(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
絶縁層の上にレジストパターン層を形成してから前記レジストパターン層の上に金属層を形成する第１工程と、
酸化グラフェンからなる炭素材料の小片が分散した分散溶液を前記金属層の上に塗布して前記金属層の上に前記炭素材料からなる炭素層を形成する第２工程と、
前記金属層の上に形成された前記炭素層を構成している酸化グラフェンを還元した後で、前記レジストパターン層を除去するリフトオフ法により前記金属層および前記炭素層をパターニングし、２つの電極の上に前記炭素材料の層が形成された状態とする第３工程と
を少なくとも備えることを特徴とする電気化学測定用電極の製造方法。
【請求項２】
請求項１記載の電気化学測定用電極の製造方法において、
２つの前記電極は、交互に入り込んで対向配置された２つの櫛形電極であることを特徴とする電気化学測定用電極の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気化学的な測定で用いられる電気化学測定用電極の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
電気化学法に基づく分析やバイオセンサーにおいては、より低濃度の目的物質を高感度に測定する技術が重要である。高感度な測定を行う技術として、作用電極をμｍオーダで近設して構成した２つの電極（ジェネレータ電極とコレクター電極）から構成する技術がある（特許文献１，非特許文献１参照）。この技術では、電気化学的な酸化還元サイクルを電極上に発生させ、１つの検出目的分子から繰り返し酸化還元電流を取り出すことで、見かけ上の電流値を増大させ、高感度な測定を可能としている。このような電極構造を用いることで、高感度な電気化学検出が可能であり、また、これを利用した高感度バイオセンサーの実現が可能となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平０１−２７２９５８号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】C.E. Chidsey et al. , "Micrometer-Spaced Platinum Interdigitated Array Electrode: Fabrication, Theory, and Initial Use", Anal. Chem. , vol.58, pp.601-607, 1986.
【非特許文献２】K.Hayashi et al. , "Development of Nanoscale Interdigitated Array Electrode as Electrochemical Sensor Platform for Highly Sensitive Detection of Biomolecules", Journal of The Electrochemical Society, vol.155, no.9, pp.J240-J243, 2008.
【非特許文献３】S.Yang et al. , "Controllable Adsorption of Reduced Graphene Oxide onto Self-Assembled Alkanethiol Monolayers on Gold Electrodes: Tunable Electrode Dimension and Potential Electrochemical Applications", J. Phys. Chem. C, vol.114, pp.4389-4393, 2010.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、上述したように、μｍオーダで接近させた２つの電極を用いてより高感度な検出を行うためには、目的物質を枯渇させることなく酸化還元サイクルを電極上に発生させることが重要である。例えば、ジェネレータ電極で反応した中間物質が拡散や輸送によってコレクター電極に到達する前に不活性化すると、十分な酸化還元サイクルが発生できず、高感度化がはかれない。
【０００６】
この高感度化の度合いは、（還元電流値）／（酸化電流値）×１００であらわされる捕捉率が指標とされている。この値が高ければ、ジェネレータ電極で反応した中間物質が電気化学活性を保ったままコレクター電極に到達し、酸化還元サイクルによって見かけ上の電流値が増大する。捕捉率を高めるには、電極幅をより微小にし、電極間隔をより近づけることで、目的物質や中間物質の拡散距離を短くすることが有効である（非特許文献２参照）。
【０００７】
しかしながら、例えばμｍオーダより小さいなど、より微細な電極パターンの形成は容易ではなく、最先端の高度な製造技術が必要となる。また、電極パターンの微細化により、再現性よく寸法の揃った電極を得ることが難しくなる。当然ながら、電極パターンの微細化には限界がある。このように、電極パターンの微細化による高感度化は、容易ではないという問題がある。
【０００８】
本発明は、以上のような問題点を解消するためになされたものであり、接近させた２つの電極を用いる電気化学的測定で、電極パターンをあまり微細化することなく、高感度化ができるようにすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る電気化学測定用電極の製造方法は、絶縁層の上にレジストパターン層を形成してからレジストパターン層の上に金属層を形成する第１工程と、酸化グラフェンからなる炭素材料の小片が分散した分散溶液を金属層の上に塗布して金属層の上に炭素材料からなる炭素層を形成する第２工程と、金属層の上に形成された炭素層を構成している酸化グラフェンを還元した後で、レジストパターン層を除去するリフトオフ法により金属層および炭素層をパターニングし、２つの電極の上に炭素材料の層が形成された状態とする第３工程とを少なくとも備える。
【００１４】
上記電気化学測定用電極の製造方法において、２つの電極は、例えば、交互に入り込んで対向配置された２つの櫛形電極である。
【発明の効果】
【００１７】
以上説明したように、本発明によれば、炭素材料の小片が分散した分散溶液を用いて２つの電極の上に炭素材料の層を形成するので、接近させた２つの電極を用いる電気化学的測定で、電極パターンをあまり微細化することなく、高感度化ができるという優れた効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本発明の実施の形態１における電気化学測定用電極の製造方法を説明するフローチャートである。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の実施の形態１における電気化学測定用電極の製造方法を説明するための工程における電気化学測定用電極の構成を模式的に示す断面図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明の実施の形態１における電気化学測定用電極の製造方法を説明するための工程における電気化学測定用電極の構成を模式的に示す断面図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、本発明の実施の形態１における電気化学測定用電極の製造方法を説明するための工程における電気化学測定用電極の構成を模式的に示す断面図である。
【図２Ｄ】図２Ｄは、本発明の実施の形態１における電気化学測定用電極の製造方法を説明するための工程における電気化学測定用電極の構成を模式的に示す断面図である。
【図２Ｅ】図２Ｅは本発明の実施の形態１における電気化学測定用電極の製造方法を説明するための工程における電気化学測定用電極の一部構成を示す平面図である。
【図３】図３は、電気化学測定用電極のチップの構成を示す構成図である。
【図４】図４は、電気化学測定用電極のチップの構成を示す斜視図である。
【図５】図５は、実施例１の櫛形電極におけるｐＡＰの酸化反応および還元反応を示す限界電流の観察結果を示す特性図である。
【図６】図６は、本発明の実施の形態２における電気化学測定用電極の製造方法を説明するフローチャートである。
【図７Ａ】図７Ａは、本発明の実施の形態２における電気化学測定用電極の製造方法を説明するための工程における電気化学測定用電極の構成を模式的に示す断面図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、本発明の実施の形態２における電気化学測定用電極の製造方法を説明するための工程における電気化学測定用電極の構成を模式的に示す断面図である。
【図７Ｃ】図７Ｃは、本発明の実施の形態２における電気化学測定用電極の製造方法を説明するための工程における電気化学測定用電極の構成を模式的に示す断面図である。
【図７Ｄ】図７Ｄは、本発明の実施の形態２における電気化学測定用電極の製造方法を説明するための工程における電気化学測定用電極の構成を模式的に示す断面図である。
【図８】図８は、実施例２の櫛形電極におけるｐＡＰの酸化反応および還元反応を示す限界電流の観察結果を示す特性図である。
【図９】図９は、実施例３の櫛形電極におけるＲｕ（ＮＨ3）62+の酸化反応および還元反応を示す応答の観測結果を示す特性図である。
【図１０】図１０は、本発明に係る電気化学測定用電極の構成例を示す断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施の形態について図を参照して説明する。
【００２０】
［実施の形態１］
はじめに、本発明の実施の形態１について説明する。図１は、本発明の実施の形態１における電気化学測定用電極の製造方法を説明するフローチャートである。以下では、２つの電極が交互に入り込んで対向配置された２つの櫛形電極で構成されている場合について説明する。
【００２１】
この製造方法は、まず、ステップＳ１０１で、絶縁層の上に金属層を形成する。次に、ステップＳ１０２で、炭素材料の小片が分散した分散溶液を金属層の上に塗布して金属層の上に炭素材料からなる炭素層を形成する。次に、ステップＳ１０３で、金属層および炭素層をパターニングし、交互に入り込んで対向配置されて対となる２つの櫛形電極の上に炭素材料の層が形成された状態とする。
【００２２】
この製造方法によれば、電気化学測定で用いる櫛形電極が、この上に炭素材料の層を備えて形成されるようになる。炭素材料の層は、炭素材料の小片から構成されている。このように、櫛形電極の上に炭素材料の層を形成することで、櫛形電極の寸法などを変更（より微細化）することなく高感度化ができるようになる。
【００２３】
単一の作用電極の上に、単層または２〜１０層の多層グラフェン、グラファイト、これらの還元誘導体のいずれかの層を形成（固定化）することで、高感度化ができることについては報告されている（非特許文献３参照）。この技術では、上述した炭素材料を塗布することで形成している。しかしながら、μｍオーダで接近させた構造を有する櫛形電極においては、上述したように炭素材料を塗布すると、電極部分の上に炭素材料の層が形成できるが、電極間にまたがるように炭素材料の層が形成され、電気化学的に短絡した状態となる。このように、２つの櫛形電極間が短絡しては、電気化学的な酸化還元サイクルを電極上に発生させることができず、高感度化は実現できない。
【００２４】
これに対し、本実施の形態によれば、櫛形電極の部分に選択的に炭素材料の層が形成されるので、２つの櫛形電極間が短絡することがなく、電気化学的な酸化還元サイクルを電極上に発生させることができる。また、電極の上に炭素材料の層が形成されるので、櫛形電極を用いた電気化学的測定で、櫛形電極の電極パターンをあまり微細化することなく、高感度化ができるようになる。
【００２５】
以下、本実施の形態における製造方法について、図２Ａ〜図２Ｅを用いてより詳細に説明する。図２Ａ〜図２Ｄは、本発明の実施の形態１における電気化学測定用電極の製造方法を説明するための各工程における電気化学測定用電極の構成を模式的に示す断面図である。また、図２Ｅは、電気化学測定用電極の一部構成を示す平面図である。
【００２６】
まず、図２Ａに示すように、絶縁層２０１の上にレジストパターン層２０２を形成する。レジストパターン層２０２は、後述する櫛形電極を形成する箇所に開口部を備えている。次に、レジストパターン層２０２の上より、例えばスパッタ法などの堆積法により金属を堆積することで、図２Ｂに示すように、絶縁層２０１およびレジストパターン２０２の上に金属層２０３を形成する。
【００２７】
次に、炭素材料の小片が分散した分散溶液を塗布することで、図２Ｃに示すように、レジストパターン層２０２を覆って絶縁層２０１の上に形成されている金属層２０３の上に、炭素層２０４を形成する。この後、レジストパターン層２０２を除去することで、この上に形成されている金属層２０３および炭素層２０４を選択的に除去する。このリフトオフにより、図２Ｄおよび図２Ｅに示すように、交互に入り込んで対向配置されて対となる櫛形電極２０５，２０６の上に、炭素材料の層２０７が形成された状態が得られる。
【００２８】
次に、実施例を用いてより詳細に説明する。
【００２９】
［実施例１］
まず、板厚０．５ｍｍの石英基板を用意する。石英基板は絶縁材料からなる基板である。この石英基板の上に、電子線レジストを塗布し、層厚０．５ｍｍのレジスト層を形成する。次に、レジスト層を形成した石英基板を、８０℃・６０分の加熱条件によりプリベークする。この加熱は、例えば、オーブンを用いて行えばよい。
【００３０】
次に、プリベークしたレジスト層を、電子線リソグラフィー技術でパターニングする。まず、上記石英基板を電子線露光装置の露光室に搬入し、櫛形電極を形成する箇所に開口が形成される形状のパターンに露光する。また、露光の後に現像を行い、レジストパターン層を形成する。形成したレジストパターン層のパターンの寸法は、例えば、櫛形電極の櫛歯の部分の長さを２ｍｍ、幅を１０μｍとした。また、交互に入り込んで対向配置されて対となる２つの櫛形電極パターンの対向する櫛歯の間隔（電極間隔）は、０．５μｍとした。
【００３１】
次に、石英基板および形成したパターンの上に金属層を形成する。例えば、真空蒸着装置により、まず、層厚１０ｎｍのチタン層を形成し、この上に層厚１００ｎｍの金層を形成する。チタン層を介して金層を形成することで、金層の剥がれを抑止する。
【００３２】
次に、上述した金属層（金層）の上に炭素材料の小片が分散した分散溶液を塗布する。例えば、炭素材料としては、グラファイトを化学的に酸化することで形成した酸化グラフェンを用いる。より詳細に説明すると、まず、ボールミルで粉砕した天然グラファイト（１ｇ）と濃硫酸（３４．５ミリリットル）とを混合し、撹拌子ながらこの混合物中に硝酸ナトリウム（０．７５ｇ）を加える。これらの混合物を氷冷下におき、さらに、過マンガン酸カリウム（４．５ｇ）を徐々に加え、撹拌を２時間継続する。この後、混合物を室温に戻し、さらに、５日間撹拌を続ける。この結果、濃灰色の生成物が得られる。
【００３３】
次に、得られた生成物に、５％希硫酸（１００ミリリットル）、過酸化水素水（３ミリリットル）を加え撹拌して液状とした後、これをさらに過剰量の硫酸（３％）／過酸化水素水（０．５％）混合溶液中に分散し、遠心分離により沈殿物を分取する。引き続き、沈殿物に純水を加えて分散し、遠心分離により沈殿物を分取する。これらのことにより、最終生成物として、濃褐色の油状物質として酸化グラフェンが得られる。
【００３４】
以上のようにして得られた酸化グラフェンを、純水に加えて撹拌することで、炭素材料（酸化グラフェン）が分散した分散溶液（均一分散水溶液）が得られる。ここで、濃度は、０．０１〜０．１ｗｔ％程度とすればよい。得られた分散水溶液は、茶褐色となる。この分散溶液中の物質は、原子間力顕微鏡観察およびラマン分光分析から、単層〜３層の酸化グラフェンの小片（膜片）が主要成分であることが確認されている。
【００３５】
次に、分散溶液（約０．１ｗｔ％水溶液）を、レジストパターン層およびこの上に金属層を形成してある石英基板に、塗布する。例えば、スピンコート法により塗布すればよい。この塗布により、分散されていた炭素材料が金属層の上に付着して固定され、炭素層が形成できる。上述したように、炭素材料を酸化体としてあるので、分散溶液においては均一に炭素材料の小片が分散した状態が得られ、この分散溶液を塗布しているので、金属層の上には、炭素材料の小片からなる炭素層が均一に形成できる。
【００３６】
次に、レジストパターン層，金属層，および炭素層を形成した石英基板を、３５％ヒドラジン水溶液および２８％アンモニア水溶液が体積比７：１０で混合された溶液とともに密閉容器に封入する。これにより、炭素層がヒドラジン／アンモニア蒸気に晒される状態となる。この状態を９５℃で１時間静置することで、金属層の表面に形成した炭素層の炭素材料を還元することができる。この還元により、炭素層は、単層〜３層の酸化グラフェンを還元したグラフェン（酸化グラフェン還元体）から構成されたものとなる。
【００３７】
以上のように炭素層を還元した後、石英基板をメチルエチルケトン中に浸漬し、また、超音波処理を行い、レジストパターン層を剥離する。この剥離によりレジストパターン層の上の金属層および炭素層が選択的に除去され（リフトオフ）、交互に入り込んで対向配置されて対となる２つの櫛形電極の上に、炭素材料の層が形成された状態が得られる。
【００３８】
次いで、石英基板の上に、スピンコート法によりスピンオングラスを塗布し、４５０℃で熱硬化し、絶縁保護膜を形成する。次に、再度、電子線レジストを塗布し、層厚０．５ｍｍのレジスト層を形成する。次に、レジスト層を形成した石英基板を、８０℃・６０分の加熱条件によりプリベークする。次に、プリベークしたレジスト層を、電子線リソグラフィー技術でパターニングする。
【００３９】
まず、上記石英基板を電子線露光装置の露光室に搬入し、露光する。また、露光の後に現像を行い、レジストパターン層を形成する。このレジストパターン層により、上述した櫛形電極および石英基板上の他の領域に形成した参照電極の一部、対向電極の一部が、被覆された状態とする。
【００４０】
次に、上述したレジストパターン層をマスクとし、ＣＦ4ガスによる反応性イオンエッチング処理により、絶縁保護膜を選択的にエッチング除去し、櫛形電極、参照電極の一部、対向電極の一部が露出され、これらを除く他の領域が、絶縁保護膜で被覆保護された状態とする。
【００４１】
上述したことにより、図３に示す電気化学測定用電極のチップ（電極チップ３０４）を形成した。電極チップ３０４は、櫛歯部で対向する２つの櫛形電極からなる作用電極３０１，対向電極３０２，および参照電極３０３を備える。各電極は、ポテンシオスタット３０５およびクーロメータ３０６に接続されている。また、ポテンシオスタット３０５およびクーロメータ３０６は、レコーダ３０７に接続されている。ポテンシオスタット３０５により、作用電極３０１と参照電極３０３との間の電圧が設定した値となるように、作用電極３０１と対向電極３０２に流れる電流を制御し、クーロメータ３０６で、作用電極３０１に流れる電流を測定する。
【００４２】
電極チップ３０４は、例えば、図４の斜視図に示すように、板厚０．５ｍｍで１２×２０（ｍｍ）の基板３００の上に、作用電極３０１，対向電極３０２，および参照電極３０３が配置されている。例えば、図４の斜視図に示すように、ビュレット４０１より、作用電極３０１の櫛歯部で対向する２つの櫛形電極の部分に試料を滴下する。また、作用電極３０１には、電極端子３０１ａおよび電極端子３０２ｂが接続し、対向電極３０２には、電極端子３０２ａが接続し、参照電極３０３には電極端子３０３が接続している。上述した櫛歯部で対向する２つの櫛形電極より構成された作用電極３０１を用いることで、よく知られたレドックスサイクルによる増幅効果を利用できる。
【００４３】
上述した電極チップを用い、酵素反応により得られる電気化学活性種の電気化学検出を行った。酵素にはアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）を用い、基質としてｐ−アミノフェニルホスフェート（ｐＡＰＰ）を反応させ、反応生成物であるｐ−アミノフェノール（ｐＡＰ）の酸化還元反応を電極上で検出した。リード線を介して各電極端子をバイポテンシオスタット（ポテンシオスタット３０５）に接続し、対となる一方の櫛形電極を−０．３Ｖから０．３Ｖまで５０ｍＶ／ｓｅｃの電位走査し、他方の櫛形電極は電位−０．３Ｖに固定し、各々の電極の応答電流を測定した。
【００４４】
一方の櫛形電極においては、ｐＡＰの酸化反応を示し、他方の櫛形電極では還元反応を示す限界電流が観測された。図５に示すように、一方の櫛形電極および他方の櫛形電極のピーク電流値の大きさ（実線）は、炭素材料の層のない金から構成された同形の櫛形電極を用いた場合（点線）と比較して、約２倍以上に増加した。さらに、両者の電流値の大きさから、一方の櫛形電極で酸化されたｐＡＰ分子のうち、他方の櫛形電極で還元反応を起こした分子の割合（捕捉率）は９７％であることが分かり、炭素材料の層が形成されていない同形の櫛形電極を用いた場合と比較して、１３％ほど高い捕捉率が得られた。
【００４５】
捕捉率の向上の度合いは、かみ合った櫛形電極の形状を、長さ２ｍｍ、電極幅２μｍ、電極間隔２μｍとした場合にほぼ匹敵する。このように、本実施の形態１（実施例１）によれば、櫛形電極を用い、この電極表面に炭素材料の層を形成することで、反応速度や拡散速度を高めることができ、電極幅や電極間隔を微小化することなく捕捉率が向上し、高感度な測定が可能になる。
【００４６】
［実施の形態２］
次に、本発明の実施の形態２について説明する。図６は、本発明の実施の形態２における電気化学測定用電極の製造方法を説明するフローチャートである。この製造方法は、まず、ステップＳ６０１で、絶縁層の上に交互に入り込んで対向配置されて対となる２つの櫛形電極を形成する。次に、ステップＳ６０２で、炭素材料の小片が分散した分散溶液を２つの櫛形電極が形成された絶縁層の上に塗布して炭素材料の層を形成する。ここで、分散溶液は、２つの櫛形電極の間隔より小さい寸法の炭素材料の小片が分散したものとする。なお、小片の寸法とは、小片の最も長い箇所の寸法のことを意味する。
【００４７】
この製造方法によれば、前述した実施の形態１と同様に、電気化学測定で用いる櫛形電極が、この上に炭素材料の層を備えて形成されるようになる。このように、櫛形電極の上に炭素材料の層を形成することで、櫛形電極の寸法などを変更することなく高感度化ができるようになる。
【００４８】
本実施の形態２によれば、櫛形電極の部分とともに櫛形電極以外の領域、例えば、２つの櫛形電極の間にも炭素材料が存在する状態となる。しかしながら、炭素材料の小片の寸法は、櫛形電極の間隔より小さいものとしているので、電極間に存在する炭素材料の小片により、電極間が接続（短絡）することがない。このように、本実施の形態２においても、前述した実施の形態１と同様に、２つの櫛形電極間を短絡させることがなく、電気化学的な酸化還元サイクルを電極上に発生させることができる。また、電極の上に炭素材料の層が形成されるので、櫛形電極を用いた電気化学的測定で、櫛形電極の電極パターンをあまり微細化することなく、高感度化ができるようになる。
【００４９】
以下、本実施の形態２における製造方法について、図７Ａ〜図７Ｄを用いてより詳細に説明する。図７Ａ〜図７Ｄは、本発明の実施の形態２における電気化学測定用電極の製造方法を説明するための各工程における電気化学測定用電極の構成を模式的に示す断面図である。
【００５０】
まず、図７Ａに示すように、絶縁層７０１の上にレジストパターン層７０２を形成する。レジストパターン層７０２は、後述する櫛形電極を形成する箇所に開口部を備えている。次に、レジストパターン層７０２の上より、例えばスパッタ法などの堆積法により金属を堆積することで、図７Ｂに示すように、絶縁層７０１およびレジストパターン層７０２の上に金属層７０３を形成する。
【００５１】
次に、レジストパターン層７０２を除去することで、この上に形成されている金属層７０３を選択的に除去する。このリフトオフにより、図７Ｃに示すように、交互に入り込んで対向配置された対となる２つの櫛形電極７０５，７０６が形成される。
【００５２】
次に、櫛形電極７０４，７０６が形成された絶縁層７０３の上に、炭素材料が分散した分散溶液を塗布する。分散溶液は、２つの櫛形電極の間隔より小さい寸法の炭素材料の小片が分散したものとする。この塗布により、図７Ｄに示すように、複数の炭素材料の小片（膜片）７０７からなる炭素材料の層７０８が形成される。複数の小片７０７が、絶縁層７０３および櫛形電極７０４，７０６の上の全域に形成される。しかしながら、小片７０７の寸法が、電極の間隔より小さいので、電極間に存在する小片７０７により、電極が短絡することがない。
【００５３】
次に、実施例を用いてより詳細に説明する。
【００５４】
［実施例２］
以下、実施例２について説明する。まず、板厚０．５ｍｍの石英基板を用意する。石英基板は絶縁材料からなる基板である。この石英基板の上に、電子線レジストを塗布し、層厚０．５ｍｍのレジスト層を形成する。次に、レジスト層を形成した石英基板を、８０℃・６０分の加熱条件によりプリベークする。この加熱は、例えば、オーブンを用いて行えばよい。
【００５５】
次に、プリベークしたレジスト層を、電子線リソグラフィー技術でパターニングする。まず、上記石英基板を電子線露光装置の露光室に搬入し、櫛形電極を形成する箇所に開口が形成される形状のパターンに露光する。また、露光の後に現像を行い、レジストパターン層を形成する。形成したレジストパターン層のパターンの寸法は、櫛形電極の櫛歯の部分の長さを２ｍｍ、幅を２μｍとした。また、交互に入り込んで対向配置されて対となる２つの櫛形電極パターンの対向する櫛歯の間隔（電極間隔）は、２μｍとした。
【００５６】
次に、石英基板および形成したパターンの上に金属層を形成する。例えば、真空蒸着装置により、まず、層厚１０ｎｍのチタン層を形成し、この上に層厚１００ｎｍの金層を形成する。チタン層を介して金層を形成することで、金層の剥がれを抑止する。次に、石英基板をメチルエチルケトン中に浸漬し、また、超音波処理を行い、レジストパターン層を剥離する。この剥離によりレジストパターン層の上の金属層が選択的に除去され（リフトオフ）、交互に入り込んで対向配置されて対となる２つの櫛形電極が形成される。このように、実施例２では、櫛形電極を金から構成する。
【００５７】
次に、塗布する分散溶液を作製する。まず、ボールミルで粉砕した天然グラファイト（１ｇ）と濃硫酸（３４．５ミリリットル）とを混合し、撹拌子ながらこの混合物中に硝酸ナトリウム（０．７５ｇ）を加える。これらの混合物を氷冷下におき、さらに、過マンガン酸カリウム（４．５ｇ）を徐々に加え、撹拌を２時間継続する。この後、混合物を室温に戻し、さらに、５日間撹拌を続ける。この結果、濃灰色の生成物が得られる。
【００５８】
次に、得られた生成物に、５％希硫酸（１００ミリリットル）、過酸化水素水（３ミリリットル）を加え撹拌して液状としたのち、これをさらに過剰量の硫酸（３％）／過酸化水素水（０．５％）混合溶液中に分散し、遠心分離により沈殿物を分取する。引き続き、沈殿物に純水を加えて分散し、遠心分離により沈殿物を分取する。これらのことにより、最終生成物として、濃褐色の油状物質として酸化グラフェンが得られる。
【００５９】
以上のようにして得られた酸化グラフェンを、純水に加えて撹拌することで、炭素材料（酸化グラフェン）が分散した分散溶液（均一分散水溶液）が得られる。ここで、濃度は、０．０１〜０．１ｗｔ％程度とすればよい。得られた分散水溶液は、茶褐色となる。この分散溶液中の物質は、原子間力顕微鏡観察およびラマン分光分析から、単層〜３層の酸化グラフェンの小片（膜片）が主要成分であることが確認されている。
【００６０】
次に、上述した単層〜３層の酸化グラフェンを主要成分とする炭素材料の小片（膜片）を含む分散溶液（約０．０２５ｗｔ％水溶液）１０ｍｌに、３５％ヒドラジン水溶液を５μｌ、２８％アンモニア水溶液３５μｌを添加し、９５℃で１時間静置する。これらのことにより、酸化グラフェンが還元された還元体の分散溶液が得られる。
【００６１】
この分散溶液を５０００ｒｐｍで遠心分離して沈殿物を除去した後、上澄み溶液をさらに１００００ｒｐｍで遠心分離して得られた沈殿物を取り出した。この沈殿物が２μｍを越えない寸法（膜片の最も長い箇所の寸法）であることは、原子間力顕微鏡観察により確認した。この沈殿物を用い、２μｍを越えない寸法の酸化グラフェン還元体の小片を含む分散溶液（約０．１ｗｔ％水溶液）を調製する。
【００６２】
次に、石英基板の上に形成した櫛形電極を１Ｎの希硫酸に浸漬し、この状態で電位を掃引して表面の酸化物を除去した後、１０ｍＭに調整した２−ナフタレンチオールのエタノール溶液に一晩浸漬し、櫛形電極の表面に２−ナフタレンチオールの層（バインダー層）を形成する。バインダー層を構成する２−ナフタレンチオールは、自身のＳＨ基と櫛形電極表面の金とが共有結合するため、バインダー層は櫛形電極の表面に固定された（吸着した）状態となる。一方、上述したような共有結合を形成しない石英基板の表面（露出面）には、バインダー層は形成されない。
【００６３】
次に、バインダー層が形成された櫛形電極を備える石英基板の上に、前述した還元体による分散溶液を塗布する。例えば、スピンコート法により塗布すればよい。この塗布により、分散溶液中のグラフェン（還元体）の小片は、バインダー層を構成している２−ナフタレンチオールのナフタレン環との相互作用（疎水的相互作用）により吸着する。この結果、グラフェン小片からなる炭素材料の層が、選択的に櫛形電極の表面に形成されるようになる。また、グラフェン小片は、電極の間隔より小さい寸法としているので、電極間の石英基板に付着しても、電極間を短絡させることがない。
【００６４】
以上のようにすることで、図３に示す電気化学測定用電極のチップ（電極チップ３０４）を形成した。電極チップ３０４は、櫛歯部で対向する２つの櫛形電極からなる作用電極３０１，対向電極３０２，および参照電極３０３を備える。各電極は、ポテンシオスタット３０５およびクーロメータ３０６に接続されている。また、ポテンシオスタット３０５およびクーロメータ３０６は、レコーダ３０７に接続されている。ポテンシオスタット３０５により、作用電極３０１と参照電極３０３との間の電圧が設定した値となるように、作用電極３０１と対向電極３０２に流れる電流を制御し、クーロメータ３０６で、作用電極３０１に流れる電流を測定する。
【００６５】
電極チップ３０４は、例えば、図４の斜視図に示すように、板厚０．５ｍｍで１２×２０（ｍｍ）の基板３００の上に、作用電極３０１，対向電極３０２，および参照電極３０３が配置されている。例えば、図４の斜視図に示すように、ビュレット４０１より、作用電極３０１の櫛歯部で対向する２つの櫛形電極の部分に試料を滴下する。また、作用電極３０１には、電極端子３０１ａおよび電極端子３０２ｂが接続し、対向電極３０２には、電極端子３０２ａが接続し、参照電極３０３には電極端子３０３が接続している。上述した櫛歯部で対向する２つの櫛形電極より構成された作用電極３０１を用いることで、よく知られたレドックスサイクルによる増幅効果を利用できる。
【００６６】
上述した電極チップを用い、酵素反応により得られる電気化学活性種の電気化学検出を行った。酵素にはアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）を用い、基質としてｐ−アミノフェニルホスフェート（ｐＡＰＰ）を反応させ、反応生成物であるｐ−アミノフェノール（ｐＡＰ）の酸化還元反応を電極上で検出した。リード線を介して各電極端子をバイポテンシオスタット（ポテンシオスタット３０５）に接続し、対となる一方の櫛形電極を−０．３Ｖから０．３Ｖまで５０ｍＶ／ｓｅｃの電位走査し、他方の櫛形電極は電位−０．３Ｖに固定し、各々の電極の応答電流を測定した。
【００６７】
対となる一方の櫛形電極においては、ｐＡＰの酸化反応が、他方の櫛形電極では還元反応を示す限界電流が観測された。図８に示すように、一方の櫛形電極と他方の櫛形電極によるピーク電流値の大きさ（実線）は、炭素原料の層のない金からなる同形の櫛形電極を用いた場合（点線）と比較して、約２倍以上に増加した。
【００６８】
さらに、一方の櫛形電極と他方の櫛形電極の電流値の大きさから、一方の櫛形電極で酸化されたｐＡＰ分子のうち、他方の櫛形電極で還元反応を起こした分子の割合（捕捉率）は９９％であることが分かり、炭素材料の層が形成されていない同形の櫛形電極を用いた場合と比較して、さらに２％ほど高い捕捉率が得られた。
【００６９】
以上に説明したように、実施例２によれば、櫛形電極を用い、この電極表面に炭素材料の層を形成することで、反応速度や拡散速度を高めることができ、電極幅や電極間隔を微小化することなく捕捉率が向上し、高感度な測定が可能になる。
【００７０】
［実施例３］
次に、実施例３について説明する。まず、板厚０．５ｍｍの石英基板を用意する。石英基板は絶縁材料からなる基板である。この石英基板の上に、電子線レジストを塗布し、層厚０．５ｍｍのレジスト層を形成する。次に、レジスト層を形成した石英基板を、８０℃・６０分の加熱条件によりプリベークする。この加熱は、例えば、オーブンを用いて行えばよい。
【００７１】
次に、プリベークしたレジスト層を、電子線リソグラフィー技術でパターニングする。まず、上記石英基板を電子線露光装置の露光室に搬入し、櫛形電極を形成する箇所に開口が形成される形状のパターンに露光する。また、露光の後に現像を行い、レジストパターン層を形成する。形成したレジストパターン層のパターンの寸法は、櫛形電極の櫛歯の部分の長さを２ｍｍ、幅を１０μｍとした。また、交互に入り込んで対向配置されて対となる２つの櫛形電極パターンの対向する櫛歯の間隔（電極間隔）は、５μｍとした。
【００７２】
次に、石英基板および形成したパターンの上に金属層を形成する。例えば、真空蒸着装置により、まず、層厚１０ｎｍのチタン層を形成し、この上に層厚１００ｎｍの金層を形成する。次に、石英基板をメチルエチルケトン中に浸漬し、また、超音波処理を行い、レジストパターン層を剥離する。この剥離によりレジストパターン層の上の金属層が選択的に除去され（リフトオフ）、交互に入り込んで対向配置されて対となる２つの櫛形電極が形成される。
【００７３】
次に、前述した実施例２と同様に、上述した単層〜３層の酸化グラフェンを主要成分とする炭素材料の小片（膜片）を含む分散溶液を作製する。また、上述した実施例２と同様にヒドラジン水溶液およびアンモニア水溶液を用いて還元することで、酸化グラフェンが還元された還元体の分散溶液を作製する。次に、作製した分散溶液（約０．０２５ｗｔ％水溶液）１０ｍｌを、５０００ｒｐｍで遠心分離し沈殿物を除去した後、上澄み溶液を２μｍ孔径のフィルタを用いてろ過し、このろ液を用いて２μｍを越えない寸法のグラフェン（酸化グラフェンの還元体）の小片（膜片）を含む分散溶液（約０．１ｗｔ％水溶液）を調製する。上記沈殿物は、寸法（膜片の最も長い箇所の寸法）が２μｍを越えないことは、原子間力顕微鏡観察により確認した。
【００７４】
次に、石英基板の上に形成した櫛形電極を１Ｎの希硫酸に浸漬し、この状態で電位を掃引して表面の酸化物を除去した後、１０ｍＭに調整した２−ナフタレンチオールのエタノール溶液に一晩浸漬し、櫛形電極の表面に２−ナフタレンチオールの層（バインダー層）を形成する。
【００７５】
次に、バインダー層が形成された櫛形電極を備える石英基板の上に、前述した分散溶液を塗布する。例えば、スピンコート法により塗布すればよい。この塗布により、分散溶液中のグラフェンの小片は、バインダー層を構成している２−ナフタレンチオールのナフタレン環との相互作用（疎水的相互作用）により吸着する。この結果、グラフェン小片からなる炭素材料の層が、選択的に櫛形電極の表面に形成されるようになる。また、グラフェン小片は、電極の間隔より小さい寸法としているので、電極間の石英基板に付着しても、電極間を短絡させることがない。
【００７６】
以上のようにすることで、図３に示す電気化学測定用電極のチップ（電極チップ３０４）を形成した。この電極チップを用い、１ｍＭのヘキサアンミンルテニウムイオン（Ｒｕ（ＮＨ3）63+/2+）ＫＣｌ溶液の酸化還元反応を検出した。リード線を介して、電極チップの電気化学測定用電極の端子部分をバイポテンシオスタットに接続し、一方の櫛形電極を用いて、−０．４Ｖから０．２Ｖの範囲を周期的に５０ｍＶ／ｓｅｃで電位走査し、電極の応答電流を測定した。
【００７７】
図９の実線に示すように、−０．１５Ｖにおいて、Ｒｕ（ＮＨ3）62+の酸化反応が観測され、−０．２２ＶにおいてＲｕ（ＮＨ3）63+の還元反応を示す応答が観測された。酸化側のピーク電流値の大きさは、炭素原料の層のない金からなる同形の櫛形電極を用いた場合（図９中点線）と比較して約２倍に増加した。また、還元側のピーク電流値の大きさは、炭素原料の層のない金からなる同形の櫛形電極を用いた場合と比較して、２．５倍以上に増加した。
【００７８】
これらのことは、櫛形電極上の負に帯電している炭素原料の層（グラフェン）の表面に、検出対象の陽イオンが引き寄せられ、酸化還元種が表面に輸送されやすいという効果により、検出信号が増加したことを示す。特に、正電荷がより大きなＲｕ（ＮＨ3）63+の還元反応において、上述した効果が顕著である。
【００７９】
以上に説明したように、実施例３によれば、櫛形電極を用い、この電極表面に炭素材料の層を形成することで、反応速度や拡散速度を高めることができ、電極幅や電極間隔を微小化することなく捕捉率が向上し、高感度な測定が可能になる。
【００８０】
なお、本発明は以上に説明した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想内で、当分野において通常の知識を有する者により、多くの変形および組み合わせが実施可能であることは明白である。例えば、上述では、櫛形電極を例に説明したが、これに限るものではない。例えば、接近させて用いる２つのリングディスク電極であっても、上述同様であり、本発明は、例えば、数μｍ程度に接近させて用いる少なくとも２つの電極に適用可能である。
【００８１】
また、例えば、上述では、２−ナフタレンチオールからなるバインダー層を介して炭素材料の層を形成するようにしたが、これに限るものではなく、チオール基を有する有機化合物であれば、バインダー層として機能する。このような有機化合物であれば、チオール基が電極を構成する金と共有結合し、有機基に、これとの相互作用（疎水的相互作用）により炭素原料が吸着する。また、電極の上に、直接、炭素材料の層を形成してもよい。
【００８２】
また、図１０の（ａ）に示すように、絶縁層１００１に凹部１００１ａを形成し、凹部１００１ａに埋め込むように電極１００２を形成し、電極１００２の上に炭素材料の層１００３を形成してもよい。また、図１０の（ｂ）に示すように、凹部１００１ａに埋め込むように形成した電極１００２の上に、バインダー層１００４を介して炭素材料の層１００３を形成してもよい。このようにすることで、電極を形成した状態で絶縁層の表面がより平坦となるので、リフトオフ法による電極などの形成がより容易になる。
【００８３】
また、電極材料は、金に限るものではなく、銅，ニッケル，プラチナ、カーボンなどを用いるようにしてもよい。
【００８４】
また、上述では、炭素材料の層が、グラフェン（還元体）より構成された場合について説明したが、これに限るものではなく、例えば、グラファイトから構成されていてもよい。この場合、グラファイトは、グラフェンが２〜１０層程度積層したものであればよい。
【符号の説明】
【００８５】
２０１…絶縁層、２０２…レジストパターン層、２０３…金属層、２０４…炭素層、２０５，２０６…櫛形電極、２０７…炭素材料の層。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図４】
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