(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖類、パパイヤおよび海藻を、乳酸菌と酵母とで共棲発酵してなる発酵エキスを有効成分とする、非アルコール性脂肪性肝疾患および／または非アルコール性脂肪肝炎の治療薬。
【請求項２】
前記多糖類が、米、米糠および／または玄米であることを特徴とする、請求項１記載の治療薬。
【請求項３】
前記乳酸菌が、ラクトバシラス  カゼイ、ラクトバシラス  プランタルム、またはラクトバシラス  ラクティスであり、および前記酵母が、サッカロマイセス  セレビシエである、請求項１または２記載の治療薬。
【請求項４】
前記発酵エキスがメラノイジンを含有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の、非アルコール性脂肪性肝疾患および／または非アルコール性脂肪肝炎の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患および／または非アルコール性脂肪肝炎の治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
食生活やライフスタイルの変化により生活習慣病が増加し、成人の２０％に脂肪肝が観察されるようになった。脂肪肝の主な原因は、大量飲酒と過栄養である。飲酒を経ずに肝疾患症状を呈する非アルコール性脂肪性肝疾患（Ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ、以下ＮＡＦＬＤと称する。）は、良性の病気で進行しない軽視されていたが、肝炎から肝硬変ついには肝臓がんに移行する例が増加し、見逃せない疾患となっている。なお、ＮＡＦＬＤが進行し肝実質への脂肪沈着とともに炎症性細胞の浸潤や肝実質の障害、線維化を介して肝硬変に至る疾患は、非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ  以下ＮＡＳＨと称する。）と称される。脂肪滴の沈着した肝臓に炎症性細胞浸潤、マロリー小体、肝細胞の風船様腫大などの肝細胞変性、肝線維化所見が加わった病態である。高度肥満者の多い米国において急増しているが、日本でも生活スタイルの欧米化に伴いＮＡＳＨ患者が増加すると予想されている。
【０００３】
ＮＡＳＨは、その背景にインスリン抵抗性を有する場合が多く、インスリン抵抗性改善薬であるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒγ  以下、ＰＰＡＲγと称する。）アゴニストであるピオグリタゾンが脂肪肝炎の病態を改善するとの報告がある（非特許文献１）。また、インスリン抵抗性改善に関与するＡＭＰキナーゼのアクチベーターの投与によって脂肪肝炎の病態が改善されたとの報告もある（非特許文献２）。また、肥満・インスリン抵抗性に関与するアディポサイトカインのシグナル欠損が、ストレスタンパク質メタロチオネインの発現誘導の抑制を介して脂肪肝炎発症への易感受性を惹起するとの報告もある（非特許文献３）。更に、アディポサイトカインの一種であるＴＮＦαがＴＩＭＰ−１の発現増強を介してＮＡＳＨ病態における肝線維化を促進するとの報告もある（非特許文献４）。インスリン抵抗性の制御とそれに関わるアディポサイトカインが、メタボリックシンドロームをバックグラウンドにするＮＡＳＨの病態に深く関与することを意味する。
【０００４】
ＮＡＳＨは進行性の疾患であるため、その治療法の確立は急務である。ＮＡＳＨを含む肝疾患予防又は治療薬として、トラニラスト（Ｎ−（３，４−ジメトキシシンナモイル）アントラニル酸）又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含む肝疾患予防又は治療薬がある（特許文献１）。トラニラストは抗アレルギー薬であるが、メチオニン・コリン欠乏食を与えた肥満糖尿病ラットにトラニラストを投与してその効果を検討したところ、肝線維化、肝脂肪化の抑制、肝炎症の改善に効果があったという。
【０００５】
また、ユーカリ属植物、サルスベリ属植物およびバンジロウ属植物からなる群より選ばれる少なくとも１種から抽出した抽出物を有効成分とする非アルコール性脂肪性肝疾患の予防および／または治療に有効な経口摂取用組成物もある（特許文献２）。食経験豊富で安全性の高い天然物から抽出した抽出物を有効成分とするので、高カロリー食に起因するＮＡＦＬＤ、特にＮＡＳＨに有効で、安全性が高く、しかもカフェインを含まず、経口摂取しやすい、という効果がある。
【０００６】
また、クルクミン類若しくはテトラヒドロクルクミン類又はクルクミン類含有物若しくはテトラヒドロクルクミン類含有物を有効成分として含むことを特徴とする非アルコール性脂肪肝炎予防・治療用組成物もある（特許文献３）。クルクミンには、抗酸化作用、胆汁分泌促進作用（利胆作用）、内臓（肝臓、膵臓）機能増強作用、発癌抑制作用、脂質代謝改善作用などが知られているが、クルクミン類やこれを微生物処理してなるテトラヒドロクルクミン類は、ＮＡＳＨ治癒効果があるといい、実施例では、ＮＡＳＨ患者に投与し、ＧＰＴ値の低下を観察している。
【０００７】
ＮＡＦＬＤやＮＡＳＨに関し、近年臨床研究・基礎研究が精力的に行われ、その病態の解明とともに治療法も模索されているが、未だ有効な治療法の開発には至っておらず、更なる開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００９−１２０６０７号公報
【特許文献２】特開２０１１−２３１０７８号公報
【特許文献３】特開２００７−３２０８６４号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ  Ｐｒｅｖｅｎｔｓ  Ａｌｃｏｈｏｌ−Iｎｄｕｃｅｄ  Ｆａｔｔｙ  Ｌｉｖｅｒ  ｉｎ  Ｒａｔｓ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃ−Ｍｅｔ，  Ｋ  Ｔｏｍｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１２６，ｐ８７３−８８５，２００４
【非特許文献２】ＡＩＣＡＲ，ａｎ  ＡＭＰＫ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ，Ｈａｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  Ａｌｃｏｈｏｌ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｆａｔｔｙ  Ｌｉｖｅｒ  ｉｎ  Ｒａｔｓ，Ｋ  Ｔｏｍｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．, Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．２９，Ｎｏ．１２，ｐｐ２４０ｓ−２４５ｓ，２００５
【非特許文献３】Ｌｅｐｔｉｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｒａｔｓ  ｔｏ  ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ，  Ｋ  Ｔｏｍｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，ｖｏｌ.２８７  ｐｐＧ１０７８−Ｇ１０８５，２００４
【非特許文献４】Ｔｕｍｏｕｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  α  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｋｕｐｆｆｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｐｌａｙｓ  ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｏｆ  ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ，Ｋ  Ｔｏｍｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｕｔ，ｖｏｌ．５５，ｐｐ４１５−４２４，２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ＮＡＦＬＤやＮＡＳＨなどの肝疾患は慢性化しやすく、このため治癒効果と共に副作用の少ない安全性に優れる治療薬の開発が望まれる。
【００１１】
一方、微生物の中で人間や動物、農作物や自然環境に対して無害で有益な働きを持つ微生物は有用微生物と称され、光合成細菌、乳酸菌、酵母、放線菌、糸状菌、担子菌、枯草菌などが知られている。光合成細菌は、光をエネルギー源として抗酸化物質、アミノ酸、糖類、各種生理活性物質を生成し、乳酸菌が生成する乳酸や酢酸は、抗菌力が強いため有害菌の増殖を抑制することができる。また、酵母は、糖をアルコールに変えるほか他の有用菌の活性を増進させることができる。更に、放線菌は、抗菌物質を生成し、糸状菌は、繊維質など難分解性の炭水化物を分解し、糖化させることができる。このような有用微生物を利用した発酵は、味噌、醤油、その他の発酵食品の生産に必須の工程である。
【００１２】
発酵食品としては、味噌や醤油以外にも、日本酒、ビール、焼酎その他の酒類、ヨーグルト、チーズなどの乳製品、納豆などの大豆発酵食品、寿司類、漬物類など古来から多くの発酵食品が利用されている。発酵食品には、原料由来の成分と菌体由来の成分とが含まれ、原料の分解に伴って消化吸収性や風味が向上したり、保存性が向上するなどの利点がある。
【００１３】
また、微生物が原料を分解して生成された発酵エキスには、還元糖とアミノ化合物とのメイラード反応生成物である褐色のメラノイジンと総称される化合物が含有されることが知られている。生成経路は十分に解明されていないが、糖類から生成したＤ−グルコシドがエナミノールを経由してアマドリ化合物になり、オソンやフルフラール類などを中間体としアミノ化合物と縮重合反応して生成する、と考えられている。還元糖やアミノ化合物の種類によって異なる生成物ができるため、メラノイジンは種々の物質の集合体である。醤油や味噌などの褐色は、このメラノイジンによると考えられている。
【００１４】
ＮＡＳＨは、ＮＡＦＬＤが重篤化した疾患であり、ＮＡＦＬＤの改善はＮＡＳＨの予防を意味する。ＮＡＦＬＤの多くは生活習慣病に由来し、長期投与を考慮すれば安全性に優れる発酵食品由来の成分によってＮＡＳＨを予防し、治療できることが好ましい。
【００１６】
また、本発明は、天然物由来の発酵エキスを有効成分とするＮＡＦＬＤやＮＡＳＨの治療薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、野菜・果物と、海藻とを、乳酸菌と酵母とを共棲発酵してなる褐色の発酵産物を含有する発酵エキスについて詳細に検討したところ、メチオニン・コリン欠乏食を与えた肥満糖尿病ラットに投与すると、肝臓組織の改善効果があることを見出し、本発明を完成させた。乳酸菌と酵母との共棲発酵により、加熱することなく褐色の発酵エキスが産生されることは知られておらず、このような発酵エキスが優れたＮＡＳＨ治癒効果を有することも全く知られていない。
【００１８】
すなわち本発明は、多糖類、パパイヤおよび海藻を、乳酸菌と酵母とで共棲発酵してなる発酵エキスを有効成分とする、ＮＡＦＬＤおよび／またはＮＡＳＨの治療薬を提供するものである。
【００２２】
また本発明は、前記多糖類が、米、米糠および／または玄米であることを特徴とする、上記治療薬を提供するものである。
【００２３】
また本発明は、前記乳酸菌が、ラクトバシラス  カゼイ、ラクトバシラス  プランタルム、またはラクトバシラス  ラクティスであり、および前記酵母が、サッカロマイセス  セレビシエである、上記治療薬を提供するものである。
【００２４】
また本発明は、前記発酵エキスがメラノイジンを含有することを特徴とする、上記治療薬を提供するものである。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、多糖類、パパイヤおよび海藻を、乳酸菌と酵母とで共棲発酵してなる発酵エキスを有効成分とするＮＡＦＬＤおよび／またはＮＡＳＨの治療薬が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】製造例２で製造した発酵エキスのスチレン系合成吸着剤吸着物のメタノール溶出画分のゲルろ過ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す図である。
【図２】製造例２で得た褐色物質のＵＶスペクトルを示す図である。
【図３】製造例１で得たメラノイジンのＵＶスペクトルを示す図である。
【図４】（Ａ）は、実施例１の血清ＡＬＴの結果を、（Ｂ）は血清ＡＳＴの結果を示す図である。
【図５】実施例１の肝ＰＡＩ−１の結果を示す図である。
【図６】実施例１の肝ＴＮＦαの結果を示す図である。
【図７】実施例１の肝ＴＩＭＰ−１の結果を示す図である。
【図８】（Ａ）は実施例２の血清ＡＬＴの結果を、（Ｂ）は肝ＴＧ（Ｌｉｖｅｒ  Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）の結果を示す図である。
【図９】実施例２のＨＥ染色の結果を示す図である。
【図１０】（Ａ）は実施例２の肝ＴＢＡＲＳの結果を、（Ｂ）は肝ＳＯＤ活性の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の第一は、多糖類、パパイヤおよび海藻を、乳酸菌と酵母とで共棲発酵してなる発酵エキスを有効成分とする、ＮＡＦＬＤおよび／またはＮＡＳＨの治療薬である。前記発酵エキスは、メラノイジンを含有していてもよい。メラノイジンは、糖質とアミノ化合物との反応産物の総称であるから、糖質やアミノ化合物の種類が異なればメラノイジンも異なる。また、発酵は、有用微生物の作用によって有機化合物を加工する工程であるから、使用する微生物が異なれば、更にさまざまなメラノイジンが生産される。本発明によれば、少なくとも乳酸菌と酵母との共棲発酵によって生成される発酵エキスは、ＮＡＦＬＤおよび／またはＮＡＳＨ治癒効果を有する。
【００２８】
本発明で使用する発酵エキスは、乳酸菌と酵母とを共棲発酵してなる発酵エキスである。少なくとも乳酸菌と酵母とを使用することで、褐色の発酵産物を含む発酵エキスを生成することができる。乳酸菌は、糖質から乳酸を生成するが、発酵液中に生成した乳酸によって培養液に含まれるタンパク質がペプチドやアミノ酸に分解される。また、アミラーゼ活性を有する乳酸菌は、米や玄米に含まれるアミラーゼを単糖に分解することができる。また、酵母は嫌気性条件下で糖類からアルコールと二酸化炭素を生成するが、タンパク分解酵素を含む酵母は培養液中のタンパク質をペプチドやアミノ酸に分解することができ、酵母が体内で摂取した糖から、ビタミンやアミノ酸などを生産することができる。なお、本発明は、少なくとも乳酸と酵母とを使用すればよく、更に、本発明の効果を損なわない範囲で麹菌、枯草菌、糸状菌、光合成細菌などが発酵系に含有されるものであってもよい。原料に付着する全ての細菌を除去することは困難である。
【００２９】
本発明において、「共棲発酵」とは、乳酸菌と酵母とを共棲培養して行う発酵であり、また、「発酵エキス」とは、共棲発酵の発酵液から微生物および原料残渣を除去したものである。
【００３０】
乳酸菌や酵母の共棲培養の栄養原は、多糖類と、野菜・果物と、海藻である。前記多糖類としては、米、米糠、玄米、酒粕、蒸留粕、麦糠、ビール粕、米粉、麦粉、澱粉、イモ類などの天然原料由来の多糖類が好ましい。より好ましくは、米、米糠、玄米、酒粕、米粉であり、特に好ましくは、米、米糠および／または玄米である。玄米や米糠には、アミラーゼを含む胚芽が含まれるため、澱粉のアミロースやアミロペクチンをグルコース、マルトース、オリゴ糖に変換することができ、多糖類を原料として円滑に乳酸菌と酵母による共棲発酵を行うことができる。
【００３１】
野菜・果物の種類は特に問わないが、ミネラルや酵素を多く含むものを好適に使用することができる。糖類、タンパク質とを含むものが好ましい。たとえば、パパイヤ、パイナップル、リンゴ、オレンジ、バナナ、ダイコン、ニンジン、キャベツ、キノコなどを好適に使用することができる。好ましくは、パパイヤである。パパイヤは、パパインなどのタンパク分解酵素を多く含み、培養液中のタンパク質をペプチドやアミノ酸に分解することができ、積極的なメラノイジン形成に関与する。パパイヤは、可食しうればよく完熟に限定されず未成熟の青パパイヤであってもよい。青パパイヤの酵素量は完熟パパイヤよりも含有量が多く、特に好ましい。
【００３２】
海藻としては特に限定はなく、昆布、ヒジキ、モズク、若布などの褐藻類、アサクサノリ、テングサなどの紅藻類、アオサ、アオノリ、カサノリ、サボテングサ、フサイワヅタ、ミルなどの緑藻類などを好適に使用することができ、より好ましくは褐藻類である。特には、昆布、ヒジキ、モズクなどが好ましい。これら海藻には、ミネラルや多糖類のほかアミノ酸が含まれる。
【００３３】
本発明で使用する乳酸菌や酵母は、共棲発酵によって最終的に発酵エキス中に褐色の発酵産物を生産できればよい。乳酸菌としては、ラクトバシラス属、ビフィドバクテリウム属、エンテロコッカス属、ラクトコッカス属、ペディオコッカス属、リューコノストック属、ストレプトコッカス属などがあり、使用する原料に応じて適宜選択することができる。本発明では、米、米糠、玄米、酒粕、蒸留粕、麦糠、ビール粕、米粉、麦粉、澱粉などの天然原料由来の多糖類を使用するため、糖類を資化できる乳酸菌を使用することが好ましい。このような、糖類を資化できる乳酸菌としては、ラクトバシラス属、ストレプトコッカス属、リューコノストック属などの乳酸菌がある。
【００３４】
ラクトバシラス属の乳酸菌としては、ラクトバシラス  カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバシラス  プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバシラス  ラクティス（Lactobacillus lactis）、ラクトバシラス  アミロフィルス（Lactobacillus amylophilus）、ラクトバシラス  サシドフィルス（Lactobacillu sacidophilus）、ラクトバシラス  ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバシラス  サンフランシスコ（Lactobacillus sanfrancisco）、ラクトバシラス  フェルメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバシラス  ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバシラス  ラムノズス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバシラス  パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）などがある。
またストレプトコッカス属の乳酸菌としては、ストレプトコッカス  ファエカリス（Streptococcus faecalis）、ストレプトコッカス  ファエシウム（Streptococcus faecium）などがある。
またリューコノストック属の乳酸菌としては、リューコノストック  マエセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）、リューコノストック  ラクティス（Leuconostoc lactis）などがある。
【００３５】
酵母としては、サッカロマイセス属、カンジダ属、トルロプシス属、ジゴサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、デバリオマイセス属、ゲオトリクム属、ウィッケルハミア属、フェロマイセス属などがある。本発明では、出芽酵母であるサッカロマイセス属、や分裂酵母であるシゾサッカロマイセス属、カンジダ属などを好適に使用することができる。好ましくは、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。
【００３６】
乳酸菌と酵母とを使用して共棲発酵するには、乳酸菌と酵母との共棲培養液に上記した原料の全てを一度に仕込んでもよく、各原料の発酵段階を均一に調整するため、それぞれの原料を別個に乳酸菌や酵母の培養液に仕込んで予備発酵し、その後に混合して共棲発酵させてもよい。乳酸菌や酵母の種類、これらの栄養源とする多糖類や野菜・果物、海藻などの種類に応じて適宜選択することができる。
【００３７】
本発明で使用する乳酸菌や酵母は、予め予備培養したものを使用する。乳酸菌の予備培養液中の濃度は、１０５〜１０１０個／ｍＬであり、酵母の予備培養液中の濃度は、１０５〜１０１０個／ｍＬである。なお、原料（湿重量）の仕込み量は、予備培養液の０．０１〜１００ｗ／ｖ％、より好ましくは０．１〜３０ｗ／ｖ％である。多糖類１００質量部に対する野菜・果物の配合割合は、１〜１００質量部、より好ましくは３〜５０質量部である。また、多糖類１００質量部に対する海藻の配合割合は、０．１〜５０質量部、より好ましくは１〜３０質量部である。
【００３８】
多糖類として玄米と米糠とを使用し、野菜・果物としてパパイヤを、海藻として昆布とモズクを使用して発酵エキスを調製する方法を説明する。まず、蒸した玄米を乳酸菌と酵母との共棲培養液に仕込む。使用する乳酸菌として、多糖類を資化しうる乳酸菌を使用する。これにより、玄米に含まれる多糖類をスクロースやグルコースなどに分解することができる。乳酸菌により多糖類が分解され、かつ乳酸が産生される。酵母は、耐酸性に優れるため、乳酸酸性の発酵液の中でも増殖し、アミノ酸などを産生することができる。
上記玄米とは別個に、乳酸菌と酵母との共棲培養液にパパイヤと、海藻とをそれぞれ別個に仕込んで予備発酵させたものとを調製しておく。パパイヤは、タンパク分解酵素その他を多く含むため、これら酵素によって発酵液中に含まれる成分が更に分解される。各発酵液内の分解の程度が略均一になったらこれらを混合して共棲発酵させる。
【００３９】
発酵は、使用する微生物の種類や原料の種類、原料の仕込み量などによって適宜選択することができ、一般には、５〜１００週間、より好ましくは１０〜５０週間、特に好ましくは２０〜４０週間である。上記は、発酵の開始から終了までの時間である。また、発酵温度は２０〜４０℃である。発酵の進行に伴い、乳酸菌の培養液や酵母の培養液を追加してもよい。
【００４０】
なお、酵母と乳酸菌とは、ともに嫌気的条件下でも好気的条件下でも生育することができ、酸素の有無で生産物も異なる。たとえば、酵母は、嫌気的条件下で糖を原料としてアルコールを生産するが、乳酸菌は、好気的条件下で乳酸の産生が進行する。本発明では、発酵の前半では乳酸菌の活性を高めることが好ましく、発酵の後半では他の微生物の活性を高めるように制御することが好ましい。発酵の前半を好気的条件に制御することで酵母によるアルコールの発生を抑制することができ、一方、乳酸菌の産生する乳酸によって混入する雑菌を滅菌しうるからである。このような制御は、ｐＨ、溶存酸素量、温度を制御して行うことができる。これにより、乳酸菌と酵母とにより、長期間に亘る共棲発酵を行うことができる。
【００４１】
発酵の終了は、発酵液が褐色に変色することで知ることができる。なお、発酵終了後に、発酵液を酸素を供給しない条件で２〜１００週間熟成させてもよい。
【００４２】
上記方法は、多糖類、野菜・果物、および海藻とをそれぞれ別個に乳酸菌と酵母との共棲培養液で予備発酵する方法で例示したが、多糖類、野菜・果物、および海藻の全量を乳酸菌と酵母との予備発酵液に仕込んで共棲培養してもよく、多糖類を乳酸菌と酵母との共棲培養液で予備発酵し、野菜・果物と海藻とを乳酸菌の培養液で予備発酵し、これら予備発酵液を混合して共棲発酵してもよい。メラノイジンは、原料が微生物によって還元糖とアミノ化合物とに分解された後に共棲する微生物によって生成されると考えられる。したがって、発酵の全工程が共棲発酵である必要はない。なお、発酵工程で、仕込み水を添加し、必要に応じて菌液を追加してもよい。
【００４３】
発酵またはその後の熟成後、ろ過、遠心などにより乳酸菌、酵母その他の微生物を除去して発酵エキスとする。ｐＨは一般に４〜８．５である。アルコール濃度は０〜５００ｍｇ／Ｌであることが好ましい。
【００４４】
発酵エキスをイオン交換樹脂、あるいは合成吸着樹脂等で処理して、発酵産物である褐色の発酵産物を分離、回収することができる。イオン交換樹脂や合成吸着樹脂等によって、発酵エキスに含まれる有機酸等を除去し、褐色の発酵産物を得ることができる。使用するイオン交換樹脂としては、イオン交換基がスルフォン酸基、リン酸基、カルボキシメチル基、ジエチルアミノ基、及び４級アミノエチル基等が使用可能であり、陽イオン交換樹脂でも陰イオン交換樹脂でも共に使用が可能である。また、合成吸着樹脂（三菱化学株式会社のダイヤイオン、セパビーズなど）を利用することで、褐色の発酵産物を得ることもできる。
【００４５】
本発明で使用するメラノイジンは、分子量５００〜３０００である。このメラノイジンは、後記する実施例に示すように、ＮＡＦＬＤおよび／またはＮＡＳＨ治癒効果を有することが判明した。
【００４６】
本発明のメラノイジンを有効成分とする治療剤の投与経路は、経口投与、又は胃内投与、皮下、筋肉内及び静脈内などの非経口投与が挙げられる。望ましくは経口投与である。なお、投与量は、投与経路によって相違し、経口投与の場合は、１〜１００ｍｇ／日であり、一日に複数回に分割して摂取することができる。
【００４７】
本発明のメラノイジンを有効成分とする治療剤は、いかなる形態に調製してもよく、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、細粒剤、噴霧剤、乳剤、注射剤等が挙げられる。
【００４８】
本発明のメラノイジンを有効成分とする治療剤は、ＮＡＦＬＤやＮＡＳＨの治療のみならずこれらの予防薬としても使用することができる。
【００４９】
本発明の第二は、多糖類と、野菜・果物と、海藻とを、乳酸菌と酵母とを共棲発酵してなり、メラノイジンを含有する発酵エキスを有効成分とする、ＮＡＦＬＤおよび／またはＮＡＳＨの治療薬である。この発酵エキスは、第一の発明に記載した方法で調製することができる。上記したように、多糖類と、野菜・果物と、海藻とを、乳酸菌と酵母とを共棲発酵するとメラノイジンが産生する。このような発酵エキスにはメラノイジンの他に種々の原料分解物や微生物生産物質が含まれ、メラノイジンを単離することなくＮＡＦＬＤおよび／またはＮＡＳＨの治癒効果を奏することが判明した。
【００５０】
本発明で使用する発酵エキスは、多糖類として米、米糠および／または玄米を使用するが、玄米や米糠には澱粉を分解するアミラーゼが含まれるため、澱粉を原料として酵母を培養することができる。また、野菜・果物としてパパインなどのタンパク分解酵素を多く含むパパイヤを使用することで、培養液中のタンパク質をペプチドやアミノ酸に分解することができる。パパイヤは、可食しうればよく完熟に限定されず未成熟の青パパイヤであってもよい。青パパイヤの酵素量は完熟パパイヤよりも含有量が多く、特に好ましい。
【００５１】
使用する乳酸菌や酵母は第一の発明に記載したものを好適に使用することができ、第一の発明に記載した発酵方法で、発酵エキスを製造することができる。本発明で使用する発酵エキスは、第一の発明で使用するメラノイジンを含有するとともに、アルコールを含有しないことが好ましい。アルコールを摂取することで、アルコール性脂肪性肝疾患の誘発を回避するためである。
【００５２】
本発明の発酵エキスを有効成分とする治療剤の投与経路は、経口投与、又は胃内投与、皮下、筋肉内及び静脈内などの非経口投与が挙げられる。望ましくは経口投与である。なお、投与量は、投与経路によって相違し、経口投与の場合は、５〜５００ｍｌ／日であり、一日に複数回に分割して摂取することができる。
【００５３】
本発明の発酵エキスを有効成分とする治療剤は、いかなる形態に調製してもよい。更に、矯味・矯臭剤、安定剤、保存剤を添加してもよい。
【００５４】
本発明の発酵エキスを有効成分とする治療剤は、ＮＡＦＬＤやＮＡＳＨの治療のみならず、これらの予防薬としても使用することができる。
【実施例】
【００５５】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。
【００５６】
（製造例１）
グルコース２モル、グリシン２モル、炭酸水素ナトリウム０．２モル濃度の溶液をｐＨ６．８に調整した。９５℃で７ｈ還流を行いメラノイジンを合成した。反応液を冷却した後、透析膜（Ｖｉｓｋａｓｅ製、商品名「ＵＣ３６−３２−１００」）にて１週間透析を行った。内液を凍結乾燥し、乳鉢で粉砕して粉末状にした。この粉末状物の水溶液について、日本分光製Ｖ−５７０を使用してＵＶスペクトルを測定した。結果を図３に示す。ＵＶスペクトルは、特定の場所に吸収ピークが見られず、波長３００ｎｍから７００ｎｍにむかって吸収がなだらかに減少するものであった。
【００５７】
（製造例２）
乳酸菌として、ラクトバシラス  カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス  プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバシラス  ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）を使用し、酵母としてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを使用した。これを米糠からなる培養液で予備発酵させた液を種菌発酵液とした。乳酸菌と酵母とを含む種菌発酵液に蒸し玄米を仕込み、乳酸菌の産生が促進される条件で一次発酵させた。同様にして乳酸菌と酵母とを含む種菌発酵液にパパイヤと海藻（昆布とモズク）とをそれぞれ別個に仕込み、玄米と同様に一次発酵させた。なお、仕込み原料は、蒸し玄米１００質量部に対し、パパイヤ２５質量部と海藻８質量部とし、全発酵液中の仕込み原料の比率は１．５質量％とした。その後、各共棲発酵液を混合した。溶存酸素量を調整して乳酸菌以外の菌の活性が促進する条件で発酵を継続した。なお、発酵工程では、必要に応じて純水や種菌発酵液を追加した。原料の分解が進み発酵液が褐色かつ澄明になったところを発酵の終点とした。一次発酵の開始から発酵の終了まで６ヶ月間を要した。ついで、発酵終了から６ヶ月間熟成した。熟成後の発酵液から直径０．４５μｍのフィルターを使用して菌体を除去し、発酵エキスを得た。この発酵エキスのｐＨは、６．０であり、アルコールは検出されなかった。
【００５８】
発酵エキスをスチレン系合成吸着剤（三菱化学株式会社製、商品名「ダイヤイオンＨＰ−２０）を通過させ、発酵エキスに含まれる発酵産物を吸着させた。その後、カラムを水にて洗浄し、メタノールで溶離し、褐色のメタノール溶出画分を分取した。
【００５９】
この褐色のメタノール溶出画分について、下記条件でゲルろ過ＨＰＬＣ分析を行った。ゲルろ過クロマトグラムを図１に示す。
【００６０】
ＨＰＬＣ分析条件
ポンプ：ＳＨＩＭＡＤＺＵ製、ＬＣ−１０ＡＤｖｐ
デガッサー：ＳＨＩＭＡＤＺＵ製、ＤＧＵ−１４Ａ
オートインジェクター：ＳＨＩＭＡＤＺＵ製、ＳＩＬ−１０ＡＤｖｐ
システムコントローラー：ＳＨＩＭＡＤＺＵ製、ＳＣＬ−１０Ａｖｐ
ダイオードアレイ検出器：ＳＨＩＭＡＤＺＵ製、ＳＰＤ−Ｍ１０Ａｖｐ
蒸発光散乱検出器：ＳＨＩＭＡＤＺＵ製、ＥＬＳＤ−ＬＴ
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＯＨ  ｐａｋ  ＳＢ−８０３  ＨＱ
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
移動相：１００ｍＭリン酸緩衝液
【００６１】
前記褐色の発酵産物の分子量分布を、プルランを分子量マーカーとして、上記ＨＰＬＣ測定条件と同条件において測定し、それにより較正曲線を作成し相対分子量分布を求めるサイズ排除クロマトグラフィー法により検討したところ、５００〜３０００であった。
【００６２】
ついで、前記褐色物質のＵＶスペクトルを測定した。測定は、日本分光製Ｖ−５７０を使用して行った。結果を図２に示す。ＵＶスペクトルは、特定の場所に吸収ピークが見られず、波長２００ｎｍから７００ｎｍにむかって吸収がなだらかに減少するものであった。このスペクトルは製造例１のメラノイジンと波形が類似するものであった。
【００６３】
また、褐色の発酵産物について、タンパク質、多糖、単糖は分光光度計を用いた比色法により、有機酸はイオンクロマトグラフィーにより、アミノ酸はアミノ酸アナライザーを使用し、脂質に関してはガスクロマトグラフィーを用いて分析を行った。同画分には、タンパク質、多糖、単糖、有機酸、アミノ酸、脂質は検出されなかった。
【００６４】
(実施例１）
８週令Ｃ５７ＢＬ６／Ｎ  雄性マウスを４群に分け、メチオニン・コリン欠乏食、メチオニン・コリン欠乏食と製造例２の褐色の発酵産物、通常食、通常食と製造例２の褐色の発酵産物とをそれぞれ４週間に亘り、摂取させた。
投与後、血清ＡＳＴおよび血清ＡＬＴを測定した。結果を図４に示す。また、肝臓を採集し、ＲＮＡ、タンパク質を抽出し、リアルタイムＰＣＲ法、ウェスタンブロッド法、免疫沈降法を用いてアディポサイトカインおよびサイトカインなどの各種パラメータの変化を定量的に評価した。肝ＰＡＩ−１、肝ＴＮＦα、肝ＴＩＭＰ−１の結果をそれぞれ図５、図６、図７に示す。
【００６５】
（結果）
図４に示すように、メチオニン・コリン欠乏食が給餌されてＮＡＳＨ様病態が誘導されたマウス群では、血清ＡＬＴが２２０ＩＵ／Ｌに、血清ＡＳＴは１７０ＩＵ／Ｌに増加した。しかしながら、ＮＡＳＨ様病態を誘導したマウスに製造例２の褐色の発酵産物を投与した群は、血清ＡＬＴ値が１４０ＩＵ／Ｌと２２０ＩＵ／Ｌの６３％に抑制し、血清ＡＳＴ値は１０５ＩＵ／Ｌであり１７０ＩＵ／Ｌの６２％に抑制した。なお、通常食では、褐色の発酵産物の投与により血清ＡＬＴおよびＡＳＴ値に変動がなかったことから、褐色の発酵産物は安全性に優れると考えられる。
【００６６】
図５に示すように、上記傾向は、肝ＰＡＩ−１でも同様に観察された。すなわち、ＮＡＳＨ様病態が誘導されたマウス群ではＰＡＩ−１の相対比率が高く、褐色の発酵産物の摂取によりこれらの値が低減された。なお、通常食が給餌されたマウス群では、褐色の発酵産物の有無に関わらず相対比率が低く、褐色の発酵産物はＮＡＳＨ様病態が誘導された場合にのみＰＡＩ−１を低減しうることが判明した。
【００６７】
図６に示すように、肝ＴＮＦαは、ＮＡＳＨ様病態が誘導されたマウス群で増加したが、褐色の発酵産物の投与により低減した。なお、通常食が投与され、さらに褐色の発酵産物が投与されたマウスでは、無投与群よりもＴＮＦα量が低下した。炎症性サイトカインであるＴＮＦαに関しては、健常マウスにおいても低下させることが分かった。
【００６８】
図７に示すように、ＮＡＳＨ様病態が誘導されたマウス群ではＴＩＭＰ−１の相対比率が高く、褐色の発酵産物の摂取によりこれらの値が低減された。なお、通常食が給餌されたマウス群では、褐色の発酵産物の有無に関わらず相対比率が低かく、褐色の発酵産物はＮＡＳＨ様病態が誘導された場合にのみＴＩＭＰ−１を低減しうることが判明した。
【００６９】
褐色の発酵産物の投与により、肝臓のＰＡＩ−１、ＴＮＦαなどの催炎症性サイトカインの産生が抑制されこれにより、肝臓保護作用が発揮されることが示唆され、また、褐色の発酵産物の投与により、肝臓ＴＩＭＰ−１の発現が抑制され、この抑制により肝臓繊維化が抑制されることが示唆された。
【００７０】
（実施例２）
４週令Ｃ５７ＢＬ／６  雌性マウスにメチオニン・コリン欠乏食を４週間投与して投与してマウスＮＡＳＨモデルを作成した。
このマウスＮＡＳＨモデルを４群に分け、通常食と生理食塩水（５ｍｌ／ｋｇ体重／日）、通常食と製造例２の発酵エキス（５ｍｌ／ｋｇ体重／日）、メチオニン・コリン欠乏食と生理食塩水（５ｍｌ／ｋｇ体重／日）、メチオニン・コリン欠乏食と製造例２の発酵エキス（５ｍｌ／ｋｇ体重／日）をそれぞれ４週間に亘り胃管投与した。
投与後、マウスの肝臓、血清を採取した。肝臓組織の一部は、４％パラホルムアルデヒド固定し、パラフィン切片を作成した。ヘマトキシリン・エオジン染色を行い、肝臓組織像を評価した。血清および組織サンプルは、−８０℃で保存し、血清ＡＳＴ、肝ＴＧ、肝臓組織免疫組織化学染色、肝臓組織中過酸化脂質量の測定、肝臓組織中スーパーオキシドジムスターゼ活性の測定を行った。
血清ＡＬＴおよび肝ＴＧの結果を図８に、ＨＥ染色の結果を図９に、肝ＴＢＡＲＳおよび肝ＳＯＤの結果を図１０に示す。なお、図９において、通常食と生理食塩水の結果をＣｏｎｔ＋Ｃ、通常食と製造例２の発酵エキスの結果をＣｏｎｔ＋Ｍ、メチオニン・コリン欠乏食と生理食塩水の結果をＭＣＤ＋Ｃ、メチオニン・コリン欠乏食と製造例２の発酵エキスの結果をＭＣＤ＋Ｍで表記した。
【００７１】
（結果）
図８に示すように、通常食で飼育したマウス群は発酵エキス投与の有無に関わらず、血清ＡＬＴは共に２０ＩＵ／Ｌであり、肝ＴＧは共に１０〜１３ｍｇ／ｇであった。これに対し、メチオニン・コリン欠乏食が給餌されてＮＡＳＨ様病態が誘導されたマウス群では、血清ＡＬＴが２２０ＩＵ／Ｌに、肝ＴＧは１２２ｍｇ／ｇに増加した。しかしながら、ＮＡＳＨ様病態を誘導したマウスに製造例２の発酵エキスを投与した群は、血清ＡＬＴ値が１４０ＩＵ／Ｌと２２０ＩＵ／Ｌの６３％に抑制し、肝ＴＧは７０ｍｇ／ｇであり１２２ｍｇ／ｇの５７％に抑制した。ＮＡＳＨ様病態の誘導により血清ＡＬＴ値や肝ＴＧが上昇するが、発酵エキスの投与により、これらを低減しうることが判明した。なお、通常食では、発酵エキスの投与により血清ＡＬＴおよびＡＳＴ値に変動がなく、健常マウスへの副作用が少ないと考えられた。
【００７２】
図９に示すＨＥ染色の結果から、通常食を摂取したマウス群では均質な肝組織が観察されたが、ＮＡＳＨ様病態が誘導されたマウス群では、脂肪細胞が散在した。しかしながら、発酵エキスを投与すると、ＮＡＳＨ様病態が誘導されたマウス群でも脂肪細胞数および脂肪細胞のサイズが縮小した。なお、通常食を摂取したマウス群では発酵エキスの投与により肝細胞の変化は少なかった。
【００７３】
図１０に示すように、通常食を給餌されたマウスでは肝ＴＢＡＲＳは相対比率が０．５であるが、メチオニン・コリン欠乏食の給餌により２に上昇した。しかしながら、発酵エキスの投与により１．３と相対比率２の６５％に低減した。なお、通常食が給餌されたマウスに発酵エキスを投与しても肝ＴＢＡＲＳの変動はない。発酵エキスは、健常肝には影響を与えず、ＮＡＳＨ様病態が誘導されたマウス群でのみ作用し、安全性が高いと考えられた。
【００７４】
なお、肝ＳＯＤは、ＮＡＳＨ様病態が誘導されたマウス群では通常食を給餌された群よりも低下した。しかしながら、発酵エキスの投与によりに、ＮＡＳＨ様病態群でもＳＯＤの相対比率が上昇した。なお、通常食が給餌されたマウスに発酵エキスを投与しても肝ＳＯＤ値の変動はない。発酵エキスは、健常肝には影響を与えず、ＮＡＳＨ様病態が誘導されたマウス群でのみ作用し、安全性が高いと考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明は、天然物の発酵産物から抽出される褐色の発酵産物や発酵エキスをＮＡＦＬＤやＮＡＳＨの治療薬として使用するもものであり、有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図９】
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