(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの異なる周波数を有するパルスレーザ光を導光する２つの光路と、
該２つの光路を導光されてきたパルスレーザ光を同軸に合波する合波手段と、
該合波手段により合波されたパルスレーザ光を標本上で走査する走査手段と、
前記標本からの光を検出する光検出手段と、
前記２つの光路の一方に設けられ、該一方の光路を導光されてきたパルスレーザ光を、前記標本内の特定の分子振動の周波数と同じ周波数で繰り返されるパルス列に変換するパルス列変換手段と
を備えるレーザ顕微鏡装置。
【請求項２】
前記パルス列変換手段が、
前記一方の光路を導光されてきたパルスレーザ光を光路長が互いに異なる２つの光路に分岐する分岐部と、
該分岐部により分岐された２つの光路を導光されてきたパルスレーザ光を合波する合波部と
を備える請求項１に記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項３】
前記パルス列変換手段が、
前記分岐部に導光されるパルスレーザ光の周波数分散量を調節する周波数分散量調節手段を備える請求項２に記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項４】
パルスレーザ光を射出するレーザ光源と、
該レーザ光源から射出されたパルスレーザ光を前記２つの光路に分岐する分岐手段と、
前記２つの光路の少なくとも一方に設けられ、前記２つの光路を導光されてきたパルスレーザ光の周波数を互いに異なる周波数に変換する周波数変換手段と、
前記２つの光路の少なくとも一方に設けられ、前記２つのパルスレーザ光の周波数分散および／または周波数帯域を調節する周波数調節手段と
を備える請求項１に記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項５】
前記２つの光路の少なくとも一方に設けられ、前記周波数調節手段により周波数帯域が調節されたパルスレーザ光であって、前記光検出手段により検出される前記標本からの光と同じ周波数のパルスレーザ光である注目成分の強度を変調する強度変調手段と、
該強度変調手段に同期して、前記光検出手段における前記強度変調手段により強度の変調されたパルスレーザ光の検出感度を調節する感度調節手段と
を備える請求項４に記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項６】
前記２つの光路のうち他方の光路に設けられ、該他方の光路を導光されるパルスレーザ光の偏光方向を設定する第１の偏光素子と、
前記標本と前記光検出手段との間に設けられ、前記第１の偏光素子の偏光軸に直交する方向に偏光軸が設定された第２の偏光素子と、
前記２つの光路のうち一方の光路に設けられ、前記第１の偏光素子の偏光軸に対して０°から９０°の範囲の方向に偏光軸が設定された第３の偏光素子と
を備える請求項１に記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項７】
前記第２の偏光素子と前記光検出手段との間に設けられ、選択された波長成分のみを透過させる波長選択手段を備える請求項６に記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項８】
前記第１の偏光素子と前記合波手段との間にλ／４波長板を備える請求項６に記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項９】
前記第３の偏光素子と前記合波手段との間にλ／４波長板を備える請求項６に記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項１０】
前記光検出手段が、互いに直交する成分を検出する第１の検出器と第２の検出器とを有し、
前記標本と前記光検出手段との間に設けられたλ／４波長板と、
該λ／４波長板を透過した光を互いに直交する成分に分岐する分岐手段と、
前記第１の検出器により検出された成分と前記第２の検出器により検出された成分との差分を算出する差分算出部と
を備える請求項６に記載のレーザ顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ顕微鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、標本中の分子のテラヘルツ領域の振動を検出する方法として、インパルシブ誘導ラマン散乱分光法が知られている（例えば、非特許文献１参照）。インパルシブ誘導ラマン散乱分光法では、まず、標本中の分子のテラヘルツ領域の振動を励起するポンプ光として、フェムト秒パルスレーザ光などの極短パルスレーザ光を標本に照射する。これにより、ポンプ光によって、標本中の分子のテラヘルツ領域の振動が励起される（インパルシブ誘導ラマン散乱）。このとき、励起される分子振動の周波数範囲は、ポンプ光の周波数帯域（スペクトル帯域）で決まる。つまり、ポンプ光の周波数帯域に応じて、テラヘルツ領域において一定の周波数範囲内の分子振動が励起される。次に、プローブ光を標本中に照射し、標本を通過する際に生じるインパルシブ誘導ラマン散乱に起因したプローブ光の強度や位相の変化（標本からの光）を検出する。こうすることで、標本中の分子のテラヘルツ領域の振動を計測することが可能となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】”Transient Grating Optical Heterodyne Detected Impulsive Stimulated Raman Scattering in Simple Liquids.", Peter Vihringer and Norbert F. Scherer, Journal of Physical Chemistry 1995, 99, 2684-2695
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、非特許文献１に開示されているインパルシブ誘導ラマン散乱分光法では、ポンプ光、プローブ光を標本に照射する際、ポンプ光とプローブ光を空間的に分離することを目的に、それぞれの光を異なる方向から標本に照射している（非同軸照射）。というのも、ポンプ光とプローブ光の周波数（または波長）が同一であり、同軸で標本に照射した場合、標本からの光として、プローブ光だけを分光選択的に検出することが不可能であるからである。このような非同軸照射の構成で標本の２次元イメージングを行うためには、ポンプ光とプローブ光それぞれの照射の位置関係を保った状態でポンプ光とプローブ光を走査する必要がある。そのため、ポンプ光とプローブ光自身を標本中で走査させるのではなく、標本を載置したステージを走査させる必要がある。ステージ走査の場合、走査速度が光走査に比べて遅く、高速に標本のイメージングを行うことが困難であるという不都合がある。
【０００５】
また、インパルシブ誘導ラマン散乱では、テラヘルツ領域において、ポンプ光の周波数帯域（スペクトル帯域）により決まる一定の周波数範囲に含まれる、全ての分子振動が励起される。言い換えれば、ポンプ光のエネルギーを効率的に特定の分子振動に利用することができないという不都合がある。このため、標本中の分子のテラヘルツ領域の特定の分子振動に注目した２次元イメージングを行う場合には、インパルシブ誘導ラマン散乱は不向きである。
【０００６】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、標本中の分子のテラヘルツ振動を利用して標本のイメージングを行うレーザ顕微鏡装置において、特定の分子振動に注目し、かつ高速にイメージングできるレーザ顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、２つの異なる周波数を有するパルスレーザ光を導光する２つの光路と、該２つの光路を導光されてきたパルスレーザ光を同軸に合波する合波手段と、該合波手段により合波されたパルスレーザ光を標本上で走査する走査手段と、前記標本からの光を検出する光検出手段と、前記２つの光路の一方に設けられ、該一方の光路を導光されてきたパルスレーザ光を、前記標本内の特定の分子振動の周波数と同じ周波数で繰り返されるパルス列に変換するパルス列変換手段とを備えるレーザ顕微鏡装置を採用する。
【０００８】
本発明に係るレーザ顕微鏡装置によれば、２つの光路のうち一方の光路を導光されてきたパルスレーザ光が、パルス列変換手段により、前記標本内の特定の分子振動の周波数と同じ周波数で繰り返されるパルス列（ポンプパルス列）に変換される。このポンプパルス列は、合波手段により、他方の光路を導光されてきたパルスレーザ光（プローブパルス列）と同軸に合波され、合波されたパルスレーザ光は、走査手段により標本上で走査される。そして、光検出手段により標本からの光が検出され、検出された光と標本上の走査位置とに基づいて、標本のイメージが生成される。
【０００９】
この場合において、標本内の特定の分子振動の周波数と同じ周波数で繰り返されるパルス列（ポンプパルス列）により、標本内の特定の分子振動のみが選択的に増強される（マルチパルスインパルシブ誘導ラマン散乱）。これにより、ポンプパルス列のエネルギーを特定の分子振動に効率的に利用することが可能となる。さらに、他方の光路を導光されてきたパルスレーザ光（プローブパルス列）を標本に照射する。標本を通過したプローブパルス列（標本からの光）の強度や位相は、マルチパルスインパルシブ誘導ラマン散乱に起因して変化する。したがって、このプローブパルス列（標本からの光）の強度や位相の変化と標本中のパルスレーザ光の照射位置の情報を用いることで、標本の２次元的なイメージを作成することが可能となる。この際、走査手段により標本上でパルスレーザ光自身を走査（光走査）しているため、ステージ走査に比べて、イメージの作成の処理を高速に行うことができる。
【００１０】
上記発明において、前記パルス列変換手段が、前記一方の光路を導光されてきたパルスレーザ光を光路長が互いに異なる２つの光路に分岐する分岐部と、該分岐部により分岐された２つの光路を導光されてきたパルスレーザ光を合波する合波部とを備えることとしてもよい。
【００１１】
このようにすることで、合波部上において、分岐部により分岐された２つの光路を導光されてきたパルスレーザ光の時間的タイミングを異ならせることができる。これにより、２つの光路に分岐されたパルスレーザ光を干渉させ、標本内の特定の分子振動の周波数に一致した周波数で繰り返されるパルス列を生成することができる。また、２つの光路の光路長を変化させ、２つの光路を導光されるパルスレーザ光の時間的タイミングを調整することで、パルス列の繰り返し周波数を変化・調整させることができる。
【００１２】
上記発明において、前記パルス列変換手段が、前記分岐部に導光されるパルスレーザ光の周波数分散量を調節することとしてもよい。
このようにすることで、分岐部に導光されるパルスレーザ光の周波数成分を時間軸上に分散させることができる。このため、例えばフェムト秒レーザ光のように比較的広い周波数スペクトル帯域を有するパルスレーザ光であっても、時間軸上の各時刻において、比較的狭い周波数スペクトル帯域を有するパルスレーザ光にすることができる。これにより、分岐部に導光されるパルスレーザ光の周波数スペクトル帯域に関わらず、２つの光路に分岐されたパルスレーザ光を干渉させて、標本内の特定の分子振動の周波数に一致した周波数で繰り返されるパルス列に変換することができる。また、分岐部に導光されるパルスレーザ光の周波数分散量を調節することで、パルス列の繰り返し周波数を変化・調整させることができる。
【００１３】
上記発明において、パルスレーザ光を射出するレーザ光源と、該レーザ光源から射出されたパルスレーザ光を前記２つの光路に分岐する分岐手段と、前記２つの光路の少なくとも一方に設けられ、前記２つの光路を導光されてきたパルスレーザ光の周波数を互いに異なる周波数に変換する周波数変換手段と、前記２つの光路の少なくとも一方に設けられ、前記２つのパルスレーザ光の周波数分散および／または周波数帯域を調節する周波数調節手段とを備えることとしてもよい。
【００１４】
このようにすることで、単一のレーザ光源から発生したパルスレーザ光から、２つの異なる周波数（色）を有するパルスレーザ光を生成し、これらパルスレーザ光を容易に分光することができる。さらに、周波数調節手段により、２つの光路を導光されてきたパルスレーザ光の周波数を、マルチパルスインパルシブ誘導ラマンの検出に最適な状態にすることができる。加えて、これらパルスレーザ光のレーザ光源を共通化して装置構成を簡略化することができる。
【００１５】
上記発明において、前記２つの光路の少なくとも一方に設けられ、前記周波数調節手段により周波数帯域が調節されたパルスレーザ光であって、前記光検出手段により検出される前記標本からの光と同じ周波数のパルスレーザ光である注目成分の強度を変調する強度変調手段と、該強度変調手段に同期して、前記光検出手段における前記強度変調手段により強度の変調されたパルスレーザ光の検出感度を調節する感度調節手段とを備えることとしてもよい。
【００１６】
このようにすることで、パルスレーザ光の注目成分に対応する標本からの光の検出感度を向上することができる。これにより、ノイズを低減しつつ、パルスレーザ光の注目成分に対応する部分が強調された標本のイメージを生成することができる。
【００１７】
上記発明において、前記２つの光路のうち他方の光路に設けられ、該他方の光路を導光されるパルスレーザ光の偏光方向を設定する第１の偏光素子と、前記標本と前記光検出手段との間に設けられ、前記第１の偏光素子の偏光軸に直交する方向に偏光軸が設定された第２の偏光素子と、前記２つの光路のうち一方の光路に設けられ、前記第１の偏光素子の偏光軸に対して０°から９０°の範囲の方向に偏光軸が設定された第３の偏光素子とを備えることとしてもよい。
【００１８】
ここで、標本内の特定の分子振動の周波数に等しい周波数で繰り返されるパルス列(ポンプパルス列)を標本に照射することで、標本内の特定の分子振動が励起され、標本に過渡的な屈折率変化の異方性（ラマン誘起カー効果）が発生する。このようにすることで、パルス列が標本に照射されていない場合には、第１の偏光素子で直線偏光となるパルスレーザ光が第２の偏光素子により遮断される。一方、パルス列を標本に照射する場合には、ラマン誘起カー効果により、第１の偏光子で直線偏光となったパルスレーザ光が標本を透過する際に楕円偏光となり、第２の偏光子において、偏光が変化した標本からの光のみを透過させることができる。これにより、光検出手段において、標本の分子振動によって偏光が変化した標本からの光のみを検出することができ、分子振動が励起された分子の位置および状態が表示された標本のイメージを生成することができる。
【００１９】
上記発明において、前記第２の偏光素子と前記光検出手段との間に設けられ、選択された波長成分のみを透過させる波長選択手段を備えることとしてもよい。
このようにすることで、波長選択手段により、パルス列により励起された標本の分子振動によって偏光が変化した標本からの光のみを選択的に透過させ、分子の電子応答や配向変化などの分子振動以外の要因によって偏光が変化した標本からの光を遮断することができ、鮮明な標本のイメージを生成することができる。
【００２０】
上記発明において、前記第１の偏光素子と前記合波手段との間にλ／４波長板を備えることとしてもよい。
このλ／４波長板を調節することで、他方の光路をパルスレーザ光が導光された結果、パルスレーザ光が経由する光学素子が有する複屈折性によって、標本面において楕円偏光となったパルスレーザ光を、直線偏光に変換することができる。これにより、パルス列により誘発された標本の分子運動によって偏光方向が変化した標本からの光のみを光検出器で検出することができ、標本のイメージのコントラストを向上することができる。
【００２１】
上記発明において、前記第３の偏光素子と前記合波手段との間にλ／４波長板を備えることとしてもよい。
このようにすることで、ポンプパルス列を直線偏光から円偏光に変化させることができ、パルス列に誘起される標本中の分子の電子分極に起因する標本からの光（非共鳴成分）を抑制し、パルス列で励起された標本の分子振動に起因する標本からの光（共鳴成分）のみを検出することができ、鮮明な標本のイメージを生成することができる。
【００２２】
上記発明において、前記光検出手段が、互いに直交する偏光成分を検出する第１の検出器と第２の検出器とを有し、前記標本と前記光検出手段との間に設けられたλ／４波長板と、該λ／４波長板を透過した光を互いに直交する偏光成分を有する光に分岐する分岐手段と、前記第１の検出器により検出された成分と前記第２の検出器により検出された成分との差分を算出する差分算出部とを備えることとしてもよい。
【００２３】
光学系、とくに集光レンズ等の光学素子を、第１の偏光素子で偏光を設定されたパルスレーザ光が透過することで、該偏光を設定されたパルスレーザ光の偏光が擾乱される。この場合、ポンプパルス列によって標本を励起しない状態においても、第２の偏光素子を透過するパルスレーザ光の偏光成分が発生するために、標本のイメージのコントラストが劣化する。ここで偏光が擾乱された結果、新たに生ずるパルスレーザ光の偏光成分に関して、標本面において第１の偏光素子の偏光軸を対称軸として線対称の関係を満たす二つの偏光成分については、標本からの光をλ／４波長板により楕円偏光に変換し、その二つの偏光成分の各々について互いに直交する偏光成分の差分を算出し足し合わせることで、上記の光学素子による偏光の擾乱に起因する成分を相殺することができる。したがって、パルス列により励起された標本の分子振動によって、偏光が変化した標本からの光のみを検出することができ、標本のイメージのコントラストを向上することができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、標本中の分子のテラヘルツ振動を利用して標本のイメージングを行うレーザ顕微鏡装置において、特定の分子振動に注目し、かつ高速にイメージングできるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成を示すブロック図である。
【図２】図１のパルス列変換装置の拡大図である。
【図３】図２の各地点におけるパルスレーザ光の周波数の時間分布を示すグラフであり、（ａ）地点Ｐ、（ｂ）地点Ｑ、（ｃ）地点Ｒにおける状態をそれぞれ示している。
【図４】図２の地点Ｒにおけるパルスレーザ光の時間波形である。
【図５】図１の地点Ａにおけるパルスレーザ光の時間波形と周波数を示している。
【図６】図１の地点Ｂにおけるパルスレーザ光の時間波形と周波数を示している。
【図７】図１の地点Ｃにおけるパルスレーザ光の時間波形と周波数を示している。
【図８】図１の地点Ｄにおけるパルスレーザ光の時間波形を示している。
【図９】図１の地点Ｄにおけるパルスレーザ光の時間波形と周波数を示している。
【図１０】図１の第１の変形例に係る地点Ａと地点Ｂの時間波形と周波数を示している。
【図１１】図１の第１の変形例に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成を示すブロック図である。
【図１２】図１の第２の変形例に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成を示すブロック図である。
【図１３】本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成を示すブロック図である。
【図１４】図１３の地点Ｅにおけるポンプ光の偏光状態を示す図である。
【図１５】図１３の地点Ｅにおけるプローブ光の偏光方向の変化を示す図である。
【図１６】ポンプ光とプローブ光の強度の時間プロファイルである。
【図１７】ポンプ光と標本からの光の強度の時間プロファイルである。
【図１８】ポンプ光のパルス列の繰り返し周波数が、標本の分子振動に非共鳴の場合における、標本からの光の強度の時間プロファイルである。
【図１９】ポンプ光のパルス列の繰り返し周波数が、標本の分子振動に非共鳴の場合における、標本からの光の周波数スペクトルである。
【図２０】ポンプ光のパルス列の繰り返し周波数が、標本の分子振動に共鳴した場合における、標本からの光の強度の時間プロファイルである。
【図２１】ポンプ光の振動周波数が標本の分子振動に共鳴した場合における、標本からの光の周波数スペクトルである。
【図２２】図１３の第１の変形例に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成を示すブロック図である。
【図２３】図２２の地点Ｅにおけるポンプ光およびプローブ光の偏光状態を示す図である。
【図２４】ポンプ光のパルス列の繰り返し周波数が、標本の分子振動に非共鳴の場合における、標本からの光の強度の時間プロファイルである。
【図２５】ポンプ光のパルス列の繰り返し周波数が、標本の分子振動に共鳴した場合における、標本からの光の強度の時間プロファイルである。
【図２６】図１３の第２の変形例に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成を示すブロック図である。
【図２７】ポンプ光非照射時におけるポンプ光およびプローブ光の偏光状態を示す図であり、（ａ）λ／４波長板通過前、（ｂ）λ／４波長板通過後、（ｃ）直交する偏光成分の差分を示す図である。
【図２８】ポンプ光照射時におけるポンプ光およびプローブ光の偏光状態を示す図であり、（ａ）λ／４波長板通過前、（ｂ）λ／４波長板通過後、（ｃ）直交する偏光成分の差分を示す図である。
【図２９】プローブパルス列の偏光状態を示す図であり、（ａ）λ／４波長板通過前、（ｂ）λ／４波長板通過後、（ｃ）直交する偏光成分の差分を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
〔第１の実施形態〕
本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１について、図１から図１２を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１は、図１に示されるように、レーザ光源装置２と、レーザ光源装置２からのレーザ光を標本Ｓに照射して標本Ｓを観察するための顕微鏡本体３とを備えている。
【００２７】
レーザ光源装置２は、フェムト秒パルスレーザ光を出射する単一のレーザ光源４と、レーザ光源４から発せられたパルスレーザ光を２つに分岐するビームスプリッタ（分岐手段）５と、ビームスプリッタ５により分岐された２つのパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２をそれぞれ通過させる２つの光路６，７と、２つの光路６，７を通過してきた２つのパルスレーザ光を同軸に合波するレーザコンバイナ（合波手段）８とを備えている。
【００２８】
光路６には、パルスレーザ光Ｌ１の周波数帯域を調節可能な周波数調節装置９が設けられている。
周波数調節装置９は、例えば、所定の周波数帯域を透過するバンドパスフィルタを備えている（図示略）。
【００２９】
光路７には、パルスレーザ光Ｌ２の周波数を変化させるフォトニッククリスタルファイバ（周波数変換手段）１０と、フォトニッククリスタルファイバ１０通過後のパルスレーザ光Ｌ２’の所定の成分のみを透過させるフィルタ１１と、パルスレーザ光Ｌ２’をパルス列に変換するパルス列変換装置（パルス列変換手段）３０とが設けられている。
【００３０】
フォトニッククリスタルファイバ１０は、通過させるパルスレーザ光Ｌ２の周波数帯域が、光路６を導光されるパルスレーザ光Ｌ１’と異なる周波数帯域となるように、パルスレーザ光Ｌ２の周波数帯域を高周波数側または低周波数側に変換して、パルスレーザ光Ｌ２’を生成するようになっている。
【００３１】
フィルタ１１は、レーザ光源装置２から射出されたパルスレーザ光Ｌ２を遮断するとともに、フォトニッククリスタルファイバ１０により周波数帯域が変換されたパルスレーザ光Ｌ２’を透過させるようになっている。
【００３２】
パルス列変換装置３０は、パルスレーザ光Ｌ２’に周波数分散量を与える周波数調節装置（周波数分散調節手段）３１と、パルスレーザ光Ｌ２’を２つの光路３５，３６に分岐するとともに、２つの光路３５，３６に分岐されたパルスレーザ光を合波する分岐合波器３２と、分岐合波器３２により分岐されたパルスレーザ光を反射する反射器３３，３４とを備えている。
【００３３】
周波数調節装置３１は、前述の周波数調節装置９と同様の構成を有しており、パルスレーザ光Ｌ２’に与える周波数分散量を調節することができるようになっている。
分岐合波器３２は、パルスレーザ光Ｌ２’を光路長が互いに異なる２つの光路３５，３６に分岐する分岐部３２ａと、分岐部３２ａにより分岐された２つの光路３５，３６を導光されてきたパルスレーザ光を合波する合波部３２ｂとを備えている。
【００３４】
反射器３３，３４は、それぞれ分岐部３２ａにより分岐されたパルスレーザ光を反射するミラー対３３ｂ，３４ｂと、ミラー対３３ｂ，３４ｂを光軸方向に移動させるステージ３３ａ，３４ａとを備えている。反射器３３，３４は、ステージ３３ａ，３４ａを動作させてミラー対３３ｂ，３４ｂを光軸方向に移動させることで、光路３５，３６の光路長を変化させることができるようになっている。
【００３５】
上記構成を有することで、パルス列変換装置３０は、フィルタ１１を透過してきたパルスレーザ光Ｌ２’を、標本Ｓ内の特定の分子運動を誘発する振動周波数で繰り返されるパルス列に変換するようになっている。
【００３６】
ここで、パルス列変換装置３０の詳細な動作について、図２から図４を用いて以下に説明する。
図２に示すように、周波数調節装置３１の入射側（フィルタ１１と周波数調節装置３１との間）の一点を地点Ｐ、周波数調節装置３１と分岐合波器３２との間の一点を地点Ｑ、分岐合波器３２の出射側（分岐合波器３２とレーザコンバイナ８との間）の一点を地点Ｒとする。これら地点Ｐ，Ｑ，Ｒの各地点におけるパルスレーザ光の周波数の時間分布が、図３（ａ）〜図３（ｃ）にそれぞれ示されている。
【００３７】
地点Ｐにおけるパルスレーザ光Ｌ２’は、図３（ａ）に示すように、周波数ω０を中心周波数とし、例えばフェムト秒レーザ光のように、比較的広い周波数スペクトル帯域（パルス幅の狭い）を有するパルスレーザ光である。
【００３８】
地点Ｑにおけるパルスレーザ光Ｌ２’’は、図３（ｂ）に示すように、周波数調節装置３１の作動により、時間軸方向の周波数成分の傾き（チャープレート）が変化させられて、周波数成分が時間軸上に分散されたパルスレーザ光である。この際、パルスレーザ光Ｌ２’’の周波数スペクトル帯域をΔω、パルス幅をΔτとした場合、チャープレートＣはΔω／Δτと表わされる。
【００３９】
地点Ｒにおけるパルスレーザ光Ｌ５は、図３（ｃ）に示すように、光路３５を導光されたパルスレーザ光Ｌ３と光路３６を導光されたパルスレーザ光Ｌ４とが合波されたパルスレーザ光である。パルスレーザ光Ｌ３とパルスレーザ光Ｌ４は、それぞれを導光する光路３５と光路３６の光路長が異なるため、時間軸上においてずれた周波数成分を有している。この際、光路３５と光路３６との時間差は、パルス遅延時間Ｔと表わされる。
【００４０】
上記のように、パルス列変換装置３０は、合波部３２ｂ上において、光路３５と光路３６を導光されてきたパルスレーザ光の時間的タイミングを異ならせることができる。これにより、図４に示すように、光路３５，３６に分岐されたパルスレーザ光を干渉させて、標本Ｓ内の特定の分子運動を誘発する振動周波数で繰り返されるパルス列に変換することができる。
【００４１】
このパルス列の繰り返し時間間隔はπ／ＣＴ、繰り返し周波数はＣＴ／πとして表わされる。ここで、前述のように、Ｃは時間軸方向の周波数成分の傾き（チャープレート）、Ｔは光路３５と光路３６との時間差（パルス遅延時間）である。
また、パルス列の時間波形|Ｅ|２は以下のように表わされる。
【００４２】
【数１】
0005508899.tif 000002
ここで、Ｅ０はパルス列の振幅、ω０はパルスレーザ光の中心周波数を表わしている。
【００４３】
上述のように、パルス列変換装置３０は、チャープレートＣとパルス遅延時間Ｔを変化させることで、パルス列の振動周波数を変化させることができる。すなわち、パルス列変換装置３０は、チャープレートＣとパルス遅延時間Ｔを適切に調整することで、テラヘルツ振動相当のパルス列を生成することができる。
【００４４】
顕微鏡本体３は、例えばレーザ走査型顕微鏡であって、図１に示すように、レーザ光源装置２から出射されたパルスレーザ光Ｌ５を２次元的に走査するスキャナ１２と、レンズ群２０と、スキャナ１２により走査されたパルスレーザ光Ｌ３を標本Ｓ面に集光する集光レンズ１３と、標本Ｓからの光を集光する集光レンズ１５と、集光レンズ１５により集光された標本Ｓからの光を検出する光検出器（光検出手段）１６と、集光レンズ１５と光検出器１６との間に設けられ標本Ｓからの光のみを透過させるフィルタ（周波数選択手段）１４と、標本Ｓを載置するステージ１８とを備えている。
【００４５】
上記構成を有するレーザ顕微鏡装置１の作用について以下に説明する。
レーザ光源４を作動させてパルスレーザ光を出射させると、レーザ光源４から発せられたパルスレーザ光は、ビームスプリッタ５により２つの光路６，７に分岐される。ここで、図１の地点Ａにおけるパルスレーザ光は、図５に示すように、時間幅の狭い(周波数幅の広い）フェムト秒パルスレーザ光である。
【００４６】
光路６に分岐されたパルスレーザ光Ｌ１は、光路６上に配置されている周波数調節装置９を通過させられることにより、パルスレーザ光Ｌ１の一定の周波数が切り出される。ここで、図１の地点Ｂにおけるパルスレーザ光Ｌ１’は、図６に示すように、周波数調節装置９により、パルス時間幅が広がったパルスレーザ光である。このパルスレーザ光Ｌ１’はプローブパルス列として用いられる。
【００４７】
一方、第２の光路７に分岐されたパルスレーザ光Ｌ２は、ミラー１９によって偏向された後、フォトニッククリスタルファイバ１０を通過させられることにより、光路６のパルスレーザ光Ｌ１と異なる周波数帯域を有するパルスレーザ光Ｌ２’となる。また、同時に、パルスレーザ光Ｌ２’にはフォトニッククリスタルファイバ１０を通過することにより所定の周波数分散量が与えられる。ここで、図１の地点Ｃにおけるパルスレーザ光Ｌ２’は、図７に示すように、フォトニッククリスタルファイバ１０により、周波数が変換されるとともに、パルス時間幅が広がったチャープを有するパルスレーザ光である。
【００４８】
フォトニッククリスタルファイバ１０を通過したパルスレーザ光Ｌ２’は、フィルタ１１を透過することで不要成分（パルスレーザ光Ｌ２）が除去されてパルス列変換装置３０に入射する。
【００４９】
パルス列変換装置３０では、周波数調節装置３１によりパルスレーザ光Ｌ２’に周波数分散量が与えられ、分岐合波器３２により光路長の異なる２つの光路３５，３６に分岐される。また、光路３５，３６に分岐されたパルスレーザ光Ｌ３，Ｌ４は、反射器３３，３４によりそれぞれ反射され、分岐合波器３２により合波される。
【００５０】
このようにすることで、図８に示すように、合波部３２ｂ上において、パルスレーザ光Ｌ３，Ｌ４の時間的タイミングを異ならせることができる。これにより、図９に示すように、２つの光路３５，３６に分岐されたパルスレーザ光Ｌ３，Ｌ４を干渉させて、標本Ｓ内の特定の分子運動を誘発する振動周波数で繰り返されるパルス列（パルスレーザ光）Ｌ５に変換される。このパルス列（パルスレーザ光）Ｌ５はポンプパルス列として用いられる。
【００５１】
その後、パルスレーザ光Ｌ１’（プローブパルス列）とパルスレーザ光Ｌ５（ポンプパルス列）は、レーザコンバイナ８によって同軸に合波され、合波されたパルスレーザ光Ｌ６は顕微鏡本体３に入射する。
顕微鏡本体３に入射したパルスレーザ光Ｌ６は、スキャナ１２によって２次元的に走査された後、レンズ群２０と集光レンズ１３を介して標本Ｓ面上に集光される。標本Ｓを通過したパルスレーザ光Ｌ１’（プローブパルス列）は、標本Ｓを挟んで集光レンズ１３とは反対側に配置された集光レンズ１５によって集光され、フィルタ１４により不要成分（ポンプパルス列Ｌ５）が除去された後に、光検出器１６により検出される。
【００５２】
ここで、標本Ｓ面上のパルスレーザ光Ｌ６が集光された各位置において、ポンプパルス列Ｌ５により、標本中の特定の分子振動が励起される（マルチパルスインパルシブ誘導ラマン散乱）。この分子振動により、標本Ｓを通過するパルスレーザ光Ｌ６（パルスレーザ光Ｌ１’）、すなわち光検出器１６により検出される標本Ｓからの光の強度が変化する。したがって、パルスレーザ光Ｌ６の標本Ｓ面上での集光位置の座標と、光検出器１６により検出された標本Ｓからの光の強度とを対応づけて記憶することにより、２次元的な標本Ｓのイメージを得ることができる。
【００５３】
以上のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１によれば、パルス列変換装置３０により変換されたポンプパルス列Ｌ５により、標本Ｓ中の特定の分子振動が励起され（マルチパルスインパルシブ誘導ラマン散乱）、この分子振動により、光検出器１６により検出される標本Ｓからの光（パルスレーザ光Ｌ１’）の強度が変化する。したがって、この標本Ｓからの光の強度の変化から、ポンプパルス列Ｌ５により励起された分子振動と該分子の位置を標本Ｓのイメージに表示することができる。この際、スキャナ１２により標本Ｓ上でパルスレーザ光を走査しているので、標本Ｓを載置したステージ１８を集光レンズ１３の光軸に直交する方向に移動させる必要がなく、イメージの生成処理を高速で行うことができる。
【００５４】
また、パルス列変換装置３０において、２つの光路３５，３６を導光されてきたパルスレーザ光Ｌ３，Ｌ４の時間的タイミングを異ならせることで、２つの光路３５，３６に分岐されたパルスレーザ光Ｌ３，Ｌ４を干渉させて、標本内の特定の分子振動の周波数に一致した周波数で繰返されるポンプパルス列Ｌ５に変換することができる。また、２つの光路３５，３６の光路長を変化させることで、ポンプパルス列Ｌ５の繰り返し周波数を変化させることができる。
【００５５】
また、パルス列変換装置３０に周波数分散量調節装置３１を備えることで、分岐部３２ａに導光されるパルスレーザ光Ｌ２’’の周波数成分を時間軸上に分散させることができる。このため、例えばフェムト秒レーザ光のように比較的広い周波数スペクトル帯域を有するパルスレーザ光であっても、時間軸上の各時刻において、比較的狭い周波数スペクトル帯域を有するパルスレーザ光にすることができる。これにより、分岐部３２ａに導光されるパルスレーザ光Ｌ２’’の周波数スペクトル帯域に関わらず、２つの光路３５，３６に分岐されたパルスレーザ光を干渉させて、標本Ｓ内の特定の分子振動を励起する振動周波数で繰り返されるポンプパルス列Ｌ５に変換することができる。また、分岐部３２ａに導光されるパルスレーザ光Ｌ２’’の周波数分散量を調節することで、ポンプパルス列Ｌ５の繰り返し周波数を変化させることができる。
【００５６】
また、レーザ光源４から射出されたパルスレーザ光を２つの光路６，７に分岐し、これらパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２の周波数を互いに異なる周波数に変換することで、単一のレーザ光源４から発生したパルスレーザ光から、２つの異なる周波数（色）を有するパルスレーザ光を得ることができる。これにより、これらパルスレーザ光を容易に分光することができるとともに、これらパルスレーザ光のレーザ光源４を共通化して装置構成を簡略化することができる。
【００５７】
なお、集光レンズ１３とレンズ群２０との間に、所定の透過／反射率を有するビームスプリッタ、その後段にフィルタと光検出器とを設け、ビームスプリッタにより分岐された標本Ｓからの光を検出することとしてもよい。
【００５８】
また、２つの光路６，７のいずれか一方に、光路長を調節する光路調節装置を設けることで、２つの光路６，７を導光されるパルスレーザ光の標本Ｓ面上における時間的なタイミングを調節することができる。
【００５９】
〔第１の変形例〕
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１の第１の変形例について以下に説明する。
本変形例に係る周波数調節装置９は、プローブパルス列の周波数分散を調節するものである。この場合において、分散調節装置９を通過するパルスレーザ光Ｌ１には、所定の周波数分散量が与えられる。その結果、図１０に示すように、プローブパルス列（パルスレーザ光）Ｌ１’の時間幅は広がる。プローブパルス列Ｌ１’の時間幅を、ポンプパルス列（パルスレーザ光）Ｌ５の時間幅に近づくように周波数分散を調節し、ポンプパルス列Ｌ５とプローブパルス列Ｌ１’の時間的な重なりを大きくすることで、インパルシブ誘導ラマン散乱に起因したプローブパルス列Ｌ１’の強度変化を効率化することができる。
【００６０】
本変形例に係る周波数調節装置９は、例えば、所定の周波数分散量を有したガラス部材（図示略）で構成されていても良い。また、例えば、相互の間隔を調節可能な一対のプリズム（図示略）と、ミラー（図示略）で構成されていても良い。一対のプリズムを通過したパルスレーザ光Ｌ１は、ミラーによって折り返された後に再度プリズム対を通過し、同一の光路６上に戻されるようになっている。この場合に、プリズムの間隔を調節することにより、周波数調節装置９を通過するパルスレーザ光Ｌ１’に与える周波数分散量を調節することができるようになっている。また、上記一対のプリズムの代わりに一対の回折格子（図示略）を用いてもよい。
【００６１】
図１１に示すように、本変形例に係るレーザ顕微鏡装置１０１は、図１に示す構成要素に加えて、光検出器１６の前段に周波数選択装置（周波数選択手段）１４’を備えている。光検出器１６で検出される標本Ｓからの光（プローブパルス列）には、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光（ＣＡＲＳ光）が含まれている。このＣＡＲＳ光はポンプパルス列とプローブパルス列により発生し、そのエネルギーはプローブパルス列に比べ、周波数が標本Ｓ中の特定の分子振動のエネルギー分（テラヘルツ領域の振動相当分）だけ大きい。図１に示す本発明の第１の実施形態におけるフィルタ１４では、このＣＡＲＳ光成分は除去されないため、光検出器１６において標本Ｓからの光（プローブパルス列の強度変化）を検出する際に、このＣＡＲＳ光も含まれた状態で検出される。そこで、本変形例に係るレーザ顕微鏡装置１０１では、周波数選択装置（周波数選択手段）１４’により、ＣＡＲＳ光成分を除去することができる。こうすることで、プローブパルス列の強度変化をコントラスト良く検出することが可能となる。
【００６２】
周波数選択装置１４’は、例えば、特定の周波数帯域を通過させるフィルタ（図示略）であってもよい。また、周波数選択装置１４’は、例えば、回折格子で構成される分光装置（図示略）であってもよい。
【００６３】
また、周波数選択装置１４’において、プローブパルス列を除去し、標本Ｓからの光としてＣＡＲＳ光のみを光検出器１６で検出してもよい。ＣＡＲＳ光も標本中の特定の分子振動の情報が反映した光であるため、標本中の特定の分子振動の２次元イメージングが可能となる。
【００６４】
また、周波数選択装置１４’は、図１に示すフィルタ１４の役割も兼ね、フィルタ１４を除いても良い。このようにすることで、装置構成を簡略化することが可能となる。
【００６５】
また、周波数変換手段１０として、フォトニッククリスタルファイバの代わりに、周波数変換機能・作用を持つ、バルク、薄膜、フィルム、フォトニック結晶構造体、ＯＰＯ（Optical Parameteric Amplifier）のいずれかを用いても良い。
【００６６】
〔第２の変形例〕
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１の第２の変形例について以下に説明する。
図１２に示すように、本変形例に係るレーザ顕微鏡装置１０１は、図１に示す構成要素に加えて、光路６に配置された強度変調素子（強度変調手段）４１と、光検出器１６の感度を調節するロックインアンプ（感度調節手段）４２とを備えている。
【００６７】
強度変調素子４１は、光路６を導光されるパルスレーザ光Ｌ１’の注目成分の強度を変調するようになっている。
ロックインアンプ４２は、強度変調素子４１に同期して、光検出器１６における強度変調素子４１により強度の変調された注目成分の検出感度を調節するようになっている。
【００６８】
本変形例に係るレーザ顕微鏡装置１０１によれば、パルスレーザ光Ｌ１’の注目成分に対応する標本Ｓからの光の検出感度を向上することができる。これにより、ノイズを低減しつつ、パルスレーザ光Ｌ１’の注目成分に対応する部分が強調された標本Ｓのイメージを生成することができる。
なお、本変形例に係るレーザ顕微鏡装置１０１において、強度変調素子４１を光路７に配置して、パルスレーザ光Ｌ２’の注目成分の強度を変調することとしてもよい。
【００６９】
〔第２の実施形態〕
次に、本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１０２について、主に図１３から図２１を参照して説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１０２が第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１と異なる点は、プローブ光自体の強度変化ではなく、ポンプパルス列によって励起される標本中の特定の分子振動に起因する、標本における過渡的な屈折率変化（ラマン誘起カー効果）の異方性によって生ずる、プローブ光の偏光の変化を検出する点である。以下、本実施形態のレーザ顕微鏡装置１０２について、第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
【００７０】
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１０２は、図１３に示されるように、レーザ光源装置６２と、レーザ光源装置６２からのレーザ光を標本Ｓに照射して標本Ｓを観察するための顕微鏡本体６３とを備えている。
【００７１】
レーザ光源装置６２は、図１に示すレーザ光源装置２の構成要素に加えて、光路６に設けられた偏光素子（第１の偏光素子）５１およびλ／４波長板５４と、光路７に設けられた偏光素子（第３の偏光素子）５３とを備えている。
顕微鏡本体６３は、図１に示す顕微鏡本体３の構成要素に加えて、標本Ｓと光検出器１６との間に設けられた偏光素子（第２の偏光素子）５２を備えている。
【００７２】
偏光素子５１は、光路６における周波数調節装置９とレーザコンバイナ８との間に設けられており、光路６を導光されるパルスレーザ光Ｌ１’の偏光を所定の直線偏光に設定するようになっている。
【００７３】
偏光素子５３は、光路７におけるパルス列変換装置３０とレーザコンバイナ８との間に設けられており、偏光素子５１の偏光軸に対して０°から９０°の範囲の角をなす所定方向に偏光軸が設定されている。ここでは、偏光素子５３は、偏光素子５１の偏光軸に対して４５°をなす方向に偏光軸が設定されていることとして説明する。
【００７４】
偏光素子５２は、標本Ｓと光検出器１６との間に設けられており、偏光素子５１の偏光軸に直交する方向に偏光軸が設定されている。
【００７５】
λ／４波長板５４は、直交する偏光成分の間に位相差を生じさせる複屈折素子であり、偏光素子５１とレーザコンバイナ８との間に設けられている。具体的には、λ／４波長板５４は、光路６を導光されるパルスレーザ光Ｌ１’の互いに直交する偏光成分の間に位相差π／２（９０°）を生じさせ、パルスレーザ光Ｌ１’を楕円偏光もしくは円偏光から直線偏光に変換するようになっている。すなわち、λ／４波長板５４は、偏光素子５１で直線偏光に設定されたパルスレーザ光Ｌ１’が、レンズ群２０および集光レンズ１３を経由することで標本Ｓ上の地点Ｅにおいて楕円偏光となる場合に、再び直線偏光となるように補正できるようになっている。
【００７６】
上記構成を有するレーザ顕微鏡装置１０２の作用について以下に説明する。
レーザ光源４を作動させてパルスレーザ光を出射させると、レーザ光源４から発せられたパルスレーザ光は、ビームスプリッタ５により２つの光路６，７に分岐される。
光路６に分岐されたパルスレーザ光Ｌ１の一部は、光路６上に配置されている周波数調節装置９（バンドパスフィルタ）によって選択される（パルスレーザ光Ｌ１’）。このパルスレーザ光Ｌ１’はプローブパルス列として用いられ、そのエネルギー幅が１０から数１０波数程度であって、かつ時間幅が数ピコ秒から１０ピコ秒程度の光パルスである。
【００７７】
一方、第２の光路７に分岐されたパルスレーザ光Ｌ２は、ミラー１９によって偏向された後、周波数変換手段１０を通過させられることにより、光路６のパルスレーザ光Ｌ１と異なる周波数帯域を有するパルスレーザ光Ｌ２’となる。また、同時に、パルスレーザ光Ｌ２’には周波数変換手段１０を通過することにより所定の周波数分散量が与えられる。
【００７８】
周波数変換手段１０としては、フォトニッククリスタルファイバ、非線形光学結晶、ラマンシフタなどを用いることができる。その他に、周波数変換作用を有するバルク、薄膜、フィルム、フォトニック結晶構造体のいずれかを用いてもよい。
【００７９】
周波数変換手段１０を通過したパルスレーザ光Ｌ２’は、フィルタ１１を透過することで不要成分（パルスレーザ光Ｌ２）が除去されてパルス列変換装置３０に入射する。
【００８０】
パルス列変換装置３０では、周波数調節装置３１によりパルスレーザ光Ｌ２’に周波数分散量が与えられ、分岐合波器３２により光路長の異なる２つの光路３５，３６に分岐される。また、光路３５，３６に分岐されたパルスレーザ光Ｌ３，Ｌ４は、反射器３３，３４によりそれぞれ反射され、分岐合波器３２により合波される。これにより、２つの光路３５，３６に分岐されたパルスレーザ光Ｌ３，Ｌ４を干渉させて、テラヘルツ周波数領域において一定の繰り返し周波数を有する光パルス列である、パルスレーザ光Ｌ５(ポンプパルス列)が発生する。このパルスレーザ光Ｌ５の光パルス列の繰り返し周波数は、標本内の特定の分子振動の振動周波数（もしくはその振動周波数を正の整数値で割算した周波数）に同調させることが可能であり、マルチパルスインパルシブ誘導ラマン散乱の励起光として用いられる。
【００８１】
その後、パルスレーザ光Ｌ１’（プローブパルス列）とパルスレーザ光Ｌ５（ポンプパルス列）は、レーザコンバイナ８によって同軸に合波され、合波されたパルスレーザ光Ｌ６は顕微鏡本体６３に入射する。顕微鏡本体６３に入射したパルスレーザ光Ｌ６は、スキャナ１２によって２次元的に走査された後、レンズ群２０と集光レンズ１３を介して標本Ｓ面上に集光される。
【００８２】
ここで、図１４に、地点Ｅにおけるパルスレーザ光Ｌ１’（プローブパルス列）及びパルスレーザ光Ｌ５（ポンプパルス列）の偏光状態を示す。地点Ｅにおいて、偏光素子５１の偏光軸、すなわちパルスレーザ光Ｌ１’（プローブパルス列）の偏光方向に対して、パルスレーザ光Ｌ５（ポンプパルス列）の偏光方向は４５°、偏光素子５２の偏光軸は９０°に設定されている。したがって、パルスレーザ光Ｌ５（ポンプパルス列）が標本Ｓへ照射されない場合には、パルスレーザ光Ｌ１’は偏光素子５２を透過しないようになっている。
【００８３】
図１５は、パルスレーザ光Ｌ６が標本Ｓに照射される場合に、標本Ｓを透過したパルスレーザ光Ｌ１’の偏光状態の変化を示している。標本Ｓ面上のパルスレーザ光Ｌ６が集光された各位置において、パルスレーザ光Ｌ５（ポンプパルス列）により、ポンプパルス列の繰り返し周波数と等しい周波数を有する、標本Ｓ中の特定の分子振動が励起される(マルチパルスインパルシブ誘導ラマン散乱)。この分子振動によって、標本Ｓにおいて分子振動の周波数で変化する過渡的な屈折率変化(ラマン誘起カー効果)が生じる。ここでパルスレーザ光Ｌ５の偏光によって、標本Ｓに過渡的な屈折率変化に異方性が生じているために、標本Ｓを透過するパルスレーザ光Ｌ１’（プローブパルス列）の偏光は、図１５に示すように直線偏光から楕円偏光へと変化する。
【００８４】
このように標本Ｓを透過し、楕円偏光となったパルスレーザ光Ｌ１’およびパルスレーザ光Ｌ５光は、標本Ｓを挟んで集光レンズ１３とは反対側に配置された集光レンズ１５によって集光され、フィルタ１４により不要成分（パルスレーザ光Ｌ５）が除去される。
【００８５】
その後、偏光素子５２により、楕円偏光となったパルスレーザ光Ｌ１’のうち、偏光素子５２の偏光軸に平行な偏光成分のみが選択され、光検出器１６により検出される。このように検出されたパルスレーザ光Ｌ１’光の偏光変化成分(標本Ｓからの信号光)の強度と、パルスレーザ光Ｌ６の標本Ｓ面上での集光位置の座標とを対応づけて記憶することにより、２次元的な標本Ｓのイメージを得ることができる。
【００８６】
以下に、テラヘルツ領域の分子振動の検出原理について図１６から図２１を用いて詳細に説明する。
図１６において、パルスレーザ光Ｌ５（ポンプパルス列）の強度の時間プロファイルを細い実線で、パルスレーザ光Ｌ１’の強度の時間プロファイルを点線で示す。パルスレーザ光Ｌ５は、一定の繰り返し周波数を有する光パルスの繰り返し列であり、その光パルス列の繰り返し周波数がωであるとする。一方、パルスレーザ光Ｌ１’は、その時間幅が数ピコ秒から１０ピコ秒程度であって、パルスレーザ光Ｌ５における光パルスの繰り返しの持続時間程度もしくはそれ以上である。
【００８７】
図１７において、パルスレーザ光Ｌ５(ポンプパルス列)の強度の時間プロファイルを実線で、パルスレーザ光Ｌ５が標本Ｓへ非照射の場合において、光検出器１６により検出される、標本Ｓからの信号光の強度の時間プロファイルを太い実線で示す。パルスレーザ光Ｌ５の非照射時には、パルスレーザ光Ｌ１’の偏光が変化せずに直線偏光となっているため、プローブ光は偏光素子５２により遮断され、光検出器１６により標本Ｓからの信号光は検出されない。
【００８８】
一方、図１８では、パルスレーザ光Ｌ５が標本Ｓへ照射され、かつポンプパルス列の繰り返し周波数が標本Ｓの特定の分子振動の周波数に非共鳴の場合において、光検出器１６により検出される、標本Ｓからの信号光の強度の時間プロファイルが示されている。ここで、パルスレーザ光Ｌ５(ポンプパルス列)の強度の時間プロファイルは実線、標本Ｓに照射されるパルスレーザ光Ｌ１’の時間プロファイルは点線、標本Ｓを透過するパルスレーザ光Ｌ１’のうち、偏光素子５２で偏光選択されて光検出器１６により検出される成分、すなわち、標本Ｓからの信号光の強度の時間プロファイルは太い実線でそれぞれ表されている。
【００８９】
この場合には、偏光素子５２を透過するパルスレーザ光Ｌ１’の成分、すなわち標本Ｓからの信号光は、ポンプパルス列に誘起される標本Ｓ中の分子の電子分極の変化に起因する。このような物理機構による標本Ｓからの信号光を非共鳴信号光と称する。分子の電子分極の変化は光照射に対して瞬間的に発生するため、標本Ｓからの信号光の強度は、繰り返し周波数がωのポンプパルス列強度の時間変化に追随してほぼ同一の時間挙動を示す。したがって図１８に示すように、光検出器１６において、標本Ｓからの信号光(非共鳴信号光)は、繰り返し周期ωを有するパルス列として検出されることとなる。
【００９０】
また、図１９は、光検出器１６により検出される標本Ｓからの信号光、すなわち、図１８における標本Ｓからの信号光をフーリエ変換した周波数スペクトルである。ここでωprobeは、パルスレーザ光Ｌ１’の中心周波数である。図１８で示したように、標本Ｓからの信号光(非共鳴信号光)は、周波数ωprobeのパルスレーザ光Ｌ１’を、ポンプパルス列の繰り返し周波数ωで強度変調された光に相当するため、図１９で示すように、その周波数スペクトルにおいては、パルスレーザ光Ｌ１’の周波数ωprobeの側波帯として、ωprobe±ωの周波数に非共鳴信号のバンドが現れることになる。
【００９１】
さらに、図２０は、パルスレーザ光Ｌ５が標本Ｓへ照射され、かつポンプパルス列の繰り返し周波数が標本Ｓの特定の分子振動の周波数に共鳴の場合において、光検出器１６により検出される、標本Ｓからの信号光の強度の時間プロファイルを示している。ここで、パルスレーザ光Ｌ５(ポンプパルス列)の強度の時間プロファイルは実線、標本Ｓに照射されるパルスレーザ光Ｌ１’の強度の時間プロファイルは点線、および標本Ｓを透過するパルスレーザ光Ｌ１’のうち、偏光素子５２で偏光選択されて光検出器１６により検出される成分、すなわち、標本Ｓからの信号光の強度の時間プロファイルは太い実線でそれぞれ表されている。
【００９２】
この場合には、ポンプパルス列によりインパルシブ誘導ラマン散乱が励起され、特定の分子振動の振動周波数ωで変化する３次非線形分極を発生する結果、ラマン誘起カー効果による屈折率変化が標本Ｓ中に誘起されている。前述したように、この屈折率変化の異方性により標本Ｓからの信号光が発生するが、このような物理機構による標本Ｓからの信号光を共鳴信号光と称する。この共鳴信号光の強度は、３次非線形分極の２乗に比例する量であるので、光検出器１６において、標本Ｓからの信号光(共鳴信号光)は繰り返し周期２ωを有するパルス列として検出されることになる。さらに、光検出器１６においては、標本Ｓからの信号光(非共鳴信号光)も検出されるが、この非共鳴信号光の時間変化は、前述したようにポンプパルス列強度の時間変化と同一であり、周波数ωで振動する。
【００９３】
また、図２１は、光検出器１６により検出される標本Ｓからの信号光、すなわち、図２０における標本Ｓからの信号光をフーリエ変換した周波数スペクトルである。ここでωprobeは、パルスレーザ光Ｌ１’の中心周波数である。図２０で示したように、標本Ｓからの信号光は、周波数ωprobeのパルスレーザ光Ｌ１’が周波数２ωおよびωで強度変調された光に相当するため、図２１で示すように、その周波数スペクトルにおいては、パルスレーザ光Ｌ１’の周波数ωprobeの側波帯として、ωprobe±２ωおよびωprobe±ωの周波数に共鳴信号光および非共鳴信号光のバンドが現れることになる。
【００９４】
以上のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１０２によれば、偏光素子５１により偏光されたパルスレーザ光Ｌ１’（プローブパルス列）を偏光素子５２により遮断する一方、パルスレーザ光Ｌ５（ポンプパルス列）で標本Ｓの特定の分子運動を励起し、これによって標本Ｓに過渡的な屈折率異方性を発生させて、標本Ｓからの信号光を透過させることができる。これにより、光検出器１６において、標本Ｓの特定の分子振動によって偏光方向が変化した標本Ｓからの信号光を検出することができ、分子振動が励起された分子の位置および状態が表示された標本Ｓのイメージを生成することができる。
【００９５】
ここで、偏光素子５２と光検出器１６との間に波長選択素子５５を配し、前述した標本Ｓからの信号光において、標本の分子振動に起因する共鳴信号光の強度変化の周波数が２ω、電子分極に起因する非共鳴信号光の強度変化の周波数がωであること着目して、共鳴信号光のみを選択して光検出器１６で検出するようにしてもよい。このようにすることで、パルスレーザ光Ｌ５（ポンプパルス列）に励起された標本Ｓの特定の分子振動によって生ずる、標本Ｓからの光(共鳴信号光)のみを検出することができ、コントラストの良好な標本Ｓのイメージイメージを生成することができる。
【００９６】
上記の波長選択素子５５としては、分光器、エタロンもしくは干渉フィルタのいずれかを用いればよい。
【００９７】
また、偏光素子５１とレーザコンバイナ８との間にλ／４波長板５４を備えることで、偏光素子５２へ入射するパルスレーザ光Ｌ１’（プローブパルス列）を楕円偏光から直線偏光に変換することができる。これにより、パルスレーザ光Ｌ５（ポンプパルス列）により励起された標本Ｓの特定の分子振動によって偏光が変化した標本Ｓからの光のみを光検出器１６で検出することができ、標本Ｓのイメージのコントラストを向上することができる。
【００９８】
〔第１の変形例〕
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１０２の第１の変形例について以下に説明する。
図２２に示すように、本変形例に係るレーザ顕微鏡装置１０３は、図１３に示す構成要素に加えて、光路７にλ／４波長板７１を備えている。
【００９９】
λ／４波長板７１は、直交する偏光成分の間に位相差を生じさせる複屈折素子であり、偏光素子５３とレーザコンバイナ８との間に設けられている。具体的には、λ／４波長板５４は、光路７を導光されるパルスレーザ光Ｌ５の互いに直交する偏光成分の間に位相差π／２（９０°）を生じさせ、図２３に示すように、パルスレーザ光Ｌ５（ポンプ光）を直線偏光から円偏光に変換するようになっている。
【０１００】
ポンプパルス列が円偏光である場合に、ポンプパルス列よって誘起される、標本中の分子の３次非線形感受率は、以下の（２）式で与えられることが知られている（参照文献：
Harvey AB. Chemical Applications of Nonlinear Raman Spectroscopy, Academic Press: New York, 1981.）。
【０１０１】
【数２】
0005508899.tif 000003
【０１０２】
上記の（２）式において、ρは偏光解消比、ω１およびω２はインパルシブ誘導ラマン散乱過程に寄与する光パルス周波数を表していて、ポンプパルス列が有する周波数帯域に含まれる。また、σはラマン散乱断面積、Ｔは温度である。インパルシブ誘導ラマン散乱により励起される標本Ｓ中の分子の電子分極に起因する光、すなわち非共鳴信号光の偏光解消比ρは１／３であり、上記の（２）式から非共鳴信号光は原理的には消光される。
【０１０３】
図２４は、パルスレーザ光Ｌ５（ポンプパルス列）が標本Ｓへ照射され、かつパルス列の繰り返し周波数が標本Ｓの特定の分子振動の周波数に非共鳴の場合において、光検出器１６により検出される、標本Ｓからの信号光強度の時間プロファイルを示している。ここで、ポンプパルス列の強度の時間プロファイルは実線、パルスレーザ光Ｌ１’の時間プロファイルは点線、標本Ｓからの信号光強度の時間プロファイルは太い実線でそれぞれ表される。
【０１０４】
この場合には、分子振動に起因する標本Ｓからの信号光（共鳴信号光）は発生せず、光検出器１６では、分子振動によらない標本からの光が検出される。この標本からの光に寄与するのは、ラマン誘起カー効果による非共鳴信号光、および同時に発生するコヒーレントアンチストークスラマン散乱における非共鳴信号光であるが、前述したようにラマン誘起カー効果による非共鳴信号光は消光される。したがって、図２４に示しように、図１８に図示した場合と比較して、強度が低減された繰り返し周波数ωの信号が検出されることになる。
【０１０５】
図２５は、パルスレーザ光Ｌ５(ポンプパルス列)が標本Ｓへ照射され、かつパルス列の繰り返し周波数が標本Ｓの特定の分子振動の周波数に共鳴している場合において、光検出器１６により検出される、標本Ｓからの信号光強度の時間プロファイルを示している。ここで、ポンプパルス列の強度の時間プロファイルは細い実線、標本Ｓに照射されるパルスレーザ光Ｌ１’の時間プロファイルは点線、および標本Ｓからの信号光の強度の時間プロファイルは太い実線でそれぞれ表されている。
【０１０６】
この場合には、ポンプパルス列に励起される標本中の特定の分子振動による共鳴信号光として、強度が該振動の有する偏光解消比に従い、繰り返し周波数２ωの光が発生する。したがって、図２５に示すように、強度が低減された非共鳴信号が繰り返し周期ωで検出されるとともに、共鳴信号光が繰り返し周期２ωで検出されることとなる。
【０１０７】
本変形例に係るレーザ顕微鏡装置１０３によれば、λ／４波長板７１を備えることで、ポンプパルス列の偏光を直線偏光から円偏光に変化させることができ、ポンプパルス列に励起される、標本Ｓ中の分子の分子振動によらない光（非共鳴信号光）を低減することができる。これにより、標本Ｓ中の分子の特定の分子振動による光（共鳴信号光）のみを検出することができ、鮮明な標本Ｓのイメージを生成することができる。
【０１０８】
非共鳴信号成分が共鳴信号成分に比して弱い場合には、偏光素子５２を透過してくる標本Ｓからの光を光検出器１６で直接検出すれば、特定のテラヘルツ振動による信号成分を検出することが可能であり、標本Ｓのイメージのコントラストを向上することができる。
【０１０９】
また、波長選択素子を光検出器１６の前段に配置して、共鳴信号成分のみを選択して検出するようにしてもよい。このようにすることで、非共鳴信号成分が共鳴信号成分に比して相対的に強い場合でも、標本Ｓのイメージのコントラストを向上することができる。
【０１１０】
〔第２の変形例〕
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１０２の第２の変形例について以下に説明する。
図２６に示すように、本変形例に係るレーザ顕微鏡装置１０４は、図２２に示す構成要素に加えて、標本Ｓの後段に、λ／４波長板７５と、偏光素子（分岐手段）７６と、光検出器（第１の検出器）１６ａおよび光検出器（第２の検出器）１６ｂと、差分算出部７７とを備えている。
【０１１１】
λ／４波長板７５は、直交する偏光成分の間に位相差を生じさせる複屈折素子であり、フィルタ１４と偏光素子７６との間に設けられている。具体的には、λ／４波長板７５は、標本Ｓからの光の互いに直交する偏光成分の間に位相差π／２（９０°）を生じさせ、標本Ｓからの光を直線偏光から円偏光に変換するようになっている。
【０１１２】
偏光素子７６は偏光ビームプリッタであり、λ／４波長板７５を透過した標本Ｓからの光を互いに直交する偏光成分を有する光に分岐するようになっている。光検出器１６ａと光検出器１６ｂは、偏光素子７６によって分岐された互いに直交する偏光成分を検出するようになっている。差分算出部７７は、光検出器１６ａおよび検出器１６ｂにより検出された、互いに直交する偏光成分の差分を算出するようになっている
【０１１３】
上記構成を有するレーザ顕微鏡装置１０４の作用について以下に説明する。
ポンプパルス列の非照射時には、図２７（ａ）に示すように、標本Ｓを透過するプローブパルス列は直線偏光である。このプローブパルス列は、λ／４波長板７５を通過することで、図２７（ｂ）に示すように、円偏光に変換される。円偏光に変換されたプローブパルス列は、偏光素子７６により互いに直交する偏光を有する成分に分岐され、各成分が光検出器１６ａおよび光検出器１６ｂに検出される。この場合、差分算出部７７により算出される各成分の差分は、図２７（ｃ）に示すように零となる。
【０１１４】
一方、ポンプパルス列の照射時には、ラマン誘起カー効果によって標本Ｓに過渡的な屈折率変化の異方性が生じるため、標本Ｓを透過したプローブパルス列は、図２８（ａ）に示すように楕円偏光となっている。このプローブパルス列は、λ／４波長板７５を通過しても、図２８（ｂ）に示すように、円偏光ではなく楕円偏光のままである。この楕円偏光に変換されたプローブパルス列は、偏光素子７６により互いに直交する偏光を有する成分に分岐され、各成分が光検出器１６ａおよび光検出器１６ｂに検出される。この場合、差分算出部７７により算出される各成分の差分は、図２８（ｃ）に示すように非零値となる。
【０１１５】
ここから、本変形例における標本からの信号光の検出方法を用いる場合に、生ずる効果について説明する。まず、第２の実施形態およびその第１の変形例に記載される検出法を用いる場合を想定する。図１３または図２２において、偏光素子５１で設定されるプローブパルス列の直線偏光が、偏光素子５２へ入射する直前までに経由する光学素子によって変化しないとする。
【０１１６】
この場合には、偏光素子５１の偏光軸に対して、偏光軸を直交するように設定した偏光素子５２によりプローブパルス列は遮断される。この遮断の程度（偏光素子の消光比）が大きいほど、光検出器１６で検出される標本Ｓからの信号光以外の背景光の強度を抑制することができ、コントラストの良好な標本Ｓのイメージを取得することができる。しかしながら、パルスレーザ光Ｌ６を標本Ｓへ集光する際に、集光レンズ１３および１５として、対物レンズのような開口数の大きなレンズが使用される場合には、偏光素子５２の直前の地点におけるプローブパルス列の偏光としては、特定方向への直線偏光が保存されずに偏光が変化した成分が発生し、標本のイメージのコントラストを劣化させる原因となる。
【０１１７】
一方、本変形例によれば、図２６のλ／４波長板７５の直前におけるプローブパルス列の偏光成分について、図２７（ａ）に示されるような、偏光素子５１で設定された方向の直線偏光を保持している成分については、前述したように差分算出部７７で算出される差分値は零値である。さらに、図２９（ａ）に示すように、λ／４波長板７５の直前において、レンズ等の光学素子によって偏光が変化したプローブパルス列の偏光成分の中には、プローブパルス列の偏光方向を対称軸として、標本面内において線対称の関係を満足する偏光成分（例えば、図２９（ａ）のプローブパルス列Ａとプローブパルス列Ｂ）が生じている。
【０１１８】
このような偏光成分については、λ／４波長板７５透過後には、図２９（ｂ）に示すように、それぞれプローブパルス列の偏光方向を対称軸とする楕円偏光(プローブパルス列Ｃとプローブパルス列Ｄ)となっている。この場合には、図２９（ｃ）に示すように、各々の楕円偏光(プローブパルス列Ｃとプローブパルス列Ｄ)は、偏光素子７６により互いに直交する偏光を有する成分に分岐され、光検出器１６ａおよび光検出器１６ｂで検出後に差分算出部７７でその差分が算出されるが、これら楕円偏光の対についての差分の総和は零値となる。
【０１１９】
このように本変形例の検出方法によれば、パルスレーザ光Ｌ１’(プローブパルス列)が光学素子群を経由することにより、偏光素子５１で設定される直線偏光を擾乱された結果、背景光が標本Ｓのイメージを劣化させる場合であっても、差分算出部７７において擾乱で生じた偏光変化成分の一部を相殺できるために、背景光の影響を抑制して標本Ｓのイメージのコントラストを改善する効果がある。
【０１２０】
以上のように、本変形例に係るレーザ顕微鏡装置１０４によれば、標本Ｓからの光をλ／４波長板７５により直線偏光から円偏光に変換し、その光の直交方向の差分を算出することで、ポンプ光により誘発された標本Ｓの分子運動によって偏光方向が変化した標本Ｓからの光を検出することができ、パルスレーザ光Ｌ５（ポンプ光）により運動が誘発された分子の位置および状態を標本Ｓのイメージに表示することができる。
なお、本変形例に係るレーザ顕微鏡装置１０４において、λ／４波長板７１のない構成としてもよく、またλ／４波長板７１を挿脱可能な構成としてもよい。
【０１２１】
以上、本発明の各実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
例えば、周波数調節装置９および周波数調節装置３１として、プリズム対とミラーとを備えて、周波数分散量を連続的に変更可能なものを例示したが、これに代えて、周波数分散量が固定のもの、それらを複数用意し、段階的に切り替える方式のものや、光路上に挿脱されてパルスレーザ光に与える分散量を切り替える方式のものを採用してもよい。
【符号の説明】
【０１２２】
Ｓ  標本
Ｌ１，Ｌ２，Ｌ２’，Ｌ２’’，Ｌ３，Ｌ４，Ｌ６  パルスレーザ光
Ｌ１’  パルスレーザ光（プローブ光）
Ｌ５  パルスレーザ光（ポンプ光、パルス列）
１，１０１，１０２，１０３，１０４  レーザ顕微鏡装置
２，６２  レーザ光源装置
３，６３  顕微鏡本体
４  レーザ光源
５  ビームスプリッタ（分岐手段）
６，７  光路
８  レーザコンバイナ（合波手段）
９  周波数調節装置（周波数分散量調節手段）
１０  フォトニッククリスタルファイバ（周波数変換手段）
１１  フィルタ
１２  スキャナ（走査手段）
１３  集光レンズ（照射手段）
１４  フィルタ
１４’周波数選択装置（周波数選択手段）
１６  光検出器（光検出手段）
１６ａ  光検出器（第１の検出器）
１６ｂ  光検出器（第２の検出器）
３０  パルス列変換装置（パルス列変換手段）
３１  周波数調節装置（周波数分散調節手段）
３２  分岐合波器
３２ａ  分岐部
３２ｂ  合波部
３３，３４  反射器
３５，３６  光路
４１  強度変調素子（強度変調手段）
４２  ロックインアンプ（感度調節手段）
５１  偏光素子（第１の偏光素子）
５２  偏光素子（第２の偏光素子）
５３  偏光素子（第３の偏光素子）
５４  λ／４波長板
７１  λ／４波長板
７５  λ／４波長板
７６  偏光素子（分岐手段）
７７  差分算出部
【図１】
0005508899.tif 000004
【図２】
0005508899.tif 000005
【図３】
0005508899.tif 000006
【図４】
0005508899.tif 000007
【図５】
0005508899.tif 000008
【図６】
0005508899.tif 000009
【図７】
0005508899.tif 000010
【図８】
0005508899.tif 000011
【図９】
0005508899.tif 000012
【図１０】
0005508899.tif 000013
【図１１】
0005508899.tif 000014
【図１２】
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【図１３】
0005508899.tif 000016
【図１４】
0005508899.tif 000017
【図１５】
0005508899.tif 000018
【図１６】
0005508899.tif 000019
【図１７】
0005508899.tif 000020
【図１８】
0005508899.tif 000021
【図１９】
0005508899.tif 000022
【図２０】
0005508899.tif 000023
【図２１】
0005508899.tif 000024
【図２２】
0005508899.tif 000025
【図２３】
0005508899.tif 000026
【図２４】
0005508899.tif 000027
【図２５】
0005508899.tif 000028
【図２６】
0005508899.tif 000029
【図２７】
0005508899.tif 000030
【図２８】
0005508899.tif 000031
【図２９】
0005508899.tif 000032