(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトIL-17Aに対する単離された抗体であって、前記抗体が重鎖可変ドメイン（VH）および軽鎖可変ドメイン（VL）を含み、前記VLおよびVHが、
（a）HCDR1が配列番号3であり、HCDR2が配列番号4であり、HCDR3が配列番号5であり、LCDR1が配列番号8であり、LCDR2が配列番号9であり、およびLCDR3が配列番号10である；
（b）HCDR1が配列番号13であり、HCDR2が配列番号14であり、HCDR3が配列番号15であり、LCDR1が配列番号18であり、LCDR2が配列番号19であり、およびLCDR3が配列番号20である；
（c）HCDR1が配列番号23であり、HCDR2が配列番号24であり、HCDR3が配列番号25であり、LCDR1が配列番号28であり、LCDR2が配列番号29であり、およびLCDR3が配列番号30である；
（d）HCDR1が配列番号33であり、HCDR2が配列番号34であり、HCDR3が配列番号35であり、LCDR1が配列番号38であり、LCDR2が配列番号39であり、およびLCDR3が配列番号40である；
（e）HCDR1が配列番号43であり、HCDR2が配列番号44であり、HCDR3が配列番号45であり、LCDR1が配列番号48であり、LCDR2が配列番号49であり、およびLCDR3が配列番号50である；
（f）HCDR1が配列番号53であり、HCDR2が配列番号54であり、HCDR3が配列番号55であり、LCDR1が配列番号58であり、LCDR2が配列番号59であり、およびLCDR3が配列番号60である；
（g）HCDR1が配列番号63であり、HCDR2が配列番号64であり、HCDR3が配列番号65であり、LCDR1が配列番号68であり、LCDR2が配列番号69であり、およびLCDR3が配列番号70である；
（h）HCDR1が配列番号73であり、HCDR2が配列番号74であり、HCDR3が配列番号75であり、LCDR1が配列番号78であり、LCDR2が配列番号79であり、およびLCDR3が配列番号80である；
（i）HCDR1が配列番号83であり、HCDR2が配列番号84であり、HCDR3が配列番号85であり、LCDR1が配列番号88であり、LCDR2が配列番号89であり、およびLCDR3が配列番号90である；
（j）HCDR1が配列番号93であり、HCDR2が配列番号94であり、HCDR3が配列番号95であり、LCDR1が配列番号98であり、LCDR2が配列番号99であり、およびLCDR3が配列番号100である；
（k）HCDR1が配列番号103であり、HCDR2が配列番号104であり、HCDR3が配列番号105であり、LCDR1が配列番号108であり、LCDR2が配列番号109であり、およびLCDR3が配列番号110である；
（l）HCDR1が配列番号113であり、HCDR2が配列番号114であり、HCDR3が配列番号115であり、LCDR1が配列番号118であり、LCDR2が配列番号119であり、およびLCDR3が配列番号120である；
（m）HCDR1が配列番号123であり、HCDR2が配列番号124であり、HCDR3が配列番号125であり、LCDR1が配列番号128であり、LCDR2が配列番号129であり、およびLCDR3が配列番号130である；
（n）HCDR1が配列番号133であり、HCDR2が配列番号134であり、HCDR3が配列番号135であり、LCDR1が配列番号138であり、LCDR2が配列番号139であり、およびLCDR3が配列番号140である；
（o）HCDR1が配列番号143であり、HCDR2が配列番号144であり、HCDR3が配列番号145であり、LCDR1が配列番号148であり、LCDR2が配列番号149であり、およびLCDR3が配列番号150である；ならびに、
（p）HCDR1が配列番号153であり、HCDR2が配列番号154であり、HCDR3が配列番号155であり、LCDR1が配列番号158であり、LCDR2が配列番号159であり、およびLCDR3が配列番号160である；
からなる群より選択される6つのCDRのセットを含む、前記抗体。
【請求項２】
前記抗体が1nMのヒトIL-17Aに応答したIL-6放出のHT1080細胞アッセイにおいて決定される1 nM以下のIC50を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体が125 pMのヒトIL-17Aおよび25 pMのTNFαに応答したIL-6の相乗的放出のHT1080細胞アッセイにおいて決定される0.5 nM以下のIC50を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
配列番号62に示されるVHドメインアミノ酸配列を有するVHドメインおよび配列番号176に示されるVLドメインアミノ酸配列を有するVLドメインを含む、単離された抗体。
【請求項５】
IgG1である、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
scFvである、請求項４に記載の抗体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体、および製薬上許容し得る賦形剤を含む組成物。
【請求項８】
手術または療法によるヒトまたは動物体の治療方法における使用のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体を含む組成物。
【請求項９】
関節リウマチおよび変形性関節症からなる群より選択される障害を治療するための薬剤の製造のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体又は請求項７〜８のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１０】
前記障害が関節リウマチである、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸を用いてin vitroで形質転換された宿主細胞。
【請求項１３】
抗体の製造のための条件下で請求項１２に記載の宿主細胞を培養することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体を製造する方法。
【請求項１４】
前記抗体を単離および／または精製することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
抗体を含む組成物を製造する方法であって、
請求項１４に記載の方法により抗体を製造すること；および
前記抗体を、少なくとも1種の追加成分を含む組成物中に製剤化すること、
を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン17(IL-17、IL-17Aとも呼ばれる)に対する結合メンバー、特に、抗体分子、および、例えば、関節リウマチなどのIL-17に関連する障害の治療におけるその治療的用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
IL-17Aは、多面的前炎症活性を有する、T細胞由来サイトカインである。in vitroでは、IL-17Aは、線維芽細胞および滑膜細胞からの炎症メディエーターの産生を調節し、他の前炎症性サイトカインと相乗作用し、軟骨分解および破骨細胞骨吸収を促進することができる。
【０００３】
IL-17Aは、2本の155個のアミノ酸鎖からなるホモダイマーである。それぞれのポリペプチド鎖は、23個のアミノ酸N末端ペプチドを含み、それが切断されて132残基の成熟ポリペプチドが産生される。IL-17Aは、IL-17受容体AおよびCに結合し、その活性化を介してその効果を発揮する(Toyら、2006)。IL-17B〜IL-17Fと呼ばれる、IL-17Aの5種の相同体が存在し、全て異なる生物学的役割を有する。IL-17相同体のSwissprot受託番号は、IL-17B Q9UHF5; IL-17C Q96P0M4; IL-17D Q8TAD2; IL-17E Q9H293; IL-17F Q96PD4である。IL-17BおよびIL-17Cは、未知のタンパク質の細胞起源と共に幅広い組織発現を有するが、IL-17B転写物は神経系において高レベルで見出される(Mooreら、2002)。IL-17BおよびIL-17Cは、単球細胞系THP-1からTNFαを誘導し(Liら、2000)、マウスモデル中に注入された場合、好中球増加症を誘導し得る(Shiら、2000)。IL-17Dは複数の組織において検出され、休止中のCD4+ T細胞およびCD19+ B細胞中で発現される(Starnesら、2002)。IL-17E (IL-25)は、気道過剰応答および好酸球増加症などのTh2型応答を引き出し、他のファミリーメンバーとは異なる特性を有する(Fortら、2001)。IL-17Fは、2つのアイソフォームとして存在し、IL-17Aと最も高い相同性を示し(55および40％相同性)、肺における好中球増加症の誘導およびIL-8などの前炎症性サイトカインの誘導などの多くの類似する機能的特性を共有する(Hymowitzら、2001；Hurstら、2002；Odaら、2005)。IL-17ファミリーメンバーは、先天性免疫および適応免疫における役割を有し、従って、IL-17Aのみを標的化する抗体は、IL-17Aが発現される領域におけるIL-17Aシグナリングの特定の効果の抑制を確保するであろう。
【０００４】
ファミリーメンバーとIL-17受容体ファミリーとの結合は、十分に理解されていない。IL-17Eは、IL-17RBを介してシグナルを発することが知られているが、IL-17Bはより低い親和性で結合するとも報告されている(Leeら、2001)。IL-17Aは、IL-17RAに加えて、IL-17RC (IL-17RL)に結合し、同様に、IL-17Fはこれらの受容体への結合を共有すると報告されている(Toyら、2006；Kuestnerら、2005)。さらなる受容体、IL-17RDおよびIL-17REが存在するが、その内因性リガンドは未だに同定されていない。IL-17RCおよびIL-17RDについては、複数のスプライス変異体が存在する(Haudenschildら、2002；Haudenschildら、2006；Moseleyら、2003)。
【０００５】
IL-17Aのその受容体への結合は、その活性化をもたらす受容体のオリゴマー化を誘導するようである。IL-17AによるIL-17RAの活性化は、細胞外シグナルにより調節されるタンパク質キナーゼ(ERK1/2)、c-jun N末端キナーゼ(JNK)およびp38 MAPキナーゼ経路などのいくつかの前炎症シグナル経路を活性化する。これらの経路の活性化は、完全には定義されていない機構を介して、様々な前炎症性遺伝子およびタンパク質の発現レベルの変化を誘発する。
【０００６】
IL-17Aは、主にCD4+およびCD8+ T細胞により分泌される(Lubbertsら、2001)。IL-17Aは、そのRNAまたは細胞内タンパク質として、好中球、好酸球およびヒト血液の単球においても検出された(Moletら、2001；Ferrettiら、2003)。IL-6およびTGFβは最近、IL-17産生T細胞へのナイーブT細胞の分化に関与してきたが(Betteliら、2006)、関節リウマチに関与する2種のさらなるサイトカイン、IL-15およびIL-23は、Tリンパ球からのIL-17Aの放出を調節する。
【０００７】
IL-17Aは、滑膜線維芽細胞からの炎症性サイトカイン産生およびプロスタグランジン産生を上方調節し、滑膜線維芽細胞および関節軟骨細胞からのMMP産生を増強し、破骨細胞骨吸収において役割を果たし得る。関節リウマチ(RA)組織における炎症環境との関係では、IL-17Aは、他の前炎症性サイトカイン、特に、TNF-αおよびIL-1βとの相乗作用において特定の役割を有し得る。
【０００８】
いくつかの系統の証拠が、関節リウマチ(RA)の病理におけるIL-17の重要な役割を示唆している。機能的なIL-17Aが、2/12のOA外植片および0/3の正常な滑膜外植片と比較して、16/18のRA滑膜外植片により自発的に分泌された。RA滑膜の免疫染色は、T細胞に富む領域においてIL-17A産生細胞を示した(Chabaudら、1999)。RA患者の血清中でのIL-17Aのレベルは、正常な対照血清と比較して上昇する(Choら、2004)。
【０００９】
IL-17Aは、様々な前炎症性サイトカインの放出を刺激することが示された。IL-17Aは、時には他のサイトカインとの相乗作用において働き、滑膜線維芽細胞からのIL-1、IL-6、およびLIFの産生を増強する(Katzら、2001；Chabaudら、1998)。さらに、IL-17Aは、炎症細胞におけるCOX-2発現を上方調節することが示された。
【００１０】
IL-17Aは、ヒト軟骨細胞、滑膜線維芽細胞およびマクロファージならびにヒト滑膜外植片においてCOX-2遺伝子発現を誘導する(例えば、Faourら、2003；Le Grandら、2001)。組換えIL-17Aは、滑膜細胞のCOX-2発現を上方調節し、TNFαにより刺激される滑膜細胞のCOX-2発現を増強する(Stampら、2004)。
【００１１】
これらの「古典的な」前炎症活性に加えて、IL-17Aは、軟骨の分解の促進などのRA関節における他の効果も引き出す。IL-17は、MMPの上方調節および軟骨分解に対する影響に関与することも示された。IL-17Aは、ヒトRA滑膜細胞によるMMP1の自発的産生を増加させる。IL-17Aは、ウシ関節軟骨細胞においてMMP3、MMP13およびADAMTS4遺伝子を協働的に上方調節する(Sylvesterら、2004)。IL-17Aは、関節軟骨外植片におけるマトリックス破壊の強力な誘導因子であり、マトリックス合成の阻害因子である(Caiら、2001)。IL-17Aが関節軟骨細胞によるマトリックス合成を抑制する1つの機構は、NO産生の増強を介するものである(Lubbertsら、2000)。II型コラーゲンで免疫されたマウスの膝関節に注入されたアデノウイルスIL-17Aは、開始を加速し、滑膜炎症を悪化させ、この部位での関節破壊を増強する(Lubbertsら、2001)。また、IL-17Aは、関節リウマチにおける破骨細胞骨吸収にも関与し得る(Kotakeら、1999)。
【００１２】
IL-17A生物学の重要な態様は、他のサイトカインと相乗作用するその能力である。例えば、IL-17Aは、滑膜線維芽細胞中でのIL-1、IL-6およびIL-8のTNFαにより誘導される合成を増強する(Katzら、2001)。さらに、破骨細胞系においては、MC-3T3、IL-17およびTNFαは、IL-6分泌の媒介において強力な相乗作用を示す(Ruddyら、2004)。IL-17Aは、RAの滑膜細胞による、IL-1βにより誘導されるIL-6およびLIF産生を増強する(Chabaudら、1998)。
【００１３】
RAにおけるIL-17Aの役割は、疾患の動物モデルからのin vivoでの証拠によりさらに支持される。IL-17Aの過剰発現は、IL-1を欠損したマウスにおいて、ストレプトコッカス細胞壁(SCW)により誘導される関節炎における軟骨損傷を誘導する(Koendersら、2005b)。コラーゲンにより誘導される関節炎(CIA)モデルにおいては、IL-17Aの過剰発現は、関節炎を増強する(Chabaud & Miossec, 2001)。さらに、CIAはIL-17A欠損マウスまたは抗IL-17 mAbで処理されたマウスにおいて抑制される(Nakaeら、2003；Lubbertsら、2001；Lubbertsら、2004)。
【００１４】
RAにおけるその役割に加えて、IL-17A活性は、以下を含む他の多くの病理と関連付けられてきた：
・変形性関節症(例えば、Honoratiら、2002)；Malemudら、2004)；
・骨量減少(Lubbertsら、2003)および骨埋込み物の弛緩(Van Bezooijenら、1999)；
・喘息(Moletら、2001；Wongら、2001；Linden、2006)およびARDSなどのアレルギー性気道疾患などの気道過敏症；
・多発性硬化症などの脱髄障害(Lockら、2002；Touilら、2006)；
・乾癬(Teunissenら、1998)および乾癬性関節炎；
・アトピー性皮膚炎などの皮膚過敏症(Todaら、2003)；
・急性移植片拒絶反応(Antonysamyら、1999；Yoshidaら、2006；Tangら、2001)；
・同種移植片拒絶反応(Hsiehら、2001)；
・移植片対宿主病；
・全身性硬化症(Kurasawaら、2000)；
・全身性エリテマトーデス(Wongら、2000)；
・潰瘍性大腸炎(Nielsenら、2003；Fujinoら、2003；Yenら、2006)およびクローン病などの自己免疫性炎症性腸疾患；
・良性前立腺過形成(Kramer & Marberger、2006)などの泌尿器炎症障害；
・アテローム性動脈硬化症(Csiszar & Ungvari, 2004)、Kawasaki病(Sohnら、2003)、虚血性心疾患(Csiszar, 2003)および卒中などの心血管疾患；
・ベーチェット病(Hamzaouiら、2002)などの脈管炎；
・家族性地中海熱(Haznedarogluら、2005)などの間欠熱；
・1型および2型糖尿病(Fisman, 2003)などのグルコース代謝；
・慢性閉塞性肺疾患(Shenら、2004a；Shenら、2004b)、気管支炎、肺気腫、閉塞性細気管支炎症候群(Vanaudenaerdeら、2003)および肺線維症などの肺疾患；
・リンパ腫(Maggioら、2002)および腫瘍(Numasakiら、2005)などの癌；
・歯周炎(Vernalら、2005；Takahashi、2005)；
・ヘルペス性間質性角膜炎(Maertzdorfら、2002)などのウイルス感染により引き起こされる疾患；
・例えば、アレルギー、反応性関節炎、炎症性疼痛、強直性脊椎炎などの脊椎関節症、皮膚および角膜の炎症性疾患、炎症性筋肉障害などの他のIL-17媒介性炎症性疾患；
・敗血症などの感染、敗血性ショックおよび内毒素ショック、髄膜炎および外傷(外科手術)などの他のIl-17媒介性急性炎症反応；
・例えば、自己免疫性血液障害、アルツハイマー病、サルコイドーシス、肝硬変、肝炎、糸球体腎炎などの胆嚢および肝臓疾患などの他のIL-17媒介性自己免疫障害；
・例えば、脂質異常症などの他のIL-17媒介性代謝障害。
【００１５】
in vivoでのIL-17Aの阻害は、いくつかの関節炎モデルにおいて炎症、関節破壊および疾患進行を抑制する。IL-17R Fc融合タンパク質の使用により、また関節炎のラットアジュバント誘導性関節炎(AIA)モデル(Bushら、2002)における組織学的分析により、マウスCIAにおける肉眼レベルでの関節損傷の抑制(Lubbertsら、2001)が証明された。IL-17(ラット抗マウス)およびIL-17R(ラット抗マウス)に対する市販の中和抗体の使用により、関節炎の感染症モデル(Burchillら、2003)における腫れおよび関節炎の開始の阻害が証明された。ウサギ抗マウスポリクローナル抗体を関節炎のマウスモデルにおいて用いたところ、関節損傷および軟骨破壊の重篤度の低下ならびにRANKL、IL-1βおよびIL-6などの前炎症性メディエーターのレベルの低下が証明された(Lubbertsら、2004；Koendersら、2005a）。
【００１６】
IL-17の中和は、様々な疾患の他の動物モデルにおける機能的効果を証明してきた。IL-17R Fc融合タンパク質は、マウス同種移植片モデルにおける生存を延長させた(Antonysamyら、1999)。IL-17R IgG融合タンパク質はまた、トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)誘導性大腸炎のマウスモデルにおける結腸炎症を軽減させた(Zhangら、2006)。市販のモノクローナル抗IL-17は、Ovaチャレンジの際に気管支好中球増加症を軽減させることにより、喘息のマウスモデルにおける有効性を証明した。ウサギポリクローナルIL-17中和抗体も、用量依存的様式で外科的接着のラットモデルにおける癒着形成(adhesiogenesis)を減少させた(Chungら、2002)。
【００１７】
IL-17Aに対する抗体が記載されている。例えば、マウス抗IL-17Aモノクローナル抗体MAB317がR&D Systemsにより製造されている。このIgG2B抗体は、精製された組換えヒトIL-17(大腸菌由来)を用いて免疫されたマウスから引き出されたマウスハイブリドーマから開発されたものである。さらに、さらなるマウス抗IL-17抗体53.159.16(Biosource Inc.)が、精製された組換えヒトIL-17を用いて免疫されたマウス(Balb/c)から引き出されたマウスハイブリドーマから開発されている。この抗体は、天然および組換えヒトIL-17を認識する。
【００１８】
WO2006/054059 (UCB CellTech)は、IL-17Aに対する中和抗体分子を記載している。元々ハイブリドーマから単離された生殖細胞系列型の抗IL-17抗体から誘導された、PEG化された抗体フラグメントが記載されている。この文献は、BIAcoreを用いて、該抗体フラグメントが133〜365 pMの範囲でIL-17に対する親和性を有することが決定されたことを記載している。
【００１９】
WO2006/013107 (Novartis Pharma GmbH)は、IL-17Aの結合メンバー、特に、ハイブリドーマから単離された、AIN457と呼ばれるヒト抗IL-17 IgG1抗体を記載している。WO2006/013107は、組換えAIN457とヒト由来IL-17(0.227 nM)、マーモセット(1.2 nM)、アカゲザル(9 nM)およびカニクイザル(6 nM)との間の相互作用に関するBIAcore親和性測定(Kd)を報告しており、それぞれ、ヒトとカニクイザルのIL-17に対する親和性においては約25倍の差異を示す。
【発明の概要】
【００２０】
IL-17A結合メンバーとも呼ばれる、IL-17Aに対する結合メンバーを、本明細書に記載する。本発明の結合メンバーは、IL-17Aに対する抗体分子、特に、ヒト抗体分子であってよい。
【００２１】
この結合メンバーは、IL-17Aに関連する障害、例えば、関節リウマチなどの、本明細書の他の場所で言及される1種以上のIL-17関連障害を治療するのに有用である。
【００２２】
本明細書で記載されるのは、成熟ヒトIL-17Aの位置71-87の領域内に結合する結合メンバーである。位置71-87は、配列Cys-Arg-His-Leu-Gly-Cys-Ile-Asn-Ala-Asp-Gly-Asn-Val-Asp-Tyr-His-Met (配列番号199)を有する。
【００２３】
本発明の結合メンバーは、Cys-Arg-His-Leu-Gly-Cys-Ile-Asn-Ala-Asp-Gly-Asn-Val-Asp-Tyr-His-Met (配列番号199)の少なくとも1個の残基に結合しうる。それは、例えば、配列番号199の1、2、3、4、5個またはそれ以上の残基に結合してもよい。
【００２４】
本発明の結合メンバーは、残基Leu74、Tyr85、His86および／またはMet87で成熟ヒトIL-17A (配列番号198)に結合してもよい。例えば、それはLeu74、Tyr85および／またはHis86に結合してもよい。この結合メンバーは、これらの残基の全部に結合してもよい。例えば、X線結晶解析を用いて決定することができる結合メンバー：IL-17A複合体の構造における、該結合メンバーとIL-17Aの残基の間の特異的相互作用を検出または観察することにより、結合を決定することができる。X線結晶解析を用いて決定されたヒトIL-17Aに結合した抗体7の構造は、抗体7が成熟配列(配列番号198)の残基74(Leu)、85(Tyr)、86(His)および87(Met)に結合することを示していた。
【００２５】
必要に応じて、結合メンバーは、配列番号199内の1個以上の残基への結合に加えて、IL-17A分子中の隣接する残基または構造的に近い残基に結合してもよい。例えば、結合メンバーは、Asn88に結合し得る。
【００２６】
本発明の結合メンバーは、以下の残基：
Ser40
Ser41
Asp42
Tyr43
Arg46
Leu74
Tyr85
His86
Met87
Asn88
Pro126
Ile127
のうち1個以上、例えば、5個以上、例えば、10個以上、例えば、その全てにおいて、成熟ヒトIL-17A(配列番号198)に結合してもよい。
【００２７】
本発明の結合メンバーは、残基Ser40、Ser41、Asp42、Tyr43および／またはArg46で成熟ヒトIL-17Aに結合してもよい。
【００２８】
本発明の結合メンバーは、残基Tyr85、His86、Met87および／またはAsn88で成熟ヒトIL-17Aに結合してもよい。
【００２９】
結合メンバーは、Pro126および／またはIle127で成熟ヒトIL-17Aに結合してもよい。
【００３０】
本明細書の他の場所に記載されるように、IL-17Aは、2個のポリペプチド鎖のダイマーを形成する。本発明の結合メンバーまたはVHドメインは、ダイマー中の2個の成熟IL-17Aポリペプチドの各々に結合してもよい。
【００３１】
例えば、前記結合メンバーは、Tyr85、His86、Met87および／もしくはAsn88で前記ダイマーの一方のIL-17Aポリペプチドに結合してもよく、ならびに／またはSer40、Ser41、Asp42、Tyr43および／もしくはArg46で該ダイマーの他方のIL-17Aポリペプチドに結合してもよい。
【００３２】
例えば、水素-重水素交換、部位特異的突然変異誘発、質量分析、NMRおよびX線結晶解析などの任意の好適な方法を用いて、結合メンバーにより結合した残基の配列を決定することができる。
【００３３】
原子分解においてタンパク質の正確な3次元構造を決定するためのX線結晶解析の使用は、当業者にはよく知られており、抗体と相互作用するタンパク質の部分を詳細に可視化するのに用いられてきた(Padavattanら、2007；Karpusasら、2001)。一度、標的抗原と複合体化させた結合メンバーの結晶が得られたら、それらにX線を照射して、正確な原子分布に依存する回折パターンを得る。結晶学者であれば、この回折パターンを分析して、構造中の全ての原子の3次元位置座標を決定することができる。これにより、結合メンバーとIL-17Aとの間の相互作用部位の詳細な検査が可能になる。
【００３４】
かくして、結合メンバーにより結合したIL-17Aの残基を、IL-17Aに結合した結合メンバーのX線結晶構造中の該結合メンバーとIL-17Aの残基との相互作用を観察することにより決定することができる。例えば、結合は、水素結合および／または非極性(疎水性)相互作用を含んでもよい。水素結合の決定には3.2Åのカットオフ距離を用いることができ、非極性相互作用の決定には4.0Åのカットオフ距離を用いることができる。X線結晶構造決定および結合した残基の同定の例を、本明細書の実施例7.4に提供する。
【００３５】
ペプチドアミド水素交換は、タンパク質を研究するのに用いられる非常によく記載された方法である(Englanderら、1994)。より最近では、これを、プロトンに交換することができる重水素標識されたタンパク質を用いるように開発し、これを質量分析法と組み合わせて、全タンパク質に渡る交換速度を測定してきた(Pantazatosら、2004)。この水素／重水素交換(H/D交換)の速度を、タンパク質の一部が別の分子への結合に関与する場合、交換の速度が有意に遅くなるような溶媒への接近性により有意に改変することができる。この手法は、抗体との相互作用に関与するタンパク質の領域をマッピングするのに用いられ(Luら、2005)、本明細書の実施例7.1に詳述されるように、本発明の抗体の結合に関与するIL-17Aの領域を調査するのに用いられてきた。質量分析をH/D交換と組み合わせて使用して、結合メンバーと接触するIL-17Aの領域を同定した。例えば、配列番号199内の残基のためのH/D交換は、IL-17Aが本発明の結合メンバーに結合した場合、有意に遅くなることを証明することができる。
【００３６】
構造を活性と相関させるためのタンパク質の単一のアミノ酸および領域の突然変異誘発は当業者にはよく知られており、抗体に結合するタンパク質の領域を定義するのに用いられてきた(Luら、2005）。本発明の結合メンバーのためのこれらの技術の使用の例を、実施例7.2に示す。
【００３７】
配列番号201のアミノ酸配列を有するヒトIL-17A変異体への結合および／またはその中和を用いて、結合メンバーが、成熟ヒトIL-17Aの位置71-87の領域内に結合するかどうかを評価することができる。野生型と比較したIL-17A変異体との結合もしくは中和の非存在、または有意に減少した結合もしくは中和は、結合メンバーが、配列番号199の少なくとも1個の残基に結合することを示唆する。
【００３８】
本発明の結合メンバーは、必要に応じて、配列番号201のアミノ酸配列を有するヒトIL-17A変異体に結合し、および／またはそれを中和してもよい。例えば、本発明の結合メンバーは、その受容体へのヒトIL-17A変異体(配列番号201)の結合を阻害しなくてもよい。IL-17Aの中和を、例えば、本明細書の他の場所に記載される様々なアッセイにより決定することができる。
【００３９】
本発明の結合メンバーは、HT1080細胞中でヒトIL-17A変異体(配列番号201)により誘導されるIL-6放出を阻害しなくてもよい。本発明の結合メンバーは、例えば、該結合メンバーが最大で50 nMの濃度にある場合、2 nMの濃度でIL-17A(配列番号201)変異体を用いるHT1080細胞におけるIL-6放出アッセイにおいて有意な中和能力を示さないかもしれない。
【００４０】
HT1080細胞中でのIL-6放出アッセイにおいて、本発明の結合メンバーは、1 nMまたは2 nMの成熟ヒトIL-17A(配列番号198)を用いるアッセイにおけるよりも、1 nMのヒトIL-17A変異体(配列番号201)において、10倍以上高い、20倍以上高い、50倍以上高いか、または100倍以上高いIC50を有してもよい。データの例を実施例7.3(表20b)に示すが、これは抗体7が成熟ヒトIL-17Aと比較して、IL-17A変異体に対するより低い能力(より高いIC50)を有することを示している。IL-17A変異体を用いるアッセイにおいては、抗体7に対してIC50値を決定することができず、かくしてこのことは、全てのIC50値がこのアッセイにおいて測定することができるものよりも高かったことを意味する。
【００４１】
本明細書の他の場所に記載されるように、IL-17への結合メンバーの結合を、表面プラズモン共鳴、例えばBIAcoreを用いて決定することができる。本発明の結合メンバーは、例えば、配列番号201のアミノ酸配列を有するヒトIL-17A変異体を用いる表面プラズモン共鳴アッセイにおいて、結合を示さず、例えば、約10 RU未満である。
【００４２】
表面プラズモン共鳴データを、二価分析物モデル(同時ka kd)にフィットさせ、親和性定数Kdを速度定数比kd1/ka1から算出することができる。本発明の結合メンバーは、ヒトIL-17A変異体(配列番号201)への結合よりも、5倍以上、例えば、10倍以上または50倍以上高い、成熟ヒトIL-17A(配列番号198)に対する結合親和性を有してもよい。
【００４３】
X線結晶解析などの技術を用いて、結合メンバーにより結合したIL-17Aの残基を同定することもでき、他の技術の結果を確認および／または詳述する、例えば、該結合メンバーにより接触した残基を同定するのに有用であってよい。二次、三次および四次構造を決定するためのタンパク質のX線結晶解析の使用は、当業者にはよく知られており、以前は抗体と相互作用するタンパク質の部分をマッピングするのに用いられていた(Padavattanら、2007；Karpusasら、2001)。配列番号199のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドもしくはペプチド、またはそれからなる単離されたペプチドを、本発明に従うIL-17Aのさらなる結合メンバーを作製、単離および／または試験する方法において用いることができる。
【００４４】
従って、本発明のさらなる態様は、配列番号199のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、配列番号198の成熟ヒトIL-17A配列の単離された断片に関する。断片は、例えば、20、25、30、50または100アミノ酸長であってよい。1個以上の断片を、IL-17Aアミノ酸配列ではない、例えば、前駆体もしくは成熟IL-17Aではなく、例えば、配列番号198ではない、より長い単離されたペプチドまたはポリペプチド内に含有させることができる。IL-17Aアミノ酸配列の単離された断片を含むペプチドまたはポリペプチドは、IL-17Aアミノ酸配列と非連続的であるさらなるアミノ酸残基を含んでもよい。例えば、配列番号199を、配列番号198に隣接していない1個以上の残基の前にまたはその後に配置することができる。そのようなポリペプチドまたはペプチドに対する、結合メンバー、例えば、抗体分子は、本発明の態様である。
【００４５】
in vivoでは、内因性IL-17Aはグリコシル化（糖鎖付加）され、従って、糖鎖付加されたヒトIL-17Aはヒト治療のための治療標的抗原である。細菌由来であり(例えば、大腸菌中で発現される)、糖鎖付加されない、組換えヒトIL-17Aを、本明細書に記載のアッセイにおいて用いることができるが、本発明者らは、本発明の結合メンバーが、ヒトT細胞またはヒト胚性腎臓(HEK)EBNA細胞により産生されるIL-17Aなどの糖鎖付加されたヒトIL-17Aに結合することができることも証明した。糖鎖付加されたヒトIL-17Aはin vivoでのヒト適用のための標的抗原であるため、これは、本発明の結合メンバーの有意な利点である。糖鎖付加された、および糖鎖付加されていないIL-17Aのための本発明の結合メンバーの親和性および／または効力はほぼ同じであってよい。
【００４６】
実施例により詳細に記載されるように、本発明に従う結合メンバーは、高い効力でIL-17Aを中和する。中和とは、IL-17Aの生物学的活性の阻害を意味する。本発明の結合メンバーは、IL-17Aの1種以上の活性を中和することができる。典型的には、阻害される生物学的活性は、その結合パートナーまたは受容体の1種以上、例えば、IL-17RAへのIL-17Aの結合である。
【００４７】
IL-17の受容体へのその結合の中和を、生物学的アッセイにおいて、生物学的分子、例えば、MMP13、PGE2またはIL-6もしくはIL-8などのサイトカインの細胞放出として測定することができるが、それは、IL-17Aの受容体へのその結合がこれらの分子の細胞放出を誘導するためであり、それをHT1080細胞(ECACC番号85111505の下で入手可能)、軟骨細胞または他の好適な細胞型もしくは組織型中での好適なアッセイを用いて決定することができる。
【００４８】
生物学的活性の阻害は、部分的であっても、全体的であってもよい。特定の実施形態においては、IL-17の生物学的活性を、結合メンバーの非存在下で該活性の少なくとも95％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80％、少なくとも75％、少なくとも70％、少なくとも60％、または少なくとも50％を阻害する結合メンバーを提供する。結合メンバーがIL-17Aを中和する程度を、その中和効力と呼ぶ。効力を、当業者には公知であり、および／または本明細書に記載もしくは言及される1種以上のアッセイを用いて決定または測定することができる。例えば、効力を、
・HTRF(登録商標)(均一時間分解蛍光)受容体-リガンド結合アッセイ
・HT1080 IL-6放出アッセイ
・IL-17およびTNFαに応答して相乗作用したIL-6放出を用いるHT1080細胞アッセイ
・軟骨細胞IL-6/IL-8/MMP13/PGE2-放出アッセイ
・軟骨外植片におけるIL-6放出アッセイ
・例えば、IL-17およびTNFαに対する相乗作用したIL-6を用いる、滑膜線維芽細胞(例えば、RAもしくはOA患者から得られる)におけるIL-6放出アッセイ
においてアッセイすることができる。
【００４９】
アッセイ方法は実施例に記載する。
【００５０】
第1の種(例えば、ヒト)に由来するIL-17を用いるアッセイにおいて算出された結合メンバーの中和効力を、第2の種(例えば、カニクイザル)に由来するIL-17を用いる同じアッセイにおける該結合メンバーの中和効力と比較して、2つの種のIL-17に対する結合メンバーの交叉反応性の程度を評価することができる。
【００５１】
本発明の結合メンバーは、ヒトIL-17AおよびカニクイザルIL-17Aに結合し、例えば、HT1080 IL-6放出アッセイにおいて決定されるように、ヒトおよびカニクイザルIL-17Aを中和する効力における30倍未満、例えば、25倍、15倍、10倍、5倍または2倍未満の差異を有してもよい。
【００５２】
例えば、本明細書に記載のデータは、抗体番号1〜4および7〜16が、本明細書に記載のHT1080 IL-6放出アッセイにおける、それぞれヒトおよびカニクイザルIL-17Aを中和する効力において20倍未満の差異を有することを示唆している。データを実施例2に提供する。かくして、いくつかの実施形態においては、ヒトおよびカニクイザルIL-17Aに関する本発明の結合メンバーの中和効力は、20倍以内である。いくつかの実施形態においては、ヒトおよびカニクイザルIL-17Aの中和効力は、ほぼ同じか、または等しく、すなわち、10倍以内である。
【００５３】
効力は、通常は特に指摘しない限り、IC50値（nM）として表される。機能的アッセイにおいては、IC50は、生物学的応答をその最大値の50％に低下させる結合メンバーの濃度である。結合メンバー濃度のlogの関数として最大生物学的応答の％をプロットし、Prism (GraphPad)またはOrigin (Origin Labs)などのソフトウェアプログラムを用いて該データにシグモイド関数をフィットさせてIC50値を生成させることにより、IC50を算出することができる。
【００５４】
本発明の結合メンバーは、本明細書に記載されるヒトIL-17A HTRF(登録商標)アッセイにおいて、最大で15 nMの中和効力またはIC50を有してもよい。このアッセイを用いて、scFv形式の結合メンバーに関するIC50を決定することができる。このIC50は、例えば、最大で10.0、5.0、4.0、3.0、2.0または1.0 nMであってよい。IC50データの例を実施例2(表5を参照)に提供する。0.75 nMの最終濃度のヒトIL-17Aを、HTRF(登録商標)受容体-リガンド結合アッセイにおいて使用し、詳細な方法を実施例に記載する。
【００５５】
本発明の結合メンバーは、ヒトIL-17 HT1080 IL-6放出アッセイにおいて最大で40 nMの中和効力またはIC50を有してもよい。このIC50は、例えば、最大で35、25、20、15、10または5 nMであってよい。本発明の結合メンバーは、ヒトIL-17 HT1080 IL-6放出アッセイにおいて最大で3.0、2.0または1.0 nMの中和効力またはIC50を有してもよい。IC50データの例を実施例2(表6Aを参照)に提供する。このアッセイは、1 nMのヒトIL-17Aに応答したIL-6放出を測定するものであり、詳細な方法を実施例に記載する。
【００５６】
本発明の結合メンバーは、ヒトIL-17 HT1080 IL-6放出アッセイにおいて、約10以下のpA2値を有してもよい。pA2分析の方法を、実施例の小節に記載する。データの例を、実施例3に提供する(表8a)。
【００５７】
本発明の結合メンバーは、125 pMのヒトIL-17Aおよび25 pMのTNFαに応答したIL-6の相乗的放出を測定するHT1080細胞アッセイにおいて1 nM以下の中和効力またはIC50を有してもよい。本発明の結合メンバーは、このアッセイにおいて1、0.5、もしくは0.3 nM以下の中和効力またはIC50を有してもよい。IC50データの例を、実施例2に提供する(表6b)。
【００５８】
本発明の結合メンバーは、ヒトT細胞に由来する糖鎖付加されたIL-17Aにより刺激されたHT1080細胞におけるIL-6放出の阻害に関して1 nM以下、例えば、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 nMのIC50を有してもよい。データの例を、実施例2に提供する(表6c)。これらのデータは、本発明の抗体が天然のヒトIL-17Aに結合し、これを中和することを示唆している。
【００５９】
有利には、高い中和効力を、良好な種交叉反応性と組み合わせることができる。かくして、例えば、結合メンバーは、ヒトIL-17Aに関するIL-6放出HT1080アッセイにおいて1 nM以下のIC50を有してもよく、ここで、ヒトIL-17A HT1080アッセイにおけるIC50は、カニクイザルIL-17A HT1080アッセイにおけるIC50とは最大で10倍異なる。ヒトIL-17Aに関する中和効力は、カニクイザルIL-17Aより大きいものであってよい。
【００６０】
本発明の結合メンバーは、カニクイザルIL-17 HT1080 IL-6放出アッセイ、例えば、IgG1形式において、最大で150 nMのIC50の中和効力を有してもよい。例えば、このIC50は、最大で150、100、50、40、30、25、15、10または5 nMであってよい。IC50データの例を、実施例2に提供する(表6A)。最終濃度1 nMのカニクイザルIL-17Aを、HT1080細胞中でのIL-6放出アッセイにおいて使用し、詳細な方法を実施例に与える。
【００６１】
IL-6、IL-8、MMP13、および／またはPGE2の放出の阻害に関する効力を、本明細書に記載のアッセイを用いて、ヒト一次軟骨細胞において決定することができる。これらのアッセイにおける本発明の結合メンバーに関するデータの例を、実施例4に示す。本発明の結合メンバーは、0.2 nMの濃度のIL-17を用いる軟骨細胞IL-6放出アッセイにおいて、最大で3.0 nM、例えば、最大で2.0、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3または0.2 nMのIC50を有してもよい。本発明の結合メンバーは、2 nMの濃度のIL-17を用いる軟骨細胞IL-6放出アッセイにおいて、最大で20 nM、例えば、最大で10、5.0、4.0、3.0または2.0 nMのIC50を有してもよい。
【００６２】
本発明の結合メンバーは、0.2 nMの濃度のIL-17を用いる軟骨細胞IL-8放出アッセイにおいて、最大で3.0 nM、例えば、最大で2.5、2.3、1.0、0.5、0.4、0.3、0.2または0.1 nMのIC50を有してもよい。2 nMの濃度のIL-17を用いる軟骨細胞IL-8放出アッセイにおいて、最大で8 nM、例えば、最大で5、4、3、2、1.8、1.6、1.5、1.0または0.8 nMのIC50を有してもよい。
【００６３】
本発明の結合メンバーは、0.2 nMの濃度のIL-17を用いる軟骨細胞MMP13放出アッセイにおいて、最大で5 nM、例えば、最大で4、3、2、1、0.5 nMのIC50を有してもよい。本発明の結合メンバーは、2 nMの濃度のIL-17を用いる軟骨細胞MMP13放出アッセイにおいて、最大で40 nM、例えば、最大で30、20、10、5 nMのIC50を有してもよい。
【００６４】
本発明の結合メンバーは、2 nMの濃度のIL-17を用いる軟骨細胞PGE2放出アッセイにおいて、最大で6 nM、例えば、最大で5、4、3、2、1、0.5 nMのIC50を有してもよい。
【００６５】
本発明の結合メンバーは、死後の軟骨外植片アッセイにおける1 ng/mlのTNFαとの相乗的応答において10 ng/mlの濃度のIL-17Aを用いるIl-6放出アッセイにおいて、阻害活性、例えば、少なくとも80％もしくは90％の阻害、または100％の阻害を示してもよい。本発明の結合メンバーは、1 ng/mlのTNFαとの相乗的応答における10 ng/mlの濃度のIL-17Aを用いる死後の軟骨外植片IL-6放出アッセイにおいて、5 nM以下、例えば、4、3、2、1、0.5 nM以下のIC50を有してもよい。例示的データを、実施例6.1に提供する(表15aおよび15b)。
【００６６】
本発明の結合メンバーは、本明細書に記載のように(例えば、TNFαとの相乗的な応答において10 ng/mlもしくは1 ng/mlのIL-17を用いるIL-8放出アッセイにおいて、最大の応答はIL-17およびTNFα成分を有する)、OA滑膜線維芽細胞中でのIL-17/TNFα相乗作用アッセイにおいて、阻害活性、例えば、少なくとも50、60または65％の阻害を示してもよい。例示的データを、実施例6.2に提供する(表16aおよび16b)。
【００６７】
本発明の結合メンバーは、2 nMの濃度のIL-17を用いるRA滑膜線維芽細胞IL-8放出アッセイにおいて、5 nM以下、例えば、4、3または2 nM以下のIC50を有してもよい。例示的データを、実施例6.3に提供する(表17)。
【００６８】
本発明の結合メンバーは、1 nMの濃度のIL-17および0.1 ng/mlのTNFαを用いる相乗作用したIL-17AとTNFα RA滑膜線維芽細胞のIL-8放出アッセイにおいて、5 nM以下、例えば、4、3または2 nM以下のIC50を有してもよい。例示的データを、実施例6.3に提供する(表17)。
【００６９】
本明細書に記載のプレミックスマウス空気嚢アッセイにおいては、本発明の結合メンバーは、IL-17Aに誘導される(結合メンバーと予備混合した)IL-6放出を少なくとも25％、例えば、少なくとも30、35、40、45、50、55または60％阻害することができる。阻害は約100％であってもよい。例えば、結合メンバーは、このアッセイにおいて最大で10、例えば、最大で5、4、3、2、1または0.5μMのID50を有してもよい。また、本明細書に記載のマウスプレミックス空気嚢アッセイにおいて、本発明の結合メンバーは、IL-17Aに誘導される白血球の流入を、少なくとも80％、例えば、少なくとも85、90、95、98または99％阻害することができる。阻害は、約100％であってもよい。例えば、結合メンバーは、このアッセイにおいて最大で5、4、3、2または1μgのID50を有してもよい。CDRの抗体2および抗体7のセットを用いる本発明の結合メンバーに関する例示的データを、実施例5に提供する(表13aおよび表14aを参照)。
【００７０】
本明細書に記載の全身投与マウス空気嚢アッセイにおいては、本発明の結合メンバーは、IL-17A(結合メンバーを全身投与した後、IL-17Aを空気嚢に投与する)により誘導されるIL-6放出を、少なくとも70％、例えば、少なくとも75、80または85％阻害することができる。例えば、結合メンバーは、このアッセイにおいて、最大で1μg、例えば、最大で0.5、0.4、0.3、0.2、0.1または0.05μgのID50を有してもよい。また、本明細書に記載の全身投与空気嚢アッセイにおいては、本発明の結合メンバーは、IL-17Aに誘導される白血球の流入を、少なくとも70％、例えば、少なくとも75、80、85、90または95％を阻害することができる。阻害は約100％であってもよい。例えば、結合メンバーは、このアッセイにおいて、最大で2、例えば、最大で1.5、1、0.9、0.8、0.7または0.6μgのID50を有してもよい。CDRの抗体7のセットを用いる本発明の結合メンバーに関する例示的データを、実施例5に提供する(表13bおよび表14bを参照)。
【００７１】
実施例5に記載の空気嚢アッセイにおいて得られたデータは、局所または全身的に投与された場合、IL-17Aにより誘導される応答を阻害する結合メンバーの能力を証明している。このデータは、本発明の結合メンバーの投与が、炎症の局所部位におけるIL-17Aと関連する障害を治療するのに有効であり、かくして、滑膜関節におけるIL-17Aにより誘導される応答の阻害を介する関節リウマチなどの障害の治療にとって有用であることを示唆している。本発明の結合メンバーの全身投与が、IL-17Aの阻害効果において有効であることが示され、局所投与は効率的な阻害にとって必要ではなかったことは注目すべきことである。これは、全身投与を用いることができ、投与部位は障害が現れる部位、例えば、滑膜関節などの炎症部位とは離れていることが多い場合、例えば、ヒトにおける結合メンバーの臨床使用にとって特に有利である。
【００７２】
さらに、IL-17Aに対するIL-17A結合メンバーの結合速度および親和性(平衡解離定数、Kdとして表される)を、例えば、BIAcoreなどの表面プラズモン共鳴を用いて決定することができるか、またはKdをpA2分析から見積もることができる。
【００７３】
本発明の結合メンバーは、例えば、ヒトIL-17 HT1080 IL-6放出アッセイにおけるpA2分析から算出されるように、1000 pM未満、例えば、600、500、400、300または200 pM未満のヒトIL-17Aに対するKdを有してもよい。
【００７４】
本明細書の他の場所に記載のように、表面プラズモン共鳴は、支持体に結合させたリガンド上に液相中の分析物を通過させ、分析物とリガンドの間の結合を決定することを含む。例えば、表面プラズモン共鳴を、支持体に結合させた結合メンバー上に液相中でIL-17Aを通過させることにより実施することができる。表面プラズモン共鳴データを、二価分析物データモデルまたは一価分析物データモデルにフィットさせることができる。本明細書の実施例に示されるように、二価分析物データモデルは、IL-17に対する結合メンバーの親和性を決定するのに特に好適であることがわかった。親和性定数Kdを、二価分析物データモデルを用いて表面プラズモン共鳴により決定される速度定数比kd1/ka1から算出することができる。
【００７５】
表面プラズモン共鳴を用いて算出された結合IL-17の見積もられたKD値の例を、実施例3に提供する(表8bを参照)。これらのデータは、大腸菌またはHEK EBNA細胞中での発現により組換え産生されたヒトIL-17Aに対する抗体7の良好な結合特性を示している。HEK EBNA細胞に由来するIL-17Aへの結合は、該抗体が天然の糖鎖付加されたヒトIL-17Aに結合することを示している。天然の糖鎖付加型の抗体7による結合は、抗体1〜16の全部が、単一の親抗体(抗体1)から誘導され、かくして、全てIL-17Aの同じか、または高度に類似するエピトープに結合すると考えられるならば、これらの抗体の全部が天然の糖鎖付加されたヒトIL-17Aに結合することができることを示唆している。
【００７６】
本発明の結合メンバーは、細菌細胞中で発現されたヒトIL-17A(例えば、大腸菌由来IL-17A)の結合に対するよりも、ヒト細胞中で発現されたヒトIL-17A(例えば、HEK EBNA由来IL-17A)の結合に対する親和性の5倍未満、例えば、2.5倍または2倍未満の差異を有してもよい。
【００７７】
本発明の結合メンバーは、二価分析物データモデルを用いて表面プラズモン共鳴により決定された速度定数比kd1/ka1から算出された、約2.5 nM以下のヒトIL-17AのKdを有してもよい。例えば、本発明の結合メンバーは、二価分析物データモデルを用いて、表面プラズモン共鳴を用いて決定された、速度定数比kd1/ka1から算出された2.5 nM、2 nM、1.5 nM、1.0 nMまたは0.5 nM未満のヒトIL-17AのKdを有してもよい。
【００７８】
本発明の結合メンバーは、一価分析物データモデルを用いて表面プラズモン共鳴により決定された、約0.3 nM以下のヒトIL-17Aに対する親和性を有してもよい。本発明の結合メンバーは、例えば、一価データモデルを用いて表面プラズモン共鳴を用いて算出されるように、300 pM未満、例えば、200 pM未満のヒトIL-17AのKdを有してもよい。
【００７９】
本発明の結合メンバーは、二価分析物データモデルを用いて表面プラズモン共鳴により決定された、速度定数比kd1/ka1から算出された約1.5 nM以下のカニクイザルIL-17AのKdを有してもよい。
【００８０】
本発明の結合メンバーは、例えば、データをフィットするための一価または二価モデルを用いて、表面プラズモン共鳴を用いて決定された、ヒトおよびカニクイザルIL-17Aに対する親和性の10倍未満の差異を有してもよい。かくして、本発明の結合メンバーは、表面プラズモン共鳴を用いて決定されるように、ヒトIL-17Aの結合についてよりも、10倍未満の差異、例えば、5倍未満または3倍未満の差異のKdでカニクイザルIL-17Aに結合してもよい。本明細書の他の場所に注記されるように、親和性は、二価分析物データモデルを用いて表面プラズモン共鳴により決定された速度定数比kd1/ka1から算出されたKdであってよい。実施例3および表8bに例示されるように、ヒトおよびカニクイザルIL-17Aの結合における良好な交叉反応性が、抗体7について決定された。
【００８１】
抗体7について得られた交叉反応性データを、抗体1〜16の全部が、単一の親抗体(抗体1)から誘導され、かくして全てIL-17の同じか、または高度に類似するエピトープに結合すると考えられるとすれば、これらの抗体の全部に対する代表的な交叉反応性であると取ることができる。
【００８２】
本明細書に報告されたデータは、本発明の結合メンバーが、IL-17相同体であるIL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17EまたはIL-17Fと交叉反応しないことを示唆している。いくつかの事例においては、IL-17Fについて弱い結合が観察される。例えば、本明細書に記載のHTRF(登録商標)エピトープ競合アッセイを用いて、本発明の結合メンバーに結合するIL-17AのIL-17相同体による阻害の程度を測定することにより、交叉反応性を決定することができる。本明細書に記載のように、IL-17相同体B〜Eは、そのようなアッセイにおいては本発明の結合メンバーに対するIL-17Aの結合を有意に阻害しないが、これは該結合メンバーがIL-17相同体B〜Eと交叉反応しないことを示している。
【００８３】
本発明の結合メンバーは、IL-17Fとのエピトープ競合アッセイにおいてIL-17Aに対する結合の部分的(すなわち、100％未満)な阻害を示してもよく、例えば、ここでIL-17Fは1μM以上の濃度にある。例えば、IL-17Fは、IL-17Aに対する結合を、50％以下、例えば、約20％以下に阻害することができる。
【００８４】
IL-17B、C、D、EまたはFはいずれも、ヒトIL-17Aに対する結合メンバーの結合を完全に阻害することはできない。ヒトIL-17Aに対する本発明の結合メンバーの結合を、エピトープ競合アッセイにおいて、1μMのIL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17EまたはIL-17Fのいずれか(個別に)により完全に阻害することはできない。かくして、二価分析物データモデルを用いて、表面プラズモン共鳴、例えばBIAcoreにより決定された速度定数比kd1/ka1から算出される、結合メンバーとヒトIL-17Aとの相互作用の解離定数Kdに等しい濃度の標識されたIL-17Aを用いるエピトープ競合アッセイにおいては、ヒトIL-17Aに対する結合メンバーの結合を、1μMのIL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17EまたはIL-17Fのいずれかにより、50％以下、例えば、20％以下に阻害することができない。そのようなエピトープ競合アッセイにおけるヒトIL-17Aに対する結合メンバーの結合を、例えば、1μMのIL-17B、IL-17C、IL-17DもしくはIL-17Eのいずれかによって阻害することができず、阻害することができないか、または1μMのIL-17Fにより、50％未満であるが阻害することができる。
【００８５】
エピトープ競合アッセイにおける例示的データを、実施例2.7に提供する(表7を参照)。IC50値を、IL-17B、C、D、EまたはFとのエピトープ競合アッセイにおいて決定することができなかったが、これはこのアッセイにおいては、IC50値が測定可能となるには高すぎたことを示している。
【００８６】
本発明の結合メンバーにより示されるIL-17相同体との限定された交叉反応性は、特に、IL-17Aを特異的に阻害するのが望ましいin vivoでの適用における、その治療および／または診断用途にとって利点を提供する。望ましくない交叉反応性により引き起こされる副作用は減少する。さらに、限定された交叉反応性は、より多くの投与される用量の結合メンバーが標的IL-17Aの結合にとって利用可能であることを意味するため、より低い濃度の結合メンバーを用いることができる。これは、in vivoでの治療適用にとって用量における特定の利点を提供する。
【００８７】
本発明の結合メンバーは、抗体分子、例えば、ヒト抗体分子を含んでもよい。通常、結合メンバーは抗体VHおよび／またはVLドメインを含む。結合メンバーのVHドメインも、本発明の一部として提供される。VHおよびVLドメインの各々の中に、相補性決定領域(「CDR」)、およびフレームワーク領域(「FR」)も含まれる。VHドメインは、HCDRのセットを含み、VLドメインはLCDRのセットを含む。抗体分子は、VH CDR1、CDR2およびCDR3およびフレームワークを含む抗体VHドメインを含んでもよい。あるいは、またはさらに、それはVL CDR1、CDR2およびCDR3ならびにフレームワークを含む抗体VLドメインを含んでもよい。VHまたはVLドメインフレームワークは、以下の構造：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
において、CDRが間に散りばめられた、4個のフレームワーク領域FR1、FR2、FR3およびFR4を含む。
【００８８】
本発明に従う抗体VHおよびVLドメイン、FRおよびCDRの例は、本開示の一部を形成する添付の配列表に列挙されている。さらなるCDRの例を、以下に、および表21に開示する。本明細書に開示される全てのVHおよびVL配列、CDR配列、CDRのセットならびにHCDRのセットならびにLCDRのセットは、本発明の態様および実施形態である。本明細書に記載されるように、「CDRのセット」は、CDR1、CDR2およびCDR3を含む。かくして、HCDRのセットとは、HCDR1、HCDR2およびHCDR3を指し、LCDRのセットとは、LCDR1、LCDR2およびLCDR3を指す。特に指摘しない限り、「CDRのセット」は、HCDRおよびLCDRを含む。典型的には、本発明の結合メンバーはモノクローナル抗体である。
【００８９】
本発明のさらなる態様は、添付の配列表に示される抗体1〜16のいずれかのVHドメインと少なくとも80、85、90、95、98もしくは99％のアミノ酸配列を有するVHドメイン、および／または添付の配列表に示される抗体1〜16のいずれかのVLドメインと少なくとも80、85、90、95、98もしくは99％のアミノ酸配列同一性を有するVLドメインを含む抗体分子である。2つのアミノ酸配列の同一性％を算出するのに用いることができるアルゴリズムとしては、例えば、デフォルトパラメーターを用いる、例えば、BLAST(Altschulら、1990)、FASTA(Pearson & Lipman, 1988)、またはSmith-Watermanアルゴリズム(Smith & Waterman, 1981)が挙げられる。
【００９０】
本発明の結合メンバーは、以下にさらに考察するように、通常は、非抗体タンパク質骨格(scaffold)中の1個以上のCDR、例えば、HCDR3および／もしくはLCDR、またはCDRのセットにより提供される、非抗体分子内の抗原結合部位を含みうる。
【００９１】
実験記載部分により詳細に記載されるように、本発明者らは、表21に示されるCDR配列のセットを有する親抗体分子(抗体番号1)を単離した。最適化のプロセスを通して、本発明者らは、親CDR3配列から誘導され、表21に示される位置に置換を有するCDR3配列を有する、一連の抗体クローン（番号2〜16）を作製した。かくして、例えば、抗体2が親HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1およびLCDR2配列を有し、Kabatの残基93および94が、それぞれPおよびHと置換された親LCDR3配列を有することを表21から見出すことができる。本明細書に記載される、親抗体分子、および抗体分子2〜16は、それぞれ、親抗体分子のCDRを有する抗体分子および抗体分子2〜16のCDRを有する抗体分子を指す。
【００９２】
HCDR1が配列番号3(Kabatの残基31-35)、HCDR2が配列番号4(Kabatの残基50-65)、HCDR3が配列番号5(Kabatの残基95-102)、LCDR1が配列番号8(Kabatの残基24-34)、LCDR2が配列番号9(Kabatの残基50-56)、およびLCDR3が配列番号10(Kabatの残基89-97)である、表21に示されるCDRの親セットを含む結合メンバーが本明細書に記載される。
【００９３】
本発明の結合メンバーは、本明細書に記載されるような1個以上のCDR、例えば、CDR3、ならびにまた、必要に応じて、CDRのセットを形成するCDR1およびCDR2を含んでもよい。このCDRまたはCDRのセットは、親CDRもしくはCDRの親セットであってよく、または抗体2〜16のいずれかのCDRもしくはCDRのセットであってよく、または本明細書に記載のその変異体であってもよい。
【００９４】
例えば、本発明に従う結合メンバーまたはVLドメインは、それぞれ、PおよびHにより置換されたKabatの残基93および94を有する親LCDR3を含んでもよい。
【００９５】
結合メンバーまたはVHドメインは、以下の置換：
FもしくはHにより置換されたKabatの残基98；
GもしくはTにより置換されたKabatの残基100A；
Rにより置換されたKabatの残基101；
GもしくはNにより置換されたKabatの残基102
のうち1個以上を有する親HCDR3を含んでもよい。
【００９６】
結合メンバー、またはそのVLドメインは、以下の置換：
Tにより置換されたKabatの残基90；
NもしくはSにより置換されたKabatの残基92；
HもしくはPにより置換されたKabatの残基93；
H、K、R、TもしくはYにより置換されたKabatの残基94；
D、NもしくはVにより置換されたKabatの残基95；
IもしくはQにより置換されたKabatの残基96
のうち1個以上を有する親LCDR3を含んでもよい。
【００９７】
LCDR3中のKabat位置93でのPによるDの置換は、ヒトおよび／またはカニクイザルIL-17Aに対する結合メンバーのより高い能力と関連している。
【００９８】
本発明の結合メンバーは、抗体1〜16のいずれかのHCDR1、HCDR2および／もしくはHCDR3ならびに／または抗体1〜16のいずれかのLCDR1、LCDR2および／もしくはLCDR3、例えば、表21に示される抗体1〜16のいずれかのCDRのセットを含んでもよい。結合メンバーは、これらの抗体の1つのVH CDRのセットを含んでもよい。必要に応じて、それはこれらの抗体の1つのVL CDRのセットを含んでもよく、VL CDRはVH CDRと同じか、または異なる抗体であってもよい。抗体1〜16のいずれかのHCDRのセットを含むVHドメイン、ならびに／または抗体1〜16のいずれかのLCDRのセットを含むVLドメインも、本発明の個々の実施形態である。
【００９９】
以下にさらに考察するように、VHまたはVLドメイン単独を用いて抗原を結合させることができるが、典型的には、VHドメインをVLドメインと対形成させて、抗体の抗原結合部位を提供する。一実施形態においては、抗体1のVHドメインは、抗体1のVHおよびVLドメインの両方を含む、抗体の抗原結合部位が形成されるように、抗体1のVLドメインと対形成させる。本明細書に開示される他のVHおよびVLドメインについても類似する実施形態が提供される。他の実施形態においては、抗体1のVHは抗体1のVL以外のVLドメインと対形成させる。軽鎖乱雑性（promiscuity）は当業界でよく確立されている。再度、本明細書に開示される他のVHおよびVLドメインについても類似する実施形態が本発明により提供される。かくして、親または抗体2〜16のいずれかのVHを、親または抗体2〜16のいずれかのVLと対形成させることができる。
【０１００】
本発明の一態様は、配列番号62に示されるVHドメインアミノ酸配列を有するVHドメインおよび配列番号67または配列番号176に示されるVLドメインアミノ酸配列を有するVLドメインを含む単離された抗体分子である。
【０１０１】
結合メンバーは、Hおよび／またはL CDRの開示されたセット内に10または9個以下、例えば、1、2、3、4もしくは5個の置換を有する親抗体または抗体2〜16のいずれかのHおよび／またはL CDRのセットを含んでもよい。例えば、本発明の結合メンバーは、10個以下の置換、例えば、5個以下の置換、例えば、0、1もしくは2個の置換を有するHおよび／またはL CDRの抗体7のセットを含んでもよい。潜在的には、置換をCDRのセット内の任意の残基で作製することができ、またそれはCDR1、CDR2および／またはCDR3内であってもよい。
【０１０２】
置換は、CDR3内、例えば、表21に示されるような、抗体2〜16のいずれかにおいて置換された位置にあってもよい。かくして、1個以上の置換は、以下の残基：
HCDR3中のKabatの残基98、100A、101もしくは102；または
LCDR3中のKabatの残基90、92、93、94、95もしくは96
において1個以上の置換を含んでもよい。
【０１０３】
かくして、CDR3は、例えば、Kabatの残基93および／または94に置換を有する親(抗体1)LCDR3であってもよい。
【０１０４】
親CDR中の置換の例を、本明細書の他の場所に記載する。記載されるように、該置換は、表21に示される1個以上の置換を含んでもよい。
【０１０５】
本発明の結合メンバーは、以下のようなHCDR1、HCDR2および／またはHCDR3を含んでもよい：
Kabatの残基31がSer、Ala、Gly、ThrもしくはCys、例えば、Serであり、および／またはKabatの残基32がTyrであるHCDR1；
Kabatの残基58がTyrもしくはPhe、例えば、TyrであるHCDR2；
HCDR3において、Kabatの残基96が疎水性残基、すなわち、非極性側鎖を有するアミノ酸残基、例えば、Leu、Ile、Val、AlaもしくはPhe、例えば、Leuであり、
Kabatの残基97が疎水性残基、例えば、Ile、Leu、Val、AlaもしくはPhe、例えば、Ileであり、および／または
Kabatの残基98が環状残基、すなわち、環式部分を含む側鎖を有するアミノ酸残基であるHCDR3。例えば、Kabatの残基98は、His、TrpまたはPhe、例えば、HisまたはTrp、例えば、Hisであってよい。
【０１０６】
実施例7.4に示されるように、これらのHCDR位置の残基は、IL-17Aに結合することができる。
【０１０７】
本発明の結合メンバーは、以下のようなLCDR1および／またはLCDR3を含んでもよい：
Kabatの残基31がTyrもしくはPhe、例えば、Tyrであり、および／またはKabatの残基32がTyrもしくはPhe、例えば、TyrであるLCDR1；
Kabatの残基91がTyrであり、および／またはKabatの残基93がPro、ヒドロキシプロリン、His、メチルヒスチジンもしくはAsp、例えば、ProもしくはHis、例えば、ProであるLCDR3。
【０１０８】
必要に応じて、LCDR1中のKabatの残基29はAlaであり、および／またはLCDR1中のKabatの残基30はAsnである。
【０１０９】
必要に応じて、本発明の結合メンバーは、Kabatの残基53が非荷電極性側鎖、例えば、Glnを有するアミノ酸残基であるLCDR2を含んでもよい。
【０１１０】
実施例7.4に示されるように、これらのLCDR位置の残基はIL-17Aに結合することができる。
【０１１１】
例えば、本発明の結合メンバーは、以下の残基：
・HCDR1のKabatの残基31のSer、Ala、Gly、ThrもしくはCys、例えば、Ser；
・HCDR1のKabatの残基32のTyr；
・HCDR2のKabatの残基58のTyrもしくはPhe、例えば、Tyr；
・Kabatの残基96の疎水性残基、例えば、Leu、Ile、Val、AlaもしくはPhe、例えば、Leu；
・HCDR3のKabatの残基97の疎水性残基、例えば、Ile、Leu、Val、AlaもしくはPhe、例えば、Ile；
・HCDR3のKabatの残基98の環状残基、例えば、His、TrpもしくはPhe、例えば、HisもしくはTrp、例えば、His；
・LCDR1のKabatの残基31のTyrもしくはPhe、例えば、Tyr；
・LCDR1のKabatの残基32のTyrもしくはPhe、例えば、Tyr；
・LCDR3のKabatの残基91のTyr；および
・LCDR3のKabatの残基93のPro、ヒドロキシプロリン、Hisもしくは3-メチルヒスチジン、例えば、ProもしくはHis、例えば、Pro
のうちの7個以上、例えば、8、9もしくは全部を含む、以下のDRのセット：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2およびLCDR3を含んでもよい。
【０１１２】
前記結合メンバーは、
HCDR1のKabatの残基31がSerである；
HCDR1のKabatの残基32がTyrである；
HCDR2のKabatの残基58がTyrである；
HCDR3のKabatの残基96がLeuである；
HCDR3のKabatの残基97がIleである；
HCDR3のKabatの残基98がHisである；
LCDR1のKabatの残基31がTyrである；
LCDR1のKabatの残基32がTyrである；
LCDR3のKabatの残基91がTyrである；および
LCDR3のKabatの残基93がProである；
CDRのセットを含んでもよい。
【０１１３】
本発明の結合メンバーにおいては、
HCDR1は、Kabatの残基31-35からなる5アミノ酸長であってよく；
HCDR2は、Kabatの残基50-65からなる17アミノ酸長であってよく；
HCDR3は、Kabatの残基95-102からなる9アミノ酸長であってよく；
LCDR1は、Kabatの残基24-34からなる13アミノ酸長であってよく；
LCDR2は、Kabatの残基50-56からなる7アミノ酸長であってよく；および／または
LCDR3は、Kabatの残基89-97からなる9アミノ酸長であってよい。
【０１１４】
HCDR1がKabatの残基31-35であり、HCDR2がKabatの残基50-65であり、HCDR3がKabatの残基95-102であり、LCDR1がKabatの残基24-34であり、LCDR2がKabatの残基50-56であり、およびLCDR3がKabatの残基89-97である、HCDRとLCDRのセットのKabatの番号を、表21に例示する。
【０１１５】
結合メンバーは、抗体フレームワーク内に、1個以上のCDR、例えば、CDRのセットを有する抗体分子を含んでもよい。例えば、抗体の1個以上のCDRまたはCDRのセットを、フレームワーク(例えば、ヒトフレームワーク)中に移植して、抗体分子を提供することができる。フレームワーク領域は、ヒト生殖細胞系列遺伝子セグメント配列を含んでもよい。かくして、該フレームワークは生殖細胞系列であってよく、それによって該フレームワーク内の1個以上の残基を、最も類似するヒト生殖細胞系列フレームワーク中の等価な位置の残基に一致するように変化させる。当業者であれば、生殖細胞系列化の前に抗体のフレームワーク配列に最も近い配列である生殖細胞系列断片を選択し、該抗体の親和性または活性を試験して、生殖細胞系列化が本明細書に記載のアッセイにおける抗原結合または効力を有意に低下させないことを確認することができるであろう。ヒト生殖細胞系列遺伝子セグメント配列は当業界で公知であり、例えば、VBase編集からアクセスすることができる。
【０１１６】
一実施形態においては、本発明の結合メンバーは、ヒト生殖細胞系列フレームワーク中のHCDRのセットを含むVHドメイン、例えば、VH3-23を有する単離されたヒト抗体分子である。かくして、VHドメインフレームワーク領域FR1、FR2および／またはFR3は、ヒト生殖細胞系列遺伝子セグメントVH3-23のフレームワーク領域を含んでもよい。FR4は、ヒト生殖細胞系列jセグメントJH1、JH4もしくはJH5のフレームワーク領域(これらのjセグメントは同一のアミノ酸配列を有する)を含んでもよく、またはそれはヒト生殖細胞系列jセグメントJH3のフレームワーク領域を含んでもよい。VH FR1のアミノ酸配列は、配列番号189であってよい。VH FR2のアミノ酸配列は、配列番号190であってよい。VH FR3のアミノ酸配列は、配列番号192であってよい。通常、前記結合メンバーはまた、例えば、ヒト生殖細胞系列フレームワーク、例えば、Vλ6a中のLCDRのセットを含むVLドメインも有する。かくして、VLドメインフレームワーク領域FR1、FR2および／またはFR3は、ヒト生殖細胞系列遺伝子セグメントVλ6aのフレームワーク領域を含んでもよい。FR4は、ヒト生殖細胞系列jセグメントJL2またはJL3(これらのjセグメントは同一のアミノ酸配列を有する)のフレームワーク領域を含んでもよい。VL FR1のアミノ酸配列は、配列番号193であってよい。VL FR2のアミノ酸配列は、配列番号194であってよい。VL FR3のアミノ酸配列は、配列番号195であってよい。VL FR4のアミノ酸配列は、配列番号196であってよい。生殖細胞系列のVHまたはVLドメインは、1個以上のVernier残基で生殖細胞系列化されていてもよいが、通常はされていない。
【０１１７】
本発明の抗体分子またはVHドメインは、Kabatの残基28がThrもしくはSer、例えば、Thrであり、および／またはKabatの残基30がSerもしくはThr、例えば、SerであるVH FR1を含んでもよい。
【０１１８】
本発明の抗体分子またはVLドメインは、Kabatの残基49が疎水性残基、例えば、Phe、TyrもしくはHis、例えば、Pheである、VL FR2を含んでもよい。
【０１１９】
実施例7.4に示されるように、VHドメインフレームワーク中のThr28およびSer30ならびにVLドメインフレームワーク中のPhe49は、IL-17Aに結合することができる。
【０１２０】
本発明の抗体分子またはVHドメインは、重鎖フレームワーク領域の以下のセット：
FR1  配列番号189；
FR2  配列番号190；
FR3  配列番号191；
FR4  配列番号192；
を含んでもよく、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸変化、例えば、置換を有する重鎖フレームワーク領域の前記セットを含んでもよい。
【０１２１】
本発明の抗体分子またはVLドメインは、軽鎖フレームワーク領域の以下のセット：
FR1  配列番号193；
FR2  配列番号194；
FR3  配列番号195；
FR4  配列番号196；
を含んでもよく、または1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸変化、例えば、置換を有する軽鎖フレームワーク領域の前記セットを含んでもよい。
【０１２２】
アミノ酸変化は、置換、挿入または欠失であってよい。必要に応じて、VH FR1中のKabatの残基Thr28、VH FR1中のKabatの残基Ser30および／またはVL FR2中のKabatの残基Phe49で変化を作製する。
【０１２３】
例えば、本発明の抗体分子は、重鎖および軽鎖フレームワーク領域のセットを含んでもよく、ここで、
重鎖FR1は配列番号189であり；
重鎖FR2は配列番号190であり；
重鎖FR3は配列番号191であり；
重鎖FR4は配列番号192であり；
軽鎖FR1は配列番号193であり；
軽鎖FR2は配列番号194であり；
軽鎖FR3は配列番号195であり；
軽鎖FR4は配列番号196であり；
または、10個以下、例えば、5個以下のアミノ酸変化、例えば、置換を有する重鎖および軽鎖フレームワーク領域の前記セットを含んでもよい。例えば、重鎖および軽鎖フレームワーク領域の前記セット中に1または2個のアミノ酸置換が存在してもよい。
【０１２４】
非生殖細胞系列化(non-germlined)抗体は、生殖細胞系列化(germlined)抗体と比較して、同じCDRであるが、異なるフレームワークを有する。
【０１２５】
本明細書に示される抗体配列のうち、抗体2、3、4、5、6、7、13、14および15のVHドメインは生殖細胞系列化されており、抗体1、8、9、10、11、12および16のVHドメインは生殖細胞系列化されておらず、抗体2および7のVLドメインは生殖細胞系列化されており、ならびに抗体1、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15および16のVLドメインは生殖細胞系列化されていない。
【０１２６】
本発明の結合メンバーは、IL-17への結合に関して、両方ともIL-17に結合し、本明細書に開示される結合メンバー、VHおよび／またはVLドメイン、CDR、例えば、HCDR3、および／またはCDRのセットを含む任意の結合メンバーと競合するものであってよい。結合メンバー間の競合を、例えば、ELISAを用いて、および／または1個以上の他の非タグ付結合メンバーの存在下で検出することができる1個の結合メンバーに特定の受容体分子をタグ付けして、同じエピトープもしくは重複するエピトープに結合する結合メンバーの同定を可能にすることにより、in vitroで容易にアッセイすることができる。例えば、IL-17をプレート上に固定し、1種以上の他のタグ付結合メンバーと共に最初にタグ付結合メンバーを該プレートに添加するELISAを用いて、競合を決定することができる。タグ付結合メンバーと競合する非タグ付結合メンバーの存在は、タグ付結合メンバーにより放出されるシグナルの低下により観察される。そのような方法は当業者には容易に公知であり、本明細書により詳細に記載されている。一実施形態においては、競合的結合を、本明細書に記載のエピトープ競合アッセイを用いてアッセイする。本発明の結合メンバーは、抗体分子、例えば、特に、VHおよび／もしくはVLドメイン、CDR、例えば、HCDR3または親抗体もしくは抗体1〜16のCDRのセットを含む抗体分子と、IL-17への結合に関して競合する、抗体の抗原結合部位を含んでもよい。本発明の態様は、本明細書に定義される任意の結合メンバーと、IL-17への結合に関して競合する、例えば、scFvまたはIgG1形式の親抗体または抗体2〜16のいずれかと競合する結合メンバーを提供する。IL-17への結合に関して、本明細書に定義される任意の結合メンバーと競合する結合メンバーは、本発明の結合メンバーに関して、本明細書に開示される任意の1個以上の構造的および／または機能的特性を有してもよい。
【０１２７】
さらなる態様においては、本発明は、本発明に従う結合メンバー、VHドメインおよび／またはVLドメインをコードする配列を含む単離された核酸、ならびに本発明の結合メンバー、VHドメインおよび／またはVLドメインを調製する方法であって、該結合メンバー、VHドメインおよび／またはVLドメインの産生をもたらす条件下で該核酸を発現させ、それを回収することを含む前記方法を提供する。
【０１２８】
本発明の別の態様は、本明細書に開示されるVH CDRまたはVL CDR配列をコードする、一般的には、単離された核酸を提供する。
【０１２９】
さらなる態様は、本発明の核酸を含むか、またはそれを用いて形質転換された宿主細胞を提供する。
【０１３０】
本発明のさらなる態様は、本発明の結合メンバーを含む組成物、ならびに療法によるヒトまたは動物体の治療方法を含む、IL-17を阻害および／または中和する方法におけるその使用を提供する。
【０１３１】
本発明に従う結合メンバーを、ヒト患者における疾患または障害の治療(予防的治療を含みうる)の方法などの、ヒトまたは動物体の治療または診断の方法であって、有効量の本発明の結合メンバーを該患者に投与することを含む前記方法において用いることができる。本発明に従って治療可能な病的状態としては、本明細書の他の場所に詳細に考察されるように、IL-17がその状態において役割を果たす任意のものが挙げられる。
【０１３２】
本発明のこれらの態様および他の態様を、以下でさらに詳細に説明する。
【０１３３】
用語
ここで、本明細書で用いられる場合、「および／または」は、他のものを含むか、または含まない、2つの特定の特徴または成分の各々の特定の開示として取られるべきであると指摘することが都合がよい。例えば、「Aおよび／またはB」は、ちょうどあたかも各々が本明細書に個々に説明されるように、(1)A、(ii)Bならびに(iii)AおよびBの各々の特定の開示として取られるべきである。
【０１３４】
IL-17
IL-17、またはIL-17Aは、インターロイキン-17である。IL-17に対する言及は通常、特に指摘しない限り、ヒトIL-17Aである。
【０１３５】
IL-17Aは、in vivoでは23アミノ酸のN末端シグナルペプチドと共に発現され、切断されて成熟IL-17Aを産生する。野生型成熟ヒトIL-17Aの配列は、配列番号198である。
【０１３６】
従来は、シグナルペプチドを含まない、成熟配列の残基番号に従ってIL-17中のアミノ酸残基を参照している。本明細書では、ヒトIL-17の残基番号は、特に指摘しない限り、配列番号198の成熟配列を参照する。成熟IL-17Aの残基1はGlyであり、それは完全長ポリペプチドの位置24にある。
【０１３７】
ヒトIL-17の配列は、シグナルペプチドを含む完全長前駆体IL-17Aを示す、受託番号Q16552(Swiss-Prot)の下で預託されている。
【０１３８】
カニクイザルIL-17の配列を、配列番号161によりコードされる、配列番号162として示す。
【０１３９】
本明細書の他の場所に記載されるように、IL-17Aは組換え体であってもよく、および／または糖鎖付加されていても、もしくは糖鎖付加されていなくてもよい。IL-17Aは、天然ではin vivoでN結合糖鎖付加型で発現される。また、糖鎖付加されたIL-17Aを、例えば、HEK EBNA細胞中、組換え系において発現させることもできる。IL-17Aを、大腸菌細胞中で、糖鎖付加されていない形態で発現させることができる。
【０１４０】
結合メンバー
これは、互いに結合する一対の分子の一方のメンバーを記載する。結合対のメンバーは天然由来であるか、または全体的もしくは部分的に合成的に産生されたものであってよい。分子対の一方のメンバーは、分子対の他方のメンバーの特定の空間的および極性組織化に結合し、従ってそれと相補的である、その表面上の領域、または空洞を有する。結合対の型の例は、抗原-抗体、ビオチン-アビジン、ホルモン-ホルモン受容体、受容体-リガンド、酵素-基質である。本発明は、抗原-抗体型反応に関する。
【０１４１】
結合メンバーは通常、抗原結合部位を有する分子を含む。例えば、結合メンバーは、抗体分子または抗原結合部位を含む非抗体タンパク質であってよい。
【０１４２】
フィブロネクチンもしくはシトクロムBなどの非抗体タンパク質骨格上のCDRの配置により(Haan & Maggos, 2004; Koide, 1998; Nygren, 1997)、または所望の標的に対して結合特異性を付与するタンパク質骨格内のループのアミノ酸残基を無作為化するか、もしくは突然変異させることにより、抗原結合部位を提供することができる。タンパク質中の新規結合部位を操作するための骨格は(scaffold)、Nygrenら(1997)により詳細に概説されている。抗体模倣物質のためのタンパク質骨格は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとするWO/0034784に開示されており、発明者らは、少なくとも1個の無作為化されたループを有するフィブロネクチン型IIIドメインを含むタンパク質(抗体模倣物質)を記載している。1個以上のCDR、例えば、HCDRのセットまたはHCDRおよび／もしくはLCDR3を移植するための好適な骨格を、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの任意のドメインメンバーにより提供することができる。この骨格はヒトまたは非ヒトタンパク質であってよい。非抗体タンパク質骨格の利点は、それが、少なくともいくつかの抗体分子よりも小さく、および／または製造するのが容易である骨格分子中に抗原結合部位を提供することができることである。小さいサイズの結合メンバーは、細胞に進入し、組織中に深く浸透するか、もしくは他の構造内の標的に到達するか、または該標的抗原のタンパク質空洞内に結合する能力などの有用な生理学的特性を付与することができる。非抗体タンパク質骨格中の抗原結合部位の使用は、Wess, 2004に概説されている。典型的なものは、安定な骨格および1個以上の可変ループを有するタンパク質であり、該ループのアミノ酸配列を特異的または無作為に突然変異させて、標的抗原に結合する抗原結合部位を作る。そのようなタンパク質としては、S. aureus由来のプロテインAのIgG結合ドメイン、トランスフェリン、テトラサイクリン、フィブロネクチン(例えば、10番目のフィブロネクチン型IIIドメイン)およびリポカリンが挙げられる。他の手法としては、シクロチド(分子内ジスルフィド結合を有する小タンパク質)に基づく合成「ミクロボディ」(Selecore GmbH)が挙げられる。
【０１４３】
抗体配列および／または抗原結合部位に加えて、本発明に従う結合メンバーは、例えば、折り畳まれたドメインなどのペプチドもしくはポリペプチドを形成するか、または抗原に結合する能力に加えて、該分子に別の機能的特性を与える他のアミノ酸を含んでもよい。本発明の結合メンバーは、検出可能な標識を担持してもよく、または毒素もしくは標的部分もしくは酵素に結合させることができる(例えば、ペプチジル結合もしくはリンカーを介して)。例えば、結合メンバーは、触媒部位(例えば、酵素ドメイン中)ならびに抗原結合部位を含んでもよく、ここで、該抗原結合部位は該抗原に結合し、かくして、該触媒部位を該抗原に対して標的化する。触媒部位は、例えば、切断により抗原の生物学的機能を阻害することができる。
【０１４４】
注記されるように、CDRを非抗体骨格により担持させることができるが、CDR、例えば、CDR3、または本発明のCDRのセットを担持させるための構造は、一般的には、CDRまたはCDRのセットが再配列された免疫グロブリン遺伝子によりコードされる天然のVHおよびVL抗体可変ドメインのCDRまたはCDRのセットに対応する位置に位置する抗体重鎖もしくは軽鎖配列またはその実質的な部分であろう。免疫グロブリン可変ドメインの構造および位置を、現在ではインターネット上で入手可能な(immuno.bme.nwu.eduで、もしくは任意の検索エンジンを用いて「Kabat」を検索)、Kabat 1987、およびそのアップデートを参照することにより決定することができる。
【０１４５】
CDR領域またはCDRとは、Kabatら(Kabat 1991a、およびその後の版)により定義された免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を示すと意図される。典型的には、抗体は3個の重鎖CDRと3個の軽鎖CDRを含む。用語「CDR」は、本明細書では、事例に従って、これらの領域の1つ、または抗体が認識する抗原もしくはエピトープに対する該抗体の親和性により結合を担うアミノ酸残基の大部分を含むこれらの領域のいくつか、もしくは全部をも示すように用いられる。
【０１４６】
6個の短いCDR配列のうち、重鎖の第3のCDR(HCDR3)は、より大きいサイズ可変性(それをもたらす遺伝子の配置機構に本質的に起因するより高い多様性)を有する。それは2アミノ酸の短さであってよいが、公知の最も長いサイズは26である。機能的には、HCDR3は、抗体の特異性の決定に部分的に役割を果たしている(Segal 1974; Amit 1986; Chothia 1987; Chothia 1989; Caton 1990; Sharon 1990a; Sharon 1990b; Kabatら、1991b)。
【０１４７】
HCDR1は、Kabatの残基31-35からなる、5アミノ酸長であってよい。HCDR2は、Kabatの残基50-65からなる、17アミノ酸長であってよい。HCDR3は、Kabatの残基95-102からなる、9アミノ酸長であってよい。LCDR1は、Kabatの残基24-34からなる、13アミノ酸長であってよい。LCDR2は、Kabatの残基50-56からなる、7アミノ酸長であってよい。LCDR3は、Kabatの残基89-97からなる、9アミノ酸長であってよい。
【０１４８】
抗体分子
これは、天然に産生されようと、部分的もしくは全体的に合成産生されようと、免疫グロブリンを説明するものである。この用語はまた、抗体の抗原結合部位を含む任意のポリペプチドまたはタンパク質にも及ぶ。本明細書では、本発明が天然形態の抗体に関連せず、すなわち、それらはその天然の環境中にないが、それらを天然の起源からの精製により単離もしくは取得するか、または他に遺伝子組換え、もしくは化学的合成により取得することができ、次いで、それらは後に記載されるであろう非天然アミノ酸を含んでもよいことが理解されるべきである。抗体の抗原結合部位を含む抗体フラグメントとしては、限定されるものではないが、Fab、Fab'、Fab'-SH、scFv、Fv、dAb、Fdなどの分子；およびダイアボディが挙げられる。
【０１４９】
本発明の抗体分子は、IgG、例えば、IgG1であってよい。
【０１５０】
モノクローナルおよび他の抗体を取り、組換えDNA技術の技術を用いて、標的抗原に結合する他の抗体またはキメラ分子を製造することができる。そのような技術は、抗体の免疫グロブリン可変領域、もしくはCDRをコードするDNAを、異なる免疫グロブリンの定常領域、もしくは定常領域＋フレームワーク領域を導入することを含んでもよい。例えば、EP-A-184187、GB 2188638AまたはEP-A-239400、および多くのその後の文献を参照されたい。抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞を、産生される抗体の結合特異性を変化させても、させなくてもよい遺伝子突然変異または他の変化にかけることができる。
【０１５１】
抗体をいくつかの方法で改変することができるため、用語「抗体分子」は、必要とされる特異性および／もしくは抗原への結合を有する抗体の抗原結合部位を有する任意の結合メンバーまたは物質に及ぶと解釈されるべきである。かくして、この用語は、天然であろうと、全体的もしくは部分的に合成であろうと、抗体の抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを含む抗体フラグメントおよび誘導体に及ぶ。従って、別のポリペプチド(例えば、別の種から誘導されるか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する)に融合された、抗体の抗原結合部位、または等価物を含むキメラ分子が含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、EP-A-0120694およびEP-A-0125023、ならびに多くのその後の文献に記載されている。
【０１５２】
抗体工学の分野で利用可能なさらなる技術により、ヒトおよびヒト化抗体を単離することができる。例えば、ヒトハイブリドーマを、Kontermann & Dubel (2001)により記載されたように作製することができる。結合メンバーを作製するための別の確立された技術であるファージ展示は、WO92/01047 (以下でさらに考察)および米国特許第5969108号、第5565332号、第5733743号、第5858657号、第5871907号、第5872215号、第5885793号、第5962255号、第6140471号、第6172197号、第6225447号、第6291650号、第6492160号、第6521404号、およびKontermann & Dubel (2001)などの多くの刊行物に詳細に記載されている。マウス免疫系の他の成分を無傷のままにしながら、マウス抗体遺伝子を不活化し、ヒト抗体と機能的に置換するトランスジェニックマウスを、ヒト抗体を単離するのに用いることができる(Mendez 1997)。
【０１５３】
例えば、Knappikら(2000)またはKrebsら(2001)により記載されたように、好適な発現ベクター内で合成および集合されたオリゴヌクレオチドにより作製された遺伝子からの発現により、合成抗体分子を作製することができる。
【０１５４】
全抗体のフラグメントは、結合抗原の機能を実行することができることが示されている。結合フラグメントの例は、(i)VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなるFabフラグメント；(ii)VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント；(iii)単一抗体のVLおよびVHドメインからなるFvフラグメント；(iv)VHもしくはVLドメインからなるdAbフラグメント(Ward 1989; McCafferty 1990; Holt 2003)；(v)単離されたCDR領域；(vi)2個の連結されたFabフラグメントを含む二価フラグメントであるF(ab')2フラグメント；(vii)VHドメインとVLドメインが、2個のドメインを結合させて、抗原結合部位を形成させるペプチドリンカーにより連結された、一本鎖Fv分子(scFv)(Bird 1988; Huston 1988)；(viii)二重特異性一本鎖Fvダイマー(PCT/US92/09965)ならびに(ix)遺伝子融合により構築された多価もしくは多特異的フラグメントである「ダイアボディ」(WO 94/13804; Holliger 1993a)である。Fv、scFvまたはダイアボディ分子を、VHおよびVLドメイン(Reiter 1996)を連結するジスルフィド架橋の組込みにより安定化させることができる。CH3ドメインに連結されたscFvを含むミニボディを作製することもできる(Hu 1996)。結合フラグメントの他の例は、抗体ヒンジ領域に由来する1個以上のシステインなどの、重鎖CH1ドメインのカルボキシル末端の数個の付加によりFabフラグメントと異なるFab'、ならびに定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を担持するFab'フラグメントであるFab'-SHである。
【０１５５】
本発明の抗体フラグメントを、本明細書に記載の抗体分子のいずれか、例えば、ペプシンもしくはパパインなどの酵素による消化および／または化学的還元によるジスルフィド架橋の切断などの方法による、抗体1〜16のいずれかのVHおよび／もしくはVLドメインまたはCDRを含む抗体分子から開始して取得することができる。別の様式では、本発明に含まれる抗体フラグメントを、同様に当業者にはよく知られた遺伝子組換えの技術によるか、または他に例えば、Applied Biosystemsなどの業者により供給されるものなどの自動ペプチド合成装置を用いるペプチド合成によるか、または核酸合成および発現により取得することができる。
【０１５６】
本発明に従う機能的抗体フラグメントは、化学的改変、特に、PEG化によるか、またはリポソーム中への組込みによりその半減期を増加させる任意の機能的フラグメントを含む。
【０１５７】
dAb(ドメイン抗体)は、抗体の小さいモノマー性抗原結合フラグメント、すなわち、抗体重鎖または軽鎖の可変領域である(Holt 2003)。VH dAbはラクダ科動物(例えば、ラクダ、ラマ)においては天然に生じ、標的抗原を用いてラクダ科動物を免疫し、抗原特異的B細胞を単離し、および個々のB細胞からdAb遺伝子を直接クローニングすることにより製造することができる。それらのサイズは小さく、可溶性および温度安定性は良好であるため、選択および親和性成熟にとって特に生理学的に有用かつ好適である。本発明の結合メンバーは、実質的に本明細書に記載のVHもしくはVLドメイン、または実質的に本明細書に記載のCDRのセットを含むVHもしくはVLドメインを含むdAbであってよい。
【０１５８】
本明細書で用いられる語句「実質的に記載の」とは、本明細書に記載の結合メンバーのVHまたはVLドメインの関連するCDRの特徴が、配列が本明細書に記載された特定の領域と同一であるか、または高度に類似するであろうことを指す。本明細書に記載のように、1個以上の可変ドメインの特定の領域に関する語句「高度に類似する」とは、1〜約5個、例えば、1〜4個、例えば、1〜3個、または1もしくは2個、または3もしくは4個のアミノ酸置換を、CDRおよび／またはVHもしくはVLドメイン中で作製することができることが意図される。
【０１５９】
二重特異性または二官能性抗体は、2個の異なる可変領域を同じ分子中で組み合わせる第2世代のモノクローナル抗体を形成する(Holliger 1999)。それらの使用は、新しいエフェクター機能を補充するか、またはいくつかの分子を腫瘍細胞の表面上に標的化するそれらの能力から、診断分野および治療分野の両方において証明されている。二重特異性抗体を用いる場合、これらは、様々な方法(Holliger 1993b)で製造、例えば、化学的に、もしくはハイブリッドハイブリドーマから調製することができる従来の二重特異性抗体であってよく、または上記の二重特異性抗体フラグメントのいずれかであってもよい。これらの抗体を、化学的方法(Glennie 1987; Repp 1995)または体細胞方法(Staerz 1986; Suresh 1986)により取得することができるが、同様に、ヘテロダイマー化を強制し、かくして求められる抗体の精製プロセスを容易にすることができる遺伝子工学技術(Merchand 1998)により取得することもできる。二重特異性抗体の例としては、異なる特異性を有する2種の抗体の結合ドメインを使用し、短い可撓性ペプチドを介して直接連結することができるBiTE(商標)技術のものが挙げられる。これは短い単一のポリペプチド鎖上で2個の抗体を組み合わせる。ダイアボディおよびscFvを、抗イディオタイプ反応の効果を潜在的に低下させる、可変ドメインのみを用いて、Fc領域を用いずに構築することができる。
【０１６０】
二重特異性抗体を、IgG全体として、二重特異性Fab'2として、Fab'PEGとして、ダイアボディとして、または他に二重特異性scFvとして構築することができる。さらに、2種の二重特異性抗体を、当業界で公知の日常的な方法を用いて連結して、四価抗体を形成することができる。
【０１６１】
二重特異性全抗体とは反対に、二重特異性ダイアボディはまた、それらを大腸菌中で容易に構築し、発現させることができるため、特に有用であり得る。好適な結合特異性のダイアボディ(および抗体フラグメントなどの多くの他のポリペプチド)を、ライブラリーからファージ展示(WO 94/13804)を用いて容易に選択することができる。ダイアボディの一方のアームを、例えば、IL-17に対する特異性と共に、一定に保持すべきであり、次いで、他方のアームを変化させたライブラリーを作製し、好適な特異性の抗体を選択することができる。二重特異性全抗体を、Ridgeway 1996に記載の代替的な遺伝子工学的方法により作製することができる。
【０１６２】
IL-17に対する抗体を取得するための様々な方法が当業界で利用可能である。この抗体は、特に、ヒト、マウス、キメラもしくはヒト化起源のモノクローナル抗体であってよく、当業者にはよく知られた標準的な方法に従って取得することができる。
【０１６３】
一般的には、特にマウス起源のモノクローナル抗体またはその機能的断片の調製について、マニュアル「抗体」(HarlowおよびLane 1988)中に具体的に記載された技術またはKohlerおよびMilstein, 1975により記載されたハイブリドーマからの調製の技術を指すことができる。
【０１６４】
例えば、IL-17、またはモノクローナル抗体により認識されるエピトープを含むそれらの断片の1つに対して免疫された動物細胞から、該モノクローナル抗体を取得することができる。特に、IL-17、またはその断片の1つを、通常の作業方法に従って、IL-17もしくはその断片をコードするcDNA配列中に含まれる核酸配列から出発する遺伝子組換えにより、IL-17および／もしくはその断片のペプチド配列中に含まれるアミノ酸の配列から出発するペプチド合成により製造することができる。例えば、IL-17またはモノクローナル抗体により認識されるエピトープを含むその断片の1つを予め固定させたアフィニティカラム上で、該モノクローナル抗体を精製することができる。より具体的には、モノクローナル抗体を、プロテインAおよび／もしくはプロテインG上でのクロマトグラフィー、次いで、それ自身中の、残留タンパク質夾雑物ならびにDNAおよびLPSを排除するためのイオン交換クロマトグラフィー(行わなくてもよい)、次いで、ダイマーまたは他のマルチマーの存在に起因する潜在的な凝集物を排除するためのセファロースゲル上での排除クロマトグラフィー(行わなくてもよい)により精製することができる。一実施形態においては、これらの技術の全部を、同時に、または連続的に用いることができる。
【０１６５】
抗原結合部位
これは、標的抗原の全部または一部に結合し、かつそれと相補的である分子の一部を記載するものである。抗体分子においては、それは抗体の抗原結合部位を指し、標的抗原の全部または一部に結合し、かつそれと相補的である抗体の一部を含む。抗原が大きい場合、抗体は、エピトープと呼ばれる抗原の特定の部分にしか結合することができない。抗体の抗原結合部位を、1個以上の抗体可変ドメインにより提供することができる。抗体の抗原結合部位は、抗体軽鎖可変領域(VL)および抗体重鎖可変領域(VH)を含んでもよい。
【０１６６】
単離された
これは、本発明の結合メンバー、またはそのような結合メンバーをコードする核酸が、一般的には本発明に従うであろう状態を指す。かくして、結合メンバー、VHおよび／もしくはVLドメイン、ならびに本発明に従うコード核酸分子およびベクターを、例えば、その天然の環境から、実質的に純粋もしくは均質な形態で、または核酸の場合、必要とされる機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の起源の核酸もしくは遺伝子を含まないか、もしくは実質的に含まない形態で単離および／もしくは精製して提供することができる。単離されたメンバーおよび単離された核酸は、他のポリペプチドなどと天然に結合しない材料またはその天然の環境、もしくはそのような調製がin vitroもしくはin vivoで実行される組換えDNA技術による場合、それらが調製される環境(例えば、細胞培養物)中で見出される核酸を含まないか、または実質的に含まないであろう。メンバーおよび核酸を、希釈剤またはアジュバントと共に製剤化し、さらに実用的な目的のために単離することができる。例えば、通常は該メンバーを、免疫アッセイにおける使用のためにマイクロタイタープレートをコーティングするのに用いる場合、ゼラチンもしくは他の担体と混合するか、または診断もしくは治療において用いる場合、製薬上許容し得る担体もしくは希釈剤と混合することができる。結合メンバーは、天然に、または異種真核細胞(例えば、CHOもしくはNS0細胞(ECACC 85110503))の系によって糖鎖付加されていてもよく、またはそれらは糖鎖付加されていなくてもよい(例えば、原核細胞中での発現により産生される場合)。
【０１６７】
抗IL-17抗体分子を含む異種調製物もまた本発明の一部を形成する。例えば、そのような調製物は、様々な程度の糖鎖および／またはピログルタミン酸残基を形成するN末端グルタミン酸の環状化などの誘導体化されたアミノ酸を含む、完全長重鎖およびC末端リジンを欠く重鎖を有する抗体の混合物であってよい。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】N末端タグ付ヒトIL-17Aアミノ酸配列(配列番号197)である。N末端タグ残基1〜21に下線を付す。成熟ヒトIL-17Aの残基71-87に対応する残基92-108を囲んである(配列番号199)。
【図２】C末端His5タグを有する完全長前駆体ヒトIL-17Aアミノ酸配列(配列番号200)である。23アミノ酸残基のN末端シグナルペプチドに下線を付す。野生型ヒトIL-17A(配列番号198)から突然変異した残基を囲み、下線を付してあり、囲みの中の配列、配列番号199は成熟ヒトIL-17Aの残基71-87に対応する。N末端ペプチドおよびHisタグを有さない、成熟ヒトIL-17A変異体は、配列番号201である。
【発明を実施するための形態】
【０１６９】
詳細な説明
上記のように、本発明に従う結合メンバーは、IL-17の生物学的活性を調節し、それを中和することができる。本明細書に記載のように、本発明のIL-17結合メンバーを、中和効力のために最適化することができる。一般的には、効力の最適化は、選択された結合メンバーの配列(通常は、抗体の可変ドメイン配列)を突然変異させて、結合メンバーのライブラリーを作製した後、効力についてアッセイし、より強力な結合メンバーを選択することを含む。かくして、選択された「効力が最適化された」結合メンバーは、ライブラリーを作製した結合メンバーよりも高い効力を有する傾向がある。にもかかわらず、高い効力の結合メンバーを、最適化を用いずに取得することもでき、例えば、高い効力の結合メンバーを、最初のスクリーニング、例えば、生化学的中和アッセイから直接取得することができる。「効力が最適化された」結合メンバーとは、IL-17の特定の活性または下流の機能の中和の最適化された効力を有する結合メンバーを指す。アッセイおよび効力は、本明細書の他の場所により詳細に記載されている。本発明は、効力が最適化された、および最適化されていない結合メンバーの両方、ならびに選択された結合メンバーからの効力最適化のための方法を提供する。かくして、本発明は、当業者が高い効力を有する結合メンバーの作製するのを可能にする。
【０１７０】
効力最適化を用いて、所与の結合メンバーからより高い効力の結合メンバーを作製することができるが、高い効力の結合メンバーを効力最適化を用いなくても取得することができることにも留意する。
【０１７１】
さらなる態様においては、本発明は、抗原に結合することができる1個以上の結合メンバーを取得する方法であって、本発明に従う結合メンバーのライブラリーと該抗原とを接触させ、該抗原に結合することができるライブラリーの1個以上の結合メンバーを選択することを含む、前記方法を提供する。
【０１７２】
ライブラリーを、例えば、酵母、細菌もしくはバクテリオファージ(例えば、T7)粒子、ウイルス、細胞もしくは共有結合、リボゾームもしくは他のin vitro展示系などの複製可能な遺伝子パッケージなどの粒子または分子複合体であって、各粒子または分子複合体が、その上に展示された抗体VH可変ドメイン、および必要に応じて、存在する場合は展示されたVLドメインをコードする核酸を含む、前記粒子または分子複合体上に展示させることができる。ファージ展示は、WO92/01047ならびに例えば、米国特許第5969108号、第5565332号、第5733743号、第5858657号、第5871907号、第5872215号、第5885793号、第5962255号、第6140471号、第6172197号、第6225447号、第6291650号、第6492160号および第6521404号(それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に記載されている。
【０１７３】
抗原に結合することができ、バクテリオファージもしくは他のライブラリー粒子もしくは分子複合体上で展示された結合メンバーの選択後、該選択された結合メンバーを展示するバクテリオファージもしくは他の粒子もしくは分子複合体から核酸を取得することができる。そのような核酸を、該選択された結合メンバーを展示するバクテリオファージもしくは他の粒子もしくは分子複合体から取得した核酸の配列を有する核酸からの発現による結合メンバーまたは抗体VHもしくはVL可変ドメインのその後の産生において用いることができる。
【０１７４】
前記選択された結合メンバーの抗体VH改変ドメインのアミノ酸配列を有する抗体VH可変ドメインは、そのようなVHドメインを含む結合メンバーであってよいため、それを単離された形態で提供することができる。
【０１７５】
IL-17に結合する能力、また、例えば、IL-17に対する結合に関して、親抗体分子または抗体分子1〜16(例えば、scFv形式および／またはIgG形式、例えば、IgG1中)と競合する能力をさらに試験することができる。本明細書の他の場所にさらに考察されるように、IL-17を中和する能力を試験することができる。
【０１７６】
本発明に従う結合メンバーは、例えば、scFvもしくはIgG1形式中、抗体1〜16のうちの1つの親和性で、またはより良好である親和性でIL-17に結合することができる。
【０１７７】
本発明に従う結合メンバーは、例えば、scFvもしくはIgG1形式中、抗体1〜16の1つの効力で、またはより良好である効力でIL-17の生物学的活性を中和することができる。
【０１７８】
異なる結合メンバーの結合親和性および中和効力を、好適な条件下で比較することができる。
【０１７９】
本明細書に開示される抗体分子の変異体を、本発明において製造および使用することができる。構造／特性活性関係(Wold 1984)に対する多変量データ分析技術の適用におけるコンピューター化学の先導後、抗体の定量活性特性関係を、統計的回帰、パターン認識および分類(Norman 1998; Kandel & Backer 1995; Krzanowski 2000; Witten & Frank 1999; Denison(編) 2002; Ghose & Viswanadhan)などのよく知られた数学的技術を用いて誘導することができる。抗体の特性を、抗体配列、機能的および3次元構造の経験的および理論的モデル(例えば、接触残基の可能性または算出された物理化学的特性の分析)から誘導し、これらの特性を単独で、および組み合わせて考慮することができる。
【０１８０】
VHドメインおよびVLドメインから構成される、抗体の抗原結合部位は、典型的には、6個のループのポリペプチド(3個は軽鎖可変ドメイン(VL)に由来し、3個は重鎖可変ドメイン(VH)に由来する)により形成される。公知の原子構造の抗体の分析により、配列と抗体結合部位の3次元構造との間の関係が解明された(Chothia 1992; Al-Lazikani 1997)。これらの関係は、VHドメイン中の第3の領域(ループ)を除いて、結合部位ループが少数の主鎖コンフォメーション：標準構造の1つを有することを示唆している。特定のループ中で形成された標準構造が、そのサイズならびにループおよびフレームワーク領域の両方における重要部位での特定の残基の存在により決定されることが示された(Chothia 1992; Al-Lazikani 1997)。
【０１８１】
配列構造関係のこの試験を、そのCDRループの3次元構造を維持するのに重要であり、従って、結合特異性を維持する、公知の配列であるが、未知の3次元構造の抗体中の残基の予測に用いることができる。これらの予測を、該予測とリード最適化実験からの出力との比較により戻すことができる。構造的手法においては、任意の自由に利用可能であるか、またはWAMなどの市販のパッケージ(Whitelegg & Rees 2000)を用いて、抗体分子(Chothia 1986)から作製することができる。次いで、Insight II (Accelerys, Inc.)またはDeep View (Guex & Peitsch 1997)などのタンパク質可視化および分析ソフトウェアパッケージを用いて、CDR中のそれぞれの位置の可能な置換を評価することができる。次いで、この情報を用いて、活性に対する最少の効果または有益な効果を有する可能性がある置換を作製することができる。
【０１８２】
CDR、抗体VHもしくはVLドメインおよび結合メンバーのアミノ酸配列内に置換を作製するのに必要な技術は、当業界で一般的に利用可能である。活性に対する最少の効果もしくは有益な効果を有することが予測されてもよい置換を有する変異配列を作製し、IL-17に結合し、および／もしくはこれを中和する能力について、ならびに／または任意の他の所望の特性について試験することができる。
【０１８３】
配列が本明細書に具体的に開示されたVHおよびVLドメインのいずれかの可変ドメインアミノ酸配列変異体を、考察されるように本発明に従って用いることができる。特定の変異体は、1個以上のアミノ酸配列変化(アミノ酸残基の付加、欠失、置換および／もしくは挿入)を含んでもよく、約20個未満の変化、約15個未満の変化、約10個未満の変化、約5個未満の変化、おそらく5、4、3、2または1個の変化であってもよい。変化を、1個以上のフレームワーク領域および／または1個以上のCDR中で作製することができる。通常、この変化は、機能の喪失をもたらさず、従ってこのように変化したアミノ酸配列を含む結合メンバーはIL-17に結合し、および／またはそれを中和する能力を保持することができる。例えば、それは、例えば、本明細書に記載のアッセイにおいて測定されるように、変化を作製しない結合メンバーと同じ定量的結合および／または中和能力を保持することができる。このように変化したアミノ酸配列を含む結合メンバーは、IL-17に結合し、および／またはそれを中和する改善された能力を有してもよい。
【０１８４】
変化は、1個以上のアミノ酸残基を、非天然の、もしくは非標準的なアミノ酸と置換すること、1個以上のアミノ酸残基を非天然の、もしくは非標準的な形態に改変すること、または1個以上の非天然の、もしくは非標準的なアミノ酸を前記配列中に挿入することを含んでもよい。本発明の配列中の変化の数および位置の例を、本明細書の他の場所に記載する。天然アミノ酸としては、その標準的な1文字コードにより、G、A、V、L、I、M、P、F、W、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D、Eとして同定された20種の「標準的な」L-アミノ酸が挙げられる。非標準アミノ酸としては、ポリペプチド主鎖に組み入れることができるか、または存在するアミノ酸残基の改変から得られる任意の他の残基が挙げられる。非標準アミノ酸は、天然または非天然のものであってよい。4-ヒドロキシプロリン、5-ヒドロキシリジン、3-メチルヒスチジン、N-アセチルセリンなど(Voet & Voet 1995)のいくつかの天然の非標準アミノ酸は当業界で公知である。そのN-α位置で誘導体化されたアミノ酸残基のみを、アミノ酸配列のN末端に配置することができる。通常、本発明においては、アミノ酸はL-アミノ酸であるが、いくつかの実施形態においては、それはD-アミノ酸であってもよい。従って、変化は、L-アミノ酸を、D-アミノ酸に改変するか、またはL-アミノ酸をD-アミノ酸と置換することを含んでもよい。アミノ酸のメチル化、アセチル化および／またはリン酸化された形態も公知であり、本発明におけるアミノ酸をそのような改変にかけることができる。
【０１８５】
本発明の抗体ドメインおよび結合メンバー中のアミノ酸配列は、上記の非天然または非標準アミノ酸を含んでもよい。いくつかの実施形態においては、非標準アミノ酸(例えば、D-アミノ酸)を、合成の間にアミノ酸配列中に組み込むことができるが、他の実施形態においては、非標準アミノ酸を、アミノ酸配列の合成後に「元の」標準アミノ酸の改変または置換により導入することができる。
【０１８６】
非標準および／または非天然アミノ酸の使用は、構造的および機能的多様性を増加させ、かくして、本発明の結合メンバーにおける所望のIL-17結合および中和特性を達成する潜在能力を増加させることができる。さらに、D-アミノ酸および類似体は、動物、例えば、ヒトへの投与後に、L-アミノ酸を有するポリペプチドのin vivoでの分解に起因して、標準的なL-アミノ酸と比較して、より良好な薬物動態プロフィールを有することが示された。
【０１８７】
本発明のCDR由来配列を担持する新規VHまたはVL領域を、可変ドメイン全体内に突然変異を作製する1個以上の選択されたVHおよび／またはVL遺伝子の無作為突然変異誘発を用いて作製することができる。そのような技術は、変異性PCRを用いたGramら(1992)により記載されている。いくつかの実施形態においては、1または2個のアミノ酸置換を、可変ドメイン全体またはCDRのセット内で作製する。用いることができる別の方法は、VHまたはVL遺伝子のCDR領域に対する直接的突然変異誘発である。そのような技術は、Barbasら(1994)およびSchierら(1996)に開示されている。
【０１８８】
上記技術は全て、当業界ではそのようなものとして公知であり、当業者であれば、そのような技術を用いて、当業界で日常的な方法を用いて本発明の結合メンバーを提供することができるであろう。
【０１８９】
本発明のさらなる態様は、IL-17の、抗体の抗原結合部位を取得する方法であって、本明細書に記載のVHドメインのアミノ酸配列中の1個以上のアミノ酸の付加、欠失、置換または挿入により、VHドメインのアミノ酸配列変異体であるVHドメインを提供し、必要に応じて、かくして提供されたVHドメインを、1個以上のVLドメインと組合せて、VHドメインおよび／またはVH/VLの組合せを試験して、IL-17に対する、および必要に応じて、1個以上の機能的特性、例えば、IL-17活性を中和する能力を有する、結合メンバーまたは抗体の抗原結合部位を同定することを含む、前記方法を提供する。前記VLドメインは、実質的に本明細書に記載されたアミノ酸配列を有してもよい。本明細書に開示されるVLドメインの1個以上の配列変異体を、1個以上のVHドメインと組み合わせる類似方法を用いることもできる。
【０１９０】
上記のように、実質的に本明細書に記載のCDRアミノ酸配列を、ヒト抗体可変ドメインまたはその実質的な部分中にCDRとして担持させることができる。実質的に本明細書に記載のHCDR3配列は、本発明の実施形態であり、例えば、これらはそれぞれ、ヒト重鎖可変ドメインまたはその実質的な部分中にHCDR3として担持させることができる。
【０１９１】
本発明において用いられる可変ドメインを、任意の生殖線もしくは再配置されたヒト可変ドメインから取得もしくは誘導することができるか、またはそれらは公知のヒト可変ドメインの共通もしくは実際の配列に基づく合成可変ドメインであってよい。可変ドメインを、非ヒト抗体から誘導することができる。本発明のCDR配列(例えば、CDR3)を、組換えDNA技術を用いて、CDR(例えば、CDR3)を欠く可変ドメインのレパートリー中に導入することができる。例えば、Marksら(1992)は、可変ドメインの5'末端に対するか、もしくはそれに隣接する共通プライマーを、ヒトVH遺伝子の第3フレームワーク領域に対する共通プライマーと共に用いて、CDR3を欠くVH可変ドメインのレパートリーを提供する抗体可変ドメインのレパートリーを製造する方法を記載している。Marksらはさらに、このレパートリーを特定の抗体のCDR3と組み合わせることができる方法を記載している。類似する技術を用いて、本発明のCDR3由来配列を、CDR3を欠くVHもしくはVLドメインのレパートリーと共にシャッフルし、シャッフルされた完全なVHもしくはVLドメインを、同族のVLもしくはVHドメインと混合して、本発明の結合メンバーを提供することができる。次いで、このレパートリーを、好適な結合メンバーを選択することができるように、WO 92/01047(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)またはKay, Winter & McCaferty (1986)などのその後の多くの文献のいずれかに記載のファージ展示系などの好適な宿主系中で展示させることができる。レパートリーは、104個以上のメンバー、例えば、少なくとも105、少なくとも106、少なくとも107、少なくとも108、少なくとも109または少なくとも1010個のメンバーに由来するいずれかからなっていてもよい。他の好適な宿主系としては、限定されるものではないが、酵母展示(display)、細菌展示、T7展示、ウイルス展示、細胞展示、リボゾーム展示および共有展示が挙げられる。
【０１９２】
類似するシャッフリングまたは組合せ技術も、β-ラクタマーゼ遺伝子に関する技術を記載しているが、該手法を抗体の生成に用いることができることを観察したStemmer (1994)により開示されている。
【０１９３】
IL-17抗原に対する結合メンバーを調製する方法であって、
(a)置換しようとするCDR3を含むか、もしくはCDR3コード領域を欠くVHドメインをコードする核酸の出発レパートリーを提供すること；
(b)該レパートリーを、VH CDR3について実質的に本明細書に記載のアミノ酸配列をコードするドナー核酸と混合して、該ドナー核酸を該レパートリー中のCDR3に挿入して、VHドメインをコードする核酸の生成物レパートリーを提供すること；
(c)該生成物レパートリーの核酸を発現させること；
(d)IL-17に対する結合メンバーを選択すること；ならびに
(e)該結合メンバーまたはそれをコードする核酸を回収すること、
を含む前記方法が提供される。
【０１９４】
再度、本発明のVL CDR3を、置換しようとするCDRを含むか、またはCDR3コード領域を欠くVLドメインをコードする核酸のレパートリーと組み合わせる類似方法を用いることができる。
【０１９５】
同様に、1個以上、または全部で3個のCDRを、VHまたはVLドメインのレパートリー中に移植した後、IL-17に対する結合メンバーについてスクリーニングすることができる。
【０１９６】
一実施形態においては、1個以上の親、もしくは抗体2〜16のHCDR1、HCDR2およびHCDR3、または親もしくは抗体2〜16のセットのHCDRを用い、ならびに／または1個以上の親もしくは抗体2〜16のLCDR1、LCDR2およびLCDR3または親もしくは抗体2〜16のセットのLCDRを用いることができる。
【０１９７】
同様に、本明細書に開示される他のVHおよびVLドメイン、CDRのセットならびにHCDRのセットおよび／またはLCDRのセットを用いることができる。
【０１９８】
いくつかの実施形態においては、免疫グロブリン可変ドメインの実質的な部分は、その介在フレームワーク領域と一緒に、少なくとも3個のCDR領域を含むであろう。この部分はまた、第1および第4のフレームワーク領域のいずれかもしくは両方の少なくとも約50％を含んでもよく、その50％は第1のフレームワーク領域のC末端の50％であり、第4のフレームワーク領域のN末端の50％である。可変ドメインの実質的な部分のN末端またはC末端のさらなる残基は、通常は天然の可変ドメイン領域と結合しないものであってよい。例えば、組換えDNA技術により作製される本発明の結合メンバーの構築物は、クローニングまたは他の操作工程を容易にするために導入されるリンカーによりコードされるNまたはC末端残基の導入をもたらし得る。他の操作工程としては、本発明の可変ドメインを、抗体定常領域、他の可変ドメイン(例えば、ダイアボディの製造における)または本明細書の他の場所により詳細に考察される検出可能／機能的な標識などのさらなるタンパク質配列に結合させるためのリンカーの導入が挙げられる。
【０１９９】
本発明のいくつかの態様においては、結合メンバーは一対のVHおよびVLドメインを含むが、VHまたはVLドメイン配列のいずれかに基づく単一の結合ドメインは本発明のさらなる態様を形成する。単一の免疫グロブリンドメイン、特に、VHドメインは、特異的な様式で標的抗原に結合することができることが知られている。例えば、上記のdAbの考察を参照されたい。
【０２００】
いずれかの単一の結合ドメインの場合、これらのドメインを用いて、IL-17に結合することができる2ドメイン結合メンバーを形成することができる相補ドメインについてスクリーニングすることができる。HもしくはL鎖クローンのいずれかを含む個々のコロニーを用いて、他方の鎖(LもしくはH)をコードするクローンの完全なライブラリーを感染させ、得られる2鎖結合メンバーを、その参考文献に記載のものなどのファージ展示技術に従って選択する、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとするWO92/01047に開示されたいわゆる階層的二重コンビナトリアル手法を用いるファージ展示スクリーニング方法により、これを達成することができる。この技術も、Marks 1992に開示されている。
【０２０１】
本発明の結合メンバーは、抗体定常領域またはその一部、例えば、ヒト抗体定常領域またはその一部をさらに含んでもよい。例えば、VLドメインを、そのC末端で、ヒトCκまたはCλ鎖、例えば、Cλ鎖などの抗体軽鎖定常ドメインに結合させることができる。同様に、VHドメインに基づく結合メンバーを、そのC末端で、任意の抗体アイソタイプ、例えば、IgG、IgA、IgEおよびIgMならびに任意のアイソタイプサブクラス、特に、IgG1およびIgG4から誘導された免疫グロブリン重鎖の全部または一部(例えば、CH1ドメイン)に結合させることができる。IgG1は、そのエフェクター機能および製造の容易性のため、有利である。これらの特性を有し、可変領域を安定させる任意の合成または他の定常領域変異体もまた、本発明の実施形態において有用である。
【０２０２】
本発明の結合メンバーを、検出可能な標識または機能的な標識を用いて標識することができる。標識は、限定されるものではないが、蛍光物質、放射標識、酵素、化学発光物質もしくは光増感剤などのシグナルを産生するか、またはシグナルを産生するように誘導することができる任意の分子であってよい。かくして、結合を、蛍光もしくは発光、放射活性、酵素活性または吸光度を検出することにより検出および／または測定することができる。
【０２０３】
好適な標識としては、限定されるものではないが、例えば、染料、触媒または他の検出可能な基でさらに標識することができる、アルカリホスファターゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(「G6PDH」)および西洋わさびペルオキシダーゼなどの酵素；染料；フルオレセイン、ローダミン化合物、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルアルデヒド、フルオレスカミン、ランタニドクリプターゼおよびキレートなどのフルオロフォア(Perkin ElmerおよびCis Biointernational)などの蛍光物質；イソルミノールなどの化学発光物質；感光剤；コエンザイム；酵素基質；限定されるものではないが、125I、131I、35S、32P、14C、3H、57Co、99Tcおよび75Seなどの放射標識ならびに本明細書に記載の他の放射標識；ラテックスまたはカーボン粒子などの粒子；金属ゾル；晶子；リポソーム；細胞などが挙げられる。好適な酵素およびコエンザイムは、Litmanら、米国特許第4,275,149号、およびBoguslaskiら、米国特許第4,318,980号(それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする)に開示されている。好適な蛍光物質および化学発光物質は、Litmanら、米国特許第4,275,149号(参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする)に開示されている。標識としては、特異的同族検出可能部分への結合を介して検出することができるビオチンなどの化学部分、例えば、標識されたアビジンまたはストレプトアビジンがさらに挙げられる。検出可能な標識を、当業界で公知の従来の化学を用いて本発明の抗体に結合させることができる。
【０２０４】
前記標識が、例えば、視覚検査、電磁気照射、熱、および化学試薬による外部手段により検出可能なシグナルを生成することができる多くの方法が存在する。この標識を、本発明の抗体に結合する別の結合メンバー、または支持体に結合させることもできる。
【０２０５】
前記標識はシグナルを直接生成することができ、従って、シグナルを生成させるのに追加成分は必要ない。多くの有機分子、例えば、蛍光物質は、紫外線および可視光線を吸収することができ、光吸収はエネルギーをこれらの分子に転移させ、それらを励起エネルギー状態に上昇させる。次いで、この吸収されたエネルギーは、第2の波長の光の放出により消散する。また、この第2の波長放出はエネルギーを標識されたアクセプター分子に転移させ、得られるエネルギーを、光、例えば、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)の放出により、該アクセプター分子から消散させることができる。シグナルを直接生成する他の標識としては、放射活性アイソトープおよび染料が挙げられる。
【０２０６】
あるいは、標識は、シグナルを生成する他の成分を必要とし、次いで、シグナル産生系は、基質、コエンザイム、エンハンサー、さらなる酵素、酵素産物と反応する物質、触媒、アクチベーター、コファクター、阻害剤、スカベンジャー、金属イオン、およびシグナル生成物質の結合にとって必要な特異的結合物質などの測定可能なシグナルを生成するのに必要な全ての成分を含む。好適なシグナル産生系の詳細な考察を、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとするUllmanら、米国特許第5,185,243号に見出すことができる。
【０２０７】
結合メンバー、抗体、またはその機能的断片の1つは、検出可能および／または定量可能なシグナルを取得するように、イムノコンジュゲートの形態で存在してもよい。このイムノコンジュゲートを、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、α-D-ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ライソザイム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼもしくはグルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼなどの酵素を用いて、またはビオチン、ジゴキシゲニンもしくは5-ブロモデオキシウリジンなどの分子によりコンジュゲートさせることができる。同様に、蛍光標識をイムノコンジュゲートまたは本発明に従うその機能的断片にコンジュゲートさせることができ、特に、フルオレセインおよびその誘導体、蛍光色素、ローダミンおよびその誘導体、GFP(「緑色蛍光タンパク質」)、ダンシル、ウンベリフェロン、ランタニドキレートまたはクリプタート、例えば、ユーロピウムなどが挙げられる。イムノコンジュゲートまたはその機能的断片を、当業者には公知の方法により調製することができる。それらを、酵素に、もしくは蛍光標識に直接的に、またはスペーサー基もしくはポリアルデヒド、同様のグルタルアルデヒド、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ジエチレン-トリアミン五酢酸(DPTA)などの連結基の中間体により、または治療用コンジュゲートについて上記されたものなどのカップリング剤の存在下で結合させることができる。フルオレセイン型の標識を含むコンジュゲートを、イソチオシアネートとの反応により調製することができる。同様に、他のイムノコンジュゲートとしては、ルミノールおよびジオキセタンなどの化学発光標識、ルシフェラーゼおよびルシフェリンなどの生物発光標識、またはヨウ素123、ヨウ素125、ヨウ素126、ヨウ素131、ヨウ素133、臭素77、テクネチウム99m、インジウム111、インジウム113m、ガリウム67、ガリウム68、硫黄35、リン32、炭素14、トリチウム(水素3)、コバルト57、セレン75、ルテニウム95、ルテニウム97、ルテニウム103、ルテニウム105、水銀107、水銀203、レニウム99m、レニウム101、レニウム105、スカンジウム47、テルル121m、テルル122m、テルル125m、ツリウム165、ツリウム167、ツリウム168、フッ素8、イットリウム199などの他の放射活性標識が挙げられる。治療用放射性アイソトープを抗体に直接または上記のEDTA、DTPAなどのキレート化剤を介して結合させるために存在する当業者には公知の方法を、診断において用いることができる放射性元素のために用いることができる。同様に、クロラミンT法(HunterおよびGreenwood 1962)によるNa[I 125]を用いる標識もしくは他にCrockfordら(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする米国特許第4,424,200号)の技術によるテクネチウム99mを用いる標識に言及するか、またはHnatowich(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする米国特許第4,479,930号)により記載されたDTPAを介して結合させることができる。さらなるイムノコンジュゲートとしては、例えば、シュードモナス外毒素(PEまたはその細胞傷害性断片もしくは突然変異体)、ジフテリア毒素またはその細胞傷害性断片もしくは突然変異体、ボツリヌス毒素A〜F、リシンまたはその細胞傷害性断片、アブリンまた��その細胞傷害性断片、サポニンまたはその細胞傷害性断片、ヤマゴボウ抗ウイルス毒素またはその細胞傷害性断片ならびにブリオジン1またはその細胞傷害性断片が挙げられる。
【０２０８】
本発明は、IL-17に対する本明細書に提供される結合メンバーの結合を引き起こすか、または可能にすることを含む方法を提供する。記載されるように、そのような結合は、例えば、結合メンバー、もしくは結合メンバーをコードする核酸の投与後に、in vivoで起こってもよく、またはそれは、例えば、ELISA、ウェスタンブロッティング、免疫細胞化学、免疫沈降、アフィニティクロマトグラフィー、および本明細書に記載されるものなどの生化学または細胞に基づくアッセイにおいて、in vitroで起こってもよい。本発明はまた、例えば、バイオセンサー系において本発明に従う結合メンバーを用いることにより、抗原のレベルを直接測定することを提供する。
【０２０９】
例えば、本発明は、IL-17への結合を検出および／または測定する方法であって、(i)IL-17に該結合メンバーを曝露すること、および(ii)IL-17に対する該結合メンバーの結合を検出することを含み、本明細書に記載の任意の方法または検出可能な標識を用いて結合を検出する、前記方法を含む。この方法、および本明細書に記載の任意の他の結合検出方法を、例えば、検出可能な標識を視覚的に観察することにより、該方法を実施する当業者により直接解釈することができる。あるいは、この方法、または本明細書に記載の任意の他の結合検出方法は、オートラジオグラフ、写真、コンピューター印刷物、フローサイトメトリー報告、グラフ、チャート、試験管もしくは容器もしくは結果を含むウェルの形態の報告、または該方法の結果の任意の他の視覚的もしくは物理的表示をもたらしてもよい。
【０２１０】
IL-17への結合メンバーの結合量を決定することができる。定量化は、診断目的のものであってよい、試験サンプル中の抗原の量に関連するものであってよい。IL-17結合および／またはその定量化のためのスクリーニングは、例えば、本明細書の他の場所で言及されるものなどの、IL-17と関連する疾患または障害に関する患者のスクリーニングにおいて有用であってよい。一実施形態においては、特に、本発明の診断方法は、(i)被験体から組織もしくは液体サンプルを取得すること、(ii)該組織もしくは液体サンプルを、本発明の1個以上の結合メンバーに曝露すること；ならびに(iii)対照サンプルと比較した結合したIL-17を検出することを含み、ここで、対照と比較したIL-17結合の量の増加は、異常なレベルのIL-17発現もしくは活性を示唆し得る。試験しようとする組織または液体サンプルとしては、血液、血清、尿、生検材料、腫瘍、または異常なIL-17レベルを含むと疑われる任意の組織が挙げられる。また、異常なIL-17レベルまたは活性について陽性であると試験する被験体は、本明細書の後の部分に開示される治療方法から利益を得ることができる。
【０２１１】
当業者であれば、本明細書に開示された方法に照らして、その好みおよび一般的な知識に従って、抗原に対する結合メンバーの結合を決定する好適な様式を選択することができる。
【０２１２】
サンプル中の結合メンバーの反応性を、任意の好適な手段により決定することができる。ラジオイムノアッセイ(RIA)は1つの可能性である。放射活性標識された抗原を、非標識抗原(試験サンプル)と混合し、結合メンバーに結合させることができる。結合した抗原を、未結合の抗原から物理的に分離し、該結合メンバーに結合した放射活性抗原の量を決定する。試験サンプル中に存在する抗原が多いほど、該結合メンバーに結合する放射活性抗原は少なくなるであろう。競合的結合アッセイを、抗原またはリポーター分子に連結された類似体を用いて、非放射活性抗原と共に用いることができる。リポーター分子は、分光的に単離された吸収または放出特性を有する蛍光色素、蛍光体または色素レーザーであってよい。好適な蛍光色素としては、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、テキサスレッド、およびランタニドキレートもしくはクリプタートが挙げられる。好適な色素としては、ジアミノベンジジンが挙げられる。
【０２１３】
他のリポーターとしては、大分子コロイド粒子または着色されたラテックスビーズなどの粒子状材料、視覚的に観察され、電気的に検出されるか、またはさもなければ記録される検出可能なシグナルを直接的または間接的に引き起こすことができる、磁性または常磁性、および生物学的または化学的に活性な薬剤が挙げられる。これらの分子は、例えば、色を生じるか、もしくはそれを変化させるか、または電気特性の変化を引き起こす反応を触媒する酵素であってよい。それらは、エネルギー状態間の電子遷移が、特徴的なスペクトル吸収または放出をもたらすように、分子的に励起可能であってよい。それらは、バイオセンサーと共に用いられる化学物質を含んでもよい。ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジンおよびアルカリホスファターゼ検出系を用いることができる。
【０２１４】
個々の結合メンバー-リポーターコンジュゲートにより生成されたシグナルを用いて、サンプル(正常および試験)中の関連する結合メンバーの結合に関する定量可能な絶対または相対データを誘導することができる。
【０２１５】
本発明の任意の態様または実施形態に従う結合メンバーを含むキットも、本発明の態様として提供される。このキットにおいては、結合メンバーを標識して、サンプル中のその反応性を、例えば、以下にさらに記載するように決定することができる。さらなる結合メンバーを、固相支持体に結合させても、させなくてもよい。キットの成分は、一般的には滅菌されており、密閉されたバイアルまたは他の容器中にある。キットを診断分析または結合メンバーが有用である他の方法において用いることができる。キットは、方法、例えば、本発明に従う方法における成分の使用のための説明書を含んでもよい。そのような方法の実施を助けるか、またはそれを可能にする補助材料を、本発明のキット内に含有させることができる。補助材料としては、第1の結合メンバーに結合し、検出可能な標識(例えば、蛍光標識、放射活性アイソトープまたは酵素)に結合させた第2の異なる結合メンバーが挙げられる。抗体に基づくキットはまた、免疫沈降を行うためのビーズを含んでもよい。該キットの各成分は、一般的にはそれ自身にとって好適な容器中にある。かくして、これらのキットは、一般的には、各結合メンバーにとって好適な異なる容器を含む。さらに、該キットは、アッセイを実施するための説明書およびアッセイの実施から得られるデータを解釈および分析するための方法を含んでもよい。
【０２１６】
本発明はまた、競合アッセイにおける抗原レベルを測定するための上記の結合メンバーの使用、すなわち、競合アッセイにおいて本発明により提供される結合メンバーを用いることによって、サンプル中の抗原のレベルを測定する方法を提供する。これは、未結合の抗原からの結合した抗原の物理的分離が必要である場合であってよい。物理的または光学的変化が結合の際に起こるように該結合メンバーにリポーター分子を連結することは、1つの可能性である。リポーター分子は、定量可能であってよい、検出可能なシグナルを直接的または間接的に生成してもよい。リポーター分子の連結は、直接的または間接的、共有結合的、例えば、ペプチド結合を介するか、または非共有結合的であってよい。ペプチド結合を介する連結は、抗体およびリポーター分子をコードする遺伝子融合物の組換え発現の結果であってもよい。
【０２１７】
例えば、本発明は、IL-17に結合する化合物を同定する方法であって、(i)支持体にIL-17を固定すること、(ii)該固定されたIL-17を、同時に、または段階的な様式で、少なくとも1種のタグ付けられた、もしくは標識された本発明に従う結合メンバーと接触させること、および(iii)結合したタグの量の減少を観察することにより、タグ付結合メンバーから新しいIL-17結合化合物を同定することを含む、前記方法を含む。
【０２１８】
IL-17結合化合物を同定する代替的な方法は、(i)結合メンバーを支持体に固定すること、(ii)該固定された結合メンバーを、同時に、または段階的な様式で、タグ付けされたIL-17および1種以上の非タグ付もしくは非標識試験結合メンバーもしくは結合化合物と接触させること、(iii)結合したタグの量の減少を観察することにより、タグ付けされたIL-17から新しいIL-17結合化合物を同定することを含む、前記方法を含んでもよい。
【０２１９】
そのような方法を、複数ウェルまたはアレイ形式を用いて高効率な様式で実施することができる。また、そのようなアッセイを、例えば、実施例2に記載のHTRF(登録商標)アッセイとしての溶液中で実施することもできる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする、米国特許第5,814,468号を参照されたい。上記のように、結合の検出を、該方法を実施する当業者により、例えば、検出可能な標識、またはその存在の減少を視覚的に観察することにより直接的に解釈することができる。あるいは、本発明の結合方法は、オートラジオグラフ、写真、コンピューター印刷物、フローサイトメトリー報告、グラフ、チャート、結果を含む試験管もしくは容器もしくはウェルの形態の報告、または該方法の結果の任意の他の視覚的もしくは物理的表示をもたらしてもよい。
【０２２０】
また、競合アッセイを、エピトープマッピングにおいて用いることができる。一例においては、エピトープマッピングを用いて、必要に応じて、最適化された中和および／または調節特性を有してもよいIL-17結合メンバーにより結合したエピトープを同定することができる。そのようなエピトープは、線状または立体的であってよい。立体的エピトープは、IL-17がその三次もしくは四次構造中に折り畳まれて、IL-17結合メンバーなどのIL-17の阻害剤により認識される立体的エピトープを形成する場合、互いに近くに位置する、IL-17の少なくとも2種の異なる断片を含んでもよい。競合について試験する際に、前記抗原のペプチド断片、特に、本質的に目的のエピトープを含むか、またはそれからなるペプチドを用いることができる。前記エピトープ配列と、いずれかの末端の1個以上のアミノ酸を有するペプチドを用いることができる。本発明に従う結合メンバーは、抗原に対するそのような結合は、所与の配列を有するか、またはそれを含むペプチドにより阻害されるようなものであってよい。
【０２２１】
本発明はさらに、本発明の結合メンバーをコードする単離された核酸を提供する。核酸は、DNAおよび／またはRNAを含んでもよい。一態様においては、本発明は、上記に定義された本発明のCDRもしくはCDRのセットまたはVHドメインもしくはVLドメインまたは抗体の抗原結合部位もしくは抗体分子、例えば、scFvもしくはIgG、例えば、IgG1をコードする核酸を提供する。
【０２２２】
本発明はまた、上記の少なくとも1個のポリヌクレオチドを含む、プラスミド、ベクター、転写物または発現カセットの形態の構築物を提供する。
【０２２３】
本発明はまた、上記の1個以上の構築物を含む組換え宿主細胞を提供する。提供された任意のCDRもしくはCDRのセットまたはVHドメインもしくはVLドメインまたは抗体の抗原結合部位もしくは抗体分子、例えば、scFvもしくはIgG1は、それ自身、本発明の一態様を形成し、コード核酸からの発現を含む、コードされた産物の製造の方法も同様である。好適な条件下で、前記核酸を含む組換え宿主細胞を培養することにより、発現を都合よく達成することができる。発現による産生後、VHもしくはVLドメイン、または結合メンバーを、任意の好適な技術を用いて単離および／または精製した後、好適に用いることができる。
【０２２４】
本発明に従う核酸は、DNAまたはRNAを含んでもよく、全体的に、または部分的に合成されたものであってよい。本明細書に記載のヌクレオチド配列に対する参照は、特定の配列を有するDNA分子を包含し、文脈が特に必要としない限り、UがTに置換された特定の配列を有するRNA分子を包含する。
【０２２５】
さらなる態様は、抗体VH可変ドメインの製造方法であって、コードされた核酸からの発現を引き起こすことを含む、前記方法を提供する。そのような方法は、該抗体VH可変ドメインの製造のための条件下で宿主細胞を培養することを含んでもよい。
【０２２６】
VL可変ドメインならびにVHおよび／またはVLドメインを含む結合メンバーの製造のための類似方法を、本発明のさらなる態様として提供する。
【０２２７】
製造方法は、前記生成物の単離および／または精製の工程を含んでもよい。製造方法は、前記生成物を、製薬上許容し得る賦形剤などの少なくとも1種の追加成分などの組成物中に製剤化することを含んでもよい。
【０２２８】
様々な異なる宿主細胞中でのポリペプチドのクローニングおよび発現のための系は、よく知られている。好適な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、繊維性菌類、酵母およびバキュロウイルス系ならびにトランスジェニック植物および動物が挙げられる。原核細胞中での抗体および抗体フラグメントの発現は、当業界でよく確立されている。総論については、例えば、Pluckthun 1991を参照されたい。一般的な細菌宿主は、大腸菌である。
【０２２９】
培養物中の真核細胞中での発現も、例えば、Chadd & Chamow (2001), Andersen & Krummen (2002), Larrick & Thomas (2001)などの結合メンバーの製造のためのオプションとして、当業者にとって利用可能である。異種ポリペプチドの発現のための当業界で利用可能な哺乳動物細胞系としては、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、NS0マウスメラノーマ細胞、YB2/0ラットミエローマ細胞、ヒト胚性腎臓細胞、ヒト胚性網膜細胞および多くの他のものが挙げられる。
【０２３０】
プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および好適な他の配列などの好適な調節配列を含む好適なベクターを選択または構築することができる。ベクターは、プラスミド、例えば、必要に応じて、ファージミド、またはウイルス、例えば、「ファージ」であってよい。さらなる詳細については、例えば、Sambrook & Russell (2001)を参照されたい。例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞中へのDNAの導入および遺伝子発現における核酸の操作、ならびにタンパク質の分析のための多くの公知の技術およびプロトコルは、Ausubel 1999に詳細に記載されている。
【０２３１】
本発明のさらなる態様は、本明細書に開示される核酸を含む宿主細胞を提供する。そのような宿主細胞は、in vitroにあってもよく、培養物中にあってもよい。そのような宿主細胞は、in vivoにあってもよい。宿主細胞のin vivoでの存在により、「イントラボディ」または細胞内抗体としての本発明の結合メンバーの細胞内発現が可能になる。イントラボディを、遺伝子治療に用いることができる。
【０２３２】
さらなる態様は、本発明の核酸を宿主細胞中に導入することを含む方法を提供する。この導入は、任意の利用可能な技術を用いることができる。真核細胞については、好適な技術としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性トランスフェクションおよびレトロウイルスもしくは他のウイルス、例えば、ワクシニアを用いる形質導入が挙げられ、または昆虫細胞については、バキュロウイルスが挙げられる。宿主細胞、特に、真核細胞への核酸の導入は、ウイルスまたはプラスミドに基づく系を使用してもよい。プラスミド系を、エピソームとして維持するか、または宿主細胞中もしくは人工染色体中に組み込むことができる。組込みは、単一もしくは複数の遺伝子座での1以上のコピーの無作為または標的化された組込みによるものであってよい。細菌細胞については、好適な技術としては、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーションおよびバクテリオファージを用いるトランスフェクションが挙げられる。
【０２３３】
導入の後、核酸からの発現を引き起こすか、または可能にする、例えば、該遺伝子の発現のための条件下で宿主細胞を培養することができる。発現産物の精製を、当業者には公知の方法により達成することができる。
【０２３４】
一実施形態においては、本発明の核酸を、宿主細胞のゲノム(例えば、染色体)中に組込む。標準的な技術に従って、ゲノムとの組換えを促進する配列の含有により、組込みを促進することができる。
【０２３５】
本発明はまた、上記の結合メンバーまたはポリペプチドを発現させるための発現系中で上述のような構築物を用いることを含む方法も提供する。
【０２３６】
本発明の結合メンバーを、ヒトまたは動物被験体、例えば、ヒトにおける診断または治療の方法において用いられるように設計する。例えば、結合メンバーを、例えば、本明細書の他の場所で言及されるIL-17に関連する疾患または障害の診断または治療において用いることができる。
【０２３７】
本発明の結合メンバーを治療または診断において用いることができる症状のさらなる例としては、
1. 気道：気道の閉塞性疾患、例えば、気道過敏性の断続的および持続的な原因の両方ならびに全ての重篤性、および他の原因の、気管支性、アレルギー性、内在性、外来性、運動誘導性、薬剤誘導性(アスピリンおよびNSAID誘導性など)および粉塵誘導性喘息などの喘息；慢性閉塞性肺疾患(COPD)；感染性および好酸球性気管支炎などの気管支炎；肺気腫；気管支拡張症；嚢胞性線維症；サルコイドーシス；農夫肺および関連疾患；過敏性肺炎；特発性間質性肺炎(cryptogenic fibrosing alveolitis)、特発性間質性肺炎肺線維症(idiopathic interstitial pneumonia)、結核およびアスペルギルス症および他の菌類感染などの、線維症合併抗新生物治療および慢性感染などの肺線維症；肺移植の合併症；肺血管の血管性および血栓性障害、ならびに肺高血圧；気道の炎症および分泌症状に関連する慢性の咳、ならびに医原性の咳の治療などの鎮咳活性；薬物性鼻炎、および血管運動神経性鼻炎などの急性および慢性鼻炎；神経性鼻炎(花粉症)などの通年性および季節性アレルギー性鼻炎；鼻ポリープ；一般的な風邪、ならびに呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザ、コロナウイルス(SARSなど)およびアデノウイルスに起因する感染などの急性ウイルス感染；
2. 骨および関節：例えば、先天的股異形成に対して一次的および二次的な骨関節炎／変形性関節症に関連するか、もしくはそれを含む関節炎；頸部および腰部脊椎症、ならびに腰部および頸部疼痛；関節リウマチおよびスティル病；強直性脊椎関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎および未分化脊椎関節症などの血清陰性脊椎関節症；敗血症性関節炎および他の感染関連関節症ならびにポッツ病およびポンセ症候群などの結核などの骨障害；尿酸性痛風、ピロリン酸カルシウム蓄積症、ならびにカルシウムアパタイトに関連する腱、滑液胞および滑液炎症などの急性および慢性の結晶誘導性疾患；ベーチェット病；一次および二次シェーグレン症候群；全身性硬化症および限局性強皮症；全身性エリテマトーデス、混合結合組織疾患、および未分化結合組織疾患；皮膚筋炎および多発性筋炎などの炎症性筋疾患；リウマチ性多発性筋痛；全ての関節分布の特発性炎症性関節炎および関連症候群などの若年性関節炎；巨細胞動脈炎、高安動脈炎、Chung-Strauss症候群、結節性多発性動脈炎、顕微鏡的多発性動脈炎、ならびにウイルス感染、過敏性反応、クリオグロブリン、およびパラプロテインと関連する血管炎；腰部疼痛；家族性地中海熱、Muckle-Wells症候群、および家族性ヒベルニアン熱、キクチ病；薬剤誘導性関節痛、腱炎、および筋疾患；
3. 損傷、例えば、スポーツによる損傷、または疾患に起因する骨格筋障害の疼痛および結合組織再モデリング：関節炎(例えば、関節リウマチ、骨関節炎、痛風もしくは結晶性関節症)、他の関節疾患(椎間板変性もしくは顎関節変性)、骨再モデリング疾患(骨粗鬆症、パジェット病もしくは骨壊死など)、多発性軟骨炎、強皮症、混合結合組織障害、脊椎関節症もしくは歯周病(歯周炎など)；
4. 皮膚：乾癬、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎もしくは他の湿疹様皮膚炎、および遅延型過敏反応；植物性皮膚炎および光線皮膚炎；脂漏性皮膚炎、疱疹状皮膚炎、扁平苔癬、硬化性萎縮性苔癬、壊疽性膿皮症、皮膚サルコイド、円板状エリテマトーデス、天疱瘡、類天疱瘡、表皮水疱症、じんま疹、血管性浮腫、血管炎、毒性紅斑、皮膚好酸球増加症、円形脱毛症、男性型禿頭症、スイート症候群、Weber-Christian症候群、多形性紅斑；感染性および非感染性の蜂巣炎；脂肪織炎；皮膚リンパ腫、非メラノーマ皮膚癌および他の異形成病変；固定薬疹などの薬剤誘導性障害；
5. 眼：眼瞼炎；通年性および春季アレルギー性結膜炎；虹彩炎；前部および後部ブドウ膜炎；脈絡膜炎；自己免疫；網膜に影響する変性障害もしくは炎症性疾患；交感性眼炎などの眼炎；サルコイドーシス；ウイルス、菌類、および細菌などの感染；
6. 胃腸管：舌炎、歯肉炎、歯周炎；逆流性などの食道炎；好酸球性胃腸炎、肥満細胞症、クローン病、大腸炎、例えば、潰瘍性大腸炎、不確定大腸炎、直腸炎、顕微鏡的大腸炎、肛門掻痒症；小児脂肪便症、過敏性腸症候群、過敏性腸障害、非炎症性下痢および腸から遠くでの効果を有し得る食品関連アレルギー(例えば、偏頭痛、鼻炎もしくは湿疹)；
7. 腹部：自己免疫性、アルコール性およびウイルス性などの肝炎；肝臓の線維症および肝硬変；急性および慢性の膵炎；
8. 尿生殖器：間質性などの腎炎および糸球体腎炎；ネフローゼ症候群；急性および慢性(間質性)膀胱炎ならびにハンナー潰瘍などの膀胱炎；急性および慢性尿道炎、前立腺炎、精巣上体炎、卵巣炎ならびに卵管炎；ペイロニー病；勃起障害(男性および女性の両方)；
9. 同種移植片拒絶反応：例えば、腎臓、心臓、肝臓、肺、骨髄、皮膚もしくは角膜の移植後または輸血後の急性および慢性拒絶反応；または慢性移植片対宿主病；
10. CNS：アルツハイマー病ならびにCJDおよびnvCJDなどの他の認知障害；アミロイドーシス；多発性硬化症および他の脱髄症候群；脳のアテローム性動脈硬化症および血管炎；側頭動脈炎；重症筋無力症；内臓痛、頭痛、片頭痛、三叉神経痛、非定型顔面痛、関節および骨の疼痛、癌および腫瘍侵襲から生じる疼痛、糖尿病性、ヘルペス後およびHIV関連性ニューロパシーなどの神経障害疼痛症候群などの急性および慢性疼痛(中枢もしくは末梢起源の急性、断続的もしくは持続的なもの)；ニューロサルコイドーシス；悪性の感染または自己免疫プロセスの中枢および末梢神経系合併症；
11. 橋本甲状腺炎、グレーブス病、アジソン病、糖尿病、特発性血小板減少性紫斑病、好酸球性筋膜炎、超IgE症候群、抗リン脂質症候群；
12. 後天性免疫不全症候群(AIDS)、ハンセン病、セザリー症候群、および腫瘍随伴症候群などの炎症成分もしくは免疫学的成分に関する他の障害；
13. 心血管：冠状循環および末梢循環に影響する、アテローム性動脈硬化症；心膜炎；心筋炎、心筋サルコイドなどの炎症性および自己免疫性心筋症；虚血性再かん流傷害；心内膜炎、弁膜炎、および感染性(例えば、梅毒)などの大動脈炎；血管炎；静脈炎および血栓症などの近位静脈および末梢静脈の障害、例えば、深静脈血栓症および静脈瘤の合併症；ならびに
14. 癌：前立腺、乳腺、肺、卵巣、膵臓、腸および結腸、胃、皮膚および脳の腫瘍ならびに骨髄(白血病など)ならびにホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫などのリンパ増殖系に影響する悪性腫瘍などの一般的な癌の治療；転移性疾患および腫瘍再発、ならびに腫瘍随伴症候群の予防および治療、
が挙げられる。
【０２３８】
かくして、本発明の結合メンバーは、異常なIL-17発現および／または活性を含む症状の治療において治療剤として有用である。一実施形態は、特に、それを必要とする患者に、有効量の本発明の結合メンバーを投与し、異常な発現および／または活性のIL-17を減少させることを含む治療方法である。別の実施形態は、特に、(i)例えば、上記の診断方法を用いて、異常なIL-17レベルまたは活性を示す患者を同定すること、および(ii)有効量の本発明の結合メンバーを該患者に投与し、異常な発現および／または活性のIL-17を減少させることを含む治療方法である。本発明に従う有効量は、治療する特定の疾患または障害の少なくとも1つの症候の重篤度を減少させるか、または低下させるが、該疾患または障害を必然的に治癒させるわけではないような、異常な発現および／または活性のIL-17を減少させる量である。従って、本発明の一実施形態は、本明細書で言及される障害のいずれかの少なくとも1つの症候の重篤度を治療するか、または低下させる方法であって、該障害のいずれかの少なくとも1つの症候の重篤度が低下するように、それを必要とする患者に、有効量の本発明の1個以上の結合メンバーを、単独で、または当業界で公知の、もしくは本明細書に記載の別の好適な薬剤と組み合わせた治療計画において投与することを含む前記方法である。本発明の別の実施形態は、特に、少なくとも1つのIL-17の効果、例えば、IL-17RAへのIL-17結合、またはサイトカイン放出などの下流の効果が中和されるように、有効量の本発明の1個以上の結合メンバーと接触させるか、またはそれを投与することを含む、少なくとも1つのIL-17の効果を中和する方法である。
【０２３９】
従って、本発明のさらなる態様は、提供される結合メンバー、そのような結合メンバーを含む医薬組成物の投与を含む治療方法、ならびに例えば、該結合メンバーを、製薬上許容し得る賦形剤と共に製剤化することを含む薬剤または医薬組成物を作製する方法における、投与のための薬剤の製造におけるそのような結合メンバーの使用を提供する。製薬上許容し得る賦形剤は、二次反応を誘発することなく医薬組成物中に進入し、例えば、活性化合物(複数も可)の投与を容易にし、その寿命および／もしくは体内でのその効力を増加させ、溶液中でのその溶解性を増加させるか、または他にその保存を改善させる化合物または化合物の組合せであってよい。これらの製薬上許容し得るビヒクルは、よく知られており、当業者であれば、その性質と選択した活性化合物の投与様式の関数としてフィットさせることができるであろう。
【０２４０】
通常、本発明の結合メンバーを、該結合メンバーに加えて、少なくとも1種の成分を含んでもよい医薬組成物の形態で投与することができる。かくして、本発明に従う医薬組成物、および本発明に従う使用のための医薬組成物は、活性成分に加えて、製薬上許容し得る賦形剤、担体、バッファー、安定化剤または当業者にはよく知られた他の材料を含んでもよい。そのような材料は非毒性的であるべきであり、前記活性成分の効力を阻害するべきではない。担体または他の材料の正確な性質は、経口、吸入または注入、例えば、静脈内注入によるものであってよい投与経路に依存するであろう。
【０２４１】
例えば、ナノボディなどのための経口投与のための医薬組成物も、本発明において想定される。そのような経口製剤は、錠剤、カプセル、粉末、液体または半固形形態にあってもよい。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバントなどの固体担体を含んでもよい。一般的には、液体医薬組成物は、水、石油、動物もしくは野菜油、鉱物油もしくは合成油などの液体担体を含む。生理食塩溶液、デキストロースまたは他の糖類溶液またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールを含有させてもよい。
【０２４２】
静脈内注入、または苦痛の部位での注入のためには、前記活性成分は、発熱原を含まず、好適なpH、等張性および安定性を有する非経口的に許容し得る水性溶液の形態にあるであろう。当業者であれば、例えば、塩化ナトリウム注入液、リンゲル注入液、乳酸加リンゲル注入液などの等張性ビヒクルを用いて、好適な溶液を調製することができる。リン酸、クエン酸、ヒスチジンおよび他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンなどの酸化防止剤；保存剤(オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール；ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；3'-ペンタノール；およびm-クレゾールなど)；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類および他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノースもしくはデキストリン；EDTAなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体(例えば、亜鉛タンパク質複合体)；ならびに／またはTWEEN(商標)、PLURONICS(商標)もしくはポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン性界面活性剤などの、保存剤、安定化剤、バッファー、酸化防止剤および／または他の添加物を、必要に応じて用いることができる。
【０２４３】
本発明の結合メンバーを、該分子の物理化学的特性および送達経路に応じて、液体、半固体または固体形態で製剤化することができる。製剤は、賦形剤、または賦形剤の組合せ、例えば、糖類、アミノ酸および界面活性剤を含んでもよい。液体製剤は、様々な抗体濃度およびpHを含んでもよい。固体製剤を、凍結乾燥、スプレー乾燥、または例えば、超臨界流体技術による乾燥によって製造することができる。抗IL-17の製剤は、意図される送達経路に依存するであろう：例えば、肺送達のための製剤は、吸入の際に肺深部への浸透を確保する物理的特性を有する粒子からなっていてもよい；局所製剤は、薬剤が作用部位に滞留する時間を延長する粘度改変剤を含んでもよい。特定の実施形態においては、結合メンバーを、埋込み物、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達系などの制御放出製剤などの迅速な放出に対して該結合メンバーを保護する担体を用いて調製することができる。エチレンビニル酢酸、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを用いることができる。そのような製剤の調製のための多くの方法は、当業者には公知である。例えば、Robinson, 1978を参照されたい。
【０２４４】
本発明の結合メンバーを用いる抗IL-17治療を、経口的に(例えば、ナノボディ)、注入により(例えば、皮下、関節内、静脈内、腹腔内、動脈内もしくは筋肉内)、吸入により、膀胱内経路(膀胱中への点滴)により、または局所的に(例えば、眼内、鼻内、直腸、傷中、皮膚上)与えることができる。特に、結合メンバーの用量を減少させながら、治療をパルス導入により投与することができる。投与経路を、治療の物理化学的特性により、疾患に関する特定の考慮により、または効力を最適化するか、もしくは副作用を最小化するための要件により決定することができる。投与の1つの特定の経路は、静脈内経路である。本発明の医薬組成物を投与する別の経路は、皮下経路である。抗IL-17治療が、診療所における使用に限定されないことが想定される。従って、針を用いない装置を用いる皮下注入が有利である。
【０２４５】
組成物を、単独で、または他の治療と組み合わせて、同時に、もしくは連続的に、または治療しようとする症状に応じて、別の治療剤もしくは薬剤との混合調製物として投与することができる。
【０２４６】
IL-17に対する結合メンバーを、さらなる医薬成分と組み合わせた組合せ治療の一部として用いることができる。組合せ治療、特に、抗IL-17結合メンバーと、1種以上の他の薬剤との組合せを用いて、有意な相乗作用を提供することができる。IL-17に対する結合メンバーを、本明細書に列挙される1種以上の症状の治療のために、同時に、もしくは連続的に、または別の治療剤もしくは薬剤との混合調製物として投与することができる。
【０２４７】
本発明に従う結合メンバーを、1種以上の以下の薬剤と組み合わせて、またはそれに加えて提供することができる：
・例えば、α、β、および／もしくはγ-インターフェロンなどの、サイトカイン機能のアンタゴニスト(例えば、SOCS系のモジュレーターなどのサイトカインシグナリング経路に対して作用する薬剤)；インスリン様増殖因子I型(IGF-1)のモジュレーター、その受容体および関連する結合タンパク質；インターロイキン(IL)、例えば、IL-1〜33のうちの1種以上、および／またはインターロイキンアンタゴニストもしくはアナキンラなどの阻害剤；インターロイキンファミリーメンバーの受容体の阻害剤またはそのような受容体の特定のサブユニットの阻害剤；抗TNFモノクローナル抗体(例えば、インフリキシマブ；アダリムマブ、および／もしくはCDP-870)などの腫瘍壊死因子α(TNF-α)阻害剤、および／もしくはTNF受容体アンタゴニスト、例えば、免疫グロブリン分子(エタネルセプトなど)および／もしくはペントキシフィリンなどの低分子量薬剤；
・B細胞のモジュレーター、例えば、Bリンパ球(CD20(リツキシマブ)もしくはMRA-aIL16Rなど)またはTリンパ球(例えば、CTLA4-Ig、HuMax Il-15もしくはアバタセプト)を標的化するモノクローナル抗体；
・破骨活性を阻害するモジュレーター、例えば、RANKLに対する抗体；
・CCR1、CCR2、CCR2A、CCR2B、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10およびCCR11(C-Cファミリーについて)；CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4およびCXCR5およびCXCR6(C-X-Cファミリーについて)ならびにC-X3-CファミリーについてはCX3CR1のアゴニストなどのケモカインまたはケモカイン受容体機能のモジュレーター；
・マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)の阻害剤、すなわち、ストロメリジン、コラゲナーゼ、およびゼラチナーゼ、ならびにアグレカナーゼのうちの1種以上；特に、コラゲナーゼ-1(MMP1)、コラゲナーゼ-2(MMP8)、コラゲナーゼ-3(MMP13)、ストロメリジン-1(MMP3)、ストロメリジン-2(MMP10)、および／もしくはストロメリジン-3(MMP11)および／もしくはMMP9および／もしくはMMP12、例えば、ドキシサイクリンなどの薬剤；
・ロイコトリエン生合成阻害剤、5-リポキシゲナーゼ(5-LO)阻害剤または5-リポキシゲナーゼ活性化タンパク質(FLAP)アンタゴニスト、例えば、ジロートン；ABT-761；フェンロートン；テポキサリン；Abbott-79175；Abbott-85761；N-(5-置換)-チオフェン-2-アルキルスルホンアミド；2,6-ジ-tert-ブチルフェノールヒドラゾン；Zeneca ZD-2138などのメトキシテトラヒドロピラン；化合物SB-210661；L-739,010などのピリジニル-置換2-シアノナフタレン化合物；L-746,530などの2-シアノキノリン化合物；MK-501、MK-886、および／もしくはBAY x 1005などのインドールならびに／またはキノリン化合物；
・L-651,392などのフェノチアジン-3-1s；GGS-25019cなどのアミジノ化合物；オンタゾラストなどのベンゾキサラミン；BIIL 284/260などのベンゼンカルボキシミダミド；ならびにザフィルルカスト、アブルカスト、モンテルカスト、プランルカスト、ベルルカスト(MK-679)、RG-12525、Ro-245913、イラルカスト(CGP 45715A)、およびBAY x 7195などの化合物からなる群より選択される、ロイコトリエン(LT)B4、LTC4、LTD4およびLTE4に対する受容体アンタゴニスト；
・メチルキサンタニンなどのホスホジエステラーゼ(PDE)阻害剤、例えば、テオフィリンおよび／もしくはアミノフィリン；ならびに／または選択的PDEイソ酵素阻害剤、例えば、PDE4阻害剤および／もしくはアイソフォームPDE4Dの阻害剤、および／もしくはPDE5の阻害剤；
・セチリジン、ロラタジン、デスロラタジン、フェキソフェナジン、アクリバスチン、テルフェナジン、アステミゾール、アゼラスチン、レボカバスチン、クロルフェニラミン、プロメタジン、シクリジン、および／もしくはミゾラスチンなどのヒスタミン1型受容体アンタゴニスト(一般的には、経口的、局所的もしくは非経口的に適用される)；
・プロトンポンプ阻害剤(オメプラゾールなど)または胃保護ヒスタミン2型受容体アンタゴニスト；
・ヒスタミン4型受容体のアンタゴニスト；
・プロピルヘキセドリン、フェニルエフリン、フェニルプロパノールアミン、エフェドリン、シュードエフェドリン、塩酸ナファゾリン、塩酸オキシメタゾリン、塩酸テトラヒドロゾリン、塩酸キシロメタゾリン、塩酸トラマゾリン、および塩酸エチルノルエピネフリンなどのα-1/α-2アドレナリン受容体アゴニスト血管収縮性交感神経様作用剤；
・抗コリン剤、例えば、アトロピン、ヒヨスチン、グリコピロレート、臭化イプラトロピウム、臭化チオトロピウム、臭化オキシトロピウム、ピレンゼピン、およびテレンゼピンなどのムスカリン受容体(M1、M2、およびM3)アンタゴニスト；
・イソプレナリン、サルブタモール、フォルモテロール、サルメテロール、テルブタリン、オルシプレナリン、ビトルテロールメシラート、および／もしくはピルブテロールなどのβ-アドレナリン受容体アゴニスト(β受容体サブタイプ1-4など)、例えば、そのキラルエナンチオマー；
・クロモン、例えば、ナトリウムクロモグリケートおよび／またはネドクロミルナトリウム；
・フルニソリド、トリアムシノロンアセトニド、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ブデゾニド、プロピオン酸フルチカゾン、シクレゾニド、および／またはフロ酸モメタゾンなどの糖質コルチコイド；
・PPARなどの核ホルモン受容体を調節する薬剤；
・免疫グロブリン(Ig)もしくはIg調製物または抗IgEなどのIg機能を調節するアンタゴニストもしくは抗体(例えば、オマリズマブ)；
・他の全身もしくは局所適用される抗炎症剤、例えば、サリドマイドもしくはその誘導体、レチノイド、ジフラノール、および／またはカルシポトリオール；
・スルファサラジン、メサラジン、バルサラジド、およびオルサラジンなどのアミノサリチル酸とスルファピリジンとの組合せ；ならびにチオプリンなどの免疫調節剤、およびブデゾニドなどのコルチコステロイド；
・抗細菌剤、例えば、ペニシリン誘導体、テトラサイクリン、マクロライド、β-ラクタム、フルオロキノロン、メトロニダゾール、および／もしくは吸入用アミノグリコシド；ならびに／または抗ウイルス剤、例えば、アシクロビル、ファムシクロビル、バラシクロビル、ガンシクロビル、シドフォビル；アマンタジン、リマンタジン；リバビリン；ザナマビルおよび／もしくはオセルタマビル；インジナビル、ネルフィナビル、リトナビル、および／もしくはサキナビルなどのプロテアーゼ阻害剤；ジダノシン、ラミブジン、スタブジン、ザルシタビン、ジドブジンなどのヌクレオシド逆転写酵素阻害剤；ネビラピン、エファビレンズなどの非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤；
・カルシウムチャンネル遮断剤、β-アドレナリン受容体遮断剤、アンギオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤、アンギオテンシン-2受容体アンタゴニストなどの心血管剤；スタチン、および／もしくはフィブラートなどの脂質低下剤；ペントキシフィリンなどの血液細胞形態のモジュレーター；血栓溶解剤、および／または凝固防止剤、例えば、血小板凝集阻害剤；
・抗うつ剤(セルトラリンなど)、抗パーキンソン病剤(デプレニル、L-ドーパ、ロピニロール、プラミペキソール、セレギンおよびラサギリンなどのMAOB阻害剤、タスマールなどのcomP阻害剤、A-2阻害剤、ドーパミン再取込み阻害剤、NMDAアンタゴニスト、ニコチンアゴニスト、ドーパミンアゴニストならびに／または神経一酸化窒素合成酵素など)、ならびにドネペジル、リバスチグミン、タクリン、COX-2阻害剤、プロペントフィリンもしくはメトリフォナートなどの抗アルツハイマー剤；
・急性および慢性疼痛の治療のための薬剤、例えば、オピオイド類似体もしくは誘導体、カルバマゼピン、フェニトイン、バルプロ酸ナトリウム、アミトリプチジンなどの中枢もしくは末梢作用性鎮痛剤または他の抗うつ剤、パラセタモール、もしくは非ステロイド系抗炎症剤；
・リグノカインまたはその類似体などの非経口または局所適用(吸入など)局所麻酔剤；
・抗骨粗鬆症剤、例えば、ラロキシフェンなどのホルモン剤、またはアレドロナートなどの二ホスホン酸；
・(i)トリプターゼ阻害剤；(ii)血小板活性化因子(PAF)アンタゴニスト；(iii)インターロイキン変換酵素(ICE)阻害剤；(iv)IMPDH阻害剤；(v)VLA-4アンタゴニストなどの接着分子阻害剤；(vi)カテプシン；(vii)キナーゼ阻害剤、例えば、チロシンキナーゼの阻害剤(Btk、Itk、Jak3 MAP阻害剤の例としては、ゲフィニチブ、イマチニブメシラートが挙げられる)、セリン／トレオニンキナーゼ(例えば、p38、JNK、タンパク質キナーゼA、BおよびCならびにIKKなどのMAPキナーゼの阻害剤)、または細胞周期調節に関与するキナーゼ(例えば、サイクリン依存的キナーゼ)；(viii)グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤；(ix)キニン-B.sub1.および／またはB.sub2.受容体アンタゴニスト；(x)抗痛風剤、例えば、コルチシン；(xi)キサンチンオキシダーゼ阻害剤、例えば、アロプリノール；(xii)尿酸排泄剤、例えば、プロベネシド、スルフィンピラゾン、および／またはベンズブロマロン；(xiii)増殖ホルモン分泌促進剤；(xiv)トランスフォーミング増殖因子(TGFβ)；(xv)血小板由来増殖因子(PDGF)；(xvi)線維芽細胞増殖因子、例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)；(xvii)顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)；(xviii)カプサイシンクリーム；(xix)タシキニンNK.sub1.および／またはNK.sub3.受容体アンタゴニスト、例えば、NKP-608C、SB-233412(タルネタント)、および／またはD-4418；(xx)エラスターゼ阻害剤、例えば、UT-77および／またはDZ-0892；(xxi)TNF-α変換酵素阻害剤(TACE)；(xxii)誘導性一酸化窒素合成酵素(iNOS)阻害剤または(xxiii)TH2細胞上で発現される化学誘因物質受容体相同分子(CRTH2アンタゴニストなど)、(xxiv)P38の阻害剤、(xxv)Toll様受容体(TLR)の機能を調節する薬剤および(xxvi)P2X7などのプリン作動性受容体の活性を調節する薬剤；(xxvii)NFκB、API、および／またはSTATなどの転写因子活性化の阻害剤。
【０２４８】
阻害剤は特異的なものであってもよいし、または混合された阻害剤、例えば、2種以上の分子(例えば、受容体)または上記の分子クラスを標的化する阻害剤であってもよい。
【０２４９】
前記結合メンバーを、化学療法剤または別のチロシンキナーゼ阻害剤と共に、同時投与において、または免疫コンジュゲートの形態で用いることもできる。前記抗体のフラグメントを、組換え機構もしくは生化学的カップリングにより得られる二重特異性抗体において使用した後、上記抗体の特異性を、IL-17が関連する活性に関与する他の分子を認識することができる他の抗体の特異性と関連させることもできる。
【０２５０】
炎症性疾患の治療のためには、本発明の結合メンバーを、局所もしくは全身的に適用される非選択的シクロオキシゲナーゼ(COX)-1／COX-2阻害剤などの非ステロイド系抗炎症剤(以後、NSAIDと呼ぶ)(ピロキシカム、ジクロフェナク、ナプロキセン、フルリビプロフェン、フェノプロフェン、ケトプロフェンおよびイブプロフェンなどのプロピオン酸、メフェナミン酸などのフェナメート、インドメタシン、スリンダック、アザプロパゾン、フェニルブタゾンなどのピラゾロン、アスピリンなどのサリチル酸塩)；選択的COX-2阻害剤(メロキシカム、セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、ルマロコキシブ、パラコキシブおよびエトリコキシブなど)；シクロオキシゲナーゼ阻害一酸化窒素供与体(CINOD)；糖質コルチコステロイド(局所、経口、筋肉内、静脈内、もしくは関節内経路により投与される)；メトトレキサート、レフルノミド；ヒドロキシクロロキン、d-ペニシラミン、オーラノフィンまたは他の非経口もしくは経口金調製物；鎮痛剤；ジアセレイン；ヒアルロン酸誘導体などの関節内治療；ならびにグルコサミンなどの栄養補給物質などの1種以上の薬剤と組み合わせることができる。
【０２５１】
本発明の結合メンバーを、癌の治療のための存在する治療剤と共に用いることもできる。組み合わせて用いられる好適な薬剤としては、
(i)アルキル化剤(例えば、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、窒素マスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファンおよびニトロソウレア)などの内科的腫瘍において用いられる、抗増殖剤／抗新生物剤；代謝拮抗剤(例えば、5-フルオロウラシルおよびテガフールなどのフルオロピリミジン、ラルチトレキセド、メトトレキサート、シトシンアラビノシド、ヒドロキシウレア、ゲムシタビンならびにパクリタキセルなどの抗葉酸剤)；抗腫瘍性抗生物質(例えば、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシンC、ダクチノマイシンおよびミトラマイシンなどのアントラサイクリン)；抗有糸分裂剤(例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビンなどのビンカアルカロイドならびにタキソールおよびタキソテールなどのタキソイド)；ならびにトポイソメラーゼ阻害剤(例えば、エトポシドおよびテニポシドなどのエピポドフィロトキシン、アムサクリン、トポテカンならびにカンポテシン)；
(ii)抗エストロゲン剤(例えば、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェンおよびヨードキシフェン)、エストロゲン受容体下方調節因子(例えば、フルベストラント)、抗アンドロゲン剤(例えば、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミドおよび酢酸シプロテロン)、LHRHアンタゴニストまたはLHRHアゴニスト(例えば、ゴセレリン、ロイプロレリンおよびブセレリン)、プロゲストゲン(例えば、酢酸メゲストロール)、アロマターゼ阻害剤(例えば、アナストロゾール、レトロゾール、ボラゾールおよびエキセメスタン)ならびにフィナステリドなどの5α-リダクターゼの阻害剤；
（iii)癌細胞侵襲を阻害する薬剤(例えば、マリマスタットなどのメタロプロテイナーゼ阻害剤およびウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体機能の阻害剤)；
(iv)増殖因子機能の阻害剤、例えば、そのような阻害剤としては、増殖因子抗体、増殖因子受容体抗体(例えば、抗erbb2抗体トラスツズマブおよび抗erbb1抗体セツキシマブ[C225])、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤ならびにセリン／トレオニンキナーゼ阻害剤、例えば、上皮増殖因子ファミリーの阻害剤(例えば、N-(3-クロロ-4-フルオロフェニル)-7-メトキシ-6-(3-モルホリノプロポキシ)キナゾリン-4-アミン(ゲフィチニブ、AZD1839)、N-(3-エチニルフェニル)-6,7-ビス(2-メトキシエトキシ)キナゾリン-4-アミン(エルロチニブ、OSI-774)および6-アクリルアミド-N-(3-クロロ-4-フルオロフェニル)-7-(3-モルホリノプロポキシ)キナゾリン-4-アミン(CI 1033)などのEGFRファミリーチロシンキナーゼ阻害剤)、例えば、血小板由来増殖因子ファミリーの阻害剤ならびに例えば、肝細胞増殖因子ファミリーの阻害剤；
(v)血管内皮増殖因子の効果を阻害するものなどの抗血管新生剤(例えば、抗血管内皮細胞増殖因子抗体ベバシズマブ、国際特許出願WO 97/22596、WO 97/30035、WO 97/32856およびWO 98/13354(それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に開示されたものなどの化合物)ならびに他の機構により作用する化合物(例えば、リノミド、インテグリンαvβ3機能の阻害剤およびアンギオスタチン)；
(vi)コンブレタスタチンA4ならびに国際特許出願WO 99/02166、WO 00/40529、WO 00/41669、WO 01/92224、WO 02/04434およびWO 02/08213(それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に開示された化合物などの血管損傷剤；
(vii)アンチセンス治療剤、例えば、ISIS 2503、抗rasアンチセンスなどの上記の標的に対するもの；(viii)例えば、異常なp53または異常なBRCA1もしくはBRCA2などの異常な遺伝子を置換する手法、シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼもしくは細菌ニトロリダクターゼ酵素を用いるものなどのGDEPT(遺伝子指向性酵素プロドラッグ治療)手法ならびに多剤耐性遺伝子治療などの化学療法もしくは放射線療法に対する患者の寛容性を増加させる手法などの遺伝子治療手法；ならびに
(ix)例えば、インターロイキン2、インターロイキン4もしくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子などのサイトカインを用いるトランスフェクションなどの、患者の腫瘍細胞の免疫原性を増加させるためのex vivoおよびin vivoでの手法、T細胞アネルギーを減少させる手法、サイトカインをトランスフェクトされた樹状細胞などのトランスフェクトされた免疫細胞を用いる手法、サイトカインをトランスフェクトされた腫瘍細胞系を用いる手法ならびに抗イディオタイプ抗体を用いる手法などの免疫治療的手法、
が挙げられる。
【０２５２】
本発明の結合メンバーおよび1種以上の上記のさらなる医薬成分を、薬剤の製剤において用いることができる。この薬剤は、個体への個別の、または組み合わせた投与のためのものであってよく、従って、前記結合メンバーと、組合せ調製物として、もしくは個別の調製物としてのさらなる成分とを含んでもよい。個別の調製物を用いて、別々の、および連続的もしくは同時的投与を容易にすることができ、異なる経路、例えば、経口および非経口投与による前記成分の投与が可能になる。
【０２５３】
本発明に従って、提供される組成物を哺乳動物に投与することができる。投与は「治療上有効量」でのものであってもよく、これは患者に対する利益を示すのに十分なものである。そのような利益は、少なくとも1つの徴候の少なくとも改善であってよい。投与される実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、治療しようとするものの性質および重篤度、治療しようとする特定の哺乳動物、個々の患者の臨床症状、障害の原因、組成物の送達部位、結合メンバーの型、投与の方法、投与の計画ならびに医師には公知の他の因子に依存するであろう。治療の処方、例えば、用量などの決定は、一般的な実務者および他の医師の責任の範囲内にあり、徴候の重篤度および／または治療する疾患の進行に依存し得る。抗体の好適な用量は当業界でよく知られている(Ledermann 1991およびBagshawe 1991)。投与する薬剤の型について必要に応じて、本明細書、またはPhysician's Desk Reference (2003)に指示される特定の用量を用いることができる。本発明の治療上有効量または好適な用量を、そのin vitroでの活性および動物モデルにおけるin vivoでの活性を比較することにより決定することができる。マウスおよび他の試験動物における有効用量のヒトへの外挿のための方法は公知である。正確な用量は、抗体が診断、予防もしくは治療のためのものであるかどうか、治療しようとする領域のサイズおよび位置、抗体の正確な性質(例えば、全抗体、フラグメントもしくはダイアボディ)、ならびに任意の検出可能な標識または抗体に結合した他の分子の性質などのいくつかの因子に依存するであろう。典型的な抗体用量は、全身適用については100μg〜1 gの範囲、および局所適用については1μg〜1 mgの範囲にあるであろう。初回のより高い負荷用量、次いで、1回以上のより低い用量を投与することができる。典型的には、前記抗体は、全抗体、例えば、IgG1アイソタイプであってよい。これは、成人患者の1回の治療のための用量であり、子供および幼児のために比例的に調整し、また、分子量に比例して他の抗体形式のために調整することができる。治療を、医師の裁量で、毎日、週に2回、週または月の間隔で繰り返してもよい。治療は、皮下投与については2〜4週毎、静脈内投与については4〜8週毎であってもよい。本発明のいくつかの実施形態においては、治療は定期的であり、投与間の期間は約2週間以上、例えば、約3週間以上、約4週間以上、または月に約1回である。本発明の他の実施形態においては、治療は外科手術の前および／または後に与えることができ、外科的治療の解剖学的部位に投与するか、または直接適用することができる。
【０２５４】
(実施例)
【実施例１】
【０２５５】
リード抗体の単離
1.1 選択
繊維性ファージM13に基づくファージミドベクター中にクローニングされた大きい一本鎖Fv(scFv)ヒト抗体ライブラリーを、選択に用いた(Vaughanら、1996、Hutchingsら、2001)。抗IL-17A特異的scFv抗体を、本質的には以前に記載された(Vaughanら、1996)ように組換えヒトIL-17Aに対する一連の選択サイクルを用いて、ファージ展示ライブラリーから単離した。簡単に述べると、PBS(ダルベッコのPBS、pH 7.4)中のヒトIL-17Aを、4℃で一晩、マイクロタイタープレートのウェル上に吸着させた。ウェルをPBSで洗浄した後、PBS-Marvel (3% w/v)を用いて1時間ブロックした。PBS-Marvel (3% w/v)中の精製されたファージをウェルに添加し、コーティングされた抗原に1時間結合させた。未結合のファージをPBS-Tween (0.1% v/v)およびPBSを用いて一連の洗浄サイクルにより除去した。結合したファージ粒子を溶出させ、細菌に感染させ、次のラウンドの選択のためにレスキューした(Vaughanら、1996)。
【０２５６】
2回目のラウンドの選択から得た個々のクローンの代表数を、96穴プレート中で増殖させた。scFvを細菌ペリプラズム中で発現させ、ヒトIL-17受容体A結合アッセイにおけるその阻害活性についてスクリーニングした。粗ペリプラズム抽出物としてIL-17A:IL-17RA相互作用に対して有意な阻害効果を示したscFvを、DNA配列決定にかけた(Vaughan 1996、Osbourn 1996)。ユニークなscFvを細菌中で再度発現させ、アフィニティクロマトグラフィー(Bannisterら、2006)により精製し、HTRF(登録商標)受容体リガンド結合アッセイ、ならびにヒトおよびカニクイザルIL-17に対するHT1080 IL-6放出アッセイにおいて精製されたscFvの希釈系列を試験することにより、IC50値を決定した。
【０２５７】
1.2 DELFIA(登録商標)エピトープ競合アッセイにおける抗体の選択性および種交叉反応性
IL-17ファミリーメンバーに対する抗体の種交叉反応性および選択性を、DELFIA(登録商標)エピトープ競合アッセイを用いて、HIS FLAG IL-17A(自社品、HEK EBNA由来)の阻害、それぞれ固定された抗IL-17抗体への結合を測定することにより実証した。
【０２５８】
非タグ付精製ヒトIL-17A(自社品、大腸菌由来)、IL-17B (Peprotech)、IL-17C (R & D Systems)、IL-17D (Peprotech)、IL-17E (R & D Systems)、およびIL-17F (Peprotech)の滴定測定を、それぞれのアッセイにおいて試験して、該アッセイにおけるIC50値により測定される、それぞれのIL-17ファミリーメンバーの効力を実証した。
【０２５９】
ヒト、カニクイザルIL-17A (自社品、大腸菌由来)、およびマウスIL-17A (R & D Systems)などのIL-17種の滴定物を、それぞれのアッセイにおいて試験して、抗体の種交叉反応性を実証した。
【０２６０】
精製されたIgGを、ビオチン化ヒトIL-17Aをその特定のIgGに関するぼぼその見積もられたKdで添加した場合に有意なシグナルを与える濃度で、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中、96穴Maxisorpマイクロタイタープレート(Nunc)上に吸着させた。PBS-Tween (0.1% v/v)を用いて過剰のIgGを洗浄除去し、ウェルをPBS-Marvel (3% w/v)を用いて1時間ブロックした。競合剤(マウスもしくはカニクイザルIL-17A、またはIL-17ファミリーメンバー)の希釈系列は、ビオチン化ヒトIL-17Aとその対応するIgGとの相互作用のKd値の約200倍の濃度で開始し、PBS中に調製した。非ビオチン化ヒトIL-17Aを、陽性対照として用いた。この希釈系列に対して、該Kdの約2倍の濃度の等量のビオチン化組換えヒトIL-17Aを添加した(競合剤抗原：ビオチン化ヒトIL-17Aの比率約100:1から出発する希釈系列を得る)。次いで、これらの混合物をブロックされたIgG上に移し、1時間平衡化させた。残りのビオチン化ヒトIL-17Aをストレプトアビジン-ユーロピウム3+コンジュゲート(DELFIA(登録商標)検出、PerkinElmer)により検出しながら、PBS-Tween (0.1% v/v)を用いる洗浄により、未結合の抗原を除去した。時間分解蛍光を、EnVisionプレートリーダー(PerkinElmer)上、620 nmで測定した。蛍光データを特異的結合(％)に変換した(100％は、ビオチン化ヒトIL-17Aを含むが、競合剤を含まない対照ウェルから決定され、0％は、ビオチン化ヒトIL-17Aおよび100倍過剰量の非ビオチン化ヒトIL-17Aを含むウェルから決定された)。得られたデータを、Prism曲線フィッティングソフトウェア(Graphpad)を用いて分析して、IC50値を決定した。IL-17Aに対するそれぞれのIgGの異なる親和性のため、およびすなわち用いた異なるアッセイ条件のため、結果は、ヒトIL-17Aと競合抗原とのIC50値の差を倍数値として表した。これにより、異なるIgGの比較が可能になる。
【表１】
0005385784.tif 000002
【０２６１】
NDは測定していないこと、NIは阻害されないことを示す。ヒトIL-17A結合の阻害は、試験したクローンのいずれに関しても、IL-17B〜Fを用いて観察されなかった。
【０２６２】
1.3 IL-17受容体へのIL-17A結合の阻害
ビオチン化ヒトIL-17A(Peprotech 200-17)、またはHIS FLAGタグ付ヒトIL-17A(自社品、HEK EBNA由来)結合IL-17RA Fc融合タンパク質(R & D Systems 177-IR)のいずれかの阻害について、受容体-リガンド結合HTRF(登録商標)(均一時間分解蛍光、CIS BIO international)アッセイ形式で、選択生成物をスクリーニングした。参照抗IL-17 mAb (Biosource)を、陽性対照として全ての効力アッセイに含めた。詳細なアッセイ方法を、「アッセイ材料および方法」の小節に提供する。
【０２６３】
HIS FLAGタグ付ヒトIL-17A結合IL-17RA Fc融合タンパク質アッセイから得られたリードscFv効力の例を、表2に示す。
【表２】
0005385784.tif 000003
【０２６４】
1.4 エピトープ結合
リードscFvを、親抗体1、mAb317 (R & D Systems)またはBiosource mAbなどのHIS FLAGヒトIL-17A(自社品、HEK EBNA由来)結合抗ヒトIL-17抗体の阻害について、エピトープ競合アッセイにおいて試験した。
【０２６５】
mAb317またはBiosource mAbを用いるエピトープ競合アッセイは、それぞれ0.4Mフッ化カリウムおよび0.1％ BSA(アッセイバッファー)を含有する50 mM HEPESバッファー中で、XL665 (CIS Bio International 61PAMXLB)で標識された20 nMまたは10 nMの抗マウスFcと共に3 nMまたは6 nMの抗IL-17抗体を予備インキュベートすることを含んでいた。抗体およびXL665検出では、暗室中、室温で1時間予備インキュベートした。抗体1を用いるアッセイについては、抗体1をクリプタート(CIS Bio International 62EUSPEA)で直接標識し、使用前にアッセイバッファー中に500倍に希釈した。
【０２６６】
並行して、mAb317またはBiosource mAbを用いるアッセイについては、10 nMのビオチン化IL-17A (20 nMモノマー)を、暗室中、室温で1時間、アッセイバッファー中の3.2 nMストレプトアビジンクリプタートと共に予備インキュベートした。抗体1アッセイについては、2 nMのHIS FLAG IL-17A (4 nMモノマー)を、暗室中、室温で1時間、アッセイバッファー中、XL665 (CIS Bio International 61FG2XLB)で標識した2 nMの抗FLAG抗体と共に予備インキュベートした。
【０２６７】
試薬の予備インキュベーション後、10μlの精製されたscFvサンプルを、384穴低容量アッセイプレート(Costar)に添加した。次いで、5μlの予備インキュベートしたIL-17抗体の添加、およびmAb317またはBiosource mAbを用いるアッセイのためのそのXL665検出、次いで5μlのヒトビオチン化IL-17Aおよびクリプタート検出混合物の添加を行った。
【０２６８】
抗体1アッセイについては、10μlの精製されたscFvサンプルを、384穴低容量アッセイプレートに添加した後、5μlのクリプタート標識抗体1、次いで、5μlのHIS FLAG IL-17AおよびXL665検出混合物を添加した。
【０２６９】
次いで、アッセイプレートを室温で1分間、1000 rpmで遠心分離し、室温で最大4時間インキュベートした後、EnVisionプレートリーダー(Perkin Elmer)を用いる620 nmおよび665 nm放射波長で時間分解蛍光を読み取った。
【０２７０】
各サンプルについて、デルタF値(％)(CIS Bio International)を算出することによりデータを分析した後、これを用いて、特異的結合(％)を決定した。
【０２７１】
結果を表3にまとめる。
【表３】
0005385784.tif 000004
【０２７２】
異なる程度の阻害が、3つのエピトープ競合アッセイにおけるscFvのリードパネル間で観察されたが、これは、これらのクローンのいくつかが、パネル中の他のscFv、およびアッセイを設定した対象のmAbとわずかに異なるかまたは重複するエピトープを認識したことを示唆している。
【０２７３】
1.5 IgG1へのscFv再構成
全抗体の重鎖および軽鎖をそれぞれ発現するベクター中にVHおよびVLドメインをサブクローニングすることにより、scFvからIgG形式にクローンを変換した。VHドメインを、ヒト重鎖定常ドメインおよび哺乳動物細胞中で全IgG重鎖を発現させるための調節エレメントを含むベクター(pEU15.1)にクローニングした。同様に、VLドメインを、ヒト軽鎖(ラムダ)定常ドメインおよび哺乳動物細胞中で全IgG軽鎖を発現させるための調節エレメントの発現のためのベクター(pEU4.4)にクローニングした。重鎖および軽鎖の発現のためのベクターは、元々Persicら、1997に記載されたものである。Cambridge Antibody Technologyのベクターは、単にOriPエレメントを導入することにより遺伝子操作されたものである。IgGを取得するために、重鎖および軽鎖IgGを発現するベクターを、EBNA-HEK293哺乳動物細胞中にトランスフェクトした。IgGを、培地中で発現および分泌させた。収穫物をプールし、濾過した後、精製した。IgGを、プロテインAクロマトグラフィーを用いて精製した。培養上清を、好適なサイズのセラミックプロテインA(BioSepra)のカラム上に載せ、50 mM Tris-HCl pH 8.0、250 mM NaClで洗浄した。結合したIgGを0.1 Mクエン酸ナトリウム(pH 3.0)を用いてカラムから溶出させ、Tris-HCl(pH 9.0)の添加により中和した。溶出された材料を、Nap10カラム(Amersham, #17-0854-02)を用いてPBS中でバッファー交換し、IgGの濃度を、IgGのアミノ酸配列に基づく吸光係数を用いて分光光度分析により決定した(Machら、1992)。精製されたIgGを、SEC-HPLCを用いて、およびSDS-PAGEにより凝集または分解について分析した。
【０２７４】
1.6 HT1080細胞からのIL-6のIL-17誘導性放出
IL-17阻害剤の生物活性を決定するために、scFvおよびIgG活性を、HT1080ヒト線維肉腫細胞アッセイにおいて評価した。これらの細胞は、用量依存的様式でIL-6を放出することにより、ヒトIL-17に応答する。アッセイ方法の詳細については、「アッセイ材料および方法」の小節を参照されたい。
【０２７５】
このアッセイにおいては、1 nMヒトまたは1 nMカニクイザル(cyno)非ヒト霊長類IL-17Aに応答した抗IL-17 scFv/IgGのパネルの、IC50値により決定される、阻害活性を決定した。得られたscFvおよびIgG効力を、表4に示す。
【表４】
0005385784.tif 000005
【０２７６】
リード単離物に由来するscFvは、一般的には、効力を決定することができないような、HT1080アッセイにおける弱い阻害を与えた。従って、HT1080アッセイにおける阻害を示す任意のscFvをIgG1に再構成し、該アッセイにおいて再試験して効力をより正確に決定し、クローンをランク付けできるようにした。
【実施例２】
【０２７７】
抗体最適化
2.1 親和性成熟
リード抗体を、標的化突然変異誘発手法および親和性に基づくファージ展示選択を用いて最適化した。リードクローンから誘導された大きなscFv-ファージライブラリーを、記載のような(Clackson 2004)標準的な分子生物学技術を用いて、可変重鎖(VH)および軽鎖(VL)相補性決定領域3(CDR3)のオリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発により作製した。このライブラリーを親和性に基づくファージ展示選択にかけて、IL-17Aに対するより高い親和性を有する変異体を選択した。結果として、これらは、その受容体へのIL-17A結合に対する阻害活性の改善を示すであろう。この選択を、本質的には以前に記載のように実施した(Thompson 1996)。簡単に述べると、scFv-ファージ粒子を、溶液中の組換えビオチン化ヒトIL-17A(bio-huIL-17A、HEK EBNA由来の自社品、および自社で改変)と共にインキュベートした。次いで、抗原に結合したscFv-ファージを、製造業者の推奨に従ってストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ(Dynabeads(登録商標)M-280)上に捕捉した。次いで、選択されたscFv-ファージ粒子を、以前に記載のようにレスキューし(Osbourn 1996)、選択プロセスを、漸減濃度(5ラウンドで100 nMから10 pMへ)のbio-huIL-17Aの存在下で繰り返した。粗scFv含有ペリプラズム抽出物を、選択生成物からの代表数の個々のクローンから調製し、本質的には実施例1に記載のようにしてヒトIL-17受容体へのヒトbio-huIL-17Aの結合を阻害する能力についてスクリーニングした。スクリーニングでヒットしたもの、すなわち、対応する親抗体と比較した場合に有意に改善した阻害効果を示したscFv変異体を、DNA配列決定にかけ、ユニークな変異体を、さらなる特性評価のために精製されたscFvとして製造した(実施例1を参照)。
【０２７８】
次いで、いくつかのscFvを選択し、実施例1に記載のようにIgG1に変換し、再度試験した。さらなる効力獲得を達成する目的で、改良されたVHおよびVLをトランスフェクション工程で組換えて、得られるIgG1を評価した。トランスフェクションレベルでのVHおよびVLの組換えは、いくらか予測不可能な技術として認識されているが、改善された効力の抗体の作製においては半ば成功した。しかしながら、偶然にも、この例においては、以下に記載のように、その技術により、抗体3、4、5、7、9、10および12などの、多くの高い効力のIgGの作製に成功した。
【０２７９】
2.2 生殖細胞系列化
最適化された抗IL-17A抗体のVHおよびVLドメインのアミノ酸配列を、VBASEデータベース(Tomlinson 1997)中の公知のヒト生殖細胞系列配列とアラインメントさせ、最も近縁な生殖細胞系列を配列類似性により同定した。Tina 12抗体系列のVHドメインについては、これはVH3-23であった。VLドメインについては、それはVλ6aであった。
【０２８０】
未変化のままであったVernierの残基(Foote & Winter 1992)は考慮していないが、VHドメインのフレームワーク中には1個の変化、VLドメイン中には2個の変化が存在し、これは全て、好適な突然変異誘発プライマーを用いる標準的な部位特異的突然変異誘発技術を用いて、ヒト抗体に同一に合致させるように最も近い生殖細胞系列配列に戻した。VHドメイン中のVernierの残基は、VH FR3中のC末端のArg(VHドメイン配列中の残基番号98)であったが、これは生殖細胞系列のLysには変化しなかった。VLドメイン中のVernierの残基は、VL FR2中のIle(VLドメイン配列中の残基番号47)であったが、これは生殖細胞系列のThrには戻されず、またVL FR2中のPhe(VLドメイン配列中の残基番号50)であったが、これは生殖細胞系列のTyrには戻されなかった。
【０２８１】
2.3 最適化されたクローンのHTRF(登録商標)受容体-リガンドアッセイ
最適化された選択生成物を、アッセイ材料および方法の小節に記載のようにして、HIS FLAGタグ付ヒトIL-17A(自社品、HEK EBNA由来)結合IL-17RA Fc融合タンパク質の阻害について、HTRF(登録商標)受容体-リガンド結合アッセイにおいてスクリーニングした。
【０２８２】
次いで、スクリーニングに由来するヒットとして同定された精製scFvの効力を、HTRF(登録商標)受容体-リガンド結合アッセイにおいて決定した。得られたリードscFv効力の例を、表5に示す。ここで示すデータは、非生殖細胞系列抗体配列に関するものである。
【表５】
0005385784.tif 000006
【０２８３】
2.4 最適化されたクローンのHT1080 IL-6放出アッセイ
リード単離物に由来する抗体の最適化後の生物活性の改善を、「アッセイ材料および方法」の小節に記載のようにHT1080ヒト線維肉腫細胞において評価した。全てのアッセイを、HEK-EBNA発現系から得られたヒトIL-17A、および大腸菌またはHEK EBNA発現系から得られたカニクイザルIL-17Aを用いて実施した。
【０２８４】
一連の最適化された抗IL-17 scFv/IgGを、濃度依存的様式で1 nMヒトまたは1 nMカニクイザル(cyno)IL-17Aに応答するHT1080アッセイにおいて評価した。得られたscFvおよびIgG効力の例を表6Aに示す。
【表６Ａ】
0005385784.tif 000007
【０２８５】
2.5 相乗作用したIL-6放出を測定するHT1080細胞アッセイ
HT1080細胞は、濃度依存的な様式でIL-6を相乗的に放出することにより、ヒトIL-17AおよびヒトTNFαに応答することができる。相乗作用したIL-6応答に対する、最適化された抗体2および7の生物活性を、IL-6放出を125 pMのヒトIL-17および25 pMのヒトTNFαに応答して測定する、以前に記載されたHT1080細胞アッセイ法の改変法を用いて評価した(「アッセイ材料および方法」の小節を参照)。
【０２８６】
抗体2および7は両方とも、相乗作用したIL-6応答を中和した。IC50値の例を表6bに示す。
【表６ｂ】
0005385784.tif 000008
【０２８７】
2.6 HT1080細胞中での天然IL-17A誘導型応答の阻害
天然起源のIL-17Aを阻害する抗体の能力を、一次ヒトT細胞から得られたIL-17Aを用いて評価した。大腸菌由来組換えIL-17Aは、N結合型グリコシル化部位を有する天然起源のものと違って、糖鎖付加されていない。T細胞由来IL-17Aを用いる抗体を評価することにより、その活性が確実に天然起源のタンパク質に対して維持されるであろう。
【０２８８】
健康なヒトドナーに由来するT細胞を、IL-17A産生を増強する条件を用いて刺激した。これらの上清は、存在する任意のIL-17Aと相乗作用しうるTNFαなどの他のサイトカインを含むであろう。T細胞に由来する馴化培地を、抗体の存在下または非存在下でHT1080細胞に添加し、ベースラインを超えるIL-6誘導を評価した。ここから、IC50値を算出した。このアッセイのための詳細な方法を、アッセイ材料および方法の小節に提供する。
【表６ｃ】
0005385784.tif 000009
【０２８９】
2.7 HTRF(登録商標)エピトープ競合アッセイにおける最適化された抗体の選択性および種交叉反応性
IL-17ファミリーメンバーに対するリード抗体の選択性および種交叉反応性を、それぞれの最適化された抗IL-17抗体へのHIS FLAG IL-17A(自社品、HEK EBNA由来)の結合の阻害を測定することにより、HTRF(登録商標)エピトープ競合アッセイを用いて実証した。
【０２９０】
非タグ付精製ヒトIL-17A(自社品、大腸菌由来)、IL-17B (Peprotech)、IL-17C (R & D Systems)、IL-17D (Peprotech)、IL-17E (R & D Systems)、およびIL-17F (Peprotech)の滴定物を、各アッセイにおいて試験して、該アッセイ中のIC50値により測定される、それぞれのIL-17ファミリーメンバーの効力を実証した。
【０２９１】
ヒト、カニクイザル、イヌ(全て自社品、大腸菌由来)およびマウスIL-17A (R & D Systems)を含むIL-17種の滴定物を、各アッセイにおいて試験して、最適化された抗体の種交叉反応性を実証した。
【０２９２】
結果を表7にまとめる。最初のデータは、試験したリード最適化抗体はヒトIL-17Aに対して選択的であるが、ファミリーメンバーIL-17B、C、D、EおよびFを認識しなかったことを示唆していた。
【０２９３】
さらなる実験においては、抗体7と共に、1μM以上の濃度で用いた場合のヒトIL-17Fについては部分的阻害が観察された。
【０２９４】
さらに、試験した全ての最適化抗体は、様々な程度の効力で、ヒト、カニクイザルおよびイヌIL-17Aを認識した。マウスIL-17Aは、最適化抗体のいずれによっても認識されなかった。
【表７】
0005385784.tif 000010
【実施例３】
【０２９５】
ヒトIL-17Aに対する抗体の親和性
3.1 pA2分析
抗IL-17A抗体をさらに特性評価するために、pA2分析を、アッセイ材料および方法の小節に記載の方法を用いて、抗体に対して行った。これを用いて、ヒトIL-17Aに対するIgGの平衡解離定数(Kd)を見積もった。HT1080ヒト線維肉腫細胞およびHEK EBNA発現ヒトIl-17Aを用いて、分析を実施した。
【０２９６】
分析により、ヒトIL-17Aについて65 pM〜550 pMである抗IL-17 IgG親和性が算出された。そのデータの例を表8に示す。また、Biosource mAbおよび陰性対照のmAbを用いた分析も実施した。単離された抗体の親和性は、Biosource mAbよりも2〜5倍高いことが示された。
【表８ａ】
0005385784.tif 000011
【０２９７】
3.2 バイオセンサー分析を用いる結合親和性データ
BIAcore 2000 (GE Healthcare)を用いて、抗体7と異なる種のIL-17Aの間の相互作用の速度パラメーターを評価した。
【０２９８】
Biosensorは、表面プラズモン共鳴(SPR)の光学的効果を用いて、バイオセンサーチップのデキストラン層に共有結合させたリガンド分子上で流れる分析物分子の相互作用から得られる表面濃度の変化を調べるものである。典型的には、規定の濃度の分析物種を、結合させたリガンド上に流し、任意の結合を、局所SPRシグナル(結合位相)の増加として検出する。それに次いでバッファーを流す期間があり、そのときに、分析物種の解離をシグナルの低下として観察することができる(分離位相)。次いで、残りの分析物を、チップに結合したリガンドから剥がし、その手順をいくつかの異なる分析物濃度で繰り返した。通常、実験の間に一連の対照を用いて、結合したリガンドの絶対結合能力も速度プロフィールも実験全体の間に有意に変化しないことを確保する。典型的には、専用のHepes緩衝化生理食塩水(HBS-EP)を、分析物サンプルのための主要な希釈バッファーとして、および分離位相の間の流動バッファーとして用いる。実験データを、任意の共鳴単位(RU、SPRシグナルに直接対応する任意の単位である) 対 時間(秒)として記録する。RUは、チップ表面上での屈折率（これがつまり、結合した分析物の質量のおおよその尺度となる）の変化に正比例する。次いで、BIAevaluationソフトウェアパッケージを用いて、データを処理し、結合モデルをそのデータセットにフィットさせればよい。戻り結合(M-1S-1)および解離(s-1)速度定数により、結合(M-1)および解離(M)親和性定数の算出が可能になる。
【０２９９】
抗体7の親和性を、IgG1を、専用のCM3チップ表面に、最終的に300 RUの表面密度となるように共有結合(アミン結合)させた単一のアッセイを用いて評価した。次いで、組換えヒトまたはカニクイザルIL-17Aの希釈系列(0.78〜50 nM)を、抗体7の上に連続的に通過させた。リガンドのモル濃度は、280 nmでの吸光度および公開された方法を用いて算出された吸光係数に基づいていた。ブランク流の細胞データを、IgG1から減算し、HBS-EPバッファーブランクを主データセットから減算した(「二重ブランク減算」)。次いで、1:1のLangmuirモデルおよび二価分析物(Bivalent Analyte)モデルを、BIAevaluation 3.2ソフトウェアを同時に用いて各分析物濃度セットに由来するデータにフィットさせた。
【０３００】
データの検証を、算出されたChi2およびT値(パラメーター値／オフセット)により評価／制約付与したところ、それぞれ2未満および100を超えるものであった。
【０３０１】
抗体7を、CM3チップの表面に固定し、組換えIL-17変異体の希釈系列(0.78〜50 nM)を、IgG1の上に連続的に通過させた。データを1:1のLangmuirモデル(同時Ka Kd)に対して同時におよび二価分析物モデル(同時Ka Kd)に対して同時にフィットさせた。二価分析物モデルは、目で見ておよびその優れたχ2値により判断される通り、より良好なフィットを与えた。次いで、親和性定数(Kd)を速度定数比kd1/ka1から算出した。
【表８ｂ】
0005385784.tif 000012
【実施例４】
【０３０２】
ヒト一次軟骨細胞中でのIL-17Aに誘導される活性の阻害
関節軟骨の破壊は、関節リウマチおよび変形性関節症などの多くの炎症性疾患の特徴である。関節の関節軟骨内の主要な細胞型は軟骨細胞である。一次ヒト軟骨細胞を、膝置換手術の間に除去された組織から単離することができる。細胞を、コラゲナーゼ消化により軟骨から抽出し、in vitroアッセイにおける使用のために無菌条件下で培養する。組換えまたは天然のIL-17を用いて刺激した場合、軟骨細胞は、サイトカイン(IL-6、IL-8など)、PGE2およびMMP13などの分解酵素などの様々な炎症および破壊メディエーターを産生する。前記アッセイは、本明細書のアッセイ材料および方法の小節に詳細に記載されている。
【０３０３】
表9aおよび10aは、このアッセイにおいて用いられるIgG1抗体の予備データを示す。表9bおよび10bは、より大きいデータセット(n数の増加)について算出されたアップデートされたデータを示す。
【表９ａ】
0005385784.tif 000013
【０３０４】
【表９ｂ】
0005385784.tif 000014
【０３０５】
【表１０ａ】
0005385784.tif 000015
【０３０６】
【表１０ｂ】
0005385784.tif 000016
【０３０７】
【表１１】
0005385784.tif 000017
【０３０８】
【表１２】
0005385784.tif 000018
【実施例５】
【０３０９】
Balb Cマウスの空気嚢中のIL-17Aにより誘導されたin vivo生物活性の阻害
5.1 空気嚢（air pouch）の形成
Balb Cマウスをイソフルランで麻酔し、背面を剃毛した。空気嚢を形成するために、2.5 mlの濾過滅菌空気を、25gの針を用いて背側正中線で皮下注入した。マウスを、回収後そのホームケージに移し、3日目にマウスを緩やかに拘束し、2.5 mlの滅菌空気を用いて空気嚢を再度膨張させた。
【０３１０】
抗体(IgG1)を、2つの方法：抗体とIL-17を一緒に混合した後で注入する予備混合方法、および抗体を投与した後でIL-17Aを注入する全身的方法を用いて評価した。全身投与の場合、抗体を滅菌PBS中に希釈し、5日目にボーラスとして腹腔内注入した。
【０３１１】
6日目に、マウスを再度緩やかに拘束し、それぞれの動物に、単独で(対照、もしくは全身投与される動物の場合)、または抗IL-17抗体(予備混合抗体およびIL-17A)と組み合わせて、大腸菌由来ヒトIL-17A(自社試薬中)を含む1 ml容量の0.5％メチルセルロースを空気嚢内に注入した。これらの実験においては、抗体とリガンドを一緒に混合し、37℃で30分間予備インキュベートした後、空気嚢中に注入した。CO2濃度を上昇させて殺処分する時点の最終的なサンプリングまでは、マウスをそのホームケージに戻した。空気嚢からの洗浄液の回収を助けるために、4 mM EDTAを含む2 mlのPBSを、穏やかに空気嚢中に注入し、空気嚢を約15秒間穏やかに触診した。洗浄液を空気嚢から穏やかに吸引し、目盛り付ポリプロピレンチューブに静かに移した。回収された容量を記録した。サンプルを、保存のために処理するまで氷上で保持した。
【０３１２】
5.2 洗浄液の分析
総白血球(TWBC)計数
10 mlのIsotonを含むそれぞれのCoulterポットに、20μlの洗浄液を添加した。サンプルをCoulter Z1カウンター上で2回読み取り、2回の計数を各サンプルについて作製し、バックグラウンドの読み取りを2000未満に維持した。次いで、細胞数を、空気嚢から回収された洗浄容量を考慮して調整した。
【０３１３】
IL-6の定量
サンプルを1500 rpmで5分間遠心分離し、300μlの上清を96穴プレート中に3セットずつに等分し、分析の準備ができるまで-20℃で保存した。50μlの標準品、対照および洗浄液サンプルを、キットのプロトコルに記載のようにR & D Systems Quantikine Mouse IL-6サイトカインELISAキット(カタログ番号M6000B)により分析した。
【０３１４】
洗浄液中のIL-6の濃度を、450 nmでのSoftMax Pro ELISAプレートリーダーおよび540 nmの補正波長を用いてマウスIL-6標準曲線から決定した。
【０３１５】
5.3 空気嚢中でのIL-17Aにより誘導されたIL-6放出の阻害
【表１３ａ】
0005385784.tif 000019
【０３１６】
【表１３ｂ】
0005385784.tif 000020
【０３１７】
5.4 空気嚢中でのIL-17Aにより誘導された白血球流入の阻害
【表１４ａ】
0005385784.tif 000021
【０３１８】
【表１４ｂ】
0005385784.tif 000022
【実施例６】
【０３１９】
IL-17A/TNFα相乗作用アッセイ
6.1 死後の軟骨外植片におけるIL-17A/TNFα相乗作用
関節軟骨の破壊は、関節リウマチおよび変形性関節症などの多くの炎症性疾患の特徴である。関節の関節軟骨内の主要な細胞型は、軟骨細胞である。ヒト軟骨を、膝置換手術の間に、または死後のドナーから取り出された組織から単離することができる。外植片ディスクを軟骨から切り取り、軟骨細胞をその細胞マトリックス内に保持しながら、in vitroアッセイにおける使用のために無菌条件下で培養した。IL-17AまたはTNFαで刺激した場合、外植片は、IL-6などのサイトカインを含む様々な炎症性および破壊メディエーターを産生する。このアッセイの詳細な方法は、アッセイ材料および方法の小節に提供されている。
【０３２０】
軟骨外植片中でのIL-17/TNFα相乗作用アッセイにおける抗体の機能的効果を評価するための最初の実験においては、限られた組織供給のため、IC50データを作製しなかった。結合メンバーの非存在下(0％阻害)での阻害％ 対 応答を、所与の濃度の結合メンバーについて算出した。データを表15aに示す。さらなる実験においては、表15bに示されるように、IC50データを算出した。
【０３２１】
IL-17AおよびTNFαは一緒になって、相乗作用IL-6応答を誘導したが、これはIL-17A中和抗体により阻害された。アイソタイプ対照抗体は相乗作用応答に影響しなかった。
【表１５ａ】
0005385784.tif 000023
【０３２２】
【表１５ｂ】
0005385784.tif 000024
【０３２３】
6.2 OA滑膜線維芽細胞におけるIL-17A/TNFα相乗作用
関節リウマチなどの疾患における関節損傷の特徴としては、例えば、マクロファージ、T細胞、B細胞および増殖中の線維芽細胞などの免疫系の細胞から構成される炎症性滑膜の存在が挙げられる。炎症性滑膜を、関節置換手術の間に除去された関節組織から単離することができる。滑膜をコラゲナーゼ消化し、単離された細胞を、主に線維芽細胞組成物と共に、in vitroアッセイにおける使用のために無菌条件下で培養する。IL-17AまたはTNFαで刺激された場合、線維芽細胞はIL-8などの様々な炎症性および破壊メディエーターを産生する。このアッセイに関する詳細な方法は、アッセイ材料および方法の小節に提供されている。
【０３２４】
IL-17AおよびTNFαは一緒になって、2つの異なるセットのサイトカイン濃度を用いて相乗作用IL-8応答を誘導した。この応答はIL-17A中和抗体を用いることで低下したが、アイソタイプ対照抗体は相乗作用応答に影響しなかった。
【表１６ａ】
0005385784.tif 000025
【０３２５】
【表１６ｂ】
0005385784.tif 000026
【０３２６】
6.3 RA滑膜線維芽細胞中でのIL-17AおよびIL-17A/TNFαが誘導するIL-8の阻害
6.2節に概略されたように、炎症性滑膜はRAの重要な特徴である。RA滑膜を、記載のものと同じ方法を用いてRA関節置換手術の間に除去された関節組織から単離することもできる。これらの細胞は、疾患に関連し、IL-8などのサイトカインを産生することによりIL-17AおよびTNFαに応答する。両サイトカインを同時に添加する場合、相乗作用応答が生じる。このアッセイに関する詳細な方法は、アッセイ材料および方法の小節に提供されている。
【表１７】
0005385784.tif 000027
【実施例７】
【０３２７】
ヒトIL-17Aへの抗体7の結合のエピトープマッピング
7.1 抗体7によるIL-17AのH/D交換速度の摂動
第1の実験においては、IL-17Aを溶液中のD2Oに交換し、カラム上に固定した抗体7 (IgG1)に結合させた後、抗体カラムに依然として結合させたまま、H2O中に戻し交換し、戻し交換反応の際にエピトープを保護し、結果として重陽子で標識した。第2の実験においては、IL-17Aを最初にカラム上の抗体7 (IgG1)に結合させた後、D2Oで標識し、最後に、IL-17Aのいかなる部分も重陽子で標識されないように、依然としてカラムに結合させたまま、H2O中に戻し交換した。次いで、2つの実験間のペプチド質量の差異を決定した。2つの実験間の重陽子レベルの差異は、抗体に結合した場合の交換の遅延の尺度である。このプロトコルに関する詳細な方法は、材料および方法の小節に提供されている。
【０３２８】
N末端タグ付IL-17Aを、図1に示される配列(配列番号197)と共にこの試験において用いた。残基1-21は、検出目的のために付加されたペプチドタグであり、特にタグ中のリジン残基での酵素ビオチン化を可能にする「Avitag(商標)」を含む。Gly22は、成熟IL-17Aの1番目の残基である。
【０３２９】
H/D交換の速度において大幅な摂動を示す唯一の領域は、配列CRHLGCINADGNVDYHM(配列番号199)を含む図1に示される配列番号197のアミノ酸92-108であった。この配列は、成熟ヒトIl-17A(配列番号198)の残基71-87に対応する。
【表１８】
0005385784.tif 000028
【０３３０】
7.2 抗体7へのIL-17A変異体の結合の分析
実施例7.1で同定されたエピトープが正確であることを確認するために、第2の手法を採った。これは、抗体7はマウスIL-17Aに結合しないが、マウスIL-17AはヒトIL-17A受容体を介してシグナル伝達し、IL-6の合成を誘導するという知見を利用したものである。実施例7.1で同定されたペプチド配列(CRHLGCINADGNVDYHM、配列番号199)は、ヒト配列とマウス配列の間で7個の変化を有する。この領域が実際に抗体7により結合したエピトープを含むならば、これらの7個の残基の全部をヒト残基からマウス等価物に変化させる場合、得られるIL-17A変異体はヒト受容体で依然として機能するが、もはや抗体7により結合または阻害されないと予想されるであろう。
【０３３１】
IL-17A変異体は以下の変化(L74Q, G75R, I77V, D80E, N82K, V83L, Y85H)を有し、図2に示す(配列番号200)。シグナル配列の除去後、1番目の残基はGly24である。5個のヒスチジン残基をC末端に付加して、精製を援助した。ヒトIL-17A変異体の成熟形態は、配列番号201である。
【０３３２】
そこでIL-17A変異体を、哺乳動物HEK/EBNA細胞系中でクローニングし、発現させた。培養培地を回収し、Niクロマトグラフィーを用いてタンパク質を精製した。このプロセスの詳細な説明は材料および方法の小節に与えられている。野生型IL-17Aをクローニングした後、同じプロトコルにより発現させ、精製した。
【０３３３】
野生型と変異体IL-17A分子の結合を、製造業者の説明書に従って、CM5チップに固定した抗体7(IgG1)を用いてBIAcoreにより分析した。これにより、5275応答単位(RU)の固定が得られた。
【表１９】
0005385784.tif 000029
【０３３４】
対照IgG(Cambridge Antibody Technology)への結合は存在しなかった。野生型IL-17Aは、固定された抗体7に強力に結合した。対照的に、IL-17A変異体は抗体7への結合を示さなかった。観察された低いRUシグナルは、バックグラウンドである「ノイズ」のみに帰することができる。IL-17A変異体への検出可能な結合の非存在は、実施例7.1に示された配列(配列番号199)が抗体7により認識されるエピトープの少なくとも一部を含むこと、すなわち、該抗体が配列番号199内の1個以上の残基に結合することのさらなる証拠を提供する。
【０３３５】
7.3 突然変異形態のIL-17Aにより誘導されるHT1080細胞からのIL-6放出に対する抗体の効果
IL-17A変異体(実施例7.2に記載の変異体)の生物活性を決定するために、HT1080ヒト線維肉腫細胞アッセイにおいて応答を評価した。アッセイ方法の詳細については、「アッセイ材料および方法」の小節を参照されたい。
【０３３６】
このアッセイにおいては、IL-6放出に対する、IL-17A(大腸菌、PeprotechもしくはHEK EBNA、自社品由来)またはIL-17A変異体(自社品、HEK EBNA由来)のEC50を評価した(表20a)。第2に、そのIC50値により決定される、抗IL-17 IgG(最大50 nM)の阻害活性を、IL-17AまたはIL-17A変異体(最大未満の濃度を用いた)に応答して測定した。様々な形態のIL-17Aに対する例としての抗体7(IgG1として)の効力を表20bに示す。対照IgGは、このアッセイにおけるIL-6応答の阻害を示さなかった。
【表２０ａ】
0005385784.tif 000030
【０３３７】
【表２０ｂ】
0005385784.tif 000031
【０３３８】
7.4 IL-17A抗体複合体のX線結晶構造決定
抗体7のFabに結合したIL-17Aの構造を、X線結晶解析により決定した。Fab生成、Il-17Aタンパク質調製、結晶化および結晶解析の方法は、材料および方法の小節に記載されている。
【０３３９】
IL-17A/Fab複合体の結晶を取得したところ、それは単斜晶空間群P21の薄いプレートであった。2.6Å分解能に対する完全な回折データを得た。この構造を、試行モデルとしてFabフラグメントを用いる分子置換により解析し、結晶学的非対称単位中に該Fabフラグメントを配向させ、位置決定することができる。非対称単位中に4個のFabフラグメントが存在していた。IL-17Aダイマーをモデル化することができるさらなる電子密度が存在した。2つのIL-17Aダイマーが、非対称単位中に認められた。
【０３４０】
結晶構造においては、それぞれのIL-17Aダイマーは2つのFabフラグメントに結合する。IL-17Aダイマーは、長いβ鎖を特徴とする長い分子である。この構造は、IL-17Fについて報告されたものと類似している(Hymowitzら、2001)。IL-17Aダイマーは、2つのFabフラグメント間に挟まれている。2つの相互作用部位は等価であり、すなわちそれらはIL-17Aダイマーの対称性により関連する。結合しているFabフラグメントから遠位のIL-17Aダイマーの部分は乱雑である、すなわち、電子密度が平均するように結晶を通じて、可撓性であり、異なる向きを採用する。かくして、IL-17Aダイマーのこの部分のモデルを構築するのは不可能である。従って、前記複合体は、Fab分子のみを介して媒介される結晶格子相互作用を作る。Hymowitzら(2001)により用いられた記述子を使用すると、エピトープ相互作用部位は構造の「襟」に近いが、反対の末端の「スカート」領域は乱雑である。
【０３４１】
前記結晶構造により、IL-17AとFabとの間のエピトープ相互作用を原子的に詳細に試験することができる。これらを表22に示す。
【０３４２】
0005385784.tif 000032
【０３４３】
表22においては、残基番号は、鎖の表示を含む(H：Fab重鎖、L：Fab軽鎖、A：IL-17A中のモノマーA、B：IL-17A中のモノマーB)。IL-17Aの残基番号は、配列番号198の成熟配列に対応する。Fab VHおよびVLドメインの残基番号は、それぞれ配列番号62および配列番号176に対応する。Fabに関するKabatの残基番号も示す。*星印は、Fabフレームワーク残基を示す。水素結合に用いたカットオフ距離は3.2Åであり、非極性相互作用については4.0Åである。
【０３４４】
この距離を、CCP4プログラムCONTACT (CCP4, 1994)を用いて取得した。それらは等価であるため、2つの相互作用部位の1つを記載することのみが必要である。この相互作用は、抗体フラグメントの重鎖および軽鎖の両方に由来する相補性決定領域(CDR)、ならびにIL-17Aダイマー中の両モノマーに由来するアミノ酸残基を含む。抗体重鎖は、IL-17Aダイマー中のA鎖およびB鎖の両方と相互作用するが、軽鎖はモノマーBとのみ相互作用する。相互作用部位の一部を形成するIL-17A中のアミノ酸残基は、A鎖中のSer40〜Tyr43の全部、およびArg46であり、ならびにダイマーのB鎖中のLeu74、Pro91、Tyr85〜Asn88およびPro126〜Ile127である。Fab軽鎖から関与する残基は、Ala30〜Tyr33の全部、Phe50、Gln54、Tyr94およびPro96である。重鎖に由来する残基は、Thr28、Ser30〜Tyr32、Tyr59、およびL100〜H102である。かくして、IL-17A中では、12個のアミノ酸がエピトープ部位を形成し、抗体中の16個のアミノ酸残基と相互作用する。この相互作用は、9個の水素結合および非極性ファン・デル・ワールス相互作用(疎水性相互作用とも呼ばれる)を含む。いくつかの疎水性相互作用は、芳香系のパイ電子などの電子スタッキング相互作用を含む。
【０３４５】
結晶構造の試験により、IL-17と相互作用するようであるFabの残基のうちのいくつかを、相互作用を維持する他の残基に置換することができることが示された。
【０３４６】
例えば、Ala30L(LCDR1中のKabatの残基29)とIL-17の間の水素結合は、アラニンの主鎖酸素に対するものであり、結合メンバーの表面に位置するAla側鎖を含まない。これは、他のアミノ酸残基を、相互作用を失うことなくこの位置でAlaに置換することができ、かくして、IL-17Aに対する結合メンバーの親和性の喪失をもたらさないことを示唆している。
【０３４７】
また、水素結合は、Ser31H、Leu100H、Ala30LおよびHis102Hで結合メンバーの主鎖の原子間でも形成され、これは他の残基を、これらの水素結合を失うことなく、これらの位置で置換することができることを示唆している。
【０３４８】
Asn31L (LCDR1中のKabatの残基30)の主鎖C-αは、Il-17との非極性相互作用を形成し、この残基を置換することによって影響されないであろう。
【０３４９】
以下は、構造の試験、ならびに相互作用の位置および性質の考慮、ならびに立体的拘束に基づいて、IL-17と相互作用することが示される残基の、さらなる、非網羅的な例である：
・HCDR1のKabatの残基31のSer、Ala、Gly、ThrまたはCys
・HCDR1のKabatの残基32のTyr
・HCDR2のKabatの残基58のTyrまたはPhe
・Kabatの残基96の疎水性残基、例えば、Leu、Ile、Val、AlaまたはPhe
・HCDR3のKabatの残基97の疎水性残基、例えば、Ile、Leu、Val、AlaまたはPhe
・HCDR3のKabatの残基98の環状残基、例えば、His、TrpまたはPhe
・LCDR1のKabatの残基31のTyrまたはPhe
・LCDR1のKabatの残基32のTyrまたはPhe
・LCDR2のKabatの残基53の極性残基、例えば、Gln
・LCDR3のKabatの残基91のTyr
・LCDR3のKabatの残基93のPro、ヒドロキシプロリン、His、3-メチルヒスチジンまたはAsp
・重鎖FR1中のKabatの残基28のThrまたはSer
・重鎖FR1中のKabatの残基30のSerまたはThr
・軽鎖FR2中のKabatの残基49の疎水性残基、例えば、Phe、TyrまたはHis。
【０３５０】
0005385784.tif 000033
【０３５１】
アッセイ材料および方法
HEK EBNA細胞
HEK EBNA細胞(ATCCカタログ番号CRL-10852)を、Invitrogenから取得した。
【０３５２】
IL-17濃度
以下および本明細書の他の場所に記載の全てのアッセイにおいては、IL-17AまたはIL-17相同体の濃度は、ジスルフィド結合したIl-17ホモダイマーの濃度を指す。
【０３５３】
受容体-リガンド結合HTRF(登録商標)アッセイ
選択出力を、ビオチン化ヒトIL-17A(Peprotech 200-17)、またはHIS FLAGタグ付ヒトIL-17A(自社品、HEK EBNA由来)結合IL-17RA Fc融合タンパク質(R & D Systems 177-IR)の阻害について、受容体-リガンド結合HTRF(登録商標)(均一時間分解蛍光)アッセイ形式でスクリーニングした。
【０３５４】
HTRF(登録商標)(均一時間分解蛍光)アッセイは、近い部位にあるドナーおよびアクセプターフルオロフォア間の蛍光共鳴エネルギー遷移を用いる均一アッセイ技術である。そのようなアッセイを用いて、目的の分子の1つを、ドナーフルオロフォアであるユーロピウム(Eu3+)クリプタートに直接または間接的に結合させ、目的の他の分子をアクセプターフルオロフォアであるXL665(安定な交叉結合アロフィコシアニン)に結合させることにより、大分子の相互作用を測定することができる。クリプタート分子の励起(337 nm)により、620 nmの蛍光放出が得られる。この放出からのエネルギーを、クリプタートの近くでXL665に移し、XL665からの特異的長命蛍光(665 nm)の放出をもたらすことができる。ドナー(620 nm)およびアクセプター(665 nm)の両方の特異的シグナルを測定し、アッセイ中の着色化合物の存在を相殺する665/620 nmの比を算出することができる。
【０３５５】
50 mM MOPSバッファーpH 7.4、0.5 mM EDTAおよび0.5 Mソルビトール中で調製されたペリプラズム抽出物を含む、希釈されていない(リード単離物)または希釈(リード最適化)された粗scFvとして、出力をスクリーニングした。3 nMビオチン化ヒトIL-17A(6 nMモノマー)または3 nM HIS FLAGタグ付ヒトIL-17A(6 nMモノマー)を、暗室中、室温で1時間、それぞれ、3.2 nMストレプトアビジンクリプタート(CIS Bio International 610SAKLB)、またはクリプタート(CIS Bio International 61GF2KL)で標識された1.6 nM抗flag IgGと共に予備インキュベートした。全ての希釈を、0.4 Mフッ化カリウムおよび0.1％ BSAを含む50 mM HEPESバッファー(アッセイバッファー)中で行った。並行して、12 nMのIL-17RA Fc融合タンパク質を、アッセイバッファー中、XL665(CIS Bio International 61HFCXLA)で標識された40 nM抗ヒトFc抗体と共に、暗室中、室温で1時間予備インキュベートした。
【０３５６】
試薬の予備インキュベーション後、10μlの粗scFvサンプルを、384穴低容量アッセイプレート(Costar 3676)に添加した。次いで、5μlの予備インキュベートされた受容体および抗Fc XL665ミックスを添加した後、5μlのヒトIL-17Aおよびクリプタート検出ミックスを添加した。
【０３５７】
アッセイにおいて用いたIL-17Aの最終濃度は、0.75 nMであった。
【０３５８】
次いで、アッセイプレートを、室温で1分間、1000 rpmで遠心分離し、室温で5時間インキュベートした後、EnVisionプレートリーダー(Perkin Elmer)を用いて620 nmおよび665 nmの放射波長で時間分解蛍光を読み取った。
【０３５９】
データを、各サンプルにつきデルタF値(％)を算出することにより分析した。デルタFを、式1に従って決定した。
【０３６０】
式１：
0005385784.tif 000034
【０３６１】
続いて、デルタF(％)を用いて、式2に記載のように特異的結合(％)を算出した。
【０３６２】
式２：
0005385784.tif 000035
【０３６３】
スクリーニングから同定された陽性クローンに由来する精製されたscFvを、IL-17受容体へのIL-17Aの結合の阻害について、両方のHTRF(登録商標)アッセイにおいて試験した。scFv濃度の滴定物を用いて、アッセイにおけるIC50値により測定されるクローン効力を実証した。4パラメーターロジスティック方程式(式3)を用いる曲線フィッティングによるGraphPad Prismソフトウェアを用いて、IC50値を決定した。
【０３６４】
式３：
0005385784.tif 000036
【０３６５】
(式中、Xは濃度の対数である。Yは特異的結合である。Yは底で開始し、シグモイド型で頂上に向かう)
【０３６６】
参照抗IL-17 mAb (Biosource)を、陽性対照として全てのアッセイに含ませた。
【０３６７】
HIS FLAGヒトIL-17A結合抗ヒトIL-17A抗体の阻害に関するエピトープ競合HTRF(登録商標)アッセイ
このエピトープ競合アッセイを用いて、IL-17Aの結合に関する結合メンバー間の競合を決定することができる。このアッセイを用いて、異なる種に由来するIL-17A、例えばヒトとカニクイザルのIL-17Aへの結合に関する結合メンバーの交叉反応性、および／または他のIL-17ファミリーメンバー、例えば、IL-17相同体A〜Fに対する結合メンバーの交叉反応性を決定することもできる。このアッセイにおいて試験する結合メンバーは、通常はscFv形式であるが、当業者であれば、IgGまたは他の結合メンバー形式での使用のためにこのアッセイを適合させることができる。一般的には、試薬の濃度は、IL-17Aに対する前記抗体の親和性に依存して変化するであろう。
【０３６８】
2 nMのヒトHIS FLAG IL-17A (4 nMモノマー)を、暗室中、室温で1時間、クリプタートで標識された1.6 nMの抗flag IgGと共に予備インキュベートした。全ての希釈を、アッセイバッファー中で行った。並行して、0.6 nMの抗Il-17 IgG1(試験結合メンバーの競合を試験する)を、暗室中、室温で1時間、アッセイバッファー中のXL665で標識された20 nMの抗ヒトFc抗体と共に予備インキュベートした。
【０３６９】
試薬の予備インキュベーション後、10μlのサンプルを、384穴低容量アッセイプレートに2つずつ添加した。この後、5μlの予備インキュベートされたHIS FLAGヒトIL-17Aおよび抗Flagクリプタートミックス、次いで、5μlの抗ヒトIL-17抗体およびXL665検出ミックスを添加した。
【０３７０】
次いで、アッセイプレートを、室温で1分間、1000 rpmで遠心分離し、室温で2時間インキュベートした後、EnVisionプレートリーダー(Perkin Elmer)を用いて620 nmおよび665 nm放射波長で時間分解蛍光を読み取った。
【０３７１】
各サンプルにつきデルタF値(％)を算出した後、これを用いて特異的結合(％)を決定することにより、データを分析した。IC50値を、Garphpad Prismソフトウェアを用いて決定した。
【０３７２】
HTRFアッセイの考察については、一般的には受容体-リガンド結合HTRF(登録商標)アッセイに関する方法を参照されたい。
【０３７３】
HT1080 IL-17誘導IL-6放出アッセイ
HT1080細胞(European Collection of Cell Cultures, ECACC番号85111505の下で入手可能)を、5 x 104細胞／ウェルで96穴平底組織培養アッセイプレート(Costar)中に播種した。次いで、細胞を200μlのアッセイ培地(Earles塩およびL-グルタミン(Invitrogen)を含む最少必須培地(MEM)、10％(v/v)熱不活化ウシ胎仔血清(FBS)(Invitrogen)、L-グルタミンを含まない1％(v/v)MEM-非必須アミノ酸(Invitrogen))中、37℃および5％CO2の加湿雰囲気中で一晩培養した。
【０３７４】
精製されたscFv/IgGの滴定物を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で調製し、アッセイ培地中、IL-17A(1 nM最終濃度)と共に、37℃で30-60分間、予備インキュベートした。並行して、培地を細胞から吸引し、100μl/ウェルのアッセイ培地を添加した。これに100μl/ウェルのサンプルを添加し、一晩(18時間±4時間)インキュベートした。上清を収穫し、すぐにアッセイするか、または-20℃で保存した。
【０３７５】
上清中のIL-6レベルを、ヒトIL-6 Duoset ELISAキット(R & D Systems)を用いて決定した。2μg/mLのIL-6捕捉抗体(Ab)(PBS中に希釈、100μl/ウェル)で一晩コーティングされたFluoroNunc Maxisorbプレート上で、ELISAを行った。ELISAプレートをPBS-Tweenで3回洗浄し、300μlの試薬希釈液を添加した(PBS中の1％ウシ血清アルブミン(BSA))。室温(RT)で1時間インキュベートした後、ELISAプレートを以前に記載のように洗浄した。1時間のインキュベーション期間に、馴化培地を1200 rpmで5分間遠心分離して、細胞破片を除去した。プレートの洗浄および馴化培地の調製後、IL-6標準品(濃度範囲1000 pg/ml〜1 pg/ml)および170μlの馴化培地をELISAプレートに添加し、RTで90分インキュベートした。
【０３７６】
インキュベーション後、サンプルを除去し、プレートを以前に記載のように洗浄した。次いで、試薬希釈液(100μl/ウェル)中、200 ng/mlのIL-6検出Abをプレートに添加し、RTで60分間インキュベートした。次いで、プレートを以前に記載のように洗浄し、100μlのストレプトアビジンユーロピウムをDELFIA(登録商標)アッセイバッファー(Perkin Elmer)中、1:1000に希釈し、RTで60分間インキュベートした。次いで、ELISAプレートをDELFIA(登録商標)洗浄バッファーで7回洗浄し、100μlのDELFIA(登録商標)増強(Perkin Elmer)を添加した。蛍光を、製造業者の説明書に記載のようにVictorプレートリーダー(Perkin Elmer)を用いて615 nmで定量した。
【０３７７】
各プレートにつきIL-6標準品から標準曲線を作製することにより、Excel (Microsoft)でデータを分析し、これを用いて、各ウェル中に存在するIL-6の量を算出した。また、阻害剤のデータを、阻害剤対照の非存在下およびIL-6対照なしでのIL-6に由来する値を用いて、最大IL-6放出の割合に対して正規化した。データをscFv/IgGのlog濃度に対する対照応答の％としてプロットするPrism (GraphPad)中でさらなる分析を行った。IC50値の決定を、Prism曲線フィッティングソフトウェア(Graphpad)を用いて算出した。
【０３７８】
相乗作用IL-6放出を測定するHT1080細胞アッセイ
このアッセイは、以前に記載されたHT1080 IL-17誘導IL-6放出アッセイの改変であり、IL-6を、ヒトIL-17A、およびヒトTNFα(R & D Systems)の添加に応答して相乗的に産生させる。
【０３７９】
精製されたscFv/IgGの摘定物を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で調製し、アッセイ培地中、IL-17A(125 pMのIL-17最終濃度)と共に、37℃で30-60分間、予備インキュベートした。並行して、培地を細胞から吸引し、ヒトTNFαを含む100μl/ウェルのアッセイ培地を添加した(最終TNFα濃度25 pM)。これに、100μl/ウェルのサンプルを添加し、一晩(18時間±4時間)インキュベートした。上清を収穫し、IL-6についてすぐにアッセイするか、または-20℃で保存した。
【０３８０】
IL-6レベルをELISAにより測定し、HT1080 IL-17誘導IL-6放出アッセイについて以前に記載されたようにデータを分析した。
【０３８１】
天然IL-17Aの作製およびHT1080細胞からのT細胞馴化培地誘導IL-6産生に対する抗体の効果
200 mlのヒト血液を、3人のドナーからヘパリンを含む血液バッグ中に回収した。血液をlymphoprepに上層し(Greiner Leucosepチューブ中の15 mlのlymphoprep上に30 mlの血液)、遠心分離した(2000 rpm、20分、室温、ブレーキなし)。血漿を新鮮なチューブ中に取り出し、遠心分離し、これを用いて、滅菌した0.9％塩水中で5％自己血漿を作製した。境界上の単核細胞(PBMC)層を、4本の50 ml遠心チューブに取り出し、各チューブ中の容量を、培地(10％ hiFCS、グルタミン(2 mM)、ペニシリン(100 U/ml)およびストレプトマイシン(0.1 mg/ml)および1％非必須アミノ酸を補給したRPMI)を用いて2倍にした。
【０３８２】
PBMCを遠心分離し(1800 rpm、10分、室温)、細胞ペレットをそれぞれ約15 mlの5％血漿中に再懸濁し、各ドナーのためにプールした。PBMCを5％血漿中で3回洗浄して(1000 rpm、10分)、血小板数を減少させた後、2 mlの培地中に再懸濁した。
【０３８３】
PBMCをナイロンウールカラム(Polysciences #425A、使用前に、培地中に浸し、37℃に温めた)に加え、インキュベート(1時間、37℃)した。次いで、20 mlの培地を滴下しながらカラムに添加し、精製されたT細胞を含む流出液を回収した。
【０３８４】
抗CD3/抗CD28(Sigma、両方とも最終的に1μg/ml)、TGFβ(R & D Systems、5 ng/ml)、IL-23 (R & D Systems、50 ng/ml)、抗IFNγ(R & D Systems、10μg/ml)およびヤギ抗マウスIgG交叉リンカー(Sigma、4μg/ml)の存在下で、最終的に5 x 106細胞／mlで、T細胞を刺激した。交叉リンカーの添加前に抗CD3/抗CD28の添加後に15分間放置した。T細胞を37℃で48時間刺激した。細胞を遠心分離(1000 rpm、5分間)し、上清を除去した。
【０３８５】
HT1080細胞を、37℃および5％CO2の加湿雰囲気中、培地(10％ hiFCS、グルタミン(2 mM)、ペニシリン(100 U/ml)およびストレプトマイシン(0.1 mg/ml)および1％非必須アミノ酸を補給したDMEM)中、96穴プレート(Costar)中に1.5 x 104細胞／ウェルで一晩播種した。
【０３８６】
抗体の滴定物を上記のように培地中で調製した。等量の抗体溶液を、条件化T細胞培地と混合し、インキュベート(37℃、1時間)した。培地を細胞から除去し、抗体溶液と置換し、細胞を一晩インキュベートした。上清を収穫し、記載のようなIL-6 ELISA (Cytoset, Biosource)を用いて分析するまで-20℃で保存した。IL-6値をOrigin v7.5 (OriginLab Corporation)を用いてプロットして、抗体の非存在下での応答と比較したIL-6放出の阻害に関するIC50値を算出した。
【０３８７】
軟骨細胞IL-6/IL-8/MMP13/PGE2-放出アッセイ
地方倫理委員会の認可の下で、変形性関節症を有する患者からの膝関節置換後に軟骨を取得した。サンプルを2 mg/mlのコラゲナーゼ中、37℃で一晩消化した。消化後、軟骨細胞を、10％ウシ胎仔血清、ペニシリン(100単位)、ストレプトマイシン(0.1 mg/ml)、L-グルタミン(2 mM)、アンホテラシンB(2.5μg/ml)および非必須アミノ酸(1X)を補給したダルベッコ改変イーグル培地を含む培養フラスコ中で増殖させた。4つの別々の細胞系を培養し、継代1代目で用いた。軟骨細胞を収穫し、96穴プレート中に、培養培地中1.5 x 104細胞／ウェルの密度で塗布し、静置して37℃、5％CO2で一晩接着させた。
【０３８８】
抗IL-17A抗体を、アッセイ培地(2％ウシ胎仔血清、ペニシリン(100単位)、ストレプトマイシン(0.1 mg/ml)、L-グルタミン(2 mM)、および非必須アミノ酸(1X)を補給したダルベッコ改変イーグル培地)中、様々な濃度(0.08〜400 nMの範囲)で希釈した。組換えヒトIL-17A(自社品またはPeprotech大腸菌由来)をアッセイ培地中に希釈し、0.2および2 nMの最終濃度で試験した。組換えIL-17Aを抗IL-17抗体溶液に添加し、1時間予備インキュベートした。培地を軟骨細胞から取り出し、100μlの組換えIL-17/抗IL-17A抗体ミックスを添加した。24時間のインキュベーション後、培養上清を回収した。ヒトIL-6、IL-8、MMP13およびPGE2を、ELISAにより測定した。
【０３８９】
ヒトIL-6産生の検出のためのELISA：
IL-6を、製造業者の説明書に従って、ELISA, Cytoset (Biosource, CHC1264)により測定した。簡単に述べると、ELISAプレートを4℃で一晩、モノクローナルIL-6抗体(1μg/ml)でコーティングし、1％BSA/重炭酸バッファーを用いてブロックした。プレートを0.05％Tween 20/PBSで洗浄し、ヒト軟骨細胞およびビオチン結合マウス抗huIL-6抗体(0.4μg/ml)に由来する培養上清と共に、室温で2時間インキュベートした。洗浄後、西洋わさびペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン(1:2500)を用いることにより、IL-6を検出した。プレートを、3,3',5,5'-テトラメチルベンズイジンを用いて展開した。反応を2 M H2SO4を用いて停止させ、光学密度を、PHERAstarプレートリーダーを用いて450 nmで決定した。
【０３９０】
ヒトIL-8産生の検出のためのELISA：
IL-8を、製造業者の説明書に従って、ELISA, Cytoset (Biosource, CHC1304)により測定した。簡単に述べると、ELISAプレートを4℃で一晩、モノクローナルIL-8抗体(1μg/ml)でコーティングし、1％BSA/重炭酸バッファーを用いてブロックした。プレートを0.05％Tween 20/PBSで洗浄し、ヒト軟骨細胞およびビオチン結合マウス抗huIL-8抗体(0.1μg/ml)の培養上清と共に、室温で2時間インキュベートした。洗浄後、西洋わさびペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン(1:5000)を用いることにより、IL-8を検出した。プレートを、3,3',5,5'-テトラメチルベンズイジンを用いて展開した。反応を2 M H2SO4を用いて停止させ、光学密度を、PHERAstarプレートリーダーを用いて450 nmで決定した。
【０３９１】
ヒトMMP13産生の検出のためのELISA：
ELISAプレートを4℃で一晩、リン酸バッファー中の抗huMMP13モノクローナル抗体(R & D Systems, MAB511: 1μg/ml)でコーティングした。プレートを2％BSA/リン酸バッファーを用いてブロックした後、0.05％Tween 20/PBSで洗浄し、ヒト軟骨細胞およびウサギ抗huMMP13ポリクローナル抗体(Abcam 9128: 1:2500希釈)に由来する培養上清と共に、37℃で2時間インキュベートした。洗浄後、西洋わさびペルオキシダーゼ結合抗ウサギIgG (Amersham Biosciences NA934: 1:2500)を用いてMMP13を検出した。プレートを、3,3',5,5'-テトラメチルベンズイジンを用いて展開した。反応を2 M H2SO4を用いて停止させ、光学密度を、PHERAstarプレートリーダーを用いて450 nmで決定した。
【０３９２】
ヒトPGE2産生の検出のためのELISA：
ELISAプレートを4℃で一晩、マウス抗ウサギIgG(Sigma, R2004: 10μg/ml)でコーティングした。プレートを0.05％Tween 20/PBSで洗浄し、ヒト軟骨細胞、プロスタグランジンAchE Tracer (Cayman Chemicals, 414010)およびPGE2抗血清(自社品で調製、1:50,000)に由来する培養上清と共に、室温で一晩インキュベートした。洗浄後、Ellmanの試薬 (Cayman Chemicals, 400050)を用いてプレートを展開し、光学密度を、PHERAstarプレートリーダーを用いて405 nmで決定した。
【０３９３】
死後の軟骨外植片におけるIL-17相乗作用アッセイ
死後の膝サンプルを、完全な倫理的認可の下、Kings Mill Hospital, Nottinghamから、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中に取得した。それぞれの膝を、滅菌条件において22番の外科用メスを用いて切り裂いた。軟骨を、可能な場合、完全な深さの小片として単離した。外植片ディスクを、穿孔器(5 mm)を用いて切断し、220μlの培地(ペニシリン(100 U/ml)、ストレプトマイシン(0.1 mg/ml)、グルタミン(2 mM)、1％非必須アミノ酸およびゲンタマイシン(1μg/ml)を補給したDMEM(フェノールレッドを含まない))中、96穴プレートのウェルあたり1個の外植片として塗布した。外植片を3日間休ませた後、刺激した。それぞれの条件は、12回反復の外植片を有していた。
【０３９４】
用いた刺激原は、培地のみ、全て硫酸ポリミキシンB(2μg/ml)を含む培地中に希釈された、10 ng/mlのIL-17A (Peprotech)、1 ng/mlのTNFα(Peprotech)のみ、または組合せであった。抗IL-17A中和抗体およびそのアイソタイプ対照(マウスIgG1(R & D Systems)、ヒトIgG1 CAT002 (Cambridge Antibody Technology Limited))を、2μg/mlポリミキシンBを含む培地中、最初の実験については50 nMに、およびIC50実験については0.5〜50 nMに希釈した。抗体を、指示される場合サイトカインと混合し、全ての溶液をインキュベートした後、外植片に添加した(37℃、30分)。
【０３９５】
培地を外植片から除去し、220μlの刺激培地と置換した。プレートを72時間インキュベート(37℃、加湿雰囲気)した後、-20℃での保存のために上清を除去した。IL-6含量を、製造業者の説明書に従って、および実施例3(ヒトIL-17Aに対する抗体の親和性)に記載のようにELISA (Cytoset, Biosource)により分析した。値を、Origin v7.5 (OriginLab Corporation)を用いて算出した。
【０３９６】
OA滑膜線維芽細胞におけるIL-17A相乗作用アッセイ
全関節置換に由来する変形性関節症の膝のサンプルを、完全な倫理的認可の下、Kings Mill Hospital, Nottinghamから、DMEM中に取得した。それぞれの膝を、滅菌条件において22番の外科用メスを用いて切り裂いた。炎症性滑膜を関節から切り取り、滅菌T75cm2フラスコ中に入れた。滑膜の小片を、ペニシリン(100 U/ml)、ストレプトマイシン(0.1 mg/ml)、グルタミン(2 mM)、1％非必須アミノ酸およびアンホテラシンB(2.5μg/ml)を補給したDMEM中のコラゲナーゼ溶液(2 mg/ml)中、37℃で維持された加湿したインキュベーター中で24時間インキュベートした。
【０３９７】
消化された滑膜細胞懸濁液を、細胞株化し、洗浄し、37℃に維持した加湿したインキュベーター中、ペニシリン(100 U/ml)、ストレプトマイシン(0.1 mg/ml)、グルタミン(2 mM)、1％非必須アミノ酸およびアンホテラシンB(2.5μg/ml)を補給したDMEM中で細胞培養した。細胞を1〜2週間毎に継代し、継代2代目で用いた。細胞を、トリプシン-EDTAを用いてフラスコから分離し、1.5 x 104細胞／ウェルで96穴プレート中に塗布し、塗布の1日後に用いた。
【０３９８】
用いた刺激原は、培地のみ、単独または組み合わせたIL-17A (Peprotech)、TNFα(Peprotech)であった。抗IL-17A中和抗体およびそのアイソタイプ対照(マウスIgG1(R & D Systems)、ヒトIgG1 CAT002 (Cambridge Antibody Technology Limited))を、1μg/mlポリミキシンBを含む培地中、50 nMに希釈した。抗体を、指示される場合、サイトカインと混合し、全ての溶液をインキュベートした後、外植片に添加した(37℃、30分)。
【０３９９】
培地を細胞から除去し、100μlの刺激培地と置換した。プレートを24時間インキュベート(37℃、加湿雰囲気)した後、-20℃での保存のために上清を除去した。IL-8含量を、製造業者の説明書に従って、および実施例3(ヒトIL-17Aに対する抗体の親和性)に記載のようにELISA (Cytoset, Biosource)により分析した。値を、Origin v7.5 (OriginLab Corporation)を用いて算出した。
【０４００】
RA滑膜線維芽細胞におけるIL-17AおよびIL-17A/TNFα誘導IL-8の阻害
全関節置換に由来する関節リウマチの膝のサンプルを、完全な倫理的認可の下、AstraZeneca R & D Charnwoodで取得した。RA滑膜線維芽細胞は、継代2代目でAstraZeneca R & D Alderley Parkに与えられたものである。細胞を、10％FCS (Hyclone)、ペニシリン(100 U/ml)、ストレプトマイシン(0.1 mg/ml)、グルタミン(2 mM)、1％非必須アミノ酸およびゲンタマイシン(1μg/ml)を補給したDMEM中、37℃に維持した加湿したインキュベーター中のT225 cm2フラスコ中で培養した。
【０４０１】
細胞を1〜2週間毎に継代し、継代5代目で用いた。細胞を、トリプシン-EDTAを用いてフラスコから分離し、5 x 103細胞／ウェルで96穴プレート中に塗布し、塗布の3日後に用いた。
【０４０２】
用いた刺激原は、培地のみ、単独で、またはTNFα(R & D Systems)と組み合わせた、IL-17A (Peprotech)であった。抗IL-17A中和抗体およびそのアイソタイプ対照(マウスIgG1(R & D Systems)、ヒトIgG1 CAT002 (Cambridge Antibody Technology Limited))を、1μg/mlポリミキシンBを含む培地中、50 nMに希釈した。抗体を、指示される場合、サイトカインと混合し、全ての溶液をインキュベートした後、線維芽細胞に添加した(37℃、30分)。
【０４０３】
培地を細胞から除去し、100μlの刺激培地と置換した。プレートを24時間インキュベート(37℃、加湿雰囲気)した後、-20℃での保存のために上清を除去した。IL-8含量を、製造業者の説明書に従って、および実施例3(ヒトIL-17Aに対する抗体の親和性)に記載のようにELISA (Cytoset, Biosource)により分析した。IL-8の値をプロットして、IC50値を生成し、Origin v7.5 (OriginLab Corporation)を用いて算出した。
【０４０４】
pA2分析
競合的アンタゴニストの親和性を定量するための主な薬理学的ツールは、Schild分析である。この手法を用いて、機能的アッセイにおいてアンタゴニストの親和性を評価する系に依存しない手段を決定することができる。その方法は、アンタゴニスト濃度およびその親和性が、アゴニスト応答の拮抗作用を決定するという概念に基づくものである。拮抗作用を定量することができ、アンタゴニストの濃度が既知であるため、アンタゴニストの親和性を決定することができる。この拮抗作用を、用量比(DR)と呼ばれる、アンタゴニストの存在下および非存在下で測定された、等しく活性な濃度のアゴニストの比率を測定することにより定量する。
【０４０５】
結合メンバーの非存在下でのアゴニスト(典型的には、IL-17A)のEC50と、単一の濃度の結合メンバーの存在下でのアゴニストのEC50との比を取ることにより、用量比を算出することができる。次いで、log(DR-1)として表される用量比を、log[結合メンバー]に対する線形回帰において用いて、Schild回帰を作製することができる。かくして、結合メンバーの濃度毎に、対応するDR値が存在するであろう；これらを、log[結合メンバー]上でのlog(DR-1)の回帰としてプロットする。拮抗作用が競合的である場合、式が
Log (DR-1)＝log[B]-logKB
(式中、Bは結合メンバーの分子濃度である)
であるSchild式に従ってlog (DR-1)とlog[結合メンバー]の間に線形関係が存在するであろう。
【０４０６】
これらの環境下では、縦座標の0の値は、log[B]＝log KBであるx軸の切片を与えるであろう。従って、log (DR-1)＝0をもたらす結合メンバーの濃度はlog KB、結合メンバー-受容体複合体の平衡解離定数に等しいであろう。これは、結合メンバー親和性の見積もりのための系に依存しない定量化である。伝統的には、この手法を、受容体アンタゴニストの親和性を決定するのに使用するが、リガンド中和に関する類似する仮定に基づいて、用量比の算出は、細胞上でのIL-17活性を中和する結合メンバー親和性の見積もりを可能にすべきである。KB値は対数プロットから取得されるため、それらは対数正規分布している。この特定の濃度の負の対数を、経験的にpA2と呼び、これはアゴニスト用量応答曲線の2倍のシフトをもたらすアンタゴニストの濃度である。アンタゴニストの効力を、式：
pA2＝log (DR-1)-log[B]
から用量比の1個の値をもたらすアンタゴニストの1個の濃度からpA2を算出することにより定量することができる。
【０４０７】
[B]は、元の最大以下の応答を引き出すアゴニスト濃度を倍加するのに必要であるアンタゴニストのモル濃度である。
【０４０８】
DR＝用量比であり、アンタゴニストの存在下および非存在下で測定されたアゴニストの等しい活性の濃度の比を測定することにより定量される。
【０４０９】
pA2を、用量応答アッセイデータから算出することができる。
【０４１０】
ヒトIL-17Aに対する抗体の親和性を算出するためのpA2分析に用いられるアッセイ方法
HT1080細胞(European Collection of Cell Culture, ECACC)を、5 x 104細胞／ウェルで96穴平底組織培養アッセイプレート(Costar)中に播種した。次いで、細胞を、ウェルあたり200μlのアッセイ培地(Earles塩およびL-グルタミン、10％(v/v)熱不活化オーストラリア製FBS、1％(v/v)MEM-非必須アミノ酸((L-グルタミンを含まない)、Invitrogen)を含むMEM)中、37℃および5％CO2で加湿雰囲気中で一晩培養した。
【０４１１】
次いで、IL-17Aの滴定物(最終濃度範囲1μM〜7 pM)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で調製し、アッセイ培地中、37℃で30〜60分間、精製されたIgG(用いたAb最終濃度範囲270 nM〜270 pM)と共に予備インキュベートした。並行して、培地を細胞から吸引し、100μl／ウェルのアッセイ培地を添加した。これに、100μl／ウェルのサンプルを添加し、一晩(18時間±4時間)インキュベートした。上清を収穫し、すぐにアッセイするか、または-20℃で保存した。
【０４１２】
上清中のIL-6レベルを、Hu IL-6 Duoset ELISAキット(R & D Systems)を用いて決定した。2μg/mlのIL-6捕捉抗体(Ab)(PBS中に希釈、100μl/ウェル)で一晩コーティングしたFluoroNunc Maxisorbプレート上でELISAを行った。ELISAプレートをPBS-Tweenで3回洗浄し、300μlの試薬希釈液を添加した(PBS中の1％ウシ血清アルブミン(BSA))。室温(RT)で1時間インキュベートした後、プレートを以前に記載のように洗浄した。1時間のインキュベーション期間に、馴化培地を1200 rpmで5分間遠心分離して、細胞破片を除去した。プレートの洗浄および馴化培地の調製の後、IL-6標準品(濃度範囲1000 pg/ml〜1 pg/ml)および170μlの馴化培地をELISAプレートに添加し、RTで90分間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを除去し、プレートを以前にように洗浄した。次いで、試薬希釈液(100 ml/ウェル)中、200 ng/mlのIL-6検出Abをプレートに加え、RTで60分間インキュベートした。次いで、プレートを以前に記載のように洗浄し、100μlのストレプトアビジンユーロピウムをDELFIA(登録商標)アッセイバッファー(Perkin Elmer)中で1:1000に希釈し、RTで60分間インキュベートした。次いで、ELISAプレートをDELFIA洗浄バッファーで7回洗浄し、100μlのDELFIA増強剤(Perkin Elmer)を添加した。製造業者の説明書に従って、Victorプレートリーダー(Perkin Elmer)を用いて615 nmで蛍光を定量した。
【０４１３】
各プレートにつき添加したIL-6標準品に関する標準曲線を作製することにより、Excel (Microsoft)中でデータを分析し、これを用いて、各ウェル中に存在するIL-6の量を算出した。また、濃度依存的曲線を、阻害剤対照の非存在下でのIL-6に由来する値を用いて、最大IL-6放出の割合に対して正規化した。データをIgGのlog濃度に対する対照応答の％としてプロットするPrism (GraphPad Software)中でさらなる分析を行い、IC50値を、Prism曲線フィッティングソフトウェア(Graphpad)を用いて作製した。濃度依存的曲線の斜面を平均化し、フィッティングさせて、用量比を算出した。これらを用いて、Schildプロット(これもPrism中)を作製し、pA2値からKd値を見積もった。
【０４１４】
結合メンバーによるIL-17AのH/D交換速度の摂動
タグ付IL-17Aを、50 mM Tris.HCl pH7.4、150 mM NaCl中、0.5 mg/mlで用いた。抗体を、PBS(1.54 mM KH2PO4、2.71 mM Na2HPO4、155 mM NaCl pH7.2)中、10.6 mg/mlで用いた。製造業者の説明書に従って、抗体をPOROS AL樹脂(Applied Biosystems)に結合させて、100μlのカラムを調製し、これを1℃で保持した。
【０４１５】
75％D2O中で調製した50 mM Tris.HCl pH7.5、150 mM NaCl中で、カラムを洗浄した。75％D2Oを用いて調製されたバッファー中にIL-17Aを0.125 mg/mlに希釈し、150、500、1500および5000秒間インキュベートした後、抗体カラム上に注入した。カラムをH2O中の0.2 mlバッファーを用いて迅速に洗浄した後、同じ時間インキュベートした、すなわち、D2O中で150秒間交換したサンプルを、H2Oに150秒間ならびに同様に、サンプルを500、1500および5000秒間戻し交換した。最初に80μl、次いで、40μlの0.8％蟻酸を注入することにより、様々な時点で溶出させた。後の40μlを回収し、1℃の20μlの2 M尿素、1 M TCEP pH3を添加した。全混合物を、ペプシンを含む100μlカラム上に注入して、12〜28.5％のアセトニトリルの勾配を用いるrpHPLCにより分離したタンパク質をペプチドに消化し、Thermo Finnigan LCQ電子スプレー質量分析装置およびMicromass Q-TOF質量分析装置の両方上で質量を決定した。SEQUESTソフトウェアプログラム(Thermo Finnigan San Jose, CA)を用いて、親ペプチドイオンの配列を同定した。
【０４１６】
様々な部分のIL-17の交換の速度に対する抗体の効果を、以下の例外を除いて、本質的には上記のように決定した：IL-17を最初にH2Oを含有するバッファー中に0.125 mg/mlに希釈した後、H2O中で調製された50 mM Tris.HCl pH7.5、150 mM NaClを用いて予め洗浄したカラム上に注入した。結合後、カラムをH2O中で調製された50 mM Tris.HCl pH7.5、150 mM NaClで洗浄した後、75％D2O中で調製された50 mM Tris.HCl pH7.5、150 mM NaClと共に、150、500、1500および5000秒間インキュベートした後、H2O中に戻し交換し、上記のように処理した。
【０４１７】
突然変異IL-17A構築物のクローニング、発現および精製
IL-17A変異体を、Gateway(著作権)技術(Invitrogen)および従来の突然変異誘発法(Stratagene多部位突然変異誘発キットを用いる)またはポリメラーゼ連鎖反応を用いるC末端ヒスチジンタグを用いてクローニングした。クローニングされた遺伝子を、LR Clonase反応を用いて発現ベクターpCEP4中に挿入した。
【０４１８】
C末端ヒスチジンタグを有する野性型IL-17AおよびIL-17A変異体を、HEK293/EBNA細胞中で発現させた。細胞が60〜70％の集密度になった時、該細胞をT162フラスコ1個あたり30μgのDNAを用いてトランスフェクトした。PEIトランスフェクション試薬(Sigma)を用いて、細胞を一晩インキュベートした後、培地を除去し、血清を含まない新鮮な培地と交換し、さらに72時間インキュベートした。これらの細胞に由来する上清を回収し、それぞれの組換えタンパク質の精製のために用いた。
【０４１９】
トランスフェクトされたHEK293/EBNA細胞に由来する上清を回収し、pHを7.4に調整した後、Ni-Sepharose Fast Flow (GE HealthCare)上でアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。精製されたタンパク質をPBSバッファー中に透析し、検出ツールとして抗ヒスチジン抗体を用いるSDS-PAGE、Edman N末端配列決定およびウェスタンブロッティングにより分析した。タンパク質の同一性を確認した後、結合および機能試験を開始した。280 nmでの吸光度と、SDS-PAGE上でのクマシーブルーによる染色の強度の組合せにより、濃度を決定した。
【０４２０】
野生型IL-17AおよびIL-17A変異体のBIAcore結合実験
100μg/mlの抗体を、製造業者の説明書に従って、BIAcore 3000およびアミン結合キット(BIAcoreカタログ番号BR-1000-50)を用いてCM5 Sensor Chip (BIAcoreカタログ番号BR-1033-99)の表面上に固定した。10 mMグリシンpH1.5を用いる酸再生により、ベースラインを再生した。それぞれの実験の前に、ベースラインを確立し、リガンド(25 nM)を、10μl／分の速度で7分間、チップの表面上に注入した。結合したIL-17Aの量を、注入前30秒間および注入後60秒間、シグナル(RU)を測定し、後者から前者を減算することにより決定した。
【０４２１】
HT1080 IL-17誘導IL-6放出アッセイ(エピトープマッピング試験)
HT1080細胞(European Collection of Cell Cultures, ECACC番号85111505)を、5 x 104細胞／ウェルで、96穴平底組織培養アッセイプレート(Costar)中に播種した。次いで、細胞を、37℃および5％CO2の加湿雰囲気中、200μlのアッセイ培地(L-グルタミン(Invitrogen)、1％ペニシリンおよびストレプトマイシン、10％(v/v)熱不活化ウシ胎仔血清(FBS)(Hyclone)、L-グルタミンを含まない1％(v/v)MEM-非必須アミノ酸(Invitrogen)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM))中で一晩培養した。
【０４２２】
目的の抗体または対照IgGの滴定物を、アッセイ培地(最終濃度範囲50〜0.03 nM)中で調製し、IL-17Aまたは突然変異形態のIL-17A(表20bに概略された最終濃度、1〜2 nMの範囲)と共に、37℃で30〜60分間予備インキュベートした。さらに、IL-17AまたはIL-17A変異体のみの滴定曲線を調製して、リガンドに対する細胞の応答性を評価した。培地を細胞から吸引し、100μl/ウェルのインキュベートされた抗体およびIL-17A(もしくはIL-17A変異体)、またはIL-17Aのみを添加し、一晩(18時間±4時間)インキュベートした。上清を収穫し、すぐにアッセイするか、または-20℃で保存した。データ点は、実験内の3点であった。
【０４２３】
上清中のIL-6レベルを、「軟骨細胞IL-6/IL-8/MMP13/PGE2-放出アッセイ」の材料および方法に概略されたように決定した。
【０４２４】
「未知のものの標準的な補正および計算」を用いる標準曲線から未知の値を外挿し、Origin v7.5 (OriginLab Corporation)内の「用量応答-1〜15セット」を用いてIC50を算出した。
【０４２５】
X線結晶解析のための抗体7のFabの産生および分析
精製された抗体7を消化して、以下のようにFabフラグメントを作製した：
・GIBCO PBS (Invitrogen)中に溶解した30 mM DL-システイン塩酸の消化バッファーを調製した。
【０４２６】
・パパイヤラテックス(Sigma)に由来するパパインを、消化バッファー中で再構成させて、10 mL/mL溶液を得て、使用前に最小で30分間、室温で保持した。
【０４２７】
・システインをIgGに添加して、30 mM溶液を得た。
【０４２８】
・パパインを、1 mgのパパインと100 mgのIgGの比でIgGに添加した。
【０４２９】
・0.5 Mヨードアセトアミド(Sigma)の添加により4時間後に消化を停止させて、最終消化混合物中の50 mMヨードアセトアミドを得た。
【０４３０】
次いで、Fabを精製し、PBS pH 7.2中でバッファー交換し、以下に記載のx線結晶解析における使用のために約10 mg/mlに濃縮した。
【０４３１】
X線結晶構造決定：タンパク質調製、結晶化および結晶解析
組換えヒトIL-17Aを大腸菌中で発現させ、よく記載された方法(Rudolphら、1996)を用いて封入体を単離した。封入体タンパク質を、室温で1時間、溶解バッファー(50 mM Tris pH 8.5、6 MグアニジンHCl、10 mM DTT)中での均一化により可溶化した。可溶化タンパク質を、室温で激しく攪拌しながら、再折畳みバッファー(0.1 M CAPSO pH 9.5、0.9 Mアルギニンおよび0.3:0.03 mM還元：酸化グルタチオン)に滴下しながら添加することにより急速に希釈することにより、0.5 mg/mlの最終濃度で再折畳みさせ、一晩静置した。再折畳みされたタンパク質を、10 kDa MWCOらせんカートリッジ(Amicon proflux(商標)M12 Tangential flow system)を用いて5倍濃縮した。濃縮されたタンパク質を、サイズ排除バッファー(50 mM Tris pH 7.4、0.15 M NaCl)で平衡化させたS75 (GE Healthcare Biosciences)サイズ排除カラム上で精製した。
【０４３２】
Superdex 200 PC 3.2/30カラム(GE Healthcare)を用いて適合させたEttan LC (GE Healthcare)を用いて分析的ゲル濾過を実施して、IL-17A/Fab複合体の最大収量をもたらす混合比を同定した。カラムをゲル濾過バッファー(BTP 25 mM, pH 7.0、NaCl 100 mM)で平衡化させた後、50μl／分で35μlのサンプルをロードした。3.6:1の比のIL-17A:Fabは、記載の材料を用いる場合、最大収量の複合体を産生した。次いで、IL-17AとFabをこの比で一緒に混合し、1 mlのゲル濾過バッファーで予め洗浄した500μlの30 kDa分子量カットオフ遠心分離濃縮装置(Viva Spin)を用いて濃縮した。タンパク質をOD280=7.6に濃縮し、ここで50μlアリコートを除去した。残りをさらに、OD280=16.6になるまで濃縮した。懸滴蒸気拡散結晶化を、Nextalトレイおよび2つのタンパク質濃度で2μl + 2μl液滴を用いて、20℃で実行した。
【０４３３】
回折品質の結晶が、90.9 mM PCTPバッファーpH 4.0、9.1 mM PCTPバッファーpH 9.5(1)、100 mM硫酸アンモニウム、14％(w/v)PEG3350を含む高濃度懸滴から2〜3週間後に成長した。結晶を収穫し、(-)(-)ブタン2,3ジオール(対応するウェル溶液中の20％v/v)を用いて凍結防止し、100KでOxford Cryostream上で簡易凍結した。Saturn 944 CCD検出器およびXstream凍結頭部を備えたRigaku FRe回転式陽極生成器を用いて回折品質について結晶をスクリーニングした。規則的回折を示したこれらの結晶を、ESRFのID-29上でのデータ収集のために待機して保存した。
【０４３４】
European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)、ビーム線ID29で、ADSC Quantum Q315r検出器を用いて、100Kで冷却した単一の結晶から回折データを収集した。2つのデータセットを、それぞれ、0.75°および0.2°の回転フレーム中、225°および155°の角度範囲に渡って、0.9787Åの波長で記録した。それぞれのデータセットに由来する画像データを、MOSFLM (Leslie, 1991)を用いて組込み、まとめ、CCP4スイート(CCP4, 1994)から得たプログラムを用いて個々にスケール化した。バッチあたり20％を超える内部Rmergeを有する画像を、最終的なスケーリングから排除した。データ収集統計値を表23に示す。
【０４３５】
全ての結晶は、β = 91.7°と共に、a = 98.5Å、b = 66.7Å、およびc = 203.8Åの典型的なセル寸法を有する単斜晶空間基P21に属する。結晶学的非対称単位は、Fabの4個の分子およびIL-17Aの2個の分子を含み、54％の溶媒含量に対応する2.68Å3/DaのMatthews共係数(Matthews, 1968)を含む。IL-17A/Fabの複合体構造を、CCP4プログラムMOLREP (CCP4, 1994)を用いる分子置換の方法により決定した。最初の試行において、Fab(PDBエントリー1AQKから作製、Faberら、1998)の可変ドメイン(軽鎖の残基2〜110および重鎖の残基2〜124)の3個の分子を、位置決定し、方向決定した。続いて、これらのFab可変ドメインの位置を固定し、Fab(軽鎖の残基111〜216および重鎖の残基125〜226)の定常ドメインの3個の分子を、位置決定し、方向決定した。正確に作製されたFab分子は、正確な分子置換溶液を示し、結晶格子の非対称単位中で4番目および最後のFab分子を置換することができる。REFMAC (Murshudovら、1997)を用いる等方性B因子を用いる拘束された最大尤度精製は、33.6％／41.5％の最初のRwork/Rfreeをもたらした。Fabモデルに対する手動による再構築および正確なアミノ酸配列の置換を、分子グラフィックプログラムCOOT (Emsley & Cowtan, 2004)を用いて実施した。IL-17A分子を、滞留FoFc電子密度マップの視覚的検査により同定した。様々な長さの鎖を未占有2FoFc電子密度に手動で置くことにより、IL-17Aの保存されたアミノ酸モチーフ[50-RSTSPW-57]を再認識し、明確にモデリングすることができた。これにより、ダイマー分子の迅速な解釈を可能にするIL-17Fのモデルの重ね合わせ(PDBエントリー1JPY、Hymowitzら、2001)が可能になった。また、この重ね合わせにより、Fabと相互作用する分子の部分が良好な順序にあるが、延長したダイマー分子の反対側の末端はその電子密度においては可視的ではない、すなわち、それが乱雑であることが明らかになった。IL-17Aモデルを、電子密度が許す限り多く構築した。27.2％／33.4％のRwork/Rfreeを用いるREFMACを用いる再拘束された最大尤度精製のラウンド後、正確なアミノ酸配列の手動による再構築および置換を、IL-17Aホモダイマーに適用した。MOLREPを用いる最後のMRラウンドにおいて、再構築されたIL-17Aホモダイマー(その電子密度において可視的な残基は、A鎖の39〜129およびB鎖の44〜132である)を用いて、第2のIL-17Aホモダイマーを方向決定し、位置決定した。4個のFab分子および2個のIl-17A分子を含むIL-17A Fab複合体構造を、REFMACを用いて収束するまで精製した後、水分子および硫酸イオンをCOOTを用いて手動で添加した。最後のR因子、RworkおよびRfreeは、それぞれ22.7％および28.4％である。
【０４３６】
0005385784.tif 000037
【０４３７】
配列
結合メンバーのVHドメイン、VLドメインおよびCDR配列を添付の配列表に示し、配列表中の配列番号は以下に対応する。  
PTN＝アミノ酸配列
0005385784.tif 000038
0005385784.tif 000039
0005385784.tif 000040
【０４３８】
抗体3、4および5は同じVHドメインを有する。
【０４３９】
抗体9、10および12は同じVHドメインを有する。
【０４４０】
抗体2および10は同じVL CDRを有する。抗体2に関して示されたVLドメイン配列は生殖細胞系列化されており、抗体10に関して示されたVLドメイン配列は生殖細胞系列化されていない。
【０４４１】
抗体3、9および11は同じVLドメインを有する。
【０４４２】
抗体4および15は同じVLドメインを有する。
【０４４３】
抗体5および8は同じVLドメインを有する。
【０４４４】
抗体12および16は同じVLドメインを有する。
【０４４５】
抗体1〜16のVLドメインヌクレオチド配列は、配列番号6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146および156中の3'末端に示されるgagコドンを含まない。従って、VLドメインアミノ酸配列は、配列番号7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147および157のそれぞれにおいてC末端Glu残基(残基112)を含まない。Glu112残基および対応するgagコドンは、抗体1〜16中で発現されなかった。記載の配列と生殖細胞系列遺伝子セグメントとの比較は、Glu残基および対応するgagコドンがVLドメインの一部を形成しないことを示唆している。
【０４４６】
位置111(Kabatの残基108)のGly残基は、発現されたscFvおよびIgG配列中に存在した。しかしながら、この残基は、VLドメインのフレームワーク4領域を形成するヒト生殖細胞系列jセグメント配列中には存在しない。そのGly残基は、VLドメインの一部であるとは考えられない。
【０４４７】
IgGの軽鎖を発現させるために、VLドメインをコードする第1エクソン、CLドメインをコードする第2エクソン、および第1エクソンと第2エクソンを分離するイントロンを含む、抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列を提供した。通常の環境下では、イントロンは、第1エクソンの3'末端と第2エクソンの5'末端を連結しており、細胞のmRNAプロセッシング機構によりスプライス除去される。そこで、前記ヌクレオチド配列を有するDNAがRNAとして発現された場合には、第1および第2エクソンは一緒にスプライスされた。スプライスされたRNAの翻訳は、VLおよびCLドメインを含むポリペプチドを産生する。スプライシング後、位置111のGlyは、VLドメインフレームワーク4の配列の最後の塩基(g)およびCLドメインの最初の2個の塩基(gt)によりコードされる。
【０４４８】
抗体1〜16のVLドメイン配列は、上記に示された配列番号163〜188である。VLドメインヌクレオチド配列は、最後のコドンとしてのctaで終わり、Leuが、対応するVLドメインアミノ酸配列中の最後のアミノ酸残基である。
【０４４９】
参考文献
本明細書中の何処かで引用された参考文献は全て、上記の何処かで引用された文献も含め、参照により全ての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれるものとする。  
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