(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一分子蛍光分析法によるゲノムＤＮＡ全体のメチル化度の決定方法であって、
（１）被検体から採取されたゲノムＤＮＡを、制限酵素処理により断片化し、断片化されたゲノムＤＮＡを得る工程と、
（２）断片化されたゲノムＤＮＡと、蛍光標識したメチル化ＤＮＡ結合タンパク質とを反応させる工程と、
（３）反応溶液中の蛍光分子の蛍光強度を一分子蛍光分析法により測定し、蛍光分子の並進拡散時間を求める工程と、
（４）得られた並進拡散時間から、ゲノムＤＮＡ全体のメチル化度を決定する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記（４）の工程において、下記式１によりメチル化度を求めることを特徴とする、請求項１に記載の方法：
式１：被検体サンプルDNAのメチル化率(%)=｛(被検体サンプルDNAの並進拡散時間-0%メチル化コントロールDNAの並進拡散時間)/(100%メチル化コントロールDNAの並進拡散時間-0%メチル化コントロールDNAの並進拡散時間)｝×100。
【請求項３】
前記（１）の工程における制限酵素がMseIであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記（２）の工程におけるメチル化ＤＮＡ結合タンパク質がＭＢＤ２（Methyl-CpG binding domain protein 2）であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
一分子蛍光分析法による特定ＤＮＡ領域のメチル化度の決定方法であって、
（１）被検体から採取されたゲノムＤＮＡにバイサルファイト変換を行い、非メチル化シトシンをウラシルに変換し、メチル化シトシンを未変換のまま維持する工程と、
（２）疾患と関連してメチル化されることが知られている特定ＤＮＡ領域を増幅し、増幅産物を得る工程と、
（３）増幅産物のＣｐＧ配列にメチル化処理を行う工程と、
（４）メチル化処理後のＤＮＡと、蛍光標識したメチル化ＤＮＡ結合タンパク質とを反応させる工程と、
（５）反応溶液中の蛍光分子の蛍光強度を一分子蛍光分析法により測定し、蛍光分子の並進拡散時間を求める工程と、
（６）得られた並進拡散時間から、特定ＤＮＡ領域のメチル化度を決定する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
疾患と関連してメチル化されることが知られている特定ＤＮＡ領域が、癌抑制遺伝子のプロモーター領域であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一分子蛍光分析法によるＤＮＡのメチル化度の決定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムＤＮＡのメチル化修飾やヒストン修飾に代表されるエピジェネティクスは、細胞の発生、分化、リプログラミングに重要であることが知られている。ヒトを含む多くの真核生物においてゲノムＤＮＡのメチル化は、シトシン塩基の次にグアニン塩基が続く“ＣｐＧ配列”のシトシン塩基に付加される。メチル化を受ける“ＣｐＧ配列”は、ゲノムの多くの領域では散在性に存在するが、“ＣｐＧ配列”が例外的に高頻度に出現する領域が存在し、この領域は“ＣｐＧアイランド”と呼ばれる。“ＣｐＧアイランド”は、転写開始点、プロモーター領域を含む。“ＣｐＧ配列”は、ゲノムの多くの領域でメチル化されているのに対し、“ＣｐＧアイランド”の多くは、非メチル化状態に保たれている。
【０００３】
ＤＮＡのメチル化異常は、種々の疾病に関与することが報告され、がん細胞では、ゲノムＤＮＡ全体の低メチル化と、癌抑制遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランドの高メチル化がみられる。ゲノムＤＮＡ全体の低メチル化は、染色体を不安定な状態にして発癌に関与し、ＣｐＧアイランドの高メチル化は、癌抑制遺伝子を不活化して発癌に関与する。
【０００４】
したがって、一見正常にみえる組織に蓄積しているＤＮＡメチル化異常の定量は、発癌リスクの診断に有用であることが期待され、ＤＮＡメチル化解析の重要性が高まっている。また、臨床応用の場面においては、個々の検体のメチル化度を数値化すること（定量性）が求められる。
【０００５】
ＤＮＡメチル化解析は、特定のＣｐＧアイランドなどの特定のゲノム領域についての解析と、ゲノム全体のメチル化異常を調べるゲノム網羅的な解析に大別される。ＤＮＡのメチル化を解析する手法としてこれまでに種々の手法が報告され、代表的な手法として、「バイサルファイトシークエンシング」、「ＤＮＡメチル化アレイ」が知られている。
【０００６】
１．バイサルファイトシークエンシング
「バイサルファイトシークエンシング」は、一本鎖ＤＮＡを重亜硫酸ナトリウム（Sodium bisulfite）で処理すると、非メチル化シトシンは反応してウラシルに変換されるが、メチル化シトシンは変換されないという原理（バイサルファイト変換）を利用し、処理前と処理後の塩基配列を解析してメチル化部位を調べる手法である。この方法は、塩基配列の解析を伴うため、ゲノム全体の解析ではなく、特定のＤＮＡ領域のメチル化状態を調べるために用いられる。この方法は、バイサルファイト処理、プライマーの設定、ＤＮＡの増幅処理、シークエンシングおよびデータ解析が必要であり、特定のＤＮＡ領域のメチル化解析を完了させるためには少なくとも数日、通常は約１週間弱の時間を要する。近年、この方法は、マイクロアレイや次世代シークエンス法と組み合わせて、ゲノム網羅的な解析に用いる試みも行われているが、現状では、この方法でゲノム全体を解析した場合、多大な労力、時間がかかり、多量のサンプルを必要とするため、ゲノム全体の解析には不向きな方法である。また、ゲノムＤＮＡの中にはバイサルファイト変換されにくいＤＮＡ領域があるため、生体ＤＮＡのメチル化状態を反映しない測定結果が得られる場合がある。
【０００７】
２．ＤＮＡメチル化アレイ
「ＤＮＡメチル化アレイ」は、マイクロアレイ解析を用いてＤＮＡのメチル化度を調べる手法である。この方法には、メチル化感受性制限酵素を使用するＭＩＡＭＩ法や、抗メチル化シトシン抗体を用いたＭｅＤＩＰ法などがある。この方法は、ゲノム全体のメチル化を解析することができるが、定量的な手法でない。また、機械が高価である上に、測定コスト（試薬）が高価である。
【０００８】
３．バイサルファイト変換を利用した方法
特許文献１および２は、バイサルファイト変換を利用して特定のゲノム領域のメチル化を解析する方法を開示する。特許文献１は、ＤＮＡをバイサルファイト変換後、標識dCTPの存在下で増幅し、取り込まれた標識dCTPの測定によりメチル化率を割り出すことを開示する。また、特許文献２は、バイサルファイト変換後、メチル化特異的プライマーと非メチル化特異的プライマーを用いたＰＣＲによって、ゲノムＤＮＡ中のＣｐＧアイランドを検出することを開示する。
【０００９】
４．メチル化ＤＮＡ結合タンパク質を用いた方法
特許文献３は、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質をメチル化ＤＮＡの検出に用いた方法を開示する。特許文献３は、メチル−ＣｐＧ結合タンパク質（ＭＢＤ）のＤＮＡ結合ドメインと抗体のＦｃフラグメントのキメラタンパクを作製して、メチル化ＤＮＡを特異的に検出する抗体として用いて、メチル化ＤＮＡを検出することを開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００５−１６８４８６号公報
【特許文献２】特表２００２−５４３８５２号公報
【特許文献３】特表２００８−５２１３８９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、従来のＤＮＡメチル化解析に比べて、定量性に優れ、簡便で、短時間での測定が可能な方法を提供することを目的とする。とりわけ、ゲノム全体の解析に適した方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、一分子蛍光分析法を用いてＤＮＡのメチル化度を決定するという新たな発想から出発し、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質を、分子量変化を引き起こすための蛍光分子として使用し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、以下の手段を提供する。
【００１３】
［１］  一分子蛍光分析法によるゲノムＤＮＡ全体のメチル化度の決定方法であって、
（１）被検体から採取されたゲノムＤＮＡを、制限酵素処理により断片化し、断片化されたゲノムＤＮＡを得る工程と、
（２）断片化されたゲノムＤＮＡと、蛍光標識したメチル化ＤＮＡ結合タンパク質とを反応させる工程と、
（３）反応溶液中の蛍光分子の蛍光強度を一分子蛍光分析法により測定し、蛍光分子の並進拡散時間を求める工程と、
（４）得られた並進拡散時間から、ゲノムＤＮＡ全体のメチル化度を決定する工程
を含むことを特徴とする方法。
【００１４】
［２］  前記（４）の工程において、下記式１によりメチル化度を求めることを特徴とする、上記［１］に記載の方法：
式１：被検体サンプルDNAのメチル化率(%)=｛(被検体サンプルDNAの並進拡散時間-0%メチル化コントロールDNAの並進拡散時間)/(100%メチル化コントロールDNAの並進拡散時間-0%メチル化コントロールDNAの並進拡散時間)｝×100。
【００１５】
［３］  前記（１）の工程における制限酵素がMseIであることを特徴とする、上記［１］に記載の方法。
【００１６】
［４］  前記（２）の工程におけるメチル化ＤＮＡ結合タンパク質がＭＢＤ２（Methyl-CpG binding domain protein 2）であることを特徴とする、上記［１］に記載の方法。
【００１７】
［５］  一分子蛍光分析法による特定ＤＮＡ領域のメチル化度の決定方法であって、
（１）被検体から採取されたゲノムＤＮＡにバイサルファイト変換を行い、非メチル化シトシンをウラシルに変換し、メチル化シトシンを未変換のまま維持する工程と、
（２）疾患と関連してメチル化されることが知られている特定ＤＮＡ領域を増幅し、増幅産物を得る工程と、
（３）増幅産物のＣｐＧ配列にメチル化処理を行う工程と、
（４）メチル化処理後のＤＮＡと、蛍光標識したメチル化ＤＮＡ結合タンパク質とを反応させる工程と、
（５）反応溶液中の蛍光分子の蛍光強度を一分子蛍光分析法により測定し、蛍光分子の並進拡散時間を求める工程と、
（６）得られた並進拡散時間から、特定ＤＮＡ領域のメチル化度を決定する工程
を含むことを特徴とする方法。
【００１８】
［６］  疾患と関連してメチル化されることが知られている特定ＤＮＡ領域が、癌抑制遺伝子のプロモーター領域であることを特徴とする、上記［５］に記載の方法。
【００１９】
［７］  一分子蛍光分析法による、被検体におけるＤＮＡメチル化異常関連疾患のかかりやすさの検査方法であって、
上記［１］に記載の方法に従って被検体のゲノムＤＮＡ全体のメチル化度を決定する工程と、
決定された被検体のゲノムＤＮＡ全体のメチル化度を、健常な個体のメチル化度と比較する工程
を含むことを特徴とする方法。
【００２０】
［８］  一分子蛍光分析法による、被検体におけるＤＮＡメチル化異常関連疾患のかかりやすさの検査方法であって、
上記［５］に記載の方法に従って被検体の特定ＤＮＡ領域のメチル化度を決定する工程と、
決定された被検体の特定ＤＮＡ領域のメチル化度を、健常な個体のメチル化度と比較する工程
を含むことを特徴とする方法。
【００２１】
［９］  一分子蛍光分析法による、被検体におけるＤＮＡメチル化異常関連疾患のかかりやすさの検査方法であって、
上記［１］に記載の方法に従って被検体のゲノムＤＮＡ全体のメチル化度を決定する工程と、
上記［５］に記載の方法に従って被検体の特定ＤＮＡ領域のメチル化度を決定する工程と、
上記［１］に記載の方法に従って決定されたメチル化度を、健常な個体のメチル化度と比較し、上記［５］に記載の方法に従って決定されたメチル化度を、健常な個体のメチル化度と比較する工程
を含むことを特徴とする方法。
【００２２】
［１０］  上記［７］〜［９］の何れか１に記載の方法であって、前記比較工程おいて被検体のメチル化度と健常な個体のメチル化度との間に有意な差が認められた場合に、被検体はＤＮＡメチル化異常関連疾患にかかりやすいと判断する工程を更に含むことを特徴とする方法。
【００２３】
［１１］  前記ＤＮＡメチル化異常関連疾患が癌であることを特徴とする、上記［７］〜［９］の何れか１に記載の方法。
【００２４】
［１２］  被検体における脱メチル化剤の効能の検査方法であって、
被検体または被検体サンプルに脱メチル化剤を投与する工程と、
投与前と投与後のそれぞれにおいて、上記［１］に記載の方法に従って被検体または被検体サンプルに由来するゲノムＤＮＡ全体のメチル化度を決定する工程と、
投与後の被検体のゲノムＤＮＡのメチル化度が、投与前の被検体のゲノムＤＮＡのメチル化度と比べて低い場合に、被検体にとって脱メチル化剤の処方が有効であると判断する工程
を含むことを特徴とする方法。
【００２５】
［１３］  被検体における脱メチル化剤の応答性の検査方法であって、
上記［５］に記載の方法に従って被検体の特定ＤＮＡ領域のメチル化度を決定する工程と、
決定された被検体の特定ＤＮＡ領域のメチル化度が、健常な個体の特定ＤＮＡ領域のメチル化度と比べて高い場合に、被検体にとって脱メチル化剤の処方が有効であると判断する工程
を含むことを特徴とする方法。
【００２６】
［１４］  被検体における脱メチル化剤の効能の検査方法であって、
被検体または被検体サンプルに脱メチル化剤を投与する工程と、
投与前と投与後のそれぞれにおいて、上記［５］に記載の方法に従って被検体または被検体サンプルに由来する特定ＤＮＡ領域のメチル化度を決定する工程と、
投与後の被検体の特定ＤＮＡ領域のメチル化度が、投与前の被検体の特定ＤＮＡ領域のメチル化度と比べて低い場合に、被検体にとって脱メチル化剤の処方が有効であると判断する工程
を含むことを特徴とする方法。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の方法によれば、ＤＮＡのメチル化度を定量的に決定することができる。本発明の方法は、簡便であり、短時間で行うことができ、測定コストが安価である。また、本発明の方法は、ゲノムＤＮＡ全体のメチル化度の決定に適している。
【００２８】
本発明の方法は、被検体におけるＤＮＡメチル化異常関連疾患（たとえば癌）のかかりやすさの検査およびかかる疾患の診断に適用することができる。また、本発明の方法は、被検体における脱メチル化剤の応答性の検査および脱メチル化剤の効能（効きやすさ）の検査に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の「一分子蛍光分析法によるゲノムＤＮＡ全体のメチル化度の決定方法」の一例を示す模式図。
【図２】酵素MseIで処理したゲノムＤＮＡの電気泳動結果を示す写真（実施例１）。
【図３】非標識MBD2を用いたゲノムＤＮＡと蛍光標識MBD2の結合阻害実験の結果を示す図（実施例２）。
【図４】0%メチル化コントロールDNAにおけるp15およびp16遺伝子プロモーター領域内CpGアイランドのバイサルファイトシークエンシングの結果を示す図（実施例３）。
【図５】100%メチル化コントロールDNAにおけるp15およびp16遺伝子プロモーター領域内CpGアイランドのバイサルファイトシークエンシングの結果を示す図（実施例３）。
【図６】0%メチル化コントロールDNA、50%メチル化コントロールDNA、100%メチル化コントロールDNAの並進拡散時間を示す図（実施例３）。
【図７】本発明の方法に従って算出されたゲノムＤＮＡのメチル化率を示す図（実施例４）。
【図８】従来法によるゲノムＤＮＡのメチル化アレイ解析の結果を示す写真（実施例４）。
【図９】本発明の「一分子蛍光分析法による特定ＤＮＡ領域のメチル化度の決定方法」の一例を示す模式図。
【図１０】本発明の方法に従って算出された特定ＤＮＡ領域のメチル化率を示す図（実施例５）。
【図１１】従来法による特定ＤＮＡ領域のバイサルファイトシークエンシングの結果を示す図（実施例５）。
【図１２】急性白血病(AML)患者および健常人に由来するゲノムＤＮＡのメチル化率を示す図（実施例６）。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明を詳細に説明するが、以下の説明は、本発明を説明することを目的とし、本発明を限定することを意図しない。
【００３１】
１．ゲノムＤＮＡ全体のメチル化度の決定方法
本発明の「一分子蛍光分析法によるゲノムＤＮＡ全体のメチル化度の決定方法」は、
（１）被検体から採取されたゲノムＤＮＡを、制限酵素処理により断片化し、断片化されたゲノムＤＮＡを得る工程と、
（２）断片化されたゲノムＤＮＡと、蛍光標識したメチル化ＤＮＡ結合タンパク質とを反応させる工程と、
（３）反応溶液中の蛍光分子の蛍光強度を一分子蛍光分析法により測定し、蛍光分子の並進拡散時間を求める工程と、
（４）得られた並進拡散時間から、ゲノムＤＮＡ全体のメチル化度を決定する工程
を含む。
【００３２】
上記方法の一例を模式的に図１に示す。図１を参照しながら以下説明する。図１において、ゲノムＤＮＡ（gDNA）のメチル化部位を黒丸で示し、非メチル化部位を白丸で示す。（１）ゲノムＤＮＡを、制限酵素ＭｓｅＩ処理により種々の長さの断片に断片化する（MseI treatment）。（２）断片化されたＤＮＡを、蛍光標識したメチル化ＤＮＡ結合タンパク質（ＴＡＭＲＡ−ＭＢＤ２）と反応させる。ここでメチル化ＤＮＡ結合タンパク質（蛍光分子）は、ゲノムＤＮＡのメチル化部位に特異的に結合する。（３）反応溶液中の蛍光分子の蛍光強度を一分子蛍光分析法（Single-molecule detection system）により測定し、蛍光分子の並進拡散時間を求める。ここで、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質（蛍光分子）がメチル化ＤＮＡのメチル化部位に結合すると、蛍光分子の分子量は増大し、蛍光分子の並進拡散時間は増大する。（４）得られた並進拡散時間に基づいて、ゲノムＤＮＡのメチル化率を求める。
【００３３】
本願明細書において、「メチル化度」と「メチル化率」は同義で使用される。
【００３４】
以下、上記（１）〜（４）の各工程について説明する。
【００３５】
（１）断片化工程
本発明において被検体は、ＤＮＡのメチル化度を決定したい任意の生物であり、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。被検体からのゲノムＤＮＡの採取は、任意の組織（たとえば血液、口腔粘膜細胞、尿、患部組織やその周辺組織、骨髄サンプル、並びに被検体から採取した細胞の初代培養細胞など）から公知の手法に従って行うことができる。なお、ヒト被検体の場合、上記組織は、少ない苦痛で採取できるものが好ましい。
【００３６】
採取されたゲノムＤＮＡを、制限酵素処理により断片化する。制限酵素は、ＤＮＡのメチル化部位（ＣｐＧ配列）を切断しない制限酵素、すなわちＣｐＧ配列以外の認識部位を有する制限酵素であれば、任意の制限酵素を使用することができる。制限酵素は、好ましくはMseI、Tru9 I（いずれも認識配列はTTAAである）が使用される。これら制限酵素の処理により得られるＤＮＡ断片（約200〜800ｂｐ）は、安定した一分子蛍光分析の測定値（並進拡散時間）を提供できることが本発明で確認されている。
【００３７】
断片化工程において、好ましくは約200〜800ｂｐのサイズのＤＮＡ断片を得る。上述の断片化サイズは、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質（蛍光分子）の分子量の増大を引き起こすサイズとして好ましい範囲を例示したものであり、かかるサイズに限定されない。
【００３８】
所望のサイズのＤＮＡ断片を得るための制限酵素処理は、たとえば、500 ngのゲノムＤＮＡに対して、終濃度2.5 Ｕ/μlの濃度の制限酵素を用いて、37℃で12〜15時間反応させることにより行うことができる。必要であれば、所望のサイズのＤＮＡ断片が得られるような処理条件を設定してもよい。
【００３９】
（２）反応工程
上記（１）の工程で得られたゲノムＤＮＡ断片と、蛍光標識したメチル化ＤＮＡ結合タンパク質とを反応させる。ここで、メチル化部位を有するゲノムＤＮＡ断片は、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質と結合するが、メチル化部位を有していないゲノムＤＮＡ断片は、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質と結合しない。
【００４０】
ここで使用されるメチル化ＤＮＡ結合タンパク質は、ＣｐＧ配列のメチル化シトシンを特異的に認識して結合することが知られているタンパク質であり、当該技術分野では、ＭｅＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２（Methyl-CpG binding domain protein 2）、ＭＢＤ３、ＭＢＤ４などが知られている。
【００４１】
メチル化ＤＮＡ結合タンパク質の蛍光標識は、市販の任意の蛍光物質を用いて行うことができ、蛍光物質としては、ＴＡＭＲＡなどを使用することができる。簡便には、株式会社プロテイン・エクスプレスより入手可能なTAMRA標識MBD2を使用することができる。あるいは、タンパク質ピンポイント蛍光標識キット（Olympus）を用いてTAMRA標識MBD2を調製してもよい。
【００４２】
反応は、適切な緩衝液中で、たとえば、15〜22℃（室温）で20分間静置することにより行うことができる。後述の実施例２で示されるとおり、5 nMの蛍光標識されたメチル化ＤＮＡ結合タンパク質に対し、1〜50 ngの断片化ゲノムＤＮＡを反応させることができる。なお、反応条件は、健常な個体（コントロール）と被検体のメチル化度を比較する場合、両者の間で同一の反応条件を採用することが好ましく、また、同一被検体のメチル化度の経時変化を検査する場合も、検査を通して同一の反応条件を採用することが好ましい。
【００４３】
（３）測定工程
反応溶液中の蛍光分子の蛍光強度を一分子蛍光分析法により測定し、蛍光分子の並進拡散時間（Diffusion time）を求める。
【００４４】
一分子蛍光分析法は、レーザ光照射により励起照射されるｆ（10-15）Ｌオーダーの微小な共焦点領域（計測領域）において、蛍光で標識した標的分子の媒質中におけるゆらぎ運動を測定し、自己相関関数を用いて解析することにより、分子の数、大きさ等の物理量を算出する公知の技術である（金城政孝、「蛍光相関分光法による１分子検出」、蛋白質核酸酵素、Vol.44 No.9 (1999) p.1431-1446参照）。一分子蛍光分析法では、小さい蛍光分子ほどゆらぎ運動の速さが速く、解析により得られる並進拡散時間は小さく、大きい蛍光分子ほどゆらぎ運動の速さが遅く、解析により得られる並進拡散時間は大きい。
【００４５】
一分子蛍光分析法による測定は、市販の一分子蛍光分析システムにより行うことができる。後述の実施例のとおり、レーザー照射条件等の測定条件は、適宜設定することができる。たとえば、レーザー照射時間5〜15秒・照射回数5〜15回とすることができる。後述の実施例のとおり、複数回のレーザー照射による複数回の測定により、測定の信頼性を高めることができる。ただし、照射時間を長くしたとき（15秒）は照射回数を少なく設定し、レーザー照射時間をtotalで１分30秒程度にすることが好ましい。後述の実施例１および５に示されるとおり、ゲノムＤＮＡ全体（種々のサイズのＤＮＡ断片の混合物）のメチル化度の測定では、照射時間を短く設定（5秒）したほうがより安定なデータを取得することができ、特定ＤＮＡ領域のメチル化度の測定では、照射時間を長く（15秒）したほうがより安定なデータを取得することができる。
【００４６】
（４）定量化工程
測定工程で得られた並進拡散時間のデータから、ゲノムＤＮＡのメチル化率を決定する。
【００４７】
ここで並進拡散時間からゲノムＤＮＡのメチル化率を決定するために、予め、種々のメチル化度を有する基準ＤＮＡサンプルを用意し、それぞれについて並進拡散時間を求め、並進拡散時間とメチル化度の相関関係を決定しておく。好ましくは、定量化のために、メチル化度が既知のコントロールDNAを複数種類作製し、検量線を作成しておく。後述の実施例３では、0％メチル化コントロールDNA、50％メチル化コントロールDNA、100％メチル化コントロールDNAの３種類を調製し、検量線を作成しているが、これに限定されない。
【００４８】
サンプルＤＮＡの並進拡散時間を以下の式に適用して、サンプルDNAのメチル化率(%)を求めることができる：
式：サンプルDNAのメチル化率(%)=｛(サンプルDNAの並進拡散時間-0%メチル化コントロールDNAの並進拡散時間)/(100%メチル化コントロールDNAの並進拡散時間-0%メチル化コントロールDNAの並進拡散時間)｝×100。
【００４９】
２．特定ＤＮＡ領域のメチル化度の決定方法
背景技術の欄に記載したとおり、がん細胞では、ゲノムＤＮＡ全体の低メチル化に加えて、癌抑制遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランドの高メチル化がみられ、この高メチル化は、癌抑制遺伝子を不活化して発癌に関与する。したがって、ゲノムＤＮＡ全体のメチル化度の決定に加えて、疾患と関連してメチル化されることが知られている特定ＤＮＡ領域のメチル化度を決定することも重要である。したがって、本発明は、「疾患と関連してメチル化されることが知られている特定ＤＮＡ領域のメチル化度を一分子蛍光分析法により決定する方法」を提供する。
【００５０】
すなわち、本発明の「一分子蛍光分析法による特定ＤＮＡ領域のメチル化度の決定方法」は、
（１）被検体から採取されたゲノムＤＮＡにバイサルファイト変換を行い、非メチル化シトシンをウラシルに変換し、メチル化シトシンを未変換のまま維持する工程と、
（２）疾患と関連してメチル化されることが知られている特定ＤＮＡ領域を増幅し、増幅産物を得る工程と、
（３）増幅産物のＣｐＧ配列にメチル化処理を行う工程と、
（４）メチル化処理後のＤＮＡと、蛍光標識したメチル化ＤＮＡ結合タンパク質とを反応させる工程と、
（５）反応溶液中の蛍光分子の蛍光強度を一分子蛍光分析法により測定し、蛍光分子の並進拡散時間を求める工程と、
（６）得られた並進拡散時間から、特定ＤＮＡ領域のメチル化度を決定する工程
を含む。
【００５１】
上記方法の一例を模式的に図９に示す（後述の実施例５参照）。図９を参照しながら以下説明する。図９において、ゲノムＤＮＡ（gDNA）のメチル化部位を黒丸で示し、非メチル化部位を白丸で示す。（１）ゲノムＤＮＡにバイサルファイト変換を行う（Bisulfite modification）。バイサルファイト変換により、非メチル化シトシンのみがウラシルに変換され、メチル化シトシンは未変換のまま維持される。なお、ウラシルは、シークエンシングにおいてチミンと読まれるため、図９ではウラシルを“Ｔ”で示す。（２）ヒトp16/INK4a遺伝子のプロモーター領域 (300bp) をＰＣＲにより増幅する。ヒトp16/INK4a遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧ部位は、腫瘍細胞において高メチル化状態にあることが知られている。図９に示すとおり、ＰＣＲによりＣｐＧ部位のメチル化修飾は脱落するため、増幅産物のＣｐＧ部位はメチル化されていない。（３）ＰＣＲ増幅産物に、ＣｐＧ配列を特異的にメチル化する酵素M.SssIによる処理をして、ＰＣＲ増幅産物のＣｐＧ配列をメチル化する。（４）メチル化処理後のＤＮＡを、蛍光標識したメチル化ＤＮＡ結合タンパク質（ＴＡＭＲＡ−ＭＢＤ２）と反応させる。ここでメチル化ＤＮＡ結合タンパク質（蛍光分子）は、ＤＮＡのメチル化部位に特異的に結合する。（５）反応溶液中の蛍光分子の蛍光強度を一分子蛍光分析法（Single-molecule detection system）により測定し、蛍光分子の並進拡散時間を求める。ここでメチル化ＤＮＡ結合タンパク質（蛍光分子）がＤＮＡのメチル化部位に結合すると、蛍光分子の分子量は増大し、蛍光分子の並進拡散時間は増大する。（６）得られた並進拡散時間に基づいて、ＤＮＡのメチル化率を求める。
【００５２】
以下、上記（１）〜（６）の各工程について説明する。
【００５３】
（１）のバイサルファイト変換は、市販のキット、たとえばEpiTect Bisulfite Kit (Qiagen)を用いて公知の方法に従って行うことができる。
【００５４】
（２）の工程において「疾患と関連してメチル化されることが知られている特定ＤＮＡ領域」は、たとえば、癌と関連して特異的に高メチル化状態になるＤＮＡ領域（ＣｐＧアイランド）であり、より具体的には、
ａ）癌抑制遺伝子のプロモーター領域（たとえばp16、p15、p53、CDH1、MLH1、RB、BRCA1、TSLC1、RUNX3遺伝子のプロモーター領域）；
ｂ）細胞周期チェックポイント遺伝子；
ｃ）アポトーシス関連遺伝子
などが挙げられる。
【００５５】
公知のプライマーまたは適宜設計したプライマーを使用して、ＰＣＲ反応により上述の特定ＤＮＡ領域を増幅することができる。この工程において、増幅される鋳型ＤＮＡのＣｐＧ部位はメチル化されているが、増幅により得られる産物のＣｐＧ部位はメチル化されていない。
【００５６】
（３）のメチル化処理は、ＣｐＧ配列をメチル化する酵素であるCpGメチルトランスフェラーゼ、たとえばM.SssIにより行うことができる。メチル化処理は、たとえば、0.2Ｕ/μlの濃度のCpGメチルトランスフェラーゼを用いて、30℃で1〜4時間反応させることにより行うことができる。（１）の工程で、非メチル化シトシンはウラシルに変換され、メチル化シトシンは未変換のまま維持されているため、この工程でメチル化される部位は、元のゲノムＤＮＡのメチル化部位と同じである。
【００５７】
（４）の反応工程、（５）の測定工程および（６）の定量化工程は、それぞれ、上述の「ゲノムＤＮＡ全体のメチル化度の決定方法」の工程（２）〜（４）の記載を参照することができる。
【００５８】
３．疾患の検査方法
背景技術の欄に記載したとおり、ゲノムＤＮＡ全体の低メチル化は、染色体を不安定な状態にして発癌に関与し、ＣｐＧアイランドの高メチル化は、癌抑制遺伝子を不活化して発癌に関与することが知られている。
【００５９】
したがって、本発明の方法に従ってＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ全体または上述の特定ＤＮＡ領域）のメチル化率を求め、このメチル化率に基づいて、被検体のＤＮＡメチル化異常関連疾患にかかりやすいか否か（リスク）を調べることができる。すなわち、本発明の方法によれば、被検体のＤＮＡメチル化異常関連疾患に関するデータを取得することができる。
【００６０】
すなわち、本発明の「ＤＮＡメチル化異常関連疾患のかかりやすさの検査方法」は、
本発明の「ゲノムＤＮＡ全体のメチル化度の決定方法」に従って被検体のゲノムＤＮＡ全体のメチル化度を決定する工程と、
決定された被検体のゲノムＤＮＡ全体のメチル化度を、健常な個体のメチル化度と比較する工程
を含み、ここで、決定された被検体のゲノムＤＮＡ全体のメチル化度が、健常な個体のメチル化度と比べて有意に低い場合に被検体はＤＮＡメチル化異常関連疾患にかかりやすい。
【００６１】
また、本発明の「ＤＮＡメチル化異常関連疾患のかかりやすさの検査方法」は、
本発明の「特定ＤＮＡ領域のメチル化度の決定方法」に従って被検体の特定ＤＮＡ領域のメチル化度を決定する工程と、
決定された被検体の特定ＤＮＡ領域のメチル化度を、健常な個体のメチル化度と比較する工程
を含み、ここで、決定された被検体の特定ＤＮＡ領域のメチル化度が、健常な個体のメチル化度と比べて有意に高い場合に被検体はＤＮＡメチル化異常関連疾患にかかりやすい。
【００６２】
更に、本発明の「ＤＮＡメチル化異常関連疾患のかかりやすさの検査方法」は、
本発明の「ゲノムＤＮＡ全体のメチル化度の決定方法」に従って被検体のゲノムＤＮＡ全体のメチル化度を決定する工程と、
本発明の「特定ＤＮＡ領域のメチル化度の決定方法」に従って被検体の特定ＤＮＡ領域のメチル化度を決定する工程と、
決定されたゲノムＤＮＡ全体のメチル化度を、健常な個体のメチル化度と比較し、決定された特定ＤＮＡ領域のメチル化度を、健常な個体のメチル化度と比較する工程
を含み、ここで、決定されたゲノムＤＮＡ全体のメチル化度が、健常な個体のメチル化度と比べて有意に低く、かつ決定された特定ＤＮＡ領域のメチル化度が、健常な個体のメチル化度と比べて有意に高い場合に、被検体はＤＮＡメチル化異常関連疾患にかかりやすい。
【００６３】
「ＤＮＡメチル化異常関連疾患」とは、ＤＮＡのメチル化異常との関連が知られている任意の疾患を意味し、ゲノムＤＮＡの低メチル化との関連が知られている任意の疾患およびＣｐＧアイランドの高メチル化との関連が知られている任意の疾患を含む。
【００６４】
ＤＮＡメチル化異常関連疾患は、とりわけ癌（癌腫および肉腫の両方を含む）であり、たとえば乳癌、胃癌、大腸癌、前立腺癌、膀胱癌、神経膠腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、骨髄異形成症候群、口腔癌などが挙げられる。
【００６５】
当該技術分野において、ＤＮＡのメチル化異常と癌との関係が数多く報告されており、たとえば、ゲノムＤＮＡの低メチル化とリンパ腫を含む種々の癌との関係、p15遺伝子のプロモーター領域の高メチル化と白血病との関係、およびp16遺伝子のプロモーター領域の高メチル化と乳癌、胃癌、大腸癌、前立腺癌、膀胱癌、神経膠腫、リンパ腫との関係、癌抑制的に機能するmicroRNA（non-coding RNA）（miR-124、miR-203、miR-34b）のプロモーター領域のメチル化異常などが知られている。
【００６６】
本発明の検査方法では、検査したい癌に応じてサンプルを選択してもよく、たとえば、白血病の検査の場合、末梢血をサンプルとすることができ、固形癌の検査の場合、末梢血、あるいは患部組織やその周辺組織をサンプルとすることができ、膀胱癌の検査の場合、尿をサンプルとすることができ、骨髄異形性症候群や骨髄腫の検査の場合、骨髄をサンプルとすることができる。
【００６７】
また、後述の実施例６では、ゲノムＤＮＡの低メチル化と急性白血病との関係が示されている。したがって、本発明の方法に従ってＤＮＡのメチル化度を決定することにより、癌のかかりやすさを検査することができる。
【００６８】
ＤＮＡメチル化異常関連疾患にかかりやすいか否かを判断するための基準となる「健常な個体のメチル化度」は、複数人（たとえば30人程度またはそれ以上）の健常な個体のメチル化度を決定し、平均値を算出することにより決定することができる。健常な個体のメチル化度は、基準値として予め決定しておくことができる。
【００６９】
本発明において、被検体と健常な個体との比較は、両者のメチル化度の差が有意であるか否かを、統計学的手法、たとえばｔ検定、ＲＯＣ解析等により調べることにより行うことができる。
【００７０】
このように、本発明の方法は発癌リスクの診断に有用である。
【００７１】
４．脱メチル化剤の応答性および効能の検査方法
４−１．第一の態様
被検体（ヒトを含む任意の生物）または被検体由来のサンプルに脱メチル化剤を投与し、投与前後のそれぞれにおいて、上述の「１．ゲノムＤＮＡ全体のメチル化度の決定方法」に従ってゲノムＤＮＡ全体のメチル化率を求め、メチル化率の変化に基づいて、被検体にとって脱メチル化剤の処方が有効であるか否か、すなわち被検体における脱メチル化剤の効能（効きやすさ）を調べることができる。
【００７２】
すなわち、本発明の「脱メチル化剤の効能の検査方法」は、
被検体または被検体サンプルに脱メチル化剤を投与する工程と、
投与前と投与後のそれぞれにおいて、本発明の「ゲノムＤＮＡ全体のメチル化度の決定方法」に従って被検体または被検体サンプルに由来するゲノムＤＮＡ全体のメチル化度を決定する工程と、
投与後の被検体のゲノムＤＮＡのメチル化度が、投与前の被検体のゲノムＤＮＡのメチル化度と比べて低い場合に、被検体にとって脱メチル化剤の処方が有効であると判断する工程
を含む。
【００７３】
脱メチル化剤としては、治療に使用されている公知の脱メチル化剤、たとえば５−アザシチジンを、治療に使用されている用法・用量で使用することができる。
【００７４】
この検査では、被検体または被検体サンプルの何れかに脱メチル化剤を投与する。被検体に投与する場合には、公知の脱メチル化剤の投与様式に従って投与することができ、５−アザシチジン（商品名Vidaza、Pharmion社）の場合、皮下注射により投与することができる。脱メチル化剤の投与は、被検体に投与する場合、１回の投与により行ってもよいし、または所定の期間を空けて（たとえば１ヶ月おきに）複数回投与することにより行ってもよい。被検体サンプルとしては、被検体から採取した任意の細胞（たとえば患部細胞）や被検体から採取された細胞（たとえば患部細胞）を培養系に移した細胞（初代培養系）を使用することができる。被検体の細胞に投与する場合、脱メチル化剤の投与は、被検体の細胞を、たとえば３〜５日間、脱メチル化剤の存在下で培養するサイクルを１回〜複数回繰り返すことにより行うことができる。
【００７５】
この検査方法では、脱メチル化剤の投与前と投与後のそれぞれにおいて、ゲノムＤＮＡ全体のメチル化度を決定するが、投与後の所定期間にわたって複数回（被検体に投与した場合、たとえば１週間毎、および被検体サンプルに投与した場合、たとえば１日毎に）メチル化度を決定し、ゲノムＤＮＡ全体のメチル化度をモニタリングしてもよい。また、脱メチル化剤の投与を複数回行った場合には、それぞれの投与の前後でメチル化度を決定してもよいし、１回目の投与前と最終回の投与後のそれぞれについてメチル化度を決定してもよい。
【００７６】
投与前と投与後との比較は、両者のメチル化度の差が有意であるか否かを、統計学的手法、たとえばｔ検定、ANOVA等により調べることにより行うことができる。
【００７７】
実際にゲノムＤＮＡ全体の低メチル化が起こっているヒト被検体サンプルに脱メチル化剤を投与してみたところ、脱メチル化剤の処方が有効な被検体で、ゲノムＤＮＡ全体の更なる低メチル化が観察されることが確認されている。この結果は、被検体が、ゲノムＤＮＡ全体としては低メチル化状態にあるが、特定ＤＮＡ領域は高メチル化状態にあるため、特定ＤＮＡ領域の高メチル化部分が脱メチル化されたことに起因すると考えられる。
【００７８】
この検査方法により、患者ごとに脱メチル化剤の効能（効きやすさ）を検査することができ、患者に脱メチル化剤に対する薬剤耐性が起きた場合にも早急に違う処方に切り替えるという判断をすることができる。
【００７９】
４−２．第二の態様
別の態様において、上述の「２．特定ＤＮＡ領域のメチル化度の決定方法」に従って特定ＤＮＡ領域のメチル化率を求め、このメチル化率に基づいて、被検体にとって脱メチル化剤の処方が有効であるか否か、すなわち被検体における脱メチル化剤の応答性を調べることができる。
【００８０】
すなわち、本発明の「脱メチル化剤の応答性の検査方法」は、
本発明の「特定ＤＮＡ領域のメチル化度の決定方法」に従って被検体の特定ＤＮＡ領域のメチル化度を決定する工程と、
決定された被検体の特定ＤＮＡ領域のメチル化度が、健常な個体の特定ＤＮＡ領域のメチル化度と比べて高い場合に、被検体にとって脱メチル化剤の処方が有効であると判断する工程
を含む。
【００８１】
被検体と健常な個体との比較は、両者のメチル化度の差が有意であるか否かを、統計学的手法、たとえばｔ検定、ＲＯＣ解析等により調べることにより行うことができる。「健常な個体のメチル化度」は上述のとおりである。
【００８２】
この検査方法により、特定ＤＮＡ領域に高メチル化が起こっていない患者に脱メチル化剤を処方しないように事前に検査することができる。
【００８３】
４−３．第三の態様
また、更に別の態様において、被検体（ヒトを含む任意の生物）または被検体由来のサンプルに脱メチル化剤を投与し、投与前後のそれぞれにおいて、上述の「２．特定ＤＮＡ領域のメチル化度の決定方法」に従って特定ＤＮＡ領域のメチル化率を求め、メチル化率の変化に基づいて、被検体にとって脱メチル化剤の処方が有効であるか否か、すなわち被検体における脱メチル化剤の効能（効きやすさ）を調べることができる。
【００８４】
すなわち、本発明の「脱メチル化剤の効能の検査方法」は、
被検体または被検体サンプルに脱メチル化剤を投与する工程と、
投与前と投与後のそれぞれにおいて、本発明の「特定ＤＮＡ領域のメチル化度の決定方法」に従って被検体または被検体サンプルに由来する特定ＤＮＡ領域のメチル化度を決定する工程と、
投与後の被検体の特定ＤＮＡ領域のメチル化度が、投与前の被検体の特定ＤＮＡ領域のメチル化度と比べて低い場合に、被検体にとって脱メチル化剤の処方が有効であると判断する工程
を含む。
【００８５】
この態様は、上述の第一の態様の「ゲノムＤＮＡ全体のメチル化度の決定」を「特定ＤＮＡ領域のメチル化度の決定」に置き換えることにより行うことができる。
【００８６】
５．本発明の効果
代表的な従来法である「バイサルファイトシークエンシング」がゲノムＤＮＡ全体の解析には不向きであり、「ＤＮＡメチル化アレイ」がゲノムＤＮＡ全体の定量的な解析に不向きであるのに対し、本発明の方法は、ゲノムＤＮＡ全体のメチル化度を定量的に決定することができる点で優れている。
【００８７】
しかも、本発明の方法は、短時間での測定が可能な簡便な方法であり、たとえば、ＤＮＡの採取、抽出に約３０分、ＤＮＡの断片化処理に約１２時間、蛍光分子との反応、測定に約３０分を要し、従来法に比べて短時間での測定が可能である。
【００８８】
また、本発明の方法は、従来法に比べて少量の試料（たとえば、出発材料として500 ngゲノムＤＮＡ）での測定が可能である。
【００８９】
また、本発明の方法は、従来法に比べて測定コストが安価である。具体的には、必要試薬のTAMRA-MBD2（20万円分）は、300サンプルの測定が可能であるため、１サンプルあたり600円程度ですむ。
【００９０】
更に、従来法の「メチル化アレイ」が前処理にバイサルファイト変換を利用するのに対し、本発明の方法は、バイサルファイト変換を利用しないでゲノムＤＮＡ全体のメチル化度を決定することができるため、生体ＤＮＡのメチル化状態を反映したゲノム網羅的な解析結果を取得することができる点で優れている（後述の実施例４参照）。
【００９１】
特定ＤＮＡ領域のメチル化度の決定に関しても、本発明の方法は、従来法の「バイサルファイトシークエンシング」より簡便な手法で、従来法に匹敵する精度でメチル化度を決定することができる点で優れている（後述の実施例５参照）。
【実施例】
【００９２】
実施例１：断片化処理に関する実験
１．ゲノムＤＮＡの抽出
培養株細胞（1x107 cell）を350μlの培養液で懸濁したサンプルから、全自動ゲノム抽出ロボット(Magtration System 6GC: Precision System Science)を用いてゲノム抽出を行った。
【００９３】
２．ゲノムDNAの前処理（ゲノムDNAの断片化）
下記表１に示したように、抽出したゲノムDNA (500ng) にTTAA配列を特異的に認識して切断する酵素MseI (NEB社)（2.5 U/μl）およびBSA（ウシ血清アルブミン、100μg/ml）を添加し、37℃で一晩処理した。
【表１】
0005492696.tif 000002
【００９４】
酵素処理後のゲノムDNAの一部をアガロースゲルにて泳動した。その結果を図２に示す。図２ａは、無処理のゲノムDNAの実験結果を示し、レーン１は、無処理のゲノムDNA、レーン２は、マーカーDNAを示す。図２ｂは、MseI酵素処理後のゲノムDNAの実験結果を示し、レーン１は、MseI酵素処理後のゲノムDNA、レーン２は、マーカーDNAを示す。図２より、ゲノムDNAが、200-1000bpに断片化されていることが確認された。
【００９５】
酵素処理後のゲノムDNAを、精製カラム (QIAquick PCR Purification Kit: QIAGEN) を用いて精製した。
【００９６】
３．前処理後のゲノムDNAと蛍光標識MBD2との反応
下記表２に示したように、5x結合バッファー (50mM Tris-HCl, 70mM KCl, 1mM EDTA, 0.007% 2-ME, 0.2mg/ml BSA, 4% Glycerol) 中で、断片化ゲノムDNA (1ng-50ng) と蛍光(TAMRA)標識MBD2 (5nM) を混合し、室温で20分間静置して反応させた。
【表２】
0005492696.tif 000003
【００９７】
４．FCS測定
反応液を、波長543nm、出力100μWのレーザー光を照射時間15秒・照射回数5回もしくは照射時間5秒・照射回数15回の条件で一分子蛍光分析システムMF20（オリンパス(株)製）によりFCS（Fluorescence correlation spectroscopy）測定して並進拡散時間を求めた。
【００９８】
５．結果
ゲノムDNAを前処理（断片化）したものと無処理のもので同様の実験を行い、その並進拡散時間（Diff. Time）およびカイ二乗係数（Chi2）の値を求め、これらを表３および表４に示す。蛍光標識MBD2と反応させるゲノムDNAの量は、１ng、10ng、または20ngとした。
【表３】
0005492696.tif 000004
【００９９】
【表４】
0005492696.tif 000005
【０１００】
MseI酵素によって断片化したゲノムDNAを用いると、レーザー照射５秒、１５回の測定において、並進拡散時間は安定しており、カイ二乗係数も小さかった。また、DNAの濃度に依存して並進拡散時間の平均値が大きくなった。一方、無処理のゲノムDNAの並進拡散時間は１５回の測定において大幅にばらつき、カイ二乗係数も異常値を示していた。そのため、DNAの濃度に依存した並進拡散時間の変化は見られなかった。このことから、MBD2に結合するDNAのサイズが大きすぎるとFCS測定の感度が悪くなり、DNAのサイズ調整が重要であることが分かる。DNAの断片化の手法として、本発明で用いられているMseI制限酵素による方法の他に超音波破砕機による断片化がある。しかし、使用する超音波破砕機によって超音波の出力調整が異なっていたり、破砕時間などの条件検討が必要であったりと、サンプル間における均一なDNAサイズの調整が困難である。従ってクルードなゲノムDNAとタンパクの結合をFCS測定に供する際の前処理には、ゲノムDNAをMseIで断片化するのが適している。
【０１０１】
また、レーザー照射条件について、２通りの条件（照射時間15秒・照射回数5回もしくは照射時間5秒・照射回数15回）で検討したが、一般的なFCS測定で用いられる条件よりも照射時間を短くした方が、より良好な結果が得られることがわかった。
【０１０２】
実施例２：非標識MBD2タンパクを用いた競合実験
１．実験方法
上述の実施例１の方法と同様にゲノムDNAを前処理（断片化）して精製後、下記表５に示したように、実施例１の反応系に非標識MBD2タンパクを高濃度(500nM)添加して、室温で２０分間静置して反応させた。
【表５】
0005492696.tif 000006
【０１０３】
反応液を、波長543nm、出力100μWのレーザー光を照射時間5秒・照射回数15回の条件で一分子蛍光分析システムMF20（オリンパス(株)製）によりFCS測定して並進拡散時間を求めた。
【０１０４】
２．結果
図３は、非標識MBD2を用いたゲノムDNAと蛍光標識MBD2の結合阻害実験における並進拡散時間を示す。図３において、非標識MBD2を添加した場合を「WT-MBD2  ＋」で表し、非標識MBD2を添加しなかった場合を「WT-MBD2  −」で表す。高濃度の非標識MBD2を添加することにより、断片化ゲノムDNAと蛍光標識MBD2の結合が阻害され、並進拡散時間が短くなっている。すなわち、断片化ゲノムDNAと蛍光標識MBD2の結合は特異的であると言える。
【０１０５】
また、図３は、断片化処理したゲノムDNA（gDNA）の濃度を1ngから50ng変化させて5nMの蛍光標識MBD2と反応させた生成物の並進拡散時間を示す。蛍光標識MBD2は、単独の場合（図３のgDNA 0ngの場合）に比べて、ゲノムDNAと反応させると並進拡散時間が長くなり、MBD2タンパクとゲノムDNAが結合していることが確認された。また、ゲノムDNAの濃度依存的に並進拡散時間が増大した。
【０１０６】
実施例３：メチル化度の決定のための検量線の作製
１．0%メチル化コントロールDNAの作製
ヒト由来のコントロールゲノムDNA (REPLI-Human Control Kit: QIAGEN) を10ng用いて、REPLI-g Mini Kit (QIAGEN)にて全ゲノム増幅反応(Whole Genome Amplification)を行った。
【０１０７】
一次WGA産物(total vol. = 50μl)から0.5μlをとり、上記のWhole Genome Amplificationを再度行った(nested whole genome amplification)。
【０１０８】
Bisulfite sequenceにてCpGサイトにおけるすべてのシトシンがメチル化されていないことを確認した（図４）。ゲノムDNAをPhi29 DNAポリメラーゼによって増幅させる際に、鋳型DNAにおけるシトシンのメチル化は引き継がれない。従って、WGA後のDNAメチル化率は0%となる。
【０１０９】
図４は、0%メチル化コントロールDNAにおけるp15およびp16遺伝子プロモーター領域内CpGアイランドのバイサルファイトシークエンシングの結果を示す。丸印が一つのCpGサイトを示す。0%メチル化コントロールDNAではp15およびp16遺伝子プロモーター領域内のシーケンスで解析したCpGサイトはすべて脱メチル化（白丸）されていた。
【０１１０】
２．100%メチル化コントロールDNAの作製
下記表６に示したように、nested WGA産物 (500ng) をSssI酵素 (NEB) にて30℃で4時間反応させた。
【表６】
0005492696.tif 000007
【０１１１】
精製カラム (QIAquick PCR Purification Kit: QIAGEN) にてタンパク除去を行った。
【０１１２】
Bisulfite sequenceにてCpGサイトにおけるすべてのシトシンがメチル化されていることを確認した（図５）。SssI酵素はCpGサイトにおけるシトシンを特異的に認識してメチル化する。従って、SssI酵素処理後のDNAメチル化率は100%となる。
【０１１３】
図５は、100%メチル化コントロールDNAにおけるp15およびp16遺伝子プロモーター領域内CpGアイランドのバイサルファイトシークエンシングの結果を示す。丸印が一つのCpGサイトを示す。100%メチル化コントロールDNAではp15およびp16遺伝子プロモーター領域内のシーケンスで解析したCpGサイトはすべてメチル化（黒丸）されていた。
【０１１４】
３．メチル化率が既知のサンプルによる検量線の作製
実施例１の方法での反応系と同様に、下記表７に示すように0%メチル化コントロールDNA、100%メチル化コントロールDNAおよび50%メチル化コントロールDNA（0%メチル化コントロールDNAと100%メチル化コントロールDNAを等量で混合したサンプル）のそれぞれを蛍光標識MBD2と室温で20分間静置して反応させた。
【表７】
0005492696.tif 000008
【０１１５】
反応液を、波長543nm、出力100μWのレーザー光を照射時間5秒・照射回数15回の条件で一分子蛍光分析システムMF20（オリンパス(株)製）によりFCS測定して並進拡散時間を求めた。
【０１１６】
４．結果
図６に、0%メチル化コントロールDNA、50%メチル化コントロールDNA、100%メチル化コントロールDNAにおけるそれぞれの並進拡散時間（Diff.Time）を示す。メチル化率が未知のゲノムDNAにおける並進拡散時間の値を以下の式に代入して、メチル化率を求めることができる。
【０１１７】
式：サンプルDNAのメチル化率(%)=｛(サンプルDNAの並進拡散時間-0%メチル化コントロールDNAの並進拡散時間)/(100%メチル化コントロールDNAの並進拡散時間-0%メチル化コントロールDNAの並進拡散時間)｝×100。
【０１１８】
なお、上記式では、メチル化率を0〜100の範囲の値で表すが、以下の式２により0.00〜1.00の範囲の値で表してもよい。  
式２：(サンプルDNAの並進拡散時間-0%メチル化コントロールDNAの並進拡散時間)/(100%メチル化コントロールDNAの並進拡散時間-0%メチル化コントロールDNAの並進拡散時間)。
【０１１９】
実施例４：本発明によるFCS測定を用いたゲノムDNAのメチル化度決定法と従来法によるメチル化解析（メチル化アレイによる網羅的なゲノムDNAメチル化解析）との比較
１．FCS測定を用いた、脱メチル化剤処理した株細胞におけるゲノムワイドなDNAメチル化率の算出
1x106 cell/mlのU937株細胞を、脱メチル化剤（3μMの５−アザシチジンまたは5μMのデシタビン）の存在下または非存在下で72時間培養した。その後、細胞を回収しゲノムDNA(500ng)を実施例１と同様に抽出、MseI酵素での前処理（断片化）およびカラム精製を行った。
【０１２０】
実施例１（表２）と同様に断片化ゲノムDNA(10ng)と蛍光標識MBD2を混合して室温で２０分間静置して反応させた。反応液を、波長543nm、出力100μWのレーザー光を照射時間5秒・照射回数15回の条件で一分子蛍光分析システムMF20（オリンパス(株)製）によりFCS測定して並進拡散時間を求めた。
【０１２１】
２．メチル化アレイを用いた、脱メチル化剤処理した株細胞におけるゲノムワイドなDNAメチル化模様の解析
1x106 cell/mlのU937株細胞を、脱メチル化剤（3μMの５−アザシチジンまたは5μMのデシタビン）の存在下または非存在下で72時間培養した。その後、細胞を回収しゲノムDNAを実施例１と同様に抽出した。
【０１２２】
メチル化アレイ(HumanMethylation27 BeadChip, Illumina)によって網羅的（27,578のCpGサイト）に脱メチル化剤処理サンプルと無処理サンプルのDNAメチル化パターンを解析した。
【０１２３】
３．結果
図７に、脱メチル化剤存在下および非存在下での培養条件におけるU937株細胞由来のゲノムDNAの拡散並進時間から算出したメチル化率を示す。図８には、同様の培養条件におけるU937株細胞由来のゲノムDNAのメチル化アレイ解析の結果（ヒートマップ）を示す。図７および８において、「U937_Mock」は、脱メチル化剤で処理しなかった細胞を示し、「U937_5AzaC」は、脱メチル化剤５−アザシチジン処理細胞を示し、「U937_DAC」は、脱メチル化剤デシタビン処理細胞を示す。FCS測定による結果から、U937株細胞のゲノムDNAは無処理では約85%のメチル化率に対して、５−アザシチジン（5AzaC）によって約15%、デシタビン（DAC）によって約5%のメチル化率となっており、脱メチル化剤の影響によってメチル化率が低下していることが確認できる。また、従来法であるメチル化アレイを用いた網羅的なゲノムメチル化解析でも同様に脱メチル化剤の影響によりメチル化パターンが変化（脱メチル化）しており、同様の結果が得られたことになる。
【０１２４】
ゲノムワイドなDNAメチル化パターンの解析において同様の結果が得られる本発明と従来法であるメチル化アレイを比較すると、本発明はメチル化アレイに比べて簡便にかつ短時間に低コストで結果を得ることができる。また、メチル化アレイでは前処理にバイサルファイト変換という化学処理工程が入り、変換効率によって得られる結果にバイアスが生じる恐れがあるが、本発明はクルードなゲノムDNAを材料としている点でも有利である。
【０１２５】
実施例５：本発明によるFCS測定を用いた特定DNA領域のメチル化度決定法と従来法によるメチル化解析（バイサルファイトシークエンシングによるメチル化解析）との比較
１．FCS測定を用いた、脱メチル化剤処理した株細胞における特定のCpGアイランドにおけるDNAメチル化率の算出
図９に、本実施例の実験方法の手順と生成物の概略を示す。
【０１２６】
(1) 1x106 cell/mlのU937株細胞を、脱メチル化剤（3μMの５−アザシチジンまたは5μMのデシタビン）の存在下または非存在下で72時間培養した。その後、細胞を回収しゲノムDNA（gDNA）を実施例１と同様に抽出した。
【０１２７】
(2) ゲノムDNAを実施例１と同様にカラム精製後、EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen)を用いてバイサルファイト変換した。
【０１２８】
(3) ヒトp16INK4a遺伝子(CDKN2A)のプロモーター領域に対する特異的プライマーを用いてPCR増幅を行った。
【０１２９】
Forward primer：GAGGAGGGGTTGGTTGGTTATTAGAG（配列番号１）
Reverse primer：TACCTAATTCCAATTCCCCTACAAAC（配列番号２）
(4) バイサルファイト変換後の産物をSssI酵素 (NEB) にて30℃で4時間反応させた。
【０１３０】
(5) 生成物をアガロースゲル泳動し、目的のバンド（300bp）を切り出し精製した。
【０１３１】
(6) 実施例１（表２）と同様に、上記の操作で得られたDNA(10ng)と蛍光標識MBD2を混合して室温で２０分間静置して反応させた。反応液を、波長543nm、出力100μWのレーザー光を照射時間15秒・照射回数5回の条件で一分子蛍光分析システムMF20（オリンパス(株)製）によりFCS測定して並進拡散時間を求めた。
【０１３２】
２．バイサルファイトシークエンシングによるメチル化解析
上述のバイサルファイト変換したDNAを鋳型に、p16遺伝子のプロモーター領域に対する上記特異的プライマーを用いてPCR増幅を行った。そのPCR産物を1.5％アガロースゲルで泳動分離してゲルから抽出後、pGEM T-Easyベクターにサブクローニングした。そして、そのクローニングベクターを大腸菌E.coli DH5α株に形質転換しクローニングを行った。5個のコロニーからそれぞれプラスミド抽出を行い、M13シーケンスプライマーにてシーケンスを決定した。
【０１３３】
３．結果
図１０に脱メチル化剤存在下および非存在下での培養条件におけるU937株細胞のp16INK4a遺伝子プロモーター領域DNAの並進拡散時間（Diff.time）を示す。図１０において、「TAMRA-MBD2」は、蛍光標識MBD2（すなわちDNA 0ng）を示し、「0% Methyl」は、0％メチル化コントロールDNAを示し、「100% Methyl」は、100％メチル化コントロールDNAを示し、「U937_Mock」は、脱メチル化剤で処理しなかった細胞サンプルを示し、「U937_5AzaC」は、脱メチル化剤５−アザシチジン処理細胞サンプルを示し、「U937_DAC」は、脱メチル化剤デシタビン処理細胞サンプルを示す。脱メチル化剤処理により並進拡散時間が短くなっており、p16INK4a遺伝子プロモーター領域のCpGサイトのメチル化率が低下していることが分かる。従来法に従って、同プロモーター領域のバイサルファイト変換後の産物のシーケンスを解析した結果を図１１に示す。図１１において、「U937 Mock」は、脱メチル化剤で処理しなかった細胞を示し、「U937 5AzaC」は、脱メチル化剤５−アザシチジン処理細胞を示し、「U937 DAC」は、脱メチル化剤デシタビン処理細胞を示す。図１１に示したように脱メチル化剤（5AzaCまたはDAC）の影響で脱メチル化（白丸）している。本発明は、ゲノムワイドなメチル化パターンを解析できるだけでなく、特定のDNA領域を抽出してメチル化率を解析することも可能であり、これらの結果は特定領域のメチル化解析法であるバイサルファイトシークエンシングと同様の結果が得られる。また、バイサルファイトシークエンシングが結果が得られるまでに１週間程度かかるのに対し、本発明は２日に短縮することができる。
【０１３４】
レーザー照射条件について、２通りの条件（照射時間15秒・照射回数5回もしくは照射時間5秒・照射回数15回）で検討したが、特定領域に限定したDNAを用いたFCS測定では照射時間15秒・照射回数5回の条件で良好な結果が得られた。
【０１３５】
実施例６：急性白血病(AML)患者の末梢血由来ゲノムDNAと健常人の末梢血由来ゲノムDNAにおけるメチル化率の比較
１．実験方法
急性白血病(AML)患者の末梢血もしくは健常人の末梢血350μlから、実施例１と同様に全自動ゲノム抽出ロボット(Magtration System 6GC: Precision System Science)を用いてゲノムDNAを抽出し、MseI酵素での前処理（断片化）およびカラム精製を行った。
【０１３６】
実施例１（表２）と同様に断片化ゲノムDNA(10ng)と蛍光標識MBD2を混合して室温で２０分間静置して反応させた。反応液を、波長543nm、出力100μWのレーザー光を照射時間5秒・照射回数15回の条件で一分子蛍光分析システムMF20（オリンパス(株)製）によりFCS測定して並進拡散時間を求めた。
【０１３７】
２．結果
図１２に急性白血病(AML)患者および健常人由来ゲノムDNAにおけるメチル化率を示す。図１２において、健常人（Normal）と比較して急性白血病患者のゲノムDNAにおいて有意にメチル化率が減少している。癌細胞のゲノムDNAでは、癌抑制遺伝子などのプロモーター領域に存在するCpGアイランドの高メチル化とゲノムワイドな低メチル化が引き起こされる現象が知られている。CpGアイランドの高メチル化は特定因子の転写不活化に、ゲノムワイドな低メチル化はゲノム不安定性に起因している。本実施例でも、急性白血病患者のゲノムDNAは低メチル化状態になっており、本発明によるゲノムワイドな低メチル化の検出が、診断マーカーとして臨床応用可能であることが実証された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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