(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイクリン依存性キナーゼＢ２（ＣＤＫＢ２）をコードする塩基配列の少なくとも一部の配列、又は、前記ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列と少なくとも一部が相補的な配列
を含む核酸を有効成分として含む、イネ科植物の核内の染色体を倍加させるための薬剤であって、
ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列の少なくとも一部の配列、又は、前記ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列と少なくとも一部が相補的な配列が、配列表の配列番号２に記載の塩基配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列に相補的な配列である、薬剤。
【請求項２】
前記核酸が、下記［ａ］〜［ｅ］：
［ａ］プロモーター；
［ｂ］配列表の配列番号２に記載の塩基配列、又は、配列表の配列番号２に記載の塩基配列に相補的な配列；
［ｃ］スペーサー；
［ｄ］前記［ｂ］の配列の少なくとも一部に対する逆方向反復配列；及び
［ｅ］ターミネーター
を含む、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記核酸が、前記［ａ］〜［ｅ］を、下記［ｆ］及び［ｇ］：
［ｆ］右側境界配列（Right Border）；及び
［ｇ］左側境界配列（Left Border）
の間に含む、請求項２に記載の薬剤。
【請求項４】
前記プロモーターが、薬剤誘導型プロモーターである、請求項２又は３に記載の薬剤。
【請求項５】
前記薬剤誘導型プロモーターが、glucocorticoid receptor誘導型プロモーター、estrogen receptor誘導型プロモーター、及びecdyson receptor誘導型プロモーターからなる群から選ばれる少なくとも一種のプロモーターである、請求項４に記載の薬剤。
【請求項６】
前記イネ科植物が、イネである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項７】
イネ科植物の核内に、請求項１〜６のいずれか１項に記載の薬剤を導入して、形質転換イネ科植物を得る工程；及び
前記形質転換イネ科植物を、前記導入された薬剤に含まれる核酸を鋳型として、前記植物内でＲＮＡ転写産物が生成し得る条件下に置く工程
を含む、イネ科植物の核内の染色体を倍加させる方法。
【請求項８】
下記［ａ］〜［ｅ］：
［ａ］プロモーター；
［ｂ］配列表の配列番号２に記載の塩基配列、又は、配列表の配列番号２に記載の塩基配列に相補的な配列；
［ｃ］スペーサー；
［ｄ］前記［ｂ］の配列の少なくとも一部に対する逆方向反復配列；及び
［ｅ］ターミネーター
が、下記［ｆ］及び［ｇ］：
［ｆ］右側境界配列（Right Border）；及び
［ｇ］左側境界配列（Left Border）
の間に配置されている塩基配列を含む核酸を含有するベクターを得る工程；
アグロバクテリウム(Agrobacteium)属細菌に、前記ベクターを導入して、形質転換アグロバクテリウム属細菌を得る工程；
イネ科植物に、前記形質転換アグロバクテリウム属細菌を接触させて、前記核酸が導入された形質転換イネ科植物を得る工程；及び
前記形質転換イネ科植物を、前記導入された薬剤に含まれる核酸を鋳型として、前記植物内でＲＮＡ転写産物が生成し得る条件下に置く工程
を含む、イネ科植物の核内の染色体を倍加させる方法。
【請求項９】
前記プロモーターが、薬剤誘導型プロモーターである、請求項７又は８に記載のイネ科植物の核内の染色体を倍加させる方法。
【請求項１０】
前記薬剤誘導型プロモーターが、glucocorticoid receptor誘導型プロモーター、estrogen receptor誘導型プロモーター、及びecdyson receptor誘導型プロモーターからなる群から選ばれる少なくとも一種のプロモーターである、請求項９に記載のイネ科植物の核内の染色体を倍加させる方法。
【請求項１１】
前記イネ科植物が、イネである、請求項７〜１０のいずれか１項に記載のイネ科植物の核内の染色体を倍加させる方法。
【請求項１２】
イネ科植物を、請求項７〜１１のいずれか１項に記載のイネ科植物の核内の染色体を倍加させる方法に供することによって、核内の染色体が倍加した形質転換イネ科植物を得る工程を含む、核内の染色体が倍加した形質転換イネ科植物の製造方法。
【請求項１３】
イネ科植物細胞のカルスを請求項７〜１１のいずれか１項に記載のイネ科植物の核内の染色体を倍加させる方法に供することによって核内の染色体が倍加したカルスを得る工程、および
前記核内の染色体が倍加したカルスを再分化させることで、核内の染色体が倍加した形質転換イネ科植物を得る工程を含む、核内の染色体が倍加した形質転換イネ科植物の製造方法。
【請求項１４】
前記再分化工程は、カルスが有するOsCDKB2の発現抑制を解除した状態で実施する、請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記再分化工程では、核内の染色体を倍加したカルスを得る工程で使用する発現誘導剤を用いない、請求項１３または１４に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、2008年12月26日出願の日本特願2008-333915号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、サイクリン依存性キナーゼＢ２（ＣＤＫＢ２）の発現を抑制する物質を有効成分として含むイネ科植物の核内の染色体を倍加させるための薬剤、並びに該薬剤を利用したイネ科植物の核内の染色体を倍加させる方法及び核内の染色体が倍加した形質転換イネ科植物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
将来において人口が増加して食糧危機が起こることが予想されるために、イネ（米）、コムギ（小麦）、トウモロコシ、オオムギ、ライムギなどのイネ科植物を中心とする穀物の収量増加を図ることが求められている。穀物増産のためのアプローチの一つとして、穀物を肥大化させる試みがある。穀物の肥大化は、穀物を種子とする植物の核内の染色体を倍加させることなどによって起こる現象である。植物の核酸を倍加させる方法としては、植物をコルヒチンなどの薬剤で処理することにより植物の染色体数を倍加させる方法が知られている（非特許文献１）。【０００４】
上記方法において、コルヒチンは植物の核酸を倍加させるための薬剤として働き、細胞分裂において紡錘糸形成を阻害する。コルヒチンで処理された植物は、細胞分裂の際に紡錘糸が形成されないことから、複製された核酸が核内に残り、結果として核内の染色体量が２倍になる。これが繰り返されることにより、核内の染色体が倍加した植物が得られる。
[非特許文献１]  P. S. Rao and P. Suprasanna 1996, In Vitro Haploid Production in Higher Plants,1, 317-339
上記非特許文献１の全記載は、ここに特に開示として援用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、コルヒチンは人体に対して有害である。コルヒチンを摂取した人体はヒ素中毒に類似した中毒症状が現れ、摂取後２〜５時間で口腔・咽頭灼熱感、発熱、嘔吐、下痢、背部疼痛、腎不全などの症状が現れ、さらには呼吸不全により死亡することもある。コルヒチン中毒に対する解毒剤はこれまでに知られていない。したがって、コルヒチン処理により核内の染色体を倍加させる方法は、処理時に作業者が、治療が困難なコルヒチン中毒に罹患する可能性のある方法である。【０００６】
さらに、コルヒチン処理は植物に対して非特異的な処理しかできず、植物の特定の組織や細胞に限定して処理することが困難であった。したがって、肥大化した種子を得るという目的でイネ科植物をコルヒチンで処理すると、イネ科植物そのものを肥大化させることとなり、結果としてイネ科植物の作付面積が広大化するという新たな問題が生じる。【０００７】
そこで、本発明は、従来技術と比べて人体への影響が少なく、かつイネ科植物の特定の組織や細胞に限定して処理できる、イネ科植物の核内の染色体を倍加させるための薬剤を提供することを解決すべき課題とした。さらに、本発明は、この薬剤を用いた、イネ科植物の核内の染色体を倍加させる方法及び核内の染色体が倍加したイネ科植物を作製する方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、植物に特異的に発現し、かつ細胞周期の進行に関与するサイクリン依存性キナーゼＢ２（ＣＤＫＢ２）の発現を抑制することにより、イネ科植物の核内の染色体を倍加させ得ることを見出した。さらに、本発明者らは、イネ科植物において、ＣＤＫＢ２をコードするｍＲＮＡを薬剤選択的にＲＮＡｉ効果により分解することができる系を構築し、該系を用いることによってイネ科植物の特定の細胞の核内の染色体を倍化させることに成功した。本発明は上記知見に基づいて完成された発明である。【０００９】
したがって、本発明によれば、サイクリン依存性キナーゼＢ２（ＣＤＫＢ２）をコードする塩基配列の少なくとも一部の配列、又は、前記ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列と少なくとも一部が相補的な配列
を含む核酸を有効成分として含む、イネ科植物の核内の染色体を倍加させるための薬剤が提供される。【００１０】
本発明の薬剤の好ましい態様は、前記核酸が、下記［ａ］〜［ｅ］：
［ａ］プロモーター；
［ｂ］サイクリン依存性キナーゼＢ２（ＣＤＫＢ２）をコードする塩基配列の少なくとも一部の配列、又は、前記ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列と少なくとも一部が相補的な配列；
［ｃ］スペーサー；
［ｄ］前記［ｂ］の配列の少なくとも一部に対する逆方向反復配列；及び
［ｅ］ターミネーター
を含む。【００１１】
本発明の薬剤の好ましい態様は、前記核酸が、前記［ａ］〜［ｅ］を、下記［ｆ］及び［ｇ］：
［ｆ］右側境界配列（Right Border）；及び
［ｇ］左側境界配列（Left Border）
の間に含む。【００１２】
本発明の薬剤の好ましい態様は、前記プロモーターが、薬剤誘導型プロモーターである。【００１３】
本発明の薬剤の好ましい態様は、前記薬剤誘導型プロモーターが、glucocorticoid receptor誘導型プロモーター、estrogen receptor誘導型プロモーター、及びecdyson receptor誘導型プロモーターからなる群から選ばれる少なくとも一種のプロモーターである。【００１４】
本発明の薬剤の好ましい態様は、前記イネ科植物が、イネである。【００１５】
本発明の薬剤の好ましい態様は、前記ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列の少なくとも一部の配列が、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の６２〜９１位の配列、１６５〜２４７位の配列、２８９〜３０２位の配列、３１８〜３４９位の配列、４６８〜４９０位の配列、６５２〜６７０位の配列、及び７２８〜８０３位の配列からなる群から選ばれる少なくとも１種の配列を含む、少なくとも２５塩基の配列である。【００１６】
本発明の薬剤の好ましい態様は、前記ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列と少なくとも一部が相補的な配列が、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の６２〜９１位の配列、１６５〜２４７位の配列、２８９〜３０２位の配列、３１８〜３４９位の配列、４６８〜４９０位の配列、６５２〜６７０位の配列、及び７２８〜８０３位の配列からなる群から選ばれる少なくとも１種の配列を含む、少なくとも２５塩基の塩基配列と相補的な配列である。【００１７】
本発明の薬剤の好ましい態様は、前記ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列の少なくとも一部の配列が、配列表の配列番号２に記載の塩基配列である。【００１８】
本発明の別の側面によれば、イネ科植物の核内に、本発明の薬剤を導入して、形質転換イネ科植物を得る工程；及び
前記形質転換イネ科植物を、前記導入された薬剤に含まれる核酸を鋳型として、前記植物内でＲＮＡ転写産物が生成し得る条件下に置く工程
を含む、イネ科植物の核内の染色体を倍加させる方法が提供される。【００１９】
本発明のイネ科植物の核内の染色体を倍加させる方法の別の態様は、
下記［ａ］〜［ｅ］：
［ａ］プロモーター；
［ｂ］サイクリン依存性キナーゼＢ２（ＣＤＫＢ２）をコードする塩基配列の少なくとも一部の配列、又は、前記ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列と少なくとも一部が相補的な配列；
［ｃ］スペーサー；
［ｄ］前記［ｂ］の配列の少なくとも一部に対する逆方向反復配列；及び
［ｅ］ターミネーター
が、下記［ｆ］及び［ｇ］：
［ｆ］右側境界配列（Right Border）；及び
［ｇ］左側境界配列（Left Border）
の間に配置されている塩基配列を含む核酸を含有するベクターを得る工程；
アグロバクテリウム(Agrobacteium)属細菌に、前記ベクターを導入して、形質転換アグロバクテリウム属細菌を得る工程；
イネ科植物に、前記形質転換アグロバクテリウム属細菌を接触させて、前記核酸が導入された形質転換イネ科植物を得る工程；及び
前記形質転換イネ科植物を、前記導入された薬剤に含まれる核酸を鋳型として、前記植物内でＲＮＡ転写産物が生成し得る条件下に置く工程
を含む。【００２０】
本発明のイネ科植物の核内の染色体を倍加させる方法の好ましい態様は、前記プロモーターが、薬剤誘導型プロモーターである。【００２１】
本発明のイネ科植物の核内の染色体を倍加させる方法の好ましい態様は、前記薬剤誘導型プロモーターが、glucocorticoid receptor誘導型プロモーター、estrogen receptor誘導型プロモーター、及びecdyson receptor誘導型プロモーターからなる群から選ばれる少なくとも一種のプロモーターである。【００２２】
本発明のイネ科植物の核内の染色体を倍加させる方法の好ましい態様は、前記イネ科植物が、イネである。【００２３】
本発明のイネ科植物の核内の染色体を倍加させる方法の好ましい態様は、前記ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列の少なくとも一部の配列が、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の６２〜９１位の配列、１６５〜２４７位の配列、２８９〜３０２位の配列、３１８〜３４９位の配列、４６８〜４９０位の配列、６５２〜６７０位の配列、及び７２８〜８０３位の配列からなる群から選ばれる少なくとも１種の配列を含む、少なくとも２５塩基の配列である。【００２４】
本発明のイネ科植物の核内の染色体を倍加させる方法の好ましい態様は、前記ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列と少なくとも一部が相補的な配列が、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の６２〜９１位の配列、１６５〜２４７位の配列、２８９〜３０２位の配列、３１８〜３４９位の配列、４６８〜４９０位の配列、６５２〜６７０位の配列、及び７２８〜８０３位の配列からなる群から選ばれる少なくとも１種の配列を含む、少なくとも２５塩基の塩基配列と相補的な配列である。【００２５】
本発明のイネ科植物の核内の染色体を倍加させる方法の好ましい態様は、前記ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列の少なくとも一部の配列が、配列表の配列番号２に記載の塩基配列である。【００２６】
本発明の別の側面によれば、イネ科植物を、本発明のイネ科植物の核内の染色体を倍加させる方法に供することによって、核内の染色体が倍加した形質転換イネ科植物を得る工程を含む、核内の染色体が倍加した形質転換イネ科植物の製造方法が提供される。【００２７】
本発明の別の側面によれば、イネ科植物細胞のカルスを請求項１０〜１７のいずれか１項に記載のイネ科植物の核内の染色体を倍加させる方法に供することによって核内の染色体が倍加したカルスを得る工程、および
前記核内の染色体が倍加したカルスを再分化させることで、核内の染色体が倍加した形質転換イネ科植物を得る工程を含む、核内の染色体が倍加した形質転換イネ科植物の製造方法が提供される。【００２８】
上記方法では、再分化工程は、カルスが有するOsCDKB2の発現抑制を解除した状態で実施することができ、また、再分化工程では、核内の染色体を倍加したカルスを得る工程で使用する発現誘導剤を用いないことができる。
【発明の効果】
【００２９】
本発明の薬剤は、植物に特異的に発現するＣＤＫＢ２の発現を抑制するものであり、人体で発現している酵素の発現を抑制するものではない。したがって、本発明の薬剤は、人体に対して影響の少ない薬剤である。本発明の薬剤に有効成分として含まれる核酸は、発現誘導型プロモーター等と組み合わせることによって、特定の部位において、特定の期間に発現させることができる。その結果として、本発明の薬剤によれば、イネ科植物において特定の組織や細胞、例えば、種子近傍の組織や細胞の核内の染色体を倍化させることにより、種子を肥大化させることが可能となる。【００３０】
本発明の核内の染色体が倍加した形質転換イネ科植物の製造方法によれば、イネ科植物、特に種子が肥大化したイネ科植物を製造することができる。したがって、本発明の製造方法によれば、作付面積をそのままに、穀物の収穫量を向上させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、細胞周期とCDKの関係を表した概略図を示す。
【図２】図２は、ｐＤＯＮＲ２２１ベクター（インビトロジェン(invitrogen)）のサイトマップを示す。
【図３】図３は、ｐＡＮＤＡベクターのサイトマップを示す。
【図４】図４は、ｐＡＮＤＡベクターにおけるＲＮＡｉ効果を生じる配列の局在を示す。
【図５】図５は、ｐＥＲ８ベクターのサイトマップを示す。ApaIとSpeIの間にpANDAのヘアピンカセットが入っている。
【図６】図６は、Northern blotによるOsCDKB2発現低下の確認結果を示す。
【図７】図７は、組換えpANDAベクターを用いた形質転換カルスにおける核相の変化を示す。
【図８】図８は、組換えpANDAベクターを用いた形質転換カルスにおいて、核相が変化した系統における染色体数の観察結果を示す。
【図９】図９は、組換えpANDAベクターを用いた形質転換カルスにおいて、核相が変化した系統における細胞増殖の確認結果を示す。
【図１０】図１０は、pANDAI (誘導型RNAi) 形質転換カルスにおけるβ-estradiolによる核相増加の誘導結果を示す。
【図１１】図１１は、Agrobacteriumを介した植物への遺伝子導入の概略図を示す。
【図１２】図１２は、イネ(Oryza sativa)及びシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)の CDK系統樹を示す。
【図１３】図１３は、高次倍数化が誘導されたカルスをβ-estradiolを含まない再分化培地に移植し約一ヶ月後に得られた植物体の写真を示す。
【図１４】図１４は、図１３に写真を示す葉の核相の測定結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明について、詳細に説明する。
本発明のイネ科植物の核内の染色体を倍加させるための薬剤は、サイクリン依存性キナーゼＢ２（ＣＤＫＢ２）をコードする塩基配列の少なくとも一部の配列、又は、前記ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列と少なくとも一部が相補的な配列を含む核酸を有効成分として含む。なお、本明細書において、「配列」とは、特に説明がない限り、塩基配列をいう。また、塩基配列は、その塩基配列からなる核酸分子を含む広い概念で解釈されるべきものである。
【００３３】
ＣＤＫＢ２は、植物において、細胞増殖や細胞分裂に関与している因子であるセリン／スレオニン・タンパク質キナーゼであるサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の一種である。ＣＤＫＢは、植物に特異的に発現するＣＤＫであり、ＰＳＴＡＩＲＥ配列を持つ。ＣＤＫＢの発現は厳格に細胞周期の制御下にあり、ＣＤＫＢ１はＳ期の末期からＭ期にかけて発現し、ＣＤＫＢ２はＧ２期からＭ期にかけて発現する。さらに、ＣＤＫＢ２の発現は細胞周期依存的な転写制御を受けるのみならず、ユビキチンプロテアソーム系によって分解されることによっても、その量が調節されることが知られている（梅田正明「器官形成による細胞分裂の制御機構」蛋白質  核酸  酵素、2002年、Vol.47、pp.1628-1632、この文献の全記載は、ここに特に開示として援用される。）。
【００３４】
ＣＤＫの酵素触媒活性はサイクリンとの結合により制御され、サイクリンはＣＤＫのいわば調節サブユニットに相当している。ＣＤＫは細胞周期の進行の鍵となるキナーゼであり、細胞分裂はＣＤＫとサイクリンが活性型の複合体を形成することにより進行する。サイクリン／サイクリン依存性キナーゼ系は、細胞分裂の制御系の一つであって、サイクリン／サイクリン依存性キナーゼ系による細胞分裂の制御機構の詳細については、いくつかの総説において解説されている（梅田正明、「サイクリン依存性キナーゼによる細胞周期の制御と分裂組織の維持機構」、「細胞工学」別冊  植物細胞工学シリーズ１３、秀潤社、pp.37-48、この文献の全記載は、ここに特に開示として援用される。）。
【００３５】
ＣＤＫＢ２の発現を抑制する物質は、ＣＤＫＢ２をコードする遺伝子（ＣＤＫＢ２遺伝子ともいう）及び該遺伝子によって転写されたｍＲＮＡ（ＣＤＫＢ２−ｍＲＮＡともいう）のいずれか又は両方に作用して、これらに基づく転写又は翻訳を阻害する物質をいう。さらに、上記ｍＲＮＡによって翻訳されたＣＤＫＢ２に作用して、ＣＤＫＢ２のキナーゼ活性を阻害する物質もまた、ＣＤＫＢ２の発現を抑制する物質に含まれる。ＣＤＫＢ２の発現を抑制する物質としては、例えば、ＣＤＫＢ２遺伝子を鋳型とする転写を阻害し得るＣＤＫＢ２をコードする塩基配列と少なくとも一部が相補的な配列を含む核酸、ＣＤＫＢ２−ｍＲＮＡに基づく翻訳を阻害し得るＣＤＫＢ２をコードする塩基配列の少なくとも一部の配列を含む核酸などを挙げることができる。ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列の少なくとも一部の配列とは、ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列の一部又は全部をいい、例えば、ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列の１０〜９８１塩基、好ましくは１５〜８００塩基、より好ましくは２０〜５００塩基、さらに好ましくは２５〜４００塩基、なおさらに好ましくは３０〜３００塩基程度の塩基をいう。
【００３６】
本発明の薬剤の作用や機構について、いかなる特定の理論にも拘泥されるわけではないが、以下のように推測され得る。
本発明者らは、イネ科植物の核内の染色体を倍化させるための研究を進めていくうちに、細胞周期のＧ２期からＭ期に移行する際に、なんらかの処置を施せば、イネ科植物における細胞分裂に変化をもたらし、次いで核内の染色体になんらかの変化をもたらすことができるのではないかと推測した。そこで、本発明者らは、さらに研究を進めた結果、まずＣＤＫに着目した。
【００３７】
イネ科植物のＣＤＫにおいて、ＣＤＫＡとＣＤＫＢは、アミノ酸配列において相同性があるが、異なるクラスターに分類される（図１２を参照）。イネ科植物において、ＣＤＫＡは、細胞周期を通じて発現し、Ｇ１／Ｓ期の移行とＧ２／Ｍ期の移行の双方に働くとされる。これに対して、ＣＤＫＢは、細胞周期特異的に転写、翻訳され、Ｍ期に移行した後に素早く分解される。イネ科植物において、ＣＤＫＢのうち特にＣＤＫＢ２がＧ２／Ｍ期の移行にのみ働く。これらの知見を基に、本発明者らは、イネ科植物において、Ｇ２／Ｍ期の移行阻害に関係し得るＣＫＤＢ２に着目し、ＣＤＫＢ２の発現抑制を行った。その結果、本発明者らは、イネ科植物のＣＤＫＢ２の発現を抑制することにより、イネ科植物は通常の細胞周期の過程として染色体を倍化させるが、その後の細胞分裂の速度を減少させることを見出した。その結果、本発明者らは、染色体が通常の２倍体ではなく、４倍体、６倍体、８倍体又は１２倍体などに倍化したイネ科植物を得ることに成功した。本発明者らは、このメカニズムについて、イネ科植物のＣＤＫＢ２の発現を抑制することによって、細胞周期における紡錘糸の形成、及びその後に続く細胞分裂が阻害されて、結果として染色体倍加体が得られるのではないかと推測している。
【００３８】
上記推測を概略図式化したものを図１に示す。図１に示す通り、イネ科植物のＣＤＫＢ２の発現を抑制することにより、Ｇ２／Ｍ期の移行が阻害され、次いで複製して２倍量（４Ｃ）となった染色体ＤＮＡが二分割されず、４Ｃのまま停滞する。次いで細胞は、Ｍ期をスキップして、Ｇ１、Ｓ期に進行し、さらなる染色体ＤＮＡ量の倍加（６Ｃ以上の細胞の出現）が起こる。なお、ＣＤＫは、Cyclin dependent kinase （ＣＤＫ）はCyclin（Ｃｙｃ）と結合することによって細胞周期を正に制御する。
【００３９】
以上の推測に基づき、本発明の薬剤は、イネ科植物のＣＤＫＢ２の発現を抑制する核酸の作用によって、イネ科植物の核内の染色体を倍加させるために使用することができる。
【００４０】
本発明の薬剤の使用対象となる生物は、イネ科植物である。イネ科植物とは、イネ科に属する植物であれば特に制限されず、成体である植物だけでなく、植物を構成する細胞、カルス、器官、組織や、種、芽、茎、葉などを含む広い概念で解釈されるべきである。イネ科に属する植物とは、学術的に分類されたイネ科植物だけでなく、慣例的にイネ科植物とみなされている被子植物単子葉類を含み、例えば、イネ、スズタケ、コムギ、ライムギ、ヒエ、キビ、ススキ、ハトムギ、トウモロコシなどを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。これらのイネ科植物のうち、本発明の薬剤の使用対象となるものは、イネであることが好ましい。
【００４１】
本発明の薬剤に有効成分として含まれる核酸は、好ましくは、植物内、特に植物の核内や染色体内に挿入された場合に、自立的に複製し得る最小の構成単位を含むことが望ましい。したがって、本発明の薬剤に有効成分として含まれる核酸の好ましい態様として、例えば、下記［ａ］〜［ｅ］：［ａ］プロモーター；［ｂ］サイクリン依存性キナーゼＢ２（ＣＤＫＢ２）をコードする塩基配列の少なくとも一部の配列、又は、前記ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列と少なくとも一部が相補的な配列；［ｃ］スペーサー；［ｄ］前記［ｂ］の配列の少なくとも一部に対する逆方向反復配列；及び［ｅ］ターミネーターを含む核酸を挙げることができる。
【００４２】
プロモーターは、イネ科植物において転写の開始に関連する配列であれば特に制限されないが、例えば、イネ科植物においてＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を開始する配列を有するものを挙げることができ、常時転写を開始させ得る非誘導型プロモーターでも、なんらかの作用によって誘導的に転写を開始させる誘導型プロモーターでもどちらでもよい。ただし、特定の部位や時期などでＣＤＫＢ２の発現を抑制する物質を転写させるためには、誘導型プロモーターが好ましく、簡便なことから薬剤誘導型プロモーターがより好ましく、glucocorticoid receptor誘導型プロモーター、estrogen receptor誘導型プロモーター、及びecdyson receptor誘導型プロモーターがさらに好ましい。薬剤誘導型プロモーターの好ましい例は、ＬｅｘＡであるが、これに限定されるものではない。プロモーターは、適宜１種又は２種以上を用いることができる。
【００４３】
スペーサーは、リンカーともいい、サイクリン依存性キナーゼＢ２（ＣＤＫＢ２）をコードする塩基配列の少なくとも一部の配列、又は、前記ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列と少なくとも一部が相補的な配列と、この配列の逆方向反復配列との間に配置されて、一本鎖時にステムループ構造をとり得る配列である。任意の配列とスペーサーを介して連結したこの任意の配列に対して逆方向反復配列を含む一本鎖核酸は、スペーサーがループ構造を形成することにより、鎖内で二本鎖のステムループ構造を形成することができる。スペーサーは、ステムループ形成時にＤＮＡの二次構造をとりうる配列でなければ特に制限されるものではないが、好ましくは１０〜２０００塩基、より好ましくは５０〜１５００塩基、さらに好ましくは１００〜１３００塩基、なおさらに好ましくは３００〜１０００塩基程度の配列である。スペーサーは、本発明の薬剤に有効成分として含まれる核酸を鋳型とする転写を抑制しない配列であることが望ましい。
【００４４】
逆方向反復配列はInverted Repeatともいわれ、例えば、任意の塩基配列に対する逆方向反復配列とは、任意の塩基配列が第一の塩基配列（例；ＡＴＣＧ）である場合、第一の塩基配列を逆方向（３’→５’）から読んだ第二の塩基配列（例；ＧＣＴＡ）の各塩基を相補的な塩基で読み替えた第三の塩基配列（例；ＣＧＡＴ）をいう。例えば、任意の塩基配列、スペーサー、及び任意の塩基配列に対する逆方向反復配列を一本鎖に含むＤＮＡが転写されると、分子内で二本鎖を形成した二本鎖ＲＮＡが取得され得る。本発明の薬剤に有効成分として含まれる核酸の逆方向反復配列は、ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列の少なくとも一部の配列、又は、前記ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列と少なくとも一部が相補的な配列の一部又は全部に対する逆方向反復配列であれば特に制限されるものではないが、例えば、ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列の少なくとも一部の配列、又は、前記ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列と少なくとも一部が相補的な配列の８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９９％以上、さらに好ましくは１００％の相同性のある塩基配列に対する逆方向反復配列である。
【００４５】
ターミネーターは、イネ科植物において転写の終結に関する配列であれば特に制限されないが、例えば、イネ科植物において転写を終了させる終止コドンを持つものを挙げることができ、より具体的にはアグロバクテリウムNosターミネーターなどの配列が挙げられるがこれに限定されるものではない。
【００４６】
ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列の少なくとも一部の配列は、イネ科植物のＣＤＫＢ２の発現を抑制するために、イネ科植物のＣＤＫＢ２をコードする塩基配列と相同性の高い配列であることが望ましく、例えば、イネのＣＤＫＢ２をコードする塩基配列である配列表の配列番号１に記載の塩基配列の６２〜９１位の配列、１６５〜２４７位の配列、２８９〜３０２位の配列、３１８〜３４９位の配列、４６８〜４９０位の配列、６５２〜６７０位の配列、及び７２８〜８０３位の配列からなる群から選ばれる１種又は２種以上の配列を含むことが好ましい。また、ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列の少なくとも一部の配列は、上記群から選ばれるいずれかの配列における全ての塩基配列だけではなく、一部の塩基配列が含まれていてもよい。例えば、ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列の少なくとも一部の配列が上記１６５〜２４７位の配列のうち１６５〜２００位の配列のみを含んでいてもよい。ただし、ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列の少なくとも一部の配列は、上記した長さ、一例を挙げると、２５〜４００塩基程度の長さの塩基配列であることが好ましい。
【００４７】
ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列と少なくとも一部が相補的な配列についても同様であり、ＣＤＫＢ２の発現を抑制するために、イネ科植物のＣＤＫＢ２をコードする塩基配列と相同性の高い配列と相補的な配列、例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなることが望ましい。このような配列は、ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、なおさらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相補性を有する塩基配列である。
【００４８】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)（この文献の全記載は、ここに特に開示として援用される。）などに記載されている方法に準じて行うことができる。
【００４９】
ただし、ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列と少なくとも一部が相補的な配列は、イネ科植物の他のＣＤＫをコードする塩基配列に対して、ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列として特異性の高い配列と相補的であることが望ましく、例えば、イネのＣＤＫＢ２をコードする塩基配列である配列表の配列番号１に記載の塩基配列の６２〜９１位の配列、１６５〜２４７位の配列、２８９〜３０２位の配列、３１８〜３４９位の配列、４６８〜４９０位の配列、６５２〜６７０位の配列、及び７２８〜８０３位の配列からなる群から選ばれる１種又は２種以上の配列に相補的な配列を含むことが好ましい。塩基の長さについては、上記した通りである。
【００５０】
ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列の少なくとも一部の配列の好ましい態様としては、例えば、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を挙げることができるが、これに限定されるものではない。さらに、ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列と少なくとも一部が相補的な配列の好ましい態様としては、例えば、配列表の配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を挙げることが、これに限定されるものではない。シロイヌナズナではＣＤＫＢ１及びＣＤＫＢ２はそれぞれ２コピー存在するのに対し、イネ科では各１コピーしか存在しない（図１２）。したがって、配列表の配列番号２に記載の塩基配列は、イネ科植物のＣＤＫＢ２中の約３００塩基と完全に一致することから、非常に強力にＣＤＫＢ２の発現を抑制することが期待できる。
【００５１】
イネ科植物の核内の染色体を倍加させるためには、本発明の薬剤とイネ科植物とを直接的又は間接的に接触させて、最終的に本発明の薬剤に有効成分として含まれる核酸がイネ科植物の核内に導入されることを要する。この核酸は、イネ科植物の核内に導入されると、自立的に又はイネ科植物の核内のゲノム（染色体）に組み込まれる。このようにして形質転換イネ科植物が得られる。この形質転換イネ科植物において、本発明の薬剤に有効成分として含まれる核酸を鋳型として転写されて得られるＲＮＡ転写産物は、イネ科植物におけるＣＤＫＢ２をコードする塩基配列又はＣＤＫＢ２−ｍＲＮＡに作用してＣＤＫＢ２の発現を抑制し、結果としてイネ科植物の核内の染色体を倍加させることができる。
【００５２】
本発明のイネ科植物の核内の染色体を倍加させる方法は、イネ科植物の核内に、本発明の薬剤を導入して、形質転換イネ科植物を得る工程；及び前記形質転換イネ科植物を、前記導入された薬剤に含まれる核酸を鋳型として、前記植物内でＲＮＡ転写産物が生成し得る条件下に置く工程を含むことを特徴とする。
【００５３】
本発明の薬剤をイネ科植物に直接的に接触させて、本発明の薬剤に有効成分として含まれる核酸をイネ科植物の核内に導入するためには、本発明の薬剤をイネ科植物の核内に直接導入することが望ましい。この直接導入の方法としては、これまでに知られている任意の物質を植物の核内に導入する方法を制限なく用いることができる、例えば、パーティクルガン法が利用され得る。パーティクルガン法は、遺伝子銃ともよばれ、金やタングステンなどの金属の微粒子に核酸（ＤＮＡ）をコーティングしたものを弾丸として、高速で射出して細胞内にＤＮＡを導入する方法である。パーティクルガン法を用いた本発明の薬剤をイネ科植物に導入させる具体的な手順としては、本発明の薬剤を金などの微粒子にまぶし、次いで該微粒子をガスなどの圧力でイネ科植物の葉や茎などの組織や細胞に打ち込む。その結果、本発明の薬剤がイネ科植物の細胞や核内に導入される。
【００５４】
本発明の薬剤をイネ科植物に間接的に接触させて、本発明の薬剤に有効成分として含まれる核酸をイネ科植物の核内に導入する方法としては、例えば、アグロバクテリウム属細菌（Agrobacterium）を利用した方法がある。アグロバクテリウム属細菌は、土壌中にいる細菌で、この細菌の中にはプラスミドがあり、その一部にＴ−ＤＮＡと呼ばれる遺伝子領域がある。アグロバクテリウム属細菌は、接触した植物の細胞に、自己のＴ−ＤＮＡを相手の植物に送り込む性質を有している。Ｔ−ＤＮＡを組み込まれた植物は、腫瘍であるこぶ状の塊（クラウンゴールともいう）や無数の根などを生じ、アグロバクテリウム属細菌の生存に必要な栄養素（アミノ酸など）を作る。このようにアグロバクテリウム属細菌のＴ−ＤＮＡは、遺伝情報に従い、接触した相手の植物にアミノ酸と植物ホルモンを合成させる働きがある。そこで、アグロバクテリウム属細菌が持つプラスミドのＴ−ＤＮＡを除去し、そこに発現させたい目的の遺伝子を組み込めば、目的の遺伝子をアグロバクテリウム属細菌を介して植物に導入することができる。
【００５５】
アグロバクテリウム属細菌による遺伝子導入を模式化した図１１を用いてさらに詳細に説明する。アグロバクテリウム属細菌におけるＴｉプラスミド上の左側の境界配列（Left border；LB）と右側の境界配列（Right border；RB）との間に、所望の遺伝子（好ましくは導入の成否を確認するために選択マーカーを含む）をクローニングする。クローニングした組換えＴｉプラスミドを、エレクトロポレーション法などの公知の細菌細胞への遺伝子導入法により、アグロバクテリウム属細菌に導入する。次いでアグロバクテリウム属細菌を植物に感染させると、アグロバクテリウム属細菌内において、ＬＢとＲＢに囲まれた配列（Ｔ−ＤＮＡ）が切り出され、該Ｔ−ＤＮＡが植物細胞の核内に運ばれる。次いでＴ−ＤＮＡは核内のゲノム中にランダムに挿入される。
【００５６】
アグロバクテリウム属細菌を利用して本発明の薬剤に有効成分として含まれる核酸をイネ科植物の核内に導入するためには、該核酸の両端が左側境界配列及び右側境界配列を有しているＴ−ＤＮＡであることが好ましい。そこで、本発明の薬剤の好ましい態様として、［ｆ］右側境界配列（Right Border）；［ａ］プロモーター；［ｂ］サイクリン依存性キナーゼＢ２（ＣＤＫＢ２）をコードする塩基配列の少なくとも一部の配列、又は、前記ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列と少なくとも一部が相補的な配列；［ｃ］スペーサー；［ｄ］前記［ｂ］の配列の少なくとも一部に対する逆方向反復配列；［ｅ］ターミネーター；及び［ｇ］左側境界配列（Left Border）からなる、Ｔ−ＤＮＡとして機能し得る核酸を有効成分として含む薬剤がある。ここで、上記Ｔ−ＤＮＡにおいて、［ｆ］右側境界配列（Right Border）と［ｇ］左側境界配列（Left Border）は、互いに入れ替わってもよい。
【００５７】
アグロバクテリウム属細菌を利用した、本発明のイネ科植物の核内の染色体を倍加させる方法の好ましい態様としては、例えば、上記Ｔ−ＤＮＡを含有するベクターを得て、次いでアグロバクテリウム属細菌に、前記ベクターを導入して、形質転換アグロバクテリウム属細菌を得て、次いでイネ科植物に、前記形質転換アグロバクテリウム属細菌を接触させて、前記核酸が導入された形質転換イネ科植物を得て、次いで前記形質転換イネ科植物において、前記核酸を鋳型としてＲＮＡ転写産物を得ることを含む方法を挙げることができる。
【００５８】
具体的には、本発明のイネ科植物の核内の染色体を倍加させる方法は、［ｆ］右側境界配列（Right Border）；［ａ］プロモーター；［ｂ］サイクリン依存性キナーゼＢ２（ＣＤＫＢ２）をコードする塩基配列の少なくとも一部の配列、又は、前記ＣＤＫＢ２をコードする塩基配列と少なくとも一部が相補的な配列；［ｃ］スペーサー；［ｄ］前記［ｂ］の配列の少なくとも一部に対する逆方向反復配列；［ｅ］ターミネーター；及び［ｇ］左側境界配列（Left Border）を含む核酸を含有するベクターを得る工程；アグロバクテリウム(Agrobacteium)属細菌に、前記ベクターを導入して、形質転換アグロバクテリウム属細菌を得る工程；イネ科植物に、前記形質転換アグロバクテリウム属細菌を接触させて、前記核酸が導入された形質転換イネ科植物を得る工程；及び前記形質転換イネ科植物を、前記導入された薬剤に含まれる核酸を鋳型として、前記植物内でＲＮＡ転写産物が生成し得る条件下に置く工程を含む。
【００５９】
本発明のイネ科植物の核内の染色体を倍加させる方法に供され得るアグロバクテリウム属細菌としては、自身が有するＴ−ＤＮＡを植物に導入させ得るアグロバクテリウム属細菌であれば特に制限されないが、例えば、Agrobacterium tumefaciens、Agrobacterium rhizogenesisなどが好ましく、Agrobacterium tumefaciensがより好ましい。
【００６０】
本発明のイネ科植物の核内の染色体を倍加させる方法に供され得るベクターとしては、アグロバクテリウム属細菌内において自己複製が可能であり、かつＴ−ＤＮＡを保持し得るものであれば特に制限されないが、例えば、Ｔｉプラスミド、ｐＡＮＤＡベクター、pPZP系ベクター、pBI系ベクターなどが好ましく、各種機能配列が組み込まれたｐＡＮＤＡベクターがより好ましい。
【００６１】
上記ベクターは選択マーカーを含有することが好ましい。選択マーカーとしては、例えば、薬剤耐性マーカー、栄養要求マーカーを使用することができる。選択マーカーの具体例としては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシ耐性遺伝子などがあり、これらを単独又は組み合わせて用いてもよい。
【００６２】
本発明のイネ科植物の核内の染色体を倍加させる方法に供され得るベクターの構築にはＧａｔｅｗａｙ法を使用することができるが、これに限定されるものではない。以下に、Ｇａｔｅｗａｙ法を利用した上記ベクターを構築する具体例について説明する。
【００６３】
まず、イネのＣＤＫＢ２(cdc2Os3)のオープンリーディングフレーム（ORF；配列表の配列番号１）の増幅を行なう。このＯＲＦがクローニングされているプラスミドを鋳型として、該ＯＲＦを増幅し得るフォワード及びリバースのプライマーを用いてＰＣＲを行なう。該ＰＣＲは、通常知られるＰＣＲの条件を適宜調整して実施することができるが、例えば、反応系が50μlであれば、×5 PrimeStar buffer 10μl、2.5mM dNTP 4μl、10μM forward primer 1μl、10μM reverse primer 1μl、PrimeStar DNA polymerase 0.5μl、dH2O 32.5μl, Plasmid DNA 1μlの組成で、PCR programを94℃ 1min → (98℃ 10 sec → 55℃ 5 sec → 72℃ 1min)を30 cycle → 72℃ 7min → 4℃として実施することができる。ここで、例えば、配列表の配列番号５及び６に記載の配列からなるプライマーを用いると、上記ＯＲＦ内の３０２塩基が増幅される。次いでこのＰＣＲ産物に組み込むべきベクターに適したアダプターを結合させる。これは一回目のＰＣＲで得られたＰＣＲ産物を鋳型として、アダプター配列を５’末端に連結させたプライマーセットを用いてＰＣＲを行なうことにより達成される。該ＰＣＲは、通常知られるＰＣＲの条件を適宜調整して実施することができるが、例えば、反応系が50μlであれば、×5 PrimeStar buffer 10μl、2.5mM dNTP 4μl、10μM attB1-adaptor primer 1μl、10μM attB2-adaptor primer 1μl、PrimeStar DNA polymerase 0.5μl、dH2O 32.5μl、1st PCR product 1μlの組成で、PCR programを94℃ 1min → (98℃ 10 sec → 55℃ 5 sec → 72℃ 1min)を30 cycle → 72℃ 7min → 4℃として実施することができる。このようなプライマーセットとして、attB1及びattB2配列が５’末端に連結した配列表の配列番号７及び８に記載の配列からなるプライマーセットが挙げられる。
【００６４】
BP反応及びLR反応は、λファージで見出された部位特異的組み換え反応である。特定の配列間で組換えが生じることを利用すると、制限酵素サイトを利用せずにクローニングが行える。BP clonase及びLR clonaseは、例えば、Invitrogen社から提供されている。これらの酵素を用いたＢＰ反応及びＬＲ反応については、同社のホームページ（http://www.invitrogen.co.jp/gateway/summary.shtml）上で、その仕組みの概要が紹介されている。
【００６５】
BP反応及びLR反応の概略について以下に述べる。上記２回のＰＣＲによって、例えば、両末端にattB1及びattB2配列が付加されたＣＤＫＢ２遺伝子断片増幅産物が得られる。このPCR産物とattP1配列とattP2配列を持つドナーベクターを混合してBP clonaseを加えると、attB1−attP1間及びattB2-attP2間が組換わり、PCR産物がベクター中に取り込まれたエントリークローンが完成する。エントリークローンでは、attBの一部とattRの一部が連結され、attL配列（より詳細にはattL1とattL2）が作られる。このattL配列はLR clonaseによりattR配列と組み換えられる。次いでattL1-ＣＤＫＢ２遺伝子断片-attL2を有するエントリークローンと、attR1-ccdB-attR2-linker-attR2-ccdB-attR1を持つデスティネーションベクター（図３のpANDA vectorのattRの拡大部分を参照）を混合することにより、エントリークローン上のPCR産物をデスティネーションベクターに組み換えることが可能である。詳しくは、２個のエントリーベクターの２個のattL1-ＣＤＫＢ２遺伝子断片-attL2と、１個のデスティネーションベクターのattR1-ccdB-attR2とattR2-ccdB-attR1とが組み換わり、最終的にはＣＤＫＢ２遺伝子断片とlinkerを介して連結されたＣＤＫＢ２遺伝子断片の逆方向反復配列（これらを、ＲＮＡｉ領域ともいう）が入ったベクターが作製される（図４を参照）。なお、この図４のpANDAベクターは、ＲＮＡｉ領域の両末端にＲＢ領域とＬＢ領域があり、このＲＢとＬＢに挟まれた領域をＴ−ＤＮＡ領域として使用できる。
【００６６】
以上の方法により作製された組換えpANDAベクターは、恒常的に二本鎖のＣＤＫＢ２−ＲＮＡを発現してＲＮＡｉ効果によりＣＤＫＢ２の発現を抑制し得る、恒常的ＣＤＫＢ２発現抑制型ベクターのpANDAベクターである。
【００６７】
また、作製した恒常的ＣＤＫＢ２発現抑制型ベクターのRNAiを及ぼす領域を切り出して、他のベクターの発現誘導型プロモーターの下流に挿入することにより、誘導的ＣＤＫＢ２発現抑制型ベクターを作製し得る。例えば、組換えpANDAベクターをApaI (pANDA vector siteA)及びSpeI (pANDA vector siteB)の制限酵素で処理し、RNAi領域を切り出す（図４）。次いでこの切り出したＲＮＡｉ領域をApaI及びSpeIで予め処理したpER8ベクター(図５)に挿入する。このようにして作製されたベクター（pANDAIベクター）は、誘導的ＣＤＫＢ２発現抑制型ベクターである。
【００６８】
上記したプライマーの作製、ＰＣＲ、ＰＣＲ産物の回収や精製、制限酵素処理などは通常知られる方法を制限なく用いることができ、例えば、上記したMolecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997) （この文献の全記載は、ここに特に開示として援用される。）などに記載されている方法に準じて行うことができる。
【００６９】
上記の方法によって作製をしたベクターをアグロバクテリウム属細菌に導入することにより、形質転換アグロバクテリウム属細菌が得られる。ベクターを導入してアグロバクテリウム属細菌を形質転換する方法は、これまでに知られている細菌にベクターを導入して細菌を形質転換する方法を制限なく用いることができ、例えば、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、カルシウムイオンを用いる方法などを挙げることができるが、好ましくはエレクトロポレーション法である。例えば、上記の組換えpANDAベクター及びpANDAI ベクターを、エレクトロポレーション法によりAgrobacterium (EHA105)に形質転換することができる。
【００７０】
イネ科植物に、上記形質転換アグロバクテリウム属細菌を接触させることにより、二本鎖のＣＤＫＢ２−ＲＮＡを転写し得る核酸が導入された形質転換イネ科植物を得ることができる。この形質転換イネ科植物を得る方法は、通常知られているアグロバクテリウム属細菌を植物に接触させる方法を制限なく用いることができ、例えば、Toki S (Plant Mol. Biol. Rep. 1997)やToki S (Plant J. 2006)（この文献の全記載は、ここに特に開示として援用される。）などの文献に記載の方法に従って実施することができるが、これらに限定されるものではない。以下に、上記文献に記載の方法の詳細について説明する。
【００７１】
脱籾した完熟種子を70 %エタノール、2.5%次亜塩素酸ナトリウム、滅菌水により洗浄する。滅菌した種子をN6D培地に置床し、カルスを誘導する。形質転換に用いるアグロバクテリウム（例えば、組換えpANDAベクター又はpANDAI ベクターを有するAgrobacterium EHA105株）をAB培地に塗布し、暗所、28℃で3日間培養する。誘導後1週間から3週目のカルスにアグロバクテリウムを感染させる。暗所、25℃で3日間共存培養した後、滅菌水でカルスを洗浄し、アグロバクテリウムの除菌を行う。除菌したカルスを選抜培地に置床し、形質転換細胞の選抜を行う。イネ種子からのカルスの誘導は、通常知られる薬剤や方法で実施することができるが、例えば、植物ホルモン等を含む固形培地上に滅菌した種子を置床して胚盤が脱分化し、細胞増殖したものをカルスとすることができる。
【００７２】
選抜培地は、ベクターに挿入した選択マーカー遺伝子に対応した選択マーカーを含む培地であれば特に制限されず、例えば、上記選択マーカー遺伝子がハイグロマイシン耐性遺伝子であれば、ハイグロマイシン入りN6D固形培地を使用することができる。選抜マーカー遺伝子と培地に入れる薬剤の組み合わせのその他の具体例としては、HPT (hygromycin phosphotransferase)とハイグロマイシン、NPTII (neomycin phosphotransrerase II)とG418、Bar (phosphinotrycin acetyltransferase)とビアラホスなどが挙げられる。
【００７３】
形質転換細胞として選抜されたハイグロマイシン耐性カルスは、再分化培地に移植され、植物体への再生が行われ得る。
【００７４】
形質転換イネ科植物において、挿入した核酸を鋳型として二本鎖のＣＤＫＢ２−ＲＮＡを転写させることにより、イネ科植物の核内の染色体を倍加させることができる。この転写は、挿入された核酸が恒常的ＣＤＫＢ２発現抑制型ベクター（例えば、pANDAベクター）に由来するものであれば、イネ科植物を生育に適した条件に置くことにより行なうことができる。挿入された核酸が誘導的ＣＤＫＢ２発現抑制型ベクター（例えば、pANDAIベクター）に由来する場合は、イネ科植物の生育に適した条件に置き、かつこのベクターの転写を促す物質を加えることにより行なうことができる。
【００７５】
形質転換イネ科植物におけるＣＤＫＢ２発現抑制は、例えば、形質転換イネ科植物におけるＣＤＫＢ２−ｍＲＮＡの量、ＣＤＫＢ２の量、染色体量、サイズ（マス）などを、形質転換していない野生型のイネ科植物と対比することにより確認することができる。
【００７６】
形質転換イネ科植物のＣＤＫＢ２−ｍＲＮＡの量は以下のNorthern blotによる方法によって確認することができる。形質転換イネカルスからRNeasy Plant Mini kit (QIAGEN)を用いてTotal RNAを回収する。回収したＲＮＡのうち10μgを電気泳動し、次いで電気泳動後の各ＲＮＡバンドをNylon membrane positively charged (Roche)メンブレンへ吸着させた後に、PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche)を用いて作成したＣＤＫＢ２−ｍＲＮＡに相補的なプローブ（例えば、配列表の配列番号９）を該メンブレン上のＲＮＡとハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションは、まずプレハイブリダイゼーションを50℃、8時間で実施し、次いでハイブリダイゼーションを50℃、20時間で実施する。ハイブリバッファーの組成は、5x SSC、50% ホルムアミド、0.1% N-ラウリルイルサルコシン、7 % SDS、2% blocking buffer、50mM リン酸ナトリウム (pH7.0)である。ハイブリダイゼーションの確認方法は、2x SSC及び0.1x SSCでメンブレンを洗浄した後に、DIG抗体を加え、メンブレン上の上記DIG labeled probeとDIG抗体を結合させる。マレイン酸でメンブレンを洗浄し、余剰DIG抗体を除いた後、発光試薬CDP star (Roche)により化学発光させ、molecular imagerにより発光を検出する。
【００７７】
形質転換イネ科植物の染色体量は以下の方法により確認することができる。CyStain UV precise P (PARTEC)を用いて、形質転換イネカルスから核を溶出し、ＤＡＰＩにより核の染色を行う。5mm2四方のカルスにExtraction bufferをスポイトで1滴垂らし、該カルスをカミソリで刻む。Nuclei extraction buffer 400μlを追加し、核をbuffer中に遊離させる。遊離核を含むNuclei extraction bufferをメッシュで濾し、残渣を除く。Test tubeにろ液を入れ、Staining buffer 1.6mlを加えて1分間程度インキュベートした後に、Partec CyFlow Ploidy Analyzer (PARTEC) にサンプルをセットし、核内の染色体量を測定する。
【００７８】
また、染色体の観察は以下の方法により実施することができる。一昼夜以上、3:1のメタノール酢酸混合液で固定したイネカルスを水で洗浄した後、染色体標本作製用酵素混合液（0.4% セルラーゼ“オノズカ”RS、0.15%マセロチームR-200、0.07%ペクトリアーゼ Y-23、0.1mM EDTA、pH 4.2）で50から60分間程度反応させる。このカルスを水洗し、スライドガラス上に移動した後、3:1のメタノール酢酸混合液を用いスライドガラス上に細胞を展開する。これを風乾させ、1.5 μg/mlのDAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)を含むVECTASHIELD Mounting Medium with DAPI (Vector Laboratories, CA) 溶液で染色する。DAPIにより染色された染色体を#01もしくはCascade blueフィルターセットを搭載した蛍光顕微鏡 (Axioplan2, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)と冷却CCDカメラ(Pentamax, Princeton Instruments, NJ)を用いて観察する。
【００７９】
イネ科植物を、本発明のイネ科植物の核内の染色体を倍加させる方法に供することによって、核内の染色体が倍加した形質転換イネ科植物を得る工程を含む、核内の染色体が倍加した形質転換イネ科植物を製造する方法もまた、本発明の範囲内である。形質転換イネ科植物の確認方法は、上記と同様の方法を用いることができる。
【００８０】
より具体的には、イネ科植物細胞のカルスを本発明のイネ科植物の核内の染色体を倍加させる方法に供することによって核内の染色体が倍加したカルスを得る工程、および前記核内の染色体が倍加したカルスを再分化させることで、核内の染色体が倍加した形質転換イネ科植物を得る工程を含む方法で、核内の染色体が倍加した形質転換イネ科植物を製造する。この方法では、再分化工程において、核内の染色体を倍加したカルスを得る工程で使用する発現誘導剤を用いないことが、再分化を容易にするという観点から適当である。
【００８１】
核内の染色体が倍加した形質転換イネ科植物を製造する方法は、具体的には、核内の染色体が倍加した形質転換イネ科植物をイネ科植物の生育に適した条件に置くことで実施できる。その際、核内の染色体が倍加した形質転換イネ科植物を製造するために用いた、ベクターの転写を促す物質（発現誘導剤）を用いないことが、イネ科植物の生育に適した条件としては適当である。核内の染色体が倍加した形質転換イネ科植物を製造するためには、形質転換により導入された核酸を発現させてＲＮＡ転写産物を生成させる。その際、本発明では、ベクターの転写を促す物質（発現誘導剤）を用いることが適当である。このようにして得られた、核内の染色体が倍加した形質転換イネ科植物は、例えば、カルスである場合には、次いで、植物体に再分化する。植物体に再分化するには、根端、茎頂分裂組織で規則的な細胞分裂が生じることが必要であるが、体細胞分裂に働くOsCDKB2を恒常的の発現抑制は生長阻害を及ぼすと考えられる。そこで、カルスの段階ではＲＮＡ転写産物を生成させることでOsCDKB2の発現抑制を行ない、倍加させた後、再分化の段階では、発現誘導剤を使用せず、ＲＮＡ転写産物の生成を抑制して、OsCDKB2の発現抑制を解除することが、植物体に再分化するには適当である。これにより、4C,8Cの体細胞分裂を繰り返す事が可能となり、倍数化した植物体が得られる。
【００８２】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらの実施例のみによって限定されるものではない。
【実施例】
【００８３】
実施例１
１．材料
イネ (日本晴)及びアグロバクテリウム属細菌 (EHA105)を用いた。【００８４】
２．方法
（１）OsCDKB2 RNAiベクターの構築
イネCDKB2 (cdc2Os3) ORFがクローニングされているプラスミドをテンプレートに配列表の配列番号５及び６に記載の配列からなるprimerを用いて1st PCRを行った。増幅領域は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の２０３〜５０４位である。PCRでは、OsCDKB2 Cording region内の302bpを増幅した。【００８５】
PCR産物をテンプレートに配列表の配列番号７及び８に記載の配列からなるprimerを用いて2nd PCRを行った。【００８６】
1stPCR条件：
反応系(50μl)組成  x5 PrimeStar buffer 10μl,2.5mM dNTP 4μl, 10μM forward primer 1μl, 10μM reverse primer 1μl, PrimeStar DNA polymerase 0.5μl, dH2O 32.5μl, Plasmid DNA 1μl
PCR program  94℃ 1min →(98℃ 10 sec → 55℃5 sec → 72℃ 1min) x 30 cycle →72℃ 7min → 4℃ 【００８７】
2ndPCR条件：
反応系(50μl)組成  x5 PrimeStar buffer 10μl,2.5mM dNTP 4μl, 10μM attB1-adaptor primer 1μl, 10μM attB2-adaptor primer 1μl, PrimeStar DNA polymerase 0.5μl, dH2O 32.5μl, 1st PCR product 1μl
PCR program  94℃ 1min →(98℃ 10 sec → 55℃5 sec → 72℃ 1min) x 30 cycle →72℃ 7min → 4℃ 【００８８】
attB配列が付加された2nd PCRフラグメントを精製し、BP反応によりエントリーベクター(pDONR221；図２)に挿入した。図２に示すベクターサイトマップの詳細情報を以下に示す。
0005594839.tif 000002
LR反応によりエントリーベクター上のCDKB2遺伝子断片と、pANDA元ベクター(図３)上のCmR-ccdB配列を入れ替えて、恒常的OsCDKB2発現抑制型ベクターである組換えpANDAベクターを作製した。図３に示すベクターサイトマップの詳細情報を以下に示す。
0005594839.tif 000003
【００８９】
作製した組換えpANDAベクターをApaI (pANDA vector siteA)及びSpeI (pANDA vector siteB)で制限酵素処理し、RNAi領域を切り出した（図４）。次いでApaI及びSpeIで処理をしたpER8ベクター(図５)に挿入した。これにより、誘導的OsCDKB2発現抑制型ベクターであるpANDAIベクターを作製した。【００９０】
（２）OsCDKB2RNAi ベクター (pANDA, pANDAI)形質転換イネの作出
上記（１）で作製した組換えpANDAベクター及びpANDAI ベクターを、エレクトロポレーション法によりAgrobacterium (EHA105)に形質転換した。【００９１】
イネへの形質転換は、Toki S (Plant Mol. Biol. Rep. 1997)、Toki S (Plant J. 2006)の方法に従って実施した。概略を説明すると、脱籾した完熟イネ(日本晴)種子を70 %エタノール、2.5%次亜塩素酸ナトリウム、滅菌水により洗浄した。滅菌した種子をN6D培地に置床し、カルスを誘導した。形質転換に用いるアグロバクテリウムをAB培地（NH4Cl  1000 mg；MgSO4・7H2O  296 mg；CaCl2・2H2O  10 mg；NaH2PO4・2H2O  1300 mg；K2HPO4  3000 mg；KCl  150 mg；FeSO4・7H2O  2.5 mg；Glucose  5 g；Bacto Agar  15 g；水  1L、pH=7.2）に塗布し、暗所、28℃で3日間培養した。誘導後3週目のカルスに組換えpANDAベクター又はpANDAI ベクターを有するAgrobacteriumを感染させた。イネカルスとAgrobacteriumを暗所、25℃で3日間共存培養し、次いで滅菌水でカルスを洗浄してAgrobacteriumを除菌した後に、イネカルスを選抜培地(ハイグロマイシン入りN6D固形培地)に置床し、形質転換カルスの選抜を行った。ハイグロマイシン耐性カルスを再分化培地に移植し、植物体への再生を行った。なお、胚盤が脱分化し、細胞増殖したものをカルスとした。【００９２】
（３）Northern blotによるOsCDKB2発現抑制の確認
組換えpANDAベクター(恒常的OsCDKB2発現抑制型ベクター)形質転換カルスからRNeasy Plant Mini kit (QIAGEN)を用いてTotal RNAを調製した。RNA10μgを電気泳動し、Nylon membrane positively charged (Roche)メンブレンへRNAを転写した後に、PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche)を用いて作成したprobe（配列表の配列番号９）を用いてNorthern blotを行った。【００９３】
Northern hybridization 条件：
プレハイブリダイゼーション50℃ 8時間, ハイブリダイゼーション 50℃ 20時間；
ハイブリバッファー組成：
5x SSC, 50% ホルムアミド、0.1% N-ラウリルイルサルコシン、7 % SDS、2% blocking buffer、50mM リン酸ナトリウム(pH7.0)；
ハイブリダイゼーションの確認方法：
2x SSC, 0.1x SSCでメンブレンを洗浄後、DIG抗体を加え、メンブレンン上のDIG labeled probeとDIG抗体を結合させた。マレイン酸でメンブレンを洗浄し、余剰DIG抗体を除いた後、発光試薬CDP star (Roche)により化学発光させ、molecular imagerにより発光を検出した。【００９４】
（４）核相測定
CyStain UV precise P (PARTEC)を用いて、イネカルスから核を溶出し、核の染色を行った。5mm2四方のカルスにExtraction buffer をスポイトで1滴垂らし、カミソリで刻んだ。Nuclei extraction buffer 400μlを追加し、核をbuffer中に遊離させた。遊離核を含むNuclei extraction bufferをメッシュで濾し、残渣を除いた。Test tubeにろ液を入れ、Staining buffer 1.6mlを加えて1分間程度インキュベートした後に、Partec CyFlow Ploidy Analyzer (PARTEC) にサンプルをセットし、核相を測定した。【００９５】
（５）染色体観察
固定された直径5mm前後のカルスを水洗した後、37℃の染色体標本作製用酵素混合液で50から60分程度反応させた。このカルスをシャーレ内で水洗し、エタノールで洗浄し風乾したスライドガラス上に移動させる。濾紙片を用いカルスの水分を除去した後、新たに作製した3:1のメタノール酢酸混合液とピンセットを用いスライドガラス上に細胞を展開した。これを風乾させた後、VECTASHIELD Mounting Medium with DAPIで染色し、蛍光顕微鏡と冷却CCDカメラを用いて染色体を観察した。【００９６】
３．結果
Northern blotの結果、組換えpANDAベクター(OsCDKB2恒常的発現抑制型RNAi)を導入したカルスでは、OsCDKB2の転写量が低下していることが確認された(図６)。核相を測定した結果、pANDAベクター形質転換カルスでは、野生型と比較してDNA量が顕著に倍加している系統(pANDA-5, 10, 17)が存在していた (図７)。pANDA-5, 10, 17のカルスの染色体を観察したところ、いずれの系統においても染色体数が増加している細胞が観察された(図８)。DNA量および染色体数が増加している系統のカルスでも細胞増殖に異常は見られなかった(図９)。【００９７】
pANDAIベクター(OsCDKB2誘導的発現抑制型RNAi)を導入したカルスにおいては、β-estradiolを含む培地に置床することにより核相の増加が誘導され、β-estradiolを含まない培地に戻す事により、DNA量の増加誘導が停止する系統(pANDAI-21)が得られた（図１０）。尚、図１０においては、核相測定のタイミングとして図示するように、以下の１〜４のタイミングで核相を測定した。
１：β-estradiol 含有培地で６日間培養した後、β-estradiolを含有しない培地で１０日間培養した後に核相を測定
２：β-estradiol 含有培地で６日間培養した後、さらにβ-estradiol 含有培地で１０日間培養した後に核相を測定
３：２の後に、１１日間培養した後に核相を測定した
４：２の後、β-estradiolを含有しない培地で１１日間培養した後に核相を測定
図１０に示すように、β-estradiol を培地に入れ続けることで核相増加は継続的に生じ(2→3)、β-estradiolを培地中から除去することで核相増加は停止した(2→4)。この結果から、培地へのβ-estradiolの含有の有無で誘導的ＲＮＡｉ（ｐＡｎＤＡＩ）の誘導をＯＮとＯＦＦできることが分かる。【００９８】
実施例２
以下の操作により、4倍体"植物"を獲得した。
1)野生型イネ(2倍体)からカルスを誘導し、OsCDKB2誘導型RNAiを形質転換する。
2)ハイグロマイシン耐性細胞を選抜することにより、RNAiコンストラクトが形質転換された細胞を選抜する。
上記1)および2)は、実施例1と同様に行った。【００９９】
3)上記2)で選抜されたRNAiコンストラクト形質転換細胞を、β-estradiolを含むN6D固形培地であるカルス化培地に移植し、OsCDKB2RNAiの発現を誘導する。移植後、6日目に核相を測定したところ、2C 65%, 4C 32%, 8C 3%の系統(pANDAI 3rd-1)が確認された。野生型カルスでは2C82%, 4C 18%であったので、pANDAI 3rd-1はRNAi発現が誘導され、高次倍数化が誘導されていると考えた。その後、pANDAI 3rd-1を3ヶ月間、β-estradiolを含むカルス化培地上で継続培養した。【０１００】
4)再分化時にRNAiを発現させ続けると根端分裂組織、茎頂分裂組織における細胞分裂が阻害され、生育阻害が生じると考え、β-estradiolを含まない再分化培地に移植した。約一ヶ月に、得られた植物体の葉(図１３に写真を示す)の核相を測定したところ、4C細胞を含む個体=倍数体が存在していた(図１４)。【０１０１】
考察
カルスの増殖とは異なり、形態形成を伴う再分化時はOsCDKB2の正常な発現が必要である。従来、恒常的RNAi (pANDA)において倍数体が得られなかった原因の一つが、再分化時にもOsCDKB2の発現が抑制されていたからであると本発明者らは推察した。上記実験では、誘導的RNAiが機能し、β-estradiolによる発現誘導のON/OFFが可能となったことで倍数体が獲得できたと考えている。【０１０２】
上記発現のON/OFFについては、具体的には以下のように考えられる。植物体に再分化するには、根端、茎頂分裂組織で規則的な細胞分裂が生じることが必要であるため、体細胞分裂に働くOsCDKB2を恒常的の発現抑制は生長阻害を及ぼすと考えられる。そこで、カルスの段階でOsCDKB2の発現抑制を行ない、倍加させた後、再分化の段階ではOsCDKB2の発現抑制を解除した。その結果、4C,8Cの体細胞分裂を繰り返す事が可能となり、倍数化した植物体が得られた考察される。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
植物は果実の肥大時等、急速な組織の成長を必要とする際、細胞当たりのＤＮＡ含量を増大させることが知られている。しかしながら、その過程を制御するメカニズムについては明らかではない。本発明の薬剤を利用すれば、イネにおける胚乳発達を制御し、収量性を高めることや、イネの特定の器官の発達を制御し、バイオマス特性を向上させることが可能になる。したがって、本発明の薬剤は、イネ産業において非常に利用可能性の高い薬剤である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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