(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体におけるエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）関連疾患に対する免疫応答を誘導するための組成物であって、少なくとも１つの全長の単離されたＥＢＶ遺伝子産物から成り、該全長の遺伝子産物がＢＺＬＦ１である、組成物。
【請求項２】
前記組成物がさらに、第２の全長の単離されたＥＢＶ遺伝子産物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第２の全長の単離されたＥＢＶ遺伝子産物が、ウイルス溶解遺伝子産物およびウイルス潜伏遺伝子産物から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記エプスタインバーウイルスが、１型、２型、ＳｉＩＩＡ、Ａ４、ＴＳＢ−Ｂ６、ａｐ８７６、ｐ３ｈｒ１、ｂ９５．８、ｃａｏ、ｒａｊｉ、およびｄａｕｄｉから選択される株である、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記第２の全長の単離されたＥＢＶ遺伝子産物が、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ３Ａ、およびＥＢＮＡ３Ｃから選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記潜伏遺伝子産物が、ＥＢＮＡ３Ｃである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
少なくとも２つのエプスタインバーウイルス遺伝子産物を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＥＢＶ関連疾患が、腫瘍性疾患、伝染性単核球症、血球貪食症候群、腎細胞尿細管炎、および肝炎から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記腫瘍性疾患が、リンパ増殖性障害、バーキットリンパ腫、ホジキン病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、胃粘膜および鼻咽頭粘膜の上皮癌腫、未分化型鼻咽頭癌、ならびに末梢Ｔ細胞およびＴ／ＮＫ細胞リンパ腫から選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記リンパ増殖性障害が、先天性免疫不全、後天性免疫不全、および医原性免疫不全により生じる、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記リンパ増殖性障害が、移植後リンパ増殖性疾患である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記被験体が、腫瘍性疾患、伝染性単核球症、血球貪食症候群、腎細胞尿細管炎、および肝炎から選択される少なくとも１つのエプスタインバーウイルス関連疾患であると診断されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記被験体が診断された前記腫瘍性疾患が、リンパ増殖性障害、バーキットリンパ腫、ホジキン病、胃粘膜および鼻咽頭粘膜の上皮癌腫、未分化型鼻咽頭癌、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、ならびに末梢Ｔ細胞リンパ腫から選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記被験体が診断された前記リンパ増殖性障害が、先天性免疫不全、後天性免疫不全、および医原性免疫不全により引き起こされる、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記被験体が、移植後リンパ増殖性疾患であると診断されている、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物が免疫原性であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのエプスタインバーウイルス溶解遺伝子産物および前記少なくとも１つのエプスタインバーウイルス潜伏遺伝子産物が、結合されている、請求項７に記載の組成物。
【請求項１８】
皮下経路、筋肉内経路、粘膜経路、腹膜内経路、または皮内経路から選択される経路によって投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
少なくとも２つのウイルス遺伝子産物および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む、少なくとも１つのエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）関連疾患に対する被験体の免疫応答を誘導するための薬学的組成物であって、少なくとも１つのウイルス遺伝子産物が全長の単離されたＢＺＬＦ１である、薬学的組成物。
【請求項２０】
前記ウイルス遺伝子産物が、ウイルス溶解遺伝子産物およびウイルス潜伏遺伝子産物から選択される、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
前記エプスタインバーウイルスが、１型、２型、ＳｉＩＩＡ、Ａ４、ＴＳＢ−Ｂ６、ａｐ８７６、ｐ３ｈｒ１、ｂ９５．８、ｃａｏ、ｒａｊｉ、およびｄａｕｄｉから選択される株である、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
前記エプスタインバーウイルス溶解遺伝子産物が、ＢＺＬＦ１であり、前記エプスタインバーウイルス潜伏遺伝子産物が、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ２、ＥＢＮＡ３Ａ、ＥＢＮＡ３Ｂ、ＥＢＮＡ３Ｃ、ＥＢＮＡ−ＬＰ、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２Ａ、およびＬＭＰ２Ｂから選択される、請求項２０に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
前記溶解遺伝子産物が、ＢＺＬＦ１であり、前記潜伏遺伝子産物が、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ３Ａ、およびＥＢＮＡ３Ｃから選択される、請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
前記エプスタインバーウイルス溶解遺伝子産物が、ＢＺＬＦ１であり、前記エプスタインバーウイルス潜伏遺伝子産物が、ＥＢＮＡ３Ｃである、請求項２３に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
前記賦形剤が、水、塩、緩衝剤、炭水化物、可溶化剤、プロテアーゼインヒビター、および乾燥粉末処方剤から選択される、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
前記薬学的組成物が、少なくとも１つの補助剤をさらに含む、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
前記補助剤が、フロイントアジュバント、油中水型エマルジョン、鉱油、顆粒白血球／マクロファージコロニー刺激因子、およびインターロイキン２から選択される、請求項２６に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
前記薬学的組成物が、少なくとも２つのエプスタインバーウイルス遺伝子産物を含む、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
前記薬学的組成物が、少なくとも３つのエプスタインバーウイルス遺伝子産物を含む、請求項２８に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
被験体における少なくとも１つのエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）関連疾患に対する免疫応答を誘導するための組成物であって、
全長の単離されたＢＺＬＦ１と、ＥＢＮＡ１とを含む、組成物。
【請求項３１】
全長の単離されたＢＺＬＦ１と組み合わせてＥＢＮＡ１を含む、被験体における少なくとも１つのエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）関連疾患に対する免疫応答を誘導するためのワクチンであって、該ワクチンが、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、ワクチン。
【請求項３２】
全長の単離されたＥＢＶ遺伝子産物ＢＺＬＦ１が、配列番号７４の配列を有する、請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
本願は、米国仮特許出願第６０／７３７，９４４号（２００５年１１月１８日出願）（その内容全体は、本明細書中に参考として援用される）に基づく優先権および任意の他の利益を主張する。
【０００２】
（政府の権利）
米国の政府は、本発明において特定の権利を有し得る。
【０００３】
（分野）
本開示内容は一般的に、ウイルス関連疾患およびいくつかの実施形態においてはエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）関連疾患を予防するためのワクチン接種方法に関する。いくつかの実施形態において、本方法は、宿主免疫を改善および／または回復させるＥＢＶ特異的メモリーＴ細胞を増加させ、疾患を制御する。これらの結果を達成するためのポリペプチドおよびＤＮＡ配列も記載する。
【背景技術】
【０００４】
（背景）
エプスタインバーウイルスは、休止期ヒトメモリーＴ細胞および上皮細胞に感染する遍在性のリンパ球指向性ヒトヘルペスウイルスである。ＥＢＶは鼻咽腔の上皮細胞の一次感染を介してヒト宿主に達し、通常このプロセスは青少年期に行われる。この宿主の一次感染は、ＥＢＶ一次感染と呼ばれる。
【０００５】
健常者のＥＢＶ一次感染は無症状であることが多いが、重篤なインフルエンザ様疾患を起こすこともあり、その場合は、ヒト（宿主）における感染したＥＢＶ陽性Ｂ細胞が限られた時間だけ増殖し、その後に宿主自身の免疫系（健常な抗原特異的Ｔ細胞を介する場合が多い）により疾患が制御される。この自己限定性のＢ細胞リンパ増殖性疾患は、伝染性単核球症（ＩＭ）または「モノ」と呼ばれており、医原性（免疫抑制剤）、後天性（ＡＩＤＳ）または先天性（ＳＣＩＤ、ＸＬＰ）の免疫抑制の後に発症するより重篤な、制御不能な、または悪性のＥＢＶ感染Ｂ細胞の増殖とは区別することができる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（要旨）
本明細書には、ある被験体における少なくとも１つのウイルス関連疾患に対する免疫応答を誘導する方法であって、少なくとも１つのウイルス遺伝子産物を前記被験体に投与することを含む、方法である。いくつかの実施形態において、遺伝子産物は、ウイルス溶解遺伝子産物およびウイルス潜伏遺伝子産物から選択される。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ＨＨＶ−１（単純ヘルペスウイルス１型）、ＨＨＶ−２（単純ヘルペスウイルス２型）、ＨＨＶ−３（水痘帯状疱疹ウイルス）、ＨＨＶ−４（エプスタインバーウイルス）、ＨＨＶ−５（サイトメガロウイルス）、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７、およびＨＨＶ−８（カポジ肉腫ヘルペスウイルス：ＫＳＨＶ）から選択されるヒトヘルペスウイルスである。エプスタインバーウイルスには、１型、２型、ＳｉＩＩＡ、Ａ４、ＴＳＢ−Ｂ６、ａｐ８７６、ｐ３ｈｒ１、ｂ９５．８、ｃａｏ、ｒａｊｉ、およびｄａｕｄｉといったウイルス株が含まれるが、これらに限定されない。
【０００７】
この他の特性および利点は、以下の説明に一部記載されているが、一部は以下の説明によって明らかになるか、あるいは本発明の実施によって認識される場合がある。本発明の目的および利点は、添付の特許請求の範囲で具体的に指摘した要素および組み合わせによって実現および達成される。
【０００８】
前述の概説および後述の詳細説明はいずれも、単に例示的かつ説明的なものであり、請求される本発明を制限するものではないことを理解されたい。
【０００９】
本明細書で援用され本明細書の一部を構成する添付の図面は、本発明のいくつかの実施形態を説明するものであり、説明とともに本発明の原理を説明するのに役立つ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（詳細な説明）
以下では本発明を、添付の図面を場合により参照しながら、いくつかのより詳細な実施形態を参照することにより説明する。しかし、本発明は、異なる形態で実現される場合があり、本明細書に記載の実施形態に限定されると解釈してはならない。むしろ、これらの実施形態は、本開示内容が完璧かつ完全であり、本発明の適用範囲を当業者に完全に伝達するように提供される。
【００１１】
特に断りのない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書における本発明の説明で使用される専門用語は、単に特定の実施形態を説明するためのものであり、本発明を限定することを目的としたものではない。本発明の説明および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、特に状況下において明記されない限り、複数形も含むことを意図する。本明細書に記載するすべての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、全体が参考として援用される。
【００１２】
特に断りのない限り、本明細書および特許請求の範囲に記載する成分の量、反応条件などを表すすべての数字は、いずれの場合にも「約」という用語によって改変されるものとして理解されたい。したがって、相反する記載がない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に記載する数値パラメータは、本発明によって得られることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、および等価物の教義の適用を特許請求の範囲に限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、有効桁数および通常の丸め法を考慮して解釈しなければならない。
【００１３】
本発明の広範な適用範囲を述べる数値範囲およびパラメータが近似値であるにもかかわらず、特定の例において記載される数値は、可能な限り正確に報告される。しかし、いずれの数値も本質的には、それぞれの試験測定において見られる標準偏差に必然的に起因する特定の誤差を含む。本明細書全体を通して定められる数値の範囲は、このようなより広範な数値範囲内に含まれるそれぞれのより狭い数値範囲が、本明細書においてすべて明記されているかのように、このようなより狭い数値範囲を包含する。
【００１４】
ＥＢＶは、安静にしているヒトメモリーＢ細胞および上皮細胞に感染する広布リンパ増殖性ヒトヘルペスウイルスである。遺伝的多型によって区別される、それぞれ１型および２型とも呼ばれるＡ型およびＢ型の２つのＥＢＶ株が存在し、それにより種々の遺伝子は、ＤＮＡ配列および／または一次アミノ酸配列が異なる。いずれのＥＢＶ型も世界中で発生するが、地理的分布は異なる。さらに、いずれのＥＢＶ型も、インビボにおける生物活性がほぼ同じであり、したがって、本発明の方法および組成物は、一方または両方の型のＥＢＶに由来する遺伝子産物を投与することによって、１型ＥＢＶとしても知られるＡ型ＥＢＶと２型ＥＢＶとしても知られるＢ型ＥＢＶの両方に対して使用するように適合させることができる。本発明の適用範囲内に含まれるＥＢＶのその他の株には、ＳｉＩＩＡ、Ａ４、ＴＳＢ−Ｂ６、ａｐ８７６、ｐ３ｈｒ１、ｂ９５．８、ｃａｏ、ｒａｊｉ、およびｄａｕｄｉがある。表１は、１型ＥＢＶのオープンリーディングフレームに対応する核酸配列を示す。
【００１５】
ＥＢＶは、鼻咽喉の上皮細胞の一次感染を介してヒト宿主に接触し、通常は青年期にＥＤＶがこれを行う。青少年のこの第１感染は、一次ＥＢＶ感染と呼ばれる。上皮内において、一次ＥＢＶ感染時における溶解遺伝子プログラムの活性化により、局所的なビリオン生成や粘膜下リンパ組織の湿潤が生じ、休止期Ｂリンパ球の感染をもたらす。溶解性感染は、ＢＺＬＦ１として知られるＥＢＶレプリコンアクチβー遺伝子産物によって開始および推進される。約８０種類のＥＢＶ  ｍＲＮＡ種が、一次感染の溶解段階中に発現し、前初期、後初期、または後期のいずれかのウイルス性溶解遺伝子として特徴付けられる。前初期溶解性感染時に検出される遺伝子は、新しいタンパク質の合成に関係なく発現し、ＢＺＬＦ１遺伝子産物によって活性化される。初期溶解性抗原（ＥＡ）の例には、ＢＲＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＭＬＦ１（トランスアクチβー）、ＢＡＬＦ５（ＤＮＡポリメラーゼ）、ＢＡＲＦ１（リボヌクレオチドレダクターゼ）、ＢＸＬＦ１（ウイルスチミジンキナーゼ）、ＢＧＬＦ４（ＣＭＶ−ＵＬ９７と相同のタンパク質キナーゼ）がある。後期溶解遺伝子の発現は、ビリオン集合に必要な構造タンパク質を主にコードする。潜伏遺伝子プログラムでその他何らかのＥＢＶ遺伝子プログラムは、一次ＥＢＶ感染のこの初期段階に感染Ｂリンパ球において活性化される。
【００１６】
健常者のＥＢＶ一次感染は無症状であることが多いが、場合によっては重篤なインフルエンザ様疾患を起こすこともあり、被験体（例えば、ヒト）の感染したＥＢＶ陽性Ｂ細胞が、限られた時間だけ増殖し、その後に被験体自身の免疫系（健常な抗原特異的Ｔ細胞を介する場合が多い）が疾患を制御する。この自己限定性のＢ細胞リンパ増殖性疾患は、伝染性単核球症（ＩＭ）または「モノ」として知られ、移植後リンパ増殖性障害と呼ばれる、臓器移植後に生じることがあるＥＢＶ陽性Ｂ細胞のより重篤な、制御不能な、または悪性の増殖とは区別される。この増殖は、しばしば致命的となることがあるが、これについては以下で考察する。本発明者は、これらの病態のいずれにおいても、感染したＢ細胞において発現するＥＢＶ溶解遺伝子産物および潜伏遺伝子産物が、宿主のＴ細胞免疫応答の主要な標的であることは明らかであることを見出した。
【００１７】
被験体が「無症状」一次ＥＢＶ感染に罹患しているか、またはＩＭを発症するかに関係なく、溶解段階は宿主のＴ細胞による制御下において生じるが、ＥＢＶは、宿主の身体から決して完全には排除されない。むしろ、ＥＢＶは、限られた数の休止期Ｂ細胞において持続的なＥＢＶプログラムに切り替えることによって、宿主の免疫系から逃れようとする。一般的に、常にというわけではないが、ウイルスが第１潜伏形態（潜伏Ｉ型）でのみ存在する限り、溶解遺伝子プログラムは沈黙しており、潜伏遺伝子の発現はＥＢＮＡ１およびＬＭＰ２Ａに限られる。したがって、ウイルスは、宿主免疫監視網を回避することによってヒト宿主内に生き残ることができ、ＬＭＰ１およびＥＢＮＡ２などの発がん性ウイルスタンパク質は沈黙しているため、感染した免疫適格宿主に対してほとんど脅威を示さない。実際に、米国の成人の約９５％が、安定した潜伏ＥＢＶ感染に罹患している。しかし、以下に言及するとおり、潜伏ＥＢＶ感染が再び活性化され、疾患プロセスと関連する場合もある。
【００１８】
潜伏ＥＢＶ遺伝子プログラムは３種類あり（図１）、それぞれが潜伏遺伝子の発現パターンと関連する。ＥＢＶ陽性休止Ｂ細胞は、エプスタインバー核抗原１（ＥＢＮＡ１）および潜伏膜タンパク質−２Ａ（ＬＭＰ２Ａ）を含むがこれらに限定されない潜伏Ｉ型遺伝子発現プロファイルを示す。これは、通常の健常なヒトにおけるメモリーＢ細胞の長期的な無症状ＥＢＶ感染に関連する潜伏プログラムである。潜伏ＩＩ型感染Ｂリンパ球は、ＥＢＮＡ１、ＬＭＰ２Ａ、およびＬＭＰ１の発現を含むがこれらに限定されない潜伏遺伝子プログラムを示す。活性化され、悪性の形質転換、すなわち無限の増殖が可能なヒトＥＢＶ陽性Ｂ細胞は、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ２、ＥＢＮＡ３Ａ、ＥＢＮＡ３Ｂ、ＥＢＮＡ３Ｃ、ＥＢＮＡ−ＬＰ、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２Ａ、およびＬＭＰ２Ｂの発現を含むがこれらに限定されないＩＩＩ型潜伏プログラムを示す。
【００１９】
一次ＥＢＶ感染および以前の潜伏ＥＢＶ感染の再活性化を伴う併発症は、先天性、後天性、および／または医原性免疫不全状態の患者において高い頻度で生じる。例えば、実質臓器または血液同種移植を受けた患者において集中Ｔ細胞抑制療法を行うと、患者はＥＢＶ関連ＰＴＬＤに罹患する危険性がある。このＰＴＬＤの危険性は、移植片拒絶または移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）の徴候がさらに見られる場合に高くなる。ＰＴＬＤは、米国で１年間に実施される実質臓器移植の２〜２０％において併発する。死亡率は５０％〜７０％と報告されており、最適な処置法については、依然として盛んに議論されている。免疫抑制の低減は、ほとんどすべての患者において最初に試行され、２３％〜５０％の症例でＰＴＬＤ病変の退行が見られると報告されているが、この手法による持続的な完全寛解はほとんど得られることがないと考えられている。新規の免疫抑制療法の出現により、実質臓器の移植は、末期腎臓病、小児患者のＩ型糖尿病、ならびに心不全や肝不全などの治療オプションとなっている。標準的な医療診療において臓器移植が多く使用されるようになれば、ＰＴＬＤを発症する頻度が高くなり、罹患率や死亡率が増大することになる。さらには、ＰＴＬＤに関連する併発症の管理が、患者やヘルスケア産業にとって大きな財政的課題をもたらす。
【００２０】
ＰＴＬＤは、一次または再活性化ＥＢＶ感染に関連する悪性Ｂ細胞リンパ増殖性障害である。ＥＢＶウイルス血症とＰＴＬＤの間の関連は、免疫抑制療法中に移植患者の末梢血液からＥＢＶ  ＤＮＡを増幅させる定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）法を使用して、再現的に文書化されている。ＰＴＬＤの範囲は、ポリクローナルのＢ細胞過形成からモノクローナルの免疫芽球性リンパ腫にわたる。ポリクローナルＥＢＶ−ＬＰＤは、免疫抑制療法の中止後に退行することが知られているが、モノクローナル疾患は、従来の療法に対して本質的な抵抗を示し、しばしば致命的である。自家Ｔリンパ球の存在下におけるＥＢＶ誘導Ｂ細胞形質転換の阻害がインビトロデータにより示され、異種移植重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにおけるＥＢＶ陽性リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）成長の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）により媒介される逆転が実証されたことで、Ｔ細胞がＥＢＶ感染とＥＢＶ形質転換Ｂ細胞の制御において不可欠であるという見解に対して納得できる裏付けが得られている。インビトロ生成ＣＴＬをＥＢＶ−ＬＰＤ患者に送達し、免疫抑制療法の中止後におけるＥＢＶ特異的ＣＴＬの内因性拡大が記録されたことで、宿主免疫の回復が、この「日和見性の」悪性疾患の制御において最も有望な療法となり得ることが示唆されている。これらの所見はまた、ＰＴＬＤの発症を防止するために実質臓器の移植前にＥＢＶ特異的ＣＴＬ先駆物質の頻度を拡大させることを目的して、宿主の免疫網を教育する方法を考案する貴重な機会ももたらす。当然ながら、上述の再活性化ＥＢＶ（または他のヘルペスウイルス）感染および悪性ＥＢＶ（または他のヘルペスウイルス）関連疾患に罹患する危険性がある他の患者群に、同様の方法を適用することも可能である。
【００２１】
種々のウイルス性タンパク質由来ペプチドと特定のＨＬＡ型の間の関連性は限られていることから、潜伏または溶解ＥＢＶ遺伝子産物に由来する選択ペプチドによる免疫化は、比較的小さな患者群に免疫優性抗原をもたらすと考えられる。この制約は、全長ＥＢＶ溶解および／または潜伏ポリペプチドもしくはタンパク質を抗原処理網に提供し、それによってすべてではないにせよ、ほとんどの型のＨＬＡクラスＩおよびＩＩ分子の状況下において最適な提示を可能にすることにより回避できることを、本発明者等は発見した。これらのより大きな分子を受容した被験体（例えば、ヒト）は、その後全長ポリペプチドを処理し、特定のＨＬＡクラスＩおよびＩＩ分子の状況下において免疫優性ペプチドを示すことができる。したがって、本明細書では、賦形剤または免疫補助剤を伴うかを問わず精製タンパク質を直接送達することによるか、あるいは組換えＤＮＡ法を介して達成することができるワクチン接種を目的とした、全長溶解および／または潜伏ＥＢＶポリペプチド免疫原を提供する。本開示内容と一貫して、本発明の方法および組成物も提供する。
【００２２】
本発明は、ウイルス由来の産物を被験体の遺伝子に投与することによりウイルス関連疾患に対する被験体の免疫応答を誘導するための方法および組成物を対象とする。本発明の標的である疾患を誘発するウイルスには、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）１〜８（ＨＨＶ−１、ＨＨＶ−２、ＨＨＶ−３、ＨＨＶ−４、ＨＨＶ−５、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７、およびＨＨＶ−８）が含まれる。本開示内容のほとんどでは、ＨＨＶ−４（エプスタインバーウイルス）に注目して本発明を例示しているが、他のＨＨＶにも等しく適用することができる。
【００２３】
いくつかの実施形態において、ウイルスは、エプスタインバーウイルスであり、少なくとも１つのウイルス遺伝子産物は、表１に列挙する遺伝子産物から選択される。いくつかの実施形態において、遺伝子産物は、１型エプスタインバーウイルスに由来し、表１に列挙する配列に関連する。いくつかの実施形態において、エプスタインバーウイルス溶解遺伝子産物は、ＢＺＬＦ１、ＢＨＲＦ１、ＢＨＬＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＭＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＡＬＦ５、ＢＡＲＦ１、ＢＯＲＦ２、ＢＣＲＦ１、ＢＫＲＦ３、ＢＤＬＦ３、ＢＩＬＦ１、ＢＦＲＦ１、ＢＸＬＦ１、ＢＧＬＦ４、ＢＧＬＦ５、ｇｐ３５０、ｇｐ２２０、およびＬＭＰ１−ｌｙｔから選択され、エプスタインバーウイルス潜伏遺伝子産物は、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ２、ＥＢＮＡ３Ａ、ＥＢＮＡ３Ｂ、ＥＢＮＡ３Ｃ、ＥＢＮＡ−ＬＰ、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２Ａ、およびＬＭＰ２Ｂから選択されるか、あるいは溶解遺伝子産物は、ＢＺＬＦ１およびＢＭＬＦ１から選択され、潜伏遺伝子産物は、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ３Ａ、およびＥＢＮＡ３Ｃから選択されるか、あるいはエプスタインバーウイルス溶解遺伝子産物はＢＺＬＦ１であり、エプスタインバーウイルス潜伏遺伝子産物はＥＢＮＡ３Ｃである。本発明の方法のいくつかの実施形態は、少なくとも２つのエプスタインバーウイルス遺伝子産物を投与することを伴う。
【００２４】
いくつかの実施形態において、ウイルス関連疾患は、腫瘍性疾患、伝染性単核球症、血球貪食症候群、腎細胞尿細管炎（ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｔｕｂｕｌｉｔｉｓ）、および肝炎から選択される。腫瘍性疾患には、リンパ増殖性障害、バーキットリンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、胃粘膜および鼻咽頭粘膜の上皮癌腫、未分化型鼻咽頭癌、ならびに末梢Ｔ細胞およびＴ／ＮＫ細胞リンパ腫が含まれるが、これらに限定されない。リンパ増殖性障害には、先天性免疫不全、後天性免疫不全、および治療的介入の結果として、またはそれに関連して生じる免疫不全状態を一般的に含む医原性免疫不全の結果として、あるいはこれらに関連して生じるものが含まれるが、これらに限定されない。医原性免疫不全には、移植後リンパ増殖性疾患となることがあるこれらの免疫不全状態のいずれかが含まれる。
【００２５】
いくつかの実施形態において、被験体は、腫瘍性疾患、伝染性単核球症、血球貪食症候群、腎細胞尿細管炎、および肝炎から選択される少なくとも１つのエプスタインバーウイルス関連疾患であると診断されている。腫瘍性疾患には、リンパ増殖性障害、バーキットリンパ腫、ホジキン病、胃粘膜および鼻咽頭粘膜の上皮癌腫、未分化型鼻咽頭癌、ならびに末梢Ｔ細胞リンパ腫が含まれるが、これらに限定されない。リンパ増殖性障害には、先天性免疫不全、後天性免疫不全、および医原性免疫不全が含まれるが、これらに限定されない。医原性免疫不全は、移植後リンパ増殖性疾患を生じることがある。
【００２６】
いくつかの実施形態において、投与は、エプスタインバーウイルス溶解遺伝子産物およびエプスタインバーウイルス潜伏遺伝子産物から選択されるエプスタインバーウイルス遺伝子産物をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを導入することによって行われ、前記エプスタインバーウイルス遺伝子産物は、調節エレメントに作動可能に結合されている。いくつかの実施形態において、エプスタインバーウイルス遺伝子産物をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドは、全長エプスタインバーウイルスｃＤＮＡコード配列を含む。全長エプスタインバーウイルスｃＤＮＡコード配列には、ＢＺＬＦ１、ＢＨＲＦ１、ＢＨＬＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＭＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＡＬＦ５、ＢＡＲＦ１、ＢＯＲＦ２、ＢＣＲＦ１、ＢＫＲＦ３、ＢＤＬＦ３、ＢＩＬＦ１、ＢＦＲＦ１、ＢＸＬＦ１、ＢＧＬＦ４、ＢＧＬＦ５、ｇｐ３５０、ｇｐ２２０、ならびにＬＭＰ１−ｌｙｔ、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ２、ＥＢＮＡ３Ａ、ＥＢＮＡ３Ｂ、ＥＢＮＡ３Ｃ、ＥＢＮＡ−ＬＰ、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２Ａ、およびＬＭＰ２Ｂコード配列が含まれるが、これらに限定されない。
【００２７】
いくつかの実施形態において、投与は、被験体において、エプスタインバーウイルス溶解遺伝子産物およびエプスタインバーウイルス潜伏遺伝子産物から選択される少なくとも１つのエプスタインバーウイルス遺伝子産物を含む免疫原組成物を導入することによって行われる。遺伝子産物は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであってもよい。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのエプスタインバーウイルス溶解遺伝子産物および少なくとも１つのエプスタインバーウイルス潜伏遺伝子産物は結合する。いくつかの実施形態において、ウイルス遺伝子産物は、皮下経路、筋肉内経路、粘膜経路、腹膜内経路、または皮内経路から選択される経路によって投与される。
【００２８】
また、少なくとも２つのウイルス遺伝子産物および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む少なくとも１つのウイルス関連疾患に対する被験体の免疫応答を誘導する薬学的組成物も提供される。いくつかの実施形態において、遺伝子産物は、ウイルス溶解遺伝子産物およびウイルス潜伏遺伝子産物から選択される。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ＨＨＶ−１（単純ヘルペスウイルス１型）、ＨＨＶ−２（単純ヘルペスウイルス２型）、ＨＨＶ−３（水痘帯状疱疹ウイルス）、ＨＨＶ−４（エプスタインバーウイルス）、ＨＨＶ−５（サイトメガロウイルス）、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７、およびＨＨＶ−８から選択されるヒトヘルペスウイルスである。いくつかの当該実施形態において、ウイルスは、エプスタインバーウイルスであり、これは、１型、２型、ＳｉＩＩＡ、Ａ４、ＴＳＢ−Ｂ６、ａｐ８７６、ｐ３ｈｒ１、ｂ９５．８、ｃａｏ、ｒａｊｉ、およびｄａｕｄｉから選択される株である場合がある。
【００２９】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのウイルス遺伝子産物は、表１に列挙する遺伝子産物から選択される。いくつかの当該実施形態において、エプスタインバーウイルス溶解遺伝子産物は、ＢＺＬＦ１、ＢＨＲＦ１、ＢＨＬＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＭＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＡＬＦ５、ＢＡＲＦ１、ＢＯＲＦ２、ＢＣＲＦ１、ＢＫＲＦ３、ＢＤＬＦ３、ＢＩＬＦ１、ＢＦＲＦ１、ＢＸＬＦ１、ＢＧＬＦ４、ＢＧＬＦ５、ｇｐ３５０、ｇｐ２２０、およびＬＭＰ１−ｌｙｔから選択され、エプスタインバーウイルス潜伏遺伝子産物は、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ２、ＥＢＮＡ３Ａ、ＥＢＮＡ３Ｂ、ＥＢＮＡ３Ｃ、ＥＢＮＡ−ＬＰ、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２Ａ、およびＬＭＰ２Ｂから選択される。いくつかの当該実施形態において、溶解遺伝子産物は、ＢＺＬＦ１およびＢＭＬＦ１から選択され、潜伏遺伝子産物は、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ３Ａ、およびＥＢＮＡ３Ｃから選択されるか、あるいはエプスタインバーウイルス溶解遺伝子産物はＢＺＬＦ１であり、エプスタインバーウイルス潜伏遺伝子産物はＥＢＮＡ３Ｃである。
【００３０】
薬学的組成物は、水、塩、緩衝剤、炭水化物、可溶化剤、プロテアーゼインヒビター、および乾燥粉末処方剤から選択される賦形剤を含む場合がある。いくつかの実施形態において、薬学的組成物はさらに、フロイントアジュバント、油中水型エマルジョン、鉱油、顆粒白血球／マクロファージコロニー刺激因子、および／またはインターロイキン２など、少なくとも１つの補助剤も含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、少なくとも２つのエプスタインバーウイルス遺伝子産物を含み、いくつかの実施形態において、薬学的組成物は少なくとも３つのエプスタインバーウイルス遺伝子産物を含む。
【００３１】
また、少なくとも１つのエプスタインバーウイルス遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド；およびエプスタインバーウイルス遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合されている異種プロモーターを含むエプスタインバーウイルス遺伝子産物発現カセットを含む、アデノウイルスベクターなどのウイルスベクターも提供される。いくつかの実施形態において、エプスタインバーウイルスは、１型、２型、ＳｉＩＩＡ、Ａ４、ＴＳＢ−Ｂ６、ａｐ８７６、ｐ３ｈｒ１、ｂ９５．８、ｃａｏ、ｒａｊｉ、およびｄａｕｄｉから選択される株である場合がある。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのエプスタインバーウイルス遺伝子産物は、表１に列挙する遺伝子産物から選択される。エプスタインバーウイルス溶解遺伝子産物には、ＢＺＬＦ１、ＢＨＲＦ１、ＢＨＬＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＭＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＡＬＦ５、ＢＡＲＦ１、ＢＯＲＦ２、ＢＣＲＦ１、ＢＫＲＦ３、ＢＤＬＦ３、ＢＩＬＦ１、ＢＦＲＦ１、ＢＸＬＦ１、ＢＧＬＦ４、ＢＧＬＦ５、ｇｐ３５０、ｇｐ２２０、およびＬＭＰ１−ｌｙｔが含まれるが、これらに限定されず、エプスタインバーウイルス潜伏遺伝子産物は、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ２、ＥＢＮＡ３Ａ、ＥＢＮＡ３Ｂ、ＥＢＮＡ３Ｃ、ＥＢＮＡ−ＬＰ、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２Ａ、およびＬＭＰ２Ｂから選択される。いくつかの当該実施形態において、溶解遺伝子産物は、ＢＺＬＦ１およびＢＭＬＦ１から選択され、潜伏遺伝子産物は、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ３Ａ、およびＥＢＮＡ３Ｃから選択され、いくつかの当該実施形態において、エプスタインバーウイルス溶解遺伝子産物はＢＺＬＦ１であり、エプスタインバーウイルス潜伏遺伝子産物はＥＢＮＡ３Ｃである。
【００３２】
また、アデノウイルスベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルスも提供する。また、アデノウイルスベクターを含むアデノウイルス部分；およびプラスミド部分を含むプラスミドも提供する。
【００３３】
また、本明細書で提供するウイルスベクターを含む哺乳動物細胞も提供する。また、ウイルス遺伝子産物に対する免疫応答を産生する条件下において哺乳動物細胞を培養する方法であって、ウイルス遺伝子産物の発現に好適な条件下において細胞を増殖させることを含む、方法も提供する。これらの細胞調製物には、自家樹状細胞、線維芽細胞、筋細胞などを含むが、これらに限定されない。また、細胞療法として使用されるＥＢＶ特異的細胞傷害性Ｔ細胞（または他のエフェクター細胞）のエキソビボ生成および膨張をもたらす（いずれかの既存のＥＢＶオープンリーディングフレームなどからの）所与のウイルス遺伝子産物の発現を可能にする方法も提供される。本明細書に記載の方法の性質は、細胞療法として使用する自家または同種抗原特異的もしくは生得免疫細胞調製物に適用される場合がある。細胞療法は、被験体に投与されると、サイトカインの分泌、共刺激分子の認識、抗原の認識、細胞傷害性療法の送達など（これらに限定されない）を介して、病原体に対する所与の応答を向上させる細胞調製物として定義される場合がある。
【００３４】
また、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤をさらに含むベクターも提供する。また、少なくとも１つのエプスタインバーウイルス遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド；および前記エプスタインバーウイルス遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合されている異種プロモーターを含むエプスタインバーウイルス遺伝子産物発現カセットを含む、エプスタインバーウイルス関連腫瘍性または非腫瘍性疾患に対する免疫応答を産生するウイルスベクター薬学的組成物も提供する。また、少なくとも１つのエプスタインバーウイルス遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド；前記エプスタインバーウイルス遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合されている異種プロモーターを含むエプスタインバーウイルス遺伝子産物発現カセットを含む、エプスタインバーウイルス関連疾患に対する免疫応答を産生するアデノウイルスベクター薬学的組成物も提供する。
【００３５】
また、エプスタインバーウイルスワクチンに対する被験体の応答を確認する方法であって、（ｉ）エプスタインバーウイルス溶解遺伝子産物およびエプスタインバーウイルス潜伏遺伝子産物から選択される少なくとも１つのエプスタインバーウイルス遺伝子産物の存在をアッセイすること、（ｉｉ）バイオマーカーとしてサイトカインを使用して被験体から単離された免疫エフェクター細胞サブセットの存在をアッセイすること、（ｉｉｉ）バイオマーカーとしてモノクローナル抗体および／またはＨＬＡ４量体技法を使用して抗原特異的リンパ球の存在をアッセイすることを含む、方法も提供する。
【００３６】
したがって、一実施形態において、本発明は、ＥＢＶ溶解遺伝子産物および／またはＥＢＶ潜伏遺伝子産物から選択される場合がある少なくとも１つのＥＢＶ遺伝子産物を含む新規のワクチンを投与することにより、被験体において少なくとも１つのＥＢＶ関連疾患を治療することを対象とする。一般的に、ＥＢＶ関連疾患は、いずれかのＥＢＶ  ＯＲＦによって発現／コードされたＥＢＶ遺伝子産物の直接的／間接的な結果としてヒト細胞の無制御の増殖、生存または死をもたらすものである。ＥＢＶ関連病理には、ＥＢＶゲノム（ＤＮＡ）を組織または体液において検出することができる任意の条件が含まれると考えられる。ＥＢＶ関連疾病単位は、ＥＢＶのいずれかのオープンリーディングフレーム、あるいはウイルスまたは細胞調節機序（すなわち、ｍｉＲＮＡなど）に参加することができるポリヌクレオチド配列をもたらす非コード配列によってコードされた１つ以上のウイルス遺伝子産物の発現による、いずれかの生理学的プロセスの調節疾患に関係する場合がある。本明細書に概説する方法はまた、関連するもしくは相同の遺伝子産物もしくはオープンリーディングフレームを有する他のウイルスに関連するか、またはこれにより生じる同様の疾患状態に適用される場合もある。これらのウイルスには、ヒトヘルペスウイルス１型および２型（ＨＨＶ−１、−２）、ＨＨＶ−３（水痘帯状疱疹）、ＨＨＶ−４（本明細書に例示するＥＢＶ）、ＨＨＶ−５（サイトメガロウイルス［ＣＭＶ］）、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７、およびＨＨＶ−８（ＫＳＨＶ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００３７】
特定のＥＢＶ関連疾患には、腫瘍性疾患、伝染性単核球症（ＩＭ）、血球貪食症候群、腎細胞尿細管炎、および肝炎が含まれるが、これらに限定されない。腫瘍性疾患には、リンパ増殖性障害、バーキットリンパ腫、ホジキン病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、胃粘膜および鼻咽頭粘膜の上皮癌腫、未分化型鼻咽頭癌、ならびに末梢Ｔ細胞およびＴ／ＮＫ細胞リンパ腫が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、リンパ増殖性障害は、先天性免疫不全、後天的免疫不全、および医原性免疫不全から選択される。医原性免疫不全の状況下において生じる腫瘍には、移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）およびメトトレキレート関連非ホジキンリンパ腫が含まれるが、これらに限定されない。ＥＢＶ関連疾患は、溶解および／または潜伏遺伝子プログラムを示し、したがって、少なくとも１つのＥＢＶ溶解遺伝子産物および／または少なくとも１つのＥＢＶ潜伏遺伝子産物を含む本発明の組成物は、有効な予防および／または治療手段を提供する。
【００３８】
本方法および組成物はまた、被験体（例えば、ヒト）が免疫適格であるため、定量的により多いメモリーＴ細胞の予備を提供する場合に、溶解および／または潜伏ＥＢＶ遺伝子産物に特異的であるＴ細胞クローン（ＣＤ４およびＣＤ８）の膨張を可能にするために使用することもできる。本実施形態は、臓器移植の準備において免疫抑制療法を受けようとしている被験体に使用することができる。したがって、免疫系が完全に機能している時に被験体がワクチン接種されるため、ＥＢＶに対するメモリーＴ細胞の予備を生成することが可能となる。メモリーＴ細胞の予備は、図４に示す４量体染色によって、あるいは４量体が特定のＨＬＡ型に利用できない場合はエリスポットアッセイによって、ワクチン接種前および接種後に測定することができる。フローサイトメトリーアッセイを使用する他の方法を使用して、メモリーＣＤ３／ＣＤ８  ＴｃおよびＣＤ３／ＣＤ４  Ｔｈ細胞の絶対数を追跡することもできる。他の方法は、ＥＢＶ  ＤＮＡゲノムコピー数を定量的に測定するために、または個体の白血球からＩＦＮ−γ−遺伝子多型の性質を決定するために分子法を使用する。最後に、サイトカイン／ケモカイン、またはウイルス遺伝子産物（またはその誘導）のポリペプチドは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定することができる。本発明の方法および組成物は、免疫抑制療法が開始された後、または免疫調節疾患が上述の機序によって誘発された後、ＥＢＶ関連疾患（例えば、ＰＴＬＤ）に対してより優れた保護を提供する。
【００３９】
本発明に基づき使用することができるＥＢＶ溶解遺伝子産物には、ＢＺＬＦ１、ＢＨＲＦ１、ＢＨＬＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＭＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＡＬＦ５、ＢＡＲＦ１、ＢＯＲＦ２、ＢＣＲＦ１、ＢＫＲＦ３、ＢＤＬＦ３、ＢＩＬＦ１、ＢＦＲＦ１、ＢＸＬＦ１、ＢＧＬＦ４、ＢＧＬＦ５、ｇｐ３５０、ｇｐ２２０、およびＬＭＰｌ−ｌｙｔが含まれるが、これらに限定されない。ＥＢＶ潜伏遺伝子産物には、ＢＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ２、ＥＢＮＡ３Ａ、ＥＢＮＡ３Ｂ、ＥＢＮＡ３Ｃ、ＥＢＮＡ−ＬＰ、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２Ａ、およびＬＭＰ２Ｂが含まれるが、これらに限定されない。本発明に基づき使用されるＥＢＶ遺伝子産物は単離または精製する必要はないが、ＥＢＶ遺伝子産物は、当業者に周知の標準的なプロトコルを使用して単離および精製することができることに留意されたい。
【００４０】
表１は、ＥＢＶに由来するオープンリーディングフレームのすべての一覧を示し、１型株に関連する核酸配列を列挙する。オープンリーディングフレームの遺伝子産物のいずれも、本発明に基づき使用される場合があるが、本明細書では特定の溶解遺伝子産物および潜伏遺伝子産物を例示する。表１に記載する特定の核酸配列は単に１型株の配列であることから、本発明がこれらに限定されるものではないことは十分に明らかなはずである。他のＥＢＶ株由来のオープンリーディングフレームは、異なる配列を有する場合があり、これらは明示的に企図されている。したがって、本明細書では全体を通して、オープンリーディングフレームの遺伝子産物の一般的な名称を参照する（例えば、「ＢＺＬＦ１」）。これらの一般的な名称の参照は、本明細書に開示する特定の１型配列に限定することを目的としたものではなく、他の株の配列も同様に包含することを理解されたい。特定の配列の参照が意図される場合には、その通りに当該配列を参照する。
【００４１】
一実施形態において、ＣＤ８およびＣＤ４陽性Ｔ細胞応答を産生するＥＢＮＡ１は、すべてがＣＤ８Ｔ細胞応答を誘発する（但しＣＤ４Ｔ細胞応答は誘発しない）上に列挙する他の遺伝子産物のいずれかと組み合わされる。したがって、本発明の本組成物は、ＣＤ４およびＣＤ８の両Ｔ細胞応答の生成においてさらに有利である。この特定の組み合わせを使用する方法は、明示的に企図されている。
【００４２】
本明細書で使用される「遺伝子産物」という用語は、遺伝子またはｃＤＮＡの全長コード配列をコードするポリヌクレオチド、あるいは所与のタンパク質の全長アミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する。但し、本発明の方法または組成物に対して影響を与えることなく、本明細書に記載のＥＢＶ遺伝子産物に対して、変異または改変が行われる場合があることに留意されたい。行われる変更の種類は様々である。特定のヌクレオチド塩基が欠失する欠失変異は、翻訳されたポリペプチドにおけるアミノ酸の欠失または変更をもたらすオープンリーディングフレーム配列を形成する。挿入変異は、所与のコード配列内においてヌクレオチド塩基を追加することにより起こり、ポリヌクレオチド配列のフレームシフトを生じる。また、１つのアミノ酸を他のアミノ酸と置換する変異も行うことができる。
【００４３】
アミノ酸の置換に関しては、種々のアミノ酸置換を行うことができる。本明細書で使用されるアミノ酸は一般的に、以下のように区分することができる：（１）無極性または疎水性の側基（Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、およびＭ）を有するアミノ酸；（２）非荷電極性側基（Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、およびＱ）を有するアミノ酸；（３）ｐＨ６．０〜７．０にて負に荷電した極性酸性アミノ酸（ＤおよびＥ）；ならびに（４）ｐＨ６．０〜７．０にて正に荷電した極性塩基性アミノ酸。一般的に、「保存的」置換、すなわち、１つの群のアミノ酸が同じ群のアミノ酸で置換される置換は、活性に対する影響を予期せずに行うことができる。さらに、いくつかの非保存的置換も、活性に影響を与えずに行われる場合がある。当業者であれば、活性に影響を与えずにどの置換を行うことができるかを理解するであろう。
【００４４】
上では天然のアミノ酸を考察したが、非天然のアミノ酸、または改変アミノ酸も企図され、引用した遺伝子産物において置換として使用される場合がある。したがって、本明細書で使用される「アミノ酸」は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、およびアミノ酸類似体を指し、すべてＤおよびＬ立体異性体である。天然アミノ酸には、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リシン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、およびバリン（Ｖ）が含まれる。非天然のアミノ酸には、アゼチジンカルボン酸、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、２，４ジアミノイソ酪酸、デモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリシン、アロ−ヒドロキシリシン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロシン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、およびピペコリン酸が含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
ＥＢＶ遺伝子産物は、一方の末端または両末端に結合するアミノ酸を含む場合もあることに留意されたい。これらの追加の配列は、結果として得られるポリペプチドの発現、精製、同定、溶解性、膜輸送、安定性、活性、局在化、毒性および／または特異性を促進する場合もあれば、あるいはその他何らかの理由により追加される場合もある。ＥＢＶ遺伝子産物は、直接またはスペーサー配列を介して結合する場合がある。スペーサー配列は、アミノ酸の除去を可能にするために、プロテアーゼ認識部位を含む場合もあれば、含まない場合もある。ＥＢＶ遺伝子産物に結合する場合があるアミノ酸の例には、ポリヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、タンデム親和性精製（ＴＡＰ）タグ、カルシウム調節タンパク質（カルモジュリン）タグ、共有結合であるが解離性の（ＣＹＤ）ＮｏｒｐＤペプチド、ＳｔｒｅｐＩＩ、ＦＬＡＧ、タンパク質Ｃ重鎖（ＨＰＣ）ペプチドタグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、金属親和性タグ（ＭＡＴ）、および／または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）タグが含まれるが、これらに限定されない。ＥＢＶ遺伝子産物はまた、ＥＢＶ遺伝子産物に沿って任意の位置で結合する非アミノ酸タグを含む場合もあることにさらに留意する必要がある。これらのさらなる非アミノ酸タグは、結果として得られるポリペプチドの発現、精製、同定、溶解性、膜輸送、安定性、活性、局在化、毒性および／または特異性を促進する場合もあれば、あるいはその他何らかの理由により追加される場合もある。ＥＢＶ遺伝子産物は、直接またはスペーサーを介して非アミノ酸タグに結合する場合がある。非アミノ酸タグの例には、ビオチン、炭水化物成分、脂質成分、蛍光群、および／またはクエンチング群が含まれるが、これらに限定されない。ＥＢＶ遺伝子産物は、さらなる群への結合を容易にするために、化学的、生物学的、またはその他何らかの種類の改変を必要とする場合もあれば、必要としない場合もある。
【００４６】
さらに、以上において特定のオープンリーディングフレーム、およびこれらから得られる遺伝子産物の一般的な名称について言及してきたが、これらの変異体も具体的に企図される。本明細書で使用される「変異体」は、アミノ酸配列が基準のペプチド／ポリペプチド／タンパク質とほぼ同じであるが、それぞれのペプチド／ポリペプチド／タンパク質と１００％同一ではないタンパク質（またはペプチドもしくはポリペプチド）を指す。変異体のペプチド／ポリペプチド／タンパク質は、基準配列のアミノ酸の１つ以上が欠失または置換されるか、あるいは１つ以上のアミノ酸が基準アミノ酸配列の配列に挿入されている（上述）変更された配列を有する。変異体は、欠失、置換または挿入の任意の組み合わせを有することができる。変更の結果として、変異体のペプチド／ポリペプチド／タンパク質は、基準配列と少なくとも約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有することができる。
【００４７】
変異体ポリペプチドが、基準ポリペプチドと実質的に同一であるかを判定するには、変異体ポリペプチド配列を、第１の基準脊椎動物のポリペプチドの配列とアライメントすることができる。１つのアライメント方法は、ＢｌａｓｔＰによる方法であり、スコアリング行列およびギャップペナルティのデフォルト設定を使用する。一実施形態において、第１の基準ポリペプチドは、このようなアライメントにより、最低のＥ値、すなわち、良好以上のアライメントスコアを有するアライメントが偶然によってのみ生じる最低の可能性が得られるものである。あるいは、このようなアライメントにより、最高の割合の同一性が得られるものである。
【００４８】
いくつかの実施形態において、少なくとも２つのＥＢＶ遺伝子産物は、被験体において免疫応答を誘導するために投与される。本実施形態により、ＥＢＶ関連疾患に対する一次および／またはメモリーＣＤ４ヘルパーおよび／またはＣＤ８ＣＴＬ応答を調整するために、抗原提示細胞によって効率的に処理することができる複数の免疫優性ペプチドを生成することが可能となる。本手法は、臓器を移植する前に、被験体が免疫適格であるために、メモリーＴ細胞のより多くの予備を提供する時に、被験体の治療に使用する場合にも実行可能である。メモリーＴ細胞の予備は、図４に示す４量体染色によって、あるいは４量体が特定のＨＬＡ型に利用できない場合はエリスポットアッセイによって、ワクチン接種前および接種後に測定することができる。選択される少なくとも２つのＥＢＶ遺伝子産物は、溶解遺伝子産物、潜伏遺伝子産物、または溶解および潜伏遺伝子産物それぞれの一方から選択することができる。溶解および潜伏遺伝子産物の異なる組み合わせも企図されている。
【００４９】
いくつかの実施形態において、投与は、ＥＢＶ溶解遺伝子産物および／またはＥＢＶ潜伏遺伝子産物から選択される少なくとも１つのＥＢＶ遺伝子産物を含む免疫原組成物を被験体において導入することによって実施される。少なくとも１つのＥＢＶ溶解遺伝子産物および少なくとも１つのＥＢＶ潜伏遺伝子産物は、皮下、筋肉内、粘膜、腹膜内、皮内、またはその他何らかの適切な経路から選択される経路によって投与される。投与の頻度は、被験体が、ＥＢＶ関連疾患の予防および／または治療をもたらす十分な細胞媒介免疫を生成できるようにしなければならない。投与の用量は、被験体が、ＥＢＶ関連疾患の予防およびまたは処置をもたらす十分な細胞媒介免疫を生成できる適切な用量でなければならない。頻度および用量はいずれも、当業者により決定することができる。
【００５０】
本発明はまた、ＥＢＶ溶解遺伝子産物および／またはＥＢＶ潜伏遺伝子産物から選択されるＥＢＶ遺伝子産物をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを投与することも対象とする。ＥＢＶ遺伝子産物は、ＥＢＶ遺伝子産物の発現レベル、ＥＢＶ遺伝子産物の局在化、ＥＢＶ遺伝子産物の特異性、ＥＢＶ遺伝子産物の安定性に関して、またはその他何らかの理由により調整できるようにするために、調節エレメントに作動可能に結合されている場合がある。いくつかの実施形態において、ＥＢＶ遺伝子産物をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドは、全長ＥＢＶ  ｃＤＮＡコード配列を含む。さらに、全長ＥＢＶ  ｃＤＮＡコード配列は、ＢＺＬＦ１、ＢＨＲＦ１、ＢＨＬＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＭＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＡＬＦ５、ＢＡＲＦ１、ＢＯＲＦ２、ＢＣＲＦ１、ＢＫＲＦ３、ＢＤＬＦ３、ＢＩＬＦ１、ＢＦＲＦ１、ＢＸＬＦ１、ＢＧＬＦ４、ＢＧＬＦ５、ｇｐ３５０、ｇｐ２２０、ならびにＬＭＰ１−ｌｙｔ、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ２、ＥＢＮＡ３Ａ、ＥＢＮＡ３Ｂ、ＥＢＮＡ３Ｃ、ＥＢＮＡ−ＬＰ、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２Ａ、およびＬＭＰ２Ｂコード配列から選択される。種々のＥＢＶ型の固有の変形により、前述のＥＢＶ遺伝子産物の配列は、患者が発症した、または発症する危険性があるＥＢＶ感染の型に対応するように適合される場合がある。さらに、コドン使用の縮退により、種々の一次ヌクレオチド配列がやはり、同じＥＢＶタンパク質を生成する場合もある。ヌクレオチドにおけるコドンの変化により、予測されたタンパク質のヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の両方が追加、欠失および置換される場合もある。しかし、追加、欠失および置換をもたらす配列の変化を有するＥＢＶ遺伝子産物を使用することによってもやはり、ＥＢＶ関連疾患から被験体を保護する十分な細胞免疫が生成される場合がある。したがって、核酸配列の変異体も、明示的に企図されている。
【００５１】
ウイルス遺伝子の送達は、ポリヌクレオチドを被験体に送達する当該技術分野の当業者には周知の方法である。ウイルス遺伝子の送達は、ポリヌクレオチドを細胞に送達することによって、細胞が自らの治療タンパク質を生成できるようにする治療の一種である。通常ポリヌクレオチドは、細胞に感染し、ＤＮＡペイロードを付着させ、所望のタンパク質を生成する細胞のマシーナリーを継承することができるウイルスを使用することによって移入される。ウイルス寿命サイクルの複製段階に必要な遺伝子（非必須遺伝子）を対象の異種遺伝子で置換することによって、組換えウイルスベクターは、通常感染する細胞型を形質導入することができる。このような組換えウイルスベクターを生成するために、非必須遺伝子は、輸送中に提供され、パッケージング細胞株のゲノムの中にまたはプラスミド上に組み込まれる。ウイルスが寄生体として発展すると、これらのウイルスはすべて、宿主免疫系応答をある程度まで誘発する。ウイルスベクターの例には、アデノウイルス、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノ随伴ウイルス、および単純ヘルペスウイルス１型が含まれるが、これらに限定されない。
【００５２】
アデノ随伴ウイルスは、伝染性ビリオンを増殖させ、集合するためにヘルパーウイルス（通常はアデノウイルス）に依存する、非病原性のヒトパルボウイルスである。これらは、分割細胞および非分割細胞の両方に感染することができ、ヘルパーウイルスがない場合は、高い頻度でヒトゲノムの特定の地点に組み込まれる。野生型ゲノムは、単鎖ＤＮＡ分子であり、ウイルスの複製、構造遺伝子の発現、およびヒトゲノムへの組込みを調節するタンパク質をコードするｒｅｐ、ならびにカプシド構造タンパク質をコードするｃａｐの２つの遺伝子からなる。ゲノムのいずれかの末端には、プロモーターを含む１４５の塩基対末端重複（ＴＲ）がある。
【００５３】
ベクターとして使用される場合、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子は、トランス遺伝子およびその関連する調節配列によって置換される。インサートの全長は、野生型ゲノムの長さの４．７ｋｂを大きく超えることはできない。組換えベクターの生成には、ヘルパーウイルス遺伝子産物（アデノウイルスゲノム由来のＥｌａ、Ｅｌｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４、およびＶＡ  ＲＮＡ）と共に、ｒｅｐおよびｃａｐが輸送中に提供されることが必要となる。従来の方法は、１つがベクターのプラスミドであり、もう１つがｒｅｐおよびｃａｐのプラスミドである２つのプラスミドを、アデノウイルスに感染した２９３Ｔ細胞に共形質移入する方法である。より最近のプロトコルでは、すべてのアデノウイルス構造遺伝子を除去し、感染の前にｒｅｐ耐性プラスミドを使用するか、またはｒｅｐ発現プラスミドを成熟ウイルスに接合する。
【００５４】
ｃＤＮＡクローンは、野生型ＥＢＶ関連リンパ芽球様細胞株またはその他の適切な供給源から単離される。各全長ｃＤＮＡの塩基配列は、ｒＡＡＶ２ベクターにクローン化する前に確認される場合がある。次いで、ヒーラープロデューサー細胞に、ＡＡＶｒｅｐ（トランス遺伝子複製の場合）およびｃａｐ（ウイルス性カプシド生成の場合）ならびに抗生物質耐性遺伝子をコードするｒＡＡＶトランス遺伝子プラスミドを形質移入する。形質移入したヒーラープロデューサー細胞は、抗生物質の選択下で培養され、耐性コロニーが回収、膨張、および低温保存される。耐性コロニーに由来する細胞は、ニトロセルロース膜（Ｄｏｔ  Ｂｌｏｔ）上で固定化し、ｃＤＮＡプローブで探査して、最も優れた複製活性を有するコロニーを識別する。高いトランス遺伝子複製活性を有するクローンは、ウェスタンブロット法によりｒＡＡＶトランス遺伝子発現（ＤＮＡ）および全長タンパク質の存在について評価する。結果として得られたベクターは、専門の抗原提示細胞（ＡＰＣ）、すなわち樹状細胞（ＤＣ）に抗原を送達し、細胞免疫応答をもたらすことができる。ＥＢＶ遺伝子産物を担持するｒＡＡＶビリオンは、ヒトＡＰＣおよび／またはＤＣに感染することができ、ＡＰＣおよび／またはＤＣの抗原処理マシーナリーが、クラスＩおよび／またはクラスＩＩのＭＨＣを介してペプチドを提示することを可能にする全長ＥＢＶ遺伝子産物を発現する。
【００５５】
本発明はまた、本明細書に記載のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの１つ以上を成分として含む薬学的組成物も含む。一実施形態において、薬学的組成物は、ＥＢＶポリペプチドを含む。別の実施形態において、薬学的組成物は、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。薬学的組成物の調製において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、通常、賦形剤と混合される、賦形剤によって希釈される、および／またはカプセル、サッシェもしくは他の容器の形態であってもよい担体内に封入される。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、賦形剤または補助剤を含めた薬物を細胞の標的集団に投与することを容易にするいずれの担体またはビヒクルも使用することができる。このような薬学的組成物は、必要な材料、説明書および機器を提供する便利なキットにパッケージングされる場合がある。薬学的組成物は、摂取および当該技術分野で既知の送達方法の経路を介して、１回量または複数回の用量にて投与することができる。
【００５６】
いくつかの実施形態において、ＥＢＶ溶解遺伝子産物および／またはＥＢＶ潜伏遺伝子産物から選択される少なくとも１つのＥＢＶ遺伝子産物は、薬学的組成物を含む。薬学的組成物はまた、ＥＢＶ溶解遺伝子産物および／またはＥＢＶ潜伏遺伝子産物から選択される２個、３個または４個のＥＢＶ遺伝子産物を含む場合もある。薬学的組成物はまた、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤をも含む場合もある。賦形剤は、水、滅菌水、塩、緩衝液、炭水化物、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール、スターチ、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゲラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、シロップ、およびメチルセルロースから選択されるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、少なくとも１つの補助剤をさらに含む。補助剤は、フロイントアジュバント、油中水型エマルジョン、鉱油、顆粒白血球／マクロファージコロニー刺激因子、およびインターロイキン２から選択される場合があるが、これらに限定されない。
【００５７】
薬学的組成物は、例えば、ＥＢＶ溶解遺伝子産物ＢＺＬＦ１およびＥＢＶ潜伏遺伝子産物ＥＢＮＡ３Ｃ、ならびに少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤および／または補助剤を含む場合がある。さらに、薬学的組成物は、例えば、ＥＢＶ溶解遺伝子産物ＢＺＬＦ１およびＢＭＬＦ１、ならびにＥＢＶ潜伏遺伝子産物ＥＢＮＡ３Ｃ、ＥＢＮＡ１およびＥＢＮＡ３Ａ、さらには少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤および／または補助剤を含む場合がある。薬学的組成物は、皮下、筋肉内、粘膜、腹膜内、皮内、または他の経路から選択される経路によって投与される場合がある。
【００５８】
本発明はまた、少なくとも１つのＥＢＶ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドおよびＥＢＶ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合されている異種プロモーターを含む、ＥＢＶ遺伝子産物発現カセットを含む、非ウイルスベクターも対象とする。非ウイルスベクターは、物理的および化学的という２つの広範なカテゴリーに分割することができる。物理的方法は、プラスミドを取り入れ、電気穿孔、音波穿孔または粒子衝撃などの手段によりプラスミドを細胞内に強制的に挿入することを伴う。化学的方法は、ＤＮＡと錯体を作成し、粒子中に凝縮させ、細胞に向けることができる脂質、ポリマーまたはタンパク質を使用する。本明細書に記載のベクターは、「ネイキッド」ＤＮＡワクチンと呼ばれることがある。いくつかの実施形態において、ＥＢＶ遺伝子産物は、ＢＺＬＦ１、ＢＨＲＦ１、ＢＨＬＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＭＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＡＬＦ５、ＢＡＲＦ１、ＢＯＲＦ２、ＢＣＲＦ１、ＢＫＲＦ３、ＢＤＬＦ３、ＢＩＬＦ１、ＢＦＲＦ１、ＢＸＬＦ１、ＢＧＬＦ、ＢＧＬＦ５、ｇｐ３５０、ｇｐ２２０、ならびにＬＭＰ１−ｌｙｔ、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ２、ＥＢＮＡ３Ａ、ＥＢＮＡ３Ｂ、ＥＢＮＡ３Ｃ、ＥＢＮＡ−ＬＰ、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２Ａ、およびＬＭＰ２Ｂから選択される。本発明はまた、上述のベクターを含む細胞を対象とする他、ＥＢＶ遺伝子産物に対する免疫応答を産生する条件下で細胞を培養する方法であって、ＥＢＶ遺伝子産物の発現に好適な条件下で細胞を成長させることを含む、方法も対象とする。
【００５９】
本発明はまた、ＥＢＶワクチンに対する被験体の応答を確認する方法であって、ＥＢＶ溶解遺伝子産物およびＥＢＶ潜伏遺伝子産物から選択される少なくとも１つのＥＢＶ遺伝子産物の存在をアッセイすることを含む、方法も対象とする。メモリーＴ細胞の予備は、図４に示す４量体染色によって、または４量体が特定のＨＬＡ型に利用できない場合はエリスポットアッセイによって、あるいはその他何らかのアッセイによって、ワクチン接種前および接種後に容易に測定することができる。
【実施例】
【００６０】
（実施例１：致死性のＥＢＶ陽性悪性リンパ増殖症（ＥＢＶ−ＬＰＤ）のｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデルがヒト移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）に極めて類似する）
重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスに、血清学的ＥＢＶ陽性の正常なヒトのドナーから採取した末梢血白血球（ＰＢＬ）を腹腔内投与したところ、これらのマウス（ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデル）の大多数に、ヒトＢ細胞を起源とする致死性のＥＢＶ−ＬＰＤがその後、自然発生的に発現した。ＥＢＶ感染のコントロールにおいてはＴ細胞が重要な役割を果たしているため、本発明者等は、ヒトＴ細胞機能疾患が外因性ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデルのＥＢＶ−ＬＰＤの原因となっているという仮説と、Ｔ細胞由来サイトカインの全身投与によりＥＢＶ−ＬＰＤに対する防御免疫が再構築されるという仮説を立てた。本発明者等は、ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスに対して極めて低い用量（５００国際単位）のポリエチレングリコール修飾組換えヒトインターロイキン２（ＰＥＧ−ＩＬ−２）を毎日皮下投与することにより、致死性のＥＢＶ−ＬＰＤの発現を防止し、生存率をプラセボ投与群（２０％  Ｐ＝０．０００８）に比較して有意に改善することができる（７８％）ことを示した。追加のリンパ球減少型試験の結果、マウスのナチュラルキラー細胞およびヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞によりＰＥＧ−ＩＬ−２介在性防御作用に必要な細胞性免疫が誘導される一方、ＣＤ４＋  Ｔ細胞が減少したヒト末梢血リンパ球を腹腔内投与しても、ＰＥＧ−ＩＬ−２療法と併用した場合、有害作用はみられず、有用である可能性があることが示された。これらの初期のデータは、極低用量のＰＥＧ−ＩＬ−２療法により、ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスにおいてＥＢＶ−ＬＰＤを来すヒトＴ細胞免疫不全を克服できることを初めて証明するものであり、ＥＢＶ−ＬＰＤに対する細胞応答とサイトカイン療法の評価を目的とした本モデルが有用であることを初めて指摘するものであった（ＢａｉｏｃｃｈｉおよびＣａｌｉｇｉｕｒｉ，１９９４）。
【００６１】
（実施例２：ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデルから自然発生的に発現するヒト腫瘍の分子および細胞特性の検討）
引き続き本発明者等は、ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデル（Ｂａｉｏｃｃｈｉら，１９９５）から自然発生的に発現したヒト腫瘍の分子および細胞特性を広範に調べた。ＰＴＬＤと同様に、腫瘍はモノクローナル（図２、レーン８、９）の場合もあれば、オリゴクローナル（レーン３）、またはポリクローナル（レーン２、７）の場合もある。ヒト腫瘍は、生存、成長およびＴ細胞免疫抑制因子として機能する、ヒトＩＬ−１０およびＩＬ−６を大量に分泌する。腫瘍はいずれもウイルス型ＥＢＶ  ＤＮＡを統合し、また腫瘍はいずれも、ウイルス遺伝子発現のＥＢＶＩＩＩ型のＰＴＬＤに類似したパターンを示す。ＳＣＩＤマウスはＢ細胞とＴ細胞を欠失しているが強力なナチュラルキラー細胞は保有している。マウスＮＫ細胞が減少している場合、低用量ＩＬ−２を投与されたｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスの８０〜１００％にＥＢＶ−ＬＰＤが発症する（ＢａｉｏｃｃｈｉおよびＣａｌｉｇｉｕｒｉ，１９９４）ため、本発明者等は、マウスＮＫ細胞が減少したｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデルを使用し、サイトカインのどのような併用が、マウスＮＫ不全に取って代わるか、また、ヒト免疫細胞の移植だけを受けたキメラマウスを、致死性のＥＢＶ−ＬＰＤから防御できるか検討した。本発明者等は、低用量ＩＬ−２とＧＭ−ＣＳＦの併用がこの防御機能を回復させることを発見した。さらに、これらのサイトカインの一方または両方の投与に無作為に割り付けたマウスのヒトＴ細胞要素の特性を慎重に調べたところ、ＩＬ−２とＧＭ−ＣＳＦを投与したキメラマウスにおいて頑健なヒトＴ細胞が存在し、他の場合では存在しないことが明らかとなった。この存在の事実は、悪性ＥＢＶ陽性Ｂ細胞の拡大がないことと関連していた。ＥＢＶ溶解抗原および潜伏抗原の４量体染色を使用してヒトＴ細胞の特性を調べた結果、Ｔ細胞はインビボにおいてＥＢＶ潜伏抗原および溶解抗原（図３）の両方に対して応答していることが初めて示された（Ｂａｉｏｃｃｈｉら，２００１）。非感作のヒトＰＢＬをＳＣＩＤマウスに移植した場合にこれらのヒト腫瘍が自然発生的に発現したことは留意する必要がある。したがって、本発明者等は、ヒトＥＢＶ特異的Ｔ細胞が、インビボにおいて、致死性のＥＢＶ−ＬＰＤの発現を効果的に調べる方法に関する最初の証拠を得た。
【００６２】
（実施例３：ＥＢＶ−ＬＰＤのｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤモデルによりＰＴＬＤにおける免疫応答を予期できる）
次に、本発明者等は、同様の免疫応答を確認するためにＰＴＬＤを有する腎移植患者を評価した。本発明者等は、１９９７年から２００２年までの間に本発明者等の施設において、本発明者等が免疫抑制の標準的な緩和法および標準的な抗ウイルス療法として開発した方法を使用して、１１例の連続する腎移植ＰＴＬＤ患者を治療した。その結果、９１％の完全寛解率を達成し、８２％が、持続期間中央値がほぼ４年に達する完全持続寛解を維持した。再発例１例は寛解にもどり３年間にわたり持続したため、９１％が現在生存し、状態は良好である（Ｐｏｒｃｕら，２００２）。本発明者等は、これが、これまでに報告された腎移植患者のＰＴＬＤに関する転帰データの中で最良のものであると確信している。さらに重要なことであるが、腫瘍退縮期に、本発明者等は４量体染色を使用して、治療が奏効しているＰＴＬＤ患者に、ＥＢＶ潜伏抗原およびＥＢＶ溶解抗原（ＲＡＫ）の両方に対するＣＤ８＋  Ｔ細胞の応答が十分に存在することを示した。その応答は、実質的に本疾患のヒトＳＣＩＤマウスモデル（図４）でみられる応答と同じである。これらのデータは、本出願に記載する取組みの裏付けとなる２つの重要なポイントを提起している。第１に、ＥＢＶ陽性ＰＴＬＤを抑制する免疫応答を確立でき、容易に定量できることであり、疾患の回復が期待できること、第２に、この応答はＥＢＶ潜伏抗原とＥＢＶ溶解抗原の両方に対して特異性が高いＣＴＬ応答であることである。
【００６３】
（実施例４：キメラマウス−ヒトモデルおよび患者で達成したインビボにおける発見）
ＰＴＬＤ発症の危険性は、末梢血におけるＥＢＶゲノムのコピー数の増加と密接に相関しているため、溶解感染の活性化は実施可能であり、本疾患の発現において重要であることは明らかである。本発明者等の研究室において得られた発見により、ＰＴＬＤ腫瘍に溶解性遺伝子の発現がみられることが示された（Ｐｏｒｃｕ，２００２；Ｒｏｙｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，２００３）。本発明者等は、ＰＴＬＤ患者８例から採取した１６個の別々の腫瘍を使用して、溶解性遺伝子産物ＢＸＬＦ１の発現の有無を調べた。ＢＸＬＦ１は、初期溶解サイクル遺伝子産物ＢＺＬＦ１（表１）によって正方向に調節されるウイルス型チミジンキナーゼ（ｖＴＫ）である。すべての腫瘍でＢＸＬＦ１転写の発現が認められ、溶解性遺伝子活性は実施可能であり、ＰＴＬＤ腫瘍で維持されていることが明確に示された（図５）。
【００６４】
本発明者等は、いくつかの治療法を発見しており、その治療法により、ＰＴＬＤの前臨床動物モデル（Ｂａｉｏｃｃｈｉ，１９９４；Ｂａｉｏｃｃｈｉ，２００１；Ｒｏｙｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，２００３；Ｒｏｙｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，２００４）およびＰＴＬＤ患者において、有望な結果が得られている（Ｒｏｙｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，２００３；Ｋｈａｔｒｉ，１９９７；Ｐｏｒｃｕ，２００２）。また、本発明者等は、ＥＢＶ特異抗原に対するインビボＴ細胞応答の特性を調べたが、それはＰＴＬＤおよび他のＥＢＶ関連悪性疾患の防止を目的とした本特許（ｕｓｅ  ｐａｔｅｎｔ）の基礎を形成するものである。ヒトＰＴＬＤのキメラマウス−ヒトモデルを使用して得たインビボでの発見（Ｂａｉｏｃｃｈｉ，２００１）、また本発明者等が治療を行ったＰＴＬＤ患者の免疫応答の観察期間におけるインビボでの発見（Ｐｏｒｃｕ，２００２）を利用して、本発明者等は、自然発生的に拡大する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、すなわちＥＢＶ特異的ＣＴＬが、ＰＴＬＤを抑制できる時に反応するいくつかのＥＢＶ抗原を同定した。ヒトＰＴＬＤのキメラマウス−ヒト前臨床モデルを使用した試験において、本発明者等はＥＢＶ抗原特異的ＭＨＣクラスＩペプチド負荷４量体を使用して、マウスに低用量のインターロイキン−２（ＩＬ−２）とＧＭ−ＣＳＦを併用投与した時にみられる、溶解性ＢＺＬＦ１抗原と潜伏ＥＢＮＡ３Ｃ抗原を認識するＥＢＶ特異的ＣＴＬの拡大を記録した。プラセボ、またはＩＬ−２もしくはＧＭ−ＣＳＦのうちの１種類のみを投与された動物においては、ＥＢＮＡ３Ｃ特異的ＣＴＬまたはＢＺＬＦ１特異的ＣＴＬは認められず、ヒトＥＢＶ陽性リンパ増殖性障害により死亡例が続いた。ＩＬ−２とＧＭ−ＣＳＦを併用投与された動物においては、ＥＢＮＡ３Ｃ特異的ＣＴＬおよびＢＺＬＦ−１特異的ＣＴＬの、有意かつ測定可能な拡大がみられ、ヒトＥＢＶ陽性リンパ増殖性障害の発現が防止された（Ｂａｉｏｃｃｈｉ，２００１）。本発明者等は、特異的ペプチドを負荷した同じＭＨＣクラスＩ４量体を使用して、ＥＢＶ抗原特異的Ｔ細胞の拡大を記録することにより、ＰＴＬＤ患者のヒトＣＴＬがＢＺＬＦタンパク質由来の免疫優勢決定ペプチドも認識していることを発見した（Ｐｏｒｃｕ，２００２）。ＢＺＬＦは、ＥＢＶをコードする遺伝子の産物であり、初期溶解性感染の期間では排他的に発現している（図５）（Ｋｉｅｆｆ，２００１）。本発明者等は、潜伏タンパク質ＥＢＮＡ３Ｃ由来のペプチドを負荷した４量体を使用して、同じＰＴＬＤ患者（図５）中にＥＢＮＡ３Ｃ特異的ＣＴＬが自然発生的に拡大していることを発見した（Ｐｏｒｃｕ，２００２）。さらに重要なことであるが、ＰＴＬＤを有する腎移植患者で免疫抑制療法を中止した後、ＢＺＬＦ１特異的ＣＴＬ集団の拡大が起こり、その拡大は相当な期間持続し、直接的にＥＢＶ陽性腫瘍負荷の退縮と直接相関していた。ＣＴＬ応答を持続できなかった患者１例においては、その後ＰＴＬＤの再発がみられた（Ｐｏｒｃｕ，２００２）。また、腫瘍ＢＺＬＦ１タンパク質由来ペプチドが、効果的なＴ細胞免疫サーベイランスを維持する目的で、抗原提示細胞によって持続的あるいは断続的に提示されるということが、Ｂ���ＬＦ特異的ＣＴＬの存在が持続的（免疫抑制中止後７２０日まで）であることから示唆される。本特許の以下に述べるように、免疫原への持続的な暴露が有効であるという推測は、ＰＴＬＤ防止のためにワクチンを利用するという手法の根拠の１つとなっている。
【００６５】
（実施例５：インビボにおける発見の臨床応用）
本発明者等が公表したインビボ試験の結果は、潜伏ＥＢＶ遺伝子産物および溶解ＥＢＶ遺伝子産物は複合免疫優性ペプチドを含む重要なタンパク質であり、抗原提示細胞により効果的に処理されて、ＰＴＬＤなどの悪性疾患を含むＥＢＶ疾患に対して生体防御するために、抗原特異的な、初期およびメモリーＣＤ４ヘルパー細胞およびＣＤ８  ＣＴＬの応答を調整する。インビボにおけるＥＢＮＡ３ＣおよびＢＺＬＦ１特異的ＣＴＬの拡大、ならびに腫瘍退縮およびＰＴＬＤ患者の生存率に密接な関係があるとすれば、全長ＥＢＶ潜伏タンパク質および全長ＥＢＶ溶解タンパク質は理想的な免疫原であり、固形臓器移植待機でＰＴＬＤ発現の危険があるすべての患者にワクチン接種をするために利用できる。このような手法により、患者に免疫能があり、したがってメモリーＴ細胞の十分に大きな蓄積がある場合は、臓器移植の前に、潜伏および溶解性ＥＢＶタンパク質由来の内因性ペプチドに特異性を有するＴ細胞クローン（ＣＤ４およびＣＤ８）を拡大させておくことが可能になるであろう。後者は、図５上に示す４量体染色によりワクチン接種の前後に簡単に測定できると考えられる。もし、特定のＨＬＡ型に対する４量体が入手できない場合は、エリスポットアッセイまたはＩＦＮγを測定する他の方法（イントラセルラーフローサイトメトリー）を利用できる。この手法により、一次感染（小児患者）または再発感染（成人の９５％）が発生した場合に、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞のインビボにおける急速な移動と拡大が可能になると考えられる。この手法により、医原性免疫抑制療法を受けている患者の、必ずしもすべてではないとしても大部分において、制御不能なエプスタインバーウイルス血症とその後のＰＴＬＤの発症に対する防御が可能になるはずである。このようなワクチン接種後もＰＴＬＤを発症する可能性のある患者については、ワクチン防御手法により、類似の同種移植片特異的ＣＴＬ反応を起こさずに免疫抑制療法を適度に抑制すれば、初期で定量的な強固なＥＢＶ特異的ＣＴＬ応答を誘導するはずである。同様にこの手法により、同種移植片の拒絶反応（あるいは幹細胞移植患者における移植片−宿主疾患）の発生率がかなり低い患者のＰＴＬＤも排除できるはずである（Ｐｏｒｃｕ，２００２）。なお、それと比較し、ワクチン接種をせずに、生命の危険があるＰＴＬＤの排除の目的で免疫抑制療法を緩和する患者の場合は、同種移植片の拒絶反応の発生率が高い。この同様の手法を、後天性、先天性または医原性（肝細胞または臓器移植以外）免疫抑制の患者を含む、ＥＢＶ関連疾患の危険性がその他何らかの患者群に拡張することができると考えられる。
【００６６】
異なるウイルスタンパク質由来ペプチドと特異的ＨＬＡ型の間の関連性には制限があるため、潜伏ＥＢＶ遺伝子産物と溶解ＥＢＶ遺伝子産物由来の選択的ペプチドによる免疫では、比較的小規模の患者群に対する免疫優性抗原になってしまうと考えられる。例えば、ＢＺＬＦ１由来のＲＡＫペプチドには、ＨＬＡ  Ａ２ではなく、ＨＬＡ  Ｂ８患者のクラスＩ分子と連携して提示された時、免疫優性性がある。全長のＥＢＶ潜伏および溶解ポリペプチドまたはタンパク質を抗原処理ネットワークに与えることによりこの制限から逃れることができる。そのことにより、ＨＬＡクラスＩおよびＩＩ分子のすべてではなくとも大部分の分子と連携することにより最適の提示が可能になる。患者は、より大きな分子の投与を受けた場合、全長のポリペプチドを処理し、特異的なＨＬＡクラスＩおよびＩＩ分子と連携して免疫優性ペプチドを処理することができる。ワクチン接種を目的とした、全長の潜伏および溶解ＥＢＶポリペプチド免疫原の送達は、免疫アジュバントに分散させた精製タンパク質の直接送達、または以下のデータで概説する組換えＤＮＡ技術により行うことができる。溶解ポリペプチドまたは潜伏ポリペプチドは、それぞれ１本では、抗原提示細胞による処理に続いて、すべてのＨＬＡ型に対して免疫優性ペプチドを提示するためには十分な大きさを有していない可能性があるため、次に述べるように、このワクチンのために少なくともそれぞれ２本の潜伏ＥＢＶ遺伝子産物と溶解ＥＢＶ遺伝子産物を開発する予定である。
【００６７】
固形臓器移植におけるＰＴＬＤの防止を意図して、効果的な細胞性免疫を誘導するためにワクチンの形で全長ＥＢＶ潜伏および溶解遺伝子産物を提供するというアイデアには新規性があり、本発明者と他の研究者によってなされた発見による裏付けがある。本発明者等が実施した、免疫抑制療法中止後のＴ細胞応答を検討するインビボ研究で検出されたＥＢＮＡ３ＣおよびＢＺＬＦ１特異的ＣＴＬに加えて、他の研究所は、ＥＢＶ初期抗原複合体ＢＭＲＦ１、ＢＨＲＦ１、ＢＯＲＦ２（Ｐｏｔｈｅｎ，１９９１；Ｐｏｔｈｅｎ，１９９３）およびｇｐ３４０／３５０（Ｗａｌｌａｃｅ，１９９１）に対して特異的なＣＤ４とＣＤ８の両方の応答、さらに潜伏遺伝子産物ＥＢＮＡ１（Ｐａｌｕｄａｎ，２００２）に対しても特異的なＣＤ４とＣＤ８の両方の応答があることを示した。したがって本発明者等はまず、次の全長ポリペプチド（あるいはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列）の送達を提案する。それは、ＢＺＬＦｌ、ＢＭＬＦｌ、ＥＢＮＡｌ、ＥＢＮＡ３ＡおよびＥＢＮＡ３Ｃである。ＰＴＬＤ防止の方法としてワクチン接種を選択した場合、それぞれ少なくとも２つの潜伏および溶解免疫原を使用すれば、次の２つの理由により最適な防御を提供する。１）上記のように、ＨＬＡ型が何であろうと、各個体は、潜伏および溶解ポリペプチド両方に関して提示される免疫優性ペプチドを有していることを保証している。２）ＣＴＬ応答の非対称性を最小にし、そのため潜伏遺伝子産物のみを発現しているＥＢＶ形質転換クローンの発生を防止する。３）抗原特異的ＴｈおよびＴｃ応答の両方を促進する。この方法は、無制御溶解性複製とウイルス血症も防止すると考えられる。ワクチン接種後のＥＢＶ特異的ＣＴＬの拡大によって評価される、上記のポリペプチドの免疫原性を基に、本発明者等は、ＥＢＶにコードされた次に示す他のポリペプチドを送達するために同様の方法を適用することによって応答を改善することを提案する。それは、ＢＺＬＦｌ、ＢＨＲＦｌ、ＢＨＬＦｌ、ＢＡＬＦ２、ＢＭＬＦｌ、ＢＲＬＦｌ、ＢＭＲＦｌ、ＢＡＬＦ５、ＢＡＲＦｌ、ＢＯＲＦ２、ＢＣＲＦｌ、ＢＫＲＦ３、ＢＤＬＦ３、ＢＩＬＦｌ、ＢＦＲＦｌ、ＢＸＬＦｌ、ＢＧＬＦ４、ＢＧＬＦ５、ｇｐ３５０、ｇｐ２２０、ＬＭＰｌ−ｌｙｔ、ＥＢＮＡｌ、ＥＢＮＡ２、ＥＢＮＡ３Ａ、ＥＢＮＡ３Ｂ、ＥＢＮＡ３Ｃ、ＥＢＮＡ−ＬＰ、ＬＭＰｌ、ＬＭＰ２Ａ、ＬＭＰ２Ｂ等である。
【００６８】
（実施例６：ヒトＰＴＬＤの予防ワクチン）
腎移植ＰＴＬＤ患者１１例のうち１０例が現在生存しておりＰＴＬＤの再発は見られない一方、５例がＴ細胞介在性臓器拒絶反応により移植片を失い、再移植または透析が必要である。したがって、腎移植ＰＴＬＤを管理するための優れた方法である本手法には２つの制限要因がある。第１に、これらＰＴＬＤ患者の５０％が移植腎を喪失したことは、致死性の悪性腫瘍の危険性を伴っている場合であっても、高率であり受け入れがたい。第２に、抗ウイルス療法を伴う免疫療法緩和の手法は、同種移植片拒絶反応が致死的である心臓、肺、肝または小腸などの他の固形臓器移植においては適用できない。したがって、代替法を考慮しなければならない。本発明者等が実施し、これまでに部分的に述べたキメラマウス−ヒト試験データおよびヒト試験データおよび他にＯ’Ｒｅｉｌｌｙ等の群（Ｌａｃｅｒｄａら，１９９６ｂ；Ｌｕｃａｓら，１９９６）が公表したデータに基づいて、本発明者等は初めて、インビボにおける、ＥＢＶ潜伏および溶解抗原に特異的なＴ細胞前駆細胞頻度は、免疫抑制療法の緩和の前にＰＴＬＤが発症する確率に比例する可能性が高く、さらに同様に免疫抑制の緩和後に起こるＰＴＬＤに対するＥＢＶ特異的免疫応答の頑健さにも比例する可能性が高いと仮定するに至った。第２に、本発明者等が予備的に実施したキメラマウス−ヒト試験データおよびヒト試験データは、標的にする必要がある抗原の種類に関して本発明者等が有力な証拠と信じるものを提供している。総合的に述べると、本発明者等が確信しているところによれば、固形臓器移植待機で移植後にＰＴＬＤのようなＥＢＶ関連合併症の危険性が高い、免疫能を有する患者におけるＰＴＬＤ防止を目的とした、効果的なワクチンを開発するための包括的な手法であると正当に評価できる十分な証拠がある。この手法により、対応する抗原を認識するＥＢＶ特異的ＣＴＬの発生頻度が増加し、ＰＴＬＤの危険性を減少させるか、除去するはずである。さらにＰＴＬＤ発現の場合には、この移植前感作により、免疫抑制の緩和後に、さらに頑健で特異的な抗腫瘍応答に至るはずであり、そのことにより移植臓器の拒絶反応を防止できる可能性もある。
【００６９】
（実施例７：ｒＡＡＶ２系ベクターの大規模生産）
（ＥＢＶ溶解抗原ＢＺＬＦ１およびＢＭＬＦ１のｒＡＡＶ２発現カセットへの分子クローン化）
本発明者等は、ＥＢＶ陽性リンパ芽球細胞株Ｂ９５．８およびＣ７Ｍ３からそれぞれ得られたＥＢＶ溶解ＢＺＬＦ１およびＢＭＬＦ１全長ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅し、これらの断片をｒＡＡＶ２系発現カセット（図６）に分子クローン化した。ｒＡＡＶ２／ＢＺＬＦ１クローンおよびｒＡＡＶ２／ＢＭＬＦ１クローンは制限酵素分解とＤＮＡ配列解析法を使用して正確に同定した。同様の技術を使用して３つの潜伏ＥＢＶ  ｒＡＡＶ２／ＥＢＮＡ１、ｒＡＡＶ２／ＥＢＮＡ３ＡおよびｒＡＡＶ２／ＥＢＮＡ３Ｃクローンを作製し、品質を確認した。
【００７０】
（ｒＡＡＶ２／ＢＺＬＦｌ、ＢＭＬＦｌウイルスＤＮＡ複製および導入遺伝子発現の解析）
本発明者等は、標準的方法を使用して、ｒＡＡＶ２／ＢＺＬＦｌおよびｒＡＡＶ２／ＢＭＬＦｌ（図７Ａ単量体〔ＭＦ〕）および二量体〔ＤＦ〕））の複製およびパッケージングが順調に進行していることを示した。ＢＺＬＦ１導入遺伝子発現を図７Ｂに示す。レーン３はクローン４ｒＡＡＶ／ＢＺＬＦである。レーン１は分子量標準であり、レーン２はＨｅＬａ細胞（陰性対照）である。
【００７１】
（ＨｅＬａ由来プロデューサー細胞株の産生およびｒＡＡＶ２／ＢＺＬＦｌ、ＢＭＬＦｌの大規模生産）
機能性プラスミドを形質移入し、平板培養し、採取し、さらに９６ウェルプレートに移した。個々のクローンをドットブロットハイブリダイゼーションにより選別し、最適なプロデューサー細胞株（１細胞当たり５０００  ｒＡＡＶベクター超）を定量的リアルタイムＰＣＲにより同定し、ＤＮａｓｅ抵抗性粒子（ＤＮａｓｅ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ−Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  〔ＤＲＰ〕）（ＤＲＰ数／細胞）を得た。大規模製造後のｒＡＡＶベクターの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ＳＹＰＲＯオレンジ蛍光染色法により検査したところ、３種のウイルスカプシドタンパク質（図８、ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３＝１：１：１０）の存在が示された。
【００７２】
本発明者等は次にｒＡＡＶ２／ＢＺＬＦ１の異なるＤＲＰを２９３Ｔ細胞に形質導入し、その後、図９に示すように免疫蛍光法とウェスタンブロット法を使用してＢＺＬＦ１タンパク質発現を解析した。これらのデータは、ｒＡＡＶ２／ＢＺＬＦ１には、２９３Ｔ細胞に対して用量依存的に形質導入する能力があることを示すものである。以上の結果本発明者等は、ＥＢＶ溶解抗原ＢＺＬＦ１およびＢＭＬＦ１を担持するｒＡＡＶ２ベクターを大量に生産することに成功し、これらのベクターにより、インビトロで効果的に細胞への形質導入ができることを示した。
【００７３】
ワクチンプロトコールを成功させるために不可欠な事項は、設計したベクターが、特殊に分化した抗原提示細胞（ＡＰＣ）、すなわち樹状細胞（ＤＣ）に抗原を運ぶ能力を有し、その結果強力な細胞免疫応答を効果的に誘導するかどうかである（Ｓｈｕｌｅｒら，２００３）。本発明者等は次に、ｒＡＡＶ２／ＧＦＰによるヒト単球由来ＤＣの感染はインビトロ分化プロセスの１日目にピークに達したこと（−７％、データ未掲載）、そしてこの感染プロセスはＤＣの成熟に変化をもたらすものではなく、未感染および偽感染対照の場合と異なっていることを示した（データ未掲載）。
【００７４】
（実施例８：ＥＢＶ潜伏抗原ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ３ＡおよびＥＢＮＡ３ＣのｒＡＡＶ２系発現カセットへの分子クローン化）
同様の方法を使用して本発明者等は、ＥＢＶ潜伏抗原ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ３ＡおよびＥＢＮＡ３Ｃの全長ｃＤＮＡをｒＡＡＶ２ベクターにクローン化した（図６）。既に図７に示し、さらに図１０に示すように、ｒＡＡＶ２の典型的なＭＦおよびＤＦ複製型が検出されており、そのことはＥＢＶ潜伏抗原ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ３ＡおよびＥＢＮＡ３Ｃを含むｒＡＡＶベクターの複製とパッケージングが順調に進行したことを示している。
【００７５】
（実施例９：ｒＡＡＶ２／ＢＺＬＦ１を形質導入した樹状細胞（ＤＣ）と自家ヒトＰＢＭＣの共培養によるＥＢＶ特異的ＣＤ８＋  ＣＴＬのインビトロ拡大）
全長ｒＡＡＶ−ＥＢＶ導入遺伝子タンパク質の免疫原性を評価するために、本発明者等は、標的抗原提示細胞（ＡＰＣ）に発現したｒＡＡＶ−ＢＺＬＦ１由来タンパク質がメモリーＥＢＶ特異的Ｔ細胞の拡大を誘導できるかどうかを試験した。そのために、ＡＰＣとしてヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来ＤＣ、およびＥＢＶ血清学的陽性ドナーから採取した自己ＰＢＭＣを使用した。ＥＢＶ特異的メモリーＴ細胞は、放射線照射自己ＥＢＶ形質導入リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）の存在下で培養すると、ＥＢＶ血清学的陽性ドナー由来のＰＢＭＣから拡大し、その拡大には再現性がみられた。その代わりに、ＥＢＶタンパク質由来の免疫優性ペプチドに専門的なＡＰＣ（ＤＣ）を適用することもできる。本発明者等は、ｒＡＡＶ−ＢＺＬＦ１ビリオンはヒトＤＣに感染することができ、その結果、全長ＢＺＬＦ１タンパク質が発現して、ＤＣの抗原処理機序がＭＨＣクラスＩおよびＩＩを介してペプチドを提示することができるようになる。この後者のシナリオは、ＡＰＣとしてＤＣを使用しているが、ｒＡＡＶ導入遺伝子ワクチン製剤の、抗原特異的メモリーＴ細胞を活性化して拡大させる効果を調べる「最良の事例シナリオ」である。
【００７６】
本発明者等は、インビトロにおけるＢＺＬＦ１特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の拡大のためのプロトコルを開発した（図１１）。第ＩＩＩ群と第ＩＶ群に関して、本発明者等は、ｒＡＡＶ−ＢＺＬＦ１存在下ＰＢＭＣ由来ＤＣ（ドナー１４７から）または対照ｒＡＡＡＶ−ＧＦＰウイルス（１０１０粒子、分化プロセス１日目に添加）を調製した。他の対照群は、既に公表したプロトコルに基づいて調製した。７日目と１４日目に細胞を採取し、ＣＤ３、ＣＤ８、ＥＢＶ−ＲＡＫクラスＩ４量体併用染色を使用したフローサイトメトリーで解析した。ＲＡＫ４量体は、ＢＺＬＦ１溶解抗原を認識するＣＤ８＋  Ｔ細胞表面のＴＣＲに特異的である（Ｂａｉｏｃｃｈｉら，２００１；Ｐｏｒｃｕら，２００２；ＲｉｃｋｉｎｓｏｎおよびＫｉｅｆｆ，２００１）。図１２下段に示すように、本発明者等は、陰性対照群（第ＩＩ群および第ＩＶ群）および陽性対照群（第Ｉ群および第Ｖ群）に比べ、ｒＡＡＶ２／ＢＺＬＦ１感染ＤＣ（第ＩＩＩ群、下段、矢印）が、ＢＺＬＦ１に対する頑健なＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘導することを示した。図１２上段は、各群についての非反応性ペプチド４量体によるバックグラウンド染色を示す。全長ＢＺＬＦ１ポリペプチドに、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって処理され提示された場合に免疫原性があるかどうか調べるために、本発明者等は、全長ＢＺＬＦ１タンパク質を合成・精製し、インビトロ実験に使用した。図１３は、全長ＢＺＬＦ１タンパク質に、ＣＤ３／ＣＤ８＋  Ｔ細胞を拡大させる能力があったことを示している。なお、ＣＤ３／ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＨＬＡＢ８の例（Ａ）について定義した免疫優性ペプチド（ＲＡＫ）に特異的な抗原である。拡大したＣＤ３／ＣＤ８＋  Ｔ細胞にエフェクター様機能の能力があるかどうか調べるために、この細胞集団が、全長ＢＺＬＦ１または対照ＢＳＡタンパク質のいずれかによる刺激の後に、ＩＦＮ−ガンマ（ＩＦＮγ）を産生できるかどうかを調べた。（Ｂ）のように、対照ＢＳＡタンパク質に比べ、ＢＺＬＦ１で刺激した場合に、４倍以上のＩＦＮγ陽性ＣＤ８＋  Ｔ細胞を検出した。本発明者等が使用した４量体は抗原特異的Ｔ細胞を検出するための有用なバイオマーカーであるが、免疫優性ペプチドを定義する特殊なドナーの場合に限られるため、すべてのドナーを調べる目的で使用できないドナーの多くは、ＥＢＶタンパク質由来の免疫優性ペプチドと関連がないＨＬＡ対立遺伝子を有している。したがって本発明者等は、全長ＥＢＶポリペプチド由来のエピトープに応答できるＴ細胞の拡大を示すバイオマーカーとして、ＩＦＮγの使用を選択した。（Ｃ）にみられるように、ＨＬＡＡ２例から得られたドナーＰＢＭＣは、全長ＢＺＬＦ１に応答してＴ細胞を拡大させ、対照ＢＳＡに比べて２倍量以上のＩＦＮγを産生した。これらのデータは、全長ＥＢＶポリペプチドは、未同定で免疫原性がある多くのペプチドを含んでおり、このようなポリペプチドは複数のＨＬＡ型を有する個体のＡＰＣにより処理され、Ｔ細胞応答（ＩＦＮγで測定）を誘導することが可能であるということを支持するものである。全長ＢＺＬＦ１ポリペプチドは、ＨＬＡ型またはＢＺＬＦ１由来の既知／定義済の免疫優性ペプチドと無関係にＴ細胞応答を誘導ことができる。
【００７７】
（実施例１０：ＥＢＶ−ＬＰＤに対する感受性およびＰＴＬＤに対する感受性）
血清学的ＥＢＶ陽性の正常な個体から得られるＰＢＬにより、ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデルに自然発生的なヒトＥＢＶ−ＬＰＤを発現させることができる一方、必ずしもすべてのドナーが同程度の効率を示すわけではない。実際に、正常なドナーの間には成功度合に極めて広い分布がみられる（すなわち、１２匹のマウスに投与後０％〜１００％のＥＢＶ−ＬＰＤ）。また、固形臓器移植患者の大多数はＰＴＬＤを発症しない。Ｔ細胞前駆細胞頻度がこのような１つの危険因子であるように思われる（Ｌａｃｅｒｄａら，１９９６ａ；Ｍａｃｋｉｎｎｏｎら，１９９５）。一方、本発明者等は、対象を変えて研究を行った。本発明者等は、サイトカイン遺伝子型がＥＢＶ−ＬＰＤの発現と関連しているという仮説を立てた。ＩＲＢ承認を得て、本発明者等は、ＨＬＡ型を判定した正常で血清学的ＥＢＶ陽性のドナーの広範な一覧を作成し、本発明者等の仮説を検討した（このドナー一覧は下記に概要を示した研究に関して利用可能）。本発明者等の所見によれば、ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスに、急速で高浸透度のＥＢＶ−ＬＰＤを誘導するＰＢＬにおいて、ＩＦＮＧ塩基＋８７４に対するＡ／Ａ（アデノシン／アデノシン）遺伝子型が認められる率が高く、その高さの程度は、進展が遅く低浸透度のＬＰＤを誘導するＰＢＬ、あるいは誘導しないＰＢＬに比べると有意であった。遺伝子型と細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）機能の間の関係を調べると、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）が、ＩＦＮγ塩基＋８７４位にアデノシンを有するＰＢＬ内のＣＴＬの再刺激を妨害する一方、チミジンに関してホモ接合型のＰＢＬにおいては妨害がみられなかった。Ａ／Ａ遺伝子型ＰＢＬを注入したｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスにおいてＴＧＦβを中和すると、ＬＰＤ発現が抑制され、ヒトＣＤ８＋  ＣＴＬの拡大がみられるようになった。したがって、本発明者のデータは、ＴＧＦβが、ＣＴＬ再刺激と拡大（Ｄｉｅｒｋｓｈｅｉｄｅら，２００５）を妨害することにより、腫瘍発現を促進する恐れがあることを示した。これは、本発明者のワクチン手法の進捗状況の中で臨床的意味を有している。ヒト化中和抗ＴＧＦβ抗体が現在開発されつつあることがそのことを証明している。臓器移植受容者に関する現在進行中の遺伝子型解析データにより、ＰＴＬＤの危険性が高い臓器移植受容者を判別するため、また、本提案で焦点を当てた防御策を開発するために、ＩＦＮ−７遺伝子型が重要な情報となる可能性があることが示されている。
【００７８】
【表１−１】
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【００７９】
【表１−２】
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【００８０】
【表１−３】
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【００８１】
【表１−４】
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【００８２】
【表１−５】
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【００８３】
【表１−６】
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【００８４】
【表１−７】
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【００８５】
【表１−８】
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【００８６】
【表１−９】
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【００８７】
【表１−１０】
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【００８８】
【表１−１１】
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【００８９】
【表１−１２】
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【００９０】
【表１−１３】
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【００９１】
【表１−１４】
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【００９２】
【表１−１５】
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【００９３】
【表１−１６】
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【００９４】
【表１−１７】
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【００９５】
【表１−１８】
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【００９６】
【表１−１９】
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【００９７】
【表１−２０】
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【００９８】
【表１−２１】
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【００９９】
【表１−２２】
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【０１００】
【表１−２３】
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【０１０１】
【表１−２４】
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【０１０２】
【表１−２５】
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【０１０３】
【表１−２６】
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【０１０４】
【表１−２７】
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【０１０５】
【表１−２８】
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【０１０６】
【表１−２９】
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【０１０７】
【表１−３０】
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【０１０８】
【表１−３１】
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【０１０９】
【表１−３２】
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【０１１０】
【表１−３３】
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【０１１１】
【表１−３４】
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【０１１２】
【表１−３５】
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【０１１３】
【表１−３６】
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【０１１４】
【表１−３７】
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【０１１５】
【表１−３８】
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【０１１６】
【表１−３９】
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【０１１７】
【表１−４０】
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【０１１８】
【表１−４１】
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【０１１９】
【表１−４２】
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【０１２０】
【表１−４３】
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【０１２１】
【表１−４４】
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【０１２２】
【表１−４５】
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【０１２３】
【表１−４６】
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【０１２４】
【表１−４７】
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【０１２５】
【表１−４８】
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【０１２６】
【表１−４９】
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【０１２７】
【表１−５０】
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【０１２８】
【表１−５１】
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【０１２９】
【表１−５２】
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【０１３０】
【表１−５３】
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【０１３１】
【表１−５４】
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【０１３２】
【表１−５５】
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【０１３３】
【表１−５６】
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【０１３４】
【表１−５７】
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【０１３５】
【表１−５８】
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【０１３６】
【表１−５９】
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【０１３７】
【表１−６０】
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【０１３８】
【表１−６１】
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【０１３９】
【表１−６２】
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【０１４０】
【表１−６３】
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【０１４１】
【表１−６４】
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【０１４２】
【表１−６５】
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【０１４３】
【表１−６６】
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【０１４４】
【表１−６７】
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【０１４５】
【表１−６８】
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【０１４６】
【表１−６９】
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【０１４７】
【表１−７０】
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【０１４８】
【表１−７１】
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【０１４９】
【表１−７２】
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【０１５０】
【表１−７３】
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【０１５１】
【表１−７４】
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【０１５２】
【表１−７５】
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【０１５３】
【表１−７６】
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【０１５４】
【表１−７７】
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【０１５５】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】図１は、ＥＢＶの遺伝子発現プロファイルおよび関連する病理を示す。ＥＢＶはＣＤ２１を介して、鼻咽腔上皮細胞および休止期Ｂリンパ球に感染する。一次感染（および伝染性単核球症）は、溶解（ビリオン産生）および潜伏遺伝子プログラムに関与する。抗原特異的Ｔ細胞は、一次（および再発）感染を制御し、結果としてウイルス複製（溶菌サイクル）の抑制、リンパ芽球の増殖（ＩＩＩ型潜伏）、および休止期の潜伏段階の確立（Ｉ型潜伏）を実現する。免疫抑制（ＩＳ、臓器移植、ＡＩＤＳ、先天性ＩＳ）を伴う患者は、Ｉ型潜伏感染の再活性化のリスクがあり、ＩＩＩ型潜伏遺伝子発現プロファイルを有する複製（溶解）または増殖が活発化しているＥＢＶ形質転換リンパ芽球へと移行するリスクがある。重要なＩＩＩ型潜伏遺伝子は、それぞれ構成細胞においてｂｃｌ２を発現させ、ＮＦｋＢおよび自己分泌生存および増殖経路を活性化させる。
【図２】図２は、Ｉｇ遺伝子再構成を示すｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウス１０例から得た１０個のＥＢＶ腫瘍のサザンブロット分析を示す。レーン１、２および４はポリクローナルであり、レーン３、５、６、７および１０はオリゴクローナルであり、レーン８および９はモノクローナルである。ＥＢＶゲノムの末端反復セグメントがプローブされたサザンブロットでは、モノクローナル腫瘍がＥＢＶゲノム（潜伏、エピソーム）の１コピーを有するのに対して、ポリクローナルおよびオリゴクローナル腫瘍は潜伏エピソームおよび複数の直鎖（複製）を有する。
【図３】図３は、ＩＬ−２（またはＧＭ−ＣＳＦ）単独ではなく、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−２の併用療法が、溶解（ＢのＢＺＬＦまたはＲＡＫ）および潜伏（ＥＢＮＡ３Ａは示さず）の両ＥＢＶ抗原への頑健なヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞の拡大（Ａ）を引き起こすことを示す。ＩＬ−２単独に対する反応（Ｃ、Ｄ）は著明ではない。
【図４】図４は、ＥＢＶ溶解遺伝子産物であるＢＺＬＦ１由来のＲＡＫペプチドをＨＬＡ四量体に負荷したＨＬＡ−Ｂ８陽性患者２例におけるＥＢＶ特異的ＣＴＬの定量を示す。ＨＬＡ−Ｂ８陽性患者２例に由来する連続ＰＢＭＣ試料を、ＡＰＣ抱合ＭＨＣ／ペプチド四量体によるフローサイトメトリーで分析した。代表的な結果は、ＥＢＶ前初期遺伝子ＢＺＬＦ−１由来のＲＡＫＦＫＱＬＬペプチド（ＨＬＡ−Ｂ８／ＲＡＫ）を含むＨＬＡ−Ｂ８四量体により、３つの時点で得たものである。リンパ球ゲートで起こるＣＤ３陽性事象を青色で示す。ＣＤ８陽性ＨＬＡ−Ｂ８／ＲＡＫ陽性事象の比率を、各プロットの右上四分円に示す。
【図５】図５は、代表的なＰＴＬＤ腫瘍試料におけるｖＴＫ発現のインサイチュ（ＩＳ）ＲＴ−ＰＣＲ解析を示す。（Ａ）腫瘍生検のＨ＆Ｅ染色で、非定型大リンパ球の瀰漫性の浸潤を認める。（Ｂ）ＥＢＥＲ−１およびＥＢＥＲ−２  ｍＲＮＡのＩＳ−ＲＴ−ＰＣＲによる検出。視野内のリンパ腫細胞の大半は、これらの大量のＥＢＶ転写産物の発現に対し陽性であり、ＥＢＶの存在が確認される。（Ｃ）溶解ＥＢＶ遺伝子産物、ウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）ｍＲＮＡ（ＢＸＬＦ１  ＯＲＦ）のＩＳ−ＲＴ−ＰＣＲ解析。ウイルスＴＫの発現が、ＥＢＥＲ−１およびＥＢＥＲ−２を発現する細胞と同等の多数のリンパ腫細胞に認められる。（Ｄ）ｖＴＫ  ｍＲＮＡのＩＳ−ＲＴ−ＰＣＲ解析後におけるＲＮａｓｅの分解により、図Ｃに存在するシグナルがＲＮＡに基づくことが示される。［Ｐｏｒｃｕ，２００２  ＃３９４］より。
【図６】図６は、野生型ＡＡＶ２および５  ｒＡＡＶ導入遺伝子ワクチン構築物の遺伝子組成を示す。すべての導入遺伝子構築物は、標準的なＣＭＶプロモーターで構成的に駆動された全長ＥＢＶ遺伝子産物ｃＤＮＡ（上）を含み、終止コドンの次にポリＡテイル（ｐＡ）を含む。ｒＡＡＶ導入遺伝子構築物内に存在する他の要素は、ｎｅｏ抵抗遺伝子であるＡＡＶ  ｒｅｐおよびＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子を含み、いずれも内部プロモーターにより駆動する。この他の対照ベクターは、βガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする。
【図７】図７は、ｒＡＡＶ２導入遺伝子の複製および発現を示す。Ａ：サザンブロット；Ｂ：抗ＢＺＬＦウェスタンブロット。レーン１：ヒーラー細胞溶解物；レーン２：ヒーラー−ｒＡＡＶ−ＢＺＬＦ１溶解物。
【図８】図８は、精製ｒＡＡＶ２ベクターのＳＹＰＲＯオレンジ染色を示す。
【図９】図９は、２９３Ｔ細胞へのｒＡＡＶ２／ＢＺＬＦ１の形質導入を示す。上部：免疫蛍光によるＢＺＬＦ１発現量の定量；下部：ウェスタンブロットによるＢＺＬＦ１発現量の定量。ＤＲＰｓ＝ＤＮＡ分解酵素抵抗粒子／細胞（テキスト参照）。
【図１０】図１０は、ｒＡＡＶ２／ＥＢＶ潜伏抗原の複製を明らかにするサザンブロットを示す。
【図１１】図１１は、ＥＢＶ特異的ＣＤ８陽性Ｔリンパ球のインビトロにおける拡大培養結果を示す。
【図１２】図１２は、ｒＡＡＶ２／ＢＺＬＦ−１に感染させたヒト自家移植ＡＰＣとともに１４日間インビトロで拡大培養したＥＢＶ特異的ＣＤ８陽性ＣＴＬのフローサイトメトリー解析結果を示す。Ｙ軸はｃｎｔｌ（上）またはＢＺＬＦ（ＲＡＫ、下）四量体を表し、Ｘ軸はＣＤ８陽性Ｔ細胞を表す。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜１３Ｃは、全長ＢＺＬＦ１ポリペプチドが、ＨＬＡ型またはＢＺＬＦ１由来の既知／規定の免疫優性ペプチドに依存しないＴ細胞の反応を誘導することができることを示す。（Ａ）対照タンパク質（ＢＳＡ）またはＢＺＬＦ１タンパク質のいずれかに適用される自家移植樹状細胞／抗原提示細胞（ＡＰＣ）に応答するＨＬＡＢ８ドナー［１４７］末梢血単核球（ＰＢＭＣ）。７日後、バイオマーカーとしてＲＡＫペプチドを負荷したＨＬＡＢ８四量体を使用すると、単一の規定の免疫優性ペプチドＲＡＫを認識する抗原特異的Ｔ細胞の拡大が認められる。左図は、対照のミスマッチ四量体（ＨＬＡＢ８−ＦＬＲ）である。中央図は、対照ＢＳＡタンパク質で刺激されたＰＢＭＣの四量体染色背景を示す。右図はインビトロで拡大したＨＬＡＢ８−ＲＡＫ四量体特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜１３Ｃは、全長ＢＺＬＦ１ポリペプチドが、ＨＬＡ型またはＢＺＬＦ１由来の既知／規定の免疫優性ペプチドに依存しないＴ細胞の反応を誘導することができることを示す。（Ｂ）全長ＢＺＬＦまたは対照タンパク質に適用された自家移植樹状細胞ＡＰＣの存在下で平板培養したＨＬＡＢ８ドナー１４７由来のＰＢＭＣ。１２日間の培養後、（対照ＢＳＡに比べた）全長ＢＺＬＦ１タンパク質に反応するＩＦＮガンマ（ＩＦＮγ）シグナルの量は、ＩＣフローの測定によると約４倍に増加した。ＨＬＡＢ８ドナーに対する、ＢＺＬＦ由来の規定された免疫優性ペプチド（ＲＡＫ）は現在のところただ１つである。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜１３Ｃは、全長ＢＺＬＦ１ポリペプチドが、ＨＬＡ型またはＢＺＬＦ１由来の既知／規定の免疫優性ペプチドに依存しないＴ細胞の反応を誘導することができることを示す。（Ｃ）全長ＢＺＬＦまたはＢＳＡ対照タンパク質に適用された自家移植ＤＣ  ＡＰＣの存在下で個々に平板培養したＨＬＡＡ２由来のＰＢＭＣ。１２日間の培養後、（対照ＢＳＡに比べて）全長ＢＺＬＦ１タンパク質に反応して拡大したＣＤ８陽性Ｔ細胞（フローサイトメトリーでは示さず）が産生するＩＦＮγシグナルの量は、ＩＣフローの測定によると約２倍増加している。ＨＬＡＡ２ドナーに対するＢＺＬＦ由来の免疫優性ペプチドは報告されていないが、ＨＬＡＡ２  ＡＰＣは全長ＢＺＬＦ１ポリペプチドを処理することができ、かつエフェクター機能とともにＴ細胞の細胞活性化を引き起こす抗原認識を示すサイトカイン反応を駆動する免疫原性ペプチドを提示することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【配列表】
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