(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４に示す塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有する抗原タンパク質において、
前記アミノ酸配列のＮ末端から３５４番目のシステイン残基が、分子量が２０ｋＤａ〜１００ｋＤａであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でＰＥＧ化修飾されていることを特徴とする、
改変タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載の改変タンパク質又はその塩を有効成分として含む、医薬組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の改変タンパク質又はその塩を有効成分として含む、アレルギー性疾患の予防及び／又は治療剤。
【請求項４】
アレルギー性疾患が、花粉症である、請求項３に記載の予防及び／又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩｇＥ抗体産生を惹起する抗原タンパク質を改変・修飾した改変タンパク質及び当該タンパク質改変体を有効成分として含む医薬組成物、アレルギー性疾患の予防及び／又は治療剤に関する。本願は、２００８年３月１７日に出願した特願2008-67111を優先権主張し、その全体が参照として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー性疾患としては、花粉症、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、アトピー性喘息や食物アレルギーなどが特に有名だが、それらに対する治療法や医薬品の多くが、アレルギー応答の後期を標的にした対症療法であるため、根本的な治療にいたらないのが現状である。また、近年ではアレルギー性疾患の治療方法として減感作療法が知られており（特許文献１〜３など）、例えば花粉症の場合、当該療法においては、アレルゲンとして、現在のところ、天然花粉のエキスが用いられている。しかしながら、花粉エキスはアナフィラキシーの危険性が高い、大量生産が困難である等の問題を有する。また、Ｔ細胞エピトープ連結組換えポリペプチドは、全ての花粉症患者のＴ細胞エピトープをカバーしていないため、幅広いスギ花粉症患者において治療効果が期待できない（即ち、汎用性が低い）という問題がある。【０００３】
一方、これまでに尿素変性された卵白アルブミンがＩｇＥ抗体（レアギニン抗体）反応抑制に関わっている可能性があること（非特許文献１）、並びに、卵白と短いポリエチレングリコール（分子量６０００、５０００および１００００）との複合体がサプレッサＴ細胞を誘導してＩｇＥ及びＩｇＧ抗体反応を抑えること（非特許文献２）などが報告されているが、汎用性が広く安全なアレルギー性疾患に対する根本的治療方法はいまだ確立されていない。【０００４】
さらに、安全性、規格、コスト、薬効の持続、社会的ニーズなどを考慮した、現実に生体内に投与可能な物質の開発が必要である。
【特許文献１】特開平５−９７８９８号公報
【特許文献２】特開平９−１７６０４４号公報
【特許文献３】特開２００５−５２０４９号公報
【非特許文献１】Takatsu, K. & Ishizaka, K. (1976) J. Immunol. 116, 1257-1264.
【非特許文献２】Lee, W. Y., Sehon, A. H. & Akerblom, E. (1981) Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 64, 100-14.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、花粉症、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性喘息、アレルギー性結膜炎、接触性皮膚炎、食物アレルギー等のアレルギー性疾患の治療及び予防に用いられ得る物質を提供することを目的とする。特に、本発明は、生体内でアナフィラキシー反応を誘発し得ず及び／又は高純度での大量生産が容易であり得る、前記疾患の治療及び予防に用いられ得る物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、以下の知見を得た：
（１）Ｔ細胞エピトープは、抗原性又は免疫原性タンパク質中に存在するペプチド領域（１０アミノ酸以下）であり、抗原提示細胞（例えば樹状細胞）に取り込まれた後、細胞内でプロテアーゼ消化を受けペプチド断片にされ、主要組織適合遺伝子複合体(major histocompatibility complex;MHC)クラスＩＩ分子に結合後、細胞表面に提示され、Ｔ細胞を活性化する、
（２）一方、Ｂ細胞は、抗原提示細胞に取り込まれる前の抗原性又は免疫原性タンパク質の立体構造またはアミノ酸配列を認識し細胞内に取り込むため、立体構造が破壊されていたり、ペプチド配列が修飾基によって覆われている場合には、Ｂ細胞の活性化は起きない。【０００７】
本発明者らはまた、このような改変タンパク質が、アレルゲンである抗原タンパク質（天然型抗原性タンパク質）と同様もしくはそれ以上に、天然型抗原性タンパク質特異的Ｔ細胞の誘導能を保持するものの、天然型タンパク質と異なり、それ自体が、所望されない天然型タンパク質特異的ＩｇＥ抗体の産生を誘導し得ないこと、さらには驚くべきことに、天然型タンパク質による天然型タンパク質特異的ＩｇＥ抗体の産生をも抑制し得ることを見出した。従って、本発明の改変タンパク質は、それ自体がアナフィラキシー反応を生じ得ないのみならず、アレルゲンに起因するアナフィラキシー反応の程度もまた抑制し得ることから、アレルギー性疾患の新規減感作療法において、並びに／あるいはアレルギー性疾患治療用ワクチン等の医薬として利用価値が高いものである。【０００８】
即ち、本発明は、以下の改変タンパク質、医薬組成物、アレルギー性疾患の予防及び／又は治療剤を提供するものである。【０００９】
項１．哺乳動物においてＩｇＥ抗体産生を惹起し、システイン残基を１個以上有する抗原タンパク質であって、
当該タンパク質を構成するアミノ酸配列中のシステイン残基が１個を除いて全てＰＥＧ化修飾を受けないアミノ酸残基に必要に応じて置換されていること、かつ
残ったシステイン残基が、Ｂ細胞エピトープの抗原性を抑制するのに十分な長さを有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でＰＥＧ化修飾されていることを特徴とする、改変タンパク質。【００１０】
項２．ＰＥＧ化修飾に用いるＰＥＧの長さが、分子量で２０ｋＤａ〜１００ｋＤａである、項１に記載の改変タンパク質。【００１１】
項３．哺乳動物においてＩｇＥ抗体産生を惹起する、システイン残基を１個以上有する抗原タンパク質が、スギ花粉、ブタクサ花粉、シラカバ花粉、ヒノキ花粉、カモガヤ花粉、イネ花粉、ダニ由来のタンパク質、カビ由来のタンパク質、食物（卵、牛乳、ピーナッツ、そば、小麦、魚貝類、甲殻類）由来のタンパク質、ラテックス由来のタンパク質、ペット（ネコ、イヌ）由来のタンパク質からなる群より選ばれる１つである、項１又は２に記載の改変タンパク質。【００１２】
項４．ＰＥＧ化修飾を受けないアミノ酸残基が、セリン、アラニン、アルギニン、アルパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トレオニン、トリブトファン、チロシン及びバリンからなる群より選択される少なくとも１つである、項１〜３のいずれか１項に記載の改変タンパク質。【００１３】
項５．項１〜４のいずれか１項に記載の改変タンパク質又はその塩を有効成分として含む、医薬組成物。【００１４】
項６．項１〜４のいずれか１項に記載の改変タンパク質又はその塩を有効成分として含む、アレルギー性疾患の予防及び／又は治療剤。【００１５】
項７．アレルギー性疾患が、花粉症、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性喘息、アレルギー性結膜炎、接触性皮膚炎、食物アレルギーからなる群から選択される、項６に記載の予防及び／又は治療剤。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の改変タンパク質は、可溶性タンパク質であるため取り扱いが容易である、高純度での大量生産が容易である、実際に生体内に投与する際に安全である等の多くの利点を有する。本発明の改変タンパク質はまた、アナフィラキシー反応を生じ得ない安全なアレルゲンとなり得る、種々のアレルゲンに起因するアナフィラキシー反応の程度を抑制し得る、アレルゲンに特異的な免疫を十分に誘導し得る、全てのアレルギー性疾患患者におけるＴ細胞エピトープをカバーし得るという優れた効果を奏することから、アレルギー性疾患の新規減感作療法において、並びに／あるいは治療用ワクチン、予防又は治療剤等の医薬として有用であり得る。加えて、本発明の改変タンパク質は免疫制御細胞の増殖誘導剤としても用いることができる。本発明はまた、このような改変タンパク質の製造方法、及び当該改変タンパク質を有効成分として含む医薬組成物などを提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の抗原タンパク質としては、哺乳動物においてＩｇＥ抗体産生を惹起し、システイン残基を１個以上有するタンパク質であって、ＤＮＡ配列又はアミノ酸配列が既知のタンパク質であればよく、例えば、スギ花粉、ブタクサ花粉、シラカバ花粉、ヒノキ花粉、カモガヤ花粉、イネ花粉、ダニ由来のタンパク質、カビ由来のタンパク質、食物（卵、牛乳、ピーナッツ、そば、小麦、魚貝類、甲殻類）由来のタンパク質、ラテックス由来のタンパク質、ペット（ネコ、イヌ）由来のタンパク質などが挙げられる。抗原タンパク質は、特にシステイン残基を少なくとも2個有するものであり、この場合、１個のシステイン残基のみを残し、他のシステイン残基は全て他のアミノ酸で置換され、唯一のシステイン残基のSH基はその後ＰＥＧ化される。また、抗原タンパク質は1種の抗原タンパク質（例えばＣｒy ｊ１）をPEG化してもよく2種以上の抗原タンパク質を連結して、融合タンパク質(例えばＣｒy ｊ１／２)として発現し、PEG化してもよい。抗原タンパク質を融合タンパク質とすることで、2以上の抗原タンパク質に基づくアレルギー性疾患の予防及び／又は治療作用を同時に獲得することができる。また、Ｃｒy ｊ１とＣｒy ｊ２の融合タンパク質の場合には、スギ花粉に基づくアレルギーを効率よく抑制することができる。【００１８】
具体的には、スギ花粉としては、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｃｒy ｊ１）、及び天然に存在するそのアイソタイプ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ３４６３９、Ｄ２６５４４、Ｄ２６５４５、ＡＢ０８１３０９、ＡＢ０８１３１０参照）が挙げられ、さらに配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｃｒｙ ｊ２）、及び天然に存在するそのアイソタイプ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ３７７６５、Ｄ２９７７２、Ｅ１０７１６、ＡＢ０８１４０３、ＡＢ０８１４０４、ＡＢ０８１４０５参照）が挙げられる。これらはシステイン残基をそれぞれ８個及び１５個有している。【００１９】
ブタクサ花粉としては、例えば、ポリペプチド（Ａｍｂａ１）、及び天然に存在するそのアイソタイプ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ６９６１，Ｍ６２９８１．１，Ｍ６３１１６参照）が挙げられる。これはシステイン残基を１２個有している。【００２０】
シラカバ花粉としては、例えば、ポリペプチド（Ｂｅｔｖ１）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号AB046540（Betula platyphylla var. japonica）、Z72435(Betula pendula (European white birch)参照）が挙げられる。これはシステイン残基を１個有している。【００２１】
シラカバ花粉は天然ポリペプチド（Ｂｅｔｖ１）がシステイン残基を１個有しているため、抗原タンパク質を構成するアミノ酸配列中のシステイン残基はＰＥＧ化修飾を受けないアミノ酸残基に置換されない。これが、抗原タンパク質を構成するアミノ酸配列中のシステイン残基が１個を除いて全てＰＥＧ化修飾を受けないアミノ酸残基に『必要に応じて』置換されているとした理由である。抗原タンパク質がシステイン残基を少なくとも２個有している場合には、抗原タンパク質を構成するアミノ酸配列中のシステイン残基が１個を除いて全てＰＥＧ化修飾を受けないアミノ酸残基に必ず置換される。【００２２】
ヒノキ花粉としては、例えば、ポリペプチド（Ｃｈａｏ１）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号D45404(Chamaecyparis obtusa (Japanese cypress)参照）が挙げられる。これはシステイン残基を１１個有している。【００２３】
ダニ由来のタンパク質としては、例えば、ポリペプチド（Derf1）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号AB034946参照）、ポリペプチド(Derf2)（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Q00855（Dermatophagoides farinae (American house dust  mite)参照）、（Derp1）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号P08176 (Dermatophagoides pteronyssinus (European house dust mite)参照）、（Derp2）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号P49278（Dermatophagoides pteronyssinus (European house dust mite)参照）が挙げられる。これらはシステイン残基をそれぞれ7個、7個、5個及び７個有している。【００２４】
食物アレルゲンとしては、例えば、ピーナッツアレルゲンのポリペプチド（ＡｒａｈＩ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号L38853（Arachis hypogaea）参照）が挙げられる。これはシステイン残基を４個有している。【００２５】
本発明の好ましい抗原タンパク質は、エピトープにCys残基を有しないものであり、この場合、ＰＥＧ化された抗原タンパク質は全てのＴ細胞エピトープを保有し、抗原タンパク質に特異的な免疫を誘導することができる。【００２６】
本発明の改変タンパク質は、上記のような抗原タンパク質が有するシステイン残基が、１個を残して全てポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化修飾を受けないアミノ酸残基に置換されていることを特徴とする。【００２７】
抗原タンパク質において、システイン残基を、ＰＥＧ化修飾を受けないアミノ酸残基に置換する方法としては、通常行われる遺伝子を改変する方法が用いられる。すなわち、抗原タンパク質のシステイン残基のコドンを、ＰＥＧ化修飾を受けないアミノ酸残基のコドンに変換することにより、システイン残基がＰＥＧ化修飾を受けないアミノ酸残基に置換された改変タンパク質の塩基配列を有するＤＮＡが作成される。【００２８】
ここで、ＰＥＧ化修飾を受けないアミノ酸残基としては、特に限定はされないが、例えば、セリン、アラニン、アルギニン、アルパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トレオニン、トリブトファン、チロシン、バリン等が挙げられ、好ましくは、セリン及びアラニンである。１個のＣｙｓを除いて全てのＣｙｓ残基を置換するこのＰＥＧ化修飾を受けないアミノ酸残基は、同一のアミノ酸残基、もしくは、異なるアミノ酸残基の組み合わせであってもよく、適宜選択することができる。【００２９】
本発明の抗原タンパク質に残す１個のシステイン残基の位置は特に限定されず、抗原タンパク質のＮ末端側、中央、又はＣ末端側のいずれの位置であってもよい。【００３０】
ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、市販のキット（PrimeSTAR(R) Mutagenesis Basal Kit（タカラバイオ）TransformerTM (Clonetech製)）、或いは公知のＰＣＲ法の利用が挙げられる。【００３１】
具体的には、まず抗原タンパク質を産生する細胞からｍＲＮＡを抽出する。次に逆転写酵素により一本鎖の相補ＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡライブラリーとする。次に、抗原タンパク質のＮ末端とＣ末端のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列の合成ヌクレオチドをそれぞれ作製し、ＰＣＲ法のプライマーとして使用する。上記ｃＤＮＡライブラリー中から抗原タンパク質遺伝子をコードするＤＮＡを上記プライマーとＴａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ法で増幅する。次に増幅したＤＮＡ断片を既に切断されているＴＯＰＯクローニングベクターとＤＮＡリガーゼによりＤＮＡを連結する。連結したＤＮＡはコンピテントＤＨ５株等を用いて形質転換する。得られたコロニーは培地で培養し、遺伝子が挿入された組換えＤＮＡをスクリーニングする。挿入されたＤＮＡ断片をＤＮＡシークエンサーなどを用いて、配列決定を行う。【００３２】
次いでシステインをコードする塩基を、ＰＥＧ化修飾を受けない他のアミノ酸をコードする塩基に置換したオリゴヌクレオチドおよびTransformerTM (Clonetech製) を用い、TransformerTM のプロトコールに従い、システイン残基が他のアミノ酸に置換された改変タンパク質をコードするＤＮＡを作成する。【００３３】
このような組換えタンパク質遺伝子の合成ＤＮＡは、例えば、シグマ・アルドリッチ（株）又はタカラバイオ（株）などにおいて委託合成することもできる。【００３４】
作成された改変タンパク質をコードするＤＮＡは、プラスミドに組み込まれて宿主微生物中に導入され、改変タンパク質を生産する形質転換体を得る。【００３５】
この際、プラスミドとしては、例えば大腸菌を宿主微生物とする場合には、ｐＵＣ系ベクターなど公知のものが使用できる。【００３６】
宿主微生物としては、例えばエシェリヒア・コリーＢＬ２１株などが利用できる。宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量の改変タンパク質を安定して生産し得る。【００３７】
形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気撹拌培養を行うのが有利である。培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。【００３８】
培養温度は菌が発育し、改変タンパク質を生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリーの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、改変タンパク質が最高収量に達する時期に培養を終了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し改変タンパク質を生産する範囲で適宜変更し得るが、特に好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度である。【００３９】
培養物中の改変タンパク質を生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般には常法に従って改変タンパク質が培養液中に存在する場合は濾過，遠心分離などにより、改変タンパク質含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。改変タンパク質が菌体内に存在する場合には、得られた培養物を濾過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及びまたは界面活性剤を添加して改変タンパク質を可溶化し、水溶液として分離採取する。【００４０】
この様にして得られた改変タンパク質含有溶液を例えば減圧濃縮、透析、更に硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーにより、精製された改変タンパク質を得ることができる。【００４１】
本発明の改変タンパク質は、残った１個のシステイン残基が、Ｂ細胞エピトープの抗原性を抑制するのに十分な長さを有するＰＥＧでＰＥＧ化修飾されている可溶性タンパク質である。なお、抗原タンパク質がシステイン残基を１個しか有していない場合（例えば、シラカバ花粉など）は、上述したようなシステイン残基の置換は必要なく、当該タンパク質が有する１個のシステイン残基をＰＥＧ化修飾すればよい。【００４２】
Ｂ細胞エピトープの抗原性を抑制するのに十分であるためには、本発明で用いるＰＥＧは分子量の大きいものである必要がある。例えば、分子量２０ｋＤａ以上のＰＥＧを用いることにより、十分に本発明の効果を得ることができる。また、分子量が１００ｋＤａを超えるようなＰＥＧを入手するのが困難であるため、好ましくは分子量２０ｋＤａ〜１００ｋＤａのＰＥＧを用いる。ＰＥＧの分子量は１００ｋＤａを超えても差し支えない。【００４３】
ＰＥＧ化処理としては、具体的には、ＰＥＧの末端にマレイミド基、スクシンイミド基などの反応性官能基を有するＰＥＧ化剤と本発明の改変タンパクを溶液中で反応させることによりＰＥＧ化された改変タンパク質を得ることができる。使用できるＰＥＧ化剤としては、例えば、システインのＳＨ基とチオエーテル結合を形成する直鎖型メチルＰＥＧｎ（ｎはＰＥＧのリピート数）マレイミドや分岐型（メチル−ＰＥＧｎ）ｎ−ＰＥＧｎマレイミド、が挙げられる。好ましくは直鎖型または４アーム型のＰＥＧ化剤、特に直鎖型メチルＰＥＧｎ（ｎはＰＥＧのリピート数）マレイミドや４アーム型を含む分岐型（メチル−ＰＥＧｎ）ｎ−ＰＥＧｎマレイミドを用いる。【００４４】
本発明の改変タンパク質を、例えば、大腸菌で本発明の改変タンパク質を発現させてインクルージョンボディになった場合には、尿素などの適当な可溶化剤で可溶化した後、ＰＥＧ化剤と反応させることにより、可溶性タンパク質として精製することができる。【００４５】
本発明の改変タンパク質はまた、Ｎ末端又はＣ末端のいずれか、あるいは双方にさらなるペプチド部分が付加されたものであってもよい。このようなペプチド部分は、本発明の改変タンパク質に付加された場合に、本発明の改変タンパク質の特性を保持し得るものである限り特に限定されない。例えば、このようなペプチド部分としては、精製用タグ（例えば、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ）が挙げられる。ペプチド部分は、ベクターに由来する部分であってもよく、例えばＰＥＧ化改変タンパク質のＮ末端またはＣ末端に1〜30個程度、好ましくは1〜25個程度、より好ましくは1〜20個程度、さらに好ましくは1〜10個程度、特に好ましくは1〜5個程度のアミノ酸が付加されていてもよい。実施例では、抗体産生能の試験は、Hisタグを含むMetAlaHisHisHisHisHisHisSerAlaAlaLeuGluValLeuPheGlnGlyProGlyの20個のアミノ酸が付加されたPEG化改変タンパク質(recCryj1/2)で試験されている。この改変タンパク質は、Ｎ末端の付加配列に酵素(HRV 3C)切断部位があるので、最終的に酵素消化して得られるPEG化recCry j1/2改変タンパクのＮ末端には、ベクター由来の３アミノ酸（Gly-Pro-Gly）が付加されることになる。本発明のPEG化改変タンパク質には、このような付加アミノ酸があってもよい。【００４６】
アナフィラキシー反応は、肥満細胞表面に結合しているＩｇＥ抗体へのアレルゲンの結合により生じるシグナルの細胞内への導入により引き起こされる。ＩｇＥ抗体は、所定の立体構造を保持しているアレルゲンに結合することが多いので、アレルゲンの立体構造を崩すことによりＩｇＥ抗体に対するアレルゲンの結合が妨げられ得、ひいてはアナフィラキシー反応の危険性が低減される可能性がある（例えば、Woodfolk et al. J. Allergy Clin. Immunol. 1994: 19-26参照）。本発明の改変タンパク質は、その立体構造が天然タンパク質と大きく異なっていると考えられるので、当該タンパク質についてのＩｇＥ抗体の認識能が喪失し得ると考えられる。【００４７】
本発明の改変タンパク質は、実際、抗原タンパク質に特異的なＩｇＥ抗体の産生を誘導し得ないばかりか、当該抗原タンパク質による特異的ＩｇＥ抗体の産生をも抑制し得る。一方で、本発明の改変タンパク質は、抗原タンパク質における１以上（好ましくは全て）のＴ細胞エピトープを保持し得る。従って、本発明の改変タンパク質は、抗原タンパク質特異的ＩｇＥ抗体に結合し得ないことから、(i)アナフィラキシー反応を生じ得ない安全なアレルゲンであり得る、(ii)抗原タンパク質に起因するアナフィラキシー反応の程度を抑制し得る、(iii)抗原タンパク質に特異的な免疫（例、細胞性免疫、ＩｇＧ等の液性免疫）を十分に誘導し得る、(iv)抗原タンパク質によって引き起こされるアレルギー性疾患の全ての患者におけるＴ細胞エピトープをカバーし得る等の利点を有する。【００４８】
従って、本発明の改変タンパク質は、様々なアレルギー性疾患の予防ないし治療剤、減感作剤等の医薬として用いられ得る。【００４９】
アレルギー性疾患としては、花粉症、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性喘息、アレルギー性結膜炎、接触性皮膚炎、食物アレルギーなどが挙げられ、本発明の改変タンパク質はこれらの疾患の予防ないし治療に有効である。【００５０】
本発明の改変タンパク質が適用され得る哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル、チンパンジー）、げっ歯類（例、マウス、ラット、モルモット）、ペット（例、イヌ、ネコ、ウサギ）、使役動物又は家畜（例、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ）が挙げられるが、臨床応用という観点からはヒト、及び／又はイヌが好ましい。【００５１】
本発明の医薬の投与形態、剤型は、経口投与、非経口投与のいずれでもよく、経口投与剤としては、グミ剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、チュアブル剤などの固形剤、溶液剤、シロップ剤などの液剤あるいは腸溶性製剤が、また、非経口投与剤としては、注射剤、スプレー剤などが挙げられる。【００５２】
本発明の医薬を舌下投与（例えば舌下減感作）に用いる場合の好ましい担体としては、グミ剤やナノ粒子（リポソーム等）などが挙げられる。【００５３】
本発明の医薬は、薬学的に許容される担体をさらに含み得る。薬学的に許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑沢剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックス、リポソームなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。【００５４】
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、シロップ、オレンジジュースのような希釈液に有効量の有効成分を溶解させた液剤、懸濁剤(suspension)、乳剤(emulsion)、並びに有効量の改変タンパク質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、散剤、顆粒剤、錠剤等である。【００５５】
非経口投与（例えば、注射（静脈内、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内）、局所注入、経皮投与、経鼻投与）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、抗菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁剤及び／又はリポソーム製剤が挙げられ、これには懸濁化剤(suspending agent)、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び薬学的に許容される担体(pharmaceutically acceptable carrier)を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。【００５６】
本発明の製剤の投与量は、有効成分の種類及び活性、病気の重篤度、投与対象となる動物、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．００１−１０μｇ／ｋｇであり得る。【００５７】
本発明の改変タンパク質を有効成分として含む減感作剤などの医薬組成物は、スギ花粉（Cry j1および／またはCry j2）の改変タンパク質と他の抗原タンパク質(例えば白樺、ブタクサ、ヒノキなどの他の花粉抗原、ハウスダスト抗原、ダニ抗原など)の改変タンパク質をさらに含んでいてもよい。【００５８】
さらに、本発明の改変タンパク質はワクチンとして用いることも可能である。本発明において、ワクチンとは減感作療法に用いるものであり、具体的には、抗原特異的に免疫応答を抑制する免疫寛容の誘導を目的とした抗原そのもの、又は抗原を含有する薬剤のことである。【００５９】
本発明の改変タンパク質は、免疫制御細胞の増殖誘導剤として用いることも可能である。本発明の誘導剤によれば、免疫制御細胞、すなわち調節性（Regulatory）T細胞の増殖が促進される。
【実施例】
【００６０】
以下にスギ花粉由来の改変タンパク質を例にとり、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。【００６１】
なお、以下の実施例においては、必要に応じて以下の略号を用いる。
Cry j1、Cry j2の順に連結した融合蛋白質： Cry j1/2（又はrecCry j1/2）【００６２】
実施例１：Cry j1/2融合改変体遺伝子の合成
Cry j1/2融合改変体遺伝子６種類の全合成を委託した（タカラバイオ（株））。改変体遺伝子は以下のとおりである。
Ｍ＃１）Cry j1/2融合遺伝子にコードされるアミノ酸配列のＮ末端から８番目のCysを残し、それ以外の２２個のCys残基をSer残基へ置換させた遺伝子（配列番号３）。
Ｍ＃２）Cry j1/2融合遺伝子にコードされるアミノ酸配列のＮ末端から３５４番目のCysを残し、それ以外の２２個のCys残基をSer残基へ置換させた遺伝子（配列番号４）。Ｍ＃３）Cry j1/2融合遺伝子にコードされるアミノ酸配列のＮ末端から７３６番目のCysを残し、それ以外の２２個のCys残基をSer残基へ置換させた遺伝子（配列番号５）。
Ｍ＃４）Cry j1/2融合遺伝子にコードされるアミノ酸配列のＮ末端から８番目のCysを残し、それ以外の２２個のCys残基をAla残基へ置換させた遺伝子（配列番号６）。
Ｍ＃５）Cry j1/2融合遺伝子にコードされるアミノ酸配列のＮ末端から３５４番目のCysを残し、それ以外の２２個のCys残基をAla残基へ置換させた遺伝子（配列番号７）。
Ｍ＃６）Cry j1/2融合遺伝子にコードされるアミノ酸配列のＮ末端から７３６番目のCysを残し、それ以外の２２個のCys残基をAla残基へ置換させた遺伝子（配列番号８）。
次に、Cry j1/2融合改変体遺伝子６種類をそれぞれpET47b(+)（Novagen）ベクター（図7）の制限酵素SmaIとEcoR I切断部位にライゲーションを行い、大腸菌DH10B株に形質転換した（pET47b(+)-Cry j1/2）。以下、必要に応じて、本実施例で作製された構築物をrecCry j1/2Ｍ＃１−６と省略する。なお、Ｍ＃１−６はpET47b(+)（Novagen）ベクターを使用して大腸菌で発現しているため、recCry j1/2は、Ｎ末端にHisタグを有しており、実施例３でPEG化recCry j1/2改変タンパクをＮｉカラムで精製し、Hisタグを付けたまま（酵素で切断せず）実施例４，５，６の試験を実施した。Hisタグ以下にベクター(pET47b(+))由来の酵素(HRV 3C)切断部位があるので、最終的に酵素消化して得られるPEG化recCry j1/2改変タンパクのＮ末端には、ベクター由来の３アミノ酸（Gly-Pro-Gly）が配列番号１のＮ末端アミノ酸Ser上流に付加されることになる。【００６３】
実施例２：recCry j1/2タンパク質の発現確認
pET47b(+)-Cry j1/2Ｍ＃１−６プラスミドDNAをそれぞれ、大腸菌BL21株（インビトロジェン）に形質転換した。カナマイシン（最終濃度20μg/ml）を添加したLB培地100 mlに形質転換株を植菌した。37℃で一昼夜培養した後、100 mlの菌体培養液全てを1 Lのカナマイシン含有LB培地に移し、さらに37℃で2時間培養した。次に、IPTGを最終濃度0.1 mMになるように添加した後、30℃で3時間培養した。菌体を回収し、超音波破砕した後、高速遠心機で沈殿を分離した。【００６４】
実施例３：recCry j1/2タンパクのポリエチレングリコール（PEG）修飾と精製
上記の方法で得られた不溶性画分（インクルージョンボディ）を0.5 mlの8 M尿素/50 mM Tris-HCl (pH7.0)に懸濁後、磁気スターラーにて攪拌し、不溶化タンパク質を溶解した後、125 mM の下記式で示す4-アームタイプのPEG化試薬（分子量２０，０００Ｄａ、日油（株））【００６５】
【化１】
0005594691.tif 000002
【００６６】
(式中、Ｘは(CH2)3-NHCO-CH2CH2-マレイミドを示す)
で又は直鎖タイプCH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2CH2NHCO(CH2)2マレイミド（分子量３０，０００Ｄａ、日油（株））を20 μl添加し、4℃で18時間反応させた。【００６７】
高速遠心機で20000 G、10分間遠心した後、その上清と沈殿を回収し、SDSポリアクリルアミド電気泳動法（図１）とHRP標識抗Cry j2モノクローナル抗体（林原研究所）を用いたウェスタンブロッティングで解析した（図２）。その結果、Ｍ＃１−３のCys→Ser改変体は4-アームタイプ又は直鎖タイプPEG修飾により可溶化したが、Ｍ＃４−６のCys→Ala改変体はアームタイプ又は直鎖タイプPEGいずれの修飾によっても可溶化されないことが明らかになった。【００６８】
PEG修飾recCry j1/2タンパクは、20 mM リン酸緩衝液（pH7.4）に一晩透析後、0.22μｍのシリンジフィルターでろ過した。次に40 mMイミダゾール/20 mM リン酸緩衝液（pH7.4）で平衡化したHisTrap FF（GEヘルスケアバイオサイエンス）カラムにアプライした。40 mMイミダゾール/20mM リン酸緩衝液（pH7.4）で洗浄後、500 mMイミダゾール/20mM リン酸緩衝液（pH7.4）でPEG化recCry j1/2タンパクを溶出した。【００６９】
実施例４：スギ花粉症患者血清中IgE抗体とPEG化recCry j1/2タンパク質の結合能
実施例３で精製したサンプルのうち、ＰＥＧ化後可溶化することができたＭ＃１−３について、実施例３と同様の方法で４アーム状および直鎖状ＰＥＧで修飾し、次いで、以下の方法によって、スギ花粉症患者血清中IgE抗体との結合能を調べた。【００７０】
抗ヒトIgEモノクローナル抗体（uniCap IgE：ファルマ社製）を0.1% BSA/PBS-50 mM炭酸緩衝液（pH 9.6）で2μg/mlに希釈し、96ウェルプレート（corning, 平底プレート・高結合型）に50μl/ウェルで分注し、37℃で3時間インキュベートした。洗浄バッファー（0.05% Tween20/TBS）で3回洗浄した後、希釈用バッファー1（10% FCS-0.005% Tween20/PBS）で任意に希釈したスギ花粉症患者血清100検体をそれぞれduplicate、50μl/ウェルで添加し、4℃で一晩インキュベートした。翌日、洗浄バッファーで3回洗浄した後、希釈用バッファー1（10% FCS-0.005% Tween20/PBS）で0.5μg/mlに希釈したビオチン化Cry j1（生化学工業）又はPEG化recCry j1/2タンパクを50μl/ウェルで添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄バッファーで3回洗浄した後、希釈用バッファー1で1 g/mlに希釈したビオチン化抗ヒスチジンタグモノクローナル抗体（Rockland社製）を添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄バッファー（0.05% Tween20/TBS）で3回洗浄した後、希釈用バッファー2（1% BSA-0.005% Tween20/PBS）で0.1ユニット/mlに希釈したStreptavidin-β-Gal conjugate（Roche）を添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄バッファー（0.05% Tween20/TBS）で6回洗浄した後、0.2 mM 4-Methyl  Umberlliferyl β-D-Galactoside（SIGMA, 希釈用バッファー3で調製、 凍結保存）を更に希釈用バッファー3（1 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% BSA/10 mM Phosphate buffer, pH 6.9）で2倍希釈した。0.1 mM 4-Methyl Umberlliferyl β-D-Galactosideを50μl/ウェルで添加し、37℃で2時間インキュベートした。反応停止溶液（0.1 M Glycine-NaOH, pH 10.2）を50μl/ウェルで添加し、Ex: 355 nm、Em: 460 nmの蛍光強度を測定した。【００７１】
その結果、Ｎ末端側、中央、またはＣ末端側に残したシステイン残基をどちらのＰＥＧで修飾した改変タンパク質においても、ＰＥＧ化修飾をしなかった比較サンプル（天然型Ｃｒｙ ｊ１）と異なり、全く反応しないという結果が得られた（図３）。【００７２】
実施例５：PEG化recCry j1/2改変タンパクによるin vivo 抗体産生能（予防効果）
C57BL6 x DBA2 F1（BDF1）マウス1群5匹（雌、８週齢、チャールズリバー）に、水酸化アルミニウムゲル・アジュバント（2 mg）と混合した天然型Cry j1（1μg）を免疫する実験開始時（0日目）よりも７日前と３日前に、PEG化recCry j1/2改変タンパクM#2（10又は 100 μg）を静脈に投与した。１４日目に再度、水酸化アルミニウムゲル・アジュバント（2 mg）に混合した天然型Cry j1（1μg）で免疫し、４２日目に天然型Cry j1（1 μg）で追加免疫した。２８、４２、４９日目に眼窩採血を実施し、血清中の天然型Cry j1特異的IgE抗体価とIgG1抗体価を測定した。その結果、PEG化recCry j1/2改変タンパクM#2投与により、IgE抗体産生は抑制されるが、逆にIgG1抗体産生は上昇することが認められた（図４）。【００７３】
次に、抗原特異性を確認する目的から、上記と同様のマウスにPEG化recCry j1/2改変タンパクM#2を７日前と３日前に静脈内投与した後、水酸化アルミニウムゲル・アジュバントに混合した天然型Cry j1または卵白アルブミン（ＯＶＡ）（シグマ）で免疫した（０日目と１４日目）。２８日目に眼窩採血を実施し、血清中の天然型Cry j1特異的IgE抗体価とＯＶＡ特異的IgE抗体化を測定した。その結果、PEG化recCry j1/2改変タンパクM#2投与により、Cry j1特異的IgE抗体産生は抑制されるが、ＯＶＡ特異的IgＥ抗体産生は抑制されないことが認められた。（図５）。【００７４】
実施例６：PEG化recCry j1/2改変タンパクのin vivo IgE抗体産生抑制能（治療効果）
BDF1マウス（雌、８週齢、チャールズリバー）に、水酸化アルミニウムゲル・アジュバント（2 mg）と混合した天然型Cry j1（1μg）を実験開始時（0日目）に腹腔内免疫した後、２日目と７日目に実施例３で得られたPEG化recCry j1/2改変タンパクM#2（10又は 100 μg）を静脈に投与した。１４日目に天然型Cry j1タンパクを1μg追加免疫し、２１日目に全マウスの天然型Cry j1特異的IgE抗体を測定した。その結果、PEG化recCry j1/2改変タンパクM#2投与により、IgE抗体産生は投与量依存的に抑制されたが、逆にIgG1抗体産生は上昇することが認められた（図６）。【００７５】
以上の実施例により、本願発明に係る改変タンパク質は、野生型ＰＥＧ修飾体と同レベルの低い抗原性（すなわち、患者のＩｇＥ抗体に結合しない）と高いＩｇＥ産生抑制能を併せ持つことがわかった。したがって、本願発明により、安全で優れた減感作抗原として用いることのできる改変タンパク質を提供できることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】PEG化recCry j1/2改変体タンパク質のSDS-PAGEの結果を示す図である。(A) 4ア−ムPEG。（B）直鎖PEG。
【図２】PEG化recCry j1/2改変体タンパク質のウェスタンブロッティングの結果を示す図である。(A)4ア−ムPEG。（B）直鎖PEG。
【図３】スギ花粉症患者血清中IgEとPEG化recCry j1/2改変体タンパク質との結合能をELISAで調べた結果を示す図である。(A) 4ア−ムPEG。（B）直鎖PEG。(C) PEGなし（天然型Cry j1)。
【図４】PEG化recCry j1/2改変タンパクM#2投与により、IgE抗体産生は抑制されるが、逆にIgG1抗体産生は上昇することを示す。(A) 抗 Cry j1-IgE抗体価。（B）抗Cry j1-IgG1抗体価。
【図５】PEG化recCry j1/2改変タンパクM#2投与により、Cry j1特異的IgE抗体産生は抑制されるが、ＯＶＡ特異的IgＥ抗体産生は抑制されないことを示す。(A) Anti-Cry j1-IgE。（B）Anti-OVA-IgE。
【図６】PEG化recCry j1/2改変タンパクM#2投与により、IgE抗体産生は投与量依存的に抑制されたが、逆にIgG1抗体産生は上昇することを示す。(A) 抗Cry j1 IgE （21日目）。（B）抗Cry j1 IgG1 （21日目）。
【図７】pET47b(+)（Novagen）ベクターを示す。
【図１】
0005594691.tif 000003
【図２】
0005594691.tif 000004
【図３】
0005594691.tif 000005
【図４】
0005594691.tif 000006
【図５】
0005594691.tif 000007
【図６】
0005594691.tif 000008
【図７】
0005594691.tif 000009
【配列表】
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