(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のREIC/Dkk-3 DNA又は該DNAを含むベクターを有効成分として含む免疫賦活化剤：
(a)  配列番号１に表される塩基配列からなるDNA；又は
(b)  配列番号１に表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAにストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであって、アポトーシス誘導活性及び細胞のIL-7産生促進活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項２】
ベクターがアデノウイルスベクターである請求項１記載の免疫賦活化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性中皮腫治療剤及び免疫賦活化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
胸部の肺、胃腸・肝臓などの腹部臓器、心臓は、それぞれ、胸膜・腹膜・心膜などの膜に包まれており、これらの膜の表面をおおっているものを中皮という。この中皮から発生した腫瘍を中皮腫という。中皮腫には、その発生部位によって、胸膜中皮腫、腹膜中皮腫、心膜中皮腫などがある。
中皮腫には、悪性中皮種と良性中皮種があり、悪性中皮腫は限局性のものとびまん性のものがある。胸膜および腹膜中皮腫はアスベスト曝露との関連性が証明されている。近年中皮腫は増加傾向にある。
従来の悪性中皮腫治療は手術療法、化学療法、放射線療法を併用するｔｒｉｍｏｄａｌｉｔｙ治療が中心であるが、依然として５年生存率が１０％以下であり、悪性中皮腫は難治世固形癌である。
手術療法としては胸膜切除剥離術と胸膜肺全摘術があるが前者では根治性に問題があり、また後者には合併症が多い。化学療法としてはｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ＋ＣＤＤＰの組み合わせをはじめとして多種多様なｒｅｇｉｍｅが試みられているが、必ずしも劇的に効果のあるものではなく、また副作用も多い。放射線療法はあくまでも補助的役割を担うのみである。近年、サイトカイン治療としてＩＬ−２やＩＦＮ−γ全身投与などが試みられているが、副作用が強く、また期待されていたほどの腫瘍縮小効果も得られていない。つまり、どの治療法も確実な効果が期待できるものではなく、更に強力な悪性中皮腫治療戦略の創出が急務となっている。
ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３は、岡山大学でヒト正常線維芽細胞の不死化に伴って発現が低下する遺伝子として同定され、後にＸｅｎｏｐｕｓの頭部形成に関わるＤｋｋ（ｄｉｃｋｋｏｐｆ）遺伝子ファミリーの哺乳類メンバーと相同であることが明らかになったものである（特許文献１及び非特許文献１を参照）。ヒト前立腺癌由来株で行った検討ではＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３アデノウイルス（以下Ａｄ−ＲＥＩＣ）を感染させると、何らかの細胞内ストレスを生じｃ−ｊｕｎ  Ｎ末端Ｋｉｎａｓｅ（ＪＮＫ）を活性化してアポトーシスを誘導することが分かっている（非特許文献２を参照）。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ０１／０３８５２３号パンフレット
【非特許文献１】Ｔｓｕｊｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２６８，２０−４（２０００）
【非特許文献２】Ａｂａｒｚｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５，１６１７−２２（２００５）
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３を用いて悪性中皮腫を治療する方法及びＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３を含む悪性中皮腫治療剤の提供を目的とする。本発明は、さらにＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３を用いて免疫を賦活化する方法及びＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３を含む免疫賦活化剤の提供を目的とする。
本発明者は、新規な画期的な悪性中皮腫治療法について検討を行った。すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて悪性中皮腫細胞（２１１Ｈ，Ｈ２８，Ｈ２０５２）にＲＥＩＣ−Ｄｋｋ−３遺伝子を含むアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＲＥＩＣ）を感染させるとＪＮＫ依存性アポトーシスを起こし、そのＪＮＫ依存性アポトーシスが細胞増殖などに深く関わっているｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−１（Ｉｄ−１）の発現低下によるものであることが証明された。このＩｄ−１の関与は同所性悪性中皮腫モデルマウスにおいても確認された。一方でｉｎ  ｖｉｖｏにおいて腫瘍細胞への遺伝子導入が１００％ではないにもかかわらず劇的な抗腫瘍効果を呈することから、Ａｄ−ＲＥＩＣ胸腔内投与が何らかの免疫活性化作用を惹起することが考えられたため、正常細胞（線維芽細胞）を用いて解析したところ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡｄ−ＲＥＩＣが正常線維芽細胞へ感染するとその線維芽細胞からＩＬ−７（ＮＫ／Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ細胞の活性化に寄与するサイトカイン）が産生亢進することを見出した。また、そのＩＬ−７産生亢進がＪＮＫ活性化→ｐ３８活性化→ＳＴＡＴ−１活性化→ＩＲＦ−１活性化によるものであることも明らかにした。本発明者が行ったウイルスベクター胸腔内投与法は胸膜への遺伝子導入効率も非常に優れていることから、正常胸膜細胞においても同様の機序でＩＬ−７の産生が亢進しＮＫ細胞を中心とする抗腫瘍免疫が賦活化されたものと考えられる。
以上の知見より、悪性中皮腫に対するＡｄ−ＲＥＩＣ胸腔内投与法は、腫瘍細胞にアポトーシスを誘導するだけではなく、正常胸膜細胞にも抗腫瘍免疫賦活化能を誘導することにより、他の治療法にはない劇的な治療効果をもたらすことが判明した。
本発明の治療剤を用いた悪性中皮腫の治療は以下の特徴を有する。
１  ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３アデノウイルスを直接胸腔内投与する。
２  投与されたＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３が癌細胞のアポトーシスを誘導する。
３  投与されたＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３が正常胸膜細胞からのＩＬ−７産生能を高めることでＮＫ細胞を活性化し、抗腫瘍免疫を賦活化する。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］  以下のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡ又は該ＤＮＡを含むベクターを有効成分として含む中皮腫治療剤：
（ａ）配列番号１に表される塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｂ）配列番号１に表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、アポトーシス誘導活性及び細胞のＩＬ−７産生促進活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［２］  ベクターがアデノウイルスベクターである［１］の中皮腫治療剤。
［３］  中皮腫が胸膜中皮腫である［１］又は［２］の中皮腫治療剤。
［４］  胸腔内投与用である［３］の中皮腫治療剤。
［５］  腫瘍細胞にアポトーシスを誘導し、正常細胞の抗腫瘍免疫を賦活化する、［１］〜［４］のいずれかの中皮腫治療剤。
［６］  以下のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡ又は該ＤＮＡを含むベクターを有効成分として含む免疫賦活化剤：
（ａ）配列番号１に表される塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｂ）配列番号１に表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、アポトーシス誘導活性及び細胞のＩＬ−７産生促進活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［７］  ベクターがアデノウイルスベクターである［６］の免疫賦活化剤。
［８］  以下のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡ又は該ＤＮＡを含むベクターを中皮腫患者に投与することを含む、中皮腫治療法：
（ａ）配列番号１に表される塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｂ）配列番号１に表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、アポトーシス誘導活性及び細胞のＩＬ−７産生促進活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［９］  ベクターがアデノウイルスベクターである［８］の中皮腫治療法。
［１０］  中皮腫が胸膜中皮腫である［９］の中皮腫治療剤。
［１１］  ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡ又は該ＤＮＡを含むベクターを胸腔内に投与する、［１０］の中皮腫治療法。
［１２］  腫瘍細胞にアポトーシスを誘導し、かつ正常細胞の抗腫瘍免疫を賦活化する［８］の中皮腫治療法。
［１３］  以下のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡ又は該ＤＮＡを含むベクターを動物に投与することを含む、動物の抗腫瘍免疫賦活化法：
（ａ）配列番号１に表される塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｂ）配列番号１に表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、アポトーシス誘導活性及び細胞のＩＬ−７産生促進活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［１４］  ベクターがアデノウイルスベクターである［１３］の抗腫瘍免疫賦活化法。
［１５］  中皮腫治療剤の製造における、以下のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡ又は該ＤＮＡを含むベクターの使用：
（ａ）配列番号１に表される塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｂ）配列番号１に表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、アポトーシス誘導活性及び細胞のＩＬ−７産生促進活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［１６］  ベクターがアデノウイルスベクターである［１５］の使用。
［１７］  中皮腫が胸膜中皮腫である［１５］又は［１６］の使用。
［１８］  ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡ又は該ＤＮＡを含むベクターが胸腔内に投与される、［１７］の使用。
［１９］  中皮腫治療剤が、腫瘍細胞にアポトーシスを誘導し、かつ正常細胞の抗腫瘍免疫を賦活化する、［１５］〜［１８］のいずれかの使用。
［２０］  動物における免疫賦活化剤の製造における、以下のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡ又は該ＤＮＡを含むベクターの使用：
（ａ）配列番号１に表される塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｂ）配列番号１に表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、アポトーシス誘導活性及び細胞のＩＬ−７産生促進活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［２１］  ベクターがアデノウイルスベクターである［２０］の使用。
［２２］  中皮腫の治療に用いる、以下のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡ：
（ａ）配列番号１に表される塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｂ）配列番号１に表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、アポトーシス誘導活性及び細胞のＩＬ−７産生促進活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［２３］  中皮腫が胸膜中皮腫である［２２］のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡ。
［２４］  胸腔内に投与される、［２３］のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡ。
［２５］  腫瘍細胞にアポトーシスを誘導し、かつ正常細胞の抗腫瘍免疫を賦活化する、［２２］〜［２４］のいずれかのＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡ。
［２６］  中皮腫の治療に用いる、［２２］のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡを含むベクター。
［２７］  ベクターがアデノウイルスベクターである［２６］のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡを含むベクター。
［２８］  中皮腫が胸膜中皮腫である［２６］又は［２７］のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡを含むベクター。
［２９］  胸腔内に投与される、［２８］のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡを含むベクター。
［３０］  腫瘍細胞にアポトーシスを誘導し、かつ正常細胞の抗腫瘍免疫を賦活化する、［２６］〜［２９］のいずれかのＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡを含むベクター。
［３１］  動物の免疫賦活化に用いる、以下のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡ：
（ａ）配列番号１に表される塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｂ）配列番号１に表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、アポトーシス誘導活性及び細胞のＩＬ−７産生促進活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［３２］  動物の免疫賦活化に用いる、［３１］のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡを含むベクター。
［３３］  ベクターがアデノウイルスベクターである［３２］のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡを含むベクター。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００８−１９６８５７号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３による２１１Ｈ細胞のアポトーシス誘導を示す図である。
図２は、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３による２１１Ｈ細胞でのｐＪＮＫ、ｐｃ−ｊｕｎ、活性化カスペース３の発現促進を示す図である。
図３は、ＪＮＫインヒビターによる２１１Ｈ細胞でのＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３のアポトーシス誘導の抑制を示す図である。
図４は、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３により２１１Ｈ細胞でのＩｄ−１の発現の抑制を示す図である。
図５は、Ｉｄ−１の強制発現による２１１Ｈ細胞でのＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３により誘導されるアポトーシスの減少を示す図である。
図６は、Ｉｄ−１の強制発現による２１１Ｈ細胞でのＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３により促進されるｐＪＮＫ、ｐｃ−ｊｕｎ、活性化カスペース３の発現の抑制を示す図である。
図７は、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３によるＨ２８細胞及びＨ２０５２細胞のアポトーシス誘導を示す図である。
図８は、Ｉｄ−１の強制発現によるＨ２８細胞及びＨ２０５２細胞でのＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３により誘導されるアポトーシスの減少を示す図である。
図９ａは、２１１Ｈ／Ｌｕｃ細胞を移植したヌードマウスにおけるＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３の抗腫瘍効果を示す図である。
図９ｂは、２１１Ｈ／Ｌｕｃ細胞を移植したヌードマウスにおけるＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３の抗腫瘍効果を示すＩＶＩＳ画像を示す図である。
図９ｃは、２１１Ｈ／Ｌｕｃ細胞を移植したヌードマウスにＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３を投与した場合のマウスの生存率を示す図である。
図１０ａは、腫瘍内に導入したＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３の発現を示す図である。
図１０ｂは、正常胸膜におけるＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３の発現を示す図である。
図１１は、正常細胞におけるＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３の抗腫瘍免疫作用を示す図である。
図１２は、正常細胞におけるＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３のＩＬ−７産生亢進作用を示す図である（サイトカインアレイ解析）。
図１３は、正常細胞におけるＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３のＩＬ−７産生亢進作用を示す図である（ノーザンブロット解析）。
図１４は、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３のＩＬ−７産生亢進の機序を示す図である。
図１５は、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３により惹起される抗悪性中皮腫作用の分子生物学的メカニズムを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の中皮腫治療剤は、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡ又は該ＤＮＡを含むベクターを有効成分として含む。
ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡの塩基配列は、配列番号１に表される。また、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡがコードするＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質のアミノ酸配列は配列番号２に表される。
本発明の中皮腫治療剤に含まれるＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡをコードするタンパク質は、配列番号２に表されるアミノ酸配列又は配列番号２に表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、腫瘍細胞に対するアポトーシス誘導活性及び細胞のインターロイキン７（ＩＬ−７）産生促進活性を有するタンパク質である。ここで、実質的に同一のアミノ酸配列としては、当該アミノ酸配列に対して１又は複数若しくは数個（１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１個若しくは２個）のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の同一性を有しているものが挙げられる。
ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡをコードするタンパク質は、配列番号１又は配列番号２の配列情報に基づいて、化学合成により得ることができる。また、遺伝子工学的手法により組換えＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質として得ることができる。さらに、ＷＯ０１／０３８５２３号公報の記載に従って得ることも可能である。
本発明の中皮腫治療剤に含まれるＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡは、配列番号１に表される塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、配列番号１に表される塩基配列と、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の同一性を有しているＤＮＡ、又は前記ＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１又は複数若しくは数個（１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１個若しくは２個）のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡなどのうち、腫瘍細胞に対するアポトーシス誘導活性及び細胞のインターロイキン７（ＩＬ−７）産生促進活性を有するタンパクをコードするものである。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、「１ＸＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、３７℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「０．５ＸＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、４２℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「０．２ＸＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６５℃」程度の条件である。さらに、本発明の中皮腫治療剤に含まれるＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡは、配列番号２に表されるタンパク質をコードするＤＮＡである。
ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡは、配列番号１の配列情報に基づいて、ヒト細胞、ヒト組織等から得ることができる。また、ＷＯ０１／０３８５２３号公報の記載に従って得ることも可能である。
さらに、本発明はＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡを含むベクターをも包含する。該ベクターを被験体に導入することにより、被験体体内でＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質が発現し中皮腫に対する治療効果を発揮し得る。
遺伝子治療における目的の遺伝子（ＤＮＡ）の被験体への導入は公知の方法により行うことができる。遺伝子を被験体へ導入する方法として、ウイルスベクターを用いる方法及び非ウイルスベクターを用いる方法があり、種々の方法が公知である（別冊実験医学、遺伝子治療の基礎技術、羊土社、１９９６；別冊実験医学、遺伝子導入＆発現解析実験法、羊土社、１９９７；日本遺伝子治療学会編、遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス、１９９９）。
遺伝子導入のためのウイルスベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス等のウイルスベクターを用いた方法が代表的なものである。無毒化したレトロウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスに目的とする遺伝子を導入し、細胞に組換えウイルスを感染させることによって、細胞内に遺伝子を導入することが可能である。
本発明に係る遺伝子をウイルスを用いた遺伝子治療に使用するとき、アデノウイルスベクターが好ましく用いられる。アデノウイルスベクターの特徴として、（１）多くの種類の細胞に遺伝子導入ができる、（２）増殖停止期の細胞に対しても効率よく遺伝子導入ができる、（３）遠心により濃縮が可能であり、高タイター（１０〜１１ＰＦＵ／ｍｌ以上）のウイルスが得られる、（４）ｉｎ  ｖｉｖｏの組織細胞への直接の遺伝子導入に適している、といった点が挙げられる。遺伝子治療用のアデノウイルスとしては、Ｅ１／Ｅ３領域を欠失させた第１世代のアデノウイルスベクター（Ｍｉｙａｋｅ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９３，１３２０，１９９６）から、Ｅ１／Ｅ３領域に加え、Ｅ２若しくはＥ４領域を欠失させた第２世代のアデノウイルスベクター（Ｌｉｅｂｅｒ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，８９４４，１９９６；Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ，Ｈ．＆Ｋａｙ，Ｍ．Ａ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１０，２０１３，１９９９）、アデノウイルスゲノムをほぼ完全に欠失させた（ＧＵＴＬＥＳＳ）第３世代のアデノウイルスベクター（Ｓｔｅｉｎｗａｅｒｄｅｒ，Ｄ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３，９３０３，１９９９）が開発されているが、本発明に係る遺伝子を導入するには、特に限定されず、いずれのアデノウイルスベクターでも使用可能である。さらに、ＡＡＶの染色体に組み込み能を付与したアデノ−ＡＡＶハイブリッドベクター（Ｒｅｃｃｈｉａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９６，２６１５，１９９９）や、トランスポゾンの遺伝子を用いることにより染色体に組み込む能力を有したアデノウイルスベクターなどを利用すれば、長期的な遺伝子発現にも応用が可能である。また、アデノウイルスファイバーのＨ１ループに組織特異的な移行性を示すペプチド配列を挿入することにより、アデノウイルスベクターに組織特異性を付与することも可能である（Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ，Ｈ．＆Ｈａｙａｋａｗａ，Ｔ．，Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ，７，１５４４，２０００）。
本発明において、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡを含むアデノウイルスベクターをＡｄ−ＲＥＩＣと呼ぶ。
また、上記ウイルスを用いることなく、プラスミドベクター等の遺伝子発現ベクターが組み込まれた組換え発現ベクターを用いて、目的遺伝子を細胞や組織に導入することができる。例えば、リポフェクション法、リン酸−カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管を用いたＤＮＡの直接注入法などにより細胞内へ遺伝子を導入することができる。また、内包型リポソーム（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）による遺伝子導入法、静電気型リポソーム（ｅｌｅｃｔｏｒｏｓｔａｔｉｃ  ｔｙｐｅ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）による遺伝子導入法、ＨＶＪ−リポソーム法、改良型ＨＶＪ−リポソーム法（ＨＶＪ−ＡＶＥ  リポソーム法）、ＨＶＪ−Ｅ（エンベロープ）ベクターを用いた方法、レセプター介在性遺伝子導入法、パーティクル銃で担体（金属粒子）とともにＤＮＡ分子を細胞に移入する方法、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法、種々のポリマーによる導入法等によっても、組換え発現ベクターを細胞内に取り込ませることが可能である。この場合に用いる発現ベクターとしては、生体内で目的遺伝子を発現させることのできるベクターであれば如何なる発現ベクターも用いることができるが、例えばｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ  １０８，１９３−２００（１９９１））や、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３、１、ｐＺｅｏＳＶ（インビトロゲン社、ストラタジーン社）、ｐＶＡＸ１などの発現ベクターが挙げられる。
ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡを含むベクターは、適宜遺伝子を転写するためのプロモーターやエンハンサー、ポリＡシグナル、遺伝子が導入された細胞の標識及び／又は選別のためのマーカー遺伝子等を含んでいてもよい。この際のプロモーターとしては、公知のプロモーターを用いることができる。
本発明のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡを含むベクターを被験体へ導入するには、遺伝子治療剤を直接体内に導入するｉｎ  ｖｉｖｏ法、及び、ヒトからある種の細胞を取り出して体外で遺伝子治療剤を該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すｅｘ  ｖｉｖｏ法等を用いればよい（日経サイエンス、１９９４年４月号、２０−４５頁；月刊薬事、３６（１），２３−４８（１９９４）；実験医学増刊、１２（１５）、（１９９４）；日本遺伝子治療学会編、遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス、１９９９）。
本発明において、中皮腫は悪性中皮腫をいい、胸膜中皮腫、腹膜中皮腫、心膜中皮腫を含む。この中でも悪性の胸膜中皮腫が好ましい。
本発明の中皮腫治療剤は、腫瘍細胞にアポトーシスを誘導するとともに、正常細胞のＩＬ−７産生能を高め、ＮＫ細胞を活性化し、その結果抗腫瘍免疫を賦活化する。この結果、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３による腫瘍細胞へのアポトーシス誘導と正常細胞による抗腫瘍免疫という２つの作用により悪性中皮腫に対する相乗的治療効果を発揮する。本発明の中皮腫治療剤による治療は腫瘍細胞及び正常細胞を標的とする悪性中皮腫遺伝子治療法と言える。
本発明は、上記のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡ又は該ＤＮＡを含むベクターを含む細胞のＩＬ−７産生促進剤を含む。さらに、本発明は、上記のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡ又は該ＤＮＡを含むベクターを含む抗腫瘍免疫賦活化剤を含む。
本発明の中皮腫治療剤、ＩＬ−７産生促進剤及び抗腫瘍免疫賦活化剤は、種々の形態で投与することができ、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、あるいは注射剤、点滴剤、座薬、スプレー剤、点眼剤、経鼻投与剤、貼付剤などによる非経口投与を挙げることができる。
本発明の中皮腫治療剤、ＩＬ−７産生促進剤及び抗腫瘍免疫賦活化剤は、局所投与することも可能であり、例えば胸膜中皮腫に対しては、胸腔内にカテーテルや注射器等により投与することによりその効果を発揮し得る。
好ましくは、胸腔内に１回又は複数回、胸腔内変全体に本剤が行き渡るように直接注入を行う。
本発明の中皮腫治療剤、ＩＬ−７産生促進剤及び抗腫瘍免疫賦活化剤は、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用してもよい。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。
その投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、数日又は数週間又は数ヶ月おきに１回あたり、ＤＮＡとして０．００１ｍｇ〜１００ｍｇを投与すればよい。
また、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡを含むベクターを用いる場合、例えば１０７〜１０９ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔのベクターを投与すればよい。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１  ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３の抗腫瘍効果
本実施例においては、Ｈｅｌａ細胞並びに悪性中皮腫細胞である２１１Ｈ細胞、Ｈ２８細胞及びＨ２０５２細胞を用いた。これらの細胞は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より入手した。細胞は、１０％透析ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ  グルタミン、１００ユニット／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社）を用い３７℃、５％ＣＯ２条件下で維持した。
ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡを含むアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＲＥＩＣ）は、以下の方法で作製した。すなわち、全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ｃＤＮＡをコスミドベクターｐＡｘＣＡｗｔに導入し、ＣＯＳ−ＴＰＣ法（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）によりアデノウイルスベクターにトランスファーした（Ａｂａｒｚｕａ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００５；６５：９６１７−９６２２）。ＬａｃＺ遺伝子を含むアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＬａｃＺ）を対照として用いた。
ルシフェラーゼ遺伝子を安定に発現する２１１Ｈトランスフェクタント細胞（２１１Ｈ／Ｌｕｃ）をＫａｓｈｉｗａｋｕｒａ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １００３；１０７：１０７８−８１の記載に従って、２１１Ｈ細胞にｐＩＲＥＳ−ｐｉｒｏ３−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｐｌａｓｍｉｄを導入し作製した。
（１）  ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３による中皮腫細胞のＪＮＫ依存性のアポトーシス誘導
Ｔｕｎｎｅｌ［細胞死（アポトーシス）］アッセイは以下の方法で行った。すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞死誘導を調べるために、細胞を平底６ウェルプレートに播き２４時間培養した。細胞をＡｄ−ＬａｃＺ及びＡｄ−ＲＥＩＣで種々のＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）で無血清培地中にて２時間処理した後、新鮮完全培地に交換した。４８時間のインキュベーション後、ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いてＴＵＮＥＬ（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＵＴＰ  ｅｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ）アッセイを行いアポトーシスを評価した。具体的にはＧＦＰ陽性の核を持つ細胞をアポトーシス細胞とし、１００個の細胞（ＤＡＰＩ陽性核）におけるアポトーシス陽性細胞の割合を解析した。細胞死が認められた細胞は、顕微鏡下で３〜５の異なる視野において計数した。
ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞死が認められた細胞を検出するために、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＴＵＮＥＬアッセイを行った。すなわち、腫瘍組織を切断し、ＯＣＴ化合物中に入れ、液体窒素中で急速凍結した。凍結切片（１０μｍ）サンプルをメタノールを用いて３０分室温で固定し洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳを浸透させ、ＴＵＮＥＬ反応混合液で染色した。
ウエスタンブロット分析は、抗ヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３抗体等図２に示すタンパク質に対する抗体を用いて行った。
２１１Ｈ細胞（ヒト悪性中皮腫細胞）にＡｄ−ＬａｃＺ又はＡｄ−ＲＥＩＣ（２０ＭＯＩ）を感染させ４８時間後にアポトーシスを評価した。図１に結果を示す。ＧＦＰ陽性の核を持つものがアポトーシス細胞である。図１に示すように、Ａｄ−ＲＥＩＣ感染細胞にて明らかにアポトーシス細胞が多かった。
図２に用いた細胞のウエスタンブロット分析の結果を示す。図２に示すように、Ａｄ−ＲＥＩＣ感染細胞で明らかにｐＪＮＫ、ｐｃ−ｊｕｎ、ａｃｔｉｖｅ  ｃａｓｐａｓｅ−３の発現が上昇していた。すなわち、Ａｄ−ＲＥＩＣ感染でＪＮＫ活性を介するアポトーシスが起こっていることが証明された。
さらに、アポトーシスアッセイにおいて、ＪＮＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを添加して行った。結果を図３に示す。ＪＮＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒでＡｄ−ＲＥＩＣ誘導性アポトーシスが有意に抑制された。従って、２１１Ｈ細胞におけるＡｄ−ＲＥＩＣ誘導性アポトーシスはＪＮＫ依存性であることが証明された。
（２）  ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３によるＩｄ−１の発現低下
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡｄ−ＲＥＩＣ感染による種々のタンパク質の発現変化を調べるために以下の感染実験を行った。まず細胞を平底６ウェルプレートに播き２４時間培養し、細胞をＡｄ−ＬａｃＺ及びＡｄ−ＲＥＩＣで２０ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）で無血清培地中にて２時間処理した後、新鮮完全培地に交換した。４８時間のインキュベーション後、タンパク質を回収しウエスタンブロットを行った。
図４にｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−１（Ｉｄ−１）のウエスタンブロット分析の結果を示す。図４に示すようにＡｄ−ＲＥＩＣ感染４８時間後において２１１Ｈ細胞で明らかにＩｄ−１の発現が低下していた。
次にＩｄ−１の再発現がＡｄ−ＲＥＩＣ誘導性アポトーシスに及ぼす影響を検討するために以下の感染実験を行いアポトーシスを解析した。平底６ウエルプレートに播き２４時間培養し、細胞をＡｄ−ＬａｃＺ、Ａｄ−ＲＥＩＣ、Ａｄ−Ｉｄ−１（Ｉｄ−１  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）で以下のＭＯＩの条件で無血清培地中にて２時間処理した。
ｗｅｌｌ１−Ａｄ−ＲＥＩＣ  ２０ＭＯＩ，ｗｅｌｌ２−Ａｄ−ＲＥＩＣ  ２０ＭＯＩ＋Ａｄ−ＬａｃＺ  １０ＭＯＩ，ｗｅｌｌ３−Ａｄ−ＲＥＩＣ  ２０ＭＯＩ＋Ａｄ−Ｉｄ−１  １０ＭＯＩ。
新鮮完全培地に交換した後、４８時間インキュベーションを行い、ＴＵＮＥＬアッセイにてアポトーシスを評価した。図５に示すように、感染４８時間後においてＩｄ−１の強制発現で明らかにＡｄ−ＲＥＩＣ誘導性アポトーシスが減少していた。このことはＡｄ−ＲＥＩＣ誘導性アポトーシスがＩｄ−１の減少に依存していることを証明している。
図６に、ｐａｒｅｎｔａｌ（何も処理していない２１１Ｈ細胞）及び図５で用いた細胞におけるウエスタンブロット分析の結果を示す。図６に示すように、Ｉｄ−１強制発現によりＡｄ−ＲＥＩＣ誘導性のｐＪＮＫ、ｐｃ−ｊｕｎ、ａｃｔｉｖｅ  ｃａｓｐａｓｅ−３の発現上昇が抑制された。すなわち、Ａｄ−ＲＥＩＣ誘導性アポトーシスの根本的メカニズムであるＪＮＫ活性化がＩｄ−１強制発現により阻害されたことが証明された。つまり「Ａｄ−ＲＥＩＣ感染によるＩｄ−１の発現低下はＡｄ−ＲＥＩＣ誘導性アポトーシスを促進している」ことが考えられた。
（３）Ｈ２８細胞及びＨ２０５２細胞を用いた検討
悪性中皮腫細胞（Ｈ２８及びＨ２０５２）を用いて上記（１）及び（２）と同様にＡｄ−ＲＥＩＣ誘導性アポトーシスを検討した。図７に示すように、Ｈ２８及びＨ２０５２においても２１１Ｈと同様にＡｄ−ＲＥＩＣの感染によりＩｄ−１低下及びＪＮＫのリン酸化（活性化）が認められた。さらに、図８に示すように、Ｉｄ−１強制発現によりＡｄ−ＲＥＩＣ誘導性アポトーシスが抑制された。つまりＡｄ−ＲＥＩＣ感染→Ｉｄ−１低下→ＪＮＫのリン酸化（活性化）→アポトーシスという機序は他の悪性中皮腫細胞においても認められた。
（４）悪性中皮腫モデルマウスを用いた検討（その１）
１００μＬ  ＰＢＳ中の２．０×１０６の２１１Ｈ／Ｌｕｃを８週齢のＢＡＬＢ／Ｃヌードマウス（ＳＬＣより入手）の右胸壁投与し、同所性悪性中皮腫モデルマウスを作製した。投与１週間後、４．０×１０８  ｐｌａｑｕｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔの１００μＬ  ＰＢＳ中のＡｄ−ＲＥＩＣ及びＡｄ−ｌａｃＺを細胞を投与した部位と同じ部位から胸腔内へ投与した。陰性コントロールとして同量のＰＢＳを投与した。ＩＶＩＳ（ｉｎ  ｖｉｖｏルシフェラーゼイメージングシステム）システムにより５日ごとに投与後２０日間にわたって発光を測定し、さらにマウスの死をモニターした。腫瘍のサイズ及び下部は別の処理群を用いて１０日目に評価した。
図９ａに、ＩＶＩＳによる２１１Ｈ／Ｌｕｃ細胞数（＝腫瘍容量）の定量化（単位：Ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃ）を示す。治療前（Ｄａｙ  ０）に比較しＤａｙ  １０においてＡｄ−ＲＥＩＣ治療群で有意に腫瘍容量が低下した。図９ｂは、図９ａに対応するＩＶＩＳ画像を示す。
図９ｃは、生存率曲線を示す。図９ｃに示すように、対照群に比較しＡｄ−ＲＥＩＣ治療群で明らかに生存率が改善していた。以上の結果より、Ａｄ−ＲＥＩＣ胸腔内投与は悪性中皮腫に対して劇的な治療効果があると考えられた。
（５）悪性中皮腫モデルマウスを用いた検討（その２）
上記（４）にて使用したＡｄ−ＬａｃＺ感染マウスを感染７日後に解剖し、腫瘍と正常組織とに分別した後ＬａｃＺ染色にて腫瘍内及び正常胸膜における導入遺伝子ＬａｃＺの発現を解析した。ＬａｃＺ染色の方法は以下の通り。固定液ＰＢＳ  ｐＨ８．０（１％ホルムアルデヒド  ３７％２．７ｍｌ、０．２％グルタールアルデヒド  ２５％０．８ｍｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２１Ｍ  ０．２ｍｌ、５ｍＭ  ＥＧＴＡ  ２００ｍＭ  ２．５ｍｌ）で１８時間３７℃にて固定後、ｌａｃＺ染色液（ＰＢＳ５０ｍｌ中  ５ｍＭ  フェリシアン化カリウム  １００ｍＭ  ２．５ｍｌ、５ｍＭ  フェロシアン化カリウム  １００ｍＭ  ２．５ｍｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２１Ｍ  ０．１ｍｌ、０．０１％  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ  １０％  ０．０５ｍｌ、０．０２％  ＮＰ４０  １０％  ０．１ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ  Ｘ−ｇａｌ  ５０ｍｇ／ｍｌ  １ｍｌ）で室温遮光にて１２時間インキュベーションしＬａｃＺの発現を解析した。
図１０ａに、Ａｄ−ＬａｃＺ群におけるＬａｃＺ染色による腫瘍内導入遺伝子発現解析の結果を示す。図１０ａに示すように、腫瘍内の約５０％の細胞に遺伝子は導入されているが、残りの細胞に遺伝子導入は見られなかった。それにもかかわらず劇的な抗腫瘍効果が見られることから、Ａｄ−ＲＥＩＣ胸腔内投与には何らかの抗腫瘍免疫作用があると考えられた。
図１０ｂに、Ａｄ−ＬａｃＺ群におけるＬａｃＺ染色による正常胸膜での導入遺伝子発現解析の結果を示す。正常臓側胸膜にしっかりとした遺伝子発現が認められた（黒矢印）。この所見より正常胸膜におけるＲＥＩＣの強発現が何らかの抗腫瘍免疫作用を惹起していることが強く示唆された。
実施例２  ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３によるＩＬ−７の発現促進
正常ヒト繊維芽細胞を用いてＡｄ−ＲＥＩＣの抗腫瘍免疫解析を行った。正常ヒト線維芽細胞としてはＯＵＭＳ２４を用いた。これらは本発明者等が確立した（Ｂａｉ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９３；５３：４５１−４５６）。
上記細胞をＡｄ−ＲＥＩＣを２０ＭＯＩで４８時間処理し、Ａｄ−ＲＥＩＣを感染させた。図１１にＡｄ−ＲＥＩＣを正常線維芽細胞に感染させたときの免疫染色の結果を示す。強制発現されたＲＥＩＣが細胞内（小胞体）にあることが確認された。
Ａｄ−ＲＥＩＣを正常線維芽細胞に感染させたときの培養上清中のサイトカインをサイトカインアレイを用いて測定した。サイトカインアレイは、ＲａｙＢｉｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｒｒａｙ  ＶＩ  ＆  ６．１（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）を用いた。図１２に結果を示す。図１２に示すように、ＩＬ−７の濃度上昇が確認された（図中の四角内）。
さらに、Ａｄ−ＲＥＩＣ感染正常繊維芽細胞を用いたノーザンブロット解析を行った。トータルＲＮＡをグアニジン酸チオシアネート／フェノール・クロロホルム抽出法により単離した。２０μｇのＲＮＡを１．０％アガロースゲル中で分画し、ナイロン膜（Ｎｙｔｒａｎ  ｐｌｕｓ  ｎｙｌｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｓ）に転写した。ヒトＩＬ−７遺伝子断片をプローブとして用いた。
図１３にＡｄ−ＲＥＩＣ感染正常線維芽細胞でのノーザンブロット解析の結果を示す。図１３中、ｅｘＲＥＩＣは添加リコンビナントＲＥＩＣタンパク質を示す。図１３に示すように、Ａｄ−ＲＥＩＣ感染正常線維芽細胞で明らかにＩＬ−７ｍＲＮＡの発現が亢進していることが確認された。
さらに、図１４に示すタンパク質に対する抗体を用いてウエスタンブロット解析を行い、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３によるＩＬ−７発現亢進の機序を解析した。ＩＬ−７はＩＲＦ−１及びＩＲＦ−２により転写が活性化するが、Ａｄ−ＲＥＩＣ感染により線維芽細胞においてＩＲＦ−１発現が亢進していることが確認された（ＩＲＦ−２は常時発現していた）。そのＩＲＦ−１発現亢進の機序としてＪＮＫ活性化→ｐ３８活性化→ＳＴＡＴ−１活性化が証明された。
本実施例の結果より、Ａｄ−ＲＥＩＣを正常細胞に感染させるとＩＬ−７産生が亢進することが確認された。ＩＬ−７はＮＫ（Ｎａｔｕａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ）細胞を活性化し抗腫瘍免疫を賦活化することが知られており、正常胸膜細胞においてもＡｄ−ＲＥＩＣの感染によりＩＬ−７の産生が亢進しＮＫ細胞を介する抗腫瘍免疫を賦活化していると考えられる。
図１５にＡｄ−ＲＥＩＣ胸腔投与により惹起される抗悪性中皮腫作用の分子生物学的メカニズムを示す。図１５に示すようにＩｄ−１発現抑制とｐ３８活性化の２つの経路があると考えられる。前者は腫瘍細胞にアポトーシスを引き起こし、後者は正常胸膜細胞からのＩＬ−７産生亢進を引き起こし、その結果ＮＫ細胞活性化を誘導する。
【産業上の利用可能性】
【０００６】
実施例に示すように、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３  ＤＮＡを含むアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＲＥＩＣ）を同所性悪性中皮腫モデルマウスにおいて（単回）胸腔内投与することにより有意に腫瘍容量が縮小しまた生存率の改善がみられる。同所性悪性中皮腫モデルマウスにおいて、Ａｄ−ＲＥＩＣ（単回）胸腔内投与により有意に腫瘍容量が縮小し、また生存率の改善がみられた。また、明らかな副作用は認められなかった。このように、Ａｄ−ＲＥＩＣ胸腔内投与法は悪性中皮腫に対する極めて有効な治療法である。また、実施例に示すようにＪＮＫ依存性アポトーシスが細胞増殖などに深く関わっているｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−１（Ｉｄ−１）の発現低下によるものであることが示された。Ｉｄ−１は多くの癌で強発現し細胞増殖や薬剤抵抗性に深く関与していることから、Ａｄ−ＲＥＩＣは幅広い癌種への抗腫瘍効果を発揮し得る。Ａｄ−ＲＥＩＣを胸腔内に投与することにより、正常胸膜におけるＩＬ−７の産生亢進につながりＮＫ細胞を中心とする抗腫瘍免疫を活性化し、Ａｄ−ＲＥＩＣ自体の腫瘍細胞に対するアポトーシス誘導効果と相まって非常に優れた治療効果を発揮する。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図３】
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【図５】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図１５】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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