(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１０６のアミノ酸配列を含むVHと配列番号１１１のアミノ酸配列を含むVLドメインとを含んでなる単離精製されたヒト化モノクローナル抗体又はそのフラグメントであって、ヒトCD19抗原に結合する、前記抗体。
【請求項２】
前記抗体が、フコースが糖鎖中の還元末端中のN-アセチルグルコサミンに結合していないFc領域に結合した複合型N-グリコシド結合糖鎖を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体が、Granta-519細胞系に対してではなく、Karpas-422、Karpas-1106P、及びDB細胞系に対するin vitro ADCC活性を効率的に媒介する、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、動物モデルにおいて、循環B細胞、血液B細胞、脾臓B細胞、辺縁帯B細胞、濾胞性B細胞、腹腔B細胞及び/又は骨髄B細胞から成る群より選択されるB細胞を枯渇させることができ、前記枯渇が、2.5 mg/kg用量の前記抗体の投与の7日後に、B細胞レベルを少なくとも50％低下させる、請求項２に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が、C1q、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA及びFcγRIVから成る群より選択される1個以上のFcリガンドに対する親和性が変化したFc変異体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
前記Fc変異体が、比較可能な分子のものよりも少なくとも5倍低いFc受容体FcγRIIIAに対する親和性を有し、該Fc変異体が比較可能な分子のものの2倍以内であるFc受容体FcγRIIBに対する親和性を有する、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
前記Fc変異体が、ADCC活性の増強をもたらす突然変異を含む、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
配列番号１０６又は１１１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体を発現する単離された細胞。
【請求項１０】
製薬上許容し得る担体中に請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体を含む医薬組成物。
【請求項１１】
ヒトにおけるB細胞疾患又は障害を治療するために使用するための請求項１〜７のいずれか１項に記載の治療上有効量の抗体であって、前記疾患又は障害が、B細胞悪性腫瘍、自己免疫疾患、自己免疫障害、ヒト移植患者における体液性拒絶、移植片対宿主疾患(GVHD)及びヒト移植レシピエントにおける移植後リンパ球増殖障害から成る群より選択される、前記治療上有効量の抗体。
【請求項１２】
前記治療が、循環B細胞、血液B細胞、脾臓B細胞、辺縁帯B細胞、濾胞性B細胞、腹腔B細胞、骨髄B細胞、前駆B細胞、初期プロB細胞、後期プロB細胞、大細胞型プレB細胞、小細胞型プレB細胞、未成熟B細胞、成熟B細胞、抗原刺激B細胞及び/又は形質細胞から成る群より選択されるB細胞の枯渇を含む、請求項１１に記載の治療上有効量の抗体。
【請求項１３】
前記枯渇が、B細胞レベルを少なくとも20％低下させ、且つ、前記枯渇が、少なくとも1週間の期間持続する、請求項１２に記載の治療上有効量の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトCD19抗原に結合するヒト、ヒト化、またはキメラ抗CD19抗体に関する。本発明はまた、1種以上の以下のもの：補体依存的細胞媒介性細胞傷害性(CDC)、抗原依存的細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)、およびプログラム化細胞死(アポトーシス)を媒介し得るヒト、ヒト化、またはキメラ抗CD19抗体を含む組成物にも関する。本発明はさらに、IgG1および／もしくはIgG3ヒトアイソタイプのヒト、ヒト化、またはキメラ抗CD19抗体を含む組成物、ならびにヒトADCC、CDC、もしくはアポトーシスを媒介し得るIgG2および／もしくはIgG4ヒトアイソタイプのヒト、ヒト化、またはキメラ抗CD19抗体を含む組成物に関する。
【０００２】
本発明はさらに、ヒトCD19抗原に結合する治療用ヒト、ヒト化、またはキメラ抗CD19抗体を用いる、B細胞悪性腫瘍などのヒト被験者におけるB細胞障害または疾患の治療のための方法に関する。本発明は、ヒトCD19抗原に結合する治療用ヒト、ヒト化、またはキメラ抗CD19抗体を用いる、自己免疫疾患の治療および予防ならびに移植片対宿主疾患(GVHD)、体液性拒絶、およびヒト移植レシピエントにおける移植後リンパ増殖障害の治療および予防のための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
B細胞は、その分化および増殖の間に様々な細胞表面分子を発現する。例としては、CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、およびCD86白血球表面マーカーが挙げられる。これらのマーカーは、一般的には、B細胞悪性腫瘍、自己免疫疾患、および移植片拒絶などのB細胞障害または疾患の治療のための治療標的として提唱されてきた。それらに特異的に結合する抗体が開発され、いくつかは疾患および障害の治療のための治療剤として試験されてきた。
【０００４】
例えば、成熟B細胞およびその悪性対応物に特異的なCD20細胞表面分子に対するキメラまたは放射標識モノクローナル抗体(mAb)に基づく治療は、非ホジキンリンパ腫のための有効なin vivo治療であることが示された(Tedderら、Immunol. Today 15:450-454 (1994); Pressら、Hematology:221-240 (2001); Kaminskiら、N. Engl. J. Med. 329:459-465 (1993); Weiner, Semin. Oncol. 26:43-51 (1999); Onrustら、Drugs 58:79-88 (1999); McLaughlinら、Oncology 12:1763-1769 (1998); Reffら、Blood 83:435-445 (1994); Maloneyら、Blood 90:2188-2195 (1997); Maloneら、J. Clin. Oncol. 15:3266-3274 (1997); Andersonら、Biochem. Soc. Transac. 25:705-708 (1997))。抗CD20モノクローナル抗体治療はまた、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、特発性血小板減少性紫斑病および溶血性貧血、ならびに他の免疫媒介性疾患の兆候を軽減するのに部分的に有効であることが見出された(Silvermanら、Arthritis Rheum. 48:1484-1492 (2002); Edwardsら、Rheumatology 40:1-7 (2001); De Vitaら、Arthritis Rheumatism 46:2029-2033 (2002); Leandroら、Ann. Rheum. Dis. 61:883-888 (2002); Leandroら、Arthritis Rheum. 46:2673-2677 (2001))。抗CD20(IgG1)抗体、RITUXANは、成人免疫性血小板減少性紫斑病、慢性関節リウマチ、および自己免疫性溶血性貧血などの特定の疾患の治療において成功裏に用いられてきた(Curedら、WO 00/67796)。これらの治療の有効性にも関わらず、B細胞がCD20を発現しないか、もしくは低レベルで発現する(例えば、プレB細胞もしくは未熟B細胞上で)か、またはCD20免疫治療後にCD20発現を失った場合、B細胞の枯渇はあまり有効ではない(Smithら、Oncogene 22:7359-7368 (2003))。
【０００５】
マウスモノクローナル抗CD19抗体、例えば、HD37 (IgG1, kappa) (DAKO North America, Inc, Carpinteria, CA)、BU12 (Callardら、J. Immunology, 148(10):2983-7 (1992))、4G7 (IgG1) (Meekerら、Hybridoma, 3(4):305-20 (1984 Winter))、J4.119 (Beckman Coulter, Krefeld, Germany)、B43 (PharMingen, San Diego, CA)、SJ25C1 (BD PharMingen, San Diego, CA)、FMC63 (IgG2a) (Zolaら、Immunol.Cell.Biol. 69(PT6): 411-22 (1991); Nicholsonら、Mol. Immunol., 34:1157-1165 (1997); Pieterszら、Cancer Immunol. Immunotherapy, 41:53-60 (1995))、89B(B4) (IgG1) (Beckman Coulter, Miami, FL;  Nadlerら、J. Immunol., 131:244-250 (1983))、および／またはHD237 (IgG2b) (Fourth International Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens, Vienna, Austria, 1989;およびPezzuttoら、J. Immunol., 138(9):2793-2799 (1987))が当業界で記載されている。抗CD19抗体またはそのコンジュゲートも、B細胞障害および疾患の様々な動物モデルにおいて治療能力が示されている(Falvellら、Br. J. Hematol. 134(2):157-70 (2006); Valleraら、Clin. Cancer Res. 11(21):7920-8 (2005); Yazawaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(42):15178-83 (2005))。
【０００６】
特に、ヒト化CD19抗体の使用が、リンパ腫、白血病、または自己免疫疾患などのB細胞疾患の治療のために記載されている(Hansenの米国特許出願公開第US2005/0070693号を参照されたい)。
【０００７】
癌治療における最近の進歩にも関わらず、非ホジキンリンパ腫、および慢性リンパ球性白血病のB細胞サブタイプなどのB細胞悪性腫瘍は、癌に関連する死亡の主要な寄与因子である。従って、B細胞悪性腫瘍の治療のためのさらなる、改良された治療計画の大きな必要性が存在する。
【０００８】
細胞性(T細胞媒介性)および体液性(抗体、B細胞媒介性)免疫は共に、移植片拒絶において重要な役割を果たすことが現在知られている。移植片拒絶におけるT細胞媒介性免疫の重要性はよく確立されているが、急性および慢性拒絶における体液性免疫の重要な役割は、最近明らかになったに過ぎない。結果として、移植片拒絶の治療および予防における進歩の多くは、T細胞活性化を標的化する治療剤から開発された。移植片拒絶の治療についてFDAに認可された初めての治療用モノクローナル抗体は、T細胞のCD3受容体に対する、マウスモノクローナル抗体ORTHOCLONE-OKT3(商標)(ムロモナブ-CD3)であった。OKT3は、モノクローナル抗CD52 CAMPATH(商標)抗体、CAMPATH-1G、CAMPATH-1H(アレムツズマブ)、およびCAMPATH-1Mなどの他の抗リンパ球に対するいくつかの抗体、ならびにポリクローナル抗胸腺細胞抗体調製物(「サイモグロビン」もしくは「サイモグロブリン」とも呼ばれる抗胸腺細胞グロブリン、または「ATG」と呼ばれる)により連結されている。移植片拒絶の予防のために認可された他のT細胞抗体としては、キメラモノクローナル抗体SIMULECT(商標)(バシリキシマブ)およびヒト化モノクローナル抗体ZENAPAX(商標)(ダクリズマブ)(両方とも活性化T細胞の高親和性IL-2受容体を標的化する)が挙げられる。
【０００９】
移植片拒絶における体液性免疫の重要性は、移植レシピエントが移植前に抗ドナーHLA抗体を有し、抗体抑制の有効な治療計画の非存在下で移植片の急速な破壊をもたらす超急性拒絶に限定されると最初は考えられていた。最近、体液性免疫も、急性および慢性拒絶の両方を媒介する重要な因子であることが明らかになってきた。例えば、臨床観察により、クラスIまたはクラスII抗HLA同種抗体(「抗MHC同種抗体」とも呼ばれる)を生じることができる患者における移植片生存は、そのような抗体を生じることができない患者における移植片生存と比較して低下することが証明された。臨床データおよび実験データも、他のドナー特異的同種抗体および自己抗体が拒絶の重要なメディエーターであることを示唆している。同種移植片拒絶におけるドナー特異的抗体の役割を支持する証拠の現在の概説については、Rifleら、Transplantation, 79: S14-S18 (2005)を参照されたい。かくして、急性および慢性移植片拒絶における体液性免疫の役割の比較的最近の適用に起因して、体液性免疫を標的化するための現在の治療剤および戦略は、細胞性免疫を標的化するためのものよりもあまり良好に開発されていない。従って、ヒト移植レシピエントにおける移植片拒絶、すなわち、移植片対宿主疾患(GVHD)、体液性拒絶、および移植後リンパ増殖性障害を治療および予防するための改良された試薬および方法の必要性が当業界に存在する。
【００１０】
自己免疫疾患は、全体として、有意な死亡率および障害を引き起こす。1965年から1995年に集められた発生率データに基づいて、約120万人が、次の5年間に渡って新しい自己免疫疾患を生じるであろうと見積もられた。Jacobsenら(Clin Immunol. Immunopathol. 84:223 (1997))は、130回の公開された研究を評価し、1996年には、米国の850万人(人口の3.2％)がこれらの研究において試験された24種の自己免疫疾患の少なくとも1種を有すると見積もった。公衆衛生に対する自己免疫疾患の主要な影響を考慮すると、これらの障害の負担を解決するには有効かつ安全な治療が必要である。かくして、自己免疫疾患を治療するための改良された試薬および方法の必要性が当業界に存在する。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、ヒトCD19抗原に結合するヒト、ヒト化、またはキメラ抗CD19抗体、ならびにこれらの抗体を含む組成物に関する。一実施形態においては、本発明は、キメラおよびヒト化形態の抗CD19マウスモノクローナル抗体、HB12AおよびHB12Bを提供する。
【００１２】
別の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、HB12A(クローンB410F12-2-A6-C2は、2005年2月11日にAmerican Type Culture Collection (「ATCC」)に預託されている：ATCC Patent Deposit Designation: PTA-6580)またはHB12B(クローンB43H12-3-B2-B6は、2005年2月11日にAmerican Type Culture Collection (「ATCC」)に預託されている：ATCC Patent Deposit Designation: PTA-6581)の1、2、3、4、5、または6種全部のCDRを含む。
【００１３】
Kabatに従って定義されたHB12Aの重鎖可変領域のCDR1、CDR2、およびCDR3のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号6、配列番号8、および配列番号10として同定されている。Kabatに従って定義されたHB12Aの軽鎖可変領域のCDR1、CDR2およびCDR3のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号12、配列番号14、および配列番号16として同定されている。
【００１４】
Kabatに従って定義されたHB12Bの重鎖可変領域のCDR1、CDR2、およびCDR3のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号22、配列番号24、および配列番号26として同定されている。Kabatに従って定義されたHB12Bの軽鎖可変領域のCDR1、CDR2、およびCDR3のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号28、配列番号30、および配列番号32として同定されている。
【００１５】
一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、下記の表1に列挙されるCDRのアミノ酸配列を有する1、2、3、4、5、または6種のCDRを含む。
【表１】
0005401314.tif 000002
0005401314.tif 000003
0005401314.tif 000004
0005401314.tif 000005
【００１６】
一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、HB12AまたはHB12Bの1個以上のフレームワーク領域を含んでもよい。一実施形態においては、本発明の抗体は、ヒト抗体に由来する(例えば、VH3-72、JH4、VkA10、もしくはJk4などのヒト生殖線抗体配列に由来する)重鎖および／または軽鎖フレームワーク(FW)領域をさらに含んでもよく、該ヒトフレームワーク領域は、ヒトFW残基が親マウス(例えば、HB12AもしくはHB12B)の重鎖もしくは軽鎖に存在する対応する残基のために交換される1個以上の突然変異を含んでもよい。
【００１７】
一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、上記の表1に列挙されたCDRのアミノ酸配列を有する1個以上のCDRを含んでもよく、HB12B-(3-72/JH4)(配列番号34)と命名されたVH領域の1個以上の重鎖フレームワーク(FW)領域をさらに含んでもよい。別の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、上記の表1に列挙されたCDRのアミノ酸配列を有する1個以上のCDRを含み、HB12B-(3-72/JH4)(配列番号34)と命名されたVH領域の1個以上の重鎖フレームワーク(FW)領域をさらに含む。一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、上記の表1に列挙されたCDRのアミノ酸配列を有する1個以上のCDRを含んでもよく、HB12B-(A10-Jk4)(配列番号52)と命名されたVK領域の1個以上の軽鎖フレームワーク(FW)領域をさらに含んでもよい。一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、上記の表1に列挙されたCDRのアミノ酸配列を有する1個以上のCDRを含み、HB12B-(A10-Jk4)(配列番号52)と命名されたVK領域の1個以上の軽鎖フレームワーク(FW)領域をさらに含む。別の実施形態においては、本明細書に記載の抗CD19抗体は、上記の表1に列挙されたCDRのアミノ酸配列を有する1個以上のCDR、HB12B-(A10-Jk4)と命名されたVK領域の1個以上の軽鎖フレームワーク領域、およびHB12B-(3-72/JH4)と命名されたVH領域の1個以上の重鎖フレームワーク領域を含んでもよい。さらなる実施形態においては、本明細書に記載の抗CD19抗体は、上記の表1に列挙されたCDRのアミノ酸配列を有する1個以上のCDR、HB12B-(A10-Jk4)と命名されたVK領域の1個以上の軽鎖フレームワーク領域、およびHB12B-(3-72/JH4)と命名されたVH領域の1個以上の重鎖フレームワーク領域を含む。
【００１８】
例えば、一実施形態においては、本発明のヒト化抗CD19抗体は、FW1が配列番号36のアミノ酸配列を含み、FW2が配列番号38のアミノ酸配列を含み、FW3が配列番号40のアミノ酸配列を含み、およびFW4が配列番号42のアミノ酸配列を含む、4個のフレームワーク領域、FW1、FW2、FW3、およびFW4を含む重鎖可変領域を含んでもよい。一実施形態においては、本発明のヒト化抗CD19抗体は、FW1が配列番号36のアミノ酸配列を含み、FW2が配列番号38のアミノ酸配列を含み、FW3が配列番号40のアミノ酸配列を含み、およびFW4が配列番号42のアミノ酸配列を含む、4個のフレームワーク領域、FW1、FW2、FW3、およびFW4を含む重鎖可変領域を含む。
【００１９】
さらに、本発明のヒト化抗CD19モノクローナル抗体は、FW1が配列番号54のアミノ酸配列を含み；FW2が配列番号56、配列番号64、および配列番号72からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み；FW3が配列番号58、および配列番号66からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み；ならびにFW4が配列番号60のアミノ酸配列を含む、4個のフレームワーク領域、FW1、FW2、FW3、およびFW4を含む軽鎖可変領域を含んでもよい。一実施形態においては、本発明のヒト化抗CD19モノクローナル抗体は、FW1が配列番号54のアミノ酸配列を含み；FW2が配列番号56、配列番号64、および配列番号72からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み；FW3が配列番号58、および配列番号66からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み；ならびにFW4が配列番号60のアミノ酸配列を含む、4個のフレームワーク領域、FW1、FW2、FW3、およびFW4を含む軽鎖可変領域を含む。
【００２０】
一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、配列番号237のアミノ酸配列を含むVHまたは配列番号238のアミノ酸配列を含むVLを含んでもよく、該抗体はヒトCD19抗原に結合する。別の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、配列番号237のアミノ酸配列を含むVHと、配列番号238のアミノ酸配列を含むVLを含む。
【００２１】
特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、HB12B VK (配列番号20)、HB12B-(A10-Jk4) (配列番号52)、HB12B-364987 (配列番号62)、HB12B-3649 (配列番号68)、HB12B-36 (配列番号70)、HB12A VK (配列番号4)、7E12 VK (配列番号110)、14H5 VK (配列番号111)、15D1 VK (配列番号112)、16C9 VK (配列番号113)、3C3 VK (配列番号193)、3E5 VK (配列番号194)、3D4 VK (配列番号195)、3F1 VK (配列番号196)、5B5 VK (配列番号197)、6F7 VK (配列番号198)、1C11 VK (配列番号199)、2B11 VK (配列番号200)、2D10 VK (配列番号201)、5C11 VK (配列番号202)、5D4 VK (配列番号203)、6C11 VK (配列番号204)、9G7 VK (配列番号205)、1H4 VK (配列番号206)、および5C4 VK (配列番号207)からなる群より選択される軽鎖可変領域を含んでもよい。
【００２２】
特定の実施形態においては、本発明はさらに、HB12B VH (配列番号18)、HB12B-(3-72/JH4) (配列番号34)、HB12A VH (配列番号2)、7E12 VH (配列番号102)、14H5 VH (配列番号103)、15D1 VH (配列番号104)、15D7 VH (配列番号105)、16C4 VH (配列番号106)、14H5-YG (配列番号107)、14H5-DG (配列番号108)、14H5-LG (配列番号109)、1A7 VH (配列番号191)、3C3 VH (配列番号191)、6C11 VH (配列番号191)、9G7 (配列番号191)、3B4 VH (配列番号236)、および3F11 VH (配列番号192)からなる群より選択される重鎖可変領域を含む抗CD19抗体に関する。
【００２３】
特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、HB12B-3649(配列番号68)軽鎖可変領域およびHB12B-(3-72/JH4)(配列番号34)重鎖可変領域を含む。ヒト化抗hCD19 VH HB12B-(3-72/JH4)を含むDNAクローンは、2006年10月26日にAmerican Type Culture Collection (「ATCC」)に預託されている。ヒト化抗hCD19 VK HB12B-3649を含むDNAクローンは、2006年10月26日にAmerican Type Culture Collection (「ATCC」)に預託されている。
【００２４】
一実施形態においては、本発明のヒト化抗CD19抗体は、マウスモノクローナル抗体HB12Aおよび／もしくはHB12Bのものと比較可能な親和性で、またはHB12B VH(配列番号18)およびHB12B VK(配列番号20)を含むchHB12B抗体のものと比較可能な親和性でヒトCD19に結合することができる。
【００２５】
本発明はさらに、本発明のヒト、ヒト化、もしくはキメラ抗CD19抗体またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、本明細書に定義されるように、ストリンジェントな、またはより低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、ヒトCD19に特異的に結合するヒト、ヒト化、またはキメラ抗体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドも包含する。
【００２６】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載のヒト、ヒト化、もしくはキメラ抗CD19抗体またはその断片をコードする1個以上のヌクレオチド配列を含むベクターである。
【００２７】
本発明はさらに、本発明のヒト、ヒト化、もしくはキメラ抗CD19抗体またはその断片をコードする1個以上のヌクレオチド配列を含むベクターを含む単離された細胞に関する。
【００２８】
本明細書に記載のキメラ、ヒト、およびヒト化抗CD19モノクローナル抗体としては、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4ヒトアイソタイプのものが挙げられる。
【００２９】
一実施形態においては、本明細書に記載のヒト化抗CD19抗体は、抗体依存的細胞性細胞傷害性(ADCC)、補体依存的細胞媒介性細胞傷害性(CDC)、および／またはアポトーシスを媒介する。
【００３０】
さらなる実施形態においては、本明細書に記載のヒト化抗CD19抗体は、抗IgM/CpG刺激B細胞増殖を阻害する。
【００３１】
本発明はさらに、キメラ、ヒト、およびヒト化抗CD19抗体を含む医薬組成物に関する。
【００３２】
さらに別の他の態様においては、本発明は、それを必要とするヒトに、治療上有効量のキメラ、ヒト、またはヒト化抗CD19モノクローナル抗体を投与することを含む、ヒトにおけるB細胞悪性腫瘍を治療する方法に関する。
【００３３】
さらなる態様においては、本発明は、それを必要とするヒトに、治療上有効量のキメラ、ヒト、またはヒト化抗CD19モノクローナル抗体を投与することを含む、ヒトにおける自己免疫疾患または障害を治療する方法に関する。
【００３４】
本発明はさらに、それを必要とするヒトに、治療上有効量のキメラ、ヒト、またはヒト化抗CD19モノクローナル抗体を投与することを含む、ヒト移植患者における体液性拒絶を治療または予防する方法に関する。
【００３５】
定義
本明細書で用いられる用語「抗体」(免疫グロブリン)は、モノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、少なくとも2種の無傷の抗体から形成された多特異的抗体(例えば、二特異的抗体)、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、一本鎖Fv(scFv)、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、所望の生物活性を示す抗体フラグメント、ジスルフィド結合したFv(sdFv)、および抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば、本発明の抗体に対する抗Id抗体を含む)、イントラボディ、ならびに上記のいずれかのエピトープ結合断片を包含する。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、すなわち、抗原結合部位を含む分子を含む。免疫グロブリン分子は、任意の型(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)またはサブクラスのものであってよい。
【００３６】
天然抗体は通常、2個の同一の軽鎖(L)と2個の同一の重鎖(H)から構成される、約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。それぞれの軽鎖は、1個の共有ジスルフィド結合により重鎖に結合するが、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。それぞれの重鎖および軽鎖はまた、規則的な間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。それぞれの重鎖は、一方の末端に可変ドメイン(VH)、次いでいくつかの定常ドメインを有する。それぞれの軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン(VL)およびその他方の末端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインを、重鎖の第1の可変ドメインと整列させ、軽鎖可変ドメインを、重鎖の可変ドメインと整列させる。軽鎖は、軽鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいて、λ鎖またはκ鎖として分類される。κ軽鎖の可変ドメインを、本明細書ではVKと呼ぶこともできる。また、用語「可変領域」を用いて、重鎖または軽鎖の可変ドメインを説明することもできる。特定のアミノ酸残基は、軽鎖および重鎖可変ドメイン間の境界を形成すると考えられる。そのような抗体を、限定されるものではないが、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウスなどの任意の哺乳動物から誘導することができる。
【００３７】
用語「可変」とは、可変ドメインの特定の部分が、抗体間で配列において広く異なり、その特定の抗原に対するそれぞれの特定の抗体の結合特異性の原因となるという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメインを通して均一に分布しない。それは、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方において相補性決定領域(CDR)と呼ばれる断片に集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分を、フレームワーク領域(FW)と呼ぶ。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、ループ接続を形成する3個のCDRにより接続される、大部分はβシート配置を採用する、およびいくつかの事例においては、βシート構造の一部を形成する、4個のFW領域を含む。それぞれの鎖中のCDRは、FW領域によりごく近くに一緒に保持され、他の鎖に由来するCDRは、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(Kabatら、「免疫学的目的のタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)」、第5版、Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)を参照されたい)。定常ドメインは、一般的には、抗原結合に直接関与しないが、抗原結合親和性に影響し、ADCC、CDCおよび／またはアポトーシスにおける抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示し得る。
【００３８】
本明細書で用いられる場合、用語「超可変領域」とは、抗原へのその結合に関連する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」のアミノ酸残基(例えば、軽鎖可変ドメインの残基24-34(L1)、50-56(L2)および89-97(L3)ならびに重鎖可変ドメインの残基31-35(H1)、50-65(H2)および95-102(H3)；Kabatら、「免疫学的目的のタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)」、第5版、Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))ならびに／または「超可変ループ」に由来する残基(例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基26-32(L1)、50-52(L2)および91-96(L3)ならびに重鎖可変ドメイン中の26-32(H1)、53-55(H2)および96-101(H3)；ChothiaおよびLesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987))を包含する。「フレームワーク」または「FW」残基は、CDRにフランキングする可変ドメイン残基である。FW残基は、キメラ、ヒト化、ヒト、ドメイン抗体、ダイアボディ、ワクチボディ、線状抗体、および二特異的抗体中に存在する。
【００３９】
本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、該集団を含む個々の抗体が、少ない量で存在してもよい可能性のある天然の突然変異について以外は同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対して、高度に特異的である。さらに、典型的には、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含む従来の(ポリクローナル)抗体調製物とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリン産生細胞により夾雑していないハイブリドーマによりそれらを合成することができる点で有利である。代替的な製造方法は、当業者には公知であり、例えば、モノクローナル抗体を、該モノクローナル抗体をコードする重鎖および軽鎖遺伝子を用いて安定に、または一過的にトランスフェクトされた細胞により製造することができる。
【００４０】
修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られるものとしての抗体の特徴を示唆し、任意の特定の方法による抗体の遺伝子操作を必要とするものと解釈されるべきではない。本明細書で用いられる用語「モノクローナル」とは、任意の真核、原核、またはファージクローンなどの細胞のクローン集団から誘導された抗体を指し、抗体が操作された方法ではない。例えば、本発明に従って用いられるモノクローナル抗体を、Kohlerら、Nature, 256: 495 (1975)により初めて記載されたハイブリドーマ方法により作製するか、または例えば、Clacksonら、Nature, 352:624-628 (1991)およびMarksら、J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)に記載の技術を用いるファージ抗体ライブラリーからの単離などの任意の組換えDNA方法(例えば、米国特許第4,816,567号を参照)により作製することができる。これらの方法を用いて、モノクローナル哺乳動物、キメラ、ヒト化、ヒト、ドメイン抗体、ダイアボディ、ワクチボディ、線状抗体、および二特異的抗体を製造することができる。
【００４１】
用語「キメラ」抗体は、重鎖および／または軽鎖の少なくとも一部分が、特定の種から誘導されるか、もしくは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか、もしくは相同であり、該鎖の少なくとも1つの他の部分が、別の種から誘導されるか、もしくは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか、もしくは相同である抗体、ならびに所望の生物活性を示す限り、そのような抗体のフラグメント(米国特許第4,816,567号；Morrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))を含む。本明細書に記載の目的のキメラ抗体は、非ヒト霊長類(例えば、ヒヒ、アカゲザルまたはカニクイザルなどの旧世界ザル)から誘導された可変ドメイン抗原結合配列とヒト定常領域配列(米国特許第5,693,780号)を含む「霊長類化」抗体を含む。
【００４２】
「ヒト化」形態の非ヒト(例えば、マウス)抗体は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含むキメラ抗体である。多くの部分について、ヒト化抗体は、天然のCDR残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種(ドナー抗体)の対応するCDRに由来する残基により置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。いくつかの例においては、ヒト免疫グロブリンのFW領域残基は、対応する非ヒト残基により置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体中には見出されない残基を含んでもよい。これらの改変を、抗体の性能をさらに改良するように作製する。一般的には、ヒト化抗体重鎖または軽鎖は、全部または実質的に全部のCDRが非ヒト免疫グロブリンのものと一致し、全部または実質的に全部のFWがヒト免疫グロブリン配列のものである、実質的に全ての少なくとも1種の可変ドメインを含むであろう。特定の実施形態においては、ヒト化抗体は、典型的には、ヒト免疫グロブリンのものである少なくとも一部の免疫グロブリン定常領域(Fc)を含むであろう。さらなる詳細については、Jonesら、Nature, 321:522-525 (1986); Riechmannら、Nature, 332:323-329 (1988); およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)を参照されたい。
【００４３】
「ヒト抗体」は、ヒトから誘導された抗体または抗原チャレンジに応答して特異的ヒト抗体を産生するように「遺伝子操作された」トランスジェニック生物から得られた抗体であってよく、当業界で公知の任意の方法により製造することができる。特定の技術においては、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座のエレメントを、内因性重鎖および軽鎖遺伝子座の標的化された破壊を含む胚性幹細胞系から誘導された生物の株に導入する。トランスジェニック生物は、ヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、該生物を用いて、ヒト抗体を分泌するハイブリドーマを作製することができる。ヒト抗体は、重鎖および軽鎖が、1種以上の起源のヒトDNAから誘導されるヌクレオチド配列によりコードされる抗体であってもよい。完全なヒト抗体を、遺伝子もしくは染色体トランスフェクション法、ならびにファージディスプレイ技術、またはin vitroで活性化されたB細胞により構築することもでき、それらは全て当業界で公知である。
【００４４】
「抗体依存的細胞媒介性細胞傷害性」および「ADCC」とは、非特異的細胞傷害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、およびマクロファージ)が、標的細胞上の結合抗体を認識した後、標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応を指す。一実施形態においては、そのような細胞はヒト細胞である。いかなる特定の作用機序にも制限されることを望むものではないが、ADCCを媒介するこれらの細胞傷害性細胞は、一般的にはFc受容体(FcR)を発現する。ADCCを媒介する一次細胞、NK細胞は、FcγRIIIを発現するが、単球はFcγRI、FcγRII、FcγRIIIおよび／またはFcγRIVを発現する。造血細胞上でのFcR発現は、RavetchおよびKinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991)にまとめられている。分子のADCC活性を評価するために、米国特許第5,500,362号または第5,821,337号に記載のものなどのin vitro ADCCアッセイを行うことができる。そのようなアッセイにとって有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞(PBMC)およびナチュラルキラー(NK)細胞が挙げられる。あるいは、またはさらに、目的の分子のADCC活性を、例えば、Clynesら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 95:652-656 (1998)に開示されたものなどの動物モデルにおいて、in vivoで評価することができる。
【００４５】
「補体依存的細胞傷害性」または「CDC」とは、補体活性化を開始し、補体の存在下で標的を溶解する分子の能力を指す。補体活性化経路は、同族抗原と複合体化した分子(例えば、抗体)への補体系(C1q)の第1成分の結合により開始する。補体活性化を評価するために、例えば、Gazzano-Santaroら、J. Immunol. Methods, 202:163 (1996)に記載のようなCDCアッセイを行うことができる。
【００４６】
「エフェクター細胞」は、1種以上のFcRを発現し、エフェクター機能を実行する白血球である。この細胞は少なくともFcγRI、FcγRII、FcγRIIIおよび／またはFcγRIVを発現し、ADCCエフェクター機能を担持する。ADCCを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核細胞(PBMC)、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球、細胞傷害性T細胞および好中球が挙げられる。
【００４７】
用語「Fc受容体」または「FcR」は、抗体のFc領域に結合する受容体を説明するのに用いられる。一実施形態においては、FcRは天然配列ヒトFcRである。さらに、特定の実施形態においては、FcRはIgG抗体に結合するもの(γ受容体)であり、FcγRI、FcγRII、FcγRIII、およびFcγRIVサブクラスの受容体、例えば、対立遺伝子変異体およびあるいは、これらの受容体のスプライスされた形態が挙げられる。FcγRII受容体としては、主にその細胞質ドメインにおいて異なる類似アミノ酸配列を有する、FcγRIIA(「活性化受容体」)およびFcγRIIB(「阻害受容体」)が挙げられる。活性化受容体FcγRIIAは、その細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ(ITAM)を含む。阻害受容体FcγRIIBは、その細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシンに基づく阻害モチーフ(ITIM)を含む(Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)を参照)。FcRは、RavetchおよびKinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991); Capelら、Immunomethods, 4:25-34 (1994);ならびにde Haasら、J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995)に概説されている。将来同定されるものを含む、他のFcRも、本明細書では用語「FcR」により包含される。この用語はまた、胎児への母体IgGの移動を担う新生児受容体FcRnを含む(Guyerら、Immunol., 117:587 (1976)およびKimら、J. Immunol., 24:249 (1994))。
【００４８】
「Fv」は、完全な抗原認識部位および結合部位を含む最小抗体フラグメントである。この領域は、固い、非共有または共有結合中の1個の重鎖および1個の軽鎖可変ドメインのダイマーからなる。それは、それぞれの可変ドメインの3個のCDRが相互作用して、VH-VLダイマーの表面上の抗原結合部位を規定するこの配置中にある。総合すれば、6個のCDRが、抗体に対する抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一可変ドメイン(または抗原に特異的な3個のCDRのみを含むFvの半分)でさえ、結合部位全体よりも低い親和性であるが、抗原を認識し、これに結合する能力を有する。
【００４９】
本明細書に記載の治療において用いられるエピトープに対する抗体の「親和性」は、当業界でよく理解された用語であり、エピトープへの抗体の結合の程度、または強度を意味する。親和性を、限定されるものではないが、平衡解離定数(KDもしくはKd)、見かけの平衡解離定数(KD'もしくはKd')、およびIC50(競合アッセイにおいて50％阻害を行うのに必要とされる量)などの、当業界で公知のいくつかの方法で測定し、および／または表すことができる。本発明の目的のために、親和性はエピトープに結合する抗体の所与の集団に対する平均の親和性であると理解される。mg IgG／mLまたはmg/mLに関して本明細書で報告されるKD'の値は、血清のmg Ig／mLを示すが、血漿を用いることもできる。抗体親和性を本明細書に記載の治療方法の投与、または本明細書に記載の治療方法の選択のための基礎として用いる場合、抗体親和性を治療の前および／または治療の間に測定することができ、得られた値を、ヒト患者が治療にとって好適な候補であるかどうかを評価する際に医師により用いることができる。
【００５０】
本明細書で用いられる「アビディティ」は、抗体が抗原に結合する全体の結合強度(すなわち、両方の抗体アーム)の尺度である。限定されるものではないが、Grayら、J. Virol. Meth., 44:11-24. (1993)により記載された間接蛍光抗体の改変によるなど、当業界で公知の任意の手段を用いて、過剰の抗原中での抗原-抗体結合の解離を測定することにより、抗体アビディティを決定することができる。
【００５１】
「エピトープ」は、当業界でよく理解された用語であり、抗体に対する特異的結合を示す任意の化学的部分を意味する。「抗原」は、エピトープを含み、かつ、そのようなものとして、抗体に特異的に結合する部分または分子である。
【００５２】
本明細書で用いられる「B細胞表面マーカー」は、それに結合する薬剤を用いて標的化することができるB細胞の表面上に発現される抗原である。B細胞表面マーカーとしては、CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、およびCD86白血球表面マーカーが挙げられる。特定の目的のB細胞表面マーカーは、哺乳動物の他の非B細胞組織と比較して、B細胞上で優先的に発現され、これを前駆B細胞および成熟B系列細胞の両方において発現させることができる。一実施形態においては、前記マーカーは、分化の様々な段階でB細胞上に認められるCD19である。
【００５３】
本明細書で用いられる用語「抗体半減期」とは、抗体分子の投与後のその平均生存時間の尺度である抗体の薬物動態特性を意味する。抗体半減期を、例えば、血清もしくは血漿、すなわち、循環半減期、または他の組織中で測定される、患者の身体またはその特定の区分に由来する既知量の免疫グロブリンの50％を排除するのに必要な時間として表すことができる。半減期は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンのクラスに応じて変化してもよい。一般的には、抗体半減期の増加は、投与される抗体の循環中での平均滞留時間(MRT)の増加をもたらす。
【００５４】
用語「アイソタイプ」とは、抗体の重鎖または軽鎖定常領域の分類を指す。抗体の定常ドメインは、抗原への結合に関与しないが、様々なエフェクター機能を示す。重鎖定常領域のアミノ酸配列に応じて、所与のヒト抗体または免疫グロブリンを、免疫グロブリンの5種の主要なクラス：IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMの1つに割り当てることができる。これらのクラスのいくつかを、サブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1(γ1)、IgG2(γ2)、IgG3(γ3)、およびIgG(γ4)、ならびにIgA1およびIgA2にさらに分割することができる。様々なクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常領域を、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ぶ。様々なクラスの免疫グロブリンの構造および三次元配置はよく知られている。種々のヒト免疫グロブリンクラスのうち、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、およびIgMが、補体を活性化することが知られている。ヒトIgG1およびIgG3は、ヒトにおけるADCCを媒介することが知られている。ヒト軽鎖定常領域を、2つの主要なクラス、κおよびλに分類することができる。
【００５５】
本明細書で用いられる用語「免疫原性」とは、化合物が免疫応答を誘発する(特異的抗体の産生および／または特異的T細胞の増殖を刺激する)ことができることを意味する。
【００５６】
本明細書で用いられる用語「抗原性」とは、化合物が抗体により認識されるか、または抗体に結合することができ、免疫応答を誘導することを意味する。
【００５７】
用語「治療する」、「治療すること」または「の治療」(または文法的に等価な用語)とは、被験体の症状の重篤度が低下するか、もしくは少なくとも部分的に改善するか、もしくは緩和すること、および／または少なくとも1つの臨床徴候におけるいくらかの緩和、軽減または低下が達成されること、および／または症状の進行の阻害もしくは遅延および／または疾患もしくは病気の開始の予防もしくは遅延が存在することを意味する。かくして、用語「治療する」、「治療すること」または「の治療」(または文法的に等価な用語)とは、予防的および治療的治療計画の両方を指す。
【００５８】
本明細書で用いられる、「十分な量」または特定の結果を達成「するのに十分な量」とは、必要に応じて治療効果である、所望の効果をもたらす(すなわち、治療上有効量の投与により)のに有効である本発明の抗体または組成物の量を指す。例えば、「十分量」または「するのに十分な量」は、B細胞を枯渇させるのに有効である量であってよい。
【００５９】
本明細書で用いられる「治療上有効」量は、被験体に対していくらかの改善または利益を提供する量である。別の方法で記述された、「治療上有効」量は、少なくとも1つの臨床徴候におけるいくらかの緩和、軽減、および／または低下を提供する量である。本発明の方法により治療することができる障害に関連する臨床徴候は、当業者にはよく知られている。さらに、当業者であれば、いくらかの利益が被験体に提供される限り、治療効果が完全であるか、または治癒的である必要がないことを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】(A) HB12B VK (配列番号20)、HB12B-(A10-Jk4) (配列番号52)、HB12B-364987 (配列番号62)、HB12B-3649 (配列番号68)、およびHB12B-36 (配列番号70)軽鎖可変領域のアミノ酸配列アラインメントを示す。配列残基を、Kabatに従って番号付けする。Kabatに従って定義されたCDR残基を囲みで示す。HB12B VK(配列番号20)のVernier、Interchain、およびCanonical残基を、明灰色で強調する。移植抗体HB12B-(A10-Jk4) (配列番号52)可変ドメインと比較した、HB12B-364987 (配列番号62) (Y40F, K53H, Y91F)、HB12B-3649 (配列番号68) (Y40F, K53H)、およびHB12B-36 (配列番号70) (Y40F)のアミノ酸置換を、暗灰色で強調する。(B) HB12B VH (配列番号18)、HB12B-(3-72/JH4) (配列番号34)、およびHB12B-9m (配列番号44)重鎖可変領域のアミノ酸配列アラインメントを示す。配列残基を、Kabatに従って番号付けする。Kabatに従って定義された、CDR残基を囲みで示す。HB12B VHのVernier、Interchain、およびCanonical残基を、明灰色で強調する。移植抗体HB12B-(3-72/JH4) (配列番号34)可変ドメインと比較した、HB12B-9m (配列番号44) (L20I, F27Y, T28A, R38I, V49I, F67A, R71A, L80M,I91Y)のアミノ酸置換を、暗灰色で強調する。
【図２】細胞に基づくELISAアッセイにおける、組換えヒトCD19発現300B4細胞への、HB12B-(3-72/JH4) VH (配列番号34)およびHB12B-364987 VK (配列番号62)を含むヒト化抗CD19抗体#1の結合プロフィールを示す。ヒト化抗CD19抗体#1のOD450読み取り値を、□で示す。HB12B VH (配列番号18)およびHB12B VK (配列番号20)を含むキメラHB12B抗体を、参照標準物(黒丸)として用いた。無関係の特異性のヒトIgG1抗体を、陰性対照(○)としてこのアッセイに含有させた。ヒト化抗CD19抗体#1の結合プロフィールは、キメラ抗CD19抗体のものと密接に一致する。
【図３】細胞に基づくELISAアッセイにおける、組換えヒトCD19発現300B4細胞へのヒト化抗CD19抗体#1、#2、および#3の結合プロフィールを示す。ヒト化抗CD19抗体#1は、HB12B-(3-72/JH4) VH (配列番号34)およびHB12B-364987 VK (配列番号62)を含む。ヒト化抗CD19抗体#2は、HB12B-(3-72/JH4) VH (配列番号34)およびHB12B-3649 VK (配列番号68)を含む。ヒト化抗CD19抗体#3は、HB12B-(3-72/JH4) VH (配列番号34)およびHB12B-36 VK (配列番号70)を含む。ヒト化抗CD19抗体#1、#2、および#3の結合プロフィールを、それぞれ、□、○、および黒丸で示す。HB12B VH (配列番号18)およびHB12B VK (配列番号20)を含むキメラHB12B抗体を、参照標準物(■)として用いた。ヒト化抗CD19抗体#1および#2の結合プロフィールは、キメラ抗CD19抗体のものと密接に一致する。組換えヒトCD19発現300B4細胞へのヒト化抗CD19抗体#3の結合は、キメラHB12B抗体のものよりも有意に弱い。
【図４】精製された抗hCD19抗体のクマシー染色されたSDS/PAGEを示す。1および5μgのフコシル化(fucosylated)(3649)およびアフコシル化(afucosylated)(3649-aFuc)精製ヒト化抗CD19抗体#2を、SDS/PAGEにより分析した。精製された調製物は、夾雑タンパク質を実質的に含まない。
【図５Ａ】様々な濃度のヒト化抗CD19抗体#2と共にインキュベートした免疫染色されたDaudi細胞の平均蛍光強度を示す。Daudi細胞を、様々な濃度のフコシル化(3649)またはアフコシル化(3649 aFuc-1および3649 aFuc-2)抗CD19抗体#2と共にインキュベートした。続いて、細胞をRPE結合ヤギ抗ヒトIgG F(ab)'2を用いて染色し、標準的なプロトコルに従ってフローサイトメーター上で分析した。抗CD20抗体と共にインキュベートしたDaudi細胞を、陽性対照として含有させた。ヒト化抗CD19抗体#2のフコシル化およびアフコシル化調製物は、重複する染色プロフィールを示す。抗CD19染色細胞の平均蛍光強度は、試験した全ての抗体濃度で、抗CD20染色細胞のものよりも低い。
【図５Ｂ】ヒト化抗CD19抗体のin vitroでのADCC活性を示す。ヒト化抗CD19抗体#2のフコシル化(3649)およびアフコシル化(3649-aFuc1および3649-aFuc2)調製物のin vitroでのADCC活性を、製造業者の説明書に従ってCytoTox 96(商標)キット(Promega)を用いて評価した。Daudi細胞を標的として用いた。また、このアッセイを、陽性対照抗CD20抗体を用いて実施した。ヒト化抗CD19抗体#2のアフコシル化調製物の双方ならびに陽性対照抗CD20抗体は、類似する、強固なADCC活性を示した。フコシル化抗CD19抗体#2のADCC活性は、用いた条件下でより低い。
【図６】ヒト化抗CD19抗体のin vitroでのADCC活性を示す。フコシル化(3649)およびアフコシル化(3649-aFuc)ヒト化抗CD19抗体#2のin vitroでのADCC活性を、製造業者の説明書に従ってCytoTox 96(商標)キット(Promega)を用いて評価した。Daudi細胞を標的として用いた。抗CD20抗体を、陽性対照として用いた。破壊されたADCCを有する抗CD19抗体#2(3649-TM)のFc変異体を、陰性対照として用いた。アフコシル化ヒト化抗CD19抗体#2(3649-aFuc)および陽性対照抗CD20抗体は、類似する、強固なADCC活性を示した。フコシル化ヒト化抗CD19抗体#2(3649)のADCC活性は、用いる条件下でより低い。陰性対照Fc変異体抗CD19抗体#2は、用いる条件下でADCC活性を示さなかった。
【図７】Raji、Ramos、Daudi、およびNamalwa細胞のCD19、CD20、およびCD22発現プロフィールを示す。Raji、Ramos、Daudi、およびNamalwa細胞を、抗CD19、抗CD20または抗CD22一次抗体、およびPE結合ヤギ抗マウスIgG二次抗体で免疫染色した後、フローサイトメーター上で分析した。棒グラフは、免疫染色され、二次抗体のみで染色された対照サンプルを用いて得られた平均チャンネル蛍光の比率を表す。CD19、CD20またはCD22のいずれも発現しないRPMI 8226多発性骨髄腫細胞系を、陰性対照として含有させた。3種全部の分子の有意な表面発現が、Raji、Ramos、およびDaudi細胞上で検出される。Namalwa細胞は、細胞表面上にCD19およびCD22を提示するが、CD20を提示しない。
【図８−１】抗CD19#2媒介性ADCCに対するRaji(A)、Daudi(B)、Ramos(C)、およびNamalwa(D)細胞の感受性を示す。ADCCアッセイを、製造業者の説明書に従ってCytoTox 96(商標)キット(Promega)を用いて実施した。用いた抗体は、(i)アフコシル化抗CD19#2 (3649-aFuc)、(ii)抗CD19#2の3M Fc変異体(3649-3M)、および(iii)抗CD20対照である。エフェクターと標的の比は2.5:1であった。4つ全ての細胞系は、抗CD19#2媒介性ADCCに対して感受性である。Raji、Daudi、およびRamos細胞のみが、抗CD20媒介性ADCCに対して感受性である。
【図８−２】図８−１の続きである。
【図９】抗CD19#2媒介性ADCCに対する新鮮な扁桃B細胞の感受性を示す。ADCCアッセイを、製造業者の説明書に従ってCytoTox 96(商標)キット(Promega)を用いて実施した。用いた抗体は、(i)アフコシル化抗CD19#2 (3649-aFuc)、(ii)抗CD19#2の3M Fc変異体(3649-3M)、および(iii)抗CD20対照である。エフェクターと標的の比は2:1であった。扁桃B細胞は、試験した3種全部の抗体により媒介されるADCCに対して感受性である。
【図１０−１】循環するリンパ球を、C57Bl6 hCD19 tg +/-、C57Bl6 hCD19 tg +/+、Balb/c hCD20 tg+/-およびBalb/cマウスから単離した。単離された細胞を、PerCP結合抗マウスCD19(α-mCD19)、PE結合抗CD3、Alexa488結合抗ヒトCD19(α-hCD19)、およびAlexa647結合抗ヒトCD20抗体(α-hCD20)を用いて染色した。nは、各群から分析した動物数に等しい。(A)hCD19、hCD20、およびmCD19特異的チャンネルにおいて測定されたCD3-細胞の平均蛍光強度を、棒グラフ形式で提供する。(B)様々な遺伝子背景におけるCD3- mCD19+リンパ球の割合を示す。
【図１０−２】図１０−１の続きである。
【図１１−１】抗CD19抗体#2によるin vivoでのB細胞枯渇を示す。(A) C57Bl6 hCD19 tg +/+および(B) C57Bl6 hCD19 tg +/-動物を、250または50μgの抗CD19抗体#2(3649)の単回i.v.用量を用いて処理した。用いる陰性対照抗体は、(i)#2のADCC障害性Fc変異体(3649TM)および(ii)無関係の特異性の抗体(R347)である。循環するリンパ球を、処理の7日後に単離した。細胞を、PerCP結合抗マウスCD19(α-mCD19)およびPE結合抗CD3抗体を用いて染色した。mCD19+ CD3- B細胞の割合を示す。nは各群から分析した動物数に等しい。単回用量の抗CD19抗体#2を用いる処理は、B細胞のほぼ完全な枯渇をもたらした。
【図１１−２】図１１−１の続きである。
【図１２−１】抗CD19抗体#2によるin vivoでのB細胞枯渇を示す。C57Bl6 hCD19 tg +/+およびC57Bl6 hCD19 tg +/-動物を、250または50μgの抗CD19抗体#2 (3649)の単回i.v.用量を用いて処理した。用いる陰性対照抗体は、(i)#2のADCC障害性Fc変異体(3649 TM)および(ii)無関係の特異性の抗体(R347)である。脾臓細胞を、処理の7日後に単離した。細胞を、PerCP結合抗マウスCD19(α-mCD19)およびPE結合抗CD3抗体を用いて染色した。脾臓リンパ球間のB細胞(mCD19+CD3-)の割合を示す。nは各群から分析した動物数に等しい。単回用量の抗CD19抗体#2を用いる処理は、B細胞のほぼ完全な枯渇をもたらした。
【図１２−２】図１２−１の続きである。
【図１３】抗CD19抗体#2がin vivoモデル系における腫瘍増殖を有意に低下させることを示す。CB17 SCIDマウスの後脇腹に、5 x 106個のRaji細胞を1日目にs.c.注入した。動物を、4日目に開始して10 mg/kgの抗体の5回の隔週用量を用いて処理した。用いる抗体は、(i)抗CD19#2(3649)、(ii)ADCC活性が低下した抗CD19#2のFc変異体(3649-TM)、(iii)抗CD20、および(iv)無関係の特異性のアイソタイプ対照(R347)である。対照動物群にはPBSのみを与えた。腫瘍サイズを、標準的な手順を用いて週に2回測定した。
【図１４】抗CD19抗体#2がin vivoモデル系における腫瘍増殖を有意に低下させることを示す。CB17 SCIDマウスの後脇腹に、5 x 106個のRaji細胞を1日目にs.c.注入した。動物を、4日目に開始して10 mg/kgまたは2.5 mg/kgの抗体の5回の隔週用量を用いて処理した。用いる抗体は、(i) 10 mg/kgまたは2.5 mg/kgの抗CD19#2(3649 10 mg/kgおよび3649* 2.5 mg/kg)、(ii) 10 mg/kgのADCC活性が低下した抗CD19#2のFc変異体(3649-TM)、(iii) 10 mg/kgのヒトADCC活性が増強された抗CD19#2のFc変異体(3649-3M)、(iv) 10 mg/kgの抗CD20、および(v) 10 mg/kgの無関係の特異性のアイソタイプ対照(R347)である。対照動物群にはPBSのみを与えた。腫瘍サイズを、標準的な手順を用いて週に2回測定した。
【図１５】ELISAにより決定されたFcγRIIIAの158V対立遺伝子への3649、3649-3M、および3649-aFuc抗CD19抗体の結合プロフィールを示す。抗CD20抗体を、参照対照としてアッセイ中に含有させた。FcγRIIIAに対する3649-3M Fc変異体抗体および3649-aFucアフコシル化抗体の結合親和性は、フコシル化3649抗体のものよりも非常に高い。3649および抗CD20抗体は、同一の結合プロフィールを有する。
【図１６−１】エフェクター細胞のFcγRIIIA遺伝子型が抗CD19#2抗体のin vitroでのADCC活性に影響することを示す。ADCCアッセイを、製造業者の説明書に従ってCytoTox 96(商標)キット(Promega)を用いて実施した。用いる抗体は、(i)アフコシル化抗CD19#2 (3649-aFuc)、(ii)抗CD19#2の3M Fc変異体(3649-3M)、および(iii)抗CD20対照である。Daudi細胞が標的として役立つ。NK細胞系(A)または新鮮に単離されたNK細胞(B-E)を、エフェクター細胞として用いた。V158/V158 (C)、V158/F158 (D)、およびF158/F158 (E) FcγRIIIA遺伝子型を有するNK細胞を試験した。少なくとも1コピーのFcγRIIIA受容体の高親和性アイソフォーム(V158/V158およびV158/F158遺伝子型)を含むNK細胞は、低親和性対立遺伝子(F158/F158遺伝子型)について同型のNK細胞よりも効率的なエフェクター細胞である。V158/V158またはV158/F158 NK細胞(C、D)により媒介されるフコシル化抗体(3649)の観察されるADCC活性は、F158/F158 NK細胞(E)により媒介されるアフコシル化抗体(3649-aFuc)のADCC活性に匹敵するものである。
【図１６−２】図１６−１の続きである。
【図１７−１】細胞表面抗原発現表現型に基づく(A)循環、(B)脾臓、(C)骨髄、および(D)腹腔B細胞サブセットの同定スキームを示す。蛍光染色された単離細胞集団を、フローサイトメーター上で分析した。B細胞サブセットをゲートの連続使用を介して同定し、測定した。プロセスの流れを、太字の灰色の矢印により示す。例えば、脾臓の濾胞性B細胞を以下のように同定した：(i)生細胞を低い7AAD染色に基づいてゲート化する、(ii)生細胞画分に由来するリンパ球を、その特徴的なFSCおよびSSC表現型に基づいて同定する、(iii)生リンパ球中のB細胞を、抗mCD19および抗B220染色を用いて同定する、(iv)B1a細胞を、B220発現の差異に基づいてB細胞から分離する、(v)成熟および過渡的B細胞集団を、CD93の示差的発現に基づいて互いから識別する、(vi)成熟B細胞の濾胞性B細胞サブ集団を、CD23発現の差異に基づいて辺縁帯のB細胞画分から分離する。
【図１７−２】図１７−１の続きである。
【図１７−３】図１７−２の続きである。
【図１７−４】図１７−３の続きである。
【図１８】細胞に基づくELISAアッセイにおける、組換えヒトCD19発現300B4細胞に対する親和性成熟3649抗CD19抗体Fabフラグメントの結合プロフィールを示す。VH CDR3中に1個のアミノ酸置換を含むFabの代表的サンプルを用いて得られた結果を示す。3649抗CD19 Fab (3649 peri)を、参照標準物として用いた。組換えヒトCD19発現300B4細胞に対する4G6および4B7 Fabの親和性は、対照3649 Fabのものよりも有意に高い。試験した他のFabは全て、対照3649 Fabのものと類似する親和性を有する。
【図１９】細胞に基づくELISAアッセイにおける、組換えヒトCD19発現300B4細胞に対する親和性成熟3649抗CD19抗体Fabフラグメントの結合プロフィールを示す。ここで特性評価されたFabを、以前のCDR特異的スクリーニングにおいて同定された有益な単一アミノ酸置換のあらゆる可能な組合せを含むライブラリーから同定した。組換えヒトCD19発現300B4細胞に対する最も高い親和性を有する6個のFabの結合プロフィールを示す。3649抗CD19 Fab(3649 peri)を参照標準物として用いた。6個全部の親和性成熟Fabの組換えヒトCD19発現300B4細胞に対する親和性は、対照3649 Fabのものよりも高い。
【図２０】細胞に基づくELISAアッセイにおける、組換えヒトCD19発現300B4細胞に対する親和性成熟3649抗CD19抗体の結合プロフィールを示す。3649抗CD19抗体を参照標準物として用いた。16C9 IgGの結合プロフィールは、3649対照抗体のものと類似している。14H5、15D1、15D7、16C4、および7E12親和性成熟抗体の結合親和性は、対照3649抗体のものよりも高い。
【図２１】細胞に基づくELISAアッセイにおける、CD19発現Raji細胞に対する親和性成熟3649抗CD19抗体の結合プロフィールを示す。3649抗CD19抗体を参照標準物として用いた。6個の抗体の全部(14H5、15D1、15D7、16C4、16C9および7E12)の結合親和性は、対照3649抗体のものよりも高い。
【図２２】細胞に基づくELISAアッセイにおける、CD19発現Daudi細胞に対する親和性成熟3649抗CD19抗体の結合プロフィールを示す。3649抗CD19抗体を参照標準物として用いた。6個の抗体の全部(14H5、15D1、15D7、16C4、16C9および7E12)の結合親和性は、対照3649抗体のものよりも高い。
【図２３】細胞に基づくELISAアッセイにおける、組換えヒトCD19発現300B4細胞に対する親和性成熟3649抗CD19抗体の結合プロフィールを示す。14H5-YG、14H5-DG、および14H5-LGは、14H5親和性成熟3649抗CD19抗体の単一アミノ酸置換変異体である。14H4および16C4親和性成熟3649抗CD19抗体を、参照標準物として用いた。14H5-YG、14H5-DG、および14H5-LG抗体の結合親和性は、14H5および16C4対照抗体のものよりも低い。
【図２４Ａ】親和性成熟3649抗CD19抗体の動的解離速度比較を示す。Ramos細胞を、親和性成熟抗CD19抗体と共にインキュベートし、洗浄し、37℃で0、30、または60分間さらにインキュベートした。インキュベーション期間の終わりに細胞を、蛍光二次抗体を用いて染色し、フローサイトメーター上で分析した。0、30、および60分間のインキュベーション後の細胞の平均蛍光強度を示す。時間0で観察される平均蛍光強度(MFI)を、試験した各抗体について100％に設定する。3649抗CD19抗体および抗CD20抗体を、参照標準物として用いた。細胞表面からの6個全部の親和性成熟3649抗CD19抗体(14H5、15D1、15D7、16C4、16C9および7E12)の排除は、参照標準物のものよりも遅い。
【図２４Ｂ】親和性成熟3649抗CD19抗体の動的解離速度比較を示す。Ramos細胞をAlexa 647結合HB12B、3649、または16C4抗CD19抗体を用いて染色し、洗浄し、37℃で0、30または60分間さらにインキュベートした。細胞を、インキュベーション期間の終わりにフローサイトメーター上で分析した。直接結合した抗CD20抗体を、参照対照として実験に含有させた。様々なインキュベーション期間後に検出された平均蛍光強度(MFI)を、時間0で見られるMFIの比率として表す。16C4親和性成熟抗CD19抗体を用いる染色後のMFIの喪失は、3649およびHB12B抗CD19抗体について見られるシグナルの喪失よりも非常に遅い。
【図２５】Daudi細胞に対する親和性成熟3649抗CD19抗体の結合プロフィールを示す。Daudi細胞を、14H5、15D1、15D7、16C4、16C9または7E12親和性成熟抗CD19抗体および蛍光標識された二次抗体を用いて染色した。3649抗CD19抗体を、参照標準物として用いた。染色された細胞を、フローサイトメーター上で分析した。様々な抗体濃度で観察される中央蛍光強度(中央FI)をチャートに提供する。親和性成熟3649抗CD19抗体に関する中央FIは、参照標準物のものよりも高かった。
【図２６】親和性成熟3649抗CD19抗体のin vitroでのADCC活性を示す。(A)14H5、14H5-DGおよび16C4親和性成熟抗CD19抗体のin vitroでのADCC活性を、Daudi標的細胞を用いてアッセイした。3649抗CD19抗体を、参照標準物として用いた。3種全部の親和性成熟抗体のADCC活性は、低い抗体濃度(0.01および0.1μg/mlの抗体)で参照標準物のものよりも高い。3種全部の親和性成熟抗体のADCC活性は、高い抗体濃度(1および10μg/mlの抗体)で参照標準物の活性と同等である。(B)アフコシル化16C4抗体(16C4-aFuc)のADCC活性を、Daudi標的細胞を用いるin vitroアッセイにおいて決定した。16C4-aFucのADCC活性は、参照対照3649-aFuc、抗CD20およびフコシル化16C4参照抗体のものよりも有意に高い。
【図２７】親和性成熟抗CD19抗体のクマシー染色IEF-PAGEを示す。16C4、16C9、7E12、14H5、15D7、15D1、14H5-DG、および3649抗体の等電点は、それぞれ、7.83、8.04、7.69、7.76、7.61、7.72、7.48、および7.75である。
【図２８−１】アフコシル化3649抗CD19抗体によるin vivoでのB細胞枯渇を示す。C57Bl6 hCD19 tg +/-動物を、10、50、または250μgのフコシル化3649抗CD19抗体(3649)またはアフコシル化3649抗CD19抗体(3649-aFuc)の単回i.v.用量を用いて処理した。陰性対照動物を、(i)3649抗CD19抗体のADCC障害性Fc変異体(3649 TM)または(ii)無関係の特異性の抗体(R347)を用いて処理した。循環リンパ球(A)または脾臓リンパ球(B)を、抗体処理の7日後に単離した。単離された細胞を表5に記載のように免疫染色して、様々なB細胞集団を同定した。B220+ CD19+ B細胞の割合を示す。アフコシル化3649抗CD19抗体は、同じ量のフコシル化抗CD19抗体よりも有意に高いB細胞枯渇を達成する。3649TM対照抗体処理された動物中では、B細胞枯渇は検出されない。
【図２８−２】図２８−１の続きである。
【図２９】アフコシル化3649抗CD19抗体で処理されたマウスにおけるNK細胞活性化の増強を示す。C57Bl6 hCD19 tg +/-動物を、10μgのフコシル化3649抗CD19抗体(3649)またはアフコシル化3649抗CD19抗体(3649-aFuc)の単回i.v.用量を用いて処理した。陰性対照動物を、同じ量の無関係の特異性のアイソタイプが一致した抗体(R347)を用いて処理した。循環リンパ球を、抗体処理の7日後に単離した。単離された細胞を、蛍光標識された抗NK1.1、抗DX5、および抗CD107a抗体を用いて染色した。NK1.1+、DX5+ゲート化生リンパ球のCD107a対NK1.1のプロットを示す。アフコシル化3649抗CD19抗体で処理された動物から単離されたより高い割合のNK細胞が、フコシル化3649抗CD19抗体で処理された動物から単離されたNK細胞よりも、その細胞表面上にCD107aを提示する。
【図３０】アフコシル化抗CD19抗体#2(3649-aFuc)がin vivoモデル系における腫瘍増殖を有意に低下させることを示す。CB17 SCIDマウスの後脇腹に、5 x 106個のRaji細胞を1日目にs.c.注入した。4日目に開始して10 mg/kgまたは2.5 mg/kgの抗体の5回の隔週用量を用いて動物を処理した。用いる抗体は、(i)10 mg/kgのフコシル化抗CD19#2(3649)、(ii)10 mg/kgまたは2.5 mg/kgのアフコシル化抗CD19#2(3649-aFuc)、(iii) 10 mg/kgの抗CD20、および(iv) 10 mg/kgの無関係の特異性のアイソタイプ対照抗体(R347)である。対照動物群にはPBSのみを与えた。腫瘍サイズを標準的な手順を用いて週に2回測定した。
【図３１−１】16C4および14H5親和性成熟抗CD19抗体を用いるin vivoでのB細胞枯渇を示す。C57Bl6 hCD19 tg +/-動物を、10、50、または250μgのフコシル化16C4親和性成熟抗CD19抗体(16C4)または14H5DG親和性成熟抗CD19抗体(14H5DG)の単回i.v.用量を用いて処理した。参照対照動物を、(i)3649抗CD19抗体(3649)、(ii)3649抗CD19抗体のADCC増強されたFc変異体(3649 3M)、および(iii)アフコシル化3649抗CD19抗体(3649-aFuc)を用いて処理した。陰性対照動物を、(i)3649抗CD19抗体のADCC障害性Fc変異体(3649 TM)または(ii)無関係の特異性の抗体(R347)を用いて処理した。循環リンパ球(A)または脾臓リンパ球(B)を、抗体処理の7日後に単離した。単離された細胞を、表5に記載のように免疫染色して、様々なB細胞集団を同定した。B220+ CD19+ B細胞の割合を示す。16C4親和性成熟抗CD19抗体は、3649抗CD19親抗体よりもわずかに高いB細胞枯渇を達成した。3649-aFucおよび3649 3M抗体は、16C4親和性成熟抗体よりも良好な枯渇を達成した。14H5DG親和性成熟抗CD19抗体は、3649抗CD19親抗体よりもB細胞の枯渇においてあまり有効ではない。パネル(A)の内側の値は、所与の抗体により達成される枯渇率の値である。
【図３１−２】図３１−１の続きである。
【図３２】細胞に基づく結合アッセイ(Luら、J. Immunol. Methods 314:74-79 (2006))における、組換えヒトCD19発現300B4細胞に対する64D4親和性成熟Fabの結合活性を示す。64D4は、VH CDR2中に単一アミノ酸置換を含む16C4抗CD19抗体の変異体である。16C4および3649抗CD19 Fab(それぞれ、16C4supおよび3649sup)を、参照標準物として用いた。組換えヒトCD19発現300B4細胞に対する64D4 Fabの親和性は、対照16C4および3649 Fabのものよりも有意に高い。
【図３３−１】コンビナトリアルファージディスプレイライブラリーから単離された親和性成熟変異体抗CD19 Fabの特性評価を示す。細胞表面に提示されたヒトCD19抗原に対する16C4 Fabの親和性成熟変異体の結合プロフィールは、(A)300B4および(B)Raji細胞を用いる細胞に基づく結合アッセイにおける尺度であった(Luら、J. Immunol. Methods 314:74-79 (2006))。16C4および3649抗CD19 Fab(それぞれ、16C4supおよび3649sup)を、参照標準物として用いた。300B4およびRaji細胞に対する6C11、2B11、3B4、5C11、3C3、9G7、1H4、および5C4親和性成熟Fabの結合親和性は、対照3649および16C4 Fabのものよりも高い。(C)親和性成熟Fabクローンのアミノ酸配列を、標準的な実験室方法を用いて決定した。ユニークなFabクローンのCDR配列を提供する。親16C4配列のものと異なるアミノ酸残基を、一文字アミノ酸コードを用いて印刷し；親配列と同一の残基を「-」を用いてマークする。
【図３３−２】図３３−１の続きである。
【図３３−３】図３３−２の続きである。
【図３４】組換えヒトCD19発現300B4細胞に対する2B11、3C3、5C4、6C11、6F7、および9G7親和性成熟IgG抗CD19抗体の結合プロフィールを示す。結合活性を、細胞に基づくアッセイを用いて測定した(Luら、J. Immunol. Methods 314:74-79 (2006))。16C4および3649抗CD19抗体を、参照標準物として用いた。300B4細胞に対する、試験した親和性成熟抗CD19抗体の結合親和性は、参照16C4および3649抗体のものよりも高い。
【図３５−１】(A)Raji細胞および(B)Daudi細胞に対する親和性成熟16C4抗CD19抗体の結合プロフィールを示す。細胞を3C3、6C11、または9G7親和性成熟抗CD19抗体および蛍光標識された二次抗体を用いて染色した。16C4抗CD19抗体を、参照標準物として用いた。染色された細胞を、フローサイトメーター上で分析した。様々な抗体濃度で観察された中央蛍光強度(中央FI)を提供する。親和性成熟16C4変異体抗CD19抗体を用いて染色された細胞の中央FIは、0.0625〜0.125μg/mlの一次抗体濃度で、参照標準染色細胞のものよりも高かった。親和性成熟抗体を用いて得られた中央FIは、0.25〜10μg/mlの範囲で、参照抗体のものと実質的に同じであった。
【図３５−２】図３５−１の続きである。
【図３６】親和性成熟16C4変異体抗CD19抗体のin vitroでのADCC活性を示す。3C3、6C11、または9G7親和性成熟抗CD19抗体のin vitroでのADCC活性を、Raji標的細胞を用いてアッセイした。16C4抗CD19抗体を、参照標準物として用いた。3種全部の親和性成熟抗体のADCC活性は、試験した全ての濃度(0.01〜10μg/ml)で参照標準物のものと実質的に同じである。
【図３７】親和性成熟16C4変異体抗CD19抗体のin vitroでのADCC活性を示す。3C3、6C11、または9G7親和性成熟抗CD19抗体のin vitroでのADCC活性を、Daudi標的細胞を用いてアッセイした。16C4抗CD19抗体を、参照標準物として用いた。3種全部の親和性成熟抗体のADCC活性は、試験した全ての濃度(0.01〜10μg/ml)で参照標準物のものと実質的に同じである。
【図３８−１】単回用量のi.v.投与されたアフコシル化16C4抗CD19抗体を用いるB細胞枯渇後のB細胞および血清免疫グロブリンレベルの長期間の回復を示す。(A)実験プロトコル。4または5匹のhuCD19 tg+/-マウスの群に、250、50、または10μgのアフコシル化16C4抗CD19抗体(16C4 aFuc)の単回i.v.用量を投与した。対照群を、PBSまたは250μgの無関係の特異性の対照抗体(R347)を用いて処理した。動物について、2週間毎に1回血液を回収した；1回目の血液回収(bleed)を、枯渇抗体の投与の7日前に行った。最初の11週間から得た知見をパネルにまとめる。(B)全ての群の動物の体重は正常なままであった。血液B細胞レベルを、(C)リンパ球画分または(D)血液1μlあたりのB細胞数として表す。3種全部の16C4 aFuc抗体用量が、完全なB細胞枯渇を達成した。B細胞の回復は、それぞれ、10および50μgの16C4 aFuc抗体を受ける動物において第5週および第9週までに完了した。250μgの16C4 aFuc抗体の投与の11週間後の場合、B細胞回復は依然として完了していなかった。血清(E)IgM、(F)IgG1、および(G)IgG2bは、50または250μgの16C4 aFucの投与後でも変化しなかった。血清免疫グロブリンレベルは、10μgの16C4 aFuc抗体または対照抗体R347またはPBSの投与後に増加した。このデータは、16C4 aFucは、進行中の免疫グロブリン産生を抑制したが、血清中に予め存在する免疫グロブリンに対する影響は最小であったことを示す。
【図３８−２】図３８−１の続きである。
【図３８−３】図３８−２の続きである。
【図３８−４】図３８−３の続きである。
【図３８−５】図３８−４の続きである。
【図３８−６】図３８−５の続きである。
【図３８−７】図３８−６の続きである。
【図３９−１】抗CD19抗体に誘導される細胞内シグナリングを示す。(A-B) 3649、3649-TM、3649-3M、3649-aFuc、または16C4抗体処理は、Raji細胞中でのCD19のチロシンリン酸化レベルを有意に増加させる。(C-D)抗CD19抗体処理は、抗IgM処理により誘導されるERK1/2リン酸化を阻害しない。
【図３９−２】図３９−１の続きである。
【図４０】抗CD19抗体処理は抗IgM/CD40に媒介されるB細胞増殖を阻害することを示す。
【図４１−１】抗CD19抗体処理は精製された末梢B細胞の抗IgM/CpGにより誘導される増殖を阻害することを示す。(A)抗IgM(1μg/ml)およびCpG(2μg/ml)の存在下でのインキュベーションの4日後のCFSE染色された精製末梢血B細胞の蛍光強度プロフィールを示す。刺激されなかった第1の対照細胞集団およびCpGのみで刺激された第2の対照細胞集団のCFSEプロフィールを、参照標準物として含有させる。(B)16C4抗CD19またはR347対照抗体の存在下での抗IgM/CpGを用いる刺激の4日後のB細胞のCFSEプロフィールを示す。抗IgM/CpGにより誘導されるB細胞増殖は、16C4抗体の存在下で有意に低下する。
【図４１−２】図４１−１の続きである。
【図４２】3649-3M Fc変異体抗CD19抗体が3649-TM Fc変異体抗体よりも抗IgM/CpGにより誘導されるB細胞増殖のより有効な阻害剤であることを示す。(A）R347対照、(B)3649-TM抗CD19、または(C)3649-3M抗CD19抗体の存在下での抗IgM/CpGによる刺激の4日後のB細胞のCFSEプロフィールを示す。
【図４３】CD19およびFcγRIIB受容体を介する3649-3M抗体により誘導されるシグナリングが抗IgM/CpGを介するB細胞増殖を相乗的に阻害することを示す。
【図４４】表面結合した抗CD19抗体がRaji細胞により効率的に内在化することを示す。35％の表面結合した16C4並びに55％の表面結合したHB12Bおよび3649抗CD19抗体は、37℃で60分間のインキュベーション後に内在化する。
【図４５】CD19の表面発現が抗CD19抗体処理の24時間後に有意に低下することを示す。CD19の細胞表面発現は、3649、3649-TM、3649-3M、3649-aFuc、または16C4抗CD19抗体の存在下での24時間のインキュベーション後に(A)Raji細胞および(B)精製末梢B細胞において55〜90％低下する。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
本発明は、ヒトCD19抗原に結合するヒト、ヒト化、またはキメラ抗CD19抗体、ならびにこれらの抗体を含む組成物に関する。特定の実施形態においては、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗CD19抗体は、抗原依存的細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)を媒介することができる。他の実施形態においては、本発明は、IgG1および／またはIgG3ヒトアイソタイプのヒト、ヒト化、またはキメラ抗CD19抗体を含む組成物、ならびに、ヒトADCC、CDC、および／またはアポトーシスを媒介することができるIgG2および／またはIgG4ヒトアイソタイプのヒト、ヒト化、またはキメラ抗CD19抗体に関する。さらなる実施形態においては、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗CD19抗体は、抗IgM/CpGに刺激されるB細胞増殖を阻害することができる。
【００６２】
本発明は、キメラおよびヒト化型の抗CD19マウスモノクローナル抗体HB12AおよびHB12Bを提供する。一実施形態においては、本発明のヒト化抗CD19抗体は、HB12AもしくはHB12Bの結合親和性に匹敵するか、またはキメラHB12B抗体の結合親和性に匹敵する親和性でヒトCD19に結合することができる。
【００６３】
一実施形態においては、本発明のヒト化抗CD19モノクローナル抗体は、VHおよびVKを含んでもよく、ここで、VHは、4個のフレームワーク領域、V3-72のヒト生殖線VH断片のFW1、FW2、およびFW3(Tomlinson, I. M.ら(1992) J. Mol. Biol., 227, 776-798に記載されたDP29)、ならびにヒト生殖線JH4断片のFW4(Mattila, P. S.ら(1995) Eur. J. Immunol., 25, 2578-2582)；ならびにHB12B抗体の3個のVH CDR配列、CDR1(配列番号22)、CDR2(配列番号24)、およびCDR3(配列番号26)を含み；VKは、4個のフレームワーク領域、ヒト生殖線Vκ断片A10(Straubinger, B. Iら(1988) Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 369, 601-607)のFW1、FW2、FW3、ならびにヒト生殖線免疫グロブリンκJ4断片(Hieter, P. A.ら(1982) J. Biol. Chem., 257, 1516-1522)；ならびにHB12B抗体の3個のVK CDR配列、CDR1(配列番号28)、CDR2(配列番号30)、およびCDR3(配列番号32)を含む。一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、VHおよびVKを含んでもよく、ここで、VHは、4個のフレームワーク領域、V3-72のヒト生殖線VH断片のFW1、FW2、およびFW3(Tomlinson, I. M.ら(1992) J. Mol. Biol., 227, 776-798に記載されたDP29)、ならびにヒト生殖線JH4断片のFW4(Mattila, P. S.ら(1995) Eur. J. Immunol., 25, 2578-2582)；ならびに上記の表1に列挙されたCDRのアミノ酸配列を有する少なくとも1個のCDRを含み；VKは、4個のフレームワーク領域、ヒト生殖線Vκ断片A10(Straubinger, B. Iら(1988) Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 369, 601-607)のFW1、FW2、FW3、ならびにヒト生殖線免疫グロブリンκJ4断片(Hieter, P. A.ら(1982) J. Biol. Chem., 257, 1516-1522)；ならびに上記の表1に列挙されたCDRのアミノ酸配列を有する少なくとも1個のCDRを含む。一実施形態においては、この抗体は、Y40F、K53HおよびY91Fからなる群より選択される1個以上のVKフレームワーク突然変異を含んでもよい。一実施形態においては、VKフレームワーク領域は、Y40F、K53HおよびY91Fのそれぞれの点突然変異を含んでもよい。別の実施形態においては、VKフレームワーク領域は、Y40FおよびK53H点突然変異のみを含んでもよい。別の実施形態においては、VKフレームワークは、Y40F点突然変異のみを含んでもよい。
【００６４】
1.1. 抗CD19抗体のCDR領域
特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、配列番号22、配列番号24、および配列番号26からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1個のCDRを含む重鎖可変領域VHを含んでもよく；配列番号36、配列番号38、配列番号40、および配列番号42からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1個のFW領域をさらに含んでもよい。別の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、配列番号22、配列番号24、および配列番号121からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1個のCDRを含む重鎖可変領域VHを含んでもよく、配列番号36、配列番号38、配列番号40、および配列番号42からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1個のFW領域をさらに含んでもよい。さらなる実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、配列番号22、配列番号116、および配列番号121からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1個のCDRを含む重鎖可変領域VHを含んでもよく、配列番号36、配列番号38、配列番号40、および配列番号42からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1個のFW領域をさらに含んでもよい。さらなる実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、配列番号208、配列番号116、および配列番号121からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1個のCDRを含む重鎖可変領域VHを含んでもよく、配列番号36、配列番号38、配列番号40、および配列番号42からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1個のFW領域をさらに含んでもよい。さらなる実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、配列番号208、配列番号210、および配列番号121からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1個のCDRを含む重鎖可変領域VHを含んでもよく、配列番号36、配列番号38、配列番号40、および配列番号42からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1個のFW領域をさらに含んでもよい。別の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、上記の表1に列挙されたVH CDR1、VH CDR2、またはVH CDR3のアミノ酸配列を有する少なくとも1個のCDRを含む重鎖可変領域VHを含んでもよく、配列番号36、配列番号38、配列番号40、および配列番号42からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1個のFW領域をさらに含んでもよい。
【００６５】
さらなる実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、配列番号22、配列番号24、および配列番号26からなる群より選択される少なくとも1個のCDR配列を含む重鎖可変領域VHを含んでもよい。
【００６６】
さらなる実施形態においては、抗CD19抗体は、配列番号6、配列番号8、および配列番号10からなる群より選択される少なくとも1個のCDR配列を含む重鎖可変領域VHを含んでもよい。
【００６７】
一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、配列番号22、配列番号24および配列番号121からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1個のCDRを含む重鎖可変領域VHを含んでもよい。別の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、配列番号22、配列番号116および配列番号121からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1個のCDRを含む重鎖可変領域VHを含んでもよい。別の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、配列番号208、配列番号116および配列番号121からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1個のCDRを含む重鎖可変領域VHを含んでもよい。別の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、配列番号208、配列番号210および配列番号121からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1個のCDRを含む重鎖可変領域VHを含んでもよい。
【００６８】
別の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、上記の表1に列挙されたVH CDR1、VH CDR2、またはVH CDR3のアミノ酸配列を有する少なくとも1個のCDRを含む重鎖可変領域VHを含んでもよい。
【００６９】
別の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、上記の表1に列挙された抗体のいずれか1つのVH CDR1、VH CDR2、およびVH CDR3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域VHを含んでもよい。本発明の抗CD19抗体は、軽鎖可変領域VLをさらに含んでもよい。
【００７０】
別の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、上記の表1に列挙された抗体のいずれか1つのVL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域VLを含んでもよい。本発明の抗CD19抗体は、重鎖可変領域VHをさらに含んでもよい。
【００７１】
別の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、上記の表1に列挙された抗体のいずれか1つのVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００７２】
特定の実施形態においては、抗CD19抗体は、HB12B-(3-72/JH4)(配列番号34)と命名されたヒト化VHのVHドメイン配列を含んでもよい。
【００７３】
一実施形態においては、本明細書に記載の抗CD19抗体は、配列番号103、106、191、および192からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域VHを含んでもよい。別の実施形態においては、本明細書に記載の抗CD19抗体は、上記の表1に列挙されたVHドメインのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域VHを含んでもよい。
【００７４】
特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、配列番号28、配列番号30、および配列番号32からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1個のCDRを含む軽鎖可変領域VKを含んでもよく、配列番号54、配列番号56、配列番号72、配列番号82、配列番号64、配列番号58、配列番号66、および配列番号60からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1個のFW領域をさらに含んでもよい。
【００７５】
一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、配列番号28、配列番号125、および配列番号32からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1個のCDRを含む軽鎖可変領域VKを含んでもよく、配列番号54、配列番号56、配列番号72、配列番号82、配列番号64、配列番号58、配列番号66、および配列番号60からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1個のFW領域をさらに含んでもよい。さらなる実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、配列番号211、配列番号218、および配列番号222からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1個のCDRを含む軽鎖可変領域VKを含んでもよく、配列番号54、配列番号56、配列番号72、配列番号82、配列番号64、配列番号58、配列番号66、および配列番号60からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1個のFW領域をさらに含んでもよい。さらなる実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、配列番号28、配列番号220、および配列番号229からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1個のCDRを含む軽鎖可変領域VKを含んでもよく、配列番号54、配列番号56、配列番号72、配列番号82、配列番号64、配列番号58、配列番号66、および配列番号60からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1個のFW領域をさらに含んでもよい。さらなる実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、配列番号215、配列番号221、および配列番号222からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1個のCDRを含む軽鎖可変領域VKを含んでもよく、配列番号54、配列番号56、配列番号72、配列番号82、配列番号64、配列番号58、配列番号66、および配列番号60からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1個のFW領域をさらに含んでもよい。別の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、上記の表1に列挙されたVK CDR1、VK CDR2、またはVK CDR3のアミノ酸配列を有する少なくとも1個のCDRを含む軽鎖可変領域VKを含んでもよく、配列番号54、配列番号56、配列番号72、配列番号82、配列番号64、配列番号58、配列番号66、および配列番号60からなる群より選択される
アミノ酸配列を有する少なくとも1個のFW領域をさらに含んでもよい。
【００７６】
さらなる実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、配列番号28、30、および32からなる群より選択される少なくとも1個のCDR配列を含む軽鎖可変領域VKを含んでもよい。
【００７７】
さらなる実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、配列番号12、14、および16からなる群より選択される少なくとも1個のCDR配列を含む軽鎖可変領域VKを含んでもよい。
【００７８】
一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、配列番号28、配列番号125、および配列番号32からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1個のCDR配列を含む軽鎖可変領域VKを含んでもよい。一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、配列番号211、配列番号218、および配列番号222からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1個のCDR配列を含む軽鎖可変領域VKを含んでもよい。一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、配列番号28、配列番号220、および配列番号229からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1個のCDR配列を含む軽鎖可変領域VKを含んでもよい。一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、配列番号215、配列番号221、および配列番号222からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1個のCDR配列を含む軽鎖可変領域VKを含んでもよい。別の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、上記の表1に列挙されたVK CDR1、VK CDR2、またはVK CDR3のアミノ酸配列を有する少なくとも1個のCDR配列を含む軽鎖可変領域VKを含んでもよい。
【００７９】
特定の実施形態においては、抗CD19抗体は、HB12B-(A10-Jk4) (配列番号52)、HB12B-364987 (配列番号62)、HB12B-3649 (配列番号68)、HB12B-36 (配列番号70)、7E12 VK (配列番号110)、14H5 VK (配列番号111)、16C9 VK (配列番号113)、15D1 VK (配列番号112)、3C3 VK (配列番号193)、6C11 VK (配列番号204)、および9G7 VK (配列番号205)からなる群より選択されるヒト化VKドメイン配列を含んでもよい。
【００８０】
本発明は、ヒトCD19に結合することができる本明細書に記載のVHドメイン、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VKドメイン、VK CDR1、VK CDR2、またはVK CDR3の誘導体(例えば、上記の表1に列挙された変異体を参照)を含む、ヒトCD19に結合する抗体を包含する。例えば、アミノ酸置換を作製するのに日常的に用いられる部位特異的突然変異誘発およびPCR媒介性突然変異誘発などの、当業者には公知の標準的な技術を用いて、抗体をコードするヌクレオチド配列中に突然変異(例えば、付加、欠失、および／または置換)を導入することができる。一実施形態においては、VHおよび／またはVK CDR誘導体は、HB12AまたはHB12B抗CD19抗体の元のVHおよび／またはVK CDRと比較して、25個未満のアミノ酸置換、20個未満のアミノ酸置換、15個未満のアミノ酸置換、10個未満のアミノ酸置換、5個未満のアミノ酸置換、4個未満のアミノ酸置換、3個未満のアミノ酸置換、2個未満のアミノ酸置換、または1個のアミノ酸置換を含んでもよい。別の実施形態においては、VHおよび／またはVK CDR誘導体は、1個以上の予測された非必須アミノ酸残基(すなわち、ヒトCD19に特異的に結合する抗体にとって重要ではないアミノ酸残基)で作製された保存的アミノ酸置換(例えば、上掲)を有してもよい。また、飽和突然変異誘発などにより、VHおよび／またはVK CDRコード配列の全部または一部に沿って突然変異を無作為に導入し、得られる突然変異体を生物活性についてスクリーニングして、活性を保持する突然変異体を同定することができる。突然変異誘発後、コードされた抗体を発現させ、抗体の活性を決定することができる。一実施形態においては、本明細書に開示された本発明の抗体は、US20050070693A1に記載のhA19抗体のVH CDR1およびVH CDR2を含まなくてもよい。
【００８１】
一実施形態においては、本明細書に記載のヒトまたはヒト化抗CD19抗体は、VH CDR変異体がアミノ酸置換を含む、上記の表1に列挙されたVH CDRのいずれか1つの変異体を含んでもよい。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、VH CDR変異体が1個以上の下記天然または置換アミノ酸残基：Kabatに従って番号付けられた、VH CDR1の位置32のトレオニン(T)、VH CDR2の位置60のチロシン(Y)、VH CDR2の位置60のアスパラギン酸(D)、VH CDR2の位置60のロイシン(L)、VH CDR2の位置61のアラニン(A)、VH CDR2の位置61のバリン、VH CDR3の位置100Bのチロシン(Y)、VH CDR3の位置100Bのアルギニン(R)、およびVH CDR3の位置100Bのアスパラギン(N)を含む、表1に列挙されたVH CDRの変異体を含む。
【００８２】
一実施形態においては、本明細書に記載のヒトまたはヒト化抗CD19抗体は、VH CDR変異体が、1個以上の下記の天然または置換アミノ酸残基：Kabatに従って番号付けられた、VH CDR1の位置33のグルタミン酸(E)、VH CDR1の位置33のロイシン(L)、VH CDR1の位置35のフェニルアラニン(F)、VH CDR1の位置35のチロシン(Y)、VH CDR1の位置35のアスパラギン酸(D)、VH CDR1の位置35のロイシン(L)、VH CDR2の位置57のセリン(S)、VH CDR2の位置57のプロリン(P)、VH CDR2の位置57のアスパラギン(N)、VH CDR3の位置100Bのヒスチジン(H)、VH CDR3の位置100Bのフェニルアラニン(F)、およびVH CDR3の位置99のプロリン(P)を含む、表1に列挙されたVH CDRの変異体を含んでもよい。
【００８３】
一実施形態においては、本明細書に記載のヒトまたはヒト化抗CD19抗体は、VH CDR変異体が、1個以上の下記の天然または置換アミノ酸残基：Kabatに従って番号付けられた、VH CDR1の位置32のバリン(V)、およびVH CDR2の位置52Aのロイシン(L)を含む、表1に列挙されたVH CDRの変異体を含んでもよい。
【００８４】
別の実施形態においては、本明細書に記載のヒトまたはヒト化抗CD19抗体は、VK CDRが1個以上の下記の天然または置換アミノ酸残基：Kabatに従って番号付けられた、VK CDR1の位置27Dのヒスチジン(H)、VK CDR1の位置33のイソロイシン(I)、VK CDR2の位置50のグルタミン酸(E)、VK CDR3の位置91のトレオニン(T)、およびVK CDR3の位置96のイソロイシン(I)を含む、表1に列挙されたVK CDRの変異体を含んでもよい。
【００８５】
別の実施形態においては、本明細書に記載のヒトまたはヒト化抗CD19抗体は、VK CDRが、1個以上の下記の天然または置換アミノ酸残基：Kabatに従って番号付けられた、VK CDR1の位置27Cのイソロイシン(I)、VK CDR1の位置30のロイシン(L)、VK CDR1の位置33のアルギニン(R)、VK CDR1の位置33のトレオニン(T)、VK CDR2の位置50のチロシン(Y)、VK CDR2の位置54のトレオニン(T)、VK CDR2の位置54のプロリン(P)、VK CDR2の位置55のチロシン(Y)、およびVK CDR3の位置96のアスパラギン(N)を含む、表1に列挙されたVK CDRの変異体を含んでもよい。
【００８６】
別の実施形態においては、本明細書に記載のヒトまたはヒト化抗CD19抗体は、VK CDRが、1個以上の下記の天然または置換アミノ酸残基：Kabatに従って番号付けられた、VK CDR2の位置54のアルギニン(R)、VK CDR2の位置54のトレオニン(T)、VK CDR2の位置54のアラニン(A)、およびVK CDR3の位置89のアラニン(A)を含む、表1に列挙されたVK CDRの変異体を含んでもよい。
【００８７】
本発明はさらに、ヒトCD19に結合する抗体、CDRがHB12AもしくはHB12B抗CD19抗体の1個以上のCDRのアミノ酸配列と少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％同一であるアミノ酸配列を含む、1個以上のCDRを含む前記抗体または抗体フラグメントを包含する。2個のアミノ酸配列の同一性(％)を、限定されるものではないが、BLASTタンパク質検索などの当業者には公知の任意の方法により決定することができる。
【００８８】
1.2. 抗CD19抗体のフレームワーク領域
一実施形態においては、本発明のヒト化抗CD19モノクローナル抗体のVHは、約64％〜約100％の範囲内で、HB12B-(3-72/JH4)VH(配列番号34)の対応するフレームワーク領域(すなわち、抗体YのFW1と比較した抗体XのFW1)とのアミノ酸配列同一性を有するフレームワーク領域を含んでもよい。この実施形態の特定の態様においては、本明細書に記載の抗体のヒトまたはヒト化VHフレームワーク領域は、少なくとも64％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、または少なくとも95％である、HB12B-(3-72/JH4)VH(配列番号34)とのアミノ酸配列同一性を有してもよい。
【００８９】
特定の実施形態においては、本明細書に記載の抗体のヒトまたはヒト化VHフレームワーク領域は、87個のアミノ酸のうちの少なくとも56個(56/87)のHB12B-(3-72/JH4)VH(配列番号34)の対応するフレームワーク領域とのアミノ酸配列同一性を有してもよい。特定の実施形態においては、VHフレームワークアミノ酸配列同一性は、少なくとも56/87、57/87、58/87、59/87、60/87、61/87、62/87、63/87、64/87、65/87、66/87、67/87、68/87、69/87、70/87、71/87、72/87、73/87、74/87、75/87、76/87、77/87、78/87、79/87、80/87、81/87、82/87、83/87、84/87、85/87、86/87、または87/87のアミノ酸であってよい。本明細書に記載の抗CD19抗体のVH配列は、HB12B-(3-72/JH4)のVernierアミノ酸残基に対して高い配列同一性、例えば、16残基のうちの少なくとも10個(10/16)、少なくとも11/16、少なくとも12/16、少なくとも13/16、少なくとも14/16、または少なくとも15/16のVernier残基のVernier配列同一性を有してもよい。別の実施形態においては、Vernierアミノ酸残基の不一致は、保存的アミノ酸置換であってよい。保存的アミノ酸置換である不一致は、不一致のアミノ酸がVernierアミノ酸と類似する物理的および化学的特性を有するものであり、例えば、不一致の残基は、Vernier残基と類似する特徴の極性(極性もしくは非極性)、酸性(酸性もしくは塩基性)、側鎖構造(例えば、分枝状もしくは直鎖状、またはフェニル環、ヒドロキシル部分、もしくは硫黄部分を含む)を有する。
【００９０】
他の実施形態においては、Vernierアミノ酸残基の不一致は、非保存的アミノ酸置換であってよい。非保存的アミノ酸置換である不一致は、不一致のアミノ酸が、Vernierアミノ酸と類似する物理的および化学的特性を有さないものであり、例えば、不一致の残基は、置換しようとするVernier残基と比較して、異なる極性、酸性、または側鎖構造(例えば、分枝状もしくは直鎖状、またはフェニル環、ヒドロキシル部分、もしくは硫黄部分を含む)を有する。
【００９１】
他の実施形態においては、本発明のヒトまたはヒト化抗CD19抗体は、VHフレームワーク領域が、1個以上の下記の残基：Kabatに従って番号付けられた、フレームワーク領域1の位置20のロイシン(L)、フレームワーク領域の位置27のフェニルアラニン(F)、フレームワーク領域1の位置28のトレオニン(T)、フレームワーク領域2の位置38のアルギニン(R)、フレームワーク領域2の位置48のバリン(V)、フレームワーク領域3の位置67のフェニルアラニン(F)、フレームワーク領域3の位置71のアルギニン(R)、フレームワーク領域3の位置80のロイシン(L)、およびフレームワーク領域3の位置91のチロシン(Y)を含んでもよい、VHフレームワーク領域を含んでもよい。
【００９２】
Kabat番号は、National Institutes of Health, National Technical Information Serviceにより3巻セットで公開された、Kabatら(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest、公開番号91-3242の影響力の大きい研究に基づく(本明細書では、以後「Kabat」と呼ぶ)。Kabatは、いくつかの種の抗体アイソタイプに由来する免疫グロブリン鎖の複数の配列アラインメントを提供する。整列された配列を、単一番号付け系、Kabat番号付け系に従って番号付ける。Kabat配列は、1991年の公開以来アップデートされており、電子配列データベース(最新のダウンロード可能なバージョンは、1997年)として利用可能である。任意の免疫グロブリン配列を、Kabat参照配列とのアラインメントを実施することにより、Kabatに従って番号付けることができる。従って、Kabat番号付け系は、免疫グロブリン鎖を番号付けるための統一系を提供する。特に指摘しない限り、本明細書に記載の全ての免疫グロブリンアミノ酸配列を、Kabat番号付け系に従って番号付ける。同様に、本明細書で言及される全ての単一アミノ酸位置を、Kabat番号付け系に従って番号付ける。
【００９３】
さらに特定の実施形態においては、本明細書に記載の抗CD19抗体のヒトまたはヒト化VHフレームワーク領域は、1個以上の下記のVernier、InterfaceまたはCanonical残基位置：20、22、24、26、27、28、29、30、36、37、39、45、47、48、49、67、69、71、73、78、80、90、91、92、93、94、および103での同一性または保存的不一致について選択されるフレームワーク領域を有してもよい。1個以上の不一致のVernier、InterfaceおよびCanonical残基を、例えば、突然変異誘発により変化させて、HB12AまたはHB12B VHフレームワーク領域の対応するアミノ酸残基と一致させることができる。
【００９４】
本発明の一実施形態においては、本明細書に記載の抗CD19抗体のヒトまたはヒト化VKフレームワーク領域は、約65％〜約100％の範囲内で、HB12B-(A10-Jk4) VK (配列番号52)のフレームワーク領域とのアミノ酸配列同一性を有してもよい。この実施形態の特定の態様においては、本明細書に記載の抗体のヒトまたはヒト化VKフレームワーク領域は、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、または少なくとも95％である、HB12B-(A10-Jk4)抗体VKとのアミノ酸配列同一性を有してもよい。
【００９５】
特定の実施形態においては、本明細書に記載の抗体のヒトまたはヒト化VKフレームワーク領域は、80個のアミノ酸のうちの少なくとも52個(52/80)のHB12B-(A10-Jk4) VH (配列番号52)の対応するフレームワーク領域(すなわち、抗体YのFW1と比較した抗体XのFW1)とのアミノ酸配列同一性を有してもよい。特定の実施形態においては、VHフレームワークアミノ酸配列同一性は、少なくとも52/80、53/80、54/80、55/80、56/80、57/80、58/80、59/80、60/80、61/80、62/80、63/80、64/80、65/80、66/80、67/80、68/80、69/80、70/80、71/80、72/80、73/80、74/80、75/80、76/80、77/80、78/80、79/80、または80/80のアミノ酸であってよい。本明細書に記載の抗CD19抗体のVK配列は、例えば、14個のうちの少なくとも9個(9/14)、少なくとも10/14、少なくとも11/14、少なくとも12/14、少なくとも13/14のVernier残基などのHB12BのVernierアミノ酸残基(図1を参照)に対する高い配列同一性を有してもよい。別の実施形態においては、Vernierアミノ酸残基の不一致は、保存的アミノ酸置換であってもよい。保存的アミノ酸置換である不一致は、Vernierアミノ酸と類似する物理的および化学的特性を有するものであり、例えば、不一致の残基は、Vernier残基と類似する特性の極性(極性もしくは非極性)、酸性(酸性もしくは塩基性)、側鎖構造(例えば、分枝状もしくは直鎖状、またはフェニル環、ヒドロキシル部分、もしくは硫黄部分を含む)を有する。
【００９６】
他の実施形態においては、Vernierアミノ酸残基の不一致は、非保存的アミノ酸置換であってよい。非保存的アミノ酸置換である不一致は、不一致のアミノ酸がVernierアミノ酸と類似する物理的および化学的特性を有さないものであり、例えば、不一致の残基は、置換しようとするVernier残基と比較して、異なる極性、酸性、または側鎖構造(例えば、分枝状もしくは直鎖状、またはフェニル環、ヒドロキシル部分、もしくは硫黄部分を含む)を有する。
【００９７】
他の実施形態においては、本明細書に記載のヒトまたはヒト化VKフレームワーク領域は、1個以上の下記の残基：Kabatに従って番号付けられた、フレームワーク領域2の位置36のフェニルアラニン(F)、フレームワーク領域2の位置49のヒスチジン(H)、およびフレームワーク領域3の位置87のフェニルアラニン(F)を含んでもよい。
【００９８】
さらに特定の実施形態においては、本明細書に記載のヒトまたはヒト化VKフレームワーク領域は、1個以上の下記のVernier、InterfaceまたはCanonical残基位置：2、3、4、23、35、36、38、44、56、47、48、49、64、66、68、69、71、87、88、および98で、同一性または保存的不一致について選択されるフレームワーク領域を有してもよい。1個以上の不一致のVernier、InterfaceおよびCanonical残基を、例えば、突然変異誘発により変化させて、HB12AまたはHB12Bフレームワーク領域の対応するアミノ酸残基と一致させることができる。
【００９９】
特定の実施形態においては、本発明のヒト化VHを含む重鎖を、本発明のヒト化VKを含む軽鎖と共に発現させて、ヒト化抗CD19抗体を製造することができる。特定の実施形態においては、本発明のヒト化抗CD19抗体は、HB12B-(3-72/JH4) (配列番号34)、7E12 VH (配列番号102)、14H5 VH (配列番号103)、15D1 VH (配列番号104)、15D7 VH (配列番号105)、16C4 VH (配列番号106)、14H5-YG (配列番号107)、14H5-DG (配列番号108)、14H5-LG (配列番号109)、1A7 VH (配列番号191)、3C3 VH (配列番号191)、6C11 VH (配列番号191)、9G7 (配列番号191)、3B4 VH (配列番号236)、および3F11 VH (配列番号92)と命名された配列からなる群より選択されるVH配列を含んでもよく; HB12B-(A10/JK4) (配列番号52); HB12B-364987 (もしくは364987) (配列番号62); HB12B-3649 (もしくは3649) (配列番号68); HB12B-36 (もしくは36) (配列番号70)、7E12 VK (配列番号110)、14H5 (配列番号111)、15D1 (配列番号112)、16C9 (配列番号113)、3C3 VK (配列番号193)、3E5 VK (配列番号194)、3D4 VK (配列番号195)、3F1 VK (配列番号196)、5B5 VK (配列番号197)、6F7 VK (配列番号198)、1C11 VK (配列番号199)、2B11 VK (配列番号200)、2D10 VK (配列番号201)、5C11 VK (配列番号202)、5D4 VK (配列番号203)、6C11 VK (配列番号204)、9G7 VK (配列番号205)、1H4 VK (配列番号206)、および5C4 VK (配列番号207)と命名された配列からなる群より選択されるVK配列をさらに含んでもよい。特定の実施形態においては、ヒト化抗CD19抗体は、VH配列HB12B-(3-72/JH4) (配列番号34)およびVK配列HB12B-364987 (配列番号62)を含む。特定の実施形態においては、ヒト化抗CD19抗体は、VH配列HB12B-(3-72/JH4) (配列番号34)およびVK配列HB12B-3649 (配列番号68)を含む。さらに別の実施形態においては、ヒト化抗CD19抗体は、VH配列HB12B-(3-72/JH4) (配列番号34)およびVK配列HB12B-36 (配列番号70)を含む。
【０１００】
特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、VH配列7E12 VH (配列番号102)およびVK配列7E12 VK (配列番号110)を含む。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、VH配列14H5 VH (配列番号103)およびVK配列14H5 VK (配列番号111)を含む。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、VH配列14H5-YG VH (配列番号107)およびVK配列14H5 VK (配列番号111)を含む。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、VH配列14H5-DG VH (配列番号108)およびVK配列14H5 VK (配列番号111)を含む。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、VH配列14H5-LG VH (配列番号109)およびVK配列14H5 VK (配列番号111)を含む。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、VH配列14H5 VH (配列番号103)およびVK配列16C9 VK (配列番号113)を含む。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、VH配列15D1 VH (配列番号104)およびVK配列15D1 VK (配列番号112)を含む。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、VH配列15D7 VH (配列番号105)およびVK配列14H5 VK (配列番号111)を含む。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、VH配列16C4 VH (配列番号106)およびVK配列14H5 VK (配列番号111)を含む。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、VH配列1A7 VH (配列番号191)およびVK配列14H5 VK (配列番号111)を含む。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、VH配列1A7 VH (配列番号191)およびVK配列3C3 VK (配列番号193)を含む。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、VH配列1A7 VH (配列番号191)およびVK配列3E5 VK (配列番号194)を含む。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、VH配列1A7 VH (配列番号191)およびVK配列3D4 VK (配列番号195)を含む。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、VH配列1A7 VH (配列番号191)およびVK配列5B5 VK (配列番号197)を含む。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、VH配列1A7 VH (配列番号191)およびVK配列6F7 VK (配列番号198)を含む。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、VH配列1A7 VH (配列番号191)およびVK配列2D10 VK (配列番号201)を含む。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、VH配列1A7 VH (配列番号191)およびVK配列5C11 VK (配列番号202)を含む。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、VH配列1A7 VH (配列番号191)およびVK配列9G7 VK (配列番号205)を含む。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、VH配列1A7 VH (配列番号191)およびVK配列1H4 VK (配列番号206)を含む。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、VH配列1A7 VH (配列番号191)およびVK配列5C4 VK (配列番号207)を含む。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、VH配列3B4 VH (配列番号236)およびVK配列14H5 VK (配列番号111)を含む。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、VH配列3F11 VH (配列番号192)およびVK配列3F11 VK (配列番号196)を含む。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、VH配列16C4 VH (配列番号106)およびVK配列1C11 VK (配列番号199)を含む。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、VH配列16C4 VH (配列番号106)およびVK配列2B11 VK (配列番号200)を含む。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、VH配列16C4 VH (配列番号106)およびVK配列5D4 VK (配列番号203)を含む。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、VH配列16C4 VH (配列番号106)およびVK配列6F7 VK (配列番号198)を含む。特定の実施形態に��いては、本発明の抗CD19抗体は、VH配列3F11 VH (配列番号192)およびVK配列6C11 VK (配列番号204)を含む。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、表1に列挙されたVHおよびVLの任意の組合せを含む。
【０１０１】
特定の実施形態においては、本発明のヒト化VKを含む軽鎖を、本発明のヒト化VHを含む重鎖と共に発現させて、ヒト化抗CD19抗体を製造することができる。一実施形態においては、本明細書に記載のヒト化抗CD19抗体は、HB12B-(A10/JK4) (配列番号52); HB12B-364987 (もしくは364987) (配列番号62); HB12B-3649 (もしくは3649) (配列番号68); HB12B-36 (もしくは36) (配列番号70)、7E12 VK (配列番号110)、14H5 (配列番号111)、15D1 (配列番号112)、16C9 (配列番号113)、3C3 (配列番号193)、3E5 (配列番号194)、3D4 (配列番号195)、3F11 (配列番号196)、5B5 (配列番号197)、6F7 (配列番号198)、1C11 (配列番号199)、2B11 (配列番号200)、2D10 (配列番号201)、5C11 (配列番号202)、5D4 (配列番号203)、6C11 (配列番号204)、9G7 (配列番号205)、1H4 (配列番号206)、および5C4 (配列番号207)と命名された配列からなる群より選択されるVK配列を含む。上記VK配列を、配列番号36、38、40および42からなる群より選択されるそのフレームワーク領域中にアミノ酸配列を含むVH配列と対形成させることができる。
【０１０２】
特定の実施形態においては、本発明のヒト化VHを含む重鎖を、本発明のヒト化VKを含む軽鎖と共に発現させて、ヒト化抗CD19抗体を製造することができる。一実施形態においては、本明細書に記載のヒト化抗CD19抗体は、HB12B-(3-72/JH4) (配列番号34)、7E12 VH (配列番号102)、14H5 VH (配列番号103)、15D1 VH (配列番号104)、15D7 VH (配列番号105)、16C4 VH (配列番号106)、14H5-YG (配列番号107)、14H5-DG (配列番号108)、14H5-LG (配列番号109)、1A7 (配列番号191)、3C3 VH (配列番号191)、6C11 VH (配列番号191)、9G7 (配列番号191)、3B4 VH (配列番号236)、および3F11 VH (配列番号192)と命名された配列からなる群より選択されるVH配列を含む。上記VH配列を、配列番号54、配列番号56、配列番号72、配列番号82、配列番号64、配列番号58、配列番号66、および配列番号60からなる群より選択されるそのフレームワーク領域中にアミノ酸配列を含むVK配列と対形成させることができる。
【０１０３】
特定の実施形態においては、親HB12AまたはHB12Bハイブリドーマから誘導されるヒト化VHまたはVKを、キメラ免疫グロブリン軽鎖またはキメラ免疫グロブリン重鎖として発現させて、キメラ抗CD19抗体を製造することができる。特定の実施形態においては、ヒト化VHを、HB12A VK (配列番号4)またはHB12B VK (配列番号20)を含むキメラ抗体として発現させることができる。別の特定の実施形態においては、ヒト化VKを、HB12A VH (配列番号2)またはHB12B VH (配列番号18)を含むキメラ抗体として発現させることができる。別の実施形態においては、キメラ抗CD19抗体は、HB12A VK (配列番号4)またはHB12B VK (配列番号20)のVK配列を含んでもよく、HB12A VH (配列番号2)またはHB12B VH (配列番号18)のVH配列をさらに含んでもよい。
【０１０４】
特定の実施形態においては、本発明のヒト化VHは、MGDNDIHFAFLSTGVHS (配列番号83)のリーダー配列をさらに含んでもよい。
【０１０５】
別の実施形態においては、本発明のヒト化VKは、ヒトVKI-L12遺伝子のリーダーペプチドから選択されるリーダー配列MDMRVPAQLLGLLLLWLPGAKC (配列番号84)をさらに含んでもよい。
【０１０６】
本明細書に記載の抗CD19抗体は、ヒトCD19 (hCD19)抗原に対する高い結合親和性を有してもよい。例えば、本明細書に記載の抗体は、少なくとも2 X 105 M-1s-1、少なくとも5 X 105 M-1s-1、少なくとも106 M-1s-1、少なくとも5 X 106 M-1s-1、少なくとも107 M-1s-1、少なくとも5 X 107 M-1s-1、または少なくとも108 M-1s-1の結合速度定数またはKon速度(抗体(Ab) + 抗原(Ag)Kon→Ab-Ag)を有してもよい。
【０１０７】
別の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、5x10-1 s-1未満、10-1 s-1未満、5x10-2 s-1未満、10-2 s-1未満、5x10-3 s-1未満、10-3 s-1未満、5x10-4 s-1未満、または10-4 s-1未満のKoff速度((Ab-Ag)Koff→抗体(Ab) + 抗原(Ag))を有してもよい。別の実施形態においては、本発明の抗体は、5x10-5 s-1未満、10-5 s-1未満、5x10-6 s-1未満、10-6 s-1未満、5x10-7 s-1未満、10-7 s-1未満、5x10-8 s-1未満、10-8 s-1未満、5x10-9 s-1未満、10-9 s-1未満、または10-10 s-1未満のKoffを有する。
【０１０８】
別の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、少なくとも102 M-1、少なくとも5 X 102 M-1、少なくともl03 M-1、少なくとも5 X 103 M-1、少なくとも104 M-1、少なくとも5 X 104 M-1、少なくとも105 M-1、少なくとも5 X 105 M-1、少なくとも106 M-1、少なくとも5 X 106 M-1、少なくとも107 M-1、少なくとも5 X 107 M-1、少なくとも108 M-1、少なくとも5 X 108 M-1、少なくともl09 M-1、少なくとも5 X l09 M-1、少なくとも1010 M-1、少なくとも5 X 1010 M-1、少なくとも1011 M-1、少なくとも5 X 1011 M-1、少なくとも1012 M-1、少なくとも5 X 1012 M-1、少なくとも1013 M-1、少なくとも5 X l013 M-1、少なくとも1014 M-1、少なくとも5 X 1014 M-1、少なくともl015 M-1、または少なくとも5 X l015 M-1の親和定数またはKa(kon/koff)を有してもよい。さらに別の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、5x10-2 M未満、10-2 M未満、5xl0-3 M未満、l0-3 M未満、5x10-4 M未満、10-4 M未満、5x10-5 M未満、10-5 M未満、5x10-6 M未満、10-6 M未満、5x10-7 M未満、10-7 M未満、5x10-8 M未満、10-8 M未満、5xl0-9 M未満、l0-9 M未満、5x10-10 M未満、10-10 M未満、5x10-11 M未満、10-11 M未満、5x10-12 M未満、10-12 M未満、5x10-13 M未満、l0-13 M未満、5x10-14 M未満、10-14 M未満、5xl0-15 M未満、またはl0-15 M未満の解離定数またはKd(koff/kon)を有してもよい。
【０１０９】
一実施形態においては、本明細書に記載の方法に従って用いられる本発明の抗体は、ヒトCD19に免疫特異的に結合することができ、本明細書に記載の方法または当業者には公知の方法(例えば、BIAcoreアッセイ、ELISA)(Biacore International AB, Uppsala, Sweden)を用いて評価されるように、3000 pM未満、2500 pM未満、2000 pM未満、1500 pM未満、1000 pM未満、750 pM未満、500 pM未満、250 pM未満、200 pM未満、150 pM未満、100 pM未満、75 pM未満の解離定数(Kd)を有してもよい。特定の実施形態においては、本明細書に記載の方法に従って用いられる本発明の抗体は、ヒトCD19抗原に免疫特異的に結合することができ、本明細書に記載の方法または当業者には公知の方法(例えば、BIAcoreアッセイ、ELISA)を用いて評価されるように、25〜3400 pM、25〜3000 pM、25〜2500 pM、25〜2000 pM、25〜1500 pM、25〜1000 pM、25〜750 pM、25〜500 pM、25〜250 pM、25〜100 pM、25〜75 pM、25〜50 pMの解離定数(Kd)を有してもよい。別の実施形態においては、本明細書に記載の方法に従って用いられる本発明の抗体は、hCD19に免疫特異的に結合することができ、本明細書に記載の方法または当業者には公知の方法(例えば、BIAcoreアッセイ、ELISA)を用いて評価されるように、500 pM、100 pM、75 pMまたは50 pMの解離定数(Kd)を有してもよい。
【０１１０】
本発明はさらに、本明細書に記載のヒト、ヒト化、もしくはキメラ抗CD19をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片を提供する。本発明はまた、例えば、本明細書に定義されるように、ストリンジェントな条件下で、またはより低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、hCD19に結合する本明細書に記載のヒト、ヒト化、またはキメラ抗体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドも包含する。
【０１１１】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、限定されるものではないが、約45℃で6X塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム(SSC)中でのフィルター結合したDNAへのハイブリダイゼーション、次いで、約50〜65℃で0.2X SSC/0.1％SDS中で1回以上の洗浄、約45℃で6X SSC中でのフィルター結合したDNAへのハイブリダイゼーションなどの高度にストリンジェントな条件、次いで、約60℃で0.1X SSC/0.2％SDS中での1回以上の洗浄、または当業者には公知の任意の他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件(例えば、Ausubel, F.M.ら(編)1989 Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, Green Publishing Associates, Inc.ならびにJohn WileyおよびSons, Inc., NY, 6.3.1〜6.3.6頁および2.10.3頁を参照)が挙げられる。
【０１１２】
前記ポリヌクレオチドを取得し、該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を、当業界で公知の任意の方法により決定することができる。例えば、前記抗体のヌクレオチド配列が公知である場合、該抗体をコードするポリヌクレオチドを、簡単に述べると、該抗体をコードする配列の一部を含む重複オリゴヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、ならびに次いで、PCRによる連結したオリゴヌクレオチドの増幅を含む、化学的に合成されたオリゴヌクレオチド(例えば、Kutmeierら、BioTechniques 17:242 (1994)に記載)から集合させることができる。
【０１１３】
抗体をコードするポリヌクレオチドを、好適な起源に由来する核酸から作製することもできる。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは入手可能でないが、抗体分子の配列が公知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸を、該配列の3'および5'末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いるPCR増幅によるか、または特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いてクローニングして、例えば、抗体をコードするcDNAライブラリーに由来するcDNAクローンを同定することにより、化学的に合成するか、または好適な起源(例えば、抗体cDNAライブラリー、または抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞などの、抗体を発現する任意の組織もしくは細胞から単離された核酸、好ましくは、ポリA+ RNAから作製されたcDNAライブラリー)から取得することができる。次いで、PCRにより作製された増幅された核酸を、当業界でよく知られた任意の方法を用いて、複製可能なクローニングベクター中にクローニングすることができる。
【０１１４】
本発明はまた、VHおよびVKフレームワーク領域をコードするポリヌクレオチド配列および本明細書に記載の抗体のCDRならびに哺乳動物細胞中でのその効率的な発現のための発現ベクターも提供する。
【０１１５】
本発明はさらに、hCD19トランスジェニックマウスモデル系(Yazawaら、Proc Natl Acad Sci U S A. 102(42):15178-83 (2005)を参照)において組換えヒトCD19分子を発現するB細胞を効率的に枯渇させることができる抗体を提供する。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、HB12Bモノクローナル抗体により達成される枯渇の少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも100％であるB細胞枯渇を達成することができる。さらなる実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、HB12B抗体により達成される枯渇よりも完全であるB細胞枯渇を達成することができる。一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、循環B細胞、血液B細胞、脾臓B細胞、辺縁帯B細胞、濾胞性B細胞、腹腔B細胞および／または骨髄B細胞を枯渇することができる。一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、前駆B細胞、初期プロB細胞、後期プロB細胞、大細胞型プレB細胞、小細胞型プレB細胞、未成熟B細胞、成熟B細胞、抗原刺激B細胞、および／または形質細胞の枯渇を達成することができる。一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体によるB細胞枯渇は、少なくとも1日、少なくとも2日、少なくとも3日、少なくとも4日、少なくとも5日、少なくとも6日、少なくとも7日、少なくとも8日、少なくとも9日、少なくとも10日、少なくとも15日、少なくとも20日、少なくとも25日、または少なくとも30日間持続し得る。別の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体によるB細胞枯渇は、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも5週間、少なくとも6週間、少なくとも7週間、少なくとも8週間、少なくとも9週間、または少なくとも10週間持続し得る。さらなる実施形態においては、本発明の抗CD19抗体によるB細胞枯渇は、少なくとも1ヶ月、少なくとも2ヶ月、少なくとも3ヶ月、少なくとも4ヶ月、少なくとも5ヶ月、少なくとも6ヶ月、少なくとも7ヶ月、少なくとも8ヶ月、少なくとも9ヶ月、少なくとも10ヶ月、少なくとも11ヶ月、または少なくとも12ヶ月間
持続し得る。
【０１１６】
本発明はまた、ヒト被験者においてB細胞を効率的に枯渇させる抗体を提供する。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約100％のB細胞枯渇を達成することができる。別の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、ヒト被験者におけるB細胞サブセットを枯渇させることができる。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、循環B細胞、血液B細胞、脾臓B細胞、辺縁帯B細胞、濾胞性B細胞、腹腔B細胞、および／または骨髄B細胞を枯渇させることができる。CD19は、全ての発達段階でB細胞の表面上に存在する。従って、抗CD19抗体は、全ての発達段階のB細胞を枯渇させることができる。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、前駆B細胞、初期プロB細胞、後期プロB細胞、大細胞型プレB細胞、小細胞型プレB細胞、未成熟B細胞、成熟B細胞、抗原刺激B細胞、および／または形質細胞の枯渇を達成することができる。B細胞の枯渇は、長期間持続し得る。一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体によるB細胞枯渇は、少なくとも1日、少なくとも2日、少なくとも3日、少なくとも4日、少なくとも5日、少なくとも6日、少なくとも7日、少なくとも8日、少なくとも9日、少なくとも10日、少なくとも15日、少なくとも20日、少なくとも25日、または少なくとも30日間持続し得る。別の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体によるB細胞枯渇は、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも5週間、少なくとも6週間、少なくとも7週間、少なくとも8週間、少なくとも9週間、または少なくとも10週間持続し得る。さらなる実施形態においては、本発明の抗CD19抗体によるB細胞枯渇は、少なくとも1ヶ月、少なくとも2ヶ月、少なくとも3ヶ月、少なくとも4ヶ月、少なくとも5ヶ月、少なくとも6ヶ月、少なくとも7ヶ月、少なくとも8ヶ月、少なくとも9ヶ月、少なくとも10ヶ月、少なくとも11ヶ月、または少なくとも12ヶ月間持続し得る。
【０１１７】
一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、循環B細胞の少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約100％を枯渇させる。一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、血液B細胞の少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約100％を枯渇させる。一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、脾臓B細胞の少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約100％を枯渇させる。一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、辺縁帯B細胞の少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約100％を枯渇させる。一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、濾胞性B細胞の少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約100％を枯渇させる。一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、腹腔B細胞の少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約100％を枯渇させる。一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、骨髄B細胞の少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約100％を枯渇させる。一実施形態においては、本発明の抗C
D19抗体は、前駆B細胞の少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約100％を枯渇させる。一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、初期プロB細胞の少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約100％を枯渇させる。一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、後期プロB細胞の少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約100％を枯渇させる。一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、大細胞型プレB細胞の少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約100％を枯渇させる。一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、小細胞型プレB細胞の少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約100％を枯渇させる。一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、未成熟B細胞の少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約100％を枯渇させる。一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、成熟B細胞の少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約100％を枯渇させる。一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、抗原刺激B細胞の少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約100％を枯渇させる。一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、形質細胞の少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約100％を枯渇させる。B細胞の枯渇は、長期間持続し得る。一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体によるB細胞枯渇は、少なくとも1日、少なくとも2日、少なくとも3日、少なくとも4日、少なくとも5日、少なくとも6日、少なくとも7日、少なくとも8日、少なくとも9日、少なくとも10日、少なくとも15日、少なくとも20日、少なくとも25日、または少なくとも30日間持続し得る。別の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体によるB細胞枯渇は、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも5週間、少なくとも6週間、少なくとも7週間、少なくとも8週間、少なくとも9週間��または少なくとも10週間持続し得る。さらなる実施形態においては、本発明の抗CD19抗体によるB細胞枯渇は、少なくとも1ヶ月、少なくとも2ヶ月、少なくとも3ヶ月、少なくとも4ヶ月、少なくとも5ヶ月、少なくとも6ヶ月、少なくとも7ヶ月、少なくとも8ヶ月、少なくとも9ヶ月、少なくとも10ヶ月、少なくとも11ヶ月、または少なくとも12ヶ月間持続し得る。
【０１１８】
B細胞悪性腫瘍は、特定のB細胞サブセットの病的な増殖を特徴とし、例えば、前駆B細胞急性リンパ芽球性白血病は、プロB細胞／プレB細胞発達段階に対応するB細胞の異常な増殖を特徴とする。悪性B細胞は、CD19などの正常なB細胞マーカーの細胞表面発現を維持する。従って、抗CD19抗体は、ヒト被験者における悪性B細胞を枯渇させることができる。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、ヒト被験者における悪性B細胞の少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％または少なくとも100％の枯渇を達成することができる。
【０１１９】
一実施形態においては、本明細書に記載のヒト化抗CD19抗体は、抗体依存的細胞性細胞傷害性(ADCC)、補体依存的細胞媒介性細胞傷害性(CDC)、および／またはアポトーシスを媒介する。一実施形態においては、本発明のヒト化抗CD19抗体は、抗体依存的細胞性細胞傷害性(ADCC)および／またはアポトーシスを媒介する。一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、抗体依存的細胞性細胞傷害性(ADCC)を増強した。一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、増強された抗体依存的細胞性細胞傷害性(ADCC)を媒介するFc領域変異体を含む。一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、フコースが還元末端中のN-アセチルグルコサミンに結合していないAsn297に連結された複合型N-グリコシド結合糖鎖を有するFc領域であって、増強された抗体依存的細胞性細胞傷害性(ADCC)を媒介する前記Fc領域を含む。
【０１２０】
本発明はさらに、in vitroで刺激されたB細胞増殖を効率的に阻害することができる抗CD19抗体を提供する。単離された末梢B細胞の増殖を、様々な刺激原、例えば、限定されるものではないが、抗IgM抗体、CD40またはCpGによる刺激により誘導することができる。これらの刺激原を、単独で、または互いに組み合わせて送達することができる。
【０１２１】
一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、in vitroで刺激されるB細胞増殖を阻害する。別の実施形態においては、本明細書に記載の抗CD19抗体は、抗IgM/CpGまたは抗IgM/CD40刺激により誘導されるin vitroでのB細胞増殖を阻害する。一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、in vitroで刺激されるB細胞増殖を、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％または少なくとも約75％阻害する。
【０１２２】
一実施形態においては、本発明のFc変異体抗CD19抗体は、抗IgM/CpGまたは抗IgM/CD40刺激により誘導されるin vitroでのB細胞増殖を阻害し、該Fc変異体は比較可能な非変異体分子と比較して1個以上のFcリガンドに対する変化した結合親和性を有する。特定の実施形態においては、本発明のFc変異体抗CD19抗体は、抗IgM/CpGまたは抗IgM/CD40刺激により誘導されるin vitroでのB細胞増殖を阻害し、該Fc変異体は比較可能な非変異体Fcドメインと比較してFcγ受容体IIBに対する増強された結合を有する。さらに特定の実施形態においては、本発明のFc変異体抗CD19抗体は、in vitroで刺激されるB細胞増殖を、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％または少なくとも約75％阻害する。別の実施形態においては、本発明のFc変異体抗CD19抗体は、in vitroで刺激されるB細胞増殖を阻害し、該変異体Fcドメインは、比較可能な非変異体Fcドメインのものよりも、少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも5倍、または少なくとも7倍、または少なくとも10倍、または少なくとも20倍、または少なくとも30倍、または少なくとも40倍、または少なくとも50倍、または少なくとも60倍、または少なくとも70倍、または少なくとも80倍、または少なくとも90倍、または少なくとも100倍、または少なくとも200倍高いFcγ受容体IIBに対する親和性を有する。
【０１２３】
本発明はまた、ヒト抗体依存的細胞性細胞傷害性(ADCC)、補体依存的細胞媒介性細胞傷害性(CDC)、および／またはアポトーシスを媒介し得るヒト、ヒト化またはキメラ抗CD19抗体を、それを必要とするヒトに、循環B細胞を枯渇させるのに十分な量で投与することを含む、ヒトにおけるB細胞悪性腫瘍を治療する方法に関する。特定の態様においては、本発明は、IgG1またはIgG3ヒトアイソタイプのものである、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗CD19抗体の治療上有効な計画の投与を含む、ヒトにおけるB細胞悪性腫瘍を治療する方法にも関する。
【０１２４】
本発明はさらに、ヒトADCC、CDC、および／またはアポトーシスを媒介し得るヒト、ヒト化、またはキメラ抗CD19抗体を、それを必要とするヒトに、循環B細胞を枯渇させるのに十分な量で投与することを含む、ヒトにおける自己免疫疾患または障害を治療する方法に関する。本発明はまた、IgG1またはIgG3ヒトアイソタイプのものである、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗CD19抗体の治療上有効な計画の投与を含む、自己免疫障害を治療する方法にも関する。
【０１２５】
本発明はまた、ヒト移植レシピエントに、本発明のヒト、ヒト化、またはキメラ抗CD19抗体を、循環B細胞、もしくは循環免疫グロブリン、またはその両方を枯渇させることができる量で投与することを含む、それを必要とするレシピエントにおける体液性拒絶を治療または予防する方法を提供する。他の実施形態においては、本発明は、移植前の移植片と、移植片に由来するB細胞を枯渇させることができる一定量のヒト、ヒト化、またはキメラ抗CD19抗体とを接触させることを含む、それを必要とするヒト移植レシピエントにおける移植片拒絶または移植片対宿主疾患を予防するための方法を提供する。
【０１２６】
2. ヒト化抗CD19抗体の製造
本明細書に記載のヒト化抗体を、限定されるものではないが、CDR移植(例えば、欧州特許第239,400号；国際特許出願公開WO 91/09967；ならびに米国特許第5,225,539号、第5,530,101号、および5,585,089号(それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照)、ベニアリングもしくは再表面化(例えば、欧州特許第592,106号および第519,596号；Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnickaら、1994, Protein Engineering, 7(6):805-814; およびRoguskaら、1994, Proc. Natl. Acad. Sci., 91:969-973(それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照)、鎖シャッフリング(例えば、米国特許第5,565,332号(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照)、ならびに、例えば、米国特許第6,407,213号、第5,766,886号、国際特許出願公開WO 9317105、Tanら、J. Immunol., 169:1119-25 (2002)、Caldasら、Protein Eng., 13(5):353-60 (2000)、Moreaら、Methods, 20(3):267-79 (2000)、Bacaら、J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997)、Roguskaら、Protein Eng., 9(10):895-904 (1996)、Coutoら、Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995)、Coutoら、Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995)、Sandhu JS, Gene, 150(2):409-10 (1994)、およびPedersen ら、J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994)(それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に開示された技術などの、当業界で公知の様々な技術を用いて製造することができる。頻繁には、FW領域中のFW残基を、CDRドナー抗体に由来する対応する残基と置換して、抗原結合を変化させる、好ましくは、改善することができる。これらのFW置換を、当業界でよく知られる方法、例えば、CDRとFW残基の相互作用のモデリングにより同定して、抗原結合にとって重要なFW残基を同定し、配列比較を行って、特定の位置の通常のものではないFW残基を同定する(例えば、Queenら、米国特許第5,585,089号; およびRiechmannら、1988, Nature, 332:323(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照)。
【０１２７】
ヒト化抗CD19抗体は、非ヒトである起源からそれに導入された1個以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、典型的には「輸入」可変ドメインから取られた、「輸入」残基と呼ばれることが多い。かくして、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリン分子に由来する1個以上のCDRと、ヒトに由来するフレームワーク領域を含む。抗体のヒト化は当業界でよく知られており、げっ歯類CDRもしくはCDR配列を、ヒト抗体の対応する配列に置換すること、すなわち、CDR移植(欧州特許第239,400号；PCT公開WO 91/09967；および米国特許第4,816,567号; 第6,331,415号; 第5,225,539号; 第5,530,101号; 第5,585,089号; 第6,548,640号(その内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする))により、本質的にはWinterおよび共同研究者(Jonesら、Nature, 321:522-525 (1986); Riechmannら、Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyenら、Science, 239:1534-1536 (1988))の方法に従って実施することができる。そのようなヒト化キメラ抗体においては、実質的に無傷ではないヒト可変ドメインは、非ヒト種に由来する対応する配列により置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのCDR残基および可能性のあるいくつかのFW残基が、げっ歯類抗体中の類似部位に由来する残基により置換されたヒト抗体である。抗CD19抗体のヒト化を、ベニアリングもしくは再表面化(欧州特許第592,106号; 第519,596号; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5): 489-498; Studnickaら、Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994); およびRoguskaら、Proc. Natl. Acad. Sci., 91:969-973 (1994))または鎖シャッフリング(米国特許第5,565,332号)(その内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)により達成することもできる。
【０１２８】
ヒト化抗体を作製するのに用いられる、ヒト可変ドメイン、両軽鎖および重鎖の選択は、抗原性を低下させるためのものである。いわゆる「最適適合」方法に従って、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次いで、げっ歯類のものと最も密接に関連するヒト配列を、意図されるヒト化mAbの抗原結合、好適な構造形成および／または安定性にとって重要であり得る特定の残基の存在についてスクリーニングする(Simsら、J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothiaら、J. Mol. Biol., 196:901 (1987)(その内容は全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする))。次いで、所望の基準に合致する得られるFW配列を、ヒト化抗体のためのヒトドナーFW領域として用いる。
【０１２９】
別の方法は、軽鎖または重鎖の特定の亜群の全てのヒト抗体の共通配列から誘導された特定のFWを使用する。同じFWを、いくつかの異なるヒト化抗CD19抗体のために用いることができる(Carterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Prestaら、J. Immunol., 151:2623 (1993)(その内容は全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする))。
【０１３０】
抗CD19抗体を、CD19に対する高い親和性の保持および他の好ましい生物学的特性を用いてヒト化することができる。本発明の一態様に従って、ヒト化抗体を、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列および様々な概念的ヒト化産物の分析のプロセスにより調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者であれば精通している。選択された候補免疫グロブリン配列の可能な三次元コンフォメーション構造を例示し、展示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらの展示の検査により、候補免疫グロブリン配列の官能化における残基の役割の可能性の分析、すなわち、CD19に結合する候補免疫グロブリンの機能に影響する残基の分析が可能になる。このように、FW残基を選択し、レシピエントおよび輸入配列から混合して、所望の抗体特性、例えば、CD19に対する親和性を達成することができる。一般的には、CDR残基は、抗原結合への影響に直接かつ最も実質的に関与する。
【０１３１】
「ヒト化」抗体は、元の抗体と類似する抗原特異性、すなわち、本発明においては、ヒトCD19抗原に結合する能力を保持することができる。しかしながら、ヒト化の特定の方法を用いて、ヒトCD19抗原に対する抗体の結合の親和性および／または特異性を、Wuら、J. Mol. Biol., 294:151 (1999)(その内容は全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)により記載された「指向性進化」の方法を用いて変化させることができる。
【０１３２】
本明細書に記載のヒト化抗CD19抗体を、以下の節に記載のHB12AまたはHB12B相補性決定領域、または「CDR」の移植のための異なるヒトフレームワーク領域の選択により構築することができる。本発明は、マウスHB12AおよびHB12B抗体のいくつかのヒト化型ならびにchHB12AおよびchHB12Bと命名されたキメラ型を包含する。
【０１３３】
3. モノクローナル抗CD19抗体
モノクローナル抗CD19抗体は、ヒトCD19抗原に対する結合特異性を示し、ヒトADCC、CDCおよび／またはアポトーシス機構を媒介し得る。そのような抗体を、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術、またはその組合せの使用などの、当業界で公知の様々な技術を用いて作製することができる。抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。遺伝子操作された抗CD19抗体を、限定されるものではないが、以下に記載の技術およびこれらの技術に対する改良などの、当業界で公知の任意の手段により作製することができる。大規模高収率生産は、典型的には、遺伝子操作された抗CD19抗体を産生する宿主細胞を培養すること、および宿主細胞から抗CD19抗体を回収することを含む。
【０１３４】
3.1. ハイブリドーマ技術
モノクローナル抗体を、当業界で公知であり、例えば、Harlowら、Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press、第2版、1988); Hammerlingら、Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)(これらの参考文献はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に教示されたものなどのハイブリドーマ技術を用いて製造することができる。例えば、ハイブリドーマ方法においては、マウスまたはハムスターもしくはマカクザルなどの他の好適な宿主動物を免疫して、免疫に用いられるタンパク質に特異的に結合するであろう抗体を産生するか、またはそれを産生することができるリンパ球を引き出す。また、リンパ球をin vitroで免疫することもできる。次いで、リンパ球を、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を用いてミエローマ細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies:  Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))。
【０１３５】
かくして調製されたハイブリドーマ細胞を、未融合の親ミエローマ細胞の増殖または生存を阻害する1種以上の物質を含む好適な培養培地中に播種し、増殖させる。例えば、親ミエローマ細胞が、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRTもしくはHPRT)酵素を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、典型的には、HGPRT欠損細胞の増殖を防止する物質である、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン(HAT培地)を含むであろう。
【０１３６】
特定の実施形態は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル産生を支援し、HAT培地などの培地に対して感受性であるミエローマ細胞を用いる。これらのミエローマ細胞系は、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, CA, USA から入手可能なMOPC-21およびMPC-11マウス腫瘍から誘導されたもの、ならびにAmerican Type Culture Collection, Rockville, MD, USAから入手可能なSP-2もしくはX63-Ag8.653細胞などのマウスミエローマ細胞である。また、ヒトミエローマおよびマウスヒトヘテロミエローマ細胞系が、ヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されている(Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeurら、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
【０１３７】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地を、ヒトCD19抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降によるか、またはラジオイムノアッセイ(RIA)もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)などのin vitro結合アッセイにより決定することができる。
【０１３８】
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限界希釈手順によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies:  Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))。この目的のための好適な培養培地としては、例えば、D-MEMまたはRPMI 1640培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞を、動物中の腹水腫瘍としてin vivoで増殖させることができる。
【０１３９】
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体を、培養培地、腹水液、または血清から、例えば、Aタンパク質-セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または親和性クロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順により好適に分離する。
【０１４０】
3.2. 組換えDNA技術
本明細書に記載の抗CD19抗体をコードするDNAを、容易に単離し、従来の手順を用いて配列決定する(例えば、抗CD19抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)。ハイブリドーマ細胞は、そのようなDNAの起源として役立つ。一度単離されたら、DNAを発現ベクター中に入れた後、大腸菌細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、またはさもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないミエローマ細胞などの宿主細胞中にトランスフェクトして、組換え宿主細胞中での抗CD19抗体の合成を得ることができる。
【０１４１】
ファージディスプレイ方法においては、機能的抗体ドメインを、それらをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面上に提示させる。特に、VHおよびVLドメインをコードするDNA配列を、動物のcDNAライブラリー(例えば、罹患した組織のヒトまたはマウスcDNAライブラリー)から増幅させる。VHおよびVLドメインをコードするDNAを、PCRによりscFvリンカーと一緒に組換え、ファージミドベクター中にクローニングする。このベクターを大腸菌中にエレクトロポレーションし、大腸菌をヘルパーファージに感染させる。これらの方法において用いられるファージは、典型的には、fdおよびM13などの繊維性ファージであり、VHおよびVLドメインを通常、ファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIに組換え融合する。特定の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージを、例えば、標識された抗原または固体表面もしくはビーズに結合したか、もしくは捕捉された抗原を用いて、該抗原を用いて選択または同定することができる。本発明の抗体を作製するのに用いることができるファージディスプレイ方法の例としては、Brinkmanら、1995, J. Immunol. Methods, 182:41-50; Amesら、1995, J. Immunol. Methods, 184:177-186; Kettleboroughら、1994, Eur. J. Immunol., 24:952-958; Persicら、1997, Gene, 187:9-18; Burtonら、1994, Advances in Immunology, 57:191-280; 国際特許出願PCT/GB91/O1 134; 国際特許出願WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401、およびWO97/13844; ならびに米国特許第5,698,426号、第5,223,409号、第5,403,484号、第5,580,717号、第5,427,908号、第5,750,753号、第5,821,047号、第5,571,698号、第5,427,908号、第5,516,637号、第5,780,225号、第5,658,727号、第5,733,743号、および第5,969,108号(それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に開示されたものが挙げられる。
【０１４２】
上記参考文献に記載のように、ファージ選択の後、ファージに由来する抗体コード領域を単離し、これを用いて、ヒト抗体、もしくは任意の他の所望の抗原結合断片などの全抗体を作製し、例えば、以下に記載のように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌などの任意の所望の宿主中で発現させることができる。また、国際特許出願公開WO 92/22324; Mullinaxら、1992, BioTechniques, 12(6):864-869; Sawaiら、1995, AJRI, 34:26-34; およびBetterら、1988, Science, 240:1041-1043(これらの参考文献はその全体が参照により組み入れられるものとする)に開示されたものなどの当業界で公知の方法を用いるFab、Fab'およびF(ab')2フラグメントを組換え産生する技術を用いることもできる。
【０１４３】
抗体を、McCaffertyら、Nature, 348:552-554 (1990)、Clacksonら、Nature, 352:624-628 (1991)に記載の技術を用いて作製された抗体ファージライブラリーから単離することができる。Marksら、J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリーを用いて、それぞれ、マウスおよびヒト抗体の単離を記載する。鎖シャッフリングを、高親和性(nM範囲)のヒト抗体の産生(Marksら、Bio/Technology, 10:779-783 (1992))、ならびに組合せ感染および非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略としてのin vivoでの組換え(Waterhouseら、Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993))において用いることができる。かくして、これらの技術は、抗CD19抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する実行可能な代替物である。
【０１４４】
全抗体を作製するために、VHまたはVLヌクレオチド配列、制限部位、および制限部位を保護するためのフランキング配列を含むPCRプライマーを用いて、scFvクローン中のVHまたはVL配列を増幅させることができる。当業者には公知のクローニング技術を用いて、PCR増幅されたVHドメインを、重鎖定常領域、例えば、ヒトγ4定常領域を発現するベクター中にクローニングし、PCR増幅されたVLドメインを、軽鎖定常領域、例えば、ヒトκもしくはλ定常領域を発現するベクター中にクローニングすることができる。VHまたはVLドメインを発現させるためのベクターは、EF-1αプロモーター、分泌シグナル、可変ドメインのためのクローニング部位、定常ドメイン、およびネオマイシンなどの選択マーカーを含んでもよい。VHおよびVLドメインを、必須定常領域を発現する1つのベクター中にクローニングすることもできる。次いで、重鎖変換ベクターおよび軽鎖変換ベクターを細胞系中に同時トランスフェクトして、当業者には公知の技術を用いて、完全長抗体、例えば、IgGを発現する安定な、または一過性の細胞系を作製する。
【０１４５】
また、例えば、相同的なマウス配列の代わりに、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより(米国特許第4,816,567号; Morrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984))、または免疫グロブリンコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部もしくは一部を共有結合させることにより、DNAを改変することもできる。
【０１４６】
4. キメラ抗体
本明細書に記載の抗CD19抗体は、具体的には、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種から誘導されるか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか、またはそれと相同であるが、鎖の別の一部が、別の種から誘導されるか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか、またはそれと相同であるキメラ抗体(免疫グロブリン)、ならびに所望の生物活性を示す限り、そのような抗体のフラグメントを含む(米国特許第4,816,567号; Morrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))。本明細書に記載の目的のキメラ抗体は、非ヒト霊長類(例えば、ヒヒ、アカゲザルもしくはカニクイザルなどの旧世界ザル)から誘導された可変ドメイン抗原結合配列と、ヒト定常領域配列(米国特許第5,693,780号)を含む「霊長類化」抗体を含む。
【０１４７】
5. 改変した抗体／突然変異抗体
本明細書に記載の組成物および方法の抗CD19抗体は、突然変異抗体であってよい。本明細書で用いられる「抗体突然変異体」または「改変(変化)した抗体」とは、抗CD19抗体の1個以上のアミノ酸残基が改変された抗CD19抗体のアミノ酸配列変異体を指す。抗CD19抗体のアミノ酸配列に対する改変としては、抗体のその抗原に対する親和性もしくはアビディティを改善し得る配列に対する改変、および／またはエフェクター機能を改善し得る抗体のFc部分に対する改変が挙げられる。
【０１４８】
従って、本発明は、本明細書に開示されるヒト、ヒト化、およびキメラ抗CD19抗体ならびに限定されるものではないが、変化したヒトCD19結合特性、例えば、変化した結合定数KON、解離定数KOFF、および／または平衡定数もしくは結合親和性、KDを示すものなどのその変化した／突然変異誘導体に関する。特定の実施形態においては、ヒトCD19に対する、本明細書に記載の抗CD19抗体、またはその変化した／突然変異誘導体のKDは、約10-6M、10-7M、10-8M、または10-9M以下であってよい。本発明の抗体、またはその変化した／突然変異誘導体のそのような結合特性の決定にとって好適な方法および試薬は、当業界で公知であり、および／または商業的に利用可能である(上記ならびに米国特許第6,849,425号、第6,632,926号、第6,294,391号、および第6,143,574号(それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照)。さらに、そのような速度分析のために設計された装備およびソフトウェアも商業的に利用可能である(例えば、Biacore(登録商標)A100、およびBiacore(登録商標)2000装置; Biacore International AB, Uppsala, Sweden)。
【０１４９】
前記改変を、任意の公知の抗CD19抗体または本明細書に記載のように同定された抗CD19抗体に対して作製することができる。そのような変化した抗体は必然的に、公知の抗CD19抗体と100％未満の配列同一性または類似性を有する。例えば、変化した抗体は、本明細書に記載の抗CD19抗体の重鎖または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と約25％〜約95％の同一性または類似性を有するアミノ酸配列を有してもよい。変化した抗体は、本明細書に記載の抗CD19抗体の重鎖または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも25％、35％、45％、55％、65％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％のアミノ酸配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を有してもよい。別の実施形態においては、変化した抗体は、本明細書に記載の抗CD19抗体の重鎖CDR1、CDR2、もしくはCDR3のアミノ酸配列と少なくとも25％、35％、45％、55％、65％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％のアミノ酸配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を有してもよい。一実施形態においては、変化した抗体は、ヒトCD19結合能力を維持してもよい。特定の実施形態においては、本明細書に記載の抗CD19抗体は、HB12B-(3-72/JH4) (配列番号34)、HB12A VH (配列番号2)、HB12B VH (配列番号18)、7E12 VH (配列番号102)、14H5 VH (配列番号103)、15D1 VH (配列番号104)、15D7 VH (配列番号105)、16C4 VH (配列番号106)、14H5-YG (配列番号107)、14H5-DG (配列番号108)、14H5-LG (配列番号109)、1A7 VH、3C3 VH、3E5 VH、3D4 VH、9G7 VH (配列番号191)、3B4 VH (配列番号236)、3F11 VHまたは6C11 VH (配列番号192)のアミノ酸配列と、少なくともまたは約10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％以上同一であるVHを含んでもよい。特定の実施形態においては、本明細書に記載の抗CD19抗体は、表1に列挙されたVHドメイン、VLドメイン、またはCDRのいずれかのアミノ酸配列と、少なくとも、または約10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％以上同一であるVHを含んでもよい。
【０１５０】
別の実施形態においては、変化した抗体は、HB12B-(3-72/JH4) (配列番号34)、HB12A VH (配列番号2)、HB12B VH (配列番号18)、7E12 VH (配列番号102)、14H5 VH (配列番号103)、15D1 VH (配列番号104)、15D7 VH (配列番号105)、16C4 VH (配列番号106)、14H5-YG (配列番号107)、14H5-DG (配列番号108)、14H5-LG (配列番号109)、1A7 VH、3C3 VH、3E5 VH、3D4 VH、9G7 VH (配列番号191)、3B4 VH (配列番号236)、3F11 VHもしくは6C11 VH (配列番号192)のFW1、FW2、FW3、またはFW4領域のアミノ酸配列との少なくとも25％、35％、45％、55％、65％、75％、80％、85％、90％、または95％のアミノ酸配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を有してもよい。別の実施形態においては、変化した抗体は、表1に列挙されたVHまたはVLドメインのいずれかのFW1、FW2、FW3、またはFW4領域のアミノ酸配列との少なくとも25％、35％、45％、55％、65％、75％、80％、85％、90％、または95％のアミノ酸配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を有してもよい。
【０１５１】
別の実施形態においては、変化した抗体は、本明細書に記載の抗CD19抗体の軽鎖CDR1、CDR2、またはCDR3のアミノ酸配列との少なくとも25％、35％、45％、55％、65％、75％、80％、85％、90％、または95％のアミノ酸配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を有してもよい。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、HB12A VK (配列番号4)、HB12B VK (配列番号20)、HB12B-(A10-Jk4) (配列番号52)、HB12B-364987 (もしくは364987) (配列番号62)、HB12B-3649 (もしくは3649) (配列番号68)、HB12B-36 (もしくは36) (配列番号70)、7E12 VK (配列番号110)、14H5 (配列番号111)、15D1 (配列番号112)、16C9 (配列番号113)、3C3 VK (配列番号193)、3E5 VK (配列番号194)、3D4 VK (配列番号195)、3F1 VK (配列番号196)、5B5 VK (配列番号197)、6F7 VK (配列番号198)、1C11 VK (配列番号199)、2B11 VK (配列番号200)、2D10 VK (配列番号201)、5C11 VK (配列番号202)、5D4 VK (配列番号203)、6C11 VK (配列番号204)、9G7 VK (配列番号205)、1H4 VK (配列番号206)、または5C4 VK (配列番号207)のアミノ酸配列と、少なくとも、または約10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％以上同一であるVLを含んでもよい。
【０１５２】
別の実施形態においては、変化した抗体は、HB12A VK (配列番号4)、HB12B VK (配列番号20)、HB12B-(A10-Jk4) (配列番号52)、HB12B-364987 (もしくは364987) (配列番号62)、HB12B-3649 (もしくは3649) (配列番号68)、HB12B-36 (もしくは36) (配列番号70)、7E12 VK (配列番号110)、14H5 (配列番号111)、15D1 (配列番号112)、16C9 (配列番号113)、3C3 VK (配列番号193)、3E5 VK (配列番号194)、3D4 VK (配列番号195)、3F1 VK (配列番号196)、5B5 VK (配列番号197)、6F7 VK (配列番号198)、1C11 VK (配列番号199)、2B11 VK (配列番号200)、2D10 VK (配列番号201)、5C11 VK (配列番号202)、5D4 VK (配列番号203)、6C11 VK (配列番号204)、9G7 VK (配列番号205)、1H4 VK (配列番号206)、または5C4 VK (配列番号207)のFW1、FW2、FW3、またはFW4領域のアミノ酸配列との少なくとも25％、35％、45％、55％、65％、75％、80％、85％、90％、または95％のアミノ酸配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を有してもよい。
【０１５３】
配列に関する同一性または類似性を、候補配列を整列させ、必要に応じて、ギャップを導入して、最大の配列同一性(％)を達成した後、該配列が、抗CD19抗体残基と同一である(すなわち、同じ残基)か、または類似する(すなわち、共通の側鎖特性に基づく同じ基に由来するアミノ酸残基、下記参照)アミノ酸残基の割合として定義する。N末端、C末端、または可変ドメインの外側の抗体配列への内部伸長、欠失、もしくは挿入はいずれも、配列同一性または類似性に影響しないと解釈されるべきである。
【０１５４】
当業界で公知のように、「同一性(％)」は、2個のポリヌクレオチドまたは2個のポリペプチドを比較することにより決定される、それらの配列間の関係の尺度である。一般的には、比較しようとする2個の配列を整列させて、該配列間の最大の相関を得る。2個の配列のアラインメントを試験し、2個の配列間の正確なアミノ酸またはヌクレオチド一致性を与える位置数を決定し、アラインメントの全長により割り、100をかけて、同一性(％)の数値を得る。この同一性(％)の数値を、同じか、もしくは非常に類似する長さの配列にとって特に好適であり、高度に相同である、比較しようとする配列の全長、または等しくない長さの配列にとってより好適であるか、もしくはより低いレベルの相同性を有する、より短い規定の長さに渡って決定することができる。
【０１５５】
例えば、配列を、「.aln」拡張子を有するファイルを作製するUnix(登録商標)の下でclustalwソフトウェアを用いて整列させた後、このファイルを、.alnファイルを開くBioeditプログラム(Hall, T.A. 1999, BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows(登録商標) 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-98)にインポートすることができる。Bioeditウィンドウ中で、個々の配列(同時に2個)を選択し、それらを整列させることができる。この方法により、配列全体の比較が可能になる。
【０１５６】
2個以上の配列の同一性を比較する方法は、当業界でよく知られている。かくして、例えば、プログラムがWisconsin Sequence Analysis Package、バージョン9.1 (Devereux J.ら、Nucleic Acids Res., 12:387-395, 1984、Genetics Computer Group, Madison, WI, USAから入手可能)中で利用可能である。2個の配列間の同一性(％)の決定を、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。例えば、BESTFITおよびGAPプログラムを用いて、2個のポリヌクレオチド間の同一性(％)および2個のポリペプチド配列間の同一性(％)を決定することができる。BESTFITは、SmithおよびWaterman(Advances in Applied Mathematics, 2:482-489, 1981)の「局所相同性」アルゴリズムを使用し、2個の配列間の類似性の最良の単一領域を発見する。BESTFITは、長さが類似していない2個のポリヌクレオチドまたは2個のポリペプチド配列を比較するのにより適しており、このプログラムは、より短い配列がより長い配列の一部であると仮定するものである。比較において、GAPは2個の配列を整列させ、NeddlemanおよびWunsch (J. Mol. Biol., 48:443-354, 1970)のアルゴリズムに従う「最大類似性」を発見する。GAPは、ほぼ同じ長さである配列を比較するのにより適しており、アラインメントは全長に渡って予想される。好ましくは、それぞれのプログラムにおいて用いられるパラメーター「ギャップ重量」および「長さ重量」はそれぞれ、ポリヌクレオチドについては50および3であり、ポリペプチドについては12および4である。好ましくは、比較する2個の配列が最適に整列された時、同一性(％)および類似性(％)を決定する。
【０１５７】
配列間の同一性および／または類似性を決定するための他のプログラム、例えば、BLASTファミリーのプログラム(Karlin & Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268、Karlin & Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877において改変、National Center for Biotechnology Information (NCB), Bethesda, MD, USAから利用可能およびwww.ncbi.nlm.nih.govのNCBIのホームページを介してアクセス可能)も当業界で公知である。これらのプログラムは、2個の配列の比較のために用いられる数学的アルゴリズムの非限定例である。そのようなアルゴリズムは、Altschulら、1990, J. Mol. Biol., 215:403-410のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み入れられている。BLASTヌクレオチド検索を、NBLASTプログラム、スコア＝100、ワード長＝12を用いて実施して、本発明の抗CD19抗体の全部または一部をコードする核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質検索を、XBLASTプログラム、スコア＝50、ワード長＝3を用いて実施して、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップ付アラインメントを得るために、ギャップ付BLASTをAltschulら、1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402に記載のように用いることができる。PSI-Blastを用いて、分子間の遠い関係を検出する反復検索を実行することもできる(上掲)。BLAST、ギャップ付BLAST、およびPSI-Blastプログラムを用いる場合、それぞれのプログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)のデフォルトパラメーターを用いることができる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。
【０１５８】
当業界で公知の配列間の同一性および／または類似性を決定するためのプログラムの別の非限定例は、FASTA(Pearson W.R.およびLipman D.J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-2448, 1988、Wisconsin Sequence Analysis Packageの一部として入手可能)である。好ましくは、BLOSUM62アミノ酸置換マトリックス(Henikoff S.およびHenikoff J.G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919, 1992)を、ヌクレオチド配列を比較前にアミノ酸配列に最初に翻訳することを含むポリペプチド配列比較において用いる。
【０１５９】
アミノ酸配列間の同一性および／または類似性を決定するための当業界で公知のプログラムのさらに別の非限定例は、プログラムのデフォルトアルゴリズムおよびパラメーター設定：blosum62、ギャップ重量8、長さ重量2と共に用いるSeqWeb Software (GCG Wisconsin Packageに対するウェブベースのインターフェイス：Gapプログラム)である。
【０１６０】
2個の配列間の同一性(％)を、ギャップを許容しながら、または許容せずに、上記のものと類似する技術を用いて決定することができる。同一性(％)の算出においては、典型的な正確な一致を計数する。
【０１６１】
好ましくは、BESTFITプログラムを用いて、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関する問い合わせポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の同一性(％)を決定し、問い合わせ配列および参照配列を最適に整列させ、プログラムのパラメーターをデフォルト値にする。
【０１６２】
変化した抗体を作製するために、1個以上のアミノ酸変化(例えば、置換)を、種依存的抗体の1個以上の超可変領域に導入する。フレームワーク領域残基の1個以上の変化(例えば、置換)を、これらが第2の哺乳動物種に由来する抗原に対する抗体突然変異体の結合親和性の改善をもたらす場合、抗CD19抗体中に導入することもできる。改変するフレームワーク領域残基の例としては、抗原に直接非共有結合するもの(Amitら、Science, 233:747-753 (1986)); CDRのコンフォメーションと相互作用／実行するもの(Chothiaら、J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)); および／またはVL-VH境界に参加するもの(EP 239 400B1)が挙げられる。特定の実施形態においては、そのようなフレームワーク領域残基の1個以上の改変は、第2の哺乳動物種に由来する抗原に対する抗体の結合親和性の増強をもたらす。例えば、約1〜約5個のフレームワーク残基を、本発明のこの実施形態において変化させることができる。時には、超可変領域残基がいずれも変化していない場合でも、前臨床試験における使用にとって好適な抗体突然変異体を得るにはこれで十分であり得る。通常、しかしながら、変化した抗体は、さらなる超可変領域変化を含むであろう。
【０１６３】
第2の哺乳動物種に由来する抗原に対する抗CD19抗体の出発結合親和性が、特に、無作為に作製された変化した抗体を容易にスクリーニングすることができるようなものである場合、変化させる超可変領域残基を、そのように無作為に変化させることができる。
【０１６４】
そのような変化した抗体を作製するための1つの有用な手順を、「アラニンスキャニング突然変異誘発」(CunninghamおよびWells, Science, 244:1081-1085 (1989))と呼ぶ。ここでは、1個以上の超可変領域残基を、アラニンまたはポリアラニン残基により置換して、アミノ酸と、第2の哺乳動物種に由来する抗原との相互作用に影響を及ぼす。次いで、該置換に対する機能的感受性を示すこれらの超可変領域残基を、置換部位で、または置換部位のために、追加の、または他の突然変異を導入することにより改良する。かくして、アミノ酸配列変異を導入するための部位は所定のものであるが、突然変異自体の性質は所定のものである必要はない。このように製造されたAla突然変異体を、本明細書に記載のその生物学的活性についてスクリーニングする。
【０１６５】
そのような変化した抗体を作製するための別の手順は、ファージディスプレイを用いる親和性成熟を含む(Hawkinsら、J. Mol. Biol., 254:889-896 (1992)およびLowmanら、Biochemistry, 30(45):10832-10837 (1991))。簡単に述べると、いくつかの超可変領域部位(例えば、6-7部位)を突然変異させて、各部位に全ての可能なアミノ酸置換を作製する。かくして作製された抗体突然変異体を、各粒子内でパッケージングされたM13の遺伝子III産物との融合物として繊維性ファージ粒子から一価様式で提示する。次いで、ファージディスプレイされた突然変異体を、本明細書に開示されるようにその生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングする。
【０１６６】
抗体配列中の突然変異としては、置換、内部欠失などの欠失、融合タンパク質をもたらす付加などの付加、またはアミノ酸配列内の、および／もしくはそれに隣接するアミノ酸残基の保存的置換であって、変化が機能的に等価な抗CD19抗体をもたらす点で、「サイレントな」変化をもたらす前記保存的置換が挙げられる。保存的アミノ酸置換を、関与する残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性における類似性に基づいて作製することができる。例えば、非極性(疎水性)アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる；極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる；正に荷電した(塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが挙げられる；負に荷電した(酸性)アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。さらに、グリシンおよびプロリンは、鎖の向きに影響し得る残基である。非保存的置換は、これらのクラスのメンバーを、別のクラスのメンバーに交換することを必要するであろう。さらに、必要に応じて、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸類似体を、抗体配列中での置換または付加として導入することができる。非古典的アミノ酸としては、限定されるものではないが、一般的アミノ酸のD-異性体、α-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、Abu、3-アミノ酪酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-アミノヘキサン酸、Aib、2-アミノイソ酪酸、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β-アラニン、フルオロ-アミノ酸、β-メチルアミノ酸、Cα-メチルアミノ酸、Nα-メチルアミノ酸などのデザイナーアミノ酸、および一般的なアミノ酸類似体が挙げられる。
【０１６７】
別の実施形態においては、改変のために選択された部位を、ファージディスプレイを用いて親和性成熟させる(上記参照)。
【０１６８】
当業界で公知の突然変異誘発のための任意の技術を用いて、抗体配列中にアミノ酸置換を作製するか、またはさらなる操作を容易にするために制限部位を作製／欠失させるために、DNA配列中の個々のヌクレオチドを改変することができる。そのような技術としては、限定されるものではないが、化学的突然変異誘発、in vitro部位特異的突然変異誘発(Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488 (1985); Hutchinson, C.ら、J. Biol. Chem., 253:6551 (1978))、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発 (Smith, Ann. Rev. Genet., 19:423-463 (1985); Hillら、Methods Enzymol., 155:558-568 (1987))、PCRに基づく重複伸長(Hoら、Gene, 77:51-59 (1989))、PCRに基づくメガプライマー突然変異誘発 (Sarkarら、Biotechniques, 8:404-407 (1990))などが挙げられる。改変を、二本鎖ジデオキシDNA配列決定により確認することができる。
【０１６９】
本発明の特定の実施形態においては、抗CD19抗体を改変して、融合タンパク質、すなわち、異種タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに融合した、抗体、またはそのフラグメントを作製することができる。特定の実施形態においては、抗CD19抗体の一部に融合したタンパク質は、抗体特異的酵素プロドラッグ療法(ADEPT)の酵素成分である。抗CD19抗体との融合タンパク質として遺伝子操作することができる他のタンパク質またはポリペプチドの例としては、限定されるものではないが、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、DNase I、スタフィロコッカス腸毒素A、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリン毒素、シュードモナス外毒素、およびシュードモナス内毒素などの毒素が挙げられる。例えば、Pastanら、Cell, 47:641 (1986)、およびGoldenbergら、Cancer Journal for Clinicians, 44:43 (1994)を参照されたい。用いることができる酵素的に活性な毒素およびその断片としては、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素A鎖(シュードモナス・エルギノーサ由来)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α-サルシン、シナアブラギリ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、およびPAP-S)、ゴーヤー(Momordica charantia)阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィシナリス(Saponaria officinalis)阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが挙げられる。例えば、1993年10月28日に公開されたWO 93/21232を参照されたい。
【０１７０】
さらなる融合タンパク質を、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エクソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング(集合的に、「DNAシャッフリング」と呼ばれる)の技術を介して作製することができる。DNAシャッフリングを用いて、抗CD19抗体またはそのフラグメント(例えば、より高い親和性およびより低い解離速度を有する抗体またはそのフラグメント)の活性を変化させることができる。一般的には、米国特許第5,605,793号; 第5,811,238号; 第5,830,721号; 第5,834,252号; および第5,837,458号、ならびにPattenら、1997, Curr. Opinion Biotechnol., 8:724-33 ; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hanssonら、1999, J. Mol. Biol., 287:265-76; ならびにLorenzoおよびBlasco, 1998, Biotechniques 24(2):308-313(これらの特許および刊行物の各々は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。前記抗体はさらに、全てLedbetterらの米国特許出願公開第20030118592号、第200330133939号、およびPCT公開WO 02/056910(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に記載の結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質であってよい。
【０１７１】
6. ドメイン抗体
本発明の組成物および方法の抗CD19抗体は、ドメイン抗体、例えば、ヒト抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域に対応する、抗体の小さい機能的結合単位を含む抗体であってよい。ドメイン抗体の例としては、限定されるものではないが、治療標的に特異的であるDomantis Limited (Cambridge, UK)およびDomantis Inc. (Cambridge, MA, USA)から入手可能なものが挙げられる(例えば、WO04/058821; WO04/003019; 米国特許第6,291,158号; 第6,582,915号; 第6,696,245号; および第6,593,081号を参照されたい)。ドメイン抗体の市販のライブラリーを用いて、抗CD19ドメイン抗体を同定することができる。特定の実施形態においては、抗CD19抗体は、CD19機能的結合単位およびFcγ受容体機能的結合単位を含む。
【０１７２】
一実施形態においては、抗CD19ドメイン抗体は、HB12AまたはHB12Bモノクローナル抗体の重鎖または軽鎖のCDRのいずれか1つ、またはいずれかの組合せを含んでもよい。
【０１７３】
別の実施形態においては、抗CD19ドメイン抗体は、HB12AまたはHB12Bモノクローナル抗体の重鎖または軽鎖可変領域により含まれるCDRのいずれかの組合せと一緒に、HB12AまたはHB12B VHのCDR3を含んでもよい。抗CD19ドメイン抗体はまた、HB12AまたはHB12Bモノクローナル抗体の重鎖または軽鎖可変領域により含まれるCDRのいずれかの組合せと一緒に、HB12AまたはHB12B VKのCDR3を含んでもよい。
【０１７４】
さらに別の実施形態においては、抗CD19ドメイン抗体は、HB12AまたはHB12B VHのCDR3を含んでもよい。抗CD19ドメイン抗体はまた、HB12AまたはHB12B VKのCDR3を含んでもよい。
【０１７５】
7. ダイアボディ
本発明の特定の実施形態においては、抗CD19抗体は、「ダイアボディ」である。用語「ダイアボディ」とは、フラグメントが同じポリペプチド鎖中の軽鎖可変ドメイン(VL)に接続された重鎖可変ドメイン(VH)を含む(VH-VL)、2個の抗原結合部位を有する小さい抗体フラグメントを指す。同じ鎖上の2個のドメイン間での対形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いることにより、該ドメインを別の鎖の相補的ドメインと強制的に対形成させ、2個の抗原結合部位を作製する。ダイアボディは、例えば、EP 404,097; WO 93/11161; およびHollingerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により完全に記載されている。
【０１７６】
8. ワクチボディ
本発明の特定の実施形態においては、抗CD19抗体は、ワクチボディである。ワクチボディはダイマーポリペプチドである。ワクチボディの各モノマーは、ヒンジ領域およびCγ3ドメインを介して第2のscFvに接続されたAPC上の表面分子に対する特異性を有するscFvからなる。本発明の他の実施形態においては、scFvの1つとして、抗CD19抗体フラグメントを含むワクチボディを用いて、破壊しようとするこれらのB細胞と、ADCCを媒介するエフェクター細胞を並置することができる。例えば、Bogenら、米国特許出願公開第20040253238号を参照されたい。
【０１７７】
9. 線状抗体
本発明の特定の実施形態においては、抗CD19抗体は、線状抗体である。線状抗体は、抗原結合領域の対を形成するタンデムFd断片(VH-CH1-VH-CH1)の対を含む。線状抗体は、二特異的であっても、一特異的であってもよい。Zapataら、Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995)を参照されたい。
【０１７８】
10. 親抗体＋
本発明の特定の実施形態においては、抗CD19抗体は、親抗体である。「親抗体」は、本明細書に開示される変化した抗体／突然変異抗体と比較して、1個以上の超可変領域中、もしくはそれに隣接する1個以上のアミノ酸残基を欠くか、またはその中に欠損を有するアミノ酸配列を含む抗体である。かくして、親抗体は、本明細書に開示される抗体突然変異体の対応する超可変領域よりも短い超可変領域を有し得る。親ポリペプチドは、天然の抗体配列(すなわち、天然の対立遺伝子変異体などの天然のもの)または天然の配列の予め存在するアミノ酸配列修飾(他の挿入、欠失および／もしくは置換など)を有する抗体配列を含んでもよい。親抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体であってよい。
【０１７９】
11. 抗体フラグメント
「抗体フラグメント」は、完全長抗体の一部、一般的には、その抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFvフラグメント；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成された多特異的抗体が挙げられる。
【０１８０】
伝統的には、これらのフラグメントは、無傷の抗体のタンパク質溶解的消化を介して誘導された(例えば、Morimotoら、Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117 (1992)およびBrennanら、Science, 229:81 (1985)を参照)。しかしながら、ここで、これらのフラグメントを、組換え宿主細胞により直接産生させることができる。例えば、抗体フラグメントを、上記で考察された抗体ファージライブラリーから単離することができる。また、Fab'-SHフラグメントを、大腸菌から直接回収し、F(ab')2フラグメントに化学的に結合させることができる(Carterら、Bio/Technology, 10:163-167 (1992))。別の手法に従えば、F(ab')2フラグメントを、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体フラグメントの製造のための他の技術は、当業者には明らかであろう。他の実施形態においては、選択したクローンは、一本鎖Fcフラグメント(scFv)である。例えば、WO 93/16185を参照されたい。特定の実施形態においては、前記抗体はFabフラグメントではない。
【０１８１】
12. 二特異的抗体
二特異的抗体は、少なくとも2個の異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例示的な二特異的抗体は、B細胞表面マーカーの2個の異なるエピトープに結合することができる。他のそのような抗体は、第1のB細胞マーカーに結合し、さらに第2のB細胞表面マーカーに結合することができる。抗B細胞マーカー結合アームを、T細胞受容体分子(例えば、CD2もしくはCD3)、またはIgGのためのFc受容体(FcγR)などの白血球上の誘発分子に結合するアームと結合させて、細胞防御機構をB細胞に集中させることができる。また、二特異的抗体を用いて、B細胞に対する細胞傷害剤を局在化させることもできる。これらの抗体は、B細胞マーカー結合アームと、細胞傷害剤(例えば、サポリン、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンA鎖、メトラ-エキサートまたは放射性アイソトープハプテン)に結合するアームとを有する。二特異的抗体を、完全長抗体または抗体フラグメント(例えば、F(ab')：二特異的抗体)として調製することができる。
【０１８２】
二特異的抗体を作製するための方法は、当業界で公知である(例えば、Millsteinら、Nature, 305:537-539 (1983); Trauneckerら、EMBO J., 10:3655-3659 (1991); Sureshら、Methods in Enzymology, 121:210 (1986); Kostelnyら、J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992); Hollingerら、Proc. Natl Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993); Gruberら、J. Immunol., 152:5368 (1994); 米国特許第4,474,893号; 第4,714,681号; 第4,925,648号; 第5,573,920号; 第5,601,81号; 第95,731,168号; 第4,676,980号; および第4,676,980号、WO 94/04690; WO 91/00360; WO 92/200373; WO 93/17715; WO 92/08802; ならびにEP 03089を参照されたい)。
【０１８３】
一実施形態においては、本発明の組成物および方法の抗CD19抗体が二特異的である場合、抗CD19抗体はヒトまたはヒト化抗体であってよく、ヒトCD19およびT細胞上のエピトープに対する特異性を有してもよく、または、例えば、単球／マクロファージおよび／もしくは細胞死を引き起こすナチュラルキラー細胞などのヒトエフェクター細胞に結合することができる。
【０１８４】
一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、第1の抗原がヒトCD19であり、第2の抗原がFcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIAおよびFcγRIVからなる群より選択されるFcγ受容体である、第1および第2の抗原に特異的に結合することができる二特異的抗体である。さらなる実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、ヒトCD19およびFcγRIIBに特異的に結合することができる二特異的抗体である。別の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、ヒトCD19およびヒトFcγRIIBに特異的に結合することができる二特異的抗体である。
【０１８５】
13. Fc領域変異体
本発明は、Fc領域変異体、すなわち、非天然のFc領域、例えば、1個以上の非天然アミノ酸残基を含むFc領域を含むタンパク質の製剤を提供する。また、アミノ酸欠失、付加および／または改変を含むFc領域も、本発明のFc領域変異体に包含される。
【０１８６】
本明細書で用いられるFc領域は、第1の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを含むことが理解されるであろう。かくして、Fcとは、IgA、IgD、およびIgGの少なくとも2個の定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにIgEおよびIgMの最後の3個の定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにこれらのドメインの可撓性ヒンジN末端を指す。IgAおよびIgMについては、FcはJ鎖を含んでもよい。IgGについては、Fcは免疫グロブリンドメインCガンマ2およびCガンマ3(Cγ2およびCγ3)ならびにCガンマ1(Cγ1)とCガンマ2(Cγ2)間のヒンジを含む。Fc領域の境界は変化してもよいが、通常、ヒトIgG重鎖Fc領域を、そのカルボキシル末端にC226またはP230残基を含むように定義するが、ここで番号付けはKabatら(1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA)に記載のEU指標に従うものである。「Kabatに記載のEU指標」とは、Kabatら、上掲に記載のヒトIgG1 EU抗体の残基番号を指す。Fcは、単離におけるこの領域、または抗体、抗体フラグメント、もしくはFc融合タンパク質の内容におけるこの領域を指す。Fc変異体タンパク質は、抗体、Fc融合物、または限定されるものではないが、Fcの非天然変異体である、Fc領域変異体を含むタンパク質などのFc領域を含む任意のタンパク質もしくはタンパク質ドメインであってよい。注記：多型性が、限定されるものではないが、Kabatの270、272、312、315、356、および358などのいくつかのFc位置で観察され、かくして、提供された配列と従来技術中の配列との間のわずかな差異は存在してもよい。
【０１８７】
本発明は、比較可能な分子(例えば、野生型Fc領域を有する以外は同じアミノ酸配列を有するタンパク質)と比較して、Fcリガンド(例えば、Fc受容体、C1q)に対する結合特異性が変化したFc変異体タンパク質を包含する。結合特性の例としては、限定されるものではないが、結合特異性、平衡解離定数(KD)、解離および結合速度(それぞれ、koffおよびkon)、結合親和性および／またはアビディティが挙げられる。一般的には、低いKDを有する結合分子(例えば、抗体などのFc変異体タンパク質)は高いKDを有する結合分子よりも好ましいと理解される。しかしながら、いくつかの例においては、konまたはkoffの値は、KDの値よりも関連性が高いかもしれない。当業者であれば、速度パラメーターが、所与の抗体適用にとって最も重要であることを決定することができる。
【０１８８】
Fcドメインの、そのリガンドに対する親和性および結合特性を、Fc-FcγR相互作用、すなわち、限定されるものではないが、平衡方法(例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、もしくはラジオイムノアッセイ(RIA))、または反応速度(例えば、BIACORE(登録商標)アッセイ)、ならびに間接結合アッセイ、競合阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー(例えば、ゲル濾過)などのFcγRに対するFc領域の特異的結合を決定するための当業界で公知の様々なin vitroアッセイ方法(生化学または免疫学に基づくアッセイ)により決定することができる。これらの方法および他の方法は、試験する1種以上の成分上の標識を利用し、および／または限定されるものではないが、色素、蛍光、発光、もしくはアイソトープ標識などの様々な検出方法を用いることができる。結合親和性および反応速度の詳細な説明を、抗体-免疫原相互作用に焦点を当てた、Paul, W.E.(編)、Fundamental Immunology、第4版、Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)に見出すことができる。
【０１８９】
一実施形態においては、Fc変異体タンパク質は、比較可能な分子と比較して1個以上のFcリガンドへの増強された結合を有する。別の実施形態においては、Fc変異体タンパク質は、比較可能な分子のものよりも少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも5倍、または少なくとも7倍、または少なくとも10倍、または少なくとも20倍、または少なくとも30倍、または少なくとも40倍、または少なくとも50倍、または少なくとも60倍、または少なくとも70倍、または少なくとも80倍、または少なくとも90倍、少なくとも100倍、または少なくとも200倍高いFcリガンドに対する親和性を有する。特定の実施形態においては、Fc変異体タンパク質は、Fc受容体に対する増強された結合を有する。別の特定の実施形態においては、Fc変異体タンパク質は、Fc受容体FcγRIIIAに対する増強された結合を有する。さらに特定の実施形態においては、Fc変異体タンパク質は、Fc受容体FcγRIIBに対する増強された結合を有する、さらに別の特定の実施形態においては、Fc変異体タンパク質は、Fc受容体FcRnに対する増強された結合を有する。さらに別の実施形態においては、Fc変異体タンパク質は、比較可能な分子と比較して、C1qに対する増強された結合を有する。
【０１９０】
一実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、Fcドメイン変異体が、比較可能な非変異体Fcドメインと比較して、Fcγ受容体IIBに対する増強された結合親和性を有する該Fcドメイン変異体を含む。さらなる実施形態においては、本発明の抗CD19抗体は、Fcドメイン変異体が、比較可能な非変異体Fcドメインのものよりも少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも5倍、または少なくとも7倍、または少なくとも10倍、または少なくとも20倍、または少なくとも30倍、または少なくとも40倍、または少なくとも50倍、または少なくとも60倍、または少なくとも70倍、または少なくとも80倍、または少なくとも90倍、少なくとも100倍、または少なくとも200倍高いFcγ受容体IIBに対する親和性を有するFcドメイン変異体を含む。
【０１９１】
FcRnに対するFc領域の結合親和性を増加させることにより、Fc領域を含むタンパク質の血清半減期を増加させることができる。一実施形態においては、Fc変異体タンパク質は、比較可能な分子と比較して、増強された血清半減期を有する。
【０１９２】
「抗体依存的細胞媒介性細胞傷害性」または「ADCC」とは、特定の細胞傷害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、およびマクロファージ)上に存在するFc受容体(FcR)上に結合した分泌されるIgが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を担持する標的細胞に特異的に結合し、細胞毒素を用いて標的細胞を殺傷するのを可能にする細胞傷害性の形態を指す。標的細胞の表面に対する特異的高親和性IgG抗体は、細胞傷害性細胞を「武装」し、そのような殺傷にとって絶対的に必要である。標的細胞の溶解は細胞外のものであり、直接的な細胞間の接触を必要とし、補体を含まない。抗体に加えて、抗原を担持する標的細胞に特異的に結合する能力を有する、Fc領域を含む他のタンパク質、特にFc融合タンパク質は、細胞媒介性細胞傷害性を実行することができることが意図される。単純性のために、Fc融合タンパク質の活性の結果生じる細胞媒介性細胞傷害性を、本明細書ではADCC活性とも呼ぶ。
【０１９３】
ADCCによる標的細胞の溶解を媒介する任意の特定のFc変異体タンパク質の能力をアッセイすることができる。ADCC活性を評価するために、目的のFc変異体タンパク質を、免疫エフェクター細胞と共に標的細胞に添加し、抗原抗体複合体により活性化し、標的細胞の細胞溶解をもたらすことができる。一般的には、細胞溶解を、溶解した細胞からの標識(例えば、放射性基質、蛍光染料または天然細胞内タンパク質)の放出により検出する。そのようなアッセイにとって有用なエフェクター細胞としては、末梢血液単核細胞(PBMC)およびナチュラルキラー(NK)細胞が挙げられる。in vitroでのADCCアッセイの特定例は、Wisecarverら、1985 79:277-282; Bruggemannら、1987, J Exp Med 166:1351-1361; Wilkinsonら、2001, J Immunol Methods 258:183-191; Patelら、1995 J Immunol Methods 184:29-38に記載されている。目的のFc変異体タンパク質のADCC活性を、例えば、Clynesら、1998, Proc. Natl. Acad. Sci.  USA 95:652-656に開示されたものなどの動物モデルにおいて、in vivoで評価することもできる。
【０１９４】
一実施形態においては、Fc変異体タンパク質は、比較可能な分子と比較して、増強されたADCC活性を有する。特定の実施形態においては、Fc変異体タンパク質は、比較可能な分子のものよりも少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも5倍、または少なくとも10倍、または少なくとも50倍、または少なくとも100倍高いADCC活性を有する。別の特定の実施形態においては、Fc変異体タンパク質は、比較可能な分子と比較して、Fc受容体FcγRIIIAに対する増強された結合を有し、増強されたADCC活性を有する。他の実施形態においては、Fc変異体タンパク質は、比較可能な分子と比較して、増強されたADCC活性と、増強された血清半減期の両方を有する。
【０１９５】
一実施形態においては、Fc変異体タンパク質は、比較可能な分子と比較して、低下したADCC活性を有する。特定の実施形態においては、Fc変異体タンパク質は、比較可能な分子のものよりも少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも5倍、または少なくとも10倍、または少なくとも50倍、または少なくとも100倍低いADCC活性を有する。別の特定の実施形態においては、Fc変異体タンパク質は、比較可能な分子と比較して、Fc受容体FcγRIIIAに対する低下した結合を有し、低下したADCC活性を有する。他の実施形態においては、Fc変異体タンパク質は、比較可能な分子と比較して、低下したADCC活性および増強された血清半減期の両方を有する。
【０１９６】
「補体依存的細胞傷害性」および「CDC」とは、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。補体活性化経路は、補体系の第1成分(C1q)の、分子、例えば、同族抗原と複合体化した抗体への結合により開始する。補体活性化を評価するために、例えば、Gazzano-Santoroら、1996, J. Immunol. Methods, 202:163に記載のものなどのCDCアッセイを実施することができる。一実施形態においては、Fc変異体タンパク質は、比較可能な分子と比較して、増強されたCDC活性を有する。特定の実施形態においては、Fc変異体タンパク質は、比較可能な分子のものよりも少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも5倍、または少なくとも10倍、または少なくとも50倍、または少なくとも100倍高いCDC活性を有する。他の実施形態においては、Fc変異体タンパク質は、比較可能な分子と比較して、増強されたCDC活性および増強された血清半減期を有する。
【０１９７】
一実施形態においては、Fc変異体タンパク質は、比較可能な分子と比較して、1個以上のFcリガンドへの低下した結合を有する。別の実施形態においては、Fc変異体タンパク質は、比較可能な分子のものよりも少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも5倍、または少なくとも7倍、または少なくとも10倍、または少なくとも20倍、または少なくとも30倍、または少なくとも40倍、または少なくとも50倍、または少なくとも60倍、または少なくとも70倍、または少なくとも80倍、または少なくとも90倍、または少なくとも100倍、または少なくとも200倍低いFcリガンドに対する親和性を有する。特定の実施形態においては、Fc変異体タンパク質は、Fc受容体に対する低下した結合を有する。別の特定の実施形態においては、Fc変異体タンパク質は、Fc受容体FcγRIIIAに対する低下した結合を有する。さらに特定の実施形態においては、本明細書に記載のFc変異体は、比較可能な分子のものよりも少なくとも約5倍低いFc受容体FcγRIIIAに対する親和性を有し、ここで、該Fc変異体は比較可能な分子のものの約2倍の範囲内にあるFc受容体FcγRIIBに対する親和性を有する。さらに別の特定の実施形態においては、Fc変異体タンパク質は、Fc受容体FcRnに対する低下した結合を有する。さらに別の特定の実施形態においては、Fc変異体タンパク質は、比較可能な分子と比較して、C1qに対する低下した結合を有する。
【０１９８】
一実施形態においては、本発明は、Fc領域が、Kabatに記載のEU指標により番号付けられた234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、247、251、252、254、255、256、262、263、264、265、266、267、268、269、279、280、284、292、296、297、298、299、305、313、316、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、339、341、343、370、373、378、392、416、419、421、440および443からなる群より選択される1個以上の位置に非天然アミノ酸残基を含むFc変異体を提供する。必要に応じて、Fc領域は、当業者には公知の追加の位置および／または代替的な位置に非天然アミノ酸残基を含んでもよい(例えば、米国特許第5,624,821号; 第6,277,375号; 第6,737,056号; PCT特許出願公開WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752; WO 04/074455; WO 04/099249; WO 04/063351; WO 05/070963; WO 05/040217, WO 05/092925およびWO 06/020114を参照)。
【０１９９】
一実施形態においては、本発明は、Fc領域が、Kabatに記載のEU指標により番号付けられた234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、247、251、252、254、255、256、262、263、264、265、266、267、268、269、279、280、284、292、296、297、298、299、305、313、316、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、339、341、343、370、373、378、392、416、419、421、440および443からなる群より選択される1個以上の位置に非天然アミノ酸残基を含む製剤を提供する。必要に応じて、Fc領域は、当業者には公知の追加の位置および／または代替的な位置に非天然アミノ酸残基を含んでもよい(例えば、米国特許第5,624,821号; 第6,277,375号; 第6,737,056号; PCT特許出願公開WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752; WO 04/074455; WO 04/099249; WO 04/063351; WO 05/070963; WO 05/040217, WO 05/092925およびWO 06/020114を参照)。
【０２００】
特定の実施形態においては、本発明は、Fc領域が、Kabatに記載のEU指標により番号付けられた234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235A、235D、235R、235W、235P、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235F、236E、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、240I、240A、240T、240M、241W、241L、241Y、241E、241R、243W、243L、243Y、243R、243Q、244H、245A、247L、247V、247G、251F、252Y、254T、255L、256E、256M、262I、262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、266A、266T、266M、267Q、267L、268E、269H、269Y、269F、269R、270E、280A、284M、292P、292L、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、296H、269G、297S、297D、297E、298H、298I、298T、298F、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、305I、313F、316D、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325T、325V、325H、327G、327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、328I、328V、328T、328H、328A、329F、329H、329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、330I、330F、330R、330H、331G、331A、331L、331M、331F、331W、331K、331Q、331E、331S、331V、331I、331C、331Y、331H、331R、331N、331D、331T、332D、332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、332H、332Y、332A、339T、370E、370N、378D、392T、396L、416G、419H、421K、440Yおよび434Wからなる群より選択される少なくとも1個の非天然アミノ酸残基を含むFc変異体を提供する。必要に応じて、Fc領域は、当業者には公知の追加の位置および／または代替的な位置に非天然アミノ酸残基を含んでもよい(例えば、米国特許第5,624,821号; 第6,277,375号; 第6,737,056号; PCT特許出願公開WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752およびWO 05/040217を参照)。
【０２０１】
特定の実施形態においては、本発明は、Fc領域が、Kabatに記載のEU指標により番号付けられた234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235A、235D、235R、235W、235P、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235F、236E、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、240I、240A、240T、240M、241W、241L、241Y、241E、241R、243W、243L、243Y、243R、243Q、244H、245A、247L、247V、247G、251F、252Y、254T、255L、256E、256M、262I、262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、266A、266T、266M、267Q、267L、268E、269H、269Y、269F、269R、270E、280A、284M、292P、292L、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、296H、269G、297S、297D、297E、298H、298I、298T、298F、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、305I、313F、316D、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325T、325V、325H、327G、327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、328I、328V、328T、328H、328A、329F、329H、329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、330I、330F、330R、330H、331G、331A、331L、331M、331F、331W、331K、331Q、331E、331S、331V、331I、331C、331Y、331H、331R、331N、331D、331T、332D、332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、332H、332Y、332A、339T、370E、370N、378D、392T、396L、416G、419H、421K、440Yおよび434Wからなる群より選択される少なくとも1個の非天然アミノ酸残基を含むFc変異体タンパク質製剤を提供する。必要に応じて、Fc領域は、当業者には公知の追加の位置および／または代替的な位置に非天然アミノ酸残基を含んでもよい(例えば、米国特許第5,624,821号; 第6,277,375号; 第6,737,056号; PCT特許出願公開WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752およびWO 05/040217を参照)。
【０２０２】
別の実施形態においては、本発明は、Fc領域が、Kabatに記載のEU指標により番号付けられた239、330および332からなる群より選択される1個以上の位置に少なくとも1個の非天然アミノ酸を含むFc変異体を提供する。特定の実施形態においては、本発明は、Fc領域が、Kabatに記載のEU指標により番号付けられた239D、330Lおよび332Eからなる群より選択される少なくとも1個の非天然アミノ酸を含むFc変異体を提供する。必要に応じて、Fc領域は、Kabatに記載のEU指標により番号付けられた252、254、および256からなる群より選択される1個以上の位置に追加の非天然アミノ酸をさらに含んでもよい。特定の実施形態においては、本発明は、Fc領域が、Kabatに記載のEU指標により番号付けられた239D、330Lおよび332Eからなる群より選択される少なくとも1個の非天然アミノ酸ならびにKabatに記載のEU指標により番号付けられた252Y、254Tおよび256Eからなる群より選択される1個以上の位置の少なくとも1個の非天然アミノ酸を含むFc変異体を提供する。
【０２０３】
別の実施形態においては、本発明は、Fc領域が、Kabatに記載のEU指標により番号付けられた234、235および331からなる群より選択される1個以上の位置に少なくとも1個の非天然アミノ酸を含むFc変異体を提供する。特定の実施形態においては、本発明は、Fc領域が、Kabatに記載のEU指標により番号付けられた234F、235F、235Y、および331Sからなる群より選択される少なくとも1個の非天然アミノ酸を含むFc変異体を提供する。さらに特定の実施形態においては、本発明のFc変異体は、Kabatに記載のEU指標により番号付けられた234F、235F、および331S非天然アミノ酸残基を含む。別の特定の実施形態においては、本発明のFc変異体は、Kabatに記載のEU指標により番号付けられた234F、235Y、および331S非天然アミノ酸残基を含む。必要に応じて、Fc領域は、Kabatに記載のEU指標により番号付けられた252、254、および256からなる群より選択される1個以上の位置に追加の非天然アミノ酸をさらに含んでもよい。特定の実施形態においては、本発明は、Fc領域が、Kabatに記載のEU指標により番号付けられた234F、235F、235Y、および331Sからなる群より選択される少なくとも1個の非天然アミノ酸を含むFc変異体を提供し；ならびに1個以上の位置の少なくとも1個の非天然アミノ酸はKabatに記載のEU指標により番号付けられた252Y、254Tおよび256Eからなる群より選択される。
【０２０４】
別の実施形態においては、本発明は、Fc領域が、Kabatに記載のEU指標により番号付けられた239、330および332からなる群より選択される1個以上の位置に少なくとも1個の非天然アミノ酸を含むFc変異体タンパク質製剤を提供する。特定の実施形態においては、本発明は、Fc領域が、Kabatに記載のEU指標により番号付けられた239D、330Lおよび332Eからなる群より選択される1個以上の位置に少なくとも1個の非天然アミノ酸を含むFc変異体タンパク質製剤を提供する。必要に応じて、Fc領域はさらに、Kabatに記載のEU指標により番号付けられた252、254、および256からなる群より選択される1個以上の位置に追加の非天然アミノ酸を含んでもよい。特定の実施形態においては、本発明は、Fc領域が、Kabatに記載のEU指標により番号付けられた239D、330Lおよび332Eからなる群より選択される少なくとも1個の非天然アミノ酸を含み、1個以上の位置の少なくとも1個の非天然アミノ酸が、Kabatに記載のEU指標により番号付けられた252Y、254Tおよび256Eからなる群より選択される、Fc変異体タンパク質製剤を提供する。
【０２０５】
別の実施形態においては、本発明は、Fc領域が、Kabatに記載のEU指標により番号付けられた234、235および331からなる群より選択される1個以上の位置に少なくとも1個の非天然アミノ酸を含む、Fc変異体タンパク質製剤を提供する。特定の実施形態においては、本発明は、Fc領域が、Kabatに記載のEU指標により番号付けられた234F、235F、235Yおよび331Sからなる群より選択される少なくとも1個の非天然アミノ酸を含む、Fc変異体タンパク質製剤を提供する。必要に応じて、Fc領域はさらに、Kabatに記載のEU指標により番号付けられた252、254、および256からなる群より選択される1個以上の位置に追加の非天然アミノ酸を含んでもよい。特定の実施形態においては、本発明は、Fc領域が、Kabatに記載のEU指標により番号付けられた234F、235F、235Y、および331Sからなる群より選択される少なくとも1個の非天然アミノ酸を含み、1個以上の位置の少なくとも1個の非天然アミノ酸が、Kabatに記載のEU指標により番号付けられた252Y、254Tおよび256Eからなる群より選択される、Fc変異体タンパク質製剤を提供する。
【０２０６】
一実施形態においては、本発明のFc変異体を、Ghetieら、1997, Nat Biotech. 15:637-40; Duncanら、1988, Nature 332:563-564; Lundら、1991, J. Immunol 147:2657-2662; Lundら、1992, Mol Immunol 29:53-59; Alegreら、1994, Transplantation 57:1537-1543; Hutchinsら、1995, Proc Natl. Acad Sci U S A 92:11980-11984; Jefferisら、1995, Immunol Lett. 44:111-117; Lundら、1995, Faseb J 9:115-119; Jefferisら、1996, Immunol Lett 54:101-104; Lundら、1996, J Immunol 157:4963-4969; Armourら、1999, Eur J Immunol 29:2613-2624; Idusogieら、2000, J Immunol 164:4178-4184; Reddyら、2000, J Immunol 164:1925-1933; Xuら、2000, Cell Immunol 200:16-26; Idusogieら、2001, J Immunol 166:2571-2575; Shieldsら、2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Jefferisら、2002, Immunol Lett 82:57-65; Prestaら、2002, Biochem Soc Trans 30:487-490; 米国特許第5,624,821号; 第5,885,573号; 第5,677,425号; 第6,165,745号; 第6,277,375号; 第5,869,046号; 第6,121,022号; 第5,624,821号; 第5,648,260号; 第6,528,624号; 第6,194,551号; 第6,737,056号; 第6,821,505号; 第6,277,375号; 米国特許出願公開第2004/0002587号およびPCT公開WO 94/29351; WO 99/58572; WO 00/42072; WO 02/060919; WO 04/029207; WO 04/099249; WO 04/063351に開示されたものなどの他の公知のFc変異体と組み合わせることができる。また、欠失、付加および／または改変を含むFc領域も本発明により包含される。Fcドメインのさらに他の改変／置換／付加／欠失は、当業者には容易に明らかとなるであろう。
【０２０７】
非天然Fc領域を作製する方法は当業界で公知である。例えば、アミノ酸置換および／または欠失を、限定されるものではないが、部位特異的突然変異誘発(Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985))、PCR突然変異誘発(Higuchi、「PCRプロトコル：方法および用途に関する案内(PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications)」、Academic Press, San Diego, pp. 177-183 (1990))、およびカセット突然変異誘発 (Wellsら、Gene 34:315-323 (1985))などの突然変異誘発方法により作製することができる。好ましくは、部位突然変異誘発を、重複伸長PCR法(Higuchi、「PCR技術：DNA増幅の原理および用途(PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification)」、Stockton Press, New York, pp. 61-70 (1989))により実施する。重複伸長PCR(Higuchi、上掲)の技術を用いて、任意の所望の突然変異を標的配列(出発DNA)に導入することもできる。例えば、重複伸長法における第1ラウンドのPCRは、外側プライマー(プライマー1)と内部突然変異誘発プライマー(プライマー3)、および別々に第2の外側プライマー(プライマー4)と内部プライマー(プライマー2)を用いて標的配列を増幅し、2個のPCR断片(断片AおよびB)を得ることを含む。内部突然変異誘発プライマー(プライマー3)を、所望の突然変異を特定する標的配列との不一致を含むように設計する。第2ラウンドのPCRにおいては、第1ラウンドのPCRの産物(断片AおよびB)を、2個の外側プライマー(プライマー1および4)を用いるPCRにより増幅する。得られる完全長PCR断片(断片C)を、制限酵素で消化し、得られる制限断片を好適なベクター中にクローニングする。突然変異誘発の第1工程として、出発DNA(例えば、Fc融合タンパク質、抗体または単にFc領域をコードする)を、突然変異誘発ベクター中に機能し得る形でクローニングする。所望のアミノ酸置換を反映するようにプライマーを設計する。Fc領域変異体の作製にとって有用な他の方法は当業界で公知である(例えば、米国特許第5,624,821号; 第5,885,573号; 第5,677,425号; 第6,165,745号; 第6,277,375号; 第5,869,046号; 第6,121,022号; 第5,624,821号; 第5,648,260号; 第6,528,624号; 第6,194,551号; 第6,737,056号; 第6,821,505号; 第6,277,375号; 米国特許出願公開第2004/0002587号およびPCT公開WO 94/29351; WO 99/58572; WO 00/42072; WO 02/060919; WO 04/029207; WO 04/099249; WO 04/063351を参照)。
【０２０８】
いくつかの実施形態においては、Fc変異体タンパク質は、1個以上の遺伝子操作された糖型、すなわち、Fc領域を含む分子に共有結合された炭水化物組成物を含む。遺伝子操作された糖型は、限定されるものではないが、エフェクター機能を増強または低下させるなどの様々な目的にとって有用であってよい。遺伝子操作された糖型を、例えば、遺伝子操作された、もしくは変異体発現株を用いることにより、1種以上の酵素、例えば、DI N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnTI11)との同時発現により、様々な生物もしくは様々な生物に由来する細胞系においてFc領域を含む分子を発現させることにより、またはFc領域を含む分子が発現された後に炭水化物を改変することにより、当業者には公知の任意の方法により作製することができる。遺伝子操作された糖型を作製する方法は当業界で公知であり、限定されるものではないが、Umanaら、1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Daviesら、20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shieldsら、2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawaら、2003, J Biol Chem 278:3466-3473、米国特許第6,602,684号; 米国特許出願第10/277,370号; 米国特許出願第10/113,929号; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; Potillegent(商標)技術(Biowa, Inc. Princeton, N.J.); GlycoMAb(商標)糖鎖工学技術(GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland)に記載のものが挙げられる。WO 00061739; EA01229125; 米国特許出願公開第20030115614号; Okazakiら、2004, JMB, 336: 1239-49を参照されたい。
【０２０９】
本明細書に記載のFc変異体を、または本明細書に記載のFc領域変異体を、限定されるものではないが、抗フルオレセインモノクローナル抗体、4-4-20(Kranzら、1982 J. Biol. Chem. 257(12): 6987-6995)、ヒト化抗TAG72抗体(CC49) (Shaら、1994 Cancer Biother. 9(4): 341-9)、限定されるものではないが、PCT公開WO 04/014292、WO 03/094859および米国特許出願第10/863,729号に開示されたものなどのEph受容体に特異的に結合する抗体、限定されるものではないが、LM609 (Scripps)、マウスモノクローナルLM609 (PCT公開WO 89/015155および米国特許第5,753,230号)などの、インテグリンαVβ3に特異的に結合する抗体;ヒト化モノクローナル抗体MEDI-522 (a.k.a. VITAXIN(登録商標), MedImmune, Inc., Gaithersburg, MD; Wuら、1998, PNAS USA 95(11): 6037-6042; PCT公開WO 90/33919およびWO 00/78815)、WO/2005/05059106に開示されたインターフェロンαに対する抗体、WO/2006/059106に開示されたインターフェロン受容体1に対する抗体、Erbitux(商標)(IMC-C225としても知られる) (ImClone Systems Inc.)、EGFRに対するキメラ化モノクローナル抗体; 転移性乳癌を有する患者の治療のためのヒト化抗HER2モノクローナル抗体であるHERCEPTIN(登録商標)(Trastuzumab) (Genentech, CA); クロット形成の予防のための血小板上の抗糖タンパク質IIb/IIIa受容体であるREOPRO(登録商標) (abciximab) (Centocor); 急性腎臓同種移植片拒絶の予防のための免疫抑制性ヒト化抗CD25モノクローナル抗体であるZENAPAX(登録商標)(daclizumab) (Roche Pharmaceuticals, Switzerland)などの、当業界で記載された任意の抗体から作製するか、またはその中に導入することができる。他の例は、ヒト化抗CD18 F(ab')2 (Genentech);ヒト化抗CD18 F(ab')2であるCDP860(Celltech, UK); CD4と融合させた抗HIV gp120抗体であるPRO542 (Progenics/Genzyme Transgenics); 抗CD14抗体であるC14(ICOS Pharm); ヒト化抗VEGF IgG1抗体 (Genentech);マウス抗CA 125抗体であるOVAREX (商標)(Altarex); マウス抗17-IA細胞表面抗原IgG2a抗体であるPANOREX(商標) (Glaxo Wellcome/Centocor); キメラ抗EGFR IgG抗体であるIMC-C225 (ImClone System); ヒト化抗αVβ3インテグリン抗体であるVITAXIN(商標) (Applied Molecular Evolution/MedImmune); ヒト化抗CD52 IgG1抗体であるCampath 1H/LDP-03 (Leukosite); ヒト化抗CD33 IgG抗体であるSmart M195 (Protein Design Lab/Kanebo); キメラ抗CD20 IgG1抗体であるRITUXAN(商標) (IDEC Pharm/Genentech, Roche/Zettyaku); ヒト化抗CD22 IgG抗体であるLYMPHOCIDE(商標) (Immunomedics); ヒト化抗HLA抗体であるSmart ID10 (Protein Design Lab); 放射標識マウス抗HLA DR抗体であるONCOLYM(商標)(Lym-1) (Techniclone); ヒト化IgG1抗体である抗CD11a (Genetech/Xoma); ヒト化抗ICAM3抗体であるICM3 (ICOS Pharm); 霊長類化抗CD80抗体であるIDEC-114 (IDEC Pharm/Mitsubishi); 放射標識マウス抗CD20抗体であるZEVALIN(商標) (IDEC/Schering AG); ヒト化抗CD40L抗体であるIDEC-131 (IDEC/Eisai); 霊長類化抗CD4抗体であるIDEC-151 (IDEC); 霊長類化抗CD23抗体であるIDEC-152 (IDEC/Seikagaku); ヒト化抗CD3 IgGであるSMART抗CD3 (Protein Design Lab); ヒト化抗補体因子5(C5)抗体である5G1.1 (Alexion Pharm); 霊長類化抗CD4 IgG1抗体であるIDEC-151 (IDEC Pharm/SmithKline Beecham); ヒト抗CD4 IgG抗体であるMDX-CD4 (Medarex/Eisai/Genmab); ヒト化抗TNF-α IgG4抗体であるCDP571 (Celltech); ヒト化抗α4β7抗体であるLDP-02 (LeukoSite/Genentech); ヒト化抗CD4 IgG抗体であるOrthoClone OKT4A (Ortho Biotech); ヒト化抗CD40L IgG抗体であるANTOVA(商標) (Biogen); ヒト化抗VLA-4 IgG抗体であるANTEGREN(商標) (Elan); ヒト抗CD64 (FcγR)抗体であるMDX-33 (Medarex/Centeon); ヒト化抗IgE IgG1抗体であるrhuMab-E25  (Genentech/Norvartis/Tanox Biosystems); 霊長類化抗CD23抗体であるIDEC-152 (IDEC Pharm); マウス抗CD-147 IgM抗体であるABX-CBL (Abgenix); ラット抗CD2 IgG抗体であるBTI-322 (Medimmune/Bio Transplant); マウス抗CD3 IgG2a抗体であるOrthoclone/OKT3 (ortho Biotech); キメラ抗CD25 IgG1抗体であるSIMULECT(商標) (Novartis Pharm); ヒト化抗β2インテグリンIgG抗体であるLDP-01 (LeukoSite); マウス抗CD18 F(ab')2である抗LFA-1 (Pasteur-Merieux/Immunotech); ヒト抗TGF-β2抗体であるCAT-152 (Cambridge Ab Tech); およびキメラ抗第VII因子抗体であるCorsevin M (Centocor)である。
【０２１０】
本明細書に記載のFc変異体領域を含んでよいさらなる抗体は、限定されるものではないが、KS 1/4膵臓癌抗原(PerezおよびWalker, 1990, J. Immunol. 142: 3662-3667; Bumal, 1988, Hybridoma 7(4): 407-415)、卵巣癌抗原(CA125) (Yuら、1991, Cancer Res. 51(2): 468-475)、前立腺酸ホスファターゼ(Tailorら、1990, Nucl. Acids Res. 18(16): 4928)、前立腺特異的抗原(HenttuおよびVihko, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 160(2): 903-910; Israeliら、1993, Cancer Res. 53: 227-230)、メラノーマ関連抗原p97 (Estinら、1989, J. Natl. Cancer Instit. 81(6): 445-446)、メラノーマ抗原gp75 (Vijayasardahlら、1990, J. Exp. Med. 171(4): 1375-1380)、高分子量メラノーマ抗原(HMW-MAA) (Nataliら、1987, Cancer 59: 55-63; Mittelmanら、1990, J. Clin. Invest. 86: 2136-2144)、前立腺特異的膜抗原、癌胎児抗原 (CEA) (Foonら、1994, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 13: 294)、多型上皮ムチン抗原、ヒト乳脂肪球抗原、CEA、TAG-72 (Yokataら、1992, Cancer Res. 52: 3402-3408)、CO17-1A (Ragnhammarら、1993, Int. J. Cancer 53: 751-758); GICA 19-9 (Herlynら、1982, J. Clin. Immunol. 2: 135)、CTA-1およびLEAなどの結腸直腸腫瘍関連抗原、Burkitt'sリンパ腫抗原-38.13、CD19 (Ghetieら、1994, Blood 83: 1329-1336)、ヒトBリンパ種抗原CD20 (Reffら、1994, Blood 83:435-445)、CD33 (Sgourosら、1993, J. Nucl. Med. 34:422-430)、ガングリオシドGD2 (Salehら、1993, J. Immunol., 151, 3390-3398)、ガングリオシドGD3 (Shitaraら、1993, Cancer Immunol. Immunother. 36:373-380)、ガングリオシドGM2 (Livingstonら、1994, J. Clin. Oncol. 12: 1036-1044)、ガングリオシドGM3 (Hoonら、1993, Cancer Res. 53: 5244-5250)などのメラノーマ特異的抗原、T抗原DNA腫瘍ウイルスおよびRNA腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原などのウイルス誘導性腫瘍抗原、結腸、膀胱腫瘍癌胎児抗原(Hellstromら、1985, Cancer. Res. 45:2210-2188)のCEAなどの癌胎児抗原-α-フェトタンパク質、ヒト肺癌抗原L6、L20 (Hellstromら、1986, Cancer Res. 46: 3917-3923)などの分化抗原、線維肉腫の抗原、ヒト白血病T細胞抗原Gp37(Bhattacharya-Chatterjeeら、1988, J. of Immun. 141:1398-1403)、新生糖タンパク質、スフィンゴ脂質、EGFR(上皮増殖因子受容体)などの乳癌抗原、HER2抗原(p185HER2)、多型上皮ムチン(PEM) (Hilkensら、1992, Trends in Bio. Chem. Sci. 17:359)、悪性ヒトリンパ球抗原-APO-1(Bernhardら、1989, Science 245: 301-304)、胎児赤血球に認められるI抗原、成人赤血球に認められる初期内胚葉I抗原、移植前の胚、胃癌に認められるI(Ma)、乳腺上皮に認められるM18、M39、骨髄細胞に認められるSSEA-1、VEP8、VEP9、My1、VIM-D5、結腸直腸癌に認められるD156-22、TRA-1-85(血液群H)、結腸癌に認められるC14、肺癌に認められるF3、胃癌に認められるAH6、Yハプテン、胚性癌細胞に認められるLey、TL5(血液群A)、胚性癌細胞に認められるFC10.2、胃癌抗原、腺癌に認められるCO-514(血液群Lea)、腺癌に認められるNS-10、CO-43(血液群Leb)、A431細胞のEGF受容体に認められるG49、結腸癌に認められるMH2(血液群ALeb/Ley)、結腸癌に認められる19.9、胃癌ムチン、骨髄細胞に認められるT5A7、ミエローマに認められるR24、4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-3、GD2、および胚性癌細胞に認められるM1:22:25:8などの分化抗原(Feizi, 1985, Nature 314: 53-57)、ならびに4〜8細胞段階の胚に認められるSSEA-3およびSSEA-4などの癌または腫瘍抗原に特異的に結合してもよい。一実施形態においては、前記抗原は皮膚T細胞リンパ腫に由来するT細胞受容体由来ペプチドである(Edelson, 1998, The Cancer Journal 4:62を参照)。
【０２１１】
本明細書に記載のFc変異体、または本明細書に記載のFc領域変異体を、任意の抗体から作製するか、またはそれに導入することができる。さらに、本明細書に記載のFc領域変異体を用いて、Fc融合タンパク質を作製することができる。従って、実質的に任意の分子を、限定されるものではないが、下記一覧のタンパク質、ならびに下記一覧のタンパク質に属するサブユニット、ドメイン、モチーフおよびエピトープ：レニン；ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；増殖ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α-1抗トリプシン；インスリンA鎖；インスリンB鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；第VII因子、第VIIIC因子、第IX因子、組織因子(TF)、およびvon Willebrands因子などの凝固因子；Cタンパク質などの凝固防止因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性剤；ウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲン活性化因子(t-PA)などのプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血増殖因子；腫瘍壊死因子αおよびβ；エンケファリナーゼ；RANTES(活性化の際に調節され、通常はT細胞により発現および分泌される)；ヒトマクロファージ炎症タンパク質(MIP-1-α)；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；Muellerian阻害物質；レラクシンA鎖；レラクシンB鎖；プロレラクシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；β-ラクタマーゼなどの微生物タンパク質；DNase；IgE；CTLA-4などの細胞傷害性Tリンパ球関連抗原(CTLA)；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子(VEGF)；例えば、EGFR、VEGFRなどのホルモンもしくは増殖因子の受容体；αインターフェロン(α-IFN)、β-インターフェロン(β-IFN)およびγ-インターフェロン(γ-IFN)などのインターフェロン；インターフェロン受容体1などのインターフェロン受容体成分；タンパク質AもしくはD；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン-3、4、5、もしくは6(NT-3、NT-4、NT-5、もしくはNT-6)、または神経増殖因子などの神経栄養因子；αFGFおよびβFGFなどの線維芽細胞増殖因子；上皮増殖因子(EGF)；TGF-αおよびTGF-β、例えば、TGF-1、TGF-2、TGF-3、TGF-4、もしくはTGF-5などのトランスフォーミング増殖因子(TGF)；インスリン様増殖因子IおよびII(IGF-IおよびIGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脳IGF-I)、インスリン様増殖因子結合タンパク質；CD2、CD3、CD4、CD 8、CD11a、CD14、CD18、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD33、CD34、CD40、CD40L、CD52、CD63、CD64、CD80およびCD147などのCDタンパク質；エリスロポエチン；骨破壊因子；イムノトキシン；骨形態形成タンパク質(BMP)；インターフェロンα、β、およびγなどのインターフェロン；M-CSF、GM-CSF、およびG-CSFなどのコロニー刺激因子(CSF)；インターロイキン(IL)、例えば、IL-1〜IL-13；TNFα、HMGB1；HMGB2；スーパーオキシドジスムターゼ；T細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；例えば、AIDSエンベロープの一部、例えば、gp120などのウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレッシン；調節タンパク質；LFA-1、Mac 1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、ICAM-3およびVCAM、a4/p7インテグリン、ならびにCD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、α7、α8、α9、αD、CD11a、CD11b、CD51、CD11c、CD41、αIIb、αIELbなどのインテグリンαもしくはそのサブユニットなどのXv/p3インテグリン; CD29、CD18、CD61、CD104、β5、β6、β7およびβ8などのインテグリンβサブユニット；限定されるものではないが、αVβ3、αVβ5およびα4β7などのインテグリンサブユニット組合せ；アポトーシス経路のメンバー；IgE；血液群抗原；flk2/flt3受容体；肥満(OB)受容体；mpl受容体；CTLA-4；タンパク質C；YKL-40およびAMCaseなどのキチナーゼもしくはキチナーゼ様分子；EphA2、EphA4、EphB2などのEph受容体；HLA-DRなどのヒト白血球抗原(HLA)；補体受容体CR1、C1RqならびにC3およびC5などの他の補体因子などの補体タンパク質；GpIbα、GPIIb/IIIaおよびCD200などの糖タンパク質受容体；CD28/CTLA-4、ICOS/AILIM、PD-1などの共刺激分子などの、本明細書に記載のFc変異体を含む抗体および／またはFc融合タンパク質により標的化し、および／またはそれに組込むことができる。
【０２１２】
本明細書に記載のFc領域変異体を含んでもよいさらなる分子は、限定されるものではないが、ALK受容体(プレイオトロフィン受容体)、プレイオトロフィン、KS 1/4膵臓癌抗原；卵巣癌抗原(CA125)；前立腺酸ホスファターゼ；前立腺特異的抗原(PSA)；メラノーマ関連抗原p97；メラノーマ抗原gp75；高分子量メラノーマ抗原(HMW-MAA)；前立腺特異的膜抗原；癌胎児抗原(CEA)；多型上皮ムチン抗原；ヒト乳脂肪球抗原；CEA、TAG-72、CO17-1A、GICA 19-9、CTA-1およびLEAなどの結腸直腸関連抗原；Burkitt'sリンパ腫抗原-38.13；CD19；ヒトBリンパ腫抗原CD20；CD33；ガングリオシドGD2、ガングリオシドGD3、ガングリオシドGM2およびガングリオシドGM3などのメラノーマ特異的抗原；腫瘍特異的移植型細胞表面抗原(TSTA)；T抗原、DNA腫瘍ウイルスおよびRNA腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原などのウイルス誘導性腫瘍抗原；結腸のCEA、5T4癌胎児トロホブラスト糖タンパク質および膀胱腫瘍癌胎児抗原などの癌胎児抗原-α-フェトタンパク質；ヒト肺癌抗原L6およびL20などの分化抗原；線維肉腫の抗原；ヒト白血病T細胞抗原Gp37；新生糖タンパク質；スフィンゴ脂質；EGFR(上皮増殖因子受容体)などの乳癌抗原；NY-BR-16；NY-BR-16およびHER2抗原(p185HER2)；多型上皮ムチン(PEM)；悪性ヒト白血球抗原APO-1；胎児赤血球に認められるI抗原などの分化抗原；成人赤血球に認められる初期内胚葉I抗原；移植前の胚；胃癌に認められるI(Ma)；乳腺上皮に認められるM18、M19；骨髄細胞に認められるSSEA-1；VEP8；VEP9；My1；VIM-D5；結腸直腸癌に認められるD156-22；TRA-1-85(血液群H)；精巣および卵巣癌に認められるSCP-1；結腸癌に認められるC14；肺癌に認められるF3；胃癌に認められるAH6；Yハプテン；胚性癌細胞に認められるLey；TL5(血液群A)；A431細胞に認められるEGF受容体；膵臓癌に認められるE1シリーズ(血液群B)；胚性癌細胞に認められるFC10.2；胃癌抗原；腺癌に認められるCO-514(血液群Lea)；腺癌に認められるNS-10；CO-43(血液群Leb)；A431細胞のEGF受容体に認められるG49；結腸癌に認められるMH2(血液群ALeb/Ley)；結腸癌に認められる19.9；胃癌ムチン；骨髄細胞に認められるT5A7；メラノーマに認められるR24；胚性癌細胞に認められる4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、およびM1:22:25:8ならびに4〜8細胞段階の胚に認められるSSEA-3およびSSEA-4；皮膚T細胞リンパ腫抗原；MART-1抗原；シアリルTn(STn)抗原；結腸癌抗原NY-CO-45；肺癌抗原NY-LU-12変異体A；腺癌抗原ART1；腫瘍随伴性関連脳-精巣癌抗原(癌神経抗原MA2；腫瘍随伴性神経抗原)；神経癌腹部抗原2(NOVA2)；血液細胞癌抗原遺伝子520；腫瘍関連抗原CO-029；腫瘍関連抗原MAGE-C1(癌／精巣抗原CT7)、MAGE-B1 (MAGE-XP抗原)、MAGE-B2 (DAM6)、MAGE-2、MAGE-4a、MAGE-4bおよびMAGE-X2；癌精巣抗原(NY-EOS-1)；YKL-40ならびに上記ポリペプチドのいずれかの断片などの癌抗原に特異的に結合するものである。
【０２１３】
14. 抗体のグリコシル化
さらに別の実施形態においては、本発明に従って用いられる抗体のグリコシル化を改変する。例えば、アグリコシル化抗体(すなわち、糖鎖を欠く抗体)を作製することができる。グリコシル化を、例えば、標的抗原に対する抗体の親和性を増加させるように変化させることができる。そのような炭水化物改変を、例えば、抗体配列内のグリコシル化の1個以上の部位を変化させることにより達成することができる。例えば、1個以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の排除をもたらす1個以上のアミノ酸置換を作製することによって、その部位でのグリコシル化を排除することができる。そのようなアグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させることができる。そのような手法は、米国特許第5,714,350号および第6,350,861号にさらに詳細に記載されている。また、Fc領域中に存在するグリコシル化部位(例えば、IgGのアスパラギン297)の排除をもたらす1個以上のアミノ酸置換を作製することもできる。さらに、アグリコシル化抗体を、必要なグリコシル化機構を欠く細菌細胞中で製造することができる。
【０２１４】
また、フコシル残基の量が減少した低フコシル化抗体または分岐GlcNAc構造が増加した抗体などの変化した型の糖鎖を有する抗体を作製することもできる。そのような変化したグリコシル化パターンは、抗体のADCC抗体を増加させることが証明されている。そのような炭水化物改変を、例えば、変化したグリコシル化機構を有する宿主細胞中で抗体を発現させることにより達成することができる。グリコシル化機構が変化した細胞は当業界で記載されており、本発明の組換え抗体を発現することによって、グリコシル化が変化した抗体を産生する宿主細胞として用いることができる。例えば、Shields, R.L.ら(2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umanaら(1999) Nat. Biotech. 17:176-1、ならびに米国特許第6,946,292号; 欧州特許第1,176,195号; PCT公開WO 03/035835; WO 99/54342(それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。
【０２１５】
15. エフェクター機能の操作
例えば、B細胞悪性腫瘍の治療における抗CD19抗体の有効性を増強するように、エフェクター機能に関して本発明の抗CD19抗体を改変するのが望ましい。例えば、システイン残基をFc領域に導入することによって、この領域中の鎖間ジスルフィド結合形成を可能にすることができる。かくして作製されたホモダイマー抗体は、改善された内在化能力ならびに／または増加した補体媒介性細胞殺傷および／もしくは抗体依存的細胞性細胞傷害性(ADCC)を有し得る。Caronら、J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992)およびShopes, B., J. Immunol., 148:2918-2922 (1992)を参照されたい。増強された抗腫瘍活性を有するホモダイマー抗体を、Wolffら、Cancer Research, 53:2560-2565 (1993)に記載のヘテロ二官能性交叉リンカーを用いて調製することもできる。また、二重Fc領域を有し、それによって増強された補体溶解およびADCC能力を有し得る抗体を遺伝子操作することもできる。Stevensonら、Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989)を参照されたい。
【０２１６】
抗体のFc領域を遺伝子操作して、エフェクター機能を変化させる他の方法は当業界で公知である(例えば、米国特許出願公開第20040185045号およびPCT公開WO 2004/016750(両方とも、FCγRIIAに対する結合親和性と比較して、FcγRIIBに対する親和性を増強するFc領域の変化を記載する、Koenigら)； また、ArmourらのPCT公開WO 99/58572、IdusogieらのWO 99/51642、およびDeoらの米国特許第6,395,272号を参照; これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)。Fc領域を改変して、FcγRIIBに対する結合親和性を低下させる方法も当業界で公知である(例えば、両方ともRavetchらの米国特許出願公開第20010036459号およびPCT公開WO 01/79299、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)。野生型Fc領域と比較してFcγRIIIAおよび／またはFcγRIIAに対する結合親和性が増強したFc領域変異体を有する改変された抗体も記載されている(例えば、StavenhagenらのPCT公開WO 2004/063351、その開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)。
【０２１７】
当業界で公知のin vitroアッセイを用いて、本発明の組成物および方法において用いられる抗CD19抗体が、本明細書に記載のものなどのADCCを媒介することができるかどうかを決定することができる。
【０２１８】
16. 抗CD19抗体の製造／生産
一度、所望の抗CD19抗体を遺伝子操作したら、抗CD19抗体を、抗体の大規模製造のために当業界でよく知られている方法を用いて商業規模で生産することができる。例えば、これを、限定されるものではないが、以下に記載のものなどの組換え発現系を用いて達成することができる。
【０２１９】
17. 組換え発現系
抗体またはその変異体の組換え発現には、一般的には、該抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築が必要である。一度、抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、またはその一部をコードするポリヌクレオチドが得られたら、該抗体分子の生産のためのベクターを、当業界でよく知られる技術を用いる組換えDNA技術により作製することができる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする米国特許第6,331,415号を参照されたい。かくして、抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現させることによりタンパク質を調製する方法が、本明細書に記載される。当業者にはよく知られる方法を用いて、抗体コード配列ならびに好適な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、in vitro組換えDNA技術、合成技術、およびin vivo遺伝子組換えが挙げられる。かくして、本発明は、プロモーターに機能し得る形で連結された、抗体分子、抗体の重鎖もしくは軽鎖、抗体の重鎖もしくは軽鎖可変ドメインまたはその一部、または重鎖もしくは軽鎖CDRをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能ベクターを提供する。そのようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列(例えば、国際特許出願WO 86/05807およびWO 89/01036; ならびに米国特許第5,122,464号を参照)を含んでもよく、抗体の可変ドメインを、重鎖全体、軽鎖全体、または重鎖および軽鎖全体の発現のためにそのようなベクターにクローニングすることができる。
【０２２０】
別の実施形態においては、抗CD19抗体を標的化された相同組換えを用いて作製して、抗CD19抗体の全部または一部を製造することができる(米国特許第6,063,630号、第6,187,305号、および第6,692,737号を参照)。特定の実施形態においては、抗CD19抗体を無作為組換え技術を用いて作製して、抗CD19抗体の全部または一部を製造することができる(米国特許第6,361,972号、第6,524,818号、第6,541,221号、および第6,623,958号を参照)。また、抗CD19抗体を、Cre媒介性部位特異的相同組換えを用いて、改変された免疫グロブリン遺伝子座を含む細胞のゲノム配列に由来する抗体を発現する細胞中で産生させることもできる(米国特許第6,091,001号を参照)。宿主細胞系は、ヒトまたは限定されるものではないが、マウスおよびチャイニーズハムスターなどの非ヒト種に由来するものであってよい。ヒトまたはヒト化抗体生産が望ましい場合、宿主細胞系はヒト細胞系であるべきである。これらの方法を有利に用いて、抗体分子を永続的に発現する安定な細胞系を遺伝子操作することができる。
【０２２１】
一度、発現ベクターを従来の技術により宿主細胞に導入したら、トランスフェクトされた細胞を従来の技術により培養して、抗体を産生させる。かくして、本発明は、異種プロモーターに機能し得る形で連結された、本発明の抗体もしくはそのフラグメント、またはその重鎖もしくは軽鎖、またはその一部、または本発明の一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二本鎖抗体の発現のための特定の実施形態においては、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターを、以下に詳述するように、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞中で同時発現させることができる。
【０２２２】
様々な宿主発現ベクター系を用いて、抗CD19抗体または抗CD19抗体の遺伝子操作および作製において用いることができるその一部を発現させることができる(例えば、米国特許第5,807,715号を参照)。例えば、ヒトサイトメガロウイルスに由来する主要中間初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと組み合わせた、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)などの哺乳動物細胞が、抗体のための有効な発現系である(Foeckingら、Gene, 45:101 (1986); およびCockettら、Bio/Technology, 8:2 (1990))。さらに、挿入された抗体配列の発現を調節するか、または所望の特定の様式で抗体遺伝子産物を改変および加工する宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のそのような改変(例えば、糖鎖)および加工(例えば、切断)は、該タンパク質の機能にとって重要であるかもしれない。異なる宿主細胞は、翻訳後プロセッシングならびにタンパク質および遺伝子産物の改変のための特性および特定の機構を有する。好適な細胞系または宿主系を選択して、発現される抗体またはその一部の正確な改変およびプロセッシングを確保することができる。この目的のために、遺伝子産物の一次転写物の適切なプロセッシング、糖鎖付加、およびリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を用いることができる。そのような哺乳動物宿主細胞としては、限定されるものではないが、CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2OおよびT47D、NS0 (任意の機能的免疫グロブリン鎖を内因的に産生しないマウスミエローマ細胞系)、CRL7O3OおよびHsS78Bst細胞が挙げられる。
【０２２３】
一実施形態においては、ヒトリンパ球を不死化することにより開発されたヒト細胞系を用いて、モノクローナルヒト抗CD19抗体を組換え産生させることができる。一実施形態においては、ヒト細胞系PER.C6.(Crucell, Netherlands)を用いて、モノクローナルヒト抗CD19抗体を組換え産生させることができる。
【０２２４】
細菌系においては、いくつかの発現ベクターを、発現させる抗体分子のために意図された使用に応じて有利に選択することができる。例えば、大量のそのような抗体を製造しようとする場合、抗CD19抗体を含む医薬組成物の作製のためには、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指令するベクターが望ましい。そのようなベクターとしては、限定されるものではないが、抗体コード配列を、融合タンパク質が産生されるように、lac Zコード領域に、フレームを合わせてベクターに個別に連結することができる大腸菌発現ベクターpUR278(Rutherら、EMBO, 12:1791 (1983))；pINベクター(Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem., 24:5503-5509 (1989))などが挙げられる。pGEXベクターを用いて、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させることもできる。一般的には、そのような融合タンパク質は可溶性であり、吸着およびグルタチオン-アガロース親和性マトリックスへの結合、次いで、遊離グルタチオンの存在下での溶出により、溶解した細胞から容易に精製することができる。pGEXベクターを設計して、アトロンビンおよび第Xa因子プロテアーゼ切断部位を、クローニングされた標的遺伝子産物をGST部分から放出させることができるように、発現されたポリペプチドに導入する。
【０２２５】
昆虫系においては、オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス(AcNPV)を、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして用いる。このウイルスはスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞中で増殖する。抗体コード配列を、該ウイルスの非必須領域(例えば、ポリヘドリン遺伝子)に個々にクローニングし、AcNPVプロモーター(例えば、ポリヘドリンプロモーター)の制御下に置くことができる。
【０２２６】
哺乳動物宿主細胞においては、いくつかのウイルスに基づく発現系を用いることができる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、目的の抗体コード配列を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび3部分リーダー配列に連結することができる。次いで、このキメラ遺伝子を、in vitroまたはin vivo組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、領域E1またはE3)への挿入は、生きている組換えウイルスをもたらし、感染した宿主中で抗体分子を発現させることができる(例えば、Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:355-359 (1984)を参照)。また、特定の開始シグナルが、挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳にとって必要であり得る。これらのシグナルとしては、ATG開始コドンおよび隣接配列を含む。さらに、開始コドンは、一般的には、挿入物全体の翻訳を確保するための所望のコード配列の読み枠とフレームが合っているべきである。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、様々な起源のものであってよく、天然および合成のものであってもよい。発現の効率を、好適な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどの含有により増強することができる(例えば、Bittnerら、Methods in Enzymol., 153:51-544(1987)を参照)。
【０２２７】
安定な発現を、組換えタンパク質の長期間、高収率の産生のために用いることができる。例えば、前記抗体分子を安定に発現する細胞系を作製することができる。宿主細胞を、発現制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)および選択マーカー遺伝子を含む好適に遺伝子操作されたベクターを用いて形質転換することができる。外来DNAの導入後、細胞を富化培地中で1〜2日間増殖させた後、選択培地に切り替えることができる。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、その染色体中にプラスミドを安定に組込んだ細胞を増殖させ、次いで細胞系にクローニングし、その中で増殖させることができるフォーカスを形成させることができる。抗CD19抗体をコードするプラスミドを用いて、遺伝子／cDNAを、培養物中での産生にとって好適な任意の細胞系に導入することができる。
【０２２８】
限定されるものではないが、それぞれ、tk-、hgprt-またはaprT-細胞中で用いることができる、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wiglerら、Cell, 11:223 (1977))、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48:202 (1992))、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowyら、Cell, 22:8-17 (1980))遺伝子などのいくつかの選択系を用いることができる。また、代謝拮抗物質耐性を、以下の遺伝子：メトトレキサートに対する耐性を付与するdhfr(Wiglerら、Natl. Acad. Sci. USA, 77:357 (1980); O’Hareら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1527 (1981)); ミコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072 (1981)); アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与するneo (WuおよびWu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); ならびにMorganおよびAnderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); May, TIB TECH 11(5):l55-2 15 (1993)); ならびにヒグロマイシンに対する耐性を付与するhygro (Santerreら、Gene, 30:147 (1984))のための選択の基礎として用いることができる。組換えDNA技術の当業界で一般的に知られる方法を日常的に適用して、所望の組換えクローンを選択することができ、そのような方法は、例えば、Ausubelら(編)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); およびDracopoliら(編)、Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994)、第12および13章; Colberre-Garapinら、1981, J. Mol. Biol., 150:1(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に記載されている。
【０２２９】
抗体分子の発現レベルを、ベクター増幅により増加させることができる(概説については、BebbingtonおよびHentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3. Academic Press, New York (1987)を参照されたい)。抗体を発現するベクター系中のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルの増加が、数コピーのマーカー遺伝子を増加させるであろう。増幅された領域は抗体遺伝子と関連するため、抗体の産生も増加するであろう(Crouseら、Mol. Cell. Biol., 3:257 (1983))。抗体発現レベルを、周囲のクロマチンを再モデル化し、活性な人工転写ドメインの形態でトランスジーン発現を増強する技術などの、組換えタンパク質生産の当業者には公知の組換え方法および道具の使用を介して増幅することができる。
【０２３０】
宿主細胞を、重鎖由来ポリペプチドをコードする第1のベクターおよび軽鎖由来ポリペプチドをコードする第2のベクターの2つの発現系を用いて同時トランスフェクトすることができる。2つのベクターは、同一または異なる選択マーカーを含んでもよい。重鎖および軽鎖の両方をコードし、それを発現することができる単一のベクターを用いることもできる。そのような状況では、軽鎖を重鎖の5'側に置いて、過剰の毒性遊離重鎖を回避するべきである(Proudfoot, Nature 322:562-65 (1986); およびKohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:2197 (1980))。重鎖および軽鎖のコード配列は、cDNAまたはゲノムDNAを含んでもよい。
【０２３１】
一度、抗体分子が組換え発現により産生されたら、それを、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和性、特に、特異的抗原Aタンパク質もしくはGタンパク質に
関する親和性による、サイズカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、示差的可溶性、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術により、免疫グロブリン分子の精製のための当業界で公知の任意の方法により精製することができる。さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントを、本明細書に記載の、またはさもなければ当業界で公知の異種ポリペプチド配列に融合させて、精製を容易にすることができる。
【０２３２】
17.1. 抗体の精製および単離
組換え技術を用いる場合、抗体を、ペリプラズム空間中で、細胞内産生させるか、または培地中に直接分泌させることができる。抗体を細胞内産生させる場合、第1工程として、粒子状破片、宿主細胞または溶解した断片を、例えば、遠心分離または超遠心分離により除去する。Carterら、Bio/Technology, 10:163-167 (1992)は、大腸菌のペリプラズム空間中に分泌される抗体を単離するための手順を記載している。簡単に述べると、細胞ペーストを、約30分かけて、酢酸ナトリウム(pH 3.5)、EDTA、およびフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)の存在下で解凍する。細胞破片を遠心分離により除去することができる。抗体突然変異体を培地中に分泌させる場合、一般的には、そのような発現系からの上清を、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、AmiconまたはMillipore Pellicon超遠心ユニットを用いて最初に濃縮する。PMSFなどのプロテアーゼ阻害剤を、前記工程のいずれかに含有させて、タンパク質溶解を阻害し、抗生物質を含有させて、偶発的な夾雑物の増殖を防止することができる。
【０２３３】
細胞から調製された抗体組成物を、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、および／または親和性クロマトグラフィーを、単独で、または他の精製工程と組み合わせて用いて精製することができる。親和性リガンドとしてのAタンパク質の好適性は、抗体突然変異体中に存在する任意の免疫グロブリンFcドメインの種およびアイソタイプに依存する。Aタンパク質を用いて、ヒトγ1、γ2、またはγ4重鎖に基づく抗体を精製することができる(Lindmarkら、J. Immunol. Methods, 62:1-13 (1983))。全てのマウスアイソタイプおよびヒトγ3については、Gタンパク質が推奨される(Gussら、EMBO J., 5:15671575 (1986))。親和性リガンドが結合するマトリックスは最も頻繁にはアガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。制御された孔ガラスまたはポリ(スチレンジビニル)ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースを用いて達成することができるものよりも、速い流速および短いプロセッシング時間を可能にする。抗体がCH3ドメインを含む場合、Bakerbond ABX樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が、精製にとって有用である。イオン交換カラム上での分画、エタノール沈降、逆相HPLC、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリン上でのクロマトグラフィー、陰イオンもしくは陽イオン交換樹脂(ポリアスパラギン酸カラムなど)上でのSEPHAROSEクロマトグラフィー、クロマト分画、SDS-PAGE、および硫酸アンモニウム沈降などのタンパク質精製のための他の技術も、回収しようとする抗体に応じて利用可能である。
【０２３４】
任意の準備精製工程の後、目的の抗体および夾雑物を含む混合物を、約2.5-4.5のpHの溶出バッファーを用いる低pH疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけて、低い塩濃度(例えば、約0〜0.25 Mの塩)で実施することができる。
【０２３５】
18. 治療用抗CD19抗体
本発明の組成物および方法において用いられる抗CD19抗体は、B細胞系列のアポトーシスおよび／もしくはヒトADCCを媒介し得るヒト抗体もしくはヒト化抗体であってよく、またはB系列細胞のアポトーシスおよび／もしくはヒトADCCを媒介を媒介し得る公知の抗CD19抗体から選択することができる。特定の実施形態においては、抗CD19抗体はキメラ抗体であってよい。特定の実施形態においては、抗CD19抗体は、モノクローナルヒト、ヒト化、またはキメラ抗CD19抗体であってよい。本発明の組成物および方法において用いられる抗CD19抗体は、IgG1もしくはIgG3ヒトアイソタイプまたはヒト集団中に認められる任意のIgG1もしくはIgG3対立遺伝子のヒト抗体もしくはヒト化抗体であってよい。他の実施形態においては、本発明の組成物および方法において用いられる抗CD19抗体は、IgG2もしくはIgG4ヒトアイソタイプまたはヒト集団中に認められる任意のIgG2もしくはIgG4対立遺伝子のヒト抗体もしくはヒト化抗体であってよい。
【０２３６】
そのような抗体を上記の技術を用いて作製することができるが、本発明の他の実施形態においては、本明細書に記載のマウス抗体HB12AおよびHB12Bまたは他の市販の抗CD19抗体をキメラ化、ヒト化するか、またはヒト抗体中で作製することができる。
【０２３７】
例えば、用いることができる公知の抗CD19抗体としては、限定されるものではないが、HD37(IgG1、κ) (DAKO North America, Inc,, Carpinteria, CA)、BU12 (Callardら、J. Immunology, 148(10):2983-7 (1992) )、4G7 (IgG1) (Meekerら、Hybridoma, 3(4):305-20 (1984 Winter))、J4.119 (Beckman Coulter, Krefeld, Germany)、B43 (PharMingen, San Diego, CA)、SJ25C1 (BD PharMingen, San Diego, CA)、FMC63 (IgG2a) (Zolaら、Immunol.Cell.Biol. 69(PT6): 411-22 (1991); Nicholsonら、Mol. Immunol., 34:1157-1165 (1997); Pieterszら、Cancer Immunol. Immunotherapy, 41:53-60 (1995))、89B(B4) (IgG1) (Beckman Coulter, Miami, FL;  Nadlerら、J. Immunol., 131:244-250 (1983))、および／またはHD237 (IgG2b) (Fourth International Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens, Vienna, Austria, 1989; およびPezzuttoら、J. Immunol., 138(9):2793-2799 (1987))が挙げられる。
【０２３８】
特定の実施形態においては、前記抗体は、上記のものなどの公知の抗体のアイソタイプ切り替え変異体(例えば、IgG1またはIgG3ヒトアイソタイプ)である。
【０２３９】
本発明の組成物および方法において用いられる抗CD19抗体は、裸の抗体、イムノコンジュゲートまたは融合タンパク質であってもよい。本発明の組成物および方法における使用のための上記の抗CD19抗体は、それを用いて治療されたヒトにおけるB細胞および循環免疫グロブリンを減少させるか、または枯渇させることができる。B細胞の枯渇は、循環B細胞、または限定されるものではないが、骨髄、脾臓、腸管関連リンパ組織、および／またはリンパ節などの特定の組織中であってもよい。そのような枯渇を、抗体依存的細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)などの様々な機構を介して、および／またはその意図されるリガンドとのCD19相互作用の遮断、および／または補体依存的細胞傷害性(CDC)、B細胞増殖の阻害および／またはB細胞死の誘導(例えば、アポトーシスを介する)により達成することができる。B細胞の「枯渇」とは、循環B細胞および／または特定の組織中のB細胞の少なくとも約25％、40％、50％、65％、75％、80％、85％、90％、95％以上の減少を意味する。特定の実施形態においては、実質的に全ての検出可能なB細胞が、循環および／または特定の組織から枯渇する。循環免疫グロブリン(Ig)の「枯渇」とは、少なくとも約25％、40％、50％、65％、75％、80％、85％、90％、95％以上の減少を意味する。特定の実施形態においては、実質的に全ての検出可能なIgが循環中から枯渇する。
【０２４０】
18.1. ヒトCD19結合に関する抗体のスクリーニング
結合アッセイを用いて、ヒトCD19抗原に結合する抗体を同定することができる。結合アッセイを、直接結合アッセイとして、または競合結合アッセイとして実施することができる。標準的なELISAまたは標準的なフローサイトメトリーアッセイを用いて、結合を検出することができる。直接結合アッセイにおいては、候補抗体を、ヒトCD19抗原に対する結合について試験する。特定の実施形態においては、スクリーニングアッセイは、第2の工程において、ヒトCD19を発現するB細胞の細胞死またはアポトーシスを引き起こす能力を決定することを含む。他方、競合結合アッセイは、候補抗体が公知の抗CD19抗体またはヒトCD19に結合する他の化合物と競合する能力を評価する。
【０２４１】
直接結合アッセイにおいては、ヒトCD19抗原を、ヒトCD19抗原への候補抗体の結合を可能にする条件下で候補抗体と接触させる。結合を、溶液中で、または固相表面上で行ってもよい。候補抗体は、検出のために予め標識されたものであってよい。任意の検出可能な化合物を、限定されるものではないが、発光性、蛍光性、もしくは放射性アイソトープまたはそれを含む基、または酵素もしくは染料などの非アイソトープ標識などの標識のために用いることができる。結合が起こるのに十分なインキュベーションの期間後、過剰の、または非特異的に結合した抗体を除去する条件および操作に反応物を曝露する。典型的には、それは好適なバッファーを用いて洗浄することを含む。最後に、CD19-抗体複合体の存在を検出する。
【０２４２】
競合結合アッセイにおいては、候補抗体を、ヒトCD19抗原への公知の抗CD19抗体(または他の化合物)の結合を阻害するか、または置換するその能力について評価する。CD19の標識された公知の結合剤を、候補抗体と混合し、候補抗体の添加を用いて、および用いずに、それらの間の相互作用が正常に起こる条件下に置くことができる。ヒトCD19に結合するCD19の標識された公知の結合剤の量を、候補抗体の存在または非存在下で結合した量と比較することができる。
【０２４３】
一実施形態においては、結合アッセイを、固相表面上に固定された1種以上の成分を用いて実行して、抗体抗原複合体形成および検出を容易にする。様々な実施形態においては、固相支持体は、限定されるものではないが、フッ化ポリビニリデン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラス、ニトロセルロース、デキストラン、ナイロン、ポリアクリルアミドおよびアガロースであってよい。支持体配置としては、ビーズ、膜、微粒子、マイクロタイタープレート、試験管または他の反応容器などの反応容器の内部表面が挙げられる。ヒトCD19、または他の成分の固定を、共有または非共有結合を介して達成することができる。一実施形態においては、前記結合は、間接的なもの、すなわち、結合した抗体を介するものであってもよい。別の実施形態においては、ヒトCD19抗原および陰性対照をグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)などのエピトープを用いてタグ付けして、固相表面への結合を、抗GST(Santa Cruz Biotechnology)などの市販の抗体により媒介することができる。
【０２４４】
例えば、そのような親和性結合アッセイを、固相支持体に固定されたヒトCD19抗原を用いて実施することができる。典型的には、結合反応の非固定成分、この場合、候補抗CD19抗体を標識して、検出を可能にする。様々な標識方法が利用可能であり、発光性、発色性、蛍光性、もしくは放射性アイソトープまたはそれを含む基、および酵素もしくは染料などの非アイソトープ標識を用いることができる。一実施形態においては、候補抗CD19抗体を、フルオレセインイソチオシアネート(FITC、Sigma Chemicals, St. Louisから入手可能)などのフルオロフォアを用いて標識する。そのような親和性結合アッセイを、固相表面上に固定されたヒトCD19抗原を用いて実施することができる。次いで、抗CD19抗体を前記抗原と共にインキュベートし、抗体の特異的結合を、限定されるものではないが、BiaCore分析、ELISA、FMETおよびRIA法などの当業界で公知の方法により検出する。
【０２４５】
最後に、固相表面上に残存する標識を、当業界で公知の任意の検出方法により検出することができる。例えば、候補抗CD19抗体をフルオロフォアで標識する場合、蛍光光度計を用いて複合体を検出することができる。
【０２４６】
ヒトCD19抗原を、ヒトCD19抗原を発現する無傷の細胞、またはヒトCD19抗原を含む単離された膜の形態で結合アッセイに添加することができる。かくして、ヒトCD19抗原への直接結合を、候補抗CD19抗体の存在および非存在下で、培養物中の無傷の細胞または動物モデルにおいてアッセイすることができる。標識された候補抗CD19抗体を、ヒトCD19抗原を発現する細胞、またはそのような細胞から得られる粗抽出物と混合し、候補抗CD19抗体を添加することができる。単離された膜を用いて、ヒトCD19と相互作用する候補抗CD19抗体を同定することができる。例えば、単離された膜を用いる典型的な実験においては、細胞を遺伝子工学的に操作して、ヒトCD19抗原を発現させることができる。膜を標準的な技術により収穫し、in vitro結合アッセイにおいて用いることができる。標識された候補抗CD19抗体(例えば、蛍光標識された抗体)を膜に結合させ、特定の活性についてアッセイする；特異的結合を、過剰の未標識(冷)候補抗CD19抗体の存在下で実施された結合アッセイとの比較により決定する。また、可溶性ヒトCD19抗原を組換え発現させ、非細胞に基づくアッセイにおいて用いて、ヒトCD19抗原に結合する抗体を同定することもできる。組換え発現されたヒトCD19ポリペプチドを、非細胞に基づくスクリーニングアッセイにおいて用いることができる。ヒトCD19抗原の1個以上の結合部分に対応するペプチド、またはヒトCD19抗原の1個以上の結合部分を含む融合タンパク質を、非細胞の基づくアッセイ系において用いて、ヒトCD19抗原の一部に結合する抗体を同定することもできる。非細胞に基づくアッセイにおいては、組換え発現されたヒトCD19を、当業者にはよく知られる手段(Ausubelら、上掲を参照)により、試験管、マイクロタイターウェルまたはカラムなどの固相基質に結合させる。次いで、試験抗体を、ヒトCD19抗原に結合するその能力についてアッセイする。
【０２４７】
また、結合反応を溶液中で行うこともできる。このアッセイにおいては、標識された成分を、溶液中でその結合パートナーと相互作用させる。標識された成分とその結合パートナーとのサイズの差異により、そのような分離が可能になり、この分離を、孔が未結合の標識成分の通過は可能にするが、その結合パートナーまたはその結合パートナーに結合した標識成分の通過は可能にしない限外濾紙を通して結合反応の産物を通過させることにより達成することができる。また、結合パートナーに対する抗体などの、溶液から標識成分の結合パートナーを捕捉することができる任意の試薬を用いて、分離を達成することもできる。
【０２４８】
一実施形態においては、例えば、ファージライブラリーを、連続的ファージディスプレイライブラリーに由来するファージを、プラスチックビーズなどの固相に結合させた、精製されたヒトCD19抗原、またはその誘導体、類似体、フラグメント、もしくはドメインを含むカラムに通過させることによりスクリーニングすることができる。洗浄バッファーのストリンジェンシーを変化させることにより、ヒトCD19抗原に対する高い親和性を有するペプチドを発現するファージを富化することができる。カラムから単離されたファージをクローニングし、親和性を直接測定することができる。抗体およびそのアミノ酸配列がヒトCD19抗原に最も強い結合を付与することがわかれば、コンピューターモデルを用いて、CD19抗原と候補抗体との分子的接触を同定することができる。
【０２４９】
別の特定の実施形態においては、固相支持体は、マイクロタイターディッシュに結合したヒトCD19抗原を含む膜である。例えば、候補抗体は、マイクロタイターディッシュ中でのライブラリーメンバーの発現を可能にする条件下で培養されたライブラリー抗体を発現する細胞に結合することができる。ヒトCD19に結合するライブラリーメンバーを収穫する。そのような方法は、例えば、ParmleyおよびSmith, 1988, Gene, 73:305-318; Fowlkesら、1992, BioTechniques, 13:422-427; PCT公開WO94/18318；ならびに上記で引用された参考文献に一般的に記載されている。ヒトCD19抗原に結合するものとして同定される抗体は、任意の型または改変の上記抗体のものであってよい。
【０２５０】
18.2. ヒトADCCエフェクター機能に関する抗体のスクリーニング
血清中での長い半減期および種々のエフェクター機能を媒介する能力などの機能的特性を有するヒトIgGクラスの抗体を、本発明の特定の実施形態において用いる(Monoclonal Antibodies:  Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., Chapter 1 (1995))。ヒトIgGクラス抗体は、以下の4つのサブクラス：IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4にさらに分類される。今までのところ、数多くの研究がIgGクラスの抗体のエフェクター機能としてのADCCおよびCDCについて行われてきており、ヒトIgGクラスの抗体のうち、IgG1サブクラスがヒトにおいて最も高いADCC活性およびCDC活性を有することが報告されている(Chemical Immunology, 65, 88 (1997))。
【０２５１】
一般的には、ヒトIgG1サブクラスの抗体のADCC活性およびCDC活性の発現は、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞または活性化マクロファージなどのエフェクター細胞の表面上に存在する抗体の受容体(本明細書では、以後「FcγR」と呼ぶ)への抗体のFc領域の結合を含む。様々な補体成分を結合させることができる。結合に関しては、抗体のヒンジ領域およびC領域の第2のドメイン(本明細書では、以後「Cγ2ドメイン」と呼ぶ)中のいくつかのアミノ酸残基が重要であり(Eur. J. Immunol., 23, 1098 (1993), Immunology, 86, 319 (1995), Chemical Immunology, 65, 88 (1997))、Cγ2ドメイン中の糖鎖(Chemical Immunology, 65, 88 (1997))も重要であることが示唆されている。
【０２５２】
抗CD19抗体を、エフェクター機能に関して改変して、例えば、抗体のADCCおよび／または補体依存的細胞傷害性(CDC)を増強することができる。抗体のFc領域中に1個以上のアミノ酸置換を導入することにより、これを達成することができる。また、システイン残基をFc領域中に導入して、この領域中での鎖間ジスルフィド結合を形成させることができる。このように、改善された内在化能力ならびに／または増加した補体媒介性細胞殺傷およびADCCを有してもよいホモダイマー抗体を作製することができる(Caronら、J. Exp. Med., 176:1191-1195 (1992)およびShopes, J. Immunol., 148:2918-2922 (1992))。また、ヘテロ二官能化交叉リンカーを用いて、増強された抗腫瘍活性を有するホモダイマー抗体を作製することもできる(Wolffら、Cancer Research, 53:2560-2565 (1993))。増強された補体溶解およびADCC能力をもたらす2個以上のFc領域を有するように、抗体を遺伝子操作することもできる(Stevensonら、Anti-Cancer Drug Design, (3)219-230 (1989))。
【０２５３】
エフェクター機能を変化させるように抗体のFc領域を操作する他の方法は、当業界で公知である(例えば、FcγRIIAに対する結合親和性と比較して、FcγRIIBに対する結合親和性を増強するようにFc領域を変化させることを記載している、両方ともKoenigらの米国特許出願公開第20040185045号およびPCT公開WO 2004/016750；また、ArmourらのPCT公開WO 99/58572、IdusogieらのWO 99/51642、およびDeoらの米国特許第6,395,272号も参照；これらの開示はその全体が本明細書に組み入れられるものとする)。Fc領域を改変して、FcγRIIBに対する結合親和性を低下させる方法も、当業界で公知である(例えば、両方ともRavetchらの米国特許出願公開第20010036459号およびPCT公開WO 01/79299、これらの開示はその全体が本明細書に組み入れられるものとする)。野生型Fc領域と比較して、FcγRIIIAおよび／またはFcγRIIAに対する結合親和性が増強された変異体Fc領域を有する改変された抗体も記載されている(例えば、StavenhagenらのPCT公開WO 2004/063351；その開示はその全体が本明細書に組み入れられるものとする)。
【０２５４】
少なくとも4種の異なる型のFcRが見出されており、それぞれ、FcγRI (CD64)、FcγRII (CD32)、FcγRIII (CD16)、およびFcγRIVと呼ばれる。ヒトにおいては、FcγRIIおよびFcγRIIIは、それぞれFcγRIIaおよびFcγRIIb、ならびにFcγRIIIaおよびFcγRIIIbにさらに分類される。FcγRは、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する膜タンパク質であり、FcγRII、FcγRIII、およびFcγRIVは、2個の免疫グロブリン様ドメインを含む細胞外領域を有するα鎖を有し、FcγRIは構成成分として、3個の免疫グロブリン様ドメインを含む細胞外領域を有するα鎖を有し、ならびにα鎖はIgG結合活性に関与する。さらに、FcγRIおよびFcγRIIIは、α鎖と関連するシグナル伝達機能を有する構成成分として、γ鎖またはζ鎖を有する(Annu. Rev. Immunol., 18, 709 (2000), Annu. Rev. Immunol., 19, 275 (2001))。FcγRIVは、Bruhnsら、Clin. Invest. Med., (Canada) 27:3D (2004)により記載されている。
【０２５５】
目的の抗CD19抗体のADCC活性を評価するために、米国特許第5,500,362号または第5,821,337号に記載のものなどのin vitro ADCCアッセイを用いることができる。このアッセイを、市販のキット、例えば、CytoTox 96(登録商標)(Promega)を用いて実施することもできる。そのようなアッセイにとって有用なエフェクター細胞としては、限定されるものではないが、末梢血単核細胞(PBMC)、ナチュラルキラー(NK)細胞、およびNK細胞系が挙げられる。トランスジェニックFc受容体(例えば、CD16)および関連するシグナリングポリペプチド(例えば、FcεRI-γ)を発現するNK細胞系も、エフェクター細胞として役立ち得る(例えば、CampbellのWO 2006/023148 A2を参照)。例えば、補体活性化および／またはADCCによる標的細胞の溶解を媒介する任意の特定の抗体の能力をアッセイすることができる。目的の細胞をin vitroで増殖させ、標識する；抗体を、抗原抗体複合体により活性化することができる免疫細胞、すなわち、ADCC応答に関与するエフェクター細胞と共に、細胞培養物に添加する。抗体を、補体活性化について試験することもできる。いずれの場合も、標的細胞の細胞溶解を、溶解された細胞からの標識の放出により検出する。標的細胞溶解の程度を、上清中への細胞質タンパク質(例えば、LDH)の放出を検出することにより決定することもできる。実際、補体の起源としての患者自身の血清および／または免疫細胞を用いて、抗体をスクリーニングすることができる。次いで、in vitro試験においてヒトADCCを媒介することができる抗体を、in vivoで、例えば、Clynesら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656 (1998)に開示されたものなどの動物モデルにおいて評価することもできる。さらに、抗体のADCC、および必要に応じてCDC活性のレベルを調節する(すなわち、増加させるか、または減少させる)ための技術は、当業界でよく知られている。例えば、米国特許第6,194,551号を参照されたい。本発明の抗体は、ADCCおよび／またはCDCを誘導することができるか、または誘導する能力を有するように改変されたものであってよい。ADCC機能を決定するためのアッセイを、ヒトエフェクター細胞を用いて実行して、ヒトADCC機能を評価することができる。そのようなアッセイとしては、壊死機構および／またはアポトーシス機構による細胞死を誘導、媒介、増強、遮断する抗体をスクリーニングするように意図されたものも挙げられる。生染料を用いるアッセイなどのそのような方法、キャスパーゼを検出および分析する方法、ならびにDNA破壊を測定するアッセイを用いて、目的の抗CD19抗体を用いて、in vitroで培養された細胞のアポトーシス活性を評価することができる。
【０２５６】
例えば、Annexin VまたはTdT媒介性dUTPニック末端標識(TUNEL)アッセイを、Deckerら、Blood (USA) 103:2718-2725 (2004)に記載のように実行して、アポトーシス活性を検出することができる。TUNELアッセイは、DNA鎖破壊への取込みのためにフルオレセイン標識されたdUTPと共に目的の細胞を培養することを含む。次いで、細胞をフローサイトメトリーによる分析のために処理する。Annexin Vアッセイは、露出されたPS分子を特異的に認識するフルオレセイン結合Annexin Vを用いて、アポトーシス細胞の細胞膜の外側上でのホスファチジルセリン(PS)の出現を検出する。同時に、ヨウ化プロピジウムなどの生染料を用いて、後期アポトーシス細胞を排除することができる。細胞を、標識されたAnnexin Vで染色し、フローサイトメトリーにより分析する。
【０２５７】
18.3. イムノコンジュゲートおよび融合タンパク質
本発明の特定の態様に従って、治療剤または毒素を、本発明の組成物および方法における使用のために、キメラ化、ヒト、またはヒト化抗CD19抗体にコンジュゲートさせることができる。特定の実施形態においては、これらのコンジュゲートを、融合タンパク質として作製することができる。治療剤および毒素の例としては、限定されるものではないが、カリケアマイシンおよびエスペラマイシンなどの、エネジインファミリーの分子のメンバーが挙げられる。化学的毒素を、ダウカルマイシン(例えば、米国特許第5,703,080号および第4,923,990号を参照)、メトトレキサート、ドキソルビシン、メルファラン、クロラムブシル、ARA-C、ビンデシン、マイトマイシンC、シスプラチン、エトポシド、ブレオマイシンおよび5-フルオロウラシルからなる群より取得することもできる。化学療法剤の例としては、アドリアマイシン、ドキソルビシン、5-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド(Ara-C)、シクロホスファミド、チオテパ、タキソテール(ドセタキセル)、ブスルファン、サイトキシン、タキソール、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンC、ミトキサントロン、ビンクレイスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラミシン(米国特許第4,675,187号を参照)、メルファラン、および他の関連する窒素マスタードも挙げられる。
【０２５８】
特定の実施形態においては、抗CD19抗体を、細胞増殖抑制剤、エネジイン、レキシトロプシン、デュオカルマイシン、タキサン、ピューロマイシン、ドラスタチン、マイタンシノイド、およびビンカアルカロイドからなる群より選択される細胞傷害剤または免疫抑制剤にコンジュゲートさせる。特定のより具体的な実施形態においては、細胞傷害剤は、パクリタキセル、ドセタキセル、CC-1065、SN-38、トポテカン、モルホリノ-ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、ドラスタチン-10、エキノマイシン、コンブレタスタチン、カリケアマイシン、マイタンシン、DM-1、オーリスタチンE、AEB、AEVB、AEFP、MMAE(米国特許出願公開第10/983,340号を参照)、またはネトロプシンである。
【０２５９】
特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体-細胞傷害剤コンジュゲートの細胞傷害剤は、抗チューブリン剤である。特定の実施形態においては、細胞傷害剤を、ビンカアルカロイド、ポドフィロトキシン、タキサン、バッカチン誘導体、クリプトフィシン、マイタンシノイド、コンブレタスタチン、およびドラスタチンからなる群より選択する。他の実施形態においては、細胞傷害剤を、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、VP-16、カンプトテシン、パクリタキセル、ドセタキセル、エピチロンA、エピチロンB、ノコダゾール、コイキシン、コルシミド、エストラムスチン、セマドチン、ジスコデルモリド、マイタンシン、DM-1、AEFP、オーリスチンE、AEB、AEVB、AEFP、MMAEまたはエレウテロビンからなる群より選択する。
【０２６０】
特定の実施形態においては、抗CD19抗体を、ペプチドリンカーであるリンカーを介して細胞傷害剤にコンジュゲートさせる。他の実施形態においては、抗CD19抗体を、val-citリンカー、phe-lysリンカー、ヒドラゾンリンカー、またはジスルフィドリンカーであるリンカーを介して細胞傷害剤にコンジュゲートさせる。
【０２６１】
特定の実施形態においては、抗CD19抗体-細胞傷害剤コンジュゲートの抗CD19抗体を、5.5未満のpHで加水分解可能であるリンカーを介して細胞傷害剤にコンジュゲートさせる。特定の実施形態においては、リンカーは5.0未満のpHで加水分解可能である。
【０２６２】
特定の実施形態においては、抗CD19抗体-細胞傷害剤の抗CD19抗体を、プロテアーゼにより切断可能であるリンカーを介して細胞傷害剤にコンジュゲートさせる。特定の実施形態においては、プロテアーゼはリソソームプロテアーゼである。他の実施形態においては、プロテアーゼは、特に、膜結合プロテアーゼ、細胞内プロテアーゼ、またはエンドソームプロテアーゼである。
【０２６３】
本発明のイムノコンジュゲートにおいて用いることができる他の毒素としては、毒性レクチン、植物毒素、例えば、リシン、アブリン、モデシン、ボツリナ、およびジフテリア毒素が挙げられる。勿論、様々な毒素の組合せを1個の抗体分子に結合させることにより、可変性の細胞毒性を適応させることもできる。本発明の治療と組み合わせて好適に用いられる例示的な毒素は、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、DNase I、スタフィロコッカスエンテロトキシンA、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリン毒素、シュードモナスエキソトキシン、およびシュードモナスエンドトキシンである。例えば、Pastanら、Cell, 47:641 (1986)、およびGoldenbergら、Cancer Journal for Clinicians, 44:43 (1994)を参照されたい。用いることができる酵素的に活性な毒素およびその断片としては、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンA鎖(シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)由来)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α-サルシン、アレウリテス・フォルジ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、およびPAP-S)、モモルディカ・チャランティア(Momordica charantia)阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィシナリス(Sapaonaria officinalis)阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが挙げられる。例えば、1993年10月29日に公開されたWO 93/21232を参照されたい。
【０２６４】
好適な毒素および化学療法剤は、RemingtonのPharmaceutical Sciences、第19版(Mack Publishing Co. 1995)、ならびにGoodmanおよびGilmanのThe Pharmacological Basis of Therapeutics、第7版(MacMillan Publishing Co. 1985)に記載されている。他の好適な毒素および／または化学療法剤は、当業者には公知である。
【０２６５】
本発明はさらに、診断目的にとって好適な放射性薬剤を含むか、またはそれにコンジュゲートされた抗体(抗体フラグメントまたはその変異体を含む)を包含する。好適な放射性材料の例としては、限定されるものではないが、ヨウ素(121I、123I、125I、131I)、炭素 (14C)、硫黄 (35S)、トリチウム (3H)、インジウム (111In、112In、113mIn、115mIn)、テクネチウム (99Tc、99mTc)、タリウム(201Ti)、ガリウム (68Ga、67Ga)、パラジウム(103Pd)、モリブデン(99Mo)、キセノン (135Xe)、フッ素 (18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、および97Ruが挙げられる。
【０２６６】
さらに、本発明の抗CD19抗体(scFvまたは抗体フラグメントもしくはその変異体を含むか、またはあるいはそれからなる他の分子)を、治療目的のために用いられる放射性金属イオンに結合またはコンジュゲートさせることができる。好適な放射性イオンの例としては、限定されるものではないが、213Biなどのα放射体、または103Pd、135Xe、131I、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、35S、90Y、153Sm、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn、90Y、117Tin、186Re、188Re、および166Hoなどの他の放射性同位体が挙げられる。特定の実施形態においては、抗体またはそのフラグメントを、限定されるものではないが、177Lu、90Y、166Ho、および153Smなどの放射性金属イオンをポリペプチドにキレートさせるマクロ環キレート化剤に結合させる。特定の実施形態においては、マクロ環キレート化剤は、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N',N'',N'''-四酢酸 (DOTA)である。他の特定の実施形態においては、DOTAを、リンカー分子を介して本発明の抗体またはそのフラグメントに結合させる。DOTAをポリペプチドにコンジュゲートさせるのに有用なリンカー分子の例は、当業界で一般的に公知であり、例えば、DeNardoら、Clin Cancer Res 4(10):2483-90, 1998; Petersonら、Bioconjug Chem 10(4):553-7, 1999; およびZimmermanら、Nucl Med Biol 26(8):943-50, 1999(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。
【０２６７】
本発明の抗CD19抗体を、プロドラッグ(例えば、ペプチジル化学療法剤、WO 81/01145を参照)を活性な抗癌剤に変換するプロドラッグ活性化酵素に該抗体をコンジュゲートさせることにより、ADEPTにおいて用いることもできる。例えば、WO 88/07378および米国特許第4,975,278号を参照されたい。ADEPTにとって有用なイムノコンジュゲートの酵素成分は、それをそのより活性な細胞傷害形態に変換するような方法で、プロドラッグに作用することができる任意の酵素を含む。
【０２６８】
本発明の方法において有用である酵素としては、限定されるものではないが、リン酸を含有するプロドラッグを遊離薬剤に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ；硫酸を含有するプロドラッグを遊離薬剤に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性5-フルオロシトシンを抗癌剤5-フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチドを含有するプロドラッグを遊離薬剤に変換するのに有用である、セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、スブチリシンなどのプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼならびにカテプシン(カテプシンBおよびLなど)；それぞれ、D-アミノ酸置換を含むプロドラッグを遊離薬剤に変換するのに有用なD-アラニルカルボキシペプチダーゼ；糖鎖付加されたプロドラッグを遊離薬剤に変換するのに有用なβ-ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼなどの炭水化物切断酵素；α-ラクタムを用いて誘導体化された薬剤を遊離薬剤に変換するのに有用なβ-ラクタマーゼ；ならびに、それぞれ、フェノキシアセチル基もしくはフェニルアセチル基を有するそのアミン窒素で誘導体化された薬剤を遊離薬剤に変換するのに有用な、ペニシリンVアミダーゼもしくはペニシリンGアミダーゼなどのペニシリンアミダーゼが挙げられる。「アブザイム」としても当業界で知られる、酵素活性を有する抗体を用いて、プロドラッグを遊離活性薬剤に変換することができる(例えば、Massey, Nature 328:457-458 (1987)を参照)。抗体-アブザイムコンジュゲートを、B細胞悪性腫瘍に罹患したヒトの一部への望ましいものとしてのアブザイムの送達のために、本明細書に記載のように調製することができる。
【０２６９】
本発明の抗体を、上記で考察されたヘテロ二官能性交叉連結試薬の使用などの当業界でよく知られる技術により、前記酵素に共有結合させることができる。酵素の少なくとも機能的に活性な部分に連結された抗CD19抗体の少なくとも抗原結合領域を含む融合タンパク質を、当業界でよく知られる組換えDNA技術を用いて構築することもできる(例えば、Neubergerら、Nature, 312:604-608 (1984)を参照)。
【０２７０】
抗CD19抗体の共有改変も本発明の範囲内に含まれる。それらを、適用可能な場合、化学的合成または抗体の酵素的もしくは化学的切断により作製することができる。他の型の抗CD19抗体の共有改変を、該抗体の標的化されたアミノ酸残基を、選択された側鎖またはN-もしくはC-末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応することにより、該分子中に導入する。
【０２７１】
最も一般的には、システイニル残基を、クロロ酢酸またはクロロアセトアミドなどのα-ハロ酢酸(および対応するアミン)と反応させて、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。同様に、ヨード試薬を用いることもできる。また、システイニル残基を、ブロモトリフルオロアセトン、α-ブロモ-β-(5-イミドゾイル)プロピオン酸、クロロアセチルリン酸、N-アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジスルフィド、メチル2-ピリジルジスルフィド、p-クロロメルクリ安息香酸、2-クロロメルクリ-4-ニトロフェノール、またはクロロ-7-ニトロベンゾ-2-オキサ-1,3-ジアゾールとの反応により誘導体化する。
【０２７２】
ジエチルピロカルボナートは、ヒスチジル側鎖にとって比較的特異的であるため、ヒスチジル残基を、pH 5.5-7.0でのこの薬剤との反応により誘導体化する。パラ-ブロモフェナシルブロミドも有用である；この反応を、pH 6.0で0.1 Mカコジル酸ナトリウム中で実施することができる。
【０２７３】
リジル残基およびアミノ末端残基を、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの薬剤を用いる誘導体化は、リジン残基の電荷を逆転させる効果を有する。α-アミノ含有残基および／またはε-アミノ含有残基を誘導体化するための他の好適な試薬としては、メチルピコリニミダートなどのイミドエステル、ピリドキサルリン酸、ピリドキサル、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、O-メチルリソウレア、2,4-ペンタンジオン、およびグリオキシレートとのトランスアミナーゼに触媒される反応が挙げられる。
【０２７４】
アルギニル残基を、フェニルグリオキサル、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンなどの1種または数種の従来の試薬との反応により改変する。一般的には、アルギニル残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いpKaのため、反応をアルカリ条件で実施する必要がある。さらに、これらの試薬は、リジンのε-アミノ基ならびにアルギニンε-アミノ基と反応し得る。
【０２７５】
チロシル残基の特異的改変を、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応により、スペクトル標識をチロシル残基に導入する際に特定の目的で作製することができる。最も一般的には、N-アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンを用いて、それぞれ、O-アセチルチロシル種および3-ニトロ誘導体を形成させることができる。チロシル残基を、125Iまたは131Iを用いてヨード化して、ラジオイムノアッセイにおける使用のための標識されたタンパク質を調製する。
【０２７６】
カルボキシル側鎖残基(アスパルチルもしくはグルタミル)を、カルボジイミド(R--N=C=N--R') (式中、RおよびR'は、1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリニル--4-エチル)カルボジイミドまたは1-エチル-3-(4-アゾニア-4,4-ジメチルペンチル)カルボジイミドなどの異なるアルキル基である)との反応により選択的に改変する。さらに、アスパルチル残基およびグルタミル残基を、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニル残基およびグルタミニル残基に変換する。
【０２７７】
頻繁には、グルタミニル残基およびアスパラギニル残基を、それぞれ、対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基に脱アミド化する。これらの残基を、中性または塩基性条件下で脱アミド化する。これらの残基の脱アミド化形態も本発明の範囲内にある。
【０２７８】
他の改変としては、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルもしくはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化(T.E. Creighton, Proteins:  Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983))、N-末端アミンのアセチル化、ならびに任意のC末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０２７９】
別の型の共有改変は、抗体に対する化学的または酵素的結合グリコシドを含む。これらの手順は、それらがN-またはO-結合糖鎖のための糖鎖付加能力を有する宿主細胞中での抗体の産生を必要としない点で有利である。用いる結合様式に応じて、糖を(a)アルギニンおよびヒスチジン、(b)遊離カルボキシル基、(c)システインのものなどの遊離スルフヒドリル基、(d)セリン、トレオニン、もしくはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基、(e)フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンのものなどの芳香族残基、または(f)グルタミンのアミド基に結合することができる。これらの方法は、1987年9月11日に公開されたWO 87/05330、ならびにAplinおよびWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
【０２８０】
19. 化学療法剤の組合せ
他の実施形態においては、抗CD19 mAbを、1種以上のさらなる化学療法剤と共に投与することができる。例えば、「CVB」(1.5 g/m2シクロホスファミド、200-400 mg/m2エトポシド、および150-200 mg/m2カルムスチン)を、本発明の組合せ治療剤において用いることができる。CVBは、非ホジキンリンパ腫(Pattiら、Eur. J. Haematol., 51:18 (1993))を治療するのに用いられる計画である。他の好適な組合せ化学療法計画は、当業者にはよく知られている。例えば、Freedmanら、「非ホジキンリンパ腫(Non-Hodgkin’s Lymphomas)」、Cancer Medicine, Volume 2、第3版、Hollandら(編)、pp. 2028-2068 (Lea & Febiger 1993)を参照されたい。例示として、中悪性度非ホジキンリンパ腫の治療のための第1世代の化学療法計画としては、C-MOPP(シクロホスファミド、ビンクリスチン、プロカルバジンおよびプレドニゾン)およびCHOP(シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン)が挙げられる。有用な第2世代の化学療法計画は、m-BACOD(メトトレキサート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、デキサメタゾン、およびロイコボリン)であるが、好適な第3世代の計画はMACOP-B(メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン、ブレオマイシン、およびロイコボリン)である。さらに有用な薬剤としては、酪酸フェニルおよびブロスタチン-1が挙げられる。
【０２８１】
本発明に従えば、癌またはその1種以上の症候を、限定されるものではないが、化学療法剤、放射線療法剤、ホルモン療法剤、および／または生物療法剤／免疫療法剤などの1種以上の治療剤の投与と組み合わせた抗CD19 mAbの投与により、予防、治療、管理または改善することができる。
【０２８２】
特定の実施形態においては、本発明の方法は、限定されるものではないが、アンギオスタチン(プラスミノーゲン断片)；抗血管新生アンチトロンビンIII；アンギオザイム；ABT-627；Bay 12-9566；ベネフィン；ベバシズマブ；BMS-275291；軟骨由来阻害剤(CDI)；CAI；CD59補体断片；CEP-7055；Col 3；コンブレタスタチンA-4；エンドスタチン(コラーゲンXVIII断片)；フィブロネクチン断片；Gro-β；ハロフギノン；ヘパリナーゼ；ヘパリンヘキササッカリド断片；HMV833；ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)；IM-862；インターフェロンα／β／γ；インターフェロン誘導性(IP-10)；インターロイキン-12；Kringle 5(プラスミノーゲン断片)；マリマスタット；メタロプロテイナーゼ阻害剤(TIMP)；2-メトキシエストラジオール；MMI 270(CGS 27023A)；MoAb IMC-1C11；ネオバスタット；NM-3；パンゼム；PI-88；胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤；プラスミノーゲン活性化因子；血小板因子-4(PF4)；プリノマスタット；プロラクチン16kD断片；プロリフェリン関連タンパク質(PRP)；PTK 787/ZK 222594；レチノイド；ソリマスタット；スクアラミン；SS 3304；SU 5416；SU 6668；SU 11248；テトラヒドロコルチゾール-S；テトラチオモリブデート；サリドマイド；トロンボスポンジン-1(TSP-1)；TNP-470；トランスフォーミング増殖因子-β(TGF-b)；バスクロスタチン；バソスタチン(カルレチクリン断片)；ZD 6126；ZD 6474；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤(FTI)；ならびにビスホスホナート(限定されるものではないが、アレドロナート、クロドロナート、エチドロナート、イバンドロナート、パミドロナート、リセドロナート、チルドロナート、およびゾレドロナート)などの1種以上の血管新生アンタゴニストの投与を包含する。
【０２８３】
特定の実施形態においては、本発明の方法は、限定されるものではないが、化学療法剤および非化学療法免疫調節剤などの1種以上の免疫調節剤の投与を包含する。化学療法剤の非限定例としては、メトトレキサート、シクロスポリンA、レフルノミド、シスプラチン、イフォスファミド、タキソールおよびパクリタキセルなどのタキサン、トポイソメラーゼI阻害剤(例えば、CPT-11、トポテカン、9-AC、およびGG-211)、ゲムシタビン、ビノレルビン、オキサリプラチン、5-フルオロウラシル(5-FU)、ロイコボリン、ビノレルビン、テモダール、シトカラシンB、グラミシジンD、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン相同体、ならびにサイトキサンが挙げられる。非化学療法免疫治療剤の例としては、限定されるものではないが、抗T細胞受容体抗体(例えば、抗CD4抗体(例えば、cM-T412(Boeringer)、IDEC-CE9.1(登録商標)(IDECおよびSKB)、mAb 4162W94、トルトクロンおよびOKTcdr4a(Janssen-Cilag))、抗CD3抗体(例えば、Nuvion (Product Design Labs)、OKT3 (Johnson & Johnson)、もしくはリツキサン (IDEC))、抗-CD5抗体 (例えば、抗-CD5リシン結合イムノコンジュゲート)、抗-CD7抗体(例えば、CHH-380 (Novartis))、抗-CD8抗体、抗-CD40リガンドモノクローナル抗体(例えば、IDEC-131 (IDEC))、抗-CD52抗体(例えば、CAMPATH 1H (Ilex))、抗-CD2抗体(例えば、MEDI-507 (MedImmune, Inc., 国際特許出願公開WO 02/098370およびWO 02/069904)、抗-CD11a抗体(例えば、Xanelim (Genentech))、および抗-B7抗体(例えば、IDEC-114) (IDEC)); 抗サイトカイン受容体抗体(例えば、抗-IFN受容体抗体、抗-IL-2受容体抗体(例えば、Zenapax (Protein Design Labs))、抗-IL-4受容体抗体、抗-IL-6受容体抗体、抗IL-10受容体抗体、および抗IL-12受容体抗体)、抗サイトカイン抗体(例えば、抗IFN抗体、抗-TNF-α抗体、抗IL-1β抗体、抗IL-6抗体、抗IL-8抗体(例えば、ABX-IL-8 (Abgenix))、抗IL-12抗体および抗IL-23抗体)); CTLA4-免疫グロブリン; LFA-3TIP (Biogen、国際特許出願公開WO 93/08656および米国特許第6,162,432号); 可溶性サイトカイン受容体(例えば、TNF-α受容体の細胞外ドメインもしくはその断片、IL-1β受容体の細胞外ドメインもしくはその断片、およびIL-6受容体の細胞外ドメインもしくはその断片); サイトカインもしくはその断片(例えば、インターロイキン(IL)-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-23、TNF-α、TNF-β、インターフェロン(IFN)-α、IFN-β、IFN-γ、およびGM-CSF); ならびに抗サイトカイン抗体(例えば、抗IL-2抗体、抗IL-4抗体、抗IL-6抗体、抗IL-10抗体、抗IL-12抗体、抗IL-15抗体、抗TNF-α抗体、および抗IFN-γ抗体)、ならびに腫瘍関連抗原に免疫特異的に結合する抗体(例えば、Herceptin(登録商標))が挙げられる。特定の実施形態においては、免疫調節剤は、化学療法剤以外の免疫調節剤である。他の実施形態においては、免疫調節剤は、IL-1、IL-2、IL-4、IL-12、IL-15、TNF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、M-CSF、G-CSF、IL-3またはエリスロポエチンなどのサイトカインまたは造血因子以外の免疫調節剤である。さらに他の実施形態においては、免疫調節剤は、化学���法剤およびサイトカインまたは造血因子以外の薬剤である。
【０２８４】
特定の実施形態においては、本発明の方法は、限定されるものではないが、非ステロイド性抗炎症剤(NSAID)、ステロイド性抗炎症剤、β-アゴニスト、抗コリン剤、およびメチルキサンチンなどの1種以上の抗炎症剤の投与を包含する。NSAIDの例としては、限定されるものではないが、アスピリン、イブプロフェン、セレコキシブ (CELEBREX(商標))、ジクロフェナク(VOLTAREN(商標))、エトドラク(LODINE(商標))、フェノプロフェン(NALFON(商標))、インドメタシン(INDOCIN(商標))、ケトララック (TORADOL(商標))、オキサプロジン、(DAYPRO(商標))、ナブメントン(RELAFEN(商標))、スリンダック (CLINORIL(商標))、トルメンチン (TOLECTIN(商標))、ロフェコキシブ (VIOXX(商標))、ナプロキセン(ALEVE(商標)、NAPROSYN(商標))、ケトプロフェン(ACTRON(商標))およびナブメトン (RELAFEN(商標))が挙げられる。そのようなNSAIDは、シクロオキシゲナーゼ酵素(例えば、COX-1および／またはCOX-2)を阻害することにより機能する。ステロイド性抗炎症剤としては、限定されるものではないが、グルココルチコイド、デキサメタゾン(DECADRON(商標))、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン(DELTASONE(商標))、プレドニゾロン、トリアムシノロン、アズルフィジン、ならびにプロスタグランジン、トロンボキサン、およびロイコトリエンなどのエイコサノイドが挙げられる。
【０２８５】
別の特定の実施形態においては、本発明の方法は、1種以上の抗ウイルス剤(例えば、アマンタジン、リバビリン、リマンタジン、アシクロビル、ファムシクロビル、フォスカルネット、ガンシクロビル、トリフルリジン、ビダラビン、ジダノシン、スタブジン、ザルシタビン、ジドブジン、インターフェロン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(正式には、アクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン(AMC))、制吐剤(例えば、アルプラゾラム、デキサメタゾン、ドンペリドン、ドロナビノール、ドロペリドール、グラニセトロン、ハロペリドール、ハロペリドール、イオラゼパム、メチルプレドニゾロン、メトクロプラミド、ナビロン、オンダンセトロン、プロクロルペラジン)、抗真菌剤(例えば、アンホテリシン、クロトリマゾール、エコナゾール、フルコナゾール、フルシトシン、グリセオフルビン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾールおよびナイスタチン)、抗寄生虫剤(例えば、デヒドロエメチン、フロ酸ジロキサニド、エメチン、メフロキン、メラルソプロール、メトロニダゾール、ニフルチモックス、パロモマイシン、ペンタビジン、ペンタミジンイセチオネート、プリマキン、キナクリン、キニジン)またはその組合せの投与を包含する。
【０２８６】
医薬組成物および投与剤形およびキットなどの本発明の様々な実施形態において用いることができる抗癌剤の特定の例としては、限定されるものではないが、アシビシン；アクラルビシン；塩酸アコダゾール；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；酢酸アメタントロン；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；塩酸ビサントレン；ジメシル酸ビスナフィド；ビゼレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナールナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチメル；カルボプラチン；カルムスチン；塩酸カルビシン；カルゼレシン；セデフィンゴール；クロラムブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；メシル酸クリスナトール；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；塩酸ダウノルビシン；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；メシル酸デザグアニン；ジアジクオン；ドセタキセル；ドキソルビシン；塩酸ドキソルビシン；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン；エダトレキサート；塩酸エフロルニチン；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロマート；エピプロピジン；塩酸エピルビシン；エルブロゾール；塩酸エソルビシン；エストラムスチン；エストラムスチンリン酸ナトリウム；ファザラビン；フェンレチニド；フロキスリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルオロシタビン；フォスキドン；フォストリエシンナトリウム；ゲンシタビン；塩酸ゲンシタビン；ヒドロキシウレア；塩酸イダルビシン；イフォスファミド；イルモフォシン；インターロイキンII(組換えインターロイキンII、もしくはrIL2など)、インターフェロンα-2a；インターフェロンα-2b；インターフェロンα-n1；インターフェロンα-n3；インターフェロンβ-Ia；インターフェロンγ-Ib；イプロプラチン；塩酸イリノテカン；酢酸ランレオチド；レトロゾール；酢酸ロイプロリド；塩酸リアロゾール；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；塩酸ロソキサントロン；マソプロコール；マイタンシン；塩酸メクロレタミン；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトギリン；ミトマルシン；ミトマイシン；ミトスペル；ミトタン；塩酸ミトキサントロン；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；硫酸ペプロマイシン；ペルフォスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；塩酸ピロキサントロン；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィメルナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；塩酸プロカルバジン；ピューロマイシン；塩酸ピューロマイシン；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；塩酸サフィンゴール；セ��スチン；シムトラゼン；スパルフォサートナトリウム；スパルソマイシン；塩酸スピロゲルマニウム；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル；タリソマイシン；テコガランナトリウム；テガフル；塩酸テロキサントロン；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；クエン酸トレミフェン；酢酸トレストロン；リン酸トリシリビン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；塩酸ツブロゾール；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン；硫酸ビングリシナート；硫酸ビンロイロシン；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンロシジン；硫酸ビンゾリジン；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；塩酸ゾルビシンが挙げられる。他の抗癌剤としては、限定されるものではないが、20-エピ-1,25-ジヒドロキシビタミンD3；5-エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アルデスロイキン；ALL-TKアンタゴニスト；アルトレタミン；アンバムスチン；アミドックス；アミフォスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラホリド；血管新生阻害剤；アンタゴニストD；アンタゴニストG；抗背側化形態形成タンパク質-1；抗アンドロゲン、前立腺癌；抗エストロゲン；抗新生物剤；アンチセンスオリゴヌクレオチド；グリシン酸アフィジコリン；アポトーシス遺伝子モジュレーター；アポトーシス調節因子；アプリン酸；アラ-CDP-DL-PTBA；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン1；アキシナスタチン2；アキシナスタチン3；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンIII誘導体；バラノール；バチマスタット；BCR/ABLアンタゴニスト；ベンゾクロリン；ベンゾイルスタウロスポリン；βラクタム誘導体；β-アレチン；βクラマイシンB；ベツリン酸；bFGF阻害剤；ビカルタミド；ビサントレン；ビサジリジニルスペルミン；ビスナフィド；ビストラテンA；ビゼレシン；ブレフラート；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルフォキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンC；カンプトテシン誘導体；カナリポックスIL-2；カペシタビン；カルボキサミド-アミノ-トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；CaRest M3；CARN 700；軟骨由来阻害因子；カルゼレシン；カゼインキナーゼ阻害剤(ICOS)；カスタノスペルミン；セクロピンB；セトロレリックス；クロリン；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；シス-ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェン類似体；コナゲニン；クラムベシジン816；クリスナトール；クリプトフィシン8；クリプトフィシンA誘導体；クラシンA；シクロペントラキノン；シクロプラタム；シペマイシン；シタラビンオクフォスフェート；細胞溶解因子；サイトスタチン；ダクリキシマブ；デシタビン；デヒドロジデムニンB；デスロレリン；デキサメタゾン；デキシフォスファミド；デキスラゾキサン；デキスベラパミル；ジアジ���オン；ジデムニンB；ジドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ-5-アザシチジン；ジヒドロタキソール,9-；ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンSA；エブセレン；エコムスチン；エデルフォシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフル；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチン類似体；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；エタニダゾール；リン酸エトポシド；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン；フルダラビン；塩酸フルオロダウノルニシン；フォルフェニメックス；フォルメスタン；フォストリエシン；フォテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；硝酸ガリウム；ガロシタビン；ガニレリックス；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲンシタビン；グルタチオン阻害剤；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ハイペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモフォシン；イロマスタット；イミダゾアクリドン；イミキモッド；免疫刺激ペプチド；インスリン様増殖因子-1受容体阻害剤；インターフェロンアゴニスト；インターフェロン；インターロイキン；イオベングアン；ヨードドキソルビシン；イポメアノール,4-；イロプラクト；イルソグラジン；イソベンガゾール；イソホモハリコンドリンB；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリドF；ラメラリン-Nトリアセテート；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；硫酸レンチナン；レプトルスタチン；レトロゾール；白血病阻害因子；白血球αインターフェロン；ロイプロリド+エストロゲン+プロゲステロン；ロイプロレリン；レバミゾール；リアロゾール；線状ポリアミン類似体；脂溶性ジサッカリドペプチド；脂溶性白金化合物；リソクリナミド7；ロバプラチン；ロンブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；HMG-CoAリダクターゼ阻害剤(限定されるものではないが、ロバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、スタチン、シンバスタチン、およびアトルバスタチン)；ロキソリビン；ルルトテカン；ルテリウムテキサフィリン；リソフィリン；溶解性ペプチド；マイタンシン；マンノスタチンA；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリライシン阻害剤；マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤；メノガリル；メルバロン；メテレリン；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；MIF阻害剤；ミフェプリストン；ミルテフォシン；ミリモスチム；不一致二本鎖RNA；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシン類似体；ミトナフィド；マイトトキシン線維芽細胞増殖因子-サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；モノクローナル抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン；モノホスホリルリピドA+ミオバクテリウム細胞壁sk；モピダモール；多剤耐性遺伝子阻害剤；多発性腫瘍抑制因子1に基づく療法；マスタード抗癌剤；マイカペロキシドB；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン；N-アセチルジナリン；N-置換ベンズア��ド；ナファレリン；ナグレスチップ；ナロキソン+ペンタゾシン；ナパビン；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン；ネリドロン酸；中性エンドペプチダーゼ；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素モジュレーター；窒素酸化物酸化防止剤；ニトルリン；O6-ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン；経口サイトカイン誘導因子；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン；オキサウノマイシン；パクリタキセル；パクリタキセル類似体；パクリタキセル誘導体；パラウラミン；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ペガスパルガーゼ；ペルデシン；ペントサンポリサルフェートナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール；ペルフルブロン；ペルフォスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；フェニル酢酸；ホスファターゼ阻害剤；ペシバニル；塩酸ピロカルピン；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチンA；プラセチンB；プラスミノーゲン活性化因子阻害剤；白金複合体；白金化合物；白金-トリアミン複合体；ポルフィメルナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピルビスアクリドン；プロスタグランジンJ2；プロテアソーム阻害剤；Aタンパク質に基づく免疫調節剤；タンパク質キナーゼC阻害剤；タンパク質キナーゼC阻害剤、微細藻類；タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート；rafアンタゴニスト；ラルチトレキセド；ラモセトロン；rasファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤；ras阻害剤；ras-GAP阻害剤；デメチル化レテリプチン；レニウムRe 186エチドロナート；リゾキシン；リボザイム；RIIレチナミド；ログレチミド；ロヒツキン；ロムルチド；ロキニメックス；ルビギノンB1；ルボキシル；サフィンゴール；サイントピン；SarCNU；サルコフィトールA；サルグラモスチム；Sdi 1模倣物質；セムスチン；セネセンス由来阻害剤1；センスオリゴヌクレオチド；
シグナル伝達阻害剤；シグナル伝達モジュレーター；一本鎖抗原結合タンパク質；シゾフィラン；ソブゾキサン；ナトリウムボロカプテート；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール；ソマトメジン結合タンパク質；ソネルミン；スパルフォシン酸；スピカマイシンD；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンギスタチン1；スクアラミン；幹細胞阻害剤；幹細胞分裂阻害剤；スチピアミド；ストロメリシン阻害剤；スルフィノシン；過活動血管作動性腸管ペプチドアンタゴニスト；スラジスタ；スラミン；スワインソニン；合成グリコサミノグリカン；タリムスチン；タモキシフェンメチオジド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフル；テルラピリウム；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン；タリブラスチン；チオコラリン；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣物質；チマルファシン；サイモポエチン受容体アゴニスト；サイモトリナン；甲状腺刺激ホルモン；チンエチルエチオプルプリン；チラパザミン；チタノセン二塩化物；トプセンチン；トレミフェン；分化全能性幹細胞因子；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼ阻害剤；チルホスチン；UBC阻害剤；ウベニメックス；尿生殖洞由来増殖阻害因子；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；バプレオチド；バリオリンB；ベクター系、赤血球遺伝子治療；ベラレゾール；ベラミン；ベルジン；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン；ビタキシン(登録商標)；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；およびジノスタチンスチマラメルが挙げられる。さらなる抗癌剤は、5-フルオロウラシルおよびロイコボリンである。これらの2種の薬剤は、サリドマイドおよびトポイソメラーゼ阻害剤を用いる方法において用いる場合、有用であり得る。特定の実施形態においては、抗癌剤は化学療法剤ではない。
【０２８７】
より具体的な実施形態においては、本発明はまた、上記の乳癌、卵巣癌、メラノーマ、前立腺癌、結腸癌および肺癌の治療のための、限定されるものではないが、表1に開示されたものなどの抗癌剤などの1種以上の療法の投与と組み合わせた、抗CD19 mAbの投与を含む。組合せ療法において用いる場合、表2に列挙される投与の用量および／または頻度を減少させてもよい。
【表２】
0005401314.tif 000006
0005401314.tif 000007
0005401314.tif 000008
【０２８８】
本発明はまた、癌細胞を破壊するためのx線、γ線および他の起源の放射線の使用を含む放射線療法と組み合わせた抗CD19 mAbの投与を包含する。特定の実施形態においては、放射線治療を、放射線が遠方の起源から検出される、外部ビーム放射線または遠隔療法として投与する。他の実施形態においては、放射線治療を、放射性起源が癌細胞または腫瘍塊に近い身体の内側に置かれる、内部療法または近接照射療法として投与する。
【０２８９】
癌療法およびその用量、投与経路ならびに推奨される使用は当業界で公知であり、Physician's Desk Reference(第56版、2002)などの文献に記載されている。
【０２９０】
20. 医薬組成物
本発明はまた、CD19抗原に結合し、ヒトADCCを媒介することができる治療用抗体を用いる、限定されるものではないが、B細胞悪性腫瘍などの、ヒト被験者におけるB細胞疾患および障害の治療のための免疫療法組成物および方法、ヒト移植レシピエントにおけるGVHD、移植片拒絶、および移植後リンパ球増殖性障害、ならびにヒト被験者における自己免疫疾患および障害の治療のための免疫療法組成物および方法に関する。
【０２９１】
本発明は、IgG1またはIgG3ヒトアイソタイプのヒト、ヒト化、またはキメラ抗CD19抗体を含む医薬組成物に関する。本発明はまた、ヒトADCCを媒介し得るIgG2またはIgG4ヒトアイソタイプのヒトまたはヒト化抗CD19抗体を含む医薬組成物に関する。特定の実施形態においては、本発明はまた、当業界で公知の手段により製造することができるモノクローナルヒト、ヒト化、またはキメラ化抗CD19抗体を含む医薬組成物に関する。
【０２９２】
限定されるものではないが、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、B細胞慢性リンパ球性白血病(CLL)、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、プロリンパ球性白血病、有毛細胞白血病、一般的な急性リンパ球性白血病およびいくつかのNull急性リンパ芽球性白血病などの、B細胞およびその前駆体から誘導されるB細胞悪性腫瘍を有すると診断されたヒト被験者を治療するための治療製剤および計画が記載される。
【０２９３】
他の特定の実施形態においては、抗CD19抗体は、ADCC、補体依存的細胞性細胞傷害性、またはアポトーシスを媒介し得る。本発明の組成物および方法はまた、他のB細胞指向性免疫療法よりも幅広いB細胞集団を標的化する利点を有する。例えば、本発明の抗CD19抗体は、骨髄細胞、循環B細胞、および成熟抗体分泌B細胞を標的化するのに有効であり得る。従って、本発明の方法および組成物は、循環B細胞ならびに循環免疫グロブリンを減少または枯渇させるのに有効であり得る。
【０２９４】
従って、一態様においては、本発明は、あまり標的化されない治療剤および計画よりも少ない、および／またはあまり重篤でない合併症と関連する、GVHD、移植片拒絶、および移植後リンパ球増殖性障害の治療および予防のための組成物および方法を提供する。一実施形態においては、本発明の組成物および方法を、本発明の方法および組成物の非存在下で可能であるよりも低用量の伝統的治療剤と共に用いる。別の実施形態においては、本発明の組成物および方法は、放射線療法、高用量化学療法、または脾臓摘出術などのより重篤な形態の療法の必要性を取り除く。
【０２９５】
特定の実施形態においては、抗CD19抗体および組成物を、単独で、またはGVHDおよび移植片拒絶の治療もしくは予防のための他の治療剤もしくは計画と組み合わせて、移植前または移植後の移植レシピエント患者に投与することができる。例えば、抗CD19抗体および組成物を用いて、同種異系移植片の移植前または移植後に移植レシピエントから同種抗体を枯渇させることができる。抗CD19抗体および組成物を用いて、移植前に、またはドナー中で、またはGVHDおよび移植片拒絶に対する予防として、ex vivoで移植片から抗体産生細胞を枯渇させることもできる。
【０２９６】
21. 医薬製剤、投与および用量
本発明の医薬製剤は、活性成分として、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗CD19抗体を含む。前記製剤は、ヒト患者への投与にとって好適な単位の重量または容量で所望の応答をもたらすのに有効な量の裸の抗体、イムノコンジュゲート、または融合タンパク質を含み、好ましくは滅菌されている。この応答を、例えば、限定されるものではないが、循環B細胞の枯渇、組織B細胞の枯渇、B細胞悪性腫瘍の回帰、または疾患徴候の減少などの抗CD19抗体組成物の生理学的効果を決定することにより測定することができる。他のアッセイは当業者には公知であり、前記応答のレベルを測定するのに用いることができる。
【０２９７】
21.1. 医薬製剤
抗CD19抗体組成物を、製薬上許容し得る担体と共に製剤化することができる。用語「製薬上許容し得る」とは、活性成分の生物活性の有効性を妨害しない1種以上の非毒性材料を意味する。そのような調製物は、日常的には、塩、緩衝剤、保存剤、適合性担体、および必要に応じて、他の治療剤を含んでもよい。そのような製薬上許容し得る調製物はまた、日常的には、ヒトへの投与にとって好適である、適合性固体もしくは液体充填剤、希釈剤またはカプセル化物質を含んでもよい。薬剤中で用いる場合、塩は製薬上許容し得るものであるべきであるが、製薬上許容できない塩を都合良く用いて、その製薬上許容し得る塩を調製することができるが、これらは本発明の範囲から除外されるものではない。そのような薬理学上および製薬上許容し得る塩としては、限定されるものではないが、以下の酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ホウ酸、蟻酸、マロン酸、コハク酸などから調製されたものが挙げられる。また、製薬上許容し得る塩を、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩、例えば、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩として調製することができる。用語「担体」は、天然もしくは合成の有機もしくは無機成分を指し、活性成分を混合して、適用を容易にする。医薬組成物の成分を、所望の医薬効力を実質的に損なう相互作用が存在しない様式で、本発明の抗体と、および互いに同時混合することもできる。
【０２９８】
本発明の特定の態様に従って、抗CD19抗体組成物を、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態で、望ましい程度の純度を有する抗体またはイムノコンジュゲートと、任意的な生理学上許容し得る担体、賦形剤または安定化剤(Remington’s Pharmaceutical Sciences、第16版、Osol, A.(編)(1999))とを混合することにより、保存のために調製することができる。許容し得る担体、賦形剤、または安定化剤は、用いる用量および濃度で、レシピエントに対して非毒性的であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンなどの酸化防止剤；保存剤(オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム；塩化ベンズエトニウム；フェノール；ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；3-ペンタノール；およびm-クレゾール)；低分子量(約10残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、および他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、もしくはデキストリン；EDTAなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対応イオン；金属錯体(例えば、Zn-タンパク質複合体)；ならびに／またはTWEEN、PLURONICS(商標)もしくはポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０２９９】
抗CD19抗体組成物はまた、必要に応じて、塩化ベンズアルコニウム；クロロブタノール；パラベンおよびチメロサールなどの好適な保存剤を含んでもよい。
【０３００】
抗CD19抗体組成物を、単位投与形態で都合良く提供し、製薬業界でよく知られる方法のいずれかにより調製することができる。全ての方法は、活性薬剤を、1種以上の補助成分を構成する担体と結合させる工程を含む。一般的には、抗CD19抗体組成物を、活性化合物を、液体担体、微細に分割された固体担体、またはその両方と均一かつ密接に結合させた後、必要に応じて、生成物を形状化することにより調製する。
【０３０１】
非経口投与にとって好適な組成物は、好ましくは、レシピエントの血液と等張性である、抗CD19抗体の滅菌水性または非水性調製物を都合良く含む。この調製物を、好適な分散剤もしくは湿潤剤および懸濁剤を用いて、公知の方法に従って製剤化することができる。また、滅菌注入可能調製物は、例えば、1,3-ブタンジオール中の溶液としての、非毒性的な非経口的に許容し得る希釈剤または溶媒中の滅菌注入可能な溶液または懸濁液であってよい。用いることができる許容し得るビヒクルおよび溶媒は、水、リンゲル液、および等張性塩化ナトリウム溶液である。さらに、滅菌固定油を、溶媒または懸濁培地として都合良く用いる。この目的のために、合成モノ-またはジ-グリセリドなどの任意のブランドの固定油を用いることができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸を、注入可能調製物中で用いることができる。経口、皮下、静脈内、筋肉内投与などにとって好適な担体製剤を、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PAに見出すことができる。特定の実施形態においては、様々な投与経路にとって好適な担体製剤は、RITUXAN(商標)について記載されたものと同じであるか、または類似するものであってよい。参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとするPhysicians’ Desk Reference (Medical Economics Company, Inc., Montvale, NJ, 2005), pp. 958-960および1354-1357を参照されたい。本発明の特定の実施形態においては、抗CD19抗体組成物を、組成物のpHを約6.5に調整する、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム二水和物、ポリソルベート80、および滅菌水を用いて、静脈内投与のために製剤化する。当業者であれば、静脈内注入が、迅速に分布する抗体中での循環の完全性に起因して、有用な様式の投与を提供することを知っているであろう。しかしながら、静脈内投与は、血管の内皮細胞および内皮細胞下マトリックスを含む血管障壁による制限にかけられる。さらに、血管障壁は、固形腫瘍による治療用抗体の取込みに関するより注目すべき問題である。リンパ腫は、有効な抗体送達に寄与する、比較的高い血液流速を有する。皮下もしくは筋肉内注入、またはリンパ管のカテーテル法によるなどのリンパ内投与経路も、B細胞リンパ腫を治療する有用な手段を提供する。特定の実施形態においては、本発明の組成物および方法の抗CD19抗体を、皮下的に自己投与する。そのような実施形態においては、前記組成物を凍結乾燥薬剤として、または約50 mg/mLの液体バッファー(例えば、PBSおよび／もしくはクエン酸)中で製剤化する。
【０３０２】
本明細書に記載の製剤はまた、治療する特定の兆候にとって必要な2種以上の活性化合物、好ましくは、互いに有害に作用しない相補的活性を有するものを含んでもよい。例えば、免疫抑制剤をさらに提供するのが望ましい。そのような分子は、好適には意図される目的にとって有効である量と共に存在する。
【０３０３】
前記活性成分を、例えば、液滴形成技術により、または界面重合、例えば、コロイド薬剤送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)もしくはマクロエマルジョン中の、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン-マイクロカプセルおよびポリ-(メチルメタクリル酸)マイクロカプセルにより調製されたマイクロカプセル中に捕捉することもできる。そのような技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences、第16版、Osol, A.(編)(1980)に開示されている。
【０３０４】
in vivoでの投与に用いられる製剤は、典型的には滅菌されている。これは、滅菌濾過膜を通す濾過により容易に達成される。
【０３０５】
持続放出調製物を調製することができる。持続放出調製物の好適な例としては、マトリックスが、造形品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態にある、抗CD19抗体を含む固形疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられる。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリル酸)、もしくはポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号)、L-グルタミン酸とγ-エチル-L-グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商標)(乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドから構成される注入可能なミクロスフェア)などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、およびポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン-酢酸ビニルおよび乳酸-グリコール酸などのポリマーは100日間に渡る分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルは、より短い時間、タンパク質を放出する。カプセル化抗体が長時間、体内に残留する場合、それらは、37℃の湿度への曝露の結果として変性または凝集し、生物活性の喪失および免疫原性の変化の可能性をもたらし得る。合理的戦術を、関与する機構に応じて、安定化のために考案することができる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換を介する分子内S-S結合形成であると発見される場合、スルフヒドリル残基を改変し、酸性溶液から凍結乾燥し、湿度含量を制御し、好適な添加物を使用し、および特定のポリマーマトリックス組成物を開発することにより、安定化を達成することができる。特定の実施形態においては、本発明の組成物中で用いられる製薬上許容し得る担体は、ヒトADCCまたはCDCに影響しない。
【０３０６】
本明細書に開示される抗CD19抗体組成物を、イムノリポソームとして製剤化することもできる。「リポソーム」は、ヒトへの薬剤(本明細書に開示される抗CD19抗体など)の送達にとって有用である様々な型の脂質、リン脂質および／または界面活性剤から構成される小さいベシクルである。リポソームの成分は、一般的には、生体膜の脂質配置と同様、二層形式で配置される。本発明の抗体を含むリポソームを、Epsteinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwangら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); ならびに米国特許第4,485,045号および第4,544,545号に記載のものなどの当業界で公知の方法により調製する。増強された循環時間を有するリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。特に有用なリポソームを、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびPEG誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(PEG-PE)を含む脂質組成物を用いて逆相蒸発法により作製することができる。リポソームを、規定の孔径のフィルターを通して押出し、所望の直径を有するリポソームを得る。本発明の抗体を、ジスルフィド交換反応を介して、Martinら、J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982)に記載のリポソームにコンジュゲートすることができる。また、治療剤をリポソーム内に含有させることもできる。Gabizonら、J. National Cancer Inst., (19)1484 (1989)を参照されたい。
【０３０７】
いくつかの医薬製剤としては、限定されるものではないが、以下のものが挙げられる。
【０３０８】
(a)100 mg(10 mL)もしくは500 mg(50 mL)の1回使用バイアル中、10 mg/mlの濃度で供給された、抗CD19抗体の静脈内(i.v.)投与のための滅菌された、保存剤を含まない液体濃縮物。この生成物を、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム二水和物、ポリソルベートおよび注入用滅菌水を用いてi.v.投与のために製剤化することができる。例えば、前記生成物を、9.0 mg/mLの塩化ナトリウム、7.35 mg/mLのクエン酸ナトリウム二水和物、0.7 mg/mLのポリソルベート80、および注入用滅菌水中で製剤化することができる。pHを6.5に調整する。
【０３０９】
(b)皮下(s.c.)注入のための1回使用ガラスバイアル中の滅菌凍結乾燥粉末。この生成物を、スクロース、L-ヒスチジンヒドロクロリド一水和物、L-ヒスチジンおよびポリソルベート20と共に製剤化することができる。例えば、それぞれの1回使用バイアルは、150 mgの抗CD19抗体、123.2 mgのスクロース、6.8 mgのL-ヒスチジンヒドロクロリド一水和物、4.3 mgのL-ヒスチジン、および3 mgのポリソルベート20を含んでもよい。1.3 mlの注入用滅菌水を用いる1回使用バイアルの再構成は、1.25 mlあたり125 mgの抗体(100 mg/ml)を送達する約1.5 mlの溶液をもたらす。
【０３１０】
(c)静脈内(i.v.)投与のための滅菌された、保存剤を含まない凍結乾燥粉末。この生成物を、α-トレハロース二水和物、L-ヒスチジンHCl、ヒスチジンおよびポリソルベート20 USPと共に製剤化することができる。例えば、それぞれのバイアルは、440 mgの抗CD19抗体、400 mgのα,α-トレハロース二水和物、9.9 mgのL-ヒスチジンHCl、6.4 mgのL-ヒスチジン、および1.8 mgのポリソルベート20, USPを含んでもよい。保存剤として1.1％のベンジルアルコールを含む、20 mlの注入用静菌水(BWFI)、USPを用いる再構成は、約6のpHの21 mg/ml抗体を含む複数回投与溶液をもたらす。
【０３１１】
(d)抗CD19抗体が、スクロース、ポリソルベート、一塩基リン酸ナトリウム一水和物、および二塩基リン酸ナトリウム二水和物と共に製剤化される静脈内注入のための滅菌凍結乾燥粉末。例えば、それぞれの1回使用バイアルは、100 mgの抗体、500 mgのスクロース、0.5 mgのポリソルベート80、2.2 mgの一塩基リン酸ナトリウム一水和物、および6.1 mgの二塩基リン酸ナトリウム二水和物を含んでもよい。保存剤は存在しない。10 mlの注入用滅菌水、USPを用いる再構成の後、得られるpHは約7.2である。
【０３１２】
(e)1回使用の1 mlの予め充填されたシリンジ中に供給された、皮下投与のための滅菌された、保存剤を含まない溶液。この生成物を、塩化ナトリウム、一塩基リン酸ナトリウム二水和物、二塩基リン酸ナトリウム二水和物、クエン酸ナトリウム、クエン酸一水和物、マンニトール、ポリソルベート80および注入用水、USPと共に製剤化することができる。水酸化ナトリウムを添加して、pHを約5.2に調整することができる。
【０３１３】
例えば、それぞれのシリンジを製剤化して、0.8 ml(40 mg)の薬剤生成物を送達することができる。それぞれの0.8 mlは、40 mgの抗CD19抗体、4.93 mgの塩化ナトリウム、0.69 mgの一塩基リン酸ナトリウム二水和物、1.22 mgの二塩基リン酸ナトリウム二水和物、0.24 mgのクエン酸ナトリウム、1.04 mgのクエン酸一水和物、9.6 mgのマンニトール、0.8 mgのポリソルベート80および注入用水、USPを含む。
【０３１４】
(f)注入用滅菌水(SWFI)、USPを用いて再構成され、皮下(s.c.)注射液として投与される1回使用バイアル中に含有される滅菌された、保存剤を含まない凍結乾燥粉末。この生成物を、スクロース、塩酸ヒスチジン一水和物、L-ヒスチジン、およびポリソルベートと共に製剤化することができる。例えば、75 mgのバイアルは、129.6 mgもしくは112.5 mgの抗CD19抗体、93.1 mgのスクロース、1.8 mgの塩酸L-ヒスチジン一水和物、1.2 mgのL-ヒスチジン、および0.3 mgのポリソルベート20を含み、0.9 mlのSWFI、USPを用いる再構成の後、0.6 ml中に75 mgの抗体を送達するように設計する。150 mgのバイアルは、202.5 mgもしくは175 mgの抗CD19抗体、145.5 mgのスクロース、2.8 mgの塩酸L-ヒスチジン一水和物、1.8 mgのL-ヒスチジン、および0.5 mgのポリソルベート20を含んでもよく、1.4 mlのSWFI, USPを用いる再構成の後、1.2 ml中に150 mgの抗体を送達するように設計する。
【０３１５】
(g)注入用滅菌水を用いる再構成のための滅菌凍結乾燥生成物。この生成物を、マンニトール、ヒスチジンおよびグリシンを用いる筋肉内(IM)注入のための1回使用バイアルとして製剤化することができる。例えば、それぞれの1回使用バイアルは、100 mgの抗CD19抗体、67.5 mgのマンニトール、8.7 mgのヒスチジンおよび0.3 mgのグリシンを含んでもよく、1.0 mlの注入用滅菌水を用いて再構成した場合、1.0 ml中に100 mgの抗体を送達するように設計する。別の例として、それぞれの1回使用バイアルは50 mgの抗CD19抗体、40.5 mgのマンニトール、5.2 mgのヒスチジンおよび0.2 mgのグリシンを含んでもよく、0.6 mlの注入用滅菌水を用いて再構成された場合、50 mgの抗体を送達するように設計する。
【０３１６】
(h)100 mg/mlの濃度で供給される、筋肉内(IM)注入のための滅菌された、保存剤を含まない溶液。この生成物を、ヒスチジン、グリシン、および注入用滅菌水と共に1回使用バイアル中で製剤化することができる。例えば、それぞれの1回使用バイアルは、1 ml中に100 mgの抗体を送達するように設計された1.2 mlの容量中の100 mgの抗体、4.7 mgのヒスチジン、および0.1 mgのグリシンと共に製剤化することができる。別の例として、それぞれの1回使用バイアルを、0.5 ml中に50 mgの抗体を送達するように設計された0.7 mlまたは0.5 mlの容量中の50 mgの抗体、2.7 mgのヒスチジンおよび0.08 mgのグリシンと共に製剤化することができる。
【０３１７】
特定の実施形態においては、本発明の医薬組成物は、4℃で安定である。特定の実施形態においては、本発明の医薬組成物は、室温で安定である。
【０３１８】
21.2. 抗体半減期
特定の実施形態においては、本発明の組成物および方法の抗CD19抗体の半減期は、少なくとも約4〜7日である。特定の実施形態においては、本発明の組成物および方法の抗CD19抗体の平均半減期は、少なくとも約2〜5日、3〜6日、4〜7日、5〜8日、6〜9日、7〜10日、8〜11日、8〜12日、9〜13日、10〜14日、11〜15日、12〜16日、13〜17日、14〜18日、15〜19日、または16〜20日である。他の実施形態においては、本発明の組成物および方法の抗CD19抗体の平均半減期は、少なくとも約17〜21日、18〜22日、19〜23日、20〜24日、21〜25日、22〜26日、23〜27日、24〜28日、25〜29日、または26〜30日である。さらなる実施形態においては、本発明の組成物および方法の抗CD19抗体の半減期は、最大で約50日であってよい。特定の実施形態においては、本発明の組成物および方法の抗体の半減期を、当業界で公知の方法により延長することができる。次いで、そのような延長は、抗体組成物の投与の量および／または頻度を減少させることができる。改善されたin vivoでの半減期を有する抗体およびそれを調製する方法は、米国特許第6,277,375号；ならびに国際特許出願公開WO 98/23289およびWO 97/3461に開示されている。
【０３１９】
in vivoでの抗CD19抗体の血清循環を、高分子量ポリエチレングリコール(PEG)などの不活性ポリマー分子を、抗体のNもしくはC末端へのPEGの部位特異的結合またはリジル残基上に存在するε-アミノ基を介する多官能性リンカーを含むか、または含まない抗体に結合させることにより延長することもできる。生物活性の最小の喪失をもたらす線状または分枝状ポリマー誘導体化を用いることができる。結合の程度を、SDS-PAGEおよび質量分析により密接にモニターして、抗体へのPEG分子の適切な結合を確保することができる。未反応のPEGを、サイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーにより抗体-PEGコンジュゲートから分離することができる。PEG-誘導体化抗体を、当業者には公知の方法を用いて、例えば、本明細書に記載の免疫アッセイにより、結合活性ならびにin vivoでの効力について試験することができる。
【０３２０】
さらに、本発明の組成物および方法の抗体をアルブミンに結合させて、in vivoでより安定であるか、in vivoでより長い半減期を有する抗体を作製することができる。その技術は当業界でよく知られており、例えば、国際特許出願公開WO 93/15199、WO 93/15200、およびWO 01/77137; ならびに欧州特許第413,622号(全て参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。
【０３２１】
21.3. 投与および用量
ヒト患者への本発明の組成物の投与は、限定されるものではないが、静脈内、皮内、経皮、皮下、筋肉内、吸入(例えば、エアロゾルを介する)、頬(例えば、舌下)、局所(すなわち、皮膚および粘膜表面の両方、例えば、気道表面)、鞘内、関節内、胸膜内、大脳内、動脈内、腹腔内、経口、リンパ管内、鼻内、直腸もしくは膣投与、局所カテーテルを介するかん流、または直接的病変内注入などの任意の経路によるものであってよい。一実施形態においては、本発明の組成物を、規定の期間(例えば、0.5〜2時間)に渡って与えられる静注または静脈内輸液により投与する。本発明の組成物を、蠕動手段により、またはデポーの形態で送達することができるが、任意の所与の事例における最も好適な経路は、当業界でよく知られるように、被験体の種、年齢、性別および全体的な症状、治療する症状の性質および重篤度ならびに／または投与する特定の組成物(すなわち、用量、製剤)の性質などの因子に依存するであろう。特定の実施形態においては、投与経路は、週に1回または2回、一定時間に渡るボーラスまたは連続輸液を介する。他の特定の実施形態においては、投与経路は、必要に応じて、週に1回または2回の皮下注入による。一実施形態においては、本発明の組成物および／または方法を、外来患者ベースで投与する。
【０３２２】
特定の実施形態においては、抗CD19抗体を含む組成物の用量を、mg/kg患者体重の単位で測定する。他の実施形態においては、抗CD19抗体を含む組成物の用量を、mg/kg患者除脂肪体重(すなわち、体重-体脂肪含量)の単位で測定する。さらに他の実施形態においては、抗CD19抗体を含む組成物の用量を、mg/m2患者体表面積の単位で測定する。さらに他の実施形態においては、抗CD19抗体を含む組成物の用量を、患者に投与される用量あたりmgの単位で測定する。用量の任意の測定値を本発明の組成物および方法と共に用いて、用量単位を当業界で標準的な手段により変換することができる。
【０３２３】
当業者であれば、被験体の年齢、性別、種および症状(例えば、B細胞悪性腫瘍の段階)、細胞枯渇の望ましい程度、治療しようとする疾患ならびに／または用いる特定の抗体もしくは抗原結合フラグメントなどのいくつかの因子に基づいて選択し、当業者により決定することができることを理解できるであろう。例えば、本発明の組成物の有効量を、in vitro試験系に由来する用量応答曲線から、または動物モデル(例えば、コットンラットもしくはサル)から外挿することができる。抗体の効果の評価のためのモデルおよび方法は当業界で公知である(Wooldridgeら、Blood, 89(8): 2994-2998 (1997)、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)。特定の実施形態においては、特定のB細胞悪性腫瘍について、抗体療法のための当業界で標準的な治療計画を、本発明の組成物および方法と共に用いることができる。
【０３２４】
本発明の方法において用いることができる投与計画の例としては、限定されるものではないが、毎日、週に3回(断続的)、毎週、または14日毎が挙げられる。特定の実施形態においては、投与計画としては、限定されるものではないが、毎月投与または6〜8週間毎に投与が挙げられる。
【０３２５】
当業者であれば、用量は維持計画と比較して、一般的により高く、および／または初回治療については投与頻度もより多いことを理解できるであろう。
【０３２６】
本発明のいくつかの実施形態においては、抗CD19抗体は、B細胞に結合し、B細胞の効率的な(すなわち、低用量で)枯渇をもたらし得る(本明細書に記載のように)。患者のB細胞の表面上のヒトCD19の密度が高い場合、より高い程度の結合を達成することができる。特定の実施形態においては、抗体の用量(必要に応じて、医薬組成物の一部としての製薬上許容し得る担体中)は、少なくとも約0.0005、0.001、0.05、0.075、0.1、0.25、0.375、0.5、1、2.5、5、10、20、37.5、もしくは50 mg/m2であり、および／または約500、475、450、425、400、375、350、325、300、275、250、225、200、175、150、125、100、75、60、50、37.5、20、15、10、5、2.5、1、0.5、0.375、0.1、0.075もしくは0.01 mg/m2である。特定の実施形態においては、用量は、約0.0005〜約200 mg/m2、約0.001〜150 mg/m2、約0.075〜125 mg/m2、約0.375〜100 mg/m2、約2.5〜75 mg/m2、約10〜75 mg/m2、および約20〜50 mg/m2である。関連する実施形態においては、用いられる抗CD19抗体の用量は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5 mg/kg患者体重である。特定の実施形態においては、用いられる裸の抗CD19抗体の用量は、少なくとも約1〜10、5〜15、10〜20、または15〜25 mg/kg患者体重である。特定の実施形態においては、用いられる抗CD19抗体の用量は、少なくとも約1〜20、3〜15、または5〜10 mg/kg患者体重である。他の実施形態においては、用いられる抗CD19抗体の用量は、少なくとも約5、6、7、8、9、または10 mg/kg患者体重である。特定の実施形態においては、抗体(必要に応じて、医薬組成物の一部としての製薬上許容し得る担体中)の単回投与単位は、少なくとも約0.5、1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、または250μg/m2であってよい。他の実施形態においては、用量は単回投与単位あたり最大で1 gである。
【０３２７】
上記用量は全て例示的なものであり、本発明の組成物および方法と共に用いることができるが、抗CD19抗体を毒素または放射線療法剤と共に用いる場合、上記のより低い用量が好ましい。特定の実施形態においては、患者が低レベルのCD19抗体を有する場合、上記のより低い用量が好ましい。
【０３２８】
キメラ抗CD19抗体を用いる本発明の特定の実施形態においては、キメラ抗体の用量または量は、約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、または16 mg/kg患者体重より大きい。キメラ抗CD19抗体を用いる本発明の他の実施形態においては、キメラ抗体の用量または量は、約1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、または0.1 mg/kg患者体重未満である。
【０３２９】
本発明の方法のいくつかの実施形態においては、本発明の抗体および／または組成物を、約375 mg/m2未満の用量；約37.5 mg/m2未満の用量；約0.375 mg/m2未満の用量；および／または約0.075 mg/m2〜約125 mg/m2の用量で投与することができる。本発明の方法の特定の実施形態においては、投与計画は、反復間隔で投与される低用量を含む。例えば、一実施形態においては、本発明の組成物を、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175または200日毎の間隔で、約375 mg/m2未満の用量で投与することができる。
【０３３０】
特定の用量は、少なくとも約1、2、3、5、7、10、14、20、30、45、60、75、90、120、150または180日以上の期間、本発明の組成物および方法を用いて治療されたヒトにおいてB細胞枯渇をもたらすことができる。特定の実施形態においては、プレB細胞(表面免疫グロブリンを発現しない)が枯渇する。特定の実施形態においては、成熟B細胞(表面免疫グロブリンを発現する)が枯渇する。他の実施形態においては、全ての非悪性型のB細胞が枯渇を示すことができる。これらの型のB細胞のいずれかを用いて、B細胞枯渇を測定することができる。B細胞枯渇を、血清などの体液中、または骨髄などの組織中で測定することができる。本発明の方法の特定の実施形態においては、B細胞を、本発明の組成物および方法の使用前に治療される患者におけるB細胞レベルと比較して、少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、または100％枯渇させる。本発明の方法の他の実施形態においては、B細胞を、ヒトに関する典型的な標準的B細胞レベルと比較して、少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、または100％枯渇させる。関連する実施形態においては、ヒトに関する典型的な標準的B細胞レベルを、年齢、性別、体重、および他の因子に関して治療する患者と比較可能な患者を用いて決定する。
【０３３１】
本発明の特定の実施形態においては、抗体または抗体結合フラグメントの約125 mg/m2以下の用量が、少なくとも約7、14、21、30、45、60、90、120、150、または200日の期間に渡ってB細胞枯渇をもたらす。別の代表的な実施形態においては、約37.5 mg/m2以下の用量は、少なくとも約7、14、21、30、45、60、90、120、150、または200日の期間に渡って、B細胞を枯渇させる。さらに他の実施形態においては、約0.375 mg/m2以下の用量は、少なくとも約7、14、21、30、45または60日に渡って、B細胞の枯渇をもたらす。別の実施形態においては、約0.075 mg/m2以下の用量は、少なくとも約7、14、21、30、45、60、90、120、150、または200日の期間に渡って、B細胞の枯渇をもたらす。さらに他の実施形態においては、約0.01 mg/m2、0.005 mg/m2またはさらに0.001 mg/m2以下の用量は、少なくとも約3、5、7、10、14、21、30、45、60、90、120、150または200日に渡ってB細胞の枯渇をもたらす。これらの実施形態に従って、用量を任意の好適な経路により投与することができるが、必要に応じて、皮下経路により投与する。
【０３３２】
別の態様においては、本発明は、B細胞枯渇および／またはB細胞障害の治療を、現在利用可能な方法において用いられるよりも低用量の抗体または抗体フラグメントで達成することができるという発見を提供する。かくして、別の実施形態においては、本発明は、ヒトに対して、CD19に特異的に結合する有効量の抗体を投与することを含み、約500、475、450、425、400、375、350、325、300、275、250、225、200、175、150、125、100、75、60、50、37.5、20、10、5、2.5、1、0.5、0.375、0.25、0.1、0.075、0.05、0.001、0.0005 mg/m2以下の用量が、少なくとも約3、5、7、10、14、21、30、45、60、75、90、120、150、180、または200日以上の期間に渡って、25％、35％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％以上のB細胞(循環B細胞および／もしくは組織B細胞)の枯渇をもたらす、B細胞を枯渇させる、および／またはB細胞障害を治療する方法を提供する。代表的な実施形態においては、約125 mg/m2または75 mg/m2以下の用量は、少なくとも約7、14、21、30、60、75、90、120、150または180日に渡って、少なくとも約50％、75％、85％または90％のB細胞の枯渇をもたらす。他の実施形態においては、約50、37.5または10 mg/m2の用量は、少なくとも約7、14、21、30、60、75、90、120または180日に渡って、少なくとも約50％、75％、85％または90％のB細胞の枯渇をもたらす。さらに他の実施形態においては、約0.375または0.1 mg/m2の用量は、少なくとも約7、14、21、30、60、75または90日に渡って、少なくとも約50％、75％、85％または90％のB細胞の枯渇をもたらす。さらなる実施形態においては、約0.075、0.01、0.001、または0.0005 mg/m2の用量は、少なくとも約7、14、21、30または60日に渡って、少なくとも約50％、75％、85％または90％のB細胞の枯渇をもたらす。
【０３３３】
本発明の特定の実施形態においては、前記用量を上昇または低下させて、血液中または限定されるものではないが、骨髄などの組織中で一定用量を維持することができる。関連する実施形態においては、前記用量を、約2％、5％、8％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、および95％上昇または低下させて、本発明の組成物および方法の抗体の所望のレベルを維持する。
【０３３４】
特定の実施形態においては、本発明の組成物および方法に対する患者の免疫応答に基づいて、用量を調整し、および／または注入速度を低下させることができる。
【０３３５】
本発明の方法の一態様に従って、本発明の抗CD19抗体および／または組成物の負荷用量を最初に投与した後、治療するB細胞悪性腫瘍が進行するまで維持用量を投与するか、または規定の治療経過を投与することができる(例えば、CAMPATH(商標)、MYLOTARG(商標)、もしくはRITUXAN(商標)、後者は追加データが作製されるにつれて増加した規定数の用量で患者を治療することができる)。
【０３３６】
本発明の方法の別の態様に従って、患者を本発明の組成物および方法を用いて予備処理して、免疫原性応答を検出、最小化するか、または本発明の組成物および方法の副作用を最小化することができる。
【０３３７】
21.4. 毒性試験
本発明の組成物および／または治療計画の寛容性、毒性および／または効力を、例えば、LD50(集団の50％に対して致死的な用量)、ED50(集団の50％において治療上有効な用量)、およびIC50(50％の阻害を達成するのに有効な用量)を決定するために、細胞培養物または実験動物中で標準的な製薬手順により決定することができる。一実施形態においては、前記用量は、循環B細胞もしくは循環免疫グロブリン、またはその両方の少なくとも60％、70％、80％、90％、95％または99％の枯渇を達成するのに有効な用量である。毒性効果と治療効果の間の用量比が治療指数であり、それをLD50/ED50比として表すことができる。大きい治療指数を示す療法が好ましい。毒性副作用を示す療法を用いることもできるが、CD19陰性細胞に対する潜在的な損傷を最小化し、それによって、副作用を減少させるために、そのような薬剤をCD19発現細胞に標的化する送達系を設計するには注意を払うべきである。
【０３３８】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータを、ヒトにおける使用のための組成物の用量範囲および／または治療計画を製剤化するのに用いることができる。そのような薬剤の用量は、毒性がほとんどないか、または全くないED50を含む循環濃度の範囲内にあるかもしれない。この用量は、用いられる剤形および用いられる投与経路に応じて、この範囲内で変化してもよい。本発明の方法において用いられる任意の療法について、治療上有効量を好適な動物モデルにより見積もることができる。動物モデルの種に応じて、用量を、例えば、Freireichら、「マウス、ラット、サル、イヌ、およびヒトにおける抗癌剤の毒性の定量的比較(Quantitative comparison of toxicity of anticancer agents in mouse, rat, monkey, dog, and human)」、Cancer Chemotherapy Reports, NCI 1966 40:219-244により提供されるように、当業界で受け入れられる公式に従って、ヒトでの使用のために計ることができる。細胞培養アッセイから得られるデータは、潜在的な毒性を予測するのに有用であってよい。動物試験を用いて特定の用量を製剤化して、細胞培養物中で決定されたIC50を含む循環血漿濃度範囲(すなわち、徴候の半最大阻害を達成する試験化合物の濃度)を達成することができる。そのような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿薬剤レベルを、例えば、高速液体クロマトグラフィー、ELISA、または細胞に基づくアッセイにより測定することができる。
【０３３９】
22. 患者の診断、癌の段階および治療計画
本発明の特定の態様に従って、本発明の組成物および方法と共に用いられる治療計画および用量を、限定されるものではないが、治療するB細胞疾患または障害の段階などのいくつかの因子に基づいて選択する。好適な治療計画を、患者または患者集団におけるB細胞疾患または障害の特定の段階について、当業者により決定することができる。用量応答曲線を、当業界で標準的なプロトコルを用いて作製して、様々な段階のB細胞疾患または障害を有する患者を治療するための本発明の組成物の有効量を決定することができる。一般的には、より進行した段階のB細胞疾患または障害を有する患者は、初期段階のB細胞疾患または障害を有する患者と比較して、より長い期間に渡って投与することができる、より高い用量および／またはより頻繁な投与を必要とするであろう。
【０３４０】
本発明の抗CD19抗体、組成物および方法を実行して、B細胞悪性腫瘍などのB細胞疾患を治療することができる。用語「B細胞悪性腫瘍」は、B細胞系列の細胞から誘導される任意の悪性腫瘍を含む。B細胞悪性腫瘍の例としては、限定されるものではないが、B細胞サブタイプの非ホジキンリンパ腫(NHL)、例えば、低悪性度／濾胞性NHL、小リンパ球性(SL)NHL、中悪性度／濾胞性NHL、中悪性度広範性NHL、高悪性度免疫芽球性NHL、高悪性度リンパ芽球性NHL、高悪性度小非切断細胞NHL；マントル細胞リンパ腫、および巨大病変NHL；バーキットリンパ腫；多発性骨髄腫；プレB細胞球性リンパ芽球性白血病および初期B細胞前駆体から誘導される他の悪性腫瘍；一般的な球性リンパ球性白血病(ALL)；慢性リンパ球性白血病(CLL)、例えば、免疫グロブリン突然変異CLLおよび免疫グロブリン非変異CLLおよび免疫グロブリン非変異；毛様細胞白血病；Null急性リンパ芽球性白血病；Waldenstrom'sマクログロブリン血症；広範性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、例えば、胚中心B細胞様(GCB)DLBCL、活性化B細胞様(ABC)DLBCL、および3型DLBCL；プロリンパ球性白血病；軽鎖疾患；形質細胞腫；骨硬化性骨髄腫；形質細胞白血病；意味未確定の単クローン性高ガンマグロブリン血症(MGUS)；くすぶり型多発性骨髄腫(SMM)；無痛性多発性骨髄腫(IMM)；ホジキンリンパ腫、例えば、古典的および結節性リンパ球プレドミナント型；リンパ形質細胞リンパ腫(LPL)；ならびに辺縁帯リンパ腫、例えば、胃粘膜関連リンパ組織(MALT)リンパ腫が挙げられる。
【０３４１】
さらなる実施形態においては、本発明を用いて、限定されるものではないが、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、広範性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、例えば、胚中心B細胞様(GCB)DLBCL、活性化B細胞様(ABC)DLBCL、および3型DLBCL、ホジキンリンパ腫、例えば、古典的および結節性リンパ球プレドミナント型、リンパ形質細胞リンパ腫(LPL)、辺縁帯リンパ腫、例えば、胃粘膜関連リンパ組織(MALT)リンパ腫、ならびに慢性リンパ球性白血病(CLL)、例えば、免疫グロブリン突然変異CLLおよび免疫グロブリン非変異CLLなどの成熟B細胞悪性腫瘍(すなわち、細胞表面上にIgを発現する)を治療することができる。
【０３４２】
さらに、CD19は、例えば、CD20よりも、B細胞発生においてより初期に発現され、従って、例えば、骨髄における、プレB細胞および未成熟B細胞悪性腫瘍(すなわち、細胞表面上にIgを発現しない)を治療するのに特に好適である。プレB細胞および未成熟B細胞悪性腫瘍の例としては、限定されるものではないが、球性リンパ芽球性白血病が挙げられる。
【０３４３】
他の特定の実施形態においては、本発明を実行して、節外性腫瘍を治療することができる。
【０３４４】
22.1. B細胞悪性腫瘍の診断および段階
腫瘍を形成し得るB細胞疾患または障害(例えば、非ホジキンリンパ腫、広範性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、およびバーキットリンパ腫)などの癌の進行は、典型的には、癌が身体を通して広がる程度により特性評価され、頻繁には、結果を予測する以下の4つの段階に分割される。段階I：癌が特定の組織に局在化し、リンパ節に広がっていない。段階II：癌が近隣のリンパ節に広がっている、すなわち、転移している。段階III：癌が原発組織から離れた身体の領域中のリンパ節に認められ、一方とは対照的に、腫瘍塊または多発性腫瘍を含む。段階IV：癌が身体の遠い部分に広がっている。癌の段階を、当業者にはよく知られる臨床観察および試験方法により決定することができる。上記の癌の段階は、腫瘍形成を特徴とする癌の臨床診断と共に伝統的に用いられており、本発明の組成物および方法と共に用いて、B細胞疾患および障害を治療することができる。典型的には、初期段階の疾患は、該疾患が患者の身体の一部に局在化したままであるか、または転移していないことを意味する。
【０３４５】
限定されるものではないが、多発性骨髄腫などの非腫瘍形成性B細胞疾患および障害に関しては、疾患の段階を決定するための基準が異なる。Durie-Salmon Staging Systemが幅広く用いられてきた。この段階決定系においては、疾患の臨床段階(段階I、IIまたはIII)は、Mタンパク質のレベル、溶解性骨病変の数、ヘモグロビン値、および血清カルシウムレベルなどのいくつかの測定値に基づく。腎臓機能に従って、段階をさらに分割する(AまたはBと分類)。Durie-Salmon Staging Systemに従って、段階I(低い細胞質量)は、以下の全て：ヘモグロビン値>10 g/dL；血清カルシウム値、正常もしくは12 mg/dL以下；骨x線、正常骨構造(スケール0)もしくは孤立性骨形質細胞のみ；および低いM成分産生速度：IgG値<5 g/dL、IgA値<3 g/dL、Bence Jonesタンパク質<4 g/24時間を特徴とする。段階Iの患者は、典型的には、関連しない器官もしくは組織損傷または徴候を有する。段階II(中間細胞質量)は、段階Iにも段階IIIにも適合しないことを特徴とする。段階III(高い細胞質量)は、以下の1個以上：ヘモグロビン値<8.5 g/dL；血清カルシウム値>12 mg/dL；進行溶解性骨病変(スケール3)；高いM成分産生速度：IgG値>7 g/dL、IgA値>5 g/dL、Bence Jonesタンパク質>12 g/24時間のサブ分類(AまたはB)を特徴とし、ここでAは比較的正常な腎臓機能(血清クレアチニン値<2.0 mg/dL)であり、Bは異常な腎臓機能(血清クレアチニン値≧2.0 mg/dL)である。
【０３４６】
骨髄腫に関する別の段階決定系は、骨髄腫に関する国際段階決定系(ISS)である。この系は、段階群間をより効率的に区別することができ、β2-ミクログロブリン(β2-M)およびアルブミンの容易に測定される血清レベルに基づく。骨髄腫に関するISSに従えば、段階Iは、β2-M<3.5およびアルブミン≧3.5を特徴とし、段階IIはβ2-M<3.5およびアルブミン<3.5もしくはβ2-M 3.5-5.5を特徴とし、段階IIIはβ2-M>5.5(Multiple Myeloma Research Foundation, New Canaan, CT)を特徴とする。
【０３４７】
患者におけるB細胞悪性腫瘍の段階は、臨床決定である。上記に示されるように、固形腫瘍に関して、腫瘍の広がり、位置、および数が、段階の臨床決定における主要な因子である。非腫瘍形成性B細胞悪性腫瘍を有する患者における段階の決定は、上記の血清レベル測定を必要とするより複雑なものであってよい。
【０３４８】
上記のB細胞疾患および障害の段階の説明は、限定的ではない。B細胞疾患および障害の診断のための当業界で公知の他の特徴を、患者に関する基準として用いて、B細胞疾患または障害の段階を決定することができる。
【０３４９】
22.2. B細胞悪性腫瘍を診断するための臨床基準
様々なB細胞悪性腫瘍のための診断基準が、当業界で公知である。歴史的には、典型的には、診断は顕微鏡観察と免疫表現型の組合せに基づく、より最近では、遺伝子発現プロファイリングなどの分子技術を適用して、B細胞悪性腫瘍の分子的定義が開発されている(例えば、Shafferら、Nature 2:920-932 (2002)を参照)。特定のB細胞悪性腫瘍の臨床診断のための方法の例を、以下に提供する。他の好適な方法は、当業者には明らかであろう。
【０３５０】
22.2.1. 濾胞性NHL
一般的には、多くのNHL(マントル細胞リンパ腫を除く)が、体細胞超変異(SHM)の結果であるようである高度に突然変異した免疫グロブリン遺伝子を有する。NHL中の最も一般的な遺伝子異常は、BCL6遺伝子の転座および突然変異である。
【０３５１】
濾胞性NHLは、濾胞増殖パターンを有する無痛性B細胞リンパ腫であることが多い。それは米国および西欧においては2番目に最も一般的なリンパ腫である。この疾患が存在する中央年齢は60歳であり、わずかに女性に多い。無痛性リンパ節症は、最も一般的な徴候である。試験は、骨髄血および時には末梢血の障害を示唆することが多い。濾胞性NHLは、濾胞性小切断細胞から巨細胞優位までの連続体を形成する等級を有する濾胞における巨細胞の割合に基づく細胞等級に分割される(S. Freedmanら、Follicular Lymphoma, pp. 367-388, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauchら(編)、Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004); T. Listerら、Follicular Lymphoma, pp. 309-324, In Malignant Lymphoma, B. Hancockら(編)、Oxford University Press, New York, N.Y. (2000)を参照)。
【０３５２】
多くの濾胞性NHLは、BCL2の過剰発現をもたらす第14染色体と第18染色体の転座を特徴とする。濾胞性NHLはまた、SHMと進行中のSHMの両方およびこの悪性腫瘍の起源の推定される細胞である、胚中心(GC)のB細胞と類似する遺伝子発現プロフィールを特徴とする(例えば、Shafferら、Nature 2:920-932 (2002)を参照)。重鎖および軽鎖再配置が典型的である。この疾患の腫瘍細胞は、モノクローナル表面免疫グロブリンを発現するが、多くはIgMを発現する。ほぼ全ての濾胞性NHL腫瘍細胞が、抗原CD19、CD20、CD22、CD79a、CD21、CD35およびCD10を発現するが、CD5およびCD43の発現を欠く。小切断細胞によるパラ小柱(paratrabecular)浸潤が骨髄中で観察される(S. Freedmanら、Follicular Lymphoma, pp. 367-388, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauchら(編)、Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004); T. Listerら、Follicular Lymphoma, pp. 309-324, In Malignant Lymphoma, B. Hancockら(編)、Oxford University Press, New York, N.Y. (2000)を参照)。
【０３５３】
濾胞性NHLの診断は、一般的には、組織構造および細胞学的特徴を評価するための切除された節の生検に依存する。微小針吸引は通常は十分ではないが、これはこの手法が評価することができる組織を提供する可能性が低く、追加試験のために十分な組織を提供できないからである。障害が不完全であり得るため、両側骨髄生検も示唆される。さらなる診断手順としては、胸部x線、胸部、腹部、頸部および骨盤のコンピュータ断層撮影(CT)走査、全血球計数、ならびに化学プロフィールが挙げられる。フローサイトメトリーおよび免疫組織化学を用いて、濾胞性NHLと他の成熟B細胞リンパ腫とを識別することができる(S. Freedmanら、Follicular Lymphoma, pp. 367-388, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauchら(編)、Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004); T. Listerら、Follicular Lymphoma, pp. 309-324, In Malignant Lymphoma, B. Hancockら(編)、Oxford University Press, New York, N.Y. (2000)を参照)。
【０３５４】
22.2.2. マントル細胞リンパ腫
マントル細胞リンパ腫は、二次卵胞のマントル領域に局在化し、結節性および／または広範性増殖パターンを特徴とする。マントル細胞リンパ腫患者は、60〜65歳の中央年齢を有し、主に男性がこの疾患に罹患する。診断目的のためには、通常存在する特徴は、全身性リンパ節症である。さらに、脾臓が肥大することが多い。このB細胞リンパ腫は、IgH座とサイクリンD1遺伝子との間のt(11;14)と関連し、サイクリンD1の過剰発現をもたらす。50％を超える事例が、さらなる染色体異常を示す。典型的には、マントル細胞リンパ腫は、SHMを特徴としない(W. Hiddemannら、Mantle Cell Lymphoma, pp. 461-476, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauchら(編)、Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004); D. Weisenburgerら、Mantle Cell Lymphoma, pp. 28-41, In Malignant Lymphoma, B. Hancockら(編)、Oxford University Press, New York, N.Y. (2000)を参照)。
【０３５５】
マントル細胞リンパ腫の免疫表現型決定(フローサイトメトリーまたは凍結切片)の免疫組織化学は、それらがほぼ常に表面IgMを担持するモノクローナルであることを示す。マントル細胞リンパ腫は、表面IgDを担持することにも留意されてきた。この細胞は抗原CD19、CD20、CD22およびCD24を発現するが、CD23を発現しない。それらはまた、表面抗原CD5を発現するが、CD10を発現せず、ほとんど常にCD5陰性である真の卵胞中心細胞リンパ腫からそれらを識別する。頻繁には、骨髄浸潤ならびに肝臓および胃腸管の腫瘍などの節外障害が認められる。軽度の貧血および白血病の発現は、マントル細胞リンパ腫については珍しくない(A. Laiら、Role of Fine Needle Aspiration in Lymphoma, pp. 181-220, In W. Finnら(編)、Hematopathology in Oncology, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA (2004); W. Hiddemannら、Mantle Cell Lymphoma, pp. 461-476, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauchら(編)、Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)を参照)。
【０３５６】
マントル細胞リンパ腫の診断は、末梢血の試験ならびに骨髄およびリンパ節生検を含む。さらに、細胞遺伝学的試験および免疫表現型決定は、様々な診断において有用である(W. Hiddemannら、Mantle Cell Lymphoma pp. 461-476, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauchら(編)、Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004); D. Weisenburgerら、Mantle Cell Lymphoma, pp. 28-41, In Malignant Lymphoma, B. Hancockら(編)、Oxford University Press, New York, N.Y. (2000)を参照)。
【０３５７】
22.2.3. バーキットリンパ腫
バーキットリンパ腫は、典型的には子供および若い成人において観察される悪性B細胞リンパ腫であり、通常、顎および／または腹部の巨大病変に関連する。約20％の患者が、骨髄障害を有する。バーキットリンパ腫の流行性形態は、悪性腫瘍細胞のエプスタイン-バーウイルス(EBV)感染を含む；散発性形態はEBV感染とは関係しない。c-myc遺伝子の脱調節をもたらす、免疫グロブリン座へのc-mycの転座は、この疾患の特徴である(t(8;14)(q24:q32))。興味深いことに、c-myc配列の欠失はこの疾患の散発性形態に関与するようであるが、流行性形態は通常、点突然変異または挿入を含む(V. Pappaら、Molecular Biology, pp. 133-157, In Malignant Lymphoma, B. Hancockら(編)、Oxford University Press, New York, N.Y. (2000)を参照)。また、バーキットリンパ腫は、SHMを特徴とし、この悪性腫瘍細胞は、GC B細胞と類似する遺伝子発現プロフィールを有し、この悪性腫瘍がGC B細胞に由来することを示唆している。
【０３５８】
バーキットリンパ腫の免疫表現型は、この疾患の細胞がCD19、CD20、CD22およびCD79aを発現するが、CD5、CD23、サイクリンDまたは末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを発現しないことを示している。頻繁には、これらの細胞は、CD10およびBCL6について陽性であり、通常、BCL2については陰性である(I. Magrathら、Burkitt's Lymphoma, pp. 477-501, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauchら(編)、Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)を参照)。
【０３５９】
高悪性度B細胞バーキット様リンパ腫は、バーキットリンパ腫と大細胞型B細胞リンパ腫との間のリンパ腫境界線である。このリンパ腫の細胞は、CD19、CD20、およびCD22を発現するが、真のバーキットリンパ腫にほぼ常に存在するCD10の発現は、存在しないことが多い。これおよび他の特徴のため、このリンパ腫を広範性大細胞型B細胞リンパ腫として分類すべきであると考える人もいる(K. Maclennan, Diffuse Aggressive B cell Lymphoma, pp. 49- 54, In Malignant Lymphoma, B. Hancockら(編)、Oxford University Press, New York, N.Y. (2000)を参照)。
【０３６０】
一般的には、バーキットリンパ腫の診断は、このリンパ腫と関連する転座の検出に依存する；かくして、通常は従来の細胞遺伝学的分析を実施する。転座およびこの疾患に関連する他の遺伝的変化におけるIg-myc結合を検出するために、長距離ポリメラーゼ連鎖反応技術および蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)が用いられてきた(R. Siebertら、Blood 91:984-990 (1998); T. Denyssevychら、Leukemia, 16:276-283 (2002)を参照)。
【０３６１】
22.2.4. 広範性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)
DLBCLは、最も一般的な非ホジキンリンパ腫であり、小細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫または辺縁帯リンパ腫から生じ得る。典型的には、患者はリンパ節症をもたらすが、多くの割合の患者は節外部位にもたらし、ならびに胃腸管障害が最も一般的である。骨髄障害が、約15％の患者に観察される(Armitageら、Diffuse Large B cell Lymphoma, pp. 427-453, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauchら(編)、Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)を参照)。臨床的、生物学的および形態学的特徴における不均一性により、この群のリンパ腫を下位分類することが困難になる。しかしながら、2つの異なる亜群が、胚中心B細胞(GC-DLBCL)に特徴的な1個の発現遺伝子および末梢血B細胞中の他の過剰発現遺伝子と共に同定された。生存率は、活性化されたB細胞型(ABC)-DLBCLを有する患者よりもGC-DLBCLを有する患者について有意に良好である(W. Chan, Archives of Pathology and Laboratory Medicine 128(12):, 1379-1384 (2004)を参照)。
【０３６２】
DLBCLは細胞表面抗原CD19、CD20、CD22、およびCD79aを発現する。CD10は、大多数の事例において発現され、CD5発現が約10％の事例において観察される(K. Maclennan, Diffuse Aggressive B cell Lymphoma, pp. 49-54, In Malignant Lymphoma, B. Hancockら(編)、Oxford University Press, New York, N.Y. (2000)を参照)。DLBCLは、BCL6の異常および／またはIgH座へのBCL2の転座を特徴とすることが多い。GC B細胞様(GC)DLBCLは、高度に突然変異した免疫グロブリン遺伝子を有するSHMおよびGC B細胞様遺伝子発現プロフィールを有する悪性クローン中の進行中のSHMを特徴とする。多くのGC DLBCLは、免疫グロブリンクラススイッチングを受けている。ABC-DLBCLは、BCL2、インターフェロン調節因子4、CD44、FLIPおよびサイクリンDなどのNF-κB標的遺伝子の高レベル発現を特徴とする。進行中のSHMではなく、SHMが存在し、ABC-DLBCLはGC B細胞遺伝子発現プロフィールを有さない。ほとんど全てのABC-DLBCLが高レベルのIgMを発現する。
【０３６３】
22.2.5. 節外辺縁帯リンパ腫
節外辺縁帯リンパ腫は、正常では組織化されたリンパ組織を欠く器官(例えば、胃、唾液腺、肺および甲状腺)に生じる節外リンパ腫である。それは、60歳を超える中央年齢を有する主に高齢者が罹患する疾患である。慢性炎症または自己免疫プロセスは、リンパ腫の発達に先行する。最も一般的な型の辺縁帯リンパ腫である、胃粘膜関連リンパ組織(MALT)リンパ腫は、ヘリコバクター・ピロリ感染に関連する。研究により、抗生物質計画後のヘリコバクター・ピロリ感染の根絶と共に、徴候が解消することが示された。胃のMALTリンパ腫に関する存在する徴候としては、非特異的消化不良、上腹部痛、吐き気、胃腸管出血および貧血が挙げられる。乳酸デヒドロゲナーゼのレベルが上昇するにつれて、全身徴候は珍しくなくなる(J. Yahalomら、Extranodal Marginal Zone B cell Lymphoma of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue, pp. 345-360, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauchら(編)、Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004); J. Radford, Other Low-Grade Non-Hodgkin's Lymphomas, pp. 325-330, In Malignant Lymphoma, B. Hancockら(編)、Oxford University Press, New York, N.Y. (2000)を参照)。全身性B徴候としては、感染の兆候なしに2週間を超える期間の38℃を超える発熱、寝汗、極端な疲労または以前の6ヶ月に渡る10％以上の体重の意図的でない体重減少が挙げられる。
【０３６４】
MALTリンパ腫の免疫表現型は、CD19、CD20、CD79a、CD21およびCD35の発現ならびにCD5、CD23、およびCD10の発現の欠如を特徴とする。約半分のMALTリンパ腫が、CD43を発現する。典型的には、この疾患の腫瘍細胞において発現される免疫グロブリンはIgMであるが、IgDは発現されない。これらの特徴は、マントル細胞リンパ腫、リンパ球性リンパ腫および濾胞性リンパ腫などの他の小細胞型B細胞リンパ腫からこのリンパ腫を識別するのに重要である。トリソミー3が、60％のMALTリンパ腫事例において報告されている。胃および肺のMALTリンパ腫の25〜40％において、t(11;18)が観察されている。この転座は、他のMALTリンパ腫においてはめったに観察されない。t(11;18)はBCL10の核内発現と関連する(J. Yahalomら、Extranodal Marginal Zone B cell Lymphoma of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue, pp. 345-360, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauchら(編)、Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)を参照)。辺縁帯リンパ腫は、一般的には、SHMおよび進行中のSHMを特徴とする。
【０３６５】
診断手順としては、細胞表面マーカーの同一性を決定するための免疫表現型決定またはフローサイトメトリーが挙げられる。さらに、分子遺伝分析を行って、t(11;18)の存在を決定すべきであるが、これはこの疾患が抗生物質に応答しないことを示すからである。組織学を用いてヘリコバクター・ピロリの存在を決定することができる。さらなる試験は、全血球計数、乳酸デヒドロゲナーゼに関するものなどの基本的生化学試験；腹部、胸部および骨盤のCT走査ならびに骨髄生検を含むべきである(J. Yahalomら、Extranodal Marginal Zone B cell Lymphoma of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue, pp. 345-360, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauchら(編)、Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)を参照)。
【０３６６】
22.2.6. 節性辺縁帯B細胞リンパ腫
節性辺縁帯B細胞リンパ腫は、比較的新しく分類されるリンパ腫であり、かくして、それに関して公開されたことはほとんどない。それは、節外および脾臓辺縁帯リンパ腫と遺伝的および形態学的特徴を共有する主要な節性B細胞リンパ腫であるが、脾臓または節外に局在化しない。C型肝炎ウイルスは、シェーグレン症候群と同様、このリンパ腫と関連することが報告されている(F. Bergerら、Nodal Marginal Zone B cell Lymphoma, pp. 361-365, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauchら(編)、Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)を参照)。
【０３６７】
節性辺縁帯B細胞リンパ腫は、異種性の細胞学および形態学を有する。その比較的高い割合の巨細胞に起因して、このリンパ腫は、他の辺縁帯リンパ腫(脾臓および節外)と違って、真の低悪性度B細胞リンパ腫として分類することができない。節性辺縁帯リンパ腫の遺伝的および免疫学的表現型としては、CD19、CD20、CD22、BCL２、sIgMおよび細胞質IgG(cIg)の発現が挙げられる。これらの細胞は、CD5、CD10、CD23、CD43またはサイクリンD1を発現しない。MALTリンパ腫に特徴的な転座、t(11;18)は、節性辺縁帯リンパ腫については観察されない。これらの特徴は、他の小細胞型B細胞リンパ腫からのこのリンパ腫の示差的診断の助けとなる(F. Bergerら、Nodal Marginal Zone B cell Lymphoma, pp. 361-365, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauchら(編)、Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)を参照)。
【０３６８】
22.2.7. 脾臓辺縁帯リンパ腫
脾臓辺縁帯リンパ腫は、顕著な脾腫ならびに末梢血および骨髄の浸潤の特徴的な臨床発現を有する無痛性小結節性B細胞リンパ腫である。さらに、比較的高レベルの肝臓障害が報告されている。このリンパ腫に関するC型肝炎ウイルスの役割が主張されている。脾臓辺縁帯リンパ腫の免疫表現型は、典型的にはCD19+、CD20+、IgD+、BCL2+、p27+、CD3-、CD5-、CD10-、CD23-、CD38-、CD43-、BCL6-、およびサイクリンD1-である。遺伝的特徴としては、7qの欠失、p53の変化およびSHMが挙げられる(M. Pirisら、Splenic Marginal Zone Lymphoma, pp. 275-282, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauchら(編)、Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)を参照)。
【０３６９】
一般的には、診断は細胞表面マーカーの同一性を決定するための免疫表現型決定に依存する。細胞表面マーカーに関するデータと共に、遺伝的および生化学的分析は、他の小細胞型B細胞リンパ腫からこのリンパ腫を識別するのに役立つ(M. Pirisら、Splenic Marginal Zone Lymphoma, pp. 275-282, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauchら(編)、Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)を参照)。
【０３７０】
22.2.8. 急性(B細胞)リンパ球性白血病(ALL)
ALLは、1〜5年間で最も高い発生率で主に子供が罹患する骨髄に基づく新生物である。発現時の最も一般的な徴候としては、疲労、昏睡、発熱ならびに骨および関節の疼痛が挙げられる。疲労および昏睡は、存在する貧血の程度と相関する。白血球計数の上昇が、発現時に一般的である。胸部の放射線写真は骨格損傷を示すことが多い。髄外拡散が一般的であり、中枢神経系、精巣、リンパ節、肝臓、脾臓および腎臓を含む。前縦隔腫瘤は、新しく診断された事例の約5〜10％にのみ観察される(J. Whitlockら、Acute Lymphocytic Leukemia, pp. 2241-2271, In Wintrobe's Clinical Hematology、第10版、G. Leeら(編)、Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1999)を参照)。
【０３７１】
ALLの免疫表現型は、CD10+、CD19+、CD20+、CD22、およびCD24+である。プレB細胞ALL細胞は、表面免疫グロブリンではなく、細胞質免疫グロブリンを発現するが、成熟B細胞ALL(ALL事例の1〜2％のみに相当する)は表面免疫グロブリンの発現により、B細胞系列の他の白血病から識別される。ALLの細胞遺伝学的特徴としては、t(8;14)、t(2;8)およびt(8;22)が挙げられる。細胞遺伝レベルで稀に検出されるが、t(12;21)は子供のALLに関連する最も一般的な細胞遺伝学的異常であり得る(約25％の事例で観察される)(M. Kinneyら、Classification and Differentiation of the Acute Leukemias, pp. 2209-2240, In Wintrobe's Clinical Hematology、第10版、G. Leeら(編)、Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1999); J Whitlockら、Acute Lymphocytic Leukemia, pp. 2241-2271; In Wintrobe's Clinical Hematology、第10版、G. Leeら(編)、Williams & Wilkins, Baltimore, MD, (1999)を参照)。
【０３７２】
通常、急性白血病の正確な診断は、骨髄穿刺液および生検に依存する。骨髄穿刺液標本を、形態学的、免疫学的および細胞学的評価に用いる。骨髄中のリンパ芽細胞の証明は、ALLの診断である。骨髄中に5％を超える白血病性リンパ芽細胞の存在は、ALLの診断を確認するが、多くの場合、確定診断のためには25％を超える必要がある。腰椎穿刺を用いて、中枢神経系障害を診断する。血清尿酸レベルおよび血清乳酸デヒドロゲナーゼレベルは、ALLにおいて上昇することが見出されている(M. Kinneyら、Classification and Differentiation of the Acute Leukemias, pp. 2209-2240, In Wintrobe's Clinical Hematology、第10版、G. Leeら(編)、Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1999); J. Whitlockら、Acute Lymphocytic Leukemia, pp. 2241-2271; In Wintrobe's Clinical Hematology、第10版、G. Leeら(編)、Williams & Wilkins, Baltimore, MD, (1999)を参照)。
【０３７３】
22.2.9. 慢性リンパ球性白血病(CLL)／小細胞型B細胞リンパ球性リンパ腫(SLL)
CLL/SLLは、最も一般的な型の白血病である。この疾患が末梢血および骨髄を含む場合、それをCLLと呼ぶ。しかしながら、リンパ節および他の組織が、CLLにおけるものと免疫学的および形態学的に同一である細胞により浸潤されるが、この疾患の白血病性特徴が存在しない場合、この疾患をSLLと呼ぶ。この疾患には主に高齢者が罹患し、その発生率は女性より男性の方が高い。無痛性リンパ節症は、発現時に最も一般的な知見である。低ガンマグロブリン血症は、多くの事例のCLL/SLLに共通であり、任意の特定のサブクラスの免疫グロブリンよりもむしろ、全ての免疫グロブリンのレベルの低下を示す。無症状性患者は、日常的な血液計数の間に診断されることが多い(5000 x 109/Lを超えるリンパ球計数)。20％ものCLL/SLL事例が、B徴候を報告している。さらなる診断的特徴は、未成熟リンパ球による30％を超える骨髄の浸潤である。一般的には、リンパ節生検は、高分化型リンパ球を含む関与した節の浸潤を示す。自己免疫性溶血性貧血および免疫血小板減少症などの自己免疫現象は、CLL/SLLと関連することが多い(J. Gribbenら、Small B cell Lymphocytic Lymphoma/Chronic Lymphocytic Leukemia and Prolymphocytic Leukemia, pp. 243-261, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauchら(編)、Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004); K. Maclennan, Diffuse Indolent B cell Neoplasms, pp. 43-47, In Malignant Lymphoma, B. Hancockら(編)、Oxford University Press, New York, N.Y. (2000); Clinical Oncology, A. Nealら、Neal, Hoskin and Oxford University Press, co-publ., New York, NY (2003)を参照)。
【０３７４】
多くの低悪性度B細胞悪性腫瘍とは対照的に、非無作為相互転座はCLL/SLLにおいてはめったに認められない。しかしながら、13q14、11q22-23および17q13での欠失(後者の2つはp53座を含む)などの他の細胞遺伝学的異常が報告されている。約20％の事例が、トリソミー12を示す。β-2ミクログロブリンレベルの上昇、より高いレベルのCD38発現および腫瘍壊死因子-αの産生は、全てCLL/SLLに特徴的である。CLL/SLLの免疫表現型は非常に診断的であり、表面免疫グロブリン、通常はIgM、またはIgMとIgGの弱い発現、ならびに細胞抗原CD19、CD22、CD20、通常はCD5とCD23の発現を含む(J. Gribbenら、Small B cell Lymphocytic Lymphoma/Chronic Lymphocytic Leukemia and Prolymphocytic Leukemia, pp. 243-261, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauchら(編)、Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004); K. Maclennan, Diffuse Indolent B cell Neoplasms, pp. 43-47, In Malignant Lymphoma, B. Hancockら(編)、Oxford University Press, New York, N.Y. (2000)を参照)。
【０３７５】
22.2.10. B細胞プロリンパ球性白血病(PLL)
かつてはCLLの変形と考えられていたPLLは、現在では異なる疾患であると理解されている。一般的には、PLLは、高齢の男性の疾患であり、非常に高い白血球計数(200 x 109/Lを超える)および脾腫を特徴とする。さらなる徴候としては、貧血および血小板減少症が挙げられる。PLLにおけるプロリンパ球は、血液および骨髄中に55％を超える細胞を含む。CLLとは対照的に、自己免疫現象はPLLにおいてはめったに観察されない(J. Gribbenら、Small B cell Lymphocytic Lymphoma/Chronic Lymphocytic Leukemia and Prolymphocytic Leukemia, pp. 243-261, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauchら(編)、Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)を参照)。
【０３７６】
PLLの免疫表現型は、CD19、CD21、CD22、CD24およびFMC7の発現を特徴とする。PLLの細胞は、CD23を発現しないが、多くはCD5を発現しない。PLL細胞は複雑な染色体異常を示し、13q14および11q23での欠失が、最も頻繁なもののうちのいくつかである。PLL細胞中でのp53変異のパターンは、CLLについて観察されるものと異なる。通常、示差的診断は、全血球計数、組織学的、免疫表現型的、および遺伝的分析に依存する(J. Gribbenら、Small B cell Lymphocytic Lymphoma/Chronic Lymphocytic Leukemia and Prolymphocytic Leukemia, pp. 243-261, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauchら(編)、Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)を参照)。
【０３７７】
22.2.11. 毛様細胞白血病(HCL)
HCLは、主に中年の、女性よりも男性がより多く罹患する稀な、無痛性慢性白血病である。典型的な徴候としては、巨大脾腫および汎血球減少症が挙げられる。末梢血および骨髄は、細胞質突起を有するBリンパ球である、典型的な「毛様細胞」を含む。90％を超えるHCL患者が、骨髄浸潤を有する(Clinical Oncology, A. Nealら、Neal, Hoskin and Oxford University Press, co-publ., New York, NY (2003); J. Johnston, Hairy Cell Leukemia, pp. 2428-2446, In Wintrobe's Clinical Hematology、第10版、G. Leeら(編)、Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1999)を参照)。
【０３７８】
細胞遺伝学的分析により、19％の事例においてクローン異常が存在し、染色体5、7および14の数値的および構造的異常を含むことが示されている。TNF-αの血清レベルは、毛様細胞白血病において上昇し、全身腫瘍組織量と相関する。毛様細胞白血病細胞は、表面免疫グロブリン(IgGおよびIgM)ならびにCD11c、CD19、CD20、CD22および典型的には、CD25を発現する。さらに、FMC7、HC-2およびCD103が発現される。HCL細胞は、CD5またはCD10を発現しない。一般的には、診断は骨髄穿刺液、細胞遺伝学的分析、血液標本および免疫表現型決定の使用を含む(Clinical Oncology, A. Nealら、Neal, Hoskin and Oxford University Press, co-publ., New York, NY (2003); J. Johnston, Hairy Cell Leukemia, pp. 2428-2446, In Wintrobe's Clinical Hematology、第10版、G. Leeら(編)、Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1999)を参照)。
【０３７９】
22.2.12. 前駆B細胞リンパ芽球性リンパ腫／プレB細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ芽球性リンパ腫
前駆B細胞リンパ芽球性リンパ腫／プレB細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ芽球性リンパ腫は、前駆TまたはB細胞の疾患である。TおよびB細胞リンパ芽球性リンパ腫は、形態学的には同一であるが、骨髄浸潤または骨髄障害の程度に基づいて臨床的な区別を行うことができる。85〜90％のリンパ芽球性リンパ腫はT細胞由来であり、残りはB細胞由来である。リンパ芽球性リンパ腫は、男性に多く、20歳の中央年齢を有する。末梢リンパ節障害が発現時に一般的な特徴であり、特に、頸部、鎖骨上および腋窩部に生じる。この疾患は、骨髄障害をもたらすことが多い。中枢神経系は、発現時にあまり一般的ではないが、再発事例において現れることが多い。他の障害部位としては、肝臓、脾臓、骨、皮膚、咽頭および精巣が挙げられる(J. Sweetenhamら、Precursor B- and T-Cell Lymphoblastic Lymphoma, pp. 503-513, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauchら(編)、Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)を参照)。
【０３８０】
前駆B細胞リンパ芽球性リンパ腫は、CD99、CD34および末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼなどの未成熟マーカーB細胞マーカーを発現する。これらの細胞はまた、CD79a、CD19、CD22および時にはCD20を発現し、典型的には、CD45および表面免疫グロブリンの発現を欠く。11q23、ならびにt(9;22)(q34;q11.2)およびt(12;21)(p13;q22)での転座は、予後不良と関連していた。良好な予後は、超二倍体核型に関連し、特に、トリソミー4、10、および17ならびにt(12;21)(p13;q22)に関連する(J. Sweetenhamら、Precursor B- and T-Cell Lymphoblastic Lymphoma, pp. 503-513, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauchら(編)、Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)を参照)。
【０３８１】
診断試験としては、リンパ節生検、血液試験、x線、CT走査、および悪性腫瘍細胞について脳脊髄液を試験するための腰椎穿刺が挙げられる。
【０３８２】
22.2.13. 縦隔原発大細胞型B細胞リンパ腫
縦隔原発大細胞型B細胞リンパ腫は、主に若い女性に発生し、胸腺を起源とする局所侵襲性前縦隔腫瘤を特徴とする広範性大細胞型B細胞リンパ腫である。末梢節への遠隔転移および骨髄障害は通常はない。全身徴候が一般的である。この疾患は節性大細胞型リンパ腫と似ているが、異なる遺伝的、免疫学的、および形態学的特徴を有する。
【０３８３】
縦隔原発大細胞型B細胞リンパ腫の腫瘍細胞の免疫表現型は、表面免疫グロブリン陰性であることが多いが、CD19、CD20、CD22、およびCD79aなどのB細胞関連抗原を発現しない。また、CD10およびBCL6も一般的に発現される。形質細胞関連マーカー、CD15、CD30、上皮膜抗原(EMA)の発現は稀である。BCL6およびc-myc遺伝子配置も珍しい。BCL6超突然変異と共に、クローン性免疫グロブリン再配置、免疫グロブリン可変領域および遺伝子超突然変異の存在は、このリンパ腫が成熟胚中心または胚中心後B細胞に由来することを示唆している。この疾患の腫瘍と関連するようである染色体転座は、他の形態の広範性大細胞型リンパ腫において観察されるものと類似している(P. Zinzaniら、Primary Mediastinal Large B cell Lymphoma, pp. 455-460, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauchら(編)、Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)を参照)。
【０３８４】
縦隔原発大細胞型B細胞リンパ腫に関する診断評価は、一般的には、完全な物理的試験、完全な血液学的および生化学的分析、全身コンピュータ断層撮影ならびに骨髄生検が挙げられる。ガリウム67走査は、段階決定、治療への応答および再発の評価のための有用な試験である(P. Zinzaniら、Primary Mediastinal Large B cell Lymphoma, pp. 455-460, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauchら(編)、Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)を参照)。
【０３８５】
22.2.14. リンパ形質細胞性リンパ腫(LPL)／リンパ形質細胞性免疫細胞腫／ヴァルデンストレームマクログロブリン血症
LPL／リンパ形質細胞性免疫細胞腫／ヴァルデンストレームマクログロブリン血症は、通常は無痛性であり、骨髄、リンパ節および脾臓を含むことが多い節性リンパ腫である。これは、一般的には、高齢者の男性にわずかに多い疾患である。多くの患者は、その血清中にモノクローナルIgMパラプロテイン(>3 g/dL)を有し、血清の過粘稠をもたらす。腫瘍細胞は形質細胞の形態を有する。LPLのサブセットは、PAX5および免疫グロブリン重鎖座を含む、第9および第14染色体の間の再発転座を特徴とする。LPLは、SHMならびに進行中のSHMを特徴とし、GC後のB細胞に由来すると考えられている(A. Rohatinerら、Lymphoplasmacytic Lymphoma and Waldstrom's Macroglobulinemia, pp. 263-273, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauchら(編)、Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004); K. Maclennan, Diffuse Indolent B cell Neoplasms, pp. 43-47, In Malignant Lymphoma, B. Hancockら(編)、Oxford University Press, New York, N.Y. (2000);  A. Lalら、Role of Fine Needle Aspiration in Lymphoma, pp. 181-220, In W. Finnら(編)、Hematopathology in Oncology, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA (2004)を参照)。
【０３８６】
この疾患の免疫表現型は、B細胞関連抗原CD19、CD20、CD22、およびCD79aの発現ならびにCD5、CD10、およびCD23の発現の欠如を示す。強力な表面免疫グロブリンおよびCD20の存在、CD5およびCD23の発現の欠如ならびに細胞質免疫グロブリンの存在は、慢性リンパ球性白血病からこの疾患を識別するのを助ける特徴である。また、この疾患の診断は、t(9;14)(p13;q32)である(A. Rohatinerら、Lymphoplasmacytic Lymphoma and Waldstrom's Macroglobulinemia, pp. 263-273, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauchら(編)、Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004); K. Maclennan, Diffuse Indolent B cell Neoplasms, pp. 43-47, In Malignant Lymphoma, B. Hancockら(編)、Oxford University Press, New York, N.Y. (2000); R. Chagantiら、Cytogenetics of Lymphoma, pp. 809-824, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauchら(編)、Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)を参照)。
【０３８７】
典型的には、診断試験としては、全血球計数、腎臓および肝臓機能試験、CT走査、生検および骨髄穿刺、パラプロテインおよび血清粘度を定量および特性評価するためのタンパク質電気泳動が挙げられる。β2-ミクログロブリンの測定を、予後検査として用いる(A. Rohatinerら、Lymphoplasmacytic Lymphoma and Waldstrom's Macroglobulinemia, pp. 263-273, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauchら(編)、Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)を参照)。
【０３８８】
22.2.15. Null-急性リンパ芽球性白血病
Null-急性リンパ芽球性白血病は、BまたはT細胞特性を欠くALLのサブセットである。白血病性芽球の表現型分析は、典型的なALLパターン、すなわち、CD10(一般的なALL抗原)陰性、強力なHLA-DR-陽性、およびCD19(B4)-陽性を示す(Katzら(1988) Blood 71 (5):1438-47を参照)。
【０３８９】
22.2.16. ホジキンリンパ腫
ホジキンリンパ腫は通常、若い成人のリンパ節に生じる。それを古典的なサブタイプおよびあまり一般的でないリンパ球優位サブタイプに分割することができる。古典的な型はSHMを示すが、進行中のSHMを示さず、GC B細胞遺伝子発現プロフィールを有さない。対照的に、結節性リンパ球優位型は、SHMおよび進行中のSHMならびにGC B細胞遺伝子発現プロフィールを特徴とする。2種の型は臨床的かつ生物学的に異なるが、それらは良性炎症細胞の背景内の新生物細胞の欠如などの特定の特徴を共有する(B. Schnitzerら、Hodgkin Lymphoma, pp. 259-290, In W. FinnおよびL. Peterson(編)、Hematopathology in Oncology, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA (2004)を参照)。
【０３９０】
発現時の最も一般的な特徴は、通常は頸部であるが、場合によっては鼠径部における、リンパ節の無痛性肥大である。結節の増悪と寛解もこの疾患の特徴である。B徴候が、ほぼ1/3の患者に観察される。単離された節外障害は稀であり、普及が起こった事例においては、節外障害が約10〜20％の時間観察される(P. Johnsonら、Hodgkin's Disease: Clinical Features, pp. 181-204, In Malignant Lymphoma, B. Hancockら(編)、Oxford University Press, New York, N.Y. (2000)を参照)。
【０３９１】
リードスタンバーグ(RS)細胞は、ホジキンリンパ腫の悪性腫瘍細胞である。RS細胞およびその変異体は、CD15、CD25、CD30およびトランスフェリン受容体を発現する。さらに、これらの細胞は、ポリクローナル細胞質性免疫グロブリンを発現する。ホジキンリンパ腫の多くの事例においては、RS細胞は、非ホジキンリンパ腫からこの疾患を識別するのを助ける特徴である、CD45を発現しない。エプスタイン・バーウイルスは、ホジキンリンパ腫事例の約1/2においてリードスタンバーグ細胞中に存在するが、その役割は明らかではない。
【０３９２】
診断は、リンパ節の生検により行われることが最も多い。さらなる診断試験としては、全血球計数(血液学的試験が通常であることが多い；1.0 x 109/L未満の白血球計数が約20％の事例に認められる)、赤血球沈降速度(疾患の進行した段階で上昇することが多い)、電解質、尿素、クレアチニン、尿酸、カルシウムなどの生化学試験(高カルシウム血症は稀であるが、発現は大規模な骨障害と関連する)、肝臓血試験、乳酸デヒドロゲナーゼ(レベルの上昇は進行した疾患と関連することが多い)、アルブミンおよびβ2-ミクログロブリン(β2-M)が挙げられる。リンパ管造影および胸部x線ならびに胸部、腹部および骨盤のCT走査は、異常なリンパ節および節外障害の程度の同定において重要である。骨髄障害は稀であり、骨髄生検の結果は臨床管理または予後に影響しないようであるため、典型的には、そのような生検が最適であると考えられる。脾臓摘出が管理に影響することが稀であり、CTまたはMRI画像が脾臓状態に関する情報を提供するため、脾臓摘出は通常今日では行われていない。p55、TNFおよびsICAM-1レベルの有意な上昇は、疾患の状態、徴候の存在および完全な応答率と相関する(P. Johnsonら、Hodgkin's Disease: Clinical Features, pp. 181-204, In Malignant Lymphoma, B. Hancockら(編)、Oxford University Press, New York, N.Y. (2000); Clinical Oncology, A. Nealら、Neal, Hoskin and Oxford University Press, co-publ., New York, NY (2003); R. Stein, Hodgkin's Disease, pp. 2538-2571,  In Wintrobe's Clinical Hematology、第10版、G. Leeら(編)、Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1999)を参照)。
【０３９３】
22.2.17. 多発性骨髄腫
多発性骨髄腫は形質細胞の悪性腫瘍である。新生物細胞は骨髄に局在し、溶骨性骨病変が特徴的である。免疫グロブリン座の1つと、様々な他の遺伝子、例えば、サイクリンD1、サイクリンD3、c-MAF、MMSET(多発性骨髄腫SET-ドメインタンパク質)または線維芽細胞増殖因子受容体3との間の相互染色体転座は、主要な癌事象であると考えられる。多発性骨髄腫はSHMを特徴とし、推定される起源の細胞はGC後のB細胞である。典型的には、多発性骨髄腫を、再発感染、疲労、疼痛、および腎臓問題などの徴候により最初に同定し、臨床試験を用いて確認する(例えば、Cancer: Principles and Practice of Oncology、第6版、DeVita, V.T., Hellman, S.およびRosenberg, S. A.(編)、2001 Lippincott Williams and Wilkins Philadelphia, PA  19106 pp. 2465-2499を参照)。
【０３９４】
特定の実施形態においては、本発明の組成物および方法による治療のための候補である患者は、限定されるものではないが、CBCに報告された細胞型が、当業界でよく知られるその正常範囲内にあるかどうかを決定するための全血球計数(CBC)、アルブミン、血中尿素窒素(BUN)、カルシウム、クレアチニン、および乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)などの様々な血中成分のレベルが、標準値から外れているかどうかを決定するための血液化学プロフィールなどの多発性骨髄腫の診断または疑いを確認するための、血液および／または尿に対するさらなる診断試験を受けてもよい。β2-ミクログロブリン(β2-M)の血清レベル、ミエローマ細胞の増殖因子であるIL-6の代理マーカーを試験することもできる。尿検査を用いて、尿中のタンパク質レベルを測定することができる。電気泳動を用いて、血中(血清タンパク質電気泳動、もしくはSPEPと呼ばれる)または尿中(尿電気泳動、もしくはUEPと呼ばれる)のMタンパク質などの様々なタンパク質のレベルを測定することができる。免疫固定電気泳動(IFE)または免疫電気泳動と呼ばれるさらなる試験を実施して、存在する異常な抗体タンパク質の型に関するより具体的な情報を提供することもできる。様々なタンパク質、特に、Mタンパク質の変化および比率の評価を用いて、骨髄腫疾患の進行および治療計画に対する応答を追跡することができる。多発性骨髄腫は、ミエローマ腫瘍細胞により分泌されるMタンパク質の大きい増加を特徴とする。
【０３９５】
骨に関する診断試験を行って、限定されるものではないが、X線および他の画像化試験、例えば、骨(骨格)測量、磁気共鳴画像化(MRI)、ならびに骨構造の変化を評価し、骨中の腫瘍の数および大きさを決定することができるコンピュータ断層撮影(CT)としても知られるコンピュータX線体軸断層撮影(CAT)などの多発性骨髄腫の診断または疑いを確認することもできる。骨髄穿刺または骨髄生検を用いて、骨髄中の形質細胞数の増加を検出することができる。穿刺には骨髄液のサンプルが必要であり、生検には固形骨組織のサンプルが必要である。両試験においては、サンプルを骨盤(臀部の骨)から取得することができる。胸骨(胸部の骨)を、骨髄穿刺に用いることもできる。
【０３９６】
多発性骨髄腫を有する患者は、典型的には、有効な治療計画を規定するのに役立つ以下の3つの群に分類される。典型的には、意味未確定の単クローン性高ガンマグロブリン血症(MGUS)は、3 g/dL未満の血清Mタンパク質レベル、10％未満の骨髄クローン性形質細胞、他のB細胞障害の証拠がない、および高カルシウム血症(血清カルシウムレベルの増加)、血清クレアチニンの増加により指摘される腎機能障害、貧血、もしくは骨病変などの関連する器官または組織損傷がないことを特徴とする。無症状性骨髄腫は、典型的には、段階Iであり、くすぶり型多発性骨髄腫(SMM)および無痛性多発性骨髄腫(IMM)が挙げられる。SMMは3 g/dL以上の血清Mタンパク質を特徴とし、IMMは10％の骨髄細胞以上の骨髄クローン性形質細胞を特徴とする。無症状性骨髄腫は、血清および／または尿中のMタンパク質を特徴とし、骨髄クローン性形質細胞もしくは形質細胞腫の存在を特徴とする段階IIの多発性骨髄腫および関連する器官もしくは組織損傷を特徴とする段階IIIの多発性骨髄腫が挙げられる。
【０３９７】
骨硬化性骨髄腫は、稀なPOEMS症候群(多発ニューロパシー、臓器肥大症、内分泌障害、単クローン性免疫グロブリン血症および皮膚病変)の成分である。発生のピークは40〜50歳である。全身特徴としては、骨格損傷、5％未満の骨髄-形質細胞、正常なCBC、血小板の増加、および臓器肥大症が挙げられる。CSFは高いタンパク質を有し、細胞が存在しない。Mタンパク質レベルは低い(<3 g/dl、中央値＝1.1 g/dl)；重鎖クラス-通常はαもしくはγ；軽鎖クラス-通常はλ；稀な尿の単クローン性および偶発性クリオグロブリン血症である。ニューロパシーは50％の患者に発生し、近位および遠位の両方の弱い感覚喪失は、小さい繊維より大きい繊維においてより多く；ならびに脱髄および長い遠位潜時を有する。
【０３９８】
くすぶり型多発性骨髄腫患者は、一般的には、数ヶ月／数年間の安定な疾患をもたらし；貧血、骨病変、腎不全もしくは高カルシウム血症がなく；骨髄およびモノクローナル血清タンパク質中に10％を超える形質細胞を有する。くすぶり型多発性骨髄腫の基準は、多発性骨髄腫の診断と適合するが、しかしながら、進行性経過の証拠はない。これらはゆっくりした進行を有する事例であり、腫瘍細胞塊は診断時に低く、S期における骨髄形質細胞の割合は低い(0.5％未満)。特徴的な臨床特性としては、3 g/dLを超える血清Mタンパク質レベルおよび／または10％以上の骨髄形質細胞；貧血、腎不全、高カルシウム血症、溶解性骨病変の非存在が挙げられる。
【０３９９】
無痛性(または無症状性)多発性骨髄腫は、通常は研究室試験のスクリーニング後に、徴候の非存在下で偶然に診断される多発性骨髄腫である。無痛性多発性骨髄腫は、くすぶり型骨髄腫と類似するが、骨病変が少なく、貧血も軽度である。無痛性多発性骨髄腫の多くの事例は、3年以内に明白な多発性骨髄腫を生じる。診断基準は、骨病変がない、もしくは1つの無症状性溶解性病変(X線調査)；IgGについては3 g/dL未満、IgAについては2 g/dLのM成分レベル、4 g/24時間未満の尿軽鎖；10 g/dlを超えるヘモグロビン、正常な血清カルシウム、2 mg/dL未満の血清クレアチニン、および感染がない以外は多発性骨髄腫と同じである。
【０４００】
22.2.18. 孤立性形質細胞腫
孤立性形質細胞腫は、良性単クローン性免疫グロブリン血症から、多発性骨髄腫に対する孤立性形質細胞腫までの形質細胞新生物の範囲の1つである。全ての孤立性形質細胞腫事例の約70％が、最終的に多発性骨髄腫をもたらす。これらの疾患は、特徴的なパラプロテインを産生するB細胞の増殖を特徴とする。孤立性形質細胞腫は、孤立性部位、通常は単一の骨または髄外組織部位におけるクローン性形質細胞の増殖をもたらす。孤立性形質細胞腫の診断基準としては、組織学的に確認される単一病変、正常な骨生検、陰性の骨格測量、貧血なし、正常なカルシウムおよび腎機能が挙げられる。多くの事例は、血清Mタンパク質(パラプロテイン)の最小的な上昇を示す。診断時の中央年齢は50〜55歳であり、多発性骨髄腫の中央年齢よりも約5〜10歳若い(C. Wilson, The Plasma Cell Dycrasias, pp. 113-144, In W. FinnおよびL. Peterson(編)、Hematopathology in Oncology, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA (2004), S. Chagantiら、Cytogenetics of Lymphoma, pp. 809-824, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauchら(編)、Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, (2004)を参照)。
【０４０１】
形質細胞腫の免疫表現型および遺伝的特徴は、多発性骨髄腫と類似するようである。
【０４０２】
22.2.19. 軽鎖疾患／軽鎖蓄積疾患(LCDD)
LCDDは、組織に蓄積した免疫グロブリン軽鎖(通常は、κ軽鎖)の過剰合成により引き起こされる形質細胞悪液質障害である。患者は一般的に器官障害、弱体化、疲労および体重減少を示す。LCDDの事例の約80％においては、モノクローナル免疫グロブリンが検出される。免疫蛍光技術を用いるモノクローナルκ軽鎖の検出は、過剰の背景染色を与える軽鎖の傾向により制限され、従って、超微細構造免疫金標識が必要であり得る(C. Wilson, The Plasma Cell Dycrasias, pp. 113-144, In W. FinnおよびL. Peterson(編)、Hematopathology in Oncology, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA (2004)を参照)。
【０４０３】
22.2.20. 形質細胞白血病(PCL)
PCL、形質細胞悪液質は、多発性骨髄腫の稀な悪性変異体である。形質細胞白血病の基準は、2 x 109/Lを超える末梢血絶対形質細胞計数または白血球の20％を超える形質細胞である。フローサイトメトリーによる細胞質軽鎖制限を用いるCD138+集団の存在の決定は、細胞質特性を有するリンパ腫からPCLを識別することができる。また、PCL細胞は、表面軽鎖の欠如、CD19およびCD22発現、ならびにCD45の発現がない、もしくは弱い発現を特徴とする。PCLの約50％の事例はCD20を発現し、約50％はCD56の発現を欠く。PCL患者において観察される遺伝子異常は、多発性骨髄腫患者について観察されるものと同じであるが、それらはPCLにおいてより高い頻度で認められる(C. Wilson, The Plasma Cell Dycrasias, pp. 113-144, In W. FinnおよびL. Peterson(編)、Hematopathology in Oncology, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA, (2004)を参照)。
【０４０４】
形質細胞白血病は2つの形態を有する：初回の診断は、骨髄腫の白血病相に基づく場合、一次形態が存在し、さもなければそれは二次形態である。一次形質細胞白血病は、より若い年齢、肝脾腫大症、リンパ節症、およびより少ない溶解性骨病変と関連するが、二次形態よりも予後不良である。形質細胞白血病患者の末梢血は、20％を超える形質細胞を有し、2000個/ml以上の絶対計数を有する。
【０４０５】
22.2.21. 意味未確定の単クローン性高ガンマグロブリン血症(MGUS)
MGUSは、電気泳動的に均一な免疫グロブリンまたは良性のM成分の存在を特徴とする比較的一般的な症状である。この症状の発生は、年齢と共に増加するようである。M成分を担持する多くの個体は、多発性骨髄腫などの悪性形質細胞悪液質を決して生じない。しかしながら、この症状を有するいくらかの個体は、関連する悪性症状を有する。無症状性である場合、患者は肝臓または脾臓の肥大および胸膜ニューロパシーを有し得る(J. Foerster, Plasma Cell Dycrasias: General Considerations, pp. 2612-2630, In Wintrobe's Clinical Hematology、第10版、G. Leeら(編)、Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1999)を参照)。
【０４０６】
MGUSを、末梢血中に循環するモノクローナル形質細胞数の増加の存在により多発性骨髄腫から識別することができる。M成分の血清学的特徴は、他の形質細胞悪液質と同一であるが、M成分の合計濃度は通常30 g/L未満である。パラプロテインは通常はIgGである；しかしながら、IgG、IgA、IgMなどの複数のパラプロテインが存在してもよい。それぞれ個々の免疫グロブリンクラスの相対量は、典型的には、正常な血清中に認められるものと比例する。タンパク血またはタンパク尿は稀である。血中および尿中のMタンパク質レベルの連続測定、ならびに臨床および研究室特性(タンパク質電気泳動など)の継続的モニタリングは、初期段階の形質細胞悪液質からMGUSを識別する最も信頼性の高い方法である(Wintrobe's Clinical Hematology、第10版、G. Leeら(編)、Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1999))。
【０４０７】
22.2.22. 成熟B細胞悪性腫瘍
さらなる実施形態においては、本発明を実施して、限定されるものではないが、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、胚中心B細胞様(GCB)DLBCL、活性化B細胞様(ABC)DLBCL、および3型DLBCLなどの広範性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、古典的および結節性リンパ球プレドミナント型などのホジキンリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫(LPL)、胃粘膜関連リンパ組織(MALT)リンパ腫などの辺縁帯リンパ腫、ならびに免疫グロブリン突然変異CLLおよび免疫グロブリン非変異CLLなどの慢性リンパ球性白血病(CLL)などの成熟B細胞悪性腫瘍を治療することができる。
【０４０８】
22.2.23. プレB細胞悪性腫瘍
さらに、CD19は、例えば、CD20よりもB細胞発達においてより早期に発現され、従って、例えば、骨髄における、プレB細胞および未成熟B細胞悪性腫瘍を治療するのに特に好適である。代表的なプレB細胞および未成熟B細胞悪性腫瘍としては、限定されるものではないが、マントル細胞リンパ腫、プレB細胞急性リンパ芽球性白血病、前駆B細胞リンパ芽球性リンパ腫、およびCD19発現を特徴とする他の悪性腫瘍が挙げられる。
【０４０９】
23. 患者の診断および移植治療計画
本発明の特定の態様に従って、本発明の組成物および方法と共に用いられる治療計画および用量を、例えば、体液性拒絶を生じる危険に患者を置く臨床徴候、またはそのような拒絶が生じる臨床的証拠などのいくつかの因子に基づいて選択する。用語「体液性」および「抗体媒介性」は、本明細書では互換的に用いられる。
【０４１０】
患者が体液性拒絶を生じる危険性を評価するための基準は、当業界における知識および技術に従って確立する。一実施形態においては、陽性補体依存的細胞傷害性または抗グロブリン増強補体依存的細胞傷害性の交叉適合試験は、患者は体液性拒絶の高い危険性を有することを示す。一実施形態においては、陽性交叉適合試験または従来の陽性補体依存的細胞傷害性もしくは抗グロブリン増強補体依存的細胞傷害性交叉適合試験は、患者が体液性拒絶の中程度の危険性を有することを示す。一実施形態においては、陰性の交叉適合試験は、患者が体液性拒絶の低い危険性を有することを示す。
【０４１１】
別の実施形態においては、移植片拒絶に対する予防を必要とする移植レシピエントを、移植前に検出可能な循環抗HLA同種抗体を有する患者または患者集団として同定することができる。別の例においては、患者または患者集団を、移植前にパネル反応性抗体を有するものとして同定する。移植後の移植レシピエント中の検出可能な循環抗HLA同種抗体の存在を用いて、本発明に従う体液性拒絶の治療を必要とする患者または患者集団を同定することもできる。体液性拒絶の治療を必要とする患者または患者集団を、移植レシピエントが体液性拒絶を生じる危険性を有するか、または既に体液性拒絶を生じていることを示す他の臨床基準に従って同定することもできる。例えば、体液性拒絶の治療を必要とする移植レシピエントを、循環抗ドナー同種抗体を特徴とする潜在的体液性応答などの体液性拒絶の初期段階において患者または集団として同定することができる。体液性拒絶の初期段階はまた、循環抗ドナー同種抗体およびC4d蓄積を特徴とするサイレントな反応、または循環抗ドナー同種抗体、C4d蓄積、および組織病理を特徴とする無症状拒絶であってもよい。後期段階においては、レシピエントを、例えば、循環抗ドナー同種抗体、C4d蓄積、組織病理、および移植片機能不全により、当業界における知識および技術に従って特性評価された体液性拒絶の臨床兆候を提供する患者または患者集団として同定する。
【０４１２】
本発明は、GVHD、拒絶症状の発現、または移植後リンパ球増殖障害の発生、重篤度、または期間を減少させるのに有効な組成物、治療用製剤、方法および計画を提供する。特定の実施形態においては、本発明の組成物および方法は、固形組織または器官移植片の虚血性再かん流傷害に対する宿主応答を弱めるのに有効である。一実施形態においては、本発明の組成物および方法は、移植レシピエントにおける移植片の生存を延長させるのに有効である。
【０４１３】
本発明は、レシピエントに対して自己、同種異系、または異種である移植片を包含する。本発明により包含される移植片の型としては、限定されるものではないが、骨髄移植片、末梢幹細胞移植片、皮膚移植片、動脈および静脈移植片、膵島細胞移植片、ならびに腎臓、肝臓、膵臓、甲状腺、および心臓の移植物などの組織および器官移植片が挙げられる。用語「移植片」および「移植物」は、本明細書では互換的に用いられる。一実施形態においては、自己移植片は、骨髄移植片、動脈移植片、静脈移植片または皮膚移植片である。一実施形態においては、同種異系移植片は、骨髄移植片、角膜移植片、腎臓移植片、膵島細胞移植片、または腎臓と膵臓の混合移植片である。一実施形態においては、移植片は異種移植片であり、可能な動物ドナーとしては、限定されるものではないが、ブタが挙げられる。本発明の組成物および方法を用いて、限定されるものではないが、人工関節、ステント、またはペースメーカー装置などの非生物学的移植片または埋込み物に対する有害な免疫応答を抑制することもできる。
【０４１４】
本発明の抗CD19抗体、組成物および方法を用いて、移植片または特定の型の組織を移植する必要性を最初に生じる特定の兆候に関係なく、GVHD、体液性拒絶、または移植後リンパ球増殖障害を治療することができる。
【０４１５】
限定されるものではないが、慢性関節リウマチ、SLE、ITP、天疱瘡関連障害、糖尿病、および強皮症などの自己免疫疾患または障害を有すると診断されたヒト被験者を治療するための本発明の治療用製剤および計画が記載されている。
【０４１６】
好適な治療計画を、特定の患者または患者集団について当業者により決定することができる。特定の実施形態においては、治療計画は、急性または慢性拒絶のための移植前の条件化計画、移植後の維持計画、または移植後の治療計画である。特定の実施形態においては、体液性応答を生じる危険性が低いと評価された患者のための計画と比較して、体液性応答を生じる危険性が高いか、または中程度であると評価された患者について、特定の計画を変化させる。
【０４１７】
特定の実施形態においては、より積極的な治療を拒絶のより後期の段階で患者のために指示すると共に、体液性拒絶の段階に従って特定の計画を変化させる。体液性拒絶の段階を、当業界の知識および技術に従って分類することができる。例えば、体液性拒絶の段階を、以下の基準：循環抗ドナー同種抗体、特に、抗HLA抗体を特徴とする段階Iの潜在的応答；循環抗ドナー同種抗体、特に、抗HLA抗体、およびC4d蓄積を特徴とするが、組織学的変化もしくは移植片機能不全を示さない段階IIのサイレントな反応；循環抗ドナー同種抗体、特に、抗HLA抗体、C4d蓄積、および組織病理を特徴とするが、移植片機能不全を示さない段階IIIの無症状性拒絶；循環抗ドナー同種抗体、特に、抗HLA抗体、C4d蓄積、組織病理、および移植片機能不全を特徴とする段階IVの体液性拒絶に従って段階I〜IVの1つとして分類することができる。
【０４１８】
用量応答曲線を当業界で標準的なプロトコルを用いて作製して、特定の計画、例えば、移植前の条件化計画、ならびにGVHD、体液性拒絶、もしくは移植後リンパ球増殖障害の予防および治療のための移植後の計画における使用のための本発明の組成物の有効量を決定することができる。一般的には、体液性拒絶を生じる危険性が高い患者および既に拒絶の1個以上の臨床指示因子を示している患者は、活発な拒絶の危険性が高いか、または活発な拒絶の指示因子を示さない患者と比較して、より長い期間に渡って投与することができるより高い用量および／またはより頻繁な投与を必要とするであろう。
【０４１９】
本発明の抗CD19抗体、組成物および方法を実行して、単独で、または他の治療剤もしくは治療計画と組み合わせて、GVHD、体液性拒絶、または移植後リンパ球増殖障害を治療または予防することができる。GVHD、体液性拒絶、または移植後リンパ球増殖障害の治療または予防のための他の治療計画は、例えば、抗リンパ球療法、ステロイド療法、抗体枯渇療法、免疫抑制療法、および血漿交換法のうちの1種以上を含んでもよい。
【０４２０】
抗リンパ球療法は、サイモグロブリンとも呼ばれる抗胸腺細胞グロブリンの移植レシピエントへの投与を含んでもよい。抗リンパ球療法はまた、T細胞表面抗原に対する1種以上のモノクローナル抗体の投与を含んでもよい。そのような抗体の例としては、限定されるものではないが、OKT3(商標)(ムロモナブ-CD3)、CAMPATH(商標)-1H (アレムツズマブ)、CAMPATH(商標)-1G、CAMPATH(商標)-1M、SIMULECT(商標)(バシリキシマブ)、およびZENAPAX(商標)(ダクリズマブ)が挙げられる。特定の実施形態においては、抗リンパ球療法は、限定されるものではないが、RITUXAN(商標)(リツキシマブ)などのB細胞に対する1種以上のさらなる抗体を含む。
【０４２１】
ステロイド療法は、コルチゾール、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、およびインドメタシンからなる群より選択される1種以上のステロイドの移植レシピエントへの投与を含んでもよい。1種以上のステロイドは、限定されるものではないが、コルチゾール、プレドニゾン、およびメチルプレドニゾロンなどのコルチコステロイドであってよい。
【０４２２】
抗体枯渇療法は、例えば、静脈内免疫グロブリンの移植レシピエントへの投与を含んでもよい。抗体枯渇療法はまた、移植前に、ex vivoで移植片に適用される免疫吸着療法を含んでもよい。免疫吸着を、例えば、Aタンパク質親和性、または抗CD3抗体、抗CD19抗体、抗CD20抗体、および抗CD19抗体などのT細胞もしくはB細胞表面マーカーに対する抗体を用いる抗体に基づく親和性技術などの任意の好適な技術を用いて達成することができる。
【０４２３】
免疫抑制療法は、サイトカイン転写(例えば、シクロスポリンA、タクロリムス)、ヌクレオチド合成(例えば、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル)、増殖因子シグナル伝達(例えば、シロリムス、ラパマイシン)、およびT細胞インターロイキン2受容体(例えば、ダクリズマブ、バシリキシマブ)の阻害剤などの1種以上の免疫抑制剤の投与を含んでもよい。特定の実施形態においては、本発明の組成物および方法と共に用いられる免疫抑制剤としては、以下の1種以上：アドリアマイシン、アザチオプリン、ブスルファン、シクロホスファミド、シクロスポリンA(「CyA」)、サイトキシン、フルダラビン、5-フルオロウラシル、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル(MOFETIL)、非ステロイド性抗炎症剤(NSAID)、ラパマイシン、およびタクロリムス(FK506)が挙げられる。免疫抑制剤はまた、補体、例えば、可溶性補体受容体-1、抗C5抗体の阻害剤、または例えば、Buerkeら、J. Immunol., 167:5375-80 (2001)に記載のような、C1の小分子阻害剤を含んでもよい。
【０４２４】
一実施形態においては、本発明の組成物および方法を、限定されるものではないが、タクロリムスおよびミコフェノール酸モフェチル療法、免疫吸着、静脈内免疫グロブリン療法、および血漿交換などの体液性拒絶を抑制するための1種以上の治療計画と共に用いる。
【０４２５】
23.1. 診断および臨床基準
本発明は、ヒト移植レシピエントにおけるGVHD、体液性拒絶、および移植後リンパ球増殖障害を治療および予防するための抗体、組成物および方法を提供する。本発明の組成物および方法を、移植の必要性を生じた特定の兆候に関係なく用いることができる。同様に、GVHD、体液性拒絶、および移植後リンパ球増殖障害の治療および予防のための本発明の組成物および方法の使用は、移植について意図されるか、または移植された特定の型の組織により制限されない。
【０４２６】
一実施形態においては、本発明は、移植レシピエントが体液性拒絶を生じる危険性が高い患者または患者集団として同定されるヒト移植レシピエントにおける体液性拒絶の予防のための組成物および方法を提供する。そのような患者を、「感作された」と呼ぶこともできる。感作された患者の同定のための基準は、当業者には公知である。そのような基準としては、例えば、HLA抗原、例えば、抗HLA同種抗体に対する検出可能なレベルの循環抗体を有する患者が挙げられる。また、そのような基準としては、以前に移植を受けた患者、妊娠した患者、または複数回の輸血を受けた患者も挙げられる。体液性拒絶の危険性が高い患者としては、不完全なドナー-レシピエントHLA適合を有する患者、および移植がABO不適合である患者も挙げられる。感作された個体は、予備治療または移植前の条件化のための候補である。感作された個体はまた、体液性拒絶の予防のための移植後の維持計画のための候補でもある。
【０４２７】
一実施形態においては、本発明の抗体、組成物、および方法は、急性もしくは慢性拒絶の治療のための治療計画を含むか、またはそれと共に用いられる。特定の実施形態においては、拒絶は段階I、段階II、段階III、または段階IVの体液性拒絶として特性評価される。
【０４２８】
一実施形態においては、本発明の抗体、組成物、および方法は、初期段階の体液性拒絶の治療のための治療計画を含むか、またはそれと共に用いられる。特定の実施形態においては、初期段階の体液性拒絶は、段階I、II、またはIIIの拒絶である。初期段階の体液性拒絶の臨床兆候は、当業界の知識および技術に従って決定され、例えば、循環ドナー特異的抗HLA抗体の患者における発生、移植片生検におけるC4dおよびC3d蓄積などの抗体活性の補体マーカーの存在、ならびに移植片生検における抗HLA抗体の存在が挙げられる。初期段階の体液性拒絶の他の指示因子は、当業者には公知であり、例えば、抗内皮抗体、特に、抗ビメンチン抗体の発生、および非古典的MHCクラスI関連A鎖(MICA)同種抗体の発生が挙げられる。
【０４２９】
一実施形態においては、本発明の組成物および方法は、部分的には移植片機能不全を特徴とする体液性拒絶の治療のための治療計画を含むか、またはそれと共に用いられる。特定の実施形態においては、体液性拒絶のための治療を必要とする患者または患者集団を、移植片機能不全のための当業界で公知の基準に従って同定する。特定の型の移植片に関するそのような基準の例を、以下の節に提供する。他の実施形態においては、体液性拒絶のための治療を必要とする患者または患者集団を、組織学的基準などの組織移植片の型に特有である他の基準に従って同定する。そのような基準の例も、以下の節に提供する。
【０４３０】
23.2. 骨髄移植
本発明の組成物および方法は、骨髄移植レシピエントにおけるGVHD、体液性拒絶、および移植後リンパ球増殖障害を治療または予防するのに有用である。一実施形態においては、本発明の組成物および方法は、移植前の条件化計画を含むか、またはそれと共に用いられる。
【０４３１】
一実施形態においては、本発明の組成物および方法を用いて、移植前に骨髄移植片からB細胞を枯渇させる。移植片は、任意の好適な起源、例えば、臍帯血幹細胞、末梢血幹細胞、または骨髄タップに由来するものであってよい。末梢血幹細胞を、好適な条件化計画の後にドナー血液から収穫することができる。好適な計画は当業界で公知であり、例えば、以下のもの：NEUPOGEN、GM-CSFなどのサイトカイン、低用量化学療法計画、およびケモカイン療法の1種以上をドナーに投与した後、ドナー血液を収穫することを含んでもよい。移植片は、移植レシピエントに対して同種であるか、または自己のものであってよい。また、移植片は異種のものであってもよい。
【０４３２】
組成物および方法は、骨髄移植に関する造血兆候が存在するいくつかの内容において有用であってよい。一実施形態においては、自己骨髄移植片は、限定されるものではないが、急性リンパ芽球性白血病(「ALL」)または非ホジキンリンパ腫などのB細胞白血病またはリンパ腫について示され、本発明の組成物および方法を、移植片に夾雑する残留悪性腫瘍の枯渇のために用いることができる。一実施形態においては、自己骨髄移植は、ウイルス感染、例えば、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、またはサイトメガロウイルス(CMV)と関連するウイルス感染を消失させることができない患者について示され、本発明の組成物および方法を用いて、該ウイルスを担持し得るB細胞の移植片を枯渇させることができる。別の実施形態においては、移植片は、同種異系移植片であり、本発明の組成物および方法を、GVHDに対する予防として移植片からドナーB細胞を枯渇させるのに用いることができる。
【０４３３】
一実施形態においては、前記兆候はB細胞関連自己免疫症状であり、本発明の組成物および方法を用いて、化学療法または放射線療法条件化計画を必要としない患者から、有害なB細胞を枯渇させることができる。一実施形態においては、本発明の組成物を、本発明の組成物の非存在下で投与される用量よりも、低い用量の1種以上の化学療法剤、または低い用量の放射線を含む、化学療法または放射線療法計画と共に投与する。一実施形態においては、患者は、化学療法または放射線療法に続いて、移植片から、本明細書に記載の組成物および方法を用いて、移植前に有害なB細胞を枯渇させた、自己骨髄移植を受ける。
【０４３４】
骨髄移植を必要とするか、またはそれから利益を得る可能性がある患者または患者集団を、当業界の知識および技術に従って同定する。骨髄移植のための候補であってよい患者の例としては、癌または自己免疫疾患もしくは障害の治療のための化学療法または放射線療法を受けた患者、および免疫系の細胞中に存在するウイルス感染を消失させることができない患者が挙げられる。
【０４３５】
23.3. 肝臓移植
本発明の組成物および方法は、肝臓移植レシピエントにおけるGVHD、体液性拒絶、および移植後リンパ球増殖障害を治療または予防するのに有用である。特定の実施形態においては、拒絶は、急性または慢性拒絶である。一実施形態においては、本発明の組成物および方法を、肝臓移植レシピエントにおけるGVHD、体液性拒絶、および移植後リンパ球増殖障害の予防に用いる。一実施形態においては、本発明の組成物および方法は、移植前の条件化計画を含むか、またはそれと共に用いられる。一実施形態においては、本発明の組成物を移植レシピエントに投与する。一実施形態においては、本発明の組成物を、移植前に、ex vivoで移植片と接触させる。
【０４３６】
肝臓移植片は、当業界の知識および技術に従って決定される任意の好適な起源に由来するものであってよい。一実施形態においては、肝臓はHLA適合同種異系移植片である。別の実施形態においては、肝臓はブタドナーに由来する異種移植片である。一実施形態においては、肝臓をex vivoで用いて、患者の血液を濾過する、例えば、体外かん流する。体外かん流は、患者を、体外で維持された肝臓に外科的に接続する肝臓透析の形態である。この手順を、「生体人工肝臓」と呼ぶこともある。この実施形態に従って、本発明の組成物および方法を用いて、患者の血液を汚染し得る肝臓抗原に対する抗体の発生を防止する。
【０４３７】
一実施形態においては、本発明の組成物および方法は、GVHD、体液性拒絶、および移植後リンパ球増殖障害の治療および予防のための改良された治療計画を含む。特定の実施形態においては、本発明の組成物および方法は、改良が伝統的な免疫抑制剤と関連する合併症の発生および／または重篤度の低下にある、改良された治療計画を含む。一実施形態においては、腎臓毒性、肝臓毒性、および多毛症の発生および／または重篤度が、シクロスポリンAまたは他のカルシニュリン阻害剤に依存する伝統的計画と比較して低下する。一実施形態においては、肥満、骨形成異常症、糖尿病ならびに細菌およびウイルス感染に対する罹患性の発生および／または重篤度が、コルチコステロイドに依存する伝統的計画と比較して低下する。
【０４３８】
一実施形態においては、本発明の組成物および方法を、抗リンパ球抗体療法の非存在下で用いられる用量よりも低用量の1種以上の伝統的な免疫抑制剤と共に用いる。この低用量は、1種以上の伝統的な免疫抑制剤に関連する1種以上の合併症の発生および／または重篤度の低下をもたらし得る。
【０４３９】
肝臓移植を必要とするか、またはそれから利益を得る可能性がある患者または患者集団を、当業界の知識および技術に従って同定する。肝臓移植の候補であってよい患者の例としては、以下の症状、疾患、または障害：急性肝不全、アミロイドーシス、ビリルビン排出障害、胆道閉鎖症、Budd-Chiari症候群、慢性活動性自己免疫性肝炎、肝硬変(B型肝炎およびC型肝炎などのウイルス性肝炎、アルコール性肝硬変、もしくは原発性胆汁性肝硬変と関連する)、胆管炎、先天性因子VIIIもしくはIX障害、銅代謝障害、嚢胞性線維症、グリコーゲン合成、高コレステロール血症、リピドース、ムコ多糖症、原発性硬化性胆管炎、ポルフィリン代謝障害、プリンおよびピリミジン代謝障害、ならびに特に、肝臓および肝臓内胆管、胆管系、胆汁道、もしくは消化系の原発性良性および悪性新生物のうちの1種以上を有する人が挙げられる。
【０４４０】
肝臓移植を必要とするか、またはそれから利益を得る可能性がある患者または患者集団の同定のための臨床基準を、当業界の知識および技術に従って決定することができる。そのような基準としては、例えば、以下の徴候の1つ以上：疲労、体重減少、上腹部疼痛、純粋性(purities)、黄疸、肝臓肥大、変色尿、アルカリホスファターゼおよびγグルタミルペプチダーゼ活性の上昇、ビリルビンレベルの上昇、血清アルブミンの低下、肝臓特異的酵素の上昇、低い胆汁産生、血液尿窒素の増加、クレアチニンの増加ならびに／または抗好中球細胞質抗体(ANCA)力価の存在、静脈瘤出血の再発、難治性腹水、自発的細菌性腹膜炎、難治性脳症、重篤な黄疸、合成機能障害の悪化、突然の整理機能低下、ならびに劇症肝炎が挙げられる。
【０４４１】
23.4. 腎臓移植
本発明の組成物および方法は、腎臓移植レシピエントにおけるGVHD、体液性拒絶、および移植後リンパ球増殖障害を治療または予防するのに有用である。本明細書で用いられる用語「腎臓移植」は、腎臓の移植ならびに腎臓および膵臓の混合移植を包含する。特定の実施形態においては、拒絶は急性拒絶または慢性拒絶を特徴とする。
【０４４２】
一実施形態においては、本発明の組成物および方法は、移植前の条件化計画を含むか、またはそれと共に用いられる。一実施形態においては、単回用量の本発明の1種以上の組成物は、前記患者または患者集団におけるパネル反応性抗体を減少させ、B細胞を枯渇させるのに有効である。別の実施形態においては、複数回用量の本発明の1種以上の組成物は、前記患者または患者集団におけるパネル反応性抗体を減少させ、B細胞を枯渇させるのに有効である。一実施形態においては、単回用量の本発明の1種以上の組成物を、1種以上の免疫抑制剤と共に投与し、これは前記患者または患者集団におけるパネル反応性抗体を減少させ、B細胞を枯渇させるのに有効である。
【０４４３】
特定の実施形態においては、本発明の組成物および方法は、腎臓移植を受けた患者におけるGVHDおよび移植片拒絶を治療または予防するためのものである。一実施形態においては、患者は拒絶の臨床兆候を依然として示していない。関連する実施形態においては、本発明の組成物および方法は、移植レシピエントにおける移植片拒絶の予防のための維持計画を含むか、またはそれと共に用いられる。一実施形態においては、本発明の組成物および方法は、無症状性体液性拒絶の治療のためのものである。関連する実施形態においては、無症状性体液性拒絶のための治療を必要とする患者または患者集団は、移植片からの生検におけるCd4蓄積の検出または循環抗HLA抗体の検出により示される。
【０４４４】
一実施形態においては、本発明の組成物および方法は、移植レシピエントにおける急性または慢性拒絶症状の発現の治療のための治療計画を含むか、またはそれと共に用いられる。一実施形態においては、急性または慢性拒絶症状の発現の治療を必要とする患者または患者集団を、拒絶の1種以上の臨床指示因子の検出により同定する。特定の実施形態においては、拒絶の1種以上の臨床指示因子を、移植の1〜6週間後に検出する。一実施形態においては、拒絶の1種以上の臨床指示因子を、移植の6、12、18、24、36、48、または60ヶ月後に検出する。一実施形態においては、急性拒絶は生検により確認された急性体液性拒絶である。
【０４４５】
一実施形態においては、本発明の1種以上の組成物は、急性拒絶の治療のための治療計画を含む。特定の実施形態においては、治療計画はさらに、1種以上の以下のもの：血漿交換法、タクロリムス／ミコフェノール酸、静脈内免疫グロブリン、Aタンパク質を用いる免疫吸着、および抗CD20抗体を含む。一実施形態においては、患者は、拒絶の発生前に免疫抑制プロトコル上にあった。特定の実施形態においては、免疫抑制プロトコルは、シクロスポリン、アザチオプリン、およびステロイド療法の1つ以上を含む。
【０４４６】
急性体液性拒絶の臨床指示因子は当業界で公知であり、例えば、腎臓機能の突然の重篤な悪化、乏尿症の発生、および腎臓かん流の悪化が挙げられる。さらなる指示因子としては、例えば、生検上での傍尿細管毛細血管中の炎症細胞および循環ドナー特異的同種抗体が挙げられる。一実施形態においては、患者は、腎臓同種異系移植片の体液性拒絶に関する以下の診断基準：(1)急性組織損傷の形態学的証拠；(2)動脈フィブリノイド壊死中のC4d蓄積もしくは免疫グロブリンおよび補体などの抗体作用の証拠；ならびに(3)ドナーHLA抗原もしくはドナー内皮抗原に対する検出可能な循環抗体の1つ以上を示す。一実施形態においては、患者は、上記診断基準の3つ全てを示す。
【０４４７】
一実施形態においては、患者は、急性体液性拒絶の前記診断基準の1つ以上を示し、本発明の組成物を以下の免疫抑制剤：静脈内免疫グロブリン、抗胸腺細胞グロブリン、抗CD20抗体、ミコフェノール酸モフェチル、またはタクロリムスの1つ以上と共に用いて、急性体液性拒絶を治療する。別の実施形態においては、本発明の組成物を、1種以上の免疫抑制剤ならびに、血漿交換または免疫吸着などの患者からの同種抗体の除去のための手順と共に用いる。
【０４４８】
一実施形態においては、本発明の組成物および方法は、慢性腎臓同種移植片拒絶の治療のための治療計画を含むか、またはそれと共に用いる。一実施形態においては、本発明の1種以上の組成物を単独で、または例えば、抗CD154(CD40L)、タクロリムス、シロリムス、およびミゾリビンなどの1種以上の免疫抑制剤と共に用いる。一実施形態においては、1種以上の抗CD19抗体を、タクロリムスおよびミコフェノール酸と共に用いる。
【０４４９】
腎臓における慢性拒絶の臨床指示因子は当業界で公知であり、例えば、血管内膜単核細胞を含む動脈内膜線維症(慢性同種移植血管障害)、糸球体基底膜の複製(慢性同種移植糸球体症)、傍尿細管基底膜の層化、傍尿細管毛細血管中のC4d、および検出可能な循環ドナーHLA反応性抗体が挙げられる。一実施形態においては、本発明の組成物および方法は、移植片病変が発生する前に慢性拒絶を治療するための治療計画を含むか、またはそれと共に用いられる。
【０４５０】
別の実施形態においては、治療を必要とする患者または患者集団を、移植糸球体症の1つ以上の臨床指示因子を有するものとして同定する。関連する実施形態においては、本発明の組成物は、1種以上の治療剤を含む治療計画を含むか、またはそれと共に用いられる。特定の実施形態においては、治療計画は、腎臓機能を安定化させ、移植片拒絶を阻害するのに有効である。特定の実施形態においては、1種以上の治療剤としては、アンギオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤および／もしくは受容体アンタゴニスト、静脈内免疫グロブリン、抗胸腺細胞グロブリン、抗CD20抗体、ミコフェノール酸モフェチル、またはタクロリムスが挙げられる。抗CD19抗体を、他の治療剤と共に、またはそれらを用いずに、ミコフェノール酸モフェチルおよびタクロリムスと組み合わせて用いることができる。血漿交換を、治療計画の一部として用いることもできる。
【０４５１】
腎臓移植を必要とするか、またはそれから利益を得る可能性がある患者または患者集団を、当業界の知識および技術に従って同定する。腎臓移植の候補であってよい患者の例としては、アミロイドーシス、糖尿病(I型もしくはII型)、糸球体疾患(例えば、糸球体腎炎)、痛風、溶血性尿毒症症候群、HIV、遺伝性腎臓病(例えば、多発性嚢胞腎、先天性閉塞性尿路疾患、シスチン蓄積症、もしくはプルーンベリー症候群)、他の腎臓病(例えば、後天性閉塞性尿路疾患、急性尿細管壊死、急性間質性腎炎)、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、または鎌状赤血球貧血を有すると診断された患者が挙げられる。腎臓移植の他の候補としては、インスリン欠損症、高血圧、重篤な損傷もしくは熱傷、大手術、心臓病もしくは心臓発作、肝臓病もしくは肝不全、血管疾患(例えば、進行性全身硬化症、腎動脈血栓症、強皮症)、膀胱尿管逆流現象、および特定の癌(例えば、偶発的癌腫、リンパ腫、多発性骨髄腫、腎細胞癌、ウィルムス腫瘍)を有する患者が挙げられる。腎臓移植の他の候補としては、例えば、ヘロイン使用者、以前に腎臓もしくは膵臓移植片を拒絶した人、および抗生物質、シクロスポリンを含む治療計画、または化学療法を受けている人が挙げられる。
【０４５２】
腎臓移植を必要とするか、またはそれから利益を受ける可能性がある患者または患者集団の同定のための臨床基準を、当業界の知識および技術に従って決定することができる。そのような基準としては、例えば、以下のもの：尿の問題、出血、あざができやすいこと、疲労、混乱、吐き気および嘔吐、食欲減退、青い皮膚(貧血に由来する)、筋肉、関節、横腹、および胸部における疼痛、骨疼痛もしくは骨折、ならびに掻痒のうちの1つ以上が挙げられる。
【０４５３】
23.5. 心臓移植
本発明の組成物および方法は、心臓移植レシピエントにおけるGVHD、体液性拒絶、および移植後リンパ球増殖障害を治療または予防するのに有用である。特定の実施形態においては、拒絶は急性または慢性拒絶である。一実施形態においては、本発明の組成物および方法は、移植前の条件化計画を含むか、またはそれと共に用いられる。
【０４５４】
特定の実施形態においては、本発明の組成物および方法は、心臓移植レシピエントにおける急性体液性拒絶の治療のための治療計画を含むか、またはそれと共に用いられる。特定の実施形態においては、治療計画はさらに、以下のもの：血漿交換、静脈内免疫グロブリン、および抗CD20抗体療法のうちの1種以上を含む。急性体液性拒絶の治療を必要とする患者または患者集団を、急性体液性拒絶の臨床兆候の1つ以上の検出により同定する。急性体液性拒絶の臨床指示因子の例としては、以下のもの：ショック、低血圧、心拍出量の低下により定義される血行動態機能障害、および肺毛細血管楔入圧もしくは肺動脈圧の上昇のうちの1つ以上が挙げられる。特定の実施形態においては、急性体液性拒絶は、移植後6、12、18、24、36、48、または60ヶ月以内に診断される。
【０４５５】
一実施形態においては、本発明の組成物および方法は、心臓移植レシピエントにおける拒絶の予防のための治療計画を含むか、またはそれと共に用いられる。一実施形態においては、拒絶に対する予防を必要とする移植レシピエントを、以下の危険因子：女性、サイトメガロウイルス血清陽性、パネル反応性抗体に対する応答の上昇、陽性移植前および／もしくは移植後交叉適合試験、ならびに免疫抑制剤による前感作のうちの1つ以上を有する患者または患者集団として同定する。
【０４５６】
一実施形態においては、本発明の組成物および方法は、心臓移植レシピエントにおける移植片劣化の治療または予防のためのものである。一実施形態においては、移植片劣化の治療、またはそれに対する予防を必要とする移植レシピエントを、体液性拒絶の以下の臨床兆候：毛細血管中の免疫グロブリン、C1q、C3、および／もしくはC4dの蓄積、毛細血管内のCD68陽性細胞の証拠、ならびに生検時の炎症細胞による移植片の浸潤の証拠のうちの1つ以上を有する患者または患者集団として同定する。一実施形態においては、本発明の組成物を、心臓移植レシピエントにおける移植片劣化を治療するための以下の免疫抑制剤：静脈内免疫グロブリン、抗胸腺細胞グロブリン、抗CD20抗体、ミコフェノール酸モフェチル、またはタクロリムスのうちの1つ以上と共に用いる。別の実施形態においては、抗CD19抗体を、1種以上の免疫抑制剤および血漿交換もしくは免疫吸着などの患者からの同種抗体の除去のための手順と共に用いることができる。
【０４５７】
一実施形態においては、本発明の組成物および方法は、慢性心臓拒絶、例えば、移植片冠動脈疾患とも呼ばれる、慢性同種異系移植片血管障害の治療のための治療計画を含むか、またはそれと共に用いられる。別の実施形態においては、本発明の組成物および方法は、危険性のある患者または患者集団における移植片冠動脈疾患の予防のための治療計画を含むか、またはそれと共に用いられる。移植片冠動脈疾患を生じる危険性がある患者または患者集団を同定するための基準としては、例えば、あまり適合しない移植片を有する患者、循環抗HLA抗体を生じる患者、および心臓移植直後の体液性拒絶の1つ以上の臨床指示因子を生じる患者が挙げられる。
【０４５８】
心臓移植を必要とするか、またはそれから利益を得る可能性がある患者または患者集団を、当業者の知識および技術に従って同定する。心臓移植の候補であってよい患者の例としては、以下のいずれかの疾患および障害：冠動脈疾患、心筋症(心臓の非炎症性疾患)、鬱血性心不全を有する心臓弁疾患、他の療法に応答しない命にかかわる異常な心拍、特発性心筋症、虚血性心筋症、拡張型心筋症、虚血性心筋症、および従来の治療法が存在しないか、または従来の治療法が失敗した先天性心臓病を有すると診断された患者が挙げられる。
【０４５９】
心臓移植を必要とするか、またはそれから利益を得る可能性がある患者または患者集団の同定のための臨床基準を、当業界の知識および技術に従って決定することができる。そのような基準としては、例えば、以下のもの：25％未満の駆出率、従来の治療法に応答しない難治性アンギナもしくは悪性心臓不整脈、および2ウッド単位未満の肺血管耐性のうちの1つ以上が挙げられる。さらに、心臓移植を必要とする患者または患者集団を、当業界の知識および技術に従って、一連の試験を実施することにより同定することができる。そのような試験としては、例えば、安静時およびストレス時の心エコー図、EKG、血中クレアチニンレベルのアッセイ、冠動脈造影法、ならびに右心および左心カテーテル法などの心肺機能評価が挙げられる。
【０４６０】
23.6. 肺移植
本発明の組成物および方法は、肺移植レシピエントにおけるGVHD、体液性拒絶、および移植後リンパ球増殖障害を治療または予防するのに有用である。特定の実施形態においては、拒絶は急性または慢性拒絶として特性評価される。一実施形態においては、本発明の組成物および方法は、移植前の条件化計画を含むか、またはそれと共に用いられる。
【０４６１】
肺移植を必要とするか、またはそれから利益を得る可能性がある患者または患者集団を、当業者の知識および技術に従って同定する。肺移植の候補であってよい患者の例としては、以下の疾患または症状：気管支拡張症、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、アイゼンメンゲル症候群もしくはアイゼンメンゲル症候群を有する先天性心疾患、肺気腫、肺の好酸球性肉芽腫、またはヒスチオサイトーシスX、吸入／熱傷性外傷、リンパ脈管筋腫症(LAM)、原発性肺高血圧症、肺線維症(肺の瘢痕化)、またはサルコイドーシスのうちの1つを有する患者が挙げられる。
【０４６２】
肺移植を必要とするか、またはそれから利益を得る可能性がある患者または患者集団の同定のための臨床基準を、当業界の知識および技術に従って決定することができる。そのような基準としては、例えば、以下のもの：慢性閉塞性肺疾患(COPD)および以下の指示因子：気管支拡張剤投与後のFEV1が25％未満であると予測されること、安静時の低酸素血症、すなわち、55〜60 mm Hg未満のPaO2、高炭酸症、二次性肺高血圧症、FEV1の急速な下落率、もしくは命にかかわる悪化の1つ以上を特徴とするα1-抗トリプシン欠損性肺気腫；以下の指示因子：60〜65％未満の肺活量(VC)およびTLCが予測されること、および安静時の低酸素血症のうちの1つを特徴とする特発性肺線維症；医学的治療中の臨床的、X線写真的、もしくは生理学的進行を特徴とする二次性肺高血圧症；以下の指示因子：NYHA機能的クラスIIIもしくはIV、10 mm Hgを超える平均右動脈圧、50 mm Hgを超える平均肺動脈圧、2.5 L/分/m2未満の心係数、および長期間のプロスタサイクリン注入を用いる治療の失敗のうちの1つ以上を特徴とする原発性肺高血圧症のうちの1つ以上が挙げられる。
【０４６３】
23.7. 移植後リンパ球増殖障害
移植の成功にとって必要な免疫抑制は、B細胞起源の移植後リンパ球増殖障害を生じ得る。一般的には、移植後リンパ球増殖障害は、エプスタイン・バーウイルス感染細胞と関連する。移植後リンパ球増殖障害(PTLD)は、重篤度において、良性の自己限定型単核球症症候群から、悪性非ホジキンリンパ腫までの範囲であってよい。本発明の組成物および方法を用いて、任意の移植片から生じるPTLDを治療することができる。移植は、固形器官移植、例えば、心臓移植、肝臓移植、腎臓移植、または腎臓-膵臓混合移植であってもよい。一実施形態においては、本発明の組成物および方法を用いて、他の免疫抑制療法の一時的停止または減少を含む治療計画の一部としてPTLDを治療する。
【０４６４】
一実施形態においては、抗CD19抗体組成物を、以下のもの：高用量静脈内ガンマグロブリン、サイトカイン、抗ウイルス剤、および抗CD20モノクローナル抗体のうちの1つ以上などの治療計画の一部として投与する。この治療計画は、免疫抑制療法の一時的停止または減少を含んでもよい。一実施形態においては、静脈内ガンマグロブリンを、0.4 g/kgの日用量で1〜5日間、好ましくは、3日間で投与し、サイトカインは少なくとも7日間投与されるインターフェロンαである。一実施形態においては、1種以上のサイトカインを、前記計画において用いる。一実施形態においては、1種以上の抗ウイルス剤を、前記計画において用いる。抗ウイルス剤を、当業者には公知の任意の好適な抗ウイルス剤から選択することができる。一実施形態においては、抗ウイルス剤はアシクロビルまたはガンシクロビルである。抗ウイルス剤を、少なくとも1または2週間投与することができる。抗ウイルス剤を、より長期間、例えば、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、または5ヶ月間投与することもできる。
【０４６５】
24. 患者の診断および治療計画：自己免疫疾患
本発明の特定の態様に従って、本発明の組成物および方法と共に用いられる治療計画および用量を、限定されるものではないが、治療する自己免疫疾患または障害の段階などのいくつかの因子に基づいて選択する。当業者であれば、好適な治療計画を、患者または患者集団において自己免疫疾患または障害の特定の段階について決定することができる。用量応答曲線を当業界で標準的なプロトコルを用いて作製して、様々な段階の自己免疫疾患または障害を有する患者を治療するための本発明の組成物の有効量を決定することができる。一般的には、より高い活性の自己免疫疾患または障害を有する患者は、より低い活性の自己免疫疾患または障害を有する患者と比較して、より長時間投与することができるより高い用量および／またはより頻繁な投与を必要とするであろう。
【０４６６】
本明細書に記載の抗CD19抗体、組成物および方法を実施して、自己免疫疾患または障害を治療することができる。用語「自己免疫疾患または障害」とは、被験者自身の細胞、組織および／もしくは器官に対する被験者の免疫反応により引き起こされる細胞、組織および／もしくは器官の損傷を特徴とする被験者における症状を指す。用語「炎症疾患」は用語「炎症障害」と互換的に用いられ、限定されるものではないが、慢性炎症などの炎症を特徴とする被験者における症状を指す。自己免疫障害は、炎症と関連してもしなくてもよい。さらに、炎症は自己免疫障害により引き起こされても、そうでなくてもよい。かくして、特定の障害を、自己免疫障害および炎症障害の両方として特性評価することができる。自己免疫疾患または障害の例としては、限定されるものではないが、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック病皮膚炎、慢性疲労免疫不全症候群(CFIDS)、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、Churg-Strauss症候群、瘢痕性類天疱瘡、CREST症候群、寒冷凝集素症、クローン病、円板状エリテマトーデス、本態性混合型クリオグロブリン血症、糖尿病、好酸球性筋膜炎、線維筋痛-線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、特発性肺線維症、特発性／自己免疫性血小板減少性紫斑病(ITP)、IgAニューロパシー、若年性関節炎、扁平苔癬、紅斑性狼瘡、メニエール病、混合型結合組織疾患、多発性硬化症、1型もしくは免疫介在型糖尿病、重症筋無力症、天疱瘡関連障害(例えば、尋常性天疱瘡)、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノルド減少、ロイター症候群、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、全身性エリテマトーデス(SLE)、スイート症候群、スティル病、紅斑性狼瘡、高安動脈炎、側頭動脈炎、巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、疱疹状皮膚炎、血管炎、白斑、およびヴェーゲナー肉芽腫症などの血管炎が挙げられる。炎症性障害の例としては、限定されるものではないが、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、アレルギー障害、敗血性ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、移植片対宿主疾患、じんま疹、フォークト・小柳・原田症候群および慢性ウイルスもしくは細菌感染の結果生じる慢性炎症が挙げられる。
【０４６７】
抗CD19免疫療法は、自己免疫疾患または障害の治療のための単一の治療剤としての抗CD19抗体の投与を包含する。一実施形態においては、本発明の抗CD19免疫療法は、in vitroで刺激されたB細胞増殖を阻害することができる抗CD19抗体の投与を包含する。別の実施形態においては、本発明の抗CD19免疫療法は、Fc変異体が、比較可能な非変異体分子と比較して、1個以上のFcリガンドに対する結合親和性が変化したFc変異体抗CD19抗体の投与を包含する。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19免疫療法は、Fc変異体が、比較可能な非変異体Fcドメインと比較して、Fcγ受容体IIBに対する結合が増強したFc変異体抗CD19抗体の投与を包含する。
【０４６８】
抗CD19免疫療法はさらに、自己免疫疾患または障害の治療のための単一の治療剤としての抗CD19二特異的抗体の投与を包含する。一実施形態においては、本発明の抗CD19免疫療法は、第1抗原がヒトCD19であり、第2抗原がFcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIAおよび／またはFcγRIVからなる群より選択されるFcγ受容体である、第1および第2抗原に特異的に結合することができる抗CD19二特異的抗体の投与を包含する。さらなる実施形態においては、本発明の抗CD19免疫療法は、ヒトCD19とFcγRIIBに特異的に結合することができる抗CD19二特異的抗体の投与を包含する。
【０４６９】
CD19は未成熟B細胞上で発現され、従って、抗CD19 mAbは、例えば、骨髄中でプレB細胞および未成熟B細胞を枯渇させるのに特に好適であり得る。
【０４７０】
24.1. 自己免疫疾患または障害の診断
自己免疫疾患または障害の診断は、それぞれの型の自己免疫疾患または障害が患者間で異なる徴候を示す点で複雑である。この徴候の不均一性は、典型的には、臨床診断を達成するのに複数の因子が用いられることを意味する。一般的には、医師は、限定されるものではないが、自己抗体の存在、サイトカインレベルの上昇、特定の器官の機能不全、皮膚発疹、関節の腫れ、疼痛、骨再形成、および／または自己免疫疾患もしくは障害の主要な指示因子としての動きの喪失などの因子を使用する。RAおよびSLEなどの、特定の自己免疫疾患または障害について、診断のための標準物は当業界で公知である。特定の自己免疫疾患または障害について、疾患の段階が特性評価されており、当業界でよく知られている。自己免疫疾患および障害ならびに疾患の段階および活動の規模および当業界でよく知られる疾患の重篤度を診断するためのこれらの業界で認識された方法を用いて、本発明の組成物および方法を用いる自己免疫疾患または障害の治療を必要とする患者および患者集団を同定することができる。
【０４７１】
24.2. 自己免疫疾患または障害を診断するための臨床基準
様々な自己免疫疾患または障害に関する診断基準は当業界で公知である。歴史的には、典型的には、診断は身体徴候の組合せに基づく。より最近では、遺伝子発現プロファイリングなどの分子技術を適用して、自己免疫疾患または障害の分子的定義を開発してきた。特定の自己免疫疾患または障害の臨床診断のための方法の例を以下に提供する。他の好適な方法は、当業者には明らかであろう。
【０４７２】
特定の実施形態においては、自己免疫疾患活動のレベルが低い患者または初期段階の自己免疫疾患(段階が認識される疾患)を有する患者を、抗CD19抗体組成物および方法を用いる治療のために同定することができる。自己免疫疾患の早期診断は、全身徴候および疾患間の徴候の重複に起因して困難である。そのような実施形態においては、初期段階で治療された患者または自己免疫疾患活動のレベルが低い患者は、自己免疫疾患または障害の少なくとも1個の徴候を含む徴候を有する。関連する実施形態においては、初期段階で治療された患者または自己免疫疾患のレベルが低い患者は、自己免疫疾患または障害の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、もしくは15個の徴候を含む徴候を有する。徴候は任意の自己免疫疾患および障害のもの、またはその組合せであってよい。自己免疫疾患および障害の徴候の例を以下に記載する。
【０４７３】
24.3. 慢性関節リウマチ
慢性関節リウマチは、主に関節の内側、または滑膜の炎症を特徴とする慢性疾患である。それは長期間の関節損傷を誘導し、慢性疼痛、機能の喪失および身体障害をもたらし得る。慢性関節リウマチの治療を必要とする患者または患者集団の同定は作業である。慢性関節リウマチの陽性または陰性診断を提供する確定的な試験は存在しない。医師は、既往歴、健康診断、実験室試験、およびX線などのいくつかの道具に依存している。
【０４７４】
身体徴候は患者間で広く変化し、一般的には、限定されるものではないが、関節の腫れ、関節の圧痛、関節における動きの喪失、関節異常、骨再形成、疲労、凝り(特に、朝および長時間座っている場合)、虚弱、流感様徴候(軽度の発熱など)、長時間座ることに関連する疼痛、疾患活動の再燃の発生、次いで、寛解もしくは疾患非活動、皮膚の下の組織のリウマチ結節もしくは瘤(典型的には、肘に認められる、それらはより重篤な疾患活動を示し得る)、筋肉疼痛、食欲減退、抑鬱、体重減少、貧血、冷たい、および／もしくは汗ばんだ手足、ならびに涙および唾液の産生低下を引き起こす、目および口の周囲の腺の障害(シェーグレン症候群)が挙げられる。シェーグレン症候群については、具体的に以下の参考文献を用いることができる：Foxら、Arthritis Rheum. (1986) 29:577-586、およびVitaliら、Ann. Rheum. Dis. (2002). 61:554-558。
【０４７５】
身体徴候とは別に、医師は一般的には、限定されるものではないが、全血球計数、赤血球沈降速度(ESRもしくは沈降率)、C反応性タンパク質、リウマチ因子、抗DNA抗体、抗核抗体(ANA)、抗カルジオリピン抗体、画像化試験、ラジオグラフ(X線)、関節もしくは器官の磁気共鳴画像化(MRI)、関節超音波、骨走査、および骨密度測定(DEXA)などの試験を用いる。これらの試験は、存在するかもしれない異常を調査する(すなわち、治療を必要とする患者もしくは患者集団を同定する)か、または薬剤の副作用をモニターし、進行を調査するための本発明の組成物および方法と共に用いることができる試験の例である。
【０４７６】
慢性関節リウマチの初期徴候は、一般的には、指、手および手首のより小さい関節に認められる。関節障害は通常対称的であるが、これは、関節が左手で痛む場合、同じ関節が右手でも痛むであろうことを意味する。一般的には、より多くの関節浸食は、より重篤な疾患活動を示す。
【０４７７】
より進行した疾患活動の徴候としては、関節における奇形および不安定性を引き起こす、軟骨、腱、靱帯および骨に対する損傷が挙げられる。この損傷は限られた範囲の運動を誘導し、毎日の仕事(フォークを握ること、髪を束ねること、シャツのボタンをはめること)がより困難になる。皮膚潰瘍、感染へのより高い罹患性、および健康の全体的な悪化も、より進行した疾患活動の指示因子である。
【０４７８】
慢性関節リウマチの進行は、一般的には3つの段階に分けられる。第1段階は、関節周囲の疼痛、温覚、凝り、発赤および腫れを引き起こす、滑膜内側の腫れである。第2段階は、滑膜の肥大を引き起こす、細胞の急速な分裂および増殖、またはパンヌスである。第3段階においては、炎症細胞が骨および軟骨を消化し得る酵素を放出し、障害を有する関節がその形状および配置を失い、より多くの疼痛、ならびに運動の喪失を引き起こすことが多い。
【０４７９】
また、分子技術を用いて、治療を必要とする患者または患者集団を同定することもできる。例えば、慢性関節リウマチは、ヒト白血球抗原(HLA)-DR4およびHLA-DRB1遺伝子の対立遺伝子多型と関連することが示されている(OllierおよびWinchester, 1999, Genes and Genetics of Autoimmunity. Basel, Switzerland; Stastny, 1978, N. Engl J Med 298:869-871; ならびにGregersenら、1987, Arthritis Rheum 30:1205-1213)。慢性関節リウマチ患者は、2個の疾患関連HLA-DRB1*04対立遺伝子を発現することが多い(Weyandら、1992 Ann Intern Med 117:801-806)。患者を、当業界で標準的な方法を用いて、対立遺伝子多型について試験することができる。MHC遺伝子は、RAに対する罹患性に影響する唯一の生殖細胞にコードされる遺伝子ではなく、治療を必要とする患者または患者集団を診断または同定するのに用いることができる。女性は明らかに危険性が高く、女性患者は男性患者とは異なる表現型の疾患を生じる。慢性関節リウマチの任意の分子指示因子を用いて、抗CD19抗体組成物または方法を用いる治療を必要とする患者または患者集団を同定することができる。
【０４８０】
活動の規模に関して患者における慢性関節リウマチの活動を決定するための方法は当業界でよく知られており、本発明の医薬組成物および方法と共に用いることができる。例えば、American College of Rheumatologists Score (ACRスコア)を用いて、患者または患者集団の慢性関節リウマチの活動を決定することができる。この方法に従って、患者は改善と相関するスコアを与えられる。例えば、ACRにより定義される因子が20％改善した患者は、ACR20スコアが与えられるであろう。
【０４８１】
最初は、慢性関節リウマチの徴候を示す患者を、鎮痛剤を用いて治療することができる。他の実施形態においては、慢性関節リウマチを有すると診断されたか、またはその徴候を示す患者を、最初に非ステロイド性抗炎症(NSAID)化合物を用いて治療する。疾患が進行し、および／または徴候が重篤度を増すにつれて、慢性関節リウマチを、限定されるものではないが、デキサメタゾンおよびプレドニゾンなどのステロイドの投与により治療することができる。より重篤な事例においては、限定されるものではないが、メトトレキサートまたはサイトキシンなどの化学療法剤を投与して、慢性関節リウマチの徴候を軽減させることができる。
【０４８２】
特定の例においては、慢性関節リウマチを金の投与により治療することができるが、他の例においては、抗体または受容体(もしくは受容体類似体)などの生物剤を投与することができる。そのような治療用抗体の例は、RituxanおよびRemicadeである。慢性関節リウマチを治療するために投与することができる可溶性受容体の例は、Enbrelである。
【０４８３】
慢性関節リウマチの極端に重篤な事例においては、外科手術を指示することができる。外科的手法としては、限定されるものではないが、関節の減少した滑膜もしくは内膜を除去することにより炎症組織の量を減少させるための滑膜切除術；組織サンプルを取得し、ゆるい軟骨を除去し、裂傷を修復し、粗い表面を平滑化するか、もしくは炎症した滑膜組織を除去する関節鏡視下手術；「骨を切断すること」を意味する骨切り術、この手順を用いて、関節上に体重を再分配することにより安定性を増加させる；関節の外科的再構成もしくは置換のための関節置換手術もしくは関節形成術；または関節固定術もしくは2個の骨を一緒に融合させるための融合が挙げられる。
【０４８４】
本発明の方法の特定の実施形態においては、患者を、上記に開示されたいずれかの療法の前に、それと同時に、またはその後に抗CD19抗体を用いて治療することができる。さらに、本発明の抗CD19抗体を、上記の鎮痛剤、NSAID、ステロイド、または化学療法剤と共に、ならびに、慢性関節リウマチの治療のために投与される生物剤と共に投与することができる。
【０４８５】
24.4. 全身性エリテマトーデス(SLE)
全身性エリテマトーデス(SLE)は、関節、筋肉および身体の他の部分に影響する慢性(長く続く)リウマチ疾患である。SLEの治療を必要とする患者または患者集団を、身体徴候を試験すること、および／または実験室試験結果により同定することができる。身体徴候は患者間で広く変化する。例えば、SLEにおいては、典型的には、患者をSLEと診断する前に以下の11個の徴候のうちの4個が存在する：1)頬骨の発疹：頬全体の発疹；2)円盤状の発疹：赤く膨らんだ斑点；3)光過敏症：皮膚発疹の発生もしくは増加をもたらす、太陽光に対する反応；4)口腔潰瘍：通常は無痛性の鼻もしくは口中の潰瘍；5)関節炎：2個以上の末梢関節を含む非びらん性関節炎(関節周囲の骨が破壊されない関節炎)；6)漿膜炎、胸膜炎もしくは心膜炎：(肺もしくは心臓の内膜の炎症)；7)腎臓障害：尿中の過剰なタンパク質(0.5 gm/日を超えるか、もしくは試験スティック上で3+)および／もしくは細胞キャスト(赤血球および／もしくは白血球および／もしくは尿細管細胞に由来する、尿中の異常な元素)；8)神経障害：そのような作用を引き起こすことが知られる薬剤もしくは代謝障害の非存在下での発作(痙攣)および／もしくは精神病；9)血液障害：溶血性貧血もしくは白血球減少症(1 mm3あたり4,000個未満の白血球計数)もしくはリンパ球減少症(1 mm3あたり1,500個未満のリンパ球)(白血球減少症およびリンパ球減少症は2つ以上の場合に検出されなければならない。血小板減少症はそれを誘導することが知られる薬剤の非存在下で検出されなければならない)；10)抗核抗体：それを誘導することが知られる薬剤の非存在下での抗核抗体(ana)に関する陽性試験；ならびに／または11)免疫障害：陽性抗二本鎖抗DNA試験、陽性抗sm試験、抗カルジオリピンなどの陽性抗リン脂質抗体、もしくは偽陽性梅毒試験(vdrl)。
【０４８６】
SLEであることを示す他の身体徴候としては、限定されるものではないが、貧血、疲労、発熱、皮膚発疹、筋肉痛、吐き気、嘔吐および下痢、肥大した腺、食欲減退、冷気への感受性(レイノルド現象)、および体重減少が挙げられる。
【０４８７】
実験室試験を用いて、治療を必要とする患者または患者集団を同定することもできる。例えば、血液試験を用いて、SLEを有するほぼ全ての人の血液中に認められる自己抗体を検出することができる。そのような試験としては、限定されるものではないが、それを誘導することが知られる薬剤の非存在下での抗核抗体(ANA)に関する試験(Rahman, A.およびHiepe, F. Lupus. (2002). 11(12):770-773)、抗二本鎖抗DNA (Keren, D.F. Clin. Lab. Med. (2002) 22(2):447-474.)、抗Sm、抗カルジオリピンなどの抗リン脂質抗体(Gezer, S. Dis. Mon. 2003. 49(12):696-741)、もしくは偽陽性梅毒試験(VDRL)が挙げられる。
【０４８８】
他の試験としては、血液中に循環する補体タンパク質の量を測定するのに用いることができる補体試験(C3、C4、CH50、CH100)(Manziら、Lupus 2004. 13(5):298-303)、炎症レベルを測定するのに用いることができる沈降速度(ESR)またはC反応タンパク質(CRP)、腎臓の問題を検出するのに用いることができる尿分析、肺損傷を検出するのに取ることができる胸部X線、および心臓の問題を検出するのに用いることができるEKGが挙げられる。
【０４８９】
慢性SLEは、障害を有する器官、特に、腎臓に対する蓄積する巻き添え被害と関連する。従って、早期の、すなわち、例えば、腎不全の前の、治療的介入が望ましい。SLEに関する利用可能な治療は、慢性関節リウマチについて利用可能なものと類似している。これらは、鎮痛剤または非ステロイド性抗炎症(NSAID)化合物を用いる初期治療を含む。疾患が進行する、および／または徴候の重篤度が増加するにつれて、SLEを、限定されるものではないが、デキサメタゾンおよびプレドニゾンなどのステロイドの投与により治療することができる。
【０４９０】
より重篤な事例においては、限定されるものではないが、メトトレキサートまたはサイトキシンなどの化学療法剤を投与して、SLEの徴候を軽減することができる。しかしながら、この手法は、患者が出産年齢の女性である場合、好ましくない。そのような例においては、患者の生殖能力を妨げない治療手法が好ましい。
【０４９１】
特定の例においては、SLEを、抗体または受容体(もしくは受容体類似体)などの生物剤の投与により治療することができる。そのような治療用抗体の例はRituxinおよびRemicadeである。SLEを治療するために投与することができる炎症性サイトカインのための可溶性受容体の例は、Enbrelである。
【０４９２】
本発明の特定の実施形態においては、患者を、SLEの治療に用いられる上記の治療法のいずれかの前、それと同時に、またはその後に、抗CD19抗体を用いて治療することができる。さらに、本発明の抗CD19抗体を、任意の鎮痛剤、NSAID、ステロイド、もしくは上記の化学療法剤と共に、ならびにSLEの治療のために投与される生物剤と共に投与することができる。
【０４９３】
24.5. 特発性／自己免疫性血小板減少性紫斑病(ITP)
特発性／自己免疫性血小板減少性紫斑病(ITP)は、血小板細胞と相互作用し、それらの血小板細胞の破壊をもたらす免疫グロブリンG(IgG)自己抗体を特徴とする血液の障害である。典型的には、この抗体は、血小板膜糖タンパク質に特異的である。この障害は急性(一時的、2ヶ月未満継続する)または慢性(6ヶ月より長い期間持続する)であってよい。ITPの治療を必要とする患者または患者集団を、患者の既往歴、身体徴候を試験すること、および／または実験室試験結果により同定することができる(Provan, D.,およびNewland, A., Br. J. Haematol. (2002) 118(4):933-944; George, J.N. Curr. Hematol. (2003) 2(5):381-387;  Karptkin, S. Autoimmunity. (2004) 37(4):363-368;  Cines, D.B.,およびBlanchette, V. S., N. Engl. J. Med. (2002) 346(13)995-1008)。
【０４９４】
身体徴候としては、血小板細胞数の減少の結果として出血が起こった皮膚および粘膜(口の内膜など)の紫色の外見が挙げられる。主な徴候は、痣(「斑状出血」)および皮膚もしくは粘膜上の小さい赤い点(「点状出血」)含んでよい出血である。いくつかの例においては、鼻、歯茎、消化管または尿道からの出血も起こり得る。稀に、脳内の出血が起こる。また、一般的な兆候、徴候、および増悪因子としては、限定されるものではないが、突発(幼児期のITP)、緩やかな始まり(成人のITP)、触知できない紫斑、紫斑、月経過多、鼻血、歯肉出血、粘膜上の出血性水疱、GI出血の兆候、機能性子宮出血、頭蓋内出血の証拠、触知できない脾臓、網膜出血、最近の生ウイルス免疫(幼児期のITP)、最近のウイルス疾患(幼児期のITP)、血小板計数が20,000/mm3未満である場合の自然出血、および痣ができやすい体質も挙げられる。
【０４９５】
ITPを診断するのに用いることができる実験室試験としては、限定されるものではないが、全血球計数試験、または骨髄中に十分な血小板形成細胞(巨核球)が存在することを検証し、転移性癌および白血病などの他の疾患を除外するための骨髄試験が挙げられる。単離された血小板減少症は、実験室評価に関する重要な知見である。末梢血液塗抹上の巨大血小板は、先天的血小板減少症を示唆する。頭蓋内出血に関する心配が存在する場合、頭部のCT走査が当然である。
【０４９６】
ITPのための現在の治療としては、血小板輸血および脾臓摘出が挙げられる。他の治療としては、糖質コルチコイドの投与、免疫抑制剤の投与、IL-11などの血小板産生を増強する薬剤、およびトロンボポエチン(TPO)などの血小板を産生する巨核球を活性化する薬剤の投与が挙げられる。
【０４９７】
より重篤な事例においては、限定されるものではないが、ビンクリスチンおよびビンブラスチンなどの化学療法剤を投与して、ITPの徴候を軽減することができる。しかしながら、この手法は、患者が出産年齢の女性である場合、好ましくない。そのような例においては、患者の生殖能力を妨げない治療手法が好ましい。
【０４９８】
特定の例においては、ITPを、抗体または受容体(もしくは受容体類似体)などの生物剤の投与により治療することができる。そのような治療用抗体の例は、Rituximabなどの抗CD20抗体である。
【０４９９】
本発明の特定の実施形態においては、ITPの治療に用いられる上記の治療法のいずれかの前に、それと同時に、またはその後に、患者を抗CD19抗体を用いて治療することができる。さらに、本発明の抗CD19抗体を、上記のいずれかの薬剤と共に、ならびにITPの治療のために投与される生物剤と共に投与することができる。
【０５００】
24.6. 天疱瘡および類天疱瘡関連障害
天疱瘡および類天疱瘡関連障害は、皮膚および／または粘膜表面の水疱形成症状を特徴とする自己免疫疾患の異種グループである。両疾患においては、水疱形成は、真皮および／または表皮中の上皮細胞の表面上に発現される種々のタンパク質を認識する自己免疫抗体により引き起こされる。
【０５０１】
天疱瘡関連疾患を有する患者においては、水疱形成は表皮内で起こり、デスモグレイン1(Dsg1)および／またはデスモグレイン3(Dsg3)に特異的な自己抗体の結合に起因する。古典的なサブタイプの天疱瘡を、抗デスモグレイン抗体特異性に従って識別することができる。落葉状天疱瘡(PF)を有する患者は、抗Dsg1抗体のみを産生する。尋常性天疱瘡(PV)を有する患者および腫瘍随伴性天疱瘡(PNP)は、その病変が粘膜組織に制限される場合、抗Dsg3抗体を産生する。対照的に、皮膚および粘膜の病変を有するPVおよびPNPは、抗Dsg1および抗Dsg3自己抗体の両方を産生する(Nagasaka, T.ら、J. Clin.Invest. 2004. 114:1484-1492; Seishema, M.ら、Arch Dermatol. 2004. 140(12):1500-1503; Amagai, M., J. Dermatol. Sci. 1999. 20(2):92-102)。
【０５０２】
限定されるものではないが、水疱性類天疱瘡、じんま疹水疱性類天疱瘡、瘢痕性類天疱瘡、後天性表皮水疱症、および線状IgA表皮水疱症などの類天疱瘡関連疾患を有する患者においては、水疱形成が真皮と表皮との境界で起こる。最も一般的な形態の類天疱瘡疾患は、水疱性類天疱瘡抗原180(BP180)、水疱性類天疱瘡抗原230(BP230)、ラミニン5、および／またはβ4インテグリンに結合する自己抗体の存在を特徴とする水疱性類天疱瘡(BP)である(Fontao, L.ら、Mol. Biol. Cell. 2003) 14(5):1978-1992; Challacombe, S. J.ら、Acta Odontol. Scand. (2001). 59(4):226-234)。
【０５０３】
天疱瘡または類天疱瘡関連障害の治療を必要とする患者または患者集団を、患者の既往歴、身体徴候を試験すること、および／または実験室試験結果により同定することができる(Mutasim, D.F. Drugs Aging. (2003).20(9):663-681; Yeh, S.W.ら、Dermatol. Ther. (2003). 16(3):214-223; Rosenkrantz, W.S.  Vet. Dermatol. 15(2):90-98に概説されている)。
【０５０４】
典型的には、これらの天疱瘡または類天疱瘡関連障害の診断を、皮膚生検により行う。生検皮膚サンプルを顕微鏡により試験して、水疱の解剖学的部位(例えば、表皮または真皮と表皮の間)を決定する。これらの知見は、病変の部位に自己抗体の存在を検出するための直接的または間接的免疫組織化学分析と相関する。患者由来の血清サンプルを、特定のタンパク質に関するELISAに基づく試験を用いて循環自己抗体の存在について試験することもできる。いくつかのELISAに基づくアッセイが、ヒトサンプル中でのデスモグレイン抗体の検出について記載されている(Hashimoto, T. Arch. Dermatol. Res. (2003) 295 Suppl.1:S2-11)。生検サンプル中でのこれらのデスモグレイン自己抗体の存在が、天疱瘡の診断である。
【０５０５】
臨床的には、尋常性天疱瘡を、口中の水疱の存在により診断することができる。また、炎症または腐食が、目およびまぶたの内側、ならびに鼻もしくは生殖管の膜に存在してもよい。また、半分の患者が、しばしば、股間、脇の下、顔、頭皮および胸部領域における、皮膚の水疱または腐食を生じる。落葉状天疱瘡は、表面的な、比較的軽度な形態の天疱瘡である。それは通常は顔および頭皮上に現れるが、背中および胸部に影響することもある。病変は口中には生じない。水疱は最も外側の表面により多く限定され、しばしば、掻痒をもたらす。腫瘍随伴性天疱瘡は非常に稀であり、一般的には癌を有する人において生じる。病変は痛みが大きく、口、唇および食道(嚥下管)ならびに皮膚に影響する。気道の障害に起因して、呼吸器疾患の兆候が生じ、命にかかわることもある。
【０５０６】
天疱瘡または類天疱瘡関連障害のための現在の治療としては、皮膚症状に関連する不快を軽減するためのクリームおよび軟膏の局所投与、抗炎症剤の投与または免疫抑制剤の投与が挙げられる。
【０５０７】
本発明の特定の実施形態においては、天疱瘡または類天疱瘡関連障害の治療に用いられる上記の治療法のいずれかの前に、それと同時に、またはその後に、患者を抗CD19抗体を用いて治療することができる。さらに、本発明の抗CD19抗体を、上記の薬剤のいずれかと共に投与することができる。
【０５０８】
24.7. 自己免疫性糖尿病
本発明の特定の態様に従って、1A型糖尿病としても知られる、自己免疫性糖尿病の治療を必要とする患者を、抗CD19抗体組成物および方法を用いて治療することができる。1A型糖尿病は、究極的には、膵臓β細胞を破壊する、遺伝的、環境的、および免疫学的因子の相乗作用により引き起こされる自己免疫疾患である。膵臓β細胞破壊の結果は、β細胞質量の減少、インスリン産生／分泌の低下および血液グルコースレベルの漸進的上昇である。
【０５０９】
1A型糖尿病の治療を必要とする患者または患者集団を、患者の既往歴、身体徴候を試験すること、および／または実験室試験結果により同定することができる。徴候は突然発生することが多く、限定されるものではないが、低いか、もしくは存在しない血液インスリンレベル、口渇の増加、排尿の増加、定常的な空腹感、体重減少、視力障害、および／または疲労が挙げられる。顕性糖尿病は通常、β細胞の大部分(>80％)が破壊されるまで明らかにならない。典型的には、患者が、11.1 mmol/L (200 mg/dL)以上の無作為(最後の食事以来の時間と無関係)の血液グルコース濃度および／または7.0 mmol/L (126 mg/dL)以上の断食(少なくとも8時間のカロリー摂取なし)血漿グルコースおよび／または11.1 mmol/L (200 mg/dL)以上の2時間の血漿グルコースを有する場合、糖尿病が診断される。理想的には、診断が確定する前に、これらの試験を、比較可能な結果と共に別の日に繰り返すべきである(Harrison's Principles of Internal Medicine、第16版、Dennis L. Kasperら(編)、The McGraw-Hill Companies, Inc. 2005 New York, New York)。
【０５１０】
1A型糖尿病の正確な病因は不明であるが、特定のHLA血清型に対する明らかな遺伝子連鎖が存在する。特に、自己免疫性糖尿病は、HLA DR3およびDR4血清型と関連する。DR3およびDR4の両方の存在は、最も高い既知の遺伝的危険性を与える。自己免疫性糖尿病に対する罹患性は、HLAクラスII(HLA-DQB1*0302)とも関連している。対照的に、DRB1-1501およびDQA1-0102-DQB1-0602を有するHLAハプロタイプは、1A型糖尿病からの防御と関連する(Redondo, M. J.ら、J. Clin. Endocrinol. Metabolism (2000) 10:3793-3797)。
【０５１１】
インスリンを産生する膵島β細胞の破壊を、膵島細胞自己抗体、膵臓および脱水リンパ節中の活性化リンパ球浸潤物、膵島細胞タンパク質に応答するTリンパ球、ならびに膵島内での炎症サイトカインの放出により達成することができる(Harrison's Principles of Internal Medicine、第16版、Dennis L. Kasperら(編)、The McGraw-Hill Companies, Inc. 2005 New York, New York)。
【０５１２】
1A型糖尿病に関連する自己抗体としては、限定されるものではないが、インスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD)、ICA-512/IA-2、フォグリン、膵島ガングリオシドおよびカルボキシペプチダーゼHに結合する抗体が挙げられる(Gianani, R.およびEisenbarth, G.S. Immunol. Rev. (2005) 204:232-249;  Kelemen, K.ら、J. Immunol. (2004) 172(6):3955-3962); Falorni, A.およびBorozzetti, A.  Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab.  2005. 19(1):119-133)。
【０５１３】
自己免疫性糖尿病のための現在の治療としては、ビタミンD、コルチコステロイド、血圧を制御する薬剤および血糖(血液糖レベル)を制御する薬剤の投与が挙げられる。
【０５１４】
本発明の方法の特定の実施形態においては、自己免疫性糖尿病の治療に用いられる上記の治療法のいずれかの前に、それと同時に、またはその後に、患者を抗CD19抗体を用いて治療することができる。さらに、本発明の抗CD19抗体を、上記の薬剤のいずれかと共に投与することができる。
【０５１５】
24.8. 全身性硬化症(強皮症)および関連障害
強皮症としても知られる全身性硬化症は、限定されるものではないが、限局性皮膚疾患、全身性皮膚疾患、サイン強皮症、未分化結合組織疾患、重複症候群、限局性強皮症、モルフェア、線状強皮症、剣創状強皮症、ブシュケ硬化浮腫症、硬化性粘液水腫、慢性移植片対宿主疾患、好酸球性筋膜炎、糖尿病性浮腫性硬化症、ならびに原発性アミロイドーシスおよび多発性骨髄腫に関連するアミロイドーシスなどの異種群の疾患を包含する(Harrison's Principles of Internal Medicine、第16版、Dennis L. Kasperら(編)、The McGraw-Hill Companies, Inc. 2005 New York, New Yorkに概説されている)。
【０５１６】
強皮症に関連する臨床的特徴としては、レイノルド現象、皮膚肥厚、皮下石灰沈着、毛細血管拡張症、関節痛／関節炎、ミオパシー、食道運動障害、肺線維症、単離された肺動脈高血圧症、鬱血性心不全および腎クリーゼが挙げられる。
【０５１７】
自己抗体としては、抗トポイソメラーゼ1、抗セントロメア、抗RNAポリメラーゼI、IIおよび／またはIII、抗Th RNP、抗U、RNP(抗フィブリラリン)、抗PM/Sci、抗核抗体(ANA)が挙げられる。
【０５１８】
強皮症の治療を必要とする患者および患者集団の同定は、臨床的履歴および身体的知見に基づいてもよい。強皮症の治療を必要とする患者または患者集団を、患者の既往歴、身体徴候を試験すること、および／または実験室試験結果により同定することができる。有意な皮膚肥厚を有さない患者においては、診断が遅れる場合がある。実験室、X線、肺機能試験、および皮膚または腎臓生検を用いて、内部器官障害の程度および重篤度を決定することができる。
【０５１９】
疾患開始の初期の数ヶ月または数年においては、強皮症は、限定されるものではないが、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、および慢性関節リウマチなどの多くの他の結合組織疾患と類似している。
【０５２０】
全身性硬化症(強皮症)の最も古典的な徴候は、手指硬化症である。初期徴候としては、この先細かつ爪のような奇形に進行することもある手のむくみが挙げられる。強皮症を有する全ての者が、この程度の皮膚硬化を生じるわけではない。他の徴候としては、モルフェア、線状手指硬化症(硬化した指)、レイノルド症候群、石灰沈着症、および毛細血管拡張症が挙げられる。
【０５２１】
抗核抗体(ANA)試験などの血液試験を、限局性強皮症および全身性強皮症の両方の診断において用いることができる。例えば、抗セントロメア抗体(ACA)および抗Scl-70抗体は、全身性硬化症の治療を必要とする患者を示唆する(Hoら、2003, Arthritis Res Ther. 5:80-93)；抗トポIIα抗体は、限局性強皮症の治療を必要とする患者を示唆する；ならびに抗トポIα抗体は全身性強皮症の治療を必要とする患者を示唆する。限定されるものではないが、若年性強皮症(Foeldvari, Curr Opin Rheumatol 14:699-03 (2002); Cefleら、Int J Clin Pract. 58:635-638 (2004)); 限局性強皮症；結節性強皮症 (Cannick, J Rheumatol. 30:250-2502 (2003))；および限定されるものではないが、石灰沈着症、レイノルド現象、食道、手指硬化症、および毛細血管拡張症(CREST)などの全身性硬化症、限局性全身性強皮症、ならびに全身性強皮症などの、いくつかの型の強皮症およびこれらの型を診断するための方法が認識されており、当業界でよく知られている。全身性強皮症は、全身性硬化症(SSc)としても知られる。また、それを進行性全身性硬化症(PSSc)、または家族性進行性漸進性硬化症(FPSSc)と呼ぶことができる(Nadashkevichら、Med Sci Monit. 10:CR615-621 (2004); Francesら、Rev Prat. 52:1884-90 (2002))。全身性硬化症は、結合組織硬化症の存在、小さいサイズの動脈に関する血管異常および微小循環、ならびに自己免疫変化を特徴とする多系統障害である。
【０５２２】
CRESTとして知られる全身性強皮症の型は、任意の皮膚肥厚を特徴としない。CRESTは、通常は指における石灰沈着症(カルシウム蓄積)；レイノルド現象；嚥下困難を引き起こし得る食道の筋肉制御の喪失；指の骨の先細奇形である手指硬化症；および指の皮膚、顔面、または口の内側の小さく赤い点である毛細血管拡張症を特徴とする。典型的には、CRESTの診断には、3つの徴候のうちの2つで十分である。CRESTは、単独で、または任意の他の型の強皮症もしくは他の自己免疫疾患と共に生じ得る。
【０５２３】
限局性強皮症は、陥凹指潰瘍(レイノルド現象に対して二次的)および／または肺線維症と共に、指に限定される固い皮膚を特徴とする。顔面および頸部の皮膚も限局性強皮症に含まれることがある。
【０５２４】
全身性強皮症は、近接した固い皮膚が存在する場合はいつでも診断される。近接とは、参照地点の最も近くに位置することを意味する。近接した固い皮膚は、手首または肘の上の皮膚の固さであってよい。典型的には、肘と手首の間にのみ固い皮膚を有する患者は、診断する医師が使用する近接の意味に応じて、全身性または限局性全身性強皮症の診断を受けるであろう。
【０５２５】
強皮症のための現在の治療法としては、6-メトキシプソラレン後の体外フォトフォレーシス、および自己幹細胞移植が挙げられる。
【０５２６】
強皮症のための現在の治療法としては、以下の薬剤：ペニシラミン、コルチシン、インターフェロンα、インターフェロンγ、クロラムブシル、シクロスポリン、5-フルオロウラシル、シクロホスファミド、ミノサイクリン、サリドマイド、エタネルセプト、またはメトトレキサートの投与が挙げられる。
【０５２７】
本発明の特定の実施形態においては、自己免疫糖尿病の治療に用いられる上記の治療法のいずれかの前に、それと同時に、またはその後に、患者を抗CD19抗体を用いて治療することができる。さらに、本発明の抗CD19抗体を、上記の薬剤のいずれかと共に投与することができる。
【０５２８】
25. サンプルまたは被験者におけるCD19密度の決定
必須ではないが、CD19密度に関するアッセイを用いて、患者の診断をさらに特性評価することができる。細胞に結合する抗体の密度を決定する方法は、当業者には公知である(例えば、特異的CD抗原の細胞表面密度を評価する方法を開示しているSatoら、J. Immunology 165:6635-6643 (2000)を参照)。他の標準的な方法としては、Scatchard分析が挙げられる。例えば、抗体またはフラグメントを単離し、放射標識し、放射標識された抗体の比活性を決定することができる。次いで、抗体を、CD19を発現する標的細胞と接触させる。細胞と結合した放射活性を測定し、比活性に基づいて、細胞に結合した抗体または抗体フラグメントの量を決定することができる。
【０５２９】
蛍光活性化フローサイトメトリーを用いることもできる。一般的には、抗体または抗体フラグメントを、CD19を発現する標的細胞に結合させる。次いで、該抗体に結合する第2の試薬、例えば、蛍光色素標識された抗免疫グロブリン抗体を添加する。次いで、蛍光色素染色を測定し、これを用いて、細胞に結合する抗体または抗体フラグメントの密度を決定することができる。
【０５３０】
別の好適な方法として、抗体または抗体フラグメントを、フルオロフォアなどの検出可能な標識を用いて直接標識し、標的細胞に結合させることができる。標識とタンパク質の比率を決定し、それに結合した既知量の標識を含む標準ビーズと比較する。細胞に結合した標識量と既知の標準物との比較を用いて、細胞に結合した抗体の量を算出することができる。
【０５３１】
さらに別の態様においては、本発明は、in vitroまたはin vivoで、サンプルまたは個人におけるCD19の存在および／または密度を検出するための方法を提供する。また、これは、疾患および治療の効果をモニターし、投与すべき抗体の用量を決定および調整するのに有用であり得る。in vivo方法を、PET(陽電子放出断層撮影)またはSPECT(単光子放出コンピュータ断層撮影)などの画像化技術を用いて実施することができる。当業者であれば、共有結合したキレート化剤を用いて、インジウムで抗CD19抗体を標識することもできる。得られる抗体を、標準的なガンマカメラを用いて画像化することができ、同様に、ZEVALIN(商標)(インジウム標識された抗CD20 mAb)(Biogen Idec, Cambridge, MA)を用いて、CD20抗原を画像化する。
【０５３２】
一実施形態においては、試験しようとするサンプルを、必要に応じて、対照サンプルと共に、本発明の抗体とヒトCD19抗原との複合体の形成を可能にする条件下で、ヒト抗CD19抗体と接触させることにより、in vivo方法を実施することができる。次いで、複合体形成を検出する(例えば、蛍光活性化フローサイトメトリーまたはウェスタンブロッティングを用いる)。試験サンプルと共に対照サンプルを用いる場合、複合体を両サンプル中で検出し、サンプル間の複合体の形成における統計学的有意差は、試験サンプル中のヒトCD19の存在を示唆する。
【０５３３】
他の実施形態においては、平均蛍光強度を、CD19密度の尺度として用いることができる。そのような実施形態においては、B細胞を患者から取り出し、蛍光標識で標識されたCD19抗体で染色し、蛍光強度をフローサイトメトリーを用いて測定する。蛍光強度を測定し、B細胞あたりの強度の平均として表すことができる。そのような方法を用いて、CD19密度を表す平均蛍光強度を、本発明の方法および組成物を用いる治療の前後の患者について、または患者とB細胞上でのhCD19の正常レベルとの間で比較することができる。
【０５３４】
B細胞上のCD19発現の密度が決定された患者においては、CD19の密度は、本発明の組成物および方法の抗CD19抗体と共に用いられる用量および／または治療計画の決定および／または調整に影響し得る。例えば、CD19の密度が高い場合、ヒトにおいてADCCをあまり効率的に媒介しない抗CD19抗体を使用することができる。特定の実施形態においては、本発明の組成物および方法を用いて治療される患者が低いCD19密度を有する場合、より高い用量の本発明の組成物および方法の抗CD19抗体を用いることができる。他の実施形態においては、本発明の組成物および方法を用いて治療される患者が低いCD19密度を有する場合、低用量の本発明の組成物および方法の抗CD19抗体を用いることができる。特定の実施形態においては、本発明の組成物および方法を用いて治療される患者が高いCD19密度を有する場合、より低用量の本発明の組成物および方法の抗CD19抗体を用いることができる。特定の実施形態においては、CD19密度を、患者におけるCD20密度と比較し、CD19密度を、ヒトもしくは特定の患者集団について平均CD19密度と比較するか、またはCD19密度を、治療前もしくはB細胞疾患もしくは障害の開始前の患者におけるCD19レベルと比較することができる。特定の実施形態においては、本発明の組成物および方法を用いて治療される患者は、CD19がB細胞の表面上に存在する場合、B細胞悪性腫瘍を有する。
【０５３５】
26. 免疫療法プロトコル
本明細書では「抗CD19免疫療法」と呼ばれる、治療計画／プロトコルにおいて用いられる抗CD19抗体組成物は、裸の抗体、イムノコンジュゲートおよび／または融合タンパク質であってよい。本発明の組成物を、単一薬剤療法として、または他の治療剤もしくは計画と共に用いることができる。抗CD19抗体またはイムノコンジュゲートを、1種以上の治療剤の投与の前に、それと同時に、またはその後に投与することができる。本発明の組成物との組合せ治療計画において用いることができる治療剤としては、細胞の機能を阻害するか、もしくは防止する、および／または細胞の破壊を引き起こす任意の物質が挙げられる。例としては、限定されるものではないが、放射性アイソトープ、化学療法剤、および細菌、菌類、植物もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素などの毒素、またはその断片が挙げられる。
【０５３６】
本明細書に記載の治療計画、または任意の所望の治療計画を、天然のCD19抗原の代わりに、ヒトCD19抗原を発現するトランスジェニック動物モデルを用いて、効力について試験することができる。かくして、抗CD19抗体治療計画を動物モデルにおいて試験して、ヒトへの投与前に効力を決定することができる。
【０５３７】
抗CD19抗体、組成物および方法を実施して、B細胞悪性腫瘍などのB細胞疾患を治療することができる。用語「B細胞悪性腫瘍」は、B細胞系列の細胞に由来する任意の悪性腫瘍を含む。B細胞悪性腫瘍の例としては、限定されるものではないが、低悪性度／濾胞性、NHL、小細胞リンパ球(SL)NHL、中悪性度／濾胞性NHL、中悪性度広範性NHL、高悪性度免疫芽球性NHL、高悪性度リンパ芽球性NHL、高悪性度小細胞非切断細胞NHLなどのB細胞サブタイプ非ホジキンリンパ腫(NHL)；マントル細胞リンパ腫、および巨大病変NHL；バーキットリンパ腫；多発性骨髄腫；プレB急性リンパ芽球性白血病および初期B細胞前駆体に由来する他の悪性腫瘍；一般的な急性リンパ球性白血病(ALL)；免疫グロブリン突然変異型CLLおよび免疫グロブリン非変異型CLLなどの慢性リンパ球性白血病(CLL)；毛様細胞白血病；Null急性リンパ芽球性白血病；ヴァルデンストレームマクログロブリン血症；胚中心B細胞様(GCB)DLBCL、活性化B細胞様(ABC)DLBCL、および3型DLBCLなどの広範性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)；プロリンパ球性白血病；軽鎖疾患；形質細胞腫；骨硬化性骨髄腫；形質細胞白血病；意味未確定の単クローン性高ガンマグロブリン血症(MGUS)；くすぶり型多発性骨髄腫(SMM)；無痛性多発性骨髄腫(IMM)；古典的および結節性リンパ球プレドミナント型などのホジキンリンパ腫；リンパ形質細胞リンパ腫(LPL)；ならびに胃粘膜関連リンパ組織(MALT)リンパ腫などの辺縁帯リンパ腫が挙げられる。
【０５３８】
さらなる実施形態においては、本発明を用いて、限定されるものではないが、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、胚中心B細胞様(GCB)DLBCL、活性化B細胞様(ABC)DLBCL、および3型DLBCLなどの広範性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、古典的および結節性リンパ球プレドミナント型などのホジキンリンパ腫、リンパ形質細胞リンパ腫(LPL)、胃粘膜関連リンパ組織(MALT)リンパ腫などの辺縁帯リンパ腫、ならびに免疫グロブリン突然変異型CLLおよび免疫グロブリン非変異型CLLなどの慢性リンパ球性白血病(CLL)などの成熟B細胞悪性腫瘍(すなわち、細胞表面上にIgを発現する)を治療することができる。
【０５３９】
さらに、CD19は、例えば、CD20よりもB細胞発生においてより早期に発現され、従って、例えば、骨髄中のプレB細胞および未成熟B細胞悪性腫瘍(すなわち、細胞表面上にIgを発現しない)を治療するのに特に好適である。プレB細胞および未成熟B細胞悪性腫瘍の例としては、限定されるものではないが、急性リンパ芽球性白血病が挙げられる。
【０５４０】
他の特定の実施形態においては、本発明を実施して、節外腫瘍を治療することができる。
【０５４１】
27. 抗CD19免疫療法
本発明に従えば、「抗CD19免疫療法」は、本明細書に記載の任意の治療計画に従う本発明の任意の抗CD19抗体の投与を包含する。抗CD19抗体を、裸の抗体、またはイムノコンジュゲートもしくは融合タンパク質として投与することができる。
【０５４２】
抗CD19免疫療法は、B細胞悪性腫瘍の治療のための単一治療剤として抗CD19抗体の投与を包含する。抗CD19免疫療法は、B細胞悪性腫瘍から生じる初期段階の疾患を治療する方法を包含する。抗CD19免疫療法は、抗CD19抗体がADCCを媒介するB細胞悪性腫瘍を治療する方法を包含する。抗CD19免疫療法は、患者が、化学療法、放射性化合物に基づく療法または外科療法であるかに関わらず、悪性腫瘍のための治療を受ける前に、抗CD19抗体を投与するB細胞悪性腫瘍を治療する方法を包含する。
【０５４３】
一実施形態においては、B細胞悪性腫瘍を有するヒト被験者を、ヒトADCCを媒介し得るヒトまたはヒト化抗体を投与することにより治療することができる。初期段階の疾患、または単一薬剤療法の事例においては、ADCCを媒介し得る任意の抗CD19抗体(マウスおよびキメラ抗体を含む)を、ヒト被験者において用いることができる；しかしながら、ヒトおよびヒト化抗体が好ましい。
【０５４４】
いくつかの事例においては、IgG1またはIgG3ヒトアイソタイプの抗体が、療法にとって好ましい。しかしながら、IgG2またはIgG4ヒトアイソタイプが関連するエフェクター機能、例えば、ヒトADCCを有するという条件で、それらを同様に用いることもできる。そのようなエフェクター機能を、in vitroまたはin vivoでエフェクター細胞による標的細胞溶解を媒介する問題の抗体の能力を測定することにより評価することができる。
【０５４５】
一実施形態においては、用いられる抗体の用量は、循環B細胞を枯渇させるのに十分なものであるべきである。血液サンプルを分析することにより、療法の進行を、患者においてモニターすることができる。臨床的改善の他の兆候を用いて、療法をモニターすることができる。
【０５４６】
本発明の組成物および方法と共に用いることができるB細胞の枯渇を測定する方法は、当業界でよく知られており、限定されるものではないが、以下の実施形態が挙げられる。一実施形態においては、循環B細胞枯渇を、B細胞に結合する抗CD19抗体以外の試薬を用いるフローサイトメトリーを用いて測定して、B細胞の量を定義することができる。他の実施形態においては、血液中のB細胞レベルを、標準的な血清分析を用いてモニターすることができる。そのような実施形態においては、B細胞枯渇を、B細胞により産生されることが知られる抗体に対する量を定義することにより、間接的に測定する。次いで、その抗体のレベルをモニターして、B細胞の枯渇および／または機能的枯渇を決定する。別の実施形態においては、B細胞枯渇を、B細胞を同定するための免疫化学染色により測定することができる。そのような実施形態においては、B細胞または患者から抽出されたB細胞を含む組織もしくは血清を、顕微鏡スライド上に置き、標識し、存在または非存在について試験することができる。関連する実施形態においては、治療前と治療後に抽出されたB細胞の間の比較を行って、B細胞の存在における差異を決定する。
【０５４７】
全身腫瘍組織量を測定し、本発明の組成物および方法と共に用いることができる。全身腫瘍組織量を測定する方法は当業界でよく知られており、限定されるものではないが、以下の実施形態が挙げられる。特定の実施形態においては、PET走査を用いて、代謝活性を測定し、腫瘍を示唆するより高い活性の領域を同定することができる。CT走査およびMRIを用いて、腫瘍の存在およびサイズについて軟組織を試験することもできる。他の実施形態においては、骨走査を用いて、腫瘍の体積および位置を測定することができる。さらに他の実施形態においては、全身腫瘍組織量を、ドップラー技術(例えば、超音波)を用いて、腫瘍中への、および腫瘍からの血流を試験することにより測定することができる。そのような実施形態においては、時間に渡る血流の変化または患者の好適な組織中の正常な血流からの偏差を用いて、全身腫瘍組織量の見積もり値を算出することができる。全身腫瘍組織量を測定するためのそのような方法を、本発明の治療法法の前に、およびその後に用いることができる。
【０５４８】
本発明の方法の特定の実施形態においては、ADCC機能を維持しながら、B細胞を枯渇させる、および／または全身腫瘍組織量を減少させる。
【０５４９】
抗CD19抗体を単一薬剤療法として投与する本発明の実施形態においては、本発明は様々な治療計画の使用を意図する。
【０５５０】
本発明の特定の態様に従って、本発明の組成物および方法において用いられる抗CD19抗体は、裸の抗体である。関連する実施形態においては、用いられる裸の抗CD19抗体の用量は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5 mg/kg患者体重である。特定の実施形態においては、用いられる裸の抗CD19抗体の用量は、少なくとも約1〜10、5〜15、10〜20、または15〜25 mg/kg患者体重である。特定の実施形態においては、用いられる裸の抗CD19抗体の用量は、少なくとも約1〜20、3〜15、または5〜10 mg/kg患者体重である。他の実施形態においては、用いられる裸の抗CD19抗体の用量は、少なくとも約5、6、7、8、9、または10 mg/kg患者体重である。
【０５５１】
特定の実施形態においては、用量は、4〜8の連続する週に渡って毎週投与される約375 mg/m2の抗CD19抗体を含む。特定の実施形態においては、用量は、4〜8の連続する週に渡って毎週投与される少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15 mg/kg患者体重である。
【０５５２】
上記の抗CD19抗体の例示的用量を、21.3節に記載のように投与することができる。一実施形態においては、上記用量は単回投与注射液である。他の実施形態においては、前記用量を一定期間に渡って投与する。この期間を、日、週、または月で測定することができる。複数回用量の抗CD19抗体を、毒性副作用を平衡を保ちながら治療的利益を達成するのに好適な間隔で投与することができる。例えば、複数回用量を用いる場合、抗体を用いる反復治療の前に患者の単球計数の回復を可能にする間隔に時間を計るのが好ましい。単球集団は患者におけるADCC機能を反映するため、この投与計画は治療の効率を最適化するであろう。
【０５５３】
特定の実施形態においては、患者が療法に応答する限り、本発明の組成物をヒト患者に投与する。他の実施形態においては、患者の疾患が進行しない限り、本発明の組成物をヒト患者に投与する。関連する実施形態においては、患者の疾患が進行しなくなるか、または一定期間進行しなくなるまで、本発明の組成物をヒト患者に投与した後、疾患が再発するか、または再度進行し始めない限り、本発明の組成物を患者に投与しない。例えば、患者が疾患の進行についてモニターされる期間、約4〜8週間に渡って、上記用量のいずれかを用いて患者を治療することができる。疾患の進行が停止するか、または逆転する場合、患者が再発するまで、すなわち、治療する疾患が再発するか、または進行するまで、本発明の組成物を該患者に投与しない。この再発または進行の際に、最初に用いたのと同じ投与計画を用いて、または上記の他の用量を用いて、患者を再度治療することができる。
【０５５４】
特定の実施形態においては、本発明の組成物を、一定期間に渡って、負荷用量、次いで複数回のより低い用量(維持用量)として投与することができる。そのような実施形態においては、投与の時間を計り、効率的なB細胞枯渇を維持するように量を調整することができる。特定の実施形態においては、負荷用量は、約10、11、12、13、14、15、16、17、または18 mg/kg患者体重であり、維持用量は、少なくとも約5〜10 mg/kg患者体重である。他の実施形態においては、維持用量を、7、10、14または21日毎の間隔で投与する。維持用量を、毒性が存在するようになるまで、血小板計数が低下するまで、疾患の進行が存在しなくなるまで、患者が免疫原性を示すようになるまで、または疾患が最終段階に進行するまで、無期限に継続することができる。さらに他の実施形態においては、本発明の組成物を、疾患が最終段階に進行するまで、ヒト患者に投与する。
【０５５５】
患者の循環単球レベルを治療計画の一部としてモニターする本発明の実施形態においては、抗CD19抗体の用量の投与を、単球計数の回復を可能にする間隔で行うことができる。例えば、本発明の組成物を、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30日毎の間隔で投与することができる。
【０５５６】
抗CD19抗体を毒素にコンジュゲートさせるか、または毒素と共に投与する本発明の実施形態においては、当業者であれば、抗CD19抗体の用量を、毒素用量に基づいて調整することができ、その毒素用量が用いる毒素の特定の型に依存することを理解できるであろう。典型的には、毒素を用いる場合、抗CD19抗体の用量は、裸の抗CD19抗体と共に用いられる用量よりも少ないであろう。当業界でよく知られる技術を用いて、好適な用量を特定の毒素について決定することができる。例えば、用量範囲試験を行って、毒素と共に投与するか、または毒素にコンジュゲートさせた場合の抗CD19抗体の最大寛容用量を決定することができる。
【０５５７】
抗CD19抗体を放射線療法剤にコンジュゲートさせるか、またはそれと共に投与する本発明の実施形態においては、抗CD19抗体の用量は、用いる放射線療法剤に応じて変化するであろう。特定の実施形態においては、2段階プロセスを用いる。第1に、ヒト患者に、裸の抗CD19抗体を含む組成物を投与し、約6、7、8、9、または10日後、少量の放射線療法剤を投与する。第2に、一度、低用量療法の寛容性、分布、および消失が決定されたら、患者に一定用量の裸の抗CD19抗体を投与した後、放射線療法剤の治療用量を投与する。そのような治療計画は、ZEVALIN(商標)(インジウム標識された抗CD20 mAb)(Biogen Idec)またはBEXXAR(商標)(GSK, Coulter Pharmaceutical)を用いる非ホジキンリンパ腫の治療のために認可されたものと類似している。
【０５５８】
28. 化学療法剤との組合せ
抗CD19免疫療法(裸の抗体、イムノコンジュゲート、もしくは融合タンパク質)を、限定されるものではないが、化学療法、放射線免疫療法(RIT)、化学療法と外部ビーム照射(混合モダリティ療法、CMT)、または混合モダリティ放射線免疫療法(CMRIT)などの他の療法を単独で、または組み合わせて用いることができる。特定の実施形態においては、本発明の抗CD19抗体療法を、非ホジキンリンパ腫を治療するための最も一般的な化学療法計画である、CHOP(シクロホスファミド-ヒドロキシドキソルビシン-オンコビン(ビンクリスチン)-プレドニゾロン)と共に投与することができる。本明細書で用いられる用語「と共に投与する」とは、抗CD19免疫療法を、用いられる他の療法の前に、その間に、またはその後に投与することができることを意味する。
【０５５９】
特定の実施形態においては、抗CD19免疫療法を、細胞傷害性放射性核種または放射線治療用アイソトープと組み合わせる。例えば、225Ac、224Ac、211At、212Bi、213Bi、212Pb、224Ra、または223Raなどのα放射性アイソトープが挙げられる。細胞傷害性放射性核種は、186Re、188Re、90Y、131I、67Cu、177Lu、153Sm、166Ho、または64Cuなどのβ放射性アイソトープであってもよい。さらに、細胞傷害性放射性核種は、オージェ電子および低エネルギー電子を放射してもよく、アイソトープ125I、123Iまたは77Brが挙げられる。他の実施形態においては、アイソトープは198Au、32Pなどであってもよい。特定の実施形態においては、被験者に投与される放射性核種の量は、約0.001 mCi/kg〜約10 mCi/kgである。
【０５６０】
いくつかの実施形態においては、被験者に投与される放射性核種の量は、約0.1 mCi/kg〜約1.0 mCi/kgである。他の実施形態においては、被験者に投与される放射性核種の量は、約0.005 mCi/kg〜0.1 mCi/kgである。
【０５６１】
特定の実施形態においては、抗CD19免疫療法を、化学毒素または化学療法剤と組み合わせる。化学毒素または化学療法剤を、カリケアマイシンおよびエスペラミシンなどのエネジン；デュオカルマイシン、メトトレキサート、ドキソルビシン、メルファラン、クロラムブシル、ARA-C、ビンデシン、マイトマイシンC、シスプラチン、エトポシド、ブレオマイシンおよび5-フルオロウラシルからなる群より選択することができる。
【０５６２】
抗CD19免疫療法との組合せ療法において用いることができる好適な化学毒素または化学療法剤としては、カリケアマイシンおよびエスペラミシンなどのエネジンファミリーの分子のメンバーが挙げられる。化学毒素を、デュオカルマイシン(例えば、米国特許第5,703,080号および米国特許第4,923,990号を参照)、メトトレキサート、ドキソルビシン、メルファラン、クロラムブシル、ARA-C、ビンデシン、マイトマイシンC、シスプラチン、エトポシド、ブレオマイシンおよび5-フルオロウラシルからなる群より取得することもできる。化学療法剤の例としては、アドリアマイシン、ドキソルビシン、5-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド(「Ara-C」)、シクロホスファミド、チオテパ、タキソテル(ドセタキセル)、ブスルファン、サイトキシン、タキソール、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンC、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラミシン(米国特許第4,675,187号を参照)、メルファランおよび他の関連する窒素マスタードも挙げられる。
【０５６３】
他の実施形態においては、例えば、「CVB」(1.5 g/m2のシクロホスファミド、200〜400 mg/m2のエトポシド、および150〜200 mg/m2のカルムスチン)を本発明の療法と共に用いることができる。CVBは、非ホジキンリンパ腫を治療するのに用いられる計画である(Pattiら、Eur. J. Haematol. 51:18(1993))。他の好適な組合せ化学療法計画は、当業者にはよく知られている。例えば、Freedman ら、「非ホジキンリンパ腫(Non-Hodgkin's Lymphomas)」、CANCER MEDICINE, VOLUME 2、第3版、Hollandら(編)、pp. 2028-2068 (Lea & Febiger 1993)を参照されたい。例として、中悪性度非ホジキンリンパ腫の治療のための第1世代の化学療法計画としては、C-MOPP(シクロホスファミド、ビンクリスチン、プロカルバジンおよびプレドニゾン)ならびにCHOP(シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン)が挙げられる。有用な第2世代の化学療法計画は、m-BACOD(メトトレキサート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、デキサメタゾンおよびロイコボリン)であるが、好適な第3世代の計画は、MACOP-B(メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン、ブレオマイシンおよびロイコボリン)である。さらなる有用な薬剤としては、酪酸フェニルおよびブロスタチン-1が挙げられる。多モデル療法においては、化学療法剤およびサイトカインの両方を、本発明に従う抗体、イムノコンジュゲートまたは融合タンパク質と共に同時投与する。サイトカイン、化学療法剤および抗体、イムノコンジュゲートまたは融合タンパク質を、任意の順序で、または一緒に投与することができる。
【０５６４】
本発明の組成物および方法において用いることができる他の毒素としては、有毒レクチン、リシン、アブリン、モデシン、ボツリナおよびジフテリア毒素などの植物毒素が挙げられる。勿論、種々の毒素の組合せを、1個の抗体分子と結合させることによって、可変的な細胞傷害性を提供することもできる。本発明の組合せ両方において好適に用いられる毒素の例は、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、DNaseI、スタフィロコッカス腸毒素A、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、およびシュードモナス内毒素である。例えば、Pastanら、Cell 47:641 (1986)、およびGoldenbergら、Cancer Journal for Clinicians 44:43 (1994)を参照されたい。用いることができる酵素的に活性な毒素およびその断片としては、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素A鎖(シュードモナス・エルギノーサ由来)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α-サルシン、アレウリテス・フォルジタンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラカ・アメリカーナタンパク質(PAPI、PAPII、およびPAP-S)、モモルディカ・チャランティア阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィシナリス阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが挙げられる。例えば、1993年10月28日に公開されたWO 93/21232を参照されたい。
【０５６５】
好適な毒素および化学療法剤は、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES、第19版(Mack Publishing Co. 1995)、およびGOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS、第7版(MacMillan Publishing Co. 1985)に記載されている。他の好適な毒素および／または化学療法剤は、当業者には公知である。
【０５６６】
本発明の抗CD19免疫療法を、プロドラッグ(例えば、ペプチジル化学療法剤、WO 81/01145を参照)を活性な抗癌剤に変換するプロドラッグ活性化酵素と組み合わせることもできる。例えば、WO 88/07378および米国特許第4,975,278号を参照されたい。そのような組合せの酵素成分としては、それをそのより活性な、細胞傷害性形態に変換するような方法で、プロドラッグに作用することができる任意の酵素が挙げられる。本出願で用いられる用語「プロドラッグ」とは、親薬剤と比較して腫瘍細胞に対する細胞傷害性が低く、酵素的に活性化するか、またはより活性な親形態に変換することができる製薬上活性物質の前駆体または誘導体形態を指す。例えば、Wilman、「癌化学療法におけるプロドラッグ(Prodrugs in Cancer Chemotherapy)」、Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986)およびStellaら、「プロドラッグ：標的化された薬剤送達に対する化学的手法(Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery)」、Directed Drug Delivery, Borchardtら(編)、pp. 247-267, Humana Press (1985)を参照されたい。抗CD19抗体と共に用いることができるプロドラッグとしては、限定されるものではないが、リン酸含有プロドラッグ、チオリン酸含有プロドラッグ、硫酸含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、D-アミノ酸改変プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、α-ラクタム含有プロドラッグ、必要に応じて置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグもしくは必要に応じて置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、5-フルオロシトシンおよびより活性な細胞傷害性遊離薬剤に変換することができる他の5-フルオロウリジンプロドラッグが挙げられる。本発明における使用のためのプロドラッグ形態に誘導体化することができる細胞傷害性薬剤の例としては、限定されるものではないが、上記の化学療法剤が挙げられる。
【０５６７】
特定の実施形態においては、本発明の組成物および方法の投与は、毒性療法の延期を可能にし、不必要な副作用および化学療法に関連する合併症の危険性を回避するのを助け、化学療法に対する耐性の発生を遅延させることができる。特定の実施形態においては、毒性療法および／または毒性療法に対する耐性を、最大で約6ヶ月、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10年間、本発明の組成物および方法を投与された患者において遅延させる。
【０５６８】
29. 治療用抗体との組合せ
本明細書に記載の抗CD19免疫療法を、限定されるものではないが、抗CD20 mAb、抗CD52 mAb、抗CD22抗体、およびRITUXAN(商標)(C2B8;RITUXIMAB(商標)；IDEC Pharmaceuticals)などの抗CD20抗体などの他の抗体と共に投与することができる。本発明の抗体と共に用いるか、または本発明の組成物中で用いることができる治療用抗体の他の例としては、限定されるものではないが、HERCEPTIN(商標)(Trastuzumab; Genentech)、MYLOTARG(商標) (Gemtuzumab ozogamicin; Wyeth Pharmaceuticals)、CAMPATH(商標) (Alemtuzumab; Berlex)、ZEVALIN(商標) (Ipritumomab tiuxetan; Biogen Idec)、BEXXAR(商標) (Tositumomab; GlaxoSmithKline Corixa)、ERBITUX(商標) (Cetuximab; Imclone)、およびAVASTIN(商標) (Bevacizumab; Genentech)が挙げられる。
【０５６９】
本明細書に記載の抗CD19免疫療法を、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIおよび／またはFcγRIVからなる群より選択されるFc受容体に特異的な抗体と共に投与することができる。特定の実施形態においては、本明細書に記載の抗CD19免疫療法を、FcγRIIBに特異的な抗体と共に投与することができる。この目的にとって好適な抗FcγRIIB抗体は、米国特許出願公開第2004185045号、PCT公開第WO05051999A、WO05018669およびWO04016750に記載されている。
【０５７０】
特定の実施形態においては、抗CD19および抗CD20および／または抗CD22 mAbおよび／または抗CD52 mAbを、必要に応じて、任意の好適な比率で、同じ医薬組成物中で投与することができる。例えば、抗CD19抗体と抗CD20抗体の比率は、約1000:1、500:1、250:1、100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、40:1、30:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:250、1:500または1:1000以上の比率であってよい。同様に、抗CD19抗体と抗CD22抗体の比率は、約1000:1、500:1、250:1、100:1、90:1、80:1、70:1、60;1、50:1、40:1、30:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:250、1:500または1:1000以上の比率であってよい。同様に、抗CD19抗体と抗CD52抗体の比率は、約1000:1、500:1、250:1、100:1、90:1、80:1、70:1、60;1、50:1、40:1、30:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:250、1:500または1:1000以上の比率であってよい。
【０５７１】
30. 単球またはマクロファージ機能を増強する組合せ化合物
本発明の方法の特定の実施形態においては、単球またはマクロファージ機能を増強する化合物(例えば、少なくとも約25％、50％、75％、85％、90％、95％以上)を、抗CD19免疫療法と共に用いることができる。そのような化合物は当業界で公知であり、限定されるものではないが、インターロイキン(例えば、IL-12)などのサイトカイン、およびインターフェロン(例えば、αまたはγインターフェロン)が挙げられる。
【０５７２】
単球もしくはマクロファージ機能を増強する化合物または増強を、抗体、イムノコンジュゲートまたは抗原結合フラグメントと同じ医薬組成物中で製剤化することができる。別々に投与する場合、抗体／フラグメントおよび化合物を、同時に(互いの時間内に)投与し、療法の同じ過程の間に投与するか、または連続的に(すなわち、患者は最初に抗体／フラグメント治療の過程を受けた後、マクロファージ／単球機能を増強する化合物の過程を受けるか、またはその逆)投与することができる。そのような実施形態においては、単球もしくはマクロファージ機能を増強する化合物を、本発明の他の治療計画および／または組成物を用いる治療の前、それと同時に、またはその後に、ヒト被験者に投与する。一実施形態においては、ヒト被験者は、ヒトに関する正常範囲内にある、血中白血球、単球、好中球、リンパ球、および／または好塩基球計数を有する。ヒト血中白血球(合計)の正常範囲は、約3.5〜約10.5(109個/L)である。ヒト血中好中球の正常範囲は、約1.7〜約7.0(109個/L)であり、単球は約0.3〜約0.9(109個/L)であり、リンパ球は約0.9〜2.9(109個/L)であり、好塩基球は約0〜約0.3(109個/L)であり、および好酸球は約0.05〜約0.5(109個/L)である。他の実施形態においては、ヒト被験者は、ヒトに関する正常範囲未満である血中白血球、例えば、少なくとも約0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、または0.8(109個/L)の白血球である。
【０５７３】
本発明のこの実施形態を、本発明の抗体、イムノコンジュゲートもしくは抗体フラグメントまたは当業界で公知である他の抗体を用いて実行することができ、これは特に、抗CD22、抗CD52および／もしくは抗CD20抗体療法(例えば、C2B8などの存在する抗体を用いる療法)に対して抵抗性である被験者、化学療法で現在治療されているか、もしくは以前に治療された被験者、B細胞障害における再発を有する被験者、免疫不全の被験者、またはさもなければマクロファージもしくは単球機能における障害を有する被験者にとって好適である。療法に対して抵抗性であるか、もしくはB細胞障害における再発を有する患者の患者数は、少なくとも部分的には、マクロファージもしくは単球機能における障害に起因し得る。かくして、本発明は、抗CD19抗体および抗原結合フラグメントを投与する方法と共に用いられるADCCおよび／もしくはマクロファージおよび／もしくは単球機能を増強する方法を提供する。
【０５７４】
31. 免疫調節剤との組合せ
本発明の抗CD19免疫療法を、免疫調節剤と組み合わせることもできる。この手法においては、キメラ、ヒトまたはヒト化抗CD19抗体を用いることができる。組合せ療法のために本明細書で用いられる用語「免疫調節剤」とは、宿主の免疫系を抑制し、隠すか、または増強するように働く物質を指す。これは、サイトカイン産生を抑制し、自己抗原発現を下方調節もしくは抑制するか、MHC抗原を隠す物質を含むであろう。そのような薬剤の例としては、2-アミノ-6-アリール-5-置換ピリミジン(米国特許第4,665,077号を参照)、アザチオプリン(もしくはシクロホスファミド、アザチオプリンに対する有害反応が存在する場合)；ブロモクリプチン；グルタルアルデヒド(米国特許第4,120,649号に記載のMHC抗原を隠す)；MHC抗原およびMHCフラグメントに対する抗イディオタイプ抗体；シクロスポリンA；糖質コルチコイドなどのステロイド、例えば、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、およびデキサメタゾン；抗インターフェロン-γ、-β、もしくは-α抗体；抗腫瘍壊死因子-α抗体；抗腫瘍壊死因子-β抗体；抗インターロイキン-2抗体および抗IL-2受容体抗体などのサイトカインもしくはサイトカイン受容体アンタゴニスト；抗L3T4抗体；異種抗リンパ球グロブリン；膵臓T抗体、例えば、抗CD3もしくは抗CD4/CD4a抗体；LFA-3結合ドメインを含む可溶性ペプチド(1990年7月26日に公開されたWO 90/08187)；ストレプトキナーゼ；TGF-β；ストレプトドルナーゼ；宿主に由来するRNAもしくはDNA；FK506；RS-61443；デオキシスペルグアリン；ラパマイシン；T細胞受容体(米国特許第5,114,721号；T細胞受容体断片(Offnerら、Science 251:430-432 (1991); WO 90/11294; およびWO 91/01133)；ならびにT10B9などのT細胞受容体抗体(EP 340,109)が挙げられる。サイトカインの例としては、限定されるものではないが、リンホカイン、モノカイン、および伝統的なポリペプチドホルモンが挙げられる。ヒト成長ホルモン、N-メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；サイロキシン；インスリン；プロインスリン；レラク
シン；プロレラクシン；卵胞刺激ホルモン(FSH)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、および黄体形成ホルモン(LH)などの糖タンパク質ホルモン；肝臓増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α；ミュラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン(TPO)；NGF-αなどの神経増殖因子；血小板増殖因子；TGF-αおよびTGF-βなどのトランスフォーミング増殖因子(TGF)；インスリン様増殖因子IおよびII；エリスロポエチン(EPO)；骨誘導因子；インターフェロン；マクロファージ-CSF (M-CSF)；顆粒球-マクロファージ-CgP (GM-CSP)；および顆粒球-CSF(G-CSF)などのコロニー刺激因子(CSF)；IL-1、IL-1a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15などのインターロイキン(IL)；TNF-αもしくはTNF-βなどの腫瘍壊死因子；ならびにLIFおよびキットリガンド(KL)などの他のポリペプチド因子も、サイトカインに含まれる。本明細書で用いられる用語「サイトカイン」は、天然起源もしくは組換え細胞培養物に由来するタンパク質および天然配列のサイトカインの生物学的に活性な等価物を含む。特定の実施形態においては、前記方法はさらに、1種以上の免疫調節剤、例えば、サイトカインを被験者に投与することを含む。好適なサイトカインを、インターロイキン-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-12、IL-15、IL-18、G-CSF、GM-CSF、トロンボポエチン、およびγインターフェロンからなる群より選択することができる。
【０５７５】
これらの免疫調節剤を、抗CD19抗体と同時に、または別々に投与する。好ましい免疫調節剤は、治療する障害の型、ならびに患者の既往歴などの多くの因子に依存するが、この薬剤を、シクロスポリンA、糖質コルチコイド(例えば、プレドニゾンもしくはメチルプレドニゾロン)、OKT-3モノクローナル抗体、アザチオプリン、ブロモクリプチン、異種抗リンパ球グロブリン、またはその混合物から選択することができることが多い。
【０５７６】
32. 他の治療剤との組合せ
腫瘍血管新生に対して作用する薬剤を、抗CD19免疫療法と共に用いることもでき、コンブレスタチンA4(Griggsら、Lancet Oncol. 2:82, (2001))およびアンギオスタチンおよびエンドスタチン(参照により本明細書に組み入れられる、Rosen, Oncologist 5:20 (2000)に概説されている)などのチューブリン結合剤が挙げられる。抗CD19抗体と共に用いるのに好適な免疫調節剤としては、限定されるものではないが、α-インターフェロン、γ-インターフェロン、および腫瘍壊死因子α(TNFα)が挙げられる。特定の実施形態においては、本発明の組成物および方法を用いる組合せ療法において用いられる治療剤は、ペプチドである。
【０５７７】
特定の実施形態においては、抗CD19免疫療法を、1種以上のカリケアマイシン分子と組み合わせる。カリケアマイシンファミリーの抗体は、ピコモル濃度以下で二本鎖DNA破壊をもたらすことができる。用いることができるカリケアマイシンの構造的類似体としては、限定されるものではないが、γ1I、γ2I、N-アセチル-γ1I、PSAGおよび011が挙げられる(Hinmanら、Cancer Research 53:3336-3342 (1993)およびLodeら、Cancer Research 58: 2925-2928 (1998))。
【０５７８】
抗CD19抗体と細胞傷害剤を含む融合タンパク質を、例えば、組換え技術またはペプチド合成により作製することもできる。
【０５７９】
さらに別の実施形態においては、アンタゴニスト-受容体コンジュゲートを患者に投与した後、消失剤を用いて循環中から未結合のコンジュゲートを除去した後、治療剤(例えば、放射性核種)に結合させた「リガンド」(例えば、アビジン)を投与する、腫瘍予備標的化における利用のために、抗CD19抗体を「受容体」(ストレプトアビジンなど)に結合させることができる。
【０５８０】
特定の実施形態においては、治療計画は、抗CD19抗体組成物の細胞傷害効果を和らげる化合物を含む。そのような化合物としては、鎮痛剤(例えば、アセトアミノフェン)、ビスホスホナート、抗ヒスタミン剤(例えば、マレイン酸クロルフェニルアミン)、およびステロイド(例えば、デキサメタゾン、レチノイド、デルトイド、ベタメタゾン、コルチゾール、コルチゾン、プレドニゾン、デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、ミネラルコルチコイド、エストロゲン、テストステロン、プロゲスチン)が挙げられる。
【０５８１】
特定の実施形態においては、抗CD19免疫療法と共に用いられる治療剤は、小分子(すなわち、約2500ダルトン未満の分子量を有する無機もしくは有機化合物)である。例えば、小分子のライブラリーを、Specs and BioSpecs B.V. (Rijswijk, The Netherlands)、Chembridge Corporation (San Diego, CA)、Comgenex USA Inc. (Princeton, NJ)、およびMaybridge Chemicals Ltd. (Cornwall PL34 OHW, United Kingdom)から商業的に取得することができる。
【０５８２】
特定の実施形態においては、抗CD19免疫療法を、抗細菌剤と共に投与することができる。抗細菌剤の非限定例としては、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、抗体、核酸分子、有機分子、無機分子、ならびに細菌感染を阻害および／もしくは低下させ、細菌の複製を阻害および／もしくは低下させるか、または他の細胞もしくは被験者への細菌の拡散を阻害および／もしくは低下させる小分子が挙げられる。抗細菌剤の特定例としては、限定されるものではないが、ペニシリン、セファロスポリン、イミペネム、アクストレオナム、バンコマイシン、シクロセリン、バシトラシン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、クリンダマイシン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、ゲンタマイシン、アミカシン、カナマイシン、ネオマイシン、スペクチノマイシン、トリメトプリム、ノルフロキサシン、リファムピン、ポリミキシン、アンホテリシンB、ナイスタチン、ケトカナゾール、イソニアジド、メトロニダゾール、およびペンタミジンなどの抗生物質が挙げられる。
【０５８３】
特定の実施形態においては、抗CD19免疫療法を、抗真菌剤と共に投与することができる。抗真菌剤の特定例としては、限定されるものではないが、アゾール剤(例えば、ミコナゾール、ケトコナゾール(NIZORAL(登録商標))、酢酸カスポファンギン(CANCIDAS(登録商標))、イミダゾール、トリアゾール(例えば、フルコナゾール(DIFLUCAN(登録商標))、およびイトラコナゾール(SPORANOX(登録商標))、ポリエン(例えば、ナイスタチン、アンホテリシンB(FUNGIZONE(登録商標)、アンホテリシンB脂質複合体(「ABLC」)(ABELCET(登録商標))、アンホテリシンBコロイド分散物(「ABCD」)(AMPHOTEC(登録商標)、リポソームアンホテリシンB(AMBISONE(登録商標))、ヨウ化カリウム(KI)、ピリミジン(例えば、フルシトシン(ANCOBON(登録商標)、およびボリコナゾール(VFEND(登録商標))が挙げられる。抗細菌剤および抗真菌剤の投与は、患者のB細胞を有意に枯渇させる本発明の方法において生じ得る感染症の効果または上昇を軽減することができる。
【０５８４】
本発明の特定の実施形態においては、抗CD19免疫療法を上記の1以上の薬剤と組合せて投与することで、本発明の組成物の投与に付随しうる毒性副作用を軽減することができる。他の実施形態においては、抗CD19免疫療法を、抗体投与、化学療法、毒素、または薬剤の副作用を軽減するのに用いられる当業界でよく知られる1種以上の薬剤と共に投与することができる。
【０５８５】
抗CD19免疫療法を投与して多発性骨髄腫を治療する本発明の特定の実施形態においては、本発明の組成物を、高用量の化学療法(メルファラン、メルファラン／プレドニゾン(MP)、ビンクリスチン／ドキソルビシン／デキサメタゾン(VAD)、リポソームドキソルビシン／ビンクリスチン、デキサメタゾン(DVd)、シクロホスファミド、エトポシド／デキサメタゾン／シタラビン、シスプラチン(EDAP))、幹細胞移植(例えば、自己幹細胞移植もしくは同種異系幹細胞移植、および／もしくはミニ同種異系(非骨髄機能廃絶)幹細胞移植)、放射線療法、ステロイド(例えば、コルチコステロイド、デキサメタゾン、サリドマイド／デキサメタゾン、プレドニゾン、メルファラン／プレドニゾン)、支援療法(例えば、ビスホスホナート、増殖因子、抗生物質、静脈内免疫グロブリン、低用量放射線療法、および／もしくは整形外科的介入)、THALOMID(商標)(サリドマイド、Celgene)、ならびに／またはVELCADE(商標)(ボルテゾミブ、Millennium)と共に、またはそれを用いる治療計画において投与することができる。
【０５８６】
抗CD19免疫療法を別の抗体および／または薬剤と共に用いる本発明の実施形態においては、追加の抗体および／または薬剤を、本発明の抗体の投与と比較して、任意の順序で投与することができる。例えば、追加の抗体を、ヒト被験者への抗CD19抗体またはイムノコンジュゲートの投与の前に、それと同時に、および／またはその後に投与することができる。追加の抗体を、本発明の抗体と同じ医薬組成物中に存在させ、および／または異なる医薬組成物中に存在させることができる。本発明の抗体の用量および投与の様式ならびに追加の抗体の用量は、本明細書に提供され、ならびに当業界でよく知られる用量および投与の様式の教示のいずれかに従って、同じか、または異なるものであってよい。
【０５８７】
33. B細胞悪性腫瘍の診断における抗CD19抗体の使用
本発明はまた、抗CD19抗体を診断または検出剤にコンジュゲートさせる、ヒトCD19抗原に免疫特異的に結合する抗CD19抗体、およびその組成物も包含する。特定の実施形態においては、抗体はヒトまたはヒト化抗CD19抗体であってよい。そのような抗CD19抗体は、特定の療法の効力を決定することなどの、臨床試験手順の一部としてB細胞悪性腫瘍の発生または進行をモニターまたは予測するのに有用であってよい。そのような診断および検出を、ヒトCD19抗原に免疫特異的に結合する抗CD19抗体を、限定されるものではないが、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、もしくはアセチルコリンエステラーゼなどの種々の酵素；限定されるものではないが、ストレプトアビジンおよびアビジン／ビオチンなどの補欠分子族；限定されるものではないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドもしくはフィコエリトリンなどの蛍光材料；限定されるものではないが、ルミノールなどの発光物質；限定されるものではないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなどの生物発光物質；限定されるものではないが、ヨウ素(131I、125I、123I、121I)、炭素(14C)、硫黄(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(115In、113In、112In、111In)、およびテクネチウム(99Tc)、タリウム(201Ti)、ガリウム(68Ga、67Ga)、パラジウム(103Pd)、モリブデン(99Mo)、キセノン(133Xe)、フッ素(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn、および117Tinなどの放射性物質；様々な陽電子放出断層撮影を用いる陽電子放出金属、非放射性常磁性金属イオン、ならびに特定の放射性アイソトープに放射標識もしくは結合された分子などの検出可能な物質に結合させることにより達成することができる。容易に測定することができる任意の検出可能な標識を、抗CD19抗体にコンジュゲートさせ、B細胞悪性腫瘍を診断するのに用いることができる。検出可能な物質を、抗体に直接的に、または当業界で公知の技術を用いて中間体(例えば、当業界で公知のリンカーなど)を介して間接的に、結合またはコンジュゲートさせることができる。例えば、本発明に従う診断剤としての使用のための抗体にコンジュゲートさせることができる金属イオンについては、米国特許第4,741,900号を参照されたい。特定の実施形態においては、本発明は、診断剤または検出剤にコンジュゲートさせた抗CD19抗体を含む診断キットを提供する。
【０５８８】
34. 免疫再構成をモニターする際の抗CD19抗体の使用
本発明はまた、抗CD19抗体を診断剤または検出剤にコンジュゲートさせる、ヒトCD19抗原に免疫特異的に結合する抗CD19抗体、およびその組成物も包含する。特定の実施形態においては、抗体はヒトまたはヒト化抗CD19抗体である。そのような抗CD19抗体は、免疫抑制療法または骨髄移植後の免疫系再構成をモニターするのに有用であってよい。そのようなモニタリングを、ヒトCD19抗原に免疫特異的に結合する抗CD19抗体を、限定されるものではないが、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、もしくはアセチルコリンエステラーゼなどの種々の酵素；限定されるものではないが、ストレプトアビジンおよびアビジン／ビオチンなどの補欠分子族；限定されるものではないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドもしくはフィコエリトリンなどの蛍光材料；限定されるものではないが、ルミノールなどの発光物質；限定されるものではないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなどの生物発光物質；限定されるものではないが、ヨウ素(131I、125I、123I、121I)、炭素(14C)、硫黄(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(115In、113In、112In、111In)、およびテクネチウム(99Tc)、タリウム(201Ti)、ガリウム(68Ga、67Ga)、パラジウム(103Pd)、モリブデン(99Mo)、キセノン(133Xe)、フッ素(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn、および117Tinなどの放射性物質；様々な陽電子放出断層撮影を用いる陽電子放出金属、非放射性常磁性金属イオン、ならびに特定の放射性アイソトープに放射標識もしくは結合された分子などの検出可能な物質に結合させることにより達成することができる。容易に測定することができる任意の検出可能な標識を、抗CD19抗体にコンジュゲートさせ、自己免疫疾患または障害を診断するのに用いることができる。検出可能な物質を、抗体に直接的に、または当業界で公知の技術を用いて中間体(例えば、当業界で公知のリンカーなど)を介して間接的に、結合またはコンジュゲートさせることができる。例えば、本発明に従う診断剤としての使用のための抗体にコンジュゲートさせることができる金属イオンについては、米国特許第4,741,900号を参照されたい。特定の実施形態においては、本発明は、診断剤または検出剤にコンジュゲートさせた抗CD19抗体を含む診断キットを提供する。
【０５８９】
35. 自己免疫疾患または障害を診断する際の抗CD19抗体の使用
本発明はまた、抗CD19抗体を診断剤または検出剤にコンジュゲートさせる、ヒトCD19抗原に免疫特異的に結合する抗CD19抗体、およびその組成物も包含する。特定の実施形態においては、抗体はヒトまたはヒト化抗CD19抗体である。そのような抗CD19抗体は、特定の療法の効力を決定することなどの、臨床試験手順の一部として自己免疫疾患または障害の発生または進行をモニターまたは予測するのに有用であってよい。そのような診断および検出を、ヒトCD19抗原に免疫特異的に結合する抗CD19抗体を、限定されるものではないが、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、もしくはアセチルコリンエステラーゼなどの種々の酵素；限定されるものではないが、ストレプトアビジンおよびアビジン／ビオチンなどの補欠分子族；限定されるものではないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドもしくはフィコエリトリンなどの蛍光材料；限定されるものではないが、ルミノールなどの発光物質；限定されるものではないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなどの生物発光物質；限定されるものではないが、ヨウ素(131I、125I、123I、121I)、炭素(14C)、硫黄(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(115In、113In、112In、111In)、およびテクネチウム(99Tc)、タリウム(201Ti)、ガリウム(68Ga、67Ga)、パラジウム(103Pd)、モリブデン(99Mo)、キセノン(133Xe)、フッ素(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn、および117Tinなどの放射性物質；様々な陽電子放出断層撮影を用いる陽電子放出金属、非放射性常磁性金属イオン、ならびに特定の放射性アイソトープに放射標識もしくは結合された分子などの検出可能な物質に結合させることにより達成することができる。容易に測定することができる任意の検出可能な標識を、抗CD19抗体にコンジュゲートさせ、自己免疫疾患または障害を診断するのに用いることができる。検出可能な物質を、抗体に直接的に、または当業界で公知の技術を用いて中間体(例えば、当業界で公知のリンカーなど)を介して間接的に、結合またはコンジュゲートさせることができる。例えば、本発明に従う診断剤としての使用のための抗体にコンジュゲートさせることができる金属イオンについては、米国特許第4,741,900号を参照されたい。特定の実施形態においては、本発明は、診断剤または検出剤にコンジュゲートさせた抗CD19抗体を含む診断キットを提供する。
【０５９０】
36. キット
本発明は、B細胞悪性腫瘍、またはB細胞悪性腫瘍により促進されたか、もしくはそれを促進させる、1つ以上の徴候の予防、治療、管理または軽減のための本発明の組成物を充填された1個以上の容器を含む医薬包装物またはキットを提供する。
【０５９１】
本発明は、上記方法において用いることができるキットを提供する。一実施形態においては、キットは、1個以上の容器中に本発明の組成物を含む。別の実施形態においては、キットは、1個以上の容器中に、本発明の組成物、および1個以上の他の容器中に、B細胞悪性腫瘍、またはB細胞悪性腫瘍により促進されたか、もしくはそれを促進させる、1つ以上の徴候の予防、管理または治療にとって有用な1種以上の他の予防剤または治療剤を含む。キットはさらに、B細胞悪性腫瘍を予防、治療、管理もしくは軽減するための説明書、ならびに投与の方法に関する副作用および投与情報を含んでもよい。必要に応じて、そのような容器と共に、ヒト投与のための製造、使用または販売の機関による認可を反映する、医薬品または生物製剤の製造、使用または販売に関する行政機関により規定された形態の通知書があってもよい。
【０５９２】
特定の実施形態
1. ヒトCD19抗原に結合する、キメラ、ヒト化、もしくはヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【０５９３】
2. 配列番号6、8、10、12、14、16、22、24、26、28、30、32、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、および127からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも1個のCDRを含む実施形態1に記載の抗体。
【０５９４】
3. HB12B-(A10-Jk4)、HB12B-3649、またはHB12B-364987軽鎖可変領域の少なくとも1個のフレームワーク領域を含む、実施形態1に記載の抗体。
【０５９５】
4. HB12B-(3-72/JH4)またはHB12B-9m重鎖可変領域の少なくとも1個のフレームワーク領域を含む、実施形態1に記載の抗体。
【０５９６】
5. 配列番号2、18、34、44、102、103、104、105、106、107、108、および109からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも1個の重鎖ポリペプチドを含む、実施形態1に記載の抗体。
【０５９７】
6. 配列番号4、20、52、62、68、70、110、111、112、および113からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも1個の軽鎖ポリペプチドを含む、実施形態1に記載の抗体。
【０５９８】
7. 配列番号12、14、16、28、30、32、123、124、125、126、および127からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも1個の軽鎖CDRをさらに含む、実施形態5に記載の抗体。
【０５９９】
8. 配列番号6、8、10、22、24、26、114、115、116、117、118、119、120、121、および122からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも1個の重鎖CDRをさらに含む、実施形態3に記載の抗体。
【０６００】
9. 配列番号2、18、34、44、102、103、104、105、106、107、108、および109からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも1個の重鎖ポリペプチド、ならびに配列番号4、20、52、62、68、70、110、111、112、および113からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも1個の軽鎖ポリペプチドを含む、実施形態1に記載の抗体。
【０６０１】
10. 軽鎖ポリペプチドがHB12A VK(配列番号4)；およびHB12B VK(配列番号20)からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、重鎖ポリペプチドがHB12A VH(配列番号2)；およびHB12B VH(配列番号18)からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも1個の軽鎖ポリペプチドおよび少なくとも1個の重鎖ポリペプチドを含む、実施形態1に記載の抗体。
【０６０２】
11. HB12B-(3-72/JH4)重鎖可変領域およびHB12B-3649軽鎖可変領域を含む実施形態1に記載の抗体。
【０６０３】
12. VHが配列番号106のアミノ酸配列を含み、VKが配列番号111のアミノ酸配列を含む、VHおよびVKを含む実施形態1に記載の抗体。
【０６０４】
13. 配列番号2、18、34、36、38、40、42、44、102、103、104、105、106、107、108、および109からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸。
【０６０５】
14. 配列番号4、20、52、62、64、66、68、70、110、111、112、および113からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸。
【０６０６】
15. 実施形態13および／または14に記載の核酸を含むベクター。
【０６０７】
16. 実施形態15に記載のベクターを含む単離された細胞。
【０６０８】
17. 実施形態1〜12のいずれかに記載の抗体を発現する単離された細胞。
【０６０９】
18. 抗体の産生にとって十分な条件下で、実施形態17に記載の単離された細胞を培養し、培養物から抗体を回収することを含む、抗体の製造方法。
【０６１０】
19. 製薬上許容し得る担体中に、実施形態1〜12のいずれかに記載の抗体を含む医薬組成物。
【０６１１】
20. 抗体がIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4ヒトアイソタイプのものである、実施形態19に記載の医薬組成物。
【０６１２】
21. 実施形態1〜12のいずれかに記載の治療上有効量の抗体を、それを必要とするヒトに投与することを含む、ヒトにおけるB細胞悪性腫瘍を治療する方法。
【０６１３】
22. 実施形態1〜12のいずれかに記載の治療上有効量の抗体を、それを必要とするヒトに投与することを含む、ヒトにおける自己免疫疾患または障害を治療する方法。
【０６１４】
23. 実施形態1〜12のいずれかに記載の治療上有効量の抗体を、それを必要とするヒトに投与することを含む、ヒト移植患者における体液性拒絶を治療または予防する方法。
【０６１５】
24. 前記抗体が、マウスモノクローナルHB12B抗体のものと同じ効力でB細胞を枯渇させる、実施形態1〜12のいずれかに記載の抗体。
【０６１６】
25. 前記抗体がB細胞アポトーシスを誘導する、実施形態1〜12のいずれかに記載の抗体。
【０６１７】
26. 前記抗体が、フコースが糖鎖中の還元末端中のN-アセチルグルコサミンに結合していないFc領域に結合した複合型N-グリコシド結合糖鎖を有する、実施形態1〜12のいずれかに記載の抗体。
【０６１８】
27. 前記抗体が、Fc変異体がADCC活性の増強をもたらす突然変異を含むFc変異体抗体である、実施形態1〜12のいずれかに記載の抗体。
【０６１９】
28. 実施形態24〜27のいずれかに記載の治療上有効量の抗体を、それを必要とするヒトに投与することを含む、ヒト患者中のB細胞を枯渇させる方法。
【０６２０】
29. 前記抗体が、Fc変異体が比較可能な分子のものよりも少なくとも約5倍低いFc受容体FcγRIIIAに対する親和性を有し、該Fc変異体が、比較可能な分子のものの約2倍の範囲内であるFc受容体FcγRIIBに対する親和性を有するFc変異体抗体である、実施形態1〜12のいずれかに記載の抗体。
【０６２１】
30. 治療上有効量の実施形態29に記載の抗体を、それを必要とするヒトに投与することを含む、ヒト患者におけるB細胞を枯渇させる方法。
【０６２２】
(実施例)
1. ヒト化抗CD19抗体の構築、発現および結合特性
以下の節は、マウス重鎖および軽鎖定常領域が、それぞれ、ヒトIgHγ1およびヒトIgLκ領域と置換された親HB12B抗体のキメラ変異体(chHB12B)の設計および構築を記載する。これらの節はまた、HB12B重鎖および軽鎖可変領域のヒト化変異体の作製のための戦略も記載する。
【０６２３】
(キメラまたはヒト化)重鎖および軽鎖可変領域の様々な組合せから製造された抗体のCD19結合活性も記載する。例えば、chHB12Bのものと比較可能なCD19結合プロフィールを示すヒト化形態のHB12Bを記載する。
【０６２４】
以下の節はまた、ヒトフレームワーク領域中のいくつかの突然変異が、特定のヒト化抗CD19抗体に導入された場合、HB12B VHおよびHB12B VKを含むchHB12Bである参照抗体のものと比較可能なヒトCD19結合をもたらすことを記載する。
【０６２５】
1.1. 遺伝子集合および発現クローニング
構築物を、Stemmer (Stemmer, W. P.ら、1995 Gene, 164:49-53)により初めて記載されたPCRに基づく遺伝子集合方法により作製した。この方法は、4つの工程：オリゴヌクレオチド合成；遺伝子集合；遺伝子増幅およびクローニングからなる。8個の遺伝子特異的プライマーを、各VHおよびVK断片のために合成した。HB12B-(3-72/JH4)VH領域およびHB12B-(A10-Jk4)VKの集合のための代表的なプライマーセットを表3に示す；特定のアミノ酸置換を含む変異体VHおよびVK領域のためのプライマーセットを、所与のアミノ酸残基をコードするプライマーの核酸配列を改変することにより作製した。プライマーを15〜20ヌクレオチドにより重複させるように設計し、サーマルサイクリングの間に完全な可変領域中に連結した。VHの場合、さらなるベクター特異的プライマー(表3中のUniversal VH FW)を、PCRを介する遺伝子集合プロセスに含有させた。VH領域のための外部5'および3'プライマーは、それぞれ、その後のクローニング工程に役立つ、XbaIおよびApaI制限エンドヌクレアーゼのユニークな認識部位を含んでいた。VKのための外部5'および3'プライマーは、それぞれ、その後のクローニング工程に役立つ、XmaIおよびBsiWI制限エンドヌクレアーゼのユニークな認識部位を含んでいた。正確なサイズのPCR産物を制限消化し、製造業者の説明書に従って、VH領域をXbaIおよびApaIを用いて消化し、VK領域をXmaIおよびBsiWIを用いて消化した発現ベクター中に読み枠を合わせて連結した。重鎖集合に用いられるベクターは、転写制御エレメントがCMV極初期プロモーターおよびSV40ポリA付加シグナルを含む、MGDNDIHFAFLSTGVHS VHリーダー配列(配列番号83)およびヒトIgHγ1定常領域をコードするポリヌクレオチドに機能し得る形で連結された真核転写制御エレメントを含む。VH集合のための好適に設計されたプライマーの使用により、VHリーダー、VH領域およびIgHγ1定常領域をコードするポリヌクレオチド配列が、最終的な重鎖発現ベクター内に読み枠を合わせて連結されることを確保した。軽鎖集合のためのベクターは、転写制御エレメントがCMV極初期プロモーターおよびSV40ポリA付加シグナルを含む、ヒトVHI-L12リーダー配列(アミノ酸配列MDMRVPAQLLGLLLLWLPGAKC (配列番号84); Bentley, D. L. & Rabbitts, T. H., Nature 288,730-733 (1980))およびヒトIgLκ定常領域をコードするポリヌクレオチドに機能し得る形で連結された真核転写制御エレメントを含む。VK集合のための好適に設計されたプライマーの使用により、VKI-L12リーダー配列、VK領域およびIgLκ定常領域をコードするポリヌクレオチド配列が、最終的な軽鎖発現ベクター内に読み枠を合わせて連結されることを確保した。連結産物を用いて、製造業者のプロトコルに従ってDH10Bコンピテント大腸菌細胞を形質転換した。プラスミドおよび正確なサイズの挿入物を含むコロニーを、当業界で公知の様々な方法(例えば、ベクターDNA調製物の制限消化、ベクター配列のPCR増幅)を用いて同定することができる。正確なサイズの挿入物を含むプラスミドクローンを、ジデオキシ配列決定反応(例えば、BigDye(登録商標) Terminator v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, ABI)を用いて配列決定した。プラスミドDNAを、製造業者のプロトコルに従って、QIAGEN MiniおよびMaxi Plasmid Kitを用いて、選択されたクローンから調製した。
【０６２６】
ヒト化またはキメラ免疫グロブリン重鎖およびヒト化またはキメラ免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAプラスミド発現ベクター調製物の対を用いて、HEK293細胞を同時トランスフェクトした。これらの同時トランスフェクトされたHEK293細胞を3日間培養して、総IgG濃度およびCD19結合活性を決定するのに好適な抗体含有条件化培地を得た。
【０６２７】
HEK293細胞上清中の総Ig濃度を、捕捉ELISAアッセイを用いて定量した。IgG分子を、固定化ヤギ抗ヒトIgG H+L特異的抗体を介して96穴プレート上に捕捉し、HRP結合抗ヒトκ軽鎖抗体を用いて検出した。このアッセイを、無関係な特異性の参照IgG1 mAbを用いて補正した。
【表３】
0005401314.tif 000009
【０６２８】
1.2. 300B4-CD19結合アッセイ
等しい濃度のそれぞれのヒト化もしくはキメラ抗体を用いて実施することによって、代替的なヒト化形態のHB12B抗体およびchHB12Bの間の直接的比較を容易にする、細胞に基づく組換えヒトCD19 ELISAアッセイを用いて、CD19結合活性を評価した。
【０６２９】
chHB12Bおよびそのヒト化変異体がhCD19に結合する能力を、捕捉剤として、組換え細胞表面ヒトCD19を発現する300B4細胞を用いて、細胞に基づくCD19結合アッセイにおいて評価した。300B4細胞を、標準的なプロトコルに従って、1 mg/mlのG418の存在下で、L-グルタミンを含有し、10％ウシ胎仔血清、β-メルカプトエタノールを補給したRPMI 1640培地中で培養した。標準的なELISAプロトコルを、細胞に基づくCD19結合アッセイのために用いることができる。例えば、96穴U底プレートの個々のウェルに、1 x105個の300B4細胞を播種し、一晩インキュベートする。細胞をELISAバッファーで1回洗浄した後、ヒト、ヒト化、またはキメラHB12B抗体と共に氷上でインキュベートする。結合反応を、試験するそれぞれの抗体濃度について3回実施する。無関係の特異性のアイソタイプが一致した抗体を用いる陰性対照ウェルを、アッセイに含有させるべきである。抗体とのインキュベーション後、300B4細胞を200μlのELISAバッファーを用いて3回洗浄する。300B4細胞に結合したキメラ、ヒト化、またはヒト抗CD19抗体の量を、標準的なプロトコルに従って、西洋わさびペルオキシダーゼに結合させたヤギ抗ヒトκ抗体を用いて検出することができる。
【０６３０】
1.3. chHB12Bの構築、発現および結合特性
マウスHB12B VHおよびヒトIgHγ1定常領域を含むchHB12B重鎖をコードする発現ベクターを、1節に記載の方法に従って構築した。マウスHB12B VKおよびヒトIgLκ定常領域を含むchHB12B軽鎖をコードする発現ベクターを、1節に記載の方法に従って構築した。
【０６３１】
HEK293細胞を、chHB12B重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターと同時にトランスフェクトした。これらのトランスフェクトされた細胞を3日間培養して、抗体を産生させた。可溶性の分泌されたchHB12b抗体を含む培養培地を収穫し、chHB12B抗体の濃度を1節に記載の方法に従って決定した。
【０６３２】
ヒトCD19へのchHB12Bの結合を、2節に記載の300B4細胞に基づくELISAアッセイを用いて評価した。無関係の特異性のアイソタイプが一致したヒト抗体を、陰性対照としてアッセイに含有させた。細胞に基づくELISAアッセイを用いて得られた結果により、100 ng/mlを超える抗体の濃度について、300B4細胞の表面上に発現された組換えヒトCD19へのキメラ抗体の有意な結合が存在し、chHB12BがhCD19結合活性を保持することを示唆することが示された(図2)。
【０６３３】
1.4. ヒト化HB12B VHをコードする発現ベクターの構築
以下の節は、マウスHB12B CDR領域および好適なヒト、または実質的にはヒトフレームワーク領域を含むHB12B VH領域のヒト化変異体の設計を記載する。これらの節はまた、ヒト化HB12B Ig重鎖の変異体の作製のための戦略を記載する。
【０６３４】
1.4.1. ヒト重鎖アクセプターフレームワーク領域の同定
全てのヒト生殖細胞免疫グロブリン重鎖V、D、およびJ領域のフレームワーク領域を含むアミノ酸配列データベースが蓄積された。必要な情報を、様々な起源、例えば、V Base：ヒト抗体遺伝子のデータベース(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)から取得することができる。重要残基、例えば、標準残基、鎖間残基およびVernier残基で、マウスHB12b VHの対応するフレームワーク領域との配列類似性を示すヒト生殖細胞VおよびJ断片について、データベースに問い合わせた。
【０６３５】
HB12Bマウス抗CD19抗体のヒト化のためのアクセプターフレームワークとして役立つヒト生殖細胞V3-72(Tomlinson, I. M.ら、J. Mol. Biol., 227:776-798 (1992))およびJH4 (Ravetch, J. V.ら、Cell 27: 583-591 (1981))断片を選択した。
【０６３６】
1.4.2. ヒト化HB12B重鎖の作製
HB12B-(3-72/JH4) VH (配列番号34)を、HB12B VHのCDRとヒト生殖細胞V3-72/JH4領域のフレームワーク残基とを結合させることにより設計した。HB12B-(3-72/JH4) VHを含む発現ベクターを、1節に記載の方法に従って作製した。
【０６３７】
HB12B-9m VH (配列番号44)は、以下の9個のアミノ酸置換：L20I、F27Y、T28A、R38I、V49I、F67A、R71A、L80M、I91Y(Kabatに従って番号付けられた残基)を含むHB12B-(3-72/JH4) VHの変異体である。HB12B-9mのための遺伝子特異的プライマーを、1節に記載のように設計した。HB12B-9m VHを含む発現ベクターを、1節に記載の方法に従って作製した。
【０６３８】
1.5. ヒト化HB12B Ig軽鎖をコードする発現ベクターの構築
以下の節は、マウスHB12B CDR領域および好適なヒト、または実質的にヒトフレームワーク領域を含むHB12B VK領域のヒト化変異体の設計を記載する。これらの節はまた、ヒト化HB12B Ig軽鎖の変異体の作製のための戦略を記載する。
【０６３９】
1.5.1. ヒト軽鎖アクセプターフレームワーク領域の同定
全てのヒト生殖細胞免疫グロブリン軽鎖VおよびJ領域のフレームワーク領域を含むアミノ酸配列データベースが蓄積された。必要な情報を、様々な起源、例えば、V Base：ヒト抗体遺伝子のデータベース(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)から取得することができる。重要残基、例えば、標準残基、鎖間残基およびVernier残基で、マウスHB12B VKの対応するフレームワーク領域との配列類似性を示すヒト生殖細胞VおよびJ断片について、データベースに問い合わせた。
【０６４０】
HB12Bマウス抗CD19抗体のヒト化のためのアクセプターフレームワークとして役立つ、ヒト生殖細胞Vk A10(Straubinger, B.ら、Biol. Chem. Hoppe-Seyler 369:601-607 (1988))およびJk4 (Hieter, P. A.ら、J. Biol. Chem.257:1516-1522 (1982))を選択した。
【０６４１】
1.5.2. ヒト化HB12B軽鎖の作製
HB12B-(A10-Jk4) VK (配列番号52)を、HB12B VK CDRと、ヒト生殖細胞A-10/Jk4領域のフレームワーク残基とを結合させることにより設計した。HB12B-(A10-Jk4) VKを含む発現ベクターを、1節に記載の方法に従って作製した。
【０６４２】
HB12B-364987 VK (配列番号62)は、以下の3個のアミノ酸置換：Y40F、K53H、Y91F(Kabatに従って番号付けられた残基)を含むHB12B-(A10-Jk4) VKの変異体である。HB12B-364987のための遺伝子特異的プライマーを、1節に記載のように設計した。HB12B-364987 VKを含む発現ベクターを、1節に記載の方法に従って作製した。
【０６４３】
1.6. ヒト化HB12B抗体の結合特性
(ヒト化またはキメラ)重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするDNAプラスミド発現ベクター調製物の対を用いて、HEK293細胞をトランスフェクトした。これらのトランスフェクトされたHEK293細胞を3日間培養して、総IgG濃度およびCD19結合活性を決定するのに好適な抗体含有条件化培地を得た。
【０６４４】
キメラおよびヒト化HB12B抗体のヒトCD19結合活性を、2節に記載の300B4細胞に基づくELISAアッセイを用いて評価した。無関係の特異性のアイソタイプが一致したヒト抗体を、陰性対照としてアッセイに含有させた。図2に示されるように、chHB12B重鎖およびchHB12B軽鎖を含むキメラ抗体と、HB12B-(3-72/JH4)VHおよびHB12B-364987 VK領域を含む新規ヒト化抗体#1の結合は同等であることが見出された。100 ng/mlを超える抗体の濃度については、両抗体のCD19への有意な特異的結合が存在し、HB12B-(3-72/JH4)VHおよびHB12B-364987 VK領域を含むヒト化抗CD19抗体#1がCD19結合活性を保持することを示唆している。驚くべきことに、HB12B-9m VH領域を含むヒト化抗体は、chHB12B対照と比較してCD19の有意な損失を示した。
【０６４５】
キメラまたはヒト化HB12B重鎖および軽鎖の対を試験し、そのヒトCD19結合活性を表4にまとめた。
【表４】
0005401314.tif 000010
【０６４６】
1.7. ヒト化HB12B軽鎖の構築、発現および結合特性
抗体ヒト化プロトコルは、一般的には、HAMA応答を最小化するために非ヒトフレームワーク残基数を制限しようとするものである。従って、ヒト化HB12B VKのさらなる変異体を作製し、そのhCD19結合活性を評価した。
【０６４７】
HB12B-3649 VK (配列番号68)は、以下の2個のアミノ酸置換： Y40F、K53H(Kabatに従う番号)を含むHB12B-(A10-Jk4) VKの変異体である。HB12B-3649 VKを含む発現ベクターを、製造業者の説明書に従って、HB12B-364987 VKを含む発現ベクターのDNA調製物上でQuickChangeキット(Stratagene, La Jolla, CA)を用いる部位特異的突然変異誘発を介して作製した。
【０６４８】
HB12B-3687 VK (配列番号74)は、以下の2個のアミノ酸置換：Y40F、およびY91F(Kabatに従う番号)を含むHB12B-(A10-Jk4) VKの変異体である。HB12B-3687 VKを含む発現ベクターを、製造業者の説明書に従って、HB12B-364987 VKを含む発現ベクターのDNA調製物上でQuickChangeキット(Stratagene, La Jolla, CA)を用いる部位特異的突然変異誘発を介して作製した。
【０６４９】
HB12B-4987 VK (配列番号76)は、以下の2個のアミノ酸置換：K53H、およびY91F(Kabatに従う番号)を含むHB12B-(A10-Jk4) VKの変異体である。HB12B-4987 VKを含む発現ベクターを、製造業者の説明書に従って、HB12B-364987 VKを含む発現ベクターのDNA調製物上でQuickChangeキット(Stratagene, La Jolla, CA)を用いる部位特異的突然変異誘発を介して作製した。
【０６５０】
HB12B-36 VK (配列番号70)は、以下のアミノ酸置換：Y40F(Kabatに従う番号)を含むHB12B-(A10-Jk4) VKの変異体である。HB12B-36 VKを含む発現ベクターを、製造業者の説明書に従って、HB12B-(A10-Jk4) VKを含む発現ベクターのDNA調製物上でQuickChangeキット(Stratagene, La Jolla, CA)を用いる部位特異的突然変異誘発を介して作製した。
【０６５１】
HB12B-49 VK (配列番号80)は、以下のアミノ酸置換：K53H(Kabatに従う番号)を含むHB12B-(A10-Jk4) VKの変異体である。HB12B-49 VKを含む発現ベクターを、製造業者の説明書に従って、HB12B-(A10-Jk4) VKを含む発現ベクターのDNA調製物上でQuickChangeキット(Stratagene, La Jolla, CA)を用いる部位特異的突然変異誘発を介して作製した。
【０６５２】
HB12B-87 VK (配列番号78)は、以下のアミノ酸置換：Y91F(Kabatに従う番号)を含むHB12B-(A10-Jk4) VKの変異体である。HB12B-87 VKを含む発現ベクターを、製造業者の説明書に従って、HB12B-(A10-Jk4) VKを含む発現ベクターのDNA調製物上でQuickChangeキット(Stratagene, La Jolla, CA)を用いる部位特異的突然変異誘発を介して作製した。
【０６５３】
HB12B-(3-72/JH4) VHおよび1.7節に記載のVK変異体を含む重鎖をコードするDNAプラスミド発現ベクター調製物の対を用いて、HEK293細胞を同時トランスフェクトした。これらの同時トランスフェクトされたHEK293細胞を3日間培養して、総IgG濃度およびhCD19結合活性を決定するのに好適なヒト化抗体含有条件化培地を得た。
【０６５４】
ヒト化HB12B抗体のヒトCD19結合活性を、1.2節に記載の300B4細胞に基づくELISAアッセイを用いて評価した。chHB12Bを、陽性対照としてアッセイに含有させた。図3に示されるように、chHB12B VHおよびchHB12B VKを含むchHB12B抗体とHB12B-(3-72/JH4)VHおよびHB12B-3649 VKを含む新規ヒト化HB12B抗体#2の結合は同等であることが見出された。100 ng/mlを超える抗体の濃度については、両抗体のhCD19への有意な特異的結合が存在し、HB12B-(3-72/JH4)VHおよびHB12B-3649 VKを含むヒト化抗体がhCD19結合活性を保持することを示唆していた。HB12B-364987 VKを含むヒト化HB12B抗体#1も、ヒトCD19の結合を示した。HB12B-36 VKを含むヒト化HB12B抗体#3は、chHB12B対照抗体の結合と比較してhCD19への有意に低下した結合を示した。
【０６５５】
総合すれば、これらのデータは、HB12Bハイブリドーマ由来親マウス抗体の結合特性を保持するいくつかのヒト化型のHB12B VHおよびVK鎖が作製されたことを示している。
【０６５６】
2. ヒト化抗CD19抗体のin vitroでのADCC活性
以下の節は、ヒト化抗CD19抗体のin vitroでのADCC活性の特性評価を記載する。
【０６５７】
2.1. ヒト化抗CD19抗体調製物
HB12B-(3-72/JH4) VH、HB12B-3649 VK、およびIgG1重鎖定常領域を含む精製されたヒト化抗CD19抗体#2(以後、「3649抗体」または「3649」と呼ぶ)を、標準的な技術を用いて調製する。簡単に述べると、3649の重鎖および軽鎖をコードするDNAプラスミド発現ベクター調製物を用いて、HEK293細胞をトランスフェクトする。トランスフェクト細胞を3日目および6日目に供給し、抗体を含有する条件化培地を9日目に収穫する。抗体を、プレキャストAタンパク質カラム(GE Healthcare)を用いて、条件化培地から精製する。抗体を、低いpHバッファーを用いてカラムから溶出させ、中和し、PBSに対して透析する。精製された抗体の濃度を、280 nmの溶液の光密度から算出する。
【０６５８】
S239D、A330L、およびI332Eアミノ酸置換を含む3649 Fc変異体をコードする抗体発現ベクター(以後「3649-3M」と呼ぶ)を、米国特許出願第2004/0132101号および第2005/0054832号(両方ともLazarら)に記載の方法を用いて作製する。簡単に述べると、必要なヌクレオチド残基置換を、重鎖定常領域をコードするポリヌクレオチド配列に導入して、3649-3M抗体発現ベクターを作製することにより、部位特異的突然変異誘発キット(例えば、QuickChange (Promega))を用いて3649をコードする抗体発現ベクターを改変する。HEK239F細胞を、3649-3M抗体発現ベクターを用いてトランスフェクトすることにより、精製された3649-3M抗体を作製する。トランスフェクトされた細胞に3日目および6日目に供給し、抗体を含有する条件化培地を9日目に収穫する。抗体を、プレキャストAタンパク質カラム(GE Healthcare)を用いて条件化培地から精製する。抗体を低いpHバッファーを用いてカラムから溶出させ、中和し、PBSに対して透析する。精製された抗体の濃度を、280 nmの溶液の光密度から算出する。
【０６５９】
L234F、L235E、およびP331Sアミノ酸置換を含む3649 Fc変異体をコードする抗体発現ベクター(以後「3649-TM」と呼ぶ)を、米国特許出願第2004/0132101号および第2005/0054832号(両方ともLazarら(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする))に記載の方法を用いて作製する。簡単に述べると、必要なヌクレオチド残基置換を、重鎖定常領域をコードするポリヌクレオチド配列に導入して、3649-TM抗体発現ベクターを作製することにより、部位特異的突然変異誘発キット(例えば、QuickChange (Promega))を用いて3649をコードする抗体発現ベクターを改変する。HEK239F細胞を、3649-TM抗体発現ベクターを用いてトランスフェクトすることにより、精製された3649-TM抗体を作製する。トランスフェクトされた細胞に3日目および6日目に供給し、抗体を含有する条件化培地を9日目に収穫する。抗体を、プレキャストAタンパク質カラム(GE Healthcare)を用いて条件化培地から精製する。抗体を低いpHバッファーを用いてカラムから溶出させ、中和し、PBSに対して透析する。精製された抗体の濃度を、280 nmの溶液の光密度から算出する。
【０６６０】
フコースが還元末端中のN-アセチルグルコサミンに結合していないFc領域のAsn297に連結された複合型N-グリコシド結合糖鎖を有する複数の抗体を含む3649抗体組成物(以後3649-aFucと呼ぶ)を、Kandaらの米国特許第6,946,292号(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に記載の方法に従って調製した。簡単に述べると、フコシルトランスフェラーゼノックアウトCHO細胞を、3649の重鎖および系鎖をコードするDNAプラスミド発現ベクター調製物を用いてトランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞に3日目および6日目に供給し、抗体を含有する条件化培地を9日目に収穫する。抗体を、プレキャストAタンパク質カラム(GE Healthcare)を用いて条件化培地から精製する。抗体を低いpHバッファーを用いてカラムから溶出させ、中和し、PBSに対して透析する。精製された抗体の濃度を、280 nmの溶液の光密度から算出する。
【０６６１】
抗体調製物は、図4に示されるように、夾雑タンパク質から実質的に純粋であった。3649-aFucの抗原結合親和性は、図5に示されるように、3649のものと同等である。
【０６６２】
2.2. in vitro ADCCアッセイ
CytoTox 96(登録商標)Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega)は、51Cr放出細胞傷害性アッセイの代替の比色分析である。CytoTox 96(登録商標)アッセイは、細胞溶解の際に放出される安定な細胞質酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)を定量的に測定する。培養上清中に放出されたLDHを、テトラゾリウム塩(INT)の赤色ホルマザン産物への変換をもたらす、30分間の結合酵素アッセイを用いて測定する。形成された色の量は、溶解した細胞数に比例する。
【０６６３】
このアッセイを製造業者の指示書に従って実施する。簡単に述べると、標的細胞をPBSで洗浄し、0.4 x 106/mlの細胞密度でRPMI-5 Phenol Free培地中に再懸濁する。NKエフェクター細胞をPBS中で1回洗浄し、1 x 106/mlの細胞密度でRPMI-5 Phenol Free培地中に再懸濁する。アッセイを、U底96穴プレート中で実施する。各アッセイプレートは、実験ウェルおよび対照ウェルの組合せを含む。実験ウェルを、50μlの好適な抗体希釈液、50μlの標的細胞懸濁液および50μlのエフェクター細胞懸濁液を混合することにより設定する。上記の細胞密度は、1:2.5の標的：エフェクター細胞比をもたらす；様々な標的：エフェクター比が望まれる場合、エフェクター細胞保存液をさらに希釈または濃縮することができる。いくつかの異なる型の対照ウェルを用いて、(i)エフェクター細胞からの自発的LDH放出(標的自発)、(ii)エフェクター細胞からの自発的LDH放出(エフェクター自発)、(iii)標的細胞からの最大LDH放出(標的最大)、および(iv)培養培地中の夾雑物の存在(バックグラウンド)を説明する。96穴プレート上での使用における全てのウェルは、同じ最終容量を含む。反応を3回設定する。設定後、プレートを120 x gで3分間遠心分離して、細胞を沈降させる。プレートを37℃／5％CO2で4時間インキュベートする。インキュベーションの終わりの45分前に、15μlの製造業者に提供された溶解バッファーを標的細胞最大放出対照ウェルに添加する。インキュベーション後、プレートを120 x gで4分間遠心分離する。各ウェルから得た50μlの上清を、新しい平底96穴プレートに移す。50μlの再構成された基質ミックス(製造業者に提供された成分から集合させた)を添加し、プレートを光から防御して10〜20分間室温でインキュベートする。50μlの製造業者に提供された停止バッファーを添加し、490または492 nmでの吸光度をプレートリーダー中で測定する。細胞傷害性(％)は(実験-エフェクター自発-標的自発)／(標的最大-標的同時)に等しい。算出の前に、細胞傷害性(％)の全ての他の値をバックグラウンドにより減少させる。
【０６６４】
3649は、ADCCアッセイにおいて、エフェクター細胞をヒトCD20発現標的細胞に効率的にリクルートする。アフコシル化形態(3649-aFuc)のADCC活性は、さらにより強固である。Fcγ受容体に対する親和性が増加した(3649-3M)または減少した(3649-TM)Fc変異体は、それぞれ、予想されるようにADCC活性の増加または減少を示す。ADCC活性は、不死化されたヒト標的細胞および新鮮に単離されたヒト標的細胞の両方について観察された。これらの主張を支持する実験データの代表サンプルを、図5〜9に提供する。
【０６６５】
2.3. in vitro抗CD19抗体を介するADCCは、FcγRIIIA受容体に対するFc領域の親和性により影響される
ヒトFcγRIIIA受容体(CD16)への種々のヒト化抗CD19抗体調製物の相対結合親和性を、ELISAアッセイを用いて確認することができる。マイクロタイタープレートを、4℃で一晩、50μlの抗体調製物(50μg/ml)でコーティングする。残存する結合部位を、37℃で1時間、PBSバッファー(ブロッキングバッファー)中の4％スキムミルクで阻害する。ウェルを洗浄した後、50μlの段階希釈されたモノマーFcγRIIIA-フラッグタンパク質を各ウェルに添加し、37℃で60分間インキュベートする。50μlの2.5μg/mlの抗フラッグ-ME-ビオチン(Sigma)を各ウェルに添加し、37℃で30分間インキュベートする。以下の試薬の各々とのインキュベーションの間に、ウェルを洗浄する。50μlの0.1μg/mlアビジン結合HRP (PIERCE)を各ウェルに添加し、37℃で30分間インキュベートする。30μlのテトラメチルベンズイジン(TMB)基質(Pierce)を添加した後、30μlの0.2 M H2SO4で中和することにより、検出を実行する。吸光度を450 nmで読み取った。
【０６６６】
図15に示されるように、FcγRIIIAに対する増強されたADCC Fc変異体3649抗体(3649-3M)およびアフコシル化3649抗体(3649-aFuc)の結合親和性は、フコシル化野生型3649抗体のものよりも高い。ヒトFcγRIIIAのV158高親和性アイソフォームの細胞外ドメインを含むFcγRIIIA-フラッグタンパク質を用いて、実験を行った。
【０６６７】
Fc受容体-Fc領域相互作用、およびかくして、抗体のエフェクター機能はまた、Fc受容体中の対立遺伝子変異により影響される。様々な対立遺伝子変異体受容体を含む新鮮に単離されたNKエフェクター細胞を用いてADCC反応を実施することにより、ADCCに対する高親和性および低親和性FcγRIIIA受容体の効果を試験することができる。図16は、そのような実験の結果をまとめたものである。Daudi標的細胞を用いて、上記のようにADCC反応を行う。フコシル化(3649)およびアフコシル化(3649-aFuc)抗CD19抗体#2の両方を試験する。抗CD20抗体を用いて、対照反応を行う。NKエフェクター細胞を、標準的なプロトコルに従って健康なドナーから単離する。NK細胞の遺伝子型を、対立遺伝子特異的PCR反応(Leppers-van de Straatら、J Immunol Methods. 242(1-2):127-32 (2000))を用いて決定することができる。図16AおよびBは、試験した3種全部の抗体が、用いた反応条件下でADCC活性を示すことを示している。ADCC活性は、エフェクターとしてNK細胞系(A)または新鮮に単離されたNK細胞(B)を用いて検出可能である。FcγRIIIA受容体(V158/V158およびV158/F158遺伝子型)の少なくとも1コピーの高親和性アイソフォームを含むNK細胞は、低親和性受容体対立遺伝子(F158/F158遺伝子型)について同型のNK細胞よりも効率的なエフェクター細胞である(図16C-E)。フコシル化の欠如は、エフェクター細胞のFcγRIIIA遺伝子型に関わらず、抗体のADCC活性を増加させる。V158/V158またはV158/F158 NK細胞により媒介されるフコシル化抗体(3649)の観察されるADCC活性(C、D)は、F158/F158 NK細胞により媒介されるアフコシル化抗体(3649-aFuc)のADCC活性(E)と同等である。
【０６６８】
3. 抗体および免疫蛍光分析
ヒトCD19抗原に結合する、上記の抗CD19抗体を、以下に開示する手法において用いることができる。以下に記載の実験において用いることができる他の抗体としては、マウスCD22に結合するモノクローナルマウス抗CD22抗体、例えば、HIB22 (Abcam; Dorken Bら、J Immunol 136:4470-9 (1986)); モノクローナルマウスCD20特異的抗体(Uchidaら、Intl. Immunol., 16:119-129 (2004)); B220抗体RA3-6B2 (DNAX Corp., Palo Alto, CA); ならびにCD5、CD43およびCD25抗体(BD PharMingen(商標)、Franklin Lakes, NJ)が挙げられる。アイソタイプ特異的および抗マウスIgまたはIgM抗体を、Southern Biotechnology Associates, Inc. (Birmingham, AL)から取得することができる。
【０６６９】
当業界で公知の方法および材料(例えば、Altら、Cell, 27:381-388 (1981)ならびにTedderおよびIsaacs, J. Immunol., 143:712-717 (1989))を用いて生じさせることができるhCD19 cDNAでトランスフェクトされたマウスプレB細胞系、または単一細胞白血球懸濁液を、所定の光学濃度のそれぞれ蛍光標識された抗体を用いて、20〜30分間、確立された方法(Zhouら、Mol. Cell. Biol., 14:3884-3894 (1994))に従って氷上で染色する。次いで、リンパ球の前方および側方光散乱特性を有する細胞を、FACSCAN(登録商標)またはFACSCALIBUR(登録商標)フローサイトメーター(Becton Dickinson, San Jose, CA)上で分析することができる。バックグラウンド染色を、非生細胞を排除する位置のゲートを有する非反応対照抗体(CALTAG(商標)Laboratories, Burlingame, CA)を用いて決定することができる。試験する各サンプルについて、単核細胞の前方および側方光散乱特性を有する10000個の細胞を、40年の対数規模で示された蛍光強度を用いて、可能な場合はいつでも分析することができる。
【０６７０】
マウス：hCD19を発現するトランスジェニックマウスおよびその野生型(WT)同腹子を、当業界で記載されたように作製することができる(Zhouら、Mol. Cell. Biol., 14:3884-3894 (1994))。例えば、hCD19tgマウスを、元のhCD19創始株(例えば、C57BL/6 x B6/SJL)から作製した後、少なくとも7世代の間、C57BL/6バックグラウンド上で交配させることができる。複数世代の戻し交配の後、そのB細胞がヒトB細胞上に認められるのとほぼ同じ密度の細胞表面密度のヒトCD19を発現するマウスを取得することができる。
【０６７１】
FcR(Fc受容体)共通γ鎖(FcRγ)欠損マウスと共に育種したマウス(FcRγ-/-、B6.129P2-Fcerg1tml)は、Tconic Farms (Germantown, NY)から入手可能であり、これを用いて、hCD19+/-FcRγ-/-およびWT同腹子を作製することができる。c-Mycトランスジーン(Eμ-cMycTG、C57Bl/6J-TgN(IghMyc); The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)について同型であるマウスは、当業界で記載されている(Harrisら、J. Exp. Med., 167:353 (1988)およびAdamsら、Nature, 318:533 (1985))。c-MycTGマウス(B6/129バックグラウンド)を、hCD19tgマウスと交配させて、半接合体hCD19tg cMycTG+/-子孫を作製し、PCRスクリーニングにより同定することができる。Rag1-/-(B6.129S7-Rag1tm1Mom/J)マウスは、The Jackson Laboratoryから入手可能である。マクロファージ欠損マウスを、標準的な方法(Van RooijenおよびSanders, J. Immunol. Methods, 174:83-93 (1994))に従って、C57BL/6マウス中に、-2日目、1日目および4日目にクロドロナートにより捕捉されたリポソーム(0.1 mL/10グラム体重；Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)を尾静脈注入することにより作製することができる。全てのマウスを、特定の病原体を含まない障壁施設中で飼育し、6〜9週齢で初めて用いるべきである。
【０６７２】
ELISA：血清Ig濃度を、親和性精製されたマウスIgM、IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3、およびIgA(Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL)を用いるELISAにより決定して、記載のように(Engelら、Immunity, 3:39 (1995))標準曲線を作製する。dsDNA、ssDNAおよびヒストンに対する血清IgMおよびIgG自己抗体レベルを、ウシ胸腺二本鎖(ds)DNA (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)、沸騰させたウシ胸腺DNA (一本鎖(ss)DNAを含む)またはヒストン (Sigma-Aldrich)によりコーティングされたマイクロタイタープレートを用いるELISAにより、記載のように(Satoら、J. Immunol., 157:4371 (1996))決定する。
【０６７３】
免疫療法：200μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の滅菌抗CD19および未反応アイソタイプ対照抗体(0.5〜250μg)を、側尾静脈を通して注入する。例えば、実験は、固定量(例えば、250μg)の抗体を使用する。血中白血球数を、赤血球溶解後に血球計により定量し、B220+ B細胞頻度を、フローサイトメトリー分析を用いる免疫蛍光染色により決定する。ヒトおよびマウスにおける抗体用量を、Oncology Tool Dose Calculator (www.fda.gov/cder/cancer/animalframe.htm)を用いて比較することができる。
【０６７４】
免疫：2ヶ月齢のWTマウスを、塩水中の50μgの2,4,6-トリニトロフェニル(TNP)結合リポ多糖(LPS)(Sigma, St. Louis, MO)または25μgの2,4-ジニトロフェノール結合 (DNP)-Ficoll(登録商標)(Biosearch Technologies, San Rafael, CA)を用いてi.p.により免疫する。また、マウスを、Freundの完全アジュバント中の100μgのDNP結合キーホールリンペットヘモシアニン(DNP-KLH, Calbiochem(登録商標)-Novabiochem(登録商標) Corp., La Jolla, CA)を用いて、i.p.により免疫し、Freundの不完全アジュバント中のDNP-KLHを用いて21日後に追加免疫する。マウスを、指示される免疫の前後に育種する。個々の血清サンプル中のDNP-またはTNP-特異的抗体力価を、標準的な方法(Engelら、Immunity, 3:39-50 (1995))に従って、DNP-BSA (Calbiochem(登録商標)-Novabiochem(登録商標) Corp., La Jolla, CA)またはTNP-BSA (Biosearch Technologies, San Rafael, CA)でコーティングされたELISAプレートを用いて2回測定する。ELISA分析のために、TNP-LPSで免疫したマウスから得た血清を、1:400に希釈し、DNP-FICOLL(登録商標)およびDNP-BSAで免疫したマウスから得た血清を、1:1000に希釈する。
【０６７５】
統計分析：全てのデータをStudentのt-検定を用いて平均±SEMとして示して、サンプル平均間の差異の有意性を決定することができる。
【０６７６】
4. トランスジェニックマウスにおけるヒトCD19発現
本明細書に記載のように生じさせることができるトランスジェニックhCD19tgマウス、またはヒトCD19を発現する他のトランスジェニック動物を用いて、投与濃度、量、およびタイミングの変化などの抗CD19抗体を含む様々な治療計画を評価することができる。様々な治療計画のヒト患者における効力を、以下に記載の2つの指示因子、すなわち、特定の体液および／もしくは組織中でのB細胞枯渇ならびにB細胞に結合するモノクローナルヒトもしくはヒト化抗CD19抗体の能力を用いて予測することができる。特定の実施形態においては、ヒトCD19トランスジェニックマウスにおいて有効である治療計画を、本発明の組成物および方法と共に用いて、限定されるものではないが、B細胞悪性腫瘍および自己免疫疾患もしくは障害などのヒトB細胞障害および疾患を治療することができる。
【０６７７】
ヒトCD19が、ヒトCD19トランスジーンを発現するトランスジェニックマウス(hCD19tg)に由来するB細胞上で発現されるかどうかを決定するために、B細胞を、これらのマウスの骨髄、血液、脾臓および腹腔洗浄液から抽出することができる。ヒトCD19およびマウスCD19発現を、これらの細胞と、ヒトCD19またはマウスCD19(mCD19)に特異的に結合する抗CD19抗体とを接触させることにより、該細胞中で評価することができる。B系列細胞への抗体の結合を、フローサイトメトリー分析を用いる2色免疫蛍光染色を用いて検出することができる。mCD19およびhCD19の相対発現レベルを、それぞれ、平均蛍光強度(hCD19については抗hCD19およびmCD19については抗mCD19)を測定することにより評価することができる。
【０６７８】
ヒトCD19およびヒトCD20トランスジーンの発現レベルを、本質的には上記のように決定した。循環リンパ球を、標準的な手順を用いて、C57Bl6 hCD19 tg+/-、C57Bl6 hCD19 tg+/+、Balb/c hCD20 tg+/-およびBalb/c野生型マウスから単離する。動物を病原体を含まない施設中で飼育する。各遺伝子型から用いられた動物の週齢および数を図10に列挙する。単離された細胞を、PerCP Cy5.5結合抗マウスCD19 (クローン1D3, BD Biosciences)、PE結合抗CD3 (例えば、クローン17A2, BD Biosciences)、Alexa Fluor(登録商標)488結合抗ヒトCD19 (クローンHIB19, BD Biosciences)、およびAlexa Fluor(登録商標)647結合抗ヒトCD20抗体(例えば、クローン2H7, AbD serotec)を用いて染色する。免疫染色された細胞を、フローサイトメーター上で分析する。B細胞集団を、抗マウスCD19+、抗CD3-細胞として定義する。hCD19およびhCD20チャンネル中で検出された抗マウスCD19+、抗CD3-細胞の平均蛍光強度を、図10Aに記載する。ヒトCD19発現は、予想されるようにhCD19トランスジェニック細胞上でのみ検出される。hCD19発現は用量依存的である；tg+/+における染色レベルは、tg+/-B細胞上に認められるものの約2倍である。hCD19発現レベルは、試験した全ての週齢群において安定であった。
【０６７９】
循環リンパ球中のB細胞の割合を、全てのサンプルについて算出した。算出のために、B細胞を抗マウスCD19+、抗CD3-細胞として定義する。結果を図10Bに示す。hCD19トランスジーンを有する動物は、循環リンパ球中のB細胞数が減少した。B細胞数の減少は、hCD19 tg+/+動物中でよりはっきりしていた。これらの結果は、以前に公開された観察(Zhouら、Mol. Cell. Biol., 14:3884-3894 (1994))と一致している。
【０６８０】
5.抗CD19抗体により媒介されるin vivoでのB細胞の枯渇
ヒトCD19に結合する本発明の抗CD19抗体を、in vivoでhCD19tg血液、脾臓、およびリンパ節B細胞を枯渇させる能力について評価することができる。例えば、各抗体を、250または50μg／マウスの、ヒトにおける抗CD20療法について最初に4回与えられた375 mg/m2用量よりも約10〜50倍低い単回用量でマウスに与えることができる(Maloneyら、J. Clin. Oncol., 15:3266-74 (1997)およびMcLaughlinら、Clinical status and optimal use of rituximab for B cell lymphomas, Oncology (Williston Park), 12:1763-9 (1998))。hCD19tgマウスの血液、脾臓およびリンパ節からのB細胞枯渇を、フローサイトメトリー分析を用いる免疫蛍光染色により決定することができる。B細胞を枯渇させることができると同定された抗CD19抗体を用いる結果を、ヒトにおける使用と相関させ、同定された抗体の特性を有する抗体を、限定されるものではないが、B細胞悪性腫瘍および自己免疫疾患または障害などのヒトB細胞障害および疾患の治療のために本発明の組成物および方法において用いることができる。
【０６８１】
3649ヒト化抗CD19抗体を、本質的には上記のようにB細胞枯渇アッセイにおいて試験した。C57Bl6 hCD19 tg +/-およびC57Bl6 hCD19 tg +/+マウスに、50または250μgの単回i.v.用量の3649抗体を与える。2つの対照群を用いる。第1群のメンバーは、50または250μgの無関係の特異性のR347抗体を受ける；第2群のメンバーは、ADCC活性が低下した50または250μgの3649-TM Fc変異体を受ける(図6を参照)。各群における動物数を、図11および12に記載する。動物を、病原体を含まない施設中で飼育する。処理の7日後、単核細胞を循環血液および脾臓から単離する。単離された細胞を、PerCP Cy5.5結合抗マウスCD19 (クローン1D3, BD Biosciences)およびApc-Cy5.5結合抗マウスB220(クローンRA3-6B2, Invitrogen)抗体を用いて染色する。免疫染色されたサンプルを、フローサイトメーター上で分析する。B細胞を、実験のために抗マウスCD19+、抗マウスB220+細胞と定義する。循環リンパ球中のB細胞の割合を、図11に提供する。脾臓細胞中のB細胞の割合および絶対数を、図12に提供する。単回用量の50 mgの3649抗CD19抗体は、循環および脾臓B細胞の有意な枯渇を達成するのに十分である。枯渇のレベルは、抗体用量およびhCD19表面密度により影響される。枯渇は、250μgの抗体を受容するhCD19 tg+/+動物中で最も完全である。枯渇は、試験した全ての動物中の脾臓よりも循環リンパ球間でより広範囲である。
【０６８２】
また、別の試験を行って、hCD19 tg+/-動物中の循環、脾臓、腹腔および骨髄B細胞サブ集団を枯渇させる種々の3649抗CD19抗体調製物の能力を測定した。実験を以下のように行った：3〜4ヶ月齢の性別を一致させたC57Bl6 hCD19 tg+/-マウスに、側尾静脈を通して、マウス用量あたり10、50または250μgでPBS中に希釈した滅菌エンドトキシン非含有抗CD19抗体調製物を注入した。以下の抗CD19抗体を試験した：フコシル化抗CD19抗体#2 (3649)、アフコシル化抗CD19抗体#2 (3649-aFuc)、ADCC増強Fc変異体抗CD19抗体#2 (3649-3M)、および減少したADCC Fc変異体抗CD19抗体#2 (3649-TM)。対照動物群に、無関係の特異性のアイソタイプが一致した対照抗体(R347)を注入した。注入の7日後、マウスを犠牲にし、血液、脾臓、骨髄および腹腔に由来する細胞を回収した。赤血球細胞を標準的なプロトコルに従って溶解させ、全生細胞計数をVia-Cell自動細胞計数装置を用いて決定した。単離された単一細胞懸濁液を免疫染色し、標準的なプロトコルに従ってフローサイトメトリー上で分析する。免疫染色に用いられる抗体を、表5に列挙する。枯渇結果を表6〜21にまとめる。アフコシル化抗CD19抗体#2(3649-aFuc)を用いて得られた枯渇結果を、図28に提供する。アフコシル化またはフコシル化抗CD19抗体#2(それぞれ、3649-aFucまたは3649)で処理された動物のNK細胞活性化表現型を、図29に提供する。分析の間に用いられたB細胞サブセットの定義は以下の通りである：
血液： B細胞：B220+、マウスCD19+
脾臓： B細胞：B220+、マウスCD19+
遷移B細胞：B細胞上でのゲーティング後、CD93+
遷移1 B細胞(T1)：IgM+CD23-
遷移1 B細胞(T2)：IgM+CD23+
遷移1 B細胞(T3)：IgM低CD23+
成熟B細胞：B細胞上でのゲーティング後、CD93-
濾胞性B細胞：IgM+CD23+
辺縁帯B細胞：IgM高CD23-
骨髄： B細胞：B220+、マウスCD19+
プロB細胞：B細胞上でのゲーティング後、CD43+IgM-
プレB細胞：B細胞上でのゲーティング後、CD43-IgM-
未成熟および成熟B細胞：B細胞上でのゲーティング後、CD43-IgM+
未成熟B細胞：CD43-IgM+CD93+
成熟B細胞：CD43-IgM+CD93+低/-
腹腔： B細胞：IgM+
【０６８３】
【表５】
0005401314.tif 000011
【０６８４】
【表６】
0005401314.tif 000012
【０６８５】
【表７】
0005401314.tif 000013
【０６８６】
【表８】
0005401314.tif 000014
【０６８７】
【表９】
0005401314.tif 000015
【０６８８】
【表１０】
0005401314.tif 000016
【０６８９】
【表１１】
0005401314.tif 000017
【０６９０】
【表１２】
0005401314.tif 000018
【０６９１】
【表１３】
0005401314.tif 000019
【０６９２】
【表１４】
0005401314.tif 000020
【０６９３】
【表１５】
0005401314.tif 000021
【０６９４】
【表１６】
0005401314.tif 000022
【０６９５】
【表１７】
0005401314.tif 000023
【０６９６】
【表１８】
0005401314.tif 000024
【０６９７】
【表１９】
0005401314.tif 000025
【０６９８】
【表３０】
0005401314.tif 000026
【０６９９】
【表３１】
0005401314.tif 000027
【０７００】
5.1. CD19密度はCD19抗体により誘導されるB細胞枯渇の有効性に影響する
B細胞を枯渇させる抗CD19抗体の能力がCD19密度に依存するかどうかを決定するために、本発明の抗CD19抗体を、変化するレベルのhCD19発現を有するマウスに投与することができる。得られた結果は、B細胞上のヒトCD19密度および抗体アイソタイプが抗CD19抗体の存在下でB細胞の枯渇に影響し得るかどうかを示すであろう。同じアッセイを用いて、他の抗CD19抗体が効率的にB細胞を枯渇させることができるかどうかを決定することができる。結果を、変化するレベルのCD19発現を有するヒト患者の治療と相関させることができる。かくして、本明細書に記載の、CD19の存在および密度を試験するための方法をヒト被験者において用いて、特定の抗CD19抗体がB細胞を枯渇させ、および／または好適な用量を決定することができる患者または患者集団を同定することができる。
【０７０１】
CD19密度が抗CD19抗体により誘導されるB細胞枯渇の有効性に影響するかどうかを決定するために、代表的な血液および脾臓B細胞枯渇を、本発明の抗CD19抗体を用いる処理後(7日、250μg/マウス)にhCD19tgマウスにおいて試験することができる。その結果は、CD19密度がin vivoで抗CD19抗体によるB細胞枯渇の効率に影響することを示すと予想される。例えば、hCD19tgマウスにおける低レベルのCD19発現は、投与された抗体による循環または組織B細胞枯渇に対する顕著な影響を有すると予想されるであろう。B細胞消失を、個々のマウスの抗CD19または対照mAb処理の24時間後に評価することができる。
【０７０２】
5.2. 組織B細胞枯渇がFcγR依存的であるかどうかの決定
本発明の抗CD19 mAbの投与が組織B細胞枯渇をもたらす場合、以下のアッセイを用いて、FcγR発現への依存性を証明することができる。hCD19tgマウスと特定のFcγRの発現を欠くマウスとの異種交配のプロセスを介して、hCD19を発現し、特定のFcγRの発現を欠くマウスを作製することができる。そのようなマウスを、FcγR発現を含む経路、例えば、ADCCを介してB細胞を枯渇させる抗CD19抗体の能力を評価するためのアッセイにおいて用いることができる。かくして、これらのアッセイにおいて同定される抗CD19抗体を用いて、上記の技術を用いてキメラ、ヒトまたはヒト化抗CD19抗体を遺伝子操作することができる。次いで、そのような抗体を、限定されるものではないが、自己免疫疾患および障害などのヒトB細胞障害および疾患の治療のための本発明の組成物および方法において用いることができる。
【０７０３】
生来の免疫系は、FcγR依存的プロセスを介する抗CD20抗体治療後にB細胞枯渇を媒介する。マウスエフェクター細胞は、IgGに関する4種の異なるFcγRクラス、高親和性FcγRI(CD64)、および低親和性FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)、およびFcγRIV分子を発現する。FcγRI、FcγRIIIおよびFcγRIVは、対応するリガンド結合α鎖が共通のγ鎖(FcRγ)と結合するヘテロオリゴマー複合体である。FcRγ鎖発現は、FcγR集合およびマクロファージによる食作用などのエフェクター機能のFcγR誘発にとって必要である。FcRγ-/-マウスは高親和性FcγRI(CD64)および低親和性FcγRIII(CD16)およびFcγRIV分子を欠くため、hCD19を発現するFcRγ-/-マウスを用いて、抗CD19抗体治療後の組織B細胞枯渇におけるFcγRの役割を評価することができる。
【０７０４】
5.3. 抗CD19抗体により誘導されるB細胞枯渇の永続性
B細胞枯渇の効力および期間を評価するために、hCD19tgマウスに抗CD19抗体の単回低用量(例えば、250μg)注射液を投与し、B細胞枯渇の期間および用量応答を時間の関数として追跡することができる。その結果は、循環B細胞が実質的な量の時間(例えば、1週間〜6ヶ月間)枯渇した後、血液B細胞が徐々に回復することを示すと予想される。
【０７０５】
6. 抗CD19抗体の投与後のB細胞の表面上でのCD19の持続性
CD19内在化がin vivoでB細胞枯渇に影響するかどうかを、本発明の抗CD19抗体の投与後の細胞表面CD19発現を比較することにより評価することができる。例えば、in vivoで本発明の抗CD19抗体またはアイソタイプが一致した対照抗体(250μg)で処理したhCD19tgマウスにおける細胞表面CD19発現およびB細胞消失を、時間の関数として試験することができる。かくして、脾臓B細胞を、時間0(抗CD19投与前)、および抗体投与の1、4および24時間後にCD19について収穫およびアッセイすることができる。また、単離されたB細胞を、飽和濃度の各抗CD19抗体でin vitroで処理し、アイソタイプ特異的二次抗体を、in vitroでフローサイトメトリー分析を行って、全細胞表面CD19発現を可視化することもできる。B細胞の表面上のCD19が維持される場合、それはADCC、CDC、およびアポトーシスに対する罹りやすさの継続を示唆するであろう。抗CD19抗体の結合後にCD19が細胞表面上で持続する場合、B細胞は依然としてADCC、CDC、またはアポトーシス活性に接近可能であろう。そのような結果は、部分的には、抗CD19抗体および本発明の治療計画が、限定されるものではないが、移植片拒絶ならびに自己免疫疾患および障害などのヒトB細胞障害および疾患のための療法を提供するのに有効である理由を証明することができる。
【０７０６】
7. 抗CD19抗体治療は体液性免疫および自己免疫を無効化し得る
CD19療法がB細胞発現量を低下させる事象においては、本実施例に記載のアッセイを用いて、本発明の抗CD19抗体が免疫応答を排除または弱体化し得ることを証明することができる。これらのアッセイを用いて、上記の技術を用いてキメラ、ヒトまたはヒト化抗CD19抗体を遺伝子操作するのに用いることができる他の抗CD19抗体を同定することもできる。次いで、そのような抗体を、ヒトにおける自己免疫疾患および障害の治療のために、ならびに移植療法のために本発明の組成物および方法において用いることができる。
【０７０７】
hCD19tgマウスに抗CD19抗体の単回注射液を与えた後、これらのマウスにおける免疫グロブリンレベルの低下を評価することにより、血清抗体レベルに対する抗CD19抗体により誘導されるB細胞枯渇の効果を評価することができる。例えば、2ヶ月齢の同腹子を、0日目に本発明の抗CD19抗体または対照抗体(例えば、250μg)の単回注射液で処理することができる。次いで、抗体レベルをELISAにより決定する。その結果は、1〜2週間後に、血清IgM、IgG2b、IgG3、およびIgA抗体レベルが有意に低下し、少なくとも10週間の低下を維持することを示すと予想される。
【０７０８】
T細胞非依存的1型(TI-1)および2型(TI-2)抗体応答に対するB細胞枯渇の影響を、抗CD19抗体または対照抗体治療の7日後に、TNP-LPSまたはDNP-FicollでhCD19tgマウスを免疫する(0日目)ことにより評価することもできる。有意なハプテン特異的IgM、IgG、およびIgA抗体応答は、いずれかの抗原で免疫された抗CD19抗体処理マウスにおいては観察されないと予想される。T細胞依存的(TD)Ag、DNP-KLHに対する抗体応答を、免疫の7日前に抗CD19抗体で処理されたマウスを用いて評価することもでき、その場合、抗CD19抗体で処理されたDNP-KLH免疫マウスは体液性免疫の低下を示すと予想される。
【０７０９】
8. 抗CD22抗体治療と組み合わせた抗CD19抗体治療
本明細書に記載のアッセイを用いて、組合せ療法、例えば、化学療法、毒素療法もしくは放射線療法と組み合わせた抗CD19抗体は、B細胞における付加的またはより付加的な枯渇などの有益な効果を有するかどうかを決定することができる。動物モデルにおいて試験された組合せ療法の結果を、当業界でよく知られる手段によりヒトに相関させることができる。
【０７１０】
抗CD20抗体は、in vivoでヒトおよびマウスB細胞を枯渇させるのに有効である。従って、本発明の抗CD19抗体と抗CD20(例えば、MB20-11；Yazawaら、Proc Natl Acad Sci U S A. 102(42):15178-83 (2005)を参照)抗体との同時治療の利益を評価して、これがB細胞枯渇を増強するかどうかを決定することができる。マウスを、準最適用量(例えば、2μg、5μg、10μg、20μg、もしくは50μg)の各抗体で個々に、または両抗体の組合せとして処理することができる。その結果は、同時的な抗CD19および抗CD20抗体治療が有益であることを示すと予想される。同様の様式で、本発明の抗CD19抗体と抗CD22抗体の組合せ、または本発明の抗CD19抗体、抗CD20抗体、および抗CD22抗体の組合せを用いる治療に関する効力を決定することができる。
【０７１１】
9. 本発明の抗CD19抗体の皮下(S.C.)投与の治療効力
本明細書に記載のアッセイを用いて、本発明の抗CD19抗体の皮下経路の投与が、B細胞を効率的に枯渇させ得るかどうかを決定することができる。動物モデルにおいて試験した様々な送達経路の効力の結果を、当業界でよく知られた手段によりヒトに相関させることができる。
【０７１２】
例えば、hCD19tgマウスを、皮下(s.c.)、腹腔内(i.p.)または静脈内(i.v.)投与により250μgの本発明の抗CD19抗体で処理することができる。フローサイトメトリーを用いて評価されるように7日目に、値を平均(±SEM)血液(1 mLあたり)、骨髄、脾臓、リンパ節、および腹腔B220+ B細胞数について決定する。結果は、本発明の抗CD19抗体の皮下(s.c.)、腹腔内(i.p.)および静脈内(i.v.)投与が、in vivoで循環および組織B細胞を効率的に枯渇させることを示すと予想される。
【０７１３】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によりその範囲を限定されるものではない。実際、本明細書に記載されたものに加えて、本発明の様々な改変が、前記説明および添付の図面から当業者には明らかになるであろう。そのような改変は添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【０７１４】
10. 抗CD19抗体はin vivoリンパ腫モデルにおける腫瘍増殖を低下させる
ヒトCD19に結合する本発明の抗CD19抗体を、in vivo動物モデルにおける腫瘍増殖を低下させる能力について評価することができる。例えば、SCIDマウスにヒトリンパ腫細胞系を注入して、腫瘍異種移植片を確立する(例えば、Raji細胞のs.c.注入)。続いて、マウスに本発明の抗CD19抗体の数回の用量を投与する(例えば、100μgの抗体／マウス、5回)。腫瘍増殖を標準的な方法を用いて追跡する(例えば、腫瘍体積、動物の体重、麻痺)。腫瘍増殖に対する抗CD19治療の効果を、抗CD19を受容する動物または対照抗体治療を比較することにより決定することができる。腫瘍増殖を低下させ得ると同定された抗CD19抗体を用いて得られた結果をヒトにおける使用に相関させることができ、腫瘍増殖を低下させ得る抗体を、限定されるものではないが、B細胞悪性腫瘍などのヒトB細胞障害および疾患の治療のために本発明の組成物および方法において用いることができる。
【０７１５】
腫瘍増殖を低下させる抗CD19抗体の能力がCD19密度に依存するかどうかを決定するために、様々なCD19発現プロフィールを有する腫瘍細胞系を、上記のin vivo腫瘍増殖アッセイにおいて試験することができる。例えば、Daudi、Raji、Namalwa、およびRamos細胞は全て、その細胞表面上でのCD19の有意なレベルを有する；一方、RPMI 8226多発性骨髄腫細胞系は、CD19を発現しない。得られた結果は、腫瘍細胞表面上のヒトCD19密度は、抗CD19抗体の活性を低下させる腫瘍増殖に影響し得る。その結果を、変化するレベルのCD19発現を有するヒト患者の治療と相関させることができる。かくして、本明細書に記載のCD19の存在および密度を試験するための方法をヒト被験者において用いて、特定の抗CD19抗体が悪性B細胞の増殖を低下させ、および／または好適な用量を決定することができる患者または患者集団を同定することができる。
【０７１６】
腫瘍増殖を低下させる抗CD19抗体の能力がFcγRに依存するかどうかを決定するために、上記のin vivo腫瘍増殖アッセイを、Fcγ受容体活性(例えば、FcRγ-/-)が低下したSCIDを用いて実施することができる。SCIDマウスと特定のFcγRの発現を欠くマウスとの異種交配のプロセスを介して、特定のFcγRの発現も欠くSCIDマウス(例えば、SCID、FcRγ-/-マウス)を作製することができる。そのようなマウスを、FcγR発現を含む経路、例えば、ADCCを介して腫瘍増殖を低下させる抗CD19抗体の能力を評価するためのアッセイにおいて用いることができる。その結果に基づいて、ADCCが増加した抗CD19抗体を、上記の技術を用いて遺伝子操作することができる。次いで、そのような抗体を、限定されるものではないが、B細胞悪性腫瘍などのヒトB細胞障害および疾患の治療のために本発明の組成物および方法において用いることができる。
【０７１７】
以下は、in vivo動物モデルにおいて腫瘍増殖を低下させる3649ヒト化抗CD19抗体の能力を示す実験の詳細である。実験の1日目に、4〜6週齢の雌のCB-17 SCIDマウスの後横腹に5 x 106個のRajiヒトリンパ腫細胞をs.c.注入する。Raji細胞は、その表面上に有意なレベルのCD19を発現し、3649指向性ADCCに対して感受性である(図7および8を参照)。10匹のRaji細胞を注入した動物群を、ヒト化抗CD19抗体、対照抗CD20抗体、無関係の特異性のアイソタイプ対照抗体で処理する。複数の様々な用量の抗体を比較試験することができる。治療計画に関する非限定例は、4日目に開始する10 mg/kgの抗体の隔週で5回のi.p.用量である。PBSのみを受容する動物のさらなる対照群も同様に含有させる。腫瘍用量を標準的な方法を用いて測定する。2000 mm3を超える腫瘍体積を有する動物または死亡の有意な兆候を有する動物をヒトにより安楽死させる。腫瘍増殖を時間に対してプロットする。
【０７１８】
図13にまとめられた実験においては、Raji細胞を注入された10匹の動物をそれぞれ、4日目に開始して、10 mg/kgの(i)抗CD20抗体、(ii)ADCCが低下した3649-TM Fc変異体、(iii)3649抗体、または(iv)R347対照抗体のi.p.用量で隔週で5回処理した。10匹の動物のさらなる対照群はPBSのみを受容した。3649抗CD19抗体および陽性対照抗CD20抗体を用いる処理は、腫瘍増殖を有意に低下させた。3649または抗CD20抗体を受容する群に関する腫瘍サイズの標準偏差は、両処理群における完全に腫瘍を含まない個体の存在のため、時間と共に増加した。3649-TM Fc変異体は、腫瘍増殖に対する有意な効果を有さなかったが、これは3649ヒト化抗CD19抗体の腫瘍増殖低下作用がADCCを介するものであることを示唆している。
【０７１９】
図14にまとめた実験においては、10匹のRaji細胞を注入された動物をそれぞれ、4日目に開始して、(i)10 mg/kgの抗CD20抗体(抗CD20)、(ii)10 mg/kgのADCCが低下した3649-TM Fc変異体(3649-TM)、(iii)10 mg/kgの3649抗体(3649)、(iv)2.5 mg/kgの3649抗体(3649*)または(v)10 mg/kgのR347対照抗体のi.p.用量で隔週で5回処理した。3649抗CD19抗体、3649-3MヒトADCC増強抗CD19抗体および陽性対照抗CD20抗体を用いる処理は、腫瘍増殖を有意に低下させた。3649-TM Fc変異体抗CD19抗体は腫瘍増殖に対する有意な効果を有さなかったが、これは3649の腫瘍増殖低下作用がADCCを介するものであることを示唆している。
【０７２０】
図30にまとめた実験においては、10匹のRaji細胞を注入された動物をそれぞれ、4日目に開始して、(i)10 mg/kgの抗CD20抗体(抗CD20)、(ii)10 mg/kgの3649抗体(3649)、(iii)2.5 mg/kgもしくは10 mg/kgのアフコシル化3649抗体(3649-aFuc)または(iv)10 mg/kgのR347対照抗体のi.p.用量で隔週で5回処理した。3649抗CD19抗体、3649-aFuc抗CD19抗体および陽性対照抗CD20抗体を用いる処理は、腫瘍増殖を有意に低下させなかった。
【０７２１】
11. 親和性成熟3649抗CD19抗体
以下の節は、親3649抗CD19抗体と比較して、細胞表面提示ヒトCD19抗原に対する結合親和性の増加を示す3649抗CD19抗体の親和性成熟CDR変異体の同定を説明する。また、当該節は、親和性成熟抗CD19抗体のin vitroにおける特性評価を説明する。
【０７２２】
11.1. 親和性の増加を示す3649変異体抗体の同定
変異体CDR配列を含むFabフラグメントライブラリーをスクリーニングすることにより、3649変異体抗CD19抗体を同定した(米国特許出願公開第US2006/0121042; Wu, H., Methods Mol Biol., 207:197-212 (2003); Wu & An, Methods Mol Biol., 207:213-33 (2003); Wuら、J. Mol. Biol., 350:126-144 (2005); Wuら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6037-6042 (1998)を参照)。
【０７２３】
試薬：全ての化合物は分析等級のものであった。制限酵素、DNA改変酵素、T4リガーゼおよびT7 DNAポリメラーゼを、New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA)から購入した。カスタムオリゴヌクレオチドを、Operon (Huntsville, AL)により合成した。ストレプトアビジン磁気ビーズを、Dynal (Lake Success, NY)から購入した。
【０７２４】
3649 Fabファージ発現ベクターの構築：3649抗CD19抗体のVHおよびVKドメインをコードするポリヌクレオチドを、lacZプロモーターの制御下でのFabフラグメントの発現を容易にするM13に基づくファージ発現ベクター中にクローニングした(Dall’Acquaら、Methods 36:43-60 (2005))。このベクターは、ヒトγ1重鎖の第1の定常領域、ヒトκ軽鎖の定常ドメインならびにVHおよびVK遺伝子のクローニングのための2個のアニーリング部位を含む。Wu & An, Methods Mol Biol., 207:213-33 (2003)に記載のようなハイブリダイゼーション突然変異誘発によりクローニングを実行した(Kunkelら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4778-82 (1985))。簡単に述べると、3649のVHおよびVK領域をコードするポリヌクレオチドを、それぞれ約0.5 pmolの以下の遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマー：3649 VH Fab Fw (配列番号128)、3649 VH Fab Rev (配列番号129)、3649 VK Fab Fw (配列番号130)、および3649 VK Fab Rev (配列番号131)を用いて増幅した(表32を参照)。各プライマーの5'ヌクレオチド配列は、PCR産物と一本鎖ベクターとのアニーリングを可能にするM13ベクター特異的配列を含む。3649 VH Fab Fw(配列番号128)および3649 VK Fab Fw(配列番号130)プライマーのヌクレオチド配列は、それぞれ、M13遺伝子3リーダー配列に対応する28/25ヌクレオチド配列を含む。3649 VH Fab Rev(配列番号129)および3649 VK Fab Rev(配列番号131)プライマーの5'ヌクレオチド配列は、それぞれ、ヒトγ1重鎖の第1の定常領域およびヒトκ軽鎖の定常ドメインに対応する28/30ヌクレオチド配列を含む。前方プライマー3649 VH Fab Fw(配列番号128)および3649 VK Fab Fw(配列番号130)をビオチン化して、PCR断片のマイナス鎖の単離を援助した。3649 VHおよびVK遺伝子をコードするポリヌクレオチドを、それぞれ、3649 VH Fab Fw (配列番号128)/ 3649 VH Fab Rev (配列番号129)および3649 VK Fab Fw (配列番号130)/ 3649 VK Fab Rev (配列番号131)プライマー組合せを用いて上記の対応する3649 IgG発現構築物からPCR増幅した。PCR産物をアガロースゲル電気泳動／電気溶出により精製した後、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(Roche)を用いてリン酸化した。PCR断片のマイナス鎖を、水酸化ナトリウムを用いて二本鎖PCR産物を解離させ、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズを用いてプラスビオチン化鎖を枯渇させ、エタノール沈降によりマイナス鎖を回収することにより単離した。等量のVHおよびVK PCR断片の単離されたマイナス鎖をウリジニル化一本鎖M13 MD101-5A鋳型にアニーリングさせ、製造業者の説明書に従ってT4 DNAポリメラーゼ(Roche)、T4 DNAリガーゼ(Roche)で処理した。単離されたVHおよびVKマイナス鎖ポリヌクレオチドに組込まれたM13特異的ヌクレオチド配列は、それぞれ、XbaI制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含むパリンドロームループを含む、M13ベクターDNAの2個の別々の領域にそれらを特異的にアニーリングさせる。パリンドロームループは、アニーリングしたVHまたはVK配列の存在下でも自身でアニーリングするため、アニーリングしたT4 DNAポリメラーゼ／T4 DNAリガーゼ処理されたDNA複合体のXbaI消化により、消化された親鋳型プラス鎖を使って、それぞれ、ヒトκ定常領域および第1のヒトγ1定常領域と読み枠を合わせて融合されたVHおよびVKドメインの両方を含む新しく合成されたマイナスベクター鎖の選択が可能になる。反応産物をXbaIを用いて消化し、熱不活化し、DH10B細胞中にエレクトロポレーションした。形質転換されたDH10B細胞を、大腸菌XL-1 Blueローンを用いて細菌プレート上で力価測定した。いくつかの独立プラークから単離されたファージDNAを配列決定して、3649 Fabフラグメントをコードするクローンの同定を援助した。
【表３２】
0005401314.tif 000028
【０７２５】
単一CDR集中Fabライブラリーの作製：2個の別々の単一のアミノ酸置換ライブラリーを、3649抗体の6個のCDR領域の各々について調製した。「NSS」ライブラリーは、置換アミノ酸がNSS縮重コドンによりコードされる8個のアミノ酸のいずれか1個である、所与のCDRのあらゆる可能な単一アミノ酸置換変異体を含んでいた。「NWS」ライブラリーは、置換アミノ酸がNWS縮重コドンによりコードされる12個のアミノ酸のいずれか1個である、所与のCDRのあらゆる単一アミノ酸置換変異体を含む。個々のライブラリーを、上記のファージベクターをコードする3649 Fabのハイブリダイゼーション突然変異誘発により調製した(Kunkelら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4778-82 (1985); Wu & An, Methods Mol Biol., 207:213-33 (2003))。簡単に述べると、2セットの縮重マイナス鎖オリゴヌクレオチドを、6個のCDRの各々について調製した。「NSS」および「NWS」セットは、それぞれ、NSSおよびNWS縮重コドンによるCDR領域のあらゆる可能な単一コドン置換を含んでいた。重鎖CDR1集中ライブラリーの調製に用いられたオリゴヌクレオチドを、一例として表33に列挙する。各縮重マイナス鎖オリゴヌクレオチドをリン酸化した後、ウリジニル化一本鎖3649 Fabファージ鋳型DNAに10:1のモル比でアニーリングさせた。アニーリング反応の温度を、1時間かけて95℃から55℃に低下させた。T4リガーゼおよびT7 DNAポリメラーゼをアニーリングした材料に添加し、37℃で1.5時間インキュベートした。単一CDR特異的セットに由来する異なるオリゴヌクレオチドを用いて得られた最終的なマイナス鎖合成産物をプールした；しかしながら、NSSおよびNWSプールを別々に維持し、独立にスクリーニングした。典型的には、1μlのプールしたマイナス鎖合成反応物を、XL1-Blue細菌ローン上でのプラーク形成のためにXL1-Blue中にエレクトロポレーションした。個々のファージクローンを、200μlの10 mM Tris (pH 7.4)、100 mM NaClバッファーを用いて溶出させ、4℃で保存する。24個の無作為に選択されたファージクローンを配列決定して、CDR内の突然変異の分布を決定し、ならびに突然変異率を算出することにより、ライブラリーを特性評価することができる。
【表３３】
0005401314.tif 000029
【０７２６】
単一CDR集中Fabライブラリーの一次スクリーニング：一次スクリーニングは、1 mlのファージ培養物の上清と捕捉剤として組換えヒトCD19を発現する300B4細胞を含む分泌されたFabを用いて実施された一点ELISA(SPE)からなっていた。通常、ライブラリーの包括的スクリーニングを、突然変異率を考慮に入れてライブラリーのサイズの3倍に等しいいくつかの個々のクローンを試験することにより達成することができる。例えば、50％の突然変異率を有するVH CDR1(5アミノ酸残基)「NSS」置換ライブラリー(縮重NSSコドンによりコードされる8個の可能なアミノ酸)の消耗を、5 x 8 x 2=80個の無作為に選択された個々のクローンをスクリーニングすることにより達成することができる。しかしながら、本明細書に記載の実験においては、CDRの長さ、または合成効率に関わらず、それぞれのライブラリーについて、約400個のクローンをスクリーニングした。小規模ファージ培養物の上清をWu & An, Methods Mol Biol., 207:213-33 (2003)に記載のように単離した。簡単に述べると、0.75 mLの指数増殖しているTG1細胞を、0.5 mM IPTGの存在下で75μlの溶出ファージ保存液に接種し、96穴プレート中で1時間、37℃でインキュベートする。プレート培養物を室温に移動させ、回転式振とう器上で一晩増殖させる。0.36 mlの一晩培養物から得た細菌を、低タンパク質結合ナイロン膜(例えば、Nalgene社製Silentスクリーンプレート)を通した濾過により回収し、2 mg/mlリゾチームを含む200μlのTESバッファー(30 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA, 20％スクロース)を含むフィルター上で室温で10分間処理して、ペリプラズム空間から分泌されたFabを放出させる。Fabフラグメントを含有する抽出物を濾過により回収する。抽出物中のFabフラグメント濃度を、標準的なアッセイを用いて決定する。300B4細胞に基づくELISAを上記のように実施した。親3649 Fab発現ファージクローンを、陽性対照として細胞に基づくELISAアッセイに含有させた。変異体Fabフラグメントの相対結合親和性を、Fab濃度に対してELISAシグナルをプロットすることにより比較した。例えば、図18は、VH CDR3内に無作為な単一アミノ酸置換を含む3649変異体Fabを用いて得られた結果を示す。Fab 4B7および4G6は、親3649 Fabのものと比較して、ヒトCD19を発現する300B4細胞に対する結合親和性が有意に増加することを示す。
【０７２７】
単一CDR集中Fabライブラリーの二次スクリーニング：3649親Fabのものよりも少なくとも10％高い一次スクリーニングのELISAシグナルを有するCDR変異体Fabクローンを、15 ml規模で再増殖させ、2個のウェルで同じ300B4細胞に基づくELISAにより再アッセイして、陽性の結果を確認した。15 ml規模のFab抽出物を、Wu, H., Methods Mol Biol., 207:197-212 (2003)に記載のプロトコルに従って調製した。Fab濃度を標準的なアッセイを用いて決定した。300B4細胞に基づくELISAを上記のように実施した。3649親Fabを陽性対照としてアッセイに含有させた。3649対照Fabのものよりも少なくとも10％高い二次スクリーニングのシグナルを有するクローンを配列決定して、ヒトCD19抗原結合の増加をもたらす単一アミノ酸置換の同一性を決定した。単離された親和性改善抗CD19 Fabクローンを配列決定することにより同定されたアミノ酸置換を、表34に列挙する。
【表３４】
0005401314.tif 000030
【０７２８】
コンビナトリアル(組合せ)Fabライブラリーの作製：CDR集中ライブラリーから同定された有益な単一アミノ酸置換の全ての可能な組合せを含む2個の組合せライブラリーを、ハイブリダイゼーション突然変異誘発により作製した。第1の組合せライブラリーを、親3649残基ならびに同定された有益な単一アミノ酸置換の両方をコードする縮重オリゴヌクレオチドのセットを用いて作製した(表35)。第2の組合せライブラリーを、3649親残基ではなく最も有益な単一アミノ酸置換残基のみをコードする縮重オリゴヌクレオチドの別のセットを用いて作製した(表36)。2個のライブラリーを作製し、別々にスクリーニングした。ライブラリー作製を、Wu, H., Methods Mol Biol., 207:197-212 (2003); Wu & An, Methods Mol Biol., 207:213-33 (2003)に記載のように行った。簡単に述べると、縮重プライマーセットを合成し、リン酸化した。1回のアニーリングおよび合成反応において全てのプライマーを用いることによりハイブリダイゼーション突然変異誘発を実施した。ライブラリー作製、試験およびスクリーニングを上記のように実施した。ヒト組換えCD19を発現する300B4細胞に対する最も高い親和性を有する6個の組合せFabクローンのELISAプロフィールを、図19に示す。クローン7E12を、親および有益なCDR置換残基の両方をコードする縮重オリゴヌクレオチドを用いて作製された第1の組合せライブラリーから回収した。クローン14H5、15D7、15D1、16C9、および16C4を、最も有益なCDR置換残基のみをコードする縮重オリゴヌクレオチドを用いて作製された第2の組合せライブラリーから回収した。図19に列挙された全てのファージクローンを配列決定して、ヒトCD19結合親和性が増加した変異体CDR領域のアミノ酸配列を決定した。
【表３５】
0005401314.tif 000031
0005401314.tif 000032
【０７２９】
【表３６】
0005401314.tif 000033
【０７３０】
11.2. 増加した親和性変異体抗CD19抗体の特性評価
抗CD19結合活性が改善した7E12、14H5、15D7、15D1、16C9、および16C4 Fab変異体の可変領域をコードするポリヌクレオチドを、pfu DNAポリメラーゼ(Dall'Acquaら、Methods 36:43-60 (2005))を用いて対応するV領域をコードするM13ファージベクターからPCR増幅した。次いで、前記ポリヌクレオチドを、ヒトサイトメガロウイルス主要極初期(hCMVie)エンハンサー、プロモーターおよび5'-非翻訳領域(M. Boshartら、Cell 41:521-530 (1985))をコードする哺乳動物発現ベクター中に個別にクローニングした。この系においては、ヒトγ1鎖はヒトκ鎖と共に分泌される(S. Johnsonら、Infect. Dis. 176:1215-1224 (1997))。様々な構築物をHEK-293細胞中で一過的に発現させ、トランスフェクションの72および144時間後に収穫した。分泌された可溶性ヒトIgG1を、製造業者の説明書(APBiotech, Inc., Piscataway, NJ)に従って、1 mlのHiTrap Aタンパク質カラムを用いて直接条件化培地から精製した。精製されたヒトIgG1(典型的には、SDS-PAGEにより判定されるように、95％を超える均一性)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に対して透析し、瞬間凍結し、-70℃で保存した。
【０７３１】
11.2.1. 細胞に基づくELISAアッセイ
ヒトCD19に結合する7E12、14H5、15D7、15D1、16C9、および16C4 IgG抗体の能力を、細胞に基づくCD19結合アッセイにおいて評価した。3種の異なる細胞系を捕捉試薬として用いた：(i)ヒト組換えCD19を発現する300B4細胞(図20)、(ii)Raji細胞(図21)、および(iii)Daudi細胞(図22)。3種全部の細胞系を、標準的なプロトコルに従って培養した。標準的なELISA手順を、細胞に基づくCD19結合アッセイのために用いることができる。例えば、96穴U底プレートの個々のウェルに、1 x105個の300B4細胞を播種し、一晩インキュベートする。細胞をELISAバッファーで1回洗浄した後、様々な量の抗CD19抗体と共に氷上でインキュベートする。結合反応を、試験した各抗体濃度について3回実施する。3649抗CD19抗体を用いる陽性対照ウェルをアッセイに含有させる。抗体と共にインキュベートした後、300B4細胞を200μlのELISAバッファーで3回洗浄する。細胞表面結合抗CD19抗体を、標準的なプロトコルに従って、西洋わさびペルオキシダーゼにコンジュゲートさせたヤギ抗ヒトκ抗体を用いて検出する。
【０７３２】
捕捉試薬として300B4細胞、Raji細胞、またはDaudi細胞を用いる3649、7E12、14H5、15D7、15D1、16C9、および16C4抗CD19 IgG抗体のELISA結合曲線を、図20〜22に示す。16C9および15D1以外の全ての試験した抗体は、対照3649抗体よりも細胞表面に提示されたヒトCD19に対する有意に高い結合親和性を示す。ヒトCD19に対する16C9および15D1抗体の結合親和性は、Raji細胞またはDaudi細胞を捕捉試薬として用いる場合、対照3649抗体のものよりも高い。
【０７３３】
11.2.2. 改変された脱アミド化部位を有する14H5抗CD19抗体変異体
3649、7E12、14H5、15D7、15D1および16C9抗体の一次アミノ酸配列は、NG(VH CDR2の残基60-61)脱アミド化モチーフを含む。14H5の3個の脱アミド化マイナス変異体を、Kabat位置60のアスパラギン(N)残基を、チロシン(Y)、アスパラギン酸(D)、またはロイシン(L)に変化させることにより作製した。14H5変異体VH領域を含むY60、D60、およびL60を、それぞれ、14H5-YG (配列番号107)、14H5-DG (配列番号108)、および14H5-LG (配列番号109)と命名する。脱アミド化マイナス14H5変異体をコードするポリヌクレオチドを含む抗体発現ベクターを、標準的な分子クローニング技術を用いて作製した。一過的に発現された14H5-YG、14H5-DG、および14H5-LG 抗CD19 IgGを、上記のように精製した。14H5-YG、14H5-DG、および14H5-LG抗体の結合親和性を、捕捉試薬としてヒト組換えCD10を発現する300B4細胞を用いる細胞に基づくELISAアッセイを用いて確認した。14H5および16C4抗CD10抗体を、陽性対照として用いた。得られた結果を図23に提供する。14H5-YG、14H5-DG、および14H5-LG抗体の組換えヒトCD19を発現する300B4細胞への結合親和性は、14H5または16C4抗体のものよりも低い。
【０７３４】
11.2.3. 親和性成熟抗CD19抗体の動力学的解離速度
7E12、14H5、15D7、15D1、16C9、および16C4抗CD19 IgG抗体の動力学的解離速度を、細胞表面に結合した抗CD19抗体の排除を長時間に渡って追跡することにより確認した。簡単に述べると、Ramos細胞を、標準的な染色プロトコルに従って、7E12、14H5、15D7、15D1、16C9、または16C4親和性成熟抗CD19抗体と共にインキュベートした。細胞をインキュベーション後に洗浄して、未結合の一次抗体を排除し、37℃で0、30、または60分間さらにインキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、細胞を、標準的なプロトコルに従って、RPE結合マウス抗ヒトIgG Fcフラグメント二次試薬を用いて染色し、フローサイトメーター上で分析した。細胞の対照バッチを、3649抗CD19抗体または参照対照抗CD20抗体と共にインキュベートした後、37℃でインキュベートした。様々な抗体を用いて様々な時点で測定した平均蛍光強度を、図24Aに示す。100％の平均蛍光強度は、所与の抗体で時間0で認められる染色強度に対応する。
【０７３５】
親和性成熟7E12、14H5、15D7、15D1、16C9、および16C4抗CD19抗体を用いて観察された平均蛍光強度の喪失は、抗CD20参照対照抗体を用いて観察されたものよりも低い。対照的に、3649抗CD19抗体染色されたRamos細胞は、参照対照抗CD20抗体を用いて染色された細胞よりも速い平均蛍光強度の喪失を示す(図24A)。
【０７３６】
別の実験においては、Ramos細胞を、標準的なプロトコルに従って、Alexa 647結合16C4、3649、またはHB12B抗CD19抗体を用いて染色した。染色後、細胞を洗浄して、未結合の抗体を除去し、37℃で0、30、または60分間さらにインキュベートした。続いて、細胞をフローサイトメーター上で分析した。蛍光結合した抗CD20抗体を、参照対照として実験中に含有させた。様々な時点で認められる平均蛍光強度(MFI)を図24Bに示す。MFIを、時間0で認められるMFI値の画分として表す。16C4親和性成熟抗CD19抗体を用いて検出されたMFIの喪失は、3649またはHB12B抗CD19抗体を用いて認められるMFIの喪失よりも有意に遅い。抗CD20参照対照抗体は、3649およびHB12B抗CD19抗体と同じ解離速度を示す。
【０７３７】
11.2.4. 親和性成熟抗CD19抗体による細胞表面染色
Daudi細胞を、標準的なプロトコルに従って、7E12、14H5、15D7、15D1、16C9、および16C4抗CD19抗体ならびにRPE結合ヤギ抗ヒトIgG(Fab')2フラグメント二次試薬を用いて免疫染色した。免疫染色された細胞を、フローサイトメーター上で分析した。様々な一次抗体濃度の染色細胞の中央蛍光強度(MFI)を図25にプロットする。3649抗CD19抗体で染色された細胞を、参照対照として含有させた。7E12、14H5、15D7、15D1、16C9、および16C4抗CD19抗体を用いて検出された染色強度は、試験した全ての濃度で3649抗体で染色された細胞のものよりも高かった。15D1を用いて検出された染色強度は、低い抗体濃度(0.5 mg/ml以下)の3649抗体を用いて検出された染色強度と類似していた。しかしながら、15D1染色細胞のMFIは、高い抗体濃度(1 mg/ml以上)の3649抗体染色細胞のものよりも高かった。
【０７３８】
11.2.5. 親和性成熟抗CD19抗体のin vitro ADCC活性
親和性成熟抗CD19抗体のin vitro ADCC活性を、本明細書に記載のアッセイを用いて測定した。例えば、Daudi標的細胞を用いて16C4、14H5、および14H5-DG抗体を用いて得られた結果を、図26に提供する。3549抗CD19抗体を、参照対照として用いた。3種全部の親和性成熟抗体は、3649参照対照抗体と比較して、0.1 mg/ml以下の抗体濃度でADCC活性の増加を示した。16C4、14H5、および14H5-DG抗体のADCC活性は、1 mg/ml以上の抗体濃度で3649抗体の活性と一致していた。
【０７３９】
親和性成熟アフコシル化抗CD19抗体のin vitro ADCC活性も、本明細書に記載のアッセイを用いて測定した。例えば、アフコシル化16C4抗体(16C4-aFuc)媒介性ADCCを、Daudi標的細胞を用いて測定した(図26)。また、実験は16C4、3649-aFuc、および参照抗体としての抗CD20抗体を含んでいた。16C4-aFucのADCCは、3649-aFuc、抗CD20、またはフコシル化16C4参照抗体のものよりも有意に高い。16C4-aFucにより媒介されるADCCは、抗体のものと同等である。
【０７４０】
16C4、16C4-aFuc、および3649-aFuc抗CD19抗体のin vitro ADCC活性を、様々な標的細胞を用いて標準化されたin vitro ADCCアッセイにおいてさらに特性評価した。抗CD20抗体を対照としてアッセイに含有させた。用いた標的細胞は、種々のB細胞悪性腫瘍ならびに様々なCD19細胞表面密度である(表37)。標的細胞のCD19およびCD20の相対表面発現を、標準的なプロトコルに従ってフローサイトメトリーにより決定した。表37は、蛍光標識された抗CD20または16C4抗CD19抗体を用いて染色された標的細胞の平均蛍光強度(MFI)を列挙している。ADCC反応を、上記のプロトコルに従って実施した。反応を、50,000個のエフェクター細胞および20,000個の標的細胞を用いて3回設定し、2.5:1のE:T比を達成した。CD16および関連するシグナリングポリペプチドFCεRI-γを発現するトランスジェニックNK細胞は、エフェクター細胞として働いた。ADCC反応を、37℃で4時間進行させた。ADCC活性を様々な抗体濃度で決定した。データを、抗体濃度の関数として細胞傷害性(％)としてプロットした。最大細胞殺傷およびEC50値(用いる反応条件下で最大の半分の細胞傷害性にとって必要な抗体濃度)を、標準的な方法を用いて標的細胞／抗体組合せについて確立した。表37は、最終的な結果を提供する。それぞれ、DLCL、NHL、ALL、およびバーキットリンパ腫を発現するOci-LY19、KArpas-422、Nalm-6、およびNamalwa細胞は、16C4-aFuc抗体を介する細胞傷害性に対して感受性であったが、抗CD20を介するADCCに対してはあまり感受性ではなかった。Daudi、Toledo、RLおよびRaji細胞は、抗CD20を介するADCCに対するよりも、16C4-aFuc抗体を介する細胞傷害性に対して感受性が有意に高かった。
【表３７】
0005401314.tif 000034
【０７４１】
11.2.6. 親和性成熟抗CD19抗体によるin vivoでのB細胞枯渇
親和性成熟抗CD19抗体を、本質的には上記のようにB細胞枯渇アッセイにおいて試験した。C57Bl6 hCD19 tg+/-動物を、単回i.v.用量の10、50、もしくは250μgの16C4親和性成熟抗CD19抗体(16C4)または14H5DG親和性成熟抗CD19抗体(14H5DG)で処理した。参照対照動物を、(i)3649抗CD19抗体(3649)、(ii)3649抗CD19抗体のADCC増強Fc変異体(3649 3M)、および(iii)アフコシル化3649抗CD19抗体(3649-aFuc)で処理した。陰性対照動物を、(i)3649抗CD19抗体のADCC障害Fc変異体(3649 TM)または(ii)無関係の特異性の抗体(R347)で処理した。循環リンパ球および脾臓リンパ球を、抗体治療の7日後に単離した。単離された細胞を表5に記載のように免疫染色して、様々なB細胞集団を同定した。サンプルを標準的なプロトコルに従ってフローサイトメーター上で分析した。
【０７４２】
16C4親和性成熟抗CD19抗体は、3649抗CD19親抗体よりもわずかに高いB細胞の枯渇を達成した。3649-aFucおよび3649 3M抗体は、16C4親和性成熟抗体よりも良好な枯渇を達成した。14H5DG親和性成熟抗CD19抗体は、3649抗CD19親抗体よりもB細胞の枯渇においてあまり有効ではない。
【０７４３】
11.2.7. 単回枯渇用量の親和性成熟抗CD19抗体の投与後のBリンパ球の長期間の回復
B細胞区画の長期間の回復を、単回枯渇用量の16C4-aFuc抗CD19モノクローナル抗体の投与後に試験した。25匹のC57Bl6 hCD19 tg+/-マウス(13匹の雄、12匹の雌、2.5〜3ヶ月齢)を、5つの群に分割した。実験抗体を投与する1週間前に(-1週)、動物を全体的な健康について試験し、体重を計量し、分析のためにそれらのうちの各1つについて小アリコートの血液を回収した。実験の0日目に、250μgの16C4-aFuc mAb、50μgの16C4-aFuc mAb、10μgの16C4-aFuc mAb、250 mgの無関係の特異性のR347対照抗体、またはPBSを、それぞれ群1、2、3、4および5の動物に静脈内投与した。7日目(週1)に、およびその後は1週間毎に、各群のマウスを試験し、出血させた。血液サンプルをフローサイトメトリーにかけて、B細胞、T細胞、NK細胞、好中球、単球および樹状細胞数を決定した。血液サンプルをさらに分析して、IgM、IgG1、IgG2b、IgG2c、IgG3、IgA、抗dsDNA IgM、抗dsDNA IgG、抗ssDNA IgM、抗ssDNA IgGの血清濃度ならびにIL-7、CXCL12、CXCL13およびBAFFの血清レベルを決定した。測定を標準的な手順に従って実施した。実験の概略および得られた結果を図38に提供する。
【０７４４】
薬剤治療後に明らかな有害作用は観察されなかった。全ての実験群の動物は、正常な活性レベルおよび体重を維持した(図38B)。16C4-aFuc抗CD19抗体を受容する動物のB細胞レベルは、対照動物のものよりも有意に低かった(図38CおよびD)。B細胞枯渇は、10 mgの16C4-aFucを受容する動物においても完了した。B細胞枯渇の期間は用量依存的であった；枯渇の期間は、16C4-aFuc抗体の用量が高くなるにつれて増加した。10μgの16C4-aFucを受容する動物上のB細胞は、3週目までに回復し始め、5週目までに正常レベルに到達した。50μgの16C4-aFucを受容する動物の回復には9週間かかった。250 mgの16C4-aFucを受容する動物は依然として、実験の11週目にほぼ完全にB細胞を含まなかった。T細胞、NK-T細胞、NK細胞、樹状細胞、好中球、および単球の血液濃度は、16C4-aFuc抗体により影響されなかった(データは示さない)。IgM、IgG1およびIgG2bの血清レベルも、16C4-aFuc抗体治療により低下した(図38E-G)。免疫グロブリンレベルの低下は用量感受的であった；レベルの有意な低下は50または250μgの16C4-aFuc抗体で処理した動物においてのみ認められた。免疫グロブリンレベルの回復は、B細胞区画の回復を大きく追跡する。
【０７４５】
11.2.8. 抗CD19抗体のIEF-PAGE分析
ネイティブ(native)等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動(IEF-PAGE)分析を、標準的なプロトコルに従って16C4、16C9、7E12、14H5、15D7、15D1、14H5-DG、および3649抗CD19抗体に対して実施した。プレキャストアンホリンゲル(Amersham Biosciences, pI範囲3.5-9.5)に、8μgの精製タンパク質を載せた。タンパク質サンプルを、ゲルに載せる前に10 mMヒスチジンpH 6.0バッファー中で透析した。広範囲のpIマーカー標準(Amersham, pI範囲3-10、8μL)を用いて、相対pI値を決定した。電気泳動を1500 V、50 mAで105分間行った。ゲルを45分間固定し、Simply Blue染色(Invitrogen)を用いて室温で一晩染色した。25％エタノール、8％酢酸溶液を用いて脱色を行った。等電点を、Quantity One Imaging Softwareを備えたBio-Rad GS-800 Densitometerを用いて決定した。クマシー染色されたゲルを図27に示す。16C4、16C9、7E12、14H5、15D7、15D1、14H5-DG、および3649抗体の等電点は、それぞれ、7.83、8.04、7.69、7.76、7.61、7.72、7.48、および7.75である。
【０７４６】
11.3. Fc変異体親和性成熟抗CD19抗体
L234F/L235F/P331SまたはL234F/L235Y/P331Sアミノ酸置換を含む16C4 Fc変異体抗体をコードする抗体発現ベクター(本明細書では以後「16C4-235F」または「16C4-235Y」と呼ぶ)を、両方ともLazarらのUS 2004/0132101およびUS 2005/0054832に記載の方法を用いて作製する。簡単に述べると、16C4をコードする抗体発現ベクターを、必要なヌクレオチド残基置換を、重鎖定常領域をコードするポリヌクレオチド配列中に導入して、16C4-235Fまたは16C4-235Y抗体発現ベクターを作製することにより、部位特異的突然変異誘発キット(例えば、QuickChange (Promega))を用いて改変する。HEK239F細胞を好適な抗体発現ベクターを用いてトランスフェクトすることにより、精製された16C4 Fc変異体抗体を作製する。トランスフェクトされた細胞に3日目および6日目に供給し、抗体を含有する条件化培地を9日目に収穫する。プレキャストAタンパク質カラム(GE Healthcare)を用いて条件化培地から抗体を精製する。抗体を低いpHのバッファーを用いてカラムから溶出させ、中和し、PBSに対して透析する。精製された抗体の濃度を、280 nmの溶液の光密度から算出する。
【０７４７】
平衡結合定数(KD)の測定：16C4およびそのFc変異体に対する全てのFcγ受容体(ヒトFcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA-V158、ならびにマウスFcγRIIB、FcγRIIIおよびFcγRIV)の平衡結合定数を、BIAcore 3000装置(Uppsala, Sweden)上で測定した。簡単に述べると、全てのIgGを、製造業者により推奨された標準的なアミノカップリング化学を用いて2個のCM5センサーチップの別々の流動細胞上に固定した。固定されたIgGレベルは8194〜8725 RUであった。4000または16000 nMの全てのFcγRの組換え発現された細胞外ドメインの保存溶液を調製した後、装置バッファー(0.01 M HEPES, pH 7.4、0.15 M NaCl、3 mM EDTAおよび0.005％P-20を含む50 mM HBSバッファー)を用いて所望の濃度に段階希釈した。次いで、各濃度のFcγRの2回の注入液を、5μL/分の流速でIgG表面の全てに対して注入した。結合データを約50分間に渡って回収した後、注入間に5 mM HClの30秒パルスを行ってIgG表面を再生させた。また、いくつかのバッファー注入液を一連の注入を通して拡散させた。これらのバッファー注入液の1つを参照細胞データと共に用いて、生のデータセットを補正した。全ての結合データを収集した後、個々のデータセットを、それぞれのγ濃度について平均した後、平均結合定数KDが誘導された1:1結合等温線に適合させた。これを、BIAevaluationソフトウェアv.4.1を用いて実行した。KD値(nM)を表38に提供する。
【表３８】
0005401314.tif 000035
【０７４８】
12. 16C4抗CD19抗体の親和性成熟変異体の単離
16C4抗体の親和性成熟変異体を、本明細書に記載のプロトコルを用いて同定した。スクリーニングは2つの段階からなっていた。第1の段階は、細胞表面に提示されたヒトCD19抗体に対する結合活性の増加をもたらす単一アミノ酸置換を含む16C4変異体Fabの同定に焦点を当てたものである。有益な単一アミノ酸置換を含む16C4変異体Fabを、単一CDR集中ファージディスプレイライブラリーのスクリーニングを介して同定した。スクリーニングの第2の段階は、(i)16C4親和性成熟プロセスの第1段階で、または(ii)3649抗CD19抗体の親和性成熟プロセスの間に同定された有益な単一アミノ酸置換の全ての可能な組合せを発現するFabクローンの組合せライブラリーのスクリーニングからなっていた。
【０７４９】
CDR特異的ファージディスプレイライブラリーを、上記のように作製した。単一点細胞に基づくアッセイ(Luら、J. Immunol. Methods 314:74-79 (2006))において多数のファージクローン(ライブラリーあたり約400クローン)を試験することにより、ライブラリーをスクリーニングした。試薬および使い捨て物を、Meso Scale Discoveryから購入した；アッセイを製造業者の説明書に従って実施した。簡単に述べると、5,000個のRajiまたは300B4細胞／ウェルを塗布し、25μlの1X PBS中、RTで1時間インキュベートした；ウェルを25μlの30％FBSを用いてRTで20分間ブロックした；上清を廃棄する；25μlの抗CD19 Abを各ウェルに添加し、RTで1時間インキュベートする；ウェルを1X PBSで3回洗浄する；25μlの0.25μg/mlヤギ抗ヒトFab'2-MSDTagを各ウェルに添加し、RTで1時間インキュベートする；ウェルを1X PBSで3回洗浄する；150μlの1X T読み取りバッファーを用いてシグナルを読み取る。VH CDR2中に有益なアミノ酸置換を含む代表的なクローンの結合曲線を、図32に示す。16C4 CDR特異的ライブラリーから同定された有益な単一アミノ酸置換を表39に列挙する。
【表３９】
0005401314.tif 000036
【０７５０】
組合せファージディスプレイライブラリーを、上記のように調製した。ライブラリー作製に用いられた16C4 Fab特異的オリゴヌクレオチドを表40に列挙する。組合せライブラリーに由来する個々のFabクローンを、300B4およびRaji細胞への結合について試験した(Luら、J. Immunol. Methods 314:74-79 (2006))。代表的なFabクローンの結合曲線を、図33A-Bに示す。300B4細胞、Raji細胞、またはその両方に対する結合活性が増加したFabクローンを、標準的な方法を用いて配列決定した。ユニークなFabクローンのCDR配列中に認められるアミノ酸変化のまとめを、図33Cに提供する。
【表４０】
0005401314.tif 000037
【０７５１】
細胞表面に提示されたヒトCD19抗原に対する結合親和性が改善した6個の親和性成熟16C4変異体Fabクローンを、本明細書に記載の方法を用いて完全なIgG1抗体中に形質転換した。3C3、6F7、2B11、6C11、9G7、および5C4親和性成熟抗CD19抗体の結合活性を、様々な細胞に基づくアッセイにおいて特性評価した。図34は、細胞に基づくECLアッセイ(Luら、J. Immunol. Methods 314:74-79 (2006))において300B4細胞を用いて得られた結果を提供する。親和性成熟16C4変異体抗体のCD19結合活性は、対照16C4または3649抗体のものよりも高い。
【０７５２】
親和性成熟抗CD19抗体による細胞表面染色：DaudiおよびRaji細胞を、標準的なプロトコルに従って、3C3、6C11、および9G7抗CD19抗体ならびにRPE結合ヤギ抗ヒトIgG(Fab')2フラグメント二次試薬を用いて免疫染色した。免疫染色された細胞をフローサイトメーター上で分析した。様々な一次抗体濃度の染色細胞の中央蛍光強度(MFI)を、図35にプロットする。16C4抗CD19抗体で染色された細胞を参照対照として含有させた。0.0625〜0.25μg/mlの抗体濃度のRaji細胞上で3C3および6C11親和性成熟抗体を用いて検出された染色強度は、16C4対照を用いて検出されたものよりも高い。親和性成熟抗体および対照抗体のRaji細胞染色強度は、0.5〜10μg/mlの抗体濃度で同じである。9G7抗体によるRaji細胞染色は、より低い(0.0625〜0.25μg/ml)抗体濃度で対照抗体と類似し、より高い(0.5〜10μg/ml)抗体濃度で対照よりも弱い。9G7および6C11染色されたDaudi細胞の中央FIは、16C4染色細胞のものよりも高い。3C3染色Daudi細胞の中央FIは、0.0625および0.125μg/mlの抗体濃度で対照細胞よりも高く、0.25〜10μg/mlの抗体濃度で対照細胞のものと実質的に同じである。
【０７５３】
親和性成熟16C4変異体抗CD19抗体のin vitro ADCC活性：親和性成熟抗CD19抗体のin vitro ADCC活性を、本明細書に記載のアッセイを用いて測定した。例えば、RajiおよびDaudi標的細胞を用いて3C3、6C11、および9G7抗体を用いて得られた結果を、それぞれ図36および37に提供する。16C4抗CD19抗体を、参照対照として用いた。3種全部の親和性成熟抗体は、試験した濃度範囲(0.0001〜10μg/ml)に渡って対照と実質的に同じADCC活性を示した。
【０７５４】
16C4抗CD19抗体の親和性成熟変異体を、本明細書に記載のプロトコルに従って改変することができることが当業者により理解される。具体的には、3C3、6C11、および9G7抗体を、本明細書に記載の変異体Fc領域のいずれか1つを含むように改変することができる。アフコシル化型の抗体も調製することができる。また、親和性成熟抗体を、本明細書に記載のアッセイを用いて特性評価することもできる。具体的には、3C3、6C11、および9G7抗体がADCCを媒介する能力、in vivoでB細胞を枯渇させる能力、腫瘍異種移植片のサイズを低下させる能力、抗IgM/CpGにより刺激されるB細胞増殖を阻害する能力を、本明細書に記載のプロトコルに従って試験することができる。
【０７５５】
13. B細胞増殖の抗CD19抗体を介する阻害
13.1. 抗CD19抗体処理により誘導されるCD19リン酸化
1000万個の細胞を、5μg/mlの3649、3649-3M、3649-aFuc、3649-TMまたは16C4抗CD19抗体の存在下で15分間インキュベートした。対照を、無関係の特異性のR347抗体で処理し、ならびに抗体処理を用いない対照細胞を陰性対照として実験に含有させた。インキュベーション後、、標準的なプロトコルに従って、細胞溶解物を調製し、免疫沈降にかけた。免疫沈降した材料および入力細胞溶解物をLaemmli SDS-PAGE上で分離し、固相支持体(Nitrocellulose Invitrogenカタログ番号LC2001)に移し、ウェスタンブロッティングにかけた。免疫沈降を、標準的なプロトコルに従って、2μgのHB12B抗CD19抗体を用いて実施した。総CD19タンパク質およびリン酸化CD19レベルを、それぞれ、(1:1000)抗CD19 (Cell Signaling Technology #3574)または(1:250)抗ホスホチロシン(PY20)(Santa Cruz Biotechnology #sc-508 HRP)抗体を用いるウェスタンブロッティングにより免疫沈降材料中で検出した。入力細胞溶解物中のリン酸化Erk1/2タンパク質および総Erk1/2タンパク質レベルを、それぞれ、(1:2000)抗ホスホErk1/2 (Cell Signaling Technology #9106S)および(1:1000)抗Erk1/2 (Cell Signaling Technology #9102)抗体を用いるウェスタンブロッティングにより検出した。
【０７５６】
図39Aは、HB12B免疫沈降、次いで、ウェスタンブロッティングの結果を示す。種々の実験(「3649」、「3649-3M」、「3649-aFuc」、「3649-TM」または「16C4」)および対照細胞溶解物(「nil」および「R347」)に由来する免疫沈降サンプルに加えて、膜はHB12B抗体のみの対照レーン(「Abのみ」)も含んでいた。総CD19タンパク質レベルは、全ての免疫沈降サンプルにおいて実質的に同一であった。リン酸化CD19レベルは、対照サンプルにおけるよりも、抗CD19処理された細胞から調製された細胞溶解物から免疫沈降されたサンプルにおいて有意に高かった。図39Bは、総細胞溶解物に関するウェスタンブロットの結果を示す。総Erk1/2タンパク質レベルは、全ての細胞溶解物において実質的に同一であった。リン酸化Erk1/2レベルは、対照サンプルにおけるよりも抗CD19処理された細胞から調製された細胞溶解物において有意に高かった。
【０７５７】
13.2. 抗CD19処理は抗IgM媒介性Erk1/2活性化を阻害しない
100万個の細胞を、10μg/mlの3648-3M抗CD19抗体または10μg/mlのR347対照抗体の存在下で5または10分間、5μg/mlの抗IgM抗体またはPMA (50 ng/ml)／イオノマイシン(1μM)で刺激した。3649またはR347のみで処理した細胞を対照として含有された。細胞を収穫し、インキュベーション期間の終わりに溶解させた。標準的なプロトコルに従って、総細胞溶解物をLaemmli SDS-PAGE上で分離し、ニトロセルロース支持膜に移し、ウェスタンブロッティングにかけた。抗ホスホErk1/2抗体および抗Erk1/2抗体を用いるウェスタンブロッティングを実施して、細胞溶解物中で、それぞれリン酸化Erk1/2および総Erk1/2レベルを検出した。結果を図39C-Dに示す。
【０７５８】
総Erk1/2レベルは総細胞溶解物中で実質的に同一であった。3649抗体のみで処理された細胞中の基線リン酸化Erk1/2レベルは、R347のみで処理された細胞よりも高かった。抗IgMまたはPMA/イオノマイシン刺激は、3649またはR347処理細胞の両方において基線より上にリン酸化Erk1/2レベルを増加させた。Erk1/2リン酸化レベルは、抗IgM抗体を用いる刺激後よりも、PMA/イオノマイシン刺激後に有意に高かった。
【０７５９】
13.3. 抗CD19抗体処理は抗IgM/CD40により誘導されるB細胞増殖を阻害する
末梢B細胞を、B細胞単離キット(Miltenyi Biotec # 130-091-151)を用いて200 mlの血液から精製する。100,000個の細胞を96穴U底プレート(100μlの1 x 106細胞/ml)中に播種する。次に、好適な濃度の抗体を、50μl容量で細胞に添加する。プレートを15分間インキュベーターに戻す。次いで、刺激原を50μl容量で細胞に添加する。細胞／抗体／刺激原混合物の最終容量は200μlである。細胞を3日間インキュベートする。Cell Titer-Glo(登録商標)Luminescent Cell Viability Assay (Promega)を用いて3日目に細胞数を読み取る。不死化された細胞系に対する実験を、10,000細胞／ウェルで播種した。
【０７６０】
抗IgM/CD40により誘導されるB細胞増殖に対する抗CD19抗体処理の効果を、図40に示す。15分後、B細胞を抗IgM(5μg/ml)のみ、抗IgM(5μg/ml)/CD40(1μg/ml)、またはCpG(1μg/ml)のみで刺激した。B細胞刺激を3日間進行させた。生細胞数を、Cell Titer-Glo(登録商標)Luminescent Cell Viability Assay (Promega)を用いて実験の終わりに測定した。無関係の特異性のR347抗体で処理された細胞を対照として含有させた。IgMのみの刺激ではなく、抗IgM/CD40またはCpG刺激により、生細胞数を増加させた。阻害のレベル(40％)は、試験した全ての抗CD19抗体について同一であった。CpGにより誘導された細胞増殖は、抗CD19抗体処理により影響されなかった。
【０７６１】
13.4. 抗CD19抗体処理は抗IgM/CpGにより誘導されるB細胞増殖を阻害する
様々な刺激原に応答する細胞増殖を、CFSEアッセイを用いて評価した。簡単に述べると、精製されたB細胞を、1 mlあたり約1000万個の細胞でリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に再懸濁する。それに等量のPBS中の1μM CFSEを添加する。CFSEの最終濃度は5μMであり、細胞は500万個/mlである。懸濁液を暗室中で10分間保持する。等量のウシ胎仔血清(FCS)を混合物に添加して、細胞外CFSEをクエンチする。細胞を洗浄し、培地中に希釈する。100,000個のCFSE標識細胞を、96穴U底プレート(100μlの1 x 106細胞/ml)中に播種する。次に、好適な濃度の抗体を50μl容量で細胞に添加する。プレートを15分間インキュベーターに戻す。次に、刺激原を50μl容量で細胞に添加する。細胞／抗体／刺激原混合物の最終容量は200μlである。細胞を4日間インキュベートする。インキュベーションの終わりに、細胞を洗浄し、7-アミノアクチノマイシンD(7-AAD)(BD Bioscience)で染色し、フローサイトメーター上で分析する。生細胞のCFSEシグナルを検出する。細胞集団のCFSEプロフィール中のCFSEシグナル低下は、細胞分裂を示す。CFSEシグナル低下の程度は、細胞増殖レベルと相関する。
【０７６２】
精製された末梢B細胞を、抗IgM(1μg/ml)/CpG(2μg/ml)またはCpG(2μg/ml)のみで4日間刺激した。細胞増殖を、CFSEアッセイを用いて評価する。図41Aは、刺激された、および刺激されなかった対照細胞のCFSEプロフィールを示す。IgM(1μg/ml)/CpG(2μg/ml)により刺激された細胞のCFSEシグナルは、対照細胞のものよりも有意に低く、これはIgM(1μg/ml)/CpG(2μg/ml)刺激が、多大な細胞増殖をもたらしたことを示している。CpGのみで刺激された細胞のCFSEプロフィールは、限定された細胞増殖のみを示す。
【０７６３】
16C4抗CD19抗体は、抗IgM/CpGにより誘導されるB細胞増殖を阻害する。精製された末梢B細胞を、5μg/mlのR347対照抗体または5μg/mlの16C4抗CD19抗体の存在下で4日間、抗IgM(1μg/ml)/CpG(2μg/ml)を用いて刺激した。細胞増殖を、CFSEアッセイを用いて評価する。図41Bは、R347または16C4抗体の存在下でIgM(1μg/ml)/CpG(2μg/ml)を用いて刺激されたB細胞のCFSEプロフィールを示す。R347抗体の存在下で抗IgM(1μg/ml)/CpG(2μg/ml)で刺激されたB細胞のCFSEプロフィールは、多大な細胞増殖を示す。16C4抗CD19抗体の存在下で抗IgM(1μg/ml)/CpG(2μg/ml)で刺激されたB細胞のCFSEプロフィールは、対照細胞において認められるものよりもあまり多くない細胞増殖を示す。
【０７６４】
13.5. Fc変異体抗CD19抗体は変化した阻害特性を示す
精製された末梢B細胞を、5μg/mlのR347対照抗体、3649-3M Fc変異体抗CD19抗体または3649-TM Fc変異体抗CD19抗体の存在下で抗IgM(1μg/ml)/CpG(2μg/ml)で4日間刺激した。細胞増殖をCFSEアッセイを用いて評価する。図42Aは、R347対照抗体の存在下で抗IgM(1μg/ml)/CpG(2μg/ml)で刺激されたB細胞のCFSEプロフィールを示す。このCFSEプロフィールは、23.5+26.5+23.2=73.2％のB細胞が少なくとも1回の細胞分裂を受けたことを示す。図42BおよびCは、それぞれ、3649-TMおよび3649-3M Fc変異体抗CD19抗体の存在下で抗IgM(1μg/ml)/CpG(2μg/ml)で刺激されたB細胞のCFSEプロフィールを示す。CFSEプロフィールは、それぞれ、3649-TMおよび3649-3M Fc変異体抗CD19抗体の存在下で刺激されたB細胞の44.8％および30.3％が、4日間の長さのインキュベーション期間に少なくとも1回の細胞分裂を受けたことを示す。3つ全部のCFSEプロフィールのより近い検査は、少なくとも1回の分裂を受ける細胞数だけでなく、2回以上の分裂を受ける細胞数も、それぞれ、R347および3649-3Mの存在下で認められる最高および最低の細胞増殖に落ち込むことを示している。3649-TMを用いる処理は、3649-3Mを用いる処理よりもあまり効率よく細胞増殖を阻害しなかった。
【０７６５】
精製されたB細胞を、5μg/mlのR347、R347-3M Fc変異体、3649、3649-3M Fc変異体、または3649-TM Fc変異体抗体の存在下で抗IgM(5μg/ml)/CpG(1μg/ml)で4日間刺激した。細胞増殖をCFSEアッセイを用いて評価する。R347の存在下で刺激されたB細胞のCFSEプロフィールは、参照標準として全てのパネルに含まれる。R347-3M Fc変異体、3649、3649-3M Fc変異体、および3649-TM Fc変異体抗体の存在下で刺激されたB細胞のCFSEプロフィールを、パネルA〜Dに示す。R347-3M Fc変異体の存在下での細胞増殖は、R347参照標準の存在下で認められるものと同じである。細胞増殖は、3種全ての抗CD19抗体により阻害される。野生型3649および3649-TM Fc変異体抗体は、同じ程度まで細胞増殖を阻害した。3649-3Mは、3649または3649-TM抗体よりもB細胞増殖の阻害において有効であった。
【０７６６】
抗CD19および抗Fcγ受容体IIB(FcγRIIbまたはCD32b)抗体の阻害的相乗作用：以下の実験設計は、B細胞増殖の抗CD32bおよび抗CD19抗体を介する阻害の間に相乗的相互作用が存在するかどうかをさらに試験する。精製されたB細胞を、(i)抗CD32b抗体(例えば、AT10)、(ii)抗CD19抗体または(iii)抗CD32bおよびCD19抗体の両方の存在下で抗IgM(2μg/ml)/CpG(2μg/ml)で4日間刺激することができる。細胞増殖をCFSEアッセイを用いて評価することができる。B細胞増殖の抗CD32bおよび抗CD19抗体を介する阻害の間の相乗作用は、抗体のみの存在下で認められる細胞増殖よりも両抗体の存在下でより少ないB細胞増殖を誘導すると予想される。
【０７６７】
13.6. 抗CD19抗体は効率的に内在化される
抗体内在化アッセイ：細胞を、37℃で最大で60分間、5μg/mlのAlexa Flour 488標識抗体と共にインキュベートする。細胞のアリコートを10分間隔で取り出し、洗浄し、2つの部分に分割し、氷上に置く。半分のアリコートを未処理のまま氷上に放置する。第2の半分のアリコートを、0.03 Mスクロースおよび10％FCSを含む低いpH(2.0)のPBS溶液で45秒間、氷上で処理して、全ての細胞表面に結合した抗体分子を除去する。酸処理されたサンプルおよび未処理のサンプルの両方を洗浄し、4％パラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメーター上で分析する。内在化された抗体(％)を、酸で洗浄された細胞の蛍光シグナル(内部シグナルのみ)と未処理の細胞の蛍光シグナル(細胞表面および内部区画に由来する全シグナル)の比として算出する。
【０７６８】
図44は、60分間にわたるRaji細胞によるHB12B、3649、および16C4抗体の内在化を示す。内在化曲線は、抗CD19取込みが約20〜30分で最大に達することを示している。最大内在化は、HB12Bおよび3649抗体については約50％、16C4抗体については約30％である。
【０７６９】
13.7. 抗CD19抗体処理の24時間後の細胞表面からのCD19の喪失
細胞を、抗CD19抗体の存在下で24時間インキュベートする。対照細胞集団を、無関係の特異性のR347抗体の存在下でインキュベートする。インキュベーション後、細胞を収穫し、洗浄し、5μg/mlの抗CD19抗体を含む染色溶液中で10分間、氷上でインキュベートする。表面結合した抗CD19抗体を、該細胞をPE結合ヤギ抗ヒトIgG二次抗体で10分間染色することにより検出する。免疫染色された細胞を4％パラホルムアルデヒド中で固定し、フローサイトメーター上で分析する。CD19表面喪失を、抗CD19抗体処理された細胞の平均蛍光強度(MFI)を、免疫染色されたR347処理細胞(0％の表面喪失)および二次抗体のみで染色されたR347処理細胞(100％の表面喪失)のMFIと比較することにより算出する。
【０７７０】
図45は、5μg/mlの3649、3649-3M、3649-TM、3648-aFuc、および16C4抗CD19抗体の存在下で24時間インキュベートした後のRaji細胞および一次B細胞上でのCD19表面喪失を示す。抗CD19抗体を用いる処理後に、CD19表面発現の55〜70％および65〜90％の喪失が、それぞれ、Raji細胞および一次B細胞中で検出される。
【０７７１】
当業者であれば、日常的な実験に過ぎないものを用いて、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認することができるであろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲により包含されることが意図される。
【０７７２】
種々の刊行物が本明細書で引用されているが、その開示はあらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。2006年9月8日に出願された米国特許仮出願第60/842,935号、2006年11月22日に出願された第60/866,917号、2007年4月12日に出願された第60/911,397号、2007年5月1日に出願された第60/915,309号、2007年5月22日に出願された第60/939,429号の開示は、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０７７３】
前記発明を明確に理解するために例示および実施例によりいくらか詳細に説明してきたが、特定の変化および改変を添付の特許請求の範囲内で実施することができることが明らかであろう。
【０７７４】
0005401314.tif 000038
0005401314.tif 000039
【図１】
0005401314.tif 000040
【図２】
0005401314.tif 000041
【図３】
0005401314.tif 000042
【図４】
0005401314.tif 000043
【図５Ａ】
0005401314.tif 000044
【図５Ｂ】
0005401314.tif 000045
【図６】
0005401314.tif 000046
【図７】
0005401314.tif 000047
【図８−１】
0005401314.tif 000048
【図８−２】
0005401314.tif 000049
【図９】
0005401314.tif 000050
【図１０−１】
0005401314.tif 000051
【図１０−２】
0005401314.tif 000052
【図１１−１】
0005401314.tif 000053
【図１１−２】
0005401314.tif 000054
【図１２−１】
0005401314.tif 000055
【図１２−２】
0005401314.tif 000056
【図１３】
0005401314.tif 000057
【図１４】
0005401314.tif 000058
【図１５】
0005401314.tif 000059
【図１６−１】
0005401314.tif 000060
【図１６−２】
0005401314.tif 000061
【図１７−１】
0005401314.tif 000062
【図１７−２】
0005401314.tif 000063
【図１７−３】
0005401314.tif 000064
【図１７−４】
0005401314.tif 000065
【図１８】
0005401314.tif 000066
【図１９】
0005401314.tif 000067
【図２０】
0005401314.tif 000068
【図２１】
0005401314.tif 000069
【図２２】
0005401314.tif 000070
【図２３】
0005401314.tif 000071
【図２４Ａ】
0005401314.tif 000072
【図２４Ｂ】
0005401314.tif 000073
【図２５】
0005401314.tif 000074
【図２６】
0005401314.tif 000075
【図２７】
0005401314.tif 000076
【図２８−１】
0005401314.tif 000077
【図２８−２】
0005401314.tif 000078
【図２９】
0005401314.tif 000079
【図３０】
0005401314.tif 000080
【図３１−１】
0005401314.tif 000081
【図３１−２】
0005401314.tif 000082
【図３２】
0005401314.tif 000083
【図３３−１】
0005401314.tif 000084
【図３３−２】
0005401314.tif 000085
【図３３−３】
0005401314.tif 000086
【図３４】
0005401314.tif 000087
【図３５−１】
0005401314.tif 000088
【図３５−２】
0005401314.tif 000089
【図３６】
0005401314.tif 000090
【図３７】
0005401314.tif 000091
【図３８−１】
0005401314.tif 000092
【図３８−２】
0005401314.tif 000093
【図３８−３】
0005401314.tif 000094
【図３８−４】
0005401314.tif 000095
【図３８−５】
0005401314.tif 000096
【図３８−６】
0005401314.tif 000097
【図３８−７】
0005401314.tif 000098
【図３９−１】
0005401314.tif 000099
【図３９−２】
0005401314.tif 000100
【図４０】
0005401314.tif 000101
【図４１−１】
0005401314.tif 000102
【図４１−２】
0005401314.tif 000103
【図４２】
0005401314.tif 000104
【図４３】
0005401314.tif 000105
【図４４】
0005401314.tif 000106
【図４５】
0005401314.tif 000107
【配列表】
0005401314000001.app