産を制限する手段を提供することは認識している。そのような条件及びその使用は、本開示の範囲内である。
【０２０９】
酵素触媒による過酸の生産が低減又は不活性化された後、比較的安定した過酸の濃度、即ち、目標過酸濃度の約２０％以内に保持する過酸の水溶液、並びにそのような安定した過酸水溶液の生成法を説明する。１つの実施態様において、標的濃度の過酸濃度を含む反応生産物水溶液の安定性は、密閉系（例えば、生成したペルオキシカルボン酸と実質的に反応（又はそれを分解）しない材質でできた反応チャンバー）で、室温（おおよそ、２１〜２２℃）で測定される。いくつかの好ましい実施態様では、過酸水溶液は、酵素触媒による過酸の生産が低減又は不活性化された後、過酸濃度を目標過酸濃度の約１５％以内に、そしてより好ましくは１０％以内に保持する。過酸濃度の安定性は、酵素触媒による過酸の生産が低減又は不活性化された後、数時間持続できる。１つの実施態様において、過酸濃度は、酵素触媒による過酸の生産が終了した後、約３時間安定である。別の実施態様において、過酸濃度は、酵素触媒による過酸の生産が終了した後、約６時間安定である。１つの実施態様において、過酸濃度は、酵素触媒による過酸の生産が終了した後、約９時間安定である。１つの実施態様において、過酸濃度は、酵素触媒による過酸の生産が終了した後、約１２時間安定である。別の実施態様において、過酸濃度は、酵素触媒による過酸の生産が終了した後、約１５時間安定である。別の実施態様において、過酸濃度は、酵素触媒による過酸の生産が終了した後、約１８時間安定である。１つの実施態様において、過酸濃度は、酵素触媒による過酸の生産が終了した後、約２１時間安定である。別の実施態様において、過酸濃度は、酵素触媒による過酸の生産が終了した後、約２４時間安定である。１つの実施態様において、過酸濃度は、酵素触媒による過酸の生産が終了した後、約３０時間安定である。１つの実施態様において、過酸濃度は、酵素触媒による過酸の生産が終了した後、約３６時間安定である。１つの実施態様において、過酸濃度は、酵素触媒による過酸の生産が終了した後、約４２時間安定である。別の実施態様において、過酸濃度は、酵素触媒による過酸の生産が終了した後、約４８時間安定である。１つの実施態様において、過酸濃度は、酵素触媒による過酸の生産が終了した後、約４８時間超安定である。
【０２１０】
反応温度は、酵素触媒活性の反応速度及び安定性の両者が制御されるように選択される。反応温度は、反応混合物の凝固点（約０℃）のすぐ上の温度から、約７５℃までの範囲であればよく、好ましい反応温度の範囲は、約５℃〜約５５℃である。
【０２１１】
別の態様では、酵素的なペルヒドロリシス反応混合物は、反応混合物におけるカルボン酸エステルの溶解速度を高めるための分散剤として作用する有機溶剤を含んでもよい。そのような溶媒としては、これらに限定されないが、プロピレングリコールメチルエーテル、アセトン、シクロヘキサノン、ジエチレングリコールブチルエーテル、トリプロピレングリコールメチルエーテル、ジエチレングリコールメチルエーテル、プロピレングリコールブチルエーテル、ジプロピレングリコールメチルエーテル、シクロヘキサノール、ベンジルアルコール、イソプロパノール、エタノール、プロピレングリコール及びそれらの混合物が挙げられる。
【０２１２】
別の態様では、酵素的なペルヒドロリシス生成物は、望ましい機能を提供する更なる成分を含んでもよい。これらの更なる成分としては、これらに限定されないが、緩衝剤、洗剤ビルダー、増粘剤、乳化剤、界面活性剤、湿潤剤、腐食抑制剤（例えば、ベンゾトリアゾール）、酵素安定化剤及び過酸化物安定化剤（例えば、金属イオンキレート剤）が挙げられる。更なる成分の多くは、洗剤産業においてよく知られている（例えば、米国特許第５，９３２，５３２号を参照；この特許は、参照することによって本明細書に組み込まれている）。乳化剤の例としては、これらに限定されないが、ポリビニルアルコール、又はポリビニルピロリドンが挙げられる。増粘剤の例としては、これらに限定されないが、ラポナイト（ＬＡＰＯＮＩＴＥ（登録商標））ＲＤ、コーンスターチ、ＰＶＰ、カーボワックス（ＣＡＲＢＯＷＡＸ（登録商標））、カーボポール（ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標））、カボシル（ＣＡＢＯＳＩＬ（登録商標））、ポリソルベート２０、ＰＶＡ及びレシチンが挙げられる。緩衝系の例としては、これらに限定されないが、一塩基性リン酸ナトリウム／二塩基性リン酸ナトリウム；スルファミン／トリエタノールアミン；クエン酸／トリエタノールアミン；酒石酸／トリエタノールアミン；コハク酸／トリエタノールアミン；及び酢酸／トリエタノールアミンが挙げられる。界面活性剤の例としては、これらに限定されないが、ａ）非イオン界面活性剤、例えば、エチレンオキシド又はプロピレンオキシドのブロックコポリマー、エトキシ化又はプロポキシル化された直鎖状及び分枝鎖状の第一級及び第二級アルコール、及び脂肪族ホスフィン酸化物、ｂ）カチオン性界面活性剤、例えば、第四級アンモニウム化合物、具体的には、３個のＣ１〜Ｃ２アルキル基と結合した窒素原子に更にＣ８〜Ｃ２０アルキル基が結合した第四級アンモニウム化合物、ｃ）アニオン性界面活性剤、例えば、アルカンカルボン酸（例えば、Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸）、アルキルホスファナート、アルカンスルホナート（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム「ＳＤＳ」）、又は直鎖状及び分枝鎖状のアルキルベンゼンスルホナート、アルケンスルホナート、及びｄ）両性及び双極性界面活性剤、例えば、アミノカルボン酸、アルキベタイン、及びそれらの混合物が挙げられる。更なる成分として、芳香剤、色素、過酸化水素の安定化剤（例えば、１−ヒドロキシエチリデン−１,１−ジホスホン酸 （ＤＥＱＵＥＳＴ（登録商標）２０１０, Solutia Inc., St. Louis, MOのような金属キレート剤及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、ＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬ、ＤＥＱＵＥＳＴ（登録商標）０５２０、ＤＥＱＵＥＳＴ（登録商標）０５３１、酵素活性の安定剤（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、及び洗剤ビルダーを含んでいてもよい。
【０２１３】
別の態様では、酵素的なペルヒドロリシス生成物は、消毒する表面又は無生物との接触の前に目的の濃度のペルオキシカルボン酸を発生させるために、前もって混合してもよい。
【０２１４】
別の態様では、酵素的なペルヒドロリシス生成物は、消毒する表面又は無生物との接触の前に目的の濃度のペルオキシカルボン酸を発生させるために、前もって混合しないが、その代わり、反応混合物の目的の濃度のペルオキシカルボン酸を発生させる成分を消毒する表面又は無生物と接触させ、目的の濃度のペルオキシカルボン酸を発生させる。いくつかの実施態様において、反応混合物の成分はその場所で結合又は混合する。いくつかの実施態様において、反応成分は、その場所に送達又は適用し、次いで混合又は結合して目的の濃度のペルオキシカルボン酸を発生させる。
【０２１５】
ペルヒドロラーゼ触媒を用いた過酸のその場生産
セファロスポリンＣデアセチラーゼ（Ｅ.Ｃ.３．１.１．４１；系統的名称は、セファロスポリンＣアセチルヒドロラーゼ；ＣＡＨ）は、セファロスポリンＣ、７−アミノセファロスポラン酸、及び７−（チオフェン−２−アセトアミド）セファロスポラン酸のような、セファロスポリンに結合したアセチルエステルを加水分解する能力を有する酵素である（Abbott, B. and Fukuda, D., Appl. Microbiol. 30(3):413-419 (1975)）。ＣＡＨは、炭水化物エステラーゼファミリー７と称される構造的に関連する酵素のより大きなファミリーに属する（ＣＥ−７； Coutinho, P.M., Henrissat, B. 炭水化物生物工学における最近の進歩「炭水化物−活性酵素：統合データベース入門」（“Carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach” in Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering）, H.J. Gilbert, G. Davies, B. Henrissat and B. Svensson eds., (1999) The Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 3-12を参照）。
【０２１６】
ＣＥ−７ファミリーは、ＣＡＨ及びアセチルキシランエステラーゼ（ＡＸＥ；Ｅ．Ｃ．３．１．１．７２）の両者を含む。ＣＥ−７ファミリーのメンバーは、共通の構造的なモチーフを共有しており、これらは典型的にはアセチル化キシロオリゴ糖及びセファロスポリンＣの両者にエステル加水分解活性を示すという点で極めて珍しく、これは、ＣＥ−７ファミリーが、一連の小さな基質に対して多機能のデアセチラーゼ活性を有する単一のタンパク質クラスを示すことを示唆している（Vincent et al., J. Mol. Biol., 330:593-606 (2003)）。Vincentらは、このファミリーのメンバーの間の構造的な類似性を説明しており、ＣＥ−７ファミリーに特徴的なシグネチャー配列モチーフを定義している。
【０２１７】
ＣＥ−７ファミリーに属する酵素は、植物、糸状菌（例えば、セファロスポリジウム・アクレモニウム（Cephalosporidium acremonium））、酵母（例えば、ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis））、及び細菌、例えば、サーモアナエロバクテリウム属（Thermoanaerobacterium sp.）；ノカルディア・ラクタムデュランス（Norcardia lactamdurans）、及びバチルス属に属する様々な菌に見られる（Politino et al., Appl. Environ. Microbiol., 63(12):4807-4811 (1997); Sakai et al., J. Ferment. Bioeng. 85:53-57 (1998); Lorenz, W. and Wiegel, J., J. Bacteriol 179:5436-5441 (1997); Cardoza et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 54(3):406-412 (2000); Mitsushima et al., supra (1995), Abbott, B. and Fukuda, D., Appl. Microbiol. 30(3):413-419 (1975); Vincent et al., supra, Takami et al., NAR, 28(21):4317-4331 (2000); Rey et al., Genome Biol., 5(10): article 77 (2004); Degrassi et al., Microbiology., 146:1585-1591 (2000);米国特許第６，６４５，２３３号；米国特許第５，２８１，５２５号；米国特許第５，３３８，６７６号；及び国際公開公報第９９／０３９８４号）。配列番号２に有意な相同性を有するＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーの非包括的なリストを表１に示す。
【０２１８】
【表２】
0005504268.tif 000011
【０２１９】
【表３】
0005504268.tif 000012
【０２２０】
【表４】
0005504268.tif 000013
【０２２１】
本発明のペルヒドロラーゼは、全てＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーに属するものである。Vincentら（上記）によって説明されているように、上記ファミリーに属するものは、このファミリーに特徴的な共通のシグネチャーモチーフを共有する。本発明のペルヒドロラーゼのＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントから、これらのものはいずれもＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーに属することが示される。本発明のペルヒドロラーゼの総体的なパーセントアミノ酸同一性の量の比較を表２に示す。
【０２２２】
【表５】
0005504268.tif 000014
【０２２３】
相対的なパーセントアミノ酸同一性に関して変動が観察される（即ち、クロストリジウム・テルモセルムＡＴＣＣ（登録商標）２７４０５（商標）のペルヒドロラーゼ；配列番号１２は、バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）のペルヒドロラーゼ；配列番号２と５７％のアミノ酸同一性しか共有せず、一方、バチルス・クラウシイのペルヒドロラーゼ；配列番号２４は、配列番号２と３３％のアミノ酸同一性しか共有しない）が、本発明のペルヒドロラーゼ酵素は、それぞれ、ＣＥ−７シグネチャーモチーフを共有する。従って、本発明のペルヒドロラーゼ触媒は、構造的にＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーに属するものとして分類される酵素である。本発明のペルヒドロラーゼ酵素は、それぞれ、ＣＥ−７シグネチャー（診断）モチーフを含む。
【０２２４】
Vincentら（上記）は、ＣＥ−７エステラーゼの構造を解析し、そのファミリーの診断要素である数種の高度に保存されたモチーフを同定した。これらの高度に保存されたモチーフは、Ａｒｇ１１８−Ｇｌｙ１１９−Ｇｌｎ１２０（ＲＧＱ）、Ｇｌｙ１７９−Ｘａａ１８０−Ｓｅｒ１８１−Ｇｌｎ１８２−Ｇｌｙ１８３（ＧＸＳＱＧ）及びＨｉｓ２９８−Ｇｌｕ２９９（ＨＥ）を含む。更に、シグネチャーモチーフを更に特徴付けるために使用可能な、高度に保存されたＬｙｓ２６７−Ｘａａ２６８−Ａｓｐ２６９（ＬＸＤ）モチーフがある。全ての配列の番号付けは、参照配列（Ｂ．ズブチリスＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）のペルヒドロラーゼ；配列番号２）の番号付けに関連する。
【０２２５】
１つの実施態様において、好適なペルヒドロリシス酵素は、ＣＥ−７シグネチャーモチーフの存在によって同定することができる（Vincent et al.、上記）。好ましい実施態様において、ＣＥ−７シグネチャーモチーフを含むペルヒドロリシス酵素は、バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）のペルヒドロラーゼ（配列番号２；即ち、相対的なアミノ酸位置の番号付けに用いられる参照配列）に対してＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントを用いて同定される。配列番号２のアミノ酸残基の番号付けのように、ＣＥ−７シグネチャーモチーフは、以下のように定義される３種の保存されたモチーフを含む。
【化７】
0005504268.tif 000015
【０２２６】
典型的には、アミノ酸残基１８０位におけるＸａａは、グリシン、アラニン、プロリン、トリプトファン又はスレオニンである。それぞれ触媒性三つ組に属している３つのアミノ酸残基のうちの２つは、太字で示す。１つの実施態様において、アミノ酸残基１８０位におけるＸａａは、グリシン、アラニン、プロリン、トリプトファン及びスレオニンから成るグループから選択される。
【０２２７】
ＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリー内の保存されたモチーフの更なる解析から、更にＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーに属するペルヒドロラーゼを特徴付ける可能性のある更なる保存されたモチーフ（配列番号２のアミノ酸２６７〜２６９位におけるＬＸＤ）の存在が示される。更なる実施態様において、上記で特徴付けされたシグネチャーモチーフは、以下のように定義される第４の保存されたモチーフを含む。
【化８】
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【０２２８】
アミノ酸残基２６８位におけるＸａａは、典型的には、イソロイシン、バリン又はメチオニンである。第４のモチーフは、触媒性の三つ組に属する３番目のアスパラギン酸残基（太字）を含む（Ｓｅｒ１８１−Ａｓｐ２６９−Ｈｉｓ２９８）。
【０２２９】
本発明のシグネチャーモチーフの存在を測定するために、複数のアミノ酸配列（ペルヒドロラーゼ活性を有する酵素を示す）をアラインさせるための、かなり多数のよく知られたグローバルアラインメントのアルゴリズム（即ち、配列解析ソフトウェア）を使用することができる（例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷ又はNeedleman and Wunsch（J. Mol. Biol., 48:443-453 (1970））。アラインした配列は、参照配列（配列番号２）と比較される。１つの実施態様において、参照アミノ酸配列（本明細書で用いられるように、バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）由来のＣＡＨ配列（配列番号２））を用いたＣＬＵＳＴＡＬアラインメント（ＣＬＵＳＴＡＬＷ）を用いて、ＣＥ−７エステラーゼファミリーに属するペルヒドロラーゼを同定することができる。保存されたアミノ酸残基の総体的な番号付けは、並べられた配列内のわずかな挿入又は欠失（５アミノ酸以下）を明らかにするために、参照アミノ酸配列における残基の番号付けに基づく。
【０２３０】
本発明において例示されたペルヒドロラーゼ間の全体のパーセント相同性の比較から、配列番号２に対してわずか３３％の同一性しか有さない酵素が（シグネチャーモチーフを保持しているものの）、有意なペルヒドロラーゼ活性を示し、構造的にＣＥ−７炭水化物エステラーゼとして分類される。１つの実施態様において、本発明のペルヒドロラーゼとしては、本発明のシグネチャーモチーフを含む酵素であって、配列番号２に対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３３％、より好ましくは少なくとも４０％、なおより好ましくは少なくとも４２％、なおより好ましくは少なくとも５０％、なおより好ましくは少なくとも６０％、なおより好ましくは少なくとも７０％、なおより好ましくは少なくとも８０％、なおより好ましくは少なくとも９０％、及び最も好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸同一性を有する酵素が挙げられる。
【０２３１】
全ての本発明のペルヒドロラーゼは、表３に示したような上記のシグネチャーモチーフで構成される。
【０２３２】
【表６】
0005504268.tif 000017
【０２３３】
或いは、４種の保存されたモチーフ（ＲＧＱ、ＧＸＳＱＧ、ＬＸＤ、及びＨＥ；配列番号２のアミノ酸残基１１８〜２９９）を含む連続したシグネチャーモチーフ（配列番号５３）も、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼを同定するための連続したシグネチャーモチーフとして使用できる。そのようなものとして、好適な酵素はペルヒドロラーゼ活性を有することが予想され、更に、配列番号５３に対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３３％、より好ましくは少なくとも４０％、なおより好ましくは少なくとも４２％、なおより好ましくは少なくとも５０％、なおより好ましくは少なくとも６０％、なおより好ましくは少なくとも７０％、なおより好ましくは少なくとも８０％、なおより好ましくは少なくとも９０％、及び最も好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸同一性を有すると同定されたものでもよい（ＣＥ−７炭水化物エステラーゼに見出される４種の保存されたモチーフは、下線で表示される）。
【化９】
0005504268.tif 000018
【０２３４】
表４に、連続したシグネチャー配列を用いた、本発明のペルヒドロラーゼ活性を有するＣＥ−７エステラーゼとの対比を示す。
【０２３５】
【表７】
0005504268.tif 000019
【０２３６】
或いは、１種又はそれ以上の本発明のペルヒドロラーゼの完全長に対するパーセントアミノ酸同一性も使用可能である。従って、好適なペルヒドロラーゼ活性を有する酵素は、配列番号２に対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３３％、より好ましくは少なくとも４０％、なおより好ましくは少なくとも４２％、なおより好ましくは少なくとも５０％、なおより好ましくは少なくとも６０％、なおより好ましくは少なくとも７０％、なおより好ましくは少なくとも８０％、なおより好ましくは少なくとも９０％、及び最も好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸同一性を有する。更なる実施態様において、好適なペルヒドロラーゼ触媒は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３０、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２から成るグループから選択されるアミノ酸配列を含む。好ましい実施態様において、ペルヒドロラーゼ活性を有し、配列番号２、又は配列番号１０、又は配列番号１４、又は配列番号１６に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸同一性を有する好適な酵素は、使用することができる。
【０２３７】
また、好適なペルヒドロラーゼ酵素は、本発明のペルヒドロラーゼ酵素（例えば、配列番号２，１０，１４、及び１６）の１つに１個又はそれ以上の欠失、置換及び／又は挿入を有する酵素を含んでいてもよい。表２に示されるように、ペルヒドロラーゼ活性を有するＣＥ−７炭水化物エステラーゼは、わずか３２％の総体的なアミノ酸同一性しか共有しない。本発明の実施例で提供されたデータに基づけば、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーに属するペルヒドロラーゼ活性を有する追加の酵素は、酵素が保存されたシグネチャーモチーフを保持してさえいれば、それより低いパーセント同一性しか有さないものでもよい。そのようなものとして、酵素内の相対的な位置に保存されたシグネチャーモチーフ（表３を参照）が認められさえすれば、欠失、置換、及び／又は挿入の数は変化してもよい。
【０２３８】
本明細書に提供された１つ又はそれ以上の本発明の配列から誘導されたアミノ酸配列を有する変異酵素を含む酵素触媒も、また、本発明の方法に使用することができる。DiCosimoらへの米国仮出願第６１／１０２５２０号（参照することによって本明細書に組み込まれている）は、改善されたペルヒドロリシス活性を有する酵素触媒について説明している。より具体的には、DiCosimoらは、数種のサーモトガアセチルキシランエステラーゼ内に存在する重要なシステイン残基に対する特定のアミノ酸置換（アラニン、バリン、セリン、又はスレオニン）が、野生型のアセチルキシランエステラーゼと比較した場合、いかに変異酵素のペルヒドロリシス活性が増加するかを教えている。サーモトガ属のアセチルキシランエステラーゼ間の高い相同性のため、いかなるサーモトガ属におけるシステイン残基へのアラニン、バリン、セリン又はスレオニンによる置換も、同様の結果をもたらすことが推定される。
【０２３９】
１つの実施態様において、本発明の方法は、ペアワイズアラインメントのデフォルトパラメーターとしてＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５及びＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５を用いたＣＬＵＳＴＡＬのアラインメント法（例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷ）に基づき、配列番号６９、７０、７１、７２又は７３のアミノ酸２７７への置換が、セリン、スレオニン、バリン及びアラニンから成るグループから選択されるという前提で、配列番号６９、７０、７１、７２又は７３と比較した場合、少なくとも９５％の配列同一性（又は、種々の実施態様において、９６％、９７％、９８％あるいは９９％の配列同一性）を有する変異型サーモトガ由来酵素を用いることができる。
【０２４０】
より具体的な実施態様では、本発明の方法は、アミノ酸残基２７７がセリン、スレオニン、バリン及びアラニンから成るグループから選択されるなら、配列番号６９, ７０、７１、７２及び７３から成るグループから選択されるアミノ酸配列を含む変異型サーモトガ酵素を用いてもよい。
【０２４１】
更なる具体的な実施態様では、本発明の方法は、アミノ酸残基２７７がセリン、スレオニン、バリン及びアラニンから成るグループから選択されるアミノ酸で置換された、配列番号６９のアミノ酸配列を含む変異型サーモトガ・ネアポリタナ酵素を用いてもよい。
【０２４２】
更なる具体的な実施態様では、本発明の方法は、アミノ酸残基２７７がセリン、スレオニン、バリン及びアラニンから成るグループから選択されるアミノ酸で置換された、配列番号７０のアミノ酸配列を含む変異型サーモトガ・マリチマ酵素を用いてもよい。
【０２４３】
加えて、それに対応する核酸配列内で見出された構造的な類似性に従って好適な酵素を同定することは、十分に当業者の技術的範囲内である。ハイブリダイゼーション技術を用いて、類似した遺伝子配列を同定することができる。従って、本発明の好適なペルヒドロラーゼ触媒は、ストリンジェントな条件下で、配列番号１；配列番号３；配列番号５；配列番号７；配列番号９；配列番号１１；配列番号１３；配列番号１５；配列番号１７；配列番号１９；配列番号２１；配列番号２３；配列番号２９；配列番号５５；配列番号５７；配列番号５９；及び配列番号６１から成るグループから選択される核酸配列を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子によってコードされたアミノ酸配列を含む。
【０２４４】
別の実施態様において、ペルヒドロラーゼ触媒は、ストリンジェントな条件下で、配列番号１、配列番号９、配列番号１３、及び配列番号１５から成るグループから選択される核酸配列にハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を有する酵素を含む。
【０２４５】
本発明の方法によれば、水性の反応条件下で、炭水化物エステラーゼのＣＥ−７ファミリーに属する酵素のペルヒドロラーゼ活性を用いて、工業的に有用な、効果的な濃度の過酸がその場生産される。１つの実施態様において、ペルヒドロラーゼ活性を有する酵素は、また、構造的及び機能的にセファロスポリンＣデアセチラーゼ（ＣＡＨ）に分類される。別の実施態様において、ペルヒドロラーゼ活性を有する酵素は、構造的及び機能的にアセチルキシランエステラーゼ（ＡＸＥ）に分類される。
【０２４６】
生産された過酸は非常に反応性があり、それは、これらに限定されないが、温度及びｐＨを含む変動要因に依存して、長時間の経過で濃度が減少する可能性がある。そのようなものとして、特に液体製剤の場合、種々の反応成分を分離した状態に維持することが望ましい。１つの態様では、過酸化水素源は、基質又はペルヒドロラーゼ触媒の何れかから分離されており、好ましくはその両者から分離されている。これは様々な技術を用いて達成することができ、この様な技術としては、これに限定されないが、多数のコンパートメントチャンバーを有するディスペンサーの使用（米国特許第４，４８４，１５０号）、及び使用時にペルヒドロラーゼ触媒と無機過酸化物及び本発明の基質とを物理的に合わせることによって、水性における酵素的なペルヒドロリシス反応を開始させることが含まれる。ペルヒドロラーゼ触媒は、場合により、反応チャンバー本体内に固定されていてもよいし、又は処理の標的となる表面及び／又は物体と接触させる前に、過酸を含む反応生産物から分離（例えば、ろ過など）してもよい。ペルヒドロラーゼ触媒は、液体マトリックス中に存在してもよいし、又は固体の形態（即ち、粉末状、錠剤）でもよいし、又は固体マトリックス内に埋め込まれていてもよく、続いてそれを、酵素的ペルヒドロリシス反応を開始させるために基質と混合する。更なる態様では、ペルヒドロラーゼ触媒を、溶解可能な、又は多孔性のパウチ内に含ませてもよく、それを、酵素的ペルヒドロリシスを開始させるために水性の基質マトリックスに添加してもよい。追加の更なる態様では、酵素触媒を含む粉末を基質（例えば、トリアセチン）に懸濁して、使用時に水中で過酸素源と混合する。
【０２４７】
過酸及び過酸化水素の濃度を測定するためのＨＰＬＣアッセイ法
本発明の方法において、反応物質及び生成物を分析するために、様々な分析方法を用いることができ、そのような方法としては、これらに限定されないが、滴定、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、マススペクトロスコピー（ＭＳ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、U. Karstら（Anal. Chem., 69(17):3623-3627 (1997)）によって説明されている分析法、及び２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾタゾリン）−６−スルホナート（ＡＢＴＳ）アッセイ（S. Minning, et al., Analytica Chimica Acta 378:293-298 (1999) 及び国際
公開公報第２００４／０５８９６１号）が挙げられる。
【０２４８】
過酸の最小殺菌濃度の測定
J. Gabrielsonら（J. Microbiol. Methods 50: 63-73 (2002)）によって説明されている方法が、過酸又は過酸化水素及び酵素基質の最小殺菌濃度（ＭＢＣ）を測定するために使用することができる。このアッセイ方法は、ＸＴＴ還元の阻害に基づいており、ここで、ＸＴＴ（２，３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル］−５−［（フェニルアミノ）カルボニル］−２Ｈ−テトラゾリウム、分子内塩、モノナトリウム塩）は、４９０ｎｍ又は４５０ｎｍで測定された光学濃度（ＯＤ）の変化によって微生物の呼吸活性を示す酸化還元色素である。しかし、消毒剤及び防腐剤の活性の試験に利用可能な様々なその他の方法があり、その方法としては、これらに限定されないが、生菌数計数、直接的な顕微鏡計数、乾燥質量、濁度測定、吸光度及び生物発光（例えば、Brock, Semour S.,「消毒、滅菌、及び保存、第５版」（Disinfection, Sterilization, and Preservation, 5th edition）,  Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, USA; 2001を参照）が挙げられる。
【０２４９】
酵素的に製造された過酸組成物の使用
本発明の方法に従って製造した酵素触媒生成の過酸は、様々な硬表面／無生物への用途において、微生物性、真菌性、プリオン関連及びウイルス性の汚染の濃度を減少させるために用いることができ、例えば、医療機器（例えば、内視鏡）、織物（例えば、衣服、カーペット）、食品製品の表面、食品保存及び食品包装器具、食品の包装に用いられる材料、鶏の孵化場、及び飼育施設、動物の囲い、及び微生物及び／又は殺ウイルス活性を有する使用済みのプロセス水の汚染除去に用いることができる。酵素により生成した過酸を、プリオンを不活化する様に設計された製剤（例えば、所定のプロテアーゼ）に用いて、追加の殺菌活性を提供してもよい。好ましい態様において、本発明の過酸組成物は、特にオートクレーブ不可能な医療機器や食品包装装置のための消毒剤として、有用である。過酸を含む製剤は、ＧＲＡＳ又は食品グレードの成分（酵素、酵素基質、過酸化水素、及び緩衝液）を用いて調製してもよいために、酵素により生成した過酸は、更に動物の死体、肉、果物及び野菜の汚染除去のために、又は加工食品の汚染除去のために用いてもよい。酵素により生成した過酸は、最終的な形態が粉末、液体、ゲル、フィルム、固体又はエアロゾルである製品に組み込んでもよい。酵素により生成した過酸は、なお有効な汚染除去効果を示すような濃度に希釈してもよい。
【０２５０】
有効な濃度の過酸を含む組成物を用いて、生きた病原性微生物の汚染物質で汚染された（又は、汚染された疑いのある）表面及び／又は物体を、表面又は物体と本発明の方法によって生産された生成物を接触させることによって消毒することができる。本明細書で用いられる「接触させること」は、噴霧すること、処理すること、浸漬すること、フラッシングすること、その上又はその中に流し込むこと、混合すること、組み合わせること、塗装すること、コーティングすること、塗布すること、付着させることによって、及びその他の方法で、有効な濃度の過酸を含む過酸溶液若しくは組成物、又は有効な濃度の過酸を形成する溶液若しくは組成物と、ある濃度の微生物集団で汚染されている疑いのある表面又は無生物が接触することを含む。消毒剤組成物は、洗浄及び消毒作用の両者を提供するために、洗浄用組成物と組み合わせてもよい。或いは、１つの組成物で洗浄及び消毒作用の両者を提供するために、製剤に洗浄剤（例えば、界面活性剤又は洗剤）が組み込まれてもよい。
【０２５１】
有効な濃度の過酸を含む組成物は、少なくとも1種の追加の抗菌剤、プリオン分解プロテアーゼの組合せ、殺ウイルス剤、殺胞子剤又は殺生物剤を含んでいてもよい。これらの薬剤と特許請求された方法によって生産された過酸の組み合わせは、病原微生物、胞子、ウイルス、真菌及び／又はプリオンで汚染された表面及び／又は物体（又は、汚染された疑いのある）を浄化及び消毒するために用いられる場合、効果の上昇及び／又は相乗効果を提供することができる。好適な抗微生物剤としては、所望の程度の微生物からの保護を提供するのに十分な量のカルボン酸エステル（例えば、ｐ−ヒドロキシアルキルベンゾエート、及びアルキルシンナメート）、スルホン酸（例えば、ドデシルベンゼンスルホン酸）、ヨード化合物若しくは活性なハロゲン化合物（例えば、元素のハロゲン）、ハロゲン酸化物（例えば、ＮａＯＣｌ、ＨＯＣｌ、ＨＯＢｒ、ＣｌＯ2）、ヨウ素、インターハロゲン化物（例えば、一塩化ヨウ素、二塩化ヨウ素、三塩化ヨウ素、四塩化ヨウ素、塩化臭素、一臭化ヨウ素、又は二臭化ヨウ素）、ポリハロゲン化物、次亜塩素酸塩、次亜塩素酸、次亜臭素酸塩、次亜臭素酸、クロロ及びブロモヒダントイン、二酸化塩素、及び亜塩素酸ナトリウム）、有機過酸化物、例えば、過酸化ベンゾイル、過酸化アルキルベンゾイル、オゾン、一重項酸素発生剤、及びそれらの混合物、フェノール誘導体、（例えば、ｏ−フェニルフェノール、ｏ−ベンジルｐ−クロロフェノール及びｔｅｒｔ−アミルフェノール、及びＣ１〜Ｃ６アルキルヒドロキシベンゾアート）、第四級アンモニウム化合物（例えば、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、及びそれらの混合物）、及びこのような抗菌剤の混合物が挙げられる。抗菌剤の有効量としては、約０．００１質量％〜約６０質量％の抗菌剤、約０．０１質量％〜約１５質量％の抗菌剤、又は約０．０８質量％〜約２．５質量％の抗菌剤が挙げられる。
【０２５２】
１つの態様において、本発明の方法によって形成された過酸は、ある場所の上及び／又はその地点に適用したとき、生存可能な微生物汚染物質（例えば、生きた微生物集団）の濃度を減少させるために使用することができる。本明細書で用いられるように、「場所」は、消毒又は漂白に好適な標的の表面の一部又は全部を含む。標的の表面としては、潜在的に微生物、ウイルス、胞子、真菌、プリオン又はそれらの組み合わせで汚染される可能性があるあらゆる表面が挙げられる。非限定的な例としては、食品又は飲料産業で見られる器具の表面（例えば、タンク、コンベヤー、床、ドレーン、クーラー、冷凍庫、器具の表面、壁、バルブ、ベルト、パイプ、ドレーン、ジョイント、裂け目、それらの組み合わせなど）；建築物の表面（例えば、壁、床及び窓）；非食料品産業に関連するパイプ及びドレーン、例えば、水処理施設、プール及び温泉場、並びに発酵槽；病院又は動物病院の表面（例えば、壁、床、ベッド、機具（例えば、内視鏡）、病院／動物病院又はその他の医療の場で着用される衣類、例えば衣類、洗浄機具、靴、及びその他の病院又は動物病院の表面）；レストランの表面；浴室の表面；トイレ；衣服、及び靴；家禽、ウシ、乳牛、ヤギ、ウマ及びブタのような家畜のための厩又は家畜小屋の表面；家禽又はエビ用の孵化場；及び薬剤又は生物製剤の表面（例えば、薬剤又は生物製剤の製造器具、薬剤又は生物製剤の成分、薬剤又は生物製剤の賦形剤）が挙げられる。また、更なる硬表面としては、食品、例えば、牛肉、鶏肉、豚肉、野菜、果実、海産食物、それらの組み合わせなども挙げられる。また、水を吸収する材料、例えば、感染したリネン又はその他の布地も挙げられる。また、収穫された植物又は植物製品も挙げられ、例えば、種子、球根、塊茎、果実及び野菜、発芽させた植物、及び特に作物の発芽させた植物、例えば、穀草、葉菜、及びサラダ用作物、根菜、豆類、ベリー系の果物、柑橘系の果物、及び硬い果物が挙げられる。
【０２５３】
硬表面を有する材料の非限定的な例は、金属（例えば、鋼、ステンレス鋼、クロム、チタン、鉄、銅、真鍮、アルミニウム及びそれらの合金）、無機物質（例えば、コンクリート）、ポリマー及びプラスチック（例えば、ポリオレフィン、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリラート,ポリアクリロニトリル、ポリブタジエン、ポリ（アクリロニトリル、ブタジエン、スチレン）、ポリ（アクリロニトリル、ブタジエン）、アクリロニトリルブタジエン;ポリエステル、例えば、ポリエチレンテレフタラート；並びにポリアミド、例えば、ナイロン）である。更なる表面としては、レンガ、タイル、セラミック、磁器、木材、ビニル、リノリウム、及びカーペットが挙げられる。
【０２５４】
過酸は、また、洗剤用途用の漂白組成物を製造するのに有用であることが報告されている（米国特許第３，９７４，０８２号；米国特許第５，２９６，１６１号；米国特許第５，３６４，５５４号）。いくつかの漂白用途では、最適な仕上がりにするために、漂白活性レベルの制御が必要になる可能性がある。更なる態様では、本発明の方法によって形成される過酸は、洗濯物又は織物の漂白に使用することができ、この場合、漂白のために生成される過酸の濃度に対して同様の制限が望ましい。
【０２５５】
組換え微生物による発現
本発明の配列及び遺伝子産物は、異種宿主細胞中で、具体的には微生物宿主の細胞中で生産してもよい。本発明の遺伝子及び核酸分子を発現させるための好ましい異種宿主細胞は、真菌又は細菌ファミリー内に見出すことができ、温度、ｐＨ値及び溶媒耐性の広範囲にわたって成長する微生物宿主である。例えば、細菌、酵母及び糸状菌のいずれかが、適切に本発明の核酸分子の発現の宿主になることが想定される。ペルヒドロラーゼは、細胞内、細胞外又は細胞内と細胞外の両者の組み合わせで発現される可能性があり、この場合、細胞内発現によって生産されたタンパク質を回収する方法よりも、細胞外で発現させる方が、発酵産物からの目的タンパク質の回収が容易になる。転写、翻訳及びタンパク質生合成装置は、細胞のバイオマスを生成するために用いられる細胞原材料と比較して不変のままである；それにもかかわらず機能的な遺伝子は発現される。宿主株の例としては、これらに限定されないが、細菌、真菌又は酵母の種類、例えば、アスペルギルス属、トリコデルマ属、サッカロミセス属、ピチア属、ファフィア（Phaffia）属、カンジダ、ハンセヌラ属、ヤロウィア（Yarrowia）属、サルモネラ属、バチルス属、アシネトバクター属、ジモモナス属、アグロバクテリウム属、エリスロバクター属、クロロビウム属、クロマチウム属、フラボバクテリウム属、キトファガ属、ロドバクター属、ロドコッカス属、ストレプトミセス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、マイコバクテリウム属、デイノコッカス属、エシェリキア属、エルウィニア属、パントエア属、シュードモナス属、スフィンゴモナス属、メチロモナス属、メチロバクター属、メチロコッカス属、メチロシナス（Methylosinus）属、メチロミクロビウム（Methylomicrobium）属、メチロシスティス（Methylocystis）属、アルカリゲネス属、シネコシスティス（Synechocystis）属、シネココッカス（Synechococcus）属、アナベナ属、チオバシラス属、メタノバクテリウム属、クレブシエラ属及びミクソコッカス属が挙げられる。１つの実施態様において、細菌の宿主株としては、エシェリキア属、バチルス属、及びシュードモナス属が挙げられる。好ましい実施態様では、細菌の宿主細胞は、エシェリキア・コリである。
【０２５６】
大規模な微生物の増殖及び機能的な遺伝子の発現には、多様で簡単な若しくは複雑な炭水化物、有機酸、及びアルコール、又はメタンのような飽和炭化水素、又は、例えば、光合成又は化学独立栄養の宿主の場合は、二酸化炭素、窒素、リン、硫黄、酸素、炭素又は低分子の無機物質イオンを含むあらゆる形態及び量の微量栄養素を使用してもよい。増殖速度の調節は、培養に特定の調節分子の添加又は無添加によって影響を受ける可能性があり、これらは、一般的には栄養素又はエネルギー源とは見なさない。
【０２５７】
好適な宿主細胞の形質転換に有用なベクター又はカセットは、当該分野で公知である。典型的には、ベクター又はカセットは、関連する遺伝子の転写及び翻訳を作動させる配列、選択マーカー、及び自律増殖させたり又は染色体を統合させたりする配列を含む。好適なベクターは、転写開始の制御を担う遺伝子の５’領域、及び転写終結を制御するＤＮＡフラグメントの３’領域を含む。両者の制御領域は、形質転換宿主細胞に相同な遺伝子、及び／又は生産宿主に対して天然型の遺伝子から誘導される場合が最も好ましいが、このような制御領域は必ずしもそのようにして誘導されていなくてもよい。
【０２５８】
望ましい宿主細胞中で本発明のセファロスポリンＣデアセチラーゼのコード領域を発現させるのに有用な開始制御領域又はプロモーターは多数あり、当業者によく知られている。実質的には、これらの遺伝子を稼働させることができればどのようなプロモーターでも本発明に好適であり、例えば、これらに限定されないが、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス属における発現に有用）、ＡＯＸ１（ピチア属における発現に有用）；及びｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ＩＰＬ、ＩＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ及びｔｒｃ（エシェリキア・コリにおける発現に有用）、ａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーター、及びバチルス属における発現に有用な様々なファージプロモーターが挙げられる。
【０２５９】
終結制御領域も、また、自然から宿主細胞に至る様々な遺伝子から誘導することができる。１つの実施態様において、終結制御領域の含有は任意である。別の実施態様において、キメラ遺伝子は、好ましい宿主細胞由来の終結制御領域を含む。
【０２６０】
工業的な生産
本発明のペルヒドロラーゼ触媒を生産するために、様々な培養方法を適用することができる。例えば、組換え微生物宿主から過剰発現される特定の遺伝子産物の大規模生産は、バッチ式及び連続培養法のどちらによっても生産することができる。
【０２６１】
古典的なバッチ式培養方法は閉鎖系であり、この場合、培地組成は培養の開始時に設定され、培養工程中に人為的な変更を受けることはない。従って、培養工程の開始時に、培地に目的の生物又は生物群を接種し、系には追加で何も添加することなしに、増殖又は代謝活性を起こすことができる。しかしながら、一般的には、「バッチ式」培養は、炭素源の添加に関してバッチ式なのであって、ｐＨ及び酸素濃度のような要因を制御する試みがなされることが多い。バッチ系においては、系の代謝産物及びバイオマス組成は、培養が終了するときまで絶えず変化する。バッチ培養中に、細胞は静止状態のラグフェーズを経て高い対数増殖期になり、最終的に定常期になり、ここで増殖速度は減少するか、又は停止する。処理をしないと、定常期中の細胞は、最終的には死滅すると予想される。処置されない場合、定常期における細胞は、いずれは死滅する。いくつかの系において、対数期中の細胞が、最終産物又は中間体の生産の大部分に関与することが多い。他の系では、静止又は対数期後に生産させることができる。
【０２６２】
標準的なバッチ系の変形は、流加培養系（fed-batch system）である。流加培養法も、また、本発明に好適であり、基質が培養の進行とともに段階的に追加されること以外は、典型的なバッチ系を含む。流加培養系は、異化代謝産物の抑制が細胞の代謝を阻害しやすい場合に有用であり、この場合、限定的な量の基質しか培地中に含まれていないことが望ましい。流加培養系における実際の基質濃度の測定は難しいため、ｐＨ、溶存酸素及び排ガス（例えば、ＣＯ2）の分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて推定される。バッチ式及び流加培養法は一般的で、当業界で公知であり、Thomas D. Brock in「バイオテクノロジー：工業微生物学教本」（Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology）, Second Edition, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1989) 及び Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol., 36:227 (1992) にその例が見られる。
【０２６３】
また、目的のペルヒドロラーゼ触媒の商業的な生産も、連続培養を用いて達成することができる。連続培養は開放系であり、この場合、確定した培地が連続的にバイオリアクターに添加され、同時に等量の馴化培地が処理するために除かれる。一般的に、連続培養では、細胞は一定した高い液相密度に維持され、そこでは、細胞は主として対数増殖期にある。或いは、固定化細胞を用いて連続培養を実施してもよく、その場合、炭素及び栄養素は連続的に添加され、有用な生成物、副産物又は老廃物は、細胞集団から連続的に除去される。細胞の固定化は、天然及び／又は合成材料で構成される様々な固体の支持体を用いて行うことができる。
【０２６４】
連続又は半連続培養によって、細胞増殖又は最終産物の濃度に影響を与える１つの因子又は多数の因子調節が可能になる。例えば、１つの方法は、炭素源又は窒素レベルのような制限される栄養素を一定の比率で維持し、その他の全てのパラメーターの調節を可能にする。他の系において、増殖に影響を与える多数の因子を連続的に変更することが可能であり、そのうえ培地の濁度によって測定される細胞濃度は一定に維持される。連続的な系では、定常状態の増殖条件を維持する努力がなされ、従って、培地の抜き取りによる細胞の損失は、培養中の細胞増殖速度とバランスをとらなければならない。連続培養方法のための栄養素及び増殖因子を調節する方法、並びに、生産物形成の速度を最大にする技術は、工業微生物学の業界においてよく知られており、上記の Brock によって様々な方法が説明されている。
【０２６５】
本発明における発酵培地は、好適な炭素基質を含んでいなければならない。好適な基質としては、これらに限定されないが、グルコース及びフルクトースなどの単糖、乳糖又はショ糖のような二糖、デンプン又はセルロース、又はそれらの混合物のような多糖、及び、例えば、チーズホエー透過物、コーンスティープリカー、砂糖大根の糖蜜、及び大麦麦芽のような再生可能な原材料由来の未精製の混合物が挙げられる。加えて、炭素基質は、二酸化炭素、メタン又はメタノール（例えば、宿主細胞がメチロトローフ微生物である場合）のような１個の炭素を含む基質であってもよい。同様に、カンジダ属の様々な種は、アラニン又はオレイン酸を代謝することができる（Sulter etal., Arch. Microbiol., 153:485489 (1990)）。従って、本発明で使用される炭素源は、多種多様な炭素含有基質を包含し得ることが考えられ、生物の選択によってのみ限定されることになる。
【０２６６】
バッチ式若しくは流加培養、又は連続培養からの所望のペルヒドロラーゼ触媒の回収は、当業者が知るいかなる方法によって達成されてもよい。例えば、ペルヒドロラーゼ触媒が細胞内に生産される場合、細胞ペーストは遠心分離又は膜濾過によって培養培地から分離し、場合により、望ましいｐＨの水又は水性緩衝液で洗浄し、次いで所望のｐＨの水性緩衝液に懸濁した細胞ペーストをホモジネートして所望のペルヒドロラーゼ触媒を含む細胞抽出物を作る。細胞抽出物は、ペルヒドロラーゼ触媒溶液から不要なタンパク質を沈殿させるための熱処理工程を行う前に、場合により、細胞残屑を除去するためにセライト又はシリカのような適切な濾過助剤を通して濾過してもよい。所望のペルヒドロラーゼ触媒を含有する溶液は、膜濾過又は遠心分離によって沈殿した細胞残屑及びタンパク質から分離し、生じた部分精製されたペルヒドロラーゼ触媒溶液は、追加の膜濾過で濃縮し、次に、場合によって、適切な担体（例えば、マルトデキストリン、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、又はそれらの混合物）と混合し、噴霧乾燥して所望のペルヒドロラーゼ触媒を含む固体粉末を製造することができる。
【０２６７】
本発明者らは、具体的に引用した全ての参考文献の全内容を本開示に組み込む。更に、量、温度又はその他の値若しくはパラメーターが、範囲、好ましい範囲、又は好ましい上方の値及び好ましい下方の値の表の何れかとして与えられている場合、これは、あらゆる上方の範囲の限界若しくは好ましい値と、あらゆる下方の範囲の限定若しくは好ましい値とのあらゆる対から形成される全ての範囲を、範囲が別々に開示されているかどうかに関係なく、具体的に開示しているものとする。本明細書において各種の数値が列挙されている場合、特に他の指定がない限り、その範囲は、それらの両端の値並びに範囲内の全ての整数及び分数を含むものとする。範囲が定義されている場合、本発明の範囲を列挙された特定の値に限定することは意図していない。
【０２６８】
一般的な方法
本発明の好ましい態様を実証するために、以下の実施例を示す。以下の実施例で開示された技術は、本発明者らによって本発明の実施において十分に機能することが発見された技術を示しており、従って、その実施にとって好ましいモードを構成することは、当業者であれば当然理解している。しかし、当業者であれば、本発明の開示に照らして、開示された特定の実施態様に多くの変更を加えることができ、それでもなお本発明の本質及び範囲から逸脱することなく同様の又は類似した結果を得ることができることを理解している。
【０２６９】
全ての試薬及び材料は、他に特に規定がない限り、DIFCO Laboratories （Detroit, MI）、GIBCO/BRL（Gaithersburg, MD）、TCI America（Portland, OR）、Roche Diagnostics Corporation（Indianapolis, IN）又はSigma/Aldrich Chemical Company（St. Louis, MO）から得た。
【０２７０】
本明細書に記載の略語は、以下に示すように測定、技術、特性又は化合物の単位に相当する：「ｓｅｃ」又は「ｓ」は、秒を意味し、「ｍｉｎ」は、分を意味し、「ｈ」又は「ｈｒ」は、時間を意味し、「μＬ」は、マイクロリットルを意味し、「ｍＬ」は、ミリリットルを意味し、「Ｌ」は、リットルを意味し、「ｍＭ」は、ミリモル濃度を意味し、「Ｍ」は、モル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」は、ミリモルを意味し、「ｐｐｍ」は、百万分率を意味し、「ｗｔ％」は、質量パーセントを意味し、「ｇ」は、グラムを意味し、「μｇ」は、マイクログラムを意味し、「ｎｇ」は、ナノグラムを意味し、「ｇ」は、重力を意味し、「ＨＰＬＣ」は、高速液体クロマトグラフィーを意味し、「ｄｄＨ2Ｏ」は、蒸留して脱イオンした水を意味し、「ｄｃｗ」は、乾燥細胞質量を意味し、「ＡＴＣＣ」又は「ＡＴＣＣ（登録商標）」は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Manassas, VA）を意味し、「Ｕ」は、ペルヒドロラーゼの活性単位を意味し、「ｒｐｍ」は、毎分回転数を意味し、及び「ＥＤＴＡ」は、エチレンジアミン四酢酸を意味する。
【０２７１】
〔実施例１〕
ｋａｔＧカタラーゼが破壊されたＥ．コリの構築
配列番号３９と同定されたＰＣＲ産物を作製するために、配列番号３７及び配列番号３８と同定されたプライマーを用いたＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によって、カナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎ：配列番号３５）をプラスミドｐＫＤ１３（配列番号３６）から増幅した。ｋａｔＧ核酸配列は配列番号４０として示され、それに対応するアミノ酸配列は配列番号４１である。Ｅ．コリＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ（登録商標）４７０７６（商標））を、λ−レッドリコンビナーゼ遺伝子（Datsenko and Wanner, 2000, PNAS USA 97:6640-6645）を含む温度感受性プラスミドｐＫＤ４６（配列番号４２）で形質転換し、ＬＢ−ａｍｐプレート上で３０℃で２４時間選択した。ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６を、ＰＣＲ産物５０〜５００ｎｇで電気穿孔法（BioRad Gene Pulser, 0.2 cm cuvette, 2.5 kV, 200 W, 25 uF）によって形質転換し、ＬＢ−ｋａｎプレート上で、３７℃で２４時間選択培養した。数個のコロニーを、ＬＢ−ｋａｎプレート上に線状に塗布し、４２℃で一晩インキュベートしてｐＫＤ４６プラスミドを養生した。コロニーをチェックして、ｋａｎＲ／ａｍｐＳの表現型を確認した。ゲノムＤＮＡを、ＰＵＲＥＧＥＮＥ（登録商標）ＤＮＡ精製システムを用いて数個のコロニーから単離し、配列番号４３及び配列番号４４と同定されたプライマーを用いたＰＣＲによってチェックし、ｋａｔＧ遺伝子の破壊を確認した。数種のｋａｔＧ遺伝子が破壊された株を、ＦＬＰリコンビナーゼを含む温度感受性プラスミドｐＣＰ２０（配列番号４５）で形質転換し、これを用いて、ｋａｎ遺伝子を切り出し、ＬＢ−ａｍｐプレート上で、３７℃で２４時間選択した。数個のコロニーを、ＬＢプレートに線状に塗布し、４２℃で一晩インキュトして、ｐＣＰ２０プラスミドを養生した。２つのコロニーをチェックして、ｋａｎＳ／ａｍｐＳの表現型を確認し、ＭＧ１６５５ＫａｔＧ１、及びＭＧ１６５５ＫａｔＧ２と命名した。
【０２７２】
〔実施例２〕
ｋａｔＥカタラーゼが破壊されたＥ．コリの構築
配列番号４８と同定されたＰＣＲ産物を作製するために、配列番号４６及び配列番号４７と同定されたプライマーを用いたＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によって、カナマイシン耐性遺伝子（配列番号３５）をプラスミドｐＫＤ１３（配列番号３６）から増幅した。ｋａｔＥ核酸配列は、配列番号４９として示され、それに対応するアミノ酸配列は配列番号５０である。Ｅ．コリＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ（登録商標）４７０７６（商標））を、λ−レッドリコンビナーゼ遺伝子を含む温度感受性プラスミドｐＫＤ４６（配列番号４２）で形質転換し、ＬＢ−ａｍｐプレート上で、３０℃で２４時間選択した。ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６を、ＰＣＲ産物５０〜５００ｎｇで電気穿孔法（BioRad Gene Pulser, 0.2 cm cuvette, 2.5 kV, 200 W, 25 uF）によって形質転換し、ＬＢ−ｋａｎプレート上で、３７℃で２４時間選択した。数個のコロニーを、ＬＢ−ｋａｎプレートに線状に塗布し、４２℃で一晩インキュベートしてｐＫＤ４６プラスミドを養生した。コロニーをチェックして、ｋａｎＲ／ａｍｐＳの表現型を確認した。ゲノムＤＮＡを、ＰＵＲＥＧＥＮＥ（登録商標）ＤＮＡ精製システムを用いて数個のコロニーから単離し、配列番号４３及び配列番号４４と同定されたプライマーを用いたＰＣＲによってチェックし、ｋａｔＧ遺伝子の破壊を確認した。数種のｋａｔＥ遺伝子が破壊された株を、ＦＬＰリコンビナーゼを含む温度感受性プラスミドｐＣＰ２０（配列番号４５）で形質転換し、これを用いて、ｋａｎ遺伝子を切り出し、ＬＢ−ａｍｐプレート上で、３７℃で２４時間選択した。数個のコロニーを、ＬＢプレート上に線状に塗布し、４２℃で一晩インキュベートして、ｐＣＰ２０プラスミドを養生した。２つのコロニーをチェックして、ｋａｎＳ／ａｍｐＳの表現型を確認し、ＭＧ１６５５ＫａｔＥ１、及びＭＧ１６５５ＫａｔＥ２と命名した。
【０２７３】
〔実施例３〕
ｋａｔＧカタラーゼ及びｋａｔＥカタラーゼが破壊されたＥ．コリ株（ＫＬＰ１８）の構築
配列番号４８と同定されたＰＣＲ産物を作製するために、配列番号４６及び配列番号４７と同定されたプライマーを用いたＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によって、カナマイシン耐性遺伝子（配列番号３５）をプラスミドｐＫＤ１３（配列番号３６）から増幅した。Ｅ．コリＭＧ１６５５ＫａｔＧ１（実施例１３）を、λ−レッドリコンビナーゼ遺伝子を含む温度感受性プラスミドｐＫＤ４６（配列番号４２）で形質転換し、ＬＢ−ａｍｐプレート上で、３０℃で２４時間選択した。ＭＧ１６５５ＫａｔＧ１／ｐＫＤ４６を、ＰＣＲ産物５０〜５００ｎｇで電気穿孔法（BioRad Gene Pulser, 0.2 cm cuvette, 2.5 kV, 200 W, 25 uF）によって形質転換し、ＬＢ−ｋａｎプレート上で、３７℃で２４時間選択した。数個のコロニーを、ＬＢ−ｋａｎプレートに線状に塗布し、４２℃で一晩インキュベートしてｐＫＤ４６プラスミドを養生した。コロニーをチェックして、ｋａｎＲ／ａｍｐＳの表現型を確認した。ゲノムＤＮＡを、ＰＵＲＥＧＥＮＥ（登録商標）ＤＮＡ精製システムを用いて数個のコロニーから単離し、配列番号５１及び配列番号５２と同定されたプライマーを用いたＰＣＲによってチェックし、ｋａｔＥ遺伝子の破壊を確認した。数種のｋａｔＥ遺伝子が破壊された株（ΔｋａｔＥ）を、ＦＬＰリコンビナーゼを含む温度感受性プラスミドｐＣＰ２０（配列番号４５）で形質転換し、これを用いて、ｋａｎ遺伝子を切り出し、ＬＢ−ａｍｐプレート上で、３７℃で２４時間選択した。数個のコロニーを、ＬＢプレート上に線状に塗布し、４２℃で一晩インキュベートして、ｐＣＰ２０プラスミドを養生した。２つのコロニーをチェックして、ｋａｎＳ／ａｍｐＳの表現型を確認し、ＭＧ１６５５ＫａｔＧ１ＫａｔＥ１８．１、及びＭＧ１６５５ＫａｔＧ１ＫａｔＥ２３と命名した。ＭＧ１６５５ＫａｔＧ１ＫａｔＥ１８．１をＥ．コリＫＬＰ１８と命名した。
【０２７４】
〔実施例４〕
サーモトガ・ネアポリタナ由来のペルヒドロラーゼのクローニング及び発現
ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）（受託番号Ｕ５８６３２）で報告されているようなサーモトガ・ネアポリタナ由来のアセチルキシランエステラーゼをコードする遺伝子を、Ｅ．コリ中での発現のために最適化されたコドンを用いて合成した（ＤＮＡ ２．０、Menlo Park, CA）。続いて、配列番号６６及び配列番号６７と同定されたプライマーを用いたＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によって、その遺伝子を増幅した。得られた核酸生成物（配列番号６８）を、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（登録商標）にサブクローニングして、ｐＳＷ１９６と同定されたプラスミドを作製した。そのプラスミドｐＳＷ１９６を使用してＥ．コリを形質転換し、細胞株ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６を作製した。ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６は、ＬＢ培地中で３７℃で振盪しながらＯＤ６００ｎｍ＝０．４〜０．５になるまで増殖させ、その時点でＩＰＴＧを、１ｍＭの最終濃度になるように添加し、インキュベートを２〜３時間続けた。細胞を遠心分離によって収穫し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、総可溶性タンパク質の２０〜４０％のペルヒドロラーゼの発現を確認した。
【０２７５】
〔実施例５〕
サーモトガ・マリチマＭＳＢ８由来のペルヒドロラーゼのクローニング及び発現
ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）（受託番号ＮＰ＿２２７８９３．１）で報告されているようなサーモトガ・マリチマＭＳＢ８由来のアセチルキシランエステラーゼをコードする遺伝子を合成した（ＤＮＡ ２．０、Menlo Park, CA）。続いて、その遺伝子を、配列番号６３及び配列番号６４と同定されたプライマーを用いたＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によって増幅した。得られた核酸生成物（配列番号６５）を制限酵素のＰｓｔＩ及びＸｂａＩで切断し、ｐＵＣ１９のＰｓｔＩ及びＸｂａＩサイトの間にサブクローニングして、ｐＳＷ２０７と同定されたプラスミドを作製した。そのプラスミドｐＳＷ２０７を使用してＥ．コリを形質転換し、ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２０７と同定された細胞株を作製した。ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２０７をＬＢ培地中で３７℃で振盪しながらＯＤ６００ｎｍ＝０．４〜０．５になるまで増殖させ、その時点でＩＰＴＧを、１ｍＭの最終濃度になるように添加し、インキュベートを２〜３時間続けた。細胞を遠心分離によって収穫し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、総可溶性タンパク質の２０〜４０％のペルヒドロラーゼの発現を確認した。
【０２７６】
〔実施例６〕
バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）由来のペルヒドロラーゼのクローニング及び発現
ゲノムＤＮＡは、ＰＵＲＥＧＥＮＥ（登録商標）ＤＮＡ精製システム（Gentra Systems, Minneapolis MN）を用いて、バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）から単離した。ペルヒドロラーゼ遺伝子は、配列番号３及び配列番号４と同定されたプライマーを用いたＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によって増幅した。得られた核酸生成物（配列番号２７）を制限酵素のＰｓｔＩ及びＸｂａＩで切断し、ｐＵＣ１９のＰｓｔＩ及びＸｂａＩサイトの間にサブクローニングして、ｐＳＷ１９４と同定されたプラスミドを作製した。そのプラスミドｐＳＷ１９４を使用してＥ．コリＫＬＰ１８を形質転換し、ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９４と同定された細胞株を作製した。ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９４をＬＢ培地中で３７℃で振盪しながらＯＤ６００ｎｍ＝０．４〜０．５になるまで増殖させ、その時点でＩＰＴＧを、１ｍＭの最終濃度になるように添加し、インキュベートを２〜３時間続けた。細胞を遠心分離によって収穫し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、総可溶性タンパク質の２０〜４０％のペルヒドロラーゼの発現を確認した。
【０２７７】
〔実施例７〕
バチルス・ズブチリスＢＥ１０１０由来のペルヒドロラーゼのクローニング及び発現
ゲノムＤＮＡは、ＰＵＲＥＧＥＮＥ（登録商標）ＤＮＡ精製システム（Gentra Systems）を用いて、バチルス・ズブチリスＢＥ１０１０（Payne and Jackson 1991 J. Bacteriol. 173:2278-2282）から単離した。ペルヒドロラーゼ遺伝子は、配列番号２５及び配列番号２６と同定されたプライマーを用いたＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によってゲノムＤＮＡから増幅した。得られた核酸生成物（配列番号２８）を制限酵素のＰｓｔＩ及びＸｂａＩで切断し、ｐＵＣ１９のＰｓｔＩ及びＸｂａＩサイトの間にサブクローニングして、ｐＳＷ１８９と同定されたプラスミドを作製した。そのプラスミドｐＳＷ１８９を使用してＥ．コリＫＬＰ１８を形質転換し、ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１８９と同定された細胞株を作製した。ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１８９をＬＢ培地中で３７℃で振盪しながらＯＤ600nm＝０．４〜０．５になるまで増殖させ、その時点でＩＰＴＧを、１ｍＭの最終濃度になるように添加し、インキュベートを２〜３時間続けた。細胞を遠心分離によって収穫し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、総可溶性タンパク質の２０〜４０％のペルヒドロラーゼの発現を確認した。
【０２７８】
〔実施例８〕
バチルス・プミルスＰＳ２１３のペルヒドロラーゼのクローニング及び発現
ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）（受託番号ＡＪ１２４９９５７）で報告されているようなバチルス・プミルスＰＳ２１３由来のアセチルキシランエステラーゼをコードする遺伝子（ａｘｅ１）は、Ｅ．コリにおける発現に最適化されたコドンを使用して合成した（ＤＮＡ ２．０、Menlo Park, CA）。次いで、その遺伝子を、配列番号３３及び配列番号３４と同定されたプライマーを用いたＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によって増幅した。得られた核酸生成物（配列番号５３）は、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（登録商標）（Invitrogen, Carlsbad CA）にサブクローニングして、ｐＳＷ１９５と同定されたプラスミドを作製した。そのプラスミドｐＳＷ１９５を使用してＥ．コリＫＬＰ１８を形質転換し、ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９５と同定された細胞株を作製した。ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９５をＬＢ培地中で３７℃で振盪しながらＯＤ600nm＝０．４〜０．５になるまで増殖させ、その時点でＩＰＴＧを、１ｍＭの最終濃度になるように添加し、インキュベートを２〜３時間続けた。細胞を遠心分離によって収穫し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、総可溶性タンパク質の２０〜４０％のペルヒドロラーゼの発現を確認した。
【０２７９】
〔実施例９〕
バチルス・リケニフォルミスＡＴＣＣ（登録商標）１４５８０（商標）由来のペルヒドロラーゼのクローニング及び発現
ゲノムＤＮＡは、ＰＵＲＥＧＥＮＥ（登録商標）ＤＮＡ精製システム（Gentra Systems）を用いて、バチルス・リケニフォルミスＡＴＣＣ（登録商標）１４５８０（商標）から単離した。ペルヒドロラーゼ遺伝子は、配列番号３１及び配列番号３２と同定されたプライマーを用いたＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によって、ゲノムＤＮＡから増幅した。得られた核酸生成物（配列番号７）は、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（登録商標）（Invitrogen, Carlsbad CA）にサブクローニングして、ｐＳＷ１９１と同定されたプラスミドを作製した。そのプラスミドｐＳＷ１９１を使用してＥ．コリＫＬＰ１８を形質転換し、ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９１と同定された細胞株を作製した。ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９１をＬＢ培地中で３７℃で振盪しながらＯＤ600nm＝０．４〜０．５になるまで増殖させ、その時点でＩＰＴＧを、１ｍＭの最終濃度になるように添加し、インキュベートを２〜３時間続けた。細胞を遠心分離によって収穫し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、総可溶性タンパク質の２０〜４０％のペルヒドロラーゼの発現を確認した。
【０２８０】
〔実施例１０〕
ペルヒドロラーゼを発現するＥ．コリＫＬＰ１８形質転換体の発酵
発酵槽用の種培養は、２Ｌの振盪フラスコに、酵母エキス（Ａｍｂｅｒｘ６９５、５．０ｇ／Ｌ）、Ｋ2ＨＰＯ4（１０．０ｇ／Ｌ）、ＫＨ2ＰＯ4（７．０ｇ／Ｌ）、クエン酸ナトリウム二水和物（１．０ｇ／Ｌ）、（ＮＨ4）2ＳＯ4（４．０ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ4七水和物（１．０ｇ／Ｌ）及びクエン酸第二鉄アンモニウム（０．１０ｇ／Ｌ）を含む０．５Ｌの種培地を入れることによって調製した。培地のｐＨを６．８に調整し、培地はフラスコ中で滅菌した。滅菌後の添加物は、グルコース（５０質量％、１０ｍＬ）及びアンピシリンのストック溶液（２５ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬを含んだ。種培地に、２０％グリセリン中のＥ．コリＫＬＰ１８／ｐＳＷ１８９、Ｅ．コリＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９１、Ｅ．コリＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９４、Ｅ．コリＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９５、Ｅ．コリＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６又はＥ．コリＫＬＰ１８／ｐＳＷ２０７の培養物１ｍＬを接種し、３５℃、及び３００ｒｐｍで培養した。種培養は、ＯＤ550が約１〜２になったら、３５℃で、ＫＨ2ＰＯ4（３．５０ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ4七水和物（０．０５ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ4七水和物（２．０ｇ／Ｌ）、クエン酸ナトリウム二水和物（１．９０ｇ／Ｌ）、酵母エキス（Ａｍｂｅｒｘ６９５、５．０ｇ／Ｌ）、Ｂｉｏｓｐｕｍｅｘ１５３Ｋ消泡剤（０．２５ｍＬ／Ｌ、Cognis Corporation）、ＮａＣｌ（１．０ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ2二水和物（１０ｇ／Ｌ）、及びＮＩＴ微量元素溶液（１０ｍＬ／Ｌ）を含む培地８Ｌと共に、１４Ｌの発酵槽（Braun）に移した。微量元素溶液は、クエン酸一水和物（１０ｇ／Ｌ）、ＭｎＳＯ4水和物（２ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（２ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ4七水和物（０．５ｇ／Ｌ）、ＺｎＳＯ4七水和物（０．２ｇ／Ｌ）、ＣｕＳＯ4五水和物（０．０２ｇ／Ｌ）及びＮａＭｏＯ4二水和物（０．０２ｇ／Ｌ）を含んだ。滅菌後の添加物は、グルコース溶液（５０質量％、８０．０ｇ）及びアンピシリンのストック溶液（２５ｍｇ／ｍＬ）（１６．００ｍＬ）を含んだ。グルコース溶液（５０質量％）は、流加培養に使用した。グルコース濃度が０．５ｇ／Ｌにまで低下した時、グルコース供給を、最初は０．３１ｇ／分で開始し、次第に、毎時それぞれ０．３６、０．４２、０．４９、０．５７、０．６６、０．７７、０．９０、１．０４、１．２１、１．４１、１．６３ｇ／分に増加させ；その後速度を一定に保った。 培地中のグルコース濃度を監視し、濃度が０．１ｇ／Ｌを超えた場合、供給速度を低下させるか、又は一時的に停止させた。誘導は、様々な細胞株について、ＯＤ550＝５６及びＯＤ550＝８０の間で、ＩＰＴＧ（０．５Ｍ）１６ｍＬを添加することによって開始した。溶存酸素（ＤＯ）濃度は、空気飽和の２５％にコントロールした。ＤＯは、最初、羽根の攪拌速度（４００〜１４００ｒｐｍ）によって、そして後には、通気速度（２〜１０ｓｌｐｍ）によって制御した。ｐＨは、６．８にコントロールした。ＮＨ4ＯＨ（２９％、質量／質量）及びＨ2ＳＯ4（２０％、質量／体積）をｐＨ調整に使用した。ヘッドの圧力は、０．５ｂａｒとした。細胞は、ＩＰＴＧ添加後１６時間に、遠心分離によって収穫した。
【０２８１】
〔実施例１１〕
ＣＥ−７エステラーゼ／ペルヒドロラーゼの比活性のｐＨ依存性
サーモトガ・ネアポリタナ（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６）、サーモトガ・マリチマＭＳＢ８（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２０７）、バチルス・プミルスＰＳ２１３（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９５）、バチルス・ズブチリスＢＥ１０１０（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１８９）、バチルス・ズブチリスＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９４）、又はバチルス・リケニフォルミスＡＴＣＣ（登録商標）１４５８０（商標）（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９１）由来のペルヒドロラーゼを発現するＥ．コリ形質転換体の細胞抽出物は、ジチオスレイトール（１ｍＭ）を含む０．０５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した細胞ペースト（２０質量％湿細胞質量）の懸濁液を、１６，０００ｐｓｉ（〜１１０Ｍｐａ）の作動圧力を有するフレンチプレスを２回通すことにより調製した。次に、粗抽出物を、２０，０００×ｇで遠心分離して細胞残屑を除き、総可溶性タンパク質をアッセイする清澄な細胞抽出物を作製した（Bicinchoninic Acid Kit for Protein Determination, Sigma Aldrich catalog # BCA1-KT）。清澄になったサーモトガ・マリチマＭＳＢ８又はサーモトガ・ネアポリタナのペルヒドロラーゼを含有する抽出物は、更に７５℃で２０分間加熱し、その後、直ちに氷／水浴で５℃に冷却した。得られた混合物は、遠心分離して沈澱したタンパク質を除去し、上清をまとめ、これまでと同様に総可溶性タンパク質をアッセイした。熱処理した上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、上清に存在する全可溶性タンパク質の少なくとも約９０％がペルヒドロラーゼで構成されることを示した。
【０２８２】
トリアセチン（２００ｍＭ）及び細胞抽出物の上清（上記のように調製）を含む反応（総量１０ｍＬ）は、表５に示した緩衝液及び緩衝液濃度を用い、２５℃で、そして４．５及び１０．０の間のｐＨで実施した。抽出物総タンパク質（Ｅ．コリ由来のタンパク質を変性及び沈殿させるための熱処理の有り又は無しで）の濃度は、３０分間に約５０ｍＭのトリアセチン濃度の減少をもたらす（典型的には、ペルヒドロラーゼに依存して、０．０２５ｍｇ／ｍＬ〜０．４ｍｇ／ｍＬの総抽出物タンパク質濃度である）ように選択した。それぞれの反応条件に対する対照反応は、添加した抽出物タンパク質の存在なしで加水分解されるトリアセチン濃度を測定するために実施した。サンプル（１００μＬ）を所定の時間に採取し、直ちに２９７μＬのｄｄＨ2Ｏ及び３μＬの６ＮＨＣｌに添加した。得られた溶液を混合し、次に３０，０００ＮＭＷＬフィルター（Millipore）を用い、マイクロ遠心機を使用して１２，０００ｒｐｍで２分間濾過した。濾液の一定量（１００μＬ）を、０．４１７ｍＭのＮ，Ｎ−ジエチルメタトルアミドのアセトニトリル溶液（外部標準）１５０μＬに添加し、得られた溶液のトリアセチンを、スペルコ・ディスカバリー（Supelco Discovery）Ｃ８カラム（２５ｃｍ×４．０ ｍｍ、５μｍ； Supelco # 59353-U40）及び１ｍＬ／分の流速で、４０％アセトニトリル／６０％蒸留水のアイソクラチック移動相を使用したＨＰＬＣによって分析した。トリアセチンは、２２５ｎｍにおけるＵＶ検出によって測定した。
それぞれのペルヒドロラーゼの比活性のｐＨ依存性を表６に示す。
【０２８３】
【表８】
0005504268.tif 000020
【０２８４】
【表９】
0005504268.tif 000021
【０２８５】
〔実施例１２〕
緩衝液の濃度を用いたサーモトガ・ネアポリタナのペルヒドロラーゼによる過酢酸生産の制御
サーモトガ・ネアポリタナ由来のペルヒドロラーゼを発現するＥ．コリの形質転換体（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６）の細胞抽出物は、ジチオスレイトール（１ｍＭ）を含む０．０５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した細胞ペースト（２０質量％湿細胞質量）の懸濁液を、１６，０００ｐｓｉ（〜１１０Ｍｐａ）の作動圧力を有するフレンチプレスを２回通すことにより調製した。次に、粗抽出物を、２０，０００×ｇで遠心分離して細胞残屑を除き、総可溶性タンパク質をアッセイする清澄な細胞抽出物を作製した（Bicinchoninic Acid Kit for Protein Determination, Sigma Aldrich catalog # BCA1-KT）。清澄になった抽出物は、７５℃で２０分間加熱し、その後、直ちに氷／水浴で冷却した。得られた混合物は、遠心分離して沈澱したタンパク質を除去し、上清をまとめ、これまでと同様に総可溶性タンパク質をアッセイした。上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ペルヒドロラーゼは少なくとも９０％純粋であることが示された。上清は、ドライアイスで凍結させ、−８０℃で保存した。
【０２８６】
トリアセチン、過酸化水素及び加熱処理した細胞抽出物の上清（上記のように調製）を含む反応（総体積１０ｍＬ）は、表７及び８に示した重炭酸ナトリウム緩衝液濃度を用い、２５℃で実施した。それぞれの反応条件に対する対照反応を実施し、添加した抽出物タンパク質の存在なしで、過酸化水素によるトリアセチンの化学的ペルヒドロリシスによって生成される過酢酸の濃度を測定した。反応混合物中の過酢酸の濃度の測定は、Karstら（上記）によって説明された方法に従って行った。反応混合物の一定量（０．０４０ｍＬ）を所定の時間に採取し、０．９６０ｍＬの５ｍＭリン酸水溶液と混合し；希釈したサンプルのｐＨをｐＨ４以下に調整することによって、反応を直ちに停止させた。得られた溶液を、ＵＬＴＲＡＦＲＥＥ（登録商標）ＭＣフィルターユニット（３０，０００標準分子量限界（ＮＭＷＬ）、Millipore cat # UFC3LKT 00）を用い、１２，０００ｒｐｍで２分間の遠心分離によって濾過した。得られた濾液の一定量（０．１００ｍＬ）を、０．３００ｍＬの脱イオン水の入った１．５ｍＬのスクリューキャップ付きＨＰＬＣバイアル（Agilent Technologies, Palo Alto, CA; #5182-0715）に入れ、次に２０ｍＭのＭＴＳ（メチル−ｐ−トリル−スルフィド）のアセトニトリル溶液を０．１００ｍＬ添加し、バイアルに蓋をして内容物を軽く混ぜ合わせた後、暗所にて約２５℃で１０分間インキュベートした。次に、それぞれのバイアルに、０．４００ｍＬのアセトニトリル及びトリフェニルホスフィン（ＴＰＰ、４０ｍＭ）のアセトニトリル溶液を０．１００ｍＬ添加し、バイアルに再度蓋をし、できた溶液を混合して、暗所にて約２５℃で３０分間インキュベートした。次に、それぞれのバイアルに、１０ｍＭのＮ,Ｎ−ジエチル−ｍ−トルアミド（ＤＥＥＴ；ＨＰＬＣ外部標準）を０．１００ｍＬ添加し、得られた溶液は、下記で説明する様にＨＰＬＣによって分析した。
【０２８７】
ＨＰＬＣの方法：
スペルコ・ディスカバリー（Supelco Discovery）Ｃ８カラム（１０ｃｍ×４．０ｍｍ、５(ｍ）（cat. #569422-U）ｗ／プレカラムのスペルコ・スペルガード・ディスカバリー（Supelco Supelguard Discovery）Ｃ８（Sigma-Aldrich; cat # 59590-U）；１０マイクロリットルの注入体積；ＣＨ3ＣＮ（Sigma-Aldrich; # 270717）及び脱イオン水を１．０ｍＬ／分及び環境温度で用いたグラジエント法：
【表１０】
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【０２８８】
それぞれ２５０ｍＭ又は１００ｍＭの過酸化水素を使用した場合の、１分、５分及び３０分間に生産される過酢酸濃度を、それぞれ表７及び表８に示す。
【０２８９】
【表１１】
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【０２９０】
【表１２】
0005504268.tif 000024
【０２９１】
〔実施例１３〕
緩衝液の濃度を用いたサーモトガ・マリチマＭＳＢ８のペルヒドロラーゼによる過酢酸生産の制御
サーモトガ・マリチマＭＳＢ８由来のペルヒドロラーゼを発現する形質転換体（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２０７）の細胞抽出物は、ジチオスレイトール（１ｍＭ）を含む０．０５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した細胞ペースト（２０質量％湿細胞質量）の懸濁液を、１６，０００ｐｓｉ（〜１１０Ｍｐａ）の作動圧力を有するフレンチプレスを２回通すことにより調製した。次に、粗抽出物を、２０，０００×ｇで遠心分離して細胞残屑を除き、総可溶性タンパク質をアッセイする清澄な細胞抽出物を作製した（Bicinchoninic Acid Kit for Protein Determination, Sigma Aldrich catalog # BCA1-KT）。清澄になった抽出物は、７５℃で２０分間加熱し、その後、直ちに氷／水浴で冷却した。得られた混合物は、遠心分離して沈澱したタンパク質を除去し、上清をまとめ、これまでと同様に総可溶性タンパク質をアッセイした。上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ペルヒドロラーゼは少なくとも８５〜９０％純粋であることが示された。上清はドライアイスで凍結させ、−８０℃で保存した。
【０２９２】
トリアセチン、過酸化水素及び加熱処理し、遠心分離した細胞抽出物の上清（上記のように調製）を含む反応（総量２ｍＬ）は、表９及び１０に示した重炭酸ナトリウム緩衝液濃度を用い、２５℃で実施した。それぞれの反応条件に対する対照反応を実施し、添加された抽出物タンパク質の非存在下で、過酸化水素によるトリアセチンの化学的ペルヒドロリシスによって生成される過酢酸の濃度を測定した。反応混合物中の過酢酸の濃度の測定は、Karstら（上記）によって説明された方法に従って行った。それぞれ２５０ｍＭ又は１００ｍＭの過酸化水素を使用した場合の、１分、５分及び３０分間に生産される過酢酸濃度を、それぞれ表９及び表１０に示す。
【０２９３】
【表１３】
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【０２９４】
【表１４】
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【０２９５】
〔実施例１４〕
緩衝液、反応物質及びペルヒドロラーゼ濃度の選択によるサーモトガ・マリチマＭＳＢ８ペルヒドロラーゼによる過酢酸生産の制御
トリアセチン（１００ｍＭ）、過酸化水素（１００ｍＭ又は２５０ｍＭ）及びサーモトガ・マリチマＭＳＢ８由来のペルヒドロラーゼを発現するＥ．コリ形質転換体（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２０７）から調製した細胞抽出物を加熱処理し、遠心分離した細胞抽出物の上清（３５〜１００μｇの総加熱処理抽出物タンパク質／ｍＬ、実施例１３で説明したように調製）を含む反応（総量１０ｍＬ）は、クエン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．５）、又は重炭酸ナトリウム緩衝液（１ｍＭ〜５ｍＭ、表１２に記載したような初期ｐＨ）、又は緩衝剤を添加しない水中で、２５℃で実施した。それぞれの反応条件に対する対照反応を実施し、添加された抽出物タンパク質の非存在下で、過酸化水素によるトリアセチンの化学的ペルヒドロリシスによって生成される過酢酸の濃度を測定した。反応混合物中の過酢酸の濃度の測定は、Karstら（上記）によって説明された方法に従って行った。所定の反応時間における生成した過酢酸の濃度を表１１に、そしてそれぞれの反応時間に対応する反応ｐＨを表１２に示す。
【０２９６】
【表１５】
0005504268.tif 000027
【０２９７】
【表１６】
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【０２９８】
〔実施例１５〕
初期反応ｐＨを利用したペルヒドロラーゼによる過酢酸生産の制御
バチルス・プミルスＰＳ２１３（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９５）、サーモトガ・マリチマＭＳＢ８（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２０７）、サーモトガ・ネアポリタナ（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６）、又はバチルス・ズブチリスＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９４）由来のペルヒドロラーゼを発現する形質転換体の細胞抽出物は、ジチオスレイトール（１ｍＭ）を含む０．０５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した細胞ペースト（２０質量％湿細胞質量）の懸濁液を、１６，０００ｐｓｉ（〜１１０Ｍｐａ）の作動圧力を有するフレンチプレスを２回通すことにより調製した。次に、粗抽出物を、２０，０００×ｇで遠心分離して細胞残屑を除き、総可溶性タンパク質をアッセイする清澄な細胞抽出物を作製した（Bicinchoninic Acid Kit for Protein Determination, Sigma Aldrich catalog # BCA1-KT）。上清は、ドライアイスで凍結させ、−８０℃で保存した。
【０２９９】
トリアセチン、過酸化水素及び遠心分離した細胞抽出物の上清（上記のように調製）の５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（初期ｐＨが７．２又は６．５）中での反応（総体積１０ｍＬ）は、２５℃で実施した。それぞれの反応条件に対する対照反応を実施し、添加した抽出物タンパク質の存在なしで、過酸化水素によるトリアセチンの化学的ペルヒドロリシスによって生成される過酢酸の濃度を測定した（データの表示はない）。反応混合物中の過酢酸の濃度の測定は、Karstら（上記）によって説明された方法に従って行った。１分、５分及び３０分までに生産された過酢酸の濃度を表１３に示す。
【０３００】
【表１７】
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【配列表】
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