(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
止血の促進に使用される組成物において、
式（Ｉ）
Ｂ−（Ｚ）ｍ−Ｘ
（式中、
Ｚは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊであり、
Ｊは、Ｈｙｐ、ｆＰｒｏ、ｍＰｒｏ及びＰｒｏから成る群から選択され、
ｍは８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５から選択される整数であり、
Ｂは、Ｐｈｅ、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換されたＰｈｅおよびＬｅｕから成る群から選択され、
Ｘは、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換されたＰｈｅ、Ｔｙｒ、３，４−（ＯＨ）２−Ｐｈｅ、ＭｅＯ−Ｔｙｒ、フェニルグリシン、２−ナフチル−Ａｌａ、１−ナフチル−Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｃｈａ、Ｃｈｇ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌから成る群から選択される）
のコラーゲン関連ペプチドから構成され、
発泡体、粉末、繊維又はフィルムの形態である、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物において、複数の前記コラーゲン関連ペプチドを更に含み、前記コラーゲン関連ペプチドが、複数のコラーゲン関連ペプチド３量体の形で存在する、組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の組成物において、前記コラーゲン関連ペプチド３量体がホモ３量体である、組成物。
【請求項４】
請求項２に記載の組成物において、前記コラーゲン関連ペプチド３量体がヘテロ３量体である、組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物において、前記組成物が発泡体の形態であり、前記発泡体の総乾燥重量に基づいて、０．１パーセント〜１５パーセントの可塑剤を更に含む、組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の組成物において、前記可塑剤が、グリセロール、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、グリセロールのモノアセテート、グリセロールのジアセテート、グリセロールのトリアセテート及びこれらの混合物から成る群から選択される、組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の組成物において、前記組成物が、０．５ｍｍ〜１０ｍｍの厚さを有する発泡体の形態である、組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の組成物において、前記組成物が、１マイクロメートル〜５００マイクロメートルの孔径を有する発泡体の形態である、組成物。
【請求項９】
請求項１に記載の組成物において、前記組成物が、５０マイクロメートル〜１５０マイクロメートルの厚さを有するフィルムの形態である、組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の組成物において、前記組成物が粉末の形態であり、前記粉末が１マイクロメートル〜２０００マイクロメートルの粒径を有する、組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組成物において、多糖類、マンニトール、多孔質溶岩、ポリエステル、並びにこれらのコポリマー及び混合物から選択される担体を更に含む、組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組成物において、前記多糖類が、デンプン、ペクチン、セルロース、アルキル基が１〜７個の炭素原子を有するアルキルセルロース、アルキル基が１〜７個の炭素原子を有するアルキルヒドロキシアルキルセルロース、アルキル基が１〜７個の炭素原子を有するヒドロキシアルキルセルロース、硫酸セルロース、カルボキシメチルセルロースの塩、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、キチン、カルボキシメチルキチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の塩、アルギネート、架橋アルギネート、アルギン酸、プロピレングリコールアルギネート、グリコーゲン、デキストラン、硫酸デキストラン、カードラン、ペクチン、プルラン、キサンタン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルキトサン、キトサン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヘパラン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、カラギーナン、キトサン、デンプン、アミロース、アミロペクチン、ポリ−Ｎ−グルコサミン、ポリマンヌロン酸、ポリグルクロン酸、並びにこれらのコポリマー及び混合物から成る群から選択される、組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか1項の組成物の使用において、当該使用が、止血の促進を必要とする個体において、前記個体の少なくとも１つの出血部位に前記組成物を適用することにより止血を促進する方法に使用される薬剤の調製のためのものである、
使用。
【請求項１４】
止血の促進に使用される組成物において、
（ａ）式（Ｉ）
Ｂ−（Ｚ）ｍ−Ｘ
（式中、
Ｚは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊであり、
Ｊは、Ｈｙｐ、ｆＰｒｏ、ｍＰｒｏ及びＰｒｏから成る群から選択され、
ｍは８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５から選択される整数であり、
Ｂは、Ｐｈｅ、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換されたＰｈｅおよびＬｅｕから成る群から選択され、
Ｘは、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換されたＰｈｅ、Ｔｙｒ、３，４−（ＯＨ）２−Ｐｈｅ、ＭｅＯ−Ｔｙｒ、フェニルグリシン、２−ナフチル−Ａｌａ、１−ナフチル−Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｃｈａ、Ｃｈｇ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌから成る群から選択される）
のコラーゲン関連ペプチドと、
（ｂ）基材と、
から構成される、組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組成物において、複数の前記コラーゲン関連ペプチドを更に含み、前記コラーゲン関連ペプチドが複数のコラーゲン関連ペプチド３量体の形で存在する、組成物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の組成物において、前記コラーゲン関連ペプチド３量体がホモ３量体である、組成物。
【請求項１７】
請求項１５に記載の組成物において、前記コラーゲン関連ペプチド３量体がヘテロ３量体である、組成物。
【請求項１８】
請求項１４に記載の組成物において、前記基材が人体に植え込むのに好適である、組成物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の組成物において、前記基材が、縫合アンカー、縫合糸、止め金、手術用鋲、クリップ、プレート、ねじ、フィルム；組織工学スカフォールド；発泡体又は粉末である、組成物。
【請求項２０】
請求項１４に記載の組成物において、前記基材が、脂肪族ポリエステル、ポリ（アミノ酸）、コポリ（エーテル−エステル）、アルキル基が１〜１０個の炭素原子を有するポリアルキレンオキザラート、ポリアミド、チロシン由来ポリカーボネート、ポリ（イミノカーボネート）、ポリオルトエステル、ポリオキサエステル、ポリアミドエステル、アミン基を含有するポリオキシエステル、ポリ（無水物）、ポリホスファゼン、コラーゲン、エラスチン、ゼラチン、多糖類、並びにこれらのコポリマー及びブレンドから成る群から選択されるポリマーから構成される、組成物。
【請求項２１】
請求項１４に記載の組成物において、前記基材が、木綿、亜麻布、絹、ナイロン、ポリエステル、フルオロポリマー、ポリオレフィン、ポリウレタン、並びにこれらのコポリマー及び組み合わせから成る群から選択される材料から構成される、組成物。
【請求項２２】
請求項１４に記載の組成物において、前記基材が人体に植え込まれない基材である、組成物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の組成物において、前記基材が、包帯、接着ガーゼ包帯または創傷被覆材である、組成物。
【請求項２４】
請求項１４に記載の組成物において、前記コラーゲン関連ペプチドが、前記基材の総表面積に基づいて、０．０１ｍｇ／ｃｍ２〜１ｍｇ／ｃｍ２の量で前記組成物中に存在する、組成物。
【請求項２５】
請求項１４に記載の組成物において、前記コラーゲン関連ペプチドが、前記基材の総表面積に基づいて、０．１ｍｇ／ｃｍ２〜０．５ｍｇ／ｃｍ２の量で前記組成物中に存在する、組成物。
【請求項２６】
請求項１４に記載の組成物において、前記基材が、ε−カプロラクトン及びグリコリドのコポリマーから構成される発泡体である、組成物。
【請求項２７】
請求項１４〜２６のいずれか1項の組成物の使用において、当該使用が、止血の促進を必要とする個体において、前記個体の出血部位に前記組成物を適用することにより止血を促進する方法に使用される薬剤の調製のためのものである、
使用。
【請求項２８】
止血の促進に使用されるゲルにおいて、
ａ）式（Ｉ）
Ｂ−（Ｚ）ｍ−Ｘ
（式中、
Ｚは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊであり、
Ｊは、Ｈｙｐ、ｆＰｒｏ、ｍＰｒｏ及びＰｒｏから成る群から選択され、
ｍは８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５から選択される整数であり、
Ｂは、Ｐｈｅ、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換されたＰｈｅおよびＬｅｕから成る群から選択され、
Ｘは、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換されたＰｈｅ、Ｔｙｒ、３，４−（ＯＨ）２−Ｐｈｅ、ＭｅＯ−Ｔｙｒ、フェニルグリシン、２−ナフチル−Ａｌａ、１−ナフチル−Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｃｈａ、Ｃｈｇ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌから成る群から選択される）
のコラーゲン関連ペプチドと、
ｂ）ゲル化剤と、
から構成され、前記コラーゲン関連ペプチドが、前記ゲルの総重量に基づいて、０．１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの量で前記ゲル中に存在する、ゲル。
【請求項２９】
請求項２８に記載のゲルにおいて、複数の前記コラーゲン関連ペプチドを更に含み、前記コラーゲン関連ペプチドが複数のコラーゲン関連ペプチド３量体の形で存在する、ゲル。
【請求項３０】
請求項２９に記載のゲルにおいて、前記コラーゲン関連ペプチド３量体がホモ３量体である、ゲル。
【請求項３１】
請求項２９に記載のゲルにおいて、前記コラーゲン関連ペプチド３量体がヘテロ３量体である、ゲル。
【請求項３２】
請求項２８〜３１のいずれか1項のゲルの使用において、当該使用が、止血の促進を必要とする個体において、前記個体の出血部位に前記ゲルを適用することにより止血を促進する方法に使用される薬剤の調製のためのものである、
使用。
【請求項３３】
止血の促進に使用される組成物において、
ａ）式（Ｉ）
Ｂ−（Ｚ）ｍ−Ｘ
（式中、
Ｚは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊであり、
Ｊは、Ｈｙｐ、ｆＰｒｏ、ｍＰｒｏ及びＰｒｏから成る群から選択され、
ｍは８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５から選択される整数であり、
Ｂは、Ｐｈｅ、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換されたＰｈｅおよびＬｅｕから成る群から選択され、
Ｘは、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換されたＰｈｅ、Ｔｙｒ、３，４−（ＯＨ）２−Ｐｈｅ、ＭｅＯ−Ｔｙｒ、フェニルグリシン、２−ナフチル−Ａｌａ、１−ナフチル−Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｃｈａ、Ｃｈｇ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌから成る群から選択される）
のコラーゲン関連ペプチドと、
ｂ）少なくとも１種の賦形剤と、
から構成される、組成物。
【請求項３４】
請求項１に記載の組成物から構成される医療用デバイス。
【請求項３５】
請求項１４に記載の組成物から構成される医療用デバイス。
【請求項３６】
請求項２８に記載のゲルから構成される医療用デバイス。
【請求項３７】
請求項３３に記載の組成物から構成される医療用デバイス。
【請求項３８】
コラーゲン関連ペプチドの使用において、
当該使用が、出血性障害の治療を必要とする個体において、前記個体の所望の部位で血小板凝集を開始させるのに有効な量で出血性障害を治療する方法に使用される薬剤の調製のための使用であり、
当該コラーゲン関連ペプチドが、式（Ｉ）
Ｂ−（Ｚ）ｍ−Ｘ
（式中、
Ｚは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊであり、
Ｊは、Ｈｙｐ、ｆＰｒｏ、ｍＰｒｏ及びＰｒｏから成る群から選択され、
ｍは８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５から選択される整数であり、
Ｂは、Ｐｈｅ、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換されたＰｈｅおよびＬｅｕから成る群から選択され、
Ｘは、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換されたＰｈｅ、Ｔｙｒ、３，４−（ＯＨ）２−Ｐｈｅ、ＭｅＯ−Ｔｙｒ、フェニルグリシン、２−ナフチル−Ａｌａ、１−ナフチル−Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｃｈａ、Ｃｈｇ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌから成る群から選択される）
のコラーゲン関連ペプチドである、
使用。
【請求項３９】
出血性障害の診断を必要とする個体において出血性障害を診断する方法に使用される薬剤の調製のためのコラーゲン関連ペプチドの使用において、
（ａ）式（Ｉ）
Ｂ−（Ｚ）ｍ−Ｘ
（式中、
Ｚは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊであり、
Ｊは、Ｈｙｐ、ｆＰｒｏ、ｍＰｒｏ及びＰｒｏから成る群から選択され、
ｍは８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５から選択される整数であり、
Ｂは、Ｐｈｅ、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換されたＰｈｅおよびＬｅｕから成る群から選択され、
Ｘは、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換されたＰｈｅ、Ｔｙｒ、３，４−（ＯＨ）２−Ｐｈｅ、ＭｅＯ−Ｔｙｒ、フェニルグリシン、２−ナフチル−Ａｌａ、１−ナフチル−Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｃｈａ、Ｃｈｇ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌから成る群から選択される）
のコラーゲン関連ペプチドを、前記個体からの血小板を含有する血液又は血漿と組み合わせて、混合物を形成することと、
（ｂ）前記混合物中の血小板凝集を評価するために、前記混合物を血小板凝集計に添加することと、
を含む、前記方法に使用される薬剤の調製のための、
使用。
【請求項４０】
止血の促進に使用される組成物において、
（ａ）式（Ｉ）
Ｂ−（Ｚ）ｍ−Ｘ
（式中、
Ｚは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊであり、
Ｊは、Ｈｙｐ、ｆＰｒｏ、ｍＰｒｏ及びＰｒｏから成る群から選択され、
ｍは８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５から選択される整数であり、
Ｂは、Ｐｈｅ、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換されたＰｈｅおよびＬｅｕから成る群から選択され、
Ｘは、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換されたＰｈｅ、Ｔｙｒ、３，４−（ＯＨ）２−Ｐｈｅ、ＭｅＯ−Ｔｙｒ、フェニルグリシン、２−ナフチル−Ａｌａ、１−ナフチル−Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｃｈａ、Ｃｈｇ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌから成る群から選択される）
のコラーゲン関連ペプチドと、
（ｂ）製薬的活性物質と、
から構成される、組成物。
【請求項４１】
請求項４０に記載の組成物において、前記製薬的活性物質が、止血剤、抗感染剤、鎮痛剤、抗炎症剤、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、組成物。
【請求項４２】
請求項４１に記載の組成物において、前記止血剤が、トロンビン、フィブリノーゲン、ＡＤＰ、ＡＴＰ、カルシウム、マグネシウム、ＴＸＡ２、セロトニン、エピネフリン、血小板因子４、第Ｖ因子、第ＥＩ因子、ＰＡＩ−１、トロンボスポンジン及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、組成物。
【請求項４３】
請求項４１記載の組成物において、前記抗感染剤が、抗体、抗原、抗生物質、抗ウイルス剤及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、組成物。
【請求項４４】
請求項４１に記載の組成物において、前記抗炎症剤が抗ヒスタミン剤である、組成物。
【請求項４５】
止血の促進に使用される組成物において、
式（Ｉ）
Ｂ−（Ｚ）ｍ−Ｘ
（式中、
Ｚは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊであり、
Ｊは、Ｈｙｐ、ｆＰｒｏ、ｍＰｒｏ及びＰｒｏから成る群から選択され、
ｍは８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５から選択される整数であり、
Ｂは、Ｐｈｅ、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換されたＰｈｅおよびＬｅｕから成る群から選択され、
Ｘは、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換されたＰｈｅ、Ｔｙｒ、３，４−（ＯＨ）２−Ｐｈｅ、ＭｅＯ−Ｔｙｒ、フェニルグリシン、２−ナフチル−Ａｌａ、１−ナフチル−Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｃｈａ、Ｃｈｇ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌから成る群から選択される）
のコラーゲン関連ペプチドを追加した、３次元ポリマーマトリックス、を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、Ｎ−及びＣ−末端に疎水性アミノ酸を有するコラーゲン関連ペプチド（ＣＲＰ）及び、コラーゲン模倣３量体及びその原線維、並びにその合成、使用方法及び組成物を目的とする。
【０００２】
〔背景技術〕
コラーゲンは、哺乳類で最も豊富なタンパク質であり、体内に広く分布し、そのロープ様３重らせん及び集合した原線維の剛性により、コラーゲンは、本質的な構造的役割を果たすことが可能になり、組織に機械的強度を与えるのを補助する。最も豊富な線維状コラーゲン、Ｉ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型は、皮膚、骨、軟骨、腱、靱帯、血管及び眼のガラス体で発生する。ＩＶ型及びＶＩ型のようなより複雑な非線維性コラーゲンは、２及び３次元ネットワークを形成し、体の間質組織を支持し、上皮及び内皮細胞層が結合できる、基底膜の基本要素である。
【０００３】
一般に、線維性コラーゲンは、互いの周りに巻き付いた３つの別々のペプチド鎖を含有して、３重らせんを形成する（リッチ（Rich）Ａ及びクリック（Crick）ＦＨＣ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６１年、３巻、４８３〜５０６頁）。幾何学的制約及びコラーゲン３重らせんの安定性は、３つのアミノ酸全てがグリシン（Ｇｌｙ又はＧ）であることを必要とし、結果として反復性−ＧＸＹ−配列（式中、Ｘ及びＹはそれぞれプロリン（Ｐｒｏ又はＰ）及びヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ又はＯ）を表すことが多い）が生じる。コラーゲンの３重らせんは、典型的には、長さが３００ｎｍ超であり、１０００アミノ酸を超える。このようなコラーゲン３重らせんの集合体から得られる線維は、長さ１μｍを超える。
【０００４】
健康で、損傷を受けていない組織では、コラーゲンは血管壁及びその周囲の組織を支持し、内皮細胞層により隠され、凝固プロセスを制御する血流内で循環している血小板と接触することはできない。しかしながら、血管壁への損傷が、罹患血管壁における物理的外傷又はアテローム斑の破裂のいずれかの結果として生じ、これは内皮細胞層を取り除いて、コラーゲンを血小板及び他の血漿タンパク質と相互作用させ、それにより凝集及び接着のために血小板を活性化することができる。これらのプロセスは、凝固反応に必須であり、当該技術分野においてよく理解されている。
【０００５】
３重らせん構成
コラーゲンは、長く科学者を魅了しているが、それは、これらのタンパク質の並外れた構造特性及び生物学的重要性のためである。コラーゲンの３重らせんの構造、安定性及び機能の研究は、合成コラーゲン関連ペプチドの使用により促進されている（フェン（Feng）Ｙ、メラシーニ（Melacini）Ｇ、タウレーン（Taulane）ＪＰ及びグッドマン（Goodman）Ｍ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９６年、１１８巻、１０３５１〜１０３５８頁；フィールド（Fields）ＧＢ及びプロコップ（Prockop）ＤＪ、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、１９９６年、４０巻、３４５〜３５７頁、及び本明細書に引用されている参考文献；ホルムグレン（Holmgren）ＳＫ、タイラー（Taylor）ＫＭ、ブレッチェル（Bretscher）ＬＥ及びレインズ（Raines）ＲＴ、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８年、３９２巻、６６６〜６６７頁；ジェンキンス（Jenkins）ＣＬ及びレインズ（Raines）ＲＴ、Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｐ．、２００２年、１９巻、４９〜５９頁；並びにシャー（Shah）ＮＫ、ラムショー（Ramshaw）ＪＡＭ、カークパトリック（Kirkpatrick）Ａ、シャー（Shah）Ｃ及びブロツキー（Brodsky）、Ｂ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９６年、３５巻、１０２６２〜１０２６８頁）。例えば、特異的認識モチーフを含む合成３重らせんペプチドの使用により、コラーゲンの受容体結合特性を詳細に調査することが可能になっている。更に、コラーゲンの３重らせん構成は、血小板及び他のコラーゲン受容体がそれを認識するための必要条件である場合がある。特定の３重らせん配列は、更に、反復するトリプレットであるグリシン−プロリン−ヒドロキシプロリン（ＧＰＯ）配列を含む、ＧｐＶＩのような血小板受容体と直接相互作用することができる。単純なコラーゲン関連ペプチドでは、（ＧＰＯ）１０配列は、融解温度が５８〜７０℃である、熱的に安定な３重らせんを形成する。ヒドロキシプロリンアミノ酸は、水介在水素結合の形成を促進することにより、及び立体電子効果を提供することにより、３重らせん構造を安定化させる。
【０００６】
更に、国際公開第０７／０５２０６７号は、血小板のフォン・ヴィレブランド因子のＡ３ドメインに対する親和性に基づいて、ＩＩＩ型コラーゲンドメインを覆い、血小板接着活性を有する、一連の短い３重らせんコラーゲンペプチドについて記載している。国際公開第０７／０１７６７１号は、ペプチド間を架橋することなく、血小板を活性化することができる、ＧＰＯ繰り返しを含む３量体ペプチドについて記載している。国際公開第０６／０９８３２６号は、ＰＯＧポリペプチド及びリン酸カルシウム化合物から調製された合成コラーゲンフィルムについて記載している。特開２００５２０６５４２号は、ポリペプチド配列Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ及びＹ−Ｚ−Ｇｌｙ（式中、Ｘ及びＺはプロリン（Ｐｒｏ）及びヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）を表し、Ｙはカルボキシル基を有するアミノ酸残基を表す）を含むコラーゲン組織構造について記載している。特開２００５１２６３６０号は、コラゲナーゼを阻害するために、固相合成により調製される、ポリペプチド配列Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｚ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（式中、ＹはＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ又はＡｌａを表し；ＺはＩｌｅ又はＬｅｕを表す）を含む化粧品及び食品組成物について記載している。米国特許公開第２００３／１６２９４１号（特開２００３３２１５００号に相当する）は、３重らせん構造を有する、配列Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ（式中、ＹはＰｒｏ又はＨｙｐを表す）を有するコラーゲン性ポリペプチドについて記載している。米国特許第５，９７３，１１２号（国際公開第９９／１０３８１号に相当する）は、配列Ｘａａ−Ｘｂｂ−Ｇｌｙ（式中、Ｘａａはアミノ酸残基を表し；Ｘｂｂは４（Ｒ）−フルオロ−Ｌ−プロリン（Ｆｌｐ）、４（Ｓ）−フルオロ−Ｌ−プロリン、４，４−ジフルオロプロリン、又はアセチル、メシル、若しくはトリフルオロメチルで修飾したヒドロキシプロリンを表す）のトリペプチドコラーゲン模倣物について記載している。コラーゲン模倣物（Ｐｒｏ−Ｆｌｐ−Ｇｌｙ）１０は、コラーゲン関連３重らせんＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ及びＰｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙに対する安定性が増加したことを示した。
【０００７】
自己集合
単離したコラーゲンリガンド配列で３重らせん構造形成を誘発するために、いくつかのストラテジが使用されている（国際公開第９８／００７７５２号に相当する、米国特許第６，０９６，８６３号及びその参考文献で論じられているような）。単離したコラーゲンリガンド配列における３重らせん構造形成は、多数のＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ反復を、コラーゲンの配列の両端に付加することにより誘発できる。しかしながら、５０％を超えるペプチド配列がＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ反復から成る場合でさえ、得られる３重らせんは、生理学的条件で生存するための安定した熱安定性を有しない場合がある。３重らせん構造の実質的な安定化は３本のペプチド鎖のＣ−末端領域間に共有結合を導入することにより達成できるが、大きなサイズ（９０〜１２５アミノ酸残基）の「分岐」３重らせんペプチド化合物が得られることにより、それを合成及び精製するのが困難になる（米国特許第６，０９６，８６３号及びその参考文献で論じられているような）。デンドリマー集合又は共有架橋を介して、オリゴマー化されたＣＲＰは、この特性を欠く、（ＰＯＧ）１０配列を有するもののような、固定化された、それほど組織化されていないＣＲＰになることなく、血小板凝集を有効に誘発できる（ラオ（Rao）ＧＨＲ、フィールズ（Fields）ＣＧ、ホワイト（White）ＪＧ及びフィールズ（Fields）ＧＢ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９４年、２６９巻、１３８９９〜１３９０３頁；モートン（Morton）ＬＦ、ハーグリーブス（Hargreaves）ＰＧ、ファーンデール（Farndale）ＲＷ、ヤング（Young）ＲＤ及びバーンズ（Barnes）ＭＪ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１９９５年、３０６巻、３３７〜３４４頁；ナイト（Knight）ＣＧ、モートン（Morton）ＬＦ、オンリー（Onley）ＤＪ、ピーチー（Peachey）ＡＲ、イチノヘ（Ichinohe）Ｔ、オクマ（Okuma）Ｍ、ファーンデール（Farndale）ＲＷ及びバーンズ（Barnes）ＭＪ、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．、１９９９年、４１巻、４５０〜４５７頁）。自己集合できるＣＲＰの利用可能性及び有用性は、その調製の容易さ、ＣＲＰ構造の単純性及び安定性、並びに凝集活性の可能性に依存する。合成は挑戦的なものであり、比較的複雑である場合があるが、マイクロメートルスケールのＣＲＰ系材料は、システインノットを使用することにより、共有的に結合した三重鎖実体の自己集合から得られた（コイデ（Koide）Ｔ、ホンマ（Homma）ＤＬ、アサダ（Asada）Ｓ及びキタガワ（Kitagawa）Ｋ、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、２００５年、１５巻、５２３０〜５２３３頁；並びにコッチ（Kotch）Ｆ及びレインズ（Raines）ＲＴ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２００６年、１０３巻、３０２８〜３０３３頁）。
【０００８】
〔発明の概要〕
〔発明が解決しようとする課題〕
したがって、ペプチドの整列並びに、原線維の開始及び成長を促進するコラーゲン様構造モチーフの構築に対する単純なアプローチが依然として必要とされている。具体的には、合成が容易であり、コラーゲン模倣特性を有する３量体に非共有自己集合できる、比較的短い、一本鎖ＣＲＰが必要とされている。
【０００９】
〔課題を解決するための手段〕
本発明は、広く、コラーゲン模倣特性を有する３量体に非共有自己集合できる、コラーゲン関連ポリペプチド（ＣＲＰ）に関する。
【００１０】
ＣＲＰは、各末端に、Ｎ−末端及びＣ−末端合成又は天然疎水性アミノ酸を有し、前記アミノ酸は原線維の成長を開始させて、コラーゲン様原線維を形成することができる。
【００１１】
本発明はまた、式（Ｉ）：
Ｂ−（Ｚ）ｍ−Ｘ
（式中、
Ｚは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ、Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ及びＪ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏから成る群から選択されるトリプレットであり、
Ｊは、各トリプレットＺについて、Ｈｙｐ、ｆＰｒｏ、ｍＰｒｏ及びＰｒｏから成る群から独立して選択され、
ｍは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５から選択される整数であり、
例えば、ＺがＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊであり、かつｍが８である場合、８つのＪ置換基のそれぞれは、Ｈｙｐ、ｆＰｒｏ、ｍＰｒｏ及びＰｒｏから成る群から独立して選択され、
Ｂ及びＸは、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換された）、Ｔｙｒ、３，４−（ＯＨ）２−Ｐｈｅ、ＭｅＯ−Ｔｙｒ、フェニルグリシン、２−ナフチル−Ａｌａ、１−ナフチル−Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｃｈａ、Ｃｈｇ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌから成る群から独立して選択される）のＣＲＰに関する。
【００１２】
本明細書に記載するＣＲＰは、血小板凝集を開始させ、出血性障害を治療及び診断するために用いることができる、合成コラーゲンの作製に有用である。本発明のＣＲＰは、止血剤のような組成物で更に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】血小板凝集の刺激について、コラーゲンと比較した、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３４及び配列番号３５を有するＣＲＰの活性を示す用量反応曲線。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、広く、コラーゲン模倣特性を有する３量体に非共有自己集合できる、ＣＲＰに関する。
【００１５】
ＣＲＰは、各末端に、Ｎ−末端及びＣ−末端合成又は天然疎水性アミノ酸を有し、前記アミノ酸は原線維の成長を開始させて、コラーゲン様原線維を形成することができる。
【００１６】
本発明はまた、式（Ｉ）：
Ｂ−（Ｚ）ｍ−Ｘ
（式中、
Ｚは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ、Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ及びＪ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏから成る群から選択されるトリプレットであり、
Ｊは、各トリプレットＺについて、Ｈｙｐ、ｆＰｒｏ、ｍＰｒｏ及びＰｒｏから成る群から独立して選択され、
ｍは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５から選択される整数であり、
例えば、ＺがＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊであり、かつｍが８である場合、８つのＪ置換基のそれぞれは、Ｈｙｐ、ｆＰｒｏ、ｍＰｒｏ及びＰｒｏから成る群から独立して選択され、
Ｂ及びＸは、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換された）、Ｔｙｒ、３，４−（ＯＨ）２−Ｐｈｅ、ＭｅＯ−Ｔｙｒ、ｐｈｅｎｙｌ−Ｇｌｙ、２−ナフチル−Ａｌａ、１−ナフチル−Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｃｈａ、Ｃｈｇ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌから成る群から独立して選択される）のＣＲＰに関する。
【００１７】
本発明のＣＲＰは、３量体に非共有自己集合することができる。得られるＣＲＰ  ３量体は、更に、非共有、芳香環スタッキング及び定序疎水性相互作用により、コラーゲン様原線維に高次自己集合できる。
【００１８】
本発明の実施形態は、複数の本発明のＣＲＰを含むコラーゲン様原線維物質を含む。
【００１９】
本発明の実施形態は、複数の本発明のＣＲＰを含むコラーゲン様原線維物質を含み、前記ＣＲＰは複数のＣＲＰ  ３量体の形でコラーゲン様原線維物質中に存在する。
【００２０】
本発明の実施形態では、ＣＲＰ  ３量体はホモ３量体であり、３つのＣＲＰは相同である。
【００２１】
本発明の実施形態では、ＣＲＰ  ３量体はヘテロ３量体であり、３つのＣＲＰは非相同である。
【００２２】
本発明の実施形態は、式（Ｉ）（式中、Ｚは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ、Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ及びＪ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏから成る群から選択されたトリプレットであり、Ｊは少なくとも４つの連続したトリプレットＺ中のＨｙｐである）のＣＲＰである。
【００２３】
本発明の実施形態は、式（Ｉ）（式中、Ｊは、各トリプレットＺについて、Ｈｙｐ、ｆＰｒｏ及びＰｒｏから成る群から独立して選択される）のＣＲＰである。
【００２４】
本発明の実施形態は、式（Ｉ）（式中、Ｊは、各トリプレットＺについて、Ｈｙｐ及びＰｒｏから成る群から独立して選択される）のＣＲＰである。
【００２５】
本発明の実施形態は、式（Ｉ）（式中、ｍは１０である）のＣＲＰである。
【００２６】
本発明の実施形態は、式（Ｉ）（式中、Ｂ及びＸは、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換された）、Ｔｙｒ、３，４−（ＯＨ）２−Ｐｈｅ、ＭｅＯ−Ｔｙｒ、フェニルグリシン、２−ナフチル−Ａｌａ、１−ナフチル−Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｃｈａ、Ｃｈｇ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌから成る群から独立して選択される）のＣＲＰである。
【００２７】
本発明の実施形態は、式（Ｉ）（Ｂ及びＸは、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ及びＬｅｕから成る群から独立して選択される）のＣＲＰである。
【００２８】
本発明の実施形態は、式（Ｉ）（式中、Ｂは、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（所望により、フェニル上に、フルオロ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換された）、Ｔｙｒ、３，４−（ＯＨ）２−Ｐｈｅ、ＭｅＯ−Ｔｙｒ、フェニルグリシン、２−ナフチル−Ａｌａ、１−ナフチル−Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｃｈａ、Ｃｈｇ及びＬｅｕから成る群から選択される）のＣＲＰである。
【００２９】
本発明の実施形態は、式（Ｉ）（式中、Ｂは、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（所望により、フェニル上に、フルオロ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換された）、及びＬｅｕから成る群から選択される）のＣＲＰである。
【００３０】
本発明の実施形態は、式（Ｉ）（式中、Ｂは、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ及びＬｅｕから成る群から選択される）のＣＲＰである。
【００３１】
本発明の実施形態は、式（Ｉ）（式中、Ｘは、Ｐｈｅ（所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換された）、Ｔｙｒ、３，４−（ＯＨ）２−Ｐｈｅ、ＭｅＯ−Ｔｙｒ、フェニルグリシン、２−ナフチル−Ａｌａ、１−ナフチル−Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｃｈａ、Ｃｈｇ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌから成る群から選択される）のＣＲＰである。
【００３２】
本発明の実施形態は、式（Ｉ）（式（Ｉ）ＸはＰｈｅである）のＣＲＰである。
【００３３】
本発明の実施形態は、
配列番号１：Ｂ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）４−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ）ｎ−Ｘ（式中、ｎは４、５、６、７、８、９、１０又は１１から選択される整数である）；
配列番号２：Ｂ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）８−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ）ｐ−Ｘ（式中、ｐは０、１、２、３、４、５、６又は７から選択される整数である）；
配列番号３：Ｂ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）１２−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ）ｑ−Ｘ（式中、ｑは０、１、２又は３から選択される整数である）；
配列番号４：Ｂ−（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）４−（Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ）ｎ−Ｘ（式中、ｎは４、５、６、７、８、９、１０又は１１から選択される整数である）；
配列番号５：Ｂ−（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）８−（Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ）ｐ−Ｘ（式中、ｐは０、１、２、３、４、５、６又は７から選択される整数である）；
配列番号６：Ｂ−（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）１２−（Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ）ｑ−Ｘ（式中、ｑは０、１、２又は３から選択される整数である）；
配列番号７：Ｂ−（Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）４−（Ｊ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）ｎ−Ｘ（式中、ｎは４、５、６、７、８、９、１０又は１１から選択される整数である）；
配列番号８：Ｂ−（Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）８−（Ｊ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）ｐ−Ｘ（式中、ｐは０、１、２、３、４、５、６又は７から選択される整数である）；又は
配列番号９：Ｂ−（Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）１２−（Ｊ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）ｑ−Ｘ（式中、ｑは０、１、２又は３から選択される整数である）；から選択される式（Ｉ）のＣＲＰである。
【００３４】
代替実施形態では、式（Ｉ）のＣＲＰは、
配列番号１０：Ｂ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ）ｎ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）４−Ｘ（式中、ｎは４、５、６、７、８、９、１０又は１１から選択される整数である）；
配列番号１１：Ｂ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ）ｐ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）８−Ｘ（式中、ｐは０、１、２、３、４、５、６又は７から選択される整数である）；
配列番号１２：Ｂ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ）ｑ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）１２−Ｘ（式中、ｑは０、１、２又は３から選択される整数である）；
配列番号１３：Ｂ−（Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ）ｎ−（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）４−Ｘ（式中、ｎは４、５、６、７、８、９、１０又は１１から選択される整数である）；
配列番号１４：Ｂ−（Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）８−Ｘ（式中、ｐは０、１、２、３、４、５、６又は７から選択される整数である）；
配列番号１５：Ｂ−（Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ）ｑ−（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）１２−Ｘ（式中、ｑは０、１、２又は３から選択される整数である）；
配列番号１６：Ｂ−（Ｊ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）ｎ−（Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）４−Ｘ（式中、ｎは４、５、６、７、８、９、１０又は１１から選択される整数である）；
配列番号１７：Ｂ−（Ｊ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）ｐ−（Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）８−Ｘ（式中、ｐは０、１、２、３、４、５、６又は７から選択される整数である）；又は
配列番号１８：Ｂ−（Ｊ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）ｑ−（Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）１２−Ｘ（式中、ｑは０、１、２又は３から選択される整数である）から選択される。
【００３５】
更に他の実施形態では、式（Ｉ）のＣＲＰは、
配列番号１９：Ｂ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ）ｒ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）４−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ）ｓ−Ｘ（式中、ｒ及びｓはそれぞれ、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０から選択される整数であり、（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ）ｒ、（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ）ｓ及び（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）４の組み合わせは、（Ｚ）１５を超えない）；
配列番号２０：Ｂ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ）ｔ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）８−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ）ｕ−Ｘ（式中、ｔ及びｕはそれぞれ、１、２、３、４、５又は６から選択される整数であり、（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ）ｔ、（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ）ｕ及び（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）８の組み合わせは、（Ｚ）１５を超えない）；
配列番号２１：Ｂ−（Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ）ｒ−（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）４−（Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ）ｓ−Ｘ（式中、ｒ及びｓはそれぞれ、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０から選択される整数であり、（Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ）ｒ、（Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ）ｓ及び（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）４の組み合わせは、（Ｚ）１５を超えない）；
配列番号２２：Ｂ−（Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ）ｔ−（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）８−（Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ）ｕ−Ｘ（式中、ｔ及びｕはそれぞれ、１、２、３、４、５又は６から選択される整数であり、（Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ）ｔ、（Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ）ｕ及び（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）８の組み合わせは、（Ｚ）１５を超えない）；
配列番号２３：Ｂ−（Ｊ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）ｒ−（Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）４−（Ｊ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）ｓ−Ｘ（式中、ｒ及びｓはそれぞれ、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０から選択される整数であり、（Ｊ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）ｒ、（Ｊ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）ｓ及び（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）４の組み合わせは、（Ｚ）１５を超えない）；
配列番号２４：Ｂ−（Ｊ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）ｔ−（Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）８−（Ｊ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）ｕ−Ｘ（式中、ｔ及びｕはそれぞれ、１、２、３、４、５又は６から選択される整数であり、（Ｊ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）ｔ、（Ｊ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）ｕ及び（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）８の組み合わせは、（Ｚ）１５を超えない）から選択される。
【００３６】
特定の実施形態では、式（Ｉ）のＣＲＰは、
配列番号２５：Ｆ５Ｐｈｅ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）１０−Ｐｈｅ；
配列番号２６：Ｐｈｅ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）１０−Ｐｈｅ；
配列番号２７：Ｌｅｕ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）１０−Ｐｈｅ；
配列番号３１：Ｆ５Ｐｈｅ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）９−Ｐｈｅ；
配列番号３２：Ｐｈｅ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）９−Ｐｈｅ；及び
配列番号３３：Ｌｅｕ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）９−Ｐｈｅから選択される。
【００３７】
本発明の議論では、特定の他のポリペプチド配列としては、
比較配列番号２８：Ｇｌｙ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）１０−Ｇｌｙ；
比較配列番号２９：Ａｃ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）１０−Ｇｌｙ；
参照配列番号３０：（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）４−（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ａｌａ）−（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）５；
参照配列番号３４：（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）１０；及び
比較配列番号３５：Ｆ５Ｐｈｅ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）５−Ｐｈが挙げられる。
【００３８】
１例として、配列番号２５を有する式（Ｉ）のＣＲＰは、以下の構造：
【化１】
0005566885.tif 000002
を有する。
【００３９】
本発明は更に、複数の式（Ｉ）のＣＲＰを選択する工程と、複数のＣＲＰを、複数の３量体、超分子複合材及びコラーゲン様原線維の形成の開始及び成長に適した水性条件下で混合する工程と、を含む、コラーゲン様原線維物質の形成方法に関する。
【００４０】
本方法の実施形態では、複数のＣＲＰ  ３量体は、複数のホモ３量体、ヘテロ３量体又はこれらの混合物から選択される。
【００４１】
本方法の実施形態では、コラーゲン様原線維物質は、複数の超分子複合材又はコラーゲン様原線維から選択される。
【００４２】
本方法の実施形態では、適した水性条件は、約５０℃未満の温度で、水中又は水性塩溶液中にて、複数のコラーゲン関連ペプチドを混合することを更に含む。
【００４３】
本方法の実施形態では、水性塩溶液は、緩衝生理食塩水、リン酸緩衝溶液、ハンクス平衡塩類溶液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ヘペス緩衝生理食塩水及びこれらの混合物から選択される。
【００４４】
本方法の実施形態では、水性塩溶液はＰＢＳである。
【００４５】
定義
本発明の実施形態に関して、以下の定義及び本明細書を通して提供される他の定義は、当業者の知識の範囲内であり、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
【００４６】
用語「トリプレット」は、３つのアミノ酸Ｇｌｙ、Ｐｒｏ及びＪを有する組Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ、３つのアミノ酸Ｐｒｏ、Ｊ及びＧｌｙを有する組Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ、及び３つのアミノ酸Ｊ、Ｇｌｙ及びＰｒｏを有する組Ｊ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏにより定義されるような、３つのアミノ酸の組を指す。
【００４７】
用語「ホモ３量体」は、３つの同一の式（Ｉ）のＣＲＰにより形成される３重らせん体を指す。
【００４８】
用語「ヘテロ３量体」は、式（Ｉ）のＣＲＰにより形成される３重らせん体を指す。
【００４９】
用語「３量体」は、３つの式（Ｉ）のＣＲＰにより形成される３重らせん体を指す。
【００５０】
用語「超分子複合材」は、コラーゲン様原線維及び原線維構造を含む、種々の形態の集合したＣＲＰ  ３量体を指す。
【００５１】
用語「Ａｌａ」又は「Ａ」はアミノ酸のアラニンを指し；「Ｃｈａ」は模倣アミノ酸シクロヘキシル−アラニンを指し；「Ｃｈｇ」は模倣アミノ酸シクロヘキシル−グリシンを指し；「Ｆ５−Ｐｈｅ」は、模倣アミノ酸１，２，３，４，５−Ｆ５−フェニル−アラニン」を指し；「ｆＰｒｏ」は模倣アミノ酸（４Ｒ）−フルオロプロリンを指し；「Ｇｌｙ」又は「Ｇ」はアミノ酸のグリシンを指し；「Ｈｙｐ」又は「Ｏ」は模倣アミノ酸（４Ｒ）−ヒドロキシプロリンを指し；「Ｍｅｔ」はアミノ酸のメチオニンを指し；「ｍＰｒｏ」は模倣アミノ酸（４Ｓ）−メチルプロリンを指し；「Ｐｈｅ」又は「Ｆ」はアミノ酸のフェニルアラニンを指し；「Ｐｒｏ」又は「Ｐ」はアミノ酸のプロリンを指し；「Ｔｙｒ」はアミノ酸のチロシンを指す。
【００５２】
本発明の議論
特定の自己集合モノマーが説明されており、ここではメタ置換フェニレンオキサミン酸ジエチルエステルモノマーは、固体状態のｘ線により、隣接するらせんがπスタッキングにより側−側（side-to-side）整列した状態で、水素結合（端−端（end-to-end））を介してらせん鎖に自己集合することが示されている（ブライ（Blay）Ｇ、フェルナンデス（Fernandez）Ｉ、ペドロ（Pedro）ＪＲ、ルイス−ガルシア（Ruiz-Garcia）Ｒ、ムニョス（Munoz）ＭＣ、カノ（Cano）Ｊ及びカラスコ（Carrasco）Ｒ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００３年、１６２７〜１６３０頁）。本発明の発明者らによる、自己集合ＣＲＰ  ３量体の初期設計は、（ＧＰＯ）１０配列のＮ−及びＣ−末端の両方にフェニルオキサミンエステルアミド基を結合させて、水素結合による端−端集合を促進することを含んでいた。
【００５３】
しかしながら、ベンゼンとヘキサフルオロベンゼンとの間の強力な非共有芳香環スタッキング相互作用に起因して（ハンター（Hunter）ＣＡ及びサンダース（Sanders）ＪＫＭ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９０年、１１２巻、５５２５〜５５３４頁；グダニーク（Gdaniec）Ｍ、ヤンコフスキ（Jankowski）Ｗ、ミレフスカ（Milewska）ＭＪ及びポロンスキ（Polonski）Ｔ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、２００３年、４２巻、３９０３〜３９０６頁（また、本明細書に引用されている参照文献９及び１０）；並びにロズマン（Lozman）ＯＲ、ブシュビー（Bushby）ＲＪ及びビンター（Vinter）ＪＧ、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．、２巻、２００１年、１４４６〜１４５３頁）、本発明の発明者らは、芳香環スタッキング（端−端及び側−側）及び定序疎水性相互作用が、本発明のＣＲＰ  ３量体がコラーゲン様原線維及び繊維に高次自己集合するのを更に可能にすると仮定した。
【００５４】
結果として、水素結合自己集合設計は、芳香族基と疎水基との間の相互作用がπスタッキング及び定序疎水性相互作用による端−端自己集合に利用される、本発明の設計に発展した。本発明の直鎖ＣＲＰの配列は、３量体に、続いて非共有的な手段により超分子複合材及び原線維に自己集合することができる。他のものは、コラーゲン配列が、特にＴｙｒ、Ｐｈｅ及びＬｅｕのような芳香族及び疎水性アミノ酸残基を含むテロペプチド領域を含むことに留意すべきである。３重らせん自己集合に対するこのような芳香族及び疎水性残基の重要性が示されている（ヘルセス（Helseth）ＤＬ，Ｊｒ及びベイス（Veis）Ａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８１年、２５６巻、７１１８〜７１２８頁；プロコップ（Prockop）ＤＪ及びファータラ（Fertala）Ａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９８年、２７３巻、１５５９８〜１５６０４頁；並びにトラウブ（Traub）Ｗ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９７８年、９２巻、１１４〜１２０頁）。
【００５５】
したがって、本発明のＣＲＰ  ３量体により、例えば、配列番号２５：Ｆ５Ｐｈｅ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）１０−Ｐｈｅを有するＣＲＰ  ３量体により、原線維の成長を開始させる可能性について調査した。実施例３に示すように、コンピュータによる分子モデリングを用いて、配列番号２５を有する２つの頭−尾（head-to-tail）ＣＲＰ  ３量体の間の干渉を評価した。ＸＥＤ（広がった電子分布）力場を用いて、互いに向かって２つの３重らせんを引いた。３重らせん体が互いに接近するにつれて、フェニル／ペンタフルオロフェニル対が正面（ＦＴＦ）配向を採用し、−５５．２ｋｃａｌ／ｍｏｌの総界面結合エネルギーが生じた。芳香環を縁−面（edge-to-face）配向で置いたとき、再最小化された集合体は面−面（face-to-face）配向に戻った。
【００５６】
配列番号２６：Ｐｈｅ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）１０−Ｐｈｅ及び配列番号２７：Ｌｅｕ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）１０−Ｐｈｅを有する類似のＣＲＰ  ３量体の界面についても調べた。比較的、配列番号２６の場合、対称的なＦＴＦ相互作用が観察されることなく、低い界面結合エネルギーが観察された（総エネルギー：−４９．２ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。配列番号２７では更に結合エネルギーが低下した（総エネルギー：−３２．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。配列番号２５を有するＣＲＰ  ３量体の両端の間の強力な相互作用、並びに、配列番号２６及び配列番号２７を有するＣＲＰ  ３量体の両端の間の相互作用は、本発明のＣＲＰ  ３量体のポテンシャルが、ＣＲＰ  ３量体間の芳香環スタッキング及び定序疎水性相互作用により、原線維の成長を開始させるという発明者らの仮説を支持する。
【００５７】
モデリング研究では原線維の成長を開始させるためのＣＲＰ  ３量体の端−端界面を調べたが、本発明の範囲は、コラーゲンテロペプチドの場合と同様に、疎水性相互作用が、ＣＲＰ  ３量体内の異なる箇所でＣＲＰ間の端−端配向で、及び、疎水性相互作用により可能になる場合、隣接するＣＲＰ  ３量体との側−側相互作用で生じるねじれ型界面のような、他の可能な界面を含むことを意図する。
【００５８】
ＣＲＰの構成
前述の非限定的な実施形態に加えて、本発明はまた、式（Ｉ）の任意の代表的な組み合わせの配列から成る、ＣＲＰ並びにそのホモ３量体及びヘテロ３量体を包含する。
【００５９】
本明細書に記載のようなＣＲＰの全長は、２６アミノ酸から最大４７アミノ酸の範囲であってよい。本発明の実施形態では、ＣＲＰの全長は最大３２アミノ酸であってよい。
【００６０】
本明細書に記載のようなＣＲＰは、エフェクタ分子、標識、マーカー、薬物、毒素、担体若しくは輸送分子、又は抗体若しくはその結合断片若しくは他のリガンドのような標的化分子等であるが、これらに限定されない、ペプチジル若しくは非ペプチジルカップリングパートナーと重合又は結合する場合がある。ＣＲＰポリペプチドをペプチジル及び非ペプチジルカップリングパートナーの両方にカップリングする技術は、当該技術分野において周知である。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のようなＣＲＰを、固体表面又は不溶性支持体上にコーティングしてもよい。支持体は、例えば、プレート、試験管、ビーズ、ボール、フィルタ、布地、ポリマー又は膜が挙げられる、微粒子又は固体状であってよい。ＣＲＰポリペプチドを固体表面又は不溶性支持体上に固定する方法は、当業者に既知である。
【００６２】
いくつかの実施形態では、支持体は、例えば、免疫グロブリン若しくはフィブロネクチンのような、血漿タンパク質又は組織タンパク質等のタンパク質であってよい。他の実施形態では、支持体は、合成であってよく、例えば、生体適合性、生分解性ポリマーであってよい。好適なポリマーとしては、ポリエチレングリコール、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリオルソエステル、ポリ無水物、ポリホスファゼン及びポリウレタンが挙げられる。本発明の別の態様は、不活性ポリマーに結合した、本明細書に記載のようなポリペプチドを含むコンジュゲートを提供する。
【００６３】
ＣＲＰの１端に反応基を含むことにより、得られる産物が、血流に入ることなく、慢性創傷又は急性外傷部位のような病変に送達し得るように、不活性担体にケミカルカップリングすることが可能になる。
【００６４】
本発明のＣＲＰは、例えば、確立された標準的な液相又は好ましくは固相ペプチド合成法に従って、化学合成により全体的に又は部分的に生成することができ、その概要は広く利用可能である（例えば、Ｊ．Ｍ．スチュアート（Stewart）及びＪ．Ｄ．ヤング（Young）、固相ペプチド合成（Solid Phase Peptide Synthesis）第２版、ピアース・ケミカル・カンパニー（Pierce Chemical Company）、ロックフォード（Rockford）、イリノイ州（１９８４年）、Ｍ．ボダンツキー（Bodanzsky）及びＡ．ヨダンツキー（Eodanzsky）、ペプチド合成の実務（The Practice of Peptide Synthesis）、スプリンガー出版（Springer Verlag）、ニューヨーク（New York）（１９８４年）；Ｊ．Ｈ．ジョーンズ（Jones）、ペプチドの化学合成（The Chemical Synthesis of Peptides.）、オックスフォード大学出版局（Oxford University Press）、オックスフォード（Oxford）、１９９１年；応用バイオシステム４３０Ａユーザーマニュアル（Applied Biosystems 430A Users Manual）、ＡＢＩ社（ABI Inc.）、フォスターシティー（Foster City）、カリフォルニア州、Ｇ．Ａ．グラント（Grant）編、合成ペプチド、ユーザーガイド（Synthetic Peptides, A User's Guide）、Ｗ．Ｈ．フリーマン社（Freeman & Co.）、ニューヨーク（New York）１９９２年、Ｅ．アサートン（Atherton）及びＲ．Ｃ．シェパード（Sheppard）、固相ペプチド合成、実践的アプローチ（Solid Phase PeptideSynthesis, A Practical Approach.）、ＩＲＬプレス（IRL Press）、１９８９年、並びにＧ．Ｅ．フィールズ（Fields）編、固相ペプチド合成（Solid-Phase Peptide Synthesis）（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２８９巻）、アカデミック・プレス（Academic Press）、ニューヨーク（New York）及びロンドン（London）、１９９７年）、又は液相法により、若しくは固相、液相及び溶液化学の任意の組み合わせにより、溶液中で調製することができる。
【００６５】
ＣＲＰ構造の修飾
本明細書に記載のようなＣＲＰは、例えば、１つ又はそれ以上のポリエチレングリコール分子、糖、リン酸塩、及び／又は他のこのような分子を付加することにより化学的に修飾してもよく、この場合分子は野性型のコラーゲンタンパク質に自然には結合しない。ＣＲＰの好適な化学修飾及び化学合成によりＣＲＰを作製する方法は、当業者に周知であり、また本発明に包含される。ＣＲＰのいくつかの部位に同じ又は異なる程度の同種の化学修飾が存在してもよい。更に、修飾は、ＣＲＰ骨格鎖、又はいずれかのアミノ酸側鎖、及びアミノ若しくはカルボキシル末端を含む、ＣＲＰ配列のいずれで起こることもできる。したがって、所与のＣＲＰは、多くの種の修飾を含むことができる。
【００６６】
上述のように、本明細書に記載のようなＣＲＰは構造的に修飾してもよい。構造的に修飾されたＣＲＰは、本明細書に記載のＣＲＰと、３次元形状及び生物活性の両方で実質的に類似しており、好ましくは、ＣＲＰ配列の活性基の３次元配置に非常に類似する反応化学部分の空間的配置を含む。アミノ酸の化学基を類似の構造の他の化学基と置換することにより、更に修飾することもできる。
【００６７】
更に、本明細書に記載のようなＣＲＰは、１つ又はそれ以上のＤ−アミノ酸を含むよう構造的に修飾してもよい。例えば、ＣＲＰは、ＣＲＰのアミノ酸配列中の１つ又はそれ以上のＬ−アミノ酸残基が、対応するＤ−アミノ酸残基又は逆−Ｄポリペプチドに置換された鏡像異性体であってよく、逆−Ｄポリペプチドとは、上述のＬ−アミノ酸に比べて逆の順序で配置されたＤ−アミノ酸から成るポリペプチドである（スミス（Smith）ＣＳら、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｒｅｓ．、１９８８年、１５巻、３７１〜３７９頁）。好適な構造的に修飾されたポリペプチドの生成方法は、当該技術分野において周知である。
【００６８】
ＣＲＰ組成物
本発明のＣＲＰは、単離及び／又は精製し、その後必要に応じて使用してよい。本発明の実施形態では、ＣＲＰは、当該技術分野において既知である１種又はそれ以上の賦形剤が挙げられるが、これらに限定されない、１種又はそれ以上の任意成分を含んでよい、医薬組成物又は医療用デバイスとして使用するのに好適な組成物のような、組成物中で用いてもよい。このような非限定的な実施形態に加えて、本発明はまた、このような組成物中の式（Ｉ）の任意の代表的な組み合わせの配列から成る、ＣＲＰ、並びにそのホモ３量体及びヘテロ３量体をも包含する。
【００６９】
特定のポリペプチドの、種々の医薬組成物、医療用デバイス及び併用製品での使用が記載されている。例えば、国際公開第０７／０４４０２６号は、損傷を受けた軟骨を修復するための、コラーゲン模倣ペプチド−ポリエチレングリコールジアクリレートヒドロゲルスカフォールドについて記載している。米国特許公開第２００６／０７３２０７号は、種々の医療用途のためのウシコラーゲン／エラスチン／ナトリウムヘパリネート（heparinate）非晶質コアセルベート組成物について記載している。米国特許公開第２００５／１４７６９０号は、人工血管として使用するためのコラーゲン／エラスチン／ヘパリンが埋め込まれた表面を有する修飾ポリウレタンフィルムについて記載している。特開２００５０６０５５０号は、分子量１００，０００〜６００，０００の、３重らせん構造を有する、ポリペプチド配列Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ（式中、ＹはＰｒｏ又はＨｙｐを表す）を含有する基材に付着する組成物について記載している。特開２００５０６０３１５号は、分子量１００，０００〜６００，０００の、３重らせん構造を有する、ポリペプチド配列Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ（式中、ＹはＰｒｏ又はＨｙｐを表す）、及びビタミンＣを含有する医薬組成物について記載している。特開２００５０６０３１４号は、分子量１００，０００〜６００，０００の、３重らせん構造を有する、ポリペプチド配列Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ（式中、ＹはＰｒｏ又はＨｙｐを表す）を含有する化粧品組成物について記載している。特開２００５０５８４９９号は、分子量１００，０００〜６００，０００の、３重らせん構造を有する、配列Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ（式中、ＹはＰｒｏ又はＨｙｐを表す）のポリペプチドを含浸させた不織布組成物であって、コラゲナーゼにより分解できる、組成物について記載している。特開２００５０５８１０６号は、分子量１００，０００〜６００，０００の、３重らせん構造を有する、ポリペプチド配列Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ（式中、ＹはＰｒｏ又はＨｙｐを表す）を含有する食用組成物であって、コラゲナーゼにより分解できる、組成物について記載している。特開２００５０５３８７８号は、分子量７０，０００〜６００，０００の、３重らせん構造を有する、配列Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ及びＰｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｚ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（式中、ＸはＰｒｏ又はＨｙｐを表し；ＹはＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ又はＡｌａを表し；ＸはＩｌｅ又はＬｅｕを表す）を有するポリペプチドであって、コラゲナーゼにより分解できる、ポリペプチドについて記載している。国際公開第９８／５２６２０号は、インプラントのプロテーゼとして使用するための、生体適合性バルク材料の表面に共有結合した配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅｕを有する、バイオポリマー化合物について記載している。米国特許第６，０９６，８６３号は、親油性部分及び、固相合成を介して調製される、コラーゲン様配列Ｒ２Ｏ２Ｃ（ＣＨ２）２ＣＨ（ＣＯ２Ｒ１）ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）０〜４−［ペプチド］−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）０〜４（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して１〜２０個のヒドロカルビル基である）を有するペプチドを有するペプチド部分を有する、ペプチド−両親媒性物��複合体について記載している。米国特許第６，０９６，７１０号及び同第６，３２９，５０６号は、反復アミノ酸トリプレットＧｌｙ−Ｘｐ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｙｐ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ及びＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（式中、Ｘｐ及びＹｐはＮ−置換アミノ酸から選択されるペプトイド残基である）を有する３重らせん合成コラーゲン誘導体について記載している。
【００７０】
本発明は、種々の局面で、所望により他の分子、ペプチド、ポリペプチド及び特異的結合メンバーにカップリングした、本明細書に記載のようなＣＲＰに及ぶだけではなく、医薬組成物、薬剤、薬物、医療用デバイス若しくはその構成要素、又はそのようなＣＲＰ等を含む他の組成物も含む。このような医薬組成物、薬剤、薬物、医療用デバイス若しくはその構成要素、又は他の組成物は、診断、治療及び／又は予防目的が挙げられるが、これらに限定されない、種々の目的のために用いてよい。
【００７１】
本発明はまた、このような組成物の製造におけるこのようなＣＲＰの使用、並びに、所望の任意賦形剤及び他の任意成分とこのようなＣＲＰを混合することを含む、このような組成物の製造方法にも拡大適用する。好適な賦形剤の例としては、当該技術分野において周知である、ビヒクル、担体、緩衝剤、安定剤等のいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
組成物が医薬組成物である実施形態では、組成物は、このようなＣＲＰに加えて、二次的な製薬的活性剤を含有してよく、ここで得られる併用製品は、当該技術分野において製薬上許容できるものとして周知であるような賦形剤と更に混合してもよい。このような好適な賦形剤の例は、例えば、製薬賦形剤ハンドブック（Handbook of Pharmaceutical Excipients）（第５版、２００５年１０月、ファーマシューティカル・プレス（Pharmaceutical Press）、ロー（Rowe）ＲＣ、シェスキー（Sheskey）ＰＪ及びウェラー（Weller）Ｐ編）に開示されている。このような材料は、非毒性であるべきであり、このようなＣＲＰ又は二次的な製薬的活性剤の効果を干渉すべきではない。本発明のこのような組成物は、局部的方式で所望の部位へ投与してもよく、又はＣＲＰ若しくは二次的な製薬的活性剤が特定の細胞若しくは組織を標的化する方式で送達してもよい。好適な二次的製薬的活性剤としては、止血剤（トロンビン、フィブリノーゲン、ＡＤＰ、ＡＴＰ、カルシウム、マグネシウム、ＴＸＡ２、セロトニン、エピネフリン、血小板因子４、第Ｖ因子、第ＸＩ因子、ＰＡＩ−１、トロンボスポンジン等及びこれらの組み合わせのような）、抗感染剤（抗体、抗原、抗生物質、抗ウイルス剤等及びこれらの組み合わせのような）、鎮痛剤及び鎮痛剤の組み合わせ、又は抗炎症剤（抗ヒスタミン剤等のような）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
このような組成物の広範な用途では、組成物は、例えば製剤処方としてのような止血剤として、又は創傷被覆材の構成要素として、創傷部位に局所的に適用してよい。組成物は、単独で投与してもよく又は、治療すべき病状に応じて実質的に同時に若しくは連続的に、他の治療と併用してもよい。このようなＣＲＰは、単独で、又は創傷被覆材を含む、このようなＣＲＰを含む物品若しくはデバイスで、例えば外部環境から内容物を保護する好適な容器に密封されたキットで提供してもよい。このようなキットは、使用説明書を含んでもよい。
【００７４】
１つの実施形態では、本明細書に記載のようなＣＲＰは、致命的な失血を引き起こす創傷に局部的に適用することにより、例えば道路交通事故又は戦場での傷害後の、急性外傷における止血を促進するのに有用である場合がある。このような創傷部位で止血を促進する方法は、部位に、本明細書に記載のようなＣＲＰから構成される組成物を接触させることを含んでよく、ここで組成物は、ＣＲＰが止血を誘発し、維持するのに十分な量で、基材表面上に存在するように、所望により基材を含んでもよい。
【００７５】
別の実施形態では、本明細書に記載のようなＣＲＰは、潰瘍のような慢性創傷で止血を促進するのに有用である場合がある。提案された機構に関して理論に束縛されるものではないが、我々は、ＣＲＰがまず細胞接着を強化するよう作用して、次いで活性化血小板顆粒成分の放出が、血流からの及び治癒プロセスに寄与する付近の損傷を受けた組織からの、細胞の遊走を刺激できると考える。個体のこのような慢性創傷部位で止血を促進する方法は、その部位を本明細書に記載のようなＣＲＰから構成される組成物と接触させることを含み、ここで組成物は、ＣＲＰが止血を誘発するのに十分な量で、基材表面上に存在するように、所望により基材を含んでもよい。
【００７６】
本明細書に記載のような本発明のこのようなＣＲＰは、出血性障害の診断用が挙げられる、多数の研究室及び臨床環境で、価値のある試薬として広く有用である場合がある。例えば、本明細書に記載のようなこのようなＣＲＰは、その後使用されて血小板の凝集を開始させることができる、合成コラーゲンの構成で有用である場合がある。別の例では、このようなＣＲＰは、血小板の凝集及び活性化、並びに／又は血液凝固を阻害する試験化合物の研究又はスクリーニングで有用である場合がある。更なる例では、このようなＣＲＰは、血小板の活性化及び／又は凝集に関する調査用の試薬として有用である場合がある。血小板の活性化及び／又は凝集方法は、本明細書に記載のようなこのようなＣＲＰで血小板を治療することを含んでよい。
【００７７】
１つの実施形態では、血小板は、血漿の存在下にて、インビトロで治療されてもよい。治療される血小板、すなわち、本明細書に記載のようなＣＲＰと接触後の血小板の活性は、当該技術分野において予想されるような、好適な対照実験を使用して、例えば、関心因子若しくは薬剤、試験組成物、若しくは物質の存在下又は非存在下で、測定又は決定してよい。血小板の活性化及び／又は凝集に対する因子の効果は、本明細書に記載のようなこのようなＣＲＰで血小板を治療することと、血小板の活性化及び／又は凝集に対する因子の効果を決定することと、を含む方法により決定できる。血小板の活性化及び／又は凝集は、因子の存在下若しくは非存在下で、又は異なる濃度の因子により決定してよい。
【００７８】
本発明の別の実施形態では、本発明のこのようなＣＲＰは、血小板凝集測定法で試薬として動物組織から抽出したコラーゲン原線維、又は血小板機能分析装置及び他の機器等で固定化したコラーゲン製剤を日常的に使用する診断のような、血小板障害の診断で有用である場合がある。例えば、このようなＣＲＰを使用して、血小板の活性若しくは機能を調査する、又は、本明細書に記載のようなこのようなＣＲＰで処理された試料中の血小板の活性化及び／若しくは凝集を決定することにより、血小板活性の機能不全を診断することができる。例えば、本明細書に記載のようなこのようなＣＲＰを、個体から得られた血液試料と接触させてよく、次いで血小板の凝集を、当該技術分野において周知である方法に従って決定できる。
【００７９】
本発明の別の実施形態では、本発明のこのようなＣＲＰは、他の生理活性分子の産生及び放出に寄与することによる等、直接細胞接着を確実にする、並びに局部的に血小板を凝集及び活性化するよう作用する、生理活性表面コーティングとして有用である場合がある。１つの方法は、例えば、本明細書に記載のようなこのようなＣＲＰに血小板を接触させることを含んでよく、前記ＣＲＰは、支持体で若しくはその付近で血小板を凝集及び／又は活性化させるために、血漿の存在下で、固体又は半固体支持体上に固定してもよい。
【００８０】
本発明のＣＲＰは、出血性障害の治療で広く有用である場合もある。
【００８１】
１つの実施形態では、本明細書に記載のようなこのようなＣＲＰが、不活性ポリマー支持体のような、固体若しくは半固体支持体上に吸着する、又は前記支持体内若しくは上に他の方法で含有され、得られる支持体は、自己免疫血小板減少症（thrombocytopaenia）から、又は癌治療で見られるような骨髄の治療的切除から、並びにグランツマン病のような他の原因による出血性障害から生じる場合がある、血小板不全の場合、血小板輸血の補助剤又は代替物として機能するのに有用である場合がある。この実施形態では、固体若しくは半固体支持体上に吸着した、又は固体若しくは半固体支持体内若しくは上に他の方法で含有されたこのようなＣＲＰを、例えば、血小板不全を有する、及び／又は上記のような病状を有する個体のような、それを必要としている個体に投与してよい。
【００８２】
本明細書に記載のようなこのようなＣＲＰは、固体若しくは半固体支持体上に吸着した、又は固体若しくは半固体支持体内若しくは上に他の方法で含有されているが、大動脈瘤の血栓形成を誘発するのに有用である場合もある。例えば、このようなＣＲＰは、塞栓性コイルの外側上にコーティングして、組織を固定する、及び／又は、拡張した動脈が更に伸展するのを防ぐことができる。この実施形態では、個体の損傷を受けた血管組織における血栓形成は、血管組織を、本明細書に記載のようなこのようなＣＲＰに接触させることにより誘発でき、前記ＣＲＰは、不活ポリマー支持体のような、固体若しくは半固体支持体上に吸着している、又は固体若しくは半固体支持体内若しくは上に他の方法で含有されている。好適な不活ポリマー支持体の例としては、ステント、塞栓性コイル等が挙げられるが、これらに限定されない。このような個体は、例えば、拡張した動脈若しくは他の血管、及び／又は大動脈瘤のような医学的問題に苦しんでいる場合がある。１つの実施形態では、支持体は、タンパク質、ポリエチレングリコール、又はリポソームから構成される不活性ポリマー支持体であってよく、これは支持体に吸着するインスタントＣＲＰでコーティングされている。
【００８３】
本明細書に記載のような本発明のこのようなＣＲＰは、胚幹細胞の指向性分化のために、前記コラーゲン関連ペプチドを追加した、化学的に定義された三次元ポリマーマトリックスを含む組成物中で更に有用である場合がある。国際公開第０７／０７５８０７号は、全ての目的のために、その全文が参考として本明細書に組み込まれているが、胚幹細胞の指向性分化を支持するコラーゲンＩＶポリペプチドを追加した、化学的に定義された三次元ポリマーマトリックスを含む組成物について記載している。
【００８４】
本発明の更に別の実施形態は、本発明のＣＲＰを含む組成物を投与することを含む、止血症状の治療を必要としている被験体の止血症状を治療する方法であって、前記組成物としては本明細書に記載のようなこのようなＣＲＰが挙げられるが、これらに限定されない、方法を目的とする。ポリペプチド組成物は、所望により、投与中基材を含んでもよい。このような組成物は、典型的には、被験体に対して効果を示すのに十分なレジメンに従って投与してよい。投与する実際の量、並びに投与速度及び時間経過は、例えば、治療される疾患又は病状の性質及び重篤度のようないくつかの要因に依存する。組成物は、治療される疾患又は病状に依存して、同時に又は連続的に、単独で又は他の治療の補助療法と併用して投与してよい。
【００８５】
止血症状を治療するためのこの方法に従って、本明細書に記載のようなＣＲＰ組成物は、単独で、又は賦形剤及び止血をもたらす他の任意成分と併せて用いてもよい。別の実施形態では、このようなＣＲＰは、止血剤として使用するために好適な基材と組み合わせてもよい。止血剤ＣＲＰ組成物は、粉末、繊維、フィルム又は発泡体が挙げられるが、これらに限定されない、種々の形態であってよい。
【００８６】
ＣＲＰを含有する発泡体は、例えば、凍結乾燥又は超臨界溶媒発泡のようなプロセスにより調製できる。これらのプロセスの詳細は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｓ．マツダ、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｊ．、１９９１年、２３（５）、４３５〜４４４頁（凍結乾燥）及び欧州特許出願第４６４，１６３（Ｂ１）号（超臨界溶媒発泡）に開示されている。一般に、本発明のＣＲＰを含有する凍結乾燥された発泡体は、まず、このような溶解に十分な温度下にて好適な溶媒中で、ＣＲＰ及び、例えば、可塑剤のような当該技術分野において既知である任意成分のいずれかを溶解させ、次いでＣＲＰ含有溶液を型に注ぐことにより調製できる。ＣＲＰは、ＣＲＰ含有溶液の総重量に基づいて、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの範囲、又は約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬ、又は約０．３ｍｇ／ｍＬの量、ＣＲＰ含有溶液中に存在してよい。好適な可塑剤としては、グリセロール；ポリエチレングリコール；グリセリン；プロピレングリコール；グリセロールのモノアセテート；グリセロールのジアセテート；グリセロールのトリアセテート及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されず、ＣＲＰ含有発泡体の最終乾燥重量に基づいて、約０．５パーセント〜約１５パーセントの範囲、又は約１パーセント〜約５パーセントの範囲の量で用いてよい。ＣＲＰに対して可能性のある有害な影響を最小限に抑えるために、溶解温度は約５０℃を超えるべきではない。溶解は、水、又は緩衝生理食塩水、リン酸緩衝溶液、ハンクス平衡塩類溶液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水、ヘペス緩衝生理食塩水、及びこれらの混合物のような、水性塩溶液が挙げられるが、これらに限定されない好ましい水性条件下で実施してよい。
【００８７】
１つの実施形態では、溶媒は、約６〜約８のｐＨ範囲に緩衝化してよい。型に所望の量の溶液を充填した後、型を次いで凍結乾燥機に移動させ（いずれ凍結する）次いで、得られる発泡体から溶媒を除去するために溶液を真空乾燥させる。得られる発泡体の厚さは、例えば、型内の溶液量、溶液中のＣＲＰ濃度等に依存して変動してよいが、典型的には、得られる発泡体は、約０．５ｍｍ〜約１０ｍｍの範囲、又は約１ｍｍ〜約５ｍｍの範囲の厚さ、及び約１マイクロメートル〜約５００マイクロメートルの孔径を有してよい。発泡体は、出血部位の止血問題に取り組むために用いるのに好適であってよい種々の大きさで製造してよい。
【００８８】
ＣＲＰ含有フィルムは、例えば、好適な溶媒からのフィルムの流延のようなプロセスにより調製できる。このプロセスの詳細は当該技術分野において周知であり、例えば、バグロディア（Bagrodia）Ｓ及びウィルキンス（Wilkes）ＧＬ、「機械的特性に関する溶媒流延コポリマー材料の効果（Effects of Solvent Casting Copolymer Materials As Related to Mechanical Properties）」、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ．、１９７６年（１月）、１０（１）、１０１−１１頁に開示されている。この実施形態に従って、本発明のＣＲＰは、例えば可塑剤のような当該技術分野において既知の任意成分のいずれかとともに、十分な量の水性溶媒に溶解できる。ＣＲＰは、溶液の総重量に基づいて、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの範囲、又は約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬの範囲、又は約０．３ｍｇ／ｍＬの量で、溶液中に存在してよい。好適な可塑剤としては、グリセロール；ポリエチレングリコール；グリセリン；プロピレングリコール；グリセロールのモノアセテート；グリセロールのジアセテート；グリセロールのトリアセテート及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されず、ＣＲＰ含有フィルムの最終乾燥重量に基づいて、約０．５パーセント〜約１５パーセントの範囲、又は約１パーセント〜約５パーセントの範囲の量で用いてよい。
【００８９】
好適な水性溶媒の例としては、水、混和性有機溶媒、アルコール、又はこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。好適な混和性有機溶媒の例としては、アセトン、エタノール、イソプロパノール、プロパノール、メタノール等及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＲＰに対して可能性のある有害な影響を最小限に抑えるために、溶解温度は約５０℃を超えるべきではない。ＣＲＰ含有溶液を、次いで、例えば液滴添加し、又は他の方法で好適な量を注いで、流延基材上の所望の表面領域を覆うこともできる。
【００９０】
好適な流延基材の例としては、ＣＲＰ含有フィルムを容易に放出する材料を含むものが挙げられ、ガラス、金属から製造されたもの、テフロンコーディングされた容器等を挙げることができるが、これらに限定されない。このような基材の大きさ及び形状は、組成物の必要性に従って変動してよい。溶媒は、次いで、蒸発又は空気乾燥によりＣＲＰ含有溶液から除去してよく、次いで所望により、得られるフィルムを、真空乾燥を介する等の種々の方法により乾燥して、任意の残留溶媒を除去してよい。より厚いフィルムが望ましい場合、既に流延されたフィルムの上面上にＣＲＰ含有溶液の１つ又はそれ以上の層を流延することにより、プロセスを繰り返してもよい。得られるフィルムの厚さは、例えば、流延基材に注がれる溶液の量、溶液中のＣＲＰ濃度等に依存して変動してよいが、典型的には、各フィルム層の厚さは、約５０マイクロメートル〜約１５０マイクロメートルの範囲であってよい。発泡体に関して上述したように、フィルムはまた、種々の大きさで調製できる。
【００９１】
ＣＲＰ含有粉末は、当該技術分野において周知のプロセスを用いて、本発明のＣＲＰから構成される、繊維、フィルム又は発泡体を、手動で若しくは機械的に粉砕する又は細かく砕くことにより、得ることができる。ＣＲＰ繊維、フィルム又は発泡体を粉末に粉砕する又は細かく砕く代表的な技術としては、乳鉢及び乳棒、回転刃、ボールミルのような衝撃粉砕機が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＲＰを粉末に粉砕するためのこれらの及び他の手段は、室温で達成できる、又は低温粉砕プロセスの手段は、ＣＲＰの凝固点を下回る温度で達成できる。得られるＣＲＰ含有粉末は、所望により、約１マイクロメートル〜約２０００マイクロメートルの範囲、又は約１０マイクロメートル〜約５００マイクロメートルの範囲の粒度を有する粉末を得るために篩い分けしてもよい。
【００９２】
ＣＲＰ含有粉末、フィルム、及び／又は発泡体は、止血を強化する又は止血を起こす止血剤として出血部位に直接適用してよい。あるいは、本明細書に記載のＣＲＰは、基材の構成要素と併せて適用してよく、このような実施形態では、ＣＲＰを以後ＣＲＰ止血剤成分と称する。基材は、個体に植え込むのに好適な基材であってよく、又は植え込みできない基材であってもよい。
【００９３】
好適な植え込み可能な基材の例としては、縫合アンカー、縫合糸、止め金、手術用鋲、クリップ、プレート、ねじ、及びフィルムのような医療用デバイス；不織布フェルト、織布メッシュ又は布地；発泡体；及び粉末のような組織工学スカフォールドが挙げられるが、これらに限定されない。これらの植え込み可能な基材は、体内に植え込むのに好適な任意の材料であってよく、脂肪族ポリエステル、ポリ（Ｌ−リジン及びポリ（グルタミン酸）のようなポリ（アミノ酸）、コポリ（エーテル−エステル）、１〜１０個の炭素原子の長さのアルキル基を有するもののようなポリアルキレンオキザラート、ポリオキサアミド、チロシン由来ポリカーボネート、ポリ（イミノカーボネート）、ポリオルソエステル、ポリオキサエステル、ポリエステルアミド、アミノ基を含有するポリオキサエステル、ポリ（無水物）、ポリホスファゼン、生体分子（コラーゲン、エラスチン及びゼラチンのようなバイオポリマー、デンプン、アルギン酸、ペクチン、カルボキシメチルセルロール、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースの塩、酸化再生セルロース等のような多糖類を含む）、並びにそのコポリマー及びブレンドに加えて、木綿、亜麻布、絹、ナイロン６−６のようなナイロン、及びＥ．Ｉ．デュポン・ド・ヌムール・アンド・カンパニー（E.I. du Pont de Nemours and Company）から商品名「ケブラー（KEVLAR）」又はノメックス（NOMEX）として市販されているもののような芳香族ポリアミドが挙げられるが、これらに限定されない非吸収性材料、ポリ（エチレンテレフタレート）のようなポリエステル、ポリテトラフルオロエチレン、フッ素化ポリ（エチレン−プロピレン）（ＦＥＰ）及びポリビニリデンフッ化物（ＰＦＡ）のようなフルオロポリマー、ポリエチレン及びポリプロピレンのようなポリオレフィン、ポリウレタン、並びにこれらの組み合わせのような生体適合性、生体吸収性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
本明細書で使用するとき、「生体吸収性」は、比較的短期間内に体組織に曝露したとき、酵素的又は加水分解的反応を介して容易に分解する材料を指す。「分解」は、材料が、体により実質的に代謝又は排除できる小セグメントに崩壊することを意味する。完全な生体吸収は、約１２ヶ月内に起こるべきであるが、生体吸収は、例えば、約９ヶ月内、約６ヶ月内、又は約３ヶ月内又はそれ未満で完了する場合もある。
【００９５】
本発明の目的において、ポリ（イミノカーボネート）には、ドーム（Domb）ら編「生分解性ポリマーの手引き（Handbook of Biodegradable Polymers）」、ハードウッド・アカデミック・プレス（Hardwood Academic Press）、２５１〜２７２頁（１９９７年）にケムニッツァー（Kemnitzer）及びコーン（Kohn）により記載されたポリマーが挙げられると理解される。本発明の目的において、コポリ（エーテル−エステル）には、コーン（Cohn）及びユーネス（Younes）によるジャーナル・オブ・バイオマテリアル・リサーチ（Journal of Biomaterials Research）、２２巻、９９３〜１００９頁、１９８８年に、及びコーン（Cohn）によるポリマー・プレプリント（Polymer Preprints）（ポリマー・ケミストリー（Polymer Chemistry）のＡＣＳ部門）、３０巻（１号）、４９８頁、１９８９年に記載されているコポリエステル−エーテル（例えば、ＰＥＯ／ＰＬＡ）が挙げられると理解される。本発明の目的のために、ポリアルキレンオキザラートとしては、米国特許第４，２０８，５１１号、同第４，１４１，０８７号、同第４，１３０，６３９号、同第４，１４０，６７８号、同第４，１０５，０３４号及び同第４，２０５，３９９号に記載されているものが挙げられる。本発明の目的のために、チロシン由来ポリカーボネートとしては、プラプラ（Pulapura）ら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、３２巻、４号、４１１〜４１７頁、及びエールテル（Ertel）ら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．、１９９４年、２８巻、９１９〜９３０頁に記載のようなポリマーを含むと理解される。本発明の目的のために、ポリホスファゼン、Ｌ−ラクチド、Ｄ，Ｌ−ラクチド、乳酸、グリコリド、グリコール酸、パラ−ジオキサノン、トリメチレンカーボネート及びε−カプロラクトンから作製されるコ−、ター−及びより高次の混合モノマーをベースとするポリマーは、「高分子科学工学百科事典（Encyclopedia of Polymer Science）」、１３巻、３１〜４１頁、ワイリー・インターサイエンシズ（Wiley Intersciences）、ジョン・ワイリー＆サンズ（John Wiley & Sons）、１９８８年に、オールコック（Allcock）により、及び、ドーム（Domb）編「生分解性ポリマーの手引き（Handbook of Biodegradable Polymers）」、ハードウッド・アカデミック・プレス（Hardwood Academic Press）、１６１〜１８２頁（１９９７年）にバンドルペ（Vandorpe）らにより、記載されているものを含むと理解される。本発明の目的ために、ポリエステルアミドは、米国特許出願第２００６０１８８５４７号及び米国特許第５，９１９，８９３号に記載のようなポリマーを含むと理解される。ポリ（無水物）としては、ＨＯＯＣ−Ｃ６Ｈ４−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−Ｃ６Ｈ４−ＣＯＯＨ（ｍは２〜８の範囲の整数である）の二酸に由来するもの及び、１２個以下の炭素原子の脂肪族α−ω二酸を有するそのコポリマーが挙げられる。アミン及び／又はアミド基を含むポリオキサエステル、ポリオキサアミド及びポリオキサエステルは、米国特許第５，４６４，９２９号、同第５，５９５，７５１号、同第５，５９７，５７９号、同第５，６０７，６８７号、同第５，６１８，５５２号、同第５，６２０，６９８号、同第５，６４５，８５０号、同第５，６４８，０８８号、同第５，６９８，２１３号、同第５，７００，５８３号及び同第５，８５９，１５��号の１つ又はそれ以上に記載されている。本発明の目的のためのポリオルソエステルは、ヘラー（Heller）の生分解性ポリマーハンドブック（Handbook of Biodegradable Polymers）、ドン（Domb）ら編、ハードウッド・アカデミック・プレス（Hardwood Academic Press）、９９〜１１８頁（１９９７年）に記載のポリマーを含むと理解される。本発明の目的ために、ポリウレタンは、米国特許第６，３２６，４１０号、同第６０１９９９６号、同第５５７１５２９及び同第４，９６０，５９４号に記載のようなポリマーを含むと理解される。
【００９６】
本発明の目的ために、脂肪ポリエステルとしては、ラクチド（乳酸Ｄ−、Ｌ−及びメソラクチドが挙げられる）、グリコリド（グリコール酸を含む）、ε−カプロラクトン、ｐ−ジオキサノン（１，４−ジオキサン−２−オン）、トリメチレンカーボネート（１，３−ジオキサン−２−オン）、米国特許第５，４１２，０６８号に記載のようなトリメチレンカーボネートのアルキル誘導体、δ−バレロラクトン、β−ブチロラクトン、γ−ブチロラクトン、ε−デカラクトン、ヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレート、１，４−ジオキセパン−２−オン（そのダイマー１，５，８，１２−テトラオキサシクロテトラデカン−７，１４−ジオンを含む）、１，５−ジオキセパン−２−オン、６，６−ジメチル−１，４−ジオキサン−２−オンのホモポリマー及びコポリマー、並びにこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されないと理解される。
【００９７】
１つの実施形態では、脂肪族ポリエステルはエラストマーコポリマーである。「エラストマーコポリマー」は、室温で、元の長さの少なくとも２倍に繰り返し伸び、応力を即時解放したとき、およそ元の長さに戻る材料として定義される。好適な生体吸収性、生体適合性エラストマーとしては、ε−カプロラクトン及びグリコリドのエラストマーコポリマー（約３０：７０〜約７０：３０の範囲、又は約３５：６５〜約６５：３５の範囲、約４５：５５〜約３５：６５の範囲の、ε−カプロラクトンのグリコリドに対するモル比を有するもののような）；ε−カプロラクトン及び、Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、これらのブレンド、又は乳酸コポリマーが挙げられるラクチドのエラストマーコポリマー（約３５：６５〜約６５：３５の範囲、又は約４５：５５〜約３０：７０の範囲の、ε−カプロラクトンのグリコリドに対するモル比を有するもののような）；ｐ−ジオキサノン（１，４−ジオキサン−２−オン）並びに、Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド及び乳酸が挙げられるラクチドのエラストマーコポリマー（約４０：６０〜約６０：４０の範囲の、ｐ−ジオキサノンのラクチドに対するモル比を有するもののような）；ε−カプロラクトン及びｐ−ジオキサノンのエラストマーコポリマー（約３０：７０〜約７０：３０の範囲の、ε−カプロラクトンのｐ−ジオキサノンに対するモル比を有するもののような）；ｐ−ジオキサノン及びトリメチレンカーボネートのエラストマーコポリマー（約３０：７０〜約７０：３０の範囲の、ｐ−ジオキサノンのトリメチレンカーボネートに対するモル比を有するもののような）；トリメチレンカーボネート及びグリコリドのエラストマーコポリマー（約３０：７０〜約７０：３０の範囲の、トリメチレンカーボネートのグリコリドに対するモル比を有するもののような）；トリメチレンカーボネート及び、Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、これらのブレンド、又は乳酸コポリマーが挙げられるラクチドのエラストマーコポリマー（約３０：７０〜約７０：３０の範囲の、トリメチレンカーボネートのラクチドに対するモル比を有するもののような）；並びにこれらのブレンドから成る群から選択されるものが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、エラストマーコポリマーは、約３５：６５〜約６５：３５の範囲の、ε−カプロラクトンのグリコリドに対するモル比を有する、ε−カプロラクトン及びグリコリドのエラストマーコポリマーである。更に別の実施形態は、エラストマーコポリマーは、約３５：６５のモル比を有するε−カプロラクトン及びグリコリドのエラストマーコポリマーである。
【００９８】
好適な植え込み不可能な基材の例としては、包帯及び創傷被覆材が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用するとき、「包帯」は、体の罹患若しくは傷害部分に巻き付ける又はそれを包むために用いることができる、布又は他の材料の小片を意味する。包帯は、創傷に対して直接定置する、又は包帯を用いて創傷に創傷被覆材を巻き付ける。本明細書で使用するとき、「創傷被覆材」は、創傷に対して直接定置し、創傷を保護する；治癒を促進する；及び／又は水分を提供する、保つ若しくは除去する目的を果たし、所望により包帯を用いて所定の位置に保持される、布又は他の材料の小片を意味する。
【００９９】
植え込み不可能な基材は、布地、発泡体、ガーゼ、フィルム、接着ガーゼ包帯、ヒドロコロイド、ゲル及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない種々の形態であってよい。これらの植え込み不可能な基材は、体への適用（植え込みなし）に好適な任意の材料で構成されてよく、脂肪族ポリエステル、ポリ（Ｌ−リジン）及びポリ（グルタミン酸）のようなポリ（アミノ酸）、コポリ（エーテル−エステル）、１〜１０個の炭素原子の長さのアルキル基を有するもののようなポリアルキレンオキザラート、ポリオキサアミド、チロシン由来ポリカーボネート、ポリ（イミノカーボネート）、ポリオルソエステル、ポリオキサエステル、ポリエステルアミド、アミノ基を含有するポリオキサエステル、ポリ（無水物）、ポリホスファゼン、生体分子（コラーゲン、エラスチン及びゼラチンのようなバイオポリマー、デンプン、アルギン酸、ペクチン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースの塩、酸化再生セルロース等のような多糖類を含む）、並びにそのコポリマー及びブレンドに加えて、木綿、亜麻布、絹、ナイロン６−６のようなナイロン、及びＥ．Ｉ．デュポン・ド・ヌムール・アンド・カンパニー（E.I. du Pont de Nemours and Company）から商品名「ケブラー（KEVLAR）」又は「ノメックス（NOMEX）」として市販されているもののような芳香族ポリアミドが挙げられる、非生体吸収性材料、ポリ（エチレンテレフタレート）のようなポリエステル、ポリテトラフルオロエチレン、フッ素化ポリ（エチレン−プロピレン）（ＦＥＰ）及びポリビニリデンフッ化物（ＰＦＡ）のようなフルオロポリマー、ポリエチレン及びポリプロピレンのようなポリオレフィン、ポリウレタン、並びにこれらの組み合わせのような生体適合性、生体吸収性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。これらの材料は上記のように定義される。
【０１００】
ＣＲＰ止血剤成分は、ディップコーティング、スプレーコーティング、凍結乾燥コーティング、及び静電コーティング技術のような、従来のコーティング技術を介してこのような基材の表面に適用できる。これらのコーティング技術の詳細は、当該技術分野において周知であり、例えば、米国特許第６，６６９，９８０号；ユン（Yun）ＪＨら、４０（３）ＡＳＡＩＯ  Ｊ．Ｍ、４０１〜５（１９９４年７〜９月）；及びクローガーズ（Krogars）Ｋら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．、２００２年（１０月）、１７（１〜２）、２３〜３０頁に開示されている。一般に、所望の量のＣＲＰ止血剤を含有する溶液を調製し、選択したコーティング技術を介して所望の基材の表面に適用することができる。基材を、次いで、空気乾燥、真空オーブン内での真空乾燥、又は凍結乾燥が挙げられるが、これらに限定されない従来の乾燥プロセスを介して乾燥してよい。ＣＲＰは、血液凝固、血小板凝集等のような所望の止血特性を達成するのに必要な量で用いるべきであるが、一般に、ＣＲＰは、基材をコーティングする目的のために、約０．０１ｍｇ／ｃｍ２〜約１ｍｇ／ｃｍ２の範囲の基材、又は約０．１ｍｇ／ｃｍ２〜約０．５ｍｇ／ｃｍ２の範囲、又は約０．４ｍｇ／ｃｍ２の範囲の量で存在する。
【０１０１】
基材は注入可能な若しくは噴霧可能なゲル又はゲル形成液体、ＣＲＰ止血剤成分（粉末又はコラーゲン様原線維物質の形態であってよい）である別の実施形態では、当該技術分野において既知の従来の混合技術を介して、注入可能な若しくは噴霧可能なゲル又は液体と組み合わせてもよい。注入可能な若しくは噴霧可能なゲル又はゲル形成液体は、水性塩溶液及びゲル化材料から構成されてよい。
【０１０２】
好適な水性塩溶液の例としては、生理学的緩衝溶液、生理食塩水、水、緩衝生理食塩水、リン酸緩衝溶液、ハンクス平衡塩類溶液、ＰＢＳ、トリス緩衝生理食塩水、ヘペス緩衝生理食塩水、及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態では、水性塩溶液は、リン酸緩衝溶液又はＰＢＳであってよい。
【０１０３】
好適なゲル化材料の例としては、コラーゲン、エラスチン、トロンビン、フィブロネクチン、ゼラチン、フィブリン、トロポエラスチン、ポリペプチド、ラミニン、プロテオグリカン、フィブリン糊、フィブリンクロット、多血小板血漿（ＰＲＰ）塊、乏血小板血漿（ＰＰＰ）塊、自己集合ペプチドヒドロゲル、及びアテロコラーゲンのようなタンパク質；デンプン、ペクチン、セルロース、アルキルセルロース（例えば、メチルセルロース）、アルキルヒドロキシアルキルセルロース（例えば、エチルヒドロキシエチルセルロース）、ヒドロキシアルキルセルロース（例えば、ヒドロキシエチルセルロース）、硫酸セルロース、カルボキシメチルセルロースの塩、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、キチン、カルボキシメチルキチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の塩、アルギネート、架橋アルギネートアルギン酸、プロピレングリコールアルギネート、グリコーゲン、デキストラン、硫酸デキストラン、カードラン、ペクチン、プルラン、キサンタン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルキトサン、キトサン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヘパラン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、カラギーナン、キトサン、デンプン、アミロース、アミロペクチン、ポリ−Ｎ−グルコサミン、ポリマンヌロン酸、ポリグルクロン酸ポリグルクロン酸、及び誘導体のような多糖類；リボ核酸、デオキシリボ核酸、並びにポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（オキシアルキレン）、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）のコポリマー、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリレート、モノステアロイルグリセロールｃｏ−スクシネート／ポリエチレングリコール（ＭＧＳＡ／ＰＥＧ）コポリマーのような他のもののようなポリヌクレオチド、並びにこれらのコポリマー及び組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
本明細書に記載のセルロース材料の定義では、用語「アルキル」は、約１〜約７個の炭素原子を含む直鎖又は分岐鎖であってよい炭化水素鎖を指し、特定の実施例で特に断らない限り、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、２，３−ジメチルブチル、ネオヘキシル又はヘプチルである。
【０１０５】
１つの実施形態では、ゲル化材料は多糖類から構成される。別の実施形態では、ゲル化材料は、カルボキシメチルセルロースナトリウムから構成される。
【０１０６】
注入可能な若しくは噴霧可能なゲル又は液体は、水性塩溶液に有効量のゲル化材料を溶解させて、初期ゲルを形成することにより調製できる。
【０１０７】
「有効量」のゲル化材料は、注入可能な若しくは噴霧可能なゲル又は液体を、患部に注入又は噴霧し、適用後も所定の位置に実質的に留まることを可能にするのに十分必要なゲル化材料の量として定義される。有効量のゲル化材料は、例えば、選択されたゲル化材料、所望のＣＲＰ量等に応じて変動するが、当業者は過度な実験を行うことなく、ゲル化材料の有効量を容易に決定できる。ゲル化材料がカルボキシメチルセルロースナトリウムである、１つの実施形態では、ゲル化材料は、溶液の総重量に基づいて、約０．１パーセント〜約５パーセントの範囲、又は約０．５パーセント〜約３パーセントの範囲の量で存在してよい。
【０１０８】
ＣＲＰ止血剤成分は、次いで、スパチュラによる手動混合、電磁攪拌又はモータ及び回転パドル若しくは刃を用いる機械混合が挙げられるが、これらに限定されない、当該技術分野において既知である、任意の従来の混合技術により初期ゲルと組み合わせてよい。可能性のあるＣＲＰに対する有害な影響を最小限に抑えるために、混合温度は約５０℃を超えるべきではない。ＣＲＰ止血剤は、出血部位に適用したとき、止血を誘発するのに有効な量で、得られるゲル中に存在し、典型的には、最終ゲルの総重量に基づいて、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの範囲、又は約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬの範囲、又は約０．３ｍｇ／ｍＬである。１つの実施形態では、注入可能な若しくは噴霧可能なゲル又は液体は、注入前にゲル状であってよく、一方、代替実施形態では、注入可能な若しくは噴霧可能なゲル又は液体は、注入前に液体状であってよいが、所望の箇所に投与したとき、ゲル状になり、実質的に所定の位置に留まることもできる。
【０１０９】
ＣＲＰ止血剤成分が粉末状である実施形態では、ＣＲＰを当該技術分野において既知である任意の好適な粉末担体と組み合わせてもよい。１つの実施形態では、担体は、例えば、マー（Maa）ＹＦら、ＳＪ  Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０００年（１１月）、１（３）、２８３〜３０２頁に開示されている方法を用いて、粉末粒子上に噴霧コーティングしてもよい。ＣＲＰ止血剤成分は、総粉末重量に基づいて、約０．５パーセント〜約１００パーセントの範囲、又は約２パーセント〜約１０パーセンの範囲の量で、粉末中に存在してもよい。
【０１１０】
好適な粉末担体の例としては、デンプン、ペクチン、セルロース、アルキルセルロース（例えば、メチルセルロース）、アルキルヒドロキシアルキルセルロース（例えば、エチルヒドロキシエチルセルロース）、ヒドロキシアルキルセルロース（例えば、ヒドロキシエチルセルロース）、硫酸セルロース、カルボキシメチルセルロースの塩、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、キチン、カルボキシメチルキチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の塩、アルギネート、架橋アルギネートアルギン酸、プロピレングリコールアルギネート、グリコーゲン、デキストラン、硫酸デキストラン、カードラン、ペクチン、プルラン、キサンタン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルキトサン、キトサン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヘパラン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、カラギーナン、キトサン、デンプン、アミロース、アミロペクチン、ポリ−Ｎ−グルコサミン、ポリマンヌロン酸、ポリグルクロン酸、マンニトール、多孔質溶岩、ポリエステル、及びコポリマーのような多糖類、並びにこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１１】
一般的なＣＲＰ合成
本発明のＣＲＰは、種々の固相又は溶液技術により製造できる。例えば、ＣＲＰは他の方法（例えば、溶液法）により調製し、次いでその後のカップリングのために支持材料に付着させることもできるが、固相ポリペプチド合成（ＳＰＰＳ）技術のような標準的な固相有機合成技術を用いることが好ましい。つまり、本発明のＣＲＰを合成し、その後支持材料に付着させ、種々の試薬とカップリングし、次いで種々の技術を用いて支持材料から取り除くことができる。しかしながら、ＣＲＰを支持材料上で合成し、試薬とカップリングし、次いで種々の技術を用いて支持材料から取り除くことが好ましい。
【０１１２】
ＣＲＰの調製では（オリゴペプチド、ポリペプチド又はタンパク質）、固相ペプチド合成は、新生ＣＲＰ鎖を、結合のための適切な官能基を含む支持材料（典型的には不溶性ポリマー支持体）に結合させる共有結合工程（すなわち、アンカリング）を含む。その後、アンカリングされたＣＲＰは、ＣからＮ−方向に段階的にＮ−保護及び側鎖保護アミノ酸を付加することを含む、一連の付加（脱保護／カップリング）サイクルにより伸びる。一旦鎖の組立が完了すると、保護基を取り除き、ＣＲＰを支持体から切断する。場合によっては、保護基を取り除く前に、他の基をＣＲＰに付加する。
【０１１３】
典型的には、ＳＰＰＳは、ハンドルを用いて、初期アミノ酸残基を官能化支持材料に結合することにより開始する。ハンドル（すなわちリンカー）は、一端に、平滑に切断可能な保護基の特性を組み込み、他端に、官能化支持材料へのカップリングを可能にするために活性化できる官能基、多くはカルボキシル基の特性を組み込む、二官能性スペーサである。既知のハンドルとしては、酸に不安定なｐ−アルコキシベンジル（ＰＡＢ）ハンドル、感光性ｏ−ニトロベンジルエステルハンドル、並びにアルベリシオ（Albericio）ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、５５巻、３７３０〜３７４３頁（１９９０年）及び本明細書に引用する参考文献、米国特許第５，１１７，００９号（バラニー（Barany））及び同第５，１９６，５６６号（バラニーら）に記載されているもののようなハンドルが挙げられる。
【０１１４】
例えば、支持材料がアミノ官能モノマーで調製される場合、典型的には、適切なハンドルは、一段階でアミノ官能化支持体に定量的に結合して、ポリペプチド鎖集合体について明確に定義された構造の一般的な起点を提供する。ハンドル保護基は取り除かれ、Ｎ’−保護第１アミノ酸のＣ−末端残基はハンドルに定量的に結合する。一旦ハンドルが支持材料にカップリングし、初期アミノ酸がハンドルに結合すると、一般的な合成サイクルが進行する。合成サイクルは、一般に、支持材料上のアミノ酸のＮ−保護アミノ基の脱保護、洗浄、及び必要に応じて中和工程、続く次のＮ−保護アミノ酸のカルボキシル活性化型との反応から成る。サイクルを繰り返して、関心ＣＲＰを形成する。官能化不溶性支持材料を用いる固相ペプチド合成法は周知である。
【０１１５】
ＳＰＰＳ技術を用いて支持材料上でＣＲＰを合成するとき、Ｆｍｏｃ方法論は、塩基に不安定な９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基を用いる、穏やかな直交性技術（mild orthogonal technique）の使用を含む。Ｆｍｏｃアミノ酸は、フルオレニルメチルスクシンイミジルカーボネート（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）、Ｆｍｏｃ塩化物、又は［４−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニルオキシ）フェニル］ジメチルスルホニウムメチルスルフェート（Ｆｍｏｃ−ＯＤＳＰ）を用いて調製できる。Ｆｍｏｃ基は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）若しくはＮ−メチルピロリドン中のピペリジンを用いて、又はＤＭＦ中の１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）を用いて取り除くことができる。Ｆｍｏｃ除去後、支持された樹脂の解放されたＮ１−アミンは、遊離しており、中和工程が介在することなく、いつでも脂質を即座に結合できる状態になっている。所望のＣＲＰの固定化された疎水性類似体を、次いで、例えば室温でトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて取り除くことができる。このようなＦｍｏｃ固相ポリペプチド合成方法論は、当業者に周知である。
【０１１６】
本発明の複合体の調製のために種々の支持材料を用いることができる。それらは、無機又は有機材料であってよく、種々の形態（膜、粒子、球体ビーズ、繊維、ゲル、ガラス等）であってよい。例としては、多孔質ガラス、シリカ、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリジメチルアクリルアミド、木綿、紙等が挙げられる。アミノ官能化ポリスチレン、アミノメチルポリスチレン、アミノアシルポリスチレン、ｐ−メチルベンズヒドラミンポリスチレン又はポリエチレングリコール−ポリスチレン樹脂のような官能化ポリスチレンを、この目的のために用いてもよい。
【０１１７】
具体的なＣＲＰ合成
当業者であれば、本明細書の記載に基づけば本発明を最大限利用することができるものと考えられる。以下の具体的な実施形態は、単なる例示として解釈すべきであり、いかなることがあっても以下の開示を限定するものではない。
【０１１８】
材料及び方法：Ｆｍｏｃアミノ酸、ＨＢＴＵ／ＨＯＢＴ、ＤＩＥＡ、ＮＭＰ及びＤＣＭは、アプライド・バイオシステム社（Applied Biosystems, Inc.）から購入した。ピペリジンはシグマ・アルドリッチから購入した。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｗａｎｇ樹脂はベイケム（Bachem）及びＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｗａｎｇ樹脂はノババイオケム（Novabiochem）から購入した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析は、マトリックスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸を用いる、ディレイド・エクストラクションレーザー脱離質量分析計に連結した、アプライド・バイオシステム・ボイジャー−ＤＥ  ＰＲＯ生体分光ワークステーション（Applied Biosystems Voyager-DE PRO Biospectrometry workstation）を用いて、Ｍ−スキャン社（M-Scan Inc.）で実施した。アミノ酸分析は、ベックマン６３００  Ｌｉベースのアミノ酸分析計（Beckman 6300 Li-based amino acid analyzer）を用いて、Ｕ．Ｃ．デービス（U.C.Davis）の分子構造施設（Molecular Structural Facility）で実施した。得られるＣＲＰの純度は＞９０％であり、ポリペプチド含量は各実験の溶液を調製するために考慮した。更に、２１４（ＰＢＳ中でε＝６．０×１０４Ｍ−１ｃｍ−１）又は２１５ｎｍ（水中でε＝６．５×１０４Ｍ−１ｃｍ−１）での吸収を測定し、ＣＲＰ濃度を確認した。電子顕微鏡実験のためのポリペプチド濾過は全て、ワットマン（Whatman）製のヌクルポア（Nuclepore）フィルタ（０．４−μｍ；ポリカーボネート膜）を用いて実施し、残りの濾過はポール（Palll）製のアクロディスク・シリンジ・フィルタ（Acrodisc syringe filters）（０．４５−μｍ；ポリテトラフルオロエチレン膜）を用いて行った。
【０１１９】
特に定義しない限り、本明細書で用いられる技術的及び科学的用語はすべて、発明が属する技術分野における当業者によって一般的に解釈されるのと同じ意味を有するものである。本明細書で用いる略記は以下の通りである。
【表１】
0005566885.tif 000003
【実施例】
【０１２０】
（実施例１）
配列番号２５：（Ｆ５）−Ｐｈｅ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）１０−Ｐｈｅ
比較配列番号２９：Ａｃ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）１０−Ｇｌｙ
比較配列番号３５：Ｆ５Ｐｈｅ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）５−Ｐｈｅ
配列番号２５を有するＣＲＰ並びに、配列番号２９及び配列番号３５を有する比較ポリペプチドを、標準的なＦａｓｔＭｏｃ化学により合成し、逆相ＨＰＬＣにより精製し、特徴付けた。
【０１２１】
配列番号２５を有するＣＲＰを、ＦａｓｔＭｏｃ化学（０．１ｍｍｏｌスケール）及びＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｗａｎｇ樹脂（０．７４ｍｍｏｌ／ｇ、１００〜２００メッシュ）を用いて、ＡＢＩ  ４３１合成装置で合成した。ＴＦＡ／トリイソプロピルシラン／水（９５：２．５：２．５）を用いて、２時間、樹脂からＣＲＰを切断した。ＨＰＬＣ精製を、５０ｍＬ／分の流速で６０分間にわたって１０〜９５％の直線勾配のＢ（Ａ：０．２％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ；Ｂ：０．１６％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ）を用いて、フェノメネックス（Phenomenex）Ｃ−１８逆相カラム（２５×５ｃｍ）で実施した。全収率３２％で、白色粉末としてＣＲＰを得た。配列番号２５：（Ｆ５）−Ｐｈｅ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）１０−Ｐｈｅの場合：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Ｍ＋Ｎａ）＋Ｃ１３８Ｈ１８５Ｆ５Ｎ３２Ｏ４３の計算値３０９６．３；実測値３０９６．８。配列番号３５を有する比較ポリペプチド：Ｆ５Ｐｈｅ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）５−Ｐｈｅを、配列番号２５を有するＣＲＰ：（Ｆ５）−Ｐｈｅ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）１０−Ｐｈｅと同様に合成した。
【０１２２】
配列番号２９を有する比較ポリペプチド：Ａｃ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）１０−Ｇｌｙを、ＦａｓｔＭｏｃ化学（０．１ｍｍｏｌスケール）及びＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｗａｎｇ樹脂（０．７ｍｍｏｌ／ｇ、１００〜２００メッシュ）を用いて、ＡＢＩ  ４３３Ａ合成装置で合成した。９５％ＴＦＡを用いて、２時間、樹脂からＣＲＰ比較ポリペプチドを切断した。ＨＰＬＣ精製を、６ｍＬ／分の流速で９０分間にわたって０〜１００％の段階的勾配のＢ（Ａ：０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ；Ｂ：０．１％ＴＦＡを含有する８０％ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ）を用いて、２つのバイダック（Vydac）Ｃ−１８逆相カラム（２５×２．５ｃｍ）で実施した。全収率３４％で、白色粉末として比較ポリペプチドを得た。配列番号２９：Ａｃ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）１０−Ｇｌｙの場合：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Ｍ＋Ｎａ）＋Ｃ１２４Ｈ１７７Ｎ３１Ｏ４３の計算値２８１１．３；実測値２８１２．２。
【０１２３】
円偏光二色性（ＣＤ）分光法
配列番号２５を有するＣＲＰ並びに配列番号２９及び配列番号３５を有する比較ポリペプチドの溶液（水中０．２５ｍＭ及び０．０１３ｍＭ）を４℃に２４時間保管し、３量体形成を監視した。１００ｎｍ／分のスキャン速度で、１０又は２０回のスキャンの平均の信号により、路長０．１ｃｍのセルを用いて、ジャスコ（Jasco）Ｊ−７１０機器で２５℃にてＣＤスペクトルを測定した。ＣＤ分光法（θｍａｘ＝２２５ｎｍ）により、配列番号２５を有するＣＲＰ及び配列番号２９を有する比較ポリペプチドは、３重らせん構造を採用することが分かった。ペルチェ温度制御システムを装備するＡｖｉｖ２１５分光計で、ＣＤ融解曲線を得た。２２５ｎｍにおける楕円率を、２０〜１００℃、速度１℃／分、増分３℃、平衡時間５分及び路長０．１ｃｍで監視した。
【０１２４】
配列番号２５を有するＣＲＰホモポリマーのＴｍは約５７℃であると決定された。配列番号２５を有するＣＲＰ  ３量体の結果は、温度依存性1Ｈ  ＮＭＲ研究により確認され、ここでプロリンのδ−Ｈの特徴的な低磁場シフト（元々δ３．０〜３．５ｐｐｍ）は、約５５℃〜約６５℃で生じた（平衡で）。したがって、配列番号２５を有するＣＲＰ  ３量体は室温超で安定であった。対照的に、配列番号２５を有するＣＲＰ  ３量体の熱安定性は、１対のジスルフィド結合により共有結合した３本のペプチド鎖を有する、最近記載されたコラーゲン模倣化合物（Ｔｍ＝４７℃）よりわずかに高かった（コッチ（Kotch）Ｆ及びレインズ（Raines）ＲＴ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２００６年、１０３巻、３０２８〜３０３３頁）。配列番号２９を有する参照ポリペプチド３量体（Ｔｍ７０℃）に比べて、配列番号２５を有するＣＲＰ  ３量体の融解温度がより低いことは、フェニル及びペンタフルオロフェニル基による配列番号２５を有するＣＲＰ  ３量体の末端のいくつかの構造的破損（「ほころび（fraying）」の原因となる場合がある。
【０１２５】
動的光散乱（ＤＬＳ）
６３３ｎｍのレーザー（Ｈｅ−Ｎｅ、４．０ｍＷ）を装備するマルバーン・ゼータサイザー・ゼン（Malvern Zetasizer Zen）１６００機器及び１７３℃における後方散乱検出によりＤＬＳ測定を行った。配列番号２５を有するＣＲＰ及び配列番号２９を有する参照ポリペプチド（水中０．５ｍｇ／ｍＬ）の溶液を７０℃で１０分間加熱し、０．４５μｍのフィルタを通して加熱濾過し、溶液が室温に達したとき（時間＝０）及び２４時間後にプラスチックのキュベット（１．０ｃｍ）内で測定した。
【０１２６】
ＤＬＳ測定を行って、２５℃の水中の配列番号２５を有するＣＲＰ及び配列番号２９を有する比較ポリペプチドにより形成された超分子複合材の大きさを決定した。２４時間後、３ｎｍ及び１９０ｎｍの２種を含む配列番号２５を有するＣＲＰの新鮮溶液を、およそ１０００ｎｍの大きさを有する凝集体材料に変換された。対照的に、配列番号２９を有する比較ポリペプチドは、およそ４及び１００ｎｍの大きさの２種を示したが、この大きさは同じ期間では増加しなかった。これらの結果は、仮定したフェニルペンタフルオロフェニル芳香環スタッキング機構は、配列番号２５を有するＣＲＰからの超分子複合材の形成を促進することを示唆する。
【０１２７】
透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）
配列番号２５を有するＣＲＰの超分子複合材の大きさ及び形態を、ＴＥＭフィリップス（Philips）ＥＭ  ３００で撮影したＴＥＭ像で評価した。配列番号２５を有するＣＲＰ（０．０５ｍｇ／ｍＬ）の水溶液を０．４μｍのフィルタを通して濾過し、炭素フィルムでコーティングされた銅格子上に沈着させた。溶液を４０℃で乾燥させ、８０ｋＶで画像を記録した。マウスの動脈を２％グルタルアルデヒドで染色し、ＴＥＭ用にエポキシブロック内に定置した。エポキシブロック内の動脈の薄切片（寸法およそ２００〜５００ｎｍ）を、ダイヤモンド切断具を用いて切断した。切片を銅格子上に実装し、６０ｋＶで画像を記録した。各実験では、長さμｍの、複合材原線維（平均直径：０．２６μｍ）（マウスの動脈組織で見られるコラーゲン原線維（平均直径：０．０５μｍ）に類似する）を観察した。配列番号２５を有するＣＲＰの原線維寸法は、各方向に少なくとも１００個の配列番号２５を有するＣＲＰ  ３量体の端端（線形）及び側側（側方）集合体の組み合わせを必要とした。
【０１２８】
プロトンＮＭＲ分光法
配列番号２５を有するＣＲＰ（２４時間４℃でインキュベートしたＤ２Ｏ中１ｍＭ）のプロトンＮＭＲスペクトルを、三重共鳴（１Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ）、三重軸、勾配プローブを装備した、ＤＭＸ−６００  ＮＭＲ分光計（ブリューカー・バイオスピン（Bruker Biospin, Inc.）、ビルリカ（Billeric）、マサチューセッツ州、ＭＡ  ０１８２１−３９９１）で回収した。リサイクルディレイ及び混合時間中、プレサチュレーションで１方向ＮＯＥＳＹを用いてデータを収集した。温度を１０℃ずつ上昇させ、平衡の１５分後スペクトルを測定した。
【０１２９】
（実施例２）
配列番号２５：Ｆ５Ｐｈｅ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）１０−Ｐｈｅ
配列番号２６：Ｐｈｅ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）１０−Ｐｈｅ
配列番号２７：Ｌｅｕ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）１０−Ｐｈｅ
配列番号２８：Ｇｌｙ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）１０−Ｇｌｙ
配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７を有するＣＲＰ、並びに配列番号２８を有する比較ポリペプチドを、標準的なＦａｓｔＭｏｃ化学により合成し、逆相ＨＰＬＣにより精製し、特徴付けた。
【０１３０】
ペプチド合成
配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７を有するＣＲＰ、並びに配列番号２８を有する比較ポリペプチド、ＦａｓｔＭｏｃ化学（０．１ｍｍｏｌスケール）及びＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｗａｎｇ樹脂（０．７４ｍｍｏｌ／ｇ、１００〜２００メッシュ）又はＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｗａｎｇ樹脂（０．６６ｍｍｏｌ／ｇ、１００−２００メッシュ）を用いて、ＡＢＩ  ４３１合成装置で合成した。ＴＦＡ／トリイソプロピルシラン／水（９５：２．５：２．５）を用いて、２時間、樹脂からＣＲＰおよりポリペプチドを切断した。精製を、２０ｍＬ／分の流速で１５分間にわたって５〜９５％の直線勾配のＢ（Ａ：０．０５％ＴＦＡ／水；Ｂ：０．０５％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ）を用いて、ＲＰ−ＨＰＬＣ（ゾルバックス（Zorbax）３００ＳＢ−Ｃ１８、２１．２×１５０ｍｍ、６０℃で）により実施した。画分を、１ｍＬ／分の流速で２０分間にわたって５〜９５％の直線勾配のＢ（Ａ：０．０２％ギ酸／水；Ｂ：０．０２％ギ酸／ＭｅＣＮ）を用いて、６０℃にて、ゾルバックス（Zorbax）３００ＳＢ−Ｃ１８カラム（３．５μｍ４．６×１５０ｎｍ）を用いてフィニガン（Finnigan）ＬＣＱ検出器に連結されたアギレント（Agilent）１１００でＬＣ／ＭＳにより分析した。
【０１３１】
表１に示すように、純（＞９０％）物質を含有する画分を組み合わせ、凍結乾燥して、白色粉末としてペプチドを得た。２１５ｎｍにおける吸収を測定し、参照ペプチド配列番号３４：（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）１０（ベンダー：ペプチド・インターナショナル（Peptides International））に対して測定した吸光計数（ε＝６．５×１０４Ｍ−１ｃｍ−１）を用いてペプチド含量を決定した。計算及び実測ＭＳ値を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Ｍ＋Ｎａ）＋を用いて決定した。
【表２】
0005566885.tif 000004
【０１３２】
ＣＲＰ分析
ＣＤ分光法：配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７を有するＣＲＰの溶液、並びに配列番号２８を有する参照ポリペプチドの溶液（水中０．２５ｍＭ及び０．０１３ｍＭ）を４℃に２４時間保管し、３重らせん体形成を監視した。１００ｎｍ／分のスキャン速度で、１０又は２０回のスキャンの平均の信号により、路長０．１ｃｍのセルを用いて、ジャスコ（Jasco）Ｊ−７１０機器で２５℃にてＣＤスペクトルを測定した。ペルチェ温度制御システムを装備するＡｖｉｖ  ２１５分光計で、ＣＤ融解曲線を得た。２２５ｎｍにおける楕円率を、２０〜１００℃、速度１℃／分、増分３℃、平衡時間５分及び路長０．１ｃｍで監視した。
【０１３３】
２５℃における３つのＣＲＰ（水中０．２５ｍＭ）のＣＤスペクトルは、コラーゲン３重らせんに特徴的な２２５ｎｍ（θｍａｘ）バンドを示した。配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７を有するＣＲＰにより形成される３重らせんの熱安定性もまた、２０〜１００℃、増分３℃及び平衡時間５分で、２２５ｎｍにおける楕円率を監視することにより比較研究した。３つのＣＲＰの融解温度は、非常に類似しており（５６〜５９℃の範囲で）、これは、Ｎ−末端の構造的差とは独立に、全て安定な３量体を形成したことを示す。
【０１３４】
（実施例３）
配列番号３１：Ｆ５Ｐｈｅ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）９−Ｐｈｅ
配列番号３２：Ｐｈｅ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）９−Ｐｈｅ
配列番号３３：Ｌｅｕ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）９−Ｐｈｅ
以下でより詳細に説明するように、本発明のＣＲＰ  ３量体のモデル構造は、配列番号３０：（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）４−（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ａｌａ）−（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）５を有するコラーゲン様ポリペプチド３量体のＸ線構造から構築した（ベラ（Bella）Ｊ、イートン（Eaton）Ｍ、ブロツキー（Brodsky）Ｂ及びバーマン（Berman）ＨＭ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９４年、２６６巻、７５〜８１頁）。配列番号３０を有するコラーゲン様ポリペプチド３量体を突然変異させて、Ｎ−末端（Ｐｒｏの位置）にＦ５Ｐｈｅを、Ｃ−末端（Ｇｌｙの位置）にＰｈｅを組み込んで、配列番号３１を有するＣＲＰ（配列番号２５に類似するが、ＧＰＯ反復を１つ欠く）を得た。配列番号３２及び配列番号３３を有するポリペプチドを、それぞれ、Ｐｈｅ及びＬｅｕを用いて同様に調製した。
【０１３５】
計算機化学
配列番号３０を有するコラーゲン様ポリペプチドの結晶構造を、モデリングの起点として用いた。この構造は中央にアラニン残基を含んでいたため、まずその残基をグリシンに突然変異させた。式（Ｉ）のＢ及びＸ単位のそれぞれ１つを、次いで、配列番号３０を有する３重らせんの各鎖のＮ−末端及びＣ−末端に付加した。Ｃ−末端では、配列番号３０のＧｌｙをＰｈｅ（配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３）に置換した。Ｎ−末端では、Ｐｒｏ−Ｈｙｐセグメントを、単一のＦ５Ｐｈｅ（配列番号３１）、Ｐｈｅ（配列番号３２）及びＬｅｕ（配列番号３３）で置換した。
【０１３６】
配列の性質により、配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３を有するＣＲＰはそれぞれ１個以下（one less）のＧＰＯモチーフ反復を含んでいたが（配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７と比べて）、配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７の分子モデリングに好適であった。各ＣＲＰ  ３量体を、拘束された骨格鎖、ＯＰＬＳ−ＡＡ力場（ヨーアンセン（Jorgensen）ＷＬ及びチラド−ライブス（Tirado-Rives）Ｊ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９８８年、１１０巻、１６５７〜１６６６頁）、ＧＢ／ＳＡ水（キ（Qui）Ｄ、スヘンキン（Shenkin）ＰＳ、ホリンガー（Hollinger）ＦＰ及びスティル（Still）ＣＷ、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ａ．、１９９７年、１０１巻、３００５〜３０１４頁）、マクロモデル（Macromodel）９．０（マクロモデル９．０、２００５年、シュレーディンガー社（Schrodinger, Inc.,）、１５００  ＳＷファーストアベニュー（First Ave.）、Ｓｕｉｔｅ  １１８０、ポートランド（Portland）、オレゴン、９７２０１）を用いて、最小限化して、修飾によりもたらされる任意のひずみを弛緩させた。各ＣＲＰ  ３量体は、次いで、３量体の中心軸に沿って３量体単位の２つを整列させることにより、同じ配列のＣＲＰ  ３量体と対を形成した。この工程では、注意深く疎水性認識単位をおおまかに整列させた。
【０１３７】
配列番号３１、配列番号３２又は配列番号３３を有する整列したＣＲＰ  ３量体対のそれぞれは、自己集合及びＸＥＤ力場を用いる原線維増殖を評価し、ここで各整列した３量体対を＜０．０１ｒｍｓに最小限化される（束縛のない共役勾配；ハンター（Hunter）ＣＡ、サンダース（Sanders）ＪＫＭ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９０年、１１２巻、５５２５〜５５３４頁）；ビンター（Vinter）ＪＧ、Ｊ．Ｃｏｍｐ．−Ａｉｄ．Ｍｏｌ．Ｄｅｓｉｇｎ、１９９４年、８巻、６５３〜６６８頁；ビンター（Vinter）ＪＧ、Ｊ．Ｃｏｍｐ．−Ａｉｄ．Ｍｏｌ．Ｄｅｓｉｇｎ、１９９６年、１０巻、４１７〜４２６頁；並びにチェッサリー（Chessari）Ｇ、ハンター（Hunter）ＣＡ、ロー（Low）ＣＭＲ、パッカー（Packer）ＭＪ、ビンター（Vinter）ＪＧ及びゾンタ（Zonta）Ｃ、Ｃｈｅｍ  Ｅｕｒ．Ｊ．、２００２年、８巻、２８６０〜２８６７頁）。全てのカルボキシレート及びアンモニウムイオンは、溶媒和効果の一部を占める、完全充電の１／８で帯電していた。最小化後、２つの３重らせん単位間の相互作用エネルギー（ＩＥ）を計算し、クーロン力及びファンデルワールス成分の両方から成っていた。このエネルギーは、各３重らせん単位間の全ての分子内項を含んでいた。分子内項及び同じ３重らせん束の鎖間エネルギーは含まれなかった。認識要素のいくつかの組み合わせの結果を表２に要約する。
【０１３８】
配列番号３１を有する整列したＣＲＰ  ３量体対のモデル化界面エネルギーを（表２、項目１）に示す。３つの芳香環対は正面配向を採用し、１つの水素結合が界面に観察された。構造は、縁面配置の芳香族を再配向し、次いで再最小化することにより試験した（表２、項目２）。得られる界面構造は、類似の界面エネルギーで正面相互作用に戻った。配列番号３２を有するＣＲＰ  ３量体対の界面は、縁面（表２、項目３）又は変位し、角度を成した正面相互作用のいずれかを示した。配列番号３３を有するＣＲＰ  ３量体対の全体的な界面エネルギーはより低かった（表２、項目４）。
【表３】
0005566885.tif 000005
１配列番号３１のＰｈｅ−ペンタフルオロフェニルアラニン（体面配向で出発）モデル
２配列番号３１のＰｈｅ−ペンタフルオロフェニルアラニン（Ｔ字型配向を出発）モデル、対面配向へ戻るのを最低化
３縁縁配向に最低化する。
【０１３９】
表２に示すように、配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３を有するポリペプチドは、様々な程度に端端を組立ための構造的要件を有する。同じように、配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７を有するポリペプチドもまた、同様に端端を組み立てるために構造的要件を有してもよい。
【０１４０】
（実施例４）
血小板凝集研究
配列番号２５を有するＣＲＰの、コラーゲンの生物学的機能を模倣する能力を、ヒト血小板凝集アッセイで評価した。健常ボランティア由来のヒト多血小板血漿（ＰＲＰ）濃縮物を、バイオロジカル・スペシャリティーズ（Biological Specialties, Inc.）（コルマル、ペンシルバニア州）から購入した。ＰＲＰは５時間より古くなく、なぜなら２４時間のＰＲＰはコラーゲン及び配列番号２５を有するＣＲＰに対する反応がかなり弱まっていたためである。ＰＲＰは７３０ｇで１５分間遠心分離した。得られる血小板ペレットを１Ｕ／ｍＬアピラーゼ（等級Ｖ、シグマ・アルドリッチ（Sigma-Aldrich）を含有するＣＧＳ緩衝剤（１３ｍＭクエン酸ナトリウム、３０ｍＭグルコース、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で２回洗浄し、タイロード緩衝剤（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、０．７６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、５．５ｍＭデキストロース、５．０ｍＭヘペス、０．２％ＢＳＡ、ｐＨ７．４）に再懸濁した。「洗浄した」血小板を、３×１０８血小板／ｍＬに希釈し、使用前、＞４５分間３７℃で維持した。
【０１４１】
このアッセイでは、１０５μＬの洗浄した血小板、２ｍＭ  ＣａＣｌ２及び２．５ｍＭのフィブリノーゲンを９６ウェルマイクロタイタープレートに添加した。血小板凝集は、ネイティブなコラーゲン原線維（ウマＩ型；ヒトコラーゲン配列と９２％同一性；クロノ−ログ社（Chrono-log Corp.）、ハーバータウン（Havertown）、ペンシルバニア州）又は試験ペプチドの連続濃縮物の添加により開始した。緩衝剤を１式の対照ウェルに添加した。アッセイプレートを絶えず攪拌し、及び断続的にマイクロプレートリーダー（ソフトマックス（Softmax）、モレキュラーデバイス（Molecular Device）、メンロパーク（Menlo Park）、カリフォルニア州）に定置し、化合物溶液の添加後０及び５分で光学密度（６５０ｎｍ）を読み取った。凝集を時間−０及び５分の間の光学密度の減少として計算し、凝集の百分率として表した。
【０１４２】
血小板凝集研究のペプチド調製条件を表３に示す。ペプチドをＰＢＳ（ｐＨ７）又は水（最終ｐＨ５）に溶解させ、２ｍｇ／ｍＬに濃縮した。いくつかの試料を水浴（７０℃）で１０分間加熱し、０．４５−μｍのフィルタを通して濾過し、２４時間又は７日間、４℃でインキュベートした。濾過前後の２１５ｎｍにおけるＵＶ測定値は、ペプチドの損失がないことを示した。ＰＢＳ（ｐＨ７）又は水中の配列番号２５を有するＣＲＰのいくつかの試験溶液を２４時間又は７日間（４℃）でインキュベートし、他の試料を変性（Ｈ＋Ｆ）し、４℃で再アニールした。
【表４】
0005566885.tif 000006
＊Ｈ＋Ｆは７０℃１０分間加熱し、０．４５−μｍのフィルタを通して濾過することを表す。
【０１４３】
配列番号２５を有するＣＲＰの様々な溶液は、血小板凝集を誘発したが、短時間のインキュベート、「Ｈ＋Ｆ」サンプルが効力低下を示した。配列番号２５を有するＣＲＰ（未処理、ＰＢＳ中で７日間熟成）；ＥＣ５０＝０．３７μｇ／ｍＬ）は、ウマＩ型コラーゲン（ＥＣ５０＝０．２５μｇ／ｍＬ）とほぼ等効力であり、一方、配列番号３４：（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）１０を有する３０メルの参照ポリペプチドは血小板の凝集に失敗した。配列番号３４（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）１０のペプチドは、ペプチド・インターナショナル（Peptides International, Inc.）から購入した。
【０１４４】
これらの結果は、配列番号２５を有するＣＲＰ  ３量体が経時的に適切な長さ及び高次構造の凝集体に自己集合して、血小板認識のための構造的要件を満たすことができる（恐らく血小板コラーゲン受容体で）ことを示す。更に、非共有的な手段による、配列番号２５を有する短い（８−ｎｍ）のＣＲＰの、ＣＲＰ  ３量体への、次いでコラーゲン模倣特性を有するコラーゲン様原線維への自己集合が観察された。とりわけ、マイクロメートルの長さの、３重らせんを含む複合材原線維を、ＣＤ、ＤＬＳ及びＴＥＭデータにより決定されたように、形成した。また、配列番号２５を有するＣＲＰ  ３量体は、コラーゲンと同じように血小板凝集を誘発する能力を有する、機能的タンパク質様材料として作用した。式（Ｉ）のＣＲＰの芳香環−芳香環及び疎水性−疎水性認識モチーフは、コラーゲン模倣ペプチドの自己集合に対する直接的アプローチを提供し、生物学的に機能する原線維構造に集合することができるＣＲＰ  ３量体を提供する。
【０１４５】
（実施例５）
配列番号２５を有するＣＲＰ  ３量体により誘発される血小板凝集の阻害は、インテグリンＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ拮抗薬エラロフィバンを用いて得た（フックストラ（Hoekstra）ＷＪら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９９年、４２巻、５２５４〜５２６５頁）。配列番号２５を有するＣＲＰ  ３量体及びコラーゲンにより誘発される血小板凝集は、エラロフィバン、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤により阻害された。
【０１４６】
配列番号２５を有するＣＲＰ  ３量体及びコラーゲンの添加前に、５分間、洗浄した血小板を種々のエラロフィバン用量（１０、１００及び１０００ｎＭ）とともにインキュベートした。血小板凝集の用量依存性阻害が観察された。これらのデータは、コラーゲン並びに配列番号２５を有するＣＲＰ  ３量体が、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａシグナル伝達を引き起こすことにより、血小板凝集を活性化したことを示唆する。
【０１４７】
（実施例６）
コラーゲン又は配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８及び配列番号３４を有するＣＲＰ  ３量体により誘発される血小板凝集を、実施例４に記載の方法により実施した。本発明の実施形態に従って、図１は、配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７を有するＣＲＰ  ３量体が、種々の程度に血小板の凝集を刺激し、配列番号２５を有するＣＲＰ  ３量体及び配列番号２６を有するＣＲＰ  ３量体はより強力であることを示す。配列番号２８、配列番号３４及び配列番号３５を有する参照ポリペプチドは、血小板凝集の刺激については有効でなかった。コラーゲン並びに、配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７を有するＣＲＰ  ３量体について得られた図１のＥＣ５０値（±ＳＥＭ）（μｇ／ｍＬ）を表４に示す。
【表５】
0005566885.tif 000007
【０１４８】
（実施例７）
脾臓傷害モデルにおける、ＣＲＰコーティングされた及びＰＢＳ対照でコーティングされたＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体
工程Ａ．ＣＲＰの懸濁
試験懸濁液は、０．３３ｍｇＣＲＰ／ｍＬＰＢＳの濃度で、ｐＨ７．４を有するリン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）に、配列番号２５を有するＣＲＰを溶解させ、次いで懸濁液を７日間４℃でインキュベートすることにより調製した。
【０１４９】
工程Ｂ．ＰＣＬ／ＰＧＡ基材発泡体の調製
厚さ３ｍｍのポリ（ε−カプロラクトン−ｃｏ−グリコリド）（「ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体」）を、約５〜約−５℃の温度条件下で、約３時間、凍結乾燥機（ＦＴＳシステム、モデルＴＤ３Ｂ２Ｔ５１００）内で、１１．４ｃｍ×１１．４ｃｍ（４．５”×４．５”）アルミニウム型内の１，４−ジオキサン中の３５／６５（モル／モル）ＰＣＬ／ＰＧＡの３重量パーセント溶液、５０グラムを凍結乾燥することにより調製した。得られるＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体を型から取り出し、いくつかの５．１ｃｍ×５．１ｃｍ（２”×２”）の正方形に切断した。
【０１５０】
工程Ｃ．ポリペプチドコーティングされた発泡体の調製
上記工程Ｂに記載した手順に従って調製したＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体の正方形を、５．１ｃｍ×５．１ｃｍ（２”×２”）のアルミニウム型に入れた。均質になるまで、上記工程Ａに記載した手順に従って調製したＣＲＰ懸濁液を混合した後、７ｍＬの懸濁液を、次いで、発泡体の上面を実質的に覆うために、型に注いだ。型を、次いで、凍結乾燥機（ＦＴＳシステム、モデルＴＤ３Ｂ２Ｔ５１００）に入れ、−５０℃に予冷し、−２５℃で約４４時間凍結乾燥させた。
【０１５１】
工程Ｄ．ＰＢＳコーティングされた対照発泡体の調製
発泡体の上面を実質的に覆うために、上記工程Ｂに記載した手順に従って調製した厚さ３ｍｍのＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体を収容している５．１ｃｍ×５．１ｃｍ（２”×２”）の型に７ｍＬのＰＢＳを添加することにより、ＰＢＳコーティングされた発泡体を調製した。型を凍結乾燥機（ＦＴＳシステム、モデルＴＤ３Ｂ２Ｔ５１００）に入れ、−５０℃に予冷し、−２５℃で約４４時間凍結乾燥させた。
【０１５２】
ＣＲＰコーティングされた発泡体及びＰＢＳコーティングされた対照発泡体を、次いで、その後の試験のために、２ｃｍ×３ｃｍのいくつかの小片に切断した。
【０１５３】
脾臓傷害モデル
２つの線状裂傷（そのそれぞれが長さ１ｃｍ、深さ０．３ｃｍであった）を、ブタの脾臓に作製した。創傷を約３〜５秒間出血させた後、工程Ｃに従って生産したＣＲＰコーティングした発泡体片を、手で１つの創傷（試験群１）の表面に適用し、工程Ｄに従って調製したＰＢＳコーティングされた対照発泡体片を手により他の創傷（試験群２）の表面に適用した。同様の下向き圧力を、次いで、それぞれの試験部位に３０秒間適用した。コーティングされた発泡体片を取り除いた後、各それぞれの創傷を視覚的に評価して、止血が達成されたかどうかを決定した。必要に応じて、３０秒間の間隔で、それぞれ、同様の種類の清潔なコーティングされた発泡体片を用いて、各創傷に圧力を再適用した。各創傷について、止血を達成した時間、出血の停止を以下の表５に示す。
【表６】
0005566885.tif 000008
【０１５４】
結果は、ＣＲＰコーティングされた発泡体が、対照発泡体より短い時間で止血を達成するのに有用であることを示す。
【０１５５】
前述の明細書は、例示の目的で提供される実施例とともに、本発明の原理を教示するが、本発明の実施は、以下の特許請求の範囲及びその均等物内の有用な変形、改作、及び／又は修正の全てを包含することが理解されよう。同様に、全ての刊行物、特許出願、特許、及び上記明細書に開示した他の参照文献は、その全文を参考として、あらゆる目的のために本明細書に組み込むものとする。
【０１５６】
〔実施態様〕
（１）  組成物であって、
式（Ｉ）
Ｂ−（Ｚ）ｍ−Ｘ
（式中、
Ｚは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ、Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ及びＪ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏから成る群から選択され、
Ｊは、Ｈｙｐ、ｆＰｒｏ、ｍＰｒｏ及びＰｒｏから成る群から選択され、
ｍは８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５から選択される整数であり、
Ｂ及びＸは、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換された）、Ｔｙｒ、３，４−（ＯＨ）２−Ｐｈｅ、ＭｅＯ−Ｔｙｒ、フェニルグリシン、２−ナフチル−Ａｌａ、１−ナフチル−Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｃｈａ、Ｃｈｇ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌから成る群から独立して選択される）
のコラーゲン関連ペプチドから構成され、
発泡体、粉末、繊維又はフィルムの形態である、組成物。
（２）  複数の前記コラーゲン関連ペプチドを更に含み、前記コラーゲン関連ペプチドが、複数のコラーゲン関連ペプチド３量体の形で存在する、実施態様１に記載の組成物。
（３）  前記コラーゲン関連ペプチド３量体がホモ３量体である、実施態様２に記載の組成物。
（４）  前記コラーゲン関連ペプチド３量体がヘテロ３量体である、実施態様２に記載の組成物。
（５）  前記組成物が発泡体の形態であり、前記発泡体の総乾燥重量に基づいて、約０．１パーセント〜約１５パーセントの可塑剤を更に含む、実施態様１に記載の組成物。
（６）  前記可塑剤が、グリセロール、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、グリセロールのモノアセテート、グリセロールのジアセテート、グリセロールのトリアセテート及びこれらの混合物から成る群から選択される、実施態様５に記載の組成物。
（７）  前記組成物が、約０．５ｍｍ〜約１０ｍｍの厚さを有する発泡体の形態である、実施態様１に記載の組成物。
（８）  前記組成物が、約１マイクロメートル〜約５００マイクロメートルの孔径を有する発泡体の形態である、実施態様１に記載の組成物。
（９）  前記組成物が、約５０マイクロメートル〜約１５０マイクロメートルの厚さを有するフィルムの形態である、実施態様１に記載の組成物。
（１０）  前記組成物が粉末の形態であり、前記粉末が約１マイクロメートル〜約２０００マイクロメートルの粒径を有する、実施態様１に記載の組成物。
【０１５７】
（１１）  多糖類、マンニトール、多孔質溶岩、ポリエステル、並びにこれらのコポリマー及び混合物から選択される担体を更に含む、実施態様１０に記載の組成物。
（１２）  前記多糖類が、デンプン、ペクチン、セルロース、アルキル基が約１〜約７個の炭素原子を有するアルキルセルロース、アルキル基が約１〜約７個の炭素原子を有するアルキルヒドロキシアルキルセルロース、アルキル基が約１〜約７個の炭素原子を有するヒドロキシアルキルセルロース、硫酸セルロース、カルボキシメチルセルロースの塩、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、キチン、カルボキシメチルキチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の塩、アルギネート、架橋アルギネート、アルギン酸、プロピレングリコールアルギネート、グリコーゲン、デキストラン、硫酸デキストラン、カードラン、ペクチン、プルラン、キサンタン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルキトサン、キトサン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヘパラン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、カラギーナン、キトサン、デンプン、アミロース、アミロペクチン、ポリ−Ｎ−グルコサミン、ポリマンヌロン酸、ポリグルクロン酸、並びにこれらのコポリマー及び混合物から成る群から選択される、実施態様１１に記載の組成物。
（１３）  止血の促進を必要とする個体において止血を促進する方法であって、
実施態様１に記載の組成物を、前記個体の少なくとも１つの出血部位に適用することから構成される、方法。
（１４）  組成物であって、
（ａ）式（Ｉ）
Ｂ−（Ｚ）ｍ−Ｘ
（式中、
Ｚは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ、Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ及びＪ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏから成る群から選択され、
Ｊは、Ｈｙｐ、ｆＰｒｏ、ｍＰｒｏ及びＰｒｏから成る群から選択され、
ｍは８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５から選択される整数であり、
Ｂ及びＸは、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換された）、Ｔｙｒ、３，４−（ＯＨ）２−Ｐｈｅ、ＭｅＯ−Ｔｙｒ、フェニルグリシン、２−ナフチル−Ａｌａ、１−ナフチル−Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｃｈａ、Ｃｈｇ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌから成る群から独立して選択される）
のコラーゲン関連ペプチドと、
（ｂ）基材と、
から構成される、組成物。
（１５）  複数の前記コラーゲン関連ペプチドを更に含み、前記コラーゲン関連ペプチドが複数のコラーゲン関連ペプチド３量体の形で存在する、実施態様１４に記載の組成物。
（１６）  前記コラーゲン関連ペプチド３量体がホモ３量体である、実施態様１５に記載の組成物。
（１７）  前記コラーゲン関連ペプチド３量体がヘテロ３量体である、実施態様１５に記載の組成物。
（１８）  前記基材が人体に植え込むのに好適である、実施態様１４に記載の組成物。
（１９）  前記基材が、縫合アンカー、縫合糸、止め金、手術用鋲、クリップ、プレート、ねじ、フィルム；組織工学スカフォールド；発泡体又は粉末である、実施態様１８に記載の組成物。
（２０）  前記基材が、脂肪族ポリエステル、ポリ（アミノ酸）、コポリ（エーテル−エステル）、アルキル基が約１〜約１０個の炭素原子を有するポリアルキレンオキザラート、ポリアミド、チロシン由来ポリカーボネート、ポリ（イミノカーボネート）、ポリオルトエステル、ポリオキサエステル、ポリアミドエステル、アミン基を含有するポリオキシエステル、ポリ（無水物）、ポリホスファゼン、コラーゲン、エラスチン、ゼラチン、多糖類、並びにこれらのコポリマー及びブレンドから成る群から選択されるポリマーから構成される、実施態様１４に記載の組成物。
【０１５８】
（２１）  前記基材が、木綿、亜麻布、絹、ナイロン、ポリエステル、フルオロポリマー、ポリオレフィン、ポリウレタン、並びにこれらのコポリマー及び組み合わせから成る群から選択される材料から構成される、実施態様１４に記載の組成物。
（２２）  前記基材が人体に植え込まれない基材である、実施態様１４に記載の組成物。
（２３）  前記基材が、包帯、接着ガーゼ包帯、創傷被覆材である、実施態様２２に記載の組成物。
（２４）  前記コラーゲン関連ペプチドが、前記基材の総表面積に基づいて、約０．０１ｍｇ／ｃｍ２〜約１ｍｇ／ｃｍ２の量で前記組成物中に存在する、実施態様１４に記載の組成物。
（２５）  前記コラーゲン関連ペプチドが、前記基材の総表面積に基づいて、約０．１ｍｇ／ｃｍ２〜約０．５ｍｇ／ｃｍ２の量で前記組成物中に存在する、実施態様１４に記載の組成物。
（２６）  前記基材が、ε−カプロラクトン及びグリコリドのコポリマーから構成される発泡体である、実施態様１４に記載の組成物。
（２７）  止血の促進を必要とする個体において止血を促進する方法であって、
実施態様１４に記載の組成物を、前記個体の出血部位に適用することから構成される、方法。
（２８）  止血の促進を必要とする個体において止血を促進する方法であって、
実施態様２６に記載の組成物を、前記個体の出血部位に適用することから構成される、方法。
（２９）  ゲルであって、
ａ）式（Ｉ）
Ｂ−（Ｚ）ｍ−Ｘ
（式中、
Ｚは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ、Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ及びＪ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏから成る群から選択され、
Ｊは、Ｈｙｐ、ｆＰｒｏ、ｍＰｒｏ及びＰｒｏから成る群から選択され、
ｍは８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５から選択される整数であり、
Ｂ及びＸは、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換された）、Ｔｙｒ、３，４−（ＯＨ）２−Ｐｈｅ、ＭｅＯ−Ｔｙｒ、フェニルグリシン、２−ナフチル−Ａｌａ、１−ナフチル−Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｃｈａ、Ｃｈｇ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌから成る群から独立して選択される）
のコラーゲン関連ペプチドと、
ｂ）ゲル化剤と、
から構成され、前記コラーゲン関連ペプチドが、前記ゲルの総重量に基づいて、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの量で前記ゲル中に存在する、ゲル。
（３０）  複数の前記コラーゲン関連ペプチドを更に含み、前記コラーゲン関連ペプチドが複数のコラーゲン関連ペプチド３量体の形で存在する、実施態様２９に記載の組成物。
【０１５９】
（３１）  前記コラーゲン関連ペプチド３量体がホモ３量体である、実施態様３０に記載の組成物。
（３２）  前記コラーゲン関連ペプチド３量体がヘテロ３量体である、実施態様３０に記載の組成物。
（３３）  止血の促進を必要とする個体において止血を促進する方法であって、
実施態様２９に記載のゲルを、前記個体の出血部位に適用することから構成される、方法。
（３４）  組成物であって、
ａ）式（Ｉ）
Ｂ−（Ｚ）ｍ−Ｘ
（式中、
Ｚは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ、Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ及びＪ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏから成る群から選択され、
Ｊは、Ｈｙｐ、ｆＰｒｏ、ｍＰｒｏ及びＰｒｏから成る群から選択され、
ｍは８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５から選択される整数であり、
Ｂ及びＸは、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換された）、Ｔｙｒ、３，４−（ＯＨ）２−Ｐｈｅ、ＭｅＯ−Ｔｙｒ、フェニルグリシン、２−ナフチル−Ａｌａ、１−ナフチル−Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｃｈａ、Ｃｈｇ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌから成る群から独立して選択される）
のコラーゲン関連ペプチドと、
ｂ）少なくとも１種の賦形剤と、
から構成される、組成物。
（３５）  実施態様１に記載の組成物から構成される医療用デバイス。
（３６）  実施態様１４に記載の組成物から構成される医療用デバイス。
（３７）  実施態様２９に記載の組成物から構成される医療用デバイス。
（３８）  実施態様３４に記載の組成物から構成される医療用デバイス。
（３９）  出血性障害の治療を必要とする個体において出血性障害を治療する方法であって、
前記個体の所望の部位で血小板凝集を開始させるのに有効な量で、式（Ｉ）
Ｂ−（Ｚ）ｍ−Ｘ
（式中、
Ｚは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ、Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ及びＪ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏから成る群から選択され、
Ｊは、Ｈｙｐ、ｆＰｒｏ、ｍＰｒｏ及びＰｒｏから成る群から選択され、
ｍは８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５から選択される整数であり、
Ｂ及びＸは、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換された）、Ｔｙｒ、３，４−（ＯＨ）２−Ｐｈｅ、ＭｅＯ−Ｔｙｒ、フェニルグリシン、２−ナフチル−Ａｌａ、１−ナフチル−Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｃｈａ、Ｃｈｇ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌから成る群から独立して選択される）
のコラーゲン関連ペプチドを用いることを含む、方法。
（４０）  出血性障害の診断を必要とする個体において出血性障害を診断する方法であって、
（ａ）式（Ｉ）
Ｂ−（Ｚ）ｍ−Ｘ
（式中、
Ｚは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ、Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ及びＪ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏから成る群から選択され、
Ｊは、Ｈｙｐ、ｆＰｒｏ、ｍＰｒｏ及びＰｒｏから成る群から選択され、
ｍは８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５から選択される整数であり、
Ｂ及びＸは、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換された）、Ｔｙｒ、３，４−（ＯＨ）２−Ｐｈｅ、ＭｅＯ−Ｔｙｒ、フェニルグリシン、２−ナフチル−Ａｌａ、１−ナフチル−Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｃｈａ、Ｃｈｇ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌから成る群から独立して選択される）
のコラーゲン関連ペプチドを、前記個体からの血小板を含有する血液又は血漿と組み合わせて、混合物を形成することと、
（ｂ）前記混合物中の血小板凝集を評価するために、前記混合物を血小板凝集計に添加することと、
を含む、方法。
【０１６０】
（４１）  組成物であって、
（ａ）式（Ｉ）
Ｂ−（Ｚ）ｍ−Ｘ
（式中、
Ｚは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ、Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ及びＪ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏから成る群から選択され、
Ｊは、Ｈｙｐ、ｆＰｒｏ、ｍＰｒｏ及びＰｒｏから成る群から選択され、
ｍは８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５から選択される整数であり、
Ｂ及びＸは、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換された）、Ｔｙｒ、３，４−（ＯＨ）２−Ｐｈｅ、ＭｅＯ−Ｔｙｒ、フェニルグリシン、２−ナフチル−Ａｌａ、１−ナフチル−Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｃｈａ、Ｃｈｇ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌから成る群から独立して選択される）
のコラーゲン関連ペプチドと、
（ｂ）製薬的活性物質と、
から構成される、組成物。
（４２）  前記製薬的活性物質が、止血剤、抗感染剤、鎮痛剤、抗炎症剤、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、実施態様４１に記載の組成物。
（４３）  前記止血剤が、トロンビン、フィブリノーゲン、ＡＤＰ、ＡＴＰ、カルシウム、マグネシウム、ＴＸＡ２、セロトニン、エピネフリン、血小板因子４、第Ｖ因子、第ＥＩ因子、ＰＡＩ−１、トロンボスポンジン及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、実施態様４２に記載の組成物。
（４４）  前記抗感染剤が、抗体、抗原、抗生物質、抗ウイルス剤及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、実施態様４２に記載の組成物。
（４５）  前記抗炎症剤が抗ヒスタミン剤である、実施態様４２に記載の組成物。
（４６）  組成物であって、
式（Ｉ）
Ｂ−（Ｚ）ｍ−Ｘ
（式中、
Ｚは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ、Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ及びＪ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏから成る群から選択され、
Ｊは、Ｈｙｐ、ｆＰｒｏ、ｍＰｒｏ及びＰｒｏから成る群から選択され、
ｍは８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５から選択される整数であり、
Ｂ及びＸは、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換された）、Ｔｙｒ、３，４−（ＯＨ）２−Ｐｈｅ、ＭｅＯ−Ｔｙｒ、フェニルグリシン、２−ナフチル−Ａｌａ、１−ナフチル−Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｃｈａ、Ｃｈｇ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌから成る群から独立して選択される）
のコラーゲン関連ペプチドを追加した、化学的に定義された３次元ポリマーマトリックス、を含む、組成物。
【０１５７】
（１１）  多糖類、マンニトール、多孔質溶岩、ポリエステル、並びにこれらのコポリマー及び混合物から選択される担体を更に含む、実施態様１０に記載の組成物。
（１２）  前記多糖類が、デンプン、ペクチン、セルロース、アルキル基が約１〜約７個の炭素原子を有するアルキルセルロース、アルキル基が約１〜約７個の炭素原子を有するアルキルヒドロキシアルキルセルロース、アルキル基が約１〜約７個の炭素原子を有するヒドロキシアルキルセルロース、硫酸セルロース、カルボキシメチルセルロースの塩、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、キチン、カルボキシメチルキチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の塩、アルギネート、架橋アルギネート、アルギン酸、プロピレングリコールアルギネート、グリコーゲン、デキストラン、硫酸デキストラン、カードラン、ペクチン、プルラン、キサンタン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルキトサン、キトサン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、カラギーナン、キトサン、デンプン、アミロース、アミロペクチン、ポリ−Ｎ−グルコサミン、ポリマンヌロン酸、ポリグルクロン酸、並びにこれらのコポリマー及び混合物から成る群から選択される、実施態様１１に記載の組成物。
（１３）  止血の促進を必要とする個体において止血を促進する方法であって、
実施態様１に記載の組成物を、前記個体の少なくとも１つの出血部位に適用することから構成される、方法。
（１４）  組成物であって、
（ａ）式（Ｉ）
Ｂ−（Ｚ）ｍ−Ｘ
（式中、
Ｚは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ、Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ及びＪ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏから成る群から選択され、
Ｊは、Ｈｙｐ、ｆＰｒｏ、ｍＰｒｏ及びＰｒｏから成る群から選択され、
ｍは８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５から選択される整数であり、
Ｂ及びＸは、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換された）、Ｔｙｒ、３，４−（ＯＨ）２−Ｐｈｅ、ＭｅＯ−Ｔｙｒ、フェニルグリシン、２−ナフチル−Ａｌａ、１−ナフチル−Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｃｈａ、Ｃｈｇ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌから成る群から独立して選択される）
のコラーゲン関連ペプチドと、
（ｂ）基材と、
から構成される、組成物。
（１５）  複数の前記コラーゲン関連ペプチドを更に含み、前記コラーゲン関連ペプチドが複数のコラーゲン関連ペプチド３量体の形で存在する、実施態様１４に記載の組成物。
（１６）  前記コラーゲン関連ペプチド３量体がホモ３量体である、実施態様１５に記載の組成物。
（１７）  前記コラーゲン関連ペプチド３量体がヘテロ３量体である、実施態様１５に記載の組成物。
（１８）  前記基材が人体に植え込むのに好適である、実施態様１４に記載の組成物。
（１９）  前記基材が、縫合アンカー、縫合糸、止め金、手術用鋲、クリップ、プレート、ねじ、フィルム；組織工学スカフォールド；発泡体又は粉末である、実施態様１８に記載の組成物。
（２０）  前記基材が、脂肪族ポリエステル、ポリ（アミノ酸）、コポリ（エーテル−エステル）、アルキル基が約１〜約１０個の炭素原子を有するポリアルキレンオキザラート、ポリアミド、チロシン由来ポリカーボネート、ポリ（イミノカーボネート）、ポリオルトエステル、ポリオキサエステル、ポリアミドエステル、アミン基を含有するポリオキシエステル、ポリ（無水物）、ポリホスファゼン、コラーゲン、エラスチン、ゼラチン、多糖類、並びにこれらのコポリマー及びブレンドから成る群から選択されるポリマーから構成される、実施態様１４に記載の組成物。
【０１５８】
（２１）  前記基材が、木綿、亜麻布、絹、ナイロン、ポリエステル、フルオロポリマー、ポリオレフィン、ポリウレタン、並びにこれらのコポリマー及び組み合わせから成る群から選択される材料から構成される、実施態様１４に記載の組成物。
（２２）  前記基材が人体に植え込まれない基材である、実施態様１４に記載の組成物。
（２３）  前記基材が、包帯、接着ガーゼ包帯、創傷被覆材である、実施態様２２に記載の組成物。
（２４）  前記コラーゲン関連ペプチドが、前記基材の総表面積に基づいて、約０．０１ｍｇ／ｃｍ２〜約１ｍｇ／ｃｍ２の量で前記組成物中に存在する、実施態様１４に記載の組成物。
（２５）  前記コラーゲン関連ペプチドが、前記基材の総表面積に基づいて、約０．１ｍｇ／ｃｍ２〜約０．５ｍｇ／ｃｍ２の量で前記組成物中に存在する、実施態様１４に記載の組成物。
（２６）  前記基材が、ε−カプロラクトン及びグリコリドのコポリマーから構成される発泡体である、実施態様１４に記載の組成物。
（２７）  止血の促進を必要とする個体において止血を促進する方法であって、
実施態様１４に記載の組成物を、前記個体の出血部位に適用することから構成される、方法。
（２８）  止血の促進を必要とする個体において止血を促進する方法であって、
実施態様２６に記載の組成物を、前記個体の出血部位に適用することから構成される、方法。
（２９）  ゲルであって、
ａ）式（Ｉ）
Ｂ−（Ｚ）ｍ−Ｘ
（式中、
Ｚは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ、Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ及びＪ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏから成る群から選択され、
Ｊは、Ｈｙｐ、ｆＰｒｏ、ｍＰｒｏ及びＰｒｏから成る群から選択され、
ｍは８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５から選択される整数であり、
Ｂ及びＸは、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換された）、Ｔｙｒ、３，４−（ＯＨ）２−Ｐｈｅ、ＭｅＯ−Ｔｙｒ、フェニルグリシン、２−ナフチル−Ａｌａ、１−ナフチル−Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｃｈａ、Ｃｈｇ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌから成る群から独立して選択される）
のコラーゲン関連ペプチドと、
ｂ）ゲル化剤と、
から構成され、前記コラーゲン関連ペプチドが、前記ゲルの総重量に基づいて、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの量で前記ゲル中に存在する、ゲル。
（３０）  複数の前記コラーゲン関連ペプチドを更に含み、前記コラーゲン関連ペプチドが複数のコラーゲン関連ペプチド３量体の形で存在する、実施態様２９に記載の組成物。
【０１５９】
（３１）  前記コラーゲン関連ペプチド３量体がホモ３量体である、実施態様３０に記載の組成物。
（３２）  前記コラーゲン関連ペプチド３量体がヘテロ３量体である、実施態様３０に記載の組成物。
（３３）  止血の促進を必要とする個体において止血を促進する方法であって、
実施態様２９に記載のゲルを、前記個体の出血部位に適用することから構成される、方法。
（３４）  組成物であって、
ａ）式（Ｉ）
Ｂ−（Ｚ）ｍ−Ｘ
（式中、
Ｚは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ、Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ及びＪ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏから成る群から選択され、
Ｊは、Ｈｙｐ、ｆＰｒｏ、ｍＰｒｏ及びＰｒｏから成る群から選択され、
ｍは８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５から選択される整数であり、
Ｂ及びＸは、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換された）、Ｔｙｒ、３，４−（ＯＨ）２−Ｐｈｅ、ＭｅＯ−Ｔｙｒ、フェニルグリシン、２−ナフチル−Ａｌａ、１−ナフチル−Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｃｈａ、Ｃｈｇ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌから成る群から独立して選択される）
のコラーゲン関連ペプチドと、
ｂ）少なくとも１種の賦形剤と、
から構成される、組成物。
（３５）  実施態様１に記載の組成物から構成される医療用デバイス。
（３６）  実施態様１４に記載の組成物から構成される医療用デバイス。
（３７）  実施態様２９に記載の組成物から構成される医療用デバイス。
（３８）  実施態様３４に記載の組成物から構成される医療用デバイス。
（３９）  出血性障害の治療を必要とする個体において出血性障害を治療する方法であって、
前記個体の所望の部位で血小板凝集を開始させるのに有効な量で、式（Ｉ）
Ｂ−（Ｚ）ｍ−Ｘ
（式中、
Ｚは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ、Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ及びＪ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏから成る群から選択され、
Ｊは、Ｈｙｐ、ｆＰｒｏ、ｍＰｒｏ及びＰｒｏから成る群から選択され、
ｍは８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５から選択される整数であり、
Ｂ及びＸは、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換された）、Ｔｙｒ、３，４−（ＯＨ）２−Ｐｈｅ、ＭｅＯ−Ｔｙｒ、フェニルグリシン、２−ナフチル−Ａｌａ、１−ナフチル−Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｃｈａ、Ｃｈｇ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌから成る群から独立して選択される）
のコラーゲン関連ペプチドを用いることを含む、方法。
（４０）  出血性障害の診断を必要とする個体において出血性障害を診断する方法であって、
（ａ）式（Ｉ）
Ｂ−（Ｚ）ｍ−Ｘ
（式中、
Ｚは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ、Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ及びＪ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏから成る群から選択され、
Ｊは、Ｈｙｐ、ｆＰｒｏ、ｍＰｒｏ及びＰｒｏから成る群から選択され、
ｍは８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５から選択される整数であり、
Ｂ及びＸは、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換された）、Ｔｙｒ、３，４−（ＯＨ）２−Ｐｈｅ、ＭｅＯ−Ｔｙｒ、フェニルグリシン、２−ナフチル−Ａｌａ、１−ナフチル−Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｃｈａ、Ｃｈｇ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌから成る群から独立して選択される）
のコラーゲン関連ペプチドを、前記個体からの血小板を含有する血液又は血漿と組み合わせて、混合物を形成することと、
（ｂ）前記混合物中の血小板凝集を評価するために、前記混合物を血小板凝集計に添加することと、
を含む、方法。
【０１６０】
（４１）  組成物であって、
（ａ）式（Ｉ）
Ｂ−（Ｚ）ｍ−Ｘ
（式中、
Ｚは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ、Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ及びＪ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏから成る群から選択され、
Ｊは、Ｈｙｐ、ｆＰｒｏ、ｍＰｒｏ及びＰｒｏから成る群から選択され、
ｍは８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５から選択される整数であり、
Ｂ及びＸは、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換された）、Ｔｙｒ、３，４−（ＯＨ）２−Ｐｈｅ、ＭｅＯ−Ｔｙｒ、フェニルグリシン、２−ナフチル−Ａｌａ、１−ナフチル−Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｃｈａ、Ｃｈｇ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌから成る群から独立して選択される）
のコラーゲン関連ペプチドと、
（ｂ）製薬的活性物質と、
から構成される、組成物。
（４２）  前記製薬的活性物質が、止血剤、抗感染剤、鎮痛剤、抗炎症剤、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、実施態様４１に記載の組成物。
（４３）  前記止血剤が、トロンビン、フィブリノーゲン、ＡＤＰ、ＡＴＰ、カルシウム、マグネシウム、ＴＸＡ２、セロトニン、エピネフリン、血小板因子４、第Ｖ因子、第ＥＩ因子、ＰＡＩ−１、トロンボスポンジン及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、実施態様４２に記載の組成物。
（４４）  前記抗感染剤が、抗体、抗原、抗生物質、抗ウイルス剤及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、実施態様４２に記載の組成物。
（４５）  前記抗炎症剤が抗ヒスタミン剤である、実施態様４２に記載の組成物。
（４６）  組成物であって、
式（Ｉ）
Ｂ−（Ｚ）ｍ−Ｘ
（式中、
Ｚは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｊ、Ｐｒｏ−Ｊ−Ｇｌｙ及びＪ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏから成る群から選択され、
Ｊは、Ｈｙｐ、ｆＰｒｏ、ｍＰｒｏ及びＰｒｏから成る群から選択され、
ｍは８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５から選択される整数であり、
Ｂ及びＸは、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はＣＦ３が１置換又は２置換された）、Ｔｙｒ、３，４−（ＯＨ）２−Ｐｈｅ、ＭｅＯ−Ｔｙｒ、フェニルグリシン、２−ナフチル−Ａｌａ、１−ナフチル−Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｃｈａ、Ｃｈｇ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌから成る群から独立して選択される）
のコラーゲン関連ペプチドを追加した、化学的に定義された３次元ポリマーマトリックス、を含む、組成物。
【図１】
0005566885.tif 000009
【配列表】
0005566885000001.app