(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に存在するＨＣＶのゲノムにおける変異を同定するためのアッセイであって、前記アッセイは、以下の連続的な工程を含む：
ａ）前記ＨＣＶを含む試料からウイルスＲＮＡを抽出する工程、
ｂ）前記ＨＣＶの遺伝子型およびサブタイプを決定する工程、
ｃ）３つの別々の逆転写反応において前記ＨＣＶのゲノムの部分的なｃＤＮＡを合成する工程であって、第１の逆転写反応は、同一の遺伝子型およびサブタイプのプロトタイプＨＣＶゲノムの３’ＵＴＲにおける配列に特異的にハイブリダイズするように選択される第１の外側のアンチセンスプライマーから開始し、第２の逆転写反応は、前記プロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ領域における配列に特異的にハイブリダイズするように選択される第２の外側のアンチセンスプライマーから開始し、第３の逆転写反応は、前記プロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ２領域における配列に特異的にハイブリダイズするように選択される第３の外側のアンチセンスプライマーから開始する工程、
ｄ）３つの別々のＰＣＲ反応において工程ｃ）の部分的なｃＤＮＡを第二鎖合成および増幅する工程であって、第１のＰＣＲ反応は、一定分量の第１の逆転写反応物、前記第１の外側のアンチセンスプライマーおよび前記プロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ領域における相補的配列に特異的にハイブリダイズするように選択される第１の外側のセンスプライマーを含み、第２のＰＣＲ反応は、一定分量の第２の逆転写反応物、前記第２の外側のアンチセンスプライマーおよび前記プロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ２領域における相補的配列に特異的にハイブリダイズするように選択される第２の外側のセンスプライマーを含み、第３のＰＣＲ反応は、一定分量の第３の逆転写反応物、前記第３の外側のアンチセンスプライマーおよび前記プロトタイプＨＣＶのゲノムの５’ＵＴＲ領域における相補的配列に特異的にハイブリダイズするように選択される第３の外側のセンスプライマーを含み、前記第２の外側のアンチセンスプライマーは、前記第１の外側のセンスプライマーと相補的である領域に対して３’に位置する前記プロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ領域における配列にハイブリダイズし、前記第３の外側のアンチセンスプライマーは、前記第２の外側のセンスプライマーと相補的である領域に対して３’に位置する前記プロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ２領域における配列にハイブリダイズする工程、
ｅ）３つの別々のネステッドＰＣＲ反応において工程ｄ）の部分的なｃＤＮＡをさらに増幅する工程であって、第１のネステッドＰＣＲ反応は、一定分量の第１のＰＣＲ反応物、ならびに第１の内側のアンチセンスプライマーおよびセンスプライマーを含み、第２のネステッドＰＣＲ反応は、一定分量の第２のＰＣＲ反応物ならびに第２の内側のアンチセンスプライマーおよびセンスプライマーを含み、第３のネステッドＰＣＲ反応は、一定分量の第３のＰＣＲ反応物ならびに第３の内側のアンチセンスプライマーおよびセンスプライマーを含み、前記内側のプライマーは、前記外側のプライマーと重ならず、前記第２の内側のアンチセンスプライマーは、第１の内側のセンスプライマーと相補的である領域に対して３’に位置する前記プロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ領域における配列とハイブリダイズし、前記第３の内側のアンチセンスプライマーは、前記第２の内側のセンスプライマーと相補的である領域に対して３’に位置する前記プロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ２領域における配列とハイブリダイズする工程、
ｆ）工程ｅ）のさらに増幅されたｃＤＮＡの配列を解析する工程、ならびに
ｇ）工程ｆ）から得られる配列と前記プロトタイプＨＣＶの配列とを比較する工程。
【請求項２】
抗ＨＣＶ薬に対して抵抗性を有するＨＣＶ変異体のゲノムにおける単一変異および伴性変異を同定し、かつ特徴付けることができるアッセイであって、前記アッセイは、下記の連続的な工程を含む：
ａ）治療の不成功によって示された、患者が処置された抗ＨＣＶ薬または合剤に対する抵抗性を有するＨＣＶを有する患者から採取された試料からウイルスＲＮＡを抽出する工程、
ｂ）前記ＨＣＶの遺伝子型およびサブタイプを決定する工程、
ｃ）３つの別々の逆転写反応において前記ＨＣＶのゲノムの部分的なｃＤＮＡを合成する工程であって、第１の逆転写反応は、同一の遺伝子型およびサブタイプのプロトタイプＨＣＶゲノムの３’ＵＴＲにおける配列に特異的にハイブリダイズするように選択される第１の外側のアンチセンスプライマーから開始し、第２の逆転写反応は、前記プロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ領域における配列に特異的にハイブリダイズするように選択される第２の外側のアンチセンスプライマーから開始し、第３の逆転写反応は、前記プロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ２領域における配列に特異的にハイブリダイズするように選択される第３の外側のアンチセンスプライマーから開始する工程、
ｄ）３つの別々のＰＣＲ反応において工程ｃ）の部分的なｃＤＮＡを第二鎖合成および増幅する工程であって、第１のＰＣＲ反応は、一定分量の第１の逆転写反応物、前記第１の外側のアンチセンスプライマーおよび前記プロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ領域における相補的配列に特異的にハイブリダイズするように選択される第１の外側のセンスプライマーを含み、第２のＰＣＲ反応は、一定分量の第２の逆転写反応物、前記第２の外側のアンチセンスプライマーおよび前記プロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ２領域における相補的配列に特異的にハイブリダイズするように選択される第２の外側のセンスプライマーを含み、第３のＰＣＲ反応は、一定分量の第３の逆転写反応物、前記第３の外側のアンチセンスプライマーおよび前記プロトタイプＨＣＶのゲノムの５’ＵＴＲ領域における相補的配列に特異的にハイブリダイズするように選択される第３の外側のセンスプライマーを含み、前記第２の外側のアンチセンスプライマーは、前記第１の外側のセンスプライマーと相補的である領域に対して３’に位置する前記プロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ領域における配列にハイブリダイズし、前記第３の外側のアンチセンスプライマーは、前記第２の外側のセンスプライマーと相補的である領域に対して３’に位置する前記プロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ２領域において配列にハイブリダイズする工程、
ｅ）３つの別々のネステッドＰＣＲ反応において工程ｄ）の部分的なｃＤＮＡをさらに増幅する工程であって、第１のネステッドＰＣＲ反応は、一定分量の第１のＰＣＲ反応物、ならびに第１の内側のアンチセンスプライマーおよびセンスプライマーを含み、第２のネステッドＰＣＲ反応は、一定分量の第２のＰＣＲ反応物ならびに第２の内側のアンチセンスプライマーおよびセンスプライマーを含み、第３のネステッドＰＣＲ反応は、一定分量の第３のＰＣＲ反応物ならびに第３の内側のアンチセンスプライマーおよびセンスプライマーを含み、前記内側のプライマーは、前記外側のプライマーと重ならず、前記第２の内側のアンチセンスプライマーは、前記第１の内側のセンスプライマーと相補的である領域に対して３’に位置する前記プロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ領域における配列とハイブリダイズし、前記第３の内側のアンチセンスプライマーは、前記第２の内側のセンスプライマーと相補的である領域に対して３’に位置する前記プロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ２領域における配列とハイブリダイズする工程、
ｆ）工程ｅ）のさらに増幅されたｃＤＮＡの配列を解析する工程、
ｇ）工程ｆ）から得られる配列と前記プロトタイプＨＣＶの配列とを比較し、変異を同定する工程、ならびに
ｈ）抗ＨＣＶ薬の抵抗性に関連するＨＣＶ変異のデータバンクに、同定された変異を登録する工程。
【請求項３】
工程ｈ）は、同定された変異についての抗ＨＣＶ薬の抵抗性に関連するＨＣＶ変異のデータバンクの調査である請求項２記載のアッセイ。
【請求項４】
前記試料は、ＨＣＶに感染している患者のいずれかの薬理学的治療の開始前に、前記患者から採取される請求項３記載のアッセイ。
【請求項５】
試料中に存在するＨＣＶのゲノムにおける変異を同定するためのアッセイであって、前記アッセイは、下記の連続的な工程を含む：
ａ）前記ＨＣＶを含む試料からウイルスＲＮＡを抽出する工程、
ｂ）前記ＨＣＶの遺伝子型およびサブタイプを決定する工程、
ｃ）ただし、工程ｂ）が、前記ＨＣＶは１ｂ型のものであることを示した場合、３つの別々の逆転写反応において前記ＨＣＶのゲノムの部分的なｃＤＮＡを合成する工程であって、第１の逆転写反応はプライマー  ポリ−Ａから開始し、第２の逆転写反応はプライマー  ＨＣＶ１ｂＯＲ６３１２（配列番号２）から開始し、第３の逆転写反応はプライマー  ＨＣＶ１ｂＯＲ３３０６（配列番号３）から開始する工程、
ｄ）３つの別々のＰＣＲ反応において工程ｃ）の部分的なｃＤＮＡを第二鎖合成および増幅する工程であって、第１のＰＣＲ反応は、一定分量の第１の逆転写反応物およびプライマー対  ポリ−Ａ／ＨＣＶ１ｂＯＦ６０７４（配列番号１／配列番号４）を含み、第２のＰＣＲ反応は、一定分量の第２の逆転写反応物およびプライマー対  ＨＣＶ１ｂＯＲ６３１２／ＨＣＶ１ｂＯＦ１９７７（配列番号２／配列番号５）を含み、第３のＰＣＲ反応は、一定分量の第３の逆転写反応物およびプライマー対  ＨＣＶ１ｂＯＲ３３０６／ＨＣＶＯＦ１２９（配列番号３／配列番号６）を含む工程、
ｅ）３つの別々のネステッドＰＣＲ反応において工程ｄ）の部分的なｃＤＮＡをさらに増幅する工程であって、第１のネステッドＰＣＲ反応は、一定分量の第１のＰＣＲ反応物およびプライマー対  ＨＣＶ１ｂＩＲ９３３９／ＨＣＶ１ｂＩＦ６１２６（配列番号７／配列番号１０）を含み、第２のネステッドＰＣＲ反応は、一定分量の第２のＰＣＲ反応物およびプライマー対  ＨＣＶ１ｂＩＲ６２８２／ＨＣＶ１ｂＩＦ２５２３（配列番号８／配列番号１１）を含み、第３のネステッドＰＣＲ反応は、一定分量の第３のＰＣＲ反応物およびプライマー対  ＨＣＶ１ｂＩＲ２７７０／ＨＣＶＩＦ２７８（配列番号９／配列番号１２）を含む工程、
ｆ）工程ｅ）のさらに増幅されたｃＤＮＡの配列を解析する工程、および
ｇ）工程ｆ）から得られる配列とプロトタイプＨＣＶ１ｂの配列とを比較する工程。
【請求項６】
抗ＨＣＶ薬に対して抵抗性を有するＨＣＶ変異体のゲノムにおける単一変異および伴性変異を同定し、かつ特徴付けることができるアッセイであって、前記アッセイは、下記の連続的な工程を含む：
ａ）患者が処置された抗ＨＣＶ薬または合剤に対して抵抗性を有するＨＣＶを有する患者から採取された試料からウイルスＲＮＡを抽出する工程、
ｂ）前記ＨＣＶの遺伝子型およびサブタイプを決定する工程、
ｃ）ただし、工程ｂ）が、前記ＨＣＶは１ｂ型のものであることを示した場合、３つの別々の逆転写反応において前記ＨＣＶのゲノムの部分的なｃＤＮＡを合成する工程であって、第１の逆転写反応はプライマー  ポリ−Ａから開始し、第２の逆転写反応はプライマー  ＨＣＶ１ｂＯＲ６３１２（配列番号２）から開始し、第３の逆転写反応はプライマー  ＨＣＶ１ｂＯＲ３３０６（配列番号３）から開始する工程、
ｄ）３つの別々のＰＣＲ反応において工程ｃ）の部分的なｃＤＮＡを第二鎖合成および増幅する工程であって、第１のＰＣＲ反応は、一定分量の第１の逆転写反応物およびプライマー対  ポリ−Ａ／ＨＣＶ１ｂＯＦ６０７４（配列番号１／配列番号４）を含み、第２のＰＣＲ反応は、一定分量の第２の逆転写反応物およびプライマー対  ＨＣＶ１ｂＯＲ６３１２／ＨＣＶ１ｂＯＦ１９７７（配列番号２／配列番号５）を含み、第３のＰＣＲ反応は、一定分量の第３の逆転写反応物およびプライマー対  ＨＣＶ１ｂＯＲ３３０６／ＨＣＶＯＦ１２９（配列番号３／配列番号６）を含む工程、
ｅ）３つの別々のネステッドＰＣＲ反応において工程ｄ）の部分的なｃＤＮＡをさらに増幅する工程であって、第１のネステッドＰＣＲ反応は、一定分量の第１のＰＣＲ反応物およびプライマー対  ＨＣＶ１ｂＩＲ９３３９／ＨＣＶ１ｂＩＦ６１２６（配列番号７／配列番号１０）を含み、第２のネステッドＰＣＲ反応は、一定分量の第２のＰＣＲ反応物およびプライマー対  ＨＣＶ１ｂＩＲ６２８２／ＨＣＶ１ｂＩＦ２５２３（配列番号８／配列番号１１）を含み、第３のネステッドＰＣＲ反応は、一定分量の第３のＰＣＲ反応物およびプライマー対  ＨＣＶ１ｂＩＲ２７７０／ＨＣＶＩＦ２７８（配列番号９／配列番号１２）を含む工程、
ｆ）工程ｅ）のさらに増幅されたｃＤＮＡの配列を解析する工程、
ｇ）工程ｆ）から得られる配列とプロトタイプＨＣＶ１ｂの配列とを比較し、変異を同定する工程、および
ｈ）抗ＨＣＶ薬の抵抗性に関連するＨＣＶ変異のデータバンクに、同定された変異を登録する工程。
【請求項７】
工程ｈ）は、同定された変異についての抗ＨＣＶ薬の抵抗性に関連するＨＣＶ変異のデータバンクの調査である請求項６記載のアッセイ。
【請求項８】
前記試料は、ＨＣＶに感染している患者のいずれかの薬理学的治療の開始前に、前記患者から採取される請求項７記載のアッセイ。
【請求項９】
ポリ−Ａ（配列番号１）およびＨＣＶ１ｂＯＦ６０７４（配列番号４）からなるプライマー対。
【請求項１０】
ＨＣＶ１ｂＯＲ６３１２（配列番号２）およびＨＣＶ１ｂＯＦ１９７７（配列番号５）からなるプライマー対。
【請求項１１】
ＨＣＶ１ｂＯＲ３３０６（配列番号３）およびＨＣＶＯＦ１２９（配列番号６）からなるプライマー対。
【請求項１２】
ＨＣＶ１ｂＩＲ９３３９（配列番号７）およびＨＣＶ１ｂＩＦ６１２６（配列番号１０）からなるプライマー対。
【請求項１３】
ＨＣＶ１ｂＩＲ６２８２（配列番号８）およびＨＣＶ１ｂＩＦ２５２３（配列番号１１）からなるプライマー対。
【請求項１４】
ＨＣＶ１ｂＩＲ２７７０（配列番号９）およびＨＣＶＩＦ２７８（配列番号１２）からなるプライマー対。
【請求項１５】
請求項９〜１４いずれか１項に記載のプライマー対を含む、ＨＣＶゲノム中の変異を検出するためのキット。
【請求項１６】
請求項９〜１４のうちのプライマー対を含む、ＨＣＶゲノム中の変異を検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＨＣＶ薬に対する患者の抵抗性と関連するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のゲノムにおける単一変異または伴性変異を検出し、かつ特徴づけるアッセイに関する。当該アッセイはまた、抗ウイルス療法の前もしくは早期に、ＨＣＶに感染している患者の抗ＨＣＶ薬に対する抵抗性を予測するため、または特定の治療薬または合剤に対する抵抗性を生じたＨＣＶに感染した患者のための代替療法の選択のためにも使用できる。本発明はまた、これらのアッセイを行うためのヌクレオチドプライマー対およびキットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＶは、約１５年前に、Ｃｈｏｏおよび共同研究者によってクローン化され、特徴付けられた（非特許文献１）。ＨＣＶは、フラビウイルス科のファミリーに属し、エンベロープを有するヌクレオカプシドおよび正極性の一本鎖ＲＮＡゲノムを含む（非特許文献２）。当該ＨＣＶゲノムは、単一の長いオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に隣接する５’および３’の非翻訳（ＵＴＲまたはＮＣＲ）領域からなる。このＯＲＦは、アミノ終端の３つの構造タンパク質、およびカルボキシ終端の６つの非構造（ＮＳ）タンパク質をコードする。当該構造タンパク質は、ヌクレオカプシド  コアタンパク質（Ｃ）、および２つの糖タンパク質（エンベロープ  １（Ｅ１）およびエンベロープ  ２（Ｅ２））である。当該非構造タンパク質は、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、ＮＳ５ｂと命名される。５’ＮＣＲは、ＨＣＶゲノムの最も高度に保存された領域であり、一方、２つのエンベロープタンパク質（Ｅ１およびＥ２）の配列は、異なるＨＣＶ分離株の間で大きく変わる。最も高い度合いの変異性は、Ｅ２内の領域（現在では一般的に、超可変領域  １と呼ばれる）において認められる。
【０００３】
ＨＣＶの最初の同定から、少なくとも７つの異なる主要なウイルス型が同定され、遺伝子型  １〜７と命名された。これらの遺伝子型は、多数のサブタイプ（例えば、ＨＣＶ  １ａ、１ｂ、１ｃ）を含む。患者が感染したウイルスの遺伝子型およびサブタイプは、臨床予後、および様々な薬物療法に対する反応性に影響する可能性がある（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。
【０００４】
ＨＣＶ感染は、現在まで、依然として深刻な医学上の問題である。現在、ＨＣＶに感染した約１７億人がいる。ＨＣＶは、血液および血液製剤によって、ならびに妊娠中の垂直伝達によって第一に伝達される。感染の初期経過は、典型的に、穏やかである。しかし、免疫系は、しばしば、ウイルスを除去できず、持続感染している患者は、肝硬変および肝細胞癌についての高いリスクを有する（非特許文献６）。
【０００５】
慢性ＨＣＶ感染に対する現在の標準的な治療は、ペグ化インターフェロンαおよびリバビリンの組み合わせに基づく。この治療は、遺伝子型２および３に感染した患者のうち８５−９０％において、持続性の抗ウイルス反応を生じるが、残念ながら、流行性の遺伝子型１に感染した患者においては約４５％のみで生じる（非特許文献７）。より高い抗ウイルス活性および優れた安全特性を与えられた他の薬物および合剤を使用したさらなる治療が、特にＨＣＶ再発の予防のために、明らかに必要とされている。
【０００６】
血液製剤のスクリーニングのための診断検査の導入は、新たな感染の割合を顕著に減少させてきた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏのモデル、すなわち、ＨＣＶサブゲノムのレプリコンモデルおよび感染細胞培養モデルの有効性、ならびに、分子研究技術（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）など）の改善は、ウイルスタンパク質を直接的に標的にし、または、ウイルス感染に関与する宿主タンパク質を通じて間接的に作用する、ＨＣＶ複製のさらに強力な阻害剤の開発を促進してきた（非特許文献８；非特許文献９）。これらの新規な化合物のうちのいくつかは、臨床治験に入っているか、または、既に市販されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｃｖａｄｖｏｃａｔｅ．ｏｒｇ／ｈｅｐａｔｉｔｉｓ／ｈｅｐＣ／ＨＣＶＤｒｕｇｓ＿２００７．ｐｄｆ）。
【０００７】
抗ＨＣＶ治療に対する反応性の可能性についての予後診断の情報を与えることを目的とするアッセイが開発されてきた（非特許文献１０；非特許文献１１）。これらのアッセイとしては、血清学的試験および定性的または定量的な分子検査が挙げられる。ＨＣＶウイルス量のＰＣＲベースのアッセイの例は、Ｃｏｂａｓ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ（登録商標）（ロシュ）、およびｍ２０００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（アボット（Ａｂｏｔｔ））である。例えば、Ｖｅｒｓａｎｔ（登録商標）ＨＣＶ遺伝子型同定アッセイ（バイエル  ダイアグノスティックス）、ＩＮＮＯ−ＬｉＰＡ  ＨＣＶ  ＩＩ（登録商標）（イノジェネティックス（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ））、ＧＥＮ−ＥＴＩ−Ｋ  ＤＥＩＡ  キット（イタリア、サルッジャ、ソーリン）および、ＴＲＵＧＥＮＥ  ＨＣＶ  ５’ＮＣ  遺伝子型同定キット（Ｖｉｓｉｂｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｅｕｒｏｐｅ、フランス、エヴリー）を含む他のＰＣＲベースのアッセイは、ＨＣＶの遺伝子型およびサブタイプを同定する。ＨＣＶの遺伝子型は、最も効果的な抗ＨＣＶ薬（例えば、リバビリンまたはインターフェロン）の選択および投与計画、ならびに治療の期間を決定するため、治療前のＨＣＶの遺伝子型の系統的評価が近年提唱されている。現在の遺伝子型の同定は、主に、ＨＣＶゲノムの小領域（例えば、５’ＵＴＲ）のシークエンシングに依存するが、全ＨＣＶゲノムまたはほぼ全ＨＣＶゲノムのシークエンシングには依存しない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｈｏｏら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４、３５９−３６２
【非特許文献２】Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒら（２００３）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ  ６０、９１−１０２
【非特許文献３】Ｓｉｍｍｏｎｄｓら（１９９５）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２１、５７０−５８２
【非特許文献４】Ｂｕｋｈら（１９９５）Ｓｅｍｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ  １５、４１−６３
【非特許文献５】ＣｈｅｖａｌｉｅｚおよびＰａｗｌｏｔｓｋｙ（２００７）Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  １３、２４６１−２４６６
【非特許文献６】Ｐｏｙｎａｒｄら（１９９７）Ｌａｎｃｅｔ  ３４９、８２５−８３２
【非特許文献７】Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇら（２００６）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  ｖｏｌ、４６３−４８６
【非特許文献８】Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ（２００２）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  １、９１１−９１６
【非特許文献９】Ｗａｋｉｔａら（２００５）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １１、７９１−７９６
【非特許文献１０】Ｇｒｅｔｃｈら（１９９７）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２６、４３ｓ−４７ｓ
【非特許文献１１】Ｐｏｄｚｏｒｓｋｉ（２００２）Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  １２６、２８５−２９０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
その最も一般的な実施態様では、本発明は、試料中に存在するＨＣＶのゲノムにおける変異を同定するためのアッセイに関する。当該アッセイは、順々に行われる下記の工程を含む：
ａ）当該ＨＣＶを含む試料からウイルスＲＮＡを抽出する工程、
ｂ）当該ＨＣＶの遺伝子型およびサブタイプを決定する工程、
ｃ）３つの別々の逆転写反応において当該ＨＣＶのゲノムの部分的なｃＤＮＡを合成する工程であって、第１の逆転写反応は、同一の遺伝子型およびサブタイプのプロトタイプＨＣＶゲノムの３’ＵＴＲにおける配列に特異的にハイブリダイズするように選択される第１の外側のアンチセンスプライマーから開始し、第２の逆転写反応は、当該プロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ領域における配列に特異的にハイブリダイズするように選択される第２の外側のアンチセンスプライマーから開始し、第３の逆転写反応は、当該プロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ２領域における配列に特異的にハイブリダイズするように選択される第３の外側のアンチセンスプライマーから開始する工程、
ｄ）３つの別々のＰＣＲ反応において工程ｃ）の部分的なｃＤＮＡを第二鎖合成および増幅する工程であって、第１のＰＣＲ反応は、一定分量の第１の逆転写反応物、上記第１の外側のアンチセンスプライマーおよび当該プロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ領域における相補的配列に特異的にハイブリダイズするように選択される第１の外側のセンスプライマーを含み、第２のＰＣＲ反応は、一定分量の第２の逆転写反応物、上記第２の外側のアンチセンスプライマーおよび当該プロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ２領域における相補的配列に特異的にハイブリダイズするように選択される第２の外側のセンスプライマーを含み、第３のＰＣＲ反応は、一定分量の第３の逆転写反応物、上記第３の外側のアンチセンスプライマーおよび当該プロトタイプＨＣＶのゲノムの５’ＵＴＲ領域における相補的配列に特異的にハイブリダイズするように選択される第３の外側のセンスプライマーを含み、当該第２の外側のアンチセンスプライマーは、当該第１の外側のセンスプライマーと相補的である領域に対して３’に位置するプロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ領域における配列にハイブリダイズし、当該第３の外側のアンチセンスプライマーは、当該第２の外側のセンスプライマーと相補的である領域に対して３’に位置するプロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ２領域における配列にハイブリダイズする工程、
ｅ）３つの別々のネステッドＰＣＲ反応において工程ｄ）の部分的なｃＤＮＡをさらに増幅する工程であって、第１のネステッドＰＣＲ反応は、一定分量の第１のＰＣＲ反応物、ならびに第１の内側のアンチセンスプライマーおよびセンスプライマーを含み、第２のネステッドＰＣＲ反応は、一定分量の第２のＰＣＲ反応物ならびに第２の内側のアンチセンスプライマーおよびセンスプライマーを含み、第３のネステッドＰＣＲ反応は、一定分量の第３のＰＣＲ反応物ならびに第３の内側のアンチセンスプライマーおよびセンスプライマーを含み、当該内側のプライマーは、当該外側のプライマーと重ならず、当該第２の内側のアンチセンスプライマーは、当該第１の内側のセンスプライマーと相補的である領域に対して３’に位置するプロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ領域における配列とハイブリダイズし、当該第３の内側のアンチセンスプライマーは、当該第２の内側のセンスプライマーと相補的である領域に対して３’に位置するプロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ２領域における配列とハイブリダイズする工程、
ｆ）工程ｅ）のさらに増幅されたｃＤＮＡの配列を解析する工程、ならびに
ｇ）工程ｆ）から得られる配列と、当該プロトタイプＨＣＶの配列とを比較する工程。
【００１０】
別の実施態様では、本発明のアッセイは、特定の抗ＨＣＶ薬または合剤に対するＨＣＶに感染した患者の抵抗性に関連する個体変異および伴性変異を同定し、特徴付け、かつ、抗ＨＣＶ薬の抵抗性に関連するＨＣＶ変異のデータバンクを作成または拡張するために使用される。当該アッセイは、順々に行われる下記の工程を伴う：
ａ）治療の不成功によって示された、患者が処置された抗ＨＣＶ薬または合剤に対する抵抗性を有するＨＣＶを有する患者から採取された試料からウイルスＲＮＡを抽出する工程、
ｂ）当該ＨＣＶの遺伝子型およびサブタイプを決定する工程、
ｃ）３つの別々の逆転写反応において当該ＨＣＶのゲノムの部分的なｃＤＮＡを合成する工程であって、第１の逆転写反応は、同一の遺伝子型およびサブタイプのプロトタイプＨＣＶゲノムの３’ＵＴＲにおける配列に特異的にハイブリダイズするように選択される第１の外側のアンチセンスプライマーから開始し、第２の逆転写反応は、当該プロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ領域における配列に特異的にハイブリダイズするように選択される第２の外側のアンチセンスプライマーから開始し、第３の逆転写反応は、当該プロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ２領域における配列に特異的にハイブリダイズするように選択される第３の外側のアンチセンスプライマーから開始する工程、
ｄ）３つの別々のＰＣＲ反応において工程ｃ）の部分的なｃＤＮＡを第二鎖合成および増幅する工程であって、第１のＰＣＲ反応は、一定分量の第１の逆転写反応物、上記第１の外側のアンチセンスプライマーおよび当該プロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ領域における相補的配列に特異的にハイブリダイズするように選択される第１の外側のセンスプライマーを含み、第２のＰＣＲ反応は、一定分量の第２の逆転写反応物、上記第２の外側のアンチセンスプライマーおよび当該プロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ２領域における相補的配列に特異的にハイブリダイズするように選択される第２の外側のセンスプライマーを含み、第３のＰＣＲ反応は、一定分量の第３の逆転写反応物、上記第３の外側のアンチセンスプライマーおよび当該プロトタイプＨＣＶのゲノムの５’ＵＴＲ領域における相補的配列に特異的にハイブリダイズするように選択される第３の外側のセンスプライマーを含み、当該第２の外側のアンチセンスプライマーは、当該第１の外側のセンスプライマーと相補的である領域に対して３’に位置するプロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ領域における配列にハイブリダイズし、当該第３の外側のアンチセンスプライマーは、当該第２の外側のセンスプライマーと相補的である領域に対して３’に位置するプロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ２領域における配列にハイブリダイズする工程、
ｅ）３つの別々のネステッドＰＣＲ反応において工程ｄ）の部分的なｃＤＮＡをさらに増幅する工程であって、第１のネステッドＰＣＲ反応は、一定分量の第１のＰＣＲ反応物、ならびに第１の内側のアンチセンスプライマーおよびセンスプライマーを含み、第２のネステッドＰＣＲ反応は、一定分量の第２のＰＣＲ反応物ならびに第２の内側のアンチセンスプライマーおよびセンスプライマーを含み、第３のネステッドＰＣＲ反応は、一定分量の第３のＰＣＲ反応物ならびに第３の内側のアンチセンスプライマーおよびセンスプライマーを含み、当該内側のプライマーは、当該外側のプライマーと重ならず、当該第２の内側のアンチセンスプライマーは、当該第１の内側のセンスプライマーと相補的である領域に対して３’に位置するプロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ領域における配列とハイブリダイズし、当該第３の内側のアンチセンスプライマーは、当該第２の内側のセンスプライマーと相補的である領域に対して３’に位置するプロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ２領域における配列とハイブリダイズする工程、
ｆ）工程ｅ）のさらに増幅されたｃＤＮＡの配列を解析する工程、
ｇ）工程ｆ）から得られる配列と、当該プロトタイプＨＣＶの配列とを比較し、変異を同定する工程、ならびに
ｈ）抗ＨＣＶ薬の抵抗性に関連するＨＣＶ変異のデータバンクに、同定された変異を登録する工程。
【００１１】
関連する実施態様では、本発明のアッセイは、施された治療に対するＨＣＶに感染した患者の抵抗性に関連する個体変異および伴性変異を同定し、特徴付けるために利用され、抗ＨＣＶ薬の抵抗性に関連するＨＣＶ変異のデータバンクを利用することで、当該患者のウイルス変異体が、当該患者のさらなる治療に対して抵抗があるとは予想されない別の抗ＨＣＶ薬または合剤を選択できる。当該アッセイは、同定された変異についての抗ＨＣＶ薬の抵抗性に関連するＨＣＶ変異のデータバンクの調査、および当該ＨＣＶが抵抗性を有すると予期されない抗ＨＣＶ薬または合剤の、患者の引き続く治療のための選択を伴う工程によって置き換えられる工程ｈ）以外は、前述の実施態様の工程と同様の工程を含む。
【００１２】
別の実施態様では、前述の実施態様のアッセイは、ＨＣＶに感染している患者のいずれかの薬理学的治療の開始前に、当該患者から採取された試料を分析するために利用される。この分析から得られる情報によって、治療医が、ＨＣＶ変異体または当該患者に存在する変異体に対する抵抗性を有すると予想されない抗ＨＣＶ薬または合剤である、当該患者の治療のための抗ＨＣＶ薬または合剤を選択することが可能になる。
【００１３】
本発明のさらに特定の実施態様は、試料中に存在するＨＣＶ１ｂのゲノムにおける変異を同定するためのアッセイに関する。当該アッセイは、順々に行われる下記の工程を含む：
ａ）当該ＨＣＶを含む試料からウイルスＲＮＡを抽出する工程、
ｂ）当該ＨＣＶの遺伝子型およびサブタイプを決定する工程、
ｃ）ただし、工程ｂ）が、当該ＨＣＶは１ｂ型のものであることを示した場合、３つの別々の逆転写反応において当該ＨＣＶのゲノムの部分的なｃＤＮＡを合成する工程であって、第１の逆転写反応はプライマー  ポリ−Ａから開始し、第２の逆転写反応はプライマー  ＨＣＶ１ｂＯＲ６３１２から開始し、第３の逆転写反応はプライマー  ＨＣＶ１ｂＯＲ３３０６から開始する工程、
ｄ）３つの別々のＰＣＲ反応において工程ｃ）の部分的なｃＤＮＡを第二鎖合成および増幅する工程であって、第１のＰＣＲ反応は、一定分量の第１の逆転写反応物およびプライマー対  ポリ−Ａ／ＨＣＶ１ｂＯＦ６０７４を含み、第２のＰＣＲ反応は、一定分量の第２の逆転写反応物およびプライマー対  ＨＣＶ１ｂＯＲ６３１２／ＨＣＶ１ｂＯＦ１９７７を含み、第３のＰＣＲ反応は、一定分量の第３の逆転写反応物およびプライマー対  ＨＣＶ１ｂＯＲ３３０６／ＨＣＶＯＦ１２９を含む工程、
ｅ）３つの別々のネステッドＰＣＲ反応において工程ｄ）の部分的なｃＤＮＡをさらに増幅する工程であって、第１のネステッドＰＣＲ反応は、一定分量の第１のＰＣＲ反応物およびプライマー対  ＨＣＶ１ｂＩＲ９３３９／ＨＣＶ１ｂＩＦ６１２６を含み、第２のネステッドＰＣＲ反応は、一定分量の第２のＰＣＲ反応物およびプライマー対  ＨＣＶ１ｂＩＲ６２８２／ＨＣＶ１ｂＩＦ２５２３を含み、第３のネステッドＰＣＲ反応は、一定分量の第３のＰＣＲ反応物およびプライマー対  ＨＣＶ１ｂＩＲ２７７０／ＨＣＶＩＦ２７８を含む工程、
ｆ）工程ｅ）のさらに増幅されたｃＤＮＡの配列を解析する工程、および
ｇ）工程ｆ）から得られる配列と、プロトタイプＨＣＶ１ｂの配列とを比較する工程。
【００１４】
別の実施態様では、本発明のアッセイは、特定の抗ＨＣＶ薬または合剤に対するＨＣＶ１ｂに感染した患者の抵抗性に関連する個体変異および伴性変異を同定し、特徴付け、かつ、抗ＨＣＶ薬の抵抗性に関連するＨＣＶ変異のデータバンクを作成または拡張するために使用される。当該アッセイは、順々に行われる下記の工程を伴う：
ａ）患者が治療された、抗ＨＣＶ薬または合剤に対して抵抗性を有するＨＣＶを有する患者から採取された試料からウイルスＲＮＡを抽出する工程、
ｂ）当該ＨＣＶの遺伝子型およびサブタイプを決定する工程、
ｃ）ただし、工程ｂ）が、当該ＨＣＶは１ｂ型のものであることを示した場合、３つの別々の逆転写反応において当該ＨＣＶのゲノムの部分的なｃＤＮＡを合成する工程であって、第１の逆転写反応はプライマー  ポリ−Ａから開始し、第２の逆転写反応はプライマー  ＨＣＶ１ｂＯＲ６３１２から開始し、第３の逆転写反応はプライマー  ＨＣＶ１ｂＯＲ３３０６から開始する工程、
ｄ）３つの別々のＰＣＲ反応において工程ｃ）の部分的なｃＤＮＡを第二鎖合成および増幅する工程であって、第１のＰＣＲ反応は、一定分量の第１の逆転写反応物およびプライマー対  ポリ−Ａ／ＨＣＶ１ｂＯＦ６０７４を含み、第２のＰＣＲ反応は、一定分量の第２の逆転写反応物およびプライマー対  ＨＣＶ１ｂＯＲ６３１２／ＨＣＶ１ｂＯＦ１９７７を含み、第３のＰＣＲ反応は、一定分量の第３の逆転写反応物およびプライマー対  ＨＣＶ１ｂＯＲ３３０６／ＨＣＶＯＦ１２９を含む工程、
ｅ）３つの別々のネステッドＰＣＲ反応において工程ｄ）の部分的なｃＤＮＡをさらに増幅する工程であって、第１のネステッドＰＣＲ反応は、一定分量の第１のＰＣＲ反応物およびプライマー対  ＨＣＶ１ｂＩＲ９３３９／ＨＣＶ１ｂＩＦ６１２６を含み、第２のネステッドＰＣＲ反応は、一定分量の第２のＰＣＲ反応物およびプライマー対  ＨＣＶ１ｂＩＲ６２８２／ＨＣＶ１ｂＩＦ２５２３を含み、第３のネステッドＰＣＲ反応は、一定分量の第３のＰＣＲ反応物およびプライマー対  ＨＣＶ１ｂＩＲ２７７０／ＨＣＶＩＦ２７８を含む工程、
ｆ）工程ｅ）のさらに増幅されたｃＤＮＡの配列を解析する工程、
ｇ）工程ｆ）から得られる配列と、プロトタイプＨＣＶ１ｂの配列とを比較し、変異を同定する工程、および
ｈ）抗ＨＣＶ薬の抵抗性に関連するＨＣＶ変異のデータバンクに、同定された変異を登録する工程。
【００１５】
有用なデータバンクが構築された時点で、同様のアッセイが、未治療のＨＣＶ１ｂに感染した患者、または治療され、かつ、治療計画に対する抵抗性を生じたＨＣＶ１ｂに感染した患者からの試料を分析するために利用でき、それぞれ、治療またはさらなる治療のための適切な抗ＨＣＶ薬または合剤を選択できる。このような実施態様では、すぐ上に記載されたアッセイの工程ｈ）は、同定された変異についての抗ＨＣＶ薬の抵抗性に関連するＨＣＶ変異のデータバンクの調査、および当該ＨＣＶが抵抗性を有すると予期されない抗ＨＣＶ薬または合剤の、患者の引き続く治療のための選択を伴う工程によって置き換えられる。
【００１６】
本発明はまた、ポリ−ＡおよびＨＣＶ１ｂＯＦ６０７４、ＨＣＶ１ｂＯＲ６３１２およびＨＣＶ１ｂＯＦ１９７７、ＨＣＶ１ｂＯＲ３３０６およびＨＣＶＯＦ１２９、ＨＣＶ１ｂＩＲ９３３９およびＨＣＶ１ｂＩＦ６１２６、ＨＣＶ１ｂＩＲ６２８２およびＨＣＶ１ｂＩＦ２５２３、ならびにＨＣＶ１ｂＩＲ２７７０およびＨＣＶＩＦ２７８からなるプライマー対に関する。ＨＣＶゲノム中の変異を検出するためのキットもまた、本発明の対象である。これらのキットは、少なくとも１つの、または全ての上述のプライマー対を含み、さらなる試薬（例えば、ポリメラーゼ、バッファー、およびヌクレオシド三リン酸など）を含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＨＣＶ１ｂ型の例についての本発明のアッセイの部分的なｃＤＮＡの合成および増幅工程を模式的に示す。
【図２】本発明の部分的なｃＤＮＡ増幅方法の感度と、全長ウイルスゲノムの増幅の感度との比較。
【図３ａ】本発明のアッセイによって得られた、２人の感染した患者からの翻訳されたＨＣＶのアミノ酸配列と、プロトタイプＨＣＶゲノムの配列との比較。
【図３ｂ】本発明のアッセイによって得られた、２人の感染した患者からの翻訳されたＨＣＶのアミノ酸配列と、プロトタイプＨＣＶゲノムの配列との比較。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の理解を助けるため、いくつかの用語が下記で定義される。
【００１９】
用語「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、増幅され、または検出されるプライマーおよびオリゴマー断片を指し、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）（ＤＮＡとも命名される）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）（ＲＮＡとも命名される）、および、プリンもしくはピリミジン塩基のＮ  グリコシド、または修飾されたプリンもしくはピリミジン塩基のＮ  グリコシドであるいずれかの他のタイプのポリヌクレオチドの総称であるものとする。用語「核酸」と「オリゴヌクレオチド」との間の長さにおける意図された区別はなく、これらの用語は、互換的に使用される。これらの用語は、当該分子の一次構造のみを指す。従って、これらの用語は、二本鎖および一本鎖のＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖のＲＮＡを含む。
【００２０】
用語「ｃＤＮＡ」は、ＲＮＡ依存性  ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼの作用によりＲＮＡ鋳型から合成されたＤＮＡである相補的なＤＮＡを指す。これらの用語は、二本鎖および一本鎖の相補的なＤＮＡを含む。
【００２１】
オリゴヌクレオチドは、例えば、適切な配列のクローニングおよび切断、ならびに、Ｎａｒａｎｇら（１９７９）（Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ６８、９０−９９）のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎら（１９７９）（Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ６８、１０９−１５１）のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２２、１８５９−１８６２）のジエチルホスホルアミダイト法；および米国特許第４，４５８，０６６号明細書の固体担体法などの方法による直接的な化学合成を含む、いずれかの適した方法によって調製することができる。
【００２２】
用語「ハイブリダイゼーション」および「ハイブリダイズ」は、相補的な塩基対形成による、２本の一本鎖の核酸による二本鎖構造の形成を指す。ハイブリダイゼーションは、完全に（正確に）相補的な核酸鎖の間、またはミスマッチの微小領域を含む「実質的に相補的な」核酸鎖の間で生じる可能性がある。完全に相補的な核酸鎖のみがハイブリダイズする条件は、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」と呼ばれる。実質的に相補的な配列の安定な二本鎖は、ストリンジェンシーが少ないハイブリダイゼーション条件下で達成できる。核酸技術の当業者は、当該技術分野によって与えられる手引きに従って、経験的に、二本鎖の安定性を特定することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー研究所（ニューヨーク州、コールド・スプリング・ハーバー）を参照）。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨでの、特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）（ｔｈｅｒｍａｌ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）よりも約５℃低くなるように選択される。このＴｍは、塩基対の５０％が解離する（規定のイオン強度およびｐＨ下での）温度である。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの緩和によって、配列のミスマッチを許容することになるだろう。許容されるミスマッチの程度は、ハイブリダイゼーション条件の適した調整によって制御できる。正確に相補的な核酸鎖および実質的に相補的な核酸鎖の両方のハイブリダイゼーションは、本願明細書において、「特異的」と呼ばれる。
【００２３】
用語「プライマー」は、核酸鎖と相補的なプライマー伸張産物の合成が誘導される条件下、すなわち、適切なバッファー中の、適した温度での、４つの異なるヌクレオシド三リン酸および重合のための薬剤（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）の存在下でのＤＮＡ合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、好ましくは、一本鎖のオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーの適切な長さは、プライマーの目的とする用途に依存するが、典型的に、約１５〜約３５ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は、一般的に、十分に安定なハイブリッド複合体を鋳型と形成するために、より冷たい温度を必要とする。プライマーは、鋳型核酸の正確な配列を反映する必要はないが、鋳型とハイブリダイズするために、十分に相補的でなければならない。プライマーは、当該プライマーを検出または固定化できるが、当該プライマーの基本的な特性、ＤＮＡ合成の開始点としての作用の基本的な特性を変化させないさらなる特徴を包含することができる。ハイブリダイズする鋳型と十分に相補的であるプライマーの領域は、本願明細書においては、ハイブリダイズ領域と呼ばれる。
【００２４】
本願明細書で使用される「センス」プライマーまたは「上流」プライマーは、その伸長産物がコード鎖のサブシーケンスであるプライマーを指す。「アンチセンス」プライマーまたは「下流の」プライマーは、その伸長産物が相補的な非コード鎖のサブシーケンスであるプライマーを指す。
【００２５】
用語「外側のプライマー」（単数または複数）は、核酸の伸長を逆転写または最初に増幅するために使用される第１のプライマーまたはプライマー対を指す。用語「内側のプライマー」（単数または複数）は、最初の増幅産物をさらに増幅するために使用されるプライマーまたはプライマー対を指す。内側のプライマーは、対応する外側のプライマーと、著しい配列の相同性を共有せず、内側のプライマーによる増幅は、典型的に、最初の増幅産物よりもわずかに短い二次増幅産物を生じる。
【００２６】
本願明細書で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、オリゴヌクレオチドと標的配列との間に存在するミスマッチの数が、オリゴヌクレオチドと非標的配列との間に存在するミスマッチの数よりも少ない場合、標的配列に対して「特異的」である。ハイブリダイゼーション条件は、存在するミスマッチの数が、オリゴヌクレオチドと標的配列との間に存在するミスマッチの数以下である場合のみに、安定な二本鎖が形成されるものを選択できる。このような条件下では、標的特異的なオリゴヌクレオチドは、標的配列とのみ、安定な二本鎖を形成することができる。適切にストリンジェントな増幅条件下での標的特異的なプライマーの使用によって、標的プライマー結合部位を含むこれらの標的配列の特異的な増幅が可能になる。
【００２７】
用語「標的領域」および「標的核酸」は、増幅され、あるいは分析される核酸の領域を指す。プライマーがハイブリダイズする配列は、「標的」と呼ぶことができる。
【００２８】
用語「変異体」または「ＨＣＶ変異体」は、ウイルスタンパク質産物における少なくとも１つのアミノ酸変化を引き起こす少なくとも１つの変異の存在だけが対応するプロトタイプウイルスのゲノムと異なるゲノムを有するＨＣＶを指す。従って、用語「変異」は、少なくとも１つのアミノ酸がプロトタイプウイルスのウイルスタンパク質産物と異なるウイルスタンパク質産物をもたらす変異体のゲノムにおけるこのような変化を指す。
【００２９】
用語「プロトタイプウイルス」または「プロトタイプＨＣＶ」は、本発明のアッセイにおいて生じたウイルス配列が比較され、当該アッセイにおいて使用されるｃＤＮＡの合成プライマー、増幅プライマーおよびシークエンス用プライマーの設計のための基礎としての役割を果たす参照ゲノムを与える参照ＨＣＶウイルスを意味する。プロトタイプウイルスは、特定のウイルス分離株を指す可能性がある。あるいは、これは、複数のウイルス分離株のゲノム配列の比較から生じるコンセンサスゲノムを含む仮定上のＨＣＶウイルスを指す可能性がある。１つのこのようなプロトタイプウイルスである、ＨＣＶ株  Ｈ７７（ジェンバンク受入番号  ＡＦ０１１７５１）は、ＨＣＶ１ｂ  プライマーを設計するために実施例１において使用された。ＨＣＶ  ｃｏｎ１（ジェンバンク受入番号  ＡＪ２３８７９９）は、実施例３のアッセイにおいて、プロトタイプＨＣＶ１ｂのゲノム配列として使用された。当業者ならば、他の遺伝子型およびサブタイプについてのプロトタイプＨＣＶ配列を選択する方法が分かるだろう。例えば、ＨＣＶ株  ＨＣ−Ｊ６（ジェンバンク受入番号  Ｄ００９４４）またはＪＦＨ１（ジェンバンク受入番号  ＡＢ０４７６３９）は、プロトタイプＨＣＶ  ２ａであると考えられる可能性がある。
【００３０】
用語「疑似種」は、感染した患者において頻繁に存在する同一の遺伝子型およびサブタイプの、高度に関連したＨＣＶの群に関する。
【００３１】
用語「抗ＨＣＶ薬または合剤」は、それぞれ、少なくとも一部の、ＨＣＶに感染した患者におけるＨＣＶのウイルス量またはウイルス価を減少させることができるいずれかの薬物または合剤を指す。特に、これらの用語はまた、それぞれ、少なくとも一部の、ＨＣＶに感染した患者におけるＨＣＶのウイルス量またはウイルス価を実質的に、または顕著に減少させることができるいずれかの薬物または合剤を指す。抗ＨＣＶ薬としては、ＨＣＶの複製阻害剤（ポリメラーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤およびシクロフィリン阻害剤など）、免疫反応修飾因子または宿主応答修飾因子、ウイルス侵入阻害剤および宿主因子阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
用語「抗ＨＣＶ薬の抵抗性に関連するＨＣＶ変異のデータバンク」は、いずれかの抗ＨＣＶ薬または合剤に対する抵抗性（抵抗性は、ウイルス量を実質的に減少させる抗ＨＣＶ薬または合剤による治療の過程の不成功（治療の不成功とも呼ばれる）によって示される）に関連する変異を、いずれかの形態で編集したものを指す。このようなデータバンクは、当該技術分野で入手できる情報、または当該技術分野で入手できるようになる情報、および、本発明のアッセイを利用して行われる、薬剤抵抗性の、感染した患者からの試料の分析から得られる情報を使用して構築される可能性がある。
【００３３】
現在利用できるアッセイは、ＨＣＶ変異体の集団のメンバーが患者に存在するかどうか（疑似種）、または優勢な変異体が特定の抗ＨＣＶ薬、または抗ＨＣＶ薬の併用による治療に対して抵抗性であるかどうかについてさえも示さない。さらに、これらの試験は、ウイルスのゲノム内のどの個体変異、伴性変異またはフィンガープリントが、特定の抗ＨＣＶ治療に対するウイルスの抵抗性と関連するかを特定しない。ＨＣＶに対する大部分の治療は、非常に高価であり、かつ、長期にわたる。利用される特定の抗ＨＣＶ薬または合剤に対して先天的に抵抗性であるかどうかを知らずに、ＨＣＶに感染した患者を治療すると、高いレベルでウイルスが存在し続ける結果、および抗ＨＣＶ治療の二次的効果（毒性）によって、患者に副作用をもたらす可能性がある。
【００３４】
特定の抗ＨＣＶ薬または合剤に対する抵抗性と関連する、特定の遺伝子型および／もしくはサブタイプの完全な、またはほぼ完全なＨＣＶゲノムにおける変異を特徴付けるための診断上のアッセイは、当業者（すなわち、病院または医療施設の、医師、臨床医または看護師）にとっての長年にわたるニーズである。本発明は、このようなアッセイを提供する。当該アッセイは、類似する長さの３つの重複ＤＮＡ断片としての、ＨＣＶゲノムの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による増幅物に依存している。発明者らは、３つの断片としてのゲノムの増幅物は、当該アッセイの感度についてのニーズと、ウイルスの変異配列を選択することの回避との間の最良の折衷を表わしていることを見出した。限度内で、当該アッセイの感度は増幅される別々の断片の数とともに増加し、一方、選択を最小限にするには、増幅される別々の断片の数を減少させることが必要となる。本発明のアッセイは高感度であり、全長ウイルスゲノムの逆転写および増幅に基づくアッセイと対照的に、非常に低いウイルス量を有する患者から採取された試料からのＨＣＶゲノムの検出および分析を可能にする。
【００３５】
本発明のアッセイは、特定の抗ＨＣＶ薬に対する抵抗性に関連する変異のデータバンクの系統的な構築を可能にし、有用なデータセットが構築された時点で、特定の抗ＨＣＶ薬（単数または複数）による治療に対して抵抗性を有するＨＣＶ変異体の感染した患者における存在を特定するための予後のアッセイとして利用できる。このような情報に基づき、治療前の患者に既に存在する検出可能なＨＣＶ変異体の薬剤抵抗性によって妨害されない、感染した患者の治療のための適切な抗ＨＣＶ薬または合剤を選択することが可能になる。さらに、特定の治療法が選択され、かつ、患者の治療が開始した時点で、当該患者から単離されたウイルスを感染細胞培養モデルに導入することがき、当該患者に使用される薬物または合剤の選択圧下で、数回の複製を起こすことができる。次いで、本発明のアッセイは、増幅がこのような増幅の前に検出することができない少数の薬剤抵抗性の変異体を出現させたかどうかを特定するために、選択されたウイルス集団において行うことができる。得られる結果は、患者に施された薬物療法を迅速に順応させ、または変化させるために利用できる。
【００３６】
ウイルス量の測定に加えて、本発明のアッセイは、抗ＨＣＶ薬または合剤で治療された患者における薬剤抵抗性の発生をモニターするために利用することができる。ウイルスは、治療の過程の終了時点、または治療中の様々な時点で単離され、本発明のアッセイを使用して分析される。公知の耐性変異または一連の伴性変異を含む主要な変異体の検出は、ウイルス量の決定とは別に、当該治療法は、別の治療法に順応される必要がある、または置き換えられる必要があるという指標を与えるだろう。変異の上記のデータバンクは、順応された治療法または別の治療法の選択について、治療医を支援するだろう。
【００３７】
本発明のアッセイは高感度であり、１つの手順によって、１つ以上の抗ＨＣＶ薬のいずれかの組み合わせによる治療に対する抵抗性に関連するＨＣＶゲノム中において基本的にどこにでも生じる、個体変異または伴性変異の検出を可能にする。
【００３８】
本発明の実行においては、他に指定がない限り、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、ポリペプチドおよび核酸の合成、ならびに免疫学の従来技術（これらは当該技術分野における技能の範囲内である）を利用する。このような技術は、文献において十分に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー研究所（ニューヨーク州、コールド・スプリング・ハーバー）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −  ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第１巻および第２巻（Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ、編集、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ、編集、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ、編集、１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ、編集、１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  −  ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、編集、１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  −  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｊ．Ｗｏｏｄｗａｒｄ、編集、１９８５）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（ニューヨーク州、ニューヨーク）；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、第１５４巻（Ｒ．ＷｕおよびＬ．Ｇｒｏｓｓｍａｎ、編集、１９８７）および第１５５巻（Ｒ．Ｗｕ、編集、１９８７）を含む；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ、編集、１９８７）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｒ．Ｊ．ＭａｙｅｒおよびＪ．Ｈ．Ｗａｌｋｅｒ、編集、１９８７）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  −  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｒ．Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ、１９８７）；ならびにＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１−４巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、編集、１９８６）を参照。
【００３９】
最も一般的な実施態様では、本発明は、試料に存在するＨＣＶ変異体のゲノム中の単一変異および伴性変異を同定し、特徴付けることができるアッセイに関し、当該アッセイは連続的に行われる下記の工程を含む：
工程１：ＨＣＶを含む試料からウイルスＲＮＡを抽出する工程、
工程２：当該ＨＣＶの遺伝子型およびサブタイプを決定する工程、
工程３：３つの別々の逆転写反応において当該ＨＣＶのゲノムの部分的なｃＤＮＡを合成する工程であって、第１の逆転写反応は、同一の遺伝子型およびサブタイプのプロトタイプＨＣＶの３’ＵＴＲにおける配列に特異的にハイブリダイズするように選択される第１の外側のアンチセンスプライマーから開始し、第２の逆転写反応は、当該プロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ領域における配列に特異的にハイブリダイズするように選択される第２の外側のアンチセンスプライマーから開始し、第３の逆転写反応は、当該プロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ２領域における配列に特異的にハイブリダイズするように選択される第３の外側のアンチセンスプライマーから開始する工程、
工程４：３つの別々のＰＣＲ反応においてＨＣＶのゲノムの部分的なｃＤＮＡを第二鎖合成および増幅する工程であって、第１のＰＣＲ反応は、一定分量の第１の逆転写反応物、上記第１の外側のアンチセンスプライマーおよびプロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ領域における配列の補完物に特異的にハイブリダイズするように選択される第１の外側のセンスプライマーを含み、第２のＰＣＲ反応は、一定分量の第２の逆転写反応物、上記第２の外側のアンチセンスプライマーおよびプロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ２領域における配列の補完物に特異的にハイブリダイズするように選択される第２の外側のセンスプライマーを含み、第３のＰＣＲ反応は、一定分量の第３の逆転写反応物、上記第３の外側のアンチセンスプライマーおよびプロトタイプＨＣＶのゲノムの５’ＵＴＲ領域における配列の補完物に特異的にハイブリダイズするように選択される第３の外側のセンスプライマーを含み、当該第２の外側のアンチセンスプライマーは、当該第１の外側のセンスプライマーと相補的である領域に対して３’に位置するプロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ領域における配列にハイブリダイズし、当該第３の外側のアンチセンスプライマーは、当該第２の外側のセンスプライマーと相補的である領域に対して３’に位置するプロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ２領域における配列にハイブリダイズする工程、
工程５：３つの別々のネステッドＰＣＲ反応において工程４の部分的なｃＤＮＡをさらに増幅する工程であって、第１のネステッドＰＣＲ反応は、一定分量の第１のＰＣＲ反応物、ならびに第１の内側のアンチセンスプライマーおよびセンスプライマーを含み、第２のネステッドＰＣＲ反応は、一定分量の第２のＰＣＲ反応物、ならびに第２の内側のアンチセンスプライマーおよびセンスプライマーを含み、第３のネステッドＰＣＲ反応は、一定分量の第３のＰＣＲ反応物ならびに第３の内側のアンチセンスプライマーおよびセンスプライマーを含み、当該内側のプライマーは、当該外側のプライマーと重ならず、当該第２の内側のアンチセンスプライマーは、第１の内側のセンスプライマーと相補的である領域に対して３’に位置するプロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ領域における配列とハイブリダイズし、当該第３の内側のアンチセンスプライマーは、第２の内側のセンスプライマーと相補的である領域に対して３’に位置するプロトタイプＨＣＶのゲノムのＮＳ２領域における配列とハイブリダイズする工程、
工程６：工程５のさらに増幅されたｃＤＮＡの配列を解析する工程、および
工程７：得られる配列と、プロトタイプＨＣＶの配列とを比較する工程。
【００４０】
さらに特定の実施態様では、本発明は、抗ＨＣＶ薬または合剤による治療を受けている患者から採取された試料中の、抗ＨＣＶ薬または合剤に対して抵抗性を有するＨＣＶ変異体のゲノム中の単一変異および伴性変異を同定し、かつ特徴付けることができるアッセイに関する。当該アッセイは、連続的に行われる下記の工程を含む：
工程１：患者が処置された抗ＨＣＶ薬または合剤に対して抵抗性を有するＨＣＶを有する患者から採取されたウイルスＲＮＡを抽出する工程、
工程２−６は上記アッセイと同様であり、
工程７：工程６において得られる配列とプロトタイプＨＣＶのゲノムの配列とを比較し、変異を同定する工程、および
工程８：抗ＨＣＶ薬の抵抗性に関連する変異のデータバンクに、同定された変異を登録する工程。
【００４１】
薬剤抵抗性に関連する変異の有用なデータバンクが確立された時点で、本発明はまた、工程８が、同定された変異についてのデータバンクの調査、および患者の引き続く治療のための、ＨＣＶが抵抗性を有すると予期されない別の抗ＨＣＶ薬または合剤の選択からなること以外は、直前に記載されたアッセイと同一のアッセイにも関する。
【００４２】
本発明の後者のアッセイはまた、ＨＣＶに感染している患者のいずれかの薬理学的治療の開始前に、当該患者から採取された試料について行われてもよい。当該アッセイからの結果によって、医師は、患者が感染したＨＣＶが抵抗性を有さない抗ＨＣＶ薬または合剤を選択することができる。患者が、優性変異体および複数の微量変異体を含むＨＣＶの疑似種に頻繁に感染することが理解される。当該アッセイは、主に、優性変異体に存在する変異を明らかにする。微量変異体に存在する変異も発見できるかどうかは、複数の要因（特に、微量変異体の相対的な存在量、および利用されるシークエンシング技術）に依存する。微量変異体における変異は、微量変異体の相対的な存在量が少なくとも約２０％である場合、ルーチンキャピラリーシークエンシング、すなわち、標準的な自動化されたシークエンシングによって同定可能であるはずである。変異体の発現量がより低い場合、高度なシークエンシングの方法論（合成による高処理量のシークエンシング技術など）は、変異の情報を得るために利用される必要がある。このようなシークエンシングの技術は、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社（カリフォルニア州、サンディエゴ）、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（コネチカット州、ブランフォード）およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（カリフォルニア州、フォスターシティ）によって開発された。シークエンシングの設備およびサービスは、市販されている。
【００４３】
ＨＣＶ１ｂ変異体を含む試料とともに使用するためのアッセイの特定の実施態様は、下記に示され、実施例の項においてさらに記載される。１つのこのようなアッセイは、順々に行われる下記の工程を含む：
工程１：ＨＣＶを含む試料からウイルスＲＮＡを抽出する工程、
工程２：当該ＨＣＶの遺伝子型およびサブタイプを決定する工程、
工程３：ただし、工程２でＨＣＶが１ｂ型のものであることが示された場合、３つの別々の逆転写反応において当該ＨＣＶのゲノムの部分的なｃＤＮＡを合成する工程であって、第１の逆転写反応はプライマー  ポリ−Ａから開始し、第２の逆転写反応はプライマー  ＨＣＶ１ｂＯＲ６３１２から開始し、第３の逆転写反応はプライマー  ＨＣＶ１ｂＯＲ３３０６から開始する工程、
工程４：３つの別々のＰＣＲ反応においてＨＣＶのゲノムの部分的なｃＤＮＡを第二鎖合成および増幅する工程であって、第１のＰＣＲ反応は、一定分量の第１の逆転写反応物およびプライマー対  ポリ−Ａ／ＨＣＶ１ｂＯＦ６０７４を含み、第２のＰＣＲ反応は、一定分量の第２の逆転写反応物およびプライマー対  ＨＣＶ１ｂＯＲ６３１２／ＨＣＶ１ｂＯＦ１９７７を含み、第３のＰＣＲ反応は、一定分量の第３の逆転写反応物およびプライマー対  ＨＣＶ１ｂＯＲ３３０６／ＨＣＶＯＦ１２９を含む工程、
工程５：３つの別々のネステッドＰＣＲ反応において工程４の部分的なｃＤＮＡをさらに増幅する工程であって、第１のネステッドＰＣＲ反応は、一定分量の第１のＰＣＲ反応物およびプライマー対  ＨＣＶ１ｂＩＲ９３３９／ＨＣＶ１ｂＩＦ６１２６を含み、第２のネステッドＰＣＲ反応は、一定分量の第２のＰＣＲ反応物およびプライマー対  ＨＣＶ１ｂＩＲ６２８２／ＨＣＶ１ｂＩＦ２５２３を含み、第３のネステッドＰＣＲ反応は、一定分量の第３のＰＣＲ反応物およびプライマー対  ＨＣＶ１ｂＩＲ２７７０／ＨＣＶＩＦ２７８を含む工程、
工程６：工程５のさらに増幅されたｃＤＮＡの配列を解析する工程、および
工程７：得られる配列とプロトタイプＨＣＶ１ｂの配列とを比較する工程。
【００４４】
患者が受けた治療に対して抵抗性を有するＨＣＶ１ｂを有する患者から得られる試料とともに使用するための、別のこのようなアッセイは、順々に行われる下記の工程を含む：
工程１：患者が処置された抗ＨＣＶ薬または合剤に対して抵抗性を有するＨＣＶに感染した患者から採取された試料からウイルスＲＮＡを抽出する工程、
工程２−６は、前述のアッセイと同様であり、
工程７：工程６において得られる配列とプロトタイプＨＣＶのゲノムの配列とを比較し、変異を同定する工程、および
工程８：抗ＨＣＶ薬の抵抗性に関連する変異のデータバンクに、同定された変異を登録する工程。
【００４５】
薬剤抵抗性に関連するＨＣＶ１ｂ  変異の有用なデータバンクが作成された時点で行うことができる同様のアッセイは、工程８が、特定された変異についての最新のデータバンクの調査、および患者の引き続く治療のための、当該ＨＣＶが抵抗性を有すると予期されない、別の抗ＨＣＶ薬または合剤の選択からなること以外は、直前に記載されたアッセイと同一である。
【００４６】
上記アッセイはまた、ＨＣＶに感染している患者のいずれかの薬理学的治療の開始前に、当該患者から採取された試料において行われてもよい。患者のＨＣＶが１ｂ型のものである場合、当該アッセイからの結果によって、医師は、患者が感染しているＨＣＶが抵抗性を有さない抗ＨＣＶ薬または合剤を選択することが可能になるだろう。
【００４７】
上記ＨＣＶ１ｂ特異的なアッセイの主要な態様はまた、図１および実施例の項において示される。ｃＤＮＡ合成プライマーおよび増幅プライマー、ならびに一連の提案されたシークエンシング用プライマーのヌクレオチド配列は、表１において与えられる。
【００４８】
【表１】
0005607532.tif 000002
0005607532.tif 000003
0005607532.tif 000004
【００４９】
本発明の他の特定の実施態様は、他の遺伝子型およびサブタイプのＨＣＶ（特に、ＨＣＶ１ａ、ＨＣＶ２およびＨＣＶ３）に感染した患者から得られた試料とともに使用するための同様のアッセイに関する。当業者ならば、プロトタイプウイルスのゲノム配列への参照により、本発明の方法の適切なｃＤＮＡ合成プライマーおよび増幅プライマー、ならびにシークエンシング用プライマーを設計するための方法が分かるだろう。
【００５０】
試料は、ＨＣＶに感染した患者、またはＨＩＶおよびＨＣＶに同時感染した患者の血液試料からなっていてもよく（しかしこれらに限定されない）、この試料は、抗ＨＣＶ薬または合剤による治療の過程の前、治療の過程中、または治療の過程の後における患者から採取されてもよい。本発明のアッセイは、他の用途のために使用されてもよい。例えば、患者からの試料に存在するＨＣＶ変異体は、感染性ＨＣＶベクターにクローン化され、哺乳類細胞に形質導入されてもよい（Ｋａｔｏら（２００７）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８１、４４０５−４４１１）。ＨＣＶ変異配列を含む感染性ウイルスは、その後、哺乳類の培養物を感染させるのに使用できる可能性があり、抗ＨＣＶ薬もしくは合剤の存在または不存在下での１以上のサイクルの感染後に得られる試料は、本発明のアッセイによって分析できる可能性がある。
【００５１】
試料からのＨＣＶ  ＲＮＡ抽出は、市販のキット（例えば、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｕｔｒａｌｓｅｎｓ（商標）ウイルスキット、トリゾール試薬（インビトロジェン）、またはＶｉｖａｓｐｉｎ濃縮）の使用を含む様々な方法によって行われてもよい。
【００５２】
当該アッセイの一部である逆転写反応およびＰＣＲ反応は、実施例および本願明細書において引用される参考文献に記載されたような標準的な反応混合物および条件を使用して行われる。典型的に、試料から抽出される核酸は、工程４のＰＣＲ反応における２０−４０の増幅サイクル、および工程５のネステッドＰＣＲ反応における２−１０サイクルにかけられる。
【００５３】
本願明細書において引用された全ての出版物および特許は、参照によってその全体が組み込まれるものとみなされるものとする。
【００５４】
本発明は、下記実施例によってさらに詳述される。当該実施例は、当業者に対する説明の目的で与えられ、請求項に記載される本発明の範囲が限定されることは意図されていない。従って、本発明は、与えられた実施例に限定されるように解釈されるべきではなく、本願明細書において与えられる教示の結果として明らかになるいずれかの変異性、および全ての変異性を含むように解釈されるべきである。
【実施例】
【００５５】
（実施例１：本発明のアッセイにおいて使用される詳細な方法）
【００５６】
試料：未治療の患者からの血漿試料を、２つの異なる病院から得た。ウイルス量は、ＨＣＶ  Ｖｉｒａｌ  Ｌｏａｄ  ＣＯＢＡＳ  ＡＭＰＬＩＣＯＲ  ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ・モレキュラー・ダイアグノスティックス（スイス、バーゼル）製）を使用して測定した。
【００５７】
試料を、ＩｎｎｏＬｉｐａ  ｔｅｓｔ（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、ベルギー、ズウェイナールデ）によって特定された１ｂ型のＨＣＶの存在に基づいて選択した。遺伝子型を確認するため、１セットの外側のプライマー対によるｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ増幅後、当該プライマーのうちの１つによってシークエンシングを行った。得られた配列について、Ｏｘｆｏｒｄ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＨＣＶ  Ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ  ｔｏｏｌを使用して、遺伝子型およびサブタイプを同定した（Ｄｅ  Ｏｌｉｖｅｉｒａら（２００５）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２１、３７９７−３８００）。
【００５８】
プライマーの選択および合成：逆転写、ＰＣＲ増幅およびシークエンシングのためのプライマーを、ＯＬＩＧＯ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｅｄｐｒｏｂｅ、ノルウェー、オスロ）を使用して開発した。アラインメントされたほぼ全長のゲノム配列を、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  ＨＣＶ  ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｈｃｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ／ＨＣＶ／ＴｏｏｌｓＯｕｔｌｉｎｅ．ｈｔｍｌ）からダウンロードした。ＨＣＶ１ｂのプライマー配列は、表１において与えられる。当該プライマーは、Ａｐｐｌｅｒａ  Ｅｕｒｏｐｅ（ベルギー、レニク）で合成した。
【００５９】
ＲＮＡ抽出：ＲＮＡ抽出は、ＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（キアゲン（オランダ、ルースデン、ヴェストブルグ）製）を使用し、製造者の手順書に従って行った。
【００６０】
ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ増幅：ＲＮＡを、３つの別々の反応（３つの外側のアンチセンスプライマーによって開始した）において、ロシュ（ロシュ・ダイアグノスティックス（ドイツ、マンハイム））製のＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  ＲＴを用いて逆転写した。第１に、２．５μＭの外側のアンチセンスプライマーおよび１０μｌのＲＮＡを、マイクロチューブ中で、５分間、６５℃で変性させ、即座に冷却した（ｓｎａｐ−ｃｏｏｌｅｄ）。次に、逆転写混合物を２０μｌの最終量にした。当該混合物は、下記のさらなる成分を含む：１×Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  ＲＴ−ｂｕｆｆｅｒ、１ｍＭ  ｄＮＴＰ、２０ＵのＰｒｏｔｅｃｔｏｒ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、１０ＵのＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、およびＭｉｌｌｉＱ水。ｃＤＮＡ合成を５０℃で９０分間行い、次いで、反応物を４℃まで冷却した。ＰＣＲ増幅を、Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ・ダイアグノスティックス（ドイツ、マンハイム）製）を使用して、２工程で行った。第１のセットのＰＣＲを、下記の条件下で行った：５０μｌの最終量中、１×Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  １、０．３５０ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．３μＭ  外側のセンスプライマー、０．３μＭ  外側のアンチセンスプライマー、３．７５Ｕ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡポリメラーゼ、５μｌ  鋳型ｃＤＮＡ、およびＭｉｌｌｉＱ水。変性工程（９４℃、２分間）の後、１０秒、９４℃、３０秒、５７℃、および４分間、６８℃を１０サイクル行った。この増幅の後、２０秒／サイクルの時間増分（ｔｉｍｅ  ｉｎｃｒｅｍｅｎｔ）で、１５秒、９４℃、３０秒、５７℃、および４分間、６８℃で２５サイクル行い、７分間、６８℃で最終的な伸長工程を行った。次いで、当該反応物を４℃まで冷却した。第２のセットのＰＣＲを下記の条件下で行った：５０μｌの最終量中、１×Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  １、０．３５０ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．３μＭ  内側のセンスプライマー、０．３μＭ  内側のアンチセンスプライマー、３．７５Ｕ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡポリメラーゼ、２μｌの第１のセットのＰＣＲからの増幅産物、およびＭｉｌｌｉＱ水。サイクル条件は、３サイクルのみを行ったこと以外は、第１のセットのＰＣＲのものと同一であった。
【００６１】
ゲル電気泳動：ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分析した。７．５μｌのＰＣＲ産物を１．５％  アガロースゲル上にロードし、電気泳動を１００Ｖで行った。ＤＮＡ断片を視覚化するため、ゲルを、１０分間エチジウムブロマイドで染色した。
【００６２】
ＰＣＲ産物の精製：Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン（オランダ、ライデン、ヴェストブルグ）製）を使用し、製造者の手順書に従って、ＰＣＲ産物を精製した。精製されたＰＣＲ産物の濃度を分光測定で測定した。シークエンシング反応には、約２ｎｇ／１００ｂｐのＤＮＡが必要だった。
【００６３】
ヌクレオチドのシークエンシング：シークエンシング反応は、Ｆａｓｔｅｒｉｓ  ＳＡ（スイス、ジュネーブ）で、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社、米国、フォスターシティ）を使用して行った。コンティグを集め、データをＳｅｑｓｃａｐｅ（アプライドバイオシステムズ社、米国、フォスターシティ）で分析した。
【００６４】
（実施例２：本発明のアッセイの検証：ＰＣＲの成功率、ならびに本発明のアッセイの再現性および感度）
【００６５】
ＨＣＶ１ｂ含有試料から得たほぼ全ウイルスゲノムを示す３つの重複ＰＣＲ産物の、視覚化でき、かつシークエンスできる量を得る成功率は、Ｉｎｎｏ−ＬｉＰＡ  ＨＣＶ  ＩによってＨＣＶ１ｂとして最初に遺伝子型を同定された、感染した患者から得た６０の試料を使用して測定した。遺伝子型／サブタイプは、多義的な結果を有する試料についてのシークエンシングおよび系統発生解析によって再度分析した。
【００６６】
当該アッセイの再現性を、確認された遺伝子型  １ｂの試料のトリプリケートの試験によって、部分的なゲノムＰＣＲのそれぞれについて評価した。３回繰り返した試験のうち少なくとも２つは、血漿試料から開始して行った。例外的に、３番目の繰り返し試験は、不十分な血漿量の試料についての抽出されたＲＮＡから開始した。
【００６７】
当該アッセイの感度を１０の試料で検証した。
【００６８】
当該アッセイの特異性は、８試料という一部から生じたＰＣＲ産物の部分的なシークエンシングによって評価した。全ての配列は、ＨＣＶ１ｂまたはＨＣＶ１ａのいずれかであった。これらの分析の結果を下記表２にまとめた。感度測定の結果の例は図２に示す。
【００６９】
表２に示されるデータは、ＰＣＲの成功率が、サブタイプの補正後に１００％に近づいたことを示す。当該アッセイは、ＨＣＶの遺伝子型１に特異的であった。良好な再現性が認められた。感度は、５’ＵＴＲ−ＮＳ２領域およびＮＳ２−ＮＳ５Ａ領域について優れており、ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ｂ領域については許容できるものだった。
【００７０】
【表２】
0005607532.tif 000005
【００７１】
（実施例３：本発明のアッセイによる、未治療のＨＣＶに感染した患者からの試料の分析）
【００７２】
未治療のＨＣＶに感染した患者の一定分量の血漿試料を本発明のアッセイ（請求項５のアッセイ）によって分析した。シークエンシング後に得た核酸配列をアミノ酸に自動的に翻訳し、（ＥＢＩｓｉｔｅの）ｃｌｕｓｔａｌｗ２．０  ｐｒｏｇｒａｍを使用して、ＨＣＶ１ｂ  コンセンサス配列、ＨＣＶ  ｃｏｎ１（ジェンバンク受入番号  ＡＦ０１１７５１）と比較／アラインメントした。配列  ５３０６および５４１５は、２人の未治療の感染した患者に由来する。当該２人の患者に存在するＨＣＶ由来の翻訳されたアミノ酸配列を、図３ａおよび図３ｂ中のｃｏｎ１  配列と比較する。コンセンサス配列との配列の同一性は、感染した患者由来の配列中のダッシュによって示す。各ウイルスタンパク質についてのコード配列の起点を示す（ＣＯＲＥ、Ｅ１、Ｅ２、Ｐ７、ＮＳ２，ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂ）。
【００７３】
未処置の感染した患者に存在するＨＣＶ由来のアミノ酸配列は、ＩＦＮ／リバビリン治療に対する抵抗性に関連するコアタンパク質中の変異  Ｌ９１Ｍ、および非ヌクレオシド阻害剤またはベンゾイミダゾール化合物に対する抵抗性に関連するＮＳ５Ｂ中の変異  Ｖ４９９Ａの存在を明らかにする。関連する、公表された情報については表３を参照。
【００７４】
【表３】
0005607532.tif 000006
【図１】
0005607532.tif 000007
【図２】
0005607532.tif 000008
【図３ａ】
0005607532.tif 000009
【図３ｂ】
0005607532.tif 000010
【配列表】
0005607532000001.app