(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子調節活性を有する組換えポリヌクレオチド分子であって、
配列番号：1、4および7〜9から選択されるポリヌクレオチド分子を含む該分子。
【請求項２】
配列番号：1、4および7〜9よりなる群から選択される請求項１記載の組換えポリヌクレオチド分子。
【請求項３】
該組換えポリヌクレオチド分子が、転写可能ポリヌクレオチド分子に作動可能に連結した請求項１記載の組換えポリヌクレオチド分子を含むポリヌクレオチド構築体。
【請求項４】
該転写可能ポリヌクレオチド分子が、作物学的に注目する遺伝子である請求項３記載のポリヌクレオチド構築体。
【請求項５】
該転写可能ポリヌクレオチド分子が、除草剤耐性遺伝子である請求項３記載のポリヌクレオチド構築体。
【請求項６】
該除草剤耐性遺伝子が、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳ、ヒドロキシフェニルピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ダラポンデハロゲナーゼ、ブロモキシニル耐性ニトリラーゼ、アントラニル酸シンターゼ、グリホサートオキシドレダクターゼおよびグリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子よりなる群から選択される請求項５記載のポリヌクレオチド構築体。
【請求項７】
請求項３記載のポリヌクレオチド構築体で安定に形質転換されたトランスジェニック植物細胞。
【請求項８】
請求項３記載のポリヌクレオチド構築体で安定に形質転換されたトランスジェニック植物。
【請求項９】
該植物が、小麦、トウモロコシ、ライ麦、米、オート麦、大麦、ターフグラス、モロコシ、雑穀（millet）およびサトウキビよりなる群から選択される単子葉植物である請求項８記載のトランスジェニック植物。
【請求項１０】
該植物が、タバコ、トマト、ジャガイモ、ダイズ豆、綿、キャノーラ、ヒマワリおよびアルファルファよりなる群から選択される双子葉植物である請求項８記載のトランスジェニック植物。
【請求項１１】
請求項９記載の該トランスジェニック植物の種子。
【請求項１２】
請求項１０記載の該トランスジェニック植物の種子。
【請求項１３】
（ｉ）（ａ）植物細胞中で活性でかつグリホサート耐性遺伝子をコードするポリヌクレオチド分子に作動可能に連結した真核生物の翻訳開始因子非コーディング調節要素ポリヌクレオチド分子を含む発現カセットで形質転換されたトランスジェニック植物を植え、ここに、該発現カセットは、グリホサート耐性蛋白質をコードするポリヌクレオチド分子に作動可能に連結した請求項１に記載のポリヌクレオチド分子を含み；次いで
（ｉｉ）雑草の成長を抑制する適用速度にてグリホサートを圃場に適用することを含み、トランスジェニック作物植物の成長および収穫が実質的にグリホサート適用により影響されないことを特徴とする、グリホサート耐性トランスジェニック作物植物の圃場における雑草成長を抑制する方法。
【請求項１４】
該グリホサート耐性遺伝子が、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳ、グリホサートオキシドレダクターゼおよびグリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子よりなる群から選択される請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
トランスジェニック植物が２５６オンス／エーカーに及ぶ適用率(application rate）を許容できる請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
グリホサートの適用が、作物の成長中に少なくとも１回である請求項１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物分子生物学および植物遺伝子工学の分野に関し、植物における導入遺伝子の発現に有用なポリヌクレオチド分子を含む。
本願は、２００４年８月１９日付で出願された合衆国仮出願シリアル番号60/602765（ここに出典明示して本明細書の一部とみなす）の米国特許法第１１９（ｅ）下の優先権を主張する。
【０００２】
配列表の取込み
各々が１４，３３６バイト（ＭＳ−ＤＯＳにおいて測定）であって、２００５年８月１７日に作成され全てがＣＤ−ＲＯＭに入ったファイル名pa_01078．rptを含む配列表（配列表コピー１および配列表コピー２）およびその配列表のコンピューター可読形態の２つのコピーを参照して本明細書の一部とみなす。
【０００３】
背景
植物遺伝子工学の目標の１つは農業学的に望ましい特徴または形質を持つ植物を生成することである。トランスジェニック植物における望ましい導入遺伝子の適当な発現は、この目標を達成する一つの方法である。プロモーター、リーダーおよびイントロンのごとき調節要素は、生細胞における遺伝子の全体的な発現における不可欠な部分を演じる非コードのポリヌクレオチド分子である。従って、植物中で機能する単離された調節要素は、遺伝子工学の方法を介して植物表現型を調節するのに有用である。
【０００４】
多数の調節要素が、利用可能あって、導入遺伝子の全体的な良好な発現を提供するのに有用である。例えば、ゴマノハグサ・モザイクウイルスの３５Ｓ転写体からのプロモーターであるＰ−ＦＭＶ（米国特許第6,051,753号）；カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ  ＲＮＡ転写体からのプロモーターであるＰ−ＣａＭＶ  ３５Ｓ（米国特許第5,530,196号）；イネ（Oryza sativa）のアクチン１遺伝子からのプロモーターであるP-Riceアクチン1（米国特許第5,641,876号）；およびAgrobacterium tumefaciensのノパリン合成酵素遺伝子からのプロモーターであるP-NOSのごとき構成プロモーターは、植物の大部分または全ての寿命の間に大部分または全ての植物組織中でいくらかのレベルの遺伝子発現を供していることが知られている。従前の研究はトランスジェニック植物における遺伝子発現に影響するのに有用な多数の調節要素を提供しているが、有益な発現特徴を持つ新規な調節要素の大きな必要性が依然として存在している。特に、高レベルにてトランスジェニック作物植物、特に、組織、器官中、あるいは植物成長の特定の発育段階の間に、導入遺伝子の発現を指令できる調節要素についての必要性が存在する。多数の従前に同定された調節要素は、トランスジェニック植物において選択された遺伝子の発現の利益を十分に実現するのに必要な発現のパターンまたはレベルを提供しない。
【０００５】
真核生物翻訳開始因子eIF-4Aは、ｍＲＮＡのリボソームへの結合に必要とされるＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼ蛋白質である。このファミリーのメンバーは、マウス、ショウジョウバエ、酵母、タバコ、Arbabidopsis、小麦および米を含めた多数の種において報告されている（KA Branderら (1995) Biochimica et Biophysica Acta 1261:424-444）。本発明者らは、eIF-4A遺伝子からのプロモーターおよび他の非コーディング調節要素が構成的発現パターン有し、そのプロモーターおよび調節要素がグリホサート耐性植物を生成するようにグリホサート耐性５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）導入遺伝子のごとき導入遺伝子の発現を指令するのに有用であろうことを仮定した。グリホサート耐性植物の効率的生成は、葯および分裂組織のごとき最も感受性の生殖器を含めたすべての組織において導入遺伝子発現を指令できるプロモーターおよび調節要素の使用を必要とする。かくして、本発明は、タバコ（Nicotiana tabacum）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）およびタルウマゴヤシ（Medicago truncatula）の真核生物翻訳開始因子（eIF4A）遺伝子から単離されたかかるプロモーターおよび調節要素を提供する。
【０００６】
概要
１つの具体例において、本発明は、植物における導入遺伝子発現を変調するのに有用な配列番号： 1〜11として提供された、タバコ、シロイヌナズナおよびタルウマゴヤシから単離されたプロモーターおよび調節要素を提供する。もう一つの具体例において、本発明は、植物における導入遺伝子発現を変調するのに有用なプロモーターおよび調節要素を含む構築体を提供する。もう一つの具体例において、本発明は、異種性ＤＮＡ分子に作動可能に連結されたプロモーターおよび調節要素を含むトランスジェニック植物ならびにそのトランスジェニック植物の種子を提供する。トランスジェニック植物は。農業経済学的に望ましい表現型、特に、除草剤耐性、より詳細には、グリホサート除草剤に対する耐性を発現する。
【０００７】
詳細な記載
本明細書に開示された本発明は、タバコ、シロイヌナズナおよびタルウマゴヤシからの遺伝子調節活性を有するポリヌクレオチド分子を提供する。これらのポリヌクレオチド分子の設計、構築および使用は、本発明の１つの目的である。これらのポリヌクレオチド分子のポリヌクレオチド配列は、配列番号： 1〜11として提供される。これらのポリヌクレオチド分子は、植物の栄養組織および再生組織における作動可能に連結した転写可能ポリヌクレオチド分子の転写に影響でき、従って、これらの組織における導入遺伝子の発現を選択的に調節できる。
【０００８】
定義
以下の定義および方法は、より良好に本発明を定義し、本発明の実施において当業者をガイドするために提供される。特記しない限りは、用語は、関連技術分野における当業者によって慣例的用法により理解されるべきである。
本明細書に用いた「断片」または「その断片」なる用語は、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも８５、または少なくとも９５個の隣接するヌクレオチド塩基を含む有限のポリヌクレオチド配列長をいい、全体におけるその完全な配列は、参照されたポリヌクレオチド分子の隣接する成分と同一である。
【０００９】
本明細書に用いた「ポリヌクレオチド分子」なる用語は、５’（上流）端から３’（下流）端に読まれたゲノム起源もしくは合成起源の単鎖または二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子、すなわち、各々、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基のポリマーをいう。
【００１０】
本明細書に用いた「ポリヌクレオチド配列」なる用語は、ポリヌクレオチド分子の配列をいう。３７ ＣＦＲ§１．８２２に記載されたヌクレオチド塩基についての命名法を本明細書に用いる。
【００１１】
本明細書に用いた「調節要素」なる用語は、遺伝子調節活性を有するポリヌクレオチド分子、すなわち、作動可能に連結した転写可能ポリヌクレオチド分子の転写または翻訳に影響する能力を有するものをいう。プロモーター、リーダー、イントロンおよび転写終了領域のごとき調節要素は、生細胞における遺伝子の全体的な発現において不可欠な部分を演じる遺伝子調節活性を有する非コードのポリヌクレオチド分子である。従って、植物において機能する単離された調節要素は、遺伝子工学の方法を介して植物表現型を改変するのに有用である。「調節要素」により、特定の遺伝子が、いつ発現されるか、どのレベルにて発現されるかを決定する一連のヌクレオチドを意図する。調節ＤＮＡ配列は、調節蛋白質または他の蛋白質と特異的に相互作用する。
【００１２】
本明細書に用いた「遺伝子調節活性」なる用語は、作動可能に連結したポリヌクレオチド分子の転写または翻訳に影響できるポリヌクレオチド分子をいう。遺伝子調節活性を有する単離されたポリヌクレオチド分子は、一過性または空間的な発現を提供するか、または作動可能に連結したポリヌクレオチド分子の発現のレベルおよび割合を変調し得る。遺伝子調節活性を有する単離されたポリヌクレオチド分子は、プロモーター、イントロン、リーダーまたは３’転写終了領域を含み得る。
【００１３】
本明細書に用いた「遺伝子発現」または「発現」なる用語は、転写されたＲＮＡ分子へのＤＮＡ分子の転写をいう。遺伝子発現は、一過性、空間的、発育的または形態学的な質ならびに定量的または定性的な指標に関連して記載し得る。転写されたＲＮＡ分子を翻訳して、蛋白質分子を生成でき、またはアンチセンスもしくは他の調節ＲＮＡ分子を提供し得る。
【００１４】
本明細書に用いた「発現パターン」は、いずれのパターンの差次的（differential）遺伝子発現である。好ましい具体例において、発現パターンは、組織、一過性、空間的、発育的、ストレス、環境、生理的、病理学的、細胞周期、および化学的な応答の発現パターンよりなる群から選択される。
【００１５】
本明細書に用いた「増強された発現パターン」は、総細胞ＲＮＡまたは蛋白質の０．０１％（ｗ／ｗ）を超えるレベル、好ましくは約０．５％と約２０％（ｗ／ｗ）との間の範囲にて発現されるいずれかの発現パターンである。
【００１６】
本明細書に用いた「作動可能に連結した」なる用語は、第１のポリヌクレオチド分子が第２のポリヌクレオチド分子の機能に影響するようにポリヌクレオチド分子が配置された場合の、注目する遺伝子のごとき第２の転写可能ポリヌクレオチド分子と連結した、プロモーターのごとき第１のポリヌクレオチド分子をいう。その２つのポリヌクレオチド分子は、単一の隣接するポリヌクレオチド分子の一部であるか、一部でなくともよく、隣接していても、隣接していなくともよい。例えば、プロモーターが細胞において注目する遺伝子の転写を調節または媒介するならば、プロモーターは注目する遺伝子に作動可能に連結される。
【００１７】
本明細書に用いた「転写可能ポリヌクレオチド分子」なる用語は、限定されるものではないが、蛋白質コード配列（例えば、導入遺伝子）および非コード配列（例えば、遺伝子抑制に有用な分子）を含めた、ＲＮＡ分子に転写できるいずれかのポリヌクレオチド分子をいう。転写可能ポリヌクレオチド分子が、翻訳される機能的なｍＲＮＡ分子に転写され、従って、蛋白質産物として発現されるように、細胞に構築体を構築または導入するための方法は、当該技術分野において知られている。転写可能ポリヌクレオチド分子が、遺伝子抑制を惹起できる分子に翻訳されるように、細胞に構築または導入するための方法は、当該技術分野において知られている。例えば、植物細胞における遺伝子発現を調節するためにアンチセンス配向した転写可能ポリヌクレオチド分子を持つ構築体を用いた転写後の遺伝子抑制は、米国特許第5,107,065号および米国特許第5,759,829号に開示され；植物における遺伝子発現を調節するためにセンス配向の転写可能ポリヌクレオチド分子を持つ構築体を用いた転写後の遺伝子抑制は、米国特許第5,283,184号および米国特許第5,231,020号に開示され、それらのすべてをここに出典明示して本明細書の一部とみなす。本発明の実施については、構築体および宿主細胞を調製および使用するための従来の組成物および方法は、当業者にはよく知られ、例えば、以下Sambrookら, 2000というJF Sambrook, DW RussellおよびN Irwin. (2000) Molecular Cloning：A Laboratory Manual, 3rd edition Volumes 1, 2, and 3. Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたし。また、構築体は、注目する特定のＲＮＡ分子の翻訳を抑制するためにアンチセンスＲＮＡ分子を発現できるように構築し得る。本発明の実施については、構築体および宿主細胞を調製および使用するための従来の組成物および方法は、当業者にはよく知られ、例えば、Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, 3rd edition Volumes 1, 2, and 3 (2000) J.F. Sambrook, D.W. Russell, and N. Irwin, Cold Spring Harbor Laboratory Press.を参照されたし。
【００１８】
プロモーター
本発明は、以下にeIF-NCRE分子という、タバコ、シロイヌナズナおよびタルウマゴヤシからの真核生物の翻訳開始因子非コーディング調節要素分子についての組成物および有用性を記載する。これらのeIF-NCRE分子はプロモーターを含む。
【００１９】
本明細書に用いた「プロモーター」なる用語は、作動可能に連結した遺伝子の転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼＩＩおよび転写因子のごとき他の蛋白質の認識および結合に関与するポリヌクレオチド分子をいう。プロモーターは、それ自体、作動可能に連結した遺伝子の転写に影響するシス−要素もしくはエンハンサードメインのごときサブ−要素を含み得る。「植物プロモーター」は、植物細胞において機能的である天然または非天然のプロモーターである。植物プロモーターは、作動可能に連結した遺伝子または遺伝子群の発現を変調する５’調節要素として用い得る。植物プロモーターは、それらの一過性、空間的、発育的な発現パターンによって定義し得る。
【００２０】
本明細書に記載されたいずれの核酸分子も、プロモーターを含む核酸配列を含み得る。本発明のプロモーターは、蛋白質コード領域の開始部位に約３００ｂｐ上流と約１０ｋｂ上流との間のトリヌクレオチドＡＴＧ配列を含むことができる。本発明のプロモーターは、好ましくは、蛋白質コード領域の開始部位に約３００ｂｐ上流と約５ｋｂ上流との間のトリヌクレオチドＡＴＧ配列を含むことができる。本発明のプロモーターは、より好ましくは、蛋白質コード領域の開始部位に約３００ｂｐ上流と約２ｋｂ上流との間のトリヌクレオチドＡＴＧ配列を含むことができる。本発明のプロモーターは、蛋白質コード領域の開始部位に約３００ｂｐ上流と約１ｋｂ上流との間のトリヌクレオチドＡＴＧ配列を含むことができる。多数の環境において、３００ｂｐプロモーターが発現に十分であり得るが、さらなる配列は、例えば、生化学的、発育的または環境的なシグナルに応じて、発現をさらに調節するために作用できる。
【００２１】
プロモーター活性
プロモーターの活性または強さは、ｍＲＮＡまたは蛋白質の総量に対して、特に生成するｍＲＮＡまたは蛋白質蓄積の量に関して測定し得る。プロモーターは、好ましくは、総計の細胞ＲＮＡまたは蛋白質の０．０１％を超えるレベルにて、好ましくは、約０．５％〜約２０％（ｗ／ｗ）の範囲にて、作動可能に連結した核酸配列を発現する。
【００２２】
あるいは、プロモーターの活性または強さは、よく特徴づけられたプロモーター（その転写活性は従前に評価された）に対して発現し得る。例えば、少なく特徴付けられたプロモーターは、リポーター配列（例えば、ＧＵＳ）に作動可能に連結され、特定の細胞型に導入し得る。よく特徴付けられたプロモーター（例えば、その３５Ｓプロモーター）は同様に調製され、同じ細胞のコンテキスト（context）に導入される。未知のプロモーターの転写活性は、よく特徴付けられたプロモーターに対してリポーター発現の量を比較することにより決定される。１つの具体例において、本発明のプロモーターの活性は、同じ細胞のコンテキストにおいて比較された場合に、その３５Ｓプロモーターのように強い。細胞のコンテキストは、好ましくは、トウモロコシ、モロコシ、コーン、大麦、小麦、キャノーラ、ダイズ豆またはトウモロコシ；より好ましくは、トウモロコシ、モロコシ、コーン、大麦または小麦；最も好ましくはトウモロコシである。
【００２３】
シス要素
本発明のプロモーターは、以下の要素：ＣＡＡＴ、ＧＣまたはＴＡＴＡシス要素の１以上を含み得る。さらに、本発明のプロモーターは、ＧＣ、ＣＡＡＴおよび／またはＴＡＴＡボックスに加えて１以上のシス要素を含み得る。
【００２４】
多数の調節要素がシス様式（「シス要素」）にて作用し、ＤＮＡトポロジーに影響し、そのＤＮＡ鋳型へのＲＮＡポリメラーゼのアクセスを選択的に可能または制限するか、または転写開始部位にて二重らせんの選択的な開口（opening）を促進する局所的な立体配置を生成すると考えられている。シス要素は、限定されるものではないが、プロモーター、およびプロモーター調節配列（誘導可能な要素）内で生じる。シス要素は、本発明のＢＬＡＳＴにおける標的配列または標的モチーフとして知られたシス要素を用いて同定できる。
【００２５】
本発明のプロモーターは、遺伝子調節を達成することが知られ、本発明のプロモーター配列との相同性を示すシス要素の相同体を含み得る。
【００２６】
５’非翻訳リーダーおよびエンハンサー配列
本発明は、以下にeIF-NCRE分子という、タバコ、シロイヌナズナおよびタルウマゴヤシからの真核生物の翻訳開始因子非コーディング調節要素分子についての組成物および有用性を記載する。これらのeIF-NCRE分子は５’非翻訳リーダー配列を含む。
【００２７】
本明細書に用いた「リーダー」なる用語は、非コードポリヌクレオチド分子をいう。リーダーは、遺伝子のゲノムコピーの非翻訳５’領域（５’ＵＴＲ）から単離でき、一般的に、転写開始部位（ＴＳＳ）とコード配列開始部位との間のセグメントとして定義され得る。あるいは、リーダーは合成的に生成または操作された非コードＤＮＡ要素であり得る。「植物リーダー」は植物細胞において機能的である天然または非天然のリーダーである。植物リーダーは、作動可能に連結した遺伝子または遺伝子群の発現を変調する５’調節要素として用いることができる。
【００２８】
本明細書に用いた「エンハンサードメイン」なる用語は、遺伝子発現の全コントロールの態様を与えるシス作用性転写調節要素、別名、シス−要素をいう。エンハンサードメインは、転写因子を結合するように機能し得る。いくつかのエンハンサードメインは、１を超える転写因子を結合し、転写因子は、異なる親和性で１を超えるエンハンサードメインと相互作用し得る。エンハンサードメインは、欠失解析、すなわち、プロモーターの５’端からまたは内部での１以上のヌクレオチドの欠失；ＤＮアーゼＩフットプリント法、メチル化干渉、電気泳動移動度シフトアッセイ、連結反応を媒介としたＰＣＲによるｉｎ ｖｉｖｏゲノムフットプリント法および他の従来のアッセイ方法を用いたＤＮＡ結合蛋白質分析；あるいは従来のＤＮＡ比較方法による公知のシス要素モチーフでのＤＮＡ配列類似性解析を含めた多数の手法によって同定できる。エンハンサードメインの微細構造は、さらに、１以上のヌクレオチドの変異原性（または置換）、あるいは他の従来方式によって試験できる。エンハンサードメインは、かかる要素を含むプロモーターからの化学合成または単離によって得ることができ、それらは、引き続いての操作を促すのに有用な制限酵素部位を含むさらなるフランキングヌクレオチドで合成できる。
【００２９】
また、翻訳エンハンサーは、組換えベクターの一部分として組込むこともできる。かくして、組換えベクターは、核酸配列の発現を増強するのに役立つ１以上の５’非翻訳リーダー配列を好ましくは含み得る。かかるエンハンサー配列は、得られたｍＲＮＡの翻訳の効率を増加または変更するのに望ましいかもしれない。他の非コードの調節要素５’核酸リーダーの例は、dSSU 5'、PetHSP70 5'およびGmHSP17.9 5'を含む
【００３０】
イントロン
本発明は、以下にeIF-NCRE分子という、タバコ、シロイヌナズナおよびタルウマゴヤシからの真核生物翻訳開始因子の非コーディング調節要素分子についての組成物および有用性を記載する。これらのeIF-NCRE分子はイントロンを含む。
【００３１】
本明細書に用いた「イントロン」なる用語は、非コードポリヌクレオチド分子をいう。イントロンは、遺伝子のゲノムコピーの介在（非コード）配列から単離されてもよく、翻訳に先立ってｍＲＮＡのプロセシングの間に切り出された領域として一般的に定義されてもよい。あるいは、イントロンは、合成的に生成されたまたは操作された非コードＤＮＡ要素であり得る。イントロンは、それ自体、作動可能に連結した遺伝子の転写に影響するシス要素もしくはエンハンサードメインのごときサブ要素を含み得る。「植物イントロン」は、植物細胞において機能的である天然または非天然のイントロンである。植物イントロンは、作動可能に連結した遺伝子または遺伝子群の発現の変調のために調節要素として用いることができる。
【００３２】
組換えベクターにおいて転写可能ポリヌクレオチド分子配列はイントロンを含み得る。イントロンは、転写可能ポリヌクレオチド分子配列に関して異種性であり得る。他の非コーディング調節要素イントロンの例は、トウモロコシ・アクチンイントロンおよびトウモロコシＨＳＰ７０イントロンを含む。
【００３３】
転写可能ポリヌクレオチド分子
本発明のeIF-NCRE分子は、eIF-NCRE分子に関して異種性である転写可能ポリヌクレオチド分子配列に作動可能に連結し得る。
【００３４】
「異種性」なる用語は、異なった源に由来する２以上の核酸または蛋白質の配列の間の関係をいう。例えば、かかる組合せが天然に通常見出されないならば、プロモーターは、転写可能ポリヌクレオチド配列に関して異種性である。加えて、特定の配列は、それが挿入される細胞または生物体に関して「異種性」であり得る（すなわち、その特定の細胞または生物体において天然には生じない）。
【００３５】
転写可能ポリヌクレオチド分子配列は、一般的に、転写のレベルの増加が望ましいいずれかの核酸配列であり得る。転写可能ポリヌクレオチド分子配列は、好ましくは、ヒトまたは動物の食事への取込みに適当であるポリペプチドをコードする。適当な転写可能ポリヌクレオチド分子配列は、限定されるものではないが、収穫蛋白質、ストレス抵抗性蛋白質、発育調節蛋白質、組織分化蛋白質、分裂組織蛋白質、環境応答性蛋白質、老化蛋白質、ホルモン応答性蛋白質、器官脱離（abscission）蛋白質、ソース蛋白質、シンク（sink）蛋白質、花調節蛋白質、種子蛋白質、除草剤抵抗性蛋白質、耐病性蛋白質、脂肪酸生合成酵素、トコフェロール生合成酵素、アミノ酸生合成酵素および殺虫性蛋白質をコードするものを含む。
【００３６】
あるいは、eIF-NCRE分子および転写可能ポリヌクレオチド分子配列は、特定の核酸配列を下方制御するように設計し得る。これは、典型的には、eIF-NCRE分子をアンチセンス方向に配向された転写可能ポリヌクレオチド分子配列に連結することにより達成される。当業者は、かかるアンチセンスの技術に精通している。略言すれば、アンチセンス核酸配列が転写されると、それは細胞内部の相補性核酸配列にハイブリダイズし、それを捕捉する。この二本鎖ＲＮＡ分子は細胞の翻訳機構によって蛋白質に翻訳できない。いずれの核酸配列も、このようにネガティブに調節し得る。
【００３７】
改変された転写可能ポリヌクレオチド分子配列
また、本発明のeIF-NCRE分子は、eIF-NCRE分子に関して異種性である改変された転写可能ポリヌクレオチド分子配列に作動可能に連結し得る。転写可能ポリヌクレオチド分子配列は、様々な望ましい特徴を提供するように改変し得る。例えば、転写可能ポリヌクレオチド分子配列は、必須アミノ酸の含量を増加させる、アミノ酸配列の翻訳を増強する、翻訳後修飾（例えば、リン酸化部位）を変更する、翻訳された産物を細胞の内側または外側のコンパートメントに輸送する、蛋白質安定性を改善する、細胞シグナリングモチーフを挿入または欠失するように改変し得る。
【００３８】
ポリヌクレオチド分子の単離および改変方法
本発明は、ｉ）ストリンジェント条件下で配列番号： 1〜配列番号： 11もしくはその相補体、またはそれらの断片よりなる群から選択される配列とハイブリダイズする；あるいはｉｉ）配列番号： 1〜配列番号： 11もしくはその相補体、またはそれらの断片よりなる群から選定される配列と８５％以上の同一性を示す核酸配列を有するポリヌクレオチド分子を含む。また、本発明は、配列番号： 1〜配列番号： 11もしくはその相補体、またはそれらの断片よりなる群から選定される核酸配列を含む核酸分子を提供する。
【００３９】
本明細書に用いた「単離されたポリヌクレオチド分子」は、その天然の状態においてそれと通常関連する他の分子から少なくとも部分的に分離されたＲＮＡまたはＤＮＡをいう。また、１つの具体例において、「単離された」なる用語は、その天然の状態においてそのポリヌクレオチドに通常隣接する核酸から少なくとも部分的に分離されたポリヌクレオチド分子に関して本明細書に用いられる。かくして、通常会合しない、例えば、組換え技術の結果として、調節配列またはコード配列に融合したポリヌクレオチドは、本明細書において単離されると考えられる。かかる分子は、例えば、宿主細胞の染色体、または核酸溶液中に存在する場合でさえ、単離されると考えられる。本明細書に用いた「単離された」なる用語は、それらの天然の状態で存在する分子を包含することを意図しない。単離されたポリヌクレオチドは、それがトランスジェニック植物における導入遺伝子の成分として生じるならば「単離された」分子である。トランスジェニック植物における本発明の単離されたポリヌクレオチドの使用は、本発明の目的である。
【００４０】
「ハイブリダイゼーション」なる用語は、相補的塩基鎖対合を介して連結する核酸分子の能力を一般的にいう。かかるハイブリダイゼーションは、核酸分子が適当な条件下で接触する場合に、生じ得る（また、以下の「特異的ハイブリダイゼーション」参照）。
【００４１】
「特異的にハイブリダイズする」とは、２つの核酸分子が逆平行の二重らせん構造の核酸構造を形成する能力をいう。ある核酸分子は、それらが「完全な相補性」を示す、すなわち、一方の配列のヌクレオチドがもう一つの配列におけるその塩基対合パートナー・ヌクレオチドに相補的であるならば、もう一つの核酸分子の「相補体」であるという。２つの分子は、それらが、少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」条件下で相互にアニーリングされるままとすることを可能にするのに十分な安定を持って相互にハイブリダイズできるならば、「最小に相補的」であるといわれる。同様に、分子は、それらが従来の「高ストリンジェンシー」条件下で相互にアニーリングされたままとすることを可能とするのに十分な安定性を持って相互にハイブリダイズするならば「相補的」であるといわれる。例えば、少なくとも、低ストリンジェンシー条件下にて他の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子は、他方の核酸分子の「ハイブリダイゼーション可能な同族（cognate）」であるという。従来の低ストリンジェンシーおよび高ストリンジェンシー条件は、本明細書およびにSambrookら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) and by Haymesら, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)より記載されている。完全な相補性からの逸脱は、かかる逸脱が二本鎖構造を形成する分子の能力を完全には排除しない限り許容可能である。
【００４２】
本明細書に用いた「配列同一性」は、２つの最適に整列したポリヌクレオチドまたはペプチド配列が、成分、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列のウィンドウを通して不変である範囲をいう。テスト配列および参照配列の整列したセグメントについての「同一性フラクション」は、参照配列セグメント、すなわち、全参照配列またはその参照配列のより小さな定義された部分における成分の総数で割られた、２つの整列した配列によって共有される同一の成分の数である。
【００４３】
本明細書に用いた「パーセント配列同一性」または「パーセント同一性」なる用語は、（比較のウィンドウにわたり総計して参照配列の２０パーセント未満になる適当なヌクレオチド挿入、欠失またはギャップを持って）２つの配列が最適に整列する場合のテスト・ポリヌクレオチド分子（あるいはその相補鎖）と比較した、参照ポリヌクレオチド分子（あるいはその相補鎖）の直線ポリヌクレオチド配列における同一のヌクレオチドのパーセンテージをいう。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適な配列は、当業者によく知られ、SmithおよびWatermanの局所ホモロジーアルゴリズム、NeedlemanおよびWunschのホモロジー配列アルゴリズム、PearsonおよびLipmanの類似性方法の検索のごときツール、好ましくは、GCGＲ Wisconsin PackageＲ (Accelrys Inc., San Diego, CA)の一部として利用可能であるGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTAのごときこれらのアルゴリズムのコンピューター化された実行により行うことができる。テスト配列および参照配列の整列したセグメントについての「同一性フラクション」は、参照配列セグメント、すなわち、全参照配列または参照配列のより小さな定義された部分における成分の総数で割られた、２つの整列した配列によって共有される同一の成分の数である。パーセント配列同一性は、同一性フラクションが１００倍するように表わされる。１以上のポリヌクレオチド配列の比較は、全長ポリヌクレオチド配列もしくはその一部、またはより長いポリヌクレオチド配列であり得る。
【００４４】
本明細書に用いた「実質的なパーセント配列同一性」なる用語は、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、または約９５％もしくは約９８％もしくは約９９％の配列同一性のごときより大きな配列同一性のパーセント配列同一性をいう。かくして、本発明の１つの具体例は、本明細書に記載されたポリヌクレオチド配列と、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、または約９５％もしくは約９８％もしくは約９９％の配列同一性のごときより大きな配列同一性のパーセント配列同一性を有するポリヌクレオチド分子である。本明細書に供された操作可能に連結した転写可能ポリヌクレオチド分子の転写を調節または影響でき、本明細書に供されたポリヌクレオチド分子のポリヌクレオチド配列に対して実質的なパーセント配列同一性を有するポリヌクレオチド分子は、本発明の範囲内に包含される。
【００４５】
「ホモロジー」は、位置的同一性（すなわち、配列類似性または同一性）のパーセントの点から２以上の核酸またはアミノ酸配列の間の類似性のレベルをいう。また、ホモロジーは、異なる核酸または蛋白質の間の類似する機能特性の概念をいう。
【００４６】
当業者によく知られたかなり多数の方法を用いて、本明細書に開示されたポリヌクレオチド分子の断片を単離できる。例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）技術を用いて、公に入手可能な配列情報を用いて、植物のゲノムライブラリーからのフランキング領域を増幅できる。公知の配列のコア領域に隣接する未知のＤＮＡ配列を増幅するための多数の方法が当業者に知られている。方法には、限定されるものではないが、逆ＰＣＲ（ＩＰＣＲ）、ベクトレット（vectorette）ＰＣＲ、Ｙ型（Y-shaped）ＰＣＲおよびゲノムウォーキングアプローチが含まれる。また、ポリヌクレオチド分子断片は、自動オリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いることにより一般的に実施されるように、化学的手段による直接的な断片の合成のごとき他の技術によって得ることができる。本発明では、ポリヌクレオチド分子は、利用可能な配列情報に基づいたＰＣＲプライマーの設計により単離された。
【００４７】
当業者は、高分子（例えば、ポリヌクレオチド分子、プラスミド等）の構築、操作および単離のための特定の条件および手順について記載する標準資源物質、ならびにに組換え生物体の生成およびポリヌクレオチド分子のスクリーニングおよび単離に精通している。
【００４８】
ポリヌクレオチド構築体
前記のeIF-NCRE分子および転写可能ポリヌクレオチド分子配列のいずれも、構築体において提供し得る。本発明の構築体は、典型的には、作動可能に転写可能ポリヌクレオチド分子に連結された配列番号： 1または配列番号： 11に供されたごときプロモーターを含むであろう。
【００４９】
本明細書に用いた「構築体」なる用語は、１以上のポリヌクレオチド分子が機能的な操作方法において連結された、すなわち、作動可能に連結したポリヌクレオチド分子を含む、プラスミド、コスミド、ウイルス、自己複製ポリヌクレオチド分子、ファージのごときいずれかの組換えポリヌクレオチド分子、あるいはゲノム組み込みまたは自律増殖できるいずれかの源に由来する直線または環状の単鎖もしくは二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド分子をいう。
【００５０】
本明細書に用いた「ベクター」または「ベクター構築体」なる用語は、形質転換、すなわち、宿主細胞への異種性のＤＮＡの導入の目的のために用いることもできるいずれかの組換えポリヌクレオチド構築体をいう。
【００５１】
加えて、構築体は、限定されるものではないが、植物遺伝子の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、例えば、ジャガイモのＰＩ−ＩＩ終了領域、エンドウルビスコ（rubisco）小サブユニット３’ＵＴＲまたはオクトピンもしくはノパリン合成酵素３’終了領域のごとき３’ＵＴＲからのさらなるポリヌクレオチド分子を含み得る。加えて、構築体は、限定されるものではないが、植物における遺伝子発現を増強することが示された熱ショック蛋白質遺伝子から由来する非翻訳５’リーダーポリヌクレオチド分子のごとき、配列番号： 1〜配列番号： 11に供されるごとき翻訳開始において重要な役割を果たすことができ、かつ植物発現構築体における遺伝成分となり得る植物遺伝子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）からのさらなるポリヌクレオチド分子を含み得る（例えば、参照、米国特許第5,659,122号および米国特許第5,362,865号参照、そのＤＮＡ配列を出典明示して本明細書の一部とみなす）。加えて、構築体は、限定されるものではないが、イントロン、例えば、イネ（Oryza sativa）からのアクチン１遺伝子の第１のイントロン（米国特許第5,641,876号）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）の光感受性１遺伝子からのＩＳ５０Ｌイントロン、ペチュニア（Petunia hybrida）の熱ショック蛋白質７０遺伝子のイントロン（米国特許第5,659,122号)、Zea maysの熱ショック蛋白質７０遺伝子のＨｓｐ７０イントロン（米国特許第5,593,874号）（それらのＤＮＡ配列を出典明示して本明細書の一部とみなす）のごときさらなるポリヌクレオチド分子を含み得る。これらのさらなるポリヌクレオチド分子は、構築体に存在する他の要素に関して天然または異種性である源から由来してもよい。
【００５２】
組換え構築体を調製する方法は、当該技術分野においてよく知られている。植物形質転換に特に適した組換えベクター構築体を作製する方法は、限定されるものではないが、米国特許第4,971,908号、第4,940,835号、第4,769,061号および第4,757,011号に記載されたものを含む。また、これらのタイプのベクターは概説されている（Rodriguezら Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston, 1988; Glickら,  Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton, Fla., 1993）。
【００５３】
高等植物における核酸の発現に有用な典型的な構築体は、当該技術分野においてよく知られ、Agrobacterium tumefaciensの腫瘍誘導（Ti）プラスミドから由来するベクターを含む(Rogersら, Meth. In Enzymol, 153: 253-277, 1987)。また、pCaMVCNトランスファーコントロールベクターを含めた植物形質転換に有用な他の組換え構築体が記載されている（Frommら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82(17): 5824-5828, 1985）。
【００５４】
組換え構築体におけるプロモーター
組換え構築体に用いたプロモーターは、好ましくは、植物において高レベルにて異種性の転写可能ポリヌクレオチド分子配列を転写する。より詳細には、そのプロモーターは、配列番号： 1〜配列番号： 11もしくはそのいずれかの相補体；またはそのいずれかの断片よりなる群から選択される核酸配列にハイブリダイズする。適当なハイブリダイゼーション条件は、前記されたものを含む。プロモーターの核酸配列は、好ましくは、低または高ストリンジェンシー条件下で、配列番号： 1〜配列番号： 11もしくはそのいずれかの相補体；またはそのいずれかの断片とハイブリダイズする。プロモーターは、最も好ましくは、高ストリンジェンシー条件下で、配列番号： 1〜配列番号： 11もしくはそのいずれかの相補体；またはそのいずれかの断片よりなる群から選択される核酸配列にハイブリダイズする。
【００５５】
別法の具体例において、プロモーターは、配列番号： 1〜配列番号： 11もしくはそのいずれかの相補体；またはそのいずれかの断片よりなる群から選択される核酸配列に、８５％またはそれ以上の同一性、より好ましくは少なくとも８６％またはそれ以上、少なくとも８７％またはそれ以上、少なくとも８８％またはそれ以上、少なくとも８９％またはそれ以上、少なくとも９０％またはそれ以上、少なくとも９１％またはそれ以上、少なくとも９２％またはそれ以上、少なくとも９３％またはそれ以上、少なくとも９４％またはそれ以上、少なくとも９５％またはそれ以上、少なくとも９６％またはそれ以上、少なくとも９７％またはそれ以上、少なくとも９８％またはそれ以上、少なくとも９９％またはそれ以上の同一性を示す核酸配列を含む。プロモーターは、最も好ましくは、配列番号： 1〜配列番号： 11もしくはそのいずれかの相補体；またはそのいずれかの断片よりなる群から選択される核酸配列を含む。
【００５６】
組換え構築体におけるさらなるプロモーター
また、１以上のプロモーターを組換え構築体に供し得る。これらのプロモーターは、前記の転写可能ポリヌクレオチド分子配列のいずれにも作動可能に連結し得る。あるいは、プロモーターは、輸送ペプチド、選択マーカー蛋白質をコードするもの、またはアンチセンス配列ごとき他の核酸配列に作動可能に連結し得る。
【００５７】
本明細書に用いた「キメラ」なる用語は、２以上の異なったポリヌクレオチド分子の一部分の融合の生成物をいう。本明細書に用いた「キメラプロモーター」は、公知のプロモーターまたは他のポリヌクレオチド分子の操作を通して生成されたプロモーターをいう。かかるキメラプロモーターは、例えば、第１のプロモーターからの異種のエンハンサードメインを、それ自体の部分的または完全な調節要素を持つ第２のプロモーターに融合させることにより、１以上のプロモーターまたは調節要素からの遺伝子発現を与えるまたは変調することができるエンハンサードメインを組み合わせてもよい。かくして、作動可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現を変調するための本明細書に開示された方法によるキメラプロモーターの設計、構築および使用は、本発明により包含される。
【００５８】
新規なキメラプロモーターは、多数の方法によって設計または操作できる。例えば、キメラプロモーターは、第１のプロモーターからのエンハンサードメインを第２のプロモーターに融合させることにより生成し得る。得られたキメラプロモーターは、第１または第２のプロモーターに対して新規な発現特性を有し得る。新規なキメラプロモーターは、第１のプロモーターからのエンハンサードメインが第２のプロモーターに対してその５’端、３’端または内部のいずれの位置にも融合されるように、構築できる。例えば、１以上のカリモウイルスエンハンサーを本発明のプロモーターに融合した。第２のプロモーターに対してのエンハンサードメイン融合の位置は、得られたキメラプロモーターが、異なった位置で作製された融合に対して新規な発現特性を有するのを可能とし得る。植物形質転換に特に適したキメラプロモーターを作製する方法は、限定なくして、米国特許第6,660,911号に記載されたものを含む。
【００５９】
これらのさらなるプロモーターは、そのベクター構築体が挿入される細胞タイプに基づいて選択し得る。細菌、酵母および植物において機能するプロモーターは、当該技術分野において良好に教示されている。また、さらなるプロモーターは、それらの調節特徴に基づいて選択し得る。かかる特徴の例は、転写活性、誘導性、組織特異性および発育期特異性の増強を含む。植物において、ウイルスまたは合成起源の誘導可能な、構成的に活性な、一時的に調節され、および空間的に調節されるプロモーターが記載されている(Poszkowskiら, EMBO J., 3: 2719, 1989; Odellら, Nature, 313:810, 1985; Chauら, Science, 244:174-181. 1989)。
【００６０】
しばしば用いられる構成的プロモーターは、CaMV 35Sプロモーター、その増強されたCaMV 35Sプロモーター、Figwort Mosaic Virus (FMV)プロモーター、マンノピン合成酵素(mas)プロモーター、ノパリン合成酵素 (nos)プロモーターおよびオクトピン合成酵素(ocs)プロモーターを含む。
【００６１】
有用な誘導可能なプロモーターは、サフェナーズ（safeners）（置換されたベンゼンスルホンアミド除草剤）の適用により誘導されたサリチル酸またはポリアクリル酸により誘導されたプロモーター、熱ショックプロモーター、ほうれん草の亜硝酸レダクターゼ転写可能ポリヌクレオチド分子配列から由来する亜硝酸塩誘導可能なプロモーター、ホルモン誘導可能なプロモーター、およびＲｕＢＰカルボキシル化酵素およびＬＨＣＰファミリーの小サブユニットと関連した光誘導可能なプロモーターを含む。
【００６２】
有用な組織特異的な、発育上調節されたプロモーターの例は、β−コングリシニン７Ｓαプロモーターおよび種子特異的なプロモーターを含む。種子色素体における優先的発現に有用な植物の機能的プロモーターは、植物貯蔵蛋白質、および脂肪種子における脂肪酸生合成に関与する蛋白質からのものを含む。かかるプロモーターの例は、ナピン、ファゼオリン、ゼイン、大豆トリプシンインヒビター、ＡＣＰ、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼおよびオレオシンのごとき転写可能ポリヌクレオチド分子配列からの５’制御領域を含む。種子特異的な調節は、ＥＰ ０ ２５５ ３７８に言及されている。もう一つの典型的な組織特異的なプロモーターは、種子組織に特異的であるレクチン・プロモーターである。
【００６３】
組換え構築体における特に好ましいさらなるプロモーターは、ノパリン合成酵素（nos）、マンノピン合成酵素（mas）およびオクトピン合成酵素（ocs）プロモーターを含み、それらはAgrobacterium tumefaciensの腫瘍誘導プラスミド；カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）１９Ｓおよび３５Ｓプロモーター；増強されたＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター；ゴマノハグサ・モザイクウイルス（figwort mosaic virus）（ＦＭＶ）３５Ｓプロモーター；リブロース−１,５−ビスリン酸カルボキシル化酵素（ｓｓＲＵＢｌＳＣＯ）の小サブユニットからの光誘導可能なプロモーター；タバコからのEIF-4Aプロモーター(Mandelら, Plant Mol. Biol, 29: 995-1004, 1995)；トウモロコシスクロース合成酵素；トウモロコシアルコール脱水素酵素１；トウモロコシ集光性複合体；トウモロコシ熱ショック蛋白質；アラビドプシスからのキチナーゼプロモーター；ブロッコリーからのＬＴＰ（脂質輸送蛋白質）プロモーター；ペチュニアカルコン・イソメラーゼ；豆グリシン富化蛋白質１；ジャガイモパタチン；トウモロコシからのユビキチンプロモーター；およびトウモロコシからのアクチンプロモーターを含む。
【００６４】
さらなるプロモーターは、好ましくは、種子選択的、組織選択的、構成的または誘導可能である。プロモーターは、最も好ましくは、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）、オクトピン合成酵素（ＯＣＳ）、マンノピン合成酵素（ＭＡＳ）、カリフラワーモザイクウィルス１９Ｓおよび３５Ｓ（ＣａＭＶ１９Ｓ、ＣａＭＶ３５Ｓ）、増強されたＣａＭＶ（ｅＣａＭＶ）、リブロース１,５−ビスリン酸塩カルボキシル化酵素（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）、ゴマノハグサ・モザイクウイルス（ＦＭＶ）、ＣａＭＶ誘導ＡＳ４、タバコＲＢ７、小麦ＰＯＸ１、タバコＥＩＦ−４、レクチン蛋白質（Ｌｅ１）またはトウモロコシＲＣ２プロモーターである。
【００６５】
組換え構築体における他の要素
本発明は、以下にeIF-NCRE分子という、タバコ、シロイヌナズナおよびタルウマゴヤシからの真核生物の翻訳開始因子非コーディング調節要素分子を含む組成物および構築体についての有用性を記載する。これらのeIF-NCRE分子は５’−非翻訳リーダー配列を含み得る。
【００６６】
種々のシス作用性非翻訳５’および３’−非コーディング調節要素配列が、組換え核酸構築体に含まれてもよい。いずれのかかる調節配列も、他の調節配列を含む組換え構築体において供されてもよい。かかる組合せは、望ましい調節特徴を生成するように設計または改変できる。
【００６７】
５’非コーディング調節要素配列は、典型的には非翻訳リーダー配列および／またはイントロンを含む。
【００６８】
３’非翻訳領域は、典型的には、転写終了シグナル、およびアデニレートヌクレオチドのそのｍＲＮＡの３’端への付加を生じる植物中で機能するポリアデニル化シグナルを提供する。これらは、ノパリン合成酵素（nos）コード配列、ダイズ豆７Ｓα貯蔵蛋白質コード配列、アルブミンコード配列およびエンドウｓｓＲＵＢｌＳＣＯ  Ｅ９コード配列に対する３’領域から得ることもできる。特に好ましい３’核酸配列は、nos 3'、E9 3'、ADR12 3'、7Sα 3'、11S 3'およびアルブミン3'を含む。
【００６９】
典型的には、ポリアデニル化部位の数百の塩基対下流に位置した核酸配列は、転写を終了するように機能する。これらの領域は、転写されたｍＲＮＡの効率的なポリアデニル化のために必要とされる。
【００７０】
組換え構築体は、輸送ペプチドをコードする核酸をさらに含み得る。このペプチドは、細胞外液腔、葉緑体、または細胞の内側または外側のいくらかの他のコンパートメントに蛋白質を向かわせるのに有用である（欧州特許出願第０２１８５７１号参照）。
【００７１】
組換え核酸構築体における転写可能ポリヌクレオチド分子配列
組換え構築体における非コードの調節要素（ＮＣＲＥ）は、好ましくは、転写可能ポリヌクレオチド分子配列に作動可能に連結される。典型的な転写可能ポリヌクレオチド分子配列およびその改変された形態は、詳細に後記される。本発明のＮＣＲＥ分子は、ＮＣＲＥについて異種性である転写可能ポリヌクレオチド分子配列に作動可能に連結し得る。１つの態様において、転写可能ポリヌクレオチド分子配列は、一般的には、増加したレベルの転写が望ましいいずれかの核酸配列であり得る。転写可能ポリヌクレオチド分子配列は、好ましくは、ヒトまたは動物の食事への取込みに適しているポリペプチドをコードする。適当な転写可能ポリヌクレオチド分子配列は、収穫蛋白質、ストレス抵抗性蛋白質、発育調節蛋白質、組織分化蛋白質、分裂組織蛋白質、環境応答性蛋白質、老化蛋白質、ホルモン応答性蛋白質、器官脱離（abscission）蛋白質、ソース蛋白質、シンク蛋白質、花調節蛋白質、種子蛋白質、除草剤抵抗性蛋白質、耐病性蛋白質、脂肪酸生合成酵素、トコフェロール生合成酵素、アミノ酸生合成酵素および殺虫性蛋白質をコードするものを含む。
【００７２】
あるいは、ＮＣＲＥまたは転写可能ポリヌクレオチド分子配列は、特定の核酸配列を下方制御するように設計し得る。これは、ＮＣＲＥを、アンチセンスの方向に配向される転写可能ポリヌクレオチド分子配列に連結することにより典型的には達成される。当業者はかかるアンチセンス技術に精通している。かかるアプローチを用いて、細胞の核酸配列を有効に下方調節し、翻訳の引き続いての工程を混乱し得る。核酸配列は、このようにネガティブに調節され得る。
【００７３】
かくして、本発明の１つの具体例は、植物細胞への構築体の導入に際して、所望のレベルまたは所望の組織もしくは発育パターンにおいて転写可能ポリヌクレオチド分子の転写を指令するように転写可能ポリヌクレオチド分子に作動可能に連結した配列番号： 1〜配列番号： 11に供されたポリヌクレオチド分子である。いくらかの場合において、転写可能ポリヌクレオチド分子はある遺伝子の蛋白質コード領域を含み、配列番号： 1〜配列番号： 11の非コーディング調節要素は、蛋白質産物として翻訳および発現される機能的なｍＲＮＡ分子の転写を供する。また、構築体は、標的宿主細胞における注目する特定の遺伝子の発現を抑制するためにアンチセンスＲＮＡ分子または他の類似する阻害性ＲＮＡ分子の転写のために構築され得る。
【００７４】
本発明の構築体への取込みのための典型的な転写可能ポリヌクレオチド分子は、例えば、標的遺伝子種以外の種からのＤＮＡ分子または遺伝子、または同一の種に由来するまたはそれに存在する遺伝子さえ含まれるが、それは古典的再生または繁殖技術よりはむしろ遺伝子工学方法によって受容細胞に取り込まれる。外来性の遺伝子または遺伝子要素は、受容細胞に導入されるいずれかの遺伝子またはポリヌクレオチド分子をいうことを意図する。外来性ＤＮＡに含まれたポリヌクレオチド分子のタイプは、植物細胞に既に存在しているＤＮＡ、もう一つの植物からのＤＮＡ、異なった生物体からのＤＮＡ、または遺伝子のアンチセンスメッセージを含むＤＮＡ分子または人工的もしくは改変バージョンの遺伝子をコードするＤＮＡ分子のごとき外部に生成されたＤＮＡを含む。
【００７５】
融合蛋白質
前記の構造的核酸配列およびその改変された形態のいずれも、さらなる核酸配列と連結して、融合蛋白質をコードし得る。さらなる核酸配列は、好ましくは、少なくとも１つのアミノ酸、ペプチドまたは蛋白質をコードする。融合蛋白質の生成は当該技術分野においてルーチンであり、多数の可能な融合の組合せが存在する。
【００７６】
例えば、融合蛋白質は、ＧＳＴ、ＧＦＰ、ＦＬＡＧまたはポリＨＩＳのごとき融合蛋白質の検出を促す「タグを付けた（tagged）」エピトープを提供し得る。かかる融合は、好ましくは、１〜５０個のアミノ酸、より好ましくは５〜３０個のさらなるアミノ酸、さらにより好ましくは５〜２０個のアミノ酸をコードする。
【００７７】
あるいは、その融合は、調節、酵素、細胞シグナリングまたは細胞内輸送機能を提供し得る。例えば、葉緑体輸送ペプチドをコードする配列を付加して、植物細胞内の葉緑体に融合蛋白質を指令し得る。かかる融合パートナーは、好ましくは１〜１０００個のさらなるアミノ酸、より好ましくは５〜５００個のさらなるアミノ酸、さらにより好ましくは１０〜２５０個のアミノ酸をコードする。
【００７８】
色素体ターゲティングが必要な場合、例えば、植物葉緑体においてＥＰＳＰＳ酵素が機能させ、従って、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）をコードするＤＮＡ分子を、ＥＰＳＰＳのＮ末端へのＣＴＰの融合蛋白質をコードするように、ＥＰＳＰＳ蛋白質をコードするＤＮＡ分子に設計して、キメラ分子を創製する。キメラポリ核酸コード配列は、キメラ蛋白質、例えば、葉緑体輸送ペプチドおよびＥＰＳＰＳ酵素をコードするフレーム内で連結された２以上のオープンリーディングフレームよりなる。キメラ遺伝子は、遺伝子を含むように作動可能に連結した異種のソースから由来する複数の遺伝子要素をいう。本発明において、ＤＮＡ構築体は、植物葉緑体にグリホサート耐性ＥＰＳＰＳ蛋白質を指令するキメラＣＴＰ−ＥＰＳＰＳ蛋白質を発現する。天然の植物ＥＰＳＰＳ遺伝子において、葉緑体輸送ペプチド領域は、天然のコード配列（例えば、CTP2, Kleeら, Mol. Gen. Genet. 210:47-442, 1987）に含まれている。ＣＴＰは、葉緑体膜でＥＰＳＰＳ酵素から切断され、その葉緑体輸送ペプチドが除去された後に残ったプロセシングされた蛋白質産物のポリペプチド配列をいう「成熟ＥＰＳＰＳまたはＥＰＳＰＳ酵素」を創製する。グリホサート耐性ＥＰＳＰＳ酵素でのアミノ末端ＣＴＰを含む融合蛋白質の発現によるグリホサート耐性植物の生成は、当該技術分野においてよく知られている（米国特許第5,627,061号、米国特許第5,633,435号、米国特許第5,312,910号、EP0218571、EP189707、EP508909およびEP924299）。当業者は、特定のＣＴＰの機能性を利用して、植物細胞葉緑体へグリホサート耐性ＥＰＳＰＳ酵素を取り込む種々のキメラ構築体を作製できることを認識するであろう。本発明は、ＥＰＳＰ合成酵素に融合した葉緑体輸送ペプチドをコードするＤＮＡ分子に作動可能に連結したeIF-NCRE分子の組合せの有用性を示す。
【００７９】
作物学的に注目するＮＣＲＥ分子および遺伝子
また、組換え構築体は、１以上のさらなる転写可能ポリヌクレオチド分子配列を含み得る。これらのさらなる転写可能ポリヌクレオチド分子配列は、一般的に組換え構築体における使用に適したいずれかの配列であり得る。かかる転写可能ポリヌクレオチド分子配列は、前記の転写可能ポリヌクレオチド分子配列およびその改変された形態のいずれかを含む。また、さらなる転写可能ポリヌクレオチド分子配列は、前記のＮＣＲＥ配列のいずれにも作動可能に連結し得る。１以上の転写可能ポリヌクレオチド分子配列を各々作動可能に連結して、ＮＣＲＥ配列を分離し得る。あるいは、転写可能ポリヌクレオチド分子配列は、単一のＮＣＲＥ（すなわち、単一のオペロン）に作動可能に連結し得る。
【００８０】
本明細書に用いた「作物学的に注目する遺伝子」なる用語は、限定されるものではないが、植物形態学、生理学、成長および発生、収穫、栄養の増強、病気もしくは病虫害抵抗性、または環境上もしくは化学的耐性に関係する所望の特性を提供する遺伝子を含む転写可能ポリヌクレオチド分子をいう。
【００８１】
さらなる転写可能ポリヌクレオチド分子配列は、好ましくは、収穫蛋白質、ストレス抵抗性蛋白質、発育調節蛋白質、組織分化蛋白質、分裂組織蛋白質、環境応答性蛋白質、老化蛋白質、ホルモン応答性蛋白質、器官脱離蛋白質、ソース蛋白質、シンク蛋白質、花調節蛋白質、種子蛋白質、除草剤抵抗性蛋白質、耐病性蛋白質、脂肪酸生合成酵素、トコフェロール生合成酵素、アミノ酸生合成酵素および殺虫性蛋白質のごとき作物学的に注目する遺伝子をコードする。
【００８２】
あるいは、さらなる転写可能ポリヌクレオチド分子配列は、特定の核酸配列を下方制御するように設計し得る。これは、典型的には、プロモーターと共に、アンチセンス配向で、第２の構造的アミノ酸を作動可能に連結することにより達成される。当業者はかかるアンチセンス技術に精通している。また、そのプロセスは、略言して前記されている。いずれの核酸配列も、このようにネガティブに調節し得る。
【００８３】
本発明の一つの具体例において、プロモーター、リーダーまたはイントロン要素のごとき調節要素を含む配列番号： 1〜配列番号： 11に示したポリヌクレオチド分子もしくはそのいずれかの相補体またはその断片は、本発明のポリヌクレオチド分子が作物学的に注目する遺伝子である転写可能ポリヌクレオチド分子に作動可能に連結するように、構築体に組み込まれる。
【００８４】
作物学的に注目する遺伝子の発現は、作物学的に重要な形質を与えるために望ましい。作物に有益な農業形質を供する作物学的に注目する遺伝子は、例えば、限定されるものではないが、除草剤抵抗性（米国特許第5,633,435号および米国特許第5,463,175号）、収穫の増加（米国特許第5,716,837号）、害虫防除（米国特許第6,063,597号；米国特許第6,063,756号；米国特許第6,093,695号；米国特許第5,942,664号；および米国特許第6,110,464号）、菌類病抵抗性（米国特許第5,516,671号；米国特許第5,773,696号；米国特許第6,121,436号；米国特許第6,316,407号および米国特許第6,506,962号）、ウイルス抵抗性（米国特許第5,304,730号および米国特許第6,013,864号）、線虫抵抗性（米国特許第6,228,992号）、細菌性病気抵抗性（米国特許第5,516,671号、スターチ生成（米国特許第5,750,876号および米国特許第6,476,295号）、改変した油生成（米国特許第6,444,876号）、高度の油生成（米国特許第5,608,149号および米国特許第6,476,295号）、改変した脂肪酸含量（米国特許第6,537,750号）、高タンパク生成（米国特許第6,380,466号）、果実の成熟（米国特許第5,512,466号）、動物およびヒトの栄養の増強（米国特許第5,985,605号および米国特許第6,171,640号）、生体高分子（米国特許第5,958,745号および米国特許第公開番号US20030028917）、環境ストレス抵抗性（米国特許第6,072,103号）、医薬ペプチド（米国特許第6,080,560号）、プロセシング形質の改善（米国特許第6,476,295号）、消化性の改善（米国特許第6,531,648号）、低ラフィノース（米国特許第6,166,292号）、産業的酵素生成（米国特許第5,543,576号）、風味の改善（米国特許第6,011,199号）、窒素固定（米国特許第5,229,114号）、ハイブリッド種子生成（米国特許第5,689,041号）および生物燃料生成（米国特許第5,998,700号）を含む遺伝子要素を含んでいてもよく、前記にリストされた特許において記載された遺伝子要素、方法および導入遺伝子であり得、それらを出典明示して本明細書の一部とみなす。
【００８５】
あるいは、転写可能ポリヌクレオチド分子は、例えば、アンチセンス、ｄｓＲＮＡまたは共抑制媒介メカニズムを介して、内因性遺伝子の発現の標的とされた抑制を引き起こすＲＮＡ分子をコードすることにより、前記の表現型に影響できる。また、ＲＮＡは、所望の内因性のｍＲＮＡの生成物を切断するように設計した触媒的ＲＮＡ分子（すなわち、リボザイム）であり得る。かくして、蛋白質をコードするいずれかのポリヌクレオチド分子、または注目する表現型または形態学的変化を発現するｍＲＮＡが、本発明の実施に有用であり得る。
【００８６】
本発明の構築体は、一般的には、Ｔ−ＤＮＡを含むAgrobacterium tumefaciensから単離されたＴｉプラスミドの右境界（ＲＢまたはＡＧＲｔｕ．ＲＢ）および左境界（ＬＢまたはＡＧＲｔｕ．ＬＢ）領域を有するダブルのＴｉプラスミド境界ＤＮＡ構築体であり、それは、Agrobacterium細胞によって供されるトランスファー分子と共に、植物細胞のゲノム中へのＴ−ＤＮＡの組み込みを可能にする。また、構築体は、細菌細胞において複製機能および抗生物質選択を提供するプラスミド骨格ＤＮＡ、例えば、ｏｒｉ３２２のごときE. Coliの複製開始点、ｏｒｉＶ、ｒｏｐまたはｏｒｉＲｉのごとき広範囲の宿主範囲の複製開始点、スペクチノマイシンまたはストレプトマイシンに対する抵抗性を与えるＴｎ７アミノ配糖体アデニルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）をコードするSpec/strpのごとき選択マーカー用のコード領域またはゲンタミシン（Ｇｍ、Gent）選択マーカー遺伝子を含む。植物形質転換については、宿主菌株は、しばしばAgrobacterium tumefaciensＡＢＩ、Ｃ５８またはＬＢＡ４４０４であるが、しかしながら、植物形質転換の技術における当業者に知られている他の株を、本発明において機能できる。
【００８７】
選択マーカー
本発明のポリヌクレオチド分子は、記載されたマーカー遺伝子を用いてＤＮＡ構築体に組み入れることができ、安定な植物系における遺伝子発現の指標を供する一過性の分析においてテストできる。
【００８８】
本明細書に用いた「マーカー遺伝子」または「選択マーカー」なる用語は、いくらかの方法でその発現をスクリーニングまたはスコアできるいずれかの転写可能ポリヌクレオチド分子をいう。また、「選択マーカー」なる用語には、形質転換細胞を識別または選択する手段としてその分泌が検出できる選択マーカーをコードする遺伝子が含まれる。
【００８９】
一過性のアッセイにおけるマーカー遺伝子発現の試験方法は、当業者に知られている。マーカー遺伝子の一過性発現は、様々な植物、組織およびＤＮＡ送達システムを用いて報告されている。例えば、一過性分析のタイプは、限定されるものではないが、注目するいずれかの植物種を用いて、いずれかの一過性の植物アッセイにおける組織のエレクトロポレーションまたは微粒子銃を介して直接的な遺伝子送達を含むことができる。かかる一過性のシステムは、限定されるものではないが、様々な組織源からのプロトプラストのエレクトロポレーションまたは注目する特定の組織の微粒子銃を含むであろう。本発明は、限定されるものではないが、選択されたレポーター遺伝子、マーカー遺伝子または作物学的に注目する遺伝子を含めた、いずれかの転写可能ポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されたポリヌクレオチド分子を評価するためのいずれかの一過性発現システムの使用を包含する。適当な送達システムを介して一過性にテストするように予見された植物組織の例は、限定されるものではないが、葉脚組織、カルス、子葉、根、内乳、胚、花組織、花粉および表皮組織を含むであろう。
【００９０】
組換え構築体は、さらに選択マーカーを含み得る。選択マーカーとして機能する核酸配列は、そのマーカーを含まない細胞に対してそれらの同定を促す細胞における表現型を生成するように機能する。
【００９１】
選択マーカーの例は、限定されるものではないが、カナマイシン抵抗性をコードし、カナマイシン、G418等を用いて選択できるｎｅｏ遺伝子；ビアラホス抵抗性をコードするbar遺伝子；グリホサート抵抗性をコードする変異体ＥＰＳＰ合成酵素遺伝子；ブロモキシニルに対する抵抗を与えるニトリラーゼ遺伝子；イミダゾリノンまたはスルホニル尿素抵抗性を与える変異体アセトラクテート合成酵素遺伝子（ＡＬＳ）（欧州特許出願第０１５４２０４号）；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）；およびメトトレキサート抵抗性ＤＨＦＲ遺伝子を含む。
【００９２】
他の典型的な選択マーカーは、様々な発色基質が知られている酵素をコードするβ−グルクロニダーゼまたはｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）；植物組織においてアントシアニン色素の生成を調節する産物をコードするＲ座遺伝子（；様々な発色基質が知られている酵素をコードするβ−ラクタマーゼ遺伝子（例えば、ＰＡＤＡＣ、発色セファロスポリン）；ルシフェラーゼ遺伝子；発色カテコールを変換できるカテコールジオキシゲナーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子；αアミラーゼ遺伝子；チロシンをＤＯＰＡおよびドーパキノンに酸化できる（今度はメラニンに凝縮する）酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子；および発色ガラクトース基質を変化させるα−ガラクトシダーゼを含む。
【００９３】
また、「選択マーカー」の用語には、形質転換細胞を識別または選択する手段としてその分泌が検出できる、分泌マーカーをコードする遺伝子が含まれる。例は、抗体相互作用により同定できる分泌抗原または触媒的に検出できる分泌酵素でさえもコードするマーカーを含む。選択可能な分泌マーカー蛋白質は、（例えば、ＥＬＩＳＡにより）検出できる小さな拡散性蛋白質、細胞外溶液中で検出できる小さな活性酵素（例えば、α−アミラーゼ、β−ラクタマーゼ、ホスフィノトリシントランスフェラーゼ）、または細胞壁に挿入または捕捉される蛋白質（例えば、伸張の発現ユニットまたはタバコＰＲ−Ｓにおいて判明したもののごとき、リーダー配列を含む蛋白質）を含めて、多数のクラスに分類される。他の可能な選択マーカー遺伝子は、当業者には明らかであろう。
【００９４】
選択マーカーは、好ましくは、ＧＵＳ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ネオマイシンリン酸トランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＸ）、抗生物質抵抗性コード配列または除草剤（例えば、グリホサート）抵抗性コード配列である。選択マーカーは、最も好ましくは、カナマイシン、ヒグロマイシンまたは除草剤抵抗性マーカーである。
【００９５】
いずれかのスコアまたはスクリーニングのマーカー遺伝子を一過性アッセイにおいて用いることができる。本発明のプロモーターまたはプロモーター断片の一過性分析についての例示的なマーカー遺伝子は、ＧＵＳ遺伝子（出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第5,599,670号）またはＧＦＰ遺伝子（出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第5,491,084号）を含む。マーカー遺伝子に作動可能に連結されたポリヌクレオチド分子を含む構築体は、組織に送達され、組織はマーカーに依存して、適当なメカニズムにより分析される。定量的または定性的な分析をツールとして用いて、安定な植物において作物学的に注目する遺伝子に作動可能に連結された場合のポリヌクレオチド分子の潜在的な発現プロファイルを評価する。
【００９６】
かくして、１つの好ましい具体例において、配列番号： 1〜配列番号： 11に示された本発明のポリヌクレオチド分子は、選択、スクリーニング、またはスコアのマーカーを提供する選択可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されるように、ＤＮＡ構築体に組み込まれる。
【００９７】
本発明の実施に使用されるマーカーは、限定されるものではないが、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、抗生物質抵抗性を与える蛋白質または除草剤耐性を与える蛋白質をコードする転写可能ポリヌクレオチド分子を含む。カナマイシン（ｎｐｔＩＩ）、ヒグロマイシンＢ（ａｐｈ  ＩＶ）、ストレプトマイシンまたはスペクチノマイシン（aad、spec/strep）およびゲンタマイシン（ａａｃ３およびａａｃＣ４）に対する抵抗性を与える蛋白質をコードするものを含めた有用な抗生物質抵抗性マーカーは、当該技術分野において知られている。
【００９８】
トランスジェニック植物耐性が示され、本発明の方法が適用できる除草剤は、限定されるものではないが、グリホサート、グルホシネート、スルホニル尿素類、イミダゾリノン、ブロモキシニル、デラポン（delapon）、シクロヘザネジオン（cyclohezanedione）、プロトプロフィリノーゲン（protoporphyrionogen）オキシダーゼ抑制物質およびイソキサスルトール（isoxasflutole）除草剤を含む。
【００９９】
「グリホサート」とは、Ｎ−ホスホノメチルグリシンおよびその塩をいい、グリホサートは、RoundupＲ除草剤 (Monsanto Co.)の有効成分である。特記しない限りは、「グリホサート」での植物処置は、RoundupＲまたはRoundup UltraＲ製剤での処置をいう。Ｎ−ホスホノメチルグリシンおよびその塩としてのグリホサートは、グリホサートに対する菌類および植物の耐性の選択に用いた、またはin vitro生化学的アッセイにおける酵素抵抗性を決定するのに用いた合成培地の成分である。グリホサートの商業的な製剤の例は、限定なくして、そのイソプロピルアンモニウム塩としてグリホサートを含有するROUNDUPＲ、ROUNDUPＲ ULTRA、ROUNDUPＲ ULTRAMAX、ROUNDUPＲ、ROUNDUPＲ CT、ROUNDUPＲ EXTRA、ROUNDUPＲ BIACTIVE、ROUNDUPＲ BIOFORCE、RODEOＲ、POLARISＲ、SPARKＲおよびACCORDＲ除草剤；そのカリウム塩としてグリホサートを含有するWEATHERMAXＲ；そのアンモニウム塩としてグリホサートを含有するROUNDUPＲ DRYおよびRIVALＲ除草剤としてモンサント社より販売されるもの；そのナトリウム塩としてグリホサートを含有するROUNDUPＲ GEOFORCEとしてモンサント社より販売されるもの；およびそのトリメチルスルホニウム塩としてグリホサートを含有するTOUCHDOWNＲとしてZeneca社より販売されるものを含む。
【０１００】
除草剤耐性に関与する蛋白質をコードするポリヌクレオチド分子は、当該技術分野において知られており、それは限定されるものではないが、グリホサート耐性について米国特許第5,627,061号、米国特許第5,633,435号、米国特許第6,040,497号および米国特許第5,094,945号（それらの全てを出典明示して本明細書の一部とみなす）に記載された５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）をコードするポリヌクレオチド分子、グリホサートオキシドレダクターゼおよびグリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド（ＧＯＸ、米国特許第5,463,175号およびＧＡＴ、米国特許公開20030083480、出典明示して本明細書の一部とみなす）；ブロモキシニル耐性について米国特許第4,810,648号（出典明示して本明細書の一部とみなす）に記載されたブロモキシニルニトリラーゼ（Ｂｘｎ）をコードするポリヌクレオチド分子；ノルフルラゾン耐性についてMisawa ら, (1993) Plant J. 4:833-840 およびMisawaら, (1994) Plant J. 6:481-489に記載されたフィトエン・デサチュラーゼ（ｃｒｔＩ）をコードするポリヌクレオチド分子；スルホニル尿素除草剤に対する耐性についてSathasiivanら (1990) Nucl. Acids Res. 18:2188-2193に記載されたアセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＨＡＳ、ａｋａ  ＡＬＳ）をコードするポリヌクレオチド分子；およびグルホシネートおよびビアラホス耐性についてDeBlockら (1987) EMBO J. 6:2513-2519に記載されたbar遺伝子；抵抗性ヒドロキシフェニル・ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＨＰＰＤ、米国特許第6,768,044号）を含む。本発明のプロモーターは、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ、グリホサート抵抗性ＥＰＳＰＳ、アミノ配糖体リン酸トランスフェラーゼ、ヒドロキシフェニルピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ヒグロマイシンリン酸トランスフェラーゼ、ネオマイシンリン酸トランスフェラーゼ、ダラポンデハロゲナーゼ、ブロモキシニル抵抗性ニトリラーゼ、アントラニル酸合成酵素、グリホサートオキシドレダクターゼおよびグリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を発現できる。
【０１０１】
形質転換された植物および植物細胞
また、本発明は、５’から３’の配向において、異種の転写可能ポリヌクレオチド分子配列に作動可能に連結された１以上の非コーディング調節要素を含む形質転換細胞の生成方法に指向される。また、他の配列は、非コーディング調節要素および転写可能ポリヌクレオチド分子配列と共に細胞へ導入し得る。これらの他の配列は、３’転写ターミネーター、３’ポリアデニル化シグナル、他の翻訳されていない配列、輸送またはターゲティングの配列、選択マーカー、エンハンサーおよびオペレーターを含み得る。
【０１０２】
形質転換方法は、一般的には、適当な宿主細胞を選択し、組換えベクターで宿主細胞を形質転換し、次いで形質転換された宿主細胞を得る工程を含む。
【０１０３】
本明細書中で使用されるように、該用語「形質転換された」は、構築体のような外来ポリヌクレオチド分子が導入されている細胞、組織、器官、または生物を指す。該導入されたポリヌクレオチド分子は、該導入されたポリヌクレオチド分子が次の子孫によって遺伝を受け継がれるように、受容細胞、組織、器官、または生物の該ゲノムDNAに組み込まれてもよい。「トランスジェニック」または「形質転換された」細胞または生物は、また、該細胞または生物の子孫およびそのようなトランスジェニック植物を、交雑種における親として使用する育種プログラムから生成され、外来ポリヌクレオチド分子の存在から得られる改変された表現型を呈する子孫を含む。
【０１０４】
好ましい組換え構築体、転写可能ポリヌクレオチド分子配列、非コーディング調節要素、および他の調節要素は、上記される。該非コーディング調節要素は、好ましくは、ストリンジェント条件下で、配列番号:1ないし配列番号:11、またはそのいずれかの相補体とハイブリダイズする；あるいは、配列番号:1ないし配列番号:11に対して、85%またはそれ以上の同一性、より好ましくは少なくとも86またはそれ以上、87またはそれ以上、88またはそれ以上、89またはそれ以上、90またはそれ以上、91またはそれ以上、92またはそれ以上、93またはそれ以上、94またはそれ以上、95またはそれ以上、96またはそれ以上、97またはそれ以上、98またはそれ以上、または99%またはそれ以上の同一性を呈する核酸配列を有する。該宿主細胞を形質転換するのに使用される組換え構築体は、典型的には、5'ないし3'の向きにおいて：転写可能ポリヌクレオチド分子配列、転写可能ポリヌクレオチド分子配列、3'転写ターミネーター、および3' ポリアデニル化シグナルの転写を方向付けるためのプロモーターを含む。さらに、該組換えベクターは、非翻訳核酸配列, 輸送および標的核酸配列、選択マーカー、エンハンサー、またはオペレーターを含み得る。適当な組換えベクター、転写可能ポリヌクレオチド分子配列、プロモーター、および他の調節要素は、制限なしに、上記のものを含む。
【０１０５】
細胞にDNAを導入するための技術は、当業者によく知られている。これらの方法は、一般的には、５つのカテゴリー： (1) 化学的方法 (GrahamおよびVan der Eb, Virology, 54(2): 536-539, 1973; Zatloukalら, Ann. N.Y. Acad. Sci., 660: 136-153, 1992); (2) マイクロインジェクション (Capecchi, Cell, 22(2): 479-488, 1980)、エレクトロポレーション (WongおよびNeumann, Biochim. Biophys. Res. Commun., 107(2): 584-587, 1982; Frommら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82(17): 5824-5828, 1985; 米国特許第5,384,253号) および粒子加速 (JohnstonおよびTang, Methods Cell Biol., 43(A): 353-365, 1994; Fynanら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(24): 11478-11482, 1993) のような物理的方法; (3) ウイルスベクター (Clapp, Clin. Perinatol., 20(1): 155-168, 1993; Luら, J. Exp. Med., 178(6): 2089-2096, 1993; EglitisおよびAnderson, Biotechniques, 6(7): 608-614, 1988); (4) 受容体媒介メカニズム (Curielら, Hum. Gen. Ther., 3(2):147-154, 1992; Wagnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89(13): 6099-6103, 1992)、および(5) Agrobacteriumによってのような細菌媒介メカニズムに分類することができる。別法として、核酸は、植物の生殖器官を直接注入することによって、花粉に直接導入することができる (Zhouら, Methods in Enzymology, 101: 433, 1983; Hess, Intern Rev. Cytol., 107: 367, 1987; Luoら, Plant Mol Biol. Reporter, 6: 165, 1988; Penaら, Nature, 325: 274, 1987)。他の形質転換方法は、例えば、米国特許第5,508,184号において説明されるように、プロトプラスト形質転換を含む。また、該核酸は、未成熟の胚芽に注入されてもよい(Neuhausら, Theor. Appl. Genet., 75: 30, 1987)。
【０１０６】
植物細胞の形質転換のために最も一般的に使用される方法は、該Agrobacterium-媒介DNA移動方法 (Fraleyら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 4803, 1983) (米国特許第5,824,877号; 米国特許第5,591,616号; 米国特許第5,981,840号;および米国特許第6,384,301に示されるとおり) およびバイオリスティックスまたはマイクロプロジェクタイル衝撃媒介方法(つまり、該遺伝子) (米国特許第5,015,580号; 米国特許第5,550,318号; 米国特許第5,538,880号; 米国特許第6,160,208号; 米国特許第6,399,861号;および米国特許第6,403,865号に記載のとおり)である。典型的には、核形質転換が望ましいが、葉緑体またはアミロプラストのような色素体を特異的に形質転換することが望ましい場合、植物色素体は、タバコ、Arabidopsis、ジャガイモおよびBrassica種のような特定の植物種に、該所望のポリヌクレオチドの微粒子媒介送達を利用して形質転換されてもよい。
【０１０７】
Agrobacterium-媒介形質転換は、該属Agrobacteriumに属する遺伝子操作された土壌菌の使用を介して達成される。いくつかのAgrobacterium種は、多くの植物種に、いずれかの所望の片のDNAを運ぶように遺伝子操作され得る「T-DNA」として知られる特異的なDNAの移動を媒介する。T-DNA媒介病変形成の方法を特徴付ける主な事象は：病原性遺伝子、T-DNAの処理および移動である。この方法は、多くの概説の主題である(Ream, Ann. Rev. Phytopathol. 27: 583-618, 1989; HowardおよびCitovsky, Bioassays, 12:103-108, 1990; Kado, Crit. Rev. Plant Sci. 10:1-32, 1991; Zambryski, Annual Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 43: 465-490, 1992; Gelvin, In Transgenic Plants, KungおよびWu eds., Academic Press, San Diego, pp. 49-87, 1993; BinnsおよびHowitz, 1994, In Bacterial Pathogenesis of PlantsおよびAnimals (Dang, ed.). Berlin: Springer Verlag, pp. 119-138, 1994; HooykaasおよびBeijersbergen, Ann. Rev. Phytopathol. 32:157-179, 1994; LesslおよびLanka, Cell 77:321-324, 1994; ZupanおよびZambryski, Annual Rev. Phytopathol. 27, 583-618, 1995)。
【０１０８】
マイクロプロジェクタイル衝撃(米国特許第5,550,318号; 米国特許第5,538,880号; 米国特許第5,610,042号;およびPCT公報WO 95/06128;各々は、その全文において、引用によって、本明細書中に特異的に援用される)に関して、粒子は核酸で覆われ、推進力によって細胞へと送達される。例示的な粒子は、タングステン、白金、および好ましくは、金よりなるものを含む。衝撃のために、懸濁液中の細胞は、フィルターまたは固体培養培地上で濃縮される。別法として、未成熟な胚芽または他の標的細胞は、固体培養培地上で並べられてもよい。衝撃される細胞は、マイクロプロジェクタイル停止プレート下の適切な距離に置かれる。
【０１０９】
マイクロプロジェクタイル衝撃技術は広範に適用可能であり、それを使用して、実質的にいずれの植物種も形質転換し得る。マイクロプロジェクタイル衝撃によって形質転換された種の例は、トウモロコシ (PCT公報 WO 95/06128)、オオムギ (Ritalaら, 1994; Hensgensら, 1993)、コムギ (米国特許第5,563,055号, その全文において引用によって本明細書中に特異的に援用される)、米 (Hensgensら, 1993)、オートムギ (Torbetら, 1995; Torbetら, 1998)、ライ麦 (Hensgensら, 1993)、サトウキビ (Bowerら, 1992)、およびソルガム(Casaら, 1993; Hagioら, 1991);ならびにタバコを含む多くの双子葉植物 (Tomesら, 1990; BuisingおよびBenbow, 1994)、大豆 (米国特許第5,322,783号, その全文において引用によって本明細書中に特異的に援用される)、ヒマワリ (Knittelら 1994)、落花生 (Singsitら, 1997)、綿 (McCabeおよびMartinell, 1993)、トマト (Van Eckら 1995)、および一般的な豆 (米国特許第5,563,055号, その全文において引用によって本明細書中に特異的に援用される)のような単子葉植物種を含む。
【０１１０】
形質転換理論に拘わらず形質転換された植物細胞を選択またはスコアするために、該細胞に導入されたDNAは、再生可能な植物組織において機能する遺伝子を含有して、さもなければ有毒な化合物に対して植物組織抵抗性を授与する化合物を精製する。選択可能、スクリーニング可能、またはスコア可能マーカーとしての使用のための関心のある遺伝子は、GUS、緑色蛍光蛋白質 (GFP)、発光酵素(LUX)、抗生物質または除草剤耐性遺伝子を含むが、これらに制限されるものではないであろう。抗生物質耐性遺伝子の例は、ペニシリン、カナマイシン（およびネオマイシン, G418, ブレオマイシン）; メトトレキサート（およびトリメトプリム）；クロラムフェニコール；カナマイシンおよびテトラサイクリンを含む。
【０１１１】
本発明における使用のための特定の好ましい選択マーカー遺伝子は、カナマイシン (nptII)、ヒグロマイシンB (aph IV)およびゲンタマイシン(aac3およびaacC4) (Dekeyserら, Plant Physiol., 90:217-223, 1989)のような抗生物質、および除草剤様グリホサート(Della-Cioppaら, Bio/Technology, 5:579-584, 1987)のような化合物に対して耐性を授与する遺伝子を含むであろう。また、他の選択デバイスが実行され得、それはホスフィノトリシン、ビアラホス、およびポジティブ選択メカニズム(Joersboら, Mol. Breed., 4:111-117, 1998)に対する耐性を含むがそれらには限定されず、それは本発明の範囲内と考えられる。
【０１１２】
次いで、選択またはスクリーニングによって同定され、再生を支持する適切な培地において培養される形質転換細胞を、植物へと成熟させる。
【０１１３】
本発明は、いずれかの形質転換可能な細胞または組織と使用することができる。本明細書中で使用されるように、形質転換可能は、植物を生み出すさらなる増殖が可能な細胞または組織を意味する。当業者は、多くの植物細胞または組織が、外生DNAの挿入後および該植物細胞または組織が分化植物へと形成し得る適切な培養条件下で、形質転換可能であることを認識する。これらの目的に適当な組織は、未成熟な胚芽、胚盤組織、懸濁細胞培養液、未成熟な花序、茎分裂組織、結節外植片、カルス組織、胚軸組織、子葉、根、および葉を含み得るが、これらに限定されるものではない。
【０１１４】
形質転換植物プロトプラストまたは外植片からの植物の再生、成長、および培養は、当該分野でよく教示されている(WeissbachおよびWeissbach, Methods for Plant Molecular Biology, (Eds.), Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1988; Horschら, Science, 227: 1229-1231, 1985)。この再生および成長方法は、典型的には、形質転換細胞を選択し、該根付いた小植物段階を介する胚芽成長の通常の段階を通して、それらの個別化された細胞を培養する工程を含む。トランスジェニック胚芽および種子は、同様に再生される。この方法において、形質転換体は、一般的には、首尾良く形質転換された細胞を選択する選択培地の存在下で培養され、苗条の再生を誘導する(Fraleyら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 4803, 1983)。これらの苗条は、典型的には、２ないし４ヶ月内に得られる。該得られたトランスジェニックな根付いた苗条は、その後、土壌のような適切な植物成長培地に植えられる。該選択剤への曝露を生存する細胞、またはスクリーニングアッセイにおいて陽性とスコアされている細胞は、植物の再生を支持する培地で培養されてもよい。次いで、苗条は、細菌成長を防ぐために、選択剤および抗生物質を含有する適切な根誘導媒体に移される。多くの苗条は、根を成長させであろう。次いで、これらは、土壌または他の培地に移植されて、根の継続した成長を許容する。概説されるように、該方法は、一般的には、使用される特定の植物株によって変動するであろう。
【０１１５】
該再生されたトランスジェニック植物は自家受粉して、ホモ接合性トランスジェニック植物を提供する。別法として、該再生されたトランスジェニック植物から得られた花粉は、非トランスジェニック植物、好ましくは農学的に重要な種の近交系と交雑させてもよい。反対に、非トランスジェニック植物からの花粉を使用して、該再生されたトランスジェニック植物に受粉してもよい。
【０１１６】
該トランスジェニック植物は、該形質転換核酸配列を、その子孫へと伝え得る。該トランスジェニック植物は、好ましくは、該形質転換核酸配列に対してホモ接合性であり、有性生殖の結果として、その子孫の全てに該配列を伝達する。子孫は、該トランスジェニック植物によって生成された種子から成長させ得る。次いで、これらのさらなる植物は自家受粉して、植物の真の育種系統を生成し得る。
【０１１７】
これらの植物からの子孫は、なかでも、遺伝子発現のために評価される。該遺伝子発現は、ウエスタンブロッティング、ノーザンブロッティング、免疫沈降、およびELISAのようないくつかの一般的な方法によって検出され得る。また、該形質転換植物は、関心のある遺伝子および本発明の非コーディング調節要素によって授与される発現レベルおよび／またはプロファイルの存在につき分析される。当業者は、形質転換植物の分析に入手可能な数多くの方法を知っている。例えば、植物分析の方法は、サザーンブロットまたはノーザンブロット、PCR系アプローチ、生化学分析、表現型スクリーニング法、フィールド評価、および免疫診断アッセイを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１１８】
双子葉植物を特異的に形質転換する方法は、当業者によく知られている。これらの方法を用いる形質転換および植物再生は、綿(Gossypium hirsutum)、大豆 (Glycine max)、落花生 (Arachis hypogaea)、および属Brassicaのメンバーを含むがこれらに限定されるものではない多くの作物につき記載されている。主にAgrobacterium tumefaciensの使用による双子葉植物を形質転換し、トランスジェニック植物を得るための方法が、綿(米国特許第5,004,863号; 米国特許第5,159,135号; 米国特許第5,518,908号); 大豆 (米国特許第5,569,834号; 米国特許第5,416,011号; McCabeら, Biotechnolgy, 6: 923, 1988; Christouら, Plant Physiol. 87:671-674 (1988)); Brassica (米国特許第5,463,174号); 落花生 (Chengら, Plant Cell Rep. 15:653-657 (1996), McKentlyら, Plant Cell Rep. 14:699-703 (1995)); パパイヤ; およびエンドウ豆(Grantら, Plant Cell Rep. 15:254-258 (1995))につき公開されている。
【０１１９】
単子葉植物を形質転換するための方法は、当業者によく知られている。これらの方法を用いる形質転換および植物再生は、オオムギ (Hordeum vulgarae); トウモロコシ (Zea mays); オーツムギ (Avena sativa); カモガヤ(Dactylis glomerata); 米 (Oryza sativa, indicaおよびjaponica種を含む); ソルガム(Sorghum bicolor); サトウキビ (Saccharum sp); ヒロハノウシノケグサ(Festuca arundinacea); 芝草種 (例えば、種: Agrostis stolonifera, Poa pratensis, Stenotaphrum secundatum); 小麦 (Triticum aestivum)、およびアルファルファ(Medicago sativa)を含むが、これらに制限されるものではない多くの作物につき記載されている。多くの形質転換理論を使用することができ、いずれかの数の関心のある標的作物からの安定したトランスジェニック植物の生成のために修飾することができることは、当業者に明白である。
【０１２０】
トランスジェニック植物およびトランスジェニック種子
本発明の種子は、稔性トランスジェニック植物から収穫することができ、それらを使用して、本発明の構築体を含み、農学的特徴のある遺伝子を発現するハイブリッド植物系統を含む本発明の形質転換植物の子孫世代を成長させることができる。
【０１２１】
また、本発明は、本発明の植物の部分を提供する。植物部分は、制限なしに、種子、胚乳、胚珠および花粉を含む。本発明の特に好ましい具体例において、該植物部分は種子である。
【０１２２】
トランスジェニック植物の利用
本発明のさらなるもう１つの態様は：
(i) (a)植物において活性であり、グリホサート耐性EPSPSをコードするDNA分子に作動可能に連結した真核生物翻訳開始因子 非コーディング調節要素 ポリヌクレオチド分子を含む発現カセットによって形質転換されたトランスジェニック植物を植え、次いで(ii)雑草の成長を阻害する適用率（application rate）にて、圃場にグリホサートを適用し、ここに該トランスジェニック作物植物の成長および収率が、該グリホサート適用によって実質的には影響を受けないことを特徴とするトランスジェニック作物植物の圃場において雑草成長を阻害する方法である。特定の具体例において、該プロモーターは配列番号:1または配列番号:2である。グリホサート適用率は、特定のグリホサート耐性作物において雑草を制御するのに必要な効果的な速度であり、これらの速度は、8 oz/Aないし256 oz/A、好ましくは16 oz/Aないし128 oz/A、より好ましくは32 oz/Aないし96 oz/Aの範囲であり得る。該グリホサートは、該グリホサート耐性作物の成長の間、少なくとも一度適用され、該作物の成長の間、2、3または4回、または必要に応じてそれ以上適用されて、その土地での雑草を制御してもよい。特定の具体例において、該トランスジェニック植物は、256オンス/エーカーまでの適用率に耐えることができる。特定の具体例において、該トランスジェニック植物は、8オンス/エーカーないし128オンス/エーカーの範囲の適用率に耐えることができる。特定の具体例において、該トランスジェニック植物は、32オンス/エーカーないし96オンス/エーカーの範囲の適用率に耐えることができる。
【０１２３】
他の形質転換生物
該上記のプロモーターおよび転写可能なポリヌクレオチド分子配列のいずれかを、藻細胞、藻、真菌細胞、真菌、細菌細胞、または昆虫細胞のようないずれかの細胞または生物に導入してもよい。好ましい宿主および形質転換体は：Aspergillusのような真菌細胞、酵母、昆虫、細菌および藻を含む。
【０１２４】
該形質転換細胞または生物は、好ましくは原核生物、より好ましくは細菌細胞、さらにより好ましくはAgrobacterium、Bacillus、Escherichia、Pseudomonas細胞、最も好ましくはEscherichia coli細胞である。別法として、該形質転換生物は、好ましくは、酵母または真菌細胞である。該酵母細胞は、好ましくは、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、またはPichia pastorisである。
【０１２５】
さて、本発明を一般的に記載してきたが、それは、説明の方法によって提供される以下の実施例への言及を介して、より容易に理解されるであろうが、特記しない限り、本発明を制限するように意図されてはいない。
【０１２６】
本明細書中に引用される各文書、特許、および引用文献は、その全文において、本明細書中に引用によって援用される。
【０１２７】
以下の実施例は、本発明の好ましい具体例を実施するように含まれる。続く実施例に開示される技術は、本発明の実施において上手く機能すると発明者らによって発見された技術を表すことが、当業者によって理解されるはずである。しかしながら、当業者は、本開示に鑑みて、多くの変更を、開示された特異的な具体例においてなすことができ、それでもなお、本発明の精神および範囲から逸脱せずに、よく似たまたは同様の結果を得ることができることを理解するはずであり、従って、添付の図面に記載されるまたは示される全ての事柄は、制限する意味ではなく、説明的なものとして解釈されるべきである。
【実施例】
【０１２８】
実施例
実施例１：ポリヌクレオチド分子同定およびクローニング
ポリヌクレオチド分子を、Nicotiana tabacum、Arabidopsis thaliana、およびMedicago truncatulaの該真核生物翻訳開始因子eIF4A遺伝子から単離して、葯および分裂組織組織のような最も感度の高い生殖器官を含む双子葉植物の全ての組織において導入遺伝子発現に作用することができる要素を同定した。全ての該ポリヌクレオチド分子を、葉緑体輸送ペプチド配列, TS-At.SHKG-CTP2; Agrobacterium tumefaciens株 CP4から単離されたグリホサート耐性EPSPS遺伝子に対するコーディング配列, Cr-AGRtu.aroA, (米国特許第5,633,435号, 本明細書中に引用によって援用される);およびPisum sativumからのリブロース二リン酸カルボキシラーゼ遺伝子の3'非翻訳領域, T-PS.RbcS2-E9に作動可能に連結し、グリホサート耐性特徴付けに使用した。
【０１２９】
該Nicotiana tabacum eIF4A-10遺伝子プロモーター、リーダー、およびイントロン(本明細書中に、それぞれ、P-Nt.eIF4A、L-Nt.eIF4A、およびI-Nt.eIF4Aと呼ばれる）を、プライマーを設計することによって、NCBIを介してGI:475215受託番号X79008として入手可能な公的に入手可能なゲノムeIF4A-10遺伝子配列へとクローン化した。Nicotiana tabacumからのゲノムDNAを単離し、使用して、PCRおよび該NteIF4A 順方向および逆方向プライマー (それぞれ、配列番号: 12および13として提供される)を用いて、該Nt.eIF4A-10プロモーター、リーダー、およびイントロンを増幅した。該プロモーターP-Nt.eIF4Aに対する配列を、配列番号: 1として提供し；該リーダーL-Nt.eIF4Aに対する配列を配列番号: 2として提供し；該イントロンI-Nt.eIF4Aに対する配列を配列番号: 3として提供する。次いで、PCR生成物を、SmaIおよびNcoIで消化し、該同一の制限酵素で消化されたプラスミド(pMON70501)へとクローン化して、該プロモーター、リーダー、およびイントロンを、該AROA遺伝子に作動可能に連結した (例えば、PCT公報WO 2004/009761-A2参照, 本明細書中に引用によって援用される)。続く構築体(pMON70500)を、制限酵素消化および配列決定によってスクリーンして、該正確な配列が存在することを確認した。第２の発現カセットを含有する二重カセット構築体を、XmaIでpMON70500を消化し、(NgoMIVおよびXmaIによって切断されたpMON13773からの)該GUS導入遺伝子に作動可能に連結した7Sa'プロモーターを含有するカセットにおいてサブクローン化することによって構築した。続く構築体(pMON65396)を、制限酵素消化によってスクリーニングした。
【０１３０】
該Arabidopsis thaliana eIF-4A1遺伝子プロモーター、リーダー、およびイントロン (本明細書においてそれぞれ、P-At.eIF4A、L-At.eIF4A、およびI-At.eIF4Aと呼ばれる)を、プライマーを設計することによって、NCBIを介して、GI:14594801受託番号AJ298137として入手可能な該公的に入手可能なeIF-4A1遺伝子配列にクローン化した。Arabidopsis thalianaからのゲノムDNAを単離し、使用して、PCRおよび該AteIF4A順方向および逆方向プライマー(それぞれ、配列番号: 14および15として提供される)を用いて、該At.eIF4A1プロモーター、リーダー、およびイントロンを増幅した。該プロモーターP-At.eIF4Aに対する配列を配列番号: 4として提供し、該リーダーL-At.eIF4Aに対する配列を配列番号: 5として提供し；該イントロンI-At.eIF4Aに対する配列を配列番号: 6として提供する。次いで、PCR生成物を、NotIおよびNcoIで消化し、該同一制限酵素で消化されたプラスミド(pMON65322)へとクローン化して、該プロモーター、リーダー、およびイントロンを、該AROA遺伝子に作動可能に連結した。該続く構築体(pMON65395)を、制限酵素消化および配列決定によってスクリーンして、該正確な配列が存在することを確認した。
【０１３１】
該Medicago truncatula eIF-4A1遺伝子プロモーター、リーダー、およびイントロンを、Medicago truncatulaにおいて最良の推定相同遺伝子を最初に同定することによって同定した。分析を、相同性系配列サーチおよび系統発生再構築を用いて行った。Nicotiana tabacum、Zea mays、Nicotinia plumbaginifolia、およびArabidopsis thalianaからの既知のeIF-4A1遺伝子に対する予測された蛋白質配列を使用して、Medicago truncatulaゲノムDNAから由来する最良の推定オルソロガス予測される蛋白質配列を同定した。次いで、この推定オルソログのゲノムDNA配列を使用して、続くクローン化のために、遺伝子のプロモーター、リーダー、およびイントロン配列を予測した。
【０１３２】
該Medicago truncatula eIF-4A1 遺伝子からの(本明細書において、それぞれ、P-Mt.eIF4A、L-Mt.eIF4A、およびI-Mt.eIF4Aと呼ばれる)プロモーター、リーダー、およびイントロンを、プライマーを設計することによって、関心のある該同定されたゲノムDNA配列へとクローン化した。Medicago truncatulaからのゲノムDNAを単離し、使用して、PCRおよび３組のMteIF4A順方向および逆方向プライマー: MtEIF4AF1 (配列番号: 16)およびMtEIF4AR (配列番号: 19); MtEIF4AF2 (配列番号: 17)およびMtEIF4AR; MtEIF4AF3 (配列番号: 18)およびMtEIF4ARを用いて、該Mt.eIF4Aプロモーター、リーダー、およびイントロンを増幅した。従って、該プロモーターの３つの変異体を、該プロモーターを、該5'末端で切り取ることによって作り出して、1941 bpプロモーター(本明細書においてP-Mt.eIF4A-1と呼ばれ、配列番号: 7として提供される)、1484 bpプロモーター(本明細書においてP-Mt.eIF4A-2として呼ばれ、配列番号: 8として提供される)、および1029 bpプロモーター(本明細書においてP-Mt.eIF4A-3として呼ばれ、配列番号: 9として提供される)を得た。該３つのプロモーター変異体を、該同一のリーダーおよびイントロンでテストして、それぞれの発現パターンを直接比較した。該リーダーに対する配列(本明細書においてL-Mt.eIF4Aとして呼ばれる)を、配列番号: 10として提供する。該イントロンに対する配列(本明細書においてI-Mt.eIF4Aとして呼ばれる)を、配列番号: 11として提供する。次いで、PCR生成物を、NotIおよびPciIで消化し、NotIおよびNcoIで消化されたプラスミド(pMON65322)へとクローン化して、該プロモーター、リーダー、およびイントロンを、該AROA遺伝子に作動可能に連結した。３つの続く構築体(pMON81504、pMON81505およびpMON81506)を、制限酵素消化および配列決定によってスクリーニングして、該正しい配列が存在することを確認した。本明細書中で言及される配列および構築体を、それぞれ、表１および２に要約する。
【０１３３】
【表１】
0005631531.tif 000002
【０１３４】
【表２】
0005631531.tif 000003
【０１３５】
実施例２：Arabidopsis thalianaにおけるプロモーター特徴付け
関心のある各遺伝子を、該コーディング領域の上流および下流の配列に特異的なプライマーを用いて、ゲノムまたはcDNAライブラリから増幅してもよい。形質転換ベクターを、調製して、直接的または間接的に、促進されたカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター(米国特許第5,359,142号)の制御下で、(促進された蛋白質発現に対する)センス配向または(内因性遺伝子抑制に対する)アンチセンス配向のいずれかにおいて、DNAを構造的に転写する(Mooreら PNAS 95:376-381, 1998; Guyerら Genetics 149: 633-639, 1998; 国際特許出願PCT/EP98/07577)。また、該形質転換ベクターは、グルフォシネート除草剤への耐性のための選択可能マーカーとして、bar遺伝子を含有する。
【０１３６】
以下の略語を使用して、生成された植物および種子を記載する：
R0 =単一の形質転換植物細胞から成長した元のトランスジェニック植物
R1 =該R0植物の種子または植物子孫
R2 =該R1植物の種子または植物子孫
【０１３７】
Arabidopsis植物の形質転換を、当該分野において知られる真空湿潤方法を用いて実施される(Bethtoldら Methods Mol. Biol. 82:259-66, 1998)。引き続いて、R1種子と名付けられた該植物から収穫された種子を、グルフォシネート含有選択培地において成長させて、実際に形質転換され、R2トランスジェニック種子を生成した植物につき選択する。
【０１３８】
一群のプロモーターを、最初に単離し、それらの双子葉植物発現パターンにつき、Arabidopsis thalianaにおいてテストした。(該aroA導入遺伝子に作動可能に連結したP-Nt.eIF4Aを含有する)pMON70500および(該aroA導入遺伝子に作動可能に連結したP-At.eIF4Aを含有する)pMON65395を含む選択された構築体を使用して、該floral dip法によって、Arabidopsis thaliana生態型Columbiaを形質転換した(N Bechtoldら (1993) CR Acad Sci Paris Sciences di la vie/life sciences 316: 1194-1199およびS Cloughら (1998) Plant Journal 16(6): 735-743)。トランスジェニック Arabidopsisにおけるグリホサート除草剤耐性の分析を、初期スクリーニングとして使用して、他の双子葉植物における続いての分析のために、見込みのあるプロモーターを同定した。
【０１３９】
R0植物からの種子を収穫した。各カセット構築体からの種子を滅菌し、形質転換体の選択のために、50 mM グリホサート寒天培地上に置いた。グリホサート含有寒天上で発芽したR1実生を、７日後、土壌に移した。
【０１４０】
次いで、各構築体からの事象を、グリホサートに対する栄養および生殖耐性につき分析した。(該aroA導入遺伝子に作動可能に連結したP-FMVを含有する) pMON26140によって形質転換された植物を、比較のために使用した。この構築体は、グリホサートに対して100%栄養耐性を提供するが、全く生殖耐性を提供しないことが分かっており、つまり、該グリホサート処理された植物は繁殖性でない。三週間後、ロゼット段階の植物を、RoundupＲUltra 除草剤の24 オンス/エーカー (oz/A)または128オンス/エーカーで噴霧した。各グリホサート処理を、１構築体につき、少なくとも20の別個のトランスジェニック事象に対して行った。栄養損傷を有する植物を捨てた。非処理植物と形態学的に似ており、種子の詰まった長角果を形成したグリホサートで処理された植物は、耐性があると考えた。データを、下記の表３に提供する。測定を、各グリホサート用量にて、各構築体について分析した総事象のうちの繁殖性のグリホサート耐性事象のパーセンテージとして提供する。
【０１４１】
【表３】
0005631531.tif 000004
【０１４２】
Arabidopsisにおいてテストされた初期の群のプロモーターから、Nicotiana tabacum (pMON70500)からの該eIF4A-10遺伝子プロモーター、リーダー、およびイントロンおよびArabidopsis thaliana (pMON65395)からの該eIF-4A1遺伝子プロモーター、リーダー、およびイントロンを、さらなる研究のために選択した。これらは、形質転換されたArabidopsisにおいて上手く機能して、該対照構築体pMON26140と比較した時、栄養および生殖組織の両方においてグリホサート耐性を提供することが分かった。
【０１４３】
Medicago truncatulaにおける相同遺伝子からの調節要素を、Arabidopsisにおいてテストした。(該aroA導入遺伝子に作動可能に連結したP-Mt.eIF4A-1を含有する)pMON81504、(該aroA導入遺伝子に作動可能に連結したP-Mt.eIF4A-2を含有する)pMON81505、および(該aroA導入遺伝子に作動可能に連結したP-Mt.eIF4A-3を含有する)pMON81506を使用して、グリホサート耐性の植物体への特徴付けのために、該floral dip法によって、Arabidopsis thalianaを形質転換した。植物形質転換およびグリホサート分析を、上記のとおり実施した。データを、下記の表４に提供する。測定を、各構築体につき分析した総事象のうちの繁殖性のグリホサート耐性事象のパーセンテージとして提供する。
【０１４４】
【表４】
0005631531.tif 000005
【０１４５】
全３つの構築体は、形質転換されたArabidopsisにおいて上手く機能して、該対照構築体pMON26140と比較した時、栄養および生殖組織の両方において、グリホサート耐性を提供することが分かった。
【０１４６】
実施例３：Nicotiana tabacumにおけるプロモーター特徴付け
pMON70500、pMON26140、pMON73663 (該GUS導入遺伝子に作動可能に連結したP-Gm.7S'および該aroA導入遺伝子に作動可能に連結したP-Nt.eIF4Aを含有する二重カセット構築体)、pMON65396 (該aroA導入遺伝子に作動可能に連結したP-Nt.eIF4Aおよび該GUS導入遺伝子に作動可能に連結したP-Gm.7S'を含有する二重カセット構築体)、pMON73662 (該aroA導入遺伝子に作動可能に連結したP-At.eIF4Aおよび該GUS導入遺伝子に作動可能に連結したP-Gm.7S'を含有する二重カセット)、pMON81509 (該aroA導入遺伝子に作動可能に連結したP-Mt.eIF4A-1および該GUS導入遺伝子に作動可能に連結したP-Gm.7S'を含有する二重カセット構築体)、pMON81510 (該aroA導入遺伝子に作動可能に連結したP-Mt.eIF4A-2および該GUS導入遺伝子に作動可能に連結したP-Gm.7S'を含有する二重カセット構築体)、およびpMON81511 (該aroA導入遺伝子に作動可能に連結したP-Mt.eIF4A-3および該GUS導入遺伝子に作動可能に連結したP-Gm.7S'を含有する二重カセット)を使用して、該葉片方法を使用することによって、Nicotiana tabacum cv. Nicotiana samsunを形質転換した(RB Horschら (1985) Science 227:1229-1231およびRB Horschら (1987) Plant Tissue and Cell Culture pp. 317-329, Alan R. Liss, Inc.)。タバコの苗条を、MS培地 (R0植物)に植え、次いで、土壌に移した。タバコの植物を、該R0段階にて、グリホサート耐性につき分析した。土壌における３８日の成長の後、30ないし35植物／構築体を、96オンス/エーカー RoundupＲUltra 除草剤で噴霧した。植物を、グリホサートに対する栄養耐性につきおよび受精率につきスコアした。栄養損傷を有する植物を捨てた。非処理植物と形態学的に似ている、種子を生成するグリホサートで処理された植物は、耐性があると考えた。
【０１４７】
形質転換効率を測定し、植物を、96オンス/エーカーのRoundupＲUltra除草剤にて、グリホサートに対して生殖組織耐性を有する事象のパーセンテージにつき分析した。データを、下記表５に提供する。
【０１４８】
【表５】
0005631531.tif 000006
【０１４９】
実施例４：Glycine maxにおけるプロモーター特徴付け
この実施例は、本発明のeIF-NCRE分子を含有する構築体を有する該トランスジェニック大豆植物の生成、および対照植物と比較して、低温ストレス下で、改善された農学特徴、つまり、改善された窒素使用効率、改善された収率、改善された水使用効率および／または改善された成長を有するトランスジェニック大豆に対するトランスジェニック種子の得られた生成および同定に有用な植物形質転換を示す。
【０１５０】
Agrobacterium媒介形質転換のために、大豆種子を一晩で発芽させ、分裂組織外植片を切除した。該分裂組織および該外植片を、損傷導管に入れる。大豆外植片および関心のある該遺伝子を有する構築体プラスミドDNAを含有する株からの誘導Agrobacterium細胞、カセットおよび植物選択可能マーカーカセットを、種子発芽の開始時から14時間以内に混合し、超音波処理を用いて損傷した。損傷後、外植片を、6-8週間、選択培地に移す時点で、2-5日間、共培養液に入れて、トランスジェニック苗条の選択および成長を可能にする。特徴陽性苗条を、衝撃後約6-8週間、収穫し、2-3週間、選択発根培地に入れた。苗条生成根を温室に移し、土壌に植える。選択の際に健康のままであるが、根を生成しない苗条を、さらに２週間、非選択発根培地に移す。根無し（roots off）選択を生成するいずれかの苗条からの根を、該植物選択マーカーの発現につきテストし、その後、それらを該温室に移し、土壌に植えた。
【０１５１】
(該aroA導入遺伝子に作動可能に連結したP-FMVを含有する)pMON70500およびpMON20999を使用して、Agrobacterium媒介方法によって、Glycine maxを形質転換した(本明細書中に引用によって援用される米国特許第6,384,301号参照)。形質転換効率を測定し、次いでR0植物を自家受粉させ、該R1世代へと進めた。
【０１５２】
R1植物を、グリホサートに対する栄養耐性につきテストした。該R1評価につき、典型的には、１事象当たり４８の種子を植え、ELISA分析を実施して、該陽性形質転換体を同定し、分離の割合を決定した。植物を、該V1段階にて、52 オンス/エーカーのRoundup UltraMaxＲ除草剤で噴霧した。噴霧の約１週間後、該事象を、白化につき評価した。また、コピー数および接合状態を評価した。取られた他の観察は：出芽、分離、さや結実（のタイミング）、植物の高さ、および成熟度を含んだ。１コピーの導入遺伝子、ベクター足場なし、および栄養グリホサート耐性を有した事象を、R2 苗床に進めて、生殖耐性を評価した。R2 植物を、グリホサートに対する生殖耐性につきテストした。非処理植物と形態学的に同様であり、種子を生成したグリホサートで処理された植物は、耐性があると考えた。データを、下記の表６に提供する。
【０１５３】
【表６】
0005631531.tif 000007
【０１５４】
該P-Nt.eIF4A プロモーター、リーダー、およびイントロンに作動可能に連結した該aroA導入遺伝子を含有する事象は、該対照と比較して、許容可能な形質転換効率ならびにグリホサートに対する優れた栄養および生殖耐性を示した。生成された該総事象のうちの４パーセントは、該R2世代において、グリホサートに対する大豆における栄養および生殖耐性を有することが分かった。
【０１５５】
実施例５：Gossypium hirsutumにおけるプロモーター特徴
構築体pMON70500を使用して、Agrobacterium媒介形質転換法によって、Gossypium hirsutumを形質転換した(本明細書中に引用によって援用されるPCT公報WO 00/36911参照)。
【０１５６】
まず、R0植物を自家受粉して、R1種子を生成した。この構築体のR1種子を、複数の事象につき、温室に植えた。グリホサート耐性を、48オンス/エーカー／適用の速度にて、Roundup UltraMaxＲ除草剤を用いて分析した。４つの適用を、各事象上の192オンス/エーカーのRoundup UltraMaxＲ除草剤またはグリホサート／エーカーの5.6ポンドの該酸同等物の合計につき、それぞれ、該3、6、10、および14結節段階にて行った。優れた栄養耐性 (メンデル遺伝学に従って3:1で分離)を示す事象を進めた。一旦植物が成熟すると、該第１の５つの結実枝(最高の潜在的なスコアは10である)の該第１および第２の位置での莢維持を記録することによってマップした。植物マッピングは、該果実(莢)が維持されるまたは失われるところを記した該植物の略図またはマップである。それは、莢を維持する該植物の能力に影響を与え得る昆虫圧力、グリホサートスプレー、または他のストレス因子のようなストレス因子に対して、該植物がどのように応答するかの良い全体的な絵を提供する、例えば、本明細書中に引用によって援用される米国特許第6,660,911号参照。この研究において、該現在の商用事象は、0 (n=4)でマップされた。テストされた該9事象のうちの７つは、該現在の商用事象より僅かに良くマップされた。該事象の２つ、Gh_S18179およびGh_S18055は、それぞれ、7.1および2.7でマップし(n=10)、両方とも、該現在の商用事象より遙かに良い。
【０１５７】
第２の組の実験を実施し、ここに30のR1種子を、複数の事象につき、温室に植えた。グリホサート耐性を、48 オンス/エーカー／適用の速度にて、Roundup UltraMaxＲ除草剤を用いて分析した。４回の適用を、4、8、10および12-14葉段階にて行った。これは、我々がより高い植物感受性の段階またはタイミングであると同定した成長段階にて、適量のグリホサートを、該植物に与えるように設計した。努力が進み、テストされたいくつかの事象からの顕著な耐性が観察されると、該48 oz/A速度は64 oz/Aに上昇した。３回の実験を、pMON70500からの事象で実施した。合計で、３６の綿事象を、綿におけるこのNelf/CP4構築体からのグリホサート耐性につきスクリーンした。生殖耐性は、莢維持に基づく。これらの３６の事象のうちの２つは、>50%の第１の位置莢を維持し、これは、現在の商用事象より高い割合に対応する。
【０１５８】
本発明の原則を説明し記載してきたが、本発明は、そのような原則から逸脱せずに、配置および詳細において修飾することができることが、当業者に明白であるはずである。我々は、添付の請求の範囲の精神および範囲内である全ての修飾を主張する。この明細書において引用された全ての公報および公開された特許文書は、各個々の公報または特許出願が、特異的にかつ個々に、引用によって援用されると示されているのと同じ程度に、引用によって本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】図１はｐＭＯＮ７０５００を表わす。
【図２】図２はｐＭＯＮ６５３９５を表わす。
【図３】図３はｐＭＯＮ８１５０４を表わす。
【図４】図４はｐＭＯＮ８１５０５を表わす。
【図５】図５はｐＭＯＮ８１５９６を表わす。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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