(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶液中で、炭水化物欠失トランスフェリン（ＣＤＴ）を固相に結合させる必要なく、該ＣＤＴと選択的に結合するモノクローナル抗体であって、
当該抗体が寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２５４０を有する細胞培養によって産生される、モノクローナル抗体。
【請求項２】
請求項１に記載の抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項３】
以下の工程：請求項１に記載の抗体または請求項２に記載の抗原結合フラグメントをサンプルと接触させ、さらにＣＤＴを含む免疫複合体の生成を定性的または定量的に決定することを含むサンプル中のＣＤＴを検出するイムノアッセイ。
【請求項４】
請求項１に記載の抗体または請求項２に記載の抗原結合フラグメントを含む、請求項３に記載のイムノアッセイを実施するための検査キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】  本発明は、トランスフェリン同族系炭水化物欠失トランスフェリン（ＣＤＴ）と水溶液中で選択的に結合し、ＣＤＴを固相に結合させる必要がない抗体に関する。ＣＤＴは、通常はトランスフェリンのＡｓｎ４１３および／またはＡｓｎ６１１に結合している２本のオリゴ糖鎖の少なくとも１本が完全に、または実質的に完全に欠落していることを特徴とする。
【従来技術】
【０００２】  アルコール中毒は世界的な問題である。アルコール中毒を診断する多数の診断検査がこれまでに開発された。しかしながらこれらの検査の大半は前記疾患に特異的ではない。もっとも最近に開発された検査はMakhloufら（EP-0605627）によって導入された。前記に開示された抗体は、アルコール中毒患者で見出されるがアルコール非中毒者では認められないＣＤＴと特異的に反応する。このことは、それを用いて中毒患者の血清でＣＤＴを検出することができるイムノアッセイをデザインすることを可能にした。しかしながら、この検査の欠点は、検出されるべき抗原は固相に堅固に結合させる必要があるということであった。なぜならば、ＥＰ−０６０５６２７に開示された抗体は、溶液中に存在するＣＤＴとは結合しないか、または不適当な結合しかもたらさないからである。
【発明が解決しようとする課題および課題を解決する手段】
【０００３】  したがって本発明の目的は、サンプルの溶液中に存在するＣＤＴを直接検出することができ、したがって検出されるべき抗原をもはや固相に結合させる必要がないようにＣＤＴ検出を改善することであった。
驚くべきことには、前記目的は、水溶液中でＣＤＴと選択的に結合し、ＣＤＴを固相に結合させることを必要としない抗体を提供することによって達成された。エピトープマッピング実験を用いて、従来技術の抗体とは対照的に、本発明の抗体はＣＤＴ配列の異なるセグメントに同時に結合することが判明した。このことから、本発明の抗体が認識するエピトープは不連続エピトープであるということが推論された。
【０００４】  本発明はしたがって、水溶液中でＣＤＴと選択的に結合し、ＣＤＴを固相に結合させることを必要としない抗体に関する。本抗体は、ＥＰ−０６０５６２７にしたがって調製したＰ１またはＰ２ペプチドと結合しないか、または実質的に結合せず、前記ペプチドが固相に結合されてあるか、溶液中に存在するかは重要ではないことが判明した。
選択的な結合とは、本発明の場合、一方のＣＤＴと他方のヒトトランスフェリンとの間の識別を明瞭に可能にする十分に特異的な結合または実質的に特異的な結合を意味する。
【０００５】  本発明の場合、“固相”という用語は、多孔性および／または無孔性の、通常水に不溶性である物質から成り、さらに多様な形状（例えばうつわ、筒、マイクロタイタープレート、球、微粒子、棒状物、細片、ろ紙またはクロマトグラフィー紙など）を有するものを包含する。前記固相の表面は通常親水性であるか、または親水性にすることができる。前記固相は多様な物質、例えば、無機および／または有機物質、合成、天然に存在する物質および／または改変された天然の物質から成るであろう。固相物質の例はポリマー、例えばセルロース、ニトロセルロース、酢酸セルロース、塩化ポリビニル、ポリアクリルアミド、架橋デキストラン分子、アガロース、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメタクリレートまたはナイロン；セラミクス；ガラス；金属、特に貴金属（例えば金または銀）；磁鉄鉱；前記の混合物または組み合わせなどである。“固相”という用語にはまた細胞、リポソームまたはリン脂質担体も含まれる。
【０００６】  前記固相は、例えば、サンプル構成物と固相との非特異的結合の減少もしくは防止のため、または例えば、粒子状固相の懸濁安定性、保存安定性、形状安定性、紫外線、微生物もしくは他の有害因子に対する耐性の改善のために、１層または２層以上の例えばタンパク質、炭水化物、親油性物質、バイオポリマー、有機ポリマーまたはその混合物のコーティングを有していてもよい。
【０００７】  本発明はさらにＣＤＴと選択的に結合する抗体に関し、この場合、前記結合はＣＤＴ配列の以下の（１）から（４）のセグメント領域で発生する：
（１）ＶＶＡＲＳＭＧＧＫＥＤＬＩＷＥＬＬ、および
（２）ＴＴＥＤＳＩＡＫＩＭＮＧＥＡＤＡＭＳＬＤＧＧＦ、および
（３）ＳＫＬＳＭＧＳＧＬＮＬＳＥＰＮ、および
（４）ＹＥＫＹＬＧＥＥＹＶＫＡＶ。
本発明はさらに、その結合が、前述の配列の（１）から（４）のセグメントの３つまたは２つの領域でのみ発生するタイプの抗体に関する。
【０００８】  好ましい実施態様では、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。
特に好ましいモノクローナル抗体は、ブダペスト条約に基づいてＤＳＭＺ（Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Brunswick, Germany）に寄託された（寄託日：2002年4月16日）、以下の細胞培養によって産生される抗体である：
細胞培養０１−１０２／０１  寄託番号：ＤＳＭ ＡＣＣ２５４１
細胞培養９８−８４／０１１  寄託番号：ＤＳＭ ＡＣＣ２５４０
抗原結合フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ′、ＦｖまたはＦ(ａｂ′)2フラグメントもまた本発明にしたがって用いることができる（前記フラグメントは当業者に公知の方法によって前述の本発明の抗体から製造できる）。
【０００９】  本発明の目的のためには、“抗体”という用語は一般に、完全な抗体だけでなく、前記抗原またはハプテンとの結合特性が維持されているかぎり、抗体フラグメント（例えば既に述べたＦａｂ、Ｆｖ、Ｆ(ａｂ′)2またはＦａｂ′）、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性もしくは複数特異性抗体、または一本鎖抗体；さらに免疫グロブリンおよび／またはそのフラグメントの凝集物、ポリマーおよび共役物もまた意味する。抗体フラグメントは、例えば抗体を例えばペプシンまたはパパインのような酵素で切断して調製できる。抗体凝集物、ポリマーおよび共役物は、多様な方法、例えば熱処理、グルタールアルデヒドのような物質との反応、免疫グロブリン結合分子との反応、抗体のビオチン化とそれに続くストレプトアビジンまたはアビジンとの反応などによって生成することができる。
【００１０】  本発明の目的のためには、抗体はモノクローナル抗体でもまたはポリクローナル抗体でもよい。前記抗体は、通常の方法、例えばヒトまたは動物（例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ）を免疫し（Messerschmid (1996) BIOforum, 11:500-502も参照されたい）、続いて抗血清を得ることによって；またはハイブリドーマ細胞の樹立とそれに続く分泌抗体の精製によって；または、天然の抗体と前記抗原および／またはハプテンとの結合に必要なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列もしくはその改変型のクローニングおよび発現によって製造してもよい。
【００１１】  本発明はさらに以下の工程によって本発明の抗体を製造する方法に関する：適当な実験動物を非糖化トランスフェリンまたはＣＤＴで免疫し、続いて前記実験動物の脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させ、抗体産生ハイブリッド細胞を作製し、続いて前記ハイブリッド細胞をクローニングし、さらに、水溶液中のＣＤＴと選択的に結合しＣＤＴを固相に結合させる必要がない抗体を産生するハイブリッド細胞クローンを選別する。最終的には、抗体は、前記のように選別したハイブリッド細胞クローンから当業者に公知の方法によって得られる。
【００１２】  本発明はさらに以下の工程によって本発明の抗体を製造する方法に関する：適当な実験動物を非糖化トランスフェリンまたはＣＤＴで免疫し、続いて前記実験動物の脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させ、抗体産生ハイブリッド細胞を作製し、続いて前記ハイブリッド細胞をクローニングし、さらに、エピトープマッピングの結果にしたがえば、その結合がＣＤＴ配列の以下のセグメント（１）から（４）：
（１）ＶＶＡＲＳＭＧＧＫＥＤＬＩＷＥＬＬ、および
（２）ＴＴＥＤＳＩＡＫＩＭＮＧＥＡＤＡＭＳＬＤＧＧＦ、および
（３）ＳＫＬＳＭＧＳＧＬＮＬＳＥＰＮ、および
（４）ＹＥＫＹＬＧＥＥＹＶＫＡＶ
の領域で発生する抗体を産生するハイブリッド細胞クローンを選別し、続いて、前記のように選別したハイブリッド細胞クローンから最終的には当業者に公知の方法により抗体を得る。
【００１３】  前述の方法の１つにしたがって適当な実験動物を免疫するために、非糖化トランスフェリンまたはＣＤＴの代わりに、前記の配列の（１）から（４）のセグメントの１つまたは２つ以上を含むペプチドもまた用いることができる。前述の配列のセグメントの例えば１つだけまたは２つ以上から成る短いペプチドを、適切な場合には適当な担体分子に結合させて適切な免疫原性を得ることができることは、当業者には理解されるところである。前記の目的に適した担体分子は、例えばペプチドまたはタンパク質であり、それらは当業者には公知である。
【００１４】  上記に述べた製造方法には、当業者に公知のモノクローナル抗体の製造のためのハイブリドーマ技術が含まれる。前記技術は、最初Koehler & Milsteinによって１９７５年に報告され、以来多数の著者によって改変または改良されてきた。前記技術はマウスの細胞からモノクローナル抗体を製造するためにしばしば用いられてきたが、また別の由来をもつモノクローナル抗体の製造を述べた文献も存在する。さらに、抗体構築物、例えばヒト化抗体、または二重特異性もしくは複数特異性抗体、またはキメラ抗体の製造方法もまた開示されており、もちろん前記も同様に本発明の抗体の製造に利用することができる。
【００１５】  本発明はまた、サンプル中のＣＤＴを検出するイムノアッセイに関する。前記アッセイは、上記で述べた本発明の抗体または対応する抗体フラグメントとサンプルとを接触させ、続いてＣＤＴを含む免疫複合体の生成を定性的または定量的に決定することを必要とする。
前述のイムノアッセイを実施することを目的とする検査キットも同様に本発明の特徴であり、前記キットは、本発明の抗体または本発明の抗体フラグメントを含む。
本発明を以下の実施例によってさらに説明する。これら実施例は、もっぱら本発明の個々の特徴を例示により詳述するために用いられ、制限と解されてはならない。
【実施例】
【００１６】実施例１：抗ヒトトランスフェリンセファロースの調製
ヒト血清（正常血清およびアルコール中毒患者血清）からトランスフェリンをアフィニティー精製するために、１２０mgの抗ヒトトランスフェリン（Dade Behring Marburg GmbH, Marburg, Germany）を０．８ｇのＣＮＢｒ活性化セファロースＣＬ−４Ｂとカップリングさせてアフィニティー支持体を調製した。１２０mgの抗ヒトトランスフェリンを０．１ＭのＮａＨＣＯ3溶液に対して透析する。０．８ｇのセファロースＣＬ−４Ｂ（Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Germany）を０．１ＭのＮａＨＣＯ3溶液で洗浄し、さらに冷却しながら１．２８ｇの臭化シアン（５mLのアセトニトリルに溶解）を添加する。懸濁物をｐＨ１１で４℃１５分攪拌する。続いて前記懸濁物を０．１ＭのＮａＨＣＯ３溶液で十分に洗浄する。前記活性化セファロースを０．１ＭのＮａＨＣＯ３溶液に懸濁し、さらに前記の調製抗体溶液を添加して室温で６時間インキュベートする。前記のようにして調製した抗ヒトトランスフェリンセファロースをｐＨ７．２のリン酸緩衝食塩水で洗浄し、リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）＋ＮａＮ３（１ｇ／Ｌ）中で使用まで保存する。【００１７】実施例２：ヒト血清（正常血清およびアルコール中毒患者血清）からヒトトランスフェリンの単離
ヒト血清からトランスフェリンをアフィニティー精製するために、実施例１で調製した抗ヒトトランスフェリンセファロースをガラスのカラムに充填し、１００mLのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）＋ＮａＮ3（１ｇ／Ｌ）で洗浄した。１０mLのヒト血清（正常血清およびアルコール中毒患者血清）を流速０．５mL／分でカラムにロードし、さらに、５０mLのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）＋ＮａＮ3（１ｇ／Ｌ）、５０mLのＮａＣｌ溶液（１Ｍ）および５０mLの水でカラムを洗浄して非結合タンパク質を除去する。結合トランスフェリンは５０mLのグリシン溶液（０．５Ｍ）（塩酸でｐＨ２．５に調節）で溶出させ、直ちに固体のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを添加して中和し、リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）＋ＮａＮ3（１ｇ／Ｌ）に対して透析する。【００１８】実施例３：非糖化ヒトトランスフェリン
ａ）リコンビナント非糖化ヒトトランスフェリン
リコンビナント非糖化トランスフェリンは、通常の遺伝子操作法および分子生物学を用いて調製する。前記は以下の文献に記載されている：Mason et al.(1993) Biochemistry, 32:5472-5379。
ｂ）ヒトトランスフェリンの酵素による脱糖化反応
６０ｍｇのヒトトランスフェリン（例えば以下から入手：Calbiochem -Novabiochem GmbH, Bad Soden, Germany）を、１０ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｇ／Ｌ（ｗ／ｖ）のデシル硫酸ナトリウム（Fluka, order No. 71443）を含む８mLのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７.２）に溶解する。前記のようにして調製したトランスフェリン溶液を水浴中で３７℃に加温し、ＮグリコシダーゼＦ（Roche, order No. 1365193）１８０単位（３単位／mgトランスフェリン）を添加する。前記混合物を水浴中で３７℃で１７時間インキュベートする。脱糖化反応の完了はＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べる（Duan et al.(1998) Applied Biochemistry and Biotechnology, 69:217-224）。【００１９】実施例４：従来技術によるモノクローナル抗体の調製
従来技術によるモノクローナル抗体の調製は、欧州特許第６０５６２７Ｂ１号に記載されたように、トランスフェリン特異的ペプチド配列Ｐ１およびＰ２を用いて免疫することによって実施される。以下のハイブリッド／モノクローナル抗体が得られた：【００２０】 抗体番号 特異性
０１−３２／０６２        抗Ｐ１
００−１７７／０１２      抗Ｐ１
００−１８７／０１６      抗Ｐ２
００−１８７／０２７      抗Ｐ２【００２１】実施例５：本発明のモノクローナル抗体の調製
ａ）マウスの免疫
完全フロイントアジュバント中の非糖化トランスフェリン２０μgでＢＡＬＢ／ｃマウスの各々を腹腔内免疫した。ブースターは、４週間後に各々のマウスに不完全フロイントアジュバント（ICN Biomedical GmbH, Eschwege, Germany）中の２０μgの非糖化トランスフェリンを、さらに８週間後に各々にフロイントアジュバントを含まない２０μgの非糖化トランスフェリンを投与して実施した。融合前の最後の３日間に、マウスに静脈内ブースターとして各々に２０μgの非糖化トランスフェリンを投与した。【００２２】  ｂ）融合
マウスをＣＯ2吸入によって殺した後、脾臓を取り出し、血清を含まないダルベッコー改変イーグル培養液（ＤＭＥＭ）（CC Pro GmbH, Neustadt/W, Germany）中の単一細胞懸濁液を調製した。細胞を遠心分離し（６５２ｇ）、ＤＭＥＭで２回洗浄した。続いて細胞数をトリパンブルー染色によって決定した。２×１０7のミエローマ細胞（Ｓｐ２／０）を約１０8の脾臓細胞に添加した。遠心分離（３６０ｇ）した後、上清を廃棄し、１mLのポリエチレングリコール溶液（ＰＥＧ４００、ＤＭＥＭ中で約５０％の濃度）（Merck Eurolab, Bruchsal, Germany）を前記細胞ペレットに添加し、再度懸濁させた後３７℃で１分インキュベートした。続いて約１０mLのＤＭＥＭを一滴ずつ添加し、さらに前記混合物を室温で２〜４分インキュベートした。融合細胞を遠心分離し（３２６ｇ）、ペレットをＤＭＥＭ＋２０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）（Biowhittaker Europe, Verviers, Belgium）＋ＨＡＴ溶液（CC Pro GmbH, Neudstadt/W, Germany）中に再懸濁し、２４ウェルの細胞培養プレート（Costar）に導入した。ウェル当たりのおおよその細胞濃度は５×１０4〜５×１０6細胞であった。
２〜３週間後に、得られた細胞コロニー（ハイブリッド）を取り出し新しい培養プレートに移した。【００２３】 ｃ）抗体の特異性の決定
免疫抗原被覆マイクロタイタープレート（Nunc, タイプＢ）（コーティング１μg／mL、約０.０１５μg／ウェル）を用いて、細胞培養中に放出された抗体の特異性を第一の検査工程で検査した。
１００μLの細胞培養上清（１：２希釈）をマイクロタイタープレートの各ウェルにピペットで加え、＋１５℃〜＋２５℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄溶液ＰＯＤ（OSEW; Dade Behring, Marburg, Germany）で２回洗浄した後、１００μLの抗マウスＩｇＧ／Ｆ(ａｂ′)2−ＰＯＤ共役物（Dade Behring, Marburg, Germany）を各ウェルに導入し、続いて＋１５℃〜＋２５℃で１時間インキュベートした。プレートをさらに２回洗浄した後、１００μＬの色素原ＴＭＢ溶液（Dade Behring, Marburg, Germany）を各ウェルに導入し、＋１５℃〜＋２５℃でさらに３０分インキュベートした。前記インキュベーションの後、１００μLの停止溶液ＰＯＤ（Dade Behring, Marburg, Germany）を各ウェルに導入し、マイクロタイタープレートをＢＥＰＩＩ（Behring ELISA Processor II; Dade Behring, Harburg, Germany）で４５０nmで調べた。【００２４】  第二の検査工程では、ヒトトランスフェリン（例えば以下から入手：Calbiochem- Novabiochem GmbH, Bad Soden, Germany）で被覆したマイクロタイタープレート(Nunc タイプＢ)を用い上記のようにハイブリッドをチェックした。コーティング１μg／mL、約０.０１５μg／ウェル。
結果は表１に示す。【００２５】
【表１】
0005492366.tif 000002
【００２６】 ｄ）クローニング
本発明の抗体（非糖化ヒトトランスフェリンと結合するが、ヒトトランスフェリンとは結合しない）を産生するハイブリッドの単細胞をマイクロマニピュレーター（Leitz, Wetzlar, Germany）を用いてクローニングした。このようにして得たクローン９８−８４／０１１および０１−１０２／０１を２００２年４月１６日に下記の機関に寄託した：DSMZ Deutsche Sammlung Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, Brunswick, Germany）。受託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５４０（９８−８４／０１１）およびＤＳＭ ＡＣＣ２５４１（０１−１０２／０１）。【００２７】 ｅ）抗体のサブクラスの決定
抗体９８−８４／０１１および０１−１０２／０１のサブクラスをアイソストリップ（IsoStrip（登録商標））マウスモノクローナル抗体アイソタイプ判定キット（Boehringer Mannheim, Germany）を用いて調べ、９８−８４／０１１および０１−１０２／０１はＩｇＧ1と決定された。【００２８】 ｆ）抗体の製造
大量の抗体を製造するために、適当な細胞クローンをローラーボトル（Corning Costar Deutschland, Bodenheim）に移し、＋３７℃で所望の最終容積に増殖させた。続いて前記ローラー培養浮遊液の０.２２μmろ過を実施して細胞を除去する。前記抗体溶液（この時点で細胞を含まない）を限外ろ過により濃縮し（分離限界３００００ダルトン）、続いて精製する。【００２９】 ｇ）抗体精製
得られた抗体溶液を再度０.１４Mのリン酸緩衝液（ｐH８.６）で処理し、ｒ−プロテインＡセファロースファストフロー（Amersham）を充填したクロマトグラフィーカラムにロードした（精製するべき抗体１０mg当たり１mLのｒ−プロテインＡセファロースファストフローを用いた）。０.１４Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８.６）でカラムを洗浄して全ての非結合成分を除去する。結合抗体は０.１Ｍのクエン酸（ｐＨ３.０）でカラムから溶出させ、以下に対して透析する：０.０５Ｍ酢酸ナトリウム＋０.５ＭのＮａＣｌ＋０.０５Ｍのトリス＋０.０１％のアジ化ナトリウム（ｐＨ７.０）。【００３０】実施例６：固相結合抗原に対する抗体の特異性の決定：本発明の抗体と従来技術の抗体との比較
得られた抗体の特異性は以下を用いてテストした：ａ）非糖化トランスフェリンで被覆したマイクロタイタープレート（Nunc, タイプＢ）（コーティング１μg／mL、約０.０１５μg／ウェル）、ｂ）ヒトトランスフェリンで被覆したマイクロタイタープレート（Nunc, タイプＢ）（コーティング１μg／mL、約０.０１５μg／ウェル）、ｃ）ペプチドＰ１で被覆したマイクロタイタープレート（Nunc, タイプＢ）（コーティング３μg／mL、約０.０４５μg／ウェル）、およびｄ）ペプチドＰ２で被覆したマイクロタイタープレート（Nunc, タイプＢ）（コーティング３μg／mL、約０.０４５μg／ウェル）。【００３１】  １００μＬのモノクローナル抗体（１μg／mL）を前記マイクロタイタープレートの各ウェルにピペットで加え、＋１５℃〜＋２５℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄溶液ＰＯＤ（OSEW; Dade Behring, Marburg, Germany）で２回洗浄した後、１００μLの抗マウスＩｇＧ／Ｆ(ａｂ′)2−ＰＯＤ共役物（Dade Behring, Marburg, Germany）を各ウェルに導入し、続いて＋１５℃〜＋２５℃で１時間インキュベートした。プレートをさらに２回洗浄した後、１００μLの色素原ＴＭＢ溶液（Dade Behring, Marburg, Germany）を各ウェルに導入し、＋１５℃〜＋２５℃でさらに３０分インキュベートした。前記インキュベーションの後、１００μLの停止溶液ＰＯＤ（Dade Behring, Marburg, Germany）を各ウェルに導入し、マイクロタイタープレートをＢＥＰＩＩ（Behring ELISA Processor II; Dade Behring, Marburg, Germany）で４５０nmで調べた。
結果は表２に示されている。【００３２】
【表２】
0005492366.tif 000003
【００３３】  本発明の抗体は非糖化トランスフェリンとのみ反応し、一方、従来技術の抗体はそれぞれのペプチドおよび固相に結合させた非糖化トランスフェリンとの反応を示した。【００３４】実施例７：溶液中の抗原に対する抗体の特異性の決定：本発明の抗体と従来技術の抗体との比較
ａ）マイクロタイタープレート（Nunc, タイプＢ）を本発明のモノクローナル抗体および従来技術のモノクローナル抗体で被覆した。コーティング濃度は１μg／mL、約０.０１５μg／ウェル。
２００μg／mLから出発した二倍段階希釈の、ａ）ヒトトランスフェリン、ｂ）酵素により脱糖化処理したヒトトランスフェリン、ｃ）正常血清由来ヒトトランスフェリンおよびｄ）アルコール中毒患者血清由来ヒトトランスフェリンの１００μLをマイクロタイタープレートのウェルにピペットで加え、＋１５℃〜＋２５℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄溶液ＰＯＤ（OSEW; Dade Behring, Marburg, Germany）で２回洗浄した後、１００μLの抗ヒトトランスフェリン−ＰＯＤ共役物（Dade Behring, Marburg, Germany）を各ウェルに導入し、続いて＋１５℃〜＋２５℃で１時間インキュベートした。プレートをさらに２回洗浄した後、１００μLの色素原ＴＭＢ溶液（Dade Behring, Marburg, Germany）を各ウェルに導入し、＋１５℃〜＋２５℃でさらに３０分インキュベートした。前記インキュベーションの後、１００μLの停止溶液ＰＯＤ（Dade Behring, Marburg, Germany）を各ウェルに導入し、マイクロタイタープレートをＢＥＰII（Behrlng ELISA Processor II; Dade Behring, Marburg, Germany）で４５０nmで調べた。
結果は表３.１および３.２に示されている。【００３５】
【表３】
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【００３６】
【表４】
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【００３７】  ｂ）マイクロタイタープレート（Nunc, タイプＢ）を本発明のモノクローナル抗体および従来技術のモノクローナル抗体で被覆した。コーティング濃度は３μg／mL、約０．０４５μg／ウェル。
１：１０希釈から出発した二倍段階希釈の、ａ）正常血清およびｄ）アルコール中毒患者血清の１００μLをマイクロタイタープレートのウェルにピペットで加え、＋１５℃〜＋２５℃で1時間インキュベートした。プレートを洗浄溶液ＰＯＤ（OSEW; Dade Behring, Marburg, Germany）で２回洗浄した後、１００μLの抗ヒトトランスフェリン−ＰＯＤ共役物（Dade Behring, Marburg, Germany）を各ウェルに導入し、続いて＋１５℃〜＋２５℃で１時間インキュベートした。プレートをさらに２回洗浄した後、１００μLの色素原ＴＭＢ溶液（Dade Behring, Marburg, Germany）を各ウェルに導入し、＋１５℃〜＋２５℃でさらに３０分インキュベートした。前記インキュベーションの後、１００μLの停止溶液ＰＯＤ（Dade Behring, Marburg, Germany）を各ウェルに導入し、マイクロタイタープレートをＢＥＰII（Behring ELISA Processor II; Dade Behring, Marburg, Germany）で４５０nmで調べた。
結果は表４に示されている。【００３８】
【表５】
0005492366.tif 000006
【００３９】  本発明の抗体は、（正常血清中の）トランスフェリンと（アルコール中毒患者血清中の）ＣＤＴとの明確な識別を可能にし、一方、従来技術の抗体は両血清と反応しない。【００４０】実施例８：エピトープマッピング
ヒトトランスフェリン配列に由来するオーバーラップペプチド（１３量体ペプチド、１１アミノ酸のオーバーラップ）のスキャンは、ＳＰＯＴ合成技術を用いて調製した。前記方法は以下の文献に記載されている：H. Wenschuh et al. (2000) Coherent membrane supports for parallel microsynthesis and screening of bioactive peptides, Biopolymers (Peptide Science), 55:188-206。前記ペプチドはセルロース支持体とそのＣ末端で結合し、さらにそのＮ末端に反応性タグを保持する。前記ペプチドを切離しＳＰＯＴとして切断した後（９６ウェルのマイクロタイタープレート）、活性化ガラスチップに結合させた。これらガラスチップのインキュベーションプロトコルは以下のとおりである：【００４１】 従来技術のモノクローナル抗体
−ＴＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化
−封鎖緩衝液（ｐＨ８．０）で２時間
−抗体のインキュベーション（封鎖緩衝液（ｐＨ８．０）に３μg／mL）、２時間
−ＴＢＳ（０．０５％トゥイーン２０）で洗浄
−封鎖緩衝液（ｐＨ８．０）中の抗マウスＩｇＧ−ＰＯＤとインキュベーション、２時間
−ＴＢＳ（０．０５％トゥイーン２０）で洗浄、３回、５分
−化学発光の検出（Lumi-Imager, Roche Diagnostics）【００４２】 本発明の抗体９８−８４／０１１
−ＴＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化
−封鎖緩衝液（ｐＨ８．０）で２時間
−抗体のインキュベーション（封鎖緩衝液（ｐＨ８．０）に３μg／mL）、２時間
−ＴＢＳ（０．０５％トゥイーン２０）で洗浄、３回、５分
−化学発光の検出（Lumi-Imager, Roche Diagnostics）【００４３】  本発明の抗体はペルオキシダーゼで直接標識した。本方法は以下の文献に記載されている：M.B. Wilson & P.K. Nakane (1978) Recent developments in the periodate method conjugating horseradish peroxidase (HRPO) to antibodies, In: Immunofluorescence and Related Staining Techniques (Eds.:W. Knapp, K. Holubar, G. Wick), pp.215-224。【００４４】  前記実験の結果、従来技術の抗体に対する結合ペプチドは以下のとおりであることが判明した：
ペプチド１に対する従来技術の抗体
１．ＶＬＡＥＮＹＮＫＳＤＮＣＥ
２．    ＡＥＮＹＮＫＳＤＮＣＥＤＴ
３．        ＮＹＮＫＳＤＮＣＥＤＴＰＥ
４．            ＮＫＳＤＮＣＥＤＴＰＥＡＧ【００４５】  ペプチド２に対する従来技術の抗体
１．ＶＨＫＩＬＲＱＱＱＨＬＦＧ
２．    ＫＩＬＲＱＱＱＨＬＦＧＳＮ
３．        ＬＲＱＱＱＨＬＦＧＳＮＶＴ
４．            ＱＱＱＨＬＦＧＳＮＶＴＤＣ
５．                ＱＨＬＦＧＳＮＶＴＤＣＳＧ
前記認識される配列は免疫に用いられたペプチドと同一である。【００４６】  本発明の抗体９８−８４／０１１は、当該配列の以下の４つの優性セグメントと反応する：
１．ＶＶＡＲＳＭＧＧＫＥＤＬＩ
２．    ＡＲＳＭＧＧＫＥＤＬＩＷＥ
３．        ＳＭＧＧＫＥＤＬＩＷＥＬＬ
４．ＴＴＥＤＳＩＡＫＩＭＮＧＥ
５．        ＳＩＡＫＩＭＮＧＥＡＤＡＭ
６．            ＡＫＩＭＮＧＥＡＤＡＭＳＬ
７．                ＩＭＮＧＥＡＤＡＭＳＬＤＧ
８．                    ＮＧＥＡＤＡＭＳＬＤＧＧＦ
９．ＳＫＬＳＭＧＳＧＬＮＬＳＥ
１０．    ＬＳＭＧＳＧＬＮＬＳＥＰＮ
１１．ＹＥＫＹＬＧＥＥＹＶＫＡＶ
領域１から３はトランスフェリンのＮ末端ドメインに位置し、一方４から８、９から１０および１１はＣ末端ドメインに位置し、不連続エピトープを示している。