(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（１）〜（２）を含む、腎細胞癌患者におけるテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤の化学療法に対する治療効果を検査する方法：
（１）患者から採取された癌細胞を含み得る生体試料に含まれるチミジル酸合成酵素遺伝子の発現量を測定する工程、
（２）上記工程（１）で得られた発現量が、予め設定した対応するカットオフポイントと比較して低い場合、患者が当該化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程であって、上記予め設定した対応するカットオフポイントが、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤の化学療法を受けた患者におけるチミジル酸合成酵素遺伝子の発現量と、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤の化学療法に対し一定以上の治療効果の有無との関係から感度と特異度の和が最大となるようＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）分析に基づき求められる値である工程。
【請求項２】
下記工程（１）〜（２）を含む、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤の化学療法が腎細胞癌患者に対する治療効果を示すか否かを試験する方法：
（１）患者から採取された癌細胞を含み得る生体試料に含まれるチミジル酸合成酵素遺伝子の発現量を測定する工程、
（２）上記工程（１）で得られた発現量を、予め設定した対応するカットオフポイントと比較する工程であって、上記予め設定した対応するカットオフポイントが、チミジル酸合成酵素遺伝子の発現量が当該カットオフポイントより低い場合は、患者が当該化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いという値であり、かつ、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤の化学療法を受けた患者におけるチミジル酸合成酵素遺伝子の発現量と、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤の化学療法に対し一定以上の治療効果の有無との関係から感度と特異度の和が最大となるようＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）分析に基づき求められる値である工程。
【請求項３】
上記テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤の化学療法に対する治療効果が、奏効度が著効（ＣＲ）、有効（ＰＲ）、不変（ＮＣ）及び進行（ＰＤ）で表現され、ＣＲ＋ＰＲが治療有効と及びＮＣ＋ＰＤが治療無効と判定される治療効果である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
上記予め設定した対応するカットオフポイントが、ベータアクチン遺伝子の発現量を基準としたチミジル酸合成酵素遺伝子の発現量の比であって、２．５０×１０−２である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤における各有効成分のモル比が、テガフール：ギメラシル：オテラシルカリウム＝１：０．４：１である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤の化学療法に対する治療効果を予測する方法および当該化学療法に十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された患者に投与するための抗腫瘍剤に関する。また、本発明は、腎細胞癌の治療方法およびテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤からなる抗腫瘍剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎細胞癌に対する全身療法は、これまでＩＦＮ―α及びＩＬ−２によるサイトカイン療法にわずかながら有用性が見いだされているのみであったが、欧米においては分子標的薬であるソラフェニブ及びスニチニブが腎細胞癌治療薬として承認され、サイトカイン療法に替わり標準療法になりつつある。【０００３】
しかしながら、分子標的薬の臨床成績（サイトカイン療法無効例を対象とした場合）は奏効率で１０〜３６．５％、無増悪生存期間（ＰＦＳ）の中央値で５．５〜８．７ヶ月と他癌腫に比べて低い（非特許文献１〜３）。また、本邦においては分子標的薬の使用実績に乏しいことから分子標的薬の有効性及び安全性が確認されているとは言い難く、検証の必要があるとされている。【０００４】
また、腎細胞癌患者に対する抗悪性腫瘍剤を中心とした全身化学療法の有効性については、Ｙａｇｏｄａらが１９９５年に８３件にのぼる臨床試験の結果を総括し、最も有効であった５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ（５−ＦＵ）あるいはｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅの奏効率が１３．４％であるとしている（非特許文献４）。１９９０年代にはｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅを中心とした検討が行われたが、サイトカイン療法を凌駕する結果は得られていない（非特許文献５）。【０００５】
以上のように、本邦における腎細胞癌の治療体系は現状においては構築されておらず、標準療法とされるべき治療法は確立されていない。また、２つの分子標的薬が新たに製造承認を得たとはいえ依然として治療法の選択肢は少なく、腎細胞癌患者の治療環境は満足できるものではない現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００７；３５６：１２５−１３４
【非特許文献２】Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００６；２４：１６−２４
【非特許文献３】ＪＡＭＡ．２００６；２９５（２１）：２５１６−２５２４
【非特許文献４】Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．１９９５；２２：４２−６０
【非特許文献５】Ｊ  Ｕｒｏｌ．２０００；１６３：４０８−４１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、腎細胞癌患者に対して、強い治療効果を奏する化学療法を提供することを目的とする。さらに本発明は、腎細胞癌の治療方法およびテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤からなる抗腫瘍剤の使用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、腎細胞癌に対する化学療法について研究を重ねた結果、チミジル酸合成酵素遺伝子の発現量（ｍＲＮＡ量または酵素量）を指標とすることにより、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤の化学療法に十分な治療効果を示す可能性が高い患者を予測する方法を見出し、本発明を完成するに至った。なお、チミジル酸合成酵素は、従来から他の癌種においてＳ−１（テガフール、ギメラシル及びオテラシルカリウム（モル比１：０．４：１）の配合剤）の治療効果規定因子として知られているが（例えば、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１１９，１９２７−１９３３（２００６））、腎細胞癌において当該化学療法の選択にチミジル酸合成酵素遺伝子の発現産物（ｍＲＮＡ、酵素）量を指標にできることは全く知られていない。【０００９】
すなわち本発明は、以下のテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤の化学療法に対する治療効果を予測する方法及び抗腫瘍剤を提供するものである。さらに本発明は、腎細胞癌の治療方法およびテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤からなる抗腫瘍剤の使用を提供するものである。
項１．
下記工程（１）〜（２）を含む、腎細胞癌患者におけるテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤の化学療法に対する治療効果を予測する方法：
（１）患者から採取された癌細胞を含み得る生体試料に含まれるチミジル酸合成酵素遺伝子の発現量を測定する工程、
（２）上記工程（１）で得られた発現量が、予め設定した対応するカットオフポイントと比較して低い場合、患者が当該化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。
項２．
テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤における各有効成分のモル比が、テガフール：ギメラシル：オテラシルカリウム＝１：０．４：１である、項１記載の方法。
項３．
項１又は２記載の方法により当該化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された癌患者に当該化学療法を実施することを特徴とする、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤からなる抗腫瘍剤。
項４．
項１又は２記載の方法により当該併用化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された癌患者に当該併用化学療法を実施することを特徴とする、胃癌の治療方法。
項５．
項１又は２記載の方法により当該併用化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された癌患者に当該併用化学療法を実施するための、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤からなる抗腫瘍剤の使用。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の予測方法は、腎細胞癌患者において強い治療効果（腫瘍縮小効果、無増悪生存期間延長効果など）を有する有効な化学療法の選択を可能にするものである。つまり、腎細胞癌において治療効果が高いと予測される患者に対し、より強い治療効果を示す化学療法を的確に提供することができ、不要な化学療法を省くことができることから、医療経済的にも好ましい。【００１１】
当該化学療法の有効性はチミジル酸合成酵素遺伝子の発現量に大きく依存し、チミジル酸合成酵素遺伝子の発現量が一定以下である場合にのみ有効であると考えられることが本発明により初めて示された。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の予測方法は、患者のチミジル酸合成酵素遺伝子の発現量に基づき、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤の化学療法による治療に対して、より強い治療効果を示す可能性が高い患者を予測するものである。
【００１３】
本発明において、「化学療法を選択するのに十分な治療効果」とは、国内外で使用されている標準療法（例えば、分子標的薬であるソラフェニブ及びスニチニブなど）より優れた治療効果（腫瘍縮小効果、無増悪生存期間延長効果など）を示すことを意味する。このような治療効果を示すか否かは、チミジル酸合成酵素遺伝子の発現量がカットオフポイント以下か否かで判断でき、チミジル酸合成酵素遺伝子の発現量がカットオフポイント以下であれば、当該化学療法を選択するのに十分な治療効果を有すると判断される。本発明における治療効果は、腫瘍縮小効果あるいは無増悪期間延長効果などにより総合的に評価し、各効果は腫瘍縮小の程度、無増悪生存期間などにより判定することができる。
【００１４】
本発明の腎細胞癌患者の化学療法は、腎摘除術を行うことなく化学療法のみで治療する場合であってもよく、一方の腎臓の一部又は全部の摘除術後の転移もしくは再発を抑制もしくは治療するための化学療法に好ましく適用できる。例えば、腎摘除術後にサイトカイン療法が適用され得る患者及びサイトカイン療法の対象として不適当と判断される転移性腎細胞癌患者に対し、本発明の方法を適用することができる。治療効果の予測は、具体的には、腎摘前で原発性の腎細胞癌がある場合、腎摘後で転移性の腎細胞癌がある場合の両方について行うことができる。
【００１５】
本発明の方法により当該化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された癌患者には、腎摘前で原発性の腎癌がある場合、腎摘後で転移性の腎癌がある場合、さらには腎摘後の転移性の腎癌の再発を防止する目的で、本発明の抗腫瘍剤を投与することができる。
【００１６】
本発明における有効成分であるテガフール（一般名、化学名：５−フルオロ−１−（２−テトラヒドロフリル）−２，４−（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン）は、公知の化合物であり、生体内で活性化を受けて抗腫瘍活性の本体である５−フルオロウラシルを放出する薬剤である。テガフールは、公知の方法、例えば特公昭４９−１０５１０号に記載されている方法に従って製造できる。
【００１７】
本発明における有効成分であるギメラシル（一般名、化学名：２，４−ジヒドロキシ−５−クロロピリジン）も、公知の化合物であり、それ自身全く抗腫瘍活性を有さないものであるが、５−フルオロウラシルが生体内において代謝されて不活性化されることを抑制するものであり、抗腫瘍効果を増強させることができる。
【００１８】
本発明における有効成分であるオテラシルカリウム（一般名、化学名：モノポタシウム  １，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−１，３，５−トリアジン−６−カルボキシレート）も公知の化合物であり、それ自身はほとんど抗腫瘍活性を有さないが、主に消化管に分布してその部位での５−フルオロウラシルの活性化を抑制することにより消化管障害を抑制するものである。
【００１９】
本発明において投与されるテガフール、ギメラシル及びオテラシルカリウムの割合は、それぞれの配合目的を奏する範囲であれば特に制限されず、例えば、特許第２６１４１６４号公報に記載されている公知の配合剤と同様の範囲で良く、テガフール１モルに対して、ギメラシルを０．１〜５モル程度、好ましくは０．２〜１．５モル程度とすればよく、オテラシルカリウムを０．１〜５モル程度、好ましくは０．２〜２モル程度とすればよい。特に好ましくは、テガフール：ギメラシル：オテラシルカリウム（モル比）＝１：０．４：１である。
【００２０】
本発明における各有効成分の投与量は、用法、患者の年齢、性別、病期、転移の有無、治療暦、他の抗腫瘍剤の有無などの条件により適宜選択されるが、テガフールの量が０.１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日程度、好ましくは０．２〜４０ｍｇ／ｋｇ／日程度、より好ましくは０．５〜２０ｍｇ／ｋｇ／日程度、ギメラシルの量が、０.０２〜３０ｍｇ／ｋｇ／日程度、好ましくは０．０５〜１２ｍｇ／ｋｇ／日程度、より好ましくは０．１〜６ｍｇ／ｋｇ／日程度、オテラシルカリウムの量が０.１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日程度、好ましくは０．２〜４０ｍｇ／ｋｇ／日程度、より好ましくは０．５〜２０ｍｇ／ｋｇ／日程度の範囲となる量を目安とするのが良い。また、各有効成分は１日に１回又は複数回に分けて投与される。また、各有効成分は同時又は間隔を空けて投与され、その投与順序は特に制限されない。
【００２１】
本発明において、テガフール、ギメラシル、オテラシルカリウムは、一の剤型に製剤化した配合剤として提供される。
【００２２】
本発明における製剤の投与形態としては特に制限は無く、具体的には経口剤（錠剤、被覆錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤など）、注射剤、坐剤、貼付剤、軟膏剤等が例示できる。本発明の各有効成分を複数の剤型に製剤化する場合は、当該製剤はそれぞれ異なる投与形態であっても同一の投与形態であってよい。例えば、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤は経口剤とすることが好ましい。
【００２３】
本発明の製剤は、薬理学的に許容される担体を用いて、それぞれの投与形態において通常公知の製剤化方法により製造される。かかる担体としては、通常の薬剤に汎用される各種のもの、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、無痛化剤等を例示できる。
【００２４】
賦形剤としては、例えば、乳糖、ショ糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マルトース、マンニトール、エリスリトール、キシリトール、マルチトール、イノシトール、デキストラン、ソルビトール、アルブミン、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、メチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム及びこれらの混合物等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール及びこれらの混合物等が挙げられる。結合剤としては、例えば、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、エチルセルロース、水、エタノール、リン酸カリウム及びこれらの混合物等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖及びこれらの混合物等が挙げられる。希釈剤としては、例えば、水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類及びこれらの混合物等が挙げられる。安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、チオグリコール酸、チオ乳酸及びこれらの混合物等が挙げられる。等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ホウ酸、ブドウ糖、グリセリン及びこれらの混合物等が挙げられる。ｐＨ調整剤及び緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、クエン酸、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム及びこれらの混合物等が挙げられる。無痛化剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカイン及びこれらの混合物等が挙げられる。溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。懸濁化剤としては、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム等が挙げられる。着色剤としては、酸化チタン、酸化鉄等が挙げられる。矯味・矯臭剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。
【００２５】
本発明における投与スケジュールは、患者の年齢、性別、病期、転移の有無、治療暦などの条件により適宜選択されるが、例えば、本発明の化学療法は、テガフール、ギメラシル及びオテラシルカリウムを２８日間連続投与し、その後１４日間休薬することを１サイクルとして１回又は複数回行うことが好ましい。
【００２６】
本発明の予測方法の対象となる患者は、腎細胞癌を有する患者であるが、原発巣が腎細胞癌であり、腎以外の臓器、組織に転移した腎細胞癌を有する患者であっても良い。
【００２７】
本発明のチミジル酸合成酵素遺伝子の発現量測定において用いることができる生体試料としては、癌細胞を含む可能性がある試料であれば特に限定されず、体液（血液、尿等）、組織、その抽出物及び採取した組織の培養物などが例示できる。また、生体試料の採取方法は、生体試料の種類や癌種に応じた方法により適宜選択することができる。生体試料からのＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質の調製は、通常公知の方法により行うことができる。組織としては、特に腎が挙げられるが、腎から他の臓器（例えば肺、骨、肝）やリンパ、腹膜などに転移した場合には、転移した部位が対象の組織となる。
【００２８】
チミジル酸合成酵素は、ｄＵＭＰから葉酸を補酵素としてｄＴＭＰを合成する活性を有する酵素であり、ＤＮＡ合成時に必要な酵素として知られている。また、５−フルオロウラシルの標的酵素としても知られている。なお、ヒトのチミジル酸合成酵素の遺伝子の塩基配列やアミノ酸配列は公知である（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：２０３５−２０４３（１９８５））。
【００２９】
本発明の予測方法は、チミジル酸合成酵素遺伝子の発現量を指標とするが、その発現量としてはｍＲＮＡの発現量であっても、タンパク質の発現量であってもよい。ここでｍＲＮＡの発現量は、チミジル酸合成酵素遺伝子と特異的にハイブリダイズするプローブ又はプライマーを用いて、ノーザンブロット法、定量的又は半定量的ＰＣＲ法（例えばＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダーゼーション法など公知の遺伝子発現量の測定法に従い測定することができる。前記発現量は、常に一定範囲の量を発現しているタンパク質／遺伝子（例えばβアクチンなどのハウスキーピング遺伝子又はその発現タンパク質）を基準として、比により評価することができる。
【００３０】
また、タンパク質発現量は、チミジル酸合成酵素を特異的に認識する抗体を用いて、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法、蛍光免疫測定法、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタン・ブロッティング法、免疫組織化学染色法など公知の免疫学的測定法を行うことにより測定することができる。
【００３１】
ノーザンブロット法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダーゼーション法などの遺伝子発現量の測定法に用いられるプローブは、チミジル酸合成酵素遺伝子の塩基配列内の少なくとも１５塩基長〜全塩基長、好ましくは２０塩基長〜全塩基長、より好ましくは３０塩基長〜全塩基長の連続した塩基配列と特異的にハイブリダイズするように、通常公知のプローブ設計方法に従い上記各塩基長を有するポリヌクレオチドとして設計される。
【００３２】
ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法などの定量的又は半定量的ＰＣＲ法に用いられるプライマー、プローブの設計は、例えば以下のようにして行うことができる。
【００３３】
本発明のプライマー及びプローブは、チミジル酸合成酵素遺伝子の塩基配列内の少なくとも１０塩基長〜全塩基長、好ましくは１０〜１００塩基長、より好ましくは１０〜５０塩基長、さらに好ましくは１０〜３５塩基長の連続した塩基配列と特異的にハイブリダイズするように、通常公知のプライマー及びプローブ設計方法に従い上記各塩基長を有するポリヌクレオチドとして設計される。例えば、チミジル酸合成酵素遺伝子の発現産物検出用のプライマー、すなわちＰＣＲのフォワードプライマー及びリバースプライマーは、チミジル酸合成酵素遺伝子のうちエキソン領域から設計及び合成することができる。フォワードプライマー及びリバースプライマーは、チミジル酸合成酵素遺伝子の各エキソン領域のうち、一方を上流側のエキソン領域の塩基配列に基づき設計し（フォワードプライマー）、他方をその下流側のエキソン領域の塩基配列に基づき設計する（リバースプライマー）。例えば、チミジル酸合成酵素遺伝子のプライマーをエキソン１〜３に基づき設計する際において、フォワードプライマーをエキソン１領域の配列に基づいて設計する場合は、リバースプライマーは、その下流側のエキソン２又はエキソン３領域の配列に基づいて設計する。リバースプライマーは、チミジル酸合成酵素遺伝子のｍＲＮＡの配列に相補的となるように設計する。また、このプライマーとしては、各エキソン領域を含むチミジル酸合成酵素遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列の全て及びその一部の配列を用いることができるが、それぞれのエキソン領域からＰＣＲによる増幅効率を考慮してプライマーを設計するのが望ましい。
【００３４】
チミジル酸合成酵素遺伝子の発現産物検出用プローブとしては、上記プライマーを使用してＰＣＲ反応により、増幅されるチミジル酸合成酵素遺伝子の各一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズ可能なものであれば特に制限されない。チミジル酸合成酵素遺伝子の全エキソンの塩基配列あるいはその一部と相補的な配列を有するかあるいはストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なものであればよい。
【００３５】
なお、当該プローブは、チミジル酸合成酵素遺伝子と特異的にハイブリダイズするものであれば、完全に相補的である必要はない。かかるポリヌクレオチドとして、好ましくはチミジル酸合成酵素遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその相補ポリヌクレオチドと比較して、塩基配列において７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するポリヌクレオチドである。
【００３６】
なお、本発明において「特異的にハイブリダイズする」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されないことをいう。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、通常公知の方法に従ってハイブリッドを形成する核酸の融解温度（Ｔｍ）などに基づいて決定することができる。具体的なハイブリダイズ状態を維持できる洗浄条件として通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の条件、より厳格には「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度の条件、さらに厳格には「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の条件が挙げられる。
【００３７】
また、ヒトにおけるチミジル酸合成酵素遺伝子の塩基配列が公知であるため、当該プローブ又はプライマーは、その塩基配列に基づいて、通常公知の合成方法、例えば市販のヌクレオチド合成機によって作製することができる。また、その塩基配列を鋳型としてＰＣＲ法によって調製することもできる。
【００３８】
また、当該プローブ又はプライマーは、チミジル酸合成酵素遺伝子を容易に検出できるように、通常慣用されている放射性物質、蛍光物質、化学発光物質、または酵素で標識されていてもよい。
【００３９】
本発明の抗体は、チミジル酸合成酵素を特異的に認識するものであれば特に制限されず、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよく、Ｆａｂ断片やＦ（ａｂ’）２断片などの抗体断片であってもよい。また、当該抗体は、通常公知の方法に従って製造することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７），  Ｐｕｂｌｉｓｈ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ．  Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．１２−１１．１３）。
【００４０】
テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤の化学療法による治療を実施すべきか否か予測する工程において、チミジル酸合成酵素遺伝子の発現量が、予め設定した各カットオフポイントと比較して、低い場合、患者が当該化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する。
【００４１】
本発明におけるカットオフポイントは、測定対象や測定方法の種類などの諸条件により変動するものであるため、条件に合わせて予め設定する必要がある。カットオフポイントは、測定対象（患者の数、年齢、性別、体重、健康状態、疾患の状態）や測定方法（遺伝子とタンパク質のいずれの発現産物を測定対象とするか、測定条件（例えば遺伝子発現産物（ｍＲＮＡ）の測定におけるプライマー、プローブの配列、標識の種類、発現産物がタンパク質の場合の抗体の種類及び感度など）、統計的手法などにより変動するため、本発明は、これらの諸条件により変動し得る任意のカットオフポイントを用いた発明を広く包含し、特定の値に限定されない。ここでカットオフポイントは、予め測定しておいたチミジル酸合成酵素遺伝子の発現量から種々の統計解析手法により求めることができる。例えば、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤の化学療法を受けた患者におけるチミジル酸合成酵素遺伝子の発現量の平均値や中央値；テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤の化学療法を受けた患者におけるチミジル酸合成酵素遺伝子の発現量と、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤の化学療法に対し一定以上の治療効果（腫瘍縮小効果、無増悪生存期間延長効果など）の有無との関係から感度と特異度の和が最大となるようＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）分析に基づき求められる値；テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤の化学療法を受けた患者におけるチミジル酸合成酵素遺伝子の発現量を用いて、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤の化学療法に対する治療効果（腫瘍縮小効果、無増悪生存期間延長効果など）との関係から、カイ二乗検定でＰ値が最小となる値及びＰ値がある水準以下になる値（例えば、Ｐ値が０．１以下になる値、Ｐ値が０．０５以下になる値）；テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤の化学療法を受けた患者におけるチミジル酸合成酵素遺伝子の発現量を用いて、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤の化学療法に対する無増悪生存期間との関係から、ログランク検定でＰ値が最小となる値及びＰ値がある水準以下になる値（例えば、Ｐ値が０．１以下になる値、Ｐ値が０．０５以下になる値）が例示できる。
【００４２】
その結果、本化学療法におけるチミジル酸合成酵素遺伝子のカットオフポイント（ベータアクチンに対する比）は、例えばリアルタイムＰＣＲ法では１．５５×１０−２〜２．６７×１０−２が好ましく、１．７８×１０−２〜２．５０×１０−２がより好ましく、２．１２×１０−２〜２．５０×１０−２が特に好ましい。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。
【実施例１】
【００４４】
チミジル酸合成酵素遺伝子の発現量測定
サイトカイン療法無効及びサイトカイン療法の対象として不適当と判断された腎摘除術後の転移性腎細胞癌患者を対象にテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤（Ｓ−１）を経口投与し併せて付随研究として遺伝薬理学的研究を実施した。Ｓ−１の1回投与量は、体表面積あたりから規定された以下の初回基準量とし、朝食後および夕食後の１日２回経口投与した。初回基準量は、体表面積が１．２５ｍ２未満の場合は４０ｍｇ／回、１．２５ｍ２以上〜１．５０ｍ２未満の場合は５０ｍｇ／回、１．５０ｍ２以上の場合は６０ｍｇ／回とした。Ｓ−１を２８日間連日経口投与した後１４日間休薬した。これを１コースとして、２コース以上４コースまで投与を行った。【００４５】
治療効果（抗腫瘍効果）の判定方法は、腎癌取扱い規約〔第３版〕に従って行った。奏効度の表現は、日本癌治療学会固形がん化学療法直接効果判定基準に準じ、以下の通りとした。
1）著効：ＣＲ
測定可能病変、評価可能病変及び腫瘍による二次的病変が全て消失し、新病変の出現が無い場合。
2）有効：ＰＲ
(i)二方向測定可能病変の縮小率が５０％以上であるとともに、評価可能病変及び腫瘍による二次的病変が増悪せず、かつ新病変の出現しない場合。
(ii)一方向測定可能病変において、それぞれの算定式で求めた縮小率が３０％以上であり、評価可能病変及び腫瘍による二次的病変が増悪せず、かつ新病変の出現しない場合。
3）不変：ＮＣ
二方向測定可能病変の縮小率が５０％未満、一方向測定可能病変においては、縮小率が３０％未満であるか、またはそれぞれの２５％以内の増大にとどまり、腫瘍による二次的病変が増悪せず、かつ新病変が出現しない場合。
4）進行：ＰＤ
測定可能病変の積または径の総和が２５％以上の増大、または他病変の増悪または新病変の出現がある場合。【００４６】
無増悪生存期間（ＰＦＳ）は投与開始日から病態進行に達した日（ＰＤ評価日）までの期間と定義した。病態進行に達する前に死亡した被験者では、死亡を病態進行と取り扱った。病態進行に達していない場合は、最終評価日を解析に用いた。【００４７】
チミジル酸合成酵素遺伝子の発現量は、薬剤の投与以前に得られた腎摘除術時の腫瘍組織のホルマリン固定パラフィン包埋切片からトータルＲＮＡを抽出し、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲ法によりベータアクチンに対する比として定量した。なお、チミジル酸合成酵素遺伝子の発現量測定用のプライマー及びプローブとして、以下の配列番号１〜３で示すプライマー及びプローブを用いた。さらに、ベータアクチン遺伝子発現量の測定には、以下の配列番号４〜６で示すプライマー及びプローブを用いた。【００４８】
【表１】
0005566376.tif 000002
【００４９】
上記表１記載のプライマー及びプローブ以外に、公知のチミジル酸合成酵素遺伝子配列のオープンリーディングフレームをもとにして種々のフォワードプライマー、リバースプライマー、プローブを設計できる。プライマー、プローブの配列、標識の種類などを変更するとカットオフポイントが多少変化し得るが、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤の化学療法を選択するのに十分な治療効果を示すか否かを予測できる本発明の効果に実質的な影響はない。
【実施例２】
【００５０】
カットオフポイントの算出
カットオフポイントは、実施例１で測定した各患者のチミジル酸合成酵素の遺伝子発現量を次のような統計解析手法により求めた。
（１）治療効果データ（有効：ＣＲ＋ＰＲ、無効：ＮＣ＋ＰＤ）を用いて、ＲＯＣ分析で感度と特異度の和が最大となる最適なカットオフポイントを算出したところ、２．５０×１０−２であった。
（２）治療効果データを用いて、カイ二乗検定でＰ値が５％以下となるカットオフポイント値を算出したところ、１．７８×１０−２〜２．６７×１０−２であった。
（３）無増悪生存期間データを用いて、ログランク検定でＰ値が最小となる値を算出したところ、２．１２×１０−２であった。
（４）無増悪生存期間データを用いて、ログランク検定でＰ値が５％以下となるカットポイント値を算出したところ、１．５５×１０−２〜２．５０×１０−２であった。
【実施例３】
【００５１】
チミジル酸合成酵素を指標にして選択された患者でのＳ−１療法における治療効果
実施例２で算出したカットオフポイント値を用いてチミジル酸合成酵素（ＴＳ）の低発現群と高発現群の２群に分けて生存期間解析を実施した。結果を表２〜表６に示す。【００５２】
【表２】
0005566376.tif 000003
【００５３】
【表３】
0005566376.tif 000004
【００５４】
【表４】
0005566376.tif 000005
【００５５】
【表５】
0005566376.tif 000006
【００５６】
【表６】
0005566376.tif 000007
【００５７】
Ｓ−１療法では、腫瘍組織中チミジル酸合成酵素の遺伝子発現量の低い患者では、高い患者と比較し、奏効率および無増悪生存期間の中央値に顕著な差があり、高い治療効果を示した。また、従来の腎細胞癌治療薬（例えば、分子標的薬であるソラフェニブ及びスニチニブなど）の治療効果（奏効率：１０〜３６．５％、無増悪生存期間の中央値：５．５〜８．７ヶ月、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００７；３５６：１２５−１３４、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００６；２４：１６−２４、ＪＡＭＡ．２００６；２９５（２１）：２５１６−２５２４）と比較しても、腫瘍組織中チミジル酸合成酵素の遺伝子発現量の低い患者においては、奏効率および無増悪生存期間の中央値が顕著に良好であった。【００５８】
以上のように、チミジル酸合成酵素遺伝子の発現量を指標として腎細胞癌患者を選択することにより、Ｓ−１療法は高い治療効果を期待できることが明らかになった。
【配列表】
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