(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍｓｎ２ｐをコードする遺伝子及び／又はＭｓｎ４ｐをコードする遺伝子が破壊されてなる酵母の遺伝子破壊株を用いた、エタノールの製造方法。
【請求項２】
酵母が、実験室酵母、清酒酵母、ワイン酵母、ビール酵母、焼酎酵母、パン酵母及びバイオエタノール酵母からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
実験室酵母がＸ２１８０−１Ａ株である、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
清酒酵母がきょうかい７号株である、請求項２に記載の製造方法。
【請求項５】
エタノールが清酒又はバイオエタノールである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エタノールの製造方法に関する。さらに詳しくは、高発酵性酵母を用いた、清酒、ビール、ワイン等の酒類やバイオエタノール等を含むエタノールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酒類や燃料用のバイオエタノールに含まれているエタノールは、一般に、ブドウ糖などの糖類をサッカロミセス属に属する酵母により発酵させて製造する。
【０００３】
したがって、エタノール発酵中の酵母細胞は、高濃度のエタノールにさらされることになる。酵母細胞は、エタノール等の環境ストレスに速やかに応答して遺伝子発現を変化させ、酵母細胞の生命を維持するための分子機構を備えている。このシステムの中心的役割を果たすのが、ストレス応答転写因子Ｍｓｎ２ｐ及びＭｓｎ４ｐである。
【０００４】
Ｍｓｎ２ｐ及びＭｓｎ４ｐは互いに相同性を有するジンク・フィンガー型転写因子であり、いずれも熱ショック、酸化ストレス、浸透圧ストレス、エタノールストレス等の様々な環境ストレス下において、細胞質から核内に移行し、様々な遺伝子のプロモーター領域に結合し、下流の遺伝子の転写を活性化するものである。Ｍｓｎ２ｐ及びＭｓｎ４ｐによって発現調節を受ける遺伝子は、炭素代謝関連、タンパク質の保護・分解関連、細胞防御反応関連、細胞内シグナル伝達関連等多岐にわたっており、Ｍｓｎ２ｐ及びＭｓｎ４ｐは、これらの遺伝子の発現を総合的に変化させることによって、環境ストレスに対する耐性に寄与すると考えられている。したがって、これらのストレス応答転写因子の機能が異常になると、ストレス条件下での生命維持に影響が現れ、例えば、非特許文献１では、ＭＳＮ２／ＭＳＮ４遺伝子二重破壊株は、様々なストレス条件下での生存率が低下することが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Martinez-Pastor MT, Marchler G, Schuller C, Marchler-Bauer A, Ruis H, Estruch F., EMBO J., 15(9), 2227-35 (1996).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
酵母を用いたエタノール生産において、エタノール生産速度を上げることは、エタノール発酵の生産性を高めるために極めて重要であるが、酵母のストレス応答転写因子に変異を導入することにより改変し、高発酵性を獲得した例は知られていない。
【０００７】
本発明の課題は、酵母を用いて、生産性高くエタノールを製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、従来の知見から、酵母によるエタノール発酵には正常なストレス応答機構が機能することが必要であると考え、そのことを証明するために、実験室酵母又は清酒酵母のストレス応答転写因子の遺伝子を破壊した形質転換酵母を用いて清酒製造試験又はエタノール製造試験を行い、遺伝子破壊がエタノール発酵に与える影響を解析した。その結果、意外にも、ストレス応答転写因子の遺伝子を破壊した形質転換酵母はいずれも、高い発酵性を示すことが判明した。そこで、本発明者らは、この現象は酵母のエタノール発酵性を改善させるために利用可能であると考え、ストレス応答転写因子の遺伝子の破壊とエタノール発酵についてさらに詳細な研究を行うことにより、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明の要旨は、
ストレス応答転写因子をコードする遺伝子が破壊されてなる酵母の遺伝子破壊株を用いた、エタノールの製造方法、に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、酵母のエタノール発酵において、速いエタノール生産速度でエタノールを生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、親株である実験室酵母Ｘ２１８０−１Ａ、及び遺伝子破壊株（ＭＳＮ２、ＭＳＮ４、ＭＳＮ２／ＭＳＮ４）を用いて清酒製造を行った際の二酸化炭素発生量を示す図である。白丸印が親株、黒丸印がＭＳＮ２遺伝子破壊株、黒三角印がＭＳＮ４遺伝子破壊株、黒四角印がＭＳＮ２／４遺伝子破壊株のデータを示す。
【図２】図２は、親株である清酒酵母きょうかい７号、及びＭＳＮ２遺伝子破壊株を用いて２種類の条件でエタノール製造を行った際の二酸化炭素発生量を示す図である。左が廃糖蜜培地、右がＹＰＤ培地での結果を示す。いずれも、白丸印が親株、黒丸印がＭＳＮ２遺伝子破壊株のデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のエタノールの製造方法は、酵母を用いてエタノールを製造するものであって、ストレス応答転写因子（例えばＭｓｎ２ｐ及びＭｓｎ４ｐ）をコードする遺伝子のうち少なくとも１種が破壊されている酵母の遺伝子破壊株を用いることに、一つの特徴を有する。
【００１３】
ストレス応答転写因子をコードする遺伝子としては、ＭＳＮ２及びＭＳＮ４が挙げられる。これらの遺伝子は、ＳＧＤ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）のホームページ（http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces）に配列が記載されており、かかる配列に基づいて、ＰＣＲプライマーを設計して遺伝子破壊や部位特異的変異を行うことができる。例えば、ＭＳＮ２を破壊するために用いるＤＮＡのプライマーとしては、ＭＳＮ２−ＤＦ（配列表の配列番号１）、ＭＳＮ４−ＤＲ（配列表の配列番号２）、ＭＳＮ４を破壊するために用いるＤＮＡのプライマーとしては、ＭＳＮ４−ＤＦ（配列表の配列番号３）、ＭＳＮ４−ＤＲ（配列表の配列番号４）等が例示される。
【００１４】
本発明における酵母とは、サッカロミセス属に属するエタノール発酵に用いることのできる酵母であって、例えば、実験室酵母、清酒酵母、ワイン酵母、ビール酵母、焼酎酵母、パン酵母、及びバイオエタノール酵母が挙げられる。これらの酵母は一種類を単独で用いてもよく、複数種の酵母を用いてもよい。実験室酵母としては、サッカロミセス・セレビシエに属するＸ２１８０−１Ａ株が好ましい。清酒酵母としては、サッカロミセス・セレビシエに属するきょうかい７号株が好ましい。
【００１５】
本明細書において、「破壊」とは、破壊される遺伝子の機能を喪失させたり、失活させたりするような遺伝子操作のことをいい、目的遺伝子領域の全遺伝子を喪失させる遺伝子操作や正常な機能に必要な部位を欠失又は変異させる遺伝子操作のことをいう。具体的には、ストレス応答転写因子をコードするＭＳＮ２又はＭＳＮ４遺伝子を全喪失させる遺伝子操作が例示される。かかる遺伝子操作を行う方法としては、特に限定はなく公知の方法を用いることができ、例えば、変異剤処理による突然変異、遺伝子工学を用いた遺伝子破壊、遺伝子工学を用いた部位特異的変異などが挙げられる。これらの遺伝子破壊株の作成方法については、Saccharomyces Genome Deletion Projectのホームページ（http://www-sequence.stanford.edu/group/yeast_deletion_project/deletions3.html）を参考にすることができる。なお、本発明においては、自然突然変異により破壊が生じた遺伝子破壊株も用いることができる。
【００１６】
なお、上記遺伝子操作を行う際には、アミノ酸などの栄養要求マーカーや、薬剤に対する耐性マーカーなどを選択マーカーとして使用してもよい。
【００１７】
ストレス応答転写因子の遺伝子破壊株の代表株については、Ｘ２１８０−１Ａ  ｍｓｎ２、Ｘ２１８０−１Ａ  ｍｓｎ４、Ｘ２１８０−１Ａ  ｍｓｎ２／４、及びＫ７  ｍｓｎ２と命名、表示され、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、それぞれ、ＮＩＴＥ  Ｐ−８１３、ＮＩＴＥ  Ｐ−８１４、ＮＩＴＥ  Ｐ−８１５、及びＮＩＴＥ  Ｐ−８１６として寄託されている。
【００１８】
本発明は、上記で得られた酵母の遺伝子破壊株を用いてエタノールを製造するが、酵母が特定のものである以外は、公知の方法を用いて、エタノールを製造することができる。
【００１９】
本発明の製造方法は、例えば、清酒、ビール、ワイン等の酒類やバイオエタノール等の製造に適用することができるが、好ましくは、清酒又はバイオエタノールの製造に適用することができる。
【実施例】
【００２０】
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら制限されるものではない。
【００２１】
実施例１
サッカロミセス・セレビシエＸ２１８０−１Ａ株のＭＳＮ２遺伝子及びＭＳＮ４遺伝子のいずれか１種又は両者を破壊した株を作成し、清酒製造試験を行った。なお、Ｘ２１８０−１Ａ株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から、ＡＴＣＣ２６７８６として入手可能である。
【００２２】
〔遺伝子破壊株の作成〕
Ｘ２１８０−１Ａ株の遺伝子破壊は、マーカー遺伝子としてｎａｔ１及びｋａｎＭＸを用いて行った。まず、ｎａｔ１を含むプラスミドｐＡＧ２５（ＥＵＲＯＳＣＡＲＦから入手可能、http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/index.html）を鋳型として、プライマーＭＳＮ２−ＤＦ（配列表の配列番号１）及びＭＳＮ２−ＤＲ（配列表の配列番号２）を用いてＰＣＲを行い、マーカーであるｎａｔ１の両側に、ＭＳＮ２のＯＲＦに隣接する上流部分及び下流部分のＤＮＡ配列を持つＤＮＡを作成した。このＤＮＡを用いてＸ２１８０−１Ａ株を形質転換して、ノーセオスリシン含有培地で増殖した酵母を、形質転換体１とした。形質転換体１からゲノムＤＮＡを抽出し、プライマーＭＳＮ２−Ｆ（配列表の配列番号５）及びＭＳＮ２−Ｒ（配列表の配列番号６）を用いてＰＣＲを行い、得られた産物のサイズを測定することによって、ＭＳＮ２が遺伝子破壊されていることを確認し、これをＸ２１８０−１Ａ株のＭＳＮ２遺伝子破壊株（Ｘ２１８０−１Ａ  ｍｓｎ２）とした。
【００２３】
次に、ｋａｎＭＸを含むプラスミドｐＵＧ６（ＥＵＲＯＳＣＡＲＦから入手可能、http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/index.html）を鋳型として、プライマーＭＳＮ４−ＤＦ（配列表の配列番号３）及びＭＳＮ４−ＤＲ（配列表の配列番号４）を用いてＰＣＲを行い、マーカーであるｋａｎＭＸの両側に、ＭＳＮ４のＯＲＦに隣接する上流部分及び下流部分のＤＮＡ配列を持つＤＮＡを作成した。このＤＮＡを用いてＸ２１８０−１Ａ株及びＭＳＮ２遺伝子破壊株を形質転換して、ジェネティシン含有培地で増殖した酵母を、それぞれ形質転換体２及び３とした。形質転換体２及び３からゲノムＤＮＡを抽出し、プライマーＭＳＮ４−Ｆ（配列表の配列番号７）及びＭＳＮ４−Ｒ（配列表の配列番号８）を用いてＰＣＲを行い、得られた産物のサイズを測定することによって、ＭＳＮ４が遺伝子破壊されていることを確認し、これらをそれぞれ、Ｘ２１８０−１Ａ株のＭＳＮ４遺伝子破壊株（Ｘ２１８０−１Ａ  ｍｓｎ４）及びＭＳＮ２／ＭＳＮ４遺伝子二重破壊株（Ｘ２１８０−１Ａ  ｍｓｎ２／４）とした。
【００２４】
〔清酒の製造〕
親株であるＸ２１８０−１Ａと、上記で得られたＭＳＮ２遺伝子破壊株、ＭＳＮ４遺伝子破壊株、及びＭＳＮ２／ＭＳＮ４遺伝子二重破壊株を用いて、以下に示す方法で清酒を製造した。
【００２５】
掛米８０ｇ、麹米２０ｇ、水１６０ｍＬ、９０％乳酸４０μＬ混合による一段仕込を実施した。掛米として精米歩合７０％のアルファー化米、麹米として精白歩合７０％の乾燥麹を用いた。各酵母は、ＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、ブドウ糖２％含有）において一晩振とう培養した後、酵母数が２×１０7ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように仕込時に添加した。発酵温度は１５℃とした。仕込試験は各株について３回ずつ繰り返した。仕込後、毎日重量を測定することにより、重量減少分から発酵に伴う二酸化炭素発生量を求め、各株について平均二酸化炭素発生量を算出した。結果を図１に示す。また、仕込後２０日目には、遠心分離によって回収した清酒におけるエタノール濃度を測定し、各株について平均エタノール濃度を算出した。また、得られた平均エタノール濃度について、親株における濃度に対する遺伝子破壊株における濃度の有意差検定も同時に行った。なお、エタノール濃度の測定は、アルコール濃度計（理研計器社製アルコメイトＡＬ−３）を用いて行った。
【００２６】
いずれの遺伝子破壊株も、親株に比べて二酸化炭素発生量が多く（図１）、エタノール発酵速度が速いこと、また、最終的なエタノール濃度も、親株が１５．４±０．２％であるのに対し、ＭＳＮ２遺伝子破壊株が１６．０±０．１％、ＭＳＮ４遺伝子破壊株が１５．７±０．１％、ＭＳＮ２／ＭＳＮ４遺伝子二重破壊株が１６．０±０．２％と高く、エタノール生産性に優れることが分かった。エタノール濃度について平均値の差の検定を行った結果、いずれの遺伝子破壊株も親株と比較して５％未満の危険率で有意であった。
【００２７】
実施例２
サッカロミセス・セレビシエ二倍体清酒酵母きょうかい７号株の２個のＭＳＮ２遺伝子を両者共に破壊した株を作成し、清酒製造試験を行った。なお、きょうかい７号株は、財団法人日本醸造協会より入手可能である。
【００２８】
〔遺伝子破壊株の作成〕
きょうかい７号株の遺伝子破壊は、マーカー遺伝子としてｎａｔ１及びｋａｎＭＸを用いて行った。きょうかい７号株は二倍体であることから、まず、１コピー目のＭＳＮ２遺伝子をｎａｔ１をマーカーとして遺伝子破壊した。ｎａｔ１を含むプラスミドｐＡＧ２５（ＥＵＲＯＳＣＡＲＦから入手可能http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/index.html）を鋳型として、プライマーＭＳＮ２−ＤＦ（配列表の配列番号１）及びＭＳＮ２−ＤＲ（配列表の配列番号２）を用いてＰＣＲを行い、マーカーであるｎａｔ１の両側に、ＭＳＮ２のＯＲＦに隣接する上流部分及び下流部分のＤＮＡ配列を持つＤＮＡを作成した。このＤＮＡを用いてきょうかい７号株を形質転換して、ノーセオスリシン含有培地で増殖した酵母を、形質転換体４とした。形質転換体４からゲノムＤＮＡを抽出し、プライマーＭＳＮ２−Ｆ（配列表の配列番号５）及びＭＳＮ２−Ｒ（配列表の配列番号６）を用いてＰＣＲを行い、得られた産物のサイズを測定することによって、１コピー目のＭＳＮ２が遺伝子破壊されていることを確認した。
【００２９】
次に、２コピー目のＭＳＮ２をｋａｎＭＸをマーカーとして遺伝子破壊した。ｋａｎＭＸを含むプラスミドｐＵＧ６（ＥＵＲＯＳＣＡＲＦから入手可能、http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/index.html）を鋳型として、プライマーＭＳＮ２−ＤＦ（配列表の配列番号１）及びＭＳＮ２−ＤＲ（配列表の配列番号２）を用いてＰＣＲを行い、マーカーであるｋａｎＭＸの両側に、ＭＳＮ２のＯＲＦに隣接する上流部分及び下流部分のＤＮＡ配列を持つＤＮＡを作成した。このＤＮＡを用いて、上記で得られた形質転換体４を形質転換して、ジェネティシン含有培地で増殖した酵母を形質転換体５とした。形質転換体５からゲノムＤＮＡを抽出し、プライマーＭＳＮ２−Ｆ（配列表の配列番号５）及びＭＳＮ２−Ｒ（配列表の配列番号６）を用いてＰＣＲを行い、得られた産物のサイズを測定することによって、２コピー分のＭＳＮ２が遺伝子破壊されていることを確認し、これを、きょうかい７号株のＭＳＮ２遺伝子破壊株（Ｋ７  ｍｓｎ２）とした。
【００３０】
〔エタノールの製造〕
親株であるきょうかい７号株と、上記で得られたＭＳＮ２遺伝子破壊株を用いて、以下に示す方法でエタノールを製造した。
【００３１】
廃糖蜜培地（ケーンモラセス原液を蒸留水にてＢｒｉｘ２５％に調整後、０．０２５％硫酸アンモニウムを添加したもの）及び高濃度ブドウ糖含有ＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、ブドウ糖２０％含有）を用いたエタノール発酵試験を実施した。各酵母は、ＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、ブドウ糖２％含有）において一晩振とう培養した後、酵母数が２×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように両培地に添加し、７２時間静置培養した。発酵温度は３０℃とした。発酵試験は各株について３回以上繰り返した。培養開始後、発酵モニター装置（アトー株式会社製ファーモグラフII）を用いて発酵に伴う二酸化炭素発生量を求め、各株について平均二酸化炭素発生量を算出した。結果を図２に示す。
【００３２】
ＭＳＮ２遺伝子破壊株は、廃糖蜜培地及びＹＰＤ培地のいずれの条件においても、親株に比べて二酸化炭素発生量が多く（図２）、エタノール発酵速度が速く、エタノール生産性に優れることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明の製造方法は、清酒、ビール、ワイン、焼酎等の酒類や、バイオエタノール等を含むエタノールの製造に好適に用いられる。
【配列表フリーテキスト】
【００３４】
配列表の配列番号１は、ＭＳＮ２破壊用ＤＮＡ作成用プライマーである。
配列表の配列番号２は、ＭＳＮ２破壊用ＤＮＡ作成用プライマーである。
配列表の配列番号３は、ＭＳＮ４破壊用ＤＮＡ作成用プライマーである。
配列表の配列番号４は、ＭＳＮ４破壊用ＤＮＡ作成用プライマーである。
配列表の配列番号５は、ＭＳＮ２増幅用プライマーである。
配列表の配列番号６は、ＭＳＮ２増幅用プライマーである。
配列表の配列番号７は、ＭＳＮ４増幅用プライマーである。
配列表の配列番号８は、ＭＳＮ４増幅用プライマーである。
【図１】
0005585952.tif 000002
【図２】
0005585952.tif 000003
【配列表】
0005585952000001.app