(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下結節伸展部に刺激を与える装置において、
複数の電極を備えた先端部と、基端部とを有するリードであって、前記複数の電極は、ペーシング電極として機能しているときにペーシング信号を供給する、又は感知電極として機能しているときに心拍数をモニタするように構成される前記リードと、
感知モード又はペーシングモードで選択的に機能するよう動作可能な回路と、を備え、
前記回路は、前記複数の電極に電気的に接続されると共に、同複数の電極のうちのどれが前記下結節伸展部を含む遅伝導路において最も強い信号を示す電極であるかを決定し、その最も強い信号を示す電極にペーシング信号を供給し、それによって前記最も強い信号を示す電極を感知電極として機能する状態からペーシング電極として機能する状態に切り替える、装置。
【請求項２】
前記複数の電極は２個の電極を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記複数の電極は３個の電極を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記リードは前記先端部に設けられたねじ部を備え、前記ねじ部は、前記リードの前記先端部のチップから延在し、前記基端部に向かって第一電極および第二電極を越えて延在するが、第一電極および第二電極を越えて第三電極までは延在していない、請求項１又は３に記載の装置。
【請求項５】
前記複数の電極は４個の電極を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記回路は、
バッテリと、
チャージスイッチを介して前記バッテリと電気的に並列接続されたキャパシタと、
感知回路と、
前記複数の電極の各々に対して少なくとも一つが対応するように設けられる複数のペーシングスイッチと、
前記複数の電極の各々に対して少なくとも一つが対応するように設けられる複数の感知
スイッチと、を備え、
前記感知モード時、前記複数の感知スイッチが前記感知回路を前記複数の電極に電気的に接続すると共に、前記複数のペーシングスイッチが前記キャパシタを前記複数の電極から電気的に切り離し、
前記ペーシングモード時、前記複数のペーシングスイッチのうちの一つが前記キャパシタを前記最も強い信号を示す電極に電気的に接続すると共に、前記感知スイッチのうちの一つが前記感知回路を前記最も強い信号を示す電極から電気的に切り離す、請求項１〜５の何れか一項に記載の装置。
【請求項７】
前記ペーシングモード時、前記最も強い信号を示す電極以外の全ての電極が感知電極として機能し続ける、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記ペーシング信号は、前記下結節伸展部に刺激を与えるために、前記ペーシング電極の作動、停止、および調整のうちの少なくとも一つを生じさせる、請求項１に記載の装置。
【請求項９】
前記装置は房室結節の血管を通じて下結節伸展部に案内されるように構成され、前記装置はさらに、前記リードを房室結節の血管を通じて下結節伸展部に案内するカテーテルを備え、同カテーテルは湾曲部を持つチップを有する先端部を備えている、請求項１〜８の何れか一項に記載の装置。
【請求項１０】
前記湾曲部は１０度〜６０度の角度をなす、請求項９に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、心臓ペーシングに関する。特に、本開示の実施形態は、右心房（「ＲＡ」）の下結節伸展部（「ＩＮＥ」）を用いた心臓ペーシングに関する。
【背景技術】
【０００２】
健康な心臓において、心拍は洞房（「ＳＡ」）結節のＲＡにおいて生じる。興奮は、両心房を通って房室（「ＡＶ」）結節にすばやく広がり、興奮の波を遅延させる。この遅延により、両心房が収縮した後に両心室が収縮することが可能となる。興奮は、ＡＶ結節により遅延された後、ＡＶ結節を出てヒス（Ｈｉｓ）束に伝わり、ヒス束を興奮させる。このヒス束の興奮は、プルキンエ線維からなる心室伝導系を介して心室まで、精密なパターン状に広がる。心室伝導系を介して興奮が広まることにより、各心室細胞が正確な時間に興奮され、心室収縮の調和が取られる。
【０００３】
さまざまな理由により、ＡＶ結節はブロックされ（「ＡＶブロック」という）、心臓伝導系の正常な利用が抑制され、あるいは阻止される。ＡＶブロックは、心房細動のある患者の心拍数を制御するために、治療上誘発されることもある。
【０００４】
ＡＶブロックのために正常な心臓伝導系を用いることができない場合、心室ペーシングが心拍障害の治療に用いられてきた。心臓の機械的機能を最適にするためには心室細胞における高度な電気同期が必要だが、心室ペーシングによりこの電気同期が得られるわけではない。最近発見されたことだが、長期的に見た場合、電気同期が得られないことで、鬱血性心不全を起こすことが多くなる。
【０００５】
心室ペーシングとして、具体的には、心臓の右心室（「ＲＶ」）心尖部からペーシングを行うものがある。リードの種類が安定しており、リード配置が簡易であるため、ＲＶペーシングが用いられてきた。ＲＶペーシング用の静脈ペーシングリードおよび電極としては、特許文献１に記載されたものがある。しかし、直接ＲＶペーシングは、非同期収縮、陰性変力効果、心室組織における組織学的な変化や超微形態的な変化、鬱血性心不全の問題の危険性、さらに死亡など、心室動作としては不良な状態をまねく可能性がある。
【０００６】
ＲＶペーシングにはこれらの欠点があるため、ペーシング中の心血行動態を高めるために、代替のペーシング部位についても研究されてきた。代替ペーシング部位としては、右室流出路（「ＲＶＯＴ」）やさまざまな中隔部位がある。また、両心室ペーシングなど、複数の心室ペーシング部位を用いることにより、再同期治療が改善されてきた。しかしながら、これらの代替ペーシング方法によっても、生理学的に必要な同期を得られないことがある。また、ＲＶＯＴの臨床的帰結については知られていない。
【０００７】
直接ヒス束ペーシングも、心室伝導系に損傷のない患者の心室収縮を同期させるようという試みに用いられてきた。しかしながら、ヒトのヒス束をペーシングする場合、いくつかの制約がある。たとえば、ヒス束の比較的小さな部分をペーシングする難しさや、膜性中隔にペーシングリードを挿入する難しさについて、研究により報告されている。また、ヒス領域では線維の含有量が多いため、ヒスペーシングでは、ＲＶペーシングよりも高いペーシング閾値と低い感知閾値が必要となる。また、ヒスペーシング部位は大動脈近くであるため、大動脈を損傷するという破壊的帰結をまねく可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第６，０９４，５９６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このため、従来の心臓ペーシングに見られる上記の欠陥を克服して改善された、心臓ペーシング装置および方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示の各実施形態にかかる心臓ペーシングの方法およびシステムは、ＩＮＥとヒス束の結合を利用して、小型ＡＶ結節を介さずヒス束を興奮させる。一実施形態において、このことは、ＲＡに位置するＩＮＥを用いてヒス束を直接興奮させ、ＡＶ結節を効果的に迂回することによって達成される。
【００１１】
一実施形態において、心臓の下結節伸展部に刺激を与える方法は、電極を備えるリードを設けるステップと、電極を心臓の下結節伸展部近くに配置するステップと、下結節伸展部に刺激を与えるために、電極の作動、停止、および調整のうちの１つ以上を行うステップとを含む。
【００１２】
別の一実施形態において、心臓のペーシングを行う方法は、電極を備えるリードを設けるステップと、電極を、下結節伸展部に刺激を与えるために、解剖学的な有効距離内、すなわち、ヒトの心臓のコッホ（Ｋｏｃｈ）の三角内で、三尖弁から５ミリメートル〜６ミリメートルの範囲内に配置するステップと、心臓のヒス束を興奮させて心室収縮を同期させるために、電極の作動、停止、および調整のうちの１つ以上を行うステップとを含む。
【００１３】
さらなる一実施形態において、心臓の下結節伸展部に刺激を与える方法は、電極を備えるリードを設けるステップと、電極が心臓の下結節伸展部近くに位置するようにリードの動きを指示するステップと、下結節伸展部に刺激を与えるために、電極の作動、停止、および調整のうちの１つ以上を行うステップとを含む。
【００１４】
下結節伸展部を刺激する装置は、第一電極および第二電極を備えた先端部と、基端部とを有するリードと、先端部に設けられたねじ部とを備え、ねじ部は、リードの先端部のチップから延在し、基端部に向かって第一電極と第二電極を越えて延在している。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】心臓の断面図。
【図２】コッホの三角を含む、図１に示す心臓の一部を拡大した概略図。
【図３】第一の実施形態にかかるペーシングリードを部分的に破線で示した、ＩＮＥへの心内膜アプローチを示す図。
【図４】図３に示すリードのチップの拡大図。
【図５】第二の実施形態にかかるペーシングリードを部分的に破線で示した、ＩＮＥへの静脈アプローチを示す図。
【図６】図４に示すリードのチップの拡大図。
【図７】第三の実施形態にかかる電極の電気回路図。
【図８】（Ａ）明確にするために、移行細胞（「ＴＣ」）の図示を省略した、コッホの三角の概略図。心房中隔（「ＩＡＳ」）のペーシングは、ボックス（１）で示す位置から行われた。コッホの三角において、ローミング電極を別のボックスで示す場所まで移動した。双極電極の位置を、複数の小さな円で示し、速い伝導路（「ＦＰ」）と遅い伝導路（「ＦＰ」）とへ入る位置を概略的に示す、（Ｂ）図８（Ａ）に示すローミング電極から与えられる０．５ミリ秒の端極性パルスの振幅が０．３３ミリアンペアから１０ミリアンペアまで上昇した結果を示す棒グラフ。２ミリ秒の双極ＩＡＳのペーシングは、２Ｘ閾値（２ミリアンペア）で一定であった。各ランプパルスは、ＩＡＳペーシングのパルス前４０ミリ秒〜６０ミリ秒に印加した。
【図９】心房組織、ヒス、結節、ＳＰ、心室、および中間の軌跡について、同じ部位で記録した電位図および光学興奮電位（「ＯＡＰ」）を選択し、その比較を示す図。双極の下ヒス電位図（「ＩＨＥ」）の軌跡の時間（各３００ミリ秒）を点線で示す。
【図１０】（Ａ）ＳＰおよびヒスを興奮させる、ＳＰ（ＳＰ電極）上のローミング電極から与えたＳＰペーシングに対応する、上ヒス電位図（「ＳＨＥ」）を示す図。Ａ、Ｈ、Ｖはそれぞれ、ＩＨＥの心房、ヒス、心室の成分を示す、（Ｂ）高位ＩＡＳの最初に興奮した心房組織に行ったＩＡＳペーシングに対応する、ＳＨＥの軌跡を示す図。Ａ、Ｈ、Ｖはそれぞれ、ＩＨＥの心房、ヒス、心室の成分を示す。
【図１１】８回の表面かん流実験で得られた、コッホの三角における興奮パターンと刺激閾値との簡略図。四角は、光学マッピングの視野を示す。
【図１２】ＩＨＥに近い領域で記録したＯＡＰと、ＩＨＥ、分界稜（「ＣｒＴ」）、およびＩＡＳペーシング電極で計測した電位図とを示す図。ランプアーチファクトは、エイリアシングのために異なる（１．５ミリ秒のパルスを、一秒ごとに１，５００個の試料でサンプリングした）。ランプが閾値を超える前に、標本をＩＡＳからペーシングした。ランプが閾値を超えると、２：１の割合でＡＶブロックが生じた。
【図１３】（Ａ）心房およびＦＰの興奮に関わる刺激とヒス興奮の間隔（Ｓ−Ｈ間隔）を示すグラフ、（Ｂ）すべての表面かん流の実験について、ＳＰおよびヒスの興奮に関わる刺激とヒス興奮との間隔（Ｓ−Ｈ間隔）を、ヒス電極からの距離との関係で示すグラフ、（Ｃ）ＳＰを興奮させた刺激ランプの終端と、ＩＡＳからペーシングしたその後の脈拍とを記録した電位図。単極ランプの電位図において、双極ＩＡＳのペーシングよりも大きな刺激アーチファクトが生じた。
【図１４】ＳＰを介してヒス束へ伝播する早期刺激を示す概略図。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
図１にヒトの心臓１０を示す。図１に示す心臓１０は、ＲＡ１２、左心房（「ＬＡ」）１４、ＲＶ１６、左心室（「ＬＶ」）１８、上大静脈（「ＳＶＣ」）２０、下大静脈（「ＩＶＣ」）２１、大動脈弓２２、および肺動脈２４から構成される。
【００１７】
図２に、心臓１０の一部を拡大した構成を示す。心臓１０は、ＩＮＥ２６、三尖弁輪２８、冠状静脈洞（「ＣＳ」）３０、冠静脈洞入口部３２、小型ＡＶ結節３４、心房中隔３６、下結節束３８、ヒス束４０、トダロ腱索４２、および心室中房４４から構成される。心臓１０における別の構成として、房室結節の血管４６と、その小孔４８が破線で示される。房室結節の血管４６と小孔４８とにより、ＡＶ結節３４からＣＳ３０内のＩＮＥ２６へのアプローチが与えられる。
【００１８】
図２において、ＡＶ結節３４は、ＡＶ結節３４を周囲の心房心筋に接続する、少なくとも二つの入力部をもつ。この入力部は、速い伝導路（ＦＰ）と、遅い伝導路（ＳＰ）／ＩＮＥであり、それぞれ独自の電気生理学的特質をもつ。ＡＶ結節３４へのＦＰ入力部は、ＲＡ１２のコッホの三角の頂点近くに位置する。ＦＰでは、伝導速度が比較的速く、不応期が比較的長い。一方、ＳＰ入力部は、ＲＡ１２の三尖弁輪２８と冠静脈洞入口部３２の間の狭部にある、三尖弁近くに位置する。ＳＰは伝導速度が比較的遅く、不応期は比較的短い。ＦＰとＳＰとの機能特性の差異は、房室結節回帰頻拍（「ＡＶＮＲＴ」）として臨床的に示される。
【００１９】
ＩＮＥ２６をヒス束４０に結合することにより、この接続を用いて、小型ＡＶ結節３４を介さずヒス束４０を興奮させることができる。図２および後述する図５に示すように、ＩＮＥへのアプローチは、ＡＶ結節の血管４６からＣＳ３０内に存在し、これにより電極配置を容易にすることができる。ＡＶ結節の血管４６が開き、コッホの三角に直接通じる
場合もある。
【００２０】
ＩＮＥを用いた心臓ペーシング
ＩＮＥを電気的に刺激し、正常な心臓伝導系を介して心室収縮を同期させることができる。ＩＮＥのペーシングにより生じる興奮は、コネキシン４３陽性の下結節束を介して心臓の小型ＡＶ結節を迂回するため、ＡＶブロックのある患者に使用することができる。特に、ペーシング電極の配置部位としてＩＮＥを用いることにより、さまざまな度合いのＡＶブロックのある患者のＡＶ伝導を回復することができる。また、ペーシング電極の配置部位としてＩＮＥを用いることにより、特殊化した心臓の伝導系を介して、正常に興奮を同期させることができる。
【００２１】
ＩＮＥをペーシングする利点としては、ペーシングリードを心臓弁に通す必要がないことが挙げられる。ペーシングリードを心臓弁に通した場合、心臓弁の機能が低下してしまう。また、心室収縮の同期に関しては、心臓の左側にペーシングリードを置く必要がないことも利点である。
【００２２】
また、ＩＮＥをペーシングすることにより、従来のＲＶおよび両心室のペーシングに見られた、電気的同期および機械的同期の問題が解消される。ＩＮＥのペーシングによって心室収縮を同期させることにより、ペーシングに誘発されて患者が心不全を起こす可能性を抑えることができる。
【００２３】
ＲＡにＩＮＥ／ＳＰの「副伝導路」が存在することにより、ＩＮＥを、長期的に同期ペーシングに用いることができる。少なくとも下記の理由により、ペーシング部位の配置を容易に探し出すことができる。理由として、（１）ＩＮＥ／ＳＰは、電位図において独自の軌跡を描き、電気生理学者は移植時にこの軌跡を用いることができること、（２）ＩＮＥ／ＳＰはＡＶＮＲＴのアブレーションの対象として好まれてきたため、電気生理学者はＩＮＥ／ＳＰを探すのに必要な用具を既に開発しているということ、そして（３）ＩＮＥ／ＳＰの捕獲部の閾値は、周囲の心房組織の閾値よりも高くてもよく、この閾値により、下心房組織の捕獲部に対してＩＮＥ／ＳＰの捕獲部が区別されることが挙げられる。
【００２４】
また、ＩＮＥ／ＳＰからのペーシングには、ヒス束直接のペーシングに比べていくつかの利点がある。利点として、（１）ＩＮＥ／ＳＰを興奮させるために、ＲＡの比較的大きな部分をペーシングすることができ、大動脈近くの小さなヒス領域をペーシングするという困難が緩和される、（２）ＩＮＥ／ＳＰペーシングにより、ＲＶＯＴのペーシングを回避することができること、（３）ヒス束周囲の線維組織のために、ＩＮＥ／ＳＰペーシングの閾値は、ヒス束ペーシングに必要な閾値よりも低くてよいこと、（４）ＩＮＥ／ＳＰペーシングにより、通常のＡＶ結節の伝導路は介さず心室収縮を同期させることができ、これにより、直接ヒス束ペーシングで組織が損傷するのを防ぐことができること、そして（５）ＩＮＥ／ＳＰへの静脈アプローチにより、安定なリード配置部位が得られ、直接ヒス束ペーシングでずれるリードの数が低減されることが挙げられる。一例として、間欠的にＡＶブロックを生じる患者の場合、ＩＮＥ／ＳＰペーシングは治療の解決法になりうる。これは、自然な歩調取りおよび伝導系で心臓のペーシングが可能となり、ＩＮＥ／ＳＰペーシングにより、必要に応じて心室収縮を同期させることができるためである。
【００２５】
図３および図５で詳述するように、心内膜アプローチ（図３）や静脈アプローチ（図５）など、ＩＮＥへのアプローチはいくつか存在する。各種実施形態のＩＮＥペーシングで用いられる、静脈と心房のペーシングリードおよび電極については、米国特許第６，７４５，０８１号明細書、特許文献１、第６，０８５，１１９号明細書、第６，０７０，０８１号明細書、第５，５４５，２０４号明細書、第４，１３６，７０３号明細書、および第３，７２９，００８号明細書、並びに国際公開第２００６／０４２２９５／号および国際
公開第９６／１０９６１／号に記載されている。これらはすべて、本明細書において参照として援用される。参照による援用については、本明細書における明確な開示に反する主題を援用されないこと、上記文献に記載のない請求項は、参照として援用されないこと、また本明細書に明示されないかぎり、上記文献に記載された定義を参照として援用しないことなどの制約がある。
【００２６】
図３を参照し、ＩＮＥへの第一のアプローチは、心内膜アプローチである。装置１００は、リード１０２とカテーテル１０４とからなる。リード１０２は、基端部１０６と先端部１０８を有する。カテーテル１０４と、リード１０２の先端部１０８は、ＳＶＣを介してＲＡに挿入される。リード１０２のチップ１１０を、たとえばねじって、ＩＮＥ２６上部の心房組織に差し込んでもよい。心房組織における挿入部位は、ＩＮＥに刺激を与えるために、解剖学的な有効距離内にあってもよい。たとえば、挿入部位は、ヒトの心臓のコッホの三角内で、三尖弁から５ミリメートル〜６ミリメートルの範囲内にあってよい。各種実施形態において、心房組織における挿入位置は、ヒトのＩＮＥ２６から約３ミリメートルの範囲内であってもよい。別の実施形態において、心房組織における挿入部位は、ヒトのＩＮＥ２６から約５ミリメートルの範囲内であってもよい。心房組織における挿入位置は、ＩＮＥから約５ミリメートルより大きくても、約３ミリメートル未満であってもよいことを、当業者には理解されたい。リード１０２をＩＮＥ２６上部の心房組織に挿入したあと、カテーテル１０４を引き抜いてもよいし、あるいはリード１０２に取り付けたままにしておいてもよい。ヒトのＩＮＥとＩＮＥへの静脈アプローチとについては、ハッカーら著の「コネキシン４３の発現により説明される、ヒトの房室接合部の２つの伝導路（Ｃｏｎｎｅｘｉｎ  ３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｅｌｉｎｅａｔｅｓ  ｔｗｏ  ｄｉｓｃｒｅｔｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ａｔｒｉｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）」、解剖記録２００７年に記載されている。この文献は、本明細書において付録Ａとして援用されている。
【００２７】
図４を参照し、本実施形態のリードチップ１１０は、第一電極１１２ａ，第二電極１１２ｂ，第三電極１１２ｃと、最先端部の二つの電極１１２ａ，１１２ｂを取り囲むねじ部１１４とを備える。リードチップ１１０はさらに尖頭部１１６を備える。尖頭部１１６は、ＩＮＥをペーシングおよび感知するために心房組織に挿入される。そして、ねじ部１１４がリードチップ１１０を心房組織に押し込むようにリードチップ１１０をねじることにより、リードチップ１１０は、ＩＮＥ２６上部の心房組織にねじ込まれる。心室収縮を遠距離場で感知するために、第三電極１１２ｃを用いてもよい。
【００２８】
上記アプローチで長期的にペーシングを行うために、ねじ部１１４は、長さが約２．０ミリメートル〜約３．０ミリメートルであってもよい。また、ねじ部１１４は、電極を取り囲んでペーシングし、任意で電極を感知してもよい。ペーシング電極（たとえば、１１２ａ，１１２ｂ）は、心房組織に埋め込まれてもよい。ペーシングリード１０２には４個以上または３個未満の電極が含まれてよいことを、当業者には理解されたい。また、ねじ部１１４の長さが約２．０ミリメートルより短く、約３．０ミリメートルより長くてもよく、その他の方法を用いてリードチップ１１０をＩＮＥ２６のペーシング部位に固定してもよいことについても、当業者には理解されたい。
【００２９】
図５に、ＡＶ結節の血管アプローチを示す。装置２００は、リード２０２とカテーテル２０４とからなる。リード２０２は、基端部２０６と先端部２０８を有する。図２に戻り、ＩＮＥ２６へのアプローチは、ＡＶ結節の血管４６からＣＳ３０内に存在する。また、ＡＶ結節の血管４６が開き、コッホの三角に直接通じる場合もある。カテーテル２０４と、リード２０２の先端部２０８は、ＳＶＣ２０を介してＲＡ１２へ、ＣＳ３０の小孔３２を介してＣＳ３０へ、そしてＩＮＥ２６へのＡＶ結節の血管４６へ挿入される。本実施形態のリード２０２のチップ２１０は、第一電極２１２ａ，第二電極２１２ｂ，第三電極２
１２ｃ，および第四電極２１２ｄを備えてもよい。
【００３０】
ＣＳの誘導や心臓へのカテーテルおよびリードの挿入を可能にするカテーテル挿入方法および設計がある。こうした挿入方法として、本明細書において援用される米国特許第６，７４５，０８１号明細書、第６，０７０，０８１号明細書、および第５，５４５，２０４号明細書に記載されたものがある。参照による援用については、本明細書における明確な開示に反する主題を援用されないこと、上記文献に記載のない請求項は、参照として援用されないこと、また本明細書に明示されないかぎり、上記文献に記載された定義を参照として援用しないことなどの制約がある。
【００３１】
従来のカテーテル設計との違いとして、各種実施形態のカテーテル設計は、心外膜のペーシングに用いられるカテーテルに比べて長さが短いこと、また、カテーテルチップがＡＶ結節の血管に入るように操作できることが挙げられる。たとえば、ＡＶ結節の血管に入るようにするために、カテーテルのチップは、約１０度〜約６０度の角度でわずかに曲がっていてもよい。別の実施形態において、カテーテルのチップは、約１０度未満の角度および約６０度より大きい角度で曲がっていてもよいことを、当業者には理解されたい。
【００３２】
図４および図６を参照し、実施形態のリードチップ１１０，２１０は、感知機能からペーシング機能に切り替え可能な複数の電極（それぞれ３個の電極、４個の電極）を備えてもよい。別の実施形態では、５個以上、３個未満の電極がリードチップに含まれることを、当業者には理解されたい。各リードの単極感知により、どのリードが最も確実に信号を伝導する遅い伝導路であるかを決定することができる。そして、リードを切り替えてペーシングリードとし、このリードでＳＰペーシングを行ってもよい。ペーシングを行わないリードを用いてペーシング中に心拍数をモニタしてもよく、このモニタは双極モードで行うことができる。
【００３３】
図７の回路は、リード３００の各リード電極がどのようにペーシング機能から感知機能に切り替わるかについて、一実施形態を示している。二つのリード電極３１２ａ，３１２ｂは、明確にするために図示されている。回路３００は、複数のスイッチ３０２ａ，３０２ｂ，３０２ｃ，３０２ｄ，３０２ｅと、第一の接地３０４ａおよび第二の接地３０４ｂと、容量器３０６と、バッテリ３０８と、心電図（「ＥＣＧ」）感知回路３１０と、複数の電極３１２ａ，３１２ｂとからなる。
【００３４】
スイッチ３０２ａが閉じると、キャパシタは充電可能であり、スイッチ３０２ａが開くと、キャパシタ３０６はバッテリ３０８との接続が切られる。スイッチ３０２ｃ，３０２ｄが閉じているとき、単極のＥＣＧがリード３１２ａ，３１２ｂ両方で感知される。このとき、ＥＣＧ感知回路３１０の基準リードは装置の容器である。ＥＣＧ感知回路３１０は、どのリードが最も遅い伝導路のＥＣＧを示すかを決定する。そして、スイッチ３０２ｃ，３０２ｄを開き、ＥＣＧ感知回路３１０により制御されるスイッチ３０２ｂ，３０２ｅを閉じて、最も遅い伝導路の可能性があるリードをキャパシタ３０６に接続し、単極ペーシングとする。電気刺激を供給する方法には電気的に何通りもの方法があり、波形、周波数、電圧、およびタイミングも何通りもあることを、当業者には理解されたい。
【００３５】
心室ペーシングの同期については、本明細書に援用として参照される、ハッカー等著の「房室結線のＡＶ遅延の有無に伴う房室伝導：ウサギの心臓におけるヒス束への２つの伝導路（Ａｔｒｉｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  Ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ＡＶ  Ｎｏｄａｌ  Ｄｅｌａｙ：Ｔｗｏ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｂｕｎｄｌｅ  ｏｆ  Ｈｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｈｅａｒｔ）」Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２００７年１０月、２９３（２）：Ｈ１１２２−３０に記載されている。
【００３６】
実験例
設定
ニュージーランド白ウサギ（ｎ＝１８、２．５〜３ヶ月齢、２〜３ｋｇ）に、ペントバービタルナトリウム１００ｍｇ／ｋｇおよびヘパリン１，０００ＩＵを静脈注射して麻酔をかけた。その後、胸骨を開いて心臓を摘出した。心臓を摂氏３７度で酸素化タイロード（９５％Ｏ２，５％ＣＯ２）によりランゲンドルフ（Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ）灌流し、５μＭのＤｉ−４−ＡＮＥＰＰＳ（オレゴン州ユージンのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）を５分間で５０マイクロリットル得た。この実験を、表面かん流し、分離したＡＶ接合部（ｎ＝８）と、ランゲンドルフかん流した心臓（ｎ＝１０）とで行った。なお、ＡＶ接合部は右心房を介して露出した状態とした。表面かん流の実験では、冷タイロード（摂氏０度）中でＡＶ接合部を切開し、洞房結節を摘出した。動きアーチファクトを防ぐために、この標本を、１５ｍＭの興奮収縮連関２，３−ブタンジオンモノオキシム（ミズーリ州セントルイスのシグマ（Ｓｉｇｍａ）社製）を含むタイロードを用い、３０ｍＬ／分で表面かん流した。光学マッピングシステムでは、１６×１６のフォトダイオードアレイを用いた。そして、光信号を１．５キロヘルツでサンプリングし、平均化し、１２０ヘルツで低域フィルタリングした。光学的な興奮マップにより、興奮波面に対応した光信号の伝搬を示した。
【００３７】
電位図の記録
電極をＩＡＳおよびＣｒＴに配置し、ヒス束上の四重電極で上ヒス電位図（ＳＨＥ）および下ヒス電位図（ＩＨＥ）両方を記録し、速いヒス興奮および遅いヒス興奮をモニタした。
【００３８】
特定のペーシングプロトコールや、伝導路が交互になることが原因でＡＶ結節の興奮伝導路に生じる変化に伴い、ヒス興奮と、ヒス電位図の形態も変化し得る。ＡＶ結節とヒスはＳＰにより興奮させられ（すなわち、遅いヒス興奮）、ＩＨＥは、ＡＶ結節がＦＰにより興奮させられる場合よりも大きな振幅を示す。反対に、ＦＰによりＡＶ結節とヒスを興奮させる場合（すなわち、速いヒス興奮）、ＳＨＥは遅いヒス興奮の場合よりも大きい振幅を示す。
【００３９】
各電極の位置を、図８（Ａ）に示す。第四ローミング電極を用いて、コッホの三角内の電位図を記録した。コッホの三角の概略は、図８（Ａ）に示すとおりである。基準リードは、電極チップから３ミリメートル離して配置した。臨床用の半球チップを模倣するために、テフロン（登録商標）で被覆された０．１３ミリメートルＰｔ／Ｉｒ配線チップを〜０．０７ミリメートルまで剥いた。この電極を力変換器（ＦＯＲＴ２５：フロリダ州サラソタのワールドプレシジョンインスツルメンツ社（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）製）に搭載して、接触力を制御した。これにより、接触力を最小にし、地点間で一定となることを保証している。電動式極微操作装置により、このローミング電極をコッホの三角内で１ミリメートルずつ動かした（図８（Ａ）のグリッド）。電位図を１．５キロヘルツ（テキサス州オースティンのナショナルインスツルメンツ社（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）製のものによる）で記録し、各電極の位置をデジタル撮影した。
【００４０】
刺激プロトコル
標本を、ＩＡＳ電極とローミング電極との二つの電極でペーシングした（図８（Ａ））。ＩＡＳペーシングは、２Ｘ閾値（最大２ミリアンペア）、パルス２ミリ秒、周期長３００ミリ秒で、一定に行った（図８（Ｂ））。ＩＡＳペーシングにより、静脈洞のペーシングを刺激し、ＳＰを起源とする房室接合部調律を隠すのに用いられた。また、ＩＡＳペーシングは、ローミング電極が場所から場所へ移動したとき、組織の興奮を一定の状態に保
持するのに用いられた。刺激閾値は、単極性パルス（パルス０．５ミリ秒、周期長３００ミリ秒、振幅０．３３ミリアンペア〜１０ミリアンペアの範囲内で、パルスごとに０．３３ミリアンペア増加：図８（Ｂ））のランプで決定した。各ランプパルスは、ＩＡＳペーシングのパルスの４５ミリ秒〜６０ミリ秒前に供給した（図８（Ｂ））。ペーシングランプは、どの場所に対してもローミング電極、すなわちコッホの三角（図８（Ａ）のグリッド）内の１４箇所ないし２４箇所から供給した。これにより、場所それぞれの閾値を速やかに決定することができた。ペーシング閾値は、ＩＡＳペーシングからの興奮パターンにおいて、ローミング電極が与える刺激に対しずれを生じたランプパルスの振幅として定義した。
【００４１】
結果―ＳＰの識別
図８（Ａ）の概略図は、ＳＰおよびＦＰへの入力位置を大まかに示したものである。ＳＰの解剖学的基質はＩＮＥと考えられることが多いが、ＦＰの解剖学的基質は十分に定義されておらず、小型ＡＶ結節に重なる複数のＴＣから構成される。
【００４２】
ＩＡＳペーシング中に記録した電位図とＯＡＰを比較した。ＩＡＳペーシング時に記録を開始し、３００ミリ秒間行った。図９は、同じ部位について記録した電位図とＯＡＰを直接比較したものである。ＩＡＳペーシング中、ＡＶ結節にはＦＰによって興奮が伝えられ、ＳＰは袋小路の伝導路として機能した。心房組織の電位図はすべて、ペーシングアーチファクト直後に鋭い信号を示している。これは、心房心筋内での伝導が速いことを表している。心房組織のＯＡＰは、心房の興奮電位を形態化したものである。ヒスの電位図は、（心房組織の軌跡に見られるタイミングと同様に）ペーシングアーチファクト直後の速い信号と、最大８０ミリ秒後に見られた、ヒス興奮を反映した鋭いスパイクとを含んでいる。ヒスのＯＡＰには、心房の興奮とヒスの興奮の合計である、二つのスパイクがある。第一のスパイクは心房興奮に対応しており、第二のスパイクはヒスの興奮に特有の停滞期である。結節の電位図とＳＰの電位図とは、複数の成分を含んでいる。最初の成分は、心房組織の電位図で見られる信号と、時間的に一致している。また、最初の成分のあとには、低振幅で複雑な二相性の記録が続く。この二相性の記録は、心房興奮とヒス興奮との間に見られる遅い伝導に一致するものである。結節の電位図は、ＡＶ結節の解剖学的位置近くのものであり、結節のＯＡＰは結節を形態化したものである。ＳＰの電位図およびＯＡＰは、ＳＰに沿ったものである。結節およびＳＰの電位図およびＯＡＰには、重複する特徴がある。
【００４３】
図９に戻り、電位図の鋭いスパイクは、蛍光信号の最大張力発生速度（ｄＦ／ｄｔｍａｘ）に対応している。結節およびＳＰの軌跡において、電位図が示す遅い伝導特性は、同じ場所のＯＡＰと相関関係にある。例外としては、結節の電位図に見られる、ＯＡＰの停滞期に生じたスパイクがある。双極のＩＨＥに対するこのスパイクのタイミングを踏まえると、結節における結節−ヒス（ＮＨ）領域の興奮または下結節束（ＬＮＢ）の興奮を、このスパイクは反映していると思われる。なお、ＮＨおよびＬＮＢでは、ヒス束に向かって興奮の速度が上がる。
【００４４】
コッホの三角内で与えられるペーシングの刺激は、与えられる場所によって異なる興奮パターンを形成する。ＩＡＳペーシングにより生じる興奮パターンはＩＡＳ電極を起源とした。そして、コッホの三角内の伝導系上部に位置する、心房組織およびＴＣにすばやく広がった。この結果、ＡＶ結節のＦＰに興奮が伝わった。興奮マップはｄＦ／ｄｔを示しているため、例外的にＡＶ結節の伝導が遅い場合（低振幅のｄＦ／ｄｔである場合）、〜５０ミリ秒乃至７０ミリ秒の間は伝導が見られない。この期間のあと、ＬＮＢ領域を起源とするヒス興奮が生じた。ＩＡＳペーシングとヒス興奮との間隔は、最大で７０ミリ秒であった。
【００４５】
コッホのトライアングル内の多数のペーシング位置において、ローミング電極によるペーシングを行った。その結果、ＩＡＳペーシングで見られるパターンと同様の心房およびＦＰの興奮パターンが生じた。
【００４６】
ローミング電極を、コッホの三角内で三尖弁から最大２ミリメートルの範囲内に置くと、ＳＰが興奮した。ＳＰの興奮は、コッホの三角の頂点に向かってゆっくり移動した狭い興奮パターンのように見える。ＡＶ結節の領域に到達した後、興奮は途切れなくヒス束に向かって続き、逆にＩＡＳに広がった。ＳＨＥの軌跡においては、ＳＰペーシング中に小振幅で、ヒス電位図の形態が遅いヒス形態へと変化した。そして、ランプの終了後はもとの形態に戻った。刺激とヒス興奮との間隔（Ｓ−Ｈ間隔）は、矛盾しているようであるが、遅いヒス興奮よりも速いヒス興奮において長い。遅いヒス電位図は、８回の表面かん流の実験中、６回観察された。
【００４７】
ＳＰの興奮と、心房およびＦＰの興奮とでは、同様の光学的興奮パターンが、ランゲンドルフ灌流した心臓のＡＶ接合部で観察された。ＳＰペーシングの興奮マップとして、ＩＨＥの軌跡を図１０に示す。心臓全体のＳＰペーシングは、遅くて狭い興奮パターンを形成し、続いてヒスが興奮状態となった。無傷の心臓においては、ヒスの興奮に続き、覆いとなっている心房組織で強い心室光信号が見られることがあった。心房興奮は、心室興奮より〜１０ミリ秒乃至１５ミリ秒先行した。
【００４８】
ＩＡＳペーシングにより、興奮の速波が生じ、心房組織およびＴＣに広がった。心房興奮のあと、興奮はＡＶ結節の領域から二方向に広がった。ヒス興奮の波面はヒス電極に向かって広がった。一方、減衰伝導の波面は下方に向かってＳＰに広がり、消えた。そして、ヒスの興奮に続き、心室が興奮状態となった。図１０に示すように、ＩＡＳペーシングを行った場合のＩＨＥは、小振幅で速いヒス電位である（すなわち、ＩＡＳペーシングよりもＳＰペーシングを行った場合、ＩＨＥの偏位が大きい）。
【００４９】
コッホの三角内でのペーシング
図９および図１０は、ＳＰの位置が電位図とＯＡＰの形態で識別されること、また、表面かん流した部分の心臓と心臓全体の両方において、ＳＰとＦＰの興奮が、興奮パターンとヒス電位図の形態で区別されることを示している。興奮パターンとヒス形態の両方を用いることにより、コッホの三角内の複数のペーシング位置に、どの興奮パターンが生じたかが識別された。
【００５０】
図１１は、表面かん流の実験において、異なる興奮パターンが生じた位置と、ペーシング閾値とについてまとめたものである。コッホの三角の頂点近くをペーシングした場合、三尖弁から２ミリメートルの範囲内で与えられたペーシング刺激により、ＳＰまたはヒスが直接興奮した。直接ヒス刺激は、刺激直後の速い伝導として定義した。すなわち、Ｓ−Ｈ間隔が最大で１０ミリ秒で、ヒス電極近くの小さな領域に生じたものである。平均して、ＳＰおよびヒスのペーシングの閾値は、４．４±２．２ミリアンペアであった。さらに離れた三尖弁から与えられたペーシングの刺激は、ほとんどの場合心房組織を興奮させ、ＡＶ結節のＦＰを興奮させた。このときの平均的な刺激閾値は、２．４±１．６ミリアンペア（ＳＰおよびヒスのペーシングの閾値との比較でＰ＜０．００１）であった。さらに、冠状静脈洞と三尖弁との間に、ペーシング閾値が非常に高い領域があった（８．６±１．４ミリアンペア、心房およびＦＰの閾値との比較でＰ＜０．００１）。この領域をペーシングすることにより、心房組織とＡＶ結節のＦＰとが興奮した。この領域のＯＡＰは、多くのノイズを含んでおり、コッホの三角のその他の領域で記録された、大振幅の心房のＯＡＰとはかなり異なった。高いペーシング閾値と非常に低いＯＡＰ振幅とにより、この領域にはわずかな興奮細胞があると言える。異なる閾値で、特に、より高い刺激強度でＳＰまたはヒスの興奮を伴う心房興奮が生じたとき、興奮パターンが異なる場合もあった。
ランゲンドルフ灌流した心臓において、各種の興奮で同様のペーシング閾値が観察された。一方、ＳＰおよびヒスの閾値は、右心室のペーシング閾値と統計的に同じであった。
【００５１】
ヒス束のＳＰが一度興奮状態になると、刺激ランプの間、ＳＰはヒス束を１：１の割合で興奮させる。しかし、ＦＰを興奮させたすべてのペーシング位置では、このような興奮状態は見られなかった。図１２に示すように、ＡＶ結節の上縁近くでペーシングすると、２：１の割合で房室ブロックが生じて房室伝導が中断したり、あるいはＡＶ伝導が長引くことが多かった。図１２に示す例では、ヒス束の上部で記録された電位図とＯＡＰの両方で見られるように、刺激ランプが閾値を超える前に、ＩＡＳペーシングが１：１でヒスに伝わった。刺激ランプが閾値を超えると、（ＯＡＰおよびＣｒＴ両方の軌跡でずれが見られるように）心房組織が興奮した。しかし、興奮はヒスまでは伝播しなかった。次の脈では、（ＯＡＰおよびＩＨＥで見られるように）興奮がヒスまで伝播し、伝導が２：１の割合で続いた。このため、この位置でペーシングすると、ＡＶ伝導が中断した。コッホの三角のこの領域にペーシングの刺激を与えると、８回の実験のうち５回で、２：１のＡＶブロックが生じるか、あるいはＡＶ伝導が長引いた。５回の実験のうちで、ＡＶ伝導の中断後、完全に回復したものはなかった。これはこの領域でのペーシングの効果が神経学的には媒介されなかったことを示唆している。Ｓ−Ｈ間隔は、各ペーシング位置で測定した。
【００５２】
閾値に達したあと、Ｓ−Ｈ間隔は通常３拍から５拍で一定となり、この安定した値を計測した。遠距離場の刺激でより多くの組織が脱分極化したと思われる刺激強度が高いＳ−Ｈ間隔は、分析から外した。これは、ランプ終端でのＳ−Ｈ間隔が、一定したＳ−Ｈ間隔とは異なったためである。稀に、ランプ全体をとおしてＳ−Ｈ間隔は一定にならず、直線的に減少した。この場合、Ｓ−Ｈ間隔の範囲について注釈を付した。図１２に示すように、ＡＶ伝導が中断したあと記録したＳ−Ｈ間隔は、分析から外した。Ｓ−Ｈ間隔は、心房およびＦＰの興奮に関係するものと、ＳＰおよびヒスの興奮に関係するものとの、二つのグループに分類した。ヒス電極からの水平距離に対してグラフにすると、心房のＳ−Ｈ間隔は、距離に依存しない（Ｐは有意でない；図１３（Ａ））が、８１±１９ミリ秒で一定のレベルにとどまることが分かる。心房の刺激とヒスの興奮との間の一定の間隔が、ＡＶ遅延である。ＳＰおよびヒスの興奮と関係するＳ−Ｈ間隔は、ヒス電極からの距離と強い関係があることを示している（Ｐ＜０．００１；図１３（Ｂ））。ＳＰの興奮によりＡＶ遅延が生じた場合、ヒス電極からわずかに離れた場所で生じた直接ヒス興奮から、８１±１９ミリ秒のＡＶ遅延の値またはそれ以上の値へ、直線的でない急激な上昇が予想される。さらに、ＳＰペーシング中のＳ−Ｈ間隔は、房室およびＦＰの興奮で計測したＡＶ遅延よりかなり短いままとなる（ＦＰの興奮では８１±１９ミリ秒の遅延、ＳＰの興奮では５３±２５ミリ秒の遅延≧ヒス電極から４ミリメートル；Ｐ＜０．００１）。
【００５３】
図１３（Ｃ）には、最後のランプ刺激（ＳＰを興奮させた）とランプ後の最初のＩＡＳペーシングパルスとによりＳＰペーシングおよびＩＡＳペーシング中に計測されるＳ−Ｈ間隔の一例を示す。Ｓ−Ｈ間隔は、最後のランプ刺激で３１ミリ秒であり、ＩＡＳペーシングによりヒス束を刺激すると６４ミリ秒まで長くなった。これに矛盾し、ＳＰのＳ−Ｈ間隔はＦＰのＳ−Ｈ間隔よりも短かった。遅いヒス電位から速いヒス電への移行は、ＩＨＥとＳＨＥとの両方の軌跡で見られる。ランゲンドルフかん流した心臓において、房室およびＳＰの興奮では、同様のＳ−Ｈ間隔が観察された。一方、ＳＰのＳ−Ｈ間隔は、ＦＰのＳ−Ｈ間隔よりも平均して短かった。
【００５４】
考察
コッホの三角内に複数の伝導層が存在するという以前の知見が、この結果により裏付けられた。また、これらの層が、さまざまな刺激強度およびペーシング位置と特異的な関係をもつことが明らかになった。冠状静脈洞下部のある領域を除いて、心房興奮の刺激閾値が、ＳＰおよびヒスの興奮の閾値よりもかなり低いことが分かった。遅いヒス電位図だけ
でなく、光学マッピングに記録した興奮パターンを用いることにより、ＳＰの興奮が確認された。また、ＳＰを興奮させるために刺激位置をヒス束に近づけると、Ｓ−Ｈ間隔は直線的に減少するが、心房およびＦＰの興奮に関係するＳ−Ｈ間隔はほぼ一定にとどまることが分かった。また、矛盾するが、ＳＰのＳ−Ｈ間隔は、ＦＰの興奮で記録したＳ−Ｈ間隔よりも短いことも分かった。
【００５５】
ＡＶ接合部の研究にはさまざまなモダリティを用いるため、構成要素について「共通の用語が十分でない」。たとえば、過去の研究の多くは、ＣＳと三尖弁との間の峡部にあるＡＶ結節の伸展部を、「後方結節伸展部」と呼んでいた。心臓を解剖学的に位置付けると、ＩＮＥが心臓の場所を正確に表すものだと命名委員会は示唆している。ＩＮＥ、ＡＶ結節、およびヒス束など、コッホの三角内の伝導系の構成要素を覆う心房細胞およびＴＣの層については、過去の研究により説明がなされている。ＩＮＥがＳＰの解剖学的基質であることは、機能的研究により明らかになっている。しかしながら、ＩＮＥ自体、ＩＮＥを覆うＴＣ、またはＩＮＥとＴＣとの組み合わせがＳＰの真の基質であるかについては、議論がなされている。今回の結果では、どの細胞層またはどの細胞構造によってＳＰが興奮したかが識別できなかった。しかし、光学マッピングの結果、コッホの三角内で三尖弁から２ミリメートルの範囲内で与えた刺激をペーシングすると、ＳＰが確実に興奮させることが確認された。ヒス電極からの距離に対する、心房興奮のＳ−Ｈ間隔をグラフにしたところ、相互関係は見られなかった（図１３（Ａ））。心房興奮のＳ−Ｈ間隔は、心房層およびＦＰの伝導時間（Ｓ−ＡＶ結節の間隔）と、ヒス束へのＡＶ結節伝導（ＡＶ遅延）との、二つの間隔からなる。心房層の伝導が速いため（最大で毎秒３５センチメートル）、刺激電極とヒス電極との距離にわずかな変化が生じても、Ｓ−ＡＶ結節の間隔はあまり変化しない。このため、Ｓ−Ｈ間隔の主な決定要因はＡＶ遅延であり、これは本質的には変わらない。
【００５６】
一方、ＳＰの興奮のＳ−Ｈ間隔と、ヒス電極からの距離との関係をグラフにすると、強い相互関係が見られる（図１３（Ｂ））。ＳＰの興奮は、その名が表すように伝導が遅いため（最大で毎秒７センチメートル）、距離に大きく依存することが予想される。このため、刺激とＡＶ結節との距離が短くなるにつれ、Ｓ−ＡＶ結節の間隔もわずかに減少することが予想される。しかし、ＳＰの伝導時間が一度小さくなると、Ｓ−Ｈ間隔をＡＶ遅延によって決定しなくてはならず、心房興奮のデータによると８１±１９ミリ秒である（図１３（Ａ））。ヒス束がさらに近づくと、ヒス直接の興奮が生じた場合、Ｓ−Ｈ間隔は非常に小さい値へと変化する。図１３（Ｂ）の生データおよび統計データは、Ｓ−Ｈ間隔がほぼ全体で８１ミリ秒未満であること、また、ヒス電極が近づくとＳ−Ｈ間隔が直線的に減少することを示している。ＳＰペーシングの興奮パターンは、ＳＰの興奮が途切れなくヒス束に向かって直線的に進んでいることを示している。これらのデータは、ＳＰおよびヒスのＳ−Ｈ間隔がＡＶ遅延に依存していないことを示唆しており、ＳＰの興奮によりＡＶ遅延が回避され、ヒス束を直接興奮させていることを暗示している。
【００５７】
高位右房またはＣｒＴにペーシングの刺激を与えることにより、早期刺激との関係で、ＳＰとＦＰの速度依存の特性が研究されてきた。これらの研究を踏まえ、ＳＰは、ヒス束へ興奮が達する時間がＦＰに比べて長かったため、ＳＰと命名された。しかしながら、ＳＰの興奮は、ＦＰの興奮よりも速くヒス束へ達したことが分かった。こうした明らかな矛盾もあったが、二つの理由により、今回の結果は、ＳＰについて立証されてきた大部分のものと完全に一致した。第一に、過去の研究では、ＳＰの興奮はＳＰの長さ全体に伝わった。すなわち、Ｓ−Ｈ間隔がＦＰの興奮のＳ−Ｈ間隔と同様であったことが、データにより示されている（図１３（Ｂ）、右）。この興奮の時間は、期外収縮との関係でさらに長くなることもある。ペーシングの刺激をＳＰへ直接与えないとき、早期刺激を難易性のＦＰに与えると、ヒスに対するＳＰの伝導だけが生じる（図１４）。ＳＰの長さ全体を伝導するのに要する時間は、ＡＶ遅延とほぼ同じ時間であるため（あるいは、早期刺激を与え
た場合、より長い時間を要するため）、ＳＰの伝導によってＡＶ遅延が回避されたとは認識しがたい。ＳＰをその長さにわたってペーシングすることによってのみ、ＳＰの興奮がＦＰの興奮と同様のＡＶ遅延を生じないことが明らかとなる。第二に、ＳＰを直接用いたことにより、ＳＰと心房組織とのインターフェースで生じ得る伝導遅延が回避された（図１４）。このインターフェースにより、ＳＰの伝導をさらに遅くする伝導遅延を回避することができる。
【００５８】
ＡＶ結節近くのコッホの三角内で、３００ミリ秒間ペーシングを行った。データの解釈としては、ヒス束が近かったために、三尖弁輪から２ミリメートルの範囲内で刺激を与えたとき、ペーシングの刺激によりヒス束が直接興奮し、ＳＰは関係しなかったといえる。ヒス束を直接刺激することにより、Ｓ−Ｈ間隔は確かに短くなるといえる。しかし、二つの理由によりこの可能性は低い。第一に、ＳＰの興奮は、光学マッピングで視覚化することにより確認された。第二に、ヒス束にさらに近い場所でペーシングの刺激を与えると、ペーシングランプの全体にわたり、８０ミリ秒以上のＡＶ遅延が生じるとともに、房室興奮も生じた。したがって、ペーシングの刺激により初期に捕獲された組織領域は、かなり小さかったと思われる。また、分析したＳ−Ｈ間隔は、ペーシングランプが閾値に達したあと、３拍から５拍測定したもの（すなわち、ペーシング閾値を２倍したもの以下）であった。このことも、ペーシングランプのこの地点で興奮した組織の範囲を制限している。
【００５９】
形態的、分子的、機能的根拠に基づき、ヒス、ＬＮＢ、およびＩＮＥにより、小型ＡＶ結節組織とは異なる連続した構造が形成されることが、文献における一致した見解となりつつある。これまで提言されてきた共通の伝導路に代わって、ヒス束への伝導路は二つあることがデータにより示唆されている。すなわち、一方は小型結節を介するもので、他方はＬＮＢを介するものである。ＩＮＥはＬＮＢを介してヒス束に接続すること、また、ＦＰは小型結節を介して設けられることが、同様に論議されている。ヒスへの二つの伝導路という概念は、ヒス電位図の形態変化によって裏付けられている（すなわち、遅いヒス電位図と速いヒス電位図）。ＦＰまたはＳＰの興奮の差異を示すヒス電位図の軌跡は、伝導路を興奮状態にすることにより、ヒス束がどのように分極化されるか、あるいはヒス束のどの部分が分極化されるかに影響を与えることを示している。
【００６０】
二重伝導路の概念に基づき、ＳＰの興奮が下方のＴＣまたはＩＮＥで始まり、勾配をもった伝導速度でＬＮＢ内のヒス束までＩＮＥを介して伝わることが、データにより示唆されている。興奮がヒスに近づくと、ヒス束に達するまでコネキシン４３のレベルが上昇し、伝導速度は上がる。ＡＶ結節を取り囲む心房組織で生じたＦＰの興奮は、ＡＶ結節を覆うＴＣを介して小型結節内に伝わる。ＡＶ結節の遅延は、小型結節の組織と、それに接続しているＴＣが原因で生じる。この遅延のあと、興奮はヒスに伝わる。興味深いことに、ＣＳの下方に、刺激閾値が周囲の心筋よりもかなり高い小さな領域が確認された。この領域は、ブロックの局所的な領域として機能し、心房心筋に異方性を与え得る。また、この領域は、通常の心房粗動を維持する領域のブロック区域と同様に、心房の粗動および細動の役割も果たし得る。
【００６１】
ＲＡにＳＰの「副伝導路」が存在するため、ヒス束を直接ペーシング処理することにより、ペーシングにより興奮可能となるヒス束の領域が拡大される。また、大動脈近くの小さなヒス領域をペーシングすることが容易になる。ＳＰペーシングの位置は、図９に示すように、ＳＰ電位図に示される遅い伝導特性に基づいて探すことができる。この特性は、ＡＶＮＲＴの処理中にＳＰのアブレーションを行うときにも用いられる。ヒス束を取り囲む線維組織のために、ＳＰペーシングでは、ヒス束のペーシングに必要な閾値よりも低いペーシング閾値を用いてもよい。ウサギの実験では、ＳＰのペーシングと直接ヒスペーシングとで用いた閾値が、統計的には差異のないものであった。しかし、ウサギでは、ヒス束の心内膜側がわずかな結合組織で覆われているだけであるのに対し、ヒトでは、ヒス束
が中心の線維体の線維組織に完全に包まれてしまう。このため、ヒトのＳＰペーシングには、ヒス束のペーシングよりも低い閾値を用いることが可能となるのであろう。加えて、右心室の心外膜のペーシングと、ＳＰおよびヒスのペーシングとで用いた閾値は、心臓全体の実験において、統計的に差異が見られなかった。このことは、臨床的なＳＰペーシングの閾値が、右心室のペーシングの閾値と近いものになり得ることを示唆している。しかし、この研究は正常なウサギのＡＶ接合部で行われたものであり、ＡＶ伝導を中断しないことを意図したものではなかった。伝導の曲線は、ＡＶ結節の二重伝導路という電気生理学を調査するうえで、望ましい基準となるものである。調査したペーシング位置の数が多いため、それぞれについて伝導の曲線を作成することはできなかった。伝導の曲線は、臨床的手段として大変有用であるが、光学マッピングにより、ＦＰおよびＳＰの興奮パターンに差異があることが確認された。また、ＳＰ興奮の光学マッピングは、標準のＳ１−Ｓ２プロトコル基づくＳＰの光学マッピングに対応している。さらに、ＦＰとＳＰとの間に伝導的な関係があることが、遅いヒス電位により裏付けられている。
【００６２】
より詳しくは、本明細書に援用として参照される、ハッカー等著の「房室結線のＡＶ遅延の有無に伴う房室伝導：ウサギの心臓におけるヒス束への２つの伝導路（Ａｔｒｉｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  Ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ＡＶ  Ｎｏｄａｌ  Ｄｅｌａｙ：Ｔｗｏ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｂｕｎｄｌｅ
ｏｆ  Ｈｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｈｅａｒｔ）」Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２００７年８月、２９３（２）：Ｈ１１２２−３０に記載されている。
【００６３】
生理的なペースメーカとしてのＩＮＥ
ＩＮＥは、生体ペースメーカ治療にも使用可能である。特に、ＩＮＥは、補助的な心臓の生理的ペースメーカである。また、変更を加えることにより、静脈洞結節のペースメーカに不具合が生じたときには主要ペースメーカとなる。生理的に正常な心拍数を得るために、ＩＮＥの歩調取りの固有特性を向上させてもよい。特に、ＩＮＥの心筋を取り囲む、心臓の自律神経系における交感神経枝の要素に対して、電気的に交感神経刺激を与えることにより、ＩＮＥの歩調取りの特性は向上される。
【００６４】
副閾値の高周波数（約２０ヘルツから約４００ヘルツ）の電流が供給されることにより、ＩＮＥを取り囲む内因性自律神経支配が刺激され、ＩＮＥで生理ペースメーカを加速することができる。また、ＩＮＥの心筋内にある、心臓の自律神経系における交感神経枝の要素に対して、電気刺激を与えることにより、ＩＮＥの歩調取りの特性は向上されてもよい。より詳しくは、本明細書に参照として援用される、ハッカー等著の「房室結合部ペースメーカの自動制御と神経支配（Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｉｎｎｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｔｒｉｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐａｃｅｍａｋｅｒ）」、Ｈｅａｒｔ  Ｒｈｙｔｈｍ、２００７年１０月、４（１０）、１３２６頁−１３３５頁に記載がある。この副閾値アプローチは、従来必要とされた心室ペースメーカのリードに代わり得るものである。副閾値の刺激は、上記の装置設計に基づいて与えられてよく、あるいは他の周知の電気設計に基づいて与えられてもよい。
【００６５】
ＩＮＥの電気調整
臨床的電気生理学において共通するさまざまな状態を治療するために、ＩＮＥを電気的に調整してもよい。たとえば、徐脈および頻脈を含む、上室に起源をもつ複数の心臓不整脈の治療において、ＩＮＥに刺激を与えてもよい。また、除脈性不整脈（心拍数の減少）のペーシング治療において、配置装置の部位として、ＩＮＥに刺激を与えてもよい。具体的には、徐脈の治療において、ペーシングの部位として、すなわち、ＩＮＥの固有速度を速めることによりＳＡ結節に代わる生物学的ペースメーカの部位として、あるいはＩＮＥ
の歩調取りの固有速度を上げるために自動的に刺激を与える部位としてＩＮＥを用いてもよい。
【００６６】
細胞治療の部位としてのＩＮＥ
ＩＮＥは、生物学的なペースメーカを再構成する、細胞治療の部位として用いられる。その理由として、心房心筋および心室筋と比べ、ＩＮＥはＡＶ結節の血管を介してアクセスしやすいこと、また固有の歩調取りの特性や、生理的に高い自律神経調節力を備えていることが挙げられる。ＩＮＥに対して遺伝子治療または細胞治療をすることにより、上記の装置、たとえばカテーテルは液体を溶出するチップを備えており、遺伝子治療薬や細胞治療薬を含む、生理食塩水を供給することができる。カテーテルは、カテーテルチップから伸張して組織に孔を開ける伸縮自在の針と、ＩＮＥを探し出す感知電極とをさらに備えていてもよい。細胞治療は、上記の二つのアプローチ、すなわち心内膜アプローチ、およびＡＶ結節の血管アプローチのいずれで行ってもよい。
【００６７】
遺伝子治療の部位としてのＩＮＥ
ＩＮＥは、遺伝子治療の部位としても用いられる。具体的には、ペースメーカチャネルのイソ型がＨＣＮ１，ＨＣＮ２，ＨＣＮ３，またはＨＣＮ４として符号化される電気穿孔カテーテルを介して、あるいは自律神経系の要素を介して遺伝子を供給することにより、ＩＮＥの固有の歩調取りの特性は向上される。
【００６８】
遺伝子治療は、下記の方法により行われる。液体を溶出するカテーテルを、ＡＶ結節の血管に置き、緩徐電位が最も大きい部位を探す。第二のカテーテルにより、ＩＮＥの心内膜表面で緩徐電位を探す。副閾値の交流電流（たとえば、約１．０マイクロアンペア〜約５０．０マイクロアンペアの範囲）を、各カテーテルのチップから供給して二つのリード間のインピーダンスを最小にし、遅い伝導路を探す。静脈壁に孔を開けるために、静脈内カテーテルの流体を溶出する針を伸張させてもよい。二つのカテーテルに電流を供給してもよく、同時に、遺伝子治療薬を含む生理食塩水を流してもよい。別の実施形態において、約１マイクロアンペア未満、または約５０マイクロアンペアを超える電流が用いられることを、当業者には理解されたい。
【００６９】
心拍制御に用いられるＩＮＥ
ＩＮＥは、心房粗動、心房細動、およびＡＶＮＲＴを含む、心房性の上室性頻脈性不整脈が生じたとき、心拍数を制御するのに用いられる。たとえば、ＡＶＭＲＴが生じたとき、刺激パルス（または一連のパルス）をＩＮＥに与えることにより、高周波アブレーションの必要なく不整脈を抑えたり、この治療で生じ得る予測される合併症（ＡＶブロック）を抑えることができる。
【００７０】
ＩＮＥの解剖学的な神経支配を刺激することにより、短い不応期などが原因で心房細動が生じたとき、心拍数を制御し、効果的に治療することができる。ＩＮＥに副交感神経刺激を与えることにより、遅い伝導路において興奮をブロックすることができる。両心室の興奮はＦＰを介して伝わり、不応期が長くなるため、ＡＶ結節のフィルタリング特性が向上されることになる。ＩＮＥをペーシングすることにより、遅い伝導路と下結節束を介して伝導が行われる。この伝導は、ＦＰおよび小型ＡＶ結節を介する伝導に比べ、安全性が高い。この結果、ＩＮＥをペーシングすることにより、発作的および慢性的な心房性の上室性頻脈性不整脈をもつ患者に対し、心房性不整脈が生じた場合に、ＡＶ結節のアブレーションをすることなく、安全に心拍数を制御することができる。
【００７１】
一般的なＡＶＮＲＴは、リエントリー性不整脈の一つの伝導路としてＩＮＥに関係する。また、ＡＶＮＲＴは、高周波アブレーションでＩＮＥ上もしくはＩＮＥ付近を損傷させることにより、治療される。別の実施形態において、ＡＶＮＲＴが生じたとき、ＩＮＥに
刺激パルス、または一連のパルスを与えることにより、高周波アブレーションの必要なく不整脈を抑えたり、予測される合併症を抑えることができる。上記のカテーテルの設計により、ＩＮＥへの心内膜アプローチ、もしくは静脈アプローチを用いて、頻脈性不整脈の治療が行える。
【００７２】
上記の実施形態は説明のためのものであり、制限を意図したものではない。この他の実施形態も請求項の範囲に含まれる。また、本発明は実施形態により記載されているが、発明の精神と範囲から逸脱することなく、形式や詳細について変更が可能であることを、当業者には理解されたい。参照として援用される上記の文献から、本明細書における明確な開示に反する主題は援用されないものとする。
【００７３】
付録Ａ
ハッカー（Ｈｕｃｋｅｒ）：ヒト房室接合部におけるＣｘ４３
２００７年１１月５日
コネキシン４３の発現により説明される、ヒトの房室接合部の２つの経路
ウィリアムＪ．ハッカー、ミーガンＬ．マケイン、ジェイコブＩ．ラーフナー、ポールＡ．アイエイゾ、＊イゴールＲ．エフィーモフ
ミズーリ州セントルイス、ワシントン大学および＊ミネソタ州ミネアポリス、ミネソタ大学
連絡先：米国ミズーリ州セントルイス、ワシントン大学、生物医学工学部、イゴールＲ．エフィーモフ
本研究が受けた支援：０７５００３１Ｚに対する米国心臓協会の助成金。
【００７４】
要約
ギャップジャンクションの発現は多くの生物種の房室接合部（ＡＶＪ）で研究されてきたが、ヒトにおけるＡＶＪの分布は不明である。ギャップ結合タンパク質であるコネキシン４３（Ｃｘ４３）のＡＶＪにおける発現は生物種に依存する。そこで、我々はヒトＡＶＪにおけるＣｘ４３の分布について詳細に調べた。方法：組織学的手法であるマッソン三色染色を用いて、我々はヒトの正常な心臓を３つおよび拡張型心筋症の心臓１つのＡＶＪを三次元再構成した。Ｃｘ４３の細胞由来を明らかにするために、Ｃｘ４３をビメンチンおよびα−アクチニンで免疫標識し、以下の構造、すなわち、心房中隔（ＩＡＳ）、ヒス束、緻密結節（ＣＮ）、下結節束（ＬＮＢ）、左側および右側結節拡張部（ＬＥおよびＲＥ）、および心臓内、左側、下移行細胞について定量化した。結果：組織学手法により、３／４の心臓で２つの結節拡張部が明らかになった。Ｃｘ４３は筋細胞に認められたが、ＡＶＪの線維芽細胞には認められなかった。ＬＥおよびＣＮのＣｘ４３はＩＡＳより少なく（Ｐ＜０．０５）、またＲＥ、ＬＮＢおよびヒス束ではＩＡＳでの発現のおよそ半分で全て同様に発現した（ＲＥ：４４±３６％、ＬＮＢ：５０±２６％、ヒス束：４８±１２％、ＩＡＳと比較した場合のＰ＝ＮＳ）。移行細胞におけるＣｘ４３レベルは、ＩＡＳと同様だった（Ｐ＝ＮＳ）。結論：Ｃｘ４３はヒトＡＶＪの筋細胞に認められた。その発現パターンは２つの別々の連続的な構造を明らかにしており、一方のＬＥおよびＣＮからなるＣｘ４３が少ない構造、および他方のヒス束、ＬＮＢおよびＲＥからなるＩＡＳのＣｘ４３の半分の量を発現する構造だった。Ｃｘ４３発現の違いは、ＡＶＪから発生する不整脈の一因となる、他とは異なる伝導特性をもつ各構造をもたらし得る。
キーワード：房室結節、二重伝導路電気生理学、コネキシン４３、遅い伝導路、房室結節回帰性頻拍（ＡＶＮＲＴ）。
【００７５】
序論
多数の動物モデルにおける房室接合部（ＡＶＪ）の詳細な研究で、この構造が細胞および組織の形態、機能特性、ならびにタンパク質分布の点で非常に複雑であることが示されている。ヒトＡＶＪで多くの組織学的研究が行われ、臨床電気生理学的研究がインビボで
のＡＶＪの機能に関するかなりの量の情報を提供してきた一方で、ヒト組織をタイミング良く調達することが本来難しいことから、ヒトＡＶＪの分子研究の数は非常に限られている（デイビスら（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９５年）。それにもかかわらず、このような研究は、房室結節回帰性頻拍（ＡＶＮＲＴ）および房室ブロックなどの臨床上関連する現象の基礎的理解に、また動物モデルでは扱いが難しい年齢などの変数の理解を深めるために絶対に必要である。また、タンパク質の発現パターンに種間差があることから、動物のデータをヒトに当てはめて推定するには限度がある恐れがある（コッペンおよびサーバーズ（Ｃｏｐｐｅｎ  ａｎｄ  Ｓｅｖｅｒｓ）、２００２年；コッペンら（Ｃｏｐｐｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、２００３年）。従って、ヒトＡＶＪにおける発現パターンが枠組みとなり、その中で動物モデルでの研究が解釈されるであろうことから、ヒトにおける分子研究は重要である。
【００７６】
心房−ヒス束伝導には複数の問題が関係し、本研究では、ＡＶＪという用語はこれら全てを含んで用いられる（ビレット（Ｂｉｌｌｅｔｔｅ）、２００２年）。ＡＶＪの特化した伝導組織は、近位では、冠状静脈洞（ＣＳ）入口部近くから結節自体に広がる下結節拡張部で構成される（イノウエおよびベッカー（Ｉｎｏｕｅ  ａｎｄ  Ｂｅｃｋｅｒ）、１９９８年）。以前は、これらの拡張部は「下」ではなく「後部」と称されていたが（イノウエおよびベッカー（Ｉｎｏｕｅ  ａｎｄ  Ｂｅｃｋｅｒ）、１９９８年；ドブジニスキら（Ｄｏｂｒｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．）、２００３年）、心臓を解剖学的に正しい方向に配置した場合、これらの拡張部は実際にはＣＮの下を通ることから、本研究において、我々は「下結節拡張部」という用語を用いる（コシオら（Ｃｏｓｉｏ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９９年）。下結節拡張部は融合して房室結節（ＡＶＮ）となる。ＡＶＮは次に、中心線維体を貫いて、ヒス束となる（タワラ（Ｔａｗａｒａ）、１９０６年）。ＡＶＮおよび結節拡張部を結合して心房組織を取り巻いているのは、移行細胞である。移行細胞は、ＡＶＮに対する位置に基づいて、心臓内の面でＡＶＮと接する心臓内移行細胞、心房中隔（ＩＡＳ）の左側からＡＶＮに近づく左側移行細胞、および冠静脈洞入口部近くのＡＶＮに接近する下移行細胞の３つのグループに分けることができる（アンダーソンおよびホー（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｈｏ）、２００２年；アンダーソンおよびホー（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｈｏ）、２０００年）。
【００７７】
この複雑な生理的役割に対応するために、ＡＶＪは、心臓の他のどこよりも多種類のギャップジャンクションタンパク質を発現して、非常に異質なギャップジャンクションの発現を発達させてきた。具体的には、これまでに４種類の心臓性コネキシン（Ｃｘ４３、Ｃｘ４０、Ｃｘ４５、およびＣｘ３０．２／３１．９）が記載されており、これらの各タンパク質はＡＶＪの動物研究において発見されている（ボエットら（Ｂｏｙｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．）、２００６年）。Ｃｘ４３およびＣｘ４０は、共に迅速に伝導を行う心臓組織に関連し（Ｃｘ４０はＣｘ４３より伝導性が高い）、Ｃｘ４５、およびＣｘ３０．２／３１．９は、緩慢な伝導を行う組織に関連する（ボエットら（Ｂｏｙｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．）２００６年）。ＡＶＪにおけるこれらのコネキシンの発現パターンは、生物種に大きく依存し、ラットの心臓はＡＶＪではＣｘ４３または４０を発現しないが、ウサギでは両方を発現する（コッペンおよびサーバーズ（Ｃｏｐｐｅｎ  ａｎｄ  Ｓｅｖｅｒｓ）、２００２年；ドブジニスキら（Ｄｏｂｒｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．）、２００３年）。我々が知る限りでは、わずか一件の研究がヒトのＡＶＪでのコネキシンの発現を示しただけであり（デイビスら（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９５年）、Ｃｘ４３、Ｃｘ４０、およびＣｘ４５がすべて存在することが発見された。しかしながら、この研究はＡＶＪのどこでコネキシンが発現されたかについては調査を行っていない。
【００７８】
従来、コネキシンは隣接する筋細胞間にギャップジャンクションを形成すると推測されてきた。しかし、近年の研究発表は、機能するギャップジャンクションは、おそらくＣｘ４３の結合を介して（ゴールドスミスら（Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．）、２００
４年）筋細胞と線維芽細胞の間に形成される（カメリティら（Ｃａｍｅｌｌｉｔｉ  ｅｔ
ａｌ．）、２００５年）、ということも示唆している。本研究では、我々はＡＶＪの様々な組織を通じたＣｘ４３の発現、およびＣｘ４３が筋細胞と線維芽細胞の間にギャップジャンクションを形成するか否かについて研究した。我々は、機能的な因果関係がある可能性がある（組織学的手法でははっきりとは見えない）ＡＶＪの領域をＣｘ４３の発現パターンが明らかにすることを示している、マッソン三色染色組織学手法から構築されたＡＶＪの三次元再構成と、Ｃｘ４３免疫蛍光とを関連づけた。
【００７９】
方法
研究のためのヒト心臓の使用は、ワシントン大学およびミネソタ大学の施設内倫理委員会により承認された。３つの検体は北部中西部臓器調達機関（Ｕｐｐｅｒ  Ｍｉｄｗｅｓｔ  Ｏｒｇａｎ  Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，  ＬｉｆｅＳｏｕｒｃｅ，  Ｓｔ．  Ｐａｕｌ，  ＭＮ；この団体は、本プロトコルの事前承認も行った）から提供された。これらの心臓は、移植用としては存続不可能と判断された。さらなる検体は、突発性拡張型心筋症（ＤＣＭ）の移植患者の外植された心臓だった。各検体に関して既知の臨床データを表１に示す。これらの検体は、凍結組織包埋剤（Ｈｉｓｔｏ  Ｐｒｅｐ（商標）、フィッシャーサイエンティフィックフェアラウン社［米国ニュージャージー州所在］）中に置き、ドライアイス詰めでワシントン大学に移送されるまで、ミネソタ大学の−８０℃の冷凍庫内に保存した。その後、解剖前に４℃で解凍した。コッホ三角を露出し、コッホ三角の頂点で組織の約４×４ｃｍ２の領域を切り取り（図１Ａ）、−８０℃で再凍結した。組織塊を１６μｍに凍結薄切し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓ（商標）ガラススライド（フィッシャーサイエンティフィックフェアラウン社［米国ニュージャージー州所在］）上に載せ、使用時まで−８０℃で保存した。各組織切片の位置は、薄切の過程を通じて記録した。
【００８０】
三次元再構築
房室接合部の三次元再構成を行うために、およそ０．５〜１．０ｍｍ離れた各組織切片（図１Ｂ）をマッソン三色染色で染色した。組織像用切片は、２×レンズで写真撮影し、組織切片のモザイク画像を作成した。各切片の画像をウィンドウズ（登録商標）用Ｒｈｉｎｏｃｅｒｏｓ  ＮＵＲＢＳモデリング、バージョン３．０（ロバート・マクニール・アソシエイツ社（Ｒｏｂｅｒｔ  ＭｃＮｅｅｌ  ＆  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）に取り込み、脂肪および埋め込まれたあらゆる移行細胞の房、ＩＡＳ／移行細胞、心室中隔、結合組織（中心繊維体、僧帽弁および三尖弁）、伝導系（ヒス束、緻密房室結節、下結節束、左側および右側下結節拡張部）、および主要な動脈および静脈の部分を分けて輪郭線を描いた（図１Ｃ）。移行細胞の境界線は、決めるのは困難であり、また非常に不規則であることから、移行細胞は伝導系を取り巻くＩＡＳまたは脂肪組織の領域に組み込んだ。その結果、移行細胞の三次元再構成画像は分かりにくく不鮮明になった。それにも関わらず、図１Ｃでは、各矢印は脂肪組織内に位置する移行細胞を指し示し、各矢じりは左心房からの移行細胞を指し示している。各切片から得られた一連の輪郭を回転させて前の切片の輪郭に位置を合わせた。各切片の正確な三次元配置は、組織の凍結薄切中に記録した距離を用いて決定した。図１Ｄは、その結果得られた、ＤＣＭ患者から外植された心臓における、正確に配置され位置付けられた伝導系の輪郭を示す。各組織型について、一連の輪郭線をロフト化して三次元ボリュームに近似させたメッシュを作成し（図１Ｅ）、次にレンダリングを行って、連続的な三次元ボリューム画像を作成した（図１Ｆ）。
【００８１】
免疫組織化学
免疫組織化学については、組織切片をまず固定し、透過処理を行い、３．７％ホルムアルデヒドに５分間、０．１５％Ｔｒｉｔｏｎに１５分間、および１０％正常ウマ血清に６０分間浸漬してブロッキングを行った。免疫組織化学により、我々は３種類のタンパク質、すなわち、ギャップジャンクションタンパク質であるＣｘ４３、筋細胞マーカーであり
筋細胞のサルコメアに発現するα−アクチニン、ならびに中間径フィラメントタンパク質であり、線維芽細胞および内皮細胞の細胞骨格中間径フィラメントで発現するビメンチンを視覚化した（カメリッティら（Ｃａｍｅｌｌｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．）、２００５年）。心臓組織では、線維芽細胞は心筋組織全体にわたって存在するのに対して、内皮細胞は血管に存在する。従って、組織内の位置に基づいて線維芽細胞を内皮細胞と識別することができる。我々は、心筋内の線維芽細胞を視覚化するためにこのマーカーを用いた。次の一次抗体、すなわち、ウサギ抗Ｃｘ４３抗体（Ｓｉｇｍａ、１：１０００）、マウス抗α−アクチニン抗体（サルコメア特異的、Ｓｉｇｍａ、１：１６００）、およびモルモット抗ビメンチン抗体（Ｐｒｏｇｅｎ、１：８００）は、４℃で一晩適用した。次の二次抗体、すなわち、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、１：８００）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、１：８００）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７ヤギ抗モルモットＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、１：８００）は、室温で２時間適用した。ヒト心臓組織での免疫蛍光研究は、自己蛍光のために非常に困難である可能性がある（ビリントンおよびナイト（Ｂｉｌｌｉｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｋｎｉｇｈｔ）、２００１年）。そこで、ヒト組織に見られるリポフスチン粒子から由来の自家蛍光を減らすために、各切片を１％スダンブラック（Ｓｉｇｍａ）溶液に１０分間浸漬した（スネルら（Ｓｃｈｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９９年）。次に、組織切片をＤＡＰＩ含有ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ褪色防止剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にマウントした。
【００８２】
コネキシンの定量
共焦点免疫組織化学像は４０×のレンズを用いて採取し、個別の画像を統合してＡＶＪ内の異なる３平面でのモザイク画像を作成した。第１の平面は下結節拡張部を通る切片であり、第２の平面は緻密房室結節（ＣＮ）を通る平面であり、また第３の平面はヒス束を通る平面だった。第１の平面では、左側下結節拡張部、右側拡張部、下移行細胞、およびＩＡＳでＣｘ４３の定量を行った。第２の平面では、ＣＮ、下結節束（ＬＮＢ）、心臓内移行細胞、左心房移行細胞、およびＩＡＳでＣｘ４３の定量を行った。最後に、第３の平面では、ヒス束および心房中隔（ＩＡＳ）でＣｘ４３の定量を行った。組織の様々な領域内のコネキシン密度は、注文プログラム（ＭＡＴＬＡＢ（商標）、マスワークス社（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ）、［マサチューセッツ州ナティック（Ｎａｔｉｃｋ）所在］）を用いて測定した。アルゴリズムの全説明は過去に発表されており（ハッカーら（Ｈｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、２００７年ａ）、補足オンラインデータに提供されている。簡単に述べると、興味ある領域のモザイク画像の閾値処理を２度行って、Ｃｘ４３用チャネルの２つの白黒画像を生成する。第１の閾値には画像のＣｘ４３陽性染色を選択した。第２の閾値は第１の閾値よりはるかに低く、画像中の任意の組織を選択した。それぞれの面積を補正し、Ｃｘ４３の面積を組織面積で割り、Ｃｘ４３染色に一致する組織面積のパーセンテージを得た（オンラインデータ補足を参照）。
【００８３】
共局在
どの細胞タイプがＣｘ４３を発現しているかを明らかにするため、共局在プロットを用いた。３チャネルの三次元共焦点Ｚスタックで、各ボクセルは、赤、緑および青染色にそれぞれ１つずつ、３つのシグナル強度値がある。Ｖｏｌｏｃｉｔｙ（インプロビジョンインコーポレイティッド社（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ，  Ｉｎｃ．）［米国マサチューセッツ州レキシントン（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ）所在］）で生成した共局在プロットは、これらのシグナル強度値の２つを互いの関数として表示する。定義によると、特定体積に相当するボクセルでこれら２つのタンパク質に相当する蛍光共同が高い場合、２つのタンパク質はこの特定体積で高度に共局在する。従って、２つのタンパク質が多数のボクセルで共存する場合、共局在プロットは顕著な対角線分布を含む。共局在の程度が最も高いボクセルは、右上の象限に示される。対照的に、２つのタンパク質が共局在しない場合、共局在プロットは各軸付近のボクセル値を示し、対角線成分は存在しない。
【００８４】
統計値
Ｃｘ４３定量データは、平均±標準偏差として示されている。Ｃｘ４３レベルは、ノンパラメトリック・クラスカル・ワリス検定（ＭＡＴＬＡＢ（商標））を用いて比較した。ｐ＜０．０５の値を統計的に顕著であると見なした。
【００８５】
結果
伝導系におけるＣｘ４３の発現
典型的なＡＶＪ標本の一つについて、標本のマッソン三色組織化学像、Ｃｘ４３免疫蛍光像、および三次元再構成画像を図２−４に示す。下方で、ＡＶＮは、長さおよび数が共に様々である下結節拡張部として始まる（イノウエおよびベッカー（Ｉｎｏｕｅ  ａｎｄ
Ｂｅｃｋｅｒ）、１９９８年）。本研究の４つの心臓のうち３つでは、下結節拡張部が２つあり、もう１つには１つのみであった。図２−４に示した標本は、左側および右側拡張部の両方があり、左側拡張部はＩＡＳの左側付近で始まり、一方、右側拡張部は、三尖弁の中隔尖に隣接して位置する（図２Ａ）。右側拡張部はＣｘ４３を発現していたが（図２Ｅおよび２Ｆ）、一方で、左側拡張部にはＣｘ４３の存在は実質的に無かった（図２Ｄ）。この標本では、右側拡張部は下移行細胞の層に密接した近傍に位置しており、Ｃｘ４３も発現していた（図２Ｅおよび２Ｆ）。４つの標本のうち３つで、移行細胞は右側拡張部に密接に関連して見いだされた。また、各標本で、図２Ａ−Ｃに見られるように、大静脈は右側拡張部に密接した近傍に見いだされた。左側拡張部および右側拡張部の間に、緻密房室結節と共に上方に連続的な、不定量のＣｘ４３陰性の組織があった（図２Ｃ）。この組織の量は、標本間で様々だった。図２全体を通じて、ビメンチン染色（青）で示されるように、線維芽細胞が右側および左側拡張部の筋細胞の間に散在していることは明らかである。この標本の三次元再構成画像は図２Ｇに示されており、図２Ａ−Ｃに示されるように、平面で分割展開して組織内の右側および左側拡張部を示している。
【００８６】
図３は、この標本のＡＶＮのマッソン三色組織化学像、Ｃｘ４３発現、および三次元再構成画像を説明する。図３Ａに見られるように、ＡＶＮは中心繊維体（ＣＶＢ）、ＡＶＮを心房組織と隔てる線維脂肪組織の層、および心臓内移行細胞の薄い層に隣接する。ＡＶＮの後面では、ＩＡＳの左側をＡＶＮに繋ぐ移行細胞がＡＶＮ組織に接触している。移行細胞の多数の房も繊維脂肪組織層内に位置しているが、これらの組織の房は、再構成像では輪郭線は分けて描かれていない。
【００８７】
ＡＶＮは、機能的形態的特性に基づいて緻密結節（ＣＮ）および下結節束（ＬＮＢ）に分けることができる（アンダーソンら（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．）、１９７４年；  ビレット（Ｂｉｌｌｅｔｔｅ）、２００２年）。ＣＮは小さく高密度に密集した不規則な形の細胞から成り、一方、ＬＮＢ細胞はより大きく、互いに平行に位置している。我々は、これらの２つの構造の間に、Ｃｘ４３発現の一貫した不均一性を認めた。心室に最も近いＡＶＮの前方部分を占めるＬＮＢは、心房に最も近いＣＮ後方領域よりも多くのＣｘ４３を発現する（図３Ｂ、Ｃ、およびＧ）。下方では、ＣＮが左側拡張部と連続し、ＬＮＢは右側拡張部と連続していた。従って、ＣＮおよび左側拡張部は、再構成画像では一つの連続的な構造として輪郭線が描かれた。同様に、右側拡張部およびＬＮＢは、一つのボリュームとして再構成された（図３Ｈ）。この切片で見ることができる、左側移行細胞および心臓内移行細胞、両方の一連の移行細胞は、ＩＡＳと同様に、高レベルのＣｘ４３を発現していた（図３ＤおよびＥ）。図３に見られるように、ＡＶＮ領域全体で、伝導系の筋細胞の周りに広範囲に及ぶ線維芽細胞のネットワークが存在していた（図３Ｂ、Ｆ，およびＧ）。
【００８８】
図４は、この標本のヒス束を示している。ヒス束は、組織化学像および三次元再構成画像の両方に見られるように、中心繊維体（ＣＦＢ）の繊維組織に完全に取り囲まれている
（図４Ａおよび４Ｅ）。ヒス束の近接端部は、タワラ（Ｔａｗａｒａ）により示唆された、ＡＶＮおよびヒス束間の移行点である（タワラ（Ｔａｗａｒａ）、１９０６年）、ＡＮＶが完全にＣＦＢに取り囲まれた点として定義された。ヒス束は、この点からヒス束が心室中隔に結合する点まで、再構成された。
【００８９】
図４Ｂおよび４Ｃに見られるように、Ｃｘ４３はヒス束全体にわたって不均一に発現していた。この例では、より高レベルのＣｘ４３発現がヒス束の心臓内面および寝室面上に見られた。しかし、このパターンに一貫性はなく、他の標本ではＣｘ４３はヒス束の心房との境界に高度に発現していた。ヒス束およびＡＶＮ間のＴａｗａｒａの移行点は形態学的に便利であるが、我々は、タワラ（Ｔａｗａｒａ）によって定義されたようなヒス束の開始点にＣｘ４３発現の劇的な変化を認めなかった。代わりに、Ｃｘ４３の発現はＡＶＮに見られるＣＮ／ＬＮＢパターンからヒス束に示されるパターンへと次第に変化した。図４Ｂおよび４Ｄに見られるように、ヒス束には、多数の線維芽細胞がヒス束筋細胞の大部分を取り囲んで存在している。
【００９０】
広範囲にわたる線維芽細胞ネットワークがＡＶＪ全体に存在するにもかかわらず、図２−４に見られるように、我々はＣｘ４３の圧倒的な大部分が筋細胞内だけで発現し、線維芽細胞または筋細胞と線維芽細胞間のＣｘ４３は非常にわずかな例であることを見いだした。図５は、α−アクチニン、ビメンチン、およびＣｘ４３で標識された、２つの典型的な高解像度三次元共焦点画像スタックの最大投影像を示す。共局在プロットの方法を用いて、我々は各ボクセル内のＣｘ４３の細胞起源を測定した。パネルＡ−Ｃでは、ＬＮＢで記録されたデータが示されている。線維芽細胞が筋細胞を取り囲んでいる一方で、Ｃｘ４３は筋細胞内および筋細胞間だけで発現されていることを、最大投影像が明らかにしている。パネルＢでは、共局在プロットが撮像されたボリューム内の各ボクセルの赤と緑のシグナル強度値を明らかにしている。高い緑のシグナル強度を持つ（つまり、Ｃｘ４３染色特異的な）ボクセルがα−アクチニン軸の値にわたって広がっており、Ｃｘ４３染色がα−アクチニンも発現するボクセル内に存在することを示している。パネルＣでは、同一ボリュームに由来する青と緑のシグナル強度値の共局在プロットが示されている。このプロットでは、特異的なＣｘ４３染色のボクセルがＣｘ４３軸に沿って一群になっており、Ｃｘ４３の特異的染色が青のシグナル強度が無いボクセル内でのみ生じたことを示している。実際に、Ｃｘ４３のシグナル強度の上位半分のうちのこの特定ボリューム内の１４、４９０ボクセルでは、ビメンチンのシグナル強度の上位半分に含まれたのは１ボクセルのみだった。図５Ｄ−Ｆは、ＣＮにおけるＣｘ４３発現の同じパターンを明らかにしている。ＣＮでは、Ｃｘ４３はＬＮＢよりもはるかに少ないが（図３）、パネルＥおよびＦの共局在プロットは、ＣＮで発現しているあらゆるＣｘ４３が筋細胞内または筋細胞間で発現しており、ボクセルの特異的Ｃｘ４３染色が何らかの青のシグナル強度を持つのは非常にわずかであることを示している。このボリュームでは、Ｃｘ４３染色のシグナル強度の上位半分の９５３ボクセルのうち、３４ボクセルがビメンチン染色でも上位半分に含まれたが、これらのボクセルは、共に一ヶ所に一群となることはなかった。代わりに、これらのボクセルは、互いに独立した１つまたは２つのボクセルとして現れた。このことから、我々は、ヒトＡＶＪにおける筋細胞および線維芽細胞間のギャップジャンクション形成の症候は非常にわずかであると結論した。
【００９１】
Ｃｘ４３の定量
Ｃｘ４３をＡＶＪの様々な組織タイプにわたって定量した。比較として、各組織切片のＩＡＳのＣｘ４３を定量した。図６に示すように、Ｃｘ４３の発現は、３グループの移行細胞およびＩＡＳの間で比較的一定だった。ＩＡＳにおけるＣｘ４３に対するパーセンテージとして表現すると、心臓内移行細胞のＣｘ４３は１１２±３２％、左側移行細胞で７８±２６％、および下移行細胞で８９±３５％だった（それぞれＰ＝ＮＳ）。
【００９２】
各標本の伝導系でＣｘ４３を定量した場合、図７の棒グラフに示すように、明確なパターンが現れた。右側拡張部、ＬＮＢ、およびヒス束は全て、互いに同様にＣｘ４３を発現した（ＩＡＳに対する割合は、それぞれ４４±３６％、５０±２６％、および４８±１２％だった）。本研究での心臓数が少なかったことから、これらの構造それぞれにおけるＣｘ４３発現の平均はＩＡＳと統計的な差はなかったが、Ｃｘ４３の発現がそれらの間で一定だったことは明らかである。しかし、左側拡張部およびＣＮにおけるＣｘ４３の発現は、ＩＡＳにおける発現よりも共に統計的に低かった（それぞれ、ＩＡＳのシグナルの５±４％、および４１２±１１％、それぞれＰ＜０．０５）。左側拡張部およびＣＮにおけるＣｘ４３の発現も、ＬＮＢより統計的に低かった（それぞれ、Ｐ＝０．０３およびＰ＝０．０２）。
【００９３】
伝導系の再構成
左側および右側拡張部、ＣＮ、ＬＮＢ、ならびにヒス束で構成される、各心臓由来の伝導系の三次元再構成を図８に２つの図で示す。各パネルは、一つの心臓の伝導系の再構成を示す。各パネルの左の図は、コッホ三角内での伝導系の方向、伝導系に密接した近傍に位置する血管、およびヒス束を包むＣＦＢを示す。右の図は、伝導系自体、およびＣｘ４３を定量した３平面を示す。各標本のヒス束は、緑で示されている。ＬＮＢおよび右側拡張部は、連続的な構造として黄色で描かれている。左側拡張部およびＣＮは、連続的な構造としてシアンで描かれている。最後に、右側拡張部に密接に関連する下線維細胞の層は、オレンジ色で示されている。移行細胞および右側拡張部の間に密接に並置するこれらの領域は、心房心筋と結節拡張部の間の接触部分である可能性がある。２つの標本では（図８ＡおよびＢ）、右側拡張部は左側拡張部よりも長かった。図８Ｃに見られるように、１つの標本には右側拡張部はあるが左側拡張部がなく、最後のＤＣＭの心臓では（パネルＤ）、左側拡張部は実際には右側拡張部よりもやや長かった。
【００９４】
ＤＣＭの心臓では（図８Ｄ）ＩＡＳが他の３標本よりもはるかに厚く、この心臓では左側拡張部がＩＡＳの左心房側に向かって（背腹方向に）著しく突出している。従って、パネルＡ−Ｃに示した心臓内図から９０°回転させた伝導系の追加図をパネルＤに示す。図８Ｄに見られるように、ＤＣＭの心臓における伝導系は、正常の心臓よりも厚かった。パネルＡのＤＣＭの心臓の再構成画像のアニメーションがオンラインのデータ補足に提供されている。
【００９５】
考察
本研究で、我々はヒトＡＶＪにおける伝導系の三次元生体構造を再構築し、Ｃｘ４３の分布および細胞由来をマッピングした。我々の結果は、Ｃｘ４３が同じようなレベルで発現する（およそ、ＩＡＳでの発現レベルの半分）右側拡張部、ＬＮＢ、およびヒス束の領域の筋細胞でＣｘ４３が不均一に分布し、一方、左側拡張部およびＣＮではＣｘ４３の発現はＩＡＳと比較して非常に少ないことを示した。
【００９６】
イノウエ（Ｉｎｏｕｅ）およびベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）は、２１個の一連の心臓について、７／２１（３３％）で右側拡張部のみで左側拡張部が無く、１３／２１（６２％）で右側拡張部が左よりも長く、また１／２１（５％）で左側拡張部のみだったと記載している（イノウエおよびベッカー（Ｉｎｏｕｅ  ａｎｄ  Ｂｅｃｋｅｒ）、１９９８年）。我々の心臓試料はイノウエ（Ｉｎｏｕｅ）およびベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）が述べたものに密接に類似しており、２／４（５０％）で右側拡張部が左よりも長く、１／４（２５％）が右側拡張部のみだった。興味深いことに、我々の研究のＤＣＭの心臓では、左側拡張部が右側拡張部よりも実質的に長く、これはＩｎｏｕｅ  ａｎｄ  Ｂｅｃｋｅｒが観察しなかった変化である。この変化が単に稀であり、彼等の研究に現れなかっただけであったかどうか、あるいは、この試料の病理的状態に起因するかどうかは、我々の研究からは判断できない。この心臓は伝導系の全体的な形態が他と異なり（図１Ｃ）、本研究の他の心
臓よりも大きかったことから（図８Ｄ）、左側拡張部が長いことがＤＣＭと関連しているとすることももちろん可能である。ＩＡＳの厚さも、この心臓では他の心臓よりもはるかに厚く（データ補足動画２）、従って、背腹方向に向いていたことから、リモデルされた心筋のようにこの心臓では左側拡張部が選択的に長くなった可能性もある。我々は、この心臓におけるＣｘ４３の発現が、正常の心臓よりも高かったということも見いだした（図６および７）。しかし、過去の研究は、左心室のＣｘ４３発現はＤＣＭ患者では減少することが示されている（デュポンら（Ｄｕｐｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．）、２００１年）。従って、ＡＶＪについて、今後、様々な心筋症の影響を明らかにする研究が必要である。
【００９７】
全体的に組織化学的研究に基づくイノウエ（Ｉｎｏｕｅ）およびベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）の研究（１９９８年）では、ＬＮＢに関しては触れられなかった。ひとつには、これはヒトのＬＮＢを組織学的手法のみで認識するのは困難であるという事実に起因するかもしれない。本研究では、Ｃｘ４３マーカーを加えて使用することにより、我々は一貫してＬＮＢを視覚化することができることを見いだし、その結果、形態的に類似した細胞および組織が非常に異なる分子特性をもつ可能性があることを示した。他のコネキシン・アイソフォームがヒトＡＶＪにおいて同様の領域を明らかにするかどうかを検討する研究が今後必要だろう。
【００９８】
ヒトのＡＶＪの実験モデルとしてウサギのＡＶＪがしばしば用いられる。ウサギでは、ヒトの右側拡張部の位置と非常に似た、冠状静脈洞および三尖弁の間の心筋峡部で右心房心内膜下に位置する結節拡張部が１つ有るのみである。本研究では、Ｃｘ４３の定量によりヒトＡＶＪにおけるＣｘ４３発現の２つの軸、すなわち、いずれもＣｘ４３が互いに同程度に、またＣＮおよび左側拡張部よりも高レベルで発現する右側拡張部、ＬＮＢ，およびヒス束が明らかになった。過去の研究は、ウサギもＣｘ４３発現の２つの領域を持つことが報告されている。コー（Ｋｏ）らは、ヒス束、下結節細胞、および結節拡張部がいずれもＣｘ４３を同程度発現すること、またＣＮは検出可能なＣｘ４３を発現しないことを見いだした（コーら（Ｋｏ  ｅｔ  ａｌ．、２００４年）。従って、ヒトおよびウサギの間では、左側拡張部／ＣＮとは異なって右側拡張部／ＬＮＢがヒス束に接続されている点で一致している。本研究とウサギでの研究におけるデータ間の類似性は、ウサギはヒトの心臓伝導系の適切なモデルであるという更なる証拠を提供する（ローザンバーグおよびエフィーモフ（Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｅｆｉｍｏｖ）、２００６年）。
【００９９】
共局在プロットの方法により、我々は線維芽細胞と筋細胞間のＣｘ４３を介した相互作用は、ヒトのＡＶＪにおいてはもしあるとしても最低限であると結論づけた（図５）。共局在の手法は、三次元空間における免疫蛍光シグナルの局在の情報を得るのに有用である。また、この手法は定量的でもあり、画像スタック中の全ボクセルの数値を示し、結果からのあらゆる選択バイアスを除去する。しかし、この手法は、線維芽細胞がＣｘ４３を発現する場合、そのシグナルがビメンチンと共局在するであろうということを前提としている。ビメンチンは細胞質タンパク質であり、Ｃｘ４３は、もし発現されて機能可能であるとすれば、膜に結合するであろうことから、この前提が正しい可能性も、正しくない可能性もある。しかし、本研究で用いられた光学的分解能では、共焦点画像のピクセル分解能はＸおよびＹで２４０ｎｍ（１２５×１２５μｍの視野で５１２×５１２ピクセル）ならびにＺで〜５００ｎｍであり、細胞内のタンパク質の分離に関して非常に大きい。おそらくビメンチン繊維が細胞膜の２４０ｎｍ以内で発現されるだろうというのは、筋が通っているようである。従って、我々の推論は妥当であると感じている。また、サルコメア特異的なα−アクチニンは筋細胞の細胞質で発現されるであろうことから、α−アクチニンおよびＣｘ４３の物理的な重なりに関しても同じ制約が適用されるが、共局在プロットは、α−アクチニンおよびＣｘ４３の間に共局在があることを示している。
【０１００】
機能的意味
二重伝導路電気生理学は、ヒトＡＶＪの病理学的な特徴の一つであり、房室結節回帰性頻拍（ＡＶＮＲＴ）などの回帰性不整脈の基質を提供する（モーら（Ｍｏｅ  ｅｔ  ａｌ．）、１９５６年）。一般的に、ＡＶＪはＡＶＮＲＴを引き起こす遅い伝導路と速い伝導路の２つの機能的経路を有すると説明される。解剖学的には、遅い伝導路の基質は、ＡＶＮＲＴを治療するために切除される冠状静脈洞および三尖弁間の心筋の峡部が関与し（ニコルスキら（Ｎｉｋｏｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．）、２００３年）、移行細胞が速い導電路として作用する。右側拡張部が遅い伝導路の基質であるという証拠があるが（イノウエら（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．）１９９９年；  メドカーら（Ｍｅｄｋｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９８年）、右側拡張部、この拡張部と重複する下移行細胞、またはこの両方の組合せが本当に遅い伝導路の基質なのかどうかが議論されている（マクガイア（ＭｃＧｕｉｒｅ）、２０００年）。もし右側拡張部が本当に遅い伝導路の基質であるなら、Ｃｘ４３の発現は速い伝導を意味するはずであるので、右側拡張部が比較的多量のＣｘ４３を含むことを我々の結果が示していることは、興味深いことである。しかし、伝導速度はＣｘ４３の発現のみに依存するわけではなく、Ｃｘ４０、Ｃｘ４５、おそらくＣｘ３０．２／３１．９（クロイツベルグら（Ｋｒｅｕｚｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．）、２００６年）、およびイオンチャンネルの発現も、もちろん結節拡張部の伝導速度に影響を与えるはずである。実際には、遅い伝導路の「遅い」性質に関与するのは下結節拡張部内の伝導時間ではないかもしれず、また、遅い伝導路に関与するのは下移行細胞および下結節拡張部の間の接点である可能性もある（ハッカーら（Ｈｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、２００７年ｂ；
（ニコルスキら（Ｎｉｋｏｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．）、２００３年）。しかし、ＡＶＮＲＴにおける結節拡張部の役割を完全に理解するためには、結節拡張部の機能的特性とＣｘ４０、Ｃｘ４５、Ｃｘ３０．２／３１．９の分布およびイオンチャンネルの分布を関連させる今後の研究が必要であろう。
【０１０１】
我々は、速い経路の基質と目される、ＣＮ周辺の移行細胞層を見いだした。この細胞層は、この細胞層内の速い伝導を機能的に支える心房中隔と同様のレベルでＣｘ４３を発現する。構造的にも機能的にも、これらの細胞は、活動電位特性および細胞形態の観点では、心房心筋およびＡＶＮの間の介在物である（アンダーソンおよびホー（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｈｏ）、２００２年；  （ビレット（Ｂｉｌｌｅｔｔｅ）、１９８７年）。一方、Ｃｘ４３の発現に関しては、移行細胞とＣＮの接点でＣｘ４３の滑らかな移行ではなく、移行細胞からＣＮへＣｘ４３の発現に劇的な減少があることを図３Ｃが示しており、これがＣＮへの活動電位の伝播を遅くする可能性がある（ショーおよびルーディー（Ｓｈａｗ  ａｎｄ  Ｒｕｄｙ）、１９９７年）。
【０１０２】
左拡張部／緻密結節の役割はあまり明らかでない。Ｃｘ４３がほとんど発現しないことから、この構造はおそらくゆっくりと伝導し、１つ以上の遅い経路が観察されるＡＶＮＲＴの場合、または結節内回帰において、ゆっくり伝導する経路を提供する可能性がある。この仮説と一致するのは、複数経路に関連するＡＶＮＲＴが遅い１経路に関連するＡＶＮＲＴよりも一般的でないという事実と、ヒトでは左側拡張部で発現に一貫性が無いことの間の相関である（イノウエおよびベッカー（Ｉｎｏｕｅ  ａｎｄ  Ｂｅｃｋｅｒ）、１９９８年）。左側拡張部は、ＩＡＳの左心房側と結節組織の間のゆっくり伝導する経路も提供する可能性もある（カトリッシスおよびベッカー（Ｋａｔｒｉｔｓｉｓ  ａｎｄ  Ｂｅｃｋｅｒ）、２００７年）。最後に、下移行細胞はいくつかの場合には左拡張部のすぐ近傍にあり（図４Ａ−Ｃ）、従って、リエントリー回路は２つの結節拡張部と下移行細胞の間におそらく維持されるだろう。
【０１０３】
右側ＩＮＥからＬＮＢおよびヒス束までのＣｘ４３の連続的な発現は、これらの構造が１つの連続的構造を形成し、また、左側拡張部とは異なって右側拡張部がヒス束に結合していることを意味する。ウサギでは、当研究室および他の研究室の機能的研究は、速い経路から広がる興奮とは異なり、下結節拡張部から広がる興奮がヒス束を刺激すること（ハ
ッカーら（Ｈｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、２００７年ｂ；  チャンら（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、２００１年）、また特に、ＡＶ遅延が下結節拡張部の付近でペーシングすることにより回避できることを示した（ハッカーら（Ｈｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、２００７年ｂ）。本研究の我々のデータは、右側拡張部での興奮がＬＮＢを介して緻密房室結節をバイパスするヒス束の明確なＣｘ４３陽性領域に広がるヒトにおいても、同じことが当てはまる可能性があることを示唆している。
【０１０４】
右側拡張部およびヒス束間の独特のカップリングの可能性は、緻密房室結節の関与なしにヒス束の興奮を達成するためにこの結合を利用する可能性を開く。近年のペーシングの戦略は、同期的な心室収縮を得るため、ヒス束直接ペーシングなど別のペーシング部位を探索している（ラスケら（Ｌａｓｋｅ  ｅｔ  ａｌ．）、２００６年；  デシュムクおよびラマニシャイン（Ｄｅｓｈｍｕｋｈ  ａｎｄ  Ｒｏｍａｎｙｓｈｙｎ）、２００４年；
ザノンら（Ｚａｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、２００６年）。ヒス束自体ではなく右側拡張部をペーシングする試みは、ペーシング用リードを埋め込むことができる右心房の底面の領域を広げるであろうし、また、右側拡張部はヒス束のような繊維状組織に包まれていないことから、おそらくペーシング閾値を更に下げる。
【０１０５】
我々のヒトＡＶＪの三次元再構成画像は、伝導系を取り囲む組織は血管が十分に発達していることを示した。ＡＶＪを取り囲む静脈は大きく、我々が再構成した４つのＡＶＪでは、直径が０．２９〜０．５６ｍｍの範囲だった。冠状静脈洞はＡＶＪの非常に近くに位置することから、図８の三次元再構成画像に示された静脈は、冠状静脈洞と開口部のすぐ近くで結合するか、または右心房に直接流れ込むかのいずれかである。一部の患者ではＣＳ開口部へのアクセスが困難である可能性があるものの（ヒルら（Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）、２００６年）、（例えば、心房性細動の際にＡＮＶを調節するための）アブレーション、ペーシング、または局所的な薬剤送達のために、心筋に動作中のリード線をねじ込むことによって引き起こされる組織の損傷なしにこれらの血管をカテーテルで通過させることがまもなく可能になるかもしれない（シグら（Ｓｉｇｇ  ｅｔ  ａｌ．）、２００６年）。
【０１０６】
結論
我々の研究は、ヒトＡＶＪにおける初のＣｘ４３マッピングを提示する。我々はヒトＡＶＪにおける伝導系がＣｘ４３密度に関連して２つの領域、すなわち、いずれもＣｘ４３が互いに同程度発現する右側拡張部、ＬＮＢ、およびヒス束と、一方で、非常にわずかなＣｘ４３を有する左側拡張部およびＣＮ、を呈することを見いだした。これら２つの別個の領域は、不均一な伝導性とＡＶＪから生じる上室性不整脈の一因となる、特有の伝導特性を有する可能性がある。
【０１０７】
限定
我々の研究は、単一のコネキシン・アイソフォーム、Ｃｘ４３に限定される。しかし、哺乳類のＡＶＪでは、Ｃｘ４５、Ｃｘ４０、およびＣｘ３１．９・３０．２など、他のアイソフォームが発現することが知られている。残念ながら、我々はヒトＡＶＪで定量可能なシグナルを提供するような、これらのコネキシンに対する抗体を得ることができなかった。また、我々の研究は、免疫組織化学手法に基づいており、従って、Ｃｘ４３の検出はこの手法の分解能により制限されている。Ｃｘ４３から成るギャップジャンクションが免疫蛍光による検出を免れるほど少ないという可能性ももちろんある。
【０１０８】
我々の研究は、過去に電気生理学研究室で解析が行われていないヒト心臓で行われた。
【０１０９】
【表１】
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【０１１０】
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【０１１１】
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【０１１２】
図および表の説明
表１：本研究に用いた各試料の患者特性
図１：ヒト房室接合部の解剖および三次元再構成。Ａ：解剖学的ランドマークを付した、切り取られた房室接合部標本。Ｂ：Ａにおいて四角で囲んだ領域の高解像度像。マッソン三色染色で染色された切片の位置に印が付いている。また、トダーロ腱（ＴＴ）、冠状静脈洞（ＣＳ）および三尖弁の中隔尖（ＴＶ）により境界される、コッホ三角の輪郭も描かれている。Ｃ：三次元再構築用に別の組織領域の輪郭線を描いた、Ｂにおいて赤線で印を付けた切片のマッソン三色染色像。Ｄ：全切片を三次元に配置した、伝導系の輪郭線。赤い輪郭線は、Ｃにおいて輪郭線が描かれた房室結節に相当する。Ｅ：ロフト化して三次
元メッシュを作成した伝導系の輪郭線。Ｆ：レンダリングを行って三次元ボリュームに近似させた、Ｅにおける三次元メッシュ。ＡＶＮ：房室結節；ＣＦＢ：中心繊維体；ＦＯ：卵円窩。ＩＡＳ：心房中隔；ＬＥ：左側拡張部；ＲＥ：右側拡張部；ＶＳ：心室中隔；Ｓ，Ｉ，Ｐ，Ａ：上、下、後ろ、前方向。
【０１１３】
図２：結節拡張部におけるＣｘ４３の密度。Ａ：結節拡張部のマッソン三色染色像。結節拡張部周囲の輪郭線が描かれた領域は、図ＢおよびＣのパネルに示した免疫組織化学像に相当する。Ｂ：α−アクチニンを赤、ビメンチンを青、およびＣｘ４３を緑で示した、結節拡張部の免疫組織化学像。Ｃ：結節拡張部におけるＣｘ４３の発現。Ｄ−Ｆ：左側拡張部（Ｄ）、右側拡張部、および下移行細胞（ＥおよびＦ）におけるＣｘ４３、ビメンチン、およびα−アクチニンの発現の高倍率像。Ｇ：パネルＡ−Ｃで示した切片平面で分割展開した、ＡＶＪの三次元再構築像。ＣＦＢ：中心繊維体；ＩＡＳ：心房中隔；ＬＥ：左側拡張部；ＲＥ：右側拡張部；ＶＳ：心室中隔；Ｐ，Ａ：前後方向。
【０１１４】
図３：房室結節におけるＣｘ４３の密度。Ａ：ＡＶＮのマッソン三色染色像。ＡＶＮ周囲の輪郭線が描かれた領域は、パネルＢおよびＣで示した免疫組織化学像に相当する。Ｂ：α−アクチニンを赤、ビメンチンを青、およびＣｘ４３を緑で示した、ＡＶＮの免疫組織化学像。Ｃ：ＡＶＮにおけるＣｘ４３の発現。Ｄ−Ｇ：ＡＶＮ部位の様々な領域におけるＣｘ４３、ビメンチン、およびα−アクチニンの発現の高倍率像。Ｈ：パネルＡ−Ｃで示した切片平面で分割展開した、ＡＶＪの三次元再構築像。ＣＦＢ：中心繊維体；ＩＡＳ：心房中隔；ＬＮＢ：下結節束；ＶＳ：心室中隔；Ｐ，Ａ：前後方向。
【０１１５】
図４：ヒス束におけるＣｘ４３の密度。Ａ：ヒス束のマッソン三色染色像。ヒス束周囲の輪郭線が描かれた領域は、パネルＢおよびＣで示した免疫組織化学像に相当する。Ｂ：α−アクチニンを赤、ビメンチンを青、およびＣｘ４３を緑で示した、ヒス束の免疫組織化学像。Ｃ：ヒス束におけるＣｘ４３の発現。Ｄ：ヒス束の様々な領域におけるＣｘ４３、ビメンチン、およびα−アクチニンの発現の高倍率像。Ｅ：パネルＡ−Ｃで示した切片平面で分割展開した、ＡＶＪの三次元再構築像。ＣＦＢ：中心繊維体；ＩＡＳ：心房中隔；ＶＳ：心室中隔；Ｐ，Ａ：前後方向。
【０１１６】
図５：Ｃｘ４３の細胞発現。Ａ：下結節束（ＬＮＢ）における、Ｃｘ４３の（緑）、α−アクチニン（赤）、およびビメンチン（青）染色の最大投影像。Ｂ：Ｃｘ４３のシグナル強度が高いボクセルではα−アクチニンのシグナル強度も高いことを示す、Ｃｘ４３およびα−アクチニンの共局在。Ｃ：Ｃｘ４３のシグナル強度が高いボクセルではビメンチンのシグナル強度がないことを示す、Ｃｘ４３およびビメンチンの共局在。Ｄ−Ｅ：緻密結節（ＣＮ）についての、Ａ−Ｃと同様のデータ。詳細は本文を参照。
【０１１７】
図６：ＡＶＪの移行細胞におけるＣｘ４３密度。心臓内（ｅｎｄｏ）、左側、および下移行細胞におけるＣｘ４３密度。全ての密度は心房中隔（ＩＡＳ）のＣｘ４３の密度に対して標準化されている。ＤＣＭ：拡張型心筋症。
【０１１８】
図７：ＡＶＪの伝導系におけるＣｘ４３密度。全ての密度は心房中隔（ＩＡＳ）のＣｘ４３の密度に対して標準化されている。ＣＮ：緻密房室結節；ＤＣＭ：拡張型心筋症；ＬＮＢ：下結節束；ＬＥ：左側拡張部；ＲＥ：右側拡張部。
【０１１９】
図８：ＡＶＪ伝導系の三次元再構築。Ａ−Ｃ：正常な各心臓の伝導系の心臓内図。各パネルの左側は、伝導系を取り囲む結合組織および血管、ならびに各標本のコッホ三角内における伝導系の位置を示す。各パネルの右側は、伝導系およびＣｘ４３を定量した３平面を示す。Ｄ：拡張型心筋症の心臓の伝導系再構成。パネル左側は、Ａ−Ｃに示したものと同じ心臓内図を示す。中央のパネルは、左側拡張部をより明確に示すために、９０°回転
させた伝導系を示す。ＣＦＢ：中心繊維体；ＩＡＳ：心房中隔；ＴＴ：トダーロ腱；ＶＳ：心室中隔；Ａ−Ｐ、Ｓ−Ｉ、Ｄ−Ｖ：前後、上下、および背腹方向。
【０１２０】
【表２】
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【０１２１】
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【０１２２】
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【０１２３】
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【０１２４】
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【０１２５】
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【０１２６】
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【０１２７】
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【０１２８】
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【０１２９】
Ｃｘ４３の定量
コッホ三角の３つの異なった場所、すなわちヒス束、緻密房室結節領域、下結節拡張部から組織切片を得た。心房中隔（ＩＡＳ）および伝導系の組織のモザイク画像を作成した。Ｃｘ４３染色の典型的な画像をデータ補足図１Ａに示す。興味ある各領域について、３
段階のアルゴリズムでＣｘ４３染色に一致する各画像の面積を測定した。まず、画像の閾値処理を行った（データ補足図１Ｂ）。画像中の総ピクセル数のうちおよそ０．２％未満のピクセル数が収まる閾値を、画像シグナル強度値のヒストグラムから決定した。この閾値は、Ｃｘ４３染色の領域を再現良く選択するよう、経験的に決定した。モザイク画像の閾値処理を行った時点で、閾値以上の領域内の穴を塗りつぶし、３μｍ２未満で閾値以上の任意の領域をノイズとして切り捨てた（図１Ｄ）。８ビット画像でシグナル強度値１０の画像を閾値処理し、次いで小さい孔を塗りつぶして、各画像中の全組織の量を決定した（図１Ｃ）。コネキシン密度は、画像ごとにＣｘ４３面積を組織面積で割って算出した。伝導系のコネキシン密度を、心房中隔での密度と比較した。同一標本由来の全画像は同一設定で撮像し、同一標本由来の心房画像および伝導系画像には同一閾値を用いた。
【０１３０】
図および動画の説明
データ補足図１：Ｃｘ４３の定量。Ａ：Ｃｘ４３染色の写真。Ｂ：閾値処理を行ってＣｘ４３染色を選択した画像。Ｃ：閾値処理を行って、画像中の任意組織を選択した同一画像。Ｄ：閾値処理を行い、閾値以上の小面積を除去し、白いピクセルで完全に囲まれた黒い穴を塗りつぶしたＢの画像。コネキシン密度は、
密度＝［（Ｃｘ４３面積）／（組織面積）＊１００］
として算出した。
【０１３１】
データ補足動画１：右心臓内図から始まる、正常な心臓の三次元再構築像。心室中隔は赤、結合組織は青、心房組織はピンク、脂肪を白で示す。伝導系が見えるように、動画が進むにつれて伝導系を取り囲む組織の構成要素が取り除かれる。ヒス束は緑、緻密房室結節および左側拡張部はシアン、ならびに下結節束及び右側拡張部は黄色で示す。伝達系に密接に関わる血管は紫で示し、ＡＶＮ動脈はえび茶色で示す。
【０１３２】
データ補足動画２：右心臓内図から始まる、ＤＣＭの心臓の三次元再構築像。心室中隔は赤、結合組織は青、心房組織はピンク、脂肪を白で示す。伝導系が見えるように、動画が進むにつれて伝導系を取り囲む組織の構成要素が取り除かれる。ヒス束は緑、緻密房室結節および左側拡張部はシアン、ならびに下結節束及び右側拡張部は黄色で示す。右側拡張部と密接に関連する下移行細胞は、オレンジ色である。伝達系に密接に関わる血管は紫で示し、ＡＶＮ動脈はえび茶色で示す。この心臓の左側拡張部は、心房中隔の左側に接近していることに注意。
【０１３３】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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