(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈ＋イオンを輸送できる環境において、緩衝能を有する固形物質である固形緩衝剤に非ヒトの標的細胞を接触させ、生存標的細胞を殺滅させる方法であって、
前記固形緩衝剤は、ポリアクリルアミド−イモビリンゲル、ポリアクリルアミド−イモビリン混合物から作られたビーズ、スルホン化テトラフルオロエチレンコポリマー、及び、スルホン化テトラフルオロエチレン誘導体、からなる群より選択される少なくとも１つの材料からなり、かつ、前記固形緩衝剤は２０ｍＭ  Ｈ＋／Ｌ・ｐＨ単位よりも大きい緩衝容量を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記標的細胞が、細菌細胞、真菌細胞、及び、酵母細胞からなる群より選択される少なくとも１種の細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的細胞が、非ヒト多細胞生物における標的細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記固形緩衝剤が、陰イオン性固形緩衝剤、及び、陰イオン性固形緩衝剤と陽イオン性固形緩衝剤との混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記固形緩衝剤が、カルボン酸とその誘導体、ホスフィン酸とその誘導体、フェノールとその誘導体、アルソン酸とその誘導体、セレン酸とその誘導体、及び、スルホン酸からなる群から選択される１以上の官能基を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記固形緩衝剤が、ポリアクリルアミド−イモビリンであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記固形緩衝剤が、少なくとも５０ｍＭ  Ｈ＋／Ｌ・ｐＨ単位の緩衝容量を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記固形緩衝剤が、少なくとも１００ｍＭ  Ｈ＋／Ｌ・ｐＨ単位の緩衝容量を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記固形緩衝剤のＨ＋濃度が、３．２×１０−５Ｍより大きいか、又は１０−８Ｍ未満であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記固形緩衝剤が、少なくとも一部にｐＨ勾配を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記固形緩衝剤が、ｐＨが異なった複数の領域を備えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記固形緩衝剤が、選択的に水に対する透過性があるバリア層で覆われていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記固形緩衝剤が、予め選択された非ヒトの非標的細胞に対する透過性はないが、予め選択された非ヒトの標的細胞に対する透過性があるバリア層に覆われていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記非標的細胞が、非ヒト哺乳類細胞及び植物細胞からなる群より選択されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｈ＋イオンを輸送できる環境において作用する細胞毒組成物であって、
前記細胞毒組成物には、２０ｍＭ  Ｈ＋／Ｌ・ｐＨ単位よりも大きい緩衝容量を有し、かつ、ポリアクリルアミド−イモビリンゲル、ポリアクリルアミド−イモビリン混合物から作られたビーズ、スルホン化テトラフルオロエチレンコポリマー、及び、スルホン化テトラフルオロエチレン誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの材料からなる固形緩衝剤が含まれており、
前記固形緩衝剤は陰イオン型、及び、陰イオン型と陽イオン型の混合からなる群から選択される型であることを特徴とする細胞毒組成物。
【請求項１６】
前記固形緩衝剤が、予め選択された非ヒトの非標的細胞に対する透過性はないが、予め選択された非ヒトの標的細胞に対する透過性があるバリア層に覆われていることを特徴とする請求項１５に記載の細胞毒組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固形緩衝剤を用いて滴定によって細胞を殺滅させる組成物及び方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
人に有害で潜在的に致死に至らしめる様々な細胞物質が知られている。たとえば、米国において癌細胞は、心臓病の次に死亡率の高い疾病をもたらす因子である（ボーリング等著「ＣＡ臨床医学者のための癌ジャーナル」第４３巻第７号（１９９３）参照）。細胞微生物も様々な疾病の原因因子である。細胞殺滅及び標的細胞殺滅（たとえば、癌死滅）はバイオテクノロジー産業において高度な研究がなされている。
【０００３】
癌は、無制限に成長する可能性のある悪性腫瘍であり、特に、人体において見られる様々な細胞の病原性の複製因子（正常な調整制御機能の喪失）である。斯かる疾患の初期治療としては、外科手術、放射線療法、あるいは、これら療法の併用が施されるが、限局的には再発及び転移性疾患が頻発する。ある種の癌には化学療法薬が有効であるが、長期に亘って回復することは殆どないので、多くの場合治療にはならない。一般に、腫瘍とその転移は、多剤耐性の亢進として知られているように化学療法が効かず、多くの場合、腫瘍はある種の化学療法薬に対して本質的に耐性がある。加えて、斯かる療法は非癌性細胞を脅かす上に、人体に負担をかけ、しかも、多様な副作用を誘発する。こうしたことから、癌細胞を標的にする改良薬が必要である。微生物は宿主組織に侵入して増殖し、重症疾患を引き起こすことがある。病原菌は、たとえば、結核、コレラ、百日咳、伝染病等々の様々な衰弱性疾患あるいは致命的疾病の真因として確認されている。重症感染症の治療には、病原菌を殺滅させる抗生物質などの薬剤が投与されるが、病原菌は通常、抗生物質に対する耐性を持つようになるので、微生物による感染症の蔓延を防止するために新たな開発薬が必要となる。
【０００４】
人体に適用導入する製品に関する主な懸念は細菌感染である。細菌は、病原菌を排除する人の免疫システムを阻害する生体膜に進化するので、埋め込み型医療機器を適用している場合には前記細菌による感染症を防止することが重要な課題になる。これらの感染症を抗生物質で治療するのが難しいので、埋め込み型装置を取り外さざるを得なくなり、結果的には、患者に身体的な苦痛と負担を強いると共に医療費も嵩む。こうしたことから、この種の医療装置に抗菌効果を持たせて滅菌できる技術が長い間切望されていた。
【０００５】
当該技術において医療器具の表面を抗菌性の被膜でコートすることが一般的な方法であったが、大抵の殺菌剤が部分的に水溶性であったり、あるいは、有効な抗菌作用を得るために少なくとも十分な可溶化が必要であるので、殺菌剤を単純にコートするだけでは信頼性に欠けることが分かっている。このため、殺菌剤を医療器具に練り込むか、あるいは、少なくとも安定した抗菌コートを形成するなどの試みがある。
【０００６】
別の方法として、抗生物質、第４級アンモニウム化合物、銀イオン、ヨウ素などの抗菌剤を含浸させ、長期に亘って抗菌剤を徐々に周囲に放出することで細菌を殺滅させることもできる。こうした方法は細菌を含む水溶液で抗菌効果が確認されているが、液体培地でなく空中浮遊菌に対して効果は期待できず、特に、抗菌剤が溶出し尽くされて効果が無力になった抗菌基材についてこのことが当てはまる。医療環境における生体膜形成を弱めるために用いる薬剤は利用者に安全でなければならない。また、生体膜を抑制するのに十分な量の殺菌剤は宿主組織をも損傷させることになる。局部組織領域に適用した抗生物質によって、特定の抗生物質に対する抵抗力をもつ浮遊微生物を含む生体膜集合体を形成する耐性細菌を生み出すことになるが、抗生体膜または防汚剤は医療装置の健全性を阻害することはない。そこで、抗菌効果を得るために添加する薬剤では補えないような扱いやすさ、柔軟性、防水性、強度、耐久性、特性などの特徴を有する材料を選択することになる。食品は細菌感染源でもあり、食品保護して、風味の低下や中毒の原因になるような栄養素の劣化や食感変質を抑制あるいは防止するためには食品の保存が最も重要である。食品の保存には様々な方法があり、保存性のある食品の物理的処理としては、たとえば、冷凍、冷蔵、加熱調理、レトルト、低温殺菌、乾燥、真空パック、無酸素パックなどがある。これらのいくつかの試みは食品加工処理の一部であり、滅菌食品をつくることと所期の品質の食品を生産することの安全性のバランスをとるように食品加工処理を選択することが好ましい。
【０００７】
医療装置の製作、食品の梱包や取り扱いのために高分子材料の使用が増加しており、抗菌性ポリマの利用が最適と考えられる。この技術分野でも抗菌性ポリマは利用されているが、更に優れた抗菌性を持ち、長期使用に際して細胞体に接しても抗菌剤が溶出しないで永久的に抗菌効果を保持しながらも安価、且つ、容易に適用できるよう改良された抗菌性被覆材料の要望がある。
【０００８】
米国特許出願公開第２００５／０２７１７８０号公報に、食品保存用に用いる第四アンモニウム塩などのイオン交換材料に結合している殺菌性ポリマ・マトリックスが開示されている。このポリマ・マトリックスは、内部に練り込まれた殺菌剤（たとえば、第四アンモニウム塩）の作用によって細菌を殺滅させる。殺菌剤の正電荷は、この正電荷と負に帯電した細胞壁との間の静電気引力に作用する。ところが、上記公報には緩衝性能を有する固体緩衝剤の使用は記載されていない。
【０００９】
米国特許出願公開第２００５／０２４９６９５号公報は、表面殺菌性を持たせるために固体表面に共有結合する第四アンモニウム塩または第四ホスホニウム塩（陽イオン正荷電体）などの抗菌性微粒子の固定化技術を開示している。当該公報に開示のポリマは、アミノ基の作用によって固体表面に付着し、付着したポリマは単に、固体表面に単分子層を形成することだけの効果を持つ。
【００１０】
米国特許出願公開第２００５／０００３１６３号公報には、抗菌・帯電防止特性を有する基板が示されている。これらの特性は、陽イオン荷電ポリマ化合物で被覆層を形成することで実現する。米国特許出願公開第２００５／０２７１７８０号、同第２００５／０２４９６９５号、同第２００５／０００３１６３号公報に記載されたようなポリマの効果は、細胞膜に殺菌材料が直接接触している場合に発揮され、また、毒性の程度は殺菌成分の表面濃度に大きく依存する。露出した陽イオン物質はイオン交換反応で急速に含浸するので前記要件には大きな制約が生じる。
【００１１】
更に、前記引用の米国特許出願のいずれにも、真核細胞を殺滅させる思想はなく、真核性細胞あるいは原核細胞タイプに対する細胞毒性薬としてのポリマの生体内使用も示されていない。しかも、上記米国特許出願には、ある種の細胞を選択的に殺滅させるポリマ構造の提案もない。
【００１２】
よって、真核性細胞及び原核細胞の両方に対する細胞毒性作用を持たせた薬剤はかなり有用であり、開発の要望がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の一実施例において、多細胞生物における標的細胞の細胞過程の変化を生み出す方法、および、真核性細胞及び原核細胞のいずれにも殺滅効果がある医薬組成物およびそのための装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記目的を達成するための本発明の多細胞生物における標的細胞の細胞過程の変化を生み出す方法は、次のとおりである。
【００１５】
本発明による多細胞生物における標的細胞の細胞過程の変化を生み出す方法は、標的細胞を固形緩衝剤に接触させて少なくとも細胞の一部の細胞内ｐＨ値を変化させ、これによって多細胞生物における標的細胞の細胞過程の変化を生み出すことを特徴とする。
【００１６】
本発明の他の実施例において、多細胞生物における標的細胞を殺滅させる方法を提供することを目的とし、本発明によるこの方法は、標的細胞を固形緩衝剤に接触させて少なくとも細胞の一部の細胞内ｐＨ値を変化させ、これによって標的細胞を殺滅させることを特徴とする。
【００１７】
本発明の更に他の実施例において、標的細胞の細胞過程の変化を生み出す方法を提供することを目的とし、本発明によるこの方法は、標的細胞を陰イオン固形緩衝剤に接触させて少なくとも細胞の一部の細胞内ｐＨ値を変化させ、これによって標的細胞の細胞過程の変化を生み出すことを特徴とする。
【００１８】
本発明の更に他の実施例において、標的細胞の細胞過程の変化を生み出す方法を提供することを目的とし、本発明によるこの方法は、緩衝層と当該緩衝層の外面に設けられた透水層とからなる固形緩衝剤に標的細胞を接触させて少なくとも細胞の一部の細胞内ｐＨ値を変化させ、これによって細胞を殺滅させることを特徴とする。
【００１９】
本発明の更なる実施例による細胞を殺滅させる方法は、５０ｍＭ Ｈ＋／ｌ．ｐＨ以上でｐＨ８以上かｐＨ４．５以下のｐＨ値の緩衝容量を有する固形緩衝剤に標的細胞を接触させて、これによって細胞を殺滅させることを特徴とする。
【００２０】
本発明の更なる実施例による細胞を殺滅可能な固形緩衝剤を選択する方法は、５０ｍＭ Ｈ＋／ｌ．ｐＨ以上でｐＨ８以上かｐＨ４．５以下のｐＨ値の緩衝容量を有する細胞を殺滅可能な固形緩衝剤を選択することを特徴とする。
【００２１】
本発明の更なる実施例による対象細胞の部分母集団を殺滅させる方法は、特に対象細胞の部分母集団を殺滅させるように選ばれた緩衝容量及びｐＨ値を有する固形緩衝剤に、対象細胞の部分母集団よりなる試料を接触させ、これによって細胞を殺滅させることを特徴とする。
【００２２】
本発明の他の実施例によって、
（ｉ）担体と、
（ｉｉ）前記担体の表面の少なくとも一部に接合した固形緩衝剤とからなり、前記固形緩衝剤が緩衝層と前記緩衝層に設けられたイオン透過層よりなることを特徴とする製品を提供する。
【００２３】
本発明のその他の実施例によって、
（ｉ）担体と、
（ｉｉ）前記担体の表面の少なくとも一部に接合した固形緩衝剤とからなり、
前記固形緩衝剤が陰イオン性であることを特徴とする製品を提供する。本発明の更に他の実施例では、病的細胞集団に関係する病状を治療する薬剤の製造用の固形緩衝剤の使用方法を提供する。
【００２４】
本発明のその他の実施例によって、有効成分として固形緩衝剤と、医薬として許容される担体または希釈剤とからなる医薬組成物を提供する。
【００２５】
本発明の更にその他の実施例によって、対象細胞を殺滅するための最適な固形緩衝剤を選択する分析方法であって、
（ｉ）複数の細胞を複数の固形緩衝剤に接触させ、
（ｉｉ）複数の細胞中の１細胞を殺滅可能な複数の固形緩衝剤のうちの対象細胞を殺滅するための最適な１固形緩衝剤を特定することからなる分析方法を提供する。
【００２６】
本発明の更にその他の実施例によって、病的細胞集団に関係する病状を治療する方法であって、必要に応じて被験者に治療効果のある量の固形緩衝剤を投与して少なくとも細胞の一部の細胞内ｐＨ値を変化させ、これによって病的細胞集団に関係する病状を治療する方法を提供する。後述する本発明の好適な実施例における更なる特徴によって、結果的に細胞を殺滅させる変化を生み出す。
【００２７】
上記した本発明の更なる好適な実施例において、多細胞生物が高等植物であることを特徴とする。
【００２８】
上記した本発明の更なる好適な実施例において、多細胞生物が哺乳動物であることを特徴とする。
【００２９】
上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記接触を生体内で行うことを特徴とする。
【００３０】
上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記接触を生体外で行うことを特徴とする。上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記接触を試験管内で行うことを特徴とする。
【００３１】
上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記固形緩衝剤の少なくとも一部にｐＨ勾配を有することを特徴とする。
【００３２】
上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記固形緩衝剤が標的細胞に吸収させたことを特徴とする。
【００３３】
上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記固形緩衝剤を親和性部分に付着させたことを特徴とする。
【００３４】
上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記親和性部分を、免疫体、受容体リガンド、炭水化物とからなる群から選択したことを特徴とする。
【００３５】
上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記固形緩衝剤の少なくとも一部を選択的バリアで覆ったことを特徴とする。
【００３６】
上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記選択的バリアが物理的バリアであることを特徴とする。
【００３７】
上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記固形緩衝剤が緩衝層と、前記緩衝層の外面に設けられた透水層とからなることを特徴とする。
【００３８】
上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記透水層が空孔ポリマであることを特徴とする。
【００３９】
上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記空孔ポリマを、ＰＶＯＨ、セルロース、ポリウレタンからなる群から選択したことを特徴とする。
【００４０】
上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記固形緩衝剤を粒状に調製したことを特徴とする。
【００４１】
上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記固形緩衝剤を噴霧調製したことを特徴とする。
【００４２】
上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記固形緩衝剤を粒子内に封入したことを特徴とする。また、上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記固形緩衝剤を粒子面に付着させたことを特徴とする。
【００４３】
上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記粒子を、ポリマー粒子と、マイクロカプセル、リポソーム、マイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、ナノカプセル、ナノスフェアからなる群から選択したことを特徴とする。
【００４４】
上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記固形緩衝剤が、透水ポリマ基材に取り込まれた陰イオン交換材料であることを特徴とする。
【００４５】
上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記固形緩衝剤が、透水ポリマ基材に取り込まれた陽イオン交換材料であることを特徴とする。
【００４６】
上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記固形緩衝剤が、透水ポリマ基材に取り込まれた陽イオン交換材料と陰イオン交換材料とからなることを特徴とする。上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記陽イオン交換材料が、スルホン酸とその誘導体、ホスホン酸とその誘導体、カルボン酸とその誘導体、ホスフィン酸とその誘導体、フェノールとその誘導体、アルソン酸とその誘導体、セレン酸とその誘導体からなる群から選択したことを特徴とする。
【００４７】
上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記陰イオン交換材料が、第４級アミン、第３級アミン、第２級アミン、第１級アミンからなる群から選択したことを特徴とする。
【００４８】
上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記固形緩衝剤がポリマであることを特徴とする。
【００４９】
上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記固形緩衝剤が、内在的イオン伝導性基材よりなることを特徴とする。
【００５０】
上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記固形緩衝剤がアイオノマであることを特徴とする。上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記アイオノマがスルホン化テトラフルオロエチレン共重合体（ナフィオン）及びその誘導体であることを特徴とする。
【００５１】
上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記固形緩衝剤が２０ｍＭ Ｈ＋／ｌ．ｐＨ以上の緩衝容量を有することを特徴とする。上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記固形緩衝剤がｐＨ８以上のｐＨ値の緩衝容量を有することを特徴とする。
【００５２】
上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記固形緩衝剤がｐＨ４．５以下のｐＨ値の緩衝容量を有することを特徴とする。
【００５３】
上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記細胞が罹患細胞であることを特徴とする。
【００５４】
上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記固形緩衝剤が担体面に付着していることを特徴とする。
【００５５】
標的細胞を固形緩衝剤に接触させて少なくとも細胞の一部の細胞内ｐＨ値を変化させ、これによって標的細胞を殺滅させることを特徴とする多細胞生物における標的細胞を殺滅させる方法。
【００５６】
標的細胞を固形緩衝剤に接触させて少なくとも細胞の一部の細胞内ｐＨ値を変化させ、これによって標的細胞を殺滅させることを特徴とする多細胞生物における標的細胞を殺滅させる方法。
【００５７】
上記した本発明の更なる好適な実施例において、対象細胞の部分母集団及び細胞の第２の部分母集団が異なる血漿緩衝能を示すことを特徴とする。
【００５８】
上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記処理を生体外で行うことを特徴とする。
【００５９】
上記した本発明の更なる好適な実施例において、前記処理を生体内で行うことを特徴とする。
【発明の効果】
【００６０】
上記した本発明の更なる好適な実施例における当該製品が、包装材料、医療装置、布材料、骨組、フィルタ、殺菌装置のいずれかの一部を形成することができる。
【００６１】
細胞を固形緩衝剤に接触させることで細胞変化をもたらす本発明の新規な方法を提供することによって、現在知られている形態の不都合を解消することができる。
【００６２】
なお、特に言及しない限り、ここでの技術用語及び学術用語は、本発明が属する技術分野における通常の技術者が理解する同じ定義を意味するものとする。また、ここでの記載内容と同様もしくは等価な方法及び材料は本発明の実施もしくは試行に際して適用可能であるが、以下に最適な方法及び材料について説明する。ここに記載の全ての文献公報、特許出願、特許、及び、他の文献は単なる参考であり、説明に矛盾が生じる場合は、本件明細書に記載の定義に基づいて解釈すべきであり、且つ、材料、方法、例示事項等は単に説明のために記載したもので、発明の限定要件ではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
本発明を添付の図面を参考にして以下に説明する。特に図面を参考にして本発明の好ましい実施例を単に図解例示する目的だけであり、最良の実施形態と考えられる態様を提案するが、あくまでも本発明の原理及び概念を示しているだけであることを理解すべきである。また、ここでは本発明を基本的に理解するのに必要な説明以上に本発明の構造を詳細に示さず、当該技術分野の技術者が添付の図面を参考に本発明の様々な態様を実施できるよう説明する。
【００６４】
本発明は、細胞殺滅組成物及び細胞殺滅方法に関し、特に、固形緩衝剤を用いた細胞過程に作用する方法に関するもので、癌性細胞などのような身体における異常細胞を殺滅させることから環境中の有害な原核細胞の殺滅に至る数々の応用に供することができる。本発明の原理及び作用は添付の図面を参考にすることで更に詳しく理解できよう。
【００６５】
本発明の一実施例を詳細に説明するに先立って、以下の例示説明において説明する適用例のみに限定するものでなく、様々な手法で本発明の実施例を実施、実現可能である。また、ここで用いる技術用語及び表現は単に説明のために用いるものであり、本発明を限定すべきではない。本発明の技術は本件発明者らによって新たに発見発明した成果である。本件発明者らによって、生体分子（たとえば、タンパク質）は一般に、ｐＨ勾配に沿う空間分布を決定するｐＨ特性を有することを明らかにし（実施例１参照）、更に、生体膜を通して再分布を起こすことができることを実験によって証明した（実施例３及び図４Ａ〜４Ｃ参照）。
【００６６】
本発明の着想に際して本件発明者らは、細胞内の過程を、その細胞に接触する固形緩衝剤の細胞外ｐＨを変化させることによって操作することができることを明らかにした。よって、本発明の発明者らは、細胞内成分のｐＨから異なったｐＨを持つ固形緩衝剤に細胞を接触させることによって細胞のｐＨホメオスタシスの崩壊を可能にしたことを示した。接触は結果的に細胞質の細胞内ｐＨの滴定を可能にし、通常、細胞過程において変化をもたらす。緩衝剤料のｐＨ値が特定細胞のｐＨの生存範囲を超えると細胞死が起こる。
【００６７】
米国特許出願公開第２００５０２７１７８０号、同第２００５０２４９６９５号、同第２００５０００３１６３号公報には殺菌性ポリマが開示されている。前記公報に開示されているポリマは、ポリマの重合体構造に組み込まれるかその表面に固定されたカチオン性分子の介在によって殺菌作用が生まれるので、細胞膜に接触させることが必要となる。毒性の程度は殺菌成分の表面濃度に大きく依存する。露出した陽イオン物質はイオン交換反応で急速に含浸するので前記要件には大きな制約が生じる。
【００６８】
本発明の新規なところは細胞膜を分離させるために陽性基の浸透に頼るのではなく、全体的なバルク緩衝効果に頼るため、ここに開示する固形緩衝剤はカチオン性ポリマだけでなく陰イオン緩衝剤にも限定されない。また、その細胞毒性がそれらの表面特性でなくバルク特性から生み出されるので、殺菌成分の表面濃度によって制限されない。本発明の実施を絞り込んで、本発明の発明者らは、固形緩衝剤が、たとえば、酵母細胞（実施例４及び表２）、哺乳類Ｊｕｒｋａｔ細胞（実施例５及び表３）、細菌性細胞（実施例１１及び表５）、真菌細胞（実施例１２）などの全ての種類の細胞に細胞毒性の影響が及ぶことを明らかにした。
【００６９】
更に本発明の発明者らは、細胞死亡率が細胞に接触する固形緩衝剤のｐＨ値を選択することで制御可能であり、細胞死亡率は細胞に接触する固形緩衝剤のｐＨ値を適切に修正することによって緻密に調整できることを証明した（一例として実施例４及び表２を参照）。
【００７０】
ｐＨに起因する細胞毒性には細胞が固形緩衝剤に直接接触することが必要であることを明らかにした。よって、ｐＨホメオスタシスが特定サイズの細胞だけのために崩壊（変態）するように、特定の空孔サイズの物理的バリアを固形緩衝剤に付着させることができる。この方法で、特定の大きさの細胞だけが標的にされて他の細胞は変化しなくなる（実施例８参照）。
【００７１】
更に、本発明の発明者らは、緩衝層の外面に設けた透水層がイオンの再分布を許し、これによって固形緩衝剤の全てのバルク効果を低下させないので、透水層によって更に固形緩衝剤が細胞作用を働かせるようになることを明らかにした。実施例１４に示すように、固形緩衝剤が空孔ポリマに覆われて、それでも細胞毒性効果を発揮することになる。
【００７２】
そこで、本発明の一実施例において、多細胞生物の標的細胞の細胞過程に変化を生み出す方法を提供することを目的とし、本発明によるこの方法は、標的細胞を固形緩衝剤に接触させて少なくとも細胞の一部の細胞内ｐＨ値を変化させ、これによって多細胞生物における標的細胞の細胞過程の変化を生み出すことを特徴とする。本発明における細胞は、たとえば、単離細胞、細胞懸濁液、細胞培養などの細胞環境における細胞、または、組織内の細胞、または、有機的組織体における細胞であってもよい。これら細胞は、正常細胞、異常細胞（たとえば、癌細胞）、あるいは、それらの混合細胞であってもよい。
【００７３】
ここでの用語「細胞過程の変化」とは、細胞過程における発現低下もしくは発現上昇を意味する。本発明の一実施例によって変化させる典型的な細胞過程では、細胞死（細胞自然死または細胞壊死）、細胞分化、細胞シグナリング、細胞成長、細胞分裂、細胞増殖、腫瘍増殖、腫瘍血管新生、腫瘍転移、腫瘍変移、腫瘍移動、細胞移動、細胞小器官機能（仮足形成、鞭毛運動等を含むが限定しない）、各種細胞の細胞内膜−細胞室間分子輸送などを含むがこれらに限定するものではない。
【００７４】
本発明の一実施例において特に好ましい実施例によれば、結果として細胞過程の変化によって細胞が殺滅される。細胞毒性作用が働く固定緩衝剤の定量標準化について以下説明する。
【００７５】
ここでの用語「多細胞生物」とは、細胞を１つ以上含む有機組織を意味する。典型的な多細胞生物には真核生物（哺乳類など）及び高等植物が含まれる。
【００７６】
本発明の固形緩衝剤は、たとえば、菌類、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌などの原核細胞の細胞過程に作用する。
【００７７】
ここでの用語「グラム陽性細菌」とは、細胞壁構造の一部としてペプチドグリカンだけでなく、多糖類ないしテイコ酸を有することを特徴とした細菌を意味し、グラム染色法における青紫色反応を特徴とする。
【００７８】
代表的なグラム陽性細菌には、アクチノミセス属放線菌類、炭疽菌、ビフィドバクテリウム類、ボツリヌス菌、ウェルシュ菌、クロストリジウム菌類、破傷風菌、ジフテリア菌、コリネバクテリウム・ジェイケイウム、大便連鎖球菌、腸球菌、ブタ丹毒菌、真正細菌類、ガルドネレラ属膣桿菌、双子菌属、リューコノストック菌類、マイコバクテリウム・アブセサス、トリ結核菌錯体、マイコバクテリウム・チェロネ、マイコバクテリウム・フォルツイタム、マイコバクテリウム・ヘモフィリム、マイコバクテリウム・カンサシイ、ハンセン菌、マイコバクテリウム・マリナム、マイコバクテリウム・スクロフラセウム、マイコバクテリウム・スメグマチス、マイコバクテリウム・テラ、マイコバクテリウム・ツバキュロシス、マイコバクテリウム・ウルセランス、ノカルジア菌類、ペプトコッカス・ニガー、ペプトストレプトコッカス菌類、プロピオニバクテリア菌類、黄色ブドウ球菌、ブドウ球菌オーリクラリス、スタフィロコッカス・カピティス、スタフィロコッカス・コーニー、スタフィロコッカス・エピデルミディス、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・オミニス、スタフィロコッカス・ラグダネシス、スタフィロコッカス・サッカロリティカ、腐性ブドウ球菌、スタフィロコッカス・シュライフェリ、スタフィロコッカス・シミランス、スタフィロコッカス・ワーネリ、スタフィロコッカス・キシロサス、ストレプトコッカス・アガラクシア（Ｂ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス・アンジノサス、ストレプトコッカス・ボヴィス、ストレプトコッカス・カニス、ストレプトコッカス・エクイ、ストレプトコッカス・ミレリ、ストレプトコッカス・ミショア、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・サリバリウム、ストレプトコッカス・サンガイスなどが含まれる。
【００７９】
ここで用いる用語「グラム陰性細菌」とは、各細菌性細胞を囲む二重膜の存在によって特徴づけられる細菌を意味する。代表的なグラム陰性細菌には、アシネトバクター・カルコアセティクス、アクチノバシラス・アクチノミセタムコミタンス、アエロモナス細菌、アルカリゲネス・キシロースオキシダンス、バクテロイデス菌類、バクテロイデス・フラジリス、バルトネラ・バシリフォーミス、ボルデテラ菌類、ライム病ボレリア、ブランハメラ・カタラーリス、ブルセラ菌類、カンピロバクター菌類、肺炎クラミジア、オウム病クラミジア、クラミジア・トラコマチス、クロモバクテリア・ビオラセウム、シトロバクター菌類、歯周病原性細菌、エンテロバクター・アエロゲネス、大腸菌、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム、フゾバクテリウム菌類、レジオネラ菌類、レプトスピラ菌類、モラクセラ・カタラーリス、モルガネラ・モルガニ、肺炎マイコプラズマ、淋菌、髄膜炎菌、パスツレラ皮膚壊死毒素、プレシオモナス・シゲロイデス、プレボテラ菌類、プロテウス菌類、プロビデンシア・レットゲリ、緑膿菌、シュードモナス菌類、発疹チフス・リケッチア、ロッキー山紅斑熱リケッチア、ロシャリメア菌類、サルモネラ菌類、チフス菌、霊菌、赤痢菌類、トレポネーマ・カラテウム、トレポネーマ・パリダム、地域流行性梅毒トレポネーマ、熱帯苺腫トレポネーマ、ベイヨネラ菌類、コレラ菌、ビブリオ・バルニフィカス、腸炎エルシニア、ペスト菌などが含まれる。
【００８０】
ここでの用語「固形緩衝剤」とは、緩衝能を有する固形の物質である。緩衝能は、酸や塩基を緩衝剤（滴定）に添加された時にｐＨの変化に耐える能力として定義されるもので、緩衝系の１ｐＨ単位の変化に作用する単位体積当たりに添加される水素陽イオン濃度によって決まる。緩衝系の緩衝能は通常、水素陽イオンを一定に供給することができる解離性及び非解離性の化合物が系において共存することから生み出される。よって、イオン伝導マトリックスまたは水／イオン透過マトリックスに取り込まれた酸性物質または塩基性物質（たとえば、イオン交換材料）を固形緩衝剤として分類することができる。固形物質の緩衝能は通常、水素陽イオンを放出または結合できる複数の官能基の存在から生じ、これらの物質の飽和度、つまり、これら全ての官能基が影響し合う濃度によって決まる。典型的な陽イオン交換物質としては、非限定的であるが、スルホン酸とその誘導体、ホスフィン酸とその誘導体、カルボン酸とその誘導体、ホスフィン酸とその誘導体、フェノールとその誘導体、ヒ酸とその誘導体、セレン酸とその誘導体などが含まれる。
【００８１】
典型的な陰イオン交換物質としては、非限定的であるが、第３級アミン、第２級アミン、第１級アミン、第４級アミンなどからなる化合物を挙げることができる。
【００８２】
典型的な透水性基材としては、非限定的であるが、空孔ポリマ、空孔セラミックス、空孔ゲルなどを挙げることができる。
【００８３】
典型的な空孔ポリマとしては、非限定的であるが、ＰＶＯＨ、ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、ポリウレタンなどを挙げることができる。
【００８４】
別の態様では、固形緩衝剤を、固有のイオン伝導性の基材よりなる。固有のイオン伝導性の固形緩衝剤の例としては、非限定的であるが、アイオノマー及びポリカチオン性物質を挙げることができる。
【００８５】
市販されているアイオノマーとしては、イー・アイ・デュポン・ドゥ・ヌムール・アンド・カンパニー（米国デラウェア州ウィルミントン市）から供給されるナフィオンＲ（商標）のペルフルオロ・スルホン酸膜及び同デュポン社から供給されるサーリンＲ（商標）の熱可塑性樹脂を挙げることができる。
【００８６】
固形緩衝剤は通常、ポリマである。本発明の実施例に適用できる固形緩衝剤として極めて多種多様のポリマが知られている。斯かるポリマを以下に列挙するがこれらに限定する物ではない。
【００８７】
ポリ（４−ビニル−Ｎ−臭化アルキルピリジニウム）、ポリ（臭化メタクリロイルオキシドデシルピリジニウム）、Ｎ−アルキル化ポリ（４−ビニルピリジン）、ポリ（ビニル−Ｎ−ヘキシルピリジニウム）、ポリ（Ｎ−アルキルビニルピリジン）、ポリ（Ｎ−アルキルエチレンイミン）、ポリ（４−ビニル−Ｎ−臭化アルキルピリジニウム）、ポリ（４−ビニル−Ｎ−臭化ヘキシルピリジニウム）、ポリ（１−（クロロメチル）４ービニールベンゼン）、ポリ（ジメチルオクチル［４−ビニルフェニル］メチルアンモニウムクロライド）、ポリ（ジメチルドデシル［４−ビニルフェニル］メチルアンモニウムクロライド）、ポリ（ジメチルテトラデシル［４−ビニルフェニル］メチルアンモニウムクロライド）、５０／５０ポリ（１−クロロメチル）−４−ビニルベンゼン）：ポリ（ジメチルドデシル［４−ビニルーフェニルメチルアンモニウムクロライド）、５０／５０ポリ（１−クロロメチル）−４−ビニルベンゼン）：ポリ（ジメチルオクチル［４−ビニルフェニル］メチルアンモニウムクロライド）、５０／５０ポリ（ジメチルオクチル［４−ビニルフェニル］メチルアンモニウムクロライド）：ポリ（ジメチルオクチル［４−ビニルフェニル］メチルアンモニウムクロライド）、ポリ（トリブチル−［４−ビニルフェニル］メチルアンモニウムクロライド）、ポリ（トリオクチル−［４−ビニルフェニル］メチルアンモニウムクロライド）などである。
【００８８】
本発明による固形緩衝剤は、適当な緩衝剤（たとえば、イモビリン（商標）アクリルアミド緩衝剤など）が適切に含まれていたポリアクリルアミド、アガロースゲル基材などのゲル基材よりなる。特定のｐＨのゲルを生成するイモビリンｐＫ緩衝剤の量は後述の実施例における表１に示している。本発明の固形緩衝剤としては、イオン交換ビーズ、ポリマ被覆イオン交換ビーズ、イオン透過マトリックスのいずれかでよい。
【００８９】
ここでの用語「接触」とは、固形緩衝剤に対する細胞の位置を意味し、細胞に固形緩衝剤を接触させる、あるいはその逆で接触させる必要性によって限定される。
【００９０】
本発明の一実施例において細胞と固形緩衝剤は互いに物理的接触をしている。たとえば、固形緩衝剤を細胞の外側に接触させてもよく、あるいは、細胞の外側に付着させてもよい。あるいは、細胞外物質を内在させる既知の方法で固形緩衝剤を細胞に内包させてもよいが、細胞のファゴサイトーシス、エンドサイトーシス、受容体を介した飲食作用、クラスリン被覆ピット、小嚢結合内在化処理、トランスファーインフェクション法等々に限定しない。
【００９１】
本発明の他の実施例における固形緩衝剤は透水層で細胞から分離している。前記透水層は、固形緩衝剤の緩衝作用によって緩衝剤と細胞との間のイオンの流れを妨げないようにイオンの流れを許す効果がある。典型的な透水層としては、ＰＶＯＨ、エチルセルロース、酢酸セルロース、ポリアクリルアミド、親水性添加物の有無を問わない微小孔性マトリックスなどがある。接触は体内接触、体外接触（たとえば、体内から摘出された細胞）、管内接触（たとえば、細胞株内）のいずれでもよい。
【００９２】
上記したように、本発明の固形緩衝剤は特定細胞過程における変化をもたらすために定式化したものであり、特に、固形緩衝剤の３つの特性を操作して固形緩衝剤をｐＨ、緩衝能、イオン伝導度などに影響する細胞過程に作用させることができる。
【００９３】
以下に、細胞死の過程に影響する（細胞死を増加させる）ために固形緩衝剤を選ぶ例を開示する。
【００９４】
（１）固形緩衝剤のｐＨ値を細胞の生存能力範囲外にする。この範囲は細胞及び細菌の種類に応じて特化する。たとえば、固形緩衝剤のｐＨ値を４未満または８を超える数値にすることで細胞のｐＨ安定性に影響を及ぼす。
【００９５】
固形緩衝剤にｐＨ勾配を持たせるように調製することも可能である。勾配は細胞への固形緩衝剤の生物学的効果を段階的に変化させるのに有効である。たとえば、固形緩衝剤に勾配をつけることによって、固形緩衝剤の一部に細胞への細胞静止作用を持たせ、固形緩衝剤の他の部分に細胞毒性効果を持たせることも可能である。
【００９６】
固形緩衝剤の基材におけるイオン交換材料を適当に制御することによって前記勾配の種類、強さ、位置、全体の形態を変化させ得ることは当該技術の基本認識の範疇であり、本発明の範囲に含まれるものとする。後述する実施例のように、勾配を有する緩衝剤を上記したイモビリン（商標）と合成することも可能である。
【００９７】
更に、本発明の固形緩衝剤を、陽イオン交換材料と陰イオン交換材料を組み合わせ、細胞殺滅に適した形態に配列して形成することも可能であり、これによる固形緩衝剤を、たとえば、陰イオンビーズと陽イオンビーズのマトリックスに構成してもよい。前記ビーズは標的細胞の位置に合わせて同じ大きさにしてもよく、あるいは、大きさを異ならせてもよい。
【００９８】
（２）細胞質ゾルと他の大半の細胞成分の一般的に許容される緩衝能値は概ね２０ｍＭ Ｈ＋／リットルのｐＨ値で細胞質ゾルが滴定されるので、固形緩衝剤の緩衝能をこの値より高くすべきである。ほとんどの種類の細胞を殺滅できる固形緩衝剤の一般的な緩衝能は１００ｍＭ Ｈ＋／リットル以上のｐＨ値である。
【００９９】
（３）固形緩衝剤のイオン伝導度（プロトン伝導度）の変化は、細胞を殺滅させ得る固形緩衝剤の速度に影響する。特に、透水性固形緩衝剤におけるイオン移動度は水の陽子の拡散運動によって決まり、拡散定数が毎秒約１０―８ｍ２程度であり、これは毎秒０．１ｍｍの流動速度に相当する。前記固形緩衝剤によって、数秒の内に接触細胞を死に至らしめることになる。このように、細胞を殺滅させる典型的方法は、細胞を滴定可能なｐＨ値である約５０ｍＭ Ｈ＋／リットルの緩衝能を持つ固形緩衝剤に細胞を接触させ、これによって細胞を死に至らしめる方法である。前記ｐＨ値は通常、ｐＨ８以上かｐＨ４．５以下である。ｐＨ値を測定して緩衝能を決定する方法は当該分野において公知である。
【０１００】
細胞のプラズマ緩衝能とｐＨ値は細胞タイプの特異型であり、そのためにこれらのパラメータの操作によって特定の種類の細胞を標的にできることになる。たとえば、腫瘍細胞は、正常細胞よりアルカリ度が高いので、固形緩衝剤が腫瘍細胞の最適細胞毒性のみに作用し、他の種類の細胞には殆ど（または、全く）作用しないようにすることができ、更には、夫々の種類の細胞には特定の膜透過性があるので、本質的に本発明の固形緩衝剤に多少なりとも影響を受けやすくなる。
【０１０１】
更なる例として、細菌の緩衝能は哺乳類のものより大きいが、細菌における数多くの緩衝培地は哺乳類細胞より約３桁以上小さいので、緩衝剤による細菌の滴定に対する脆弱性は高くなる。このことは、緩衝能が低い固形緩衝剤を用いて、哺乳類細胞を殺さずに細菌だけを殺滅可能であることを意味する。
【０１０２】
固形緩衝剤のｐＨ値及び緩衝能を変化させる一方法として、水溶（イオン透過性）マトリックス中のイオン交換材料の濃度を変化させることがある。他の方法として、イオン交換材料の濃度を一定に維持してイオン交換材料を変える方法がある。対象とする細胞を殺滅させる最適な固形緩衝剤は、対象とする細胞を含む混合細胞に関して異なったｐＨ値と緩衝能を持つ複数の固形緩衝剤を試験することによって選別する。その上で、対象とする細胞を分析して最適な固形緩衝剤を決定する。対象とする細胞を分析する方法としては、当該技術分野で公知の顕微鏡検査、免疫組織化学検査、生物学的検定技術などがある。
【０１０３】
本発明では固形緩衝剤を用いて疾病（たとえば、病理細胞集団に関連する疾患）を治療する目的もあり、この固形緩衝剤を主に管内もしくは生体外で身体に適用することによって、固形緩衝剤が特定の種類の細胞を選択的に狙って作用できることは極めて重要である。
【０１０４】
よって、本発明の一実施例によれば、固形緩衝剤を抗体、受容体リガンド、炭水化物などの親近部に付着させることができる。本発明の実施例で適用できる抗体の例としては、限定的ではないが、腫瘍抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＩＬ−２Ｒアルファ抗体などを含む。典型的な受容体としては、限定的ではないが、葉酸受容体、ＥＧＦ受容体がある。本発明の一実施例で適用可能な炭水化物の典型としては、レクチンがある。
【０１０５】
上記親近部は、何らかの連結方法もしくは結合方法を用いて、あるいは、当該技術分野において公知の適当な化学的リンカーを用いて固形緩衝剤に共有結合または非共有結合させることができ、好ましくは、架橋剤または架橋方法の種類及び化学的特性を、用いる類縁集団の種類と固形緩衝剤の特性に適応させる。アフィニティー標識と類縁集団を結合または吸収または連結させる方法は当該分野において公知である。
【０１０６】
本発明の好適な一実施例における標的細胞は、同定可能な表面マーカーを意味する転移癌細胞であってもよい。接触する細胞を殺滅させるよう固定緩衝剤のｐＨ値と緩衝能を選択すれば、悪性細胞によって表された特定のマーカーに対抗する１以上の抗体が前記親近部であってもよい。
【０１０７】
特定の種類の細胞（たとえば、原核細胞であって真核細胞でない細胞）を標的にするための本発明における別の方法は、固定緩衝剤と特定の種類の細胞との物理的接触を選択的に阻止することを基本にしている。本発明のもう一つの実施例では、固定緩衝剤を少なくとも部分的に選択的なバリアで覆っている。たとえば、固定緩衝剤の表面を、調整された空孔サイズ（限定的ではないが、たとえば、選択された空孔サイズを有するナイロンフィルタなどのフィルタ、あるいは、選択された開口サイズを有するメッシュ等々）の物理的バリアで覆うか、または、保護した場合、あるサイズ以上の細胞を固形緩衝剤と接触または付着させずに、小さいサイズの細胞だけ空孔に進入させたり、あるいは、物理的バリアに透通させ、固形緩衝剤と接触させることが可能になる。
【０１０８】
本発明による固形緩衝剤を標的にする方法は、「受動的」ターゲッティング方法を用いることで実現でき、侵漏脈管及びリンパ排液漏のために腫瘍組織中の粒子の浸透性促進と鬱滞を利用する。２００〜６００ナノメートルの大きさの腫瘍の選択性は健常組織に対して１０〜１００倍である。この特殊なタイプの受動的ターゲッティングには、認識グループもしくは認識部分によって官能化されない粒子を利用できる。
【０１０９】
本発明の固形緩衝剤を有機的組織体そのもの、もしくは、適当な担体または賦形剤と組み合わせた医薬組成物に適用することができる。
【０１１０】
ここでの用語「医薬組成物」とは、生理学的に適した担体及び賦形剤のような他の化学成分と共に１以上の有効成分の製剤を意味する。医薬組成物の目的は、有機的組織体への適用を容易にすることである。
【０１１１】
ここでの用語「有効成分」とは、意図する生物学的効果をもたらす固形緩衝剤を意味する。
【０１１２】
以後用いる用語「生理学的に許容される担体」及び「医薬として許容される担体」は互いに置換可能であるが、有機的組織体に重大な炎症等を起こさず、適用成分の生物活性や生物特性を無効にすることのない希釈剤または担体を意味する。この用語には補助剤も含まれる。
【０１１３】
ここでの用語「賦形剤」とは、有効成分の投与を更に容易にするために医薬組成物に添加する不活性物質を意味する。賦形剤の例として、限定的ではないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、各種糖類、デンプン類、セルロース誘導体、ゼラチン、植物性油脂、ポリエチレン・グリコールなどがある。
【０１１４】
薬剤の調製技術が記載された参考文献として、マック出版社（米国ペンシルベニア州イーストン）「レミントン薬学」の最新版を挙げる。
【０１１５】
本発明の固形緩衝剤は粒子状またはビーズ状に調製することができ、数ナノメートルから数ミリ以上の平均サイズで製造することができる。
【０１１６】
固形緩衝剤を粒子面に付着させてもよく、また、粒子内に封入してもよい。固形緩衝剤を粒子内に保持した場合、封入粒子は、イオンが固形緩衝剤と細胞との間を流れるようにイオン伝導性材料で作る必要がある。典型的な粒子としては、限定的ではないが、ポリマー粒子、マイクロカプセルリポソーム、高分子微粒子、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、ナノカプセル、ナノ微粒子などがある。本発明の固形緩衝剤は、選択性を向上させ、且つ、活性作用を防止するために分解性のコーティングで被覆してもよい。
【０１１７】
分解性コーティングとしては、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）コーティング、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コーティング、修飾ゼラチンコーティング、または、その他の適当なコーティング材料を用いることができる。適切な投与手段としては、たとえば、経口投与、直腸投与、経粘膜的投与、特に、経鼻投与、腸内吸収投与の他に、筋内注射、皮下注射、髄内注射などの非経口投与、更には、髄腔内投与、直接心室内投与、静脈内投与、腹膜吸収投与、経鼻投与、眼内注射などがある。別の方法として、浸透方法でなく、たとえば、患者の組織域に直接医薬組成物を注入するような局所的に医薬組成物を投与してもよい。
【０１１８】
本発明の医薬組成物は当技術分野において公知の方法で製造でき、たとえば、混合処理、溶解処理、整粒処理、糖衣処理、粉末処理、乳化処理、カプセル化処理、封入処理、凍結乾燥処理などの従来の方法で調製できる。
【０１１９】
本発明において用いる医薬組成物は、有効成分を調製剤に容易に加工するために医薬として用いることができる賦形剤と助剤よりなる生理学的に許容される１以上の担体を用いた従来の方法で調製できる。適した調製方法は、薬剤の投与方法によって異なる。
【０１２０】
注射用の医薬組成物の有効成分は、水溶液、好ましくは、ハンクス溶液、リンガー溶液、生理食塩水などの生理活性適合緩衝溶液として調製できる。経粘膜投与剤としては、浸透させる緩衝剤に適した浸透剤を調製に用いる。この浸透剤は当技術分野において公知である。
【０１２１】
局所性投与用として、本発明の固形緩衝剤をゲル、クリーム、洗剤、洗浄液、噴霧液の形態で調製できる。この態様は固形緩衝剤を被験者に局所的に投与したり、あるいは、個体表面に用いる場合に適用できる。
【０１２２】
経口投与用として、当技術分野で公知の医薬として許容される担体と活性化合物を混合することによって容易に調製できる。この担体によって、患者が経口摂取できるように医薬組成物を、タブレット、錠剤、糖衣錠、カプセル、溶液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等々の形態で調製できる。経口用の薬理調製は、固形賦形剤を用い、結果的に得られる混合物を随意に粉砕し、必要な適当な助剤を加えた上で顆粒状の混合物を加工してタブレットや糖衣錠に仕上げる。
【０１２３】
適切な賦形剤としては特に、糖質などの溶加剤があり、これには乳糖、蔗糖、マンニトール、ソルビトールなどがあり、他に、たとえば、トウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、ジャガイモ澱粉、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル・セルロース、カルボメチル・セルロース・ナトリウム等があり、更に、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容されるポリマがある。必要に応じて、交差結合ポリビニルピロリドン、寒天、あるいは、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム等のアルギン酸塩などの崩壊剤を添加してもよい。
【０１２４】
糖衣錠には適当なコーティングを施せばよい。たとえば、ゴム糊、滑石、ポリビニルピロリドン、カルボポル・ゲル剤、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー液、適当な有機溶剤、溶媒混合液などを選択的に含む濃縮砂糖液を用いることができる。活性化合薬剤の識別、あるいは、組み合わせを特徴的に区別する目的で染料または顔料をタブレットや糖衣錠のコーティングに加えてもよい。
【０１２５】
系統投与用の医薬組成物には、ゼラチンからなる押合カプセルや、ゼラチン、及び、グリセロールやソルビトールなどの可塑剤からなる柔軟な密封カプセルを用いることができ、押合わせカプセルには、乳糖などの溶加剤、澱粉などの結合剤、滑石やステアリン酸マグネシウムなどの滑剤、更には任意に安定剤等を混合した有効成分を含ませることができる。柔軟なカプセルは、脂肪油、流動パラフィン、液体ポリエチレングリコールなどの適当な液体に有効成分を溶解または懸濁させて調製でき、更に、安定剤を加えてもよい。選択した投与方法に適した用量で経口投与用に調製する。
【０１２６】
口腔投与用には、調製剤を従来の方法でタブレットやトローチ状に形成してもよい。
【０１２７】
鼻孔吸入投与用には、本発明による有効成分を、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、炭酸ガスなどの適当な加圧噴霧剤を用いた加圧パックや噴霧器からエアゾール噴霧して簡便に利用できるようにする。加圧エアゾール式を用いた場合、適量を供給できる弁手段を用いて投薬量を決めるようにするとよい。
【０１２８】
たとえば、投薬機に用いるゼラチンのカプセルや薬剤容器に、乳糖や澱粉などの適当な調製剤との混合粉体を入れて調製する。
【０１２９】
上記した医薬組成物を、たとえば、静脈内ボーラス注入法または持続注入法によって非経口的投与用に適用できる。注射用の調製は、単位用量投薬形態、たとえば、アンプルや反復投与容器などの形態で準備し、任意で保存料等を添加する。調製成分は、油性または水性媒体を主体にした懸濁液、溶液剤、乳剤などであってもよく、懸濁化剤、安定剤、分散剤などの調合剤を入れてもよい。
【０１３０】
非経口的投与用の医薬組成物には、水溶性の有効調製水溶液を入れている。また、有効成分の懸濁液は、適当な油性または水性の注射用懸濁液として調製することができる。親油性溶剤または媒質には、胡麻油あるいはオレイン酸エチル、トリグリセリド、リポソームなどの合成脂肪酸エステルを含ませる。水溶液注入懸濁液に、カルボキシルメチル・セルロース・ナトリウム、ソルビトール、デキストランなどの懸濁粘度を高める成分を入れてもよい。また、懸濁液に、有効成分の溶解性を高める適当な安定剤を適宜に入れて、高い濃溶液を調製できるようにしてもよい。
【０１３１】
本発明の医薬組成物は、たとえば、ココアバターやグリセリンなどのような従来の坐基剤を用いた座薬または浣腸などの形態で調製することもできる。本発明が提案する使用目的に適した医薬組成物に、本来の用途を達成するのに効果的な量の有効成分を含める。更に詳しくは、「治療有効量」とは、疾患症状（虚血など）を予防、緩和、改善したり、あるいは、治療を受けた被験者を延命させるのに効果的な有効成分（核酸成分など）の量である。治療有効量は当該技術分野における知識に基づいて適宜決定でき、特に、ここに開示の詳細説明を参考に決めればよい。
【０１３２】
本発明の方法で用いる調製剤に関する投薬量または治療有効量は、最初に生体外での細胞培養試験により推定判断する。たとえば、投薬量は、動物モデルを用いて定式化して、所期の濃度乃至滴定量を決めることができ、そうして得られた情報データに基づいてヒトへの有効投薬量を正確に決定する。
【０１３３】
ここに開示の有効成分の毒性及び治療効力は、生体外試験管内で、あるいは、細胞培地で、あるいは、動物実験で行う標準的な製剤方法によって測定する。生体外試験管、細胞培地、動物実験のいずれかで得られたデータに基づいてヒトへの適用投薬量を定式化できる。投薬量は、適用した投薬量判定方法と適用した投与手段に大きく依存する。投与の正確な製剤処方と手段、及び、投薬量は患者の状態を踏まえて各医師が決定する。（例として、Ｅ．フィングル等（１９７５）「治療学の薬理学的基礎」第１頁第１章参照）
【０１３４】
投薬量と投与間隔は、有効成分の血漿中濃度および脳中濃度を十分に保ち、生物学的効果（最小有効濃度（ＭＥＣ）など）を誘起または抑制するように個別に調製すればよく、前記ＭＥＣは各調製剤によって変化するが、生体外データで予測できる。ＭＥＣを達成するのに必要な投薬量は個々の投薬の特徴と方法によって異なり、検出分析を用いて血漿濃度を測定する。
【０１３５】
治療すべき症状の重症度および反応性に応じて、投薬の回数を、数日から数週間に至る治療経過中、あるいは、回復までまたは病状の改善が見られるまでに１回または複数回投与する。
【０１３６】
言うまでもなく、投与する調製剤量は、治療する対象者の苦痛の程度などの状態、投与方法、担当医師の判断によって変化する。
【０１３７】
本発明の調製剤は、必要に応じて、包装パックに入れたり、あるいは、有効成分を含む１以上の単位用量に分けてＦＤＡなどの認可キットなどの薬ケースに装填して供与するなどの方法をとることができる。包装パックとしては、たとえば、金属ホイルや、あるいは、ブリスター包装などのプラスチック包装などがある。包装パックまたは薬ケースには投薬指示を添付するとよい。また、包装パックまたは薬ケースには、薬剤の製造、使用、販売に係わる政府機関の規則の警告を添付するとよく、警告文にはヒトや動物に投与する薬剤成分について政府機関が認可する旨の内容を含める。前記警告には、たとえば、米国食品医薬品局の許可の基に処方例または認可製品を記入したラベルを添付するとよい。医薬として許容される担体の形態で定式化した本発明の調製薬の組成成分表示も適当な容器に付けておくとよく、上記したような治療の方法指定も付記しておくとよい。本発明による固形緩衝剤成分で固体表面または材料をコーティングする方法も本発明の範疇であることは当然である。ここでの「表面」とは、ガラス、プラスチック、金属、ポリマ等々を含む各種材料の面を意味し、被覆面を持つ１以上の材料から構成された面を含む。固形緩衝剤を、噴霧、湿潤、浸透、浸漬、塗布、超音波溶着、溶融、結合、付着などの当該技術分野で公知の方法、あるいは、他の任意の方法によって目的表面に付着させることができる。本発明の固形緩衝剤は、単層、多層のいずれにも形成できる。本発明の固形緩衝剤をコーティングできる固体表面として、体内または体外医療器具またはインプラント機器も含まれる。
【０１３８】
ここでの「インプラント」とは、生体組織でない人体に設ける目的の対象を意味する。このインプラントは一時的もしくは恒久的なものであり、生体組織が失活するよう処理された天然由来の対象も含まれる。たとえば、生体細胞が除去（無細胞化）されなららも、ホストからの骨片が成長するためのテンプレート片として働くよう形態を維持する目的で骨移植治療される場合を挙げることができる。他の例としては、自然に起こる白化現象にも適用でき、整形外科治療や歯科治療のために身体に適用するヒドロキシアパタイト製剤を作り出すことも可能である。インプラントは、人工的要素からなる加工品でもある。
【０１３９】
したがって、たとえば、本発明による固形緩衝剤で血管ステントを覆う技術も本発明の範疇に入る。本発明の固形緩衝剤の表面に接触する内皮細胞の細胞周期に影響して、固形緩衝剤が細胞中の特定タンパク質に反発もしくは吸着して、動脈再狭窄を軽減または阻止することも可能であり、また、本発明の方法で被覆した一般的なインプラントに影響してインプラントと組織の融合に顕著な効果を発揮することもある。
【０１４０】
本発明の固形緩衝剤の他の適用例としては、医療および歯科環境で見られる特定対象面へのコーティングである。医療環境における対象面としては、使い捨て形態か再使用形態かに拘わらず各種機器および装置の内面および外面がある。
【０１４１】
例として、医療用途に適用する多種多様の物品があり、メス・針・鋏を含む侵襲的外科治療・治療処置・診断処置に用いる機器、血液フィルタ、人工血管・カテーテルなどを含む埋め込み医療素子・機器、輸血機器装置、人工心臓、人工腎臓、整形外科用ピン・プレート・インプラント素子、カテーテルおよび他の医療管類（泌尿器管、胆管、気管内チューブ、周辺刺通中心静脈カテーテル、透析カテーテル、長期刺通中心静脈カテーテル、末梢静脈カテーテル、短期中心静脈カテーテル、動脈カテーテル、肺カテーテル、スワンガンツカテーテル、導尿カテーテル、腹膜カテーテルなどを含む）、泌尿器系医療機器（長期使用泌尿機器、組織結合泌尿機器、人工括約筋、泌尿器拡張器）、バイパス機器（心室シャント、動静脈シャント）、人工器官（豊胸インプラント、人工陰茎、移植血管、動脈瘤修復機器、心臓弁、人工関節、人工喉頭、耳鼻インプラント）、吻合機器、血管カテーテル部品、鉗子、塞栓治療機器、創傷排液管、脳水腫シャント、ペースメーカーおよび植え込み型除細動器等々を挙げることができる。他にも多様に適用可能であり、当業者には用意の範疇であろう。
【０１４２】
医学的環境で見られる面には、医療機器および健康医療環境における担当者が身につける医療器具等の各部の内側面および外側面を含み、医療処置の領域範囲における備品やカウンターの上面、呼吸器官治療における酸素投与および噴霧器および麻酔薬における可溶化剤供給のための管類や容器類の表面などが含まれる。更に、医療機関における感染性微生物に対する生物学的バリアである手袋、エプロン、マスク等々の表面も含まれる。生物学的バリアとして通常用いられる素材には、ラテックスと非ラテックス系がある。通常、非ラテックス製の手術用手袋の材料としてビニールが用いられる。また、特に消毒の必要のない医療用機器または歯科装置におけるハンドルやケーブル類もここでの対象面として含まれる。更には、血液または体液あるいは他の危険性のある医用生体材料に遭遇する領域に見られる管類や他の装置の非消毒外面も対象面である。
【０１４３】
他に健康に関連する表面として、浄水、水貯蔵、給水などに伴う機器および食品加工用具などの内面および外面もある。本発明では食品および飲料容器の固体表面を被覆する状況も想定し、斯かる対象の内容物を維持保管する用途もある。
【０１４４】
また、健康に関連する表面としては、栄養摂取、衛生設備、病気予防等を目的とした家庭用品の内面および外面も含まれる。一例として、家庭用食品加工機器、保育用品、タンポン、便器などの対象も含まれる。
【０１４５】
実施例１５に示すように、本発明の固形緩衝剤は、創傷包帯の抗菌性を高めるためにも利用できる。同様に、本発明の固形緩衝剤は、縫合糸、クロス、布地、傷軟膏などの抗菌作用を高めるためにも利用できる。
【０１４６】
本発明による他の実施例における固体表面として、顕微鏡スライドガラス、培養フード、シャーレ、あるいは、当該分野で公知の他の組織培養皿または培養容器なども含まれる。
【０１４７】
ここでの用語「約」とはプラスマイナス１０％範囲を意味する。本発明の他の目的、特長、新規な特徴は、当業者であれば、限定的ではないが以下の実施例の説明から明らかになるであろう。更に、上記した本発明の多様な実施例の夫々は以下の実施例で示す実験的裏付けで明らかにする。
【実施例】
【０１４８】
上記説明を踏まえて以下の実施例を非限定的に例示する。
【０１４９】
ここで用いる学術用語および本発明で用いる検査法には通常、分子技術、生化学技術、微生物学的技術、遺伝子組み換え技術が含まれ、こうした技術は、たとえば下記の文献など明確に紹介されている。
【０１５０】
「分子クローニング：実験室マニュアル」サンバロック等著（１９８９）、「分子生物学における現在の慣習」第Ｉ〜ＩＩＩ巻・Ｒ．オウスベル編（１９９４）、Ｒ．オウスベル等著「分子生物学における現在の慣習」ジョン・ウィリー・アンド・サン刊（米国メリーランド州バルチモア（１９８９））、パーベル著「分子クローニングの解説書」ジョン・ウィリー・アンド・サン刊（米国メリーランド州バルチモア（１９８８））、ワトソン等著「組み換えＤＮＡ」サイエンティフィック・アメリカ（ニューヨーク）、ビレン等編「ゲノム分析；実験室マニュアル集」第１〜４巻コールド・スプリング・ハーバー研究所刊（ニューヨーク（１９９８））、米国特許第４６６６８２８号／同第４６８３２０２号／同第４８０１５３１号／同第５１９２６５９号／同第５２７２０５７号に記載の方法論、「細胞生物学：実験室ハンドブック」第Ｉ〜ＩＩＩ巻Ｊ．Ｅ．チェリス編（１９９４）、「動物細胞の培養：基礎技術マニュアル」フレネー・ウィリーリス刊（ニューヨーク（１９９４））第三版、「免疫学の現在の慣習」第１〜３巻Ｊ．Ｅ．コリガン編（１９９４）、スティテス等編「基礎臨床免疫学」第８版アップルトン・ラング社刊（米国コネチカット州ノーウォーク（１９９４））、ミッシェルとシーギ編「細胞免疫学の選択的方法」Ｗ．Ｈ．フリーマン社刊（ニューヨーク（１９８０））、米国特許第３７９１９３２号／同第３８３９１５３号／同第３８５０７５２号／同第３８５０５７８号／同第３８５３９８７号／同第３８６７５１７号／同第３８７９２６２号／同第３９０１６５４号／同第３９３５０７４号／同第３９８４５３３号／同第３９９６３４５号／同第４０３４０７４号／同第４０９８８７６号／同第４８７９２１９号／同第５０１１７７１号／同第５２８１５２１号に記載の適用可能な免疫学技術、「オリゴヌクレオチド合成」Ｍ．Ｊ．ゲイト編（１９８４）、「核酸雑種形成」Ｂ．Ｄ．ハメスとＳ．Ｊ．ヒギンス編（１９８５）、「複製と転移」Ｂ．Ｄ．ハメスとＳ．Ｊ．ヒギンス編（１９８４）、「動物細胞培養」Ｒ．Ｌ，フレシュニー編（１９８６）、「固定化細胞と酵素」ＩＲＬプレス社刊（１９８６）、「分子クローニング解説書」Ｂ．パーバル著（１９８４）、「酵素学における手法」第１〜３１７巻アカデミック・プレス社刊、「ＰＣＲプロトコル：方法と応用ガイド」アカデミック・プレス社（米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０））、マーシャク等著「タンパク質精製と特徴付けのための方法・実習コースマニュアル」ＣＳＨＬプレス社刊（１９９６）
【０１５１】
上記の全てを参考文献としてここに採用する。他にも一般参考として採用できる文献があり、当該技術分野の技術者には公知の方法であり、ここでの技術理解の参考までに列挙した。
【０１５２】
実施例１：ｐＨ勾配におけるタンパク質分布
タンパク質が固有のｐＨ特性を有するか否かを確認するために下記の実験を実施した。
【０１５３】
実験素材と方法：ゲル製剤：長さ約７センチメートルのイモビリンゲル細条を４つ用いた。各細条を、当該技術分野では公知である４〜９％のｐＨ勾配を有する（ポリアクリルアミドを４％とビスアクリルアミド架橋剤を５％含む）アクリルアミドゲルを含むアンフォラインから切離した。
【０１５４】
タンパク溶液製剤：４種の異なったタンパク溶液を調製した。
【０１５５】
第１溶液はミオグロビン（米国シグマ社から市販／カタログ番号Ｍ−０６３０）を精製水で１．０ｍｇ／ｍＬ含む。第２溶液は、タンパク質変性に尿素８Ｍの最終濃度のミオグロビンを精製水で１．０ｍｇ／ｍＬ含む。第３溶液はフィコシアニン（米国シグマ社から市販／カタログ番号Ｐ−２１７２）を精製水で１．０ｍｇ／ｍＬ含む。第４溶液は、タンパク質変性に尿素８Ｍの最終濃度のフィコシアニンを精製水で１．０ｍｇ／ｍＬ含む。タンパク質溶液は全て、ｐＨが約７．０であった。
【０１５６】
実験方法：上記タンパク質溶液を夫々１０ｍリットル、シャーレに入れ、そこにゲル片を浸した。シャーレを蓋して、室温で３〜５日間保存した。保存期間の最後にゲル片をシャーレから取り出し、余分な水分を入念に拭き取り、エプソン製の平面走査スキャナで走査した。
【０１５７】
結果：  図１Ａ、１Ｂおよび図２Ａ、２Ｂに示したように、タンパク質は、ゲル片の異なった領域のｐＨ値によってゲル片の異なった領域に別々に吸収された。ミオグロビンはｐＩ〜６であり、フィコシアニンはｐＩ〜４．２であった。天然タンパク質と変性タンパク質の間のミオグロビン空間分布（および、ペーハー依存分布）の変位はかなり小さいが（図２Ａ、２Ｂ）、タンパク質フィコシアニンの相当広い範囲でかなり大きい変位（ゲル片にｐＨ機能としての吸収度の空間分布の差）が観察された（図１Ａ、１Ｂ）。
【０１５８】
結論：  ｐＨ勾配中のタンパク質分布は、各試料タンパク質の固有の特性であることを表しており、タンパク質のｐＨ特性として考えることができる。
【０１５９】
実施例２：ｐＨ特性によるゲル膜を通るタンパク質の再分布
実験素材と方法：  ゲル製剤：図３Ａ、３Ｂに示すように、矩形の試験容器内に、厚さ２ｍｍのポリアクリルアミドゲル板状に形成した２つのゲル膜を配置することで３つの区画を形成した。イモビリン（アマシャム社の商標）１０μリットルと、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）０．５μリットルと、ＴＥＭＥＤ（１：１０）０．２５μリットルと、ポリカリルアミド１０％と、ビスアクリルアミド５％を加えてゲルを調製した。１つのゲル膜は、ｐＨ４に調製し（酸性、イモビリンを有するポリアクリルアミド）、もう一つのゲル膜はｐＨ６に調製した（塩基性、イモビリンを有するポリアクリルアミド）。
【０１６０】
タンパク溶液製剤：ミオグロビンとフィコシアニンを、夫々が０．１グラム／リットル（ｇ／Ｌ）の濃度になるように精製水（ＤＤＷ）中に溶解して調製した。
【０１６１】
実験方法：タンパク質溶液を夫々３００μリットルずつ、試験容器内を２枚の膜で仕切って形成した中央区画に入れ、酸性側の区画室をグルタミン酸（ｐＨ＝３．８）の緩衝液１ｍＭで満たし、塩基側の区画室をＴＰＪＳ（ｐＨ＝８．３）の溶液１ｍＭで満たし、その状態で区画室を室温に保った。数日後に各区画室を目視観察し、デジタルカメラで撮影した（平面撮影）。
【０１６２】
結果：  実験の最初で、上記した複数区画室を有する試験容器内の中央区画室２の溶液は、ミオグロビンとフィコシアニンの混合吸収度によって暗色を呈していたが、酸性緩衝剤（グルタミン酸１ｍＭ、ｐＨ＝３．８）と塩基緩衝剤（ＴＲＩＳ溶液１ｍＭ、ｐＨ＝８．３）を入れた番号１、３の区画室は殆ど色を視認できなかった（図３Ａ）。
【０１６３】
図３Ｂのように、実験の最後までには、上記した複数区画室を有する試験容器内の中央区画室２は、残っていたオグロビンとフィコシアニンの相当低い濃度の混合吸収度によって、かなり淡い赤紫色になっていた。ミオグロビンの大部分が変移した酸性緩衝剤（グルタミン酸１ｍＭ、ｐＨ＝３．８）を入れた番号１の区画室は濃い赤みを帯びた色になっていた。フィコシアニンの大部分が変移した塩基緩衝剤（ＴＲＩＳ溶液１ｍＭ、ｐＨ＝８．３）を入れた番号３の区画室は濃い青みがかかった色になっていた。
【０１６４】
結論：  ２色になったタンパク質は、イモビリン（商標）膜によって分離された区画室内の異なったｐＨ値に支配されて、ほぼ完全に再分布および分離した。
【０１６５】
実施例３
生体機能細胞内の細胞質タンパク質の細胞内分布に影響する可能性を実証するために以下の実験を行った。
【０１６６】
実験素材と方法：  細胞質ゾル内のＧＦＰを表すヒーラ細胞に核酸導入した。溶解に続いて抽出タンパク質をテストし、上記実施例１で記載したＧＦＰタンパク質の最大蓄積量のｐＨ範囲を計測した。ＧＦＰタンパク質の最大蓄積量の範囲（走査ゲル片の最高蛍光発光点を見つけて判定）が約ｐＨ９であることが分かった。
【０１６７】
市販されている約５０ミクロンの平均径のポリアクリルアミドビーズ（米国バイオラッド社製バイオゲルＰ１０、カタログ番号１５０４１４０）を、ポリアクリルアミド共重合体とイモビリンよりなるｐＨ９の溶液（上記実施例２に詳細説明あり）に浸漬した。イモビリン（商標）ポリアクリルアミド溶液を化学的に重合させ、ＧＦＰを表すヒーラ細胞の細胞培地に、結果的に得られるビーズの水性懸濁液を加えた。細胞の一部がビーズに付着した。アガロース溶液（摂氏約３６度の溶融点を有する米国バイオラッド社製低溶融アガロース、カタログ番号１６２００１９）を細胞とビーズに流し込み、アガロースを摂氏約２５度に冷却することによって細胞とビーズの混合体を固相化した。ビーズに接触した細胞が蛍光顕微鏡（ドイツ国ツァイス社製Ａｘｉｏｓｃｏｐｅ２型蛍光顕微鏡）によって観察し、ＧＦＰ分布の変化を視覚的に確認し、且つ、３０分以上写真モニタした。
【０１６８】
結果：  図４Ａ〜４Ｃに示すように、細胞がビーズに付着した点の蛍光強度は、実験開始時に測定した細胞の初期発光強度に比べて初期付着から３０分後には約５０倍になっていた。この測定強度は細胞のＧＦＰのほんの一部の影響でしかない。ビーズに付着した細胞のいくつかの例において同様の現象が見られた。
【０１６９】
ｐＨ７のコーティングが施された同様のビーズ（図示せず）を用いた対照実験では、ビーズに付着した細胞のＧＦＰの分布パターンになんの変化も見られなかった。
【０１７０】
結論：  上記実験の観察によって、ｐＨ分割に基づくタンパク質（ＧＦＰ）の局所的蓄積および再分布のメカニズムが生体細胞で起こることと、表面ｐＨ値が制御されている対象または要素と接触する細胞内タンパク質の濃度勾配または局所濃度を生み出す可能性のあることを明確に実証している。
【０１７１】
実施例４：  酵母細胞の細胞毒性に関するｐＨ効果
この実験は酵母細胞のｐＨ変性面の細胞毒性をテストするために行った。
【０１７２】
実験素材と方法：  ９枚のプラスチックシャーレの底を、イモビリン（アクリルアミド緩衝剤）を含む厚さ０．５ミリのポリアクリルアミドゲルでコーティングした。ここでの各ゲルは約１ｐＨ単位ずつ異なったｐＨ値を有する。第１シャーレのコーティングはｐＨ３のアクリルアミド・イモビリン（商標）緩衝ゲルであり、第２シャーレのコーティングはｐＨ４のアクリルアミド・イモビリン（商標）緩衝ゲルであり、第３シャーレのコーティングはｐＨ５のアクリルアミド・イモビリン（商標）緩衝ゲルであり、順次第９シャーレまで増えて、最後の第９シャーレのコーティングはｐＨ１１のアクリルアミド・イモビリン（商標）緩衝ゲルである。
【０１７３】
コーティングは当該技術分野で知られている標準的な重合法によって施された。イモビリンの成分を下記の表１に列挙する。
【０１７４】
【表１】
0005492416.tif 000002
【０１７５】
表１の数字は、精製水添加によるｐＨ液１０ｍＬを作るために出発原料（１００ｍＭの濃度を有する）のμＬで示している。
【０１７６】
組織培養基（ロズウェル・パークメモリアル組織培養基ＲＰＭＩ１６４０・ダッチＭＯＤ０１−１−７−１）に懸濁した１００〜２００万の酵母細胞サッシャロミクス（市販されているパン酵母）を夫々、シャーレに入れた。細胞は、シャーレの底に沈殿してポリアクリルアミド面に接触したまま、下記の表２に示した設定時間放置した。指定の接触時間の後、細胞をトリパンブルー染色法によって着色し、各シャーレに死細胞の数を計測した。
【０１７７】
結果：  下の表２に、指定ｐＨ値で指定時間における細胞の死亡率データ（総細胞に対する割合％）を示している。
【０１７８】
【表２】
0005492416.tif 000003
【０１７９】
表２から分かるように、ｐＨ極値（ｐＨ３、ｐＨ４、ｐＨ１０、ｐＨ１１）で、ｐＨ調整物質との比較的短い接触時間のうちに細胞は死滅した。ｐＨ７およびｐＨ８では長時間後でも顕著な細胞毒性は見られなかった。ｐＨ中間値（ｐＨ５〜９）では、経時的に毒性が顕れるのが観察できた。
【０１８０】
結論：  ゲルに変化を唯一のパラメータはアクリルアミド緩衝剤の成分であった。ゲルは水性浸漬においてかなり安定しており、細胞培養への毒性物質が作り出される様子はなかった。よって、観察された細胞毒性は、実験で用いたｐＨ調整用のアクリルアミドゲルの表面に接触する細胞中のイオン（荷電タンパク質、水素イオン、カリウムイオン、他の細胞内イオンなど）の再分布による原因が濃厚である。この仮説は更に、その成分をｐＨ３、４、５、６で観察されるような毒性と比較しても、高い酸性成分は殆ど一定であるが毒性変化は著しく大きいことからも裏付けられる。同様に、殆どの主要成分はｐＨ１１、１０、９、８で僅かに変化するだけであるが毒性は著しく変化することも基本的側面として考察できる。この考察によって、毒性が、従来技術において権利主張されているような高い陰イオン種または陽イオン種の結合の結果でなく、バルクｐＨ特性の結果であることが分かる。
【０１８１】
この実験の結果によって、細胞に接触するｐＨ調整物質またはｐＨ調整基材におけるｐＨ値を選択することで細胞死亡率（毒性遅発効果）を制御できること、および、細胞に接触する面または基材のｐＨ値を適切に変更することによって斯かる効果（細胞死亡率）を微調整できることを明らかにした。
【０１８２】
実施例５：  Ｊｕｒｋａｔ細胞のｐＨ誘発細胞毒性の効果
実験素材と方法：  Ｌ−グルタミン１０ｍＭと、ＨＥＰＥＳ１０ｍＭと、ピルビン酸ナトリウム１０ｍＭと、ＰＢＳ１０％を補完したＲＰＭＩ１６４０においてＪｕｒｋａｔ細胞「クローンＥ６−１」を成長させた。上記した酵母細胞（実施例４）で適用した可変ｐＨ面に細胞を曝した。
【０１８３】
結果：  下の表３に、指定ｐＨ値で指定時間における細胞の死亡率データ（総細胞に対する割合％）を示している。
【０１８４】
【表３】
0005492416.tif 000004
【０１８５】
実施例６：  黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）の吸収特性
実験素材と方法：  黄色蛍光タンパク質（供給元：フィアラジュウムＳＰ「ＳＬ−２００３」）を示すＨ１２９９肺癌細胞１μグラムを溶解した。
【０１８６】
抽出タンパク質をテストして、ＩＰＧ片（アマシャム生命科学「イモビリン（商標）」乾燥片＝ｐＨ３〜１０）におけるＹＦＰの最大蓄積量のｐＨ範囲を計測した。ＩＰＧ片を溶液に２２時間浸漬し、その後にツァイス社製「Ａｘｉｓｃｏｐｅ２プラス紫外線顕微鏡」の紫外線スキャナを用いて走査処理した。
【０１８７】
結果：  図５に示すように、ｐＨ９．５〜１０の範囲で最も大きいＹＦＰ蓄積量が認められた。
【０１８８】
実施例７：  物理的バリアによってｐＨ誘発細胞毒性を防止する。
ｐＨ誘発細胞毒性にとって細胞がｐＨ調整物質の表面に直接接触する必要があるのか否かを確認するために以下の実験を設定した。
【０１８９】
実験素材と方法：  ｐＨ３のイモビリン・ポリアクリルアミドゲルを０．５ｍｍ厚の層状にシャーレの底に形成した。平均空孔サイズが２μｍで厚さ１０μｍのナイロンフィルタ（米国ナルジェ社から市販）をＩＰＧ層の表面に緊密に接触させて配置した。組織培養基（ロズウェル・パークメモリアル組織培養基ＲＰＭＩ１６４０・ダッチＭＯＤ０１−１−７−１）に懸濁した酵母細胞２０万個体をシャーレに入れ、６時間放置して沈殿させた。沈殿６時間経過後に、細胞をトリパンブルー染色法によって着色した。
【０１９０】
結果：  計測した脂肪細胞の数は細胞総数の約５％であった。
【０１９１】
結論：  細胞とｐＨ調整物質との間に介在するナイロンフィルタがｐＨ誘発細胞毒性を阻止した。
【０１９２】
実施例８：  特異的細胞毒性装置
ｐＨ誘発細胞毒性には細胞とｐＨ調整物質との直接接触が必要であることを更に立証するために、細菌体をｐＨ調整物質に接触させるが酵母細胞は接触させないフィルタを以下のように用いた。
【０１９３】
実験素材と方法：  ｐＨ３のイモビリン・ポリアクリルアミドゲル（ＩＰＧ）を０．５ｍｍ厚の層状にシャーレの底に形成した。実施例６で用いた平均空孔サイズが２μｍで厚さ１０μｍのナイロンフィルタをＩＰＧ層の表面に緊密に接触させて配置した。０．５ミリリットルの細胞培養液に懸濁した大腸菌（１００単位／マイクロリットル）と酵母細胞（１００万個体／ｍＬ）の混合物をナイロンフィルタのシャーレに入れ、シャーレを摂氏３７度で１２時間培養した。培養期間後に、マクコンキー寒天上の細菌集落分析のために培地をサンプリングし、死細胞を計測するために酵母細胞をトリパンブルー染色法によって着色した。
【０１９４】
結果：  細菌集落は検出されず、顕著な酵母細胞死が見られなかった。
【０１９５】
結論：  実験の結果、細胞毒性薬に接触していた細菌性細胞は殺滅したが、細胞毒性薬に非接触の酵母細胞は生存したことを実証し、更に、この実験の結果から、ｐＨ調整物質の細菌素特性が明らかになった。
【０１９６】
実施例９：  Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるｐＨ誘発細胞毒性
実験素材と方法：  約１ミクロンの平均粒径を有するポリアクリルアミドビーズの懸濁液を、ｐＨ９．０のポリアクリルアミドとイモビリン（商標）の混合液から調製した。細胞に対するビーズの比率がＪｕｒｋａｔ細胞に対してビーズ２０個になるように、１ｍＬの組織培養基に懸濁するＪｕｒｋａｔ細胞１００万個体にビーズを加えた。ビーズを細胞懸濁液に加えてから０．５時間、１時間、２時間後にアリコートを抽出し、細胞をトリパンブルー染色法によって着色して死細胞の数と総細胞数を計測した。
【０１９７】
結果：
ビーズを加えてから０．５時間経過後の死細胞割合は５％であった。
ビーズを加えてから１時間経過後の死細胞割合は１０％であった。
ビーズを加えてから２時間経過後の死細胞割合は２７％であった。
【０１９８】
実施例１０：  ナフィオンの細胞毒性効果
スルホン化テトラフルオロエチレン共重合体（ナフィオン）は酸性物質（陰イオン電荷）生物活性ポリマであり、強い緩衝性能と高い緩衝能を有する。この種のフィルムは、基材（ポリメチルアクリレート、ナイロン、ポリエステル等）と、活性層としてのスルホン化ポリマとからなる。ナフィオンの細胞毒性または殺菌性は確認されておらず、燃料電池用途におけるイオン導電性電極として一般に用いられている。ナフィオンが細胞に対して毒性を持つのか否かを確認するために下記の毒性試験を実施した。
【０１９９】
実験素材と方法：  ＰＢＳ緩衝剤中にある１００万固体のＪｕｒｋａｔ細胞を、市販のナフィオン膜（シグマ社製「ナフィオン１１７」ペルフルオロ化合物２７４６７４−ＩＥＡ）を１ｃｍ角にした膜体上に堆積させた。生細胞と死細胞とを識別するために、膜体を１μｇ／μＬのヨウ化プロピジウムを１μＬ用いた着色法か、トリパンブルー染色法で着色した。
【０２００】
結果：  図６Ａ〜６Ｂに示すように、ナフィオンに１０分間曝した後、９５％以上の細胞が死滅した。
【０２０１】
実施例１１：  ラミネート層の細菌毒性および細胞毒性
実験素材と方法：  ラミネート層サンプル：  １１０μｍ厚のポリエステル基材上に形成したフィルムよりなるラミネート層サンプルを使用
活性化担体「ＢＩＯＡＣＴ１３、１５、１６」シリーズ
「ＢＩＯＡＣＴ１６」１１０μｍ厚のポリエステルベース＋アクリル変性ポリウレタン下塗層
「ＢＩＯＡＣＴ１３」１１０μｍ厚のポリエステルベース＋アクリル変性ポリウレタン下塗層＋サブミクロン厚の「活性」陽イオンシリカを含むＰＶＯＨバインダ（Ｗ／Ｗ比＝４：１）、総コーティング重量＝０．９７ｇ／ｍ２、コーティングｐＨ＝４．０６
「ＢＩＯＡＣＴ１５」１１０μｍ厚のポリエステルベース＋アクリル変性ポリウレタン下塗層＋サブミクロン厚の「活性」陽イオンシリカを含むＰＶＯＨバインダ（Ｗ／Ｗ比＝４：１）、総コーティング重量＝０．７６ｇ／ｍ２、コーティングｐＨ＝４
コーティングしていないサンプルを比較対象として用いた。
【０２０２】
ＭＶＣ／ＨＴ／５６シリーズＡ、Ｂ、Ｃ：  このラミネート層は、コーティングの活性成分としてポリ（ジエチルアミノエチルメタクリレート）のｐ−トルエンスルホン酸塩（ｐＨ３）の混和物を基にしている。
「ＭＶＣ／ＨＴ／５６Ａ」１１０μｍ厚のポリエステルベース＋ＰＶＯＨ＋ｐ−トルエンスルホン酸塩。乾燥コーティング総重量が０．９グラム（〜０．９ミクロン）のうち、活性成分の重量は０．６グラム。
「ＭＶＣ／ＨＴ／５６Ｂ」ＭＶＣ／ＨＴ／５６Ａと同一であるが、処理が異なる。
「ＭＶＣ／ＨＴ／５６Ｃ」１１０μｍ厚のポリエステルベース＋ＰＶＯＨ＋ｐ−トルエンスルホン酸塩。乾燥コーティング総重量が０．５８グラム（〜０．５ミクロン）のうち、活性成分の重量は０．２４グラム。
「ＭＶＣ／ＨＴ／５６Ｄ」ＭＶＣ／ＨＴ／５６Ａと同一であるが、処理が異なる。
【０２０３】
生細菌および死細菌の懸濁溶液の調製：１０ｍＬの大腸菌ＤＨ５をＬＢ培地で後期対数期まで成長させた。培地１ｍＬを、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離にかけて濃縮した。沈殿物を更に、０．８５％ＮａＣｌの１００μＬ溶液中に再懸濁させ、懸濁物５０μＬを０．８５％ＮａＣｌの９５０μＬ溶液（生細菌用）と７０％の２−プロパノール（死細菌用）中に加えた。両サンプルをＲＴで１時間培養し、その上で、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離にかけてペレット状にした。こうして得られたペレットを０．８５％ＮａＣｌの５００μＬ溶液中に再懸濁させて、再度遠心分離処理した。最後に、両ペレットを０．８５％ＮａＣｌの５０μＬ溶液中に再度懸濁させた。
【０２０４】
生細菌および死細菌の着色：細菌生存キット「ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  ＢａｃＬｉｇｈｔ（商標）」（モレキュラ・プルーブ社製）を用いて着色処理した。ＳＹＴＯ９とヨウ化プロピジウム染色液の混合液によって、無傷細胞膜を含む細菌を蛍光緑色に着色し、損傷膜の細菌を蛍光赤色に着色した。基本的には、ＳＹＴＯ９染料と、１．６７ｍＭのヨウ化プロピジウムと、１．６７ｍＭの成分Ａの溶液２μＬを、１．６７ｍＭのヨウ化プロピジウムと１８．３ｍＭの成分Ｂの溶液２μＬと混合した。染料０．１５μＬを細菌懸濁液５０μＬに加え、着色細菌２．５μＬをスライドと蓋部材との間に捕捉させ、生細胞と殺滅細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
【０２０５】
フィルムの抗菌性テスト：  非活性フィルムとＩＭーＮａＣｌ溶液中で２０分間処理したフィルムを用いて２種類のテストを行った。いずれの場合も、生物活性フィルムに堆積させたサンプルを蛍光顕微鏡で観察し、着色した生細菌および死細菌の数を計測して抗菌作用を推定評価した。
【０２０６】
フィルムの細胞毒性テスト：  次の方法によって生物活性フィルムに適用した上で生Ｊｕｒｋａｔ細胞および死Ｊｕｒｋａｔ細胞を計測した。Ｊｕｒｋａｔ細胞が１００万固体入った５０μＬのＰＢＳ中に色素混合液０．１５μＬを加え、着色細胞２．５μＬを活性フイルムと蓋部材の間に捕捉させた。その状態で、生細胞と死細胞を、蛍光顕微鏡を用いて観察した。
【０２０７】
結果：  ＭＶＣ／ＨＴ／５６Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの抗菌性テスト：  上記ラミネート層を用いたＪｕｒｋａｔ細胞を３０分培養した後、生細胞（運動細胞）を対照ＭＶＣ／ＨＴ／５６／ＢフィルムとＭＶＣ／ＨＴ／５６／Ｄフィルムで観察したところ、グリーンフィルタ（５−２）の元で緑または赤みを帯びた色を呈した。対称的に、ＭＶＣ／ＨＴ／５６／ＡおよびＣのラミネートでの培養の１分後には全ての細胞が付着し、グリーンフィルタの元で赤色を呈した。
【０２０８】
ＭＶＣーＨＴ５６Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの細胞毒性テスト：  図７および表４から分かるように、Ｊｕｒｋａｔ細胞の５６／Ａおよび５６／Ｃフィルムとの相互作用は５６／Ｂおよび５６／Ｄフィルムのものとは異なる。
【０２０９】
【表４】
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【０２１０】
ＢＩＯＡＣＴ１３、１５、１６の抗菌性テスト：  ＢＩＯＡＣＴ１３で４５分培養した後、５０−７０％の大腸菌細胞が死滅した。同時に、大腸菌の２０〜４０％がＢＩＯＡＣＴ１５での培養後に死滅した。大腸菌はＢＩＯＡＣＴ１６には付着しなかった。ＢＩＯＡＣＴ１５での培養後２０〜３０分後に殆どの大腸菌が死滅した。これら細胞の付着の評価は、暗雑音が高いため困難であった。
【０２１１】
ＢＩＯＡＣＴ１３、１５、１６の細胞毒性テスト：  異なる３種の実験結果を表５に示す。同表に、緑／赤のＪｕｒｋａｔ細胞の数及び緑色全体の割合を表している。
【０２１２】
【表５】
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【０２１３】
下表６に３種類の実験結果として赤色細胞の割合をまとめている。
【０２１４】
図８Ａ〜８ＤにはＪｕｒｋａｔ細胞をＢｉｏａｃｔ１３に曝した代表的な実験を示している。
【０２１５】
【表６】
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【０２１６】
結論：  ５６／Ａおよび５６／Ｃフィルムにおける大腸菌とＪｕｒｋａｔ細胞の相互作用は５６／Ｂおよび５６／Ｄのものとは異なる。ＢＩＯＡＣＴ１３、１５、１６シリーズにおいては、ＢＩＯＡＣＴ１３が最も高い細胞毒性と抗菌性を現した。
【０２１７】
実施例１２：  ナフィオンおよびポリアクリルアミドｐＨゲル
ナフィオンと他のフィルムが細菌に対して毒性を持つのか否かを確かめるために以下の毒性試験を行った。
【０２１８】
実験素材と方法：  殺菌効果を確認するために６種類のプラスチックフィルムをテストした。
１．ナフィオン（デュポン製品）
２．ナフィオン（デュポン製品）
３．ポリエステルベースｐＨ１０に形成したイモビリンを有する５００ミクロン厚のポリアクリルアミド
４．上記３と同じでｐＨが９の素材
５．ポリウレタンフィルム（市販品）
６．ポリエステルｐＨ５に５００ミクロン厚ポリアクリルアミドを形成した対照ポリエステルフィルム
【０２１９】
黄色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌属、Ａ群β溶血性連鎖球菌、Ｇ群β溶血性連鎖球菌：  これら細菌の生存能力を、「播種」方法を用いて血液寒天培地で実験した。基本的に、微生物培養液０．０１ｍＬを特殊な細菌ループを用いて血液寒天培地に拡散した。６枚のプラスチックフィルム（１０ｍｍ×１０ｍｍ）を、活性側を下に向けて試験板上に載せた。摂氏３７度で一晩培養した後、菌集落の数を評価し、実験群と対照群を比較した。
【０２２０】
総微生物剤と真菌剤のテスト：  上記フィルムの総抗菌効果および抗真菌効果を「沈殿」法を用いてサブロー寒天培地で行った。サブロー寒天培地を入れた試験板を覆いをせずに８時間放置した後、６枚のプラスチックフィルム（１０ｍｍ×１０ｍｍ）を夫々、活性側を下に向けて試験板上に載せた。摂氏３７度で一晩培養した後、菌集落の数を評価し、実験群と対照群を比較した。
【０２２１】
結果：  本発明によるシートの黄色ブドウ球菌の成長への効果を表７にまとめている。本発明によるシートのブドウ球菌属の成長への効果を表８にまとめている。本発明によるシートのＡ群β溶血性連鎖球菌の成長への効果を表９にまとめている。本発明によるシートのＧ群β溶血性連鎖球菌の成長への効果を表１０にまとめている。本発明によるシートの総微生物剤および真菌剤への効果を表１１にまとめている。
【０２２２】
【表７】
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【０２２３】
【表８】
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【０２２４】
【表９】
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【０２２５】
【表１０】
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【０２２６】
【表１１】
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【０２２７】
結論：  ナフィオンおよびシート番号３（ポリエステルベースｐＨ１０に形成したイモビリンを有する５００ミクロン厚のポリアクリルアミド）の双方が、高い抗菌性および総抗菌活性と抗真菌活性を示した。
【０２２８】
実施例１３：  牛乳の保存期限
本発明のフィルムを牛乳の保存期間への効果についてテストした。
【０２２９】
実験素材と方法：  本発明のフィルムを用いて牛乳の安定性を検証するために殺菌均質牛乳を用いた。２つの実験で牛乳を紫外線で処理した。
【０２３０】
テスト１：  ３５ｍｍ径の７つの空のシャーレを新鮮な牛乳で満杯にした。６つのシャーレを、本発明のフィルムで覆い、牛乳が空気に触れずにフィルムの活性側が触れるようにした。７番目のシャーレは対照用である。シャーレをテーブルに置いたまま室温の状態で６日間放置した。蒸発を補うために無菌の精製水を毎日補充した。補充した精製水の総量を総牛乳量の５％以下にしたので、ｐＨ活性動態に影響を及ぼさないはずである。実験を２回繰り返した。
【０２３１】
テスト２（ナフィオンを用いた１４日間テスト）：  このテストは活性剤（層）として市販のナフィオンを用いて行った。殺菌均質牛乳（抗生物質を含まない）を用いて牛乳の安定性をテストした。３５ｍｍ径の３つの空のシャーレを新鮮な牛乳で満杯にし、２つのシャーレを、ナフィオンで覆い、牛乳が空気に触れずにナフィオンの活性側が触れるようにした。３番目のシャーレは対照用である。
【０２３２】
シャーレをテーブルに置いたまま室温の状態で１４日間放置し、毎日シャーレのｐＨを測定した。蒸発を補うために無菌の精製水を毎日補充した。補充した精製水の総量を総牛乳量の５％以下にしたので、ｐＨ活性動態に影響を及ぼさないはずである。
【０２３３】
総微生物剤および真菌剤のテスト：  このテストは「沈殿」法を用いてサブロー寒天培地に対して行った。サブロー寒天培地を入れたシャーレを蓋をせずに８時間放置した後、プラスチックフィルム（１０ｍｍ×１０ｍｍ）を、活性側を下に向けて試験板上に載せた。摂氏３７度で一晩培養した後、菌集落の数を評価し、実験群と対照群を比較した。
【０２３４】
結果：  テスト１による牛乳のｐＨ結果を下表１２に示す。
【０２３５】
【表１２】
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【０２３６】
牛乳（テスト１の繰り返し実験）のｐＨ結果を下表１３に示す。
【０２３７】
【表１３】
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【０２３８】
１４日間テスト（テスト２）のｐＨ結果を下表１４に示す。
【０２３９】
【表１４】
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【０２４０】
微生物剤および真菌剤のテスト結果を下表１５に示す。
【０２４１】
【表１５】
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【０２４２】
実施例１４：  第２ラミネート層の細胞毒性テスト
２番目の態様のポリエステルベースのラミネート層を熱可塑性層形成方法によって準備した。ラミネート層は、ＰＶＯＨマトリックス中の活性陰イオン成分からなり、いくつかのサンプルでは、活性層をＰＶＯＨ層で保護した。
【０２４３】
ラミネート層の成分および構成は下表１６に示している。
【０２４４】
【表１６】
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【０２４５】
上表１６において、「Ｔ」はグラム／平方メートルで表した合計厚み、「Ｒ」活性成分とＰＶＯＨバインダの比率、「Ｔ１」ミクロンで表した概略厚み、「Ｔ２」ミクロンで表したＰＶＯＨ保護層の厚みである。
【０２４６】
実験素材と方法：  
ｐＨの決定：  水中でフィルムを湿潤させた後、ｐＨ−Ｆｉｘ０−１４（マッハライ・ナーゲル社製）を用いてｐＨを測定した。
細胞毒性テスト：  上記実施例１２、１３で説明した細胞毒性テストを行った。
【０２４７】
結果：  ｐＨの測定結果を下表１７に示した。
【０２４８】
【表１７】
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【０２４９】
細胞毒性の結果を下表１８に示した。細胞毒性効果はＰＩ着色細胞（死細胞）の割合％として測定した。２０分後、対照サンプル（フィルムなし）では約８０％の細胞が緑色になった。
【０２５０】
【表１８】
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【０２５１】
（注：サンプル３、４、７には中性ＰＶＯＨ保護層を設けており、高い細胞毒性を残した。）
【０２５２】
実施例１５：  抗菌性繊維
本発明の材料を用いると細胞壊死を防止できるか否かを確かめるために、イオン交換樹脂ビーズを木綿繊維に組み込んで、２日間、壊死組織に接触させた。
【０２５３】
実験素材と方法：  初期材料：  バイオ・ラッド社製イオン交換樹脂ＡＧ５０１−Ｘ８（Ｄ）（カタログ番号Ｎ１４２−６４２５）
【０２５４】
木綿繊維の１平方ｃｍ当たり約１００個のビーズを含ませた。
【０２５５】
結果：  図９Ａ〜９Ｃに示すように、バイオ・ラッド・イオン交換樹脂よりなる木綿には抗壊死効果が現れた。
【０２５６】
結論：  緩衝特性を有するイオン交換樹脂よりなる材料は壊死を防止するのに有効である。本発明の様々な実施例を通して明らかにした本発明の複数の特徴を一つの形態に組み合わせて実施することも可能である。反対に、個々に概略説明した本発明の様々な特徴を別々に単独適用してもよく、また、二次的に適当に組み合わせて実施することも可能である。
【０２５７】
以上のことから明らかなように、本発明によって標的細胞を固形緩衝剤に接触させて少なくとも細胞の一部の細胞内ｐＨ値を変化させ、これによって多細胞生物における標的細胞の細胞過程の変化を生み出すことができるので、真核性細胞及び原核細胞のいずれにも殺滅効果があり、優れた抗菌性を発揮することができ、長期使用に際して細胞体に接しても抗菌剤が溶出しないで永久的に抗菌効果を保持しながらも安価、且つ、容易に適用できる固形緩衝剤を用いて滴定によって細胞を殺滅させる組成物及び方法が実現した。
【０２５８】
本発明を特定の実施例を参考に説明したが、当該技術分野の技術者であれば様々に置換、改変、変更が可能であることは自明である。よって、斯かる置換、改変、変更は本発明の権利範囲に包括されるものとし、特定の個々の公報、特許および特許出願が参照された場合に本発明の一部と見なすように当該明細書の記載に基づく全ての公報、特許および特許出願は本発明に同等に包括される。更に、当該明細書で参考までに引用した内容は本発明に先行する技術として有効な文献であると認めた訳ではない。
【図面の簡単な説明】
【０２５９】
【図１】ｐＨ勾配を有するポリアクリルアミド細条ゲルを含む天然尿素変性形態の細条タンパク質フィコシアニンの空間分布を示すグラフであり、（Ａ）のグラフは天然（非変性）フィコシアニンの走査結果を示し、（Ｂ）のグラフは８Ｍ尿素変性フィコシアニンの走査結果を示し、同図において縦軸はＯＤ単位で表した吸収度であり、横軸はｐＨ単位で表したゲル片の走査位置を示す。
【図２】ｐＨ勾配を有するポリアクリルアミドゲルを含む天然尿素変性形態の細条タンパク質ミオグロビンの空間分布を示すグラフであり、（Ａ）のグラフは天然（非変性）ミオグロビンの走査結果を示し、（Ｂ）のグラフは８Ｍ尿素変性ミオグロビンの走査結果を示し、同図において縦軸はＯＤ単位で表した吸収度であり、横軸はｐＨ単位で表したゲル片の走査位置を示す。
【図３】２つの異なったタンパク質ミオグロビン及びフィコシアニンのｐＨ依存分離と再分布を実証する２つの異なった実験結果を示す写真であり、（Ａ）はミミオグロビンとフィコシアニンの混合物を中央区画２に配置した直後の試験容器の平面であり、（Ｂ）はミオグロビンとフィコシアニンの混合物を配置した７日後に撮った同一試験容器の平面である。
【図４】ｐＨ変性ビーズに細胞を付着させた後のＧＦＰ分布の時間的変化を示しており、（Ａ）は基点時間（細胞のビーズへの付着時）におけるビーズ６に付着した細胞８を示し、（Ｂ）は左側の写真の撮影から１０分後に撮ったビーズ６に付着した細胞８を示し、（Ｃ）は左側の写真の撮影から３０分後に撮ったビーズ６に付着した細胞８を示している。白い矢印で指した蛍光点は、ビーズ６と細胞８との接点で移動蓄積するＧＦＰの蛍光発光である。
【図５】ｐＨ勾配を有するアクリルアミドゲルを含む細条イモビリン上の黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）の空間分布を示すグラフであり、図において縦軸は光学密度であり、横軸はｐＨ単位で示す帯状ＩＰＧに沿う位置を表す。
【図６】Ｊｕｒｋａｔ細胞上のナフィオンの細胞毒性効果を表す顕微鏡写真であり、（Ａ）は非ナフィオン面上のＪｕｒｋａｔ細胞を示しており、（Ｂ）はナフィオン面上のＪｕｒｋａｔ細胞を示す。
【図７】本発明による４枚のＭＶＣ／ＨＴ／５６Ａ膜、同Ｂ膜、同Ｃ膜、同Ｄ膜との接触後のＪｕｒｋａｔ死細胞（赤）の割合を示すグラフ。
【図８】「ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）ＢａｃＬｉｇｈｔ（商標）」Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｋｉｔ（米国モレキュラー・プルーブ社製）を利用して撮影したＪｕｒｋａｔ細胞上のＢＩＯＡＣＴ１３膜、同１５膜、同１６膜、同１１０膜の細胞毒性効果を表す顕微鏡写真であり、蛍光顕微鏡下で死細胞が赤色に発色し、生細胞が緑色に発色しており、（Ａ）は１分後の対照Ｊｕｒｋａｔ細胞（生体膜と非接触）を示し、（Ｂ）は１分後に加えたＢＩＯＡＣＴ１３膜を有するＪｕｒｋａｔ細胞を示し、（Ｃ）は１０分後の対照Ｊｕｒｋａｔ細胞（生体膜と非接触）を示し、（Ｄ）は１０分後に加えたＢＩＯＡＣＴ１３膜を有するＪｕｒｋａｔ細胞を示す。
【図９】イオン交換樹脂ビーズの抗壊死作用を示す写真であり、（Ａ）はイオン交換樹脂ビーズの投与前の壊死細胞の写真であり、（Ｂ）はイオン交換ビーズの投与から２日後の同細胞の写真であり、（Ｃ）はイオン交換ビーズを適用した布地の写真である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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