(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式：
【化１】
0005453248.tif 000037
を有し、
式中、
ｑは１から８の整数であり；
Ｘ1およびＸ2はそれぞれ、ＣおよびＮからなる群から独立して選択され、ここで、Ｘ1およびＸ2の一方がＮであり、ただし、（ｉ）Ｘ1がＣである場合、Ｒ1はＺであるか、またはＸ2がＣである場合、Ｒ2はＺであり、Ｚは以下に定義されるとおりであり；（ｉｉ）Ｘ1がＮである場合、Ｒ1は存在する場合Ｚ’であるか、またはＸ2がＮである場合、Ｒ2は存在する場合Ｚ’であり、ここで、Ｚ’は、
−（ＣＨ2）nＸ3Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ4、
（式中、
ｎは、１から８の整数であり；
Ｘ3はＮＲ6である）
からなる群から選択され；
Ｒ3、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＺはそれぞれ、Ｈ、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシシクロアルキル、アルコキシシクロアルキル、アミノアルキル、アシルオキシル、アルキルアミノアルキル、およびアルコキシカルボニルからなる群から独立して選択されるか；または
Ｒ7およびＲ8は一緒になって、Ｃ2からＣ10アルキル、Ｃ2からＣ10置換アルキル、またはＣ2からＣ10アルキレンを表し；
Ｒ4は−（ＣＨ2）m−Ｘ4であり；
式中、ｍは１から８の整数であり；
Ｘ4はハロゲンである
ことを特徴とするフルオロフォア。
【請求項２】
フルオロフォアは、
【化２】
0005453248.tif 000038
からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のフルオロフォア。
【請求項３】
以下の式：
【化３】
0005453248.tif 000039
を有し、
式中、
ｑ’は１から８の整数であり；
Ｘ1’およびＸ2’はそれぞれ、ＣおよびＮからなる群から独立して選択され、ここで、Ｘ1’およびＸ2’の一方がＮであり、ただし、（ｉ）Ｘ1’がＣである場合、Ｒ1’はＺであるか、またはＸ2’がＣである場合、Ｒ2’はＺであり、Ｚは以下に定義されるとおりであり；（ｉｉ）Ｘ1’がＮである場合、Ｒ1’は存在する場合Ｚ”であるか、またはＸ2’がＮである場合、Ｒ2’は存在する場合Ｚ’であり、ここで、Ｚ”は、
−（ＣＨ2）nＸ3’Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ4’、
（式中、
ｎは、１から８の整数であり；
Ｘ3’はＮＲ6’である）
からなる群から選択され；
それぞれのＲ3’、Ｒ6’、Ｒ7’、Ｒ8’およびＺは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシシクロアルキル、アルコキシシクロアルキル、アミノアルキル、アシルオキシル、アルキルアミノアルキル、およびアルコキシカルボニルからなる群から独立して選択されるか；または
Ｒ7’およびＲ8’は一緒になって、Ｃ2からＣ10アルキル、Ｃ2からＣ10置換アルキル、またはＣ2からＣ10アルキレンを表し；
Ｒ4’は−（ＣＨ2）m’−Ｂであり；
式中、ｍ’は１から８の整数であり；
Ｂは、検出されるリガンドまたは分析対象に対して結合親和性を有する結合メンバーであり、
試験下の試料において、前記リガンドもしくは分析対象に結合する結果として、または前記リガンドもしくは分析対象の濃度の変化の結果として蛍光特性の検出可能な変化を示す
ことを特徴とするバイオセンサー化合物。
【請求項４】
【化４】
0005453248.tif 000040
からなる群から選択されることを特徴とする請求項３に記載のバイオセンサー化合物。
【請求項５】
結合メンバーは結合タンパク質であることを特徴とする請求項３に記載のバイオセンサー化合物。
【請求項６】
結合タンパク質はペリプラズム結合タンパク質であることを特徴とする請求項５に記載のバイオセンサー化合物。
【請求項７】
結合タンパク質は、グルコース結合タンパク質およびグルコース／ガラクトース結合タンパク質（ＧＧＢＰ）からなる群から選択されることを特徴とする請求項６に記載のバイオセンサー化合物。
【請求項８】
結合タンパク質は、Ｗ１８３Ｃ、ＳＭ４、およびＹ１０Ｃからなる群から選択されることを特徴とする請求項７に記載のバイオセンサー化合物。
【請求項９】
グルコース／ガラクトース結合タンパク質は、少なくとも１個のアミノ酸置換を有し、前記少なくとも１個のアミノ酸置換は、
（ａ）位置１１におけるシステイン；
（ｂ）位置１４におけるシステイン；
（ｃ）位置１９におけるシステイン；
（ｄ）位置４３におけるシステイン；
（ｅ）位置７４におけるシステイン；
（ｆ）位置１０７におけるシステイン；
（ｇ）位置１１０におけるシステイン；
（ｈ）位置１１２におけるシステイン；
（ｉ）位置１１３におけるシステイン；
（ｊ）位置１３７におけるシステイン；
（ｋ）位置１４９におけるシステイン；
（ｌ）位置２１３におけるシステイン；
（ｍ）位置２１６におけるシステイン；
（ｎ）位置２３８におけるシステイン；
（ｏ）位置２８７におけるシステイン；
（ｐ）位置２９２におけるシステイン；
（ｑ）位置１１２におけるシステインおよび位置２３８におけるセリン；
（ｒ）位置１４９におけるシステインおよび位置２３８におけるセリン；
（ｓ）位置１５２におけるシステインおよび位置２１３におけるセリン；
（ｔ）位置２１３におけるシステインおよび位置２３８におけるシステイン；
（ｕ）位置１４９におけるシステインおよび位置２１３におけるアルギニン；
（ｖ）位置１４９におけるシステインおよび位置２１３におけるセリンおよび位置２３８におけるセリン；ならびに
（ｘ）位置１４９におけるシステインおよび位置２１３におけるアルギニンおよび位置２３８におけるセリン
からなる群から選択されることを特徴とする請求項７に記載のバイオセンサー化合物。
【請求項１０】
結合メンバーは受容体の少なくとも１つの断片であり、前記受容体は天然のタンパク質であり、活性部位を介して適切なリガンドに結合することができ、前記断片の少なくとも１つのアミノ酸残基は活性部位の近傍に位置し、システイン残基であるかまたはシステイン残基で置換されていることを特徴とする請求項３に記載のバイオセンサー化合物。
【請求項１１】
受容体は１つまたは複数のジスルフィド架橋を有することを特徴とする請求項１０に記載のバイオセンサー化合物。
【請求項１２】
受容体は抗体または抗体断片であることを特徴とする請求項１１に記載のバイオセンサー化合物。
【請求項１３】
受容体は天然または人工のモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１２に記載のバイオセンサー化合物。
【請求項１４】
試料中の１種または複数の分析対象の存在または量を決定する方法であって、
（ａ）少なくとも１つの変異結合タンパク質を、前記変異結合タンパク質のチオール基によってそれに共有結合しているフルオロフォアとともに有する請求項３に記載のバイオセンサー化合物を提供する段階；
（ｂ）前記バイオセンサー化合物を、１種または複数の分析対象を含む疑いがある試料と接触させて、前記１種または複数の分析対象を、存在する場合、結合タンパク質に結合させる段階、
（ｃ）前記１種または複数の分析対象を含む疑いがある試料を電磁放射で照射して、フルオロフォアに蛍光を発するようにさせる段階、および
（ｄ）蛍光特性を検出して、前記試料中の１種または複数の分析対象の存在または量を決定する段階
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
【化５】
0005453248.tif 000041
からなる群から選択されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
結合メンバーは結合タンパク質であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
結合タンパク質はペリプラズム結合タンパク質であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
結合タンパク質は、グルコース結合タンパク質およびグルコース／ガラクトース結合タンパク質（ＧＧＢＰ）からなる群から選択されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
結合タンパク質は、Ｗ１８３Ｃ、ＳＭ４、およびＹ１０Ｃからなる群から選択されることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
グルコース／ガラクトース結合タンパク質は、少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、前記少なくとも１つのアミノ酸置換は、
（ａ）位置１１におけるシステイン；
（ｂ）位置１４におけるシステイン；
（ｃ）位置１９におけるシステイン；
（ｄ）位置４３におけるシステイン；
（ｅ）位置７４におけるシステイン；
（ｆ）位置１０７におけるシステイン；
（ｇ）位置１１０におけるシステイン；
（ｈ）位置１１２におけるシステイン；
（ｉ）位置１１３におけるシステイン；
（ｊ）位置１３７におけるシステイン；
（ｋ）位置１４９におけるシステイン；
（ｌ）位置２１３におけるシステイン；
（ｍ）位置２１６におけるシステイン；
（ｎ）位置２３８におけるシステイン；
（ｏ）位置２８７におけるシステイン；
（ｐ）位置２９２におけるシステイン；
（ｑ）位置１１２におけるシステインおよび位置２３８におけるセリン；
（ｒ）位置１４９におけるシステインおよび位置２３８におけるセリン；
（ｓ）位置１５２におけるシステインおよび位置２１３におけるセリン；
（ｔ）位置２１３におけるシステインおよび位置２３８におけるシステイン；
（ｕ）位置１４９におけるシステインおよび位置２１３におけるアルギニン；
（ｖ）位置１４９におけるシステインおよび位置２１３におけるセリンおよび位置２３８におけるセリン；ならびに
（ｘ）位置１４９におけるシステインおよび位置２１３におけるアルギニンおよび位置２３８におけるセリン
からなる群から選択されることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
結合メンバーは受容体の少なくとも１つの断片であり、前記受容体は天然のタンパク質であり、活性部位を介して適切なリガンドに結合することができ、前記断片の少なくとも１つのアミノ酸残基は活性部位の近傍に位置し、システイン残基であるかまたはシステイン残基で置換されていることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
受容体は１つまたは複数のジスルフィド架橋を有することを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
受容体は抗体または抗体断片であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
受容体は天然または人工のモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
（ａ）バイオセンサー化合物を１種または複数の分析対象を有する疑いがある試料と接触させる前に、第１の放射波長での蛍光強度を測定する段階；
（ｂ）バイオセンサー化合物を１種または複数の分析対象を有する疑いがある試料と接触させた後に、第２の放射波長での蛍光強度を測定する段階；および
（ｃ）第２の放射波長対第１の放射波長の比を決定して、試料中の１種または複数の分析対象の存在または量を決定する段階
をさらに含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
連続的に
（ａ）結合タンパク質を１種または複数の分析対象を含む疑いがある試料と接触させる段階；
（ｂ）試料を電磁放射で照射する段階；および
（ｃ）蛍光特性を検出する段階
をさらに含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項２７】
変異結合タンパク質は、１種または複数の分析対象を含む疑いがある試料の分析対象濃度の変化の結果として立体配座の変化を受け、前記方法は分析対象濃度の変化の結果として蛍光特性の変化を検出することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項２８】
１種または複数の分析対象は、グルコース、脂肪酸、および乳酸塩からなる群から選択されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項２９】
請求項３に記載のバイオセンサー化合物を含むことを特徴とするバイオセンサー装置。
【請求項３０】
試料中の１種または複数の分析対象の存在または量を決定するための反応剤であって、請求項３に記載のバイオセンサー化合物を含むことを特徴とする反応剤。
【請求項３１】
試料中の１種または複数の分析対象の存在または量を決定するためのキットであって、請求項２９に記載のバイオセンサー装置を備えることを特徴とするキット。
【請求項３２】
以下の式：
【化６】
0005453248.tif 000042
を有し、
式中、
ｑ’は１から８の整数であり；
Ｘ1’およびＸ2’はそれぞれ、ＣおよびＮからなる群から独立して選択され、ここで、Ｘ1’およびＸ2’の一方がＮであり、ただし、（ｉ）Ｘ1’がＣである場合、Ｒ1’はＺであるか、またはＸ2’がＣである場合、Ｒ2’はＺであり、Ｚは以下に定義されるとおりであり；（ｉｉ）Ｘ1’がＮである場合、Ｒ1’は存在する場合Ｚ”であるか、またはＸ2’がＮである場合、Ｒ2’は存在する場合Ｚ’であり、ここで、Ｚ”は、
−（ＣＨ2）nＸ3’Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ4’、
【化７】
0005453248.tif 000043
（式中、
ｎ、ｐ、およびｒは、それぞれ独立して、１から８の整数であり；
Ｘ3’はＯまたはＮＲ6’である）
からなる群から選択され；
それぞれのＲ3’、Ｒ6’、Ｒ7’、Ｒ8’およびＺは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシシクロアルキル、アルコキシシクロアルキル、アミノアルキル、アシルオキシル、アルキルアミノアルキル、およびアルコキシカルボニルからなる群から独立して選択されるか；または
Ｒ7’およびＲ8’は一緒になって、Ｃ2からＣ10アルキル、Ｃ2からＣ10置換アルキル、またはＣ2からＣ10アルキレンを表し；
Ｒ4’は−（ＣＨ2）m’−Ｂであり；
式中、ｍ’は１から８の整数であり；
Ｂは、ＳＭ４である
ことを特徴とするバイオセンサー化合物。
【請求項３３】
【化８】
0005453248.tif 000044
からなる群から選択されることを特徴とする請求項３２に記載のバイオセンサー化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ここで開示される主題は、蛍光色素、それらのコンジュゲート、および生物試料における１種または複数の代謝産物を検出するためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物試料における代謝産物などの生理学的に重要な分子の検出は、患者の状態または疾患状態をモニターするために重要であり得る。例えば、グルコースのモニタリングは糖尿病を診断および管理するために使用することができ、ここで、インスリン療法とともに血糖を７０から１２０ｍｇ／ｄＬの正常範囲内に維持することおよびグルコース増加のモニタリングは、糖尿病を患う患者の長期にわたる予後を改善することができる。しかし、グルコース濃度だけでは、糖尿病およびその発症の基礎にある代謝過程を理解するのに十分な情報が得られない。脂肪酸のモニタリングにより、糖尿病、特に２型糖尿病を患う患者における前糖尿病状態またはインスリン耐性の発症に至る事象のさらなる理解を得ることができる。同様に、例えば、適度な運動の副産物である乳酸塩などのエネルギー代謝産物は、モニターして患者のエネルギー消費、運動負荷、または疲労度を評価することができる。
【０００３】
例えば、グルコース、脂肪酸、および乳酸塩などの代謝産物を検出する１つの方法には、蛍光色素などのフルオロフォアを結合メンバー、すなわち、リガンド、例えば、目的の代謝産物に対して親和性および特異性を有する特定の結合対の結合メンバーと結合させ、リガンド結合後のフルオロフォアの蛍光特性の変化を測定する段階が含まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／０２８０６５２号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００３／０１５３０１２号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５／０１１３６５７号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００６／００７８９０８号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Smith, E.R. and Storch, J., J.Biol. Chem., 274(50): 35325-35330 (1999)
【非特許文献２】T.E. Creighton, Proteins-Structure And Molecular Properties, 2nd ed., W.H. Freeman and Company, New York (1993)
【非特許文献３】Wold, F., "Posttraslational Protein Modifications: Perspective and Prospects," in Posttranslational Covalent Modification Of Proteins", B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983)
【非特許文献４】Seifter et al., Methods in Enzymol, 182: 626-646 (1990)
【非特許文献５】Rattan et al., Ann NY Acad Sci., 663: 48-62 (1992)
【非特許文献６】Looger, L.L., et al., Nature 423 (6936): 185-190 (2003)
【非特許文献７】Richieri, G.V. et al., J. Biol. Chem., 267: 23495-501 (1992)
【非特許文献８】Creighton, T.E., "Proteins:Structure and molecular properties," 2nd ed., (W.H. Freeman & Co., New York) 227-229 (1993)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、このような系においてフルオロフォアとして使用するための改善された蛍光色素に対する必要性が当技術分野にはある。ここで開示される主題は、全体的でまたは部分的に、当技術分野におけるこれらの必要性および他の必要性に対処するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ここで開示される主題は、チオール反応性で、環境に敏感な蛍光色素、即ち、フルオロフォアを提供し、これらは可視スペクトル領域に発光波長を有し、かつ１種または複数のリガンドまたは標的分析対象に対して比率測定応答を示す。一部の実施形態において、ここで開示されるフルオロフォアは、以下の一般式：
Ａ−Ｙ
を有し、
式中、
Ａは、クマリン核およびアザクマリン核からなる群から選択され；
Ｙは、
【０００８】
【化１】
0005453248.tif 000002
【０００９】
［式中、
ｓおよびｔは、それぞれ独立して、１から８の整数であり；
Ｘ1およびＸ2はそれぞれ、Ｃ、Ｓ、およびＮからなる群から独立して選択され、ここで、Ｘ1およびＸ2の少なくとも一方はＮであり、ただし、（ｉ）Ｘ1がＣもしくはＳである場合、Ｒ1はＺであるか、またはＸ2がＣもしくはＳである場合、Ｒ2はＺであり、Ｚは以下で定義されるとおりであり；（ｉｉ）Ｘ1およびＸ2の両方が同時にＮである場合、Ｒ1およびＲ2の少なくとも一方は存在せず；（ｉｉｉ）Ｘ1がＮである場合、Ｒ1は存在する場合Ｚ’であるか、またはＸ2がＮである場合、Ｒ2は存在する場合Ｚ’であり、ここで、Ｚ’は、
−（ＣＨ2）nＸ3Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ4、
【００１０】
【化２】
0005453248.tif 000003
【００１１】
（式中、
ｎ、ｐ、およびｒは、それぞれ独立して、１から８の整数であり；
Ｘ3はＯまたはＮＲ6である）
からなる群から選択され；
Ｒ3、Ｒ5、Ｒ6およびＺはそれぞれ、Ｈ、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシシクロアルキル、アルコキシシクロアルキル、アミノアルキル、アシルオキシル、アルキルアミノアルキル、およびアルコキシカルボニルからなる群から独立して選択され；
Ｒ4は−（ＣＨ2）m−Ｘ4であり；
式中、ｍは１から８の整数であり；
Ｘ4はハロゲンである］
からなる群から選択される。
【００１２】
一部の実施形態において、ここで開示される蛍光色素は、別の分子、例えば、特異的リガンドまたは分析対象に対して親和性を有する特定の結合対のメンバーなどとコンジュゲートさせることができる。このようなコンジュゲートは、目的の代謝産物を検出するバイオセンサー化合物として使用することができる。したがって、一部の実施形態において、ここで開示される主題は、式：
Ａ−Ｙ’−Ｂ
を有するバイオセンサー化合物であって、
式中、
Ａは、クマリン核およびアザクマリン核からなる群から選択され；
Ｙ’は、
【００１３】
【化３】
0005453248.tif 000004
【００１４】
［式中、
ｓ’およびｔ’は、それぞれ独立して、１から８の整数であり；
Ｘ1’およびＸ2’はそれぞれ、Ｃ、Ｓ、およびＮからなる群から独立して選択され、ここで、Ｘ1’およびＸ2’の少なくとも一方はＮであり、ただし、（ｉ）Ｘ1’がＣもしくはＳである場合、Ｒ1’はＺであるか、またはＸ2’がＣもしくはＳである場合、Ｒ2’はＺであり、Ｚは以下で定義されるとおりであり；（ｉｉ）Ｘ1’およびＸ2’の両方が同時にＮである場合、Ｒ1’およびＲ2’の少なくとも一方は存在せず；（ｉｉｉ）Ｘ1’がＮである場合、Ｒ1’は存在する場合Ｚ’であるか、またはＸ2’がＮである場合、Ｒ2’は存在する場合Ｚ”であり、ここで、Ｚ”は、
−（ＣＨ2）nＸ3’Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ4’、
【００１５】
【化４】
0005453248.tif 000005
（式中、
【００１６】
ｎ、ｐおよびｒは、それぞれ独立して、１から８の整数であり；
Ｘ3’はＯまたはＮＲ6’である）
からなる群から選択され；
Ｒ3’、Ｒ5’、Ｒ6’およびＺはそれぞれ、Ｈ、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシシクロアルキル、アルコキシシクロアルキル、アミノアルキル、アシルオキシル、アルキルアミノアルキル、およびアルコキシカルボニルからなる群から独立して選択され；
Ｒ4’は−（ＣＨ2）m−Ｂであり；
式中、ｍは１から８の整数であり；
Ｂは、検出されるリガンドまたは分析対象に対して結合親和性を有する結合メンバーである］
からなる群から選択され；
試験下の試料において、該リガンドもしくは分析対象に結合する結果として、またはリガンドもしくは分析対象の濃度の変化の結果として蛍光特性の検出可能な変化を示す、バイオセンサー化合物を提供する。
【００１７】
一部の実施形態において、ここで開示される主題は、試料中の１種または複数の分析対象の存在または量を決定する方法であって、（ａ）少なくとも１つの変異結合タンパク質を、該変異結合タンパク質のチオール基によってそれに共有結合しているフルオロフォアとともに有する式Ａ−Ｙ’−Ｂのバイオセンサー化合物を提供する段階；（ｂ）該バイオセンサー化合物を、１種または複数の分析対象を含む疑いがある試料と接触させて、１種または複数の分析対象を、存在する場合、結合タンパク質と結合させる段階；（ｃ）該１種または複数の分析対象を含む疑いがある試料を電磁放射で照射して、フルオロフォアに蛍光を発するようにさせる段階；および（ｄ）蛍光特性を検出して、該試料中の１種または複数の分析対象の存在または量を決定する段階を含む方法を提供する。
【００１８】
一部の実施形態において、ここで開示される主題は、式Ａ−Ｙ’−Ｂのバイオセンサー化合物を含むバイオセンサー装置を提供する。一部の実施形態において、ここで開示される主題は、試料中の１種または複数の分析対象の存在または量を決定するための反応剤であって、式Ａ−Ｙ’−Ｂのバイオセンサー化合物を含む反応剤を提供する。一部の実施形態において、ここで開示される主題では、試料中の１種または複数の分析対象の存在または量を決定するためのキットであって、式Ａ−Ｙ’−Ｂのバイオセンサー化合物を含むキットを提供する。
【００１９】
以上に述べられたここで開示される主題の特定の目的は、ここで開示される主題によって全体的または部分的に対処され；その他の目的は、以下に最も良く記載されるとおりの添付の実施例および図面と関連して考慮される場合、この説明が進むにつれて明らかになる。
【００２０】
したがって、ここで開示される主題を一般用語で説明してきたが、必ずしも正確な縮尺で描かれていない添付の図面についてこれから参照がなされる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】グルコースの存在に対する、今回開示されるフルオロフォア結合タンパク質コンジュゲート、例えば、Ｗ１８３標識ＩＣＯＰＩＣコンジュゲートの比率測定応答を示す図である。上の曲線はグルコース不存在下でＷ１８３標識ＩＣＯＰＩＣコンジュゲートの蛍光強度を示し、下の曲線は１００ｍＭのグルコース存在下でＷ１８３Ｃ標識ＩＣＯＰＩＣコンジュゲートの蛍光強度を示す。
【図２】今回開示されるフルオロフォア結合タンパク質コンジュゲート、例えば、Ｗ１８３Ｃ標識ＩＣＯＰＩＣコンジュゲートの代表的な吸収スペクトルを示す図である。２Ａは、コンジュゲートが４℃で３日間保存された場合の吸収スペクトルを示し、２Ｂは、３７℃で３日間保存された場合の吸収スペクトルを示す。
【図３】今回開示されるオルト置換フルオロフォア結合対コンジュゲート、例えば、ＳＭ４−ｏ−ＩＣＯＰＩＣエステル色素の蛍光スペクトルを示す図である。３Ａは、グルコース不存在下でＳＭ４−ｏ−ＩＣＯＰＩＣエステル色素の蛍光スペクトルを示し、３Ｂは、グルコース存在下でＳＭ４−ｏ−ＩＣＯＰＩＣエステル色素の蛍光スペクトルを示す。
【図４】ＮＭＲ分光分析でモニターして今回開示されるｐ−ＩＣＯＰＩＣ色素の安定性を示す図である。４Ａは、今回開示される、１日目におけるｐ−ＩＣＯＰＩＣ色素のＮＭＲスペクトルを示し、４Ｂは、今回開示される、３７℃で７日後のｐ−ＩＣＯＰＩＣ色素のＮＭＲスペクトルを示し、４Ｃは、今回開示される、５５℃で７日後のｐ−ＩＣＯＰＩＣ色素のＮＭＲスペクトルを示す。
【図５】ＮＭＲ分光分析でモニターして今回開示されるｏ−ＩＣＯＰＩＣ色素の安定性を示す図である。５Ａは、今回開示される１日目におけるｏ−ＩＣＯＰＩＣ色素のＮＭＲスペクトルを示し、５Ｂは、今回開示される３７℃で７日後のｏ−ＩＣＯＰＩＣのＮＭＲスペクトルを示し、５Ｃは、今回開示される５５℃で７日後のｏ−ＩＣＯＰＩＣ色素のＮＭＲスペクトルを示す。
【図６】ＨＰＬＣでモニターして今回開示されるｐ−ＩＣＯＰＩＣ色素の安定性を示す図である。６Ａは、今回開示される新たに調製されたｐ−ＩＣＯＰＩＣ色素のＨＰＬＣ痕跡（λ＝５００ｎｍ）を示し、６Ｂは、今回開示されるインキュベーション後１４日目におけるｐ−ＩＣＯＰＩＣ色素のＨＰＬＣ痕跡（λ＝５００ｎｍ）を示す。
【図７】ＨＰＬＣでモニターして今回開示されるｏ−ＩＣＯＰＩＣ色素の安定性を示す図である。７Ａは、今回開示される新たに調製されたｏ−ＩＣＯＰＩＣ色素のＨＰＬＣ痕跡（λ＝５００ｎｍ）を示し、７Ｂは、今回開示されるインキュベーション後１４日目におけるｏ−ＩＣＯＰＩＣ色素のＨＰＬＣ痕跡（λ＝５００ｎｍ）を示す。
【図８】ＳＭ４−ｏ−ＩＣＯＰＩＣコンジュゲートのＵＶ−ＶＩＳスペクトルを示す図である。
【図９Ａ】ＳＭ４−ｏ−ＩＣＯＰＩＣコンジュゲートの蛍光スペクトルおよび結合曲線を示す図である。この図は、約０ｍＭ（最も上の曲線）から約２００ｍＭ（最も下の曲線）へのグルコースの濃度増加におけるＳＭ４−ｏ−ＩＣＯＰＩＣコンジュゲートの蛍光スペクトルを示す。
【図９Ｂ】ＳＭ４−ｏ−ＩＣＯＰＩＣコンジュゲートの蛍光スペクトルおよび結合曲線を示す図である。この図は、グルコースと一緒のＳＭ４−ｏ−ＩＣＯＰＩＣの結合曲線を示す。
【図１０】今回開示されるＷ１８３Ｃ−ｏ−ＩＣＯＰＩＣコンジュゲートのＵＶ−ＶＩＳスペクトルを示す。
【図１１Ａ】Ｗ１８３Ｃ−ｏ−ＩＣＯＰＩＣコンジュゲートの蛍光スペクトルおよび結合曲線を示す図である。この図は、約０ｍＭ（最も上の曲線）から約２００ｍＭ（最も下の曲線）へのグルコースの濃度増加におけるＷ１８３Ｃ−ｏ−ＩＣＯＰＩＣコンジュゲートの蛍光スペクトルを示す。
【図１１Ｂ】Ｗ１８３Ｃ−ｏ−ＩＣＯＰＩＣコンジュゲートの蛍光スペクトルおよび結合曲線を示す図である。この図は、グルコースと一緒のＷ１８３Ｃ−ｏ−ＩＣＯＰＩＣの結合曲線を示す。
【図１２】今回開示されるＹ１０Ｃ−ｐ−ＩＣＯＰＩＣコンジュゲートのＵＶ−ＶＩＳスペクトルを示す図である。
【図１３Ａ】Ｙ１０Ｃ−ｏ−ＩＣＯＰＩＣコンジュゲートの蛍光スペクトルおよび結合曲線を示す図である。この図は、約０ｍＭ（最も上の曲線）から約２００ｍＭ（最も下の曲線）へのグルコースの濃度増加におけるＹ１０Ｃ−ｏ−ＩＣＯＰＩＣコンジュゲートの蛍光スペクトルを示す。
【図１３Ｂ】Ｙ１０Ｃ−ｏ−ＩＣＯＰＩＣコンジュゲートの蛍光スペクトルおよび結合曲線を示す図である。この図は、グルコースと一緒のＹ１０Ｃ−ｏ−ＩＣＯＰＩＣの結合曲線を示す。
【図１４】Ｗ１８３Ｃ−ｏ−ＩＣＯＰＩＣ（点線）およびＷ１８３Ｃ−アクリロダン（実線）の蛍光スペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
これからここで示される主題が、ここで開示される主題の全部ではないが一部の実施形態が示される添付の図面を参照して以下により十分に説明される。本明細書で示されるここで開示される主題の多くの変更形態および他の実施形態は、ここで開示される主題が属する分野の技術者が思いつき、前述の説明およびその関連図面に提示される教示の利点を有する。したがって、ここで開示される主題は、開示された特定の実施形態に限定されるべきでないこと、ならびに修正および他の実施形態は添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図されることが理解されるべきである。具体的な用語が本明細書において用いられるが、それらは総称的および記述的意味のみで用いられ、限定する目的のためには用いられない。
【００２３】
長年の特許法の慣習に従って、用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、特許請求の範囲も含めて、本出願で用いる場合「１つまたは複数の」を指す。したがって、例えば、「１つの試料（ａ  ｓａｍｐｌｅ）」への言及には、その文脈が明らかにそれと反対（例えば、複数の試料）でない限り、複数の試料が含まれる、などである。
【００２４】
本明細書および特許請求の範囲を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｓ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｉｎｇ）」という語は、文脈が別に要する場合を除いて、非排他的な意味で用いられる。
【００２５】
本明細書で用いられるように、値に言及する場合、「約」という用語は、変動が開示された方法を行うまたは開示された組成物を用いるために適当であるように、その具体的量から一部の実施形態において±５０％、一部の実施形態において±２０％、一部の実施形態において±１０％、一部の実施形態において±５％、一部の実施形態において±１％、一部の実施形態において±０．５％、および一部の実施形態において±０．１％の変動を包含することが意味される。
【００２６】
Ｉ．環境に敏感な蛍光色素およびその使用方法
ここで開示される主題では、チオール反応性で、環境に敏感な蛍光色素（本明細書においてフルオロフォアとも称される）が提供され、これは、可視スペクトル領域に発光波長を有し、かつ１種または複数のリガンドまたは標的分析対象に対する比率測定応答を示す。本明細書で用いられるように、「フルオロフォア」という用語は、照射される、すなわち、適当な波長の電磁放射によって励起される場合、蛍光を発するようにさせることができるより大きな分子またはコンジュゲートの部分を含むことを意味する。より詳しくは、フルオロフォアは、特定の波長の光を吸収し、異なる波長で光を発する分子またはコンジュゲートの官能基であることができる。発せられる光の強度および波長、ならびに、限定されないが、蛍光寿命、異方性、分極、およびそれらの組合せを含む他の蛍光特性は、フルオロフォアそのものおよびその化学的環境に依存する。フルオロフォアは、蛍光分子、例えば、ここで開示される蛍光色素などを含むことができる。
【００２７】
Ａ．チオール−反応基を有する蛍光色素
一部の実施形態において、ここで開示される主題は、式：
Ａ−Ｙ
を有するフルオロフォアであって、
式中、
Ａは、クマリン核およびアザクマリン核からなる群から選択され；
Ｙは、
【００２８】
【化５】
0005453248.tif 000006
【００２９】
［式中、
ｓおよびｔは、それぞれ独立して、１から８の整数であり；
Ｘ1およびＸ2はそれぞれ、Ｃ、Ｓ、およびＮからなる群から独立して選択され、ここで、Ｘ1およびＸ2の少なくとも一方はＮであり、ただし、（ｉ）Ｘ1がＣもしくはＳである場合、Ｒ1はＺであるか、またはＸ2がＣもしくはＳである場合、Ｒ2はＺであり、Ｚは以下に定義されるとおりであり；（ｉｉ）Ｘ1およびＸ2の両方が同時にＮである場合、Ｒ1およびＲ2の少なくとも一方は存在せず；（ｉｉｉ）Ｘ1がＮである場合、Ｒ1は存在する場合Ｚ’であるか、またはＸ2がＮである場合、Ｒ2は存在する場合Ｚ’であり、ここで、Ｚ’は、
−（ＣＨ2）nＸ3Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ4、
【００３０】
【化６】
0005453248.tif 000007
【００３１】
（式中、
ｎ、ｐ、およびｒは、それぞれ独立して、１から８の整数であり；
Ｘ3はＯまたはＮＲ6である）
からなる群から選択され；
Ｒ3、Ｒ5、Ｒ6およびＺはそれぞれ、Ｈ、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシシクロアルキル、アルコキシシクロアルキル、アミノアルキル、アシルオキシル、アルキルアミノアルキル、およびアルコキシカルボニルからなる群から独立して選択され；
Ｒ4は−（ＣＨ2）m−Ｘ4であり；
式中、ｍは１から８の整数であり；
Ｘ4はハロゲンである］
からなる群から選択されるフルホロフォアを提供する。
【００３２】
Ｘ1およびＸ2の少なくとも一方がＮであり、Ｒ1およびＲ2の少なくとも一方が存在し、かつ窒素原子に結合している、直ぐ上に開示される実施形態において、その窒素原子に結合したＲ1またはＲ2を有する窒素原子は、四級窒素原子、すなわち、４個の炭素原子に結合し、かつ残りの原子価についてアニオンにイオン的に結合するために利用できる正電荷を有する５価窒素原子である。
【００３３】
一部の実施形態において、ここで開示されるフルオロフォアには、クマリン核またはクマリン核の誘導体が含まれる。好適な核は、参照によりそっくりそのまま組み込まれて、２００５年５月１８日に出願された特許文献１に記載されている。本明細書で用いられるように、「クマリン核の誘導体」は、親化合物、すなわち、クマリンに由来するかまたはそれから得られる化合物を指し、親化合物に必須の元素を含むが、通常１個または複数の異なる官能基を有する。このような官能基は、親化合物に付加して、例えば、分子の溶解性、吸収性、生物学的半減期、蛍光特性などを改善することができ、またはその分子の毒性を低下させ、その分子の任意の望ましくない副作用をなくすかもしくは弱めることなどができる。クマリン核の誘導体は、クマリン核への任意の化学的修飾、付加、欠失、または置換を含むことを意味する。さらに、クマリン核の誘導体には、誘導体の任意の反応生成物、例えば、誘導体とアミノ酸残基との反応生成物を含むことができる。したがって、一部の実施形態において、ここで開示されるフルオロフォアには、アミノ酸、例えば、タンパク質のアミノ酸残基とコンジュゲートする、例えば、共有的に結合することができる反応基を有するクマリン核を含むことができる。誘導体の非限定的な例は、カルボン酸官能基を有する親化合物のエステルまたはアミドである。
【００３４】
より詳しくは、一部の実施形態において、クマリン核には、天然または工学処理（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）もしくは変異タンパク質中のシステインアミノ酸残基のチオール部分とコンジュゲートさせることができるチオール−反応基を含むことができる。本明細書で用いられるように、「チオール−反応基」という用語は、チオール部分と反応し、炭素−硫黄結合を形成することができる置換基を指す。ここで開示されるフルオロフォアに導入することができる好適なチオール−反応基の例には、ハロ−アセチル基およびハロ−アセトアミド基が含まれる。一部の実施形態において、ハロ−アセチル基にはヨードアセチル基を含み、一方、ハロ−アセトアミド基にはヨードアセトアミド基またはブロモアセトアミド基を含むことができる。ここで開示される主題の検討後当業者であれば、当技術分野で知られている他のチオール−反応基、例えば、マレイン酸イミド基などが、ここで開示される主題による使用に好適であることを理解するであろう。
【００３５】
したがって、式Ａ−Ｙのフルオロフォアの一部の実施形態において、Ａはクマリンであり、ここで開示されるフルオロフォアは以下の式：
【００３６】
【化７】
0005453248.tif 000008
【００３７】
を有し、
式中、
ｑは１から８の整数であり；
Ｘ1およびＸ2はそれぞれ、Ｃ、Ｓ、およびＮからなる群から独立して選択され、ここで、Ｘ1およびＸ2の少なくとも一方はＮであり、ただし、（ｉ）Ｘ1がＣもしくはＳである場合、Ｒ1はＺであるか、またはＸ2がＣもしくはＳである場合、Ｒ2はＺであり、Ｚは以下に定義されるとおりであり；（ｉｉ）Ｘ1およびＸ2の両方が同時にＮである場合、Ｒ1およびＲ2の少なくとも一方は存在せず；（ｉｉｉ）Ｘ1がＮである場合、Ｒ1は存在する場合Ｚ’であるか、またはＸ2がＮである場合、Ｒ2は存在する場合Ｚ’であり、ここで、Ｚ’は、
−（ＣＨ2）nＸ3Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ4、
【００３８】
【化８】
0005453248.tif 000009
【００３９】
（式中、
ｎ、ｐ、およびｒは、それぞれ独立して、１から８の整数であり；
Ｘ3はＯまたはＮＲ6である）
からなる群から選択され；
Ｒ3、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＺはそれぞれ、Ｈ、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシシクロアルキル、アルコキシシクロアルキル、アミノアルキル、アシルオキシル、アルキルアミノアルキル、およびアルコキシカルボニルからなる群から独立して選択されるか；または
Ｒ7およびＲ8は一緒になって、Ｃ2からＣ10アルキル、Ｃ2からＣ10置換アルキル、またはＣ2からＣ10アルキレンを表し；
Ｒ4は−（ＣＨ2）m−Ｘ4であり；
式中、ｍは１から８の整数であり；
Ｘ4はハロゲンである。
【００４０】
一部の実施形態において、式Ａ−Ｙのフルオロフォアは、
【００４１】
【化９】
0005453248.tif 000010
【００４２】
からなる群から選択される。
【００４３】
以下に直ぐ記載されるように、ここで開示される式Ａ−Ｙのフルオロフォアは、例えば、結合タンパク質などの特定の結合対の結合メンバーとコンジュゲートさせ、試験下の試料中の１種または複数の分析対象を検出するために用いることができるバイオセンサー化合物を形成することができる。
【００４４】
Ｂ．チオール−反応基を有する環境に敏感な蛍光色素を含むバイオセンサー化合物
ここで開示されるフルオロフォアは、結合タンパク質アッセイと組み合わせて使用し、生物試料中の代謝産物、例えば、グルコース、脂肪酸、および乳酸塩などを含む生理学的に重要な分子を検出することができる。一部の実施形態において、ここで開示されるフルオロフォアには、フルオロフォアを、特定のリガンドまたは分析対象に対して親和性を有する、例えば、結合タンパク質または受容体などの特定の結合対のメンバーを含む別の分子とカップリングまたはコンジュゲートさせるために用いることができる反応基が含まれる。
【００４５】
本明細書で用いられるように、「コンジュゲート」という用語は、単一の分子構造を形成するために、場合によって連結基によって、一緒に結合された２個またはそれを超えるサブユニットを含む分子を指す。この結合は、サブユニット間の直接の化学結合によってまたは連結基を介して作ることができる。コンジュゲートにおけるこのような結合は通常、不可逆的である。本明細書で用いられるように、「親和性」という用語は、特定の結合部位における特定の結合対の一方の結合メンバーと特定の結合対の別の結合メンバー間の引力の強さを指す。「特異性」という用語およびその由来は、結合メンバーが特定の結合対の別のメンバーに結合する可能性を指す。一方の結合メンバー、例えば、結合タンパク質と特定の結合対の別の結合メンバー、例えば、リガンドまたは分析対象との間のこのような結合は、可逆的であることができる。
【００４６】
標的分析対象またはリガンドに結合した場合、ここで開示されるコンジュゲートは、結合タンパク質またはフルオロフォアコンジュゲートの受容体の環境の変化に対する応答における蛍光特性の検出可能な変化を示すことができる。蛍光特性の検出可能な変化には、蛍光発光波長のシフト、蛍光強度の変化、蛍光寿命の変化、異方性の変化、分極の変化、およびそれらの組合せを含むことができる。
【００４７】
いずれの１つの特定の理論に拘束されることも望むものではないが、結合タンパク質または受容体は、リガンドなしの開形態およびリガンドに結合した場合の閉形態の２つの立体配座をとることができる。これらの２つの立体配座は、例えば、リガンド結合またはリガンド濃度の変化後に包括的なヒンジ結合機構を介して相互転換する。これらの包括的立体配座の変化と協調した局所的立体配座の変化を受ける場所に環境に敏感なフルオロフォアを置くことによって、このようなリガンドが介在した立体配座の変化は１つまたは複数の蛍光特性の変化にリガンド結合を結びつける（ｃｏｕｐｌｅ）ために活用することができる。したがって、これらの工学処理された立体配座のカップリング機構（ｅｎｇｉｅｅｒｅｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）は、反応剤なしの光学バイオセンサーが選択された結合タンパク質および環境に敏感なフルオロフォアから形成されることを可能にする。
【００４８】
本明細書で用いられるように、「バイオセンサー」および「バイオセンサー化合物」という用語は一般に、リガンドまたは標的分析対象に対する特異的な応答の検出可能な変化を受ける化合物を指す。より特に、ここで開示されるバイオセンサーでは、例えば、結合タンパク質などの生物学的高分子の分子認識特性が、リガンド結合後に蛍光特性の検出可能な変化を生じる環境に敏感なフルオロフォアと組み合わされる。したがって、バイオセンサーでは、結合事象が直接的に測定可能な蛍光特性に変えられる。
【００４９】
一部の実施形態において、ここで開示される主題は、式：
Ａ−Ｙ’−Ｂ
を有するバイオセンサー化合物であって、
式中、
Ａは、クマリン核およびアザクマリン核からなる群から選択され；
Ｙ’は、
【００５０】
【化１０】
0005453248.tif 000011
【００５１】
［式中、
ｓ’およびｔ’は、それぞれ独立して、１から８の整数であり；
Ｘ1’およびＸ2’はそれぞれ、Ｃ、Ｓ、およびＮからなる群から独立して選択され、ここで、Ｘ１’およびＸ２’の少なくとも一方はＮであり、ただし、（ｉ）Ｘ1’がＣもしくはＳである場合、Ｒ1’はＺであるか、またはＸ2’がＣもしくはＳである場合、Ｒ2’はＺであり、Ｚは以下に定義されるとおりであり；（ｉｉ）Ｘ1’およびＸ2’の両方が同時にＮである場合、Ｒ1’およびＲ2’の少なくとも一方は存在せず；（ｉｉｉ）Ｘ1’がＮである場合、Ｒ1’は存在する場合Ｚ’であるか、またはＸ2’がＮである場合、Ｒ2’は存在する場合Ｚ”であり、ここで、Ｚ”は、
−（ＣＨ2）nＸ3’Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ4’、
【００５２】
【化１１】
0005453248.tif 000012
【００５３】
（式中、
ｎ、ｐ、およびｒは、それぞれ独立して、１から８の整数であり；
Ｘ3’はＯまたはＮＲ6’である）
からなる群から選択され；
Ｒ3’、Ｒ5’、Ｒ6’およびＺはそれぞれ、Ｈ、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシシクロアルキル、アルコキシシクロアルキル、アミノアルキル、アシルオキシル、アルキルアミノアルキル、およびアルコキシカルボニルからなる群から独立して選択され；
Ｒ4’は−（ＣＨ2）m−Ｂであり；
式中、ｍは１から８の整数であり；
Ｂは、検出されるリガンドまたは分析対象に対して結合親和性を有する結合メンバーである］
からなる群から選択され；
試験下の試料において、該リガンドもしくは分析対象に結合する結果として、または該リガンドもしくは分析対象の濃度の変化の結果として蛍光特性の検出可能な変化を示す、バイオセンサー化合物を提供する。
【００５４】
ここで開示されるバイオセンサー化合物の、一部の実施形態において、Ａはクマリンであり、式Ａ−Ｙ’−Ｂのバイオセンサー化合物は以下の式：
【００５５】
【化１２】
0005453248.tif 000013
【００５６】
を有し、
式中、
ｑ’は１から８の整数であり；
Ｘ1’およびＸ2’はそれぞれ、Ｃ、Ｓ、およびＮからなる群から独立して選択され、ここで、Ｘ1’およびＸ2’の少なくとも一方はＮであり、ただし、（ｉ）Ｘ1’がＣもしくはＳである場合、Ｒ1’はＺであるか、またはＸ2’がＣもしくはＳである場合、Ｒ2’はＺであり、Ｚは以下に定義されるとおりであり；（ｉｉ）Ｘ1’およびＸ2’の両方が同時にＮである場合、Ｒ1’およびＲ2’の少なくとも一方は存在せず；（ｉｉｉ）Ｘ1’がＮである場合、Ｒ1’は存在する場合Ｚ”であるか、またはＸ2’がＮである場合、Ｒ2’は存在する場合Ｚ”であり、ここで、Ｚ”は、
−（ＣＨ2）nＸ3’Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ4’、
【００５７】
【化１３】
0005453248.tif 000014
【００５８】
（式中、
ｎ、ｐ、およびｒは、それぞれ独立して、１から８の整数であり；
Ｘ3’はＯまたはＮＲ6’である）
からなる群から選択され；
Ｒ3’、Ｒ5’、Ｒ6’、Ｒ7’、Ｒ8’、およびＺはそれぞれ、Ｈ、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシシクロアルキル、アルコキシシクロアルキル、アミノアルキル、アシルオキシル、アルキルアミノアルキル、およびアルコキシカルボニルからなる群から独立して選択されるか；または
Ｒ7’およびＲ8’は一緒になって、Ｃ2からＣ10アルキル、Ｃ2からＣ10置換アルキル、またはＣ2からＣ10アルキレンを表し；
Ｒ4’は−（ＣＨ2）m'−Ｂであり；
ここで、ｍ’は１から８の整数であり；
Ｂは、検出されるリガンドまたは分析対象に対して結合親和性を有する結合メンバーである。
【００５９】
一部の実施形態において、バイオセンサー化合物は、
【００６０】
【化１４】
0005453248.tif 000015
【００６１】
からなる群から選択される。
【００６２】
一部の実施形態において、結合メンバーＢは結合タンパク質である。本明細書で用いられるように、「結合タンパク質」という用語は、フルオロフォアとコンジュゲートした場合、標的分析対象もしくはリガンドが存在もしくは非存在であるか、または標的分析対象もしくはリガンドが時間経過とともに変化する濃度で存在する場合から区別できる検出可能な蛍光シグナルを生成することができるような特定の分析対象またはリガンドと相互作用するタンパク質を指す。「検出可能なシグナルを生成する」という用語は、リガンド−タンパク質結合の検出を可能とする仕方でレポーター基、例えば、フルオロフォアの特性の変化を認識する能力を指す。さらに、検出可能なシグナルを生成することは、可逆的または非可逆的であることができる。シグナル生成事象には、１回限りまたは再使用可能な用途も含めて、連続的、プログラム化された、および一時的な手段が含まれる。可逆的シグナル生成事象は、分析物の存在または濃度との相互関係が確立されている限り、瞬間的であることができるかまたは時間依存性であることができる。
【００６３】
一部の実施形態において、ここで開示されるフルオロフォアとコンジュゲートした結合メンバーはポリペプチドまたはタンパク質を含む。一部の実施形態において、結合タンパク質は、Ｗ１８３Ｃ、ＳＭ４、およびＹ１０Ｃからなる群から選択される。ここで開示されるフルオロフォアによる使用に好適な代表的な結合タンパク質には、ペリプラズム結合タンパク質（ＰＢＰ）が含まれるが、これに限定されない。本明細書で用いられるように、ＰＢＰは、そのアミノ酸配列（一次構造）よりもむしろその三次元配置（三次構造）を特徴とするタンパク質であり、ローブ−ヒンジ−ローブ領域を特徴とする。ＰＢＰは通常、ＰＢＰのローブ間の谷間（ｃｌｅｆｔ）領域で特異的に分析物と結合する。さらに、谷間領域での分析物の結合は、その分析物の検出を可能にするＰＢＰへの立体配座の変化を引き起こすことができる。ここで開示されるフルオロフォアによる使用に好適なペリプラズム結合タンパク質には、本明細書で記載される構造特性を所有する任意のタンパク質が含まれる。ＰＢＰの特徴的なローブ−ヒンジ−ローブ構造を決定するためにタンパク質の三次元構造を分析することは、十分に当業者の能力の範囲内である。ＰＢＰの例には、グルコース−ガラクトース結合タンパク質（ＧＧＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、リボース結合タンパク質（ＲＢＰ）、アラビノース結合タンパク質（ＡＢＰ）、ジペプチド結合タンパク質（ＤＰＢＰ）、グルタメート結合タンパク質（ＧｌｕＢＰ）、鉄結合タンパク質（ＦｅＢＰ）、ヒスチジン結合タンパク質（ＨＢＰ）、ホスフェート結合タンパク質（ＰｈｏｓＢＰ）、グルタミン結合タンパク質（ＱＢＰ）、オリゴペプチド結合タンパク質（ＯｐｐＡ）、またはそれらの誘導体、ならびに、ペリプラズム結合タンパク質様Ｉ（ＰＢＰ−様Ｉ）およびペリプラズム結合タンパク質様ＩＩ（ＰＢＰ−様ＩＩ）として知られているタンパク質のファミリーに属する他のタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。ＰＢＰ−様ＩおよびＰＢＰ−様ＩＩタンパク質は、平行βシートおよび隣接αヘリックスから構成される２つの同様のローブドメインを有する。グルコース−ガラクトース結合タンパク質（ＧＣＢＰ）はタンパク質のＰＢＰ−様Ｉファミリーに属するが、一方、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）はタンパク質のＰＢＰ−様ＩＩファミリーに属する。リボース結合タンパク質（ＲＢＰ）もタンパク質のＰＢＰファミリーのメンバーである。ペリプラズム結合タンパク質の他の非限定的な例は表Ｉに記載される。
【００６４】
【表１−１】
0005453248.tif 000016
【００６５】
【表１−２】
0005453248.tif 000017
【００６６】
【表１−３】
0005453248.tif 000018
【００６７】
【表１−４】
0005453248.tif 000019
【００６８】
結合メンバーを含むことができるタンパク質の他の例には、腸内脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＰＢ）が含まれるが、これに限定されない。ＦＡＢＰは、肝臓、腸、腎臓、肺、心臓、骨格筋、脂肪組織、異常皮膚、脂肪、内皮細胞、乳腺、脳、胃、舌、胎盤、睾丸、網膜で少なくとも発現されるタンパク質のファミリーである。ＦＡＢＰのファミリーは、一般的に言えば、非共有相互作用によって脂肪酸および他の疎水性リガンドに結合する低分子量細胞内タンパク質（約１４ｋＤａ）のファミリーである。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、非特許文献１を参照されたい。タンパク質のＦＡＢＰファミリーのメンバーには、遺伝子ＦＡＢＰ１、ＦＡＢＰ２、ＦＡＢＰ３、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５、ＦＡＢＰ６、ＦＡＢＰ７、ＦＡＢＰ（９）およびＭＰ２が含まれるが、これらに限定されない。ＦＡＢＰに属するタンパク質には、Ｉ−ＦＡＢＰ、Ｌ−ＦＡＢＰ、Ｈ−ＦＡＢＰ、Ａ−ＦＡＢＰ、ＫＬＢＰ、ｍａｌ−１、Ｅ−ＦＡＢＰ、ＰＡ−ＦＡＢＰ、Ｃ−ＦＡＢＰ、Ｓ−ＦＡＢＰ、ＬＥ−ＬＢＰ、ＤＡ１１、ＬＰ２、メラニン形成阻害剤などが含まれるが、これらに限定されない。
【００６９】
一部の実施形態において、結合メンバーは、ＧＧＢＰ、ＦＡＢＰおよびＧＧＢＰ誘導体からなる群から選択される。ここで開示される主題の１つの実施形態において、変異グルコース／ガラクトース結合タンパク質（ＧＧＢＰ）は、検出可能なレポーター基、例えば、クマリン系フルオロフォアを含み、この検出可能な特性はグルコース結合後に変化する。検出可能な特性の変化は、変異ＧＧＢＰに結合したフルオロフォアの環境の変化または結合から生じるタンパク質の立体配座の変化によることができる。一部の実施形態において、ＦＡＢＰはＩ−ＦＡＢＰである。
【００７０】
本明細書で用いられるように、「タンパク質の誘導体」または「ポリペプチドの誘導体」は、野生型タンパク質と実質的な配列同一性を共有するタンパク質またはポリペプチドである。ここで開示される主題の誘導タンパク質またはポリペプチドは、当業者によく知られている技術によって作製または調製することができる。
【００７１】
このような技術の例には、突然変異生成および直接合成が含まれるが、これらに限定されない。誘導タンパク質は、翻訳後プロセシングなどの自然過程によって、または当技術分野でよく知られている化学修飾技術によって修飾することができる。このような修飾は、基礎的な教科書およびより詳しい論文、ならびに多量の研究文献に十分に記載されている。
【００７２】
修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含むポリペプチド鎖のどこにも起こり得る。同じ種類の修飾は所与のポリペプチドまたはタンパク質のいくつかの部位において同じまたは様々な程度で存在することができることが理解される。また、所与のポリペプチドまたはタンパク質は、２以上の修飾を含むことができる。修飾の例には、グリコシル化、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニン化などのタンパク質へのアミノ酸の転移−ＲＮＡ介在付加、およびユビキチン化が含まれるが、これらに限定されない。ポリペプチドまたはタンパク質は、ユビキチン化の結果としてさらに分岐させることもでき、それらは分岐を有してまたは有さずに環状であることができる。（例えば、それらのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる、非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４および非特許文献５を参照されたい。誘導タンパク質の例には、変異および融合タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【００７３】
「変異タンパク質」は、それが当技術分野で知られているように本明細書において用いられる。一般に、変異タンパク質は、タンパク質またはポリペプチドの野性型一次構造の付加、欠失または置換によって生成させることができる。変異には、例えば、システイン基の付加または置換、非天然起源のアミノ酸、および反応性アミノ酸による実質的に非反応性アミノ酸の置換が含まれる。変異タンパク質は、特異的な仕方で２種以上の分析対象に結合するように変異させることができる。事実、変異タンパク質は、その野性型分析対象およびその他の標的リガンドに対する特異性を有することができる。同様に、変異タンパク質は、野性型結合タンパク質が結合しない分析対象（単数または複数）に結合することだけができることもあり得る。変異タンパク質を生成させる方法は、当技術分野でよく知られている。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、非特許文献６には、タンパク質に対する新たな分析物結合特性を与えるペリプラズム結合タンパク質内に結合部位を再設計する方法が開示されている。これらの変異結合タンパク質は、立体配座の変化を受ける能力を保持し、これは分析対象結合後に直接生成されるシグナルを生じることができる。５から１７個の間のアミノ酸変化を導入することによって、Ｌｏｏｇｅｒらは、いくつかの変異タンパク質を構築し、それぞれ、ＴＮＴ（トリニトロトルエン）、Ｌ−乳酸塩、またはセロトニンに対する新たな選択性を有した。例えば、Ｌｏｏｇｅｒらは、ＡＢＰ、ＧＧＢＰ、ＲＢＰ、ＨＢＰおよびＱＢＰからＬ−乳酸塩結合タンパク質を生成した。
【００７４】
表ＩＩには、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、非特許文献６から取られた、ＧＧＢＰに対する他の変異が記載されている。
【００７５】
【表２】
0005453248.tif 000020
【００７６】
ＧＧＢＰタンパク質、例えば、２３アミノ酸リーダー配列（すなわち、成熟鎖）をもたないＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号Ｐ０２９２７のＧＧＢＰタンパク質の変異の例には、位置１１でリシンを置換したシステイン（Ｋ１１Ｃ）、位置１４でアスパラギン酸を置換したシステイン（Ｄ１４Ｃ）、位置１９でバリンを置換したシステイン（Ｖ１９Ｃ）、位置４３でアスパラギンを置換したシステイン（Ｎ４３Ｃ）、位置７４でグリシンを置換したシステイン（Ｇ７４Ｃ）、位置１０７でチロシンを置換したシステイン（Ｙ１０７Ｃ）、位置１１０でスレオニンを置換したシステイン（Ｔ１１０Ｃ）、位置１１２でセリンを置換したシステイン（Ｓ１１２Ｃ）、位置１１２でセリンを置換したシステインおよび位置２３８でロイシンを置換したセリンを含む二重変異（Ｓ１１２Ｃ／Ｌ２３８Ｓ）、位置１１３でリシンを置換したシステイン（Ｋ１１３Ｃ）、位置１３７でリシンを置換したシステイン（Ｋ１３７Ｃ）、位置１４９でグルタミン酸を置換したシステイン（Ｅ１４９Ｃ）、位置１４９でグルタミン酸を置換したシステインおよび位置２１３でアラニンを置換したアルギニンを含む二重変異（Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｒ）、位置１４９でグルタミン酸を置換したシステインおよび位置２３８でロイシンを置換したセリンを含む二重変異（Ｅ１４９Ｃ／Ｌ２３８Ｓ）、位置２１３でアラニンを置換したセリンおよび位置１５２でヒスチジンを置換したシステインを含む二重変異（Ｈ１５２Ｃ／Ａ２１３Ｓ）、位置１８２でメチオニンを置換したシステイン（Ｍ１８２Ｃ）、位置２１３でアラニンを置換したシステイン（Ａ２１３Ｃ）、位置２１３でアラニンを置換したシステインおよび位置２３８でロイシンを置換したシステインを含む二重変異（Ａ２１３Ｃ／Ｌ２３８Ｃ）、位置２１６でメチオニンを置換したシステイン（Ｍ２１６Ｃ）、位置２３６でアスパラギン酸を置換したシステイン（Ｄ２３６Ｃ）、位置２３８でロイシンを置換したシステイン（Ｌ２３８Ｃ）、位置２８７でアスパラギン酸を置換したシステイン（Ｄ２８７Ｃ）、位置２９２でアルギニンを置換したシステイン（Ｒ２９２Ｃ）、位置２９６でバリンを置換したシステイン（Ｖ２９６Ｃ）、位置１４９でグルタミン酸を置換したシステインおよび位置２１３でアラニンを置換したセリンおよび位置２３８でロイシンを置換したセリンを含む三重変異（Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｓ／Ｌ２３８Ｓ）、位置１４９でグルタミン酸を置換したシステインおよび位置２１３でアラニンを置換したアルギニンおよび位置２３８でロイシンを置換したセリンを含む三重変異（Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｒ／Ｌ２３８Ｓ）、１４９でグルタミン酸を置換したシステインおよび位置２１３でアラニンを置換したシステインおよび位置２３８でロイシンを置換したセリン（Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｃ／Ｌ２３８Ｓ）を有することが含まれるが、これらに限定されない。
【００７７】
変異はいくつかの目的の１つまたは複数に働くことができる。例えば、天然起源タンパク質は変異して、タンパク質の熱安定性を含む長期安定性を変化させる、特定のカプセル化マトリックスまたはポリマーとタンパク質をコンジュゲートさせる、検出可能なレポーター基に結合部位を与える、特定の分析対象に関してその結合定数を調整することができ、またはそれらの組合せであることができる。
【００７８】
分析対象および変異タンパク質は結合パートナーとして作用することができる。本明細書で用いられるような「会合する（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）」または「結合する（ｂｉｎｄ）」という用語は、検出手段によってタンパク質への結合の検出を可能とさせるのに十分に強力な相対結合定数（Ｋｄ）を有する結合パートナーを指す。Ｋｄは、半分のタンパク質が結合している（またはその逆である）遊離の分析対象の濃度として計算することができる。目的の分析対象がグルコースである場合、結合パートナーのＫｄ値は、約０．０００１ｍＭから約５０ｍＭである。
【００７９】
結合特性を変化させることに加えて、誘導ポリペプチドまたはタンパク質は、結合メンバー上にまたはその内部にここで開示されるフルオロフォアを取り込むために用いることもできる。フルオロフォアは、限定されないが、三次元立体配座の変化、タンパク質様結合ドメインのアミノ酸側鎖の配列の変化、および結合メンバーのレドックス状態を含む、結合メンバーの変化を示すために用いることができる。タンパク質の一次構造中への１個または複数の残基の付加／置換に関して、現在の方法および組成物で用いられる一部の標識部分は、例えば、還元、酸化、結合、および縮合の反応などの化学的手段によって結合させることができる。タンパク質を標識するために通常用いられる残基の例には、リシンおよびシステインが含まれるが、これらに限定されない。例えば、任意のチオール−反応基は、ポリペプチドの一次構造中の天然起源または工学処理システインに結合させるためにフルオロフォアを用いることができる。また、例えば、リシン残基は、フルオロフォアのスクシンイミドエステル誘導体を用いて標識することができる。参照により本明細書に組み込まれる、非特許文献７を参照されたい。
【００８０】
フルオロフォアは、当技術分野で知られている任意の従来手段によって変異タンパク質、例えば、ＧＧＢＰに結合させることができる。例えば、レポーター基は、タンパク質上のアミンまたはカルボキシル残基を介して結合させることができる。例示的な実施形態には、変異または天然タンパク質のシステイン残基上のチオール基を介する共有カップリングが含まれる。例えば、変異ＧＧＢＰについて、システインは、位置１０、位置１１、位置１４、位置１５、位置１９、位置２６、位置４３、位置７４、位置９２、位置９３、位置１０７、位置１１０、位置１１２、位置１１３、位置１３７、位置１４９、位置１５２、位置１５４、位置１８２、位置１８３、位置１８６、位置２１１、位置２１３、位置２１６、位置２３８、位置２４０、位置２４２、位置２５５、位置２５７、位置２８７、位置２９２、位置２９４、および位置２９６に位置させることができる。
【００８１】
ここで開示される蛍光色素は、蛍光の所望の変化を得るために部位−特異的な仕方で結合タンパク質に共有結合させることができる。蛍光色素は、立体配座の変化が蛍光特性の変化を最大化するように、結合タンパク質上の部位において結合させることができる。様々な部位、例えば、変異ＧＧＢＰに構築されたシステイン変異部位において結合したフルオロフォアを含むコンジュゲートは、スクリーニングして、グルコース結合後に蛍光の最大変化をもたらす部位を同定することができる。
【００８２】
一部の実施形態において、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｎａｒｄらに対する特許文献２に記載されているように、結合メンバーは受容体の少なくとも１つの断片であり、受容体は天然のタンパク質であり、活性部位を介して適切なリガンドに結合することができ、断片の少なくとも１個のアミノ酸残基は活性部位の近傍に位置し、システイン残基であるかまたはシステイン残基で置換されている。
【００８３】
本明細書で用いられるように、「受容体」という用語は、リガンドに結合することができる活性部位を有するタンパク質高分子を指す。より特に、「受容体」は、抗体、ホルモンもしくは細菌受容体、親和性タンパク質、輸送タンパク質、ウイルス受容体、またはリガンドに対して特異的親和性を有する任意のポリペプチドを指す。
【００８４】
一部の実施形態において、受容体は１つまたは複数のジスルフィド架橋を有することができる。一部の実施形態において、受容体は、限定されないが、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、もしくはＦａｂ断片、またはミニ抗体を含む、抗体または抗体断片であることができる。一部の実施形態において、抗体は天然または人工のモノクローナル抗体であることができる。
【００８５】
本明細書で用いられるように、「リガンド」という用語は、活性部位を介して受容体に結合することができる任意の分子を指す。一部の実施形態において、リガンドは、タンパク質、ペプチドもしくは細菌性抗原などのハプテン抗原、またはホルモン、サイトカイン、インターロイキン、癌壊死因子（ＴＮＦ）、成長因子、ウイルスタンパク質、またはペプチドもしくはヌクレオチド配列である。
【００８６】
本明細書で用いられるように、例えば、「受容体または受容体断片の活性部位」に言及する場合「活性部位」という用語は、リガンドの結合に寄与する受容体または受容体断片のアミノ酸残基を指す。この活性部位はまた、「結合部位」または「パラトープ」と称することもできる。
【００８７】
本明細書で用いられるような「近傍」という用語は、リガンドと直接接触している受容体のアミノ酸残基、水分子によって接触している受容体のアミノ酸残基、およびそれらに対して溶媒接近表面領域（ＡＳＡ）が、その用語が当技術分野で知られているように（例えば、非特許文献８を参照されたい）、リガンドの結合によって変えられている受容体のアミノ酸残基の位置を指す。
【００８８】
Ｃ．代謝産物の存在または量を検出する方法
一部の実施形態において、ここで開示される主題は、試料中の１種または複数の分析対象の存在または量を決定する方法であって、
（ａ）少なくとも１つの変異結合タンパク質を、該変異結合タンパク質のチオール基によってそれに共有結合しているフルオロフォアとともに有するバイオセンサー化合物であって、以下の式：
Ａ−Ｙ’−Ｂ
を有し、
式中、
Ａは、クマリン核およびアザクマリン核からなる群から選択され；
Ｙ’は、
【００８９】
【化１５】
0005453248.tif 000021
【００９０】
［式中、
（式中、
ｓ’およびｔ’は、それぞれ独立して、１から８の整数であり；
Ｘ1’およびＸ2’はそれぞれ、Ｃ、Ｓ、およびＮからなる群から独立して選択され、ここで、Ｘ1’およびＸ2’の少なくとも一方はＮであり、ただし、（ｉ）Ｘ1’がＣもしくはＳである場合、Ｒ1’はＺであるか、またはＸ2’がＣもしくはＳである場合、Ｒ2’はＺであり、Ｚは以下で定義されるとおりであり；（ｉｉ）Ｘ1’およびＸ2’の両方が同時にＮである場合、Ｒ1’およびＲ2’の少なくとも一方は存在せず；（ｉｉｉ）Ｘ1’がＮである場合、Ｒ1’は存在する場合Ｚ’であるか、またはＸ2’がＮである場合、Ｒ2’は存在する場合Ｚ”であり、ここで、Ｚ”は、
−（ＣＨ2）nＸ3’Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ4’、
【００９１】
【化１６】
0005453248.tif 000022
【００９２】
（式中、
ｎ、ｐおよびｒは、それぞれ独立して、１から８の整数であり；
Ｘ3’はＯまたはＮＲ6’である）
からなる群から選択され；
Ｒ3’、Ｒ5’、Ｒ6’およびＺはそれぞれ、Ｈ、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシシクロアルキル、アルコキシシクロアルキル、アミノアルキル、アシルオキシル、アルキルアミノアルキル、およびアルコキシカルボニルからなる群から独立して選択され；
Ｒ4’は−（ＣＨ2）m−Ｂであり；
式中、ｍは１から８の整数であり；
Ｂは、検出されるリガンドまたは分析対象に対して結合親和性を有する結合メンバーである］
からなる群から選択され；
試験下の試料において、該リガンドもしくは分析物に結合する結果として、または該リガンドもしくは分析対象の濃度の変化の結果として蛍光特性の検出可能な変化を示す、バイオセンサー化合物を提供する段階；
（ｂ）該バイオセンサー化合物を、１種または複数の分析対象を含む疑いがある試料と接触させて、該１種または複数の分析対象を、存在する場合、結合タンパク質に結合させる段階；
（ｃ）該１種または複数の分析対象を含む疑いがある試料を電磁放射で照射して、フルオロフォアに蛍光を発するようにさせる段階；および
（ｄ）蛍光特性を検出して、該試料中の１種または複数の分析対象の存在または量を決定する段階
を含む方法を提供する。
【００９３】
ここで開示される方法の一部の実施形態において、Ａはクマリンであり、式Ａ−Ｙ’−Ｂのバイオセンサー化合物は、以下の式：
【００９４】
【化１７】
0005453248.tif 000023
【００９５】
を有し、
式中、
ｑ’は１から８の整数であり；
Ｘ1’およびＸ2’はそれぞれ、Ｃ、Ｓ、およびＮからなる群から独立して選択され、ここで、Ｘ1’およびＸ2’の少なくとも一方はＮであり、ただし、（ｉ）Ｘ1’がＣもしくはＳである場合、Ｒ1’はＺであるか、またはＸ2’がＣもしくはＳである場合、Ｒ2’はＺであり、Ｚは以下に定義されるとおりであり；（ｉｉ）Ｘ1’およびＸ2’の両方が同時にＮである場合、Ｒ1’およびＲ2’の少なくとも一方は存在せず；（ｉｉｉ）Ｘ1’がＮである場合、Ｒ1’は存在する場合Ｚ”であるか、またはＸ2’がＮである場合、Ｒ2’は存在する場合Ｚ”であり、ここで、Ｚ”は、
−（ＣＨ2）nＸ3’Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ4’、
【００９６】
【化１８】
0005453248.tif 000024
【００９７】
（式中、
ｎ、ｐ、およびｒは、それぞれ独立して、１から８の整数であり；
Ｘ3’はＯまたはＮＲ6’である）
からなる群から選択され；
Ｒ3’、Ｒ5’、Ｒ6’、Ｒ7’、Ｒ8’、およびＺはそれぞれ、Ｈ、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシシクロアルキル、アルコキシシクロアルキル、アミノアルキル、アシルオキシル、アルキルアミノアルキル、およびアルコキシカルボニルからなる群から独立して選択されるか；または
Ｒ7’およびＲ8’は一緒になって、Ｃ2からＣ10アルキル、Ｃ2からＣ10置換アルキル、またはＣ2からＣ10アルキレンを表し；
Ｒ4’は−（ＣＨ2）m'−Ｂであり；
ここで、ｍ’は１から８の整数であり；
Ｂは、検出されるリガンドまたは分析対象に対して結合親和性を有する結合メンバーである。
【００９８】
一部の実施形態において、バイオセンサー化合物は、
【００９９】
【化１９】
0005453248.tif 000025
【０１００】
からなる群から選択される。
【０１０１】
一部の実施形態において、Ｂは上記に、より詳細に記載される結合タンパク質である。一部の実施形態において、結合タンパク質は、Ｗ１８３Ｃ、ＳＭ４、およびＹ１０Ｃからなる群から選択される。
【０１０２】
リガンド結合後発光波長のシフトを示す実施形態により、自己参照性であるここで開示されるフルオロフォアを含むバイオセンサーが可能となる。このような実施形態において、フルオロフォアは、グルコースなどの代謝産物の存在下で第１の発光波長での増大、および第２の発光波長での減少を示す。第１の発光波長と第２の波長の間の比を計算して、試験下の試料中のグルコースの濃度を決定することができる。このような自己参照性は、対照色素を必要とすることなくバイオセンサーの励起源の強度ならびに他の源のノイズおよび不安定性の変化を補正することができる。したがって、バイオセンサーの蛍光出力の比率測定応答を観察するために、単一の励起波長を用いることができる。本明細書で用いられるように、「比率測定応答」という用語は、第１の発光波長および第２の発光波長の強度は、この２つの発光波長の比（「比率測定係数」または「ＱＲ」）を試料中のリガンドまたは分析対象の存在および／または量、例えば、濃度を示すために用いることができるように独立して変化することを意味する。
【０１０３】
したがって、一部の実施形態において、ここで開示される方法は、（ａ）バイオセンサー化合物を１種または複数の分析対象を含む疑いがある試料と接触させる前に、第１の発光波長での蛍光強度を測定する段階；（ｂ）バイオセンサー化合物を１種または複数の分析対象を含む疑いがある試料と接触させた後に、第２の発光波長での蛍光強度を測定する段階；および（ｃ）第２の発光波長対第１の発光波長の比を決定して、試料中の１種または複数の分析対象の存在または量を決定する段階をさらに含む。
【０１０４】
フルオロフォア結合メンバーコンジュゲートへの１種または複数の分析物の結合は、識別可能な蛍光特性を生成するかまたは変化させる。蛍光特性の識別可能な変化には、発光波長シフトおよびシグナル強度の変化、例えば、増加または減少が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、標的分析対象に結合しない場合、ここで開示されるフルオロフォア結合メンバーコンジュゲートはシグナルを生成しない。他の実施形態において、標的分析対象に結合しない場合でさえもフルオロフォア結合メンバーコンジュゲートはシグナル、例えば、第１の発光波長を生成する。しかし、このような実施形態において、標的分析対象の結合は、結合が識別できるように、蛍光特性をなお変化させることができる。標的分析対象へのフルオロフォア結合メンバーの結合は、シグナル強度の減少をもたらすこともできる。
【０１０５】
結合タンパク質の立体配座の変化、蛍光色素のミクロ環境におけるその後の変化のいずれか、または両方による検出された蛍光特性もしくは検出された蛍光特性の変化は、１種または複数の分析対象の存在および／もしくは量、すなわち濃度と相関させることができる。ここで開示される方法の一部の実施形態において、変異結合タンパク質は、１種または複数の分析対象を含む疑いがある試料の分析対象の濃度の変化の結果として立体配座の変化を受ける。したがって、この方法は、分析対象の濃度の変化の結果として蛍光特性の変化を検出する。
【０１０６】
試験下の試料中に存在する１種または複数の分析対象の量は、濃度として表すことができる。本明細書で用いられるように、「濃度」という用語は、当技術分野でのその通常の意味を有する。濃度は、ネガティブ形式またはポジティブ形式の結果、例えば、標的分析物の存在もしくは不存在を示す「Ｙｅｓ」もしくは「ＮＯ」応答としてなどの、または量的値、例えば、ｍｇ／ｄＬの単位で表すことができる。さらに、所与の分析対象の濃度は、相対量または絶対量として報告することができる。本明細書で用いられるように、「量的結果」は、絶対値または相対値を与える結果を指す。
【０１０７】
分析対象の量（濃度）は、ゼロに等しいことができ、この場合、求められる特定の分析対象の不存在または特定の分析対象の濃度がアッセイの検出限界未満であることを示す。測定された量は、いずれの追加的な測定または操作もなしに、測定されたシグナル、例えば、蛍光であることができる。あるいは、測定された量は、特定の分析対象の測定値対別の化合物（限定されないが、標準または別の分析対象を含む）の測定値の差、パーセントまたは比として表すことができる。差は負であることができ、測定分析対象（複数可）の量の減少を示す。量はまた、時間の異なる点で測定して、分析対象（複数可）対それ自体の差または比として表すことができる。分析対象の量は、生成されたシグナルから直接決定することができるか、または生成されたシグナルはアルゴリズムで用いることができ、このアルゴリズムは、生成されたシグナルの値を試料中の分析対象（複数可）の量と相関させるように設計される。
【０１０８】
反応基、例えば、チオール−反応基を有するここで開示されるフルオロフォアは通常、約５７５ｎｍまたはそれを超える発光波長を示す。一部の実施形態において、ここで開示されるフルオロフォアは、約６１５ｎｍの発光波長を有する。このような発光特性を有するフルオロフォアは通常、生物学的系または分析対象中の他の成分、例えば、グルコース、を原因とするバックグラウンド干渉を回避または最小化する。さらに、長い発光波長（例えば、約５７５ｎｍまたはそれを超える）で動作するフルオロフォアは、インビボでのバイオセンサーとして用いることができる。例えば、このようなフルオロフォアは、移植可能なバイオセンサー装置中に組み込むことができる（ヒト皮膚は約５７５ｎｍ未満で不透明である）。
【０１０９】
１種または複数の標的分析対象の存在および／または量を検出するここで開示される方法において、１種または複数の標的分析対象を含む疑いがある試料は、レーザーまたは発光ダイオード（ＬＥＤ）などのエネルギー源で照射されて、蛍光色素を励起する。次いで、蛍光特性または蛍光特性の変化を検出することができる。
【０１１０】
一部の実施形態において、蛍光の波長および／または強度を測定するために蛍光光度計を用いることができる。ここで開示されるフルオロフォアとともに使用するのに適切な蛍光光度計の例は、参照により本明細書に組み込まれる、２００３年１１月２６日に出願された特許文献３に記載されている。
【０１１１】
蛍光発光およびその検出は、連続的に、または行われる分析対象、例えば、グルコースの散発的もしくは連続的検出を可能にするよう連続的または所定の間隔で断続的に行うことができる。したがって、ここで開示される蛍光色素は、１種または複数の分析対象の濃度を連続的に測定することができる装置による使用に敏感に反応する。したがって、一部の実施形態において、この方法は、連続的に（ａ）結合タンパク質を１種または複数の分析対象を含む疑いがある試料と接触させる段階；（ｂ）試料を電磁放射で照射する段階；および（ｃ）蛍光特性を検出する段階をさらに含む。本明細書で用いられるように、分析対象を測定することに関連して、「連続的」という用語は、装置の寿命の間、任意の時間で検出可能なシグナルを生成させるか、または生成させることができる装置を意味するために用いられる。検出可能なシグナルは、シグナルが検出されない場合でさえも、この装置がシグナルを常に生成させていることにおいて、一定であることができる。あるいは、この装置は、任意の所望の時間に検出可能なシグナルを生成させ、そして検出できるように、一時的に使用することもできる。
【０１１２】
ここで開示される主題では、目的の特定の分析対象（単数または複数）に対する特異的結合パートナーを用いることができる方法が提供される。本明細書で用いられるように、特異的結合パートナーまたはメンバーは、特異的結合対のメンバーである。「特異的結合対」は、化学的または物理的手段によって分子の１つが第２の分子に特異的に結合する２つの異なる分子を指す。この意味において、分析物は特異的結合対の相互的メンバーである。さらに、特異的結合対には、元の特異的結合パートナーの類似体、例えば、分析対象と同様の構造を有する分析対象−類似体を含むことができる。「同様の」は、例えば、分析対象−類似体が、当技術分野でよく知られているアライメントプログラムおよび標準パラメータを用いて分析対象のアミノ酸配列と比較して少なくとも約６０％もしくは６５％の配列相同性、約７０もしくは７５％の配列相同性、約８０％もしくは８５％の配列相同性、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えるアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列を有することを意味する。分析対象の類似体は分析対象と同じ機能を有することもできる。
【０１１３】
本明細書で用いられるように、「分析対象」という用語は一般に、試験試料に存在しているかまたは存在している疑いがあり得る、検出される物質を指す。より特に、「分析対象」は、それに対して天然起源の特異的結合パートナー、例えば、結合タンパク質もしくは受容体が存在する、またはそれに対して特異的結合パートナーを調製することができる任意の物質であることができる。したがって、「分析対象」は、アッセイにおいて１種または複数の特異的結合パートナーに結合することができる物質である。一部の実施形態において、分析対象は、検出または測定される、少なくとも１つの結合部位を有する任意の化合物、例えば、代謝産物などであることができる。
【０１１４】
標的分析対象は、その存在または量が試験下の試料において決定される任意の分子または化合物であることができる。ここで開示される方法で測定することができる分析対象のクラスの例には、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、脂肪酸、脂質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、グリコタンパク質またはプロテオグリカン、リポタンパク質、リポ多糖類、薬剤、薬剤代謝産物、有機小分子、無機分子および天然または合成ポリマーが含まれるが、これらに限定されない。標的分析対象の例には、グルコース、遊離脂肪酸、乳酸、Ｃ反応性タンパク質および抗炎症メディエータ、例えば、サイトカイン、エイコサノイド、またはロイコトリエンが含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、標的分析対象は、脂肪酸、Ｃ反応性タンパク質、およびロイコトリエンからなる群から選択される。別の実施形態において、標的分析対象は、グルコース、乳酸および脂肪酸からなる群から選択される。
【０１１５】
本明細書で用いられるように、「炭水化物」という用語には、単糖類、二糖類、オリゴ糖および多糖類が含まれるが、これらに限定されない。「炭水化物」にはまた、糖類の伝統的な定義に入らない、炭素、水素および酸素を含む分子、すなわち、少なくとも３個の炭素原子を含む、直鎖ポリヒドロキシルアルコールのアルデヒドまたはケトン誘導体が含まれるが、これらに限定されない。したがって、例えば、本明細書で用いられるような炭水化物は、３個より少ない炭素原子を含んでいてもよい。
【０１１６】
本明細書で用いられるような「脂肪酸」という用語には、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）および他の分子とエステル化された脂肪酸を含めて、すべての脂肪酸が含まれる。具体的な脂肪酸の例には、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、オレイン酸塩、リノール酸塩、リノレン酸塩、およびアラキドン酸塩が含まれるが、これらに限定されない。「遊離脂肪酸」という用語は、当技術分野で知られているように、ＦＦＡが、例えば、トリグリセリドまたはリン脂質などの他の分子の一部でないものとして本明細書において用いられる。遊離脂肪酸にはまた、アルブミンに結合しているまたはその上に吸着されている非エステル化脂肪酸も含まれる。本明細書で用いられるように、「非結合遊離脂肪酸」（非結合ＦＦＡ）という用語は、アルブミンまたは他の血清タンパク質に結合していないまたはこれらに吸着されていない遊離脂肪酸（単数または複数）を意味するために用いられる。
【０１１７】
本明細書で用いられるように、「脂質」という用語は、当技術分野で現在あるとおりに、すなわち、水溶媒にわずかに溶けるにすぎない以外はほとんどの有機溶媒に容易に溶解する、非極性化学基から主にまたはそれのみからできている生物起源の物質として用いられる。脂質の例には、脂肪酸、トリアシルグリセロール、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、コレステロール、ステロイドおよびそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。例えば、「脂質」には、限定されないが、セラミドが含まれ、これは、例えば、スフィンゴミエリン、セレブロシドおよびガングリオシドなどのスフィンゴ脂質の誘導体およびセラミドの誘導体である。「脂質」にはまた、例えば、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロールなどのグリセロリン脂質（またはリン脂質）の一般的なクラスが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１８】
本明細書で用いられるように、「薬剤」は、知られている薬剤または、特定の細胞型に対するその活性または効果がまだ知られていない薬剤候補であってもよい。「薬剤代謝産物」は、別の化合物（単数または複数）に化学的に変化させられている薬剤の任意の副産物または崩壊産物である。本明細書で用いられるように、「有機小分子」には、本明細書で強調された他の分類へ正確にあてはまらない有機分子または化合物が含まれるが、これらに限定されない。より特に、本明細書で用いられるような「有機小分子」という用語は、比較的低分子量であり、かつタンパク質、ポリペプチド、または核酸でない、天然起源または人工的に生成された（例えば、化学合成を介して）にかかわらない有機化合物を指す。通常、小分子は、約１５００ｇ／モル未満の分子量を有する。また、小分子は通常、複数の炭素−炭素結合を有する。
【０１１９】
本明細書で用いられるように、「試料」という用語には、全血液または全血液成分、例えば、赤血球、白血球、血小板、血清および血漿；腹水（ａｓｃｉｔｅｓ）；尿；唾液；汗；乳液；滑液；腹水（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｆｌｕｉｄ）；羊水；脳周囲脊髄液；リンパ液；肺塞栓症液；脳脊髄液；心嚢液；子宮頚膣試料；組織抽出物；細胞抽出物；および目的の分析対象を含む疑いがある身体の他の成分を含む、生理液などの生物源由来の試料を含む任意の液体または体液試料が含まれる。生理液に加えて、環境または食物生産のアッセイの実施のために、他の液体試料、例えば、水、食品などが、ここで開示される主題による使用に好適である。分析対象を含む疑いがある固体物質もその試験試料として用いることができる。ある場合には、固体試験試料を変性して、液体媒体を形成させるかまたは分析対象を放出させることが有益であることもある。
【０１２０】
一部の実施形態において、血液から血漿を調製する、粘性体液を希釈するなど、使用前に前処理することができる。このような処理方法には、ろ過、蒸留、濃縮、干渉化合物の不活性化、および反応剤の添加を含むことができる。
【０１２１】
試料は対象から得られる任意の試料であることができる。「対象」という用語は、試料をそれから得ることができる生物、組織、または細胞を指す。対象には、状態または疾患の診断および／または治療などの医学目的のヒト対象、または医学、獣医学的目的、または開発目的のための動物対象を含むことができる。対象にはまた、組織培養、細胞培養、臓器複製、幹細胞産物などからの試料材料を含むことができる。好適な動物対象には、哺乳動物および鳥類が含まれる。本明細書で用いられるような「鳥類」という用語には、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、七面鳥、および雉が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で用いられるような「哺乳動物」の用語には、霊長類（例えば、ヒト、サル、類人猿など）；ウシ亜科動物（例えば、蓄牛、雄牛など）；ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）（例えば、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）など）；ヤギ（ｃａｐｒｉｎｅ）（例えば、ヤギ（ｇｏａｔ）など）；ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）（例えば、ブタ（ｐｉｇ、ｈｏｇ）など）；ウマ科（例えば、ウマ、ロバ、シマウマなど）；ネコ科（野生および家ネコを含む）；イヌ科（イヌを含む）；ウサギ目（ウサギ、野ウサギなどを含む）；および齧歯動物（マウス、ラットなどを含む）が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、対象は哺乳動物または哺乳動物細胞である。より好ましくは、対象はヒトまたはヒト細胞である。ヒト対象には、胎児、新生児、幼児、若年者および成人の対象が含まれるが、これらに限定されない。さらに、「対象」には、状態または疾患に苦しんでいるまたは苦しんでいる疑いがある患者を含めることができる。したがって、「対象」および「患者」という用語は本明細書において同義的に用いられる。対象は、実験室における細胞もしくは細胞の集合、または生存可能性、分化、マーカー産生、発現などのための試験におけるバイオプロセスで作る培養物も指す。
【０１２２】
ここで開示される方法は、予後診断、または疾患状態もしくは状態のモニタリングのための、診断に用いることができる。本明細書で用いられるように、「診断」という用語は、疾患、障害または他の医学的状態の治療の存在、不存在、重症度または治療過程が評価される予測過程を指す。本明細書における目的のために、診断には、治療から生じる転帰を決定するための予測過程も含まれる。同様に、「診断する」という用語は、試料試験体が、状態または疾患の１つまたは複数の特徴を示すかどうかの決定を指す。「診断する」という用語には、例えば、標的抗原もしくは反応剤結合標的の存在もしくは不存在を確立すること、あるいは、その種類、等級、段階、または同様の状態を含む、状態もしくは疾患の１つまたは複数の特徴を確立する、またはそうでなければ決定することが含まれる。本明細書で用いられるように、「診断する」という用語には、１つの形態の疾患を別のものと区別することを含むことができる。「診断する」という用語は、状態または疾患の初期診断または検出、予後診断、およびモニタリングを包含する。
【０１２３】
「予後診断」という用語およびその派生は、疾患または状態の過程の決定または予測を指す。疾患または状態の過程は、例えば、平均寿命または生活の質に基づいて決定することができる。「予後診断」には、治療（単数または複数）をしてまたはぜずに、疾患または状態の経時変化の決定が含まれる。治療（複数可）が企図される場合、予後診断には、疾患または状態のための治療の有効性を決定することが含まれる。
【０１２４】
本明細書で用いられるように、「リスク」という用語は、特定の転帰の可能性が評価される予測過程を指す。
【０１２５】
「疾患または状態の過程をモニターすること」におけるなどの「モニタリング」という用語は、疾患または状態を有するかまたは有する疑いがある対象から得られた試料継続的に診断することを指す。
【０１２６】
「マーカー」という用語は、試料中で検出される場合、疾患もしくは状態の特徴であるか、またはその存在を示す、抗原を含むタンパク質などの分子を指す。
【０１２７】
ここで開示される主題では、慢性疾患、例えば、限定されないが、心疾患、冠動脈疾患、糖尿病、代謝障害、炎症性疾患（例えば、関節リウマチ）、および癌を含む、対象における疾患状態をモニターする方法も提供される。代謝障害には、高脂血症、低リポタンパク症、甲状腺機能亢進症、および甲状腺機能低下症を含むことができるが、これらに限定されない。
【０１２８】
さらに、ここで開示される方法は、慢性疾患の特異的なマーカーをモニターするために用いることができる。分子人工物の濃度、代謝産物、および疾患状態の有害および／または有益分子をモニターすることによって、対象の進行、退行または安定性を評価することができ、治療もやはり、それに応じて調整または変更することができる。例えば、ここで開示されるバイオセンサーを用いてインビボでモニターすることができる心疾患のマーカーには、全脂肪酸、乳酸塩、グルコース、遊離脂肪酸および種々の強心剤（例えば、限定されないが、強心配糖体および交感神経興奮剤など）が含まれるが、これらに限定されない。糖尿病のマーカーには、グルコース、乳酸塩および脂肪酸が含まれるが、これらに限定されない。同様に、冠動脈疾患のためのマーカーには、Ｃ反応性ペプチドおよび遊離脂肪酸が含まれるが、これらに限定されない。一般に、種々の代謝障害のマーカーには、特異的脂肪酸が含まれるが、これに限定されない。
【０１２９】
ここで開示される蛍光色素は、薬剤治療をモニターするための装置での使用にも好適である。実際、バイオセンサーは、薬剤、薬剤候補または薬剤代謝産物に特異的に結合するように設計することができる。このように、薬剤の血漿濃度をモニターすることができ、投与量をこのセンサーによって得られる濃度測定値に基づいて調整または維持することができる。したがって、薬剤の血漿濃度を決定する薬剤または薬剤代謝産物に特異的および可逆的に結合することできるバイオセンサーの使用を含めて、特定の対象に対して医薬計画を個別化することができる。次いで、センサーにより得られる濃度を用いて、対象における薬剤の生物学的利用能を決定することができる。次いで、対象に投与される薬剤の用量は、毒性を避けて最大の治療利益を与えるために、対象への薬剤の生物学的利用能を増加または減少させるために変更することができる。
【０１３０】
ここで開示されるフルオロフォアを含むバイオセンサー装置は、種々の代謝産物を同時にモニターするために用いることができ、その測定値を対象の代謝または身体状態のプロフィールを与えるために使用することができる。例えば、長期間の激しい運動の間に、グルコースは嫌気性プロセスで乳酸に分解される。ここで開示されるバイオセンサーは、運動選手の乳酸閾値を決定するために使用することができ、トレーニングの効果を最大化し、回復時間を減少させることができる。同様に、バイオセンサーは、兵士の乳酸閾値を決定ために使用することができ、疲労および消耗を防ぎ、回復時間を減少させることができる。その目的のために、ここで開示されるバイオセンサーは、運動または身体ストレスの間のグルコース濃度、乳酸濃度および他の代謝産物をモニターするために使用することができる。
【０１３１】
一部の実施形態において、ここで開示されるフルオロフォアは、シグナル、例えば、放射光をそのシグナルを検出することができる検出器に搬送することができるバイオセンサー装置により使用することができる。一部の実施形態において、この装置は検出器を備え、一方、他の実施形態において、この装置は検出器を備えない、すなわち、検出器は装置外部である。装置によって生成されるシグナルは、フルオロフォアと結合した、結合メンバー、例えば、結合タンパク質または受容体への１種または複数の標的分析対象の結合の直接の指標であることができる。
【０１３２】
ここで開示されるフルオロフォアは、インビボ、インビトロおよびインサイチューを含む様々な設定での使用に好適なバイオセンサー装置で用いることができる。このような装置には、対象の代謝基質濃度をモニターするための医療装置または埋入物が含まれる。このような装置が対象に埋め込まれる場合、埋入物は、炎症／拒絶反応がほとんどまたはまったく検出できないほど生体適合性であるべきである。埋入物をより生体適合性にするための１つの手法は、例えば、ポリ（ウレタン）エラストマー、ポリ（尿素）およびポリ（塩化ビニル）などの生体適合性ポリマーで埋入物を被覆することを含む。例示的なバイオセンサー装置は、２００５年６月７日に出願された特許文献４、および特許文献３に記載され、それらのそれぞれはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３３】
ここで開示されるフルオロフォアを含むバイオセンサー装置は、例えば、緊急治療室もしくは術後回復室または病院などの救急施設において患者の状態または疾患状態をモニターするために使用することができる。例えば、対象のグルコース濃度をモニターする方法を与える実施形態において、グルコース濃度がモニターされ、正常に保たれる場合、術後患者において死亡率を３０％程度減少させることができることが研究により示されている。したがって、ここで開示されるバイオセンサーは、グルコースまたは他の代謝産物のモニタリングが対象の回復または健康全般に必須である状況で使用することができる。
【０１３４】
ここで開示されるバイオセンサーは、細片、埋入物、ミクロおよびナノ粒子などで使用することができるかまたはそれらにおける使用のために適合させることができる。
【０１３５】
ＩＩ．化学的定義
以下の用語は当業者によって十分に理解されると考えられるが、以下の定義は、ここで開示される主題の説明を容易にするために示される。別に定義されない限り、本明細書で用いられる技術および科学用語のすべては、このここで開示される主題が属する当業者によって普通に理解されるのと同じ意味を有する。
【０１３６】
本明細書および特許請求の範囲を通して、所与の化学式または名称は、光学および立体異性体のすべて、ならびにこのような異性体および混合物が存在する場合ラセミ混合物を包含するものである。
【０１３７】
「独立して選択される」という用語が用いられる場合、言及されている置換基（例えば、Ｒ基、例えば、基Ｒ1およびＲ2など、または基Ｘ1およびＸ2）は、同一であるかまたは異なっていることができる。例えば、Ｒ1およびＲ2の両方が置換アルキルであることができるか、またはＲ1が水素であることができ、Ｒ2が置換アルキルであることができるなどである。
【０１３８】
本明細書で特に断りのない限り、指定された「Ｒ」または「Ｘ」基は一般に、その名称を有する基に相当するとして当技術分野で認められている構造を有する。説明の目的のために、上に示されたような特定の代表的な「Ｒ」および「Ｘ」基は、以下に定義される。これらの定義は、本開示を検討後に当業者に明らかになる定義を補足および説明し、排除しないことが意図される。
【０１３９】
本明細書で用いられるように、「アルキル」という用語は、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、オクテニル、ブタジエニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、およびアレニル基を含む、直線状（すなわち、「直鎖」）、分岐、もしくは環状、飽和もしくは少なくとも部分的におよび一部の場合に完全に不飽和（すなわち、アルケニルおよびアルキニル）炭化水素鎖を含めたＣ1~20を指す。「分岐の」は、例えば、メチル、エチルまたはプロピルなどの低級アルキル基が直線状のアルキル鎖に結合しているアルキル基を指す。「低級アルキル」は、１から約８個の炭素原子（すなわち、Ｃ1~8アルキル）、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個の炭素原子を有するアルキル基を指す。「高級アルキル」は、約１０から約２０個の炭素原子、例えば、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個の炭素原子を有するアルキル基を指す。ある実施形態において、「アルキル」は、特に、Ｃ1~8直鎖アルキルを指す。他の実施形態において、「アルキル」は、特に、Ｃ1~8分岐鎖アルキルを指す。
【０１４０】
アルキル基は、１種または複数のアルキル基置換基で場合によって置換されている（「置換アルキル」）ことができ、このアルキル基置換基は同じであっても異なっていてもよい。「アルキル基置換基」という用語には、アルキル、置換されたアルキル、アミノ、ハロ、アリールアミノ、アシル、ヒドロキシル、アリールオキシル、アルコキシル、アルキルチオ、アリールチオ、アラルキルオキシル、アラルキルチオ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、オキソ、およびシクロアルキルが含まれるが、これらに限定されない。したがって、本明細書で用いられるように、「置換アルキル」という用語には、アルキル基の１個もしくは複数の原子または官能基が、例えば、アルキル、置換アルキル、ハロゲン、アリール、置換アリール、アルコキシル、ヒドロキシル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、スルフェートおよびメルカプトを含む、別の原子または官能基で置き換えられている、本明細書で定義されるアルキル基が含まれる。
【０１４１】
１個または複数の酸素、硫黄または置換もしくは非置換窒素原子をアルキル鎖に沿って場合によって挿入することができ、ここで、窒素置換基は、水素、低級アルキル（本明細書で「アルキルアミノアルキル」とも称される）、またはアリールである。したがって、「ヘテロアルキル」という用語は、アルキル基と一緒の１個または複数の炭素原子が、限定されないが、窒素、酸素、および／または硫黄原子などを含む、別の原子で置き換えられている、本明細書で定義されるアルキル基を指す。このようなヘテロアルキル基は、本明細書で定義される１個または複数のアルキル基置換基で置換することもできる。
【０１４２】
「環式」および「シクロアルキル」は、約３から約１０個の炭素原子、例えば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の炭素原子の非芳香族単環式または多環式の環系を指す。シクロアルキル基は、場合によって部分的に不飽和であることができる。シクロアルキル基は、本明細書で定義されるアルキル基置換基、オキソ、および／またはアルキレンで場合によって置換することもできる。１個または複数の酸素、硫黄または置換もしくは非置換の窒素原子を環状アルキル鎖に沿って場合によって挿入することができ、ここで、窒素置換基は、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、または置換アリールであり、したがって、ヘテロ環式基を与える。代表的な単環式シクロアルキル環には、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびシクロヘプチルが含まれる。多環式シクロアルキル環には、アダマンチル、オクタヒドロナフチル、デカリン、カンファー、カンファンおよびノルアダマンチルが含まれる。
【０１４３】
本明細書で用いられるような「シクロアルキルアルキル」という用語は、また上に定義されるアルキル基によって親分子部分に結合している、上記に定義されるシクロアルキル基を指す。シクロアルキルアルキル基の例には、シクロプロピルメチルおよびシクロペンチルエチルが含まれる。
【０１４４】
「シクロヘテロアルキル」または「ヘテロシクロアルキル」という用語は、同じであるか異なっていることができ、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される１個または複数のヘテロ原子を含む、３から７員の置換または非置換シクロアルキル環系などの非芳香族環系を指し、場合によって１つまたは複数の二重結合を含むことができる。シクロヘテロアルキル環は、他のシクロヘテロアルキル環および／または非芳香族炭化水素環に場合によって縮合またはそうでなければ結合していることができる。代表的なシクロヘテロアルキル環系には、ピロリジニル、ピロリニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペリジル、ピペラジニル、インドリニル、キヌクリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、チアジアジナニル、テトラヒドロフラニルなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４５】
本明細書で用いられるような「アルケニル」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む設計数の炭素原子の直鎖または分岐の炭化水素を指す。「アルケニル」の例には、ビニル、アリル、２−メチル−３−ヘプテンなどが含まれる。
【０１４６】
本明細書で用いられるような「シクロアルケニル」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む環状炭化水素を指す。シクロアルケニル基の例には、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロペンタジエン、シクロヘキセニル、１，３−シクロヘキサジエン、シクロヘプテニル、シクロヘプタトリエニル、およびシクロオクテニルが含まれる。
【０１４７】
本明細書で用いられるような「アルキニル」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む設計数の炭素原子の直鎖または分岐の炭化水素を指す。「アルキニル」の例には、プロパルギル、プロピン、および３−ヘキシンが含まれる。
【０１４８】
「アルキレン」は、１から約２０個の炭素原子、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個の炭素原子を有する直鎖または分岐の二価の脂肪族炭化水素を指す。アルキルレン基は、直鎖、分岐または環状であってもよい。アルキレン基はまた、場合によって不飽和であるかおよび／または１個もしくは複数の「アルキル基置換基」で置換されていてもよい。１個または複数の酸素、硫黄または置換もしくは非置換の窒素置換基（本明細書で「アルキルアミノアルキル」とも称される）をアルキレン基に沿って場合によって挿入されていてもよく、ここで、窒素置換基は前述のとおりのアルキルである。例示的なアルキレン基には、メチレン（−ＣＨ2−）；エチレン（−ＣＨ2−ＣＨ2−）；プロピレン（−（ＣＨ2）3−）；シクロヘキシレン（−Ｃ6Ｈ10−）；−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−；−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−；−（ＣＨ2）q−Ｎ（Ｒ）−（ＣＨ2）r−が含まれ、ここで、ｑおよびｒはそれぞれ独立して、０から約２０、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の整数であり、Ｒは、水素または低級アルキル；メチレンジオキシル（−Ｏ−ＣＨ2−Ｏ−）；およびエチレンジオキシル（−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−）である。アルキレン基は約２から約３個の炭素原子を有していてもよく、６〜２０個の炭素をさらに有していてもよい。
【０１４９】
「アリール」という用語は、芳香族単環または、一緒に縮合している、共有的に連結している、または共通の基、例えば、限定されないが、メチレンまたはエチレン部分に連結している芳香族多環であってもよい芳香族置換基を指すために本明細書で用いられる。共通の連結基は、ベンゾフェノンにおけるようなカルボニル、またはジフェニルエーテルにおけるような酸素、またはジフェニルアミンにおけるような窒素であってもよい。「アリール」という用語は特に、ヘテロ環式芳香族化合物を包含する。芳香族環（複数可）は、なかんずく、フェニル、ナフチル、ビフェニル、ジフェニルエーテル、ジフェニルアミンおよびベンゾフェノンを含んでいてもよい。特定の実施形態において、「アリール」という用語は、約５から約１０個の炭素原子、例えば、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の炭素原子を含む環式芳香族を意味し、５員および６員の炭化水素およびヘテロ環式芳香族環を含む。
【０１５０】
アリール基は、同じであるか互いに異なっていてもよい、１個または複数のアリール基置換基で場合によって置換されていてもよく（「置換アリール」）、ここで、「アリール基置換基」には、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アリールオキシル、アラルキルオキシル、カルボキシル、アシル、ハロ、ニトロ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アラルコキシカルボニル、アシルオキシル、アシルアミノ、アロイルアミノ、カルバモイル、アルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、アリールチオ、アルキルチオ、アルキレン、および−ＮＲ’Ｒ”（ここで、Ｒ’およびＲ”は、それぞれ独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、およびアラルキルであることができる）が含まれる。
【０１５１】
したがって、本明細書で用いられるように、「置換アリール」という用語には、アリール基の１個もしくは複数の原子または官能基が、例えば、アルキル、置換アルキル、ハロゲン、アリール、置換アリール、アルコキシル、ヒドロキシル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、スルフェート、およびメルカプトを含む、別の原子または官能基で置き換えられている、本明細書で定義されるアリール基が含まれる。
【０１５２】
アリール基の具体的な例には、シクロペンタジエニル、フェニル、フラン、チオフェン、ピロール、ピラン、ピリジン、イミダゾール、ベンズイミダゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール、ピラゾール、ピラジン、トリアジン、ピリミジン、キノリン、イソキノリン、インドール、カルバゾールなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５３】
「ヘテロアリール」という用語は、例えば、同じであるか互いに異なっていてもよい、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される１個または複数のヘテロ原子を含む、限定されないが、５員または６員の環系などの芳香族環系を指す。ヘテロアリール環は、１つまたは複数のヘテロアリール環、芳香族もしくは非芳香族炭化水素環、またはヘテロシクロアルキル環に縮合、またはそうでなければ、結合していてもよい。代表的なヘテロアリール環系には、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、ピラゾリル、アゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、イミダゾリル、フラニル、チエニル、キノリニル、イソキノリニル、インドリニル、インドリル、ベンゾチエニル、ベンゾチアゾリル、エンゾフラニル、ベンズイミダゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンゾピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリルなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５４】
本明細書で用いられるような、環構造が芳香族または非芳香族であってもよい式
【０１５５】
【化２０】
0005453248.tif 000026
【０１５６】
によって一般に表される構造は、例えば、置換基Ｒ基（ここで、Ｒ基は存在してもしなくてもよく、存在する場合、１個または複数のＲ基はそれぞれ、環構造の１個または複数の利用できる炭素原子上に置換されていてもよい）を含む、本明細書で定義される飽和環構造、部分的飽和環構造、および不飽和環構造環構造を含み、限定されないが、３−炭素、４−炭素、５−炭素、６−炭素などの脂肪族および／または芳香族環式化合物などの環構造を指す。Ｒ基の存在、不在およびＲ基の数は、整数ｎの値で決定される。２以上の場合、それぞれのＲ基は、別のＲ基上よりはむしろ環構造の利用できる炭素上に置換されている。例えば、ｎが０から２である場合上の構造は、限定されないが、
【０１５７】
【化２１】
0005453248.tif 000027
【０１５８】
などを含む化合物群を含む。
【０１５９】
環式環構造中の結合を表す点線は、結合が環中に存在することも存在しないこともあることを示す。すなわち、環式環構造中の結合を表す点線は、環構造が、飽和環構造、部分的飽和環構造、および不飽和環構造からなる群から選択されることを示す。
【０１６０】
芳香族環またはヘテロ環式環の指定原子が「存在しない」と定義される場合、指定原子は直接結合で置き換えられる。
【０１６１】
本明細書で用いられるように、「アシル」という用語は、カルボキシル基の−ＯＨが別の置換基［すなわち、ＲＣＯ−（ここで、Ｒは本明細書で定義されるアルキル基またはアリール基である）で表されるような］で置き換えられている有機酸基を指す。したがって、「アシル」という用語には特に、例えば、アセチルフランおよびフェナシル基などのアリールアシル基が含まれる。アシル基の具体的な例には、アセチルおよびベンゾイルが含まれる。
【０１６２】
「アルコキシル」は、アルキルが前述のとおりであるアルキル−Ｏ−基を指す。本明細書で用いられるような「アルコキシル」という用語は、例えば、メトキシル、エトキシル、プロポキシル、イソプロポキシル、ブトキシル、ｔ−ブトキシル、およびペントキシルを含む、直線状、分岐、または環状の飽和または不飽和オキソ−炭化水素鎖を包含するＣ1~20を指すことができる。
【０１６３】
本明細書で用いられるような「アルコキシアルキル」という用語は、アルキル−Ｏ−アルキルエーテル、例えば、メトキシエチルまたはエトキシメチル基を指す。
【０１６４】
「アリールオキシル」は、置換アリールを含む、アリール基が前述のとおりであるアリール−Ｏ−基を指す。本明細書で用いられるような「アリールオキシル」という用語は、フェニルオキシルもしくはヘキシルオキシル、およびアルキル、置換アルキル、ハロ、またはアルコキシルで置換されたフェニルオキシルもしくはヘキシルオキシルを指すことができる。
【０１６５】
本明細書で用いられるような「アルキル−チオ−アルキル」という用語は、アルキル−Ｓ−アルキルチオエーテル、例えば、メチルチオメチルまたはメチルチオエチル基などを指す。
【０１６６】
「アラルキル」は、アリールおよびアルキルが前述されたとおりであるアリール−アルキル−基を指し、置換アリールおよび置換アルキルが含まれる。例示的なアラルキル基には、ベンジル、フェニルエチル、およびナフチルメチルが含まれる。
【０１６７】
「アラルキルオキシル」は、アラルキル基が前述されたとおりであるアラルキル−Ｏ−基を指す。例示的なアラルキルオキシル基はベンジルオキシルである。
【０１６８】
「アルコキシカルボニル」は、アルキル−Ｏ−ＣＯ−基を指す。例示的なアルコキシカルボニルには、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ブチルオキシカルボニル、およびｔ−ブチルオキシカルボニルが含まれる。「アリールオキシカルボニル」は、アリール−Ｏ−ＣＯ−基を指す。例示的なアリールオキシカルボニル基には、フェノキシ−およびナフトキシ−カルボニルが含まれる。
【０１６９】
「アラルコキシカルボニル」は、アラルキル−Ｏ−ＣＯ−基を指す。例示的なアラルコキシカルボニル基はベンジルオキシカルボニルである。
【０１７０】
「カルバモイル」は、Ｈ2Ｎ−ＣＯ−基を指す。「アルキルカルバモイル」は、ＲおよびＲ’の一方が水素であり、ＲおよびＲ’の他方が前述されたとおりのアルキルおよび／または置換アルキルであるＲ’ＲＮ−ＣＯ−基を指す。「ジアルキルカルバモイル」は、ＲおよびＲ’のそれぞれが、独立して、前述されたとおりのアルキルおよび／または置換アルキルであるＲ’ＲＮ−ＣＯ−基を指す。
【０１７１】
「アシルオキシル」は、アシルが前述されたとおりであるアシル−Ｏ−基を指す。
【０１７２】
「アミノ」という用語は、−ＮＨ2基を指し、有機ラジカルで１個または複数の水素ラジカルを置き換えることによるアンモニア由来の当技術分野で知られているような窒素含有基も指す。例えば、「アシルアミノ」および「アルキルアミノ」という用語は、それぞれアシルおよびアルキル置換基を有する特定のＮ置換有機ラジカルを指す。
【０１７３】
「アルキルアミノ」という用語は、Ｒが前述されたとおりのアルキル基および／または置換アルキル基である−ＮＨＲ基を指す。例示的なアルキルアミノ基には、メチルアミノ、エチルアミノなどが含まれる。
【０１７４】
「ジアルキルアミノ」は、ＲおよびＲ’のそれぞれが、独立して、前述されたとおりのアルキル基および／または置換アルキル基である−ＮＲＲ’基を指す。例示的なジアルキルアミノ基には、エチルメチルアミノ、ジメチルアミノ、およびジエチルアミノが含まれる。
【０１７５】
「アシルアミノ」は、アシルが前述されたとおりであるアシル−ＮＨ−基を指す。「アロイルアミノ」は、アロイルが前述されたとおりであるアロイル−ＮＨ−基を指す。
【０１７６】
「カルボニル」という用語は、−（Ｃ＝Ｏ）−基を指す。
【０１７７】
「カルボキル」という用語は、−ＣＯＯＨ基を指す。
【０１７８】
本明細書で用いられるような「ハロ」、「ハロゲン化物」、または「ハロゲン」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨード基を指す。
【０１７９】
「ヒドロキシル」という用語は、−ＯＨ基を指す。
【０１８０】
「ヒドロキシアルキル」という用語は、−ＯＨで置換されたアルキル基を指す。
【０１８１】
「メルカプト」という用語は、−ＳＨ基を指す。
【０１８２】
「オキソ」という用語は、炭素原子が酸素原子で置き換えられている本明細書で前述された化合物を指す。
【０１８３】
「ニトロ」という用語は、−ＮＯ2基を指す。
【０１８４】
「チオ」という用語は、炭素または酸素原子が硫黄原子で置き換えられている本明細書で前述された化合物を指す。
【０１８５】
「スルフェート」という用語は、−ＳＯ4基を指す。
【実施例】
【０１８６】
以下の実施例は、ここで開示される主題の代表的な実施形態を実施するために当業者への手引きを提供するために含めた。本開示および当技術分野での技術の一般的なレベルに照らして、当業者は、以下の実施例が例示であることのみが意図され、多数の変化、修正、および変更をここで開示される主題の範囲から逸脱することなく用いることができることを理解することができる。以下の実施例は、説明する目的であって、限定する目的ではなく提供される。
【０１８７】
＜実施例１＞
ＩＣＯＰＩＣ色素の合成
ここで開示されるＩＣＯＰＩＣ色素は、四級窒素、すなわち、正電荷を有する窒素原子が芳香族環の一部であり、クマリンまたはアザクマリン核とハロアセチル部分との間の架橋二重結合から遠く離れているように設計した。ＩＣＯＰＩＣ色素は、スキーム１に示すように合成した。
【０１８８】
【化２２】
0005453248.tif 000028
【０１８９】
スキーム１．ＩＣＯＰＩＣ色素の合成
これからスキーム１を参照して、４−ピコリンと２−ブロモエタノールとをトルエン中１２０℃で反応させることによって化合物１を合成した。反応を４５分後に停止させ、室温に冷却し、トルエン層を静かに流し出した。得られた淡黄色油をヘキサンで２回洗浄し、ロータリーエバポレータで蒸発させた。得られた残渣を冷却し、低融点の淡黄色固体を得た。生成物を1Ｈおよび13ＣＮＭＲ分光法およびＦＡＢ−質量分光法で特徴づけた。
【０１９０】
再度スキーム１を参照して、化合物２を次のとおり合成した。化合物１を無水メタノール中に溶解させ、触媒量のピペリジンを添加した。得られた溶液を７０℃に３０分間加熱した。この時間の間に、この反応混合物は淡褐色に変わった。この反応混合物にクマリンアルデヒドを添加し、加熱還流させた。２時間後、反応を停止させ、次いで、冷蔵庫で冷却し、赤色固体を得て、これをろ過し、乾燥させた。この粗色素をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、純色素を得た。ＦＡＢ−質量分析により生成物を確認した。
【０１９１】
再度スキーム１を参照して、ここで開示されるＩＣＯＰＩＣ色素を以下のとおり合成した。クロロホルムおよびアセトニトリルの混合物中化合物２の溶液に、３滴のピリジンを添加し、得られた溶液をアルゴン雰囲気下、室温で１０分間攪拌した。この反応混合物にヨード酢酸無水物を添加し、室温で２時間攪拌を続けた。２時間後、反応を停止させ、溶媒を蒸発させて、赤色固体を得た。得られた固体をＭＴＢＥエーテルで洗浄し、真空下で乾燥させ、赤色固体としてＩＣＯＰＩＣを得た。この化合物をＦＡＢ−質量分光法およびＮＭＲで確認した。
【０１９２】
＜実施例２＞
ＩＣＯＰＩＣ標識試験
ＩＣＯＰＩＣ（エステルバージョン）をグルコース結合タンパク質Ｗ１８３Ｃ上に標識した。これから図１を参照して、グルコースに対する比率測定応答を試験した。再度図１を参照して、ここで開示されるＩＣＯＰＩＣ色素はグルコースに比率測定的に応答し、得られたＱＲは約２．０である。ＱＲは、色素対タンパク質の標識比を増加させることによって著しく改善させることができた。
【０１９３】
＜実施例３＞
温度安定性
Ｗ１８３Ｃ−ＩＣＯＰＩＣコンジュゲートの温度安定性試験を３７℃で３日間にわたって行った。これから図２を参照して、色素吸収スペクトルは３７℃で３日後にほとんど変化しないままであった。しかし、グルコースに対する蛍光応答は、より低かった（データは示さず）。いずれの１つの特定の理論に拘束されることを望むわけではないが、この観察結果は、エステル結合の切断およびシステイン残基からの色素の放出による可能性が高い。システイン残基からの色素の放出可能性は、実施例５で与えられるように、色素のヨードアセトアミドバーションで最小化されると考えられる。
【０１９４】
＜実施例４＞
グルコース結合試験−ＳＭ４−ｏ−ＩＣＯＰＩＣエステル
ｏ−ＩＣＯＰＩＣエステル色素をＳＭ４（ＧＢＰ）タンパク質とコンジュゲートさせ、グルコースの不存在および存在下で蛍光応答を試験した。図３を参照すると、得られた応答が示されている。再度図３を参照して、グルコースの付加により、スペクトルは蛍光強度で１．５倍強化され、約６００ｎｍから約６２５ｎｍへ波長がシフトした。ＱＲを計算し、最適値が約７．０であることを見出した。このＱＲ値はＳＭ４と一緒の任意の知られている比率測定色素として観察された最も高いＱＲ値である。したがって、この色素は、バイオ−センサー化学で重要な利用性を有する。
【０１９５】
＜実施例５＞
ヨードアセトアミドの合成−ピコリン色素
ＩＣＯＰＩＣの色素のリンカー基の安定性を改善するために、色素のヨードアセトアミドバージョンの合成を行った。ヨードアセトアミドリンカーは、ヨードアセチルリンカー基と比べた場合加水分解に対してより安定である。
【０１９６】
ここで開示されるＩＣＯＰＩＣ色素のヨードアセトアミドバージョンを合成する１つの方法を、スキーム２に示す。
【０１９７】
【化２３】
0005453248.tif 000029
【０１９８】
スキーム２．ヨードアセトアミドの合成−ピコリン色素
これからスキーム２を参照して、４−ピコリンを２−ブロモエチルアミンヒドロブロミドとメタノール中還流下で４８時間反応させることによって化合物２を合成した。この反応混合物を室温に冷却し、生成物を白色固体として沈殿させた。この沈殿生成物をろ過し、冷メタノール、その後メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルで洗浄し、真空下で乾燥させた。ＮＭＲ分光法（1Ｈ、13Ｃ）およびＦＡＢ−質量スペクトルによりその構造を確認した。
【０１９９】
再度スキーム２を参照して、化合物４および５を次のとおり調製した。化合物２をメタノールに溶解させ、触媒量のピペリジンを添加し、３０分間還流させた。クマリンアルデヒド（３）を添加し、さらに４時間還流を続けた。反応の進行をＴＬＣでモニターした。反応が完了後、溶媒を蒸発させて残渣(化合物４)を得た。得られた残渣をアルミナ上でクロマトグラフにかけ、数滴のアンモニア溶液を含むＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ（６：４）で溶出させた。純生成物を赤色バンドとして溶出させ、溶媒を蒸発させて赤色色素を得た。ＦＡＢ−質量スペクトルでの分析により生成物(化合物５)を確認した。
【０２００】
再度スキーム２を参照して、メタノールおよびクロロホルムの混合物中ピリジンの存在下で化合物５をヨード酢酸無水物と反応させることによって、ヨードアセトアミド部分を含む最終色素６を合成した。この最終色素を過剰のヨード酢酸無水物およびピリジンを洗い落とすことによって精製した。ＦＡＢ−質量スペクトルにより最終色素を確認した。
【０２０１】
＜実施例６＞
ｐ−ＩＣＯＰＩＣアミドを合成する方法
ｐ−ＩＣＯＰＩＣアミドを合成する代替方法をスキーム３で与える。
【０２０２】
【化２４】
0005453248.tif 000030
【０２０３】
スキーム３．ｐ−ＩＣＯＰＩＣを合成する方法
これからスキーム３を参照して、ここで開示されるｐ−ＩＣＯＰＩＣ色素を次のとおり調製することができる。
【０２０４】
化合物９：化合物８（４−ピコリン、１．０ｇ）を無水メタノール（５ｍＬ）中に溶解させた。この溶液にブロモエチルアミンＨＢｒ（２．２０ｇ）を添加した。反応物を加熱還流させ、一晩反応させた。翌日冷却後、生成物が沈殿した。この沈殿物をろ過で収集し、少量のメタノールで洗浄し、空気乾燥させた。生成物（１．２ｇ）を無色固体として得た。生成物を1Ｈ、13ＮＭＲおよびＦＡＢ−ＭＳにより確認した。化合物９の1H NMR (400MHz, CD3OD) δ = 8.88 (d, 2H), 8.01 (d, 2H), 4.96 (t, 2H), 3.69 (t, 2H), 2.71 (s, 3H). 9の13C NMR (400MHz, CD3OD), δ = 162.9, 145.3, 130.5, 58.4, 40.5, 22.4. FAB-MS 実測値 = 137.1 計算値 = 137.11.
化合物１０：化合物９（２００ｍｇ）および炭酸ナトリウム（１６６ｍｇ、２当量）を５ｍＬのＨ2Ｏ中に溶解させた。Ｂｏｃ2Ｏ（１６１ｍｇ、１．１当量）を５ｍＬのジオキサン中に溶解させ、この水溶液に滴下した。反応物を室温で一晩攪拌させた。翌日溶媒を蒸発乾固すると、固体の白色残渣が残った。メタノール（１０ｍＬ）を添加し、得られた溶液をろ過し、炭酸ナトリウムを除去した。ろ過溶液を蒸発させ、２１０ｍｇの生成物（化合物１０）を得て、これをさらに精製することなく用いた。生成物を1ＨＮＭＲにより確認した。化合物１０の1H NMR (400MHz, CD3OD), δ = 8.77 (d, 2H), 7.94 (d, 2H), 4.64 (t, 2H), 3.62 (t, 2H), 2.66 (s, 3H), 1.31 (s, 9H).
化合物１１：化合物１０（１９０ｍｇ）および７−ジエチルアミノ−クマリン−３−アルデヒド（１４０ｍｇ）を６ｍＬのメタノール中に溶解させ、その後５０μＬのピペリジンを添加した。この反応物を５０℃に加熱し、攪拌しながら一晩反応させた。次いで、溶媒を蒸発させ、残った赤色残渣をカラムクロマトグラフィーで精製した。生成物をジクロロメタン中１０％メタノール溶液で溶出させた。純分画を合わせて、蒸発させ、７２ｍｇの所望の生成物（化合物１１）を得た。生成物を1Ｈ、13ＣＮＭＲおよびＨＲＭＳで確認した。化合物１１の1H NMR (400MHz, CDCl3), δ = 8.87 (d, 1H) 8.06 (s, 1H), 7.93 (d, 1H), 7.68 (d, 1H), 7.63 (d, 1H), 7.39 (d, 1H), 6.55 (d, 1H), 6.36 (s, 1H), 4.90 (t, 2H), 3.75 (q, 2H), 3.40 (q, 4H), 1.23 (s, 9H), 1.18 (t, 6H). 11の13C NMR (400MHz, CDCl3), δ = 160.6, 156.9, 156.7, 154.7, 152.5, 146.4, 144.4, 138.1, 131.1, 123.7, 122.9, 114.1, 110.2, 109.4, 96.9, 80.0, 60.0, 45.4, 41.3, 28.5, 12.8. HRMS 実測値 = 464.2551, 計算値 = 464.25
化合物１２：化合物１１（７２ｍｇ）をジクロロメタン：トリフルオロ酢酸の１：１溶液中に溶解させ、１時間攪拌させた。ＴＦＡ溶液を添加後直ちに赤色が消失した。１時間後、溶媒を蒸発させると、オレンジ色の残渣が残った。この残渣をメタノール中に溶解させ、複数回蒸発させ、ほとんどのＴＦＡを除去し、この時点で深紅色が再度存在した。この赤色残渣生成物(化合物１２)を少量の水に溶解させ、その後冷凍し、凍結乾燥させた。生成物を1Ｈ、13ＣＮＭＲおよびＨＲＭＳで確認した。化合物１２の1H NMR (400MHz, CD3OD), δ = 8.75 (d, 2H), 8.13 (s, 1H), 8.11 (d, 2H), 7.81 (d, 1H), 7.73 (d, 1H), 7.47 (d, 1H), 6.77 (dd, 1H), 6.53 (d, 1H), 4.84 (t, 2H), 3.66 (t, 2H), 3.51 (q, 4H), 1.23 (t, 6H). 12の13C NMR (400MHz, CD3OD), δ = 163.0, 159.1, 158.0, 155.0, 148.3, 146.2, 140.5, 132.9, 125.9, 124.5, 115.9, 112.4, 111.3, 98.4, 58.9, 46.9, 41.3, 13.6. HRMS 実測値 = 364.2025, 計算値 = 364.20
化合物１３：化合物１２をジクロロメタン（３ｍＬ）中に溶解させ、数滴のメタノールを添加した。この溶液にクロロ酢酸無水物（１０当量）およびピリジン（１０当量）を添加した。反応を２時間進行させ、この時点でさらに１０当量のクロロ酢酸無水物を添加した。さらに４時間後、溶媒を蒸発させ、この反応混合物をメタノール／ジクロロメタン溶媒混合物を用いてシリカクロマトグラフィーで精製した。所望の生成物(化合物１３)を１０％メタノール／ジクロロメタン混合物で溶出させた。生成物を1Ｈおよび13ＣＮＭＲおよびＨＲＭＳで確認した。化合物１３の1H NMR (400MHz, CD3OD), δ = 8.70 (d, 1H) 8.16 (s, 1H), 8.08 (d, 1H), 7.81 (d, 1H), 7.74 (d, 1H), 7.50 (d, 1H), 6.81 (dd, 1H), 6.57 (d, 1H), 4.64 (t, 2H), 4.06 (s, 2H), 3.84 (t, 2H), 3.55 (q, 4H), 1.26 (t, 6H). 13の13C NMR (400MHz, CD3OD), δ = 169.0, 161.1, 157.0, 155.2, 152.9, 146.0, 144.2, 137.7, 130.7, 123.5, 122.7, 114.1, 110.3, 109.4, 96.4, 59.7, 44.8, 41.8, 40.0, 11.6. HRMS 実測値 = 440.1743, 計算値 = 440.17.
化合物１４：次いで、ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）を用いて単純置換によって、ｏ−ＩＣＯＰＩＣクロロアセトアミド（化合物１３）をヨードアセトアミドに変換した。ｏ−ＩＣＯＰＩＣクロロアセトアミド（化合物１３）を３ｍＬの１：２ＭｅＯＨ：アセトン溶液に溶解させた。この混合物にヨウ化ナトリウム（５当量）を添加した。この溶液をアルミニウムホイルで覆い、一晩還流させた。翌日、さらに３当量のＮａＩを添加し、さらに２４時間還流させた。翌日、溶媒を減圧下で蒸発させた。赤色固体を少量のＭｅＯＨとともにジクロロメタン中に溶解させた。不溶性塩をろ過し、ろ液を再度蒸発させた。赤色残渣を少量の２０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭに溶解させ、旋回させながら大量のジエチルエーテルに添加し、色素を沈殿させた。沈殿物を赤色固体としてろ過した。精製生成物（化合物１４）をＮＭＲおよびＨＲＭＳで確認した。化合物１４の1H NMR (400MHz, CD3OD), δ = 8.81 (d, 1H) 8.18 (s, 1H), 8.02 (d, 1H), 7.76 (d, 1H), 7.68 (d, 1H), 7.45 (d, 1H), 6.66 (dd, 1H), 6.47 (d, 1H), 4.77 (t, 2H), 3.85 (q, 2H), 3.70 (s, 2H), 3.46 (q, 4H), 1.23 (t, 6H). 14の13C NMR (400MHz, CD3OD), δ = 170.8, 161.5, 156.9, 155.0, 152.8, 146.1, 144.0, 137.9, 130.9, 123.9, 122.6, 113.9, 110.4, 109.4, 96.8, 58.8, 45.2, 40.0, 12.4, -1.2 ppm. HRMS 実測値 = 532.1097, 計算値 = 532.11.
【０２０５】
＜実施例７＞
ｏ−ＩＣＯＰＩＣ色素の合成
これからスキーム４を参照して、ここで開示されるｏ−ＩＣＯＰＩＣ色素のエステルバージョンを次のとおり調製した：
【０２０６】
【化２５】
0005453248.tif 000031
【０２０７】
スキーム４．ｏ−ＩＣＯＰＩＣエステル色素の合成
【０２０８】
＜実施例８＞
ｏ−ＩＣＯＰＩＣアミド色素の合成
これからスキーム５を参照して、ここで開示されるｏ−ＩＣＯＰＩＣ色素のアミド誘導体が次のとおり合成される：
【０２０９】
【化２６】
0005453248.tif 000032
【０２１０】
スキーム５．ｏ−ＩＣＯＰＩＣのアミドバージョンの合成
【０２１１】
＜実施例９＞
ｏ−ＩＣＯＰＩＣのアミドバージョンの合成
ここで開示されるｏ−ＩＣＯＰＩＣ色素のアミドバージョンを合成する代替方法をスキーム６で与える。
【０２１２】
【化２７】
0005453248.tif 000033
【０２１３】
スキーム６．ｏ−ＩＣＯＰＩＣのアミドバージョンの合成
これからスキーム６を参照して、ここで開示されるｏ−ＩＣＯＰＩＣ色素のアミドバージョンを合成する方法を与える。
【０２１４】
化合物２：化合物１（２−ピコリン、１．０ｇ）を無水メタノール（５ｍＬ）中に溶解させた。この溶液にブロモエチルアミンＨＢｒ（２．２０ｇ）を添加した。反応物を加熱還流させ、一晩反応させた。翌日冷却後、生成物が沈殿していた。この沈殿物をろ過により収集し、少量のメタノールで洗浄し、空気乾燥させた。生成物(化合物２)（１．０５ｇ）を無色固体として得た。生成物を1ＨＮＭＲで確認した。化合物２の1H NMR, (400MHz, CD3OD) δ 9.03 (d, 1H), 8.50 (d, 1H), 8.07 (d, 1H), 8.00 (t, 1H), 4.99 (t, 2H), 3.64 (t, 2H), 2.98 (s, 3H).
化合物３：化合物２（２００ｍｇ）および炭酸ナトリウム（１６６ｍｇ、２当量）を５ｍＬのＨ2Ｏ中に溶解させた。Ｂｏｃ2Ｏ（１６１ｍｇ、１．１当量）を５ｍＬのジオキサン中に溶解させ、その水溶液に滴下した。反応物を室温で一晩攪拌させた。翌日、溶媒を蒸発乾固させると、固体の白色残渣が残った。メタノール（１０ｍＬ）を添加し、得られた溶液をろ過し、炭酸ナトリウムを除去した。ろ液を蒸発させ、１９０ｍｇの生成物（化合物３）を得て、これをさらに精製することなく用いた。生成物を1ＨＮＭＲで確認した。化合物３の1H NMR (400MHz, CD3OD), δ = 8.77 (d, 1H), 8.43 (t, 1H), 8.00 (d, 1H), 7.92 (t, 1H), 4.68 (t, 2H), 3.62 (t, 2H), 2.94 (s. 3H), 1.31 (s, 9H).
化合物４：化合物３（１９０ｍｇ）および７−ジエチルアミノ−クマリン−３−アルデヒド（１４０ｍｇ）を６ｍＬのメタノール中に溶解させ、その後、５０μＬのピペリジンを添加した。反応物を５０℃に加熱し、攪拌しながら一晩反応させた。次いで、溶媒を蒸発させ、残りの赤色残渣をカラムクロマトグラフィーで精製した。生成物をジクロロメタン中１０％メタノール溶液で溶出させた。純分画を合わせて、蒸発させ、６５ｍｇの所望の生成物（化合物４）を得た。生成物を1Ｈ、13ＣＮＭＲおよびＨＲＭＳで確認した。化合物４の1H NMR, (400MHz, CDCl3) δ = 9.16 (d, 1H), 8.73 (s, 1H), 8.30 (d, 1H), 8.21 (t, 1H), 8.02 (d, 1H), 7.86 (d, 1H), 7.62 (m, 1H), 7.54 (d, 1H), 6.58 (dd, 1H), 6.42 (s, 1H), 5.10 (t, 2H), 3.76 (q, 2H), 3.42 (q, 4H), 1.25 (s, 9H), 1.21 (t, 6H). 4の13C NMR, (400MHz, CDCl3) δ = 161.4, 157.4, 156.7, 154.0, 152.8, 146.0, 145.8, 143.7, 140.2, 131.8, 125.0, 124.1, 115.0, 113.8, 109.6, 110.4, 97.1, 79.9, 57.7, 45.5, 40.1, 28.6, 12.8. 化合物４のHRMS 実測値 = 464.2546. 計算値 = 464.25
化合物５：化合物４（６５ｍｇ）をジクロロメタン：トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の１：１溶液中に溶解させ、１時間攪拌させた。ＴＦＡ溶液を添加後直ちに赤色が消失した。１時間後、溶媒を蒸発させると、オレンジ色の残渣が残った。残渣をメタノール中に溶解させ、複数回蒸発させ、ほとんどのＴＦＡを除去し、この時点で深紅色が再度存在した。この赤色残渣生成物を少量の水に溶解させ、その後、冷凍して凍結乾燥させた。生成物(化合物５)を1Ｈ、13ＣＮＭＲおよびＨＲＭＳで確認した。化合物５の1H NMR (400MHz, CD3OD), δ = 8.80 (d, 1H), 8.43 (m, 2H), 8.30 (s, 1H), 7.93 (d, 1H), 7.82 (t, 1H), 7.81 (d, 1H), 7.51 (m, 1H), 6.80 (dd, 1H), 6.53 (dd, 1H), 5.07 (t, 2H), 3.65 (t, 2H), 3.52 (q, 4H), 1.23 (t, 6H). 5の13C NMR (400MHz, CD3OD), δ = 163.3, 159.2, 156.2, 155.2, 149.2, 147.4, 147.1, 143.0, 133.2, 127.7, 126.9, 117.0, 115.3, 112.6, 111.2, 98.4, 56.7, 46.9, 40.0, 13.6. 化合物５のHRMS: 実測値 = 364.2022, 計算値 = 364.20.
化合物６：化合物５をジクロロメタン（３ｍＬ）中に溶解させ、数滴のメタノールを添加した。この溶液にクロロ酢酸無水物（１０当量）およびピリジン（１０当量）を添加した。反応物を２時間攪拌し、この時点でさらに１０当量のクロロ酢酸無水物を添加した。さらに４時間後、溶媒を蒸発させ、反応混合物をメタノール／ジクロロメタン溶媒混合物を用いてシリカクロマトグラフィーで精製した。所望の生成物(化合物６)を１０％メタノール／ジクロロメタン混合物で溶出させた。生成物を1Ｈおよび13ＣＮＭＲおよびＨＲＭＳで確認した。化合物６の1H NMR (400MHz, CD3OD), δ = 8.66 (d, 1H), 8.40 (m, 2H), 8.28 (s, 1H), 8.07 (d, 1H), 7.77 (m, 2H), 7.52 (d, 1H), 6.81 (dd, 1H), 6.57 (s, 1H), 4.82 (t, 2H), 3.99 (s, 2H), 3.84 (t, 2H), 3.54 (q, 4H), 1.24 (t, 6H). 6の13C NMR (400MHz, CD3OD), δ = 169.0, 161.2, 157.1, 154.2, 153.1, 146.7, 145.4, 144.5, 140.0, 131.0, 125.2, 124.5, 115.9, 113.5, 110.4, 109.1, 96.4, 57.3, 44.9, 41.7, 38.9, 11.6. 化合物６のHRMS: 実測値 = 440.1743, 計算値 = 440.17.
化合物７：次いで、ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）を用いる単純置換によりｏ−ＩＣＯＰＩＣクロロアセトアミド（化合物６）をヨードアセトアミドに変換した。ｏ−ＩＣＯＰＩＣクロロアセトアミド（化合物６）を３ｍＬの１：２ＭｅＯＨ：アセトン溶液中に溶解させた。この混合物にヨウ化ナトリウム（５当量）を添加した。この溶液をアルミニウムホイルで覆い、一晩還流させた。翌日、さらに３当量のＮａＩを添加し、さらに２４時間還流させた。翌日、溶媒を減圧下で蒸発させた。赤色固体を少量のＭｅＯＨとともにジクロロメタン中に溶解させた。不溶性塩をろ過し、ろ液を再度蒸発させた。赤色残渣を少量の２０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ中に溶解させ、大量のジエチルエーテルを旋回させながらこれに赤色残渣溶液を添加し、色素を沈殿させた。沈殿物を赤色固体としてろ過した。精製生成物（化合物７）をＮＭＲおよびＨＲＭＳで確認した。化合物７の1H NMR (400MHz, CD3OD), δ = 8.74 (d, 1H), 8.46 (m, 2H), 8.42 (t, 1H), 7.98 (d, 1H), 7.85 (d, 1H), 7.83 (m, 1H), 7.57 (d, 1H), 6.79 (d, 1H), 6.50 (s, 1H), 4.87 (t, 2H), 3.82 (t, 2H), 3.64 (s, 2H), 3.53 (q, 4H), 1.23 (t, 6H). 7の13C NMR (400MHz, CD3OD), δ = 171.0, 161.4, 157.1, 153.8, 153.0, 146.7, 145.5, 144.4, 139.9, 131.1, 125.5, 124.9, 115.7, 113.4, 110.5, 109.1, 96.3, 57.3, 44.9, 41.7, 38.9, 11.8, -3.0. 化合物７のHRMS: 実測値 = 532.1097, 計算値 = 532.11.
【０２１５】
＜実施例１０＞
オルト−およびパラ−ＩＣＯＰＩＣアミドの熱安定性
オルトおよびパラ−ＩＣＯＰＩＣアミドの安定性を、最初に３７℃で７日間、その後５５℃で７日間インキュベーションして、ＮＭＲおよびＨＰＬＣの両方でモニターした。約２ｍｇのそれぞれのＩＣＯＰＩＣ（１、２）を０．７ｍＬのＣＤ3ＯＤ中に溶解させた。試料を調製後、最初のＮＭＲスペクトルを取り、プロトン化学シフトを帰属させた（下記にコードした色）。次いで、調製試料を、それぞれ３７℃および５５℃においてＮＭＲチューブ中で７日間インキュベートした。分子構造におけるいずれの変化も、プロトンピークの消失および新たなピークの形成により明らかになる。反応性に対して最も敏感な領域であるので、図４Ａ〜図４Ｃ（パラ−ＩＣＯＰＩＣアミドに対する）および図５Ａ〜図５Ｃ（オルト−ＩＣＯＰＩＣアミドに対する）中のＮＭＲスペクトルを芳香族領域上で拡大した。スペクトルは、７日間のインキュベーション後にいずれの色素も有意な変化が生じないことを示す。ＮＭＲ実験も溶媒としてＤ2Ｏで行い、これも構造において有意な変化を示さなかった（データを示さず）。
【０２１６】
ＮＭＲ分析に加えて、２つの時点−１回目は新たに溶解させたときおよび２回目は１４日（３７℃で７日プラス５５℃で７日）間のインキュベーション後で、この色素をＨＰＬＣでも分析した。ｐ−ＩＣＯＰＩＣに対するＨＰＬＣクロマトグラフは図６Ａおよび図６Ｂに示し、ｏ−ＩＣＯＰＩＣに対するＨＰＬＣクロマトグラフは図７Ａおよび図７Ｂに示す。再度クロマトグラフ中で新たなピークはまったく見られなかった。色素試料の濃度は、記載温度でのインキュベーション前後で一致しなかったことに留意されたい。したがって、図６Ａ、図６Ｂ、図７Ａ、および図７Ｂ中のＹ軸スケールは任意であり、ピークの位置および数だけが関連がある。
【０２１７】
＜実施例１１＞
ＧＧＢＰタンパク質標識およびグルコース結合データ
ＳＭ４−ｏ−ＩＣＯＰＩＣ
ＳＭ４（１．２ｍｇ）を約５０当量のｏ−ＩＣＯＰＩＣアミドと混合した。この溶液を４時間反応させ、その後ゲルろ過（ＮＡＰ−１０）で精製した。標識後のＵＶ／Ｖｉｓスペクトルを図８に示す。
【０２１８】
ＳＭ４−ｏ−ＩＣＯＰＩＣ系の蛍光を２．５ｍＭから２００ｍＭの範囲のグルコースの存在下で測定した。得られたスペクトルは２５−ｎｍの赤色シフト（図９Ａを参照）を示し、それらをそれぞれのスペクトルに対して５５０〜５７０ｎｍおよび６５０〜６７０ｎｍの波長範囲を用いて比率測定的に分析した。比率点をグルコース濃度に対してプロットし、図９Ｂに示される双曲線の結合曲線を得た。
【０２１９】
値の以下の表は双曲線適合によって決定した：
【０２２０】
【表３】
0005453248.tif 000034
【０２２１】
＜実施例１２＞
ＧＧＢＰタンパク質標識およびグルコース結合データ
Ｗ１８３Ｃ−ｏ−ＩＣＯＰＩＣ
ＳＭ４（２．０ｍｇ）を２０μＬのＤＭＳＯ中に溶解させた約５０当量のｏ−ＩＣＯＰＩＣアミドと混合した。この溶液を４時間反応させ、その後、ゲルろ過（ＮＡＰ−１０）で精製した。標識後のＵＶ／Ｖｉｓスペクトルを図１０に示す。
【０２２２】
Ｗ１８３Ｃ−ｏ−ＩＣＯＰＩＣ系の蛍光を２．５ｍＭから２００ｍＭの範囲のグルコースの存在下で測定した。得られたスペクトルは２５−ｎｍの赤色シフトを示し（図１１Ａを参照）、それらをそれぞれのスペクトルに対して５５０〜５７０ｎｍおよび６５０〜６７０ｎｍの波長範囲を用いて比率測定的に分析した。比率点をグルコース濃度に対してプロットし、図１１Ｂに示す双曲線の結合曲線を得た。
【０２２３】
値の以下の表は、双曲線適合によって決定した：
【０２２４】
【表４】
0005453248.tif 000035
【０２２５】
＜実施例１３＞
ＧＧＢＰタンパク質標識およびグルコース結合データ
Ｙ１０Ｃ−ｐ−ＩＣＯＰＩＣ
Ｙ１０Ｃ  ＧＧＢＰ（２５ｍｇ）の新たなバッチを絞り出し、精製した。Ｙ１０Ｃ（０．６ｍｇ）を、２０μＬのＤＭＳＯに溶解させた約４０当量のｐ−ＩＣＯＰＩＣ（０．２８ｍｇ）アミドと混合した。この溶液を４時間反応させ、その時点で反応の進行をＨＰＬＣで検査した。４時間後、タンパク質の約２０％のみが標識された。さらに約４０当量のｐ−ＩＯＣＰＩＣアミドを添加し、一晩反応させた。翌日、進行をＨＰＬＣで再度検査し、色素：タンパク質の比は約０．４５であった。このタンパク質をゲルろ過（ＮＡＰ−５）で精製した。標識後のＵＶ／Ｖｉｓスペクトルを図１２に示す。
【０２２６】
Ｙ１０Ｃ−ｐ−ＩＣＯＰＩＣ系の蛍光を１ｍＭから１００ｍＭの範囲のグルコースの存在下で測定した。得られたスペクトルは、蛍光強度で５倍低下とともに４３−ｎｍの赤色シフト（図１３Ａを参照のこと）を示す。スペクトルは、それぞれのスペクトルに対して５５０〜５７０ｎｍおよび７００〜７２０ｎｍの波長範囲を用いて比率測定的に分析した。比率点をグルコース濃度に対してプロットして、図１３Ｂに示す双曲線の結合曲線を得た。
【０２２７】
以下の値の表を双曲線適合によって決定した：
【０２２８】
【表５】
0005453248.tif 000036
【０２２９】
＜実施例１４＞
Ｗ１８３−ｏ−ＩＣＯＰＩＣ対Ｗ１８３Ｃ−アクリロダンの蛍光強度
図１４において、Ｗ１８３−ｏ−ＩＣＯＰＩＣの蛍光強度をＷ１８３Ｃ−アクリロダンのそれと比較する。以下に記載されるように、２μＭのタンパク質濃度でＷ１８３Ｃ−ｏ−ＩＣＯＰＩＣ（色素：タンパク質比＝０．８）の蛍光強度は、Ｗ１８３Ｃ−アクリロダン（色素：タンパク質比＝１．２）のそれより１．５倍大きい。色素：タンパク質比を要因の１つとして含める場合、蛍光強度の増加は、Ｗ１８３Ｃ−ｏ−ＩＣＯＰＩＣ対Ｗ１８３Ｃ−アクリロダンについて２倍を超えるようにみえる。蛍光強度の増加は、センサーの感度増加を高めることができる。Ｗ１８３Ｃ−ｏ−ＩＣＯＰＩＣに対する励起波長は４８５ｎｍであり、Ｗ１８３Ｃ−アクリロダンの励起波長は３８０ｎｍであった。他の条件はすべて同じであった。
【０２３０】
前述の主題を明確な理解のために説明および実施例によっていくらか詳細に説明してきたが、ある種の変化および修正を添付の特許請求の範囲の範囲内で実施することができることが当業者によって理解される。
【０２３１】
本明細書で言及された刊行物、特許出願、特許、他の参考文献のすべては、ここで開示される主題が属する分野の技術者の技術レベルを示すものである。刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献はすべて、あたかもそれぞれの個々の刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献が、参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示されたのと同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。多くの特許出願、特許、および他の参考文献が本明細書において言及されるが、このような参考文献は、これらの文書のいずれも当技術分野の通常の一般的な知識の一部を形成することを認めるものではないことが理解される。
【図１】
0005453248.tif 000045
【図２】
0005453248.tif 000046
【図３】
0005453248.tif 000047
【図４】
0005453248.tif 000048
【図５】
0005453248.tif 000049
【図６】
0005453248.tif 000050
【図７】
0005453248.tif 000051
【図８】
0005453248.tif 000052
【図９Ａ】
0005453248.tif 000053
【図９Ｂ】
0005453248.tif 000054
【図１０】
0005453248.tif 000055
【図１１Ａ】
0005453248.tif 000056
【図１１Ｂ】
0005453248.tif 000057
【図１２】
0005453248.tif 000058
【図１３Ａ】
0005453248.tif 000059
【図１３Ｂ】
0005453248.tif 000060
【図１４】
0005453248.tif 000061