(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ  ID NO:2又は3からなるアミノ酸配列を含み、以下の群より選択される１以上のアミノ酸置換を含む単離されたグルコアミラーゼ変異種：
T010F：T010G：T010M：T010R：T010S：F059A：A059G：N061V：E068I：E068M：E068W：A072E：A072Q：G073W：S097V：A099C：A099L：S102A：K140Q：K140S：K140W：N153D：N153L：N153W：N182R：A204D：A204M：T205D：T205N：T205P：T205S：T205V：T205Y：S214T：W228A：W228F：W228G：W228H：W228I：W228L：W228M：W228T：V229E：V229I：V229M：V229N：V229Q：S230C：S230D：S230E：S230F：S230G：S230H：S230K：S230L：S230N：S230P：S230Q：S230R：S230T：S230V：S230Y：S231C：S231D：S231F：S231L：S231M：S231N：S231Q：S231R：S231V：S231Y：D236F：D236G：D236L：D236M：D236N：D236P：D236T：D236V：T241V：N242F：L264A：G265E：G265H：G265I：G265K：G265R：G265T：A268C：A268D：A268E：A268F：A268G：A268I：A268K：A268L：A268P：A268R：A268T：A268W：D276S：V284R：V284T：V284Y：S291A：S291E：S291F：S291H：S291K：S291N：S291P：S291W：P300R：A301K：A301L：A301P：A301S：A301W：A303I：A303L：A311S：A311Y：V338P：V338Q：V338S：V338Y：S344A：S344T：S346M：T346N：T346P：T346Q：T346Y：A349L：V359Q：V359R：G361H：G361L：G361R：A364M：A364W：T375E：T375H：T375V：T375W：T375Y：N379A：N379C：N379D：N379G：N379I：N379M：N379P：S382A：S382N：S382P：E391L：E391R：E391W：E391Y：A393E：A393G：A393H：A3931：A393K：A393L：A393M：A393N：A393Q：A393R：A393S：A393T：A393V：A393W：A393Y：K394A：K394H：K394L：K394M：K394Q：K394R：K394T：K394V：S410E：S410H：S410N：L417I：L417K：L417Q：L417R：L417V：L417Y：T430A：T430E：T430F：T430H：T430I：T430K：T430M：T430N：T430Q：T430R：T430V：A431I：A431R：R433A：R433M：R433W：R433Y：S444K：S444M：S444Q：T448F：T448I：T448Q：T448V：S451K。
【請求項２】
請求項１に記載の変異種をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項４】
請求項１に記載のグルコアミラーゼ変異種を含む酵素組成物。
【請求項５】
請求項４の酵素組成物であってさらにアルファアミラーゼを含む酵素組成物。
【請求項６】
請求項４の酵素組成物であって、前記組成物はデンプン変換法で使用される酵素組成物。
【請求項７】
請求項４の酵素組成物であって、前記組成物は動物飼料調合物で使用される酵素組成物。
【請求項８】
請求項４の酵素組成物であって、前記組成物はアルコール発酵法で使用される酵素組成物。
【請求項９】
請求項２のポリヌクレオチドを含むDNA構造体により宿主細胞を形質転換し、前記グルコアミラーゼ変異種を発現させ、産生させるために適した条件で当該宿主細胞を培養し、前記変異種を産生させることを含む、宿主細胞において変異グルコアミラーゼを産生する方法。
【請求項１０】
請求項９の方法であってさらに前記培地から当該グルコアミラーゼを回収することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願の相互参照
本出願は２００７年１０月９日出願の国際特許出願PCT/US/21683基づく優先権を主張する。国際特許出願PCT/US/21683は、2006年10月10日出願の米国仮特許出願60/850,431に基づく優先権を主張している。両出願の内容はその全部を引用により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は性質が変更された（例．熱安定性及び/又は特異的活性の改善）親グルコアミラーゼの変異種に関する。特に、本発明は、デンプン加水分解性組成物、動物飼料組成物及び洗浄剤組成物等の、このグルコアミラーゼ変異種を含む組成物を提供する。本発明はまた、この変異種をコードするDNA構造体と宿主細胞にこのグルコアミラーゼ変異種を産生する方法に関連する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景
グルコアミラーゼ酵素は（グルカン1,4-α-グルコヒドロラーゼ、EC3.2.1.3）は、デンプン加水分解エキソ型炭水化物分解酵素であり、デンプン又は関連するオリゴ糖及び多糖分子の非還元性末端から、連続するグルコース単位の切断を触媒する。グルコアミラーゼはデンプンの直鎖の及び分岐したグルコースの結合（例．アミロースとアミロペクチン）の両者を加水分解できる。
【０００４】
グルコアミラーゼは、細菌、菌類、酵母及び植物の多くの株により産生されている。特に、興味深く、商業的に重要なグルコアミラーゼは細胞外に産生される菌類の酵素であり、例えばアスペルギルス属 (Svenssonら、(1983)、Carlsberg Res.Commun.48:529-544;Boelら(1984) EMBO J.3:1097-1102 ; HayashidaらAgric.Biol.Chem.53:923-929;USP5,024,941;USP4,794,175及びWO88/09795)；タラロマイセス属(Talaromyces)（USP4,247,637;USP6,255,084及びUSP6,620,924）；リソプス属(Rhizopus)（Ashikariら(1986) Agric.Biol.Chem.50:957-964;Ashikariら(1989)App. Microbiol. And Biotech.32:129-133及びUSP4,863,864）；フミコラ属（Humicola）（WO05/052148及びUSP4,618,579）及びムコル属(Mucor)(Houghton-Larsenら(2003)Appl.Microbiol.Biotechnol.62:210-217) の株から産生されるものである。これらの酵素をコードする遺伝子の多くはクローニングされ酵母、菌類及び/又は細菌の細胞に発現されている。
【０００５】
商業的に、グルコアミラーゼは非常に重要な酵素でありデンプンの加水分解を要する広い用途で使用されてきた（例.デンプンからグルコースと他の単糖を生産する場合）。グルコアミラーゼは高い含量のフルクトースとうもろこし甘味料を生産するために使用され、米国の甘味剤市場の50%より多くを占めている。一般的に、グルコアミラーゼはデンプンを加水分解しデキストリンとし、次にグルコースへ加水分解するデンプン加水分解法において、アルファアミラーゼとともに使用することができ、普通に、使用されている。グルコースは、その後他の酵素（例．グルコース異性化酵素）によりフルクトースへ変換され、結晶化され又は、発酵で使用され多くの目的物となる（例．エタノール、クエン酸、乳酸、コハク酸、アスコルビン酸中間体、グルタミン酸、グリセロールと１，３−プロパンジオール）。デンプン及び/又はセルロース含有物質の発酵でグルコアミラーゼを使用することにより生産されるエタノールは燃料源又はアルコール性飲食料の原料として使用できる。
【０００６】
グルコアミラーゼは多年にわたり事業用に成功裏に使用されてきたが、性質を変えた新しいグルコアミラーゼに対する需要は依然存在する。
【発明の概要】
【０００７】
発明の要約
ある面では、本発明は、次の残基の位置に対応する位置で１以上のアミノ酸置換をもつ単離されたグルコアミラーゼ変異種に関する。即ち、SEQ ID NO:2又はSEQ ID NO:3の10,14,15,23,42,45,46,59,60,61,67,68,72,73,97,98,99,102,108,110,113,114,122,124,125,133,140,144,145,147,152,153,164,175,182,204,205,214,216,219,228,229,230,231,236,239,240,241,242,244,263,264,265,268,269,276,284,291,300,301,303,310,311,313,316,338,342,344,346,349,359,361,364,379,382,390,391,393,394,408,410,415,417,418,430,431,433,436,442,443,444,448及び451又は親グルコアミラーゼの同等の位置である。いくつかの実施態様では、親グルコアミラーゼはSEQID NO :1,4,5,6,7,8又は9の配列を含む。いくつかの実施態様では、親グルコアミラーゼはトリコデルマ属の種、アスペルギルス属の種、フミコラ属の種、ペニシリウム属の種、タラロマイセス属の種又はシゾサッカリマイセス属の種から得られる。さらに別の実施態様では、親の同等の位置は配列の同定により決定される。他の実施態様では、親グルコアミラーゼは、SEQID NO:２と少なくとも80%配列が同じである。別の実施態様では、親株での同等の位置はSEQID NO2又は3との構造的な一致により決定される。この面のさらに別の実施態様では、この変異種は以下から選ばれた位置で置換されている。
即ち、SEQ ID:ID2又はSEQIDNO:3のT10D/F/G/K/L/M/P/R/S; L14E/H;N15D/N;P23A/G;  F59A/G;K60F/H;N61D/I/L/Q/V/W;R65A/C/G/I/K/M/S/V/Y;T67C/I/K/M/T;E68I/M/W;  A72E/G/L/M/Q/R/W/Y;G73C/L/W;S97F/M/N/P/R/S/V/W/Y;L98H/M;A99C/L/M/N/P;S102A/C/I/L/M/N/R/V/W/Y;E110Q/S/W;L113E/N;K114C/D/E/L/M/Q/S/T/V;I133K/R/S/T;
0005594898.tif 000002
0005594898.tif 000003
S444/M/N/P/Q/R/T/V/W;T448F/G/I/P/Q/T/V;及びS541E/H/K/L/Q/T、または親グルコアミラーゼの同等の位置である。
【０００８】
別の面では、本発明は以下の位置に対応する位置で１以上のアミノ酸置換を含む単離されたグルコアミラーゼ変異種に関連する。即ちSEQID NO:2又はSEQIDNO:3の10,14,15,42,45,46,
0005594898.tif 000004
364,379,382,390,391,393,394,408,410,415,417,418,430,431,433,436,442,443,444,448及び451である。この面の別の実施態様では、このグルコアミラーゼ変異種はSEQIDNO:2又はSEQIDNO:3の61,67,72,97,102,133,205,219,228,230,231,239,263,268,291,342,  394,430,431及び451に対応する位置で１以上のアミノ酸置換を含む。この面のさらに別の実施態様では、このグルコアミラーゼ変異種は以下のうち少なくとも１個に対応する１以上のアミノ酸置換を受けている。即ち、SEQIDNO:2又はSEQIDNO:3のT67M,A72Y,S97N,  S102M,I133T,T205Q,Q219S,W228M,S230F,S230G,S230N,S230R,S231L,I239V,I239Y,  N263P,A268C,A268G,A268K,S291A,T342V,K394S,T430K,A431Q,S451Kである。
【０００９】
さらに別の実施態様では、本発明のグルコアミラーゼ変異種は親グルコアミラーゼと比較して変更された性質を有している。いくつかの実施態様では、変更された性質はSEQIDNO:2、SEQIDNO:3の配列を含むグルコアミラーゼ又は、SEQID:NO2と少なくとも80%同一の配列を含む親グルコアミラーゼと比較して特定の活性が増強されている。いくつかの実施態様では、このグルコアミラーゼ変異種はSEQIDNO:2を含むグルコアミラーゼと比較して特異的活性が増強されている。この面の他の実施態様では、このグルコアミラーゼ変異種は以下の位置から選ばれた位置に対応する１以上のアミノ酸置換を含んでいる。即ち、SEQIDNO:2又は3の10,14,15,23,59,60,61,65,67,68,72,
0005594898.tif 000005
451である。
【００１０】
さらに別の面では、本発明のこのグルコアミラーゼ変異種はSEQIDNO:2、SEQIDNO:3の配列を含むグルコアミラーゼ又は、SEQIDNO:2と少なくとも80%の配列同一性を有する親グルコアミラーゼと比較して熱安定性が増強されている。いくつかの実施態様では、このグルコアミラーゼ変異種はSEQIDNO:2又はSEQIDMO:3を含むグルコアミラーゼと比較して熱安定性が増強されている。この面のいくつかの実施態様では、本発明のこのグルコアミラーゼ変異種は以下から選択された位置に対応する１以上のアミノ酸置換を含んでいる。即ち、SEQ ID NO:2又はSEQ ID NO:3の10,15,
0005594898.tif 000006
444,448及び451である。この面の他の実施態様では、本発明のこのグルコアミラーゼ変異種は、以下から選ばれた位置に対応する１以上のアミノ酸置換を含む。即ち、SEQID:NO2又はSEQIDNO:3の10,42,68,73,97,114,153,229,231,236,264,291,301,344,361,364,417,及び433である。この面のさらに別の実施態様では、このグルコアミラーゼ変異種は以下から選ばれた位置に対応する１以上のアミノ酸置換を含む。即ち、SEQIDNO:2又はSEQIDNO:3の68,73,114,153,236,344,361,364及び433である。この面のさらにいくつかの実施態様では、このグルコアミラーゼ変異種は以下のうち少なくとも１つに対応する１以上のアミノ酸置換を含む。即ち、SEQID NO:2又はSEQIDNO:3のT10S、T42V、E68C、E68M、G73F、G73W、K114M、K114T、N153A、N153S、N153V、W228V、D236R、G361D、G361E、G361P、G361Y、A364D、A364E、A364F、A364G、A364K、A365L、A365R、R433C、R433G、R433L、R433N、R433S、R433V及びI436Hである。
【００１１】
さらに別の面では、本発明のグルコアミラーゼ変異種はSEQIDNO:2、SEQIDNO:3、又はSEQIDNO:2の配列を含むグルコアミラーゼ又はSEQIDNO:2と少なくとも80%同一の配列を有する親グルコアミラーゼと比較して、特異的活性と熱安定性が増強されている。この面のいくつかの実施態様では、本発明のこのグルコアミラーゼ変異種は以下の位置から選ばれた位置に対応する１以上のアミノ酸置換を含んでいる。即ち、SEQIDNO:2又はSEQIDNO:3の10,15,59,61,72,73,97,99,102,133,140,153,182,204,205,214,228,229,230, 231,236,241,242,264,265,268,275,284,291,300,301,303,311,338,344,346,359,361,364,370,382,391,393,394,410,417,430,431,433,444,448及び451である。この面のさらに別の実施態様では、このグルコアミラーゼ変異種はSEQIDNO:2又はSEQIDNO:3の228,230,231,  268,291,417,433及び451から選ばれた位置に対応する１以上のアミノ酸置換を含む。この面の別の実施態様では、このグルコアミラーゼ変異種は以下の少なくとも１つに対応する１以上のアミノ酸置換を有する。即ち、SEQIDNO:2又はSEQIDNO:3のW228A,W228F,  W228H,W228M,S230F,S230G,S230R,S231L,A268C,A268G,S291A,L417R,R433Y及びS451Kである。
【００１２】
さらに別の実施態様では、本発明は本発明に含まれるグルコアミラーゼ変異種のいずれか一つをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。いくつかの実施態様では、本発明は本発明に含まれるグルコアミラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。
【００１３】
他の面では、本発明は本発明に含まれる１以上のグルコアミラーゼ変異種を含む酵素組成物に関する。いくつかの実施態様では、この酵素組成物は１以上のアルファアミラーゼのような追加の酵素を含む。いくつかの実施態様では、この酵素組成物はデンプン変換法、アルコール発酵法及び/又は動物飼料調合物で使用される。
【００１４】
いくつかの面では本発明は、本発明のグルコアミラーゼ変異種をコードするポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換すること、前記グルコアミラーゼ変異種の発現と産生に適した条件で宿主細胞を培養すること及び前記変異種を産生することを含む、本発明に属する変異グルコアミラーゼの産生法に関する。いくつかの実施態様では、このグルコアミラーゼ変異種は培地から回収される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】図１Aは632個のアミノ酸を有するトリコデルマ・レセイグルコアミラーゼ（TrGA）を示す(SEQIDNO:1)。シグナルペプチドには下線を付し、触媒領域（SEQIDNO:3）はアミノ酸残基SVDFI（SEQIDNO:12）から始まり、太字の453個のアミノ酸残基を有する。；連結領域はイタリックで示し、デンプン結合部位(SBD)は、イタリックで下線が付されている。触媒領域（SEQIDNO:3）、連結領域（SEQIDNO:10）及びデンプン結合領域（SEQIDNO:11）を含む成熟したタンパク質は、SEQIDNO:2により表されている。
【図１Ｂ】図１BはTrGAをコードしているcDNA(SEQIDNO:4)を示す。
【図１Ｃ】図1Cは、前駆体及び成熟タンパク質のTrGA領域を示す。
【図２】図２はTrGAのｃDNA（SEQIDNO:4）を含むデスチネーションプラスミドpDONR-TrGAを示す。
【図３】図３はプラスミドpTTT-Destを示す。
【図４】図４は最終発現ベクターpTTT-TrGAを示す。
【図５】図５A-５Bは、アスペルギルス・アワモリ（AaGA）（SEQIDNO:5）；アスペルギルス・ニゲル（AnGA）(SEQIDNO:6)；アスペルギルス・オリゼ（AoGA）（SEQIDNO:7）;トリコデルマ・レセイ（TrGA）（SEQIDNO:3）；フミコラ・グリセア（HgGA）（SEQIDNO:8）及びヒポクレア・ビノサ（HvGA）(SEQIDNO:9)に由来するグルコアミラーゼの親グルコアミラーゼの触媒領域の配列比較を示す。同一のアミノ酸はアステリスク（＊）で示されている。図5Cは、タラロマイセス・グルコアミラーゼ(TeGA)成熟タンパク質配列（SEQID NO:308）を示す。
【図６】図６は横から見たリコデルマ・グルコアミラーゼ（黒）(SEQIDNO:2)とアスペルギルス・アワモリグルコアミラーゼ（灰色）の３次元構造の比較である。横側とは活性部位に対しての横側である。活性部位への入り口は分子の「上側」にある。
【図７】図７はトリコデルマ・グルコアミラーゼ（黒）とアスペルギルス・アワモリグルコアミラーゼ（灰色）の３次元構造を上から見た比較である。活性部位への入り口が分子の「上側」である。発明の詳細な説明１．    定義
【００１６】
別に記載されているのではない限り、本明細書で使用される全ての技術的、科学的用語は、この発明が属する技術分野の普通の技術者により普通に理解されているものと同一の意味をもつ。Singletonら、DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 第２版、John Wiley and Sons、New York(1994)、及びHale&Markham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial,N.Y.(1991)は、本明細書で使用される用語の多くの一般的意味を技術者に提供している。しかし、ある用語は明確にしておくため、また参照の便のため下記に定義している。
【００１７】
本明細書で使用する場合、用語「グルコアミラーゼ（EC3.2.1.3）」はデンプンと関連するオリゴ糖及び多糖の非還元末端からＤ-グルコースの遊離を触媒する酵素をいう。
【００１８】
本明細書で使用する場合、用語「親」又は「親配列」はTrGA（例.SEQID NO:1,2及び/又は3）と同一の配列及び/又は構造をもち、宿主細胞で固有にまたは自然に発生する配列をいう。
【００１９】
本明細書で使用する場合、用語「TrGA」はSEQIDNO:2で示された成熟タンパク質配列をもつトリコデルマ・レセイグルコアミラーゼ配列をいい、SEQIDNO:3で示された配列をもつ触媒領域を含む。TrGAの単離、クローニング及び発現はWO2006/060062と2006年5月4日公開されたUS特許公開第2006/0094080に記載されている。これらは引用により組み入れる。TrGAは、また親グルコアミラーゼ配列であると考えられている。いくつかの実施態様では、親配列はタンパク質操作の開始点であるTrGAをいう。本明細書のグルコアミラーゼのアミノ酸の数字のつけ方はTrGAグルコアミラーゼ配列の配列に基づく(SEQIDNO:2及びSEQIDNO:3)。
【００２０】
「タンパク質又はポリペプチドの成熟型」という言葉は、タンパク質又はポリペプチドの最終的な機能型をいう。例えば、TrGAの成熟型は、触媒領域、連結領域及びデンプン結合領域を含み、SEQIDNO:2のアミノ酸配列をもつ。
【００２１】
用語「トリコデルマグルコアミラーゼ相同体」はTrGA配列(SEQIDNO:1、SEQIDNO2又はSEQIDNO:3)と少なくとも80%同一のアミノ酸配列をもち、グルコアミラーゼの機能的な特徴を保持している、親グルコアミラーゼをいう。
【００２２】
本明細書で使用する場合、「相同配列」は比較のために最適な位置合わせをした場合に、ある核酸配列又はポリペプチド配列と少なくとも100%、少なくとも99%、少なくとも98%、少なくとも97%、少なくとも96%、少なくとも95%、少なくとも94%、少なくとも93%、少なくとも92%、少なくとも91%、少なくとも90%、少なくとも88%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、少なくとも70%、少なくとも65%、少なくとも60%、少なくとも55%、少なくとも45%の配列の同一性をもつ核酸又はポリヌクレオチド配列をいう。ここで候補の核酸配列又はポリペプチド配列の機能は、前記候補相同体の配列が比較されている核酸配列又はポリペプチド配列と本質的に同一である。いくつかの実施態様では、相同体の配列は、85%乃至100%の配列同一性を有す。一方、他の実施態様では、90%乃至100%の配列同一性がある。及び他の実施態様では、95%と100%の配列の同一性がある。いくつかの実施態様では、この候補相同体配列又は親は、TrGA核酸配列又は成熟タンパク質配列と比較される。この配列の同一性は、親又は相同配列の全長にわたり評価され得る。
【００２３】
本明細書に使用される場合、用語「グルコアミラーゼ変異種」、「変異種」及び「TrGA変異種」は親グルコアミラーゼ配列に類似し、しかし、そのアミノ酸配列に少なくとも１個の置換、欠失又は挿入を含み、親グルコアミラーゼと配列が異なったものになっているグルコアミラーゼをさして使用される。（例．TrGA又はトリコデルマグルコアミラーゼ相同体）。いくつかの場合、それらは操作され/設計されてそのアミノ酸配列に少なくとも１個の置換、欠失又は挿入を含み、親グルコアミラーゼと配列の異なるものにされている。
【００２４】
本明細書で使用する場合、用語「触媒領域」はポリペプチドのある構造領域をいい、基質を加水分解する活性部位を含む。
【００２５】
用語「連結部位」は、触媒領域を含むアミノ酸配列と、デンプン結合領域を含むアミノ酸配列とを共有結合で結合している一般的に3乃至40個のアミノ酸残基をもつ短いアミノ酸配列をいう。
【００２６】
用語「デンプン結合領域」はデンプン基質に優先的に結合するアミノ酸配列をいう。
【００２７】
本明細書で使用する場合、用語「変異配列」と「変異遺伝子」は相互に交換して使用され宿主細胞の親配列で少なくとも１個のコドンに生じた変異をもつポリヌクレオチド配列をいう。変異配列の発現生成物は親と比較して変異したアミノ酸配列をもつ変異タンパク質である。発現生成物は変異した機能性能を持ちうる。（例．向上した酵素活性）
【００２８】
ポリペプチドついて述べるとき、用語「性質」又はそれと文法的に同等なものは、本明細書で使用される場合、選択され得る、又は検出され得るポリペプチドのいずれかの特性又は属性をいう。これらの性質は酸化安定性、基質特異性、触媒活性、熱安定性、pH活性プロファイル、タンパク質分解に対する抵抗性、ＫＭ、KCAT、KCAT/ＫＭ比率、タンパク質の折り曲げ、基質を結合する能力、分泌される能力を非限定的に含む。
【００２９】
核酸について、用語「性質」又はそれと文法的に同等なものは、本明細書で使用される場合、選択され得る、又は検出され得る核酸のいずれかの特性又は属性をいう。これらの性質は、遺伝子の転写に影響する性質（例．プロモータ強度又はプロモーター認識）、RNA処理に影響する性質（例．RNAスプライシングとRNA安定性）、翻訳に影響する性質（例．調節、mRNAのリボソームタンパク質への結合）を非限定的に含む。
【００３０】
用語「熱的安定」は、例えば、温度を変更したとき、デンプン基質の加水分解の一般的な条件下、所定の時間にわたり、特定の温度に暴露された後、特定の酵素活性を保持する本発明のグルコアミラーゼをいう。
【００３１】
熱安定性のような性質について用語「向上した熱安定性」とは、別の対照（例．親）グルコアミラーゼと比較したとき時間が経過しても比較的高いデンプン加水分解活性を保持することを言う。
【００３２】
熱安定性のような性質について用語「減少した熱安定性」は、別の対照グルコアミラーゼと比較して時間が経過しても比較的低いデンプン加水分解活性を保持していることをいう。
【００３３】
用語「特異的活性」はグルコアミラーゼタンパク質1mgについての活性として定義される。いくつかの実施態様では、グルコアミラーゼ活性は、本明細書に記載されたエタノール定量により決定され、かつデンプン基質から生成されるグルコース量として表される。いくつかの実施態様では、タンパク質濃度は本明細書に記載されたCaliper定量を使用して決定できる。
【００３４】
用語「活性な」と「生物学的に活性な」は特定のタンパク質と関連する生物学的活性をいう。従って、所与のタンパク質の生物学的活性は、本技術分野の技術者によりそのタンパク質に通常帰属されるいずれかの生物学的活性をいう。例えば、グルコアミラーゼと関連する酵素的活性は加水分解性であり、従って、活性なグルコアミラーゼは加水分解活性を有している。
【００３５】
本明細書で相互に入れ替えて使用される、用語「ポリヌクレオチド」と「核酸」はいずれかの鎖長のヌクレオチド、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドの重合体をいう。これらの用語は単一、二重又は三重鎖のDNA、ゲノムDNA、cDNA、RNA、DNA-RNAハイブリッド体、又はプリンとピリミジン塩基を含むポリマー、又は他の天然の、又は化学的、生化学的に修飾された、非天然の又は誘導体に導かれた塩基を含むポリマーを非限定的に含む。
【００３６】
本明細書で使用される場合、用語「DNA構造体」「形質転換性DNA」及び「発現ベクター」は宿主細胞又は器官に配列を導入するために使用されるDNAを指すために相互に交換して使用される。このDNA構造体は、PCR又は本技術分野で技術者に知られているいずれかの他の適した技術により生体外で生成されても良い。このDNA構造体、形質転換DNAまたは組換え発現カセットはプラスミド、クロモソーム、ミトコンドリアDNA、プラスミドDNA、ウィルス又は核酸断片に組み込むことが出来る。通常、発現ベクター、DNA構造体または形質転換DNAの組換え発現カセット部は、他の配列のうち、転写を受ける核酸配列とプロモータを含む。実施態様において、発現ベクターは宿主細胞に異種DNA断片を組み入れ、発現する能力を有する。
【００３７】
本明細書で使用する場合、用語「ベクター」は１以上の種類の細胞に核酸を導入するために設計されたポリヌクレオチド構造体をいう。ベクターはクローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、カセット等を含む。
【００３８】
核酸配列の細胞への導入について、本明細書で使用される場合、用語「導入された」は細胞へ核酸配列を移すために適したいずれの方法をも指す。導入のそのような方法はプロトプラスト融合、トランスフェクション、形質転換、接合及び形質導入を非限定的に含む。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「形質転換された」と「安定に形質転換された」は、その固有でない（異種の）ポリヌクレオチド配列をゲノムに組み入れて又は、少なくとも二世代維持されるエピソーム性プラスミドとして有している細胞を言う。
【００４０】
本明細書で使用する場合、用語「選択的マーカー」はベクターを含むこれらの宿主の選択を容易にするため宿主細胞で発現しうる核酸（例.遺伝子）をいう。通常は、選択的遺伝子は宿主細胞に抗微生物剤耐性又は代謝上の優位性を与え、形質転換の際に外来の配列を受けなかった細胞から、外来性のDNAを含む細胞遺伝子を識別させる遺伝子である。
【００４１】
本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」は下流の遺伝子の転写を指令するため機能する核酸配列をいう。プロモーターは、他の転写及び翻訳調節核酸配列（または「調節配列」と呼ばれる）とともに所与の遺伝子の発現のために必要である。一般的に、転写と翻訳調節配列はプロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び停止配列、翻訳開始及び停止配列と増幅又は活性化配列を含む。
【００４２】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係があるように配置されている場合「機能的に連結されている」。例えば、分泌リーダー（例．シグナルペプチド）をコードするDNAはポリペプチドの分泌に関与するたんぱく質前駆体として発現される場合にはポリペプチドのDNAと機能的に連結している。一般的に、「機能的に連結されている」とは連結されているDNA配列が隣接しており、分泌リーダーの場合、隣接しかつリーディング相(reading phase)にあることをいう。
【００４３】
本明細書で使用する場合、用語「遺伝子」はポリヌクレオチド（例．DNA片）をいい、ポリペプチドをコードし、このコード領域の前と後ろの領域と、個別のコード領域（エクソン）の間の介在配列を含む。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「相同性遺伝子」とは、異なっているがしかし普通関連する種由来の一対の遺伝子をいい、互いに対応し、かつ互いに同一又は非常に近似しているものである。この用語は種の分化により分離された遺伝子（つまり、新種の出現）（例．オルソロガス遺伝子）及び遺伝子の重複化により分離された遺伝子（例．パラロガス遺伝子）を含む。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「オルソローグ」と「オルソロガス遺伝子」は、種の分化により共通の祖先の遺伝子（つまり相同遺伝子）から進化した異なる種の遺伝子を言う。通常は、オルソローグは、進化の間、同一の機能を保持する。オルソローグの同定は新しく配列決定されたゲノムの遺伝子の機能の信頼できる予測に用いられる。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「パラローグ」と「パラロガス遺伝子」はゲノム内での重複化により関連づけられている遺伝子をいう。オルソローグは進化の段階において同一の機能を保持する一方、パラローグは、いくつかの機能は、元の機能と関係することが多いけれども、新しい機能を進化させている。パラロガス遺伝子の例はトリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ及びトロンビンをコードする遺伝子を非限定的に含み、これらは全てセリンプロテアーゼであり、同一の種において共に存在している。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「相同性」は配列の類似性又は同一性をいい、同一が好ましい。この相同性は本技術分野で既知の標準的技術を用いて決定される。(例えば、Smith and Waterman,(1981)Adv.Appl.Math.,2:482;Needleman and Wunsch.,(1988)  J.Mol.Biol.,48:443;Pearson and Lipman,(1988) Proc Natl. Acad.Sci.USA 85:2444;プログラム、例えばthe Wisconsin Genetics Software PackageのGAP,BESTFIT,FASTA,及びTFASTA(Genetics Computer Group, Madison,WI);及びDevereuxら(1984)Nucl.Acid Res.,12:387-395参照)
【００４８】
「パーセント(%)核酸配列同一性」または「パーセント(%)アミノ酸配列同一性」は、元の配列（例えば、TrGA）のヌクレオチド残基またはアミノ酸残基と同一である、候補配列中のヌクレオチド配列またはアミノ酸残基のパーセントとして決定される。この配列同一性は元の配列の全長にわたり評価することができる。（つまり、TrGASEQIDNO:2又は3）。
【００４９】
相同配列は配列の位置合わせの既知の方法により決定される。普通に使用される位置合わせ法は、Altschulらにより述べられているBLASTである（Altschulら、(1990)J.Mol.Biol.,215:403-410;及びKarlinら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-  5787）。特に有用なBLASTプログラムは、WU-BLAST-2プログラムである。（Altschulら(1996)Meth.Enzymol.,266:460-480）WU-BLAST-2はいくつかの検出パラメータを使用する。それらの殆どは初期値に設定される。調整できるパラメータは以下の値により設定される。：オーバーラップスパン(overlap span)＝１、オーバーラップフラクション(overlap fraction)＝0.125、ワード閾値(T)(word threshold)＝11。HSP SとHSP S2パラメーターは動的な値であり、特定の配列の組成と目的配列が検索する対象となる特定のデータベースの組成によりプログラム自身により決定される。しかしこの値は感度を上げるために調整されても良い。A%アミノ酸配列同一性は、位置合わせをされた領域で「長い方の」配列の残基総数で、重なった同一の残基数を割った値で決定される。「長い方の」配列は位置合わせされた領域に最も多くの残基をもつ配列である。（位置合わせのスコアを最大化するためにWU-Blast-2により導入されるギャップは無視される。）
【００５０】
他の方法が配列の位置合わせに使用される。有用なアルゴリズムの一例はPILEUPである。PILEUPはプログレッシブペアワイズ(progressive pair-wise )位置合わせ法を用いて関連する配列からなる群から複数の配列の位置の一致を見出す。これは、この位置の一致を見出すため使用されるクラスタリング関係(clustering relationships)を示すツリーをプロットすることもできる。PILEUPはFengとDoolittleのプログレッシブ位置合わせ法の単純化した方法を用いる。(FengとDoolittle,(1987)J.Mol.Evol.,35:  351-360)この方法はHigginsとSharp(HigginsとSharp,(1989) CABIOS 5:151-153)により述べられた方法に似ている。役に立つPILEUPパラメータは、3.00のデフォルトギャップウェイト(default gap weight)、0.10のデフォルトギャップレングスウェイト(default gap length weight)、及びウェイテドエンドギャップス(weighted end gaps)である。
【００５１】
用語「最適な位置合わせ」とは最も高いパーセント同一性評価点を与える位置合わせをいう。「同等の位置」とは２配列の間で最も良く一致している位置である。例えば図5Dと図5Eを用いると、TrGA(SEQ ID NO:2)の位置491はC491である。；アスペルギルス・ニゲルの同等の位置はC509である.;そしてアスペルギルス・アワモリの同等の位置はQ538である。３次元の配列の位置の一致の例については図8参照。
【００５２】
本明細書で使用する場合、用語「ハイブリッド形成」は、本技術分野で知られているように、核酸の鎖が塩基対形成により相補鎖と結合する処理をいう。
【００５３】
中程度から高い厳密度と洗浄条件下、２本の配列が互いに特異的にハイブリッド形成する場合、核酸配列は対照核酸配列と「選択的にハイブリッド形成され得る」と考えられる。ハイブリッド形成条件は核酸結合複合体又はプローブの融解温度(Tm)に基づく。例えば、「最大の厳密性」は通常、約Tm-5℃(プローブのTmの5℃低い温度)である。；「高い厳密性」はTmより約5-10℃低い温度である。；「中間的な厳密性」は、プローブのTmより約10-20℃低い温度である。；「低い厳密性」はTmの約20-25℃低い温度である。機能的には、最大の厳密性条件はハイブリッド形成プローブと厳密な同一性又はほぼ厳密な同一性をもつ配列を同定するために使用されても良い。；中間的な又は低い厳密性のハイブリッド形成はポリヌクレオチド配列相同体を同定又は検出するために使用できる。
【００５４】
中程度及び高い厳密性のハイブリッド形成条件は、本技術分野で良く知られている。高い厳密性の条件の例は、約42℃で、50%ホルムアミド、5XSSC,5X Denhardt’s溶液、0.5% SDS及び100μg/mlの変性キャリアDNAを含む液中でのハイブリッド形成、その後の2X SSC及び0.5% SDS中での室温における２回の洗浄、42℃での0.1XSSCと0.5%SDS中でのさらに２回の洗浄を含む。中程度に厳密な条件の例は、20%ホルムアミド、5xSSC(150mM NaCl、15mMクエン酸３ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5xDenhard’s溶液、10%硫酸デキストラン及び20mg/mlの変性切断サケ精子DNAを含む溶液中での37℃における一晩の保温、その後の約37-50℃での1xSSCにおけるフィルターの洗浄を含む。本技術分野の技術者は、プローブの長さ等の因子を使用するため必要である温度、イオン強度等の調整法を知っている。
【００５５】
本明細書では、「組換え体」は細胞やベクターを含み、異種又は相同の核酸配列の導入により修飾されたものであり、又はそのように修飾された細胞に由来するものである。そのため、例えば、ヒトの介入の結果、組換え細胞はその細胞の固有の形体（非組換え）では、同一の形体で見出されない遺伝子を発現し、ヒトの介入のない場合には、発現されても異常に発現され、または全く発現されない固有の遺伝子を発現する。
【００５６】
本発明のいくつかの実施態様では、変異を受けたDNA配列は少なくとも１個のコドンで部位飽和変異誘導により生成される。他の実施態様では、部位飽和変異誘導は２個以上のコドンで行われる。さらに他の実施態様では、変異DNA配列は、親配列と50%より多く、55%より多く、60%より多く、65%より多く、70%より多く、75%より多く、80%より多く、85%より多く、90%より多く、95%より多く、98%より多く、99%より多い相同性を有する。他の実施態様では、変異DNAは、例えば放射線照射、ニトロソグアニジン等のいずれかの既知の変異誘導法を用いて生体内で生成される。所期のDNA配列は次に単離され本明細書に記載の方法において使用される。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「異種タンパク質」は宿主細胞内で天然には生じないタンパク質又はポリペプチドをいう。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「同種タンパク質」は細胞内に固有に存在する又は天然に発生するタンパク質又はポリペプチドをいい、組換えDNA技術によりまたは自然に、細胞内に過剰に発現される固有のタンパク質を含む。
【００５９】
酵素が対応する野生型の細胞に発現されるよりも高い水準で細胞内に発現されている場合、酵素は、宿主細胞内に「過剰発現されている」。
【００６０】
用語「タンパク質」と「ポリペプチド」は、本明細書では相互に交換されて使用される。本開示及び請求項においては、アミノ酸残基の従来の１文字コードと３文字コードが使用される。アミノ酸の３文字コードは生化学的命名法に関するIUPAC-IUB共同委員会に従い決定されたものである。ポリペプチドは、遺伝子コードの縮重のため、あるポリペプチドは１個のヌクレオチド配列よりも多くによりコードできることも理解される。
【００６１】
本発明の変異種は以下の命名法により記述される。：[元のアミノ酸残基/位置/置換したアミノ酸残基]。例えば、76の位置でアルギニンに対するロイシンによる置換は、R76Lとして表される。複数のアミノ酸が所与の位置で置換されるときは、この置換は1) Q172C、Q172D又はQ172R; 2) Q172C,D,R又はc) Q172C/D/Rとして表される。置換に適した位置が特定のアミノ酸を示唆せずに本明細書で特定されている場合、いずれのアミノ酸残基もその位置のアミノ酸残基を置換できると理解されるべきである。変異グルコアミラーゼが他のグルコアミラーゼと比較したとき欠失を含む場合、この欠失は“＊”で示される。例えば、R76の欠失はR76＊として表される。２個以上の連続するアミノ酸の欠失は例えば（76-78）＊として示される。
【００６２】
「プロ配列」とは、タンパク質の分泌に必要なシグナル配列と成熟タンパク質の間のアミノ酸配列である。
【００６３】
用語「シグナル配列」又は「シグナルペプチド」はタンパク質の成熟体又は前駆体の分泌に関与するヌクレオチド及び/又はアミノ酸のいずれかの配列をいう。このシグナル配列の定義は機能的な定義であり、このタンパク質のN末端までコードされている全てのアミノ酸配列を含み、タンパク質の分泌に関与する。これらはタンパク質のＮ-末端部または前駆体タンパク質のN-末端部に結合することが多いが、全ての場合にそうであるのではない。このシグナル配列は、内因性又は外来性でもよい。このシグナル配列は、正常にそのタンパク質（例．グルコアミラーゼ）と組み合わされるものであるが、別の分泌を受けるタンパク質をコードする遺伝子由来でも良い。
【００６４】
用語、タンパク質又はペプチドの「前駆体」は、そのタンパク質のアミノ基又はカルボニル末端に機能的に連結するプロ配列を有するタンパク質の成熟した形体をいう。この前駆体はプロ配列のアミノ基末端に機能的に連結された「シグナル」配列も有することができる。この前駆体は翻訳後の活性に関与するポリペプチドを付加しても良い（例．成熟体のタンパク質又はポリペプチドから開裂されて成熟体のタンパク質又はポリペプチドを生成するポリペプチド）
【００６５】
「宿主株」又は「宿主細胞」は、本発明に従いDNAを含む発現ベクターに適した宿主をいう。
【００６６】
用語「・・に由来する」と「・・から得られる」は、生物の株により産生される又は産生され得るグルコアミラーゼを指すばかりでなく、そのような株から単離されたDNA配列によりコードされ、かつそのようなDNA配列を含む宿主生物中に産生されるグルコアミラーゼもいう。さらに、この用語は、合成したDNA配列及び/又はcDNAによりコードされ、かつ元のグルコアミラーゼの特徴を同定する特徴を有するグルコアミラーゼをいう。
【００６７】
ここでの定義の範囲内にある「誘導体」は、一般的に、野生の、天然の又は親の形体で観察される特徴的な加水分解活性を、その誘導体が野生の、天然の又は親の形体と同様の目的に対し有用である限度で保持する。グルコアミラーゼの機能的誘導体は、本発明のグルコアミラーゼの一般的特性をもつ、天然に生じる、合成される又は遺伝子組み換えにより生じるペプチド又はペプチド断片を含む。
【００６８】
用語「単離された」又は「精製された」はその元の環境（例.それが自然に生じる場合には自然の環境）から取り出された物質を言う。いくつかの実施態様では、単離されるタンパク質はSDS-PAGEにより測定して、純度が10%より高く、好ましくは20%より高く、さらに好ましくは30%よりも高い。本発明の別の面は、SDS-PAGEにより測定して、高純度（つまり、純度が40%より高く、60%より高く、80%より高く、90%より高く、95%より高く、97%より高く、さらに99%より高い）に精製された形態のタンパク質を含む。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「組み合わせ変異誘導」は元の配列の変異のライブラリーが作成される方法を言う。これらのライブラリーでは、この変異種は予め定めた変異の組から選ばれた１個又は多数の変異を含む。加えて、この方法は予め定めた組の変異に属さない無作為な変異を導入する手段を提供する。いくつかの実施態様では、この方法はUSP6,582,914に記載されたものを含む。これは引用により組み入れる。別の実施態様では、組み合わせ変異法は商業的に入手できるキット（例．QUICKCHANGE（登録商標）Multisite, Stratagene, San Diego,CA）を含む。
【００７０】
本明細書で使用される場合、用語「変異種のライブラリー」はそのゲノムの大部分で同一で、しかし、１以上の遺伝子で異なる相同体を含む細胞の集団をいう。そのようなライブラリーは、例えば、形質が向上した遺伝子又はオペロンを特定するために使用できる。
【００７１】
本明細書で使用される場合、用語「乾燥固体含量(DS又はds)」は乾燥重量ベースで％でのスラリーの総固体量をいう。
【００７２】
本明細書で使用される場合、用語「初期ヒット」は組み合わせコンセンサス変異ライブラリー(combinatorial consensus mutagenesis library)をスクリーニングすることにより特定された変異種をいう。実施態様では、初期ヒットは、元の遺伝子と比較して性能が向上した特性を持つ。
【００７３】
本明細書で使用する場合、用語「改良ヒット」は、高次組み合わせコンセンサス変異ライブラリーのスクリーニングより特定された変異種をいう。
【００７４】
本明細書で使用する場合、用語「目的性質」は変異されるべき元の遺伝子の性質をいう。本発明が、いずれか特定の目標の性質に限定されることは意図していない。しかし、ある実施態様では、目標性質は遺伝子産生物の安定性（例．変性、タンパク質分解又は他の分解性因子への耐性）であり、他の実施態様では産生宿主の産生量が変えられる。実際、元の遺伝子のいずれの性質も本発明において用いられると考えられている。用語の他の定義は明細書全体から明らかになるであろう。
【００７５】
実施例がより詳細に述べられる前に、本発明が本発明に述べられた個々の実施態様に限定されないことが理解されるべきである。それらは変わり得るからである。本明細書で用いられる用語類は、個々の実施例を記述する目的にのみ用いられ、限定する意図はないことも理解されるべきである。
【００７６】
ある範囲の値が記載されている場合、文脈が明らかに別様に述べている場合を除き、下限値の10分の1単位までの、その範囲の上限と下限の間にある各中間的な値も、具体的に開示されている。いずれか記載された値又は記載された範囲にある中間値と、いずれか他の記載された値又は記載された範囲にある中間的な値の間にあるより小さな範囲のそれぞれも本発明に含まれる。これらのより小さい範囲の上限と下限はその範囲に独立して含まれるか又は除外され、このより小さい範囲に一方の限度が含まれ又はいずれもが含まれず、又は両者が含まれる場合の各範囲もまた本発明に含まれ、その記載された範囲内で、特定の限度が除外される。記載された範囲がこの限度の一方又は両者を含む場合、これらの含まれる限度の一方又は両者を除く範囲もまた本発明に含まれる。
【００７７】
本明細書に述べられるものと類似又は同等のいずれの方法と物質も本発明の実施又は試験で用いることが出来るが、例示的で好ましい方法と物質がこれより述べられる。本明細書に記載された全ての刊行物は、それに関して刊行物が引用された方法と/又は物質を開示し記述するために引用により本明細書に組み入れられる。
【００７８】
本明細書及び本出願の請求項で用いられる場合、文脈が明らかに別様に指示している場合を除き、単数表記は複数も含む。従って、「遺伝子」は、複数のそのような候補物質を含み、「細胞」は、１以上の細胞と本技術分野の技術者に知られているその同等物等も含む。
【００７９】
本明細書に述べられた刊行物は本出願の出願日前の開示を示すためにのみ記載されている。本明細書のいずれの記載も、本発明が先行発明のために、そのような公表に先行する資格がないことを認めるものとして解釈されてはならない。
詳細な実施態様
【００８０】
本発明の目標は性質、例えば、親グルコアミラーゼの熱安定性及び/又は特定の活性を変えることであり、特にトリコデルマ・レセイグルコアミラーゼ(TrGA)を変えデンプン転換又はアルコール発酵法のような種々の用途に有用である変更された性質をもつグルコアミラーゼ変異種を得ることである。
親グルコアミラーゼ
【００８１】
いくつかの実施態様では、本発明は親グルコアミラーゼのグルコアミラーゼ変異種を提供する。親グルコアミラーゼはTrGA(SEQ ID No:2及び/又は3)と配列上及び/又は構造上の同一性をもつ配列を含み得る。ある実施態様では、この親グルコアミラーゼはSEQ ID NO:1,2,3,5,6,7,8又は9に示されているようなアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様では、親グルコアミラーゼは相同体である。いくつかの実施態様では、親グルコアミラーゼがSEQ ID NO:2のTrGAアミノ酸配列と少なくとも50%の配列同一性、少なくとも60%の配列同一性、少なくとも70%の配列同一性、少なくとも80%の配列同一性、少なくとも85%の配列同一性、少なくとも88%の配列同一性、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性及びまた少なくとも99%の配列同一性を有する。
【００８２】
いくつかの実施態様では、親グルコアミラーゼはSEQ ID NO:1,2,3,5,6,7,または8で示されている１以上のアミノ酸配列と少なくとも50%のアミノ酸配列の同一性、少なくとも60%のアミノ酸配列の同一性、少なくとも70%アミノ酸配列の同一性、少なくとも80%のアミノ酸配列の同一性、少なくとも85%のアミノ酸配列の同一性、少なくとも88%のアミノ酸配列の同一性、少なくとも90%のアミノ酸配列の同一性、少なくとも93%のアミノ酸配列の同一性、少なくとも95%のアミノ酸配列の同一性、少なくとも97%のアミノ酸配列の同一性、少なくとも99%のアミノ酸配列の同一性をもつアミノ酸配列をもつ触媒領域を含む。他の実施態様では、親グルコアミラーゼは、SEQ ID NO:3のTrGAアミノ酸配列の触媒領域と少なくとも80%の配列同一性、少なくとも85%の配列同一性、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性及び少なくとも98%の配列同一性も有するであろう。
【００８３】
親グルコアミラーゼはSEQID NO:1、2または3のアミノ酸配列の一を有するグルコアミラーゼをコードするDNAと中間的、高い又は厳密な条件でバイブリッド形成するDNA配列によりコードすることができる。いくつかの実施態様では、少なくとも50%配列同一性、少なくとも60%アミノ酸配列同一性、少なくとも70%アミノ酸配列同一性、少なくとも80%アミノ酸配列同一性、少なくとも90%アミノ酸配列同一性、少なくとも95%アミノ酸配列同一性及び少なくとも97%アミノ酸配列同一性をもつ親グルコアミラーゼはまた、SEQID2及び/又は3と構造的同一性ももつ。親グルコアミラーゼは宿主細胞に生じる固有の又は天然の配列であるが、いくつかの実施態様では、親グルコアミラーゼは天然に生じる変異種である。いくつかの実施態様では、親グルコアミラーゼは工学的操作を受けた変異種であり、及び/又はハイブリッドグルコアミラーゼである。
【００８４】
グルコアミラーゼの予測される構造と既知の配列は菌類の種において保存されている（Coutinhoら(1994) Protein Eng.,7:393-400及びCoutinhoら(1994),Protein Eng., 7:749-760）。いくつかの実施態様では、親グルコアミラーゼは糸状菌グルコアミラーゼである。いくつかの実施態様では、親グルコアミラーゼは、トリコデルマ株（例．Ｔ.レセイ、Ｔ.ロンギブラキアツム、Ｔ.ストリクチピリス、Ｔ.アスペレルム、Ｔ.コニラングブラとＴ.ハジアヌム）、アスペルギルス株（例．A.ニゲル、A.ニジュランス、A.カワチ、A.アワモリ、及びA.オリゼ）、タラロマイセス株（例．T.エメルソニ、T.テルモフィルス、T.ヂュポンチ）、ヒポクレア株（例．H.ゲラチノサ、H.オリエンタリス、H.ビノサ、H.シトリナ）、フザリウム株（例．F.オキシスポラム、F.ロセウム及びF.ベネナタム）、ニューロスポラ株（例．Ｎ．クラッサ）及びフミコラ株（例．H.グリセア、H.インソレンス及びH.ラヌギノサ）、ペニシリウム株（例．P.ノナタム又はP.クリソゲヌム）またはサッカロマイコプシス株（例．S. フィブリゲラ）から得られる。
【００８５】
いくつかの実施態様では、親グルコアミラーゼは細菌グルコアミラーゼである。例えば、ポリペプチドはバシルス（例．B.アルカロフィルス、B.アミロリケファシエンス、B.レンツス、B.リケニフィルミス、B.ステアロテルモフィルス、B.スブチリス及びB.スリンギエンシス）またはストレプトマイセス株（例．S.リビダンス）のようなグラム陽性株から得ても良い。
【００８６】
いくつかの他の実施態様では、親グルコアミラーゼはSEQID NO:5又はSEQ ID NO:6のアスペルギルス親グルコアミラーゼの触媒領域と少なくとも90%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性及びまた少なくとも99%の配列同一性をもつアミノ酸配列を含む。
【００８７】
他の実施態様では、親グルコアミラーゼはSEQ ID NO:8のフミコラ・グリセア（HgGA）親グルコアミラーゼの触媒領域と少なくとも90%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性及び少なくとも99%の配列同一性をもつアミノ酸配列を含む。
【００８８】
いくつかの実施態様では、親グルコアミラーゼはSEQ ID NO:2または3のTrGAアミノ酸配列と少なくとも50%の配列同一性、少なくとも60%の配列同一性、少なくとも70%の配列同一性、少なくとも80%の配列同一性、少なくとも85%の配列同一性、少なくとも88%の配列同一性、少なくも90%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一異性及び少なくとも99%の配列同一性をもち、SEQID NO:2または3のグルコアミラーゼと構造上の同一性をもつ。
【００８９】
さらに別の実施態様では、トリコデルマグルコアミラーゼ相同体はトリコデルマ属の株またはヒポクレア属の株から得られる。いくつかのトリコデルマグルコアミラーゼ相同体は米国特許公表第2006/0094080に記載され、その文献のSEQIDNO:17-22及び43-47に表されたアミノ酸配列に具体的に言及している。
【００９０】
いくつかの実施態様では、親グルコアミラーゼはSEQIDNO:2のアミノ酸配列を含むTrGAであり、またはTrGA配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも88%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一の配列をもつトリコデルマグルコアミラーゼ相同体である。
【００９１】
親グルコアミラーゼは標準的組換えDNA技術を用いて単離及び/又は同定されえる。技術者に知られているいずれの標準的技術も使用できる。例えば、グルコアミラーゼの保存領域に特異的なプローブ及び/またはプライマーは、細菌又は菌類の細胞中の相同体を同定するために使用できる（触媒的領域、活性部位等）。または、縮重したPCRが細菌又は菌類の細胞の相同体を同定するために使用される。いくつかの場合、既知の配列、例えば、データベースにあるもの、がSEQID NO:1,2又は3を含む既知のグルコアミラーゼの一つに対する配列的及び/又は構造的な相同性の分析に使用できる。機能的定量も細菌又は菌類の細胞中のグルコアミラーゼ活性を同定するために使用できる。グルコアミラーゼ活性をもつタンパク質は単離され、逆にDNA配列が求められ、対応するDNA配列が単離される。このような方法は技術者に知られている。
グルコアミラーゼの構造的同一性
【００９２】
分子生物学のセントラルドグマは、ある酵素の遺伝子をコードするDNAの配列はそのタンパク質のアミノ酸配列を決定し、この配列が、次にこの酵素の三次元の折りたたみを決定するというものである。この折りたたみが、触媒中心と基質の結合表面を作る異種の残基を集め、これは、その酵素の高い特異性と活性となる。
【００９３】
グルコアミラーゼは３個の別の構造領域、構造的に保存された約450個の残基の触媒領域と一般的にその後に続く30個乃至80個の残基からなる連結領域、これに結合する約100個の残基のデンプン結合領域からなる。３領域全てが完全なトリコデルマ・レセイグルコアミラーゼの構造が、1.8オングストロームの分解能で決定され本明細書に記載されている（表９及び実施例8と9参照）。座標(coordinate)を用いて(表９参照)触媒構造が既に決定されたアスペルギルス・アワモリ株X100の触媒領域の座標(Aleshinら、(1994)J.Mol.Biol 238:575-591)と位置合わせされた。アスペルギルス・アワモリの結晶構造は触媒領域のみを含んでいた。図６と図７に見られるように、触媒領域の構造は非常に良く重なり合い、この構造的重ね合わせに基づいて同等の残基を同定することが可能である。発明者は全てのグルコアミラーゼが図６と７に描かれた基本構造を共有すると信じている。グルコアミラーゼ分子の構造の保存は全てのグルコアミラーゼの活性の保存及び作用機構の保存と相関している。高い相同性がある場合、トリコデルマグルコアミラーゼの部位特異的変異種で機能が変化した種もまた、他のグルコアミラーゼと類似の構造、それゆえ類似の機能を有するであろう。
【００９４】
本発明は、しかし、図１に開示された親トリコデルマグルコアミラーゼの変異種に限られず、トリコデルマレセイグルコアミラーゼ(SEQ ID NO:2)にある同定された残基と「同等である」位置に残基を含む親グルコアミラーゼの変異種に及ぶ。本発明のいくつかの実施態様では、親グルコアミラーゼは、タラロマイセスGAであり、タラロマイセスグルコアミラーゼ(SEQ ID NO:308、図5C参照)の、本明細書で述べられたものと同等のアミノ酸残基の位置で置換を受けている。他の実施態様では、親グルコアミラーゼは、SEQID NO:5: SEQID NO:6 :SEQID NO:7: SEQID NO:3: SEQID NO:8;及びSEQID NO:9を含む（図5A-5B参照）。さらに別の実施態様では、親グルコアミラーゼはペニシリウムグルコアミラーゼであり、例えば、ペニシリウム・クリソゲヌムである。
【００９５】
構造的同一性はアミノ酸残基が同等であるかを決定する。構造的同一性は２構造（三次元及びアミノ酸構造）が位置合わせされたときの、一対一の位相的な同等性である。グルコアミラーゼの残基（アミノ酸）の位置は、それが、（化学的に結合し、反応し又は相互作用する同一または類似の性能をもつ）T・レセイグルコアミラーゼの特定の残基又は部位と相同（つまり一次構造又は三次構造の位置に対応する）或いは類似である場合、T・レセイグルコアミラーゼの残基と同等である。
【００９６】
一次構造の同一性を決定するため、グルコアミラーゼのアミノ酸配列はトリコデルマ・レセイグルコアミラーゼ一次配列と、特に配列が知られておりグルコアミラーゼにおいて不変であると知られている一組の残基と直接的に比較され得る。例えば、本明細書の図5Aと5Bはグルコアミラーゼの間で保存されている残基を示す。その保存されている残基を位置合わせし、位置の一致を維持するように必要な挿入と欠失を考慮に入れ（つまり、任意の欠失と挿入により保存残基が除去されることを避けるようにした）後、トリコデルマ・レセイグルコアミラーゼの一次構造中にあるアミノ酸と同等の残基が決定される。保存残基の位置の一致はそのような残基を100%保存することができる。しかし、保存残基の75%より大きい一致又は50%程の少ない位置の一致も同等の残基を決定するために適当であり、特に構造上の同一性に基づく位置の一致が含まれる場合にはそうである。
【００９７】
例えば、図5において、６種類の生物由来のグルコアミラーゼが位置合わせを受けアミノ酸配列間で最大の相同性を与えるように配置されている。これらの配列を比較するとアステリスクにより示されているように各配列中に多くの保存残基が含まれていることが分かる。これらの保存された残基は、そのため、例えばアスペルギルス・ニゲル由来のグルコアミラーゼのような他のグルコアミラーゼにおいて、トリコデルマ・レセイグルコアミラーゼの相当する同等のアミノ酸残基を決定するために使用できる。
【００９８】
構造的同一性は２構造の間の同等の残基の同定に関与する。「同等の残基」は、三次構造がX線結晶構造解析により決定された酵素について三次構造のレベルにおいて相同性（構造的同一性）を決定することにより定めることが出来る。同等の残基とは、トリコデルマ・レセイグルコアミラーゼの、あるアミノ酸残基の主鎖の原子のうち２以上の原子の原子座標（Ｎ対Ｎ、CA対CA、C対C、O対O）が位置合わせをした後に0.13nm以内好ましくは0.1nm以内にある残基であると定義される。位置合わせは、最良のモデルが、トリコデルマ・レセイグルコアミラーゼと比較対象となるグルコアミラーゼの水素以外のタンパク質原子の原子座標が最大の重なりを与えるように向きを決められ、位置を決められた後に行われる。この最良のモデルは、最高の分解能での実験的回折について最小のR因子(R factor)を与える結晶構造解析モデルである。
0005594898.tif 000007
【００９９】
トリコデルマ・レセイグルコアミラーゼの特定の残基と機能的に類縁である同等の残基は、トリコデルマ・レセイグルコアミラーゼの特定の残基について決まった方法で、そしてそれに帰すことの出来るやり方で、タンパク質構造、基質の結合又は触媒作用を変化させ、修飾し又は寄与するようにコンフォメーションをとることのできる酵素のアミノ酸として定義される。さらにそれらは、（残基の主鎖の原子が相同の位置を占めるとことに基づく同等性の基準を満たさないかもしれないが）その残基の側鎖の原子の少なくとも２個の原子座標がトリコデルマ・レセイグルコアミラーゼの対応する側鎖の原子の0.13nm以内にあるという限度で類似の位置にある（その三次構造がX線構造結晶解析により得られている）酵素の残基である。トリコデルマ・レセイグルコアミラーゼの三次元の座標は表９に記載され、上記に概略されたように三次構造のレベルで同等の残基を決定するために使用できる。
変異種
【０１００】
本発明の変異種は親グルコアミラーゼのアミノ酸配列に少なくとも１つの置換、欠失又は挿入を含み、その変異種を親グルコアミラーゼから配列において異なるものにしている。いくつかの実施態様では、本発明の変異種はTrGA(SEQ IDNo:2)のグルコアミラーゼ活性の少なくとも20%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも100%を有するだろう。いくつかの実施態様では、本発明の変異種は親TrGA(SEQIDNO:2)の少なくとも１のアミノ酸の位置、又は、TrGA配列と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%で配列同一性をもつもの、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも99%の配列同一性をもつものを非限定的に含む別の親グルコアミラーゼの配列中の同等の位置に、置換、欠失または挿入を含む。いくつかの実施態様では、親グルコミラーゼはTrGA配列と構造的同一性をもつ。
【０１０１】
他の実施態様では、本発明の変異種は、TrGA配列（SEQID NO:3）の触媒領域を含む親TrGAの断片の少なくとも１のアミノ酸の位置に、又は、そのTrGA配列の断片と少なくとも50％、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも99%の配列同一性をもつ、親グルコアミラーゼの触媒領域を含む断片の同等の位置に置換、欠失又は挿入を含む。いくつかの実施態様では、この断片は少なくとも400、425、450、及び/又は500個のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施態様では、この親グルコアミラーゼが触媒領域、連結領域及びデンプン結合領域を含む場合、この断片は連結領域の部分を含んでも良い。いくつかの実施態様では、この変異種はTrGA配列(SEQ ID NO:2またはSEQ IS NO:3)の断片のアミノ酸配列に置換、欠失又は挿入を含むであろう。いくつかの実施態様では、この変異種はTrGA配列(SEQ IDNO:2又は3)と構造的に同一性をもつであろう。
【０１０２】
アミノ酸置換に関し構造的同一性とは、相同グルコアミラーゼ又は親グルコアミラーゼの同等のアミノ酸の位置に置換を受けていることをいう。用語、同等の位置とは、TrGA対照グルコアミラーゼアミノ酸配列及び三次元配列と、問題にしている親グルコアミラーゼのアミノ酸配列の位置合わせと、問題にしている親グルコアミラーゼの三次元構造の位置合わせに基づいて、２個の親配列に共通である位置をいう。例えば、図５を参照すると、TrGA（SEQIDNO:3）の位置24は、D24であり、アスペルギルス・ニゲル(SEQ IDNO.6)の同等の位置は位置D25であり、アスペルギルス・オリゼ(SEQIDNO:7)の同等の位置はD26である。三次元配列の位置合わせの例について図６と７を参照せよ。
【０１０３】
いくつかの実施態様では、このグルコアミラーゼ変異種は対応する親グルコアミラーゼと比較したとき、１以上の置換（例．2，３または４置換）をもつ。
【０１０４】
ある実施態様では、グルコアミラーゼ変異種は、図5Aと5Bに示されているような非保存性アミノ酸の領域に対応する位置（例．図5Aと5Bに“＊”で指定されていない位置に対応するアミノ酸の位置）の少なくとも１個のアミノ酸の位置で置換、欠失又は挿入を含む。
いくつかの実施態様では、この変異種は図5Aと5Bに示されているような非保存性アミノ酸の領域に対応する位置で少なくとも１個のアミノ酸の位置に置換を含む。
【０１０５】
変異は、いくつかの実施態様では成熟タンパク質配列（SEQID NO:2または3）のいずれかの位置で起こりうるが、グルコアミラーゼ変異種はSEQID NO2又は3に表されているアミノ酸配列の以下の位置に１以上の置換を含む。：10,14,15,23,42,45,46,59,60
0005594898.tif 000008
379,382,390,391,393,394,408,410,415,417,418,430,431,433,436,442,443,444,448及び451または親グルコアミラーゼの同等の位置。いくつかの実施態様では、親グルコアミラーゼSEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:3と少なくとも50%同一、少なくとも60%同一、少なくとも70%同一、少なくとも80%同一、少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、少なくとも99%同一の配列をもつ。他の実施態様では、親グルコアミラーゼはトリコデルマグルコアミラーゼ相同体である。いくつかの実施態様では変異種は性質が変えられている。いくつかの実施態様では、親グルコアミラーゼはSEQ ID NO:2または3のグルコアミラーゼと構造的な同一性がある。
【０１０６】
いくつかの実施態様では、グルコアミラーゼ変異種はSEQID:2または3に表されるアミノ酸配列の以下の位置に１以上の置換を含む。：T10, L14, N15, T42,
0005594898.tif 000009
T430,A431,R433,I436,A442,N443,S444,T448及びS451または親グルコアミラーゼの同等の位置（例トリコデルマグルコアミラーゼ相同体）。いくつかの実施態様では、この変異種は親グルコアミラーゼと比較して性質が変えられている。
【０１０７】
他の実施態様では、親グルコアミラーゼの変異種はSEQ ID NO:2又は3に表されるアミノ酸配列の以下の位置で１以上の置換を含む。：10,14,15,23,59,60,61,65,67,68,72,73,97,98,99,102,110,113,133,140,144,145,147,152,153,164,182,204,205,214,216,219,228,229,230,231,236,239,241,242,263,264,265,268,269,276,284,291,300,301,303,311,338,342,344,346,349,359,361,364,375,379,382,390,391,393,394,410,417,418,430,431,433,442,444,448及び451または親グルコアミラーゼの同等の位置。いくつかの実施態様では、親グルコアミラーゼはSEQID:NO2またはSEQID NO:3と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一の配列をもつ。他の実施態様では親グルコアミラーゼはトリコデルマグルコアミラーゼ相同体である。いくつかの実施態様では、変異種は親グルコアミラーゼと比較して少なくとも１個性質が変化している。いくつかの実施態様では、少なくとも１個の変異した性質は特異的活性である。いくつかの実施態様では、この変異種は以下の位置の１つに対応する１以上の置換をもつ。：SEQID NO:2及び/又は3の61,67,72,97,102,133,205,219,228,  230,231,  239,263,268,291,342,394,430,431及び451である。いくつかの実施態様では、これらの位置での置換は、SEQIDNO:2及び/または3のN61I,T67M,A72Y,S97N,S102M,  I133T,T205Q,Q219S,W228H,W228M,S230F,S230G,S230N,S230R,S231L,I239V,I239Y,  N263P,A268C,A268G,A268K,S291A,T342V,K394S,T430K,A431Q,及びS451Kから選ばれる。いくつかの実施態様では、この変異種は以下の位置の一つに対応する１以上の置換をもつ。：SEQIS NO:2及び/または3の72,133,219,228,230,231,239,263,268及び451。いくつかの実施態様では、この位置での置換は、SEQID NO:2及び/または3のA72Y、I133T、Q219S、W228H、W228M、S230R、S230F、S230G、S230N、S230R、S231L、I239V、N263P、A268C、A268G、及びS451K。いくつかの実施態様では、この変異種は少なくとも１個の変異した性質をもち、この少なくとも１つの変異した性質は親グルコアミラーゼと比較して特異的活性が増大している。
【０１０８】
さらに別の実施態様では、親グルコアミラーゼの変異種はSEQID NO:2または3で表されたアミノ酸配列の以下の位置に以下の置換のうち少なくとも１個の置換を含んでいる。
0005594898.tif 000010
0005594898.tif 000011
0005594898.tif 000012
及びS451E/H/K/L/Q/Tまたは親グルコアミラーゼの同等の位置の置換。
【０１０９】
他の実施態様では、親グルコアミラーゼの変異種はSEQID NO:2又は3で表されるアミノ酸配列の以下の位置に１以上の置換を含む。；10,15,23,42,59
0005594898.tif 000013
448及び451または親グルコアミラーゼ（例．トリコデルマグルコアミラーゼ相同体）の同等の位置。いくつかの実施態様では、親グルコアミラーゼはSEQIDNO:2またはSEQIDNO:3と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一の配列をもつ。いくつかの実施態様では、親グルコアミラーゼはまた、SEQIDNO:2または3のグルコアミラーゼと構造的同一性も示す。他の実施態様では、親グルコアミラーゼはトリコデルマグルコアミラーゼ相同体である。いくつかの実施態様では、この変異種は以下の位置の一つに対応する１以上の置換をもつ。SEQID:NO：2及び/または3の10、42、68、73、97、114、153、229、231、236、264、291、301、344、361、364、375、417、及び433。いくつかの実施態様では、これらの位置での置換は、SEQIDNO:2及び/または3のT10S、T42V、E68C、E68M、G73F、G73W、K114M、K114T、N153A、N153S、N153V、W228V、D236R、G361D、G361E、G361P、G361Y、A364D、A364E、A364F、A364G、A364K、A365L、A365R、R433C、R433L、R433N、R433S、R433V、及びI436Hから選ばれる。いくつかの実施態様では、この変異種は以下の位置の１つに対応する１以上の置換を有する。:SEQID NO:2及び/または3の42,68,73,114,153,236,361及び364。いくつかの実施態様では、これらの位置での置換は、SEQIDNO:2及び/または3のT42V、E68M、G73F、G73W、K114T、N153S、N153V、D236R、G361D、A364F及びA364Lから選ばれる。いくつかの実施態様では、この変異種は少なくとも１つの変異した性質をもち、この少なくとも１つの変異した性質は親グルコアミラーゼと比較して熱安定性の増大である。
【０１１０】
他の実施態様では、親グルコアミラーゼの変異種はSEQIDNO:2または3で表されたアミノ酸配列の以下の位置で１以上の置換を含む。10,15,59,61,68,
0005594898.tif 000014
430、431、433、444、448、及び451及び/または親グルコアミラーゼの同等の位置（例．トリコデルマグルコアミラーゼ相同体）。いくつかの実施態様では、親グルコアミラーゼはSEQID:2またはSEQIDNO:3と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、及び少なくとも99%の配列の同一性をもつ。いくつかの実施態様では、親グルコアミラーゼは、またSEQID No:2及び/または3のグルコアミラーゼと構造的同一性ももつ。他の実施態様では、親グルコアミラーゼはトリコデルマグルコアミラーゼ相同体である。いくつかの実施態様では、変異種は親グルコアミラーゼと比較して少なくとも１個の変異した性質をもつ。いくつかの実施態様では、この変異種はSEQID NO2及び/または3の以下の位置：228,230,231,268,291,417,433及び451のうち対応する１箇所に対応する１以上の置換を受けている。いくつかの実施態様では、これらの位置での置換は、SEQID:2又は3のＷ228H, W228M, S230F, S230G, S230R, S231L, A268C, A268G, S291A, L417R, R433Y,及びS451Kから選ばれる。いくつかの実施態様では、この変異種は、少なくとも１個の変異した性質を有し、この少なくとも１個の変異した性質は親グルコアミラーゼと比較して熱安定性又は特異的活性の増大である。いくつかの実施態様では、この変異種は親グルコアミラーゼと比較して熱安定性と特異的活性の両者が増大している。
【０１１１】
本発明のグルコアミラーゼ変異種は、例えば、一のグルコアミラーゼ由来のデンプン結合領域(SBD)と、別のグルコアミラーゼ由来の触媒領域及び連結部位をもつキメラ又はハイブリッドのグルコアミラーゼを含んでも良い。例えば、あるハイブリッドグルコアミラーゼはTrGA由来のSBD をAnGA由来のSBDと交換し、AnGA SBDとTrGA触媒領域及び連結部位をもつハイブリッドを形成することにより作成できる。または、AnGA由来のSBDと連結部位は、TrGAのSBDと連結部位と交換できる。
【０１１２】
いくつかの面では、この変異グルコアミラーゼは親グルコアミラーゼと比べて熱的安定性が増大している。いくつかの実施態様では、変異した性質は親グルコアミラーゼと比較して特異的活性が増大している。いくつかの実施態様では、この変異した特異的活性は、親グルコアミラーゼと比較して増大した低温で熱安定性である。いくつかの実施態様では、この変異した性質は親グルコアミラーゼと比較して増大した特異的活性と熱安定性の両者である。
【０１１３】
多くの親グルコアミラーゼはTrGAのアミノ酸配列と位置合わせされた。図５は、以下の親グルコアミラーゼ、つまりアスペルギルス・アワモリ(AaGA)(SEQID NO:5);アスペルギルス・ニゲル(AnGA)(SEQIDNO:6);アスペルギルス・オリゼ(AoGA)(SEQIDNO:7)、フミコラ・グリセア(HgGA)(SEQ ID NO:8)及びヒポクレア・ビノザ(HvGA)(SEQID NO:9)の触媒領域を含む。この触媒領域の%同一性は下の表１に表されている。
0005594898.tif 000015
【０１１４】
いくつかの実施態様では、例えば、この変異グルコアミラーゼはアスペルギルスグルコアミラーゼである親グルコアミラーゼに由来し、この変異種はSEQID NO:2又はSEQID NO:3に表された位置と同等の位置、特に以下に対応する位置に少なくとも１個の置換を含む。T10,L14,N15,P23,T42,P45,D46,F59,K60,N61,R65,T67,E68,A72,G73,S97,L98,A99,  S102,K108,E110,L113,K114,R122,Q124,R125,I133,K140,N144,N145,Y147,S152,N153,N164,F175,N182,A204,T205,S214,V216,Q219,W228,V229,S230,S231,D236,I239,N240,T241,N242,G244,N263,L264,G265,A268,G269,D276,V284,S291,P300,A301,A303,Y310,A311,D313,Y316,V338,T342,S344,T346,V349,V359,G361,A364,T375,N379,S382,S390,E391,A393,K394,K408,S410,S415,L417,H418,T430,A431,R433,I436,A442,N443,S444,T448及びS451。
変異された性質
【０１１５】
本発明は親グルコアミラーゼ、特にTrGAと比較したとき少なくとも１個の変異した性質（例．改良された性質）を有するグルコアミラーゼ変異種も提供する。いくつかの実施態様では、少なくとも１個の変異した性質（例．改善された性質）は酸安定性、熱的安定性及び特異的活性から選ばれる。いくつかの実施態様では、この変異された性質は、酸安定性の増大、熱的安定性の増大及び/または特異的活性の増大である。いくつかの実施態様では、この増大した熱的安定性は高い温度で現れる。いくつかの実施態様では、この増大したpH安定性は高いpHで現れる。さらに別の実施態様では、増大したpH安定性は低いpHで現れる。
【０１１６】
本発明のこのグルコアミラーゼ変異種は、また親グルコアミラーゼと比較して低い基質濃度でのデンプン加水分解の高い速度も与えうる。この変異種は同一条件下で試験したとき、親グルコアミラーゼと比較して大きいVmaxと小さいKmを持ちうる。例えば、この変異グルコアミラーゼは25℃から70℃の温度範囲(25℃から35℃；30℃から35℃；40℃から50℃；50℃から55℃及び55℃から62℃)で大きいVmaxを持ち得る。ミカエリス-メンテンの定数、KmとVmax値は標準的な既知の手順を用いて容易に決定できる。
熱的安定性（熱的に安定な変異種）
【０１１７】
いくつかの実施態様では、本発明は親（野生型）と比較して熱的安定性が変化した変異グルコアミラーゼに関する。変異した熱安定性は高い温度又は低い温度で増大している。熱的安定性は、NaAc緩衝液pH4.5、64℃で1時間保温後の%残存活性として測定される。これらの条件下では、TrGAは保温前の初期活性と比較して、日常的な変化により約15乃至44%の残存活性を有する。そのため、いくつかの実施態様では、熱的安定性の増大した変異種は保温前の初期活性と比較したとき、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27％、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%及び50%
を含む、親株よりも少なくとも1%乃至少なくとも50%以上大きい残存活性（NaAc 緩衝液、pH4.5、64℃で1時間保温後）を有する。例えば、親株の残存活性が15%のとき、熱安定性が増大している変異種は約16%乃至約75%の残存活性を有しうる。いくつかの実施態様では、このグルコアミラーゼ変異種は、例えば、少なくとも60分、120分、180分、240分、300分などの、所与の期間にわたり、温度を変えて暴露した後、少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%又は99%の酵素活性を保持するような改善された熱安定性を有する。いくつかの実施態様では、この変異種は40から80℃の範囲、また50から75℃の範囲、60から70℃の範囲の選択された温度と4.0から6.0のpHの範囲で、親グルコアミラーゼと比較して熱安定性が増大する。いくつかの実施態様では、熱安定性は実施例で述べられているように決定される。いくつかの実施態様では、変異種は35℃から45℃及び30℃から40℃等の20℃から50℃の範囲で選ばれた温度で親グルコアミラーゼと比較して比較的低温で熱安定性が増大している。
【０１１８】
いくつかの実施態様では、熱安定性が改善された変異種は、SEQIDNO:2またはSEQIDNO:3で表されたアミノ酸配列の以下の位置で、１以上の欠失、置換または挿入、特に置換を含む。即ち、T10, N15, P23, T42, F59, K60, N61, E68, A72, G73, S97, L98, A99, S102, K114, I133, K140, N144, Y147, S152, N153, N164, N182, A204, T205,S214, V216, W228, V229, S230, S231, D236, T241, N242, N263, L264, G265, A268, G269, D276, V284, S291, P300, A301, A303,A311,V338,T342,S344,T346,A349,V359,G361,A364,T375,  N379,S382,S390,E391,K394,S410,L417,T430,A431,R433,I436,A442,N443,S444,T448とS451及び/または親グルコアミラーゼの同等の位置である。いくつかの実施態様では、この親グルコアミラーゼはトリコデルマグルコアミラーゼ相同体であり、さらに別の実施態様では、親グルコアミラーゼは、SEQID NO:2または3と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%及び少なくとも98%配列が同一である。いくつかの実施態様では、親グルコアミラーゼは、またSEQID NO:2及び/又は3と構造的に同一である。いくつかの実施態様では熱安定性の増大した変異種はSEQ ID NO:2及び/又は3の位置10, 42, 68, 73, 97, 153, 229, 231, 236, 264, 291, 301, 344, 361, 364, 375及び/または417の少なくとも１つで置換を受けている。いくつかの実施態様では、熱安定性を有するこの変異種はSEQID :2またはSEQID NO:3の位置42,68,73,  153,236,344,361,364及び365の少なくとも１つに置換を受けている。
特異的活性
【０１１９】
本明細書で使用する場合、特異的な活性はタンパク質1mg当たりのグルコアミラーゼの活性である。活性はエタノール定量を用いて決定された。このスクリーニングは親TrGA PIと比較する性能指数(PI)＞1.0をもつ変異種を同定した。このPIは野生型(WT)と変異種の特異的活性（1mg の酵素当たりの活性）から計算される。これは「変異種の特異的活性」/「野生体の特異的活性」の商であり、この変異種の特異的活性の増分の尺度である。2のPIは野生型より約２倍活性が高い。いくつかの面では、本発明は親または野生型グルコアミラーゼと比較して変わった特異的活性を有する変異グルコアミラーゼに関する。いくつかの実施態様では、特異的活性の変化は特異的活性の増大である。特異的活性の増大は、約1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9及び2等の、約１以上の性能指数の増大として定義できる。いくつかの実施態様では、特異的活性の増大は、1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,  2.0,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3.0,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6,3.7,3.8,3.9,4.0,4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6,4.7,4.8及び4.9等の約1.0から約5.0である。いくつかの実施態様では、この変異種は、少なくとも1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.2倍、2.5倍、2.7倍、2.9倍、3倍、４倍及び5倍等、親グルコアミラーゼよりも少なくとも１倍高い特異的活性を有する。
【０１２０】
いくつかの実施態様では、特異的活性が改良されている変異種は、SEQID NO:2及び/又は3で表されたアミノ酸配列の以下の位置に１以上の欠失、置換又は挿入を含む。即ち、T10、L14、N15、P23、F59、K60、N61、T67、E68、A72、Ｇ73、S97、L98、A99、S102、E110、L113、Ｉ133、K140、N144、N145、Y147、S152、N153、N164、N182、A204、T205、S214、V216、Q219、W228、V229、S230、S231、D236、I239、T241、N242、N263、L264、G265、A268、G269、D276、V284、S291、P300、A301、A311、V338、T342、S344、T346、A349、V359、G361、A364、T375、N379、S382、S390、E391、A393、K394、S410、S415、L417、H418、T430、A431、R433、A422、S444、T448及び/またはS451及び/又は親グルコアミラーゼの同等の位置。いくつかの実施態様では、改善された特異的活性をもつ本発明の変異種はSEQ ID NO:2または3で表されたアミノ酸配列の以下の位置に置換を受けている。61,67,72,97,102,133,205,219,228,230,231,239,263,268,291,342,394,430,431及び451及び/又は親グルコアミラーゼの同等の位置。いくつかの実施態様では、親グルコアミラーゼはSEQID NO:2または3と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%の配列の同一性を有する。いくつかの実施態様では、親グルコアミラーゼはSEQ ID NO 2及び/または3と構造的な同一性を有する。いくつかの実施態様では、特異的活性が増大した変異種は、SEQID NO:2及び/又は3の72、133、219、228、230、231、239、263、268及び451の位置の少なくとも一つの位置で置換を受けている。
熱安定性と特異的活性の組み合わせ
【０１２１】
いくつかの面では、本発明は親（例．野生型）と比較して変化した熱安定性及び変化した特異的活性の両者を有する変異グルコアミラーゼに関する。いくつかの実施態様では、この変化した特異的活性は増大した特異的活性である。いくつかの実施態様では、この変化した熱安定性は親グルコアミラーゼと比較して高い温度（例．80℃より高い温度）で熱安定性が増大したものである。
【０１２２】
いくつかの実施態様では、熱安定性が増大し、特異的活性が増大した変異種はSEQID NO:2または3で表されたアミノ酸配列の以下の位置において１以上の欠失、置換または挿入を含む。T10、N15、F59、N61、Ｅ68、A72、G73、S97、A99、S102、I133、K140、N153、N182、A204、T205、S214、W228、V229、S230、S231、D236、T241、N242、L264、G265、A268、D276、V284、S291、Ｐ300、A301、A303、A311、V338、S344、T346、V359、G361、A364、T375、N379、S382、E391、A393、K394、S410、L417、T430、A431、R433、S444及び/またはS451及び/または親グルコアミラーゼの同等の位置。いくつかの実施態様では、親グルコアミラーゼはトリコデアルマグルコアミラーゼ相同体であり、さらに別の実施態様では、この親グルコアミラーゼはSEQID:2 または3と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%の配列の同一性を有する。いくつかの実施態様ではこの親グルコアミラーゼは、またSEQIDNO:2及び/または3と構造的に同一である。いくつかの実施態様では、増大した熱安定性と特異的活性を有するこの変異種はSEQID NO:2及び/又は3の228、230、231、268、291、417、433及び451のうち少なくとも１つの位置に置換を受けている。
ポリヌクレオチド
【０１２３】
本発明は、また本発明の変異グルコアミラーゼをコードしている単離されたポリヌクレオチドに関する。このポリヌクレオチドは本技術分野で既知の確立された技術により調製できる。このポリヌクレオチドは、たとえば自動DNA合成装置により、合成できる。このDNA配列は、断片をつなぐことにより作成されたゲノムDNA（又はcDNA）と合成品の混合物でも良い。このポリヌクレオチドは、特異的なプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によっても調製される。一般的には、Minshull, J.,ら(2004), Engineered protein function by selective amino acid diversification, Methods 32(4):416-427を参照。DNAは、またGeneart AG, Regenburug,Germany  のような多くの企業により合成されている。
【０１２４】
本発明は(i) 少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%等、SEQ ID NO:4と少なくとも50%同一性をもち、または(ii)中間から高い厳密性の条件下でSEQ ID NO:4で表されたヌクレオチド配列に由来するプローブへハイブリッド形成でき、または(iii)SEQ ID NO:4で表されたヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性をもつヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドも提供する。本発明に有用なプローブは、SEQ IDNO:4の少なくとも50、100、150、200、250、300またはそれより多い連続的なヌクレオチドを含んでも良い。いくつかの実施態様では、このコードされたポリペプチドは、またSEQID NO2及び/または3と構造的に同一である。
【０１２５】
本発明は、さらにSEQ ID NO:2と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一のアミノ酸配列を含む変異グルコアミラーゼをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。加えて、本発明は上記の提供されたポリヌクレオチドのいずれかを含む発現ベクターを提供する。
【０１２６】
本発明は本明細書に記載された変異グルコアミラーゼをコードするDNAの断片(つまり、一部分)も提供する。これらの断片は糸状菌（例．トリコデアルマ、アスペルギルス、フザリウム、ペニシリウムとフミコラ属）由来の本明細書に述べられた成熟グルコアミラーゼ酵素、またはグルコアミラーゼ活性をもつその一部分をコードするポリヌクレオチドを単離するまたは同定するために使用され得る、一部分のDNA断片を得るときに使用される。いくつかの実施態様では、このDNAの断片は、少なくとも50、100、150、200、250、300個またはそれより多い連続したヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施態様では、SEQID NO:4で与えられたDNAの一部分は、他の種、例えばグルコアミラーゼをコードする糸状菌、から親グルコアミラーゼ、特にトリコデルマグルコアミラーゼ相同体を得るときに使用される。
DNA構造体とベクター
【０１２７】
本発明の一実施態様によれば、本発明に含まれ、プロモーター配列に機能的に連結されている変異グルコアミラーゼをコードする上記に述べたようなポリヌクレオチドを含むDNA構造体が作成され宿主細胞へ導入される。
【０１２８】
DNA構造体はベクターを用いて宿主細胞へ導入されても良い。このベクターは宿主細胞へ導入されるとき、安定に導入されるいずれのベクターでも良い。いくつかの実施態様では、このベクターは、宿主細胞のゲノムへ組み入れられ、複製される。クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセット等を含む。いくつかの実施態様では、このベクターはグルコアミラーゼをコードする配列に機能的に連結されている調整配列を含む発現ベクターである。
【０１２９】
適した発現及び/または組み込みベクターの例はSambrookら(1983)上記、及びAusubel  (1987)上記、及びBennettとLasure(編)のvan den Hondelら(1991)MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press pp. 396-428及びＵＳ特許第5,874,276号に与えられている。ベクターの一覧についてはFungal Genetics Stock Center Catalog of Strains(FGSC, ＜www.fgsc.net＞)も参照せよ。特に有用なベクターは例えば、InvitrogenとPromegaから得られるベクターを含む。
【０１３０】
細菌細胞に使用される適したプラスミドはpBR322とpUC19を含み、大腸菌で複製でき、pE194は例えば、バシルス属で複製できる。大腸菌宿主細胞での使用に適した他の具体的なベクターはpFB6、pBR322、pUC18、pUC100、pDONR(商標)201、pDONR (商標)221、pENTR(商標)、pGEM（登録商標）3Z及びpGEN（登録商標）4Zのようなベクターを含む。
【０１３１】
菌類の細胞で用いるに適した具体的ベクターはpRAXを含み、アスペルギルス属で有用な一般用の発現ベクターは、glaAプロモーターをもつpRAXであり、ヒポクレア属/トリコデルマ属については、cbh1プロモーターをもつpTrex3gを含む。
【０１３２】
いくつかの実施態様では、このプロモーターは細菌又は菌類宿主細胞で転写活性を示し、そして宿主細胞と同種又は異種のタンパク質をコードする遺伝子由来でも良い。このプロモーターは変異、短縮(truncated)及び/またはハイブリッドプロモーターでも良い。上記のプロモーターは本技術分野で知られている。菌類細胞で、特にトリコデルマ属又はアスペルギルス属細胞のような糸状菌菌類細胞で有用な、適したプロモーターの例は、T・レセイプロモーター、cbh1、cbh2、egl1、egl2、eg5、xln1とxln2のようなプロモーターを含む。有用なプロモーターの他の例は、A・アワモリとA・ニゲルグルコアミラーゼ遺伝子(glaA)由来のプロモーター（Nunbergら(1984) Mol.Cell.Biol.4:2306-2315及びBoelら(1984)EMBO J. 3:1581-1585）、A・オリゼTAKA アミラーゼプロモーター、S・セレビシエ由来のTPI(リン酸トリオース異性化酵素)プロモーター、アスペルギルス・ニジュランスアセトアミド遺伝子とリゾムコル・ミヘイリパーゼ遺伝子由来のプロモーターを含む。細菌細胞で有用な、適したプロモーターの例は大腸菌lacオペロンからのもの；バシルス・リケニフォルミスアルファアミラーゼ遺伝子(amyL)からのもの、B・ステアロテルモフィラスアミラーゼ遺伝子(amyS)からのもの;バシラス・スブチリス xylAとxylB遺伝子からのもの、ベータ-ラクタマーゼ遺伝子からのもの、及びtacプロモーターを含む。いくつかの実施態様では、このプロモーターは宿主細胞に固有のものである。例えば、T・レセイが宿主であるとき、プロモーターは固有のT・レセイプロモーターである。他の実施態様では、このプロモーターは菌類宿主細胞にとり異種である。いくつかの実施態様では、このプロモーターは親グルコアミラーゼ(例．TrGAプロモーター)のプロモーターである。
【０１３３】
いくつかの実施態様では、DNA構造体はシグナル配列、つまりコードされるポリペプチドを細胞の分泌経路へ向かわせる、そのポリペプチドのアミノ酸末端に結合したアミノ酸配列、の核酸のコードを含む。核酸配列のコード領域の5’末端はシグナルペプチドコード領域を天然に含んでも良く、これは翻訳領域内で、分泌を受けるグルコアミラーゼをコードするグルコアミラーゼコード領域の部分と天然に連結している。または核酸配列のコード領域の5’末端はコード領域にとり異種のシグナルペプチドを含んでも良い。いくつかの実施態様では、DNA構造体は、変異グルコアミラーゼが得られた親グルコアミラーゼ遺伝子と天然に組み合わされているシグナル配列を含む。いくつかの実施態様では、このシグナル配列はSEQ ID NO:1に記された配列であり、または、それに少なくとも90%、少なくとも94%、少なくとも98%の配列の同一性を有する配列である。効果的なシグナル配列は他の糸状菌菌類酵素、例えば、トリコデルマ属(T・レセイグルコアミラーゼ)、フミコラ属（H．インソレンスセルラーゼ、又はH．グリセアグルコアミラーゼ）、アスペルギル属(A.ニゲルグルコアミラーゼとA.オリゼTAKAアミラーゼ)、及びリゾプス属から得られるシグナル配列を含む。
【０１３４】
他の実施態様では、宿主細胞に導入される、シグナル配列とプロモーター配列を含むDNA構造体またはベクターは、同一の源から得られる。いくつかの実施態様では、トリコデルマグルコアミラーゼ相同体、例えば、ヒポクレア属の株由来のシグナル配列の固有のグルコアミラーゼシグナル配列を使用できる。
【０１３５】
いくつかの実施態様では、発現ベクターはまた、終止配列も含む。宿主細胞で機能するいずれの終止配列も本発明で使用できる。いくつかの実施態様では、終止配列とプロモーター配列は同一の源から得られる。別の実施態様では、この終止配列は宿主細胞と同種である。有用な終止配列はトリコデアルマ・レセイcbh1；A・ニゲルまたはA・アワモリグルコアミラーゼ(Nunbergら(1984)上記、及びBoelら(1984)上記)、アスペルギルス・ニジュランスアントラアニレート合成酵素、アスペルギルス・オリゼTAKAアミラーゼ、またはA・ニジュランス trpC (Punt,ら(1987), Gene 56:117-124)の遺伝子から得られる終止配列を含む。
【０１３６】
いくつかの実施態様では、発現ベクターは選択的マーカーを含む。選択的マーカーの例は抗菌剤耐性（例．ヒグロマイシンとフレオマイシン）を与えるものを含む。amdS (アセトアミダーゼ)、argB（オルニチンカルバモイル転移酵素）及びpyrG（オロチジン-5’リン酸脱炭酸酵素）のような本技術分野で知られているマーカーを含む、栄養的選択的マーカーもまた本発明で使用できる。トリコデルマ属の形質転換のためのベクター系で有用なマーカーは、本技術分野で知られている。（例．Finkelstein、BIOTECHNOLOGY OF FILAMENTOUS FUNGI, Finkelsteinら (1992) 編の第6章、Butterworth-Heinemann, Boston, A; Kinghornら、(1992) APPLIED MOLECULAR GENETICS OF FILAMENTOUS FUNGI, Blackie Academic and Professional, Chapman 及びHall, ロンドン；BergesとBarreau(1991) Cur. Genet. 19:359-365;；及びvan Hartingsveldtら(1987) Mol.Gen.Genet.206:71-75参照）。いくつかの実施態様では、選択的マーカーはamdS遺伝子であり、これは酵素アセトアミダーゼをコードし、形質転換された細胞を窒素源としてアセトアミドを使用して増殖させる。選択的マーカーとしてA・ニジュランス amdS遺伝子の使用はKelleyら(1985) EMBO J. 4:475-479とPenttilaら(1987) Gene 61:155-164に述べられている。
【０１３７】
変異グルコアミラーゼ、プロモーター、ターミネーターと他の配列をコードする核酸配列を含むDNA構造体を結合し、適したベクターへ挿入するために使用される方法は本技術分野で良く知られている。結合は一般的に都合の良い制限部位でのリゲーションにより行われる。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドリンカーが従来の方法に従い使用される。（Sambrook(1989)上記、及びBennettとLasure, MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press, San Diego(1991) pp70-76参照）。加えて、ベクターは既知の組換え技術を用いて構築できる。(例．Invitrogen Life Technology, Gateway Technology)
宿主細胞
【０１３８】
本発明は、また本発明の変異グルコアミラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞にも関する。いくつかの実施態様では、宿主細胞は細菌、菌類、植物細胞及び酵母から選ばれる。用語、宿主細胞は、細胞、その細胞の前駆体及び本発明に従い変異グルコアミラーゼを産生するために使用される細胞から作成されたプロトプラストを含む。
【０１３９】
いくつかの実施態様では、宿主細胞は菌類細胞であり、好ましくは糸状菌菌類宿主細胞である。用語「糸状菌菌類」は、亜門ユーマイコチナ(Eumycotina)の全ての糸状菌の形態（Alexopoulos, C.J. (1982), INTRODUCTORY MYCOLOGY, Wieley, New York参照）をいう。これらの菌類はキチン、セルロース及び他の複雑な多糖からなる細胞壁により植物性菌糸体により特徴付けられる。本発明の糸状菌菌類は形態的に、生理的に及び遺伝学的に酵母とは異なる。糸状菌菌類による植物的な増殖は菌糸の伸長により、炭素代謝は必然的に嫌気的である。本発明では、糸状菌菌類の親細胞は、非限定的にトリコデルマ属の種（例．トリコデルマ・レセイ、ヒポクレア・ジェコリナの無性体、以前T. ロンギブラキアツムと分類されていたもの、トリコデルマ・ビルデ、トリコデルマ・コニンギ、トリコデルマ・ハルジアヌム）（Sheir-Nerisら(1984) Appl. Microbiol.Biotechnol 20:46-53;ATCC No.56765及びATCC No.26921）、ペニシリウム属の種、フミコラ属の種（例．H・インソレンス、H・ラヌギノザ及びH・グリセア）クリソスポリウム属の種（例．C. ルクノベンス）、グリオクラジム属の種、アスペルギルス属の種(例．A・オリゼ、A・ニゲル、A・ソジェ、A・ジャポニクス、A・ニジュランス及びA・アワモリ)(Wardら(1993)Appl. Microbiol. Biotechnol. 39:738-743及びGoedegebuurら(2002) Genet 41:89-98)、フサリウム属の種（例．F・ロゼウム、F・グラミヌム、F・セレアリス、F・オキシスポラム及びF・ベネナタム）、ニューロスポラ属の種(N.クラッサ)、ヒポクレア属の種、ムコル属の種(M.ミヘイ)、リゾプス属の種及びエメリセラ属（Innisら(1985)Sci.228:21-26）の種の細胞でもよい。用語「トリコデルマ」または「トリコデルマ属の種」はトリコデルマとして以前または現在分類されているいずれの菌類もいう。
【０１４０】
いくつかの実施態様では、宿主細胞はグラム陽性細菌細胞である。非限定的な例はストレプトマイセス属の株（例．S.リビダンス、S．セリカラー及びS.グリセウス）及びバシルス属の株を含む。本明細書で使用する場合、「バシルス属」は、B・スブチリス、Ｂ・リケニフォルミス、B・レンタス、B・ブレビス、B・ステアロテルモフィルス、B・アルカロフィルス、B・アミロリケファシエンス、Ｂ・クラウシ、Ｂ・ハロジュランス、Ｂ・メガテリウム、Ｂ・コアグランス、Ｂ・サーキュランス、Ｂ・ラウツス及びＢ・スリンギエンシスを非限定的に含む、本技術分野の技術者に知られている「バシルス」属の全ての種を含む。
バシルス属は分類学上の再分類を受けて続けていることが知られている。従って、この属は、現在「ジオバシルス・ステアロテルモフィルス」と名づけられている、B・ステアロテルモフィルスのような生物を非限定的に含む、再分類されている種を含むことが意図されている。
【０１４１】
いくつかの実施態様では、宿主細胞は大腸菌やシュードモナス属の種のような、グラム陰性菌株である。他の実施態様では、この宿主細胞はサッカロマイセス属の種、シゾサッカロマイセス属の種、ピキア属の種またはカンジダ属の種のような酵母の細胞でもよい。
【０１４２】
他の実施態様では、この宿主細胞は、例えば細菌又は菌類細胞中で欠失により固有の遺伝子が不活性化された遺伝学子工学的に操作を受けた宿主細胞である。１以上の不活性化された遺伝子を有する菌類の宿主細胞を得ることを望む場合、既知の方法が使える（例．USP第5,246,853号、USP第5,475,101号及びWO92/06209に開示された方法）。遺伝子不活性化は、完全な、又は部分的欠失、挿入的不活性化又は、意図する目的のため遺伝子を非機能化するいずれか他の方法（その結果、この遺伝子が機能的タンパク質の発現することを妨げられる）により達成されても良い。いくつかの実施態様では、宿主細胞がトリコデルマ細胞であり、特にT・レセイ宿主細胞であるとき、cbh1、cbh2、egl1及びegl2遺伝子は不活性化され及び/または欠失される。USP第5,847,276号とWO05/001036に、４タンパク質が欠失されたトリコデルマ・レセイ宿主細胞の例が記載され、述べられている。他の実施態様では、この宿主細胞はプロテアーゼ欠損又はプロテアーゼマイナス株である。
宿主細胞の形質転換
【０１４３】
宿主細胞へのDNA構造体又はベクターの導入は形質転換、エレクトロポレーション、核マイクロインジェクション、トランスダクション、トランスフェクション（例．リポフェクション媒介及びDEAE-デキストリン媒介トランスフェクション）；リン酸カルシウムDNA沈殿物による導入；DNAコートされたマイクロプロジェクタイル(microprojectile)による高速射出；及びプロトプラスト融合のような技術を含む。一般的な形質転換技術は本技術分野で知られている（Ausbelら(1987)、上記、第９章、及びSambrook(1989)上記、及びCampbellら(1989) Curr.Genet 16:53-56参照）。
【０１４４】
バシルスの形質転換法はAnagnostopoulos CとJ.Spizizen(1961) J.Bacteriol.81:741-746とWO02/14490を含む多くの引用文献に開示されている。
【０１４５】
アスペルギルス属の形質転換法はYeltonら(1984) Proc. Natl.Acad.Sci.USA 81:1470-1474;  Berkaら(1991), Applications of Enzyme Biotechnology, Eds. Kelly 及び Baldwin, Plenum Press(NY);Caoら(2000)Sci.9:991-1001；Campbellら(1989) Curr Genet.16:53-56、EP238023に述べられている。トリコデルマ属での異種タンパク質の発現は、USP6,022,725;USP6,268,328；、Harkkiら(1991); Enzyme Microb. Technol. 13:227-233；Harkkiら(1989) Bio Technol. 7: 596-603；EP 224,234;EP215,594;及びLeongとBerka編、Marcel Dekker Inc.,NY(1992),  MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY pp129-148のNevalainenら”The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes”に述べられている。フザリウム株の形質転換については、WO96/00787とBajarら(1991) Proc Natl Acad. Sci. USA 88:8202-28212も参照せよ。
【０１４６】
ある具体的な実施態様では、形質転換のためのトリコデルマ属の種の調製は菌類の菌糸体からプロトプラストの調製を含む。（Campbellら(1989) Curr.Genet. 16:53-56;Pentillaら(1987) Gene 61:155-164参照）アグロバクテリウム・ツメファシエンス-が媒介する糸状菌菌類の形質転換が知られている。（de Grootら,(1998) Nat. Biotechnol. 16:839-842参照）。糸状菌菌類の宿主で使用された形質転換手順についてUSP6,022,725とUS6,268,328も参照せよ。
【０１４７】
いくつかの実施態様では、遺伝学的に安定な形質転換体が、ベクターシステムにより構築され、その際、変異グルコアミラーゼをコードする核酸が安定的に宿主株の染色体へ組み入れられる。形質転換体はその後、既知の技術により精製される。
【０１４８】
いくつかの別の実施態様では、この宿主細胞は植物細胞であり、例えば単子葉植物由来の細胞（例．とうもろこし、小麦及びモロコシ）または双子葉植物（例．大豆）由来の細胞である。植物の形質転換においてDNA構造体を有用にする方法と植物の形質転換の方法は知られている。これらの方法のいくつかは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスが媒介する遺伝子転移、マイクロプロジェクタイル注入、プロトプラストのPEG媒介形質転換、エレクトロポレーション等を含む。USP6,803,499、USP6,777,589、Frommら(1990) Biotechnol.8:833-839;Potrykusら(1985) Mol.Gen.Genet. 199:169-177を参照。
タンパク質の産生
【０１４９】
本発明は、さらに変異グルコアミラーゼを産生する方法に関連し、これは、本発明の変異グルコアミラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターによる宿主細胞を形質転換し、発現と変異グルコアミラーゼの産生に適した条件下でこの宿主細胞を培養し、及び任意にこの変異種を回収することを含む。
【０１５０】
本発明の発現と産生法において、宿主細胞は、実験的又は工業的発酵において、振とうフラスコ培養、小スケール又は大スケールの発酵（連続式、バッチ式及び供給式バッチ発酵等）において適した条件下で、生理的な塩と栄養を含む適した培地で培養される（例えば、Pourquie, J.らBIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSE DEGRADATION、Ausbert、Ｊ．Ｐら編、Academic Press, pp.71-86,1988及びIlmen,Mら(1997) Appl.Environ.  Microbiol.63:1298-1306  参照）。一般的な市販の調製された培地（例．Yeast Malt Extract (YM）液体培地、Luria Bertani(LB)液体培地及びSabouraud Dextrose(SD)液体培地)は、本発明で使用できる。細菌と糸状菌菌類細胞用の培養条件は、本技術分野で知られており、科学的文献に見出すことができ、及び/又はAmerican Type Culture CollectionとFungal Genetics Stock Centerのような菌類の保存源から見出しうる。グルコアミラーゼコーディング配列が誘導プロモーターの調節下にある場合、誘導物質（例．糖、金属塩または抗生物質）がグルコアミラーゼ発現を誘導するため有効な濃度で培地へ加えられる。
【０１５１】
いくつかの実施態様では、本発明は、本発明のグルコアミラーゼ変異種をコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより植物細胞を形質転換し、この変異種の発現と産生に適した条件下で植物細胞を増殖させることを含む、植物宿主に変異グルコアミラーゼを産生する方法に関する。
【０１５２】
いくつかの実施態様では、定量が、本発明に含まれる変異グルコアミラーゼをコードするポリヌクレオチドにより形質転換された細胞ラインによる変異グルコアミラーゼの発現を評価するために行われる。この定量はタンパク質量、RNA量及び/またはグルコアミラーゼの活性及び/又は産生に特異的な機能的生物学的定量の使用により行うことができる。これらの定量のいくつかは、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング(DNAまたはRNA分析)、RT-PCR(逆転写ポリメラーゼ連鎖反応)、適当にラベルされたプローブ（その核酸をコードする配列に基づく）を使用する生体内ハイブリッド形成及び従来のサザンブロッティング及びオートラジオグラフィーを含む。
【０１５３】
加えて、変異グルコアミラーゼの産生と/または発現は、サンプル中で直接に定量され得、例えば、培地中のグルコースのような還元糖を直接に測定する定量により、及びグルコアミラーゼの活性、発現及び/又は産生を測定する定量により測定できる。特に、グルコアミラーゼ活性は、3,5-ジニトロサリチル酸(DNS)法（Gotoら(1994) Biosci.Biotechnol.Biochem.  58: 49-54参照）により定量できる。別の実施態様では、タンパク質発現は、免疫学的方法により評価される。例えば、細胞、組織片の免疫組織化学的染色又は組織培養培地の免疫学的定量（例．ウェスターンブロット又はELISA）である。このような免疫学的定量はグルコアミラーゼの発現を定性的及び定量的に評価するために使用できる。このような方法の詳細は本技術分野の技術者に知られ、そのような方法を行う多くの試薬が市販されている。
【０１５４】
本発明のグルコアミラーゼは遠心分離、ろ過、抽出、沈殿等の本技術分野で知られている種々の手順により培地から回収又は精製できる。
組成物
【０１５５】
本発明の変異グルコアミラーゼはデンプン加水分解・糖化組成物、洗浄及び洗剤組成物（例．洗濯洗剤、皿洗い洗剤、及び堅い表面の洗浄組成物）、アルコール発酵組成物、及び動物飼料組成物を非限定的に含む酵素組成物で使用できる。さらに、この変異グルコアミラーゼは、パンとケーキの生産のようなベーキング用、醸造、健康管理、繊維、環境廃棄物質変換法、生物学的パルプ処理、バイオマス変換に使用できる。
【０１５６】
いくつかの実施態様では、本発明に含まれる変異種を含む酵素組成物は、任意に以下の酵素のいずれか一つ又はその組み合わせと、組み合わせて使用される。アルファアミラーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、シクロデキストリングルコトランスフェラーゼ、リパーゼ、フィターゼ、ラッカーゼ、酸化酵素、エステラーゼ、クチナーゼ、キシリナーゼ、顆粒デンプン加水分解酵素及び他のグルコアミラーゼ。
【０１５７】
いくつかの実施態様では、この酵素組成物は菌類アルファアミラーゼ（例．アスペルギルス属の種）または細菌アルファアミラーゼ（例．バシラス属の種、例えば、B.ステアロテルモフィルス、B.アミロリケファシエンスとB．リケニフォルミス）のようなアルファアミラーゼと変異種及びそれらの混合物を含む。いくつかの実施態様では、このアルファアミラーゼは酸に安定なアルファアミラーゼである。いくつかの実施態様では、このアルファアミラーゼはアスペルギルス・カワチアルファアミラーゼ(AkAA)である。US7,037,704参照。本発明の組成物で用いられることが考えられている市販のアルファアミラーゼは、既知であり、GZYME G997、ＳPEZYME FRED, SPEZYNE XTRA,(Danisco US,Inc,  Genencor Division), TERMAMYL 120-L及びSUPRA(Novozymes,Biotech)を含む。
【０１５８】
いくつかの実施態様では、この酵素組成物は酸菌類プロテアーゼを含む。さらに別の実施態様では、この酸菌類プロテアーゼはトリコデルマ属に由来し、2006年7月11日に公開されたUS2006/015342に開示されたプロテアーゼのいずれか一つ（例．SEQ ID NO:10）でも良い。さらに別の実施態様では、この酵素組成物はフィターゼ（例．ブチオーグジエラ(Buttiauxiella)属の種またはその変異種、例えば、PCT公開WO2006/043178参照）を含む。
【０１５９】
他の実施態様では、本発明の変異種グルコアミラーゼは、他のグルコアミラーゼと組み合わされても良い。いくつかの実施態様では、本発明のグルコアミラーゼは、1以上の、アスペルギルス属の菌株またはその変異種、例えば、A.オリゼ、A.ニゲル、A.カワチ及びA.アワモリ、由来のグルコアミラーゼ、；フミコラ属またはその変異種の菌株、特に、H．グリセア由来のグルコアミラーゼ、例えば、WO05/052148に開示されているSEQ ID NO:3と少なくとも90%、93%、95%、96%、97%、98%、及び99%配列の同一性を有するグルコアミラーゼ；タラロマイセス属またはその変異種の菌株、特にT．エメルソニに由来するグルコアミラーゼ；アテリア属(Athelia)特にA・ロルフシ(A.rolfsii)の菌株由来のグルコアミラーゼ；ペニシリウム属の菌株、特にP・クリソゲナム由来のグルコアミラーゼと、と組み合わされる。
用途
【０１６０】
特に、本変異グルコアミラーゼはデンプン転換法に使用されても良く、特に、フルクトースシロップ用、特性のある糖用のデキストロースの生産に、及びデンプン含有基質の発酵によるアルコールや他の最終生産物（例．有機酸、アスコルビン酸、及びアミノ酸）の生産に使用されても良い（G.M.A van Beynum ら、編(1985) STARCH CONVERSION TECHNOLOGY, Marcel Dekker Inc. NY）。本発明の変異グルコアミラーゼ組成物を使用して生産されるデキストリンは少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%の収率でグルコースを与える。本発明に含まれるグルコアミラーゼを用いるデンプン基質の発酵によるアルコールの生産は燃料アルコールまたは飲料用アルコールの生産を含む。いくつかの実施態様では、アルコールの生産は、親グルコアミラーゼと同一の条件下で変異グルコアミラーゼが使用されるとき、多くなる。いくつかの実施態様では、アルコールの生産は、親グルコアミラーゼよりも約0.5%乃至2.5%多く、非限定的に0.6%,0.7%,0.8%,0.9%,1.0%,1.1%,1.2%,1.3%,1.4%,1.5%,1.6%,1.7%,1.8%,1.9%,2.0%,2.1%,2.2%,2.3%,及び2.4%、親グルコアミラーゼよりもより多い。
【０１６１】
いくつかの実施態様では、本発明のこの変異グルコアミラーゼは種々の植物由来の基質からのデンプンの加水分解で使用され、これらはアルコールの生産に使用される。いくつかの実施態様では、この植物由来の基質はとうもろこし、小麦、オオムギ、ライ麦、マイロ、コメ、サトウキビ、馬鈴薯及びそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施態様では、この植物由来の基質は分離された植物原料であり、例えば、トウモロコシのような穀物粒では、繊維、胚芽、タンパク質及びデンプン（胚乳）などの成分に分離される。（USP6,254,914及びUSP6,899,910）アルコール発酵の方法はTHE ALCOHOL TEXTBOOK, A REFERENCE FOR THE BEVERAGE, FUEL AND INDUSTRIAL ALCOHOL INDUSTRIES, 第3版、K.A.Jacquesら編,1999, Nottingham University Press, UKに記載されている。ある実施態様では、このアルコールはエタノールである。特に、アルコール発酵生産法は湿式粉砕法または乾式粉砕法として特徴付けられる。いくつかの実施態様では、この変異グルコアミラーゼは湿式粉砕発酵法で使用され、他の実施態様では、この変異グルコアミラーゼは乾式粉砕法で使用される。
【０１６２】
乾燥粒粉砕は多くの基本的段階を含み、一般的に、粉砕、蒸煮、液状化、糖化、発酵及びアルコールと他の副産物をえるための液体と固体の分離を含む。植物性原料と特に穀物粒全体、例えばトウモロコシ、コムギ又はライ麦は粉砕される。ある場合は、この穀物粒は最初に、各部分に分けられる。粉砕された植物性原料は粉末化され、粗い又は微細な粒子が得られる。この粉砕植物性原料はスラリータンク内で液体（例．水と/又は薄いスチレージ(stillage)）と混合される。このスラリーは液状化酵素（例．アルファアミラーゼ）と、ともにジェットクッカー内で高温(例．90℃から105℃、さらに高温)に暴露され、穀物中のデンプンを溶解し、デキストリンに加水分解する。この混合物は冷却され、さらに、本発明に含まれるグルコアミラーゼのような糖化酵素によりさらに処理を受けグルコースを生産する。グルコースを含有するマッシュは、その後、発酵微生物、例えば、エタノール産生微生物、特に酵母（サッカロマイセス属の種）の存在下、約24時間から120時間発酵される。このマッシュ内の固形物は液体から分離され、エタノールのようなアルコールと蒸留所のグレイン(grain)のような有益な副産物が得られる。
【０１６３】
いくつかの実施態様では、糖化工程と発酵工程は組み合わされ、この方法は同時糖化及び発酵又は同時糖化、酵母増殖及び発酵と呼ばれる。
【０１６４】
他の実施態様では、本変異グルコアミラーゼは、本法の温度が30℃と75℃の間にあるデンプン加水分解の方法において使用され、いくつかの実施態様では、40℃と65℃の間で使用される。いくつかの実施態様では、この変異グルコアミラーゼはpH3.0とpH6.5の間のpHでデンプン加水分解の工程で使用される。いくつかの実施態様での発酵工程は、穀物粒又は分離された穀物粒の粉砕、及び粉砕穀物粒を液体と混合しスラリーを形成し、本発明による変異グルコアミラーゼ、任意に他の酵素、例えば、非限定的に、アルファアミラーゼ、他のグルコアミラーゼ、フィターゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、又は顆粒デンプンを加水分解する活性を有する他の酵素及び酵母、と単一の反応器中で混合を受け、エタノールと他の副産物を生産することを含む（USP4,514,496, WO04/081193及びWO04/080923参照。）。
【０１６５】
いくつかの実施態様では、本発明は液体デンプン溶液の糖化方法に関し、これは本発明の種々のグルコアミラーゼを使用する酵素的糖化工程を含む。
【０１６６】
本発明は、また、本発明に含まれる少なくとも1個の変異グルコアミラーゼを含む動物飼料組成物又は調合物も提供する。デンプンを含有する飼料の生産においてグルコアミラーゼ酵素を使用する方法は、WO03/049550（引用によりその全部を組み入れる）に記載されている。要約すれば、このグルコアミラーゼ変異種はデンプンを含有する飼料と混合される。このグルコアミラーゼは動物に用いるため、抵抗性のデンプンを分解することができる。
【０１６７】
本発明の他の目的と利点は本明細書から明らかである。
【発明を実施するための形態】
【０１６８】
実験
以下の開示と実験項では、以下の略号が使用される。GA（グルコアミラーゼ）；GAU（グルコアミラーゼ単位）；wt%（重量パーセント）；℃（摂氏）；rpm（毎分回転数）；H2O(水)、d H2O（脱イオン水）；dI H2O（脱イオン水、ミリ-Qろ過）；aaまたはAA（アミノ酸）；bp（塩基対）；kb(キロ塩基対)；kD（キロダルトン）；gまたはgm（グラム）；μg(マイクログラム)；mg（ミリグラム）；μL（マイクロリットル）；mlとmL（ミリリットル）；mm（ミリメートル）；μm（マイクロメートル）；M（モル）；mM（ミリモル）；μM（マイクロモル）；U（単位）；V（ボルト）；MW（分子量）；sec または s(s)（秒）；min(s)またはm(s)（分）；hr(s)またはｈ(s)（時間）、DO（溶存酸素）；ABS（吸光度）；EtOH（エタノール）；PSS（生理的塩溶液）;m/v(質量/容量)；及びMTP（マイクロタイタープレート）；Ｎ（規定）；DP1（単糖）；DP2（二糖）；DP＞3（3より大きい重合度をもつオリゴ糖、糖）；ppm（百万分の一）
【０１６９】
下記の実施例で使用される定量法と方法が提供されている。しかし、異なる方法が親分子の変異種を与えるために使用でき、本発明は実施例で使用される方法に限定されない。変異種を作成し変異種の選択するために適した如何なる方法も用いることが出来る。
96孔ミクロタイタープレート用pNPGグルコアミラーゼ活性定量法
【０１７０】
試薬溶液は：NaAc緩衝液（200mM酢酸ナトリウム緩衝液,pH4.5）；基質（NaAc緩衝液中(0.3 g/20ml)の50mM p-ニトロフェニル-α-Ｄ-グルコピラノシド(Sigma N-1377)）と停止溶液(800mM グリシン-NaOH緩衝液 pH10)である。30μlのろ過を受けた上澄み液が96-孔の平底MTPに加えられた。各孔に50μlのNaAc緩衝液と120μlの基質が加えられ、50℃で30分間保温された（Termolab systems iEMS Incubator/shaker HT）。反応は100μlの停止溶液を加えることにより停止された。吸光度がMTP-リーダー（Molecular Devices Spectramax 384 plus）中で405nmで測定され、活性が0.011μM/cmのモル吸光係数を用いて計算された。
熱安定性の測定
【０１７１】
粗製の上澄み液(8μl)が280μl、50mM NaAc緩衝液pH4.5に加えられた。この稀釈サンプルは、２個のMTPに分けられた。一方のMTP(初期プレート)は4℃で１時間保温され、他方のMTP（残存プレート）は64℃(Themolab systeｍs iEMS Incubator/Shaker HT)で1時間保温された。残存プレートは氷上で10分間、冷却された。下記に述べたエタノールスクリーニング定量を用いて、両プレートについて活性が測定された。60μlの初期プレート又は残存プレートが120μl 4%可溶トウモロコシデンプンへ加えられ、32℃で2時間、900rpmで保温された(Themolab systeｍs iEMS Incubator/Shaker HT)。
【０１７２】
熱安定性は以下のように%残存活性として計算された。
(ABS(340) 残存−.ブランクテスト)/（ABS(340)初期−ブランクテスト)  X 100%
【０１７３】
培養終了後、粗製上澄み液が培地中の残存グルコースについて試験された。残存グルコースが検出された場合、熱安定性は計算されなかった。
【０１７４】
WTと変異種の残存活性に基づき、熱安定性について機能指数(PI)が計算された。変異種のPIは、変異種の「残存活性/野生体(WT)の残存活性」の商である。WTのPIは1.0であり、PI＞1.0の変異種はWTより大きい特異的活性をもつ。
キャリパー(Caliper)によるタンパク質の量決定
【０１７５】
エタノールアップリケーション定量法の性能指数のデータ分析と計算
【０１７６】
タンパク質濃度が微小流体電気泳動装置(microfluidic electrophoresis instrument)を使用して測定された（Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA,USA）。微小流体チップとタンパク質サンプルがメーカーの指図（LABCHIP（登録商標）HT Protein Express, P/N 760301）に従い調製された。培養上澄液が調製され、使用まで-20℃で96-孔マイクロプレートで貯蔵された。使用時は30分間37℃の保温器中で加温され解凍された。迅速に振とうした後、2μlの各培養サンプルが、7μlのサンプル緩衝液(Caliper)を含む96-孔のPCRプレートに移され（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）、このプレートはサーモスタットで調整されたプレートヒーターで5分間90℃まで加熱された。このプレートは冷却され、40μlの水が各サンプルへ加えられた。このプレートは、メーカーが提供する定量済みのタンパク質標準サンプルとともにこの装置へ入れられた。このタンパク質がチップのフォーカルポイントを移動するとき、ケイ光信号が記録され、タンパク質濃度が、較正用のタンパク質標準サンプルセットにより生じる信号と比較して信号を定量することにより決定された。
【０１７７】
キャリパーによるタンパク質の量の測定の後、このデータは以下の方法で処理された。キャリブレーションラダー(calibration ladder)は、ピークパターンの真度についてチェックされた。その試験と関連するキャリブレーションラダーが十分でないときは、次の試験のキャリブレーションラダーと置き換えられる。ピークの検出のため、キャリパーソフトウェアのグローバルピークファインドオプション(global peak find option)の初期値が使用された。問題のピークは75kDA+/-10%で選択された。
【０１７８】
この結果はスプレッドシートプログラムに入力され、ピーク面積がエタノールアップリケーション定量中の対応する活性（ABS340-ブランクの測定値）と関係付けられた。12個の野生型サンプルの面積と活性値により、検量線が、非線型近似関数と組合わせて、プログラムGrafit Version 5（Erithacus Software, Horley,UK）の「酵素反応速度論」式を用いて作成された。初期値はKmとVmaxパラメーターを計算するために使用された。これら２個のパラメーターに基づき、ミカエリス-メンテンの標準線が作成され、各変異種の特異的活性はこの標準線に基づき計算された。
【０１７９】
WTと変異種の特異的活性に基づき、特異的活性の性能指数(PI)が計算された。変異種のPIは「変異種-特異的活性/WT-特異的活性」の商である。WTのPIは1.0であり、PI＞1.0をもつ変異種はWTより大きい特異的活性をもった。
ヘキソキナーゼ活性定量
【０１８０】
ヘキソキナーゼカクテル：使用10-1５分前、90ｍｌの水がBoatILコンテナーグルコースHK R1（IL試験グルコース(HK)キット、Instrument Laboratory# 182507-40）に加えられ、穏やかに混合された。100μlのヘキソキナーゼカクテルが85μlのdH2Oに加えられた。15μlのサンプルがこの混合物に加えられ、室温で暗所に置かれた。吸光度がMTP-リーダーで340nmで測定された。グルコースの濃度はグルコース(0 - 2mg/ml)検量線により計算された。
定量条件  エタノールスクリーニング定量：
【０１８１】
8%の原液：8gのトウモロコシ澱粉(Sigma#S4180)が室温で40mlのdH2Oに懸濁された。50mlの沸騰dH2Oが250mlフラスコのスラリーに加えられ、5分間、煮沸された。このデンプン溶液は25℃まで冷却され、容量が、dH2Oで100mlに調製された。
【０１８２】
停止溶液：800mMグリシン-NaOH緩衝液、pH10
【０１８３】
4%(m/v)の可溶性デンプン試験液：原液が100mM酢酸ナトリウム緩衝液pH3.7で稀釈(1:1)された。
【０１８４】
5μlの粗製上澄液は平底96-孔MTP中の175μl, 50mMNaAc緩衝液pH4.5で稀釈された。60μlのこの溶液が120μl、4%可溶性デンプンに加えられ、32℃、900rpm（Thermolabsystems iEMS Incubator/Shaker HT）で2時間保温された。この反応は90μl４℃-冷停止溶液を加えることにより停止された。このサンプルは氷上に置かれた。デンプンが15℃、5分間1118Xgで分離され(SIGMA 6K15)、15μlの上澄液がグルコース含量を決定するため、上記に述べたヘキソース活性定量で使用された。
【０１８５】
粗製の上澄液原料は培養終了後、培養液中の残存グルコースについて試験された。残存グルコースが検出された場合、このグルコアミラーゼにより生じたグルコース量は計算されなかった。
実施例
【０１８６】
以下の実施例は本発明のある実施態様と局面を実証しさらに説明するために提供されるが、その範囲を制限するものと解してはならない。
実施例１．トリコデルマ・レセイでの発現用pTTTベクター中のTrGA部位評価ライブラリー(SEL)の構築。
【０１８７】
トリコデルマ・レセイcDNA配列(SEQ ID NO:4)はGateway（登録商標）BP組換え反応(Invitrogen, Carlsbad, CA,USA)により、pDONR（商標）201にクローンされ、エントリーベクターpDONR-TrGA（図2）とされた。このcDNA配列(SEQ:ID:NO:4)はTrGAシグナルペプチド、前駆配列、触媒領域、連結領域とデンプン結合領域等の成熟タンパク質(SEQ ID NO:1)をコードしている。SEQID NO:1は図1Bと1Aに示されている。図1Cは、前駆体及び成熟タンパク質TrGA領域を示す。
【０１８８】
トリコデルマ・レセイのTrGAタンパク質を発現するために、TrGAコーディング配列は(SEQ IDNO:4)がGATEWAY（登録商標）LR組換え反応によりゲートウェイ適合性デスティネーションベクターpTTT-Dest（図３）にクローンされた。この発現ベクターは、目的の遺伝子の強い誘導的発現を行わせるT・レセイ cbhI-由来プロモーターとターミネーター領域を含んでいた。このベクターはまた、唯一の窒素源のアセトアミド上でこの形質転換種の増殖を可能にするアスペルギルス・ニジュランスamdS選択マーカーも含んでいた。この発現ベクターは、また、菌類の細胞で非-染色体プラスミドを維持するＴ・レセイテロメア領域も含んでいた。このデスティネーションpTTT-Destプラスミドでは、cbhIプロモーターとターミネーター領域はクロラムフェニコール耐性遺伝子、CmRと致死大腸菌遺伝子、ccdBにより分離され、バクテリオファージラムダに基づく特異的組換え部位attR1、attR2が隣接している。この配置によりGATEWAY（登録商標）LR組換え反応により正しい向きに、cbhI調整因子の調整下にあるTrGA遺伝子を含んだ組換え体を直接選択することが可能になる。最終発現ベクターpTTT-TrGAは図４に示されている。
【０１８９】
SELはテンプレートとしてpDNOR-TrGAエントリーベクター（図2）を、また、表２に記載されたプライマーを用いて構築された。変異誘導実験で使用される全てのプライマーは、変異を意図したTrGA配列(SEQ ID NO:1)のコドンと一致する位置にトリプレットNNS（N=A,C,T,G及びS=C又はG）を含み、予め選択した位置にヌクレオチドの無作為の導入を行う。各SELライブラリーの構築はpDONR-TrGAエントリーベクター上での２個の独立したPCR増幅により開始した。：Gateway F(pDONR201-FW)と特異的変異プライマーR（表２）を使用するもの、及び他のもの-GatewayプライマーR(pDONR201-RV)と特異的変異プライマーF（表２）を使用するものである。高い正確性(High fidelity)のPHUSION DNAポリメラーゼ（Finnzyme OY, Espoo, Finland）が0.2μMのプライマーを含むPCR増幅反応で使用された。本反応はFinnzymesにより提供されるプロトコールに従い25サイクル行われた。1μlの得られたPCR断片がGateway FWとGateway RV プライマー（Invitrogen）とともに、後のfusion PCR反応のためテンプレートとして使用された。このPCR増幅は、22サイクルの後、特異的なコドンの位置で無作為に変異された完全な長さをもつ線状のTrGA断片の集団を産生した。この断片は、両端のGateway-特異的attL1とattL2の組換え部位により挟まれている。このDNA断片は、Invitrogenにより提供されるプロトコールに従い、CHARGESWITCH（登録商標）PCRクリーンアップ-キット(Invitrogen, Carlsbad USA)により精製され、次に、LR CLONASE（商標）II酵素混合物を用いて、100ngのpTTT-デスティネーションベクター（図３）に組み換えられる。生成したこの組換え産物は、Invitrogenの述べるとおりE.coli Max Efficiency DH5αへ形質転換された。所望の位置に変異をもつ最終発現構造体pTTT-TrGAは、100μg/mlアンピシリンを含む、2xYT寒天プレート（16g/L Bacto Tryptone(Difco),10g/L Bacto Yeast Extract(Difco),5g/L NaCl, 16g/L Bacto Agar(Difco)）上で細菌を培養することにより選択された。
【０１９０】
各ライブラリーからの96個の単一コロニーが100μg/ml  アンピシリンを含む200μL 2xYT培地を含むMTPで24時間、37℃で培養された。培養は、特異的変異が導入された領域を含むPCR断片を増幅するために直接に行われた。得られたこの特異的PCR産生物はABI3100配列分析器(Applied Biosystems)を用いて配列決定された。各ライブラリーは、最終発現ベクターにおいて15から19個の異なるTrGA変異種を含んでいた。これらの変異種は下記のようにT・レセイをそれぞれ形質転換した。ライブラリーは無作為に変異されたTrGA配列中の特定のアミノ酸残基を示す1から182の番号が付されている。
表２-TrGA SELの生成に使用されたプライマー
F=フォワードプライマー、R=リバースプライマー
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実施例２；TrGA SELによるトリコデルマ・レセイの形質転換
【０１９１】
SELはPEGプロトプラスト法を使用してT・レセイを形質転換した。配列分析で確認されたSELの大腸菌クローンは、アンピシリン(100μg/ml)とカナマイシン(50μg/ml)を含む1,200μlの2xYT培地を入れた深孔マイクロタイタープレートで37℃で一夜増殖された。プラスミドDNAは培養後、CHEMAGIC（登録商標）プラスミドMiniキット(Chemagen-Biopolymer Technologie AG, Baseweiler, ドイツ)を使用して単離され、それぞれは、以下の変更を加えたPEG-プロトプラスト法(Penttilaら(1987) Gene 61:155-164)を用いて４個の遺伝子が欠失（Δcbh1、Δcbh2、Δegl1、Δegl2、即ち、「４個の欠失」；USP5,847,276、WO92/06184及びWO05/001036参照）しているRL-P37由来のT・レセイ宿主株を形質転換した。
1)プロトプラスト調製のため、芽胞は、トリコデルマ最小培地(MM)(20g/Lグルコース、15g/L KH2PO4、pH4.5、5g/L(NH4)2SO4、0.6g/LMgSO4 x７H2O、0.6g/LCaCl2x2H2O、1mlの1000X T・レセイ微小元素溶液{5g/L FeSO4X７H2O、1.4g/L ZnSO4 x7H2O、1.6g/L MnSO4 xH2O、3.7g/L CoCl2X6H2O })で24℃で16-24時間、150rpmの振とうにより増殖された。発芽した芽胞は遠心分離により集められ、菌類の細胞壁を分解するため15mg/mlのβ-D-グルカナーゼ-G(Interspex-Art.No.0439-1)溶液により処理された。プロトプラストのその後の処理はPenttilaら(1987上記)に述べられたように、標準的方法により行われた。2)形質転換法は10分の１に小さくされた。一般に、総容量25μl中に600ngのDNAと1-5x105個のプロトプラストまで含む形質転換混合物は200mlの25%PEG溶液で処理され、2倍容量の1.2Mソルビトール溶液で稀釈され、アセトアミドを含む3%の選択的トップアガロースMM（上記と同一の最小培地であるが、(NH4)2SO4は20mMアセトアミドで置き換えられていた。）と混合され、24孔のマイクロタイタープレート又は、48に仕切られた20x20cm Q-トレー中の、アセトアミドを含む2%選択的アガロースに注がれた。このプレートは28℃で8日間保温された。各孔で再形成された形質転換体の総ての芽胞は0.85%NaCl、0.015% Tween80の溶液を使用してこのプレートから集められた。芽胞の懸濁液が96孔のMTP中で培養するために加えられた。24孔のMTPの場合、芽胞数を増やすために、選択的アセトアミドMMを含む新たな24孔MTPでのプレーティング段階を追加した。
実施例３：MTPにおけるTrGA変異種を発現しているT・レセイ形質転換体の発酵
【０１９２】
形質転換体が培養され、発現された変異TrGAタンパク質を含む上澄み液は種々の性質について試験を受けた。簡単にいうと、200μLのLD-GSM 培地（5.0 g/L (NH4)2SO4、33g/L 1,4-ピペラジンビス（プロパンスルホン酸）、pH5.5、9.0g/Lカザミノ酸、1.0g/L KH2PO4、1.0g/L CaCl2x2H2O、1.0g/L MgSO4 x7H2O、2.5ml/Lの1000XT・レセイ微小元素、20g/Lのグルコース、10g/Lのソフォロース)を含む96孔のフィルタープレート(Corning Art No. 3505)にTrGA変異種を発現しているT・レセイ形質転換種の芽胞懸濁液を４回接種した（各孔当たり104芽胞より多い）。このプレートは28℃、230rpmの振とうで、80%の湿度で6日間培養された。培養上澄み液は真空ろ過により集められた。この上澄み液は性質が改良された変異種をスクリーニングするため異なる定量法で使用された。
実施例４：GA-産生形質転換体の全成分液体培地の調製
【０１９３】
TrGA産生形質転換体は、最初30mlのProflo培地を含む250mlの振とうフラスコ中で予備培養された。Proflo培地は、30g/Lα-ラクトース、6.5g/L (NH4)2SO4、2g/L KH2SO4、0.3g/LMgSO4x7H2O、0.2g/L CaCl2x2H2O、1ml/L 1000Xの先に述べた微量元素塩溶液、2ml/L 10％Tween 80、22.5 g/L Proflo培地綿実粉(Traders protein、メンフィス、TN)、0.72g/L CaCO3を含んでいた。28℃で140rpmでの２日の培養の後、10% Proflo培地は30mlのラクトース調合培地(Lactose Defined Medium)を含む250mlの振とうフラスコへ移された。このラクトース調合培地の組成は以下のものである。：5g/L (NH4)2SO4、33g/L 1,4-ピペラジンビス（プロパンスルホン酸）緩衝液、pH5.5、9g/Lカザミノ酸、4.5g/L KH2SO4、1.0g/L MgSO4x7H2O、5ml/L Mazu DF-60消泡剤(Mazur Chemicals)、1ml/Lの1000X微小元素溶液。40ml/Lの40%(w/v)ラクトース溶液が、滅菌後、この培地に加えられた。このラクトース調合培地を入れた振とうフラスコは28℃、140rpmで4-5日間培養された。
【０１９４】
菌糸体は遠心分離により培養サンプルから除去され、実験項で先に述べたように、上澄み液が総タンパク質含量とGA活性を求めるために分析(BCA Protein Assay Kit, Pierce Cat. No. 23225) された。
【０１９５】
全成分液体培地サンプルのタンパク質プロファイルはSDS−PAGE電気泳動により決定された。培養上澄み液のサンプルは、等量の還元剤を含む２Xサンプルローディング緩衝液と混合され、NUPAGE（登録商標）Novex10％Bis-Trisゲル上で、MESSDS移動緩衝液(Invitrogen, Carlsbad, 米国)で分離された。ポリペプチド帯がSIMPLYBLUESafeStain（Invitrogen、Carlsbad, 米国)で可視化された。
実施例５：熱安定性が改良された変異種
【０１９６】
親TrGA分子は述べた条件下で15-44%（日常的変化）の間の残存活性を持っていた。性能指数が、同一バッチのTrGA熱安定性に基づいて計算された。性能指数はPI=(変異種の残存活性)/(TrGA残存活性)の商である。＞１の性能指数は安定性の向上を示す。1.0より大きい熱安定性性能指数(PI)をもった変異種は以下の表に示されている。
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表３は試験を受けたとき、親グルコアミラーゼより大きい性能指数を示した変異種を含む。これらは、以下の部位を含んでいた。10,42,59,60,61,68,72,73,97,98,99,102,114,133,140,  144,147,152,153,164,182,204,205,214,216,228,229,230,231,241,242,263,264,265,268,269,276,284,291,300,301,303,311,338,342,344,346,349,359,361,364,375,379,382,390,391,393,394,410,417,430,431,433,436,442,443,444,448及び451。最大の増大を示す置換のあった部位は、T10S、T42V、E68C、E68M、G73F、G73W、K114M、K114T、I133V、N153A、N153S、N153V、W228V、V229I、V229L、S231V、D236R、L264D、S291M、S291T、A301P、A301R、S344M、S344P、S344Q、S344V、G361D、G361E、G361F、G361L、G361M、G361P、G361S、G361W、G361Y、A364D、A364E、A364F、A364G、A364K、A364L、A354R、A364S、A364V、A364W、T375N、R433C、R433G、R433N、R433S、R433V及びI436Hを含む。
実施例６：エタノールスクリーニング定量で改良された特異的活性（SA）をもつ変異種
【０１９７】
変異種は、先に述べた定量法によりエタノールスクリーニング定量を受けた。表４は親TrGA PIと比較して性能指数(PI)＞1.0をもつ変異種のスクリーニング定量の結果を示す。このPIはWTと変異酵素の特異的活性（活性/mg酵素）から計算される。これは「変異体の特異的活性/WTの特異的活性」の商である。野生型TrGAの特異的活性のPIは1.0であり、PI＞1.0をもつ変異種は、親TrGAより大きい特異的活性をもった。この特異的活性は先に述べたCaliper定量法で得られる結果で除した、エタノールスクリーニング定量で測定された活性である。
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【０１９８】
表４は少なくとも1.0の性能指数をもつ変異種を与える。これらは以下の位置を含む。;10,14,15,23,59,60,61,65,67,68,72,73,97,98,99,102,110,113,133,140,144,145,147,152,153,164,182,204,205,214,216,219,228,229,230,231,236,239,241,242,263,264,265,268,269,276,284,291,300,301,303,311,338,342,344,346,349,359,361,364,375,379,382,390,391,393,394,410,417,418,430,431,433,442,444,448及び451。最高の特異的活性を示す位置（約1.2より大きい性能指数をもつ）は、61,67,72,97,102,133,145,153,205,219,228,230,231,239,  263,268,291,311,342,394,430,431及び451である。
実施例７：特異的活性と熱安定性を併せて有する変異種
【０１９９】
表５は特異的活性と熱安定性の両性質ともに親と比較して1.0以上の性能指数を有した変異種を示す。これらは以下の部位を含む。10,15,59,61,68,72,73,97,99,102,133,140,153,182,204,205,214,228,229,230,231,236,241,242,264,265,268,275,284,291,300,301,303,311,338,344,346,359,361,364,375,370,382,391,393,394,410,417,430,431,433,444,448及び451。最も高い特異的活性と熱安定性を併せて示した位置は、228、230、231、268、291、417、433及び451である。
表５：両活性が向上した変異種
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実施例８：TrGAの結晶構造
【０２００】
トリコデルマ・レセイ（ヒポクレア・ジェコリナ）グルコアミラーゼ（TrGA）の完全な３次元構造が1.9Åの分解能で決定された。表６はトリコデリマグルコアミラーゼ結晶構造の座標を示す。TrGAは599残基と天然の宿主において通常起こる翻訳後の全ての変更を含む完全な形で結晶化された。この結晶構造は以下のように作られ、分析された。
【０２０１】
タンパク質の発現と精製―H.ジェコリナGAをコードする遺伝子がDunn-Colemmanらによる特許出願公開第US2006/0094080 A1（2006年5月４日）で述べられたプロトコールに従いクローンされ、発現された。
【０２０２】
全ての結晶化実験で使用されるこのTrGAタンパク質原料は、最初は、以下のようにしてアニオン交換クロマトグラフィーによる一段階で精製された。180mg/mlの総タンパク質からなる、発現されたTrGAの濃縮培養上澄み液が、25mMTris-HCl、pH8.0緩衝液中で1:10にサンプルを稀釈することにより調製された。HIPREP16/10 QセファロースFFカラム（GE Healthcare）がアニオン交換精製のため使用された。このHIPREPカラムは、カラム容量(CV)の４倍の開始緩衝液(25mM Tris-HCl, pH8.0)で平衡化され、続いて10mlの稀釈タンパク質サンプルが加えられた。結合タンパク質を溶出するため、移動層の緩衝液（25mM Tris-HCl, pH8.0）に0から140mMNaClの８CV線型のグラジエントがかけられた。約80mMのNaClの塩濃度でHIPREP Qセファロースカラムから結合TrGAが溶出された。純粋なTrGAタンパク質を含む分画が貯留され、10kD未満の分子量を除去(MWCO)する25mlのVIVASPIN遠心分離型濃縮管を用いて50mg/mlまで濃縮された。精製、濃縮されたTrGA原料は、50mM酢酸ナトリウム緩衝液、PH4.3で平衡化されたDG-10脱塩カラム(Bio-Rad)を用いて、緩衝液交換を受けた。タンパク質濃度は280nmでの吸光度を測定することにより決定された。この最初の精製を受け濃縮されたTrGAタンパク質原液は、-20℃で保存された。
【０２０３】
２つの追加の精製段階、１つ追加のアニオン交換精製、及びサイズ排除精製がTrGAタンパク質物質が結晶を形成する傾向を高めるため行われた。これらの２個の追加の精製工程は以下のようにして行われた。最初のアニオン交換精製工程では、10mlMONOQカラム(GE Healthcare)が使用された。最初に精製され凍結されたTrGA原料（50mg タンパク質）１mlのサンプルが解凍され、緩衝液が、新しい緩衝液中で、6mlにサンプルを稀釈することを繰り返すことにより20mMTris-HCl,pH8.0に変えられ、6ml 5kD MWCO濃縮管を用いて0.5mlまでこのサンプルを再び濃縮した。このTrGAサンプルは、このタンパク質サンプルの電気伝導率がアニオン精製の開始緩衝液、つまり、25mM Tris-HCl, pH8.0の電気伝導率に対応するものに達するまで、濃縮工程後、蒸留水中で稀釈された。MONOQカラムは最初、カラム容量の４倍(4CV)の開始緩衝液で平衡化され、稀釈されたタンパク質サンプルをカラムに加えた。結合したタンパク質は、２つの異なるグラジエントでMONOQカラムから溶出された。第１のグラジエントでは、４CVの線型pHグラジエントが、出発緩衝液のpHが8.0から6.0で用いられた。第２のグラジエントでは、移動緩衝液（25nM Tris-HCl, pH6.0）中でNaCl を0から350mMに高める8CVの長い塩濃度のグラジエントが用いられた。TrGAを含む分画が貯留され、6ml 5kD MWCO VIVASPIN 濃度管を使用して2mlまで濃縮された。濃縮されたTrGAサンプルはその後、4CVの20mM-Tris-Cl, pH8.0と50ｍM NaCl（移動緩衝液として使用された）と平衡化されたSUPERDEX 200 16/60サイズ排除カラム(GE Healthcare)に加えられた。サイズ排除精製後のメイン溶出ピークからの分画は、貯留され、6ml 5kD MWCOVIVASPIN 濃縮管を用いて約7.5mg/mlのタンパク質濃度まで濃縮された。
【０２０４】
タンパク質の結晶化-初期のTrGA結晶化条件を見出すために使用されたタンパク質サンプルは、アニオン交換精製により１度精製され、その後-20℃で貯蔵されたTrGA原料のサンプルであった。最初の結晶化実験前に、このTrGAタンパク質サンプルは解凍され、50mM酢酸ナトリウム緩衝液,pH4.3により約12mg/mlまで稀釈された。TrGA結晶は、20℃で、懸滴を用いる蒸気-拡散法(McPherson 1982)を用いて、25%PEG3350、0.20M酢酸アンモニウム、0.10MBis-Tris pH5.5(貯蔵溶液)からなる溶液中で成長することが見出された。結晶化する液滴は等量のタンパク質溶液(12mg/ml)と貯留溶液を混合し最終容量10μlにすることにより調製された。このTrGA結晶は斜方晶系空間群P212121に属し、単位格子の大きさの概略はa=52.2Å、b=99.2Å、c=121.2Åであり、非対称単位格子における１分子についてVm 2.3が計算された（Matthews 1968）。
【０２０５】
X-線データ収集-室温で密封された毛細管に入れられた単結晶から２個の斜方晶系TrGAデータセットが収集された。分子置換法(molecular replacement method(MR))により構造を解析するため使用される、初期低分解能の斜方晶系TrGA X-線データセットが、焦点ミラー（focusing mirrors）を備えたホームX線源(home X-ray source)、MSC/Rigaku(Molecular Structures Corp., The Woodlands, Texas)R軸IV++画像プレート検出器で、Rigaku RU200 回転アノードジェネレーター(anode generator)からのCuKα線を使用して集められた。このデータセットは、MSC/Rigakuにより提供されたd*trekソフトウェアを用いて、処理を受け、計測され(sacled)、平均化された。斜方晶系X-線データセットが分子置換法(MR)によりTrGAの構造を解析するため使用され、高分解能斜方晶系データベースが最終的な斜方晶系空間群TrGA構造モデルのために使用された。C中心のある単斜晶系のデータベースが100Kで、１個の凍結TrGA結晶から収集された。この単結晶は凍結保護因子として25%PEG 3350、15%グリセロール 50mM CaCl2及び0.1M Bis-Tris pH5.5からなる凍結保護剤中で平衡化され、レイヨン線維ループに加えられ、シンクロトロンに移される前に液体窒素に浸され凍結された。高分解能斜方晶系(1.9Å)のデータセットとC中心のある単斜晶系データセット(1.8Å)の両者が、スウェーデン、LundのMAX LABにおいてシンクロトロン源、ビームライン911:5で収集された。シンクロトロン源で集められた両データセットはMOSFLMで処理され、CCP4プログラムパッケージ(Collaborative Computational project Number 4 1994)のプログラムSCALAにより計測された。別に記載されている場合を除き、全てのその後のデータ処理はCCP4プログラムパッケージ(Collaborative Computational Project Nimber 4 1994)を使用して行われた。各データセットからの5%の反射(reflection)のセットは保留され、R-freeをモニターするために使用された（Brunger, A (1992) Nature, b355:472-474）。
【０２０６】
構造解析-このTrGA構造は、初期低分解能斜方晶系データセットと、サーチモデルとして、アスペルギルス・アワモリGA(AaGA)変異種X100(pdb entry 1GLM(Aleshinら(1994) J.Mol. Biol.238:  575-591)の座標を使用して、CCP4プログラムパッケージに含まれる自動置換プログラムMOLREP(Collaborative Computational Project Number 4 1994)を用いるMRにより最初に解析された。このアワモリGAサーチモデルはMR実験を行う前に、N-及びO-グリコシル化によるタンパク質分子に付加した全てのグリコシル化部分と全ての溶媒分子を除くために編集された。初期低分解能TrGAデータセットからの、36.8Åと2.8Åの間の分解能での全ての反射は、MR解析のために使用された。このMRプログラムは１つのrotation functionを見出し、これはバックグランドの上11.1σの極大値をもち、次の極大値は、バックグランドの上3.8σであった。translation function solutionは、48.7%のR-factorを与え、17.4のcontrast factorを有した。このMR解析はプログラムRefmac 5.0( Murshudovら、(1997) Acta Crystallogr., D53:240-255)を使用して制限的最小二乗近似(restrained least suares refinement)精密化を10回繰り返して精密化された。これにより結晶学的R-factorは31.1%に低くなり、R-free値は42.2%から41.1%に低下した。
【０２０７】
モデル適合化と精密化-精密化されたMR解析モデルは低分解能斜方晶系TrGAデータベースから得られる初期密度マップを計算するために使用された。TrGAの残基19と26の間のジスルフィド架橋、このA.アワモリ変異種X100構造モデルに存在しないジスルフィド架橋、の電子密度はこの電子密度マップで容易に特定できる。これは、この電子密度マップがそのアミノ酸配列からTrGAの構造モデルを構築するために使用できるほどの質をもつことを示すものと考えられた。低分解能のデータセットに基づく初期TrGA構造モデルは、Cootを使用するモデル構築のサイクル（Emsleyら(2004) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60:2126-32）とRefmac 5.0を使用する最大可能性精密化(maximum likelihood refinement)を使用するモデル構築サイクルを交互に使用することにより精密化された。
【０２０８】
初期TrGA構造モデルの分解能は、プログラムRefmac 5.0を使用して制限的精密化(restrained refinement)を10回繰り返し、高分解能データベースに対して初期TrGA構造を精密化することにより高分解能斜方晶系データセット(1.9Å)の分解能に向上した。構造モデル中の殆どの水分子は、精密化プログラムの水選択プロトコールを使用して自動的に配置され、次に肉眼による検討により手動により選択され又は除去された。全ての構造上の比較はCoot(Emsleyら(2004)上記)又はO(Jonesら(1991) Acta Crystallogr. ,A47:110-119)により行われ、図はPyMOL(DeLano W.L.(2002) The PyMOL Molecular Graphics System. Palo Alto, CA, USA;Delano Scientific)により作成された。
【０２０９】
これらの結果から、TrGA触媒中心部分はAaGAについてAleshinら(1992上記)により述べられたものと同一の(α/α)6-バレルトポロジー(barrel topology)をとり、外部ラセンのC-末端が内部ラセンのN-末端につながるアルファラセンの二重バレルからなる。AaGAと比較したとき残基19と残基26の間のジスルフィド架橋やar挿入(残基257-260)のような電子密度における重要な違いを特定することが可能であった。80-100を含む部分は、また、拡張的モデル再構築を受けた。１つの主要グリコシル化部位は、Asn 171に特定され、これは４個までのグリコシド部位が付加されていた。同様のグリコシル化部位がAaGAで特定された。加えて、残基22-23,44-45及び122-123の間の3個のシス-ペプチド(cis-peptide)を含む触媒中心はTrGAとAaGAの間で保存されていた。全体的に、TrGAとAaGAの触媒中心の座標を比較したき、453個のCα原子のうち409個の間で0.533Åの二乗平均(rms)の変動があった。
実施例９：TrGAとアスペルギルスアワモリGAの間の相同性
【０２１０】
実施例８で同定されたTrGAの結晶構造はアウペルギルス・アワモリGA（AaGA）の以前同定された結晶構造に重ねあわされた。このAaGA結晶構造はタンパク質データベース(PDB)から得られた。結晶化されたAaGAの形は触媒領域のみを含む形であった。全ての３領域が完全であるトリコデルマ・レセイグルコアミラーゼの構造は、明細書に示すように1.8Åの分解能まで決定された（表６と実施例８参照）。この座標を使用して（表６参照）この構造は、先に決定されたアスペルギルス・アワモリ株X100の触媒領域の座標(Aleshin, A.E., Hoffman, C., Firsov, L.M., 及びHonzatko, R.B.(1994) J Mol Biol 238:575-591 とPBD)と位置合わせされた。図６と７で見られるように、触媒領域の構造は非常にうまく重なり合い、この構造の重ね合わせに基づく同等の残基の特定が可能になった。
【０２１１】
本分析に基づいて、TrGAにおいて変異を受け得る部位が特定され、安定性及び/又は特異的活性が増大した。これらの部位は、活性部位の108、124、175及び316を含む。また、特異的な対形成Y47W/Y315F及びY47F/Y315Wも同定された。同定された他の部位は143, D44, P45、D46、R122、R125、V181、E242、Y310、D313、V314、N317、R408とN409であった。高い構造上の相同性により、トリコデルマ・レセイGAにおける部位で見出される有利な変異はアスペルギルス・アワモリと他の相同のグルコアミラーゼにおいて同様の結果をもたらすであろう。
【０２１２】
述べられた方法と本発明のシステムの種々の修飾、変更は本発明の範囲と思想から逸脱しない範囲内で、本技術分野の技術者に明らかである。本発明は具体的実施態様に関して述べられてきたが、請求項の発明はそのような具体的実施態様に不法に限定されるべきではない。まさに、本技術分野の技術者に明らかな、発明の実施のための記載された方法の種々の修飾は、以下の特許請求の範囲内にあると考える。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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