(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダプトマイシンを精製する方法であって、以下の工程：
ａ）  発酵ブロス中で、ｎ−デカン酸の供給によりＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓを発酵させて、ダプトマイシンを産生する工程、
ｂ）  該発酵ブロスを浄化して、浄化した溶液を得る工程、
ｃ）  該浄化した溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、濃縮されたダプトマイシン調製物を得る工程、
ｄ）  酸を使用して、該濃縮したダプトマイシン調製物をｐＨ２．５〜５．０に調整し、ミセルを形成させる工程、
ｅ）  該濃縮したダプトマイシン調製物をＨＰ−２０ｓｓ樹脂と接触させ、半精製したダプトマイシン調製物を得る工程であって、ここで、工程ｅ）の疎水性相互作用クロマトグラフィーの間に、ｐＨ３．５〜６．５で３０〜４０％イソプロピルアルコールを用いた溶出により、ダプトマイシンミセルがｐＨ６．０〜７．５でダプトマイシンモノマーに解離し、
ｆ）  該半精製ダプトマイシン調製物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、精製されたダプトマイシンを得る工程
を含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記工程ａ）におけるｎ−デカン酸の供給を調節して、発酵の間にｎ−デカン酸の残留濃度が５０ｐｐｍ（百万分の１）を越えないことを達成する、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記工程ｂ）における浄化の工程が、濾過または遠心分離、およびデプスフィルタレイション（ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を含む、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記工程ｃ）における陰イオン交換クロマトグラフィーがＦＰ−ＤＡ  １３樹脂上で実施される、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記工程ｆ）における陰イオン交換クロマトグラフィーがＦＰ−ＤＡ  １３樹脂上で実施される、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記工程ｆ）における陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して、前記工程ｂ）からの溶媒レベルを減少させる、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、ここで該方法が連続フロークロマトグラフィーを介して実施される、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、ダプトマイシンを濾過する工程または濃縮する工程をさらに含む、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、限外濾過を使用してダプロマイシンを発熱物質除去化する工程をさらに含む、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、ここで前記の発熱物質除去が以下の工程：
ｉ）ダプトマイシンがモノマー状態および非ミセル状態である条件化で該ダプトマイシン溶液を提供する工程；
ｉｉ）該ダプトマイシンはフィルターを通過するが、発熱物質は該フィルターを通過しない条件化で該ダプトマイシン溶液を濾過する工程；
ｉｉｉ）該ダプトマイシン溶液を、ダプトマイシンの凝集物が形成される条件化に置く工程；
ｉｖ）該ダプトマイシン凝集物がフィルター上に残留する条件化で、ダプトマイシン凝集物を濾過する工程；
ｖ）該ダプトマイシン凝集物を収集する工程
を含む、方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法であって、ダプトマイシンを凍結乾燥する工程をさらに含む、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記工程ｂ）の浄化工程が、精密濾過または遠心分離を含む、方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、ダプトマイシンを濾過し、濃縮する工程をさらに含む、方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、工程ｄ）で得られた濃縮ダプトマイシンを、限外濾過によって、低分子量物質から分離する工程をさらに含む、方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法であって、前記ダプトマイシンを発熱物質除去化する工程をさらに含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポペプチド（ダプトマイシン（グラム陽性細菌（従来の抗生物質に耐性の株を含む）に対する強力な殺菌活性を有するリポペプチド抗生物質）を含む）の高度に精製された形態に関する。本発明はまた、リポペプチドの高度に精製された形態を調製するためのプロセスに関する。本発明はさらに、リポペプチドのミセルに関する。本発明はまた、リポペプチドミセルの薬学的組成物およびこれらの組成物を使用する方法に関する。本発明はまた、リポペプチドの非会合モノマーからリポペプチドミセルを作製する方法、およびリポペプチドミセルを非会合モノマーに変換するための方法に関する。本発明はまた、商業的産生のために容易に拡大される、ミセルを使用してリポペプチドを調製するためのプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
グラム陽性感染（抗生物質耐性細菌によって引き起こされる感染を含む）の発生率の急速な増加は、新規クラスの抗生物質の開発における新たな関心を引き起こした。１つのこのようなクラスは、リポペプチド抗生物質であり、これには、ダプトマイシンが含まれる。ダプトマイシンは、重篤かつ生命を脅かす疾患を引き起こす臨床的に関連するグラム陽性細菌に対する、インビトロでの強力な殺菌活性を有する。これらの細菌としては、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、糖ペプチド中間体感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ（ＧＩＳＡ）、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣＮＳ）およびペニシリン耐性Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＰＲＳＰ）のような耐性病原体が挙げられ、これらに対しては、ほとんど治療用代替物が存在しない。例えば、Ｔａｌｌｙら、１９９９、Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ８：１２２３−１２３８（本明細書以降「Ｔａｌｌｙ」）を参照のこと。ダプトマイシンの阻害効果は、インビトロおよびインビボにおける、迅速な濃度依存性殺菌効果であり、そしてインビボでの比較的長期の濃度依存性の後期抗生物質（ｐｏｓｔ−ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ）効果である。
【０００３】
ダプトマイシンは、Ｂａｌｔｚ（ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，第２版、Ｗ．Ｒ．Ｓｔｒｏｈｌ編（ＮｅｗＹｏｒｋ：ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、１９９７、４１５−４３５頁（本明細書中以降「Ｂａｌｔｚ」））によって記載される。ダプトマイシン（ＬＹ１４６０３２としても公知である）は、環状リポペプチド抗生物質であり、これは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓの発酵から誘導され得る。ダプトマイシンは、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓの因子Ａ−２１９７８Ｃ０型抗生物質のメンバーであり、そして環状１３アミノ酸ペプチドのＮ末端トリプトファンに連結されたデカノシル側鎖から構成される（図１）。ダプトマイシンは、以下に起因して、優れた活性プロフィールを有する：これは、ほとんどのグラム陽性細菌に対して非常に効果的である；これは、非常に殺菌性かつ即効性である；これは、低い耐性率を有しかつ抗生物質耐性生物に対して効果的である。この化合物は、現在、細菌（メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）およびバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）を含むが、これらに限定されない）によって引き起こされる重篤な感染を処置するための種々の処方物において開発されている。
【０００４】
多くの米国特許は、Ａ−２１９７８Ｃ抗生物質およびそれらの誘導体（ダプトマイシン（ＬＹ１４６０３２）を含む）、ならびにＡ−２１９７８Ｃ抗生物質およびそれらの誘導体を生成および単離する方法を記載する。
【０００５】
米国特許再発行第３２，３３３号、同第３２，４５５号および米国特許第４，８００，１５７号は、水中の好気発酵条件下でＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓＮＲＬ１５９９８を培養することによる、ダプトマイシンを合成する方法を記載する。米国特許第４，８８５，２４３号は、発酵培養物にデカン脂肪酸あるいはそのエステルまたは塩を供給することによる、ダプトマイシンを合成する改善された方法を記載する。
【０００６】
米国特許再発行第３２，３１０号、同第３２，３１１号、米国特許第４，５３７，７１７号、同第４，４８２，４８７号および同第４，５２４，１３５号は、Ａ−２１９７８Ｃ抗生物質を脱アシル化し、そしてペプチド核およびこのプロセスによって作製された抗生物質誘導体を再アシル化する方法を記載する。これらの全ての特許は、精製脱アシル化Ａ−２１９７８Ｃ抗生物質核またはその誘導体を記載し、これらは、濾過によって発酵ブロスから単離され、次いで、ＤｉａｉｏｎＨＰ−２０カラムクロマトグラフィーおよびシリカゲル／Ｃ１８クロマトグラフィーによって精製されている。
【０００７】
米国特許再発行第３２，３３３号および同第３２，４５５号は、全発酵ブロスの濾液を多くの沈殿および抽出工程を通して精製し、粗Ａ−２１９７８Ｃ複合体を得る、精製方法を開示する。この粗複合体は、ＩＲＡ−６８でのイオン交換クロマトグラフィーおよび２回のシリカゲルクロマトグラフィーによってさらに精製された。個々のＡ−２１９７８Ｃ因子は、逆相シリカゲルまたはシリカゲル／Ｃ１８によって分離された。米国特許再発行第３２，３３３号および同第３２，４５５号はまた、Ａ−２１９７８Ｃが、ＤｉａｉｏｎＨＰ−２０樹脂を使用するバッチカラムクロマトグラフィー、それに続く、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、精製され得ることもまた開示する。
【０００８】
米国特許第４，８７４，８４３号は、発酵ブロスを濾過しそしてＨＰ−２０樹脂を含むカラムに通す、ダプトマイシン精製方法を記載する。溶出後、半精製ダプトマイシンは、ＨＰ−２０ｓｓを含むカラムに通され、次いで、ＨＰ−２０樹脂で再度分離された。‘８４３特許は、この方法による構造的に類似の化合物からのダプトマイシンの最終的な分割および分離が、発酵ブロスの紫外線分析によって同定されない不純物の存在によって妨げられることを記載する。‘８４３特許はさらに、シリカゲルでの逆相クロマトグラフィー、シリカゲルでの順相（ｎｏｒｍａｌｐｈａｓｅ）クロマトグラフィー、またはイオン交換クロマトグラフィーによってこれらの不純物を除去するための試みもまた、ダプトマイシンの純度を有意に改善しなかったことを記載する。‘８４３特許はまた、精製のための「逆方法（ｒｅｖｅｒｓｅｍｅｔｈｏｄ）」を開示する。この方法は、水相中で発酵生成物の水溶液に非官能性樹脂を接触させる工程、この荷電した樹脂から水を物理的に除去する工程、この荷電した樹脂を極性の有機溶媒で再度湿潤させる工程、この樹脂をこの有機溶媒で洗浄する工程、この溶媒の極性を増加することによってこの樹脂から発酵生成物を溶出する工程、および発酵生成物を回収する工程を包含する。‘８４３特許は、この方法が、最終純度を約８０％〜約９３％に改善し、収率を約５％〜約３５％に増加することを教示するが；‘８４３特許は、ダプトマイシン調製物中に存在する不純物の型を開示していない。
【０００９】
米国特許第５，９１２，２２６号は、ダプトマイシンの製造中に生成される２つの不純物の同定および単離を記載する。ダプトマイシン（α−アスパルチルペプチド）は、ペプチド転移されて、安定な中間体を形成し、ここで、アスパルチル基は、無水スクシンイミド基となる（図３）。‘２２６特許は、この中間体（無水ダプトマイシンと呼ばれる）の存在が、ｐＨ４〜６でより顕著であることを教示する。無水スクシンイミド形態の再水和は、第２の分解性生物を生じ、これは、β−アスパルチル基を含み、そしてダプトマイシンのβ−異性体形態と呼ばれる（図２）。
【００１０】
‘２２６特許は、無水ダプトマイシンのｔ−ＢＯＣ誘導体が、逆相シリカゲル／Ｃ−１８カラムでのクロマトグラフィーによって単離され、沈殿され、そして逆相シリカゲル／Ｃ−１８クロマトグラフィーによって再精製され得ることを開示する。‘２２６特許はまた、ダプトマイシンのβ−異性体形態が、ＤｉａｉｏｎＨＰ−２０ｓｓ樹脂でのクロマトグラフィーによって精製され、ＤｉａｉｏｎＨＰ−２０樹脂でのクロマトグラフィーによって脱塩され、そして逆相Ｃ−１８カラム、その後の逆様式でのＨＰ−２０樹脂カラムを使用してさらに精製され得ることを教示する。
【００１１】
Ｋｉｒｓｃｈら（ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ，６：３８７−３９３，１９８９，本明細書中以降「Ｋｉｒｓｃｈ」）は、無水ダプトマイシンおよびそのβ−異性体がダプトマイシンの精製中に生成されたことを述べた。Ｋｉｒｓｃｈは、ｐＨ条件および温度条件の操作を介して無水ダプトマイシンおよびβ−異性体のレベルを最小化する方法を記載した。しかし、Ｋｉｒｓｃｈは、ダプトマイシンを安定化しそして無水ダプトマイシンへのダプトマイシンの変換およびβ−異性体へのその後の異性化を妨げることができなかった。Ｋｉｒｓｃｈはまた、無水ダプトマイシンおよびβ−異性体に無関係の他の分解生成物へのダプトマイシンの分解を妨げることができなかった。
【００１２】
‘２２６特許は、これらの手順を使用して、合わせた総量で２．５重量％以上の無水ダプトマイシンおよびβ−異性体を含まないダプトマイシンが調整し得ることを記しているが、他の不純物のレベルについては何ら言及していない。米国特許第４，８７４，８４３号に教示される方法において、および臨床試験のためのダプトマイシンのラージスケール調製物において、観察された最も高いダプトマイシン純度レベルは、約９０％〜９３％であった。より高度に精製されたダプトマイシンを生成するため、そして可能であるなら、精製後の収率を増加するための、商業的に実現可能な方法の必要性が存在する。さらに、無水ダプトマイシンおよびダプトマイシンのβ−異性体形態をほとんどまたは全く含まない精製ダプトマイシンを得ることもまた望ましい。ダプトマイシン中の多くの他の不純物のレベルを減少することが望ましい。しかし、ダプトマイシン生成物中の無水ダプトマイシン、β−異性体形態および他の不純物のレベルをさらに減少し得ることが示されている、当該分野で利用可能な方法は存在しない。
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、高レベルの精製リポペプチドを生成するための商業的に実現可能な方法を提供することによって、これらの問題に取り組む。好ましい実施形態において、このリポペプチドは、ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチドである。本発明の１つの実施形態において、９５〜９７％の純度レベルでダプトマイシンを生じる商業的に実現可能な方法が、開示される。本発明の別の実施形態において、ダプトマイシンの調製物中の主要な不純物である無水ダプトマイシンおよびβ−異性体ならびに他の不純物をほぼ完全に排除する商業的に実現可能な方法が、開示される。本発明の別の実施形態において、リポペプチド（ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチドを含む）を精製するための商業的に実現可能な方法が開示され、この方法は、低分子量の混入物からリポペプチドミセルを分離する工程、および高分子量の混入物から非会合リポペプチドを分離する工程を包含する。本発明はまた、ダプトマイシンの純度を分析し、そしてダプトマイシン中の他の不純物（これらのいくつかは以前には知られていなかった）を検出および特徴付ける、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）方法を提供する。
【００１４】
本発明はまた、少なくとも９８％の純度を有するか、あるいは無水ダプトマイシンおよびβ−異性体を実質的または本質的に含まない、精製ダプトマイシンを提供する。本発明は、無水ダプトマイシンを含まないかまたは本質的に含まず、かつ先行技術においては以前に得られていたよりもはるかに低レベルのβ−異性体および他の混入物しか含まない、精製ダプトマイシンを提供する。本発明はまた、リポペプチドミセルを提供する。好ましい実施形態において、このミセルは、ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチドを含む。本発明はまた、高度に精製されたダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチドのミセルを含む薬学的組成物ならびにこれらの組成物を使用する方法を提供する。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
（発明の目的）
本発明の１つの目的は、容易に商業的生産のスケールにされるリポペプチドを精製するための方法を提供し、これは、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーの独特の組み合わせを含む。好ましい実施形態において、この方法は、９５％より高く純粋であり、かつ先行技術によって調製されるダプトマイシンと比較して減少したレベルの不純物を示す、精製されたダプトマイシンを製造するために使用される。別の好ましい実施形態において、この方法は、先行技術の方法に使用される方法と比較して、減少したレベルの溶媒を使用してダプトマイシンを製造するために使用される。別の好ましい実施形態において、本方法は、９５％より高い純度である、精製されたダプトマイシン関連リポペプチドを製造するために使用される。
【００１６】
本発明の別の目的は、発酵培養物に減少したレベルの脂肪酸を供給することによって、微生物によって産生されるリポペプチドのレベルを増加するための方法を提供することである。米国特許第４，８８５，２４３号におけるダプトマイシン発酵について提案されるレベルよりも低いレベルのデカン酸を使用することによって、高度に純粋な形態のダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチドを産生することに加えて、改善された経済性を生じる。好ましい実施形態にいて、本発明の方法は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓによって生成されるダプトマイシンの濃度および量を増加し、一方、関連する混入物の生成を最小化するために使用される。発酵ブロスにおける低下したレベルの混入物は、ダプトマイシンのより効率的な回収および精製をもたらし、これは、高い収率の製造プロセスを提供する。
【００１７】
本発明の別の目的は、改変緩衝液増強陰イオン交換クロマトグラフィーの使用を含む、ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチドを精製するための方法を提供することである。好ましい実施形態において、本発明の方法は、少なくとも９８％純粋であるかあるいは無水ダプトマイシンまたはβ−異性体を実質的にまたは本質的に含まないダプトマイシンを精製するために使用される。別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、ダプトマイシン関連リポペプチドを少なくとも９８％純粋に精製するために使用される。
【００１８】
本発明の別の目的は、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび改変緩衝液増強陰イオン交換クロマトグラフィーの新規な組み合わせを含む、リポペプチドを精製するためのプロセスクロマトグラフィー方法を提供することである。好ましい実施形態において、このプロセスクロマトグラフィー方法は、ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチドを精製するために使用される。改変緩衝液は、以前の先行技術のクロマトグラフィー方法では可能ではなかった、ダプトマイシンからの無水ダプトマイシンの分離を予想外に可能にする。
【００１９】
本発明の別の目的は、リポペプチドミセルを使用する、容易に商業的生産のスケールにされる、リポペプチドを精製するための方法を提供することである。１つの実施形態において、本発明の方法は、精製手順の間に、リポペプチド溶液をモノマー性非ミセル状態からミセル状態に変換し、再び戻す工程を包含する。好ましい実施形態において、本発明の方法は、リポペプチドをミセルが形成される条件に供し、リポペプチドミセルを低分子量混入物から分離（例えば、サイズ分離技術によって）する工程を包含する。別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、リポペプチドを、リポペプチドがモノマー性形態である条件に供し、そしてモノマー性リポペプチド分子を高分子量分子または凝集物から分離（例えば、サイズ分離技術によって）する工程を包含する。より好ましい実施形態において、本発明の方法は、両方の工程：リポペプチドをミセルが形成される条件に供し、リポペプチドミセルを低分子量混入物から分離する工程、次いで、リポペプチドミセルを、リポペプチドがモノマー性形態である条件に供し、そしてリポペプチドモノマーを高分子量分子または凝集物から分離する工程を包含する。これら２つの工程は、いかなる順序でも実行され得る。なおさらに好ましい実施形態において、サイズ分離技術は、限外濾過またはサイズ排除クロマトグラフィーである。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってリポペプチド（ダプトマイシンを含む）の純度を測定するための改善された方法を提供することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、精製されたリポペプチド（例えば、ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチド）およびその薬学的に受容可能な塩または処方物を提供することである。好ましい実施形態において、本発明は、本明細書中に記載される方法の１つによって精製されたダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチドを提供する。本発明はまた、精製されたリポペプチドまたはその塩の薬学的組成物およびこれらの組成物を投与する方法を提供する。好ましい実施形態において、薬学的組成物は、精製されたダプトマイシンを含む。
【００２２】
本発明の別の目的は、リポペプチドミセルおよびその薬学的に受容可能な処方物を提供することである。好ましい実施形態において、本発明は、ダプトマイシンミセルまたはダプトマイシン関連リポペプチドミセルおよびその薬学的に受容可能な処方物を提供することである。別の実施形態において、本発明はまた、リポペプチドミセルまたはその薬学的処方物を、それが必要な患者に投与する方法を提供する。好ましい実施形態において、リポペプチドミセルは、静脈内的に、非経口的に、筋肉内的に、または局所的に投与される。
【００２３】
（定義）
他に規定されない限り、本明細書中に使用される全ての技術および科学的用語は、本発明が属する当業者によって通常理解される意味を有する。本発明の実行は、他に示されない限り、従来の化学、生化学および微生物学の技術および本明細書中で使用される基礎的な用語法を使用する。
【００２４】
用語「単離された」とは、混合物中に存在する化合物の少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも２０％または３０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％または７０％、そして最も好ましくは少なくとも８０％または９０％を表す化合物を示す化合物または生成物をいう。
【００２５】
用語「リポペプチド」とは、ペプチド部分に共有結合される脂質様部分を含む分子、ならびその塩、エステル、アミドおよびエーテルをいう。用語「リポペプチ ド」はまた、1つ以上のアミノ基、カルボキシレート基またはヒドロキシル基が保護されるリポペプチドの保護された形態を包含する。例えば、保護基の例とし て、例えば、Ｔｈｅｏｄｏｒａ Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅによる「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８１を参照のこと。好ましい実施形態において、リポペプチドは、抗生物質である。別の好ましい実施形態において、リポペプチドは、 ＬＹ３０３３６６、エキノカンジン（ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎｓ）、プネウモカンジン（ｐｎｅｕｍｏｃａｎｄｉｎｓ）、アクレアシン （ａｃｕｌｅａｃｉｎｓ）、サーファクチン（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ）、プリパスタチン（ｐｌｉｐａｓｔａｔｉｎ Ｂ１）、アンホマイシンまたは米国特許第５，６２９，２８８号に開示されるリポペプチド誘導体である。これらのリポペプチドは、当該分野において公知であ る。例えば、米国特許第５，２０２，３０９号および国際ＰＣＴ出願ＷＯ００／０８１９７号を参照のこと。別の実施形態において、リポペプチドは、ダプトマ イシン関連分子（特に、Ａ５４１４５、米国特許第４，５３７，７１７号、同第４，４８２，４８７号、同再発行第３２，３１１号、同再発行第３２，３１０ 号、同第５，９１２，２２６号、米国シリアル番号第０９／５４７，３５７号として現在再発行されているもの、国際ＰＣＴ出願ＷＯ０１／４４２７２、ＷＯ０１／４４２７４およびＷＯ０１／４４２７１（こ れらはすべて、本明細書中で参考として援用される）に開示されるダプトマイシン関連リポペプチド、あるいはダプトマイシンのｎ−デカノイル脂肪酸側鎖が、 ｎ−オクタノイル脂肪酸側鎖、ｎ−ノナノイル脂肪酸側鎖、ｎ−ウンデカノイル脂肪酸側鎖、ｎ−ドデカノイル脂肪酸側鎖、ｎ−トリデカノイル脂肪酸側鎖また はｎ−テトラデカノイル脂肪酸側鎖によって置きかえられているＡ−２１９７８抗生物質を含む）である。ＷＯ０１／４４２７２、ＷＯ０１／４４２７４およびＷＯ０１／４４２７１に 開示されるダプトマイシン関連リポペプチドは、オルニチンまたはキヌリン（ｋｙｎｕｒｉｎｅ）残基またはダプトマイシンの脂肪酸側鎖が改変される合成また は半合成リポペプチドに関する。より好ましい実施形態において、リポペプチドは、ダプトマイシンである。用語ダプトマイシン関連リポペプチドとは、上記化 合物およびその塩をいう。
【００２６】
用語「ダプトマイシン」とは、因子Ａ−２１９７８Ｃ０型抗生物質のｎ−デカノイル誘導体、またはその薬学的に受容可能な塩をいう。「ダプトマイシン」は、ＬＹ１４６０３２と同義である。図１を参照のこと。
【００２７】
用語「無水ダプトマイシン」は、ダプトマイシンのα−アスパルチル基が、無水スクシイミド基にペプチド転移されるダプトマイシン誘導体をいう。図３を参照のこと。
【００２８】
用語「β−異性体」または「ダプトマイシンのβ−異性体」とは、α−アスパルチル基の代わりにβ−アスパルチル基を含むダプトマイシン誘導体をいう。図２を参照のこと。
【００２９】
ダ  プトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチドは、サンプルの少なくとも９５％が、ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチドである場合、「実質的に純粋」である。好ましくは、ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチドは、サンプルの少なくとも９７％が、ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチドである場合、「実質的に純粋」である。
【００３０】
ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチドは、サンプルの少なくとも９８％が、ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチドである場合、「本質的に純粋」である。好ましくは、ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチドは、サンプルの少なくとも９９％が、ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチドである場合、「本質的に純粋」である。
【００３１】
ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチドは、他の化合物がダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチド調製物の量の１％以下の量で存在する場合、別の化合物を「実質的に含まない」。
【００３２】
ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチドは、他の化合物がダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチド調製物の量の０．５％以下の量で存在する場合、別の化合物を「本質的に含まない」。
【００３３】
ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチドは、他の化合物がダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチド調製物の量の０．１％以下の量で存在する場合、別の化合物を「含まない」。あるいは、別の化合物が、検出の限界がダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチド調製物の量の約０．０５％以下である、最大感度の条件下でＨＰＬＣによって検出され得ない場合、ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチドは、別の化合物を「含まない」。例示的なＨＰＬＣ方法は、本明細書中に記載される（表１および２）。
【００３４】
「精製された」ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチドとは、実質的に純粋なダプトマイシンもしくはダプトマイシン関連リポペプチド、本質的に純粋なダプトマイシンもしくはダプトマイシン関連リポペプチド、またはその塩、あるいは、別の化合物を実質的に含まないか、本質的に含まないか、または含まないダプトマイシンもしくはダプトマイシン関連リポペプチド、またはその塩をいう。
【００３５】
「部分的に精製された」ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチドとは、９０％未満の純度である、ダプトマイシン、ダプトマイシン関連リポペプチド、またはこれらの塩のことをいう。
【００３６】
ダプトマイシン、ダプトマイシン関連リポペプチド、または別のリポペプチドの純度とは、薬学的組成物中への処方の前の、リポペプチドのことをいう。この純度は、任意の手段（核磁気共鳴（ＮＭＲ）、ガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）、または微生物学的検定法を含む）により測定され得る。ダプトマイシンの純度を測定するための好ましい手段は、分析用高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による手段である。
【００３７】
用語「ミセル」とは、両親媒性分子の凝集体のことをいう。水性媒質中で、この凝集体の分子の親油性ドメインはミセルの内側に向かって配向し、そして親水性ドメインは媒質と接触する。ミセル構造としては、球、層（ｌａｍｉｎａｒ）、円柱、楕円、小胞（リポソーム）、層（ｌａｍｅｌｌａｒ）、および液晶が挙げられるが、これらに限定されない。図１４を参照のこと。
【００３８】
用語「混合ミセル」とは、ミセルが１つより多い型の両親媒性分子を含む、特定のミセル型のことをいう。本発明の状況において、混合ミセルは、リポペプチドおよび別のリポペプチドであり得る、少なくとも１つの他の両親媒性分子を含む。混合ミセルは、少なくとも１０重量％のリポペプチドを含む。他の実施形態では、混合ミセルは、少なくとも、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％のリポペプチドを含む。
【００３９】
用語「ミセル溶液」とは、重量で測定して、溶液中の、リポペプチド分子の５０％より多くが、ミセル中に存在する溶液のことをいう。好ましくは、分子の、少なくとも、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％が、ミセル中に存在する。ミセル溶液は、１０，０００ダルトンの見かけの分子量（ＮＭＷ）カットオフ値を有する限外濾過膜に保持される。
【００４０】
用語「臨界ミセル濃度」（ｃｍｃ）とは、分子の特定の濃度のことをいい、これは、温度、塩濃度、ならびに両親媒性分子の性質および型に依存する。ｃｍｃを超えると、非会合モノマーとミセルが、平衡状態で存在する。
【００４１】
用語「モノマー」とは、凝集体の一部ではなく、単一の分子として存在する両親媒性分子のことをいう。本発明の状況において、用語モノマーは、非会合リポペプチドのことをいう。
【００４２】
用語「モノマー溶液」とは、重量で測定して、リポペプチド分子の５０％より多くが、モノマーとして存在する溶液のことをいう。好ましくは、少なくとも、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％が、モノマーとして存在する。モノマー溶液は、１０，０００ダルトンのＮＭＷカットオフ値を有する限外濾過膜に保持されずに、この膜を通過する。
【００４３】
用語「低イオン強度緩衝液」とは、５０ｍＭ未満の塩濃度を有する溶液のことをいい；用語「中イオン強度緩衝液」とは、５０〜２５０ｍＭの間の塩濃度を有する溶液のことをいい；「高イオン強度緩衝液」とは、２５０ｍＭを超える塩濃度を有する溶液のことをいう。
【００４４】
（精製したリポペプチドを産生するための方法）
本発明の１つの実施形態は、商業的に実現可能な様式で、精製したリポペプチドを生産する、プロセスクロマトグラフィー（ｐｒｏｃｅｓｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）法に関する。好ましい実施形態では、リポペプチドは、ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチドである。プロセスクロマトグラフィー法は、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、および陰イオン交換クロマトグラフィーを順次用いて、リポペプチド（例えば、ダプトマイシン、またはダプトマイシン関連リポペプチド）を含む調製物を精製する工程を包含する。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態では、この精製法は、さらに、ダプトマイシン産生を増加させ、そしてＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ発酵培養物により産生される不純物および関連夾雑物を減少させるために、Ａ２１９７８Ｃ含有粗生成物が、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓにより産生される発酵条件を変化させる工程を包含する。
【００４６】
プロセスクロマトグラフィー法の好ましい実施形態を以下に記載する：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓを、発酵の全収率を減少させることなく可能な限り低いレベルにｎ−デカン酸の供給を維持する変更を用いて、米国特許第４，８８５，２４３号に開示されるように、ｎ−デカン酸の供給を用いて発酵させる。好ましい実施形態では、残余のデカン酸は、好気性発酵の間に、５０ｐｐｍ未満に維持される。より好ましい実施形態では、残余のデカン酸は、好気性発酵の間に１〜２０の間に維持される。さらにより好ましい実施形態では、残余のデカン酸は、好気性発酵の間に約１０ｐｐｍに維持される。好ましい実施形態では、残余のデカン酸の濃度を、発酵の間中測定し、そしてデカン酸の供給レベルは、好ましいパラメーター内に残余のデカン酸レベルを継続的に維持するように調整される。先行技術は、低レベルの不純物を含むダプトマイシンの最適な発現を達成するために必要とされる、インサイチュでの、規定されかつ低い、一定の残余のドデカン酸濃度を記載していない。
【００４７】
発酵後、細胞外溶液を、発酵ブロスから菌糸体を取り除くことにより、清澄化する。発酵物から菌糸体を取り出すことは、任意の標準的な分離技術（例えば、遠心分離または精密濾過）により行われる。好ましい実施形態では、発酵ブロスは、精密濾過により（例えば、ＰａｌｌＳｅｐＴＭ膜システムにより）清澄化される。より好ましい実施形態では、発酵ブロスを、工業用遠心分離機（例えば、ＷｅｓｔｆａｌｉａＴＭ遠心分離機）を用いて清澄化し、次いで、仕上げの深層濾過を行う。他のデバイス（例えば、フィルタープレス、回連ドラムフィルター、またはディスポーザブルデプスフィルター）を発酵ブロスから菌糸体を取りだすために用いて、大スケールのカラムクロマトグラフィーに適した清澄化したブロスを産生し得る。
【００４８】
別の実施形態では、ダプトマイシンは、溶媒分離遠心分離機またはフィルターでの清澄化の前に、有機溶媒（例えば、ブタノール）を用いることにより、菌糸体発酵物から直接的抽出され得る。４つ以上の炭素を有する任意のアルコールが、本実施形態に従う抽出に用いられ得る。好ましい溶媒は、ｎ−ブタノールである。有機溶媒の使用は、ダプトマイシンの純粋な水性分離に匹敵するダプトマイシンの最初の追加精製を生じる。例えば、ｎ−ブタノールを１０％を超える濃度で用いる場合、およびこのプロセスを、ｎ−ブタノールが分離相を（例えば、４〜５のｐＨ値（この値は、ダプトマイシンの等電点付近である）で）形成する条件下で行う場合、ダプトマイシンはｎ−ブタノール中に分配する（実施例４を参照のこと）。
【００４９】
別の実施形態では、ダプトマイシンは、固定された反応容器中で産生される。この反応容器は、エネルギー源（好ましくは、糖）、基本成分（例えば、アミノ酸およびアンモニア）、ならびにデカン酸を用いる、ダプトマイシンの非発酵産生のために、前もって活性化した菌糸体を使用する。次いで、固定された酵素反応容器中でのダプトマイシンの産生は、本明細書中に記載される方法により処理される。
【００５０】
発酵ブロスの清澄化の後、ダプトマイシンのレベルは、陰イオン交換クロマトグラフィーにより、清澄化溶液中において高められる（すなわち、濃縮される）。清澄化溶液は、初めに、ほとんどまたは全てのダプトマイシンが、陰イオン交換樹脂に結合する条件下で、陰イオン交換樹脂と接触される。結合後、樹脂を、適切なイオン水性緩衝液を用いて洗浄して、非結合物質およびダプトマイシン不純物のいくらかを取り除く。最終的に、樹脂に結合した、精製されたダプトマイシンは、ダプトマイシンがこの樹脂から解離する条件下で溶出される。
【００５１】
結合工程、洗浄工程、および溶出工程は、当該分野で公知の緩衝液および方法を用いて、本明細書中に従って行われ得る。例えば、溶出は、洗浄緩衝液と比較して高められた塩濃度を有する緩衝液、洗浄緩衝液と比較してより低いｐＨを有する緩衝液、または洗浄緩衝液よりもより高い塩濃度およびより低いｐＨを有する緩衝液を用いて行われ得る。好ましい実施形態では、ダプトマイシンは、中性から塩基性であるｐＨで、追加の塩を含まないかまたは低塩濃度を含む緩衝溶液中で平衡化された陰イオン交換樹脂に結合される。充填した樹脂を、３カラムベット容量の水を用いて洗浄し、次いで、３０〜６０ｍＭＮａＣｌを含む、３〜６ベット容量の中間塩緩衝液（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓａｌｔｂｕｆｆｅｒ）を用いて洗浄する。ダプトマイシンは、１〜３カラム容量の、３００〜５００ｍＭＮａＣｌを含む、高められた塩および／またはより低いｐＨの緩衝液を用いて、カラムから溶出される。高濃度の塩化ナトリウムおよび代替塩（例えば、塩化カリウム）もまた、樹脂からダプトマイシンを溶出する。好ましい実施形態では、速い流速の陰イオン交換樹脂が用いられる。より好ましい実施形態では、ＦＰ−ＤＡ１３樹脂（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）が用いられる。
【００５２】
陰イオン交換クロマトグラフィーは、カラムクロマトグラフィーにより行われ得るか、またはバッチ法で達成され得る。商業的産生のために、バッチ様式を用いることが好適であり得る。陰イオン交換樹脂を洗浄して、段階的な塩の勾配または連続的な塩の勾配を用いて溶出してもよい。適切な段階的なまたは連続的な塩の勾配は、夾雑物からのダプトマイシンの分離を可能にする任意の勾配である。好ましい実施形態では、連続的な塩の勾配は、０〜１０００ｍＭのＮａＣｌの範囲にある勾配である。より好ましい実施形態では、連続的な塩の勾配は、１００〜５００ｍＭＮａＣｌまたは０〜４００ｍＭＮａＣｌの範囲にある勾配である。ラジアルフロー（ｒａｄｉａｌｆｌｏｗ）クロマトグラフィーもまた、米国特許第５，７５６，６８０号、同第４，８６５，７２９号、同第４，８４０，７３０号、または同第４，７０８，７８２号に記載されるように用いられ得る。
【００５３】
陰イオン交換クロマトグラフィーの後、ダプトマイシン調製物は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によりさらに精製される。この工程の１つの実施形態は、米国特許第４，８７４，８４３号（本明細書中で参考として援用される）に記載される。溶出した水性ダプトマイシン調製物は、ほとんどまたは全てのダプトマイシンが、樹脂に結合する条件下で、ＨＩＣ樹脂と接触される。ダプトマイシン担荷（ｌｏａｄｅｄ）樹脂の含水量は、樹脂を、高めた濃度の無極性溶媒と接触させることにより、減少する。この樹脂は、不純物が、ダプトマイシンが結合したままの樹脂から解離する条件下で、適切な極性有機溶媒を用いて洗浄される。最終的に、ダプトマイシン調製物は、ダプトマイシンが樹脂から解離する条件下で、溶出される。一般に、ダプトマイシンは、洗浄緩衝液よりも、より低い極性（より高い極性溶媒レベル）および／またはより高いｐＨを有する溶媒含有緩衝液を用いて溶出される。
【００５４】
好ましい実施形態では、ＨＩＣのための無官能性樹脂は、小粒子のＨＰ−２０ｓｓ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）である。結合したダプトマイシンは、有機相溶媒（例えば、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、ブタノール、または他の適切な溶媒を含む溶媒）を用いてＨＰ−２０ｓｓ樹脂から、特異的に取出される。より好ましい実施形態では、ダプトマイシンを、ＨＰ２０ｓｓ樹脂に結合させる。このＨＰ−２０ｓｓ樹脂は、１０％アセトニトリルまたは等極性溶媒（例えば、イソプロピルアルコール）を含む酢酸緩衝液中で平衡化されている。ダプトマイシン担荷樹脂を、少なくとも３カラムベット容量の平衡化緩衝液を用いて洗浄する。ダプトマイシン担荷樹脂は、非溶出濃度の極性溶媒を含む、３〜６ベット容量の酢酸洗浄緩衝液を用いて洗浄することにより、不純物をさらに開放する。好ましい実施形態では、ダプトマイシン担荷樹脂を、３０％アセトニトリルまたは４５％イソプロピルアルコールを用いて洗浄する。このダプトマイシン担荷樹脂を、３５％以上のアセトニトリル、または５０％を超えるイソプロピルアルコールを含む、１〜３ベット容量の酢酸緩衝液を用いて溶出させる。好ましい実施形態では、ダプトマイシンを、ｐＨ４．５〜５．０で、３５％のアセトニトリルを用いて溶出させるか、または５５〜６０％のイソプロピルアルコールを用いて溶出させる。別の実施形態では、ダプトマイシン担荷樹脂を、高められたｐＨで、１〜３ベット容量の緩衝液を用いて溶出させる。この実施形態では、緩衝液のｐＨは、電荷の差に起因して、異なる速度でカラムから異なる化合物を溶出するように、漸増される。高められたｐＨ（例えば、ｐＨ６．０〜７．０）では、アセトニトリルの溶出濃度は、１０〜２０％まで減少される。同様に、高められたｐＨ（例えば、６．０〜７．０）では、イソプロピルアルコールの溶出濃度は、２０〜２５％まで減少される。クロマトグラフィーが行われる温度の制御もまた、溶媒濃度に影響する。より低い温度（すなわち、冷蔵条件下）での溶出は、全てのｐＨ条件で高められたレベルの溶媒を必要とする。
【００５５】
ＨＩＣの後、ダプトマイシン調製物中の有機溶媒を、陰イオン交換クロマトグラフィーによって減少させた。好ましい実施形態において、ＦＰ−ＤＡ１３を、上記で議論されたように使用した。
【００５６】
第２の陰イオン交換クロマトグラフィーの後、この精製したダプトマイシンを、発熱物質除去化し、濾過し、そして冷凍条件下で濃縮した。ダプトマイシンの濾過は、当該分野で公知の任意の方法によって行われ得る。一実施形態において、濾過および発熱物質除去化は、以下の（ｉ）〜（ｖ）によって行われ得る：（ｉ）ダプトマイシンがモノマー状態および非ミセル状態である条件下で、ダプトマイシン溶液を提供すること；
（ｉｉ）ダプトマイシンがフィルターを通過するが、発熱物質がこのフィルターを通過しない条件下で、ダプトマイシン溶液を濾過すること（例えば、ダプトマイシン溶液をｐＨ６．０〜８．０にし、そしてこの溶液を、３，０００ＮＭＷと３０，０００ＮＭＷとの間に格付けされる限外濾過膜（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｅｒ）を用いて濾過すること）；
（ｉｉｉ）例えば、ダプトマイシン溶液のｐＨを、ダプトマイシンがミセルを形成するように２．５〜４．５に変化させることによって、このフィルターを通過したダプトマイシン溶液を、ダプトマイシンが凝集するように変化させること；
（ｉｖ）ダプトマイシンがこのフィルター上に保持される条件下で、このダプトマイシン溶液を濾過すること（例えば、逆浸透膜のような３０，０００ＮＭＷ未満の限外濾過膜上のダプトマイシンを濃縮すること）；および（ｖ）発熱物質除去化したダプトマイシンを収集すること。
【００５７】
好ましい実施形態において、工程（ｉｉ）のダプトマイシンは、約７〜８のｐＨで、１０，０００ダルトンの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）限外濾過膜で、加圧下で濾過される。より好ましい実施形態において、ダプトマイシンは、４０ｍｇ／ｍｌ未満の初期濃度であり、より好ましくは、約３１．２５ｍｇ／ｍＬの濃度である。これらの条件下で、ダプトマイシンは、このフィルターを通過するが、リポ多糖類（ＬＰＳ）のような発熱物質は、通過しない。最初の限外濾過の後、濾液のｐＨを、ｐＨ２．５〜４．５まで下げ、そしてこの濾液を、約１２０ｍｇ／ｍＬになるまで、１０，０００ＭＷＣＯ限外濾過膜で濃縮する。これらの条件下で、ダプトマイシンは、このフィルター上に保持される。好ましい実施形態において、濾液のｐＨは、ｐＨ３．５である。濃縮の後、ダプトマイシンの濃度を、１０５ｍｇ／ｍＬに調整し、エンドトキシンのレベルを調べ、そして無菌条件下でバイアルを満たすために使用する。
【００５８】
別の実施形態において、逆浸透ナノ濾過は、ｐＨ１．５〜３．０で行われる。精製されたダプトマイシンの分解を遅らせるために、低いｐＨおよび冷凍条件が使用される。生体負荷量を軽減するために、ダプトマイシンは０．２μｍフィルターを通してさらに濾過され得、次いで、大量でまたはバイアルでのいずれかで、凍結乾燥される。
【００５９】
上記の限外濾過および濃縮工程の代替として、ダプトマイシンを含む溶離された画分は、約４．５のｐＨで、９部のダプトマイシン溶液に対して、１部のブタノールよりも大きな割合で、ブタノール（ｎ−ブタノール、ｉｓｏ−ブタノールまたはｔ−ブタノールのいずれか）と混合される。好ましい実施形態において、１部のブタノールを、４部のダプトマイシン溶液と混合して、２０％のブタノール溶液を得る。このブタノール−ダプトマイシン溶液を、有機相と水相に分離する。ダプトマイシンを有機相に分配し、これを収集する。この有機溶媒中のダプトマイシンの脱水は、ダプトマイシンを安定化し得、そして精製されたダプトマイシンから無水ダプトマイシンへの分解、および引き続くβ異性体の形成を防止する。最後に、ｐＨ６．５〜７．５の緩衝液を、この有機相に添加することによって、ダプトマイシンを水相に戻し得る。ダプトマイシンの濃縮または収集の後、ダプトマイシンを凍結乾燥する。
【００６０】
本発明の別の実施形態において、ダプトマイシン以外のリポペプチド（例えば、Ａ５４１４５、ＬＹ３０３３６６、エキノカンジン （ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ）、ニューモカンジン（ｐｎｅｕｍｏｃａｎｄｉｎ）、アキュレアシン、サーファクチン、プリパスタチンＢ１、アンホマイシン、 または米国特許第５，６２９，２８８号に開示されるリポペプチド誘導体）を精製するために、処理クロマトグラフィー法が使用される。別の実施形態におい て、この処理クロマトグラフィー法を使用して、ダプトマイシン関連リポペプチド（Ａ５４１４５、または米国特許第４，５３７，７１７号、同第 ４，４８２，４８７号、Ｒｅ．３２，３１１、Ｒｅ．３２，３１０、同第５，９１２，２２６号（現在、米国出願番号第０９／５４７，３５７号として再発行さ れている）、国際ＰＣＴ出願ＷＯ ０１／４４２７２、ＷＯ ０１／４４２７４、およびＷＯ ０１／４４２７１に 開示されるリポペプチド、あるいはＡ−２１９７８抗生物質（ここで、ダプトマイシンのｎ−デカノイル脂肪酸側鎖は、ｎ−オクタノイル、ｎ−ノナノイル、 ｎ−ウンデカノイル、−ドデカノイル、ｎ−トリデカノイルまたはｎ−テトラデカノイル脂肪酸側鎖で置換されている）を含む）を精製する。
【００６１】
本発明の別の実施形態において、「ＳａｌｔＣｌｏｕｄＭｅｔｈｏｄ」［ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＮｅｗｓ，第１９巻、Ｎｏ．２０、１、３４および４３頁（１９９９年１１月１５日）］が、ダプトマイシンまたは他のリポペプチドの精製に使用される。このＳａｌｔＣｌｏｕｄＭｅｔｈｏｄは、選択的分離と高容量スループットを組み合わせた膜ベースのシステムである。このＳａｌｔＣｌｏｕｄＭｅｔｈｏｄを、本明細書中に開示されるこれらの処理工程と共にかまたは別々に使用して、ダプトマイシンまたは他のリポペプチドを精製し得る。
【００６２】
本発明の別の実施形態は、従来技術のクロマトグラフィー法により達成され得なかった高度に精製されたリポペプチドを生成するクロマトグラフィー法に関する。このクロマトグラフィー法は、リポペプチドを含む調製物を精製するための改変した緩衝液増強陰イオン交換クロマトグラフィーの使用を包含する。好ましい実施形態において、この方法は、高度に精製されたダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチドを生成するためにしようされる。この方法は、部分的に精製されたダプトマイシンと共に使用される場合、少なくとも純度９８％のダプトマイシンを生成する。この方法はまた、無水ダプトマイシンを含まないかまたは実質的に含まないダプトマイシンを生成する。この方法は、以下の工程を包含する：部分的に精製されたダプトマイシンは、当該分野で公知であるか本明細書中で記載される任意の方法により調製される。次いで、このダプトマイシン調製物は、改変した緩衝液増強陰イオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製される。ダプトマイシンがモノマーおよび非ミセル状態で樹脂イオンに結合する条件下で、ダプトマイシンは、適切なイオン性改変緩衝液の存在下で、陰イオン交換樹脂に結合する。この改変緩衝液は、緩衝化剤（例えば、酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、およびＴｒｉｓ−ＨＣｌであるが、これらに現地得されない）、または中性ｐＨで十分に緩衝化する任意の他の緩衝剤を含む。この改変緩衝液は、１つ以上のカオトロピック剤（グアニジン、アンモニア、尿素、強力な還元剤、安息香酸、アスコルビン酸、または緩衝液を改変し得る別のイオン性エンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない）をさらに含み、その結果、ダプトマイシンは、不純物から容易に分離される。ダプトマイシンを充填した樹脂は、無水ダプトマイシンを含む不純物を溶離するために、適切なイオン性改変緩衝液で洗浄される。次いで、樹脂に結合したままの不純物（β−異性体を含む）からのダプトマイシンの分離を可能にする条件下で、ダプトマイシンが溶離される。
【００６３】
好ましい実施形態において、この改変緩衝液は、中性のｐＨ（６〜８のｐＨ）であり、２〜６Ｍの尿素を含む。さらに好ましい実施形態において、陰イオン交換樹脂は、ＰｏｒｏｕｓＲｅｓｉｎＰ１５０またはＰｏｒｏｕｓＤ５０（ＰＥＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）である。より好ましい実施形態において、陰イオン交換樹脂は、ＰｏｒｏｕｓＰ１５０である。好ましい実施形態において、ダプトマイシンは、低イオン強度の緩衝液中の樹脂に結合され、低〜中程度のイオン強度の緩衝剤で洗浄され、そして高イオン強度の緩衝液で溶離される。１つの好ましい実施形態において、ダプトマイシンは、６Ｍの尿素を含有するＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、ＰｏｒｏｕｓＰ１５０樹脂に結合される。ダプトマイシンを充填したＰｏｒｏｕｓＰ１５０樹脂は、３総容量のＴｒｉｓ緩衝液またはダプトマイシンを溶離することなく混入物および無水ダプトマイシンを除去する塩レベルを含む他の適切な緩衝液で洗浄される。ダプトマイシンは、カラムに結合したさらなる不純物（β−異性体の有意な部分を含む）を残す増大した塩条件下で、ＰｏｒｏｕｓＰ１５０樹脂から、Ｔｒｉｓ緩衝液または他の適切な緩衝液で溶離される。別の好ましい実施形態において、ＰｏｒｏｓＰ１５０が使用され、そしてダプトマイシンは、２Ｍの尿素を含有する酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で樹脂に結合する。このダプトマイシンを充填したＰｏｒｏｕｓＰ１５０樹脂は、２Ｍの尿素を含有する酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を使用することを除いては、上記の方法と同様にして洗浄および溶離される。生成物の画分を、ＨＰＬＣまたはＵＶモニタリングによって測定し得る。
【００６４】
改変した緩衝液増強陰イオン交換クロマトグラフィーは、カラムクロマトグラフィーによって実施され得るか、またはバッチ様式で達成され得る。米国特許第５，７５６，６８０号、同第４，８６５，７２９号、同第４，８４０，７３０号または同第４，７０８，７８２号に記載されるような、円形フロークロマトグラフィーもまた使用され得る。この改変した緩衝液増強陰イオン交換樹脂は、段階的な塩勾配または連続的な塩勾配で洗浄および溶離され得る。適切な段階的または連続的塩勾配は、不純物（無水ダプトマイシンおよびβ−異性体が挙げられるが、これらに限定されない）からのダプトマイシンの分離を可能にする任意の勾配である。好ましい実施形態において、連続塩勾配は、０〜１０００ｍＭＮａＣｌである。さらに好ましい実施形態において、この塩勾配は、１００〜５００ｍＭＮａＣｌ、または０〜４００ｍＭＮａＣｌである。
【００６５】
本発明の別の実施形態において、ダプトマイシン以外のリポペプチド化合物を精製するために、改変した緩衝液増強陰イオン交換クロマトグラフィーが使用され る。これらのリポペプチド化合物としては、Ａ５４１４５、ＬＹ３０３３６６、エキノカンジン、ニューモカンジン、アキュレアシン、サーファクチン、および プリパスタチンＢ１（Ｔｓｕｇｅら、１９９６，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６５：２４３−５１）、ならびに米国特許第５，６２９，２８８号に開示さ れるリポペプチド誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、改変した緩衝液増強陰イオン交換クロマトグラフィーは、ダプトマイ シン関連リポペプチド（例えば、Ａ５４１４５、または米国特許第４，５３７，７１７号、同第４，４８２，４８７号、Ｒｅ．３２，３１１、 Ｒｅ．３２，３１０、同第５，９１２，２２６号（現在、米国出願番号第０９／５４７，３５７号として再発行されている）、国際ＰＣＴ出願ＷＯ ０１／４４２７２、ＷＯ ０１／４４２７４、およびＷＯ ０１／４４２７１に 開示されるリポペプチド、あるいはＡ−２１９７８抗生物質（ここで、ダプトマイシンのｎ−デカノイル脂肪酸側鎖は、ｎ−オクタノイル、ｎ−ノナノイル、 ｎ−ウンデカノイル、−ドデカノイル、ｎ−トリデカノイルまたはｎ−テトラデカノイル脂肪酸側鎖で置換されている）を含む）を精製するために使用される。
【００６６】
本発明の別の実施形態において、ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチドを精製するために、処理クロマトグラフィー工程の新規の組み合わせが使用される。この方法は、陰イオン交換クロマトグラフィー、小粒子逆相クロマトグラフィー、および改変した緩衝液増強陰イオン交換クロマトグラフィーを含む。この精製方法は、Ａ２１９７８Ｃ含有粗生成物がＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓにより産生される発酵条件を変える工程をさらに包含し得る。これらの方法は、純度が少なくとも９８％であるダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチドを生成する。好ましい実施形態において、この方法は、純度が９９％より大きいダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチドを生成する。
【００６７】
処理クロマトグラフィー法の好ましい実施形態を以下に記載する：デカン酸の供給を、上記のような発酵の全収率を減少させることなく可能な限り低いレベルに保つように変更して、米国特許第４，８８５，２４６号に開示されるように、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓをｎ−デカン酸を与えて発酵させる。代替の実施形態において、供給原料がダプトマイシン核への付加のためのｎ−デカノイル基を最終的に提供する限りは、異なる供給原料を使用し得る。これらの供給原料の例としては、デカン酸アミド、デカン酸エステル（ブチルエステルを含む）、ココナッツオイルまたはパーム油の原料供給源、動物由来のデカン酸、デカン酸の様々な塩、およびデカン酸の石油化学供給源が挙げられるが、これらに限定されない。発酵の後、細胞外供給源を上記のように除去する。代替の実施形態において、ダプトマイシンは、有機溶媒（例えば、ｎ−ブタノール）を使用して、上記のような溶媒分離遠心分離またはフィルターを用いる浄化の前に、菌子体から抽出され得る。発酵ブロスの浄化の後、ダプトマイシンのレベルを、上記のように、初めに陰イオン交換クロマトグラフィー、次いでＨＩＣによって、浄化された溶液中に濃縮する。
【００６８】
ＨＩＣの完了後、ダプトマイシン調製物中の有機溶媒を、当該分野で公知の任意の方法によって減少させる。好ましい実施形態において、この有機溶媒は、上記のような、陰イオン交換クロマトグラフィーによって減少される。ダプトマイシンは、改変した緩衝液増強クロマトグラフィーに必要な緩衝液に適合性の緩衝液で、カラムから溶離されるべきである。あるいは、溶離緩衝液は、逆浸透圧または１０，０００ＭＷＣＯフィルターによる濾過により、改変した緩衝液と交換され得る。別の好ましい実施形態において、有機溶媒は、エバポレーションまたは緩衝液での希釈によって減少される。第３の好ましい実施形態において、逆相クロマトグラフィー溶媒および残りの塩は、ｐＨ１．５〜４．０における逆浸透圧またはｐＨ２．５〜４．５における限外濾過を使用して除去される。得られた生成物は、大量貯蔵のために冷凍され得るか、または凍結乾燥により乾燥され得、次いで、水または改変した緩衝液増強陰イオン交換クロマトグラフィーのために使用される緩衝液で再水和される。
【００６９】
ダプトマイシンは、上記のように、改変した緩衝液増強陰イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製される。
【００７０】
改変した緩衝液増強陰イオン交換クロマトグラフィーの後、この精製されたダプトマイシンは、濾過され、そして冷凍条件下で濃縮される。ダプトマイシンの濾過は、当該分野で公知の任意の方法によって行われ得る。好ましい実施形態において、ダプトマイシンは、上記のように、発熱物質除去化され、そして濃縮される。あるいは、ダプトマイシンは、ｐＨ１．５〜４で、冷凍条件下で、逆浸透圧によって濃縮され得る。低ｐＨおよび冷凍条件は、精製されたダプトマイシンの分解を遅らせるために使用される。
【００７１】
上記の濾過工程および濃縮工程の代替としてまたはこれら工程に加えて、改変した緩衝液増強陰イオン交換クロマトグラフィーからのダプトマイシンを含む溶出画分は、ブタノール（ｎ−、イソ−、またはｔ−ブタノールのいずれか）と、約ｐＨ４．５で、９部のダプトマイシン溶液に対して１部のブタノールよりも大きい割合で混合され得る。好ましい実施形態において、１部のブタノールは、４部のダプトマイシン溶液と混合されて、２０％ブタノール溶液を生じる。ブタノール−ダプトマイシン溶液は、有機相と水相に分離される。ダプトマイシンは、有機相に分配され、この相が、回収される。有機溶媒中のダプトマイシンの脱水は、ダプトマイシンを安定化させ、精製ダプトマイシンが無水ダプトマイシンに分解し、続くβ−異性体の形成を回避する。
【００７２】
ダプトマイシンの濃縮または回収後、ダプトマイシンは、凍結乾燥される。
【００７３】
本発明の別の実施形態において、クロマトグラフィープロセスは、ダプトマイシン以外のリポペプチド（例えば、上記のようなもの）を精製するために使用される。
【００７４】
（リポペプチドミセルの形成およびこれらの使用方法）
本発明の別の実施形態は、リポペプチドミセル、リポペプチドミセルを形成するための方法、ならびにリポペプチド精製および薬学的組成物のためのリポペプチ ドミセルの使用方法を提供する。好ましい実施形態において、リポペプチドは、ダプトマイシン関連分子であり、とりわけ、ダプトマイシン、Ａ５４１４５、米 国特許第４，５３７，７１７号、同第４，４８２，４８７号、Ｒｅ．３２，３１１、Ｒｅ．３２，３１０、米国特許第５，９１２，２２６号、米国特許出願番号 ０９／５１７，３５７として現在再発行中のもの、国際ＰＣＴ出願ＷＯ ０１／４４２７２、ＷＯ ０１／４４２７４、ＷＯ ０１／４４２７１に 開示される、ダプトマイシン関連リポペプチド、またはＡ−２１９７８抗生物質（ここで、ダプトマイシンのｎ−デカノイル側鎖は、ｎ−オクタノイル側鎖、 ｎ−ノナノイル側鎖、ｎ−ウンデカノイル側鎖、ｎ−ドデカノイル側鎖、ｎ−トリデカノイル側鎖またはｎ−テトラデカノイル側鎖で置換されている）が挙げら れる。より好ましい実施形態において、リポペプチドは、ダプトマイシンである。
【００７５】
ミセルは、両親媒性分子の凝集体である。水性媒体において、この分子の脂肪親和性部分は、ミセルの内側に向かって配向され、そしてこの分子の親水性部分は、水性媒体と接触する。ミセルは、この分子の濃度が十分に高い場合、両親媒性分子を含む溶液中で自発的に形成する。
【００７６】
ミセルの形成は、溶液のいくらか大量の物理特性に変化を引き起こし、この変化としては、以下が挙げられる：浸透圧、濁度、電気伝導性、表面張力、共イオンおよび対イオン活性（イオン性両親媒性分子の場合）、屈折率、ＵＶスペクトルおよびＮＭＲスペクトル、部分モル容積、粘性、拡散係数および色素溶解度。ｃｍｃは、両親媒性分子の濃度の関数としてこれらのミセル依存性物理特性のうちの１つ以上を測定することによって決定され得る。ミセルの大きさおよび形状は、動的レーザー光散乱実験、超遠心分離実験、粘性および／または低角（ｌｏｗａｎｇｌｅ）Ｘ線散乱実験によって決定され得る。ミセルはまた、液晶相に存在し得る。
【００７７】
リポペプチドは、リポペプチドのｃｍｃよりも大きいリポペプチド濃度を提供することによって、ミセルに凝集され得る。ｃｍｃは、リポペプチドの性質および温度、リポペプチドを含む水溶液の濃度およびｐＨに依存する。リポペプチドの性質に関して、リポペプチドのｃｍｃは、ＣＨ２基を脂肪親和性炭素鎖に付加することによって減少される。従って、特定の塩濃度、温度およびｐＨでダプトマイシンに関するｃｍｃが提供されると、ｎ−デカノイル脂肪酸側鎖がｎ−オクタノイル脂肪酸側鎖またはｎ−ノナノイル脂肪酸側鎖によって置換されているＡ−２１９７８型の抗生物質は、より大きなｃｍｃを有し、一方、ダプトマイシンのｎ−デカノイル脂肪酸側鎖がｎ−ウンデカノイル脂肪酸側鎖、ｎ−ドデカノイル脂肪酸側鎖、ｎ−トリデカノイル脂肪酸側鎖またはｎ−テトラデカノイル脂肪酸側鎖によって置換されているＡ−２１９７８抗生物質は、ダプトマイシンに対してより低いｃｍｃを有する。
【００７８】
本発明の１つの実施形態において、リポペプチドのｃｍｃｇは、リポペプチドに対してＣＨ２基を付加または除去することによって操作され得る。好ましい実施形態において、リポペプチドは、Ａ−２１９７８であり、ここで、ダプトマイシンのｎ−デカノイル脂肪酸側鎖は、ｎ−オクタノイル脂肪酸側鎖、ｎ−ノナノイル脂肪酸側鎖、ｎ−ウンデカノイル脂肪酸側鎖、ｎ−ドデカノイル脂肪酸側鎖、ｎ−トリデカノイル脂肪酸側鎖またはｎ−テトラデカノイル脂肪酸側鎖で置換されている。別の実施形態において、本明細書の教示に従って、リポペプチドのおおよそのｃｍｃが計算され得る。ダプトマイシンのようなリポペプチドのｃｍｃが与えられると、関連リポペプチド（ここで、ｎ−デカノイル脂肪酸側鎖は、ｎ−オクタノイル脂肪酸側鎖、ｎ−ノナノイル脂肪酸側鎖、ｎ−ウンデカノイル脂肪酸側鎖、ｎ−ドデカノイル脂肪酸側鎖、ｎ−トリデカノイル脂肪酸側鎖またはｎ−テトラデカノイル脂肪酸側鎖で置換されている）のおおよそのｃｍｃが計算され得る。上記のものは、当業者に公知の方法によって実行され得る。
【００７９】
別の好ましい実施形態において、１つのリポペプチドのｃｍｃが与えられると、関連ペプチド部分を含むリポペプチドのおおよそのｃｍｃが計算され得る。好ま しい実施形態において、ダプトマイシンのｃｍｃおよび先行技術の教示が与えられると、Ａ５４１４５、米国特許第４，５３７，７１７号、同第 ４，４８２，４８７号、Ｒｅ．３２，３１１、Ｒｅ．３２，３１０、米国特許第５，９１２，２２６号、米国特許出願番号０９／５１７，３５７として現在再発 行中のもの、国際ＰＣＴ出願ＷＯ ０１／４４２７２、ＷＯ ０１／４４２７４、ＷＯ ０１／４４２７１に開示される、ダプトマイシン関連リポペプチドのような関連リポペプチドのｃｍｃが容易に決定され得る。
【００８０】
本発明の別の実施形態において、リポペプチドのｃｍｃは、リポペプチドを含む溶液の温度を変更することによって操作される。リポペプチドのｃｍｃは、通常、溶液の漸増する温度とともに増加する。従って、ミセル形成は、温度を低下することによって促進され、そして温度を上げることによって妨害される。例えば、リポペプチドを含む溶液は、ミセルを４℃で形成し得、なぜなら、この温度において、ｃｍｃは、より低くされ、そしてリポペプチド濃度は、ｃｍｃを超えるからである；しかし、同じリポペプチド溶液は、２０℃では単量体であり得、なぜなら、ｃｍｃは温度とともに増加し、そしてリポペプチド濃度がここではｃｍｃよりも下であるからである。従って、好ましい実施形態において、リポペプチド濃度は、ある温度においてはｃｍｃよりも高く、そして別のより高い温度においてはｃｍｃよりも低い。より好ましい実施形態において、リポペプチドは、ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連分子（例えば、上記のような分子）である。なおより好ましい実施形態において、リポペプチドは、ダプトマイシンである。
【００８１】
別の好ましい実施形態において、ｃｍｃに影響を与えるために異なる温度を用いることによってリポペプチドのミセル形成を操作する能力は、リポペプチドの精製に使用される。より好ましい実施形態において、リポペプチドは、ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連分子（例えば、上記のような分子）である。なおより好ましい実施形態において、リポペプチドは、ダプトマイシンである。別の好ましい実施形態において、温度を変更することによってリポペプチドミセル形成を操作する能力は、特定の温度条件下ではミセルであり、そして他の温度条件下では単量体である薬学的組成物を作製するために使用される。好ましい実施形態において、薬学的組成物は、ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチド（例えば、上記のようなリポペプチド）を含む。別の好ましい実施形態において、薬学的組成物は、ダプトマイシンを含む。
【００８２】
本発明のさらなる実施形態において、電解質の添加が、イオン性リポペプチドのｃｍｃを減少するために使用される。好ましい実施形態において、塩（例えば、ＮａＣｌ）は、リポペプチドミセル中の荷電基間の反発を減少するために、リポペプチドを含む溶液に添加される。好ましい実施形態において、リポペプチドは、ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連分子（例えば、上記のような分子）である。例えば、ダプトマイシンのペプチド部分は、３つのアスパラギン酸残基およびＬ−トレオ−３−メチルグルタミン酸残基（３−ＭＧ）（これらの全ては、中性ｐＨで荷電されている）を含む。従って、電解質（例えば、ＮａＣｌまたは等価な塩）の添加は、ダプトマイシンのｃｍｃを減少する。好ましい実施形態において、塩濃度は、少なくとも１００ｍＭである。より好ましい実施形態において、塩濃度は、１５０ｍＭ〜３００ｍＭの塩である。よりさらに好ましい実施形態において、塩は、ＮａＣｌである。
【００８３】
ｃｍｃにおける減少はまた、他のリポペプチド（例えば、アスパラギン酸残基、３−ＭＧ残基または他の荷電残基を含むダプトマイシンに関連する分子）に対す る電解質の添加で観察される。従って、好ましい実施形態において、塩は、ダプトマイシン関連リポペプチド（例えば、Ａ５４１４５、米国特許第 ４，５３７，７１７号、同第４，４８２，４８７号、Ｒｅ．３２，３１１、Ｒｅ．３２，３１０、米国特許第５，９１２，２２６号、米国特許出願番号 ０９／５１７，３５７として現在再発行中のもの、国際ＰＣＴ出願ＷＯ ０１／４４２７２、ＷＯ ０１／４４２７４、ＷＯ ０１／４４２７１に 開示される、ダプトマイシン関連リポペプチド、またはＡ−２１９７８抗生物質（ここで、ダプトマイシンのｎ−デカノイル脂肪酸側鎖は、ｎ−オクタノイル脂 肪酸側鎖、ｎ−ノナノイル脂肪酸側鎖、ｎ−ウンデカノイル脂肪酸側鎖、ｎ−ドデカノイル脂肪酸側鎖、ｎ−トリデカノイル脂肪酸側鎖またはｎ−テトラデカノ イル脂肪酸側鎖で置換されている））のｃｍｃを減少するために、溶液に添加される。別の実施形態において、イオン性リポペプチドのｃｍｃを増加するため に、塩濃度は、低下される。好ましい実施形態において、イオン性リポペプチドは、ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチド（上記のようなリポ ペプチド）である。
【００８４】
別の好ましい実施形態において、ｃｍｃに影響を与えるために電解質濃度を変更することによって、リポペプチドのミセル形成を操作する能力が、リポペプチドの精製に使用される。より好ましい実施形態において、リポペプチドは、ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連分子（上記のような分子）である。なおより好ましい実施形態において、リポペプチドは、ダプトマイシンである。別の好ましい実施形態において、電解質濃度によってリポペプチドミセル形成を操作する能力は、特定の電解質濃度においてミセルであり、そして他の電解質濃度において単量体である薬学的組成物を作製するために使用される。好ましい実施形態において、薬学的組成物は、ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチド（上記のようなリポペプチド）を含む。別の好ましい実施形態において、薬学的組成物は、ダプトマイシンを含む。
【００８５】
本発明の別の実施形態において、リポペプチドを含む溶液のｐＨは、リポペプチドのｃｍｃに影響を与えるために操作される。好ましい実施形態において、リポペプチドは、ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連分子（上記のような分子）である。なおより好ましい実施形態において、リポペプチドは、ダプトマイシンである。１つの実施形態において、ｐＨは、リポペプチドの濃度が１つのｐＨにおいてｃｍｃよりも高くあり、そして別のｐＨにおいてｃｍｃよりも低くあるように、操作される。例えば、ダプトマイシンに関して、２０〜２５℃の温度の水中においてｐＨ４．０でのｃｍｃは、ｐＨ６．０または７．５よりもはるかに低かった。ｐＨ４．０において、ｃｍｃは、これらの条件下において約４００μｇ／ｍＬである。図１５を参照のこと。さらに、ダプトマイシンは、ｐＨ６．５で１５０ｍｇ／ｍＬのダプトマイシンでさえ、単量体である（ここで、塩濃度は、１５０ｍＭ〜３００ｍＭのＮａＣｌであり、そして温度は４℃である）。従って、ダプトマイシンに関して、ｐＨ４．０でのｃｍｃは、より高いｐＨかまたはより低いｐＨのいずれかの溶液においてよりも、低い。異なるｐＨレベルでのｃｍｃの変化はまた、他の荷電リポペプチド（上記のようなダプトマイシンに関連するリポペプチドを含む）に対しても使用され得る。
【００８６】
別の好ましい実施形態において、ｃｍｃに影響を与えるためにｐＨを変更することによってリポペプチドのミセル形成を操作する能力は、リポペプチドの精製に使用される。より好ましい実施形態において、リポペプチドは、ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連分子（例えば、上記のような分子）である。なおより好ましい実施形態において、リポペプチドは、ダプトマイシンである。別の好ましい実施形態において、ｐＨによってリポペプチドミセル形成を操作する能力は、特定のｐＨにおいてミセルでありそして別のｐＨ下では単量体である薬学的組成物を作製するために使用される。好ましい実施形態において、薬学的組成物は、ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチド（上記のようなリポペプチド）を含む。別の好ましい実施形態において、薬学的組成物は、ダプトマイシンを含む。
【００８７】
本発明の別の局面において、リポペプチドは、混合ミセルの一部であり得る。混合ミセルは、リポペプチドが１つ以上の他の型の両親媒性分子と共にミセルを形 成しているミセルである。このような両親媒性分子の例としては、中鎖脂肪酸および長鎖脂肪酸、ホスホグリセリド（リン脂質）、スフィンゴミエリン、糖脂質 およびコレステロールが挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、中鎖長のアルコールは、ミセル中に組込まれ得、ここで、これらは、 静電反発および立体障害を減少し、従ってリポペプチドのｃｍｃを低下させる。別の実施形態において、１つ以上の型の両親媒性分子の添加は、ミセル構造を、 球形ミセル（図１４のａ部を参照のこと）から平面脂質二重層構造（図１４、ｂ部を参照のこと）またはリポソーム構造（図１４のｃ部を参照のこと）に変更するために使用され得る。一般的に、リン脂質および／または糖脂質を含む混合ミセルは、球形ミセルを生じて脂質二重層構造に変換し、これは、イオンおよび最も極性の分子に対する浸透性関門としてはたらく。
【００８８】
別の実施形態では、混合ミセルは、異なる２以上のリポペプチドから形成され得る。例えば、混合ミセルは、ダプトマイシンおよび別のリポペプチド（例えば、Ａ５４１４５または前出に考察されたようなダプトマイシン関連リポペプチド）から形成され得る。別の実施形態では、混合ミセルは、当業者に公知の１以上の治療的に有用な両親媒性分子（例えば、抗生物質、抗炎症剤または抗真菌剤）と共に、リポペプチドを含み得る。好ましい実施形態では、リポペプチドは、ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチド（例えば、Ａ５４１４５、前出に開示されたダプトマイシン関連リポペプチド、またはＡ−２１９７８抗生物質（ここで、ダプトマイシンのｎ−デカノイル脂肪酸側鎖は、ｎ−オクタノイル脂肪酸側鎖、ｎ−ノナノイル脂肪酸側鎖、ｎ−ウンデカノイル脂肪酸側鎖、ｎ−ドデカノイル脂肪酸側鎖、ｎ−トリデカノイル脂肪酸側鎖、またはｎ−テトラデカノイル脂肪酸側鎖によって置換されている））である。より好ましい実施形態では、リポペプチドはダプトマイシンである。
【００８９】
本発明の別の実施形態では、混合であろうと単一型のリポペプチド分子を含もうと、ミセルは、治療的に有用なリポペプチドを含む。好ましい実施形態では、リポペプチドは抗生物質である。さらにより好ましい実施形態では、リポペプチドはダプトマイシンである。ダプトマイシンは、水中で約４．０のｐＨにて１ｍｇ／ｍＬの濃度において、約５．４ｎｍ（５４Å）のミセルを形成する。図１６を参照のこと。
【００９０】
別の好ましい実施形態では、ミセルは、異なる型の１以上の治療的物質を含む。１つの実施形態では、治療的物質は、溶液中でリポペプチドと混合され得、その結果、ミセルがこのリポペプチドから形成され、そしてこの治療的物質は、疎水性内部に捕捉される。別の実施形態では、治療的物質は、リポペプチドおよび１以上の他の両親媒性分子と共に混合され、その結果、混合ミセルが、このリポペプチドと他の両親媒性分子とから形成され、そしてこの治療的物質は、疎水性内部に見出される。好ましい実施形態では、治療的物質は、抗生物質、抗炎症剤または抗真菌剤である。より好ましい実施形態では、治療的物質は、下記に開示される抗生物質または抗真菌剤である。別の好ましい実施形態では、治療的物質は、疎水性環境下において可溶性であるが、水溶液中では可溶性ではない。
【００９１】
本発明の別の実施形態では、リポペプチドは、リポソームへと形成され得、このリポソームは、球状の脂質二重層が水性内部を取り囲む小胞である。図１４の ｃ部分を参照のこと。リポソームは、治療的用途のために有利である。なぜなら、リポソームは、形質膜と容易に融合し、そしてまた、その内部の水性区画中に 物質を捕捉するために使用され得るからである。この物質は、水溶液中においてのみ可溶性であるものであり得る。１つの実施形態では、リポペプチドおよび別 の両親媒性分子を含む溶液を音波破砕して、リポソームを生成し得る。別の実施形態では、リポペプチド単独を音波破砕して、リポソームを生成し得る。好まし い実施形態では、リポソームは、以下を含む：ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチド（例えば、Ａ５４１４５、米国特許第４，５３７，７１７ 号、同第４，４８２，４８７号、Ｒｅ．３２，３１１、Ｒｅ．３２，３１０、米国特許第５，９１２，２２６号、米国特許出願番号第０９／５４７，３５７号と して現在再発行中のもの、国際ＰＣＴ出願ＷＯ０１／４４２７２、ＷＯ０１／４４２７４、およびＷＯ０１／４４２７１に おいて開示されたリポペプチド、またはＡ−２１９７８抗生物質（ここで、ダプトマイシンのｎ−デカノイル脂肪酸側鎖は、ｎ−オクタノイル脂肪酸側鎖、ｎ− ノナノイル脂肪酸側鎖、ｎ−ウンデカノイル脂肪酸側鎖、ｎ−ドデカノイル脂肪酸側鎖、ｎ−トリデカノイル脂肪酸側鎖、またはｎ−テトラデカノイル脂肪酸側 鎖によって置換されている））。より好ましい実施形態では、リポペプチドはダプトマイシンである。
【００９２】
別の好ましい実施形態では、リポソームは、その内部の水性区画中に１以上の治療的物質を含む。好ましい実施形態では、治療的物質は、抗生物質、抗炎症剤または抗真菌剤である。より好ましい実施形態では、治療的物質は、下記に開示される抗生物質または抗真菌剤である。別の好ましい実施形態では、治療的物質は、水溶液中において可溶性である。別の好ましい実施形態では、薬学的組成物はリポソームを含む。
【００９３】
好ましい実施形態では、薬学的組成物は、治療的物質を含むリポペプチドミセル型配置を含む。リポペプチドミセル型配置は、 球状ミセル、混合ミセルまたはリポソームであり得る。リポペプチドミセルを含む薬学的組成物は、注射に際してかまたは静脈内投与された場合に、局所刺激を 最小化し得る。１つの実施形態では、薬学的組成物は、塩、特定のｐＨを維持するための緩衝液、およびミセルを含む。さらなる実施形態では、薬学的組成物 は、ミセルを安定化するため、および／またはリポペプチドもしくは他の治療的物質を安定化するための１以上の薬剤を含む。１つの実施形態では、薬学的組成 物はまた、１以上の治療的物質を含む。好ましい実施形態では、治療的物質は、抗生物質、抗炎症剤または抗真菌剤である。より好ましい実施形態では、治療的 物質は、下記に開示される抗生物質または抗真菌剤である。治療的物質は、ミセルに取り込まれた治療的物質以外であり得るか、またはミセルに取り込まれた治 療剤であり得る。
【００９４】
薬学的組成物は、乾燥され得るかまたは凍結乾燥され得、この場合には、ミセルは、水溶液（例えば、水）または緩衝液のいずれかが薬学的組成物に添加された場合に形成される。好ましい実施形態では、薬学的組成物は凍結乾燥され、そして再構築された場合に生理的濃度の塩と、滅菌水または他の緩衝液を添加した場合にミセルを室温で自発的に形成するｐＨを維持する緩衝液とを含む。さらにより好ましい実施形態では、薬学的組成物は、ダプトマイシンまたは関連リポペプチド（例えば、Ａ５４１４５、前出に開示されたダプトマイシン関連リポペプチド、またはＡ−２１９７８抗生物質（ここで、ダプトマイシンのｎ−デカノイル脂肪酸側鎖は、ｎ−オクタノイル脂肪酸側鎖、ｎ−ノナノイル脂肪酸側鎖、ｎ−ウンデカノイル脂肪酸側鎖、ｎ−ドデカノイル脂肪酸側鎖、ｎ−トリデカノイル脂肪酸側鎖、またはｎ−テトラデカノイル脂肪酸側鎖によって置換されている））を含む。さらにより好ましい実施形態では、リポペプチドはダプトマイシンである。別の実施形態では、薬学的組成物は水性である。リポソームが使用される場合が好ましい。好ましい実施形態では、薬学的組成物は、リポソームについての安定化剤を含む。
【００９５】
本発明の別の局面では、ミセル溶液を単離および／または精製する。１つの実施形態では、ミセルは、限外濾過によって、より小さな置換物（ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ）から単離される。限外濾過膜の選択は、ミセルのサイズに基づく。一般的に、１０，０００ＮＭＷまたは３０，０００ＮＭＷの膜が、より小さな置換物（例えば、夾雑物）を貫流させつつミセルを保持するに十分である。別の実施形態では、ミセルは、透析、密度勾配遠心沈殿法、またはサイズ排除クロマトグラフィーによって、単離および／または精製され得る。これらの方法は、当該分野において周知である。１つの実施形態では、ミセルは、３０％より高く純粋であり、ここで純度は、リポペプチドまたは他の分子の単量体形態の重量と比較したミセルの重量として測定される。好ましい実施形態では、ミセルは、５０％より高く純粋、６０％より高く純粋、７０％より高く純粋、８０％より高く純粋、９０％より高く純粋、または９５％より高く純粋である。
【００９６】
本発明の別の局面では、リポペプチドミセルを形成する能力、次いで、温度、ｐＨ、電解質濃度および／またはリポペプチド濃度を変更することによって、それらを解離する能力は、リポペプチドを精製する方法を提供する。１つの実施形態では、この方法は、リポペプチドがミセルを形成する条件に対してリポペプチドを供すること、次いで、サイズ選択技術（例えば、限外濾過またはサイズ排除クロマトグラフィー）によって、夾雑物からミセルを分離することによって、低分子量の夾雑物からリポペプチドを精製する工程を包含する。本発明の別の実施形態では、この方法は、リポペプチドがミセルを形成する条件に対してリポペプチドを供すること、次いで、サイズ選択技術によってそれらを濃縮することによって、リポペプチドを濃縮する工程を包含する。より好ましい実施形態では、この方法は、単一工程として、精製および濃縮の両方を包含する。
【００９７】
本発明の別の実施形態では、この方法は、リポペプチドが単量体である条件に対してリポペプチドを供すること、次いで、サイズ分離技術によって高分子量の夾雑物から単量体リポペプチド溶液を分離することによって、高分子量の夾雑物（発熱物質（例えば、リポポリサッカリド）を含む）からリポペプチドを精製する工程を包含する。好ましい実施形態では、サイズ分離技術は、上記に考察されたような限外濾過である。別の好ましい実施形態では、リポペプチドは、ダプトマイシンまたは関連リポペプチド（例えば、Ａ５４１４５、前出に開示されたダプトマイシン関連リポペプチド、またはＡ−２１９７８抗生物質（ここで、ダプトマイシンのｎ−デカノイル脂肪酸側鎖は、ｎ−オクタノイル脂肪酸側鎖、ｎ−ノナノイル脂肪酸側鎖、ｎ−ウンデカノイル脂肪酸側鎖、ｎ−ドデカノイル脂肪酸側鎖、ｎ−トリデカノイル脂肪酸側鎖、またはｎ−テトラデカノイル脂肪酸側鎖によって置換されている））である。さらにより好ましい実施形態において、リポペプチドはダプトマイシンである。
【００９８】
ダプトマイシンを精製するための、ミセルを使用するプロセスクロマトグラフィー方法の好ましい実施形態を、以下に記載する：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓを、上記のようなｎ−デカン酸の食餌と共に発酵する。発酵後、細胞外溶液を上記のように浄化する。
【００９９】
次いで、浄化された調製物を、上記のような陰イオン交換樹脂（例えば、ＦＰ−ＤＡ１３）に適用する。ダプトマイシンを、３００〜５００ｍＭのＮａＣｌを含む１〜３カラム容量の高塩緩衝液を用いて、このカラムから溶出する。
【０１００】
溶出されたダプトマイシン調製物を、酸を使用して２．５〜５．０のｐＨへと調整する。好ましい実施形態では、酸は希リン酸である。２．５〜４．７のｐＨ、３００〜５００ｍＭのＮａＣｌおよび２〜１５℃の温度にて、ダプトマイシンはミセルを形成する。
【０１０１】
ダプトマイシン調製物を、１０，０００〜３０，０００ＮＭＷの限外濾過膜にて濾過する。限外濾過の間に、ダプトマイシン調製物を、３０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）を含有する緩衝液を用いて、そして１５℃までの温度にて洗浄する。最初の塩濃度は、溶出条件に起因して３００ｍＭのＮａＣｌであるが、この塩濃度は、洗浄を継続するにつれて減少する。ダプトマイシンはミセルの形態であるので、ダプトマイシンはフィルター上に保持されるが、１０，０００〜３０，０００（使用されるフィルターに依存する）よりも小さな不純物はフィルターを通過する。得られるダプトマイシン調製物は、約８５〜９０％純粋である。
【０１０２】
任意の工程として、ダプトマイシン調製物を希釈し、そしてそのｐＨを６．５まで上昇させて、ダプトマイシンを単量体状態へと転換し得る。次いで、ダプトマイシン調製物を、１０，０００ＮＭＷ限外濾過膜を通過させる。この任意の工程は、発熱物質含量を有意に減少させる。
【０１０３】
（ダプトマイシンの純度を分析する方法）
本発明の別の実施形態は、ダプトマイシンの純度を測定する分析方法を提供する。
【０１０４】
先行技術において、ダプトマイシンと共に同時精製される多くの夾雑物が未解決であるか、または同定されていなかった。なぜなら、不純物を可視化および測定する能力が、利用可能な分析方法および装置によって制限されていたからである。例えば、米国特許第４，８７４，８４３号およびＫｉｒｓｃｈら、を参照のこと。より高感度な分析的ＨＰＬＣシステムおよび技術の開発によって、先行技術の方法によって調製されたダプトマイシンバッチ中に存在する多くの夾雑物の解明が可能となる。より解像度の高いＨＰＬＣ方法によって、先行技術の方法により精製されたダプトマイシンは、先行技術の方法の実施の間にダプトマイシンと共に同時精製される（そして、以前に確立されていたＨＰＬＣ検出条件下で同時溶出される）、以前に同定されていた不純物（例えば、アンヒドロダプトマイシンおよびβ−異性体）、および他の以前には未知であった夾雑物で夾雑されていることが示される。これらの夾雑物の同定により、現在、これらの夾雑物を排除するように設計される方法の開発が可能とされる。
【０１０５】
上記に考察したように、アンヒドロダプトマイシンおよびβ−異性体は、ダプトマイシン調製の間に持続的かつ一貫して生じる不純物として、以前に記載されていた。本明細書中に記載のＨＰＬＣ分析を使用して、ダプトマイシン生成の間に生成されるさらなる約１２個の不純物が識別された。これらのいくつかは、以前には同定されていなかった。これらの不純物は、米国特許第４，８７４，８４３号に開示された方法による精製後に取り除かれなかった。これらの化合物のうちの少なくとも１０個が同定された（例えば、図２〜１１を参照のこと）。さらに、これらの化合物のうちの少なくとも６個は、アンヒドロダプトマイシンおよびダプトマイシンのβ−異性体形態を生成する反応の直接的な結果ではなく、ダプトマイシンの発酵または精製の間に生じる関連のない他のプロセスによって生成された化合物である。以下に記載される本発明の方法はまた、これらの多くの不純物のレベルを有意に減少させる（実施例を参照のこと）。
【０１０６】
当該分野において公知の任意の方法を使用して、ダプトマイシン調製物中の他の化合物の量を測定し得る。ダプトマイシン夾雑物を同定する方法としては、質量分析法、赤外分光学、キャピラリー電気泳動、および核磁気共鳴分光学が挙げられるが、これらに限定されない。ダプトマイシン調製物中の他の化合物の量を測定する好ましい方法は、ＨＰＬＣである。
【０１０７】
２つの方法を使用して、本発明においてダプトマイシン不純物を測定した。第１の方法は、第２の方法よりもわずかに低い解像方法である。両方の方法において、ＳｈｉｍａｄｚｕまたはＨＰＨＰＬＣＳｙｓｔｅｍ（ＰＥＮｅｌｓｏｎ’ｓＴｕｒｂｏｃｈｒｏｍＳｏｆｔｗａｒｅＶｅｒｓｉｏｎ４．１を備える）を使用する。「第１」の解像方法を、表１にまとめる。そして「第２」の解像方法を、表２にまとめる。
【０１０８】
（表１）
１．溶媒送達システム：モード：イソクラティックポンピング流量：１．５ｍＬ／分実行時間：３０分。
【０１０９】
２．溶媒Ａ：０．５％ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４中３４％アセトニトリル（ｐＨ４．５）
溶媒Ｂ：０．５％ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４中２０％アセトニトリル（ｐＨ４．５）
標的条件は、１５．０±０．５分でダプトマイシンを保持することである。溶媒Ｂは、溶媒Ａとともに使用して、ＨＰＬＣ移動相条件を調整して所望の保持時間を達成し得る。
【０１１０】
３．オートサンプラークーラー：５（４〜６）℃４．注入体積：５μＬ〜７５μＬ（通常２０μＬ）
５．カラム：ＩＢ−ＳＩＬ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、Ｃ−８、５μ、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ（もしくは等価物）
６．プレカラム：ＩＢ−ＳＩＬ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、Ｃ−８、５μ、４．６ｍｍ×３０ｍｍ（もしくは等価物）
７．検出波長：２１４ｎｍ８．カラム温度：室温９．積分：ピーク面積を測定し得るコンピューターシステムもしくは積分計。
【０１１１】
（表２）
１．溶媒送達システム：モード：イソクラティックポンピング流量：１．５ｍＬ／分実行時間：７５分。
【０１１２】
２．溶媒Ａ：０．４５％ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４中２０％アセトニトリル（ｐＨ３．２５）
溶媒Ｂ：０．４５％ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４中５０％アセトニトリル（ｐＨ３．２５）
標的条件は、３６．０±１．５分でダプトマイシンを保持するための、０．４５％ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４中約３５％アセトニトリル（ｐＨ３．２５）（５０％溶媒Ｂ）である。しかし、この溶媒比は、ＨＰＬＣ移動相条件を調整して所望の保持時間を達成するように使用される。
【０１１３】
３．オートサンプラークーラー：５（４〜６）℃４．注入体積：５μＬ〜７５μＬ（通常２０μＬ）
５．カラム：ＩＢ−ＳＩＬ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、Ｃ−８、５μ、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ（もしくは等価物）
６．プレカラム：ＩＢ−ＳＩＬ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、Ｃ−８、５μ、４．６ｍｍ×３０ｍｍ（もしくは等価物）
７．検出波長：２１４ｎｍ８．カラム温度：２５（２２〜２８）℃９．積分：ピーク面積を測定し得るコンピューターシステムもしくは積分計。
【０１１４】
（精製リポペプチド、その薬学的組成物および使用方法）
本発明の別の目的は、精製リポペプチド、ならびにその塩、エステル、アミド、エーテルおよび保護形態、ならびに精製リポペプチドもしくはその塩を含む薬学 的処方物を提供することである。好ましい実施形態において、そのリポペプチドは、上記のようなダプトマイシンもしくはダプトマイシン関連リポペプチドであ る。本発明のさらなる目的は、リポペプチドミセル型配置を含む薬学的組成物を提供することである。好ましい実施形態において、そのリポペプ チドミセルは、ダプトマイシンもしくは１つ以上のダプトマイシン関連リポペプチドを含む、ミセルである。リポペプチドミセルに対する本明細書中におけるす べての言及は、すべてのリポペプチドミセル型配置を言うだけでなく、ダプトマイシンもしくは関連リポペプチド（例えば、Ａ５４１４５（上記 で開示されたダプトマイシン関連リポペプチド）またはＡ−２１９７８抗生物質）を特に意図し、その関連リポペプチドにおいて、ダプトマイシンのｎ−デカノ イル脂肪酸側鎖が、ｎ−オクタノイル脂肪酸側鎖、ｎ−ノナノイル脂肪酸側鎖、ｎ−ウンデカノイル脂肪酸側鎖、ｎ−ドデカノイル脂肪酸側鎖、ｎ−トリデカノ イル脂肪酸側鎖またはｎ−テトラデカノイル脂肪酸側鎖により置換される。さらに、リポペプチドミセル型配置に対する本明細書中におけるすべての言及は、上記のような、球状ミセルもしくは混合ミセルおよびリポソームを特に意図する。
【０１１５】
精製リポペプチド、その薬学的に受容可能な塩、またはリポペプチドミセルが、疾患（特に細菌感染）の治療処置もしくは予防処置のための、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、エアロゾル投与、局所投与または非経口投与のために処方され得る。好ましい実施形態において、その精製リポペプチドは、精製ダプトマイシンもしくはダプトマイシン関連リポペプチドである。「精製ダプトマイシン」、「精製ダプトマイシン関連リポペプチド」または「精製リポペプチド」に対する本明細書中における言及は、それらの薬学的に受容可能な塩を含む。ダプトマイシン、ダプトマイシン関連リポペプチドまたは他のリポペプチドのミセルが、ダプトマイシンもしくは目的のリポペプチドと適合可能な、任意の薬学的に受容可能なキャリアもしくは賦形剤を使用して、処方され得る。例えば、ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＡｄｄｉｔｉｖｅｓ：ＡｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＧｕｉｄｅｔｏＭｏｒｅｔｈａｎ６０００ＰｒｏｄｕｃｔｓｂｙＴｒａｄｅＮａｍｅ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄＭａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ、ＡｓｈｇａｔｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．、Ｍ．ＡｓｈａｎｄＩ．Ａｓｈ編、１９９６；ＴｈｅＭｅｒｃｋＩｎｄｅｘ：ＡｎＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＣｈｅｍｉｃａｌｓ，ＤｒｕｇｓａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｓ．Ｂｕｄａｖａｒｉ編、年鑑；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ；Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ：ＴｈｅＣｏｍｐｌｅｔｅＤｒｕｇＲｅｆｅｒｅｎｃｅ、Ｋ．Ｐａｒｆｉｔｔ編、１９９９；ならびにＧｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓＴｈｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＢａｓｉｓｏｆＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＰｅｒｇａｍｏｎＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ、Ｌ．Ｓ．Ｇｏｏｄｍａｎら編（これらの内容は、ヒト治療のために種々の抗菌剤を投与するための方法の一般的説明のために、本明細書中に参考として援用される）。本発明の精製ダプトマイシン、ダプトマイシン関連リポペプチドまたは他のリポペプチドのミセルは、従来の薬学的キャリアおよび賦形剤と混合され得、そして錠剤、カプセル、エリキシル、懸濁物、シロップ、ウエファー（ｗａｆｅｒ）、クリームなどの形態で使用され得る。ダプトマイシン、ダプトマイシン関連リポペプチドまたは他のリポペプチドのミセルが、本明細書中で説明されるような、他の治療剤および抗生物質と混合され得る。本発明の化合物を含む組成物は、約０．１重量％〜約９０重量％の活性化合物を含み、そしてより一般的には約１０％〜約３０％を含む。
【０１１６】
本発明の組成物は、制御放出送達系（例えば、カプセル）または徐放送達系（例えば、生体侵食可能な（ｂｉｏｅｒｏｄａｂｌｅ）マトリックス）を使用して送達され得る。本発明の組成物の投与に適切な薬物送達のための例示的な遅延放出送達系は、米国特許第４，４５２，７７５号（Ｋｅｎｔに対して発行）、同第５，２３９，６６０号（Ｌｅｏｎａｒｄに対して発行）、同第３，８５４，４８０号（Ｚａｆｆａｒｏｎｉに対して発行）に記載される。
【０１１７】
この組成物は、一般的キャリアおよび賦形剤（例えば、コーンスターチもしくはゼラチン、ラクトース、スクロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウムおよびアルギン酸）を含み得る。この組成物は、クロスカルメロース（ｃｒｏｓｃａｒｍｅｌｌｏｓｅ）ナトリウム、微結晶性セルロース、コーンスターチ、グリコレートスターチナトリウムおよびアルギン酸を含み得る。
【０１１８】
含まれ得る錠剤結合剤は、アカシア、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン（Ｐｒｏｖｉｄｏｎｅ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロース、スターチおよびエチルセルロースである。
【０１１９】
使用され得る潤沢剤としては、ステアリン酸マグネシウムまたは他のステアリン酸金属、ステアリン酸、シリコーン液、滑石、ロウ、油およびコロイド状シリカが挙げられる。
【０１２０】
香味剤（例えば、ペパーミント、ウインターグリーン油、サクランボ香料など）もまた、使用され得る。投薬形態を見かけ上もっと美しくするためまたは製品を識別するために、着色剤を添加することもまた、望ましくあり得る。
【０１２１】
経口用途のために、固体処方物（例えば、錠剤およびカプセル）が特に有用である。徐放調製物もしくは腸溶性調製物もまた、考案され得る。小児適用および老年適用のために、懸濁物、シロップおよび咀嚼錠が、特に適切である。経口投与のために、その薬学的組成物は、例えば、錠剤、カプセル、懸濁物もしくは液体の形態である。その薬学的組成物は、治療上有効な量の活性成分を含む投薬単位形態で、好ましくは作製される。このような投薬単位の例は、錠剤およびカプセルである。治療目的のために、その錠剤およびカプセルは、活性成分に加えて、従来のキャリア（例えば、結合剤（例えば、アラビアゴム、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ソルビトールまたはトラガカントゴム）；充填剤（例えば、リン酸カルシウム、グリシン、ラクトース、トウモロコシデンプン、ソルビトール、またはスクロース）；潤沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、シリカ、もしくは滑石）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプン）、香味剤もしくは着色剤、あるいは受容可能な湿潤剤）を含み得る。経口液体調製物は、一般に、水性もしくは油状の、溶液、懸濁物、乳濁物、シロップもしくはエリキシルの形態であり、そして、従来の添加剤（例えば、懸濁剤、乳化剤、非水性剤、保存剤、着色剤および香味剤）を含み得る。経口液体調製物は、リポペプチドミセルまたはこのリポペプチドのモノマー形態を含み得る。液体調製物のための添加剤の例としては、アカシア、アーモンド油、エチルアルコール、分留ココナッツ油、ゼラチン、グルコースシロップ、グリセリン、水素化食用油、レシチン、メチルセルロース、メチルｐａｒａ−ヒドロキシベンゾエートもしくはプロピルｐａｒａ−ヒドロキシベンゾエート、プロピレングリコール、ソルビトール、もしくはソルビン酸が挙げられる。
【０１２２】
静脈内（ＩＶ）用途のために、水溶性形態のダプトマイシン、ダプトマイシン関連リポペプチドもしくは他のリポペプチドが、一般的に使用される静脈内液のいずれかに溶解され得、そして注入により投与され得る。リポペプチドミセルのために、このリポペプチドは、そのリポペプチドがそのｃｍｃを超える濃度で存在する条件下で、静脈内処方物中に溶解される。当業者は、本発明の教示に従って、ｐＨ、温度、もしくは塩濃度を変化して、リポペプチドミセルを含む静脈内溶液を入手し得る。さらに、リポペプチドリポソームを得るために、そのリポペプチド溶液を超音波処理し得る。静脈内処方物としては、キャリア、賦形剤もしくは安定剤（カルシウム、ヒト血清アルブミン、シトレート、アセテート、塩化カルシウム、カルボネート、および他の塩を含むが、これらに限定されない）が挙げられ得る。静脈内液としては、生理食塩水もしくはリンゲル溶液が挙げられるが、これらに限定されない。ダプトマイシンもしくはダプトマイシン関連リポペプチドはまた、注入器、カニューレ、カテーテルおよびラインに配置され得る。
【０１２３】
非経口投与のための処方物は、水性もしくは非水性の、等張性の滅菌した、注射溶液もしくは注射懸濁物の形態であり得る。これらの溶液もしくは懸濁物は、経口投与のための処方物中における使用のために言及されるキャリアのうちの１つ以上を有する滅菌した粉末もしくは顆粒から調製され得る。リポペプチドミセルは、非経口投与のために特に望ましくあり得る。この化合物は、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、コーン油、ベンジルアルコール、塩化ナトリウム、および／または種々の緩衝剤中に溶解され得る。筋肉内調製物のために、リポペプチド化合物の滅菌処方物もしくはこの化合物の適切な可溶性塩形態（例えば、塩酸塩）の滅菌処方物が、薬学的希釈剤（例えば、注射用水（ＷＦＩ）、生理食塩水、または５％グルコース）中に溶解され得そして投与され得る。
【０１２４】
リポペプチドミセルは、非経口投与に特に望ましくあり得る。なぜなら、これは、注入部位で局所刺激をおそらく引き起こさないからである。いかなる理論によって束縛されることも望まないが、リポペプチドミセルは、脂質テール（注入の際に刺激を生じ得る）がそのミセルの内部にて封鎖され、一方でそのペプチドの核（脂質テールよりも局所刺激を引き起こす可能性が低い）が組織に対して露出されるので、モノマーリポペプチドよりも弱い局所刺激しか引き起こさない可能性が高い。リポペプチドミセルは、リポペプチドミセルを含む調製物を得るための本発明の教示に従うことによって、筋肉内調製物および非経口調製物のために調製され得る。さらに、リポペプチドリポソームを得るために、そのリポペプチド溶液を超音波処理し得る。その化合物の適切な不溶性形態はまた、水性基剤もしくは薬学的に受容可能な油基剤（例えば、オレイン酸エチルのような、長鎖脂肪酸のエステル）中に懸濁物として調製され得、そして投与され得る。
【０１２５】
注射可能な蓄積物形態が、生分解性ポリマー（例えば、ポリラクチド−ポリグリコリド）中にこの化合物の微小カプセル化マトリックスを形成することによって作製され得る。ポリマーに対する薬物の比および使用される特定のポリマーの性質に依存して、薬物放出速度が制御され得る。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルソエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。蓄積注射可能な処方物もまた、身体組織と適合可能な微小乳濁物中に薬物を捕捉することによって調製される。
【０１２６】
局所用途のために、本発明の化合物およびミセルはまた、皮膚、または鼻および喉の粘膜に適用されるのに適切な形態で調製され得、そしてクリーム、軟膏、液体スプレーもしくは吸入剤、ロゼンジ、または喉ペイント（ｔｈｒｏａｔｐａｉｎｔ）の形態を取り得る。このような局所処方物はさらに、活性成分の表面浸透を促進するために、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような化合物を含み得る。局所調製物のために、ダプトマイシンの滅菌処方物、ダプトマイシン関連リポペプチドの滅菌処方物、その適切な塩形態の滅菌処方物またはリポペプチドミセルの滅菌処方物が、クリーム、軟膏、スプレーもしくは他の局所ドレッシング中にて投与され得る。局所調製物はまた、精製ダプトマイシン、ダプトマイシン関連リポペプチドもしくはリポペプチドミセル組成物を浸透させられた、包帯の形態であり得る。
【０１２７】
眼または耳への適用のために、本発明の化合物は、軟膏、クリーム、ローション、ペイントもしくは粉末として、疎水性基剤もしくは親水性基剤中に処方された、液体形態もしくは半液体形態で提示され得る。
【０１２８】
直腸投与のために、本発明の化合物は、従来のキャリア（例えば、ココアバター、ロウまたは他のグリセリド）と混合された坐剤の形態で、投与され得る。
【０１２９】
エアロゾル調製物のために、精製ダプトマイシンの滅菌処方物またはダプトマイシン関連リポペプチドの滅菌処方物またはこの化合物の塩形態の滅菌処方物が、吸入器（例えば、計測用量吸入器）および噴霧器にて使用され得る。リポペプチドミセルの滅菌処方物もまた、エアロゾル調製物のために使用され得る。エアロゾル化形態が、呼吸器感染（例えば、肺炎および洞に基づく感染）を処置するために特に有用であり得る。
【０１３０】
あるいは、本発明の化合物は、送達時に適切な薬学的に受容可能なキャリア中で再構成するための粉末形態であり得る。この粉末形態がリポペプチドミセルとして再構成される場合、この粉末は、特定の量の滅菌水もしくは滅菌生理食塩水で再構成するとそのリポペプチドがミセルを形成するように、緩衝剤および／または塩を含み得る。あるいは、この粉末形態は、ミセルを得るためにそのリポペプチドを再構成するために使用されるべき、薬学的に受容可能なキャリアの量および種類に関する指示を含み得る。別の実施形態において、その化合物の単位投薬形態は、滅菌した密封アンプル中にある適切な希釈液中の、その化合物の溶液、その塩の溶液もしくはリポペプチドミセルの溶液であり得る。単位投薬量のその化合物の濃度は、使用される化合物およびその溶解度、ならびに医師により所望される用量に依存して、例えば、約１％から約５０％まで変動し得る。その組成物が投薬単位を含む場合、各投薬単位は、５０ｍｇから５００ｍｇまでの活性物質を好ましくは含む。成体ヒト処置のために、使用される投薬量は、投与の経路および頻度に依存して、好ましくは１日あたり１００ｍｇから３ｇまでの範囲である。
【０１３１】
さらなる局面において、本発明は、ヒトおよび他の動物において、感染（特にグラム陽性細菌により引き起こされる感染）を処置するための方法を提供する。用語「処置する」は、感染の予防と、宿主動物が感染した後の確立した感染の制御の両方を示すために使用される。確立した感染は、急性感染でもあり得るし、もしくは慢性感染でもあり得る。その方法は、有効用量の本発明の化合物を、ヒトもしくは他の動物に投与する工程を包含する。有効用量は、一般には、精製ダプトマイシン、ダプトマイシン関連リポペプチドもしくはその薬学的に受容可能な塩１ｋｇあたり、約０．１ｍｇ〜約２５ｍｇである。このダプトマイシンもしくはダプトマイシン関連リポペプチドは、モノマーであり得るし、またはリポペプチドミセルの一部であり得る。好ましい用量は、精製ダプトマイシンもしくはダプトマイシン関連リポペプチドまたはそれらに薬学的に受容可能な塩１ｋｇあたり、約１ｍｇから約２５ｍｇまでである。より好ましい用量は、精製ダプトマイシンまたはそれらに薬学的に受容可能な塩１ｋｇあたり、約１ｍｇから約１２ｍｇまでである。
【０１３２】
１実施形態において、本発明は、被験体において、治療有効量のダプトマイシンまたは他の抗菌性リポペプチドを用いて、感染（特にグラム陽性細菌によって引き起こされる感染）を処置するための方法を提供する。ダプトマイシンまたは抗菌性リポペプチドは、モノマーであるか、またはリポペプチドのミセルの状態であり得る。抗菌剤を送達するための例示的な手順は、Ｒｏｇｅｒに発光された米国特許第５，０４１，５６７号およびＰＣＴ特許出願番号ＥＰ９４／０２５５２号（公開番号ＷＯ９５／０５３８４）（これらの文献の内容全体は、本明細書中でその全体が参考として引用されている）に記載されている。本明細書中で使用される場合、句「治療有効量」は、細菌感染の発病を防止するか、症状を緩和するか、進行を止める、本発明の従ったダプトマイシンまたは抗菌性リポペプチドの量を意味する。用語「処置（する）」は、本発明の治療有効量の化合物を被験体に投与して、感染の発生を防止し、そして感染を制御または排除するものとして規定される。本明細書中で記載される場合、用語「被験体」は、哺乳動物、植物または細胞培養物として規定される。好ましい実施形態において、被験体は、リポペプチド化合物での処置が必要なヒト患者または他の動物患者である。
【０１３３】
リポペプチド抗菌性化合物は、１日に単一の用量でかまたは１日に複数の用量で投与され得る。この処置レジメンは、長期間（例えば、数日または２〜４週間） にわたる投与を必要とし得る。１回の投与された用量当たりの量または投与された全部の量は、感染の性質および重篤度、患者の年齢および全体的な健康、抗生 物質に対する患者の許容性、および感染に関連する微生物、のような因子に依存する。投与方法は、ＰＣＴ出願ＷＯ００／１８４１９に開示される。
【０１３４】
本発明の方法は、精製されたダプトマイシンもしくは他のリポペプチド抗生物質、またはそれらの薬学的組成物を、グラム陽性細菌の感染を減少または排除するのに有効な量で、それらを必要とする患者に投与する工程を包含する。ダプトマイシンまたはリポペプチド抗生物質は、モノマーであり得るか、またはリポペプチドのミセルの状態で存在し得る。この抗生物質は、経口投与され得るか、吸入投与、局所投与、直腸投与、経鼻投与、経頬投与、経膣投与によるか、または移植されたレザバ、外部ポンプもしくはカテーテルによって非経口で投与され得る。抗生物質は、眼での使用またはエアロゾル化した使用のために調製され得る。精製されたダプトマイシン、リポペプチド抗生物質、またはそれらの薬学的組成物はまた、膿瘍、室または関節に直接的に注射または投与され得る。非経口投与としては、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、槽内、髄腔内、肝臓内、病変内および頭蓋内の注射または注入が挙げられる。好ましい実施形態において、ダプトマイシンまたは他のリポペプチドは、静脈内、皮下または経口的に投与される。
【０１３５】
本発明の方法は、感染が任意の型のグラム陽性細菌によって発生または悪化される、細菌感染を有する患者を処置するために使用され得る。好ましい実施形態において、精製されたダプトマイシン、ダプトマイシン関連リポペプチド、他のリポペプチドまたはそれらの薬学的組成物が、本発明の方法に従って患者に投与される。別の好ましい実施形態において、細菌感染は、細菌によって発生または悪化され得、この細菌としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：メチシリン感受性ブドウ球菌およびメチシリン耐性ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、および凝固酵素陰性ブドウ球菌を含む）、グリコペプチド移動感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ（ＧＩＳＡ）、ペニシリン感受性連鎖球菌およびペニシリン耐性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｌｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｖｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓａｎｇｉｕｓおよびＣ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｇ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉおよびビィリダンス型連鎖球菌）、腸球菌（ＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃｉｕｍのような、バンコマイシン感受性株およびバンコマイシン耐性株を含む）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｌｏｓｔｒｉｄｆｉｆｏｒｍｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｉｎｎｏｃｕｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｒａｍｏｓｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｊｅｉｋｅｉｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐｐ．、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｆｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐｐ．、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｓｐｐ．、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｌｏｃｏｃｃｕｓａｎａｅｒｏｂｉｕｓ、Ｐｅｐｌｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｓａｃｃａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍａｇｎｕｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｉｃｒｏｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｒｅｖｏｔｉｉ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｒｏｄｕｃｔｕｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｎｅｓ、ならびにＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｓｐｐ。
【０１３６】
古典的「耐性」株に対するダプトマイシンの抗菌活性は、古典的「感受性」株に対する活性と、インビトロ実験において匹敵する。さらに、感受性株に対する、ダプトマイシンの最小阻止濃度（ＭＩＣ）値は、代表的に、バンコマイシンの値の１／４以下である。従って、好ましい実施形態において、精製されたダプトマシン、ダプトマシン関連リポペプチド抗生物質、またはそれらの薬学的組成物は、バンコマイシンを含む他の抗生物質に対して耐性である細菌感染を示す患者に、本発明の方法に従って投与される。さらに、グリコペプチド抗生物質とは異なり、ダプトマイシンは、グラム陽性生物に対して迅速な濃度依存的な細菌活性を示す。従って、好ましい実施形態において、精製されたダプトマシン、リポペプチド抗生物質、またはそれらの薬学的組成物は、迅速に作用する抗生物質治療の必要がある患者に、本発明の方法に従って投与される。
【０１３７】
本発明の方法は、身体の任意の器官または組織のグラム陽性細菌感染に使用するために使用され得る。これらの生物または組織としては、骨格筋、皮膚、血流、腎臓、心臓、肺および骨が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法は、皮膚および軟部組織の感染、菌血および尿路感染症（これに限定されない）を処置するために使用され得る。本発明の方法は、市中呼吸感染（中耳炎、静脈洞炎、慢性気管支炎および肺炎（薬物耐性ＳｔｒｅｐｔｏｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）によって引き起こされる肺炎を含むが、これに限定されない）を処置するために使用され得る。本発明の方法はまた、異なるタイプのグラム陽性細菌を含むか、またはグラム陽性細菌とグラム陰性細菌の両方（好気性、糞性もしくは嫌気性の細菌を含む）を含む、混合性感染を処置するために使用され得る。これらのタイプの感染としては、腹腔内感染および産科学的感染／婦人科学的感染が挙げられる。本発明の方法は、院内感染（肺炎、腹腔内敗血症、皮膚および軟部組織の感染ならびに骨および関節の感染が挙げられるが、これらに限定されない）のためのステップダウン（ｓｔｅｐ−ｄｏｗｎ）治療において使用され得る。本発明の方法はまた、感染（心内膜炎、腎炎、敗血症性関節炎および骨髄炎が挙げられるが、これらに限定されない）を処置するために使用され得る。好ましい実施形態において、上記の任意の疾患が、精製したダプトマイシン、リポペプチド抗生物質、またはそれらの薬学的組成物を使用して処置され得る。さらに、この疾患は、モノマー形態またはミセル形態のいずれかで、ダプトマシンまたはリポペプチド抗生物質を使用して処置され得る。
【０１３８】
ダプトマイシン、ダプトマイシン関連リポペプチドまたは他のリポペプチドはまた、患者または動物の食事または食餌中にて投与され得る。全食事摂取の一部として投与される場合、ダプトマイシンまたは他のリポペプチドの量は、食事の重量の約１％未満であり得、そして好ましくは、重量の０．５％以下であり得る。動物の食餌は、普通の食材であり得、これに、ダプトマイシンまたはリポペプチドが添加され得るか、または予め混合されたものに添加され得る。
【０１３９】
本発明の方法はまた、実行され得る一方で、１以上の抗真菌剤および／またはダプトマイシンあるいは他のリポペプチド抗生物質以外の１以上の抗生物質が同時に投与され得る。抗真菌剤およびダプトマイシンまたは他のリポペプチド抗生物質以外の抗生物質の同時投与は、混合性感染（例えば、異なるタイプのグラム陽性細菌によって引き起こされる感染、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の両方によって引き起こされる感染、または細菌および真菌の両方によって引き起こされる感染）のために使用され得る。さらに、ダプトマイシンまたは他のリポペプチド抗生物質は、１以上の同時に投与された抗生物質の毒性プロフィールを改良し得る。ダプトマイシンおよびアミノグリコシドの投与は、アミノグリコシドのよって引き起こされる腎毒性を寛解させる得ることが示されている。好ましい実施形態において、抗生物質および／または抗真菌剤は、精製されたダプトマイシン、他のリポペプチド抗生物質と共にか、または精製されたダプトマイシンもしくは別のリポペプチド抗生物質を含む薬学的組成物中で、同時に投与され得る。
【０１４０】
ダプトマイシンまたは別のリポペプチド抗生物質を含む別の治療剤の同時投与は、ダプトマイシンまたはリポペプチド抗生物質を使用して、モノマー形態またはミセル形態のいずれかで実施され得る。上記のように、球状のリポペプチドのミセルは、低い水溶性を示す薬剤剤を可溶化するのを補助するために使用され得る。さらに、リポペプチドリポソームは、リポソームの小胞内の水性媒体中で可溶性である、薬剤を捕捉するために使用され得る。本明細書の教示に従って、当業者は、治療剤（例えば、抗炎症剤、抗真菌剤および他の抗生物質）を含むリポペプチドミセルを製造し得る。
【０１４１】
ダプトマイシンまたは他のリポペプチド抗生物質と共に同時投与され得る、抗菌剤およびそれらの種類としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ペニシリンおよび関連する薬物、カルバペネム（ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ）、セファロスポリンおよび関連する薬物、アミノグリコリド、バシトラシン、グラミシジン、ムピロシン、クロラムフェニコール、チアンフェニコール、フシジン酸ナトリウム、リンコマイシン、クリンダマイシン、マクロライド、ノボビオシン、ポリミキシン、リファマイシン、スペクチノマイシン、テトラサイクリン、バンコマイシン、テイコプラニン、ストレプトグラミン（ｓｔｒｅｐｔｏｇｒａｍｉｎ）、抗葉酸剤（スルホンアミド、トリメトプリムおよびそれらの組み合わせ、ならびにピリメタミンを含む）、合成抗菌剤（ニトロフラン、マンデル酸メテナミンおよび馬尿酸メテナミンを含む）、ニトロイミダゾール、キノロン類、フルオロキノロン類、イソニアジド、エタンブトール、ピラジンアミド、パラ−アミノサリチル酸（ＰＡＳ）、シクロセリン、カプレオマイシン、エチオナミド、プロチオナミド（ｐｒｏｔｈｉｏｎａｍｉｄｅ）、チオアセタゾン、バイオマイシン、エベミノマイシン（ｅｖｅｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、グリコペプチド、グリシルサイクリン（ｇｌｙｃｙｌｃｙｌｃｌｉｎｅ）、ケトリド（ｋｅｔｏｌｉｄｅ）、オキサゾリジオン、イミペネム、アミカシン、ネチルマイシン、ホスホマイシン、ゲンタマイシン、セフトリアキソン、ジラシン（Ｚｉｒａｃｉｎ）、ＬＹ３３３３２８、ＣＬ３３１００２、ＦＭＩＲ３６４７、リネゾリド（Ｌｉｎｅｚｏｌｉｄ）、シネルシド（Ｓｙｎｅｒｃｉｄ）、アズトレオナム（Ａｚｔｒｅｏｎａｍ）、およびメトロニダゾール（Ｍｅｔｒｏｎｉｄａｚｏｌｅ）、エピロプリム（Ｅｐｉｒｏｐｒｉｍ）、ＯＣＡ−９８３、ＧＶ−１４３２５３、サンフェトリネウムナトリウム（Ｓａｎｆｅｔｒｉｎｅｍｓｏｄｉｕｍ）、ＣＳ−８３４、ビアペネム（Ｂｉａｐｅｎｅｍ）、Ａ−９９０５８．１、Ａ−１６５６００、Ａ−１７９７９６、ＫＡ１５９、ジネミシンＡ（ＤｙｎｅｍｉｃｉｎＡ）、ＤＸ８７３９、ＤＵ６６８１；セフルプレナム（Ｃｅｆｌｕｐｒｅｎａｍ）、ＥＲ３５７８６、セフォセリス（Ｃｅｆｏｓｅｌｉｓ）、サンフェトリネウムセレキセチル（Ｓａｎｆｅｔｒｉｎｅｍｃｅｌｅｘｅｔｉｌ）、ＨＧＰ−３１、セフピロム（Ｃｅｆｐｉｒｏｍｅ）、ＨＭＲ−３６４７、ＲＵ−５９８６３、メルサシジン（Ｍｅｒｓａｃｉｄｉｎ）、ＫＰ７３６、リファラジル（Ｒｉｆａｌａｚｉｌ）；コサン（Ｋｏｓａｎ）、ＡＭ１７３２、ＭＥＮ１０７００、レナペネム（Ｌｅｎａｐｅｎｅｍ）、ＢＯ２５０２Ａ、ＮＥ−１５３０、ＰＲ３９、Ｋ１３０、ＯＰＣ２００００、ＯＰＣ２０４５、ベネプリム（Ｖｅｎｅｐｒｉｍ）、ＰＤ１３８３１２、ＰＤ１４０２４８、ＣＰ１１１９０５、スロペネム（Ｓｕｌｏｐｅｎｅｍ）、リチペナムアコキシル（ｒｉｔｉｐｅｎａｍａｃｏｘｙｌ）、ＲＯ−６５−５７８８、シクロチアジリン（Ｃｙｃｌｏｔｈｉａｌｉｄｉｎｅ）、Ｓｃｈ−４０８３２、ＳＥＰ−１３２６１３、ミカコシジンＡ（ｍｉｃａｃｏｃｉｄｉｎＡ）、ＳＢ−２７５８３３、ＳＲ−１５４０２、ＳＵＮＡ００２６、ＴＯＣ３９、カルモナム、セフォゾプラン（Ｃｅｆｏｚｏｐｒａｎ）、セファタメトピボキシル（Ｃｅｆｅｔａｒｎｅｔｐｉｖｏｘｉｌ）、ならびにＴ３８１１。
【０１４２】
好ましい実施形態において、本発明に従ってダプトマイシンと共に同時投与され得る抗菌剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：イミペネム、アミカシン、ネチルマイシン、ホスホマイシン、ゲンタマイシン、セフトリアキソン、テイコプラニン、ジラシン（Ｚｉｒａｃｉｎ）、ＬＹ３３３３２８、ＣＬ３３１００２、ＨＭＲ３６４７、リネゾリド（Ｌｉｎｅｚｏｌｉｄ）、シネルシド（Ｓｙｎｅｒｃｉｄ）、アズトレオナム（Ａｚｔｒｅｏｎａｒｎ）、およびメトロニダゾール（Ｍｅｔｒｏｎｉｄａｚｏｌｅ）。
【０１４３】
ダプトマイシンまたは他のリポペプチド抗生物質と共に同時投与され得る抗真菌剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：カスポフンゲン（Ｃａｓｐｏｆｕｎｇｅｎ）、ボリコナゾール（Ｖｏｒｉｃｏｎａｚｏｌｅ）、セルタコナゾール（Ｓｅｒｔａｃｏｎａｚｏｌｅ）、ＩＢ−３６７、ＦＫ−４６３、ＬＹ−３０３３６６、Ｓｃｈ−５６５９２、シタフロキサシン（Ｓｉｔａｆｌｏｘａｃｉｎ）、ＤＢ−２８９ポリエン（例えば、アンホテリシン、ナイスタチン、プリマリシン（Ｐｒｉｍａｒｉｃｉｎ））；アゾール（例えば、フルコナゾール、イトラコナゾールおよびケトコナゾール）；アリルアミン（例えば、ナフチフィンおよびテルビナフィン）；ならびに代謝産物拮抗物質（例えば、フルシトシン）。他の抗真菌剤としては、ＦｏｓｔｅｌらのＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙＴｏｄａｙ５：２５−３２（２０００）（本明細書中で参考として援用される）に記載される薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。Ｆｏｓｔｅｌらは、以下を含む抗真菌剤を開示している：コリネカンジン、Ｍｅｒ−ＷＦ３０１０、フサカンジン（Ｆｕｓａｃａｎｄｉｎｓ）、アルトリキチン／ＬＬ（Ａｒｔｒｉｃｈｉｔｉｎ／ＬＬ）１５Ｇ２５６γ、ソルダリン（Ｓｏｒｄａｒｉｎｓ）、シスペンタシン（Ｃｉｓｐｅｎｔａｃｉｎ）、アゾキシバシリン（Ａｚｏｘｙｂａｃｉｌｌｉｎ）、アウレオバシジン（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ）およびクフラフンギン（Ｋｈａｆｒｅｆｕｎｇｉｎ）。
【０１４４】
ダプトマイシンまたは他のリポペプチド抗生物質（ダプトマイシン関連リポペプチドを含む）は、細菌の感染が根絶または減少させるまで、この方法に従って投与され得る。１実施形態において、ダプトマイシンまたは他のリポペプチドは、３日から６ヶ月の期間に投与される。好ましい実施形態において、ダプトマイシンまたは他のリポペプチドは、７日から５６日の間に投与される。より好ましい実施形態において、ダプトマイシンまたは他のリポペプチドは、７日から２８日の間に投与される。さらにより好ましい実施形態において、ダプトマイシンまたは他のリポペプチドは、７から１４日の間に投与される。ダプトマイシンまたは他のリポペプチドは、所望される場合、より長いかまたはより短い期間に投与され得る。
【０１４５】
本発明がより完全に理解され得るために、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、例示のみの目的のためであり、いかなるようにも本発明の範囲を減縮するとして解釈されるべきでない。
【０１４６】
（実施例１）
Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓＮＲＲＬ株１５９９８の発酵培養を、混入物の生成を最小にしながら、抗生物質の生成を最適にするレベルの制御されたデカン酸供給発酵において実施する。この残留デカン酸供給は、ガスクロマトグラフィーによって測定され、そして標的残留レベルは、誘導の開始（約時間３０）から回収まで、１０ｐｐｍのデカン酸である。培養物の遠心分離および清澄化ブロスの引き続く分析は、ＨＰＬＣによるダプトマイシンの生成を測定するために使用される。回収力価は、代表的に、発酵ブロス１リットルあたり２．１グラムと２．６グラムの間である。
【０１４７】
この発酵物は、Ｐａｌｌ−Ｓｅｐを使用する微細濾過または完全な商業規模の遠心分離およびデプスフィルター（ｄｅｐｔｈｆｉｌｔｅｒ）のいずれかによって、回収される。この清澄化ブロスは、陰イオン交換樹脂（ＭｉｔｓｕｂｉｓｈｉＦＰ−ＤＡ１３）に適用され、ｐＨ６．５の３０ｍＭＮａＣＩで洗浄され、そしてｐＨ６．０〜６．５の３００ｍＭＮａＣｌで溶出される。あるいは、このＦＰ−ＤＡ１３カラムを、ｐＨ６．５の６０ｍＭＮａＣｌで洗浄し、そしてｐＨ６．０〜６．５の５００ｍＭＮａＣｌで溶出する。溶出物を、ＨＩＣ樹脂（ＨＰ−２０ｓｓ）に適用し、３０％アセトニトリルで洗浄し、そしてｐＨ４．０〜５．０の３５％アセトニトリルで溶出する。あるいは、このＨＩＣ樹脂を、４５％イソプロピルアルコールで洗浄し、そして５５〜６０％のイソプロピルアルコールで溶出する。この溶出物を、ＦＰ−ＤＡ１３樹脂に適用し、そして上記のように洗浄および溶出する。最終の陰イオン交換工程は、３分の１またはそれより多く溶媒を減少される。逆浸透ダイアフィルトレーションおよびｐＨ１．５〜２．５での濃縮を、０．２μｍフィルターを使用して実施し、そしてダプトマイシン調製物を凍結する。最後の逆浸透ダイアフィルトレーションを、Ｗａｔｅｒ−Ｆｏｒ−Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（ＷＦＩ）を使用して実施し、ダプトマイシンを洗浄し、そして滅菌充填の前にその濃度を調節する。次いで、バイアルまたは大量のダプトマイシンを凍結乾燥する。
【０１４８】
（実施例２）
Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓの発酵培養において、ダプトマイシンを生成し、そして部分的に精製されたダプトマイシン（９．９ｋｇ）を、米国特許第４，８８５、２４３号に記載される方法によって、５５００リットルの発酵ブロスから微細濾過によって精製した。この部分的に精製されたダプトマイシンを、米国特許第４，８７４，８４３号に記載される方法によってさらに精製し、そして９１％の純度の大量のダプトマイシン調製物を生じた。このダプトマイシン調製物は、ＨＰＬＣ分析によると１４の不純物を含んだ（実施例１０を参照のこと）。このダプトマイシン調製物を、６Ｍ尿素を含むＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中のＰｏｒｏｓＰ１５０陰イオン交換樹脂（ＰＥＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に適用し、そしてこの樹脂に結合させた。この樹脂を、緩衝液におけるＮａＣｌ勾配の開始の前に、３カラム容量の同じ緩衝液で洗浄した。あるいは、混入物は、３０ｍＭＮａＣｌの固定された塩レベルを用いて、カラムから有効に除去され得る。精製されたダプトマイシンの樹脂からの溶出は、０〜１０００ｍＭのＮａＣｌ勾配の間に、約３００ｍＭＮａＣｌで起こる。このカラムから溶出されたダプトマイシンは、「最初の」ＨＰＬＣ方法によって測定されたように、９９％より大きい純度であった。この精製されたダプトマイシンは、１つの検出可能なダプトマイシン混入物のみを含んだ。アンヒドロ−ダプトマイシンおよびβ−異性体は、検出可能ではなかった（０．０１％未満の混入）。同定されなかった混入物のレベルは、０．１％より大きく、そして０．５％より小さかった。
【０１４９】
（実施例３）
９１％の純度の大量のダプトマイシン調製物を、実施例２に記載されるように調製した。この生成物を、６Ｍ尿素を含む酢酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）中のＰｏｒｏｓＤ５０陰イオン交換樹脂（ＰＥＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に適用した。このＰｏｒｏｓＤ５０樹脂を、実施例２に記載されるのと同じ様式で洗浄および溶出した。このカラムから溶出されたダプトマイシンは、「第二の」ＨＰＬＣ方法によって測定されたように、９６．９２％の純度であった。本発明の生成物は、最初の１４の不純物のうちの２つのみを含んだ（０．５未満の混入）。アンヒドロ−ダプトマイシンは、精製されたダプトマイシン調製物において検出され得ない（０．０１％未満での混入および０．０５％未満での正確な定量化）。
【０１５０】
（実施例４）
ダプトマイシンを含む発酵ブロスを、実施例２に記載されるように生成した。この発酵ブロスを微細濾過によって清澄化した。この清澄化生成物を、ｐＨ４．５の２０％ｎ−ブタノールまたはイソブタノールを用いて抽出した（４部の清澄化溶液に対して２部のブタノール）。この清澄化溶液の再抽出を、清澄化溶液中の全ダプトマイシンの９０％より多い、部分的に精製されたダプトマイシンの収率を達成するために、実施した。ダプトマイシンを、ｐＨ６．５の水性緩衝液の添加によってブタノール相から回収し、この水性緩衝液の容積は、ダプトマイシンをブタノール相から水相に抽出するためにブタノールの容積の２分の１またはそれより多い量である。このブタノール抽出工程は、清澄化溶液と比較して、５倍に精製され、そして１０倍に濃縮された部分的に精製されたダプトマイシン調製物を生じた。
【０１５１】
次いで、この水性ダプトマイシン調製物を、米国特許第４，８７４，８４３号に開示される方法によって精製し、９１％の純度のダプトマイシンが生じた。ダプトマイシンは、１４の不純物を含んだ。この生成物を、６Ｍ尿素を含むＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）におけるＰｏｒｏｓＤ５０樹脂に適用した。この樹脂を、Ｔｒｉｓ緩衝液における０〜１００ｍＭのＮａＣｌ勾配の開始の前に、６Ｍ尿素を含む３ベット容量のＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。この樹脂からの精製ダプトマイシンの溶出は、約３００ｍＭＮａＣｌで起こった。ダプトマイシンは、「第二の」ＨＰＬＣ方法によって測定されたように９８％の純度であった。
【０１５２】
（実施例５）
ダプトマイシンを実施例２に記載されるように発酵させる。５５００リットルの発酵ブロスは、１３ｋｇのダプトマイシンを含む。この発酵ブロスを、２０％ｎ−ブタノール（ｐＨ４．５）を用いて直接抽出し、これにより、ダプトマイシンをブタノールに分配する。ブタノールを用いる発酵ブロスの再抽出を、発酵ブロス中の全ダプトマイシンの９０％よりも大きい収量を達成するために実施する。ブタノール相を水性酢酸塩緩衝液（ｐＨ６．５）で抽出し、発酵ブロスと比較して、５倍に精製され（３５％）そして１０倍に濃縮されたダプトマイシンを生じる。この水性ダプトマイシンを、米国特許第４，８８５，２４３号に記載される方法によって微細濾過し、次いで、米国特許第４，８７４，８４３号に記載される方法にょって精製する。この方法は、約９１％の純度のダプトマイシンを生じる。ダプトマイシンは、先行技術のときに使用されたＨＰＬＣ方法によると、１４の不純物を含む。この生成物を、６Ｍ尿素を含む酢酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）におけるＰｏｒｏｓＤ５０樹脂カラムに適用する。この樹脂の洗浄および溶出を、実施例２に示されるように実施する。クロマトグラフィー工程の生成物は、第二のＨＰＬＣ方法によって測定されるように約９８％〜９９％に純度である。
【０１５３】
（実施例６）
微細濾過または遠心分離によって清澄化される場合、発酵の品質を約１０％の純度に改善するために、減少した残留デカン酸供給を使用することを除いて、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓの発酵培養において、ダプトマイシンを生成した。デカン酸レベルをモニターし、そして発酵の間、５０ｐｐｍ未満、および好ましくは１と１０ｐｐｍとの間に、残留デカン酸レベルを維持するように周期的に調節した。この発酵ブロスを、米国特許第４，８８５，２４３号に記載される方法によって微細濾過し、５５００リットルの発酵ブロスから１２．１ｋｇの部分的に精製されたダプトマイシンを生成した。清澄化した発酵ブロスを、酢酸塩緩衝液（中性ｐＨ）における陰イオン交換樹脂（ＦＰ−ＤＡ１３（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ））に結合させ、３０ｍＭＮａＣｌを含む酢酸塩緩衝液で洗浄し、そして引き続き、３００ｍＭＮａＣｌの酢酸塩緩衝液で溶出した。この陰イオン交換工程は、７０％より大きい純度のダプトマイシンを生成した。この部分的に精製されたダプトマイシンを、ＨＰ−２０ｓｓ樹脂を使用することを変更した米国特許第４，８７４，８４３号の方法によってさらに精製した。特に、この部分的に精製されたダプトマイシンを、１０％アセトニトリルを含む酢酸塩緩衝液中のＨＰ−２０ｓｓに充填し、３０％アセトニトリルを含む酢酸塩緩衝液で洗浄し、そして酢酸塩緩衝液中の４０％アセトリトリルで溶出し、「第二の」ＨＰＬＣ方法によって測定されるように約９４〜９６％の純度でダプトマイシンを得た。この生成物を、実施例５に記載されるようにＰｏｒｏｓＤ５０樹脂を使用して、改変した緩衝液増強陰イオン交換クロマトグラフィーに供する。ダプトマイシンは、９９％より大きい純度であり、そして先行技術に記載される方法によって生成される１４の不純物のうちの２つのみを含む。
【０１５４】
（実施例７）
９３％の純度のダプトマイシン調製物を、実施例２に記載されるように調製した。この生成物を、２Ｍ尿素を含む酢酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）中のＰｏｒｏｓＰ１５０樹脂（ＰＥＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に適用した。このＰｏｒｏｓＰ１５０樹脂を、３カラム容量の緩衝液で洗浄した。ダプトマイシンを、２Ｍ尿素を含む酢酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）中の０〜４００ｍＭＮａＣｌ勾配を使用して、この樹脂から溶出した。ダプトマイシンは、１５０と３００ｍＭとの間のＮａＣｌで溶出した。このカラムから溶出したダプトマイシンは、「第一の」ＨＰＬＣ方法によって測定される場合、９９．０〜９９．５％の純度であった。ダプトマイシンは微量の４つの不純物を含み、この不純物は、ダプトマイシンの総量の１％未満であった。アンヒドロ−ダプトマイシンは、精製されたダプトマイシン調製物において検出され得ない（０．０２％未満の混入）。
【０１５５】
（実施例８）
９３％の純度のダプトマイシン調製物を、実施例２に記載されるように調製した。この生成物を、２Ｍ尿素を含む酢酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）中のＰｏｒｏｓＰ１５０樹脂（ＰＥＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に適用した。このカラムを、２Ｍ尿素を含む酢酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）（「洗浄緩衝液」）中の６０ｍＭＮａＣｌの６カラム容量で洗浄した。この洗浄緩衝液は、５０〜７２ｍＭＮａＣｌで変化し得る。この洗浄により、実質的に全てのアンヒドロ−ダプトマイシンが除去される。ダプトマイシンを、ｍ２Ｍ尿素を含む酢酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）中の２５０ｍＭＮａＣｌの１６カラム容量で溶出する。ダプトマイシンは、「第一の」ＨＰＬＣ方法によって測定されるように９８．５〜９９．５％の純度である。
【０１５６】
（実施例９）
実施例２に記載されるようなダプトマイシン調製物を、ＨＰ２０ｓｓクロマトグラフィーを実施するために必要とされる溶媒の濃度を有意に減少される方法を使用して調製した。予想外に、ダプトマイシンの溶出のための溶媒（４０％アセトニトリルまたは５５〜６０％イソプロピルアルコール）は、それぞれ、１２％および２５％にまで減少した。これは、ＨＰ−２０ｓｓクロマトグラフィーが、米国特許第４，８７４，８４３号に記載されるように酸性ｐＨよりもむしろ中性ｐＨで実施される場合であった。好ましい実施形態において、ｐＨシフトが、溶媒を除去することなくＨＰ−２０ｓｓをリサイクルするために使用され得る。
【０１５７】
ｐＨ６．５〜７．０でのＦＰ−ＤＡ１３カラムからの溶出の後に、ダプトマイシンを、平衡化されたＨＰ−２０ｓｓカラム（これは、６０ｍＭ酢酸塩（ｐＨ６．６）で平衡化されたもの）に充填する。このカラムを、５〜８カラムベット容量（ＣＢＶ）の洗浄緩衝液で洗浄する。例示の洗浄緩衝液は、５％イソプロピルアルコール／６０ｍＭ酢酸塩（ｐＨ６．６）である。ダプトマイシンを、溶出緩衝液を用いてカラムから溶出する。例示的な溶出緩衝液は、２〜３のＣＢＶの２５％イソプロピルアルコール／６０ｍＭ酢酸塩（ｐＨ６．６）である。このカラムを、ストリップ緩衝液でストリッピングする。１つの実施形態において、このカラムを、１つのＣＢＶ４０％イソプロピルアルコール／６０ｍＭ酢酸塩（ｐＨ６．６〜７．０）でストリッピングする。このダプトマイシン溶液をｐＨ３．５〜４．０に調節し、そしてさらに純度を増加させるために、ＨＰ−２０ｓｓカラムに再充填する。１つの実施形態において、ｐＨ６．５でＨＰ−２０ｓｓカラムから溶出されたダプトマイシンを、０．２５Ｍリン酸を使用してｐＨ３．５に調節する。このダプトマイシン溶液を、６０ｍＭ酢酸塩（ｐＨ３．５）で平衡化された、先にストリッピングされたＨＰ−２０ｓｓに再充填する。このカラムを、ｐＨが６．５となるように、ｐＨ調節緩衝液で洗浄する。例示のｐＨ調節緩衝液は、５〜８のＣＢＶの５％イソプロピルアルコール／６０ｍＭ酢酸塩（ｐＨ６．６）である。このダプトマイシンを、溶出緩衝液で溶出し、そして所望ならば、陰イオン交換または他の精製方法によってさらに精製し得る。このＨＰ−２０ｓｓカラムを、再使用の前に、ストリップ緩衝液でストリッピングし、そしてクリーニングする。例示の洗浄プロセスは、３つのＣＢＶの０．５ＭＮａＯＨで洗浄する工程、１つのＣＢＶの水で洗浄する工程、次いで平衡の前に、０．２５Ｍのリン酸で洗浄する工程を包含する。このカラムは、０．５ＭＮａＯＨ中で保存され得る。
【０１５８】
（実施例１０）
実施例２に記載されるように調製された大量のダプトマイシンを、半分取（ｓｅｍｉ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）ＨＰＬＣを介して特徴付けし、そして陽イオンモードおよび陰イオンモードの両方を使用する液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）に特徴付けした。ＰｏｒｏｓＰ１５０陰イオン交換樹脂デのクロマトグラフィーの前の大量のダプトマイシンの不純物プロフィールが図３に示され、そして大量のダプトマイシン調製物のクロマトグラムが図１２に示される。
【０１５９】
表３
【０１６０】
【表１】
0005631439.tif 000002
不純物１（ＣＢ−１３１０１２）（これは、約７．９６分で溶出する）（ＭＷ：１６３８）は、ダプトマイシンのラクトン加水分解生成物として提唱される（図４）。この結果は、ダプトマイシンのデシル開環誘導体としてＬｉｌｌｙによって以前に同定されたＬＹ２１２２１８と一致するようである。
【０１６１】
不純物２（ＣＢ−１３１０１１）（これは、約９．１１分で溶出する）（ＭＷ：１６３８）もまた、β−異性体のラクトン加水分解生成物として提唱される（図５）。
【０１６２】
不純物３（ＣＢ−１３１００８）（これは、約１１．５４分で溶出する）（ＭＷ：７４５）は、トリプトファン、アスパラギン、アスパラギン酸、スレオニンおよびグリシンを含む５つのアミノ酸鎖、ならびにカプリン酸鎖からなる直鎖状リポペプチドであると提唱される（図６）。この結果は、Ｌｉｌｌｙによって以前に同定されたＬＹ２１３９２８と一致するようである。
【０１６３】
不純物４（ＣＢ−１３１００６）（これは、約１２．２８分で溶出する）（ＭＷ：１６２４）は、ダプトマイシンの酸化アナログであると提唱され、ここで、アミノ酸のトリプトファンは、キヌル酸まで酸化される（図７）。
【０１６４】
不純物５（これは、約１３．１０分で溶出する）（ＭＷ：１６１８）は、未だ構造が割り当てられていない。
【０１６５】
不純物６（ＣＢ−１３０９８９）および不純物７（ＣＢ−１３１００５）は、約１４．４３分に同時溶出する。ＣＢ−１３０９８９（ＭＷ：５８７）は、Ｌｉｌｌｙによって以前に同定されたような、トリプトファン、アスパラギンおよびアスパラギン酸の３つのアミノ酸鎖、およびカプリン酸鎖からなる直鎖状リポペプチドＬＹ２１３８２７と一致するようである（図８）。ＣＢ−１３１００５（ＭＷ：１６０６）は、ダプトマイシンアナログに対応し、ここでこのカプリン酸は１つのメチル基を欠く（図９）。
【０１６６】
不純物８（ＣＢ−１３１０１０）（約１５．１０分で溶出する）（ＭＷ：１６２０）は、Ｌｉｌｌｙによって以前に同定されたようなＬＹ２１３８４６（β−異性体）と一致するようである（図２）。β−異性体のレベルは、１％より大きい。
【０１６７】
不純物９（これは、約１７．９２分で溶出する）（ＭＷ：８７４）は、未だ構造が割り当てられていない。
【０１６８】
不純物１０および１１（これらは、約１９．５７分に同時溶出する）は、構造が割り当てられていない。
【０１６９】
不純物１２（ＣＢ−１３１００９）（これは、約２０．９３分に溶出する）（ＭＷ：８５９）は、トリプトファン、アスパラギン、アスパラギン酸、スレオニン、グリシンおよびオルニチンの６つのアミノ酸鎖、ならびにカプリン酸鎖からなる直鎖状リポペプチドであると提唱される（図１０）。
【０１７０】
不純物１３（ＣＢ−１３０９５２）（これは、約２３．１１分で溶出する）（ＭＷ：１６０２）は、アンヒドロダプトマイシンであると提唱され（図３）、そしてＬＹ１７８４８０と同じであるようである。アンヒドロダプトマイシンのレベルは、１％より大きい。
【０１７１】
不純物１４（ＣＢ−１３１０７８）（これは、約２４．５３分に溶出する）（ＭＷ：１６３４）は、カプリン酸鎖に余分のメチル基を含むダプトマイシンアナログとしてＬｉｌｌｙによって以前に同定された、ＬＹ１０９２０８と同じであるようである（図１１）。
【０１７２】
大量のダプトマイシンは、実施例２または７〜８において上記のようにＰｏｒｏｓＰ１５０によって精製され得るか、または実施例３〜５において上記のようにＰｏｒｏｓＤ５０上で精製され得る。実施例２に記載されるようにＰｏｒｏｓＰ１５０上での精製の後、クロマトグラム（図１３）は、ダプトマイシンの純度が９９．０％より高く、そしてβ−異性体およびアンヒドロダプトマイシンが検出レベル未満（合計で０．０５％未満）であることを示す。１つの同定されていない不純物が存在し、これは０．１％より多いが０．５％未満の量で存在する。
【０１７３】
（実施例１１）
Ｓ  ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓＮＲＲＬＳｔｒａｉｎ１５９９８の発酵培養を、抗生物質の産生に最適であるが混入物の産生を最小にするレベルで制御されたカプリン酸給送で行う。残余カプリン酸給送をガスクロマトグラフィーによって測定し、そして標的残余レベルは、誘発の開始（約３０時間）から回収まで１０ｐｐｍのカプリン酸である。この培養物の遠心法および引き続く清澄した培養液の分析を、ＨＰＬＣによってダプトマイシンの産生を測定するために使用する。収集物の力価は、代表的に発酵ブロス１リットルあたり１．０グラムと３．０グラムとの間である。
【０１７４】
この発酵物を、Ｐａｌｌ−Ｓｅｐを用いる微量濾過によって、または完全に商業規模の遠心法およびデプスフィルターによってのいずれかで回収する。この清澄化した培養液を、陰イオン交換樹脂ＭｉｔｓｕｂｉｓｈｉＦＰ−ＤＡ１３に適用し、ｐＨ６．５で３０ｍＭのＮａＣｌで洗浄し、そしてｐＨ６．０〜６．５で３００ｍＭのＮａＣｌで溶出する。あるいは、このＦＰ−ＤＡ１３カラムをｐＨ６．５で６０ｍＭのＮａＣｌで洗浄し、そしてｐＨ６．０〜６．５で５００ｍＭのＮａＣｌで溶出する。このｐＨを３．０〜４．８に調整し、そして温度を２〜１５℃に調整する。これらの条件下で、ダプトマイシンはミセルを形成する。このダプトマイシンのミセル溶液を、このミセル調製物を洗浄することによって精製するが、一方、これは、任意の構成の、１０，０００ＮＭＷフィルター（ＡＧＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏｒｐ．ＵＦ中空繊維または均等物）を使用する限外濾過器上に保持される。このダプトマイシンミセルは、このフィルターに保持されるが、多くの不純物は除去される。なぜなら、これらの不純物は１０，０００ＮＭＷのフィルターを通過するためである。ダプトマイシンミセルの限外濾過は、約４０％から８０％以上までダプトマイシンの純度を増加する。
【０１７５】
この溶出液を、ＨＩＣ樹脂、ＨＰ−２０ｓｓに適用し、３０％アセトニトリルで洗浄し、そしてｐＨ４．０〜５．０で３５％アセトニトリルで溶出する。あるいは、ＨＩＣ樹脂を２０〜３０％のイソプロピルアルコールで洗浄し、そしてｐＨ３．５〜６．５で３０〜４０％のイソプロピルアルコールで溶出する。増加した溶媒および６．０〜７．５のより高いｐＨのこれらの条件下で、ダプトマイシンは単一の非ミセル状態に戻る。この溶出液を、ＦＰ−ＤＡ１３樹脂カラムに適用し、そして以前と同様に洗浄および溶出する。最後の陰イオン交換工程は、１／３以上溶媒を減少する。ｐＨ１．５〜２．５での逆浸透ダイアフィルトレーションおよび濃縮を、０．２μｍのフィルターを使用して行い、そしてダプトマイシン調製物を凍結する。ダプトマイシンを洗浄し、かつその濃度を滅菌充填の前に調節するために、最後の逆浸透ダイアフィルトレーションを注入用水（ＷＦＩ）を用いて行う。次いで、バイアルまたは大量のダプトマイシンを凍結乾燥する。
【０１７６】
（実施例１２）
上記の実施例のいずれかに記載されるように（例えば、実施例１１に記載されるように）精製した、凍結乾燥ダプトマイシンを、４．０〜５．０のｐＨで生理食塩水（約１４０ｍＭのＮａＣｌ）中で再構成する。これらの条件下で、ダプトマイシンはミセルとして存在し、そして注入あるいは静脈内投与、非経口投与、経口投与、または局所投与のために使用され得る。
【０１７７】
（実施例１３）
ダプトマイシンを、実施例１１に記載されるように発酵によって産生し、そして微量濾過によって培養液から清澄化する。この清澄化した培養液を、陰イオン交換樹脂ＭｉｔｓｕｂｉｓｈｉＦＰ−ＤＡ１３に適用し、ｐＨ６．５で３０ｍＭのＮａＣｌで洗浄し、そしてｐＨ６．０〜６．５で３００ｍＭのＮａＣｌで溶出して、約４０％の純度のダプトマイシン調製物を得る。実質的に全てのダプトマイシンがミセルを形成するように、この溶出液を希釈リン酸でｐＨ３．５に調整する。このミセル調製物を１０，０００ＮＭＷの限外濾過膜にロードする。このダプトマイシン調製物を、ｐＨ３．５および１５℃までの温度で、３０ｍＭの酢酸ナトリウムで洗浄する。容量の減少および洗浄は、混入のレベルを低下し、これは８５％の純度のダプトマイシン調製物を生じる。このダプトマイシン調製物を、本明細書中に記載される方法のいずれかを使用して、さらに精製し得る。
【０１７８】
（実施例１４）
ダプトマイシンを、実施例１１に記載されるように発酵によって産生し、微量濾過によって培養液から清澄化し、そしてＦＰ−ＤＡ１３樹脂上で分画する。実質的に全てのダプトマイシンがミセルを形成するように、この溶出液を希釈リン酸でｐＨ３．５に調整する。このミセル調製物を１０，０００ＮＭＷの限外濾過膜にロードする。このダプトマイシン調製物を、ｐＨ３．５および１５℃までの温度で、３０ｍＭの酢酸ナトリウムで洗浄する。容量の減少および洗浄は、混入のレベルを低下し、これは８０〜９０％の純度のダプトマイシン調製物を生じる。このダプトマイシン調製物を、本明細書中に記載される方法のいずれかを使用して、さらに精製し得る。
【０１７９】
（実施例１５）
ダプトマイシンを、実施例１１に記載されるように発酵によって産生し、そして微量濾過を使用して培養液から清澄化する。この調製物を、米国特許第４，８７４，８４３号（本明細書中に参考として援用される）に記載されるような疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて精製する。この方法において、ＨＰ−２０およびＨＰ−２０ｓｓ樹脂上の繰り返しのカラムクロマトグラフィーを使用する。ダプトマイシンの純度は９３％であり、ＨＰＬＣクロマトグラフ上の目に見える不純物および測定可能なピロゲンを含む。この生成物を水で希釈し、そしてそのｐＨを、ＮａＯＨまたはその等価物でｐＨ６．５に調整した。このダプトマイシン調製物を、１０，０００ＮＭＷ限外濾過膜を通して濾過する。これらの条件下で、ダプトマイシンはモノマーであり、そして限外濾過膜を通過する。得られた生成物は依然として９３％の純度であるが、０．１〜０．２％で存在するいくつかの不純物が限外濾過膜によって除去される。さらに、ピロゲン成分が、検出可能でないレベルまで減少される。
【０１８０】
（実施例１６）
約９３％の純度のダプトマイシン調製物を、実施例１５に記載のように調製する。このダプトマイシン調製物を、ＨＣｌまたはその等価物でｐＨを４．７まで低下し、そしてこのダプトマイシン調製物を２〜５℃まで冷却することによって、ミセル状態に変える。この生成物を、４００リットルから３リットルまで濃縮し、そして１０，０００ＮＭＷの限外濾過膜上での濾過によって約１００ｍｇ／ｍｌの最終濃度にする。これらの条件下で、ダプトマイシンは膜によって保持される。これは、ダプトマイシン濃度の大きな増加を生じる。純度は約９３％である。
【０１８１】
（実施例１７）
ダプトマイシン調製物を、実施例１６に記載のように調製する。バイアルを約２５０ｍｇのダプトマイシンで満たし、そして凍結乾燥する。このダプトマイシンを、ヒトまたは動物患者に投与するために、５０ｍｌの滅菌した１５０ｍＭの生理食塩水中、４．０〜５．０のｐＨで再構成する。投与されるダプトマイシンの用量は、感染の性質、患者の年齢および体重、ならびに動物の種に依存する。１５０ｍＭの生理食塩水中４．０〜５．０のｐＨで、このダプトマイシンはミセル状態で存在し、これは可溶性であり、そして静脈内注射、筋肉内注射、または非経口注射に適切である。この処方物は、ダプトマイシンのリポペプチド性質に起因して、任意の局所刺激を最小化する。
【０１８２】
（実施例１８）
ダプトマイシンミセルを、２５℃、ｐＨ４．０、水中で１．０ｍｇ／ｍＬの濃度のダプトマイシンを用いて調製した。ダプトマイシンミセルのサイズを、ＺｅｔａｓｉｚｅｒＴＭ（ＭａｌｖｅｒｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍｏｄｅｌ３０００ＨＳ）を使用して測定した。計測速度は３６．３、細胞型は毛細管細胞、検出角度（ｄｅｇ）は９０°、そして波長は（ｎｍ）６３３であった。結果は、ミセルの直径が５４Åであることを示し、これは単一のモノマーダプトマイシン分子の直径の約２倍である。図１８を参照のこと。
【０１８３】
本明細書中に列挙される全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願の各々が詳細かつ個別に参考として援用されたように、本明細書中に参考として援用される。本発明は、理解の明快さの目的のための例示および実施例によってある程度詳細に記載されてきたが、特定の変化および改変が、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなくなされ得ることが、本発明の教示を考慮して当業者に容易に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１８４】
【図１】図１は、ダプトマイシンの構造を示す。
【図２】図２は、不純物８、ＣＢ−１３１０１０（以前に、β異性体、ＬＹ２１３８４６として同定された）の構造を示す。
【図３】図３は、不純物１３、ＣＢ−１３０９５２（以前に、無水ダプトマイシン、ＬＹ１７８４８０として同定された）の構造を示す。
【図４】図４は、不純物１、ＣＢ−１３１０１２（以前に、ＬＹ２１２２１８として同定された）の提案される構造を示す。
【図５】図５は、不純物２、ＣＢ−１３１０１１の提案される構造を示す。
【図６】図６は、不純物３、ＣＢ−１３１００８（以前に、ＬＹ２１３９２８として同定された）の提案される構造を示す。
【図７】図７は、不純物４、ＣＢ−１３１００６の提案される構造を示す。
【図８】図８は、不純物６、ＣＢ−１３０９８９（以前に、ＬＹ２１３８２７として同定された）の提案される構造を示す。
【図９】図９は、不純物７、ＣＢ−１３１００５の提案される構造を示す。
【図１０】図１０は、不純物１２、ＣＢ−１３１００９の提案される構造を示す。
【図１１】図１１は、不純物１４、ＣＢ−１３１０７８（以前に、ＬＹ１０９２０８として同定された）の提案される構造を示す。
【図１２】図１２は、不純物１〜１４を含む、ダプトマイシンの大量調製についてのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図１３】図１３は、ＰｏｒｏｓＰ１５０樹脂上での精製後のダプトマイシンの調製についてのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図１４】図１４ａ〜１４ｃは、ミセル構造を示す。図１４ａは、球形ミセルを示し、ここで、両親媒性分子の疎水性テールが球の中心に向かって配向し、一方、両親媒性分子の親水性ヘッドは、球の外側に向かって、水性環境と接触して配向する。図１４ａは、親水性ヘッドが陰性に荷電した例を示す。図１４ｂは、脂質二重層の各層の疎水性テールが互いに向かって配向し、一方、二重層のいずれかの側の親水性ヘッドが水性環境と接触するように、両親媒性分子の２つの層が組み立てられる、脂質二重層構造を示す。脂質二重層は、球形または平面状のいずれかであり得る。図１４ｃは、リポソームを示し、ここで、図１４ｂに示されるような脂質二重層は、水性の内部を囲む球形構造を形成する。リポソームの親水性ヘッドは、水性の内部および外部の水性の環境に面する。
【図１５】図１５は、ｐＨ４．０での、ダプトマイシンの臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）を決定するための実験の結果を示す。
【図１６】図１６は、光散乱によるダプトマイシンミセルのサイズ分布を示す。ダプトマイシンミセルは、５．４ｎｍ（５４Å）の平均サイズを有する。
【図１】
0005631439.tif 000003
【図２】
0005631439.tif 000004
【図３】
0005631439.tif 000005
【図４】
0005631439.tif 000006
【図５】
0005631439.tif 000007
【図６】
0005631439.tif 000008
【図７】
0005631439.tif 000009
【図８】
0005631439.tif 000010
【図９】
0005631439.tif 000011
【図１０】
0005631439.tif 000012
【図１１】
0005631439.tif 000013
【図１２】
0005631439.tif 000014
【図１３】
0005631439.tif 000015
【図１４】
0005631439.tif 000016
【図１５】
0005631439.tif 000017
【図１６】
0005631439.tif 000018