(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で示されるペプチド、または薬学的に許容可能なその塩、
Ｘ１−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３  （Ｉ）
前記式で、Ｘ１はＧｌｕまたはＡｓｐであり、Ｘ２はＨｉｓ、ＬｙｓまたはＡｒｇであり、Ｘ３はＡｓｐまたはＧｌｕであり、前記Ｇｌｕはグルタミン酸、Ａｓｐはアスパラギン酸、Ｌｅｕはロイシン、Ｈｉｓはヒスチジン、ＬｙｓはリシンでＡｒｇはアルギニンである。
【請求項２】
前記Ｘ１はＧｌｕで、前記Ｘ２はＨｉｓであり、前記Ｘ３はＡｓｐであることを特徴とする請求項１に記載のペプチド、または薬学的に許容可能なその塩。
【請求項３】
請求項１または請求項２のペプチド、または薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含んでいることを特徴とする組成物であって、軟骨損傷または関節炎のうちから選択された一つ以上の、治療または予防用組成物。
【請求項４】
前記治療または予防は軟骨組織再生、軟骨組織基質分解酵素発現抑制、および軟骨組織骨化抑制のうちから選択された一つ以上によるものであることを特徴とする請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記関節炎は、軟骨および軟骨下骨の変成を伴う関節疾患であることを特徴とする請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物は、薬学組成物であることを特徴とする請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１または請求項２のペプチド、または薬学的に許容可能なその塩およびＴＧＦβ１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ  １；形質転換成長因子ベータ１）を含むことを特徴とする組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規ペプチドに関し、詳細には軟骨損傷、関節炎治療および／または予防に有効な新規ペプチドに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
軟骨組織は基質（ｍａｔｒｉｘ）と軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）で構成されている。このうち、基質の膠原繊維（ｃｏｌｌａｇｅｎ、ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）は、非膠原性蛋白質（ｎｏｎｃｏｌｌａｇｅｎｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と共に軟骨に水分を吸収排出しつつ軟骨特有の物理的性質を維持するのに重要な役割をはたす。軟骨組織は、主に関節疾患で損傷し、関節の軟骨組織は大きく４つの層、最も外側表面の表層（ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｚｏｎｅ）、中間層（ｍｉｄｄｌｅ  ｚｏｎｅ）、深層（ｄｅｅｐ  ｚｏｎｅ）、石灰化層（ｃａｌｃｉｆｉｅｄ  ｚｏｎｅ）に区分される（Ｃｌｏｕｅｔ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  （２００９）  １４：１９／２０、９１３−９２５）。表層は比較的に少ない基質を含む部位で、膠原線維が関節表面に沿って緻密に配列されており細く平たい形態の軟骨細胞が存在し、関節運動の剪斷力を吸収する。中間層は表層より厚く、太い膠原繊維と球形の軟骨細胞で形成されておりプロテオグリカンと水を含む基質比率が高く荷重に耐える役割をはたす。深層はプロテオグリカンと非膠原性蛋白質が豊富で基質成分が最も多いが水分比率は最も少ない部分で、円形に近い比較的少数の軟骨細胞と膠原繊維が垂直に配列され組織の安全性に付与する。石灰化層は石灰化線（ｔｉｄｅｍａｒｋ）という特異構造を含み、軟骨組織を骨組織に固定させる役割をはたす。
【０００３】
関節を構成する軟骨組織が損傷すると、腫れ、熱感、疼痛を伴った関節炎（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）が誘発されるが、関節炎は人種に関係がなく発病し、その原因によって１００種以上に分けられる。そのうち最もありふれている形態が主に老化によって発病する変形性関節疾患｛せい  かんせつ  しっかん｝（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｊｏｉｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）である骨関節炎（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）であり、その他、自己免疫疾患の関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）と乾癬性関節炎（ｐｓｏｒｉａｔｉｃ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、感染による敗血症性関節炎（ｓｅｐｔｉｃ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）等がある。特に変形性関節症は老年層の代表的な疾患で主に関節の老化によって発病するが、その他にも遺伝的要因、栄養の不均衡、運動不足、過激な運動やケガ、過度な労働のように関節に無理をあたえる行動や、正しくない姿勢、肥満による過負荷などのさまざまな要因が複合的に作用して発病するため、若年層でも頻繁に発病する疾患である（Ｃｌｏｕｅｔ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ（２００９）１４：１９／２０、９１３−９２５；Ｇｅｇｏｕｔ  ＰＰ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｉｎｔ  Ｂｏｎｅ  Ｓｐｉｎｅ（２００８）６６９−６７１）。
【０００４】
外傷や退行性変化で関節を支持する組織が弱化すると緩衝作用をする軟骨組織が損傷し骨の間の摩擦を増加させて疼痛と炎症を誘発する。炎症は関節周囲で骨棘（ｏｓｔｅｏｐｈｙｔｅ）の生成を促進させ、運動性を制限し、より大きい疼痛を誘発することになる。
【０００５】
関節炎は幅広い年齢層で発病頻度が高い疾患であるが、一度損傷した組織は自然には再生や復旧がされずらく、長期間患者の社会的活動を制限し生活の質を低下させる原因となる。
【０００６】
現在までの治療法は大きく、体重調節を含む運動療法、食事療法、注射療法、薬物療法のような保存的な治療法と、成長因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）を使用する組織再生技術（ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、人工培養細胞を使用する移植法（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、損傷の程度が激しい場合に使用する人工関節置換術のような手術療法に区分される（Ｃｌｏｕｅｔ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ（２００９）１４：１９／２０、９１３−９２５）。
【０００７】
関節に無理を与えない範囲の運動療法は、関節周辺組織を強化させ症状悪化を遅延させる効果はあるが、損傷した組織を根本的に再生させるものではなく症状が激しい場合、疼痛によって行うことは難しい。
【０００８】
関節の組織再生を促進したり炎症を軽減させる目的で、軟骨構成成分であるグルコサミン（ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）やコンドロイチン（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ）、消炎作用がある魚油（ｆｉｓｈ  ｏｉｌ）、その他生薬組成物などが使用されている（Ｄｅｒｆｏｕｌ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  （２００７）１５、６４６−６５５；Ｔｉｒａｌｏｃｈｅ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．（２００５）５２、１１１８−１１２８；ＭｃＡｌｉｎｄｏｎ  ＴＥ  ｅｔ  ａｌ．ＪＡＭＡ（２０００）２８３（１１）：１４６９−１４７；Ｚａｉｎａｌ  Ｚ  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ（２００９）１７（７）：８９６−９０５）。
【０００９】
また損傷した部位の摩擦を減らし、疼痛を軽減させて症状の悪化を防ぐために関節の潤滑液成分であるヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ；ＨＡ）を注射する方法も行われている（Ｗａｄｄｅｌｌ  ＤＤ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｒｔｈｒｏｓｃｏｐｙ（２０１０）２６（１）：１０５−１１；Ｗａｎｇ  ＣＴ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．Ａｍ．（２００４）８６−Ａ  ５３８−５４５）。
【００１０】
このような保存的な治療療法の一部は肯定的な効果を見せるものと報告されているが、疼痛の軽減や治療効果が微々たるものであったり、その作用機序がよく明らかになっていない場合が大部分であるため、治療療法として使用するためには追加検証が要求されている（ＭｃＡｌｉｎｄｏｎ  ＴＥ  ｅｔ  ａｌ．  ＪＡＭＡ（２０００）２８３（１１）：１４６９−１４７）。
【００１１】
炎症や疼痛を軽減させる目的でアスピリン（ａｓｐｉｒｉｎ）、アセトアミノフェン（ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ）、またはさまざまな種類の非ステロイド性抗炎症薬（ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ  ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｒｕｇｓ、ＮＳＡＩＤｓ）とコルチゾン（ｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）のようなステロイド性薬品が使用されている。しかし、このような薬物療法も損傷した組織を復旧させることができる根本的な治療法ではなく、長期間使用時に副作用として胃腸や組織、骨を損傷させるものと報告されている（Ｃｌｏｕｅｔ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ（２００９）１４：１９／２０、９１３−９２５；Ｇｌａｓｓ  ＧＧ  Ｄｉｓ．  Ｍｏｎ．  （２００６）３４３−３６２；Ｚｈａｎｇ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｎ．  Ｒｈｅｕｍ．  Ｄｉｓ．  （２００４）６３、９０１−９０７）；Ｆｒａｍｐｔｏｎ  ＪＥ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｒｕｇｓ（２００７）６７（１６）：２４３３−７２；ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ  ＡＬ．  Ｐｈｙｓ  Ｔｈｅｒ．  （１９８２）６２（６）：８３５−９．）。
【００１２】
損傷した軟骨組織を再生、復旧する目的でアピゲニン、ＦＧＦ、ＢＭＰｓ  （ＢＭＰ７／ＯＰ−１）、ＴＧＦβ１のような成長因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）あるいはその一部を含む組成物の使用が考慮されている（Ｃｌｏｕｅｔ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  （２００９）  １４：１９／２０、９１３−９２５；ＳＨｉ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  （２００９）  ２８４  （１）：６６９７−６７０４；Ｍｏｏｒｅ  ＥＥ  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  （２００５）  １３、６２３−６３１）。しかし関節炎患者に蛋白質から成る高分子の成長因子を直接的で反復的に注入することは容易でなく、実際に患者に適用するためにはこのような成長因子の伝達方法についての追加研究が要求される。
【００１３】
前述した保存的な治療法で効果がなかったり、深刻な疼痛が持続する場合、人工関節に置き換える手術的療法が使用されるが、人工関節は寿命が約１０年程度と限定されており必要により再手術が必要である。この場合、骨に狭窄した人工関節除去の難しさ、より大きい人工関節移植の必要性、より広範囲な周辺骨組織が必要になり再手術に制限がともなう。このような問題点で人工関節置換術を若年層に適用する時はより慎重を期さなければならない。
【００１４】
最近では人工細胞培養技術が発達するのにともない多能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）や自家間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）から軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）を人工的に培養して移植（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）する方法が報告された（Ｃｓａｋｉ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｎ  Ａｎａｔ．  （２００８）  １９０（５）：３９５−４１２）。しかし、充分な自家細胞を得るのは容易でなく、移植した細胞の付着、再生効率、安全性の側面で多くの患者に適用するには技術的、費用的な側面でいまだ解決しなければならない問題点が多い。
【００１５】
高齢化社会に入りつつ関節炎によって苦痛を受ける老年層の人口が着実に増加しており、過度な運動、栄養の不均衡、肥満などによる関節疾患が若年層でも増加傾向にある。これにともなう経済的損失と社会的費用を低減させ老齢人口の生活の質を改善するためには、既存の炎症や疼痛を軽減させる保存的な食餌、薬物療法や、人工関節置換術のような手術療法、人工培養した軟骨細胞を移植する方法でなく、関節炎で損傷した軟骨組織をより手軽で安全に根源的に再生、復旧させることができる新しい概念の関節炎治療剤の開発が早急に要求されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明が解決しようとする課題は、新規なペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩を提供するものである。
【００１７】
また、本発明が解決しようとする課題は、軟骨損傷または関節炎のうちから選択された一つ以上の、治療および／または予防用組成物を提供するものである。
【００１８】
また、本発明が解決しようとする課題は、軟骨損傷または関節炎などに効果的な組成物を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は下記一般式（Ｉ）で示されるペプチド、または薬学的に許容可能なその塩を提供する。
【００２０】
Ｘ１−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３  （Ｉ）
前記式で、Ｘ１はＧｌｕまたはＡｓｐであり、Ｘ２はＨｉｓ、ＬｙｓまたはＡｒｇであり、Ｘ３はＡｓｐまたはＧｌｕであり、前記Ｇｌｕはグルタミン酸、Ａｓｐはアスパラギン酸、Ｌｅｕはロイシン、Ｈｉｓはヒスチジン、ＬｙｓはリシンでＡｒｇはアルギニンである。
【００２１】
望ましくは、前記ペプチドのＸ１はＧｌｕであり、前記Ｘ２はＨｉｓであり、前記Ｘ３はＡｓｐであるペプチド（配列番号１；Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ）である。
【００２２】
アミノ酸はＲ基（アミノ酸に共通に結合されたカルボキシル基、アミノ基、水素以外に可変的な基）の属性にしたがい分類し、前記ＧｌｕまたはＡｓｐは酸性アミノ酸｛Ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ  Ｃｈａｒｇｅｄ（Ａｃｉｄｉｃ）  Ｒ  Ｇｒｏｕｐｓ｝に分類され、前記Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｒｇは塩基性アミノ酸｛Ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ  Ｃｈａｒｇｅｄ（Ｂａｓｉｃ）  Ｒ  Ｇｒｏｕｐｓ｝に分類される。前記酸性アミノ酸はｐＨ７．０で負電荷を有するＲ基を有し、また１つのカルボキシル基を有する。前記塩基性アミノ酸はｐＨ７．０で正電荷を有するＲ基を有する。前記同一分類に属するアミノ酸は類似の特性を示す。
【００２３】
前記ペプチドを構成するアミノ酸にはＬ−体、Ｄ−体、ＤＬ−体が存在し、本発明のペプチドを構成するアミノ酸はこれらをすべて含む。
【００２４】
前記薬学的に許容可能なその塩は例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩などをあげることができる。
【００２５】
また、本発明は本発明のペプチド、または薬学的に許容可能なその塩の軟骨損傷または関節炎治療および／または予防用途を提供する。
【００２６】
したがって、本発明は本発明のペプチド、または薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含む組成物であって、軟骨損傷または関節炎のうちから選択された一つ以上の、治療および／または予防用組成物を提供する。
【００２７】
前記治療および／または予防は軟骨組織再生、軟骨組織基質分解酵素発現抑制、および軟骨組織骨化抑制のうちから選択された一つ以上によるものでありえ、前記関節炎は望ましく軟骨および軟骨下骨の変成をともなう関節疾患である。
【００２８】
また、本発明は本発明のペプチド、または薬学的に許容可能なその塩およびＴＧＦβ１  （Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ  １）を含む組成物を提供する。
【００２９】
前記ペプチド、または薬学的に許容可能なその塩とＴＧＦβ１は重量比で１：２０〜４０でありうる。
【００３０】
本発明の組成物は薬学組成物であることもありえ、薬学的に許容される担体を添加して製剤化することができる。
【００３１】
本発明のペプチドはペプチド化学で通常使用される方法によって製造することができる。例えば、ペプチドをＳｃｈｒｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｌｕｂｋｅ著、「Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」第１巻、Ａｃａｄｍｅｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９６５）等に記載された方法によって製造することができ、溶液相合成または固体相合成二つのうち一つによって製造することができる。
【００３２】
ペプチド結合を形成するための方法の例はアジド法、酸クロリド法、対称無水物法、混合無水物法、カルボジイミド法、カルボジイミド−付加物法、活性エステル法、カルボジイミダゾール法、酸化−還元法、およびＷｏｏｄｗａｒｄ試薬Ｋを使用する方法などがある。
【００３３】
縮合反応を行う前に、反応に関与しなかったカルボキシル基、アミノ基などを保護させることができ、縮合反応に関与するカルボキシル基およびアミノ基を当分野に公示された方法で活性化させることができる。
【００３４】
カルボキシル基を保護する基の例はメチル、エチル、ベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｔ−ブチルおよびシクロヘキシルのようなエステル−形成基をあげることができる。
【００３５】
アミノ基を保護する基の例はベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、および／または９−フルオレニルメチルオキシカルボニルなどをあげることができる。
【００３６】
カルボキシル基の活性形態の例は対称的な無水物、アジドおよび活性エステル［アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２、４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２、３−ジカルボキシイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドまたは１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）とのエステル］などをあげることができる。
【００３７】
活性化アミノ基の例はアミドホスファイトである。
【００３８】
反応をクロロホルム、ジクロロメタン、エチルアセテート、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、水、メタノールおよびこれらの混合物のような溶媒で行う。
【００３９】
反応温度は反応に一般的に使用される約−３０℃〜５０℃の範囲でありうる。
【００４０】
ペプチド保護基を除去する反応は保護基の種類によって異なるが、ペプチド結合にどのような影響も与えずに保護基の離脱を可能にしなければならない。
【００４１】
保護基を酸処理例えば、塩化水素、臭化水素、フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸およびこれら酸の混合物で処理することによって除去することができる。また、液体アンモニアでナトリウム金属を使用する還元またはパラジウム−炭素を使用する触媒性還元を使用することができる。
【００４２】
前記酸処理で保護基を除去する反応を行う時、アニソール、フェノールおよびチオアニソールなどを添加することができる。
【００４３】
反応完結後、本発明の製造されたペプチドを通常のペプチド精製｛せいせい｝方法、例えば、抽出、分配、再沈殿、再結晶またはカラムクロマトグラフィーによって回収することができる。
【００４４】
また、本発明のペプチドを通常の方法にしたがい、その変異体または薬学的に許容可能なその塩に転換させることができる。
【００４５】
本発明によるペプチドは自動ペプチド合成器によって合成することができ、遺伝子操作技術によっても生産することができる。例えば遺伝子操作によって融合パートナーと本発明のペプチドとされた融合蛋白質をコーディングする融合遺伝子を製造し、それをもって宿主微生物を形質転換させた後、宿主微生物で融合蛋白質形態に発現させた後、蛋白質分解酵素または化合物を利用して融合蛋白質から本発明のペプチドを切断、分離して所望するペプチドを生産することができる。
【００４６】
前記ペプチド、または薬学的に許容可能なその塩の投与量は、非経口投与時、１５０μｇ／日〜１ｍｇ／日であり、望ましくは０．５ｍｇ／日〜１ｍｇ／日である。経口投与の場合、投与量は非経口投与量の１．２〜１．５倍である。本発明のペプチドまたは組成物を主に非経口方法で、例えば局所注射（関節腔内注射）、静脈または皮下注射、あるいは経皮投与で投与する。また、場合に応じて経口で投与することができる。
【００４７】
本発明のペプチド、薬学的に許容可能なその塩、または組成物は、薬学的に許される担体とともに製剤化し、注射剤、粉末、点鼻剤、顆粒、錠剤などの形態で製造することができる。
【００４８】
薬学的に許される担体は当業者によく知られたさまざまな因子により製造されるが、例をあげれば、利用された特定生理活性物質、これの濃度、安定性および意図的生体利用性；治療しようとする疾患、病気および状態；治療を受ける個体、年齢、大きさおよび一般的な状態；組成物を投与するのに利用される経路、例えば局所、静脈、筋肉、経皮、口腔および鼻腔などの要因を考慮しなければならないが、これに制限されはしない。一般的に経口投与経路以外の生理活性物質投与に利用される薬剤学的に利用可能な担体にはＤ５Ｗ（水のうち５％葡萄糖）、デキストロースおよび生理学的塩を容積の５％以内で含む水溶液などを含み、病巣内局所注射の場合、治療効果を増進させて持続時間を増加させるためにさまざまな注射可能なヒドロゲル（ｈｙｄｒｏｇｅｌ）を使用することができる。また薬学的に利用可能な担体には保存剤および抗酸化剤のような活性成分の安定性を補強できる追加成分を含むことができる。本発明のペプチドまたは組成物は該当分野の適切な方法で製造することができ、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ（最近版）等に開示されている方法を参照して各疾患に応じて、または成分に応じて、望ましいように製剤化することができる。
【００４９】
本発明のペプチドを生理食塩水溶液で保管することができ、マンニトールまたはソルビトールの添加後にアンプル（ａｍｐｌｅ）として凍結乾燥することができ、これを投与するために使用する時は生理食塩水などに溶解させることができる。
【００５０】
本発明はまた、本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩の投与を必要とする人間を含む哺乳類に、投与するステップを含む軟骨損傷または関節炎の治療および／または予防法を提供する。
【００５１】
本発明はまた、本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩の医薬用途、望ましくは軟骨損傷または関節炎の治療および／または予防用途を提供する。
【００５２】
本発明のペプチド、または薬学的に許容可能なその塩と組成物において言及した事項は本発明の用途、治療および／または予防法に矛盾しない限り同様に適用される。
【発明の効果】
【００５３】
本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩は、軟骨損傷または関節炎などの治療または予防に効果的であり、軟骨組織再生、軟骨組織基質分解酵素発現抑制、および／または軟骨組織骨化抑制などの効果を示しうる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】損傷した軟骨組織において、本発明による一実施例によって起きる軟骨組織の変化を撮影した写真である。
【図２】本発明の一実施例によって起きる軟骨組織再生効果をヘマトキシリンとエオシンで染色して観察した結果である。
【図３】本発明の一実施例によって起きる軟骨組織再生効果を、コラーゲンを染色して観察した結果である。
【図４】本発明の一実施例によって起きる軟骨組織再生効果をヘマトキシリンとエオシンで染色して観察した結果である。
【図５】本発明の一実施例による軟骨組織培養細胞のうち、コラーゲンタイプＩＩの発現の変化を測定した結果である。
【図６】本発明の一実施例による軟骨組織培養細胞のうちＭＭＰ１３の発現の変化を測定した結果である。
【図７】本発明の一実施例による軟骨組織培養細胞のうちコラーゲンタイプＸの発現の変化を測定した結果である。
【図８】変形性関節症モデルにおいて、本発明の一実施例による軟骨再生効果を肉眼で確認した結果写真である。
【図９】変形性関節症モデルにおいて、本発明の一実施例による軟骨再生効果をヘマトキシリンとエオシン染色で確認した結果である。
【図１０】変形性関節症モデルにおいて、本発明の一実施例による軟骨再生効果をＳａｆｒａｎｉｎ０染色で確認した結果である。
【図１１】変形性関節症モデルにおいて、本発明の一実施例による軟骨再生効果をＭａｓｓｏｎ’ｓ  Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色で確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本発明の理解を促すために実施例を示す。下記の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるのみであり、実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【実施例】
【００５６】
〔実施例１〕
ペプチドの製造
配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド（Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ：配列番号１）を（株）ペプトロン（Ｐｅｐｔｒｏｎ  Ｉｎｃ）(韓国)に依頼して製造した。具体的に自動合成器（ＡＳＰ４８Ｓ、Ｐｅｐｔｒｏｎ  Ｉｎｃ）を使用してＦｍｏｃ  ＳＰＰＳ（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）方法を利用してＣ−末端から一つずつカップリング（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）した。
【００５７】
ペプチドのＣ−末端の最初のアミノ酸が樹脂（ｒｅｓｉｎ）に付着（ａｔｔａｃｈｅｄ）したＮＨ２−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−２−ｃｈｌｏｒｏ−Ｔｒｉｔｙｌ  Ｒｅｓｉｎを使用した。ペプチド合成に使用したすべてのアミノ酸の原料はＮ−末端がＦｍｏｃで保護され、残基はすべて酸で除去されるトリチル（Ｔｒｔ）、ｔ−ブチルオキシカーボニル（Ｂｏｃ）、ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）等で保護されたものを使用した。カップリング試薬としてはＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−１−ｙｌ）−１、１、３、３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ  ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）／ＨＯＢｔ（Ｈｙｄｒｏｘｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）／ＮＭＭ（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ）を使用した。（１）保護アミノ酸（８当量）とカップリング試薬  ＨＢＴＵ（８当量）／ＨＯＢｔ（８当量）／ＮＭＭ（１６当量）をＤＭＦ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）に溶かして添加した後、常温で２時間反応させた。（２）Ｆｍｏｃ除去は２０％  ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ  ｉｎ  ＤＭＦを加えて常温で５分間、２回反応させた。（１）と（２）の反応を反復して行い、ペプチドの基本骨格を作った後、ＴＦＡ（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）／ＥＤＴ（１、２−ｅｔｈａｎｅｄｉｔｈｉｏｌ）／Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ／ＴＩＳ（ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅ）／Ｈ２Ｏ＝９０／２．５／２．５／２．５／２．５を使用してペプチドをＲｅｓｉｎから分離した。Ｖｙｄａｃ  Ｅｖｅｒｅｓｔ  Ｃ１８  ｃｏｌｕｍｎ（２５０ｍｍ×２２ｍｍ、１０μｍ）を使用してｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｈａｓｅ  ＨＰＬＣ方法で精製した後、０．１％（ｖ／ｖ）ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄを含むｗａｔｅｒ−ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ  ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（１０〜７５％（ｖ／ｖ）  ｏｆ  ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）方法で分離した。精製されたペプチドの分子量は、ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ１１００  ｓｅｒｉｅｓ）を使用して確認し凍結乾燥した。
【００５８】
〔実施例２〜１２〕
ペプチドの製造
実施例１のアミノ酸配列の代わりに、下記の表１に記載されたアミノ酸配列としたものを除き、実施例１のような方法で実施例２〜１２のペプチドを製造した。
【００５９】
【表１】
0005607176.tif 000002
【００６０】
〔実施例１３〕
損傷した軟骨組織移植片（ｅｘｐｌａｎｔ）を使用した軟骨再生効果確認
軟骨組織移植片（ａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｅｘｐｌａｎｔ）は、地域の屠殺場（大韓民国大田市梧井洞所在）で屠殺されて１時間が経過していない３才以下の牛のかかとの関節から分離して使用した。関節から骨を除いた軟骨の部分を均一に切り出した後、手術用ナイフで約３ｍｍｘ３ｍｍに切って軟骨組織移植片を作った。先端を短く切って研磨した２１ゲージ（２１Ｇ）の注射針を使用して移植片の中央に表面と垂直となるように均一に穴をあけて損傷部位を作った。
【００６１】
穴をあけた組織移植片を、対照群を含み４つの群に分けてアスコルベート（Ａｓｃｏｒｂａｔｅ、５０ｕｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）と１０％牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ／Ｆ１２、１：１；Ｗｅｌｇｅｎｅ）で、各々実施例１のペプチド２５ｕＭ、形質転換成長因子ベータ１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ  １、ＴＧＦβ１；Ｐｒｏｍｏｋｉｎｅ）２ｎｇ／ｍｌ、実施例１のペプチド２５ｕＭとＴＧＦβ１  ２ｎｇ／ｍｌを混合して処理し、それぞれの群をさらに２つに分けて１週間および６週間培養した。６週間培養した群に対しては１週間ごとに損傷部位を顕微鏡で観察して写真に撮影した。また、１週間培養した組織移植片と６週間培養した組織移植片各々を３．７％ホルムアルデヒド／リン酸塩緩衝液（３．７％  ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ／ＰＢＳ）で固定した後、標準組織化学（ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）実験法にしたがいパラフィン切片（ｐａｒａｆｆｉｎ  ｓｅｃｔｉｏｎ）スライドを作り、ヘマトキシリンとエオシン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ＆  Ｅｏｓｉｎ；Ｈ＆Ｅ）で染色して顕微鏡で細胞の形、分布を形態学的に観察した。コラーゲンはＭａｓｓｏｎ’ｓ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅで染色して組織内で細胞の形、分布を顕微鏡で観察した。対照のために実施例１のペプチドを処理しないものを除き、実施例１のペプチド処理群と同様に処理した組織移植片を対照群とした。
【００６２】
その結果を図１〜４に示した。
【００６３】
図１は関節軟骨組織移植片に実施例１または実施例１とＴＧＦβ１を処理した後、時間経過による軟骨組織の変化を顕微鏡で観察し、写真に撮影した結果である。
【００６４】
図１で見られるように、実施例１の単独処理によって、２週以後から損傷部位が順次縮小され４週後から損傷部位周辺に細胞が付着し始め、６週後には顕著に小さくなり、実施例１のペプチドによって損傷部位が再生することが観察された（図１Ｆ〜Ｊ）。また、実施例１のペプチドとＴＧＦβ１を共に処理した場合、３週以後から切断面周囲に細胞が増殖し始め、６週後には完全に損傷部位を満たした（図１Ｐ〜Ｔ）。実施例の１ペプチド単独処理に比べてＴＧＦβ１を共に処理した場合、再生が１週間程度早く進行し、３週目に切断面にだけ見えた細胞が４週目には完全に満たされたことが分かる。
【００６５】
図２は実施例１、または実施例１とＴＧＦβ１を処理した関節軟骨組織移植片を１週間培養した後、ヘマトキシリンとエオシンで染色して組織再生効果を観察した結果を示し、図３はコラーゲンを染色した結果を示す。また、図４は実施例１、または実施例１とＴＧＦβ１を処理した関節軟骨組織移植片を６週間培養した後、ヘマトキシリンとエオシンで染色して組織再生効果を観察した結果を示す。図２と図３の矢印は軟骨組織移植片の表層（ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｌａｙｅｒ）を意味する。図４のＣとＦは各々図ＢとＥの四角形の拡大図であり、矢印は軟骨組織移植片の表層（ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｌａｙｅｒ）部位を意味する。
【００６６】
図２と図３で見られるように、実施例１のペプチドとＴＧＦβ１を共に処理した場合、軟骨組織移植片の表層（ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｌａｙｅｒ）厚さが対照群に比べて２倍以上増加することが分かり（図２Ｄ、図３Ｄ）、コラーゲン染色がさらに濃くなり実施例１のペプチドによってコラーゲン合成が増加したことが分かる（図３Ｄ）。
【００６７】
また、図４で見られるように、実施例１のペプチドで６週処理時に損傷部位が狭くなっており、損傷部位周囲に新しい細胞が付着していることが分かり（図４Ｂ、４Ｃ）、ＴＧＦβ１を共に処理した場合、軟骨組織移植片の損傷部位が表層部位（図４Ｆの矢印部位）を含み軟骨組織が本来の形態に再生され完全に満たされることが分かる（図４Ｅ、４Ｆ）。反面、対照群やＴＧＦβ１を単独で処理した場合は移植片の損傷部位の変化はほぼなかった（図４Ａ、４Ｄ）。
【００６８】
このような結果から、実施例１のペプチドによって主要基質成分であるコラーゲンの合成を増加させつつ、損傷部位に軟骨細胞の付着と増殖を促進させることによって損傷軟骨が再生されうることが分かり、ＴＧＦβ１によってその速度がさらに増加することが分かる。また、実施例１のペプチドと類似のアミノ酸配列を有する変異体である実施例２〜１２のペプチドでも類似の効果を示すものと見られる。
【００６９】
〔実施例１４〕
関節軟骨ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を使用した軟骨再生効果確認
＜遺伝子発現に対する実施例１のペプチドの影響＞
関節軟骨細胞（ａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）の性質を生体組織と類似するように維持するために細胞をペレット形態に作って培養した。
【００７０】
軟骨組織は、地域の屠殺場（大韓民国大田市梧井洞所在）で屠殺されて１時間が経過していない３才以下の牛のかかと関節全体から骨を除いた軟骨の部分を手術用ナイフで切り集めて使用した。一辺の長さが約１ｍｍの六面体形態に細かく切った軟骨組織をプロナーゼ（Ｐｒｏｎａｓｅ、１ｍｇ／ｍｌ；Ｒｏｃｈｅ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｗｅｌｇｅｎｅ）培地に入れて摂氏３７度、５％  ＣＯ２培養基で１時間３０分反応させた。プロナーゼで処理した組織をリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で２回、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液で１回洗浄した。洗浄した軟骨組織を５％牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、コラゲナーゼＰ（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  Ｐ、０．２５ｍｇ／ｍｌ；Ｒｏｃｈｅ）、ディーエヌアーゼ（ＤＮａｓｅ  Ｉ、２０ｕｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に入れて摂氏３７度、５％  ＣＯ２培養基で８〜１２時間反応させて組織が完全に分解されるようにした。分解が終わると５００ｘｇで１５分間遠心分離して細胞を集め、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄した。細胞濃度が２ｘ１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１０％牛胎児血清とアスコルベート（Ａｓｃｏｒｂａｔｅ、５０ｕｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に混濁して１５ｍｌ円錘形チューブ（ｃｏｎｉｃａｌ  ｔｕｂｅ）に各々１ｍｌずつ分配した。５００ｘｇで１０分間遠心分離してペレット形態に作り、摂氏３７度、５％  ＣＯ２培養基で２日間培養して解けない細胞ペレットを作った。ペレットを２４ｗｅｌｌプレートに移して５日間培養した後、各々ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、形質転換成長因子ベータ１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ  １、ＴＧＦβ１；Ｐｒｏｍｏｋｉｎｅ）２ｎｇ／ｍｌ、実施例１のペプチド２５ｕＭとＴＧＦβ１  ２ｎｇ／ｍｌの混合物、実施例１のペプチド２５ｕＭを処理して５日間さらに培養した。細胞分離後、１３日目には無血清培地（Ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍ）で２４時間培養し、１４日目は無血清培地に各々ＴＧＦβ１  ２ｎｇ／ｍｌ、実施例１のペプチド２５ｕＭとＴＧＦβ１  ２ｎｇ／ｍｌの混合物、実施例１のペプチド２５ｕＭを処理して２４時間培養した。
【００７１】
培養が終わったペレットはトリゾール（ＴＲＩＺＯＬ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＲＮＡを分離し、２６０ｎｍ吸光度でＲＮＡを定量した。ＲＮＡ２．２５ｕｇからｒａｎｄｏｍ  ｈｅｘａｍｅｒと５ｘ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｍａｓｔｅｒ  ｐｒｅｍｉｘ（Ｅｌｐｉｓ  ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ合成液１ｕｌを使用して重合酵素連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）で増幅し遺伝子の発現の程度を調査した。調査対象とされた遺伝子は、関節軟骨組織の再生の可否を確認するための遺伝子で軟骨細胞に特徴的なタイプＩＩコラーゲン（ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ、ＣＯＬ２Ａ１）、追加的な軟骨損傷を予防できるかの可否を確認するための遺伝子で損傷した軟骨組織で過剰発現して基質分解に関与する基質メタロペプチダーゼ１３（Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  １３、ＭＭＰ１３）、過多な活性化で骨化（ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）と進行するのかの可否を確認するための遺伝子で関節組織の骨化に関与する肥厚性軟骨細胞（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）に特徴的なタイプＸコラーゲン（ｔｙｐｅ  Ｘ  ｃｏｌｌａｇｅｎ、ＣＯＬ１０Ａ１）であった。
【００７２】
各遺伝子の増幅に使用されたＰＣＲプライマーの塩基配列とＰＣＲ産物の大きさは次の通りである。
【００７３】
Ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  （ｐｒｏｄｕｃｔ  ｓｉｚｅ：３８１ｂｐ）
ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＣＡＧＧＡＣＣＡＡＡＧＧＧＡＣＡＧＡＡＡ−３’（配列番号１３）
ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＧＴＴＧＣＣＴＴＧＡＡＡＴＣＣＴＴＧＡ−３’（配列番号１４）
ＭＭＰ１３  （ｐｒｏｄｕｃｔ  ｓｉｚｅ：６００ｂｐ）
ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＡＴＧＧＡＣＣＣＴＣＴＧＧＴＣＴＧＴＴＧ−３’（配列番号１５）
ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＣＧＴＧＴＴＴＴＧＧＡＡＡＴＣＣＣＡＧＴ−３’（配列番号１６）
Ｔｙｐｅ  Ｘ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  （ｐｒｏｄｕｃｔ  ｓｉｚｅ：４５４ｂｐ）
ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＣＡＧＴＣＡＡＧＧＧＣＣＴＴＡＡＴＧＧＡ−３’（配列番号１７）
ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＣＣＴＧＡＡＧＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＧＴＡ−３’（配列番号１８）
ＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）  （ｐｒｏｄｕｃｔ  ｓｉｚｅ：３４５ｂｐ）
ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＴＧＧ−３’（配列番号１９）
ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＣＣＣＡＧＣＡＴＣＧＡＡＧＧＴＡＧＡＡＧ−３’（配列番号２０）
具体的に、次のような条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応額はｃＤＮＡ  １ｕｌ、２ｘ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ｓｏｌｇｅｎｔ）１０ｕｌ、各ｐｒｉｍｅｒ（１０ｐｍｏｌｅ／ｕｌ）０．５ｕｌずつ、蒸溜水８ｕｌを使用した。ＰＣＲ反応は、摂氏９４度で２分間変成させた後、摂氏９４度で３０秒、摂氏５８度で４５秒、摂氏７２度で１分の条件で、Ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ、Ｔｙｐｅ  Ｘ  ｃｏｌｌａｇｅｎ、ＭＭＰ１３は、各々３２サイクル、ＧＡＰＤＨは２６サイクルのあいだ増幅させた。ＰＣＲ増幅産物は、１％  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌで電気泳動し、ＥｔＢｒ（ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ、２ｕｇ／ｍｌ）で１５分間染色した後、ＵＶ上で確認し、Ｉｍａｇｅ  Ｊ（ＮＩＨ）プログラムを使用してＧＡＰＤＨ発現量で平均化させた後、相対的な発現量を比較した。
【００７４】
その結果を図５ないし図７に示した。図５は関節軟骨組織培養細胞に実施例１のペプチド処理によるコラーゲンタイプＩＩ（ＣＯＬ２Ａ１）の発現の変化を観察した結果であり、図６はＭＭＰ１３の発現の変化を観察した結果であり、図７はコラーゲンタイプＸ（ＣＯＬ１０Ａ１）の発現の変化を観察した結果である。それぞれの図（図５〜図７）において、上はＰＣＲ増幅産物を１％アガロースゲル上で電気泳動した写真であり、下は電気泳動したバンドをＩｍａｇｅ  Ｊ（ＮＩＨ）プログラムを使用して定量したグラフである。グラフのうちｙ軸は対照群のバンドの濃さを１００％とした時、対照群と比較した実施例試料の相対的なバンドの濃さを％で計算した値を示す。
【００７５】
図５ないし図７で見られるように、実施例１のペプチドは、軟骨組織の再生と関連したタイプＩＩコラーゲンの発現をＴＧＦβ１無処理対照群と比較して５５％増加させ、実施例１のペプチドとＴＧＦβ１を共に処理した時は、ＴＧＦβ１単独処理群と比較して２７％増加させた（図５）。そして実施例１のペプチドは軟骨組織の基質分解と関連した基質メタロペプチダーゼ１３（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  １３、ＭＭＰ１３）の発現をＴＧＦβ１無処理対照群と比較して１０％減少させ、実施例１のペプチドとＴＧＦβ１を共に処理した時はＴＧＦβ１単独処理群と比較して１５０％減少させた（図６）。実施例１のペプチドは過多な活性化による関節組織の骨化（ｏｃｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に関与する肥厚性軟骨細胞（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）に特徴的なタイプＸコラーゲン（ｔｙｐｅ  Ｘ  ｃｏｌｌａｇｅｎ、ＣＯＬ１０Ａ１）の発現はＴＧＦβ１無処理対照群と比較して６９％減少させ、実施例１のペプチドとＴＧＦβ１を共に処理した時はＴＧＦβ１単独処理群と比較して７８％減少させた（図７）。
【００７６】
前記結果から、実施例１のペプチドは関節組織の軟骨細胞を活性化させて軟骨を構成する主要基質蛋白質の合成は促進し、主要基質分解酵素の発現は阻害することによって、効果的に損傷した関節軟骨組織の再生を促進する効果を示す。また、実施例１のペプチドは軟骨細胞の活性化を促進するにもかかわらず、関節組織が骨化（ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｏｓｔｅｏｐｈｙｔｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に進行しうる肥厚性軟骨細胞（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）での分化は抑制することによって、正常な組織としての再生を促進する効果を有する。
【００７７】
＜遺伝子発現に対する実施例２〜実施例１２ペプチドの影響＞
また、実施例１のペプチドの代わりに実施例２〜１２のペプチド各々を使用したものを除き、＜遺伝子発現に対する実施例１のペプチドの影響＞と同一の方法でペプチドの影響を評価した。実施例１〜１２のペプチドが軟骨組織培養細胞のうちコラーゲンタイプＩＩの発現に及ぼす影響に対する実験結果を下記表２に示した。
【００７８】
【表２】
0005607176.tif 000003
【００７９】
表２は実施例１のペプチドと類似のアミノ酸配列を有する変異体の実施例２〜１２のペプチドによる軟骨組織培養細胞のうちコラーゲンタイプＩＩの発現の変化を相互比較したものである。参考のために無処理についての結果も共に示した。表の数値は平均標準偏差で、試料の数はそれぞれの場合３つであった。データはＰＡＳＷ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ（ｖｅｒ．１７．０、ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．）統計プログラムを利用して算出し、平均±標準偏差はｐ＜０．０５水準で一元配置分散分析法（ｏｎｅ−ｗａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｃｅ）を行いＬＳＤ（最小有意差検定法）で各試験群平均値間の有意性を検定した。実施例１と類似に、実施例２〜１２もやはり無処理群に比べてコラーゲンタイプＩＩの発現を有意に増加させた。その結果、実施例１のアミノ酸配列変異体である実施例２〜実施例１２のペプチドもやはり実施例１のペプチドと類似するように軟骨の主な細胞外マトリックス要素（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ（ＥＣＭ）  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）のコラーゲンタイプＩＩの発現に影響を及ぼすことを示す。したがって、実施例１〜１２のペプチドはすべて軟骨再生効果を示すことが分かる。
【００８０】
〔実施例１５〕
変形性関節症モデルを利用した軟骨再生効果確認
すべての動物実験はＳａｍｓｕｎｇ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＳＢＲＩ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認の下に、ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＩＬＡＲ）ｇｕｉｄｅｌｉｎｅを遵守して１８〜２２週齢の体重３〜３．５ｋｇの雄ウサギ（Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  ｗｈｉｔｅｓ  ｒａｂｂｉｔｓ；（株）オリエントバイオ（韓国））１０匹に対する実験を実施した。関節軟骨変成は膝前十字靭帯を手術で切開した後、４週間ケージで飼育して誘発させ、対照群と試験群で分けて実験を行った。
【００８１】
ウサギにキシラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ）（Ｒｏｍｐｕｎ、Ｂａｙｅｒ）２．５ｍｇ／ｋｇとチレタミン（Ｔｉｌｅｔａｍｉｎｅ）／ゾラゼパム（Ｚｏｌａｚｅｐａｍ）（Ｚｏｌｅｔｉｌ、Ｖｉｒｂａｃ）８ｍｇ／ｋｇを筋肉注射して全身麻酔した後、右後肢膝関節部位を剃って消毒を行った。膝蓋骨部の皮膚を切開して関節嚢を切開した後膝蓋骨を転位させ、前十字靭帯を露出させた。この後ブレイド（Ｎｏ．１１）で靭帯を切開した後、関節嚢と皮膚縫合を行った。手術後、ウサギは４週間ケージで日常的な動きを許容し飼育した。飼育条件は温度２０−２５℃、湿度１０％〜５０％、照明午前８時〜午後８時であり、餌は一日に一度供給した。手術後４週目、ウサギを二群に分けて関節腔内注射を行った。対照群は溶媒（５％  ｌａｃｔｏｓｅ／生理食塩液）を注射し、試験群の場合、実施例１のペプチド３０ｕＭ投与群は５２．５  ｕＭ  ２００  ｕｌ、９０ｕＭ投与群は１５７．５  ｕＭ  ２００  ｕｌを各々注射した。前記ペプチドは溶媒の５％  ｌａｃｔｏｓｅ／生理食塩水額に溶解して使用した。注射は１週に一回ずつ４週間にかけて行われ、最後の注射した後、各々１週、５週経過時（最初の手術後、各々８週目、１２週目）実験動物を深麻酔状態でＫＣｌ１〜２ｍＭ／ｋｇ血管注射で安楽死させた。
【００８２】
膝関節骨の近位部（大腿骨部位）を摘出し、正常組織との比較のために左側正常関節部位も追加摘出した。Ｉｎｄｉａ  ｉｎｋを塗布して肉眼所見を観察した後、写真撮影を行った。その後、摘出された関節部位は１０％ホルマリンに固定後、脱灰液（ＣａｌｃｉＣｌｅａｒ  Ｒａｐｉｄ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して脱灰をさせた後パラフィンブロックを作った。関節骨の観賞面を４ｕｍ厚さで切りスライドを作り、細胞の構造と分布を観察するためにヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を行い、基質内プロテオグリカンの分布を観察するためにＳａｆｒａｎｉｎ  Ｏ染色を行い、コラーゲンの分布を観察するためにＭａｓｓｏｎ’ｓ  Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色を行った。ヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色はスライドをＸｙｌｅｎｅ、１００％、９０％、７０％エタノールに各々１０分間連続的に脱水させた後、Ｈａｒｒｉｓ  ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（Ｍｅｌｒｏｓｅ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ、Ｓｐｉｎｅ  （２００２）１７５６−１７６４）を使用して行い、Ｓａｆｒａｎｉｎ  Ｏ染色はスライドをＨ＆Ｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ方法と同様に脱水させた後、０．０２％  Ｆａｓｔ  ｇｒｅｅｎで３分、１％  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄで３０秒、０．１％  Ｓａｆｒａｎｉｎ  Ｏで５分間染色した後、７０％、９０％．１００％エタノール、Ｘｙｌｅｎで１０度連続的に浸漬して脱水して行い、Ｍａｓｓｏｎ’ｓ  Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色はＴｒｉｃｈｒｏｍｅを使用して行った（Ｍｅｌｒｏｓｅ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒ．  Ｓｐｉｎｅ  Ｊ．（２００７）２１９３−２２０５）。スライドは正常群、対照群（ラクトース投与群）、そして試験群（実施例１のペプチド投与群）で分けて作られ、微細顕微鏡下でそれぞれの所見を観察した。
【００８３】
肉眼観察の結果を図８に示した。図８で見られるように、正常群の関節軟骨組織はなめらかで光沢がある反面、変形性関節症モデルの対照群（ラクトース投与群）は軟骨組織が損傷して削られていった部分が観察され、光沢が減少していた。反面、試験群（実施例１のペプチド投与群；３０ｕＭ、９０ｕＭ）の関節軟骨組織は再生して正常に近く、なめらかな表面と光沢が観察された。
【００８４】
Ｈ＆Ｅ染色結果は図９に示した。図９で見られるように、軟骨組織の表層（ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｌａｙｅｒ）で、対照群（ラクトース投与群）にのみ繊維性軟骨細胞（濃く染色）が観察され、試験群（実施例１のペプチド投与群）では正常群と類似の染色パターンを見せ、細胞が活性化して大きさが大きくなっていることが観察された。したがって、試験群において実施例１のペプチドは関節軟骨細胞を活性化させることが分かった。
【００８５】
軟骨基質内プロテオグリカン染色（Ｓａｆｒａｎｉｎ  Ｏ）結果を図１０に示した。図１０で見られるように、対照群（ラクトース投与群）では正常群と比較して中間層（ｍｉｄｄｌｅ  ｌａｙｅｒ）と深層（ｄｅｅｐ  ｌａｙｅｒ）でのプロテオグリカンの合成が顕著に減少した反面、試験群（実施例１のペプチド投与群）では投与濃度に比例してプロテオグリカンの合成が増加したことが観察された。したがって試験群において、実施例１のペプチドは関節軟骨組織の主要基質成分であるプロテオグリカンの合成を増加させて再生を促進すると確認された。
【００８６】
コラーゲン染色（Ｍａｓｓｏｎ’ｓ  Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）結果を図１１に示した。図１１で見られるように、正常群と試験群（実施例１のペプチド投与群）は類似の染色パターンを示したが、対照群（ラクトース投与群）の損傷部位では濃い染色を示し、損傷部位に繊維性コラーゲンの合成が増加したことが観察された。したがって実施例１のペプチドは正常表面軟骨組織（ｈｙａｌｉｎｅ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ、主にコラーゲンタイプＩＩ）の再生を促進させた反面、対照群（ラクトース投与群）は退行性変化に対する適応過程（ａｄａｐｔｉｖｅ  ｐｒｏｃｅｓｓ）で物理的性質が弱いため、簡単に損傷になる繊維性軟骨組織（ｆｉｂｒｏｃａｒｔｉｌａｇｅ、主にコラーゲンタイプＩ）の合成が増加することが確認された。
【００８７】
対照群（ラクトース投与群）のコラーゲン染色結果において観察された繊維性コラーゲン合成の増加はＨ＆Ｅ染色で対照群の損傷部位に観察された表層での繊維性軟骨細胞の増加と相応する結果で、退行性変化に対する適応過程では正常な組織再生を誘導できないが、試験群では実施例１のペプチドによって正常組織の再生が誘導されることを見せた。
【００８８】
結果的に、変形性関節症モデルを利用した実験で実施例１のペプチドが軟骨細胞の活性化と軟骨基質成分（プロテオグリカン、コラーゲンタイプＩＩ）の合成を促進させ損傷した軟骨組織を正常組織と類似するように再生させるに卓越した効能が有ることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明のペプチド、または薬学的に許容可能なその塩、前記ペプチド、または薬学的に許容可能なその塩を有効性分として含む軟骨損傷または関節炎のうちから選択された一つ以上の治療または予防用組成物、および前記ペプチド、または薬学的に許容可能なその塩およびＴＧＦβ１を含む組成物を提供し、前記ペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩は、軟骨損傷、関節炎などの治療および／または予防に効果的で、軟骨組織再生、軟骨組織基質分解酵素発現抑制、および／または軟骨組織骨化抑制などの効果を示すことができ産業上の利用可能性がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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