(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の塩基配列からなる核酸。
【請求項２】
配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸。
【請求項３】
１０塩基以上のヌクレオチド長を有し、配列番号１の塩基配列又はその塩基配列に相補的な塩基配列の部分塩基配列を含み、請求項１又は２に記載の核酸に特異的にハイブリダイゼーションできるポリヌクレオチドであって、配列番号１８〜３８のいずれかの塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項４】
５０塩基以下のヌクレオチド長を有する請求項３記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１の塩基配列もしくはその相補的な配列またはそれらの部分配列を含む核酸を検出する方法であって、請求項３又は４に記載のポリヌクレオチドを下記の組み合わせのいずれかでプライマーとして使用して前記核酸を増幅することを含む方法。
配列番号１８と１９、配列番号１９と２０、配列番号２１と２２、配列番号２３と２４、配列番号２５と２６、配列番号２７と２８、配列番号２９と３０、配列番号３１と３２、配列番号３３と３４、配列番号３５と３６、及び、配列番号３７と３８
【請求項６】
第１段階として配列番号１８と１９の組み合わせをプライマーとして用いた第１増幅を行い、続いて前記増幅の産物を鋳型とし、配列番号１９と２０の組み合わせをプライマーとして用いた第２増幅を行うことを含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の核酸を含む発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝炎患者の血液に見出された新規核酸及びそれがコードするポリペプチドに関する。より具体的には、既知肝炎ウイルスの感染が否定される肝炎（以下、原因不明肝炎と呼ぶ）の臨床例に高率に存在することが見出された新規核酸及びそれがコードするポリペプチドに関する。本発明は、さらに、前記新規核酸およびそれがコードするポリペプチドの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝炎は多様な原因によって肝臓に起こる炎症であり、肝機能が障害され、時に死に至ることがある医学的に重要な疾患である。肝炎の原因としては、ウイルス、薬物、アルコール、自己免疫等が知られている。特にウイルス（肝炎ウイルス）を原因とするウイルス性肝炎は患者数が多く、血液や便を介して伝染することから特に重要である。これまでに、肝炎ウイルスとしては、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＴＴ型が報告されており、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎ウイルスについては肝炎との関連性が確立している。これらウイルスについては多くの研究が行われ、血清学的および／または遺伝学的な検出方法が確立されており、スクリーニングおよび診断に広く用いられている。特に血液伝搬性の肝炎ウイルスであるＢ型およびＣ型肝炎ウイルスについては多くの国で輸血用血液のスクリーニングが実施されており、輸血によるＢ型およびＣ型肝炎の感染防止に役立っている。【０００３】
しかしながら、未だ原因が解明されていない肝炎が存在している（非特許文献１〜２）。これらの原因の解明、ならびに、スクリーニング、診断および治療方法の確立が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】World J Gastroenterol. 2006 Aug 21; 12(31):5048-50
【非特許文献２】Transplantation. 2000 Jul 27; 70(2):292-7
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、原因不明肝炎に関連する物質を見出し、これに関する情報、特には、遺伝子情報を提供すること、ならびに、該物質を検出する方法及び該方法に使用できる材料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、アラニンアミノ基転移酵素(ＡＬＴ)異常／肝炎ウイルスマーカー陰性の５００例の血液から核酸を抽出し、独自に作成したヘリカーゼファミリー反応性のヘリカーゼプライマーを用いた増幅を行った結果、１２例で核酸の増幅が見られることを見出した。増幅された核酸の配列を決定し、核酸配列データベースを用いて検索をおこなったところ、８例は既知核酸配列に一致したが、４例についてはデータベース中に一致する核酸配列を見出せなかった。これら４例の配列は同一であった。本発明者らは、この新規配列が見出された試料を用いてプライマーウォーキング（primer walking）を実施し、該新規配列を含む遺伝子の３’および５’方向の配列をさらに明らかにした。最終的に９４９６ヌクレオチド長の新規核酸配列（配列番号１）を得た。得られた核酸配列は、データベース検索の結果、新規配列であることが確認された。【０００７】
こうして得た配列を基にして、当該新規遺伝子の存在を検出するための方法を完成させた。さらに上記試料について、逆転写の可否、ＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅに対する感受性、制限酵素反応等の分析を行ったところ、本核酸配列は２本鎖ＤＮＡとして存在することが明らかになった。こうして明らかにされた２本鎖ＤＮＡについての構造解析により、推定オープンリーディングフレーム領域（配列番号３〜９）が特定され、それら領域にコードされているアミノ酸配列（配列番号１０〜１７）が明らかになった。さらに、様々な臨床検体について当該新規ＤＮＡを得て、それらの塩基配列を詳細に調べたところ、本遺伝子では突然変異が比較的少なく配列が保存されていることが明らかになり、当該遺伝子検出に有用なオリゴヌクレオチドを設計することができた。【０００８】
本発明は、以上の知見に基づき完成されたものであり、以下の発明を包含する。
（１）  配列番号１の塩基配列からなる核酸。
（２）  配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸。
（３）  配列番号１の塩基配列において、２０アミノ酸以上の長さのタンパク質をコードするオープンリーディングフレームの塩基配列からなる核酸。
（４）  前記核酸のオープンリーディングフレームにコードされるアミノ酸配列またはその２０アミノ酸以上の長さの断片のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（５）  １０塩基以上のヌクレオチド長を有し、配列番号１の塩基配列又はその塩基配列に相補的な塩基配列の部分塩基配列を含み、前記の核酸に特異的にハイブリダイゼーションできるポリヌクレオチド。
（６）  ５０塩基以下のヌクレオチド長を有する前記のポリヌクレオチド。
（７）  配列番号１８〜３８のいずれかの塩基配列を含む前記のポリヌクレオチド。
（８）  配列番号１の塩基配列もしくはその相補的な配列またはそれらの部分配列を含む核酸を検出する方法であって、前記のポリヌクレオチドの１種以上をプライマーおよび／またはプローブに使用することを特徴とする方法。
（９）  前記ポリヌクレオチドをプライマーとして使用して前記核酸を増幅することを含む前記の方法。
（１０）  前記プライマーとして使用する前記ポリヌクレオチドの組み合わせが、配列番号１８と１９、配列番号１９と２０、配列番号２１と２２、配列番号２３と２４、配列番号２５と２６、配列番号２７と２８、配列番号２９と３０、配列番号３１と３２、配列番号３３と３４、配列番号３５と３６、及び、配列番号３７と３８のいずれかである前記の方法。
（１１）  第１段階として配列番号１８と１９の組み合わせをプライマーの組み合わせとして用いた第１増幅を行い、続いて前記増幅の産物を配列番号１９と２０の組み合わせをプライマーの組合わせとして用いた第２増幅を行うことを含む、前記の方法。
（１２）  前記の核酸を含む発現ベクター。
（１３）  前記の核酸の導入により形質転換された、前記核酸がコードするポリペプチドを発現する細胞。
（１４）  前記の細胞を培養し、培養物から前記ポリペプチドを回収することを含む、前記ポリペプチドの製造方法。
（１５）  前記のポリペプチドに対する抗体。【０００９】
本明細書では、用語「核酸」は、場合によって「遺伝子」、「ＤＮＡ」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」と互換的に用いられる。すなわち、「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡを包含する一般的な核酸を指す。また、「ポリペプチド」は、「タンパク質」および「ペプチド」と互換的に用いられる。【００１０】
用語「原因不明肝炎」とは、既知肝炎ウイルスの感染が否定される肝炎を指し、より具体的には、臨床的に肝炎と診断されたが、少なくとも肝炎の主たる原因であるＡ型、Ｂ型、およびＣ型肝炎ウイルスマーカーが陰性である肝炎を指す。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、原因不明肝炎に関連する核酸が提供される。本発明の核酸やその翻訳産物を検出することは、原因不明肝炎の診断に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例における未知遺伝子の探索に使用したヘリカーゼファミリープライマーの配列、およびプライマーの設定位置を示す図。
【図２】実施例における未知遺伝子の配列決定に用いた配列伸長方法を表す図。
【図３】実施例における核酸測定法の手順を表わす図。
【図４】配列番号１の塩基配列における推定ORFの配置を表わす図。
【図５】発現用コンストラクトの構築を表わす図。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の核酸は、ＡＬＴ異常／肝炎ウイルスマーカー陰性の肝炎、すなわち、原因不明肝炎の患者の血液から見出されたものであり、配列番号１の塩基配列又はその相補的塩基配列からなる。本発明の核酸は、二本鎖および一本鎖のいずれであってもよい。
【００１４】
本発明により明らかにされた塩基配列に基づき、そのオープンリーディングフレーム候補を探し出すこと、その情報に基づき新規遺伝子がコードする構造および非構造遺伝子候補がコードするタンパク質の配列を予測すること、ならびに前記構造および／または非構造遺伝子候補がコードするタンパク質（以下遺伝子産物と言う）およびその断片を遺伝子工学的にまたは化学的に合成することができる。配列中からオープンリーディングフレーム候補を探し出す方法、および遺伝子がコードする遺伝子産物およびその断片を遺伝子工学的に発現する、または化学的に合成する方法は当技術分野では周知である。従って、本発明は、上記核酸の断片、上記核酸に含まれる構造および非構造遺伝子、及び、それらの遺伝子産物も包含する。
【００１５】
上記構造および非構造遺伝子としては、配列番号１の塩基配列において、２０アミノ酸以上の長さのタンパク質をコードするオープンリーディングフレームの塩基配列からなる核酸が挙げられる。また、上記遺伝子産物としては、この核酸のオープンリーディングフレームにコードされるアミノ酸配列またはその２０アミノ酸以上の長さの断片のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。２０アミノ酸以上の長さは、通常、抗原性を示すのに十分な長さである。
さらに具体的には、上記構造および非構造遺伝子としては、配列番号２〜９の塩基配列のいずれかからなる核酸が挙げられる。上記遺伝子産物としては、配列番号１０〜１７のアミノ酸配列のいずれかからなるポリペプチドが挙げられる。
【００１６】
また、遺伝子には、その機能に影響しない変異が存在し得ることが知られているから、本発明の核酸等は、例示された配列のものだけでなく、実質的に同一な範囲の塩基配列およびアミノ酸配列からなるものも含まれるものと認められる。実質的に同一の範囲は当該塩基配列またはアミノ酸配列を他のもの（例えば、既知の肝炎原因遺伝子）と比較した場合に明確に区別できる配列の相同性の割合をもって判断することができる。また、実質的に同一の範囲は、既知の同種の生物において知られている種内における配列の多様性を参考にして定めることができる。例えば、新規遺伝子配列を既知遺伝子配列と比較することによって、その遺伝子が由来した生物の分類学的位置づけを明らかにすることができる。新規遺伝子と既知遺伝子配列との比較は、公的に利用可能なデータベース（例えばAAA）を利用することで容易に実施できる。
【００１７】
配列番号１の塩基配列において、２０アミノ酸の長さ以上のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームの塩基配列（例えば、配列番号１〜９記載の塩基配列）と実質的に同一の塩基配列と実質的に同一の塩基配列とは、例えば、前記配列のいずれか一つの塩基配列と約95％以上、好ましくは97％以上の同一性を有する配列である。
【００１８】
また、上記塩基配列（例えば、配列番号２〜９の塩基配列）がそれぞれコードしている配列番号１０〜１７のアミノ酸配列を、遺伝子コードの縮重によってコードする塩基配列も実質的に同一の塩基配列に含まれる。
【００１９】
この核酸のオープンリーディングフレームにコードされるアミノ酸配列またはその２０アミノ酸の長さ以上の断片のアミノ酸配列（例えば、配列番号１０〜１７記載のアミノ酸配列）と実質的に同一のアミノ酸配列とは、例えば、前記配列中のアミノ酸が、タンパク質の構造を大きく変化させないことが知られているアミノ酸間の置換によって置換された配列である。このような置換とは、通常には、脂肪族アミノ酸Ala、Val、Leu、およびIle問の相互置換、SerおよびThr間の相互置換、AspおよびGlu間の相互置換、AsnおよびGln間の相互置換、LysおよびArg間の相互置換、ならびにPheおよびTyr間の相互置換である。
【００２０】
本発明の核酸が提供されたことにより、その配列から本発明の核酸（特には該核酸に含まれる新規遺伝子）に特異的な配列を見出し、それら配列および／またはそれらに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、それらをプライマーおよび／またはプローブとして用いて本発明の核酸を検出および／または増幅することもできる。配列に特異的な領域を見出すことは、前記データベースおよび市販のソフトウエア（例えばLasergene、DNASTAR（登録商標））を利用して容易に実施できる。更に、同様にソフトウエアを用いて、遺伝子の検出および／または増幅に適したプライマーおよび／またはプローブを特定することもできる。これらプライマーおよび／またはプローブを用いて遺伝子検出系を構築する方法は当技術分野において周知であり、例えばPCR最新活用マニュアル（佐々木博己著、羊土社、2003）を参照できる。本発明では、遺伝子を増幅する方法としてポリメラーゼチェインリアクション（Polymerase Chain Reaction：PCR）を一例として使用しているが、PCR以外の増幅法、例えばLCR（Ligase Chain Reaction）法等を用いることもできる。PCRには二段階PCRも包含される。
【００２１】
このようなプライマー／プローブとしては、１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、特に好ましくは２０塩基以上のヌクレオチド長を有し、配列番号１の塩基配列又はその塩基配列に相補的な塩基配列の部分塩基配列を含み、本発明の核酸に特異的にハイブリダイゼーションできるポリヌクレオチドが挙げられる。ハイブリダイゼーションの条件は、公知のものでよいが、通常には下記のような典型的なサザンブロッティングのプロトコルで用いられるハイブリダイゼーションの条件である。
【００２２】
1．アガロースゲル電気泳動後のゲルからDNAを転写させ、そのDNAを固定したニトロセルロースを3×SSC溶液に浸し、65℃、30分間処理する。
2．5×SSC，1％SDS，1×denhardt液（標識プローブを含む）に浸し、65℃、2時間処理する。
3．更に、65℃で一晩保温する。
4．約100mLの2×SSC，0.1％SDS溶液に浸し、室温で浸透する。
5．0.2×SSC，0.1％SDS溶液に換え、65℃、30分保温し、再度溶液を交換して保温する。
6．2×SSCで洗浄し、風乾後、オートラジオグラフィーを行う。
【００２３】
上記ポリヌクレオチドは、通常には、５０塩基以下、好ましくは４０塩基以下、特に好ましくは３０塩基以下のヌクレオチド長を有する。
【００２４】
上記ポリヌクレオチドの例として具体的には、配列番号１８〜３８の塩基配列を含むものが挙げられる。
【００２５】
PCRのプライマーの組み合わせの例としては、配列番号１８と１９、配列番号１９と２０、配列番号２２と２３、配列番号２４と２５、配列番号２６と２７、配列番号２８と２９、配列番号３０と３１、配列番号３２と３３、配列番号３４と３５、配列番号３６と３７、及び、配列番号３８と３９が挙げられる。二段階PCRのプライマーの組合わせの例としては、第１増幅用として配列番号１８と１９、第２増幅用として配列番号１９と２０の組合わせが挙げられる。
【００２６】
実施例に示されるように、本発明の核酸では突然変異が非常に少なく、配列の保存性が非常に高いことを明らかになっている。従って本明細書中に具体的に開示されているプライマーの組み合わせ以外にも同等の性能を有するプライマーの組み合わせが存在することは当業者にとって容易に理解できる。これらのプライマーの組み合わせも本発明の範囲内である。
【００２７】
本発明は、本発明の核酸あるいはその一部を組み込んだ発現ベクターも提供する。本明細書における「発現ベクター」の用語は外因性のポリヌクレオチドを宿主細胞遺伝子に発現可能な状態で挿入するベクターを意味する。具体的には該ポリヌクレオチドを組み込むことが可能な制御配列を有するベクターである。また、「一部」の用語は、遺伝子産物が機能するのに十分な、又は、抗原性を示すのに十分なペプチドをコードする部分を意味する。
【００２８】
この発現ベクターは免疫活性あるいは生物活性を有するウイルスペプチドを得るのに有効に用いることができる。現在、発現を所望する遺伝子を組み込むベクターについては様々なものが知られており、さらにベクターを用いて遺伝子を組み込み最終的にペプチドを発現させる宿主細胞についても様々なものが知られている。
【００２９】
本発明の発現ベクターは、通常には、本発明の核酸の塩基配列あるいはそのＯＲＦを有する組換え発現ベクターであって、該ＯＲＦが所望の宿主と適合し得る制御配列に対して作動可能なように連結されている組換え発現ベクターである。この発現ベクターを用いて組換え遺伝子発現系を構成することができる。
【００３０】
本明細書における「形質転換細胞」の用語は、本発明の核酸またはその一部にコードされたポリペプチドの全部または一部を発現することが可能な細胞を意味する。
【００３１】
本発明の形質転換細胞は、本発明の核酸の全部または一部を含むポリヌクレオチドを直接に導入して、または、このポリヌクレオチドを組み込んだ上記組換え発現ベクターを宿主細胞に導入して、宿主細胞を形質転換することによって得ることができる。本発明では、公知のトランスファーベクター、宿主細胞を使用することができる。
【００３２】
このような宿主細胞を培養し、発現したポリペプチドを培養物から回収することにより本発明の核酸にコードされるポリペプチドを製造することができる。宿主細胞の培養の条件は、用いる宿主細胞に応じて適宜選択される。また、ポリペプチドの回収の条件は、目的のポリペプチドの性質に応じて適宜選択される。
【００３３】
一度新規遺伝子がコードする遺伝子産物またはその断片を得ることができれば、これらを抗原として用い、生物試料中に存在する前記遺伝子産物またはその断片に対する抗体を検出および／または分離することができる。抗原を用いた、該抗原に対する抗体を検出および／または分離するための方法は当技術分野では周知である。
【００３４】
前記遺伝子産物またはその断片は、該遺伝子産物またはその断片に対する抗体の作製および／または精製にも用いることができる。遺伝子産物またはその断片を含むポリペプチドを免疫抗原またはプローブとして用いて抗体を作製または精製するための方法は様々在り、且つ当技術分野において周知である。
【００３５】
前記遺伝子産物の断片を免疫抗原として使用する場合、断片が遺伝子産物のエピトープを含有していることが望まれる。ポリペプチド中に存在するエピトープの位置を特定する方法は数多く開示されており、また市販ソフトウエアを用いて、 解明されたアミノ酸配列よりエピトープ候補を探索することもできる。エピトープを解析・決定する技術は当技術分野で周知であり、または解析ツールは商業的に供給されている。
【００３６】
以下に、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、その要旨を逸脱しない限りこれらの実施例に限定されるものではない。特記しない限り、下記実施例は、標準的な方法（例えばSambrookら、MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL， 2nd Ed；Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor， New York （1989）を参照）に従って行われた。
【実施例１】
【００３７】
＜１＞ヘリカーゼ遺伝子検出用プライマーの設定・作成
肝機能を表すマーカーであり、輸血用血液のスクリーニング検査の一つとして用いられているALT検査の値が異常でありながら、既知の血液伝播性肝炎ウイルスであるB型肝炎およびC型肝炎ウイルスのスクリーニング検査については結果が陰性であった血液中には未知の肝炎病原体が存在している可能性が高いと考えた。かくして、未知の肝炎病原体を得るための出発材料として、ALT異常／肝炎ウイルスマーカー陰性の血液を選択した。【００３８】
次の理由から前記血液より新規肝炎病原体候補の遺伝子を探索するためのツールとしてヘリカーゼファミリー共通プライマーを選択し、これを作製して使用した。生存に必須な機能を担うタンパク質ほど、多くの生物に共通して存在し、かつそのアミノ酸配列（従って、それをコードする核酸配列）は保存されていることが知られており、目的とする新規肝炎病原体候補遺伝子にも存在することが期待される。ヘリカーゼはDNA／DNAやDNA／RNAの二本鎖構造あるいはRNAの二次構造を、水素結合を切断することによって一本鎖にする活性をもつ酵素であり、DNAの複製、修復、組み換え、RNAの転写、スプライシング、蛋白への翻訳などに幅広く関与する、生体の生存にとって必須な酵素の一つであり、多くの生物に存在していることが知られている。そこで、目的の新規肝炎病原体遺伝子の探索に使用するツールとしてヘリカーゼファミリーに共通する核酸配列を有するプライマーを選んだ。ヘリカーゼファミリーを検索して配列情報を集めて配列特性を調べた。次にウイルスのヘリカーゼの核酸配列を基に、これにイノシン挿入を行い広範囲のヘリカーゼファミリー遺伝子に反応するヘリカーゼプライマーを作製した。【００３９】
すなわち、使用するヘリカーゼ遺伝子検出用プライマーは、HCVヘリケースファミリーのNS3ヘリカーゼコンセンサスドメインから選択された配列に、イノシン挿入を行って作成した。具体的には以下3種類のプライマーを作成・使用した。【００４０】
IA-3（フォワードプライマー）：CCI ACI ggI AgI ggI AAR AgC AC（配列番号４０）
IV-3（リバースプライマー）：CTI CCM gTg CgI CCI CgS CgY Tg（配列番号４１）
III R-2（リバースプライマー）：CCI ggR IIg TIg CIg TRg C（配列番号４２）
【００４１】
IA-3とIII R-2の組み合わせからは469bpの遺伝子断片が、IA-3とIV-3の組み合わせからは800bpの遺伝子断片が増幅されると予想された（図１）。【００４２】
＜２＞未知病原体候補遺伝子断片の増幅・分析
ヘリカーゼ遺伝子検出用プライマーを用いて、500例のALT異常ヒト血液検体についてヘリカーゼ遺伝子（未知病原体候補の遺伝子断片）の増幅を試みた。【００４３】
検体からの核酸抽出はExR＆Dスマイテストキット（医学生物研究所）を用いて次の様に行った。検体の血液より得た血漿100μｌを遠心チューブに入れ、これにキットのＩ液（酵素溶液）１５μL、ＩＩ液（検体希釈液）380μL、およびＩＶ液（共沈剤溶液）5μLを加えて55℃で30分間インキュベーションした。次にＩＩＩ液（タンパク質溶解液）250μLを加えて55℃で15分間インキュベーションした後、イソプロパノール600μLを加えて氷中で10分間インキュべ−ションした。インキュベーション終了後、15,000rpmで10分間遠心分離し、上清を捨てて沈殿を得て、これに75％（Ｖ／v）エタノールを600μL加えた。これを再度15,000rpm、10分間の遠心分離にかけ、得られた沈殿を乾固した。乾固した沈殿に蒸留水（DW）を30μL加えて溶解し、得られた溶液を鋳型DNAとした。【００４４】
ヘリカーゼ遺伝子（未知病原体遺伝子）の増幅は、前記鋳型DNAを鋳型とする、TaKaRa Ex-Taqを酵素に用いたポリメラーゼチェインリアクション（PCR）反応をTaKaRa PCR Thermal Cycler 480増幅装置を用いて行った。PCR反応溶液は、チューブ当たり次のものを含んでいる：鋳型DNAを20μL、Ex-Taq 0.25μL、10×バッファー 20μL、10mM dNTP １μL、フォワードプライマーIA-3 0.5μL、リバースプライマー IV-3 0.5μL、および蒸留水22.75μL（総量50μL）。PCRの反応条件は、94℃、2分間の変性反応の後、94℃の変性、30秒、55℃のアニーリング、30秒、及び72℃の伸長２分間からなる増幅サイクルを35回行い、最後に72℃の伸長を7分間行うものであった。【００４５】
増幅された遺伝子は、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度1.5％、20mA、30分間）で分離した後、エチジウムブロマイドで30分間染色し、紫外線を当てて検出した。500例のALT異常ヒト血液検体からヘリカーゼ遺伝子（未知病原体候補遺伝子）が強く増幅される検体が12例見つかった。【００４６】
次に増幅した核酸を、電気泳動のゲルから切り出してMinElute Gel Extractionキット（Qiagen）を用いて精製した。具体的にはまずゲルの重量を測定し、キット付属のバッファーQGをゲル100mg当たり600μL加え、50℃で10分間インキュべ−ションした。インキュべ−ション終了後これに溶液の1／10量（ｖ／v）のイソプロパノールを加え、MinElute Spinカラムに加えて15,000r pmで1分間遠心分離した。次にカラムにバッファーQGを500μL加え、15,000r pmで1分間遠心分離し不純物を洗浄した。次にバッファーPEを700μL加え、15,000rpmで1分間遠心分離して洗浄を繰り返した。さらにバッファーを加えずに15,000rpmで1分間の遠心分離を行って洗浄液をカラムから完全に取り除いた後、溶出物を受け取るためのチューブをカラム下部にセットし、バッファーEBを10μL加えて15,000rpmで1分間遠心分離して核酸を溶出させ、下部チューブに回収した。【００４７】
次に回収した増幅核酸の配列を次の手順で決定した。まず増幅された核酸を、Big Dye Terminator v1.1サイクルシーケンシングキット（ABI）、GeneAmp PCRシステム9700（Applied Biosystems）、ならびに次の成分組成を持つ2種類（フォワードおよびリバース）の増幅溶液を用いて増幅した：フォワード（Pr e Mix 8μL、フォワードプライマーIA-3 4μL、鋳型（核酸）4μL、蒸留水4μL）、およびリバース（Pre Mix 8μL、リバースプライマーIV-3 4μL、鋳型（核酸）4μL、蒸留水4μL）。次に反応生成物（増幅核酸）をDyeEx 2.0 Spinキット（Qiagen）を用いて精製した。具体的にはキット付属のDyeEx 2.0 Spinカラムを3,200r pmで3分間遠心分離した後に反応生成物を全量カラムに加えて3,200r pmで3分間遠心分離し精製した。精製された増幅核酸（液体）を95℃で2分間処理し、氷上（0℃）に10分間置いてから遠心分離にかけ、その全量をシーケンス測定用プレートに移した。このプレートをGene tic Analyzer with EDTA 3100 POP-6ポリマーを用いてABI PRISM 3100 Gene tic Analyzerで分析し、配列を決定した。配列決定には、Mobility FileとしてDT3100POP6（BD）v2.mobを、RunモジュールとしてSR-Seq50-POP6-20S-5400secを、AnalysisモジュールとしてBC-3100SR-SeqOffFtOffを用いた。得られたデータは、解析ソフトSEQUENCER GENETYX-MACを用いて解析した。【００４８】
ホモロジー検索はDDBJ BLASTおよびNCBI BLASTを用いて行った。配列についてはまずホモロジー検索を行い、未知病原体候補遺伝子の可能性があるものについてはオープンリーディングフレーム解析、アミノ酸配列への翻訳、相補的変換を行った後のアミノ酸配列への翻訳、アミノ酸配列のホモロジー検索、制限酵素部位解析、GC含量分布分析を実施した。その結呆、ヘリカーゼ共通プライマーを用いた増幅で強陽性の結果を示した12例のうち8例については、増幅された配列が細菌およびG型肝炎ウイルスの配列（即ち既知病原体配列）であることが判明した。残り4例は同一の配列を示し、ホモロジー検索スコア（ビット：bits）が50以下、E値は3.5であり、新規配列の可能性が高いことが判明したため、続いて遺伝子の伸長を行ってよって全配列を明らかにすることとした。【００４９】
＜３＞未知病原体候補遺伝子の配列決定
図２に、本発明の遺伝子配列を決定したプライマーウオーキング法の概略を示す。＜２＞により決定された、未知病原体候補の遺伝子配列に基づき、複数のフォワードプライマー（A、B、C）およびリバースプライマー（D、E、F）を作製した。これらプライマーを、DNA Walking SpeedUP Premixキット-II（Seegene）と共に、キット添付の取り扱い説明書に従って使用し、まだ決定されていない未知病原体候補の遺伝子配列（図２中では未知のSeqと表示）を決定した。具体的には、キット付属のプライマー1とプライマーAを用い、未知病原体候補遺伝子断片が増幅された核酸分画を鋳型として核酸（DNA）増幅を実施し（1s t PCR）、次にこの1s t PCRで増幅されたDNAを鋳型として、キット付属のプライマー2とプライマーBを用いて2回目のDNA増幅（2nd PCR）を行い、更にこの2nd PCRで増幅したDNAを鋳型に、キット付属のプライマー3とプライマーCを用いて3回目のDNA増幅（3r d PCR）を行う。各増幅で得られたDNAをゲル精製し、上記の配列決定換作により増幅されたヌクレオチドの配列を決定する。この作業を、新たな配列が決定されなくなるまで繰り返し実施し、未知病原体候補遺伝子の全核酸配列（配列番号1：以下発明の核酸配列と言う）を決定した。1st PCR、2nd PCR、および3rd PCRの反応溶液の組成および反応条件は次の通りであった。【００５０】
【表１】
0005607528.tif 000002
【００５１】
以上より決定された塩基配列（本発明の核酸配列）を配列番号１に示す。この塩基配列に基づき、オープンリーディングフレーム候補を検索した結果を図４に示す。この結果、８つのオープンリーディングフレーム候補が見出された。これらの塩基配列を配列番号２〜９に、その塩基配列にコードされるアミノ酸配列を配列番号１０〜１７に示す。
【実施例２】
【００５２】
本発明の核酸配列の検出方法
実施例１において明らかとなった核酸配列に基づいて複数のポリヌクレオチドを作成し、プライマーとして使用可能であるか検討した。具体的には、配列番号18〜39のオリゴヌクレオチドを合成し、配列番号18と19、19と20、22と23、24と25、26と27、28と29、30と31、32と33、34と35、36と37、38と39の組み合わせについて、発明の核酸配列の増幅能力について試験し、これらが同等に使用できることを確認した。試験の条件は図３のとおりであった。従って、これらのプライマーを用いるPCRにより本発明の核酸配列を検出できることが確認された。
【実施例３】
【００５３】
原因不明肝炎患者を含む臨床検体における本発明の核酸配列の存在
本発明の核酸配列が、原因不明肝炎の病原体に由来するものであれば、正常人には検出されず、原因不明の肝炎症例には検出されることが期待された。発明の核酸配列の臨床有用性を検証するために、正常人、非A、非B、非C肝炎患者の検体、および既知ウイルス性肝炎（HBVおよびHCV）患者、ならびに肝疾患である脂肪肝、胆汁うっ滞型肝炎、原発性胆汁性肝炎、アルコール性肝炎、およびアルコール性肝硬変患者の検体（血漿）について、実施例２で確立した核酸配列検出法（使用プライマー：配列番号18及び19(1st PCR)と20及び21(2nd PCR)）を用いて本発明の核酸配列が存在するか調べた。結果を下表に示す。【００５４】
【表２】
0005607528.tif 000003
【００５５】
結果が示す様に、正常人および既知ウイルス性肝炎患者での陽性率は極めて低かった。一方、非A、非B、非C型肝炎患者、原発性胆汁性肝炎、およびアルコール性肝硬変での陽性率は極めて高かった。原発性胆汁性肝炎およびアルコール性肝硬変の病因はまだ確定されておらず、本発明の新規核酸を有する病原体が原因である可能性が示唆される。
【実施例４】
【００５６】
本発明の核酸配列の性質
（1）逆転写の可否
検体からの核酸抽出はExR＆Dスマイテストキット（医学生物研究所）を用いた。血漿100μLにキットのＩ液（酵素溶液）15μL，ＩＩ液（検体希釈液）380μL、およびＩＶ液（共沈剤溶液）5μLを加えて55℃で30分間インキュベーションした。次にＩＩＩ液（蛋白質溶解液）250μLを加えて55℃で15分間インキュべーションした後、イソプロパノール600μLを加えて氷中で10分間インキュべーションした。終了後、15,000rpmで10分遠心し、沈殿に75％エタノールを600μL加えた。再度15,000rpmで10分遠心し、沈殿を乾固した。乾固した沈殿に蒸留水を30μL加えて溶解した。核酸抽出後、最終濃度10U DNaseと最終濃度10mMマグネシウムを加え、37℃で30分間処理した。処理液にフェノール：クロロホルム（1：1）混合液50μLを加え、撹拌し、15,000rpmで15分遠心し、上清に1／10容積の8M酢酸アンモニウムと2.5倍容積のエタノールを添加後、−80℃で20分間静置し、15,000rpmで20分の遠心を行い沈殿を核酸とし、回収した。得られた核酸に蒸留水20μLを加えた。核酸溶液10μLに0.1M DTTを2μL、10mMのdNTP １μL、RNA分解酵素阻害剤40U／μL（Rnasin，PROMEGA 社）を１μL、逆転写酵素 200U／μL（SuperScriptII，GIBCO−BRL社）を1μL加え42℃で50分間反応させcDNA合成を行った。さらに1stPCR反応を行った後、ゲル電気泳動により目的増幅産物を検出した。結果は、増幅産物は検出されなかった。よって目的の核酸はRNAでななく、DNAと判断した。【００５７】
さらに核酸抽出後、RNase処理し、反応液にフェノール：クロロホルム（1：1）混合液50μLを加え、撹拌し、15,000rpmで15分の遠心分離を行い、上清に1／10容積の8M酢酸アンモニウムと2.5倍容積のエタノールを添加後、−80℃で20分間静置し、15,000rpmで20分遠心を行い、沈殿を核酸として回収した。得られた核酸を用いて1st PCR反応を行った結果は、増幅産物が検出された。これらの結果から目的の核酸はDNAであることが判明した。【００５８】
(2) 核酸の状態の証明（Freeの状態か殻に包まれた状態かを検証する）
血漿100μLに最終濃度8U Cloned DNase1（TaKaRa）を4μLと最終濃度10mMマグネシウムを加え、37℃で30分間処理した。対照として血漿ではなく抽出したDNAをDNase1処理したものをおいた。処理後検体からの核酸抽出はExR＆Dスマイテストキット（医学生物研究所）を用いて次ぎのように行った。血漿100μLにキットのＩ液（酵素溶液）15μL、ＩＩ液（検体希釈液）380μL、およびＩＶ液（共沈剤溶液）5μLを加えて55℃で30分間インキュべーションした。次にＩＩＩ液（蛋白質溶解液）250μLを加えて55℃で15分間インキュベーションした後、イソプロパノール600μLを加えて4℃で10分間インキュベーションした。終了後、15,000rpmで10分間遠心分離し、沈殿に75％エタノールを600μL加えた。再度15,000rpmで10分の遠心を行い、沈殿を乾固した。乾固した沈殿に蒸留水を30μL加えて溶解した。溶解した核酸の10倍の希釈系列を作りエンドタイターを測定し。1stPCRの条件で、配列番号18と19のプライマーを用い、2ndPCRには配列番号20と21を用いた。結果は、DNase未処理とDNase処理検体はエンドタイターは同じ値で検出された。また、DNaseの作用効果を測定するために抽出DNAをDNase処理した検体は増幅が検出されなかった。これはDNaseが十分に作用している結果であった。これらの結果からDNAは血漿中でFreeの状態で存在するのではなく、殻に包まれた状態で存在していると証明できた。【００５９】
(3)制限酵素反応SalI消化
検体からの核酸抽出はExR＆Dスマイテストキット（医学生物研究所）を用いた。血漿100μLにキットのＩ液（酵素溶液）15μL，ＩＩ液（検体希釈液）380μL、およびＩＶ液（共沈剤溶液）5μLを加えて55℃で30分間インキュべーションした。次にＩＩＩ液（蛋白質溶解液）250μLを加えて55℃で15分間インキュべーションした後、イソプロパノール600μLを加えて氷中で10分間インキュべーションした。終了後、15,000rpmで10分遠心し、沈殿に75％エタノールを600μL加えた。これを再度15,000rpmで10分遠心し、沈殿を乾固した。乾固した沈殿に蒸留水を45μL加えて溶解した。溶解した後に、10倍濃度のH緩衝液（制限酵素付属緩衝液）（宝酒造製）5μL、SalI（宝酒造製）（20,000U／mL）4μLを添加し、混合して37℃で90分間反応させた。反応液にフェノール：クロロホルム（1：1）混合液50μLを加え、撹拌し、15,000rpmで15分遠心を行い、上清に1／10容積の8M酢酸アンモニウムと2.5倍容積のエタノールを添加後、−80℃で20分間静置した。15,000rpmで20分遠心を行い核酸を沈殿として回収した。対照にはSalI酵素処理しないDNAをおいて検討した。制限酵素切断サイトを挟むプライマーでPCRを行った。結果は、SalI消化DNAは増幅が検出されないが、SalI消化をしないDNAでは増幅が検出された。このことから目的のDNAは制限酵素により切断され、二重鎖DNAであると証明できた。
【実施例５】
【００６０】
臨床検体における塩基配列の検索
実施例２でPCR陽性となった臨床検体について塩基配列の検索を行った。抽出した核酸について初めにLong-PCR（LA-taq）を行った。反応液の組成はLA-taq 0.5μL，2×GC(1)バッファー25μL，2.5mM dNTP ８μL，配列番号22のプライマー0.5μL，配列番号39のプライマー0.5μL，抽出核酸液16μLで、以下のPCR条件で行った。【００６１】
【表３】
0005607528.tif 000004
【００６２】
LA-Taq PCR終了後、配列番号22から39の塩基配列又はその相補的配列からなるプライマーの下記の組合せで再度PCRを行った。条件は図３の条件で行った。PCR終了後、アガロースゲル電気泳動を行い、バンドを切り出し、シークエンス反応を行い、塩基配列を決定した。すでに決定している配列番号１の塩基配列と比較し、98〜100％の配列の一致を確認した。【００６３】
【表４】
0005607528.tif 000005
【実施例６】
【００６４】
オープンリーディングフレーム(ORF)にコードされるタンパク質の発現
(1) 発現ベクターの構築
配列番号１の塩基配列に存在するORFのうち、５つのORF（No.１ 3070〜3669bp  No.2  3826〜4293bp  No.3  5233〜6117bp  No.4  7198〜7872bp  No.5  7888〜8610bpのORF）を含むターゲット遺伝子を下記表に示すプライマーにて増幅させ、XbaI、DraI制限酵素サイトをもつ6×His PCR産物を得た。【００６５】
【表５】
0005607528.tif 000006
【００６６】
上記のようにして得た6×His PCR産物をXbaI/DraIで制限酵素処理を行った。次に、アガロースゲル電気泳動により目的の長さの断片が得られたことを確認した。XbaI/SmaIで酵素処理したpPSC8(日本農産工業社)と混合し、ライゲーション反応を行った（図５）。ライゲーション産物をE.coli DH5αで形質転換し、形質転換体から目的配列を有するクローンを選択した（pPSC8/KIV-6）。また、得られた配列の解析を行い、同一配列を確認した。【００６７】
(2) コトランスフェクション
25cm2フラスコに播いた1.0×106cellsのSf9細胞(日本農産工業社)に発現ベクターDNA約2μg、Linear AcNPV DNA(日本農産工業社) 85ng、及びInsect GeneJuice(Merck社)5μLを含むSf900II（Invitrogen社）200μL を加えた。28℃で6日間程度培養後、培養上清を回収した（コトランスフェクション溶液）。【００６８】
(3) 発現物の簡易生産
1.5×106cells/mLになるようにSf900IIで希釈したSF＋細胞(日本農産工業社)を250mL三角フラスコに100mL用意した。これに(2)で作製したコトランスフェクション溶液を加え、130回転、28℃で振とう培養した。72時間後に細胞培養液を回収し、3.000×ｇ，４℃で30分間遠心分離を行い沈殿と上清に分画した。【００６９】
(4) 6×His結合発現タンパク質の精製
3.000×ｇで遠心分離された沈殿および上清をNoVagen社のHis Trap Affinity Columnsを使用し、HisTrapの方法に準じて精製した。
【実施例７】
【００７０】
発現したポリペプチドに対する抗体の検出
実施例６で精製したタンパク質を固定した固相を用いるEIAにより、検体に含まれる抗体を検出した。検体（血漿）としては、下記のものを用いた。
一般検体：ＡＬＴ値が61ＩＵ／Ｌ以下の正常者検体
ＡＬＴ異常者検体：ＡＬＴ値が61ＩＵ／Ｌ異常で肝障害がある検体【００７１】
EIAは下記に示すように実施した。
EIA（抗体の測定）
方法：タンパク質量5μg / ウェルとなるように0.2M Carbonate Buffer pH9.5に希釈し、96穴プレートに４℃で一晩置き固相化する。固相化後、洗浄液（Na2HPO4・12H2O 23.8g、NaH2PO4・2H2O 5.23g、NaCL 42.5g、Tween20 2.5mL  /Ｌ）で3回洗浄し、20％ ウシ血清/PBS 100μLを加え、60分間ブロッキングする。ブロッキング後、3回洗浄し、20％ ウシ血清/PBS で50倍希釈した検体を50μL加えて60分間反応させる。反応後、5回洗浄し、20％ ウシ血清/PBS で5000倍希釈したanti-Human IgG Peroxidase標識抗体(Jackson Immuno Reseach社)を加えて60分間反応させる。反応後、5回洗浄し、OPDにて発色（暗所30分）発色後、492nmと640nmの二波長にて測定する。【００７２】
陽性を示した検体については発現タンパク質での抑制試験を行った。抑制試験は、EIA陽性となった検体に発現タンパク質を50μg加えて60分反応させたものを検体として用いる他は、検体を測定した方法と同様に行った。抑制率50％以上のものを抗体陽性とした。【００７３】
上記検体は、実施例２に記載の核酸配列検出法を用いて核酸配列の有無も測定した。用いたプライマーは、下記の通りであり、PCR条件は図３の通りであった。
1st PCR ：配列番号18  プライマー101-Ｃ
：配列番号19  プライマーＮ101-Ｂ
2nd PCR ：配列番号20  プライマーＫＳ−2
：配列番号21  プライマーＮ101-Ｄ【００７４】
結果は下記表に示す。表中、ＰＣＲ−はＰＣＲ陰性を、ＰＣＲ＋はＰＣＲ陽性を示す。ＰＣＲ陽性の列には抑制試験の抑制結果を示す。これらの結果から、ALT異常検体に、発
現タンパク質に対する抗体が存在することが分かる。
【００７５】
【表６】
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【実施例８】
【００７６】
EIA陽性検体によるウイルスの免疫沈降反応
実施例６で発現タンパクNo.１,２,３,４に対して陽性を示す検体３例及び陰性検体３例を用いて、下記の方法によりウイルスの免疫沈降反応を調べた。【００７７】
PCR陽性検体と50倍希釈したEIA陽性検体またはEIA陰性検体を100μLずつ混合し、60分間反応させる。（混合前処理としてそれぞれの検体は0.2μmフィルターを通し、15000rpm, 10min遠心を行う。）反応後、12000 rpm, 10min遠心し、上清を破棄、ペレットをSalineにて3回洗浄する（12000 rpm, 5min遠心）洗浄後、Saline 100μLを加え、核酸抽出を行い、PCR測定をする。【００７８】
結果を下記表に示す。この結果より、EIA陽性検体に含まれる抗体がウイルス粒子を認識していることが分かる。【００７９】
【表７】
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【００８０】
[配列の説明]
配列番号1：KIV9496の塩基配列（9496ヌクレオチド）
配列番号2：推定ORF-Aの塩基配列
配列番号3：推定ORF-Bの塩基配列
配列番号4：推定ORF-Cの塩基配列
配列番号5：推定ORF-Dの塩基配列
配列番号6：推定ORF-Eの塩基配列
配列番号7：推定ORF-Fの塩基配列
配列番号8：推定ORF-Gの塩基配列
配列番号9：推定ORF-Hの塩基配列
配列番号10：推定ORF-Aのアミノ酸配列
配列番号11：推定ORF-Bのアミノ酸配列
配列番号12：推定ORF-Cのアミノ酸配列
配列番号13：推定ORF-Dのアミノ酸配列
配列番号14：推定ORF-Eのアミノ酸配列
配列番号15：推定ORF-Fのアミノ酸配列
配列番号16：推定ORF-Gのアミノ酸配列
配列番号17：推定ORF-Hのアミノ酸配列
配列番号18：プライマー101-C  CAACACCgCAATCACAAAgT (3007-3026）
配列番号19：プライマーN101-B  AACATTgAAACgTCATgTCC（3445-3464）
配列番号20：プライマーKS-2  CTCgTCTCgTCgTCATCgTA（3082-3101）
配列番号21：プライマーN101-D  CATTTgCTCCCgCTggAgATg（3365-3385）
配列番号22：プライマーK-5  AACgATCCggACATCCACCACCA（145-167）
配列番号23：プライマーKIV-21  gCgATCgAggCATggCTCAA（536-555）
配列番号24：プライマー101-1a  CTgCAgAgCATCATgCggAg（796-815）
配列番号25：プライマー101-T  TCgATCCgCTTTCggTACgT（1383-1402）
配列番号26：プライマーX-2  ACCTAATgAAgACgCCgAAT（2290-2309）
配列番号27：プライマーKS-1  gAgACATggTgTAAgAgTCg（3057-3076）
配列番号28：プライマー101-11  AgTggATgAAgCTggACCTT（3887-3906）
配列番号29：プライマーOp-3  gATCTTgATCCTgTACTCTT（4416-4435）
配列番号30：プライマー101-21  gCgAAAgAggATTCTCgACT（4788-4807）
配列番号31：プライマーX-7  TgggAgTATggAgTCgACAT（5331-5350）
配列番号32：プライマー101-23  TACACTAAAATCgACTCCTCC（6047-6067）
配列番号33：プライマーX-13  ATgAgTTTgAgAACgATCTT（6733-6752）
配列番号34：プライマー101-29  ACCTgCgCCTgAggCTACgA（6888-6907）
配列番号35：プライマーX-17 gCAgATCgTTTCCgTTTggg（7564-7583）
配列番号36：プライマー101-38  AACATCgAAAgATTAAAgAAA（7940-7960）
配列番号37：プライマー101-6R  CACgCgATTCCCATATCCCT（8789-8808）
配列番号38：プライマーKIV-14  CgTgTACTAACTATACTgAC（9255-9274）
配列番号39：プライマーKIV-16  CTCAAATTCCATCCgAATAg（9425-9444）
配列番号40：ヘリカーゼ遺伝子検出用プライマーIA-3
配列番号41：ヘリカーゼ遺伝子検出用プライマーIV-4
配列番号42：ヘリカーゼ遺伝子検出用プライマーIII R-2
配列番号43：プライマー1-1F
配列番号44：プライマー1-2F
配列番号45：プライマー1-3F
配列番号46：プライマー1-4F
配列番号47：プライマー1-5F
配列番号48：プライマー1-1R
配列番号49：プライマー1-2R
配列番号50：プライマー1-3R
配列番号51：プライマー1-4R
配列番号52：プライマー1-5R
【図１】
0005607528.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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