(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
清澄化されたネイティブの高アシルジェラン調製物であり、
スフィンゴモナス・エロデアのＰＨＢ欠失変異株から産生され、
１％ｗ／ｗで溶解させたときの光線透過率が、６００〜６５０ｎｍの波長で測定して６０％超であり、
ａ）ジェラン水溶液を３０℃から７０℃の清澄化温度に加熱するステップと、
ｂ）前記ジェラン水溶液を、少なくとも１種のキレート剤で処理するステップと、
ｃ）ステップｂ）の後に、前記キレート剤で処理したジェラン水溶液をリゾチーム酵素で処理するステップと、
ｄ）前記ジェラン水溶液を、苛性剤又は酸化剤で処理するステップと、
ｅ）前記ジェラン水溶液を、プロテアーゼ酵素で処理するステップと、
ｆ）得られた処理したジェラン溶液から、アルコールを用いた沈殿により、清澄化されたジェランを単離するステップと
を含む方法により調製される、
ことを特徴とする、調製物。
【請求項２】
１％ｗ／ｗで溶解させたときの光線透過率が、６００〜６５０ｎｍの波長で測定して少なくとも７７．９％であり、パーセント距離により測定したゲル強度が、少なくとも８７．２であり、グラムで表される穿刺力が、少なくとも４２８グラムである、
請求項１に記載の清澄化されたネイティブの高アシルジェラン調製物。
【請求項３】
１％ｗ／ｗで溶解させたときの光線透過率が、６００〜６５０ｎｍの波長で測定して、５．５０の相対標準偏差で少なくとも８２．３８％であり、パーセント距離により測定したゲル強度が、０．０２の相対標準偏差で少なくとも８７．８４であり、グラムで表される穿刺力が、０．２８の相対標準偏差で少なくとも４２８グラムである、
請求項１に記載の清澄化されたネイティブの高アシルジェラン調製物。
【請求項４】
請求項１に記載の清澄化されたジェラン調製物を含む溶液。
【請求項５】
請求項１に記載の清澄化されたジェラン調製物を含む食品。
【請求項６】
前記光線透過率は、７０％超である、請求項１に記載の清澄化されたジェラン調製物。
【請求項７】
請求項６に記載の清澄化されたジェラン調製物を含む溶液。
【請求項８】
請求項６に記載の清澄化されたジェラン調製物を含む食品。
【請求項９】
前記光線透過率は、８０％超である、請求項１に記載の清澄化されたジェラン調製物。
【請求項１０】
請求項９に記載の清澄化されたジェラン調製物を含む溶液。
【請求項１１】
請求項９に記載の清澄化されたジェラン調製物を含む食品。
【請求項１２】
清澄化された高アシルジェラン溶液を調製する方法であり、
前記ジェラン溶液はスフィンゴモナス・エロデアのＰＨＢ欠失変異株から産生され、
ａ）ジェラン水溶液を３０℃から７０℃の清澄化温度に加熱するステップと、
ｂ）前記ジェラン水溶液を、少なくとも１種のキレート剤で処理するステップと、
ｃ）ステップｂ）の後に、前記キレート剤で処理したジェラン水溶液をリゾチーム酵素で処理するステップと、
ｄ）前記ジェラン水溶液を、苛性剤又は酸化剤で処理するステップと、
ｅ）前記ジェラン水溶液を、プロテアーゼ酵素で処理するステップと、
ｆ）アルコールを用いた沈殿により、清澄化されたジェランを回収するステップと
を含み、
ここで、得られた前記清澄化されたジェランの、１％ｗ／ｗで溶解させたときの光線透過率は、６００〜６５０ｎｍの波長で測定して６０％超である
ことを特徴とする、方法。
【請求項１３】
前記ジェラン水溶液を、次亜塩素酸ナトリウム又は他の次亜塩素酸塩、二酸化塩素、過酸化水素、過酢酸、及びオゾンからなる群から選択される少なくとも１種の酸化剤で処理する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１種のキレート剤が、エチレンジアミン四酢酸、リン酸、メタリン酸、炭酸、クエン酸、酒石酸、グルコン酸、グルタミン酸、ピロリン酸、ポリリン酸、メタリン酸、糖酸、エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、エチレンジアミン、２，３−ジアミノブタン、１，２−ジアミノシクロヘキサン、トリアミノトリエチルアミン、又はそれらの塩から選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１種のキレート剤が、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸二カリウム、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸四カリウム、クエン酸三ナトリウム、クエン酸三カリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸カリウム、ポリリン酸ナトリウム、ポリリン酸カリウム、ピロリン酸ナトリウム、ピロリン酸カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸二カリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸三カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、陽イオン交換樹脂、エチレンジアミン二塩酸、エチレンジアミン二酢酸、エチレンジアミンリチウム塩、エチレンジアミンジヒドロヨウ素、及びそれらの混合物から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
苛性剤が、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、及びリン酸三ナトリウムからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
ステップｂ）で、前記ジェラン水溶液を更に界面活性剤で処理する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記界面活性剤が、ＳＤＳ、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、レシチン、モノグリセリド、モノグリセリドの酒石酸エステル、リン酸モノグリセリド、乳酸モノグリセリド、アセチル化モノグリセリド、コハク酸モノグリセリド、エトキシ化モノグリセリド、ソルビタンエステル、ポリソルベート、ポリグリセリンエステル、ショ糖エステル、ステアロイル乳酸ナトリウム、及びプロピレングリコールエステルから選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記リゾチーム酵素での処理を、３から７．５のｐＨで行う、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記プロテアーゼ酵素での処理を、６．５から９のｐＨで行う、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は、無発現変異により内部の貯蔵高分子であるポリヒドロキシ酪酸（「ＰＨＢ」）の産生に欠陥があるが、一般にスフィンガン（ｓｐｈｉｎｇａｎ）と呼ばれる正常な質のカプセル（ｃａｐｕｌａｒ）多糖を産生する、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属の細菌変異株に関する。本発明はまた、ＰＨＢの産生を欠失するスフィンゴモナスの変異株によって産生されたスフィンガンを清澄化する方法に関する。本発明は、さらに、ＰＨＢ欠失スフィンガンおよび／または清澄化されたスフィンガンを含む、食品または工業製品に関する。
【０００２】
関連技術の考察
スフィンガンは、スフィンゴモナス属の細菌から分泌されるカプセル多糖である。スフィンガン同士は、構造的に関連があるが、まったく同じではない。スフィンゴモナス属の通常のメンバーと、それらが産生するスフィンガンには、ゲラン（ｇｅｌｌａｎ）（Ｓ−６０）を産生するスフィンゴモナス・エロデア（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｅｌｏｄｅａ）ＡＴＣＣ  ３１４６１、ウェラン（ｗｅｌａｎ）（Ｓ−１３０）を産生するスフィンゴモナス種  ＡＴＣＣ  ３１５５５、ラムサン（ｒｈａｍｓａｎ）（Ｓ−１９４）を産生するスフィンゴモナス種ＡＴＣＣ  ３１９６１、ジウタン（ｄｉｕｔａｎ）（Ｓ−６５７）を産生するスフィンゴモナス種  ＡＴＣＣ  ５３１５９、まだ無名の多糖（Ｓ−８８）を産生するスフィンゴモナス種  ＡＴＣＣ  ３１５５４、まだ無名の多糖（Ｓ−１９８）を産生するスフィンゴモナス種  ＡＴＣＣ  ３１８５３、まだ無名の多糖（Ｓ−７）を産生するスフィンゴモナス種  ＡＴＣＣ  ２１４２３、まだ無名の多糖（ＮＷ−１１）を産生するスフィンゴモナス種  ＡＴＣＣ  ５３２７２、アルカラン（バイオポリマーＢ−１６）を産生するスフィンゴモナス種  ＦＥＲＭ−ＢＰ２０１５（旧名Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ  Ｂ−１６）、などがある。スフィンゴモナスおよびそれらが産生する多糖についての記載は、米国特許第４，３７７，６３６号、第４，３２６，０５３号、第４，３２６，０５２号、および第４，３８５，１２３号（ＡＴＣＣ  ３１４６１およびそのＳ−６０多糖について）；米国特許第４，３４２，８６６号（ＡＴＣＣ  ３１５５５およびＳ−１３０について）；米国特許第４，４０１，７６０号（ＡＴＣＣ  ３１９６１およびＳ−１９４について）；米国特許第５，１７５，２７８号（ＡＴＣＣ  ５３１５９およびＳ−６５７について）；米国特許第４，３３１，４４０号および第４，５３５，１５３号（ＡＴＣＣ  ３１５５４およびＳ−８８について）；米国特許第４，５２９，７９７（ＡＴＣＣ  ３１８５３およびＳ−１９８について）；米国特許第３，９６０，８３２号（ＡＴＣＣ  ２１４２３およびＳ−７について）；米国特許第４，８７４，０４４号（ＡＴＣＣ  ５３２７２およびＮＷ−１１について）；米国特許第５，１７５，２７９号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２０１５およびＢ−１６について）に出ており、これらのすべてを参照により本明細書に組み込む。
【０００３】
スフィンガン多糖同士は、糖類であるＤ−グルコース、Ｄ−グルクロン酸、およびＬ−ラムノース（またはＬ−マンノース）を含む骨格の一次構造が構造的に関連している。例えば、ゲランＳ−６０の一次構造は、糖類であるＤ−グルコース、Ｄ−グルクロン酸、およびＬ−ラムノースを、モル比２：１：１で含み、これらの糖類はグルコース、グルクロン酸、グルコース、ラムノースの順序で互いに結合し、四糖リピートユニットを形成している。天然の形では、ゲランの同じグルコース残基が、アセチルおよびグリセリル置換基で修飾される。概して、ゲランは、四糖リピートユニットあたり１つのグリセリン酸置換基、および２つの四糖リピートユニットあたり１つの酢酸置換基を有する。別のスフィンガン、ジウタンＳ−６５７の一次構造は、１つのグルコース残基にＬ−ラムノースの二糖側鎖が結合し、その結果六糖リピートユニットを形成する点でゲランとは異なる。Ｓ−６５７は、前記以外のグルコース残基の２位および／または６位にアセチル基を含む。
【０００４】
スフィンガン多糖は、ゴムとも呼ばれ、水溶液を濃化あるいはゲル化するために最初に使用され、しばしば増粘剤、ゲル化剤という２つのグループに分類される。通常の増粘剤には、デンプン、グアーガム、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、メチルセルロース、キサンタン、カラヤゴム、トウガカントゴムがある。通常のゲル化剤には、ゲラン、ゼラチン、デンプン、アルギン酸塩、ペクチン、カラギーナン、寒天、メチルセルロースがある。
【０００５】
ゲル化剤は、食品工業で、菓子のゼリー、ジャム、デザートのゼリー、アイシング、乳製品、飲料などを含めた様々な用途で使用される。さらに、ゲル化剤は、微生物学的な培地の成分としても使用することができる。ゲル化剤は、使用する条件、および形成するゲルの感触に応じて異なる。ゲルにはそれぞれ特有の特徴があるので、特定の製品に、ある種のゲル化剤が限定的に使用されている（例えば、菓子のゼリーにはデンプン、デザートのゼリーにはゼラチン、アイシングには寒天、ピメントストリップ（ｐｉｍｅｎｔｏ  ｓｔｒｉｐｓ）にはアルギン酸塩）。
【０００６】
特定の製品にある種のゲル化剤を使用するにもかかわらず、従来の食品への配合には不都合がある。例えば、デザートのゼリーへの配合にしばしば使用されるゼラチンは、動物由来であり、固めるためには冷却する必要があり、熱に対して不安定なために用途が限られる。デザートのゼリー、菓子類、およびジャム／ゼリーへの配合にしばしば使用されるカラギーナン、カラギーナンとローカストビーンガムのブレンド、およびペクチンは、一般に感触がもろくぼろぼろとして（ｂｒｉｔｔｌｅ）弾力がない配合物に限られ、保管安定性が乏しく、地理的に日本などのいくつかの国では、使用が制限される可能性がある。菓子への配合でしばしば使用されるデンプンは、透明度が低く、香料の放出性が低い。したがって、食品への配合で使用するための、従来のゲル化剤に伴っていた問題のない、ゲル化剤を開発することが望まれている。
【０００７】
特に有用なゲル化剤の１つは、ゲラン（Ｓ−６０）であり、これは、細菌スフィンゴモナス・エロデアＡＴＣＣ  ３１４６１によって産生されるカプセル多糖である。商業的には、好気条件下で、発酵培地にスフィンゴモナス・エロデア細菌を接種することによって、ゴムが形成される。発酵培地は、炭素源、リン酸塩、有機および無機窒素源、および適切な微量元素を含む。通気、攪拌、温度、およびｐＨを厳密に制御しながら、無菌条件下で発酵を行う。発酵完了と同時に、粘性のブロスを低温殺菌して、生細胞を殺し、その後ゴムを回収する。しかし、ゲランを産生する発酵の最適条件は、ゲランの最終的な清澄化および回収を妨げる内部の貯蔵高分子であるポリヒドロキシ酪酸（「ＰＨＢ」）の産生も促進する。発酵中、ＰＨＢ合成とゲラン合成は、使用可能な炭素源に対して競合するので、ＰＨＢ合成は、ゲラン合成と競合する可能性がある。
【０００８】
ゲランは、発酵ブロスからの回収方法に応じて、異なる特徴を示す。発酵ブロスから直接回収することにより、天然または高アシル型のゲランが生じ、Ｓ．ｅｌｏｄｅａによってその１つのグルコース残基がアセチルおよびグリセリル置換基で修飾される。この天然または高アシル型のゲランを単離すると、軟らかく、柔軟性があり、弾力があるゲルがもたらされる。ゲランは熱アルカリで処理することによって脱アシル化することができ、それによって低アシル型のゲランがもたらされる。この脱アシル型ゲランを単離すると、硬質で、堅く、もろい（ｂｒｉｔｔｌｅ）ゲルがもたらされるが、これはその商業用途が限られている。天然のゲランと脱アシル化ゲランをブレンドすると、中間の感触のゲルが生成する。
【０００９】
ある種の用途では、透明なゲランが必要である。しかし、現在、清澄化することができるのは、脱アシル化ゲランのみである。脱アシル化プロセス中に、ゲランを高温でアルカリ処理すると、ゲランからアシル置換基が除去され、かつＳ．エロデア細胞が溶解する。次いで、固形物および細胞片を、濾過によって取り除き、透明かつアシル化していないゲランを得る。現在は、固まるために必要な温度（冷却したときゴムがゲルを形成する温度）が高く、また、この生物のカプセルの性質により、Ｓ．エロデア細胞からゲランを分離することは容易ではないために、天然または高アシル型のゲランを濾過で清澄化することはできない。天然のゲランが必要な用途では、Ｓ．エロデア細胞を化学的または酵素的に溶解できるが、最終生成物中に、残留ＰＨＢが存在し、得られる溶液は透明ではなく濁ることとなる。
【００１０】
ゲル化剤としてのゲランの使用以外に、他のスフィンガン多糖についても、有用な商業用途が発見されている。Ｓ−６５７多糖は、水などの極性溶媒に、著しい擬似塑性を与え、その結果Ｓ−６５７は、粒子の懸濁、摩擦の減少、エマルジョンおよび泡の安定化、濾過ケークの処分、ならびに濾過の制御が可能な流体力学的モディファイアーとして作用できるようになる。したがって、参照によって本明細書に組み込む米国特許第６，１１０，２７１号に開示されるように、Ｓ−６５７は、様々なセメントシステム（ｃｅｍｅｎｔｉｔｉｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ）において、流体力学的モディファイアーとしての産業的有用性が見出されている。
【００１１】
透明度を損なう以外に、スフィンガン中にみられるＰＨＢは、それらのゴムのレオロジー特性に影響を与える。特に、Ｓ−６５７ゴム中のＰＨＢは、レオロジーが、油井を掘る際に完成および改修用流体の重要な役目を果たしている油田などの多孔質の内部流動（ｍｅｄｉａｌ  ｆｌｏｗ）環境で、多糖がレオロジーを変更する能力に影響を与える。さらに、Ｓ−６５７中のＰＨＢ残留物は、貯水池形成中に障害を引き起こす可能性があり、また、油井の生産性を低下させる可能性もある。さらに、ＰＨＢの存在は、外観が消費者に受け入れられることが不可欠である家庭用製品およびパーソナルケア製品において、Ｓ−６５７ゴムの応用性を制限する。
【００１２】
したがって、スフィンガン中のＰＨＢ産生を失わせることが試みられてきた。スフィンゴモナス種におけるＰＨＢ産生を妨げる問題を解決するための１つの方法は、米国特許第５，３００，４２９号に記載されるように、ランダム変異を化学的に誘発させて、ＰＨＢの産生を阻害する株にすることであった。米国特許第５，３００，４２９号は、ＰＨＢの産生を阻害するが、ゲランを産生する能力はそのままである、ＬＰＧ−２、スフィンゴモナス・エロデアの変異株を開示している。スフィンゴモナス・エロデアは、以前はシュードモナス・エロデア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｌｏｄｅａ）として知られており、同じ生物である。ＬＰＧ−２株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、ＡＴＣＣ  ５３９６７と名付けられている。ＬＰＧ−２株はゲランを産生するが、その質は安定していない。おそらく、化学的変異誘発で引き起こされる付加的な変異のためである。
【００１３】
遺伝子操作は、ＰＨＢ産生に欠陥があるスフィンゴモナスの無発現変異株を産み出すための、より選択的な変異誘発手法である。遺伝子操作により、ＰＨＢ合成経路内の遺伝子の選択的な変異または欠失が可能になり、また、ゴムの産生の質に影響を与えることなく、ＰＨＢの産生を完全に阻害することが可能になる。
【００１４】
したがって、ＰＨＢ合成能力に欠陥があるが、スフィンガン産生を最大にし、かつスフィンガンからＰＨＢを除去するのに必要な労力を軽減する、スフィンゴモナスの変異株を開発することが非常に望まれている。
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、ポリヒドロキシ酪酸（「ＰＨＢ」）合成に必要とされるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を、選択的に変異させるあるいは欠失させることにより、スフィンガンは産生するがＰＨＢは産生しないようにした、スフィンゴモナス属の変異株に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＬａｓｅｒＧｅｎｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によるＤＮＡ  ｓｔａｒ  ＭｅｇＡｌｉｇｎｓ（登録商標）というソフトウェアを使用して並べた、Ｒｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ（Ｕ１７２２７）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ（Ｊ０５００３）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種  ＲＡ３８４９株（Ｌ３７７６１）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐａｅｒｏｉｄｅｓ（Ｌ１７０４９）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、およびＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ（Ｌ０７８９３）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）からのＰＨＢ合成酵素タンパク質の配列を示す。
【図２】プラスミドｐＥＢＩ中の４０８ｂｐ挿入断片の配列を示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）。
【図３】スフィンゴモナス・エロデアのｐｈａＣ遺伝子中の内部欠失をクローン化し、構築するために使用するステップの模式図である。
【図４】ｐｈａＣ領域の配列を示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）。
【図５】変異させたｐｈａＣ遺伝子の、スフィンゴモナス・エロデア染色体への相同的組換え、および染色体中に無処置のまたは変異させたｐｈａＣ遺伝子を残すようにした、組み込まれたベクターの切除の概略図である。
【図６】プラスミドｐＬＯ２の説明図である。
【図７】ｐｈａＣ欠失を含むベクターの、スフィンゴモナス・エロデア染色体への組込みを説明する概略図である。
【図８】１０Ｌ発酵物からのブロスサンプルを培養することによって求められた、細胞数のグラフ表示である。
【図９】ＥｃｏＲＩを用いて消化させ、ＡＴＣＣ  ５３１５９のｐｈａＣ遺伝子に対するプローブとハイブリダイズさせたスフィンゴモナスゲノムＤＮＡ調製物のサザンハイブリダイゼーションを示す。
【図１０】ＡＴＣＣ  ５３１５９のｐｈａＣ遺伝子、および隣接領域のＤＮＡ配列である（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）。
【図１１】ｐｈａＣ領域の遺伝子地図およびＰＣＲ増幅のためのプライマーを示す。
【図１２】ＰＣＲを用いて、ｐｈａＣに隣接する領域のみを含み、ｐｈａＣ遺伝子全体を欠く生成物を構築するクローニング戦略を示す。
【図１３】透過率に対する水酸化カリウム濃度の効果のグラフである。
【図１４】ゲル強度に対する水酸化カリウム濃度の効果のグラフである。
【図１５】透過率に対するカルゴン（Ｃａｒｇｏｎ）濃度の効果のグラフである。
【図１６】ゲル強度に対するカルゴン濃度の効果のグラフである。
【００１７】
本発明の別の実施形態は、複数のスフィンゴモナス種のＤＮＡから、すなわちＡＴＣＣ  ３１４６１および５３１５９から単離した、ＰＨＢ合成酵素のタンパク質をコードする単離されたＤＮＡ配列を対象とする。
【００１８】
本発明の別の実施形態は、スフィンゴモナス属の変異株を発酵させるステップと、発酵ブロスから得たＰＨＢ欠失スフィンガンを清澄化するステップとを含む、ＰＨＢ欠失清澄化されたスフィンガンを調製する方法を対象とする。
【００１９】
本発明のさらに別の実施形態は、スフィンガン発酵ブロスを約３０℃から約７０℃の清澄化温度に加熱するステップと、スフィンガン発酵ブロスを清澄化剤で処理し、次いでこの発酵ブロスを酵素で処理するステップとを含む、清澄化されたスフィンガン溶液を調製する方法を対象とする。本発明のいっそうさらなる別の実施形態は、スフィンガン発酵ブロスを約３０℃から約７０℃の清澄化温度に加熱するステップ、この発酵ブロスをキレート剤で処理するステップ、この発酵ブロスをリゾチーム酵素で処理するステップ、この発酵ブロスを苛性剤または酸化剤で処理するステップ、およびこの発酵ブロスをプロテアーゼ酵素で処理するステップを含む、清澄化されたスフィンガン溶液を調製する方法を対象とする。
【００２０】
本発明の別の実施形態は、清澄化された、ＰＨＢ欠失、高ゲル強度の（天然の）高アシルゲランの調製を可能にする、スフィンゴモナス・エロデアの変異株を対象とする。
【００２１】
本発明のさらに別の実施形態は、ＰＨＢ欠失および／または清澄化されたスフィンガンを含む食品または工業製品を対象とする。
【００２２】
図１は、ＬａｓｅｒＧｅｎｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によるＤＮＡ  ｓｔａｒ  ＭｅｇＡｌｉｇｎｓ（登録商標）というソフトウェアを使用して並べた、Ｒｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ（Ｕ１７２２７）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ（Ｊ０５００３）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種  ＲＡ３８４９株（Ｌ３７７６１）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐａｅｒｏｉｄｅｓ（Ｌ１７０４９）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、およびＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ（Ｌ０７８９３）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）からのＰＨＢ合成酵素タンパク質の配列を示す。中程度の（ｍｏｄｅｒａｔｅ）縮重がある保存領域として領域ＩおよびＩＩを選んだが、それは約４００塩基対（「ｂｐ」）のポリメラーゼ連鎖反応法（「ＰＣＲ」）産物をもたらす位置にあった。
図２は、プラスミドｐＥＢＩ中の４０８ｂｐ挿入断片の配列を示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）。
図３は、スフィンゴモナス・エロデアのｐｈａＣ遺伝子中の内部欠失をクローン化し、構築するために使用するステップの模式図である。
図４は、ｐｈａＣ領域の配列を示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）。ＰｓｔＩに対する制限酵素部位（ＣＴＧＣＡＧ）には下線を引いてある。プライマー結合部位を、矢印で示す。ｐｈａＣ遺伝子の部分は、最初のＰｓｔＩ部位からＴＧＡ終止コドンまで延びている（太字）。変異株で欠失している塩基は、字間をあけて並べてある。ＸｂａＩ部位（ＴＣＴＡＧＡ、二重下線）を、本文中で述べたように、変異株の欠失領域と置換する。
図５は、変異させたｐｈａＣ遺伝子の、スフィンゴモナス・エロデア染色体への相同的組換え、および染色体中に無処置のまたは変異させたｐｈａＣ遺伝子を残すようにした、組み込まれたベクターの切除の概略図である。
図６は、プラスミドｐＬＯ２の説明図である。
図７は、ｐｈａＣ欠失を含むベクターの、スフィンゴモナス・エロデア染色体への組込みを説明する概略図である。
図８は、１０Ｌ発酵物からのブロスサンプルを培養することによって求められた、細胞数のグラフ表示である。
図９は、ＥｃｏＲＩを用いて消化させ、ＡＴＣＣ  ５３１５９のｐｈａＣ遺伝子に対するプローブとハイブリダイズさせたスフィンゴモナスゲノムＤＮＡ調製物のサザンハイブリダイゼーションを示す。レーン１および２は、サイズマーカーを含む（それぞれ、λ  ＨｉｎｄＩＩＩ、λ  ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＥｃｏＲＩ）。レーン３〜６は、スフィンゴモナス種のＡＴＣＣ  ５３１５９、３１４６１、３１５５５、および３１９６１株からのゲノムＤＮＡ消化物を含む。
図１０は、ＡＴＣＣ  ５３１５９のｐｈａＣ遺伝子、および隣接領域のＤＮＡ配列である（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）。ＢａｍＨＩ（ｇｇａｔｃ）、ＥｃｏＲＩ（ｇａａｔｔｃ）、およびＮｏｔＩ（ｇｃｇｇｃｃｇｃ）に対する制限酵素部位には下線、プライマー重複部位には二重下線を引いてある。プライマー部位を矢印で示す。ｐｈａＣ遺伝子は、太字で強調してある。
図１１は、ｐｈａＣ領域の遺伝子地図およびＰＣＲ増幅のためのプライマーを示す。
図１２は、ＰＣＲを用いて、ｐｈａＣに隣接する領域のみを含み、ｐｈａＣ遺伝子全体を欠く生成物を構築するクローニング戦略を示す。
図１３は、透過率に対する水酸化カリウム濃度の効果のグラフである。
図１４は、ゲル強度に対する水酸化カリウム濃度の効果のグラフである。
図１５は、透過率に対するカルゴン（Ｃａｒｇｏｎ）濃度の効果のグラフである。
図１６は、ゲル強度に対するカルゴン濃度の効果のグラフである。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、ＰＨＢ合成を不活性化させる無発現変異により内部の貯蔵高分子であるポリヒドロキシ酪酸（「ＰＨＢ」）を合成する能力に欠失があるスフィンゴモナス属の、遺伝子操作株に関する。本発明によるＰＨＢ欠陥性のスフィンゴモナス変異株は、当分野でよく知られた比濁法によって定性的に決定されるところの、ＰＨＢを含まない、商業的に有用なスフィンガンの合成が可能である（以下の実施例４、および米国特許第５，３００，４２９号（その内容を参照により組み込む）を参照のこと）。ＰＨＢは、スフィンゴモナスにおいて、最適濃度のスフィンガンを産生する条件と同様の、高炭素および低窒素の条件下で細胞内に蓄積する貯蔵高分子である。
【００２４】
ＰＨＢの合成は、いくつかの生物で研究されており、少なくとも３種のＰＨＢ合成遺伝子が同定されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａ，Ｊ．およびＥ．Ａ．Ｄａｗｅｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ  ５４：４５０〜７２（１９９０年））。ＰＨＢは、アセチル補酵素Ａ（ＣｏＡ）から、３つのステップで誘導される。第１のステップは、３−ケトチオラーゼ（ｐｈａＡ）によって触媒され、アセトアセチルＣｏＡが形成される。第２のステップでは、酵素アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ｐｈａＢ）が、アセトアセチルＣｏＡを、β−ヒドロキシブチリルＣｏＡに変換し、それが最終的に、第３のステップでＰＨＢ合成酵素（ｐｈａＣ）によって重合化され、ＰＨＢが形成される。ポリヒドロキシ酪酸合成に必要とされるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子、すなわち、ｐｈａＡ、ｐｈａＢ、またはｐｈａＣを、選択的に変異させるあるいは欠失させる変異により、ＰＨＢ欠失スフィンゴモナス株を得ることが可能である。
【００２５】
例えば、本明細書に記載するスフィンゴモナス変異株は、少なくとも次の２種の変異の結果である。（１）ＰＨＢの産生をブロックし、スフィンガン産生を減少させるという予期せぬ結果を伴う、ＰＨＢ合成酵素をコードするｐｈａＣ遺伝子の欠失、または同遺伝子内の欠失、（２）スフィンガン産生を回復させる自然突然変異。本発明はまた、スフィンゴモナス変異株の、プラスミドＤＮＡを取り込む能力を増進させる自然突然変異、すなわちスフィンゴモナス・エロデアにおけるＳ−６０ｗｔｃ変異を含む、所望により行う事前変異も提供する。
【００２６】
さらに、本発明は、キレート剤、苛性剤、または酸化剤、ならびに細胞溶解およびタンパク質消化のための酵素を使用して、スフィンゴモナス変異株によって産生される、ＰＨＢ欠失ゲランおよび他のスフィンガンを清澄化する方法を開示する。本発明はまた、ＰＨＢ欠失および／または清澄化されたスフィンガンを含む食品または工業製品も開示する。
【００２７】
本発明の詳細を示すために、スフィンゴモナス・エロデアおよびスフィンゴモナス種  ＡＴＣＣ  ５３１５９の遺伝子操作に関与するステップを説明する。しかし、以下に言及するように、本発明は、スフィンゴモナス・エロデアおよびスフィンゴモナス種  ＡＴＣＣ  ５３１５９の操作に限定されず、またＰＨＢの合成に必要とされるタンパク質をコードするいかなる特定の遺伝子の操作にも限定されない。
【００２８】
タンパク質をコードするｐｈａＣの２つの保存領域から設計された縮重プライマーを用いるＰＣＲによって、Ｓ．エロデア株、ＡＴＣＣ  ３１４６１、ｐｈａＣ遺伝子の内部フラグメントを得た。図２に示すこのフラグメントのヌクレオチド配列を利用して、ｐｈａＣ遺伝子および３’隣接配列の大きな部分の単離を可能にする逆ＰＣＲ（ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ）のためのプライマーを設計した。一般に、逆ＰＣＲの技術は、配向がその本来の向きとは逆方向である、当該のヌクレオチドの隣接領域をクローン化する（図３参照）。本来の配向の逆ＰＣＲフラグメントを配列するクローン化プロセスにより、２３２塩基対（「ｂｐ」）の欠失がもたらされた。このフラグメントを染色体のｐｈａＣ遺伝子と対立的に交換（ａｌｌｅｌｉｃ  ｅｘｃｈａｎｇｅ）し、Ｓ．エロデアにおけるＰＨＢ産生を失わせた。２３２ｂｐの内部欠失により、ゲラン産生を減少させるという予期せぬ効果がもたらされた。
【００２９】
ゲラン産生の回復を伴う自然発生的誘導体を、大規模増殖させたＳ．ｅｌｏｄｅａ変異株から単離した。本発明のＰＨＢ欠陥性誘導体は、外来ＤＮＡを含まず、および天然の染色体からの２３２ｂｐの欠失、および特徴付けられていない自然突然変異を含む。ＰＤＧ−１およびＰＤＧ−３株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、それぞれＡＴＣＣ  Ｎｏ．        、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．        と名付けられている。
【００３０】
特定の分子生物学技術、すなわちスフィンゴモナス変異株を産生するために使用する逆ＰＣＲおよび欠失変異は、ＰＨＢ産生では不可欠ではない。スフィンゴモナス変異株を産生するために通常の分子生物学技術を使用することは、当分野の技術者の知るところである。異なるスフィンゴモナス株においてｐｈａＣ類似の遺伝子を変異させるために使用できる他の有用な分子生物学技術には、これだけには限らないが、トランスポゾン変異誘発、点変異、および挿入配列（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）変異がある。
【００３１】
ｐｈａＣ遺伝子は、ＰＨＢ合成経路における唯一の遺伝子である。したがって、ＰＨＢ合成経路に関与する他の遺伝子を選択的に変異、または欠失させることによって、所望の表現型をもつ、すなわちＰＨＢの産生に欠失があるスフィンゴモナス変異株を産生することが可能である。所望の表現型を得るために選択的に変異、または欠失させることができる当該の遺伝子には、これだけには限らないが、ｐｈａＡ（３−ケトチオラーゼ）およびｐｈａＢ（アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ）がある。
【００３２】
スフィンゴモナス変異株を作り出した後、それを発酵ブロスとして知られる水溶液中で、増殖または発酵させて、スフィンガンがカプセル多糖として分泌されるようにする。変異株としてのＰＨＢ欠失スフィンゴモナス変異株を発酵させた後、当分野でよく知られた技術を用いて、このブロスを低温殺菌し、スフィンガンをイソプロパノールなどのアルコールで沈殿させることによって、スフィンガンを調製することができる。
【００３３】
好ましくは、発酵後、スフィンガンを清澄化し、発酵ブロス環境の一部である懸濁した固形物および細胞片から単離し、ＰＨＢ欠失清澄化されたスフィンガンを得ることができる。さらに、本発明の清澄化プロセスは、上記のＰＨＢ欠陥性スフィンガン以外にもいかなるスフィンガン株にも適用することができる。本明細書に述べるように、清澄化プロセスは、発酵ブロスを加熱すること、および発酵ブロスを１種または複数のキレート剤、１種または複数の苛性剤あるいは酸化剤、あるいはそれらの混合物で処理し、次いでリゾチーム酵素および／またはいずれかのプロテアーゼ酵素で処理することを含む。
【００３４】
特にゲランについては、本発明の清澄化プロセスと組み合わせた、ＰＨＢ産生に欠失があるＳ．エロデア変異株は、高アシル型の清澄化ゲランを産生できるようになる。この変異株およびプロセスから得られるゲランは、デザートのゼリー、菓子、飲料などを製造するのに有用な、高い透明度と、高いゲル強度を示す。
【００３５】
以下で「第１のプロトコル」と呼ぶ本発明の一実施形態では、スフィンガン溶液を所望により１種または複数の界面活性剤、１種または複数のキレート剤、１種または複数の苛性剤あるいは酸化剤、あるいはそれらの混合物で処理すること、およびそれに続いて１種または複数のいずれかのリゾチーム酵素および／または１種または複数のいずれかのプロテアーゼ酵素で処理することを含むプロセスによって、スフィンガンの水溶液を清澄化することができる。
【００３６】
以下で「第２のプロトコル」と呼ぶ本発明の別の実施形態では、スフィンガン溶液を１種または複数のキレート剤、続いて１種または複数のいずれかのリゾチーム酵素、続いて１種または複数の苛性剤あるいは酸化剤、続いて１種または複数のいずれかのプロテアーゼ酵素またはプロテアーゼ酵素の混合物で処理することを含むプロセスによって、スフィンガンの水溶液を清澄化することができる。
【００３７】
第１のプロトコルでは、本発明のプロセスを、以下のように段階的に実施することができる。スフィンガン溶液を、最初に１種または複数のキレート剤、所望により１種または複数の界面活性剤、１種または複数の苛性剤あるいは酸化剤あるいはそれらの混合物で処理し、続いて１種または複数のいずれかのリゾチーム酵素および／またはいずれかのプロテアーゼ酵素で処理する。第２のプロトコルでは、次の段階的プロセスを実施することができる。スフィンガン溶液を、最初に１種または複数のキレート剤、続いて１種または複数のいずれかのリゾチーム酵素、続いて１種または複数の苛性剤あるいは酸化剤で処理し、続いて１種または複数のいずれかのプロテアーゼ酵素で処理するという順序である。
【００３８】
有利には、本明細書に述べる清澄化されたスフィンガン溶液を生成する方法は、望むなら、適当な希釈の後に、さらに（低温殺菌および沈殿以外に）化学的または物理的処理をすることなく使用できるスフィンガン溶液を提供する。いくつかの用途では、通常の技術に従って、ブロスを低温殺菌すること、ブロスを所望のｐＨに調整すること、およびスフィンガンをアルコール（すなわちイソプロピルアルコール）で沈殿させることによって、スフィンガンを、これら清澄化されたスフィンガンブロスから単離することができる。
【００３９】
このスフィンガンを水に再水和および溶解することによって、実質上透明なスフィンガン溶液がもたらされる。本発明による実質上透明なスフィンガン溶液（１％  ｗ／ｗ）は、光線透過率が６０％より高く、好ましくは７０％より高く、もっとも好ましくは８０％より高い。光線透過率は、通常の技術および装置（例えば、市販品として利用できる分光光度計）を用いて、可視スペクトルのいかなる波長でも測定することができる。光線透過率は通常、約６００ｎｍ〜約６５０ｎｍの波長で測定する。光線透過率は、未処理のブロス、部分的に処理したブロス（例えば、１種または複数のキレート剤、１種または複数の苛性剤あるいは酸化剤、キレート剤／苛性剤あるいはキレート剤／酸化剤の混合物のみで処理したブロス、あるいは、リゾチームおよび／またはプロテアーゼ酵素のみで処理したブロス）、処理したブロス、あるいは再構成したスフィンガン溶液など、いくつかのタイプのスフィンガン溶液について求めることができる。光線透過率が６０％より高い、本明細書に述べる実質上透明な溶液は、本発明による方法で処理したブロスから単離した、スフィンガンを約１重量％含む水溶液である。
【００４０】
本発明のプロセスを用いて清澄化することができるスフィンガン溶液には、栄養培地でスフィンガンを産生する微生物を発酵させることによって得られるスフィンガンを含む完全な発酵ブロス、単離したスフィンガンを水性の溶媒に加えることによって得られる溶液、および部分的に精製したスフィンガン溶液がある。本発明のプロセスで有用な、望ましくない発酵固形物を含むスフィンガンの水溶液は、溶液の総重量に対して約０．０１重量％〜約１０重量％のスフィンガンを含むことができる。本発明を実施する際には、いかなる既知のスフィンガンを含むいかなる水溶液も使用することができる。
【００４１】
本発明のいずれかの清澄化プロセスの第１のステップは、ジャケット付きタンク中での温度調節、直接蒸気噴射などの通常の技術によって、スフィンガン溶液を清澄化温度に加熱することを含む。直接蒸気噴射は、加熱時間を最小限にするために好ましい。清澄化温度は、約３０℃から約７０℃、好ましくは約５０℃から約６０℃の範囲である。スフィンガン溶液を所望の温度に加熱するために必要な時間の長さは、処理するスフィンガン溶液のサイズおよび体積に応じてかなり変わってくる。例えば、体積が小さい（例えば５０ｍｌ）のスフィンガン溶液の温度を室温から約６０℃まで上昇させるためには、数分しかかからないのに対し、（例えば、バッチ処理で存在する可能性がある）４０，０００リットルの溶液の温度を同様に上昇させるためには、数時間かかる可能性がある。
【００４２】
本発明のプロセスの次のステップは、２つのプロトコルのうちの１つに従って、スフィンガン水溶液を、少なくとも１種のキレート剤、少なくとも１種の苛性剤または酸化剤、あるいはそれらの混合物から選択される清澄化剤で処理することを含む。あるいは、スフィンガンブロスを上記の清澄化温度に加熱するのと同時に、清澄化剤を加えてもよい。
【００４３】
第１のプロトコルでは、次のステップは、１種または複数の苛性剤または酸化剤が存在するスフィンガン溶液に１種または複数のキレート剤を加えることである。通常、１種または複数のキレート剤、および１種または複数の苛性／酸化剤への接触時間は、それぞれ約０．５時間から約２時間ずつ、好ましくは１種または複数のキレート剤に１時間、１種または複数の苛性または酸化剤に約０．５から約１．０時間の範囲である。通常、１種または複数の苛性剤または酸化剤を、約０ｇ／Ｌから約２ｇ／Ｌ、好ましくは約０．５ｇ／Ｌから約１．５ｇ／Ｌの範囲の濃度で、スフィンガン溶液に加える。通常、１種または複数のキレート剤を、約０ｐａｒｔｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ（「ｐｐｍ」）〜約３０００ｐｐｍ、好ましくは約１０００ｐｐｍ〜約２０００ｐｐｍの範囲の濃度でスフィンガン溶液に加える。
【００４４】
第１のプロトコルでは、清澄化剤で処理した後、スフィンガンブロスを、酵素処理のステップにかける。このステップでは、酵素リゾチームおよび／またはプロテアーゼを、スフィンガンブロスに、別々にまたは同時に加える。通常、これらの酵素は、スフィンガンブロスに、少なくともそれぞれ０．５時間から８時間ずつ、好ましくは少なくともそれぞれ１時間ずつ、最も好ましくは少なくともそれぞれ２時間ずつの範囲の時間接触させる。通常のリゾチーム濃度は、約１１，０００ＭＣＧ単位／Ｌから約４４，０００ＭＣＧ単位／Ｌ、好ましくは約２０，０００ＭＣＧ単位／Ｌから約２５，０００ＭＣＧ単位／Ｌの範囲であり、通常のプロテアーゼ濃度は、約６５，０００Ｄｅｌｆｔ単位／Ｌから約２６，０００Ｄｅｌｆｔ単位／Ｌ、好ましくは約１００，０００Ｄｅｌｆｔ単位／Ｌから約１５０，０００Ｄｅｌｆｔ単位／Ｌの範囲である。本出願では、「ＭＣＧ単位」とは、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．によって記載されるように、ｐＨ６．６かつ３７℃で、参照基準と比較したＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓの溶解率を意味し、同様に、用語「Ｄｅｌｆｔ単位」とは、販売元であるＧｅｎｅｎｃｏｒによって提供される溶液中にある場合の吸光率（ｒａｔｅ  ｏｆ  ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ）に関する特異的分析結果を意味する。
【００４５】
酵素処理ステップで使用するこれらの酵素は、固形状の細胞片を可溶性化合物に分解し、その結果、スフィンガン溶液の透過率が向上し、清澄化プロセスの助けとなる。このプロセスで使用するのに適したプロテアーゼ酵素は、細菌、真菌、または植物が起源の酸性、中性、またはアルカリ性のプロテアーゼである。本発明のプロセスで有用な酸性のプロテアーゼ酵素の例には、これだけには限らないが、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）などアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の微生物によって産生されるプロテアーゼがある。本発明のプロセスで有用な中性のプロテアーゼ酵素には、これだけには限らないが、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ）などのプロテアーゼがある。本発明のプロセスで有用なアルカリ性のプロテアーゼ酵素には、これだけには限らないが、Ｂ．ズブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）およびＢ．プミリス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｉｓ）などバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の微生物、ならびにＳ．フラジア（Ｓ．ｆｒａｄｉａｅ）、Ｓ．グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）およびＳ．レクツス（Ｓ．ｒｅｃｔｕｓ）など、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）によって合成されるプロテアーゼ、ならびにサブチロペプチダーゼ（ｓｕｂｔｉｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）ＡおよびサブチロペプチダーゼＢなどのプロテアーゼを含めて、サブチリシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）Ｎｏｖｏ、サブチリシンＣａｒｓｂｅｒｇなどサブチリシンから得られるプロテアーゼがある。このプロセスで使用するのに適したリゾチームには、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）からのＭｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）リゾチーム、あるいは植物、動物、または微生物を起源として得ることができるいずれかのリゾチームがある。本発明で使用するどのプロテアーゼ酵素またはリゾチームの起源も、重大ではない。これらの酵素およびこれらの酵素を得る方法は、当技術分野でよく知られている。
【００４６】
上の第１のプロトコルで述べたように、酵素処理（リゾチーム酵素および／またはプロテアーゼ酵素による処理）を含む酵素は、同時に加えても別々に加えてもよい。同時処理は、処理の間、両方の酵素がスフィンガン溶液に存在するという条件で、プロテアーゼ酵素およびリゾチーム酵素をスフィンガン溶液にいかなる順序で、いかなる時間加えてもよいことを意味する。同時に加える場合、本発明の酵素処理プロセスは、リゾチーム酵素およびプロテアーゼ酵素の両方が活性であり、所望の酵素作用をもたらすような条件下で行う。この実施形態の同時酵素処理プロセスは、約３０℃から約７０℃の温度、約５から約９、好ましく約６から８のｐＨで行うことができる。この実施形態の特定の温度およびｐＨ範囲は、使用する酵素に応じて異なる可能性があるのに対し、この同時実施形態では、リゾチーム酵素およびプロテアーゼ酵素（酸性、中性またはアルカリ性のプロテアーゼ）が、スフィンガン溶液を清澄化するために許容できる活性レベルを示すように、本発明のプロセスを比較的穏やかな温度で、ほぼ中性の条件で行う。
【００４７】
いずれかのリゾチームおよび／またはプロテアーゼ酵素をスフィンガン溶液に別々に加えるようにして、酵素処理を行うことが好ましい。各酵素を、それぞれの最適ｐＨ条件下、すなわちリゾチームでは酸性から中性ｐＨ範囲（約３から約７．５のｐＨ範囲）、プロテアーゼでは中性から塩基性ｐＨ範囲（約６．５から約９のｐＨ範囲）でスフィンガン溶液に別々に加えることが最も好ましい。異なるリゾチームおよびプロテアーゼ酵素では、最適清澄化活性を示す温度およびｐＨは、異なる可能性がある。さらに、酵素処理で使用するリゾチーム酵素とプロテアーゼ酵素との選択をしなければならない場合、酵素処理が１種または複数のプロテアーゼ酵素を含むことが好ましい。
【００４８】
第２のプロトコルでは、キレートステップの後、１種または複数のいずれかのリゾチーム酵素での酵素処理、それに続いて１種または複数の苛性または酸化剤処理、続いて１種または複数のいずれかのプロテアーゼ酵素処理を行う。上で例示したように、酵素処理は、１種または複数のリゾチーム酵素と１種または複数のプロテアーゼ酵素の２つに分かれる。二者択一的なこの順序づけは、１種または複数のいずれかのリゾチーム酵素をその好ましい中性から酸性ｐＨ条件下で作用できることを可能にし、１種または複数のいずれかのプロテアーゼ酵素をその好ましい中性から塩基性ｐＨ条件下で作用できることを可能にする。第２のプロトコルを実施する際に、上記の第１のプロトコルと同様のリゾチーム酵素およびプロテアーゼ酵素およびキレート剤、界面活性剤、ならびに苛性剤または酸化剤を使用することができる。
【００４９】
スフィンガン溶液の攪拌は必須ではないが、ふさわしければ、固形物の不適切な沈殿を防止し酵素との接触を促進するために、酵素のスフィンガン溶液を穏やかにまたは定期的にかき回すまたはかき混ぜる。
【００５０】
本発明のプロセスで使用するのに適したキレート剤は、金属イオンとともに多歯状突起を有する（ｐｏｌｙ−ｄｅｎｔａｔｅ）複合体を形成することによってスフィンガン溶液中で多価の金属イオン（例えばＭｇ＋２、Ｃａ＋２など）を封鎖することができ、金属イオンとともに沈殿物を形成するあるいは金属イオンを吸着する化合物または組成物である。キレート剤は、水または水−アルコールに溶ける化合物または組成物であり、アルカリ金属またはアルカリ土類の有機酸および／または無機酸の塩、あるいは塩基性（アミンを含有する）有機化合物の有機／無機酸塩、ならびに有機酸および／または無機酸自体あるいは塩基性化合物自体であることが好ましい。本発明のプロセスで有用な他のキレート剤は、陽イオン交換樹脂および炭酸塩および炭酸塩である。本発明のプロセスで特に有用な、塩の化合物および組成物には、エチレンジアミン四酢酸、リン酸、メタリン酸、炭酸、クエン酸、酒石酸、グルコン酸、グルタミン酸、ピロリン酸、ポリリン酸、メタリン酸、糖酸、エチレングリコール−ｂｉｓ−（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、エチレンジアミン、２，３−ジアミノブタン、１，２−ジアミノシクロヘキサン、トリアミノトリエチルアミンなどの塩がある。有用な塩として、適当な、上記の酸の一、二、三および／または四金属塩、ならびに上記の塩基の一、二、三酸塩を挙げることができる。好ましくは、本発明のプロセスで使用するキレート剤には、エチレンジアミン四酢酸、クエン酸、リン酸、ピロリン酸、ポリリン酸、炭酸、メタリン酸、およびエチレンジアミンの塩を含む。有用なキレート剤の例には、これだけには限らないが、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸二カリウム、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸四カリウム、クエン酸三ナトリウム、クエン酸三カリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸カリウム、ポリリン酸ナトリウム、ポリリン酸カリウム、ピロリン酸ナトリウム、ピロリン酸カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸二カリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸三カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、陽イオン交換樹脂、エチレンジアミン二塩酸、エチレンジアミン二酢酸、エチレンジアミンリチウム塩、エチレンジアミンジヒドロヨウ素などの塩がある。キレート剤としてヘキサメタリン酸ナトリウムを使用することが、より好ましい。
【００５１】
上記のプロトコルで述べたように、最終ゲラン生成物の透過率をさらに向上させるために、苛性剤、酸化剤、およびキレート剤と組み合わせて、場合によっては界面活性剤を使用することができる。本発明のプロセスで使用するのに適した界面活性剤は、親水性および疎水性物質（固体または液体）の存在下で、水性のエマルジョンを形成することができる化合物または組成物である。界面活性剤は、水または水−アルコールに溶ける化合物または組成物が好ましい。有用な界面活性剤の例には、これだけには限らないが、ＳＤＳ、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標）、ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）、これだけには限らないがＳＤＳ、レシチン、モノグリセリド、モノグリセリドの酒石酸エステル、（例えば一ナトリウム塩としての）リン酸モノグリセリド、乳酸モノグリセリド、アセチル化モノグリセリド、コハク酸モノグリセリド、エトキシ化モノグリセリド、ソルビタンエステル、ポリソルベート、ポリグリセリンエステル、ショ糖エステル、ステアロイル乳酸ナトリウム、プロピレングリコールエステルなどがある。
【００５２】
所望により界面活性剤を、１種または複数のキレート剤、あるいは１種または複数の苛性剤または酸化剤で処理する間のいずれかの時期に、スフィンガンブロスに加え、それぞれ約０．５時間から約８時間、好ましくは約２時間の時間接触させる。通常、界面活性剤を、スフィンガン溶液に、約０．０ｇ／Ｌから約３．０ｇ／Ｌ、好ましくは約０．１ｇ／Ｌから約１．０ｇ／Ｌの範囲の濃度で加える。通常、１種または複数の界面活性剤を、約０ｐａｒｔｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ（「ｐｐｍ」）から約３０００ｐｐｍ、好ましくは約３００ｐｐｍから約１０００ｐｐｍの範囲の濃度でスフィンガン溶液に加える。
【００５３】
本発明のプロセスで使用するのに適した苛性剤には、これだけには限らないが、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、リン酸三ナトリウムなどがある。水酸化カリウムが好ましい苛性剤である。あるいは、酸化剤を、苛性剤の代わりに使用することもできる。本発明の清澄化プロセスで使用できる酸化剤には、次亜塩素酸ナトリウムまたは他の次亜塩素酸塩、二酸化塩素、過酸化水素、過酢酸、オゾン、および他の当技術分野でよく知られた酸化剤がある。本発明では、好ましい酸化剤は、次亜塩素酸ナトリウムである。
【００５４】
スフィンガン溶液を１種または複数のキレート剤、１種または複数の界面活性剤、１種または複数の苛性剤または酸化剤あるいはそれらの混合物で処理することによってもたらされる清澄化の程度は、酵素濃度またはその後の酵素処理を完了させるために必要とされる時間に影響を与える可能性があることに留意すべきである。例えば、このプロセスで使用する１種または複数のキレート剤、１種または複数の界面活性剤、１種または複数の苛性剤または酸化剤あるいはそれらの混合物の量を増加させると、使用する酵素の量および／またはスフィンガン溶液の清澄化をもたらすのに必要な時間を減少させることができる。本明細書に記載する清澄化されたＰＨＢ欠失スフィンガンの産生を最適化するためには、１種または複数のキレート剤、１種または複数の界面活性剤、１種または複数の苛性剤または酸化剤あるいはそれらの混合物の濃度および処理時間、および／またはリゾチームおよび／またはプロテアーゼの濃度および処理時間とを調整し、またバランスをとって、スフィンガン溶液を得ることが好ましい。
【００５５】
本明細書に記載するＰＨＢ欠失および／または清澄化されたスフィンガンを、様々な食料または工業用途で使用することができる。例えば、ＰＨＢ欠失および／または清澄化された、天然の（高アシル）ゲランなどのスフィンガンを使用して、デザートのゼリー、菓子、ジャム、およびゼリー、飲料、フィルム、コーティングなどの食品の、味、感触、安定性および外観を向上させることができる。追加の例として、ＰＨＢ欠失および／または清澄化された、Ｓ−６５７などのスフィンガンには、油田掘削またはセメントシステムなどの工業用途における流動学的モディファイアーとしての向上された有効性を見出すことができる。本発明の他のＰＨＢ欠失および／または清澄化されたスフィンガンにはまた、食品および工業の両方におけるより広い範囲の用途も見出されることとなるであろう。
【００５６】
以下の実施例は、本発明の例示を提供するものであり、いずれにせよ本発明の範囲を限定するものと誤解されるべきものではない。
【実施例１】
【００５７】
スフィンゴモナス・エロデアｐｈａＣフラグメントの作製
ＰＨＢ合成酵素遺伝子の高度に保存された領域を同定するため、別種の生物からのＰＨＢ合成酵素配列を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（「ＮＣＢＩ」）Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋから検索した。Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ（ｇｂ：Ｕ１７２２７）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐａｅｒｏｉｄｅｓ（ｇｂ：Ｌ１７０４９）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ（ｇｂ：０７８９３）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ（ｇｂ：Ｊ０５００３）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種  ＲＡ３８４９株（ｇｂ：Ｌ３７７６１）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）からの配列を選択し、研究した。選択したＰＨＢ合成酵素遺伝子のタンパク質配列を、図１に並べて示した。保存領域の中で、領域Ｉ（Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉのコドン４１１〜４１７）および領域ＩＩ（Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉのコドン５３５〜５４１）をそれらの位置および比較的低い縮重の程度に基づいて選択し、約４０８ｂｐのＰＣＲ生成物を得た。
【００５８】
縮重したＰＣＲプライマーを設計し、保存されるタンパク質配列およびスフィンゴモナス・エロデア、ＡＴＣＣ  ３１４６１の明白なコドン選択に基づいた領域Ｉと領域ＩＩの間の配列を増幅した。コドン選択は、Ｄｒ．Ｌｕｉｓ  Ｉｅｌｐｉ（未刊）によって配列決定された、Ｓ．エロデア、ＡＴＣＣ  ３１４６１における細胞外多糖（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）生合成酵素をコードする領域からの、ならびにＳ−８８ゴムを産生する（Ｙａｍａｚａｋｉ他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：２６７６〜２６８７（１９９６年））密接に関連したスフィンゴモナスＡＴＣＣ  ３１５５４の細胞外多糖生合成酵素の完全な遺伝子クラスターからの、５つの遺伝子におけるコドン使用頻度から推論した。
【００５９】
ＰＨＡＤＧ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）と呼ばれるＮ−末端プライマーは、５’−ＡＧＴＴクランプ領域（ｃｌａｍｐ  ｒｅｇｉｏｎ）、ＴＣＴＡＧＡ  ＸｂａＩ部位、および領域Ｉを標的にするＴＴＣ  ＧＡＹ  ＣＴＳ  ＣＴＳ  ＴＡＹ  ＴＧＧ  ＡＡＹ３’縮重ハイブリダイズ領域を含んだ。ＰＨＡＤＧ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）と呼ばれるＣ−末端プライマーは、５’−ＧＴＡＴクランプ、ＡＣＴＡＧＴ  ＳｐｅＩ部位、および領域ＩＩを標的にするＣＣＡ  ＩＩＩ  ＳＧＧ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＧＣＴ  ＧＣＣ縮重ハイブリダイズ領域を含んだ。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０では、「Ｉ」はイノシン、すなわち他のいかなる塩基、すなわちＡ、Ｃ、Ｔ、またはＧとも適合性があるヌクレオチドを意味する。
【００６０】
プライマーＰＨＡＤＧ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）およびＰＨＡＤＧ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）を、鋳型の働きをする非ムコイド株であるＧｐｓ３１からの染色体ＤＮＡと共に、ＰＣＲ反応で利用した。Ｇｐｓ３１は、Ｓ−６０ゲランを産生しない変異株である。Ｔａｑポリメラーゼを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）によるＴａｑ  Ｓｔａｒｔ（登録商標）抗体とともに使用することにより、１００μｌの反応体積中に各ｄＮＴＰ  ２．５ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ４ｍＭ、および各プライマー５０ピコモルを用いるＰＣＲのホットスタートが提供された。温度プログラムは、９６℃で５分、次いで９６℃で１分、５８℃で１分、７２℃で１分を３０サイクル、次いで７２℃で５分であり、その後４℃に冷却することによって反応を停止させた。このＰＣＲ反応により、予測された４１６ｂｐ（４０８ｂｐ＋クランプ）サイズの単一のバンドが得られた。ＸｂａＩおよびＳｐｅＩを用いた消化の後、フラグメントをＸｂａＩで消化させた、ウシ小腸アルカリホスファターゼ（ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（「ＣＩＡＰ」）で処理したｐＵＣ１９ベクターにクローン化し、プラスミドｐＥＢ１を得た。両方の株からの４０８ｂｐ挿入断片のＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を、図２に示す。このフラグメントは、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、およびＰｖｕＩＩに対する制限部位を含む。他のＰＨＢ合成酵素タンパク質を用いた翻訳されたクローン化フラグメントのアラインメントにより、ＰＨＢ合成酵素がクローン化されていることが示された。
【実施例２】
【００６１】
逆ＰＣＲによるｐｈａＣ欠失の構築
サザンハイブリダイゼーションを使用して、スフィンゴモナスＳ−６０  ｐｈａＣ遺伝子のより大きなフラグメント、ただし逆ＰＣＲによって容易に再生するのにあまり大きすぎないもの、をもたらす適切な制限酵素を決定した。ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）（Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）ＤＮＡ精製キットに記載された方法に従って、Ｇｐｓ３１から染色体ＤＮＡを単離した。ｐＥＢ１でクローン化した４０８ｂｐ挿入断片（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）から作成したプローブを用いたサザン分析では、Ｓ．エロデアＤＮＡのＰｓｔＩ消化物において、４０８ｂｐ  ｐｈａＣフラグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）は、約２ｋｂのフラグメント中にあることが示された。
【００６２】
図２に示すように、４０８ｂｐ  スフィンゴモナスＳ−６０  ｐｈａＣフラグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の配列を用いて、外側を読むＰＣＲプライマーを選択した。プライマーＰＨＡＣ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）は、クランプ５’ＧＴＴＣ、ＸｂａＩ部位ＴＣＴＡＧＡ、およびハイブリダイズ領域ＧＧＣ  ＧＣＧ  ＡＴＣ  ＡＧＣ  ＴＴＧ  ＴＴＧ  ＴＣ３’をもち、タンパク質をコードするｐｈａＣのＮ末端側（ｔｏｗａｒｄ）を読む。プライマーＰＨＡＣ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）は、クランプ５’ＧＴＴＣ、ＸｂａＩ部位ＴＣＴＡＧＡ、およびハイブリダイズ領域ＧＡＧ  ＴＣＧ  ＣＴＣ  ＧＡＡ  ＴＣＣ  ＴＴＴ  ＧＴＣ３’をもち、タンパク質をコードするｐｈａＣのＣ末端側（ｔｏｗａｒｄ）を読む。Ｓ．ｅｌｏｄｅａ染色体ＤＮＡをＰｓｔＩで消化し、ＤＮＡ０．５μｇを体積２００μｌ中で結合させ、環状にさせた。直鎖状のＤＮＡ分子を作成するためにＫｐｎＩ消化物を逆ＰＣＲ反応において鋳型として使用して、図３に示すように、４０８ｂｐ  ｐｈａＣフラグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を隣接する領域の１．７ｋｂフラグメントを作成した。
【００６３】
この１．７ｋｂフラグメントは、ＰｓｔＩ末端では本来の配向と比較すると逆転した配向で結合した２つの隣接領域を含む。ＰｓｔＩ部位の切断により、これらの隣接領域がほぼ同じサイズ、８５０ｂｐと９８０ｂｐであることが示された。このフラグメントを本来の配向に配向し直し、同時に、欠失した元の４０８ｂｐクローンの大部分を有するフラグメントを作成するため、この１．７ｋｂフラグメントをＸｂａＩで消化させ、環状にさせるための希釈条件下でそれを結合させ、次いでＰｓｔＩで消化させた。得られたフラグメントを、ＰｓｔＩで消化し、ＣＩＡＰ処理したｐＵＣ１９でクローン化し、ｐＥＢ４と名付けた。
【実施例３】
【００６４】
ｐｈａＣクローンの配列決定
ｐＥＢ４中の１．７ｋｂ挿入断片を配列決定し、４０８ｂｐフラグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の配列と結合させた。結合させた１９２０ｂｐ  ＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）を、図４に示す。この配列のＰｓｔＩ部位からＴＧＡ終止コドンまでの部分（塩基１〜２０００）は、他のｐｈａＣ遺伝子のカルボキシ側２／３と相同なタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）をコードする。配列アラインメントで、正確な遺伝子がクローン化されたことを確認した。
【００６５】
このｐｈａＣクローンは、４０８ｂｐセグメント内の２３２ｂｐの欠失、およびＸｂａＩ部位に相当する６ｂｐ、ＴＣＴＡＧＡの挿入があった。この欠失および挿入により、カルボキシ末端を改変し、塩基対１１０２に新規の終止コドンを導入する、フレームシフト変異が引き起こされた。
【実施例４】
【００６６】
組込みベクターの構築および相同的組換えによるスフィンゴモナスへの導入
ｐｈａＣ欠失変異を、スフィンゴモナス・エロデアに移送するために、プラスミドの構築に適した宿主、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中では複製することができるが、スフィンゴモナス中では複製することができない「自殺」プラスミドを使用した。スフィンゴモナスにおいて、このプラスミドによってコードされる抗生物質耐性について選択することにより、相同的組換えの結果としてプラスミドが染色体に組み込まれているコロニーが同定される。抗生物質耐性の喪失について選択することにより、図５に図示される、変異の保持（すなわち、欠失）または野生型の遺伝子をもたらす可能性がある、複製された領域が完全に再結合したコロニーが同定される。欠失を有するクローンと野生型ＤＮＡをもつクローンの区別は、形質発現（ＰＨＢ合成）によって決定することができる。ＰＨＢの形質発現を測定するため、定性的な比濁法を用いた。ブロスのアリコート約１ｍｌをＣｌｏｒｏｘ（登録商標）（Ｃｌｏｒｏｘ  Ｃｏ．，Ｏａｋｌａｎｄ，ＣＡ）９体積に加え、３７℃で少なくとも４時間または終夜インキュベートした。白色沈殿の出現が、ＰＨＢの存在を示す。
【００６７】
第２の交叉型組換え事象の検出を容易にするため、ポジティブ選択システム（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）をＳ．エロデア用に適合させた。レバンスクローゼをコードする枯草菌遺伝子であるｓａｃＢは、グラム陰性細菌に導入することができる（Ｋａｍｏｕｎ．Ｓ．他、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：８０９〜８１６（１９９２年）；Ｇａｙ，Ｐ．他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６４：９１８〜９２１（１９８５年））。スクロース中でこうした細菌を増殖させると、細菌に対して毒性があるレバンの合成が促進される。したがって、ｓａｃＢ遺伝子がベクター中に存在すれば、スクロース中での成長を使用して、ベクターを失った分離株を同定することができる。
【００６８】
ｐＬＯ２プラスミドは、Ｓｔｅｖｅｎ  Ｓｌａｔｅｒ  ａｔ  Ｃｅｒｅｏｎ，Ｍｏｎｓａｎｔｏから入手した。ｐＬＯ２プラスミドは、図６に示されるように、カナマイシン耐性のベクター上のｓａｃＢ遺伝子と、複製のＣｏＩＥＩ起点および導入のＲＰ４起点を含む（Ｌｅｎｚ，Ｏ．他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：４３８５〜４３９３（１９９４年）。ｐＬＯ２プラスミドを使用し、接合の自然のプロセスを通じて、遺伝子を導入することができる。このプラスミドは、大腸菌中で複製することができるが、スフィンゴモナス中では複製できず、また、プラスミドの可動化のための部位を含むが、導入機能は含まない。つまり、ｐＬＯ２プラスミドは、移動可能であるが自己伝染可能ではない。接合導入（ｃｏｎｊｕｇａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）機能のための遺伝子は、第２のプラスミドおよびトランス機能によって与えられる。この実施例ではｐＬＯ２プラスミドを使用したが、ｐＬＯ２プラスミドを使用することは重要ではない。当分野の技術者であれば、適当な別のプラスミドを設計し、操作する方法や、エレクトロポレーション、形質転換などの通常の技術を用いて、そのプラスミドをスフィンゴモナスに導入する方法は分かるであろう。同様に、選択マーカーとしてカナマイシンを使用することも、重要ではない。当分野の技術者であれば、適切な別の選択マーカーを選ぶ方法は分かるであろう。
【００６９】
ｐｈａＣ欠失を含む１．７ｋｂ  ＰｓｔＩフラグメントを、ＰｓｔＩ消化ｐＬＯ２に結合させ、ｐＬＯ２−ｐｈａＣｖまたはｐＥＢ１１と命名し、エレクトロポレーションを用いる形質転換によって、大腸菌ＹＭＣ９（Ｆ−ΔｌａｃＵ１６９  ｔｈｉ  ｅｎｄＡ  ｈｓｄＲ）に導入した。この大腸菌株を精製し、接合導入の機能を与える（Ｄｉｔｔａ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：７３４７〜７３５１（１９８０年））プラスミドｐＲＫ２０１３を保有する大腸菌株ＪＺ２７９と一緒に、スフィンゴモナス・エロデア株Ｓ−６０ｗｔｃと混合した。Ｓ−６０ｗｔｃは、Ｓ．エロデア、ＡＴＣＣ３１４６１株の誘導体であり、プラスミドＤＮＡの取り込みを増進させる能力をもつ自然発生的分離株として選択された。定常期（終夜）培養株、すなわちＹＭＣ９／ｐＬＯ２−ｐｈａＣΔ  １ｍｌ、ＪＺ２７９／ｐＲＫ２０１３  １ｍｌ、およびスフィンゴモナス・エロデア２〜３ｍｌを用いて、接合導入を行った。培養株を混合し、フィルタ上で濃縮し、続いてそれをＴＹＥペトリ皿（８ｇ／ｌ  トリプトン、５ｇ／ｌ  酵母エキス、および５ｇ／ｌ  塩化ナトリウム）に入れて３７℃で７時間インキュベートした。その後細胞を脱イオン水に懸濁し、選択培地で培養した。約７時間インキュベートした後、Ｓ−６０ｗｔｃのカナマイシン耐性組換え接合体を、ストレプトマイシン（大腸菌の逆選別のため）２５μｇ／ｍｌおよびプラスミドを選択するためのカナマイシン  ７．５μｇ／ｍｌを添加したＹＭ培地（酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ、ペプトン  ５ｇ／Ｌ、およびグルコース  １０ｇ／Ｌ）上で選択した。カナマイシン耐性によって測定されるように、組込みは、１．５×１０−６の頻度で起こっていた。
【実施例５】
【００７０】
第２の交叉型欠失株の選択
２種のカナマイシン耐性組込み体を精製し、非選択性ＹＥＭＥ培地（０．２５％  酵母エキス、０．０２５％麦芽エキス）に３回通し、その後７．５％スクロースで培養し、交叉体について選択した。７つのカナマイシン感受性交叉体が得られたが、全てＰＨＢ陽性であった。ＰＣＲ試験を用いて、ベクターｐｈａＣｖが、染色体のｐｈａＣ領域に挿入されていることを実証し、また、野生型のｐｈａＣと比較したときの挿入断片の位置を決定した。欠失の側面領域およびベクターの端部に相同的なプライマーを設計した。図７に示すように、組換えは、次の（１）または（２）をもたらす２つの配向で起こる可能性がある。（１）ベクターの左側に欠失があるｐｈａＣ遺伝子があり、およびベクターの右側にｐｈａＣ遺伝子のフラグメントがあり、ＰＨＢ陰性のクローンをもたらすこととなる配向、または（２）ベクターの左側に無処置のｐｈａＣ遺伝子があり、およびベクターの右側にｐｈａＣｖがあり、ＰＨＢ陽性のクローンをもたらすこととなる配向。
【００７１】
６種のｐＬＯ２ｐｈａＣｖ単一交叉組込み体の試験により、すべてが、第２の、好ましい可能性がある、ＰＨＢ陽性の配向であることが示された。欠失の片側における組換えについて優先度が高い、あるいは、ＰＨＢ陽性株は、ＰＨＢ陰性の組換え体より増殖が早い可能性が大いにある。第１の、ＰＨＢ陰性の配向であるあまり好ましくない方式でプラスミドが組み込まれたコロニーは、おそらく、変異株の変異型を保持する二重交叉をもたらす好ましい部位で、第２の組換え現象が起こる可能性がある。
【００７２】
組換え接合体をＰＣＲで選別し、ＰＨＢ発現について試験し、第１の、またはＰＨＢ陰性の配向の組込み体を同定した。ＰＣＲの結果では、試験した２４コロニーのうち、２１コロニーがＰＨＢ陽性であり、３コロニーがＰＨＢ陰性構成体であることが示された。ＰＨＢ試験により結果を確認した。３つのＰＨＢ陰性株（３、１５、および２２）を選択し、精製し、非選択条件下で３代継代増殖させ、スクロース中で培養した。それぞれの親からの５つのカナマイシン感受性コロニーのうち、１つはＰＨＢ陰性であった。したがって、３つのＰＨＢ欠失カナマイシン感受性変異株を単離し、ＮＰＧ−１、ＮＰＧ−２、およびＮＰＧ−３と名付けた。
【実施例６】
【００７３】
ゲラン生合成のための変異株の特徴付け
ＮＰＧ−１、ＮＰＧ−２、およびＮＰＧ−３を、１４Ｌの発酵槽に送り込んだ発酵液１０Ｌ中で試験し、化学的変異原性剤（米国特許第５，３００，４２９号）によって単離したＰＨＢ欠失変異株であるＬＰＧ−２と比較した。使用する発酵液および培地のステージは、ステージ２の培地をすべての接種ステージで使用すること以外は、米国特許第５，３００，４２９号に記載されるものとほぼ同じであった。最終の培地に接種する前に、３つの接種ステージを使用した。移送体積は、２．５〜５％であった。ｐｒｏｍｏｓｏｙ０．５ｇ／Ｌの代わりに、異なる有機窒素（０．４１ｇ／Ｌ、Ｑｕｅｓｔ  Ｎｚａｍｉｎｅ  ＥＫＣ，Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を使用した。接種ステージにおけるコーンシロップの濃度は３．７５％ではなく３％であった。最終の１０Ｌ発酵液は、接種培地とほぼ同じであったが、含まれるリン酸塩が少なく（０．５ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４）、ｐＨを必要に応じてＫＯＨを加えることによって調節した。無機窒素、ＮａＮＯ３（１．５ｇ／Ｌ）と同様、有機窒素は、より高濃度（１．１  ｇ／Ｌ）であった。消泡剤Ｈ−６０−Ｋを０．６ｍｌ／Ｌに加えた。コーンシロップの濃度は、３．８５％であった。最終ステージの培地にカルシウムおよびマグネシウムを補足した脱イオン水を補って完全にした。
【００７４】
表１に示すように、全沈殿性物質（「ＴＰＭ」）および粘度に基づくと、ＮＰＧ変異株は、ＬＰＧ−２よりもゲランの生成がはるかに少なかった。ブロスの粘度は、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒで、ｎｕｍｂｅｒ  ４の軸（ｓｐｉｎｄｌｅ）を用いて、６０ｒｐｍで求めた。全沈殿性物質は、ブロスをオートクレーブで１０分間加熱し、次いで２倍体積のイソプロパノールで沈殿させ、乾燥させることによって求めた。これらの結果は再現性があった。発酵中のブロスサンプルの分析により、大量の有機酸が産生されることが示された。したがって、ＮＰＧ変異株についてゲランの産生量が低いことは、ＰＨＢ合成をせず、炭素数２および３の中間体、ならびに二酸化炭素に加水分解する炭水化物の量が多いことと相関関係がある。
【００７５】
【表１】
0005486110.tif 000002
【実施例７】
【００７６】
復活したゲラン（ｇｅｌｌａｎ）産生性を有する変異体の単離
ＰＨＢ合成遮断による代謝中間体（例えば、有機酸）の蓄積は、ゲラン合成に悪影響を及ぼす可能性がある。ゲラン合成を促進する培地での増殖中、ゲラン合成を正常なレベルで進行させる補償変異を生じ得ることが予想された。１０Ｌの発酵液から一定分割量の発酵ブロス（実施例６）を塗布し、細胞数を測定した（図８）。発酵終了近くで（すなわち、４４時間から６９時間で）、約０．５％から２％の間でコロニーがＮＰＧ株よりも大きく、かつより粘液性であることが認められた。これらのコロニーを精製し、振とうフラスコ発酵液におけるＰＨＢおよびゲラン生産について試験した。新たな単離物はＰＨＢが欠乏しており、元のＮＰＧ変異体よりも高収量のゲランを有していた。最良の補償変異体は、総計ＬＰＧ−２と同等で野生型の８０％以上（凡そ１０〜１５％のＴＰＭ減少が、ＰＨＢの重量損失のためと予想される）の沈殿性物質を有した。これらの株は、ＰＤＧ変異体と名付けた：ＰＤＧ−１はＮＰＧ−１から誘導され、ＰＤＧ−３はＮＰＧ−３から誘導される。各々の株は、ＰＨＢとゲラン生産について振とうフラスコ発酵液において評価された。
【００７７】
【表２】
0005486110.tif 000003
さらに、第２のバッチのＳ６０−ｗｔｃ、ＬＰＧ−２、ＰＤＧ−１およびＰＤＧ−３のブロス粘度を、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ粘度計を用い、４号のスピンドルで６０ｒｐｍにて測定した。ブロス粘度を下表３に示す。
【００７８】
【表３】
0005486110.tif 000004
【００７９】
振とうフラスコに用いられた培地は、米国特許第５，３００，４２９号に記載されたものと同様であった。最初の接種にはＹＭ培地を含有した。第２および最終段階では、緩衝用の高濃度のリン酸塩（Ｋ２ＨＰＯ４、２．８ｇ／Ｌ；ＫＨ２ＰＯ４、１．２ｇ／Ｌ）と１．０ｇ／Ｌの有機窒素をも有する前記の培地を含む、５００ｍｌフラスコにつき１００ｍｌとした。
【００８０】
理論に拘束されないが、新規変異体は、グルコースの有機酸への分解を制限する自然突然変異体と思われる。発酵漕からのサイクル内サンプル分析は、ＰＤＧ−１およびＰＤＧ−３による有機酸の産生が、対照株であるＳ−６０ｗｔｃおよびＬＰＧ−２とほぼ同じであることを示した。
【００８１】
ＰＤＧ−１株は、一貫してＴＰＭ＞１４ｇ／Ｌで良好な収量の高粘度ゲランを生産した。
【００８２】
株の安定性をチェックし、特に自然ＰＤＧ−１変異体と、ゲラン低収量の元のＮＰＧ株とを比較するために、これら培養液のプレート上におけるコロニーの形態を評価した。約３７℃で約６０時間ＹＭ寒天上で増殖後、ＰＤＧ−１は、その親株のＮＰＧ−１よりも明らかに異なる形態を示した。ＮＰＧ−１型形態を有するコロニーはＰＤＧ−１発酵液のブロスに認められず、この株の安定性を示している。
【実施例８】
【００８３】
Ｓ．エロデア以外のスフィンゴモナス株における相同性ｐｈａＣ遺伝子の存在
ｐｈａＣに相同な遺伝子が、スフィンゴモナス・エロデア以外のスフィンゴモナス株に確認され、それによりスフィンゴモナス・エロデア以外のスフィンゴモナス株においてＰＨＢ欠失変異体が生成する可能性を証明した。
【００８４】
サザンＤＮＡハイブリッド形成を、４種のスフィンゴモナス株：デュウタン（ｄｉｕｔａｎ）（Ｓ−６５７）を産生するＡＴＣＣ５３１５９、ウェラン（ｗｅｌａｎ）（Ｓ−１３０）を産生するＡＴＣＣ３１５５５、ラムサン（ｒｈａｍｓａｎ）（Ｓ−１９４）を産生するＡＴＣＣ３１９６１、対照としてゲラン（Ｓ−６０）を産生するＡＴＣＣ３１４６１で実施した。ゲノムＤＮＡを各株から単離し、酵素ＥｃｏＲＩで消化した。消化されたゲノムＤＮＡ（１μｇ）のサンプルを１％アガロースゲル上で分離し、中性条件下でＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ  Ｔｕｒｂｏｂｌｏｔｔｅｒ（登録商標）（Ｎｅｗ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ州、Ｋｅｅｎｅ）を用いてキャピラリ−操作によりナイロン膜に移した。
【００８５】
変性プライマーのＰＨＡＤＧ５およびＰＨＡＤＧ７を用いて（実施例１を参照）、ジゴキシゲニン標識プローブを、製造元のＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（スイス国）のプロトコルに従ってジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰを有するスフィンゴモナスＳ−６５７ｐｈａＣ遺伝子の内部領域のＰＣＲ増幅により調製した。ハイブリッド形成は、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社（ドイツ、マンハイム）のＤｉｇＥａｓｙＨｙｂ（登録商標）を用いて、製造元のプロトコルに従って中性条件下で実施した。フィルタは、計算値Ｔｏｐｔより１０℃低い４４℃でハイブリッド形成した。これらの条件により、９０％を超えて同一であるＤＮＡ分子のハイブリッド形成が生じると予想された（Ｂｉｒｒｅｎ、Ｂ．ら、編集Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、実験室マニュアル、１９９７年）。ここに用いられる用語のＴｏｐｔは、Ｔｍ−２０として定義され、式中Ｔｍは、式５０＋０．４１（％ＧＣ）−６００／プローブ長として定義され、式中％ＧＣは６５％であり、プローブ長は４００個のヌクレオチドである。該フィルタを、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで４４℃、１５分間２回洗浄し、製造元のプロトコル（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）に従って抗ジゴキシゲニン−アルカリホスファターゼ接合体およびジゴキシゲニン検出キットを用いて展開した。
【００８６】
ハイブリッド形成結果を図９に示す。予想された大きさ（２．６ｋＢ）のＥｃｏＲＩ消化バンドがスフィンゴモナス株のＡＴＣＣ３１４６１において検出された。スフィンゴモナス株のＡＴＣＣ５３１５９およびＡＴＣＣ３１９６１は、全く同じ大きさのバンドを生成した。スフィンゴモナスＡＴＣＣＡＴＣＣ３１５５５は、ｐｈａＣプローブにハイブリッド形成した２．４ｋＢのフラグメントを有した。斯様に、サザンＤＮＡハイブリッド形成により、これら３種の株がｐｈａＣ様遺伝子を含み、ＰＨＢ欠失株が、ここに記載された方法に従って生成できることが確認された。
【実施例９】
【００８７】
ｐｈａＣ欠失のＡＴＣＣ５３１５９変異株の構築
組換えＤＮＡ技術を用いて、ｐｈａＣ遺伝子を完全に失ったスフィンゴモナスＡＴＣＣ５３１５９の変異株を構築した。変異株の構築は、以下のように実施された：ｐｈａＣ遺伝子の側面ＤＮＡ領域をＰＣＲにより増幅して自殺ベクターにクローン化し、側面ＰＣＲ産物を含有する該自殺ベクターは、ＡＴＣＣ５３１５９細胞への接合により導入され、次いでスフィンゴモナスＡＴＣＣ５３１５９染色体におけるｐｈａＣの直接上流または下流の相同座における全プラスミドの組込みを、カナマイシン耐性（ベクターによりコード化された）に対する選択により達成した。該染色体からのｐｈａＣ座プラスベクターＤＮＡの切除は、ベクター上にコード化されたショ糖感受性により選択された続く第２の交叉事象の結果、生じた。
【００８８】
ｐｈａＣ遺伝子および側面領域を含有するクローン類を単離するために、ゲノムＤＮＡライブラリを作成し、ＰＨＡＤＧ５プライマーおよびＰＨＡＤＧ７プライマーを用いてＰＣＲにより選別した（上記実施例１を参照）。２つのゲノムライブラリが作成され、その１つは、ベクターｐＺＥＲＯ−２にＮｏｔＩ制限酵素フラグメントを有し（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）、２つ目はｐＬＡＦＲ３にＳａｕ３Ａの部分消化フラグメントを有する（Ｓｔａｓｋａｗｉｃｚら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５７８９〜９４（１９８７））。１つの陽性クローンを、各ライブラリから単離した。これらプラスミドのＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩフラグメントがサブクローン化され、適切なフラグメントが配列決定されて、ｐｈａＣ遺伝子および５’および３’の側面領域ＤＮＡ配列を決定した。プラスミドｐ２１−７およびｐＪＣＳ１０４−２には、それぞれｐｈａＣ遺伝子および側面領域の５’および３’の末端を含有する。
【００８９】
ｐｈａＣ遺伝子および側面領域ＤＮＡ配列を図１０に示す。遺伝子マップを図１１に示す。オープンリーディングフレームは、開始および終止コドンの存在、並びにＢｏｒｏｄｏｖｓｋｙ解析（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ  ＧｅｎｅＱｕｅｓｔモジュール）およびＧｅｎｅＭａｒｋのＰ＿ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ＿３．ｍａｔマトリックスを用いて、予想コード化領域と組み合わせたＢＬＡＳＴ解析により決定した。該配列を、クローンｐ２１−７およびｐＪＣＳ１０４−２における挿入配列と結びつける。２つの配列間の接合部はＮｏｔＩ部位にある。
【００９０】
図１２は、ｐｈａＣの側面領域のみを含み、出発コドンの第１のヌクレオチドから終止コドンの最終ヌクレオチドまでの全ｐｈａＣ遺伝子（１７３７ｂｐ）を失ったｐＪＣＳ１０５  １１２−１産物を作製するＰＣＲの使用法を示している。２種の外側プライマー（プライマー１Ｘｂａとプライマー４Ｘｂａ）を、ｐｈａＣの上流および下流領域の間の所望の連結部に伸びているプライマー（重複１）と一緒にした。プライマー配列を表４に示す。
【００９１】
【表４】
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【００９２】
プラスミドｐＪＣＳ１０４−２およびｐ２１−７（各々２００ｎｇ）を、製造元のプロトコルに従ってプライマー１Ｘｂａとプライマー４Ｘｂａ（各々５０ピコモル）、重複プライマー１（２ピコモル）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（カリフォルニア州パロアルト）のＡｄｖａｎｔａｇｅ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ２ＰＣＲキットのｄＮＴＰ類およびＴａｑポリメラーゼに混合した。次に増幅は、マトリックスサーモサイクラー中、９５℃で１分、９５℃で３０秒の５サイクル、４４℃で３０秒、６８℃で２分、次いで９５℃で３０秒の２０サイクル、５３〜６８℃で３０秒、６８℃で２分、次いで６８℃で３分の１サイクルで実施した。増幅されたＤＮＡフラグメントを、ゲルから精製し、さらに同じプライマーで増幅してより多くの産物を生成した。増幅条件は、９５℃で１分、９５℃で３０秒の２５サイクル、６４℃で３０秒、６８℃で２分、次いで６８℃で１サイクルであった。次に１．１ｋＢバンドを、ＳＮＡＰゲルＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてゲルから単離し、トポイソメラーゼ、３’Ｔオーバーハングを有するベクターおよび化学的にコンピテントＴＯＰ１０細胞を用いることによりベクターｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のプロトコルに従ってクローン化し、図１２に示されるｐＪＣ１０５−１１２−１を形成した。
【００９３】
ｐＪＣ１０５−１１２−１からのｐｈａＣ欠失構築物を含有する１．１ｋＢのＸｂａＩフラグメントをゲル精製し、ＸｂａＩ消化ｐＬＯ２にクローン化した。２種の配位の挿入物を回収し、ｐＪＣＳ１０６−５およびｐＪＣ１０６−１６と名付けた。
【００９４】
トランス結合によりＡＴＣＣ５３１５９に導入されたＡＴＣＣ５３１５９プラスミドｐＪＣ１０６−５およびｐＪＣＳ１０６−１６のＰＨＢ欠失株を作製するために、上記の実施例４に従ってマーカー交換が使用された。第１および第２の交叉欠失株の選択は、上記の実施例４および５のとおりに進行した。すなわち、最初にカナマイシン耐性によって示される組込みについて選択し、次いでショ糖上で培養してカナマイシン感受性交叉体を選択する。該欠失交叉体（野生型に対する）は、診断用ＰＣＲにより検出され、ＮＰＤ−３（ｐＪＣＳ１０６−５から誘導）およびＮＰＤ−６（ｐＪＣＳ１０６−１６から誘導）と名付けた。
【００９５】
生じたＮＰＤ−３およびＮＰＤ−６株には、外来ＤＮＡの残留はなく正確にｐｈａＣの染色体欠失体である。これら欠失株のガム収量は大きく減少したが、しかしガム産生を復活させたサプレッサーが発酵増殖時に続いて単離された。
【００９６】
ＮＰＤ−３およびＮＰＤ−６はＳ−６５７合成を促進する条件下で増殖され、大きな粘液性コロニーを有するサプレッサー株が、上記実施例７のゲラン合成に関して行われたとおり選択された。これら大きな粘液性コロニーは、誘導されたコロニーによりＰＤＤ−３およびＰＤＤ−６と名付け、ＰＨＢおよびＳ−６５７について分析した。ＰＤＤ−３株およびＰＤＤ−６株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに保管が委託され、それぞれＡＴＣＣ番号  およびＡＴＣＣ番号  と名付けられている。下表５は、ＰＤＤ−６が、その親株ＮＰＤ−６よりもより多くのガム生産を行うが、また本質的にＰＨＢは生産しないことを示す。
【００９７】
【表５】
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【実施例１０】
【００９８】
透過度およびゲル強度に対する水酸化カリウム濃度の影響
苛性剤の水酸化カリウム（「ＫＯＨ」）濃度の影響が、最初のプロトコルとして上記に概説したステップを含んで成る清澄プロセスで評価された。ＰＨＢ欠失変異体を含んで成るゲラン発酵ブロスを前処理してＫＯＨの濃度を変えて１５分間混合し、次いでキレート化剤として１０００ｐｐｍのカルゴン（Ｃａｌｇｏｎ）と１時間、引き続き２２ｐｐｍのリゾチーム並びに２２０ｐｐｍのプロテアーゼ各々と５５℃で２時間混合した。ＫＯＨ濃度を、約０．０ｇ／Ｌと約０．４５ｇ／Ｌとの間で変えて試験した。図１３に示すように、透過度は、ＫＯＨの濃度を０．４５ｇ／Ｌに増すとほぼ２０％増加した（３１％の相対的増加）。
【００９９】
ＴＡ−ＴＸ２  Ｔｅｘｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（登録商標）（Ｔｅｘｔｕｒｅ  Ｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ニューヨーク州Ｓｃａｒｓｄａｌｅ）により、感圧プランジャーによる調製ゲル表面割れに要する穿刺力量と距離という２つの指標の産物としてゲル強度データを測定する。穿刺力は、負荷セルがゲル表面の割れ目を検出する場合に測定され、また穿刺力は高さのパーセント変化として測定される。図１４に示されるように、穿刺力に関するゲル強度は、被験ＫＯＨの同じ範囲よりも２８０ｇ、すなわち３２％減少したが、これはゲランの部分脱アシル化に帰すると思われる。しかし、パーセント距離に関するゲル強度は、１．５％の変化にのみ反映し、大きく影響されなかったと思われた。
【０１００】
少量２×２の階乗試験は、第１のプロトコルの清澄プロセスに従って実施された。ＰＨＢ欠失変異体を含んで成るゲラン発酵ブロスを前処理し、ＫＯＨの濃度を変えて１５分間混合し、次いでキレート化剤として２０００ｐｐｍのカルゴンと１時間、引き続き２２ｐｐｍのリゾチーム並びに２２０ｐｐｍのプロテアーゼ各々と５５℃で２時間混合した。パーセント透過度、穿刺力およびパーセント距離は、動力学的に相互に関連すると思われるので本試験においてそれらを試験した。ＫＯＨ濃度は約０．２２５ｇ／Ｌと約０．４５ｇ／Ｌとの間で変え、温度は約５５℃と約６０℃との間で変えて以下の表に示される成績を生じ、ゲラン清澄時のＫＯＨ濃度と温度の影響を評価するパーセント透過度、穿刺力およびパーセント距離の結果を示した。
【０１０１】
【表６】
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表に示されるように、透過度は、ＫＯＨ濃度または温度のいずれかを別々に増加してもあまり変化しなかった。しかしながら、透過度は、ＫＯＨ濃度と温度の双方を増加させた場合約６％まで増加するが、これは、透過度増加を達成させるためには両パラメータが重要であり、また相加的であることを示している。同様にゲル強度は相加効果を示した。穿刺力は、温度またはＫＯＨ濃度のいずれかを個々に増加すると約１３０ｇから約１９０ｇ減少した。しかし、温度とＫＯＨ濃度の双方を増加させた場合、穿刺力は約３２６ｇ減少し、したがって、ゲル強度は、温度とＫＯＨ濃度の双方の変化に鋭敏であることを示唆した。
【実施例１１】
【０１０２】
ゲランの性質に及ぼすヘキサメタリン酸ナトリウムの影響
カルゴンとしても知られているヘキサメタリン酸ナトリウム（「ＳＨＭＰ」）の透過度、穿刺力およびパーセント距離に及ぼす影響を、上記実施例１０に記載された清澄化工程に従って評価した。ＰＨＢ欠失変異体を含むゲラン発酵ブロスを前処理し、０．４５ｇ／ＬのＫＯＨと１５分間混合し、次いでカルゴンの濃度を変えて１時間、引き続き２２ｐｐｍのリゾチーム並びに２２０ｐｐｍのプロテアーゼ各々と５５℃で２時間混合した。ＳＨＭＰ濃度を、約１０００ｐｐｍと約３０００ｐｐｍの間で変えると、この範囲に亘って線形の相関関係が図１５に示したようにＳＨＭＰ濃度と透過度との間に存在した。ＳＨＭＰを約１０００ｐｐｍ増加すると、透過度が約５％増加する。図１６に示されるように、穿刺力およびパーセント距離は、試験範囲でのＳＨＭＰ濃度の増加により比較的影響を受けないことから、ＳＨＭＰがゲル強度に影響するとは思われない。
【実施例１２】
【０１０３】
ＳＨＭＰによる他の清澄工程順序
清澄方法の２つの変法を、２Ｌスケールで天然のゲランブロスに対して実施した。製造元のＧｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（ニューヨーク州ロチェスター）により提供された情報によれば、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）リゾチームは、酸性から中性ｐＨレベルで安定であり、アルカリ性ｐＨで短時間に不活化できる。清澄工程に従って０．４５ｇ／ＬのＫＯＨ添加後、一般にこのｐＨはリゾチームにとって準最適であるｐＨ８を超えるが、一方、プロテアーゼはこれらの条件下でよく作用するとのことである。斯様に清澄化工程を第２のプロトコルに従って変更し、リゾチーム酵素による処理後にＫＯＨを加えた（工程順序の要約：リゾチーム、次にＫＯＨ、次にプロテアーゼ）。ＫＯＨをリゾチーム酵素処理の前に添加しても処理後に添加しても、以下の表に示されるように５．５％の相対的標準偏差（「ＲＳＤ」）が観察された。
【０１０４】
【表７】
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【実施例１３】
【０１０５】
菓子配合物
本実施例は、優れた透明性および安定性を示す、伸縮弾性がある十分に噛む必要のある菓子を製造するために使用し得る配合物を示す。
成分                                                            ％
Ａ部分
ぶどう糖シロップ                                          ４５．００
水                                                        ２１．６７
Ｂ部分
ショ糖                                                    ３０．００
清澄化高アシルゲラン                                        １．３３
Ｋｅｌｏｃｏｇｅｌ  Ｆ（登録商標）ゲラン                    ０．６７
（米国ＣＰ  Ｋｅｌｃｏ社、カリフォルニア州サンディエゴ）
Ｃ部分
クエン酸溶液、５４％                                        ０．６７
クエン酸ナトリウム溶液、３３％                              ０．６７
【０１０６】
Ａ部分を含んで成る成分を加熱容器内で合わせ４０℃に加熱した。
Ｂ部分の成分を乾式混合し、混合加熱容器に速やかに加えて沸騰させる。該混合物を７２％固体まで減量した。Ｃ部分の成分を合わせて、フレーバーおよび着色剤に加えて均一になるまで混合する。
【０１０７】
材料をデポジッターに入れて、用意した澱粉鋳型に鋳込みする。次に詰められた澱粉鋳型を、固体レベルが約８２％から８５％に達するまで３０℃、３５％相対湿度で３日間から４日間保存した。材料を鋳型から外し、ワックスを塗り、密封バッグに密封した。
【０１０８】
Ａ部分の成分にさらに水を加えて、ヒドロコロイドの完全な水和を促進してもよい。
【実施例１４】
【０１０９】
デザートゲル配合物
この配合物は、優れた透明性および安定性を有する伸縮弾性のあるデザートゲルを製造するために使用された。
成分                                                            ％
Ａ部分
ショ糖                                                      １３．２０
アジピン酸                                                    ０．４０
清澄化高アシルゲラン                                          ０．１６
クエン酸ナトリウム                                            ０．１３
リン酸二ナトリウム                                            ０．１３
フマール酸                                                    ０．１１
Ｋｅｌｏｃｏｇｅｌ  Ｆ（登録商標）ゲラン                      ０．０４
（米国ＣＰ  Ｋｅｌｃｏ社、カリフォルニア州サンディエゴ）
Ｂ部分
水                                                          ８５．８３
Ａ部分の成分を乾燥フレーバーおよび着色剤に加えて乾式混合し、Ｂ部分に分散させて混合し、９０℃に加熱した。次いで該混合物を好適な容器に注いで、室温で固めた。
【実施例１５】
【０１１０】
ゼリー配合物
本配合物は、優れた透明性、保存安定性、フレーバー放出および拡散性を有するゼリーを提供した。
成分                                                            ％
Ａ部分
調和性グレープジュース                                      ４５．６９
高フルクトースコーンシロップ                                ３０．４６
水                                                          ２２．８５
Ｂ部分
清澄化高アシルゲラン                                          ０．１８
クエン酸ナトリウム                                            ０．１０
ＳＨＭＰ                                                      ０．１０
ソルビン酸カリウム                                            ０．０９
Ｃ部分
クエン酸、５０％溶液                                          ０．５３
【０１１１】
Ａ部分の成分を合わせた。Ｂ部分の成分を乾式混合し、攪拌しながらＡ部分の成分と分散した。生じた混合物を混合しながら沸騰させ、約１分から約３分間沸騰を維持し、その時点で、Ｃ部分の成分を攪拌しながら混合した。次に該混合物を滅菌ジャーに入れて密封した。
【０１１２】
本発明は、現在好ましい実施形態と考えられているものに関して上に記述したが、本発明は上記のものに限定されないことを解すべきであって、本発明は、添付の請求の範囲の精神と範囲内に含まれる種々の修飾並びに同等の改変を包含することが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
0005486110.tif 000019
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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