(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性を有するポリペプチドであって、
非天然アミノ酸であるチロシン誘導体を認識するように改変されたチロシルｔＲＮＡ合成酵素である改変ポリペプチドと、
フェニルアラニルｔＲＮＡ合成酵素に由来する校正反応活性部位を含む校正ポリペプチドと、
を含み、
上記校正ポリペプチドは、上記改変ポリペプチド中に存在するロスマンフォールドＮ領域とロスマンフォールドＣ領域の間に挿入されているもの、又は上記改変ポリペプチドのＮ末端に結合されているもの、であることを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
上記校正ポリペプチドが、上記ロスマンフォールドＮ領域とロスマンフォールドＣ領域の間にあるＣＰ１領域に挿入されているものであることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
上記校正ポリペプチドと上記改変ポリペプチドとを連結するリンカーポリペプチドがさらに挿入されていることを特徴とする請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
上記チロシルｔＲＮＡ合成酵素が、真核生物又は真正細菌に由来するものであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
上記真正細菌が大腸菌であることを特徴とする請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
上記チロシン誘導体が３−ヨードチロシンであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
上記改変ポリペプチドが、以下の（ａ）又は（ｂ）に記載のポリペプチドであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３−ヨードチロシンとｔＲＮＡとを結合させる活性を有するポリペプチド。
【請求項８】
上記フェニルアラニルｔＲＮＡ合成酵素が、真核生物又は古細菌に由来するものであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
上記古細菌がパイロコッカス属であることを特徴とする請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
上記古細菌がパイロコッカスホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ
ｉ）であることを特徴とする請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
上記校正ポリペプチドは、以下の（ｃ）又は（ｄ）に記載のポリペプチドを含むものであることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチド：
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、チロシンとｔＲＮＡとの結合を分解する活性、又はチロシルアデニル酸中間体をチロシンと無機リン酸とに分解する活性を有するポリペプチド。
【請求項１２】
以下の（ｅ）又は（ｆ）に記載のポリペプチドであることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド：
（ｅ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｆ）配列番号３に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、チロシンとｔＲＮＡとの結合を分解する活性又はチロシルアデニル酸中間体をチロシンと無機リン酸とに分解する活性、及び非天然アミノ酸とｔＲＮＡとを結合させる活性を有するポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性を有するポリペプチドの製造方法であって、
非天然アミノ酸であるチロシン誘導体を認識するように改変されたチロシルｔＲＮＡ合成酵素である改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、
フェニルアラニルｔＲＮＡ合成酵素に由来する校正反応活性部位を含む校正ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されたポリヌクレオチドを調製する調製工程と、
上記調製工程により得られたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを発現させる発現工程と、
を含み、
上記調製工程では、上記校正ポリペプチドが上記改変ポリペプチド中に存在するロスマンフォールドＮ領域とロスマンフォールドＣ領域の間に位置するように導入されたポリヌクレオチド、又は上記校正ポリペプチドが上記改変ポリペプチドのＮ末端に結合するように導入されたポリヌクレオチドを、調製することを特徴とするポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性を有するポリペプチド及びその利用に関するものである。より具体的には、非天然アミノ酸とｔＲＮＡとの対応付けの特異性が高いアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性を有するポリペプチド及びその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子工学が発展し、タンパク質の立体構造、ゲノム配列等の情報が充実したこともあって、タンパク質を人工的に改変して、新たな機能を有するタンパク質を創り出すことが可能になった。具体的には、ある活性を有するタンパク質を基にして、そのタンパク質のアミノ酸残基をいくつか改変することで、新たな活性を有するタンパク質を創り出すことが行なわれている。アミノ酸残基を他のアミノ酸残基に改変する際、その選択肢として天然のアミノ酸だけでは制限があり、目的の機能、活性を有するタンパク質を作製することが困難なことがある。
【０００３】
そこで、タンパク質の機能を拡張する方法として、非天然アミノ酸をタンパク質に導入する様々な方法が提案されている（例えば、非特許文献１等を参照）。中でも、収率が高く、生きた細胞内で使用できる方法として、近年、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（以下、「ａａＲＳ」と称する場合もある。）改変体を用いる方法が開発されている（特許文献１、非特許文献２）。
【０００４】
ａａＲＳは全ての生物に存在し，ｔＲＮＡにアミノ酸を正確に対応付けることで遺伝暗号の忠実な翻訳を担っている。ａａＲＳによる触媒反応はアミノ酸をＡＴＰで活性化する第１段階と、活性化したアミノアシルアデニル酸中間体をｔＲＮＡの３’末端に付加する第２段階とからなり、両方の反応は１つの活性部位（アミノアシル化活性部位）により行われる（非特許文献３及び４）。
【０００５】
ａａＲＳは進化的起源の異なる２つのクラスに分類され，各クラスとも１０のａａＲＳからなる（非特許文献５）。クラスＩのａａＲＳはロスマンフォールド領域と呼ばれるアミノアシル化活性部位を有している。一方、クラスＩＩのａａＲＳはロスマンフォールド領域を有しておらず、逆平行βシートに囲まれたアミノアシル化活性部位を持つ。ａａＲＳによるｔＲＮＡとアミノ酸との対応付けは正確に行われなければならない。ｔＲＮＡは分子量が２万を超える大きな分子で、その配列は多様である。一方、アミノ酸は低分子であり、共通構造としてα−アミノ基及びα−カルボキシル基を持ち、異なる点は側鎖だけである。そのため、ａａＲＳにとって、アミノ酸同士の違いを識別することは、ｔＲＮＡを識別することに比べて困難なことである。例えば、イソロイシンとバリンとはメチル基１つの違いしかなく、この差を酵素が識別するのは難しいとされている（非特許文献６）。
【０００６】
そのため、天然のａａＲＳのうち、クラスＩのａａＲＳではイソロイシルｔＲＮＡ合成酵素（以下、「ＩｌｅＲＳ」という。）、バリルｔＲＮＡ合成酵素（以下、「ＶａｌＲＳ」という。）、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素（以下、「ＬｅｕＲＳ」という。）、クラス ＩＩではアラニルｔＲＮＡ合成酵素（以下、「ＡｌａＲＳ」という。）、プロリルｔＲＮＡ合成酵素（以下、「ＰｒｏＲＳ」という。）、トレオニルｔＲＮＡ合成酵素（以下、「ＴｈｒＲＳ」という。）、フェニルアラニルｔＲＮＡ合成酵素（以下、「ＰｈｅＲＳ」という。）といった全体の３分の１にもなる７種類のａａＲＳが、活性部位であるアミノアシル化活性部位では正しい基質であるアミノ酸だけではなく、それとよく似た他のアミノ酸を誤認識してしまうことが知られている（非特許文献７〜１７）。この誤認識の結果、本来の基質とは異なったアミノ酸との間で活性化されたアミノアシルアデニル酸中間体、又は生成物であるアミノアシルｔＲＮＡが作られる。
【０００７】
しかし、これらのａａＲＳは、アミノアシル化活性部位とは別に、校正反応活性部位を持っており、誤って作られたアミノアシルアデニル酸中間体、アミノアシルｔＲＮＡをアミノ酸と無機リン酸とに、又はアミノ酸とｔＲＮＡとに分解する活性を持っている。この校正反応活性部位は、アミノアシル化活性部位を含むドメインとは別に、独立したドメインに存在する（非特許文献９、１０、１３、１８、１９）。このドメインは校正反応ドメインと呼ばれる。具体的には、２つの反応部位でアミノ酸側鎖の別々の特徴（大きさ、親水性・疎水性）を認識することで、厳密に１つのアミノ酸だけを認識している（非特許文献９）。
【０００８】
なお、上述した、校正反応活性部位を有する７種類以外のａａＲＳは、校正反応部位を有しておらず、アミノアシル化活性部位のみで１つのアミノ酸を認識する（非特許文献２０）。
【０００９】
ところで、ａａＲＳ改変体は、野生型ａａＲＳの基質認識部位のアミノ酸残基を置換することで作られる。例えば、ＴｙｒＲＳは、初めて非天然アミノ酸の導入のための改変に成功したａａＲＳである。また、チロシンという比較的大きなアミノ酸を認識するためにアミノ酸結合ポケットが大きく、現在最も多くの非天然アミノ酸に特異的な改変体が作製されている（特許文献１、非特許文献２１）。例えば、特許文献１では、チロシルｔＲＮＡ合成酵素（以下、「ＴｙｒＲＳ」という。）の改変体について報告されている。具体的には、特許文献１には、非天然アミノ酸のひとつである３−ヨードチロシンを認識する改変体としては、大腸菌由来のＴｙｒＲＳを改変したもの、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のＴｙｒＲＳを改変したもの（ＭｊＩＹＲＳ）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００３／０１４３５４号パンフレット（２００３年２月２０日公開）
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Wang, L., and Schultz, P.G., Expanding the genetic code. Angew Chem Int Ed Engl, 2005, 44, 34-66.
【非特許文献２】Lee, N., Bessho, Y., Wei, K., Szostak, J.W., and Suga, H., Ribozyme-catalyzed tRNA aminoacylation. Nat Struct Biol 2000, 7, 28-33.
【非特許文献３】Fersht, A.R., and Kaethner, M.M.,Mechanism of aminoacylation of tRNA. Proof of the aminoacyl adenylate pathway for the isoleucyl- and tyrosyl-tRNA synthetases from Escherichia coli K12. Biochemistry, 1976, 15, 818-823.
【非特許文献４】Freist, W., and Sternbach, H., Tyrosyl-tRNA synthetase from baker's yeast. Order of substrate addition, discrimination of 20 amino acids in aminoacylation of tRNATyr-C-C-A and tRNATyr-C-C-A（3'NH2）. Eur J Biochem, 1988, 177, 425-433.
【非特許文献５】Eriani, G., Delarue, M., Poch, O., Gangloff, J., and Moras, D., Partition of tRNA synthetases into two classes based on mutually exclusive sets of sequence motifs. Nature, 1990, 347, 203-206.
【非特許文献６】Pauling, L., The Probability of Errors in the Process of Synthesis of Protein Molecules., 1957.
【非特許文献７】Crepin, T., Yaremchuk, A., Tukalo, M., and Cusack, S., Structures of two bacterial prolyl-tRNA synthetases with and without a cis-editing domain. Structure, 2006, 14, 1511-1525.
【非特許文献８】Dock-Bregeon, A., Sankaranarayanan, R., Romby, P., Caillet, J., Springer, M., Rees, B., Francklyn, C.S., Ehresmann, C., and Moras, D., Transfer RNA-mediated editing in threonyl-tRNA synthetase. The class II solution to the double discrimination problem. Cell,2000, 103, 877-884.
【非特許文献９】Fukai, S., Nureki, O., Sekine, S., Shimada, A., Tao, J., Vassylyev, D.G., and Yokoyama, S., Structural basis for double-sieve discrimination of L-valine from L-isoleucine and L-threonine by the complex of tRNA（Val） and valyl-tRNA synthetase. Cell, 2000, 103, 793-803.
【非特許文献１０】Fukunaga, R., and Yokoyama, S., Aminoacylation complex structures of leucyl-tRNA synthetase and tRNALeu reveal two modes of discriminator-base recognition. Nat Struct Mol Biol, 2005, 12, 915-922.
【非特許文献１１】Lin, L., Hale, S.P., and Schimmel, P., Aminoacylation error correction. Nature, 1996, 384, 33-34.
【非特許文献１２】Nomanbhoy, T.K., Hendrickson, T.L., and Schimmel, P., Transfer RNA-dependent translocation of misactivated amino acids to prevent errors in protein synthesis. Mol Cell, 1999 4, 519-528.
【非特許文献１３】Nureki, O., Vassylyev, D.G., Tateno, M., Shimada, A., Nakama, T., Fukai, S., Konno, M., Hendrickson, T.L., Schimmel, P., and Yokoyama, S., Enzyme structure with two catalytic sites for double-sieve selection of substrate. Science, 1998, 280, 578-582.
【非特許文献１４】Roy, H., Ling, J., Irnov, M., and Ibba, M., Post-transfer editing in vitro and in vivo by the beta subunit of phenylalanyl-tRNA synthetase. EMBO J, 2004, 23, 4639-4648.
【非特許文献１５】Ruan, B., and Soll, D., The bacterial YbaK protein is a Cys-tRNAPro and Cys-tRNA Cys deacylase. J Biol Chem, 2005, 280, 25887-25891.
【非特許文献１６】Sokabe, M., Okada, A., Yao, M., Nakashima, T., and Tanaka, I., Molecular basis of alanine discrimination in editing site. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102, 11669-11674.
【非特許文献１７】Swairjo, M.A., Otero, F.J., Yang, X.L., Lovato, M.A., Skene, R.J., McRee, D.E., Ribas de Pouplana, L., and Schimmel, P., Alanyl-tRNA synthetase crystal structure and design for acceptor-stem recognition. Mol Cell, 2004, 13, 829-841.
【非特許文献１８】Kotik-Kogan, O., Moor, N., Tworowski, D., and Safro, M.,Structural basis for discrimination of L-phenylalanine from L-tyrosine by phenylalanyl-tRNA synthetase. Structure, 2005, 13, 1799-1807.
【非特許文献１９】Ribas de Pouplana, L., and Schimmel, P., Two classes of tRNA synthetases suggested by sterically compatible dockings on tRNA acceptor stem. Cell, 2001, 104, 191-193.
【非特許文献２０】Fersht, A.R., Shindler, J.S., and Tsui, W.C., Probing the limits of protein-amino acid side chain recognition with the aminoacyl-tRNA synthetases. Discrimination against phenylalanine by tyrosyl-tRNA synthetases. Biochemistry, 1980 19, 5520-5524.
【非特許文献２１】Wang, L., Xie, J., and Schultz, P.G., Expanding the genetic code. Annu Rev Biophys Biomol Struct, 2006, 35, 225-249.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述のように、これまで非天然アミノ酸を特異的に認識するａａＲＳの改変体が作製されてきたが、ａａＲＳ改変体の非天然アミノ酸に対する基質特異性は十分ではなく、新たなａａＲＳ改変体の開発が求められていた。
【００１３】
本発明の目的は、認識するアミノ酸の特異性が高い、新たなａａＲＳ及びこれを利用した技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決するために発明者らは鋭意検討した結果、クラスＩのａａＲＳであって校正反応活性部位を有さないａａＲＳを、非天然アミノ酸を認識するように改変した改変ポリペプチドにおいて、校正反応活性部位を有するａａＲＳ由来の校正ポリペプチドを、特定の領域に結合させることにより、当該改変ポリペプチドの非天然アミノ酸認識機能を損なうことなく、且つ校正反応活性を発揮させるという新規の知見を見出した。本発明は、かかる全く新たな知見に基づいたものであり、以下の発明を包含する。
【００１５】
即ち、本発明に係るポリペプチドは、上記課題を解決するために、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性を有するポリペプチドであって、アルギニルｔＲＮＡ合成酵素、システイニルｔＲＮＡ合成酵素、メチオニルｔＲＮＡ合成酵素、グルタミニルｔＲＮＡ合成酵素、グルタミルｔＲＮＡ合成酵素、リジルｔＲＮＡ合成酵素、チロシルｔＲＮＡ合成酵素又はトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素において、非天然アミノ酸を認識するように改変された改変ポリペプチドと、フェニルアラニルｔＲＮＡ合成酵素、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素、イソロイシルｔＲＮＡ合成酵素、バリルｔＲＮＡ合成酵素、アラニルｔＲＮＡ合成酵素、プロリルｔＲＮＡ合成酵素又はトレオニルｔＲＮＡ合成酵素に由来する校正反応活性部位を含む校正ポリペプチドと、を含み、上記校正ポリペプチドは、上記改変ポリペプチド中に存在するロスマンフォールドＮ領域とロスマンフォールドＣ領域の間に挿入されているもの、又は上記改変ポリペプチドのＮ末端に結合されているもの、であることを特徴としている。
【００１６】
本発明に係るポリペプチドでは、上記校正ポリペプチドが、上記改変ポリペプチドが有し、上記ロスマンフォールドＮ領域とロスマンフォールドＣ領域の間にあるＣＰ１領域に挿入されているものであることがより好ましい。
【００１７】
本発明に係るポリペプチドでは、上記校正ポリペプチドと上記改変ポリペプチドとを連結するリンカーポリペプチドがさらに挿入されていることがより好ましい。
【００１８】
本発明に係るポリペプチドでは、上記改変ポリペプチドは、非天然アミノ酸を認識するように改変されたチロシルｔＲＮＡ合成酵素であってもよい。
【００１９】
本発明に係るポリペプチドでは、上記チロシルｔＲＮＡ合成酵素が、真核生物又は真正細菌に由来するものであることがより好ましい。
【００２０】
本発明に係るポリペプチドでは、上記真正細菌が大腸菌であることがより好ましい。
【００２１】
本発明に係るポリペプチドでは、上記チロシルｔＲＮＡ合成酵素は、チロシン誘導体を認識するように改変されたポリペプチドであってもよい。
【００２２】
本発明に係るポリペプチドでは、上記チロシン誘導体が３−ヨードチロシンであってもよい。
【００２３】
本発明に係るポリペプチドでは、上記改変ポリペプチドが、以下の（ａ）又は（ｂ）に記載のポリペプチドであることがより好ましい：（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３−ヨードチロシンとｔＲＮＡとを結合させる活性を有するポリペプチド。
【００２４】
本発明に係るポリペプチドでは、上記校正ポリペプチドが、フェニルアラニルｔＲＮＡ合成酵素に由来のものであってもよい。
【００２５】
本発明に係るポリペプチドでは、上記フェニルアラニルｔＲＮＡ合成酵素が、真核生物又は古細菌に由来するものであることがより好ましい。
【００２６】
本発明に係るポリペプチドでは、上記古細菌がパイロコッカス属であることがより好ましい。
【００２７】
本発明に係るポリペプチドでは、上記古細菌がパイロコッカスホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）であることがより好ましい。
【００２８】
本発明に係るポリペプチドでは、上記校正ポリペプチドは、以下の（ｃ）又は（ｄ）に記載のポリペプチドを含むものであることがより好ましい：（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、チロシンとｔＲＮＡとの結合を分解する活性、又はチロシルアデニル酸中間体をチロシンと無機リン酸とに分解する活性を有するポリペプチド。
【００２９】
本発明に係るポリペプチドでは、以下の（ｅ）又は（ｆ）に記載のポリペプチドであることがより好ましい：（ｅ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｆ）配列番号３に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、チロシンとｔＲＮＡとの結合を分解する活性又はチロシルアデニル酸中間体をチロシンと無機リン酸とに分解する活性、及び非天然アミノ酸とｔＲＮＡとを結合させる活性を有するポリペプチド。
【００３０】
本発明に係るポリペプチドでは、上記改変ポリペプチドが非天然アミノ酸を認識するように改変されたチロシルｔＲＮＡ合成酵素であり、上記校正ポリペプチドがフェニルアラニルｔＲＮＡ合成酵素に由来する校正反応活性部位を含むものである、又は、上記改変ポリペプチドが非天然アミノ酸を認識するように改変されたメチオニルｔＲＮＡ合成酵素であり、上記校正ポリペプチドがロイシルｔＲＮＡ合成酵素に由来する校正反応活性部位を含むものであることがより好ましい。
【００３１】
また、本発明には、上記本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが包含される。
【００３２】
また、本発明に係る製造方法は、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性を有するポリペプチドの製造方法であって、アルギニルｔＲＮＡ合成酵素、システイニルｔＲＮＡ合成酵素、メチオニルｔＲＮＡ合成酵素、グルタミニルｔＲＮＡ合成酵素、グルタミルｔＲＮＡ合成酵素、リジルｔＲＮＡ合成酵素、チロシルｔＲＮＡ合成酵素又はトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素において、非天然アミノ酸を認識するように改変された改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中に、フェニルアラニルｔＲＮＡ合成酵素、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素、イソロイシルｔＲＮＡ合成酵素、バリルｔＲＮＡ合成酵素、アラニルｔＲＮＡ合成酵素、プロリルｔＲＮＡ合成酵素又はトレオニルｔＲＮＡ合成酵素に由来する校正反応活性部位を含む校正ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されたポリヌクレオチドを調製する調製工程と、上記調製工程により得られたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを発現させる発現工程と、を含み、上記調製工程では、上記校正ポリペプチドが上記改変ポリペプチドに存在するロスマンフォールドＮ領域とロスマンフォールドＣ領域の間に位置するように導入されたポリヌクレオチド、又は上記校正ポリペプチドが上記改変ポリペプチドのＮ末端に結合するように導入されたポリヌクレオチドを、調製することを特徴としている。
【発明の効果】
【００３３】
本発明に係るポリペプチドは、以上のように、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性を有するポリペプチドであって、アルギニルｔＲＮＡ合成酵素、システイニルｔＲＮＡ合成酵素、メチオニルｔＲＮＡ合成酵素、グルタミニルｔＲＮＡ合成酵素、グルタミルｔＲＮＡ合成酵素、リジルｔＲＮＡ合成酵素、チロシルｔＲＮＡ合成酵素又はトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素において、非天然アミノ酸を認識するように改変された改変ポリペプチドと、フェニルアラニルｔＲＮＡ合成酵素、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素、イソロイシルｔＲＮＡ合成酵素、バリルｔＲＮＡ合成酵素、アラニルｔＲＮＡ合成酵素、プロリルｔＲＮＡ合成酵素又はトレオニルｔＲＮＡ合成酵素に由来する校正反応活性部位を含む校正ポリペプチドと、を含み、上記校正ポリペプチドは、上記改変ポリペプチド中に存在するロスマンフォールドＮ領域とロスマンフォールドＣ領域の間に挿入されているもの、又は上記改変ポリペプチドのＮ末端に結合されているもの、であるので、認識するアミノ酸の特異性が高いという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明の実施形態を示すものであり、校正反応ペプチドの加水分解活性を示す図である。
【図２】本発明の実施形態を示すものであり、融合タンパク質の構成の概略を示す図である。
【図３】本発明の実施形態を示すものであり、融合タンパク質の加水分解の活性を示す図である。
【図４】本発明の実施形態を示すものであり、融合タンパク質の基質認識の特異性を示す図である。
【図５】本発明の実施形態を示すものであり、融合タンパク質の加水分解の活性を示す図である。
【図６】本発明の実施形態を示すものであり、融合タンパク質の基質認識の特異性を示す図である。
【図７】本発明の実施形態を示すものであり、融合タンパク質の加水分解の活性を示す図である。
【図８】本発明の実施形態を示すものであり、融合タンパク質を用いて無細胞翻訳系においてタンパク質合成を行なった結果を示すウェスタンブロッティングの図である。
【図９】本発明の実施形態を示すものであり、融合タンパク質を用いて哺乳類培養細胞においてタンパク質合成を行なった結果を示すウェスタンブロッティングの図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
＜１．本発明に係るポリペプチド＞
本発明に係るポリペプチドは、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性を有するポリペプチドであって、アルギニルｔＲＮＡ合成酵素（以下、「ＡｒｇＲＳ」という。）、システイニルｔＲＮＡ合成酵素（以下、「ＣｙｓＲＳ」という。）、メチオニルｔＲＮＡ合成酵素（以下、「ＭｅｔＲＳ」という。）、グルタミニルｔＲＮＡ合成酵素（以下、「ＧｌｎＲＳ」という。）、グルタミルｔＲＮＡ合成酵素（以下、「ＧｌｕＲＳ」という。）、リジルｔＲＮＡ合成酵素（以下、「ＬｙｓＲＳ」という。）、チロシルｔＲＮＡ合成酵素（以下、「ＴｙｒＲＳ」という。）又はトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素（以下、「ＴｒｐＲＳ」という。）において、非天然アミノ酸を認識するように改変された改変ポリペプチドと、ＰｈｅＲＳ、ＬｅｕＲＳ、ＩｌｅＲＳ、ＶａｌＲＳ、ＡｌａＲＳ、ＰｒｏＲＳ又はＴｈｒＲＳに由来する校正ポリペプチドと、を含み、上記校正ポリペプチドは、上記改変ポリペプチド中に存在するロスマンフォールドＮ領域とロスマンフォールドＣ領域の間に挿入されているもの、又は上記改変ポリペプチドのＮ末端に結合されているものであればよい。
【００３６】
これにより、基質特異性に優れたａａＲＳを得ることができる。例えば、チロシルｔＲＮＡ合成酵素の基質を、チロシン以外の非天然アミノ酸（例えば３−ヨードチロシン）とするためには、ＴｙｒＲＳのアミノ酸を認識する領域を改変する必要がある。当該領域をどのように改変するかによって、改変後に当該非天然アミノ酸以外のアミノ酸を認識する虞が生じる。しかしながら、本発明に係るポリペプチドは、上記校正ポリペプチドを有している。しかも、ロスマンフォールドＮ領域とロスマンフォールドＣ領域の間に挿入されているか、又は上記改変ポリペプチドのＮ末端に結合されているので、当該校正ポリペプチドは有効に機能する。つまり、アミノ酸を誤認識しても、校正ポリペプチドにより校正することができるので、非天然アミノ酸とｔＲＮＡとの対応付けの特異性が高いアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を得ることができる。
【００３７】
本明細書において「アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性を有するポリペプチド」とは、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素のアミノアシルｔＲＮＡ合成活性を有するポリペプチドを意味する。アミノアシルｔＲＮＡ合成活性とは、アミノ酸とｔＲＮＡとを結合してアミノアシルｔＲＮＡを合成する活性を意味する。
【００３８】
また、「非天然アミノ酸」とは、天然の生物で遺伝的にコード化されているアミノ酸以外のアミノ酸を意味する。なお、遺伝的にコード化されているアミノ酸とは、生物が普遍的に利用する２０種類の標準型アミノ酸に、セレノメチオニン、ピロリジンを加えた２２種類のアミノ酸のことである。
【００３９】
また、非天然アミノ酸としては、例えば、チロシンの３位に置換体を有する、３−ヨードチロシン等の３−ハロゲン置換チロシン、３−ヒドロキシチロシン、３−アジドチロシン、さらに、フェニルアラニンの４位に置換基を有する、パラベンゾイルフェニルアラニン、４−ヨードフェニルアラニン、４−アジドフェニルアラニン等が挙げられる。
【００４０】
〔１−１．改変ポリペプチド〕
本明細書において「改変ポリペプチド」とは、ＡｒｇＲＳ、ＣｙｓＲＳ、ＭｅｔＲＳ、ＧｌｎＲＳ、ＧｌｕＲＳ、ＬｙｓＲＳ、ＴｙｒＲＳ又はＴｒｐＲＳを、非天然アミノ酸を認識するように改変したポリペプチドであればよい。
【００４１】
ＡｒｇＲＳ、ＣｙｓＲＳ、ＭｅｔＲＳ、ＧｌｎＲＳ、ＧｌｕＲＳ、ＬｙｓＲＳ、ＴｙｒＲＳ及びＴｒｐＲＳとしては、特に限定されないが、大腸菌及び耐熱性菌などの真正細菌、古細菌、酵母、動物、植物等の真核生物由来のものが好ましく、中でも大腸菌及び古細菌由来のものが好ましい。
【００４２】
古細菌由来のａａＲＳは、真核生物の細胞内においては非天然アミノ酸を含有するタンパク質の合成に用いられないが、原核生物の細胞内において用いることができる。したがって、改変ポリペプチドに用いるａａＲＳとして古細菌由来のものを用いた場合には、原核生物の細胞内又は原核生物由来の無細胞翻訳系において利用することができる。
【００４３】
また、大腸菌由来のａａＲＳは、原核生物の細胞内において用いることができないが、真核生物の細胞（酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞）内において機能し、非天然アミノ酸を含有するタンパク質の合成に用いられる。従って、改変ポリペプチドに用いるａａＲＳとして大腸菌由来のものを用いた場合には、真核生物細胞内又は真核生物由来の無細胞翻訳系において、タンパク質の合成に利用することができる。
【００４４】
上述した生物からＡｒｇＲＳ等を得る方法としては特に限定されないが、例えば、以下に示す従来公知の塩基配列等に基づいて、ＰＣＲ等の核酸増幅反応によってＡｒｇＲＳ等をコードするポリヌクレオチドを取得して、当該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを発現させてもよい。
【００４５】
ＡｒｇＲＳのＤＮＡ配列としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＰ＿００２４９６等を参照できる。
【００４６】
ＣｙｓＲＳのＤＮＡ配列としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＰ＿００１１７３等を参照できる。
【００４７】
ＭｅｔＲＳのＤＮＡ配列としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＰ＿００２７１２等を参照できる。
【００４８】
ＧｌｎＲＳのＤＮＡ配列としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号Ｐ００９６２等を参照できる。
【００４９】
ＧｌｕＲＳのＤＮＡ配列としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＰ＿００１３１８等を参照できる。
【００５０】
ＬｙｓＲＳのＤＮＡ配列としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＰ＿００４６３１等を参照できる。
【００５１】
ＴｙｒＲＳのＤＮＡ配列としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＰ＿００２５９等を参照できる。
【００５２】
ＴｒｐＲＳのＤＮＡ配列としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＰ＿００４４０６等を参照できる。
【００５３】
ａａＲＳの基質となるアミノ酸を改変する方法としては、従来公知の方法を用いればよい。例えば、上記非特許文献２が参照できる。上記特許文献１に記載されているＰＣＲを利用した手法に従い、ａａＲＳに変異を導入することにより、ａａＲＳの基質となるアミノ酸を改変してもよい。アミノ酸認識部位を改変した後のａａＲＳ改変体をスクリーニングする方法としては、Wang, L., Brock, A., Herberich, B., and Schultz, P.G., Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science, 2001 292, 498-500.等を参考にするとよい。
【００５４】
また、改変ポリペプチドは、認識するアミノ酸が改変された従来公知のａａＲＳであってもよい。例えば、ＥｃＩＹＲＳ、ＭｊＩＹＲＳ等であってもよい。また、非特許文献２１に開示されている各ａａＲＳの改変体であってもよい。非特許文献２１には、ｐ−ベンゾイルフェニルアラニンに特異的な大腸菌由来のＴｙｒＲＳ改変体、ｐ−アジドフェニルアラニンに特異的な大腸菌由来のＴｙｒＲＳ改変体、ｐ−ヨードフェニルアラニンに特異的な大腸菌由来のＴｙｒＲＳ改変体、ｐ−アセチルフェニルアラニンに特異的な大腸菌由来のＴｙｒＲＳ改変体、ｐ−ベンゾイルフェニルアラニンに特異的なＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のＴｙｒＲＳ改変体、ｐ−アジドフェニルアラニンに特異的なＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のＴｙｒＲＳ改変体、ｐ−ヨードフェニルアラニンに特異的なＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のＴｙｒＲＳ改変体、ｐ−アセチルフェニルアラニンに特異的なＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のＴｙｒＲＳ改変体、Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−Ｏ−トレオニンに特異的なＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のＴｙｒＲＳ改変体、Ｎ−アセチルグルコサミン−Ｏ−セリンに特異的なＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のＴｙｒＲＳ改変体等が挙げられている。また、トリフルオロメチルジアジニルフェニルアラニンに特異的なＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のＴｙｒＲＳ改変体（Tippmann, E. M. et al., Chembiochem, 2007, 8, 2210-2214を参照）、ｐ−カルボキシメチルフェニルアラニンに特異的なＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のＴｙｒＲＳ改変体（Xie, J., Supekova, L., Schultz, P. G., ACS Chem Biol., 2007, 2, 474-478を参照）、Ｏ−アリルチロシンに特異的なＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のＴｙｒＲＳ改変体（Zhang, Z. et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2002, 41, 2840-2842,）、スルホチロシンに特異的なＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のＴｙｒＲＳ改変体（Liu, C. C., Schultz, P. G., Nature biotechnology, 2006, 24, 1436-1440）等を、本発明の改変ポリペプチドとして採用してもよい。ここに示した例の中でも真正細菌のａａＲＳに由来するＥｃＩＹＲＳが好ましい。
【００５５】
なお、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのＴｙｒＲＳの、７０位のヒスチジンをアラニンに、１５８位のアスパラギン酸をトレオニンに、１５９位のイソロイシンをセリンに置換することによって、ＴｙｒＲＳの基質アミノ酸がチロシンから非天然アミノ酸である３−ヨードチロシンに改変されたＭｊＩＹＲＳを作製することができる。
【００５６】
また、例えば、本発明に係るポリペプチドに用いる改変ポリペプチドとして、チロシン誘導体を認識するように改変したものを用いることができ、チロシン誘導体として３−ヨードチロシンを認識するように改変したＴｙｒＲＳの改変体を用いることができる。
【００５７】
なお、本明細書において「チロシン誘導体」とは、チロシンを構成する原子のいずれかに任意の置換基が導入されたものを意図し、置換基の導入される位置に制限はない。チロシン誘導体としては、フェノール性芳香族環の３位の炭素原子に結合した水素原子が他の原子又は原子団に置換されたものであってもよく、ハロゲン原子に置換されたものであってもよく、ヨウ素原子に置換されたもの（３−ヨードチロシン等）であってもよい。また、フェノール性芳香族環の４位が置換されたものでもよく、例えば、４位がＯ−メチル基（Ｏ−メチルチロシン）、アジド基（アジドフェニルアラニン）、ベンゾイル基（パラベンゾイルフェニルアラニン）、アセチル基（４−アセチルフェニルアラニン）、ジアジリン基（トリフルオロメチルジアジリニルフェニルアラニン）を含む原子団、又はヨウ素原子（４−ヨードフェニルアラニン）に置換されたものでもよい。なお、ヨードチロシンはタンパク質の結晶構造決定において位相決定に使用できるという点で有用である。
【００５８】
また、基質となるアミノ酸をチロシン誘導体となるように改変したＴｙｒＲＳの改変体としては、例えば、大腸菌由来のＴｙｒＲＳの、３７位のチロシンを、バリン、ロイシン、イソロイシン又はアラニンに置換し、１９５位のグルタミンを、アラニン、システイン、セリン又はアスパラギンに置換したものがある。以上の置換を導入することにより、ＴｙｒＲＳの基質アミノ酸がチロシンから非天然アミノ酸である３−ヨードチロシンに改変されたＴｙｒＲＳを作製することができる。
【００５９】
一実施形態において、改変ポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが好ましい。配列番号１に示されるアミノ酸配列は、大腸菌由来のＴｙｒＲＳを、３−ヨードチロシンを認識するように改変したポリペプチドのアミノ酸配列である。また、改変ポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３−ヨードチロシンとｔＲＮＡとを結合させる活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００６０】
〔１−２．校正ポリペプチド〕
本明細書において「校正ポリペプチド」とは、ａａＲＳが正しい基質アミノ酸とは異なるアミノ酸を誤認識することによって生成されたアミノアシルアデニル酸中間体及びアミノアシルｔＲＮＡを、それぞれ、アミノ酸と無機リン酸とに、及びアミノ酸とｔＲＮＡとに加水分解する活性（この活性を「校正反応活性」という。）を有するポリペプチドを意味する。なお、この校正ポリペプチドを含む領域（ドメイン）を校正反応ドメインと称することもある。校正ポリペプチドを有するａａＲＳは、ＩｌｅＲＳ、ＶａｌＲＳ、ＬｅｕＲＳ、ＡｌａＲＳ、ＰｒｏＲＳ、ＴｈｒＲＳ及びＰｈｅＲＳである。なお、校正ポリペプチドとしては、起源となるａａＲＳが校正の対象とするアミノアシルｔＲＮＡ及び／又はアミノアシルアデニル酸中間体以外のものに対して校正反応活性を示すように改変されたものも「ａａＲＳ由来の校正ポリペプチド」の範疇である。例えば、ＩｌｅＲＳ由来の校正ポリペプチドは、バリルｔＲＮＡを分解するが、バリン以外のアミノ酸（非天然アミノ酸等）とｔＲＮＡとの結合を加水分解するように改変されたものであってもよい。当業者であれば、校正ポリペプチドを構成するアミノ酸のいくつかを置換することで適宜校正ペプチドを改変することができる。ただし、説明の便宜のため、特に断りがなければ、明細書中の説明において「ａａＲＳ由来の校正ポリペプチド」といった場合、校正の対象とするアミノアシルｔＲＮＡ及び／又はアミノアシルアデニル酸中間体が改変されていないものを意味するものとする。
【００６１】
校正ポリペプチドを得る方法としては特に限定されるものではない。例えば、次の方法が一例として挙げられる。ＩｌｅＲＳ、ＶａｌＲＳ、ＬｅｕＲＳ、ＡｌａＲＳ、ＰｒｏＲＳ、ＴｈｒＲＳ及びＰｈｅＲＳをコードするポリヌクレオチド、又はこれらのａａＲＳを有する生物のゲノムＤＮＡ等を鋳型として、従来公知の校正ポリペプチドの塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いてＰＣＲ等の核酸増幅反応により、校正ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得る。これを無細胞タンパク質翻訳系、微生物等の従来公知の発現系を用いて、当該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを発現させればよい。なお、校正反応ドメインのうち、活性中心として知られている部位のみではなく、適宜周囲の領域も含めて発現させるとよい。例えば、後述するパイロコッカスホリコシイのＰｈｅＲＳの場合、Ｂ３／４領域を含むようにポリペプチドを発現させることで、より良好な校正反応活性を得ることができる。
【００６２】
校正ポリペプチドを取得する元となるＰｈｅＲＳ、ＩｌｅＲＳ、ＶａｌＲＳ、ＬｅｕＲＳ、ＡｌａＲＳ、ＰｒｏＲＳ及びＴｈｒＲＳについてより具体的に述べると次の通りである。
【００６３】
ＰｈｅＲＳとしては、特に限定されないが、真核生物、原核生物由来のものを用いることができるが、原核生物由来のものが好ましく、中でも古細菌由来のものがより好ましく、さらに好ましくはパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属由来のものであり、最も好ましくはパイロコッカスホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）由来のものである。例えば、パイロコッカスホリコシイのβサブユニット（ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＮＰ＿１４２６１１を参照できる）を用いることができる。なお、パイロコッカスホリコシイのＰｈｅＲＳについては、非特許文献１４、１８、Sasaki, H., et al., Structural and mutational studies of the amino acid-editing domain from archaeal/eukaryal phenylalanyl-tRNA synthetase, Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103, 14744-14749等に開示されており、Ｂ３／４ドメインが校正反応部位であることが特定されている。また、ＰｈｅＲＳが有する校正反応ドメインは、チロシルｔＲＮＡ、及びチロシルアデニル酸中間体を加水分解する活性を有する。ＰｈｅＲＳはαサブユニット及びβサブユニットの２種類が存在するが、校正反応ドメインは、このうち、βサブユニットに含まれる。
【００６４】
また、一実施形態において、上記校正ポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが好ましい。別の実施形態において、上記校正ポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ校正反応活性を有するポリペプチドが好ましい。この配列番号２はパイロコッカスホリコシイ由来のＰｈｅＲＳに由来する校正ポリペプチドのアミノ酸配列の一つであり、Ｂ３／４ドメインのアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列からなるポリペプチドには校正反応活性が損なわれない範囲で、他のポリペプチドが結合されていてもよい。例えば、Ｂ３／４ドメインのアミノ酸配列からなるポリペプチドに、後述するＢ１、Ｂ２ドメインがＮ端側に結合していてもよく、Ｂ５ドメインがＣ端側に結合していてもよい。
【００６５】
なお、ＰｈｅＲＳは、α、βのヘテロ二量体がさらに二量体を組むことにより機能する酵素である。このうち校正反応ドメインは、βサブユニットに存在する。βサブユニットは、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３／４、Ｂ５、Ｂ６／７及びＢ８ドメインからなり、Ｂ３／４ドメインが校正反応ドメインである。真核生物及び古細菌のＰｈｅＲＳにおいては、Ｂ２及びＢ８ドメインは、欠損しており存在しない。いくつかのａａＲＳでは、校正反応ドメインのみを含むポリペプチドが安定に存在し、加水分解活性を保持している。ここで本発明者らは、パイロコッカスホリコシイ由来のＰｈｅＲＳから校正ポリペプチドを得る場合、Ｂ３／４ドメインを含むポリペプチドを用いれば、極めて安定して良好な校正反応活性を発揮できることを見出した。従って、パイロコッカスホリコシイのＰｈｅＲＳ由来の校正ポリペプチドを採用するときは、Ｂ３／４ドメインを含むポリペプチドが好ましく、Ｂ３／４ドメインからなるポリペプチドを用いることがより好ましい。
【００６６】
なお、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＰｈｅＲＳ由来の校正ポリペプチドを採用するときもＢ３／４ドメインを含むポリペプチドが好ましく、Ｂ３／４ドメインからなるポリペプチドを用いることがより好ましい。
【００６７】
また、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＰｈｅＲＳ由来の校正ポリペプチドを採用するときは、Ｂ３／４ドメインのみではなく、Ｂ１、Ｂ２を付加したＢ１−Ｂ３／４ドメインのポリペプチドを用いることが、優れた安定性が得られるため好ましい。
【００６８】
ＬｅｕＲＳ、ＩｌｅＲＳ、ＶａｌＲＳ、ＡｌａＲＳ、ＰｒｏＲＳ及びＴｈｒＲＳとしては、特に限定されず、真核生物、原核生物に由来するものを適宜用いればよいが、原核生物由来のものが好ましい。具体的には次の通りである。
【００６９】
ＬｅｕＲＳとしては、例えば、Lincecum, T. L. et al., Structural and Mechanistic Basis of Pre- and Posttransfer Editing by Leucyl-tRNA Synthetase Molecular Cell, 2003, 11, 951-963を参照にできる。これには、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＬｅｕＲＳの結晶構造が開示されており、校正反応部位（Ｔｈｒ２４７〜Ｔｈｒ２５２、及びＬｅｕ３２９〜Ａｓｐ３４７を含む領域）が特定されている。また、例えば、非特許文献１０を参照にできる。これには、Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉのＬｅｕＲＳの結晶構造が開示されており、校正反応ドメイン（Ｐｒｏ２０５周辺〜Ｐｈｅ４３３周辺）が特定されている。
【００７０】
ＩｌｅＲＳとしては、例えば、非特許文献１３を参照にできる。これには、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＩｌｅＲＳの結晶構造が開示されており、校正反応部位（Ｔｒｐ２３２、Ｐｈｅ３５９、Ｈｉｓ３８４、及びＴｙｒ３８６含む領域）が特定されている。
【００７１】
ＶａｌＲＳとしては、例えば、非特許文献９を参照にできる。これには、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＶａｌＲＳの結晶構造が開示されており、校正反応部位（Ｔｈｒ２１４、Ａｒｇ２１６、Ｔｈｒ２１９、Ｌｙｓ２７０、Ｔｈｒ２７２、Ａｓｐ２７６、及びＡｓｐ２７９を含む領域）が特定されている。
【００７２】
ＡｌａＲＳとしては、例えば、Beebe, K. et al., Distinct domains of tRNA synthetase recognize the same base pair, Nature, 2008, 451, 90-93を参照にできる。これには、Ｅ．ｃｏｌｉのＡｌａＲＳのＡｓｐ５５３〜Ａｌａ７０５を含むポリペプチドに校正反応活性があることが示されている。
【００７３】
ＰｒｏＲＳとしては、例えば、Crepin, T. et al., Structures of Two Bacterial Prolyl-tRNA Synthetases with and without a cis-Editing Domain, Structure, 2006, 14, 1511-1525を参照にできる。これには、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓのＰｒｏＲＳの結晶構造が開示されており、校正反応ドメイン（Ｔｈｒ２３７〜Ｇｌｙ３９０）が特定されている。
【００７４】
ＴｈｒＲＳとしては、例えば、Dock-Bregeon, A.-C. et al., Transfer RNA-Mediated Editing in Threonyl-tRNA Synthetase: The Class II Solution to the Double Discrimination Problem, Cell, 2000, 103, 877-884を参照にできる。これには、Ｅ．ｃｏｌｉのＴｈｒＲＳの結晶構造が開示されており、校正反応部位（Ｈｉｓ７３、Ｈｉｓ７７、Ｃｙｓ１８２、及びＨｉｓ１８６を含む領域）が特定されている。また、Korencic, D. et al., A freestanding proofreading domain is required for protein synthesis quality control in Archaea, Proc Natl Acad Scie USA, 2004, 101, 10260-10265の図４には、古細菌の校正反応ドメインのアミノ酸配列アラインメントが記載されている。
【００７５】
これら校正反応部位、校正反応ドメインが特定されているａａＲＳについては、ＰＣＲ等の核酸増幅反応により、校正反応部位等を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得る。これを、従来公知の発現系を用いて、当該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを発現させる。当該ポリペプチドの校正反応活性を確認し、校正反応活性を有するポリペプチドを、校正ポリペプチドとすればよい。
【００７６】
また、校正反応部位のアミノ酸配列は、同じａａＲＳであれば生物種を超えて相同性がある。そのため、上記した生物以外のａａＲＳについても、校正反応部位が特定されているａａＲＳとアラインメントすることにより、校正反応部位を特定することができる。この校正反応部位に基づき、上記と同様の手法により、他の生物由来の校正ポリペプチドを、適宜取得することができる。
【００７７】
〔１−３．改変ポリペプチドと校正ポリペプチドとの位置関係〕
上述のように、本発明に係るポリペプチドにおいて、校正ポリペプチドは、上記改変ポリペプチド中に存在するロスマンフォールドＮ領域とロスマンフォールドＣ領域の間に挿入されているか、又は改変ポリペプチドのＮ末端に結合されていることが好ましい。
【００７８】
本明細書において「ロスマンフォールド領域」とは、クラスＩのａａＲＳタンパク質において普遍的に存在し、ロスマンフォールド構造を形成する領域を意図している。ロスマンフォールド構造とは、ペプチド鎖のβ構造及びαへリックスが連続しているβαβ構造が重複したβαβαβという構造単位のことである。ロスマンフォールド領域にはロスマンフォールド構造が２個並んでおり、Ｎ末端側のロスマンフォールド構造を「ロスマンフォールドＮ領域」、Ｃ末端側のロスマンフォールド構造を「ロスマンフォールドＣ領域」という。ロスマンフォールド領域内の合計６本のβ構造は互いに平行に並んでいる。ロスマンフォールド構造は、ヌクレオチドと結合する活性を有している。
【００７９】
一実施形態において、校正ポリペプチドは、ロスマンフォールドＮ領域とロスマンフォールドＣ領域の間にあるＣＰ１領域に挿入されているものであることが好ましい。
【００８０】
本明細書において「ＣＰ１（connective peptide１）領域」とは、クラスＩに含まれるａａＲＳにおいて、一次配列上、ロスマンフォールド領域のＮ領域とＣ領域とに挟まれるアミノ酸配列からなる領域を意図している。
【００８１】
ＣＰ１領域に校正ポリペプチドを挿入することにより、アミノ酸とｔＲＮＡとを結合させる活性を保持したまま、校正ポリペプチドを導入することができる。
【００８２】
校正ポリペプチドが、改変ポリペプチドのＮ末端に結合している場合には、校正ポリペプチドのＮ末端がメチオニンに改変されているか、又はＮ末端がメチオニンである付加ペプチドがさらに付加されていることが好ましい。
【００８３】
以上のように、校正ポリペプチドの位置が、上記ロスマンフォールドＮ領域とロスマンフォールドＣ領域の間、好ましくはＣＰ１領域の間か、又は改変ポリペプチドのＮ末端であれば、アミノアシル化活性及び校正反応活性が有効に発揮される。これらの位置に挿入された校正ポリペプチドは、それ自身の３次元構造を維持できるだけでなく、改変ポリペプチドの３次元構造を乱すことがないからである。さらに、本発明における校正ポリペプチドと改変ポリペプチドの位置関係であれば、アミノアシル化されたｔＲＮＡの３'末端が改変ポリペプチドから速やかに校正ポリペプチドに移るという観点からも適切な位置関係を形成していると考えられる。
【００８４】
また、本発明に係るポリペプチドは、校正ポリペプチドと改変ポリペプチドとを連結するポリペプチドであるリンカーポリペプチドがさらに挿入されていてもよい。リンカーポリペプチドの配列、及び長さは、限定されるものではなく、校正ポリペプチド及び改変ポリペプチドによって適宜設定することができる。例えば、セリン又はグリシンからなる２残基〜１０残基のリンカーポリペプチドを校正ポリペプチドのＮ端側とＣ端側のそれぞれに挿入することが好ましい。また、本発明に係るポリペプチドにおいて、認識するアミノ酸を非天然アミノ酸に改変したＴｙｒＲＳの改変体に、ＰｈｅＲＳ由来の校正ポリペプチドを挿入した形態である場合、配列番号５０に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを校正ポリペプチドのＮ端側に、配列番号５１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを校正ポリペプチドのＣ端側に、リンカーとしてさらに含ませるとよい。
【００８５】
〔１−４．改変ポリペプチドと校正ポリペプチドとの組み合わせ〕
改変ポリペプチドとして、ＡｒｇＲＳ、ＣｙｓＲＳ、ＭｅｔＲＳ、ＧｌｎＲＳ、ＧｌｕＲＳ、ＬｙｓＲＳ、ＴｙｒＲＳ及びＴｒｐＲＳのうちいずれのａａＲＳを選択して、校正ポリペプチドとして、ＰｈｅＲＳ、ＩｌｅＲＳ、ＶａｌＲＳ、ＬｅｕＲＳ、ＡｌａＲＳ、ＰｒｏＲＳ及びＴｈｒＲＳのいずれに由来する校正ポリペプチドを選択するかに関して、その組み合わせについては特に限定されるものではないが、好ましい組み合わせについて説明すると次の通りである。
【００８６】
ＡｒｇＲＳ、ＣｙｓＲＳ、ＭｅｔＲＳ、ＧｌｎＲＳ、ＧｌｕＲＳ、ＬｙｓＲＳ、ＴｙｒＲＳ又はＴｒｐＲＳを改変したａａＲＳを改変ポリペプチドとするとき、これらのａａＲＳが改変されなければ認識したアミノ酸を、誤認識することによって生成されたアミノアシルアデニル酸中間体及びアミノアシルｔＲＮＡを、それぞれ、アミノ酸と無機リン酸とに、及びアミノ酸とｔＲＮＡとに加水分解する活性を有する校正ポリペプチドを選択すればよい。認識するアミノ酸を改変したａａＲＳにおいて、改変する前に認識していたアミノ酸を誤認識することを抑制することができるからである。
【００８７】
実際、非天然アミノ酸を特異的に認識するａａＲＳ改変体を作製する際には、野生型ａａＲＳの本来の基質（ＴｙｒＲＳの場合にはチロシン）を認識させなくすることが最も重要かつ困難な作業となるとされている（Kiga et al., PNAS 99, 9715-9720, 2002; Summerer et al., PNAS 103, 9785-9789, 2006）。
【００８８】
例えば、改変ポリペプチドとしてＴｙｒＲＳを改変したものを用いる場合には、ＰｈｅＲＳ由来の校正ポリペプチドを用いることが好ましい。
【００８９】
ＰｈｅＲＳは、本来の基質であるフェニルアラニンとよく似たチロシンを誤認識し、チロシルｔＲＮＡＰｈｅを生成することが知られている。ＰｈｅＲＳの校正反応ドメインはこのチロシルｔＲＮＡＰｈｅにおけるチロシンとｔＲＮＡとのエステル結合を、チロシンとｔＲＮＡとに加水分解する活性を有している。一方、ＴｙｒＲＳを改変した改変ポリペプチドは、本来の基質であるチロシンを誤認識してしまう虞がある。ＴｙｒＲＳ由来の改変ポリペプチドにＰｈｅＲＳの校正反応ドメインを導入することにより、ＴｙｒＲＳ由来の改変ポリペプチドがチロシンを誤認識して生成したチロシルｔＲＮＡを、チロシンとｔＲＮＡとに分解することができる。これにより、誤認識によるチロシルｔＲＮＡの生成を防ぐことができる。
【００９０】
また、改変ポリペプチドとしてＭｅｔＲＳを改変したものを用いる場合には、ＬｅｕＲＳ由来の校正ポリペプチドを用いることが好ましい。ＭｅｔＲＳ改変体はメチオニンをご認識する虞がある。一方、ＬｅｕＲＳ由来の校正ポリペプチドは、メチオニンとｔＲＮＡとの結合を加水分解することができる。
【００９１】
即ち本発明の好ましい形態の一つは、上記改変ポリペプチドが非天然アミノ酸を認識するように改変されたチロシルｔＲＮＡ合成酵素であり、上記校正ポリペプチドがフェニルアラニルｔＲＮＡ合成酵素に由来する校正反応活性部位を含むものである。また、本発明の好ましい形態の一つは上記改変ポリペプチドが非天然アミノ酸を認識するように改変されたメチオニルｔＲＮＡ合成酵素であり、上記校正ポリペプチドがロイシルｔＲＮＡ合成酵素に由来する校正反応活性部位を含むものである。
【００９２】
〔１−５．本発明に係るポリペプチドのその他の構成〕
本発明に係るポリペプチドは、例えば、ポリペプチドの精製を容易にするペプチドであるタグ標識（タグ配列）がＮ末端又はＣ末端に付加されるものであってもよい。このような配列は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。タグ配列としては、ヒスチジンタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇ等がある。
【００９３】
一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドが好ましい。
【００９４】
これまで、本発明に係るポリペプチドの各構成について説明してきたが、本発明に係るポリペプチドの好ましい形態の一つは、配列番号３に示すアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ校正反応活性、及び非天然アミノ酸とｔＲＮＡとを結合させる活性を有するポリペプチドが好ましい。配列番号３は後の実施例で述べるＰｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳのアミノ酸配列であり、最も高い３−ヨードチロシンに対する認識特性を示したポリペプチドである。
【００９５】
なお、当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法（変異誘発法）に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマー設計して欠失変異体又は付加変異体を作製することができる。
【００９６】
一つの局面において、本発明に係るポリヌクレオチドは、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性を有する上記ポリペプチドをコードすることが好ましい。本発明に係るポリヌクレオチドは化学合成によりポリヌクレオチド全長を合成するものであってよく、又は複数のポリヌクレオチドを連結させて合成するものであってもよい。
【００９７】
〔１−６．本発明に係るポリペプチドの使用方法〕
本発明に係るポリペプチドを、非天然アミノ酸とともに、無細胞タンパク質翻訳系、真正細菌及び真核生物細胞（酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞）に導入することにより、無細胞タンパク質翻訳系、真正細菌及び真核生物細胞内において、非天然アミノ酸を含むタンパク質を合成することができる。
【００９８】
＜２．本発明に係るポリペプチドの製造方法＞
本発明に係るポリペプチドの製造方法（以下、単に「本発明に係る製造方法」という。）は、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性を有するポリペプチドの製造方法であって、ＡｒｇＲＳ、ＣｙｓＲＳ、ＭｅｔＲＳ、ＧｌｎＲＳ、ＧｌｕＲＳ、ＬｙｓＲＳ、ＴｙｒＲＳ又はＴｒｐＲＳにおいて、非天然アミノ酸を認識するように改変された改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中に、ＰｈｅＲＳ、ＬｅｕＲＳ、ＩｌｅＲＳ、ＶａｌＲＳ、ＡｌａＲＳ、ＰｒｏＲＳ又はＴｈｒＲＳに由来する校正反応活性部位を含む校正ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されたポリヌクレオチドを調製する調製工程と、上記調製工程により得られたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを発現させる発現工程と、を含み、上記調製工程では、上記校正ポリペプチドが上記改変ポリペプチドに存在するロスマンフォールドＮ領域とロスマンフォールドＣ領域の間に位置するように導入されたポリヌクレオチド、又は上記校正ポリペプチドが上記改変ポリペプチドのＮ末端に結合するように導入されたポリヌクレオチドを、調製すればよい。
【００９９】
〔２−１．調製工程〕
本発明において行われる調製工程は、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性を有するポリペプチドの製造方法であって、ＡｒｇＲＳ、ＣｙｓＲＳ、ＭｅｔＲＳ、ＧｌｎＲＳ、ＧｌｕＲＳ、ＬｙｓＲＳ、ＴｙｒＲＳ又はＴｒｐＲＳにおいて、非天然アミノ酸を認識するように改変された改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中に、ＰｈｅＲＳ、ＬｅｕＲＳ、ＩｌｅＲＳ、ＶａｌＲＳ、ＡｌａＲＳ、ＰｒｏＲＳ又はＴｈｒＲＳに由来する校正反応活性部位を含む校正ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されたポリヌクレオチドを調製する工程であって、校正ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、非天然アミノ酸を認識するように改変された上記改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中の、ロスマンフォールドＮ領域とロスマンフォールドＣ領域との間に位置するように導入されたポリヌクレオチド、又は上記校正ポリペプチドが上記改変ポリペプチドのＮ末端に結合するように導入されたポリヌクレオチドを、調製する工程であればよい。
【０１００】
当業者は、周知技術を使用して、校正ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのロスマンフォールドＮ領域とロスマンフォールドＣ領域との間に相当する位置に導入したり、改変ポリペプチドのＮ末端に相当する位置に結合したりすることができる。例えば、校正ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ＰＣＲ等の核酸増幅反応により取得した後に、リガーゼで結合させるものであることができる。
【０１０１】
核酸増幅反応に供する鋳型は特に限定されないが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、クローニングされた当該ポリヌクレオチドを含むプラスミドを用いることができる。また、当該プラスミドから制限酵素消化により切り出した断片を結合させるものであってもよい。また後述する実施例に記載のように、オーバーラップＰＣＲにより調製するものであってもよい。また、校正ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとのポリヌクレオチド全長を化学合成するものであってもよい。
【０１０２】
〔２−２．発現工程〕
調製工程により得られたポリヌクレオチドを用いて、大腸菌等の真正細菌又は真核生物細胞（酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞）の形質転換を行い、形質転換細胞内で、発現させることができる。また、従来公知のウサギ網状赤血球系、昆虫系、コムギ系の無細胞系で転写反応、タンパク質合成反応をおこなうことができる。
【０１０３】
調製工程により得られたポリヌクレオチドは、発現ベクターに組み込まれているものであることができる。ベクターの具体的な種類は特に限定されず、発現に用いる宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを発現させるために適宜プロモータ配列を選択し、これと本発明に係るポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。なお、目的タンパク質が常に合成される場合に限定されず、ＩＰＴＧを添加することにより、合成が誘導されるものであってもよい。また、ベクターには、合成されるタンパク質のＮ末端又はＣ末端にヒスチジンタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇ等のタグ配列を付加する配列を含むものであってもよい。
【０１０４】
上記発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、培養した後、培養物等から慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等）に従って、目的タンパク質を回収、精製することができる。また、合成されるタンパク質に上記タグが付加されている場合には、容易に回収することができる。
【０１０５】
発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養については、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、又はネオマイシン、ゼオシン、ジェネティシン、ブラストシジンＳ、ハイグロマイシンＢ等の薬剤耐性遺伝子、及び大腸菌及び他の細菌における培養については、カナマイシン、ゼオシン、アクチノマイシンＤ、セフォタキシム、ストレプトマイシン、カルベニシリン、ピューロマイシン、テトラサイクリン又はアンピシリン等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。
【０１０６】
上記選択マーカーを用いれば、本発明に係るポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。
【０１０７】
上記の宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。
【０１０８】
本発明に係るポリヌクレオチド又は本発明に係るポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔（エレクトロポレーション）法、リン酸カルシウム法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【０１０９】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
【実施例】
【０１１０】
〔実施例１：校正反応ペプチド発現プラスミドの構築〕
上述のように、ＰｈｅＲＳのβサブユニットは、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３／４、Ｂ５、Ｂ６／７及びＢ８ドメインからなり、Ｂ３／４ドメインが校正反応ドメインである。
【０１１１】
ＰｈｅＲＳのβサブユニットのうち、Ｂ６／７ドメイン及びＢ８ドメインは、立体構造上、Ｂ３／４ドメインと離れて存在する。また、Ｂ５ドメイン−Ｂ６／７ドメイン間においては定まった構造を形成していないとされている。
【０１１２】
そこで、本実施例では、校正ポリペプチドとして、Ｂ３／４ドメインを含むポリペプチド断片（以下、「校正反応ペプチド」という）を用いることとし、Ｂ６／７ドメイン及びＢ８ドメインを含めないこととした。
【０１１３】
Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉのゲノムＤＮＡを鋳型として、それぞれの生物におけるＰｈｅＲＳのβサブユニットの、Ｂ１ドメインからＢ５ドメインまで（Ｂ１−Ｂ５）をコードするＤＮＡ断片、Ｂ１ドメインからＢ３／４（Ｂ１−Ｂ３／４）ドメインまでをコードするＤＮＡ断片、Ｂ３／４ドメインからＢ５ドメインまで（Ｂ３／４−Ｂ５）をコードするＤＮＡ断片、及びＢ３／４ドメインのみをコードするＤＮＡ断片を、ＰＣＲにより増幅した。
【０１１４】
具体的には、配列番号５２に示すＥ．ｃｏｌｉのＰｈｅＲＳのβサブユニットのアミノ酸配列の、１番目から４７５番目までのアミノ酸残基をＢ１−Ｂ５とし、１番目から４０３番目までのアミノ酸残基をＢ１−Ｂ３／４とし、１８８番目から４７５番目までのアミノ酸残基をＢ３／４−Ｂ５とし、１８８番目から４０３番目までのアミノ酸残基をＢ３／４として用いた。
【０１１５】
Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＰｈｅＲＳについては、配列番号５３に示すＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＰｈｅＲＳのβサブユニットのアミノ酸配列の、１番目から４７３番目までのアミノ酸残基をＢ１−Ｂ５とし、１番目から４０１番目までのアミノ酸残基をＢ１−Ｂ３／４とし、１９０番目から４７３番目までのアミノ酸残基をＢ３／４−Ｂ５とし、１９０番目から４０１番目までのアミノ酸残基をＢ３／４として用いた。
【０１１６】
Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉのＰｈｅＲＳについては、配列番号５４に示すＰ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉのＰｈｅＲＳのβサブユニットのアミノ酸配列の、１番目から３５３番目までのアミノ酸残基をＢ１−Ｂ５とし、１番目から２８０番目までのアミノ酸残基をＢ１−Ｂ３／４とし、８３番目から３５３番目までのアミノ酸残基をＢ３／４−Ｂ５とし、８３番目から２８０番目までのアミノ酸残基をＢ３／４として用いた。
【０１１７】
Ｅ．ｃｏｌｉの各ドメインをコードするＤＮＡの増幅においては、Ｂ１−Ｂ５の増幅にはプライマーＥｃ−Ｂ１−Ｆ（配列番号５５）及びＥｃ−Ｂ５−Ｒ（配列番号５６）を用い、Ｂ１−Ｂ３／４の増幅にはプライマーＥｃ−Ｂ１−Ｆ及びＥｃ−Ｂ３／４−Ｒ（配列番号５７）を用い、Ｂ３／４−Ｂ５の増幅にはプライマーＥｃ−Ｂ３／４−Ｆ（配列番号５８）及びＥｃ−Ｂ５−Ｒを用い、Ｂ３／４の増幅にはプライマーＥｃ−Ｂ３／４−Ｆ及びＥｃ−Ｂ３／４−Ｒを用いて、それぞれＰＣＲを行なった。
【０１１８】
Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの各ドメインをコードするＤＮＡの増幅においては、Ｂ１−Ｂ５の増幅にはプライマーＴｔ−Ｂ１−Ｆ（配列番号５９）及びＴｔ−Ｂ５−Ｒ（配列番号６０）を用い、Ｂ１−Ｂ３／４の増幅にはプライマーＴｔ−Ｂ１−Ｆ及びＴｔ−Ｂ３／４−Ｒ（配列番号６１）を用い、Ｂ３／４−Ｂ５の増幅にはプライマーＴｔ−Ｂ３／４−Ｆ（配列番号６２）及びＴｔ−Ｂ５−Ｒを用い、Ｂ３／４の増幅にはプライマーＴｔ−Ｂ３／４−Ｆ及びＴｔ−Ｂ３／４−Ｒを用いて、それぞれＰＣＲを行なった。
【０１１９】
Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉの各ドメインをコードするＤＮＡの増幅においては、Ｂ１−Ｂ５の増幅にはプライマーＰｈ−Ｂ１−Ｆ（配列番号６３）及びＰｈ−Ｂ５−Ｒ（配列番号６４）を用い、Ｂ１−Ｂ３／４の増幅にはプライマーＰｈ−Ｂ１−Ｆ及びＰｈ−Ｂ３／４−Ｒ（配列番号６５）を用い、Ｂ３／４−Ｂ５の増幅にはプライマーＰｈ−Ｂ３／４−Ｆ（配列番号６６）及びＰｈ−Ｂ５−Ｒを用い、Ｂ３／４の増幅にはプライマーＰｈ−Ｂ３／４−Ｆ及びＰｈ−Ｂ３／４−Ｒを用いて、それぞれＰＣＲを行なった。
【０１２０】
ＰＣＲは、いずれも、９８℃で１分間の後に、９８℃で１０秒間、５４℃で３０秒間及び７２℃で１分間を２５サイクルの条件で行なった。ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ社）を使用した。
【０１２１】
増幅したそれぞれのＤＮＡ断片を、発現するポリペプチドのＣ末端にＨｉｓ−ｔａｇが付加されるように、ベクターｐＥＴ−２６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｄｅ部位とＸｈｏＩ部位との間に導入して校正反応ペプチド発現プラスミドを作製し、クローニングした。
【０１２２】
〔実施例２：校正反応ペプチドの発現及び精製〕
クローニングした各発現プラスミドのそれぞれを用いて、大腸菌ＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地において、３７℃で培養した。培養液のＯ．Ｄ．６００の値が０．４−０．６になった時点で終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加した。ＩＰＴＧ添加後、培養温度を２０℃に下げて、各校正反応ペプチドの発現を誘導した。誘導開始から２０時間後に菌体を回収した。
【０１２３】
次に、回収した菌体から各校正反応ペプチドを抽出し、精製した。２００ｍｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭ  イミダゾール、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）に対して、プロテアーゼ阻害剤であるｃＯｍｐｌｅｔｅ（Ｒｏｃｈｅ社）を一粒加えたものを、溶菌用緩衝液とした。回収した菌体をこの溶菌用緩衝液に懸濁し、超音波破壊した。遠心によって不溶性画分を沈殿させた。溶菌用緩衝液を用いて平衡化したＮｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）レジンに、上清に含まれる各校正反応ペプチドを吸着させた。溶菌用緩衝液によってレジンを洗浄した後に、緩衝液Ａのイミダゾールの濃度を５００ｍＭにした緩衝液Ｂを用いて、レジンから各校正反応ペプチドを溶出した。
【０１２４】
この溶出液中のＴｒｉｓ−Ｃｌ，ＮａＣｌ及びイミダゾールの濃度が、おおよそ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、１２５ｍＭ  イミダゾールとなるように、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）を用いて溶出液を希釈した。希釈した溶出液について、Ａｍｉｃｏｎ−Ｕｌｔｒａ４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて、容量が１００μｌ程度になるまでタンパク質を濃縮した。濃縮したタンパク質は、終濃度５０％となるようにグリセロールを加えて、よく混ぜ、−２０℃で保存した。
【０１２５】
１２種類の各校正反応ペプチドは、生物種によって、多少の発現量の違いはあるものの、おおむね可溶性画分にくるように発現した。また、濃縮の際に、凝集することはなかった。
【０１２６】
〔実施例３：校正反応ペプチドの加水分解活性〕
次に、各校正反応ペプチドの、加水分解活性を測定した。各校正反応ペプチドの加水分解の測定は、チロシルｔＲＮＡＴｙｒにおける加水分解を直接測定するのではなく、ＥｃＩＹＲＳによるｔＲＮＡＴｙｒのチロシル化を、どの程度抑制することができるかを測定した。ＥｃＩＹＲＳについては、次のようにして得た。即ち、ＥｃＩＹＲＳのＣ末端にＨｉｓ−ｔａｇが付くようにクローニングされたｐＥＴ−２６ｂ由来のプラスミド（理化学研究所  小林博士から供与された。）を用いて、大腸菌ＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を形質転換した。この後の操作は、上述の校正反応ペプチドの発現及び精製と同じ方法で行なった。
【０１２７】
なお、ＥｃＩＹＲＳの塩基配列を配列番号４に示す。なお、ＥｃＩＹＲＳのアミノ酸配列は上述した配列番号１に示す配列である。
【０１２８】
アミノアシル化緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５μＭ  ｔＲＮＡＴｙｒ、４ｍＭ  ＡＴＰ）に対して、２００μＭ  チロシン、及び１μＭ  ＥｃＩＹＲＳ、２．５μＭ  校正反応ペプチドを加えた、２０μｌの反応液を調製した。この反応液を３７℃で２５分間インキュベートした。３００ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、８Ｍ尿素、０．０５％  ブロモフェノールブルー、０．０５％キシレンシアノールを含む溶液を、反応液に等量加えて反応を終結させた。次に、この反応液を、０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）によって平衡化した８Ｍ尿素変性７％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビスアクリルアミド＝２９：１）を用いた電気泳動（尿素変性酸性ＰＡＧＥ）に供した。泳動緩衝液としては、０．１Ｍ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）を使用した。温度は４℃、電流は２４〜３０ｍＡの条件下で、１０〜１４時間泳動を行なった。泳動後のゲルをトルイジンブルーにより染色し、ｔＲＮＡを検出した。
【０１２９】
図１は、電気泳動の結果を示す図である。図１の（ａ）から（ｃ）に示すように、校正反応ペプチドを加えない条件では、ＥｃＩＹＲＳは、ｔＲＮＡＴｙｒをチロシル化し、ｔＲＮＡのバンドがほぼ完全にシフトした（レーン２）。このことから、校正反応ペプチドを加えた際のシフトしたバンドの減少は、校正反応ペプチドによる加水分解によるものと判断できる。
【０１３０】
Ｅ．ｃｏｌｉ由来の校正反応ペプチドを添加した場合には、Ｂ１−Ｂ３／４、Ｂ３／４−Ｂ５又はＢ３／４の校正反応ペプチドを添加した場合に、バンドのシフトの顕著な減少が観察された（図１（ａ）レーン４、５及び６）。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の校正反応ペプチドを添加した場合には、Ｂ１−Ｂ３／４の校正反応ペプチドを添加した場合に、バンドのシフトの減少が観察された（図１（ｂ）レーン４）。Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来の校正反応ペプチドを添加した場合には、Ｂ１−Ｂ５又はＢ３／４の校正反応ペプチドを添加した場合に、バンドのシフトの減少が観察された（図１（ｃ）レーン３及び６）。
【０１３１】
以上の結果から、Ｂ３／４ドメインを含むポリペプチド断片であれば、タンパク質全長でなくても加水分解活性を保持していることが分かる。Ｅ．ｃｏｌｉ及びＰ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来の校正反応ペプチドでは、最も短い校正反応ペプチドにおいても加水分解活性を保持している。
【０１３２】
一方、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの場合では、Ｂ３／４に比べて、Ｂ１ドメイン及びＢ２ドメインを付加したＢ１−Ｂ３／４を用いた場合に、極めて良好な加水分解活性が示された。
【０１３３】
〔実施例４：Ｎ末端融合タンパク質発現プラスミドの構築〕
校正反応ペプチドをＥｃＩＹＲＳのＮ末端に導入した融合タンパク質を発現するプラスミドの構築を行なった。
【０１３４】
Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する校正反応ペプチドのうち、最も小さい校正反応ペプチドを、ＥｃＩＹＲＳのＮ末端に融合させた。すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＰ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉの校正反応ペプチドについては、校正反応ドメインであるＢ３／４を用い、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの校正反応ペプチドについては、Ｂ１−Ｂ３／４を用いた。
【０１３５】
なお、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＢ３／４ドメインのアミノ酸配列を配列番号５に示し、塩基配列を配列番号６に示す。Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来のＢ３／４ドメインのアミノ酸配列を配列番号２に示し、塩基配列を配列番号７に示す。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＢ１−Ｂ３／４ドメインのアミノ酸配列を配列番号８に示し、塩基配列を配列番号９に示す。
【０１３６】
なお、校正反応ドメインの由来生物種及び融合場所を基に、各改変体を、「Ｅｅｄ−Ｎ−ＩＹＲＳ」（Ｅ．ｃｏｌｉ）、「Ｔｅｄ−Ｎ−ＩＹＲＳ」（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）及び「Ｐｅｄ−Ｎ−ＩＹＲＳ」（Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）という。図２は、これら融合タンパク質の構成の概略を示す図である。
【０１３７】
また、それぞれの融合タンパク質において、校正反応活性を不活性化した改変体を作製した（Ｅｅｄｍｕ−Ｎ−ＩＹＲＳ、Ｔｅｄｍｕ−Ｎ−ＩＹＲＳ、及びＰｅｄｍｕ−Ｎ−ＩＹＲＳ）。Ｅｅｄｍｕ−Ｎ−ＩＹＲＳ及びＴｅｄｍｕ−Ｎ−ＩＹＲＳにおいては、本来のＰｈｅＲＳ  βサブユニットにおけるＡｌａ３５６がＴｒｐに置換されており、Ｐｅｄｍｕ−Ｎ−ＩＹＲＳにおいては、本来のＰｈｅＲＳ  βサブユニットにおけるＡｌａ１４１がＴｒｐに置換されている。これら２種類のアミノ酸残基は、構造上はほぼ同じところに位置する。この変異によって、基質結合ポケットをＴｒｐが埋めてしまい、校正反応活性が失われる。
【０１３８】
校正反応を不活性化する変異は、プラスミド全体をＰＣＲで増幅することにより部位特異的に導入した。Ｅｅｄｍｕ−Ｎ−ＩＹＲＳ発現プラスミドの作製は、Ｅｅｄ−Ｎ−ＩＹＲＳ発現プラスミドを鋳型とし、プライマーＥｃ−Ｍｕ−Ｆ（配列番号６７）及びＥｃ−Ｍｕ−Ｒ（配列番号６８）を用いたＰＣＲを行い、プラスミド全体を増幅することにより作製した。また、Ｔｅｄｍｕ−Ｎ−ＩＹＲＳ発現プラスミドの作製は、Ｔｅｄ−Ｎ−ＩＹＲＳ発現プラスミドを鋳型とし、プライマーＴｔ−Ｍｕ−Ｆ（配列番号６９）及びＴｔ−Ｍｕ−Ｒ（配列番号７０）を用いたＰＣＲを行い、プラスミド全体を増幅することにより作製した。Ｐｅｄｍｕ−Ｎ−ＩＹＲＳ発現プラスミドの作製は、Ｐｅｄ−Ｎ−ＩＹＲＳ発現プラスミドを鋳型とし、プライマーＰｈ−Ｍｕ−Ｆ（配列番号７１）及びＰｈ−Ｍｕ−Ｒ（配列番号７２）を用いたＰＣＲを行い、プラスミド全体を増幅することにより作製した。ＰＣＲは、いずれも、９８℃で１分間の後に、９８℃で１０秒間、５４℃で３０秒間及び７２℃で２分３０秒間を１６サイクルの条件で行なった。ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ使用した。
【０１３９】
Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムＤＮＡを鋳型として、を鋳型として、プライマーＥｃＮ１（配列番号１５）及びプライマーＥｃＮ２（配列番号１６）を用いたＰＣＲを行い、Ｅ．ｃｏｌｉのＢ３／４ドメインをコードするＤＮＡを増幅した。ＰＣＲは、９８℃で１分間の後に、９８℃で１０秒間、５４℃で３０秒間及び７２℃で１分間を２５サイクルの条件で行なった。最後のサイクルの後に７２℃で５分間保持した。
【０１４０】
ＥｃＩＹＲＳをコードするＤＮＡを含むプラスミドＡ（理化学研究所  小林博士から供与された。）を鋳型として、プライマーＥｃＮ３（配列番号１７）及びプライマーＥｃＮ４（配列番号１８）を用いたＰＣＲを行い、ＥｃＩＹＲＳをコードするＤＮＡを増幅した。ＰＣＲの条件は、Ｅ．ｃｏｌｉのＢ３／４ドメインをコードするＤＮＡを増幅した際と同一である。
【０１４１】
次いで、Ｅ．ｃｏｌｉのＢ３／４ドメインをコードするＰＣＲ増幅ＤＮＡ及びＥｃＩＹＲＳをコードするＰＣＲ増幅ＤＮＡ、ならびにプライマーＥｃＮ５（配列番号１９）及びプライマーＥｃＮ６（配列番号２０）を用いたオーバーラップＰＣＲを行い、ＥｃＩＹＲＳタンパク質のＮ末端に、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰｈｅＲＳ  βサブユニットのＢ３／４ドメインが付加されている融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片を増幅した。まず、プライマーＥｃＮ５及びＥｃＮ６を含まない反応液を調製した。この反応液を用いて、９８℃で１分間の後に、９８℃で１０秒間、５７℃で３０秒間及び７２℃で１分間を８サイクルの条件で行なった。８サイクル終了した後に、この反応液に、プライマーＥｃＮ５及びＥｃＮ６を添加した。プライマーを添加した反応液を用いて、９８℃で１分間の後に、９８℃で１０秒間、５７℃で３０秒間及び７２℃で１分４５秒を２６サイクルの条件でＰＣＲを行なった。最後のサイクルの後に７２℃で５分間保持した。この増幅ＤＮＡを、Ｈｉｓ  ｔａｇが付加されるように発現用ベクターｐＥＴ−２６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｄｅ部位とＸｈｏＩ部位との間に挿入して、Ｅｅｄ−Ｎ−ＩＹＲＳ発現プラスミドを作製した。Ｅｅｄ−Ｎ−ＩＹＲＳの塩基配列を配列番号１０に示す。
【０１４２】
Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーＴｔＮ１（配列番号２１）及びプライマーＴｔＮ２（配列番号２２）を用いたＰＣＲを行い、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＢ１−Ｂ３／４ドメインをコードするＤＮＡを増幅した。ＰＣＲは、９８℃で１分間の後に、９８℃で１０秒間、７２．２℃で３０秒間及び７２℃で１分間を２５サイクルの条件で行なった。最後のサイクルの後に７２℃で５分間保持した。
【０１４３】
上記プラスミドＡを鋳型として、プライマーＴｔＮ３（配列番号２３）及びプライマーＴｔＮ４（配列番号２４）を用いたＰＣＲを行い、ＥｃＩＹＲＳをコードするＤＮＡを増幅した。
【０１４４】
次いで、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＢ１−Ｂ３／４ドメインをコードするＰＣＲ増幅ＤＮＡ及びＥｃＩＹＲＳをコードするＰＣＲ増幅ＤＮＡ、ならびにプライマーＴｔＮ５（配列番号２５）及びプライマーＴｔＮ６（配列番号２６）を用いたオーバーラップＰＣＲを行い、ＥｃＩＹＲＳタンパク質のＮ末端に、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＢ１−Ｂ３／４ドメインが付加されている融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片を増幅した。まず、プライマーＴｔＮ５及びＴｔＮ６を含まない反応液を調製してＰＣＲを行い、途中でプライマーＴｔＮ５及びＴｔＮ６を添加して再度ＰＣＲを行なった。オーバーラップＰＣＲの具体的な条件は、Ｅｅｄ−Ｎ−ＩＹＲＳをコードするＤＮＡを調製した条件と同一である。この増幅ＤＮＡを、Ｈｉｓ  ｔａｇが付加されるように発現用ベクターｐＥＴ−２６ｂのＮｄｅＩ部位とＸｈｏＩ部位との間に挿入して、Ｔｅｄ−Ｎ−ＩＹＲＳ発現プラスミドを作製した。Ｔｅｄ−Ｎ−ＩＹＲＳの塩基配列を配列番号１１に示す。
【０１４５】
Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉのゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーＰｈＮ１（配列番号２７）及びプライマーＰｈＮ２（配列番号２８）を用いたＰＣＲを行い、Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉの及びＢ３／４ドメインをコードするＤＮＡを増幅した。ＰＣＲは、９８℃で１分間の後に、９８℃で１０秒間、５７℃で３０秒間及び７２℃で１分間を２５サイクルの条件で行なった。最後のサイクルの後に７２℃で５分間保持した。
【０１４６】
上記プラスミドＡを鋳型として、プライマーＰｈＮ３（配列番号２９）及びプライマーＰｈＮ４（配列番号３０）を用いたＰＣＲを行い、ＥｃＩＹＲＳをコードするＤＮＡを増幅した。
【０１４７】
次いで、Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉのＢ３／４ドメインをコードするＰＣＲ増幅ＤＮＡ及びＥｃＩＹＲＳをコードするＰＣＲ増幅ＤＮＡ、ならびにプライマーＰｈＮ５（配列番号３１）及びプライマーＰｈＮ６（配列番号３２）を用いたオーバーラップＰＣＲを行い、ＥｃＩＹＲＳタンパク質のＮ末端に、Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉのＢ３／４ドメインが付加されている融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片を増幅した。まず、プライマーＰｈＮ５及びＰｈＮ６を含まない反応液を調製した。この反応液を用いて、９８℃で１分間の後に、９８℃で１０秒間、５７℃で３０秒間及び７２℃で１分間を８サイクルの条件で行なった。８サイクル終了した後に、この反応液に、プライマーＰｈＮ５及びＰｈＮ６を添加した。プライマーを添加した反応液を用いて、９８℃で１分間の後に、９８℃で１０秒間、５７℃で３０秒間及び７２℃で１分間を２５サイクルの条件でＰＣＲを行なった。最後のサイクルの後に７２℃で５分間保持した。この増幅ＤＮＡを、Ｈｉｓ  ｔａｇが付加されるように発現用ベクターｐＥＴ−２６ｂのＮｄｅＩ部位とＸｈｏＩ部位との間に挿入して、Ｐｅｄ−Ｎ−ＩＹＲＳ発現プラスミドを作製した。Ｐｅｄ−Ｎ−ＩＹＲＳの塩基配列を配列番号１２に示す。
【０１４８】
後述するＰＣＲも含め、本実施例のＰＣＲにおいては、ポリメラーゼとして、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ社）を使用した。
【０１４９】
各融合タンパク質の発現及び精製は、発現誘導後の培養温度条件を２４℃に変更した以外は、実施例２に記載の方法と同じ手法により行なった。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより発現を確認した（図示せず）。
【０１５０】
〔実施例５：Ｎ末端融合タンパク質のアミノアシル化活性の測定〕
次に、各融合タンパク質のアミノアシル化活性（チロシル化活性）を測定した。アミノアシル化緩衝液に対して、３０μＭ  [１４Ｃ]−Ｌ−チロシン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）、及び１μＭ  ａａＲＳを加え、アミノアシル化反応液を調製した。この反応液を３７℃でインキュベートし、アミノアシル化反応を行なった。アミノアシル化反応によって生成された[１４Ｃ]−チロシルｔＲＮＡＴｙｒを、１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）によって濾紙に沈殿させた。５％ＴＣＡ及び１００％エタノールによって濾紙を洗浄した後、濾紙の放射活性を液体シンチレーションカウンターによって測定した。濾紙には高分子の物質しか吸着しないため、未反応の[１４Ｃ]−チロシンは洗い流され、チロシル化されたｔＲＮＡである[１４Ｃ]−チロシルｔＲＮＡＴｙｒのみを測定できる。この放射活性を以って各融合タンパク質がどの程度チロシンを認識するか測定した。
【０１５１】
図３は、チロシンの認識を測定した結果を示す図である。図３に示すように、校正反応ドメインの校正反応活性を不活性にした改変校正反応ドメインをＮ末端に付加した改変体は、どの生物種の校正反応ドメインを融合した改変体も、ＥｃＩＹＲＳと同程度のチロシル化活性を維持していた。このことから、Ｎ末端に外来性の配列を融合したことによるＥｃＩＹＲＳのチロシル化活性の低下はほとんどないということが分かる。したがって、野生型の校正反応ドメインを融合した際のチロシル化活性の低下は、全て校正反応による加水分解によって引き起こされたものであるといえる。
【０１５２】
どの生物種由来の校正反応ドメインを融合した場合にもある程度のチロシル化の低下が見られた。細菌であるＥ．ｃｏｌｉ、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの校正反応ドメインを付加した場合には、検出された[１４Ｃ]−チロシルｔＲＮＡＴｙｒの量は、ＥｃＩＹＲＳを用いた場合と比較し半分程度であることが確認された。すなわち活性がＥｃＩＹＲＳの半分程度に抑えられた。また、古細菌であるＰ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉの校正反応ドメインを付加した場合には、[１４Ｃ]−チロシルｔＲＮＡＴｙｒがほとんど検出されず、ｔＲＮＡＴｙｒのチロシル化が抑えられていることが確認された。
【０１５３】
次に、各融合タンパク質の基質特異性を調べるアッセイを行なった。アミノアシル化緩衝液に、２００μＭ  チロシン又は３−ヨードチロシン、及び１μＭ  融合タンパク質を加えた反応液を調製した。この反応液を２４℃で３０分間インキュベートした。３００ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、８Ｍ尿素、０．０５％  ブロモフェノールブルー、０．０５％キシレンシアノールを含む溶液を、反応液に等量加えて反応を終結させた。反応液は、上述した校正反応ペプチドにおける加水分解活性の測定と同じ手法により尿素変性酸性ＰＡＧＥを行い、ｔＲＮＡのバンドのシフトを観察した。このアッセイにより、３−ヨードチロシンを認識するかどうかを確認することができる。
【０１５４】
図４は、基質特異性を調べるアッセイの結果を示す図である。図４に示すように、Ｅｅｄ−Ｎ−ＩＹＲＳ、Ｔｅｄ−Ｎ−ＩＹＲＳ、Ｐｅｄ−Ｎ−ＩＹＲＳにおいては、チロシンを用いた場合にはバンドシフトをおこさないが（レーン４、６及び８）、ヨードチロシンを用いた場合には、バンドシフトをおこしている（レーン５、７及び９）ことが確認された。これに対して、校正反応ドメインを含まないＥｃＩＹＲＳについては、チロシンを用いた場合にもバンドシフトをおこしていた（レーン２）。このことから、校正反応ドメインは、３−ヨードチロシルｔＲＮＡＴｙｒを分解せずに、校正反応ドメインを用いることによりチロシルｔＲＮＡのみを認識し分解することが分かった。
【０１５５】
〔実施例６：校正反応ドメインの挿入場所の探索〕
クラスＩに分類されるａａＲＳは共通の基本構造であるロスマンフォールドドメインを含み、さらに各ａａＲＳは、付加的なドメインを、ロスマンフォールドドメインのＮ末端側もしくはＣ末端側、又は内部に挿入するような形で有している。それらの挿入配列が存在する位置というのは、ロスマンフォールド構造を乱さずに、他の配列を挿入することが可能な場所であると考えられる。
【０１５６】
Ｓｗｉｓｓ−ｐｒｏｔに登録されている２４６７種のクラスＩａａＲＳのアミノ酸配列をアラインメントした。アラインメントのためのソフトウェアとしては、ＭＡＦＦＴ（Katoh, K., Misawa, K., Kuma, K., and Miyata T., MAFFT: a novel method for rapid multiple sequence alignment based on fast Fourier transform. Nucleic Acids Res, 2002, 30, 3059-3066, Katoh, K., Kuma, K., Toh, H., and Miyata, T., MAFFT version 5: improvement in accuracy of multiple sequence alignment. Nucleic Acids Res, 2005, 33, 511-518)を用いた。
【０１５７】
クラスＩａａＲＳの一次配列をアラインメントした結果、全てのクラスａａＲＳについて、いくつかの特徴的な挿入配列が見られた。それらの挿入配列の中で、最も顕著な挿入配列はＶａｌＲＳ、ＩｌｅＲＳ及びＬｅｕＲＳにおけるＣＰ１領域である。ＶａｌＲＳ、ＩｌｅＲＳ及びＬｅｕＲＳにおいてはＣＰ１領域が校正反応ドメインであった。
【０１５８】
ＣＰ１は全てのクラスＩａａＲＳに見られるロスマンフォールド内部への挿入配列である。いずれのクラスＩａａＲＳにおいてもロスマンフォールドの同じ部位にＣＰ１が挿入されている。その長さと機能は各ａａＲＳによって様々である。ＶａｌＲＳ、ＩｌｅＲＳ及びＬｅｕＲＳの３つのＣＰ１が最も長く、約２００アミノ酸残基であり、校正反応ドメインとなっている。一方ＴｙｒＲＳのＣＰ１は短く、約７０アミノ酸残基である。ＴｙｒＲＳのＣＰ１は、ｔＲＮＡ認識、二量体化、及び基質認識に関わっている。このアラインメントではＶａｌＲＳ、ＩｌｅＲＳ及びＬｅｕＲＳの校正反応ドメインが、ＴｙｒＲＳのＣＰ１ドメインの中に存在するループ領域（１６３−１６９番目のアミノ酸残基）の１６６番目と１６７番目の残基の間に挿入される形となっていた。このループは、ＣＰ１領域の中において、他のどの領域にも接していない。そのため、特に機能を有しておらず、校正反応ドメインを挿入しても、ＥｃＩＹＲＳの構造は乱れないであろうと考えた。そこで、このループ領域にＰｈｅＲＳの校正反応ドメインを挿入することにした。
【０１５９】
校正反応ドメインにはＰ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来の校正反応ドメインを用いた。得られたＥｃＩＹＲＳの改変体を、校正反応ドメインの挿入場所に基づいて、「Ｐｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳ」という。つまり、校正反応ドメインは、Ｐｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳではＣＰ１領域内に挿入されている。
【０１６０】
なお、以下、比較のため、ＡＣｂｉｎｄｉｎｇ領域内に校正反応ドメインを挿入したものについても検討する。これを、以下、「Ｐｅｄ−ＡＣ−ＩＹＲＳ」という。
【０１６１】
図２は、これら融合タンパク質の構成の概略を示す図である。なお、図２には、比較の容易のためＥｃＩＹＲＳ、及び実施例４で作製した融合タンパク質をも示す。
【０１６２】
〔実施例７：Ｐｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳ発現プラスミドの構築〕
Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉのゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーＰｈＣ１（配列番号３３）及びプライマーＰｈＣ２（配列番号３４）を用いたＰＣＲを行い、Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉのＢ３／４ドメインをコードするＤＮＡを増幅した。ＰＣＲは、９８℃で１分間の後に、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で１分間を２５サイクルの条件で行なった。最後のサイクルの後に７２℃で２分間保持した。
【０１６３】
プラスミドＡを鋳型として、プライマーＰｈＣ３（配列番号３５）及びプライマーＰｈＣ４（配列番号３６）を用いたＰＣＲ、ならびにプライマーＰｈＣ５（配列番号３７）及びプライマーＰｈＣ６（配列番号３８）を用いたＰＣＲを行い、ＥｃＩＹＲＳの１番目から１６６番目までのアミノ酸残基をコードするＤＮＡ、及びＥｃＩＹＲＳの１６７番目から４２４番目までのアミノ酸残基をコードするＤＮＡを増幅した。
【０１６４】
次いで、Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉの及びＢ３／４ドメインをコードするＰＣＲ増幅ＤＮＡならびにＥｃＩＹＲＳのＮ末端側（１−１６６）及びＣ末端側（１６７−４２４）をコードするＰＣＲ増幅ＤＮＡ、ならびにプライマーＰｈＣ７（配列番号３９）及びプライマーＰｈＣ８（配列番号４０）を用いたオーバーラップＰＣＲを行い、ＥｃＩＹＲＳのＣＰ１内に、Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉの及びＢ３／４ドメインが挿入されている融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片を増幅した。上記Ｎ末端側ＤＮＡ及び上記Ｃ末端側ＤＮＡ、プライマーＰｈＣ７及びＰｈＣ８を含む反応液を調製した。この反応液について、９８℃で１分間の後に、９８℃で１０秒間、５２℃で３０秒間及び７２℃で１分１０秒間を２５サイクルの条件で行なった。最後のサイクルの後に７２℃で２分間保持した。
【０１６５】
この増幅ＤＮＡを、発現用ベクターｐＥＴ−２６ｂのＮｄｅＩ部位とＸｈｏＩ部位との間に、Ｃ末端にＨｉｓ  ｔａｇが付加されるようにクローニングして、Ｐｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳ発現プラスミドを作製した。なお、Ｐｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳの塩基配列を配列番号１３に示す。
【０１６６】
校正反応を不活性化する変異は、プラスミド全体をＰＣＲで増幅することにより部位特異的に導入した。
【０１６７】
Ｐｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳタンパク質の発現及び精製は、実施例４に記載の方法と同じ手法により行なった。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより発現を確認した（図示せず）。
【０１６８】
なお、校正活性を不活性にした変異体も同様にして作製した（Ｐｅｄｍｕ−ＣＰ１−ＩＹＲＳ）。校正反応ドメインを不活性化させる変異は、実施例４に記載したＰｅｄｍｕ−Ｎ−ＩＹＲＳと同一のものである。Ｐｅｄｍｕ−ＣＰ１−ＩＹＲＳ発現プラスミドの作成方法も、鋳型をＰｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳに変更した以外は、実施例４に記載したＰｅｄｍｕ−Ｎ−ＩＹＲＳの作製方法と同一である。
【０１６９】
〔比較例１：Ｐｅｄ−ＡＣ−ＩＹＲＳ発現プラスミドの構築〕
Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉのゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーＰｈＡ１（配列番号４１）及びプライマーＰｈＡ２（配列番号４２）を用いたＰＣＲを行い、Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉのＢ３／４ドメインをコードするＤＮＡを増幅した。ＰＣＲは、９８℃で１分間の後に、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で１分間を２５サイクルの条件で行なった。最後のサイクルの後に７２℃で２分間保持した。
【０１７０】
プラスミドＡを鋳型として、プライマーＰｈＡ３（配列番号４３）及びプライマーＰｈＡ４（配列番号４４）を用いたＰＣＲ、ならびにプライマーＰｈＡ５（配列番号４５）及びプライマーＰｈＡ６（配列番号４６）を用いたＰＣＲを行い、ＥｃＩＹＲＳの１番目から３０４番目までのアミノ酸残基をコードするＤＮＡ、及びＥｃＩＹＲＳの３０５番目から４２４番目までのアミノ酸残基をコードするＤＮＡを増幅した。
【０１７１】
次いで、Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉの及びＢ３／４ドメインをコードするＰＣＲ増幅ＤＮＡならびにＥｃＩＹＲＳのＮ末端側（１−３０４）及びＣ末端側（３０５−４２４）をコードするＰＣＲ増幅ＤＮＡ、ならびにプライマーＰｈＡ７（配列番号４７）及びプライマーＰｈＡ８（配列番号４８）を含む反応液を調製し、オーバーラップＰＣＲを行なった。これにより、ＥｃＩＹＲＳのαヘリカルドメイン（ＡＣ）内に、Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉのＢ１、Ｂ２及びＢ３／４ドメインが挿入されている融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
【０１７２】
この増幅ＤＮＡを、発現用ベクターｐＥＴ−２６ｂのＮｄｅＩ部位とＸｈｏＩ部位との間に、Ｃ末端にＨｉｓ  ｔａｇが付加されるようにクローニングして、Ｐｅｄ−ＡＣ−ＩＹＲＳ発現プラスミドを作製した。なお、Ｐｅｄ−ＡＣ−ＩＹＲＳの塩基配列を配列番号１４に示す。
【０１７３】
校正反応を不活性化する変異は、プラスミド全体をＰＣＲで増幅することにより部位特異的に導入した。
【０１７４】
Ｐｅｄ−ＡＣ−ＩＹＲＳタンパク質の発現及び精製は、実施例４に記載の方法と同じ手法により行なった。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより発現を確認した（図示せず）。
【０１７５】
なお、校正活性を不活性にした変異体も同様にして作製した（Ｐｅｄｍｕ−ＡＣ−ＩＹＲＳ）。校正反応ドメインを不活性化させる変異は、実施例４に記載したＰｅｄｍｕ−Ｎ−ＩＹＲＳと同一のものである。Ｐｅｄｍｕ−ＡＣ−ＩＹＲＳ発現プラスミドの作成方法も、鋳型をＰｅｄ−ＡＣ−ＩＹＲＳに変更した以外は、実施例４に記載したＰｅｄｍｕ−Ｎ−ＩＹＲＳの作製方法と同一である。
【０１７６】
〔実施例８：アンバーサプレッサーｔＲＮＡＴｙｒの調製〕
アンバーサプレッサーｔＲＮＡＴｙｒは、Ｎｕｒｅｋｉらの方法（Nureki O et al., J Mol Biol 236, 710-724 1994）により、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて調製した。
【０１７７】
大腸菌ｔＲＮＡＴｙｒのアンチコドン部位の配列を、アンバーコドンに対応するようにＣＵＡとした。ｔＲＮＡの鋳型となるＤＮＡ配列の上流にＴ７プロモータ配列（配列番号７３）を付加した。ｔＲＮＡのＣＣＡ末端に相当する部位を制限酵素Ｍｖａ  Ｉで切れるようにＣＣＡＧＧとしたものを設計した。この配列は１２０塩基と短いため、鋳型を用いず２本のプライマーを組み合わせてＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片を増幅し、増幅ＤＮＡ断片をｐＵＣ１８ベクターにクローニングした。
【０１７８】
Ｍ１３フォワード、Ｍ１３リバースのプライマーを用いて、クローニングした領域を含むＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅した。増幅したＤＮＡ断片をＭｖａ  Ｉにより切断することで一方の末端をＣＣＡで揃えた。このＤＮＡ断片を鋳型として、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いてｔＲＮＡを転写した。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応は（組成）の反応溶液中で３７℃で、５時間インキュベートした。インキュベート開始から２時間経過した際に、最初に加えたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの１／１０量のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを再び加えた。この反応液を、フェノール／クロロホルム抽出に供した。抽出液に、酢酸アンモニウムを塩として添加した後に、イソプロパノール沈殿を行い、沈殿物を２ｍｌの１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−Ｎａ（ｐＨ７．５）に溶解した。溶解した後、ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に通し、未反応のヌクレオチドを除いた。再度エタノール沈殿を行い、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−Ｎａ（ｐＨ７．５）及び２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む溶液に溶解した。８０℃で２分間、ｔＲＮＡを熱変性させた後、徐冷することでｔＲＮＡの巻き戻しを行なった。
【０１７９】
〔実施例９：Ｐｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳのアミノアシル化活性の測定〕
次に、各融合タンパク質のアミノアシル化（チロシル化）活性を測定した。測定は、実施例５に記載の方法と同じ方法で行なった。結果を図５に示す。なお、校正反応ドメインに変異が導入されている融合タンパク質の活性は、校正反応ドメインの挿入によるＥｃＩＹＲＳの活性の変化を示す。
【０１８０】
図５に示すように、Ｐｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳは、ｔＲＮＡＴｙｒにチロシンをほとんど付加しなかった。
【０１８１】
また、Ｐｅｄ−ＡＣ−ＩＹＲＳでは、チロシル化が検出された。なお、不活性型の校正反応ドメインの挿入した以外は、Ｐｅｄ−ＡＣ−ＩＹＲＳと同様にして作製した改変体によるＥｃＩＹＲＳのｔＲＮＡＴｙｒへのチロシル化の低下は見られず、Ｐｅｄ−ＡＣ−ＩＹＲＳと同様にチロシル化が検出された。すなわち、Ｐｅｄ−ＡＣ−ＩＹＲＳでは、校正反応ドメインによる加水分解は見られなかった。
【０１８２】
次に、各融合タンパク質の基質特異性を調べるアッセイを行なった。尿素変性酸性ＰＡＧＥにより、各融合タンパク質が、３−ヨードチロシンを認識しているかを調べた。Ｐｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳの濃度を１ｍＭ又は２ｍＭとし、反応温度を２４℃又は３７℃で行なった以外は、上述したＮ末端融合タンパク質における測定の際の手法と同一の手法により反応を行なった。
【０１８３】
図６は各改変体における結果を示す図である。図６に示すように、Ｐｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳは、３−ヨードチロシンの認識が観察された。反応条件を、３７℃で１分にした場合には、ｔＲＮＡのほぼ完全なシフトが観察された。また、反応条件を、２４℃にした場合には、さらに長時間反応させても、バンドのシフトが観察された。一方、Ｐｅｄ−ＡＣ−ＩＹＲＳは、３−ヨードチロシンをＥｃＩＹＲＳと同様に認識した。
【０１８４】
〔実施例１０：Ｐｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳ及びＰｅｄ−Ｎ−ＩＹＲＳのチロシルｔＲＮＡに対する加水分解活性の測定〕
次に、実施例９にて、アミノアシル化反応においてｔＲＮＡＴｙｒをチロシル化しなかったＰｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳの、チロシルｔＲＮＡに対する加水分解活性を直接調べた。また、実施例４で作製したＰｅｄ−Ｎ−ＩＹＲＳについても検討を行なった。
【０１８５】
Ｎ末端融合タンパク質におけるアミノアシル化活性の測定と同様の条件で、酵素として野生型ＥｃＴｙｒＲＳを用いて[１４Ｃ]−チロシルｔＲＮＡＴｙｒを作製した。３０分間の反応の後、フェノール/クロロホルム処理によってタンパク質を除去し，エタノール沈殿によって、[１４Ｃ]−チロシルｔＲＮＡＴｙｒを沈殿させた。自然に起こる加水分解を抑えるために、得られた沈殿を、１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解した。
【０１８６】
加水分解反応は、緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に２．２ｍＭ  に[１４Ｃ]−チロシルｔＲＮＡＴｙｒ、５０ｎＭ  Ｐｅｄ−Ｎ−ＩＹＲＳ又はＰｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳを加えることにより行なった。アミノアシル化の活性測定同様に、液体シンチレーションカウンターにより、残った[１４Ｃ]−チロシルｔＲＮＡＴｙｒを定量化した。
【０１８７】
図７は、Ｐｅｄ−Ｎ−ＩＹＲＳ、Ｐｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳの加水分解活性の結果を示す図である。
【０１８８】
図７に示すように、両改変体において加水分解活性が見られた。また、Ｐｅｄ−Ｎ−ＩＹＲＳに比べてＰｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳの方が加水分解活性は高かった。校正反応ドメインがＮ末端にあるよりも、ＣＰ１領域に挿入した方が、効率良くチロシルｔＲＮＡを加水分解できるようであった。
【０１８９】
次に、小麦胚芽無細胞翻訳系において、Ｐｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳが、チロシン、３−ヨードチロシンをアンバーコドンに導入するかどうかを調べた。小麦胚芽無細胞翻訳系には、ＲＴＳ１００小麦胚芽ＣＥＣＦキット（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、キットに付属のプロトコールに従った。この反応は２４℃で行われるので、Ｐｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳの構造が乱れることがなく、３−ヨードチロシンを認識することが期待される。
【０１９０】
このキットに、Ｔ７プロモータで制御された遺伝子を組み込んだプラスミドを加えることにより、その遺伝子を発現させることができる。大腸菌由来であるＥｃＩＹＲＳと大腸菌ｔＲＮＡＴｙｒは小麦胚芽の翻訳系の中で直交すること（ＥｃＩＹＲＳが細胞に内在するｔＲＮＡと反応せず、また、大腸菌ｔＲＮＡＴｙｒが、細胞内に存在するａａＲＳと反応しないこと）が知られている（Kiga, D., Sakamoto, K., Kodama, K., Kigawa, T., Matsuda, T., Yabuki, T., Shirouzu, M., Harada, Y., Nakayama, H., Takio, K., Hasegawa, Y., Endo, Y., Hirao, I., Yokoyama, S., An engineered Escherichia coli tyrosyl-tRNA synthetase for site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in eukaryotic translation and its application in a wheat germ cell-free system. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99, 9715-9720）。
【０１９１】
発現させるレポータータンパク質としては、ＧＳＴ（glutathione-S-transferase）にアンバーコドンを導入したＧＳＴを用いた。ＧＳＴ遺伝子の上流に、余分な配列が付加されており、その中にアンバーコドンが導入されている（ＧＳＴ（Ａｍ））（配列番号４９）（理化学研究所  小林博士から供与された）。ＰＣＲによってＧＳＴ（Ａｍ）をコードするＤＮＡ断片を増幅し、ベクターｐＥＵ３−ＮＩＩ（ＴＯＹＯＢＯ社）のＥｃｏＲＶ−ＸｈｏＩ部位にクローニングした。無細胞翻訳系にＥｃＩＹＲＳ、大腸菌アンバーサプレッサーｔＲＮＡを加えると、チロシンがＧＳＴ（Ａｍ）のアンバーコドンに導入され、ＧＳＴタンパク質が翻訳される。すなわちＥｃＩＹＲＳのアミノアシル化の活性をＧＳＴタンパク質の量で見積もることができる。
【０１９２】
小麦胚芽無細胞翻訳系のキットに含まれる反応液に、５ｍＭ  大腸菌アンバーサプレッサーｔＲＮＡ、１ｍＭ  ３−ヨードチロシン、２ｍＭ  ａａＲＳ、及び４０ｎｇ／μｌ  ＧＳＴ（Ａｍ）をコードするプラスミドを加え、２４℃で６時間反応させた。翻訳されたＧＳＴタンパク質は抗ＧＳＴ抗体を用いたウェスタンブロッティングによって検出した。
【０１９３】
図８は、ウェスタンブロッティングの結果を示す図である。
【０１９４】
図８に示すように、Ｐｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳは３−ヨードチロシン非存在下では全くＧＳＴを発現しなかった（レーン８）。したがって、Ｐｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳの校正反応ドメインが、翻訳系においても適切に働いていることが分かる。また、３−ヨードチロシン存在下では、Ｐｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳは、ＥｃＩＹＲＳと同程度のＧＳＴが発現していた。すなわち、校正反応ドメインの挿入によるアミノアシル化活性の低下は見られなかった。したがって、Ｐｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳは、３−ヨードチロシンに対する特異的な認識を達成できていた。
【０１９５】
Ｐｅｄｍｕ−ＣＰ１−ＩＹＲＳは、ＥｃＩＹＲＳと同様に３−ヨードチロシン非存在下において、ＧＳＴのバンドが観測されたのに加えて、３−ヨードチロシン存在下においても、ＥｃＩＹＲＳと同程度のＧＳＴが発現した。
【０１９６】
なお、Ｐｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳでは、ロスマンフォールド領域との間に校正反応ペプチドのＮ端側には配列番号５０で示すリンカー、Ｃ端側には配列番号５１で示すリンカーが挿入されている。これは、上述のオーバーラップＰＣＲで用いたプライマーの配列に基づいて挿入されたものである。Ｐｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳにおいて、リンカーを代えた場合、３−ヨードチロシンを特異的に認識してアミノアシル化ｔＲＮＡを合成する活性に影響があることが分かった。中でも、配列番号５０で示すリンカーをＮ末端側に、配列番号５１で示すリンカーをＣ末端側に用いているＰｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳの活性が最も優れていた。
【０１９７】
〔実施例１１：哺乳類培養細胞におけるPed-CP1-IYRSを用いたヨードチロシンのタンパク質への部位特異的導入〕
Ｐｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳの有用性をさらに検証するために、哺乳類培養細胞においてＰｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳを使用してヨードチロシンをタンパク質に導入する実験を行った。実験の手順及び方法はすべて非特許文献（Sakamoto, K., Hayashi, A., Sakamoto, A., Kiga, D., Nakayama, H., Soma, A., Kobayashi, T., Kitabatake, M., Takio, T., Saito, K., Shirouzu, M., Hirao, I., and Yokoyama, S., “Site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in mammalian cells”, Nucleic Acids Research 30, 4692-4699, 2002）に記載されている通りに行った。Ｐｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳを哺乳類培養細胞（ＣＨＯ細胞）で発現させるにあたって、当該文献に記載されたＴｙｒＲＳ及びＩＹＲＳの発現方法をそのまま用いた。よって、発現させたＰｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳにはＣ末端にＦＬＡＧタグが付加されている。
【０１９８】
ＲＡＳ遺伝子の３２番目のコドンをアンバーコドンに置換し（Ａｍ３２）、この位置にヨードチロシン（ＩＹ）の導入を試みた。なお、なにかしらのアミノ酸がこの位置に導入されれば、全長のＲＡＳタンパク質が発現する。ここで、強制発現させた全てのタンパク質には、ＦＬＡＧタグが付加されており、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタン・ブロットによってタンパク質の発現を検出した。結果を図９に示す。図中、バンドＡはＰｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳに、バンドＢはＩＹＲＳまたは大腸菌ＴｙｒＲＳに、およびバンドＣはＲＡＳタンパク質にそれぞれ対応している。
【０１９９】
まず、対照実験として、アンバーコドンを含まないＲＡＳ遺伝子を発現させて（レーン２）、全長ＲＡＳタンパク質のウェスタン・ブロット上の位置（バンドＣ）を確認した。レーン３，４は、大腸菌ＴｙｒＲＳを発現させたときにも全長ＲＡＳが発現していることを示している。このＴｙｒＲＳはヨードチロシンではなく、通常のチロシンを認識するため、培地にＩＹを添加したとき（ＩＹ＋）でも、添加していないときでも（ＩＹ−）、チロシンがアンバー部位に導入されている。ヨードチロシンを認識するようにＴｙｒＲＳを改変した変異体ＩＹＲＳを発現させると（レーン５）、ヨードチロシンが存在するときには、このアミノ酸をアンバー部位に導入して全長ＲＡＳが発現する。ここで，ヨードチロシン添加時にＩＹＲＳがアンバー部位に導入するアミノ酸がヨードチロシンであることは上記文献に記載の通りである。しかし、ＩＹＲＳはチロシンに対する親和性も残している。そのため、ヨードチロシンが添加されていないときには、チロシンがアンバー部位に導入され、やはり全長ＲＡＳが発現する（レーン６）。
【０２００】
Ｐｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳを発現させたときには、ヨードチロシン添加時に全長ＲＡＳが発現する。したがって、この変異体が、哺乳類細胞でアンバー部位にヨードチロシンを導入する活性を持つことがわかる。ヨードチロシンを添加していないときには、全長ＲＡＳは発現せず、Ｐｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳがチロシンをアンバー部位に導入しないことがわかる。すなわち、図８に示された小麦胚芽無細胞翻訳系の結果と同様に、哺乳類培養細胞中においても、Ｐｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳはヨードチロシンに対して劇的に改善された特異性を示している。
【０２０１】
〔実施例１２：ショウジョウバエ培養細胞におけるＰｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳを用いたヨードチロシンのタンパク質への部位特異的導入〕
Ｐｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳの有用性をさらに検証するために、ショウジョウバエ培養細胞においてＰｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳを使用してヨードチロシンをタンパク質に導入する実験を行った。
【０２０２】
Ｐｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳをショウジョウバエ培養細胞（Ｓ２細胞）で発現させるにあたって、市販の発現ベクターであるｐＭＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。その結果、発現させたＰｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳにはＣ末端にＨＡタグが付加されている。Bacillus stearothermophilus由来のサプレッサーｔＲＮＡＴｙｒをＳ２細胞で発現させるにあたって、非特許文献（Sakamoto, K. et. al., Nucleic Acids Research 30, 4692-4699, 2002）に記載されたサプレッサーｔＲＮＡＴｙｒ配列の上流に、非特許文献（Wakiyama M., Matsumoto T., Yokoyama S., “Drosophila U6 promoter-driven short hairpin RNAs effectively induce RNA interference in Schneider 2 cells”, Biochemical and biophysical research communications 331, 1163-1170, 2005）に記載されているＵ６プロモーター（ＤＵ６−２  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を用いた。
【０２０３】
ｌａｃＺ遺伝子の９１番目のコドンをアンバーコドンに置換し（ＬａｃＺ（ＵＡＧ））、この位置にヨードチロシン（ＩＹ）の導入を試みた。なお、なにかしらのアミノ酸がこの位置に導入されれば、全長のＬａｃＺタンパク質が発現し、β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ活性を示す。結果を表１に示す。
【０２０４】
まず、対照実験として、ＩＹＲＳを発現させて、全長ＬａｃＺタンパク質のβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ活性を確認した。ＬａｃＺとしてＬａｃＺ（ＵＡＧ）を用いた場合、野生型ＬａｃＺ（ＬａｃＺ  ＷＴ）の発現量に比べて１７．４％の活性を示し、ショウジョウバエ培養細胞におけるヨードチロシン導入系の有用性を示した。
【０２０５】
次にＰｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳを発現させたときには、ヨードチロシン添加時に全長ＬａｃＺが発現し、この変異体が、Ｓ２細胞でアンバー部位にヨードチロシンを導入する活性を持つことが示された。一方、ヨードチロシンを添加していないときには，全長ＬａｃＺ発現量はヨードチロシン添加時の４％程度に落ち込んだ。このことから、Ｐｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳがチロシンをアンバー部位にほとんど導入しないことが示された。
【０２０６】
すなわち、図８に示された小麦胚芽無細胞翻訳系の結果、及び図９に示された哺乳類培養細胞中における結果に加え、ショウジョウバエ細胞においてもＰｅｄ−ＣＰ１−ＩＹＲＳはヨードチロシンに対して劇的に改善された特異性を示している。また、Ｓ２細胞を用いた実験系において、特異性のみならず、ヨードチロシンの導入効率においてもＩＹＲＳに匹敵する活性を示すことがわかった。
【０２０７】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【０２０８】
本発明によれば、認識するアミノ酸の特異性が高いａａＲＳを提供することが出来るので、非天然アミノ酸を用いて様々な機能を有するタンパク質を製造することができるので、生化学分野、創薬等の医薬品産業で利用可能である。
【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図１】
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【図４】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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