(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリガー鎖と、エフェクター鎖と、サポート鎖との３本のオリゴヌクレオチドで構成され、
前記３本のオリゴヌクレオチドは、それぞれの鎖が、他の２本の鎖と結合して三方向ジョイント構造を形成し、
前記トリガー鎖は、前記サポート鎖の結合している部位の外側に他のポリヌクレオチドの配列を認識する部位を有する、オリゴヌクレオチド構造体。
【請求項２】
前記三方向ジョイント構造は、前記トリガー鎖に結合する前記他のポリヌクレオチドにより崩壊する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【請求項３】
前記エフェクター鎖は、標的遺伝子または標的遺伝子転写産物の少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有する、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【請求項４】
前記エフェクター鎖は、相補性を有するオリゴヌクレオチドと二本鎖を形成する、請求項１ないし３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【請求項５】
前記トリガー鎖が結合する他のポリヌクレオチドの配列がそれぞれ異なるトリガー鎖を有する二種類のオリゴヌクレオチド構造体から、得られるエフェクター鎖同士から二本鎖を形成する、請求項１ないし３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【請求項６】
前記他のポリヌクレオチドの配列が異なる遺伝子由来のものである、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【請求項７】
トリガー鎖と、エフェクター鎖と、サポート鎖との３本のオリゴヌクレオチドで構成され、前記３本のオリゴヌクレオチドは、それぞれの鎖が、他の２本の鎖と結合して三方向ジョイント構造を形成し、前記トリガー鎖は、前記サポート鎖の結合している部位の外側に他のポリヌクレオチドの配列を認識する部位を有する、オリゴヌクレオチド構造体を個体以外の細胞、あるいは組織に導入し、
他のポリヌクレオチドが存在する細胞、あるいは組織においてのみ、前記三方向ジョイント構造の崩壊を生じさせ、１本鎖エフェクター鎖を得る、
遺伝子発現抑制方法。
【請求項８】
前記エフェクター鎖は、標的遺伝子または標的遺伝子転写産物の少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有する、請求項７に記載の遺伝子発現抑制方法。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチド構造体と共に、このオリゴヌクレオチド構造体のエフェクター鎖と相補的に結合するオリゴヌクレオチドを導入し、
前記三方向ジョイント構造の崩壊を生じた細胞、あるいは組織内で、生じた１本鎖エフェクター鎖とオリゴヌクレオチドとが二本鎖を形成する、請求項７または８に記載の遺伝子発現抑制方法。
【請求項１０】
エフェクター鎖の塩基配列が同一で、トリガー鎖が認識する他のポリヌクレオチドが異なる二種類のオリゴヌクレオチド構造体を個体以外の細胞、あるいは組織に導入し、
前記トリガー鎖が認識する他のポリヌクレオチドが二種類存在する細胞、あるいは組織においてのみ、前記二種類のオリゴヌクレオチド構造体の三方向ジョイント構造を崩壊させ、
生じたエフェクター鎖同士が二本鎖を形成する、請求項９に記載の遺伝子発現抑制方法。
【請求項１１】
トリガー鎖と、エフェクター鎖と、サポート鎖との３本のオリゴヌクレオチドで構成され、前記３本のオリゴヌクレオチドは、それぞれの鎖が、他の２本の鎖と結合して三方向ジョイント構造を形成し、前記トリガー鎖は、前記サポート鎖の結合している部位の外側に他のポリヌクレオチドの配列を認識する部位を有する、オリゴヌクレオチド構造体と、他のポリヌクレオチドまたは他のポリヌクレオチドの一塩基置換体とを混合し、
前記オリゴヌクレオチド構造体の崩壊の有無により、他のポリヌクレオチドの一塩基置換体を検出する、一塩基置換体の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡ干渉、ＲＮＡ干渉阻害、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害、デコイ核酸、ＳＮＰ検出などに有効に使用できる、オリゴヌクレオチド構造体および遺伝子発現制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガンやエイズなどの難病を効率的に治療する医薬の開発は、ライフサイエンスの分野における大きな課題の一つである。ポストゲノム時代において、遺伝子の発現を制御することが新たな難病の治療法として着目されている。【０００３】
遺伝子治療としては、従来、アンチセンスやデコイでタンパク質の発現を制御したり、ゲノムの修復を行ったり、欠損もしくは損傷している遺伝情報を外来遺伝子の形で入れて、タンパク質の発現を誘発することが行われてきた。また、最近では、遺伝情報の発現をコントロールするＲＮＡ、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）やｍｉＲＮＡを利用した遺伝子治療も注目を集めている。【０００４】
ＲＮＡｉやｍｉＲＮＡは、ガイド鎖ＲＮＡとパッセンジャー鎖ＲＮＡまたはｍｉＲＮＡとｍｉＲＮＡ＊とが互いに結合して形成されたｄｓＲＮＡを、細胞内へ導入することによって、当該ｄｓＲＮＡと相同な配列を持つｍＲＮＡが分解されるなどして、遺伝子の発現を抑制するという現象をいう（例えば、非特許文献１〜４参照）。【０００５】
しかし、ＲＮＡｉやｍｉＲＮＡを用いて発現抑制する場合には、以下のような問題がある。ＲＮＡｉやｍｉＲＮＡは、原理的には、ｄｓＲＮＡと相同な配列を持つｍＲＮＡに結合する。しかし、一塩基置換がされたｍＲＮＡに対しても、同様に結合する。このため、正常遺伝子と異常遺伝子との配列差がわずかしかない場合には、正常細胞中で正常なｍＲＮＡを分解などしてしまうという問題がある。このように、ＲＮＡｉ／ｍｉＲＮＡ医薬は副作用が大きいという問題がある。【０００６】
また、ＲＮＡｉ効率を上げるために、修飾したポリヌクレオチドを用いるなどが行われている（例えば、特許文献１参照）。【０００７】
近年の研究から、短いＲＮＡが２本鎖ｓｉＲＮＡとして機能する以外に、1本鎖のままダイサーに取込まれたり、1本鎖として別の機能を持つことが知られつつある（例えば、非特許文献５参照）。【０００８】
さらに、近年ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）などの幹細胞を用いて、臓器・組織などを分化させる再生医療が注目されている。しかし、全てのｉＰＳ細胞やＥＳ細胞が所望の細胞に分化するわけではない。分化・誘導された細胞群には、未分化の幹細胞や所望の細胞に分化しなかった細胞が含まれている。多種の細胞が存在することで、最終的に癌化するなどの問題を生ずるおそれがある。例えば、再生医療で移植される細胞群中に未分化の細胞が０．０１％混入すると、腫瘍を形成する可能性が指摘されている。このため、幹細胞から分化・誘導された細胞群から未分化の幹細胞や所望の細胞に分化しなかった細胞を除去することが試みられている。【０００９】
例えば、分化・誘導された細胞群に含まれる所望の細胞の細胞表層抗原マーカーに蛍光標識抗体でラベルしたものを、セルソーターによって分離することが試みられている。しかし、この方法では、セルソーターが高価である、目的細胞を選別するための細胞表層抗原マーカーが容易に見つからないなどの問題がある。このため、分化・誘導された細胞群から所望の細胞を容易に分離することができる方法を開発することが望まれている。
【非特許文献１】Ｆｉｒｅ，Ａ．，Ｘｕ，Ｓ．，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｍ．Ｋ．，Ｋｏｓｔａｓ，Ｓ．Ａ．，Ｄｒｉｖｅｒ，Ｓ．Ｅ．  ａｎｄ  Ｍｅｌｌｏ，Ｃ．Ｃ．（１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６−８１１．
【非特許文献２】Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，Ｈａｒｂｏｒｔｈ，Ｊ．，Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ，Ｗ．，Ｙａｌｃｉｎ，Ａ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｋ．  ａｎｄ  Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．（２００１）  Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８．
【非特許文献３】Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．Ｒ．，Ｂｅｒｎａｒｄｓ，Ｒ．  ａｎｄ  Ａｇａｍｉ，Ｒ．（２００２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６，５５０−５５３．
【非特許文献４】Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．，Ｃａｕｄｙ，Ａ．Ａ．，Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｅ．，Ｈａｎｎｏｎ，Ｇ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｃｏｎｋｌｉｎ，Ｄ．Ｓ．（２００２）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，１６，９４８−９５８．
【非特許文献５】Ｌｉｍａ  ＷＦ，  Ｍｕｒｒａｙ  Ｈ，  Ｎｉｃｈｏｌｓ  ＪＧ，  Ｗｕ  Ｈ，  Ｓｕｎ  Ｈ，  Ｐｒａｋａｓｈ  ＴＰ，  Ｂｅｒｄｅｊａ  ＡＲ，  Ｇａｕｓ  ＨＪ，Ｃｒｏｏｋｅ  ＳＴ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００９  Ｊａｎ  ２３；２８４（４）：２５３５−４８．Ｅｐｕｂ  ２００８  Ｎｏｖ．  １８．  Ｌｉｎｋｓ
【特許文献１】特表２００７−５３１５２０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
すなわち、本発明は、上記問題に鑑みなされたものであり、その目的は、正常細胞と癌細胞などの異常細胞とを区別して異常細胞内あるいは正常細胞内でのみ機能する、オリゴヌクレオチド構造体および遺伝子発現制御方法を提供することを目的とする。【００１１】
また、本発明の別の目的は、多種類の細胞が含まれる細胞群から所望の細胞を容易に選択・分離することができる、オリゴヌクレオチド構造体および遺伝子発現制御方法を提供することを目的とする。【００１２】
さらに、本発明の別の目的は、一塩基置換体の検出をする新たな一塩基置換体の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討をした結果、以下のオリゴヌクレオチド構造体および遺伝子発現制御方法を見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下の通りである。【００１４】
本発明のオリゴヌクレオチド構造体は、トリガー鎖と、エフェクター鎖と、サポート鎖との３本のオリゴヌクレオチドで構成され、前記３本のオリゴヌクレオチドは、それぞれの鎖が、他の２本の鎖と結合して三方向ジョイント構造を形成し、前記トリガー鎖は、前記サポート鎖の結合している部位の外側に他のポリヌクレオチドの配列を認識する部位を有する。【００１５】
本発明のオリゴヌクレオチド構造体は、上記のような三方向ジョイント（Ｔｈｒｅｅ  Ｗａｙ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ、以下、「ＴＷＪ」ということもある）構造を有する。また、前記トリガー鎖は、前記サポート鎖の結合している部位の外側に他のポリヌクレオチドの配列を認識する部位を有している。前記トリガー鎖が、他のポリヌクレオチドの配列を認識すると、サポート鎖と他のポリヌクレオチドの交換反応を生ずる。この交換反応により、前記三方向ジョイント構造は崩壊して、オリゴヌクレオチド構造体は、トリガー鎖と他のポリヌクレオチドの結合体、エフェクター鎖と、サポート鎖とに分割される。【００１６】
ここで、エフェクター鎖を標的遺伝子または標的遺伝子転写産物の少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有するように設計しておく。例えばＲＮＡｉにおいて、ガイド鎖ＲＮＡになる鎖とするなどである。これにより、標的遺伝子または標的遺伝子転写産物と結合できるエフェクター鎖を細胞内で得ることができる。【００１７】
なお、本明細書中で、「実質的に同一の塩基配列」には、標的遺伝子または標的遺伝子転写産物の少なくとも一部の塩基配列と完全に相補的な塩基配列、ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列、標的遺伝子または標的遺伝子転写産物の少なくとも一部の塩基配列の変異鎖などを含む。【００１８】
また、上記したようにトリガー鎖は、他のポリヌクレオチドの配列を認識する部位を有する。さらに、トリガー鎖とサポート鎖とが結合している部分の塩基配列は、他のポリヌクレオチドにより鎖の交換反応が生ずる部分である。したがって、トリガー鎖の一部を、例えば癌細胞などの異常細胞内で発現し、正常細胞内で発現しない遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有するように設計しておく。このような構成とすることで、本発明のオリゴヌクレオチド構造体を所望の細胞内でのみ崩壊させることができる。一方、トリガー鎖の一部を、正常細胞内または幹細胞から分化した細胞群中の所望の細胞内で発現し、異常細胞内または所望の細胞に分化していない細胞内で発現しない遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有するように設計しておいてもよい。このような構成とすることで、正常細胞または幹細胞から分化した細胞群中の所望の細胞のみを生存させることができる。【００１９】
この構造によれば、例えばトリガー鎖に結合するオリゴヌクレオチドが、異常細胞内で特異的に発現するものであれば、異常細胞内でのみ三方向ジョイント構造を分解させて、エフェクター鎖が１本鎖となる。エフェクター鎖は、１本鎖のままであっても、例えばアンチセンスや１本鎖機能性ＲＮＡとして機能させることができる。また、エフェクター鎖に相補的に結合する他の１本鎖が存在すれば、２本鎖となり、例えばＲＮＡｉとして機能する。また、トリガー鎖結合する他の１本鎖は、トリガー鎖と、相同でなければ鎖の交換反応は起こらない。すなわち、三方向ジョイント構造を分解しない。このため、正常なポリヌクレオチドと異常なポリヌクレオチドとの塩基配列の差が一塩基置換であっても、両者を区別できる。また、本発明のオリゴヌクレオチド構造体を用いれば、ＳＮＰｓなどの検出にも用いることができる。【００２０】
前記エフェクター鎖は、相補性を有するオリゴヌクレオチドと二本鎖を形成するとよい。前記トリガー鎖が結合する他のポリヌクレオチドの配列がそれぞれ異なるトリガー鎖を有する二種のオリゴヌクレオチド構造体から、得られるエフェクター鎖同士から二本鎖を形成するとよい。特に、前記他のポリヌクレオチドの配列が、異なる遺伝子由来のものであると好ましい。【００２１】
また、本発明の遺伝子発現抑制方法は、トリガー鎖と、エフェクター鎖と、サポート鎖との３本のオリゴヌクレオチドで構成され、前記３本のオリゴヌクレオチドは、それぞれの鎖が、他の２本の鎖と結合して三方向ジョイント構造を形成し、前記トリガー鎖は、前記サポート鎖の結合している部位の外側に他のポリヌクレオチドの配列を認識する部位を有する、オリゴヌクレオチド構造体を細胞、あるいは組織に導入し、他のポリヌクレオチドが存在する細胞、あるいは組織においてのみ、前記三方向ジョイント構造の崩壊を生じさせ、１本鎖エフェクター鎖を得る、ことにより行う。【００２２】
前記エフェクター鎖は、標的遺伝子または標的遺伝子転写産物の少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有する。【００２３】
前記オリゴヌクレオチド構造体と共に、このオリゴヌクレオチド構造体のエフェクター鎖と相補的に結合するオリゴヌクレオチドを導入し、前記三方向ジョイント構造の崩壊を生じた細胞、あるいは組織内で、生じた１本鎖エフェクター鎖とオリゴヌクレオチドとが二本鎖を形成するものであってもよい。【００２４】
エフェクター鎖の塩基配列が同一で、トリガー鎖が認識する他のポリヌクレオチドが異なる二種類のオリゴヌクレオチド構造体を細胞、あるいは組織に導入し、前記トリガー鎖が認識する他のポリヌクレオチドが二種類存在する細胞、あるいは組織においてのみ、前記二種類のオリゴヌクレオチド構造体の三方向ジョイント構造を崩壊させ、生じたエフェクター鎖同士が二本鎖を形成するものであってもよい。【００２５】
本発明の一塩基置換体の検出方法は、トリガー鎖と、エフェクター鎖と、サポート鎖との３本のオリゴヌクレオチドで構成され、前記３本のオリゴヌクレオチドは、それぞれの鎖が、他の２本の鎖と結合して三方向ジョイント構造を形成し、前記トリガー鎖は、前記サポート鎖の結合している部位の外側に他のポリヌクレオチドの配列を認識する部位を有する、オリゴヌクレオチド構造体と、他のポリヌクレオチドまたは他のポリヌクレオチドの一塩基置換体とを混合し、前記オリゴヌクレオチド構造体の崩壊の有無により、他のポリヌクレオチドの一塩基置換体を検出する。【００２６】
本発明のオリゴヌクレオチド構造体を用いると、トリガー鎖の前記サポート鎖の結合している部位の外側に他のポリヌクレオチドの配列を認識する部位に同一な他のポリヌクレオチドが存在すれば、オリゴヌクレオチド構造体が崩壊する。一方、他のポリヌクレオチドの一塩基置換体の場合は、トリガー鎖に結合できないので、オリゴヌクレオチド構造体が崩壊しない。したがって、オリゴヌクレオチド構造体の崩壊の有無を確認することで、一塩基置換体を検出することができる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明のオリゴヌクレオチド構造体は、トリガー鎖と、エフェクター鎖と、サポート鎖との３本のオリゴヌクレオチドで構成され、前記３本のオリゴヌクレオチドは、それぞれの鎖が、他の２本の鎖と結合して三方向ジョイント構造を形成し、前記トリガー鎖は、前記サポート鎖の結合している部位の外側に他のポリヌクレオチドの配列を認識する部位を有する。この構造により、正常細胞または幹細胞から分化した細胞群中の所望の細胞と、異常細胞または所望の細胞に分化していない細胞などとを区別していずれかの細胞内でのみ三方向ジョイント構造を分解させ、エフェクター鎖を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、本発明のオリゴヌクレオチド構造体の概念を説明する図である。
【図２】図２は、本発明のオリゴヌクレオチド構造体の崩壊の機構を説明する図である。
【図３】図３は、ＴＷＪ、ＴＷＪ  ｎｏ  ｔａｉｌ、ＴＷＪ  ｍｕｔａｎｔ  ｔａｉｌ、ｓｉＲＮＡ、核酸成分を導入していない（図中、「ｎｏｎｅ」）ものの、ＫＤＲのｍＲＮＡの相対量を示すグラフである。
【図４】図４は、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図５】図５は、図５は、長さの異なるｍＲＮＡ相当配列が、ＴＷＪ構造体の崩壊に及ぼす影響を評価した結果を示す写真である、
【図６】図６は、長さの異なるｍＲＮＡ相当配列が、一塩基置換認識能に及ぼす影響を評価した結果を示す写真である。
【図７】図７は、一塩基置換の位置が異なるｍＲＮＡ相当配列が、一塩基置換認識能に及ぼす影響を評価した結果を示す写真である。
【図８】図８は、一塩基置換の位置が３であるｍＲＮＡ相当配列とこれに相補的な配列を有するトリガー鎖が、ＴＥＪ崩壊に及ぼす影響を評価した結果を示す写真である。
【図９】図９は、ＧＦＰ発現株とＧＦＰ非発現株において、カスパーゼに対するｓｉＲＮＡの効果を評価したグラフである。
【図１０】図１０は、ＧＦＰ  ｍＲＮＡに反応し、カスパーゼ３または８のｓｉＲＮＡを放出するＴＷＪ構造体を説明する図である。
【図１１】図１１は、ＧＦＰ発現株とＧＦＰ非発現株において、カスパーゼに対するｓｉＲＮＡを放出するＴＷＪ構造体の効果を評価したグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下に、本発明を詳細に説明する。
図１は、本発明のオリゴヌクレオチド構造体の概念を説明する図である。【００３０】
本発明のオリゴヌクレオチド構造体を構成するオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれでもよく、またＤＮＡとＲＮＡのキメラであっても、さらに化学修飾をしたものであってもよい。【００３１】
本発明のオリゴヌクレオチド構造体は、トリガー鎖１と、エフェクター鎖２と、サポート鎖３との３本のオリゴヌクレオチドで構成されている。図１に示すように、トリガー鎖１と、エフェクター鎖２と、サポート鎖３鎖とは、それぞれの鎖が、他の２本の鎖と相補的に結合して三方向ジョイント構造を形成している。具体的には、トリガー鎖１のｔ２部位とエフェクター鎖２のｅ２部位とが、エフェクター鎖２のｅ１部位とサポート鎖３のｓ２部位とが、サポート鎖３のｓ１部位とトリガー鎖１のｔ１−１部位とがそれぞれ結合している。これらの結合は、相補的な結合でなくてもよく、その一部が結合したものであればよい。【００３２】
トリガー鎖のｔ１部位は、他のポリヌクレオチドと相同配列を有する。この配列により、他のポリヌクレオチドが相補的に結合し、オリゴヌクレオチド構造体の三方向ジョイント構造を崩壊させることができる。また、トリガー鎖１のｔ１部位には、サポート鎖３と結合せず、他のポリヌクレオチドの配列を認識する部位ｔ１−２が存在する。このｔ１−２に特定のポリヌクレオチドが結合することで、鎖の交換反応が起こり、本発明のオリゴヌクレオチド構造体の三方向ジョイント構造が崩壊する。【００３３】
本発明のオリゴヌクレオチド構造体の三方向ジョイント構造を崩壊させるためには、トリガー鎖１のｔ１部位は、ガン細胞などの異常細胞内で特異的に発現するｍＲＮＡの一部と相補的に結合する塩基配列を有する。あるいは、正常細胞内または幹細胞から分化した細胞群中の所望の細胞内で発現するｍＲＮＡの一部と相補的に結合する塩基配列を有するものであってもよい。また、このようなｍＲＮＡが、トリガー鎖１のｔ１部位を認識し、オリゴヌクレオチド構造体の三方向ジョイント構造を完全に崩壊させるためには、ｔ１−２部位は、６〜２０塩基の配列であればよい。一方、オリゴヌクレオチド構造体の三方向ジョイント構造の崩壊をコントロールさせるためには、ｔ１−２部位は、４塩基程度であればよい。あるいは、トリガー鎖と相補的に結合するｍＲＮＡ塩基配列を調整して上記範囲にしてもよい。トリガー鎖１のｔ１部位に結合するｍＲＮＡは、後述するエフェクター鎖２が結合するｍＲＮＡと同一のｍＲＮＡであってもよく、異なるｍＲＮＡであってもよい。同一のｍＲＮＡである場合には、トリガー鎖１のｔ１部位に結合するｍＲＮＡの部位と、エフェクター鎖２が結合するｍＲＮＡの部位が異なるように、塩基配列を決定すればよい。【００３４】
エフェクター鎖２は、オリゴヌクレオチド構造体の崩壊後にＲＮＡｉなどの機能を奏する元となるオリゴヌクレオチドである。エフェクター鎖２は、全体で（ｅ１部位＋ｅ２部位）２１〜３０塩基程度のオリゴヌクレオチドである。エフェクター鎖２のｅ１部位またはｅ２部位は、６〜７塩基以上であればよい。エフェクター鎖２とトリガー鎖１との結合は、上記トリガー鎖１と特定のオリゴヌクレオチドとの結合により分解する程度の弱い結合になるように、エフェクター鎖２のｅ２部位の配列に対して、トリガー鎖１のｔ２部位を設計すればよい。【００３５】
エフェクター鎖２は、オリゴヌクレオチド構造体の崩壊後に標的遺伝子または標的遺伝子転写産物に対して何らかの機能を奏する配列である。このため、エフェクター鎖２は、標的遺伝子または標的遺伝子転写産物の少なくとも一部の実質的に同一の塩基配列を有する必要がある。標的遺伝子または標的遺伝子転写産物は、本発明のオリゴヌクレオチド構造体を使用する目的に応じて適宜選択すればよい。例えば、ガン細胞で特異的に発現しているガン遺伝子などである。あるいは、正常細胞内のみ発現している遺伝子や幹細胞から分化した細胞群中の所望の細胞内でのみ発現している遺伝子などであってもよい。【００３６】
サポート鎖３は、上記エフェクター鎖２とトリガー鎖１とにそれぞれ結合をし、三方向ジョイント構造を形成する。サポート鎖３のｓ１部位は、三方向ジョイント構造を維持する程度以上に相補的にトリガー鎖１のｔ１−１部位に結合している。また、サポート鎖３とエフェクター鎖２との間の結合は、三方向ジョイント構造の崩壊に伴い、分裂できる程度の弱さを有する結合である。【００３７】
次に、本発明のオリゴヌクレオチド構造体の崩壊の機構を図２を用いて説明する。
図２（ａ）に示すように、本発明のオリゴヌクレオチド構造体の近傍に上記トリガー鎖１と相補的に結合する部位を有するポリヌクレオチド４（図２の例では、ｍＲＮＡ）が存在すると、トリガー鎖１の他のポリヌクレオチドの配列を認識する部位ｔ１−２を認識し、サポート鎖３との間で交換反応が起こる。この交換反応により、三方向ジョイント構造が崩壊する。【００３８】
上記した三方向ジョイント構造の崩壊により、トリガー鎖１と、エフェクター鎖２と、サポート鎖３とは、それぞれ分離する。これにより、１本鎖のエフェクター鎖が得られる。１本鎖のエフェクター鎖は、このままで、例えばアンチセンスや１本鎖機能性ＲＮＡとして機能させることができる。また、一塩基置換体を検出する場合は、エフェクター鎖は特に機能を有しない。【００３９】
三方向ジョイント構造の崩壊後に、１本鎖のエフェクター鎖２と相補的なオリゴヌクレオチド２’が存在すると、エフェクター鎖２と相補的なオリゴヌクレオチド２’とは二本鎖を形成する。エフェクター鎖がＲＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡとのキメラの場合は、形成された２本鎖オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡとしてＲＮＡｉ機構を介してこれと相同な配列を持つｍＲＮＡを分解する。【００４０】
この１本鎖のエフェクター鎖２と相補的に結合する他のオリゴヌクレオチド２’は、オリゴヌクレオチド構造体と同時に加えたものでも、細胞内に存在するオリゴヌクレオチドでもよい。好ましくは、エフェクター鎖２と相補的に結合するオリゴヌクレオチド２’は、別のオリゴヌクレオチド構造体のエフェクター鎖２由来のものであればよい。細胞内でのＲＮＡｉなどをより効果的に行うことができるからである。【００４１】
一方、図２（ｂ）に示すように、上記トリガー鎖１と相補的に結合する部位を有するポリヌクレオチドが存在しないと、三方向ジョイント構造は崩壊しない。したがって、本発明では、トリガー鎖１およびこのトリガー鎖と相補的に結合する部位を有するポリヌクレオチドの選択が重要となる。トリガー鎖と相補的に結合する部位を有するポリヌクレオチドが、例えばガン細胞など特定の細胞内にのみ存在するものを選択することにより、特定の細胞内でのみ、三方向ジョイント構造を崩壊させることができる。また、一塩基置換されたポリヌクレオチドの場合には、鎖の交換反応が生じないので、三方向ジョイント構造は崩壊しない。【００４２】
本発明のオリゴヌクレオチド構造体は、１種類で使用してもよいが、複数種のオリゴヌクレオチド構造体を使用してもよい。特に、鎖の交換反応によりトリガー鎖に結合する前記他のポリヌクレオチドの塩基配列が異なるものを用いると好ましい。例えば、本発明のオリゴヌクレオチド構造体の三方向ジョイント構造を崩壊させたい細胞内で特異的に発現する、異なる遺伝子Ａ、Ｂが存在する場合に、一のオリゴヌクレオチド構造体のトリガー鎖に遺伝子ＡのｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する配列を設け、他のオリゴヌクレオチド構造体のトリガー鎖に遺伝子ＢのｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する配列を設けるなどである。この構成により、遺伝子Ａ、Ｂが発現している場合にのみ、エフェクター鎖から２本鎖を形成することができる。【００４３】
本発明のオリゴヌクレオチド構造体の細胞、組織、あるいは個体への導入する対象となるのは、標的遺伝子がその細胞内でＲＮＡに転写、またはタンパク質に翻訳され得るものであれば如何なるものであってもよい。具体的には、本発明の対象となる被導入体は、細胞、組織、あるいは個体を意味する。本発明に用いられる細胞としては、生殖系列細胞、体性細胞、分化全能細胞、多分化能細胞、分割細胞、非分割細胞、実質組織細胞、上皮細胞、不滅化細胞、または形質転換細胞等何れのものであってもよい。具体的には、例えば、幹細胞のような未分化細胞、幹細胞から分化・誘導された細胞群、器官または組織由来の細胞あるいはその分化細胞等が挙げられる。組織としては、単一細胞胚または構成性細胞、または多重細胞胚、胎児組織等を含む。また、上記分化細胞としては、例えば、脂肪細胞、繊維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、神経細胞、グリア、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球、ケラチン生成細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞および内分泌線または外分泌腺の細胞等が挙げられる。【００４４】
本発明で被導入体として用いられる個体として、具体的には、植物、動物、原生動物、ウィルス、バクテリア、または真菌種に属するもの等が挙げられる。植物は単子葉植物、双子葉植物または裸子植物であってよく、動物は、脊椎動物または無脊椎動物であってよい。本発明の被導入体として好ましい微生物は、農業で、または工業によって使用されるものであり、そして植物または動物に対して病原性のものである。真菌には、カビ及び酵母形態両方での生物体が含まれる。脊椎動物の例には、魚類、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ハムスター、マウス、ラット、サル及びヒトを含む哺乳動物が含まれ、無脊椎動物には、線虫類及び他の虫類、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、および他の昆虫が含まれる。【００４５】
被導入体へのオリゴヌクレオチド構造体の導入法としては、被導入体が細胞、あるいは組織の場合は、カルシウムフォスフェート法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ウィルス感染、２本鎖ポリヌクレオチド溶液への浸漬、あるいは形質転換法等が用いられる。また、胚に導入する方法としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション法、あるいはウィルス感染等が挙げられる。被導入体が植物の場合には、植物体の体腔または間質細胞等への注入または灌流、あるいは噴霧による方法が用いられる。また、動物個体の場合には、経口、局所、（皮下、筋肉内及び静脈内投与を含む）非経口、経膣、経直腸、経鼻、経眼、腹膜内投与等によって全身的に導入する方法、あるいはエレクトロポレーション法やウィルス感染等が用いられる。経口導入のための方法には、オリゴヌクレオチド構造体を生物の食物と直接混合することができる。さらに、個体に導入する場合には、例えば埋め込み長期放出製剤等として投与することや、オリゴヌクレオチド構造体を導入した導入体を摂取させることにより行うこともできる。【００４６】
本発明のオリゴヌクレオチド構造体を用いると、所定の場所で、所望のオリゴヌクレオチドを得て、所望のオリゴヌクレオチドを利用するものであれば、いかなる目的にも使用できる。例えば、以下の目的に使用できる。【００４７】
本発明のオリゴヌクレオチド構造体において、得られる１本鎖のエフェクター鎖２が、ＲＮＡの場合は、相補的に結合する他のオリゴヌクレオチド２’がＲＮＡの場合は、２本鎖ＲＮＡとしてＲＮＡｉを引き起こすことができる。【００４８】
または、本発明のオリゴヌクレオチド構造体において、得られる１本鎖のエフェクター鎖２が、修飾ＲＮＡの場合は、１本鎖修飾ＲＮＡとして、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの機能を阻害することができる。【００４９】
または、本発明のオリゴヌクレオチド構造体において、得られる１本鎖のエフェクター鎖２が、ＤＮＡの場合は、２本鎖ＤＮＡとしてデコイ核酸として機能させることができる。【００５０】
あるいは、本発明のオリゴヌクレオチド構造体において、エフェクター鎖、サポート鎖の末端に、三方向ジョイント構造が崩壊した際に発色する蛍光色素などを付加しておいて、一塩基置換の検出に用いることもできる。あるいは、電気泳動などで三方向ジョイント構造の崩壊の有無を確認することで、一塩基置換の検出に用いることもできる。【００５１】
本発明のオリゴヌクレオチド構造体は、一塩基置換されたオリゴヌクレオチドでは、三方向ジョイント構造が崩壊しない。これにより、特定のオリゴヌクレオチドを所望の細胞内でのみ機能させることができる。このように、本発明のオリゴヌクレオチド構造体を用いると、正常細胞と異常細胞とを区別できる。あるいは、幹細胞から分化・誘導された細胞群から所望の細胞に分化した細胞のみを選択することができる。【００５２】
しかも、本発明のオリゴヌクレオチド構造体は、単純な３本の短い配列が結合した構造をしている。この結果、毒性はないと考えられる。【００５３】
また、本発明のオリゴヌクレオチド構造体を用いれば、正常細胞内での三方向ジョイント構造の崩壊を抑制できる。このため、従来問題とされたＲＮＡｉ医薬の副作用を軽減できる。【００５４】
本発明のオリゴヌクレオチド構造体において、有効なトリガー鎖と、エフェクター鎖とを選択し、これと結合できるサポート鎖を設計することで、遺伝子が関与する疾病や個人の遺伝型が影響する疾病に対しても柔軟に対応できる。
【実施例】
【００５５】
以下本発明を詳細に説明するため実施例を挙げて説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。【００５６】
（実施例１）
［細胞内におけるＲＮＡｉの発生の評価］
ヒト乳がん由来細胞（ＭＣＦ−７細胞）におけるＲＮＡｉの発生を評価した。具体的には、エフェクター鎖として、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）のｍＲＮＡの一部に対応するＤＮＡを用い、トリガー鎖として、ＶＥＧＦの受容体の一つであるＫＤＲ（２型受容体）のＤＮＡを用いた。ＶＥＧＦは、多くのガン細胞が産生しており、血管をガン組織に誘導する因子である。さらに、ガン細胞自身がこの増殖因子に反応して、増殖することが知られている。ＫＤＲは、血管内皮細胞やガン細胞などの細胞表面などにあり、ＶＥＧＦと結合する。【００５７】
図１に示す三方向ジョイント構造を有するオリゴヌクレオチド構造体（以下、「ＴＷＪ構造体」という）、およびオリゴヌクレオチド構造体がトリガー鎖を認識する部位ｔ１−２の配列がトリガー鎖を認識できない配列にした、三方向ジョイント構造を有するオリゴヌクレオチド構造体（以下、「ＴＷＪ  ｍｕｔａｎｔ  ｔａｉｌ」という）、オリゴヌクレオチド構造体がトリガー鎖を認識する部位ｔ１−２を有さない三方向ジョイント構造を有するオリゴヌクレオチド構造体（以下、「ＴＷＪ  ｎｏ  ｔａｉｌ」という）を作製した。作製したオリゴヌクレオチドの配列を表１に示す。
【表１】
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【００５８】
上記作製したオリゴヌクレオチド構造体及びエフェクター鎖（配列番号１）と、配列番号４で示すＲＮＡを用いて作製したｓｉＲＮＡ（以下、「ｓｉＲＮＡ」という）と、をそれぞれヒト乳がん由来細胞（ＭＣＦ−７細胞）に導入した。２４時間後、全ＲＮＡを抽出した。ＫＤＲのｃＤＮＡを作製し、リアルタイムＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ポリメラーゼ連鎖反応）により、ｍＲＮＡの相対量を調べた。結果を図３に示す。図３は、ＴＷＪ、ＴＷＪ  ｎｏ  ｔａｉｌ、ＴＷＪ  ｍｕｔａｎｔ  ｔａｉｌ、ｓｉＲＮＡ、核酸成分を導入していない（図中、「ｎｏｎｅ」）ものの、ＫＤＲのｍＲＮＡの相対量を示すグラフである。【００５９】
図３から、ＴＷＪは明らかにＲＮＡｉを引き起こし、ＫＤＲのｍＲＮＡを減少させていることがわかる。一方、ＴＷＪ  ｎｏ  ｔａｉｌおよびＴＷＪ  ｍｕｔａｎｔ  ｔａｉｌは、これらはＫＤＲのｍＲＮＡを減少させておらず、ＲＮＡｉをほとんど引き起こしていないことがわかる。このことから、本発明のオリゴヌクレオチド構造体を用いると、ＲＮＡｉを引き起こすことができることがわかった。【００６０】
（実施例２）
［電気泳動におけるオリゴヌクレオチド構造体の崩壊の評価］
図１に示す三方向ジョイント構造を有するオリゴヌクレオチド構造体（以下、「ＴＷＪ構造体」という）が出来ているかどうか、およびｍＲＮＡ相当配列によって、その構造が崩壊しているかどうか検討をした。作製したオリゴヌクレオチドの配列を表２に示す。
【表２】
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【００６１】
実験は、エフェクター鎖、サポート鎖、トリガー鎖、構造体を崩壊させる鎖（ｍＲＮＡ相当鎖）、エフェクター鎖に相補的な鎖（エフェクター鎖とともにｓｉＲＮＡ相当二本鎖を生成する鎖）うちから以下のような組み合わせを混合し、３０分後Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥによって分析した。結果を、図４に示す。図４は、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。【００６２】
図４において、各レーンは以下のものを示す。
ａのレーン：  エフェクター鎖、サポート鎖、トリガー鎖
ｂのレーン：  エフェクター鎖、サポート鎖、トリガー鎖、ｍＲＮＡ相当鎖、エフェクター鎖に相補的な鎖
ｃのレーン：  エフェクター鎖、サポート鎖、トリガー鎖、エフェクター鎖に相補的な鎖
ｄのレーン：  エフェクター鎖、エフェクター鎖に相補的な鎖【００６３】
図４から、ａのレーンでは１００ｂｐ超の位置にＴＷＪのバンドが確認された。構造体が生成していることがわかった。【００６４】
また、ｂのレーンではｍＲＮＡ相当鎖の添加により、ｍＲＮＡ相当鎖とトリガー鎖からなるバンドがＣの位置（図中、白い楕円で囲んだ領域）に強く検出され、構造体が崩壊していることがわかった。同時に、放出されたエフェクター鎖とエフェクター鎖に相補的な鎖からなるｓｉＲＮＡ相当二本鎖がＡの位置（図中、白い楕円で囲んだ領域）に強く検出された。【００６５】
ｃのレーンではｍＲＮＡ相当鎖を加えていないので、ＴＷＪ構造体がほとんど残っていた。また、ｂのレーンと同量のエフェクター鎖に相補的な鎖を加えているにも関わらず、ｓｉＲＮＡ相当二本鎖はほとんど検出されず（Ｂの位置（図中、白い楕円で囲んだ領域））、エフェクター鎖がＴＷＪ構造体から放出されていないことがわかった。【００６６】
ｄのレーンはｂ及びｃのレーンで加えたエフェクター鎖、エフェクター鎖に相補的な鎖が全量ｓｉＲＮＡ相当二本鎖を生成した場合のポジティブコントロールを示す。【００６７】
（実施例３）
［ＴＷＪ構造のトリガー鎖に結合するポリヌクレオチドの長さの評価］
図１に示す三方向ジョイント構造を有するＴＷＪ構造体を作製し、ｍＲＮＡ相当配列の長さが、ＴＷＪ構造体の崩壊に対する、ｍＲＮＡ相当配列の長さの影響を検討した。具体的には、エフェクター鎖として、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）のｍＲＮＡの一部に対応するＤＮＡを用い、トリガー鎖として、ＶＥＧＦの受容体の一つであるＫＤＲ（２型受容体）のＤＮＡを用いた。作製したオリゴヌクレオチドの配列を表３に示す。各配列中のアンダーラインは、ＴＷＪ構造体の１本鎖の部分または１本鎖の部分の相補鎖を意味する。
【表３】
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【００６８】
図５は、長さの異なるｍＲＮＡ相当配列が、ＴＷＪ構造体の崩壊に及ぼす影響を評価した結果を示す図である。まず、図５に示すように、ｍＲＮＡ相当配列の長さｎが異なる（ｎ＝０、４、８、１２、１６）ｍＲＮＡ相当配列とＴＷＪ構造体とを１μＭずつ混合し、３０分後Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥによって分析した。図５は、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。図中、Ｍレーンは標準物質を、ＴＷＪレーンは、ＴＷＪ構造体自体を、ｎ＝０、４、８、１２、１６レーンはそれぞれｍＲＮＡ相当配列の長さが異なるものとＴＷＪ構造体とを混合して反応させたものを電気泳動させた結果を示す。【００６９】
図５から、ｎ＝０のときは、ＴＷＪ構造体が全く崩壊しなかったことがわかる。すなわち、ｍＲＮＡ相当鎖が、トリガー鎖の有する、サポート鎖の結合している部位の外側に他のポリヌクレオチドの配列を認識する部位を認識できないため、ＴＷＪ構造体が全く崩壊しなかった。【００７０】
図５から、ｎ＝４のときは、ＴＷＪ構造体（図中、「Ａ」で示す）とＴＷＪ構造体の崩壊断片（図中、「Ｂ」で示す）の両方のバンドが観察された。このことから、ｎ＝４のときは、ＴＷＪ構造体のトリガー鎖とｍＲＮＡ相当鎖との結合が十分でなく、ＴＷＪ構造体を完全に崩壊することができないことがわかった。この結果、ｎ＝４程度であれば、ＴＷＪ構造体の崩壊をコントロールすることができることがわかる。
図５から、ｎ＝８以上のときは、ＴＷＪ構造体は完全に崩壊していることがわかる。【００７１】
（実施例４）
［一塩基置換認識能の評価］
図１に示す三方向ジョイント構造を有するＴＷＪ構造体を作製し、ｍＲＮＡ相当配列の長さが、一塩基置換認識能に対する、ｍＲＮＡ相当配列の長さの影響を検討した。具体的には、エフェクター鎖として、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）のｍＲＮＡの一部に対応するＤＮＡを用い、トリガー鎖として、ＶＥＧＦの受容体の一つであるＫＤＲ（２型受容体）のＤＮＡを用いた。作製したオリゴヌクレオチドの配列を表４に示す。各配列中のアンダーラインは、ＴＷＪ構造体の１本鎖の部分または１本鎖の部分の相補鎖を意味する。
【表４】
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【００７２】
図６は、長さの異なるｍＲＮＡ相当配列が、一塩基置換認識能に及ぼす影響を評価した結果を示す写真である。まず、図６に示すように、ｍＲＮＡ相当配列の長さｎ（ｎは、トリガー鎖１のｔ１−２部位に結合するｍＲＮＡの部位）と一塩基置換の位置が異なるｍＲＮＡ相当配列とＴＷＪ構造体とを１μＭずつ混合し、３０分後Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥによって分析した。結果を、図６に示す。図６は、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。図中、Ｍレーンは標準物質を、ＴＷＪレーンは、ＴＷＪ構造体自体を、各レーンにおいて、上側の数字は、ｎの長さを、下側の数字は、一塩基置換の位置を示す。また、「−」は、一塩基置換を含まないものを示す。一塩基置換の位置を示す数字で、正の数字は、トリガー鎖１のｔ１−２部位に結合するｍＲＮＡの部位に一塩基置換が存在することを、負の数字は、トリガー鎖１のｔ１−１部位に結合するｍＲＮＡの部位に一塩基置換が存在することを意味する。また、正負は、トリガー鎖１のｔ１−１部位とｔ１−２部位との境から起算する。【００７３】
図６から、ｎ＝８のときは、一塩基置換の位置（１の位置）によってＴＷＪ構造体が崩壊することがわかる。一塩基置換の位置が３の位置にあるときは、ＴＷＪ構造体は崩壊していない。一方、ｎ＝１６のときは、一塩基置換の位置に関わらず、ＴＷＪ構造体が崩壊することがわかる。すなわち、ｍＲＮＡ相当鎖のトリガー鎖と相補的に結合する部位の長さがｎ＝８程度であれば、一塩基置換認識能があることがわかった。【００７４】
（実施例５）
［一塩基置換認識能の位置特異性の評価］
図１に示す三方向ジョイント構造を有するＴＷＪ構造体を作製し、ｍＲＮＡ相当配列に含まれる一塩基置換の位置が、一塩基置換認識能に対する、影響を検討した。具体的には、エフェクター鎖として、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）のｍＲＮＡの一部に対応するＤＮＡを用い、トリガー鎖として、ＶＥＧＦの受容体の一つであるＫＤＲ（２型受容体）のＤＮＡを用いた。作製したオリゴヌクレオチドの配列を表５に示す。各配列中のアンダーラインは、ＴＷＪ構造体の１本鎖の部分または１本鎖の部分の相補鎖を意味する。
【表５】
0005594838.tif 000006
【００７５】
図７は、一塩基置換の位置が異なるｍＲＮＡ相当配列が、一塩基置換認識能に及ぼす影響を評価した結果を示す写真である。まず、表５に示すようにｍＲＮＡ相当配列の長さｎ＝８（ｎは、トリガー鎖１のｔ１部位に結合するｍＲＮＡの部位）であり、塩基置換の位置が異なるｍＲＮＡ相当配列とＴＷＪとを１μＭずつ混合し、３０分後Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥによって分析した。結果を、図７に示す。図７中、ｍａｔｃｈは、トリガー鎖１のｔ１部位と相補的に結合するｍＲＮＡ相当配列を、１〜８は、表５に示す一塩基置換体を、２'、４'は、２、４の一塩基置換体と同一の位置で異なるリボ核酸を導入した一塩基置換体を示す。【００７６】
図７から、ｎ＝８のときは、一塩基置換が３の位置の置換体は、ＴＷＪ構造体が崩壊していないことがわかる。一塩基置換が１、２の位置の置換体は、ＴＷＪ構造体が残存しているが、ＴＷＪ構造体がほぼ崩壊していることがわかる。このことから、一塩基置換の位置にもよるが、ＴＷＪ構造体を用いれば、一塩基置換認識能があることがわかった。【００７７】
表５に示すＴＷＪ構造体のトリガー鎖において、表６に示すようにｍＲＮＡ相当配列の位置３に相補的なトリガー鎖を作製して、上記と同様の実験を行った。配列中のアンダーラインは、ＴＷＪ構造体の１本鎖の部分を意味する。
【表６】
0005594838.tif 000007
【００７８】
図８は、一塩基置換の位置が３であるｍＲＮＡ相当配列とこれに相補的な配列を有するトリガー鎖が、ＴＥＪ構造体崩壊に及ぼす影響を評価した結果を示す写真である。図８中、Ｍレーンは標準物質を、レーン１は、ＴＷＪ構造体を、レーン２は、ＴＷＪ構造体とｍＲＮＡ相当配列とを混合して反応させたものを示す。図８から、ＴＷＪ構造体が崩壊していることがわかる。すなわち、ＴＷＪ構造体を用いれば、一塩基置換認識能があることがわかった。【００７９】
（実施例６）
［細胞選択性の評価］
（カスパーゼ８またはカスパーゼ３のｓｉＲＮＡによるノックダウンの確認）
Ｆａｓリガンドは受容体Ｆａｓに結合すると細胞にアポトーシスを誘導するサイトカイン=デス因子である。具体的には、Ｆａｓリガンドは細胞表層の受容体Ｆａｓに結合して、カスパーゼ８を活性化する。次にカスパーゼ８はカスパーゼ３を活性化し、アポトーシスを引き起こす。このとき、カスパーゼ８または３が細胞内になければ、この細胞はＦａｓリガンドによるアポトーシスに耐性となる。【００８０】
ヒト培養細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ（ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ））非発現株）およびそれにＧＦＰを恒常発現させた株（ＧＦＰ発現株）を用い、表７に示すカスパーゼ8および３に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＣａｓｐ８およびｓｉＣａｓｐ３、各３３  ｍｉｃｒｏＭ）、コントロールとしてＧＦＰに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＦＰ、３３  ｍｉｃｒｏＭ）、トランスフェクション剤だけ（Ｌｉｐｏ）、無添加（ｎｏｎｅ）をそれぞれの細胞株にトランスフェクションした。２日後、Ｆａｓリガンドを（２５  ｎｇ／ｍｌ）を添加した。１日後、細胞の生死をＷＳＴで常法によりアッセイした。
【表７】
0005594838.tif 000008
【００８１】
図９は、ＧＦＰ発現株とＧＦＰ非発現株において、カスパーゼに対するｓｉＲＮＡの効果を評価したグラフである。図中、横軸において、ＦａｓＬ＋はＦａｓリガンドを添加したもの、ＦａｓＬ−はＦａｓリガンドを添加しなかったものを示し、縦軸は細胞のＷＳＴ活性を示す。図９から、ＧＦＰ発現、非発現株にかかわらず、Ｆａｓリガンドを入れた細胞のＷＳＴ活性は入れない場合の半分以下であった。一方、カスパーゼに対するｓｉＲＮＡを入れた場合もＧＦＰ発現、非発現株にかかわらず、Ｆａｓリガンドを入れない場合とほぼ同等であった。すなわち、カスパーゼに対するｓｉＲＮＡは細胞内でカスパーゼのｍＲＮＡをノックダウンしていることが示唆された。【００８２】
（ＴＷＪ構造体の設計）
ＧＦＰのｍＲＮＡを認識する部位を有するトリガー鎖と、カスパーゼ８または３に対するｓｉＲＮＡを放出するエフェクター鎖（下記表８に示す「ガイド鎖」）を有するＴＷＪ構造体を設計した。このＴＷＪ構造体を用いると、細胞がＧＦＰを発現していると、ＧＦＰ  ｍＲＮＡによって、ＴＷＪ構造体が崩壊し、カスパーゼ８または３に対するｓｉＲＮＡを放出し、カスパーゼ８または３をノックダウンする。これにより、Ｆａｓリガンドによるアポトーシス誘導に耐性となる。一方、ＧＦＰ非発現細胞ではＧＦＰ  ｍＲＮＡが存在しないので、ＴＷＪ構造体は崩壊しない。すなわち、ｓｉＲＮＡは放出せず、アポトーシスに感受性である。このため、Ｆａｓリガンドによって細胞死が起こる。【００８３】
具体的には、表８に示す配列を有するＴＷＪ構造体を作製した。トリガー鎖は、ＧＦＰ  ｍＲＮＡの２１９−２４０または５４３−５６５の位置と相補的になるようにしてあり、これらの部位に反応して崩壊する。これらの組み合わせで、計４種類のＴＷＪ構造体を設計した。表中、ＴＷＪｃａｓｐ８  ２１９とは、図１０に示すように、ＧＦＰ  ｍＲＮＡ２１９−に反応し、カスパーゼ８のｓｉＲＮＡを放出するＴＷＪ構造体を意味する。
【表８】
0005594838.tif 000009
【００８４】
（ＴＷＪ構造体による細胞選択的生存）
ヒト培養細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ（ＧＦＰ非発現株）およびそれにＧＦＰを恒常発現させた株（ＧＦＰ発現株）を用い、４種類のＴＷＪ構造体＋パッセンジャー鎖（各３３  ｍｉｃｒｏＭ）、コントロールとしてトランスフェクション剤だけ（Ｌｉｐｏ）、無添加（ｎｏｎｅ）をそれぞれの細胞株にトランスフェクションした。２日後、ＦａｓＬｉｇａｎｄを（２５  ｎｇ／ｍｌ）を添加した。１日後、細胞の生死をＷＳＴで常法によりアッセイした。結果を図１１に示す。【００８５】
図１１は、ＧＦＰ発現株とＧＦＰ非発現株において、カスパーゼに対するｓｉＲＮＡを放出するＴＷＪ構造体の効果を評価したグラフである。図中、横軸において、ＦａｓＬ＋はＦａｓリガンドを添加したもの、ＦａｓＬ−はＦａｓリガンドを添加しなかったものを示し、縦軸は細胞のＷＳＴ活性を示す。図１１から、ＧＦＰ非発現株では、ＴＷＪ構造体の有無にかかわらず、Ｆａｓリガンドを添加するとアポトーシスが誘導し、ＷＳＴ活性は半分程度になった。一方、ＧＦＰ発現株ではＴＷＪ構造体を入れないコントロールでは同様にアポトーシスが誘導された。しかし、ＴＷＪ構造体添加後、Ｆａｓリガンドを入れたものは（ＴＷＪ  ｃａｓｐ３  ２１９を除き）細胞が死んでおらず、アポトーシスしていない、すなわち選択的に生存していることがわかった。【００８６】
以上より、本発明のＴＷＪ構造体を用いると、ＧＦＰ  ｍＲＮＡがあると生存し、ないとアポトーシスが誘導され死に至るという細胞選択性を有することが示された。
【符号の説明】
【００８７】
１    トリガー鎖
２    エフェクター鎖
２’    エフェクター鎖に相補的なオリゴヌクレオチド
３    サポート鎖
４    トリガー鎖に相補的に結合する部位を有するポリヌクレオチド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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