(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロッド状の金微粒子がポリマーの多層膜によって被覆されており、該ポリマー多層膜の最表面層を形成するポリマーにポリエチレングリコール(PEG)がグラフト重合によって結合しており、さらに該ポリエチレングリコール(PEG)が結合している最表面層のポリマーが下層のポリマーと複数の架橋点でアミド結合していることを特徴とする金微粒子被覆体。
【請求項２】
ポリマー多層膜が、金微粒子を被覆するポリスチレンスルホネート層(PSS)、これを被覆するポリアリルアミンハイドロクロライド層(PAH)、これを被覆するポリ−Ｎ−アクリロキシスクシンイミド層(PNAS)によって形成されており、該ＰＮＡＳにポリエチレングリコール(PEG)が結合している請求項１に記載する金微粒子被覆体。
【請求項３】
ポリエチレングリコール(PEG)の片末端がメトキシ基である請求項１または請求項２に記載する金微粒子被覆体。
【請求項４】
ポリエチレングリコール(PEG)の片末端がカルボキシル基である請求項１または請求項２に記載する金微粒子被覆体。
【請求項５】
ポリスチレンスルホネート層(PSS)と該PSS層を被覆するポリアリルアミンハイドロクロライド層(PAH)を有するロッド状金微粒子と、ポリ−Ｎ−アクリロキシスクシンイミド(PNAS)にポリエチレングリコール(PEG)をグラフトしたポリマーとを混合して、該PNASのアミノ基と上記PAHのスクシンイミド基とを反応させてアミド結合を形成することによって、金微粒子表面にＰＳＳ層／ＰＡＨ層／ＰＮＡＳ層／ＰＥＧからなり、該ＰＥＧがグラフト重合によって結合しており、該ＰＮＡＳ層が該ＰＡＨ層と複数の架橋点でアミド結合している被覆層を形成することを特徴とする金微粒子被覆体の製造方法。
【請求項６】
ＣＴＡＢが表面修飾した金ナノロッド水分散液とポリスチレンスルホネート(PSS)水溶液とを混合して金ナノロッド表面にＰＳＳが吸着したＰＳＳ被覆体を形成し、次いで、このＰＳＳ被覆体の水分散液とポリアリルアミンハイドロクロライド(PAH)水溶液と混合してＰＳＳ表面にＰＡＨが吸着したＰＡＨ被覆体を形成し、一方、ポリ−Ｎ−アクリロキシスクシンイミドにポリエチレングリコール(PEG)をグラフトしたポリマー(PEG-g-PNAS)を調製し、このPEG-g-PNAS水溶液と上記ＰＡＨ被覆体水分散液とを混合し、該ＰＮＡＳのアミノ基と該ＰＡＨのスクシンイミド基との反応によるアミド結合を形成させることによって、金ナノロッド表面にＰＳＳ層／ＰＡＨ層／ＰＮＡＳ層／ＰＥＧからなり、該ＰＥＧがグラフト重合によって結合しており、該ＰＮＡＳ層が該ＰＡＨ層と複数の架橋点でアミド結合している被覆層を形成する請求項５に記載する金微粒子被覆体の製造方法。
【請求項７】
金微粒子被覆体をバイオマーカーとして使用し、生体外部から近赤外光を照射することによって、生体内に投与した金ナノロッドの分散状態または凝集状態による分光特性の変化を測定する近赤外光分析方法に使用する請求項１〜請求項４の何れかに記載する金微粒子被覆体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリエチレングリコール（PEG）を側鎖にグラフトしたポリマーによって被覆されているロッド状の金微粒子被覆体とその製造方法、およびその用途に関する。本発明の金微粒子はナノサイズのロッド状微粒子（金ナノロッド）であり、本発明の金微粒子被覆体は金ナノロッド被覆体である。
【０００２】
本発明は、より具体的には、ＰＥＧをグラフトしたポリマーを微粒子表面のポリマーと化学結合させることによって金微粒子の分散安定性を高めた金ナノロッド被覆体とその用途に関する。本発明の技術は、水中や血液中での金ナノロッドの分散安定性を高める方法として有用であり、金ナノロッドを生体内へ投与しバイオマーカーとして利用できるため生体内の近赤外イメージングが可能である。
【背景技術】
【０００３】
溶媒中に分散した金属微粒子に光を照射すると局在表面プラズモン共鳴（Localized Surface Plasmon resonance：LSPR）と呼ばれる共鳴吸収現象が生じる。この吸収現象は金属の種類と形状、そして金属微粒子周囲における媒体の屈折率によって吸収波長が決定される。例えば、球状の金微粒子が水に分散した場合は５３０nm付近に吸収域を持ち、金微粒子の形状を短軸１０nm程度のロッド状（金ナノロッド）にすると、ロッドの短軸に起因する５３０nm付近の吸収の他に、ロッドの長軸に起因する長波長側の吸収を有することが知られている（非特許文献１）。この吸収波長については、ロッドの長軸長さ、短軸長さの数値に基づいた吸収波長の理論計算が可能である。
【０００４】
なお、ロッド状とは、非特許文献１に記載されているように、形状が円柱状ないし棒状であって、その長さが短い方向を短軸と云い、長い方向を長軸と云う。ナノサイズ（数nm〜数百nm）のロッド状の金微粒子を金ナノロッドと云う。非特許文献２に記載されているように、金ナノロッドは表面には異なる結晶面が存在しており、単純な円柱ではなく多面体構造である。
【０００５】
これらの金属微粒子分散液は、低分子化合物や高分子化合物を保護剤として金属微粒子表面に吸着ないし結合させることによって、金属微粒子が凝集することなく安定に溶媒に分散させることができる。特に金ナノロッドは、形状の変化や凝集状態の変化、金ナノロッド周辺の環境によって分光特性が変化する特異な金微粒子であり（非特許文献３〜６）、近赤外光をプローブとして用いる新しい分光分析の材料として可能性がある。
【０００６】
金ナノロッドはアスペクト比（長軸長さ／短軸長さ）が１より大きいロッド状のナノサイズの金微粒子であり、例えば、カチオン性界面活性剤である第４級アンモニウム塩のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）に溶解した水中で合成され、ＣＴＡＢ水溶液中の金イオンを化学還元、電気還元、光還元などによって合成することが可能であり、合成した金ナノロッドはＣＴＡＢの保護作用によって水中で安定に分散している（特許文献１〜４、非特許文献７）。
【０００７】
金ナノロッドの表面処理方法として、近赤外域にプラズモン吸収のピークトップを有する金ナノロッドについて、ＣＴＡＢを除去しつつ、フォスファチジルコリン(ＰＣ)を金ナノロッドへ吸着させ、ＣＴＡＢの細胞毒性を低減させる方法が報告されており、ＣＴＡＢの低減とＰＣの吸着をゼータ電位の変化として測定している（非特許文献８）。また、金ナノロッド水分散液中の過剰なＣＴＡＢを除去しておき、α−メトキシ−ω−メルカプトポリエチレングリコール（mPEG-SH）を表面修飾して生体内での分散安定性を高める技術（非特許文献９）が報告されている。
【０００８】
近年、窒素や硫黄を吸着基とする分散剤を、水中で合成した金ナノロッドに表面処理して有機溶媒中へ安定に抽出させる方法が報告されている（特許文献５、６）。さらに、保護鎖としてＰＥＧを共有結合したポリリジン骨格中のアミノ基に近赤外域（650nm〜1300nm）に吸収を有する蛍光色素を共有結合させた近赤外蛍光プローブを用いた生体内の近赤外イメージング技術が報告されている（特許文献７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００４−２９２６２７号公報
【特許文献２】特開２００５−９７７１８号公報
【特許文献３】特開２００６−１６９５４４号公報
【特許文献４】特開２００６−１１８０３６号公報
【特許文献５】特開２００５−２７０９５７号公報
【特許文献６】特開２００６−１７６８７６号公報
【特許文献７】特許公表２００２−５１４６１０号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】S. Link, M. B. Mohamed, M. A. El-Sayed, J. Phys. Chem. B, 103, p3073（1999）
【非特許文献２】Z. L. Wang, M. B. Mohamed, S. Link, M. A. El-Sayed, Surface Science, 440, L809(1999)
【非特許文献３】K. Honda, Y. Niidome, N. Nakashima, H. Kawazumi, S. Yamada, Chem. Lett., 35, p854（2006）
【非特許文献４】Y. Niidome, H. Takahashi, S. Urakawa, K. Nishioka, S. Yamada, Chem. Lett., 33, p454（2004）
【非特許文献５】S. Link, M. A. El-Sayed, J. Phys. Chem. B, 109, p10531（2005）
【非特許文献６】P. K. Jain, S. Eustis, M. A. El-Sayed, J. Phys. Chem. B, 110, p18243 (2006)
【非特許文献７】Y. Niidome, H. Kawasaki, S. Yamada, S. Chem. Commun, 18, p2376 (2003)
【非特許文献８】H. Takahashi, Y. Niidome, T. Niidome, K. Kaneko, H. Kawasaki, S.Yamada, Langmuir, 22, p2 (2006)
【非特許文献９】T. Niidome, M. Yamagata, Y. Okamoto, Y. Akiyama, H. Takahashi, T. Kawano, Y. Katayama, Y. Niidome, J. Control. Release, 114, p343 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
特許文献１〜４や非特許文献７などに記載されている方法で合成された金ナノロッドはＣＴＡＢに被覆されて水中に分散しているが、ＣＴＡＢは高い細胞毒性を示すため、血液中への投与などの生体内への適用はできない。特許文献５〜６に記載されている方法では、窒素や硫黄で吸着する分散剤を用いて有機溶媒に金ナノロッドを安定に分散させることが可能であるが、血液中での分散安定性は検討されていない。特許文献７に記載されているものは、蛍光色素による生体内の近赤外イメージングを目的とした蛍光プローブであるが、蛍光色素をバイオマーカーに使用した場合は、得られる光信号の定量性に欠けており、再現性の得られる測定結果が得られない。
【００１２】
非特許文献８には、ＣＴＡＢを低減してＰＣで修飾した金ナノロッドは細胞毒性を低減することが報告されているが、水中や血液中の分散安定性を高めたものではなく、ゼータ電位はＣＴＡＢの除去割合を指標として数値化したものである。非特許文献９には、ＰＥＧ修飾による金ナノロッドは血液中で分散安定性が高まることが報告されているが、ＰＥＧ鎖の金ナノロッドからの脱離により分散安定性が低下する問題については、解決方法が開示されておらず、さらにＰＥＧには反応性の官能基がないため、他の化合物を導入することはできない。
【００１３】
本発明は、金ナノロッドについて、従来の上記技術では知られていない新規技術を提供する。具体的には、水中や血液中での分散安定性を高めた生体に対して安全な金ナノロッド被覆体とその製造方法、およびその用途を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、以下の構成を有する金微粒子被覆体に関する。
〔１〕ロッド状の金微粒子がポリマーの多層膜によって被覆されており、該ポリマー多層膜の最表面層を形成するポリマーにポリエチレングリコール(PEG)がグラフト重合によって結合しており、さらに該ポリエチレングリコール(PEG)が結合している最表面層のポリマーが下層のポリマーと複数の架橋点でアミド結合していることを特徴とする金微粒子被覆体。
〔２〕ポリマー多層膜が、金微粒子を被覆するポリスチレンスルホネート層(PSS)、これを被覆するポリアリルアミンハイドロクロライド層(PAH)、これを被覆するポリ−Ｎ−アクリロキシスクシンイミド層(PNAS)によって形成されており、該ＰＮＡＳにポリエチレングリコール(PEG)が結合している上記[１]に記載する金微粒子被覆体。
〔３〕ポリエチレングリコール(PEG)の片末端がメトキシ基である上記[１]または上記[２]に記載する金微粒子被覆体。
〔４〕ポリエチレングリコール(PEG)の片末端がカルボキシル基である上記[１]または上記[２]に記載する金微粒子被覆体。
【００１５】
また、本発明は、以下の構成を有する金微粒子被覆体の製造およびその用途に関する。
〔５〕ポリスチレンスルホネート層(PSS)と該PSS層を被覆するポリアリルアミンハイドロクロライド層(PAH)を有するロッド状金微粒子と、ポリ−Ｎ−アクリロキシスクシンイミド(PNAS)にポリエチレングリコール(PEG)をグラフトしたポリマーとを混合して、該PNASのアミノ基と上記PAHのスクシンイミド基とを反応させてアミド結合を形成することによって、金微粒子表面にＰＳＳ層／ＰＡＨ層／ＰＮＡＳ層／ＰＥＧからなり、該ＰＥＧがグラフト重合によって結合しており、該ＰＮＡＳ層が該ＰＡＨ層と複数の架橋点でアミド結合している被覆層を形成することを特徴とする金微粒子被覆体の製造方法。
〔６〕ＣＴＡＢが表面修飾した金ナノロッド水分散液とポリスチレンスルホネート(PSS)水溶液とを混合して金ナノロッド表面にＰＳＳが吸着したＰＳＳ被覆体を形成し、次いで、このＰＳＳ被覆体の水分散液とポリアリルアミンハイドロクロライド(PAH)水溶液と混合してＰＳＳ表面にＰＡＨが吸着したＰＡＨ被覆体を形成し、一方、ポリ−Ｎ−アクリロキシスクシンイミドにポリエチレングリコール(PEG)をグラフトしたポリマー(PEG-g-PNAS)を調製し、このPEG-g-PNAS水溶液と上記ＰＡＨ被覆体水分散液とを混合し、該ＰＮＡＳのアミノ基と該ＰＡＨのスクシンイミド基との反応によるアミド結合を形成させることによって、金ナノロッド表面にＰＳＳ層／ＰＡＨ層／ＰＮＡＳ層／ＰＥＧからなり、該ＰＥＧがグラフト重合によって結合しており、該ＰＮＡＳ層が該ＰＡＨ層と複数の架橋点でアミド結合している被覆層を形成する上記[５]に記載する金微粒子被覆体の製造方法。
〔７〕金微粒子被覆体をバイオマーカーとして使用し、生体外部から近赤外光を照射することによって、生体内に投与した金ナノロッドの分散状態または凝集状態による分光特性の変化を測定する近赤外光分析方法に使用する上記[１]〜上記[４]の何れかに記載する金微粒子被覆体。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の金微粒子被覆体は、金微粒子がポリマーの多層膜によって被覆されているので該ポリマー層が剥離し難く安定である。好ましくは、表面のポリマー層が下層のポリマー層と複数の架橋点でアミド結合しているので、金微粒子を被覆しているポリマー多層膜が剥離し難く安定である。
【００１７】
本発明の金微粒子被覆体は、好ましくは、ポリマー多層膜が、金微粒子を被覆するポリスチレンスルホネート層(PSS)、これを被覆するポリアリルアミンハイドロクロライド層(PAH)、これを被覆するポリ−Ｎ−アクリロキシスクシンイミド層(PNAS)によって形成されており、ＰＡＨ層とＰＮＡＳ層は複数の架橋点でアミド結合しているので、結合が強固であり、該ポリマー層が剥離し難く安定である。
【００１８】
また、本発明の金微粒子被覆体は、ポリマー多層膜の最表面層を形成するポリマーにポリエチレングリコール(PEG)が結合しているので、水中や血液中での分散安定性が高い。好ましくは、ＰＥＧは最表面層ポリマーの側鎖にグラフト重合されているので、結合が強固であり離脱し難く、安定である。さらに好ましくは、ＰＥＧは予め最表面層ポリマーに結合してから、金ナノロッド表面のポリマーと結合させればよいので、金ナノロッドに修飾するＰＥＧの量や鎖長を任意に調整することが可能である。
【００１９】
本発明の金微粒子被覆体は、例えば、カルボキシル基などの官能基を有するＰＥＧを用いることによって、アミノ基を有する化合物とアミド結合させて該化合物を導入することができる。例えば、アミノ基を有するペプチド、タンパク質、蛍光色素、ビオチンなどのように生体内で機能性を発現する化合物を導入することができる。
【００２０】
さらに、本発明の金微粒子被覆体は、ＬＳＰＲの最大吸収波長が７００〜２０００nmの範囲の金ナノロッドを用いれば、波長７５０〜１１００nmの近赤外光は水の吸収による影響が少なく（Water Window）、生体にも安全な波長域であり、生体内に投与された場合、金ナノロッドをバイオマーカーとしてＬＳＰＲの分光変化を確認することで、近赤外光を用いたバイオイメージングが可能であり、近赤外分析システムを構築するのに適している。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ポリマー多層膜で被覆された金ナノロッドの概念図
【図２】CTAB-NRs水分散液の吸収スペクトル図
【図３】mPEG-g-PNAS/PAH/PSS/NRs水分散液の吸収スペクトル図
【図４】cPEG-g-PNAS/PAH/PSS/NRs水分散液の吸収スペクトル図
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明を実施形態に基づいて具体的に説明する。なお、濃度の％は特に示さない限り質量％である。また、本発明明において、吸収スペクトルの変化とは、金ナノロッドの凝集に伴うＬＳＰＲの最大吸収波長の吸光度の低下や吸収スペクトル形状の変化を意味する。
【００２３】
本発明の金微粒子被覆体は、ロッド状の金微粒子がポリマーの多層膜によって被覆されており、該ポリマー多層膜の最表面層を形成するポリマーにポリエチレングリコール(PEG)がグラフト重合によって結合しており、さらに該ポリエチレングリコール(PEG)が結合している最表面層のポリマーが下層のポリマーと複数の架橋点でアミド結合していることを特徴とする金微粒子被覆体である。
【００２４】
本発明の金微粒子被覆体は、例えば、（イ）ポリマー多層膜が、金微粒子を被覆するポリスチレンスルホネート層(PSS)、これを被覆するポリアリルアミンハイドロクロライド層(PAH)、これを被覆するポリ−Ｎ−アクリロキシスクシンイミド層(PNAS)によって形成されており、該ＰＮＡＳにポリエチレングリコール(PEG)が結合している態様、（ロ）ポリエチレングリコール(PEG)の片末端がメトキシ基である態様、（ハ）ポリエチレングリコール(PEG)の片末端がカルボキシル基である態様を含む。
【００２５】
本発明の金微粒子被覆体は、ポリスチレンスルホネート層(PSS)と該PSS層を被覆するポリアリルアミンハイドロクロライド層(PAH)を有するロッド状金微粒子と、ポリ−Ｎ−アクリロキシスクシンイミド(PNAS)にポリエチレングリコール(PEG)をグラフトしたポリマーとを混合して、該PNASのアミノ基と上記PAHのスクシンイミド基とを反応させてアミド結合を形成することによって、金微粒子表面にＰＳＳ層／ＰＡＨ層／ＰＮＡＳ層／ＰＥＧからなる被覆層を形成することによって製造することができる。
【００２６】
本発明の金微粒子被覆体は、より具体的には、ＣＴＡＢが表面修飾した金ナノロッド水分散液とポリスチレンスルホネート(PSS)水溶液とを混合して金ナノロッド表面にＰＳＳが吸着したＰＳＳ被覆体を形成し、次いで、このＰＳＳ被覆体の水分散液とポリアリルアミンハイドロクロライド(PAH)水溶液と混合してＰＳＳ表面にＰＡＨが吸着したＰＡＨ被覆体を形成し、一方、ポリ−Ｎ−アクリロキシスクシンイミドにポリエチレングリコール(PEG)をグラフトしたポリマー(PEG-g-PNAS)を調製し、このPEG-g-PNAS水溶液と上記ＰＡＨ被覆体水分散液とを混合し、該ＰＮＡＳのアミノ基と該ＰＡＨのスクシンイミド基との反応によるアミド結合を形成させ、金ナノロッド表面にＰＳＳ層／ＰＡＨ層／ＰＮＡＳ層／ＰＥＧからなる被覆層を形成することによって製造することができる。
【００２７】
〔金ナノロッド〕
本発明に用いる金微粒子は、金ナノロッドであり、好ましくは、長軸長さが５〜１００nm、短軸長さが３〜３０nmであって、アスペクト比が２〜１２であり、ＬＳＰＲの最大吸収波長が７００〜２０００nmの金ナノロッドであり、長軸長さが２０〜８０nm、短軸長さが４〜１０nmの粒子径を有するものが分散安定性の面からより好ましい。長軸長さが１００nmより長いと、金ナノロッドが自重で沈降しやすくなる傾向があるため、分散媒中での分散安定性が失われる。また、金ナノロッドのアスペクト比は、生体内に投与した場合でも、光照射や検出が可能な近赤外域にＬＳＰＲの最大吸収波長を有するものが好ましいので、上記アスペクト比２〜１２が良い。
【００２８】
上記金ナノロッドは次式[Ｉ]で示される４級アンモニウム塩が溶解した水溶液中で金イ
オンを還元することによって合成することができる。例えば、n＝１５のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）を使用することによって、ＣＴＡＢが表面に吸着した金ナノロッドを得ることができる。合成した段階での金ナノロッドはＣＴＡＢが吸着した状態で水中に安定に分散している。
【００２９】
ＣＨ3(ＣＨ2)nＮ+(ＣＨ3)3Ｂｒ- （ｎは１〜１５の整数） …[Ｉ]
【００３０】
金ナノロッド水分散液は、式[Ｉ]に示される水中に存在する余剰の界面活性剤を除去し
てから表面処理に使用するとよい。具体的には、金ナノロッド水分散液を遠心分離して金ナノロッドを遠沈管の底に沈降させ、界面活性剤を含む上澄みを除去する。沈降した金ナノロッドは水を添加して再分散させる。この操作を１〜３回繰り返すことによって余剰な界面活性剤を除去することができる。なお、界面活性剤を過剰に除去すると金ナノロッドが凝集して水に再分散しなくなる。
【００３１】
〔PEGグラフトポリマー〕
金ナノロッドに表面修飾するＰＥＧとしては、片方の末端がメトキシ基、またはカルボキシル基であり、もう一方の末端がアミノ基を有する重量平均分子量500〜50000のＰＥＧ（PEG-NH2）が好ましく、重量平均分子量1000〜20000のPEG-NH2がより好ましい。このPEG-NH2の重量平均分子量が50000より大きい場合には血液中での分散安定性に変化はなくコスト的に不利である。また、PEG-NH2の重量平均分子量が500より小さい場合には血液中での分散安定性が低くなり、金ナノロッドが凝集する可能性が高くなる。このPEG-NH2はポリマー多層膜の最表面層を形成するポリマーに予めグラフトしておけばよい。
【００３２】
ＰＥＧをグラフトするポリマーとしては、ＰＥＧ末端のアミノ基、および金ナノロッドに表面処理されているポリマー中のアミノ基と化学反応して、生体中で安定なアミド結合が得られる官能基を有するポリマーを選択すればよい。このようなポリマーとしては、好ましくは、アミノ基と反応してアミドを形成するスクシンイミド基を有するポリ−Ｎ−アクリロキシスクシンイミド（Poly-N-acryloxysuccinimide;PNAS）を用いればよい。
【００３３】
上記ＰＮＡＳの重量平均分子量は1000〜100000が適当であり、10000〜50000が好ましい。重量平均分子量が100000より大きい場合、ＰＥＧ末端のアミノ基、および金ナノロッドに表面処理されているポリマー中のアミノ基と反応するスクシンイミド基は過剰に存在するためコスト的に不利である。また、重量平均分子量が1000より小さい場合、ＰＮＡＳ分子中のスクシンイミド基数が不足し、上記PEG-NH2や金ナノロッドに表面処理されているポリマーとの反応が不完全となりＰＥＧの脱離傾向が高まるため、血中で金ナノロッドが凝集を起こす可能性が高くなる。
【００３４】
PEG-NH2は、あらかじめＰＮＡＳと反応させてグラフトしておくとよい（PEG-g-PNAS）。ＰＥＧをグラフとしたＰＮＡＳ（PEG-g-PNAS）は、金ナノロッドに表面処理されているポリマーと反応させるため、未反応のスクシンイミド基が残るように調整する。具体的には、ＰＮＡＳ中のスクシンイミド基の２〜８０％、好ましくは５〜８０％をPEG-NH2と反応させればよい。ＰＥＧをＰＮＡＳにグラフトさせておくことによって、金ナノロッドに導入するＰＥＧの量や鎖長を任意に調整することが可能である。
【００３５】
〔金ナノロッドの表面処理〕
余剰のＣＴＡＢを除去した金ナノロッド水分散液に、アニオン性高分子であるポリスチレンスルホネート（PSS）を添加して攪拌すると、負の電荷をもつＰＳＳは正電荷のＣＴＡＢで被覆されている金ナノロッド表面に静電相互作用で吸着し、ＰＳＳで被覆された金ナノロッドが得られる（PSS-NRs）。
【００３６】
ＰＳＳは重量平均分子量が１０００以上のものが好ましい。特に重量平均分子量が10000〜100000の範囲が好ましく、この重量平均分子量のＰＳＳは金ナノロッド表面に残存するＣＴＡＢの正電荷と過不足なく吸着することが可能である。重量平均分子量が１０００より小さいと、金ナノロッド表面に残存するＣＴＡＢの正電荷に対するＰＳＳの負電荷点が不足し、金ナノロッドの分散安定性が失われ、金ナノロッドが凝集する可能性が高くなる。
【００３７】
ＰＳＳの使用量は、余剰のＣＴＡＢを除去した金含有率３.０mMの金ナノロッド水分散液０.５mlに対して、ＰＳＳを０.１〜１０mg添加して攪拌すればよく、好ましくはＰＳＳを１〜５mg添加すればよい。ＰＳＳの添加量が０.１mgより少ないと金ナノロッド表面への処理量が不足して金ナノロッドの凝集が発生する。一方、ＰＳＳの添加量が１０mgより多いと金ナノロッドに吸着しないＰＳＳの余剰分が発生しコスト的に不利である。
【００３８】
ＰＳＳで被覆された金ナノロッド（PSS-NRs）は負に荷電しており、静電相互作用によってカチオン性高分子をPSS-NRsに被覆することができる（PAH-PSS-NRs）。カチオン性高分子としてはポリアリルアミンハイドロクロライド（PAH）を使用するとよい。具体的には、ＰＳＳで被覆された金ナノロッド（PSS-NRs）水分散液とＰＨＡ水溶液とを混合して攪拌することによって、PSS-NRs表面にＰＡＨが静電相互作用によって吸着し、ＰＡＨで被覆された金ナノロッド（PAH-PSS-NRs）が得られる。
【００３９】
ＰＡＨは重量平均分子量が１０００以上のものが好ましい。特に重量平均分子量が10000〜100000のＰＡＨが好ましく、このＰＡＨは金ナノロッド表面のＰＳＳの負電荷と過不足なく吸着することが可能である。重量平均分子量が１０００より小さいと、金ナノロッド表面のＰＳＳの負電荷に対するＰＡＨの正電荷点が不足し、金ナノロッドの分散安定性が失われ、金ナノロッドが凝集する可能性が高くなるばかりでなく、PEG-g-PNASのスクシンイミド基との反応が不完全となる。
【００４０】
ＰＡＨの使用量は、金含有率３.０mMのPSS-NRs分散液０.５mlに対して、ＰＡＨを０.１〜１０mg添加して攪拌すればよく、好ましくはＰＡＨを１〜５mg添加すればよい。ＰＡＨの添加量が０.１mgより少ないとＰＳＳ表面への処理量が不足して金ナノロッドの凝集が発生する。一方、ＰＡＨの添加量が１０mgより多いとＰＳＳに吸着しないＰＡＨやPEG-g-PNASのスクシンイミド基と吸着しないＰＡＨが発生し、コスト的に不利である。
【００４１】
〔金ナノロッドへのPEG鎖導入〕
本発明の金微粒子被覆体（PEG-g-PNAS/PAH/PSS/NRs）は、PEG-g-PNASに残存しているスクシンイミド基と、ＰＡＨで被覆された金ナノロッド（PAH-PSS-NRs）のアミノ基とを反応させてアミド結合を形成することによって得られる。具体的には、PAH-PSS-NRs水分散液とPEG-g-PNAS水溶液とを混合して攪拌し、炭酸水素ナトリウムなどｐＨ=８.５程度の緩衝液を添加してPNASのスクシンイミド基とPAHのアミノ基とを反応させ、アミド結合を形成することによって本発明の金微粒子被覆体（PEG-g-PNAS/PAH/PSS/NRs）を得ることができる。
【００４２】
PEG-g-PNASの使用量は、金含有率３.０mMのPAH-PSS-NRs水分散液０.２５mlに対して、PEG-g-PNASを０.１〜１０００mg添加して攪拌すればよく、好ましくはPEG-g-PNASを１〜２００mg添加すればよい。PEG-g-PNASの添加量が０.１mgより少ないとPAH-PSS-NRs表面への処理量が不足し金ナノロッドの凝集が発生する。一方、PEG-g-PNASの添加量が１０００mgより多いとPAH-PSS-NRsに吸着しないPEG-g-PNASが発生しコスト的に不利である。
【００４３】
本発明の金微粒子被覆体（PEG-g-PNAS/PAH/PSS/NRs）は、ＰＥＧ鎖が分散剤として機能するため生体内における金ナノロッドの分散安定性が得られる。さらに、ＰＥＧ、ＰＮＡＳ、ＰＡＨ間では生体安定性の高いアミド結合で多点結合しており、即ち、複数の架橋点でアミド結合しているため分解や脱着によるＰＥＧ鎖の解離が起こり難く、高い分散安定性が得られる。
【００４４】
本発明の金微粒子被覆体（PEG-g-PNAS/PAH/PSS/NRs）は、PEGの片末端のメトキシ基、またはカルボキシル基によって、表面電荷（ゼータ電位）を調整することが可能である。メトキシ基と比較してカルボキシル基を用いた場合、金微粒子被覆体のゼータ電位は低くなる。
【００４５】
金微粒子被覆体（PEG-g-PNAS/PAH/PSS/NRs）のゼータ電位は、+２５mV以下が適当であり、+２０mV以下が好ましい。ゼータ電位が+２５mVより大きいと、血液中での分散安定性が低下し、凝集を起こす傾向が高くなる。
【００４６】
本発明の金微粒子被覆体（PEG-g-PNAS/PAH/PSS/NRs）は、PEGの片末端がカルボキシル基の場合、アミノ基を有する化合物とアミド結合を形成することによって該化合物を導入することができる。例えば、アミノ基を有するペプチド、タンパク質、蛍光色素、ビオチンなどのような生体内で機能性を発現する化合物を導入することができる。
【００４７】
〔用途〕
本発明の金微粒子被覆体は、好ましくは、７００〜２０００nmの近赤外域にＬＳＰＲの吸収ピークを有する金ナノロッドが用いられ、これは血液中で安定に分散するので、バイオマーカーとして使用することができる。特に波長８００nm〜１２００nmの近赤外光は水の吸収による影響が少なく（Near Infrared Window）、生体にも安全な波長域であるので、生体外部から近赤外光を照射することによって、生体内に投与した金ナノロッドの分散状態や凝集状態による分光特性の変化を安全に測定することが可能であり、近赤外光分析システムやバイオイメージングシステムなどを構築することができる。近赤外光としては、近赤外線を発する近赤外線レーザー（CW、半導体レーザー）などを利用すればよい。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例によって具体的に示す。また、比較例を示す。なお、以下の実施例において、金ナノロッドは特許文献３に示されるＣＴＡＢを保護剤として塩化金酸を水中で還元して合成されたものであり、長軸４０nm、短軸１０nm、アスペクト比４のロッド状の金微粒子であり、主に９００nm付近の波長域におけるLSPRの吸収波長シフトを測定しているが、金ナノロッドのアスペクト比を変更することによって700〜2000nmまでの波長域についても同様の吸収波長のシフトを測定することができる。また、実施例では水中での保存安定性を確認しているが、血中においても同等の保存安定性が得られる。また分光特性（吸光度）は日本分光株式会社製品（製品名V-670）を用いて測定した。ゼータ電位はMalverne社製測定器（Zeta-sizer NanoZS）を用いて測定した。なお、各例の相対遠心加速度は遠心加速度を地球の重力加速度で除した速度である。
【００４９】
〔実施例１〕
以下の手順で、ポリマー多層膜で被覆した金微粒子を調製した。ポリマー多層膜で被覆された金ナノロッドの概念図を図１に示す。
【００５０】
〔金ナノロッド水分散液〕
CTABで修飾された金ナノロッド水分散液を次の手順で準備した。
400mMのCTAB水溶液中で合成された金ナノロッド水分散液（金原子濃度1.5mM）１mlを遠沈管に入れ、14000(×g)の相対遠心加速度で１０分間遠心分離して金ナノロッドを遠沈管の底に沈降させた。上澄み液を除去し、沈降した金ナノロッドを１mlの水で再分散させた。さらに再分散させた金ナノロッドを14000(×g)で１０分間遠心分離して金ナノロッドを沈降させ、上澄み液を除去した。沈降した金ナノロッドを０.５mlの水で再分散し、金ナノロッド水分散液０.５ml（CTAB-NRs、金原子濃度3.0mM）を得た。金ナノロッド水分散液中の金原子濃度は吸光度から求めた。CTAB-NRs水分散液のゼータ電位を測定したところ、+４０mVであった。CTAB-NRs水分散液の吸収スペクトルを図２に示す。
【００５１】
〔PNASの調製〕
Ｎ−アクリロキシスクシンイミド（N-acryloxysuccinimide;NAS）１５０３.５mgとアゾビスイソブチロニトリル（azobisisobutyronitrile;AIBN）７５mg、そしてＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（N,N-dimethylformamide;DMF）１０mlを混合し、６０℃で１時間反応させて、ポリ−Ｎ−アクリロキシスクシンイミド（PNAS）を生成させた。反応終了後、アセトン沈殿を行い、得られたＰＮＡＳを回収して真空乾燥した。得られたＰＮＡＳ（重量平均分子量30765）の収率は６０％であった。
【００５２】
〔mPEG-g-PNASの調製〕
片末端がメトキシ基を有するPEG-NH2（mPEG-NH2、重量平均分子量5000）をＰＮＡＳに導入した。PNASのスクシンイミド基のモル数：mPEG-NH2のアミノ基のモル数＝４：１になるように、ＰＮＡＳを２００mg、mPEG-NH2を１５５８mg、ＤＭＦを２０ml混合し、３日間攪拌して反応させた。
【００５３】
〔PSS-NRsの調製〕
金原子濃度３.０mMのCTAB-NRs水分散液０.５mlと、ＰＳＳ（重量平均分子量70,000）を6mM塩化ナトリウム水溶液で溶解したＰＳＳ水溶液（PSS：2mg/ml）０.５mlを混合し、金ナノロッド表面にＰＳＳを静電相互作用で吸着させた（PSS-NRs）。得られたPSS-NRs水分散液１mlを遠沈管に入れ、8000(×g)の相対遠心加速度で１０分間遠心分離してPSS-NRsを遠沈管の底に沈降させた。上澄み液を除去し、沈降したPSS-NRsは１mlの水で再分散させた。さらに再分散させた金ナノロッドを8000(×g)で１０分間遠心分離して金ナノロッドを沈降させ、上澄み液を除去した。沈降したPSS-NRsは０.５mlの水で再分散して余剰のPSSを除去し、PSS-NRs水分散液０.５ml（金原子濃度３.０mM）を得た。このPSS-NRs水分散液のゼータ電位を測定したところ、−３８mVであった。
【００５４】
〔PAH-PSS-NRsの調製〕
金原子濃度３.０mMのPSS-NRs水分散液０.５mlと、ＰＡＨ（重量平均分子量15,000）を6mM塩化ナトリウム水溶液で溶解したＰＡＨ水溶液（PSS：2mg/ml）０.５mlを混合し、PSS-NRs表面にＰＡＨを静電相互作用で吸着させた（PAH-PSS-NRs）。得られたPAH-PSS-NRs水分散液１mlを遠沈管に入れ、4000(×g)の相対遠心加速度で５分間遠心分離してPAH-PSS-NRsを遠沈管の底に沈降させた。さらに上澄み液を4000(×g)の相対遠心加速度で５分間遠心分離してPAH-PSS-NRsを遠沈管の底に沈降させた。上澄み液を除去し、沈降したPAH-PSS-NRsは０.２５mlの水で再分散し、余剰のＰＡＨを除去したPAH-PSS-NRs水分散液０.２５ml（金原子濃度３.０mM）を得た。このPAH-PSS-NRs水分散液のゼータ電位を測定したところ、+４３mVであった。
【００５５】
〔mPEG-g-PNAS／PAH／PSS／NRsの調製〕
金原子濃度３.０mMのPAH-PSS-NRs水分散液０.２５mlと、mPEG-g-PNAS水溶液（mPEG-g-PNAS：20mg/ml）０.２５mlを混合し、３時間撹拌した。その後、０.２Mの炭酸水素ナトリウム０.５mlを混合し、１２時間攪拌し、PAH-PSS-NRs表面のＰＡＨのアミノ基とmPEG-g-PNASのスクシンイミド基を反応させ、片末端がメトキシ基のＰＥＧ鎖を導入した金ナノロッド被覆体（mPEG-g-PNAS/PAH/PSS/NRs）の水分散液１.０ml（金原子濃度３.０mM）を得た。このmPEG-g-PNAS/PAH/PSS/NRs水分散液のゼータ電位を測定したところ、−１６mVであった。このmPEG-g-PNAS/PAH/PSS/NRs水分散液の吸収スペクトルを図３に示す。図３の吸収スペクトルは表面処理前の図２の吸収スペクトルと同様にシャープな吸収ピークを示しており、凝集せず安定に分散していることが確認された。
【００５６】
〔mPEG-g-PNAS／PAH／PSS／NRsの水中での安定性〕
CTAB-NRs水分散液のLSPRの最大吸収波長における吸光度を１００％として設定し、調製した上記mPEG-g-PNAS/PAH/PSS/NRs水分散液の室温における経時安定性（１日〜５６日経過）を調べた。この結果を表１に示した。表１に示すように、上記mPEG-g-PNAS/PAH/PSS/NRs水分散液は経過５６日目で７６％以上の吸光度を示しており、安定に分散していることが確認された。
【００５７】
〔実施例２〕
片末端がカルボキシル基を有するPEG-NH2（cPEG-NH2、重量平均分子量10000）をＰＮＡＳに導入する以外は実施例１と同様に処理し、片末端がカルボキシル基のＰＥＧ鎖を導入した金ナノロッド被覆体（cPEG-g-PNAS/PAH/PSS/NRs）の水分散液１.０ml（金原子濃度３.０mM）を得た。このcPEG-g-PNAS/PAH/PSS/NRs水分散液のゼータ電位を測定したところ、−２４mVであった。このcPEG-g-PNAS/PAH/PSS/NRs水分散液の吸収スペクトルを図４に示す。図４の吸収スペクトルは表面処理前の図２の吸収スペクトルと同様にシャープな吸収ピークを示しており、凝集せず安定に分散していることが確認された。
【００５８】
〔cPEG-g-PNAS／PAH／PSS／NRsの水中での安定性〕
CTAB-NRs水分散液のLSPRの最大吸収波長における吸光度を１００％として設定し、調製した上記cPEG-g-PNAS/PAH/PSS/NRs水分散液の室温における経時安定性（１日〜５６日経過）を調べた。この結果を表１に示した。表１に示すように、上記ｃPEG-g-PNAS/PAH/PSS/NRs水分散液は経過５６日目で８０％の吸光度を示しており、安定に分散していることが確認された。
【００５９】
〔比較例１〕
金原子濃度３.０mMのCTAB-NRs水分散液０.５mlと、片方の末端がメトキシ基であり、もう一方の末端がチオール基を有するポリエチレングリコール（mPEG-SH、重量平均分子量5000）を溶解したmPEG-SH水溶液（mPEG-SH：9mg/ml）０.５mlを混合し、mPEG-SH末端のチオール基で金ナノロッド表面と結合した金ナノロッド（mPEG-NRs）を得た。このmPEG-NRs水分散液１mlを遠沈管に入れ、14000(×g)の相対遠心加速度で10分間遠心分離してmPEG-NRsを遠沈管の底に沈降させた。金ナノロッドに吸着していないmPEG-SHを含む上澄み液を除去し、沈降したmPEG-NRsを１mlの水で再分散させることによって、PNAS/PAH/PSS多層膜を有しないmPEG-NRs水分散液を得た。
【００６０】
〔mPEG-NRsの水中での安定性〕
CTAB-NRs水分散液のLSPRの最大吸収波長における吸光度を１００％として設定し、調製した上記mPEG-NRs水分散液の室温における経時安定性（１日〜５６日経過）を調べた。この結果を表１に示した。表１に示すように、上記mPEG-NRs水分散液は経過５６日目で６２％の吸光度を示しており、比較的に安定に分散していることが確認されたが、本発明の金微粒子被覆体（mPEG-g-PNAS/PAH/PSS/NRs、およびｃPEG-g-PNAS/PAH/PSS/NRs）の水中での安定性よりも低い値であった。
【００６１】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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