(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
電子顕微鏡で観察するための針状試料を作製する方法であって、目的試料を載置用試料上に載置する工程と、
前記目的試料を前記載置用試料上に固定する工程と、
前記目的試料と前記載置用試料に集束イオンビームを照射して、前記目的試料と前記載置用試料からなる薄片試料を作製する工程と、
前記薄片試料を溶液に入れて、前記載置用試料を溶解せしめて目的試料のみにする工程と、
残った目的試料を溶液から取り出す工程とを含んだことを特徴とする電子顕微鏡用針状試料の作製方法。
【請求項２】
前記薄片試料を試料保持材の上に載置し、該試料保持材を前記溶液中に入れるようにしたことを特徴とする請求項１記載の電子顕微鏡用針状試料の作製方法。
【請求項３】
前記試料保持材は電子顕微鏡の試料ホルダに装着されるグリッドであることを特徴とする請求項２記載の電子顕微鏡用針状試料の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は電子顕微鏡用針状試料の作製方法に関し、更に詳しくは汎用の透過型電子顕微鏡（Transmission electron microscopy：ＴＥＭ）や、走査透過型電子顕微鏡（Scanning  transmission electron microscopy：ＳＴＥＭ）を用いてトモグラフィーを行なう際に使用する針状試料を簡単に作製することができるようにした電子顕微鏡用針状試料の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
産業上及び学術分野で一般的に知られているＴＥＭやＳＴＥＭトモグラフィーにおいて、試料の３次元観察及び３次元解析を行なうことがある。物体にＸ線や電子線等を照射して、物体の内部構造を立体的に知る方法として、ＣＴ（Computerized Tomography）法が知られている。Ｘ線を用いるＸ線ＣＴ法は医用の分野で広く使用されているが、ＴＥＭによる電子線ＣＴ法（ＴＥＭトモグラフィーや電子線トモグラフィー）は、試料の極微小領域の３次元構造を観察する手法として、材料、医学、生物分野等で使用されるようになってきている。
【０００３】
３次元像を構築するためには、物体断面と投影像との関係を求める必要がある。そのため、ＴＥＭを用いる電子線ＣＴ法では、試料を傾斜させて様々な方位の透過電子顕微鏡像（以下ＴＥＭ像という）、即ち連続傾斜像を取得する方法がある。
【０００４】
図５は透過型電子顕微鏡の構成例を示す図である。図５は電子線ＣＴを行なうＴＥＭの構成例を示している。図において、１００はＴＥＭの電子光学系、１は電子線源、２は電子線を集束して試料への電子線照射量を調節するための集束レンズ群、３は試料の観察位置の移動と傾斜を行なうゴニオメータステージ、４は試料Ｓを保持する試料保持台（試料ホルダ）、５は試料を透過した電子線を拡大するための対物レンズ、６は対物レンズの取り込み角を制限するための絞り、７は対物レンズと併用又は独立して使用する対物ミニレンズ、８は対物ミニレンズ７の取り込み角を制限するための絞りである。
【０００５】
９は対物レンズ５又は対物ミニレンズ７の像面を検出面に拡大結像する中間・投影光学系、１０はＴＥＭ像観察用のＣＣＤカメラ、１１は電子光学系１００において加速電圧設定及び各レンズ励磁及びオン／オフ及び各絞り孔径の選択を制御可能な電子光学系制御部、１２はＣＣＤカメラ１０の出力を画像に変換する画像処理装置、１３はＴＥＭ全体の制御と演算を行なう制御演算装置である。該制御演算装置１３としては、例えばパーソナルコンピュータが用いられる。
【０００６】
１４は液晶モニタ等の表示装置、１５はマウス、キーボード等の入力装置である。なお、電子光学系１００内部の電子線通路は、図示しない真空排気装置により高真空が保持されるようになっている。
【０００７】
このように構成されたＴＥＭにおいて、制御演算装置１３からゴニオメータステージ（以下単にゴニオメータと略す）３に制御信号を送り、試料Ｓを段階的に所定角ずつ傾斜させながら、透過された電子線像を得て、これら得られた複数枚の透過電子線画像を画像処理装置１２で画像に変換し、変換された画像を制御演算装置１３により複数枚の画像を元に、３次元画像を得るようになっている。得られた３次元画像は表示装置１４に表示される。
【０００８】
図６はトモグラフィの作成原理図である。この手法は、先ずＴＥＭやＳＴＥＭを用いて試料Ｓをさまざまな角度で傾斜させてＴＥＭ像若しくはＳＴＥＭ像２０を取得する。例えば傾斜角度の設定範囲が±６０°で１°ずつ傾斜させて同時にＴＥＭ像若しくはＳＴＥＭ像を取得すれば、合計取得傾斜画像の枚数は１２１枚となる。取得した傾斜像シリーズに対して対してＣＴ法を適用して再構成断面像２１を得る。ここで、ＣＴ法としては既存の技術を用いる。そして、得られた再構成断面像のシリーズを重ね合わせることで、３次元像２２を得る。
【０００９】
従来のこの種の装置としては、試料を一定の角度毎に傾斜させて得られる一連の透過像からリファレンス画像との２次元相関処理によって同一視野を切り出して試料の位置ずれを補正する装置が知られている（例えば特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００５−１９２１８号公報（段落００２３〜００２７、段落００４４〜００５０、図１〜図３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
前述したように、３次元画像を得るためには、全方位の透過像が必要である。しかしながら、試料を傾斜させるためのゴニオメータと、試料の光学系との物理的配置から傾斜角度が制限され、全方位の透過像の取得が困難である。このようにして傾斜角度が制限された傾斜像シリーズからＣＴ法を適用して得た再構成断面像２１は、厚み方向に像が伸び、試料厚み方向の空間分解能が低下する原因となる。
【００１２】
この問題を解決するためには、傾斜角度の制限を解除する必要があるが、ＴＥＭやＳＴＥＭを用いた場合、２つの大きな原因により傾斜角度の制限が起きる。
１）試料Ｓを観察・傾斜するための試料ホルダ４と電磁レンズのポールピースが物理的に干渉するために、全方位傾斜することができない。
２）電子線が試料Ｓを透過する厚みが高傾斜角度になるにつれて大きくなるために、電子ビームの透過率が低下し、像自体が得られなくなってしまう。
【００１３】
後者の問題に対して、近年、集束イオンビーム装置（ＦＩＢ）を用いて試料形状を針状にすることで解決してきた。しかしながら、この針状試料の作成は非常に高度な技術と多くの時間を要するという問題がある。
【００１４】
本発明はこのような課題に鑑みてなされたものであって、ＴＥＭやＳＴＥＭを用いてトモグラフィを行なう際に使用する針状試料を簡単に作製することができる電子顕微鏡用針状試料の作製方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記の課題を解決するために、本発明は以下に示すような構成をとっている。
【００１６】
（１）請求項１記載の発明は、電子顕微鏡で観察するための針状試料を作製する方法であって、目的試料を載置用試料上に載置する工程と、前記目的試料を前記載置用試料上に固定する工程と、前記目的試料と前記載置用試料に集束イオンビームを照射して、前記目的試料と前記載置用試料からなる薄片試料を作製する工程と、前記薄片試料を溶液に入れて、前記載置用試料を溶解せしめて目的試料のみにする工程と、残った目的試料を溶液から取り出す工程とを含んだことを特徴とする。
【００１７】
（２）請求項２記載の発明は、前記薄片試料を試料保持材の上に載置し、該試料保持材を前記溶液中に入れるようにしたことを特徴とする。
【００１８】
（３）請求項３記載の発明は、前記試料保持材は電子顕微鏡の試料ホルダに装着されるグリッドであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は以下のような効果を奏する。
【００２０】
（１）請求項１記載の発明によれば、針状試料を簡単に作製することができる。
【００２１】
（２）請求項２記載の発明によれば、載置用試料を溶かして目的試料のみを取り出すことができる。
【００２２】
（３）請求項３記載の発明によれば、試料保持材としてグリッドを用いることにより、目的試料を確実に保持することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】針状試料の作製手順を示す図である。
【図２】薄片試料から高分子試料Ｂ除去の説明図である。
【図３】試料の透過率特性を示す図である。
【図４】薄片試料への電子ビームの透過状態を示す図である。
【図５】透過型電子顕微鏡の構成例を示す図である。
【図６】トモグラフィーの作成原理図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明の実施例について、図面を参照して詳細に説明する。図１は針状試料の作製手順を示す図である。図では（ａ）〜（ｌ）の手順よりなっている。以下、各手順について詳細に説明する。なお、図中において灰色の領域は、イオンビームにより試料Ｓを削る（加工する）領域である。図において、（ａ）〜（ｄ）はＦＩＢ装置内、（ｅ），（ｆ）は大気中、（ｇ）〜（ｌ）はＦＩＢ装置内である。
（ａ）試料をＦＩＢの試料載置部に載置する。ここでは、試料Ｓとして試料Ａを用いる。該試料Ａとしては、種々の試料、例えば生体試料等を用いることができる。先ず、試料ＡのＡ１部分をイオンビームで削る。
（ｂ）図に示すように二つの穴によって囲まれた部分Ａ５が形成されたので、Ａ５の底部分Ａ２をイオンビームで削る。
（ｃ）試料部分Ａ５の側面Ａ３をイオンビームで削り、薄くする。
（ｄ）試料部分Ａ５が試料Ａとつながっている部分Ａ４をイオンビームで削る。
（ｅ）試料Ａから取り外せるようになった薄片試料Ａ５を、ピックアップシステムを用いてガラスプローブ３０で接着して取り出す。この時、ガラスプローブ３０は静電気により薄片試料Ａ５を接着する。これにより薄片試料Ａ５を容易に取り出すことができる。
（ｆ）バルクの高分子試料（載置用試料）Ｂの上にピックアップされた薄片試料（目的試料）Ａ５を載せる。ここで、試料Ｂとしては、高分子試料に限るものではなく、その他の溶液に溶ける性質の材料であればよい（詳細後述）。
（ｇ）高分子試料Ｂの上に載っている薄片試料Ａ５の両端をカーボン蒸着３１で固定する。カーボン蒸着は、薄片試料Ａ５を高分子試料Ｂに固定する方法の一つであって、必ずしもカーボン蒸着である必要はない。その他の固定方法を用いることができる。
（ｈ）Ｂ１部分をイオンビームで削る。
（ｉ）図に示すように、二つの穴によって囲まれた部分Ｂ５が形成されたので、Ｂ５の底部分Ｂ２をイオンビームで削る。
（ｊ）試料部分Ｂ５の側面Ｂ３をイオンビームで削り、薄くする。
（ｋ）試料部分Ｂ５が試料Ｂとつながっている部分Ｂ４をイオンビームで削る。
（ｌ）ピックアップシステムのガラスプローブ３０を用いて試料部分Ｂ５を取り出す。
【００２５】
以上の手順により、ＴＥＭにより観察できる厚さの薄片試料が形成される。この時、取り出される薄片試料Ｂ５は両端にカーボン蒸着３１が付いた状態で、凸型の薄片試料となっている。この状態では、試料Ｂ５に高分子試料が付いているので、高分子試料を除去する必要がある。
【００２６】
図２は薄片試料Ｂ５から高分子試料Ｂの除去の説明図である。３４は電子顕微鏡の試料ホルダに装着されるグリッドで、この上に高分子試料Ｂ（３２）を付けた試料Ｂ５が載っている。グリッド３４を用いることで、薄片試料を安定に保持することができる。グリッド３４の上に載せているのは高分子試料Ｂと目的試料Ａ５’である。グリッド３４に載せた試料Ｂ５を溶液３５中に浸す。溶液３５は瓶等の容器の中に入っている。この溶液３５は、高分子試料Ｂのみ溶かすような溶液である。該溶液としては、例えばアセトンが用いられる。その後、溶液からグリッド３４を引き上げると目的試料Ａ５’のみが残る。目的試料Ａ５’の両端にはカーボン蒸着３１が付着したままである。このようにして得られた試料を針状試料という。以上の方法で、非常に簡単に針状試料の作製が可能となる。
【００２７】
針状試料Ａ５’はトモグラフィーには非常に重宝されている。その理由を以下に示す。図３は針状試料と通常試料の透過率特性を示す図である。横軸は傾斜角度、縦軸は透過率である。図では、試料ｆ１〜ｆ３の３種類の試料の特性を示している。図中の太い実線が針状試料の傾斜角度に対する透過率、細い実線が通常試料の傾斜角度に対する透過率である。ここで、透過率は試料を透過する割合を示し、１．０の場合は全部のビームが透過することを示し、０の場合は全く透過しないことを示している。但し、針状試料は矩形と仮定している。図４は薄片試料への電子ビームの透過状態を示す図である。図のθが試料傾斜角である。図の場合は試料傾斜角が４５度の場合を示している。針状試料の場合は、試料傾斜角が４５度の時が一番透過率が悪い（後述）。この針状試料の傾斜角θは、ゴニオメータ３により設定され、所定角ずつ変化させながら、透過像を得るようになっている。
【００２８】
通常の試料の場合、傾斜角度が増加するに伴い透過率は低下していく。特に、透過率が０．６の傾斜角度０度の通常試料であっても、傾斜角度８０度の場合には透過率はほぼ０となる。この場合には、物理的に傾斜が可能であっても、透過できないので、像を得ることができない。一方、針状試料の場合には、傾斜角度４５度の場合の時に透過率が一番低くなり、それ以上の傾斜角度になると透過率が上昇することが分かる。針状試料として四角柱材を用いた場合、傾斜角４５度の時が試料厚さが最も厚くなるからである。また、一番低い透過率と一番高い透過率の差も０．１度程度であり、全ての角度で透過率の高い像を得ることが可能となる。このようにして作製された薄片試料を図５に示す透過型電子顕微鏡で３次元像として観察することができる。
【００２９】
即ち、上述の方法で作製した針状試料Ａ５’を試料ホルダ４に設定した後、ゴニオメータ３で所定角度ずつ傾斜を変えて透過像２０を得、得られた透過像２０から再構成断面像２１を得る。得られた再構成断面像２１を重ね合わせて３次元像２２を得ることができる。
【００３０】
なお、針状試料の形状として四角柱状のものを用いた場合を例にとったが、本発明はこれに限るものではなく、例えば三角柱状や五角柱状のものを用いてもよい。
【００３１】
以上、詳細に説明したように、本発明によれば、ＴＥＭやＳＴＥＭを用いてトモグラフィーを行なう際に使用する針状試料を簡単に作製することができ、実用上の効果が大きい。
【符号の説明】
【００３２】
３０    ガラスプローブ
３１    カーボン蒸着
Ａ５    薄片試料
Ａ５’  薄片試料
Ｂ      高分子試料
【図１】
0005492115.tif 000002
【図２】
0005492115.tif 000003
【図３】
0005492115.tif 000004
【図４】
0005492115.tif 000005
【図５】
0005492115.tif 000006
【図６】
0005492115.tif 000007