(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトを除く動物の皮膚にヘルペスウイルスＨＳＶ−１、７４０１Ｈ株を接種する工程、および、
水痘帯状疱疹ウイルス前初期タンパク質ＩＥ６２中に含まれる配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを認識し、かつ、脳由来神経栄養因子と交差反応する抗体を前記動物に投与する工程
を含む、帯状疱疹痛および帯状疱疹後神経痛モデル動物の作製方法。
【請求項２】
前記脳由来神経栄養因子が二量体である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
動物がげっ歯類である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか１項に記載の方法により得られる帯状疱疹痛および帯状疱疹後神経痛モデル動物。
【請求項５】
請求項４に記載の帯状疱疹痛および帯状疱疹後神経痛モデル動物に被験物質を投与する工程を含む、帯状疱疹痛および／または帯状疱疹後神経痛の治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、帯状疱疹後神経痛モデル動物の作製方法に関する。詳しくは、帯状疱疹痛および帯状疱疹後神経痛モデル動物の作製方法ならびに得られたモデル動物を用いた帯状疱疹痛および／または帯状疱疹後神経痛の治療薬のスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
水痘帯状疱疹ウイルス(ＶＺＶ)感染は、急性小脳失調症（ＡＣＡ）、ヘルペス後神経痛（ＰＨＮ）等の神経学的合併症を生じさせる。ＡＣＡは、水痘感染に伴う最もよく起こる神経学的合併症である。１５歳未満の小児の４０００症例当たり１例で起こると推定されている。ＡＣＡは、発疹の開始の数日前から３週間後に出現し、完全回復まで２〜４週間続く。帯状疱疹は、感覚の異常を伴うデルマトームに沿った領域分布中に水疱性発疹が現れ、一般的集団における年間発生率は、英国において１０００人当たり３．４である(非特許文献１)。ＰＨＮは、帯状疱疹の最も頻度の高い合併症であり、患者の７〜３５％（６０歳以上では５０％を越える）で発症する。ＰＨＮは、急性神経炎に伴う痛みとは異なり、休みなく続く痛み、電撃痛およびアロディニアを合併する（非特許文献２）。
【０００３】
脳由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)は、発達段階および成人において、生存、分化、シナプス可塑性ならびに末梢および中枢ニューロンの選択伸長に重要な役割を果たしていると認識されている、神経栄養因子ファミリーのメンバーである（非特許文献３、４）。ＢＤＮＦのｃＤＮＡは、２４７アミノ酸残基からなる前駆体タンパク質をコードしている。前駆体タンパク質は、シグナルペプチドおよびプロプロテインを有し、これらは切断されて１１９アミノ酸残基の成熟ＢＤＮＦが生成する。生物活性なＢＤＮＦ(２７ｋＤａ)は、強力な疎水性相互作用により２つの同じサブユニットから形成される二量体である。ＢＤＮＦがシナプスの長期増強、学習および記憶等の頻度依存性可塑性メカニズムに関与していることはよく知られている。ＢＤＮＦは、臨床上の痛覚過敏症の原因となる可塑性に関与している（非特許文献５）。
【０００４】
帯状疱疹痛および帯状疱疹後神経痛は、モルヒネなどの強力な鎮痛薬に抵抗性を示すことが知られている。したがって、帯状疱疹痛および帯状疱疹後神経痛に対する有用な鎮痛薬の開発が望まれているが、いまだ実現には至っていない。かかる医薬品の開発にとって、帯状疱疹痛および帯状疱疹後神経痛と同様の臨床症状を示すモデル動物が不可欠である。しかしながら、ＶＺＶは種特異性が高く、ヒト以外の動物に実験的に感染し、ヒトと同様の臨床症状を示したという報告はない。
【０００５】
一方、ＶＺＶと同様、ヘルペスウイルス科に属する単純ヘルペスウイルス１型（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １、以下、ＨＳＶ−１と称することがある）はＶＺＶと同様に、一次知覚神経に感染し、感覚神経節に感染する特徴を有する。ＨＳＶ−１は種特異性が低く、ウサギ、モルモット、ラット、マウスなどに感染させることが可能であり、マウスを用いた動物実験においてＨＳＶ−１を感染させて帯状疱疹様皮膚病変を誘発するマウス帯状疱疹モデルが報告されている（非特許文献６）。マウス帯状疱疹モデルを用いた、皮膚病変の進展を指標にした抗ウイルス薬の開発やＨＳＶ−１感染のメカニズム解明に関する報告は多くある。また、ＨＳＶ−１感染による痛み反応を発現させた帯状疱疹または類似の病態に伴う痛みのモデル動物が知られている（特許文献１）。前記モデル動物はウイルス感染の急性期における疼痛モデルであり、慢性期に移行した帯状疱疹後の疼痛を発現させたモデルではない。帯状疱疹の慢性期モデルを作出させるため、ＨＳＶ−１感染による帯状疱疹後神経痛モデル動物の作製方法が知られている（特許文献２）。前記方法は、ＨＳＶ−１感染後に感染動物を治療する工程を要するので、モデル動物の作出は治療の有効無効に左右され、急性期の疼痛モデルとはなり得ない。このように、ヒトのＶＺＶ感染の予後を明確に反映し、かつ感受性の高い帯状疱疹痛および帯状疱疹後神経痛を発現するモデル動物は、いまだ知られていない。
【特許文献１】特開２００１−３７３７２号公報
【特許文献２】特開２００２−３３０６６６号公報
【非特許文献１】Johnson, R. W. et al., BMJ 326: 748-750, 2003
【非特許文献２】Donald H. Gilden et al., Neurology 64: 21-25, 2005
【非特許文献３】Nagappan G. Lu B., Trends in Neurosciences, 28: 464-471, 2005
【非特許文献４】Bramham CR et al., Progress in Neurology, 76: 99-125, 2005
【非特許文献５】Coull, J. A. M. et al., Nature 438: 1017-1021, 2005
【非特許文献６】Kurokawa M. and Shiraki K., J.Traditional Medicines, 11: 71-85, 1994
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、帯状疱疹痛および帯状疱疹後神経痛の機序の解明に寄与し、当該疾患の治療に役立つ手段の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の前初期タンパク質ＩＥ６２は、最も主要な転写調節因子である。本発明者らは、ＢＤＮＦが臨床上の痛覚過敏症の原因となる可塑性に関与していることからＰＨＮの病態のメカニズムを解析できるのではないかという仮説を立て、ＶＺＶとＢＤＮＦとの免疫学的関連を調べた。ＶＺＶは、潜伏感染した神経節で遺伝子４、２１、２９、６２、６３を発現し、前初期タンパク質ＩＥ６２が感染中にウイルス遺伝子の転写活性化に中心的役割を果たす。ＰＨＮ患者を含む水痘回復期患者由来の血清は、ウェスタンブロット解析でＩＥ６２およびＢＤＮＦを認識した。本発明者らは、ＩＥ６２とＢＤＮＦとの免疫学的関係をさらに調べ、これらの間で免疫学的交差反応性を見出した。ＢＤＮＦと交差するＩＥ６２抗体のなかには、ＢＤＮＦの生物活性を阻害する抗体と、他にもＢＤＮＦの生物活性を促進する抗体があることを見出し（PCT/JP2007/72284）、後者の促進抗体を用いることで帯状疱疹痛および帯状疱疹後神経痛のモデルを作出することに成功し、本発明を完成するに至った。すなわち、本願発明は、以下に示す通りである。
【０００８】
〔１〕  ヒトを除く動物の皮膚にヘルペスウイルスを接種する工程、および、
水痘帯状疱疹ウイルス前初期タンパク質を認識し、かつ、脳由来神経栄養因子と交差反応する抗体を前記動物に投与する工程
を含む、帯状疱疹痛および帯状疱疹後神経痛モデル動物の作製方法。
〔２〕  前記タンパク質がＩＥ６２であり、前記抗体が配列番号２の４１４−４２９位のアミノ酸配列を有するペプチドを認識するものである前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕  前記脳由来神経栄養因子が二量体である前記〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕  動物がげっ歯類である前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載の方法。
〔５〕  前記〔１〕〜〔４〕いずれか１項に記載の方法により得られる帯状疱疹痛および帯状疱疹後神経痛モデル動物。
〔６〕  前記〔５〕に記載の帯状疱疹痛および帯状疱疹後神経痛モデル動物に被験物質を投与する工程を含む、帯状疱疹痛および／または帯状疱疹後神経痛の治療薬のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の帯状疱疹痛および帯状疱疹後神経痛モデル動物の作製方法によれば、ヒトの帯状疱疹痛と帯状疱疹後神経痛の病因に関与する抗水痘ＩＥ６２抗体を用いることによって、ヒトの帯状疱疹痛および帯状疱疹後神経痛を良好に反映した、神経損傷を伴う痛覚閾値の低下をきたしたモデル動物を作出することができる。本発明のモデル動物および当該モデル動物を用いたスクリーニング方法によれば、これまで達成できなかった新規抗疼痛性治療薬の開発が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明において「帯状疱疹痛」とは、ヘルペスウイルス感染による帯状疱疹様皮膚病変の発症に先行あるいはそれと同時に起こるアロディニアを含む疼痛をいう。
【００１１】
本発明において「帯状疱疹後神経痛」とは、ヘルペスウイルス感染による帯状疱疹様の皮膚症状が治癒した後にアロディニアを主訴として起こる疼痛をいう。
【００１２】
本発明において「ヘルペスウイルス」とは、ヘルペスウイルス科に属するウイルスをいい、特に単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２型（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２、ＨＳＶ−２）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）が好ましい。
【００１３】
水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）は、水痘(varicella)および帯状疱疹(zoster)の病原媒体である。ＶＺＶゲノムは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ分子であり、例えば、J. Gen Virol. (1986), 67, 1759-1816にその全塩基配列およびコードされるタンパク質のアミノ酸配列が開示されている。あるいは、ＶＺＶ（ヒトヘルペスウイルス３）として、Genbank Accession No: NC_001348においても、全ゲノムの塩基配列および当該ゲノムからコードされるタンパク質のアミノ酸配列が開示されている。ＶＺＶゲノムは、約７０種のタンパク質をコードしている。ＶＺＶの全遺伝子は、前初期(ＩＥ)、初期(Ｅ)および後期(Ｌ)という３つの広い動態クラス中で、感染細胞中に発現すると考えられている。ＶＺＶ ＩＥ６２タンパク質は、ＶＺＶタンパク質の３つの動態クラスのすべての発現の活性化に関与している。
【００１４】
本発明において「水痘帯状疱疹ウイルス前初期タンパク質を認識し、かつ、脳由来神経栄養因子と交差反応する抗体（以下、促進抗体とも称する）」は、ＶＺＶがコードするタンパク質の中で、前初期タンパク質、好ましくはＩＥ６２を抗原として製造されたものである。抗原としてのＩＥ６２タンパク質も、前記文献およびGenbank等でそのアミノ酸配列が開示されている。例えば、ヒトヘルペスウイルス３  ＶＺＶ−Ｏｋａ株の場合、Genbank Accession No:AY016449にＩＥ６２の塩基配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）が開示されている。また、ヒトヘルペスウイルス３  ＶＺＶ−野生株（河口株）は、Journal of Virology 2002 p11447-11459を参照のこと。
【００１５】
前記促進抗体は、配列番号２のＩＥ６２のアミノ酸配列において、４１４−４２９位のアミノ酸配列（ＰＧＹＲＳＩＳＧＰＤＰＲＩＲＫＴ：配列番号３）を有するペプチドを認識するものであることが好ましい。かかるペプチドを認識する促進抗体は、後述するＢＤＮＦとの交差反応性をより顕著に有するため、好ましい。前記ペプチドは、本発明における促進抗体のエピトープとして機能するものであり、その抗原決定基としての機能を失わない限りにおいて、配列番号３のアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端から１〜３アミノ酸程度欠失していてもよい。あるいは、前記ペプチドは、その抗原決定基としての機能を失わない限りにおいて、追加のアミノ酸配列を１〜数個（通常１〜５、好ましくは１〜３）、そのＮ末端またはＣ末端に有していてもよい。追加のアミノ酸残基としては、後述する高分子化合物（タンパク質）との結合のために導入されるシステイン残基などがあげられる。
【００１６】
前記促進抗体は、前初期タンパク質、好ましくはＩＥ６２を高感度かつ高い特異性で認識することができるとともに、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）と交差反応することを特徴とする。
【００１７】
脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）は、ヒトＢＤＮＦとして、GenBank Accession No.NM_170731-170735、NM_001709にその塩基配列およびアミノ酸配列が開示されている。前記促進抗体が交差反応するＢＤＮＦは、成熟体であり、好ましくは成熟体の二量体である。
【００１８】
本明細書でいう「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等の天然型抗体、遺伝子組換え技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体や一本鎖抗体、ヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造され得るヒト抗体、ファージディスプレイによって作製された抗体およびこれらの結合性断片が含まれる。
【００１９】
結合性断片とは、前述した抗体の一部分の領域を意味し、具体的には例えばF(ab')2、Fab'、Fab、Fv（variable fragment of antibody）、sFv、dsFv（disulphide stabilised Fv）、dAb（single domain antibody）等があげられる（Exp. Opin. Ther. Patents，Vol.6, No.5, p.441-456, 1996）。
【００２０】
抗体のクラスは、特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。好ましくは、ＩｇＧまたはＩｇＭであり、精製の容易性等を考慮するとより好ましくはＩｇＧである。
【００２１】
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、既知の一般的な製造方法によって製造することができる。即ち、例えば、免疫原を、必要に応じてフロイントアジュバント（Freund's Adjuvant）とともに、哺乳動物、例えばポリクローナル抗体の場合、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマまたはウシ等、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヤギ、ウマまたはウサギに、モノクローナル抗体の場合、マウス、ラット、ハムスターに免疫する。
【００２２】
一実施態様において、免疫原としてのＩＥ６２ペプチドは、公知の方法により製造することができる。例えば、配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチドを常法に従って合成し、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン（ＴＧ）、免疫グロブリン等の高分子化合物（タンパク質）との複合体を形成させた後、免疫原として用いることができる。
【００２３】
前記ＩＥ６２ペプチドと高分子化合物との複合体を形成させる等の目的で、１個または数個のアミノ酸を付加してもよい。付加されるアミノ酸の数は、特に限られないものの、製造される抗体の特異性を考慮すると、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜２個、最も好ましくは１個である。付加されるアミノ酸の位置はポリペプチドのＮ末端またはＣ末端いずれでもよいが、Ｃ末端が好ましい。
【００２４】
複合体の形成方法は、公知の方法により行なうことができ、特に限定されるものではない。例えば、混合酸無水物法または活性エステル法等により前記ＩＥ６２ペプチドのカルボキシ基と前記高分子化合物の官能基とを反応させて、複合体を形成することができる。あるいは、前記ＩＥ６２ペプチドのＣ末端にシステイン残基を導入し、当該システインの側鎖であるＳＨ基を介して前記高分子化合物と結合させることもできる。
【００２５】
別の態様において、例えば、配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチドをコードするヌクレオチドを他のタンパク質（例、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ））をコードするヌクレオチドと連結した発現ベクターを用いて、常法により他のタンパク質との融合タンパク質として宿主で発現させ、精製したものを免疫原として用いることができる。促進抗体の作製方法の具体例は、後述する実施例で詳細に説明している。
【００２６】
本発明の帯状疱疹痛および帯状疱疹後神経痛モデル動物（以下、単にモデル動物と省略する場合がある）の作製方法は、下記工程：
ヒトを除く動物の皮膚にヘルペスウイルスを接種する工程、および、
水痘帯状疱疹ウイルス前初期タンパク質を認識し、かつ、脳由来神経栄養因子と交差反応する抗体を前記動物に投与する工程
を含むことを特徴とする。
【００２７】
（１）ヒトを除く動物の皮膚にヘルペスウイルスを接種する工程
本工程により、動物に対する神経損傷が誘導される。
【００２８】
本発明の方法に用いられる動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ、ブタ、ネコ、イヌ、サル等の実験動物があげられるが、好ましくはげっ歯類、より好ましくはマウスである。マウスを用いる場合には５〜８週齢のものが好ましい。
【００２９】
ヘルペスウイルスを前記動物の皮膚に接種する方法として、動物におけるウイルス感染に用いられている種々の方法が利用できる。特に、脱毛、創傷した表皮にウイルスを滴下して感染させる方法が好ましい。滴下するウイルス量としては、１×１０4〜１×１０8ＰＦＵを用いることが好ましく、さらに、好ましくは、１×１０5〜１×１０7ＰＦＵである。
【００３０】
（２）水痘帯状疱疹ウイルス前初期タンパク質を認識し、かつ、脳由来神経栄養因子と交差反応する抗体を前記動物に投与する工程
本工程は、神経損傷した動物に対して痛覚過敏が誘導される。
【００３１】
促進抗体の投与量は、動物当たり通常5〜1000μｇであり、好ましくは50〜100μｇである。促進抗体の投与経路は特に限定されるものではなく、腹腔内、髄腔内、静脈内、皮下があげられる。痛覚に関係するので、神経系に直接作用させるという観点から、好ましくは髄腔内である。
【００３２】
ＩＥ６２の交差する４１４−４２９位のアミノ酸配列含むＧＳＴ−Ｃ蛋白（１０μｇ）の複数回（好ましくは３回程度）の投与により、ＢＤＮＦと免疫交差する抗体を誘導する方法も挙げられる。
【００３３】
工程（２）は、抗体投与による動物に痛覚過敏が誘導される限りにおいて、工程（１）より前、工程（１）と同時、工程（１）より後のいずれでもよい。工程（１）より前に投与する場合、２時間前が好ましい。工程（１）より後に投与する場合、０〜２４時間後が好ましい。
【００３４】
このようにして得られた本発明の帯状疱疹痛および帯状疱疹後神経痛モデル動物は、以下の特徴を有することが好ましい。
１．ＨＳＶによる病変であっても帯状疱疹様病変を形成し、そこに、ＢＤＮＦ活性を増強する促進抗体を存在させることで、帯状疱疹中の痛覚過敏のみならずＰＨＮを発現するモデルである。
２．痛覚の閾値を指標とした場合には、ヘルペスウイルスの病変による痛覚に加え、促進抗体によって増強された痛覚に対する治療効果が判定できるので、薬剤のスクリーニングに優れる。
３．促進抗体によって形成された痛覚過敏は、当該抗体のエピトープ等のＩＥ６２関連物質による予防または治療効果が判定できる。
【００３５】
したがって、本発明は、本発明のモデル動物を用いた帯状疱疹痛および／または帯状疱疹後神経痛の治療薬のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、本発明のモデル動物に被験物質を投与する工程を含む。より具体的には、下記工程（ａ）〜（ｃ）を含む。
【００３６】
（ａ）本発明のモデル動物に被験物質を投与する工程、
（ｂ）前記被験物質を投与したモデル動物における痛覚過敏の程度を調べ、被験物質を投与しないモデル動物における程度と比較する工程、および、
（ｃ）前記（ｂ）の比較結果に基づいて、痛覚過敏の閾値を上昇させる被験物質を選択する工程を含む。
【００３７】
前記工程（ａ）において、被験物質とは、いかなる公知物質および新規物質であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分などがあげられる。また、これらの化合物の２種以上の混合物を試料として供することもできる。
【００３８】
前記被験物質を本発明のモデル動物に投与する方法は特に限定されるものではないが、経口的または非経口的に投与され得る。非経口的投与としては、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、皮下等の全身投与、あるいは標的組織付近への局所投与等があげられる。
【００３９】
前記被験物質の投与量は、有効成分の種類、分子の大きさ、投与経路、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって適宜設定することができる。
【００４０】
前記工程（ｂ）において、被験物質を投与したモデル動物における痛覚過敏の程度を調べる方法としては、例えば、von Frey hairを用いた測定法があげられる。
【００４１】
前記工程（ｂ）において、被験物質を投与しないモデル動物における痛覚過敏の程度も同時にまたは別途調べ、投与モデル動物の結果と非投与モデル動物の結果とを比較する。
【００４２】
前記工程（ｃ）において、工程（ｂ）で得られた比較結果に基づき、痛覚過敏の閾値を上昇させる被験物質を選択する。選択する基準は、非投与モデル動物に比べて、痛覚過敏の閾値を有意に上昇させることを指標にすればよい。
【００４３】
本発明のスクリーニング方法によって選別された物質（医薬候補物質）が適用される疾患としては、神経突起の伸長を阻害することにより病態の改善が期待される疾患である。例えば、帯状疱疹痛および帯状疱疹後神経痛を始めとして、慢性疼痛、経験依存性社会嫌悪、ストレスなどがあげられる。慢性疼痛は、
(1)侵害受容器が持続的に刺激されて生じると考えられる侵害受容性疼痛、
(2)疼痛伝達または抑制機構にかかわる神経線維の働きに異常をきたした結果である神経因性疼痛、および
(3)感情または情動面に重きがおかれる心因性疼痛、に分類される。本明細書でいう慢性疼痛は、神経因性疼痛（神経の損傷や圧迫などからくる痛み）、侵害受容性疼痛（ガンやリウマチなどの痛み）の二種類をいう。経験依存性社会的嫌悪(社会的挫折ストレス)とは、中辺縁ドーパミン経路のＢＤＮＦが必須の役割を果たしている状態である。
【００４４】
本発明のモデル動物を用いて、後根神経節、脊髄後根の病理組織学的検討や遺伝子発現より、痛覚モデルの機構の解析を行うことができる。さらに、本発明のモデル動物を用いることにより、帯状疱疹後神経痛などの疾患に対する新規医薬品の他、バイオマーカーの創出にもつながるものである。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【００４６】
ウイルスおよび細胞培養
ＶＺＶの岡株（弱毒水痘ウイルス岡株（日本国特公昭５３−４１２０２号又は米国特許第３，９８５，６１５号）に由来のウイルスをシードに用いて製造され、世界の諸国で広く実用に供されている（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｖａｒｉｃｅｌｌａ Ｖａｃｃｉｎｅ（Ｌｉｖｅ）Ａｄｏｐｔｅｄ １９８４；Ｒｅｖｉｓｅｄ １９９３：ＷＨＯ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｎｏ．８４８，ｐｐ．２２−３８，１９９４）。該弱毒岡株は、寄託番号ＶＲ−７９５として１９７５年３月１４日にＡＴＣＣに寄託されている。）およびＶＺＶの河口株（Journal of Virology, Nov. 2002, P.11447-11459）は、ヒト胎性肺細胞またはヒト肺癌細胞株Ａ５４９細胞で増殖させた。前記細胞はそれぞれ、１０％および２％ウシ胎仔血清を補足したEagle'ｓ最小必須培地中で生育し、維持した。
ＨＳＶ１の培養方法は、下記のように行なった。
単層培養Ｖｅｒｏ細胞に、ＨＳＶ−１（７４０１Ｈ株）を感染し、十分にウイルス感染が広がり、細胞変性現象を認めた培養フラスコを３回凍結融解し、遠心後その上清を分注後、凍結し、使用まで保存した。一部、ウイルス力価測定に用いた。
ラット皮質ニューロンの初代培養細胞は、既報(Tabuchi, A., et al., J. Biol. Chem.277, 35920-35931 (2002))に従って、17〜18日齢胎仔ラット(Sprague-Dawley)の大脳皮質から調製した。要約すると、大脳皮質の小片を酵素（ＤＮアーゼＩ（Sigma）の後にトリプシン（Sigma））処理および機械的分離により断片化し、当該細胞を、60mmの培養皿(Iwaki)に５×１０6個の密度で播種した。前記細胞を１０％ウシ胎仔血清を含むDulbecco’s 変法Eagle’s 培地(Nissui) 中で４８時間生育させ、次いで、グルコース(4.5mg/ml)、トランスフェリン(5μg/ml)、インスリン(5μg/ml)、亜セレン酸ナトリウム(5μg/ml)、ウシ血清アルブミン(1mg/ml)および硫酸カナマイシン(100μg/ml)を含む、無血清Dulbecco’s 変法Eagle’s 培地(ＴＩＳ培地)に交換した。シトシンアラビノシド(Sigma)を２μＭ加え、グリア細胞の増殖を抑制した。ＤＮＡのトランスフェクションの２時間前に、培地を新鮮なＴＩＳ培地（シトシンアラビノシドは不含）と置換した。
【００４７】
製造例１
ＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質の発現およびポリクローナル抗体の産生
ＶＺＶのＩＥタンパク質の一部を断片に分割し、ＧＳＴ融合タンパク質として合成した。前記ＧＳＴ融合タンパク質は、図１Ａに示すように、相互に重複して分子全体をカバーしている。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＩＥ６２融合タンパク質を発現する組換えプラスミドは、ＶＺＶ遺伝子のＩＥ６２遺伝子を増幅し、増幅ＤＮＡ断片をベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１（ファルマシア）に挿入することにより構築した。
【００４８】
１）ＲＮＡの単離および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ−ＰＣＲ)
全ＲＮＡを、ISOGEN(日本ジーン)を用いて培養細胞から抽出した。ＲＴ−ＰＣＲは、既報(Kawasaki, E. S., et al., Amplification of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and applications, Academic Press, Inc., SanDiego,21−27（1991）)に従って行った。要約すると、全ＲＮＡ（１μｇ）を、２０μlの１×第一鎖緩衝液中でｃＤＮＡに逆転写した。前記緩衝液は、以下のものを含む：
プライマーとして、0.5μM オリゴ(dT)15 (5’-AAGCTTTTTTTTTTV-3’)（配列番号６）、200 unitsのSuperScript II reverse transcriptase (Invitrogen)、400μM dNTPs、および10 unitsのＲＮアーゼ阻害剤(Invitrogen)。
逆転写反応の後、反応混合物を１．１ユニットのＲＮアーゼＨ(Invitrogen)で３７℃で２０分処理し、ｃＤＮＡ溶液としてＰＣＲに用いた。ＰＣＲは、1μlのｃＤＮＡ溶液、1.25 unitsのAmpliTaq Gold ＤＮＡ ポリメラーゼ (PerkinElmer Life Sciences)、1.5 mM MgCl2、200μM dNTPsおよび0.5μM プライマー対を含む50μlの1×ＰＣＲ緩衝液中で行った。ラットＢＤＮＦ遺伝子の４つのエキソン(エキソンI、エキソンII、エキソンIIIおよびエキソンIV)を区別するため、E-I(5’-ACTCAAAGGGAAACGTGTCTCT-3’)（配列番号７）、E-II(5’-CGGTGTAGGCTGGAATAGACT-3’)（配列番号８）、E-III(5’-CTCCGCCATGCAATTTCCACT-3’)（配列番号９）、E-IV(5’-GTGACAACAATGTGACTCCACT-3’)（配列番号１０）およびE-Vas(5’-GCCTTCATGCAACCGAAGTA-3’)（配列番号１１）を用いた。
【００４９】
内部標準として、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH) cDNA を、GAPDH センス(5’-TCCATGACAACTTTGGCATTGTGG-3’)（配列番号１２）およびアンチセンス(5’-GTTGCTGTTGAAGTCGCAGGAGAC-3’)（配列番号１３）プライマー対を用いて増幅した。ＢＤＮＦ ｃＤＮＡの増幅では、ＰＣＲ条件は、95℃で10分間前加熱した後、以下の通りであった:変性94℃、1分、アニーリング55℃、1分および伸長72℃、1.5分を32サイクル(エキソンI)、31サイクル(エキソンII)、26サイクル(エキソンIII)および29サイクル(エキソンIV)、ならびに最終伸長を72℃で10分。ＧＡＰＤＨの増幅は、前記と同じ条件下で31サイクル行った。ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲルでの電気泳動により分離し、臭化エチジウムで染色したＤＮＡのバンドの密度を、Bit-Map loader (ATTO) およびソフトウエア(NIH Image 1.52)を用いて分析した。
【００５０】
２）ＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質の発現
構築した組換えプラスミドで大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、形質転換体を得た。形質転換体を培養し、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加して、３７℃で４時間または室温で一晩インキュベートすることにより融合タンパク質の発現を誘導した。誘導した融合タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した（図１Ｂ）。誘導した融合タンパク質を、グルタチオンセファロース４Ｂ（ファルマシア）を用いて、製造者の指示書およびＳＤＳ−ＰＡＧＥで同定した分子量に基づいて精製した。組換えプラスミドの構築は、シークエンスにより確認した。ＩＥ６２融合タンパク質の抗原性は、イムノブロッティングで機能した。
【００５１】
製造例２
ＩＥ６２に対するモノクローナル抗体の産生
ＩＥ６２に対するモノクローナル抗体は、ＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質を用いて、本質的に既報（Okuno et al, Virology 129, 357-368 (1983)）に記載の方法に従って製造した。ハイブリドーマの培養上清をＧＳＴタンパク質に対するＥＬＩＳＡおよびＶＺＶ感染細胞に対する免疫蛍光抗体によりスクリーニングし、ＩＥ−６２モノクローナル抗体産生ハイブリドーマをクローニングした。
【００５２】
試験例１
免疫蛍光抗体（ＩＦＡ）アッセイ
ＶＺＶ感染細胞を−２０℃でアセトン固定し、ＢＤＮＦまたはＩＥ６２に対するモノクローナル抗体およびフルオレセイン結合抗マウスＩｇＧ血清をそれぞれ一次および二次抗体として用いて染色した。ＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質に対するウサギ抗血清は、フルオレセイン結合抗ウサギＩｇＧ血清(Jackson)を二次抗体として用いて、ＶＺＶ感染細胞に対する免疫蛍光抗体により確認した。
【００５３】
試験例２
ウェスタンブロッティング
ＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質またはＶＺＶ感染細胞の溶解液をＳＤＳゲルに負荷し、電気泳動により分離し、ニトロセルロース膜（Millipore）に転写した。前記膜を、ＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質に対するウサギ抗血清、ＩＥ６２モノクローナル抗体(1:10,000希釈、大阪大学微生物病研究所製)またはヒトＢＤＮＦモノクローナル抗体(0.5μg/mlに希釈、R&Dシステムズ製)でプローブした。ペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ血清またはヤギ抗マウスＩｇＧ血清とともにさらに１時間インキュベーションした後、免疫ブロットをＥＣＬ法(ナカライテスク)により展開した。
【００５４】
試験例３
ＩＥ６２モノクローナル抗体により認識されるＩＥ６２のエピトープの決定
ＩＥ６２モノクローナル抗体により認識されるＩＥ６２のエピトープは、合成ペプチドを用いたＩＥ６２のウェスタンブロットのブロッキングにより解析した。エピトープは、図１Ａに示す融合タンパク質ＣとＦの間の重複領域であり、ＩＥ６２の４１４−４４７位のアミノ酸に相当する領域であった。
前記領域を３つの区分に分け、下記アミノ酸配列からなるペプチド：
ペプチドI：PGYRSISGPDPRIRKT（配列番号：３）
ペプチドII：KRLAGEPGRQRQKSF（配列番号：４）
ペプチドIII：SLPRSRTPIIPPVSG（配列番号：５）
の３種を１８０μｇ用いて、ウェスタンブロットでＩＥ６２モノクローナル抗体とＩＥ６２との相互作用をブロッキングした。
【００５５】
結果
融合タンパク質
組換えプラスミドの構築は、シークエンスにより確認した。ＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質１〜５の免疫原性は、ＶＺＶの抗血清を用いるウェスタンブロットにより確認した。当該抗血清は、ＩＦＡ試験によりＶＺＶ感染細胞の核染色が陽性であり、ウェスタンブロットでＩＥ６２タンパク質を検出した。次いで、ＩＥ６２−ＧＳＴ融合タンパク質を定量し、ＩＥ６２タンパク質としてさらなるキャラクタリゼーションに使用した。図１Ａは、ＩＥ６２全分子とそれらの産物を含むＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質１〜５とＡ〜Ｇの概略図を示す。
【００５６】
帯状疱疹回復期血清によるＩＥ６２とＢＤＮＦの認識
図１Ｃおよび１Ｄは、帯状疱疹患者由来血清の、ＢＤＮＦ、ＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質２との反応のまとめ、ならびにウェスタンブロットの代表的パターンの一例を示す。帯状疱疹患者血清(No.23)は、ウェスタンブロットで、ＩＥ６２の断片２およびＦならびにＢＤＮＦを認識した。一方、患者血清(No.28)は、ＩＥ６２の断片２を認識したが、ＩＥ６２の断片ＦまたはＢＤＮＦを認識しなかった。６名の血清はＢＤＮＦと反応し、それらのうちの５つがＩＥ６２融合タンパク質を認識した。２名の血清は、ＩＥ６２を認識したが、ＢＤＮＦを認識しなかった。ＩＥ６２とＢＤＮＦの認識は、すべての患者において関連付けられなかったが、６名の患者由来の血清は、ＩＥ６２とＢＤＮＦへの抗体応答の関連を示した。図１Ｅは、帯状疱疹およびＰＨＮ患者由来の血清がＢＤＮＦの転写活性に及ぼす影響を調べたグラフである。
【００５７】
各モノクローナル抗体によるＢＤＮＦおよびＩＥ６２の交差認識
本発明者らは、ＩＥ６２−ＧＳＴ融合タンパク質に対するモノクローナル抗体を製造した。ＩＥ６２分子全体を網羅するＩＥ６２−ＧＳＴ融合タンパク質に対する当該モノクローナル抗体の反応性を図２Ａに示す。図２Ａに示すように、抗ＢＤＮＦモノクローナル抗体および抗ＶＺＶ ＩＥ６２モノクローナル抗体は両方とも、ＶＺＶ ＩＥ６２の同じ領域を同様に認識した。図２Ｂは、抗ＢＤＮＦモノクローナル抗体および抗ＶＺＶ ＩＥ６２モノクローナル抗体により染色されたＩＦＡパターンを示し、両抗体は感染細胞の核を主に染色した。抗ＢＤＮＦモノクローナル抗体は、ウェスタンブロットおよびＩＦＡによりＩＥ６２タンパク質を認識することが確認された。
【００５８】
図２Ｃに示すように、ＢＤＮＦタンパク質は、抗ＶＺＶ ＩＥ６２モノクローナル抗体および抗ＢＤＮＦモノクローナル抗体の両方でブロットされ、プローブされ、両抗体は同様にＢＤＮＦを認識した。ＢＤＮＦを抗ＩＥ６２モノクローナル抗体でプローブした場合、ＢＤＮＦの単量体よりは二量体と反応した。このことは、抗ＩＥ６２モノクローナル抗体はＢＤＮＦ二量体により形成された立体構造的なエピトープを認識することを示唆する。ＩＥ６２を認識する抗ＢＤＮＦモノクローナル抗体は、抗ＩＥ６２モノクローナル抗体と同様に、ＢＤＮＦの単量体よりはむしろＢＤＮＦ二量体と反応した。ＶＺＶ ＩＥ６２とＢＤＮＦのこのような免疫学的交差反応性は、それぞれのモノクローナル抗体により確認された。
【００５９】
ＢＤＮＦとＩＥ６２との交差反応エピトープの同定
抗ＩＥ６２モノクローナル抗体は、ＧＳＴ融合タンパク質２に加え、さらに領域ＣおよびＦを認識した（図２Ａ）。領域ＣおよびＦの重複領域は、ＩＥ６２タンパク質のアミノ酸４１４−４４７位を示し、当該領域を含む３つの構成ペプチドを用いて、ウェスタンブロットで反応をブロッキングすることによりＶＺＶ ＩＥ６２のエピトープを決定した。４１４番目から４２９番目のアミノ酸を含有するペプチドは、抗ＶＺＶ ＩＥ６２抗体と抗ＢＤＮＦ抗体の両抗体の相互作用をブロックした。このことは、ＩＥ６２のアミノ酸４１４−４４７位のペプチドのエピトープは、抗ＶＺＶ ＩＥ６２抗体と抗ＢＤＮＦ抗体により認識されることを示す(図３)。しかしながら、このペプチドは、ウェスタンブロットでＢＤＮＦに対する抗ＩＥ６２および抗ＢＤＮＦモノクローナル抗体の反応をブロックできなかった。したがって、両モノクローナル抗体のエピトープは、ＩＥ６２のアミノ酸４１４−４４７位の線状のエピトープである。いずれのモノクローナル抗体も、同じ条件下で二量体により形成される立体構造的エピトープをブロックしなかった。
【００６０】
以上の結果から、交差反応エピトープはＶＺＶ  ＩＥ６２のアミノ酸４１４〜４２９位であることが示唆される。
【００６１】
実施例１および比較例１
帯状疱疹痛モデルマウスの作製
雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの片側の脊髄神経を露出後、Ｌ５神経を絹糸にて結紮後開放し、その支配領域の痛覚閾値の変化をvon Frey hair法を用いて測定した。神経損傷モデル動物の抗ＩＥ６２抗体による痛覚閾値低下の比較対照として、ＰＢＳ（ｃｏｎｔｒｏｌ）、抗麻疹モノクローナル抗体、抗ＩＥ６２抗体を髄腔内投与して、痛覚閾値の変化を計測した。
ＨＳＶの皮膚感染前２時間に、抗体を髄腔内投与し、皮膚感染を実施した。皮膚感染は、マウスの片側の側腹・大腿から後肢をバリカンにて剃毛し、ヘアリムーバー(資生堂）により除毛した。そして、マウス側面の除毛部に、27ゲージ針の束にて、マウスの皮膚を擦過し、そこに、５〜１０μLの感染用ＨＳＶ液を滴下して、すり込むように感染させた。対照として、抗体を投与しないマウスに対しても同様にＨＳＶの皮膚感染を行なった。
【００６２】
結果
結果を図４Ａに示す。図４Ａのように、抗ＩＥ６２抗体投与群では、ｃｏｎｔｒｏｌ群や抗麻疹抗体投与群に比べ、３日後から約２週間、結紮側の有意に痛覚閾値の低下（痛覚過敏）を認めた。
【００６３】
図４Ｂは、免疫誘導した動物における痛覚過敏の誘導を示す。
非免疫群のｃｏｎｔｒｏｌ、ＩＥ６２の交差する４１４−４２９位のアミノ酸配列含むＧＳＴ−Ｃ蛋白（１０μｇ）とＩＥ６２を含まないＧＳＴ蛋白（１０μｇ）のみを、アジュバントとともに、３回皮下投与して、ＢＤＮＦと免疫交差する抗体を誘導した後に、神経結紮モデルにて痛覚閾値について検討した。
【００６４】
結果
ＧＳＴに対する抗体はＥＬＩＳＡ法によって測定し、 ｃｏｎｔｒｏｌ群、ＧＳＴ群、ＧＳＴ−Ｃ群の抗体価は、それぞれ0.020 ± 0.001 (SEM)、0.788 ± 0.115または0.628 ± 0.055(n=５〜６)であり、
ＧＳＴ−Ｃ群では、水痘感染細胞の核に対する抗体を認めた。そのＧＳＴ−Ｃ免疫群では、他群に比べ、結紮側の痛覚閾値の低下を認めた。
【００６５】
比較例１で得られたモデルマウスは、図５に示すように、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１）をマウス(BALB/c)に皮膚感染させたことにより、帯状疱疹様の皮膚病変を生じた。ＨＳＶ１に対して抵抗性であるC57BL/6Jでは、図５上段に示すようなスコア４までで病変の進行は止まる。そして、感染部位の痛覚閾値の低下(痛覚過敏)を生じている。比較例１のモデルでは、見かけ上は帯状疱疹と同様な病変を生じる。そのため、末梢神経の損傷を伴っていることから、ＩＥ６２抗体の存在下では、ＨＳＶ病変によって生じる痛覚過敏より、さらに、強い痛覚過敏のモデルを誘導できることが考えられ、ＩＥ６２抗体の髄腔内投与によって、そのモデルを確立した（図６）。
【００６６】
ＨＳＶ１ではＢＤＮＦと免疫交差を誘導する抗体を産生しないが、ＶＺＶではＢＤＮＦと免疫交差する抗体を誘導するため、神経過敏・痛覚過敏を誘導すると考えられる。すなわち、末梢神経の損傷を伴う帯状の皮膚病変とＩＥ６２抗体によって、帯状疱疹経過中の痛覚過敏とＰＨＮモデルが作製されたことが確認された。
【００６７】
【表１】
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【００６８】
表１より、ＨＳＶ１接種２５日目において、疼痛反応の残存するマウス（帯状疱疹後神経痛マウスと定義）の数を調べた。ＩＥ６２抗体投与群ではすべてのマウスが帯状疱疹後神経痛に移行した。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１Ａ】図１Ａは、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の前初期（ＩＥ）６２タンパク質の断片の位置関係を示す概略図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＩＥ６２断片とＧＳＴとの融合タンパク質の電気泳動の写真である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、帯状疱疹およびＰＨＮ患者由来の血清のＩＥ６２およびＢＤＮＦへの反応性を調べたウェスタンブロットのまとめを示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、帯状疱疹およびＰＨＮ患者由来の血清のＩＥ６２およびＢＤＮＦへの反応性を調べたウェスタンブロットの一例を示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、帯状疱疹およびＰＨＮ患者由来の血清がＢＤＮＦの転写活性に及ぼす影響を調べたグラフである。
【図２Ａ】図２Ａは、ＩＥ６２モノクローナル抗体およびＢＤＮＦモノクローナル抗体のＩＥ６２断片に対する反応性を示す電気泳動の写真である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＩＥ６２モノクローナル抗体およびＢＤＮＦモノクローナル抗体を用いたＶＺＶ感染細胞での免疫組織染色を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＢＤＮＦタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真ならびにＩＥ６２モノクローナル抗体およびＢＤＮＦモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットの写真である。
【図３】図３は、ＩＥ６２モノクローナル抗体およびＢＤＮＦモノクローナル抗体のエピトープを決定した電気泳動の写真である。
【図４Ａ】図４Ａは、von Frey hairを用いた痛覚過敏の程度を調べたグラフである。抗ＩＥ６２抗体を髄腔内投与した場合の神経結紮モデルでの痛覚過敏を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、von Frey hairを用いた痛覚過敏の程度を調べたグラフである。ＢＤＮＦと免疫交差するＩＥ６２の４１４−４２９位のアミノ酸配列含むＧＳＴ−Ｃ群の免疫によって、神経結紮モデルでの痛覚過敏を示す。
【図５】図５は、ＨＳＶ１を感染させたマウスの皮膚における病変をスコア表示で示した写真である。
【図６】図６は、マウス帯状疱疹痛モデルの皮膚症状と疼痛反応に対する抗ＩＥ６２抗体の効果を示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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