(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１及び第２のI-CreIモノマーからなるヘテロダイマーであるI-CreI変異型であって、該２つのI-CreIモノマーの少なくとも一方が、I-CreIアミノ酸配列(配列番号143又は144)の26位〜40位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第１機能的サブドメインの26位、28位、30位、32位、33位、38位及び/又は40位に少なくとも１つの第１の置換を有し、前記I-CreIアミノ酸配列の44位〜77位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第２機能的サブドメインの44位、68位、70位、75位及び/又は77位に少なくとも１つの第２の置換を有し、前記第１及び第２のI-CreIモノマーが、以下の配列の対：配列番号32と52、配列番号32と53、配列番号32と54、配列番号32と55、配列番号32と56、配列番号32と57、配列番号32と58、配列番号32と60、配列番号32と65、配列番号32と66、配列番号32と67、配列番号32と68、配列番号32と69、配列番号32と70、配列番号32と71、配列番号32と72、配列番号32と73、配列番号32と74、配列番号75と56、配列番号76と56、配列番号77と56、配列番号78と56、配列番号79と56、配列番号80と56、配列番号81と56、配列番号82と56、配列番号147と148、及び前記配列対において一方の配列にG19S変異を導入することにより得られる配列対より選択される、HPRT遺伝子のDNA標的配列(配列番号４)を切断することができるI-CreI変異型。
【請求項２】
ペプチドスペーサーにより連結された、請求項１に記載のI-CreI変異型の２つのモノマーを含む単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項３】
請求項１に記載のI-CreI変異型又は請求項２に記載の単鎖メガヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド断片を含む発現ベクター。
【請求項４】
チャイニーズハムスター(Criteculus sp.)のHPRT遺伝子に導入される配列であって、該HPRT遺伝子の前記I-Cre I変異型又は単鎖メガヌクレアーゼにより切断されるDNA標的(配列番号４)を取り囲む配列と相同な配列で挟まれている前記配列を含有するターゲティングDNA構築物を含む請求項３に記載の発現ベクター。
【請求項５】
(i)請求項１に記載のI-CreI変異型若しくは請求項２に記載の単鎖メガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド断片又は(ii)請求項３若しくは４に記載のベクターで改変された宿主細胞。
【請求項６】
請求項１に記載のI-CreI変異型又は請求項２に記載の単鎖メガヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド断片を含む非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項７】
請求項１に記載のI-CreI変異型又は請求項２に記載の単鎖メガヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド断片を含むトランスジェニック植物。
【請求項８】
少なくとも１つの請求項１に記載のI-CreI変異型若しくは請求項２に記載の単鎖メガヌクレアーゼ及び/又は少なくとも１つの請求項３若しくは４に記載の発現ベクターを含む組成物。
【請求項９】
少なくとも１つの請求項１に記載のI-CreI変異型、請求項２に記載の単鎖メガヌクレアーゼ又は請求項３に記載の発現ベクターと、チャイニーズハムスター(Criteculus sp.)のHPRT遺伝子に導入される配列であって、該HPRT遺伝子の前記I-Cre I変異型又は単鎖メガヌクレアーゼにより切断されるDNA標的(配列番号４)を取り囲む配列と相同な配列で挟まれている前記配列を含有するターゲティングDNA構築物を含む少なくとも１つの発現ベクターとを含む組成物。
【請求項１０】
非治療目的でのチャイニーズハムスター(Criteculus sp.)HPRT遺伝子における部位特異的改変の誘発のための、請求項１に記載のI-CreI変異型、請求項２に記載の単鎖メガヌクレアーゼ、及び/又は請求項３若しくは４に記載の発現ベクターの、ヒトでのインビボ使用を除く使用。
【請求項１１】
非治療目的でのチャイニーズハムスター(Criteculus sp.)HPRT遺伝子における部位特異的改変の誘発のための、請求項１に記載のI-CreI変異型、請求項２に記載の単鎖メガヌクレアーゼ又は請求項３に記載の発現ベクター、及びチャイニーズハムスター(Criteculus sp.)のHPRT遺伝子に導入される配列であって、該HPRT遺伝子の前記I-Cre I変異型又は単鎖メガヌクレアーゼにより切断されるDNA標的(配列番号４)を取り囲む配列と相同な配列で挟まれている前記配列を含有するターゲティングDNA構築物を含むベクターの、ヒトでのインビボ使用を除く使用。
【請求項１２】
前記HPRT遺伝子の部位特異的改変が、前記I-CreI変異型又は単鎖メガヌクレアーゼによるHPRT遺伝子の切断と、興味対象の遺伝子を含むターゲティングDNA構築物を用いる相同組換えとによる興味対象の遺伝子の挿入である請求項１０又は１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記HPRT遺伝子の部位特異的改変が、前記I-CreI変異型又は単鎖メガヌクレアーゼによるHPRT遺伝子の切断と、HPRT遺伝子の不活性化カセットを含むターゲティングDNA構築物を用いる相同組換えとによる不活性化カセットの挿入である請求項１０又は１１に記載の使用。
【請求項１４】
前記HPRT遺伝子の部位特異的改変が、前記I-CreI変異型又は単鎖メガヌクレアーゼによるHPRT遺伝子の切断と、非相同末端結合による二本鎖破断の修復とによるHPRT遺伝子の不活性化である請求項１０又は１１に記載の使用。
【請求項１５】
非ヒトトランスジェニック動物又は組換え株化細胞を作製するためにチャイニーズハムスター(Criteculus sp.)HPRT遺伝子において部位特異的改変を誘発するための、請求項１に記載のI-CreI変異型、請求項２に記載の単鎖メガヌクレアーゼ、及び/又は請求項３若しくは４に記載の発現ベクターの使用。
【請求項１６】
非ヒトトランスジェニック動物又は組換え株化細胞を作製するためにチャイニーズハムスター(Criteculus sp.)HPRT遺伝子において部位特異的改変を誘発するための、請求項１に記載のI-CreI変異型、請求項２に記載の単鎖メガヌクレアーゼ又は請求項３に記載の発現ベクター、及びチャイニーズハムスター(Criteculus sp.)のHPRT遺伝子に導入される配列であって、該HPRT遺伝子の前記I-Cre I変異型又は単鎖メガヌクレアーゼにより切断されるDNA標的(配列番号４)を取り囲む配列と相同な配列で挟まれている配列を含有するターゲティングDNA構築物を含むベクターの使用。
【請求項１７】
組換えヒト株化細胞を作製するための請求項１５又は１６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、HPRT遺伝子からのDNA標的配列を切断するメガヌクレアーゼ変異型、該変異型をコードするベクター、該ベクターにより改変された細胞、動物若しくは植物、並びにゲノム工学及びゲノム療法のための該メガヌクレアーゼ変異型及びその誘導生成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
メガヌクレアーゼは、定義によると、DNA二本鎖破断(DSB)を生細胞の特定の遺伝子座にもたらし得る大きい(＞14 bp)切断部位を有する配列特異的エンドヌクレアーゼである(Thierry及びDujon, Nucleic Acids Res., 1992, 20, 5625〜5631)。メガヌクレアーゼは、培養細胞及び植物のそれらの標的配列の近傍において相同組換えを促進するために用いられ(Rouetら, Mol. Cell. Biol., 1994, 14, 8096〜106; Choulikaら, Mol. Cell. Biol., 1995, 15, 1968〜73; Donohoら, Mol. Cell. Biol, 1998, 18, 4070〜8; Elliottら, Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 93〜101; Sargentら, Mol. Cell. Biol., 1997, 17, 267〜77; Puchtaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 5055〜60; Chiurazziら, Plant Cell, 1996, 8, 2057〜2066)、これにより、メガヌクレアーゼにより誘発される組換えが、ゲノム工学における効率的で強固な方法となっている。
【０００３】
メガヌクレアーゼにより誘発される組換えの使用は、天然のメガヌクレアーゼのレパトアにより長い間制限されており、現在の技術の主要な制限は、興味対象の遺伝子座において、メガヌクレアーゼ切断部位を予め導入する必要があることである。よって、仕立てられた基質特異性を有する人工メガヌクレアーゼを作製することが、熱心に研究されている。このようなタンパク質は、真の染色体配列を切断するために用いることができ、広範囲の使用においてゲノム工学についての新しい展望を開く。例えば、メガヌクレアーゼは、染色体における内因性遺伝子のノックアウト又は外因性配列のノックインのために用い得る。これは、遺伝子修正、及び原則として、単一遺伝子疾患に関連する変異の修正のためにも用い得る。
【０００４】
本質的に、メガヌクレアーゼは、可動性遺伝要素によりコードされるエンドヌクレアーゼのファミリーであるホーミングエンドヌクレアーゼ(HE)により本質的に代表され、その機能は、ホーミングと呼ばれるプロセスにおいてDNA二本鎖破断(DSB)により誘発される組換え事象を開始することである(Chevalier及びStoddard, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757〜74; Kostrikenら, Cell; 1983, 35, 167〜74; Jacquier及びDujon, Cell, 1985, 41, 383〜94)。細菌、真核生物及び始原生物において、数百のHEが同定されている(Chevalier及びStoddard,既出)。しかし、選択された遺伝子内にHE切断部位が見出される可能性は非常に低い。
【０００５】
それらの生物学的機能並びに効率及び特異性の点での例外的な切断特異性に鑑みて、HEは、ゲノム工学のための新規なエンドヌクレアーゼをもたらす理想的な足場を提供する。
HEは、４つの主要なファミリーに属する。触媒中心に含まれる保存されたペプチドモチーフにちなんで命名されたLAGLIDADGファミリーは、最も広まった、最もよく特徴付けされた群である(Chevalier及びStoddard,既出)。現在、7つの構造が入手可能である。このファミリーからのほとんどのタンパク質は、モノマーであり、2つのLAGLIDADGモチーフを示すが、いくつかは1つのモチーフのみを有するが二量体を形成して、パリンドローム又は偽パリンドローム標的配列を切断する。
【０００６】
LAGLIDADGペプチドは、ファミリーのメンバーのうちの唯一の保存領域であるが、これらのタンパク質は、非常に良く似た構造を共有する(図1A)。触媒コアは、I-CreI (Chevalierら, Nat. Struct. Biol., 2001, 8, 312〜6)及びI-MsoI (Chevalierら J. Mol. Biol., 2003, 329, 253〜69)のようなホモダイマーについて完全二回転対称の、そしてI-SceI (Moureら, J. Mol. Biol, 2003, 334, 685〜95)、I-DmoI (Silvaら, J. Mol. Biol., 1999, 286, 1123〜36)又はI-AniI (Bolducら, Genes Dev., 2003, 17, 2875〜88)のようなモノマーについて偽対称の2つのDNA結合ドメインに挟まれている。両方のモノマー又は両方のドメイン(モノマータンパク質について)は、2価のカチオンの周囲に組織された触媒コアに寄与する。触媒コアのすぐ上では、2つのLAGLIDADGペプチドが二量体形成界面において本質的な役割も演じている。DNA結合は、DNAの主溝上に位置する2つの典型的なサドル形のββαββ折り畳みに依存する。天然の標的に結合したI-CreIの構造の分析は、各モノマーにおいて、8つの残基(Y33, Q38, N30, K28, Q26, Q44, R68及びR70)が、±3、4、5、6、7、9及び10位にて7つの塩基と直接の相互作用を確立している(Juricaら, Mol. Cell., 1998, 2, 469〜76)。さらに、いくつかの残基は、いくつかの塩基と水が媒介する接触を確立している。例えば、S40、K28及びN30は、+8位及び-8位の塩基対とである(Chevalierら, 2003,上記)。例えばPI-PfuI (Ichiyanagiら, J. Mol. Biol., 2000, 300, 889〜901)及びPI-SceI (Moureら, Nat. Struct. Biol., 2002, 9, 764〜70)のようなインテインにおいて、他のドメインを見出すこともでき、そのタンパク質スプライシングドメインも、DNA結合に関与する。
【０００７】
機能的なキメラ及び単鎖人工HEを、I-DmoIドメインのN末端をI-CreIモノマーと融合することにより作製すること(Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜62; Chevalierら, Mol. Cell., 2002, 10, 895〜905; Steuerら, Chembiochem., 2004, 5, 206〜13; 国際PCT出願WO 03/078619及びWO 2004/031346)により、LAGLIDADGタンパク質の可塑性が証明される。異なるモノマー又はコアドメインを、単一タンパク質に融合させて、新規な(非パリンドローム)標的配列を切断する新規なメガヌクレアーゼを得ることができる。
【０００８】
さらに、種々のグループが、合理的なアプローチを用いて、I-CreI (Seligmanら, Genetics, 1997, 147, 1653〜64; Sussmanら, J. Mol. Biol., 2004, 342, 31〜41; Seligmanら, Nucleic Acids Res., 2006年9月13日発行; Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458及び国際PCT出願WO 2006/097853及びWO 2006/097784)、I-SceI (Doyonら, J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 2477〜2484)、PI-SceI (Gimbleら, J. Mol. Biol., 2003, 334, 993〜1008)及びI-MsoI (Ashworthら, Nature, 2006, 441, 656〜659)の特異性を局所的に変更している。
変更された特異性を有する数百のI-CreI誘導体が、半合理的アプローチ及びハイスループットスクリーニングの組み合わせにより工学的に改変された(HTS; Arnouldら(既出);国際PCT出願WO 2006/097853及びWO 2006/097784)。I-CreIの残基Q44、R68及びR70、又はQ44、R68、D75及びI77に突然変異誘発し、±3〜5位(5NNN DNA標的)の特異性が変更された変異型の集団を、スクリーニングにより同定した。
【０００９】
次いで、2つの異なる変異型(図1B; 右上及び左下)を組み合わせ、それぞれの変異型DNA標的配列の異なる半分(half)の融合から得られるキメラ標的を切断できる機能的ヘテロダイマーエンドヌクレアーゼ(図1B; 右下)に組み立てた(図1B; Arnouldら, 上記;国際PCT出願WO 2006/097854)。興味深いことに、新規なタンパク質は、正確な折り畳み及び安定性、高い活性、並びに狭い特異性を保持していた。
【００１０】
よって、天然のLAGLIDADGメガヌクレアーゼの特異性を仕立てるために、2工程方策を用い得る。第1工程は、I-CreIのような天然LAGLIDADGメガヌクレアーゼに局所的に突然変異を誘発し、スクリーニングにより特異性が変更された変異型の集団を同定することである。第2工程は、これらのタンパク質のモジュール性に依拠し、選択された部位を切断する新規なメガヌクレアーゼを作製するコンビナトリアルアプローチを用いる(図1B)。
【００１１】
新規なメガヌクレアーゼの集団の作製、及び2つの異なるモノマー/コアドメインを組み立てることにより新規なメガヌクレアーゼを組み合わせる能力は、標的にされ得るDNA配列の数を著しく増やすが、全ての可能性のある配列はまだ飽和されない。
より多数の配列に到達するために、組み合わせ得るより小さい独立したサブドメイン(図1C)を同定できることは、非常に価値があるだろう。
【００１２】
しかし、コンビナトリアルアプローチを、単一のモノマー又はドメインに適用することは、モノマー同士に適用することよりもさらにより難しい。なぜなら、結合界面の構造は非常に緻密であり、実質的に全ての塩基特異的相互作用を担う2つの異なるββヘアピンは、別個のサブドメインを構成しないが、単一の折り畳みの一部であるからである。例えば、I-CreIのDNA結合領域の内部において、gtcトリプレットには、第1ヘアピンからの1つの残基(Q44)と、第2ヘアピンからの2つの残基(R68及びR70; Chevalierら, 2003,既出の図1Bを参照)とが結合する。さらに、一連の変異の蓄積された影響が、結果的に正確な折り畳みを破壊しうる。
【００１３】
構造レベルで明らかなモジュール性がないにもかかわらず、本発明者らは、I-CreIの残基28〜40及び44〜77が、ホーミングエンドヌクレアーゼハーフサイトの異なる部分に結合できる2つの分離可能な機能的サブドメインを形成することを証明している。
【００１４】
異なるモノマーからの2つのサブドメイン、又は同じモノマー内の2つのコアドメインを組み立てることにより、本発明者らは、パリンドロームキメラ標的(図1C)を切断できる機能的ホーミングエンドヌクレアーゼ(ホモダイマー)変異型を工学的に作製している。さらに、より大きいコンビナトリアルアプローチが、4つの異なるサブドメインを組み立てて、非パリンドロームキメラ標的を切断できる新しいヘテロダイマー分子を形成することにより可能である(図1D)。異なるサブドメインは、別々に改変されて、新しい切断特異性を工学的に作製し、興味対象の遺伝子からの標的を切断できる1つのメガヌクレアーゼ変異型(ホモダイマー、ヘテロダイマー、単鎖分子)に組み合わせることができる。
【００１５】
ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)遺伝子は、X染色体上に位置する単一コピー遺伝子であり、よって、1コピーで存在するか(XY細胞)、又は1つの対立遺伝子から発現される(XX細胞)。例えば、マウス及びヒトHPRT遺伝子は、NCBIデータベースにおいて、それぞれアクセッション番号NC_000086及びNC_000023の下で入手可能である。これらの遺伝子はともに9つのエキソンを有し(図2)、これらは、88位〜744位(マウス)、又は86位〜742位(ヒト)にHPRT ORFを有する1289塩基のmRNA (マウス; アクセッション番号NM_013556)、又は1331塩基のmRNA (ヒト; アクセッション番号NM_000194)に転写される。チャイニーズハムスター(Criteculus sp.)のmRNAは、91位〜747位にHPRT ORFを有する1301塩基の配列(アクセッション番号J00060.1)である。
【００１６】
ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼは、5-ホスホリボシル-1-ピロホスフェート及びヒポキサンチン、グアニン又は6-メルカプトプリンの、対応する5'-モノヌクレオチド及びピロホスフェートへの変換を触媒する酵素である。酵素は、プリンの生合成、及び中枢神経系機能において重要である。その生物学的機能に鑑みて、HPRT遺伝子は、遺伝子ターゲティング実験のための選択マーカーとして用いられる。他の選択マーカーに比較して、HPRTは、ポジティブ及びネガティブ選択マーカーの両方の利点を有する。さらに、HPRT遺伝子における変異は、レッシュ-ナイハン症候群に関連する。
【００１７】
マウスHPRTの遺伝子ターゲティングは、胚性幹(ES)細胞において、最初に、Thomas, K.R.及びM.R. Cappechiにより行われた(Cell, 1987, 51, 503〜512)。しかし、効率は非常に低いままであった(約10-7のトランスフェクションされた細胞)。HPRT遺伝子座にて二本鎖破断を作製する能力は、その遺伝子座での相同組換えを著しく増進させる手段を提供する。伝統的な遺伝子ターゲティングを用いて、Donohoら(Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 4070〜4078)は、I-SceIメガヌクレアーゼについての切断部位を、マウスHPRT遺伝子に導入した。第2工程において、彼らは、修復マトリクス及びI-SceI発現ベクターを用いる同時形質転換により、細胞の1%に遺伝子ターゲティングを誘導できた。
【００１８】
つまり、HPRT遺伝子座を標的にする人工メガヌクレアーゼは、効率的な遺伝子挿入を可能にする(図3A)。この遺伝子座にて遺伝子を効率的に挿入する能力は、再現可能な発現レベルを可能にし、挿入を作製するための予測可能なスケジュールを可能にする利点を有する。
さらに、マウスについて記載されたように(van der Lugtら Gene, 1991, 105, 263〜267; Selfridgeら, Somat. Cell. Mol. Genet., 1992, 18, 325〜336)、HPRTは、遺伝子ターゲティング実験についての選択マーカーとして用い得る。
【００１９】
元来、Reidらにより提案された(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 4299〜4303)二重置換遺伝子ターゲティング法(double replacement gene targeting procedure)は、HPRT選択マーカーに基づいて(Maginら, Gene, 1992, 122, 289〜296)、わずかな遺伝子改変を有するマウスを生成する。この方法は、HPRT欠損胚性幹細胞におけるヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)ミニ遺伝子の使用と、HPRT発現について及びHPRT発現に対して選択する能力とに基づく。
【００２０】
第1工程において、標的を不活性化するために、標的遺伝子座の領域を、HPRTマーカー発現についてHAT (ヒポキサンチン/アミノプテリン/チミジン) (Littlefield J.W., Science, 1964, 145, 709〜)選択を行って、HPRTミニ遺伝子で置き換える。HATは、ヒポキサンチンナトリウム、アミノプテリン及びチミジンの混合物である。アミノプテリンは、効力のある葉酸アンタゴニストであり、これは新しいヌクレオシド合成を遮断するジヒドロ葉酸レダクターゼを阻害する。細胞は、プリン及びピリミジン再利用経路が活性である場合のみ、HAT中で生存できる。ヒポキサンチンは、プリン再利用経路の基質である。よって、HPRT変異体は、プリン再利用経路を用いることができず、HAT選択に対して感受性である。
【００２１】
第2ターゲティング工程において、HPRTミニ遺伝子は、それ自体、標的遺伝子の変更された領域で置き換えられて遺伝子座を再構築し、プリンアナログである6-チオグアニン(6-TG)を用いるHPRTマーカーの欠失について選択される。
しかし、このことは、マーカーの導入前の細胞が、不活性なHPRT遺伝子を含有することを必要とする。つまり、HPRT遺伝子を標的にする人工メガヌクレアーゼは、HPRT遺伝子を不活性化するために用い得る(図3A及びB)。
【００２２】
レッシュ-ナイハン症候群は、HPRTの欠損により引き起こされる伴性形質として遺伝される遺伝性障害であり、高尿酸血症、重篤な運動能力障害及び自傷行為を特徴とする。
レッシュ-ナイハン病又は完全な症候群のいくらかの部分のみを有するより軽度の臨床表現型に関連する突然変異の非常に不均質な集団が、同定されている。現在の遺伝子治療の方策は、相補性アプローチに基づき、ここでは、無作為に挿入されているが機能的な余分の遺伝子コピーは、変異された内因性コピーの機能を提供する。これとは対照的に、メガヌクレアーゼにより誘発される組換えは、インサイチューでの突然変異の正確な修正を可能にし(図3C)、それにより現在の遺伝子療法のアプローチが遭遇する無作為に挿入された導入遺伝子による危険性を回避する(Hacein-Bey-Abinaら, Science, 2003, 302, 415〜419)。
【００２３】
遺伝的欠損を修正するための最も正確な様式は、遺伝子の変異されていないコピーを有する修復マトリクスを用いることであり、変異の復帰をもたらす(図3C)。しかし、遺伝子修正の効率は、変異とDSBとの間の距離が大きくなるほど減少し、200 bpの距離では5倍の減少(1/5)である。よって、所定のメガヌクレアーゼを用いて、そのDNA標的の近傍の変異のみを修正できる。「エキソンノックイン」と命名された代替法は、図3Dに説明される。この場合、遺伝子の5'部分を切断するメガヌクレアーゼは、有害変異の上流にある機能的エキソン配列をノックインするために用い得る。この方法は、導入遺伝子をその通常の位置に配置するが、エキソンの重複ももたらし、これは、評価されるべきままである長い範囲に影響する。さらに、天然にシス作用する要素は、切断の下流のイントロンに位置するべきであるが、それらの直接の環境は改変され、それらの正確な機能も探索される必要があろう。しかし、この方法は、甚だしい利点を有する：単一メガヌクレアーゼを多くの異なる患者に用い得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明者は、HPRT遺伝子中に、I-CreI変異型により切断され得る一連のDNA標的を同定した(図2及び19)。図1Dに記載されるコンビナトリアルアプローチを用いて、4つの一連の変異を、完全に工学的に作製された特異性を有するヘテロダイマーホーミングエンドヌクレアーゼに組み立てて、HPRT遺伝子からのDNA標的を切断した。HPRT遺伝子からのゲノムDNA標的を切断できるこれらのI-CreI変異型は、HPRT遺伝子座でのゲノム工学のため(ノックアウト及びノックイン)、及び任意の遺伝子座でのゲノム工学のための選択的マーカーとしてHPRTを用いるために用い得る(図3A及び3B)。
さらに、これらのメガヌクレアーゼは、レッシュ-ナイハン症候群に関連するHPRT変異を修復するために用い得る(図3C及び3D)。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明は、非治療目的でのHPRT遺伝子における部位特異的改変の誘発のためのI-CreI変異型又は単鎖誘導体の使用であって、該I-CreI変異型又は単鎖誘導体が、I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位に位置するLAGLIDADGコアドメインの2つの機能的サブドメインの一方に少なくとも1つの置換を有し、かつ配列番号1〜14の配列からなる群より選択されるDNA標的配列を切断できる使用に関する。
【００２６】
本発明において定義される変異型の切断活性は、任意の公知のインビトロ又はインビボ切断アッセイ、例えば国際PCT出願WO 2004/067736、Arnouldら(J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458)、Epinatら(Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜2962)、及びChamesら(Nucleic Acids Res., 2005, 33, e178)に記載されるものにより測定できる。例えば、本発明の変異型の切断活性は、レポーターベクターを用いる酵母又は哺乳動物細胞における直列反復組換えアッセイ(direct repeat recombination assay)により測定できる。レポーターベクターは、酵母又は哺乳動物発現ベクターにクローニングされたレポーター遺伝子の2つの短縮された非機能的コピー(直列反復)と、介在配列内のゲノムDNA標的配列とを含む。変異型の発現は、ゲノムDNA標的配列を切断できる機能的エンドヌクレアーゼをもたらす。この切断は、直列反復間の相同組換えを誘発し、機能的レポーター遺伝子をもたらし、その発現は適切なアッセイによりモニターできる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ホーミングエンドヌクレアーゼのモジュール構造及びカスタムメガヌクレアーゼを設計するためのコンビナトリアルアプローチを示す。
【図２】ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子及び対応するmRNAを表す。
【図３Ａ】遺伝子挿入及び／又は遺伝子不活性化。
【図３Ｂ】非相同性末端結合による遺伝子不活性化。
【図３Ｃ】遺伝子修正。
【図３Ｄ】エキソン配列ノックイン。
【図４】I-CreI N75足場タンパク質をコードするヌクレオチド配列、並びにUlib4及びUlib5ライブラリー構築のために用いる縮合プライマーの配列を表す。
【図５】それぞれの標的を切断する変異体のパターン及び数の例を示す。
【図６】28位、30位、33位、38位及び／又は40位でのI-CreI変異型の切断パターンを示す。
【図７】標的に結合したI-CreIホモダイマー上での、タンパク質及びDNA標的での変異の局在化を表す。
【図８Ａ】I-CreI誘導体標的の定義。
【図８Ｂ】I-CreI誘導体標的の定義。
【図８Ｃ−Ｄ】I-CreI誘導体標的のプロファイリング。
【図９】標的に結合したI-CreIホモダイマー上でのタンパク質及びDNA標的内の変異の局在化を示す。
【図１０】標的のHprCH3シリーズ及び近縁の誘導体を示す。
【図１１】10NNN_P変異体によるHprCH3.3の切断を示す。
【図１２】コンビナトリアル変異体によるHprCH3.4の切断を示す。
【図１３】ヘテロダイマーコンビナトリアル変異体によるHprCH3.2及びHprCH3の切断を示す。
【図１４】HprCH3標的の切断を示す。
【図１５】HprCH3標的の切断を示す。
【図１６】pCLS1055ベクターマップを示す。
【図１７】pCLS0542ベクターマップを示す。
【図１８】pCLS1107ベクターマップを示す。
【図１９】チャイニーズハムスターのHPRT遺伝子に存在するDNA標的配列、及び該DNA 標的を切断できる対応するI-CreI変異型を示す。
【図２０】哺乳動物細胞におけるレポーターシステムの設計を示す。
【図２１】哺乳動物細胞におけるI-CreI N75の発現用プラスミドであるpCLS1088のマップを表す。
【図２２】HprCH3 DNA標的配列を切断するメガヌクレアーゼの切断効率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
定義
- ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は、本明細書において、1文字コードに従って表し、例えばQはGln又はグルタミン残基を意味し、RはArg又はアルギニン残基を意味し、DはAsp又はアスパラギン酸残基を意味する。
- ヌクレオチドは、次のように表す：1文字コードは、ヌクレオシドの塩基を表すために用いる：aはアデニンであり、tはチミンであり、cはシトシンであり、gはグアニンである。縮重ヌクレオチドについて、rはg又はa (プリンヌクレオチド)を表し、kはg又はtを表し、sはg又はcを表し、wはa又はtを表し、mはa又はcを表し、yはt又はc (ピリミジンヌクレオチド)を表し、dはg、a又はtを表し、vはg、a又はcを表し、bはg、t又はcを表し、hはa、t又はcを表し、nはg、a、t又はcを表す。
【００２９】
- 「メガヌクレアーゼ」により、14〜40 pbの2本鎖DNA標的配列を有するエンドヌクレアーゼを意図する。該メガヌクレアーゼは、各ドメインがモノマーであるダイマー酵素、又は単一ポリペプチド上に2つのドメインを含むモノマー酵素である。
- 「メガヌクレアーゼドメイン」により、メガヌクレアーゼのDNA標的の一方の半分と相互作用し、かつDNA標的の他方の半分と相互作用する同じメガヌクレアーゼの他方のドメインと会合して、該DNA標的を切断できる機能的メガヌクレアーゼを形成できる領域を意図する。
【００３０】
- 「メガヌクレアーゼ変異型」又は「変異型」により、野生型メガヌクレアーゼ(天然のメガヌクレアーゼ)のアミノ酸配列中の少なくとも1つの残基の、異なるアミノ酸での置換により得られるメガヌクレアーゼを意図する。
- 「機能的変異型」により、DNA標的配列を切断できる変異型を意図し、好ましくは、該標的は親のメガヌクレアーゼにより切断されない新しい標的である。例えば、このような変異型は、DNA標的配列と接触するか、又は該DNA標的と直接的若しくは間接的に相互作用する位置にてアミノ酸の変動を有する。
【００３１】
- 「新規な特異性を有するメガヌクレアーゼ変異型」により、親のホーミングエンドヌクレアーゼのものとは異なる切断される標的のパターンを有する変異型を意図する。等価であり同様に用いられる用語「新規な特異性」、「改変された特異性」、「新規な切断特異性」、「新規な基質特異性」は、DNA標的配列のヌクレオチドに向かう変異型の特異性のことをいう。
- 「I-CreI」により、配列SWISSPROT P05725 (配列番号143)又はpdbアクセッションコード1g9y (配列番号144)を有する野生型I-CreIを意図する。
【００３２】
- 「LAGLIDADGコアドメイン」又は「コアドメイン」により、約100アミノ酸残基の配列に相当する、LAGLIDADGファミリーのホーミングエンドヌクレアーゼの特徴的なα1β1β2α2β3β4α3折り畳みである「LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメイン」を意図する。該ドメインは、DNA標的の一方の半分と相互作用する逆平行ベータシートに折り畳まれる4つのベータ鎖(β1、β2、β3、β4)を含む。このドメインは、DNA標的の他方の半分と相互作用する別のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインと会合して、該DNA標的を切断できる機能エンドヌクレアーゼを形成できる。例えば、ダイマーホーミングエンドヌクレアーゼI-CreI (163アミノ酸)の場合、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインは、残基6〜94に相当する。
【００３３】
- 「単鎖メガヌクレアーゼ」、「単鎖キメラメガヌクレアーゼ」、「単鎖キメラエンドヌクレアーゼ」、「単鎖メガヌクレアーゼ誘導体」、「単鎖キメラメガヌクレアーゼ誘導体」又は「単鎖誘導体」は、ペプチドスペーサーにより連結された2つのLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼドメイン又はコアドメインを含むメガヌクレアーゼを意図する。単鎖メガヌクレアーゼは、それぞれの親のメガヌクレアーゼ標的配列の1つの異なる半分を含むキメラDNA標的を切断できる。
- 「サブドメイン」により、ホーミングエンドヌクレアーゼDNA標的ハーフサイトの独特の(distinct)部分と相互作用するLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの領域を意図する。2つの異なるサブドメインは、独立して挙動し、一方のサブドメイン中の変異は、他方のサブドメインの結合及び切断特性を変更しない。よって、2つのサブドメインは、ホーミングエンドヌクレアーゼDNA標的ハーフサイトの独特の部分に結合する。
【００３４】
- 「ベータヘアピン」により、ループ又はターンにより接続されたLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの逆並行ベータシートの2つの連続するベータ鎖(β1β2又はβ3β4)を意図する。
- 「I-CreI部位」により、I-CreIにより切断される22〜24 bpの2本鎖DNA配列を意図する。I-CreI部位は、野生型(天然)非パリンドロームI-CreIホーミング部位、及び派生パリンドローム配列、例えば、C1221 (配列番号16; 図10)ともよばれる5'- t-12c-11a-10a-9a-8a-7c-6g-5t-4c-3g-2t-1a+1c+2g+3a+4c+5g+6t+7t+8t+9t+10g+11a+12の配列を含む。
【００３５】
- 「DNA標的」、「DNA標的配列」、「標的配列」、「標的部位」、「標的」、「部位」、「興味対象の部位」、「認識部位」、「認識配列」、「ホーミング認識部位」、「ホーミング部位」、「切断部位」により、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、例えばI-CreI、又はI-CreIに由来する変異型若しくは単鎖キメラメガヌクレアーゼにより認識されかつ切断される20〜24 bpの2本鎖パリンドローム、部分的パリンドローム(偽パリンドローム)又は非パリンドロームのポリヌクレオチド配列を意図する。これらの用語は、そこでエンドヌクレアーゼにより2本鎖破断(切断)が誘導される独特のDNAの位置、好ましくはゲノムの位置のことをいう。DNA標的は、C1221について上で記載したように、2本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の5'から3'配列により定義する。DNA標的の切断は、センス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれについて+2位及び-2位のヌクレオチドにて生じる。そうでないと記載しない限り、I-Cre Iメガヌクレアーゼ変異型によるDNA標的の切断が生じる位置は、DNA標的のセンス鎖上の切断部位に相当する。
【００３６】
- 「DNA標的ハーフサイト」、「ハーフ切断部位」又は「ハーフサイト」により、それぞれのLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインが結合するDNA標的の部分を意図する。
- 「キメラDNA標的」又は「ハイブリッドDNA標的」により、2つの親のメガヌクレアーゼ標的配列の異なる半分の融合を意図する。さらに、該標的の少なくとも一方の半分は、少なくとも2つの別個のサブドメインが結合するヌクレオチドの組み合わせ(組み合わせたDNA標的)を含み得る。
- 「HPRT遺伝子からのDNA標的配列」により、メガヌクレアーゼ変異型が認識して切断するHPRT遺伝子の20〜24 bpの配列を意図する。
- 「HPRT遺伝子」により、脊椎動物のHPRT遺伝子を意図する。
- 「ベクター」により、それが連結された別の核酸を輸送できる核酸分子を意図する。
【００３７】
- 「相同な」により、配列同士の間の相同組換えを導くのに充分な別の配列との同一性を有する、より具体的には少なくとも95%の同一性、好ましくは97%の同一性、より好ましくは99%を有する配列を意図する。
- 「同一性」は、2つの核酸分子又はポリペプチド間の配列同一性のことをいう。同一性は、比較の目的のために整列させ得るそれぞれの配列中の位置の比較により決定できる。比較される配列中の位置が同じ塩基により占められる場合、その分子同士は、その位置において同一である。核酸又はアミノ酸配列間の類似性又は同一性の程度は、核酸配列により共有される位置での同一又は一致するヌクレオチドの数の関数である。種々のアラインメントアルゴリズム及び／又はプログラムを用いて、2つの配列間の同一性を計算することができ、例えば、GCG配列解析パッケージ(University of Wisconsin, Madison, Wis.)の一部分として利用可能であり、例えばデフォルト設定で用い得るFASTA又はBLASTを含む。
【００３８】
- 「個体」は、哺乳動物、及びその他の脊椎動物(例えば鳥類、魚類及び爬虫類)を含む。用語「哺乳動物」及び「哺乳類」は、本明細書で用いる場合、その子に授乳し、生存する子を出産する(真獣類(eutharian)又は胎盤哺乳類(placental mammals))又は産卵する(後獣類(metatharian)又は無胎盤哺乳類(nonplacental mammals))単孔類、有袋類及び有胎盤類(placental)を含むいずれの脊椎動物のことをいう。哺乳動物の種の例は、ヒト、及びその他の霊長類(例えばサル、チンパンジー)、げっ歯類(例えばラット、マウス、モルモット)、並びに例えばウシ、ブタ及びウマのようなその他のものを含む。
- 変異により、ポリヌクレオチド(cDNA、遺伝子)又はポリペプチド配列中の1又は複数のヌクレオチド／アミノ酸の置換、欠失、挿入を意図する。該変異は、遺伝子のコード配列又はその調節配列に影響し得る。これは、ゲノム配列の構造、又はコードされたmRNAの構造／安定性にも影響し得る。
【００３９】
- 「遺伝病」は、部分的又は完全に、そして直接的又は間接的に1又は複数の遺伝子における異常による任意の疾患のことをいう。該異常は、変異であり得る。該遺伝病は、劣性又は優性であり得る。
【００４０】
本発明による使用の好ましい実施形態において、I-CreIの44位〜77位に位置するサブドメイン中の置換は、44位、68位、70位、75位及び／又は77位にある。
本発明による使用の別の好ましい実施形態において、I-CreIの26位〜40位に位置するサブドメイン中の置換は、26位、28位、30位、32位、33位、38位及び／又は40位にある。
【００４１】
本発明による使用の別の好ましい実施形態において、上記のI-CreI変異型又は単鎖誘導体は、DNA標的配列と接触するか、又はDNA主鎖若しくはヌクレオチド塩基と直接若しくは水分子を介して相互作用する他のアミノ酸残基の置換を含む。これらのI-CreI相互作用残基は、当該技術において公知である。
【００４２】
本発明による使用の別の好ましい実施形態において、上記のI-CreI変異型又は単鎖誘導体は、上記で定義されるHPRT遺伝子のDNA標的に向かう変異型の結合及び／又は切断活性を改善する1又は複数のさらなる置換を含む。これらの置換は、I-CreI配列全体に、又はI-CreIのC-末端の半分(80位〜163位)のみに位置する。
好ましくは、上記のさらなる置換は、2位、9位、19位、42位、43位、54位、66位、69位、72位、81位、82位、86位、90位、92位、96位、100位、103位、104位、105位、107位、108位、109位、110位、113位、120位、125位、129位、130位、131位、132位、135位、136位、137位、140位、143位、151位、154位、155位、157位、158位、159位、161位及び162位からなる群より選択されるI-CreIの位置にある。
より好ましくは、上記の置換は、I-CreI変異型/単鎖誘導体の切断活性を増大させるG19S又はG19A変異である。さらにより好ましくは、上記の変異は、機能的ホモダイマーの形成をさらに減じるG19S変異である。G19S変異は、ヘテロダイマーI-CreI変異型の2つのモノマーの一方に導入されるのが有利であり、それにより切断活性が増進され、切断特異性が増大されたメガヌクレアーゼが得られる。
【００４３】
本発明による使用の別の好ましい実施形態において、上記の置換は、元の(initial)アミノ酸の、A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、Y、C、V、L、W、M及びIからなる群より選択されるアミノ酸への置換である。
例えば：
- 28位のリジン(K)は、Rに変異でき、
- 30位のアスパラギン(N)は、S、C、R、Y、Q、D及びTに変異でき、
- 32位のセリン(S)は、D、T、R、G及びWに変異でき、
- 33位のチロシン(Y)は、H、T、G、R、C、Q、D及びSに変異でき、
- 38位のグルタミン(Q)は、W、S、T、G、E、A、Y、C、D及びHに変異でき、
- 40位のセリン(S)は、Q、A、T及びRに変異でき、
- 44位のグルタミン(Q)は、N、T、R、K、D、Y及びAに変異でき、
- 68位のアルギニン(R)は、K、Q、E、A、Y、N、H及びTに変異でき、
- 70位のアルギニン(R)は、S、H、N及びKに変異でき、
- 75位のアスパラギン酸(D)は、R、S、N、Y、E、H及びQに変異でき、
- 77位のイソロイシン(I)は、T、W、Y、K、N、R、H、D、F、E、Q及びLに変異できる。
【００４４】
さらに、本発明において定義されるI-CreI変異型は、I-CreI配列のNH2末端及び／又はCOOH末端にて挿入された1又は複数の残基を含み得る。例えば、タグ(エピトープ又はポリヒスチジン配列)は、NH2末端及び／又はCOOH末端にて導入される。上記のタグは、上記の変異型の検出及び／又は精製に有用である。
【００４５】
本発明において定義されるI-CreI変異型は、I-CreIの26位〜40位又は44位〜77位に少なくとも1つの変異を有する第1モノマーと、I-CreI又はI-CreI変異型である第2モノマーとの会合により得られるホモダイマー又はヘテロダイマーであり得る。
【００４６】
本発明による使用の別の好ましい実施形態において、上記のI-CreI変異型は、I-CreIの26位〜40位及び／又は44位〜77位に異なる変異を有する第1モノマーと第2モノマーとの会合により得られるヘテロダイマーである。
さらに好ましい実施形態において、少なくとも1つのモノマーは、I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位に位置する2つの機能的サブドメインのそれぞれに1つずつ、少なくとも2つの置換を有する。
【００４７】
より好ましくは、該ヘテロダイマーは、以下の配列の対から選択される第1モノマーと第2モノマーとからなる：配列番号83と97、配列番号84と98、配列番号85と99、配列番号32と52、配列番号32と53、配列番号32と54、配列番号32と55、配列番号32と56、配列番号32と57、配列番号32と58、配列番号32と60、配列番号32と65、配列番号32と66、配列番号32と67、配列番号32と68、配列番号32と69、配列番号32と70、配列番号32と71、配列番号32と72、配列番号32と73、配列番号32と74、配列番号75と56、配列番号76と56、配列番号77と56、配列番号78と56、配列番号79と56、配列番号80と56、配列番号81と56、配列番号82と56、配列番号86と96、配列番号87と100、配列番号88と101、配列番号89と102、配列番号90と103、配列番号91と104、配列番号92と105、配列番号93と106、配列番号94と107、配列番号95と108、配列番号147と148。
【００４８】
本発明において定義されるI-CreI変異型の単鎖誘導体は、LAGLIDADGメガヌクレアーゼの2つのモノマー若しくは2つのコアドメイン又はこれらの組み合わせを含む融合タンパク質であり、ここで、少なくとも1つのモノマー又はコアドメインは、上記で定義されるように、I-CreIの26位〜40位及び／又は44位〜77位に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の配列を有する。
I-CreI変異型又は単鎖誘導体により切断されるDNA標的配列は、HPRT ORFに位置し、これらの配列は、HPRT ORF全体をカバーする(表I及び図2)。
【００４９】
【表１】
0005453097.tif 000002
【００５０】
DNA標的配列は、少なくとも1つの哺乳動物(ヒト又は動物)のHPRT遺伝子中に存在する。
例えば、標的配列である配列番号6及び12は、少なくともヒト、マウス及びチャイニーズハムスター(Criteculus sp.)のHPRT遺伝子中に存在する。
標的配列である配列番号7及び9は、少なくともマウス及びチャイニーズハムスターのHPRT遺伝子中に存在する。
標的配列である配列番号1〜5、8、10、11、13及び14は、少なくともチャイニーズハムスターのHPRT遺伝子中に存在する。
【００５１】
さらに、配列番号8〜14の配列の±3〜5位及び±8〜10位のヌクレオチドとの配列同一性を有する標的配列は、少なくともヒト及びマウスHPRT遺伝子中に存在する。配列番号10及び11の配列の±3〜5位及び±8〜10位のヌクレオチドと配列同一性を有する標的配列は、少なくともマウスHPRT遺伝子中に存在する(配列同一性は、ヒトHPRT遺伝子中で見出されない)。配列番号9の配列の±3〜5位及び±8〜10位のヌクレオチドと配列同一性を有する標的配列は、少なくともヒトHPRT遺伝子中に存在する。
よって、配列番号6及び12のDNA標的配列の1つを切断するI-CreI変異型は、少なくともヒト、マウス及びチャイニーズハムスターのHPRT遺伝子中に部位特異的改変を誘発できる。さらに、配列番号9のDNA標的配列を切断するI-CreI変異型は、チャイニーズハムスター及びマウスHPRT遺伝子の両方において、そしていくつかのものについてはヒトHPRT遺伝子中でも部位特異的改変を誘発できる。配列番号8のDNA標的配列を切断するI-CreI変異型は、チャイニーズハムスターにおいて、そしていくつかのものについてはヒト及び／又はマウスのHPRT遺伝子中でも部位特異的改変を誘発できる。HPRT遺伝子中の改変の位置は、ゲノムDNA切断部位の位置に相当する(ゲノムDNA標的のセンス鎖の+2位(すなわち、配列番号6、12、9及び8の配列についてそれぞれ101位(エキソン3)、16位(エキソン8)、21位(エキソン6)、150位(エキソン3))。
【００５２】
配列番号7のDNA標的配列を切断するI-CreI変異型は、少なくともマウス及びチャイニーズハムスターのHPRT遺伝子中で部位特異的改変を誘発できる(しかし、ヒトHPRT遺伝子の対応する位置ではできない)。さらに、配列番号10及び11のDNA標的配列を切断するI-CreI変異型は、チャイニーズハムスターのHPRT遺伝子、そしていくつかのものについてはマウスHPRT遺伝子中でも部位特異的改変を誘発できる(しかし、ヒトHPRT遺伝子の対応する位置ではできない)。HPRT遺伝子中での改変の位置は、それぞれ106位(エキソン3)、51位(エキソン6)及び52位(エキソン6)に相当する。
配列番号14のDNA標的配列を切断するI-CreI変異型は、チャイニーズハムスターHPRT遺伝子、そしていくつかのものについてはヒトHPRT遺伝子中でも部位特異的変異を誘発できる(しかし、マウスHPRT遺伝子の対応する位置ではできない)。HPRT遺伝子中の改変の位置は、68位(エキソン9)に相当する。
配列番号1〜5及び13のDNA標的配列の1つを切断するI-CreI変異型は、少なくともチャイニーズハムスターのHPRT遺伝子中で部位特異的変異を誘発できる(しかし、ヒト又はマウスHPRT遺伝子の対応する位置ではできない)。HPRT遺伝子中の改変の位置は、それぞれATGから-7位(エキソン1)、54位(エキソン2)、93位(エキソン2)、29位(エキソン3)、69位(エキソン3)、93位(エキソン9)及び21位(エキソン9)に相当する。
【００５３】
それぞれのDNA標的を切断するヘテロダイマー変異型の例を、表II及び図19に示す。
【表２−１】
0005453097.tif 000003
【００５４】
【表２−２】
0005453097.tif 000004
【００５５】
各変異型の配列は、記載される位置でのそのアミノ酸残基により定義される。例えば、表IIの1つ目のヘテロダイマー変異型は、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位にそれぞれK、Q、D、Y、Q、S、N、K、S、R及びTを有する第1モノマーと、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位にそれぞれK、N、S、G、C、S、Q、R、R、N及びIを有する第2モノマーとからなる。位置はI-CreI配列SWISSPROT P05725又はpdbアクセッションコード1g9yを参照にして示す。I-CreIは、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位にそれぞれK、N、S、Y、Q、S、Q、R、R、D及びIを有する。記載しない位置は変異されておらず、よって、野生型I-CreI配列に相当する。
【００５６】
本発明による使用の別の好ましい実施形態において、上記のI-CreI変異型又は単鎖誘導体は、上記で定義されるように、上記のI-CreI変異型又は単鎖誘導体のゲノムDNA切断部位を取り囲む(surrounding) HPRT遺伝子の領域と相同性を有する配列で挟まれた、導入される配列を含むターゲティングDNA構築物と組み合わされる。
好ましくは、少なくとも50 bp、好ましくは100 bpを超える、より好ましくは200 bpを超える相同配列が用いられる。実際に、DNA相同性は、破断の部位の上流及び下流に接する領域に位置し、導入されるDNA配列は、2つの腕の間に位置する。導入される配列は、興味対象の外因性遺伝子、又はHPRT遺伝子若しくはその一部分を不活性化又は欠失させる配列を含む。
【００５７】
このような染色体DNAの変更は、HPRT遺伝子が不活性化され(ノックアウト)、最終的には興味対象の外因性遺伝子で置き換えられた(ノックイン) HPRTノックアウト及びノックイン動物を作製するために用い得る。
よって、このような染色体DNAの変更は、内因性HPRT遺伝子が不活性化されて、導入遺伝子が最終的にはHPRT遺伝子座に挿入された、遺伝的に改変された脊椎動物(ヒトを含む哺乳動物)株化細胞を作製するためにも用いられる。
さらに、内因性HPRT遺伝子の不活性化の後に、HPRTは、HPRT欠損細胞/動物の染色体の任意の遺伝子座でのさらなる遺伝子ターゲティング手順における陽性の選択マーカーとして用い得る(HATを用いるHPRTマーカー発現についての選択)。
【００５８】
本発明の主題は、少なくとも以下の工程を含む、HPRTノックイン又はノックアウト動物を作製する方法でもある：
(a) 動物の多能性前駆細胞又は胚に、上記で定義されるI-CreI変異型又は単鎖誘導体を導入して、該I-CreI変異型又は単鎖誘導体のDNA認識及び切断部位を含むHPRT遺伝子の興味対象部位にて2本鎖切断を誘発し、同時に又は続いて、
(b) 工程(a)の動物前駆細胞又は胚に、(1) 切断部位を取り囲む領域と相同性を有するDNAと、(2) ターゲティングDNAと染色体DNAとの間の組換えの際に興味対象の部位を修復するDNAとを含むターゲティングDNAを導入して、相同組換えにより興味対象の部位が修復されたゲノム改変された動物前駆細胞又は胚を作製し、
(c) 工程(b)の前記ゲノム改変された動物前駆細胞又は胚を、キメラ動物に発達させ、
(d) 工程(c)のキメラ動物からトランスジェニック動物を派生させる。
好ましくは、工程(c)は、工程(b)で作製されたゲノム改変された前駆細胞を、キメラ動物を作製するように胚盤胞に導入することを含む。
【００５９】
本発明の主題は、少なくとも以下の工程を含む、HPRTノックイン又はノックアウト細胞を作製する方法でもある：
(a) 細胞に、上記で定義されるI-CreI変異型又は単鎖誘導体を導入して、該I-CreI変異型又は単鎖誘導体のDNA認識及び切断部位を含むHPRT遺伝子の興味対象部位にて2本鎖切断を誘発し、同時に又は続いて、
(b) 工程(a)の細胞に、(1) 切断部位を取り囲む領域と相同性を有するDNAと、(2) ターゲティングDNAと染色体DNAとの間の組換えの際に興味対象の部位を修復するDNAとを含むターゲティングDNAを導入して、相同組換えにより興味対象の部位が修復された組換え細胞を作製し、
(c) 任意の適切な手段により、工程(b)の組換え細胞を単離する。
ターゲティングDNAは、興味対象の部位にターゲティングDNAを導入するのに適する条件下で、細胞に導入される。
【００６０】
好ましい実施形態において、上記のターゲティングDNA構築物は、ベクターに挿入される。
あるいは、HPRT遺伝子は、非相同性末端結合による2本鎖破断の修復により不活性化してもよい(図3B)。
【００６１】
本発明の主題は、少なくとも以下の工程を含む、HPRTノックアウト動物を作製する方法でもある：
(a) 動物の多能性前駆細胞又は胚に、上記で定義されるI-CreI変異型又は単鎖誘導体を導入して、該I-CreI変異型又は単鎖誘導体のDNA認識及び切断部位を含むHPRT遺伝子の興味対象部位にて2本鎖切断を誘発し、それにより非相同性末端結合により2本鎖破断が修復されたゲノム改変された前駆細胞又は胚を作製し、
(b) 工程(a)のゲノム改変された動物前駆細胞又は胚をキメラ動物に発達させ、
(c) 工程(b)のキメラ動物からトランスジェニック動物を派生させる。
好ましくは、工程(b)は、工程(a)で作製されたゲノム改変された前駆細胞を胚盤胞に導入して、キメラ動物を作製することを含む。
【００６２】
本発明の主題は、少なくとも以下の工程を含む、HPRT欠陥細胞を作製する方法でもある：
(a) 細胞に、上記で定義されるI-CreI変異型又は単鎖誘導体を導入して、該I-CreI変異型又は単鎖誘導体のDNA認識及び切断部位を含むHPRT遺伝子の興味対象部位にて2本鎖切断を誘発し、それにより、非相同性末端結合により2本鎖破断が修復されたゲノム改変されたHPRT欠陥細胞を作製し、
(b) 任意の適切な手段により、工程(a)のゲノム改変されたHPRT欠陥細胞を単離する。
【００６３】
改変される細胞は、興味対象の任意の細胞であり得る。トランスジェニック/ノックアウト動物を作製するために、細胞は、当該技術で公知の胚幹(ES)細胞のような多能性前駆細胞である。上記のI-CreI変異型/単鎖誘導体は、細胞に直接提供されるか、又は該メガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含み、用いられる細胞での発現に適する発現ベクターを介して提供され得る。
動物は、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは実験げっ歯類(マウス、ラット、モルモット)、又はウシ、ブタ、ウマ又はヤギである。
さらに、改変細胞中の内因性HPRT遺伝子の欠失は、プリンアナログである6-チオグアニン(6-TG)を用いることにより選択できる。
【００６４】
本発明による使用の別の好ましい実施形態において、上記のI-CreI変異型又は単鎖誘導体は、ポリヌクレオチド断片によりコードされる。上記のポリヌクレオチドは、ホモダイマー変異型若しくはヘテロダイマー変異型の1つのモノマー、又は単鎖キメラエンドヌクレアーゼの2つのドメイン/モノマーをコードできる。
より好ましい実施形態において、上記のポリヌクレオチド断片は、用いられる細胞での発現に適切なベクター中に挿入される。上記のベクターは、有利には、上記で定義されるようなターゲティングDNA構築物を含む。好ましくは、上記のベクターは、上記で定義されるヘテロダイマーI-Cre I変異型のモノマーの1つをそれぞれがコードする2つの異なるポリヌクレオチド断片を含む。
【００６５】
本発明において用い得るベクターは、限定されないが、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、或いは染色体、非染色体、半合成又は合成の核酸からなり得る線状若しくは環状のDNA又はRNA分子を含む。好ましいベクターは、自律複製できるもの(エピソームベクター)及び／又は連結された核酸の発現を可能にするもの(発現ベクター)である。多数の適切なベクターが当業者に知られ、商業的に入手可能である。
【００６６】
ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス(例えばアデノ随伴ウイルス)、コロナウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、例えばオルトミクソウイルス(例えばインフルエンザウイルス)、ラブドウイルス(例えば狂犬病及び水疱性口内炎ウイルス)、パラミクソウイルス(例えば麻疹及びセンダイ)、プラス鎖RNAウイルス、例えばピコルナウイルス及びアルファウイルス、並びにアデノウイルス、ヘルペスウイルス(例えば単純ヘルペスウイルス1及び2型、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス)及びポックスウイルス(例えばワクシニア、鶏痘及びカナリア痘)を含む二本鎖DNAウイルスを含む。その他のウイルスは、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス及び肝炎ウイルスを含む。レトロウイルスの例は、トリ白血病肉腫、哺乳類C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV-BLV群、レンチウイルス、スプマウイルスを含む(Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, 第3版, B. N. Fieldsら編, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996)。
好ましいベクターは、レンチウイルスベクター、特に自己不活化レンチウイルスベクター(self inactivacting lentiviral vectors)を含む。
【００６７】
ベクターは、選択マーカー、例えば真核細胞培養についてネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グルタミンシンセターゼ及びヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ；S. cerevisiaeについてTRP1；E. coliにおいてテトラサイクリン、リファンピシン又はアンピシリン耐性を含み得る。
【００６８】
好ましくは、上記のベクターは、本発明の変異型／単鎖誘導体をコードする配列が、適切な転写及び翻訳制御要素の制御下に位置して、該変異型の産生又は合成を許容する発現ベクターである。よって、上記のポリヌクレオチドは、発現カセットに含まれる。より具体的には、該ベクターは、複製起点、該コードポリヌクレオチドに機能可能に連結するプロモーター、リボソーム結合部位、RNAスプライシング部位(ゲノムDNAを用いる場合)、ポリアデニル化部位、及び転写終結部位を含む。これは、エンハンサーも含み得る。プロモーターの選択は、ポリペプチドが発現される細胞に依存する。好ましくは、上記の変異型がヘテロダイマーである場合、各モノマーをコードする2つのポリヌクレオチドは、両方のポリヌクレオチドの発現を同時に駆動し得る1つのベクターに含まれる。適切なプロモーターは、組織特異的及び／又は誘導性プロモーターを含む。誘導性プロモーターの例は、重金属のレベルの増加により誘導される真核メタロチオネインプロモーター、イソプロピル-β-D-チオガラクト-ピラノシド(IPTG)に応答して誘導される原核lacZプロモーター、及び温度の増加により誘導される真核熱ショックプロモーターである。組織特異的プロモーターの例は、骨格筋クレアチンキナーゼ、前立腺特異的抗原(PSA)、α-抗トリプシンプロテアーゼ、ヒトサーファクタント(SP)タンパク質A及びB、β-カゼイン及び酸性ホエータンパク質遺伝子である。
【００６９】
ターゲティングDNAは、ターゲティングDNAを、興味対象の部位に導入するのに適する条件下で細胞に導入される。
【００７０】
ノックイン動物/細胞を作製するために、興味対象の部位を修復するDNAは、興味対象の外因性遺伝子の配列、最終的には選択マーカー、例えばHPRT遺伝子を含む。
ノックアウト動物/細胞を作製するために、興味対象の部位を修復するDNAは、興味対象の内因性遺伝子を不活性化する配列を含む。
【００７１】
本発明の主題は、必要とする個体において、HPRT遺伝子中の変異に関連する遺伝病を予防、改善又は治癒するための医薬品の製造のための、上記で定義されるI-CreI変異型又は単鎖誘導体の使用でもあり、該医薬品は、該個体に任意の手段により投与される。
この場合、上記で定義されるI-CreI変異型又は単鎖誘導体の使用は、(a)個体の体性組織に、前記変異型の少なくとも1つの認識及び切断部位を含むHPRT遺伝子の興味対象部位にて、2本鎖切断を誘発し、(b) 個体に、(1) 前記切断部位を取り囲む領域と相同性を有するDNAと、(2) ターゲティングDNAと染色体DNAとの間の組換えの際に興味対象の部位を修復するDNAとを含むターゲティングDNAを導入する工程を少なくとも含む。ターゲティングDNAは、興味対象の部位へのターゲティングDNAの導入に適する条件下で個体に導入される。
【００７２】
本発明によると、上記の2本鎖切断は、個体への該メガヌクレアーゼの投与により全体として(in toto)、又は個体から回収した体細胞への該メガヌクレアーゼの導入及び改変後に個体に戻すことによりエクスビボで誘発される。
上記の使用の好ましい実施形態において、I-CreI変異型又は単鎖誘導体は、上記で定義される該I-CreI変異型又は単鎖誘導体のゲノムDNA切断部位を取り囲むHPRT遺伝子の領域と相同性を有する配列により挟まれたHPRT遺伝子における変異を修復する配列を含むターゲティングDNA構築物と組み合わせる。
【００７３】
HPRT遺伝子を修正するために、遺伝子の切断は、変異の近傍、好ましくは変異から500 bp以内で生じる(図3C)。ターゲティング構築物は、切断を修復するために、ゲノムDNA切断部位に接する少なくとも200 bpの相同配列を有するHPRT遺伝子断片を含み(最小修復マトリクス)、変異を修復するために、HPRT遺伝子の正しい配列を含む(図3C)。よって、遺伝子修正のためのターゲティング構築物は、最小修復マトリクスからなるか、又はこれを含む。これは、200 pb〜6000 pb、より好ましくは1000 pb〜2000 pbである。
【００７４】
機能的遺伝子を回復するために(図3D)、遺伝子の切断は、変異の上流で生じる。好ましくは、該変異は、遺伝子の配列中の最初の既知の変異であり、そのことにより、遺伝子の全ての下流の変異が同時に修正され得る。ターゲティング構築物は、フレーム内で融合された(cDNAとして)ゲノムDNA切断部位の下流のエキソンと、3'での転写を停止するポリアデニル化部位を含む。導入される配列(エキソンノックイン構築物)は、切断部位を取り囲むイントロン又はエキソンで挟まれることにより、工学的遺伝子(エキソンノックイン遺伝子)を、機能的タンパク質をコードできるmRNAに転写することが可能になる(図3D)。例えば、エキソンノックイン構築物は、上流及び下流の配列で挟まれる。
【００７５】
上記の使用の別の好ましい実施形態において、I-CreI変異型又は単鎖誘導体は、ベクターによりコードされる。好ましくは、ベクターは、上記で定義されるターゲティングDNA構築物を含む。
上記の使用の別の好ましい実施形態において、遺伝病は、レッシュ-ナイハン症候群である。
【００７６】
本発明の主題は、上記で定義される少なくとも1つのI-CreI変異型若しくは単鎖誘導体、及び／又は該変異型/単鎖分子をコードする少なくとも1つの発現ベクターと、医薬的に許容される賦形剤とを含むことを特徴とする組成物でもある。
上記の組成物の好ましい実施形態において、組成物は、上記で定義される変異型のゲノムDNA切断部位と相同性を有する配列で挟まれた、HPRT遺伝子の変異を修復する配列を含むターゲティングDNA構築物を含む。変異を修復する配列は、上記で定義される正しい配列を有する遺伝子の断片、又はエキソンノックイン構築物のいずれかである。
好ましくは、上記のターゲティングDNA構築物は、本発明で定義されるように、組換えベクターに含まれるか、又は変異型/単鎖誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターに含まれる。
【００７７】
本発明の主題は、上記で定義されるような、少なくとも1つのI-CreI変異型/単鎖誘導体、又は該メガヌクレアーゼをコードする1つの発現ベクターと、ターゲティング構築物を含むベクターとを、HPRT遺伝子中の変異に関連する遺伝病の予防又は治療における同時、別々又は逐次的な使用のための組み合わせ製剤として含む製品でもある。
【００７８】
本発明の主題は、必要とする個体におけるHPRT遺伝子中の変異に関連する遺伝病を予防、改善又は治癒する方法でもあり、該方法は、任意の手段により、上記で定義される組成物を個体に投与する工程を少なくとも含む。
治療の目的のために、I-CreI変異型/単鎖誘導体と、医薬的に許容される賦形剤とは、治療有効量で投与される。このような組み合わせは、投与される量が生理的に重要である場合に、「治療有効量」で投与されるという。作用剤は、その存在が、受容者の生理機能に検出可能な変化をもたらす場合に、生理的に重要である。この関係において、作用剤は、その存在が、標的にされる疾患の1又は複数の症状の重篤度の減少、及び損傷又は異常のゲノム修正をもたらす場合に、生理的に重要である。
【００７９】
本発明による使用のある実施形態において、I-CreI変異型/単鎖誘導体は、実質的に非免疫原性であり、すなわち、有害な免疫応答をほとんど又は全く生じない。この種の有害な免疫反応を緩和又は消去するための種々の方法を、本発明に従って用いることができる。好ましい実施形態において、I-CreI変異型/単鎖誘導体は、N-ホルミルメチオニンを実質的に含まない。望ましくない免疫反応を回避する別の方法は、メガヌクレアーゼをポリエチレングリコール(「PEG」)又はポリプロピレングリコール(「PPG」) (好ましくは平均分子量(MW)が500〜20,000ダルトンのもの)とコンジュゲートさせることである。PEG又はPPGとのコンジュゲートは、例えばDavisら(米国特許第4,179,337号)に記載されるように、抗ウイルス活性を有する非免疫原性で生理活性で水溶性のエンドヌクレアーゼコンジュゲートを提供できる。ポリエチレン-ポリプロピレングリコールコポリマーを用いる同様の方法も、Saiferら(米国特許第5,006,333号)に記載されている。
【００８０】
I-CreI変異型又は単鎖誘導体は、ポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物/ベクターとして用い得る。これは、細胞に、インビトロ、エクスビボ、又はインビボで、具体的な細胞の種類に適切な当業者に公知の任意の簡便な手段により、単独又は少なくとも適切なビヒクル若しくはキャリア及び／又はターゲティングDNAとともに導入される。細胞内に一旦入ると、メガヌクレアーゼと、存在するならばターゲティングDNA及び／又はメガヌクレアーゼをコードする核酸を含むベクターとは、細胞により、細胞質から核の作用部位まで運び込まれるか又は移送される。
【００８１】
I-CreI変異型又は単鎖誘導体(ポリペプチド)は、有利には、リポソーム、ポリエチレンイミン(PEI)、及び／又は膜転位ペプチド(membrane translocating peptides) (Bonetta, The Scientist, 2002, 16, 38; Fordら, Gene Ther., 2001, 8, 1〜4 ; Wadia及びDowdy, Curr. Opin. Biotechnol., 2002, 13, 52〜56)と会合し得る。後者の場合、I-Cre 変異型/単鎖誘導体の配列は、膜転位ペプチドの配列と融合される(融合タンパク質)。
【００８２】
ターゲティングDNA及び／又はメガヌクレアーゼをコードする核酸を含むベクターは、種々の方法により細胞に導入できる(例えば注入、直接の取り込み、噴出衝撃、リポソーム、エレクトロポレーション)。メガヌクレアーゼは、発現ベクターを用いて、細胞中で安定的に又は一過的に発現できる。真核細胞内での発現の方法は、当該技術において公知である(Current Protocols in Human Genetics: 第12章"Vectors For Gene Therapy"及び第13章"Delivery Systems for Gene Therapy"を参照)。任意に、組換えタンパク質中に核局在化シグナルを組み込んでそれが核内で発現されることを確実にすることが好ましい場合がある。
【００８３】
本発明の主題は、I-CreI 変異型/単鎖誘導体、該変異型又は単鎖誘導体をコードするポリヌクレオチド断片、該ポリヌクレオチド断片及び／又はDNAターゲティング構築物を含むベクター、上記で定義されるポリヌクレオチド又はベクター、好ましくは発現ベクターで改変された原核又は真核宿主細胞でもある。
【００８４】
本発明の主題は、細胞の全て又は一部分が、上記で定義されるポリヌクレオチド又はベクターで改変されている非ヒトトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物でもある。
本明細書で用いる場合、細胞は、細菌細胞のような原核細胞、又は動物、植物若しくは酵母細胞のような真核細胞のことをいう。
【００８５】
本発明で定義されるI-CreI変異型は、少なくとも以下の工程を含む、脊椎動物遺伝子からのゲノムDNA標的配列を切断できるI-CreI 変異型を工学的に作製する方法により得ることができる：
(a)   I-CreIの26位〜40位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第1機能的サブドメイン中に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第1シリーズを構築し、
(b)   I-CreIの44位〜77位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第2機能的サブドメイン中に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第2シリーズを構築し、
(c)   (i) I-CreI部位の-10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットがcag、att、cct、ttg、gac、atg、ttt、ttc、tgg、gtc、aag、gagからなる群より選択されるヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、前記I-CreI部位の-10位〜-8位を置換する前記ヌクレオチドトリプレットの逆相補配列(すなわち、それぞれctg、aat、agg、caa、gtc、cat、aaa、gaa、cca、gac、ctt及びctc)で置き換えられている変異I-CreI部位を切断できる変異型を工程(a)の第1位シリーズから選択及び／又はスクリーニングし、
(d)   (i) I-CreI部位の-5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、gac、taa、tca、gtg、gct、tgt、tgg、ctg、ttg、tag及びgagからなる群より選択されるヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、前記I-CreI部位の-5位〜-3位を置換する前記ヌクレオチドトリプレットの逆相補配列(すなわち、それぞれgtc、tta、tga、cac、agc、aca、cca、cag、caa、cta及びctc)で置き換えられている変異I-CreI部位を切断できる変異型を工程(b)の第2シリーズから選択及び／又はスクリーニングし、
【００８６】
(e)   (i) I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、cat、cga、tat、ggg、tac、taa、cag、gca、aca、gaa、tga、atgからなる群より選択されるヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、前記I-CreI部位の+8位〜+10位を置換する前記ヌクレオチドトリプレットの逆相補配列(すなわち、それぞれatg、tcg、ata、ccc、gta、tta、ctg、tgc、tgt、ttc、tca及びcat)で置き換えられている変異I-CreI部位を切断できる変異型を工程(a)の第1位シリーズから選択及び／又はスクリーニングし、
(f)   (i) I-CreI部位の+3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、tcc、tat、gtg、gaa、tgg、tac、ttt、aca、agc、gcg、tcc、act、caa及びaagからなる群より選択されるヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、前記I-CreI部位の+3位〜+5位を置換する逆相補配列(すなわち、それぞれgga、ata、cac、ttc、cca、gta、aaa、tgt、gct、cgc、gga、agt、ttg及びctt)で置き換えられている変異I-CreI部位を切断できる変異型を工程(b)の第2シリーズから選択及び／又はスクリーニングし、
(g1) 配列番号1〜14の配列のDNA標的を切断できる変異型を、工程(c)〜(f)から選択及び／又はスクリーニングする。
【００８７】
本発明の第1の実施形態によると、上記のI-CreI変異型は、少なくとも上記の工程(a)〜(f)と、以下のさらなる工程とを含む方法により得ることができる：
(g2) 工程(c)〜(f)のいずれかで得られた異なる変異型を、互いに又はI-CreIと組み合わせてヘテロダイマーを形成し、
(h2) 配列番号1〜14の配列のDNA標的を切断できるヘテロダイマーを、工程(g2)から選択及び／又はスクリーニングする。
【００８８】
本発明の第2の実施形態によると、上記のI-CreI変異型は、少なくとも上記の工程(a)〜(f)と、以下のさらなる工程とを含む方法により得ることができる：
(g3) 工程(c)及び工程(d)からの2つの変異型の26位〜40位及び44位〜77位の変異を、単独の変異型に組み合わせて、(i) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、配列番号1〜14の配列のDNA標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、配列番号1〜14の配列のDNA標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、配列番号1〜14の配列のDNA標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(iv) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、配列番号1〜14の配列のDNA標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一である配列を切断する新規なホモダイマーI-CreI 変異型を得て、及び／又は
【００８９】
(h3) 工程(e)及び工程(f) からの2つの変異型の26位〜40位及び44位〜77位の変異を、単独の変異型に組み合わせて、(i) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、配列番号1〜14の配列のDNA標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、配列番号1〜14の配列のDNA標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii) I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、配列番号1〜14の配列のDNA標的の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(iv) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、配列番号1〜14の配列のDNA標的の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一である配列を切断する新規なホモダイマーI-CreI 変異型を得て、
(i3) 配列番号1〜14の配列のDNA標的を切断できる変異型を、工程(g3)又は(h3)から選択及び／又はスクリーニングする。
【００９０】
本発明の第3の実施形態によると、上記のI-CreI変異型は、少なくとも工程(a)〜(f)と工程(g3)及び／又は工程(h3)と、以下のさらなる工程とを含む方法により得ることができる：
(i4) 工程(g3)で得られた変異型を、工程(h3)で得られた変異型、I-CreI又は工程(e)若しくは工程(f)で得られた変異型と組み合わせてヘテロダイマーを形成するか、又は
(i'4) 工程(h3)で得られた変異型を、I-CreI又は工程(c)若しくは工程(d)で得られた変異型と組み合わせてヘテロダイマーを形成し、
(j4) 配列番号1〜14の配列のDNA標的を切断できるヘテロダイマーを、工程(i4)又は(i'4)から選択及び／又はスクリーニングする。
【００９１】
工程(c)、(d)、(e)、(f)、(g1)、(h2)、(i3)及び(j4)での選択及び／又はスクリーニングは、国際PCT出願WO 2004/067736、Epinatら(Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜2962)、Chamesら(Nucleic Acids Res., 2005, 33, e178)、及びArnouldら(J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458)に記載されるような、インビトロ又はインビボの切断アッセイを用いることにより行うことができる。好ましくは、工程(c)、(d)、(e)、(f)、(g1)、(h2)、(i3)及び／又は(j4)は、上記の変異型により作製される変異DNA標的配列における2本鎖破断が、国際PCT出願WO 2004/067736、Epinatら(Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜2962)、Chamesら(Nucleic Acids Res., 2005, 33, e178)、及びArnouldら(J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458)に記載されるような、上記のDNA 2本鎖破断の組換え媒介修復により、陽性の選択マーカー若しくはレポーター遺伝子の活性化、又は陰性の選択マーカー若しくはレポーター遺伝子の不活性化を導く条件下で、インビボにて行われる。
【００９２】
工程(a)及び(b)は、特にDNA標的配列と接触するか又は該DNA標的と直接若しくは間接的に相互作用する他の位置で、変異型の結合及び／又は切断特性を向上するために、さらなる変異の導入を含み得る。これらの工程は、国際PCT出願WO 2004/067736及びArnouldら(J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458)に記載されるようなコンビナトリアルライブラリーを作製することにより行うことができる。
【００９３】
工程(g2)、(i4)、及び(i'4)における変異型の(分子内)組み合わせは、工程(c)と(d)、(e)と(f)、(g3)と(h3)、(g3)と(e)、(g3)と(f)、(h3)と(c)、(h3)と(d)からの2つの異なる変異型、又は工程(c)〜(f)、(g3)又は(h3)のいずれかからの1つの変異型とI-CreIとを同時発現させて、ヘテロダイマーの形成を可能にすることにより行われる。例えば、宿主細胞は、上記の変異型をコードする1つ又は2つの組換え発現ベクターにより改変され得る。細胞は、国際PCT出願WO 2006/097854及びArnouldら(J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458)に記載されるように、次いで、変異型の発現を可能にする条件下で培養され、宿主細胞内でヘテロダイマーが形成される。
【００９４】
工程(g3)及び(h3)における変異の(分子間)組み合わせは、2つのサブドメインのそれぞれを含むオーバーラップ断片を、公知のオーバーラップPCR法により増幅することにより行うことができる。
さらに、工程(g3)及び／又は(h3)は、変異型全体又は変異型の一部分、特に変異型のC-末端の半分(80位〜163位)に対するランダム変異の導入をさらに含み得る。このことは、当該技術において公知であり商業的に入手可能な標準の突然変異誘発法により、変異型のプールに対するランダム突然変異誘発ライブラリーを作製することにより行うことができる。
【００９５】
本発明の主題は、I-CreIの26位〜40位及び／又は44位〜77位に変異を有するI-CreI変異型でもあり、これは、本発明に従って、HPRT遺伝子からのDNA標的を切断できる変異型を工学的に作製するために有用である。特に、本発明は、配列番号24〜47及び129〜142の配列の変異型を含む、上記で定義されるI-CreI変異型を工学的に作製する方法の工程(c)〜(f)で定義されるI-CreI変異型を含む。本発明は、配列番号52〜60の配列の変異型を含む、上記で定義されるI-CreI変異型を工学的に作製する方法の工程(g3)及び(h3)で定義されるI-CreI変異型も含む。
【００９６】
興味対象の遺伝子からのDNA標的を切断できる単鎖キメラエンドヌクレアーゼは、当該技術において公知の方法により、本発明による変異型から導かれる(Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜62; Chevalierら, Mol. Cell., 2002, 10, 895〜905; Steuerら, Chembiochem., 2004, 5, 206〜13; 国際PCT出願WO 03/078619及びWO 2004/031346)。このような方法のいずれも、本発明で定義される変異型から導かれる単鎖キメラエンドヌクレアーゼを構築するために用い得る。
【００９７】
ターゲティングDNA構築物の配列又は本発明で定義されるI-CreI変異型若しくは単鎖誘導体をコードする配列を有するポリヌクレオチド断片は、当業者に知られる任意の方法により調製できる。例えば、これらは、特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応により、DNA鋳型から増幅される。好ましくは、I-CreI変異型又は単鎖誘導体をコードするcDNAのコドンは、所望の発現系の中での上記のタンパク質の発現に好ましいように選択される。
上記のポリヌクレオチドを含む組換えベクターは、公知の組換えDNA及び遺伝子工学の技術により得て、宿主細胞に導入される。
【００９８】
本発明において定義されるI-CreI変異型又は単鎖誘導体は、上記で定義されるポリペプチドを発現させることにより製造される。好ましくは、上記のポリペプチドは、1つの発現ベクター又は2つの発現ベクター(変異型の場合のみ)により改変された宿主細胞又はトランスジェニック動物/植物中で、ポリペプチドの発現又は同時発現に適する条件下で、発現又は同時発現(変異型の場合のみ)され、変異型又は単鎖誘導体は、宿主細胞培養又はトランスジェニック動物/植物から回収される。
【００９９】
本発明の実行は、そうでないと記載しない限り、当該技術の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA及び免疫学の通常の技術を用いる。このような技術は、文献に充分に説明される。例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, (Sambrookら, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編, 1984); Mullisら 米国特許第4,683,195号; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries及びS. J. Higgins編 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames及びS. J. Higgins編 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); シリーズであるMethods In ENZYMOLOGY (J. Abelson及びM. Simon監修, Academic Press, Inc., New York)、特に154巻及び155巻(Wuら編)、並びに185巻「Gene Expression Technology」(D. Goeddel編); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller及びM. P. Calos編, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer及びWalker編, Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, I〜IV巻(D. M. Weir及びC. C. Blackwell編, 1986);並びにManipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)を参照されたい。
【０１００】
上記の特徴に加えて、本発明は、本発明によるI-CreIメガヌクレアーゼ変異型及びそれらの使用を説明する実施例並びに添付の図面に言及する以下の記載から明らかになるその他の特徴をさらに含む：
- 図1は、ホーミングエンドヌクレアーゼのモジュール構造及びカスタムメガヌクレアーゼを設計するためのコンビナトリアルアプローチを示す。A. DNA標的に結合したI-CreIホーミングエンドヌクレアーゼの3次元構造。触媒コアは、DNA主溝の上のサドル形相互作用界面を形成する2つのαββαββα折り畳みにより取り囲まれる。B. I-CreI標的配列に由来する異なる結合配列(右上及び左下)を組み合わせて、非パリンドロームキメラ標的を切断するヘテロダイマー又は単鎖融合分子を得ることができる(右下)。C. より小さい独立サブユニット、すなわち単独モノマー又はαββαββα折り畳み内のサブユニット(右上及び左下)は、同じモノマー内の変異の組み合わせにより新規なキメラ分子の設計を可能にする(右下)。このような分子は、パリンドロームキメラ標的を切断する(右下)。D. 2つの先の工程の組み合わせは、4つの異なるサブドメインを含むより大きいコンビナトリアルアプローチを可能にする。第1工程において、新規なメガヌクレアーゼの対を、切断したい標的に由来するパリンドローム標的を切断する新しい分子に組み合わせ得る(「ハーフメガヌクレアーゼ」)。次に、このような「ハーフメガヌクレアーゼ」の組み合わせは、興味対象の標的を切断するヘテロダイマー種をもたらし得る。つまり、各サブドメインについての新しい切断者の少数の同定が、仕立てられた特異性を有する新規なエンドヌクレアーゼの非常に多数の設計を可能にする。
【０１０１】
- 図2は、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子及び対応するmRNAを表す。エキソンを箱で囲み、マウス遺伝子中の各エキソンのサイズ(アクセッション番号NC_000086)を示す。ヒト遺伝子(NC_000023)とのサイズの違いも示す。I-CreI変異型の切断部位(配列番号1〜14)を、エキソンの上に示す。チャイニーズハムスターHPRT mRNA (アクセッション番号J00060.1; 配列番号15)は、遺伝子の下に表すORFは、灰色の箱として示す。HprCH3標的部位は、その配列(配列番号4)及び位置とともに示す。
- 図3は、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)遺伝子を切断するメガヌクレアーゼを利用する4つの異なる方策を示す。A. 遺伝子挿入及び／又は遺伝子不活性化。メガヌクレアーゼによる切断と、切断部位を取り囲む配列との相同性を有する配列で挟まれた興味対象の遺伝子(遺伝子挿入)又は不活性化カセット(遺伝子不活性化)を含む修復マトリクスを用いる組換えの際に、遺伝子挿入又は遺伝子不活性化が起こる。B. 非相同性末端結合による遺伝子不活性化。メガヌクレアーゼによる切断の際に、DNA末端が分解され、非相同性末端結合(NHEJ)により再結合され、遺伝子不活性化が起こる。C. 遺伝子修正。変異はHPRT遺伝子内で起こる。メガヌクレアーゼによる切断及び修復マトリクスを用いる組換えにより、有害突然変異が修正される。D. エキソン配列ノックイン。変異はHPRT遺伝子内で起こる。変異mRNA転写産物は、遺伝子の下に示す。修復マトリクスにおいて、切断部位の下流に位置するエキソンを、(cDNA内で)フレーム内でポリアデニル化部位と融合させて、3'で転写を停止させる。イントロン及びエキソン配列は、相同領域として用い得る。エキソン配列ノックインは、機能的タンパク質をコードできるmRNAに転写される工学的に作製された遺伝子をもたらす。
【０１０２】
- 図4は、I-CreI N75足場タンパク質をコードするヌクレオチド配列、並びにUlib4及びUlib5ライブラリー構築のために用いる縮合プライマーの配列を表す。A. scaffolf (配列番号111)は、D75Nコドン置換、ATG開始コドンの後のアラニン(A)コドンの挿入、及び3'末端での3つの付加コドン(AAD)を含むI-CreI ORFである。B. プライマー(配列番号112、113、114)。
- 図5は、それぞれの標的を切断する変異体のパターン及び数の例を示す。A. プロファイリングの例。それぞれの新規エンドヌクレアーゼは、酵母において、配列C1221 (配列番号16; 図8B)からは±8位、±9位及び±10位が異なる図5Bのように配列した一連の64個のパリンドローム標的に対して、プロファイルされる。それぞれの標的配列を、-10,-9,-8トリプレットにちなんで命名する(10NNN)。例えば、GGGは、tcgggacgtcgtacgacgtcccga標的(配列122; 図8B)に対応する。メガヌクレアーゼは、64個の標的に対して4回試験する。I-CreI (D75)、I-CreI N75又は10個の派生変異型により切断される標的は、黒又は灰色の点で視覚化する。B. それぞれの標的を切断する変異型の数、及び切断の平均的な強さ。各配列は、-10,-9,-8トリプレット(10NNN)にちなんで命名される。各標的を切断するタンパク質の数を下に示し、灰色の着色のレベルは、酵母内でのこれらの切断者を用いて得られる平均シグナル強度に比例する。
【０１０３】
- 図6は、28位、30位、33位、38位及び／又は40位でのI-CreI変異型の切断パターンを示す。スクリーニング後に得られ、28位、30位、33位、38位、40位、70位及び75位での残基により定義される141個のI-CreI変異型のそれぞれについて、切断を、酵母内で、±8〜10位のヌクレオチドの置換により、I-CreIにより切断されるC1221パリンドローム標的に由来する64個の標的を用いてモニターした。標的は、-10位、-9位及び-8位のヌクレオチドの相当する3文字により示す。例えば、GGGは、tcgggacgtcgtacgacgtcccga標的(配列番号122)に相当する。値(箱で囲む)は、フィルタの走査後に適切なソフトウェアにより評価された切断強度に対応し、ここで(0)は切断がないことを示す。
- 図7は、標的に結合したI-CreIホモダイマー上での、タンパク質及びDNA標的での変異の局在化を表す。2組の変異(残基44、68及び70; 残基30、33及び38)を、左側のモノマー上に黒で示す。2組の変異は、空間的に明らかに異なる。しかし、異なるサブドメインについての構造的な証拠はない。DNA標的部位中の同族領域(領域-5〜-3; 領域-10〜-8)は、ハーフサイト上に灰色で示す。
【０１０４】
- 図8:  I-CreI誘導体標的の定義(A及びB)及びプロファイリング(C及びD)。全ての標的は、I-CreI野生型により切断されるパリンドローム標的であるC1221に由来し、A及びBの上に示す。A. 64個の標的の第1シリーズは、±5位〜±3位の突然変異誘発に由来する(灰色の箱内)。いくつかの例を下に示す。I-CreI残基44、68及び70との相互作用を示す。B. 64個の標的の第2位シリーズは、±10位〜±8位の突然変異誘発に由来する(灰色の箱内)。いくつかの例を下に示す。±8位、±9位及び±10位は、残基44、68及び70と接触しない。C. 図8Dでの標的の編制。左のパネルについて、表中の3文字は、-5位、-4位、-3位の塩基を示す(例えば、GGGはtcaaaacggggtaccccgttttga (配列番号115)を意味する)。右側のパネルについて、3文字は、-10位、-9位、-8位の塩基を示す(例えば、GGGはtcgggacgtcgtacgacgtcccga (配列番号122)を意味する)。D. プロファイリング。I-CreI N75 (QRR)を含むC1221を切断する10個のI-CreI変異型を、2組の64個の標的(左側に±5〜±3、右側に±10〜±8)を用いてプロファイルする。 標的は、図8Cのように整列させる。C1221標的(四角で囲む)が両方の組で見出される。変異体は、44位、68位及び70位で見出される残基に対応する3文字で同定され(例:QRRはQ44、R68、R70)、これらの全てはさらなるD75N変異を有する。
- 図9は、標的に結合したI-CreIホモダイマー上でのタンパク質及びDNA標的内の変異の局在化を示す。2組の変異(残基44、68及び70; 残基28、30、33、38及び40)は、左側のモノマー上に黒で示す。2組の変異は、空間的に明らかに異なっている。しかし、異なるサブドメインについての構造的な証拠はない。DNA標的部位中の同族の領域(領域-5〜-3; 領域-10〜-8)は、一方のハーフサイト上に灰色で示す。
【０１０５】
- 図10は、標的のHprCH3シリーズ及び近縁の誘導体を示す。10GAG_P、10CAT_P及び5CTT_P (配列番号17〜19)は、I-CreI変異体により切断されることが見出された近縁の誘導体である。これらは、C1221 (配列番号16)とは、箱で囲んだモチーフが異なる。C1221、10GAG_P、10CAT_P及び5CTT_Pは、まず24 bp配列として記載されたが、構造データは、22 bpのみがタンパク質/DNA相互作用に関連することを示唆する。しかし、±12位を括弧内に示す。HprCH3.2標的(配列番号20)において、標的の中間のatga配列を、C1221で見出される塩基であるgtacで置き換える。HprCH3.3 (配列番号21)は、HprCH3.2の左部分に由来するパリンドローム配列であり、HprCH3.4 (配列番号22)は、HprCH3.2の右部分に由来するパリンドローム配列である。図に示すように、10GAG_P、10CAT_P及び5CTT_Pからの箱で囲んだモチーフは、標的のHprCH3シリーズで見出される。
- 図11は、10NNN_P変異体によるHprCH3.3の切断を示す。図は、HprCH3.3標的を用いるI-CreIの1次スクリーニングの例を示す。陽性のクローンを箱で囲む。G1、H6及びH7の位置での陽性の変異体の配列は、それぞれKNDTQS/QRRDI (配列番号24)、KNTPQS/QRRDI (配列番号44)及びKNTTQS/QRRDI (配列番号45)である(表IIIについてと同じ命名法)。
【０１０６】
- 図12は、コンビナトリアル変異体によるHprCH3.4の切断を示す。この図は、HprCH3.4標的を用いるI-CreIコンビナトリアル変異体の1次スクリーニングの例を示す。A9及びB1の位置での陽性変異体の配列は、それぞれKNTHQS/RYSDN (配列番号54)及びKNSYQS/RYSNI (配列番号60)である(表IVについてと同じ命名法)。
- 図13は、ヘテロダイマーコンビナトリアル変異体によるHprCH3.2及びHprCH3の切断を示す。A. HprCH3.2標的を用いるI-CreI変異体の組み合わせの2次スクリーニング。B. HprCH3標的を用いる、I-CreI変異体の同じ組み合わせの2次スクリーニング。
- 図14は、HprCH3標的の切断を示す。HprCH3.4を切断する一連のI-CreI変異体を最適化し、HprCH3.3を切断する変異体と同時発現させた。切断は、HprCH3標的を用いて試験する。HprCH3の切断が向上した変異体を丸で囲む。示したフィルタにおいて、C9は、ヘテロダイマー28R,32S,33S,38Y,40Q,44R,68,70S,75N,77N (配列番号65) + 33H (配列番号32)に相当し、E6は28R,32S33S,38Y,40Q,44R,68A,70S,75H,77Y (配列番号66) + 33H (配列番号32)に相当し、F3は28K,32T,33H,38Q,40S,44K,68Y,70S,75D,77R,92R,96R,107R,132V,140A,143A (配列番号74) + 33H (配列番号32)に相当する。H11は、HprCH3.3, KNSHQS/QRRDI (配列番号32)を切断する変異体と同時発現させた元来のヘテロダイマー(HprCH3.4, KSSQQS/RYSDN (配列番号53) を切断する変異体)である。H12は、陽性対照である。
【０１０７】
- 図15は、HprCH3標的の切断を示す。HprCH3.3を切断する一連のI-CreI変異体を最適化し、HprCH3.4を切断する変異体と同時発現させた。切断は、HprCH3標的を用いて試験する。HprCH3の効率的な切断を示す変異体を、丸で囲む。最初のフィルタにおいて、B10は、ヘテロダイマー33H,71R,103I,129A及び130G (配列番号80) + 33T,38Y,44K,68Y,70S,75E及び77V (配列番号56)に相当する。2枚目のフィルタにおいて、H3は、ヘテロダイマー2I,33H,81V,86I,110G,131R,135Q,151A及び157V (配列番号79) + 33T,38Y,44K,68Y,70S,75E及び77V (配列番号56)に相当する。H12は、陽性対照である。
- 図16は、pCLS1055ベクターマップを示す。
- 図17は、pCLS0542ベクターマップを示す。
- 図18は、pCLS1107ベクターマップを示す。
【０１０８】
- 図19は、チャイニーズハムスター(Criteculus griseus)のHPRT遺伝子に存在するDNA標的配列、及び該DNA 標的を切断できる対応するI-CreI変異型を示す。DNA標的(列3)は、その最初のヌクレオチド(始点、列1)と最後のヌクレオチド(終点、列2)とで示す。位置は、HPRT mRNA配列(アクセッション番号J00060.1)に対して示す。それぞれのヘテロダイマー変異型の配列は、第1モノマー(列4)及び第2モノマー(列5)の記載する位置でのアミノ酸残基により定義される。例えば、図19の1つ目のヘテロダイマー変異型は、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位にそれぞれK、Q、D、Y、Q、S、N、K、S、R及びTを有する第1モノマーと、28位、30位、32位、38位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位にそれぞれK、N、S、G、C、S、Q、R、R、Nを有する第2モノマーとからなる。位置は、I-CreI配列SWISSPROT P05725又はpdbアクセッションコード1g9yを参照にして示す。I-CreIは、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位にそれぞれK、N、S、Y、Q、S、Q、R、R、D、Iを有する。記載しない位置は変異されておらず、よって、野生型I-CreI配列に相当する。
【０１０９】
- 図20は、哺乳動物細胞におけるレポーターシステムの設計を示す。開始コドンの132bp下流でI-SceI切断部位が割り込んでいるピューロマイシン耐性遺伝子は、EFIαプロモーターの制御下にある(1)。導入遺伝子は、CHO-K1細胞内にて、単一コピーで安定に発現される。同じ染色体の関係においてメガヌクレアーゼ標的部位を導入するために、修復マトリクスは、i) プロモーターレスハイグロマイシン耐性遺伝子と、ii) 完全lacZ発現カセットと、iii) 相同配列の2つの腕(1.1 kb及び2.3 kb)とで構成される。いくつかの修復マトリクスは、lacZ遺伝子に割り込んでいる認識部位のみを変更することにより構築されている(2)。つまり、非常に良く似た細胞株が、A1株化細胞、I-SceI株化細胞及びI-CreI株化細胞として作製されている。機能的lacZ遺伝子は、lacZ修復マトリクス(長さ2kb)が、認識部位を切断するメガヌクレアーゼを発現するベクターとともに同時トランスフェクションされたときに、復帰する(3)。メガヌクレアーゼ誘発組換えのレベルは、トランスフェクション後の青色のコロニー又は増殖巣(foci)の数から推定できる。
【０１１０】
- 図21は、哺乳動物細胞におけるI-CreI N75の発現用プラスミドであるpCLS1088のマップを表す。
- 図22は、HprCH3 DNA標的配列を切断するメガヌクレアーゼの切断効率を示す。LacZ遺伝子の修復の頻度は、HprCH3染色体レポーターシステムを含むCHO細胞を、修復マトリクスと、元の工学的に改変されたヘテロダイマー(HprCH3.3 / HprCH3.4)又はそれらのG19S誘導体(HprCH3.3 / HprCh3.4 G19S又はHprCH3.3 G19S / HprCh3.4)をコードする種々の量のメガヌクレアーゼ発現ベクターとでトランスフェクションした後に検出される。
【実施例】
【０１１１】
実施例1：ヌクレオチド±8〜±10 (10NNN)に対する新しい特異性を有する機能的エンドヌクレアーゼ
メガヌクレアーゼ変異型を作製する方法、及び特異性が変更された変異型をスクリーニングするために用いられる、哺乳動物又は酵母細胞での切断誘発組換えに基づくアッセイは、国際PCT出願WO 2004/067736; Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜2962; Chamesら, Nucleic Acids Res., 2005, 33, e178,及びArnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458に記載される。これらのアッセイは、標準的な方法によりモニターできる機能的LacZレポーター遺伝子をもたらす。
【０１１２】
A) 材料及び方法
a) 変異体ライブラリーの構築
I-CreI wt (I-CreI D75)、I-CreI D75N (I-CreI N75)及びI-CreI S70 N75のオープンリーディングフレームを、以前に記載されたようにして合成した(Epinatら, N.A.R., 2003, 31, 2952〜2962)。コンビナトリアルライブラリーは、一方のDNA標的ハーフサイトの±8〜10位の塩基との相互作用に関わる可能性がある残基(Q26, K28, N30, S32, Y33, Q38及びS40)の種々の組み合わせを置き換えることにより、I-CreI N75、I-CreI D75及びI-CreI S70 N75足場から誘導した。メガヌクレアーゼライブラリーの多様性は、選択された位置のそれぞれにてユニーク縮重コドンを有する縮重プライマーを用いるPCRにより、作製した。
【０１１３】
変異D75Nは、コドン75をaacで置き換えることにより導入した。次いで、N30位、Y33位及びQ38位(Ulib4ライブラリー)、又はK28位、N30位及びQ38位(Ulib5ライブラリー)での3つのコドンを、12個の異なるアミノ酸: A,D,E,G,H,K,N,P,Q,R,S,Tをコードする縮重コドンVVK (18個のコドン)で置き換えた。その結果、これらのタンパク質ライブラリーの最大(理論的)多様性は、123、すなわち1728であった。しかし、核酸の点では、多様性は、183、すなわち5832であった。
【０１１４】
BIOMETHODESに注文したLib4において、I-CreI N75足場の70位のアルギニンを、まず、セリンに置き換えた(R70S)。次いで、28位、33位、38位及び40位を無作為化した。通常のアミノ酸(K28、Y33、Q38及びS40)を、10個のアミノ酸(A,D,E,K,N,Q,R,S,T,Y)のうちの1つで置き換えた。得られたライブラリーは、タンパク質の点で、10000の理論的複雑さを有する。
さらに、2つの位置のみの無作為化により得られる225 (152)の複雑さの小さいライブラリーを、NVK縮重コドン(24コドン、アミノ酸ACDEGHKNPQRSTWY)を用いて、I-CreI N75又はI-CreI D75足場で構築した。
【０１１５】
所望の変異の組み合わせを有する断片を、10個、12個又は15個の異なるアミノ酸をコードする縮重プライマー対を用い、DNA鋳型としてI-CreI N75 (図4A)、I-CreI D75又はI-CreI S70 N75オープンリーディングフレーム(ORF)を用いるPCRにより得た。例えば、図4Bは、それぞれUlib4及びUlib5ライブラリーを作製するために用いた2つのプライマー対(Ulib456forとUlib4rev; Ulib456forとUlib5rev)を示す。対応するPCR産物を、LEU2栄養要求性マーカー遺伝子を有する酵母複製可能発現ベクターpCLS0542 (Epinatら, 既出; 図17)内で、I-CreI N75、I-CreI D75又はI-CreI S70 N75 ORFにクローニングして戻した。この2ミクロンベースの複製可能ベクターにおいて、I-CreI変異型は、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下にある。
【０１１６】
b) 標的クローンの構築
C1221に由来する64個のパリンドローム標的は、次のようにして構築した。オリゴヌクレオチド(ggcatacaagtttcnnnacgtcgtacgacgtnnngacaatcgtctgtca (配列番号109)と逆相補配列との64対を、Sigmaに注文し、アニールし、同じ向きでpGEM-T Easy (PROMEGA)にクローニングした。次いで、400 bpのPvuII断片を切り出し、pCLS0042ともよばれる、以前に記載された(Epinatら, 既出)酵母ベクターpFL39-ADH-LACURAZにクローニングして、64個の酵母レポーターベクター(標的プラスミド)を得た。
【０１１７】
c) 酵母株
メガヌクレアーゼ発現変異型の3つのライブラリーで、leu2変異体1倍体酵母株FYC2-6A: MATalpha, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200を形質転換した。(Gietz及びWoods, Methods Enzymol., 2002, 350, 87〜96)に由来するDNA 1μgあたり106個の独立した形質転換体を日常的に与える伝統的な化学／熱ショックプロトコルを、形質転換に用いた。個別の形質転換体(Leu+)クローンは、個別に96ウェルマイクロプレートに採取した。64個の標的プラスミドを、1倍体酵母株FYBL2-7B: MATa, ura3Δ851, trp1Δ63, leu2Δ1, lys2Δ202に同じプロトコルを用いて形質転換して、64個のテスター株を得た。
【０１１８】
d) メガヌクレアーゼ発現クローンの交配及び酵母でのスクリーニング
メガヌクレアーゼ発現クローンを、64個の標的株とそれぞれ交配させ、2倍体をベータ-ガラクトシダーゼ活性について、国際PCT出願WO 2004/067736; Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜2962; Chamesら, Nucleic Acids Res., 2005, 33, e178及びArnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458に以前に記載されたスクリーニングアッセイを用いることにより試験した。I-CreI変異型クローン、及び酵母レポーター株を、グリセロール(20%)中に貯蔵し、新しいマイクロプレートに複製した。交配は、コロニーグリッダー(QpixII, GENETIX)を用いて行った。変異体は、YPDプレートを覆うナイロンフィルタ上に、高密度(約20スポット/cm2)を用いてグリッドした。2回目のグリッド手順は、同じフィルタ上に、それぞれの変異型について64個の異なるレポーター含有酵母株からなる第2層をスポットして行った。メンブレンを、固形アガロースYEPDリッチ培地上に置き、30℃にて一晩インキュベートして、交配を可能にした。次いで、フィルタを、ロイシン及びトリプトファンを欠き、ガラクトース(1%)を炭素源として(及び同時発現実験についてはG418も)含有する合成培地に移し、37℃にて5日間インキュベートして、発現ベクター及び標的ベクターを有する2倍体を選択した。5日後に、フィルタを、0.5 Mリン酸ナトリウムバッファー、pH 7.0中の0.02 % X-Gal、0.1 % SDS、6 %ジメチルホルムアミド(DMF)、7 mM β-メルカプトエタノール、1%アガロースを含む固形アガロース培地上に置き、37℃にてインキュベートして、β-ガラクトシダーゼ活性をモニターした。2日間のインキュベーションの後に、陽性クローンを、走査により同定し、クローンのβ-ガラクトシダーゼ活性は、適切なソフトウェアを用いて定量した。
【０１１９】
少なくとも1つの標的に対する活性を示すクローンを単離し(1次スクリーニング)、それぞれの陽性クローンは、64個のレポーター株に対して4重で試験することにより、完全なプロフィールを作製した(2次スクリーニング)。
【０１２０】
c) 配列
酵母での第1及び／又は第2スクリーニングの間に同定された陽性クローンのオープンリーディングフレーム(ORF)を、PROLIGOからのプライマー: PCR-Gal10-F (gcaactttagtgctgacacatacagg, 配列番号48)及びPCR-Gal10-R (acaaccttgattgcagacttgacc, 配列番号49)を用いて酵母コロニー上でPCRにより増幅した。簡単に、酵母コロニーを採取し、100μlのLGlu液体培地に再懸濁し、一晩培養する。遠心分離後に、酵母ペレットを10μlの滅菌水に再懸濁し、1.5μlの各特異的プライマー(100 pmol/μl)を含有する最終容量50μl中でPCR反応を行うために用いる。PCR条件は、94℃にて10分間の変性の1サイクル、94℃にて30秒間の変性、55℃にて1分間のアニーリング及び72℃にて1.5分間の伸長の35サイクル、並びに5分間の最終の伸長であった。配列決定は、PCR産物上で直接、MILLEGENにより行った。
【０１２１】
d) 構造解析
タンパク質構造の全ての解析は、Pymolを用いて行った。I-CreIからの構造は、pdbエントリー1g9yに相当する。テキスト中の残基の番号付けは、残基の番号が第1ドメインについて設定されているホモダイマーの第2 I-CreIタンパク質ドメインの残基を除いて、常に、これらの構造を参照する。
【０１２２】
B) 結果
I-CreIは、22 bpの偽パリンドローム標的を切断するダイマーホーミングエンドヌクレアーゼである。その天然の標的に結合したI-CreIの構造解析により、各モノマーにおいて、8残基が7塩基と直接の相互作用を確立することが示されている(Juricaら, 1998, 既出)。これらの構造データによると、±8〜10位のヌクレオチドの塩基が、I-CreIのアミノ酸N30、Y33、Q38と直接の接触を確立し、I-CreIのアミノ酸K28及びS40と間接的に接触している。つまり、30位、33位及び38位に変異を有する新規タンパク質は、I-CreIにより切断されるパリンドローム標的の±8位、±9位及び±10位の置換により得られた64個の標的(10NNN標的)との新規な切断プロフィールを示し得る。さらに、変異は、DNA塩基との直接の接触に関わる残基の数及び位置を変更するだろう。より具体的には、30位でも33位でも38位でもない位置であるが、折り畳まれたタンパク質の近傍にある位置は、同じ塩基対との相互作用に関わり得る。
【０１２３】
網羅的なタンパク質ライブラリー対標的ライブラリーアプローチを用いて、DNA結合界面のこの部分を局所的に工学的に改変した。5アミノ酸の位置の無作為化により、205 = 3.2×106の理論的多様性が導かれるだろう。しかし、より低い多様性のライブラリーを、それぞれ2、3又は4残基を無作為化することにより作製し、225 (152)、1728 (123)又は10,000 (104)の多様性を得た。この方策により、以前に記載された酵母ベースのアッセイを用いて(Epinatら, 2003, 既出及び国際PCT出願WO 2004/067736)、64個のパリンドローム10NNN DNA標的に対するこれらのライブラリーのそれぞれの広範なスクリーニングが可能になった。
【０１２４】
まず、I-CreI足場を、D75からNに変異させた。D75N変異は、タンパク質構造に影響しなかったが、過剰発現実験においてI-CreIの毒性を低減した。
次に、Ulib4ライブラリーを構築した。残基30、33及び38を無作為化し、通常のアミノ酸(N30、Y33及びQ38)を、12アミノ酸(A,D,E,G,H,K,N,P,Q,R,S,T)の1つで置き換えた。得られたライブラリーは、タンパク質の点で1728の複雑さを有する(核酸の点で5832)。
次いで、2つの他のライブラリー、Ulib5及びLib4を構築した。Ulib5において、残基28、30及び38を無作為化し、通常のアミノ酸(K28、N30及びQ38)を、12アミノ酸(ADEGHKNPQRST)の1つで置き換えた。得られたライブラリーは、タンパク質の点で1728の複雑さを有する(核酸の点で5832)。Lib4において、70位のアルギニンを、まず、セリンで置き換えた。次いで、28位、33位、38位及び40位を無作為化し、通常のアミノ酸(K28、Y33、Q38及びS40)を、10アミノ酸(A,D,E,K,N,Q,R,S,T,Y)の1つで置き換えた。得られたライブラリーは、タンパク質の点で10000の複雑さを有する。
【０１２５】
1次スクリーニング実験において、Ulib4からの20000クローン、Ulib5からの10000クローン及びLib4からの20000クローンを、64個のテスター株のそれぞれと交配させ、2倍体を、ベータ-ガラクトシダーゼ活性について試験した。64個の標的のうちの少なくとも1つとの切断活性を示す全てのクローンを、4重で、64個の標的に対して2回目のスクリーニングで試験し、それぞれの切断プロフィールを図5に示すように確立した。次いで、メガヌクレアーゼORFを、PCRにより各株から増幅し、配列決定した。
【０１２６】
2次スクリーニング及び陽性をコード領域全体について配列決定した後に、少なくとも1つの標的に対して切断活性を示す、合計で1484個のユニーク変異体が単離された。異なるパターンが観察できた。図6は、I-CreIにより切断されない34個の標的と、I-CreIにより切断される3個の標的(aag, aat及びaac)を含む、141個の変異型の集団により切断される37個の新規標的を示す。I-CreI N75及びI-CreI D75を含むプロフィールの12個の例を、図5Aに示す。これらの新しいプロフィールのいくつかは、野生型足場といくらかの類似性を有していたが、その他の多くは全く異なっていた。ホーミングエンドヌクレアーゼは、それらの標的配列におけるいくらかの縮重に通常は対応でき、I-CreI及びI-CreI N75タンパク質は、それら自体が、それぞれ一連の16個及び3個の標的を切断する。切断の縮重性は、新規なエンドヌクレアーゼの多くについて見出され、変異体あたり平均で9.9個の標的が切断された(標準偏差：11)。しかし、同定された1484個の変異体のうち、219個(15 %)が1つのDNA標的のみを切断し、179個(12 %)が2つを切断し、169個(11 %)及び120個(8 %)がそれぞれ3及び4つの標的を切断することが見出された。つまり、それらの好ましい標的に関わらず、著しい数のI-CreI誘導体が、I-CreI N75変異体(3つの10NNN標的配列が切断される)、又はI-CreI (16個の10NNN標的配列が切断される)のものより高くないとしても類似の特異性レベルを示す。また、10NNN配列についての特異性が変更されたことについて単離された変異体の大多数が、元来のC1221標的配列をもはや切断しない(それぞれ61%及び59%)。
【０１２７】
まとめると、変異体のこの大きい集団は、±10位、±9位及び±8位で異なる64個の可能性のあるDNA配列の全てのターゲティングを可能にする(図5B)。しかし、各標的を切断する変異体の数には大きい変動があり(図5B)、これらの数は、3〜936の範囲で、平均228.5であった(標準偏差：201.5)。切断は、±8位にグアニンを有するか、±9位にアデニンを有する標的について頻繁に観察されたが、±10又は±8のシトシンは、切断するものの数が低かった。さらに、全ての標的は、同じ効率では切断されなかった。変異体に依存して、シグナルの著しい変動が同じ標的について観察できたので(例えば図5B の野生型10AAA標的についての切断効率を比較されたい)、平均切断効率を、以前に報告されたようにして各標的について測定した(Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458)。これらの平均効率は、図5Bで灰色のレベルにより表す。結果の分析は、この平均効率と切断者の数との間に明確な相関関係を示し、最も頻繁に切断される標的は、最も効率的に切断されるものでもある(図5Bにおいて、例えば10TCN、10CTN及び10CCN標的を、10GAN、10AAN及び10TANと比較されたい)。
【０１２８】
つまり、新規な基質特異性を有する変異体を含む数百の新規な変異型が得られた。これらの変異型は、高レベルの活性を維持でき、新規なタンパク質の特異性は、その標的について野生型タンパク質のものよりもさらに狭いことが可能である。
【０１２９】
実施例2：2つのI-CreI機能的サブドメインは、DNA結合の点で独立して挙動できる。
この実施例は、I-CreI標的を、異なるサブドメインと結合し、独立して挙動する2つの部分に分けることができることを示す。I-CreI DNA標的において、±5位、±4位及び±3位には、残基44、68及び70が結合する。44位、68位、70位及び75位で変異した、実施例1に記載されるいくつかのI-CreI変異型は、I-CreI野生型により切断されるパリンドローム標的である(Chevalier, et al., 2003)C1221に対して検出可能な活性を示すことが示されたが、その他の標的を多様な効率で切断した。結合部位の外の部分において、±9位及び±8位は、残基30、33及び38と接触する。図7に示すように、2組の残基がタンパク質の異なる部分にある。±8の塩基との直接接触はない。±5位〜±3位及び±10位〜±8位に、2つの異なる独立した機能的サブドメインが結合するならば、1つのサブドメインの工学的改変は、他方のドメインの結合特性に影響しないはずである。
±5位〜±3位及び±9位〜±8位に、2つの異なる独立した機能的サブドメインが結合するかを決定するために、±5〜±3領域での特異性が変更されているがC1221にまだ結合する変異体を、±10〜±8領域でのそれらの切断特性についてアッセイした。
【０１３０】
A) 材料及び方法
a) 構造解析
実験手順は、実施例1のとおりである。
【０１３１】
b) I-CreI変異型発現酵母株
変異体を、実施例1に記載されるようにして、44位、68位、70位及び75位を変異させ、C1221由来標的を切断できるクローンをスクリーニングすることにより作製した。変異体を発現するプラスミドで、S. cerevisiae FYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を形質転換する。
【０１３２】
c) 標的クローンの構築
±5〜±3での変異によりC1221から導いた64個のパリンドローム標的プラスミドを、実施例1に記載されるようにして、64対のオリゴヌクレオチド(ggcatacaagtttcaaaacnnngtacnnngttttgacaatcgtctgtca (配列番号110)及び逆相補配列)を用いて構築した。64個の標的プラスミドで、実施例1に記載されるプロトコルを用いて、1倍体酵母FYBL2-7B株: MATa, ura3Δ851, trp1Δ63, leu2Δ1, lys2Δ202を形質転換して、64個のテスター株を得た。
【０１３３】
d) メガヌクレアーゼ発現クローンの交配と、酵母でのスクリーニング
交配は、実施例1に記載されるようにして、低格子密度(gridding density) (約4スポット/cm2)を用いて行った。
【０１３４】
B) 結果
C1221に由来する全ての可能なパリンドローム標的に相当する64個の標的を、図8Bに示すようにして、±10〜±8の塩基の突然変異誘発により構築した。I-CreI N75切断プロフィールが確立され、aaa及びaat標的との強いシグナルと、aag標的とのより弱いシグナルを示した。
【０１３５】
図8Cに示すように、±5〜±3で明らかに異なる切断プロフィールを有するタンパク質、例えばQAR、QNR、TRR、NRR、ERR及びDRRは、±10〜±8において類似のプロフィールを有する。±10〜±8でのaaa配列はC1221標的に相当し、C1221を切断する全ての我々の変異型により必ず切断される。aatも、ほとんどの変異体で切断されるが(90%)、aagではしばしば観察されず、これは、おそらく、わずかな切断者ではシグナルが検出レベル未満に落ちるからであろう。他の標的は全く切断されない。これらの結果は、±5〜±3及び±10〜±8の領域に、2つの異なる、ほとんど独立した結合ユニットが結合することを示す。
【０１３６】
実施例3：HPRT遺伝子からの標的を切断する新規なメガヌクレアーゼを工学的に作製する方策
A) 仕立てられた特異性を有する新規なメガヌクレアーゼを設計するためのコンビナトリアルアプローチの原理
ここでの目的は、I-CreI DNA結合界面で、分けることができる機能的サブドメインを、新規なDNA標的を切断するために組み合わせることが可能であるかを決定することである。
C1221標的配列の2つの異なる領域(10NNN (-10位〜-8位及び+8位〜+10位：±8〜10又は±10〜8；実施例1)及び5NNN (-5位〜-3位及び+3位〜+5位：±3〜5又は±5〜3; Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458, 国際出願WO 2006/097784及びWO 2006/097853)に対する切断特異性を変更するI-CreIコード配列における変異の異なる群の同定は、これらの2つの群の変異体を分子間で組み合わせて、位置10NNN及び5NNNで同時に変更された標的配列(図1C)を切断できるコンビナトリアル変異体を作製する可能性を上昇させる。
【０１３７】
一方で28位、30位、33位、38位及び40位、他方で44位、68位及び70位は、同じDNA結合折り畳みに存在するが、これらが独立して挙動するとの構造的な証拠はない。しかし、2組の変異は、DNA標的の異なる領域の周囲に位置するこの折り畳みの2つの空間的に異なる領域に明確に存在する(図7及び9)。さらに、一連の変異体の蓄積された影響は、最終的に折り畳みを混乱させ得る。これらが2つの独立した機能的サブユニットの一部分であるかを確認するために、これらの2組の変異体からの変異を組み合わせ、得られた変異型が、組み合わせた標的配列を切断する能力をアッセイした(図1D)。
【０１３８】
よって、4つの切断された5NNN及び10NNN標的のパッチワークであり得る非パリンドローム標的配列を同定する。さらに、パリンドロームの形の左半分及び右半分を表す2つの派生標的配列が設計される。パリンドローム標的を標的にできる適切なI-CreIコンビナトリアル変異体を作製するために、それぞれのパリンドローム配列の10NNN及び5NNN部分を効率的に切断する変異体を選択し、それらの特徴的な変異を、酵母でのインビボクローニングにより、同じコード配列内に取り込んだ。
【０１３９】
本文及び図を通して、コンビナトリアル変異体配列は、11文字コードを用いて、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位及び70位、75位及び77位での残基にちなんで命名する。例えば、KNSTYS/KYSEVは、I-CreI K28, N30, S32, T33, Y38, S40, K44, Y68, S70, E75及びV77 (I-CreI 28K, 30N, 32S, 33T, 38Y, 40S, 44K, 68Y, 70S, 75E及び77V)のことである。親の対照は、6文字コードを用いて、28位、30位、32位、33位、38位及び40位での残基にちなんで、又は5文字コードを用いて、44位、68位、70位、75位及び77位の残基にちなんで命名する。例えば、KNSTYSは、I-CreI 28K, 30N, 32S, 33T, 38Y及び40Sのことであり、KYSEVは、-CreI 44K, 68Y, 70S, 75E及び77Vのことである。
【０１４０】
これらの実施例に記載される全ての標的配列は、22又は24 bpのパリンドローム配列である。よって、これらは、最初の11又は12ヌクレオチドと、その後の接尾辞_Pとによってのみ記載される。例えば、I-CreIタンパク質により切断される標的5' tcaaaacgtcgtacgacgttttga 3' (配列番号16)は、tcaaaacgtcgt_Pとよばれる。
【０１４１】
B) チャイニーズハムスターのHPRT遺伝子からの標的を切断する新規なメガヌクレアーゼの設計
このコンビナトリアルアプローチは、I-CreIメガヌクレアーゼのDNA結合ドメインを工学的に改変し、Criteculus griseusのHPRT遺伝子を切断するために用いた。
HprCH3は、Criteculus griseus (チャイニーズハムスター)のHPRT遺伝子のエキソン3 (17位〜38位)に位置する22 bp (非パリンドローム)標的である(図2)。この標的配列は、mRNAの241位〜262位に相当する(アクセッション番号J00060; 配列番号15; 図2)。
【０１４２】
HPRT遺伝子座に異種遺伝子を挿入して、脊椎動物組換え株化細胞又はトランスジェニック動物における再現可能な遺伝子発現レベルを可能にするか、或いはHPRT遺伝子を不活性化して、脊椎動物組換え株化細胞又はトランスジェニック動物の選択を可能にするためのいずれかに、HprCH3を切断するメガヌクレアーゼを用いることができる(図3A及び3B)。
【０１４３】
HprCH3配列は、国際PCT出願WO 2006/097784及びWO 2006/097853; Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458; 実施例1に記載されるようにして得られた、以前に同定されたメガヌクレアーゼにより切断される10GAG_P、10CAT_P及び5CTT_P標的(図10)の部分的にパッチワークである。つまり、HprCH3は、これらの以前に同定されたメガヌクレアーゼから得られるコンビナトリアル変異体により切断され得る。
10GAG_P、10CAT_P及び5CTT_P標的配列は、I-CreIにより切断されるパリンドローム配列であるC1221の24 bp誘導体である(Arnouldら, 既出)。しかし、そのDNA標的に結合したI-CreIの構造は、これらの標的の2つの外の塩基対(-12位及び12位)が、結合及び切断に対して影響を有さないことを示唆し(Chevalierら, Nat. Struct. Biol., 2001, 8, 312〜316; Chevalier及びStoddard, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757〜3774; Chevalierら, J. Mol. Biol., 2003, 329, 253〜269)、この研究において、-11位〜11位を考慮した。結局、標的のHprCH3シリーズを、24 bpではなく22 bp配列として同定した。HprCH3は、C1221とは、4 bpの中央領域が異なる。標的に結合したI-CreIタンパク質の構造によると、4つの中央の塩基対(-2位〜2位)とI-CreIタンパク質との間に接触はない(Chevalierら, Nat. Struct. Biol., 2001, 8, 312〜316; Chevalier及びStoddard, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757〜3774; Chevalierら, J. Mol. Biol., 2003, 329, 253〜269)。つまり、これらの位置の塩基は、結合効率に影響しないはずである。しかし、これらは切断に影響でき、これはこの領域の端での2つのニックに起因する。つまり、-2〜2のatga配列を、まず、C1221からのgtac配列で置き換え、標的HprCH3.2を得た(図10)。次いで、2つのパリンドローム標的HprCH3.3及びHprCH3.4を、HprCH3.2から導いた(図10)。HprCH3.3及びHprCH3.4はパリンドロームであるので、これらは、ホモダイマータンパク質により切断されるはずである。よって、ホモダイマーとしてHprCH3.3及びHprCH3.4配列を切断できるタンパク質を、まず設計し(実施例4及び5)、次いで、同時発現させて、HprCH3を切断するヘテロダイマーを得た(実施例6)。HprCH3.2及びHprCH3標的を切断するヘテロダイマーが同定できる。HprCH3標的についての切断活性を向上させるために、HprCH3.3及びHprCH3.4を切断する一連の変異体を選択し、次いで、洗練した。選択された変異体は、無作為に突然変異誘発し、これを用いて新規なヘテロダイマーを形成し、これをHprCH3標的に対してスクリーニングした(実施例7及び8)。HprCH3標的についての切断活性が向上されたヘテロダイマーを同定できた。
【０１４４】
実施例4：HprCH3.3を切断するメガヌクレアーゼの同定
この実施例は、I-CreI変異体が、パリンドロームの形のHprCH3.2標的の左半分に由来するHprCH3.3 DNA標的配列を切断できることを示す(図10)。この実施例に記載される標的配列は22 bpパリンドローム配列である。よって、これらは、最初の11ヌクレオチドと、その後の接尾辞_Pによってのみ記載される(例えば、標的HprCH3.3は、cgagatgtcgt_P (配列番号21)と表される)。
HprCH3.3は、±6位以外の全ての位置において10GAG_Pに類似する。±6位が、結合及び切断活性にほとんど影響しないと仮定された。10GAG_P標的を切断できる変異体を、I-CreI又はI-CreI S70 N75の、28位、30位、32位、33位、38位、40位での突然変異誘発により、実施例1に記載されるようにして得た。これらの変異体のスクリーニングにより、HprCH3.3標的を切断するメガヌクレアーゼの同定が可能になるだろう。
【０１４５】
A) 材料及び方法
a) 標的ベクターの構築
標的は、次のようにしてクローニングした。ゲートウェイクローニング配列と接する標的配列に相当するオリゴヌクレオチドを、PROLIGOから購入した: 5'tggcatacaagtttcgagatgtcgtacgacatctcgacaatcgtctgtca3' (配列番号23)。一本鎖オリゴヌクレオチドのPCR増幅により作製した二本鎖標的DNAを、Gatewayプロトコル(INVITROGEN)を用いて、酵母レポーターベクターにクローニングした(pCLS1055, 図16)。酵母レポーターベクターで、Saccharomyces cerevisiae FYBL2-7B株(MAT a, ura3Δ851, trp1Δ63, leu2Δ1, lys2Δ202)を形質転換して、レポーター株を得た。
【０１４６】
b) メガヌクレアーゼ発現クローンの交配及び酵母でのスクリーニング
10GAG_Pを切断するI-CreI変異体は、実施例1に記載するように、以前に同定された。これらの変異体は、S. cerevisiae FYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)中の酵母発現プラスミド(pCLS0542, 図17)上に存在した。
メガヌクレアーゼ発現クローンを、レポーター株と交配させ、二倍体を、低格子密度(約4スポット/cm2)を用いて、実施例1に記載するようなスクリーニングアッセイを用いることにより、ベータ-ガラクトシダーゼ活性について試験した。
【０１４７】
c) 変異体の配列決定
実験手順は、実施例1に記載したとおりである。
【０１４８】
B) 結果
10GAG_Pを切断できるI-CreI変異体を、HprCH3.3 DNA標的(cgagatgtcgt_P; (配列番号21)に対する切断についてスクリーニングした。38個の陽性クローンが見出され、2次スクリーニングによる配列決定及び確認の後に、表IIIに列挙する24個の変異体を同定した。陽性の例を、図11に示す。
【０１４９】
【表３】
0005453097.tif 000005
【０１５０】
実施例5：HprCH3.4を切断するメガヌクレアーゼの作製
この実施例は、I-CreI変異体が、パリンドローム形のHprCH3.2標的(図10)の右半分に由来するHprCH3.4 DNA標的配列を切断できることを示す。本実施例に記載する全ての標的配列は、22 bpパリンドローム配列である。よって、これらを、最初の11ヌクレオチドと、その後の接尾辞_Pによってのみ記載する(例えば、HprCH3.4は、ccatctcttgt_Pとよばれる; 配列番号22)。
【０１５１】
HprCH3.4は、±1位、±2位、±3位、±4位、±5位及び±11位にて5CTT_Pに、そして±1位、±2位、±8位、±9位、±10位及び±11位にて10CAT_Pに類似する。±6位及び±7位は、結合及び切断活性にほとんど影響しないと仮定した。5CTT_P (caaaaccttgt_P; 配列番号19)を切断できる変異体を、以前に記載されるようにして(国際PCT出願WO 2006/097784及びWO 2006/097853; Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458)、I-CreI N75を44位、68位及び70位にて、又はI-CreI S70を44位、68位、75位及び77位にて突然変異誘発することにより得た。10CAT_P標的(ccatacgtcgt_P; 配列番号18)を切断できる変異体を、I-CreI (D75)を、実施例1に記載されるようにして、30位、32位、33位及び38位にて突然変異誘発することにより得た。つまり、このような変異体の対を組み合わせることにより、HprCH3.4標的の切断が可能になる。よって、組み合わせた変異体がHprCH3.4標的を切断できるかを確かめるために、5CTT_Pを切断するタンパク質からの44位、68位、70位、75位及び77位のアミノ酸を、10CAT_Pを切断するタンパク質からの30位、32位、33位及び38位のアミノ酸と組み合わせた。
【０１５２】
A) 材料及び方法
a) 標的ベクターの構築
実験手順は、実施例4に記載されるとおりである。
【０１５３】
b) コンビナトリアル変異体の構築
10CAT_P又は5CTT_Pを切断するI-CreI変異体は、国際PCT出願WO 2006/097784及びWO 2006/097853; Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458、並びに実施例1に記載されるように、以前に同定された。両方のシリーズからの変異を含有するI-CreI由来コード配列を作製するために、I-CreIコード配列の5'末端(aa 1位〜43位)又は3'末端(39位〜167位)を増幅する別々のオーバーラップPCR反応を行った。5'及び3'末端の両方について、PCR増幅を、ベクター(pCLS0542, 図11)に特異的なプライマー(Gal10F 5'-gcaactttagtgctgacacatacagg-3' (配列番号48)又はGal10R 5'-acaaccttgattggagacttgacc-3' (配列番号49)と、プライマー(assF 5'-ctannnttgaccttt-3' (配列番号50)又はassR 5'-aaaggtcaannntag-3'(配列番号51) (nnnは、残基40をコードする)とを用いて行う。同じプライマーを用い、かつ残基40について同じコード配列を用いて達成された、増幅反応により得られるPCR断片をプールした。次いで、プライマーGal10F及びassR、又はassF及びGal10Rを用いる反応から得られるPCR断片の各プールを、等モル比で混合した。最後に、2つのオーバーラップPCR断片のそれぞれの最終プール約25 ngと、DraIII及びNgoMIVを用いる消化により線状にしたベクターDNA (pCLS1107, 図18) 75 ngとを用いて、酵母Saccharomyces cerevisiae FYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を、高効率のLiAc形質転換プロトコル(Gietz及びWoods, Methods Enzymol., 2002, 350, 87〜96)を用いて形質転換した。両方の群の変異を含むインタクトなコード配列を、酵母でのインビボ相同組換えにより作製する。
【０１５４】
c) メガヌクレアーゼ発現クローンの交配及び酵母でのスクリーニング
実験手順は、実施例4に記載されるとおりである。
d) 変異体の配列決定
実験手順は、実施例4に記載されるとおりである。
【０１５５】
B) 結果
本実施例で用いた10CAT_P標的又は5CTT_P標的を切断するI-CreI変異体を、表IVに列挙する。I-CreI組み合わせ変異体は、I-CreI足場上に、5CTT_P標的を切断する変異体からの44位、68位、70位、75位及び77位のアミノ酸を、10CAT_P標的を切断する変異体からの30位、32位、33位及び38位のアミノ酸と結合させることにより構築して(表IV)、480の複雑さを有するライブラリーを得た。このライブラリーで酵母を形質転換し、1728個のクローン(多様性の3.6倍)を、HprCH3.4 DNA標的(ccatctcttgt_P; 配列番号22)に対する切断についてスクリーニングした。10個の陽性クローンを見出し、配列決定及び2次スクリーニングによる確認の後に、9個のコンビナトリアル変異体を同定した(表IV)。変異体は、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位のアミノ酸残基に相当する11文字コードにより表す。例えば、KNSTYS/KYSEVは、I-CreI K28, N30, S32, T33, Y38, S40, K44, Y68, S70, E75及びV77 (配列番号56)のことである。
【０１５６】
これらの9個の変異体のうち、4つは、2つの親の分子の真の組み合わせに相当したが(表IV; 配列番号52〜55)、他の5つは28位、30位、32位、33位、38位、40位又は44位、68位、70位、75位、77位にて親の組み合わせではない組み合わせを示した。これらの5つの変異体は：
- KNSTYS/KYSEV (配列番号56)
- KNRDQS/KYSDR (配列番号57)
- KNSSDS/KYSDR (配列番号58)
- KNTHQS/KYSNR (配列番号59)
- KNSYQS/RYSNI (配列番号60)
このような変異体は、形質転換プロセスの間の、類似のPCR断片同士の間での組換えに起因するようである。陽性の例を、図12に示す。
【０１５７】
【表４−１】
0005453097.tif 000006
【０１５８】
【表４−２】
0005453097.tif 000007
【０１５９】
実施例6: HprCH3.2及びHprCH3を切断するメガヌクレアーゼの作製
パリンドロームHprCH3由来標的(HprCH3.3及びHprCH3.4)のそれぞれを切断できるI-CreI変異体を、実施例4及び実施例5で同定した。このような変異体の対(HprCH3.3を切断するもの1つと、HprCH3.4を切断するもの1つ)を、酵母で同時発現させた。同時発現の際に、3つの活性分子種、すなわち2つのホモダイマーと1つのヘテロダイマーとが存在するはずである。形成されるはずのヘテロダイマーがHprCH3及びHprCH3.2標的を切断するかをアッセイした。
【０１６０】
A) 材料及び方法
a) 変異体同時発現
実験手順は、国際PCT出願WO 2006/097854及びArnouldら J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458に記載されるとおりである。
簡単に、酵母DNAを、HprCH3.4標的を切断する変異体から、標準的なプロトコルを用いて抽出し、E. coliを形質転換するために用いた。得られたプラスミドDNAを用いて、次いで、HprCH3.3標的を切断する変異体を発現する酵母株を形質転換した。形質転換体を、-L Glu + G418培地で選択した。
【０１６１】
b) メガヌクレアーゼ同時発現クローンの交配及び酵母でのスクリーニング
実験手順は、低格子密度(約4スポット/cm2)を用いた以外は、実施例4に記載されるとおりである。
【０１６２】
B) 結果:
HprCH3.3配列及びHprCH3.4配列を切断する変異体の同時発現により、ほとんどの場合、HprCH3.2標的が効率的に切断された(図13A)。さらに、これらの組み合わせのいくつかが、-1位、-2位、1位及び2位にてHprCH3.2配列とは4 bp異なるHprCH3天然標的を切断できた(図13B)。機能的組み合わせを、表V及び表VIにまとめる。
【０１６３】
【表５】
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【０１６４】
【表６】
0005453097.tif 000009
【０１６５】
実施例7: HprCH3を切断するメガヌクレアーゼの、HprCH3.4を切断するタンパク質のランダム突然変異誘発、及びHprCH3.3を切断するタンパク質との組み立てによる改良
パリンドロームHprCH3.3及びHprCH3.4標的を切断する変異体の組み立てにより、HprCH3.2及びHprCH3標的を切断できるI-CreI変異体を、実施例4で以前に同定した。しかし、これらの変異体は、HprCH3標的に比較して、HprCH3.2標的とより強い活性を示す。
【０１６６】
よって、HprCH3を切断するコンビナトリアル変異体に突然変異を誘発し、この標的のより強い切断を示す変異型をスクリーニングした。その標的に結合したI-CreIタンパク質の構造によると、4つの中央の塩基対(-2位〜2位)とI-CreIタンパク質との間に接触はない(Chevalierら, Nat. Struct. Biol., 2001, 8, 312〜316; Chevalier及びStoddard, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757〜3774; Chevalierら, J. Mol. Biol., 2003, 329, 253〜269)。つまり、突然変異を誘発する位置の組を合理的に選択するのは困難であり、突然変異誘発を、タンパク質全体に対して行った。ランダム突然変異誘発は、高い複雑さのライブラリーをもたらす。よって、試験される変異型ライブラリーの複雑さを制限するために、HprCH3を切断するヘテロダイマーの2つの成分の一方のみに突然変異を誘発した。
よって、最初の工程において、HprCH3.4を切断するタンパク質に突然変異を誘発し、第2工程において、これらがHprCH3.3を切断するタンパク質と同時発現されたときに、HprCH3を切断できるかについて評価した。
【０１６７】
A) 材料及び方法
a) ランダム突然変異誘発によるライブラリーの構築
ランダム突然変異誘発を、選択された変異体のプールに対して、Mn2+を用いるPCR、又はJBS dNTP-MutagenisキットについてのJena Bioscience GmbHからのプロトコルに記載されるようなdNTP誘導体である8-オキソ-dGTP及びdPTPを用いる2ステップPCRプロセスにより行った。用いたプライマーは、preATGCreFor (5'-gcataaattactatacttctatagacacgcaaacacaaatacacagcggccttgccacc-3': 配列番号61)及びICreIpostRev (5'-ggctcgaggagctcgtctagaggatcgctcgagttatcagtcggccgc-3': 配列番号62)であった。約25 ngのPCR産物、並びにDraIII及びNgoMIVでの消化により線状にした75 ngのベクターDNA (pCLS1107, 図18)を用いて、酵母Saccharomyces cerevisiae FYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を、高効率のLiAc形質転換プロトコル(Gietz及びWoods, Methods Enzymol., 2002, 350, 87〜96)を用いて形質転換した。I-CreI変異体についてのインタクトなコード配列を含む発現プラスミドを、酵母でのインビボ相同組換えにより作製した。
【０１６８】
b) 変異体-標的酵母株、スクリーニング及び配列決定
酵母レポーターベクター(pCLS1055, 図16)内にHprCH3標的を含有する酵母株FYBL2-7B (MAT a, ura3Δ851, trp1Δ63, leu2Δ1, lys2Δ202)を、ロイシンベクター(pCLS0542)中の、HprCH3.3標的を切断する変異体で、高効率のLiAc形質転換プロトコルを用いて形質転換した。変異体-標的酵母を、実施例4に記載されるような交配アッセイのための標的株として用いた。得られた陽性クローンを、実施例4に記載されるようにして配列決定(MILLEGEN)により確認した。
【０１６９】
B) 結果:
HprCH3.4を切断する4つの変異体(I-CreI 32T,33H,44K,68Y,70S,75N,77R、I-CreI  30S,33Q,44R,68Y,70S,77N、I-CreI 32T,33H,70S,75H,77Y及びI-CreI 32T,33H,68N,70S,75Q,77R、表IVの命名法によるとKNTHQS/KYSNR, KSSQQS/RYSDN, KNTHQS/QRSHY及びKNTHQS/QNSQRともよばれる; 配列番号59、53、63及び64)をプールし、ランダム突然変異誘発し、酵母を形質転換した。1140個の形質転換クローンを、次いで、(i) レポータープラスミド中にHprCH3標的、(ii) HprCH3.3標的(I-CreI 33H、すなわちKNSHQS/QRRDI; 配列番号32)を切断する変異体を含有する発現プラスミドを含有する酵母株と交配した。この酵母株と交配させた後に、23個のクローンが、HprCH3標的を、元の変異体よりも効率的に切断することが見出された。つまり、23個の陽性クローンが、HprCH3標的についての強い切断活性を有するKNSHQS/QRRDIとのヘテロダイマーを形成できる。陽性の例を、図14に示す。これらの23個の陽性クローンの配列決定は、表VIIに列挙される10個の異なる変異体が同定されたことを示す。
【０１７０】
【表７】
0005453097.tif 000010
【０１７１】
実施例8: HprCH3を切断するメガヌクレアーゼの、HprCH3.3を切断するタンパク質のランダム突然変異誘発及びHprCH3.4を切断するタンパク質との組み合わせによる改良
実施例6を補うものとして、HprCH3.3を切断する変異体を用いてランダム突然変異誘発を行うことも決定した。1つのHprCh3.3変異体のみがHprCH3を切断できたので、この変異体と、HprCH3.3を強く切断するがHprCH3を切断しない3つの他の変異体とをランダム突然変異誘発に用いた。
HprCH3.3を切断する突然変異が誘発されたタンパク質は、次いで、HprCH3.4を切断するタンパク質と同時発現されたときに、HprCH3を効率的に切断できるかについて試験して決定した。
【０１７２】
A) 材料及び方法
a) ランダム突然変異誘発によるライブラリーの構築
ランダム突然変異誘発を、選択された変異体のプールに対して、Mn2+を用いるPCR、又はJBS dNTP-MutagenisキットについてのJena Bioscience GmbHからのプロトコルに記載されるようなdNTP誘導体である8-オキソ-dGTP及びdPTPを用いる2ステップPCRプロセスにより行った。用いたプライマーは、preATGCreFor (5'-gcataaattactatacttctatagacacgcaaacacaaatacacagcggccttgccacc-3': 配列番号61)及びICreIpostRev (5'-ggctcgaggagctcgtctagaggatcgctcgagttatcagtcggccgc-3': 配列番号62)であった。約25 ngのPCR産物、並びにNcoI及びEagIでの消化により線状にした75 ngのベクターDNA (pCLS0542, 図17)を用いて、酵母Saccharomyces cerevisiae FYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を、高効率のLiAc形質転換プロトコル(Gietz及びWoods, Methods Enzymol., 2002, 350, 87〜96)を用いて形質転換した。I-CreI変異体についてのインタクトなコード配列を含む発現プラスミドを、酵母でのインビボ相同組換えにより作製した。
【０１７３】
b) 変異体-標的酵母株、スクリーニング及び配列決定
酵母レポーターベクター(pCLS1055, 図16)内にHprCH3標的を含有する酵母株FYBL2-7B (MAT a, ura3Δ851, trp1Δ63, leu2Δ1, lys2Δ202)を、カナマイシン耐性ベクター(pCLS1107)中の、HprCH3.4標的を切断する変異体で、高効率のLiAc形質転換プロトコルを用いて形質転換した。変異体-標的酵母を、実施例6に記載されるような交配アッセイのための標的株として用いた。得られた陽性クローンを、実施例4に記載されるようにして配列決定(MILLEGEN)により確認した。
【０１７４】
B) 結果
HprCH3.3を切断する4つの変異体(I-CreI 32D,33T、I-CreI 32T,33T、I-CreI 33H及びI-CreI 33Q、表IVの命名法によるとKNDTQS/QRRDI, KNTTQS/QRRDI, KNSHQS/QRRDI及びKNSQQS/QRRDIともよばれる; 配列番号24、45、32及び35)をプールし、ランダム突然変異誘発し、酵母を形質転換した。1140個の形質転換クローンを、次いで、(i) レポータープラスミド中にHprCH3標的、(ii) HprCH3.4標的(I-CreI 33T,38Y,44K,68Y,70S,75E,77V、すなわちKNSTYS/KYSEV; 配列番号56) を切断する変異体を含有する発現プラスミドを含有する酵母株と交配した。この酵母株と交配させた後に、18個のクローンが、HprCH3標的を効率的に切断することが見出された。よって、18個の陽性が、HprCH3標的についての切断活性を有するKNSTYS/KYSEVとのヘテロダイマーを形成できる。陽性の例を、図15に示す。このようなヘテロダイマー変異体の例を、表VIIIに列挙する。
【０１７５】
【表８】
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【０１７６】
実施例9: HprCH3標的部位を切断するメガヌクレアーゼの、グリシン-19のセリンへの置換(G19S)をもたらす部位特異的突然変異誘発による改良
G19S置換の、I-CreI由来メガヌクレアーゼの切断活性を増大させる能力を確認するために、この変異を、ヘテロダイマーHprCH3.3 (KNSHQS/QRRDI/42A43L, 配列番号147) / HprCH3.4 (KNTHQS/RYSNN/72T, 配列番号148)の2つのタンパク質のそれぞれに組み込んだ。HprCH3標的を切断するこのヘテロダイマーは、実施例7及び8に記載されるように、ランダム突然変異誘発により得られた。
【０１７７】
元来の及びG19S由来の変異体の切断活性を評価するために、CHO細胞での染色体レポーターシステムを用いた(図20)。このシステムでは、CMVプロモーターにより駆動される単一コピーLacZ遺伝子の中にHprCH3部位が介在し、よって、機能的でなくなっている。HprCH3.3 / HprCH3.4についてのCHO発現プラスミド及びLacZ修復プラスミドでの株化細胞のトランスフェクションにより、相同組換えによる機能的LacZ遺伝子の回復が可能になる。二本鎖破断が、相同組換えを誘発できることが以前に示されている。よって、LacZ遺伝子が修復される頻度は、ゲノムHprCH3標的部位の切断効率の指標である。
【０１７８】
1) 材料及び方法
a) 部位特異的突然変異誘発
G19S置換をHprCH3.3及びHprCH3.4コード配列に導入するために、2つの別々のオーバーラップPCR反応を行って、I-CreIコード配列の5'末端(残基1〜24)又は3'末端(残基14〜167)を増幅した。5'及び3'末端の両方について、PCR増幅を、ベクターとの相同性を有するプライマーと：
CCM2For 5'-aagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaccatggccaatacca aatataacaaagagttcc-3' (配列番号149)、又はCCMRev 5'-tctgatcgattcaagtcagtgtctctctag atagcgagtcggccgccggggaggatttcttcttctcgc -3': 配列番号150)、置換変異G19Sを含有するアミノ酸14〜24のI-CreIコード配列に特異的なプライマー：G19SF 5'-gccggctttgtggactctgacggtagcatcatc-3' (配列番号151)又はG19SR 5'-gatgatgctaccgtcagagtccacaaagccggc-3' (配列番号152)を用いて行う。
得られたPCR産物は、互いに33 bpの相同性を有する。その後、断片を、2つの断片のそれぞれの一定量と、CCM2For及びCCMRevプライマーとを用いてPCRにより組み立てる。
【０１７９】
b) CHO発現ベクターでの変異体のクローニング
SacI-XbaIで消化したPCR産物を、I-CreI N75コード配列を含むCHOゲートウェイ発現ベクターpCDNA6.2 (INVITROGEN)であるプラスミドpCLS1088 (図21)の対応するSacI-XbaI部位にクローニングした。I-CreI N75コード配列についてのHprCH3.3-G19S又はHprCH3.4-G19Sコード配列の置換を、配列決定(MILLEGEN)により確かめた。
【０１８０】
c) 哺乳動物細胞での染色体アッセイ
レポーターシステムを有するCHO株化細胞を、10cmディッシュあたり2×105細胞の密度で、完全培地(2 mM L-グルタミン、ペニシリン(100 UI/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)、アンフォテリシンB (Fongizone) (0.25μg/ml) (INVITROGEN-LIFE SCIENCE)及び10% FBS (SIGMA-ALDRICH CHIMIE)を補ったKaighn改変F-12培地(F12-K))中に播種した。次の日に、細胞を、Polyfectトランスフェクション試薬(QIAGEN)でトランスフェクションした。簡単に、2μgのlacz修復マトリクスベクターに、種々の量のメガヌクレアーゼ発現ベクターを同時トランスフェクションした。37℃にて72時間のインキュベーションの後に、細胞を、0.5%グルタルアルデヒド中で4℃にて10分間固定し、0.02 % NP40を含む100 mMリン酸バッファーで2回洗浄し、以下の染色バッファーで染色した(10 mMリン酸バッファー、1 mM MgCl2、33 mM Kヘキサシアノ鉄(III)、33 mM Kヘキサシアノ鉄(II)、0.1 % (v/v) X-Gal)。37℃にて1晩のインキュベーションの後に、プレートを、光学顕微鏡の下で観察して、LacZ陽性細胞クローンの数を計数した。LacZ修復の頻度を、LacZ+増殖巣の数を、トランスフェクションさせた細胞の数(5×105)で除し、トランスフェクション効率で校正して表す。
【０１８１】
2) 結果
2つの元の変異体(HprCH3.3 / HprCH3.4)又は対応する元の変異体と組み合わせた2つのG19S誘導変異体の1つ(HprCH3.3 / HprCh3.4 G19S又はHprCH3.3 G19S / HprCh3.4)のいずれかを含有するヘテロダイマーの活性を、HprCH3標的を含有するCHO株化細胞での染色体アッセイを用いて試験した。この染色体アッセイは、最近の文献に詳しく記載されている(Arnouldら, J. Mol. Biol. Epub May 10, 2007)。簡単に、単一コピーの導入遺伝子を有するCHO株化細胞を、まず、創出した。導入遺伝子は、ヒト EF1αプロモーターをI-SceI切断部位の上流に含む(図20, 工程1)。次に、I-SceIメガヌクレアーゼを用いて、DSB誘発相同組換えをこの遺伝子座で引き起こし、新規なメガヌクレアーゼ切断部位を有する5.5 kbのカセットを挿入した(図20, 工程2)。このカセットは、CMVプロモーターにより駆動される非機能的LacZオープンリーディングフレームと、プロモーターレスハイグロマイシンマーカー遺伝子とを含む。LacZ遺伝子自体は、試験されるメガヌクレアーゼ切断部位(ここではHprCH3切断部位)を含有する50 bp挿入断片により不活性化されている。この株化細胞は、次いで、DSB誘発遺伝子ターゲティング効率(LacZ修復)について、HprCH3標的を切断する工学的に作製されたI-CreI誘導体を用いて評価できる(図20, 工程3)。
【０１８２】
この株化細胞を、修復マトリクスと、メガヌクレアーゼを発現する種々の量のベクターとで同時トランスフェクションした。LacZ遺伝子の修復頻度は、元の工学的ヘテロダイマー(HprCH3.3 / HprCH3.4)を用いての最大2.0×10-3から、HprCH3.3-G19S誘導変異体を用いての最大1.15×10-2、及びHprCH3.4-G19S誘導変異体を用いての最大1.2×10-2に増加した(図22)。
【０１８３】
これらの知見は、G19S変異が、それ自体で、そのモノマーの1つにおいてのみ見出されるときに、ヘテロダイマーの活性を増大させ得ることを示す。単一G19S置換は、他の標的を切断する完全に異なるヘテロダイマーの活性を増大させることが示された。つまり、G19S変異は、異なるI-CreI誘導体の活性をそれ自体で、又は他の変異との組み合わせで増大させ得る「ポータブル」モチーフのように挙動する。
しかし、HprCH3.3 G19S / HprCH3.4 G19Sヘテロダイマーを、修復マトリクスで変換したときに、LacZ+増殖巣は検出されず、6.0×10-6の組換え頻度を示す。これらの知見は、単一G19S置換が活性を増大させ、ヘテロダイマー中のそれぞれのモノマーのG19S置換が、活性を非常に強く減少させることを示す。
【図１Ａ】
0005453097.tif 000012
【図１Ｂ】
0005453097.tif 000013
【図１Ｃ】
0005453097.tif 000014
【図１Ｄ】
0005453097.tif 000015
【図２】
0005453097.tif 000016
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
0005453097.tif 000018
【図３Ｃ】
0005453097.tif 000019
【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５Ａ】
0005453097.tif 000022
【図５Ｂ】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ−Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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