(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１３のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
哺乳動物細胞においてＢＭＰ−２による骨形成の程度又は速度を増加させるか、又は、脊椎動物細胞において石灰化の程度又は速度を増加させるために使用される、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２記載のペプチドをコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
増殖因子とは、インビボ又はインビトロにおいて、規定された細胞集団の増殖及び分化に影響する、ペプチドを含む物質である。
【背景技術】
【０００２】
正常な骨形成は成長期に起こり、骨リモデリング（remodeling）は成人期に起こり、そして骨修復は骨格の完全性を保存するために起こる。骨形成、リモデリング及び修復は、破骨細胞による骨再吸収及び骨芽細胞による骨形成を含む。細胞分化及び骨芽細胞及び破骨細胞の活性は、増殖因子によって調節されている。それ故、細胞分化及び再吸収の平衡間のいかなる干渉も骨恒常性、骨形成及び修復に影響し得る。
骨芽細胞は、骨髄間質細胞（間葉系幹細胞としても知られている）のプールから誘導される。ＭＳＣは多様な組織に存在し、骨髄間質に多くみられる。ＭＳＣは多能性であり、骨芽細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、筋細胞及び脂肪細胞を含む、軟骨形成（chondrogenic）又は骨形成（osteogenic）細胞に分化し得る。
脱ミネラル化骨マトリックス（ＤＢＭ）による異所性骨形成の誘導については、すでに記載されている。（Urist, M. R.: Bone: Formation by autoinduction. Science 150:893-899, 1965; Urist, et al., Purification of bovine morphogenetic protein by hydroxyapatite chromatography. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :371-375, 1984; Urist, M. R. Emerging concepts of bone morphogenetic protein. In Fundamentals of Bone Growth: Methodology and Applications, Boston C. R. C. Press, pp. 189-198, 1991.）。さらに、特定の精製されたタンパク質分画、骨形態形成タンパク質（bone morphogenic protein）／非コラーゲン性タンパク質（「ＢＭＰ／ＮＣＰ」又は「ＢＭＰ」）の特性についても、すでに記載されている。（Urist, et al. Methods of Preparation and Bioassay of Bone Morphogenetic Protein and polypeptide fragments. Methods in Enzymology. Vol. 146. New York, Academic Press, pp. 294-312, 1987; Urist, et al., Hydroxyapatite affinity, electroelution, and radioimmunoassay for identification of human and bovine bone morphogenetic proteins and polypeptides. Development and Diseases of Cartilage and Bone Matrix. New York, Alan R, Liss, Inc., pp. 149-176, 1987.）。
【０００３】
ＢＭＰ／ＮＣＰは、均一なまで精製されたことはないが、他の研究者は、多数の組換え「ＢＭＰ」をクローン化するため、類似の出発物質を使用した。しかしながら、これらの分子のいくつかはわずかな骨形成活性しか有していないか又は全く有していない。「ＢＭＰ」及び他の骨形成因子は、臨床応用に使用するために研究されてきた。しかしながら、例えば、ＢＭＰ−７の最低有効用量を使用する費用が、臨床使用における制限因子であった。それ故、効果的そして手頃な組成物及び方法が、骨に関連する臨床応用に望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Urist, M. R.: Bone: Formation by autoinduction. Science 150:893-899, 1965
【非特許文献２】Urist, et al., Purification of bovine morphogenetic protein by hydroxyapatite chromatography. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :371-375, 1984
【非特許文献３】Urist, M. R. Emerging concepts of bone morphogenetic protein. In Fundamentals of Bone Growth: Methodology and Applications, Boston C. R. C. Press, pp. 189-198, 1991
【非特許文献４】Urist, et al. Methods of Preparation and Bioassay of Bone Morphogenetic Protein and Polypeptide Fragments. In Methods in Enzymology. Vol. 146. New York, Academic Press, pp. 294-312, 1987
【非特許文献５】Urist, et al., Hydroxyapatite affinity, electroelution, and radioimmunoassay for identification of human and bovine bone morphogenetic proteins and polypeptides. In Development and Diseases of Cartilage and Bone Matrix. New York, Alan R, Liss, Inc., pp. 149-176, 1987
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、ｒｈＢＭＰ−２を強く結合するＢＭＰ結合ペプチド（ＢＢＰ）と称される合成ペプチドに関する。ＢＢＰは、ｒｈＢＭＰ−２が誘発する骨形成の割合及び速度を増加させる。ＢＢＰは単独で軟骨形成、骨形成及び骨芽細胞の石灰化を誘発する。ＢＢＰ、ＢＢＰに対する抗体を含む組成物及び基質、及びＢＢＰを使用する方法は、骨に関連する適用において有用である。
【０００６】
本発明は、骨恒常性を維持する、骨形成を増強する及び／又は骨修復を増強する剤の全身的送達又は該剤による局所治療の方法を含むことができる。
本発明の一つの応用において、該方法は、骨の局部修復を誘発するために、又は骨粗鬆症のような骨関連障害を治療するために適用することができる。
【０００７】
本発明は、骨形成又は修復を誘発するための、剤を有している又は多能性又は分化細胞が播種されたインプラント（implant）も含むことができる。本発明は、骨形成又は骨修復が望まれる部位での物質又は分化細胞の適用も含むことができる。
【０００８】
本発明は、少なくともＢＢＰが軟骨形成又は骨形成前駆細胞の石灰化を増強することにおいて利点がある。さらに本発明は、少なくともＢＢＰが骨形成を増強することをより速く、より大きな程度で起こすことにおいて利点があり、それは、ＢＭＰでの治療の臨床率及び有効性を改善し、用量そしてそれ故、治療の費用を減少させることができる。
【０００９】
これら、ならびに他の目的、特色及び利点は、例示的態様及び付随する図面についての以下の詳細な説明の検討から明らかになるであろう。
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、効果的なそして手頃な組成物及び方法を、骨に関連する臨床応用に提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１Ａは、それぞれＢＢＰウシ（１）アミノ酸及び（２）核酸配列である；図１Ｂは、ウシＢＭＰ結合タンパク質（「ＢＢＰ」）の部分アミノ酸配列であり、シスタチン相同性領域、ＢＭＰ−２相同性領域及びＴＧＦ−β受容体ＩＩ相同ドメインを示している。
【図２】図２は、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸配列アライメント及びウシＳＰＰ−２４中のＢＭＰ−２相同性領域である；（ｉ、同一；ｃ、保存的置換；ｓｃ、半保存的置換）。
【図３】図３は、ウシ  フェチュインのアミノ酸配列アライメント、及びヒトＴＧＦ−β受容体ＩＩ（上）及びウシＳＰＰ−２４（ＢＢＰに相当する）のヒトＴＧＦ−β受容体ＩＩ及びＴＧＦ−β受容体ＩＩ相同ドメイン（下）である；（ｉ、同一；ｃ、保存的置換；ｓｃ、半保存的置換）。
【図４】図４は、ＢＢＰ５００μｇを含むアテロコラーゲン（上）又はアテロコラーゲン単独（下）埋め込み２１日後の、マウス後四半部のＸ線写真である。
【図５】図５は、ＢＢＰ５００μｇを含むアテロコラーゲン埋め込み２１日後の、マウス筋肉の組織学的切片である（Ｈ＆Ｅ染色。原倍率１００Ｘ）。
【図６】図６は、５μｇのｒｈＢＭＰ−２（左）又は５μｇのｒｈＢＭＰ−２＋５００ｍｇのＢＢＰ（右）埋め込み２１日後の、マウス後四半部のＸ線写真である。
【図７】図７は、５μｇのｒｈＢＭＰ−２（左）又は５μｇのｒｈＢＭＰ−２＋５００ｍｇのＢＢＰ（右）の埋め込み、９（上）及び１２（下）日後のマウス後四半部のＸ線写真である。
【図８】図８は、５μｇのｒｈＢＭＰ−２単独（Ａ）又は５μｇのｒｈＢＭＰ−２＋５００μｇのＢＢＰ（Ｂ）の埋め込み９日後のマウス後四半部の組織学的切片である。
【図９】図９は、ｒｈＢＭＰ−２（チップに固定されている）と１ｘ１０−５Ｍ〜１ｘ１０−４Ｍの濃度範囲の環化ＢＢＰの相互作用についての表面プラズモン共鳴センサグラムである。
【図１０】図１０は、ＢＢＰの存在又は非存在下での、１、３及び７日にわたるｒｈＢＭＰ−２保持のパーセンテージを示している棒グラフである。
【図１１】図１１には、特異的ＳＳＰ−２４／ＢＢＰ抗体が発生したアミノ酸配列が含まれている。
【図１２Ａ】図１２Ａは、本発明の例示的方法のフローチャートを示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、本発明の例示的方法のフローチャートを示す。
【図１３】図１３Ａ＆Ｂは、本発明の２つの態様の模式図的描写である。
【図１４Ａ】図１４Ａは、多様な種におけるＢＰＰについてのアミノ酸配列を示している図表である（配列番号１１、１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５及び２７は、それぞれ出現順に開示されている）。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは多様な種におけるＢＰＰについての核酸配列のリストである（配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６及び２８は、それぞれ出現順に開示されている）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の一つの態様は、配列番号１ａのアミノ酸配列を有しているペプチドを含む。ウシ由来アミノ酸配列番号１ａはＢＢＰと称されており、そして配列番号１ｂはＢＢＰをコードするウシ核酸配列に相当する。
【００１３】
本発明の一つの態様は、配列番号１２ａのアミノ酸配列を有しているペプチドを含んでおり、それはヒトＢＢＰの配列である。配列番号１２ｂはヒトＢＢＰをコードするヒト核酸配列に相当する。
【００１４】
ＢＢＰは、１９アミノ酸、２．１ｋＤペプチドであり、既知の２４ｋＤａ分泌型リンタンパク質（「ＳＰＰ−２４」）の１８．５ｋＤ断片に由来する。ＳＰＰ−２４は、配列番号２により示されている。特に、ＳＰＰ−２４はＢＭＰ−２誘発骨形成を抑制する。ＢＢＰは、ＳＰＰ−２４のシスタチン様ドメインを含有する。ＢＢＰは、少なくとも肝臓及び骨（少なくとも脱ミネラル化皮質骨及び骨膜を含む）で発現されている。
【００１５】
ＢＢＰアミノ酸配列は、プロテアーゼ阻害剤のシスタチンファミリーのメンバー、フェチュインのＴＧＦ−β／ＢＭＰ結合領域に類似している。ＢＢＰは、ｘ１０−５ＭのＫＤでｒｈＢＭＰ−２（組換えヒトＢＭＰ−２）を強く結合する。ＢＢＰは、他のＴＧＦ−βタンパク質（限定されるわけではないが、ＢＭＰ−４及びＢＭＰ−７を含む）のような、ＢＭＰ−２と類似の結合ドメインを有する他の分子も結合し、同様にそれらの保持率及び／又は活性に影響することができる。
【００１６】
ＢＢＰは単独で、脊椎動物の軟骨形成及び骨形成前駆細胞の石灰化を誘発する。ＢＢＰは、ｒｈＢＭＰ−２が誘発する骨形成の速度及び程度を増加させる。驚いたことに、インビボでＢＭＰ−２とともに使用されたＢＢＰは、より早く及びより大きな程度で、そしてより少ない量のｒｈＢＭＰ−２で骨形成を起こす。
【００１７】
例えば、マウス筋肉に単独で埋め込まれた場合、ＢＢＰは異栄養性石灰化を誘発する。修復における骨形成又は「マウス後四半部」又は「筋肉嚢」モデルの異所性骨形成の過程は、軟骨内骨形成を繰り返す。第一のステップは、軟骨の産生を含んでおり、それは骨により置き換えられる。発生における軟骨内骨形成間にこれと同一の過程が起こっているが、一方、いくらかの膜性骨形成が軟骨中間段階なしに直接起こっている。
【００１８】
本発明の一つの態様において、もし、ＢＢＰの断片が同様に哺乳動物細胞においてＢＭＰ−２による骨形成の程度又は速度を増加させる、又は脊椎動物細胞又は具体的には哺乳動物の軟骨形成又は骨形成前駆細胞において石灰化の程度又は速度を増加させるならば、該断片を含むペプチドは有用であることができる。
【００１９】
アミノ酸配列番号１の修飾を有するＢＢＰの形態も本発明において有用であることができる。例えば、種間で保存されたＢＢＰのアミノ酸配列、欠失性又は挿入性修飾、保存的又は半保存的置換性修飾は、修飾されたアミノ酸配列がＢＭＰ−２又は他のＴＧＦ−β相同的分子の滞留時間及び／又は活性を増加させる限り、特許請求されたＢＢＰに包含されることが意図されている。ＢＢＰはβプリーツシート−ターン−βプリーツシート分子モチーフ（「Ｂ−Ｔ−Ｂ」）である。増殖因子結合アミノ酸はＴ区域に存在すると現在信じられている。それ故、Ｔ区域のアミノ酸置換が、Ｂ領域の置換よりも大きな程度でＢＢＰの活性に影響することができる。
【００２０】
本発明の一つの態様は、ＢＢＰの哺乳動物コンセンサス配列である配列番号１１：Ｃ−Ｒ−Ｓ−Ｔ−Ｖ−Ｘ−Ｙ−Ｓ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｖ−Ｘ−Ｘ−Ｖ−Ｘ−Ｙ−Ｙ−Ｃの配列を有しているペプチドを含む。図１４Ａは、ウシ（配列番号１；核酸配列は配列番号２に示す）、ヒト（配列番号１３；核酸配列は配列番号１４に示す；９位はＡか又はＶである）、ブタ（配列番号１５；核酸配列は配列番号１６に示す）、ヒツジ（配列番号１７；核酸配列は配列番号１８に示す）、ラット（配列番号１９；核酸配列は配列番号２０に示す）及びマウス（配列番号２１；核酸配列は配列番号２２に示す）ＢＢＰにわたるアミノ酸配列の相同性を示している。図１４Ａは、ニワトリ（配列番号２３；核酸配列は配列番号２４に示す）、サケ（配列番号２５；核酸配列は配列番号２６に示す）及びマス（配列番号２７；核酸配列は配列番号２８に示す）で高度に保存された領域も示している。
【００２１】
図１４Ａにおいて、「Ｘ」及び「Ｙ」は、それぞれ半保存的又は保存的であると理解されているアミノ酸置換を表示するために使用した。保存的置換は同一グループから選択されたアミノ酸を含み、半保存的置換は、ＢＭＰ−２結合ドメイン又はＢＢＰの機能に影響しないと信じられている置換を含む。例えば、６位での置換はヒト、ラット及びヒツジ間では保存的であるが、異なった種においては、その位置で報告されたアミノ酸がＱ及びＥ（ブタ、ラット及びマウスＢＢＰにおいてはＱ、及びニワトリにおいてはＥ）であるので、半保存的である。Ｋ及びＲは両方とも塩基性アミノ酸と分類されるが、Ｑは非荷電極性アミノ酸と分類され、それ故、該置換は保存的ではない。しかしながら、ＢＢＰの機能は影響されないと信じられるので、該置換は半保存的である。半保存的置換は、９、１０、１１及び１６位にも観察される。９位では、ラット及びマウスＢＢＰにおけるＫと比較して、ウシ、ヒト、ブタ及びヒツジＢＢＰではアミノ酸Ａが観察される。１０位では、ウシ、ブタ及びヒツジＢＢＰについてはアミノ酸Ｅが報告されているが、ヒトＢＢＰはその位置にＱを含み、そしてラット及びマウスＢＢＰはアミノ酸Ｇを含む。１１位では、アミノ酸Ｑがウシ、ヒト、ラット及びマウスで観察され、一方、ブタＢＢＰについてはＫ、そしてヒツジＢＢＰについてはＲが報告されている。１６位では、Ｗがウシ、ブタ、ヒツジ、ラット及びマウスＢＢＰで観察され、一方、ヒトＢＢＰはＨを含む。他の種とは対照的に、ラット／ヒト間では１３及び１４位に半保存的置換もある。
【００２２】
保存的置換の例は７位に観察された。この位置では、異なった疎水性アミノ酸が異なった種で観察された：即ち、ヒトにおけるＶ及びブタＢＢＰにおけるＩと比較して、ウシ、ヒツジ、ラット及びマウスＢＢＰにおけるＭ。Ｍ、Ｖ及びＩはすべて疎水性アミノ酸であるので、この置換は保存的と考えられる。他の保存的置換は１７及び１８位で生じている。二つの疎水性アミノ酸、Ａ及びＶが１７位で観察されている。１８位では、二つの塩基性アミノ酸、Ｒ及びＨが観察された。
【００２３】
本発明の一つの態様は、脊椎動物細胞、より具体的には哺乳動物の軟骨形成又は骨形成前駆細胞において石灰化の程度又は速度を増加させるＢＢＰを含む組成物であることができる。さらに本発明は、ＢＭＰ−２による骨形成の程度又は速度を増加させるＢＢＰ、及びＢＭＰ−２又は脱ミネラル化骨マトリックスの一つを含んでいることができる。さらに、該組成物は、限定されるわけではないが、ＢＭＰ−４又はＢＭＰ−７を含んだ他のＴＧＦ−βファミリーメンバーを追加として又は代わりに含んでいてもよい。他のＴＧＦ−βファミリーメンバーは免疫システム機能に関与しており、そしてＢＢＰはこれらの分子の滞留時間又は活性に影響して結合することができ、その上それは免疫機能、炎症又は腫瘍増殖に影響することができるということが知られている。
一つの態様において、本発明は、治療的に有効量のＢＢＰ及びＢＭＰ又はＤＢＭが含まれている、脊椎動物において該骨形成の速度又は程度を誘発することに使用のための医薬を含むことができる。本発明はさらに、ＢＢＰを含んでいるペプチドが含まれている、脊椎動物において該石灰化の速度又は程度を誘発することに使用のための医薬を含むことができる。
【００２４】
ＢＢＰの応用
多数のＢＢＰの応用がその薬理学的（生物学的活性）特性から示唆される。例えば、ＢＢＰ単独で、又はＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４及びＢＭＰ−７のような他のＴＧＦファミリーメンバー又は脱ミネラル化骨マトリックスとの組み合わせを、骨形成を誘発する、骨恒常性を維持する及び／又は骨修復を増強するための臨床又は研究法で使用することができる。ＢＢＰは単独で又は組み合わせて、発育性又は恒常性骨疾患（骨粗鬆症のような）、骨損傷（平らな（例えば、膜性）及び長い（例えば、軟骨内）骨の骨折治癒のような［これは等しく応用可能と解釈される］）、癒着不能骨折を治療するため、及び再建手術に使用することができる。本発明は、歯周炎治療、歯周組織再生、歯インプラント再構築のための歯槽堤増大術、癒着不能骨折の治療、膝／腰／関節修復の部位又は置換手術にも使用することができる。
【００２５】
骨恒常性を維持するための方法又は化合物の能力の臨床指標は、少なくともＤＥＸＡスキャニングにより評価される、体中のいたるところの異なった部位での骨密度の改善により明らかにされる。骨折治癒における増強された骨形成は、選択された時間間隔での、骨折部位の通常のＸ線によりルーチン的に評価される。定量的ＣＴスキャニング又は定量的組織学的方法（例えば、組織は加工され、染色され及び顕微鏡検査され、そして画像分析で骨が規定され及び測定される）のような、上記指標を決定するためのより進歩した技術を使用することができる。さらに、骨密度、骨領域、骨塩量、異所性骨の形成及びＸ線検査による組織の乳白度の増加、アルカリホスファターゼ活性の発現、カルシウム取り込み、ミネラル化又はオステオカルシンｍＲＮＡの発現の測定を、ＢＢＰ石灰化及び／又は骨形成の効果を観察するために使用することができる。
【００２６】
本発明は、破骨細胞骨吸収を阻害する剤の使用も含むことができる。破骨細胞骨吸収に影響するために本発明において有用であろう剤には、限定されるわけではないが、ビスホスホネート、選択的エストロゲン受容体変調剤、カルシトニン、及びビタミンＤ／カルシウム補給剤が挙げられる。本発明は、骨芽細胞骨形成を誘発する剤の使用も含むことができる。本発明において有用であろう剤には、限定されるわけではないが、ＰＴＨ、フッ化ナトリウム、及びインスリン様増殖因子Ｉ及びＩＩのような増殖因子が挙げられる。
【００２７】
ＢＢＰ単独の石灰化作用又はＢＭＰと組み合わされた骨形成作用を示すために使用されたインビボモデルは、他の化合物の同様な挙動を明らかにするため以前に使用されている。特に、インビボモデルは、ＢＭＰ及びインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）のような化合物のインビボ骨形成作用を、成功裡に予測することも以前に可能であった。具体的には、動物モデルにおけるＢＢＰの骨形成作用はラット大腿骨、異所性骨形成モデルを使用することが示されている。それ故、これらの類似の発見に基づけば、ＢＢＰはヒトにおいてインビボで骨形成作用を有するであろうことが予期される。これらのインビボモデルにおける化合物の骨形成作用の実証は、ヒトにおいてインビボでそれらの作用を示すであろう試行に先立って必要である。
【００２８】
治療的有効量
本発明で有用なＢＢＰ又はＴＧＦ−βファミリーメンバーの治療的有効量は、患者に対して正の臨床効果、又は前述のように、石灰化又は骨形成を増強する剤の能力により測定される所望の効果を細胞において有する量である。各剤の治療的有効量は、負の副作用を最少化する一方、所望の臨床効果を達成するように変調することが可能である。剤の用量は、投与経路、疾患の重症度、患者の年齢及び体重、患者が服用している他の医薬、及び主治医により考慮される他の因子に依存し、特定の患者に適した個々の投与計画及び用量レベルを決定する際に選択することができる。
【００２９】
本発明は、骨形成の所与の速度又は程度を誘発するために必要とされるＢＭＰ−２の用量が、ＢＭＰ−２をＢＢＰと併用した場合に減量することができる点で少なくとも有利である。
【００３０】
剤形
剤形中に含まれている剤の治療的有効量は、選択された剤のタイプ及び投与の経路を考慮することにより選択することができる。剤形は、薬学分野の当業者には公知である、患者への投薬を容易にするための補助剤及び薬学的に許容できる担体が含まれる他の不活性成分と組み合わされた剤を含むことができる。
【００３１】
ＢＢＰ（特許請求された場合、それらの修飾物又は断片を含むことが意図される）の治療製剤は、所望の純度を有するＢＢＰと、存在してもよい生理学的に許容できる担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより、凍結乾燥したケーキ又は水溶液の形態で保存のために製造することができる。許容できる担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに無害であり、そしてリン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンのようなタンパク質を含む。他の成分としては、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトール又はソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成対イオン；及び／又はツイーン（Tween）、プルロニック（Pluronics）又はポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤 が含まれる。
【００３２】
該剤形は、例えば、皮下（持続放出性カプセルのような）、静脈内、腹腔内、筋肉内、骨格周囲又は内のための製剤で提供することができる。剤のいずれか一つ又は組み合わせを剤形に含ませることができる。もしくは、剤の組み合わせを別の剤形で患者に投与することができる。剤の組み合わせは、患者が治療のための少なくとも二つの剤に曝されるように、同時に投与することができる。
【００３３】
追加の剤
本発明は、石灰化骨形成を増強するために独立して又はＢＢＰと相乗的に働く追加の剤での治療を含むことができる。例えば、ＢＢＰはＢＭＰ、ビスホスホネート、エストロゲン受容体変調剤のようなホルモン療法治療、カルシトニン及びビタミンＤ／カルシウム補給、ＰＴＨ（フォルテオ又はテリパラチド（Eli Lilly）のような）、フッ化ナトリウム、及びインスリン様増殖因子Ｉ及びＩｌ及びＴＧＦ−βのような骨に対して正の効果を有する増殖因子と併用することができる。当業者は、標準治療用量パラメーターを使用して各療法についての許容できる用量、あるいはＢＢＰの効果がＢＢＰのような第二の剤と相乗的である場合には、減量した用量を決定することができるであろう。
【００３４】
ＢＢＰは、ＢＭＰ−２に対し、その基質との滞留時間を増加させることにより作用すると現在考えられている。本発明の一つの態様は、ＴＧＦ−β相同分子の滞留時間を増強するＢＢＰの能力を検出する方法であり、第一及び第二の選択された位置にＴＧＦ−β相同分子のある量を投与することを含む。さらに、ＢＢＰの選択された量を第一の選択した位置に投与し、そして最後に選択された期間後に第一及び第二の位置で、ＴＧＦ−β相同分子の量を検出し；第一及び第二の位置でのＴＧＦ−β相同分子の量間の差違を計算する。
【００３５】
一つの態様において、本発明は脊椎動物組織における骨形成の速度又は程度を増強する方法を含むことができ、哺乳動物細胞においてＢＭＰ−２による骨形成の程度又は速度を増加させるＢＢＰ、及びＢＭＰ−２のようなＴＧＦ−βファミリーメンバーの一つ又は脱ミネラル化骨マトリックスを投与することを含んでいる。
【００３６】
一つの態様において、本発明は、脊椎動物組織又はより具体的には脊椎動物軟骨形成又は骨形成前駆細胞の石灰化を誘発する方法を含むことができ、ＢＢＰの投与を含む。
一つの態様において、本発明は、脊椎動物組織における骨形成の速度又は程度を増強する方法を含むことができ、患者に対し、骨形成が所望される位置の近位に軟骨形成又は骨形成前駆細胞を投与すること；さらにＢＢＰを投与すること；そしてＢＭＰ−２のようなＴＧＦ−βファミリーメンバーの一つ又は脱ミネラル化骨マトリックスを投与することを含む。
【００３７】
一つの態様において、本発明は、脊椎動物組織における石灰化の速度又は程度を増強する方法を含むことができ、患者に対し、石灰化が所望される位置の近位に骨形成細胞を投与すること、そしてさらにＢＢＰを投与することを含む。
【００３８】
一つの態様において、本発明は、脊椎動物における骨形成の速度又は程度を増強する方法を含むことができ、脊椎動物間葉系幹細胞をＢＭＰ−２のようなＴＧＦ−βファミリーメンバーの一つ又は脱ミネラル化骨マトリックスで処理し、該細胞の骨形成を誘発することを含んでいる。さらに、ＢＢＰで脊椎動物間葉系幹細胞を処理し；そして患者に対し、骨形成が所望される位置の近位に脊椎動物間葉系幹細胞を投与する。
【００３９】
例えば、間葉系幹細胞のような哺乳動物細胞は、患者又は細胞ドナーから採取し得る。該細胞は、骨形成又は修復が所望される位置（骨折部位又は埋め込み部位のような）に注射することができるか、あるいは最初にＢＢＰ及び／又はＢＭＰで処理される。該細胞は次に、患者に対し、全身的か又は石灰化の骨形成が所望される選択された部位に再投与することができる。加えて、該患者を骨形成又は石灰化に影響する少なくとも一つの追加の剤で局所的に又は全身的に治療することができる。
【００４０】
図１２Ａ及びＢは、本発明の例示的方法のフローチャートを示しており、その工程は任意の順で実施することができる。
本発明の一つの態様は、固体支持体上に固定化されたＢＢＰを含む製品を含むことができる。該固体支持体はさらに、ＢＭＰ−２のようなＴＧＦ−βファミリーメンバー又は脱ミネラル化骨マトリックスを含むことができる。
【００４１】
本発明の一つの態様は、インビボで使用するためのインプラントを含むことができ、少なくとも該インプラントの表面がＢＢＰを含む基質を含んでいる。該インプラントはさらに、ＭＳＣ、軟骨細胞の又は造骨細胞の前駆細胞を含むことができる。さらに該インプラントは、例えば、ピン、スクリュー、プレート又は人工関節の形状に成形することができる。
【００４２】
例えば、図１３Ａ＆Ｂは、本発明の二つの態様を描写している。図１３Ａにおいて、本発明は体で使用するためのインプラント又は移植片（２００）を含むことができ、表面（２０１）を有する基質を含み、ここで少なくとも該インプラントの表面は、周辺組織における石灰化又は骨形成を誘発するために十分な量のＢＢＰ（２０３）を含む。該インプラントは、ＢＢＰを発現している間葉系幹細胞、軟骨形成又は骨形成細胞、及び／又はＢＭＰ−２、脱ミネラル化骨マトリックス又はコラーゲン培養物を含むことができる。該インプラントは限定されるわけではないが、ピン、スクリュー、プレート又は人工関節の形状であることができ、それは骨除去、骨折又は他の骨損傷（２０４）の部位の形成又は修復を刺激することにより、骨折を固定化、骨形成を増強する、又は人工インプラントの安定化させるために使用される骨（２０２）に近接して又は接触して置くことができる。
図１３Ｂに示されるように、本発明は、インビトロ（コラーゲン又は軟骨細胞培養物のような）、又は骨形成及び／又は石灰化が所望される骨除去、骨折又は他の骨損傷の部位（２０４）で、骨（２０２）、インプラント（２００）に近接して又は接触した、少なくともＢＢＰ含有組成物又はＢＢＰ発現細胞（２０６）のインビボ適用も含むことができる。ＢＢＰ組成物は、ＢＭＰ−２、脱ミネラル化骨マトリックス又はコラーゲン培養物のような他の剤と組み合わせて適用することができる。
【００４３】
例えば、ヒトにおける骨関連障害を治療するための幹細胞の使用も試験した。健常個体からの骨芽細胞前駆幹細胞の疾患個体への注入は、これらの患者（Ｏｌ）における骨密度を改善することが示された。細胞は、ＢＭＰ及びＢＰＰで前処理するか、又はそれらと同時に投与することができる。
【００４４】
一つの態様において、本発明は、ＢＢＰのいずれかの部分、又はＢＢＰ前駆体、ＳＳＰ−２４のＢＢＰ部分への選択的結合性を有するモノクローナル又はポリクローナル抗体を含んでいてもよい。
【００４５】
ＢＢＰ又はそれらの断片は、免疫原性ポリペプチドに融合することができ（例えば、組み換え発現又はインビトロ共有結合法により）、そしてこれを順に、ＢＢＰに対する抗体を上昇させるために動物を免疫するために使用することができる。抗体は、免疫した動物の血清から回収可能である。もしくは、モノクローナル抗体を、慣用的様式で免疫した動物からの細胞から調製することができる。固定化された抗体は、特にＢＢＰの検出又は精製に有用であることができる。
【００４６】
ウサギポリクローナル抗体を発生させた特異的ペプチド配列の二つの例には：（１）ウシ及びヒトＳＳＰ−２４（ＢＢＰ前駆体）の両方と反応するペプチド配列 「ＩＱＥＴＴＣＲＲＥＳＥＡＤＰＡＴＣＤＦＱＲＧＹＨＶＰＶＡＶＣＲＳＴＶＲＭＳＡＥＱＶ」（図１１−配列番号３）に対する抗体が含まれる。この抗体は、上に示した合成ペプチドで免疫したウサギにおいて発生した。さらに、（２）配列「ＣＧＥＰＬＹＥＰＳＲＥＭＲＲＮ」（図１１−配列番号４）に対して方向付けられた抗体が含まれ、それも、示された配列に対応する合成ペプチドで免疫されたウサギにおいて産生された。この二番目の抗体は、ウシＳＳＰ−２４と反応する。
【００４７】
Ｎ末端システインは天然のＳＳＰ−２４配列の一部ではない；しかし、アフィニティクロマトグラフィーのためのクロマトグラフィー樹脂に該ペプチドが結合されるのを可能にするため、好ましくは含まれている。追加のペプチド配列は、ＢＢＰへの特異的結合のために同定することができ、配列は、ＢＢＰと選択的結合を有する抗体を作製するために、しかし、ＢＭＰ−２又は他のＴＧＦ−βファミリーメンバーを結合するＢＢＰの領域のようなＢＢＰ結合を妨害しないように選択することができる。
【００４８】
上記配列、マウス、ヒト及びラットゲノム中の対応する配列、又は該免疫原性配列のいずれの誘導体に対する抗体も、本発明に有用である。少なくともこれらの抗体が高い特異性でＢＢＰアミノ酸配列を認識する限り、これらは有用である。こうした抗体は、抗体が他の分子と相互作用するペプチド上の位置に結合する場合、他の分子とＢＢＰのタンパク質特異的相互作用を阻害することにおいても有用であることができる。軟骨形成又は骨形成の速度又は程度の状況におけるＢＢＰ活性の阻害は修飾することができる。
【００４９】
本発明の一つの態様において、ＢＢＰに特異的な抗体は、脊椎動物細胞において、ＢＭＰ−２による骨形成の程度又は速度を減少させること、又は脊椎動物細胞、より具体的には哺乳動物の軟骨形成又は造骨性前駆細胞において、石灰化の程度又は速度を減少させることに有用であることができる。
【００５０】
本発明の一つの態様は、サンプル（限定されるわけではないが、細胞培養物、組織サンプル、ペプチド画分、ウエスタンブロットを含む）中のＳＳＰ−２４／ＢＢＰの存在を検出するために、ＢＢＰ選択的抗体を使用する方法も含み、ＢＢＰ選択的抗体にサンプルを暴露すること、及びＳＳＰ−２４／ＢＢＰ及びＢＢＰ抗体の複合体を可視化することを含む。
【００５１】
本発明の一つの態様において、ＢＢＰ抗体は、組換え細胞培養物又は天然源からのＢＢＰのアフィニティ精製のために使用することができる。他の増殖因子と検出可能な交差反応を行わないＢＢＰ抗体は、これら他のファミリーメンバーからＢＢＰを純化するために使用し得る。
一つの態様において、本発明は、ＢＢＰをコードするＤＮＡ又はＲＮＡ核酸配列、又は上記修飾されたアミノ酸配列に対応する修飾配列を含む核酸構築物を含むことができる。
本発明は、ＢＢＰ又は前駆体ＳＳＰ−２４をコードする核酸配列に機能可能であるように連結された発現ベクターも含むことができる。さらに、ＢＢＰ又はその前駆体ＳＳＰ−２４をコードする核酸構築物を宿主細胞内に導入することにより形質転換体を得ることができる。
【００５２】
本発明の実施は、ＢＢＰ及び哺乳動物又はウイルス発現ベクターにおいて機能可能であるように連結されたプロモーター配列をコードする配列を含む、オリゴヌクレオチド構築物の使用を含むことができる。発現及びクローニングベクターは、一つ又はそれ以上の選択された宿主細胞においてベクターが複製されるのを可能にするヌクレオチド配列を含む。一般的に、クローニングベクターにおいては、この配列は宿主染色体とは独立したベクターの複製を可能にし、そして複製の開始点又は自己複製配列を含むものである。こうしたクローニングベクターは、当業者には公知である。クローニングベクターと異なり、発現ベクターは、宿主生物により認識され、そしてＢＢＰ核酸に機能可能であるように連結された、誘導可能又は構成的プロモーターを含むことができる。該核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、機能可能であるように連結されることができる。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのためのＤＮＡは、ポリペプチドのためのＤＮＡに機能可能であるように連結されている（もし、それが該ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるならば）。
【００５３】
一つの態様において、本発明は、サンプル（限定されるわけではないが、細胞培養物、組織サンプル、核酸分画又はサザンブロット又はノーザンブロットを含む）中のＢＢＰ  ＤＮＡ又はＲＮＡの存在を検出するため、それぞれ、ＢＢＰをコードするＤＮＡ又はＲＮＡ配列に相補的で及び特異的結合を有する、ＤＮＡ又はＲＮＡ核酸配列を使用する方法も含むことができ、サンプルを相補的ＢＢＰ  ＤＮＡ又はＲＮＡ配列に暴露すること、及びハイブリッドの複合体を可視化することを含む。
【実施例】
【００５４】
実施例１：非コラーゲン骨タンパク質（ＮＰＣ）の抽出及び分離。
方法：ＮＣＰは、脱脂、脱ミネラル化ヒト皮質骨粉から、４Ｍ  ＧｕＨＣｌ、０．５Ｍ  ＣａＣｌ２、２ｍＭ  Ｎ−エチルマレイミド、０．１ｍＭベンズアミジンＨＣｌ及び２ｍＭ  ＮａＮ３にて、６℃で１８時間抽出した。残留コラーゲン及びクエン酸可溶性ＮＣＰは２５０ｍＭクエン酸、ｐＨ３．１に対して６℃で２４時間の透析により抽出した。残渣を遠心分離（１０，０００ｘｇ、６℃で３０分）によりペレット化し、１：１（ｖ／ｖ）クロロホルム：メタノールにて２３℃で２４時間脱脂し、ろ過により集め、２２℃で乾燥した。該材料を４Ｍ  ＧｕＨＣｌに再懸濁し、４Ｍ  ＧｕＨＣｌ、０．２％（ｖ／ｖ）トリトンＸ１００、１００ｍＭトリス−ＨＣＩ、ｐＨ７．２、に対して６℃で２４時間透析し、次ぎに水に対して透析し、１０，０００ｘｇにて６℃で３０分遠心分離した。ペレットを凍結乾燥し、続いてヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより分離した。
【００５５】
クロマトグラフィーは、ＣＨＴ−１０セラミックヒドロキシアパタイトカラムを備えたBioLogicクロマトグラフィーワークステーション（BioRad, Hercules, CA）を使用して実施した。ウシＢＭＰ／ＮＣＰを６Ｍ尿素、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、に可溶化した。サンプルをヒドロキシアパタイトに加え、結合されない分画を集めた。結合されたタンパク質は、５カラム容量の直線濃度勾配でリン酸ナトリウムの濃度を３００ｍＭまで増加させることにより溶出した。実行の過程において、５ｍｌ分画を集めた。１８０ｍＭリン酸で分離された分画を、さらにＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により分離した。１８．５のＭｒに相当するバンドを切り出し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ  ＭＳ）による配列分析にかけた。
【００５６】
結果：配列同定及び分析：
１８０ｍＭリン酸でヒドロキシアパタイトから溶出したｂＢＭＰ／ＮＣＰの分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により分離し、１８．５ｋＤのＭｒを有する物質をＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ  ＭＳ分析にかけた。この物質の主タンパク質成分はＳＰＰ−２４の断片であることが、該タンパク質の領域と同一の配列を有する六つのペプチドに基づいて決定された（Hu, et al.,Isolation and molecular cloning of a novel bone phosphoprotein related in sequence to the cyatatin family of thiol protease inhibitors. J. Biol. Chem. 270:431-436, 1995.）。これらのペプチドの配列は、表１に示されている。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベースを用いたこの配列の分析は、以前に記述されているシスタチン様ドメインを明らかにしたが、骨代謝に関連する他の配列類似性は明らかにされなかった（Hu, et al.）。しかしながら、他のシスタチン様タンパク質が骨代謝に役割を果たすタンパク質と相互作用することが、他の研究から知られている。特に、シスタチンファミリーのメンバーは、ＴＧＦ−β受容体との類似性に基づいたＴＧＦ−β及びＢＭＰ−２結合特性を有する（Brown, et al., Friends and relations of the  cystatin superfamily- new members and their evolution.: Protein Sci. 6:5-12, 1997; Demetriou, et al., Fetuin/α2-HS glycoprotein is a transforming growth factor-β type II receptor mimic and cytokine antagonist. J. Biol. Chem. 271 :12755- 12761 , 1996.）。しかしながら、フェチュインはＢＭＰ活性に拮抗する（Hu, et al.）。それ故、ＳＰＰ−２４のシスタチン様領域とフェチュインのシスタチン様ドメインのマニュアル比較を行った。
【００５９】
図１Ｂは、ウシＳＳＰ−２４の部分アミノ酸配列、ＢＭＰ−２相同性領域及びＴＧＦ−β受容体Ｉｌ相同性ドメインである。下線を付けたアミノ酸は質量分析法により存在していると確認されている（GenBank 寄託番号U08018; Hu, et al.）。
【００６０】
興味深い二つの領域が、ＳＰＰ−２４のシスタチン様領域中に同定された。一つの領域はＢＭＰ−２といくらかの配列相同性を有し、一方、他の領域はフェチュインのＴＧＦ−β受容体Ｉｌ相同性ドメインと配列相同性を有していた。これら二つの領域を含むＳＰＰ−２４配列の一部が図１Ｂに示されている。
【００６１】
ヒトＢＭＰ−２及びヒトＴＧＦ−β受容体ＩＩと興味深い二つの領域の比較は、図２及び３に示されている。図２は、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸配列アライメント及びウシＳＰＰ−２４中のＢＭＰ−２相同性領域である。図３は、ウシ  フェチュインとヒトＴＧＦ−β受容体ＩＩ（上）、及びヒトＴＧＦ−β受容体ＩＩとウシＳＰＰ−２４のＴＧＦ−β受容体ＩＩ相同性ドメイン（ＢＢＰに相当する）（下）のアミノ酸配列アライメントである。ＳＰＰ−２４、フェチュイン、ヒトＢＭＰ−２及びヒトＴＧＦ−β受容体ＩＩ配列のアライメントは、T-Coffeeプログラム（Notredame, et al, T-Coffee: A novel method for multiple sequence  alignments. J. Molecular Biol. 302:205-217, 2000.）を使用して達成された。これら二つの領域に対応する合成ペプチドが得られ、以下に記述の化学及びインビボ分析にかけられた。
実施例２：ＢＢＰのインビボ活性
方法：材料の骨形成活性は、８〜１０週齢の雄 Swiss-Weberマウス（Taconic Farms, Germantown, NY）を使用して試験した。アッセイに先立ち、ＢＢＰをアテロコラーゲン２ｍｇに可溶化し、凍結乾燥した。乾燥材料を＃５ゼラチンカプセル中に入れ、クロロホルム蒸気に暴露することにより滅菌した。アッセイを実施するため、マウスは小動物麻酔器（VetEquip, Pleasanton, CA）を介し、２ｌ／分の酸素で送達された１％イソフルランを使用して麻酔した。動物を手術板に固定し、後四半部の毛皮を剪毛した。皮膚を７０％エタノールで洗浄し、後四半部に隣接する脊椎にわたって正中切開した。はさみによる鈍的切開を使用して一側面の四頭筋を暴露させた。はさみの先端を使用して筋肉に小さな嚢を作製し、試験材料を含有する＃５カプセルを嚢内に挿入した。次ぎに３つの１１ｍｍマイケル止血鉗子で皮膚を閉じ、モニタリングのため動物をそのケージに戻した。
【００６２】
２１日後、動物を殺し、後四半部を取り除いた。検体の放射線検査はスモールパーツＸ線キャビネット（Faxitron, Wheeling, IL）を使用して行った。骨形成の素量化のため、異所性骨形成の部位を包含する興味を引く領域の骨領域及び骨塩量（ＢＭＣ）を、ＰＩＸＩｍｕｓ２小動物デンシトメーター（GE Lunar, Madison, WI）を使用して決定した。次に検体を緩衝化ホルマリン中に置き、組織学的検査についてのルーチンな加工のために提出した。
【００６３】
種々の量のｒｈＢＭＰ−２及びＢＢＰを混合し、埋め込みのために調製した。パイロット研究においては、以下の量のすべての可能な組み合わせを使用した：ｒｈＢＭＰ−２：０μｇ、０．０５μｇ、０．５μｇ、５μｇ及び５０μｇ；ＢＢＰ：０μｇ、５０μｇ及び５００μｇ。５μｇのｒｈＢＭＰ−２サンプルを、その量が信頼できる分析のために大きすぎず又小さすぎない異所性骨の量を一貫して産生したので、より詳しい続いての研究に使用した。
【００６４】
結果：ＢＢＰは単独で及びｒｈＢＭＰ−２と組み合わせて試験した。
図４は、ＢＢＰ５００μｇを含むアテロコラーゲン（上）又はアテロコラーゲン単独（下）埋め込み２１日後の、マウス後四半部のＸ線写真である。担体と単独で埋め込まれた場合、ＢＢＰは石灰化を誘発した。
【００６５】
図５は、ＢＢＰ５００μｇを含むアテロコラーゲン埋め込み２１日後の、マウス筋肉の組織学的切片である。異栄養性石灰化は主として筋肉内脂肪組織に付随していることに注目されたい。（Ｈ＆Ｅ染色、原倍率１００Ｘ）。
【００６６】
ＴＧＦ−β受容体ＩＩと配列類似性を有する５００μｇのＢＢＰが５μｇのｒｈＢＭＰ−２とともに埋め込まれた場合、形成された異所性骨の量は（デンシトメトリーにより測定された）、同量のｒｈＢＭＰ−２が単独で埋め込まれた動物において形成された骨の量よりも一貫して多かった。
【００６７】
図６は、５μｇのｒｈＢＭＰ−２（左）又は５μｇのｒｈＢＭＰ−２＋５００ｍｇのＢＢＰ（右）埋め込み２１日後の、マウス後四半部のＸ線写真である。増加した乳白度はｒｈＢＭＰ−２及びＢＢＰ両方を含有するサンプルと関係していたことに注目されたい。
【００６８】
さらに、ペプチド及びｒｈＢＭＰ−２両方を含有するインプラントは、ＢＭＰ−２単独のインプラントよりも早期に検出可能な軟骨及び骨を産生した。
図７は、５μｇのｒｈＢＭＰ−２（左）又は５μｇのｒｈＢＭＰ−２＋５００ｍｇのＢＢＰ（右）の埋め込み、９（上）及び１２（下）日後のマウス後四半部のＸ線写真である。ｒｈＢＭＰ−２及びＢＢＰ両方を含有する９日目のサンプルからのサンプル中の石灰化の出現、しかしＢＭＰ−２単独を含有するサンプルからは出現がないことに注目されたい。
【００６９】
図８は、５μｇのｒｈＢＭＰ−２単独（Ａ）又は５μｇのｒｈＢＭＰ−２＋５００μｇのＢＢＰ（Ｂ）の埋め込み９日後のマウス後四半部の組織学的切片である。ＢＭＰ＋ＢＢＰ検体中の豊富な軟骨、一方、ＢＭＰ単独の検体は炎症の初期段階及び中胚葉細胞増殖を示すことに注目されたい。
【００７０】
【表２】
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【００７１】
実施例３：ＢＭＰ−２及び合成ペプチドの相互作用を決定するための表面プラズモン共鳴
方法：ｒｈＢＭＰ−２及びＢＢＰ間の結合相互作用を、Biacom X 装置（Biacore, Piscataway, NJ）を用いる表面プラズモン共鳴を使用して特徴付けた。該方法のための緩衝液及びチップはBiacore から入手した。ｒｈＢＭＰ−２を１ｍｇ／ｍｌの濃度で１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５内へ透析した。この材料は次に、製造元により供給された試薬及び方法を用いてＣＭ−５センサーチップへ結合させた。ランニング緩衝液は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０であった。ペプチドを１ｘ１０−５Ｍ〜１ｘ１０−４Ｍの濃度範囲でランニング緩衝液に溶解した。５〜５０μｌ／分の流速及び２０〜１００μｌの注入量を用いた。再生溶液は、１０μＭグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．０であった。
【００７２】
結果：ｒｈＢＭＰ−２及びＢＢＰ間の相互作用を決定するための表面プラズモン共鳴研究の結果は図９に示されている。
図９は、ｒｈＢＭＰ−２（チップに固定されている）と１ｘ１０−５Ｍ〜１ｘ１０−４Ｍの濃度範囲の環化ＢＢＰの相互作用についての表面プラズモン共鳴センサグラムである。該相互作用についての推定解離定数（ＫＤ）は３ｘ１０−５Ｍであった。ＢＢＰがβ−メルカプトエタノールによる前もっての還元により脱環化された場合、有意な結合は生じなかった。
【００７３】
実施例４：滞留時間研究：ＢＢＰ及びｒｈＢＭＰ−２
方法：標識化したｒｈＢＭＰ−２をＢＢＰ又はベヒクルと混合し、コラーゲンスポンジに加えた。該スポンジを齧歯動物の筋肉嚢内へ埋め込んだ。所定の時間に（１、３及び７日）インプラントを取り出し、残存するＢＭＰの量を決定した。各群について４匹の動物を使用した。
【００７４】
結果：ＢＢＰはｒｈＢＭＰ−２の保持を約２倍増加させた。図１０は、ＢＢＰの存在又は非存在下での、１、３及び７日にわたるｒｈＢＭＰ−２保持のパーセンテージを示している棒グラフである。
【００７５】
考察：インプラント部位でのＢＭＰの保持を増加させることは、ＢＭＰの有効性を改善し、そして同一治療結果に必要とされる量も減少させることができる。
本明細書は本発明の特定の態様を記述しているが、当業者は発明概念から離れることなく本発明の変形を考案することができる。
【００７６】
実施例５：ヒトＢＢＰのインビボ活性
方法：実施例５の方法は、５μｇのｒｈＢＭＰ−２単独（対照）又は５μｇのｒｈＢＭＰ−２＋０．０５ｍｇのヒトＢＢＰ（ｈＢＢＰ）を使用する後四半部異所性骨形成アッセイ法において、８匹のマウスのｈＢＢＰの活性を試験するために利用した。４週間後、動物を殺し後四半部を切除した。Ｘ線及びＤＥＸＡ分析を実施した。
【００７７】
結果：ｈＢＢＰは、ｒｈＢＭＰ−２と組み合わせて試験した。
埋め込まれた場合、ＢＭＰを伴ったｈＢＢＰは、ＢＭＰ単独よりも多い量の石灰化誘発を生じた。
【００７８】
【表３】
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【図１】
0005508275.tif 000005
【図２】
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【図３】
0005508275.tif 000007
【図４】
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【図５】
0005508275.tif 000009
【図６】
0005508275.tif 000010
【図７】
0005508275.tif 000011
【図８Ａ】
0005508275.tif 000012
【図８Ｂ】
0005508275.tif 000013
【図９】
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【図１０】
0005508275.tif 000015
【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【配列表】
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