(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
増殖したＴ制御性細胞を含む、炎症性腸疾患の治療用組成物であって、該増殖したＴ制御性細胞は、（ａ）ＩＢＤ（炎症性腸疾患）に冒された腸セグメントまたは冒されていない腸セグメントを排液する患者のセンチネルリンパ節から、活性化状態または非活性化状態の制御性Ｔ細胞を採取し、（ｂ）採取した該Ｔ細胞を生体外にて増殖させることにより得られ、該組成物は該増殖したＴ細胞を患者に再注入するのに適合する、上記組成物。
【請求項２】
前記炎症性腸疾患がクローン病である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記制御性Ｔ細胞が活性化状態で採取される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記Ｔ細胞が、ＩＢＤに冒された腸セグメントを排液するリンパ節から採取される、請求項３または４に記載の組成物。
【請求項６】
前記採取したＴ細胞が、炎症のある腸セグメントで得られる抗原エキスと併用して、１種以上のサイトカインによってさらに活性化される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
増殖の前に活性化を行う、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
増殖と同時に活性化を行う、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
増殖の後に活性化を行う、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
前記１種以上のサイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β１及びＴＳＬＰから選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項１１】
採取したＴ細胞を、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８および／またはラパマイシンでさらに活性化させることを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１２】
前記制御性Ｔ細胞が非活性化状態で採取される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記制御性Ｔ細胞が、ＩＢＤに冒されていない腸セグメントを排液するリンパ節から採取される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記採取したＴ細胞が、炎症のある腸セグメントから得られる抗原エキスと併用して、１種以上のサイトカインによって活性化される、請求項１２または１３に記載の組成物。
【請求項１５】
活性化が増殖に先行する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
増殖と同時に活性化を行う、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
増殖の後に活性化を行う、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
前記１種以上のサイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β１及びＴＳＬＰから選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１９】
採取したＴ細胞を、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８および／またはラパマイシンでさらに活性化させることを含む、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
制御性Ｔ細胞がＩＢＤに冒された腸セグメントまたは冒されていない腸セグメントを排液するリンパ節から採取され、低用量のサイトカインＩＬ−２と併用して炎症部位から得られる抗原エキスとの接触によって活性化され、そして増殖される、請求項２に記載の組成物。
【請求項２１】
前記制御性Ｔ細胞をＩＦＮ−γおよび／またはＴＮＦ−αに対する抗体と接触させ、ＴＨ１のスキューイングおよびＴＨ２の増殖を抑えることによる活性化をさらに含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
毎日から５日に１回の間隔で培地を調整することを含む、請求項２０または２１に記載の組成物。
【請求項２３】
１週間以上の期間、毎日から５日に１回の間隔で培地を調整することを含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
３週間から４週間の期間、培地を調整することを含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
ＴＨ２スキューイングを改善するために、抗ＩＬ−１２抗体と併用した抗ＣＤ２８抗体による活性化を含む、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
制御性Ｔ細胞がＩＢＤに冒されたまたは冒されていない腸セグメントを排液するリンパ節から採取され、サイトカインＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−αのうちの１種以上と併用した炎症部位から得られる抗原エキスとの接触によって活性化され、そして増殖される、請求項３に記載の組成物。
【請求項２７】
前記制御性Ｔ細胞がＣＤ３および／またはＣＤ２８と接触させることで、さらに活性化を与えられる、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２８】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に冒された腸セグメントを排液するセンチネルリンパ節から単離された、制御性Ｔ細胞。
【請求項２９】
前記制御性Ｔ細胞が炎症性腸疾患の治療用である、請求項２８に記載の制御性Ｔ細胞。
【請求項３０】
ＩＢＤがクローン病である、請求項２８に記載の制御性Ｔ細胞。
【請求項３１】
ＩＢＤが潰瘍性大腸炎である、請求項２８に記載の制御性Ｔ細胞。
【請求項３２】
（ａ）ＩＢＤ患者のセンチネルリンパ節から採取した制御性Ｔ細胞を、好適な培地にて提供し、（ｂ）該細胞をサイトカインと接触させることで活性化させ、（ｃ）活性化した該細胞を増殖させることを含む、ＩＢＤの治療に有用な制御性Ｔ細胞を増殖する方法。
【請求項３３】
活性化の一部または全部が増殖時に行われる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
クローン病に羅患した患者のＴＨ１／ＴＨ２バランスを再構築するための、増殖したＴ細胞を含む組成物であって、該増殖したＴ細胞は、（ａ）クローン病に冒されたまたは冒されていない腸セグメントを排液する患者のセンチネルリンパ節から活性化状態の制御性Ｔ細胞を採取し、（ｂ）このようにして採取されたＴ細胞を、低用量のサイトカインＩＬ−２と併用して、炎症部位由来の抗原エキスを用いて活性化させ、（ｃ）該細胞を増殖させ、（ｄ）任意に、ＴＨ１のスキューイングおよびＴＨ２の増殖を抑えるために、該細胞を増殖時にＩＦＮ−γおよび／またはＴＮＦ−αに対する抗体と接触させることを含む、上記の組成物。
【請求項３５】
間隔をあけた培地の調整を組み合わせる、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
調整が毎日から５日に１回である、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
細胞をＣＤ３抗体と接触させて増殖を刺激することを含む、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３８】
ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β１及びＴＳＬＰから選択されるサイトカインの、ＩＢＤに羅患した患者のセンチネルリンパ節から得られた制御性Ｔ細胞の生体外での活性化への使用。
【請求項３９】
前記制御性Ｔ細胞が炎症性腸疾患の治療用である、請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
ＩＢＤに羅患した患者の炎症のある腸セグメントから得られる抗原エキスの、サイトカインと併用して、該患者のセンチネルリンパ節から得られた制御性Ｔ細胞の生体外での活性化への使用。
【請求項４１】
前記制御性Ｔ細胞がＩＢＤ治療用である、請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β１及びＴＳＬＰから選択される、請求項４０又は４１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性腸疾患の治療方法と、この方法を実施するための手段とに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
クローン病（ＣＤ：Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ：ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ）などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ：Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ）では、根治的治療法が欠けている。スウェーデンでは、２０歳を発症のピークとして毎年１４００名の患者が新たにＩＢＤであると診断され、重篤な副作用を伴うコルチゾンおよび／または免疫抑制剤を使って生涯にわたり治療を続けることになる。さらに、ＩＢＤは外科的腸摘除および永久人工肛門の造設に至ることが多く、これは大きなハンディキャップのひとつである。また、潰瘍性大腸炎になると大腸癌にかかるリスクも高くなる。
【０００３】
ＩＢＤは、通常は無害な粘膜抗原に対する免疫反応の異常に起因する自己免疫疾患であると考えられている。関与しているサイトカインに基づいて、ＣＤの炎症はＴＨ１細胞媒介免疫応答であるとみなされている。ＵＣはＴＨ２細胞媒介反応をするといわれているが、そのことが明らかにされているわけではない（フス（Ｆｕｓｓ）  Ｉ  Ｊら、１９９６、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、１５７：１２６１〜７０；マリン（Ｍｕｌｌｉｎ）  Ｇ  Ｅら、１９９６、インフラマトリー・バウル・ディジーズ（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）、２：１６〜２６）。
【０００４】
サイトカインは、関連する細胞成分の分化と増殖とを刺激することから、免疫反応のレギュレーターとして作用する。ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、エフェクター細胞の２つの主な亜集団に分類でき、ＩＬ−１２に刺激された場合はＴＨ１細胞、ＩＬ−４に刺激された場合はＴＨ２細胞に分類できる。ＴＨ１細胞は、ウイルスまたは細胞内細菌などの細胞内微生物に対する貪食細胞−および細胞溶解性Ｔ細胞依存性反応を刺激するＩＦＮ−γを分泌する。ＴＨ２細胞は、ＩｇＥの産生および寄生虫に対する好酸球／肥満細胞媒介防御を刺激するＩＬ−４およびＩ−Ｌ５を分泌する。また、ＴＨ２にはＴＨ１反応を下方制御する働きもある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の一目的は、炎症性腸疾患を治療する、あるいはこの疾患を長期間にわたって少なくとも食い止める方法を提供することにある。
【０００６】
本発明の他の目的は、本方法で用いるための手段を提供することにある。
【０００７】
上記以外の目的は、以下に記載する発明の概要、これを示す複数の図面、その好ましい実施形態の記載ならびに、添付の特許請求の範囲から明らかになろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、炎症性腸疾患、特にクローン病および／または潰瘍性大腸炎が、患者のセンチネル節から採取してそして生体外(in vitro)にて増殖させた制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を投与することによって、根治的に治療、あるいは少なくとも休眠または非活動状態に保つことが可能であるという見識に立脚したものである。よって、コルチコステロイドなどによる薬物療法に頼る必要なく腸の炎症を低減し、そして完全に抑制できることすらある。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
経口投与した抗原に対する免疫系の不応答を経口免疫寛容という。見たところ、この機序は腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）の内容物に対する不適切な免疫反応を阻止しており、少なくとも以下の２とおりのプロセスによって媒介されると考えられている。ひとつがＴヘルパー細胞ファミリー（ＣＤ４＋）のメンバーである制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）の活性化、もうひとつが、クローン除去の誘導またはＴ細胞のアネルギーである。第１のプロセスは、低用量の抗原曝露への寛容を担うものであり、おそらくは局所的な腸のリンパ系で起き、サイトカインＴＧＦ−βの産生に依存している。第２の（除去）プロセスは、おそらくは全身のリンパ組織で起き、濾過された抗原によって誘発され、免疫アジュバントなしで静脈投与された抗原に対する誘導寛容の背後にある機序と類似している。後者の寛容原性(tolerogenic)の機序は、高用量の抗原曝露後のほうが顕著になるようにみえる。
【００１０】
自己免疫に見られるような過剰かつ誤った免疫応答を避けて免疫系でのバランスを維持するために、Ｔ細胞の活性化は厳密に調節される。クローン病患者では、Ｔ細胞活性化の調節がうまく制御されていないことのサインとして、腸管膜リンパ節が大幅に肥大する。
【００１１】
ＩＢＤは炎症のひとつであるため、その部位の排液(drainage)は主に炎症部位に隣接する腸管膜リンパ節が担っている。炎症のある領域と直接つながる経路上の最初のリンパ節をセンチネル節と呼ぶ。
【００１２】
本発明の第１の好ましい態様によれば、ＩＢＤに冒された腸セグメントを排液する(draining)患者のリンパ節（センチネル節）から、活性化状態にある制御性Ｔ細胞を採取し、生体外にて増殖させ、患者に再注入する。
【００１３】
本発明の第２の好ましい態様によれば、健康な腸セグメントすなわち、ＩＢＤに冒されていない腸セグメントを排液する患者のリンパ節から、非活性化状態にある制御性Ｔ細胞を採取し、生体外にて増殖させ、患者に再注入する。このようにして採取した活性化状態ならびに非活性化状態の制御性Ｔ細胞は、サイトカインなどの好適な薬剤で生体外にて（さらに）活性化することが可能である。
【００１４】
本発明の第３の好ましい態様によれば、ＩＢＤに冒された腸セグメントまたは冒されていない腸セグメントを排液するリンパ節から、それぞれ活性化状態または非活性化状態にある制御性Ｔ細胞を採取し、生体外にて増殖させる。増殖は連続したものであってもよいし、休止状態の段階で中断された複数の段階のように間隔をあけたものであってもよい。増殖された制御性Ｔ細胞を、炎症性の腸セグメントから得た抗原エキスとの併用で、サイトカイン（単数または複数）によって活性化する（刺激する）。あるいは、ＩＢＤに冒された腸セグメントまたは冒されていない腸セグメントを排液する（draining,腸セグメントから液体を排出する）リンパ節から採取した制御性Ｔ細胞を、増殖前または増殖段階の間に活性化する（刺激する）。この場合、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＴＳＬＰから選択された１種類のサイトカイン、好ましくは２種類以上のサイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、特にＴＧＦ−β１、ＴＳＬＰを含むサイトカインカクテルなどを、炎症性の腸セグメントから得た抗原エキスと併用して、Ｔｒｅｇを活性化させる。抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８およびラパマイシンを利用して、Ｔｒｅｇをさらに活性化するようにするのも好ましい。増殖後、増殖かつ活性化された制御性Ｔ細胞を患者に再注入する。
【００１５】
自己の制御性Ｔ細胞を用いる治療には、副作用を軽減または排除できることすらある上、有効性が高いという利点がある。
【００１６】
第３の好ましい態様の第１の変形例によれば、クローン病患者からのＩＢＤに冒された腸セグメントまたは冒されていない腸セグメントを排液するリンパ節から活性化状態の制御性Ｔ細胞を採取し、増殖用の低用量のサイトカインＩＬ−２と併用、好ましくはＩＦＮ−γおよび／またはＴＮＦ−αに対する抗体をさらに併用して、炎症部位から得た抗原エキスで活性化して、ＴＨ１のスキューイングとＴＨ２の増殖を抑制する。さらに、毎日から５日に１回、特に、１週間以上の期間、特に３週間から４週間の期間は毎日のような間隔で、培養液を調整すると好ましい。このようにしてＴＨ２細胞集団を得て、これを自己血輸血に利用して患者のＴＨ１／ＴＨ２バランスを再構築する。ＣＤ３抗体を用いてさらに活性化すれば、増殖を後押しすることが可能である。ＴＨ２スキューイングを改善するには、増殖時に抗ＣＤ２８抗体を抗ＩＬ−１２抗体との併用で追加して用いることができる。
【００１７】
第３の好ましい態様の第２の変形例によれば、潰瘍性大腸炎疾患の患者からのＩＢＤに冒された腸セグメントまたは冒されていない腸セグメントを排液するリンパ節から採取した活性化状態の制御性Ｔ細胞を、増殖用のサイトカインＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−αのうちの１種以上と併用、好ましくは抗ＩＬ４および／または抗ＩＬ−１０抗体をさらに併用して、炎症部位から得た抗原エキスで活性化する。さらに、毎日から５日に１回、特に、１週間以上の期間、特に３週間から４週間の期間は毎日のような間隔で、培養液を調整するのも好ましい。特に増殖期間の終わりに向けて、ＣＤ３およびＣＤ２８などの別の刺激を与えてもよい。
【００１８】
本発明の第４の好ましい態様によれば、ＩＢＤに冒された患者から採取した、特にＩＢＤに冒されたセンチネル節から採取した制御性Ｔ細胞の生体外での活性化用に、薬学的に許容されるキャリア中の１種またはそれ以上のサイトカインが提供される。
【００１９】
本発明の第５の好ましい態様によれば、ＩＢＤに冒された腸セグメントを排液するセンチネルリンパ節を得る方法であって、ＩＢＤに羅患した患者の腸の病変領域にパテントブルー(patent blue)などのリンパ腺染色剤を注射し、この薬剤で染色されたリンパ組織を特定し、任意に、染色された組織を縫合糸でマークし、そして染色された組織を摘除することを含む方法が提供される。摘除された組織を慎重に調べ（顕微鏡によるなどの方法で検査し）、その際にＩＢＤに冒された腸セグメントを排液するセンチネルリンパ節を組織から切除する。
【００２０】
本発明の第６の好ましい態様によれば、ＩＢＤに冒された腸セグメントを排液するセンチネルリンパ節から制御性Ｔ細胞を単離する方法であって、リンパ節に圧力を印加し、これによって該節から追い出された細胞懸濁液を回収し、制御性Ｔ細胞を該懸濁液から単離することを含む方法が提供される。
【００２１】
本発明の第７の好ましい態様によれば、ＩＢＤに冒された腸セグメントを排液するセンチネルリンパ節から単離された制御性Ｔ細胞が提供される。
【００２２】
本発明の上記以外の好ましい態様は添付の特許請求の範囲に含まれる。
【００２３】
以下、多くの図面に示される、好ましいが限定するものではない本発明の実施形態を参照して、本発明について詳細に説明する。
【実施例】
【００２４】
実施例１  炎症性の腸セグメントを排液するセンチネル節の同定
悪性腫瘍、主に悪性黒色腫および乳癌の病期の特定には、１０年間にわたってセンチネル節技法が利用されている。センチネル節は、パテントブルー（ＣＡＳ  １２９−１７−９）およびパテントブルーＶ（ＣＡＳ  ３５３６−４９−０；しばしばカルシウムキレート二量体として提供される）などのリンパ腺染色剤を使用し、これを腸の病変領域に注射して癌からのリンパ排液(drainage)を可視化することによって、外科手術中に同定される。このようにして同定されたセンチネル節に、縫合糸または他の手段でマークを付ける。続いて、脈管および所属リンパ節を含む感染していない辺縁帯および腸間膜と一緒に、腸の病変を従来の方法で摘除する。摘除された組織を慎重に調べ、センチネル節を同定して取り除く。
【００２５】
この方法は、潰瘍性大腸炎またはクローン病の患者で炎症のある腸と感染していない腸の両方をも排液するセンチネル節に適用される。また、患者から静脈血試料を採取する。末梢血試料と節とを、炎症性病変ならびに疾患にかかっていない腸セグメントから得た検体と一緒に、免疫学的分析およびＴ細胞増殖の目的で研究室にて処理する。末梢血白血球（ＰＢＬ）をフィコールハイパック（ファルマシア、アマーシャム）で精製する。すき間はめガラスホモジナイザーを用いて、穏やかな圧力でリンパ節細胞の単細胞懸濁液を得る。組織フラグメントをダウンセ（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザー中でホモジナイズし、次いで９７℃で５分間変性させて、腸試料から抗原エキスを調製する。続いて、細胞の機能分析を行う。
【００２６】
実施例２  Ｔ細胞集団の単離
フィコール−ハイパックプラス(Ficoll-Hypague Plus)（アマシャム  バイオサイエンス、スウェーデン、ウプサラ）を用いて、リンパ球と単球を血液試料またはバフィーコート(buffy coats)から精製する。問題とするバフィーコートまたは血液試料をＰＢＳで希釈し、フィコール−ジアトリゾ酸ナトリウム溶液の上に慎重に重ね、その後、二相系を４００・ｇで３０分間遠心処理した。フィコール溶液と血漿との相間でリンパ球と単球を採取し、赤血球と顆粒球については管底で集めた。パスツールピペットを使ってリンパ球の層を除去し、ＨＢＳＳで細胞を洗浄して、余分なフィコールハイパックプラス、血漿および血小板を取り除いた。細胞をすぐに使用しない場合は、１０％ＨｕＳ、１％ＰｅＳｔおよび１％グルタミンを含有するＲＰＭＩ培地中に３７℃で保管した。ａｕｔｏＭＡＣＳ分離装置（ミテルニーバイオテク、ドイツ、ベルギッシュグラートバッハ）を利用して従来のＣＤ４＋  Ｔｈ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を精製した。この細胞を計数し、３００・ｇで１０分間遠心処理し、上清をピペットで完全に取り除き、細胞１０７個あたりＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中、０．５％ＢＳＡ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％アジ化ナトリウム）９０μＬおよびビオチン抗体カクテル１０μＬに細胞を溶解させた。これによって非ＣＤ４＋細胞集団をすべて標識した。４μＣで１０分間のインキュベーション後、細胞１０７個あたり抗ビオチンマイクロビーズ２０μＬを加え、４℃でさらに１５分間インキュベートした。細胞を約２０容量のＭＡＣＳ緩衝液で洗浄し、３００・ｇで１０分間遠心処理し、上清を完全に除去し、細胞１０８個あたりＭＡＣＳ緩衝液５００μＬ中に細胞を再懸濁させた。ａｕｔｏＭＡＣＳ分離装置で磁気分離を行い、非ＣＤ４＋細胞を試料から枯渇させた。ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞をＣＤ４＋集団から単離するために、ＣＤ４＋細胞を計数し、３００・ｇで１０分間遠心処理し、上清を完全に除去し、そして細胞１０７個あたりＭＡＣＳ緩衝液９０μＬおよびＣＤ２５マイクロビーズ１０μＬにペレットを溶解させた。４℃で１５分間のインキュベーション後、細胞を上述のようにして洗浄し、ａｕｔｏＭＡＣＳ分離装置での正の選択によってＣＤ２５＋細胞を単離した。すべての集団から得たアリコートをフローサイトメトリーで分析した。
【００２７】
実施例３  フローサイトメトリーによる細胞の特徴付け
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を用いて、単離した細胞集団の異なる表面マーカーの発現について調査研究を行った。細胞を４ｍＬのＦＡＣＳ管に分配し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中、２％ＦＣＳ、０．０５％アジ化ナトリウム）２ｍＬで洗浄し、３００・ｇで１０分間遠心処理し、上清を捨て、ＦＡＣＳ緩衝液１００μＬにペレットを再懸濁させた。使用する各抗体７μＬを加え、４℃で少なくとも３０分間インキュベートし、そして細胞をＦＡＣＳ緩衝液で再度洗浄し、前と同様に遠心処理し、ＦＡＣＳ溶解溶液１ｍＬに再懸濁させて細胞を固定するとともに赤血球を溶解させ、混合し、４℃で１０分間でインキュベートした後、洗浄し、上述したように再度遠心処理した。上清を捨て、細胞をチューブ１本あたりＦＡＣＳ緩衝液５００μＬに再懸濁させ、その後ベクトン・ディッキンソンのＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機器（フランクリン・レイクス、米国ニュージャージー州）を用いて分析を行った。
【００２８】
実施例４  増殖アッセイ
精製したＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の抑制能について調査研究を行った。９６ウェルの丸底プレートを、ＰＢＳ中２５μＬの５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３  ＩｇＧと一緒に３７℃で９０分間インキュベートした。ウェルを２００μＬのＰＢＳで３回洗浄した後、３種類の細胞集団を加えた。１ｍＬあたり細胞５００，０００個の割合の２５Ｇｙの光線を照射したＣＤ４細胞１００μＬを、３０，０００個のＣＤ４＋ＣＤ２５−レスポンダー細胞および１μｇ／ｍＬの可溶性ＣＤ２８（最終濃度）と一緒に各ウェルに加えた。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞をさまざまな量でウェルに加えて、多くの異なるＣＤ４＋ＣＤ２５−／ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞比を得た。対照として、別途用意した一組のウェルで同数のＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞をレスポンダー細胞に加えた。
【００２９】
プレートを４日間または５日間３７℃に維持した後、各ウェルに［３Ｈ］チミジン１μＣｉを加え、プレートを１８時間インキュベートし、その後これを−２０℃で凍結させた。細胞を融解し、細胞回収装置（トムテック、米国コネチカット州ハムデン）を使ってウェルの内容物をガラス繊維フィルタ（ワラック、フィンランドのトゥルク）に移した。ＭｅｌｔｉＬｅｘ  Ａ−Ｍｅｌｔ−ｏｎシンチレータシート（ワラック、フィンランドのトゥルク）をフィルタの上に乗せて８５℃で融解させた。１２０５ベータプレート液体シンチレーションカウンタ（ワラック、フィンランドのトゥルク）を用いて放射活性を測定した。
【００３０】
実施例５  ＦｏｘＰ３のＴＧＦ−β１誘導
上述のようにしてバフィーコートからＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞を調製した。異なるドナーからＰＢＭＣを調製し、照射（２５Ｇｙ）した。次に、１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１を使用した場合と使用しない場合とで、６ウェルのプレートにて１ウェルあたりの容量２ｍＬで、３・１０６個のＣＤ４＋細胞を１．２５・１０６個のＰＢＭＣで異種(allo)活性化させた。これらのプレートを３７℃に保った。２日目、５日目、及び７日目にフローサイトメトリー分析とＲＮＡ抽出用に、細胞試料を取り分けた。
【００３１】
実施例６  ＲＮＡ抽出とｃＤＮＡ合成
後にＰＣＲアッセイに使用する目的で、異なる細胞集団からのＲＮＡ抽出を以下のようにして行った。細胞５〜６・１０６個あたり１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン、米国カリフォルニア州カールズバッド）に細胞を溶解させ、その後試料を保管用に−７０℃で直ちに凍結させるか、又は室温にて５分間インキュベートした上でＴＲＩｚｏｌ試薬１ｍＬあたり０．２ｍＬのクロロホルムを添加し、チューブを強く振盪した。２〜３分後、チューブを１２，０００・ｇで４℃にて１５分間遠心処理した。透明な水性相を新しいチューブに移し、第１のステップで用いたＴＲＩｚｏｌを１ｍＬあたり０．５ｍＬのイソプロパノールを用いてＲＮＡを沈殿させ、室温にて１０分間インキュベートした後、１２，０００・ｇで４℃にて１０分間遠心処理した。上清を除去し、第１のステップで用いたＴＲＩｚｏｌ  １ｍＬあたり１ｍＬの７５％エタノールでペレットを洗浄した。チューブをボルテックスし、７，５００・ｇで４℃にて５分間遠心処理し、その後、ペレットを簡単に風乾させ（５〜１０分間）、ＲＮＡｓｅを含まない水１０μＬに溶解させ、５５℃で１０分間インキュベートした。ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（バイオ−ラッド、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）を製造業者のプロトコールに沿って用いてｃＤＮＡ合成を実施した。
【００３２】
実施例７  ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリアルタイム定量ＰＣＲ
異なる細胞集団からの合成ｃＤＮＡをＰＣＲに使用した。ＰＣＲを用いる目的は、ＦｏｘＰ３の発現を検出するためであり、スウェーデンのハディンゲにあるサイバージーン社（Ｃｙｂｅｒｇｅｎｅ  ＡＢ）からＧＡＰＤＨプライマーおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＰＩＩ）プライマーを入手した。配列：ＦｏｘＰ３、フォワード−ＣＡＧＣＡＣＡＴＴＣＣＣＡＧＡＧＴＴＣＣＴＣ、リバース−ＧＣＧＴＧＴＧＡＡＣＣＡＧＴＧＧＴＡＧＡＴＣ；ＧＡＰＤＨ、フォワード−ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ、リバース−ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ；ＲＰＩＩ、フォワード−ＧＣＡＣＣＡＣＧＴＣＣＡＡＴＧＡＣＡＴ、リバース−ＧＴＧＣＧＧＣＴＧＣＴＴＣＣＡＴＡＡ。通常のＰＣＲでは、ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ反応緩衝液およびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラブス、ドイツ国フランクフルトアムマイン）を用いていたが、定量リアルタイムＰＣＲではｉＱＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（バイオ−ラッド、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いた。反応はそれぞれＭｙＣｙｃｌｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  ＣｙｃｌｅｒまたはｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ検出システム（バイオ−ラッド、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）で、９５℃で３０秒、４８〜６５℃で３０秒、７２℃で３０秒を少なくとも４０回繰り返すサイクルのプロトコールに従って実施した。定量リアルタイムＰＣＲ反応では、Ｇｉｎｚｉｎｇｅｒ  Ｄ  Ｇ、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２００２  ３０：５０３〜１２に概説されているような相対定量法を適用した。ＰＣＲ生成物を２％アガロースゲルで分離し、取り込まれた臭化エチジウムのＵＶ励起によりバンドを検出した。
【００３３】
実施例８  ＩＢＤ患者のセンチネル節から得られたＴｒｅｇの調査研究
合計で２０名のＩＢＤ患者からのセンチネル節を外科手術で摘出し、調査研究を行った。センチネル節獲得リンパ球（ＳＥＡＬ）を、表面マーカーＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ１４の発現に関して特徴付けした。ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＴｒｅｇ集団の数を調べた（図１）。炎症性の腸セグメントを排液するセンチネル節でのＴｒｅｇ細胞数は、腸の非患部を排液するセンチネル節でのＴｒｅｇ数に比して正常であることが明らかになった。
【００３４】
しかしながら、炎症のあるセグメントを排液するセンチネル節から精製したＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ）と、炎症には関与しない腸セグメントから精製したＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ）とは、それらのＴ細胞の制御活性化が実質的に異なっていた：炎症部位を排液するセンチネル節由来のＴｒｅｇは、Ｔ細胞の活性化の制御が不満足であった（図２）。つまり、患部を排液するセンチネル節由来のＴｒｅｇのＴ細胞反応制御能は、明らかに損なわれていた。
【００３５】
実施例９  制御性Ｔ細胞の増殖
Ｔｒｅｇの誘導および増殖の目的で、末梢血由来のＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を、ＩＬ−２、ＣＤ２８、同種(allogenic)フィーダー細胞およびＴＧＦ−βで刺激した。増殖後、８５％を超えるＣＤ４＋Ｔ細胞が高いレベルでＣＤ２５を発現したことから、ＦＡＣＳで調査研究したようなＴｒｅｇ表現型が示された（図示せず）。ＲＴ−ＰＣＲでは、増殖後の集団にＴｒｅｇの特質(hallmark)である転写物のＦｏｘＰ３が含まれることが明らかになったが、これは増殖前にはＣＤ４＋ＣＤ２５−集団に存在しなかったものである（図３）。
【００３６】
誘導および増殖後のＴｒｅｇ集団がＴ細胞の活性化を阻害する能力を示すために、機能的に試験した。増殖後のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋集団（図３）は、すでに１：１０の比でのＴヘルパー細胞増殖の阻害で示されたように、Ｔｒｅｇ制御特性を呈した（図４）。Ｔｒｅｇの数は、ＩＢＤに冒された患者の炎症性の腸セグメントを排液するセンチネル節で正常であるようにみえる。刺激されたＴ細胞の反応の阻害の点では効率的でないように思われる。ナイーブＴ細胞を刺激および増殖すれば、効率的なＴ制御特性を与えることができる。
【００３７】
実施例１０  センチネル節由来の制御性Ｔ細胞による、炎症部位由来の抗原の認識
センチネル節、無症状の節(negative node)、腸上皮および末梢血白血球由来の制御性Ｔ細胞を、異なる腸細胞ホモジネート濃度で５から７日間インキュベートした。炎症のある領域からの抗原エキスで刺激したセンチネル節由来のＴｒｅｇに増殖が観察された（図５）。
【００３８】
しかしながら、センチネル節由来の制御性Ｔ細胞を非炎症部位からの抗原エキスで刺激すると、全く反応が認められないか極めて弱い反応が認められる（図示せず）。クローン病に冒された患者から得られた所見は、潰瘍性大腸炎に冒された患者から得られた所見と類似していた。
【００３９】
盲腸およびＳ状結腸における患部を排液するセンチネル節は、どちらも炎症部位由来の同じ抗原エキスを認識しそしてそれに従って増殖する（図６）。これらの所見は、Ｔ細胞のクローン増殖を担う共通の抗原が存在することを示す。観察された高い自発的な増殖は、センチネル節でのＴ細胞の生体内クローン増殖によるものである。センチネル節由来の制御性Ｔ細胞は、抗原エキスの用量に比例して反応する。
【００４０】
センチネル節由来の制御性Ｔ細胞は、サイトカイン発現量の増加を示す。センチネル節からのＣＤ４＋Ｔ細胞はＵＣに冒された患者のＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＣＲ５＋であり、炎症のある粘膜に対するＴｈ２炎症反応が悪化した状態を示唆する（図７）。
【００４１】
ＵＣに冒された患者のセンチネル節では、炎症部位からの抗原エキスでの活性化により、ＩＬ−４、Ｔｈ２サイトカインの分泌量が増える（図８）。
【００４２】
クローン病に冒された患者のセンチネル節由来の制御性Ｔ細胞は、抗原特異的活性化によりＴＨ１サイトカインＩＦＮ−γの産生量を増やすように反応する（図９）。
【００４３】
これらの所見から、ＵＣに冒された患者のセンチネル節由来のＴ細胞は、炎症部位由来の抗原に対する増殖反応が悪化し、センチネル節由来の制御性Ｔ細胞はＣＣＲ５発現量の増大（図７）およびＩＬ−４などのＴＨ２サイトカイン生成量の増加（図８）から示唆されるように、ＴＨ２反応と反応（ｒｅａｃｔ）することが分かる。クローン病患者のセンチネル節由来のＴ細胞は、ＩＦＮ−γなどのＴＨ１サイトカインのほうが優先的に産生される逆の活性化パターンを示す。
【００４４】
ＵＣに冒された患者またはクローン病に冒された患者のＵＣの潰瘍あるいは腸の炎症部位からの内皮細胞は、アポトーシスまたはネクローシスを起こし、次にプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）に取り込まれる。ＡＰＣは、崩壊した内皮細胞を取り込み、リンパ管を介して排液リンパ節であるセンチネル節まで移動し、そのセンチネル節でＡＰＣは内皮細胞由来のタンパク質（抗原）を処理してＴ細胞に提示する。Ｔ細胞は活性化され、クローン増殖して、炎症の領域を探すためにリンパ節を離れ、そこでエフェクター細胞となって炎症に関与する。
【００４５】
実施例１１  ＩＢＤの治療
炎症のある領域を排液する患者のセンチネル節に由来する制御性Ｔ細胞を採取し、これを増殖させて生体外にて活性化させ、注入により患者に戻すことで、ＩＢＤ、特にクローン病および／または潰瘍性大腸炎を治療することが可能である。特に、抗原特異的方法での制御性Ｔ細胞の生体外での増殖では、センチネル節に蓄積されたクローン増殖Ｔｒｅｇを巧みに利用する。ＩＢＤ患者のセンチネル節からのＴｒｅｇをＧＭＰ条件下で増殖させ、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−βが含まれるサイトカインカクテルを、炎症性の腸セグメントから得た抗原エキスと一緒に使って活性化し、Ｔｒｅｇの抗原特異的増殖を実現する。上述したようなＲＴ−ＰＣＲ、ＦＡＣＳおよび生体外での抑制アッセイを用いて活性化の効能を評価する（図４）。抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８およびラパマイシンを用いてのさらなる活性化を利用して、ＩＢＤのＴｒｅｇの最適な増殖と機能性を得ることが可能である。あるいは、炎症性の腸セグメントを排液するセンチネル節由来のＴｒｅｇがその数および／または機能の点で満足できるものでない場合は、同じプロトコールを用いた場合の非炎症性セグメントを排液するセンチネル節由来のＴｒｅｇの増殖について考慮する。この別の取り組みの背景にある論拠は、非炎症セグメントは適切に制御されているため、Ｔｒｅｇは数が少なすぎて隣接する腸セグメントでの調節を維持できないが、機能はしていると考え得ることにある。増殖したＴｒｅｇはどちらの種類であっても規則正しい免疫調節の回復のために自己輸血で戻される。
〔図面の説明文〕
図１は、表面マーカーＣＤ４＋と高レベルのＩＬ−２レセプターＣＤ２５、すなわちＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉの発現によって同定されたＴｒｅｇを示す。
図２は、機能的Ｔｒｅｇアッセイを示す。炎症のある腸セグメント（白丸）と非炎症性セグメント（黒丸）を排液するセンチネル節由来の精製Ｔｒｅｇを、末梢血から精製したＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔヘルパー細胞と一緒にインキュベートし、そして抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で活性化した。最後の１６時間中に培養物に３Ｈチミジンを添加した。
図３は、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を示す。Ｔｒｅｇ細胞の増殖を刺激するために、ＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞を、ＩＬ−２、ＴＧＦ−β、抗ＣＤ２８およびフィーダー細胞で活性化した。増殖ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＴｒｅｇからｍＲＮＡを抽出し、そして増殖後の集団をＴｒｅｇとして同定して、ＲＴ−ＰＣＲでＦｏｘＰ３転写物が示された。
図４は、刺激されたレスポンダーＴヘルパー細胞の調節を示す。ＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞を含有する増殖前集団は調節できない（黒丸）のに対し、増殖されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞（白丸）では適切な調節がなされる。
図５は、ヒト免疫細胞の活性化を示す。センチネルリンパ節、非センチネルリンパ節、腸、ならびに末梢血リンパ球から得た細胞を、潰瘍性大腸炎患者の炎症のある腸セクション由来の内在性抗原エキスで活性化させた。
図６は、用量反応図である。同じ炎症のある腸セクション由来の内在性抗原エキスによって活性化された、盲腸およびＳ状結腸を排液するセンチネル節由来の制御性Ｔ細胞の用量反応が示されている。
図７は、ＴＨ２マーカーとしてのＣＣＲ５の発現を示す。ＵＣ患者のセンチネル節由来の制御性Ｔ細胞では、ＴＨ２活性化のサインとしてＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋記憶細胞上のＣＣＲ５の発現が増大した。
図８は、ＵＣ患者の制御性Ｔ細胞におけるＴＨ２サイトカインＩＬ−４の分泌を示す。非センチネルリンパ節（ｎＳＬＮ）およびセンチネルリンパ節（ＳＬＮ）からの細胞を炎症抗原エキスで４８時間刺激した。分泌されたＩＬ−４はサンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用して培養上清で測定した。
図９は、クローン病患者のセンチネル節由来の制御性Ｔ細胞によるＴＨ１サイトカインＩＦＮ−γの分泌を示す。非センチネルリンパ節（ｎＳＬＮ）およびセンチネルリンパ節（ＳＬＮ１およびＳＬＮ２）からの細胞を炎症抗原エキスで４８時間刺激した。分泌したＩＦＮ−γを、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用して培養上清で測定した。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】２種類の表面マーカーの発現によって同定されるＴｒｅｇ試料中の活性化Ｔｒｅｇを示す図である。
【図２】機能的Ｔｒｅｇアッセイを示す図である。
【図３】増殖後のＴｒｅｇから抽出したｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲアッセイを示す。
【図４】増殖前後のＴｒｅｇ集団の制御能を示す図である。
【図５】炎症のある腸セクションからの内在性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）エキスによるヒト免疫細胞の活性化を示す図である。
【図６】センチネル節由来で同様に活性化されたＴｒｅｇの用量反応を示す図である。
【図７】ＴＨ２マーカーとしてのＣＣＲ５の発現を示す。
【図８】ＵＣ患者からのＴｒｅｇにおけるＩＬ−４の分泌を示す。
【図９】ＣＤ患者からのＴｒｅｇにおけるＩＦＮ−γの分泌を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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