(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４、６、８または１０のエステラーゼ。
【請求項２】
請求項１に記載のエステラーゼをコードする単離された核酸。
【請求項３】
請求項２に記載のクローニングされた核酸を有する遺伝子、ベクター、プラスミドまたは組み換え型微生物。
【請求項４】
少なくとも１つのクローニングされたシャペロン遺伝子をさらに含む、請求項３に記載の組み換え型微生物。
【請求項５】
エナンチオマー的に富化されたアルコール、カルボン酸およびエステルを製造するための請求項１に記載のエステラーゼの使用。
【請求項６】
（ｉ）配列番号３、５、７または９の突然変異誘発、（ｉｉ）（ｉ）から得られる核酸配列の好適なベクター中へのクローニングと、それに続く好適な発現系中への形質転換、ならびに（ｉｉｉ）改善された活性および／または選択性および／または安定性を有するポリペプチドの検出および単離により製造される、配列番号２のポリペプチドに対して改善された活性および／または選択性および／または安定性を有するポリペプチドの製造法における請求項２に記載の核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブタ肝臓エステラーゼのイソ型（γＰＬＥ）、これを含むビヒクルならびにエナンチオマー的に富化されたアルコールおよびエステルの生産におけるその使用に関する。
【０００２】
リパーゼおよびエステラーゼは、多数の光学活性化合物を製造するために有効な生体触媒として使用できる。しかし、相当数のリパーゼ、特に微生物起源のものが市販されているが、ラセミ化合物の分割に使用するために工業規模の量で入手可能なエステラーゼはごくわずかである［Ｂｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒ，Ｕ．Ｔ．ａｎｄ  Ｋａｚｌａｕｓｋａｓ  Ｒ．Ｊ．，Ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２００５），２ｎｄ  ｅｄ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ］。
【０００３】
ブタ肝臓エステラーゼは、有機合成におけるその興味深い触媒特性のために、本明細書において特に興味深い［Ｆａｂｅｒ，Ｋ．，Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００４），５ｔｈ  ｅｄ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ；Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．Ｂ．Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ，（１９９０），６２，１４４５−１４４８，Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ．ａｌ．Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．（１９８５），６３，４５２−４５６；Ｌａｍ，Ｌ．Ｋ．Ｐ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９８６），５１，２０４７−２０５０）。
【０００４】
ブタ肝臓組織からのエステラーゼ抽出物は良好な立体選択性で基質を部分的に変換できることが証明されてきたが、このような抽出物の使用には多くの欠点がある。立体選択性に関する具体的な問題は、様々なバッチ間でのエステラーゼの割合のばらつきに加えて、さらに別のヒドロラーゼの存在であると考えられる（Ｓｅｅｂａｃｈ，Ｄ．ｅｔ．ａｌ，２５  Ｃｈｉｍｉａ（１９８６），４０，３１５−３１８）。従来の抽出物は多数のイソ酵素（Ｆａｒｂ，Ｄ．，ｅｔ．ａｌ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．（１９８０）２０３，２１４−２２６）からなるというさらなる問題もあり、このイソ酵素の基質特異性は場合によってかなり異なる。Ｈｅｙｍａｎｎ，Ｅ．およびＪｕｎｇｅ，Ｗ．（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７９），９５，５０９−５１８；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７９），９５，５１９−５２５）は複雑な電気泳動的分離を実施し、これにより好ましくはブチリルコリン、プロリン−β−ナフチルアミドおよびメチルブチレートを切断するフラクションを単離した。対照的に、他の研究（例えば、Ｌａｍ，Ｌ．Ｋ．Ｐ．，ｅｔ．ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８８）１１０，４４０９−４４１１）は異なる活性を有するが、異なる特異性を有さない個々のフラクションを示すだけである。
【０００５】
推定ブタ肝臓エステラーゼ−遺伝子のクローニングはかなり前から知られ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９），２６４，１１５６５−１１５７１；ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．（１９９１），２８０，２９７−３００；ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．（１９９１），２９３，３７−４１；Ｄａｖｉｄ，Ｌ．ｅｔ．ａｌ，Ｅｕｒ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）２５７，１４２−１４８）、活性ブタ肝臓エステラーゼの機能的組換え発現は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｌａｎｇｅ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ（２００１），２，５７６−５８２）およびＥ．ｃｏｌｉ（独国特許第１００６１８６４号）においてのみ、すでに記載されている。
【０００６】
文献は同様にＥ．ｃｏｌｉにおける発現中の培地への添加を記載している。エタノールを最高３％（ｖ／ｖ）まで培地に添加することにより、フォールディングプロセスを助け、通常は正しいフォールディングを支援する酵素である、内因性Ｅ．ｃｏｌｉシャペロンの形成が誘発される（Ｔｈｏｍａｓ，ＪＧ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆ（１９９７），１１，２８９−２９６）。３％（ｖ／ｖ）エタノールを培地に添加して、ブタ肝臓エステラーゼをＥ．ｃｏｌｉ  Ｏｒｉｇａｍｉにおいて発現させると、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて検出可能な活性エステラーゼ発現は得られず、封入体のみが得られた。
【０００７】
独国特許第１００６１８６４号は特定のシャペロンおよびγＰＬＥの同時発現を提案している。このようにしてＥ．ｃｏｌｉから活性γＰＬＥを最初に生成させることができた。
【０００８】
まとめると、Ｅ．ｃｏｌｉからの天然のブタ肝臓エステラーゼの発現は可能であるが、まだ工業規模で確立されていないと言える。化学中間体の生合成による製造のフレームワーク内で、好ましくは工業的規模で使用できる改善されたシステムをさらに得るために、ブタ肝臓エステラーゼの（基質）活性を改善することはさらに有用であり、必要である。
【０００９】
したがって、従来技術よりも改善された新規エステラーゼを特定することが本発明の１つの目的であった。改善された活性および／または選択性および／または安定性を有する新規エステラーゼを提供することを目的とした。これらのエステラーゼは従来技術のものよりも、特に空時収量および変換中のエナンチオ選択性および変更または拡張された基質特異性に関して優れている。
【００１０】
この目的を請求の範囲にしたがって達成する。
【００１１】
以下のもの：
【表１】
0005453238.tif 000002
【００１２】
からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を有する配列番号２のエステラーゼを提供することにより、意外にも前述の目的を実現する種が得られる。さらに詳細には、これらの部位での突然変異により、γＰＬＥの基質特異性、エナンチオ選択性および／または天然活性を修飾し、改善することができる。ここでの位置はもちろん配列番号２の第１アミノ酸をさす。
【００１３】
配列番号４、６、８および１０のエステラーゼが好ましい。これらは天然のγＰＬＥよりも優れた活性および／または選択性および／または安定性を有する。本発明のエステラーゼは特に活性、エナンチオ選択性および他の基質特異性に関して区別される。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、本発明のエステラーゼをコードする単離された核酸に関する。好適な核酸配列は、配列番号３、５、７および９のもの、またはその相補性形態である。
【００１５】
さらに別の展開で、本発明は、１以上の本発明の核酸を有する遺伝子、組換え発現系（例えば、微生物）または組換えプラスミド／ベクターに関する。
発現系とは、本発明の核酸の組換え発現系、ひいては本発明のポリペプチドの組換え産生系を意味する。前記産生は、好ましくは対応する核酸配列またはベクター（下記参照）を用いて形質転換または形質移入された（「形質転換」および「形質移入」という用語を本発明では同義的に用いる）微生物または他の宿主においておこなうことができる。形質転換および形質移入は公知の方法、例えばリン酸カルシウム共沈、リポフェクション、エレクトロポレーション、ＰＥＧ／ＤＭＳＯ法、粒子衝撃またはウイルス／バクテリオファージ感染に従っておこなうことができる。本発明の細胞は、組換え核酸を染色体外または染色体に組み込まれた形態で含み得る。言い換えると、形質移入／形質転換は安定であるか、または一時的であり得る。形質移入および形質転換プロトコルは当業者に公知である（Ｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ．１９７９．Ｈｉｇｈ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ  ｂｙ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ．Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．１６８（１）：１１１−５；Ｋｉｅｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｎｏｒｗｉｃｈ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｉｎ：ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ．ＮＹ．；Ｉｒａｎｉ  ａｎｄ  Ｒｏｗｅ．１９９７．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１  ｂｙ  Ｍｇ2+  ａｎｄ  ｈｅａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２２：５４−５６；Ｂａｌｂａｓ，Ｐ．ａｎｄ  Ｂｏｌｉｖａｒ，Ｆ．（１９９０），Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５，１４−３７；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｒ．Ｌ．  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ，Ｄ．Ｔ（ｅｄｓ）（１９８８），Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ，２０５−２２５，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ）。一般的な手順（ＰＣＲ、クローニング、発現等）に関しては、以下の文献およびその中で言及されている引例も参照する：Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）Ｋｉｔ  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，３／２０００；Ｔｒｉｇｌｉａ  Ｔ．；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｇ．ａｎｄ  Ｋｅｍｐ，Ｄ．Ｊ．（１９８８），Ａ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｔｈａｔ  ｌｉｅ  ｏｕｔｓｉｄｅ  ｔｈｅ  ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ  ｏｆ  ｋｎｏｗｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６，８１８６。
【００１６】
宿主は好ましくは原核生物起源の組換え微生物である。好適な宿主細胞は、単細胞微生物の細胞、例えば細菌細胞を包含する。この点に関して言及される微生物は原核生物、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。本発明の核酸配列の発現に用いることができる他の細菌は、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｕｓ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、カウロバクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、およびアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属／種のものである。この目的のためにＥ．ｃｏｌｉ株を用いるのが好適である。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１  Ｂｌｕｅ、ＮＭ  ５２２、ＪＭ１０１、ＪＭ１０９、ＪＭ１０５、ＲＲ１、ＤＨ５α、ＴＯＰ  １０−、ＨＢ１０１、ＢＬ２１  ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓ、ＢＬ２１、Ｒｏｓｅｔｔａ、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ、ＭＭ２９４、Ｗ３１１０、ＤＳＭ１４４５９（欧州特許第１４４４３６７号）、Ｏｒｉｇａｍｉが特に好適である。対応する株は従来技術において入手可能であり、国際寄託機関、例えばＡＴＣＣまたはＤＭＳＺ経由で少なくとも一部入手することができる。
真核生物、例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞もしくは植物細胞または生命体、例えばハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピチア種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の酵母、あるいは真菌、例えばアスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）等をポリペプチドの組み換え産生に用いることが同様に可能である。好適な真核細胞としては、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞等が挙げられる。これらの細胞の多くはＡＴＣＣまたはＤＭＳＺ等の寄託機関経由で入手できる。
【００１７】
本発明のポリペプチドを非ヒト宿主において組み換え的に製造することもできる。非ヒト宿主は単細胞または複数細胞ないし多細胞生物であってもよい。好適な多細胞生命体としては、分子生物学でよく知られているモデル系、例えばキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、ゼブラフィッシュまたはシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）が挙げられる。トランスジェニック非ヒト動物を従来技術で公知の方法により産生することができる。本発明のトランスジェニック非ヒト動物は好ましくは異なる遺伝子構成を有し得る。これは（ｉ）本発明の核酸配列の遺伝子を構造的または誘導的に過剰発現するか、（ｉｉ）本発明の核酸配列の内在性遺伝子の不活性形態を含むか、（ｉｉｉ）本発明の核酸配列の突然変異遺伝子を含むか（この遺伝子は本発明の核酸配列内在性遺伝子を完全に、または部分的に置換する）、（ｉｖ）本発明の核酸配列の遺伝子の条件付および組織特異的過剰発現または過小発現を有するか、または（ｖ）本発明の核酸配列の遺伝子の条件付および組織特異的ノックアウトを有し得る。
【００１８】
トランスジェニック動物は、好ましくはさらに、過剰発現を可能にするプロモータの制御下にある本発明の核酸配列の外来遺伝子を含む。あるいは、本発明の核酸配列の内在性遺伝子を、内因性プロモータの活性化および／または置換により過剰発現させることができる。好ましくは、本発明の核酸配列の遺伝子の内因性プロモータは遺伝子改変を含み、その結果、前記遺伝子の発現が増大する。内因性プロモータの遺伝子改変は、個々の塩基の突然変異ならびに欠失変異および挿入変異の両方を含む。本発明の宿主の特に好適な実施形態において、前記宿主は、トランスジェニック齧歯動物、好ましくはトランスジェニックマウス、トランスジェニックウサギ、トランスジェニックラット、またはトランスジェニックヒツジ、トランスジェニックウシ、トランスジェニックヤギまたはトランスジェニックブタである。マウスは他の動物よりも優れた多くの利点を有する。マウスは飼いやすく、その生理機能はヒトの生理機能のモデル系と見なされる。このような遺伝子操作された動物の産生は当業者に周知であり、通常の方法により実施される（例えば、Ｈｏｇａｎ，Ｂ．，Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，Ｒ．，Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ，Ｆ．ａｎｄ  Ｌａｃｙ，Ｅ．（１９９４），Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ−Ｅｍｂｒｙｏ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；国際特許公開第９１／０８２１６号を参照）。あるいは、またはそれに加えて、細胞培養系、特にヒト細胞培養系を、本発明の非ヒトトランスジェニック動物について記載した用途に用いることも可能である。
【００１９】
本発明の別の展開は、本発明の核酸を有する完全遺伝子に関する。遺伝子とは、本出願によると、原則として次の２つの異なる領域：
・ＤＮＡ切片（これから一本鎖ＲＮＡコピーを転写により作製する）
・このコピープロセスの調節に関与するすべての追加のＤＮＡ切片
からなる分子レベルでの部分を意味する。
【００２０】
さらに詳細な定義は：ｈｔｔｐ：／／ｄｅ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｇｅｎで見いだすことができる。
【００２１】
コード核酸配列を通常のプラスミド／ベクター中にクローニングし、かかるベクターを用いて微生物または他の宿主細胞を形質移入した後に、細胞培養において発現することができる。好適なプラスミドまたはベクターは原則として、このために当業者が入手可能な任意の実施形態である。このようなプラスミドおよびベクターは、例えばＳｔｕｄｉｅｒおよび共同研究者（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｗ．Ｆ．；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  Ａ．Ｈ．；Ｄｕｎｎ  Ｊ．Ｊ．；Ｄｕｂｅｎｄｒｏｆｆ  Ｊ．Ｗ．；Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｔｏ  ｄｉｒｅｃｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９０，１８５，６１−８９）またはＮｏｖａｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＣｌｏｎｔｅｃｈもしくはＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ社のカタログで見いだすことができる。他の好適なプラスミドおよびベクターは：Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．（１９８５），ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌ．Ｉ−Ｉｌｌ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｒ．Ｌ．ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ，Ｄ．Ｔ（ｅｄｓ）（１９８８），Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ，１７９−２０４，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ；Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．，Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９０，１８５，３−７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．；Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋにおいて見いだすことができる。
本発明の核酸配列またはこれらを含む遺伝子構築物を非常に好適な方法で宿主生物中にクローニングするために用いることができるプラスミドは次のものである：ｐＵＣ１８（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ｐＫＫ−１７７−３Ｈ（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ｐＢＴａｃ２（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ｐＫＫ２２３−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ｐＫＫ−２３３−３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ）。好適なベクターはまた、例えばＥ．ｃｏｌｉについてはｐＥＴ−２１ａ（＋）であるが、原核単細胞生物の他の発現ベクターおよび真核生物のベクターも使用できる。酵母に好適であることがわかっている好適なベクターの例は、ｐＲＥＰベクターおよびｐｌＮＴベクターである。バクロウイルスベクター、例えば欧州特許第１２７８３９号または同第５４９７２１号のバクロウイルスベクターが昆虫細胞における発現について開示されており、ＳＶ４０ベクターは、例えば哺乳動物細胞における発現に好適であり、一般に入手可能である。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、特にＥ．ｃｏｌｉ  Ｏｒｉｇａｍｉの形質転換に関して、単細胞真核生物のベクター、特にｐＥＴベクター群からのもの特に好適である。
【００２２】
特に好適な実施形態において、ベクター中に導入された本発明の核酸配列をさらに前記ベクターにより提供されるヒスチジンタグと融合させる。ベクター中に存在するＩＰＴＧ調節可能なプロモータの制御下に転写があるような方法で、導入された核酸配列を好適なｐＥＴベクター中にクローニングすることが好ましい。あるいは、ラムノース調節可能なプロモータを用いることも好ましい。
【００２３】
抗生物質耐性遺伝子等の通常のマーカーのほかに、ベクターはＡＤＨ遺伝子および／またはレポーター遺伝子の発現を調節、特に抑制または誘発するためのさらに別の機能性ヌクレオチド配列を含むことができる。調節可能な弱いプロモータ、例えばｒｈａプロモータまたはｎｍｔ１プロモータ、または調節可能な強いプロモータ、例えば、ｌａｃ、ａｒａ、ラムダ、ｐＬ、Ｔ７またはＴ３プロモータであるプロモータを用いることが好ましい。コードＤＮＡフラグメントはベクター中のプロモータから転写可能でなければならない。確立されたプロモータの他の例は、昆虫細胞における発現に関してはバクロウイルスポリヘドリンプロモータ（例えば、欧州特許第１２７８３９号参照）および早期ＳＶ４０プロモータ、および例えばＭＭＴＶ（マウス乳癌ウイルス；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ，２９４（５８３８），２２８−２３２）のＬＴＲプロモータである。
【００２４】
したがって、本発明の遺伝子、ベクター／プラスミドはさらに別の機能的配列領域、例えば、複製起点、オペレータ、または終結シグナルを含んでもよい。
【００２５】
特に有利な実施形態において、本発明は、本発明の核酸配列に加えて、１以上のクローニングされたシャペロン遺伝子も含む組み換え型微生物に関する。好ましい適当なシャペロンは、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳ、好ましくはＥ．ｃｏｌｉ  Ｏｒｉｇａｍｉ株におけるものである。意外にも、活性酵素の発現は、これらの２つのフォールディングヘルパータンパク質の存在下で達成されたが、別のシャペロン系、例えば、エタノールの添加により誘発された内在性Ｅ．ｃｏｌｉシャペロンまたは他の同時発現されたシャペロン、例えばＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥは成功しなかった（独国特許第１００６１８６４号）。
【００２６】
当業者には、シャペロン系Ｄｎａｋ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥおよびＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳの等価な同時発現、またはＧｒｏＥＬもしくはＧｒｏＥＳ単独をＥ．ｃｏｌｉ  Ｏｒｉｇａｍｉにおいてブタ肝臓エステラーゼと一緒に同時発現すると、結果として封入体の形態で発現が得られるだけで、Ｅ．ｃｏｌｉ粗細胞抽出物において検出可能な活性が得られないことは意外である。したがってどんな場合でも、他のシャペロン系が同時に宿主生物中に存在していても、シャペロン系ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳが好適な誘発／発現系であることが好ましい。
【００２７】
Ｅ．ｃｏｌｉ株における真核生物のタンパク質の機能的発現は、特に前記タンパク質が翻訳後にグリコシル化されたタンパク質である場合に、厄介な問題である。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるブタ肝臓エステラーゼの組換え発現の場合、特別なシャペロン系ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳを利用すると、明らかに翻訳後グリコシル化がないことが無効にされる。この発展およびその実施形態に関しては、独国特許第１０２００６０３１６００号が参照される。
【００２８】
さらに別の発展において、本発明は、エナンチオマー的に富化されたアルコール、カルボン酸およびエステルを、特に前記化合物のメソ型、例えばマロン酸ジエステル等の場合により置換されたジカルボン酸エステルから製造するために、本発明の（組み換え型）ポリペプチドを使用することに関する。
【００２９】
固定化形態の酵素を使用することが可能である（Ｓｈａｒｍａ  Ｂ．Ｐ．；Ｂａｉｌｅｙ  Ｌ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍｅｓｓｉｎｇ  Ｒ．Ａ．（１９８２），Ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｉｅｒｔｅ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉｅｎ−Ｔｅｃｈｎｉｋｅｎ  ｕｎｄ  Ａｎｗｅｎｄｕｎｇｅｎ［Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ］，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．９４、８３６−８５２）。固定化は凍結乾燥により有利に行うことができる（Ｐａｒａｄｋａｒ，Ｖ．Ｍ．；Ｄｏｒｄｉｃｋ，Ｊ．Ｓ．（１９９４），Ａｑｕｅｏｕｓ−Ｌｉｋｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  α−Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ  Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｎｅａｒｌｙ  Ａｎｈｙｄｒｏｕｓ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｏｌｖｅｎｔｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６，５００９−５０１０；Ｍｏｒｉ，Ｔ．；Ｏｋａｈａｔａ，Ｙ．（１９９７），Ａ  ｖａｒｉｅｔｙ  ｏｆ  ｌｉｐｉ−ｃｏａｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ  ａｓ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｃａｔａｌｙｓｔｓ  ｉｎ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｏｌｖｅｎｔｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３８，１９７１−１９７４；Ｏｔａｍｉｒｉ，Ｍ．；Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚ，Ｐ．；Ｍａｔｔｈｉａｓｓｏｎ，Ｂ．（１９９２），Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ  ａｎｄ  ｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ａｓ  ａ  ｍｅａｎｓ  ｔｏ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎ  ａｃｔｉｖｅ  ｆｏｒｍ  ｉｎ  ｔｏｌｕｅｎｅ，Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ６，２９１−３０５）。例えばＡｅｒｏｓｏｌ  ＯＴまたはポリビニルピロリドンまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＢｒｉｊ５２（ジエチレングリコールモノセチルエーテル）等の界面活性剤の存在下での凍結乾燥が非常に好ましい（Ｋａｍｉｙａ，Ｎ．；Ｏｋａｚａｋｉ，Ｓ．−Ｙ．；Ｇｏｔｏ，Ｍ．（１９９７），Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ−ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ａｎｈｙｄｒｏｕｓ  ｂｅｎｚｅｎｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｅｃｈ．１１，３７５−３７８）。
【００３０】
Ｅｕｐｅｒｇｉｔ（登録商標）、特にＥｕｐｅｒｇｉｔ  Ｃ（登録商標）およびＥｕｐｅｒｇｉｔ２５０Ｌ（登録商標）（Ｒｏｅｈｍ）に対する固定化が最も好ましい（総説については：Ｅ．Ｋａｔｃｈａｌｓｋｉ−Ｋａｔｚｉｒ，Ｄ．Ｍ．Ｋｒａｅｍｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ：Ｅｎｚｙｍ．２０００，１０，１５７参照）。Ｈｉｓタグ（ヘキサヒスチジン）を結合させることにより修飾されたポリペプチドと組み合わせてＮｉ−ＮＴＡへ固定化することが同様に好ましい（Ｐｅｔｔｙ，Ｋ．Ｊ．（１９９６），Ｍｅｔａｌ−ｃｈｅｌａｔｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｉｎ：Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）。
【００３１】
ＣＬＥＣとしての使用も想定できる（Ｓｔ．Ｃｌａｉｒ，Ｎ．；Ｗａｎｇ，Ｙ．−Ｆ．；Ｍａｒｇｏｌｉｎ，Ａ．Ｌ．（２０００），Ｃｏｆａｃｔｏｒ−ｂｏｕｎｄ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ  ｃｒｙｓｔａｌｓ（ＣＬＥＣ）ｏｆ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３９．３８０−３８３）。
【００３２】
これらの方法により、水性および有機溶媒の混合物において、または完全に有機物中で機能し得る有機溶媒ポリペプチドにより不安定にされる（組み換え型）ポリペプチドから作製できる可能性がある。
【００３３】
本発明のポリペプチドを用いてエステルまたはカルボン酸およびアルコールを好ましくは以下のように変換する。ポリペプチドを所望の形態（遊離、固定化、宿主生物中またはランダムに分裂された形態）で適切な培地、好ましくは水性溶液に添加する。最適温度範囲および最適ｐＨ範囲を維持しつつ、基質をこの混合物に添加する。変換の完了後、得られたアルコールまたはエステルを当業者に公知の方法（結晶化、抽出、クロマトグラフィー）により反応混合物から単離することができる。
【００３４】
エステルまたはカルボン酸およびアルコールをエステラーゼによりエナンチオマー的に富化されたアルコール、カルボン酸およびエステルに酵素変換することは原則として当業者に公知である（はじめに記載した引例；図２参照）。これに関して特に興味深いのは、前記誘導体のメソ型の変換である。ここで、エナンチオマー的に富化された生成物を１００％の収率で得ることができ、一方、ラセミ化合物の通常の分割により最高５０％までの特定のエナンチオマーしか得られない点で、本発明の変換は有益である。したがって、例えば特定の置換マロン酸ジエステルを用いて、化学合成における有益な中間体であるエナンチオマー的に富化された生成物を作製することができる。このようにして、場合によりＮ保護されたアミノマロン酸ジエステルから、対応するエナンチオマー的に富化された不斉アミノカルボン酸モノエステルを有効かつ容易に作製することが可能である。下記図１に示す反応シーケンスも興味深い。
【００３５】
図１：
【化１】
0005453238.tif 000003
【００３６】
この反応の好適なラジカルを以下のリストで見いだすことができる。
【００３７】
アミド化およびＣ１分解の手段は当業者に周知である（Ｏｒｇａｎｉｋｕｍ，ＶＥＢ  Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  ｄｅｒ  Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ，Ｂｅｒｌｉｎ  １９８６，ｐｐ．３８８ｆｆ，ｐｐ．５７１ｆｆ）。
【００３８】
図２：
【化２】
0005453238.tif 000004
【００３９】
ＩまたはＶＩの対応するキラルエステルから製造できるか、またはエナンチオマー的に富化されたエステルを製造するために使用できるエナンチオマー的に富化されたアルコールの例も同様に当業者には公知である。これらを例えば次の一般式：
【化３】
0005453238.tif 000005
【００４０】
［式中、Ｒ、Ｒ’およびＲ"は互いに異なり、特に、Ｈ、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、（Ｃ1−Ｃ8）アルコキシ、ＨＯ−（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、（Ｃ2−Ｃ8）アルコキシアルキル、（Ｃ6−Ｃ18）アリール、（Ｃ7−Ｃ19）アルアルキル、（Ｃ3−Ｃ18）ヘテロアリール、（Ｃ4−Ｃ19）ヘテロアルアルキル、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル−（Ｃ6−Ｃ18）アリール、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル−（Ｃ3−Ｃ18）ヘテロアリール、（Ｃ3−Ｃ8）シクロアルキル、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル−（Ｃ3−Ｃ8）シクロアルキル、（Ｃ3−Ｃ8）シクロアルキル−（Ｃ1−Ｃ8）アルキルであるか、またはＲおよびＲ’および／またはＲおよびＲ"および／またはＲ’およびＲ"は（Ｃ3−Ｃ5）アルキレン架橋を形成する］により要約することができる。
【００４１】
エナンチオマー的に富化されたエステルまたは酸の例は下記の一般式：
【化４】
0005453238.tif 000006
【００４２】
［式中、Ｒ、Ｒ’およびＲ"は同一または互いに異なり、特に、Ｈ、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、（Ｃ1−Ｃ8）アルコキシ、ＨＯ−（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、（Ｃ2−Ｃ8）アルコキシアルキル、（Ｃ6−Ｃ18）アリール、（Ｃ7−Ｃ19）アルアルキル、（Ｃ3−Ｃ18）ヘテロアリール、（Ｃ4−Ｃ19）ヘテロアルアルキル、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル−（Ｃ6−Ｃ18）アリール、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル−（Ｃ3−Ｃ18）ヘテロアリール、（Ｃ3−Ｃ8）シクロアルキル、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル−（Ｃ3−Ｃ8）シクロアルキル、（Ｃ3−Ｃ8）シクロアルキル−（Ｃ1−Ｃ8）アルキルであるか、またはＲおよびＲ’もしくはＲおよびＲ"もしくはＲ’およびＲ"は（Ｃ3−Ｃ5）アルキレン架橋を形成し、
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は同一または互いに異なり、特に、Ｈ、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、（Ｃ1−Ｃ8）アルコキシ、ＨＯ−（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、（Ｃ2−Ｃ8）アルコキシアルキル、シクロペンタジエニル、（Ｃ6−Ｃ18）アリール、（Ｃ7−Ｃ19）アルアルキル、（Ｃ3−Ｃ18）ヘテロアリール、（Ｃ4−Ｃ19）ヘテロアルアルキル、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル−（Ｃ6−Ｃ18）アリール、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル−（Ｃ3−Ｃ18）ヘテロアリール、（Ｃ3−Ｃ8）シクロアルキル、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル−（Ｃ3−Ｃ8）シクロアルキル、（Ｃ3−Ｃ8）シクロアルキル−（Ｃ1−Ｃ8）アルキルであるか、またはＲ1およびＲ2および／またはＲ1およびＲ3および／またはＲ2およびＲ3は（Ｃ3−Ｃ5）アルキレン架橋を形成する］により指定できる。
【００４３】
本発明の使用に適しているのは、好適に緩衝された水性溶媒である。しかし、ｐＨスタット装置（Ｓｃｈｏｔｔ  ＡＧ（ドイツ国マインツ）、商標ＴｉｔｒｏＬｉｎｅ  ａｌｐｈａ）を用いて反応を実施することも可能である。
【００４４】
０℃〜８５℃、特に好ましくは３０〜８０℃、非常に好ましくは５０℃付近の温度で変換をおこなうことが好ましい。当業者は、反応のｐＨを自由に選択することもでき、固定されたｐＨで、またｐＨをあるｐＨ範囲内で変えて反応をおこなうこともできる。特に本発明の最適の反応結果に関してｐＨを選択する。ｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８、特に好ましくはｐＨ６．５〜７．５で反応をおこなうことが好ましい。
【００４５】
前述のように、関連するポリペプチドを均質に精製された化合物により、または組換え産生された酵素として天然形で適用することができる。さらに、（組み換え型）ポリペプチドを、無傷寄生生物の成分として、または宿主生物の破壊細胞塊に関連して用いることもでき、どの程度の純度であってもよい。
【００４６】
使用される基質が細胞培養において，例えば好適な宿主を用いることにより所望の生成物に変換されるならば、使用される宿主生物または使用される細胞培養物に応じて好適な栄養培地を用いる。宿主細胞に適した培地は、一般に公知であり、市販されている。さらに、細胞培養物に通常の添加剤、例えば、抗生物質、成長促進剤、例えば、血清（ウシ胎仔血清等）および類似の公知の補給剤を添加することができる。
【００４７】
さらなる最適な反応条件は、独国特許第１０２００６０３１６００号で見いだすことができる。
【００４８】
別の出願は、
（ｉ）本発明の核酸、好ましくは配列番号３、５、７、９の突然変異誘発、
（ｉｉ）（ｉ）から得ることができる核酸配列の好適なベクター中へのクローニングと、それに続く好適な発現系中への形質転換、ならびに
（ｉｉｉ）改善された活性および／または選択性および／または安定性を有する前記ポリペプチドの検出および単離
による、配列番号２のポリペプチドよりも改善された活性および／または選択性および／または安定性を有するポリペプチドの製造に関する。
【００４９】
本発明の核酸配列またはこれらによりコード化されるポリペプチドを突然変異誘発法によって改善する手順は当業者に周知である。好適な突然変異誘発法は、この目的のために当業者が利用可能な任意の方法である。これらは特に、飽和突然変異誘発、ランダム変異導入法、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組み換え法、および部位特異的突然変異誘発法である（Ｅｉｇｅｎ，Ｍ．ａｎｄ  Ｇａｒｄｉｎｅｒ，Ｗ．，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ＲＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．１９８４，５６，９６７−９７８；Ｃｈｅｎ，Ｋ．  ａｎｄ  Ａｒｎｏｌｄ，Ｆ．，Ｅｎｚｙｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｎｏｎａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｖｅｎｔｓ：ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  Ｅ  ｉｎ  ｐｏｌａｒ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｍｅｄｉａ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９１，９．１０７３−１０７７；Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｍ．ａｎｄ  Ｌｏｅｂ，Ｌ．，Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ｒａｎｄｏｍ  ＤＮＡ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３，１９８６，７４０５−７４０９；Ｄｕｂｅ，Ｄ．ａｎｄ  Ｌ．Ｌｏｅｂ，Ｍｕｔａｎｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  Ｂｙ  Ｔｈｅ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｏ  Ｔｈｅ  Ａｃｔｉｖｅ−Ｓｉｔｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｂｅｔａ−Ｌａｃｔａｍａｓｅ  Ｇｅｎｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８９．２８，５７０３−５７０７；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐ．Ｃ．，Ｒａｐｉｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  １９９４，３７０，３８９−３９１およびＳｔｅｍｍｅｒ、Ｐ．Ｃ．，ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｂｙ  ｒａｎｄｏｍ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１，１９９４，１０７４７−１０７５１）。
【００５０】
得られた新規核酸配列を後述の方法（下記参照）により宿主生物中にクローニングし、このようにして発現されたポリペプチドを、好適なスクリーニング法を用いて検出し、続いて単離する。検出に好適なのは、原則としてこのポリペプチドにより産生される分子について可能な任意の検出反応である。これに関して特に好適なのは、産生・消費されたＮＡＤＨの測光分析、この酵素により産生されたアルコールを検出するためのＨＰＬＣまたはＧＣ法である。さらに、ゲル電気泳動または抗体を用いた検出法も、遺伝子操作法により修飾された新規ポリペプチドの検出に適している。
【００５１】
光学的に富化された（エナンチオマー的に富化された、エナンチオマー富化された？）化合物とは、本発明において、１つの光学対掌体の他の対掌体との混合物中の存在が＞５０モル％であることを意味する。
【００５２】
核酸配列という用語は、あらゆる種類の一本鎖または二本鎖ＤＮＡならびにＲＮＡまたはその混合物を意味する。したがって、本発明の核酸配列はＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であり得る。核酸分子がｃＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子であるのが好ましい。本発明によると、ＤＮＡ分子はゲノムＤＮＡ分子であってもよい。本発明は、ＤＮＡ分子がＰＮＡ分子またはＤＮＡ分子のもう１つ別の誘導体である実施形態もさらに含む。
【００５３】
「相補的な」という用語は、本発明によると、相補性が本発明の核酸分子の全領域にわたり、ギャップがないことを意味する。言い換えると、本発明では１００％の相補性が本発明の配列の全領域にわたり、すなわち図示された５’末端から図示された３’末端までおよぶのが好ましい。
【００５４】
活性および／または選択性および／または安定性の改善とは、本発明によると、ポリペプチドがより活性および／またはより選択的および／または使用される反応条件下でより安定であることを意味する。酵素の活性および安定性はもちろん工業用途に関してはできるだけ高くなければならないが、選択性に関する改善とは、基質の選択性が減少するが、酵素のエナンチオ選択性は増加する状態を意味する。同じことが、必要ならば変更を加えて、これに関連して用いられる実質的に減少しないという表現について当てはまる。
【００５５】
特許請求の範囲のタンパク質配列および核酸配列のうち、本発明はこれらの配列のいずれかと９７％以上、好ましくは９７．５％以上、９８％または９８．５％以上、さらに好ましくは９９％または９９．５％以上の相同性（自然分解を除く）である配列も含む。ただし配列はその機能性または目的を保持するものとする。「相同性」（または同一性）という表現は、本明細書において用いられる場合、等式Ｈ（％）＝［１−Ｖ／Ｘ］×１００（式中、Ｈは相同性を意味し、Ｘは比較配列の核酸塩基／アミノ酸の合計数であり、Ｖは検討される配列の異なる核酸塩基／アミノ酸の数である（比較配列基準））により定義できる。どんな場合でも、ポリペプチドをコードする核酸配列という用語は、遺伝子コードの縮重にしたがって可能であると思われる任意の配列を包含する。
【００５６】
「ストリンジェントな条件下」という表現は、本明細書においてはＳａｍｂｒｏｏｋ等（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．；Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されているとおりであると理解される。好ましくは、本発明によると、１×ＳＳＣ（１５０ｍＭの塩化ナトリウム、１５ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）および０．１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を用いて、５０℃、好ましくは５５℃、さらに好ましくは６２℃、最も好ましくは６８℃で１時間、さらに好ましくは０．２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳを用いて５０℃、より好ましくは５５℃、さらに好ましくは６２℃、最も好ましくは６８℃で１時間洗浄した後、プラスのハイブリダイゼーションシグナルが依然として観察されるならば、ハイブリダイゼーションはストリンジェントである。
【００５７】
（Ｃ1−Ｃ8）アルキル基は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチルまたはオクチル、およびこれらの結合異性体のいずれかと考えられる。
【００５８】
（Ｃ1−Ｃ20）アルキル基は、本発明の定義の範囲内で、１から最高２０個までの炭素原子を有する対応する基である。
【００５９】
（Ｃ3−Ｃ20）アルキル基は、本発明の定義の範囲内で、３から最高２０個までの炭素原子を有する対応する基である。
【００６０】
基（Ｃ1−Ｃ8）アルコキシは、酸素原子を介して結合するという条件で基（Ｃ1−Ｃ8）アルキルに相当する。
【００６１】
（Ｃ2−Ｃ8）アルコキシアルキルは、アルキル鎖に少なくとも１つの酸素官能基が割り込んでいる基を意味し、２個の酸素原子は互いに結合できない。炭素原子の数は、基中に含まれる炭素原子の合計数を示す。
【００６２】
（Ｃ3−Ｃ5）アルキレン架橋は、３〜５個の炭素原子を有する炭素鎖であり、この鎖は２個の異なる炭素原子により、検討される分子に結合する。
【００６３】
前述の基はハロゲンおよび／または（Ｃ1−Ｃ8）アルコキシカルボニルおよび／またはＮ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、Ｓｉ原子含有基で一置換または多置換されていてもよい。後者は特に前記種類のアルキル基であり、その鎖が１以上の前記ヘテロ原子を有するものであるか、またはこれらのヘテロ原子の１つを介して分子と結合するものである。
【００６４】
（Ｃ3−Ｃ8）シクロアルキルとは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルおよびシクロヘプチル基等を意味する。これらは１以上のハロゲンおよび／またはＮ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、Ｓｉ原子含有基で置換されていてもよい、および／または例えば、１−、２−、３−、４−ピペリジル、１−、２−、３−ピロリジニル、２−、３−テトラヒドロフリル、２−、３−、４−モルホリニル等の環中にＮ−、Ｏ−、Ｐ−、Ｓ−原子を有してもよい。
【００６５】
（Ｃ3−Ｃ8）シクロアルキル−（Ｃ1−Ｃ8）アルキル基は、前述のようにアルキル基を介して分子と結合する、前述のシクロアルキル基を意味する。
【００６６】
（Ｃ1−Ｃ8）アルコキシカルボニルとは、本発明では、最高８個までの炭素原子を有する前記定義のアルキル基であって、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）官能基を介して結合するものを意味する。
【００６７】
（Ｃ1−Ｃ8）アシルオキシとは、本発明では、最高８個までの炭素原子を有する前記定義のアルキル基であって、（Ｃ＝Ｏ）Ｏ官能基を介して結合するものを意味する。
【００６８】
（Ｃ1−Ｃ8）アシルとは、本発明では、最高８個までの炭素原子を有する前記定義のアルキル基であって、（Ｃ＝Ｏ）官能基によりを介して結合するものを意味する。
【００６９】
（Ｃ6−Ｃ18）アリール基とは、６〜１８個の炭素原子を有する芳香族基を意味する。さらに詳細には、フェニル、ナフチル、アントリル、フェナントリル、ビフェニル基等の化合物、または該分子とアニールしている前記種類の系、例えばインデニル系を包含し、これらは（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、（Ｃ1−Ｃ8）アルコキシ、（Ｃ2−Ｃ8）アルコキシアルキル、ＮＨ（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、Ｎ（（Ｃ1−Ｃ8）アルキル）2、ＯＨ、Ｏ（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、ＮＯ2、ＮＨ（Ｃ1−Ｃ8）アシル、Ｎ（（Ｃ1−Ｃ8）アシル）2、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ3、（Ｃ1−Ｃ8）アシル、（Ｃ1−Ｃ8）アシルオキシ、（Ｃ7−Ｃ19）アルアルキル基、（Ｃ4−Ｃ19）ヘテロアルアルキルで場合によって置換されていてもよい。
【００７０】
（Ｃ7−Ｃ19）アルアルキル基は、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル基を介して分子と結合する（Ｃ6−Ｃ18）アリール基である。
【００７１】
（Ｃ3−Ｃ18）ヘテロアリール基は、本発明の範囲では、３から１８個の炭素原子の５、６または７員芳香族環系であって、環中に例えば窒素、酸素または硫黄等のヘテロ原子を有するものを意味する。このようなヘテロ原子は、特に１−、２−、３−フリル、例えば１−、２−、３−ピロリル、１−、２−、３−チエニル、２−、３−、４−ピリジル、２−、３−、４−、５−、６−、７−インドリル、３−、４−、５−ピラゾリル、２−、４−、５−イミダゾリル、アクリジニル、キノリニル、フェナントリジニル、２−、４−、５−、６−ピリミジニル等の基と考えられる。ヘテロ芳香族化合物は前述の（Ｃ6−Ｃ18）アリール基と同様に置換されていてもよい。
【００７２】
（Ｃ4−Ｃ19）ヘテロアルアルキルとは、（Ｃ7−Ｃ19）アルアルキル基に対応するヘテロ芳香族系を意味する。
【００７３】
好適なハロゲン（Ｈａｌ）は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素である。
【００７４】
水性溶媒という用語は、水、または主に水からなり、水溶性有機溶媒、例えばアルコール、特にメタノールもしくはエタノール、またはエーテル、例えばＴＨＦもしくはジオキサン、または他の共溶媒、例えばＤＭＳＯを含む溶媒混合物を意味する。
【００７５】
本明細書において言及する文献も本開示の範囲内に含まれると見なされる。
【００７６】
配列表に示すタンパク質配列はＨｉｓタグおよびリンカー配列をＣ末端でさらに含む。活性γＰＬＥを代表する実際のタンパク質配列は、したがって配列表に示す配列であって、Ｃ末端で２１アミノ酸により切断されたものである。同じことが、前記タンパク質配列をコードする核酸配列に当てはまる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、β−アクチン遺伝子の増幅によるｃＤＮＡ品質管理を示す。
【図２】図２は、ブタ肝臓ｃＤＮＡ由来のＰＬＥ遺伝子の増幅を示す。
【図３】図３は、見いだされたＰＬＥであるＰＬＥ２、３、４および５のアミノ酸配列のγ−ＰＬＥ配列（ＰＬＥ１）との部分アラインメントを示す。
【図４】図４は、ＰＬＥ２、クローン１２、ＰＬＥ３、ＰＬＥ４、ＰＬＥ５、γＰＬＥおよびＥ．ｃｏｌｉ  Ｏｒｉｇａｍｉ  ｐＧｒｏ７野生型（負の対照）の粗抽出物の天然ＰＡＧＥを示す。
【図５】図５は、基質１〜４のラセミ化合物の速度論的分割における様々なブタ肝臓エステラーゼイソ酵素のエナンチオ選択性を示す。
【図６】図６は、シス−３，５−ジアセトキシシクロペント−１−エンの加水分解における様々なブタ肝臓エステラーゼイソ酵素の生成物のエナンチオマー過剰を示す。
【００７８】
方法：
ｍＲＮＡの単離およびｃＤＮＡの合成
新鮮なブタ肝臓組織（０．１ｇ）をＴｒｉｚｏｌ（登録商標）試薬（ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｐｌｕｓ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国カリフォルニア州））で処理し、均質化し（室温で１０分；Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ  Ｔ２５、ＩＫＡ−Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ）、製造元の指示に従ってＲＮＡを単離した。ＲＮＡ濃度を分光光度法で測定した。ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５プライマーおよびＲＮａｓｅＨ活性を有するＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ（米国ウィスコンシン州マディソン））を用いたＲＴ−ＰＣＲによりｃＤＮＡ合成を実施した。
【００７９】
ＰＬＥ遺伝子の増幅およびクローニング
ＲＴ−ＰＣＲ生成物を、γＰＬＥ配列（５’−ＣＡＣＣＣＡＴＡＴＧＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＣＣＴＣＧＣ−３’（配列番号１１）（Ｎｄｅｌ制限切断部位を斜字体で表す）、および５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＴＴＡＴＣＴＴＧＧＧＴＧＧＣＴＴＣＴＴＴＧＣ−３’（配列番号１２）（Ｘｈｏｌ制限切断部位を斜字体で表し；開始コドンおよび終始コドンに下線を施す）に基づく２つの遺伝子特異的プライマーを用いたＰＬＥ遺伝子の増幅に使用した。順プライマーはさらにその５’末端で、その後のＴＯＰＯベクター中へのクローニングを可能にする塩基ＣＡＣＣを含む（下記参照）。これらのプライマーは、もとのブタ遺伝子のＮ末端と結合した１８アミノ酸シグナル配列、および４アミノ酸Ｃ末端ＥＲ（小胞体）残留シグナルをすでに削除し、これによりＥ．ｃｏｌｉにおけるその後の発現を促進する（Ｌａｎｇｅ，Ｓ，ｅｔ．ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ（２００１），２，５７６−５８２）。ＰＣＲをサーモサイクラー（Ｔｅｃｈｎｅ  Ｐｒｏｇｅｎｅ（Ｊｅｐｓｏｎ  Ｂｏｌｔｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ（英国ウォトフォード））で実施した。ＰＣＲは製造元の指示に従い、下記の温度プログラムにしたがって、Ｐｆｕ  Ｐｌｕｓ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｂｏｋｌｏｎ（ドイツ国ベルリン））を使用した：９５℃で５分間変性後、９５℃で１分、６０℃で１分、７２℃で３分を３０サイクル実施し、最後は７２℃で７分であった。ＰＣＲ産物をアガロースゲル中で分画し、精製し、製造元の指示にしたがってＴＯＰＯ／ｐＥＴ１０１ベクター中にクローニングした（ＣｈａｍｐｉｏｎＴＭ  ｐＥＴ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国カリフォルニア州カールズバッド））。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０細胞［ＦｍｃｒＡ  Ｄ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳｍｃｒＢＣ）（Ｆ８０１ａｃＺＤＭ１５）ＤｌａｃＸ７４  ｒｅｃＡ１  ｄｅｏＲ  ａｒａＤ１３９  Ｄ（ａｒａ−ｌｅｕ）７６９７  ｇａｌＵ  ｇａｌＫ  ｒｐｓＬ（ＳｔｒR）ｅｎｄＡｌ  ｎｕｐＧ］（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、構築物混合物を用いて形質転換し、寒天プレート上で分離させた。このようにして得られた組換えシグナルクローンを別々に培養し、プラスミドＤＮＡを単離し、サイズ決定または制限マッピングにより同定し、ＰＬＥ配列のＰＣＲ増幅用テンプレートとして使用した。増幅された配列を次いで配列決定した（ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ（ドイツ国マーチンスリード））。
【００８０】
発現系の構築
各ＴＯＰＯ／ｐＥＴ１０１−ＰＬＥ構築物のプラスミドＤＮＡを製造元の指示にしたがってＮｄｅｌおよびＸｈｏｌで消化し（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（米国マサチューセッツ州ベバリー）；Ｐｒｏｍｅｇａ（米国ウィスコンシン州マディソン））、約１６９４ｂｐのサイズの特定のフラグメントをＮｄｅｌ／Ｘｈｏｌ消化されたアガロースゲル精製ｐＥＴ１５ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ（米国ウィスコンシン州マディソン））中に挿入し、これはさらにＮ末端Ｈｉｓタグを遺伝子に追加した。結紮産物をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株（Ｎｏｖａｇｅｎ（米国ウィスコンシン州マディソン））［ｓｕｐＥ４４ΔｌａｃＵ１６９（Φ８０１ａｃＺΔＭ１５）ｈｓｄＲ１７  ｒｅｃＡｌ  ｅｎｄＡｌ  ｇｙｒＡ９６  ｔｈｉ−ｌｒｅｌＡｌ］の形質転換のために使用し、形質転換された株を培養することによりプラスミドを増殖させた。プラスミドを組換え株から単離し、試験するために再度配列決定した。このようにして得られたｐＥＴ１５ｂ−ＰＬＥ構築物を、あらかじめｐＧｒｏ７プラスミド（Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｅｔ（タカラバイオ株式会社会社（日本国滋賀県大津市））で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）株［Δ（ａｒａ−ｌｅｕ）７６９７  ΔｌａｃＸ７４  ΔｐｈｏＡ  ＰｖｕＩＩ  ｐｈｏＲ  ａｒａＤ１３９  ａｈｐＣ  ｇａｌＥ  ｇａｌＫ  ｒｐｓＬ  Ｆ’［ｌａｃ+  ｌａｃｌq  ｐｒｏ］（ＤＥ３）ｇｏｒ５２２：：Ｔｎ１０  ｔｒｘＢ（ＫａｎR、ＳｔｒR、ＴｅｔR）４］（Ｎｏｖａｇｅｎ（米国ウィスコンシン州マディソン））の形質転換のために使用し、これによりシャペロンＧｒｏＥＬ＋ＧｒｏＥＳを発現させることができる。
【００８１】
ブタ肝臓エステラーゼの発現とシャペロン複合体ＧｒｏＥＬ／ＥＳの同時発現の詳細については、Ｂｏｅｔｔｃｈｅｒ、Ｄ．，Ｂｒｕｅｓｅｈａｂｅｒ，Ｅ．，Ｄｏｄｅｒｅｒ．Ｋ．，Ｂｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒ，Ｕ．Ｔ．（２００７），Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇａｍｍａ−ｉｓｏｅｎｚｙｍｅ  ｏｆ  ｐｉｇ  ｌｉｖｅｒ  ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｅｓｔｅｒａｓｅ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（２００７），７３（６），１２８２−１２８９を参照。
【００８２】
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏｒｉｇａｍｉにおける組換えＰＬＥイソ酵素の発現とシャペロン複合体ＧｒｏＥＬ／ＥＳの同時発現
プラスミド選択のために２０μｇｍＬ-1のクロラムフェニコールおよび５０μｇｍＬ-1のアンピシリンを含む１５０ｍＬのＬＢ培地中でシャペロンをＰＬＥイソ酵素と同時発現させた。１ｍｇｍＬ-1のＬ−アラビノースを添加することにより、シャペロン発現を直ちに開始した。４０μＭのＩＰＴＧを添加することにより、ＯＤ６００＝０．５でＰＬＥ産生を誘発した。２４時間後、細胞を遠心分離により除去し、１０ｍｌのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）中に再懸濁させ、超音波を用いて破壊した。細胞片を遠心分離により除去し、上清をさらなる実験に使用した（粗細胞抽出物）。タンパク質含量およびエステラーゼ活性をＢｒａｄｆｏｒｄにしたがうか、またはｐＮＰＡ分析を用いて決定した。
【００８３】
天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびＦａｓｔ  Ｒｅｄを用いた活性染色
組換え産生されたＰＬＥの粗抽出物を含む混合物（５〜１５μＬ、ｐＮＰＡ分析の０．０５〜０．１５Ｕに相当）を緩衝液（２０％（ｗ／ｖ）グリセリン；０．００２５％（ｗ／ｖ）ｄＨ２０中ブロモフェノールブルー）（５〜１０μＬ）と混合した。そのアリコートを天然ポリアクリルアミドゲル（７．５％）上で分離した。活性染色のために、新たに製造したα−ナフチルアセテートおよびＦａｓｔ  Ｒｅｄの混合物中でゲルをインキュベートした。生成したα−ナフトールおよびＦａｓｔ  Ｒｅｄ間に赤色複合体が形成されることはエステラーゼの加水分解活性を示す。（Ｋｒｅｂｓｆａｅｎｇｅｒ，Ｎ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９８）Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ，２２，６４１−６４６）。ゲルを次にクマシーブリリアントブルーで染色した。
【００８４】
エステラーゼ活性
基質としてｐ−ニトロフェニルアセテート（１０ｍＭ、ジメチルスルホキシド中に溶解）を用いて、リン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ）中分光光度法でエステラーゼ活性を決定した。生成したｐ−ニトロフェノールの量を４１０ｎｍ（ε＝１５＊１０3Ｍ-1ｃｍ-1）の波長、ＲＴおよびｐＨ７．５で決定した。１単位（Ｕ）を、１分あたり１μＭのｐ−ニトロフェノールを分析条件下で変換できる酵素の量と定義する（Ｋｒｅｂｓｆａｅｎｇｅｒ，Ｎ．，ｅｔ．ａｌ．（１９９８）Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ，２２，６４１−６４６）。
エステラーゼの基質特異性を一定ｐＨで分析した。既知量のエステラーゼを、エステル基質（５％（ｖ／ｖ）；トリブチリン、酢酸エチル、トリオレインまたは酪酸メチル）およびアラビアゴム（２％（ｗ／ｖ））を含むエマルジョン（２０ｍＬ）に３７℃で添加した。遊離した酸をｐＨ−Ｓｔａｔｉｏｍｅｔｅｒ（Ｓｃｈｏｔｔ（ドイツ国マインツ））中、一定のｐＨ７．５に維持するために０．０１ＮのＮａＯＨを用いて自動的に滴定した。１単位（Ｕ）を、分析条件下で１分あたり１μＭの酸を生成できる酵素の量と定義する。
【００８５】
第２アルコールのアセテートの酵素加水分解の立体選択性（独国特許公開第１０２５８３２７（Ａ１）号を参照）
加水分解をサーモミキサー（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  ｃｏｍｆｏｒｔ  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ドイツ国ハンブルク））中の１．５ｍｌの反応容器中、３７℃で実施した。１ｍｌの基質溶液（リン酸ナトリウム緩衝液中（ｐＨ７．５、５０ｍＭ）中１０ｍＭ）について０．５Ｕのエステラーゼ粗抽出物（ｐＮＰＡ分析に基づく）を使用した。混合物をジクロロメタンで抽出することにより反応を停止し、有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。
【００８６】
エナンチオマー純度および変換率をガスクロマトグラフィーにより決定した。変異型酵素のエナンチオ選択性をＣｈｅｎ等（Ｃ．Ｓ．Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，Ｇ．Ｇｉｒｄａｕｋａｓ，Ｃ．Ｊ．Ｓｉｈ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８２，１０４，７２９４．）にしたがって計算した。
【００８７】
基質の合成およびＧＣ分析における滞留時間についてのさらも詳細な説明については、Ｍｕｓｉｄｌｏｗｓｋａ−Ｐｅｒｓｓｏｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｂｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒ，Ｕ．Ｔ．，"Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  γ−ｉｓｏｅｎｚｙｍｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｉｇ  ｌｉｖｅｒ  ｅｓｔｅｒａｓｅ  ｔｏｗａｒｄｓ  ａｃｅｔａｅｓ  ｏｆ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｌｃｏｈｏｌｓ"  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ．Ｅｎｚｙｍ．２００２，１９−２０，１２９−１３３．を参照。
【００８８】
シス−３，５−ジアセトキシシクロペント−１−エンの酵素加水分解の立体選択性
実験手順は、第２アルコールのラセミ化合物の分割についてと同じであり、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５、５０ｍＭ）中１０ｍＭの基質を含む１ｍｌの反応混合物において０．５単位（ｐＮＰＡ）のＰＬＥ粗抽出物を使用した。反応を３７℃で実施し、表示した時間で試料を採取した。変換率および生成物エナンチオマー過剰の分析をガスクロマトグラフィーにより実施した。分析はＣ−Ｒ５Ａ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｐａｃ／Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ  ＧＣ装置（Ｓｈｉｍａｄｚｕ（ドイツ国デュイスブルク））中Ｈｙｄｒｏｄｅｘ（登録商標）−ｂ−３Ｐ（ヘプタキス−（２，６−ジ−Ｏ−メチル−３−Ｏ−ペンチル−ｂ−シクロデキストリン（２５ｍ、０．２５ｍＭ））ＧＣカラム（Ｍａｃｈｅｒｙ  Ｎａｇｅｌ（ドイツ国デューレン））を使用した。１１０℃のカラム温度での等温分別の滞留時間は次のとおりであった：シス−３，５−ジアセトキシ−シクロペント−１−エン：２１．８分、３（Ｓ）アセトキシ−５（Ｒ）−ヒドロキシ−シクロペント−１−エン：１８．２分、３（Ｒ）アセトキシ−５（Ｓ）−ヒドロキシ−シクロペント−１−エン：１６．０分。
【００８９】
結果：
ブタ肝臓からのｍＲＮＡの単離およびＲＴ−ＰＣＲ
単離されたＲＮＡの品質をアガロースゲル上で試験し（不図示）、前記ＲＮＡを分光光度法により定量し（２．６μｇ／μｌ）；このようにして、使用した組織０．１ｇから２６０μｇのＲＮＡを得た。ＲＴ−ＰＣＲによりｃＤＮＡ中に転写した後、前記ｃＤＮＡの品質を、ハウスホールド遺伝子β−アクチン増幅用の鋳型として使用することにより試験した。図１は、ｃＤＮＡによりβ−アクチン遺伝子の増幅が可能になり、その品質はしたがってさらなる実験に適していることを示す。
【００９０】
図１：β−アクチン遺伝子の増幅によるｃＤＮＡ品質管理。鋳型：レーン１：ヒトｃＤＮＡ（正の対照）、レーン２：ブタ肝臓由来のｃＤＮＡ、レーン３：水（負の対照）。
【００９１】
ＰＬＥ遺伝子の増幅およびクローニング
γＰＬＥの配列に基づいたプライマーを使用したＰＬＥ遺伝子の増幅のためにｃＤＮＡを使用した。図２に示すように、ＰＣＲ後に反応混合物をアガロースゲルに付すことにより、約１．７ｋｂｐでγＰＬＥのサイズに対応する鋭いバンドが得られた。このバンドを切除し、ＤＮＡを単離し、順プライマーを介して結合したＣＡＣＣオーバーハングを用いてＴＯＰＯベクター中にクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０細胞を、この構造混合物を用いて形質転換した後、組換えクローンを得た。プラスミドＤＮＡをこれらのクローンから単離し、制限マッピングにより試験し、配列決定した。
【００９２】
図２：ブタ肝臓ｃＤＮＡ由来のＰＬＥ遺伝子の増幅。レーン１：鋳型としてのｃＤＮＡ、レーン２：１ｋｂｐのマーカー、レーン３：鋳型としての水（負の対照）。
【００９３】
配列決定結果
新規ＰＬＥ遺伝子の配列決定により、互いに異なり、γ−ＰＬＥに関して異なる４つの新規遺伝子配列が得られたことが明らかになった。γ−ＰＬＥ配列と異なる部位を図３のアミノ酸配列のアラインメントで図示する。このように存在するＰＬＥおよびその遺伝子に１から５の番号をつけ、ＰＬＥ１はすでに開示されているγ−ＰＬＥに相当する。新規ＰＬＥの公知のγ−ＰＬＥとの違いは次のようにまとめることができる：
ＰＬＥ２：６ヌクレオチド置換（３アミノ酸置換）［イソ酵素４］
ＰＬＥ３：３５ヌクレオチド置換（２０アミノ酸置換）［イソ酵素２４］
ＰＬＥ４：３４ヌクレオチド置換（２０アミノ酸置換）［イソ酵素３９］
ＰＬＥ５：３４ヌクレオチド置換（２１アミノ酸置換）［イソ酵素４１］
【００９４】
図３：見いだされたＰＬＥであるＰＬＥ２、３、４および５のアミノ酸配列のγ−ＰＬＥ配列（ＰＬＥ１）との部分アラインメント。
【００９５】
タンパク質の発現
見いだされた５つの遺伝子をｐＥＴ１５ｂベクター中にサブクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏｒｉｇａｍｉをこれらの構築物ならびに２つのシャペロン部分であるＧｒｏＥＳおよびＧｒｏＥＬをコードするプラスミドｐＧｒｏ７で形質転換した。この発現系に関してＥ．ｃｏｌｉにおけるＰＬＥの有効な過剰発現が記載されている（独国特許第１００６１８６４号）。株を小規模（５０ｍｌ／１５０ｍｌ）で培養し、シャペロンおよびＰＬＥ構築物のタンパク質発現を誘発した。加えて、ｐＧｒｏ７を用い、ｐＥＴベクターを用いないでγＰＬＥおよびＥ．ｃｏｌｉ  Ｏｒｉｇａｍｉを比較のために同時培養し、タンパク質発現を誘発した。上清を破砕し（体積：３ｍｌ／９ｍｌ）、遠心分離により可溶性細胞内タンパク質を含む粗抽出物を得、次の実験に使用した。
【００９６】
すべての粗抽出物中のタンパク質含量は約７〜９ｍｇ／ｍｌであり（そのうち、形成されたタンパク質の大部分はシャペロンに相当する）；粗抽出物の最終体積は、培養物のサイズによって３または９ｍｌであった。
【００９７】
天然ゲルおよびＦａｓｔ  Ｒｅｄ染色
粗抽出物を天然ゲルに適用し、これを次いで、α−ナフチルアセテートを基質として含むＦａｓｔ  Ｒｅｄ溶液中でインキュベートすることにより、エステラーゼ活性を試験した。これに続いてクマシー染色をおこなった（図４：ＰＬＥ２、クローン１２、ＰＬＥ３、ＰＬＥ４、ＰＬＥ５、γＰＬＥおよびＥ．ｃｏｌｉ  Ｏｒｉｇａｍｉ  ｐＧｒｏ７野生型（負の対照）の粗抽出物の天然ＰＡＧＥ。左図：α−ナフチルアセテートを用いたＦａｓｔ  Ｒｅｄ染色、右図：その後のクマシーブリリアントブルー染色）。
【００９８】
活性エステラーゼバンドはＰＬＥ２、ＰＬＥ３、ＰＬＥ４、ＰＬＥ５およびγＰＬＥで可視であり、これらは異様に異なるサイズを有し、ひどく汚染されていた。これは、方法によるものであり、天然ゲルは変性ＳＤＳゲルほど明確に動作しないからである；しかし、いくつかの抽出物は三量体および四量体ＰＬＥ構築物を含む可能性があり、これらはどちらも活性である。
【００９９】
クローン１２は活性を示さない。同様に、予想されるように、ｐＥＴ１５ｂ構築物なしでＥ．ｃｏｌｉ  Ｏｒｉｇａｍｉの粗抽出物においてエステラーゼ活性は検出できない。
【０１００】
クマシー染色におけるタンパク質バンドは、γＰＬＥに加えて多くのシャペロンが過剰発現されたことを明らかに示す。Ｂｒａｄｆｏｒｄにより決定されたタンパク質含量はしたがって主にシャペロンを含み、γＰＬＥ含量についての情報は得られない。Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ後におこなわれたクマシー染色に基づいて過剰発現の程度をもはや正確に評価できない。シャペロンを用いたＥ．ｃｏｌｉ野生型と比較して、活性バンドの領域中で見ることができる追加のタンパク質バンドはない。しかし、活性染色後にタンパク質をクマシーでもはや染色できないことが多い。しかし、このことは、過剰発現がごくわずかであるが、それでも良好な活性を有するタンパク質を提供することも意味する。
【０１０１】
ｐ−ニトロフェニルアセテートに関する活性
まずｐＮＰＡ分析を用いることによりエステラーゼ活性を試験した。これにより、第１表に記載する結果が得られた。
【０１０２】
第１表：ＰＬＥ変異体および発現株（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＯｒｉｇａｍｉとシャペロンプラスミドｐＧｒｏ７）のｐＮＰＡに関する体積活性（Ｕ／ｍｌ）。すべてのエステラーゼはＮ末端Ｈｉｓ６タグを有する。
【０１０３】
【表２】
0005453238.tif 000007
【０１０４】
すべてのＰＬＥはｐＮＰＡに関して活性を示し、いくつかの新規エステラーゼについてはγ−ＰＬＥよりもさらに２倍〜４倍高かった。
【０１０５】
アキラルエステルに関する活性
ｐＨスタットを用いて新規ＰＬＥ変異体のアキラルエステルに関する活性を調べた。酵素の精製後、比活性を測定し、第２表に記載した。
【０１０６】
第２表：ｐＨスタットにより３７℃で、およびｐＨ７．５で１０分間の測定期間にわたって測定した、新規ＰＬＥおよびγ−ＰＬＥのいくつかのアキラルエステルに関する比活性。
【０１０７】
【表３】
0005453238.tif 000008
【０１０８】
第２アルコールのアセテートのラセミ化合物の分割
次のラセミアセテートの加水分解を調べた：
【化５】
0005453238.tif 000009
【０１０９】
ガスクロマトグラフィー研究により第３表〜第６表に示した結果を得た。Ａ．Ｍｕｓｉｄｌｏｗｓｋａ（Ｍｕｓｉｄｌｏｗｓｋａ−Ｐｅｒｓｓｏｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｂｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒ，Ｕ．Ｔ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ．Ｅｎｚｙｍ．２００２，１９−２０，１２９−１３３．）による市販のＰＬＥ製造物について得られたデータを比較のために付け加えた。
【０１１０】
第３表：１（Ｒ，Ｓ）−１−フェニル−１−プロピルアセテートのラセミ化合物の速度論的分割における新規ＰＬＥ変異体のエナンチオ選択性。（＊）Ｆｌｕｋａ  ＰＬＥおよびＣｈｉｒａｚｙｍｅ  Ｅ２のデータは、Ｍｕｓｉｄｌｏｗｓｋａ−Ｐｅｒｓｓｏｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｂｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒ、Ｕ．Ｔ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ．Ｅｎｚｙｍ．２００２，１９−２０，１２９−１３３から取得した。
【０１１１】
【表４】
0005453238.tif 000010
【０１１２】
第４表：２（Ｒ，Ｓ）−１−フェニル−エチルアセテートのラセミ化合物の速度論的分割における新規ＰＬＥ変異体のエナンチオ選択性。（＊）Ｆｌｕｋａ  ＰＬＥおよびＣｈｉｒａｚｙｍｅ  Ｅ２のデータは、Ｍｕｓｉｄｌｏｗｓｋａ−Ｐｅｒｓｓｏｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｂｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒ，Ｕ．Ｔ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ．Ｅｎｚｙｍ．２００２，１９−２０，１２９−１３３から取得した。
【０１１３】
【表５】
0005453238.tif 000011
【０１１４】
第５表：３（Ｒ，Ｓ）−１−フェニル−２−ブチルアセテートのラセミ化合物の速度論的分割における新規ＰＬＥ変異体のエナンチオ選択性。（＊）Ｆｌｕｋａ  ＰＬＥおよびＣｈｉｒａｚｙｍｅ  Ｅ２のデータはＭｕｓｉｄｌｏｗｓｋａ−Ｐｅｒｓｓｏｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｂｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒ，Ｕ．Ｔ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ．Ｅｎｚｙｍ．２００２，１９−２０，１２９−１３３から取得した。
【０１１５】
【表６】
0005453238.tif 000012
【０１１６】
第６表：４（Ｒ，Ｓ）−１−フェニル−２−ペンチルアセテートのラセミ化合物の速度論的分割における新規ＰＬＥ変異体のエナンチオ選択性。（＊）Ｆｌｕｋａ  ＰＬＥおよびＣｈｉｒａｚｙｍｅ  Ｅ２のデータは、Ｍｕｓｉｄｌｏｗｓｋａ−Ｐｅｒｓｓｏｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｂｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒ，Ｕ．Ｔ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ．Ｅｎｚｙｍ．２００２，１９−２０，１２９−１３３から取得した。
【０１１７】
【表７】
0005453238.tif 000013
【０１１８】
図５は、エナンチオマー過剰における違いを再度図式により示す。
【０１１９】
図５  基質１〜４のラセミ化合物の速度論的分割における様々なブタ肝臓エステラーゼイソ酵素のエナンチオ選択性。市販のＦｌｕｋａ  ＰＬＥのデータは文献（Ｍｕｓｉｄｌｏｗｓｋａ−Ｐｅｒｓｓｏｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｂｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒ，Ｕ．Ｔ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ．Ｅｎｚｙｍ．２００２，１９−２０，１２９−１３３）から取得した。
【０１２０】
シス−３，５−ジアセトキシシクロペント−１−エンの加水分解
【化６】
0005453238.tif 000014
【０１２１】
第７表：新規ＰＬＥ変異体、γ−ＰＬＥ（ＰＬＥ１）および市販のＦｌｕｋａ  ＰＬＥによるメソ−シス−３，５−ジアセトキシシクロペント−１−エンの不斉化。０．５単位（ｐＮＰＡ）の粗抽出物を用いて３７℃で反応を実施し、ガスクロマトグラフィーによりエナンチオマー過剰を決定した。
【０１２２】
【表８】
0005453238.tif 000015
【０１２３】
図６は、生成物のエナンチオマー過剰に関するＰＬＥ変異体の違いを示す。
【０１２４】
図６  シス−３，５−ジアセトキシシクロペント−１−エンの加水分解における様々なブタ肝臓エステラーゼイソ酵素の生成物のエナンチオマー過剰
【０１２５】
阻害剤の影響
粗抽出物を３つのエステラーゼ阻害剤のいずれかで処理することにより、新規ＰＬＥ変異体の阻害可能性を決定した。フェニルメチルスルホニルフルオリド、フッ化ナトリウムおよびフィゾスチグミンの影響を調べた。試料をある時点で採取し、残存エステラーゼ活性をｐＮＰＡ分析により決定した。第８表に結果を示す。
【０１２６】
第８表：フッ化ナトリウム、フェニルメチルスルホニルフルオリドおよびフィゾスチグミンの３つの阻害剤で２５℃でインキュベーションした後の新規ＰＬＥイソ酵素の残存活性［％］。活性をｐＮＰＡ分析により決定した。
【０１２７】
【表９】
0005453238.tif 000016
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図３ａ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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