(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
判定対象から得られたＤＮＡにおけるＡＢＣＣ６遺伝子を解析し、そのバリアントが、次の１）〜４）のいずれかである場合に、網膜色素線条症と判定する方法。
１）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン１０に位置する４１９番目のアミノ酸がＲ（アルギニン）からＱ（グルタミン）に変わる変異又はエキソン１０に位置する１２５６番目の塩基（以下、いずれもスタートコドンのＡＴＧのＡを１番目とした）がＧからＡに変わる変異
２）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン１０に位置する４２２番目のアミノ酸がＥ（グルタミン酸）からＫ（リジン）に変わる変異又はエキソン１０に位置する１２６４番目の塩基がＧからＡに変わる変異
３）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン２７に位置する３７７４番目と３７７５番目の塩基の間の場所に１個新たなＣという塩基が挿入（インサーション）されてフレームシフトが起こる変異
４）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン３０に位置する１４２７番目のアミノ酸がＥ（グルタミン酸）からＫ（リジン）に変わる変異又はエキソン３０に位置する４２７９番目の塩基がＧからＡに変わる変異
【請求項２】
さらに、ＡＢＣＣ６遺伝子を解析し、そのバリアントが、次の１）または２）である場合に、網膜色素線条症と判定する請求項１に記載の方法。
１）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン１９に位置する２５４２番目の塩基であるＧが欠失し、フレームシフトが起こる変異
２）ＡＢＣＣ６遺伝子のイントロン２２の５’端から６２０番目の塩基対からイントロン２３の４９３番目の塩基対までの３８９７塩基対が欠失する変異
【請求項３】
ＡＢＣＣ６遺伝子を解析し、そのバリアントを認識するためのオリゴヌクレオチドであって、次の１）〜５）のいずれかであるオリゴヌクレオチドをプローブとして有するマイクロアレイを用いて、判定対象から得られたＤＮＡにおけるＡＢＣＣ６遺伝子を解析する、請求項１または２に記載の方法。
１）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン１０に位置する１２５６番目の塩基がＡである塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド
２）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン１０に位置する１２６４番目の塩基がＡである塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド
３）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン１９に位置する２５４２番目の塩基であるＧが欠失した塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド
４）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン２７に位置する３７７４番目と３７７５番目の塩基の間の場所に１個新たなＣという塩基が挿入された塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド
５）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン３０に位置する４２７９番目の塩基がＡである塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド
【請求項４】
ＡＢＣＣ６遺伝子のバリアントが、エキソン２３の欠落であり、そのバリアントを認識するための次の１）〜３）のいずれかであるオリゴヌクレオチドをＷＴ＿エキソン２３検出用プライマー又はＤＥＬ＿エキソン２３検出用プライマーとして用いて、判定対象から得られたＤＮＡにおけるＡＢＣＣ６遺伝子を解析する、請求項１または２に記載の方法。
１）配列表配列番号１６に記載のオリゴヌクレオチド
２）配列表配列番号１７に記載のオリゴヌクレオチド
３）配列表配列番号１８に記載のオリゴヌクレオチド
【請求項５】
判定対象がアジア人である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は網膜色素線条症（Ａｎｇｉｏｉｄ  ｓｔｒｅａｋｓ；以下ＡＳとする）の判定方法に関する。さらに詳しくは、ＡＢＣＣ６遺伝子のバリアントを調べることによるＡＳの判定方法に関する。また、この判定方法に用いられる網膜色素線条症判定キットやこれに用いられるオリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＳは色素線条と呼ばれるブルッフ膜の弾力線維の断裂を生じる疾患であり、ＡＳの症状の進行によって脈絡膜新生血管（ｃｈｏｒｏｉｄａｌ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ；ＣＮＶ）が発生すると、高度の視力低下を起こすことが知られている。この発生を避けるべく、ＡＳの早期発見、早期治療が望まれているが、ＡＳは原因不明であるため、従来は発症後に眼底検査や造影検査で判定することしかできず、患者の負担が重いという問題があった。また、軽症のＡＳは無症状であることが多く、通常は眼底検査を受けることがないため、早期発見は困難であった。
【０００３】
ＡＳ患者は皮膚疾患である弾力線維性仮性黄色腫（Ｐｓｅｕｄｏｘａｎｔｈｏｍａ  ｅｌａｓｔｉｃｕｍ；以下ＰＸＥとする）を高頻度で合併することが知られている（例えば、非特許文献１、参照）。そして、ＰＸＥの原因遺伝子として、染色体１６ｐ１３．１に存在するＡＢＣＣ６遺伝子が報告されている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００４】
そこで、本発明者らはＡＳ患者とＡＢＣＣ６遺伝子変異の関係をＣａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｔｕｄｙによって調べたところ、ｒｓ２２３９３２４、ｒｓ２１２６２０、ｒｓ２２３８４７０、ｒｓ２２３８４７２、ｒｓ２１２０９７と名付けた５個の一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：以下、ＳＮＰとする）において、顕著な有意差を示すことを確認した。
さらに、ｒｓ２２３８４７２を除くこれらのＳＮＰについてのハプロタイプを用いたＣａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｔｕｄｙにおいても全体の有意差がｐ＜０．０００１と有意であったことから、ＡＢＣＣ６遺伝子がＡＳ原因遺伝子であるとの予測を発表している。
このうち、最も頻度の多いハプロタイプを含めて、この４つのハプロタイプがＡＳ群に占める割合は８８．９％であり、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に占める割合は４４％であったことから、この４つのハプロタイプを持つＡＳサンプルについて塩基配列決定法にて変異検索をすることで、ＡＳ群のかなりの量の変異が予測できると考えられた（例えば、非特許文献３参照）。
【０００５】
しかし、このようなＳＮＰやハプロタイプを用いた関連解析（ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｔｕｄｙ）において単にそれらの頻度分布を統計的に処理し、有意差を出す作業のみでは確定的な判定ができない。すなわち、常染色体劣性遺伝形式の疾患を確定診断するためには、少なくとも変異をホモ接合体で持つ者がＣｏｎｔｒｏｌ群には存在しないことを確認するという作業が必要であり、実際、前記ＳＮＰやハプロタイプを用いた関連解析では原因ＳＮＰ等の特定は不可能であった。
従って、現段階において、発症前を含むＡＳの確定的な判定を高い確率で行う方法は得られておらず、臨床において有用なＡＳの判定方法の提供が望まれていた。
【非特許文献１】Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ＪＧ，Ａｌｔｍａｎ  ＲＤ．Ａｎｇｉｏｉｄ  ｓｔｒｅａｋｓ．  Ｓｕｒｖ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１９８２；２６：２３５−２４６．
【非特許文献２】Ｓｔｒｕｋ  Ｂ，Ｃａｉ  Ｌ，Ｚａｃｈ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２０００；７８：２８２−２８６．
【非特許文献３】水谷吉宏、中山智祥、浅井聰、湯沢美都子、島田宏之、日大医学雑誌、６１：３１４−３１８，２００２．９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＡＳの判定方法の提供を課題とする。さらに詳しくは、ＡＢＣＣ６遺伝子のバリアントを調べることによるＡＳの判定方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ＡＢＣＣ６遺伝子においてアミノ酸配列の変換又はフレームシフトを伴う複数のバリアント（ｐ.Ｒ４１９Ｑ、ｐ.Ｅ４２２Ｋ、ｃ.２５４２ｄｅｌＧ、エキソン２３の欠落、ｃ.３７７４−３７７５ｉｎｓＣ又はｐ.Ｅ１４２７Ｋ）を調べることで、ＡＳの判定を行うことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
これらのバリアントを用いる本発明の判定方法は、５９．３％という高い確率で発症前のＡＳの確定的な判定が可能であり、臨床における価値が極めて大きく有用である。また、判定対象において、ＡＳ患者のみ両染色体に変異が見られている「ｐ.Ｒ４１９Ｑ」、「ｐ.Ｅ４２２Ｋ」、「ｐ.Ｅ１４２７Ｋ」のバリアントのいずれかにおいて変異がホモでみつかれば、１００％に近い確率でＡＳの発症前判定が可能である。
さらに本発明者らはこれらのバリアントを認識するオリゴヌクレオチドを得て、これを有するＡＳ判定キットを得た。このキットを用いることにより、ＡＳの確定的な判定を容易に行うことができる。
【０００８】
すなわち、本発明は次の（１）〜（１４）の網膜色素線条症の判定方法、網膜色素線条症判定キット等に関する。
（１）判定対象におけるＡＢＣＣ６遺伝子のバリアントを調べる網膜色素線条症の判定方法。
（２）ＡＢＣＣ６遺伝子のバリアントが、ｐ.Ｒ４１９Ｑ、ｐ.Ｅ４２２Ｋ、ｃ.２５４２ｄｅｌＧ、ＤＥＬ＿エキソン２３、ｃ.３７７４−３７７５ｉｎｓＣ又はｐ.Ｅ１４２７Ｋの１以上である上記（１）に記載の網膜色素線条症の判定方法。
（３）ＡＢＣＣ６遺伝子のバリアントが、次の１）〜６）のいずれかである上記（１）又は（２）に記載の網膜色素線条症の判定方法、
１）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン１０に位置する４１９番目のアミノ酸がＲ（アルギニン）からＱ（グルタミン）に変わる変異又はエキソン１０に位置する１２５６番目（以下、いずれもスタートコドンのＡＴＧのＡを１番目とした）の塩基がＧからＡに変わる変異、
２）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン１０に位置する４２２番目のアミノ酸がＥ（グルタミン酸）からＫ（リジン）に変わる変異又はエキソン１０に位置する１２６４番目の塩基がＧからＡに変わる変異、
３）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン１９に位置する２５４２番目の塩基であるＧが欠失し、フレームシフトが起こる変異、
４）ＡＢＣＣ６遺伝子のイントロン２２の５’端から６２０番目の塩基対からイントロン２３の４９３番目の塩基対までの３８９７塩基対が欠失する変異、
５）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン２７に位置する３７７４番目と３７７５番目の塩基の間の場所に１個新たなＣという塩基が挿入（インサーション）されてフレームシフトが起こる変異、
６）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン３０に位置する１４２７番目のアミノ酸がＥ（グルタミン酸）からＫ（リジン）に変わる変異又はエキソン３０に位置する４２７９番目の塩基がＧからＡに変わる変異。
（４）ＡＢＣＣ６遺伝子のバリアントを認識するオリゴヌクレオチド。
（５）ＡＢＣＣ６遺伝子のバリアントが、ｐ.Ｒ４１９Ｑ、ｐ.Ｅ４２２Ｋ、ｃ.２５４２ｄｅｌＧ、ＤＥＬ＿エキソン２３、ｃ.３７７４−３７７５ｉｎｓＣ又はｐ.Ｅ１４２７Ｋのいずれかである上記（４）に記載のオリゴヌクレオチド。
（６）オリゴヌクレオチドが、次の１）〜５）のいずれかである上記（４）又は（５）に
記載のオリゴヌクレオチド、
１）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン１０に位置する１２５６番目の塩基がＡである塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド、
２）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン１０に位置する１２６４番目の塩基がＡである塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド、
３）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン１９に位置する２５４２番目の塩基であるＧが欠失した塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド、
４）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン２７に位置する３７７４番目と３７７５番目の塩基の間の場所に１個新たなＣという塩基が挿入された塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド、
５）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン３０に位置する４２７９番目の塩基がＡである塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド。
（７）オリゴヌクレオチドが、次の１）〜５）のいずれかである上記（４）〜（６）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、
１）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン１０に位置する１２５６番目の塩基がＡである塩基配列に結合する配列表配列番号１１に記載の全部又は一部のオリゴヌクレオチド、
２）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン１０に位置する１２６４番目の塩基がＡである塩基配列に結合する配列表配列番号１２に記載の全部又は一部のオリゴヌクレオチド、
３）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン１９に位置する２５４２番目の塩基であるＧが欠失した塩基配列に結合する配列表配列番号１３に記載の全部又は一部のオリゴヌクレオチド、
４）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン２７に位置する３７７４番目と３７７５番目の塩基の間の場所に１個新たなＣという塩基が挿入された塩基配列に結合する配列表配列番号１４に記載の全部又は一部のオリゴヌクレオチド、
５）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン３０に位置する４２７９番目の塩基がＡである塩基配列に結合する配列表配列番号１５に記載の全部又は一部のオリゴヌクレオチド。
（８）上記（４）〜（７）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドをプローブとして有するマイクロアレイ。
（９）上記（８）に記載のマイクロアレイを用いて判定対象におけるＡＢＣＣ６遺伝子のバリアントを調べる網膜色素線条症の判定方法。
（１０）ＡＢＣＣ６遺伝子のバリアントが、エキソン２３の欠落である上記（４）に記載のオリゴヌクレオチド。
（１１）オリゴヌクレオチドが、次の１）〜３）のいずれかである上記（１０）に記載のＡＢＣＣ６遺伝子のバリアントを認識するオリゴヌクレオチド、
１）配列表配列番号１６に記載のオリゴヌクレオチド、
２）配列表配列番号１７に記載のオリゴヌクレオチド、
３）配列表配列番号１８に記載のオリゴヌクレオチド。
（１２）上記（１０）又は（１１）に記載のオリゴヌクレオチドをＷＴ＿エキソン２３検出用プライマー又はＤＥＬ＿エキソン２３検出用プライマーとして用いて、判定対象におけるＡＢＣＣ６遺伝子のバリアントを調べる網膜色素線条症の判定方法。
（１３）判定対象がアジア人である上記（１）〜（３）、（９）又は（１２）のいずれかに記載の網膜色素線条症の判定方法。
（１４）上記（４）〜（７）、（１０）又は（１１）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを含む網膜色素線条症判定キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のＡＳの判定方法により、ＡＳに対する早期発見ができる。臨床においては臨床像からＡＳの判定をさらに確かにすることができ、確診率が高められる。さらに判定後の治療として定期的に診断を受けるという方針を立てることができる。
また、本発明の判定方法に用いられるＡＳ判定キット、ＡＳ発症予測キット、ＡＳ診療指導キット等の提供により、簡便にＡＳに対する早期発見を行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の「ＡＳの判定方法」とは、判定対象においてＡＢＣＣ６遺伝子のバリアントを調べることによってＡＳの判定を行うことをいう。
ＡＢＣＣ６遺伝子のバリアントとしては、ＡＳの判定を行うことができるバリアントであればいずれのものでも良いが、ｐ.Ｒ４１９Ｑ、ｐ.Ｅ４２２Ｋ、ｃ.２５４２ｄｅｌＧ、ＤＥＬ＿エキソン２３、ｃ.３７７４−３７７５ｉｎｓＣ又はｐ.Ｅ１４２７Ｋのいずれかであることが好ましく、これらの１以上又はこれらを組み合わせて調べることが好ましい。判定対象において、これらのバリアントを調べることにより、ＡＳの早期発見を行うことができる。
【００１１】
本発明のＡＢＣＣ６遺伝子のバリアントを図１に示した。このうち、「ｐ.Ｒ４１９Ｑ」とは、ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン１０に位置する４１９番目のアミノ酸がＲ（アルギニン）からＱ（グルタミン）に変わる変異である。これはエキソン１０に位置する１２５６番目の塩基がＧからＡに変わることによる変異である。
「ｐ.Ｅ４２２Ｋ」とは、エキソン１０に位置する４２２番目のアミノ酸がＥ（グルタミン酸）からＫ（リジン）に変わる変異である。これはエキソン１０に位置する１２６４番目の塩基がＧからＡに変わることによる変異である。
「ｃ. ２５４２ｄｅｌＧ」とは、エキソン１９に位置する２５４２番目の塩基であるＧが欠失し、フレームシフトが起こる変異である。
「ＤＥＬ＿エキソン２３」とは、イントロン２２の一部からエキソン２３を含み、イントロン２３の一部までを含む一続きの塩基配列が欠失する変異である。具体的にはイントロン２２の５’端から６２０番目の塩基対からイントロン２３の４９３番目の塩基対までの３８９７塩基対の欠失という変異である。
「ｃ.３７７４−３７７５ｉｎｓＣ」とは、エキソン２７に位置する３７７４番目と３７７５番目の塩基の間の場所に１個新たなＣという塩基が挿入されてフレームシフトが起こる変異である。
「ｐ.Ｅ１４２７Ｋ」とは、エキソン３０に位置する１４２７番目のアミノ酸がＥ（グルタミン酸）からＫ（リジン）に変わる変異である。これはエキソン３０に位置する４２７９番目の塩基がＧからＡに変わることによる変異である。
これらのバリアントはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）を始めとするＯｎｌｉｎｅ  ｄａｔａｂａｓｅには見当たらない新たなバリアントである。
【００１２】
本発明の「ＡＢＣＣ６遺伝子のバリアントを認識するオリゴヌクレオチド」としては、ＡＢＣＣ６遺伝子のバリアントを認識できるオリゴヌクレオチドであればいずれのものも含まれる。
このＡＢＣＣ６遺伝子のバリアントとしては、ｐ.Ｒ４１９Ｑ、ｐ.Ｅ４２２Ｋ、ｃ.２５４２ｄｅｌＧ、ｃ.３７７４−３７７５ｉｎｓＣ又はｐ.Ｅ１４２７Ｋ等が挙げられる。これらのバリアントを認識するオリゴヌクレオチドとしては、１）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン１０に位置する１２５６番目の塩基がＡである塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド、２）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン１０に位置する１２６４番目の塩基がＡである塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド、３）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン１９に位置する２５４２番目の塩基であるＧが欠失した塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド又は４）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン２７に位置する３７７４番目と３７７５番目の塩基の間の場所に１個新たなＣという塩基が挿入された塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又は５）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン３０に位置する４２７９番目の塩基がＡである塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
これらの「ＡＢＣＣ６遺伝子のバリアントを認識するオリゴヌクレオチド」をプローブとして有するマイクロアレイを得て、本発明のＡＳの判定方法に用いることができる。
【００１３】
さらに、これらのバリアントを認識するオリゴヌクレオチドとして、１）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン１０に位置する１２５６番目の塩基がＡである塩基配列に結合する配列表配列番号１１に記載のオリゴヌクレオチド、２）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン１０に位置する１２６４番目の塩基がＡである塩基配列に結合する配列表配列番号１２に記載のオリゴヌクレオチド、３）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン１９に位置する２５４２番目の塩基であるＧが欠失した塩基配列に結合する配列表配列番号１３に記載のオリゴヌクレオチド、４）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン２７に位置する３７７４番目と３７７５番目の塩基の間の場所に１個新たなＣという塩基が挿入された塩基配列に結合する配列表配列番号１４に記載のオリゴヌクレオチド、５）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン３０に位置する４２７９番目の塩基がＡである塩基配列に結合する配列表配列番号１５に記載のオリゴヌクレオチド等も挙げられる。これらの「ＡＢＣＣ６遺伝子のバリアントを認識するオリゴヌクレオチド」の全部又は一部をプローブとして有するマイクロアレイを得て、本発明のＡＳの判定方法に用いることができる。このオリゴヌクレオチドの「一部」として、例えば、各変異部分の塩基とその前後６−１５塩基程度の配列を含むオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
【００１４】
また、本発明の「ＡＢＣＣ６遺伝子のバリアントを認識するオリゴヌクレオチド」の対象とするバリアントとしては、エキソン２３の欠落が挙げられる。このバリアントを認識するオリゴヌクレオチドとしては、１）配列表配列番号１６に記載のオリゴヌクレオチド、２）配列表配列番号１７に記載のオリゴヌクレオチド、３）配列表配列番号１８に記載のオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
これらの「ＡＢＣＣ６遺伝子のバリアントを認識するオリゴヌクレオチド」をＷＴ＿エキソン２３検出用プライマー又はＤＥＬ＿エキソン２３検出用プライマーとして用いることで、本発明のＡＳの判定方法に用いることができる。ここで、ＷＴ＿エキソン２３検出用プライマーとは、これを用いてＰＣＲを行うことで、エキソン２３の欠落が起きていないＷｉｌｄ  ＴｙｐｅにおいてはＰＣＲによる増幅が起こるが、エキソン２３の欠落が起きているＤｅｌｅｔｉｏｎ  ＴｙｐｅではＰＣＲによる増幅が起こらないように設定されたプライマーのことをいう。また、ＤＥＬ＿エキソン２３検出用プライマーとはエキソン２３の欠落が起きていないＷｉｌｄ  ＴｙｐｅにおいてはＰＣＲによる増幅が起こらず、エキソン２３の欠落が起きているＤｅｌｅｔｉｏｎ  ＴｙｐｅではＰＣＲによる増幅が起こるように設定されたプライマーのことをいう。
【００１５】
本発明の判定方法として、判定対象よりＤＮＡを得て、塩基配列決定法、ＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＰＣＲ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法やＯｌｉｇｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ法等の一般に用いられている方法を用いる事でＡＢＣＣ６遺伝子のバリアントを調べ、ＡＳの判定を行うことができる。このうち特に塩基配列決定法は、各エキソンについて別々に行うことによって、エキソン内に存在する未知の変異を見出せるために有用である。さらにその変異が既知となった後も各患者がその変異を持つか否かの確認（Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）にも利用できる。
また、ＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＰＣＲ法によるＧｅｎｏｔｙｐｉｎｇは既知となった変異のみをターゲットとしているが、塩基配列決定法と比べて大量の患者を同時に解析することができるため、時間的、経済的に有用である。
【００１６】
塩基配列決定法を用いる検出法としては、ジデオキシ法に基づく塩基配列決定法により本発明のバリアントを検出することが好ましい。塩基配列決定に用いるシークエンサースキットには、市販のＡＢＩシリーズやGEヘルスケアバイオサイエンス社製等を用いることができる。
【００１７】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＰＣＲ法を用いる検出法としては、蛍光標識したアレル特異的オリゴ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）とＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ反応とを利用した方法を用いることが好ましい。まず、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが鋳型ＤＮＡとハイブリダイゼーションし、その後、ＰＣＲプライマーからの伸長反応が起こる。これによってＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性により蛍光色素結合部分が切断されて、蛍光色素が遊離する。この蛍光を検出することで特定のバリアントを同定し、ゲノムタイプを判定することができる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＰＣＲ法で用いるアレル特異的オリゴ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブという）は、対象とするバリアントの遺伝子情報に基づいて設定できる。
【００１８】
ＰＣＲ法を用いる検出法としては、Ｆｉｄｅｌｉｔｙの高いＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）、ＫＯＤ  Ｄａｓｈポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）等を用いて判定対象者のゲノムＤＮＡを増幅することが好ましい。用いるプライマーは、対象とするバリアントを増幅できるようにプライマーの任意の位置にそのバリアントの塩基配列が含まれるように設定し合成することが好ましい。増幅反応終了後増幅産物の検出を行い、多型の有無を判定する。
数キロ塩基対の長い領域を増幅するにはＬｏｎｇ  ＰＣＲ法（タカラバイオ社等）を用いることが好ましい。対象とするバリアントを増幅できるように設定したプライマーを用いて増幅したＰＣＲ産物や、Ｌｏｎｇ  ＰＣＲ法で増幅したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動することで、多型の有無を判定することもできる。対象とするバリアントを増幅できるように設定したプライマーとしては、ＷＴ＿エキソン２３検出用プライマーやＤＥＬ＿エキソン２３検出用プライマーを挙げることができる。
【００１９】
マイクロアレイを用いる検出法としては、支持体上にヌクレオチドプローブが固定されたＤＮＡマイクロアレイを用いることが好ましい。このマイクロアレイには、ＤＮＡチップ、Ｇｅｎｅ  チップ、マイクロチップ、ビーズアレイなどを含む。
マイクロアレイを用いる検出法として、まず、判定対象者の染色体ＤＮＡのオリゴヌクレオチドを単離し、ＰＣＲにより増幅し、蛍光レポーター基により標識する。続いて、標識化ＤＮＡ／ｍＲＮＡ，ｔｏｔａｌ  ＲＮＡをアレイと共にインキュベートする。次にこのアレイをスキャナーに差し込み、ハイブリダイゼーションパターンを検出する。ハイブリダイゼーションのデータは、プローブアレイに結合した（すなわち標的配列に取り込まれた）蛍光レポーター基からの発光として採集する。標的配列と完全に一致したプローブは、標的配列と一致していない部分を有するものよりも強いシグナルを生じる。アレイ上の各プローブの配列及び位置は分かっているため、相補性によって、プローブアレイと反応させた標的オリゴヌクレオチドの配列を決定することができる。
【００２０】
インベーダー法を用いる検出法としては、アレル特異的オリゴと鋳型とをハイブリダイゼーションすることによりバリアントを検出することが好ましい。インベーダー・オリゴがターゲットＤＮＡとプローブ間の二重鎖に少なくとも１塩基の浸入（インベージョン）を起こして部分的な三重鎖構造を形成すると、構造特異的な５’−ヌクレアーゼがプローブ５’末端部分を切断する。そして、対象とするバリアントの塩基配列に対応してインベージョンを発生させるインベーダー・オリゴを利用することで特定のバリアントを同定し、ゲノムタイプを判定することができる。インベーダー法を行うためのキットは市販されており、この方法により容易にバリアントを検出することが可能である。
【００２１】
本発明の「判定対象」は、ＡＢＣＣ６遺伝子のバリアントを調べることによってＡＳの判定を行うことができるものであればいずれのものでも良いが、アジア人であることが好ましく、日本人であることが特に好ましい。
【００２２】
本発明の「ＡＳ判定キット」は、本発明の判定方法に用いられることで判定対象におけるＡＳの判定を行うことができるものであれば、いずれのものも含むことができる。例えば、ＡＢＣＣ６遺伝子のバリアントを認識するオリゴヌクレオチドと、本発明を実施するために必要な１種以上の成分を含むもの等を組み合わせてキットとして用いることもできる。
ＡＢＣＣ６遺伝子のバリアントを認識するオリゴヌクレオチドとしては、ＡＢＣＣ６遺伝子のバリアントを認識できるオリゴヌクレオチドであればいずれのものも含まれるが、上記のようなオリゴヌクレオチドを用いることができる。
また、本発明を実施するために必要な１種以上の成分としては、例えば、酵素を保存若しくは供給するためのもの、及び／又はバリアントの検出を実施するために必要な反応成分が挙げられる。具体的には、酵素緩衝液、ｄＮＴＰ、コントロール用試薬（例えば、組織サンプル、ポジティブ及びネガティブコントロール用標的オリゴヌクレオチドなど）、標識用及び／又は検出用試薬、固相支持体、説明書などが挙げられる。また本発明のキットは、必要な成分のうちの一部のみを含む部分的キットであってもよく、その場合には、ユーザーが他の成分を用意することができる。
【００２３】
本発明のキットは、上記のＡＢＣＣ６遺伝子のバリアントを認識するオリゴヌクレオチドを支持体に固定したマイクロアレイを含むこともできる。マイクロアレイは、支持体上に本発明のオリゴヌクレオチドが固定されたものであればよく、ＤＮＡチップ、Ｇｅｎｅチップ、マイクロチップ、ビーズアレイなどが含まれる。
本発明のＡＢＣＣ６遺伝子のバリアントを認識するオリゴヌクレオチドを有するキットを用いることにより、治療用の薬物を患者等に使用する前、又は使用後の段階で、判定対象から得たＡＢＣＣ６遺伝子をキット中のオリゴヌクレオチドと反応させることができる。この反応の結果より判定対象の遺伝子型を同定し、同定された遺伝子型によってＡＳの確定的な判定をすることができる。
本発明の「ＡＳ判定キット」には、ＡＳが疑われるような患者に対して本発明のＡＢＣＣ６遺伝子のバリアントを認識するオリゴヌクレオチド等を用いて確定診断の判定に用いる「ＡＳ判定キット」、ＡＳを発症していない者に対して行う「ＡＳ発症予測キット」、ＡＳを発症した後に遺伝学的な確定診断の判定に用いる「ＡＳ診療指導キット」等を含むこともできる。
以下、試験例、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
ＡＳの判定方法
１．ＤＮＡの抽出
判定対象者から採血を行った。各対象者においての末梢血全血を用いてゲノムＤＮＡを標準的なフェノール・クロロホルム法で抽出した（例えば、参考文献１参照）。
これらの判定対象者は駿河台日本大学病院眼科を受診した日本人であり、片眼あるいは両眼にＣＮＶを有するＡＳ患者（ＡＳ群）５４人及びボランティア（コントロール群）１５０人でインフォームドコンセントを得た者であった。
ＡＳ患者（ＡＳ群）の年齢は１９〜７８歳、６０．９±１０．０歳（平均±標準偏差）、男性３４人、女性２０人であった。全ての患者に視力測定、倒像鏡による眼底検査、フルオレセイン蛍光眼底造影（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ａｎｇｉｏｇｒａｐｈｙ；以下ＦＡ）を行った。ＣＮＶの有無は眼底検査とＦＡで判断した。５４人中４１人は当院皮膚科を受診し、ＰＸＥの有無は皮膚生検又は視診で判定された。ＰＸＥは３４人（８２．９％）で認められ、７人（１７．１％）では認められなかった。
コントロール群の年齢５０〜８１歳、５７．５±６．４歳（平均±標準偏差）、男性１０７人、女性４３人で血縁関係がない日本人であり、日本大学医学部総合健診センター受診者の中からボランティアを募って行った。
参考文献：Ｎａｋａｙａｍａ  Ｔ，  Ｓｏｍａ  Ｍ，  Ｒａｈｍｕｔｕｌａ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｍｏｎｉｔ．２００１；７：３４５−３４９．
【００２５】
２．塩基配列の決定
各対象者におけるＡＢＣＣ６遺伝子の配列情報を次のような手法によって調べた。
即ち、ＡＢＣＣ６遺伝子の全３１エキソンのそれぞれをはさむようなプライマー対をイントロン領域に設定し、対象者末梢血から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、各領域を増幅した。ＰＣＲ産物を精製後、ジデオキシ法にて塩基配列決定を行った。エキソン１から、エキソン９までは偽遺伝子と重複するため、既知のアレル特異的プライマーを使用した。
【００２６】
１）ＰＣＲ法
５０ｎｇの上記ゲノムＤＮＡ１μｌ、濃度１０ｐｍｏｌ／μｌの表１に示した配列表配列番号１〜１０のＦプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄプライマー）及びＲプライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー）の溶液各々０．２μｌ、ヌクレオチド三リン酸（タカラバイオ社製）各々２．５ｍＭの混合溶液を０．８μｌ、１０倍緩衝液（２０ｍＭのＭｇＣｌ２  含有、タカラバイオ社製）１μｌ、Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）５units／μｌを０．０５μｌ、そして滅菌超純水６．７５μｌの混合物、計１０μｌの系にて、ＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００）を用いて増幅した。ＰＣＲ条件は、９５−９６℃で３分間、続いて９５℃で３０秒間（デネーチャー）、５５−６６℃で３０秒間（アニーリング）、７２℃で１分間（エクステンション）のサイクルを３５サイクル、その後、７２℃で１０分間の後、４℃に保温とした。
エキソン２３の欠落に対してはＬｏｎｇ  ＰＣＲを行い増幅した。Ｌｏｎｇ  ＰＣＲでは、ヌクレオチド三リン酸各々２．５ｍＭの混合溶液を１．６μｌ、ＤＮＡポリメラーゼとしてＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用い、エクステンションを７２℃で１０分間とした。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
２）ＰＣＲ産物の精製
上記１）にて得られたＰＣＲ産物内に残存する過剰なプライマー等の一本鎖ＤＮＡを大腸菌由来のエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）を用いて特異的に消化した。またシュリンプ由来アルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）によって未反応ｄＮＴＰｓのリン酸基を除去してｄＮＴＰｓを不活性化した。
この２つの酵素を同時に含むＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用い、先のＰＣＲ産物溶液１０μｌに２μｌ加え計１２μｌとして、ヒートブロックにて３７℃で３０分で反応を行った後８０℃で１５分にて酵素を失活させた。
【００２９】
３）塩基配列決定法
上記２）にて精製したＰＣＲ産物のうち１μｌを別のチューブにとりわけ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製シーケンシングキット（ＢｉｇＤｙｅ(R)  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ  ｖ１．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ）のＭｉｘ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ溶液を８μｌ、ＰＣＲ法に用いたプライマー（片側）（１ｐｍｏｌ／μｌ）を３．２μｌ加え、さらに水を加え２０μｌとした。
シーケンシング条件は９５℃で１０秒間、５５℃で５秒、６０℃で２分間のサイクルを２５サイクルとした。これをＣｅｎｔｒｉｃｅｐ  ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社製）で精製後、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ジェネティックアナライザ３７００にて解析した。
【００３０】
３．Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ
上記３）で調べたＡＢＣＣ６遺伝子の配列情報についてＧｅｎｏｔｙｐｉｎｇを行った。５個すべては塩基配列決定法で決定した。また、ｐ.Ｒ４１９Ｑ、ｐ.Ｅ４２２Ｋ、ｃ.２５４２ｄｅｌＧ、ｃ.３７７４−３７７５ｉｎｓＣ及びｐ.Ｅ１４２７ＫのＧｅｎｏｔｙｐｉｎｇにおいて、その変異のみをより簡便に検出する方法としてＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＰＣＲ法に用いるプローブを設定した。
エキソン２３の欠落については、その変異をより簡便に検出する方法のために設定したＷｉｌｄ  ＴｙｐｅとＤｅｌｅｔｉｏｎ  Ｔｙｐｅとで増幅が異なるプライマー対（ＷＴ＿エキソン２３検出用プライマー対及びＤＥＬ＿エキソン２３検出用プライマー対）を用いて、得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動することで、Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇを行った。
【００３１】
１）ｐ.Ｒ４１９Ｑ、ｐ.Ｅ４２２Ｋ、ｃ.２５４２ｄｅｌＧ、ｃ.３７７４−３７７５ｉｎｓＣ及びｐ.Ｅ１４２７Ｋについて
ＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＰＣＲ法に用いるプローブの設定
ＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＰＣＲ法に用いるプローブは、各バリアントの遺伝子情報に基づいて、各変異部分の塩基とその前後６−１５塩基程度の配列をもとに設定できる。プローブ配列を含む周辺の配列を表２（配列表配列番号１１〜１５）に示した。
このように設定したＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用い、ＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＰＣＲ法を行うことができる。例えば、鋳型ＤＮＡとしてヒトゲノムＤＮＡ  ５０ｎｇを用い、各プライマー  ９００ｎＭ、５’側に蛍光プライマーが標識されたＴａｑＭａｎ  プローブ  ２００ｎＭ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＳＮＰ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ａｓｓａｙｓ）、緩衝液とＭｇＣｌ２とＤＮＡポリメラーゼとを含んだＰＣＲカクテル（ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘｍ）を全体量の半量（１２．５・戟jを入れ、水で満たした全体量２５・撃フ系にてＰＣＲを行うことで、ＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＰＣＲ法を行うことができる（ＰＣＲ条件：１．９５  １０分間、２．９２  １５秒間（デネーチャー）、３．６０  １分間（アニーリング及びエクステンション）を４０サイクル）。
【００３２】
【表２】
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【００３３】
２）エキソン２３の欠落について
ＰＣＲ法による検出
Ｌｏｎｇ  ＰＣＲ法を用いずに一般的なＰＣＲで判定できるように新たなＷＴ＿エキソン２３検出用プライマー、ＤＥＬ＿エキソン２３検出用プライマーを設定してＰＣＲを行った。ＰＣＲとして、５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ１μｌ、濃度１０ｐｍｏｌ／μｌの表３に示した配列表配列番号１６〜１８のＦプライマー及びＲプライマーの溶液各々０．２μｌ、ヌクレオチド三リン酸（タカラバイオ社製）各々２．５ｍＭの混合溶液を０．８μｌ、２５ｍＭのＭｇＣｌ２  １μｌ、１０倍緩衝液（２０ｍＭのＭｇＣｌ２  含有、タカラバイオ社製）１μｌ、Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）５units／μｌを０．０５μｌ、そして滅菌超純水６．７５μｌの混合物、計１０μｌの系にて、ＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００）を用いて増幅した。ＰＣＲ条件は、９５−９６℃で３分間、続いて９５℃で３０秒間（デネーチャー）、５５−６６℃で３０秒間（アニーリング）、７２℃で１分間（エクステンション）のサイクルを３５サイクル、その後、７２℃で１０分間の後、４℃に保温とした。
【００３４】
【表３】
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【００３５】
その結果、図２で示すように、Ｗｉｌｄ  Ｔｙｐｅにおいては、ＷＴ＿エキソン２３検出用プライマー対によって４４９ｂｐの増幅産物が得られた。また、ＤＥＬ＿エキソン２３検出用プライマー対ではプライマー間の距離があるので７２℃  １分間の伸長条件では増幅しなかった。
一方、図３で示すように、Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ＴｙｐｅではＷＴ＿エキソン２３検出用プライマー対ではイントロン２２の一部からエキソン２３を含み、イントロン２３の一部までを含む一続きの塩基配列が欠失しているため、増幅しなかった。また、ＤＥＬ＿エキソン２３検出用プライマー対ではこの欠失によりプライマー間の距離が縮み４４２ｂｐの増幅産物が得られた。
【００３６】
４．ＡＳの確定的な判定
上記１〜３の工程によって得られた結果より各判定者におけるＡＳの確定的な判定を行った。その結果、表４に示すように、ｐ.Ｒ４１９Ｑ、ｐ.Ｅ４２２Ｋ、ｃ.２５４２ｄｅｌＧ、ＤＥＬ＿エキソン２３、ｃ.３７７４−３７７５ｉｎｓＣ又はｐ.Ｅ１４２７Ｋの６種類のバリアントについて変異を調べたところ、これら６種類のバリアントの変異はＡＳ５４人中３２人に見出され、５９．３％という高い頻度でこの６種類のバリアントの変異がＡＳの原因として関与していることが示された。３２人の内訳は両染色体１７人（３１．５％）、片染色体１５人（２７．８％）であり、この結果によってＡＳ患者の３１．５％がこの５種類によって完全に説明可能となった。従って、これら５種類のバリアントの変異を示すもののうち、５７．４％がＡＳ患者として確定的な判定がされ得ることが示された。
【００３７】
【表４】
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【実施例２】
【００３８】
ＡＳ判定キットの作製
ＡＢＣＣ６遺伝子のバリアントを認識するオリゴヌクレオチド、酵素緩衝液、ｄＮＴＰ、コントロール用試薬、標識用及び／又は検出用試薬、固相支持体、説明書を組み合わせてキットとした。
ＡＢＣＣ６遺伝子変異部位を含むオリゴヌクレオチドとして、次の１）〜５）の１以上のオリゴヌクレオチドを用いた。
１）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン１０に位置する１２５６番目の塩基がＡである塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド、
２）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン１０に位置する１２６４番目の塩基がＡである塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド、
３）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン１９に位置する２５４２番目の塩基であるＧが欠失した塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド、
４）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン２７に位置する３７７４番目と３７７５番目の塩基の間の場所に１個新たなＣという塩基が挿入された塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド、
５）ＡＢＣＣ６遺伝子のエキソン３０に位置する４２７９番目の塩基がＡである塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明のＡＳの判定方法を用いることで、ＡＳに対する早期発見、早期治療が可能となる。本発明の判定方法を用いるＡＳ判定キット、ＡＳ発症予測キット、ＡＳ診療指導キット等の提供は、研究や臨床において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ＡＢＣＣ６遺伝子のバリアントを示した図である。
【図２】エキソン２３の欠落部位をＷｉｌｄ  ｔｙｐｅ（健常者）での増幅で示した図である（実施例１）。
【図３】エキソン２３の欠落部位をＤｅｌｅｔｉｏｎ  ｔｙｐｅ（患者）での増幅で示した図である（実施例１）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
0005594655.tif 000008
【配列表】
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