(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における髄鞘形成不全または脱髄領域、あるいは、哺乳動物におけるミエリンの破壊を治療するための組成物であって、単離セマフォリン６Ａ（Ｓｅｍａ６Ａ）ポリペプチドを含み、該哺乳動物が多発性硬化症（ＭＳ）を有すると診断されている、組成物。
【請求項２】
哺乳動物における髄鞘形成不全または脱髄領域、あるいは、哺乳動物におけるミエリンの破壊を治療するための組成物であって、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドをコード化する単離ポリヌクレオチドを含み、該哺乳動物が多発性硬化症（ＭＳ）を有すると診断されている、組成物。
【請求項３】
前記Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、プレキシン−Ａ２ポリペプチドに結合可能である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、
ｉ．  配列番号２の５６〜４１７、
ｉｉ．  配列番号２のａ〜４１７、
ｉｉｉ．  配列番号２のｂ〜４１７、
ｉｖ．  配列番号２の１〜４１７、
ｖ．  配列番号２の５６〜ｃ、
ｖｉ．  配列番号２のａ〜ｃ、
ｖｉｉ．  配列番号２のｂ〜ｃ、
ｖｉｉｉ．  配列番号２の１〜ｃ、
ｉｘ．  配列番号６の５６〜ｃ’、
ｘ．  配列番号６のａ〜ｃ’、
ｘｉ．  配列番号６のｂ〜ｃ’、
ｘｉｉ．  配列番号６の１〜ｃ’、
ｘｉｉｉ．  配列番号２の５６〜ｄ、
ｘｉｖ．  配列番号２のａ〜ｄ、
ｘｖ．  配列番号２のｂ〜ｄ、
ｘｖｉ．  配列番号２の１〜ｄ、
ｘｖｉｉ．  配列番号６の５６〜ｄ’、
ｘｖｉｉｉ．  配列番号６のａ〜ｄ’、
ｘｉｘ．  配列番号６のｂ〜ｄ’、
ｘｘ．  配列番号６の１〜ｄ’、
ｘｘｉ．  配列番号２の５６〜ｅ、
ｘｘｉｉ．  配列番号２のａ〜ｅ、
ｘｘｉｉｉ．  配列番号２のｂ〜ｅ、
ｘｘｉｖ．  配列番号２の１〜ｅ、
ｘｘｖ．  配列番号６の５６〜ｅ’、
ｘｘｖｉ．  配列番号６のａ〜ｅ’、
ｘｘｖｉｉ．  配列番号６のｂ〜ｅ’、
ｘｘｖｉｉｉ．  配列番号６の１〜ｅ’、
ｘｘｉｘ．  配列番号８の５６〜ｅ’’、
ｘｘｘ．  配列番号８のａ〜ｅ’’、
ｘｘｘｉ．  配列番号８のｂ〜ｅ’’、
ｘｘｘｉｉ．  配列番号８の１〜ｅ’’、
ｘｘｘｉｉｉ．  配列番号４の５６〜ｅ’’’、
ｘｘｘｉｖ．  配列番号４のａ〜ｅ’’’、
ｘｘｘｖ．  配列番号６のｂ〜ｅ’’’、
ｘｘｘｖｉ．  配列番号８の１〜ｅ’’’、
ｘｘｘｖｉｉ．  配列番号２の５６〜ｆ、
ｘｘｘｖｉｉｉ．  配列番号２のａ〜ｆ、
ｘｘｘｉｘ．  配列番号２のｂ〜ｆ、
ｘｌ．  配列番号２の１〜ｆ、
ｘｌｉ．  配列番号６の５６〜ｆ’、
ｘｌｉｉ．  配列番号６のａ〜ｆ’、
ｘｌｉｉｉ．  配列番号６のｂ〜ｆ’、
ｘｌｉｖ．  配列番号６の１〜ｆ’、
ｘｌｖ．  配列番号８の５６〜ｆ’’、
ｘｌｖｉ．  配列番号８のａ〜ｆ’’、
ｘｌｖｉｉ．  配列番号８のｂ〜ｆ’’、
ｘｌｖｉｉｉ．  配列番号８の１〜ｆ’’、
ｘｌｉｘ．  配列番号４の５６〜ｆ’’’、
ｌ．  配列番号４のａ〜ｆ’’’、
ｌｉ．  配列番号４のｂ〜ｆ’’’、
ｌｉｉ．    配列番号４の１〜ｆ’’’、
ｌｉｉｉ．  配列番号２の５６〜１０００、
ｌｉｖ．  配列番号２のａ〜１０００、
ｌｖ．  配列番号２のｂ〜１０００、
ｌｖｉ．  配列番号２の１〜１０００、
ｌｖｉｉ．  配列番号４の５６〜１０４７、
ｌｖｉｉｉ．  配列番号４のａ〜１０４７、
ｌｉｘ．  配列番号４のｂ〜１０４７、
ｌｘ．  配列番号４の１〜１０４７、
ｌｘｉ．  配列番号６の５６〜９７１、
ｌｘｉｉ．  配列番号６のａ〜９７１、
ｌｘｉｉｉ．  配列番号６のｂ〜９７１、
ｌｘｉｖ．  配列番号６の１〜９７１、
ｌｘｖ．  配列番号８の５６〜９７５、
ｌｘｖｉ．  配列番号８のａ〜９７５、
ｌｘｖｉｉ．  配列番号８のｂ〜９７５、
ｌｘｖｉｉｉ．  配列番号８の１〜９７５、
ｌｘｉｘ．  配列番号２の１９〜４１７、
ｌｘｘ．  配列番号２の１９〜４７２、
ｌｘｘｉ．  配列番号２の１９〜５５１、
ｌｘｘｉｉ．  配列番号６の１９〜４９２、
ｌｘｘｉｉｉ．  配列番号２の１９〜６４７、
ｌｘｘｉｖ．  配列番号６の１９〜５８８、
ｌｘｘｖ．  配列番号８の１９〜５９２、
ｌｘｘｖｉ．  配列番号４の１９〜６６４、
ｌｘｘｖｉｉ．  配列番号２の５６〜４７２、
ｌｘｘｖｉｉｉ．  配列番号２の５６〜５５１、
ｌｘｘｉｘ．  配列番号６の５６〜４９２、
ｌｘｘｘ．  配列番号２の５６〜６４７、
ｌｘｘｘｉ．  配列番号６の５６〜５８８、
ｌｘｘｘｉｉ．  配列番号８の５６〜５９２、
ｌｘｘｘｉｉｉ．  配列番号４の５６〜６６４、
ｌｘｘｘｉｖ．  配列番号２の１〜６４９、
ｌｘｘｘｖ．  配列番号６の１〜５９０、
ｌｘｘｘｖｉ．  配列番号８の１〜５９４、
ｌｘｘｘｖｉｉ．  配列番号４の１〜６６６、
ｌｘｘｘｖｉｉｉ．  配列番号２の１８〜７０３、
ｌｘｘｘｉｘ．  配列番号６の１８〜６４４、
ｘｃ．  配列番号８の１８〜６４８、
ｘｃｉ．  配列番号４の１８〜７２０、
ｘｃｉｉ．  配列番号２の１〜６４８、
ｘｃｉｉｉ．  配列番号６の１〜５８９、
ｘｃｉｖ．  配列番号８の１〜５９３、
ｘｃｖ．  配列番号４の１〜６６５、および
ｘｃｖｉ．  ２つ以上の前記アミノ酸配列の組み合わせ、
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含み、
ａは２４から５６までの間の任意の整数であり、ｂは１９から２１までの間の任意の整数であり、ｃは４７２から５１２までの間の任意の整数であり、ｃ’は４１８から４５３までの間の任意の整数であり、ｄは５１４から５６９までの間の任意の整数であり、ｄ’は４５５から５１０までの間の任意の整数であり、ｅは５７０から６５０までの間の任意の整数であり、ｅ’は５１１から５９１までの間の任意の整数であり、ｅ’’は５７０から５９５までの間の任意の整数であり、ｅ’’’は５７０から６６７までの間の任意の整数であり、ｆは６４７から６７１までの間の任意の整数であり、ｆ’は５８８から６１２までの間の任意の整数であり、ｆ’’は５９２から６１６までの間の任意の整数であり、ｆ’’’は６６４から６８８までの間の任意の整数である、請求項１から３のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸５６〜４１７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１から３のうちのいずれか1項に記載の組成物。
【請求項６】
前記アミノ酸配列は、前記配列番号２のアミノ酸５６〜４１７と同一である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ポリペプチドは、非Ｓｅｍａ６Ａ部分に付着されている、請求項１から６のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記非Ｓｅｍａ６Ａ部分は、前記Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドに融合されている非相同ポリペプチドである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記非相同ポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドまたはそのフラグメント、血清アルブミンポリペプチドまたはそのフラグメント、標的ポリペプチド、レポーターポリペプチドならびに精製促進ポリペプチド、および２つ以上の前記非相同ポリペプチドの組み合わせから成る群より選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記非相同ポリペプチドは、ｃ−ｍｙｃ、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ、免疫グロブリンヒンジならびにＦｃ領域、および２つ以上の前記非相同ポリペプチドの組み合わせから成る群より選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記非Ｓｅｍａ６Ａ部分は、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドに共役されているポリマーである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ポリマーは、ポリアルキレングリコール、糖ポリマー、およびポリペプチドから成る群より選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ポリマーはポリアルキレングリコールである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ポリアルキレングリコールはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、１、２、３または４つのポリマーと共役されている、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
ポリマーの総分子量は、５，０００Ｄａから１００，０００Ｄａである、請求項１１から１５のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
ボーラス注入法または長期注入によって投与されることを特徴とする、請求項１から１６のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
中枢神経系に直接投与されることを特徴とする、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
ＭＳの慢性病巣に直接投与されることを特徴とする、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物は、前記オリゴデンドロサイトへの遺伝子導入により投与されることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ポリヌクレオチドは、発現制御配列への操作可能な連結により、前記Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドをコード化する、請求項２または３に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ポリヌクレオチドは、発現ベクターとして投与されることを特徴とする、請求項２０または２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記発現ベクターはウイルスベクターである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
（ａ）前記ポリヌクレオチドを含む培養宿主細胞を提供するステップであって、前記培養宿主細胞は前記Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドを発現するステップと、（ｂ）前記培養宿主細胞を前記哺乳動物に導入し、前記Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドが前記哺乳動物において発現するようにさせるステップを含む方法により投与されることを特徴とする、請求項２または３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記培養宿主細胞は、髄鞘形成不全または脱髄領域の部位、あるいはその付近において前記哺乳動物に導入されることを特徴とする、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記培養宿主細胞は、（ａ）Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいは該ポリヌクレオチドを含むベクターを用いて、受容宿主細胞を形質転換または遺伝子導入するステップと、（ｂ）前記形質転換または遺伝子導入した宿主細胞を培養するステップと、を含む方法によって形成される、請求項２４または２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記培養宿主細胞は、治療対象の哺乳動物に由来する、請求項２４から２６のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、髄鞘形成不全または脱髄領域の部位、あるいはその付近におけるオリゴデンドロサイトの増殖、分化または生存の阻害を低減するために十分な量で発現する、請求項２から２７のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、髄鞘形成不全または脱髄領域の部位、あるいはその付近におけるニューロン髄鞘形成の阻害を低減するために十分な量で発現する、請求項２から２８のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、パポバウイルスベクター、およびポックスウイルスベクターから成る群より選択される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ヘルペスウイルスベクターは、単純ヘルペスウイルスおよびＥＢウイルスベクターから成る群より選択される、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ポックスウイルスベクターは、ワクシニアウイルスベクターである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
前記ベクターは、局所投与、眼内投与、非経口投与、くも膜下投与、硬膜下投与、および皮下投与から成る群より選択される経路によって投与されることを特徴とする、請求項２２、２３、または３０から３２のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、神経生物学、神経学および薬理学に関する。より具体的には、セマフォリン６Ａ（「Ｓｅｍａ６Ａ」）ポリペプチドの投与によって、中枢神経系髄鞘形成に関する疾病を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経系の多くの疾病は、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中心髄鞘崩壊症（ＣＰＭ）、ウォラー変性、ならびに副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、およびペリツェウス・メルツバッヘル病（ＰＭＺ）等のある種の遺伝病を含む脱髄および髄鞘形成不全と関係する。かかる疾病の中で、ＭＳは最も広まっており、世界中で約２５０万人が罹患している。
【０００３】
ＭＳは、概して、再発−軽減パターンの神経障害から開始し、次いで、神経損傷の増大をともなう慢性期に進行する。ＭＳは、慢性病巣に局在するミエリン、オリゴデンドロサイト、および軸索の破壊と関連する。ＭＳにおいて観察される脱髄は、必ずしも永久的ではなく、疾病の初期段階における再髄鞘形成が記録されている。中枢神経系（「ＣＮＳ」）ニューロンの再髄鞘形成は、オリゴデンドロサイトを必要とする。
【０００４】
ＭＳに対して様々な疾病改変治療が使用可能であり、副腎皮質ステロイドおよびインターフェロンベータ等の免疫賦活剤の使用を含む。加えて、ＭＳにおけるオリゴデンドロサイトおよび髄鞘形成の中心的役割のために、オリゴデンドロサイト数を増加させる、または髄鞘形成を強化するための治療法を開発する努力が為されている。例えば、Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，特許文献１、非特許文献１を参照されたい。しかしながら、ＭＳに対する付加療法を考案することが依然として急務である。
【０００５】
セマフォリンは、分泌または膜結合性タンパク質であり、軸索ガイダンスおよび細胞移動を制御することが知られている。非特許文献２を参照されたい。多くの膜貫通セマフォリンは、発達中のＣＮＳにおいて発現するが、それらの生体内機能についてはほとんど知られていない。同上を参照されたい。クラス６セマフォリンは、Ｓｅｍａ６Ａ〜Ｓｅｍａ６Ｄの、４つのタンパク質を含み、それらは無脊椎動物の膜貫通セマフォリンと密接に関連する。非特許文献３を参照されたい。すべてのセマフォリンは、Ｎ末端細胞外部分にセマフォリン（Ｓｅｍａ）ドメインおよびプレキシン−セマフォリン−インテグリン（ＰＳＩ）ドメイン（プレキシン、セマフォリン、およびインテグリンにおいて見出される）を有する。
【０００６】
プレキシンは、一群の分子（プレキシンファミリー）であり、様々な動物種に分布している。非特許文献４を参照されたい。プレキシンは、４つのサブファミリー、すなわちプレキシン−Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに分類される。同上を参照されたい。マウスおよびヒトにおいて、プレキシンＡ−サブファミリーの４つのメンバー（プレキシン−Ａ１、Ａ２、Ａ３、およびＡ４）が、単離されている。非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、および非特許文献９を参照されたい。プレキシン−Ａサブファミリーの外部ドメインは、セマフォリンによって共有されるＳｅｍａドメインに対して著しい相同性を呈する、約５００の一連のアミノ酸（ａａ）残基を有する。非特許文献１０を参照されたい。Ａ型プレキシンは、クラス６セマフォリンと相互作用することが知られている。非特許文献１１を参照されたい。例えば、Ｓｕｔｏらは、プレキシン−Ａ４がＳｅｍａ６Ａの直接受容体であることを示した。非特許文献１２を参照されたい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，５７４，００９号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１６５−７３（２００２）
【非特許文献２】Ｋｅｒｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｓｃｉ．８（１１）：１５１６−１５２４（２００５）
【非特許文献３】Ｆｉｏｒｅ＆Ｐｕｓｃｈｅｌ．Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：２４８４−２４９９（２００３）
【非特許文献４】Ｍｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｄｙｎａｍ．２２０：２４６−２５８（２００１）
【非特許文献５】Ｋａｍｅｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２６：３９６−４０２（１９９６）
【非特許文献６】Ｋａｍｅｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２６：５２４−５２９（１９９６）
【非特許文献７】Ｍａｅｓｔｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：６７４−６７８（１９９６）
【非特許文献８】Ｔａｍａｇｎｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９９：７１−８０（１９９９）
【非特許文献９】Ｓｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．１２０：３８５−３９６（２００３）
【非特許文献１０】Ｍｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｄｙｎ．２２０：２４６−２５８（２００１）
【非特許文献１１】Ｔｏｙｏｆｕｋｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．１８：４３５−４４７（２００４）
【非特許文献１２】Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５（１４）：３６２８−３６３７（２００５）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、セマフォリン６Ａ（Ｓｅｍａ６Ａ）がオリゴデンドロサイトにおいて発現し、オリゴデンドロサイト分化、生存、および／または軸索髄鞘形成を調整するという発見に基づく。さらに、ある種のＳｅｍａ６Ａポリペプチドは、オリゴデンドロサイトの生存、増殖、および／または分化、ならびにニューロンの髄鞘形成を促進する。かかる発見に基づいて、本発明は、概して、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドの投与によって、脱髄および／または髄鞘形成不全（例えば、多発性硬化症）に関連する状態を治療する方法に関する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
オリゴデンドロサイトの増殖、分化、または生存を促進するための方法であって、前記オリゴデンドロサイトを、単離セマフォリン６Ａ（「Ｓｅｍａ６Ａ」）ポリペプチドを含む、有効量の組成物と接触させるステップを含む、方法。
（項目２）
ニューロンのオリゴデンドロサイト媒介による髄鞘形成を促進するための方法であって、ニューロンおよびオリゴデンドロサイトの混合物を、単離セマフォリン６Ａポリペプチドを含む、有効量の組成物と接触させるステップを含む、方法。
（項目３）
哺乳動物において、オリゴデンドロサイトの増殖、分化、または生存を促進するための方法であって、単離Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドを含む有効量の組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与するステップを含む、方法。
（項目４）
哺乳動物において、ニューロンの髄鞘形成を促進するための方法であって、単離Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドを含む有効量の組成物をその哺乳動物に投与するステップを含む、方法。
（項目５）
哺乳動物において、髄鞘形成不全または脱髄に関連する疾病、疾患、または損傷を治療するための方法であって、単離Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドを含む治療有効量の組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与するステップを含む、方法。
（項目６）
哺乳動物において、オリゴデンドロサイト細胞死または分化の欠失に関連する疾病、疾患、または損傷を治療するための方法であって、単離Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドを含む治療有効量の組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与するステップを含む、方法。
（項目７）
哺乳動物において、ミエリンの破壊を伴う疾病、疾患、または損傷を治療するための方法であって、単離Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドを含む治療有効量の組成物を投与するステップを含む、方法。
（項目８）
哺乳動物において、オリゴデンドロサイトの増殖、分化、または生存を促進するための方法であって、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドをコード化する単離ポリヌクレオチドを含む、有効量の組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与するステップを含む、方法。
（項目９）
哺乳動物において、ニューロンの髄鞘形成を促進するための方法であって、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドをコード化する単離ポリヌクレオチドを含む、有効量の組成物を、その哺乳動物に投与するステップを含む、方法。
（項目１０）
哺乳動物において、髄鞘形成不全または脱髄を伴う疾病、疾患、または損傷を治療するための方法であって、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドをコード化する単離ポリヌクレオチドを含む、治療有効量の組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与するステップを含む、方法。
（項目１１）
哺乳動物において、オリゴデンドロサイト細胞死または分化の欠失を伴う疾病、疾患、または損傷を治療するための方法であって、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドをコード化する単離ポリヌクレオチドを含む、治療有効量の組成物を投与するステップを含む、方法。
（項目１２）
哺乳動物において、ミエリンの破壊を伴う疾病、疾患、または損傷を治療するための方法であって、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドをコード化する単離ポリヌクレオチドを含む、治療有効量の組成物を投与するステップを含む、方法。
（項目１３）
前記Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、プレキシン−Ａ２ポリペプチドに結合する、項目１から１２のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
前記Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、
ｉ．  配列番号２の５６〜４１７、
ｉｉ．  配列番号２のａ〜４１７、
ｉｉｉ．  配列番号２のｂ〜４１７、
ｉｖ．  配列番号２の１〜４１７、
ｖ．  配列番号２の５６〜ｃ、
ｖｉ．  配列番号２のａ〜ｃ、
ｖｉｉ．  配列番号２のｂ〜ｃ、
ｖｉｉｉ．  配列番号２の１〜ｃ、
ｉｘ．  配列番号６の５６〜ｃ’、
ｘ．  配列番号６のａ〜ｃ’、
ｘｉ．  配列番号６のｂ〜ｃ’、
ｘｉｉ．  配列番号６の１〜ｃ’、
ｘｉｉｉ．  配列番号２の５６〜ｄ、
ｘｉｖ．  配列番号２のａ〜ｄ、
ｘｖ．  配列番号２のｂ〜ｄ、
ｘｖｉ．  配列番号２の１〜ｄ、
ｘｖｉｉ．  配列番号６の５６〜ｄ’、
ｘｖｉｉｉ．  配列番号６のａ〜ｄ’、
ｘｉｘ．  配列番号６のｂ〜ｄ’、
ｘｘ．  配列番号６の１〜ｄ’、
ｘｘｉ．  配列番号２の５６〜ｅ、
ｘｘｉｉ．  配列番号２のａ〜ｅ、
ｘｘｉｉｉ．  配列番号２のｂ〜ｅ、
ｘｘｉｖ．  配列番号２の１〜ｅ、
ｘｘｖ．  配列番号６の５６〜ｅ’、
ｘｘｖｉ．  配列番号６のａ〜ｅ’、
ｘｘｖｉｉ．  配列番号６のｂ〜ｅ’、
ｘｘｖｉｉｉ．  配列番号６の１〜ｅ’、
ｘｘｉｘ．  配列番号８の５６〜ｅ’’、
ｘｘｘ．  配列番号８のａ〜ｅ’’、
ｘｘｘｉ．  配列番号８のｂ〜ｅ’’、
ｘｘｘｉｉ．  配列番号８の１〜ｅ’’、
ｘｘｘｉｉｉ．  配列番号４の５６〜ｅ’’’、
ｘｘｘｉｖ．  配列番号４のａ〜ｅ’’’、
ｘｘｘｖ．  配列番号６のｂ〜ｅ’’’、
ｘｘｘｖｉ．  配列番号８の１〜ｅ’’’、
ｘｘｘｖｉｉ．  配列番号２の５６〜ｆ、
ｘｘｘｖｉｉｉ．  配列番号２のａ〜ｆ、
ｘｘｘｉｘ．  配列番号２のｂ〜ｆ、
ｘｌ．  配列番号２の１〜ｆ、
ｘｌｉ．  配列番号６の５６〜ｆ’、
ｘｌｉｉ．  配列番号６のａ〜ｆ’、
ｘｌｉｉｉ．  配列番号６のｂ〜ｆ’、
ｘｌｉｖ．  配列番号６の１〜ｆ’、
ｘｌｖ．  配列番号８の５６〜ｆ’’、
ｘｌｖｉ．  配列番号８のａ〜ｆ’’、
ｘｌｖｉｉ．  配列番号８のｂ〜ｆ’’、
ｘｌｖｉｉｉ．  配列番号８の１〜ｆ’’、
ｘｌｉｘ．  配列番号４の５６〜ｆ’’’、
ｌ．  配列番号４のａ〜ｆ’’’、
ｌｉ．  配列番号４のｂ〜ｆ’’’、
ｌｉｉ．    配列番号４の１〜ｆ’’’、
ｌｉｉｉ．  配列番号２の５６〜１０００、
ｌｉｖ．  配列番号２のａ〜１０００、
ｌｖ．  配列番号２のｂ〜１０００、
ｌｖｉ．  配列番号２の１〜１０００、
ｌｖｉｉ．  配列番号４の５６〜１０４７、
ｌｖｉｉｉ．  配列番号４のａ〜１０４７、
ｌｉｘ．  配列番号４のｂ〜１０４７、
ｌｘ．  配列番号４の１〜１０４７、
ｌｘｉ．  配列番号６の５６〜９７１、
ｌｘｉｉ．  配列番号６のａ〜９７１、
ｌｘｉｉｉ．  配列番号６のｂ〜９７１、
ｌｘｉｖ．  配列番号６の１〜９７１、
ｌｘｖ．  配列番号８の５６〜９７５、
ｌｘｖｉ．  配列番号８のａ〜９７５、
ｌｘｖｉｉ．  配列番号８のｂ〜９７５、
ｌｘｖｉｉｉ．  配列番号８の１〜９７５、
ｌｘｉｘ．  配列番号２の１９〜４１７、
ｌｘｘ．  配列番号２の１９〜４７２、
ｌｘｘｉ．  配列番号２の１９〜５５１、
ｌｘｘｉｉ．  配列番号６の１９〜４９２、
ｌｘｘｉｉｉ．  配列番号２の１９〜６４７、
ｌｘｘｉｖ．  配列番号６の１９〜５８８、
ｌｘｘｖ．  配列番号８の１９〜５９２、
ｌｘｘｖｉ．  配列番号４の１９〜６６４、
ｌｘｘｖｉｉ．  配列番号２の５６〜４７２、
ｌｘｘｖｉｉｉ．  配列番号２の５６〜５５１、
ｌｘｘｉｘ．  配列番号６の５６〜４９２、
ｌｘｘｘ．  配列番号２の５６〜６４７、
ｌｘｘｘｉ．  配列番号６の５６〜５８８、
ｌｘｘｘｉｉ．  配列番号８の５６〜５９２、
ｌｘｘｘｉｉｉ．  配列番号４の５６〜６６４、
ｌｘｘｘｉｖ．  配列番号２の１〜６４９、
ｌｘｘｘｖ．  配列番号６の１〜５９０、
ｌｘｘｘｖｉ．  配列番号８の１〜５９４、
ｌｘｘｘｖｉｉ．  配列番号４の１〜６６６、
ｌｘｘｘｖｉｉｉ．  配列番号２の１８〜７０３、
ｌｘｘｘｉｘ．  配列番号６の１８〜６４４、
ｘｃ．  配列番号８の１８〜６４８、
ｘｃｉ．  配列番号４の１８〜７２０、
ｘｃｉｉ．  配列番号２の１〜６４８、
ｘｃｉｉｉ．  配列番号６の１〜５８９、
ｘｃｉｖ．  配列番号８の１〜５９３、
ｘｃｖ．  配列番号４の１〜６６５、および
ｘｃｖｉ．  ２つ以上の前記アミノ酸配列の組み合わせ、
から成る群より選択される参照アミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、
ａは２４から５６までの間の任意の整数であり、ｂは１９から２１までの間の任意の整数であり、ｃは４７２から５１２までの間の任意の整数であり、ｃ’は４１８から４５３までの間の任意の整数であり、ｄは５１４から５６９までの間の任意の整数であり、ｄ’は４５５から５１０までの間の任意の整数であり、ｅは５７０から６５０までの間の任意の整数であり、ｅ’は５１１から５９１までの間の任意の整数であり、ｅ’’は５７０から５９５までの間の任意の整数であり、ｅ’’’は５７０から６６７までの間の任意の整数であり、ｆは６４７から６７１までの間の任意の整数であり、ｆ’は５８８から６１２までの間の任意の整数であり、ｆ’’は５９２から６１６までの間の任意の整数であり、ｆ’’’は６６４から６８８までの間の任意の整数である、項目１から１３のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
前記アミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記アミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列と同一である、項目１４または１５に記載の方法。
（項目１７）
前記Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは環状ペプチドである、項目１から１６のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
前記環状ペプチドは、前記環状ペプチドのＮ末端に付着したビオチン分子およびＣ末端に付着したシステイン残基を含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記環状ペプチドは、前記環状ペプチドのＮ末端およびＣ末端に付着したシステイン残基を含み、前記Ｎ末端システイン残基はアセチル化される、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
前記Ｃ末端システインは付着したＮＨ２部分を有する、項目１８または１９に記載の方法。
（項目２１）
前記ポリペプチドは、非Ｓｅｍａ６Ａ部分に付着する、項目１から０のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
前記非Ｓｅｍａ６Ａ部分は、前記Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドに融合される非相同ポリペプチドである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記非相同ポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドまたはそのフラグメント、血清アルブミンポリペプチドまたはそのフラグメント、標的ポリペプチド、レポーターポリペプチドならびに精製促進ポリペプチド、および２つ以上の前記非相同ポリペプチドの組み合わせから成る群より選択される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記非相同ポリペプチドは、ｃ−ｍｙｃ、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ、免疫グロブリンヒンジならびにＦｃ領域、および２つ以上の前記非相同ポリペプチドの組み合わせから成る群より選択される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記非Ｓｅｍａ６Ａ部分は、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドに共役したポリマーである、項目２１に記載の方法。
（項目２６）
前記ポリマーは、ポリアルキレングリコール、糖ポリマー、およびポリペプチドから成る群より選択される、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記ポリマーはポリアルキレングリコールである、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記ポリアルキレングリコールはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、１、２、３または４つのポリマーと共役する、項目２５に記載の方法。
（項目３０）
ポリマーの総分子量は、５，０００Ｄａから１００，０００Ｄａである、項目２５から２９のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記哺乳動物は、脱髄、髄鞘形成不全、または神経変性を伴う疾病、疾患、または損傷を診断されている、項目３から１３のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
前記疾病、疾患、または損傷は、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中心髄鞘崩壊症（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス・メルツバッヘル病（ＰＭＺ）、ウォラー変性、視神経炎、横断性脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷、外傷性脳損傷、放射線照射後の損傷、化学療法の神経合併症、脳梗塞、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠乏、ビタミンＥ単独欠損症、ＡＲ、バッセン・コーンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ・ビニャミ症候群、異染性白質萎縮症、三叉神経痛、およびベル麻痺から成る群より選択される、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記疾病、疾患、または損傷は多発性硬化症（ＭＳ）である、項目３１に記載の方法。
（項目３４）
前記組成物は、ボーラス注入法または長期注入によって投与される、項目３から３３のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
前記組成物は、中枢神経系に直接投与される、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記組成物は、ＭＳの慢性病巣に直接投与される、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記接触ステップは、（ａ）発現制御配列への操作可能な連鎖を通して、前記Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを用いて、前記オリゴデンドロサイトを遺伝子導入するステップと、（ｂ）前記Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドの発現を可能にするステップと、を含む、項目１または２のいずれか１項に記載の方法。
（項目３８）
前記ポリヌクレオチドは、発現制御配列への操作可能な結合を通して、前記Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドをコード化する、項目８から１３のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目３９）
前記ポリヌクレオチドは、発現ベクターとして投与される、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記発現ベクターはウイルスベクターである、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記投与するステップは、（ａ）前記ポリヌクレオチドを含む培養宿主細胞を提供するステップであって、前記培養宿主細胞は前記Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドを発現するステップと、（ｂ）前記培養宿主細胞を前記哺乳動物に導入し、前記Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドが前記哺乳動物において発現するようにさせるステップを含む、項目８から１３のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目４２）
前記培養宿主細胞は、神経系の疾病、疾患、または損傷の部位、あるいはその付近において前記哺乳動物に導入される、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記培養宿主細胞は、（ａ）項目３７または３８のポリヌクレオチド、あるいは項目３９または４０のベクターを用いて、受容宿主細胞を形質転換または遺伝子導入するステップと、（ｂ）前記形質転換または遺伝子導入した宿主細胞を培養するステップと、を含む方法によって形成される、項目４１または４２に記載の方法。
（項目４４）
前記培養宿主細胞は、治療対象の哺乳動物に由来する、項目４１から４３のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目４５）
前記Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、神経系の疾病、疾患、または損傷の部位、あるいはその付近におけるオリゴデンドロサイトの増殖、分化または生存の阻害を低減するために十分な量で発現する、項目３から４４のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目４６）
前記Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、神経系の疾病、疾患、または損傷の部位、あるいはその付近におけるニューロン髄鞘形成の阻害を低減するために十分な量で発現する、項目３から４５のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目４７）
前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、パポバウイルスベクター、およびポックスウイルスベクターから成る群より選択される、項目４０に記載の方法。
（項目４８）
前記ヘルペスウイルスベクターは、単純ヘルペスウイルスおよびＥＢウイルスベクターから成る群より選択される、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記ポックスウイルスベクターは、ワクシニアウイルスベクターである、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
前記ベクターは、局所投与、眼内投与、非経口投与、くも膜下投与、硬膜下投与、および皮下投与から成る群より選択される経路によって投与される、項目３９、４０、または４７から４９のうちのいずれか１項に記載の方法。
【００１０】
ある実施形態においては、本発明は、オリゴデンドロサイトの増殖、分化、または生存を促進するための方法を含み、オリゴデンドロサイトを、単離Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドを含む有効量の組成物と接触させるステップを含む。他の実施形態においては、本発明は、ニューロンのオリゴデンドロサイト媒介髄鞘形成を促進するための方法を含み、ニューロンおよびオリゴデンドロサイトの混合物を、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドを含む有効量の組成物と接触させるステップを含む。
【００１１】
本発明は、哺乳動物においてオリゴデンドロサイトの増殖、分化、または生存を促進するための方法、またはニューロンの髄鞘形成を促進するための方法を対象とし、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドを含む有効量の組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与するステップを含む。
【００１２】
また哺乳動物において、髄鞘形成不全または脱髄に関する、あるいはオリゴデンドロサイト細胞死または分化の欠失に関する疾病、疾患、または損傷を治療するための方法であって、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドを含む治療有効量の組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与するステップを含む方法が含まれる。
【００１３】
さらに、哺乳動物においてミエリンの破壊を伴う疾病、疾患、または損傷を治療するための方法であって、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドを含む治療有効量の組成物を投与するステップを含む方法が含まれる。
【００１４】
追加として、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、プレキシン−Ａ２ポリペプチドまたはプレキシン−Ａ４ポリペプチドに結合する、本明細書に記載される本発明の方法が含まれる。他の実施形態においては、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドが単離される。
【００１５】
さらに、本発明の実施形態は、生体内遺伝子治療法によって、オリゴデンドロサイトまたはミエリンの破壊を伴う疾病、疾患、または損傷を治療する方法であって、疾患、疾病、または損傷の部位あるいはその付近において、哺乳動物にて、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドが、損傷の部位またはその付近において、ニューロンによる軸索伸長を促進するために十分な量でヌクレオチド配列から発現するように、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含むベクターを、哺乳動物に投与するステップを含む。ある実施形態においては、本発明は、哺乳動物において、オリゴデンドロサイトの増殖、分化、または生存を促進するため、あるいはニューロンの髄鞘形成を促進するための方法であって、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドをコード化する、ポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与するステップを含む方法を含む。
【００１６】
追加として、本発明は、哺乳動物において、髄鞘形成不全または脱髄に関連した、あるいはオリゴデンドロサイト細胞死または分化の欠失に関連した疾病、疾患、または損傷を治療するための方法であって、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドをコード化する、ポリヌクレオチドを含む治療有効量の組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与するステップを含む方法を含む。本発明は、哺乳動物において、ミエリンの破壊を伴う疾病、疾患、または損傷を治療するための方法であって、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドをコード化する、ポリヌクレオチドを含む治療有効量の組成物を投与するステップを含む方法をさらに含む。ある実施形態においては、本発明のＳｅｍａ６Ａポリペプチドは、プレキシン−Ａ２ポリペプチドまたはプレキシン−Ａ４ポリペプチドに結合する。本発明の方法で使用されるポリヌクレオチドは、単離され得る。
【００１７】
ある実施形態においては、ベクターは、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ＥＢウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターから成る群より選択される、ウイルスベクターである。
【００１８】
一部の実施形態においては、疾病、疾患、損傷、または状態は、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中心髄鞘崩壊症（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス・メルツバッヘル病（ＰＭＺ）、グロボイド細胞白質ジストロフィー（クラッベ病）、ウォラー変性、視神経炎、横断性脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷、外傷性脳損傷、放射線照射後の損傷、化学療法の神経学的合併症、脳梗塞、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠損、ビタミンＥ単独欠損症、ＡＲ、バッセン・コルンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ・ビニャミ病、異染性白質ジストロフィー、三叉神経痛、およびベル麻痺から成る群より選択される。一部の実施形態においては、培養宿主細胞は、治療対象の哺乳動物に由来する。
【００１９】
特定のＳｅｍａ６Ａポリペプチドは、膜貫通領域および細胞質ドメインを欠失する、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドのフラグメント、変異体、またはその誘導体を含むが、これらに限定されない。Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、（ｉ）シグナル配列、（ｉｉ）Ｓｅｍａドメイン、（ｉｉｉ）ＰＳＩドメイン、（ｉｖ）細胞外ドメイン、（ｖ）膜貫通領域、（ｖｉ）細胞質ドメイン、および（ｖｉｉ）２つ以上のドメインの組み合わせを含むポリペプチドを含む。一部の実施形態においては、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、シグナル配列、Ｓｅｍａドメイン、ＰＳＩドメイン、膜貫通領域、細胞質ドメイン、または２つ以上のドメインの組み合わせを欠失する。一部の実施形態においては、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、Ｓｅｍａドメインを含み、シグナル配列、ＰＳＩ配列、膜貫通領域、および細胞質ドメインを欠失する。一部の実施形態においては、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基１〜６４９を含む。
【００２０】
一部の実施形態においては、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、ボーラス注入法または長期注入によって投与される。一部の実施形態においては、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、中枢神経系に直接投与される。一部の実施形態においては、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、ＭＳの慢性病巣に直接投与される。
【００２１】
一部の実施形態においては、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、非Ｓｅｍａ６Ａ部分を含む融合ポリペプチドである。一部の実施形態においては、非Ｓｅｍａ６Ａ部分は、抗体Ｉｇ部分、血清アルブミン部分、標的部分、レポーター部分、および精製促進部分から成る群より選択される。一部の実施形態においては、抗体Ｉｇ部分はヒンジおよびＦｃ部分である。
【００２２】
一部の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、ポリマーに共役される。一部の実施形態においては、ポリマーは、ポリアルキレングリコール、糖ポリマー、およびポリペプチドから成る群より選択される。一部の実施形態においては、ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。一部の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、１、２、３、または４つのポリマーに共役される。一部の実施形態においては、ポリマーの総分子量は、５，０００Ｄａから１００，０００Ｄａである。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ヒトＳｅｍａ６Ａポリペプチドイソ型、すなわち、イソ型Ａ〜Ｄ間の配列比較である。
【図２】マウスＳｅｍａ６Ａポリペプチドイソ型、すなわち、イソ型１〜３間の配列比較である。
【図３】マウス神経系におけるＳｅｍａ６Ａ発現。Ｐ１５マウスの神経系におけるＳｅｍａ６Ａ発現を、原位置ハイブリダイゼーションによって分析した。最もＳｅｍａ６Ａを発現する細胞のほとんどは、白質において認められる。白質におけるＳｅｍａ６Ａ発現細胞はオリゴデンドロサイトである。
【図４】Ｐ１６における前交連（ＡＣ）中のミエリンプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）発現Ｓｅｍａ６Ａ＋／−（Ａ）またはＳｅｍａ６Ａ−／−（Ｂ）オリゴデンドロサイトの免疫染色分析。（Ｃ）異なる段階、すなわちＰ１６、Ｐ３０、およびＰ４５におけるＡＣ中のＰＬＰ発現細胞の定量。
【図５】（Ａ）Ｓｅｍａ６Ａ−／−オリゴデンドロサイトの生体外成熟。オリゴデンドロサイトのフラクタル次元（ＦＤ）を４８時間後に測定した。左表示棒は、Ｓｅｍａ６Ａ−／−オリゴデンドロサイトのＦＤであり、右表示棒は、Ｓｅｍａ６Ａ＋／−オリゴデンドロサイトのＦＤである。（Ｂ）４８時間後、位相差顕微鏡法および抗Ｏ４抗体を用いる免疫染色によって可視化したＳｅｍａ６Ａ−／−のオリゴデンドロサイト。（Ｃ）２４時間および４８時間後のＳｅｍａ６Ａ−／−オリゴデンドロサイトの生体外成熟。左表示棒は２４時間を示し、右表示棒は４８時間を示す。（Ｄ）４８時間後、位相差顕微鏡法および抗Ｏ４抗体を用いる免疫染色によって可視化したＳｅｍａ６Ａ＋／−のオリゴデンドロサイト。
【図６】様々な投与量のＳｅｍａ６Ａ−Ｆｃの添加を伴う、後根神経節細胞（ＤＲＧ）およびオリゴデンドロサイトの共培養における髄鞘形成、（Ａ）負の対照、（Ｂ）０．１μｇ／ｍｌ、および（Ｃ）０．３μｇ／ｍｌ。髄鞘形成の程度は、抗ＭＢＰ抗体を用いる免疫染色によって示される。
【図７】マウスをクプリゾンで処理し、脱髄および再髄鞘形成中のＳｅｍａ６Ａ発現を試験した。Ｓｅｍａ６Ａ発現細胞の数を異なる段階、すなわち３から６週間で測定した。
【図８】（Ａ）〜(Ｂ)倍率１倍(Ａ)および倍率１倍（Ｂ）で、ヒトＭＳ病巣組織および非病巣組織において、Ｓｅｍａ６Ａリボプローブを使用する原位置ハイブリダイゼーション、（Ｃ）倍率１０倍で、ヒトＳｅｍａ６Ａ抗体を使用するヒトＭＳ病巣組織の免疫染色。
【図９】（Ａ）プレキシン−Ａ２＋／＋（野生型）、プレキシン−Ａ２タンパク質ヌルノックアウト（プレキシン−Ａ２−／−）マウス、およびセマフォリンドメイン（ＮＭＦ４５４）において単一アミノ酸置換（Ａ３９６Ｅ）を担持するプレキシン−Ａ２突然変異体におけるプレキシン−Ａ２ポリペプチド発現のウェスタンブロット解析、（Ｂ）アラニン（３９６）を同定するためのプレキシン−Ａ２、プレキシン−Ａ４、プレキシン−Ａ１、およびプレキシン−Ａ３の配列調整、（Ｃ）ＣＯＳ細胞において発現した野生型プレキシン−Ａ２タンパク質に対するＳｅｍａ６Ａ結合アッセイ、および（Ｄ）ＣＯＳ細胞において発現した突然変異プレキシン−Ａ２Ａ３９６Ｅに対するＳｅｍａ６Ａ結合アッセイ。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当該技術分野において従来技術を有する者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。矛盾する場合は、該定義を含む本適用を採用する。文脈によって別段の必要がない限り、単数の用語は複数を含み、複数の用語は単数を含み得る。本明細書で言及されるすべての発行物、特許、および他の参照物は、それぞれ個別の発行物または特許出願が、参照によって組み込まれるものとして具体的および個別に示されるかのように、あらゆる目的のために、それら全体を参照することによって組み込まれる。
【００２５】
本明細書に記載されるものに類似または同等の方法および材料を、本発明の実践または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に説明する。材料、方法、および実施例は単なる例証であり、限定することを意図しない。本発明の他の特徴および利点は、発明を実施するための形態および請求項から明らかになるだろう。
【００２６】
本発明をさらに定義するために、以下の用語および定義を提供する。
【００２７】
「１つ（ａまたはａｎ）の」実体という用語は、１つ以上のその実体を意味し、例えば、「１つのポリペプチド」は、１つ、または以上のポリペプチドを表すことが理解されることに留意されたい。したがって、「１つ（ａまたはａｎ）」、「１つ以上の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」および「少なくとも１つの（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」という用語は、本明細書において同義的に使用することができる。
【００２８】
本明細書および請求項を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」もしくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」等の変型例は、任意の列挙される整数または整数群を含むことを示すが、いかなる他の整数または整数群の除外も示すことはない。
【００２９】
本明細書および請求項を通して、「〜から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」という用語、および「ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ」または「ｃｏｎｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ」等の変型例は、任意の列挙される整数または整数群を含むことを示すが、追加の整数または整数群は、特定の方法、構造、または組成物に追加され得ないことを示す。
【００３０】
本明細書および請求項を通して、「本質的に〜から成る（ｃｏｎｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語、および「ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ」または「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ」等の変型例は、任意の列挙される整数または整数群を含むこと、および特定の方法、構造、または組成物の基本的または新規特性を実質的に変化させない、任意の列挙される整数または整数群を任意に含むことを示す。
【００３１】
本明細書で使用される「抗体」は、正常な免疫グロブリン、またはその抗原結合フラグメントを意味する。本発明の抗体は、任意のイソ型またはクラス（例えば、Ｍ、Ｄ、Ｇ、Ｅ、およびＡ）または任意のサブクラス（例えば、Ｇ１−４、Ａ１−２）であり得、カッパ（κ）またはラムダ（λ）軽鎖のいずれかを有し得る。
【００３２】
本明細書で使用される「Ｆｃ」は、１つ以上の重鎖定常領域ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む、免疫グロブリン重鎖の部分、例えば、パパイン消化によって取得可能な抗体の重鎖定常領域の部分を意味する。
【００３３】
本明細書で使用される「ヒト化抗体」は、非ヒト配列の少なくとも一部が、ヒト配列と置換される抗体を意味する。ヒト化抗体の形成方法の実施例は、米国特許第６，０５４，２９７号、第５，８８６，１５２号、および第５，８７７，２９３号において見出され得る。
【００３４】
本明細書で使用される「キメラ抗体」は、第１の抗体からの１つ以上の領域、および少なくとも１つの他の抗体からの１つ以上の領域を含む抗体を意味する。第１の抗体および追加の抗体は、同一または異なる種に由来し得る。
【００３５】
本明細書で使用される「治療有効量」は、望ましい治療結果を達成するために必要な投与量および時間において有効な量を意味する。治療結果は、例えば、症状の緩和、長期生存、運動性の改善等であり得る。治療結果は「治癒」である必要はない。
【００３６】
本明細書で使用される「予防的有効量」は、望ましい予防的結果を達成するために必要な投与量および時間において有効な量を意味する。典型的には、予防的用量は、疾病前、または疾病の初期段階において対象に使用されるので、予防的有効量は、治療有効量よりも少なくなる。
【００３７】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」は、非翻訳５’および３’配列、コーディング配列、ならびに核酸配列のフラグメント、エピトープ、ドメイン、および変異体を含む、全長ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を含有し得る。ポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドで構成することができ、非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖またはより典型的には、二本鎖であり得るか、あるいは一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得る、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子で構成することができる。加えて、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖で構成することができる。ポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾塩基、あるいは安定性または他の理由のために修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡ骨格も含有し得る。「修飾」塩基は、例えば、トリチル化塩基およびイノシン等の異常塩基を含む。多様な修飾をＤＮＡおよびＲＮＡに行うことができ、したがって、「ポリヌクレオチド」は化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態を包含する。
【００３８】
本発明において、ポリペプチドは、ペプチド結合または修飾ペプチド結合、すなわちペプチド等量式によって互いに結合したアミノ酸で構成することができ、遺伝子によってコード化した２０のアミノ酸以外のアミノ酸（例えば、自然には発生しないアミノ酸）を含有し得る。本発明のポリペプチドは、翻訳後処理等の自然過程、または当該技術分野において公知の化学的修飾技術のいずれかによって修飾され得る。かかる修飾は、基本の教科書、およびより詳細な論文、ならびに膨大な研究文献において十分に説明されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含む、ポリペプチドの任意の場所で生じ得る。当然のことながら、同一タイプの修飾は、同一または異なる程度で、所与のポリペプチドにおける複数の部位において存在し得る。また所与のポリペプチドは、多くのタイプの修飾を含有し得る。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分岐され得、また分岐を伴い、または伴わず、環状であり得る。環状、分岐、および分岐環状ポリペプチドは、翻訳後の自然過程から生じ得るか、または合成方法によって形成され得る。修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジリノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル反応、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ＰＥＧ付加、タンパク質分解処理、リン酸化反応、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化等のタンパク質に対するトランスファーＲＮＡ媒介アミノ酸付加、およびユビキチン化を含む。（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）、Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ．１−１２（１９８３）、Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−６４６（１９９０）、Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３：４８−６２（１９９２）を参照されたい）。
【００３９】
「フラグメント」、「変異体」、「誘導体」、および「類似体」という用語は、本発明のＳｅｍａ６Ａポリペプチドを参照する場合、少なくともある程度の免疫原性、すなわち、Ｓｅｍａ６Ａに対する免疫反応を誘発する能力、またはＳｅｍａ６Ａの任意の自然発生的機能、例えば、プレキシン−Ａサブファミリーポリペプチド、すなわち、プレキシン−Ａ１、プレキシン−Ａ２、プレキシン−Ａ３、またはプレキシン−Ａ４のうちの任意の１つに結合する能力を保持する、任意のポリペプチドを含む。自然発生的なＳｅｍａ６Ａ機能の例は、プレキシン−Ａ２またはプレキシン−Ａ４ポリペプチドに結合するその能力である。本明細書で説明されるようなＳｅｍａ６Ａポリペプチドは、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドが、免疫原性または自然発生的機能の任意の１つを依然として保持する限りにおいて、フラグメント、変異体、または誘導体分子を制限なく含み得る。本発明のＳｅｍａ６Ａポリペプチドは、Ｓｅｍａ６Ａタンパク質分解フラグメント、欠損フラグメント、特に、動物に送達されると、より簡単に作用部位に到達するフラグメントを含み得る。ポリペプチドフラグメントは、線形ならびに三次元エピトープを含む、天然ポリペプチドの抗原または免疫原性エピトープを含む、ポリペプチドの任意の部分をさらに含む。本発明のＳｅｍａ６Ａポリペプチドは、上述のようなフラグメントを含む、変異体Ｓｅｍａ６Ａ領域を含み、アミノ酸置換、欠損、または挿入による改変アミノ酸配列を有するポリペプチドも含む。変異体は、自然発生し得、それには対立遺伝子変異体等がある。「対立遺伝子変異体」とは、有機体の染色体上の特定位置を占有する遺伝子の代替型を意図する。Ｇｅｎｅｓ  ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８５）。自然発生しない変異体は、当該技術分野において既知の突然変異誘発法を使用して産生され得る。Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠損、または追加を含み得る。本発明のＳｅｍａ６Ａポリペプチドは、誘導体分子も含み得る。例えば、本発明のＳｅｍａ６Ａポリペプチドは、天然のポリペプチドでは認められない追加機能を呈するように改変されたＳｅｍａ６Ａ領域を含み得る。その例には、融合タンパク質およびタンパク質共役が含まれる。
【００４０】
本発明において、「ポリペプチドフラグメント」または「タンパク質フラグメント」は、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドの短いアミノ酸配列を意味する。タンパク質またはポリペプチドフラグメントは、「独立している」か、または該フラグメントが領域の一部を形成するより大きいポリペプチド内に包含され得る。本発明のポリペプチドフラグメントの代表的な例は、例えば、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約３０アミノ酸、約４０アミノ酸、約５０アミノ酸、約６０アミノ酸、約７０アミノ酸、約８０アミノ酸、約９０アミノ酸、および約１００アミノ酸を含むフラグメントである。
【００４１】
本明細書で使用される「結合した」、「融合した」、または「融合」という用語は同義的に使用される。かかる用語は、化学共役または組み換え手段を含む何らかの手段によって、２つ以上の要素または構成要素を結合することを意味する。「インフレーム融合（ｉｎ−ｆｒａｍｅ  ｆｕｓｉｏｎ）」は、２つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を結合し、オリジナルＯＲＦの正しいリーディングフレームを維持する方法で、連続する、より長いＯＲＦを形成することを意味する。したがって、結果として生じる組み換え融合タンパク質は、オリジナルＯＲＦによってコード化されるポリペプチドに対応する２つ以上のセグメント（かかるセグメントは、通常、自然では、結合されない）を含有する単一のタンパク質である。リーディングフレームは、そのようにして、融合セグメント全体で連続的に形成されるが、セグメントは、例えば、インフレームリンカー配列によって物理的または空間的に分離され得る。
【００４２】
ポリペプチドの文脈において、「直鎖状配列」または「配列」は、ポリペプチドにおけるアミノ酸の、アミノからカルボキシル末端への方向での順序であり、配列内で互いに隣接する残基は、ポリペプチドの一次構造において隣接する。
【００４３】
本明細書で使用される「発現」という用語は、遺伝子が生化学物質、例えばＲＮＡまたはポリペプチドを産生する過程を意味する。該過程は、細胞内での遺伝子のいかなる機能的存在の発現をも含み、遺伝子ノックダウンならびに一時的発現および安定発現の両方を含むむが、これらに限定されない。これには、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または任意の他のＲＮＡ産生物への遺伝子の転写、およびポリペプチドへのかかるｍＲＮＡの翻訳が含まれるが、これらに限定されない。最終的に望ましい産生物は生化学物質である場合、発現は、該生化学物質および任意の前駆体の形成を含む。
【００４４】
「対象」、「個別の」、「動物」、「患者」、または「哺乳動物」とは、診断、予後、または治療法が望まれる任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象は、ヒト、家畜、農場動物、動物園動物、競技用動物、愛玩動物（イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、肉牛、乳牛等）、霊長類（類人猿、サル、オランウータン、およびチンパンジー等）、イヌ科動物（イヌおよびオオカミ等）、ネコ科動物（ネコ、ライオン、およびトラ等）、ウマ科動物（ウマ、ロバ、およびシマウマ等）、クマ、食用動物（ウシ、ブタ、およびヒツジ等）、有蹄動物（シカおよびキリン等）、齧歯動物（マウス、ラット、ハムスター、およびモルモット等）等を含むが、これらに限定されない。ある実施形態においては、哺乳動物はヒト被験者である。
【００４５】
Ｓｅｍａ６Ａ
本発明は、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドが、それらの生存、増殖および／または分化を促進することによって、オリゴデンドロサイト数を増加させるという発見に基づく。加えて、本発明者は、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドがニューロンの髄鞘形成を促進することを発見した。
【００４６】
自然発生するヒトＳｅｍａ６Ａポリペプチドは、発達中の脳、腎臓、肺、および肝臓で発現することが知られている。Ｓｅｍａ６Ａは、皮膚（樹状細胞）等のヒト成人組織、および極めて再生力のある胎盤組織においても検出される。ヒトＳｅｍａ６Ａ遺伝子は、２つの非翻訳エクソンを含む２０エクソンから成り、染色体５上の約６０ｋｂのゲノム配列を占める。
【００４７】
全長ヒトＳｅｍａ６Ａポリペプチドは、シグナル配列、細胞外ドメイン、膜貫通領域、および細胞質ドメインから成る。細胞外ドメインは、Ｓｅｍａドメインおよびプレキシン−セマフォリン−インテグリン（ＰＳＩ）ドメインを含む。全長ヒトＳｅｍａ６Ａポリペプチドは、変異体によって、長さが約９７１アミノ酸から約１０４９アミノ酸まで異なる。図１を参照されたい。同様の変異体は、マウスＳｅｍａ６Ａにおいて生じる。例えば、図２を参照されたい。
【００４８】
１０３０ａａのポリペプチド配列は、ヒトＳｅｍａ６Ａポリペプチド配列として報告されており、ジェンバンクの受入番号はＮＰ−０６５８４７である。ヒトＳｅｍａ６Ａポリペプチド配列は、本明細書において、イソ型Ａおよび配列番号２として指定される。配列番号１は、配列番号２をコード化するヌクレオチド配列である。１０４７ａａのポリペプチド配列は、ヒトＳｅｍａ６Ａポリペプチド配列の変異体として報告されており、ジェンバンクの受入番号はＥＡＷ４８９３７である。１０４７ａａポリペプチドは、本明細書において、イソ型Ｂおよび配列番号４として指定される。配列番号４をコード化するヌクレオチド配列は配列番号３である。９７１ａａを有するヒトＳｅｍａ６Ａポリペプチドの別の変異体は、ジェンバンクの受入番号はＥＡＷ４８９３５である。９７１ａａポリペプチドは、本明細書において、イソ型Ｃおよび配列番号６として指定される。９７５ａａのポリペプチド配列は、ヒトＳｅｍａ６Ａポリペプチド変異体として報告されており、ジェンバンクの受入番号はＥＡＷ４８９３４である。９７５ａａポリペプチド配列は、本明細書において、イソ型Ｄおよび配列番号８として指定される。ヒトＳｅｍａ６Ａの変異体は、アミノ酸１００１以降が欠損して、１０００アミノ酸を有するポリペプチドになる、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドのイソ型Ａを含むが、これに限定されない。Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１２（１１）：１７７３-１７８４（２００２）、Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９（２６）：１６８９９−１６９０３（２００２）を参照されたい。他のＳｅｍａ６Ａ変異体も、例えば、Ｐｒｉｓｌｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．７（１）：２３３−２４１（２００７）において知られている。
【００４９】
マウスＳｅｍａ６Ａポリペプチド配列およびその変異体も報告されている。１０３１ａａマウスＳｅｍａ６ＡポリペプチドのＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔエントリにおける受入番号は、Ｏ３５４６４である。ポリペプチドは、本明細書において、イソ型１および配列番号１０として指定される。配列番号１０をコード化するヌクレオチド配列は、配列番号９として指定される。１００５ａａの別のポリペプチド配列は、マウスＳｅｍａ６Ａポリペプチド配列として報告されており、ジェンバンクの受入番号はＡＦ２８８６６６である。ポリペプチド配列は、イソ型２および配列番号１２として指定される。配列番号１２をコード化するヌクレオチド配列は、本明細書において、配列番号１１として指定される。マウスＳｅｍａ６Ａポリペプチド配列の別の変異体のＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔエントリにおける受入番号は、Ｏ３５４６４と報告されている。ポリペプチド配列は、本明細書において、イソ型３および配列番号１４として指定される。配列番号１４をコード化するヌクレオチド配列は、配列番号１３である。マウスＳｅｍａ６Ａの変異体は、以下の突然変異を有するポリペプチドを含むが、これらに限定されない。Ａ１７２Ｖ、Ｌ２０１Ｐ、Ｎ３３７Ｄ、Ｓ５８５Ｎ、Ｑ６８５Ｒ、ＴＫ７０３−７０４ＳＥ、Ｐ７３５Ｓ、Ｑ７６６Ｅ、Ｉ８５６Ｔ，またはＫＳＰＮＨＧＶＮＬＶＥＮＬＤＳＬＰＰＫＶＰＱＲＥＡＳ８６３−８８８ＥＳＳＰＹＶＬＫＱＦＳＥＡＦＮＲＱＧＩＩＬＳＶＡＶＥ。
【００５０】
他の動物において知られるＳｅｍａ６Ａポリペプチドは、チンパンジー、イヌ、およびゼブラフィッシュを含むが、これらに限定されない。チンパンジーＳｅｍａ６Ａポリペプチド、例えば、ジェンバンク受入番号ＸＰ＿００１１５０６３４、ＸＰ＿００１１５０９０１、ＸＰ＿００１１５０７０６、ＸＰ＿００１１５１１７７、ＸＰ＿００１１５１１０９、ＸＰ＿００１１５１０４１、ＸＰ＿００１１５０９７１、およびＸＰ＿５１７８８９が存在する。イヌＳｅｍａ６Ａポリペプチド変異体の限定されない実施例は、ジェンバンク受入番号ＸＰ＿５３８５５２、ＸＰ＿８５９００２、ＸＰ＿８５８９６４、ＸＰ＿８５８９２１、ＸＰ＿８５８８８６、およびＸＰ＿８５８８４３である。Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドおよび変異体は、他の動物において見出され得る。
【００５１】
Ｓｅｍａ６Ａ機能ドメイン指定は、以下のように定義され得る。
【００５２】
【表１】
0005492567.tif 000002
【００５３】
【表２】
0005492567.tif 000003
当業者が理解するように、上に列挙したドメインの開始および終了残基は、ドメインの決定に使用されるコンピュータモデリングプログラム、または方法に応じて異なり得る。したがって、Ｓｅｍａ６Ａの様々な機能ドメインは、上で定義したものとは異なり得る。例えば、ヒトＳｅｍａ６Ａポリペプチドイソ型Ａ、すなわち、配列番号２の機能ドメインは、以下のように異なり得る。
【００５４】
【表３】
0005492567.tif 000004
配列番号２における配列変異に基づいて、当業者は、配列番号４、６、および８における配列変異を確認することができる。
【００５５】
配列番号１０における機能ドメインの配列、すなわち、マウスＳｅｍａ６Ａポリペプチド配列のイソ型１は、以下のように異なる。
【００５６】
【表４】
0005492567.tif 000005
加えて、マウスまたは他の動物における配列番号１２または１４の配列変異、あるいは任意の他の変異体は、表２〜４に基づいて容易に確認することができる。
【００５７】
プレキシン−Ａ２
プレキシン−Ａ２ポリペプチドは、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドに結合することが知られている。Ｓｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ  ５３：５３５（２００７）を参照されたい。全長ヒトプレキシン−Ａ２ポリペプチド（配列番号１５）は、シグナル配列、細胞外ドメイン、膜貫通領域、および細胞質ドメインから成る。細胞外ドメインは、Ｓｅｍａドメインおよび４つのＩＰＴ／ＴＩＧドメイン、すなわち、ＩＰＴ／ＴＩＧ１〜４を含む。Ｓｅｍａドメインは、配列番号１５のアミノ酸０〜５２３である。ＩＰＴ／ＴＩＧドメイン１〜４は、それぞれ配列番号１５のアミノ酸８７３〜９６７、９６７〜１０５３、１０５６〜１１５５、および１１５８〜１２５１である。当業者が理解するように、上で列挙したドメインの開始および終了残基は、ドメインの決定に使用されるコンピュータモデリングプログラム、または方法に応じて異なり得る。
【００５８】
全長ヒトプレキシン−Ａ２ポリペプチドの配列は多様である。プレキシン−Ａ２ポリペプチド変異体の一例は、１８９４ａａ配列を有し、ジェンバンクの受入番号はＮＰ０７９４５５である。また他の動物からのプレキシン−Ａ２配列も、当該技術分野において公知である。例えば、マウスプレキシン−Ａ２ポリペプチドは、当該技術分野において周知であり、ジェンバンクにおいて、ＮＰ＿０３２９０８、ＡＡＨ６８１５５、ＥＤＬ１２９３８、ＥＤＬ１２９３７、およびＮＰ＿７８６９２６として報告されている。
【００５９】
プレキシン−Ａ４
プレキシン−Ａ４は、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドの受容体であることも知られている。Ｓｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ  ５３：５３５（２００７）を参照されたい。全長ヒトプレキシン−Ａ４ポリペプチド（配列番号１６）は、シグナル配列、細胞外ドメイン、膜貫通領域、および細胞質ドメインから成る。細胞外ドメインは、Ｓｅｍａドメイン、３つのＰＳＩドメイン、すなわち、ＰＳＩ１〜３、および４つのＩＰＴ／ＴＩＧドメイン、すなわち、ＩＰＴ／ＴＩＧ１〜４を含む。Ｓｅｍａドメインは、配列番号１６のアミノ酸２４〜５０７である。ＰＳＩドメイン１〜３は、それぞれ配列番号１６のアミノ酸５０９〜５５９、６５５〜７０２、および８０３〜８５６である。プレキシン−Ａ４ポリペプチドのＩＰＴ／ＴＩＧドメイン１〜４は、それぞれ配列番号１６のアミノ酸８５８〜９５２、９５４〜１０３７、１０４０〜１１３９、および１１４２〜１２３０である。熟練者であれば、上で列挙したドメインの開始および終了残基が、ドメインを決定するために使用されるコンピュータモデリングプログラム、または方法に応じて異なり得ることを理解する。
【００６０】
全長ヒトプレキシン−Ａ４ポリペプチドの配列は多様である。例えば、プレキシン−Ａ４の複数の変異体は、ジェンバンクにおいて、ＥＡＷ８３７９６、ＮＰ＿００１０９９０１３、ＥＡＷ８３７９５、ＡＡＨ２８７４４、およびＥＡＬ２４０７７として報告されている。さらに、他の動物からのプレキシン−Ａ４配列も報告されている。例えば、マウスプレキシン−Ａ４ポリペプチドは、ジェンバンクにおいて、ＮＰ＿７８６９２６、ＢＡＣ５６５９９、ＥＤＬ１３７０５、およびＥＤＬ１３７０４として報告されている。
【００６１】
本発明の一部の実施形態は、全長または成熟Ｓｅｍａ６Ａポリペプチド、あるいは可溶性Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドを提供する。具体的には、本発明の可溶性Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、全長または成熟Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドのフラグメント、変異体、またはその誘導体を含む。上記の表１〜４は、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドの様々な機能ドメインを説明する。本発明の可溶性Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、概して、ポリペプチドの細胞外ドメインの一部またはすべてを含む。可溶性Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、概して、膜貫通領域および／または細胞質ドメインを欠失する。当業者が理解するように、Ｓｅｍａ６Ａの細胞外ドメイン全体は、細胞外ドメインポリペプチドのＣ末端またはＮ末端のいずれかに追加またはより少ないアミノ酸を含んでもよく、内部欠損を含み得る。
【００６２】
本発明の方法において使用するためのヒトＳｅｍａ６Ａポリペプチドは、参照アミノ酸配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、本質的に当該アミノ酸配列から成る、または当該アミノ酸配列から成るＳｅｍａ６Ａポリペプチドを含むが、これらに限定されず、当該参照アミノ酸配列は、配列番号２の５６〜４１７、配列番号２のａ〜４１７、配列番号２のｂ〜４１７、配列番号２の１〜４１７、配列番号２の５６〜ｃ、配列番号２のａ〜ｃ、配列番号２のｂ〜ｃ、配列番号２の１〜ｃ、配列番号６の５６〜ｃ’、配列番号６のａ〜ｃ’、配列番号６のｂ〜ｃ’、配列番号６の１〜ｃ’、配列番号２の５６〜ｄ、配列番号２のａ〜ｄ、配列番号２のｂ〜ｄ、配列番号２の１〜ｄ、配列番号６の５６〜ｄ’、配列番号６のａ〜ｄ’、配列番号６のｂ〜ｄ’、配列番号６の１〜ｄ’、配列番号２の５６〜ｅ、配列番号２のａ〜ｅ、配列番号２のｂ〜ｅ、配列番号２の１〜ｅ、配列番号６の５６〜ｅ’、配列番号６のａ〜ｅ’、配列番号６のｂ〜ｅ’、配列番号６の１〜ｅ’、配列番号８の５６〜ｅ’’、配列番号８のａ〜ｅ’’、配列番号８のｂ〜ｅ’’、配列番号８の１〜ｅ’’、配列番号４の５６〜ｅ’’’、配列番号４のａ〜ｅ’’’、配列番号６のｂ〜ｅ’’’、配列番号８の１〜ｅ’’’、配列番号２の５６〜ｆ、配列番号２のａ〜ｆ、配列番号２のｂ〜ｆ、配列番号２の１〜ｆ、配列番号６の５６〜ｆ’、配列番号６のａ〜ｆ’、配列番号６のｂ〜ｆ’、配列番号６の１〜ｆ’、配列番号８の５６〜ｆ’’、配列番号８のａ〜ｆ’’、配列番号８のｂ〜ｆ’’、配列番号８の１〜ｆ’’、配列番号４の５６〜ｆ’’’、配列番号４のａ〜ｆ’’’、配列番号４のｂ〜ｆ’’’、配列番号４の１〜ｆ’’’、のアミノ酸、および２つ以上の当該アミノ酸配列の組み合わせから成る群より選択され、ａは２４から５６までの間の任意の整数であり、ｂは１９から２１までの間の任意の整数であり、ｃは４７２から５１２までの間の任意の整数であり、ｃ’は４１８から４５３までの間の任意の整数であり、ｄは５１４から５６９までの間の任意の整数であり、ｄ’は４５５から５１０までの間の任意の整数であり、ｅは５７０から６５０までの間の任意の整数であり、ｅ’は５１１から５９１までの間の任意の整数であり、ｅ’’は５７０から５９５までの間の任意の整数であり、ｅ’’’は５７０から６６７までの間の任意の整数であり、ｆは６４７から６７１までの間の任意の整数であり、ｆ’は５８８から６１２までの間の任意の整数であり、ｆ’’は５９２から６１６までの間の任意の整数であり、ｆ’’’は６６４から６８８までの間の任意の整数である。ある実施形態においては、本発明の方法において使用するためのＳｅｍａ６Ａポリペプチドは、プレキシン−Ａ２またはプレキシン−Ａ４ポリペプチドに結合する。
【００６３】
ある実施形態においては、本発明の方法において使用するためのヒトＳｅｍａ６Ａポリペプチドは、参照アミノ酸配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、本質的に当該アミノ酸配列から成る、または当該アミノ酸配列から成るＳｅｍａ６Ａポリペプチドを含み、当該参照アミノ酸配列は、配列番号８の１〜９７５、配列番号２の１９〜４１７、配列番号２の１９〜４７２、配列番号２の１９〜５５１、配列番号６の１９〜４９２、配列番号２の１９〜６４７、配列番号６の１９〜５８８、配列番号８の１９〜５９２、配列番号４の１９〜６６４、配列番号２の５６〜４７２、配列番号２の５６〜５５１、配列番号６の５６〜４９２、配列番号２の５６〜６４７、配列番号６の５６〜５８８、配列番号８の５６〜５９２、配列番号４の５６〜６６４、配列番号２の１〜６４９［Ｒ＆Ｄからの、ヒトＳｅｍａ６Ａ−Ｆｃ］、配列番号６の１〜５９０、配列番号８の１〜５９４、配列番号４の１〜６６６、配列番号２の１８〜７０３、配列番号６の１８〜６４４、配列番号８の１８〜６４８、配列番号４の１８〜７２０、配列番号２の１〜６４８、配列番号６の１〜５８９、配列番号８の１〜５９３、配列番号４の１〜６６５、のアミノ酸および２つ以上の当該アミノ酸配列の組み合わせから成る群より選択される。別の実施形態においては、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、プレキシン−Ａ２またはプレキシン−Ａ４ポリペプチドに結合する。
【００６４】
別の実施形態においては、本発明の方法において使用するためのヒトＳｅｍａ６Ａポリペプチドは、参照アミノ酸配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、本質的に当該アミノ酸配列から成る、または当該アミノ酸配列から成るＳｅｍａ６Ａポリペプチドを含み、当該参照アミノ酸配列は、配列番号２の５６〜４１７、配列番号２の５５〜４１７、配列番号２の５４〜４１７、配列番号２の５３〜４１７、配列番号２の５２〜４１７、配列番号２の５１〜４１７、配列番号２の５０〜４１７、配列番号２の４９〜４１７、配列番号２の４８〜４１７、配列番号２の４７〜４１７、配列番号２の４６〜４１７、配列番号２の４５〜４１７、配列番号２の４４〜４１７、配列番号２の４３〜４１７、配列番号２の４２〜４１７、配列番号２の４１〜４１７、配列番号２の４０〜４１７、配列番号２の３９〜４１７、配列番号２の３８〜４１７、配列番号２の３７〜４１７、配列番号２の３６〜４１７、配列番号２の３５〜４１７、配列番号２の３４〜４１７、配列番号２の３３〜４１７、配列番号２の３２〜４１７、配列番号２の３１〜４１７、配列番号２の３０〜４１７、配列番号２の２９〜４１７、配列番号２の２８〜４１７、配列番号２の２７〜４１７、配列番号２の２６〜４１７、配列番号２の２５〜４１７、配列番号２の２４〜４１７、配列番号２の２３〜４１７、配列番号２の２２〜４１７、配列番号２の２１〜４１７、配列番号２の２０〜４１７、配列番号２の１９〜４１７、配列番号２の１８〜４１７、配列番号２の１７〜４１７、配列番号２の１６〜４１７、配列番号２の１５〜４１７、配列番号２の１４〜４１７、配列番号２の１３〜４１７、配列番号２の１２〜４１７、配列番号２の１１〜４１７、配列番号２の１０〜４１７、配列番号２の９〜４１７、配列番号２の８〜４１７、配列番号２の７〜４１７、配列番号２の６〜４１７、配列番号２の５〜４１７、配列番号２の４〜４１７、配列番号２の３〜４１７、配列番号２の２〜４１７、配列番号２の１〜４１７の、アミノ酸および２つ以上の当該アミノ酸配列の組み合わせから成る群より選択され、当該Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、プレキシン−Ａ２ポリペプチドを結合する。
【００６５】
本発明の方法において使用するためのヒトＳｅｍａ６Ａポリペプチドを含むさらなる実施形態は、参照アミノ酸配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、本質的に当該アミノ酸配列から成る、または当該アミノ酸配列から成るＳｅｍａ６Ａポリペプチドを含み、当該参照アミノ酸配列は、配列番号２の４０〜４７２、配列番号２の４１〜４７２、配列番号２の４２〜４７２、配列番号２の４３〜４７２、配列番号２の４４〜４７２、配列番号２の４５〜４７２、配列番号２の４６〜４７２、配列番号２の４７〜４７２、配列番号２の４８〜４７２、配列番号２の４９〜４７２、配列番号２の５０〜４７２、配列番号２の５１〜４７２、配列番号２の５２〜４７２、配列番号２の５３〜４７２、配列番号２の５４〜４７２、配列番号２の５５〜４７２、配列番号２の５６〜４７２、配列番号２の５７〜４７２、配列番号２の５８〜４７２、配列番号２の５９〜４７２、配列番号２の６０〜４７２、配列番号２の５６〜４６５、配列番号２の５６〜４６６、配列番号２の５６〜４６７、配列番号２の５６〜４６８、配列番号２の５６〜４６９、配列番号２の５６〜４７０、配列番号２の５６〜４７１、配列番号２の５６〜４７２、配列番号２の５６〜４７３、配列番号２の５６〜４７４、配列番号２の５６〜４７５、配列番号２の５６〜４７６、配列番号２の５６〜４７７、配列番号２の５６〜４７８、配列番号２の５６〜４７９、配列番号２の５６〜４８０の、アミノ酸および２つ以上の当該アミノ酸配列の組み合わせから成る群より選択される。
【００６６】
本発明の方法において使用するためのヒトＳｅｍａ６Ａポリペプチドを含むさらなる実施形態は、参照アミノ酸配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、本質的に当該アミノ酸配列から成る、または当該アミノ酸配列から成るＳｅｍａ６Ａポリペプチドを含み、当該参照アミノ酸配列は、配列番号２の１〜５５１、配列番号２の１〜５５２、配列番号２の１〜５５３、配列番号２の１〜５５４、配列番号２の１〜５５５、配列番号２の１〜５５６、配列番号２の１〜５５７、配列番号２の１〜５５８、配列番号２の１〜５５９、配列番号２の１〜５６０、配列番号２の１〜５６１、配列番号２の１〜５６２、配列番号２の１〜５６３、配列番号２の１〜５６４、配列番号２の１〜５６５、配列番号２の１〜５６６、配列番号２の１〜５６７、配列番号２の１〜５６８、配列番号２の１〜５６９、配列番号２の１〜５７０、配列番号２の１〜５７１、配列番号２の１〜５７１、配列番号２の１〜５７２、配列番号２の１〜５７３、配列番号２の１〜５７４、配列番号２の１〜５７５、配列番号２の１〜５７６、配列番号２の１〜５７７、配列番号２の１〜５７８、配列番号２の１〜５７９、配列番号２の１〜５８０、配列番号２の１〜５８１、配列番号２の１〜５８２、配列番号２の１〜５８３、配列番号２の１〜５８４、配列番号２の１〜５８５、配列番号２の１〜５８６、配列番号２の１〜５８７、配列番号２の１〜５８８、配列番号２の１〜５８９、配列番号２の１〜５９０、配列番号２の１〜５９１、配列番号２の１〜５９２、配列番号２の１〜５９３、配列番号２の１〜５９４、配列番号２の１〜５９６、配列番号２の１〜５９７、配列番号２の１〜５９８、配列番号２の１〜５９９、配列番号２の１〜６００の、アミノ酸および２つ以上の当該アミノ酸配列の組み合わせから成る群より選択される。
【００６７】
他の実施形態においては、本発明の方法において使用するためのヒトＳｅｍａ６Ａポリペプチドのさらなる実施形態は、参照アミノ酸配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、本質的に当該アミノ酸配列から成る、または当該アミノ酸配列から成るＳｅｍａ６Ａポリペプチドを含み、当該参照アミノ酸配列は、配列番号２の１〜６４９、配列番号２の２〜６４９、配列番号２の３〜６４９、配列番号２の４〜６４９、配列番号２の５〜６４９、配列番号２の６〜６４９、配列番号２の７〜６４９、配列番号２の８〜６４９、配列番号２の９〜６４９、配列番号２の１０〜６４９、配列番号２の１１〜６４９、配列番号２の１２〜６４９、配列番号２の１３〜６４９、配列番号２の１４〜６４９、配列番号２の１５〜６４９、配列番号２の１６〜６４９、配列番号２の１７〜６４９、配列番号２の１８〜６４９、配列番号２の１９〜６４９、配列番号２の２０〜６４９、配列番号２の２１〜６４９、配列番号２の２２〜６４９、配列番号２の２３〜６４９、配列番号２の２４〜６４９、配列番号２の２５〜６４９、配列番号２の２６〜６４９の、アミノ酸および２つ以上の当該アミノ酸配列の組み合わせから成る群より選択される。
【００６８】
本発明の方法は、参照アミノ酸配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、本質的に当該アミノ酸配列から成る、または当該アミノ酸配列から成るＳｅｍａ６Ａポリペプチドをさらに含み、当該参照アミノ酸配列は、配列番号２の１〜６４０、配列番号２の１〜６４１、配列番号２の１〜６４２、配列番号２の１〜６４３、配列番号２の１〜６４４、配列番号２の１〜６４５、配列番号２の１〜６４６、配列番号２の１〜６４７、配列番号２の１〜６４８、配列番号２の１〜６４９、配列番号２の１〜６５０、配列番号２の１〜６５１、配列番号２の１〜６５２、配列番号２の１〜６５３、配列番号２の１〜６５４、配列番号２の１〜６５５、配列番号２の１〜６５６、配列番号２の１〜６５７、配列番号２の１〜６５８、配列番号２の１〜６５９、配列番号２の１〜６６０、配列番号２の１〜６６１、配列番号２の１〜６６２、配列番号２の１〜６６３、配列番号２の１〜６６４、配列番号２の１〜６６５、配列番号２の１〜６６６、配列番号２の、配列番号２の１〜６６８、配列番号２の１〜６６９、配列番号２の１〜６７０の、アミノ酸および２つ以上の当該アミノ酸配列の組み合わせから成る群より選択される。
【００６９】
本発明の方法は、参照アミノ酸配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、本質的に当該アミノ酸配列から成る、または当該アミノ酸配列から成るＳｅｍａ６Ａポリペプチドをさらに含み、当該参照アミノ酸配列は、配列番号４の１〜５７０、配列番号４の１〜５７１、配列番号４の１〜５７２、配列番号４の１〜５７３、配列番号４の１〜５７４、配列番号４の１〜５７５、配列番号４の１〜５７６、配列番号４の１〜５７７、配列番号４の１〜５７８、配列番号４の１〜５７９、配列番号４の１〜５８０、配列番号４の１〜５８１、配列番号４の１〜５８２、配列番号４の１〜５８３、配列番号４の１〜５８４、配列番号４の１〜５８５、配列番号４の１〜５８６、配列番号４の１〜５８７、配列番号４の１〜５８８、配列番号４の１〜５８９、配列番号４の１〜５９０の、アミノ酸および２つ以上の当該アミノ酸配列の組み合わせから成る群より選択される。
【００７０】
本発明の方法は、参照アミノ酸配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、本質的に当該アミノ酸配列から成る、または当該アミノ酸配列から成るＳｅｍａ６Ａポリペプチドをさらに含み、当該参照アミノ酸配列は、配列番号４の１〜６３０、配列番号４の１〜６３１、配列番号４の１〜６３２、配列番号４の１〜６３４、配列番号４の１〜６３５、配列番号４の１〜６３６、配列番号４の１〜６３７、配列番号４の１〜６３３、配列番号４の１〜６３８、配列番号４の１〜６３９、配列番号４の１〜６４０、配列番号４の１〜６４１、配列番号４の１〜６４２、配列番号４の１〜６４３、配列番号４の１〜６４４、配列番号４の１〜６４５、配列番号４の１〜６４６、配列番号４の１〜６４７、配列番号４の１〜６４８、配列番号４の１〜６４９、配列番号４の１〜６５０、配列番号４の１〜６５１、配列番号４の１〜６５２、配列番号４の１〜６５３、配列番号４の１〜６５４、配列番号４の１〜６５５、配列番号４の１〜６５６、配列番号４の１〜６５７、配列番号４の１〜６５８、配列番号４の１〜６５９、配列番号４の１〜６６０、配列番号４の１〜６６１、配列番号４の１〜６６２、配列番号４の１〜６６３、配列番号４の１〜６６４、配列番号４の１〜６６５、配列番号４の１〜６６６の、アミノ酸および２つ以上の当該アミノ酸配列の組み合わせから成る群より選択される。
【００７１】
本発明の方法は、参照アミノ酸配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、本質的に当該アミノ酸配列から成る、または当該アミノ酸配列から成るＳｅｍａ６Ａポリペプチドをさらに含み、当該参照アミノ酸配列は、配列番号６の４５〜４９２、配列番号６の４６〜４９２、配列番号６の４７〜４９２、配列番号６の４８〜４９２、配列番号６の４９〜４９２、配列番号６の５０〜４９２、配列番号６の５１〜４９２、配列番号６の５２〜４９２、配列番号６の５３〜４９２、配列番号６の５４〜４９２、配列番号６の５５〜４９２、配列番号６の５６〜４９２、配列番号６の５７〜４９２、配列番号６の５８〜４９２、配列番号６の５９〜４９２、配列番号６の６０〜４９２、配列番号６の６１〜４９２、配列番号６の５６〜４８５、配列番号６の５６〜４８６、配列番号６の５６〜４８７、配列番号６の５６〜４８８、配列番号６の５６〜４８９、配列番号６の５６〜４９０、配列番号６の５６〜４９１、配列番号６の５６〜４９２、配列番号６の５６〜４９３、配列番号６の５６〜４９４、配列番号６の５６〜４９５、配列番号６の５６〜４９６、配列番号６の５６〜４９７、配列番号６の５６〜４９８、配列番号６の５６〜５９９の、アミノ酸および２つ以上の当該アミノ酸配列の組み合わせから成る群より選択される。
【００７２】
本発明の方法は、参照アミノ酸配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、本質的に当該アミノ酸配列から成る、または当該アミノ酸配列から成るＳｅｍａ６Ａポリペプチドをさらに含み、当該参照アミノ酸配列は、配列番号６の１〜５８０、配列番号６の１〜５８１、配列番号６の１〜５８３、配列番号６の１〜５８４、配列番号６の１〜５８５、配列番号６の１〜５８６、配列番号６の１〜５８７、配列番号６の１〜５８８、配列番号６の１〜５８９、配列番号６の１〜５９０、配列番号６の１〜５９１、配列番号６の１〜５９２、配列番号６の１〜５９３、配列番号６の１〜５９４、配列番号６の１〜５９５、配列番号６の１〜５９６、配列番号６の１〜５９７、配列番号６の１〜５９８、配列番号６の１〜５９９、配列番号６の１〜６００、配列番号６の２〜５９０、配列番号６の３〜５９０、配列番号６の４〜５９０、配列番号６の５〜５９０、配列番号６の６〜５９０、配列番号６の７〜５９０、配列番号６の８〜５９０、配列番号６の９〜５９０、配列番号６の１０〜５９０、配列番号６の１１〜５９０、配列番号６の１２〜５９０、配列番号６の１３〜５９０、配列番号６の１４〜５９０、配列番号６の１５〜５９０、配列番号６の１６〜５９０、配列番号６の１７〜５９０、配列番号６の１８〜５９０、配列番号６の１９〜５９０の、アミノ酸および２つ以上の当該アミノ酸配列の組み合わせから成る群より選択される。
【００７３】
本発明の方法は、参照アミノ酸配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、本質的に当該アミノ酸配列から成る、または当該アミノ酸配列から成るＳｅｍａ６Ａポリペプチドをさらに含み、当該参照アミノ酸配列は、配列番号８の５６〜５８０、配列番号８の５６〜５８１、配列番号８の５６〜５８３、配列番号８の５６〜５８４、配列番号８の５６〜５８５、配列番号８の５６〜５８６、配列番号８の５６〜５８７、配列番号８の５６〜５８８、配列番号８の５６〜５８９、配列番号８の５６〜５９０、配列番号８の５６〜５９１、配列番号８の５６〜５９２、配列番号８の５６〜５９３、配列番号８の５６〜５９４、配列番号８の５６〜５９５、配列番号８の５６〜５９６、配列番号８の５６〜５９７、配列番号８の５６〜５９８、配列番号８の５６〜５９９、配列番号８の５６〜６００、配列番号８の５６〜６０１、配列番号８の５６〜６０２、配列番号８の５６〜６０３、配列番号８の５６〜６０４、配列番号８の５６〜６０５、配列番号８の４５〜５９５、配列番号８の４６〜５９５、配列番号８の４７〜５９５、配列番号８の４８〜５９５、配列番号８の４９〜５９５、配列番号８の５０〜５９５、配列番号８の５１〜５９５、配列番号８の５２〜５９５、配列番号８の５３〜５９５、配列番号８の５４〜５９５、配列番号８の５５〜５９５の、アミノ酸および２つ以上の当該アミノ酸配列の組み合わせから成る群より選択される。
【００７４】
本発明の方法は、参照アミノ酸配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、本質的に当該アミノ酸配列から成る、または当該アミノ酸配列から成るＳｅｍａ６Ａポリペプチドをさらに含み、当該参照アミノ酸配列は、配列番号８の１〜５８０、配列番号８の１〜５８１、配列番号８の１〜５８３、配列番号８の１〜５８４、配列番号８の１〜５８５、配列番号８の１〜５８６、配列番号８の１〜５８７、配列番号８の１〜５８８、配列番号８の１〜５８９、配列番号８の１〜５９０、配列番号８の１〜５９１、配列番号８の１〜５９２、配列番号８の１〜５９３、配列番号８の１〜５９４、配列番号８の１〜５９５、配列番号８の１〜５９６、配列番号８の１〜５９７、配列番号８の１〜５９８、配列番号８の１〜５９９、配列番号８の１〜６００、配列番号８の１〜６０１、配列番号８の１〜６０２、配列番号８の１〜６０３、配列番号８の１〜６０４、配列番号８の１〜６０５、配列番号８の２〜５９５、配列番号８の３〜５９５、配列番号８の４〜５９５、配列番号８の５〜５９５、配列番号８の６〜５９５、配列番号８の７〜５９５、配列番号８の８〜５９５、配列番号８の９〜５９５、配列番号８の１０〜５９５、配列番号８の１１〜５９５、配列番号８の１２〜５９５、配列番号８の１３〜５９５、配列番号８の１４〜５９５、配列番号８の１５〜５９５、配列番号８の１６〜５９５、配列番号８の１７〜５９５、配列番号８の１８〜５９５、配列番号８の１９〜５９５の、アミノ酸および２つ以上の当該アミノ酸配列の組み合わせから成る群より選択される。
【００７５】
ある実施形態においては、本発明のＳｅｍａ６Ａポリペプチドは、プレキシン−Ａサブファミリーポリペプチドに結合する。例えば、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、プレキシン−Ａ１ポリペプチド、プレキシン−Ａ２ポリペプチド、プレキシン−Ａ３ポリペプチド、またはプレキシン−Ａ４ポリペプチドに結合する。他の実施形態においては、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは単離され得る。
【００７６】
「参照アミノ酸配列」とは、任意のアミノ酸置換の導入がない特定の配列を意味する。当業者が理解するように、置換がない場合、本発明の「単離ポリペプチド」は、参照アミノ酸配列に同一のアミノ酸配列を含む。
【００７７】
本明細書に記載のＳｅｍａ６Ａポリペプチドは、置換、挿入、または欠損等の様々な改変を有し得る。ポリペプチドにおいて置換され得る例示的なアミノ酸は、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香性側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。
【００７８】
本明細書に記載のポリペプチドおよび参照ポリペプチドに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一である、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドの対応するフラグメントも考慮される。
【００７９】
当該技術分野で既知のとおり、２つのポリペプチド間の「配列同一性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列を第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。本明細書で説明される際、任意の特定のポリペプチドが、別のポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるかどうかは、限定されないが、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｕｎｉｘ（登録商標）用ウィスコンシン配列解析パッケージバージョン８，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７１１）等の当該技術分野において既知の方法およびコンピュータプログラム／ソフトウェアを使用して、決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ２：４８２−４９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムを使用して、２つの配列間相同性の最適なセグメントを見出す。ＢＥＳＴＦＩＴまたは任意の他の配列調整プログラムを使用して、特定の配列が、例えば、本発明に従う参照配列に対して９５％同一であるかどうかを決定する場合、パラメータは、当然のことながら、同一性の割合（％）が、参照ポリペプチド配列の全長にわたって計算され、相同性の差が参照配列におけるアミノ酸の総数の最大５％まで許容されるように設定される。
【００８０】
本発明の方法において、本発明のＳｅｍａ６Ａポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントは、事前に形成したポリペプチドとして直接投与され得る。本明細書の他所で論じられるように、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、細胞によって取り込まれ、そこで発現するポリヌクレオチドとして投与することもできる。例えば、Ｓｅｍａ６Ａをコード化するポリヌクレオチドは、ウイルスベクターとして投与され得る。
【００８１】
Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドを使用する治療方法
本発明の一実施形態は、多発性硬化症等の髄鞘形成不全または脱髄に関連した疾病、疾患、または損傷を、かかる疾病に罹患する動物において治療するための方法であって、有効量のＳｅｍａ６Ａポリペプチドまたはそのフラグメント、溶解Ｓｅｍａ６Ａポリペプチド、またはその変異体、誘導体、または類似体を、動物に投与するステップを含む、本質的に当該ステップから成る、または当該ステップから成る方法を提供する。
【００８２】
加えて、本発明は、哺乳動物において、ニューロンの髄鞘形成を促進するための方法であって、治療有効量のＳｅｍａ６Ａポリペプチドまたはそのフラグメント、可溶性Ｓｅｍａ６Ａポリペプチド、およびその変異体、誘導体、または類似体を投与するステップを含む、本質的に当該ステップから成る、または当該ステップから成る方法を対象とする。
【００８３】
本発明の追加の態様は、多発性硬化症、ペリツェウス・メルツバッヘル病、またはグロボイド細胞白質ジストロフィー（クラッベ病）等のオリゴデンドロサイト細胞死または分化の欠失に関連した疾病、疾患、または損傷を、かかる疾病に罹患する動物において治療するための方法であって、有効量のＳｅｍａ６Ａポリペプチドまたはそのフラグメント、可溶性Ｓｅｍａ６Ａポリペプチド、およびその変異体、誘導体、または類似体を、投与するステップを含む、本質的に当該ステップから成る、または当該ステップから成る方法を提供する。
【００８４】
本発明の別の態様は、哺乳動物において、オリゴデンドロサイトの増殖、分化、および生存を促進するための方法であって、治療有効量のＳｅｍａ６Ａポリペプチドまたはそのフラグメント、可溶性Ｓｅｍａ６Ａポリペプチド、およびその変異体、誘導体、または類似体を投与するステップを含む、本質的に当該ステップから成る、または当該ステップから成る方法を含む。
【００８５】
本発明は、オリゴデンドロサイトの増殖、分化、および生存を促進するための方法であって、オリゴデンドロサイトを、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドを含む有効量の組成物と接触させるステップを含む方法を対象とする。本発明は、ニューロンのオリゴデンドロサイト媒介髄鞘形成を促進するための方法であって、ニューロンおよびオリゴデンドロサイトの混合物を、単離Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドを含む有効量の組成物と接触させるステップを含む方法をさらに対象とする。
【００８６】
本明細書で開示する治療方法において使用されるＳｅｍａ６Ａポリペプチドは、Ｓｅｍａ６Ａの能力を誘発、促進、活性化、または刺激する治療薬として調製および使用して、オリゴデンドロサイトによるニューロンの髄鞘形成を調節することができる。加えて、本明細書で開示する治療方法において使用されるＳｅｍａ６Ａポリペプチドは、Ｓｅｍａ６Ａの能力を誘発、促進、活性化、または刺激する治療薬として調製および使用して、オリゴデンドロサイト分化、増殖、および生存を調節することができる。
【００８７】
本発明のさらなる実施形態は、オリゴデンドロサイトの増殖または生存を誘発して、オリゴデンドロサイトまたはミエリンの破壊を伴う疾病、疾患、または損傷を治療する方法であって、疾病、疾患、または損傷の部位、またはその付近において、軸策伸長の阻害を低減し、髄鞘形成を促進するために十分な量を哺乳動物に投与する方法を含む。
【００８８】
別の実施形態においては、本発明は、哺乳動物において、オリゴデンドロサイトの増殖、分化、または生存を促進するための方法であって、本明細書で開示するＳｅｍａ６Ａポリペプチドをコード化する単離ポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与する方法、または哺乳動物において、ニューロンの髄鞘形成を促進するための方法であって、本明細書で開示するＳｅｍａ６Ａポリペプチドをコード化する単離ポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を、その哺乳動物に投与する方法を対象とする。
【００８９】
本発明は、哺乳動物において、ミエリンの破壊、あるいは髄鞘形成不全または脱髄に関連した疾病、疾患、または損傷、あるいはオリゴデンドロサイト細胞死または分化の欠失に関連した疾病、疾患、または損傷を治療するための方法であって、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドをコード化する単離ポリヌクレオチドを含む治療有効量の組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与するステップを含む方法を含む。
【００９０】
本発明の方法において、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、患者に対してＳｅｍａ６Ａポリペプチドの直接投与によって投与することができる。代替として、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、特定のＳｅｍａ６Ａポリペプチドを産生する発現ベクターを介して投与することができる。本発明のある実施形態においては、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、（１）Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドを発現する、核酸、例えばベクターを有する移植可能な宿主細胞を形質転換または遺伝子導入するステップと、（２）形質転換した宿主細胞を、疾病、疾患、または損傷の部位において、哺乳動物に移植するステップと、を含む、治療方法において投与される。例えば、形質転換した宿主細胞は、ＭＳの慢性病巣の部位に移植することができる。本発明の一部の実施形態においては、移植可能な宿主細胞は、哺乳動物から摂取し、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドをコード化する単離核酸を用いて一時的に培養、形質転換、または遺伝子導入し、それを採取した同一の哺乳動物に移植し戻す。細胞は、それが移植される同一部位から摂取することができるが、そうである必要はない。かかる実施形態は、生体外遺伝子治療法として知られる場合があり、限定された時間で、作用の部位に局在するＳｅｍａ６Ａポリペプチドの連続供給を提供することができる。
【００９１】
本発明の方法によって治療または緩和され得る疾病または疾患は、哺乳動物ニューロンの髄鞘形成不全または脱髄に関連する疾病、疾患、または損傷を含む。具体的には、ニューロンを取り囲むミエリンが、欠失している、不完全である、適切に形成されていない、または悪化している疾病および疾患を含む。かかる疾病は、多発性硬化症（ＭＳ）の再発、緩和、二次進行性、および一次進行性形態を含むＭＳ、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中心髄鞘崩壊症（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス・メルツバッヘル病（ＰＭＺ）、グロボイド細胞白質ジストロフィー（クラッベ病）、ウォラー変性、視神経炎、および横断脊髄炎を含むが、これらに限定されない。
【００９２】
本発明の方法によって治療または緩和され得る疾病または疾患は、神経変性疾病または疾患を含む。かかる疾病は、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、アルツハイマー病、およびパーキンソン病を含むが、これらに限定されない。
【００９３】
本発明の方法によって治療または緩和され得る追加の疾病、疾患、または損傷の例は、脊髄損傷、慢性脊髄症または神経根障害、外傷性脳損傷、運動ニューロン疾患、軸索せん断、打撲傷、麻痺、放射線照射後の傷害または化学療法の他の神経学的合併症、脳梗塞、大ラクナ、中規模から大規模の血管閉塞、びまん性白質病変、脳梗塞、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠乏（単独欠損症、ＡＲ、バッセン・コーンツヴァイク症候群）、Ｂ１２、Ｂ６（ピリドキシン−ペラグラ）、チアミン、葉酸、ニコチン酸欠乏、マルキアファーヴァ・ビニャミ症候群、異染性白質萎縮症、三叉神経痛、ベル麻痺、または軸索再生、再ミエリン形成、またはオリゴデンドロサイト生存または分化／増殖必要とする任意の神経損傷を含むが、これらに限定されない。
【００９４】
融合タンパク質および共役ポリペプチド
本発明の一部の実施形態は、非相同ポリペプチド部分に対して融合されたＳｅｍａ６Ａポリペプチドを使用して、融合タンパク質を形成することを伴う。かかる融合タンパク質を使用して、様々な目的、例えば、血中半減期の増加、バイオアベイラビリティの改善、特定の臓器または組織タイプへの生体内標的、組み換え発現効率の改善、宿主細胞分泌の改善、精製の容易化、およびより高い親和力を達成することができる。達成すべき目的に応じて、非相同部分は、不活性であるか、または生物活性であり得る。また生体外または生体内で、本発明のＳｅｍａ６Ａポリペプチド部分に対して安定に融合されるか、または切断可能であるかを選択することができる。これらの他の目的を達成するための非相同部分は、当該技術分野において既知である。
【００９５】
融合タンパク質の発現に対する代替として、選択した非相同部分を事前に形成し、本発明のＳｅｍａ６Ａポリペプチド部分に対して化学的に共役することができる。大部分の場合において、選択した非相同部分は、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチド部分に対して融合されるか、または共役されるかにかかわらず、同様に機能する。したがって、非相同アミノ酸配列に関する以下の論考において、別段の記載がない限り、非相同配列は、ポリペプチドまたは他の組成物に対する融合タンパク質の形態で、または化学共役（共有および非共有結合を含む）としてＳｅｍａ６Ａポリペプチド部分と結合できることを理解されたい。例えば、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、検出アッセイにおいて標識として有用な分子、および非相同ポリペプチド、薬剤、放射性核種、または毒素等のエフェクタ分子に対して、組み換えによって融合または共役され得る。例えば、国際公開第ＷＯ９２／０８４９５号、第ＷＯ９１／１４４３８号、第ＷＯ８９／１２６２４号、米国特許第５，３１４，９９５号、および欧州特許第３９６，３８７号を参照されたい。
【００９６】
本明細書に記載の治療方法において使用するためのＳｅｍａ６Ａポリペプチドは、共有結合によってＳｅｍａ６ＡポリペプチドがＳｅｍａ６Ａの生物学的機能を阻害することがないようにするために、すなわち、任意の種類の分子の共有結合によって修飾される誘導体を含む。例えば、限定されないが、本発明のＳｅｍａ６Ａポリペプチドは、例えば、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ付加、ホスフィル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／封鎖基による誘導体化、タンパク分解的切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への結合等によって修飾され得る。多数の化学修飾のいずれも、限定されないが、特定の化学分解、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等を含む既知の手技によって実行され得る。加えて、誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。
【００９７】
本明細書に記載の治療方法において使用するためのＳｅｍａ６Ａポリペプチドは、ペプチド結合または修飾ペプチド結合、すなわちペプチド等量式によって、互いに結合したアミノ酸で構成することができ、２０遺伝子コード化アミノ酸以外のアミノ酸を含有し得る。Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、翻訳後過程等の自然過程によって、または当該技術分野において公知の化学修飾手技によって修飾され得る。かかる修飾は、基本の教科書、およびより詳細な論文、ならびに膨大な研究文献において、十分に説明されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ酸またはカルボキシル末端、または炭水化物等の部分上を含む、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドの任意の位置で起こり得る。同一タイプの修飾が、特定のＳｅｍａ６Ａポリペプチド内の複数部位において、同一または異なる程度で存在し得ることを理解されたい。また所与のＳｅｍａ６Ａポリペプチドは、多くのタイプの修飾を含有し得る。Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分岐され得、また分岐を伴ない、また、分岐を伴なわずに環状であり得る。環状、分岐、および分岐環状Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、翻訳後自然過程の結果として生じ得るか、または合成方法によって形成され得る。修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジリノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ＰＥＧ付加、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化等のタンパク質に対するアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介性付加、およびユビキチン化を含む（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２ｎｄ  Ｅｄ．（１９９３）、Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ．１−１２（１９８３）、Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−６４６（１９９０）、Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３：４８−６２（１９９２）を参照されたい）。
【００９８】
本発明は、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチド融合を含む、本質的に当該融合から成る、または当該融合から成る融合タンパク質も提供する。ある実施形態においては、Ｓｅｍａ６Ａ融合ポリペプチドは、プレキシン−Ａ２またはプレキシン−Ａ４に結合する。本発明のある実施形態においては、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチド、例えば、ＳｅｍａドメインおよびＰＳＩドメインを含むＳｅｍａ６Ａポリペプチド、または全体細胞外ドメイン（配列番号２のアミノ酸１〜６４９に対応する）は、非相同ポリペプチド部分に融合され、Ｓｅｍａ６Ａ融合ポリペプチドを形成する。
【００９９】
薬理活性のポリペプチドは、急速な生体内クリアランスを呈し得、体内で治療上有効な濃度を達成するために大量摂取を必要とする結果となる。加えて、約６０ｋＤａより小さいポリペプチドは、糸球体ろ過を経る可能性があり、腎臓毒性に至る場合がある。ポリペプチドフラグメントの融合または共役を採用して、かかる腎臓毒性のリスクを低減または回避することができる。様々な非相同アミノ酸配列、すなわち、治療ポリペプチドの生体内安定性、すなわち、血清半減期を増加させるためのポリペプチド部分または「担体」が知られている。
【０１００】
その長い半減期、広範な生体内分散、および酵素または免疫機能の欠失のために、本質的に全長のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはＨＳＡフラグメントが、非相同部分として一般に使用される。Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１９０４−０８（１９９２）およびＳｙｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８９：３２４３−５２（１９９７）において教示される方法および材料の適用により、ＨＳＡを使用して、Ｓｅｍａ６Ａ部分に基づいて薬理活性を表示する一方で、有意に高い、例えば、１０倍から１００倍高い生体内安定性を示すＳｅｍａ６Ａ融合ポリペプチドを形成することができる。ＨＳＡのＣ末端は、Ｓｅｍａ６Ａ部分のＮ末端に融合することができる。ＨＳＡは自然に分泌されるタンパク質であるため、融合タンパク質が真核、例えば、哺乳動物の発現系において産生される場合、ＨＳＡシグナル配列を利用して、細胞培地へのＳｅｍａ６Ａ融合タンパク質の分泌を得ることができる。
【０１０１】
シグナル配列は、小胞体の膜を越えてタンパク質の輸送を開始するアミノ酸配列をコード化するポリヌクレオチドである。免疫融合を構成するために有用なシグナル配列は、抗体軽鎖シグナル配列、例えば、抗体１４．１８（Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１２５：１９１−２０２（１９８９））、および抗体重鎖シグナル配列、例えば、ＭＯＰＣ１４１抗体重鎖シグナル配列（Ｓａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２８６：５７７４（１９８０））を含む。代替として、他のシグナル配列を使用することができる。例えば、ＷａｔｓｏｎのＮｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：５１４５（１９８４）を参照されたい。シグナルペプチドは、通常、シグナルペプチダーゼによって、小胞体のルーメンにおいて切断する。これは、Ｆｃ領域およびＳｅｍａ６Ａ部分を含有する免疫融合の分泌を生じる。
【０１０２】
一部の実施形態においては、ＤＮＡ配列は、分泌カセットとＳｅｍａ６Ａポリペプチドとの間のタンパク質分解的切断部位をコード化し得る。かかる切断部位は、例えば、コード化した融合タンパク質のタンパク質分解的切断部位を提供し得、したがって、Ｆｃドメインを標的タンパク質から分離する。有用なタンパク質分解的切断部位は、トリプシン、プラスミン、トロンビン、Ｘａ因子、またはエンテロキナーゼＫ等のタンパク質分解酵素によって認識されるアミノ酸配列を含む。
【０１０３】
分泌カセットは、複製可能な発現ベクターに組み込むことができる。有用なベクターは、直鎖核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド等を含む。例示的な発現ベクターはｐｄＣであり、そこでは、免疫融合ＤＮＡの転写が、ヒトサイトメガロウイルスのエンハンサおよびプロモータの制御下で配置される。例えば、Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０８８：７１２（１９９１）、およびＬｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：４９５−５００（１９９８）を参照されたい。適切な宿主細胞は、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドをコード化するＤＮＡで形質転換または遺伝子導入することができ、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドの発現および分泌に使用することができる。使用される宿主細胞は、典型的には、不死のハイブリドーマ細胞、ミエローマ細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｈｅｌａ細胞、およびＣＯＳ細胞を含む。
【０１０４】
一実施形態においては、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、ヒンジおよびＦｃ領域、すなわち、Ｉｇ重鎖定常領域のＣ末端部分に融合される。Ｓｅｍａ６Ａ−Ｆｃ融合の潜在的な利点は、溶解性、生体内安定性、および多価性、例えば、二量化を含む。使用されるＦｃ領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＧ  Ｆｃ領域であり得る（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）。代替として、ＩｇＥまたはＩｇＭ  Ｆｃ領域であり得る（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４）。例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域等のＩｇＧ  Ｆｃ領域が一般に使用される。一実施形態においては、ＩｇＧ  Ｆｃを化学的に定義するパパイン切断部位の上流でヒンジ領域において開始する配列（すなわち、残基２１６であり、Ｋａｂａｔシステムに従って、重鎖定常領域の第１の残基を１１４とする）、または他の免疫グロブリンの類似部位を融合に使用する。融合を行う正確な部位は重要ではない。特定の部位がよく知られており、分子の生物活性、分泌、または結合特性を最適化するために選択することができる。Ｆｃ融合をコード化するＤＮＡを構成および発現するための材料および方法は、当該技術分野において周知であり、過度の実験を行わずにＳｅｍａ６Ａ融合を得るために適用することができる。本発明の一部の実施形態は、Ｃａｐｏｎらの米国特許第５，４２８，１３０号および第５，５６５，３３５号に記載されるような融合タンパク質を採用する。
【０１０５】
完全に正常な野生型Ｆｃ領域は、本発明の方法において使用されるＦｃ融合タンパク質に不要かつ望ましくない場合があるエフェクタ機能を示す。したがって、特定の結合部位は、典型的には、分泌カセットの構成中に、Ｆｃ領域から削除される。例えば、軽鎖との同時発現は不要であるため、重鎖結合タンパク質、Ｂｉｐ（Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ８：１１１−１４（１９８７））の結合部位は、ＩｇＥのＦｃ領域のＣＨ２ドメインから削除され、この部位が免疫融合の効率的な分泌を干渉しないようにする。ＩｇＭにおいて存在するような膜貫通領域配列も一般的に削除される。
【０１０６】
ＩｇＧ１  Ｆｃ領域が最も頻繁に使用される。代替として、免疫グロブリンγの他のサブクラス（γ−２、γ−３、およびγ−４）のＦｃ領域を分泌カセットにおいて使用することができる。免疫グロブリンγ−１のＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、概して、分泌カセットにおいて使用され、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。一部の実施形態においては、免疫グロブリンγ−１のＦｃ領域は、ＣＨ２削除したＦｃであり、ヒンジ領域およびＣＨ３領域の一部を含むが、ＣＨ２領域は含まない。ＣＨ２削除したＦｃは、Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  １：４７（１９９０）によって説明されている。一部の実施形態においては、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭのうちの１つのＦｃ領域を使用する。
【０１０７】
Ｓｅｍａ６Ａ−Ｆｃ融合タンパク質は、幾つかの異なる構成で構築することができる。１つの構成において、Ｓｅｍａ６Ａ部分のＣ末端は、Ｆｃヒンジ部分のＮ末端に直接融合される。わずかに異なる構成において、短鎖ポリペプチド、例えば、２〜１０アミノ酸は、Ｓｅｍａ６Ａ部分のＮ末端とＦｃ部分のＣ末端との間の融合に組み込まれる。かかるリンカーは、立体配座の柔軟性を提供し、一部の状況において、生物活性を改善し得る。ヒンジ領域の十分な部分がＦｃ部分に維持される場合、Ｓｅｍａ６Ａ−Ｆｃ融合は二量化し、したがって、二価分子を形成する。モノマーＦｃ融合の相同集団は、単一特異的な二価二量体を産出する。それぞれ異なる特異性を有する２つのモノマーＦｃ融合の混合物は、二重特異性二価二量体を産出する。
【０１０８】
対応するアミノ反応基およびチオール反応基の多数の架橋剤のいずれをも使用して、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドを血清アルブミンまたは他の異種ポリペプチドに結合させることができる。適切なリンカーの例は、チオール反応マレイミドを挿入するアミン反応架橋剤、例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳ、およびＧＭＢＳを含む。他の適切なリンカーは、チオール反応ハロ酢酸基、例えば、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢを挿入する。メルカプト基と反応させて縮小可能な結合を産生するための保護または非保護チオールを提供するリンカーは、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡ、およびＳＡＴＰを含む。かかる試薬は市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
【０１０９】
共役は、Ｓｅｍａ６ポリペプチドのＮ末端または血清アルブミン上のチオール部分を伴う必要はない。例えば、Ｓｅｍａ６Ａ−アルブミン融合は、遺伝子工学技術を使用して得ることができ、Ｓｅｍａ６Ａ部分は、そのＮ末端、Ｃ末端、または両方において血清アルブミン遺伝子に融合される。
【０１１０】
Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、非相同ペプチドに融合して、Ｓｅｍａ６Ａ部分の精製または確認を促進することができる。例えば、ヒスチジン標識をＳｅｍａ６Ａポリペプチドに融合し、市販のクロマトグラフ培地を使用して、精製を促進することができる。
【０１１１】
本発明の一部の実施形態においては、Ｓｅｍａ６Ａ融合構成を使用して、細菌中のＳｅｍａ６Ａ部分の産生を強化する。かかる構成において、通常、高レベルで発現および／または分泌される細菌タンパク質を、Ｓｅｍａ６ＡポリペプチドのＮ末端融合パートナーとして採用する。例えば、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ６７：３１（１９８８）、Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４（１９８８）、Ｌａ  Ｖａｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１８７（１９９３）を参照されたい。
【０１１２】
適切な融合パートナーのアミノおよびカルボキシ末端において、Ｓｅｍａ６Ａ部分を融合することにより、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドの二価または四価形態を得ることができる。例えば、Ｓｅｍａ６Ａ部分をＩｇ部分のアミノおよびカルボキシ末端と融合し、２つのＳｅｍａ６Ａ部分を含有する二価モノマーポリペプチドを産生することができる。かかる２つのモノマーを二量化する際に、Ｉｇ部分によって、四価形態のＳｅｍａ６Ａタンパク質が得られる。かかる多価形態を使用して、標的に対する高い結合親和性を達成することができる。Ｓｅｍａ６Ａの多価形態は、Ｓｅｍａ６Ａ部分を縦一列に配置することによって取得し、コンカテマーを形成することもでき、それは、単独で採用するか、ＩｇまたはＨＳＡ等の融合パートナーに融合することができる。
【０１１３】
ある実施形態においては、本発明の方法において使用するためのＳｅｍａ６Ａポリペプチドは、標的部分をさらに含む。標的部分は、体の特定の部分、例えば、脳またはその分室に局在性を導くタンパク質またはペプチドを含む。ある実施形態においては、本発明の方法において使用するためのＳｅｍａ６Ａポリペプチドは、脳標的部分に付着する、または融合される。脳標的部分は、共有結合されるか（例えば、直接翻訳融合、または任意で切断可能な直接またはスペーサ分子を通じた化学結合）、または非共有結合される（例えば、アビジン、ビオチン、タンパク質Ａ、ＩｇＧ等の逆相互作用を通して）。他の実施形態においては、その本発明の方法において使用するためのＳｅｍａ６Ａポリペプチドは、もう１つの脳標的部分に取り付けられる。追加の実施形態においては、脳標的部分は、本発明の方法において使用するための複数のＳｅｍａ６Ａポリペプチドに取り付けられる。
【０１１４】
Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドに関連する脳標的部分は、かかるＳｅｍａ６Ａポリペプチドの脳送達を強化する。タンパク質または治療薬に融合される場合に、血液脳障壁（ＢＢＢ）を通してタンパク質または治療薬を送達する、多数のポリペプチドが説明されている。非限定例は、単一ドメイン抗体ＦＣ５（Ａｂｕｌｒｏｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．９５，１２０１−１２１４（２００５））、ｍＡＢ  ８３−１４、ヒトインスリン受容体に対する単クローン抗体（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．１２，８０７−８１６（１９９５））、ヒトトランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）に対するＢ２、Ｂ６およびＢ８ペプチド結合（Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，１１３５９−１１３６６（２０００））、トランスフェリン受容体に対するＯＸ２６単クローン抗体（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２５９，６６−７０（１９９１））、および米国特許第６，３０６，３６５号の配列番号１〜１８を含む。上記参照文献の内容は、それら全体を参照することによって本明細書に組み込まれる。
【０１１５】
強化されたＳｅｍａ６Ａ組成物の脳送達は、当該技術分野において十分に確立された多数の手段によって測定される。例えば、脳標的部分に結合した放射活性物質で標識したＳｅｍａ６Ａポリペプチドを動物に投与する、脳局在化を決定する、および局在化を脳標的部分に関連しない等量の放射活性物質で標識したＳｅｍａ６Ａポリペプチドと比較する。強化した標的を決定する他の手段は、上記の参照文献において説明される。
【０１１６】
共役ポリマー（ポリペプチド以外）
本発明の一部の実施形態は、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドを伴い、１つ以上のポリマーがＳｅｍａ６Ａポリペプチドに共役（共有結合）される。かかる共役に適切なポリマーの例は、ポリペプチド（上述）、糖ポリマー、およびポリアルキレングリコール鎖を含む。典型的には（必ずしもそうではないが）、溶解性、安定性、またはバイオアベイラビリティのうちの１つ以上を改善する目的で、ポリマーをＳｅｍａ６Ａポリペプチドに共役する。
【０１１７】
Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドに対する共役に一般に使用されるポリマーのクラスは、ポリアルキレングリコールである。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、最も頻繁に使用される。ＰＥＧ部分、例えば、１、２、３、４、または５ＰＥＧポリマーは、それぞれＳｅｍａ６Ａポリペプチドに共役され、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチド単独と比較して、血清半減期を増大させることができる。ＰＥＧ部分は、非抗原的であり本質的に生物不活性である。本発明の実践において使用されるＰＥＧ部分は、分岐または非分岐であり得る。
【０１１８】
Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドに付着したＰＥＧ部分の数および個別のＰＥＧ鎖の分子量は異なり得る。一般に、ポリマーの分子量が高いほど、ポリペプチドに付着したポリマー鎖が少ない。通常、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドに付着した総ポリマー質量は、２０ｋＤａから４０ｋＤａである。したがって、１つのポリマー鎖が付着する場合、鎖の分子量は、概して２０〜４０ｋＤａである。２つの鎖が付着する場合、各鎖の分子量は、概して１０〜２０ｋＤａである。３つの鎖が付着する場合、分子量は、概して７〜１４ｋＤａである。
【０１１９】
例えば、ＰＥＧ等のポリマーは、ポリペプチド上の任意の適切な露出反応基を通して、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドに結合することができる。露出反応基は、例えば、内部リジン残基のＮ末端アミノ基またはエプシロンアミノ基、または両方であり得る。活性ポリマーは、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチド上の任意の遊離アミノ基において反応および共有結合することができる。Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドの遊離カルボキシル基、適切に活性したカルボニル基、ヒドロキシル、グアニジル、イミダゾール、酸化カーボハイドレート部分、およびメルカプト基（入手可能な場合）を、ポリマー付着のための反応基として使用することもできる。
【０１２０】
共役反応において、典型的には、ポリペプチドのモル当たり約１．０から約１０モルの活性ポリマーが、ポリペプチド濃度に応じて採用される。通常、選択した比率は、反応を最大にする一方で、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドの望ましい薬理活性を損ない得る副作用（非特異性である場合が多い）を最小にするバランスを示す。好ましくは、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドの少なくとも５０％の生物活性（証明されるように、例えば、本明細書に記載されるか、または当該技術分野において既知のアッセイのうちのいずれかにおいて）が維持され、最も好ましくは、約１００％が維持される。
【０１２１】
ポリマーは、従来の化学反応を使用して、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドに共役することができる。例えば、ポリアルキレングリコール部分は、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドのリジンエプシロンアミノ基に結合することができる。リジン側鎖への結合は、ＰＥＧコハク酸スクシニミジル（ＳＳ−ＰＥＧ）およびプロピオン酸スクシニミジル（ＳＰＡ−ＰＥＧ）等のＮヒドロキシルスクシニミド（ＮＨＳ）活性エステルを用いて行うことができる。適切なポリアルキレングリコール部分は、例えば、カルボキシメチル−ＮＨＳおよびノルロイシン−ＮＨＳ、ＳＣを含む。これらの試薬は、商業的に入手可能である。追加のアミン反応ＰＥＧリンカーは、スクシニミジル部分と置換することができる。これらは、例えば、イソチオシアン酸、ニトロフェニルカーボネート（ＰＮＰ）、エポキシド、炭酸ベンゾトリアゾール、ＳＣ−ＰＥＧ、トレシレート、アルデヒド、エポキシド、カルボニルイミダゾール、および炭酸ＰＮＰを含む。通常、条件を最適化して、反応の選択性および程度を最大化する。反応条件のかかる最適化は、当該技術分野における通常技術の範囲内である。
【０１２２】
ＰＥＧ付加は、当該技術分野において既知のＰＥＧ付加反応のいずれかによって実行することができる。例えば、Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３：４−１０（１９９２）、および欧州特許出願第０１５４３１６号および第０４０１３８４号を参照されたい。ＰＥＧ付加は、反応性ポリエチレングリコール分子（または類似する反応水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を使用して実行することもできる。
【０１２３】
アシル化によるＰＥＧ付加は、概して、ポリエチレングリコールの活性エステル誘導体を反応させるステップを含む。任意の反応性ＰＥＧ分子は、ＰＥＧ付加に採用することができる。Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）にエステル化したＰＥＧは、頻繁に使用される活性ＰＥＧエステルである。本明細書で使用される「アシル化」は、限定されないが、治療タンパク質とＰＥＧ等の水溶性ポリマーとの間の以下の種類の結合を含む：アミド、カルバミン酸、ウレタン等。例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：１３３−１４０，１９９４を参照されたい。反応パラメータは、概して、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドを損傷または不活性化する温度、溶媒、およびｐＨ状態を回避するように選択される。
【０１２４】
一般に、接続結合は、アミドであり、および典型的には、結果として生じる産物の少なくとも９５％は、モノ−、ジ−、またはトリ−ＰＥＧ付加される。しかしながら、より高い段階のＰＥＧ付加を有する一部の種は、使用される特異的反応条件に基づいた量で形成され得る。任意で、精製したＰＥＧ付加種は、例えば、透析、塩析、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィ、ゲルろ過クロマトグラフィ、疎水性交換クロマトグラフィ、および電気泳動法を含む従来の精製方法によって、混合物、特に未反応の種から分離される。
【０１２５】
アルキル化によるＰＥＧ付加は、一般に、還元剤の存在下で、ＰＥＧの末端アルデヒド誘導体をＳｅｍａ６Ａポリペプチドと反応させるステップを含む。加えて、反応条件を操作して、実質的にＳｅｍａ６ＡポリペプチドのＮ末端アミノ基のみにおけるＰＥＧ付加、すなわちモノ−ＰＥＧ付加タンパク質のみに対する好適な条件を提供する。モノ−ＰＥＧ付加またはポリ−ＰＥＧ付加のいずれかの場合において、ＰＥＧ基は、典型的には、−ＣＨ２−ＮＨ−基を介してタンパク質に付着する。特に−ＣＨ２−基を参照して、この種類の結合は、「アルキル」結合として知られる。
【０１２６】
Ｎ末端標的モノ−ＰＥＧ付加産生物を産生するための還元アルキル化による誘導体化は、誘導体化に使用可能な異なるタイプの一次アミノ基（リジン対Ｎ末端）を利用する。反応は、リジン残基のエプシロン−アミノ基とタンパク質のＮ末端アミノ基とのｐＫａ差の利用を可能にするｐＨで行う。かかる選択的誘導体化によって、アルデヒド等の反応基を含有する水溶性ポリマーのタンパク質への付着を制御し、ポリマーとの共役は、主にタンパク質のＮ末端で生じ、リジン側鎖アミノ基等の他の反応基の有意な修飾は生じない。
【０１２７】
アシル化およびアルキル化アプローチの両方において使用されるポリマー分子は、水溶性ポリマーの中から選択される。選択されたポリマーは、典型的には、アシル化の場合は活性エステルまたはアルキル化の場合はアルデヒド等の単一反応基を有するように修飾し、本方法において提供されるように重合の程度を制御できるようにする。例示的な反応性ＰＥＧアルデヒドは耐水性のポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドであるか、またはそのモノＣ１〜Ｃ１０アルコキシまたはアリールオキシ誘導体である（例えば、Ｈａｒｒｉｓらの米国特許第５，２５２，７１４号を参照されたい）。ポリマーは分岐であるか、または非分岐であり得る。アシル化反応の場合、選択されるポリマーは、典型的には、単一反応性エステル基を有する。還元アルキル化の場合、選択されるポリマーは、典型的には、単一反応性アルデヒド基を有する。一般に、水溶性ポリマーは、通常、哺乳動物の組み換え発現系によってより便宜的に形成されるため、自然発生するグリコシル残基から選択されない。
【０１２８】
ＰＥＧ付加Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドを調製するための方法は、概して、（ａ）分子が１つ以上のＰＥＧ基に付着する状況下で、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドをポリエチレングリコール（ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体等）と反応させるステップと、（ｂ）反応産物を取得するステップと、を含む。一般に、アシル化反応のための最適反応条件は、公知のパラメータおよび望ましい結果に基づいて、個別に決定される。例えば、タンパク質に対するＰＥＧの比率が大きいほど、概して、ポリＰＥＧ付加産物の割合（％）が大きくなる。
【０１２９】
モノポリマー／Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドの実質的に相同の集団を産生するための還元アルキル化は、概して、（ａ）還元アルキル化条件下、ポリペプチドのＮ末端アミノ基のペン−ニット選択的修飾に適切なｐＨにおいて、Ｓｅｍａ６Ａタンパク質またはポリペプチドを反応性ＰＥＧ分子と反応させるステップと、（ｂ）反応産物を取得するステップと、を含む。
【０１３０】
モノポリマー／Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドの実質的に相同の集団の場合、還元アルキル化反応条件は、ポリペプチドのＮ末端に対する水溶性ポリマー部分の選択的付着を可能にする条件である。かかる反応条件は、概して、リジン側鎖アミノ基とＮ末端アミノ基間のｐＫａ差を提供する。本発明の目的のために、ｐＨは、概して、３〜９、典型的には３〜６の範囲である。
【０１３１】
Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、例えば、タンパク質分解によって後に放出され得る部分等の標識を含み得る。したがって、リジン部分は、最初にリジンおよびＮ末端の両方と反応するＴｒａｕｔ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）等の低分子量リンカーで修飾したＨｉｓ標識を反応させ、次いでＨｉｓ標識を放出することによって、選択的に修飾することができる。その後、ポリペプチドは、マレイン酸、ビニルスルホン基、ハロアセテート基、または遊離あるいは保護ＳＨ等のチオール反応性頭部基を含有するＰＥＧで選択的に修飾され得る遊離ＳＨ基を含有する。
【０１３２】
Ｔｒａｕｔ試薬は、ＰＥＧ付着のための特定部位を設定する任意のリンカーと置換することができる。例えば、Ｔｒａｕｔ試薬は、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡ、またはＳＡＴＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）と置換することができる。同様に、タンパク質を、マレイミド（例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳ、またはＧＭＢＳ）、ハロアセテート基（ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ）、またはビニルスルホン基を挿入するアミン反応性リンカーと反応させ、結果として生じる産物を、遊離ＳＨを含有するＰＥＧと反応させることができる。
【０１３３】
一部の実施形態においては、ポリアルキレングリコール部分は、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドのシステイン基に結合される。結合は、例えば、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基礎、またはチオール基を使用して達成することができる。
【０１３４】
任意で、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、不安定結合を通してポリエチレン−グリコール部分に共役される。不安定結合は、例えば、生化学的加水分解、タンパク質分解、またはメルカプト基切断において切断することができる。例えば、結合は、生体内（生理的）条件下で切断することができる。
【０１３５】
反応基がＮ末端におけるαアミノ基上にある場合、反応は、一般に約ｐＨ５〜８、例えば、ｐＨ５、６、７、または８において、生物活性のある材料を不活性ポリマーと反応させるために使用される任意の適切な方法で起こり得る。一般に、過程は、活性ポリマーを調製するステップと、その後にタンパク質を活性ポリマーと反応させて、製剤に適切なタンパク質を産生するステップと、を含む。
【０１３６】
ベクター
Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドをコード化する核酸を含むベクターも、本発明の方法において使用することができる。かかる核酸が操作可能に結合されるベクターおよび発現制御配列の選択は、望ましい機能特性、例えば、タンパク質発現、および形質転換される宿主細胞に依存する。
【０１３７】
操作可能に結合されるコード化配列の発現を調節するために有用な発現制御要素は、当該技術分野において既知である。例には、誘発可能プロモータ、構造性プロモータ、分泌シグナル、および他の調節要素が含まれるが、これらに限定されない。誘発可能プロモータが使用される場合は、例えば、栄養状態の変化、または温度の変化によって、宿主細胞培地中で制御することができる。
【０１３８】
ベクターは、原核性レプリコン、すなわち、細菌宿主細胞において組み換えＤＮＡ分子の自己複製および維持を染色体外に導く能力を有するＤＮＡ配列を含み得る。かかるレプリコンは、当該技術分野において公知である。加えて、原核性レプリコンを含むベクターは、発現が薬物耐性等の検出可能なマーカーを授与する遺伝子も含み得る。細菌薬物耐性遺伝子の例は、アンピリシンまたはテトラサイクリンに対する耐性を授与するものである。
【０１３９】
原核性レプリコンを含むベクターは、細菌宿主細胞において、コード化遺伝子配列の発現を導くための原核性またはバクテリオファージプロモータも含み得る。細菌宿主に適合するプロモータ配列は、典型的には、発現対象のＤＮＡセグメントを挿入するために便宜的な制限酵素認識部位を含有するプラスミドベクターにおいて提供される。かかるプラスミドベクターの例は、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、およびｐＢＲ３２９（ＢｉｏＲａｄ）、ｐＰＬおよびｐＫＫ２２３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。任意の適切な原核性宿主細胞を使用して、本発明の方法で使用されるタンパク質をコード化する組み換えＤＮＡ分子を発現することができる。
【０１４０】
この発明の目的のために、多数の発現ベクター系が採用され得る。例えば、あるクラスのベクターは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ、またはＭＯＭＬＶ）またはＳＶ４０ウイルス等の動物ウイルスに由来するＤＮＡ要素を利用する。他は、内部リボソーム結合部位を有する多シストロン系の使用を伴う。加えて、ＤＮＡをクロモソームに統合した細胞は、遺伝子導入した宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することによって、選択することができる。マーカーは、栄養素要求株宿主に対する原栄養体、殺生剤耐性（例えば、抗生物質）、または銅等の重金属に対する耐性を提供し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、発現対象のＤＮＡ配列に直接結合されるか、または同時形質転換によって同一細胞に導入される。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ネオ）遺伝子は、選択可能なマーカー遺伝子の例である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−３４１（１９８２）を参照されたい）。ｍＲＮＡの最適合成のために、追加要素が必要とされる場合もある。これらの要素は、シグナル配列、接合シグナル、ならびに転写プロモータ、エンハンサ、および終止シグナルを含み得る。
【０１４１】
一実施形態においては、ＮＥＯＳＰＬＡ（米国特許第６，１５９，７３０号）と称されるＢｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ，Ｉｎｃ．の特許発現ベクターを使用することができる。このベクターは、サイトメガロウイルスプロモータ／エンハンサ、マウスβグロビン主要プロモータ、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエクソン１およびエクソン２、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子およびリーダー配列を含有する。このベクターは、ＣＨＯ細胞における遺伝子導入時、次いで培地およびメトトレキサート増幅を含有するＧ４１８における選択時に、極めて高レベルの発現を生じることが見出されている。当然のことながら、本発明において、真核細胞中で発現を導出できる、いかなる発現ベクターをも使用することができる。適切なベクターの例は、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、およびｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能）、およびプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）を含むが、これらに限定されない。追加真核細胞発現ベクターは、当該技術分野において既知であり、市販されている。典型的には、かかるベクターは、望ましいＤＮＡセグメントを挿入するための便宜的な制限部位を含有する。例示的なベクターは、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１、ｐｍｌ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ３１２５５）、レトロウイルス発現ベクターｐＭＩＧおよびｐＬＬ３．７、アデノウイルスシャトルベクターｐＤＣ３１５、およびＡＡＶベクターを含む。他の例示的なベクター系は、例えば、米国特許第６，４１３，７７７号において開示される。
【０１４２】
一般に、高レベルのポリペプチドを適切に発現するものについて、多数の形質転換した細胞をスクリーニングすることは、例えば、ロボットシステムによって実行され得るルーチン実験である。
【０１４３】
哺乳動物宿主細胞発現に対して頻繁に使用される調節配列は、哺乳動物細胞において高レベルのタンパク質発現を導くウイルス要素、例えば、レトロウイルスＬＴＲに由来するプロモータおよびエンハンサ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモータ／エンハンサ等）、Ｓｉｍｉａｎウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモータ／エンハンサ等）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモータ（ＡｄｍｌＰ））、ポリオーマ、および天然免疫グロブリンおよびアクチンプロモータ等の強力な哺乳動物プロモータ等を含む。ウイルス調節要素およびその配列に関するさらなる説明については、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉの米国特許第５，１６８，０６２号、Ｂｅｌｌの米国特許第４，５１０，２４５号、およびＳｃｈａｆｆｎｅｒの米国特許第４，９６８，６１５号を参照されたい。
【０１４４】
組み換え発現ベクターは、宿主細胞（例えば、複製起点）および選択可能なマーカー遺伝子において、ベクターの複製を調節する配列を担持し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入される宿主細胞の選択を容易にする（例えば、Ａｘｅｌの米国特許第４，３９９，２１６号、第４，６３４，６６５号、および第５，１７９，０１７号を参照されたい）。例えば、典型的には、選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入される宿主細胞上で、Ｇ４１８、ヒグロマイシンまたはメトトレキサート等の薬物に対する耐性を授与する。頻繁に使用される選択可能なマーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ−宿主細胞において、メトトレキサート選択／増幅で使用するため）、およびネオ遺伝子（Ｇ４１８選択用）を含む。
【０１４５】
Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドをコード化するベクターは、適切な宿主細胞の形質転換に使用することができる。形質転換は、任意の適切な方法によって行うことができる。外因性ＤＮＡを哺乳動物細胞に導入するための方法は、当該技術分野において既知であり、デキストラン媒介性形質転換、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性形質転換、原形質融合、電気穿孔、リポソーム内へのポリヌクレオチドのカプセル化、および原子核へのＤＮＡの直接顕微注入を含む。加えて、核酸分子は、ウイルスベクターによって、哺乳動物細胞に導入され得る。
【０１４６】
宿主細胞の形質転換は、採用されるベクターおよび宿主細胞に適した従来の方法によって達成することができる。原核性宿主細胞の形質転換の場合は、電気穿孔および塩治療方法を採用することができる（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２１１０−１４（１９７２）を参照されたい）。脊椎動物細胞の形質転換の場合は、電気穿孔、陽イオン脂質、または塩治療方法を採用することができる。例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６−４６７（１９７３）、Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：１３７３−７６（１９７９）を参照されたい。
【０１４７】
タンパク質発現に使用される宿主細胞系は、哺乳動物起源であり得、当業者であれば、そこで発現する望ましい遺伝子産物に最適な特定の宿主細胞系を選択的に決定することができると考えられる。例示的な宿主細胞系は、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、新生ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣系、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓系）、ＣＯＳ（ＳＶ４０  Ｔ抗原を有するＣＶＩの誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓系）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、および２９３（ヒト腎臓）を含むが、これらに限定されない。宿主細胞系は、典型的には、商業サービス、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、または既刊文献から入手可能である。
【０１４８】
産生細胞系のポリペプチドの発現は、既知の手法を使用して強化することができる。例えば、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）システムは、ある条件下で、発現を強化するために一般に使用される。例えば、欧州特許第０２１６８４６号、第０２５６０５５号、および第０３２３９９７号、および欧州特許出願第８９３０３９６４．４号を参照されたい。
【０１４９】
宿主細胞
本発明の方法において使用するためのＳｅｍａ６Ａポリペプチドを発現するための宿主細胞は、原核性または真核性であり得る。例示的な真核宿主細胞は、酵母および哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ６１）、ＮＩＨスイスマウス胚細胞ＮＩＨ−３Ｔ３（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ１６５８）、および新生ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）を含むが、これらに限定されない。他の有用な真核宿主細胞は、昆虫細胞および植物細胞を含む。例示的な原核宿主細胞は、大腸菌およびストレプトミセスを含む。
【０１５０】
遺伝子治療法
Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、オリゴデンドロサイトの生存、増殖、および／または分化を促進すること、またはニューロンの髄鞘形成を促進することが治療上有効である、神経系疾病、疾患、または損傷の治療に対する遺伝子治療法アプローチを使用して、例えば、ヒト患者等の哺乳動物において、生体内で産生することができる。これは、適切な発現制御配列に操作可能に結合する、適切なＳｅｍａ６Ａポリペプチドコード化核酸の投与を伴う。一般に、かかる配列は、ウイルスベクターに組み込まれる。かかる遺伝子治療法に適切なウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ＥＢウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターを含む。ウイルスベクターは、複製不全ウイルスベクターであり得る。そのＥ１遺伝子またはＥ３遺伝子に欠損を有するアデノウイルスベクターが、典型的に使用される。アデノウイルスベクターを使用する場合、ベクターは、通常、選択可能なマーカー遺伝子を有しない。
【０１５１】
薬理組成物
本発明の方法において使用されるＳｅｍａ６Ａポリペプチドは、ヒトを含む哺乳動物に投与するための医薬組成物に形成することができる。本発明の方法において使用される医薬組成物は、例えば、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミン等の血清タンパク質、リン酸等の緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の一部グリセリド混合物、水、硫酸プロタミン等の塩、または電解質、リン酸水素２ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂等を含む、医薬上許容し得る担体を含む。
【０１５２】
本発明の方法で使用される組成物は、任意の適切な方法で、例えば、非経口的、脳室内、経口的、吸入スプレーにより、局所的、経直腸的、経鼻腔的、頬側、経膣的、または埋め込まれた容器を介して投与され得る。本明細書で使用される「非経口的」という用語は、皮下、経静脈、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、肝内、髄板内、および頭蓋内注射または注入法を含む。前述のように、本発明の方法で使用されるＳｅｍａ６Ａポリペプチドは、神経系において作用し、オリゴデンドロサイトの生存、増殖、および分化、ならびにニューロンの髄鞘形成を促進する。したがって、本発明の方法において、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、それらが血液脳関門を横断するように投与される。この横断は、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチド分子自体が本来有する物理化学特性、医薬製剤中の他の構成要素、または血液脳関門を破るための針、カニューレ、または手術器具等の機械的装置の使用に起因し得る。Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドが、本来、血液脳関門を横断しない分子である場合、例えば、横断を促進する部分に融合する場合、適切な投与経路は、例えば、髄腔内または頭蓋内であり、例えば、ＭＳの慢性病巣への直接投与である。Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドが、本来、血液脳関門を横断する分子である場合、投与経路は、以下に記載の様々な経路のうちの１つ以上により得る。
【０１５３】
本発明の方法で使用される組成物の無菌注入形態は、水性または油性の懸濁液であり得る。かかる懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤、および懸濁剤を使用して、当該技術分野において既知の手法に従って調製され得る。無菌注入製剤または懸濁液は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌注入溶液または懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオール中の懸濁液であり得る。採用され得る許容される媒体および溶媒には、水、リンガー溶液、および等浸透圧の塩化ナトリウム溶液が含まれる。加えて、無菌の固定油が、溶媒または懸濁培地として従来採用される。この目的において、任意の無菌性固定油を採用し得、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体等の脂肪酸は、オリーブオイルまたはキャスターオイル等の医薬的に許容し得る天然油と同様に、特にそれらのポリオキシエチル化版での注入剤の調製に有用である。かかる油溶液または懸濁液は、カルボキシメチルセルロース等の長鎖アルコール希釈剤または分散剤、あるいは乳化剤および懸濁液を含む医薬的に許容し得る剤形で一般に使用される、同様の分散剤も含有し得る。Ｔｗｅｅｎｓ、Ｓｐａｎｓ等の他の一般に使用される界面活性剤、および医薬的に許容される固体、液体、または他の剤形の製造に一般に使用される他の乳化剤またはバイオアベイラビリティエンハンサを、製剤の目的で使用することもできる。
【０１５４】
非経口製剤は、単回ボーラス注射、後に維持量が加えられる、注入または負荷ボーラス用量であり得る。かかる組成物は、特定の固定または可変間隔、例えば、１日に１回、または「必要に応じて」投与され得る。
【０１５５】
本発明の方法で使用されるある種の医薬組成物は、例えば、カプセル、錠剤、水性懸濁液または溶液を含む、許容し得る剤形で経口投与され得る。ある種の医薬組成物は、鼻エアロゾルまたは吸入によって投与することもできる。かかる組成物は、生理食塩水で、ベンジルアルコールまたは他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティを強化するための吸収プロモータ、および／または他の従来の可溶化または分散剤を用いた溶液として調製され得る。
【０１５６】
担体材料と組み合わせて単一剤形を産生できるＳｅｍａ６Ａポリペプチドの量は、治療される宿主、使用されるポリペプチドの種類、および特定の投与モードに応じて異なる。組成物は、単回投与、複数投与、または確定した期間をかけて注入投与することができる。投与量レジメンは、最適で望ましい反応（例えば、治療または予防反応）を提供するように調整することもできる。
【０１５７】
本発明の方法は、「治療有効量」または「予防有効量」のＳｅｍａ６Ａポリペプチドを使用する。かかる治療または予防有効量は、個人の疾病状態、年齢、性別、および体重等の要因にしたがって異なり得る。治療または予防有効量は、任意の毒性または有害な影響よりも、治療的に有益な効果が上回る量でもある。
【０１５８】
任意の特定患者に対する特定の投与量および治療レジメンは、使用される特定のＳｅｍａ６Ａポリペプチド、患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別、および食事、投与時間、排出率、薬物の組み合わせ、および治療対象の特定の疾病の重度を含む、様々な要因に依存する。医療従事者によるかかる要因の判断は、当該技術分野における通常技術の範囲内である。量は、治療対象の個別の患者、投与経路、製剤の種類、使用される化合物の特徴、疾病の重度、および望ましい効果にも依存する。使用される量は、当該技術分野において公知の薬理および薬物動態の原理によって決定することができる。
【０１５９】
本発明の方法において、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、概して、大脳心室内または髄腔内的に、神経系、例えば、ＭＳの慢性病巣に直接投与される。本発明の方法に従って投与するための組成物は、１日に体重１ｋｇ当たり０．００１〜１０ｍｇのＳｅｍａ６Ａポリペプチドが投与されるように製剤することができる。本発明の、いくつかの実施形態においては、投与量は、１日に体重１ｋｇ当たり０．０１〜１．０ｍｇである。いくつかの実施形態においては、投与量は、１日に体重１ｋｇ当たり０．００１〜０．５ｍｇである。ある実施形態においては、投与量は、１日に体重１ｋｇ当たり５ｍｇ〜１００ｍｇである。本発明のさらなる実施形態においては、投与量は、１日に体重１ｋｇ当たり５０ｍｇ〜５００ｍｇである。本発明は、１日に体重１ｋｇ当たり１００ｍｇ〜１ｇの投与量をも含む。本発明の方法において使用される投与量の非限定例は、１日に体重１ｋｇ当たり０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ｍｇから成る群より選択される。本発明において使用される投与量は、１日に体重１ｋｇ当たり１ｇ〜５ｇであり得る。上述の範囲の中間にある用量も、本発明の範囲内であることが意図される。かかる投与量を、毎日、１日おき、１週間に１回、または実験による分析によって決定される任意の他のスケジュールに従って、対象に投与することができる。例示的な治療は、長期間、例えば、少なくとも６ヶ月をかけて、複数回投与での投与を含む。追加の例示的な治療レジメンは、２週間毎に１回、または１ヶ月に１回、あるいは３〜６ヶ月毎に１回の投与を含む。例示的な投与量スケジュールは、限定されないが、連日１〜１０ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇ、１日おきに３０ｍｇ／ｋｇ、１週間に１回６０ｍｇ／ｋｇの投与を含む。
【０１６０】
ある実施形態においては、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドをコード化する核酸分子を用いて対象を治療することができる。核酸の用量は、患者当たり約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇ、または３０〜３００μｇＤＮＡの範囲である。伝染性ウイルスベクターの用量は、１用量当たり１０〜１００ビリオン以上の範囲で変化する。
【０１６１】
補足的な活性化合物を、本発明の方法において使用される組成物に組み込むこともできる。例えば、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドまたは融合タンパク質を、１つ以上の追加治療薬と同時形成および／または同時投与することができる。
【０１６２】
本発明は、選択した標的組織へのＳｅｍａ６Ａポリペプチドの任意の適切な送達方法を包含し、それには、水溶液のボーラス注入または制御放出システムが含まれる。制御放出インプラントの使用は、反復注射の必要性を低減する。
【０１６３】
本発明の方法において使用されるＳｅｍａ６Ａポリペプチドは、脳に直接注入することができる。化合物を直接脳に注入するための様々なインプラントが知られており、神経系疾患に罹患するヒト患者への治療化合物の送達に有効である。これらには、ポンプ、定位固定的に埋め込まれた一時的間質カテーテル、永久間質カテーテルインプラント、および手術的に埋め込まれた生体分解性インプラントを使用しての、脳への長期注入が含まれる。例えば、Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，上記、Ｓｃｈａｒｆｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｉｇｈ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｏｄｉｎｅ−１２５  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔ  Ｆｏｒ  Ｇｌｉｏｍａｓ，”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．２４（４）：５８３−５９１（１９９２）、Ｇａｓｐａｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ  １２５Ｉ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ，”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．４３（５）：９７７−９８２（１９９９）；ｃｈａｐｔｅｒ  ６６，ｐａｇｅｓ  ５７７−５８０、Ｇｉｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（１９９８）におけるＢｅｌｌｅｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｂｒａｃｈｙｔｈｅｒａｐｙ，”、およびＢｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ＢＣＮＵ−Ｌｏａｄｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｅｗｌｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｅｄ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ：Ｐｈａｓｅ  Ｉ  Ｔｒｉａｌ，”Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２６：１１１−２３（１９９５）を参照されたい。
【０１６４】
組成物は、化合物に対する適切な送達または支持システムとして機能する、生体適合担体材料に分散したＳｅｍａ６Ａポリペプチドも含み得る。持続放出担体の適切な例は、座薬またはカプセル等の造形品形態の半透性ポリマーマトリクスを含む。埋め込み可能、または微小カプセル持続放出マトリクスは、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，３１９号、欧州特許第５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５６（１９８５））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）、ＬａｎｇｅｒのＣｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））またはポリ−Ｄ−（−）−３ヒドロキシブチル酸（欧州特許第１３３，９８８号）を含む。
【０１６５】
本発明の一部の実施形態においては、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、直接注入によって、患者の脳の適切な領域に投与される。例えば、Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｉｒｅｃｔ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．９：５８９−９５（２００３）を参照されたい。代替手法を使用することができ、本発明に従って、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドを投与するために適用することができる。例えば、カテーテルまたはインプラントの定位固定配置は、Ｒｉｅｃｈｅｒｔ−Ｍｕｎｄｉｎｇｅｒ単位、およびＺＤ（Ｚａｍｏｒａｎｏ−Ｄｕｊｏｖｎｙ）多目的ローカライズ単位を使用して達成することができる。２ｍｍスライス厚の１２０ｍｌのオムニパーク、３５０ｍｇヨウ素／ｍｌを注入して造影コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンは、３次元の多平面治療計画を可能にする（ＳＴＰ，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。この機器は、明確な標的確認のためのＣＴおよびＭＲＩ標的情報を踏まえて、磁気共鳴映像法研究に基づく計画を可能にする。
【０１６６】
ＧＥ  ＣＴスキャナ（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）とともに使用するために改変したＬｅｋｓｅｌｌ定位固定システム（Ｄｏｗｎｓ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｃａｔｕｒ，ＧＡ）、ならびにＢｒｏｗｎ−Ｒｏｂｅｒｔｓ−Ｗｅｌｌｓ（ＢＲＷ）定位固定システム（Ｒａｄｉｏｎｉｃｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）をこの目的で使用することができる。したがって、インプラントの朝に、ＢＲＷ定位固定フレームのアニュラベースリングを患者の頭蓋骨に取り付けることができる。連続ＣＴ断面を、底板に留めたカーボン竿ローカライザフレームを用いて、（標的組織）領域を通して、３ｍｍ間隔で取得することができる。コンピュータ化した治療計画プログラムは、カーボン竿画像のＣＴ座標を使用して、ＶＡＸ１１／７８０コンピュータ（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｙｎａｒｄ，Ｍａｓｓ）上で実行し、ＣＴスペースとＢＲＷスペースとの間をマップすることができる。
【０１６７】
本明細書に記載される脱髄または髄鞘形成不全疾患の治療方法は、典型的には、ヒトにおいて使用する前に、望ましい治療または予防活性に関して生体外で試験された後、許容し得る動物モデルにおいて生体内で試験される。形質転換動物を含む適切な動物モデルは、当該技術分野において通常の技術を有する者に公知である。例えば、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドの分化および生存効果を示す生体外アッセイは、本明細書に記載されている。軸索またはオリゴデンドロサイト分化の髄鞘形成に関するＳｅｍａ６Ａポリペプチドの効果は、実施例において説明されるように、生体外で試験することができる。最後に、生体内試験は、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドを発現する遺伝子移植マウスを形成することによって、またはＳｅｍａ６Ａポリペプチドをモデルのマウスまたはラットに投与することによって行うことができる。
【０１６８】
神経変性病の診断またはモニタリング
本発明の一部の実施形態は、（ａ）診断またはモニタリングされる対象から、組織、または血液もしくはＣＳＦ等の生物学的液体試料等の標本を取得する、（ｂ）標本においてＳｅｍａ６Ａポリペプチドのレベルを測定する、および（ｃ）Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドのレベルを対比試験片と比較することによって、対象における神経系疾患または状態を診断またはモニタリングするための方法を対象とする。
【０１６９】
「診断する」という用語は、個人を特定の疾病または状態を有すると確認することを意味する。「モニタリングする」という用語は、特定の状態または現象を常に、および／または定期的にチェックすることを意味する。一実施形態においては、神経変性病をモニタリングするための方法は、神経変性病の治療中に、患者のモニタリングの一部として、幾つかの時点において、一定間隔で生物学的液体試料を取得するステップを含む。別の実施形態においては、神経変性病をモニタリングするための方法は、ＭＳの治療中に、患者のモニタリングの一部として、幾つかの時点において、一定間隔で生物学的液体試料を取得するステップを含む。
【０１７０】
一実施形態においては、診断またはモニタリングされる疾病または状態は多発性硬化症（ＭＳ）である。他の実施形態においては、疾病または状態は、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中心髄鞘崩壊症（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス・メルツバッヘル病（ＰＭＺ）、ウォラー変性、視神経炎、横断性脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷、外傷性脳損傷、放射線照射後の損傷、化学療法の神経学的合併症、脳梗塞、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠乏、ビタミンＥ単独欠損症、ＡＲ、バッセン・コーンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ・ビニャミ症候群、異染性白質萎縮症、三叉神経痛、およびベル麻痺から成る群より選択され得る。
【０１７１】
生物学的液体試料は、血液、尿、および脳脊髄液（ＣＳＦ）を含むが、これらに限定されない。生物学的液体試料が含まれ得る方法は、組織生検、静脈穿刺、尿採取および脊椎穿刺を含むが、これらに限定されない。一実施形態においては、生物学的液体試料は、ＣＳＦまたは血液である。
【０１７２】
組織は、上皮、筋肉組織、結合組織、または神経組織を含むが、これらに限定されない。一実施形態においては、組織は上皮、例えば、皮膚組織の一部である。別の実施形態においては、組織またはＣＳＦまたは血液等の生物学的流体から収集した樹状細胞を使用して、Ｓｅｍａ６Ａ発現を検出する。
【０１７３】
生物学的液体試料を対象から取得する。一部の実施形態においては、対象は脊椎動物である。脊椎動物は、ヒト、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、爬虫類、魚類、両生類、および鳥類、爬虫類、および魚類の卵を含むが、これらに限定されない。一実施形態においては、対象はヒトである。別の実施形態においては、対象は、ＭＳ、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中心髄鞘崩壊症（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス・メルツバッヘル病（ＰＭＺ）、グロボイド細胞白質ジストロフィー（クラッベ病）、ウォラー変性、視神経炎、横断性脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷、外傷性脳損傷、放射線照射後の損傷、化学療法の神経学的合併症、脳梗塞、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠乏、ビタミンＥ単独欠損症、ＡＲ、バッセン・コルンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ・ビニャミ病、異染性白質ジストロフィー、三叉神経痛、およびベル麻痺から成る一覧より選択される神経系疾患を有するか、または有することが疑われるヒトである。特定の一実施形態においては、対象は、しびれ、衰弱、視力障害、平衡感覚障害、めまい、尿意切迫、疲労、およびうつ病から成る群より選択した少なくとも１つの状態を最近患ったＭＳ患者である。本明細書で使用される「最近」とは、３、５、７、１０、１４または２１日以内であり得る。
【０１７４】
標本におけるＳｅｍａ６Ａ発現のレベルは、疾病状態、例えば、疾病または状態の重篤度、疾病にかかる対象の傾向、対象の予後、または疾病に対する治療の有効性の指標となり得る。
【０１７５】
本発明は、対象から採取した標本におけるＳｅｍａ６Ａポリペプチドの存在を検出する方法をさらに提供する。タンパク質またはｍＲＮＡを検出するための、当該技術分野において既知の任意の方法を使用することができる。かかる方法は、クマシーブルー染色、免疫拡散、免疫電気泳動法、免疫化学的方法、バインダー−リガンドアッセイ、免疫組織化学的方法、凝集、および補体測定を含むが、これらに限定されない［Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２１７−２６２，Ｓｉｔｅｓ  ａｎｄ  Ｔｅｒｒ，ｅｄｓ．，Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９１）は、参照することにより組み込まれる］。Ｓｅｍａ６Ａ  ｍＲＮＡを検出する方法は、当該技術分野において公知である。Ｔｕａｎ  Ｒｏｃｋｙ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（１ｓｔ  ｅｄ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＰＡ  １９９７）。かかる方法の非限定例は、ノーザンブロット、ヌクレアーゼ保護アッセイ、原位置ハイブリダイゼーション、またはＲＴ−ＰＣＲである。
【０１７６】
多数の競合および非競合タンパク質結合免疫アッセイが、当該技術分野において公知である。かかるアッセイにおいて採用される抗体は、例えば、凝集試験に使用されるように、非標識であり得るか、または多様なアッセイ方法で使用するために標識化され得る。使用可能な標識は、放射免疫測定（ＲＩＡ）、酵素免疫学的検定、例えば、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定、ウェスタンブロット解析等で使用するための放射性核種、酵素、蛍光剤、化学ルミネセンス、酵素基質、または共同因子、酵素阻害剤、粒子、染料等を含む。
【０１７７】
対象における神経系疾患の診断またはモニタリングにおいて、標本中のＳｅｍａ６Ａポリペプチドのレベルを、対比試験片中のＳｅｍａ６Ａポリペプチドのレベルと比較することができる。適切な対比試験片は、神経学的に正常な個人から得た組織または生物学的液体試料を含むが、これらに限定されない。一実施形態においては、対比試験片は、神経変性病を患っていない対象から得る。別の実施形態においては、対比試験片は、ＭＳを患っていない対象から得る。加えて、アルブミン等の対象によって産生される既知のタンパク質は、血清または総タンパク質から測定する場合、内部標準または対照として作用し得る。
【０１７８】
診断キット
診断キットもまた本発明によって考慮される。かかるキットによって、神経変性病の検出、診断、またはモニタリングが可能になる。これらの診断キットによって適合されるかかる単一検査アプローチは、個人において神経変性病を診断するために必要な時間を削減する、および／または疾病の進行および／または疾病治療の効果をモニタリングされている際、患者の生物学的液体試料において分化発現したタンパク質を検出するために必要な時間を削減する。
【０１７９】
本発明の一実施形態は、抗体または本明細書に記載のＳｅｍａ６Ａポリペプチドに対して特異的に結合する抗原結合フラグメント、および検出可能な標識を使用して、患者において神経変性病の検出、診断、またはモニタリングするための診断キットを対象とする。別の実施形態においては、本発明は、抗体または本明細書に記載のＳｅｍａ６Ａポリペプチドに対して特異的に結合する抗原結合フラグメント、および検出可能な標識を使用して、患者においてＭＳを検出、診断、またはモニタリングするための診断キットを対象とする。
【０１８０】
一部の実施形態においては、抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、ブドウ糖酸化酵素等の検出に有用な酵素で標識化される。検出可能な酵素で標識化される実施形態においては、抗体は、酵素が使用して検出可能な反応産物を産生する追加試薬を添加することによって検出される。例えば、過酸化水素およびジアミノベンジジンとともにホースラディッシュペルオキシダーゼを使用する。抗体は、ビオチンで標識化され、アビジンまたはストレプトアビジン結合の間接測定を通して検出され得る。抗体は、二次レポーターによって認識される既定のポリペプチドエピトープでも標識化され得る（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープ標識）。
【０１８１】
本発明によって考慮されるキットは、ヒト、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、爬虫類、魚類、両生類、および鳥類、爬虫類、および魚類の卵を含むが、これらに限定されない、脊椎動物において、神経変性病を検出、診断、またはモニタリングすることを意図する。
【０１８２】
本発明の診断キットは、本発明に従う望ましい免疫測定を行うために必要な必須の試薬の一部またはすべてを含む。診断キットは、必要な試薬を保持する１つ以上の容器の組み合わせとして、市販のパッケージ化された形態で提供され得る。かかるキットは、幾つかの従来キットの構成要素と組み合わせて、本発明の抗体を含み得る。従来キットの構成要素は、当業者には容易に明らかとなり、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８８（その全体は参照することによって本明細書に組み込まれる）を含む、多数の発行物において開示されている。従来キットの構成要素は、例えば、マイクロタイタープレート、アッセイ混合物のｐＨを維持するためのバッファ（これらに限定されないが、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、リン酸、炭酸等）、ペルオキシダーゼ共役した抗マウスＩｇＧ（または一次抗体が派生した動物に対する任意の抗ＩｇＧ）等の共役二次抗体、安定剤、殺生物剤、例えば、血清アルブミン等の不活性タンパク質等の要素、および他の標準試薬を含み得る。
【０１８３】
本発明の診断キットは、自宅、ならびにクリニック、診療所、または研究所において使用するために適切なキットも含み得る。家庭用試験キットの例は、例えば、米国特許第５，６０２，０４０号において見出され、これは、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０１８４】
患者におけるタンパク質の存在を検出するという文脈において、本明細書で使用される「検出」という用語は、タンパク質量または患者においてタンパク質量を発現する能力の決定、疾病の考えられる結果および回復の見込みに関する予後の推測、状態の状況の測定としての一定期間のタンパク質レベルのモニタリング、および例えば、神経変性病を有する者等の患者に対する好ましい治療レジメンを決定するためのタンパク質レベルのモニタリングを含むことが意図される。
【実施例】
【０１８５】
実施例１
Ｓｅｍａ６Ａは、オリゴデンドロサイト生物学に関与する
オリゴデンドロサイトは、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＮＧ２を発現する）から幾つかの発達段階を通して成熟し、ミエリン化前オリゴデンドロサイト（Ｏ１およびＯ４を発現する）に分化して、最後にミエリン化オリゴデンドロサイト（Ｏ１、Ｏ４、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）および抗プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）を発現する）に成熟する。したがって、ＮＧ２、Ｏ１、Ｏ４、ＭＢＰ、およびＰＬＰマーカーの存在および不在をモニタリングすることによって、所与の細胞の発達段階を決定し、オリゴデンドロサイト生物学におけるＳｅｍａ６Ａポリペプチドの役割を評価することができる。オリゴデンドロサイト転写調節因子−２（Ｏｌｉｇ−２）は、オリゴデンドロサイト系統において発現することが知られ、したがって、オリゴデンドロサイトを検出するためのマーカーとして使用される。Ｙｏｋｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．ｏｆ  Ｐａｔｈ．１６４：１７１７−１７２５（２００４）を参照されたい。オリゴデンドロサイト生物学の一般評論については、例えば、ＢａｕｍａｎｎおよびＰｈａｍ−ＤｉｎｈのＰｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．８１：８７１−９２７（２００１）、Ｂｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．４９：２０９−２２０（２００５）を参照されたい。
【０１８６】
Ｏ４およびＭＢＰに対する単クローン抗体は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎから得た。ＰＬＰに対する単クローン抗体（クローンＡＡ３、１：１０）は、Ｐｒ．Ｃ．Ｌｕｂｅｒｚｋｉからの寄贈であった。Ｙａｍａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５７（５）：１６７１−８０（１９９１）を参照されたい。星状細胞前駆細胞（ＡＰＣ）に対する単クローン抗体は、ＶＷＲインターナショナル（Ｆｏｎｔｅｎａｙ  Ｓｏｕｓ  Ｂｏｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）から得た。ＣＮＰａｓｅに対する抗体は、Ｓｉｇｍａから得た。ＮＧ２（ＡＢ５３２０）に対する抗体は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎから得た。ヒトＳｅｍａ６Ａに対する抗体は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から得た。Ｎａ２＋およびパラノジンに対する抗体は、Ｓｉｇｍａから得た。抗ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０，１：１００）は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＳＣ−４０）から得た。
【０１８７】
Ｓｅｍａ６Ａ  ｍＲＮＡは、オリゴデンドロサイトにおいて発現する
Ｓｅｍａ６Ａ  ｍＲＮＡの発現は、原位置ハイブリダイゼーションによって、Ｐ１およびＰ１５マウスの新鮮な凍結脳（矢状断面）または脊髄（冠状断面）において解析した。Ｓｗｉｓｓマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ，Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ  Ｓａｉｎｔ  Ｉｓｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）をイソフルレンフォレン（Ａｂｂｏｔｔ）の吸入によって麻酔し、頭部を切除した。脳および視神経をイソペンタン（−５０℃）中で即時凍結し、ハイブリダイゼーション前に−８０℃で保存した。組織断面を４％ＰＦＡ中で１０分間後置し、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で洗浄し、プロテイナーゼＫ（１０μｇ／ｍｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で３〜５分間処理し、４％ＰＦＡ中で５分間後置し、ＰＢＳ中で洗浄、アセチル化して、ＰＢＳ１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で洗浄した。スライドをハイブリダイゼーションバッファ（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、１×デンハルト、２５０μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ、および５００μｇ／ｍｌニシン精液、ｐＨ７．４）中、室温で２時間インキュベートした後、ジゴキシゲニン標識Ｓｅｍａ６Ａリボプローブ（０．５ｎｇ／μｌ）を用いて、組織断面を７２℃で一晩ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、２×ＳＳＣ中７２℃で２時間断面を洗浄し、１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）を含有する０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．１５Ｍ  Ｎａｃｌ（Ｂ１）中、室温で１時間ブロックした。ブロッキング後、１％ＮＧＳを含有するＢ１中、アルカリホスファターゼ（１：５０００；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で共役した抗ジゴキシゲニン抗体を用いて、室温で一晩スライドをインキュベートした。追加洗浄後、塩化ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）（３３７．５μｇ／ｍｌ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−リン酸インドリル（ＢＣＩＰ）（１７５μｇ／ｍｌ）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、アルカリホスファターゼ活性を検出した。Ｍｏｗｉｏｌ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ／Ｍｅｒｃｋ，Ｃａｒｌｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に断面を載置した。図３に示されるように、Ｓｅｍａ６Ａ  ｍＲＮＡは、出生後の発達中、オリゴデンドロサイトによって、Ｐ１５マウスＣＮＳ白質において広範に発現する。
【０１８８】
Ｓｅｍａ６Ａタンパク質はオリゴデンドロサイトにおいて発現する
Ｐ１５マウス脳断面（４％ＰＦＡ固定脳から得た）上のオリゴデンドロサイトにおいてＳｅｍａ６Ａタンパク質の発現は、Ｓｅｍａ６ＡおよびＰＬＰ、Ｓｅｍａ６ＡおよびＡＰＣ（オリゴデンドロサイト用のマーカー）、ならびにＳｅｍａ６ＡおよびＣＮＰａｓｅ（オリゴデンドロサイトおよびＳｃｈｗａｎｎ細胞）の二重免疫染色によって確認した。０．２％ゼラチン（Ｐｒｏｌａｂｏ，Ｆｏｎｔｅｎａｙ−ｓｏｕｓ−Ｂｏｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）および０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＰＢＳ−Ｇ−Ｔ）を含有するＰＢＳ中、室温（ＲＴ）で１時間断面をブロックした後、一次抗体、すなわち、抗マウスＳｅｍａ６Ａ抗体、抗ＰＬＰ抗体、抗ＡＰＣ抗体、および抗ＣＮＰａｓｅ抗体とともに、室温で一晩インキュベートした。次いで、４％ＰＦＡを用いて、培養物を室温で１０分間固定、洗浄した後、飽和させ、１０％ＮＧＳおよび０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含有するＰＢＳバッファ中で３０分間透過させた。二次抗体、すなわち、Ｓｅｍａ６Ａに対するＣＹ３共役抗体およびＰＬＰ、ＡＰＣ、およびＣＮＰａｓｅに対するＦＩＴＣ共役抗体を、１０％ＮＧＳおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳ中で１時間希釈し、洗浄した後、二次抗体とともに室温で１時間インキュベートした。洗浄した後、培養物をＭｏｗｉｏｌ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ／Ｍｅｒｃｋ，Ｃａｒｌｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に載置する。
【０１８９】
二重免疫染色は、細胞を発現するすべてのＳｅｍａ６Ａが、白質においてＡＰＣ、ＣＮＰａｓｅ、またはＰＬＰも発現したことを示した（データ図示せず）。しかしながら、ＰＬＰ、ＡＰＣ、およびＣＮＰａｓｅを発現する一部の細胞は、Ｓｅｍａ６Ａを発現しない。したがって、Ｓｅｍａ６Ａタンパク質は、オリゴデンドロサイト系統の細胞のサブセット、またはオリゴデンドロサイトにおいて、特定の正確な成熟段階で発現するように思われる。したがって、オリゴデンドロサイトマーカー、ＰＬＰ、ＡＰＣ、またはＣＮＰａｓｅと結合されるＳｅｍａ６Ａから得た共免疫標識は、生体内オリゴデンドロサイト細胞によってＳｅｍａ６Ａの発現を確認した。
【０１９０】
同一のＰ１５脳断面（小脳、皮質）上で、オリゴデンドログリアル固有のタンパク質、例えば、ＰＬＰを用いる免疫染色を、Ｓｅｍａ６Ａ原位置ハイブリダイゼーションと組み合わせた。標準原位置ハイブリダイゼーションを、プロテイナーゼＫ消化（１０μｇ／ｍｌ）を２分に短縮したこと以外は、上で示したように実行した。Ｓｅｍａ６Ａを用いた原位置ハイブリダイゼーションの後、断面をＰＢＳ−Ｔ中で洗浄し、ＰＢＳ−Ｇ−Ｔ中室温で１時間ブロックし、抗ＰＬＰ抗体（クローンＡＡ３）を用いて室温で一晩インキュベートした後、ビオチニル化ウサギ抗ラット抗体（１：２００；Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）およびＨＲＰ共役ストレプトアビジン（１：４００；Ａｍｅｒｓｈａｍ）中でインキュベートした。ジアミノベンジジン反応（茶色の沈殿物）を用いて断面を発達させた。すべての細胞発現Ｓｅｍａ６Ａ転写は紫色で現れ、またＰＬＰ発現を示す茶色の沈殿物によって取り囲まれた（データ図示せず）。
【０１９１】
Ｓｅｍａ６Ａタンパク質の発現は、発達上調節される
Ｐ１５、Ｐ３０、およびＰ４５マウスから得た前脳冠状断面上のＳｅｍａ６ＡおよびＡＰＣの発現も、上述のような抗マウスＳｅｍａ６Ａおよび抗ＡＰＣ抗体を使用して、二重免疫染色によって解析した。強力なＡＰＣ発現が、すべての異なる年齢で観察されたが、ＡＰＣ／Ｓｅｍａ６Ａ細胞の最大同時標識がＰ１５において認められ、オリゴデンドロサイト（ＡＰＣ＋細胞）の６５％がＳｅｍａ６Ａを発現した（データ図示せず）。白質においてＳｅｍａ６Ａも発現するＡＰＣ陽性細胞の割合は、Ｐ３０において１４％に減少し、Ｐ４５において８％まで低下した（データ図示せず）。これは、Ｓｅｍａ６Ａ発現が発達上調節され、髄鞘形成のピーク中、Ｐ１５において最大に達することを示した。
【０１９２】
実施例２
オリゴデンドロサイト分化の様々な段階におけるＳｅｍａ６Ａ発現
Ｓｅｍａ６Ａの発現は、精製したオリゴデンドロサイト培養物においても生体外で示された。Ｐ０からＰ５マウスの皮質脳半球を解剖し、１０％ウシ血清で補完したＤＭＥＭから成る培地に移した。培地において７０μｍメッシュナイロンのふるいにかけることよって、組織を分離した。細胞懸濁液を、ポリオルニチンでコーティングした１００ｍｍ直径のプラスチック組織培養皿に注いだ。細胞層上で培地を優しく注入することによって、オリゴデンドロサイト前駆細胞を選択的に分離した。次いで、コーティングしていないプラスチック培養皿において、採取した細胞を２つの連続する事前プレーティングに１２時間以上かけて、残存する星状細胞および小膠細胞の付着を可能にした。非付着細胞および付着のゆるい細胞（オリゴデンドロサイト）を、６０ｍｍプラスチック培養皿において二次培養した。抗マウスＳｅｍａ６Ａ抗体および抗ＮＧ２（オリゴデンドロサイト前駆細胞に対するマーカー）または抗Ｏ４（オリゴデンドロサイト前段階から発現したオリゴデンドロサイト系統のマーカー）および抗ＭＢＰ抗体（成熟オリゴデンドロサイトに対するマーカー）を用いて、培養物を染色した。ＣＹ３共役抗体を二次抗体として使用し、Ｓｅｍａ６Ａ発現およびＮＧ２、Ｏ４、およびＭＢＰに対するＦＩＴＣ共役発現を可視化した。生体外で２４時間後、異なる種類の細胞がＮＧ２を発現し、極めて分化した形態学を有する一部の細胞は、ＦＩＴＣ標識化（ＮＧ２＋）されたに過ぎず、およびしたがってＳｅｍａ６Ａに対して陰性であり、他のより分化した（より多くの過程を経た）細胞は、細胞過程ではなく、細胞体においてＮＧ２および低レベルのＳｅｍａ６Ａを発現した（データ図示せず）。生体外で４８時間後、Ｏ４陽性細胞は、Ｓｅｍａ６Ａを高く発現した（データ図示せず）。生体外で７２時間後、ＭＢＰ陽性細胞は、Ｓｅｍａ６Ａを高く発現した（データ図示せず）。これは、Ｓｅｍａ６Ａが、分化した（Ｏ４およびＭＢＰ＋）オリゴデンドロサイトにおいてより高く発現したことを示す（生体内で観察されるとおり）。
【０１９３】
実施例３
Ｓｅｍａ６Ａ−ノックアウトマウスは、ミエリン化した軸索の減少を呈する
Ｓｅｍａ６Ａノックアウトマウスを生成するために、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって分離された、カセットコード化ＣＤ４膜貫通領域−β−ガラクトシダーゼ−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＴＭ−β−ｇｅｏ）およびヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）を、Ｌｅｉｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１０：１７４−１７９に記載されるように、Ｓｅｍａ６Ａの第１７イントロンに挿入した。アミノ酸６２３までのＳｅｍａ６Ａタンパク質の残存する（およびしたがって、膜貫通および細胞質ドメインを欠失する）Ｎ末端部分は、β−ガラクトシダーゼに融合し、小胞体に捕捉した。
【０１９４】
髄鞘形成の遅延を解析するために、Ｓｅｍａ６Ａ不全マウスにおけるランヴィエ絞輪を研究した。ランヴィエ絞輪は、結節において特徴的な発現および機能を有する、幾つかの十分に同定されたタンパク質を発現する。パラノジン等のランヴィエ絞輪の形成に関与するタンパク質に対して生じた抗体を使用して、タンパク質の発現を検出した。結節は、十分に組織化された構造であり、ミエリン化される軸索とオリゴデンドロサイトとの間で密接に相互作用する。結節上のタンパク質の特徴的な発現により、異なる領域を可視化することができる。すなわち、Ｎａ２＋電圧依存性チャネルは、結節の中央領域を可視化し、パラノジンは、結節の中央領域を取り囲む２つのドメインを可視化し、これらは、パラノジン／Ｎａ２＋チャネルクラスタと称される。Ｎａ２＋チャネルおよびパラノジンの発現は、抗Ｎａ２＋チャネルおよびパラノジン抗体を使用して、Ｐ１６マウスの視神経における免疫組織化学によって可視化した（データ図示せず）。免疫組織化学は、Ｓｅｍａ６Ａ不全マウスにおいて、パラノジン／Ｎａ２＋チャネルクラスタ（−４０．５４％；ｎ＝３）の数の著しい減少を示した（データ表示せず）。この結果は、Ｐ１６Ｓｅｍａ６Ａ不全マウスが、野生型よりもミエリン化した軸索が少ないことを示唆する。
【０１９５】
Ｓｅｍａ６Ａノックアウトマウスは、オリゴデンドロサイトにおいて低いＰＬＰ発現を呈する
Ｓｅｍａ６Ａ不全マウスにおいてオリゴデンドロサイトの分化または増殖が正常であったかどうかを決定するため、３つの主要な軸索路である、前交連（ＡＣ）、脳梁（ＣＣ）、および視神経（ＯＮ）を、非放射性原位置ハイブリダイゼーションによって標識化し、ＰＬＰ発現細胞の数を定量した。ＡＣおよびＣＣに関して、３つの年齢、すなわち、Ｐ１６、Ｐ３０、およびＰ４５（それぞれ３匹の動物）を解析し、ＯＮに関してＰ１６を解析した。ＣＣにおいて、いかなる年齢でもＰＬＰの発現に有意な変化は認められなかった（データ図示せず）。しかしながら、ＰＬＰ発現細胞の数は、野生型同腹子と比較して、Ｓｅｍａ−／−マウス（−４３％）において、Ｐ１６で減少した（図４）。Ｐ１６におけるこの減少は、ＰＬＰ発現細胞の数の主要な減少（−６０％）によって説明されるが、ＡＣの表面の３０％減少も伴う。ＡＣのＰ３０において、減少はそれほど顕著ではなく（−２０％）、図４に示されるように、成人において正常に戻る。同様に、Ｐ１６視神経におけるＰＬＰの発現も、同様の減少（−２６％）を示した（データ図示せず）。しかしながら、ＡＣにおいて、オリゴデンドロサイト系統に属する転写調節因子２（Ｏｌｉｇ２）発現細胞の数に有意な変化は認められなかった（データ図示せず）。かかる結果は、生体内のオリゴデンドロサイトの分化、または軸索路を移行および移植させる能力のいずれかにおけるＳｅｍａ６Ａの考えられる役割を示唆する。
【０１９６】
Ｓｅｍａ６Ａ不全オリゴデンドロサイトは、分化の遅延を呈する
オリゴデンドロサイトは、Ｓｅｍａ６Ａ−／−新生マウスから精製し、Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．６５：４３９−４４５，２００１に記載される方法によって分化するそれらの能力を解析した。簡潔に述べると、Ｐ０〜Ｐ１０マウスまたはラットの脳半球全体を、リン酸バッファ生理食塩水中で解剖し、ペニシリン（５０単位／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１５１４０）、ウシ血清（１０％）（Ｇｉｂｃｏ  １６０３００７４）、５ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦＢＢ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ３２０１）、および５ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ  Ｆ０２９１）で補完したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ３１９６６０４７）から成る培地に移した。培地において、組織を７０μｍメッシュナイロン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のふるいにかけることによって解離を行った。細胞懸濁液を、ポリオルニチンでコーティングした１００ｍｍ直径のプラスチック組織培養皿（Ｓｉｇｍａ  Ｐ３６５５）に注いだ。培養物は、９５％空気−５％ＣＯ２で均衡した水飽和インキュベータ中、３７℃でインキュベートした。培地は、播種後４日目に取り替え、その後は１週間に２回取り替えた。８〜１０日後に、細胞層上で培地を優しく注入することによって、オリゴデンドロサイト前駆細胞を選択的に分離した。次いで、コーティングしていないプラスチック培養皿において、採取した細胞を２つの連続する事前プレーティングに１２時間以上かけて、残存する星状細胞および小膠細胞の付着を可能にした。非付着細胞および付着のゆるい細胞を、０．５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１０μＭインスリン、１００μｇ／ｍｌトランスフェリン、０．５μｇ／ｍｌアルブミン、２μＭプロゲステロン、１００μＭプトレッシン、４０ｎｇ／ｍｌトリヨードチロニン、４０ｎｇ／ｍｌＬ−チロキシン、４０ｎＭ  ｄ−ビオチンおよび１００ｎＭヒドロコルチゾンを含有する化学的に定義した培地中、ポリオルニチンでコーティングした６０ｍｍプラスチック培養皿において二次培養した。追加マイトジェンの不在下において、かかる二次培養物は、１０日後に、９０％Ｇａｌ−Ｃ陽性細胞を含有する、略均質の細胞集団を生じる。Ｂｅｓｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７（４）：４０１−４０９，１９８９を参照されたい。かかる細胞をオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）段階において維持し、処理前の早期分化を回避するため、ＰＤＧＦＡＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）（ラット）またはＰＤＧＦＢＢ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびｂＦＧＦ（ラットの場合１０ｎｇ／ｍｌおよびマウスの場合２０ｎｇ／ｍｌ）を培地に添加した。マイトジェン離脱後、ＯＰＣ分化は２４〜７２時間以内に生じる。Ｂｏｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７（１６）：６３６８−６３７２，１９９０；Ｄｕｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１６（２）：３０６−３１７，１９９７を参照されたい。Ｒ＆Ｄシステムから購入したＳｅｍａ６Ａ−Ｆｃタンパク質も化学的に定義した培地に添加した。
【０１９７】
オリゴデンドロサイトの成熟段階は、培養したオリゴデンドロサイトの形態的な複雑性によって、例えば、細胞のフラクタル次元（ＦＤ）を測定することによって測定することができる。同上。図５は、生体外で２４時間および４８時間後に、Ｓｅｍａ６Ａ＋／−およびＳｅｍａ６Ａ−／−マウスから得た精製オリゴデンドロサイト（位相差顕微鏡によって可視化するか、または抗Ｏ４抗体で標識化した）のＦＤ定量を示す。これは、４８時間後にＳｅｍａ６Ａ＋／−オリゴデンドロサイトの大部分が１．２５のＦＤを有するが、大部分のＳｅｍａ６Ａ−／−オリゴデンドロサイトは、１．０５〜１．１５（ｎ＝３）のみのＦＤを有することを示した（図５Ａ）。生体外で２４時間後のＳｅｍａ６Ａ＋／−およびＳｅｍａ６Ａ−／−オリゴデンドロサイトのＦＤは、４８時間後のＳｅｍａ６Ａ−／−オリゴデンドロサイトのＦＤに類似する（データ表示せず）。かかる結果は、オリゴデンドロサイト分化が、Ｓｅｍａ６Ａ−／−マウスにおいて遅延することを示す。
【０１９８】
７２時間後、培地において、抗Ｏ４抗体（分化しているオリゴデンドロサイトに対するマーカー）および抗ＭＢＰ抗体（分化したオリゴデンドロサイトに対するマーカー）を用いてオリゴデンドロサイトを免疫染色し、オリゴデンドロサイト分化を測定した。二次抗体として、Ｏ４に対するＦＩＴＣ共役抗体およびＭＢＰに対するＣＹ３共役抗体を使用した。顕微鏡下で、ランダムに選択した領域を解析した。７２時間後、Ｓｅｍａ６Ａ−／−におけるＯ４＋／ＭＢＰ＋細胞の数は、野生型のそれと比較して、４０．０９％減少した（データ図示せず）。生体外データは、オリゴデンドロサイト分化がオリゴデンドロサイトを欠失するＳｅｍａ６Ａにおいて遅延するという結論を支持する。
【０１９９】
実施例４
Ｓｅｍａ６Ａ−Ｆｃは、生体外で髄鞘形成を促進する
後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンおよびオリゴデンドロサイトの共培養をＳｅｍａ６Ａ−Ｆｃで処理し、免疫組織化学およびウェスタンブロットにより髄鞘形成を試験することによって、髄鞘形成におけるＳｅｍａ６Ａの役割を生体外で調べた。かかる研究の場合、ＤＲＧニューロンおよびオリゴデンドロサイトの初代培養を最初に生成することが必要であった。
【０２００】
ＳＤラットＥ１４〜Ｅ１７胎児後根神経節を、ポリ−Ｌ−リジン（１００μｇ／ｍｌ）でコーティングしたカバースリップ上に置いた。Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １７５０４）で補完したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ２１１０３０４９）において、それらを２週間成長させた。増殖しているグリア細胞を採取するため、培養物をフルオロデオキシウリジン（２０μＭ）で１週間に２回パルスした。オリゴデンドロサイトは、実施例３に記載されるように調製した。
【０２０１】
共培養研究のため、１００〜３００ｎｇ／ｍｌのＳｅｍａ６Ａ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ，１１４６−Ｓ６−０２５）の存在下または不在下で、オリゴデンドロサイトをＤＲＧニューロン点滴培養物に添加した。培地（Ｂ２７および１００ｎｇ／ｍｌ  ＮＧＦで補完したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地）を取り替え、新鮮なＳｅｍａ６Ａ−Ｆｃを３日毎に細胞に添加した。髄鞘形成の変化を確認するため、３週齢の培養物を抗ＭＢＰ抗体で標識化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いでウェスタンブロット解析に共した。
【０２０２】
図６は、Ｓｅｍａ６Ａ−Ｆｃタンパク質の添加が、用量依存的に、負の対照から０．１μｇ／ｍｌ、および０．１μｇ／ｍｌから０．３μｇ／ｍｌに髄鞘形成を増加させたことを示す。ウェスタンブロットも、Ｓｅｍａ６Ａ−Ｆｃの添加によって、ＭＢＰ発現が増加する、すなわち、０．１μｇ／ｍｌから０．３μｇ／ｍｌに増加することを示した（データ表示せず）。したがって、かかるデータは、Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドが髄鞘形成を促進または誘発できることを示す。
【０２０３】
実施例５
Ｓｅｍａ６Ａ−Ｆｃは、生体内の再髄鞘形成に関与した
クプリゾン（銅キレート）への露出を、マウス脳の広い領域において重要な脱髄を再生可能に誘発できる実験モデルとして使用した。Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．１１（１），１０７-１１６，２００１を参照されたい。８週齢のマウスに０．２％クプリゾンを食餌に入れて６週間与え、成熟オリゴデンドロサイトをアポトーシスによって死亡させた。細胞死は、小膠細胞の動員およびミエリンの食細胞活動に続いてすぐに生じた。クプリゾン治療の終了時、または継続するクプリゾン露出の後であっても、オリゴデンドロサイト前駆細胞は、増殖を開始し、脱ミエリン化領域を侵襲した。クプリゾン治療が終了すると、概して完全な再髄鞘形成が数週間後に生じる。クプリゾンモデルを使用して、脱髄および再髄鞘形成中のＳｅｍａ６Ａ発現を解析することができる。クプリゾン露出および次いで終了後に、クプリゾン処理したマウスの脳梁において、Ｓｅｍａ６Ａ発現オリゴデンドロサイトの数の有意な増加が認められ、それは、クプリゾンの投与後３週間から始まり、４週間目にピーク（＋３１０％，ｎ=３）に達した後、６週間目に発現の基準レベルに戻った（図７）。病巣におけるかかるＳｅｍａ６Ａ発現細胞は、ｏｌｉｇ−２に対してすべて陽性であった。Ｓｅｍａ６Ａ発現のこの上方規制を特徴付けるために、犠牲死の１週間前に、クプリゾン処理した動物にＢｒｄＵを注入した。Ｓｅｍａ６Ａ発現オリゴデンドロサイトの一部はＢｒｄＵ陽性であって、クプリゾンによる脱髄の誘発中に分化した前駆体から動員されたことを示唆する。
【０２０４】
実施例６
Ｓｅｍａ６Ａは、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）に関与し得る
ＥＡＥを誘発するために、マウスのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）配列３５〜５５に基づいた２０アミノ酸ペプチドを使用した。ＥＡＥの開始日を実験の１日目として、ＥＡＥの臨床アセスメントを７日目から開始し、それを毎日行い、疾病に関して、マウスを以下の基準に従って採点した：疾病なし（０）、尾部の色調の低下（１）、後肢の衰弱または部分麻痺（２）、後肢の完全麻痺（３）、前肢および後肢麻痺（４）、および瀕死状態（５）。かかる得点は、脱髄疾患の発生を反映する。２０アミノ酸ペプチドによるＥＡＥ誘発後に、Ｓｅｍａ６Ａ−／−マウスは、対照動物よりも少ない欠陥挙動を発症した。Ｓｅｍａ６Ａ−／−マウスの平均得点は、最大０．５にしか達しなかったが、対照動物の平均得点は３．５に達した（データ図示せず）。２５％のＳｅｍａ６Ａ−／−マウスのみが、病気の任意の兆候を示した（データ図示せず）。かかる実験は、Ｓｅｍａ６Ａが、ＥＡＥ誘発において、また恐らくは、多発性硬化症等のより広範な自己免疫病理に関与し得ることを示唆する。
【０２０５】
加えて、ＥＡＥ誘発に関して、プレキシンＡ４−／−マウスを試験した。Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．ＤＯＩ：１０．１０９３／ｉｎｔｉｍｍ／ｄｘｎ００６（Ｊａｎ．２００８）を参照されたい。Ｓｅｍａ６Ａ−／−マウスは、上で示されるように、ＥＡＥ耐性を示したが、プレキシンＡ４−／−マウスは、ＥＡＥ誘発に対してより高い感度を示した。同上を参照されたい。さらに、Ｓｅｍａ６Ａ−／−およびプレキシンＡ４−／−マウスの両方において、生体外Ｔ細胞増殖アッセイを行った。同上を参照されたい。プレキシンＡ４−／−マウスは、Ｔ細胞増殖の有意な増加を示したが、Ｓｅｍａ６Ａ−／−マウスは、Ｔ細胞増殖において差を示さなかった。同上を参照されたい。この情報は、Ｓｅｍａ６Ａ−／−マウスにおけるＥＡＥ耐性が、Ｓｅｍａ６Ａ−／−マウスにおける免疫反応の異常に起因しない可能性があることを示唆する。
【０２０６】
実施例７
Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、ヒト多発性硬化症の病巣組織において発現する。
【０２０７】
Ｓｅｍａ６Ａ発現が、ヒトＭＳ病巣組織と非病巣組織との間で異なるかどうかを決定するために、標準原位置ハイブリダイゼーションおよびヒトＭＳ組織（新皮質試料）における免疫染色によって、Ｓｅｍａ６Ａ発現を測定した。ＭＳ組織は、Ｓａｌｐｅｔｒｉｅｒｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，７５０１３  ＰａｒｉｓのＦｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｄｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｅから取得した。標準原位置ハイブリダイゼーションを行った。４％パラホルムアルデヒドに浸漬することによって組織を固定し、パラフィンに埋め込んだ。原位置ハイブリダイゼーションのため、最初に組織断面をキシレン中でろう除去し（３×５分）、次いで、減少勾配のエタノール（１００％、８０％、７０％、５０％）および最後に水およびＰＢＳに連続して通すことによって、水分補給した。組織断面を４％ＰＦＡ中で１０分間後置し、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で洗浄し、プロテイナーゼＫ（５０μｇ／ｍｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて１５分間３７℃で処理し、４％ＰＦＡ中で５分間後置し、ＰＢＳで洗浄し、アセチル化して、連続エタノール浴（５０％、７０％、８０％、１００％）で脱水した。ハイブリダイゼーションバッファ中、６８℃で２時間スライドをインキュベートし、実施例１に示されるように処理する。ハイブリダイゼーションバッファ（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、１×デンハルト、２５０μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ、および５００μｇ／ｍｌニシン精液、ｐＨ７．４）中、室温で２時間スライドをインキュベートした後、ジゴキシゲニン標識化したＳｅｍａ６Ａリボプローブ（０．５ｎｇ／μｌ）を用いて、７２℃で一晩、組織断面をハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、２×ＳＳＣ中７２℃で２時間、断面を洗浄し、１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）を含有する０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（Ｂ１）中、室温で１時間ブロックした。ブロッキングした後、１％ＮＧＳを含有するＢ１中、アルカリホスファターゼ（１：５０００；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）と共役した抗ジゴキシゲニン抗体を用いて、室温で一晩スライドをインキュベートした。追加洗浄の後、塩化ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）（３３７．５μｇ／ｍｌ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−リン酸インドリル（ＢＣＩＰ）（１７５μｇ／ｍｌ）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、アルカリホスファターゼ活性を検出した。図８Ａおよび８Ｂに示されるように、Ｓｅｍａ６Ａ  ｍＲＮＡは、ヒトＭＳ病巣組織において広範に発現するが、非病巣組織においては発現しない。
【０２０８】
ＭＳ病巣組織および非病巣組織の免疫染色も行ったところ、ヒトＭＳ病巣組織が、Ｓｅｍａ６Ａを高く発現することを示した。０．２％ゼラチン（Ｐｒｏｌａｂｏ，Ｆｏｎｔｅｎａｙ−ｓｏｕｓ−Ｂｏｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）および０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＰＢＳ−Ｇ−Ｔ）を含有するＰＢＳ中、室温（ＲＴ）で１時間、組織断面をブロックした後、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）からの抗ヒトＳｅｍａ６Ａ抗体を用いて、室温で一晩インキュベートした。次いで、ＰＢＳ−Ｇ−Ｔ中で希釈したＣＹ３共役抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）とともに、室温で１時間、断面をインキュベートした。ＰＢＳ−Ｇ−Ｔ（３×１０分）で洗浄した後、断面をＭｏｗｉｏｌ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ／Ｍｅｒｃｋ，Ｃａｒｌｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に載置した。図８Ｃに示されるように、ＭＳ病巣組織は、高レベルのＳｅｍａ６Ａ発現を示し、非病巣組織は、Ｓｅｍａ６Ａ発現をほとんど、またはまったく示さない（図８Ａおよび図８Ｂ）。
【０２０９】
バイオマーカーとしてのＳｅｍａ６Ａ発現の可能な使用を見出すために、非ＭＳ患者の組織においてもＳｅｍａ６Ａ発現を測定したところ、非ＭＳ患者においてＳｅｍａ６Ａは発現しなかった（データ図示せず）。血液細胞、例えば、樹状細胞はＳｅｍａ６Ａを発現することがよく知られている。Ｇａｕｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６８（２）：４５３−４６５（２００６）を参照されたい。樹状細胞は、脳脊髄液（ＣＳＦ）中に存在することも知られている。Ｐａｓｈｅｎｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  １２４（３）：４８０−４９２（２００１）を参照されたい。
【０２１０】
樹状細胞上のＳｅｍａ６Ａ発現およびＭＳ病巣組織と非病巣組織との間の分化Ｓｅｍａ６Ａ発現を考慮して、皮膚組織等の組織、または血液もしくはＣＳＦ等の体液等の検体をヒトから収集し、ＭＳの病状について試験する。例えば、ＥＬＩＳＡによって、Ｓｅｍａ６Ａの発現について標本を試験する。体液における特定レベルの発現は、ＭＳの可能性、またはＭＳを発症する潜在性を示し得る。追加の実施形態において、かかるアッセイを使用して、特定のＭＳ治療法の有効性を測定することができる。血清またはＣＳＦがＳｅｍａ６Ａの発現を呈する場合、血清を採取したヒトは、ＭＳの疑いがあり得る。代替として、収集した標本から得た樹状細胞を濃縮した後、例えば、ＥＬＩＳＡを使用して、標本中のＳｅｍａ６Ａを測定することができる。本方法にしたがって、Ｓｅｍａ６Ａの検出を、実際または潜在的なＭＳ疾患のマーカーとして使用することができる。
【０２１１】
実施例８
Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドは、プレキシン−Ａ２ポリペプチドと相互作用する
Ｓｅｍａ６Ａポリペプチドとプレキシン−Ａ２ポリペプチドとの間の相互作用を決定するために、組み換えＦｃ二量化ＡＰ標識Ｓｅｍａ６Ａ外部ドメイン（細胞外ドメイン）（ＡＰ−Ｓｅｍａ６Ａｅｃｔ−Ｆｃ）を、Ｓｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：３６２８−３６３７（２００５）に記載されるように、全長マウスプレキシン−Ａ２ポリペプチドを発現しているマウス線維芽細胞系統細胞（Ｌ細胞）に添加した。組み換えＳｅｍａ６Ａ外部ドメインを形成するために、マウスＳｅｍａ６Ａの外部ドメインに対応する配列（Ｓｅｍａ６Ａｅｃｔ；アミノ酸１８〜６４８）を増幅させて、Ａｐｔａｇ−４ベクターに挿入した（Ｄｒ．Ｊ．Ｆｌａｎａｇａｎ，Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡからの寄贈）（ＡＰ−Ｓｅｍａ６Ａｅｃｔ）。Ｆｌａｎａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３２７：１７−３５（２０００）を参照されたい。組み換えタンパク質を二量化するために、ＡＰ−Ｓｅｍａ６ＡｅｃｔをコードするフラグメントをｐＥＦ−Ｆｃに挿入した（ＡＰ−Ｓｅｍａ６Ａｅｃｔ−Ｆｃ；ＡＰ−Ｓｅｍａ６Ｂｅｃｔ−Ｆｃ；ｐＥＦ−Ｆｃ発現ベクターは、Ｄｒ．Ｓ．Ｎａｇａｔａ，Ｏｓａｋａ  Ｕｎｉｎｖｅｒｓｉｔｙからの寄贈であった）。ヒト胎児腎臓２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用し、ｐＥＦ−ＡＰ−Ｓｅｍａ６Ａｅｃｔ−Ｆｃ（ｐＣＡＧＧＳ発現ベクターは、Ｄｒ．Ｊ．Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｏｓａｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙからの寄贈であった）を用いて、遺伝子導入し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭにおいて、５％ＣＯ２中３７℃で５〜７時間培養した。培養物の上清を収集し、０．２２μｍフィルターを使用してろ過した。
【０２１２】
プレキシン−Ａ２発現Ｌ細胞を生成するために、全長マウスプレキシン−Ａ２タンパク質をコード化するｃＤＮＡを、マウスＳｅｍａ３Ａのシグナル配列の側面に配置し、Ｎ末端においてｍｙｃ標識（ＧＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ：配列番号１７）を付加した後、発現ベクターｐＣＡＧＧＳに結紮した。カルシウムリン酸化方法（ＣｈｅｎおよびＯｋａｒａｍａのＭｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：２７４５−２７５２，１９８７）に従って、Ｌ細胞をプレキシン−Ａ２発現ベクターおよびｐＳＴ−ｎｅｏＢ（Ｋａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．１２：５７５−５８０，１９８７）で同時遺伝子導入し、ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（ＧＩＢＣＯ）を用いて選択した。ＤＨ１０倍地を用いてＬ細胞を培養した。プレキシン−Ａ２タンパク質を安定して発現する細胞系統を、抗ｍｙｃ抗体９Ｅ１０を用いた免疫染色によって単離した。Ｅｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：３６１０−３６１６，１９８５を参照されたい。
【０２１３】
プレキシン−Ａ２に対するＳｅｍａ６Ａの結合を示すために、全長マウスプレキシン−Ａ２タンパク質を安定して発現するＬ細胞を、０．５ｍｇ／ｍｌＢＳＡを有する２５０μｌのＨＢＳＳ、０．１％ＮａＮ３、および１％ＦＢＳおよびＡＰ−Ｓｅｍａ６Ａｅｃｔ−Ｆｃ組み換えタンパク質（培養上清）を含有する２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０（ＨＢＨＡ溶液）を用いて、ＦｌａｎａｇａｎおよびＬｅｄｅｒのＣｅｌｌ  ６３：１８５−１９４（１９９０）に記載されるように、氷上で１時間インキュベートした。ＨＢＨＡ溶液を除去した後、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で補完した２５０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で細胞を処理し、細胞表面に結合した組み換えタンパク質を溶解した。細胞溶解物を比色分析に共し、ＦｌａｎａｇａｎおよびＬｅｄｅｒのＣｅｌｌ  ６３：１８５−１９４（１９９０）およびＦｌａｎａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｘｙｍｏｌ  ３２７：１７−３５（２０００）に記載されるように、ＡＰ活性を測定した。
【０２１４】
Ｓｅｍａ６ＡのＦｃ二量体化組み換えＡＰ標識外部ドメインが、高い親和性でプレキシン−Ａ２発現Ｌ細胞と結合したことが示された。Ｓｅｍａ６Ａのプレキシン−Ａ２との相互作用の解離定数（Ｋｄ）値は、３．２１ｎＭであった（データ表示せず）。Ｋｄ値は、Ｓｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｓｃｉ．２５：３６２８−３６３７（２００５）に記載されるＳｅｍａ６Ａのプレキシン−Ａ４、すなわち、３．５６ｎＭとの相互作用に関するＫｄ値と同程度であった。
【０２１５】
実施例９
プレキシン−Ａ２における単一突然変異は、Ｓｅｍａ６Ａの結合を除去し得る
Ｓｅｍａ６Ａに対するプレキシン−Ａ２／プレキシン−Ａ４の結合部位を決定するために、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ突然変異マウス、すなわち、ＮＭＦ４５４を試験した。Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスの後退ゲノム−幅広Ｎ−エチルＮ−ニトロソウレア（ＥＮＵ）突然変異誘発スクリーニングで、ＮＭＦ４５４マウス（Ｄｒ．Ｓ．Ａｃｋｅｒｍａｎ，Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＵＳＡからの寄贈）を確認した。ＮＭＬ４５４突然変異マウスの組織学的分析により、プレキシン−Ａ２およびＳｅｍａ６Ａヌルマウスのそれと著しく類似するように思われる、小脳の過形成性分子層が明らかになった。Ｒｅｎａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２００８）を参照されたい。
【０２１６】
ＮＭＦ４５４突然変異が、プレキシン−Ａ２またはＳｅｍａ６Ａ遺伝子のいずれかにおいて生じたか否かを決定するために、マイクロサテライトマーカーを使用する遺伝子マッピングを行った。ＮＭＦ４５４表現型を示したＦ２子孫（ｎ＝１１）は、マッピングクロス（Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ  Ｘ  ＢＡＬＢ／ｃＢｙ）からのＦ１子孫の交雑受精によって生成し、罹患したＦ２子孫を組織学的に確認した。次いで、それぞれプレキシン−Ａ２およびＳｅｍａ６Ａ遺伝子と密接に結合する多様型のマイクロサテライトマーカーである、Ｄ１Ｍｉｔ１５５およびＤ１８Ｍｉｔ１７８を用いて、Ｆ２子孫の遺伝子型を特定した。Ｄ１８Ｍｉｔ１７８との結合は認められなかった（Ｘ２＝１．２；Ｐ＞０．５）。しかしながら、Ｄ１Ｍｉｔ１５５との堅固な結合が認められた（Ｘ２＝３３．０；Ｐ＜０．０００１）。この結果は、表現型分析と併せて、ＮＭＦ４５４突然変異が、プレキシン−Ａ２遺伝子（Ｐｌｘｎａ２）中に存在することを示唆した。
【０２１７】
突然変異の正確な位置を決定するために、小脳および新皮質におけるプレキシン−Ａ２発現のウェスタンブロット解析を行った。図９Ａに示されるように、ウェスタンブロット解析により、約２５０ｋＤａの帯域が、ＮＭＦ４５４同型突然変異マウス（ｎ＝２）、野生型、およびＮＭＦ４５４異型対照（ｎ＝２）において存在したが、通常のプレキシン−Ａ２ノックアウト系統には存在しなかったことが明らかになった。このデータは、ＥＮＵ突然変異が、ヌル対立遺伝子または切断プレキシン−Ａ２タンパク質を生じなかったことを示唆する。突然変異の位置をさらに特定するために、プレキシン−Ａ２遺伝子（Ｐｌｘｎａ２）のすべてのエクソンを、ＮＭＦ４５４同型突然変異（ｎ＝３）および野生型対照（ｎ＝２）のゲノムＤＮＡから完全に配列決定した。これにより、アデニンによる１１８７位でのシトシンの単一ヌクレオチド置換が、グルタミン酸残基によってアラニン（３９６）の置換を生じることが明らかになった。さらに、脊椎動物のプレキシン−Ａ配列の配置により、セマフォリンドメインに位置するこのアラニンは、双方のＳｅｍａ６Ａ受容体、すなわち、プレキシン−Ａ２およびプレキシン−Ａ４タンパク質の両方において進化的に保存されていることが明らかになった（図９Ｂ）。しかしながら、この配置は、アラニン（３９６）が、Ｓｅｍａ６Ａに結合することが知られていないプレキシン−Ａ１およびプレキシン−Ａ３において不在であったことを示した（図９Ｂ）。Ｓｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：３６２８（２００５）を参照されたい。またＳｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ５３：５３５（２００７）も参照されたい。
【０２１８】
ＮＭＦ４５４同型突然変異体におけるアラニン（３９６）突然変異が、Ｓｅｍａ６Ａに対するプレキシン−Ａ２の結合を混乱させるか否かを決定するために、標的突然変異誘発を行い、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、プレキシン−Ａ２  ｃＤＮＡに、シトシン１１８７の同一点突然変異（ＧＣＧからＧＡＧ）を導入した。突然変異誘発に使用したプライマーは、以下のとおりであった。
【０２１９】
順方向プライマー（配列番号１８）
５’−ＧＣＡＧＴＧＣＡＣＣＡＡＧＧＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＡＡＴＣＧ−３’
逆方向プライマー（配列番号１９）
５’−ＣＧＡＴＴＧＧＧＡＣＡＧＧＣＴＣＣＴＴＧＧＴＧＣＡＣＴＧＣ−３’
突然変異した組成物（プレキシン−Ａ２Ａ３９６Ｅ）を完全に配列決定し、シトシン１１８７のみがアデニンにより置換されたことを確認された。
【０２２０】
次いで、このプレキシン−Ａ２Ａ３９６Ｅ  ｃＤＮＡを、ＣＯＳ７細胞において発現させ、実施例８に示されるものと同一の方法を使用して、Ｓｅｍａ６Ａ−ＡＰに結合するその能力を試験した。Ｓｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ５３：５３５４（２００７）を参照されたい。結合アッセイの結果は、Ｓｅｍａ６Ａ−ＡＰが、野生型プレキシン−Ａ２を発現するＣＯＳ７細胞に極めて強力に結合したことを示した（図９Ｃ）。しかしながら、野生型および突然変異タンパク質の両方が同様のレベルで発現したようであったが、Ｓｅｍａ６Ａ−ＡＰは、プレキシン−Ａ２Ａ３９６Ｅを発現する細胞にまったく結合しなかった（図９Ｄ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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