(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
各画像のピクセルのデータが時系列的に取得された複数のピクセルからなる複数フレームの画像を時系列的に取得する画像取得ステップと、
前記複数フレームの各画像に対して解析領域を設定する解析領域設定ステップと、
前記複数フレームの画像の中から解析に利用する２フレーム以上の選定画像を選定する画像選定ステップと、
前記選定画像の同一画像の前記解析領域内の取得時間間隔が同じ二つのピクセルのデータペアの積和計算を前記選定画像のすべてに対して行なうとともに、前記選定画像の異なる二つの画像の前記解析領域内の取得時間間隔が同じ二つのピクセルのデータペアの積和計算を行なって相関値を計算する演算ステップとを有している画像解析方法。
【請求項２】
前記解析領域の区分値を算出する区分値算出ステップと、
前記複数フレームの画像を前記区分値に基づいて複数グループに分類する分類ステップと、
前記グループごとに前記解析領域の平均画像を算出する平均画像算出ステップと、
前記グループごとに前記解析領域の各画像から前記平均画像を減算して前記解析領域の再構築画像を算出する再構築画像算出ステップとをさらに有し、
前記演算ステップは、再構築画像に対して相関値を計算する、請求項１に記載の画像解析方法。
【請求項３】
前記複数フレームの画像を複数ブロックに分割するステップをさらに有し、
前記演算ステップは、前記複数ブロックごとに相関値を計算し、
前記複数ブロックごとに計算された相関値の平均値を計算するステップをさらに有している、請求項１または２に記載の画像解析方法。
【請求項４】
前記データペアの各々は、前記ピクセルのデータの統計値であり、前記統計値は、前記ピクセルのデータの平均値、最大値、最小値、相対差、絶対差、相対比のいずれかである、請求項１ないし請求項３のいずれかひとつに記載の画像解析方法。
【請求項５】
前記ピクセルのデータは、２次元または３次元の観察領域から得られた蛍光強度である、請求項１ないし請求項４のいずれかひとつに記載の画像解析方法。
【請求項６】
前記演算ステップは、前記ピクセルのデータに基づいて、前記複数の画像をそれぞれ構成し直し、構成し直した画像について相関値を演算する、請求項１ないし５のいずれかひとつに記載の画像解析方法。
【請求項７】
前記画像は、走査型顕微鏡によって得られたものである、請求項１ないし６のいずれかひとつに記載の画像解析方法。
【請求項８】
前記演算ステップは、次式（１）を用いて、２次元または３次元の観察領域の自己相関の計算を行なう、請求項１ないし請求項７のいずれかひとつに記載の画像解析方法
【数１】
0005508809.tif 000015
ここで、ＧｓａはＲＩＣＳの空間自己相関値、Ｉ１γはチャンネル１のγフレーム目の蛍光強度データ（ピクセルのデータ）、Ｉ１（γ＋η）はチャンネル１の（γ＋η）フレーム目の蛍光強度データ（ピクセルのデータ）、ｘ，ｙは測定点の空間的座標、ξ，ψは測定点からの空間的座標の変化量、γは１以上の整数（γ＝１，２，…，ｑ）、ηは０以上ｑ未満の整数（η＝０，１，…，ｐ（＜ｑ））、ｑは空間相関計算に使用するフレームの総数、ｐは空間相関計算における最大の遅延時間を決めるフレーム数、Ｍ１γ１（γ＋η）は、チャンネル１のγフレーム目とチャンネル１の（γ＋η）フレーム目との積和計算の回数、Ａ１は、チャンネル１のｑフレームデータの平均値の二乗である。
【請求項９】
前記平均値Ａ１は次式（２）で表される、請求項８に記載の画像解析方法
【数２】
0005508809.tif 000016
ここで、Ｍ１γは、チャンネル１のγフレーム目の計算に使用するデータ数である。
【請求項１０】
前記演算ステップは、次式（３）を用いて、２次元または３次元の観察領域の相互相関値の計算を行なう、請求項１ないし請求項７のいずれかひとつに記載の画像解析方法
【数３】
0005508809.tif 000017
ここで、ＧｓｃはＲＩＣＳの空間相互相関値、Ｉ１γはチャンネル１のγフレーム目の蛍光強度データ（ピクセルのデータ）、Ｉ２（γ＋η）はチャンネル２の（γ＋η）フレーム目の蛍光強度データ（ピクセルのデータ）、ｘ，ｙは測定点の空間的座標、ξ，ψは測定点からの空間的座標の変化量、γは１以上の整数（γ＝１，２，…，ｑ）、ηは０以上ｑ未満の整数（η＝０，１，…，ｐ（＜ｑ））、ｑは空間相関計算に使用するフレームの総数、ｐは空間相関計算における最大の遅延時間を決めるフレーム数、Ｍ１γ２（γ＋η）は、チャンネル１のγフレーム目とチャンネル２の（γ＋η）フレーム目の積和計算の回数、Ａ２は、チャンネル１のｑフレームデータの平均値とチャンネル２のｑフレームデータの平均値の積である。
【請求項１１】
平均値Ａ２は、次式（４）で表される、請求項１０に記載の画像解析方法
【数４】
0005508809.tif 000018
ここで、Ｍ１γは、チャンネル１のγフレーム目の計算に使用するデータ数、Ｍ２γは、チャンネル２のγフレーム目の計算に使用するデータ数である。
【請求項１２】
前記演算ステップは、次式（５）を用いて、前記空間相関値の計算結果をフィッティングし、分子数または拡散定数を推定する、請求項８ないし１１のいずれかひとつに記載の画像解析方法
【数５】
0005508809.tif 000019
ここで、ＧｓはＲＩＣＳの空間相関値、ＳはＲＩＣＳの解析におけるスキャンの影響、ＧはＲＩＣＳの解析における時間遅延の影響、Ｄは拡散定数、δｒはピクセルサイズ、Ｎは分子数、Ｗ０は励起レーザビームの横方向の半径、ＷＺは励起レーザビームの縦方向の半径、τｐはピクセル時間、τｌはライン時間、τｆはフレーム時間である。
【請求項１３】
各画像のピクセルのデータが時系列的に取得された複数のピクセルからなる複数フレームの画像を時系列的に取得する画像取得部と、
前記複数フレームの各画像に対して解析領域を設定する解析領域設定部と、
前記複数フレームの画像の中から解析に利用する２フレーム以上の選定画像を選定する画像選定部と、
前記選定画像の同一画像の前記解析領域内の取得時間間隔が同じ二つのピクセルのデータペアの積和計算を前記選定画像のすべてに対して行なうとともに、前記選定画像の異なる二つの画像の前記解析領域内の取得時間間隔が同じ二つのピクセルのデータペアの積和計算を行なって相関値を計算する演算部とを有している画像解析装置。
【請求項１４】
前記演算部は、
前記解析領域の区分値を算出し、
前記複数フレームの画像を前記区分値に基づいて複数グループに分類し、
前記グループごとに前記解析領域の平均画像を算出し、
前記グループごとに前記解析領域の各画像から前記平均画像を減算して前記解析領域の再構築画像を算出し、
再構築画像に対して相関値を計算する、請求項１３に記載の画像解析装置。
【請求項１５】
前記演算部は、
前記複数フレームの画像を複数ブロックに分割し、
前記複数ブロックごとに相関値を計算し、
前記複数ブロックごとに計算された相関値の平均値を計算する、請求項１３または１４に記載の画像解析装置。
【請求項１６】
前記データペアの各々は、前記ピクセルのデータの統計値であり、前記統計値は、前記ピクセルのデータの平均値、最大値、最小値、相対差、絶対差、相対比のいずれかである、請求項１３ないし１５のいずれかひとつに記載の画像解析装置。
【請求項１７】
前記ピクセルのデータは、２次元または３次元の観察領域から得られた蛍光強度である、請求項１３ないし１６のいずれかひとつに記載の画像解析装置。
【請求項１８】
前記演算部は、前記ピクセルのデータに基づいて、前記複数の画像をそれぞれ構成し直し、構成し直した画像について相関値を演算する、請求項１３ないし１７のいずれかひとつに記載の画像解析装置。
【請求項１９】
前記画像は、走査型顕微鏡によって得られたものである、請求項１３ないし１８のいずれかひとつに記載の画像解析装置。
【請求項２０】
前記演算部は、次式（１）を用いて、２次元または３次元の観察領域の自己相関の計算を行なう、請求項１３ないし１９のいずれかひとつに記載の画像解析装置
【数６】
0005508809.tif 000020
ここで、ＧｓａはＲＩＣＳの空間自己相関値、Ｉ１γはチャンネル１のγフレーム目の蛍光強度データ（ピクセルのデータ）、Ｉ１（γ＋η）はチャンネル１の（γ＋η）フレーム目の蛍光強度データ（ピクセルのデータ）、ｘ，ｙは測定点の空間的座標、ξ，ψは測定点からの空間的座標の変化量、γは１以上の整数（γ＝１，２，…，ｑ）、ηは０以上ｑ未満の整数（η＝０，１，…，ｐ（＜ｑ））、ｑは空間相関計算に使用するフレームの総数、ｐは空間相関計算における最大の遅延時間を決めるフレーム数、Ｍ１γ１（γ＋η）は、チャンネル１のγフレーム目とチャンネル１の（γ＋η）フレーム目との積和計算の回数、Ａ１は、チャンネル１のｑフレームデータの平均値の二乗である。
【請求項２１】
前記平均値Ａ１は次式（２）で表される、請求項２０に記載の画像解析装置
【数７】
0005508809.tif 000021
ここで、Ｍ１γは、チャンネル１のγフレーム目の計算に使用するデータ数である。
【請求項２２】
前記演算部は、次式（３）を用いて、２次元または３次元の観察領域の相互相関値の計算を行なう、請求項１３ないし１９のいずれかひとつに記載の画像解析装置
【数８】
0005508809.tif 000022
ここで、ＧｓｃはＲＩＣＳの空間相互相関値、Ｉ１γはチャンネル１のγフレーム目の蛍光強度データ（ピクセルのデータ）、Ｉ２（γ＋η）はチャンネル２の（γ＋η）フレーム目の蛍光強度データ（ピクセルのデータ）、ｘ，ｙは測定点の空間的座標、ξ，ψは測定点からの空間的座標の変化量、γは１以上の整数（γ＝１，２，…，ｑ）、ηは０以上ｑ未満の整数（η＝０，１，…，ｐ（＜ｑ））、ｑは空間相関計算に使用するフレームの総数、ｐは空間相関計算における最大の遅延時間を決めるフレーム数、Ｍ１γ２（γ＋η）は、チャンネル１のγフレーム目とチャンネル２の（γ＋η）フレーム目の積和計算の回数、Ａ２は、チャンネル１のｑフレームデータの平均値とチャンネル２のｑフレームデータの平均値の積である。
【請求項２３】
平均値Ａ２は、次式（４）で表される、請求項２２に記載の画像解析装置
【数９】
0005508809.tif 000023
ここで、Ｍ１γは、チャンネル１のγフレーム目の計算に使用するデータ数、Ｍ２γは、チャンネル２のγフレーム目の計算に使用するデータ数である。
【請求項２４】
前記演算部は、次式（５）を用いて、前記空間相関値の計算結果をフィッティングし、分子数または拡散定数を推定する、請求項２０ないし２３のいずれかひとつに記載の画像解析装置
【数１０】
0005508809.tif 000024
ここで、ＧｓはＲＩＣＳの空間相関値、ＳはＲＩＣＳの解析におけるスキャンの影響、ＧはＲＩＣＳの解析における時間遅延の影響、Ｄは拡散定数、δｒはピクセルサイズ、Ｎは分子数、Ｗ０は励起レーザビームの横方向の半径、ＷＺは励起レーザビームの縦方向の半径、τｐはピクセル時間、τｌはライン時間、τｆはフレーム時間である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、画像解析方法および画像解析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ラスターイメージ相関分光法（ＲＩＣＳ：Raster Image Correlation Spectroscopy）として非特許文献１，２に示すような方法が提案されている。この画像解析方法において、１フレーム以上のラスター走査画像からなる蛍光画像を取得する。つまり、画像解析したい試料において、興味を持っている領域を決め、その領域をラスター走査方式で繰り返し走査し、複数フレームの蛍光強度からなる画像を取得する。フレーム中の蛍光強度はピクセル単位でデータとして表わされている。
【０００３】
これらのピクセル単位のデータ（ピクセルのデータ）は、それぞれ取得された時間および取得された位置が異なるため、各データに対応する取得時間および取得位置はずれている。
【０００４】
したがって、これらのピクセルのデータを用いて、空間相関解析することで、分子の揺らぎによる相関特性を得ることができる。ここで、分子の相関特性からは、拡散定数や分子数を求めることができる。
【０００５】
このように、空間相関解析することで、分子拡散時間や、分子数等を評価することができるため、分子間の相互作用を観察することが可能である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】「Measuring Fast Dynamics in Solutions and Cells with a Laser Scanning Microscope」, Michelle A. Digman, Claire M. Brown, Parijat Sengupta, Paul W. Wiseman, Alan R. Horwitz, and Enrico Gratton, Biophysical Journal, Vol.89, P1317-1327, August 2005.
【非特許文献２】「Fluctuation Correlation Spectroscopy with a Laser-Scanning Microscope: Exploiting the Hidden Time Structure」, Michelle A. Digman, Parijat Sengupta, Paul W. Wiseman, Claire M. Brown, Alan R. Horwitz, and Enrico Gratton, Biophysical Journal: Biophysical Letters, L33-36, 2005.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来、ＲＩＣＳの空間相関解析において、一つのＲＩＣＳの解析結果を得るためには、１フレームの画像を構成するピクセルのデータだけを用いる。これは、１フレーム以上の画像を取得した場合であっても同様で、一つのＲＩＣＳの解析結果を得るためには、１フレームの画像を構成するピクセルのデータだけを用いる。
【０００８】
しかし、細胞観察のような細胞の核、膜、質などの異なる局所的な解析領域に限定してＲＩＣＳの解析を行なう場合、解析領域に含まれるピクセル数が少なくなり、解析結果の精度が低下するという問題が生じる。何故なら、ＲＩＣＳの空間相関演算は統計計算の一種で、データ数が多いほど精度が高く、データ数が少ないほど誤差が大きくなるためである。つまり、空間相関解析をする領域に含まれるデータ数が少なすぎると、統計計算の結果としてのＲＩＣＳの解析精度が低下してしまう。
【０００９】
また、分子拡散時間が短い分子を観察するには、１ピクセルのデータを得るのに要するピクセル時間と１ラインを走査するのに要するライン時間とを小さく設定する必要がある。これは、ピクセル時間とライン時間を大きく設定すると、分子拡散時間に対するピクセル間の取得時間のずれが大きくなり、十分な回数の相関計算をすることができなくなるからである。一方、分子拡散時間が長い分子を観察するには、ピクセル時間とライン時間を大きく設定する必要がある。これは、ピクセル時間とライン時間を小さく設定すると、実際の分子拡散時間が、１フレームで観察可能な分子拡散時間の最大値を越え、分子拡散時間を算出することができなくなるからである。
【００１０】
ピクセル時間とライン時間は、走査速度によって決まるので、画像を取得した後に変更することはできない。このため、分子の拡散定数等を適切に得るには、画像取得の前に、適切なピクセル時間およびライン時間を推測する必要が生じる。しかし、ほとんどのサンプルの分子拡散時間は未知数であるため、事前にピクセル時間およびライン時間の設定を推測することは難しい。
【００１１】
本発明の目的は、ピクセル数の少ない解析領域に対しても高い精度で空間相関解析を行なえるとともに観察可能な拡散時間を拡張可能なＲＩＣＳの画像解析方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明による画像解析方法は、各画像のピクセルのデータが時系列的に取得された複数のピクセルからなる複数フレームの画像を時系列的に取得する画像取得ステップと、前記複数フレームの各画像に対して解析領域を設定する解析領域設定ステップと、前記複数フレームの画像の中から解析に利用する２フレーム以上の選定画像を選定する画像選定ステップと、前記選定画像の同一画像の前記解析領域内の取得時間間隔が同じ二つのピクセルのデータペアの積和計算を前記選定画像のすべてに対して行なうとともに、前記選定画像の異なる二つの画像の前記解析領域内の取得時間間隔が同じ二つのピクセルのデータペアの積和計算を行なって相関値を計算する演算ステップとを有している。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ピクセル数の少ない解析領域に対しても高い精度で空間相関解析を行なえるとともに観察可能な拡散時間を拡張可能なＲＩＣＳの画像解析方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の実施形態による画像解析装置を概略的に示している。
【図２】図１に示される制御部の機能ブロックを示している。
【図３】本発明の実施形態による画像解析のフローチャートである。
【図４】画像解析に使用する時系列的に取得された複数フレームの画像を示している。
【図５】観察領域と解析領域を示している。
【図６】複数グループに分類された複数フレームの画像を模式的に示している。
【図７】複数ブロックに分割された複数フレームの画像を模式的に示している。
【図８】γフレーム目の画像内における相関計算の積和計算を模式的に示している。
【図９】γフレーム目と（γ＋１）フレーム目の画像間における相関計算の積和計算を模式的に示している。
【図１０】γフレーム目と（γ＋２）フレーム目の画像間における相関計算の積和計算を模式的に示している。
【図１１】γフレーム目とｐフレーム目の画像間における相関計算の積和計算を模式的に示している。
【図１２】式（１）〜式（４）における変数ξ、ψ、ηと計算に使用するフレームを示している。
【図１３】小さい分子に対するＲＩＣＳによる空間相関値の計算結果を輝度で示した画像である。
【図１４】小さい分子に対するＲＩＣＳによる空間相関値のフィッティング結果を示している。
【図１５】大きい分子に対するＲＩＣＳによる空間相関値の計算結果を輝度で示した画像である。
【図１６】大きい分子に対するＲＩＣＳによる空間相関値のフィッティング結果を示している。
【図１７】ＥＧＦＰ溶液の拡散定数（Ｄ）を解析領域のＲＯＩサイズを変えながら比較した結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。
【００１６】
[装置構成]
図１は、本発明の実施形態による画像解析装置を概略的に示している。この画像解析装置は、試料の蛍光観察のための走査型共焦点光学顕微鏡をベースに構成されている。
【００１７】
図１に示すように、画像解析装置１００は、試料Ｓに励起光を照射する光照射部１１０と、試料Ｓ内の測定点から発せられる光を検出する光検出部１３０と、画像解析に必要な制御を行なう制御部１６０と、試料Ｓを支持する試料ステージ１９０とを有している。
【００１８】
試料Ｓはマイクロプレートやスライドガラスなどの試料容器に収容され、試料ステージ１９０に載置される。試料ステージ１９０は、たとえば、試料Ｓを光照射部１１０および光検出部１３０に対して横方向（ｘｙ方向）および高さ方向（ｚ方向）に移動可能に支持する。たとえば、試料ステージ１９０は、出力軸が互いに直交する三つのステッピング・モーターを含んでおり、これらのステッピング・モーターによって試料Ｓをｘｙｚ方向に移動し得る。
【００１９】
画像解析装置１００は、多重光照射・多重光検出型である。このため、光照射部１１０はｎチャンネルの光源系１１１を含み、これに対応して光検出部１３０はｎチャンネルの検出系１３１を含んでいる。ｎチャンネルの検出系１３１は、それぞれ、ｎチャンネルの光源系１１１から射出された励起光によって生成された蛍光を検出する。ここで、ｎチャンネルは、チャンネル１、チャンネル２、・・・チャンネルｎによって構成される。チャンネルは、励起光の種類によってそれぞれ異なる。
【００２０】
光照射部１１０のｎチャンネルの光源系１１１は、光源１１２ａ，…，１１２ｎとコリメートレンズ１１４ａ，…，１１４ｎとダイクロイックミラー１１６ａ，…，１１６ｎとを含んでいる。光源１１２ａ，…，１１２ｎは、試料Ｓに含まれる蛍光色素を励起して試料Ｓから光（蛍光）を発せさせるための励起光を発する。光源１１２ａ，…，１１２ｎから発せられる励起光の波長は、試料Ｓに含まれる蛍光色素の種類に対応して、互いに相違している。光源１１２ａ，…，１１２ｎは、たとえば、試料Ｓ中の蛍光色素に合った発振波長のレーザー光源で構成される。コリメートレンズ１１４ａ，…，１１４ｎは、それぞれ、光源１１２ａ，…，１１２ｎから発せられた励起光をコリメートする。ダイクロイックミラー１１６ａ，…，１１６ｎは、それぞれ、コリメートレンズ１１４ａ，…，１１４ｎを通過した励起光を同じ方向に反射する。ダイクロイックミラー１１６ａ，…，１１６ｎは、それぞれ、図１の上方から入射する励起光を透過し、図１の右方から入射する励起光を反射する。その結果、光源１１２ａ，…，１１２ｎからそれぞれ射出された異なる波長の励起光は、ダイクロイックミラー１１６ａの通過後に一本のビームに合成される。ダイクロイックミラー１１６ｎは、励起光を透過する必要がないので、単なるミラーに変更されてもよい。
【００２１】
光照射部１１０はさらに、ダイクロイックミラー１２２とガルバノミラー１２４と対物レンズ１２６と対物レンズ駆動機構１２８を含んでいる。ダイクロイックミラー１２２は、光源系１１１からの励起光をガルバノミラー１２４に向けて反射し、試料Ｓから発せられる蛍光を透過する。ガルバノミラー１２４は、励起光を対物レンズ１２６に向けて反射するとともに、その反射方向を変更する。対物レンズ１２６は、励起光を収束して試料Ｓ内の測定点に照射するとともに、試料Ｓ内の測定点からの光を取り込む。対物レンズ１２６には、微小な共焦点領域（測定点）の形成のために、ＮＡ（開口数）の大きいものが使用される。これにより得られる共焦点領域の大きさは、直径０．６μｍ程度、長さ２μｍ程度の略円筒状となる。ガルバノミラー１２４は、測定点をｘｙ方向に走査するｘｙ走査機構を構成している。ｘｙ走査機構は、ガルバノミラーを使用して構成するほかに、音響光学変調素子（ＡＯＭ）やポリゴンミラー、ホログラムスキャナーなどを使用して構成してもよい。対物レンズ駆動機構１２８は、対物レンズ１２６を光軸に沿って移動させる。これにより、測定点がｚ方向に移動される。つまり、対物レンズ駆動機構１２８は、測定点をｚ方向に走査するｚ走査機構を構成している。
【００２２】
光検出部１３０は、対物レンズ１２６とガルバノミラー１２４とダイクロイックミラー１２２を光照射部１１０と共有している。光検出部１３０はさらに、収束レンズ１３２とピンホール１３４とコリメートレンズ１３６とを含んでいる。収束レンズ１３２は、ダイクロイックミラー１２２を透過した光を収束する。ピンホール１３４は、収束レンズ１３２の焦点に配置されている。つまり、ピンホール１３４は、試料Ｓ内の測定点に対して共役な位置にあり、測定点からの光だけを選択的に通す。コリメートレンズ１３６は、ピンホール１３４を通過した光を平行にする。コリメートレンズ１３６を通過した光は、ｎチャンネルの検出系１３１に入射する。
【００２３】
ｎチャンネルの検出系１３１は、ダイクロイックミラー１３８ａ，…，１３８ｎと蛍光フィルター１４０ａ，…，１４０ｎと光検出器１４２ａ，…，１４２ｎとを含んでいる。
【００２４】
ダイクロイックミラー１３８ａ，…，１３８ｎは、それぞれ、光源１１２ａ，…，１１２ｎからの励起光によって試料Ｓから生成された蛍光の波長域付近の波長の光を選択的に反射する。ダイクロイックミラー１３８ｎは、光を透過する必要がないので、単なるミラーに変更されてもよい。蛍光フィルター１４０ａ，…，１４０ｎは、それぞれ、ダイクロイックミラー１３８ａ，…，１３８ｎによって反射された光から、不所望な波長成分の光を遮断し、光源１１２ａ，…，１１２ｎからの励起光によって生成された蛍光だけを選択的に透過する。蛍光フィルター１４０ａ，…，１４０ｎを透過した蛍光はそれぞれ光検出器１４２ａ，…，１４２ｎに入射する。光検出器１４２ａ，…，１４２ｎは、入射した光の強度に対応した信号を出力する。すなわち、光検出器１４２ａ，…，１４２ｎは、試料Ｓ内の測定点からの蛍光強度信号を出力する。
【００２５】
制御部１６０はたとえばパーソナルコンピューターで構成される。制御部１６０は、試料Ｓの観察領域の蛍光画像の取得と記憶と表示、取得する蛍光画像のフレーム数（枚数）や解析領域の設定の入力待ち、画像解析（相関値の算出）、拡散時間の推定などを行なう。また制御部１６０は、ｘｙ走査機構であるガルバノミラー１２４、ｚ走査機構である対物レンズ駆動機構１２８、試料ステージ１９０などの制御を行なう。
【００２６】
図１に示される制御部の機能ブロックを図２に示す。制御部１６０は、図２に示すように、走査制御部１６２と画像形成部１６４と記憶部１６６と表示部１６８と入力部１７０と解析領域設定部１７２と画像選定部１７４とデータ抽出部１７６と解析部１７８とステージ制御部１８０とを含んでいる。ここで、走査制御部１６２と画像形成部１６４と記憶部１６６とステージ制御部１８０と上述したガルバノミラー１２４と対物レンズ駆動機構１２８と試料ステージ１９０と光検出器１４２とが画像取得部を構成し、データ抽出部１７６と解析部１７８とが演算部を構成する。
【００２７】
走査制御部１６２は、試料Ｓの蛍光画像を取得する際、励起光の照射位置を試料Ｓに対してラスター走査するようにガルバノミラー１２４を制御する。走査制御部１６２はまた、必要であれば、励起光の照射位置を試料Ｓに対してｚ走査するように対物レンズ駆動機構１２８を制御する。画像形成部１６４は、走査制御部１６２から入力される励起光の照射位置の情報と光検出器１４２ａ，…，１４２ｎの出力信号とから試料Ｓの蛍光画像を形成する。これにより、蛍光画像が取得される。記憶部１６６は、画像形成部１６４で形成された蛍光画像を順次記憶する。表示部１６８は、試料Ｓの蛍光画像や解析結果を表示する。入力部１７０は、たとえばマウスやキーボードを含み、表示部１６８と共同してＧＵＩを構成する。このＧＵＩは、取得フレーム数や観察領域や解析領域の設定などに利用される。ステージ制御部１８０は、たとえば観察領域を設定するために、入力部１７０からの入力情報にしたがって試料ステージ１９０を制御する。解析領域設定部１７２は、入力部１７０からの入力情報にしたがって解析領域を設定する。画像選定部１７４は、入力部１７０からの入力情報にしたがって、解析に利用する２フレーム以上の蛍光画像を選定する。データ抽出部１７６は、解析領域設定部１７２と画像選定部１７４からの入力情報に基づいて、記憶部１６６に記憶されている蛍光画像から必要なデータを抽出する。必要なデータは、画像選定部１７４によって選定された蛍光画像の同一画像の前記解析領域内の取得時間間隔が同じ二つのピクセルのデータペアと、画像選定部１７４によって選定された選定画像の異なる二つの画像の前記解析領域内の取得時間間隔が同じ二つのピクセルのデータペアである。これら複数のデータペアに含まれるデータは、たとえば、記憶部１６６に記憶されているすべての蛍光画像のすべてのピクセルのデータまたは一部のピクセルのデータであってよく、あるいは、記憶部１６６に記憶されている一部の蛍光画像のすべてのピクセルのデータまたは一部のピクセルのデータであってもよい。データの抽出は、後述する式（１）〜式（４）にしたがって行なわれる。解析部１７８は、データ抽出部１７６によって抽出されたデータに対して後述する相関値の演算を行なう。
【００２８】
図１において、光源１１２ａ，…，１１２ｎから発せられた励起光は、コリメートレンズ１１４ａ，…，１１４ｎとダイクロイックミラー１１６ａ，…，１１６ｎとダイクロイックミラー１２２とガルバノミラー１２４と対物レンズ１２６を経て試料Ｓ内の測定点に照射される。励起光が照射される測定点は、ガルバノミラー１２４によってｘｙ方向にラスター走査される。さらに必要であれば、対物レンズ駆動機構１２８によってｚ走査される。励起光を受けた試料Ｓは測定点から蛍光を発する。試料Ｓからの光（蛍光のほかに不所望な反射光などを含む）は、対物レンズ１２６とガルバノミラー１２４とダイクロイックミラー１２２と収束レンズ１３２を経てピンホール１３４に至る。ピンホール１３４は測定点と共役な位置にあるため、試料Ｓ内の測定点からの光だけがピンホール１３４を通過する。ピンホール１３４を通過した光すなわち試料Ｓ内の測定点からの光はコリメートレンズ１３６を経てｎチャンネルの検出系１３１に入射する。ｎチャンネルの検出系１３１に入射した光は、ダイクロイックミラー１３８ａ，…，１３８ｎによって波長にしたがって分離される（つまり分光される）とともに、蛍光フィルター１４０ａ，…，１４０ｎによって不所望な成分が除去される。その結果、光源１１２ａ，…，１１２ｎからの励起光によって生成された蛍光だけが光検出器１４２ａ，…，１４２ｎにそれぞれ入射する。光検出器１４２ａ，…，１４２ｎは、それぞれ、入射光すなわち試料Ｓ内の測定点から発せられた蛍光の強度を示す蛍光強度信号を出力する。この蛍光強度信号は画像形成部１６４に入力される。画像形成部１６４は、１回のラスター走査（およびｚ走査）ごとに、入力される蛍光強度信号をｘｙ方向（およびｚ方向）の位置情報に同期させて処理して、試料Ｓ内の焦点面（測定点が移動した平面または曲面）の１フレームの蛍光画像を形成する。形成された蛍光画像は、記憶部１６６に保存される。ここに述べた一連の動作は、設定された取得するフレーム数だけ繰り返され、設定されたフレーム数の蛍光画像が取得される。各蛍光画像は、ピクセルのデータが時系列的に取得された複数のピクセルからなる。
【００２９】
記憶部１６６に保存された蛍光画像は、必要に応じて処理され、表示部１６８に表示される。たとえば、測定点のｚ位置を変えて複数フレームの蛍光画像を取得し、それらを合成して三次元画像を形成し、これを表示部１６８に表示することも可能である。
【００３０】
[空間相関計算式]
本実施形態において使用する空間相関計算式は、十分なデータ数と十分な遅延時間とが得られるように、従来の空間相関計算式を拡張したものである。
【００３１】
次式（１）は、本実施形態において使用するＲＩＣＳの解析に使用する空間自己相関計算式を表している。式（１）は、チャンネル１の自己相関計算式の例である。
【数１】
0005508809.tif 000002
【００３２】
ここで、ＧｓａはＲＩＣＳの空間自己相関値、Ｉ１γはチャンネル１のγフレーム目の蛍光強度データ（ピクセルのデータ）、Ｉ１（γ＋η）はチャンネル１の（γ＋η）フレーム目の蛍光強度データ（ピクセルのデータ）、ｘ，ｙは測定点の空間的座標、ξ，ψは測定点からの空間的座標の変化量、γは１以上の整数（γ＝１，２，…，ｑ）、ηは０以上ｑ未満の整数（η＝０，１，…，ｐ（＜ｑ））、Ｍ１γ１（γ＋η）は、チャンネル１のγフレーム目とチャンネル１の（γ＋η）フレーム目との積和計算の回数、Ａ１は平均値である。
【００３３】
γと（γ＋η）は共に積和計算の対象となるフレームを示すパラメータである。言い換えれば、γとηは、複数フレームの蛍光画像に対して、相関解析に利用する蛍光画像を選定するためのものである。γは、積和計算の対象の一方のフレームを示し、ηは、時間拡張のために導入されたパラメータであり、γに対するフレーム数の遅れを示している。ｑは、空間相関計算に使用するフレームの総数を表している。ｐは、空間相関計算における最大の遅延時間を決めるフレーム数を表している。ｐの取り得る最大の値はｑ−１である。
【００３４】
平均値Ａ１は、たとえば次式（２）で表される。
【数２】
0005508809.tif 000003
【００３５】
ここで、Ｍ１γは、チャンネル１のγフレーム目の計算に使用するデータ数である。
【００３６】
平均値Ａ１の算出式は式（２）に限定されない。平均値Ａ１は、他の周知の任意の計算式を使用して算出されてもよい。
【００３７】
次式（３）は、本実施形態において使用するＲＩＣＳの解析に使用する空間相互相関計算式を表している。式（３）は、チャンネル１とチャンネル２の相互相関計算式の例である。
【数３】
0005508809.tif 000004
【００３８】
ここで、ＧｓｃはＲＩＣＳの空間相互相関値、Ｉ１γはチャンネル１のγフレーム目の蛍光強度データ（ピクセルのデータ）、Ｉ２（γ＋η）はチャンネル２の（γ＋η）フレーム目の蛍光強度データ（ピクセルのデータ）、ｘ，ｙは測定点の空間的座標、ξ，ψは測定点からの空間的座標の変化量、γは１以上の整数（γ＝１，２，…，ｑ）、ηは０以上ｑ未満の整数（η＝０，１，…，ｐ（＜ｑ））、Ｍ１γ２（γ＋η）は、チャンネル１のγフレーム目とチャンネル２の（γ＋η）フレーム目の積和計算の回数、Ａ２は平均値である。
【００３９】
γとηは、式（１）の同様に、それぞれ、積和計算の対象の一方のフレームと、γに対するフレーム数の遅れを示している。
【００４０】
平均値Ａ２は、たとえば次式（４）で表される。
【数４】
0005508809.tif 000005
【００４１】
ここで、Ｍ１γは、チャンネル１のγフレーム目の計算に使用するデータ数、Ｍ２γは、チャンネル２のγフレーム目の計算に使用するデータ数である。
【００４２】
次式（５）は、本実施形態において使用するＲＩＣＳの解析に使用するフィッティング式を表している。
【数５】
0005508809.tif 000006
【００４３】
ここで、ＧｓはＲＩＣＳの空間相関値（空間自己相関値Ｇｓａまたは空間相互相関値Ｇｓｃ）、ＳはＲＩＣＳの解析におけるスキャンの影響、ＧはＲＩＣＳの解析における時間遅延の影響、Ｄは拡散定数、δｒはピクセルサイズ、Ｎは分子数、Ｗ０は励起レーザビームの横方向の半径、ＷＺは励起レーザビームの縦方向の半径、τｐはピクセル時間、τｌはライン時間、τｆはフレーム時間である。
【００４４】
ここで、τｐはピクセル間の取得時間のずれである。すなわち、ピクセル時間τｐは、１ピクセルのデータを取得するのに要する時間である。またτｌは、任意のラインの最初のピクセルと、その次のラインの最初のピクセルとの間の取得時間のずれ（ライン時間）である。すなわち、ライン時間τｌは、１ラインを走査するのに要する時間を意味する。またτｆは、任意のフレームの最初のピクセルと、その次のフレームの最初のピクセルとの間の取得時間のずれである。すなわち、フレーム時間τｆは、１フレームを走査するのに要する時間を意味する。
【００４５】
式（１）〜式（４）において、γは、γ＝１，２，…，ｑと表され、ηは、η＝０，１，…，ｐと表され、ｐとｑの間には、ｐ＜ｑの関係がある。ｑ＝１の場合（１フレームだけのデータで空間相関計算を行なう場合）、ｐ＝０となり、ηの取り得る値は０だけとなる。この場合、本実施形態においてＲＩＣＳの解析に使用する空間相関計算式とフィッティング式は、η＝０の場合には、従来のＲＩＣＳの解析に使用する空間相関計算式とフィッティング式と同じになる。すなわち、η＝０のとき、式（１）の空間自己相関計算式は次式（６）で表される。
【数６】
0005508809.tif 000007
【００４６】
ここで、Ｉ１はチャンネル１の同一フレームの蛍光強度データ（ピクセルのデータ）、ｘ，ｙは測定点の空間的座標、ξ，ψは測定点からの空間的座標の変化量、Ｍ１１はチャンネル１の同一フレーム中の積和計算の回数である。
【００４７】
平均値Ａ１は、次式（７）で表される。
【数７】
0005508809.tif 000008
【００４８】
ここで、Ｍ１は、チャンネル１の同一フレーム中の計算に使用するデータ数である。
【００４９】
また、式（３）の空間相互相関計算式は次式（８）で表される。
【数８】
0005508809.tif 000009
【００５０】
ここで、Ｉ１はチャンネル１の計算に使用するフレームの蛍光強度データ（ピクセルのデータ）、Ｉ２はチャンネル２の計算に使用するフレームの蛍光強度データ（ピクセルのデータ）、ｘ，ｙは測定点の空間的座標、ξ，ψは測定点からの空間的座標の変化量、Ｍ１２はチャンネル１とチャンネル２中のデータの積和計算の回数である。
【００５１】
平均値Ａ２は、次式（９）で表される。
【数９】
0005508809.tif 000010
【００５２】
ここで、ここで、Ｍ１は、チャンネル１の計算に使用するフレーム中の計算に使用するデータ数、Ｍ２は、チャンネル２の計算に使用するフレーム中の計算に使用するデータ数である。
【００５３】
また、式（５）のフィッティング式は次式（１０）で表される。
【数１０】
0005508809.tif 000011
【００５４】
[測定手順]
以下、図３を参照しながら画像解析の手順について説明する。また、各ステップについて、適宜、図４〜図１２を参照しながら説明する。
【００５５】
（ステップＳ１）
試料Ｓの観察領域と取得する蛍光画像のフレーム数を設定する。設定した観察領域の設定したフレーム数の蛍光画像を時系列的に取得する。蛍光画像の取得は、同一の観察領域に対して同一の走査方法によって行なう。すなわち、所定の方向に向けて光を照射した後、再び当該所定の方向に向けて光を照射するまでを１セットの走査とした場合、少なくとも２セット以上、解析領域が走査される。
【００５６】
画像解析に使用する複数フレームの蛍光画像を模式的に図４に示す。画像解析に使用する複数フレームの蛍光画像は、ステップＳ１で取得した画像の全部であってもよく、また一部であってもよい。以下では、画像解析に使用する複数フレームの蛍光画像を単に複数フレームの蛍光画像と呼ぶ。図４において、Ｆｋは、一つのチャンネルにおけるｋフレーム目の蛍光画像を表している。各蛍光画像は、ピクセルのデータが時系列的に取得された複数のピクセルからなる。ピクセルのデータは、たとえば、２次元または３次元の観察領域から得られた蛍光強度である。
【００５７】
（ステップＳ２）
図５に示すように、画像解析に使用する蛍光画像の領域（観察領域）Ｒ１に対して解析する領域（解析領域）Ｒ２を設定する。解析領域Ｒ２は、観察領域Ｒ１の一部に限定されるものではなく、観察領域Ｒ１に一致していてもよい。解析領域Ｒ２は、アプリケーション的にはデフォルトで観察領域Ｒ１すなわちステップＳ１における走査領域に設定されている。観察領域Ｒ１の全体を解析する場合には、このステップは不要である。
【００５８】
（ステップＳ３）
複数フレームの蛍光画像をデータ情報変化に基づいて分類する。たとえば、複数フレームの蛍光画像の解析領域Ｒ２の区分値をそれぞれ算出し、算出した区分値に基づいて複数フレームの蛍光画像を複数グループに分類する。区分値は、たとえば、解析領域Ｒ２のピクセルのデータの統計値であり、解析領域Ｒ２のピクセルのデータの最大値、最小値、平均値、相対差、相対比のいずれかである。ピクセルのデータは、たとえば、２次元または３次元の観察領域から得られた蛍光強度である。相対差は、たとえば、最大値と最小値との差である。
【００５９】
複数グループに分類された複数フレームの蛍光画像の解析領域の画像を模式的に図６に示す。図６において、Ｆａｋはｋフレーム目の蛍光画像の解析領域の画像を表している。Ｄａ，Ｄｂ，Ｄｃ，Ｄｄ，Ｄｅ，Ｄｆは、蛍光画像の解析領域の区分値を表している。ここでは、一例として、区分値は６種類あるとしている。図６の例では、Ｆａ１，Ｆａ２，Ｆａ７９，Ｆａ８０が同じグループに分類され、Ｆａ３，Ｆａ７４，Ｆａ７５が同じグループに分類され、Ｆａ４，Ｆａ７１，Ｆａ７２，Ｆａ７３が同じグループに分類され、Ｆａ５，Ｆａ７６，Ｆａ７７，Ｆａ７８が同じグループに分類され、Ｆａ６，Ｆａ７が同じグループに分類され、Ｆａ８，Ｆａ９，Ｆａ１０が同じグループに分類されている。
【００６０】
（ステップＳ４）
グループごとに解析領域の平均画像を算出する。平均画像は、各グループに含まれる全ての画像の平均値であってもよく、または各グループに含まれる一部の画像の平均値であってもよい。たとえば、平均画像の算出は、各グループに含まれる画像の数を算出し、算出した画像の数に基づいて各グループの平均画像を算出する。
【００６１】
より具体的には、各グループに含まれる全ての画像について、解析領域を構成するピクセルごとに、ピクセルのデータの平均値を算出する。そして、ピクセルごとに算出された各ピクセルのデータの平均値からなる画像を平均画像としてよい。
【００６２】
さらに、グループごとの平均画像のすべてのピクセルの平均値を算出する。
【００６３】
（ステップＳ５）
グループごとに解析領域の各画像から平均画像を減算する。これにより画像に共通に重畳する不要なデータが除去される。たとえば、大きい分子や不動分子などの影響を取り除かれる。解析領域の各画像から平均画像を減算するには、たとえば、解析領域を構成するピクセルごとに、各画像のピクセルのデータから平均画像のピクセルのデータを減算し、算出された値からなる画像を得ればよい。
【００６４】
さらに、グループごとに解析領域の各画像に平均値を加算する。これにより減算によって低下した輝度値の低下が補われる。ここでは、平均値を加算する例をあげたが、これに代えて、最小値を加算してもよい。
【００６５】
以下、このように平均画像の減算と平均値の加算を経て算出された画像を解析領域の再構築画像と呼ぶことにする。
【００６６】
ここで、ｋフレーム目の解析領域の再構築画像をＦｂｋとする。また、区分値Ｄａ，Ｄｂ，Ｄｃ，Ｄｄ，Ｄｅ，Ｄｆに対応する蛍光画像の解析領域の平均画像をそれぞれＡａ，Ａｂ，Ａｃ，Ａｄ，Ａｅ，Ａｆとする。ここで、Ａａ，Ａｂ，Ａｃ，Ａｄ，Ａｅ，Ａｆはそれぞれ相応の平均値を加算済みのものとする。このようにした場合、図６の例では、再構築画像は、Ｆｂ１＝Ｆａ１−Ａａ，Ｆｂ２＝Ｆａ２−Ａａ，Ｆｂ３＝Ｆａ３−Ａｂ，Ｆｂ４＝Ｆａ４−Ａｃ，Ｆｂ５＝Ｆａ５−Ａｄ，Ｆｂ６＝Ｆａ６−Ａｅ，Ｆｂ７＝Ｆａ７−Ａｅ，Ｆｂ８＝Ｆａ８−Ａｆ，Ｆｂ９＝Ｆａ９−Ａｆ，Ｆｂ１０＝Ｆａ１０−Ａｆ，…，Ｆｂ７１＝Ｆａ７１−Ａｃ，Ｆｂ７２＝Ｆａ７２−Ａｃ，Ｆｂ７３＝Ｆａ７３−Ａｃ，Ｆｂ７４＝Ｆａ７４−Ａｂ，Ｆｂ７５＝Ｆａ７５−Ａｂ，Ｆｂ７６＝Ｆａ７６−Ａｄ，Ｆｂ７７＝Ｆａ７７−Ａｄ，Ｆｂ７８＝Ｆａ７８−Ａｄ，Ｆｂ７９＝Ｆａ７９−Ａａ，Ｆｂ８０＝Ｆａ８０−Ａａとなる。
【００６７】
画像解析に使用する蛍光画像の解析領域の画像が同種類のものであること、言い換えれば解析領域のデータ情報変化が実質的にないことがあらかじめ分かっている場合には、ステップＳ３，Ｓ４，Ｓ５は省略してよい。
【００６８】
（ｐとｑの値について）
式（１）〜（４）の空間相関計算を実施するにあたってｐとｑの値を決定する必要がある。前述したように、ｐは、空間相関計算における最大の遅延時間を決めるフレーム数を表し、ｑは、空間相関計算に使用するフレームの総数を表している。ｐとｑの値が大きいほど、計算に使用するデータ数は多くなるので、計算結果の精度つまり信頼度は増加するが、計算に要する時間は長くなる。反対に、ｐとｑの値が小さいほど、計算に使用するデータ数は少なくなるので、計算に要する時間は短くなるが、計算結果の精度つまり信頼度は低下する。このような理由から、ｐとｑの値は、十分な精度の計算結果が得られる範囲において、なるべく小さく設定するとよい。
【００６９】
（ステップＳ６）
ｐの値を決定するため、まず、拡散時間を推定する。拡散時間の推定は、式（６）〜（１０）を使用してＲＩＣＳの解析をすることにより行なう。具体的には、式（６）〜式（９）を使用して、異なる遅延時間に対する相関値Ｇｓをそれぞれ求める。そして、遅延時間と相関値Ｇｓとの関係から、式（１０）を使用して、拡散定数と分子数を求める。
【００７０】
式（１０）において、遅延時間がゼロのときは（ξ＝０、ψ＝０）、Ｓは１であり、Ｇｓは１／Ｎで表せる。したがって、分子数を求めることができる。
【００７１】
拡散定数と拡散時間との関係は次式（１１）で表される。この式（１１）に基づいて、先に求めた拡散定数から拡散時間を求めることができる。
【数１１】
0005508809.tif 000012
【００７２】
ここで、Ｄは拡散定数、τは拡散時間、Ｗ０は励起レーザビームの横方向の半径を意味する。
【００７３】
なお、解析の対象が拡散時間の短い分子である場合には、式（６）〜式（１０）を使用して得られる拡散時間は適切な拡散時間を示している。最大の遅延時間が拡散時間の２倍よりも大きい場合、式（１０）を用いて十分にフィッティングできるからである。しかし、解析の対象が拡散時間の長い分子である場合には、式（１０）を用いてフィッティングしても、そこから得られる拡散時間は、必ずしも、実際の拡散時間と一致しない。この場合、拡散時間は推定値に過ぎない。
【００７４】
（ステップＳ７）
ｐの値を決定するため、次に、次式（１２）を使用してｐを求める。
【数１２】
0005508809.tif 000013
【００７５】
ここで、τＤは推定拡散時間、ξｍａｘ，ψｍａｘは、１フレーム中の空間的座標の変化の最大値、ｎは２以上の整数（ｎ≧２）である。
【００７６】
一般に、相関値の算出には、最大の遅延時間が、拡散時間の２倍程度あればよいとされている。最大の遅延時間が、拡散時間の２倍よりも短いと、式（５）を用いて適切にフィッティングすることが困難となる。したがって、少なくともｎ＝２とした上で、式（１１）を用いて、ｐを算出すれば、式（５）を用いて適切にフィッティングすることができると考えられる。ただし、解析結果に求められる精度に応じて、ｎを３以上の整数に設定してもよい。これにより、式（１１）を満足するｐを用いた式（１）〜式（４）を使用したＲＩＣＳの解析であれば、適切な解析結果が得られると考えられる。
【００７７】
（ステップＳ８）
パラメータγの最終値ｑを決定する。ｑの値は、前述したように、ｑ＞ｐを満足するものでなければならない。ｑの値は、たとえば、解析領域がｍ×ｍの場合、次式（１３）を満足するように決める。
【数１３】
0005508809.tif 000014
【００７８】
（ステップＳ９）
ステップＳ５において算出された再構築画像を、ステップＳ５において決定したｑの値に基づいて複数ブロックに分割する。また、複数ブロックを順序づけ、最初のブロックを、続くステップＳ１０における空間相関計算の計算対象に設定する。
【００７９】
複数ブロックに分割された複数フレームの蛍光画像の解析領域の再構築画像を模式的に図７に示す。図７には、一例として、８０フレームの蛍光画像の解析領域の再構築画像Ｆｂ１〜Ｆｂ８０が、８フレームずつ、１０個のブロックＢ１〜Ｂ１０に分割された例が示されている。
【００８０】
（ステップＳ１０）
計算対象のブロックに対して空間相関値を計算する。空間自己相関値を計算する場合は式（１）と式（２）の空間自己相関計算式を使用し、空間相互相関値を計算する場合は式（３）と式（４）の空間相互相関計算式を使用する。
【００８１】
相関値の計算に使用する各ピクセルのデータは、そのピクセルのデータそのものであってもよいし、そのピクセルを含む複数のピクセルのデータの統計値であってもよい。複数のピクセルは、たとえば、注目のピクセルおよびこれに隣接するピクセルであってよい。統計値は、たとえば、ピクセルのデータの平均値、最大値、最小値、相対差、絶対差、相対比のいずれかであってよい。どのような統計値を使用するかは、ＲＩＣＳの解析によってどのような情報を得たいかによって決める。
【００８２】
また相関値の計算は、ピクセルのデータに基づいて画像をそれぞれ構成し直し、構成し直した画像について相関値を計算してもよい。たとえば、隣のピクセルのデータ同士を足して、ピクセルのデータの数を半分にする。または、一つのピクセルのデータを複数に分割する。本来ならば、一度画像を取得するとピクセルのデータの数は増えないが、取得したピクセルのデータの強度がそのピクセルのデータの周囲にガウシアン分布で広がっていると仮定して、本来取得できていないピクセルのデータを補う。本質的にピクセルのデータの数が増えている訳ではないが、見た目が良くなる。
【００８３】
式（１）〜式（４）を使用する計算は、ηの値を０，１，２，…，ｐと順に変えつつ、ηの各値に対して、さらにγの値を１，２，…，ｐ−ηと順に変えつつ、さらにγの各値に対して、ξ，ψを順に変えつつ行なう。たとえば、解析領域Ｒ２が２５６ピクセル×２５６ピクセルの領域である場合、ξ，ψをそれぞれ０，１，２，…，２５５と順に変える。
【００８４】
たとえば、η＝０，γ＝１，ψ＝０に対して、ξを０，１，２，…，２５５と１ずつ増やしながら、ξの各値について計算処理を行ない、次にψを１増やし、η＝０，γ＝１，ψ＝１に対して、ξを０，１，２，…，２５５と１ずつ増やしながら、ξの各値について計算処理を行ない、この計算処理をψ＝２５５になるまで繰り返す。その後、γを１増やし、η＝０，γ＝２，ψ＝０に対して、ξを０，１，２，…，２５５と１ずつ増やしながら、ξの各値について計算処理を行ない、次に、η＝０，γ＝２，ψ＝１に対して、ξを０，１，２，…，２５５と１ずつ増やしながら、ξの各値について計算処理を行ない、この計算処理をψ＝２５５になるまで繰り返す。この計算処理をψ＝２５５になるまで繰り返す。この計算処理はγを１ずつ増やしながら、γ＝ｑになるまで繰り返す。
【００８５】
その後、ηを１増やし、η＝１，γ＝１，ψ＝０に対して、ξを０，１，２，…，２５５と１ずつ増やしながら、ξの各値について計算処理を行ない、次にψを１増やし、η＝１，γ＝１，ψ＝１に対して、ξを０，１，２，…，２５５と１ずつ増やしながら、ξの各値について計算処理を行ない、この計算処理をψ＝２５５になるまで繰り返す。その後、γを１増やし、η＝１，γ＝２，ψ＝０に対して、ξを０，１，２，…，２５５と１ずつ増やしながら、ξの各値について計算処理を行ない、次に、η＝１，γ＝２，ψ＝１に対して、ξを０，１，２，…，２５５と１ずつ増やしながら、ξの各値について計算処理を行ない、この計算処理をψ＝２５５になるまで繰り返す。この計算処理をψ＝２５５になるまで繰り返す。この計算処理はγを１ずつ増やしながら、γ＝ｑ−１になるまで繰り返す。
【００８６】
以降、ηを１ずつ増やしながらηの各値に対して、γを１ずつ増やしながら、同様の計算処理を、γ＝ｑ−ηになるまで繰り返す。この計算処理は、ηを１ずつ増やしながら、η＝ｐになるまで繰り返す。
【００８７】
図８は、Ｇｓ（２，４，０）中の積和計算を模式的に示している。この計算は、同一フレーム（γフレーム目）の再構築画像の解析領域Ｒ２内のピクセルのデータ間の相関計算である。この計算において、γの取り得る最終値はｑである。
【００８８】
図９は、Ｇｓ（２，４，１）中の積和計算を模式的に示している。この計算は、異なるフレームの画像の解析領域Ｒ２内のピクセルのデータの間の相関計算である。具体的には、γフレーム目の再構築画像の解析領域Ｒ２内のピクセルのデータと（γ＋１）フレーム目の再構築画像の解析領域Ｒ２内のピクセルのデータとの間の相関計算である。この計算において、γの取り得る最終値はｑー１である。
【００８９】
図１０は、Ｇｓ（２，４，２）中の積和計算を模式的に示している。つまり、γフレーム目の再構築画像の解析領域Ｒ２内のピクセルのデータと（γ＋２）フレーム目の再構築画像の解析領域Ｒ２内のピクセルのデータとの間の相関計算を示している。この計算において、γの取り得る最終値はｑー２である。
【００９０】
図１１は、Ｇｓ（２，４，ｐ）中の積和計算を模式的に示している。つまり、γフレーム目の再構築画像の解析領域Ｒ２内のピクセルのデータとｐフレーム目の再構築画像の解析領域Ｒ２内のピクセルのデータとの間の相関計算を示している。この計算において、γの取り得る最終値はｑーｐである。
【００９１】
図１２は、式（１）〜式（４）における変数ξ，ψ，ηと計算に使用するフレームを示している。図１２から、本実施形態による式（１）〜式（４）を使用した計算では、遅延時間が拡張されていることがわかる。具体的には、遅延時間は、２５６τｐ＋２５５τｌを超えて、２５６τｐ＋２５５τｌ＋ｐτｆまで拡大されている。
【００９２】
ここで、遅延時間とは、一つのピクセルの取得時間と別のピクセルの取得時間との差を意味している。たとえば、（ξ，ψ，η）＝（１，１，０）と、（ξ，ψ，η）＝（４，２，０）との遅延時間は、（４−１）τｐ＋（２−１）τｌ＋（０−０）τｆで表される。
【００９３】
そして、一つの遅延時間に対して、一つの相関値Ｇｓが得られる。ここで、理想的には、遅延時間が小さいほど、相関値Ｇｓは大きくなり、遅延時間が大きいほど、相関値Ｇｓは小さくなる。
【００９４】
（ステップＳ１１）
計算対象のブロックが最終ブロックであるかを判断する。計算対象のブロックが最終ブロックでない場合には、計算対象のブロックを次のブロックに変更してステップＳ１０に戻る。また計算対象のブロックが最終ブロックであい場合には、次のステップＳ１２に進む。
【００９５】
（ステップＳ１２）
ステップＳ１１において計算された複数の空間相関値の平均値を計算する。
【００９６】
（ステップＳ１３）
ステップＳ１２において計算された空間相関値を式（５）によってフィッティングする。
【００９７】
式（５）によってフィッティングすることにより拡散時間の推定をする。具体的には、式（１）〜式（４）を使用して、異なる遅延時間に対する自己相関値Ｇｓａまたは相互相関値Ｇｓｃをそれぞれ求める。そして、自己相関値Ｇｓａまたは相互相関値Ｇｓｃと遅延時間との関係から、式（５）を使用して、拡散定数と分子数を求める。
【００９８】
式（５）において、遅延時間がゼロのときは（ξ＝０，ψ＝０，η＝０）、Ｓは１であり、自己相関値Ｇｓａまたは相互相関値Ｇｓｃは１／Ｎで表せる。したがって、分子数を求めることができる。
【００９９】
未知数である拡散定数Ｄと分子数Ｎを変動させながら、測定値として得られる相関値Ｇｓａまたは相関値Ｇｓｃと理論値として得られるＧｓとの差が最小となるように、適切な拡散定数Ｄと分子数Ｎを求める。このように、式（５）によるフィッティングとは、拡散定数Ｄと分子数Ｎを変動させながら、２次元または３次元の観察領域における、最適な、分子数または拡散定数を推定することである。
【０１００】
拡散定数と拡散時間との関係を示す式（１１）に基づいて、求めた拡散定数から拡散時間を求めることができる。
【０１０１】
（ステップＳ１４）
計算結果を表示し保存する。具体的には、ステップＳ１２で得た空間相関平均値と、ステップＳ１４で得た空間相関値のフィッティング結果を表示する。解析結果の一例を図１３〜図１６に示す。図１３は、小さい分子に対する空間相関値の計算結果を輝度で示した画像であり、図１４は、そのフィッティング結果を示している。また図１５は、大きい分子に対する空間相関値の計算結果を輝度で示した画像であり、図１６は、そのフィッティング結果を示している。
【０１０２】
ＲＩＣＳのような画像データを計算の元とする空間的相関解析において、本実施形態では、ステップＳ３〜Ｓ５において、複数フレームの画像をフレームデータの変化に応じていくつかのグループに分類し、グループごとに平均画像の減算処理を行なっている。つまり、異なる大きい分子や不動分子の影響が混在するフレームから一つの平均画像を算出して減算処理することを避け、大きい分子や不動分子の影響を事前に分類し、分類したグループごとに平均画像を算出して減算処理している。これにより、フレームデータの変化に応じたグループごとに、大きい分子や不動分子の影響が適材適所に除去される。
【０１０３】
従来、ＲＩＣＳのような画像データを計算の元とする空間的相関解析では、１フレームの画像の解析領域中のピクセルのデータを用いて一つの相関値を計算する。しかし、細胞観察のような細胞の核、膜、質などの異なる局所的な解析領域に限定してＲＩＣＳの解析を行なう場合、解析領域が小さくなる。解析領域が小さくなると、積和計算に利用できるピクセルデータの数（たとえば８×８）が減少する。このため、解析領域が非常に小さくなると、相関値が適切に算出できなくなる。図１７は、ＥＧＦＰ溶液（色素液を蒸留水で希釈したもの）の拡散定数（Ｄ）を解析領域のＲＯＩサイズを変えながら比較した結果を示している。図１７において、ＲＯＩサイズ＝２５６は、解析領域内に２５６×２５６のピクセル数が含まれていることを意味する。図１７から分かるように、解析領域のＲＯＩサイズが大きいほど、ＥＧＦＰ溶液の拡散定数９０（理論値）に近い値を示し、解析領域のＲＯＩサイズが小さいほど、ＥＧＦＰ溶液の拡散定数９０（理論値）から遠い値を示している。すなわち、ピクセルのデータが多いほど、正しい結果（理論値）に近い値（測定値）が得られることが分かる。
【０１０４】
これに対して本実施形態では、ステップＳ１０における空間相関値計算において、１フレームの画像の解析領域内の二つのピクセルに対する積和計算によって一つの相関値を計算するのではなく、複数フレーム（ｑフレーム）の画像の解析領域内の二つのピクセルに対して積和計算を継続的に行なって一つの相関値を計算する。このように複数フレームの画像のデータを使用して一つの相関値を計算するので、相関値の計算に使用するデータが１フレームの画像中のデータに制限されず、一つの相関値の計算に使用するデータの数が増大する。このため、高い精度でＲＩＣＳの解析を行なえる。
【０１０５】
さらに本実施形態では、ステップＳ１０における空間相関値計算において使用する式（１）〜（４）は、パラメータηによって遅延時間の拡張が図られている。これにより、ピクセル時間とライン時間を調整することなく、観察可能な拡散時間を拡張できる。このため、データ収集をし直さなくても、すでに取得したデータを用いて試料に適した拡散時間を推測することができる。これにより、大きい拡散時間の分子についても、小さい拡散時間の分子についても、適切な拡散時間を算出することが可能となる。
【０１０６】
これまで、図面を参照しながら本発明の実施形態を述べたが、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。
【０１０７】
また実施形態では、ラスター走査によって取得された画像について説明したが、画像は、ラスター走査によって取得されたものに限定されるものではなく、ピクセルのデータが時系列的に取得された複数のピクセルからなる画像であればよく、他の走査方法によって取得されたものであってもよい。
【符号の説明】
【０１０８】
１００…画像解析装置、１１０…光照射部、１１２ａ，…，１１２ｎ…光源、１１４ａ，…，１１４ｎ…コリメートレンズ、１１６ａ，…，１１６ｎ…ダイクロイックミラー、１２２…ダイクロイックミラー、１２４…ガルバノミラー、１２６…対物レンズ、１２８…対物レンズ駆動機構、１３０…光検出部、１３２…収束レンズ、１３４…ピンホール、１３６…コリメートレンズ、１３８ａ，…，１３８ｎ…ダイクロイックミラー、１４０ａ，…，１４０ｎ…蛍光フィルター、１４２ａ，…，１４２ｎ…光検出器、１６０…制御部、１６２…走査制御部、１６４…画像形成部、１６６…記憶部、１６８…表示部、１７０…入力部、１７２…解析領域設定部、１７４…画像選定部、１７６…データ抽出部、１７８…解析部、１８０…ステージ制御部、１９０…試料ステージ、Ｒ１…観察領域、Ｒ２…解析領域。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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