(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体アンタゴニストであって、
配列番号４又は配列番号１３で表される配列のＩ８３に相当するイソロイシン残基が、陽性に荷電したアミノ酸で置換されているヒトＶＥＧＦ−Ａである、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト。
【請求項２】
請求項１に記載のＶＥＧＦ受容体アンタゴニストにおいて、配列番号４で表される配列のＩ８３が陽性に荷電したアミノ酸で置換された配列を有する、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト。
【請求項３】
請求項１に記載のＶＥＧＦ受容体アンタゴニストにおいて、配列番号１３で表される配列のＩ８３が陽性に荷電したアミノ酸で置換された配列を有する、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト。
【請求項４】
前記陽性に荷電されたアミノ酸が、リシン、アルギニン、又はヒスチジンである、請求項１から３のいずれか１項に記載のＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト。
【請求項５】
請求項１に記載の配列番号４又は配列番号１３で表される配列のＩ８３に相当するイソロイシン残基が陽性に荷電したアミノ酸で置換されているヒトＶＥＧＦ−Ａが、２つのサブユニットを有するホモダイマー又はヘテロダイマーの少なくとも１つのサブユニットとして発現される、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト。
【請求項６】
請求項１に記載のＶＥＧＦ受容体アンタゴニストにおいて、配列番号４のＥ４４、Ｅ６７、Ｅ７２、Ｅ７３、及びＱ８７からなる群より選択される残基に相当する位置に１以上の追加の塩基性アミノ酸による置換を有する、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト。
【請求項７】
前記追加の置換が、配列番号４におけるＥ７２ＲおよびＥ７３Ｒからなる群に相当する置換より選択される、請求項６に記載のＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト。
【請求項８】
前記追加の置換が、配列番号４におけるＥ７２Ｋ及びＥ７３Ｋからなる群に相当する置換より選択される、請求項６に記載のＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト。
【請求項９】
前記追加の置換が、配列番号４におけるＥ４４Ｒ又はＥ４４Ｋに相当する置換である、請求項６に記載のＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト。
【請求項１０】
前記追加の置換が、配列番号４におけるＱ８７Ｋ又はＱ８７Ｌに相当する置換である、請求項６に記載のＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト。
【請求項１１】
前記追加の置換が、配列番号４におけるＥ６７Ｋに相当する置換である、請求項６に記載のＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト。
【請求項１２】
前記ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストと天然ＶＥＧＦ受容体との相互作用が、血管新生を阻害する、請求項１に記載のＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト。
【請求項１３】
前記天然ＶＥＧＦ受容体がＫＤＲである、請求項１２に記載のＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト。
【請求項１４】
請求項６に記載のＶＥＧＦ受容体アンタゴニストにおいて、配列番号４におけるＥ７２Ｒ＋Ｅ７３Ｒ＋Ｉ８３Ｋに相当するアミノ酸置換を含有する、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト。
【請求項１５】
請求項６に記載のＶＥＧＦ受容体アンタゴニストにおいて、配列番号４におけるＥ４４Ｒ＋Ｅ７２Ｒ＋Ｅ７３Ｒ＋Ｉ８３Ｋに相当するアミノ酸置換を含有する、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト。
【請求項１６】
請求項１、２、４、５、及び６のいずれか１項に記載のＶＥＧＦ受容体アンタゴニストにおいて、配列番号４のＣ１４６またはＣ１６０に相当する位置に追加のアミノ酸置換を含有する、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト。
【請求項１７】
前記アミノ酸置換が、配列番号４におけるＣ１４６ＳまたはＣ１６０Ｓに相当する置換である、請求項１６に記載のＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト。
【請求項１８】
請求項１、６または１６に記載のＶＥＧＦ受容体アンタゴニストにおいて、配列番号４のＡ１１１および／またはＡ１４８に相当する位置に追加のアミノ酸置換を含有する、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト。
【請求項１９】
前記アミノ酸置換が、配列番号４におけるＡ１１１Ｐおよび／またはＡ１４８Ｐに相当する置換である、請求項１８に記載のＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト。
【請求項２０】
請求項１に記載のＶＥＧＦ受容体アンタゴニストが、毒素をさらに含む、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト。
【請求項２１】
前記毒素が、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素（ＰＥ）、ジフテリア（Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）毒素（ＤＴ）、リシン毒素、アブリン毒素、炭疽毒素類、志賀毒素、ボツリヌス毒素、破傷風毒素、コレラ毒素、マイトトキシン、パリトキシン、シグアトキシン、テクスチロトキシン、バトラコトキシン、アルファコノトキシン、タイポキシン、テトロドトキシン、アルファチチューストキシン、サキシトキシン、アナトキシン、ミクロシスチン、アコニチン、エクスフォリアチン毒素Ａ、エクスフォリアチンＢ、エンテロトキシン、毒物ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）、ペスト菌（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ）毒素およびガス壊疽毒素からなる群から選択される、請求項２０に記載のＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト。
【請求項２２】
前記ＶＥＧＦ−Ａが、ＶＥＧＦ１６５である、請求項１に記載のＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト。
【請求項２３】
前記ＶＥＧＦ−Ａが、ＶＥＧＦ１６５ｂである、請求項１に記載のＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト。
【請求項２４】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体アンタゴニストであって、 配列番号６で表される配列のＩ８３に相当するイソロイシン残基が、陽性に荷電したアミノ酸で置換されているヒトＶＥＧＦ−Ａである、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト。
【請求項２５】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体アンタゴニストであって、 配列番号８で表される配列のＩ８３に相当するイソロイシン残基が、陽性に荷電したアミノ酸で置換されているヒトＶＥＧＦ−Ａである、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト。
【請求項２６】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体アンタゴニストであって、 配列番号１０で表される配列のＩ８３に相当するイソロイシン残基が、陽性に荷電したアミノ酸で置換されているヒトＶＥＧＦ−Ａである、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト。
【請求項２７】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体アンタゴニストであって、 配列番号１５で表される配列のＩ８３に相当するイソロイシン残基が、陽性に荷電したアミノ酸で置換されているヒトＶＥＧＦ−Ａである、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト。
【請求項２８】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体アンタゴニストであって、 配列番号１７で表される配列のＩ８３に相当するイソロイシン残基が、陽性に荷電したアミノ酸で置換されているヒトＶＥＧＦ−Ａである、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト。
【請求項２９】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体アンタゴニストであって、 配列番号１９で表される配列のＩ８３に相当するイソロイシン残基が、陽性に荷電したアミノ酸で置換されているヒトＶＥＧＦ−Ａである、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト。
【請求項３０】
請求項１、６、１６または２０に記載のＶＥＧＦ受容体アンタゴニストを含む、医薬組成物。
【請求項３１】
癌患者の治療に用いられる請求項３０に記載の医薬組成物であって、
前記癌が、膀胱、乳房、肝臓、骨、腎臓、大腸、卵巣、前立腺、膵臓、肺、脳、乳房、および皮膚からなる群から選択される固形腫瘍癌である、医薬組成物。
【請求項３２】
血管新生関連眼疾患の患者の治療に用いられる請求項３０に記載の医薬組成物であって、
前記血管新生関連眼疾患が、未熟児網膜症、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、黄斑変性症、翼状片、血管新生緑内障、及び角膜損傷若しくは移植に関連する新血管新生からなる群から選択される、医薬組成物。
【請求項３３】
血管新生関連疾患の患者の治療に用いられる請求項３０に記載の医薬組成物であって、
前記血管新生関連疾患が、血管腫、アテローム硬化症、特発性肺線維症、血管再狭窄、動静脈形成異常、髄膜腫、血管芽細胞腫、血管線維腫、化膿性肉芽腫、水晶体後線維増殖症、強皮症、トラコーマ、滑膜炎、及び子宮内膜症からなる群より選択される、医薬組成物。
【請求項３４】
リウマチ様関節炎、骨関節炎、敗血症性関節炎、及び喘息からなる群より選択される疾患の患者の治療に用いられる、請求項３０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本出願は、血管新生に関連する病態および疾患の処置のための、血管新生を阻止または減少させるために血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体アンタゴニストとしてのＶＥＧＦ類縁体の設計および使用に関する。本出願はまた、ＫＤＲなどの天然受容体に対して受容体結合親和性が増加しているＶＥＧＦ類縁体を開示する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２００５年１０月６日に出願された米国仮出願６０／７２３，９１７および２００６年５月２５日に出願された米国仮出願６０／８０８，１０６の利益を主張し、それらは、参照としてその全体が本明細書に組み込まれている。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）類は、血管およびリンパ管の発育を調節する。それらは、低酸素状態と形質転換成長因子、インターロイキン類および血小板誘導成長因子などの成長因子による刺激とに応答して内皮細胞、造血細胞および間質細胞により主として産生される。
【０００４】
哺乳動物において、ＶＥＧＦ類は、遺伝子ファミリーによりコードされ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄおよび胎盤様成長因子（ＰｌＧＦ）を含む。関連の高いタンパク質としては、ＶＥＧＦ−Ｅと称されるオルフウィルスコード化ＶＥＧＦ様タンパク質およびＶＥＧＦ−Ｆと称される一連のヘビ毒を含む。ＶＥＧＦ類およびＶＥＧＦ関連タンパク質は、シスチンノット成長因子の血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）スーパー遺伝子ファミリーのメンバーである。ＰＤＧＦスーパー遺伝子ファミリーの全てのメンバーは、ＰＤＧＦと高度の構造相同性を共有する（参照としてその全体が本明細書に組み込まれているU.S. Patent Application 09/813,398を参照）。
【０００５】
ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−ＢおよびＰｌＧＦは、主として血管形成を必要とするが、一方、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄは、リンパ管形成を必須とする。血管新生は、新規な血管またはリンパ管が、先在する血管から発生することによって形成する過程である。この過程は、ＶＥＧＦ類が、内皮細胞、内皮細胞のシグナル伝達活性化に対する受容体に結合する際に開始される。活性化内皮細胞は、既存の血管周囲の基底膜に小さな孔を溶解させる酵素を産生する。次いで内皮細胞は、新規な血管を形成するために既存の血管の溶解孔を介して増殖および遊走を開始する（Alberts et al., 1994, Molecular Biology of the Cell. Garland Publishing, Inc., New York, N. Y. 1294 pp）。
【０００６】
３つのＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼは、新生血管中のＶＥＧＦ類：ｆｍｓ様チロシンキナーゼ（Ｆｌｔ−１、ＶＥＧＦＲ１としても知られている）、キナーゼドメイン受容体またはキナーゼ挿入ドメイン含有受容体（ＫＤＲ、ＶＥＧＦＲ２およびＦｌｋ−１としても知られている）およびＦｌｔ−４（ＶＥＧＦＲ３としても知られている）により活性化される。ＫＤＲは、血管新生シグナル伝達において主要な受容体であるが、Ｆｌｔ−１は血管形態形成の調節に関連し、Ｆｌｔ−４はリンパ管形成を調節する。これらの受容体は、走化性を媒介する単球におけるＦｌｔ−１の発現などの２，３の例外を除いて内皮細胞に殆ど独占的に発現される（Barleon et al., 1996, Blood. 87: 3336-3343）。
【０００７】
ＶＥＧＦ受容体は、Ｆｍｓ、ＫｉｔおよびＰＤＧＦ受容体と密接に関連する。それらは、７つの細胞外免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン、膜間（ＴＭ）ドメイン、調節性膜近傍ドメイン、短ペプチドにより断続される細胞内チロシンキナーゼドメイン、キナーゼ挿入ドメイン、次いで下流シグナル伝達分子の補充に関与する幾つかのチロシン残基を担持する配列からなる。Ｆｌｔ−１およびＫＤＲの細胞外ドメインの突然変異分析により、第二および第三のＩｇ様ドメインは、それぞれリガンド結合および受容体二量化を明らかに調節する第一および第四のＩｇドメインとでＶＥＧＦの高親和性リガンド結合ドメインを構成することを示す（Davis-Smyth et al., 1998, J. Biol. Chem. 273: 3216-3222；Fuh et l., 1998, J. Biol. Chem. 273: 11197-11204；およびShinkai et al., 1998, J. Biol. Chem. 273: 31283-31288）。受容体チロシンキナーゼ類は、リガンド媒介受容体二量化の際に活性化される（Hubbard, 1991, Prog. Biophys. Mol. Biol. 71: 343-358；Jiang and Hunter, 1999, Curr. Biol. 9: R568-R571；およびLemmon and Schlessinger, 1998, Methods Mol. Biol. 84: 49-71）。ＶＥＧＦ受容体のシグナル特異性は、ニューロピリン類、硫酸ヘパリン、インテグリン類またはカドヘリン類などの共受容体の補充の際にさらに調節される。
【０００８】
ＶＥＧＦ分子は、血管新生中に１つ以上のチロシンキナーゼ受容体と相互作用する。例えば、ＶＥＧＦ−Ａは、主としてＫＤＲおよびＦｌｔ−１を介して作用する。ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄは、ＫＤＲおよびＶＥＧＦＲ３に特異的なリガンドである。ＰｌＧＦおよびＶＥＧＦ−Ｂは、Ｆｌｔ−１にのみに結合すると考えられている。ウィルス性ＶＥＧＦ−Ｅ変異体は、ＫＤＲを活性化する。ＶＥＧＦ−Ｆ変異体は、ＶＥＧＦＲ３またはＫＤＲのいずれかと相互作用する。
【０００９】
２つの古典的受容体に加えて、ＶＥＧＦの生物活性および血管新生を調節する幾つかの膜または可溶性受容体がある。例えば、ニューロピリン−１およびニューロピリン−２は、それぞれＫＤＲおよびＦｌｔ−１の双方と相互作用し、これら受容体のシグナル伝達を刺激する。ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＰｌＧＦ−２のアイソフォームは、ニューロピリン−１に結合することが示されている（Soker et al., 1998, Cell. 92: 735-745；Makinen et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 21217-21222；およびMigdal et al., 1998, J. Biol. Chem. 273: 22272-22278）。ニューロピリンと相互作用できるＶＥＧＦアイソフォーム、すなわち、エクソン７または６および７を有するこれらのアイソフォームもまた、硫酸ヘパリンと相互作用できる。
【００１０】
ＶＥＧＦ−Ａは、ＶＥＧＦタンパク質について最良に特性化されているが、ＶＥＧＦ−ＡとＫＤＲとＦｌｔ−１との間の相互作用の分子的根拠は、十分に理解されていない。ＶＥＧＦＲ１は、ＫＤＲよりも５０倍高い親和性でＶＥＧＦ−Ａに結合するが、ＫＤＲは、ＶＥＧＦ−Ａ血管新生効果、すなわち、分裂促進性、走化性および管形成誘導の主要なトランスデューサであると考えられている。しかしながら、Ｆｌｔ−１が、造血および単球の補充において重要な役割を有する増殖証拠があり、腫瘍血管系に向かい、血管新生を促進し得る他の骨髄由来細胞がある（Hattori et al., 2002, Nature Med. 8: 841-849；Gerber et al., 2002, Nature. 417: 954-958；およびLuttun et l., 2002, Nature Med. 8: 831-840）。さらに、幾つかの場合、Ｆｌｔ−１は、腫瘍細胞により発現され、走化性シグナルを媒介でき、したがって可能性として癌増殖におけるこの受容体の役割を拡張する（Wey et al., 2005, Cancer. 104: 427-438）。
【００１１】
単一のＶＥＧＦ−Ａホモダイマーは、２つのＫＤＲ受容体の二量化および細胞質部分の自己リン酸化を誘導する。以前の研究により、糖タンパク質ホルモンに対する相似性により、ＶＥＧＦ−Ａの周辺ループにおける荷電アミノ酸残基もまた、そのそれぞれの受容体との高親和性静電的相互作用を提供する上で重要であることを示唆した（Szkudlinski et al., 1996, Nat. Biotechnol. 14(10): 1257-63；Fuh et al., 上記文献；Muller et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94(14): 7192-7；Keyt et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(10): 5638-46）。しかしながら、ＶＥＧＦ−Ａにおける多くの突然変異は、受容体結合親和性に対して主要な効果を有さないことに注目すべきである。ＶＥＧＦの周辺ループの突然変異により、本質的に機能喪失を生じている。さらに、以前のＫＤＲに対して２倍超の結合親和性を増加させるようなアミノ酸置換がないように思われる。
【００１２】
血管新生は、創傷治癒、心筋梗塞修復、および排卵などの有益な生物学的事象の原因である。一方、血管新生はまた、固形腫瘍の成長および転移などの疾患を引き起こすか、または寄与する原因となる（Isayeva et al., 2004, Int. J. Oncol. 25(2): 335-43；Takeda et al., 2002, Ann Surg. Oncol. 9(7): 610-16）；アテローム硬化症、未熟児網膜症などの疾患に見られる眼の異常新血管新生、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、および加齢関連黄斑変性（Yoshida et al., 1999, Histol Histopathol. 14(4): 1287-94；Aiello, 1997, Ophthalmic Res. 29(5): 354-62）；リウマチ様関節炎、骨関節炎、敗血症性関節炎などの慢性炎症病態；神経変性疾患（Ferrara, N., 2004, Endocr. Rev. 25: 581-611）；胎盤機能不全、すなわち子癇前症（Ferrara、上記文献）；および皮膚炎、乾癬、いぼ、皮膚悪性疾患、褥瘡性潰瘍、うっ血性潰瘍、化膿性肉芽腫、血管腫、カポジ肉腫、過形成性瘢痕、およびケロイド（Arbister, 1996, J. Am. Acad. Dermatol. 34(3): 486-97）などの皮膚疾患の原因である。リウマチ様関節炎、例えば、内皮細胞が活性化され、接着分子およびケモカインを発現して、血液から組織へと白血球の遊走に導く。内皮細胞の浸透性が増加して、関節の浮腫形成および腫脹に導く（Middleton et al., 2004, Arthritis Res. Ther. 6(2): 60-72）。
【００１３】
ＶＥＧＦ、特にＶＥＧＦ−Ａは、血管新生の増加、減少、および／または調節不全に関連する多くの疾患よおび病態に関係している（Binetruy-Tourniere et al., 2000, EMBO J. 19(7): 1525-33）。例えば、ＶＥＧＦは、腫瘍関連血管新生を刺激することにより固形腫瘍成長および転移の促進に関係している（Lu et al., 2003, J. Biol. Chem. 278(44): 43496-43507）。ＶＥＧＦはまた、眼内新血管新生および浸透性の重要な媒介物質である。遺伝子導入マウスにおけるＶＥＧＦの過度発現により、ヒト眼疾患に見られるように、臨床的網膜内および網膜下新血管新生、および血管造影法により検出可能な漏出性眼内血管の形成を生じる（Miller, 1997, Am. J. Pathol. 151(1): 13-23）。さらに、ＶＥＧＦは、原因不明女性不妊症および子宮内膜症の女性の腹腔内液中に確認されており（Miedzybrodzki et al., 2001, Ginekol. Pol. 72(5): 427-430）、精巣および副精巣におけるＶＥＧＦの過度発現は、遺伝子導入マウスにおいて不妊症を引き起こすことが判明している（Korpelainen et al., 1998, J. Cell Biol. 143(6): 1705-1712）。最近、ＶＥＧＦ−Ａは、滑液中およびリウマチ様関節炎（ＲＡ）患者の血清中に確認されており、その発現は、疾患重症度と相関している（Clavel et al., 2003, Joint Bone Spine. 70(5): 321-6）。このような多種多様の障害および疾患に病原性血管新生の関与を考慮すると、血管新生の阻止、特にＶＥＧＦシグナル伝達の阻止は、所望の治療目標である。
【００１４】
血管新生の阻止および腫瘍抑制は、ＫＤＲに対するＶＥＧＦの結合を遮断するペプチド（Binetruy-Tourniere et al., 2000, EMBO J. 19(7): 1525-33）；ＶＥＧＦに対する抗体（Kim et al., 1993, Nature 362, 841-844；Kanai et al., 1998, J. Cancer 77, 933-936；Margolin et al., 2001, J. Clin. Oncol. 19, 851-856）；ＫＤＲに対する抗体（Lu et al., 2003、上記文献；Zhu et al., 1998, Cancer Res. 58, 3209-3214；Zhu et al., 2003, Leukemia 17, 604-611；Prewett et al., 1999, Cancer Res. 59, 5209-5218）；可溶性受容体（Holash et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99,11393-11398；Clavel et al.,上記文献）；チロシンキナーゼ阻害剤（Fong et al., 1999, Cancer Res. 59, 99-106；Wood et al., 2000, Cancer Res. 60, 2178-2189；Grosios et al., 2004, Inflamm Res. 53(4): 133-42 ）；抗ＶＥＧＦ免疫毒素（Olson et al., 1997, Int. J. Cancer 73, 865-870）；リボザイム（Pavco et al., 2000, Clin. Cancer Res. 6, 2094-2103）；アンチセンス媒介ＶＥＧＦ抑制（Forster et al., 2004, Cancer Lett. 20; 212(1): 95-103）；ＲＮＡ干渉（Takei et al., 2004, Cancer Res. 64(10): 3365-70；Reich et al., 2003, Mol Vis. 9: 210-6）；および硫酸下、低分子量グリコールスプリットヘパリン（Pisano et al., 2005, Glycobiology. 15(2)1-6）など、ＶＥＧＦ
−ＡおよびＫＤＲの相互作用を妨げ、および／またはＫＤＲシグナル伝達経路を遮断する薬剤を用いることにより達成されている。しかしながら、これらの処置の幾つかは、望ましくない副作用を生じている。例えば、ＶＥＧＦを標的とするモノクローナル抗体であるＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社のアバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）は、何人にかの大腸癌患者において重篤な動脈血栓塞栓性事象を増加させ、非小細胞肺癌患者において重篤で、幾つかの場合、重篤な喀血、および致死さえも生じることが報告されている（Ratner, 2004, Nature Biotechnol. 22(10): 1198）。さらに最近、胃腸管系穿孔が、アバスチン（２００５年９月２３日付けでＧｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｐｒｅｓｓ社の発表）により処置された卵巣癌患者の１１％（試験女性４４人のうち５人）に見られたことを、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社は報告している。同様に、最初のＶＥＧＦ標的薬物であるＰｆｉｚｅｒ社の受容体チロシンキナーゼ阻害剤ＳＵ５４１６は、血栓塞栓性事象を含む重症の毒性を示したので、Ｐｆｉｚｅｒ社は開発を中止した（Ratner、上記文献）。有効な抗血管新生処置の開発からの利益を受ける多種多様の患者および幾つかの公知の抗血管新生処置の欠点を考慮すると、新規な抗血管新生療法の必要性が残っている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の要旨
本発明は、ＶＥＧＦ類縁体およびそれをコードする核酸を包含し、それらは、野生型ＶＥＧＦと比較して１つ以上の天然ＶＥＧＦ受容体に対して強力な結合親和性を示す。本発明はまた、受容体結合親和性および生物活性の分離を示すＶＥＧＦ類縁体およびそれをコードする核酸を包含する。特に、開示された類縁体のｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの生物活性は、野生型ＶＥＧＦと比較して、実質的に減少するが、一方、１つ以上の天然受容体に対する結合親和性は、野生型ＶＥＧＦと比較して、ほぼ同じか、または実質的に増加している。ＶＥＧＦ類縁体は、ＫＤＲなどの天然受容体に対する受容体結合親和性において少なくとも約３倍から４倍の増加を立証できる。
【００１６】
本発明の一実施形態において、ＶＥＧＦ類縁体は、修飾されたＶＥＧＦホモダイマーまたはヘテロダイマーである。これらの分子は、ＶＥＧＦ分子の一方または双方のサブユニットに存在し得る少なくとも１つの突然変異を含有する。本発明の一実施形態において、１つ以上の突然変異を含有するＶＥＧＦ類縁体は、ＶＥＧＦ−Ａである。ＶＥＧＦ−Ａ類縁体は、任意のＶＥＧＦ−Ａアイソフォーム、例えば、１２１、１４５、１４８、１６５、１８３、１８９、または２０６のアミノ酸のアイソフォームであり得る。一実施形態において、本発明のＶＥＧＦ−Ａ類縁体は、ＶＥＧＦ１６５ｂのアイソフォームである。別の実施形態において、１つ以上の突然変異を含有する本発明のＶＥＧＦ分子は、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−ＤまたはＰｌＧＦである。
【００１７】
本発明は、１つ以上のサブユニットにおける１つ以上の突然変異を含有するＶＥＧＦ融合タンパク質を含む。本発明のＶＥＧＦ融合タンパク質としては、少なくとも１つのサブユニット、すなわち、限定はしないが、他のシスチン成長因子または糖タンパク質など、異なるタンパク質の少なくとも１つのサブユニットに融合されたサブユニットが挙げられる。例えば、本発明は、ＶＲＧＦ分子が、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＶＥＧＦ−Ｆ、ＰＤＧＦまたはＰｌＧＦサブユニットに融合されたＶＥＧＦ−Ａサブユニット；ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＶＥＧＦ−Ｆ、ＰＤＧＦまたはＰｌＧＦサブユニットに融合されたＶＥＧＦ−Ｂサブユニット；ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＶＥＧＦ−Ｆ、ＰＤＧＦまたはＰｌＧＦサブユニットに融合されたＶＥＧＦ−Ｃサブユニット；ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＶＥＧＦ−Ｆ、ＰＤＧＦまたはＰｌＧＦサブユニットに融合されたＶＥＧＦ−Ｄサブユニット；またはＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＶＥＧＦ−Ｆ、またはＰＤＧＦサブユニットに融合されたＰｌＧＦサブユニットを含有するキメラＶＥＧＦ類縁体を含む。サブユニットは、リンカーペプチドにより任意に分離できる。本発明はまた、一緒に融合された同じＶＥＧＦ、すなわちＶＥＧＦ１６５ｂに融合されたＶＥＧＦ１６５サブユニットの異なるアイソフォームを含む。
【００１８】
一実施形態において、ＶＥＧＦ類縁体は単鎖分子である。例えば、本発明のＶＥＧＦ類縁体は、２つのＶＥＧＦサブユニット、すなわち、リンカーペプチドを介して一緒に結合されたモノマー類を含む。１つまたは両結合サブユニットは、１つ以上の塩基性アミノ酸置換を含有することができる。さらに、結合サブユニットは、異なるＶＥＧＦタンパク質サブユニットであり、同じサブユニットの異なるアイソフォームであり得る。例えば、本発明は、Ｉ８３Ｋアミノ酸置換を有するＶＥＧＦ１６５サブユニットにＧＳリンカーを介して結合された野生型ＶＥＧＦ１６５サブユニットを含む。
【００１９】
本発明の別の実施形態において、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、またはＰｌＧＦサブユニット、あるいは１つ以上の突然変異を含む二量体は、毒素に融合される。この実施形態のペプチドは、腫瘍細胞のターゲティングおよび破壊に有用であり得る。
【００２０】
本発明のＶＥＧＦ類縁体としては、４４位、６７位、７２位、７３位、８３位、および８７位の群からのリシンまたはアルギニンなどの１つ以上の塩基性アミノ酸置換が挙げられる。本発明の一実施形態において、ＶＥＧＦ類縁体は、８３位に塩基性アミノ酸置換および任意に４４位、６７位、７２位および７３位に１つ以上の塩基性アミノ酸置換を含有する。例えば、本発明は、Ｉ８３Ｋ突然変異を有するＶＥＧＦ類縁体を含む。本発明はまた、例えば、７２位、７３位および８３位に塩基性アミノ酸を有するＶＥＧＦ類縁体を含む。
【００２１】
本明細書に記載された塩基性アミノ酸置換を有するＶＥＧＦ類縁体は、ＫＤＲに対する受容体結合親和性をさらに増加させるために、および／またはニューロピリン−１に対する受容体結合親和性を減少させるために追加のアミノ酸置換を含有できる。例えば、本発明は、ニューロピリン−１結合部位を破壊するように作用する１４６位および１６０位において突然変異を含む。
【００２２】
本発明の類縁体はまた、安定性の増加および血清中半減期の増加を付与する追加のアミノ酸置換を含有できる。例えば、本発明は、１１１位および１４８位における置換のようなタンパク分解的切断部位を除去するアミノ酸置換を含む。
【００２３】
本発明のＶＥＧＦ受容体アンタゴニストは、野生型ＶＥＧＦと比較して血漿中半減期の増加を示すことができる。これは、半減期を増加させるために当技術分野に公知の方法によりＶＥＧＦ類縁体をさらに修飾することによって達成できるか、あるいは、血漿中半減期の増加をＶＥＧＦ類縁体固有の特徴としてもよい。本発明のＶＥＧＦ受容体アンタゴニストはまた、野生型ＶＥＧＦと比較して、吸収速度が増加および／または作用時間が減少するものであってもよい。
【００２４】
本発明の修飾類縁体は、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストとして作用し、したがって血管新生に関連する広いスペクトルの疾患および病態を患っている患者に対して待望の解決策を提供する。ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストは、固形腫瘍癌、血管腫、リウマチ様関節炎、骨関節炎、敗血症性関節炎、喘息、アテローム硬化症、特発性肺線維症、血管再狭窄、動静脈形成異常、髄膜腫、血管新生緑内障、乾癬、カポジ症候群（Ｋａｐｏｓｉ’ｓ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、血管線維腫、血友病関節、過形成性瘢痕、オースラー−ウェーバー症候群、化膿性肉芽腫、水晶体後線維増殖症、強皮症、トラコーマ、フォン・ヒッペル・リンドウ病、血管接着病状（ｖａｓｃｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅｓ）、滑膜炎、皮膚炎、神経変性疾患、子癇前症、原因不明女性不妊症、子宮内膜症、原因不明男性不妊症、翼状皮膚、創傷、ただれ、皮膚潰瘍、胃潰瘍、および十二指腸潰瘍を含むがこれらに限定されない血管新生に関連する疾患の処置のために、単独、または、別のＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、抗癌薬、もしくは抗血管新生薬と組み合わせて患者に投与できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体アンタゴニストとして驚くべき活性を示すＶＥＧＦファミリーの修飾血管新生成長因子を提供する。ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストとして、本発明の化合物は、「抗血管新生」の性質を有する。「修飾」されるとは、タンパク質が、対象の野生型ＶＥＧＦ、すなわち、ヒトＶＥＧＦまたは動物ＶＥＧＦとは異なるアミノ酸配列を含有するが、その配列が他の種の既知のＶＥＧＦ配列と同一であるように変化していないことを意味する。用語の「突然変異」および「置換」は、修飾アミノ酸残基を称するために本明細書において同義に用いられる。用語の「修飾ＶＥＧＦ分子」、「修飾ＶＥＧＦタンパク質」、「ＶＥＧＦ類縁体」、「ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト」、「ＶＥＧＦキメラ」、「ＶＥＧＦ融合タンパク質」および「ＶＥＧＦ単鎖分子」は、修飾ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、およびＰｌＧＦ類縁体分子を称するために本明細書において同義に用いられる。
【００２６】
「アンタゴニスト」は、血管新生の誘導など、ＶＥＧＦの天然の生物学的活性を遮断、阻止または軽減するように作用する分子を称するために本明細書において同義に用いられる。本明細書に用いられる用語「抗血管新生」とは、本発明の修飾ＶＥＧＦ分子が、血管新生の過程、または新規な血管またはリンパ管が先在する血管から形成する過程を遮断、阻止または軽減することを意味する。本発明のＶＥＧＦ類縁体の活性が、ＶＥＧＦが受容体に結合する際に通常生じる正常なＶＥＧＦ／受容体シグナル伝達を破壊する。したがって、本発明の類縁体は、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストである。理論に拘束されるものではないが、本発明のＶＥＧＦ類縁体は、シグナル伝達に必要なＫＤＲの二量化を破壊すると考えられる。
【００２７】
血管新生の阻止は、完全または部分的であり得る。ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストは、血管新生をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、および少なくとも約１００％阻止できる。血管新生の阻止は、当技術分野に知られた方法により当業者により測定できる。血管新生の阻止測定は、陰性および／または陽性対照の使用を含むことができる。例えば、当業者は、本発明のＶＥＧＦ類縁体により処置された対象における血管新生をＶＥＧＦ類縁体により処置されなかった同様の対象と比較することによって、本発明のＶＥＧＦ類縁体はＶＥＧＦ誘導血管新生を阻止すると結論付けることができる。
【００２８】
本発明の修飾ＶＥＧＦ分子は、野生型ＶＥＧＦと比較して、１つ以上の天然ＶＥＧＦ受容体に対して受容体結合親和性の増加した、または同様の受容体結合親和性を示す。本明細書に用いられるように、天然ＶＥＧＦ受容体は、ＶＥＧＦと特異的に相互作用する非修飾受容体である。例えば、内因性ＶＥＧＦ受容体は天然ＶＥＧＦ受容体である。本発明の一実施形態において、この天然受容体はＫＤＲである。ＫＤＲは、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−ＥおよびＶＥＧＦ−Ｆの受容体である。別の実施形態において、天然受容体はＦｌｔ−１である。Ｆｌｔ−１は、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−ＢおよびＰｌＧＦの受容体である。
【００２９】
「受容体結合親和性」とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで受容体に結合するリガンドの能力のことであり、限定はしないが、競合的結合アッセイおよび直接的結合アッセイなど、当技術分野で容易に利用できる方法によって評価できる。本明細書に用いられるように、受容体結合親和性とは、限定はしないが、Ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦ−Ｒ１としても知られている）、ＫＤＲ（ＶＥＧＦ−Ｒ２としても知られている）およびＦｌｔ−４（ＶＥＧＦ−Ｒ３としても知られている）など、天然ＶＥＧＦ受容体に結合するＶＥＧＦ分子の能力のことである。例えば、本発明の修飾ＶＥＧＦ−Ａ分子は、野生型ＶＥＧＦ−Ａと比較してＫＤＲに対して受容体結合親和性の増加または同様の結合親和性を示す。一実施形態において、本発明の修飾ＶＥＧＦ分子の受容体結合親和性の増加は、野生型ＶＥＧＦよりも少なくとも約１．２５培、少なくとも約１．５培、少なくとも約１．７５培、少なくとも約２培、少なくとも約３培、少なくとも約４培、少なくとも約５培、少なくとも約６培、少なくとも約７培、少なくとも約８培、少なくとも約９培または少なくとも約１０培大きい。
【００３０】
別の実施形態において、修飾ＶＥＧＦは、ＫＤＲおよび／または野生型ＶＥＧＦと同様または同等の血管新生に関与する他の受容体に対する受容体結合親和性を示す。同様または同等の受容体結合親和性は、野生型のＶＥＧＦ親和性の少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、もしくはそれ以上である。例えば、本発明は、野生型ＶＥＧＦにより示される受容体結合親和性の約７５％から８５％、約８５％から９５％および約９５％から１００％を示すＶＥＧＦ−Ａ類縁体を含む。
【００３１】
本発明はまた、少なくとも１つの天然受容体に対して増加した、または同様の受容体結合親和性を示すが、別の天然受容体に対して受容体結合親和性の減少を示すＶＥＧＦ類縁体を含む。例えば、本発明のＶＥＧＡ−Ａ類縁体は、野生型ＶＥＧＦ−Ａと比較してＫＤＲに対して増加または同様の受容体結合親和性を示し得るが、野生型ＶＥＧＦ−Ａと比較してＦｌｔ−１、ニューロピリン−１またはニューロピリン−２に対して受容体結合親和性の減少を示し得る
【００３２】
本発明のＶＥＧＦ類縁体はまた、野生型ＶＥＧＦ−Ａと比較して生物活性の減少を示す。「生物活性」とは、限定はしないが、内皮細胞における細胞増殖を誘導するためのＶＥＧＦの能力など、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでＶＥＧＦの天然の生物学的活性のことである。生物活性の減少は、血管新生の減少を生じる。本発明の一実施形態において、本発明のＶＥＧＦ類縁体は、同じアイソフォームの野生型ＶＥＧＦと比較して生物活性の減少を示す。例えば、本発明のＶＥＧＦ１６５類縁体は、野生型ＶＥＧＦ１６５と比較して生物活性の減少を示すことができ、ＶＥＧＦ１６５ｂ類縁体は、野生型ＶＥＧＦ１６５ｂと比較して生物活性の減少を示すことができる。
【００３３】
生物活性は、限定はしないが、ＶＥＧＦへの曝露の際にヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）などの内皮細胞の生存度をアッセイするｉｎ  ｖｉｔｒｏ生存度アッセイなど、当技術分野で知られた幾つかの方法によりアッセイできる。野生型ＶＥＧＦへの曝露から生じるものと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％またはそれ以上の内皮細胞生存度の減少は、生物活性の減少を示す。
【００３４】
生物活性は、さらにｉｎ  ｖｉｖｏで評価できる。例えば、生物活性は、腫瘍周囲の血管新生の増加欠如を検出することにより腫瘍対象者においてｉｎ  ｖｉｖｏで評価できる。血管新生増加欠如の検出は、限定はしないが、ｉｎ  ｖｉｖｏマトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）遊走アッセイ、ディスク血管新生アッセイ、マウスの背部皮膚ひだチャンバーを含むアッセイ、角膜移植および血管新生のスポンジインプラントモデルなど、当技術分野で知られた幾つかの方法により達成できる。一実施形態において、血管新生は、腫瘍およびその周囲の血管新生と未処置対象の同様のタイプの腫瘍、サイズおよび位置とを比較することにより評価される。当技術分野に知られている生検法は、組織を取り出し、血管形成に関して分析するために使用できる。
【００３５】
受容体結合親和性と生物活性との「解離」とは、受容体結合親和性および生物活性が相関していない概念のことである。比較すると、受容体結合親和性および生物活性は、野生型ＶＥＧＦ−Ａなどの野生型ＶＥＧＦタンパク質に相関する。受容体結合親和性の増加により、例えば、野生型ＶＥＧＦ−Ａに対する生物活性の増加を生じることが予想されるであろう。一方、本発明の修飾ＶＥＧＦ分子は、野生型ＶＥＧＦと比較して同様の受容体結合親和性または受容体結合親和性の増加を示すが、野生型ＶＥＧＦと比較して生物活性の減少を示す。
【００３６】
哺乳動物のＶＥＧＦ類は、関連遺伝子ファミリーの選択的スプライシングのため複数アイソフォームで産生される。本発明は、血管新生に関与するＶＥＧＦアイソフォームに相当するＶＥＧＦ類縁体を記載する。本発明のＶＥＧＦ類縁体は、他に指定されない限り、任意のＶＥＧＦアイソフォームを用いて創製できる。
【００３７】
ＶＥＧＦ−Ａは、限定はしないが、それぞれ１２１、１４５、１４８、１６５、１８３、１８９、および２０６のアミノ酸などのアイソフォームで存在できる。３つの主要なｍＲＮＡ種は、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５およびＶＥＧＦ１８９である。本明細書に用いられるように、ＶＥＧＦ１２１（配列番号６）、ＶＥＧＦ１４５（配列番号８）、ＶＥＧＦ１４８（配列番号１０）、ＶＥＧＦ１６５（配列番号４）、ＶＥＧＦ１６５ｂ（配列番号１３）、ＶＥＧＦ１８３（配列番号１５）、ＶＥＧＦ１８９（配列番号１７）、およびＶＥＧＦ２０６（配列番号１９）は、抗血管新生特性を有するように修飾できるＶＥＧＦ−Ａのアイソフォームである。本明細書に記載されたアミノ酸位置は、配列番号３のリーダー配列などのリーダー配列を欠くＶＥＧＦ分子に基づいている。リーダー配列を有するＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのアミノ酸配列は、配列番号２、５、７、９、１２、１４、１６および１８の配列である。
【００３８】
ＶＥＧＦ−Ａの種々のアイソフォームは、１１０のアミノ酸の共通したアミノ末端ドメインを共有する。ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームは、エキソン２〜５によりコード化された受容体結合ドメインを有する。アイソフォーム間で最も著しい相違は、エキソン６ａ、６ｂ、７ａおよび７ｂによりコード化されるニューロピリンおよびヘパリン結合ドメインに見られる。
【００３９】
最も共通するＶＥＧＦ−Ａアイソフォームは、ＶＥＧＦ１６５である。ＶＥＧＦ１６５をコードする核酸は、配列番号１の配列である。最近、カルボキシ末端にエキソン８の代わりに、エキソン９によりコード化された配列を含有するＶＥＧＦ１６５ｂと称される内因性スプライス変異体が記載された。このタンパク質をコードする核酸分子は、配列番号１１の配列である。ＶＥＧＦ１６５ｂ（リーダー配列を有する配列番号１２；リーダー配列の無い配列番号１３）は、ＶＥＧＦ１６５により加えられると内皮細胞におけるＶＥＧＦシグナル伝達を阻止した（参照としてその全体が本明細書に組み込まれているWoolard et al., 2004, Cancer Research. 64: 7822-7835を参照；またU.S. 2005/0054036を参照）。
【００４０】
本発明の一実施形態において、ＶＥＧＦ類縁体はＶＥＧＦ−Ａ類縁体である。ＶＥＧＦ−Ａ類縁体としては、「修飾ＶＥＧＦ−Ａタンパク質」、「ＶＥＧＦ−Ａ受容体アンタゴニスト」、「ＶＥＧＦ−Ａキメラ」、「ＶＥＧＦ−Ａ融合タンパク質」および「ＶＥＧＦ−Ａ単鎖分子」が挙げられる。ＶＥＧＦ−Ａ類縁体は、少なくとも１つの修飾ＶＥＧＦ−Ａサブユニットを含有するＶＥＧＦ−Ａ分子である。
【００４１】
ＶＥＧＦ−Ｂは、２つのアイソフォーム、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７（配列番号４８）およびＶＥＧＦ−Ｂ１８６（配列番号５０）で存在する（Makinen et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 21217-21222）。本発明の一実施形態において、ＶＥＧＦ類縁体はＶＥＧＦ−Ｂ類縁体である。ＶＥＧＦ−Ｂ類縁体としては、「修飾ＶＥＧＦ−Ｂタンパク質」、「ＶＥＧＦ−Ｂ類縁体」、「ＶＥＧＦ−Ｂ受容体アンタゴニスト」、「ＶＥＧＦ−Ｂキメラ」、「ＶＥＧＦ−Ｂ融合タンパク質」および「ＶＥＧＦ−Ｂ単鎖分子」が挙げられる。ＶＥＧＦ−Ｂ類縁体は、少なくとも１つの修飾ＶＥＧＦ−Ｂサブユニットを含有するＶＥＧＦ−Ｂ分子である。
【００４２】
ＶＥＧＦ−Ｃは、２１−ｋｄ活性タンパク質を形成するためにタンパク分解的に切断されるプロペプチド（配列番号５１）として産生される（Nicosia, 1998, Am. J. Path. 153: 11-16）。本発明の一実施形態において、ＶＥＧＦ類縁体はＶＥＧＦ−Ｃ類縁体である。ＶＥＧＦ−Ｃ類縁体としては、「修飾ＶＥＧＦ−Ｃタンパク質」、「ＶＥＧＦ−Ｃ類縁体」、「ＶＥＧＦ−Ｃ受容体アンタゴニスト」、「ＶＥＧＦ−Ｃキメラ」、「ＶＥＧＦ−Ｃ融合タンパク質」および「ＶＥＧＦ−Ｃ単鎖分子」が挙げられる。ＶＥＧＦ−Ｃ類縁体は、少なくとも１つの修飾ＶＥＧＦ−Ｃサブユニットを含有するＶＥＧＦ−Ｃ分子である。
【００４３】
ＶＥＧＦ−Ｄはまた、活性タンパク質を形成するためにタンパク分解的に切断されるプロペプチド（配列番号５２）として産生される。ＶＥＧＦ−Ｄは、ＶＥＧＦ−Ｃと４８％同一である（Nicosia,上記文献）。本発明の一実施形態において、ＶＥＧＦ類縁体はＶＥＧＦ−Ｄ類縁体である。ＶＥＧＦ−Ｄ類縁体としては、「修飾ＶＥＧＦ−Ｄタンパク質」、「ＶＥＧＦ−Ｄ類縁体」、「ＶＥＧＦ−Ｄ受容体アンタゴニスト」、「ＶＥＧＦ−Ｄキメラ」、「ＶＥＧＦ−Ｄ融合タンパク質」および「ＶＥＧＦ−Ｄ単鎖分子」が挙げられる。ＶＥＧＦ−Ｄ類縁体は、少なくとも１つの修飾ＶＥＧＦ−Ｄサブユニットを含有するＶＥＧＦ−Ｄ分子である。
【００４４】
胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）は、３つのアイソフォーム、ＰｌＧＦ−１（配列番号５４）、ＰｌＧＦ−２（配列番号５６）およびＰｌＧＦ−３（配列番号５８）で存在する。ＰｌＧＦ−２は、他の２つのアイソフォームに不在するヘパリンおよびニューロピリン−１結合性を付与するエキソン６コード化ペプチドを含有する。ＰｌＧＦ−１およびＰｌＧＦ−２の双方は、内皮細胞遊走を誘導できるものとして報告されている（Migdal et al., 1998, J. Biol. Chem. 273: 22272-22278）。本発明の一実施形態において、ＶＥＧＦ類縁体はＰｌＧＦ類縁体である。別の実施形態において、ＶＥＧＦ類縁体はＰｌＧＦ−１またはＰｌＧＦ−２である。ＰｌＧＦ類縁体としては、「修飾ＰｌＧＦタンパク質」、「ＰｌＧＦ類縁体」、「ＰｌＧＦ受容体アンタゴニスト」、「ＰｌＧＦキメラ」、「ＰｌＧＦ融合タンパク質」および「ＰｌＧＦ単鎖分子」が挙げられる。ＰｌＧＦ類縁体は、少なくとも１つの修飾ＰｌＧＦサブユニットを有するＰｌＧＦ分子である。
【００４５】
本発明のＶＥＧＦ類縁体は、修飾動物またはヒトＶＥＧＦ分子である。本発明の一実施形態において、ＶＥＧＦ類縁体は、哺乳動物のＶＥＧＦ分子である。本発明の別の実施形態において、ＶＥＧＦ類縁体は、鳥類のＶＥＧＦ分子である。本発明のＶＥＧＦ類縁体としては、限定はしないが、修飾霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、マウス、ラットおよびウサギＶＥＧＦ分子が挙げられる。一実施形態において、動物ＶＥＧＦ類縁体はＶＥＧＦ−Ａ類縁体である。例えば、本発明の動物ＶＥＧＦ−Ａ類縁体は、動物ＶＥＧＦ１６５または動物ＶＥＧＦ１６５ｂ類縁体であり得る。
【００４６】
ヒト以外の種の修飾ＶＥＧＦ分子は、本明細書に開示された修飾ヒトＶＥＧＦ分子のものに相当する位置に置換を有し、限定はしないが、ＤＮＡＳＩＳ、ＡＬＩＯＮｍｅｎｔ、ＳＩＭおよびＧａｐ、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＦｒａｍｅＡｌｉｇｎ、ならびにＣｏｍｐａｒｅなどのＧＣＧプログラムなど、任意のアラインメントプログラムを用いて同定できる。当業者によって認識できるように、塩基性アミノ酸により置換されるための相当するアミノ酸は、ヒトＶＥＧＦ−Ａのものと同一ではないと思われる。例えば、グルタメート（Ｅ）が、アスパルテート（Ｄ）などの動物における異なる酸性アミノ酸に相当し得ることを、当業者により認識するであろう。
【００４７】
別の実施形態において、相当するアミノ酸は、規定された構造内、例えば、外部ループ構造上の同じ一般的な位置に配置されるものとして同定される。タンパク質の構造は、タンパク質のアミノ酸に基づくソフトウェアを用いて予測できる。したがって、当業者は、関連タンパク質において相当する位置を確認するためにタンパク質の折りたたみおよびループ構造を予測するソフトウェアを使用できる。
【００４８】
ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストの設計
本発明に包含されるＶＥＧＦ受容体アンタゴニストは、他の種のＶＥＧＦタンパク質における塩基性残基を同定するために、対象のＶＥＧＦのアミノ酸配列を他の種のものに比較することにより設計できる。例えば、ＶＥＧＦ−Ａの場合、ヒトＶＥＧＦ−Ａを別の種のものに比較することにより設計できる。このような方法は、参照としてその全体が本明細書に組み込まれているU.S. 6,361,992に開示されている。また、種々の種からＶＥＧＦの相対的な生物活性に対して考慮することができ、その種は比較およびアミノ酸置換のために選択できる。関連糖タンパク質の構造に基づきさらなる相同性モデリングは、表面曝露アミノ酸残基を同定するために有用である。相同性モデリングは、限定はしないが、タンパク質モデリングコンピュータソフトウェアの使用など、一般に当技術分野に公知の方法により実施できる。
【００４９】
本発明はまた、修飾ＶＥＧＦタンパク質を提供し、修飾ＶＥＧＦは、野生型ＶＥＧＦよりも結合親和性の増加および／または生物活性の減少を有する別の種からＶＥＧＦタンパク質において同じアミノ酸位置に相当する位置に置換されたアミノ酸を含む。例えば、ヘビ毒ＶＥＧＦ−Ｆは、高親和性でＫＤＲに結合し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで血管内皮細胞の増殖を強力に刺激する。ヒトＶＥＧＦ−Ａをヘビ毒ＶＥＧＦに比較でき、ヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質を、ヘビ毒およびヒト配列が異なる１つ以上の位置におけるアミノ酸置換により設計でき、ヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質を、選択された変更により構築でき、修飾ヒトＶＥＧＦ−Ａをヒトに投与できる。ヘビ毒ＶＥＧＦ−Ｆは、ＫＤＲ結合親和性の増加および生物活性を示すが、すなわち、ヒトＶＥＧＦと比較して、結合親和性と生物活性とは相関しているが、受容体結合親和性を増加させるが、生物活性に対する効果を減少させるか、または有さないアミノ酸置換を同定するために、アミノ酸置換を経験的に試験し得ることを当業者は解するであろう。受容体結合親和性を増加させ、および／または生物活性に対する効果を減少させるか、または有さないアミノ酸置換は、次に受容体結合親和性を増加させ、および／または生物活性を減少させることが知られている１つ以上の他のアミノ酸置換と組合わせることができる。
【００５０】
本発明の別の実施形態において、修飾ＶＥＧＦ分子は、天然の節足動物に存在するＶＥＧＦ相同体の同じアミノ酸位置に相当する位置で置換された１つ以上のアミノ酸を含有できる。節足動物において、単一成長因子は、高等生物におけるＰＤＧＦおよびＶＥＧＦにより実施されたタスクを実施する。受容体結合親和性を増加させるが、生物活性に対する効果を減少させるか、または有さないか、あるいは、受容体結合親和性に対する効果が殆どないが、生物活性を減少させるアミノ酸置換を同定するために、アミノ酸置換を経験的に試験し得ることを当業者は解するであろう。
【００５１】
さらに、本発明は、修飾ＶＥＧＦを提供し、修飾ＶＥＧＦは、異なるＶＥＧＦまたはＶＥＧＦアイソフォームにおける同じアミノ酸か、または同一種または異種からのＰＤＧＦファミリーにおかえるタンパク質などの密接に関連する糖タンパク質に相当する位置に置換された塩基性アミノ酸を含む。例えば、ＶＥＧＦ１６５は、同一種からのＰＤＧＦおよび任意の配列相違に基づくＶＥＧＦタンパク質に成されたアミノ酸置換と比較できる。当業者は、ＤＮＡＳＩＳ、ＡＬＩＯＮｍｅｎｔ、ＳＩＭおよびＧａｐ、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＦｒａｍｅＡｌｉｇｎ、ならびにＣｏｍｐａｒｅなどのＧＣＧプログラムなど、任意のアラインメントプログラムの使用など、当技術分野に公知の方法を用いて、ＶＥＧＦタンパク質またはＶＥＧＦ関連タンパク質の２つ以上の配列を比較できる。
【００５２】
本発明の別の態様において、本明細書に記載されたアミノ酸置換は、ＶＥＧＦ−Ｅ（配列番号６０）、ＶＥＧＦ−Ｆ（配列番号６２）およびＰＤＧＦ（配列番号６３および配列番号６４）などの密接に関連したタンパク質に取り込むことができる。例えば、Ｅ６７、Ｅ７２、Ｅ７３，Ｉ８３およびＱ８７からなる群から選択された１つ以上の塩基性アミノ酸置換は、同一種からのＰＤＧＦアイソフォームおよびＰＤＧＦアイソフォームに成されたアミノ酸置換と比較できる。
【００５３】
本発明のＶＥＧＦ類縁体は、野生型ＶＥＧＦ−Ａと比較してＦｌｔ−１受容体に対する受容体結合親和性の減少を示すように設計できる。これらの類縁体は、Ｆｌｔ−１に対する受容体結合親和性の減少を示すが、それらは、野生型ＶＥＧＦ−Ａと比較してＫＤＲに対する受容体結合親和性を増加させ得るか、または同等であり得る。
【００５４】
本発明のＶＥＧＦ類縁体は、限定はしないが、野生型ＶＥＧＦと比較してニューロピリン−１またはニューロピリン−２など、共受容体に対する受容体結合親和性の減少を示すように設計できる。ニューロピリン−１またはニューロピリン−２に対する受容体結合親和性の減少を有する類縁体は、野生型ＶＥＧＦと比較してＫＤＲ、Ｆｌｔ−１またはＶＥＧＲ３に対する受容体結合親和性を増加させるか、または同様にすることができる。例えば、ＶＥＧＦ類縁体は、ニューロピリン−１に対する受容体結合親和性の減少およびＫＤＲおよび／またはＦｌｔ−１に対する受容体結合親和性の増加を示すように設計できる。本発明の一実施形態において、ニューロピリン−１に対する受容体結合親和性の減少を示すＶＥＧＦ−Ａは、ＶＥＧＦ１６５ｂスプライス変異体において設計された類縁体である。別の実施形態において、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７およびＰｌＧＦ−２類縁体は、ニューロピリン−１に対する受容体結合親和性の減少およびＦｌｔ−１に対する結合親和性の増加を示すように設計できる。
【００５５】
本発明の一実施形態において、ＶＥＧＦ類縁体は、ＶＥＧＦニューロピリン結合部位を破壊することによって、野生型ＶＥＧＦと比較してニューロピリン−１またはニューロピリン−２に対する受容体結合親和性の減少を示すように設計される。これは、ニューロピリン−１受容体結合ドメインの多数のシステインアミノ酸残基を還元することによって達成できる。例えば、ＶＥＧＦ１６５類縁体は、配列番号４の１４６位および／または１６０位におけるシステイン残基を、ジスルフィド架橋の破壊を引き起こすセリンのようなアミノ酸で置換することによりＶＥＧＦ１６５のニューロピリン１結合部位を破壊するように設計できる。配列番号４の１４６位および／または１６０位におけるシステイン残基の置換により、ニューロピリン−１結合を破壊するが、ヘパリン結合を破壊しない。１４６位および／または１６０位における突然変異は、１つ以上の突然変異と連結して、本明細書に記載されるようにＫＤＲ、Ｆｌｔ−１および／またはＶＥＧＦＲ３に対する受容体結合親和性を増加、維持または回復させることができる。
【００５６】
同様に、本発明は、野生型ＶＥＧＦと比較してニューロピリン−２に対する受容体結合親和性の減少を示すＶＥＧＦ類縁体を含む。例えば、本発明は、ニューロピリン−２に対する受容体結合親和性の減少を示すが、野生型ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄと比較してそれぞれＫＤＲおよび／またはＶＥＧＦＲ３に対して増加または同様の結合親和性を示すＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄ類縁体を含む。
【００５７】
本発明はまた、安定性の増強および耐プロテアーゼを示すＶＥＧＦ類縁体を含む。一実施形態において、配列番号４のＡ１１１位およびＡ１４８におけるアミノ酸置換により、耐プロテアーゼを改善するためにＶＥＧＦ−Ａ類縁体に取り込まれる。本発明はまた、ＶＥＧＦ−ＣプロペプチドおよびＶＥＧＦ−Ｄプロペプチドの切断をそれぞれ防止する突然変異を含有するＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄ類縁体を含む。例えば、本発明はまた、耐セリンプロテアーゼプラスミンおよび／または耐プラスミノーゲンファミリーの他のメンバーを誘導する１つ以上の突然変異を含有するＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄ類縁体を含む。
【００５８】
本発明の別の実施形態において、１つ以上のＶＥＧＦ受容体、好ましくはＫＤＲに対する受容体結合親和性の増加を示すＶＥＧＦ−Ｄ類縁体は、アンタゴニストの性質を示す天然ＶＥＧＦ分子を創製できる。例えば、腎組織から単離されたアイソフォームであるＶＥＧＦ１６５ｂを修飾して、受容体結合親和性の増加およびタンパク質の生物活性の減少に関連するアミノ酸置換を取り込むことができる。同様に、当業者は、ＶＥＧＦ１６５ｂの性質を含有するＶＥＧＦの合成または新規なアイソフォームにおいて本発明のアミノ酸置換を取り込むことができるであろう。特に本発明の突然変異は、エキソン８によってコード化されたアミノ酸（ＣＤＫＰＲＲ；配列番号７１）に加え、またはその代わりに、アミノ酸ＳＬＴＲＫＤ（配列番号７０）、すなわちエキソン９と呼ばれているものによりコード化されたアミノ酸を含有する他のＶＥＧＦタンパク質により使用できる。
【００５９】
アミノ酸置換
本発明のＶＥＧＦ類縁体は、受容体結合親和性の増強および生物活性の減少を付与する１つ以上の塩基性アミノ酸置換を含有する。本発明の一実施形態において、ＶＥＧＦ類縁体は、限定はしないが、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストなど、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストである。
【００６０】
本発明の修飾ＶＥＧＦ分子は、１つ以上のサブユニット、すなわち、ＶＥＧＦのモノマーにおいて塩基性アミノ酸置換を有することができる。塩基性アミノ酸は、アミノ酸リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびヒスチジン（Ｈ）、およびこれら任意の３種のアミノ酸の修飾であり得る任意の他の塩基性アミノ酸、通常天然には見られない合成塩基性アミノ酸、または中性ｐＨで陽性に荷電された任意の他のアミノ酸を含む。他の中で好ましいアミノ酸は、リシンおよびアルギニンからなる群から選択される。
【００６１】
一実施形態において、本発明の修飾ＶＥＧＦ分子は、少なくとも１つの修飾サブユニットを含み、修飾サブユニットは、野生型ヒトＶＥＧＦ１６５（配列番号４）、ＶＥＧＦ１２１（配列番号６）、ＶＥＧＦ１４５（配列番号８）、ＶＥＧＦ１４８（配列番号１０）、ＶＥＧＦ１６５ｂ（配列番号１３）、ＶＥＧＦ１８３（配列番号１５）、ＶＥＧＦ１８９（配列番号１７）またはＶＥＧＦ２０６（配列番号１９）のＩ８３位に塩基性アミノ酸置換を含む。例えば、本発明は、ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのアミノ酸配列に相当する配列番号４、６、８、１０、１３、１５、１７または１９におけるＩ８３Ｋアミノ酸置換を含む。
【００６２】
本発明はまた、他のＶＥＧＦ分子、すなわち、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−ＤおよびＰｌＧＦにおける８３位、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７（配列番号４８）またはＶＥＧＦ−Ｂ１８６（配列番号５０）のＩ８３位およびＰｌＧＦ−１（配列番号５４）、ＰｌＧＦ−２（配列番号５６）またはＰｌＧＦ−３（配列番号５８）の１９１位などに相当する位置に塩基性アミノ酸置換を含む。
【００６３】
本発明は、ヒト以外の動物における修飾ＶＥＧＦ分子を含み、１つ以上のサブユニットにおいてＶＥＧＦ分子は、ヒトのＶＥＧＦ−Ａの８３位に相当する位置に塩基性アミノ酸置換を含有する。一実施形態において、修飾動物ＶＥＧＦは修飾ＶＥＧＦ−Ａ分子である。例えば、本発明は、霊長類の（配列番号２２）のＩ８３位、ウシの（配列番号２５）のＩ８２位、イヌの（配列番号２８）のＩ８２位、ニワトリの（配列番号３１）のＩ８３位、ウマの（配列番号Ｉ８２）のＩ８２位、マウスの（配列番号３７）のＩ８２位、ブタの（配列番号４０）のＩ８２位、ラットの（配列番号４３）のＩ８２位およびヒツジの（配列番号４６）のＩ８２位に塩基性アミノ酸置換を含む。
【００６４】
本発明はまた、限定はしないが、配列番号４のＩ８３位に相当するアミノ酸置換を含有するＶＥＧＦ−Ｅ、ＶＥＧＦ−ＦおよびＰＤＧＦなど、修飾ＶＥＧＦ関連タンパク質を考慮する。例えば、ＶＥＧＦ−Ｆ（配列番号６２）は、Ｉ８３のアミノ酸置換を含むように修飾できる。
【００６５】
本発明の修飾ＶＥＧＦ分子は、野生型ＶＥＧＦ−Ａなどの野生型ＶＥＧＦと比較して、ＶＥＧＦの結合親和性をさらに増加させるか、またはＶＥＧＦの生物活性を減少させる塩基性アミノ酸置換を含有できる。ＶＥＧＦ１６５（配列番号４）、ＶＥＧＦ１２１（配列番号６）、ＶＥＧＦ１４５（配列番号８）、ＶＥＧＦ１４８（配列番号１０）、ＶＥＧＦ１６５ｂ（配列番号１３）、ＶＥＧＦ１８３（配列番号１５）、ＶＥＧＦ１８９（配列番号１７）またはＶＥＧＦ２０６（配列番号１９）の４４位、６７位、７２位、７３位および／または８７位のうちの１つ以上に塩基性アミノ酸置換を有するＶＥＧＦ分子は、野生型ＶＥＧＦと比較してＫＤＲに対する結合親和性を増加できる。例えば、本発明は、塩基性アミノ酸修飾Ｅ４４Ｒ、Ｅ４４Ｋ、Ｅ７２Ｋ、Ｅ７３Ｒ、Ｅ７３Ｋ、Ｑ８７Ｒ、Ｑ８７ＫおよびＥ６７Ｋを含む。
【００６６】
本発明の一実施形態において、配列番号４の４４位、６７位、７２位、７３位および／または８７位に相当する塩基性アミノ置換は、配列番号４の８３位に相当する塩基性アミノ酸置換と結合してＶＥＧＦ受容体アンタゴニストを産生する。例えば、本発明の修飾アミノ酸は、７２＋７３＋８３、４４＋８３、７２＋８３、７３＋８３、４４＋７２＋８３、４４＋７３＋８３、４４＋７２＋７３＋８３、４４＋８３＋８７、８３＋８７、６７＋７２＋７３＋８３、４４＋６７＋８３、６７＋７２＋８３、６７＋７３＋８３、４４＋６７＋７２＋８３、４４＋６７＋７３＋８３、４４＋６７＋７２＋７３＋８３、４４＋６７＋８３＋８７および６７＋８３＋８７の位置に塩基性アミノ酸置換を含む。
【００６７】
本発明の別の実施形態において、類縁体は、Ｅ４４、Ｅ６７、Ｅ７２、Ｅ７３およびＱ８７の位置に１つ以上の塩基性アミノ酸および任意にＩ８３位に塩基性アミノ酸置換を含有するＶＥＧＦ１６５ｂ分子である。ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームが、ＶＥＧＦ１６５ｂである場合、他のＶＥＧＦ１６５において受容体結合親和性の増加を別に生じ得るのみの単一アミノ酸修飾を取り込むことにより、ＶＥＧＦ１６５など、野生型ＶＥＧＦ−Ａと比較して結合親和性の増加および生物活性の減少を有する本発明のＶＥＧＦ類縁体を作出することは可能である。
【００６８】
例えば、本発明は、Ａ４４、Ｅ６７、Ｇ７２、Ｑ７３およびＳ８７の位置に１つ以上の塩基性アミノ酸置換を含有する修飾ＶＥＧＦ−Ｂ類縁体（配列番号４８および５０）ならびにＥ４４、Ｅ６７、Ｅ７２、Ｅ７３およびＱ８７の位置に１つ以上の塩基性アミノ酸置換を含有する修飾ＶＥＧＦ−Ｆ類縁体（配列番号６２）を含む。
【００６９】
本発明の修飾動物、すなわち、非ヒトＶＥＧＦ−Ａ分子は、野生型動物ＶＥＧＦと比較して修飾動物ＶＥＧＦ分子の結合親和性を増加させるか、または生物活性を減少させるために、さらなるアミノ酸修飾を同様に含有できる。本発明は、上記のとおり配列番号４のＩ８３に相当するアミノ酸置換と関連するこれらの修飾の使用を含む。例えば、本発明は、霊長類（尾長マカクザル）のＶＥＧＦ−Ａ（配列番号２２）のＥ４４位、Ｅ６７位、Ｅ７２位、Ｅ７３位、Ｉ８３位、およびＩ８７位からなる群から選択される１つ以上の塩基性アミノ酸置換；ウシのＶＥＧＦ−Ａ（配列番号２５）のＥ４３位、Ｅ６６位、Ｅ７１位、Ｅ７２位、Ｉ８２位、およびＱ８６位からなる群から選択される１つ以上の塩基性アミノ酸置換；イヌのＶＥＧＦ−Ａ（配列番号２８）のＥ４３位、Ｅ６６位、Ｅ７１位、Ｅ７２位、Ｉ８２位、およびＱ８６位からなる群から選択される１つ以上の塩基性アミノ酸置換；鳥類（ニワトリ）のＶＥＧＦ−Ａ（配列番号３１）のＥ４４位、Ｅ６７位、Ｅ７２位、Ｅ７３位、Ｉ８３位、およびＱ８７位からなる群から選択される１つ以上の塩基性アミノ酸置換；ウマのＶＥＧＦ−Ａ（配列番号３４）のＥ４３位、Ｅ６６位、Ｅ７１位、Ｅ７２位、Ｉ８２位、およびＱ８６位からなる群から選択される１つ以上の塩基性アミノ酸置換；マウスのＶＥＧＦ−Ａ（配列番号３７）のＥ４３位、Ｅ６６位、Ｅ７１位、Ｅ７２位、Ｉ８２位、およびＱ８６位からなる群から選択される１つ以上の塩基性アミノ酸置換；ブタのＶＥＧＦ−Ａ（配列番号４０）のＥ４３位、Ｅ６６位、Ｅ７１位、Ｅ７２位、Ｉ８２位、およびＱ８６位からなる群から選択される１つ以上の塩基性アミノ酸置換；ラットのＶＥＧＦ−Ａ（配列番号４３）のＥ４３位、Ｅ６６位、Ｅ７１位、Ｅ７２位、Ｉ８２位、およびＱ８６位からなる群から選択される１つ以上の塩基性アミノ酸置換；およびヒツジのＶＥＧＦ−Ａ（配列番号４６）のＥ４３位、Ｅ６６位、Ｅ７１位、Ｅ７２位、Ｉ８２位、およびＱ８６位からなる群から選択される１つ以上の塩基性アミノ酸置換を含む。
【００７０】
１つ以上の塩基性アミノ酸置換を含有するＶＥＧＦ類縁体はまた、共受容体結合部位を破壊するように設計されたアミノ酸置換と組合わせることができる。一実施形態において、本発明のＶＥＧＦ類縁体は、破壊されたニューロピリン−１結合部位を含有する。ニューロピリン−１結合部位は、ＶＥＧＦ１６５（配列番号０４）のアミノ酸１１１から１６５を含む。このドメインは、エキソン６および７によりコード化されたヘパリン結合ドメインを重なる。本発明は、ニューロピリン−１結合部位ドメインを破壊するが、硫酸ヘパリンを結合するヘパリン結合ドメインの能力を破壊しないものの中またはその近辺（すなわち、約５つのアミノ酸内）で任意のアミノ酸修飾を含む。このようなアミノ酸修飾は、当業者により経験的に判定できる。
【００７１】
本発明の一実施形態において、ニューロピリン−１結合ドメインは、ドメイン中の多数のシステインアミノ酸残基を還元することにより、すなわち、ＶＥＧＡ−Ａのアミノ酸１１１から１６５の間の多数のシステインアミノ酸残基を還元することにより破壊される。例えば、ＶＥＧＦ１６５類縁体は、配列番号４の１４６位および／または１６０位におけるシステイン残基を、ジスルフィド架橋の破壊を引き起こすセリンなどのアミノ酸で置換することによりニューロピリン−１結合部位を破壊するように設計できる。配列番号：４の１４６位および１６０位におけるシステイン残基の置換により、ニューロピリン−１結合を破壊するが、ヘパリン結合を破壊しない。ニューロピリン−１結合部位もまた、１４６位または１６０位におけるアミノ酸ペプチドを終了させることにより破壊することができる。
【００７２】
本発明はまた、１４６位および１６０位におけるシステイン残基がジスルフィド架橋を形成できないように、配列番号４の１４６位および１６０位におけるアミノ酸周囲のアミノ酸の修飾を含むことができる。例えば、本発明は、限定はしないが、ジスルフィド架橋の形成を破壊できる１３６位から１６５位を通して１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【００７３】
本発明の修飾ＶＥＧＦ類縁体は、本明細書に記載された配列番号４のＥ４４、Ｅ６７、Ｅ７２、Ｅ７３、Ｉ８３およびＱ８７に相当する１つ以上の塩基性アミノ酸置換を含有する。例えば、本発明は、Ｅ４４Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ６７Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ、Ｅ６７Ｂ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ６７Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｅ６７Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｅ６７Ｂ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｅ６７Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ７２Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ、Ｅ７２Ｂ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ７２Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ７３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ、Ｅ７３Ｂ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ７３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ７２Ｂ＋Ｅ７３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ、Ｅ７２Ｂ＋Ｅ７３Ｂ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ７２Ｂ＋Ｅ７３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ、Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｑ８７Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ、Ｑ８７Ｂ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｑ８７Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｅ６７Ｂ＋Ｅ７２Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｅ６７Ｂ＋Ｅ７２Ｂ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｅ６７Ｂ＋Ｅ７２Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｅ６７Ｂ＋Ｅ７３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｅ６７Ｂ＋Ｅ７３Ｂ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｅ６７Ｂ＋Ｅ７３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｅ６７Ｂ＋Ｅ７２Ｂ＋Ｅ７３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｅ６７Ｂ＋Ｅ７２Ｂ＋Ｅ７３Ｂ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｅ６７Ｂ＋Ｅ７２Ｂ＋Ｅ７３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ６７Ｂ＋Ｅ７２Ｂ＋Ｅ７３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ、Ｅ６７Ｂ＋Ｅ７２Ｂ＋Ｅ７３Ｂ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ６７Ｂ＋Ｅ７２Ｂ＋Ｅ７３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｅ７２Ｂ＋Ｅ７３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｅ７２Ｂ＋Ｅ７３Ｂ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｅ７２Ｂ＋Ｅ７３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ６７Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ、Ｅ６７Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ６７Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｅ６７Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｅ６７Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｅ６７Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ７２Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ、Ｅ７２Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ７２Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ７３Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ、Ｅ７３Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ７３Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ７２Ｂ＋Ｅ７３Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ、Ｅ７２Ｂ＋Ｅ７３Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ７２Ｂ＋Ｅ７３Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｉ８３Ｂ＋Ｑ８７Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ、Ｉ８３Ｂ＋Ｑ８７Ｂ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｉ８３Ｂ＋Ｑ８７Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｅ６７Ｂ＋Ｅ７２Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｅ６７Ｂ＋Ｅ７２Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｅ６７Ｂ＋Ｅ７２Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｅ６７Ｂ＋Ｅ７３Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｅ６７Ｂ＋Ｅ７３Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｅ６７Ｂ＋Ｅ７３Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｅ６７Ｂ＋Ｅ７２Ｂ＋Ｅ７３Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｅ６７Ｂ＋Ｅ７２Ｂ＋Ｅ７３Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｅ６７Ｂ＋Ｅ７２Ｂ＋Ｅ７３Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ６７Ｂ＋Ｅ７２Ｂ＋Ｅ７３Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ、Ｅ６７Ｂ＋Ｅ７２Ｂ＋Ｅ７３Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ６７Ｂ＋Ｅ７２Ｂ＋Ｅ７３Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ＋Ｃ１６０Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｅ７２Ｂ＋Ｅ７３Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ、Ｅ４４Ｂ＋Ｅ７２Ｂ＋Ｅ７３Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１６０ＸおよびＥ４４Ｂ＋Ｅ７２Ｂ＋Ｅ７３Ｂ＋Ｉ８３Ｂ＋Ｃ１４６Ｘ＋Ｃ１６０Ｘの位置にアミノ酸置換を有するＶＥＧＦ類縁体を含み、式中、Ｂは塩基性アミノ酸であり、Ｘはシステイン以外の任意のアミノ酸である。一実施形態において、Ｘはセリンである。
【００７４】
本発明の修飾タンパク質はまた、さらなる置換、特に増強されたタンパク質の性質を変えない保存的置換を含有できる。しかしながら、典型的にこのような修飾タンパク質は、上記に掲げたもの以外の位置に５つ未満の置換を含有し、上記に掲げた位置以外の位置に相当する野生型ＶＥＧＦサブユニットと完全なアミノ酸配列同一性を示すことができる。
【００７５】
当業者により認識できるように、本発明に開示された全てのアミノ酸置換およびペプチド修飾は、ＶＥＧＦタンパク質と関連タンパク質との間に高度の相同性のため、種に無関係に任意のＶＥＧＦタンパク質または関連タンパク質に取り込むことができる。当業者は、限定はしないが、アミノ酸配列アラインメントソフトウェアの使用など、当技術分野に公知の方法を用いて本明細書に記載されたアミノ酸置換を相互に関連させることができる。
【００７６】
血清中増加半減期を有するＶＥＧＦ類縁体
本発明のＶＥＧＦ類縁体は、野生型ＶＥＧＦと比較して血清中増加半減期を有し得る。一実施形態において、野生型ＶＥＧＦと比較して受容体結合親和性を増加させるか、または維持し、生物活性を減少させる修飾はまた、野生型ＶＥＧＦと比較してＶＥＧＦの血漿中半減期を増加させる。別の実施形態において、本発明の修飾ＶＥＧＦタンパク質を、野生型ＶＥＧＦと比較して血漿中半減期を増加させるようにさらに修飾する。
【００７７】
タンパク質、特に糖タンパク質の半減期を増加させるために使用できる当技術分野に公知の多くの修飾が存在する。例えば、本発明の修飾ＶＥＧＦタンパク質は、アルファ鎖またはベータ鎖のいずれかにＮ−グリコシル化部位および／またはＯ−グリコシル化部位を含む配列など、潜在的なグリコシル化部位を有する少なくとも１つの配列をさらに含むことができる。潜在的なグリコシル化認識を提供する配列は、いずれかのサブユニット上にＮ末端またはＣ末端伸長であり得る。代表的な修飾タンパク質は、ＡＮＩＴＶ（配列番号７２）およびＡＮＩＴＶＮＩＴＶ（配列番号７３）からなる群から選択されるサブユニット上のＮ末端伸長を含有する。
【００７８】
半減期の増加はまた、ｈＣＧのカルボキシル末端伸長ペプチドなどのペプチド伸長の使用により提供できる。参照としてその全体が本明細書に組み込まれているUS 09/519,728を参照されたい。ＶＥＧＦ類縁体のサブユニットは、ＣＴＥＰに対して当技術分野に公知の任意の方法、例えば、ペプチド結合により、または限定はしないが、ペプチドリンカーなど、タンパク質のアミノ末端とカルボキシル末端との間の共有結合を形成できるヘテロ二官能性試薬により共有結合できる。
【００７９】
本発明の別の実施形態において、本発明の塩基性アミノ酸置換は、１つ以上のタンパク分解的切断部位を除去することにより安定性および血清中半減期を増加させる１つ以上のアミノ酸置換と結合する。一実施形態において、追加のアミノ酸置換はタンパク分解的切断を減少させる。別の実施形態において、追加のアミノ酸置換はタンパク分解的切断を防止する。本発明は、プラスミンおよびプラスミノーゲンファミリーの他のメンバーに対する抵抗性を誘導する１つ以上の突然変異を含有するＶＥＧＦ類縁体を含む。本発明の一実施形態において、ＶＥＧＦ分子の少なくとも１つのサブユニットは、ＶＥＧＦ１６５（配列番号４）またはＶＥＧＦ１６５ｂ（配列番号１３）のＡ１１１Ｐおよび／またはＡ１４８Ｐなどのアミノ酸のＡ１１１位および／またはＡ１４８位に相当するアミノ酸置換を含有する。例えば、本発明は、Ａ１１１位にアミノ酸置換を含有するＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１４８、ＶＥＧＦ１８３、ＶＥＧＦ１８９およびＶＥＧＦ２０６を含む。本発明は、プロテアーゼ切断を阻止するか、または減少させるＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−ＤおよびＰｌＧＦにおいて１つ以上の突然変異を含む。例えば、本発明は、生物活性に必要なＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄの切断を防止するアミノ酸置換を含む。
【００８０】
別の実施形態において、半減期は、ＶＥＧＦモノマー類を結合することによって、ならびに融合タンパク質を構築することによって増加させることができる。結合部位を干渉することなくＶＥＧＦ類縁体のサイズの増加により、分子の半減期を増加させることができる。
【００８１】
半減期の増加は、限定はしないが、他の適切な化学基のＰＥＧ化または結合などの架橋により提供できる。このような方法は、U.S. Patent 5,612,034、U.S. Patent 6,225,449、およびU.S. Patent 6,555,660に記載されているとおり当技術分野に知られており、それらの各々が参照としてその全体が本明細書に組み込まれている。半減期は、多数の分子内負電荷残基、例えば、多数のグルタメート残基および／またはアスパルテート残基を増加させることによっても増加できる。このような変化は、部位特異的突然変異誘発により、または他の中でＧＥＦＴおよびＧＥＦＴＴからなる群から選択される挿入など、１つ以上の負電荷残基を含有するアミノ酸配列の前記修飾ＶＥＧＦへの挿入により達成できる。
【００８２】
タンパク質の半減期は、タンパク質安定性の測定であり、タンパク質濃度で半分の減少に必要な時間を示す。本明細書に記載された修飾ＶＥＧＦ分子の血清中半減期は、経時的に対象からのサンプル中のＶＥＧＦ濃度を測定するために好適な任意の方法により、例えば、限定はしないが、修飾ＶＥＧＦの投与後、経時的に採取された血清サンプル中のＶＥＧＦ濃度を測定するために抗ＶＥＧＦ抗体を用いる免疫アッセイにより、または標識ＶＥＧＦの投与後、対象から採取されたサンプル中、標識ＶＥＧＦ分子、すなわち、放射性標識分子の検出により測定することができる。
【００８３】
本発明のＶＥＧＦ類縁体の吸収速度は、作用時間の増加または減少を生じ得る。吸収速度の増加および作用時間の減少を有するＶＥＧＦ類縁体は、皮下投与または投与経路に関連する吸収量を相殺することにより吸収の遅速および／または作用時間の増加に一般的関連する他の投与経路によってＶＥＧＦ類縁体製薬組成物を受ける患者にとって有利となり得る。
【００８４】
リンカー
本発明のＶＥＧＦ類縁体は、リンカーペプチドにより分離された２種以上のモノマーを含有できる。リンカーペプチドは、単鎖コンフォメーションでＶＥＧＦ類縁体を形成するために使用できる。種々のタイプのリンカーが、ＶＥＧＦ受容体を結合でき、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストとして作用するＶＥＧＦ単鎖分子を形成するために本発明に使用できることを当業者は認識することができる。リンカーペプチドは、ＶＥＧＦ受容体を結合する単鎖分子の能力を妨げてはならない。
【００８５】
リンカーペプチドは、約２から約５０またはそれ以上の長さのアミノ酸の範囲であり得る。例えば、リンカーは、約２つのアミノ酸、約３つのアミノ酸、約４つのアミノ酸、約５つのアミノ酸、約６つのアミノ酸、約７つのアミノ酸、約８つのアミノ酸、約９つのアミノ酸、約１０のアミノ酸、約１０〜１５のアミノ酸、または約１５〜２０のアミノ酸からなり得る。本発明の一実施形態において、リンカーはＧｌｙ−Ｓｅｒであるか、またはＧｌｙ−Ｓｅｒを含有する。別の実施形態において、リンカーは、グリシンに富むポリペプチド鎖である。
【００８６】
リンカーを含有するＶＥＧＦ分子は、本明細書に記載された方法を用いて構築できる。リンカーペプチドを含有する本発明のＶＥＧＦ類縁体分子が、本明細書に記載された任意の突然変異を１種以上のモノマーにおいて含むことができることを、当業者は認識できるであろう。さらに１種以上のリンカーペプチドを含有するＶＥＧＦ類縁体は、２種以上のタイプのＶＥＧＦタンパク質またはアイソフォームを結合できる。例えば、本発明は、限定はしないが、Ｉ８３Ｂ置換を含有する修飾ＶＥＧＦ１６５モノマーに結合された野生型ＶＥＧＦ１６５モノマーを有する修飾ＶＥＧＦ単鎖分子；Ｉ８３Ｂ置換を含有する修飾ＶＥＧＦ１６５ｂに結合された野生型ＶＥＧＦ１６５モノマー；および修飾ＶＥＧＦ−Ｆモノマーに融合された修飾ＶＥＧＦ１６５モノマーを含む。
【００８７】
ＶＥＧＦ融合タンパク質
本発明はまた、融合タンパク質、すなわち、１つ以上の修飾ＶＥＧＦタンパク質または断片を含有するキメラを含む。「融合タンパク質」および「キメラ」は、本明細書において同義に用いられる。本明細書に用いられるＶＥＧＦ部分は、本発明の１つ以上の塩基性アミノ酸置換を含有するＶＥＧＦタンパク質またはタンパク質断片である。ＶＥＧＦ融合タンパク質は、１つ以上のＶＥＧＦ部分を有することができる。
【００８８】
このような融合タンパク質は、適切なコード化フレーム内において当技術分野に公知の方法により、互いに所望のアミノ酸配列をコードし、本明細書に記載された任意の手段により融合タンパク質を発現する適切な核酸配列を結合させることにより作製できる。あるいは、このような融合タンパク質は、タンパク質合成技法により、例えば、ペプチドシンセサイザーを用いて作製できる。
【００８９】
本発明の融合タンパク質は、本明細書に記載された１つ以上の塩基性アミノ酸置換を含有する少なくとも１つのＶＥＧＦタンパク質またはタンパク質断片を含有する。一実施形態において、融合タンパク質は、ＶＥＧＦ１６５（配列番号４）、ＶＥＧＦ１６５ｂ（配列番号１３）、ＶＥＧＦ１２１（配列番号６）、ＶＥＧＦ１４５（配列番号８）、ＶＥＧＦ１４８（配列番号１０）、ＶＥＧＦ１８３（配列番号１５）、ＶＥＧＦ１８９（配列番号１７）またはＶＥＧＦ２０６（配列番号１９）のＩ８３位に１つの塩基性アミノ酸置換を含有する。別の実施形態において、融合タンパク質は、別のＶＥＧＦタンパク質、例えば、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−ＤまたはＰｌＧＦのアイソフォームにおいて配列番号４のＩ８３Ｋに相当する位置に少なくとも１つの塩基性アミノ酸置換を含有する。当業者により認識できるように、ヒトまたは動物ＶＥＧＦタンパク質またはその断片は、本発明の融合タンパク質に使用できる。
【００９０】
本発明の一実施形態において、２つの異なるＶＥＧＦタンパク質サブユニットまたはそれらの断片が融合される。例えば、本発明は、ＶＥＧＦ−Ｂサブユニットまたはその断片、ＶＥＧＦ−Ｃサブユニットまたはその断片、ＶＥＧＦ−Ｄサブユニットまたはその断片、またはＰｌＧＦサブユニットまたはその断片に融合されたＶＥＧＦ−Ａサブユニットまたはその断片；ＶＥＧＦ−Ａサブユニットまたはその断片、ＶＥＧＦ−Ｃサブユニットまたはその断片、ＶＥＧＦ−Ｄサブユニットまたはその断片、またはＰｌＧＦサブユニットまたはその断片に融合されたＶＥＧＦ−Ｂサブユニットまたはその断片；ＶＥＧＦ−Ａサブユニットまたはその断片、ＶＥＧＦ−Ｂサブユニットまたはその断片、ＶＥＧＦ−Ｄサブユニットまたはその断片、またはＰｌＧＦサブユニットまたはその断片に融合されたＶＥＧＦ−Ｃサブユニットまたはその断片；ＶＥＧＦ−Ａサブユニットまたはその断片、ＶＥＧＦ−Ｂサブユニットまたはその断片、ＶＥＧＦ−Ｃサブユニットまたはその断片、またはＰｌＧＦサブユニットまたはその断片に融合されたＶＥＧＦ−Ｄサブユニットまたはその断片；およびＶＥＧＦ−Ａサブユニットまたはその断片、ＶＥＧＦ−Ｂサブユニットまたはその断片、ＶＥＧＦ−Ｃサブユニットまたはその断片、またはＶＥＧＦ−Ｄサブユニットまたはその断片に融合されたＰｌＧＦサブユニットまたはその断片を含む。
【００９１】
本発明は、同じＶＥＧＦタンパク質またはその断片の２つ以上の異なるアイソフォームからなる融合タンパク質を含む。例えば、本発明は、ＶＥＧＦ１２１サブユニットまたはその断片、ＶＥＧＦ１４５サブユニットまたはその断片、ＶＥＧＦ１４８サブユニットまたはその断片、ＶＥＧＦ１６５ｂサブユニットまたはその断片、ＶＥＧＦ１８３サブユニットまたはその断片、ＶＥＧＦ１８９サブユニットまたはその断片、またはＶＥＧＦ２０６サブユニットまたはその断片に融合されたＶＥＧＦ１６５サブユニットまたはその断片からなる融合タンパク質を含む。本発明はまた、ＶＥＧＦ１２１サブユニットまたはその断片、ＶＥＧＦ１４５サブユニットまたはその断片、ＶＥＧＦ１４８サブユニットまたはその断片、ＶＥＧＦ１６５サブユニットまたはその断片、ＶＥＧＦ１８３サブユニットまたはその断片、ＶＥＧＦ１８９サブユニットまたはその断片、またはＶＥＧＦ２０６サブユニットまたはその断片に融合されたＶＥＧＦ１６５ｂサブユニットまたはその断片を含む。
【００９２】
本発明の塩基性アミノ酸置換は、タンパク質の１つ以上のサブユニットに存在できる。例えば、ＶＥＧＦ１６５サブユニットおよびＶＥＧＦ１６５ｂサブユニットを含有する融合タンパク質は、ＶＥＧＦ１６５サブユニットにアミノ酸置換のみを含有できる。本発明は、Ｉ８３Ｋアミノ酸置換を含有するＶＥＧＦ１６５に、ＧＳリンカーによって融合された野生型ＶＥＧＦ１６５サブユニットを含む。当業者により認識できるように、１つの突然変異サブユニットを含有する本発明の融合タンパク質は、双方の配向性で創製でき、すなわち、突然変異を含有するサブユニットは、融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端のいずれかであり得る。
【００９３】
本発明の別の実施形態において、ＶＥＧＦサブユニットまたはその断片を、関連タンパク質サブユニットまたはその断片に融合する。例えば、ＶＥＧＦサブユニットまたはその断片は、ＰＤＧＦサブユニットもしくは他の糖タンパク質サブユニットまたはその断片に融合できる。
【００９４】
通常の当業者により認識できるように、本明細書に記載された融合タンパク質は、ヒトまたは動物ＶＥＧＦ配列を用いて構築できる。さらに、融合タンパク質は、動物ＶＥＧＦサブユニットに融合されたヒトＶＥＧＦサブユニットを用いて構築できる。
【００９５】
ＶＥＧＦ融合タンパク質は、ＶＥＧＦ類縁体であることを理解する必要がある。本明細書に検討された全ての修飾、例えば、受容体結合親和性をさらに増加させる修飾、半減期および安定性を増加させる修飾、プロテアーゼ切断を減少または阻止する修飾、およびニューロピリン−１結合部位などの共受容体結合部位を破壊する修飾は、ＶＥＧＦ融合タンパク質の１つ以上のサブユニットに取り込ませることができる。
【００９６】
本発明の融合タンパク質は、２つ以上のＶＥＧＦサブユニットまたはＶＥＧＦ関連タンパク質サブユニットを分離するリンカーを含有することもできる。このリンカーは、融合タンパク質のペプチドに、ならびにそのペプチド間で共有結合できる。
【００９７】
ＶＥＧＦおよび毒素融合タンパク質
本発明は、毒素および１つ以上の修飾ＶＥＧＦサブユニット、すなわち、本明細書に記載された１つ以上の塩基性アミノ酸置換を含有するモノマー類を含む融合タンパク質を提供する。例えば、ＶＥＧＦモノマー、すなわち、ＶＥＧＦ−毒素融合タンパク質のサブユニットは、４４、６７、７２、７３、８３および８７（配列番号４または配列番号１３）からなる群からアミノ酸位置に相当する１つ以上のアミノ酸位置に塩基性アミノ酸を含有することができる。本発明のＶＥＧＦおよび毒素融合タンパク質は、毒素および１つ以上のＶＥＧＦサブユニットを分離するリンカー配列を任意に含有できる。
【００９８】
本明細書に用いられる用語「毒素」とは、生物起源の毒性物質のことである。本発明の毒素は、当技術分野に知られた可溶性毒素であり得る。可溶性毒素を含む融合タンパク質は、腫瘍を標的にするために使用できる。このような融合タンパク質もまた、診断目的のために使用できる。
【００９９】
毒素の例としては、限定はしないが、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素（ＰＥ）、ジフテリア（Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）毒素（ＤＴ）、リシン毒素、アブリン毒素、炭疽毒素類、志賀毒素、ボツリヌス毒素、破傷風毒素、コレラ毒素、マイトトキシン、パリトキシン、シグアトキシン、テクスチロトキシン（ｔｅｘｔｉｌｏｔｏｘｉｎ）、バトラコトキシン、アルファコノトキシン、タイポキシン（ｔａｉｐｏｘｉｎ）、テトロドトキシン、アルファチチューストキシン（ａｌｐｈａ  ｔｉｔｙｕｓｔｏｘｉｎ）、サキシトキシン、アナトキシン、ミクロシスチン、アコニチン、エクスフォリアチン毒素（ｅｘｆｏｌｉａｔｉｎ  ｔｏｘｉｎ）ＡおよびＢ、エンテロトキシン、毒物ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）、ペスト菌（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ）毒素およびガス壊疽毒素などが挙げられる。
【０１００】
一実施形態において、本発明は、修飾ＶＥＧＦに融合した毒素および製薬的に許容できる担体を含む製薬組成物を提供する。別の実施形態において、本発明は、血管新生に関連する疾患または病態の処置および防止のための薬剤製造のために可溶性毒素を含む修飾ＶＥＧＦ融合タンパク質の使用を提供する。
【０１０１】
理論に拘束されるものではないが、本発明のＶＥＧＦ−毒素融合タンパク質は、ＶＥＧＦ受容体ならびに周囲の内皮細胞および腫瘍細胞を標的とし、死滅させることにより血管新生、腫瘍の成長および／または癌の拡大を防止するか、または軽減させると考えられている。
【０１０２】
ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストの発現および／または合成
本発明は、本発明の修飾ＶＥＧＦタンパク質をコードする核酸、ならびに核酸を発現するベクターおよび宿主細胞を含む。
【０１０３】
本明細書に用いられる用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」とは、一本鎖または二本鎖形態におけるデオキシリボヌクレオチド類またはリボヌクレオチド類およびそのポリマーのことである。本発明は、本発明の修飾ＶＥＧＦ分子をコードする核酸分子を含む。例えば、本発明は、修飾ＶＥＧＦ１６５分子をコードする核酸分子を含む。野生型ＶＥＧＦ１６５分子をコードする配列番号１の核酸分子は、突然変異のＶＥＧＦ１６５核酸分子が修飾タンパク質をコードするような当技術分野に公知の方法により変異化できる。同様に、野生型ＶＥＧＦ１６５ｂをコードする配列番号１１の核酸分子は、本発明のＶＥＧＦ１６５ｂ分子をコードするような当技術分野に公知の方法により変異化できる。
【０１０４】
対象の特定の修飾ＶＥＧＦをコードする核酸、または塩基性アミノ酸置換を含有するタンパク質の部分をコードするその核酸の領域が、構成され、修飾され、または単離されたら、次にその核酸を、修飾ＶＥＧＦタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成を方向付けることができる適切なベクターにクローン化できる。あるいは、本発明のＶＥＧＦ類縁体をコードする核酸は、対象の発現ベクターにおいて直接クローン化または修飾できる。このベクターは、挿入された遺伝子、またはハイブリッド遺伝子の転写を方向付けし、調節するのに必要な機能性要素を有するように考慮されている。これらの機能性要素としては、限定はしないが、プロモーター、プロモーターの転写活性を調節できるエンハンサーなど、プロモーターの上流または下流領域、複製の起源、プロモーターに隣接する挿入物のクローン化を促進させる適切な制限部位、ベクターを含有する細胞または挿入物を含有するベクターを選択するために役立ち得る耐抗体遺伝子または他のマーカー、ＲＮＡスプライス接合部、転写終結領域、または挿入遺伝子またはハイブリッド遺伝子の発現を促進させるのに役立ち得る任意の他の領域が挙げられる（一般にSambrook et al., Moleculr Cloning: A Laboratory Mannual, 2nd ed. (1989)を参照）。異なる宿主細胞における核酸発現のための適切なプロモーターは、当技術分野に周知であり、発現の用いられるベクター−宿主系に依って容易に互換できる。代表的なベクターおよび宿主細胞は、参照としてその全体が本明細書に組み込まれているU.S. 6,361,992に記載されている。
【０１０５】
核酸挿入物の発現に有用である通常の当業者に知られている多数の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）発現ベクターがある。使用に好適な他のベクターとしては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの桿菌、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、および種々のシュードモナス菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種などの他の腸内細菌科に由来の発現ベクターが挙げられる。これらの発現ベクターは、典型的に宿主細胞と適合した発現制御配列（例えば、複製起源）を含有する。さらに、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（Ｔｒｐ）プロモーター系、ベータ−ラクタマーゼプロモーター系、またはファージラムダに由来のプロモーター系など、種々多数の周知のプロモーターが存在する。これらのプロモーターは典型的に、任意にオペレーター配列による発現を制御し、例えば、転写および翻訳を開始および完結させるためにリボソーム結合部位配列を有する。必要ならば、アミノ末端メチオニンは、Ｍｅｔコドン５’の挿入および下流核酸挿入物によるインフレームにより提供できる。また、核酸挿入物のカルボキシ末端伸長は、標準的なオリゴヌクレオチドの変異誘発手法を用いて除去できる。
【０１０６】
さらに、酵母発現系を用いることができる。酵母発現系には幾つかの利点がある。第一に、酵母分泌系で産生されたタンパク質は、正確なジスルフィドペアリングを示すという証拠が存在する。第二に、翻訳後のグリコシル化は、酵母分泌系により効率的に実施される。酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）プレ−プロ−アルファ−因子リーダー領域（ＭＦ”−１遺伝子によりコード化された）は、酵母からのタンパク質分泌を方向付けるためにルーチン的に使用される（Brake, et al., "varies-Factor-Directed Synthesis and Secretion of Mature Foreign Proteins in Saccharomyces cerevisiae." Proc. Nat. Acad. Sci., 81: 4642-4646 (1984)）。プレ−プロ−アルファ−因子のリーダー領域は、シグナルペプチドおよびＫＥＸ２遺伝子によりコード化された酵母プロテアーゼに関する認識配列を含むプロセグメントを含有する。この酵素は、Ｌｙｓ−Ａｒｇジペプチド切断シグナル配列のカルボキシル側の前駆体タンパク質を切断する。ＶＥＧＦコード化配列は、インフレームでプレ−プロ−アルファ−因子リーダー領域に融合できる。次にこの構成体を、アルコールデヒドロゲナーゼＩプロモーターまたは解糖プロモーターなど、強力な転写プロモーターの制御下に置く。この核酸コード化配列は、翻訳終結コドンに次いで転写終結シグナルが続く。あるいは、核酸コード化配列は、アフィニティークロマトグラフィによる融合タンパク質の精製を容易にするために使用できるＳｊ２６またはベータ−ガラクトシダーゼなどの第二のタンパク質コード化配列に融合できる。融合タンパク質の成分を分離するためにプロテアーゼ切断部位の挿入により、酵母の発現に用いられる構成体に適用できる。効率的な翻訳後のグリコシル化および組換えタンパク質の発現はまた、バキュロウィルス系で達成できる。
【０１０７】
哺乳動物細胞は、折りたたみおよびシステインペアリングなどの重要な翻訳後修飾に好都合である環境でタンパク質の発現、複雑な炭水化物構造の添加、および活性なタンパク質の分泌を可能にする。哺乳動物細胞における活性なタンパク質の発現に有用なベクターは、強力なウィルスまたは他のプロモーターとポリアデニル化シグナルとの間にタンパク質コード化配列の挿入を特徴とする。このベクターは、耐ヒグロマイシン、耐ゲンタマイシンを付与する遺伝子、もしくは選択性マーカーとしての使用に好適な他の遺伝子または表現型、または遺伝子増幅のために耐メトトレキサートを含有できる。キメラタンパク質コード化配列は、耐メトトレキサートコード化ベクターを用いるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、または好適な選択性マーカーを用いる他の細胞系に導入できる。形質転換細胞にベクターＤＮＡの存在は、サザンブロット解析により確認することができる。挿入コード化配列に相当するＲＮＡの産生は、ノーザンブロット解析により確認できる。無処置ヒトタンパク質を分泌できる多くの他の好適な宿主細胞系としては、当技術分野において開発されており、ＣＨＯ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、ジャーカット細胞などが挙げられる。これらの細胞に対する発現ベクターは、複製起源、プロモーター、エンハンサーなどの発現対照配列、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列などの必要な情報処理部位を含むことができる。代表的な発現対照配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウィルス、ウシパピローマウィルスなどに由来のプロモーターである。対照の核酸セグメントを含有するベクターは、細胞宿主のタイプに依って変わる周知の方法により宿主細胞に移入させることができる。例えば、塩化カルシウムの変換は、通常、原核細胞に利用されるが、一方、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、またはリポフェクチン媒介トランスフェクションまたは電気穿孔は、他の細胞宿主に用いることができる。
【０１０８】
遺伝子またはハイブリッド遺伝子の発現は、ｉｎ  ｖｉｖｏであってもｉｎ  ｖｉｔｒｏであってもよい。ｉｎ  ｖｉｖｏ合成は、ベクターに関して宿主細胞として役立ち得る原核細胞または真核細胞を形質転換することを含む。例えば、真菌を形質転換する技法は文献に周知であり、例えば、Beggs（同書）、Hinnen et al., （Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933, 1978）、Yelton et al., （Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1740-1747, 1984）、およびRussell（Nature 301: 167-169, 1983）により記載されている。電気穿孔など、クローン化ＤＮＡ配列を真菌細胞に導入する他の技法（Becker and Guarente, Methods in Enzymol. 194: 182-187, 1991）を使用できる。宿主細胞の遺伝子型は、一般に発現ベクターに存在する選択性マーカーにより補足される遺伝子欠陥を含有する。特定の宿主および選択性マーカーの選択は、通常の当技術分野レベルに十分に入る。
【０１０９】
本発明の修飾ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ融合タンパク質を含むクローン化ＤＮＡ配列は、例えば、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションにより培養哺乳動物細胞に導入できる（Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981；Graham and Van der Eb, Virology 52: 456, 1973）。電気穿孔など、哺乳動物細胞へクローン化ＤＮＡ配列を導入する他の技法（Neumann et al., EMBO T. 1: 841-845, 1982）、またはリポフェクションもまた使用できる。クローン化ＤＮＡを組込んだ細胞を確認するために、選択性マーカーは一般に、対象の遺伝子またはｃＤＮＡと共に細胞に導入される。培養哺乳動物細胞の使用に好ましい選択性マーカーは、ネオマイシン、ヒグロマイシン、およびメトトレキサートなどの耐薬物を付与する遺伝子を含む。この選択的マーカーは、増幅可能な選択性マーカーであり得る。特に好ましい増幅可能な選択性マーカーは、ＤＨＦＲ遺伝子である。好ましい増幅可能な選択性マーカーは、ＤＨＦＲｒ（U.S. Patent 6,291,212を参照）、ｃＤＮＡ（Simonsen and Levinson, Pro. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2495-2499, 1983）である。選択性マーカーは、Ｔｈｉｌｌｙ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ社、ストーンハム、マサチューセッツ州）によりレビューされており、選択性マーカーの選択は、通常の当技術分野のレベルに十分に入る。
【０１１０】
あるいは、遺伝子発現は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系に生じることができる。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系は、市販されており、比較的大量のｍＲＮＡを合成するためにルーチン的に使用される。このようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系において、修飾ＶＥＧＦをコードする核酸は、転写プロモーターに隣接する発現ベクターにクローン化されるであろう。例えば、ブルースクリプトＩＩクローニングおよび発現ベクターは、強力な原核細胞転写プロモーターによりフランクされる複数のクローニング部位を含有する（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）。ブルースクリプトベクターなどのＤＮＡテンプレートからＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成用の全て必要な試薬を含有するキットを入手できる（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）。このようなシステムによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されるＲＮＡは、次にｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳されて所望のＶＥＧＦ類縁体を生成できる（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）。
【０１１１】
ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストを生成する別の方法は、タンパク質化学技法により２つのペプチド類またはポリペプチド類を一緒に結合することである。ペプチド類またはポリペプチド類は、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）またはＢｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）化学を用いる現在利用できる実験室装置を用いて化学的に合成できる（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティー、カリフォルニア州）。当業者は、ハイブリッドＶＥＧＦタンパク質に相当するペプチドまたはポリペプチドは、標準的な化学反応により合成できることを容易に認識できる。例えば、ペプチドまたはポリペプチドを合成でき、その合成樹脂から切断されないが、一方、ハイブリッドペプチドの他の断片を合成でき、続いて樹脂から切断され、それによって他の断片上に機能的に遮断される末端基を暴露する。ペプチド縮合反応により、これら２つの断片は、ハイブリッドペプチドを形成するために、それぞれカルボキシル末端およびアミノ末端にペプチド結合を介して共有結合できる（Grant, G. A., "Synthetic Peptides: A User Duide," W. H. Freeman and Co., N. Y. (1992)およびBodansky, M and Trost, B. Ed., "Principles of Peptide Synthesis," Springer-Verlag Inc., N. Y. (1993)）。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドは、上記のとおりｉｎ  ｖｉｖｏにより独立して合成できる。単離されたら、これら独立したペプチド類またはポリペプチド類は、同様のペプチド縮合反応を介してＶＥＧＦを形成するために結合できる。例えば、より大きなペプチド断片、ポリペプチド類または全体のタンパク質ドメインを生成するために、クローン化または合成ペプチドセグメントの酵素的または化学的結合より、比較的短いペプチド断片を結合させることができる（Abrahmsen, L. et al., Biochemistry, 30: 4151(1991)；Dawson, et al., "Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation," Science, 266: 776-779 (1994)）。
【０１１２】
本発明はまた、アンタゴニスト活性を有する修飾ＶＥＧＦの断片を提供する。本発明のポリペプチド断片は、ペプチド類を産生できる発現系においてペプチド類をコードする核酸をクローニングにより得られた組換えタンパク質であり得る。例えば、アミノまたはカルボキシル末端アミノ酸は、天然またはＶＥＧＦタンパク質および上記の多数の利用できるアッセイのうちの１つで試験されたそれぞれの活性から連続的に除去できる。別の例において、本発明の修飾タンパク質は、アミノ末端またはカルボキシ末端アミノ酸の一部、または修飾ＶＥＧＦの精製を容易にできるビオチンなど、ポリペプチド断片または他の部分で置換されたタンパク質の内部領域さえも有することができる。例えば、コード化領域の発現がハイブリッドポリペプチドを生じるように、修飾ＶＥＧＦは、発現ベクターに２つのポリペプチド断片をコードするそれぞれの核酸をクローニングするペプチドを介してマルトース結合タンパク質に融合できる。ハイブリッドポリペプチドは、アミロースアフィニティーカラム上を通過させることによりアフィニティー精製でき、次いで、修飾ＶＥＧＦは、ハイブリッドポリペプチドを特異的プロテアーゼ因子Ｘａにより切断することによりマルトース結合領域から分離できる（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔ社のカタログ、１９９６年、１６４頁を参照）。
【０１１３】
本発明のＶＥＧＦ類縁体は、ヘテロダイマーであってもホモダイマーであってもよい。一実施形態において、ＶＥＧＦ類縁体は、１つ以上のＶＥＧＦサブユニットを含有する融合タンパク質である。本発明のＶＥＧＦ融合タンパク質は、ペプチド類を結合させることにより分離された２つ以上のＶＥＧＦサブユニットを含有する単鎖タンパク質であり得る。別の実施形態において、本発明のＶＥＧＦ類縁体は、毒素に融合された１つ以上のＶＥＧＦサブユニットを含有する融合タンパク質である。本発明のＶＥＧＦ類縁体およびＶＥＧＦ類縁体融合タンパク質は、当技術分野に知られた手段により単離され、精製できる。
【０１１４】
本発明のＶＥＧＦ類縁体の全ては、少なくとも１つのＶＥＧＦサブユニットにおける少なくとも１つの塩基性アミノ酸置換を含有する。本発明の一実施形態において、本発明のＶＥＧＦ類縁体は、少なくとも１つまたは少なくとも２つのＶＥＧＦサブユニットにおいて、少なくとも２つの塩基性アミノ酸置換、少なくとも３つの塩基性アミノ酸置換、少なくとも４つの塩基性アミノ酸置換または少なくとも５つの塩基性アミノ酸置換を含有する。
【０１１５】
本発明は、ＶＥＧＦ活性断片、すなわち、完全長でないタンパク質であるペプチドを含有するＶＥＧＦ類縁体を含む。本発明の修飾ＶＥＧＦの活性断片はまた、直接合成できるか、またはより大きく修飾されたＶＥＧＦタンパク質の化学的破壊または機械的破壊により得ることができる。活性断片は、関連する活性、例えば、結合活性または調節活性を有する天然アミノ酸配列に由来する、少なくとも５連続アミノ酸、少なくとも１０連続アミノ酸、少なくとも２０連続アミノ酸、少なくとも３０連続アミノ酸、少なくとも４０連続アミノ酸、少なくとも５０連続アミノ酸、少なくとも６０連続アミノ酸、少なくとも７０連続アミノ酸、少なくとも８０連続アミノ酸、少なくとも９０連続アミノ酸、少なくとも１００連続アミノ酸、少なくとも１１０連続アミノ酸、少なくとも１２０連続アミノ酸、少なくとも１３０連続アミノ酸、少なくとも１４０連続アミノ酸、少なくとも１５０連続アミノ酸、少なくとも１６０連続アミノ酸のアミノ酸配列として定義される。他の配列に結合されようとなかろうと、この断片はまた、修飾ＶＥＧＦと比較してペプチドの活性が著しく変化または損なわれないという条件で、挿入、削除、置換、または特定の領域もしくは特定のアミノ酸残基の他の選択された修飾を含むことができる。これらの修飾は、その生体寿命および／または生物活性などを増加させるためにジスルフィド結合できるアミノ酸を除去／添加するように何らかの追加の性質を提供する。いずれの場合においても、当該ペプチドは、結合ドメインなどにおいて結合活性、結合調節などの生物活性を有さなければならない。ＶＥＧＦの機能的または活性領域は、ホルモンの特定領域の変異誘発、次いで発現ポリペプチドの発現および試験により確認できる。このような方法は、当業熟練実務者にとって容易に明らであり、受容体をコードする核酸の部位特異的変異誘発を含むことができる（Zoller, M. J. et al.）。
【０１１６】
使用方法
本発明は、ＶＥＧＦ媒介血管新生を軽減させるように本明細書に記載されたＶＥＧＦ−Ａ１６５およびＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂ類縁体などのＶＥＧＦ類縁体と、細胞発現キナーゼドメイン受容体（ＫＤＲ）とを接触させることを含み、ＶＥＧＦ媒介血管新生を軽減させる方法を包含する。本発明の方法により標的化されるＫＤＲ発現細胞は、原核細胞および真核細胞のいずれか、または双方を含むことができる。このような細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持できるか、またはそれらがｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、癌または別の血管新生関連疾患と診断された患者または対象に存在し得る。
【０１１７】
本発明は、本明細書に記載された任意のＶＥＧＦ受容体アンタゴニストの治療的有効量により、血管新生関連疾患または病態と診断された患者を処置する方法を含み、前記血管新生関連疾患または病態が軽減されるか、または阻止されるように前記患者に前記ＶＥＧＦ類縁体または融合タンパク質を投与することを含む。血管新生の軽減を測定するために、患者の結果を、プラセボ投与の患者と比較できる。代表的な血管新生関連疾患としては、本出願を通して記載されており、限定はしないが、腫瘍および新生物、血管腫、リウマチ様関節炎、骨関節炎、敗血症性関節炎、喘息、アテローム硬化症、特発性肺線維症、血管再狭窄、動静脈形成異常、髄膜腫、血管新生緑内障、乾癬、カポジ症候群、血管線維腫、血友病関節、過形成性瘢痕、オースラー−ウェーバー症候群、化膿性肉芽腫、水晶体後線維増殖症、強皮症、トラコーマ、フォン・ヒッペル・リンドウ病、血管接着病状、滑膜炎、皮膚炎、子宮内膜症、翼状皮膚、糖尿病性網膜症、角膜損傷または移植に関連する新血管新生、創傷、ただれ、および潰瘍（皮膚、胃および十二指腸）からなる群から選択される疾患が挙げられる。
【０１１８】
血管新生の増加、血管新生の減少、あるいは血管新生調節不全により引き起こされるか、または悪化する疾患患者は、ＶＥＧＦ類縁体単独または既知のＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、抗血管新生療法、抗癌療法、あるいは疾患または病態を処置するために知られた他の療法と組合わせて処置できる。本明細書に用いられる用語「療法」は、限定はしないが、既知の薬物を含む。既知のＶＥＧＦ受容体アンタゴニストまたは抗血管新生療法としては、限定はしないが、ＶＥＧＦ／ＫＤＲ相互作用を妨げ、および／またはＶＥＧＦのＫＤＲへの結合を遮断するペプチド類のようなＫＤＲシグナル伝達経路を遮断する薬剤、ＶＥＧＦに対する抗体、ＫＤＲに対する抗体、可溶性受容体、チロシンキナーゼ阻害剤、抗ＶＥＧＦ免疫毒素、リボザイム、アンチセンス媒介ＶＥＧＦ抑制剤、および硫酸化低分子量グリコールスプリットヘパリンが挙げられる。
【０１１９】
本発明のＶＥＧＦ類縁体が、別の療法と組合わせて使用される場合、それらの療法の結合により相乗効果をもたらす。さらに、本発明のＶＥＧＦ類縁体は、望ましくない副作用に関連した薬物と組合わせ得る。ＶＥＧＦ類縁体とこのような薬物との結合により、副作用を有する薬物の有効投与量は、生じる副作用の確率を低減するように低下させることができる。
【０１２０】
本発明は、癌と診断された患者を、本明細書に記載された任意のＶＥＧＦ受容体アンタゴニストの治療的有効量により処置する方法を含み、前記癌の拡がりを軽減するか、または阻止するように、前記患者に前記アンタゴニストを投与することを含む。本発明は、癌と診断された患者を、本明細書に記載された任意のＶＥＧＦ受容体アンタゴニストの治療的有効量により処置する方法を含み、腫瘍の成長を軽減するか、または阻止するように、前記患者に前記アンタゴニストを投与することを含む。一実施形態において、ＶＥＧＦ類縁体は、ＶＥＧＦ誘導血管新生を軽減させるか、または防止し、血管新生を阻止することによって機能する。別の実施形態において、ＶＥＧＦ類縁体は、腫瘍細胞、内皮細胞および／またはＶＥＧＦ受容体などの血管細胞を標的にするか、または死滅させることによって血管新生を防止するか、または軽減させるＶＥＧＦ−毒素融合タンパク質である。
【０１２１】
本発明の方法により処置可能な癌としては、限定はしないが、膀胱癌、乳癌、肝癌、骨癌、腎癌、大腸癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、肺癌、脳癌および皮膚癌からなる群から選択されるものなど、全ての固形腫瘍および転移癌が挙げられる。本発明は、限定はしないが、本発明のＶＥＧＦ類縁体単独で、当技術分野に公知の方法（U.S. Patent 6,596,712を参照）により化学療法と併用するか、または放射線療法と併用した癌の処置を含む。例えば、ＶＥＧＦ類縁体は、セシウム放射線、イリジウム放射線、ヨウ素放射線、またはコバルト放射線により使用できる。
【０１２２】
本発明は、不妊症と診断された患者を、本明細書に記載された任意のＶＥＧＦ受容体アンタゴニストの治療的有効量により処置する方法を含み、不妊症が当業者により処置されると思われるように前記患者に前記アンタゴニストを投与することを含む。不妊症は、卵母細胞の定量、受精率、胚盤胞形成率、および胚芽形成率など、当技術分野に公知の定量的および定性的パラメータにより測定できる。このような不妊症疾患としては、限定はしないが、原因不明女性不妊症、および子宮内膜症、原因不明男性不妊症など、患者の受精脳を損なうＶＥＧＦ発現に関連する疾患が挙げられる。本発明は、限定はしないが、ＶＥＧＦ類縁体単独の投与、または他の抗ＶＥＧＦ処置、抗血管新生処置、および／または不妊症処置と組合わせた投与により不妊症の処置を含む。
【０１２３】
本発明はまた、血管新生関連眼疾患と診断された患者を、本明細書に記載された任意のＶＥＧＦ受容体アンタゴニストの治療的有効量により処置する方法を含み、前記眼疾患が軽減されるか、または阻止されるように前記患者に前記アンタゴニストを投与することを含む。このような眼疾患としては、限定はしないが、未熟児網膜症、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、および加齢性黄斑変性など異常な眼内新血管新生に関連する眼疾患が挙げられる。本発明は、限定はしないが、ＶＥＧＦ類縁体単独の投与、または他の抗ＶＥＧＦ処置、抗血管新生処置、および／または他の眼疾患処置と組合わせた投与により血管新生関連眼疾患の処置を含む。例えば、本発明のＶＥＧＦ類縁体は、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、および加齢関連黄斑変性の処置のために、ＶＥＧＦに結合してＶＥＧＦの活性を阻止することにより作用するＰＥＧ化抗ＶＥＧＦアプタマーであるＰｆｉｚｅｒ社のＭａｃｕｇｅｎ（ペガプタニブ）と共に患者に投与できるであろう。
【０１２４】
本発明はまた、血管新生関連の炎症病態または自己免疫疾患と診断された患者を、本明細書に記載された任意のＶＥＧＦ受容体アンタゴニストの治療的有効量により処置する方法を含み、前記炎症病態が軽減されるか、または阻止されるように前記患者に前記アンタゴニストを投与することを含む。このような炎症病態または疾患としては、限定はしないが、全てのタイプの関節炎、特にリウマチ様関節炎ならびに骨関節炎、喘息、肺線維症および皮膚炎など、ＶＥＧＦの発現およびＶＥＧＦによる細胞の活性化に関連する炎症障害が挙げられる。本発明は、限定はしないが、ＶＥＧＦ類縁体単独の投与、または他の抗ＶＥＧＦ処置、抗血管新生処置、炎症療法、および／または自己免疫疾患処置と組合わせた投与により血管新生関連の炎症病態または自己免疫疾患の処置を含む。
【０１２５】
本発明の別の実施形態において、本発明の修飾ＶＥＧＦタンパク質は、診断薬として使用される。本発明のＶＥＧＦ類縁体またはＶＥＧＦ受容体は、タンパク質またはペプチドアレイにおけるなど、合成表面にディスプレイできる。このようなアレイは、当技術分野に周知であり、血管新生に関与することが知られているＫＤＲおよび他の受容体に結合するＶＥＧＦ類縁体をスクリーンするために使用できる。本明細書に開示されたＶＥＧＦ類縁体は、ＫＤＲおよび血管新生に関与することが知られている他の受容体に結合する推定上のＶＥＧＦ類縁体の能力を評価するための陽性対照として使用できる。本発明はまた、血管新生に関与し得る推定上のＶＥＧＦ受容体をスクリーンするために本発明のＶＥＧＦ類縁体を含むアレイを含む。
【０１２６】
本明細書に記載された類縁体の特性化に好適なアッセイは、参照としてその全体が本明細書に組み込まれているPCT/US/99/05908に記載されている。例えば、種々の免疫アッセイは、限定はしないが、ラジオイムノアッセイなどの技法を用いる競合的結合アッセイおよび非競合的アッセイシステム、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチ免疫アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュ免疫アッセイ、ウェスタンブロット、沈殿反応、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、タンパク質Ａアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどが使用できる。
【０１２７】
製薬製剤
本発明は、本発明の有効量の治療薬を対象に投与することによる診断法および処置法を提供する。対象は、限定はしないが、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物であり、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトである。特定の実施形態において、非ヒト哺乳動物が対象である。
【０１２８】
本発明の製薬組成物は、製薬的に許容できる担体と組合わせて本発明の１種以上の修飾ＶＥＧＦタンパク質の有効量を含む。当該組成物は、標的にされる特定の疾患の処置に好適な他の既知の薬物を含む。本発明のＶＥＧＦ受容体アンタゴニストの有効量とは、化合物の不在下で生じると思われるものと比較して、内皮細胞のＶＥＧＦ刺激を遮断、阻止または軽減する量のことであり；言い換えれば、化合物の不在下で生じると思われるものと比較して、内皮の血管新生活性を減少させる量のことである。この有効量（および投与様式）は、個々の根拠に基づいて判定される；すなわち、使用される特定の治療用ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストおよび対象の考慮事項（サイズ、年齢、全身の健康状態）、処置を受ける病態（癌、関節炎、眼疾患など）、処置を受ける症状の重症度、求められる成績、使用される特定の担体または製薬製剤、投与経路、および当業者に明白と思われる他の因子に基づくであろう。この有効量は、当技術分野に公知である技法を用いて当業者により決定することができる。本明細書に記載された化合物の治療的有効量は、当技術分野に公知のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験、動物モデル、または他の用量応答試験を用いて判定できる。本発明のＶＥＧＦタンパク質は、単独または他の療法と併用して使用できる。治療的有効量は、ＶＥＧＦ類縁体が別の療法と併用して使用される場合に軽減できる。
【０１２９】
本発明の製薬組成物は、皮内投与、皮下投与、経口投与、直腸投与、膣投与、非経口投与、腹腔内投与、局所投与、肺投与、鼻腔内投与、舌下投与、眼投与、くも膜下投与、硬膜外投与、または別の投与経路に好適な製剤に調製、包装、または販売できる。化合物は、任意の好適な経路により、例えば、輸液またはボーラス注入、上皮または皮膚粘膜内層（すなわち、口腔粘膜、直腸および腸管粘膜など）を介して投与でき、ならびに他の生物活性剤と共に投与できる。投与は、全身であっても局所的であってもよい。例えば、本発明の製薬組成物は、ミクロ注入を介して腫瘍に局所的に投与できる。さらに、投与は単回投与でも連続投与であってもよい。
【０１３０】
製薬使用に関して、本発明のＶＥＧＦ類縁体は、製薬的に許容できる担体と組合わせて使用でき、製薬的に許容できる希釈剤または賦形剤を任意に含むことができる。さらに、本発明のＶＥＧＦ類縁体は、限定はしないが、抗ＶＥＧＦ療法、抗血管新生療法、抗癌療法、不妊症療法、自己免疫疾患療法、炎症療法、眼疾患療法、および皮膚疾患療法など、他の公知の療法と併用して使用できる。
【０１３１】
したがって、本発明は、対象への投与に好適な製薬組成物を提供する。担体は、その組成物が非経口投与に適合させる場合に液体であっても、または経口投与に処方された固体、すなわち、錠剤または丸剤であってもよい。さらに、担体は、その組成物が吸入に適合させる場合に噴霧可能な液体または固体の形態であり得る。非経口的に投与される場合、組成物は、許容できる非経口用担体で無発熱物質である必要がある。あるいは、活性化合物は、既知の方法を用いてリポソーム中で処方またはカプセル化できる。他の考慮された製剤としては、突出ナノ粒子および免疫学的ベースの製剤が挙げられる。
【０１３２】
リポソームは、閉じ込め水性容量を含有する完全閉鎖脂質二層膜である。リポソームは、単層（単一膜）であっても多層（複数膜二層を特徴とする玉ねぎ様構造で、各層が水により次の層から分離されている）であってもよい小胞である。この二層は、疎水性「尾部」領域と親水性「頭部」領域とを有する２つの脂質単層を含む。二層膜において、脂質単層の疎水性（非極性）「尾部」は二層の中心に向けられており、一方、親水性（極性）「頭部」は水相に向けられている。
【０１３３】
本発明のリポソームは、当技術分野に公知の任意の方法により形成できる。幾つかの方法が、本発明のリポソームを形成するために使用できる。例えば、複数多層小胞（ＭＬＶ）、安定な複数多層小胞（ＳＰＬＶ）、小型の複数単層小胞（ＳＵＶ）、または逆相蒸発複数小胞（ＲＥＶ）を使用できる。しかしながら、複数ＭＬＶは、利用されるフィルターサイズに依ってサイズの大きな複数単層小胞（ＬＵＶ）を形成するフィルターを通して押出されることが好ましい。一般に、３０、５０、６０、１００、２００または８００ｎｍのポアのポリカーボネートフィルターを使用できる。その関連部分が参照として本明細書に組み込まれている、Cullis et al. のU.S. Pat. No. 5,008,050に開示されている本法において、リポソーム懸濁液を、押出しデバイスを反復して通過させることができるため、均質なサイズ分布のリポソーム集団を生じる。
【０１３４】
例えば、ろ過は、ストレートスルー膜フィルター（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅポリカーボネートフィルター）または湾曲パスフィルター（例えば、０．１μｍサイズのＮｕｃｌｅｏｐｏｒｅ  Ｍｅｍｂｒａｆｉｌフィルター（混合セルロースエステル））を通すか、または均質化などの代替サイズ減少技法により実施できる。リポソームのサイズは、直径が約０．０３から上記の約２ミクロン；好ましくは、約０．０５から上記の０．３ミクロン、最も好ましくは約０．１から約０．２ミクロンと変わり得る。このサイズ範囲は、複数のＭＬＶ、ＳＰＬＶ、またはＬＵＶであるリポソームを含む。
【０１３５】
本発明のリポソーム製剤に使用できる脂質としては、合成または天然リン脂質が挙げられ、他の中でもとりわけ、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、スフィンゴミエリン（ＳＰＭ）およびカルジオリピンを単独でまたは組合わせて、かつまたコレステロールとの組合わせで挙げることができる。本発明に有用なリン脂質としてはまた、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）およびジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）挙げることができる。他の実施形態において、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、または水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）もまた使用できる。ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）およびジアラキドノイルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）も同様に使用できる。
【０１３６】
リポソームの調製中、脂質を懸濁させるために有機溶媒も使用できる。本発明に使用される好適な勇気溶媒としては、脂質を可溶化する、種々の極性および誘電性を有するもの、例えば、他にもあるが中でも、クロロホルム、メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メチレンクロリド、およびベンゼン：メタノール（７０：３０）などの溶媒混合物が挙げられる。その結果、脂質を含有する溶液（脂質および他の成分が全体に均一に分散している混合物）が形成される。溶媒は一般に、それらの生体適合性、低毒性、および可溶化能力に基づいて選択される。
【０１３７】
本発明のＶＥＧＦ受容体アンタゴニストをリポソーム内に封入するために、関連部分が参照として本明細書に組み込まれているU.S. Patent No. 5,380,531に記載された方法が、本発明の類縁体と共に使用できる。
【０１３８】
本発明のＶＥＧＦ類縁体を含有するリポソームは、持続放出製剤、ならびに反復投与を必要とする多数の疾患状態または薬理学的病態の治療において、哺乳動物、特にヒトに治療的に使用できる。本発明の薬剤を含有するリポソームの投与様式により、ＶＥＧＦ類縁体を送達できる生体内の部位および細胞が決定され得る。
【０１３９】
本発明のリポソームは、単独で投与できるが、一般には、意図された投与経路および標準的な製薬実践に関して選択された製薬担体と混合して投与される。該製剤は、非経口的に、例えば、静脈内に注入できる。非経口的投与では、それらは、例えば、他の溶質、例えば、等張が必要であるか、または望ましいならば、該溶液を等張にする上で十分な塩類またはグルコースを含有し得る滅菌水溶液の形態で使用できる。本発明のリポソームは、皮下に、または筋肉内に使用することもできる。該製剤の特定の性質に依存して、他の使用法も、当業者に予想できると思われる。
【０１４０】
経口投与様式では、本発明のリポソーム製剤は、錠剤、カプセル剤、舐剤、トローチ剤、散剤、シロップ剤、エリキシル剤、水性液剤および懸濁剤などの形態で使用できる。錠剤の場合、使用できる担体としては、乳糖、クエン酸ナトリウムおよびリン酸塩が挙げられる。澱粉、滑剤、およびタルクなどの種々の崩壊剤が、一般に錠剤中に使用される。カプセル形態における経口投与では、有用な希釈剤は、乳糖および高分子量ポリエチレングリコールである。水性懸濁剤が経口投与に必要な場合、該活性成分は、乳化剤および懸濁化剤と組み合わされる。所望の場合、一定の甘味剤および／または芳香剤を添加できる。
【０１４１】
局所投与様式では、本発明の製薬製剤は、液剤、懸濁剤、ゲル剤、油剤、軟膏剤または軟膏などの投与形態に組み込むことができる。このような局所製剤の調製は、例えば、Gennaro et al.(1995) Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishingによって例示される製薬製剤の技術に記載されている。局所適用では、該組成物は、粉末またはスプレー、特に、エアロゾル形態におけるものとしても投与し得る。疾患状態または薬理学的病態の治療におけるヒトへの投与では、処方医師が、所与のヒト対象に対する薬剤の適切な投与量を最終的に決定することになり、これは、個体の年齢、体重および応答、ならびに使用される薬剤の薬物動態によって変わることが予想され得る。
【０１４２】
本発明の製薬組成物は、生分解性ミクロスフェアなどのバイオポリマーのデポー製剤をさらに含む。薬剤の放出速度を制御し、薬剤を体内の特定の部位に標的化し、それによって、治療的応答を最適化し、毒性の副作用を減少させ、反復注入の不都合を除くために、生分解性ミクロスフェアが用いられる。生分解性ミクロスフェアは、移植および除去に外科的操作を必要としない点で、大型ポリマーインプラントに対して利点を有する。
【０１４３】
本発明の文脈で用いられる生分解性ミクロスフェアは、該タンパク質の放出を遅らせ、作用部位における治療的有効量を、長期間保持するポリマーによって形成される。該ポリマーは、エチルセルロース、ポリスチレン、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（乳酸）およびポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）から選択できる。ＰＬＧＡコポリマーは、再生可能な徐放特性を有する合成生分解性および生体適合性ポリマーの１つである。ＰＬＧＡコポリマーの利点は、それらの分解速度が、数ヶ月から数年の範囲であり、ポリマーの分子量およびポリグリコール酸残基に対するポリ乳酸の比率の関数であることである。米国では、ＬｕｐｒｏｎおよびＺｏｌａｄｅｘ、欧州では、Ｅｎａｎｔｏｎｅ  Ｄｅｐｏｔ、Ｄｅｃａｐｅｐｔｉｌ、およびＰａｒｉｏｄｅｌ  ＬＡなど、非経口適用にＰＬＧＡを用いているいくつかの製品が、現在市販されている（レビューに関しては、Yonsei, Med J. 2000 Dec; 41(6):720-34を参照）。
【０１４４】
本発明の製薬組成物はさらに、鼻上皮の密着帯を通す透過性の増加が示されていることから、経鼻投与に好適な製剤で、調製、充填、または販売できる（Pietro and Woolley, The Science behind Nastech's intranasal delivery technology. Manufacturing Chemist, August, 2003)。このような製剤は、該活性成分を含み、約０．５ナノメートルから約７ナノメートル、好ましくは、約１ナノメートルから約６ナノメートルの範囲の直径を有する乾燥粒子を含み得る。このような組成物は、パウダーを分散させるために噴射剤の流れを向けることのできるドライパウダーリザバーを含むデバイスを用いるか、または密封容器内に低沸点噴射剤中に溶解または懸濁させた該活性剤を含むデバイスなどの自己噴射溶媒／パウダー分散容器を用いた投与のために、ドライパウダーの形態が便利である。このようなパウダーは、好ましくは、該粒子の少なくとも９８重量％が０．５ナノメートル超の直径を有し、該粒子の少なくとも９５％の数が７ナノメートル未満の直径を有する粒子を含む。より好ましくは、該粒子の少なくとも９５重量％が１ナノメートル超の直径を有し、該粒子の少なくとも９０％の数が６ナノメートル未満の直径を有する。ドライパウダー組成物は、好ましくは、砂糖などの微細な固体粉末希釈剤を含み、単位用量形態で便利に提供される。
【０１４５】
経鼻送達用に処方された本発明の製薬組成物は、溶液または懸濁液の小滴の形態における該活性成分も提供できる。このようなこのような製剤は、該活性成分を含む水性または希釈アルコール溶液または懸濁液の任意に滅菌したものとして、調製、充填、または販売できる。このような製剤は、限定はしないが、サッカリンナトリウムなどの芳香剤、揮発性油、緩衝剤、界面活性剤、またはメチルヒドロキシベンゾエートなどの保存剤など、１種以上の添加成分を、さらに含む。この投与経路で提供される小滴は、約０．１ナノメートルから約２００ナノメートルの範囲の平均直径を有することが好ましい。
【０１４６】
鼻腔内投与に好適な他の製剤は、該活性剤を含み、約０．２マイクロメートルから５００マイクロメートルの範囲の平均直径を有する粗パウダーである。このような製剤は、スナッフを用いる、すなわち、鼻近くに保持したパウダーの容器から、鼻通路を通しての急速な吸入による様式で投与される。
【０１４７】
経鼻投与に好適な製剤は、例えば、約０．１％（ｗ／ｗ）の低さおよび１００％（ｗ／ｗ）の高さの該活性剤を含み得、さらに、本明細書に記載された1種以上の添加成分を含み得る。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は吸入によって投与できる。吸入療法では、該活性成分は、用量計測吸入器による投与に有用な溶液中に、またはドライパウダー吸入器に好適な形態にあり得る。他の実施形態において、該組成物は、気管支洗浄による投与に好適である。
【０１４９】
経口投与に好適な製剤としては、硬または軟ゼラチンカプセル剤、丸剤、コーティング錠剤などの錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤または吸入剤、およびそれらの放出制御形態が挙げられる。
【０１５０】
本発明のＶＥＧＦアンタゴニストは、急性的に投与できる（すなわち、炎症に至るイベントの発症中、またはそれからまもなく）か、または投与しなければ生じると考えられる症状の進行を低減または寛解させるために、変性疾患の過程の間に投与できる。投与のタイミングおよび間隔は、対象の症状によって変わり、当業者によって決定されるとおり、数時間から数日の間隔で、数時間、数日、数週間またはより長期の時間経過にわたって投与できる。毎日の典型的な療法は、一日当たり約０．０１μｇ／ｋｇ体重から、一日当たり約１ｍｇ／ｋｇ体重から、一日当たり約１０ｍｇ／ｋｇ体重から、一日当たり約１００ｍｇ／ｋｇ体重から、および一日当たり約１ｇ／ｋｇ体重からであり得る。
【０１５１】
本発明のＶＥＧＦ受容体アンタゴニストは、ＶＥＧＦタンパク質、タンパク質製剤および治療される疾患を考慮して、静脈内、経口、経鼻、眼内、筋肉内、くも膜下内、または任意の好適な経路により投与できる。炎症性関節炎の治療のためには、修飾ＶＥＧＦを滑液内に直接注入できる。固形腫瘍の治療のためには、修飾ＶＥＧＦを腫瘍内に直接注入できる。皮膚疾患の治療のためには、修飾ＶＥＧＦを、局所に、例えば、ローションまたはスプレーの形態で適用できる。くも膜下内投与、すなわち、脳腫瘍の治療のための投与は、脳内への直接注入を含み得る。あるいは、血液−脳関門を透過し、血液−脳関門を越えて該活性剤を輸送する能力のために選択されるペプチドまたは非タンパク質様部分である第２の分子（「担体」）に、修飾ＶＥＧＦを結合または共役させることができる。好適な担体の例は、参照として本明細書にそれらの全体が組み込まれている、U.S. Patent Nos. 4,902,505、同5,604,198および同5,017,566に開示されている。
【０１５２】
本発明のＶＥＧＦ受容体アンタゴニストを投与する代替法は、修飾ＶＥＧＦタンパク質をコードする核酸配列を担持するベクターを対象に投与することによって実施され、該ベクターは、該タンパク質の発現および分泌を指示することができる。好適なベクターは、典型的には、ＤＮＡウィルス、ＲＮＡウィルス、およびレトロウィルスなどのウィルスベクターである。ベクター送達系を利用し、遺伝子療法を実施する方法は、当技術分野に知られている（最近のレビューに関しては、Lundstrom, 2003, Trends Biotechnol. 21(3): 117-22を参照）。
【０１５３】
遺伝子導入動物
受容体結合親和性、および任意にアンタゴニスト性を増加させた修飾ＶＥＧＦ構築体を含有する遺伝子導入非ヒト動物の作出が、本発明の一実施形態において考慮されている。
【０１５４】
遺伝子導入非ヒト動物の成功した作出は、例えば、内容の全体が参照として本明細書に組み込まれている、U.S. Patent 6,291,740 (September 18, 2001発行)；U.S. Patent 6,281,408 (August 28, 2001発行）；およびU.S. Patent 6,271,436 (August 7, 2001発行）などの多数の特許および刊行物に記載されている。
【０１５５】
乳牛、ブタ、ヤギ、ウマ、畜牛、およびヒツジを含む家畜哺乳動物などの動物の遺伝子組立てを変更する能力により、多数の商業的適用が可能になる。これらの適用としては、容易な採集形態で大量の外来性タンパク質を発現する（例えば、乳汁または血液内への発現）動物の作出、体重増加、飼料効率、屠体組成、乳汁産生または乳汁含量、疾病耐性および特定の微生物による感染に対する耐性を有する動物の作出および成長速度または生殖性能が増大した動物の作出が挙げられる。ゲノム内に外来ＤＮＡ配列を含有する動物は遺伝子導入動物と称される。
【０１５６】
遺伝子導入動物作出のための最も広く用いられている方法は、受精胚の前核内へのＤＮＡの微量注入である（Wall et al., J. Cell. Biochem. 49:113 [1992]）。遺伝子導入動物作出の他の方法としては、胚へのレトロウィルスまたはレトロウィルスベクターの感染が挙げられる。移植前と移植後双方のマウス胚への、野生型または組換えレトロウィルスの感染が報告されている（Janenich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:1260 [1976]；Janenich et al., Cell 24: 519 [1981]; Stuhlmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7151 [1984]; Jahner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6927 [1985]; Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6148-6152 [1985]；Stewart et al., EMBO J. 6: 383-388 [1987]）。
【０１５７】
胚へのレトロウィルス感染の代替手段は、マウス胚の胞胚腔内へのウィルスまたはウィルス産生細胞の注入である（Jahner, D. et al., Nature 298: 623 [1982]）。妊娠中期マウスの子宮内レトロウィルス感染を用いたマウスの生殖系への導入遺伝子の導入が報告されている（Jahner et al.,上記文献[1982]）。遺伝子導入動物を作出するための、ウシ胚およびヒツジ胚へのレトロウィルスまたはレトロウィルスベクターの感染が報告されている。これらのプロトコルは、レトロウィルス粒子、またはレトロウィルス粒子を受精卵または初期胚の周囲空間内に流し入れる増殖停止（すなわち、マイトマイシンＣ処理した）細胞の微量注入を含む（PCT International Application WO 90/08832 [1990]；およびHaskell and Bowen, Mol. Reprod. Dev.、40:386 [1995]）。PCT International Application WO 90/08832には、２から８細胞期におけるヒツジ胚の周囲空間内への野生型ネコ白血病ウィルスBの注入が記載されている。注入胚由来の胎仔では、複数部位の組み込みが示されている。
【０１５８】
U.S. Patent 6,291,740（September 18, 2001発行）には、分裂細胞に形質導入するレトロウィルスベクターを用いた、成熟前卵母細胞および成熟した未受精卵母細胞（すなわち、受精前卵母細胞）への外来DNAの導入による遺伝子導入動物の作出が記載されている。この特許には、種々の組換えタンパク質の、サイトメガロウィルスプロモーターに駆動された、ならびに、マウス乳腺腫瘍ＬＴＲの発現に関する方法および組成物も記載されている。
【０１５９】
U.S. Patent 6,281,408（August 28, 2001発行）には、胚性幹細胞を用いて遺伝子導入動物を作出する方法が記載されている。簡単に述べると、遺伝子導入動物を作出するために、胚性幹細胞が、桑実胚と共に細胞共培養混合物中で用いられる。共培養前に、例えば、電気穿孔、微量注入またはレトロウィルス送達により、外来遺伝子材料を胚性幹細胞内に導入する。この様式でトランスフェクトされたＥＳ細胞は、ネオマイシンなどの選択マーカーにより、遺伝子の組み込みのために選択される。
【０１６０】
U.S. Patent 6,271,436（August 7, 2001発行）には、始原生殖細胞の単離、これらの細胞を培養して始原生殖細胞由来の細胞系を作出すること、始原生殖細胞と培養した細胞系双方の形質転換、およびこれらの形質転換した細胞および細胞系を用いて遺伝子導入動物を作出すること、を含む方法を用いる遺伝子導入動物の作出が記載されている。遺伝子導入動物を作出する効率は大いに増大し、それにより、遺伝子導入非齧歯類動物種の作出における相同的組換えの使用が可能になる。
【０１６１】
修飾ＶＥＧＦタンパク質を含有するキット
さらなる実施形態において、本発明は、例えば、治療的または非治療的適用のために使用できるＶＥＧＦ類縁体および／またはＶＥＧＦ類縁体融合タンパク質を含有するキットを提供する。該キットはラベルを有する容器を含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、および試験管が挙げられる。該容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成できる。該容器は、上記のものなど、治療的または非治療的適用のために有効なＶＥＧＦ類縁体またはＶＥＧＦ融合タンパク質を含む組成物を保持する。該容器上のラベルは、該組成物が特定の療法、または非治療的適用に使用されることを示し、また、上記のものなどのｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用に関する指示も示し得る。
【０１６２】
本発明のキットは典型的に、上記の容器、ならびに、緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用を説明した添付文書などを含む、商業的に、および使用者の立場から望ましい材料を含む１つ以上の他の容器を含む。また、本発明のキットは、野生型ＶＥＧＦ１６５またはＶＥＧＦ１６５ｂなどの野生型ＶＥＧＦからなる対照も含むことができる。
【０１６３】
本発明を説明し例示するために、以下の実施例が提供されている。したがって、それらは、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。当業者は、他の多くの実施形態もまた、上記の本明細書および請求項に記載されている本発明の範囲に入ることを理解するであろう。
【実施例】
【０１６４】
実施例
実施例１：ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストの設計
本発明のＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、野生型ＶＥＧＦ−Ａに比較して、受容体結合親和性を増加させ、生物活性を低下させるために設計された。これを行った一つの方法は、ＶＥＧＦ−Ａのループに正電荷を加えることによるものであった。超アンタゴニストを設計するためのこのアプローチは、はしないが、相同性モデリング、配列比較、電荷スキャニング変異誘発、ならびに、結合モノマーの文脈におけるモノマーの結合および変異の導入など、当技術分野に知られた種々の方法の組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【０１６５】
バミン（Ｖａｍｍｉｎ）または蛇毒ＶＥＧＦは、高親和性でＫＤＲ−ＩｇＧに結合し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで血管内皮細胞の増殖を強力に刺激することが示されている（参照としてその全体が本明細書に組み込まれている、Yamazaki et al., 2003, J. Biol. Chem. 278, 51985-51988を参照）。ＶＥＧＦ−Ａ受容体アンタゴニストは、バミンに対するＶＥＧＦ１６５の相同性に基づいて設計された。ＶＥＧＦ１６５は、７２位と７３位にグルタメート残基を有するが、一方、バミンは、これらの位置に、グリシンおよびリシンをそれぞれ含有する。７２位および７３位に２つの塩基性アミノ酸残基を含有するようにＶＥＧＦ−Ａを修飾することによって、該修飾ＶＥＧＦ−Ａは、野生型ＶＥＧＦ−Ａに比較して、結合親和性の有意な増加を示した（図３Ａ）。
【０１６６】
実施例２：ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストの特性化
ＶＥＧＦ類縁体、Ｉ８３Ｋ、Ｅ４４Ｒ、Ｅ７２ＲＥ７３Ｒ、Ｅ６７ＫおよびＱ８７Ｋを作出し、野生型ＶＥＧＦに比較して、ＫＤＲに結合する能力および細胞増殖を減少させるそれらの能力に関してアッセイした。
【０１６７】
方法
酵母細胞によって発現したＶＥＧＦ類縁体を、固定化ＫＤＲ−Ｆｃと共にインキュベートし、ＫＤＲ−Ｆｃに結合する該類縁体の能力をアッセイした。結合アッセイは以下のとおり実施した。
１．Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）９６マイクロウェルプレートを、１５０ｎｇ／ウェルのＫＤＲ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社）および１００μｌの５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３＋３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３）、ｐＨ９．６でコーティングした。試験した各ＶＥＧＦ類縁体および野生型ＶＥＧＦは、別々のプレートを用いた。
２．該プレートを、４℃で一晩インキュベートした。
３．翌日、該ウェルを洗浄用緩衝液（ＰＢＳ中０．０５％のツウィーン（ｔｗｅｅｎ））中で、３回洗浄した。
４．該ウェルを、３％のＢＳＡ、０．０３％のツウィーンを有するＰＢＳによって、室温で１時間ブロックした。
５．ブロックした後、該ウェルを、洗浄用緩衝液（ＰＢＳ中０．０５％のツウィーン）中で、３回洗浄した。
６．ＶＥＧＦ−Ａ（野生型または変異体）を、種々の濃度で、５０μｌの結合用緩衝液（ＰＢＳ中、１％のＢＳＡおよび０．０３％のツウィーン）中、ウェルに加えた。
７．５０μｌの結合用緩衝液（ＰＢＳ中、１％のＢＳＡおよび０．０３％のツウィーン）中、各ウェルに、７０，０００ｃｐｍ／ウェルで、１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦ−Ａ（野生型または変異体）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を加えた。
８．該ウェルの内容物を混合し、室温で２時間、緩やかに振とうさせながらインキュベートした。
９．該ウェルを、洗浄用緩衝液（ＰＢＳ中０．０５％のツウィーン）で３回洗浄した。
１０．各ウェルに、１２０μｌの溶解用緩衝液（０．２ＭのＮａＯＨ＋０．５％のＳＤＳ）を加えた。プレートを、室温で２０分間、激しく振とうさせた。
１１．各ウェルからの溶解用緩衝液を個々の管に移した。該ウェルをさらに２回、溶解用緩衝液で洗浄し、対応する管の溶解溶液緩衝液と合わせた。
１２．野生型ＶＥＧＦ−Ａおよび種々のＶＥＧＦ−Ａ変異体に関する結合の測定は、ガンマカウンターによるカウントによって判定した。
【０１６８】
ＶＥＧＦ類縁体の存在下でＨＵＶＥＣ内皮細胞の増殖する能力を、以下のとおりアッセイした。
１．成長因子を有するＭｅｄｉａ−２００を用い、ＨＵＶＥＣ内皮細胞（継代６）を、３，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレート内に接種し、一晩インキュベートした。
２．一晩のインキュベーション後、該培地を取り出し、２％の透析ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を有するＭｅｄｉａ  １９９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を加えた。
３．細胞を２０時間インキュベートした。
４．野生型ＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−Ａ類縁体を、９６ウェルプレートにおいて、２％の透析ＦＢＳを有するＭｅｄｉａ  １９９中、２００ｎｇ／ウェルで出発して連続希釈した。
５．各ウェルから培地を取り出し、２００μｌ／ウェルの希釈ＶＥＧＦ培地に替えた。
６．細胞を、３７℃で７２時間インキュベートした。
７．Ｐｒｏｍｅｇａ社のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙを用いて、細胞増殖を分析した。簡単に述べると、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ緩衝液を解凍し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ基質中に移し、十分に混合させて基質混合物を作製した。各ウェルから１００μｌの増殖培地を取り出して、新たな９６ウェルプレートに入れ、１００μｌの基質混合物と十分に混合させた。該プレートを２分間振とうし、室温でさらに１０分間インキュベートした。
８．組込み時間を２５０ｍＳに設定したプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ社）を用いて、プレートを発光シグナルに関して読み取った。
【０１６９】
分析
ＫＤＲ−Ｆｃに対するＩ８３Ｋ類縁体の受容体結合親和性は、野生型ＶＥＧＦ−Ａのものよりわずかに小さかった（図１Ａ）。しかし、Ｉ８３Ｋ類縁体は、野生型ＶＥＧＦ−Ａに比較して、内皮細胞増殖の有意な減少を示した（図１Ｂ）。ＶＥＧＦ−Ａ類縁体、Ｅ４４Ｒ、ＥＥ７２／７３ＲＲ、Ｅ６７ＫおよびＱ８７Ｋは全て、野生型ＶＥＧＦ−Ａに比較して、受容体細胞結合親和性の増加を示した（図２Ａ、３Ａ、４、５、および６）。しかし、類縁体Ｅ４４ＲおよびＥＥ７２／７３ＲＲは、内皮細胞増殖にほとんど変化無しから変化無しを示した（図２Ｂおよび３Ｂ）。これらの結果は、Ｉ８３Ｋを含むＶＥＧＦ１６５類縁体が、ＶＥＧＦ−Ａ受容体アンタゴニストとして有効に機能できることを示している。さらに、ＶＥＧＦ−Ａ類縁体、Ｅ４４ＲおよびＥＥ７２／７３ＲＲは、Ｉ８３Ｋに加えた場合、単独で内皮細胞増殖を減少することはできなかったが、これらの修飾は、受容体結合親和性をさらに増加させる可能性を有する。
【０１７０】
本出願において説明された刊行物、特許および特許出願は全て、参照として本明細書に組み込まれている。先の明細書において、本発明を、その一定の好ましい実施形態に関連して記載し、詳細は例示を目的として記載してあるとしても、本発明には、さらなる実施形態が可能であり、本明細書に記載された一定の詳細を、本発明の基本的原理から逸脱することなく、相当に変更できることは、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
図面の簡単な説明
【図１Ａ】Ｉ８３Ｋ突然変異体および野生型ＶＥＧＦ−ＡのＫＤＲに対する結合の比較を示すグラフである。
【図１Ｂ】Ｉ８３Ｋ  ＶＥＧＦ−Ａ突然変異体の存在下でのＨＵＶＥＣ−２内皮細胞の増殖の減少を、野生型ＶＥＧＦ−Ａと比較して示すグラフである。
【図２Ａ】Ｅ４４Ｒ類縁体および野生型ＶＥＧＦ−ＡのＫＤＲに対する結合の比較を示すグラフである。
【図２Ｂ】Ｅ４４Ｒ  ＶＥＧＦ−Ａ類縁体のの存在下でのＨＵＶＥＣ−２細胞の増殖を、野生型ＶＥＧＦ−Ａと比較したグラフである。
【図３Ａ】Ｅ７２Ｒ＋Ｅ７３Ｒ  ＶＥＧＦ突然変異体および野生型ＶＥＧＦ−ＡのＫＤＲに対する結合の比較を示すグラフである。
【図３Ｂ】Ｅ７２Ｒ＋Ｅ７３Ｒ  ＶＥＧＦ突然変異体の存在下でのＨＵＶＥＣ−２細胞の増殖を、野生型ＶＥＧＦ−Ａと比較したグラフである。
【図４】Ｅ４４ＲおよびＥＥ７２／７３ＲＲ突然変異体の結合を野生型ＶＥＧＦ−Ａと比較したグラフである。
【図５】Ｑ８７Ｋ突然変異体の結合を野生型ＶＥＧＦ−Ａと比較したグラフである。
【図６】Ｅ６７Ｋ突然変異体の結合を野生型ＶＥＧＦ−Ａに比較したグラフである。
【図１Ａ】
0005567271.tif 000002
【図１Ｂ】
0005567271.tif 000003
【図２Ａ】
0005567271.tif 000004
【図２Ｂ】
0005567271.tif 000005
【図３Ａ】
0005567271.tif 000006
【図３Ｂ】
0005567271.tif 000007
【図４】
0005567271.tif 000008
【図５】
0005567271.tif 000009
【図６】
0005567271.tif 000010
【配列表】
0005567271000001.app