(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生分解性樹脂を主成分としシロキサンを含有する繊維状物質で構成された第１不織布
層と、生分解性樹脂を主成分とする繊維状物質で構成された第２不織布層との２層構造を有する骨再生誘導膜において、
前記第１、第２不織布層は、エレクトロスピニング法によって形成されたものであり、
前記第２不織布層の前記繊維状物質の平均直径は、前記第１不織布層の前記繊維状物質の平均直径よりも小さく、前記第２不織布層を構成する前記繊維状物質の平均直径は、０よりも大きく５μｍ以下であることを特徴とする骨再生誘導膜。
【請求項２】
前記第１不織布層を構成する前記繊維状物質の平均直径は、１０μｍ以上２０μｍ以下
であることを特徴とする請求項１に記載の骨再生誘導膜。
【請求項３】
前記第１不織布層を構成する前記繊維状物質は、前記シロキサンが炭酸カルシウム
微粒子に分散された状態で前記繊維状物質に組み込まれたものであることを特徴とする
請求項１または２に記載の骨再生誘導膜。
【請求項４】
前記生分解性樹脂がポリ乳酸またはその共重合体である請求項１ないし３のいずれ
か１つに記載の骨再生誘導膜。
【請求項５】
生分解性樹脂を主成分としシロキサンを含有する繊維状物質で構成された第１不織
布層と、生分解性樹脂を主成分とする繊維状物質で構成された第２不織布層との２層構
造を有する骨再生誘導膜の製造方法において、
前記第１、第２不織布層をエレクトロスピニング法によって形成するとともに、
前記第２不織布層を形成する際では、前記繊維状物質の平均直径を前記第１不織布
層の前記繊維状物質の平均直径よりも小さく、前記繊維状物質の平均直径を、０より大
きく５μｍ以下として、前記第２不織布層を形成することを特徴とする骨再生誘導膜の製造方法。
【請求項６】
前記第１不織布層を構成する前記繊維状物質の平均直径を、１０μｍ以上２０μｍ以下
とすることを特徴とする請求項５に記載の骨再生誘導膜の製造方法。
【請求項７】
前記第１不織布層を構成する前記繊維状物質として、前記シロキサンが炭酸カルシウム微粒子に分散された状態で前記繊維状物質に組み込まれたものを用いて、前記第１不織布層を形成することを特徴とする請求項５または６に記載の骨再生誘導膜の製造方法。
【請求項８】
前記生分解性樹脂としてポリ乳酸またはその共重合体を用いることを特徴とする請求項５ないし７のいずれか１つに記載の骨再生誘導膜の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、整形外科手術や口腔や顎顔面手術の分野において広く利用される骨欠損修復方法のひとつである骨組織誘導再生（Guided Bone Regeneration；GBR）法に用いられる骨再生誘導（GBR）膜およびその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
GBR膜は骨形成に寄与しない細胞や組織の骨欠損部への侵入を防ぎ、骨の自己再生能力を活かし、骨を再建させるために欠損部を覆う遮蔽膜である。この膜を用いるGBR法は生体が本来もっている治癒力を利用して骨欠損を治癒するもので、手術法も複雑でなく整形外科手術や口腔外科では多くの良好な結果が得られている。
【０００３】
このようなGBR膜の１つとして、シロキサンを含有する炭酸カルシウム微粒子と生分解性樹脂（例えばポリ乳酸）とを主成分とする第１不織布層と、生分解性樹脂（例えばポリ乳酸）を主成分とする第２不織布層の２層構造を有するGBR膜が特許文献１に開示されている。このGBR膜では、シロキサンが骨形成を促進させる因子として機能することで、第１不織布層によって骨再生を促し、第２不織布層によって骨形成に寄与しない細胞や軟組織の骨欠損部への侵入を防ぐことを図っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−６１１０９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、GBR膜の材料特性としては、患部に即した形状に変形し、その形状を維持できるほどの柔軟性（可塑性）が要求される。これは、GBR膜の柔軟性が低いと、GBR膜で骨欠損部を覆った際、GBR膜と骨欠損部の周辺部位との間に隙間が生じ、この隙間から骨欠損部に軟組織が進入してしまうからである。隙間から軟組織が進入すると、骨芽細胞よりも軟組織の方が細胞の増殖が速いため、骨再生が阻害されてしまう。
【０００６】
したがって、上述の２層構造のGBR膜においては、骨再生に寄与しない細胞や軟組織の進入を確実に防ぐために、第２不織布層が高い柔軟性を有することが重要である。
【０００７】
なお、このことは、第１不織布層を、シロキサンが分散された炭酸カルシウム微粒子と生分解性樹脂とを主成分とする繊維状物質で構成した場合に限らず、第１不織布層を、炭酸カルシウム微粒子を含まず、シロキサンを含有する生分解性樹脂を主成分とする繊維状物質で構成した場合においても、同様に言えることである。
【０００８】
本発明は上記点に鑑みて、上述の２層構造を有するGBR膜において、第２不織布層の柔軟性を向上させることで、GBR膜の骨再生能力を向上させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、請求項１に記載の発明では、生分解性樹脂を主成分としシロキサンを含有する繊維状物質で構成された第１不織布層と、生分解性樹脂を主成分とする繊維状物質で構成された第２不織布層との２層構造を有する骨再生誘導膜において、
第１、第２不織布層は、エレクトロスピニング法によって形成されたものであり、
第２不織布層の繊維状物質の平均直径は、第１不織布層の繊維状物質の平均直径よりも小さいことを特徴とする。
【００１０】
まず、請求項１に記載の発明の骨再生誘導膜は、上述の特許文献１と同様に、シロキサンを有する第１不織布層によって骨再生を促し、第２不織布層によって骨形成に寄与しない細胞や軟組織の骨欠損部への侵入を防ぐことを図ったものである。
【００１１】
そして、本発明では、第２不織布層の繊維状物質の平均直径を、第１不織布層の繊維状物質の平均直径よりも小さくしているので、第２不織布層の繊維状物質の平均直径を、第１不織布層の繊維状物質の平均直径と同一とする場合と比較して、第２不織布層の柔軟性を向上させることができる。これは、生分解性樹脂を主成分とする繊維状物質は、直径が小さいほど、しなやかさが増すからである。
【００１２】
よって、本発明によれば、第２不織布層の柔軟性を向上できるので、本発明のGBR膜で骨欠損部を覆った際に、GBR膜と骨欠損部の周辺部位との間に隙間が生じることを確実に防止でき、GBR膜の骨再生能力を向上できる。
【００１３】
ここで、請求項１に記載の発明のように、エレクトロスピニング法によって第１、第２不織布層を形成する場合、繊維状物質の直径を大きくすることで、繊維間の空隙を大きくでき、繊維状物質の直径を小さくすることで、繊維間の空隙を小さくできる。
【００１４】
したがって、第１不織布層においては、繊維状物質の直径を大きくすることで、繊維間の空隙を大きくでき、第１不織布層の内部へ細胞を進入させることができる。これにより、第１不織布層の内部での骨再生に寄与する細胞の増殖が可能となる。一方、第２不織布層においては、繊維状物質の直径を小さくすることで、繊維間の空隙を小さくでき、骨再生に寄与しない細胞や軟組織の進入を阻止できる。
【００１５】
具体的には、請求項１に記載の発明のように、第２不織布層を構成する繊維状物質の平均直径が０よりも大きく５μｍ以下のものとすることで、第２不織布層によって骨再生に寄与しない細胞や軟組織の進入を阻止できる。また、請求項２に記載の発明のように、第１不織布層を構成する繊維状物質の平均直径が１０μｍ以上２０μｍ以下のものとすることで、第１不織布層の内部へ細胞を進入させることができる。
【００１６】
また、請求項１〜２に記載の発明に関し、請求項３に記載の発明のように、第１不織布層を構成する繊維状物質が、シロキサンが炭酸カルシウム微粒子に分散された状態で繊維状物質に組み込まれたものとすることができる。また、請求項４に記載の発明のように、生分解性樹脂がポリ乳酸またはその共重合体であるものとすることができる。   
【００１７】
ここで、請求項３に記載の発明のように、第１不織布層を構成する繊維状物質が、シロキサンが炭酸カルシウム微粒子に分散された状態で繊維状物質に組み込まれたものである場合、剛性が高い炭酸カルシウム微粒子の存在によって、この炭酸カルシウム微粒子を含まない場合と比較して、第１不織布層全体の柔軟性が低下してしまう。このため、隙間を生じることなく患部を覆うという観点では、第２不織布層の柔軟性が特に重要となるので、請求項１に記載の発明は、請求項３に記載の発明のように、第１不織布層を構成する繊維状物質が、シロキサンが炭酸カルシウム微粒子に分散された状態で繊維状物質に組み込まれたものである場合に適用することが特に有効である。
【００１８】
請求項５に記載の発明では、生分解性樹脂を主成分としシロキサンを含有する繊維状物質で構成された第１不織布層と、生分解性樹脂を主成分とする繊維状物質で構成された第２不織布層との２層構造を有する骨再生誘導膜の製造方法において、
第１、第２不織布層をエレクトロスピニング法によって形成するとともに、第２不織布層を形成する際では、繊維状物質の平均直径を第１不織布層の繊維状物質の平均直径よりも小さく、前記繊維状物質の平均直径を、０より大きく５μｍ以下として、前記第２不織布層を形成することを特徴とする。この請求項５に記載の発明によれば、請求項１に記載の発明と同様の効果を奏する。
【００１９】
請求項５に記載の発明に関し、具体的には、請求項６に記載の発明のように、第１不織布層を構成する繊維状物質の平均直径を、１０μｍ以上２０μｍ以下とすることが好ましい。また、請求項７に記載の発明のように、第１不織布層を構成する繊維状物質として、シロキサンが炭酸カルシウム微粒子に分散された状態で繊維状物質に組み込まれたものを用いて、第１不織布層を形成することができる。また、請求項８に記載の発明のように、生分解性樹脂としてポリ乳酸またはその共重合体を用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例１で作製した第１不織布層としてのSi- PLA層を構成する繊維のSEM写真である。
【図２】実施例１で作製した第２不織布層としてのPLA層（５μｍφ）を構成する繊維のSEM写真である。
【図３】実施例１で作製した第２不織布層としてのPLA層（１〜２μｍφ）を構成する繊維のSEM写真である。
【図４】繊維状物質の直径が異なる３種類の不織布層の気孔径を測定した結果を示す図である。
【図５】繊維状物質の直径が異なる３種類の不織布層への細胞進入性の調査結果を示す図である。
【図６】実施例２で作製した第１不織布層としてのSi-CaCO3/PLA層を構成する繊維のSEM写真である。
【図７】実施例２で作製した第２不織布層としてのPLA層を構成する繊維のSEM写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明に係るGBR膜は、生分解性樹脂を主成分としシロキサンを含有する繊維状物質で構成された第１不織布層と、生分解性樹脂を主成分とする繊維状物質で構成された第２不織布層との２層構造を有するものである。このGBR膜は、シロキサンを有する第１不織布層によって骨再生を促し、第２不織布層によって骨形成に寄与しない細胞や軟組織の骨欠損部への侵入を防ぐことを図ったものである。
【００２２】
第１、第２不織布層は、エレクトロスピニング法によって形成され、例えば、紡糸溶液にプラス高電圧を印加し、マイナスに帯電したコレクターに紡糸溶液がスプレーされる過程で、紡糸溶液中の物質がファイバー化して堆積することで形成される。
【００２３】
紡糸溶液としては、第１不織布層の形成では、生分解性樹脂を主成分としシロキサンを含有する物質を溶剤に溶解させたものを用い、第２不織布層の形成では、生分解性樹脂を主成分とする物質を溶剤に溶解させたものを用いる。
【００２４】
生分解性樹脂としては、好ましくはポリ乳酸（PLA）、あるいはポリ乳酸とポリグリコール酸（PGA）との共重合体が挙げられ、その他に使用可能な生分解性樹脂としては、ポリエチレングリコール（PEG)、ポリカプロラクトン（PCL)や、PLA、PGA、PEG及びPCLの共重合体のような合成高分子の他、フィブリン、コラーゲン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、キトサンのような天然高分子が挙げられる。
【００２５】
第１不織布層形成用の紡糸溶液として、最も代表的には、PLAをクロロホルム（CHCl3）もしくは、ジクロロメタンに溶解させ、これにアミノプロピルトリエトキシシラン（APTES）の水溶液を混合した溶液を用いる。このときのPLA：APTESの重量比は１：0.01〜１：0.5が可能であるが、多量にAPTESを加えても水溶液に浸漬すると初期にほとんどが溶出してしまうため効果が薄く、好ましくはPLA：APTES＝１：0.01〜１：0.05（重量比）である。PLA（分子量：20〜30万kDa程度）の濃度は4〜12wt%が紡糸しやすい。良好な紡糸状態を維持するためにジメチルホルムアミドまたは、メタノールをクロロホルムやジクロロメタンに対して50wt%程度まで適宜加えてもよい。このような紡糸溶液を用いることで、シロキサンを含有する生分解性樹脂で構成された第１不織布層を形成できる。
【００２６】
また、第１不織布層形成用の紡糸溶液としては、シロキサンが分散された炭酸カルシウム微粒子（Si-CaCO3）を例えば特開２００８−１００８７８号公報に記載される方法を用いて調製し、これを最大60重量％までPLAと混合したものを、生分解性樹脂を主成分としシロキサンを含有する物質として溶剤に溶解したものを用いることもできる。また、他の例として、予め所定の割合のPLAとSi-CaCO3微粒子を加熱ニーダーで混練して調製した複合体を溶媒に溶かして紡糸溶液とする方法が微粒子の均一な分散化を図るために好適である。このような紡糸溶液を用いることで、シロキサンが分散された炭酸カルシウム微粒子と生分解性樹脂との複合体で構成された第１不織布層を形成できる。
【００２７】
第２不織布層形成用の紡糸溶液として、最も代表的には、PLAをクロロホルム（CHCl3）もしくは、ジクロロメタンに溶解させた溶液を用いる。このような紡糸溶液を用いることで、生分解性樹脂で構成された第２不織布層を形成できる。
【００２８】
そして、エレクトロスピニング装置を用いて、第１不織布層形成用の紡糸溶液を噴霧して第１不織布層を形成させ、引き続き、第２不織布層形成用の紡糸溶液を噴霧して第２不織布層を積層させることで、２層構造のGBR膜を製造することができる。なお、第１、第２不織布層の形成順序を入れ替えたり、第１、第２不織布層を別々に作製した後、合着させることにより２層構造のGBR膜を製造することもできる。
【００２９】
紡糸条件（紡糸溶液の濃度や溶媒の種類や供給速度、紡糸時間、印加電圧、ノズルとコレクターの距離など）を適切に設定することで所望のGBR膜を製造することができる。本実施形態では、第２不織布層の繊維状物質の平均直径が、第１不織布層の繊維状物質の平均直径よりも小さくなるように、第１、第２不織布層の紡糸条件を設定する。具体的には、第１不織布層を構成する繊維状物質の平均直径が１０μｍ以上２０μｍ以下となり、第２不織布層を構成する繊維状物質の平均直径が０よりも大きく５μｍ以下となるように、紡糸条件を設定する。繊維状物質の直径は紡糸溶液の粘性によってほぼ制御可能であり、紡糸溶液の粘度は紡糸溶液の濃度や溶媒の種類および割合等で決定されることから、所望の直径となるように、例えば、紡糸溶液の濃度や溶媒の種類および割合を設定する。ちなみに、繊維状物質の平均直径は、電子顕微鏡観察等によって算出することができる。
【００３０】
このように、第２不織布層の繊維状物質の平均直径を、第１不織布層の繊維状物質の平均直径よりも小さくすることで、第２不織布層の繊維状物質の平均直径を、第１不織布層の繊維状物質の平均直径と同一とする場合と比較して、第２不織布層の柔軟性を向上させることができる。これは、生分解性樹脂を主成分とする繊維状物質は、直径が小さいほど、しなやかさが増すからである。
【００３１】
この結果、本発明のGBR膜によれば、第２不織布層の柔軟性を向上できるので、このGBR膜で骨欠損部を覆った際に、GBR膜と骨欠損部周辺部位との間に隙間が生じることを確実に防止でき、骨再生能力を向上できる。
【００３２】
なお、第１不織布層を構成する繊維状物質が、Si-CaCO3微粒子とPLAとの複合体の場合、剛性が高いSi-CaCO3微粒子の存在によって、繊維状物質がSi-CaCO3微粒子を含まないPLA単体で構成された場合と比較して、第１不織布層全体の柔軟性が低下するとともに、第１不織布層の強度も低下する。このため、GBR膜で患部を覆う際では、第１不織布層が破断して隙間が生じ易くなるが、本実施形態によれば、第２不織布層の柔軟性を向上させているので、第２不織布層によって隙間が生じることなく患部を覆うことができる。
【００３３】
また、同じエレクトロスピニング装置を用いて、第１、第２不織布層を形成する場合、繊維状物質の直径を大きくすることで、繊維間の空隙（気孔径）を大きくでき、繊維状物質の直径を小さくすることで、繊維間の空隙（気孔径）を小さくできる。
【００３４】
このため、第１不織布層を構成する繊維状物質の平均直径を１０μｍ以上とすると、後述の実施例（図５参照）で説明するように、繊維間の間隙を細胞自体の大きさよりも大きくできるので、第１不織布層の内部へ細胞を進入させることができる。なお、繊維状物質の平均直径を２０μｍ以下としているのは、一般的なエレクトロスピニング装置によって形成できる繊維状物質の平均最大径が２０μｍ程度だからである。
【００３５】
一方、第２不織布層を構成する繊維状物質の平均直径を５μｍ以下とすると、後述の実施例（図５参照）で説明するように、繊維間の空隙を細胞自体の大きさよりも小さくできるので、第２不織布層の内部への骨再生に寄与しない細胞や軟組織の進入を阻止できる。ちなみに、現状のエレクトロスピニング装置では、直径が０．０５μｍよりも小さな繊維状物質を製造することは困難であるが、第２不織布層の役割から、繊維状物質の平均直径は０よりも大きければ良く、エレクトロスピニング装置の工夫次第では、直径が０．０５μｍよりも小さな繊維状物質を製造できるものと思われる。
【００３６】
ところで、第２不織布層の製造方法としては、本実施形態とは異なり、繊維状物質の平均直径を第１不織布層と同じとして、第２不織布層を製造した後に、第２不織布層をプレスすることで、第２不織布層の気孔径を小さくすることも可能である。しかし、この場合、第２不織布層の気孔径を所望の大きさにするためには、プレス工程が必要となってしまう。さらに第１不織布層と同じ条件で作製した場合、繊維状物質の平均直径は大きくなるため、繊維径が細い場合に比べて柔軟性はやや劣り、プレスすることでさらに低下する場合が多い。
【００３７】
これに対して、本実施形態の製造方法によれば、エレクトロスピニング法によって第２不織布層を形成する工程において、所望の繊維径となるように、紡糸条件を設定することで、所望の気孔径にすることができる。さらに、本実施形態の製造方法によれば、プレス工程を行わないので、第２不織布層をプレスする場合と比較して、第２不織布層の柔軟性を向上できる。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明に係るGBR膜の製造方法の実施例について説明する。以下の実施例についての説明は本発明をより深く理解するためのものであって、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。
〔各実施例で用いた原料〕
・ポリ乳酸（PLA）：分子量20-30万Da、PURAC biochem、または、分子量15〜17万Da、島津製作所
・クロロホルム（CHCl3）：特級試薬、純度99.0％以上、キシダ化学株式会社
・γ−アミノプロピルトリエトキシシラン（APTES）：（TSL8331、純度98％以上、GE東芝シリコーン株式会社）
・シロキサン含有炭酸カルシウム（Si-CaCO3）：消石灰（ミクロスターＴ、純度96％以上、矢橋工業株式会社）、メタノール（特級試薬、純度99.8％以上、キシダ化学株式会社）、APTES、炭酸ガス（高純度液化炭酸ガス、純度99.9％、大洋化学工業株式会社）を用いて調製された、シロキサンを含む（ケイ素イオン量換算で2.9重量％）のバテライト
（実施例１）
第１不織布層としてSi-PLA層を作製し、第２不織布層として平均直径が異なる２種類のPLA層（５μｍφ、１〜２μｍφ）を作製した。
具体的には、分子量15〜17万DaのPLA1.0ｇをクロロホルムに溶解して8％のPLA溶液としたものに、APTES67％の水溶液0.075ｇを混合撹拌したものを、Si-PLA層を作製するための紡糸溶液とした。
また、平均５μｍφのPLA層を作製するために、分子量15〜17万DaのPLAを9％とクロロホルム91％を混合して9％のPLA溶液とし、これを紡糸溶液とした。さらに、平均１〜２μｍφのPLA層を作製するために、分子量15〜17万DaのPLAを9％、クロロホルムを76％、メタノールを15％とを混合撹拌して紡糸溶液とした。
【００３９】
これらの紡糸溶液を用いて、エレクトロスピング法により、Si-PLA層と平均５μｍφのPLA層との２層構造を有するGBR膜と、Si-PLA層と平均１〜２μｍφのPLA層との２層構造を有するGBR膜を作製した。なお、紡糸溶液以外の紡糸条件はすべて同一とした。
紡糸溶液供給速度：約0.05 ml/min、印加電圧：20 kV、ノズルとコレクターの距離：15 cm、ノズル：15 cm/minで左右（15 cm幅）に移動、コンベア式コレクター（コンベア速度：2 m/min）、紡糸時間：約60min
図１の走査型電子顕微鏡（SEM）写真に第１不織布層としてのSi- PLA層の微構造を示す。第１不織布層を構成する繊維状物質の直径は１０μｍ前後であることが確認できる。
【００４０】
また、図２のSEM写真に第２不織布層としてのPLA層（５μｍφ）の微構造を示す。第２不織布層を構成する繊維状物質の直径は５μｍ前後であることが確認できる。図３のSEM写真に第２不織布層としてのPLA層（１〜２μｍφ）の微構造を示す。第２不織布層を構成する繊維状物質の直径は１〜２μｍ前後であることが確認できる。
【００４１】
なお、図１〜図３からわかるように、各不織布層内における複数の繊維状物質の直径のバラツキは小さく、各不織布層内における複数の繊維状物質の直径はほぼ同等であった。
試料Ａ、Ｂ、Ｃを水銀ポロシメータ（島津製作所、Poresizer9320）を用いて気孔率、および気孔系を測定した結果を図４に示す。試料Ａ、Ｂ、Ｃは、それぞれ、実施例１のSi-PLA層、PLA層（５μｍφ）、PLA層（１〜２μｍφ）である。求められた気孔率は、Ａ：86μｍ、Ｂ：81μｍ、Ｃ：70μｍであり、３試料間で大きな差はなかった。しかし、気孔径は差が見られ、Ａ：42μｍ、Ｂ：17μｍ、Ｃ：11μｍであった。
【００４２】
ここで、図５に、繊維状物質の直径が異なる３種類の不織布層への細胞進入性の調査結果を示す。＊印はスチューデントｔ検定で統計的に差を認めたことを意味する。図５中の試料Ａ、Ｂ、Ｃは、いずれもPLA層であり、それぞれ、実施例１と同様に、平均直径が１０μｍφ、５μｍφ、１〜２μｍφである繊維状物質で構成されたものである。図５からわかるように、試料Ａでは、１３ｄで約９０μｍの細胞侵入が見られた。このことから、試料Ａは、繊維径が太く、それに伴い気孔径も大きいので、不織布層の内部へ細胞が侵入したものと考えられる。一方、試料Ｂ、Ｃでは、細胞の侵入が見られなかったことから、試料Ｂ、Ｃは、繊維径が細く、気孔径が細胞自体の大きさよりも小さかったため、不織布層の内部へ細胞が侵入できなかったものと考えられる。
〔細胞培養実験の条件〕
細胞種；マウス骨芽細胞様細胞（MC3T3-E1細胞：理研）
24wellプレート使用細胞播種数；1×104cell/well（Ａ、Ｂ、Ｃの3種類のサンプルをそれぞれ24 wellプレートに入れ、予め10％ウシ胎仔血清含有α-MEM培地に1 hさらした後、播種）
培養培地；α-MEM（10％ウシ胎仔血清含有）
培地交換；播種翌日、その後は１日おき
培養：各懸濁液1 mLをサンプル表面に滴下し、そのままの状態で1, 6, 13 d培養（インキュベーター内にて5% CO2、37 oC環境下保持）。
（実施例２）
第１不織布層としてSi-CaCO3/PLA層を作製し、第２不織布層としてPLA層を作製した。具体的には、 第１不織布層（Si-CaCO3/PLA層）用の紡糸溶液として、Si-CaCO3:1.5ｇ、分子量15〜17万のPLA:1.0ｇ、クロロホルム:9.0ｇを混合した紡糸溶液（Si-CaCO3:13.0％、PLA:8.7％）を準備し、第２不織布層（PLA層）用の紡糸溶液として、分子量15〜17万DaのPLA 1ｇをクロロホルム10.11ｇに溶解して紡糸溶液（PLA:9％）とした。これらの紡糸溶液を用いて、エレクトロスピング法により不織布２層構造を有するGBR膜を作製した。
【００４３】
[Si-CaCO3/PLA層作製条件]
紡糸溶液供給速度：約0.24 ml/min、印加電圧：20 kV、ノズルとコレクターの距離：15 cm、ノズル：10 cm/minで左右（15 cm幅）に移動、コンベア式コレクター（コンベア速度：2 m/min）、紡糸時間：約180 min
[PLA層作製条件]
紡糸溶液供給速度：約0.05 ml/min、印加電圧：20kV、ノズルとコレクターの距離：15 cm、ノズル：15 cm/minで左右（15 cm幅）に移動、コンベア式コレクター（コンベア速度：2 m/min）、紡糸時間：約180 min
図６の走査型電子顕微鏡（SEM）写真に第１不織布層としてのSi-CaCO3/PLA層の微構造を示す。第１不織布層を構成する繊維状物質の直径は１０〜２０μｍ程度であることが確認できる。図７のSEM写真に第２不織布層としてのPLA層の微構造を示す。第２不織布層を構成する繊維状物質の直径は５μｍ前後であることが確認できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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