(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
αアミラーゼ活性を有し、酵素の性能を改善する少なくとも１つの変更された特徴を有する変異ポリペプチドであって、
前記ポリペプチドはＡｍｙＳ（配列番号１）又はＡｍｙＳ切断変異体（配列番号２）から選択される親αアミラーゼポリペプチドに対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、親ポリペプチドと変異ポリペプチドとのアラインメントにより決定される親αアミラーゼポリペプチドのアミノ酸残基に対応する変異体のアミノ酸残基において、該変異は親ポリペプチドのアミノ酸残基から該変異ポリペプチドのアミノ酸残基に変更するものである変異を有しており、
前記変異は、Ｉ１８１Ａ、Ｉ１８１Ｐ、Ｓ２４２Ｑ、Ｎ１９３Ｙ、及びＥ１８８Ｐからなる群より選択される１つ以上の置換を導入するものである、変異ポリペプチド。
【請求項２】
親ポリペプチドが配列番号１のポリペプチドに対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１に記載の変異ポリペプチド。
【請求項３】
親ポリペプチドが配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１に記載の変異ポリペプチド。
【請求項４】
親ポリペプチドがＣ末端の２９アミノ酸残基が切断されている、請求項１に記載の変異ポリペプチド。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む洗浄組成物。
【請求項６】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載のポリペプチドを含むデンプン液化組成物。
【請求項７】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の変異体αアミラーゼとデンプン基質を接触させる工程を含む、αアミラーゼ変異体を用いて可溶性デンプン基質を加水分解する方法。
【請求項８】
デンプン基質を前記変異体αアミラーゼと接触させる前又は同時にフィターゼと接触させる工程を更に含む、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本出願は２００８年６月に出願された米国特許継続出願６１／０５９，４２３に基づいて優先権を主張する。
【０００２】
親αアミラーゼに対して特異活性、基質特異性、基質結合、基質切断、基質安定性、ｐＨ依存活性、ｐＨ依存安定性、酸化安定性、Ｃａ２＋依存性、ｐＩ、及び洗浄性能の少なくとも１つが改善されている親αアミラーゼの変異体を提供する。この変異体はデンプン転換、エタノール生成、洗濯、食器洗浄、硬表面洗浄、テキスタイルデサイジング、及び／又は甘味料生産に適している。
【背景技術】
【０００３】
アルファ（α）アミラーゼ（α−１，４−グルカン−グルカノヒドロラーゼ、Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）はデンプン又は他の直鎖及び／又は分岐１，４−グルコシドオリゴ及びポリサッカライドの加水分解を触媒する酵素のグループに属する。αアミラーゼは、デンプン処理の初期ステージ（液化）、湿式トウモロコシ粉砕、アルコール生成、洗剤基材中の洗浄剤として、テキスタイル工業におけるデンプンデサイジングにおいて、パン焼き工程において、飲料工業において、油田のドリル工程において、再生紙製造のインク除去工程において、及び動物飼料において、商業的に用いられている。
【０００４】
近年利用可能となっているαアミラーゼは前述の利用形態の幾つかにおいて、成功裏に用いられている。しかし、特異活性、改良された基質特異性、改善された熱、ｐＨ、及び酸化安定性、及び低いＣａ２＋依存性を有するαアミラーゼに対する需要がいまだ存在する。
【発明の概要】
【０００５】
１つの側面において、ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａの又はＡｍｙＳ様αアミラーゼの新規なαアミラーゼ変異体が提供される。特に、デンプンの工業的処理（デンプン液化、洗浄等）に関して有利な、改善された性質を有する変異体を提供する。
【０００６】
そのような性質を変更することは親αアミラーゼに、例えば、特異活性、基質特異性、基質結合、基質切断パターン、熱安定性、ｐＨ／活性プロファイル、ｐＨ／安定性プロファイル、酸化に対する安定性、Ｃａ２＋依存性、及び他の所望の性質に影響を与える変異を導入することにより達成できる。例えば、この修飾は親Ｓｐｅｚｙｍｅ  Ｘｔｒａ様αアミラーゼと比較したときに、Ｃａ２＋依存性が少なく、及び／又は変更されたｐＨ／活性プロファイル及び／又は熱安定性を有する変異体となる。
【０００７】
幾つかの態様において、この変異体は親ゲオバチルスステアロセレモフィリス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）αアミラーゼに基づくものであり、このαアミラーゼに対して、例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。他の態様において、この変異体は関連する親αアミラーゼに基づくものであり、ゲオバチルスステアロセレモフィリスαアミラーゼに対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の特定の配列同一性を有する。
【０００８】
幾つかの態様において、このαアミラーゼ活性を有し、及び酵素の少なくとも１つの性質が修飾された変異ポリペプチドが提供される。この変異ポリペプチドはＡｍｙＳ（配列番号１）由来αアミラーゼ又はＡｍｙＳの欠失変異体（配列番号２）ポリペプチドから選択される親αアミラーゼポリペプチドに対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有し、親ポリペプチドと変異ポリペプチドの配列アラインメントにより決定される、親αアミラーゼポリペプチドのアミノ酸残基において少なくとも１つの以下の変異を有する：
ａ）
0005492879.tif 000002
からなる群より選択される１つ以上位置において陽性チャージされたアミノ酸残基を導入する置換、
ｂ）
0005492879.tif 000003
からなる群より選択されるアミノ酸残基の１つ以上を導入する置換、
ｃ）
0005492879.tif 000004
からなる群より選択されるアミノ酸残基の１つ以上を導入する置換、
ｄ）
0005492879.tif 000005
からなる群より選択されるアミノ酸残基の１つ以上を導入する置換、
ｅ）
0005492879.tif 000006
からなる群より選択されるアミノ酸残基の１つ以上を導入する置換、及び
ｆ）
0005492879.tif 000007
からなる群より選択されるアミノ酸残基の１つ以上を導入する置換。
【０００９】
幾つかの態様において、この変異体は
0005492879.tif 000008
からなる群より選択される１つ以上の陽性チャージされたアミノ酸を導入する変異を含む。特定の態様において、改善された洗浄は北米における洗濯条件下であり、マイクロスウォッチアッセイを用いて決定される。特定の態様において、この陽性にチャージされたアミノ酸残基はアルギニンである。
【００１０】
幾つかの態様において、この変異体は
0005492879.tif 000009
からなる群より選択されるアミノ酸の１つ以上を導入する置換を含む。この変異体は親ポリペプチドと比較した場合、改善された熱安定性を有する。
【００１１】
幾つかの態様において、この変異体は
0005492879.tif 000010
からなる群より選択されるアミノ酸残基の１つ以上を導入する置換を含む。この変異体は親ポリペプチドに対して改善された熱安定性を有する。
【００１２】
幾つかの態様において、この変異体は
0005492879.tif 000011
からなる群より選択されるアミノ酸残基の１つ以上を導入する置換を含む。この変異体は親ポリペプチドと比較して高められた活性又は発現を示す。
【００１３】
幾つかの態様において、この変異体は
0005492879.tif 000012
からなる群より選択されるアミノ酸残基の１つ以上を導入する置換を含む。この変異体は親ポリペプチドと比較して高い活性又は発現を示す。
【００１４】
幾つかの態様において、この変異体は、
0005492879.tif 000013
からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸残基を導入する置換を含む。この変異体は親ポリペプチドと比較して、デンプン液化アッセイにおいて増大された粘度低下を示す。
【００１５】
幾つかの態様において、変異体αアミラーゼが提供される。このアミラーゼは親αアミラーゼポリペプチド由来のアミノ酸配列を含み、
0005492879.tif 000014
からなる群より選択される位置において３つ以上の変異の組み合わせを有する。このポリペプチドはαアミラーゼ活性を有し、少なくとも３つ以上の変異のそれぞれは、親ポリペプチドとは異なるアミノ酸残基を導入する。特定の態様において、変異箇所の数は４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上である。
【００１６】
幾つかの態様において、変異が既に２４２で起こっていなければ、変異はＳ２４２Ａ、Ｓ２４２Ｅ、Ｓ２４２Ｑ、Ｓ２４２Ｆ、Ｓ２４２Ｈ、又はＳ２４２Ｈの置換と組み合わせたものである。特定の態様において、この置換はＳ２４２Ｑである。幾つかの態様において、変異が既に１７９又は１８０で生じていなければ、変異は１７９及び１８０の位置の欠失とともに生じている。幾つかの態様において、変異が既に３４９又は４２８で生じていなければ、変異はこれらのアミノ酸の１つ以上におけるシステインの置換と共に生じている。
【００１７】
幾つかの態様において、変異が既に以下に列挙する位置で生じていなければ、変異は
0005492879.tif 000015
の位置における置換と共に生じている。
【００１８】
幾つかの態様において、変異が以下に列挙する位置で既に生じていなければ、この変異は
0005492879.tif 000016
の位置における置換と共に生じている。
【００１９】
幾つかの態様において、親ポリペプチドは配列番号１のポリペプチドに少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、のアミノ酸配列同一性を有している。
【００２０】
幾つかの態様において、この親ポリペプチドは配列番号２のポリペプチドに少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、のアミノ酸配列同一性を有している。
【００２１】
幾つかの態様において、この親ポリペプチドは配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５、及び配列番号１６からなる群より選択されるポリペプチドに少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有している。幾つかの態様において、この親ポリペプチドはＣ末端アミノ酸残基の欠失を含む。特定の態様において、この欠失はＣ末端の２９アミノ酸残基である。
【００２２】
幾つかの態様において、この変異ポリペプチドは１０６又は１９９のいずれか、あるいは両方の位置での変異を含まない。
【００２３】
幾つかの態様において、本明細書から逸脱しない変異のリストから１つ以上の変異を追加又は欠失させることができる。関連して、変異のリストに照らして１つ以上の変異を変異のサブセットとして組み合わせることができる。
【００２４】
他の側面において、前述の変異体αアミラーゼの１つ以上を含む組成物が提供される。特定の態様において、この組成物は洗濯用洗剤、食器用洗剤、硬表面洗浄組成物等の洗浄組成物である。この組成物は界面活性剤を含んでいてもよい。
【００２５】
他の側面において、αアミラーゼ変異体を用いて可溶性デンプン基質を加水分解する方法を提供する。幾つかの態様において、この変異体はＩ１８１Ａ、Ｉ１８１Ｐ、Ｉ１８１Ｃ、Ｉ１８１Ｅ、Ｉ１８１Ｙ、Ｓ２４２Ａ、Ｓ２４２Ｅ、Ｓ２４２Ｑ、Ｎ１９３Ｙ、及びＥ１８８Ｐからなる群より選択されるアミノ酸残基の１つ以上を導入する置換を含む。
【００２６】
幾つかの態様において、この変異体αアミラーゼはフィチン酸加水分解酵素と一緒に組み合わせて用いる。αアミラーゼ活性（αアミラーゼ単位）のフィチン酸活性（フィターゼ）に対する割合、即ち、ＡＡＵ：ＦＴＵは約１：１５乃至約１５：１、及び好ましくは１：１０乃至約１０：１である。特定の態様において、ＡＡＵ：ＦＴＵの割合は１：４乃至３：１、又は１：１でもよい。
【００２７】
更なる態様において、スラリーにおいてデンプンを液化する方法を提供する。この方法は乾燥又は湿式粉砕のいずれかからの顆粒デンプン等の植物物質を含む基質を含む。この方法は１次及び／又は２次液化工程を含む。１次及び／又は２次液化工程において、スラリーに、少なくとも１つのフィチン酸加水分解酵素及び／又は少なくとも変異体αアミラーゼとの組み合わせを、同時に又は任意の順番で別々に添加する工程を含む。この方法は更に、液化されたデンプンを糖化して発酵性糖を得る工程、及びこの発酵性糖を回収する工程を含む。幾つかの態様において、この方法は更に好適な条件下でこの発酵性糖を発酵させてアルコール等の最終生成物を得る工程を含む。幾つかの態様において、この酵素組成物は少なくとも１つの変異体αアミラーゼ及びフィターゼを含む。幾つかの態様において、この酵素組成物はブレンドされたものである。
【００２８】
更なる態様において、デンプン基質を発酵する方法を提供する。この方法は変異体αアミラーゼ及びフィターゼの組み合わせを単独で、又は分割して添加する工程を含む。他の側面において、処理されたデンプン基質はエタノールへと発酵される。
【００２９】
他の側面において、デンプン転換方法及びエタノール発酵方法が提供される。これらの方法は酸又はアルカリを添加してｐＨ調整をする必要がない。１つの態様は、ｐＨ調製を必要としない液化工程に関する。この液化工程のｐＨはｐＨ４．５乃至５．４の範囲であり、酸性中和剤は液化工程に添加されない。他の態様において、この液化工程のｐＨは４．８乃至５．８の範囲であり、酸性中和剤を添加しない。
【００３０】
他の側面において、発酵性基質を得る方法を提供する。この方法は基質デンプンを含む粉砕された穀物のスラリーを０乃至３０℃のデンプンゼラチン化温度未満の温度で、フィチン酸加水分解酵素と接触させる工程、このスラリーを変異体αアミラーゼと接触させる工程、温度を顆粒デンプンのゼラチン化温度以上に高くして、デンプンをゼラチン化する工程、及びデンプンを加水分解し発酵性基質を得るのに十分な時間、ゼラチン化されたデンプンをこのαアミラーゼと接触させて、ゼラチン化されたデンプンを加水分解する工程を含む。このフィチン酸加水分解酵素はバクテリア又は糸状菌フィターゼである。糸状菌フィターゼは（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）フィターゼ又はブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼでよい。幾つかの態様において、バクテリアフィターゼはエシュリキアリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来である。
【００３１】
他の側面において、発酵性糖を生成する方法を提供する。この方法は（ａ）粉砕されたデンプン含有物質を水又は蒸留残渣（ｔｈｉｎ  ｓｔｉｌｌａｇｅ）と混合して（この蒸留残渣は１０乃至７０％ｖ／ｖである）、及び乾燥固形含量（ｄｓ）が２０乃至５０％ｗ／ｗデンプン含有スラリーを得る工程、（ｂ）このスラリーをデンプンの液化前又は液化と同時にフィターゼで処理をする工程、（ｃ）デンプンを液化する工程、（ｄ）工程（ｂ）の間に及び／又は液化工程と同時に、デンプンに変異体αアミラーゼを添加する工程、及び（ｅ）液化されたデンプンを糖化して発酵性糖を得る工程を含む。工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、又は（ｅ）のいずれにおいてもｐＨを調整しない。幾つかの態様において、発酵性糖は回収され、又は精製され、あるいは異性化される。他の態様において、フィターゼを液化工程の前に添加する。幾つかの態様において、このαアミラーゼをフィターゼと一緒に添加する。更なる態様において、第二αアミラーゼ投与が液化工程の間に行われる。
【００３２】
更なる側面において、デンプン含有物質からアルコールを生成する方法を提供する。この方法は前述の液化デンプンを液化及び糖化して発酵性糖を得る工程、及びこの発酵性糖を発酵性微生物を用いて好適な条件下で更に発酵して、アルコールを得る工程を含む。幾つかの態様において、この糖化及び発酵工程は同時に行う。幾つかの態様において、アルコールはエタノールである。
【００３３】
他の側面において、変異体αアミラーゼをコードしている、発現ベクターを含むＤＮＡ構築体を提供する。この変異体αアミラーゼを発現する方法、及び変異体αアミラーゼ単独又は他のαアミラーゼ酵素と組み合わせて、デンプン液化工程及び洗浄等の各種工業プロセスに用いる方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は幾つかの関連するＡｍｙＳαアミラーゼの配列アラインメントを示す。
【図２】図２はｐＨＰＬＴ−ＡｍｙＳプラスミドを示す。
【図３】図３は９５℃で３０分間熱ストレス下に置いた後のＳ２４２ライブラリー変異体の残余活性を示す。Ｐ、Ｓ、Ｗ、及びＹの位置での変異体は欠落しており、野生型ＡｍｙＳ（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ、「Ｚ」のラベルがある）により置換されている。ラインは野生型酵素の残余活性の標準誤差の２倍及び３倍以上高い位置を示す。Ｓ２４２Ａ及びＳ２４２Ｑは明らかに野生型酵素よりも高い残余活性を示している。
【図４】図４Ａ乃至４Ｉは図１に示したアミノ酸配列の対アラインメントを示す。
【図５】図５は野生型及びアミラーゼ変異体のカルシウムを添加していない熱融解曲線及び融点を示す。
【図６】図６は２ｍＭカルシウムを添加した野生型及びアミラーゼ変異体の熱融解曲線及び融点を示す。
【図７】図７は３つの経時ポイントにおけるＬｉｑｕｏｚｙｍｅＳＣと比較したＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ及び２つの変異体の活性プロファイルを示す。
【図８】図８は３つの経時ポイントにおけるＳ２４２Ｑ変異体と比較した４つの変異体の活性プロファイルを示す。
【図９】図９は３０μｇ投与におけるＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（商標）ＳＣ又はＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａαアミラーゼの作用によるトウコロコシ粉の粘度減少を示す。
【図１０】図１０は３０μｇ投与におけるＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（商標）ＳＣ又はＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａαアミラーゼ、又は２つの変異体の１つ（Ｓ２４２Ａ及びＳ２４２Ｑ）の作用に依存するトウコロコシ粉の粘度減少を示す。
【図１１】図１１は２０μｇ投与におけるＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（商標）ＳＣ又はＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａαアミラーゼ、又は２つの変異体の１つ（Ｓ２４２Ａ及びＳ２４２Ｑ）の作用によるトウコロコシ粉の粘度減少を示す。
【図１２】図１２は、Ｌｉｑｕｏｚｙｍｅ（商標）ＳＣ又はＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ、又は２つの変異体の１つ（Ｓ２４２Ａ及びＳ２４２Ｑ）で処理した全粒粉砕コーンの経時的（０、３０、６０、及び９０分）なＤＥ変化を示す。
【図１３】図１３は、Ｌｉｑｕｏｚｙｍｅ（商標）ＳＣ又はＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ、又は２つの変異体の１つ（Ｓ２４２Ａ及びＳ２４２Ｑ）で処理した全粒粉砕コーンの経時的（０、３０、６０、及び９０分）な蒸気処理後の粘度を示す。
【図１４】図１４は、フィターゼ及びアミラーゼ（ＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ、又はＳ２４２Ｑ変異体）で処理した全粒粉砕コーンの経時的（０、３０、６０、及び９０分）ＤＥ変化を示す。ＭＡＸＡＬＩＱ（商標）はダニスコ、ジェネンコアディビジションより入手可能なフィターゼ／アミラーゼブレンドである。実施例８参照。
【図１５】図１５はフィターゼ及びアミラーゼ（ＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ、又はＳ２４２Ｑ変異体）で処理した全粒粉砕コーンの経時的（０、３０、６０、及び９０分）蒸気処理後の粘度を示す。
【図１６】図１６は、Ｓ２４２Ｑ変異体及びフィターゼで処理した全粒粉砕コーンのＤＥ変化を示す。実施例９を参照。
【図１７】図１７はＳ２４２Ｑ及びフィターゼで処理した全粒粉砕コーンの蒸気処理後の粘度を示す。実施例９を参照。
【図１８】図１８はＳ２４２Ｑ変異体の熱安定性及び低ｐＨ安定性の増加における全粒コーンのフィターゼ処理の効果を示す。実施例９を参照。
【図１９】図１９は蒸気処理後の粘度低下における全粒コーンの１次液化の間にフィターゼを添加することの効果を示す。実施例９参照。
【図２０】図２０は１）従来法、及び２）ｐＨ調整を行わない方法におけるＤＤＳＧの硫酸塩及びフィチン酸含量を示す。実施例１０参照。
【図２１】図２１はＤＥ変化及びＩＰ６としてのフィチン酸の減少の割合を示すグラフである。
【図２２】図２２は従来の処理条件下でのＤＥ変化におけるＳ２４２Ｑ変異体αアミラーゼの効果を示すグラフである。実施例８を参照。
【図２３】図２３は北米の洗浄条件下での機能を付加したコメデンプンマイクロスウォッチアッセイにおけるＳ２４２Ｑ及びその変異体の性能を示すグラフである。条件はＴＩＤＥ（商標）２ｘ２０℃。実施例１６参照。
【図２４】図２４は西ヨーロッパ洗濯条件の下でコメデンプンマイクロスウォッチアッセイにおけるチャージ変異を有するＴＳ−２３アミラーゼ他のαアミラーゼ（即ち、欠失バチルス株、ＴＳ−２３）の性能を示す図である。条件はＰＥＲＳＩＬ（商標）、４０℃である。実施例１６を参照のこと。
【図２５】図２５はＳ２４２Ｑの性能及び、チャージの機能としてのＢＯＤＩＰＹデンプンアッセイにおけるその変異体の性能を示すグラフである。実施例１６を参照。
【図２６】図２６Ａは振とうチューブ発現の関数としての相対的ＢＯＤＩＰＹデンプン加水分解（即ち、相対的ＢＯＤＩＰＹデンプン加水分解対相対的振とうチューブ発現）図を示すグラフである。図２６Ｂは相対的振とうチューブ発現の関数としての相対的マイクロスウォッチデンプン加水分解（即ち、相対的マイクロスウォッチデンプン加水分解対相対的振とうチューブ発現）を示すグラフである。実施例１９参照。
【図２７】図２７Ａはチャージの関数としての相対的振とうチューブ発現を示すグラフである。図２７Ｂはチャージの関数としての相対的ＢＯＤＩＰＹデンプン加水分解を示すグラフである。実施例１９参照。
【図２８】図２８Ａはチャージの関数としての相対的な振とうチューブ発現を示すグラフである。図２８Ｂはチャージの関数としての相対的マイクロスウォッチ洗浄活性を示すグラフである。実施例１９を参照。
【図２９】図２９は、第一ＡｍｙＳラダー、３０％ＤＳ、ｐＨ５．８、酵素量３０ｍｇを用いたコーンデンプン液化の後の最終粘度を示すグラフである。＋６変異体について、最終粘度は非常に高く測定不能であった（装置過負荷）。実施例１６参照。
【図３０】図３０は野生型に対するチャージ変化の関数としての第一ＡｍｙＳチャージラダーの熱安定性を示す図である。実験は標準的なアミラーゼ熱安定性アッセイを用いて行った。実施例１７参照。
【図３１Ａ】図３１ＡはｐＨの関数としての第一ＡｍｙＳチャージラダーのデンプン洗浄活性を示す。ｐＨ３．０乃至４．２５は２００ｍＭギ酸ナトリウム＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０である。ｐＨ４．２５乃至５．５は２００ｍＭギ酸ナトリウム＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０である。それぞれ単一のｐＫ値を有する複数の滴定曲線にデータを当てはめた。実施例２１を参照。
【図３１Ｂ】図３１ＢはＡｍｙＳ触媒作用に対する見掛けのｐＫａにおけるチャージ変異体（第一チャージラダー）の効果を示すグラフである。実施例は２１である。
【図３２Ａ】図３２ＡはＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａと比較するＡｍｙＳ変異体によるコーン粉の粘度低下を示す。
【図３２Ｂ】図３２Ｂ上段はＡｍｙＳＳＮ１９３Ｙによるコーン粉の粘度低下を示す。  図３２Ｂ下段はＡｍｙＳＮ１９３Ｙによる粘度低下におけるフィターゼ添加の効果を示す。配列の簡単な説明
【００３５】
本明細書において以下のアミノ酸及び核酸を参照する。
【００３６】
配列番号１（完全長野生型ＡｍｙＳ）
0005492879.tif 000017
【００３７】
配列番号２（欠失野生型ＡｍｙＳ、ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ）
0005492879.tif 000018
【００３８】
配列番号３（完全長Ｓ２４２Ａ  ＡｍｙＳ）
0005492879.tif 000019
【００３９】
配列番号４（完全長Ｓ２４２Ｑ  ＡｍｙＳ）
0005492879.tif 000020
【００４０】
配列番号５（完全長Ｓ２４２Ｅ  ＡｍｙＳ）
0005492879.tif 000021
【００４１】
配列番号６（Ｙａｍａｎｅ７０７）
0005492879.tif 000022
【００４２】
配列番号７（野生型ＡｍｙＬ；ＬＡＴ）
0005492879.tif 000023
【００４３】
配列番号８（野生型ＡｍｙＬ；Ｔｅｒｍａｎｙｌ）
0005492879.tif 000024
【００４４】
配列番号９（バチルスアミロリケファシエンスアミラーゼ）
0005492879.tif 000025
【００４５】
配列番号１０（ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（商標））
0005492879.tif 000026
【００４６】
配列番号１１（ＮＡＴＡＬＡＳＥ（商標））
0005492879.tif 000027
【００４７】
配列番号１２（ＫＡＯ  ＫＳＭ  １３７８）
0005492879.tif 000028
【００４８】
配列番号１３（ＫＡＯ  ＫＳＭ  Ｋ３８）
0005492879.tif 000029
【００４９】
配列番号１４（ＫＡＯ  ＫＳＭ  Ｋ３６）
0005492879.tif 000030
【００５０】
配列番号１５（ＬＩＱＵＩＺＹＭＥ（商標）ＳＣ）
0005492879.tif 000031
【００５１】
配列番号１６（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｅｔｈｙｌ）
0005492879.tif 000032
【００５２】
配列番号１７（プライマーＳ２４２Ｆ）
0005492879.tif 000033
【００５３】
配列番号１８（プライマーＳ２４２Ｒ）
0005492879.tif 000034
【００５４】
配列番号１９（ＢＰ１７  ｐｈｙｔａｓｅ）
0005492879.tif 000035
【００５５】
配列番号２０（ＬＡＴシグナルペプチドのコード配列）
0005492879.tif 000036
【００５６】
配列番号２１（ＬＡＴシグナルペプチド）
0005492879.tif 000037
【００５７】
配列番号２２（欠失Ｓ２４２ＱＡｍｙＳ）
0005492879.tif 000038
【００５８】
配列番号２３（成熟ＡｍｙＳのコード配列）
0005492879.tif 000039
【００５９】
配列番号２４（ＳｔａｔｏｒｉＦ）
0005492879.tif 000040
【００６０】
配列番号２５（ＳｔａｔｏｒｉＲ）
0005492879.tif 000041
【発明の詳細な説明】
【００６１】
Ｉ．序論
本発明の組成物及び方法は親αアミラーゼに対して、特異活性、基質特異性、基質結合、基質切断、基質安定性、ｐＨ依存活性、ｐＨ依存安定性、酸化安定性、Ｃａ２＋依存性、ｐＩ、及び洗浄性能のうちの少なくとも１つが改善されている親αアミラーゼの変異体を提供する。この変異体はデンプン転換、エタノール生成、洗濯、食器洗浄、硬表面洗浄、テキスタイルデサイジング、及び／又は甘味料生産に適している。
【００６２】
数多くの変異体を開示しているけれども、それらは、いずれもアミノ酸配列同一性、及び３次元構造の観点から構造的特徴を有する親αアミラーゼの性能を改善するという共通の性質を有している。これらの変異体のいくつかは他の変異体と組み合わせて用いられる。この他の変異体は所望の性質を有する変異体αアミラーゼに特定の性質を付与する。一般的に変異に適していないか又は変異及び他の変異との組み合わせに適していない位置も開示されている。これらの位置の同定は所望の性質を有する変異体αアミラーゼの設計において重要である。
【００６３】
本発明及び組成物の実施のために行った研究は主にゲオバチルスステアロセレモフィリス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の特定の親αアミラーゼを用いて行われたが、構造的に関連しているαアミラーゼについても等しく有利である。従って、本明細書は多くのαアミラーゼのいずれかを修飾して有利な性質を創造し、特定の位置において特定のアミノ酸残渣の存在に基づいて好ましい性能を有するように新規なαアミラーゼを同定するためのロードマップを提供する。
【００６４】
本発明の組成物及び方法の他の側面及び態様の詳細を以下に説明する。
ＩＩ．定義及び用語
【００６５】
本発明の組成物及び方法を詳細に説明する前に、各種用語、命名法、及び一般的な原理を以下で定義する。
Ａ．定義
【００６６】
以下の用語及びフレーズを明確するために以下のように定義する。定義されていない用語は、当業者が通常用いているものと同じ意味を有する。参考文献はＳａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（２ｎｄ  Ｅｄ．，１９８９）；Ｋｒｅｉｇｌｅｒ，ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ；Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（１９９０）；Ａｕｓｕｂｅｌら、（ｅｄｓ．）ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９４）；  Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，２Ｄ  ＥＤ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  Ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）；及び  Ｈａｌｅ  Ａｎｄ  Ｍａｒｋｈａｍ，Ｔｈｅ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）等の標準的な分子生物学のテキストである。
【００６７】
本明細書において、「デンプン」の語は式（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）Ｘを有するアミロース及びアミロペクチンからなる植物の複合多糖炭水化物からなる任意の物質を意味する。式中Ｘは任意の整数である。デンプンの例示的な源は穀物、草、塊茎、及び根であり、より具体的には小麦、大麦、コーン、ライ麦、コメ、ソルガム、ふすま、キビ、ジャガイモ、甘藷、及びタピオカを含む。
【００６８】
本明細書において、「アルファ（α）アミラーゼ」の語は、例えば、ＥＣ３．２．１．１のクラスの酵素であり、α−１，４−グルコシド結合の加水分解を触媒するものを意味する。これらの酵素は１，４−α結合Ｄ−グルコース単位を含むポリサッカライドにおいて、１，４−α−Ｄ−グルコシド結合のエキソ型又はエンド型加水分解に作用するとも理解されている。これらの酵素に用いる他の用語は「グリコゲナーゼ」である。例示的な酵素はα−１，４−グルカン−４−グルカノハイドラーゼグルカノヒドロラーゼを含む。
【００６９】
本明細書において、「組換え」の語は、細胞、核酸、タンパク質、又はベクターに対して用いた場合、この細胞、核酸、タンパク質、又はベクターが異種の核酸又はタンパク質、あるいは野生型核酸又はタンパク質の修飾を導入することにより修飾されている、あるいはそのように修飾された細胞由来の細胞であることを意味する。従って、例えば、組換え細胞はこの細胞の野生型（組換えされていない）には見られない遺伝子を発現し、又は野生型遺伝子が他の方法では過剰発現したり、又は少なく発現したり、全く発現しない場合に適当な発現を行う。
【００７０】
本明細書において、「タンパク質」及び「ポリサッカライド」の語はペプチド結合により結合されたアミノ酸残基の連続的な鎖を意味する。従来用いられているアミノ酸の一文字標記又は３文字表記を用いる。
【００７１】
本明細書において、「シグナル配列」の語はポリペプチドのＮ末端のアミノ酸残基の配列を意味する。この配列は細胞の外に細胞外ポリペプチドの分泌を促進する。細胞外タンパク質の成熟形態は分泌工程でシグナル配列を切断するので、この配列を欠いている。
【００７２】
本明細書において、「遺伝子」の語はポリペプチドの生成工程に関与するＤＮＡセグメントであり、コード領域の前後の領域並びに個々のコード領域（エキソン）の間に、介在領域（イントロン）を含む。遺伝子の命名は通常、イタリックで表す。対応するタンパク質は通常イタリックでは表示せず、初めの文字を大文字で表記する。
【００７３】
本明細書において、「核酸配列」及び「ポリヌクレオチド」の語は互換的に使用され、フォスフォジエステル又は同様の結合により結合されたヌクレオチドの連続的な鎖を意味し、１本鎖、２本鎖、又は部分的に２本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、並びにキメラ修飾されたＤＮＡ又はＲＮＡ、あるいはこれらの合成誘導体を含む。別に定義しない限り、核酸の配列は５’末端から３’末端方向へ記載する。当業者は遺伝子コドンの退縮により、１つ以上のコドンが特定のアミノ酸をコードすることを理解している。
【００７４】
本明細書において、「ベクター」の語は１つ以上の細胞タイプへ核酸を導入するためのポリヌクレオチド配列を意味する。ベクターはクローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミドベクター、ファージベクター、カセット等を含む。
【００７５】
本明細書において、「発現ベクター」の語は好適な宿主細胞中でＤＮＡの効果的な発現を可能にする好適な制御配列に作動可能に結合しているＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築体を意味する。前述の制御配列は効果的な転写のためのプロモーター配列、転写を調節するための任意のオペレーター配列、ｍＲＮＡ上の好適なリボゾーム結合部位をコードしている配列、エンハンサー、並びに転写及び翻訳を制御する配列を含む。
【００７６】
本明細書において、「プロモーター」の語は遺伝子の転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼに結合する調節配列である。プロモーターは誘発プロモーター又は構造プロモーターのいずれかでよい。例示的なプロモーターは誘発プロモーターのトリコデルマレーシｃｂｈ１遺伝子である。
【００７７】
本明細書において、「転写調節下」の語は、特定のポリヌクレオチドの転写、通常ＤＮＡ配列が特定のプロモーター及び／又はその転写を調節する他のエレメントに作動可能に結合してこれに依存していることを示す。
【００７８】
本明細書において、「転写調節下」の語は、特定のポリヌクレオチドの転写、通常ｍＲＮＡ配列が特定のプロモーター及び／又はその転写を調節する他のエレメントに作動可能に結合してこれに依存していることを示す。
【００７９】
本明細書において、「由来」の語の意味は、「〜から生じた」「〜得られた」「〜得ることができる」、及び「〜単離された」を包括的に含み、特定されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクター等が親ポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクター、宿主細胞等の修飾された変異体であることを示す。
【００８０】
本明細書において、「作動可能に結合する」の語は、説明されている成分がその意図する方式において機能するような位置関係にあることを意味する。例えば、調節配列は、コード配列の発現が調節配列に適合する条件を満たす方法でコード配列に結合しているときに作動可能に結合しているという。
【００８１】
「選択／選択可能マーカー」の語は、培地成分又は育成条件を用いてこれらの宿主細胞の選択を容易にするための宿主細胞で発現され遺得る伝子を意味する。例示的な選択マーカーの例としては、抗生物質／抗菌耐性（例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、又はクロラムフェニコール）を付与する遺伝子及び／又は代謝又は栄養的な利点をもたらす遺伝子があるがこれらに限定されない。
【００８２】
本明細書において、複数の配列をアラインメントしたときに、塩基又はアミノ酸残基の特定されたパーセンテージが同じである場合、ポリヌクレオチド又はポリペプチドは特定の「パーセント配列同一性」（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９９％）を有すると言う。アラインメント及びパーセントホモロジー又は同一性はＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  （Ａｕｓｕｂｅｌら（ｅｄｓ）（１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３０，ｓｅｃｔｉｏｎ  ７．７．１８）に記載のような、当業者に知られている任意の好適なソフトウェアを用いて決定することができる。好適なプログラムは、ベクター  ＮＴＩ  Ａｄｖａｎｃｅ（商標）９．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＧＣＧ  Ｐｉｌｅｕｐ、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８）、及びＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎａｔｌ  Ｃｅｎｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｉｎｆ．，  Ｎａｔｌ  Ｌｉｂ．Ｍｅｄ．（ＮＣＩＢ  ＮＬＭ  ＮＩＨ）、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，Ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）ＮＡＲ  ２５：３３８９−３４０２）プログラムを含む。他の好適なアラインメントプログラムはＡＬＩＧＮ  Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＰＡ）であり、デフォルトパラメータを用いるのが好ましい。他の用いることができる配列ソフトウェアプログラムはＴｈｅ  ＴＦＡＳＴＡ  Ｄａｔａ  Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）である。
【００８３】
本明細書において、「宿主株」又は「宿主細胞」の語は意図するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクター又はＤＮＡ構築体を導入するのに好適な有機体を意味する。宿主細胞は好ましくはバクテリア又は糸状菌細胞であるが、植物細胞（例えば、プロトプラスト）、昆虫細胞、又は哺乳動物細胞でもよい。
【００８４】
本明細書において、「培養」の語は液体又は固形培地において好適な条件下で微生物細胞の集団を育成することを意味する。培養は顆粒デンプンを含む基質を最終生成物へ（通常発酵管又は反応管において）生物学的に発酵転換することを含む。
【００８５】
本明細書において「発酵」の語は、微生物がより単純な有機化合物を生成することによる、有機基質の酵素的及び実質的に嫌気性の分解を意味する。発酵は一般的に嫌気性条件下で起こるが、発酵は酸素の存在下でも生じるので、この語を単に厳密な嫌気性条件に限定することを意図しない。
【００８６】
本明細書において、「接触」の語は酵素及びその基質が酵素を基質の十分に近い場所に配置させて酵素が基質を最終生成物に添加することを意味する（即ち、基質に作用する）。接触は酵素及び基質の溶液又は懸濁液を混合することにより行うことができる。
【００８７】
本明細書において、「酵素的転換」の語は通常酵素作用により、基質の修飾を行うことを意味し、例えば、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、又は他の酵素の作用によるデンプン基質の修飾がある。
【００８８】
本明細書において、「糖化」の語はデンプンをグルコースへ酵素的に転換することを意味する。
【００８９】
本明細書において、「ゼラチン化」の語はデンプン（例えば、生の又は結晶性デンプン）を調理により粘性懸濁液に可溶化させることである。
【００９０】
本明細書において「液化」の語はデンプンの転換において、ゼラチン化されたデンプンを加水分解して低分子量のデキストリンにすることを意味する。
【００９１】
本明細書において、「重合の程度（ＤＰ）」の語は、所与のサッカライドにおける無水グルコピラノースの数（ｎ）を意味する。ＤＰ１の例としては、グルコース及びフルクトース等の単糖である。ＤＰ２の例としては、マルトース及びスクロース等の二糖である。ＤＰ＞３サッカライドは重合度３以上を有する。
【００９２】
本明細書において、「最終生成物」又は「所望の最終生成物」の語はデンプン等の基質から酵素的に処理された分子を意味する。
【００９３】
本明細書において、「乾燥固形含量（ｄｓ）」は乾燥重量ベースの％で表されるスラリーの総固形分を意味する。
【００９４】
本明細書において、「スラリー」の語は不溶性固形物を含む水性混合物を意味する。
【００９５】
本明細書において、「残余デンプン」（デンプン残渣）の語は発酵の後にデンプン組成物中に残っているデンプン（可用性又は不溶性）を意味する。
【００９６】
本明細書において、「再生工程」の語は残余デンプン、酵素、及び／又は微生物を含むマッシュ成分を再利用して、追加的デンプン組成物の発酵において、作用させる又は参加させることを意味する。
【００９７】
本明細書において、「マッシュ」の語は、アルコール等の発酵生成物を生成するのに使用される、水中の発酵可能な炭素分子の混合物を意味する。「ビア」及び「マッシュ」は互換的に使用される。
【００９８】
本明細書において、「スティリッジ」の語は発酵されたマッシュからアルコールを除去した後の残渣である、非発酵固形物及び水の混合物を意味する。
【００９９】
本明細書において、「醸造用乾燥固形穀物（ＤＧＳ）」及び「水溶性醸造用乾燥固形穀物」穀物発酵の有用な副生成物を意味する。
【０１００】
本明細書において、「エタノール生成微生物」の語は、糖又はオリゴサッカライドをアルコールへ転換することができる微生物を意味する。エタノール生成微生物は通常個々に又は組み合わせて糖をアルコールに転換する１つ以上の酵素を発現する能力を有していることからエタノール生成微生物であるといわれている。
【０１０１】
本明細書において、「エタノール生成」の語はヘキソース又はペントースからエタノール生成することができる任意の有機体又は細胞を意味する。通常、エタノール生成細胞はアルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼを含む。エタノール生成微生物の例としては、酵母等の糸状菌微生物を含む。好ましい酵母はサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ）、とくにサッカロマイセスセルビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含む。
【０１０２】
本明細書において、ポリヌクレオチド又はポリペプチドに対して用いる「異種」の語は、宿主細胞中では自然発生しないポリヌクレオチド又はポリペプチドを意味する。酵素等の異種タンパク質は商業的に重要な工業用ポリペプチドである。この語は自然発生遺伝子、変異遺伝子、及び／又は合成遺伝子である（又はこれらにコードされた）ポリヌクレオチド及びポリペプチドを含むことを意図する。
【０１０３】
本明細書において、ポリヌクレオチド又はポリペプチドに対して用いる「内性」は宿主細胞中で自然発生するポリヌクレオチド又はポリペプチドを意味する。
【０１０４】
本明細書において、「回収された」「単離された」及び「分離された」の語は本来関与している少なくとも１つの成分から分離された、化合物、タンパク質、細胞、核酸、又はアミノ酸を意味する。
【０１０５】
ここで用いる「形質転換」、「安定な形質転換」又は「トランスジェニック」の語は、細胞がゲノム内に統合された、またはエピソームプラスミドとして少なくとも２世代に渡り維持された非天然（異種）核酸を有することをいう。
【０１０６】
ここで用いる「発現」とは、ポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて生成されるプロセスをいう。当該プロセスは転写及び翻訳の両方を含む。
【０１０７】
細胞内に核酸配列を挿入することの文脈上用いられる「導入」という語は、「形質感染」又は、「形質転換」又は「形質移入」及び核酸配列が、細胞内のゲノムに取り込まれ（例えば、染色体、プラスミド、プラスミド、又はミトコンドリアＤＮＡ）、自律レプリコン内に転化され、又は一時的な発現（例えば、核酸導入されたＲＮＡ）の場所である、真核又は原核細胞内へ、取り込まれることを言う。
【０１０８】
本明細書で用いる「特異活性」の語は、特定条件下において、所定の時間内に酵素調製物によりを生成物に転換する基質のモル数であると定義される。特異活性は、単位（Ｕ）/ｍｇタンパク質で表す。
【０１０９】
本明細書において、「生産性」の語は特定の方法及び特定の試薬（酵素を含む）を用いて生成された最終生成物の量を意味する。最終生成物の量としては、嵩、容量、濃度等で表され、開始物質（例えば、基質）の量、時間、又は他の条件を参照することを含む。
【０１１０】
本明細書において、「性能インデックス（ＰＩ）」の語は親又は対照とする酵素に対する変異酵素の性能の比を意味する。本明細書では、各種の更なる用語及びフレーズを用いて変異の性能を特徴づけする；ｕｐ変異は１より大きいＰＩを有する；中性の変異は０．５より大きいＰＩを有する；有害ではない変異は０．０５より大きいＰＩを有する；有害な変異はＰＩが０．０５である。結合可能変異はＰＩが０．５の性質を少なくとも１つ有し、全ての性質のＰＩが０．０５より小さい。
【０１１１】
本明細書において、「結合可能変異」は１つ以上の所望の性質について予め決められたパフォーマンスインデックス（ＰＩ）を有するタンパク質を提供するために組み合わせることができる変異である。
【０１１２】
本明細書において、「ＡＴＣＣ」は米国、バージニア州、マナッサスにあるアメリカンタイプカルチャーコレクションを意味する。
【０１１３】
本明細書において、「ＮＲＰＬ」の語は、米国、イリノイ州、ピオリアにある農業利用調査のための農業調査サービスカルチャーセンター、北センター（以前はＵＳＤＡ北領域調査研究所として知られていた）を意味する。
【０１１４】
一般的に数の範囲は定義している範囲の数を含むものとする。単数の冠詞、「１つ」（ａ）（ａｎ）及び「この」（ｔｈｅ）は別に明らかに定義しない限り複数も含むものとする。理解しやすくするために見出しを提供しているが、見出しは明細書の一部に説明された主題を確定するものであると理解すべきではない。全ての特許及び刊行物、並びにこれらの中に開示されている全ての配列は参照により本明細書に援用する。
Ｂ．用語
【０１１５】
別に定義しない限り、従来用いられているアミノ酸の一文字表記及び三文字表記を用いる。変異ポリペプチドは以下のように記載する：オリジナルアミノ酸：位置：置換アミノ酸。
【０１１６】
このルールに従って、例えば、セリンを２４２位でアラニンに置換した場合はＳｅｒ２４２Ａｌａ又はＳ２４２Ａと記載する。
【０１１７】
３０位におけるアラニンの欠失はＡｌａ３０＊又は△Ａ３０と示す。
【０１１８】
追加的なアミノ酸残基の挿入は、それがリジンである場合、Ａｌａ３０ＡｌａＬｙｓ又はＡ３０ＡＫと示す。
【０１１９】
３０位から３３位のアミノ酸残基の連続的な欠失は（３０−３３）＊又は△（Ａ３０−Ｎ３３）と示す。
【０１２０】
ポリペプチドが他のポリペプチド（又は親ポリペプチド）と比較して「欠失」を含み、その位置において挿入があった場合、＊３６Ａｓｐ又は＊３６Ｄと示す。この例は３６位におけるアスパラギン酸の挿入である。
【０１２１】
複数の変異はプラスの記号で分けて記載する。例えば、３０位及び３４位において、アラニンとグルタミン酸をアスパラギン酸及びセリンにそれぞれ置換した場合、Ａｌａ３０Ａｓｐ＋Ｇｌｕ３４Ｓｅｒ又はＡ３０Ｎ＋Ｅ３４Ｓと記載する。
【０１２２】
１つ以上の代替的なアミノ酸残基が所与の位置において挿入された場合は、Ａ３０Ｎ，Ｅ又はＡ３０Ｎ又はＡ３０Ｅと示す。
【０１２３】
更に、修飾する形態を特定せずに、修飾に好適な位置のみが同定されている場合、任意のアミノ酸をこの位置に存在しているアミノ酸残基に置換することを意味する。例えば、３０位におけるアラニンの修飾を意図する場合、アラニンは任意の他のアミノ酸、例えば、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ａ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖのいずれかに置換される。
【０１２４】
更に、「Ａ３０Ｘ」は以下の置換のいずれかの１つを意味し得る。
Ａ３０Ｒ、Ａ３０Ｎ、Ａ３０Ｄ、Ａ３０Ｃ、Ａ３０Ｑ、Ａ３０Ｅ、Ａ３０Ｇ、Ａ３０Ｅ、Ａ３０Ｉ、Ａ３０Ｌ、Ａ３０Ｋ、Ａ３０Ｍ、Ａ３０Ｆ、Ａ３０Ｐ、Ａ３０Ｓ、Ａ３０Ｔ、Ａ３０Ｗ、Ａ３０Ｙ、又はＡ３０Ｖ。
更に、これは以下のようにも記載される、
Ａ３０Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖ。
【０１２５】
すでにナンバリングについて用いられた親酵素が所定の位置において置換をされたものとしてにアミノ酸残基があるとすると、Ｘ３０Ｎ、又はＸ３０ＮＶと示される。このケースにおいて、例えば、Ｎ又はＶは野生型において存在している。
【０１２６】
従って、他の対応する親酵素はＡｓｎ又はＶａｌが３０位において置換されていることを示す。
Ｃ．アミノ酸残基の特徴づけ
【０１２７】
アミノ酸残基の特徴として以下の一般的な情報が参照として提供される。
【０１２８】
電荷アミノ酸
ＡＳｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ
【０１２９】
負電荷アミノ酸（最も負にチャージされた残基を初めに記載）
Ａｓｐ、Ｇｌｕ
【０１３０】
正電荷アミノ酸（最も正にチャージされた残基を初めに記載）
Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ
【０１３１】
中性アミノ酸
Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｉｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ
【０１３２】
疎水性アミノ酸残基（最も疎水性の高いものを最後に記載）
Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ｌｉｅ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ
【０１３３】
親水性アミノ酸残基（最も親水性の高いものを最後に記載）
Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ
ＩＩＩ．本発明の組成物及び方法に用いるαアミラーゼ
【０１３４】
以下の段落は本明細書に従って修飾され及び使用することができる「Ｓｐｅｚｙｍｅ（商標）Ｘｔｒａ様又はＡｍｙＳ様」αアミラーゼを説明する。
Ａ．αアミラーゼ間の相同性
【０１３５】
本発明の組成物及び方法を説明するための実験は配列番号２で例示されるＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ステアロセレモフィリスαアミラーゼを用いて行った。このアミラーゼの変異体はＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ（ダニスコ・ユーエスインク・ジェネンコア・ディビジョン、パロアルト、カリフォルニア、米国）として入手可能である。
【０１３６】
バチルス株により生成されるαアミラーゼの多くはアミノ酸レベルでＡｍｙＳに高い相同性（同一性）を有し、本明細書で説明する変異体の多くはこれらのアミラーゼにおいて生じる同様の効果を生成するために発現される。これらのアミラーゼは、正しくは「ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｒａ様αアミラーゼ」又は「ＡｍｙＳ様αアミラーゼ」と言う。既知の多くのバチルスαアミラーゼを表Ａにまとめた。
0005492879.tif 000042
（表Ａ  パーセント同一性）
【０１３７】
配列番号７で定義されるアミノ酸配列を有するこのバチルスリケニフォルミスαアミラーゼ（ＬＡＴ）は配列番号９で定義されるアミノ酸配列を有するバチルスアミロリケファシエンスαアミラーゼに８１％の配列同一性を有し、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むゲオバチルス（バチルス由来）ステアロセレモフィリスαアミラーゼに約６５％の配列同一性を有することが発見されている。更なる相同αアミラーゼはＷＯ９５／２６３９７に記載のＳＰ６９０及びＳＰ７２２、及び配列番号６で示されＴｓｕｋａｍｏｔｏ  ら（１９８８）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  １５１：２５−３１により説明されているバチルス株由来の＃７０７αアミラーゼを含む。ＫＳＭＡＰ１３７８αアミラーゼ（配列番号１２）はＷＯ９７／００３２４（花王コーポレーション）に記載されている。
【０１３８】
更なる相同αアミラーゼはＥＰ０２５２６６６（ＡＣＴＴ２７８１１）に記載のバチルスリケニフォルミス株及びＷＯ９１／００３５３およびＷＯ９４／１８３１４に記載のαアミラーゼを含む。他の市販のＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ様αアミラーゼは以下の商標で販売されているものである：ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＡＡ及びＵｌｔｒａｐｈｌｏｗ（ダニスコ・ユーエスインク・ジェネンコアアディビジョン）、及びＫＥＩＳＴＡＳＥ（商標）（Ｄａｉｗａ）及びＬＩＱＵＥＺＹＭＥ（商標）ＳＣ（配列番号１５）（ノボノルディスクＤＫより販売）。他の関連するαアミラーゼはＴｅｒｍａｍｙｌ（商標）（配列番号８、ノボザイム）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（商標）（配列番号１０、ノボザイム）、ＮＡＴＡＬＡＳＥ（商標）（配列番号１１、ノボザイム）、ＫＡＯ  ＫＳＭＫ３８（配列番号１３）、ＫＡＯ  ＫＳＭ  Ｋ３６（配列番号２４）、本発明明細書及び表に記載の他のαアミラーゼを含む。
【０１３９】
これらのαアミラーゼの間の同一性が高いことから、これらはαアミラーゼの同じクラスに属すると考えられ及び本発明の組成物及び方法に包含される。Ｇ．ステアロセレモフィリスαアミラーゼ（配列番号２）は出発材料として用いられるが、これらの又は他のαアミラーゼにおける対応する位置、例えば、ＳＰ７２２、ＢＬＡ、ＢＡＮ、ＡＡ５６０、ＳＰ６９０、ＫＳＭ  ＡＰ１３７８、＃７０７、及び他のバチルスαアミラーゼも説明されている修飾に起因する有利な効果を得ることが可能である。
【０１４０】
従って、ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ様αアミラーゼ又はＡｍｙＳ様αアミラーゼは配列番号１、２、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、及び１６のアミノ酸配列を有するαアミラーゼを含む。幾つかの態様において、ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ様αアミラーゼ又はＡｍｙＳ様αアミラーゼは配列番号２に対してアミノ酸のレベルで、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％の同一性を有する。更なる態様において、ＳＥＰＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ様αアミラーゼ又はＡｍｙＳ様αアミラーゼは配列番号１、２、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、及び１６に対してアミノ酸のレベルで、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％の同一性を有する。
【０１４１】
参照するαアミラーゼに対する既知の又は予測されるαアミラーゼの同一性は当業者に既知のコンピュータープログラム手段で決定される。通常、ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ（配列番号２）及び例えば、他のαアミラーゼの間の構造的アラインメントは、同様の効果を生じさせるために本明細書で説明するように変異させることができる他のＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ様αアミラーゼにおいて、等しい／対応する位置を決定するために用いる。１つの代表的なプログラムはＧＡＰである。このプログラムはＧＣＧプログラムパッケージ（前述）で提供されている。特に、ＧａｐＣＧＣｖ８は同一性のデフォルトスコアリングマトリクスで用いられ、以下のパラメータを含む：ＧＡＰクリエションペナルティー５．０及びＧＡＰエクステンションペナルティ０．３をそれぞれの核酸配列の比較に用いる。ＧＡＰクリエションペナルティー３．０及びＧＡＰエクステンションペナルティ０．１をそれぞれのタンパク質配列の比較に用いる。ＧＡＰはアラインメントをつくり同一性を計算するためにＮｅｅｄｌｅｍａｎ  Ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０），Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３を用いる。
【０１４２】
構造アラインメントを用いるための他の方法はｇａｐペナルティーの既存の値、即ち、クリエーションペナルティー３．０及びエクステンションペナルティ０．１、を用いたＧＣＧパッケージからのＰｉｌｅ  Ｕｐプログラムを用いることである。他の構造的なアラインメント方法は疎水性クラスター解析（Ｇａｂｏｒｉａｕｄら（１９８７），ＦＥＢＳ  ＬＥＴＴＥＲＳ  ２２４，ｐｐ．１４９−１５５）及びリバーススレッディング（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）（Ｈｕｂｅｒ．Ｔ；Ｔｏｒｄａ，ＡＥ，ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ  Ｖｏｌ．７、Ｎｏ．１ｐｐ．１４２−１４９（１９９８）を含む。
【０１４３】
ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ様αアミラーゼ又はＡｍｙＳ様αアミラーゼは更に１つ以上の前述の他のαアミラーゼをコードしているＤＮＡ配列にハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされているポリペプチドを含んでいてもよい。そのようなαアミラーゼは配列番号９（ＢＡＮ）、配列番号５（ＢＳＧ；ＡｍｙＳ）、配列番号３（ＳＰ７２２）、配列番号７（ＬＡＴ）、及びＷＯ０６）／００２６４３の配列番号１１（ＡＡ５６０）及び配列番号１、２、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、及び１６にアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチドである。核酸の１本鎖が好適な温度及び溶液イオン強度の好適な条件下で他の核酸にアニールすることができる場合、他の核酸配列にハイブリダイズ可能である。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は当業者に知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）上記、特に９章及び１１章参照）。既知の又は配列決定されたＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ様αアミラーゼの特徴付けに用いるオリゴヌクレオチドプローブは意図するαアミラーゼの完全長又は部分的親核酸配列又はアミノ酸配列に基づいて調製される。
【０１４４】
試験するハイブリダイゼーションについての好適な条件は、４０℃、２０％ギ酸溶液中で１時間の浸漬、次いで２０％ギ酸、５ｘデンハード溶液、５０ｍＭリン酸ナトリウム、及び５０ｍｇの超音波で変性した仔ウシ胸腺ＤＮＡの溶液中で、４０℃、１時間の予備ハイブリダーゼーション、次いで４０℃、１８時間、１００ｍＭＡＴＰを含む同じ溶液でのハイブリダーゼーション、次いで３０分、４０℃（低い過酷条件）、２ＸＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中で３回洗浄を行う。この温度は、好ましくは５０℃（中程度の過酷条件）、より好ましくは６５℃（高い過酷条件）、更により好ましくは７５℃（非常に過酷な条件）である。ハイブリダーゼーション方法のより詳しい記載はＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９にある。幾つかの態様において、過酷条件は６５℃のＴｍ及び０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに対応する。
Ｂ．親αアミラーゼ
【０１４５】
任意の前述のＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ／ＡｍｙＳ様αアミラーゼは本明細書において、修飾される又は用いられる親αアミラーゼとして提供される。この親αアミラーゼは「バックボーン」又は「テンプレート」と言い、変異体アミラーゼはこれらに由来する。幾つかの態様において、この親αアミラーゼはＧ．ステアロセレモフィリス由来である。特定の態様において、この親αアミラーゼは配列番号２を有する。幾つかの態様において、この親αアミラーゼは配列番号１、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、及び１６のアミノ酸配列を有するか、配列番号１、２、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、及び１６の配列にアミノ酸のレベルで相当な同一性、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する。
【０１４６】
親αアミラーゼはハイブリッドαアミラーゼ、即ち、前述の少なくとも２つの親アミラーゼに由来する親アミノ酸配列の組み合わせを含んでいてもよい。更に、このハイブリッドαアミラーゼはＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ／ＡｍｙＳ様αアミラーゼ及び微生物（バクテリア又は糸状菌）及び／又は哺乳動物細胞由来の１つ以上の他のαアミラーゼの一部を含むハイブリッドαアミラーゼでもよい。
【０１４７】
従って、親ハイブリッドαアミラーゼは少なくとも２つのＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ様アミラーゼに由来するアミノ酸配列、又は少なくとも２つのＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ様及び／又は少なくとも１つのＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ様ではないαアミラーゼに由来する配列、又は少なくとも１つのＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ様及び／又はＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ１つの他の糸状菌αアミラーゼ等由来の配列を含む。例えば、親αアミラーゼはＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株由来のαアミラーゼのＣ末端と、Ｇ．ステアロセレモフィリス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株由来のαアミラーゼのＮ末端を含む。
ＩＶ．αアミラーゼ変異体の変更された性質
【０１４８】
以下のセクションは本明細書で説明する変異ポリペプチドにおいて存在している変異体の間の関係を説明する。以下の説明は、それらの変異体から得られる性質の変更（親ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ様αアミラーゼに対する）も説明する。
【０１４９】
第一の側面において、親Ｇ．ステアロセレモフィリス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）αアミラーゼの変異体が提供される。この変異体は
0005492879.tif 000043
からなる群より選択される１つ以上の位置が変異されている（アミノ酸の位置番号は配列番号１又は２を用いる）。ここにおいて、
（ａ）それぞれの変異は独立して、
（ｉ）所定位置を占めるアミノ酸の下流におけるアミノ酸の挿入、
（ｉｉ）所定位置を占めるアミノ酸の欠失、
（ｉｉｉ）所定位置を占めるアミノ酸を別のアミノ酸で代替置換する、から選択され、
（ｂ）この変異体はαアミラーゼ活性を有する、
（ｃ）各位置は配列番号１又は２で定義されるアミノ酸配列を有する親Ｇ．ステアロセレ（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）モフィリスαアミラーゼのアミノ酸配列の位置に対応している。
【０１５０】
具体的に、意図される置換は、Ｓ２４２Ａ、Ｓ２４２Ｑ、Ｓ２４２Ｎ、及びＳ２４２Ｅである。これらの変異はカルシウム−ナトリウム結合に関係しているＲ１７９、Ｇ１８０、Ｉ１８１、Ｇ１８２、及びＫ１８３における変異と組み合わせてもよく、αヘリックスの中央において、Ｐ２４５での変異と組み合わせてもよい。
【０１５１】
他の親ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ様αアミラーゼにおける対応する位置は前述のアラインメントにより決定してもよいし、図４におけるアラインメントに示されている。
安定性
【０１５２】
本明細書の変異体において、重要な変異（アミノ酸置換及び欠失を含む）は安定性を変更できるかどうかという観点から決められており、特に、遊離状態での（即ち、未結合、従って溶液）６０ｐｐｍ以下のカルシウム濃度、高温での（即ち、７０乃至１２０℃）及び／又は極限ｐＨ（即ち、低い又は高い、即ち、ｐＨ４乃至６又はｐＨ８乃至１１）において改善された安定性（即ち、高い又は低い）、は「変更された性質」を説明するセクションに列挙されている変異体のいずれかを含む。この安定性は以下の方法のセクションで説明する。
【０１５３】
熱安定性が改善されたＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｅｘｔｒａ及び変更されたαアミラーゼの例としては、
（ａ）以下のアミノ酸残基の１つ以上を導入する置換
0005492879.tif 000044
（ｂ）以下のアミノ酸残基の１つ以上を導入する置換
0005492879.tif 000045
を含む。
Ｃａ２＋安定性
【０１５４】
変更されたＣａ２＋安定性はＣａ２＋欠失下での酵素の安定性が改善された、即ち、高い又は低い安定性のいずれかを示す。本明細書の変異体において、Ｃａ２＋安定性を特に、高いｐＨ（即ち、ｐＨ８乃至１０．５）において改善された安定性（即ち、高い又は低い安定性）を達成することに関して重要な変異（アミノ酸置換及び欠失を含む）、は「変更された性質」を説明するセクションに列挙されている変異体のいずれかを含む。この安定性は以下の方法のセクションで説明する。
特異活性及び／又は改善された発現量
【０１５５】
更なる側面において、変更された特異的活性、特に１０乃至６０℃の温度、好ましくは２０乃至５０℃、特に３０乃至４０℃、の温度において特に高められた又は減らされた活性、を有する変異体を得る事に関して重要な変異（アミノ酸置換及び欠失を含む）は「変更された性質」のセクションに列挙された任意の性質を有する。この特異活性は以下の「方法」のセクションで説明する。幾つかのケースにおいて、この変異体は特異活性よりも、又は特異活性に加えて、発現量が増えている。例示的な変異体を以下に示す：
（ａ）
0005492879.tif 000046
よりなる群より選択されるアミノ酸残基の１つ以上を導入する置換、又は
（ｂ）
0005492879.tif 000047
よりなる群より選択されるアミノ酸残基の１つ以上を導入する置換。
酸化安定性
【０１５６】
開示された変異体は親αアミラーゼと比較して、変更された酸化安定性、特に高濃度酸化物に対する酸化安定性を有する。高められた酸化安定性は、例えば洗剤組成物において有利であり、修飾された酸化安定性はデンプン液化のための組成物において有利である。酸化安定性は以下の「方法」のセクションに記載する。
変更されたｐＨプロファイル
【０１５７】
変更されたｐＨプロファイル、特に高いｐＨ（即ち、ｐＨ８乃至１０．５）又は低いｐＨ（ｐＨ４乃至６）における改善された活性を有する変異体を得るという点における重要な位置及び変異は活性部位残基の近くに位置しているアミノ酸残基の変異体を含む。幾つかのケースにおいて、この改善された活性は、例えば、ｐＨ６未満、ｐＨ５未満、又はｐＨ９以上で見られる。
【０１５８】
好適な特異変異／置換は意図する位置についての「変更された性質」のセクションで列挙しているものである。好適なアッセイは以下の「方法」のセクションで説明する。
洗浄性能
【０１５９】
特に高いｐＨ（即ち、ｐＨ８．５乃至１１）において改善された洗浄性能を有する変異体を得るという点から重要な位置及び変異は意図する位置についての「変更された性質」のセクションで列挙しているものである。洗浄性能は以下の「方法」のセクションにおいて説明するように試験する。
デンプン液化
【０１６０】
いくつかの変異体はＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ等の野生型αアミラーゼを用いた場合に観察されるものと比較すると、デンプン組成物の粘度を減らす効果が高い。例示的な変異体はＩ１８１Ａ、Ｉ１８１Ｐ、Ｉ１８１Ｃ、Ｉ１８１Ｅ、Ｉ１８１Ｙ、Ｓ２４２Ａ、Ｓ２４２Ｅ、Ｓ２４２Ｑ、Ｇ１３２Ａ、Ｎ１９３Ｙ、及びＥ１８８Ｐからなる群より選択されるアミノ酸残基の１つ以上を導入する置換を含む。
変異体における他の変異
【０１６１】
幾つかの態様において、本発明変異体は前述に加えて１つ以上の修飾を含む。例えば、１つ以上のプロリン残基は非プロリン残基に置換される。非プロリン残基の例としてはアラニン、グリシン、セリン、バリン、及びロイシンを含む。同様に、１つ以上のシステイン残基を非システイン残基に置換することも有効である。非システイン残基の例としては、セリン、アラニン、スレオニン、バリン、及びロイシンを含む。
【０１６２】
更に、１つ以上の以下の位置における変異も有効である。（ナンバリングは配列番号７に基づく）Ｍ１５、Ｖ１２８、Ａ１１１、Ｈ１１３、Ｗ１３８、Ｔ１４９、Ｍ１９７、Ｎ１８８、Ａ２０９、Ａ２１０、Ｈ４０５、Ｔ４２１、特に以下の部位において、１つ、２つ、３つ、又はそれ以上の置換が有効である：
Ｍ１５Ｘ、特にＭ１５Ｔ、Ｌ；
Ｖ１２８Ｘ、特にＶ１２８Ｅ；
Ｈ１３３Ｘ、特にＨ１３３Ｙ；
Ｎ１８８Ｘ、特にＮ１８８Ｓ、Ｔ、Ｐ；
Ｍ１９７Ｘ、特にＭ１９７Ｔ、Ｌ；
Ａ２０９Ｘ、特にＡ２０９Ｖ；
Ｍ１９７Ｔ／Ｗ１３８Ｆ；Ｍ１９７Ｔ／１３８Ｙ；Ｍ１５Ｔ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８Ｓ；
Ｍ１５Ｎ１２８Ｅ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８Ｓ；Ｅ１１９Ｃ／Ｓ１３０Ｃ；Ｄ１２４Ｃ／Ｒ１２７Ｃ；Ｈ１３３Ｙ／Ｔ１４９Ｉ；
Ｇ４７５Ｒ，Ｈ１３３Ｙ／Ｓ１８７Ｄ；Ｈ１３３Ｙ／Ａ２０９Ｖ。
【０１６３】
配列番号７で定義されるアミノ酸配列を有する親αアミラーゼのケースにおいて、酸化安定性を改善する点ために欠失又は置換される関連するアミノ酸残基は、１つのシステイン残基（Ｃ３６３）及び配列番号２のＭ８、Ｍ９、Ｍ９６、Ｍ２００、Ｍ２０６、Ｍ２８４、Ｍ３０７、Ｍ３１１、Ｍ３１６、及びＭ４３８に位置しているメチオニン残基を含む。
【０１６４】
親αアミラーゼに対するαアミラーゼ変異体の熱安定性を高める点において、少なくとも１つの、好ましくは２つの、更に好ましくは３つの以下のアミノ酸残基を欠失することが特に好ましい。Ｆ１７８、Ｒ１７９、Ｇ１８０、Ｉ１８１、Ｇ１８２、及びＫ１８３（配列番号２のアミノ酸残基に対応する）。特に有用な組み合わせ欠失は、Ｒ１７９＊＋Ｇ１８０＊、及びＩ１８１＊＋Ｇ１８２＊（それぞれ配列番号１５及び１６）（又は本明細書における親αアミラーゼの条件を満たしている他のαアミラーゼにおけるこれらの欠失組み合わせに等しいもの）。
【０１６５】
所望の他の変異体は例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列におけるＮ１９３Ｆ及びＶ４１６Ｇを含む。
Ｖ．αアミラーゼ変異体の調製方法
【０１６６】
遺伝子に変異を導入する幾つかの方法は当業者に知られている。αアミラーゼをコードするＤＮＡ配列のクローニングの簡単な説明の後に、αアミラーゼのコード配列内の特定の部位における変異を生成する方法を説明する。
Ａ．αアミラーゼをコードしている核酸のクローニング及び発現
【０１６７】
親αアミラーゼをコードしているＤＮＡ配列は当業者に知られている各種方法を用いて、意図するαアミラーゼを生成する任意の細胞又は微生物から単離される。第一に、ゲノムｃＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリーをが目的とするαアミラーゼを生成する有機体からの染色体ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを用いて構築される。その後、このαアミラーゼのアミノ酸配列が知られているなら、相同体、ラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが合成され、意図する有機体から調製されたゲノムライブラリー由来のαアミラーゼコーディングクローンを同定するのに用いられる。代替的に、既知のαアミラーゼ遺伝子に相同な配列を含むラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが低い過酷条件のハイブリダーゼーション及び／又は洗浄条件を用いてαアミラーゼコーディングクローンを同定するためのプローブとして用いられる。
【０１６８】
αアミラーゼコードクローンを同定するための他の方法はプラスミド等の発現ベクターにゲノムＤＮＡンフラグメントを挿入し、得られたゲノムＤＮＡライブラリーでαアミラーゼを発現しない有機体を形質転換して、その後αアミラーゼの基質を含むアガー上で形質転換されたバクテリアを平板培養し、同定されるαアミラーゼ発現しているコロニーを育成する。
【０１６９】
酵素をコードしているＤＮＡ配列は確立された標準的な方法、例えば、Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＭ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）に記載のフォスフォアミジン法及びＭａｔｔｈｅｓら（１９８４）に記載の方法により合成的に生成することができる。フォスフォアミジン法では、オリゴヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ自動合成機で合成され、精製され、アニールされ、結合され、及び好適なベクター内でクローニングされる。
【０１７０】
最終的に、このＤＮＡ配列は、標準的技術に従って、合成、ゲノム、又はｃＤＮＡのフラグメント（必要に応じて完全長ＤＮＡ配列の各種部分を対応するフラグメント）を結合することにより得られた、混合されたゲノム及び／又は合成物由来、混合された合成及び／又はｃＤＮＡ由来物、又は混合されたゲノム及び／又はｃＤＮＡ由来物である。このＤＮＡ配列は例えば、米国特許第４，６８３，２０２号に記載の特定のプライマーを用いてポリメラーゼチェーン反応（ＯＣＲ）により調製することもできる。
Ｂ．部位指定変異誘発
【０１７１】
一旦αアミラーゼコードＤＮＡ配列が単離され、好ましい部位に変異が同定されると、変異体は合成オリゴヌクレオチドを用いて導入される。これらのオリゴヌクレオチドは所望の変異部位に隣接しているヌクレオチドを含む、変異ヌクレオチドはオリゴヌクレオチド合成の間に挿入される。特定の方法において、αアミラーゼコード配列をつなぐＤＮＡの１本鎖ギャップ（ｇａｐ）をαアミラーゼ遺伝子を運ぶベクター内で生成する。その後、所望の変異を得た合成ヌクレオチドが１本鎖ＤＮＡの相同部位へアニールする。残りのギャップはその後ＤＮＡポリメラーゼＩ（クノウェルフラグメント）で満たされて、Ｔ４リガーゼを用いて結合される。
【０１７２】
αアミラーゼコードＤＮＡ配列へ変異を導入する他の方法は、キメラ的に合成されたＤＮＡ鎖をＰＣＲ反応のプライマーの１つとして用いて導入された所望の変異を含むＰＣＲフラグメントの３工程生成を含む。このＰＣＲ生成されたフラグメントから変異を運ぶＤＮＡフラグメントを制限エンドヌクレアーゼで切断して、発現プラスミドに再挿入する。
【０１７３】
変異体を提供する代替的な方法はＷＯ９５／２２６２５（Ａｆｆｙｍａｘ  Ｔｅｃｈｎｉｌｉｇｉｅｓ  Ｎ．Ｖ．）又はＷＯ９６／００３４３（ノボノルディクスＡ／Ｓ）に記載の遺伝子シャッフリング、又は意図する変異、例えば、置換及び／又は欠失を含むハイブリッド酵素を得ることができる技術を含む。
Ｃ．αアミラーゼ変異体の発現
【０１７４】
前述の方法により、又は代替的な方法により生成された変異体をコードしているＤＮＡ配列は、発現ベクターを用いて発現させることができる。このベクターは通常、プロモーター、オペレーター、リボゾーム結合部位、翻訳開示シグナル、及び／又は任意でリプレッサー遺伝子、又は各種活性遺伝子をコードしている制御配列を含む。
【０１７５】
αアミラーゼ変異体をコードしているＤＮＡ配列を運ぶ組換え発現ベクターは組換えＤＮＡに用いることができる任意のベクターであり、ベクターの選択は、ベクターを導入する宿主細胞に依存している。従って、このベクターは自動複製ベクター、即ち、染色体外に存在するベクターであり、その複製は染色体、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、又は染色体外エレメント、ミニ染色体、又は人工染色体の複製から独立している。代替的に、このベクターは、宿主細胞に導入されたときに、宿主細胞のゲノムに統合され、組み込まれる染色体と一緒に複製される。
【０１７６】
ＤＮＡ配列は好適なプロモーター配列に作動可能に結合している。このプロモーターはＤＮＡ配列であり、選択された宿主細胞において転写活性を示し、宿主細胞と相同又は異種のいずれかのタンパク質をコードしている遺伝子由来でよい。αアミラーゼ変異体をコードしているＤＮＡ配列の転写、特にバクテリア宿主細胞における転写、を導くための好適なプロモーターの例としては、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃオペロン、ストレプトマイセスコエリコラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子ｄａｇＡプロモーター、バチルスリケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）αアミラーゼ遺伝子のプロモーター（ａｍｙＬ）、Ｇ．ステアロセレモフィリス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂ．アミミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）αアミラーゼ（ａｍｙＱ）のプロモーター、バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子等である。糸状菌宿主細胞における転写に有用なプロモーターは、アスペルギルスオリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼリゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルスニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）中性αアミラーゼ、アスペルギルスニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）酸安定性αアミラーゼ、アスペルギルスニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、リズムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、アスペルギルスオリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）アルカリプロテアーゼ、アスペルギルスオリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ、又はアスペルギルスニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ由来のものである。
【０１７７】
発現ベクターは好適な転写ターミネーターも含む。真核細胞においては、αアミラーゼ変異体をコードしているＤＮＡ配列に作動可能に結合しているポリアデニレーション配列である。ターミネーション及びポリアデニレーション配列はプロモーターと同じ源由来のものが好ましい。
【０１７８】
ベクターは、意図する宿主細胞中で複製することができるＤＮＡ配列を含む。そのような配列の例としては、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１、及びｐＩＪ７０２の複製起源である。
【０１７９】
このベクターは選択マーカー、例えば、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、又はＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のｄａｌ遺伝子等の宿主細胞中の欠損を補完する遺伝子、又はアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、又はテトラサイクリン耐性を付与するものである。更に、このベクターは、ａｍｄＳ、ａｒｇＢ、ｎｉａＤ、及びｓＣ等のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ選択マーカー、ハイグロマイシン耐性を高めるマーカーであり、例えば、ＷＯ９１／１７２４３に記載の共形質転換により選択することができる。
【０１８０】
細胞内発現は、例えば、宿主細胞として特定のバクテリアを用いた場合には、有効であるが、通常、発現は細胞外であることが好ましい。通常、本明細書で言及するバチルスαアミラーゼは発現されたタンパク質を培養培地に分泌するためのプレ領域を含む。必要であれば、このプレ領域は、別のプレ領域又はシグナル配列に置換され、このことは個々のプレ領域をコードしているＤＮＡ配列の置換により達成される。
【０１８１】
αアミラーゼ変異体、プロモーター、ターミネーター、又は他のエレメントをコードしているＤＮＡ構築体を結合し、複製のために必要な情報を含む好適なベクターにそれらを挿入するのに用いる方法は当業者に知られている。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９参照。）
【０１８２】
ＤＮＡ構築体又は発現ベクターを含む細胞は、αアミラーゼ変異体の組換え生成における宿主細胞として用いられることが好ましい。この細胞は変異体をコードしているＤＮＡ構築体と共に形質転換され、これは好ましくは宿主細胞の染色体におけるＤＮＡ構築体（１つ以上のコピーにおける）を組み込むことにより行われる。ＤＮＡ配列は細胞中ではより安定であるので、組み込みが通常有利であると考えられている。ＤＮＡ構築体の宿主細胞染色体への組み込みは従来の方法、例えば、相同又は異種組み込みにより、行うことができる。代替的に、この細胞は別のタイプの宿主細胞に関係している発現ベクターを用いて、前述のように、形質転換される。
【０１８３】
この細胞は哺乳動物又は昆虫のような高等有機体の細胞でもよいが、バクテリア又は糸状菌（酵母を含む）細胞等の微生物が好ましい。
【０１８４】
好適なバクテリアの例としては、バチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルスリエｋニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，  バチルスレンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、ゲオバチルスステアロセレモフィリス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアルカロフィリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスコアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルスサーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスレンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルスメガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルスツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセスリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、又は  ストレプトマイセスムリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ）等のグラム陽性バクテリア、又はＥ．ｃｏｌｉ等のグラム陰性バクテリアがある。バクテリアの形質転換は、例えば、プロトプラスト形質転換により、コンピテント細胞を既知の方法で用いることにより、行うことができる。
【０１８５】
酵母微生物はサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）又はシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）例えば、サッカロマイセスセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から選択される。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）に属する微生物が好まれ、例としてはアスペルギルスオリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）又はアスペルギルスニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）がある。糸状菌細胞はプロトプラスト形成及びプロトプラストの形質転換を含む工程により形質転換され、次いで既知の方法による細胞壁の再生が行われる。アスペルギルス宿主細胞を形質転換するのに好適な方法はＥＰ２３８０２３に記載されている。
【０１８６】
本発明の組成物及び方法の側面は、変異体アミラーゼの生成を行うための条件下で宿主細胞を培養してαアミラーゼ変異体を生成する工程及び細胞及び培養培地から変異体アミラーゼを回収する工程に関する。細胞の培養に用いる培地は意図する宿主細胞を育成し、αアミラーゼ変異体の発現させることができるのに好適な従来の培地でよい。好適な培地は販売されており、公知のレシピ（例えば、ＡＴＣＣのカタログに記載のように）に基づいて調製することもできる。
【０１８７】
宿主細胞から分泌されたαアミラーゼ変異体は遠心又はろ過、及び硫酸アンモニウム等の塩を用いて培地のタンパク様成分を沈殿させることを含む、既知の方法により、培地から細胞を分離し、次いで、エクスチェンジクロマトグラフィー、又は親和クロマトグラフィー等のクロマトグラフ法を用いて、培養培地から回収される。
ＶＩ．工業的応用
【０１８８】
本発明αアミラーゼ変異体は各種工業製品に有用な性質を有している。例えば、本発明の変異体はデンプン液化（例えば、米国特許Ｎｏ．３，９１２，５９０、ＥＰ特許出願Ｎｏｓ．２５２７３０及び６３９０９、ＷＯ９９／１９４６７、及びＷＯ９６／２８５６７、これらの文献を参照により本明細書に援用する）のような、デンプン処理／添加に用いられる。本発明の変異体は更にデンプン又は全粒穀物からの燃料用、飲料用、及び工業用エタノール等の甘味料及びエタノールの生成に有用である（例えば、米国特許Ｎｏ．５，２３１，０１７参照）。本発明の変異体はビール製造又は醸造に有用である。この変異体は、組成物中に用いることができ、この組成物は好適な緩衝剤、安定剤、防腐剤等のほかに、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、及び他のαアミラーゼを更含んでいてもよい。
【０１８９】
本発明のアミラーゼ変異体は洗剤組成物の成分として、洗濯、食器洗浄、及び硬表面洗浄において有用である。この変異体はテキスタイル、ファブリック、及びガーメント等のダサイジング（例えば、ＷＯ９５／２１２４７、米国特許Ｎｏ．４，６４３，７３６，ＥＰ１１９，９２０参照。これらの文献を参照により本明細書に援用する）、及びパルプ及び製紙工業において有用である。
【０１９０】
本発明の組成物及び方法のこれらの他の使用については以下でより詳細に説明する。
Ａ．穀物処理及びデンプン転換製品
【０１９１】
穀物処理製品及びデンプン転換製品は３つのカテゴリーに分けることができる。即ち、（１）デンプンを例えば、マルトデキストリン、デキストロース、及びフルクトース高含有シロップに転換する一般的なデンプン転換、（２）エタノール生成、及び（３）ビール醸造。これらの方法に含まれる数多くの工程は同じであるが、これらを別々に説明する。幾つかの態様において、変異体αアミラーゼはフィターゼと組み合わせて用いる（４）。これらの製品を製造するための組成物も説明される（５）。
１．一般的なデンプン転換
【０１９２】
液化及び糖化等の従来のデンプン転換工程は、例えば、米国特許Ｎｏ．３，９１２，５９０、及びＥＰ特許出願Ｎｏｓ．２５２７３０及び６３９０９に記載されている。これらの文献を参照により本明細書に援用する。一般的に、デンプン転換工程はデンプンをより低分子量の炭水化物成分に分解する。そのようなデンプンを糖へ転換する場合、デンプンは予備処理工程及び２つ又は３つの連続的処理工程、即ち、液化工程、糖化工程、及び意図される最終生成物に応じて、任意で異性化工程、を含む連続工程で、解重合される。
【０１９３】
ａ．天然／生デンプンの前処理
ミクロサイズの顆粒からなる天然／生デンプンは室温では不溶性である。水性デンプンスラリーを加熱した時、顆粒は膨潤して、時たま破裂し、デンプン分子が水溶液中に分散する。この「ゼラチン化」工程の間に粘度が劇的に上昇する。典型的な工業プロセスでは固形含量レベルは、３０乃至４０％であるので、デンプンを希釈又は「液化」して、操作しやすくしなければならない。このために粘度を低くすることは、酵素的分解により簡単に行うことができる。
ｂ．液化
【０１９４】
液化工程の間、長い鎖デンプン分子が、αアミラーゼにより、より短い分岐及び直鎖分子（マルトデキストリン）へと分解される。この液化工程は１０５乃至１１０℃で５分間、次いで９５℃で１乃至２時間行われる。ｐＨは通常約５．５乃至約６．２である。これらの条件下における工学的酵素安定性を確実にするために、１ｍＭのカルシウムが通常添加される（４０ｐｐｍの遊離カルシウムイオン）。この処理の後、液化されたデンプンは１０乃至１５のデキストロース当量（ＤＥ）を示す。
【０１９５】
ｃ．糖化
液化工程の後、このマルトデキストリンはグルコアミラーゼ（例えば、ＯＰＴＩＤＥＸ（商標）Ｌ−４００）及びイソメラーゼ（米国特許Ｎｏ．４，３３５，２０８）又はプルラナーゼ等の脱分岐酵素の添加によりデキストロースへ転換される。この工程の前に、高温を維持して（約９５℃）、ｐＨを約４．５以下に下げ、液化αアミラーゼを不活性化して、「パノース前駆体」といわれる短鎖オリゴサッカライドを形成させないようにする。この「パノース前駆体」は脱分岐酵素により加水分解できない。温度を６０℃にまで下げて、グルコアミラーゼ及び脱分岐酵素を添加する。この糖化工程は２４乃至７２時間行われる。
【０１９６】
通常、液化工程の後にαアミラーゼを変性する場合、糖化生成物の約０．２乃至０．５％が、プルラナーゼにより分解することができない、分岐トリサッカライド、Ｇｌｃｐａｌ−Ｇｌｃｐａｌ−４Ｇｌｃ（パノース）である。もし、液化工程からの活性アミラーゼが糖化工程の間に存在すると、（即ち、変性されていない）、パノースのレベルは１乃至２％にまで高くなり、このレベルは糖化工程での生産性を低めるので非常に好ましくない。
ｄ．異性化
【０１９７】
最終的に得られる所望の糖が、例えば、フルクトース高含有シロップ等のデキストロースシロップである場合、糖化工程の後に、ｐＨを約６乃至８の範囲、好ましくは７．５に高め、イオン交換によりカルシウムを除去する。このデキストロースシロップは、例えば、固定化されたグルコースイソメラーゼ（ＧＥＮＳＷＥＥＴ（商標）ＩＧＩ−ＨＦ）等を用いて、フルクトース高含有シロップへと転換される。
２．エタノール生成
【０１９８】
一般的に、全粒穀物からのアルコール（エタノール）生成は、４つの工程に分けられる。即ち、（ａ）粉砕、（ｂ）液化、（ｃ）糖化、及び（ｄ）発酵である。これらの工程の幾つかは前述と同じである。
ａ．粉砕及びスラリー生成
【０１９９】
穀粒、コーン、マイロ等のデンプン含有基質を粉砕して、構造を壊し、更に処理しやすくする。用いられる２つのプロセスは、通常、湿式及び乾式粉砕である。乾式粉砕において、全粒穀物を粉砕し、このプロセスの残りの部分に用いる。湿式粉砕は胚及び粗引き粉（デンプン顆粒とタンパク質）の好適な分離を提供することができ、若干の例外を除いて、シロップを同時生産することができる。
【０２００】
粉砕されたデンプン含有物質は水及び蒸留残渣を組み合わせ、水性シロップとなる。このスラリーは１５乃至５５％ｄｓｗ／ｗ（例えば、２０乃至５０％、２５乃至５０％、２５乃至４５％、２５乃至４０％、２０乃至３５％、及び３０乃至３６％ｄｓ）を含む。再利用された蒸留残渣（バックセット）は通常１０乃至７０％ｖ／ｖ（例えば、１０乃至６０％、１０乃至５０％、１０乃至４０％、１０乃至３０％、１０乃至２０％、２０乃至６０％、２０乃至５０％、２０乃至４０％、及び２０乃至３０％）の範囲である。２５乃至４０％ｄｓが一般的である。
【０２０１】
一旦、粉砕されたデンプン含有物質が水及びバックセットと組み合わされた後は、ｐＨは通常このスラリーにおいて、調整されない。更に、ｐＨはフィターゼ（以下参照）及びαアミラーゼをこのスラリーに添加した後でも、調整されない。このスラリーのｐＨは通常ｐＨ４．５乃至６．０未満である（例えば、ｐＨ４．５−５．８、ｐＨ４．５―５．６、ｐＨ４．８−５．８、ｐＨ５．０−５．８、ｐＨ５．０−５．４、ｐＨ５．２−５．５、及びｐＨ５．２―５．９）。このスラリーのｐＨはスラリーに添加される蒸留残渣の量及び蒸留残渣に含まれる物質のタイプに依存して、ｐＨ４．５乃至５．３の間である。例えば、蒸留残渣のｐＨはｐＨ３．８及び４．５の間である、表Ｂは１５５ｏＦで２時間撹拌した後に、全粒コーンスラリー（３２％ｄｓ）に蒸留残渣を添加した量に応じたｐＨ変化を示す。
0005492879.tif 000048
（表Ｂ  蒸留残渣の添加量の増加に伴うｐＨ変化）
【０２０２】
エタノール生成の間に、蒸留前、ビールに酸を添加して、ｐＨを低くして、微生物汚染のリスクを減らす。
【０２０３】
幾つかのケースにおいて、フィターゼをスラリーに添加する。フィターゼは以下でより詳細に説明する。幾つかのケースにおいて、αアミラーゼがこのスラリーに添加される。幾つかのケースにおいて、フィターゼ及びαアミラーゼをこのスラリーに連続的に添加する。幾つかのケースにおいて、フィターゼ及びαアミラーゼをこのスラリーに同時に添加する。幾つかのケースにおいて、フィターゼ及びαアミラーゼを含むスラリーを５分から８時間（例えば、５分から６時間、５分から４時間、５分から２時間、及び１５分から４時間）インキュベーション（予備処理）する。他のケースにおいて、このスラリーを４０−１１５℃の範囲の温度で（例えば、４５℃乃至８０℃、５０℃乃至７０℃、５０℃乃至７５℃、６０℃乃至１１０℃、６０℃乃至９５℃、７０℃乃至１１０℃、７０℃乃至８５℃、及び７７℃乃至８６℃）インキュベーションする。
【０２０４】
幾つかのケースにおいて、このスラリーをデンプン含有物質のデンプンゼラチン化温度以下の、０乃至３０℃の温度で（例えば、０乃至２５℃、０乃至２０℃、０乃至１５℃、０乃至１０℃、及び０乃至５℃）、インキュベーションする。幾つかのケースにおいて、この温度は、６８℃以下、６５℃以下、６２℃以下、６０℃以下、更には５５℃以下である。幾つかのケースにおいて、この温度は、４５℃以上、５０℃以上、５５℃以上、及び更には６０℃以上である。フィターゼ及びαアミラーゼを含むスラリーをデンプンゼラチン化温度以下の温度でインキュベーションすることは一次液化とも言われる。
【０２０５】
近年、液化工程で用いられる商業的に利用可能な微生物αアミラーゼは８０℃以上の温度、５．６未満のｐＨで全粒粉砕穀粒を用いた乾燥粉砕プロセスから液化デンプン基質を生成するのに十分な安定性を有していないと信じられている。
ｂ．液化
【０２０６】
液化工程において、４以上のＤＰのマルトデキストリン部分を加水分解することにより、デンプン顆粒を可溶化する。原料は粉砕された全粒穀物又はデンプン処理からのサイド流である。粉砕された及び液化された穀物はマッシュとして知られている。加水分解は酸処理又はαアミラーゼによる酵素処理により行われる。酸加水分解は非常に限られた場合に行われる。
【０２０７】
酵素的液化は通常、３つの高温スラリープロセスとして実施される。このスラリーは６０乃至９５℃（好ましくは７７−８６℃、８０−８５℃、及び８３−８５℃）の間で加熱され、酵素が添加される。その後、このスラリーを９５乃至１４０℃、好ましくは１０５乃至１２５℃で蒸気処理して、６０乃至９５℃に冷却し、追加的な酵素を添加して、最終的な加水分解物を得る。この液化工程は４．０乃至６．０のｐＨ、通常５及び６の間ｐＨで行われる。
【０２０８】
このスラリーをαアミラーゼと、任意でフィターゼと一緒に、６０乃至７５℃の範囲の温度で、５分から２時間の間インキュベーションする。更なる液化工程において、このインキュベーションされた又は前処理されたデンプン含有物質はデンプン含有物質のゼラチン化温度より０乃至４５℃高い温度（例えば、７０℃乃至１２０℃、７０℃乃至１１０℃、及び７０℃乃至９０℃）に、２分乃至６時間（例えば、２分乃至４時間、９０分、１４０分、及び９０分乃至１４０分）、約４．０乃至５．５のｐＨで、より好ましくは１乃至２時間、曝される。この温度は、例えば、１乃至１５分のような短時間、従来の蒸気処理により高くすることができる。その後このデンプンは１５乃至１５０分（例えば、３０乃至１２０分）の間、７５℃乃至９５℃（例えば、８０℃乃至９０℃、及び８０℃乃至８５℃）の範囲の温度で更に加水分解される。このｐＨはこれらの工程の間に調整せず、液化されたマッシュのｐＨは４．０乃至５．８（例えば、ｐＨ４．０乃至ｐＨ５．８、ｐＨ４．８乃至５．４、及びｐＨ５．０乃至５．２）である。幾つかの態様において、熱安定性αアミラーゼの第二投与分が第二液化工程で添加される。他の態様において、これらはαアミラーゼの追加的な投与分ではない。
【０２０９】
本発明のインキュベーション及び液化工程に次いで糖化工程及び発酵工程が行われる。
ｃ．発酵
【０２１０】
液化工程の間に得られた発酵性糖は微生物発酵による、アルコール生成、特にエタノール生成に用いられる。発酵に用いる微生物は最終生成物により異なる。
【０２１１】
通常、エタノールが所望の最終生成物である場合、酵母が発酵微生物として用いられる。幾つかの好適な態様において、エタノール生成微生物は酵母、特にサッカロマイセスセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（米国特許Ｎｏ．４，３１６，９５６）等のサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）株である。各種サッカロマイセスセレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が販売されており、例としてはＦＡＬＩ（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ’ｓ酵母）、ＳＵＰＥＲＳＴＡＲＴ（Ａｌｌｔｅｃｈ）、ＦＥＲＭＩＯＬ（ＤＳＭ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ）、ＲＥＤ  ＳＴＡＲ（Ｌｅｓａｆｆｒｅ）、及びＡｎｇｅｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｙｅａｓｔ（Ａｎｇｅｌ  Ｙｅａｓｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｈｉｎａ）を含むがこれらに限定されない。この方法に用いられる開始酵母の量は好適な時間に商業的に十分な量のエタノールを生成するのに効果的な量である（例えば、７２時間未満に２５乃至４０％ｄｓの基質から少なくとも１つ１０％のエタノールを生成する）。酵母細胞は通常、発酵ブロス１ｍｌ当り１０４乃至１０１２の生菌量で供給され、好ましくは１０７乃至１０１０の生菌量で供給される。発酵は発酵微生物（例えば、酵母）に加え、栄養素、任意フィターゼ含むがこれらに限定されない追加的な酵素を含む。発酵に酵母を使用することは当業者によく知られており。参考文献はＴｈｅ  ＡＬＣＯＨＯＬ  ＴＥＸＴＢＯＯＫ，Ｋ．ＪＡＣＱＵＥＳ  ＥＴＡＬ．，ＥＤＳ．１９９９，ＮＯＴＴＩＮＧＨＡＭ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＰＲＥＳＳ，ＵＫである。酵母発酵は通常２４乃至９６時間、典型的には３５乃至６０時間行われる。発酵の温度は通常２６℃乃至３４℃、例えば、３２℃であり、ｐＨは約３乃至６、好ましくは４乃至５である。
【０２１２】
好適な発酵微生物の使用により、他の最終生成物も得ることができる。これらの非限定的な例としては、グリセロール、１，３−プロパンジオール、グルコネート、２−ケト−Ｄ−グルコネート、２，５−ジケト−Ｄ−グルコネート、２−ケト−Ｌ−グルコネート、スクシニル酸、酪酸、アミノ酸、及びこれらの誘導体がある。例えば、酪酸が所望の最終生成物である場合、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株（ラクトバチルスカゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ））を用いる。グリセロール又は１，３−プロパンジオールが所望の最終生成物である場合、Ｅ．ｃｏｌｉが用いられる。２−ケト−Ｄ−グルコネート、２，５−ジケト−Ｄ−グルコネート、及び２−ケト−Ｌ−グロン酸が所望の最終生成物の場合、パントエアシトレア（Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ）が用いられる。
ｄ．糖化及びＳＳＦ
【０２１３】
液化されたデンプン含有物質はグルコアミラーゼ等の糖化酵素の存在下で糖化される。糖化プロセスは少なくとも１つ１２時間乃至１２０時間、（例えば、１２乃至９０時間、１２乃至６０時間、及び１２乃至４８時間）行われる。しかしながら、約３０分乃至２時間（例えば、３０乃至９０分）、３０乃至６０℃、通常５０℃以上、しばしば６０℃の温度範囲で予備糖化工程を行い、その後発酵の間に完全に糖化される。後者の工程は、同時糖化及び発酵（ＳＳＦ）に好適である。ＳＳＦはエタノール生成において、一般的であり、糖化酵素と発酵有機体（例えば、酵母）と一緒に添加し、７０℃乃至４０℃の温度及び４．２乃至４．８ｐＨ（好ましくは４．５のｐＨで実施する）。
【０２１４】
発酵性糖（例えば、デキストリン類、単糖類、特にグルコース）は酵素的糖化により生成される。これらの発酵性糖は、更に精製され、及び／又は有用な糖生成物に転換される。更に、糖はアルコール（例えば、エタノール及びブタノール）、有機酸（例えば、スクシニル酸及び酪酸）、糖アルコール（例えば、グリセロール）、アスコルビン酸中間体（例えば、グルコネート、２−ケト−Ｄ−グルコネート、２，５−ジケト−Ｄ−グルコネート、及び２−ケト−Ｌ−グルコン酸）、アミノ酸（例えば、リジン）、タンパク質（例えば、抗体及びそれらのフラグメント）等の最終生成物の製造のための微生物発酵プロセスにおける発酵原料として用いられる。
ｅ．蒸留
【０２１５】
任意で、発酵に次いで、アルコール（例えば、エタノール）が蒸留により回収される。エタノールの生成量は、通常少なくとも８％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％（ｖ／ｖ）であり、幾つかのケースにおいて、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％（ｖ／ｖ）である。得られたエタノールは、例えば、燃料エタノール、飲料用エタノール、即ち、ポータブルニュートラルスピリッツ、又は工業用エタノールに用いられる。
ｆ．副生成物
【０２１６】
発酵生成物を取り去ったものは穀物残渣であり、これは通常液体又は乾燥のいずれかの状態で、動物用飼料に用いられる。穀物残渣は「発酵共生成物」といわれる、蒸留乾燥穀物（ＤＤＳ）や蒸留乾燥パルプ可溶化物（ＤＤＧＳ）等の形態をとり、動物用飼料に用いられる。
３．ビール醸造
【０２１７】
本発明の変異体αアミラーゼはビール製造工程にも有用である。通常、好ましくはαアミラーゼはマッシュ工程の間に添加される。デンプン転換の場合と同様に、安定性、特異活性等の観点からこのプロセスでの添加が有利である。
４．変異体αアミラーゼと他の酵素との組み合わせ
【０２１８】
液化、糖化、ＳＳＦ、及び炭水化物処理の全ての側面において、通常、本発明のαアミラーゼポリペプチドは、例えば、追加的αアミラーゼ、グルコアミラーゼ、イソアミラーゼ、βアミラーゼ、マルトジェニックアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、エステラーゼ、オキシダーゼ、ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、クチナーゼ、ラッカーゼ、及び／又はフィターゼ等の１つ以上の追加的な酵素と組み合わせて用いられる。これらの酵素の多くは、洗浄製品の関するセクションでより詳細に説明する。
【０２１９】
フィターゼは穀物及びオイルシードにおいて見られるフィチン酸（フィテート）を分解する能力のある酵素である。フィターゼ及び分解中の中間体はαアミラーゼの作用を阻害又は他の有害な作用を及ぼし、それゆえそれらの効率を減らすと信じられている。
【０２２０】
変異体αアミラーゼと一緒に用いることができるフィターゼはインキュベーション及び液化工程の決められた条件下でフィチン酸を加水分解することができる。幾つかの態様において、フィターゼはイノシトールヘキサフォスヘート（フィチン酸）からの、無機リン酸の少なくとも１つを放出することができる。フィターゼは加水分解を開始するフィテート分子上のリン酸エステル基の特異位置に対する適合性に基づいてグループ分けすることができる（例えば、３−フィターゼ（ＥＣ３．１．３．８）又は６−フィターゼ（ＥＣ３．１．３．２６）。フィターゼの典型的な例としては、ｍｙｏ−イノシトール−フェキサキフォスヘート−３−フォスフォヒドロラーゼがある。
【０２２１】
フィターゼは糸状菌及びバクテリア有機体等の微生物から得ることができる。これらの微生物の幾つかは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株（例えば、アスペルギルスニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルステルレウス（Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルスフカム（Ａ．ｆｉｃｕｍ）及びアスペルギルスフミガタス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ））、マイセリオフトーラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）株（マイセリオフトーラセルモフィラ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）），タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）株（タラロマイセスセルモフィラス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）株（トリコデルマレーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ））、及びセルモマイセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）株（ＷＯ９９／４９７４０）を含む。フィターゼは、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）株，例えば、ペニリシウムホルデイ（Ｐ．ｈｏｒｄｅｉ）（ＡＴＣＣＮｏ．２２０５３）、ペニシリウムピセウム（Ｐ．ｐｉｃｅｕｍ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１０５１９）、又はペニシリウムブレビ−コンパクタム（Ｐ．ｂｒｅｖｉ−ｃｏｍｐａｃｔｕｍ）（ＡＴＣＣＮｏ．４８９４４）からも利用可能である。例えば、米国特許Ｎｏ．６，４７５，７６２参照。更に、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株（例えば、バチスルスブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）株、ペニオフォラ（Ｐｅｎｉｏｐｈｏｒａ）株、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、シトロバクテリア（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｂａｃｔｅｒ）及びブチラキセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）（ＷＯ２００６／０４３１７８参照）からも利用可能である。
【０２２２】
商業的に利用可能なフィターゼはＮＡＴＵＰＨＯＳ（商標）（ＢＡＳＦ）、ＲＯＮＯＺＹＭＥ（商標）Ｐ（ノボザイムＡ／Ｓ），ＰＨＺＹＭＥ（商標）（ＤａｎｉｓｃｏＡ／Ｓ，Ｄｉｖｅｒｓａ）、及びＦＩＮＡＳＥ（商標）（ＡＢ  Ｅｎｚｙｍｅｓ）がある。微生物フィターゼ活性を決定して、フィターゼ単位を定義するための方法は、Ｅｎｇｅｌｅｎら（１９９４）Ｊ．ＡＯＡＣ  Ｉｎｔ．１１：１６０−７６４に記載されている。フィターゼは野生型フィターゼや、これらのフィターゼの変異体又は断片でもよい。
【０２２３】
例示的なフィターゼはブチラキセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｉｅｌｌａ）種に由来する。この種は、ブチラキセラアグレスチツ（Ｂ．ａｇｒｅｓｔｉｓ）、ブチラキセラブレンネラエ（Ｂ．ｂｒｅｎｎｅｒａｅ）、ブチラキセラフェラグチアーゼ（Ｂ．ｆｅｒｒａｇｕｔｉａｓｅ）、ブリラキセラガビニアエ（Ｂ．ｇａｖｉｎｉａｅ）、ブチラキセライザルディー（Ｂ．ｉｚａｒｄｉｉ）、ブチラキセラノアキアエ（Ｂ．ｎｏａｃｋｉａｅ）、及びブチラキセラワームドルディアエ（Ｂ．ｗａｒｍｂｏｌｄｉａｅ）を含む。ブチラキセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）株はＤＳＭＺ、Ｔｈｅ  Ｇｅｒｍａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌ（Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｂｅ  ７Ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，ＤＥ）で入手可能である。登録番号ＮＣＩＭＢ  ４１２４８のブチラキセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）株Ｐ１−２９はフィターゼを得るのに特に有用な株の例である。フィターゼは、ＢＰ野生型、ＷＯ０６／０４３１７８に記載のそれらの変異体、又は２００７年３月６日に出願された米国特許出願公開公報ＵＳ２００８０２２０４９８号に記載の変異体でよい（例えば、表１及び配列番号３）。
【０２２４】
このフィターゼは以下に示すハイブリダーゼーション１９のアミノ酸配列を有するブチラキセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｉｅｌｌａ）フィターゼのＢＰ−１７変異体、又は配列番号１９で定義されるアミノ酸配列に少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２５、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、同一なフィターゼである。
0005492879.tif 000049
（配列番号１９）
【０２２５】
インキュベーション及び／又は液化工程に用いるフィターゼの量（投与量）は０．００１乃至５０ＦＴＵ／ｇｄｓ（例えば、約０．０１乃至２５ＦＴＵ／ｇｄｓ、約０．０１乃至１５ＦＴＵ／ｇｄｓ、約０．０１乃至１０ＦＴＵ／ｇｄｓ、約０．０５乃至１５ＦＴＵ／ｇｄｓ、及び約０．０５乃至５．０ＦＴＵ／ｇｄｓ）である。
５．穀物処理及びデンプン転換のための組成物
【０２２６】
本発明の組成物及び方法の１つの側面は一般的なデンプン転換、アルコール発酵、ビール製造等を含むデンプン転換に用いるための変異体αアミラーゼの１つ以上を含む組成物である。そのような組成物は変異体αアミラーゼの成熟前分解（タンパク質分解）から保護し、貯蔵期間を長くし、概観を改善し、組成物のカラーコードのために選択された、緩衝剤、塩、ミネラル、安定剤、防腐剤、抗微生物剤、顔料、香料等を含む。
【０２２７】
この組成物は、例えば、グルコアミラーゼ及びフィターゼ等を含むデンプン転換に関連する追加的な酵素を更に含んでいてもよい。特定のグルコアミラーゼはＢｏｅｌら（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１０９７−１１０２に記載のアスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｇｉｌｌｉｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のＧ１又はＧ２ＡＭＧ又はＷＯ００／０４１３６  又はＷＯ  ０１／０４２７３に記載のそれらの変異体、ＷＯ９９／２８４４８に記載のタラロマイセスエメルソニ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）由来のＡＭＧ、又はＷＯ  ０６／０６００６２に記載のトリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）由来グルコアミラーゼである。
Ｂ．パルプ及び製紙
【０２２８】
本発明の変異体αアミラーゼはデンプン強化古紙、ダンボールから、パルプ、紙、及びダンボール等のリグノセルロース系の物質の生成に用いられる。ここではリパルピングがｐＨ７以上で行われ、アミラーゼが強化デンプンを分解して、古紙の分解を促進する。本発明の変異体αアミラーゼはデンプンコートされた印刷紙から再生紙を精製する工程に特に有用である。このプロセスはＷ９５／１４８０７に記載のように行われ、（ａ）紙を分解してパルプを生成する工程、（ｂ）工程（ａ）の前、間、又は後にデンプン分解酵素で処理工程、及び（ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）の後パルプからインク分子を分離する工程を含む。
【０２２９】
このαアミラーゼは、酵素的に修飾されたデンプンが、炭酸カルシウム、カオリン、及びクレイ等のアルカリ充填剤を一緒に製紙工程に用いられる場合にも有用である。本発明の変異体αアミラーゼと一緒に用いると、充填剤の存在下でデンプンを修飾することが可能になり、従って、単純化された総合的な工程が可能になる。
Ｃ．テキスタイル、ファブリック、及びガーメントのデサイジング
【０２３０】
本発明の変異体αアミラーゼはテキスタイル、ファブリック、又はガーメントのデサイジングにも有用である。テキスタイルの工業的加工工程において、αアミラーゼは伝統的に、デンプン含有サイズの除去を促進するためのデサイジング工程に補助的に用いられてきた。デンプン含有サイズウェービングの間に濡れた毛糸をコートして保護するために用いられている。ウェービングの後にサイズコーティングを完全に除去することは、布の汚れを落とし、色を落とし、染色する下流の工程を確実に行うために重要である。繊維物質に有害な影響を含まないので、酵素的デンプン分解が他の方法より好ましい。
【０２３１】
処理コストを減らして、工場の処理能力を向上させるために、デサイジング工程は時たま、洗浄及び漂白工程と組み合わされる。伝統的なαアミラーゼは、高いｐＨ及び漂白剤と相性が悪いので、そのようなケースにおいて、１つの酵素的補助、アルカリ又は酸性剤等を用いてデンプンを分解する。デンプンデサイズの非酵素的分解は、刺激の強い薬品を使うので、繊維にダメージを与える。従って、アルカリ溶液中で改善された性能を示す変異体αアミラーゼの使用が好まれる。そのような変異体は、セルロース含有ファブリック又はテキスタイルのデサイジングをするときに、セルラーゼと一緒に、又は別に用いてもよい。
【０２３２】
デサイジング及び漂白工程は当業者に知られている。例えば、そのような工程はＷＯ９５／２１２４７，米国特許Ｎｏ．４，６４３，７３６，ＥＰ１１９，９２０に記載されており、参照により本明細書に援用する。デサイジングに用いる近年の製品としてはジェネンコアのＯＰＴＩＳＩＺＥ（商標）ＦＬＥＸがある。
Ｄ．洗浄及び洗剤組成物
【０２３３】
本発明の変異体αアミラーゼは洗剤組成物に添加することができるので、この組成物の成分として用いることができる。この洗浄組成物は汚れた布及びリンス添加された布用柔軟剤組成物の予備処理に好適な洗濯用添加剤を含む手動又は洗濯機用洗剤に製剤化することができる。洗浄組成物は手洗い用又は食器洗浄機用洗剤、又は一般的な家庭用硬表面洗浄用組成物にも製剤化することができる。一般的にこの変異体αアミラーゼの性質は選択されたｐＨ、他の酵素及び非酵素成分と相性がよい。
【０２３４】
洗剤組成物又は添加剤は、プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシド、他のアミロ分解性酵素（例えば、他のαアミラーゼ）、グルコアミラーゼ、マルトジェニックアミラーゼ、ＣＧＴアーゼ、及び／又はセルラーゼ、マンナーゼ（ＭＡＮＮＮＡＳＴＡＲ（商標）、ダニスコユーエスインク、ジェネンコアディビジョン）、ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、クリナーゼ、及び／又はラッカーゼ等の１つ以上の追加的な酵素を含む。これらの酵素は以下でより詳細に説明する。
【０２３５】
プロテアーゼ：好適なプロテアーゼは有機体由来のものであり、化学的に修飾された又は遺伝子工学的に処理された変異体も含む。このプロテアーゼはセリンプロテアーゼ、又はメタロプロテアーゼでよく、好ましくはアルカリ微生物プロテアーゼ、又はトリプシン様プロテアーゼでよい。アルカリプロテアーゼの例としては、スブチリシン、特に、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のもの、例えば、スブチリシンＮｏｖｏ、スブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、スブチリシン３０９、スブチリシン１４７、及びスブチリシン１６８（ＷＯ８９／０６２７９に記載）がある。トリプシン様プロテアーゼの例としては、トリプシン（例えば、トリ又はウシ由来）、及びＷＯ８９／０６２７０及びＷＯ９４／２５５８３に記載のフサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）プロテアーゼを含む。
【０２３６】
有用なプロテアーゼの例としては、ＷＯ９８／２３７３２、ＷＯ９９／２０７７０、ＷＯ９２／１９７２９、ＷＯ９８／２０１１５、ＷＯ９８／２０１１６、及びＷＯ９８／３４９４６に記載の変異体があり、特に、２７、３６、５７、７６、８７、９７、１０１、１０４、１２０、１２３、１６７、１７０、１９４、２０６、２１８、２２２、２２４、２３５、及び２７４の位置において１つ以上の置換を有する変異体を含む。
【０２３７】
好適な商業的に利用可能なプロテアーゼ酵素はＡＬＣＡＬＡＳＥ（商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）、ＰＲＩＭＡＳＥ（商標）、ＤＵＲＡＬＡＳＥ（商標）、ＥＳＰＥＲＡＳＥ（商標）、及びＫＡＮＮＡＳＥ（商標）（ＮｏｖｏｚｙｍｅｓＡ／Ｓ）、ＭＡＸＡＴＡＳＥ（商標）、ＭＡＸＡＣＡＬ、ＭＡＸＡＰＥＭ（商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴＯＸＰ（商標）、ＦＮ２（商標）、ＦＮ３（商標）、ＦＮ４（商標）（ジェネンコアインターナショナルインク）を含む。
【０２３８】
リパーゼ：好適なリパーゼは糸状菌由来のバクテリアを含み、化学的に修飾された又は遺伝子工学的に処理された変異体を含む。有用なリパーゼの例としては、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）（セルモマイセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）の別名）由来、例えば、ＥＰ２５８０６８及びＥＰ３０５２１６に記載のフミコーララングイノーサ（Ｈ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）セルモマイセスランギグイノーサ（Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ））、あるいはＷＯ９６／１３５８０に記載のフミコーラインソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）；シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）リパーゼ、例えば、シュードモナスアルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）又はシュードモナスシュードアルカリゲネス（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）（ＥＰ２１８２７２）、シュードモナスセパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）（ＥＰ３３１３７６）、シュードモナススツゼリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）（ＧＢ１、３７２，０３４），シュードモナスフルオレセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ），シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）株ＤＳ７０５（ＷＯ９５／０６７２０及びＷＯ９６／２７００２），シュードモナスウィスコンシエンシス（Ｐ．ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）（ＷＯ９６／１２０１２）；バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）リパーセ、例えば、バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｄａｒｔｏｉｓら（１９９３），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１３１，２５３−３６０）、バチスルステアロセレモフィリス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＪＰ６４／７４４９９２）又はバチルスプミラス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）（ＷＯ９１／１６４２２）由来を含む。他の例としては、ＷＯ９２／０５２４９，ＷＯ９４／０１５４１，ＥＰ４０７２２５，ＥＰ２６０１０５，ＷＯ９５／３５３８１，ＷＯ９６／００２９２，ＷＯ９５／３０７４４，ＷＯ９４／２５５７８，ＷＯ９５／１４７８３，ＷＯ９５／２２６１５，ＷＯ９７／０４０７９、及びＷＯ９７／０７２０２に記載のリパーゼ変異体がある。好適な市販のリパーゼはＬＩＰＯＬＡＳＥ（商標）及びＬＩＰＯＬＡＳＥ  ＵＬＴＲＡ（商標）（ノボザイムＡ／Ｓ）を含む。
【０２３９】
アミラーゼ：１つ以上の好ましくは追加的なアミラーゼも含まれる。好適なアミラーゼは（α及び／又はベータ）はバクテリア又は糸状菌由来のものを含み、化学的に修飾された又は遺伝子工学的変異体を含む。アミラーゼの例としては、ＧＢ１，２９６，８３９に記載のバチルスリケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）を含む。有用なアミラーゼの例としては、ＷＯ９４／１８３１４、ＷＯ９６／３９５２８、ＷＯ９４／０２５９７、ＷＯ９４／１８３１４、ＷＯ９６／２３８７３、及びＷＯ９７／４３４２４に記載の変異体であり、特に、１５、２３、１０５、１０６、１２４、１２８、１３３、１５４、１５６、１８１、１８８、１９０、１９７、２０２、２０８、２０９、２４３、２６４、３０４、３０５、３９１、４０８、及び４４４において、１つ以上の置換を有する変異体である。商業的に利用可能なαアミラーゼはＤＵＲＡＭＹＬ（商標）、Ｌ１ＱＵＥＺＹＭＥ（商標）、ＴＥＲＭＡＭＹ（商標）、ＮＡＴＡＬＡＳＥ（商標）、ＦＮＧＡＭＹＬ（商標）、及びＢＡＮ（商標）（ノボザイムＡ／Ｓ）、ＲＡＰＩＤ  ＡＳＥ（商標）及びＰＵＲＡＳＴＡＲ（商標）（ジェネンコア）がある。
【０２４０】
セルラーゼ：好適なセルラーゼはバクテリア又は糸状菌由来のものを含む。化学的に修飾された又はタンパク質工学的に処理された変異体も含まれる。好適なセルラーゼはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）株、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）株、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）株、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）株、シエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）株、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）由来のものであり、例えば、米国特許Ｎｏ．４，４３５，３０７、米国特許Ｎｏ．５，６４８，２６３、米国特許Ｎｏ．５，６９１，１７８、米国特許Ｎｏ．５，７７６，７５７及びＷＯ８９／０９２５９記載のフミコーラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ミセリオフィセラセルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）及びフサリウムオキシオウポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から生成されたセルラーゼを含む。トリコデルマレーシセルラーゼは米国特許Ｎｏ．４，６８９，２９７，米国特許Ｎｏ．５，８１４，５０１，米国特許Ｎｏ．５，３２４，６４９，ＷＯ９２／０６２２１、及びＷＯ９２／０６１６５に記載されている。バチルスセルラーゼは米国特許Ｎｏ．６，５６２，６１２に記載されている。商業的に利用可能なセルラーゼはＣＥＬＬＵＺＹＭＥ（商標）、ＣＡＲＥＺＹＭＥ（商標）（ノボザイムＡ／Ｓ），ＣＬＡＺＩＮＡＳＥ（商標），ＰＵＲＡＤＡＸ  ＨＡ（商標）（ジェネンコアインターナショナルインク）、ＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（花王）を含む。
【０２４１】
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：好適なペルオキシダーゼ／オキシダーゼは植物、バクテリア、又は糸状菌由来のものを含み、化学的に修飾された又は化学的に修飾されたものを含む。有用なペルオキシダーゼの例としては、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）株、例えば、ＷＯ９３／２４６１８、ＷＯ９５／１０６０２、及びＷＯ９８／１５２５７に記載のコプリナスシネレウス（Ｃ．ｃｉｎｅｒｅｕｓ）及びこれらの変異体を含む。商業的に利用可能なペルオキシダーゼはＧＵＡＲＤＺＹＭＥ（商標）（ノボザイムＡ／Ｓ）を含む。
【０２４２】
洗剤酵素は１つ以上の酵素を含む別の添加剤を添加することにより、又はこれらの酵素の全てを含む、組み合わせた添加剤を添加することにより、洗剤組成物に配合することができる。洗浄添加剤は液体、スラリー、バー、タブレッド、粉末、ペースト等として製剤化することができる。例示的な洗浄添加剤組成物は粉塵精製のない顆粒及び安定化された液体又はスラリーである。液体洗剤は水性でもよく。通常７０％までの水を、０乃至３０％の有機溶媒又は非水性溶媒を含む。
【０２４３】
粉塵精製のない顆粒は、例えば、米国特許Ｎｏｓ．４，１０６，９９１及び４，６６１，４５２に記載のように製造することができ、任意で当業者に既知の方法でコートされている。コーティング物質の例としては、ポリ（エチレンオキシド）製品、モル重量１０００乃至２００００（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）；１６乃至５０エチレンオキシド単位のエチレンオキシレートノニルフェノール；１２乃至２０炭素原子数のアルコールを含み、１５乃至８０エチレンオキシド単位のエトキシレートファッティーアルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；及び脂肪酸のモノ−、ジ−、及びトリグリセリドを含む。流動床技術での製造に好適なフィルム形成コーティング物質の例はＧＢ１４８３５９１に記載されている、液体酵素調製は既知の方法に従って、例えば、ポリプロピレングリコース、糖又は糖アルコール、酪酸又はホウ酸により安定化される。保護された酵素はＥＰ２３８，２１６に記載の方法に従って、調製することができる。
【０２４４】
洗浄組成物は通常１つ以上の、非イオン性（準極性のものを含む）、アニオン、カチオン、及び／又は両性の界面活性剤を含む。この界面活性剤は重量により通常０．１％乃至６０％の範囲で含まれる。例示的な界面活性剤の例は、約１％乃至約４０％の直鎖アルキルベンゼンスルホネート、αオレフィンスルホネート、アルキルスルホネート（脂肪アルコールスルフェート）、アルコールエトキシレート、二級アルカンスルホネート、αスルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−又はアルケニルスクシニル酸、又は石鹸等のアミオン界面活性剤、及び／又は約０．２％乃至約４０％のアルコールエトキシレート、ノニルフェニルエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシレート脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミン（グルコアミド）のＮ−アシルＮ−アルキル誘導体等の非イオン界面活性剤を含む。
【０２４５】
洗浄組成物は０乃至６５％の洗浄ビルダー又はゼオライト、ジフォスフェート、カルボネート、シトレート、ニトリロトリアセチック酸、エチレンジアミンテトラアセチックアシド、ジエチレントリ−アミンペン−ｔａアセチックアシド、アルキル又はアルケニルスクシニック酸、可用性シリケート、又は層状シリケート（例えば、ＨｏｅｃｈｓｔのＳＫＳ−６）等の複合剤を含む。洗浄組成物はカルボキシメチルセルロース、ポリ（ビニル−ピロリドン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニリデン−Ｎ−オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリアクリレート、ポリカルボキシレート等のポリカルボキシレート、マレイン／アクリル酸コポリマー、及びラウリルメタアクリル酸コポリマー等の１つ以上のポリマーも含む。
【０２４６】
この洗剤はテトラアセチルエチレンジアミド又はノナノイルオキシベンゼネスルホネート等を組み合わせて過酸を形成する漂白剤となる、過ホウ酸、又は過炭酸等の、Ｈ２Ｏ２源漂白システムを含む。代替的に、この漂白システムはアミド、イミド、又はスルフォンタイプ等のペルオキソ酸を含んでいてもよい。
【０２４７】
洗浄組成物の酵素は、例えば、プロピレングリコール、又はグリセロール、糖又は糖アルコール、酪酸、ホウ酸、又はホウ酸誘導体、例えば、芳香族ホウ酸、又は４−ホルミフフェニルホウ酸等のフェニルホウ酸誘導体等の従来の安定剤を用いて安定化され、例えば、ＷＯ９２／１９７０９及びＷＯ９２／１９７０８に記載の方法で製剤化される。
【０２４８】
この洗浄組成物は布柔軟剤、クレイ、発泡剤、抗凝集剤、汚れ懸濁剤、汚れ再付着防止剤、ダイ、殺菌剤、光学的漂白剤、ハイドロトロープ、変色防止剤、又は香料等の従来の洗浄組成物に用いる成分も含む。
【０２４９】
変異体αアミラーゼは本明細書で説明するアッセイを用いて容易に検出することができる、有効量で存在すべきである。開始点として、１つ（又はそれ以上）の変異体αアミラーゼは洗浄液１リットル当たり０．０１乃至１００ｍｇ、好ましくは０．１乃至１ｍｇの酵素タンパク質になるように添加される。例示的な添加量は洗浄液１リットル当たり０．０５５ｍｇである。
【０２５０】
例示的な食器用洗剤組成物は以下を含む；
１）  粉末自動食器洗浄機用組成物
非イオン界面活性剤  ０．４−２．５％
メタシリケートナトリウム  ０−２０％
ジシリケートナトリウム  ３−２０％
ナトリウム三リン酸  ２０−４０％
炭酸ナトリウム  ０−２０％
過ホウ酸ナトリウム  ２−９％  
テトラアセチルエチレンジイミド（ＴＡＥＤ）１−４％
硫酸ナトリウム  ５−３３％
酵素類  ０．０００１−０．１％
２）  粉末自動食器洗浄機用組成物
非イオン界面活性剤  １−２％  （例えば、アルコールエトキシレート）
ジシリケートナトリウム  ２−３０％
炭酸ナトリウム  １０−５０％
リン酸ナトリウム  ０−５％
無水クエン酸三ナトリウム  ９−３０％
酢酸ニトリロト酸ナトリウム（ＮＴＡ）  ０−２０％
過ホウ酸ナトリウム  一水和物  ５−１０％
テトラアセチルエチレンジイミド（ＴＡＥＤ）  １−２％
ポリアクリレートポリマー  ６−２５％（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー）
酵素類  ０．０００１−０．１％
香料  ０．１−０．５％
水  ５−１０％
３）  粉末自動食器洗浄機用組成物
非イオン界面活性剤  ０．５−２．０％
ジシリケートナトリウム  ２５−４０％
クエン酸ナトリウム  ３０−５５％
炭酸ナトリウム  ０−２９％
重炭酸ナトリウム  ０−２０％
過ホウ酸ナトリウム一水和物  ０−１５％
テトラアセチルエチレンジイミド（ＴＡＥＤ）  ０−６％
マレイン酸／アクリル酸コポリマー  ０−５％
クレイ  １−３％
ポリアミノ酸  ０−２０％
ポリアクリル酸ナトリウム  ０−８％  
酵素類  ０．０００１−０．１％
４）  粉末自動食器洗浄機用組成物
非イオン界面活性剤  １−２％
ゼオライトＭＡＰ  １５−４２％
ジシリケートナトリウム  ３０−３４％
クエン酸ナトリウム  ０−１２％
炭酸ナトリウム  ０−２０％
過ホウ酸ナトリウム一水和物  ７−１５％
テトラアセチルエチレン  ０−３％  
ジアミド（ＴＡＥＤ）ポリマー  ０−４％
マレイン酸／アクリル酸コポリマー  ０−５％
有機リン酸塩  ０−４％
クレイ  １−２％
酵素類  ０．０００１−０．１％
硫酸ナトリウム（１００％にする）
５）  粉末自動食器洗浄機用組成物
非イオン界面活性剤  １−７％
ジシリケートナトリウム  １８−３０％
クエン酸三ナトリウム  １０−２４％
炭酸ナトリウム  １２−２０％
モノペルスルホネート  １５−２１％  
漂白安定剤  ０．１−２％
マレイン酸／アクリル酸コポリマー  ０−６％
ジエチレントリアミンペンタアセチレート  ０−２．５％
ペンタナトリウム塩
酵素類  ０．０００１−０．１％
硫酸ナトリウム、水（１００％にする）
６）  洗浄界面活性剤システムを含む粉末及び液体食器洗浄機用組成物
非イオン界面活性剤  ０−１．５％
オクタデシルジメチルアミンＮ−オキシドヒドレート  ０−５％
８０：２０（重量比）Ｃ１８／Ｃ１６  オクタデシルジメチルアミンのブレンド  ０−４％
Ｎ−オキシド二水和物及びヘキサデシルジメチルアミンＮオキシドジヒドレート
７０：３０（重量比）Ｃ１８／Ｃ１６オクタデシルビス（ヒドロキシエチル）アミンＮ−オキシドアンヒドラス及びヘキサデシルビス（ヒドロエチル）アミンＮ−オキシドアンヒドラス  ０−５％
平均エトキシル化３のＣ１３−Ｃ１５アルキルエトキシスルホネート  ０−１０％
平均エトキシル化３のＣ１２−Ｃ１５アルキルエトキシスルホネート  ０−５％
平均エトキシル化１２のＣ１３−Ｃ１５エトキシル化アルコール  ０−５％  
平均エトキシル化９のＣ１２−Ｃ１５エトキシル化アルコールのブレンド  ０−６．５％
平均エトキシル化３０のＣ１３−Ｃ１５エトキシル化アルコールのブレンド  ０−４％
ジシリケートナトリウム  ０−３３％
トリポリリン酸ナトリウム  ０−４６％
クエン酸ナトリウム  ０−２８％
クエン酸  ０−２９％
炭酸ナトリウム  ０−２０％
過ホウ酸ナトリウム一水和物  ０−１１．５％
テトラアセチルエチレンジイミド（ＴＡＥＤ）  ０−４％
マレイン酸／アクリル酸コポリマー  ０−７．５％
硫酸ナトリウム  ０−１２．５％
酵素類  ０．０００１−０．１％
７）  非水性液体食器洗浄機用組成物
液体非イオン界面活性剤（例えば、アルコールエトキシレート）２．０−１０．０％
アルカリメタルシリケート  ３．０−１５．０％
アルカリメタルホスフェート  ２０．０−４０．０％
グリコール、ポリグリコール、ポリオキシド、グリコエーテルから選択される液体キャリア  ２５．０−４５．０％
安定剤（例えば、リン酸の部分エステル及びＣ１６乃至Ｃ１８アルカノール）  ０．５−７．０％
泡抑制剤（例えば、シリコン）０−１．５％
酵素類  ０．０００１−０．１％
８）  非水性食器洗浄組成物
液体非イオン界面活性剤（例えば、アルコールエトキシレート）  ２．０−１０．０％
ケイ酸ナトリウム  ３．０−１５．０％
アルカリ金属炭酸塩  ７．０−２０．０％
クエン酸ナトリウム  ０．０−１．５％
安定化システム（例えば、細かく粉砕したシリコン及び低分子量のジアルキルポリグリコールエステル）０．５−７．０％
低分子量ポリアクリレートポリマー  ５．０−１５．０％
クレイゲル粘着剤（例えば、ベントナイト）  ０．０−１０．０％
ヒドロキシプロピルセルロースポリマー  ０．０−０．６％
酵素類  ０．０００１−０．１％
高級ライコール、ポリグリコール、ポリオキシド、及びグリコールエステルから選択される液体キャリア（１００％にする）バランス
９）  チキソトロピック液体食器洗浄機用洗剤組成物
Ｃ１２−Ｃ１４脂肪酸  ０−０．５％
ブロックコポリマー界面活性剤  １．５−１５．０％
クエン酸ナトリウム  ０−１２％
トリポリリン酸ナトリウム  ０−１５％
炭酸ナトリウム  ０−８％
アルミニウムトリステアレート  ０−０．１％
クメンスルホン酸ナトリウム  ０−１．７％
ポリアクリレート粘着剤  １．３２−２．５％
ポリアクリル酸ナトリウム  ２．４−６．０％
ホウ酸  ０−４．０％  
ギ酸ナトリウム  ０−０．４５％  
ギ酸カルシウム  ０−０．２％
ｎ−デシルジフェニルオキシドジスルホン酸ナトリウム  ０−４．０％
モノエタノールアミン（ＭＥＡ）  ０−１．８６％
水酸化ナトリウム（５０％）  １．９−９．３％
１，２−プロパンジオール  ０−９．４％
酵素類  ０．０００１−０．１％
消泡剤、香料、水（１００％にする）
１０）  液体食器洗浄機用洗剤組成物
アルコールエトキシレート  ０−２０％
スルホン酸の脂肪酸エステル  ０−３０％
ドデシルスルホン酸ナトリウム  ０−２０％
アルキルポリグリコシド  ０−２１％
オレイン酸  ０−１０％
ジシリケートナトリウム一水和物  １８−３３％
無水クエン酸ナトリウム  １８−３３％
ステアリン酸ナトリウム  ０−２．５％
過ホウ酸ナトリウム一水和物  ０−１３％
テトラアセチルエチレンジイミド（ＴＡＥＤ）  ０−８％
マレイン酸／アクリル酸コポリマー  ４−８％
酵素類  ０．０００１−０．１％
１１）保護された漂白剤粒子を含む液体食器洗浄機用組成物
ケイ酸ナトリウム  ５−１０％
ピロリン酸四カリウム  １５−２５％
トリリン酸ナトリウム  ０−２％
炭酸カリウム  ４−８％
保護された漂白剤粒子（例えば、塩素）５−１０％
ポリマー性増粘剤  ０．７−１．５％
水酸化カリウム  ０−２％
酵素類  ０．０００１−０．１％
水（１００％にする）
１２）１）、２）、３）、４）、６）及び１０）に記載の食器洗浄機用組成物であって、過ホウ酸塩過炭酸塩に置き換えられているもの
１３）ｌ）−６）に記載の食器洗浄機用組成物であって、更にマンガン酵素を含むもの。このマンガン酵素は、例えば、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍａｎｇａｎｅｓｅ  ｃａｔａｌｙｓｔｓ  Ｆｏｒ  ｌｏｗ−ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｂｌｅａｃｈｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６９，１９９４，ｐｐ．６３７−６３９に記載のものでよい。
ＶＩＩ．αアミラーゼの性質を測定するための方法
【０２５１】
このセクションはαアミラーゼの性質を測定するための基本的なアッセイを説明する。追加的なアッセイは実施例のセクションで説明する。
Ａ．フィルタースクリーニングアッセイ
【０２５２】
親アミラーゼ及びＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ様αアミラーゼと比較して、変更された高い又は低いｐＨでの安定性及び／又はＣａ２＋依存条件での安定性を有するＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ様αアミラーゼ変異体のスクリーニングに以下のアッセイを用い得る。
１．高ｐＨフィルターアッセイ
【０２５３】
バチルスライブラリーは１０マイクログラム／ｍｌカナマイシンを含むＴＹアガープレート上のセルロースアセテート（ＯＥ６７，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ，  Ｄａｓｓｅｌ，ＤＥ）―及びニトロセルロースフィルター（Ｐｒｏｔｒａｎ−Ｂａ８５，  Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｄａｓｓｅｌ，ＤＥ）のサンドイッチで３７℃で少なくとも２１時間平板培養する。このセルロースアセテート層はＴＹアガープレート上に位置する。
【０２５４】
各フィルターサンドイッチを、プレートを形成した後でインキュベーションの前に、フィルター上に陽性変異体を局在させるために針を用いて傷をつけた。変異体が結合したニトロセルロースフィルターをｐＨ８．６乃至１０．６のグリシン−ＮａＯＨ緩衝液を含むコンテナに移し、室温でインキュベーションした。（温度は１０乃至６０℃で変更することができる。）このコロニーを有するセルロースアセテートフィルターは、使用するまで、室温でＴＹプレート上で貯蔵する。インキュベーションの後、残りの活性をｐＨ８．６乃至１０．６のグリシン−ＮａＯＨ緩衝液中に１％アガー、０．２％のデンプンを含むプレートで検出する。ニトロセルロースフィルターを含むアッセイプレートはフィルターサンドイッチと同じ方法で印をつけ、２時間室温でインキュベーションした。フィルターを除去した後、のアッセイプレートを１０％ルゴール溶液で染色した。デンプンを分解する変異体を暗青バックグラウンド上のホワイトスポットとして検出し、その後、貯蔵プレート上で同定する。陽性変異体を第一スクリーニングと同じ条件で２回スクリーニングする。
２．低カルシウムフィルターアッセイ
【０２５５】
バチルスライブラリーは１０マイクログラム／ｍｌカナマイシンを含むＴＹアガープレート上のセルロースアセテート（ＯＥ６７，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｄａｓｓｅｌ，ＤＥ）――及びニトロセルロースフィルター（Ｐｒｏｔｒａｎ−Ｂａ８５，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｄａｓｓｅｌ，ＤＥ）のサンドイッチで３７℃で少なくとも２１時間平板培養する。このセルロースアセテート層はＴＹアガープレートの上に位置する。
【０２５６】
各フィルターサンドイッチを特に、プレートを形成した後でインキュベーションの前に、フィルター上に陽性変異体を局在させるために針を用いて傷をつけた。変異体が結合したニトロセルロースフィルターを異なるＥＤＴＡ濃度（０．００１ｍＭ乃至１００ｍＭ）のｐＨ８乃至１０のカルボネート／ビカルボネート緩衝液を含むコンテナに移す。このフィルターを室温で１時間インキュベーションする。コロニーを有するセルロースアセテートフィルターを使用するまで室温でＴＹプレート上で貯蔵する。インキュベーションの後、残余活性を１％アガー、０．２％のデンプンを含むｐＨ８．５乃至１０のカルボネート／ビカルボネート緩衝液を含むプレートで検出する。このニトロセルロースフィルターを有するアッセイプレートをサンドイッチフィルターと同様に印を付け、室温で２時間インキュベーションする。フィルターを除去した後、このアッセイプレートを１０％ルゴール溶液で染色した。デンプンを分解する変異体を暗青バックグラウンド上のホワイトスポットとして検出し、その後、貯蔵プレート上で同定する。陽性変異体を第一スクリーニングと同じ条件で２回スクリーニングする。
３．低ｐＨフィルターアッセイ
【０２５７】
バチルスライブラリーは１０マイクログラム／ｍｌカナマイシンを含むＴＹアガープレート上のセルロースアセテート（ＯＥ６７，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｄａｓｓｅｌ，ＤＥ）―及びニトロセルロースフィルター（Ｐｒｏｔｒａｎ−Ｂａ８５，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｄａｓｓｅｌ，ＤＥ）のサンドイッチで３７℃で少なくとも２１時間平板培養する。このセルロースアセテート層はＴＹアガープレートの上に位置する。
【０２５８】
各フィルターサンドイッチを特に、プレート形成の後でインキュベーションの前に、針で印をつけ、フィルター上の陽性変異体の位置を明らかにする。変異体が結合したこのニトロセルロースフィルターをｐＨ４．５のクエン酸緩衝液を含むコンテナに移し、（野生型からの変異体をスクリーニングする場合）８０℃で２０分インキュベーションし、又は（親αアミラーゼの変異体をスクリーニングする場合）８５℃で６０分インキュベーションする。コロニーを含むこのセルロースアセテートフィルターは使用まで室温でＴＹプレート上に貯蔵される。インキュベーションの後、残りの活性を、ｐＨ６．０のクエン酸緩衝液中に１％のアガー、０．２％のデンプンを含むアッセイプレートで検出する。ニトロセルロースを含むこのアッセイプレートはフィルターサンドイッチと同様に印をつけ、５０℃で２時間インキュベーションする。フィルターを除去した後、このアッセイプレートを１０％ルゴール溶液で染色した。デンプンを分解する変異体を暗青バックグラウンド上のホワイトスポットとして検出し、その後、貯蔵プレート上で同定する。陽性変異体を第一スクリーニングと同じ条件で２回スクリーニングする。
３．二次的スクリーニング
【０２５９】
スクリーニングの後の陽性変異体を貯蔵プレートから採取し、二次プレートアッセイで試験する。陽性形質転換体は５ｍｌのＬＢ＋クロラムフェニコール中、３７℃で２２時間育成した。各陽性形質転換体のバチルス培養物及び対応するバックグラウンドを発現しているクローンをコントロールとして、ｐＨ４．５、９０℃でインキュベーションし、サンプルを０、１０、２０、３０、４０、６０、及び８０分後に採取する。３μＬのサンプルをアッセイプレート上にスポットする。このアッセイプレートは１０％ルゴール溶液で染色する。改善された変異体は、バックボーンよりも残余活性の高い変異体として検出される（アッセイプレートのハローとして検出される）。この改善された変異体は核酸の配列決定により確定される。
Ｂ．未精製変異体の安定性アッセイ
【０２６０】
変異体の安定性は以下のようにアッセイした。解析される変異体を発現しているバチルス培養物を１０ｍｌＬＢ＋クロラムフェニコール中、３７℃で２１時間育成した。８００μＬの培養物を２００μＬのクエン酸緩衝液ｐＨ４．５を混合する。採取時間ポイントの数に対応する７０μＬのアリコートをＰＣＲチューブにいれ、７０℃又は９０℃でＰＣＲ機器中で各種時間ポイント（通常、５、１０、２０、２５、及び３０分）でインキュベーションする。０分のサンプルは高温でインキュベーションしない。サンプルの活性を以下の「αアミラーゼのアッセイ」で説明するように、２０μＬ乃至２００μＬのαアミラーゼＰＮＧ−Ｇ７基質ＭＰＲ３（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  カタログＮｏ．１６６０７３０）に移して測定した。結果を時間対活性のパーセンテージ（０時間に対する）としてプロットするか、特定の時間インキュベーションしたとの残余活性のパーゼンテージとして表す。
Ｃ．αアミラーゼ変異体の発酵及び精製
【０２６１】
関連する発現プラスミドを含むバチスルスブチリス株を以下のように発酵及び精製する。この株は８０℃のストックから１０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢアガープレート上に接種し、３７℃で育成した。コロニーを１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを懸濁した１００ｍｌのＰＳ−１培地を含む５００ｍｌ振とうフラスコに移す。培養物を７３℃、２７０ｒｐｍで５日間培養する。
ＰＳ−１培地の組成：
タピオカ糖  １００ｇ／Ｌ
ダイズミール  １４０ｇ／Ｌ
Ｎａ２ＨＰＯ４，１２Ｈ２Ｏ１０  ｇ／Ｌ
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）ＰＥ６１００  ０．１ｇ／Ｌ
ＣａＣＯ３  ５ｇ／Ｌ
【０２６２】
細胞及び細胞の破片を４５００ｒｐｍ、２０乃至２５分の遠心分離で取り除く。その後、上清をろ過し、完全に透明な溶液を得る。ろ過物を濃縮し、ＦＵフィルター（１０，０００ＭＷろ過膜）で洗浄し、緩衝液を２０ｍＭ酢酸ｐＨ５．５に変える。ＵＦろ過したものをＳ−セファロースＦＦカラムを通して、０．２ＭのＮａＣｌを含む同じ緩衝液中で溶出する。溶出物を１０ｍＭトリスｐＨ９．０で透析し、Ｑ−セファロースＦＦカラムに通して、６カラム容量異常の０−０．３ＭＮａＣｌの直線グラジエントで溶出する。（Ｐｈａｄｅｂａｓアッセイにより測定する）活性を含むフラクションを収集し、ｐＨを７．５に調整し、残りの色を０．５％ｗ／ｖｏｌ活性炭で５分間処理して除去する。
Ｄ．特異活性の検出
【０２６３】
特異活性はＰＨＡＤＥＢ  ＡＳ（商標）アッセイ（ファルマシア）を用いて、酵素１グラム当りの活性をして決定した。取り扱い説明書は以下のようである（以下の「αアミラーゼ活性のアッセイ」参照）。
Ｅ．等電点の決定
【０２６４】
ｐＩは等電点フォーカシング（例えば、ファルマシア，アンフォリン，ｐＨ３．５−９．３）を用いて行う。
Ｆ．安定性の決定
【０２６５】
アミラーゼの安定性は、以下で説明する方法により決定する。
【０２６６】
酵素を関連する条件下でインキュベーションする。サンプルを各種タイムポイント（例えば、０、５、１０、１５、及び３０）で採取し、アッセイ緩衝液（５０ｍＭＢｒｉｔｔｏｎ緩衝液、ｐＨ７．３）で２５倍に希釈剤する（採取したサンプルについて同じ希釈を行う）。アッセイは標準的な条件であるｐＨ３．７、３７℃でＰｈａｄｅｂａｓアッセイ（ファルマシア）を用いて行う。
【０２６７】
インキュベーションの前に測定した活性を対照とする（即ち、１００％）。パーセントの表示はインキュベーション時間のフラクションごとに計算する。表は、例えば、インキュベーションから３０分後の残余活性を示す。
Ｇ．アッセイアミラーゼ活性のアッセイ
１．ＰＨＡＤＥＢＡＳ（商標）アッセイ
【０２６８】
αアミラーゼ活性は基質としてＰＨＡＤＥＢＡＳ（商標）タブレットを用いる方法により決定する。Ｐｈａｄｅｂａｓタブレット（ＰＨＡＤＥＢＡＳ（商標）アミラーゼ試験，ファルマシアダイアグノスティック）はボバインシーラムアルブミンと混合されたデンプンポリマー及び基質の緩衝剤とを混合しタブレットにした架橋された不溶性の青色のデンプン含有ポリマーである。
【０２６９】
１つの測定ごとに、１つのタブレットを５ｍｌの５０ｍＭブリットン−ロビンソン緩衝液（５０ｍＭ酢酸，５０ｍＭリン酸、５０ｍＭホウ酸、０．１ｍＭＣａＣｌ２、ＮａＯＨでｐＨを所望の値に調節する）を懸濁する。この試験は所望の温度のウォーターバス中で行う。試験するαアミラーゼをブリットン−ロビンソン緩衝液で希釈する。１ｍｌの希釈したαアミラーゼ溶液を５ｍｌの５０ｍＭブリットン−ロビンソン緩衝液に加える。αアミラーゼはデンプンを加水分解した所与の可溶性青色フラグメントを生じる。得られた青色溶液の吸光度を、６２０ｎｍで測定し、αアミラーゼ活性を計算する。インキュベーションの１０又は１５分後の６２０ｎｍの吸光度を測定することが重要である。この吸光度の範囲は活性と吸光度（Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｂｅｅｒ法）の間の直線性を示す。酵素の希釈率をこの基準に当てはめなければならない。特定の条件のセット（温度、ｐＨ、反応時間、緩衝液条件）の下において、所与のαアミラーゼ１ｇが特定量の基質を加水分解し、青色を呈する。色の強度は６２０ｎｍで測定される、この吸光度の測定は所与のセットの条件におけるこのαアミラーゼの特異活性に直接比例する。
２．代替法
【０２７０】
αアミラーゼ活性はＰＮＰ−Ｇ７基質を用いる方法でも決定できる。ＰＮＰ−Ｇ７はｐ−ニトロフェニル−α，Ｄ−マルトヘパトシドの省略形であり、エンドアミラーゼにより切断されるブロックオリゴサッカライドである。切断に続いて、キットに含まれるα−グルコシドが基質を消化して、遊離ＰＮＰ分子を放出する。この分子は黄色であり、λ＝４０５ｎｍ（４００乃至４２０ｎｍ）の分光光度計で測定される。ＰＮＰ−Ｇ７基質及びα−グルコシダーゼを含むキットはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ（カタログＮｏ．１０５４６３５）により製造されている。
【０２７１】
試薬溶液を調製するために、１０ｍｌの基質／緩衝液を５０ｍｌの酵素／緩衝液溶液に説明書に従って添加する。このアッセイは２０μＬのサンプルを９６ウェルのマイクロタイタープレートに移して、２５℃でインキュベーションする。２５℃で前もって平衡化しておいた２００μＬの試薬溶液を添加する。この溶液を混合し、１分予備インキュベーションし、ＥＬＡＩＳＡリーダーにおいてＯＤ４０５ｎｍで、各３０秒ずつ４分間測定する。
【０２７２】
時間に依存している吸光度カーブの傾斜は所与のセット条件下での意図するαアミラーゼの活性に直接比例している。
Ｈ．ＬＡＳ感受性の決定
【０２７３】
変異体を異なる濃度のＬＡＳ（直鎖アルキルベンゼンスルホネート、Ｎａｎｓａｌ、１１６９Ｐ）で、４０℃で１０分インキュベーションする。残余活性をＰＨＡＤＥＢＡＳ（商標）アッセイ又はＰＮＰ−Ｇ７基質を用いる代替的な方法で決定する。ＬＡＳは０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．５で希釈剤する。以下の濃度を用いた：５００ｐｐｍ、２５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、２５ｐｐｍ、及び１０ｐｐｍＬＡＳ。
【０２７４】
この変異体を総量１０ｍｌ中０．０１乃至５ｍｇ／ｍｌの濃度へと異なるＬＡＳ濃度の緩衝液で希釈し、温度を制御したウォーターバス中で１０分間インキュベーションする。少量のサンプルアリコートを冷却したアッセイ緩衝液に移すことによりインキュベーションを停止する。測定する活性に影響を与えないために、活性測定中はＬＡＳ濃度は１ｐｐｍ以下であることが重要である。
【０２７５】
その後、残余活性をＰＨＡＤＥＢＡＳ（商標）アッセイ又は代替法で決定する。この活性はブランクを引いたあとで測定される。ＬＡＳに曝されていないサンプルの活性を１００％とする。
Ｇ．フィターゼ活性（ＦＴＵ）の決定
【０２７６】
フィターゼ活性は無機リン酸の放出により測定する。この無機リン酸は酸性モリブデン試薬と結合して黄色になり、この黄色の複合体が分光光度計において４１５ｎｍで測定され、放出された無機リン酸がリン酸の標準曲線を用いて定量化できる。フィターゼ１単位（ＦＴＵ）はヨーロッパ標準における所与の反応条件下（ＣＥＮ／ＴＣ  ３２７，２００５−ＴＣ３２７ＷＩ００３２７０ＸＸ）で１分間に、フィテートから無機リン酸１マイクロモル放出する酵素の量である。
Ｈ．フィチン酸含量の決定
【０２７７】
フィチン酸含量を決定するために、フィチン酸を（もし乾燥サンプルであれば）５％スラリーのｐＨを１０に調整することによりサンプルから抽出し、イオン交換カラムを用いたＨＰＬＣ法により含量を決定する。フィチン酸はＮａＯＨグラジエントシステムを用いてカラムから溶出される。液体中のフィチン酸含量はフィチン酸標準と比較して計算される。
【０２７８】
本発明の組成物及び方法は以下の実施例でより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。本明細書において引用される文献はその記載の全てを参照により本明細書に援用する。
【実施例】
【０２７９】
以下の開示及び実施例において、以下の略語を用いる。ｗｔ％（重量パーセント）；℃（摂氏）；Ｈ２Ｏ（水）；ｄＨ２Ｏ（脱イオン水）；ｄＩＨ２Ｏ（脱イオン水、ミリＱろ過）；ｇ又はｇｍ（グラム）；μｇ（マイクログラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｋｇ（キログラム）；μＬ及びμｌ（マイクロリットル）；ｍＬ及びｍｌ（ミリリットル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；Ｍ（モル）；ｍＭ（ミリモル）；μＭ（マイクロモル）；Ｕ（単位）；ＭＷ（分子量）；ｓｅｃ（秒）；ｍｉｎ（ｓ）（分）；ｈｒ（ｓ）（時間）；ＤＯ（溶存酸素）；Ｗ／Ｖ（重量対容量）；ｗ／ｗ（重量対重量）；Ｖ／Ｖ（容量対容量）；ＩＫＡ（ＩＫＡ  Ｗｏｒｋｓ  ｉｎｃ．２６３５  Ｎｏｒｔｈ  Ｃｈａｓｅ  Ｐａｒｋｗａｙ  ＳＥ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ）；ジェネンコア（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）；Ｎｃｍ（ニュートンセンチメートル）、ＥＴＯＨ（エタノール）；ｅｑ（等量）；Ｎ（ノルマル）；ｄｓ又はＤＳ（乾燥固形含量）、ＳＡＰＵ（分光光度のプロテアーゼ単位、１ＳＡＰＵはアッセイ条件下でカゼインから１分間に１マイクロモルのトリプシンを放出するプロテアーゼ酵素の量である）ＧＡＵ（グルコアミラーゼ単位、ｐＨ４．２及び６０℃において可溶性基質から１時間当たりグルコースとして還元糖を１ｇ生成する酵素の量であると定義される）。
実施例１
変異体の構築
【０２８０】
ＡｍｙＳの成熟配列の変異体を部位変異誘発法を用いて構築した。例として、Ｓ２４２変異体を以下のように構築した。
【０２８１】
変異体のテンプレートはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）のｄａｍ−メチラーゼを用いたメチル化ｐＨＰＬＴ−ＡｍｙＳ（図２参照）である。変性プライマー（Ｓ２４２Ｆ（前方向）及びＳ２４２Ｒ（後ろ方向）（以下に示す）を合成し、この反応において結合のために５’リン酸を含む前方向及び後ろ方向の配列の両方で、Ｏｐｅｒｏｎ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）において、１０μＭに希釈した。親αアミラーゼの配列を配列番号２に示す。標的位置においてＮＮ（Ｇ／Ｃ）でランダマイズされたオリグヌクレオチドプライマーを用いるＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＱＵＩＫ−ＣＨＡＮＧＥ（商標）Ｍｕｌｔｉ−ｓｉｔｅキットでライブラリーを生成した。選択されたアミノ酸（例えば、Ｓ２４２）を１９の可能な代替物とランダムに置換した。
変異のためのＳ２４２プライマー：
0005492879.tif 000050
反応は以下のように行った：
クイックチェンジ反応
【０２８２】
反応物は１８μＬの蒸留Ｈ２Ｏ、２．５μＬの１０ｘキット緩衝液、１．２５μＬの前方向プライマー（１０μＭストック）、１．２５μＬの後ろ方向プライマー（１０μＭストック）、１μＬのｐＨＰＬＴ−ＡｍｙＳプラスミドＤＮＡ（テンプレートとして）（〜７０ｎｇ）、及び１μＬのキットの酵素ブレンド、総量で２６．５μＬからなる。
サイクル条件
【０２８３】
サイクル条件は９５℃で１分を１回、その後、９５℃１分、５５℃１分、６５℃１０分を２５サイクル行う。１μＬＤｐｎＩ（１０Ｕ／μＬ）をこのＭｕｌｔｉ−ｓｉｔｅ  Ｑｕｉｋ−  Ｃｈａｎｇｅ反応混合物に添加して、３７℃で１８時間インキュベーションして、その後他の０．５μＬを添加して３時間インキュベーションを続けた。
【０２８４】
１μＬのＤｐｎＩ消化反応物をＴｅｍｐｌｉｐｈｉ増幅キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いるローリングサイクル増幅に、テンプレートとして用いて、アマシャムの説明書に基づいて反応を行った。１μＬのローリングサイクルＤＮＡを１００μＬのバチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）コンピテントセル（２つのプロテアーゼを欠失させたバチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株（△ａｐｒＥ，△ｎｐｒＥ，ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｎｉＫ−ｐｈｌｅｏ））へ形質転換し、１時間３７℃で振とう培養した。全ての形質転換をＬＡ＋１０ｐｐｍＮｅｏ＋１％不溶性デンプンプレート上で平板培養し（２５μＬ一プレート、７５μＬ他のプレート）、３７℃で一晩インキュベーションした。６９の形質転換体をマイクロタイタープレート中の１５０μＬのＬＢ＋１０ｐｐｍＮｅｏに採取し、３７℃で一晩育成した。一晩培養したプレートをラージＬＡ＋１０ｐｐｍＮｅｏ＋１％不溶性デンプンプレート上に９６ピン複製ツールでスタンプして、コロニーＰＣＲのためのＱｕｉｎｔａｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を行い、配列決定した。
【０２８５】
変異体の配列決定を行った後、この変異体を１２５μＬのＬＢ＋１０ｐｐｍＮｅｏを含む９６ウェルマイクロタイタープレートへ採取して、コントロールと共に４つ一組の配列とした。配置させたマイクロタイタープレートを３７℃、２５０ｒｐｍで、６時間育成した。複製ツール（Ｅｎｚｙｓｃｒｅｅｎ，Ｌｅｉｄｅｎ，ＴＨＥ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて、このマイクロタイター培養プレートをタンパク質発現のためのＭＢＤ培地（Ｇ．Ｖｏｇｔｅｎｔａｎｚら，Ａ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｓｏｙｂｅａｎ  Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，  Ｐｒｏｔ．  Ｅｘｐｒ．＆Ｐｕｒｉｆ．，５５（２００７）４０−５２  ）の１５０μＬを含む新しいマイクロタイタープレートへ接種し、タンパク質発現のために５ｍＭのＣａＡＣｌ２で懸濁した。発現プレートは７０％の湿度で３７℃、２５０ｒｐｍで６４時間育成された。発現培地をマイクロフィルタープレート（０．２２μｍ，ミリポア，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を通して次にろ過し、改善された熱安定性のスクリーニングに用いた（実施例３参照）。
ＡｍｙＳライブラリー
【０２８６】
以下のＡｍｙＳ変異体についての部位評価ライブラリーを生成した：
0005492879.tif 000051
実施例２
変異体の発現、精製、及び特徴付け
【０２８７】
コロニーをマイクロタイタープレートからストリークし、１０ｐｐｍネオマイシンを含むデンプンプレート上に置いた。このプレートを３７℃で一晩インキュベーションし、１つづつのコロニーを採取し、培地（以下参照により本明細書に援用する。及び２０ｐｐｍネオマイシンを含む振とうフラスコ（２０ｍｌの培地を含む２５０ｍｌの）に用いた。これらを３７℃、２７５ｐｐｍで約８時間、（ＯＤ６００ｎｍになるまで）育成した。培地ブロスを５０％グリセロールと２：１の割合で混合するときに、それらを別々のラベルされた培地バイアルへ置き、−８℃で冷凍した。これらのグリセロールストックから選択されたアミラーゼの以降の育成がなされた。
【０２８８】
アミラーゼの発酵は１％（ｗ／ｖ）ソイトンを含むＭＯＰＳ（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９７４）１１９（３）：７３６−７４７）を最小培地中で、５００ｍｌ振とうフラスコにおいて、３７℃、６０時間行った。疎水相互クロマトグラフィー法を用いて、発酵ブロスから酵素を精製した。簡単に説明すると、ブロスを１０倍濃縮し、その後、１Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭＭＥＳ、２ｍＭＣａＣｌ２、ｐＨ６．８で希釈して、ガラス繊維フィルターで滅菌ろ過した。その後、サンプルを同じ緩衝液で予備平衡化したフェニルセファロースＦＦ高密度カラム（２０ｘ９５ｍｍ；Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＢＩＯ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）に導入した。非アミラーゼタンパク質を、１０倍カラム量の硫酸アンモニウムを含まない同じ緩衝液で洗浄、除去し、ついで５カラム容量の水で洗浄した。最後に所望の酵素を４０％プロピレングリコールを含む、５０ｍＭＭＥＳ、２ｍＭＣａＣｌ２、ｐＨ６．８で溶出した。
【０２８９】
タンパク質濃度は標準的な提供ＤＳＤページゲルデンシトメトリー法又はＭｅｇａｚｙｍｅ（Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ）からの標準的なアミラーゼアッセイキットを用いた活性測定のいずれかにより決定した。アッセイは精製アミラーゼ（バチルス７０７アミラーゼ、配列番号６）を用いて作成された標準曲線を用いて、タンパク質濃度を換算した。
実施例３
変性された性質の決定
【０２９０】
この実施例は本発明の変異体が親αアミラーゼに対して修飾された性質を有していることを示す。Ｇ．ステアロセレモフィリスαアミラーゼ（ＡｍｙＳ）変異体の高い熱安定性のスクリーニングを行った。
【０２９１】
熱ストレス条件を調査し、熱ストレス後に、開始野生型酵素が熱ストレスを受けていないときの活性の約４０％になるように（即ち、熱ストレス後の活性／熱ストレス前の活性が約０．４である）、選択した。変異体のライブラリーを４つ一組でスクリーニングし、同じ野生型酵素の平均残余活性よりも標準偏差の２倍より高いものを可能性のある好適な変異体とした。
【０２９２】
アミラーゼ発現は発現プレートの培地の上清中約１００ｐｐｍであった。高湿シェーカー中３７℃で６０乃至６５時間の育成の後、培地上清をフィルタープレートを用いて培養物質と分けて透明にした。この透明な培地を５０ｍＭＮａＯＡｃ／２．６ｍＭＣａＣｌ２／０．００２％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ５．８を含む緩衝液で１０倍に希釈して、最終濃度を１０ｐｐｍにした。上清の１つのアリコートを０．０２ｐｐｍまで更に希釈して、変異体酵素の活性を蛍光ラベルしたコーンスターチ基質用いて以下で説明するように決定した。５０ｍＭＮａＯＡｃ／２．６ｍＭＣａＣｌ２／０．００２％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ５．８を含む緩衝液で０．０２ｐｐｍで希釈する前に、上清の第二のアリコートをサーモサイクラーで９０℃の熱ストレス下で３０分過熱し、以下と同様の基質及びアッセイを用いて残余活性をアッセイした。
【０２９３】
アミラーゼ活性は、説明書に従って、アミラーゼＥｎｚＣｈｅｃｋアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）を用いて決定した。このアッセイにおけるアミラーゼの最終濃度は約０．０２ｐｐｍである。緩衝液は５０ｍＭＮａＯＡｃ／２．６ｍＭＣａＣｌ２／０．００２％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ５．８であった。基質はＢＯＤＩＰＹ蛍光剤を結合させたＤＱ（商標）コーンスターチ１００μｇ／ｍＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  −  Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）であった。アミラーゼ活性を示す高い蛍光性はＳｐｅｃｔｒｐｍａｘＭ２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて測定した。動的モードの機械的な記録を用いて、５分間室温で反応をモニタリングした。励起波長は４８５ｎｍで、発光波長は２５０ｎｍで、５１５ｎｍのカットオフフィルターを用いた。
【０２９４】
野生型ＡｍｙＳ（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ）は９５℃で３０分熱ストレス下においた後に３３乃至４３％の残余活性を示した。ＡｍｙＳ変異体であるＳ２４２Ａ及びＳ２４２Ｑは、同じ熱ストレス下でそれぞれ５５乃至６５％及び７０乃至８０％の残余活性を示した。図３及び表３−１参照。これらの残余活性測定値はこの２つの変異体が野生型αアミラーゼよりも高い熱安定性を有することを示す。幾つかの変異体はライブラリーから消えた。このことは消し線で示した。その代わり、野生型（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ）を置いた；（ＷＴ）は代わりに置かれた野生型を示す。各プレートは対照としてＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａを含む。
0005492879.tif 000052
（表３−１）
実施例４  ＤＣＳによる修飾された性質の決定
【０２９５】
ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ、Ｓ２４２Ａ、及びＳ２４２Ｑを疎水相互作用クロマトグラフィーを用いて振とうフラスコ発酵ブロスから精製した。このタンパク質を４０％プロピレングリコール及び２ｍＭＣａＣｌ２を含む５０ｍＭＭＥＳを用いて、精製形態で、このカラムから溶出した。
【０２９６】
過度の熱キャパシティー曲線を超高感度ミクロカリーメーター、ＶＰ−ＣａｐＤＳＣ（ＭｉｃｒｏＣａｌ，Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を用いて測定した。ＤＳＣ測定についての標準的手順及びこの技術の理論は公開されている（Ｆｒｅｉｒｅ，Ｅ．（１９９５）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．４１，１９１−２１８）。約５００μＬの、０．５ｍｇ／ｍｌ野生型バチルスステアロセレモフィリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）αアミラーゼ又は変異体Ｓ２４２Ｓ及びＳ２４２Ｑ（２ｍＭ塩化カルシウムを加えた場合と加えない場合において）を３０乃至１２０℃温度範囲をスキャンした。同じサンプルをこの方法の可逆性をチェックするために再スキャンした。用いた緩衝液は１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．５であった。２００℃／ｈｒスキャン速度を用いて凝集に起因するアーティファクトを最小化した。ＤＳＣカーブの熱中点（Ｔｍ）を熱安定性のインジケーターとして用いた。表４−１は試験されたアミラーゼタンパク質についての熱融点を示す。この熱融点曲線及び野生型及びアミラーゼ変異体の融点を図５に示す。
【０２９７】
２ｍＭ塩化カルシウムを加えた場合と加えない場合の有無において、アミラーゼ変異体Ｓ２４２Ａ及びＳ２４２Ｑの熱折り畳みを野生型と比較したときの変異体の融点の増加を示す。塩化カルシウムを添加しない場合において、この野生型アミラーゼは１００．８℃の融点を有する。一方Ｓ２４２Ａ及びＡ２４２Ｑはそれぞれ１０６．５℃及び１１０．１℃であった。従って、Ｓ２４２をＡで置換すると５．７℃、Ｔｍが増加し、Ｓ２４２をＱで置換するとＴｍが９．３℃増加する。
【０２９８】
２ｍＭ塩化カルシウムの存在下において、特徴づけられた野生型アミラーゼは１０６．８℃の熱融点を有する、一方Ｓ２４２Ａ及びＳ２４２ＱのＴｍはそれぞれ１１１．８℃及び１１３．８℃であった。従って、２ｍＭの塩化カルシウムの存在下において、これら３つのタンパク質は高められたＴｍの値を示す。野生型及びＡ２４２ＡのＴｍにおける増加はそれぞれ、６℃及び５．３℃であった。Ｓ２４２ＱのＴｍにおける増加は３．７℃であった。このことは、Ｓ２４２Ｑ変異体がカルシウムにより不安定になり、安定性についてカルシウムに依存していることを示している。塩化カルシウムの存在下での野生型に対するＳ２４２Ａ及びＳ２４２ＱのＴｍの増加分はそれぞれ、５℃及び３℃であった。このことは、変異体の熱力学的性質はＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａのものとは異なり、応用研究（実施例５参照）における高められた性能と一致する。
0005492879.tif 000053
（表４−１）
実施例５
活性プロファイル
【０２９９】
この実施例は試験された変異体が親αアミラーゼだけでなく、工業的標準物質に対しても修飾された活性プロファイルを有することを示す。タンパク質の検出は精製された又は平板培養されたサンプルで作られた。全ての実験変異体及び標準αアミラーゼを同じ濃度で投与した。
【０３００】
平板培養された又は精製された変異体のいずれかをｐＨ５．６のマレイン酸緩衝液を用いて約２０ｐｐｍに希釈した。基質は同じｐＨ５．６マレイン酸緩衝液中１５％のコーンスターチを含む。デンプン懸濁液４００μＬを２．５分間７０℃で平衡化した。７μＬの希釈酵素を素早く平衡化したデンプンに添加した（最終タンパク質濃度０．３６ｐｐｍ）。この反応混合物を８５℃の予備加熱した振とう熱ブロックにおき、３００ｒｐｍで混合した。予め決められた時間間隔で、反応物を５０μＬの１２５ｍＭＮａＯＨで冷却した。反応チューブからサンプルを採取し、上清を１０ｍＭＮａＯＨで１０倍に希釈して、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによるＤＰプロファイルについて解析した。
【０３０１】
反応物を４分、１０分、及び２０分に採取した。ＨＰＬＣ稼動の最後までのＤＰ２の総面積を積分し、この面積を総タンパク質及び反応時間で割った。
【０３０２】
４分の反応生成物はどれほど早く酵素が基質を分解するかを示し、１０分の反応生成物は酵素の熱活性を示し、２０分の反応生成物は、酵素の熱安定性を提供した。これらの結果は図７及び８に示す。
実施例６
粘度計における液化
【０３０３】
この実施例は野生型に対して変更された残余活性を有する実施例３のＳ２４２Ａ及びＳ２４２Ｑ変異体が親αアミラーゼに対しても変更された性能を有することを示す。実施例２の変異体αアミラーゼを精製し、この実施例を行う前に、総タンパク質及び特異活性について特徴付けた。
【０３０４】
αアミラーゼの作用に依存するトウモロコシ粉の粘度低下は、ＨＡＡＫＥ粘度計５５０装置を用いてモニターした。基質スラリーを３０％のトウモロコシ粉乾燥固形重量になるようにバッチモードで毎日新しく作った。ｐＨを酸で５．８に調整した。スラリーの５０ｇ（１５グラム乾燥固形分）を量り、１０分で７０℃になるように撹拌しながら予備インキュベーションした。αアミラーゼの添加において、７５の回転速度で温度を直ちに７０℃から８５℃に上げた。一旦スラリー及び酵素の温度が８５℃に達すると、この温度を一定に維持し、以降３０分間粘度をモニターした。この粘度を稼働中モニターし、μＮｍで報告した。野生型ＡｍｙＳ、Ｓ２４２Ａ、及びＳ２４２Ｑは全て同じタンパク濃度で投与された（２０又は３０μｇ／５０ｇトウモロコシスラリー）。
【０３０５】
この粘度計応用試験は両方のＡｍｙＳ変異体、Ｓ２４２Ａ及びＳ２４２Ｑがベンチマークαアミラーゼ、即ち、ＬＩＱＵＯＺＹＭＥ（商標）ＳＣ及びＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａよりも好適な性能を有する結果となった。両変異体はＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａの特徴である低いピーク粘度及びＬＩＱＵＯＺＹＭＥ（商標）ＳＣの低い最終粘度を示した。２０μｇ総タンパク質の低濃度の場合は、ＬＩＱＵＯＺＹＭＥ（商標）ＳＣのピーク粘度と比較したこれらの変異体の低いピーク粘度の違いは更に大きかった。図９、１０、及び１１参照。
実施例７
ジェットクッカーにおける液化
【０３０６】
全粒粉砕コーンを７０：３０の割合の水：蒸留残渣を用いて、３２％（乾燥固形コーン）のスラリーを調製した。このスラリーのｐＨを１０ＮのＮａＯＨを用いてｐＨ５．８に調整した。このスラリーをジャケットケトル中の水及び蒸気を用いて７０℃（１５８ｏＦ）に加熱した。液化酵素（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ、ＬＩＱＵＯＺＹＭＥ（商標）ＳＣ、又はＳ２４２Ｑ）を添加して、このスラリーを８５℃（１８５ｏＦ）に加熱して１０分以上置いた。８５℃で更に１０分インキュベーションを行い、このスラリーを１０７℃（Ｈｙｄｒｏ−ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｗａｕｋｅｓｈａ，ＷｉｓｃｏｎｓｉｎのＭ１０３水熱器を備えた）ラージパイロットプラントジェットを用いて３分のホールド時間で１０７℃で（２２５ｏＦ）維持した。この液化物をジェットクッカーから収集し、８５℃のウォーターバス中に置いた。液化酵素の第二投与をジェットクッカーに投与した。サンプルを０、３０、６０、及び９０で採取した。全てのサンプルをＤＥについてポストジェットで試験し（スカラー法及び他の方法を用いて）、及び粘度について（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ−ｔｙｐｅ  ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ（Ｌａｂ−ｌｉｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．ｏｆ  Ｍｅｌｒｏｓｅ  Ｐａｒｋ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）スピンドル３、２０ｒｐｍ）試験した。プレ又はポストジェット処理の液化酵素の投与はＸ＋Ｙの式で示す。式中、Ｘはジェットの前に添加する酵素単位数を示し、ジェットクッカーで処理した後の液化物に添加する酵素の単位数を示す。結果を図１２及び１３に示す。
実施例８
αアミラーゼ熱安定性におけるフィチン酸除去の効果
【０３０７】
全粒粉砕コーンのスラリー（Ｂａｄｇｅｒ  Ｓｔａｔｅ  Ｅｔｈａｎｏｌ，Ｍｏｎｒｏｅ，ＷＩ，ＵＳＡより入手）を３０％ｖ／ｖ蒸留残渣を含む水で最終濃度が３２％ｄｓのスラリーを調製した。トウモロコシ固形物をジャケットケトル中で調製した。このスラリーをよく混合し、ｐＨを測定し（ｐＨ５．２）、更なるｐＨ調製を行わずに用いた。このスラリーをジャケットケトルで混合し、７０℃の前処理温度にまで高くした。７０℃になる直前に、液化酵素、即ち、αアミラーゼ（コーン１グラム当り４ＡＡＵ）及びフィターゼ（コーンｄｓ１グラム当り４ＦＴＵ）を添加して、タイマーを始動させ、インキュベーション又は一次液化を開始した。このスラリーを追加的なフィターゼのある場合とない場合とにおいて、３０分インキュベーションした。この実験に用いたフィターゼはＢＰ−１７（上記参照）であった。このフィターゼをこの実験ではαアミラーゼと同時に添加したけれども、アミラーゼの前に添加してもよい。
【０３０８】
処理したスラリーを９０℃に維持したウォーターバス中に置き、第二液化工程を行った。サンプルを０、３０、６０、及び９０分で採取して、粘度及びＤＥ（スカラー法）を測定した。結果を図１４乃至１５に示す。
Ｂ．蒸気処理有り（部分的な酵素投与）
【０３０９】
全粉砕コーンのスラリー（Ｂａｄｇｅｒ  Ｓｔａｔｅ  Ｅｔｈａｎｏｌ，  Ｍｏｎｒｏｅ，ＷＩより入手）を蒸留残渣を３０％（ｖ／ｖ）含む水を用いて最終濃度が約３２％ｄｓに成るように調製した。トウモロコシ固形物はジャケットケトル中で調製した。このスラリーをよく混合し、ｐＨを測定した（ｐＨ５．２）。このスラリーをジャケットケトル中で混合し、７０℃の予備加熱温度に加熱した。７０℃になる直前に、液化酵素、即ち、Ｓ２４２Ｑ変異体αアミラーゼを添加し（コーンｄｓ１グラム当り３ＦＴＵ）、タイマーを始動させ、インキュベーション又は一次液化を開始した。このスラリーを追加的なフィターゼのある場合（コーンｄｓ１グラム当り４ＦＦＵ）とない場合とにおいて、３０分インキュベーションした。このフィターゼをこの実験ではαアミラーゼと同時に添加したけれども、アミラーゼの前に添加してもよい。
【０３１０】
インキュベーションしたスラリーを蒸気及び水を用いて所望の温度に予備加熱しておいたジェットクッカー（２２５ｏＦ；１０７．２℃）に通過させた。このスラリーをその後約４リットル／分の最大スピードでジェットに送り込んだ（１．５セット）。固定コイルの初めの３つのループを用いて、ホールド時間が３分を少し超えるように設定した。水の全部を分散させ、所望の温度に安定した後、可溶化されたコーンマッシュのアリコートを収集し、８５℃に維持した第二バス（上部撹拌）中に置き、第二液化工程を開始した。Ｓ２４２Ｑの第二投与（１ＡＡＵ／ｇｍｄｓ）を添加し、液化を更に９０分続けた。サンプルを０、３０、６０、９０分に採取し、粘土（ブルックフィールド法）及びＤＥ（スカラー法）を試験した。この液化物は実施例１０Ｂで用いた。
Ｃ．ジェットクッキング、従来法
【０３１１】
全粒粉砕コーンのスラリー（Ｂａｄｇｅｒ  Ｓｔａｔｅ  Ｅｔｈａｎｏｌ，Ｍｏｎｒｏｅ，ＷＩより入手）を蒸留残渣を３０％（ｖ／ｖ）含む水を用いて最終能動が約３２％ｄｓに成るように調製した。トウモロコシ固形物はジャケットケトル中で調製した。このスラリーをよく混合し、ｐＨを測定し（ｐＨ５．２）、希釈ＮａＯＨでｐＨ５．８になるように調整した。このスラリーをジャケットケトル中で混合し、温度を７０℃にまで加熱した。７０℃になる直前に、液化酵素、即ち、Ｓ２４２Ｑ変異体αアミラーゼを添加し（コーンｄｓ１グラム当り３ＦＴＵ）、タイマーを始動させ、インキュベーション又は一次液化を開始した。このスラリーを追加的なフィターゼのある場合とない場合とにおいて、３０分インキュベーションした。
【０３１２】
インキュベーションしたスラリーを蒸気及び水を用いて所望の温度に予備加熱しておいたジェットクッカー（２２５ｏＦ；１０７．２℃）に通過させた。このスラリーをその後約４リットル／分の最大スピードでジェットに送り込んだ（１．５セット）。水の全部を分散させ、所望の温度に安定した後、可溶化されたコーンマッシュのアリコートを収集し、８５℃に維持した第二バス（上部撹拌）中に置き、第二液化工程を開始した。Ｓ２４２Ｑの第二投与（１ＡＡＵ／ｇｍｄｓ）を添加し、液化を更に９０分続けた。この実験のスラリーのｐＨは５．５であった。図２２参照。この液化物を実施例１０Ａに用いた。
Ｄ．ジェットクッキング処理及び無処理の結果
【０３１３】
インキュベーション（一次液化）の間にＢＰ−１７フィターゼを添加すると、全粒粉砕コーンのフィチン酸含量を０．６０％ｄｓコーンから０．０９％ｄｓコーンに減らした（＞８５％低減）（図２１）。図１４及び１５から、このαアミラーゼはＤＥ変化及び粘度低減に基づいて、２２５ｏＦ（１０７℃）のジェットクッキング温度で不活性化したことが明らかとなった。しかしながら、ジェットクッキングの前にフィターゼ（フィターゼはフィチン酸抑制を除去すると信じられている）を添加しておくと、第二液化工程の間の９０℃でのＤＥ変化及び粘度低減により示されるように、このαアミラーゼの熱安定性が有意に高くなった。同様な結果が図１４及び１５で示すように、ジェットクッキングを用いても見られた。
実施例９
低ｐＨにおけるＢＰ−１６フィターゼ濃度のαアミラーゼの熱安定性における効果
【０３１４】
αアミラーゼの熱安定性の向上はαアミラーゼのフィチン酸抑制の除去に依存しているかどうかを試験した。フィチン酸は全粒粉砕コーンの第二液化の前にフィターゼを用いて加水分解し、低ｐＨにおけるｐＨ安定性における改善を試験した。
【０３１５】
典型的な実験において、全粒粉砕コーンを水及び蒸留残渣の比が７０：３０である溶液を用いて３２％（ｄｓコーン）のスラリーを調製した。このスラリーのｐＨを測定して、ｐＨ５．２であることを確認した。このスラリーをジャケットケトル中の水及び蒸気を用いて７０℃に加熱した。液化酵素、即ち、Ｓ２４２Ｑ変異体αアミラーゼ（４ＡＡＵ／ｇｍｄｓコーン）及び各種濃度のＢＰ−１７（０−１２ＦＴＵ／ｇｍｄｓコーン）を添加し、このスラリーを７０℃で４５分間維持して予備加熱した。予備加熱の４５分後、このスラリーを９０℃のウォーターバス中に置いた。液化物を連続撹拌し、９０℃で９０分維持した。サンプルを０、３０、６０、及び９０分後に採取した。全てのサンプルをＤＥ（スカラー法）及び粘度（ブルックフィールド粘度計スピンドル２、２０ｒｐｍ）について試験した。ＤＥ変化及び粘度のデータを図１６及び１７にまとめた。
【０３１６】
図１６及び１７の結果はフィチン酸抑制によるＳ２４２Ｑ変異体αアミラーゼの低減は、９０℃でのＤＥ変化における安定的な増加と液化による粘度の低減が両方とも達成されていることから、活性の低ｐＨにおける安定性が有意に高くなったといえる。このデータはＳ２４２Ｑ変異体αアミラーゼがフィチン酸抑制が排除された場合、ｐＨ５．２における全粒粉砕コーの液化工程に好適に用いることができることを示している。図２１において、ＤＥ変化の速度がフィチン酸の除去と共に増加しており、４ＦＴＵ／ｇｍで最大になることを示している。このことは、フィターゼがスラリーからフィチン酸を除去してＳ２４２Ｑ変異体αアミラーゼの熱安定性を高くすることを示している。
実施例１０
ｐＨの効果
【０３１７】
この実施例において、Ｓ２４２Ｑ変異体αアミラーゼのｐＨにおける影響を試験した。
【０３１８】
全粒粉砕コーンを水及び蒸留残渣の比が７０：３０である溶液を用いて３２％（ｄｓコーン）のスラリーを調製した。このスラリーのｐＨを測定して、ｐＨ５．２であることを確認した。ｐＨをＨ２ＳＯ４を用いて４．２乃至４，８の間に調整した。このスラリーをジャケットケトル中の水及び蒸気を用いて７０℃に加熱した。液化酵素、即ち、Ｓ２４２Ｑ変異体（４ＡＡＵ／ｇｍｄｓコーン）及びＢＰ−１７（４ＦＴＵ／ｇｍｄｓ）を添加して、このスラリーを７０℃で４５分間維持して、予備加熱した。予備加熱の４５分後、このスラリーを９０℃でウォーターバス中に置いた。この液化物を連続的に撹拌して、９０℃で９０分間維持した。サンプルを０、３０、６０、及び９０分に採取した。全てのサンプルは（スカラーズ法を用いて）ＤＥについて及び粘度（ブルックフィールド粘度計スピンドル２、２０ｒｐｍ）について試験した。ＤＥ変化及び粘度のデータを図１８及び１９にまとめた。
【０３１９】
結果は、ｐＨを５．２から４．５に低めると、ＤＥ生成も低くなることを示した。この酵素はｐＨ４．２で完全に失活した。
実施例１１
エタノール生成における影響
【０３２０】
液化物をエタノール発酵の発酵原料として、アルコール生成を行った。全粒粉砕コーンのスラリー（Ｂａｄｇｅｒ  Ｓｔａｔｅ  Ｅｔｈａｎｏｌ，Ｍｏｎｒｏｅ，ＷＩより入手）を蒸留残渣を３０％（ｖ／ｖ）含む水を用いて最終濃度が約３２％ｄｓになるように調製した。
Ａ．従来法
【０３２１】
実施例８Ｃからの液化を用いた（液化物Ａ）。
【０３２２】
第二液化物のｐＨをＨ２ＳＯ４を用いて、同時糖化及び発酵（ＳＳＦ）工程の前に、４．２に調整した。
Ｂ．低ｐＨ、ジェットクッキング（線量分割法）
実施例８Ｂからの液化物を用いた（液化物Ｂ）。ＳＳＦの前にｐＨ調整を行わなかった。
Ｃ．同時糖化及び発酵
【０３２３】
各実験において、発酵間の風袋重量を培地調製の前に測定した。３２％ＤＳコーンｄｓ液化物（２リットル）を２Ｌフラスコに入れた。Ｒｅｄ  Ｓｔａｒ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ  ｙｅａｓｔ（ＲＥＤ  ＳＴＡＲ（Ｌｅｓａｆｆｒｅ）接種材料を、１０グラムの酵母及び１グラムの来るコースを４０グラムの水に緩やかに撹拌しながら添加して、調製した。各接種材料の５グラムを平衡化した発酵間に添加して、０．４ＧＡＵ／ｇｄｓコーンのＧ  Ｚｙｍｅ（商標）４８０（ダニスコユーエスインク、ジェネンコアディビジョンを添加してエタノール同時糖化及び発酵を開始した。初期増加重量を記録しフラスコを３２℃に維持したウォーターバス中に入れた。サンプルを異なるインターバルで採取し、ＨＰＬＣを用いて炭水化物及びエタノールについて解析した。発酵物は各液化物のそれぞれ１キログラムを用いても行い、発酵の間の重量損失を異なる時間間隔で測定した。二酸化炭素の損失による重量ロスに基づいて、アルコールを測定した。発酵の最後に、最終総重量を測定した。このブロスは同じように５Ｌの円底反応管へも移した。希釈は真空下で、２００ｍｌまでの水を含んでもよく、約８００ｍｌのエタノールが収集されるまで行った。このエタノールを２Ｌに希釈して、ＨＰＬＣで解析した。残留物の重量及びＤＳを乾燥前に測定した。残余デンプン解析をＤＤＧＳにおいて行った。化学量論的計算を重量損失分、希釈率、及び残余デンプン解析に基づいて行った。
【０３２４】
ＣＯ２重量損失に基づくエタノール計算:
エタノール生成（ｍｍｏｌ）=ＣＯ２損失分（ｇ）／８８
エタノール生成（ｇ）=（ＣＯ２損失分（ｇ）／８８）＊９２→ＣＯ２損失分（ｇ）＊１．０４５
エタノール生成（ｍｌ）=（（ＣＯ２損失分（ｇ）／８８）＊９２）／０．７８９→ＣＯ２損失分（ｇ）ｘ１．３２５
【０３２５】
図２０におけるデータは従来法及び本発明のｐＨ調製プロセスの間の遊離硫酸塩及びフィチン酸の主な違いを示している。インキュベーション中の熱安定性αアミラーゼのフィチン酸抑制の除去はフィチン酸含量の減少、高い遊離利用可能燐酸塩及び硫酸の減少を伴うＤＤＧＳの結果となった。従って、ｐＨ調製を行わない方法はデンプンの液化における液化熱安定性αアミラーゼに低ｐＨでのｐＨ安定性を付与する。
実施例１２
追加的な方法
【０３２６】
以下で説明するアッセイを、以下で説明する実施例で用いている。以下で提供するプロトコルの変法もこの実施例で用いることができる。これらの実験において、反応が完了した後の生成物の吸光度を分光光度計で測定した。
Ａ．タンパク質含量測定
ＢＣＡ（ビシンコニン酸）アッセイ
【０３２７】
これらのアッセイにおいて、ＢＣＡ（ピアス）アッセイを用いて、マイクロタイタープレートスケールのサンプルのタンパク質濃度を決定した。このアッセイシステムにおいて、用いた化合物及び試薬は以下のようである：ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬、及びピアス希釈緩衝液８５０ｍＭＭＥＳ、ｐＨ６．５、２ｍＭＣａＣｌ２、０．００５％ＴＷＥＥＮ（商標）８０）。用いた装置はＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ（タイプ３４０；デモキュラーデバイス）ＭＴＰリーダーであった。ＭＴＰをＣｏｓｔａｒ（タイプ９０１７）より入手した。
【０３２８】
この試験において、２００μＬのＢＣＡ試薬を各ウェルに分注し、２０μＬ希釈タンパク質を分注した。軽く撹拌した後、ｍＴＰを３７℃で３０分インキュベーションした。気泡を抜き、各ウェル内の光学密度（ＯＤ）５６２ｎｍで読み取った。タンパク質濃度を決定するために、獏グラウンド試薬をサンプル測定値から差し引いた。ＯＤ５６２をタンパク質標準（精製酵素）に基づいてプロットし、標準曲線を作成した。サンプルのタンパク質濃度をこの標準曲線から補完した。
ブラッドフォードアッセイ
【０３２９】
これらのアッセイにおいて、ブラッドフォードダイ試薬（クイックスター）をアッセイをＭＴＰスケールにおけるサンプルのタンパク質濃度の決定に用いた。このアッセイシステムにおいて、用いた化学物質及び試薬溶液はＱｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｄｙｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．５００−０２０５），希釈緩衝液（１０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１  ｍＭ  ＣａＣｌ２，０．００５％ＴＷＥＥＮＯ−８０）であった。用いた装置はＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ（タイプ３４０；モレキュラーデバイス）ＭＴＰリーダーであった。ＭＴＰをＣｏｓｔａｒ（タイプ９０１７）より入手した。
【０３３０】
この試験において、２００μＬのＢＣＡ試薬を各ウェルに分注し、１５μＬ希釈タンパク質を分注した。最終的に１０μＬの希釈した培地ブロスをこのウェルに添加した。軽く撹拌した後、ｍＴＰを室温で１０分インキュベーションした。気泡を抜き、各ウェル内の光学密度（ＯＤ）５９５ｎｍで読み取った。タンパク質濃度を決定するために、バックグラウンド試薬（即ち、接種なし）をサンプル測定値から差し引いた。ＯＤ５９５をタンパク質標準（精製酵素）に基づいてプロットし、標準曲線を作成した。
Ｂ．試験に供する酵素の性能についてのマイクロスウォッチアッセイ
【０３３１】
このアッセイにおいて用いた試薬は酵素を含んでいない、又は市販の洗剤中に存在する酵素は本明細書において説明するほうに熱により失活させた。エッペンドルフサーモミキサーに含まれる装置及びＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ（タイプ３４０）ＭＴＰリーダーを用いた。ＭＴＰをＣｏｓｔａｒ（タイプ９０１７）より入手した。
洗剤調製（ＡＡＴＣＣ  ＨＤＬ；ＵＳコンディション）
【０３３２】
ミリＱ水を６ｐｇｐ水硬度（Ｃａ／Ｍｇ＝３／１）に調節し、１．５ｇ／ＬＡＡＴＣＣ２００３標準対照液体洗剤（漂白剤無し）を添加した。洗剤溶液を激しく、少なくとも１５分間撹拌した。その後、５ｍＭＨＥＰＥＳ（酸無し）を添加して、ｐＨを８．０に調製した。
試験アミラーゼ性能のためのコメデンプンマイクロスウォッチアッセイ
【０３３３】
試験洗剤を本明細書に説明しているように調製した。用いた装置はＮｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｉｎｎｏｖａ  ４２３０  シェーカー／インキュベーター及びＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ  （タイプ３４０）ＭＴＰ  リーダーであった。ＭＴＰはコーニング（ｔｙｐｅ３６４１）より入手した。有機酸含量スウォッチ（ＣＳ−２８）を含む老化させたコメデンプンを試験物質センター（Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手した。０．２５インチの円形マイクロスウォッチを切断する前に、布を水で洗浄した。２つのマイクロスウォッチを９６ウェルのマイクロタイタープレートに入れた。試験洗剤を２０℃（北米）、又は４０℃（西ヨーロッパ）で平衡化した。１９０μＬの洗剤溶液をマイクロスウォッチを含む各ウェルに添加した。この混合物に、１０μＬの希釈した酵素溶液を添加した。このＭＴＰを粘着性ホイルで密閉して、所望の試験温度（通常２０℃μ４０℃）で、７５０ｒｐｍで撹拌しながら、１時間インキュベーションした。インキュベーションに続いて、各ウェルからの１５０μＬの溶液を新しいＭＴＰに移した。このＭＴＰをＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ＭＴＰリーダーを用いて４８８ｎｍを読み取り、洗浄を定量化した。ブランクコントロール、並びにマクロスウォッチ及び洗剤を含むが酵素を含まない対照も含む。
酵素性能の計算
【０３３４】
得られた吸光度の値をブランクの値（酵素を添加しないで洗浄したマイクロスウウォッチ）で補正した。得られた吸光度は加水分解活性の測定値である。
Ｃ．抗体滴定によるアミラーゼ濃度測定
【０３３５】
本明細書で説明するように、αアミラーゼ濃度及び特異活性は抑制ポリクローナル抗体を用いた滴定により決定した。ポリクローナル抗体はバチルスステアロセレモフィリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）αアミラーゼ（ＡｍｙＳ）により育成され、ＡｍｙＳ及びバチルス株ＴＳ２３由来のαアミラーゼの強力な抑制効果があることが知られている（例えば、この結合は活性損失の線形滴定を形成するのに充分である）。それゆえ、この抗体は、特異活性の計算の代わりに酵素濃度の測定に用いることができる。簡単に説明すると、幾つかの知られている酵素により精製された酵素抑制の量を測定する。この情報から、完全な抑制のために必要な抗体の濃度が推定され、この濃度はサンプル中の酵素濃度と等しい。αアミラーゼ活性及び抑制を蛍光ＢＯＤＩＰＹデンプンアッセイを用いて測定した。緩衝液は０．００５％ＴＷＥＥＮを含む５０ｍＭＭＯＰＳ、ｐＨ７．０であった。
【０３３６】
精製されたＡｍｙＳに対するポリクローナル抗体をラビットで生成し、標準的方法で生成した。抗体ストック溶液の経験による明らかな濃度の値を特異活性の分かっているＡＭｔＳのサンプルの抑制を測定することにより決定した。その後、この抗体サンプルをＡｍｙＳ及びＴＳ２３ｔ変異体の濃度及び特異活性を決定するために用いた。これらの値を用いて、変異体の全て同じ濃度に希釈して、標準化された９６ウェル酵素ストックプレートを生成した。
Ｄ．野生型タンパク質ゲル電気泳動
【０３３７】
変異体タンパク質サンプルの電気泳動移動度を７．５％又は１２．５％の濃度のいずれかで、プレキャストネイティブポリアクリルアミドゲル（ＰｈａｓｔＧｅｌ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）上で、ファストゲルシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、測定した。０．８８ＭＬ−アラニン、０．２９Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８．８からなるバッファーストリップ（ＰｈａｓｔＧｅｌ  Ｎａｔｉｖｅ）を用いた。通常の稼動条件は４００Ｖを１２．５分で、陽極から陰極の距離が３．７ｃｍ分である。
【０３３８】
代替的に、変異体タンパク質サンプルの電気泳動移動度は、１ｍｍ圧の０．５％−１．５％のアガロースゲルに対する各種ｐＨ（即ち、５．８、８．０、及び１０．０）好適な緩衝システムを選択して、測定することができる。この電気泳動は濃度勾配のない状態で行われる。陽極−陰極の長さは１３．９ｃｍである。１−２μｇタンパク質のサンプルを５％グリコール＋０．０５％ブロモフェノールブルーを混合して各レーンに装填する。ゲルを通常１００Ｖで１時間泳動する。
【０３３９】
いずれかのケースにおいて、ルイスビル青色ダイを１０％酢酸に溶解した溶液でゲルを染色し、１０％エタノール及び１０％酢酸水溶液で脱色した。用いた天然ゲルシステムに依存して、１２及び２０の間の変異体を同時に検査することができる。タンパク質変異体の電気泳動移動度は同じサンプルゲル上の付加されたチャージラダー標準に対して評価することができる。
【０３４０】
Ｅ．洗剤の熱失活
市販の洗剤を熱失活すると、酵素成分の酵素活性は破壊されるが、非酵素成分のタンパク質は維持されている。従って、この方法は本発明の酵素を試験するのに用いる市販洗剤商品に好適な方法である。北米（ＮＡ）及び西ユーロッパ（ＷＥ）における重質液体洗剤について、９５℃のウォーターバス中で２時間、予め重量を測定した液体洗剤（ガラスボトル）を置くことにより熱失活を行った。北米（ＮＡ）及び日本（ＪＰＮ）の重質顆粒潜在（ＨＤＧ）についてのインキュベーション時間は８時間であり、西ヨーロッパ（ＷＥ）ＨＤＧ洗剤は５時間であった。ＮＡ及びＥＷ食器洗浄機の熱失活についてのインキュベーション時間は８時間であった。洗剤は地域のスーパーマーケットより購入した。非加熱及び過熱した洗剤を５分以内で八日し、ただちに失活したペーセンテージを決定した。酵素活性をｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡアッセイにより試験した。
【０３４１】
熱失活洗剤における酵素活性の試験のために、洗剤の希釈標準溶液を熱非失活ストックから作成した。好適な水硬度（６ｇｐｇ及び１２ｐｇｐ）及び緩衝液を洗剤溶液に添加し、所望の条件を作成した（表１２−１）。この溶液をボルテクス又はボトルを反転することにより混合した。
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（表１２−１）
Ｆ．洗浄性能を決定するためのテルゴ−Ｏ−メータアッセイ
【０３４２】
タンパク質及び炭水化物汚れを評価する標準的な方法は各種レベルの汚れを付着させた布見本を標準的な条件下での洗浄前と後で測定する。この布見本はキビデンプン、コメデンプン、又は血液、ミルク、及び炭化水素混合物で汚れを付けた綿布からなり、Ｔｅｓｔｆａｂｒｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔ  Ｐｉｔｔｉｓｔｏｎ，ＰＡ）より入手した。キビデンプン（ＥＭＰＡ１６１）及び血液、ミルク、カーボンブラック（ＥＭＰＡ１１６）試験用汚れをＥＭＰＡ  Ｔｅｓｔ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＡＧ（Ｓｔ．Ｇａｌｌｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により調製した。コメデンプン（ＣＦＴ―２８）汚れはＴｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｆｏｒ  Ｔｅｓｔ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＢＶ（Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）が調製した。各汚れをＤ６５（５６００ｏＫ）にセットしたＭｉｎｏｌｔａ  Ｒｅｆｌｅｃｔｏｍｅｔｅｒ  ＣＲ−４１０を用いて光反射率により、洗浄前と後で測定した。Ｌ、ａ、ｂの値における違いをＣＩＥ−ＬＡＢカラースペースにより定義されているように総色違い（ｄＥ）に転換した。汚れの洗浄は洗浄前及び後の色の違いの間の比を用いて、汚れの付いていない布に対する汚れの付着した洗浄していない布の違いを比較して、汚れの除去指標（％ＳＲＩ）として表す。
【０３４３】
洗浄実験を上部に撹拌装置を有する２リットルのステンレスポット６つを有するＴｅｒｇ−Ｏ−ｔｏｍｅｔｅｒ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ）中で行った。各処理を１ガロン当たり６グラムの３：１（カルシウム：マグネシウム）水硬度、又は１ガロン当たり１２グレイン水硬度のいずれかの水１Ｌ中で行った。洗浄試験に用いた洗剤は５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ８を含む１．５ｇ／Ｌ  ＡＡＴＣＣ  ＨＤＬ  ＷＯＢ２００３液体洗剤、０．７ｇ／Ｌ  ＡＡＴＣＣ  ＨＤＤ  ＷＯＢ  １９９３顆粒洗剤，過ホウ酸及びＴＡＥＤを含む８ｇ／Ｌ  ＩＥＣ  Ａ＊６０４５６  顆粒洗剤又は５ｇ／Ｌ  Ｐｅｒｓｉｌパワーゲル液体洗剤であった。酵素４０ｇ／Ｌ又は２００ｇ／Ｌの汚されたバラストを直接洗剤溶液に添加して、反応を開始した。洗浄反応は１００ｒｐｍで撹拌しながら、１０、１５、又は４０分で、２０℃、２５℃、３０℃、４０℃、又は５０℃で行った。洗浄に続き、布見本を水道水で３分間すすぎ、前蓋式の洗濯機に１０００ｐｒｍで回転させ過剰な水を除去し、乾燥機に入れパーマネントプレスサイクルで約加えて４５分低温で乾燥させた。固形除去の程度の比較は反射率測定法により比較され、パーセント汚れ除去指数（％ＳＲＩ）として表した。対照は酵素を含んでおらず、ベンチマーク市販酵素の各量を含むものを陽性対照とした。
Ｇ．アミラーゼ活性の決定のためのＢｏｄｉｐｙデンプンアッセイ
【０３４４】
このＢｏｄｉｐｙデンプンアッセイはＥＮＺＣＨＥＫ（商標）Ｕｌｔｒａ  Ａｍｙｌａｓｅ  Ａｓｓａｙキット（Ｅ３３６５１，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。ＤＱデンプン基質の１ｍｇ／ｍｌストック溶液を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．０の１００μＬで凍結乾燥デンプンを含むバックボーン威圧の内容物を溶解して調製した。このバイアルを約２０秒ボルテックス撹拌して、暗室で室温放置し、使用するまで、時々混合した。９００μＬのアッセイ緩衝液（２．６ｍＭＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．８）を添加して、このバイアルを約２０秒間ボルテックス混合した。基質溶液を暗室において、使用まで室温又は４℃で貯蔵した。アッセイのために、１００μｇ／ｍｌのＤＱ基質の希釈標準溶液をアッセイ緩衝液中の１ｍｇ／ｍＬ基質から調製した。１００μｇ／ｍＬの１９０μＬ基質溶液を９６ウェル平底マイクロタイタープレート中の各ウェルに添加した。酵素サンプルの１０μＬをこのウェルに添加して、３０秒間、サーモミキサーを用いて８００ｒｐｍで混合した。緩衝液及び基質のみを含むブランクサンプル（酵素非含有サンプル）をアッセイに含めた。蛍光強度の変化の速度を２５℃で５分間蛍光マイクロタイタープレートリーダーで測定した（励起：４８５ｎｍ、蛍光５２０ｎｍ）。
Ｈ．アミラーゼ活性の決定のためのコーン粉加水分解
【０３４５】
酵素活性のためのコーン粉基質アッセイのデンプン加水分解。有機コーン粉（Ａｚｕｒｅ  Ｆａｒｍｓ，ロットＮｏ．０３２２７）を固形物分散装置（Ｖ＆Ｐ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ポリプロピレン、ブラック、平底煙突型９６ウェルマイクロプレートに均一に広げた。２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．６の８５μＬを各ウェルに添加して、混合した。ホイルシールでプレートの上を密封し、このプレートをサーモサイクラーで２０乃至３０分予備インキュベーションした。酵素サンプルを２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中のＡｇｉｌｅｎｔポリプロピレンプレート（５０４２−１３８５）中に希釈した。１１０μＬの希釈した控訴を基質プレートに転換して、このプレートを新しいホイルで硬く密閉した。このプレートをその後、金属ブロックを有するＬａｂｎｅｔ  ＶｏｒＴｅｍｐ５６Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ／Ｓｈａｋｅｒに移して、９５℃で予備加熱して、振とうスピードを５００ｒｐｍにした。このインキュベーションを３０分続けた。インキュベーションの最後に、アイスバケット中でこのプレートを急激に冷却して、１００μＬの０．１ＮＨ２ＳＯ４を各ウェルに添加してデンプン加水分解反応を停止した。このプレートを軽く混合し、デンプン加水分解反応精製物をＰＡＨＢＡＨアッセイ又はＨＰＬＣのいずれかで解析した。
【０３４６】
コーン粉基質の酵素加水分解物の可溶性糖濃度の程色反応検出。０．５ＮＮａＯＨの８０μＬアリコートを空のＰＣＲプレートの全てのウェルに添加して、次いで２０μＬのＰＡＨＢＡＨ試薬（５％ｗ／ｖｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（ＰＡＨＢＡＨ，シグマ  ＃  Ｅ９８８２，０．５ＮＨＣｌ中に溶解）を添加して、混合した（ＰＡＨＢＡＨ  反応プレート）。１０μＬのデンプン加水分解反応上清をこのＰＡＨＢＡＨ  反応プレートに添加した。全てのプレートを密封し、２時間９５℃、その後２０℃に冷却するようにプログラムされた熱サイクラー（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｔｒａｄ）中に置いた。得られたＰＡＨＢＡＨ反応混合物の８０μＬのサンプルをリードプレートに写し、分光光度計中４０５ｎｍで吸光度を測定した。
【０３４７】
トウモロコシ粉基質の酵素加水分解からの可溶性糖濃度のＨＰＬＣ法検出。Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からえら得た可溶性糖基質（ＤＰ１−ＤＰ７）をミリＱ水で１００ｍｇ／ｍＬに希釈して、糖のピークエリア面積を実際の糖濃度へ換算するのに用いた。デンプン加水分解アッセイらの冷却サンプルを３０００ｒｐｍ、２５℃で５分間Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａｌｌｅｇｒａ  ６ＲＣｅｎｔｒｉｆｕｇｅで遠心分離した。この上清をスパンプレートから採取して、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ−ＨＶフィルタープレート（Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．ＭＡＨＶＮ４５５０）に移した。このフィルタープレートを６０００ｒｐｍ、２５℃、１０分でＨｅｔｔｉｃｈ  Ｒｏｔａｎｔａ遠心分離機のＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣプレートで回転させた。５０μＬの０．０１Ｎ硫酸移動相（０．１Ｍ硫酸をミリＱ水で１０倍に希釈）をＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣプレートの新しい各ウェルに添加した。ろ過されたプレートを簡単に混合し、５０μＬのろ過物を移動相を５０μＬ含む対応する各ウェルに移した。希釈した糖標準溶液をプレートの空のウェルに添加して、キャリブレーションに用いた。内容物をプレートフォームシェーカーで簡単に混合して、このプレートをＮａｌｇｅｎｅ  Ｐｒｅ−ｓｌｉｔウェルキャップで密閉した。０．６ｍＬ／分の流速で２Ｌも移動相を用いて行う前に、ＨＰＬＣカラム（ＢＩＯ−Ｒａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｅ  カラムカタログＮｏ．１２５−０１４０）を調製した。プレート中の全てのサンプルを２０μＬのインジェクション容量で解析して、検出器としてＡＭＩＮＥＸＨ．Ｍ  Ａｎｄ  ＲＩＤ（屈折率）を用いた。試験が終わった後、ＨＰＬＣの流速を０．０５ｍＬ／分に落とした。
Ｉ．アミラーゼのよるデンプン粘度減少の検出
【０３４８】
このアッセイにおいて、コーンスターチ基質溶液の粘度低下を粘度計で測定した。コーンスターチ基質スラリーはバッチモードで３０％のトウモロコシ粉固形分になるように蒸留水中で調製し、硫酸でｐＨを５．８に調整した。各回のテストのために、このスラリーの５０グラム（１５グラム乾燥固形分）の重量を測定し、７０℃になるまで１０分、予備インキュベーションした。アミラーゼ添加後、この温度を急激に７５ｒｐｍの速度で撹拌しながら上昇させた。このスラリー及びアミラーゼ混合物の温度が８５℃になると、温度を一定に維持して更に３０分間粘度をモニターした。
Ｊ．マクロ分子基質に結合する酵素の測定
【０３４９】
結合アッセイは、アミラーゼチャージラダー変異体（チャージ変化＝野生型ＡｍｙＳに対して−１２乃至＋１２）のコーンストーバー及びバガスへの基質結合を評価するために行った。用いた基質はバッガス（ブラジルのシュガーコーンバッガス，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにより入手、希酸処理し，ｐＨ５で洗浄及び緩衝）、ＡＦＥＸ（アンモニアで繊維を膨張させたコーンスターバー）、及びＰＣＳ（希硫酸で前処理したコーンストーバー、ｐＨ５で洗浄及び緩衝）を含む。全ての基質を使用前に所望及びの固形分含量に調整した。
【０３５０】
アミラーゼ結合：アミラーゼチャージラダー変異体を精製し、試験のために２００ｐｐｍに希釈した。１％セルロースバッガス溶液をホウ酸緩衝液（４０ｍＭ、ｐＨ８．５、０．０１６％Ｔｗｅｅｎ８０）中で調製した。１５０μＬのバッガス溶液をマイクロタイタープレートの各ウェルに添加した。１５０μＬのホウ酸緩衝液を別のウェルに添加して対象として用いた。１０μＬのアミラーゼチャージラダー変異体をろ過プレートに添加した。各条件について２回試験を行った。このプレートを室温で２時間インキュベーションした。このろ過物を収集し、上清中のアミラーゼ活性をＢＯＤＩＰＹデンプンアッセイにより測定した。
【０３５１】
マイクロスウォッチへの酵素結合の測定：アミラーゼ変異体を標準的な洗浄条件下で、３０分間ＣＳ−２８コメデンプンマイクロスウォッチを添加し、又は添加しないでインキュベーションした。遊離酵素の量をＢＯＤＩＰＹデンプンアッセイにより測定した。マクロスウォッチに結合した酵素分画を以下のように計算した：布結合＝（汚れのない布中の酵素活性−汚れたマイクロスウォッチ中の酵素活性）／マイクロスウォッチがない場合の酵素活性）。
Ｋ．ゲオバチルスステアロセレモフィリス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アミラーゼタンパク質の定量
【０３５２】
ゲオバチルスステアロセレモフィリス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アミラーゼタンパク質を競合イムノアッセイにより定量化した。簡単に説明すると、精製されたゲオバチルスステアロセレモフィリス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アミラーゼを蛍光ダイ（蛍光色素）でラベルして、抗体に結合するゲオバチルスステアロセレモフィリスを消光ダイ（テトラメチルローダミン）でラベルした。蛍光色素アミラーゼ結合体の蛍光シグナルを消光分子ラベル抗体の結合により消光した。サンプル中遊離アミラーゼの存在が消光ラベル抗体と競い合って、蛍光シグナルが増加する。それゆえ、蛍光シグナル強度がサンプル中の蛍光シグナルに比例する。このアッセイは精製された既知の濃度のゲオバチルスステアロセレモフィリスアミラーゼでキャリブレーションしている。
【０３５３】
ゲオバチルスステアロセレモフィリスアミラーゼの蛍光ダイでのラベル：精製されたゲオバチルスステアロセレモフィリスアミラーゼを蛍光イソチオシアネート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲ）で、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液中ｐＨ９．５で、説明書に従ってラベルした。反応の最後に、セファロース緩衝整理食塩水中でＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  （シグマ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）でゲルろ過してこのタンパク質を未結合ダイから分離した。
【０３５４】
抗体調製及び蛍光ダイでのラベル：ゲオバチルスステアロセレモフィリスアミラーゼの抗体をウサギでの免疫作成及び抗血清から回収して調製した。この抗血清は使用まで−２０℃で保存した。１．５ｍｌ、３．７５Ｍ硫酸アンモニウムでの沈殿により得た免疫グロブリン分画の調製物を、２０ｍｌ抗血清に添加して、４℃で６０分放置して、２，０００ｇで遠心分離して、沈殿物を得た。沈殿物を回収して、再懸濁して２回洗浄し、１．６Ｍ冷却硫酸アンモニウム１０ｍｌ中で沈殿させた。採取沈殿生成物を４ｍｌの水に溶解して、５０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．５、４℃で透析した。減衰係数ε１％＝１５を用いてＡ２８０によりタンパク質濃度は２９．２ｍｇ／ｍｌであると測定された。このイムノグロブリン分画を５０ｍＭ炭酸ナトリウムｐＨ９．５中でテトラメチルローダミンイソチオシアネート（シグマ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）でラベルした。未結合ダイをその後、０．１％デオキシクロレートを含むリン酸緩衝整理食塩水で平衡化したセファデックスＧ−２５のカラム上でゲルろ過した。
【０３５５】
アッセイ手順：このイムノアッセイは９６ウェルマイクロタイタープレート（コーニング＃３６５０）で行った。蛍光色素−アミラーゼの濃度をこのアッセイにおける最終濃度が所望の標準曲線の真ん中になるように調整した。同様に、消光色素−抗体を最終布見本濃度が蛍光シグナルの最大調節を許容するように調整した。自動的に生成された液体ハンドリングシステムを用いて、５μＬの各サンプル、蛍光色素−アミラーゼ、及び冷却抗体を２％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００（シグマ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含む１８０μＬリン酸緩衝生理食塩水に添加した。軽く混合した後、このプレートを室温で１時間インキュベーションし、蛍光シグナルを励起波長及び蛍光波長をそれぞれ４９５ｎｍ及び５２０ｎｍに設定した、蛍光プレートリーダー（モレキュラーデバイス）を用いて決定した。
実施例１３．Ｂ．スブチリスにおけるアミラーゼ生成
【０３５６】
この実施例において、ゲオバチルスステアロセレモフィリスアミラーゼから切断された変異体アミラーゼ（Ｓ２４２Ｑ変異体及びＣ末端の２９アミノ酸の欠失を有する；これもＳ２４２Ｑ変異体と言う）及びそれらの変異体のバチルススブチリス中での生成を説明する。形質転換は既知の方法（例えば、ＷＯ０２／１４４９０参照）で行った。簡単に説明すると、親アミラーゼをコードしている遺伝子を発現ベクタークローニングした。この発現ベクターはＬＡＴプロモーター（ＰＬＡＴ）、ＬＡＴシグナルペプチド（ｐｒｅＬＡＴ）をコードしている配列、次いで、クローニングのためのＰｓｔＩ及びＨｐａｌ制限部位を含む。
【０３５７】
ＬＡＴシグナルペプチドのコード領域を以下に示す：
0005492879.tif 000055
（配列番号２０）
【０３５８】
ＬＡＴシグナルペプチドのアミノ酸配列を以下に示す：
0005492879.tif 000056
（配列番号２１）
【０３５９】
置換アミノ酸を有する成熟切断Ｓ２４２Ｑ変異体のアミノ酸配列を本明細書における変異体ライブラリーの作成のための根拠として用いた：
0005492879.tif 000057
（配列番号２２）
【０３６０】
成熟ＡｍｙＳアミラーゼをコードする領域を以下に示す：
0005492879.tif 000058
（配列番号２３）
【０３６１】
成熟ＡｍｙＳアミラーゼのアミノ酸配列をＡｍｙＳ変異体ライブラリーの根拠として用いた。この配列は配列番号２である。
【０３６２】
ＰＣＲ生成物をキアゲンカラムを用いて生成し、脱イオン水５０μＬに再懸濁した。５０μＬの精製したＤＮＡをＨｐａＩ（ロシュ）及びＰｓｔＩ（ロシュ）で消化した。得られたＤＮＡを３０μＬ脱イオン水に再懸濁した。１０乃至２０ｎｇ／ｍｌのＤＮＡをＰｓｔＩ及びＨｐａＩクローニング部位を用いてプラスミドｐＨＰＬＴへクローンした。このリゲーション混合物を直接コンピテントバチルススブチリス細胞（ゲノタイプ:Δｖｐｒ，ΔｗｐｒＡ，Δｍｐｒ−ｙｂｆＪ，ΔｎｐｒＢ）で形質転換した。このバチルススブチリス細胞はキシロース誘発プロモーターの下流にあるコンピテンシー遺伝子（ｃｏｍＫ）を有しており、キシロースがＤＮＡ結合及び取込を誘発するのに用いることができる（Ｈａｈｎら（１９９６）ＭｏＩ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２１：７６３−７７５参照）。
【０３６３】
プラスミドｐＨＰＬＡＴ−ＡｍｙＳの要素は、プラスミドｐＵＢ１１０由来のｐＵＢ１１０＝ＤＮＡフラグメントを含む（ＭｃＫｅｎｚｉｅら（１９８６）Ｐｌａｓｍｉｄ  １５：９３−１０３）。プラスミドの特徴は、ｏｒｉ−ｐＵＢ１１０＝ｐＵＢ１１０由来の複成起源、ｎｅｏ＝ｐＵＢ１１０由来のネイマイシン耐性遺伝子、Ｐｌａｔ＝バチルスリケニフォルミスアミラーゼからの転写プロモーター、ＰｒｅＬＡＴ＝バチルスリケニフォルミスアミラーゼ由来のシグナルペプチド、ＳＡＭＹ４２５ｓｓ＝切断されたＡｍｙＳ遺伝子配列のコード領域（この実験では、発現された各切断ＡｍｙＳ変異体についてのコード領域で置換している）。ターミネーター＝バチルスリケニフォルミスアミラーゼからの転写ターミネーター。
実施例１４．酵素変異体の発現
【０３６４】
この実施例は前述の実施例で形質転換されたバチスルスブチリスの各種組換え酵素の発現に用いた方法を、２ｍｌスケールで、説明する。
【０３６５】
ＡｍｙＳ（又はこれらの変異体）又はＳ２４２Ｑ（又はこれらの変異体）発現ベクターを含むバチスルスブチリスクローンをグリセロールストックから１５０μＬのＬＡＢ培地＋１０μｇ／ｍｌのネオマイシンを含む９６ウェル培養プレートへ、スチール９６ウェルレプリケーターで、３７℃、高湿な容器内で、２２０ｒｐｍで複製した。一晩培養した培地からの１００μＬのアリコートを５ｍｌのプラスチックチューブに２，０００μＬの決められた培地＋１０μｇ／ｍｌのネオマイシンに接種した。この培養培地は主な窒素源としての尿素、主な炭素源としてグルコース、及び細胞育成を確実にするための１％ソイトン及び５ｍＭカルシウムを含むＭＯＰＳ緩衝液に基づいた強化セミデファインド培地である。培養チューブを３７℃、２５０ｒｐｍで７２時間インキュベーションした。インキュベーションの後、培地ブロスを３，０００ｘｇで１０分間遠心分離した。この上清を１５ｍｌのポリプロピレンコニカルチューブ内に移し、タンパク質定量のために８０μＬの各サンプルを９６ウェルプレートに分注した。
実施例１５．酵素変異体の生成
【０３６６】
この実施例は酵素チャージラダー（ｃｈａｒｇｅ  ｌａｄｄｅｒ）及びチャージラダーの組み合わせの生成を説明する。
酵素チャージラダー
【０３６７】
所望の物理的特徴の範囲を有する複数のタンパク質変異体を既存のライブラリーから選択し、又は既知の部位指定変異誘発（例えば、米国特許出願公開公報Ｎｏ．２００８−０２９３６１０参照）により生成した。プローブタンパク質の決められたセットをその後所望の試験でアッセイした。
【０３６８】
典型的なアミラーゼ変異体チャージラダーを以下のテーブルで示し、本明細書に記載のようにアッセイした。これらのテーブルにおいて、チャージ変化は親酵素に関連していた。
【０３６９】
ＡｍｙＳ遺伝子の配列を、表１５−１乃至１５−２に示すように２８チャージラダーの合成のためにジーンオラクル（Ｇｅｎｅ  Ｏｒａｃｌｅ）（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）へ提供した。ジーンオラクルではベクターｐＧｏｖ４でＡｍｙＳ変異体をクローニングして、Ｅ．ｃｏｌｉで形質転換し、ミニプレップから単離されたＤＮＡ、並びにアガーｓｔａｂを各変異体について供給した。
【０３７０】
変異体をＰＣＲ増幅し、ｐＨＰＬＴバチルススブチリス発現ベクターへクローンした。変異体を以下のプライマーを用いてｐＧｏｖ４プラスミドからＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして増幅した。
0005492879.tif 000059
（配列番号２４及び配列番号２５）
【０３７１】
このＰＣＲ生成物をキアゲンクイックチェンジカラムを用いて生成して、５０μＬのミリＱ水中に再懸濁した。生成したＤＮＡ５０μＬをＨｉｎｄＩＩＩ（ロシュ）及びＰｓｔＩ（ロシュ）で切断し、得られたＤＮＡを３０μＬ脱イオン水に再懸濁した。１０乃至２０ｎｇ／ｍｌのＤＮＡをＰｓｔＩ及びＨｐａＩクローニング部位を用いてプラスミドｐＨＰＬＴへクローンした。リゲーション混合物を直接バチルススブチリスコンピテント細胞へ形質転換した（ゲノタイプ：ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｐｈｌｅｏ）。これらのバチルススブチリス細胞はこのバチルススブチリス細胞はキシロース誘発プロモーターの下流にあるコンピテンシー遺伝子（ｃｏｍＫ）を有しており、キシロースがＤＮＡ結合及び取込を誘発するのに用いることができる。
0005492879.tif 000060
（表１５−１）
0005492879.tif 000061
（表１５−２）
0005492879.tif 000062
（表１５−３）
酵素組み合わせチャージラダー（ＣＣＬ）：ゲオバチルスステアロセレモフィリスＡｍｙＳＳ２４２ＱＣＣＬの生成
【０３７２】
ＡｍｙＳ−Ｓ２４２ＱプラスミドＤＮＡを形質転換されたＢ．スブチリス株（ゲノタイプ:  △ａｐｒＥ，△ｎｐｒＥ，ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｎｉＫ−ｐｈｌｅｏ）から単離して、ＤＮＡ２．０Ｉｎｃ．にＣＣＬ工構築物をテンプレートとして送った。表１５−４に示すようにＡｍｙＳ−Ｓ２４２Ｑ（Ｓ２４２Ｑ）アミラーゼにおける４つの位置のそれぞれにおいて、位置ライブラリーをＤＮＡ２．０Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）に作るように要求した。変異体は９６ウェルプレート中のグリセロースストックとして供給された。
【０３７３】
ＡｍｙＳＳ２４２Ｑ組み合わせチャージライブラリーは以下の４つの残基を同定することにより設計された：Ｇｌｎ−９７，ＧＩｎ３１９，ＧＩｎ３５８，及びＧＩｎ４４３。４つの部位について、８１メンバーＣＣＬを各部位における３つの可能な組み合わせ、野生型、アルギニン、又はアスパラギン酸、の全部を作成することにより生成した。
0005492879.tif 000063
（表１５−４）
0005492879.tif 000064
（表１５−４）
0005492879.tif 000065
（表１５−４）
実施例１６
酵素の洗浄性能
【０３７４】
この実施例は各種イオン強度下におけるＡＡＴＣＣ  ＨＤＬ洗剤又は５ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液中１．０μg/ｍｌのマイクロスウォッチアッセイにおけるＳ２４２Ｑ変異体の試験を説明する。実施例１２で説明した方法を用いた。（例えば、「試験アミラーゼ性能のためのコメデンプンマイクロスウォッチアッセイ」を参照。）
【０３７５】
ＡＡＴＣＣ  ＨＤＬ洗剤において酵素についての洗浄性能のための好適な正味のチャージ変化がある。性能はコメデンプンマイクロスウォッチ活性アッセイにおいて観察された洗浄性能の観点で測定する。１．０付近の値がこのアッセイにおいて最高の洗浄性能を示す。このことは所与の結果又は効果を改善する（例えば、液体洗濯用洗剤の洗浄性能）ためのタンパク質の物理的性質（例えば、正味のチャージ）最適化の例である。プローブタンパク質の限られたセットで同定されたチャージ最適化は、全体チャージ組み合わせライブラリーを測定したときに観察される最適チャージと同時に生じる。プローブタンパク質の使用はそれゆえライブラリー全体の特性が予測される。
【０３７６】
Ｄｅｂｙｅ−Ｈｕｃｋｅｌ理論（Ｉｓｒａｅｌａｃｈｉｖｉｌｉ，Ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｆｏｒｃｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  ＥＤＩＴＩＯＮ：Ｗｉｔｈ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓｚｄ  Ｅｄ．［１９９２］）によると、静電相互作用は一定のポテンシャル、又は一定のチャージ（酵素、基質、布、及び洗剤）、それらのサイズ、及び環境媒体の誘電率における物質の相互作用の間の二層エネルギーの強度により主に抑制される。洗剤製剤等の複合媒体中の粒子の電気的特性を特徴付けるために、同じＤｅｂｙｅスクリーニングレングスを処理している還元された環境における相互作用が好ましい。これは、適合するｐＨの緩衝液及び洗浄条件下での緩衝液の伝導性を選択することにより達成できる。そのような試験に好適な緩衝液はＮａＣｌのような、中性電解液の量を変化させた、ｐＨ８．０の５ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液である。この緩衝液に２．５ｍＭのＮａＣｌを添加すると、北米洗浄条件のタイプのｐＨ及び伝導性になる。１００ｍＭのＮａＣｌの添加は日本及び西ヨーロッパの洗浄条件であり、通常水の硬度と洗剤の濃度の両方が高くなると、イオン強度も高くなる。
【０３７７】
図２３は陽性チャージＳ２４２Ｑは北米洗浄条件下でコメデンプンマイクロスウォッチの洗浄が優れていることを示した。同様に、他のαアミラーゼ（即ち、ＴＳ２３ｔ）の陽性変異体は北米洗浄条件下でコメデンプンマイクロスウォッチの洗浄が優れていることを示した（図２４）。このことは異なるαアミラーゼにおいてチャージ変異体が同様の効果有することを示している。陽性チャージＳ２４２Ｑ変異体は粉砕コーン基質加水分解に対するより高い特異活性も示している（図２５）。
【０３７８】
ＡｍｙＳチャージラダーによるデンプン液化はコーンスターチの液化の後の最終粘度のモニタリングにより決定した。低い粘度の値は、デンプンポリサッカライドの分解を示す。図１４に示すように、チャージ最適化（例えば、―４乃至―２）を液化について観察した。陰性の強いＡｍｙＳ変異体（例えば、―１２乃至−１０）は非常に高い最終粘度を示し、陽性の強い変異体（例えば、＋６以上）もより高い最終粘度を示した（例えば、トルク過負荷により試験装置の限界を超えていた。）
実施例１７
熱安定性
【０３７９】
タンパク質チャージ及び熱安定性の間の関係を決定する実施例を説明する。アミラーゼアッセイを培養上清を過熱する前及び後で、ＢＯＤＩＰＹデンプン加水分解に基づいてアッセイした。実施例１２で説明した化合物及び試薬溶液を用いた。
αアミラーゼの熱安定性アッセイ
【０３８０】
ろ過した培養上清を０．００２％Ｔｗｅｅｎを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム＋２ｍＭＣａＣｌ２、ｐＨ５．８で連続的に希釈した。１０μＬの希釈した各培養上清をＢＯＤＩＰＹデンプンアッセイにより初期の活性を決定した。５０μＬの各希釈培養上清をＶＷＲロープロファイルＰＣＲ９６ウェルプレートに入れた。３０μＬのミネラルオイルを各ウェルに添加して密閉した。このプレートを、ＢｉｏＲａｄ  ＤＮＡ  ｅｎｇｉｎｅ  Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒで、親酵素の安定性により、３０μ６０分で、９５℃でインキュベーションした。インキュベーションの後、このプレートを４℃で５分間冷却して、その後室温で維持した。１０μＬの各サンプルを新しいプレートに添加して、実施例１で説明したように、ＢＯＤＩＰＹデンプンアッセイにより最終アミラーゼ活性を決定した。
熱安定性の計算
【０３８１】
サンプルの残余活性を初期の吸光度に対する最終吸光度の比として表した。両吸光度はブランクで補正している。高い指標はより熱安定性があることを示している。これは液体洗濯用洗剤の改善された酵素熱安定性について、タンパク質物理的性質、この場合は正味のチャージの最適化の例である。
【０３８２】
変異体の熱安定性は前述のように評価した。Ｓ２４２ＱＣＣＬからの熱安定性の優れているものを表１７−１に示す。熱安定性の優れている変異体は親（即ち、Ｓ２４２Ｑ）残余活性に対する変異体の残余活性の比が１より大きなものであると定義した。図３０は野生型に対するチャージラダーの関数としてのＡｍｙＳチャージラダーの残余活性を示す。このアッセイに用いた熱安定性は実施例１２で説明した。図で証明されたように、野生型に対して過剰な陰性チャージ（−１２）又は陽性チャージ（＋４）は熱安定性には有害である。このことは、液体洗濯用洗剤の酵素熱安定性改善するためのタンパク質物理的性質、この場合正味チャージの最適化の例である。
0005492879.tif 000066
（表１７−１）
実施例１８
酵素性能
【０３８３】
この実施例は酵素性能がチャージにより影響されることを示す。酵素性能は実施例１２で説明したように、熱失活させた洗剤を用いて評価した。好適な変異体は性能インデックス（ＰＩ）が１より大きなものであると定義した。ＰＩは親（即ち、Ｓ２４２Ｑ）の残余活性に対する変異体残余活性の比である。結果を表１８−１及び１８−２に示した。
0005492879.tif 000067
（表１８−１）
0005492879.tif 000068
（表１８−１）
0005492879.tif 000069
（表１８−２）
0005492879.tif 000070
（表１８−２）
0005492879.tif 000071
（表１８−２）
【０３８４】
活性を本明細書で説明したＢＯＤＩＰＹデンプン加水分解アッセイを用いても評価した。結果を表１８−３に示す。このデンプン基質（コーンスターチ）に対する相対的特異活性が１よりおおきなものはＳ２４２Ｑ親株よりも高い特異活性を有する変異体である。相対的ｐｐｍを親に対する変異体の発現力価であり、１より大きなものはＳ２４２Ｑ親株よりも高い力価（振とうチューブ内）を示す。
0005492879.tif 000072
（表１８−３）
0005492879.tif 000073
（表１８−３）
実施例１９
アミラーゼ活性及び発現におけるバランス変異効果
【０３８５】
この実施例は、２つの矛盾する酵素の性質が変異アミノ酸置換の導入により同時に最適化されることを示す。
【０３８６】
これまで説明してきたように、陽性チャージを増加させるとＡｍｙＳ−２４２平均的発現が減少した。しかしながら、特定のＢＯＤＩＰＹデンプン加水分解は要請チャージが増加すると増加した。高められた組換えアミラーゼ発現及びデンプン加水分解は燃料エタノール工業におけるデンプン液化又は所望の洗剤製品における洗浄に好適なＡｍｙＳ２４２Ｑの変異体の改良に好ましい。これまで説明してきたように、本発明の方法を用いると、選択された１部位変異の組み合わせにより、デンプン加水分解に妥協することなく、より高いアミラーゼ変異体を生成することが可能になる。本発明のストラテジーは第一性質（例えば、主要な性質としての発現）において改善を有し、第二性質（例えば、第二性質としてデンプン加水分解）を改善又は損なわずに、複数置換されたＡｍｙＳ２４２Ｑ変異体の生成及び選択に用いた。
【０３８７】
更に、ＡｍｙＳ２４２Ｑｈｅの平均発現とは反対に、コーンスターチマイクロスウォッチ洗浄が陽性チャージが高くなるにつれて向上した。高められた組換えアミラーゼ発現及び洗浄性能はＡｍｙＳ２４２Ｑの修飾された変異体において望ましい。しかしながら、これらの性質も明らかに矛盾した性質である。本発明についてこれまで説明してきたように、本発明の方法を用いて、１部位変異の組み合わせを選択することにより、洗浄性能を犠牲にすることなく、より高いアミラーゼ変異体を発現させることができる。本明細書に説明したストラテジーは第二性質（例えば、第二性質として、コメデンプンマクロスウォッチ洗浄性能）を改善しつつ又は犠牲にすることなく、第一性質（例えば、第一性質としての発現）における改善を有する複数置換されたＡｍｙＳ−２４２Ｑ変異体を生成及び選択に使用される。
0005492879.tif 000074
0005492879.tif 000075
【０３８８】
特に、１つ乃至４つのチャージされた残基の組み合わせを有する変異体を含む、８０メンバーのＡｍｙＳ−Ｓ２４２Ｑチャージ組み合わせライブラリー（ＣＣＬ）を振とうフラスコ発現、ＢＯＤＩＰＹデンプン加水分解、及びコメデンプン洗浄活性について試験した。成績のよいＡｍｙＳ−Ｓ２４２Ｑ変異体を表１９−１及び１９−２に示す。重要なことは、表１９−１の複数置換をした変異体は親酵素と比較して、同じか又は改善された発現及び同じか又は改善されたＢＯＤＩＰＹデンプン加水分解を有している。同様に、表１９−２の複数置換の変異体は、親酵素と比較して、同じか又は改善された発現、又は同じか又は改善されたコメデンプン洗浄活性を示した。
【０３８９】
まとめると、酵素活性及び酵素生成は異なるチャージ依存性を有することから（図２７Ａ、２７Ｂ、２８Ａ、及び２８Ｂ）、これらは負の相関を有する（図２６Ａ及び２６Ｂ参照）。しかしながら、発現及び活性の両方が改善された多くの変異体があり、これらを解析して同定した。
【０３９０】
アミラーゼを用いて説明してきたけれども、この方法はプロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、トランスフェラーゼ、及びペクチナーゼ等の他の酵素のクラスにも適用することができる。更に、発現、活性、結合、熱安定性、界面活性剤及びキレート安定性等の２つ以上の性質の任意の組み合わせを同時に解析することができる。
実施例２０
マイクロスウォッチ洗浄及びデンプン加水分解
【０３９１】
酵素性能は前述のように熱失活させた洗剤を用いて評価した。アッセイは実施例１２で説明するように行った（試験アミラーゼのためのコメデンプンマイクロスウォッチアッセイ及びアミラーゼ活性の決定のためのＢｏｄｉｐｙ−デンプンアッセイを参照）。良好な結果の変異体は１より大きな性能インデックス（ＰＩ）を有するものであると定義する。ＰＩは野生型残余活性に対する変異体残余活性の比である。表２０−１はチャージ変化スコア（△ＧＨＲＧ）と比較したときの、野生型（△△Ｇ＜０）野生型よりも良好なＡｍｙＳ変異体についての計算を示す。チャージ変化、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｅｉｓｅｎｇｅｒｇ及び水素結合は、２００８年６月６日に出願されたＷＯ２００８／１５９２５に記載されている。更に、表２０−１はＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ  （△Ｋ−Ｄ）及びＥｉｓｅｎｂｅｒｇ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ  スケール（△Ｅ）の結果も示す。表２０−１は水素結合（△ＨＢ）の値も示す。−２のスコアは水素結合能力の損失を意味する。表２０−１は５分、１０分、及び６０分におけるコーン粉加水分解について、ｐＨ４．０及び５．８（ｐＨ４、ｐＨ５．８）におけるＤＰ７基質における活性、ｐＨ８．６及び１０（Ｃｌｅａｎ８及びＣｌｅａｎ１０）コメデンプン洗浄能力、及びバチルススブチリス（ＥＸＰ）におけるタンパク質発現の野生型よりも良い結果であるＡｍｙＳ変異体についての計算を示す。活性におけるチャージの影響は発現に対するチャージの影響とは反対であった。水素結合及び加水分解も、これらの性質に統計的に有意な影響を示した。明らかに、チャージ及び加水分解等アミノ酸置換体の性質はバチルススブチリス及びＥ．ｃｏｌｉでの発現レベル並びにタンパク質の基本的活性及び安定性に影響を与えた。
0005492879.tif 000076
（表２０−１）
0005492879.tif 000077
（表２０−１）
実施例２１
酵素のｐＨ−活性プロファイルの調整
【０３９２】
この実施例は所与の反応のための酵素のｐＨ−活性プロファイルを最適化するための表面チャージへの使用を説明する。図３１Ａは実施例１５の第一ＡｍｙＳチャージラダーについてのｐＨの関数としてのコメデンプンマイクロスウォッチ洗浄活性を示す。３．０乃至４．２５の範囲のｐＨは０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０を含む２００ｍＭギ酸ナトリウムで調整し、４．２５乃至５．５のｐＨ範囲は０．１％Ｔｗｅｅｎ−８０を含む２００ｍＭ酢酸ナトリウムで調整した。データをそれぞれが１つのｐＫａ値を有する滴定曲線に当てはめた。図３１Ｂは実施例１５の第一ＡｍｙＳチャージラダーについてのチャージ変化の関数としてのＡｍｙＳ触媒についての明らかなｐＫａを示す。これらのデータはαアミラーゼについてのｐＨ−活性プロファイルは２００ｍＭ緩衝液の中でさえ、表面チャージ変異体により有意にシフトすることができることを示している。このことは、非常に低イオン強度のスブチリシン（Ｒｕｓｓｅｌｌら（１９８７）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１９３：８０３−１３）及びＤ−キシロールイソメラーゼ（Ｃｈａら（１９９８）ＭｏＩ  Ｃｅｌｌ．８：３７４−８２）では報告されているけれども、本発明はαアミラーゼにおいて、驚くべきことに高いイオン強度でも、達成できることを始めて証明した。
実施例２２
ＡｍｙＳスーパースクリーン
【０３９３】
以下のアッセイを以下の実施例で用いた。以下に提供するプロトコルからの任意の偏差がこの実施例において示されている。これらの試験において、９６ウェル分光光度計を用いて組成物の反応の後に形成された生成物の吸光度を測定した。
特異活性決定及び熱安定性のためのデンプン加水分解アッセイ
【０３９４】
コーン粉に対するαアミラーゼ活性アッセイを用いてバチスルスブチリスＡｍｙＳ及びＡｍｙＳ変異体の特異活性及び安定性を測定した。活性はＰＡＨＢＡＨ（ｐ−ヒドラジドニトロヒドロキシ安息香酸）法によるコーン粉の酵素分解により精製する還元糖として決定された。安定性は８５℃における持続活性により評価した。
【０３９５】
設備：  ＰＣＲプレートアダプターを備えたＩｎｈｅｃｏ  Ｖａｒｉｏｍａｇ  Ｔｅｌｅｓｈａｋｅ  ９５、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ、Ａｘｙｇｅｎ  ＰＣＲ−９６−ＦＳ−ＣフルスカートＰＣＲ  プレート、最小で４つの９６ウェルブロックを備えたサーモサイクラー（ａｎ  ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｔｒａｄ）、Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸ液体ハンドラー
【０３９６】
デンプン加水分解：液体ハンドリング目的にシフトされた、アジアーファームズ有機コーン粉（Ａｚｕｒｅ  Ｆａｒｍｓ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｒｎ  Ｆｌｏｕｒ）を６００未満ミクロン分画を入手し、４時間８０℃で焼成し、室温で一晩平衡化した。２％（ｗ／ｗ）懸濁液を５００ｇ及び１０００ｇバッチ中で調製した。この懸濁液を激しく撹拌して、ｐＨ調整及びｐＨ平衡化を連続的に行い、ビーカーからＰＣＲプレートに移した。２３ｇ予備焼成したコーン粉及び９７７ｇの脱イオン水で１０００ｇとし、１５分間撹拌して、Ｈ２ＳＯ４でｐＨを５８にして、３０分間平衡化した。必要に応じて最終的なｐＨ調整を行った。８チャンネルのチップを装着したピペットを約１．５ｍｍの好適なサイズに合わせて、懸濁液をＡｘｙｇｅｎＰＣＲプレートに移した。
【０３９７】
ＡｍｙＳ及びＡｍｙＳ変異体の培養上清を希釈緩衝液（水＋０．００５％Ｔｗｅｅｎ−８０）で約１μｇ／ｍｌに希釈して、１０μＬの希釈した各上清を５分、１０分、及び６０分反応プレートに移して、サンプルをピペットを用いて上下させて１度混合した。５０μＬの形質ミネラルオイルのアリコートを各ウェルに移した。プレートを８５℃に予備加熱したＩｎｈｅｃｏユニットに移した。インキュベーションの後決められた時間で（５、１０、及び６０分）で、各ウェルに１０μＬの４ＮＮａＯＨを添加して、反応を停止させた。デンプン加水分解反応生成物をＰＡＨＢＡＨアッセイにより解析した。
【０３９８】
ＰＡＨＢＡＨアッセイ：８０μＬの０．５ＮＮａＯＨのアリコートを空のＰＣＲプレートの全てのウェルに添加し、次いで２０μＬのＰＡＨＢＡＨ試薬（５％ｗ／ｖのｐ−ヒドラジドニトロヒドロキシ安息香酸）（ＰＡＨＢＡＨ，シグマ  ＃Ｈ９８８２，０．５ＮＨＣｌ中に溶解）を添加し、ピペットで内容物を上下させて混合した（ＰＡＨＢＡＨ反応プレート）。全てのプレートを密閉して、９５℃２分その後２０℃で冷却するように設定された熱サイクラー中に置いた。発色したＰＡＨＢＡＨ反応混合物の８０μＬのサンプルを新しいプレート（リードプレート）に移し、吸光度を分光光度計において、４０５ｎｍで測定した。
汚れ除去性能のためのスウォッチ洗浄アッセイ
【０３９９】
このアッセイにおいて、バチルススブチリスＡｍｙＳ及びＡｍｙＳ変異体の汚れ除去性能をＣＳ−２８コメデデンプンで汚れたマイクロスウォッチを用いてマイクロタイタープレートスケールで行った。直径１／４”マイクロスウォッチをＣＦＴ  Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）より入手した。２つのマイクロスウォッチを９６マイクロタイタープレートの各ウェルに置いた。
【０４００】
ろ過した培養ブロスサンプルを１０ｍＭＮａＣｌ、０．１ｍＭＣａＣｌ２、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−８０の混合物で２０倍希釈してこの性能試験の所望の最終濃度にして試験を行った（試験に用いる最終濃度は０．００２５乃至０．１０ｐｐｍ）。
【０４０１】
アミラーゼ性能はｐＨ８及びｐＨ１０の両方で測定した。
【０４０２】
１９０μＬの２５ｍＭＨＥＰＥＳ（シグマ、Ｈ７５２３）、２ｍＭＣａＣｌ２、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−８０を含む緩衝液１９０μＬ、ｐＨ８．０又は１９０μＬの２５ｍＭＣＡＰＳ（シグマ、Ｃ２６３２）、２ｍＭＣａＣｌ２、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−８０を含む緩衝液１９０μＬ、ｐＨ１０．０いずれかをマイクロスウォッチを含むプレートの各ウェルに添加した。１０μＬの希釈したアミラーゼサンプルをマイクロスウォッチを含むウェルに添加した（総容量は２００μＬ／ウェル）。このプレートをプレートシールで覆って、１１５０ｒｐｍで撹拌しながら、４０℃に維持しているインキュベーター中に６０分置いた。好適な条件下でのインキュベーションの後、１００μＬの各ウェルからの溶液を除去し、新しいマイクロタイタープレートに移し、分光光度計で４８８ｎｍの吸光度を測定した。１ウェル当り２つのマイクロスウォッチ及び洗剤を含むが、酵素サンプルを含まない「ブランクカラム」もこの試験でインキュベーションした。
【０４０３】
ＣＳ−２８コメデンプンか性能の計算：得られた吸光度の値を（酵素なしでインキュベーションしたマイクロスウォッチ）ブランクの値で補正した。得られた吸光度−△ＯＤ４８８−をデンプン分解活性について測定した。各サンプルについて（ＡｍｙＳ又はＡｍｙＳ変異体）、性能インデックスを野生型酵素の活性で変異体の活性を割って計算した。同じタンパク質濃度で変異体の性能（実際の値）及び標準的なＡｍｙＳ対照酵素（理論的値）の性能インデックスを比較した。
【０４０４】
１より大きい（ＰＩ＞１）性能インデックス（ＰＩ）はより良い変異体（標準、例えば、野生型と比較して）を示す。１のＰＩ（ＰＩ＝１）は標準と同じ性能の変異体である。１より低いのＰＩ（ＰＩ＜１）は標準より劣る性能の変異体である。従って、ＰＩは野生型とは異なる性能を有する変異体を同定した。
【０４０５】
以下の部位変異はこの実施例で評価された。
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実施例２３
ＡｍｙＳ変異体の性能
【０４０６】
ＡｍｙＳ変異体の性能（例えば、実施例２２で説明したような）をタンパク質発現（発現）、１０分間でのコーン粉加水分解（コーン粉１０）、又は６０分間でのコーン粉加水分解（コーン粉６０）、ｐＨ４でのＤＰ７基質における活性（ＤＰ７ｐＨ４）又はｐＨ５．８でのＤＰ７基質における活性（ＤＰ７ｐＨ５．８）、ｐＨ８でのＣＳ２８コメデンプンマイクロスウォッチ洗浄（クリーニング８）又はｐＨ１０でのＣＳ２８コメデンプンマイクロスウォッチ洗浄（クリーニング１０）について試験した。結果を表２３−１に示す。タンパク質発現は実施例１２で説明したブラッドフォードアッセイで測定した。コーン粉加水分解及びスウォッチ洗浄アッセイは実施例２２で説明したように測定した。ＡｍｙＳ変異体の機能性を性能インデックス（Ｐｉ）（即ち、野生型ＡｍｙＳに対する変異体の性能の比）で定量化した。各種性質について、ＰＩ＞１はこの性質について変異体が改善されていることを示す。ＮＤは得られた値がアッセイの範囲外であることを示す。
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（表２３−１）
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【０４０７】
野生型αアミラーゼに対して１つ以上の改善された性質を有する数多くの変異体αアミラーゼが生成されたことが明らかである。これらの置換体は本発明の組成物及び方法に含まれる。
実施例２４
ＡｍｙＳ変異体の変更された性質
【０４０８】
この実施例は幾つかのゲオバチルスステアロセレモフィリスαアミラーゼ（ＡｍｙＳ）変異体（実施例２２で説明）が親αアミラーゼに対して変更された性質を有していることを示す。ＡｍｙＳ変異体の高い熱安定性の処理能力スクリーンを実施例３のように行った。性能は活性について示し（ＢＯＤＩＰＹアッセイで測定）、残余活性を（熱ストレス後）を表２４−１、２４−２、及び２４−３に示した。
表２４−１
野生型ＡｍｙＳよりも活性及び熱ストレス後残余活性の両方についての性能インデックスを有する変異を有するＡｍｙＳタンパク質の置換位置（カラムではＶａｒｉａｎｔと記載）
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表２４−２
野生型ＡｍｙＳよりも熱ストレス後残余活性が野生型に対して少なくとも２０％良好で開始活性又は発現が野生型ＡｍｙＳの少なくとも半分である性能インデックスを有する変異を有するＡｍｙＳタンパク質の置換位置（カラムではＶａｒｉａｎｔと記載）
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表２４−３
野生型ＡｍｙＳよりも少なくとも２０％大きな活性又は発現の性能インデックスを有する変異を有するＡｍｙＳタンパク質の置換位置（カラムではＶａｒｉａｎｔと記載）
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【０４０９】
表２３−１、２４−１、２４−２、及び２４−３に記載のＡｍｙＳ位置に関する相対的性能及び熱安定性データに基づいて、以下のようにＡｍｙＳ位置を限定対非限定として分類した：非限定的位置は少なくとも１つの性質について２０％以上ニュートラル変異を有する。これらの位置における変異は性能が改善される可能性が高い変異体であるので、これらの位置は、修飾されたαアミラーゼを作るときには好適な候補変異部位である。限定的位置は活性及び安定性が２０％未満のニュートラル変異を有する。これらの位置は、性能を高めるというよりもむしろ減少させる置換位置であるので、αアミラーゼの修飾についてはそのままにしておく（即ち、変異させない）。
実施例２５
ＡｍｙＳタンパク質における追加的なポジショナルライブラリー
【０４１０】
実施例２２に記載のＡｍｙＳ変異体に加えて、追加的な部位におけるポジショナルライブラリーを切断部位を有するゲオバチルスステアロセレモフィリスαアミラーゼ（配列番号２）中に生成した。このライブラリーはＧｅｎｅａｒｔ（Ｇｅｎｅａｒｔ  ＧｍｂＨ，Ｊｏｓｅｆ−  Ｅｎｇｅｒｔ−ｓｔｒａｓｓｅ  １１，Ｄ−９３０５３  Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，ＤＥ）により生成された。表２５−１は生成された部位変異体を示す。
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（表２５−１）
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実施例２６
実施例２５における変異体の変更された性質
【０４１１】
この実施例は（実施例２５で説明した）ゲオバチルスステアロセレモフィリスαアミラーゼ（ＡｍｙＳ）変異体が親αアミラーゼに対して変更された性質を有することを示す。ＡｍｙＳ変異体の高い処理能力の熱安定性スクリーンを実施例３に記載の通りに行った。活性（ＢＯＤＩＰＹアッセイ）及び残余活性（熱ストレス後）についての性能インデックスを表２６−１、２６−２、及び２６−３に示す。
表２６−１
活性及び熱ストレス後の残余活性の両方について野生型ＡｍｙＳよりも好適な性能インデックスを有する変異を有するＡｍｙＳタンパク質中の置換位置（変異体と表示したカラム）
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表２６−２
野生型ＡｍｙＳよりも熱ストレス後残余活性が野生型に対して少なくとも２０％良好で開始活性又は発現が野生型ＡｍｙＳの少なくとも半分である性能インデックスを有する変異を有するＡｍｙＳタンパク質の置換位置（カラムではＶａｒｉａｎｔと表示）
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表２６−３
野生型ＡｍｙＳよりも少なくとも２０％大きな活性又は発現の性能インデックスを有する変異を有するＡｍｙＳタンパク質の置換位置（カラムではＶａｒｉａｎｔと表示）
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表２６−４
この表は１５２位におけるＡｍｙＳの２，６６６変異体についての性能インデックス（ＰＩ）を示す。活性アッセイにおいて０．０５以下の性能インデックスは０．００５と表記し、イタリック太字で表記した。熱安定性測定について、性能インデックスが０．０５以下の場合も０．０５と表記した。
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表２６−５
この表は１５２位におけるコンビネーショナル変異体であるＡｍｙＳ変異体を列挙する。これらの変異体は少なくとも１つの性質（活性又は安定性）について０．５以上の性能インデックス及び両方の性質において０．００５より大きい性能インデックスを有する。
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実施例２７
有用な置換部位と有用ではない置換部位
実施例２６に記載のＡｍｙＳ置換位置についての相対的な性能及び安定性のデータに基づいて、ＡｍｙＳ置換位置を「限定的置換位置」及び「非限定的置換位置」に以下のように分類した。非限定的置換位置は少なくとも１つの性質について２０％以上の中立突然変異を有する。限定的置換位置は活性及び安定性について２０％未満の中立突然変異を有する。非限定的置換位置は、数多くの変異体が現状維持（野生型の性能に近い性能を維持している）又は改善された性能のいずれかであるから、改善された機能を有するαアミラーゼを設計するための変異の好適な候補である。限定的置換位置は変異体が許容できないものであるので、変異のための候補としては好ましくない。任意のアミラーゼの性質は非限定的位置における変異の組み合わせにより改善される。表２７−１はＡｍｙＳにおいて同定された２つの限定的位置を示す（％は中立突然変異の定義に一致する評価された変異体のパーセンテージである）。表２７−２はＡｍｙＳにおいて同定された１５０の有用な置換位置を示す（％は中立突然変異の定義に一致する評価された変異体のパーセンテージ；少なくとも１つの性質についての中立突然変異体が≧２０％）。限定的及び非限定的位置は異なるαアミラーゼの間で保存されていると考えられている。
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（表２７−１）
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（表２７−２）
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実施例２８
ＡｍｙＳ変異体による粘度低下
【０４１２】
ＡｍｙＳ変異体による異なるバッチのコーン粉（バッグＡ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）の粘度低下を実施例６に記載のようにモニターし、ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ（ジェネンコア）による粘度低下と比較した。結果を図３２Ａ及び表２８−１に示す。粘度計アッセイにおいて改善されたＡｍｙＳ変異体はいくつかの基準により確認された。これらはピーク粘度の減少、最終粘度の減少、又は野生型酵素について所定のピーク又は最終粘度に必要とされる酵素投与量と同じ効果を得るために必要とされる酵素の投与量の減少等である。表２８−１において、ＡｍｙＳ変異体の改善された性質は太字部分で示す。
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（表２８−１）
実施例２９
フィターゼの存在下におけるＡｍｙＳ変異体による粘度低下
【０４１３】
コーン粉の粘度低下は実施例６に以下の変更を加えて、フィターゼＢＰ１１１を添加し、又は添加せずに、モニターした。粘度低下の効果はｐＨ５．２、ｐＨ５．５、及びｐＨ５．８で測定した。結果を図３２Ｂ及びＣに示す。ＡｍｙＳＮ１３９Ｙにフィターゼ（ＢＰ１１１）を添加すると、粘度計における粘度低下能力が有意に改善された。
【０４１４】
これまでに言及してきた全ての刊行物及び特許は参照により本明細書に援用される。本発明の範囲及び精神を逸脱せずに、当業者は本発明で説明した方法及びシステムの各種変更及びバリエーションを理解することができる。本発明は特定の好適な態様に基づいて説明してきたけれども、特許請求の範囲に記載の発明はこれらの特定の態様に限定することを意図するものではない。即ち、本発明を実施するために説明された態様の各種変更を当業者は行うことができ、このような態様も添付の特許請求の範囲に属す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【配列表】
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