(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質であって、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質よりも、式（XIII）で表される化合物または式（XIV）で表される化合物から式（XV）で表される化合物または式（XVI）で表される化合物への転換反応の転換率または転換速度が向上した蛋白質。
【化１】
0005631534.tif 000026
（式中、Ｒ1は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表す）
【化２】
0005631534.tif 000027
【化３】
0005631534.tif 000028
（式中、Ｒ1は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表す）
【化４】
0005631534.tif 000029
【請求項２】
請求項１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２記載のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３記載の組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
【請求項５】
宿主細胞がエシェリヒア（Escherichia）属、バチルス（Bacillus）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、アスペルギルス（Aspergillus）属またはペニシリウム（Penicillium）属に属する微生物である、請求項４記載の形質転換体。
【請求項６】
宿主細胞がエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus  terreus）、またはペニシリウム・シトリナム（Penicillium citrinum）に属する微生物である、請求項４記載の形質転換体。
【請求項７】
請求項１に記載の蛋白質を式（XIII）
【化５】
0005631534.tif 000030
（式中、Ｒ1は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表す）で表される化合物［以下、化合物（VII-a）という］または式（XIV）
【化６】
0005631534.tif 000031
で表される化合物（VII-a）の閉鎖ラクトン体［以下、化合物（VII-b）という］と接触させて、式（XV）
【化７】
0005631534.tif 000032
（式中、Ｒ1は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表す）で表される化合物［以下、化合物（VIII-a）という］または式（XVI）
【化８】
0005631534.tif 000033
で表される、化合物（VIII-a）の閉鎖ラクトン体［以下、化合物（VIII-b）という］を生成させ、化合物（VIII-a）または（VIII-b）を採取することを特徴とする化合物（VIII-a）または化合物（VIII-b ）の製造方法。
【請求項８】
請求項４〜６のいずれか１項に記載の形質転換体の培養物または該培養物の処理物と、化合物（VII-a）または（VII-b）とを、水性媒体中で接触させ、該媒体中に化合物（VIII-a）または化合物（VIII-b）を生成蓄積させ、該媒体中から化合物（VIII-a）または化合物（VIII-b）を採取することを特徴とする化合物（VIII-a）または化合物（VIII-b）の製造方法。
【請求項９】
化合物(VII-b)が化合物(VII-a)よりラクトンを形成させて得られた化合物(VII-b)である、請求項７又は８に記載の製造法。
【請求項１０】
化合物(VIII-a)が化合物(VIII-b)のラクトンを開環させて得られた化合物(VIII-a)である、請求項７又は８に記載の製造法。
【請求項１１】
形質転換体の培養物の処理物が培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物の凍結乾燥物、培養物から得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕物、該菌体の溶媒処理物から選ばれる菌体処理物、菌体の蛋白分画物、並びに菌体および菌体処理物の固定化物から選ばれる処理物である、請求項８に記載の製造法。
【請求項１２】
請求項４〜６のいずれかに記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求項１に記載の蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取することを特徴とする、該蛋白質の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、ヒドロキシメチルグルタリルCoA(HMG-CoA)レダクターゼを阻害し、血清コレステロールの低下作用を有する化合物を生成する活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを有する形質転換体、および該蛋白質または該形質転換体を用いた該化合物の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
式（XI)【０００３】
【化１】
0005631534.tif 000002
【０００４】
（式中、Ｒ1は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表す）で表される化合物［以下、化合物(VI-a)という］のうち、Ｒ1が水素原子もしくはアルカリ金属である化合物、または式（XII）【０００５】
【化２】
0005631534.tif 000003
【０００６】
で表される、化合物（VI-a）の閉鎖ラクトン体［以下、化合物（VI-b)という］は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクタ−ゼを阻害し、血清コレステロールの低下作用等を示すことが知られている（非特許文献１）。
微生物によって、式（IX）【０００７】
【化３】
0005631534.tif 000004
【０００８】
（式中、Ｒ1は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表す）で表される化合物［以下、化合物（V-a）という］または式（X）【０００９】
【化４】
0005631534.tif 000005
【００１０】
で表される、化合物（V-a）の閉鎖ラクトン体［以下、化合物（V-b）という］から化合物（VI-a）または化合物（VI-b）を生成する方法に関しては既に幾つかの報告がある。
即ち、特許文献１には糸状菌を用いる方法が、特許文献２および３には放線菌を用いる方法が述べられている。しかしこれらの微生物は菌糸を伸ばして成長するため、発酵槽で増殖させると培養液の粘度が上昇する。このため酸素が不足しやすく、培養液が不均一になるため反応効率の低下を招きやすい。この酸素不足を解消し、培養液を均一に保つためには、発酵槽の攪拌速度を上げなければならないが、攪拌速度を上げると菌糸がせん断され、微生物の活性が低下しやすい（非特許文献２）。【００１１】
こうした問題点を回避する方法として特許文献４には枯草菌を用いる方法が、特許文献５には胞子を形成せずかつ菌糸を形成しない微生物を用いる方法が述べられている。しかし、いずれの方法も培養・反応に長時間を要する点や投入した原料化合物(V-a)または(V-b)に対する目的化合物(VI-a)または(VI-b)の収率が低いといった問題点を有し、工業的に有利な製法とは言い難いものであった。【００１２】
これらの問題点を解決する手法として、化合物(V-a)または(V-b)から化合物(VI-a)または(VI-b)を生成する反応を触媒する酵素遺伝子を増幅することによって反応速度や収率を向上させる方法が考えられる。該反応を触媒する酵素遺伝子は、既に本発明者らによって枯菌草から取得されている（特許文献６）。しかしながら遺伝子の導入によって生成活性の増大効果は認められたものの、生成速度や収率の点で工業的に満足できる成績は得られていなかった。
【非特許文献１】ザ・ジャーナル・オブ・アンチビオチクス（The Journal of Antibiotics）, 29, 1346(1976)
【非特許文献２】醗酵工学の基礎，P169-190, P.F.Stansbury, A.Whitaker著、学会出版センター(1988)]
【特許文献１】特開昭57-50894号公報
【特許文献２】特開平7-184670号公報
【特許文献３】国際公開第96/40863号パンフレット
【特許文献４】国際公開第99/07872号パンフレット
【特許文献５】国際公開第00/43533号パンフレット
【特許文献６】国際公開第00/44886号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本願発明の目的は、HMG-CoAレダクターゼを阻害し、血清コレステロールの低下作用を有する化合物を生成する活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを有する形質転換体、および該蛋白質または該形質転換体を用いた該化合物の工業的に有利な製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本願発明は、以下(１)〜(２２)に関する。
（１）配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質。ただし、配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を除く。
（２）配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。ただし、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを除く。
（３）配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡ。
（４）上記（２）または（３）のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡ。
（５）上記（４）の組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
（６）宿主細胞がEscherichia属、Bacillus属、Corynebacterium属、Streptomyces属、Aspergillus属またはPenicillium属に属する微生物である、上記（５）の形質転換体。
（７）宿主細胞がEscherichia coli、Bacillus subtilis、Bacillus megaterium、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium ammoniagenes、Streptomyces lividans、Aspergillus terreus、またはPenicillium citrinumに属する微生物である、上記（５）の形質転換体。
（８）上記（１）または（２）の蛋白質を式（I）【００１５】
【化５】
0005631534.tif 000006
【００１６】
（式中、Ｒ1は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表し、Ｒ2は置換もしくは非置換のアルキルまたはアリールを表す）で表される化合物［以下、化合物（I-a）という］または式（II）【００１７】
【化６】
0005631534.tif 000007
【００１８】
（式中、Ｒ2は置換もしくは非置換のアルキルまたはアリールを表す）で表される、化合物（I-a）の閉鎖ラクトン体［以下、化合物（I-b）という］と接触させて、式(III) 【００１９】
【化７】
0005631534.tif 000008
【００２０】
（式中、Ｒ1は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表し、Ｒ2は置換もしくは非置換のアルキルまたはアリールを表す）で表される化合物［以下、化合物（II-a）という］または式（IV）【００２１】
【化８】
0005631534.tif 000009
【００２２】
（式中、Ｒ2は置換もしくは非置換のアルキルまたはアリールを表す）で表される、化合物（II-a）の閉鎖ラクトン体［以下、化合物（II-b）という］を生成させ、化合物（II-a）または（II-b）を採取することを特徴とする化合物（II-a）または化合物（II-b）の製造方法。
（９）上記（５）〜（７）のいずれか１つの形質転換体の培養物または該培養物の処理物と、化合物（I-a）または（I-b）とを、水性媒体中で接触させ、該媒体中に化合物（II-a）または化合物（II-b）を生成蓄積させ、該媒体中から化合物（II-a）または化合物（II-b）を採取することを特徴とする化合物（II-a）または化合物（II-b）の製造方法。
（１０）  化合物（I-a）が式（V）【００２３】
【化９】
0005631534.tif 000010
【００２４】
（式中、Ｒ1は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表し、Ｒ2は置換もしくは非置換のアルキルまたはアリールを表す）で表される化合物[以下化合物（III-a）という]であり、化合物（I-b）が式（VI）【００２５】
【化１０】
0005631534.tif 000011
【００２６】
（式中、Ｒ2は置換もしくは非置換のアルキルまたはアリールを表す）で表される化合物[以下、化合物（III-b）という]であり、化合物（II-a）が式（VII）【００２７】
【化１１】
0005631534.tif 000012
【００２８】
（式中、Ｒ1は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表し、Ｒ2は置換もしくは非置換のアルキルまたはアリールを表す）で表される化合物[以下、化合物（IV-a）という]であり、化合物（II-b）が式（VIII）【００２９】
【化１２】
0005631534.tif 000013
【００３０】
（式中、Ｒ2は置換もしくは非置換のアルキルまたはアリールを表す）で表される化合物[以下、化合物(IV-b)という]である、上記（８）または（９）の製造法。
（１１）化合物（I-a）が式（IX）【００３１】
【化１３】
0005631534.tif 000014
【００３２】
（式中、Ｒ1は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表す）で表される化合物［以下、化合物（V-a）という］であり、化合物（I-b）が式（X）【００３３】
【化１４】
0005631534.tif 000015
【００３４】
で表される化合物［以下、化合物（V-b）という］であり、化合物（II-a）が式（XI）【００３５】
【化１５】
0005631534.tif 000016
【００３６】
（式中、Ｒ1は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表す）で表される化合物［以下、化合物（VI-a）という］であり、化合物（II-b）が式（XII）【００３７】
【化１６】
0005631534.tif 000017
【００３８】
で表される化合物［以下、化合物（VI-b）という］である、上記（８）または（９）の製造法。
（１２）化合物（I-a）が式（XIII）【００３９】
【化１７】
0005631534.tif 000018
【００４０】
（式中、Ｒ1は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表す）で表される化合物［以下、化合物（VII-a）という］であり、化合物（I-b）が式（XIV）【００４１】
【化１８】
0005631534.tif 000019
【００４２】
で表される化合物［以下、化合物（VII-b）という］であり、化合物（II-a）が式（XV）【００４３】
【化１９】
0005631534.tif 000020
【００４４】
（式中、Ｒ1は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表す）で表される化合物［以下、化合物（VIII-a）という］であり、化合物（II-b）が式（XVI）【００４５】
【化２０】
0005631534.tif 000021
【００４６】
で表される化合物［以下、化合物（VIII-b）という］である、上記（８）または（９）の製造法。
（１３）化合物(II-b)が化合物(II-a)よりラクトンを形成させて得られた化合物(II-b)である、上記（８）または（９）の製造法。
（１４）化合物(II-a)が化合物(II-b)のラクトンを開環させて得られた化合物(II-a)である、上記（８）または（９）の製造法。
（１５）化合物(III-b)が化合物(III-a)よりラクトンを形成させて得られた化合物(III-b)である、上記（１０）の製造法。
（１６）化合物(IV-a)が化合物(IV-b)のラクトンを開環させて得られた化合物(IV-a)である、上記（１０）の製造法。
（１７）化合物(V-b)が化合物(V-a)よりラクトンを形成させて得られた化合物(V-b)である、上記（１１）の製造法。
（１８）化合物(VI-a)が化合物(VI-b)のラクトンを開環させて得られた化合物(VI-a)である、上記（１１）の製造法。
（１９）化合物(VII-b)が化合物(VII-a)よりラクトンを形成させて得られた化合物(VII-b)である、上記（１２）の製造法。
（２０）化合物(VIII-a)が化合物(VIII-b)のラクトンを開環させて得られた化合物(VIII-a)である、上記（１２）の製造法。
（２１）形質転換体の培養物の処理物が培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物の凍結乾燥物、培養物から得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕物、該菌体の溶媒処理物から選ばれる菌体処理物、菌体の蛋白分画物、並びに菌体および菌体処理物の固定化物から選ばれる処理物である、上記（９）〜（１２）のいずれか１項に記載の製造法。
（２２）上記（５）〜（７）のいずれか１つの形質転換体を培地に培養し、培養物中に上記（１）の蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取することを特徴とする、該蛋白質の製造法。
【発明の効果】
【００４７】
本発明により、HMG-CoAレダクターゼを阻害し、血清コレステロールの低下作用を有する化合物を効率よく、工業的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１はpSC6の製造過程を示す図である。
【図２】図２は、pSYN2-39上のyjiB遺伝子中の変異箇所と制限酵素サイトを示す図である。矢印はyjiB遺伝子領域を、太線は変異位置をそれぞれ示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
以下、本願発明を詳細に説明する。
１．本発明の蛋白質
本発明の蛋白質は、配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を除く、配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質である。
また、配列番号１〜３で表されるいずれかのアミノ酸配列において、Xaaで表されるアミノ酸以外の１以上、５０以下、好ましくは１以上、２０以下、より好ましくは１以上、１５以下、さらに好ましくは１以上、１０以下、特に好ましくは１以上、５以下、特に好ましくは１以上、３以下のアミノ酸残基が置換、欠失または付加したアミノ酸配列からなり、かつ上記式(I) （式中、Ｒ1は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表し、Ｒ2は置換もしくは非置換のアルキルまたはアリールを表す）で表される化合物［以下、化合物（I-a）という］または上記式（II）（式中、Ｒ2は置換もしくは非置換のアルキルまたはアリールを表す）で表される、化合物（I-a）の閉鎖ラクトン体［以下、化合物（I-b）という］を、式(III) （式中、Ｒ1は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表し、Ｒ2は置換もしくは非置換のアルキルまたはアリールを表す）で表される化合物［以下、化合物（II-a）という］または式（IV）（式中、Ｒ2は置換もしくは非置換のアルカリまたはアリールを表す）で表される、化合物（II-a）の閉鎖ラクトン体［以下、化合物（II-b）という］に変換する活性を有する蛋白質も本発明の蛋白質に含まれる。
２．本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡとしては、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを除く、配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、および配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。【００５０】
ただし、配列番号８および９で表される塩基配列からなるＤＮＡは本発明のＤＮＡから除かれてもよい。
３．本発明のＤＮＡの製造法
公知の化学合成法により配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡを合成することにより、本願発明のＤＮＡを製造することができる。ＤＮＡの合成は市販のＤＮＡの合成装置（例えばPE  BioSystems社製のABI-381Aなど）を用いて行うことができる。一度に全長を合成する代わりに、幾つかの部分に分けて合成し、各断片を順次つなぎ合わせることによっても本発明のＤＮＡを製造することができる。【００５１】
また、配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡをいったん合成したのち、該ＤＮＡに公知の方法で変異を導入することによっても本発明のＤＮＡを製造することができる。もしくは、そのようにして得られた各々の変異部位を、制限酵素などを利用して組み合わせることによっても本発明のＤＮＡを製造することができる。
具体的には以下の方法により本発明のＤＮＡを製造することができる。なおＤＮＡ操作、大腸菌の形質転換、大腸菌からのプラスミド回収等は、常法、例えばMolecular cloning, A laboratory manual, Third Edition, Cold Harbor Laboratory Press (2001) (以下、モレキュラー・クローニング第3版と略す)、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等に記載された方法、あるいは市販のキットなどを用いて行うことができる。【００５２】
まず配列番号９記載の塩基配列を分割した部分配列を合成する。好ましくは後の連結操作を容易にするために、該部分配列に相補的な塩基配列を突出部位として導入する、または制限酵素部位を適宜加える。該部分配列としては、例えば配列番号１０〜３３で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。該部分配列は、図１に示すように、制限酵素サイトを末端に持つ５つのブロックにわけることができる。【００５３】
該部分配列をブロックごとに相補的な部分配列をアニールさせ、あらかじめ設定しておいた制限酵素で末端を切断したのち適当なベクターに連結し大腸菌、例えばE. coli DH5α(東洋紡社より購入)を形質転換する。
ベクターとしては大腸菌で自律複製可能であれば特に制限はないが、具体的には、pBluescript II SK(+) [Nucleic Acid Research, 17, 9494 (1989)]、Lambda ZAP II (ストラタジーン社製)、λgt10、λgt11 [DNA Cloning A Practical Approch, 1, 49 (1985)]、pT7T313U (ファルマシア社製)、pcD2 [H.Okayama and P.Berg; Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)]、pMW218 (和光純薬社製)、pUC118、pUC119、pSTV28、pSTV29 (宝酒造社製)、pEG400 [J. Bac., 172, 2392 (1990)]、pHMV1520 (MoBiTec社製)]、pQE-30 (QIAGEN社製)等をあげることができる。【００５４】
得られた形質転換体より、目的とするプラスミドを回収し、適当な制限酵素で切断後、アガロースゲル電気泳動などでブロック部分のＤＮＡ断片を分離する。
これらのＤＮＡ断片を連結して、配列番号９で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片を製造することができる。いちどに３つ以上のブロックを連結するのが困難な場合は、連続するブロックを順次付加する方法（図１）で目的とする断片を製造することができる。【００５５】
この断片に変異を導入することによって配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片を製造することができる。変異を導入する方法としては、エラープローンＰＣＲ法、ヒドロキシルアミンを用いる方法、該ＤＮＡ断片を有する細胞にUV等の変異剤を作用させる方法などをあげることができる。
例えばエラープローンＰＣＲ法を用いる場合には、配列番号９で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドを鋳型とし、配列番号３４および３５をプライマーとし、通常よりマンガン（Mn）塩濃度を高めた反応液中でＰＣＲ反応を行う。Mn塩濃度としては0.1mmol/lから1mmol/l程度の濃度を用いることができる。
４．本発明の蛋白質の製造法
本発明の蛋白質は、上記３の方法で製造された本発明のＤＮＡを宿主細胞中で発現させることにより、製造することができる。【００５６】
該ＤＮＡを宿主細胞中で発現させるためには、まず、目的とする該ＤＮＡを、制限酵素またはＤＮＡ分解酵素などで、コーディング領域を含む適当な長さのＤＮＡ断片とした後に、発現ベクターのプロモーターの下流に挿入し、次いで該発現ベクターを、発現ベクターに適合した宿主細胞中に導入する。
宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、動物細胞、植物細胞など目的とする遺伝子を発現できる細胞であれば、いずれの細胞も用いることができる。【００５７】
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能または染色体ＤＮＡ中への組込みが可能で、上記目的とするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、該ＤＮＡを発現させるための発現ベクターは該細胞中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、該ＤＮＡおよび転写終結配列により構成された組換えベクターであることが望ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。【００５８】
発現ベクターとしては、pBTrp2、pBTac1、pBTac2（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、pKK233-2（ファルマシア社製）、pGEX（ファルマシア社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-8（キアゲン社製）、pET-3（ノバジェン社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200〔Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)〕、pLSA1〔Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescriptII SK+（ストラタジーン社製）、pBluescript II SK(-)（ストラタジーン社製）、pTrS30〔大腸菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製〕、pTrS32〔大腸菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)より調製〕、pUC19〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pSTV28(タカラバイオ社製)、pUC118（タカラバイオ社製）、pPA1（特開昭63-233798）pEG400[J.Bacteriol., 172, 2392 (1990)]、pHW1520（MoBiTec社製）、pCS299P(WO 00/63388)等を例示することができる。【００５９】
プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ptrp）、lacプロモーター（Plac）、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター等をあげることができる。またPtrpを２つ直列させたプロモーター（Ptrpｘ２）、tacプロモーター、lacT7プロモーター、letIプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。さらにBacillus属細菌中で発現させるためのxylAプロモーターやCorynebacterium属細菌中で発現させるためのP54-6プロモーターなども用いることができる。【００６０】
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明の組換え体ＤＮＡにおいては、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主細胞として用いられる原核生物としては、Escherichia属、Corynebacterium属、Brevibacterium属、Bacillus属、Microbacterium属、Serratia属、Pseudomonas属、Agrobacterium属、Alicyclobacillus属、Anabaena属、Anacystis属、Arthrobacter属、Azobacter属、Chromatium属、Erwinia属、Methylobacterium属、Phormidium属、Rhodobacter属、Rhodopseudomonas属、Rhodospirillum属、Scenedesmun属、Streptomyces属、Synnecoccus属またはZymomonas属等に属する微生物をあげることができ、好ましくは、Escherichia属、Corynebacterium属、Brevibacterium属またはBacillus属等に属する微生物等をあげることができる。【００６１】
該微生物の具体例として、例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichiacoli DH1、Escherichia coli DH5α、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Escherichia coli MP347 、Escherichia coli NM522、Bacillus subtilis ATCC33712、Bacillus megaterium、Bacillus sp. FERM BP-6030、Bacillus amyloliquefacines、Brevibacterium ammmoniagenes、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Brevibacterium flavum ATCC14067、Brevibacterium lactofermentum ATCC13869、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14297、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Corynebacterium ammoniagenes ATCC6872、Corynebacterium ammoniagenes ATCC21264、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Serratia marcescens、Pseudomonas sp. D-0110、Agrobacterium radiobacter、Agrobacterium rhizogenes、Agrobacterium rubi、Anabaena cylindrica、Anabaena doliolum、Anabaena flos-aquae、Arthrobacter aurescens、Arthrobacter citreus、Arthrobacter globformis、Arthrobacter hydrocarboglutamicus、Arthrobacter mysorens、Arthrobacter nicotianae、Arthrobacter paraffineus、Arthrobacter protophormiae、Arthrobacter roseoparaffinus、Arthrobacter sulfureus、Arthrobacter ureafaciens、Chromatium buderi、Chromatium tepidum、Chromatium vinosum、Chromatium warmingii、Chromatium fluviatile、Erwinia uredovora、Erwinia carotovora、Erwinia ananas、Erwinia herbicola、Erwinia punctata、Erwinia terreus、Methylobacterium rhodesianum、Methylobacterium extorquens、Phormidium sp. ATCC29409、Rhodobacter capsulatus、Rhodobacter sphaeroides、Rhodopseudomonas blastica、Rhodopseudomonas marina、Rhodopseudomonas palustris、Rhodospirillum rubrum、Rhodospirillum salexigens、Rhodospirillum salinarum、Streptomyces ambofaciens、Streptomyces aureofaciens 、Streptomyces aureus、Streptomyces fungicidicus、Streptomyces griseochromogenes、Streptomyces griseus、Streptomyces lividans、Streptomyces olivogriseus、Streptomyces rameus、Streptomyces tanashiensis、Streptomyces vinaceusおよびZymomonas mobilis等をあげることができる。【００６２】
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法またはGene, 17, 107 (1982)やMolecular & General Genetics, 168, 111 (1979)に記載の方法等をあげることができる。【００６３】
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEp13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS19、pHS15等を例示することができる。
プロモーターとしては、酵母中で機能するものであればいかなるものでもよく、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、MFα1プロモーター、CUP1プロモーター等のプロモーターをあげることができる。【００６４】
酵母としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisae ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クリュイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、トリコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulans）、シュワニオミセス・アルビウス（Schwanniomyces alluvius）等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods. Enzymol., 194, 182 (1990〕、スフェロプラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)〕、酢酸リチウム法〔J. Bacteriol., 153, 163(1983)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)〕記載の方法等をあげることができる。【００６５】
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pcDNAI、pcDM8（フナコシ社より市販）、pAGE107〔特開平3-22979；Cytotechnology, 3, 133, (1990)〕、pAS3-3（特開平2-227075）、pCDM8〔Nature, 329, 840, (1987)〕、pcDNAI/Amp（Invitrogen社製）、pREP4（Invitrogen社製）、pAGE103〔J. Biochem., 101, 1307 (1987)〕、pAGE210等を例示することができる。【００６６】
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトCMV）のIE（immediate early）遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、SRαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。【００６７】
宿主細胞としては、ナマルバ細胞、HBT5637(特開昭63−299）、COS1細胞、COS7細胞、CHO細胞等をあげることができる。
動物細胞への組換えベクターの導入法としては、動物細胞にＤＮＡを導入できるいかなる方法も用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Cytotechnology, 3, 133(1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平2−227075）、リポフェクション法〔Proc.Natl.Acad.Sci.,USA, 84, 7413(1987)、virology, 52, 456 (1973)〕に記載の方法等を用いることができる。形質転換体の取得および培養は、特開平2-227075号公報あるいは特開平2-257891号公報に記載されている方法に準じて行なうことができる。【００６８】
発現方法としては、本発明の蛋白質をそのまま発現させる方法以外に、モレキュラー・クローニング 第3版に記載されている方法等に準じて、分泌型蛋白質または融合蛋白質として発現させることができる。
酵母、動物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。【００６９】
本発明のＤＮＡを組み込んだ上記組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培地に培養し、本発明の蛋白質を培養物中に生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取することにより、本発明の蛋白質を製造することができる。
該形質転換体を培地に培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。【００７０】
該形質転換体が原核生物、または酵母等の微生物を宿主細胞とする形質転換体である場合、これら微生物を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が用いられる。【００７１】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等が用いられる。
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。【００７２】
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は15〜50℃がよく、培養時間は、通常16時間〜7日間である。培養中pHは、3.0〜9.0に保持する。pHの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。【００７３】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG）等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（IAA）等を、xylAプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する時にはキシロースを、それぞれ培地に添加してもよい。【００７４】
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地〔The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)〕、EagleのMEM培地〔Science, 122, 501 (1952)〕、DMEM培地〔Virology, 8, 396 (1959)〕、199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1(1950)〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。【００７５】
培養は、通常pH6〜8、30〜40℃、5％CO2存在下等の条件下で1〜7日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養物から本発明の蛋白質を単離、精製するには、通常の酵素の単離、精製法を用いればよい。【００７６】
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（DEAE）−セファロース、DIAION HPA-75（三菱化学社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用いることにより、精製標品を得ることができる。【００７７】
また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該蛋白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まない、または蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、もしくは透析し、該蛋白質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。【００７８】
本発明の蛋白質またはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋白質あるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。【００７９】
このようにして取得される蛋白質として、例えば、配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をあげることができる。また、上記方法により発現させた蛋白質を、Ｆｍｏｃ法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、ｔＢｏｃ法(t-ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法によっても製造することができる。また、桑和貿易(米国Advanced chemTech社製)、パーキンエルマージャパン(米国Perkin-Elmer社製)、ファルマシアバイオテク(スウューデンPharmacia Biotech社製)、アロカ(米国Protein Technology Instrument社製)、クラボウ(米国Synthecell-Vega社製)、日本パーセプティブ・リミテッド(米国PerSeptive社製)、島津製作所等のペプチド合成機を利用し合成することもできる。
５．化合物（II-a）または化合物（II-b）の製造法
上記４の方法に準じて培養して得られる細胞、該細胞の培養物、該培養物の処理物、または精製された本発明の蛋白質等と化合物（I-a）または化合物（I-b）とを媒体中で接触させ、該媒体中に化合物II-aまたは化合物II-bを生成、蓄積させ、該媒体から化合物（II-a）または化合物（II-b）を採取することにより化合物（II-a）または化合物（II-b）を製造することができる。【００８０】
本発明の細胞の培養物の処理物としては、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物の凍結乾燥物、培養物を遠心分離等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の溶媒処理物および該細胞の固定化物などの細胞の形態を保持している処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕物などの粗酵素抽出物、並びに該細胞からの蛋白質分画物および酵素の固定化物などの粗精製酵素などをあげることができる。【００８１】
媒体としては、水、水性媒体もしくは有機溶媒、または水もしくは水性媒体と有機溶媒との混合液が用いられる。水性媒体としては、例えばリン酸緩衝液、HEPES（N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N-エタンスルホン酸）緩衝液、トリス［トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン］塩酸緩衝液等の緩衝液が用いられる。有機溶媒としては反応を阻害しないものであればいずれでもよく、例えば、アセトン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、キシレン、メタノール、エタノール、ブタノール等が用いられる。水もしくは水性媒体と有機溶媒との混合液は、例えば化合物（I-b）を用いる場合好ましく用いられる。また水性媒体としては、本発明の細胞を培養する培養液、および培養して得られる培養液もあげることができる。【００８２】
化合物（I-a）または化合物（I-b）を媒体に添加する場合、化合物（I-a）または化合物（I-b）を溶解することのできる水、水性媒体もしくは有機溶媒、または水もしくは水性媒体と有機溶媒との混合液に化合物（I-a）または化合物（I-b）を溶解し、媒体に添加することができる。有機溶媒としては、反応を阻害しないものであればいずれでもよく、例えば、アセトン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、キシレン、メタノール、エタノール、ブタノール等が用いられる。【００８３】
本発明の細胞を培養する培養液を媒体として用いる場合、培養開始前にあらかじめ化合物（I-a）または化合物（I-b）を培養液に添加してもよいし、培養中または培養終了後に化合物（I-a）または化合物（I-b）を培養液に添加してもよい。
化合物（I-a）または化合物（I-b）を培養液中に添加する場合、化合物（I-a）または化合物（I-b）は培地1mlあたり0.1〜10mg、好ましくは0.2〜１mgを培養の初発または途中に添加する。化合物（I-a）または化合物（I-b）は、水またはメタノール、エタノール等の有機溶媒に溶解した後、培養液中に添加することが望ましい。【００８４】
本発明の化合物（II-a）または化合物（II-b）を製造する方法において、用いられる酵素源の量は、その比活性等により異なるが、例えば、酵素源として細胞の培養物もしくはその処理物を用いる場合は、1mgの化合物（I-a）または化合物（I-b）あたり、湿重量として5〜1000mg、好ましくは10〜400mg添加する。反応は20〜50℃で行なうことが好ましく、特に25℃〜37℃で行なうことが好ましい。反応時間は用いる酵素源の量および比活性等により異なるが、通常2〜150時間、好ましくは6〜120時間である。【００８５】
化合物（I-b）および化合物（II-b）は下記に例示するラクトンの開環方法により、容易に化合物（I-a）および化合物（II-a）にそれぞれ変換することができる。また化合物（I-b）および化合物（II-b）は下記に例示するラクトンの生成方法により容易に化合物（I-b）および化合物（II-b）にそれぞれ変換することができる。
ラクトンの開環方法としては、化合物（I-b）または化合物（II-b）を水性媒体に溶解し、酸またはアルカリを添加し開環する方法があげられる。水性媒体としては、例えば水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液など反応を阻害しない塩類を含む水溶液があげられる。該水溶液中には、反応を阻害しない濃度のメタノール、エタノール、酢酸エチルなどの有機溶媒を含んでいてもよい。酸としては酢酸、塩酸、硫酸などの酸があげられ、アルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなどがあげられる。【００８６】
ラクトンの生成方法としては、化合物（I-a）または化合物（II-a）を非水系の溶媒に溶解し、酸または塩基触媒を添加しラクトンを形成させる方法があげられる。非水系の溶媒としては実質的に水を含まない有機溶媒で化合物（I-a）または化合物（II-a）を溶解できるものならばいかなるものでも用いることができる。溶媒として例えばジクロロメタン、酢酸エチル、などがあげられる。触媒としては、ラクトン化反応を触媒し、基質や反応産物にラクトン化以外の作用を及ぼさないものならば、どのようなものでも使用できる。該触媒としては、トリフルオロ酢酸やパラトルエンスルホン酸などがあげられる。反応温度は特に制限はないが、0〜100℃が好ましく、20〜80℃が特に好ましい。【００８７】
媒体中からの化合物（II-a）および（II-b）の採取は、通常の有機合成化学で用いられる方法、例えば、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
本発明の方法で製造される化合物（II）の確認または定量方法は、化合物化合物（II）、好ましくは（II-a）および/または（II-b）を確認または定量できる方法であれば、いずれの方法でも用いられるが、例えば、13C-NMRスペクトル、1H-NMRスペクトル、マススペクトル、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)等の方法により行うことができる。
６．本発明における化合物の各基の定義
式（I）〜（IX）、（XI）、（XIII）および（XV）で表される化合物の各基において、アルキルとしては、直鎖または分岐状の、炭素数１〜１０、好ましくは１〜６のアルキルであり、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、４，４−ジメチルペンチル、オクチル、２，２，４−トリメチルペンチル、ノニル、デシル、これら各種分岐鎖異性体等があげられる。【００８８】
アリールとしては、フェニル、ナフチル等があげられる。
置換アルキルにおける置換基としては、同一または異なって１〜３のハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アリール等があげられる。
置換アリールにおける置換基としては、同一または異なって１〜３のハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキシ等があげられる。【００８９】
ハロゲンとしては、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードがあげられる。
アルコキシにおけるアルキル部分は上述のアルキルと同義である。
置換アルキルにおけるアリール基は上述のアリールと同義である。
置換アリールにおけるアルキル基は上述のアルキルと同義である。
アルカリ金属とは、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、フランシウムの各元素を表す。【００９０】
以下に本発明の参考例および実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
参考例  ベクタープラスミドの作製
Corynebacterium ammoniagenes由来のプロモーター領域を含むプラスミドpFM54-6(Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679, 2000)を鋳型とし、配列番号３６で表される塩基配列からなるＤＮＡ、および配列番号３７で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行い、プロモーター領域を含む0.7kbのＤＮＡ断片を増幅した。この断片をEcoRVおよびBamHIで消化した後、市販の大腸菌ベクターpTZ18R (Protein Engineering, 1, 67-74, 1986)のHincII-BamHI領域に挿入しプラスミドpRI107を得た。このプラスミドをPstIおよびBamHIで消化し、得られた約0.7kbのPstI-BamHIＤＮＡ断片をpCS299P(WO00/63388)のSse8387I-BamHI領域に導入してpRI109を得た。
【実施例１】
【００９１】
反応基質の調製
100mgの化合物（VII-b）（シグマ社製）を9.5mlのメタノールに溶解した後、0.5mlの1mol/l水酸化ナトリウムを加えて室温で１時間振盪した。得られた反応液を乾固し、5mlの脱イオン水を加えて溶解した後、約0.1mlの1mol/l塩酸を用いてpHを約pH6.5〜7.5に調整し、さらに4.9mlの脱イオン水を加えることにより最終濃度が10mg/mlの化合物（VII-a）[式（XIII）中、Ｒ１がナトリウムである化合物]を10ml得た。
【実施例２】
【００９２】
pRIyjiBとpSYN2-39の取得
pWyjiB(WO 00/44886および対応するUS7049111、EP1148122)を鋳型し、配列番号３８で表される塩基配列からなるＤＮＡおよび配列番号３９で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行った。
ＰＣＲは、96℃で1分間保温した後、95℃で30秒間、50℃で45秒間、72℃で3分間からなる工程を25回行い、その後72℃で10分間保温する条件で行った。該ＰＣＲにより、約1.4kbの増幅ＤＮＡ断片を得た。該ＤＮＡ断片をSalIとBamHIで切断後、同じくSalIとBamHIで切断したpRI109と連結した。【００９３】
連結した組換え体ＤＮＡを、エレクトロポレーション法を用いて大腸菌DH5αに導入した。得られたプラスミドを大腸菌から単離し、C. glutamicum ATCC13032株にエレクトロポレーション法で導入した。得られた形質転換体10株の各株の化合物（VII-a）から化合物（VIII-a）への転換活性を以下のようにして測定した。
すなわち、各株をカナマイシン100μg/mLを含むKM102培地（普通ブイヨン2%, 酵母エキス0.5％）3mL入りの試験管に植菌し、30℃で終夜培養した。得られた培養物のうち0.5 mLをカナマイシン 100μg/mLを含むLMC培地[グルコース3%, NH4Cl 0.1%, KH2PO4 0.1%, K2HPO40.3%, MgSO4・7H2O 0.01%, 酵母エキス 0.05%, コーンスティープリカー 1%, FeSO42mg/L, MnSO4 2mg/L, ビオチン 50μg/L, チアミン 0.5mg/L (pH7.2)]5 mL入りの試験管に添加し、30℃で5時間振とう培養したのち、実施例１で調製した化合物（VII-a）を終濃度500mg/Lになるよう添加して、更に30℃で6時間振とう培養した。【００９４】
得られた培養物のうち0.5mlを1.5mlチューブに移し、15,000rpmで２分間遠心分離して菌体を分離した。得られた上清部分をメタノールで5〜20倍に希釈し、15,000rpmで２分間遠心分離した後、その一部をHPLC分析[カラム；Inertsil  ODS-2(5μm, 4x250mm, ジーエルサイエンス社製)、カラム温度；60℃、移動相；アセトニトリル：水：リン酸＝55：45：0.05、流速；0.9ml/分、検出波長；237nm]に供し、化合物（VIII-a）（式（XV）中、R1はナトリウムである化合物）の定量を行った。最も転換活性が高い株［化合物（VIII-a）の生成量56mg/l、転換率16%］を選択し、該株をATCC13032/pRIyjiBと名づけた。【００９５】
該株から抽出したプラスミドpRIyjiBをもとにさらにSD配列と開始コドンの距離を最適化し、yjiB遺伝子のN末端側の２、３、４および７番目のコドンをC. glutamicumに適合したコドンに変更した発現プラスミドを作製した。
次に、pRIyjiBを鋳型にし、配列番号４０および３９で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、96℃で１分間保温した後、95℃で30秒間、50℃で45秒間、72℃で3分間の工程を25回行い、その後72℃ で10分間保温する条件で行った。該ＰＣＲにより、約1.4kbの増幅ＤＮＡ断片を得た。【００９６】
該ＤＮＡ断片をXhoIとBamHIで切断後、SalIとBamHIで切断したpRI109と連結して組換え体ＤＮＡを得た。該組換え体ＤＮＡを、エレクトロポレーション法を用いて大腸菌DH5αに導入して形質転換体を取得した。該形質転換体からプラスミドを単離し、C. glutamicum ATCC13032株にエレクトロポレーション法を用いて導入した。
得られた形質転換体30株を上記と同様に培養し、化合物（VII-a）から化合物（VIII-a）への転換活性を測定し、最も転換活性が高い株［化合物（VIII-a） の生成量80mg/l、転換率28%］を選択し、該株が保持するプラスミドをpSYN2-39、該株をATCC13032/pSYN2-39と名づけた。
【実施例３】
【００９７】
制限酵素を用いた変異点の分離
実施例２で得られたpRIyjiBとpSYN2-39のyjiB遺伝子のコーディング領域の塩基配列を決定したところ、公知のyjiB遺伝子の塩基配列に比べそれぞれ２塩基、８塩基が異なっていることが判明した。これらの変異を表１に示す。なお、以下塩基の位置はyjiB遺伝子の翻訳開始コドンATGのAを、アミノ酸残基の位置はyjiB遺伝子がコードする蛋白質のN末端のMet（配列番号４で表されるアミノ酸配列中の１番目Met）を、それぞれ１として表示する。【００９８】
【表１】
0005631534.tif 000022
【００９９】
これらの変異が転換活性に及ぼす影響を調べた。
まず、pSYN2-39と同じ構造で無変異型のyjiB遺伝子をpRI109に挿入したプラスミドを作製した。Bacillussubtilis 168株の染色体ＤＮＡ(WO 00/44886)を鋳型とし、配列番号３８および３９で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、96℃で1分間保温した後、95℃で30秒間、50℃で45秒間、72℃で3分間からなる工程を25回行い、その後72℃で10分間保温する条件で行った。該ＰＣＲにより、約1.2kbの増幅ＤＮＡ断片を得た。【０１００】
該ＤＮＡ断片をpT7Blue(Novagen社製)と連結して得られた組換え体ＤＮＡを、エレクトロポレーション法を用いて大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換からプラスミドを抽出し、yjiB遺伝子のコーディング領域の塩基配列を決定し、変異のないことを確認した。
該プラスミドをSalIとBamHIで切断して得られたyjiBを含む約1.2kbのＤＮＡ断片を、SalIとBamHIで切断したpRI109およびpBluescriptII SK+に連結して組換え体ＤＮＡを取得し、それぞれpN9およびpN9SKと命名した。【０１０１】
pN9SKのClaI-BamHI部分をpRIyjiBの相当部分と入れ替えることでpN5SKを、またpN5SKのSalI-BamHI断片をpRI109に導入してpN5を作製した。
次に、pSYN2-39を鋳型にし、配列番号４０および３９で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いて、ＰＣＲを行い、yjiB領域を増幅した。得られた1.2kbのＤＮＡ断片をpT-Blue(Novagen社製)に連結して組換え体ＤＮＡを取得した。該組換え体ＤＮＡの塩基配列を決定しpSYN2-39が有する変異を保持していることを確認した後、該組換え体ＤＮＡのSalI-BamHI断片をpRI109およびpBluescriptII SK+に連結して組換え体ＤＮＡを取得し、それぞれpN1およびpN1SKと命名した。【０１０２】
次に、pN1SK、pN5SKおよびpN9SKのClaI-BamHI断片またはEcoRI-BamHI断片をそれぞれ交換することにより、pN1C9SK、pN9C1SK、pN1E9SKおよびpN9E1SKと命名したプラスミドを取得し、さらにこれらのプラスミドのyjiB部分を含むSalI-BamHI断片をpRI109に導入することによりpN1C9、pN9C1、pN1C5、pN1E9およびpN9E1と命名したプラスミドを取得した。
またpN1、pN5およびpN9のDraI-BamHI領域をpN1SK、pN5SK、pN9SKの相当領域と置換することでpN1D9、pN1D5、pN9D1およびpN5D9と命名したプラスミドを取得した。さらにpN1C9およびpN1C5のDraI-BamHI領域をpN1と交換することによりpN1C9D1およびpN1C5D1と命名したプラスミドを取得した。【０１０３】
またpN1C9SKおよびpN1C5SKのEcoRI-BamHI断片をpN1と置換することによりpN1C9E1SKおよびpN1C5E1と命名したプラスミドを取得し、さらに、これらのプラスミドのyjiB部分を含むSalI-BamHI断片をpRI109に導入することでpN1C9E1およびpN1C5E1と命名したプラスミドを取得した。
上記したプラスミドが有するyjiB遺伝子相当部分に存在する変異点と制限酵素部位の位置関係を図２に示す。【０１０４】
上記で得られたpN1、pN5、pN9、pN1C9、pN1C5、pN1E9、pN1D9、pN1D5、pN9C1、pN9E1、pN9D1、pN5D9、pN1C9D1、pN1C5D1、pN1C5E1およびpN1C9E1をエレクトロポレーション法によってそれぞれC. glutamicum ATCC13032に導入した。得られた形質転換体を実施例２と同様の方法で培養し、化合物（VII-a）から化合物（VIII-a）への転換活性を測定した。
結果を表２に示す。【０１０５】
【表２】
0005631534.tif 000023
【０１０６】
表２に示すとおり、８つの変異はyjiB遺伝子産物による化合物（VII-a）から（VIII-a）の転換反応の転換率および転換速度を変化させる効果のあること、変異の効果は相加性があることがわかった。
例えば野生型yjiB(pN9)に比べQ11P変異を持つpN1C9は高い転換率を示すのでこの変異は転換率向上効果を持つことがわかる。一方pN5はV104AとF232L変異をもち、pN9に比べ化合物（VIII-a）の生成量が多いことから転換速度向上効果を持つことがわかる。これらの変異を併せ持つpN1C5は高い転換率と転換速度の両者の性質を併せ持っている。【０１０７】
別の例としてpN1C9とpN1E9を比べると転換速度、転換率ともやや低下しているのでpN1E9に含まれるN83SとV104Aの両方またはどちらかは有害な変異であると考えられる。一方V104A変異のみをもつpN5D9は野生型に比べ転換率はやや低下するものの転換速度が向上している。従ってN83Sは有害もしくは無効変異と推定される。事実pN1からこの変異のみを除いたpN1C5E1はpN1と同等の成績を示した。
【実施例４】
【０１０８】
pSYN2-39codの作製
以下のようにしてpSYN2-39のyjiB遺伝子に相当するコーディング領域のコドンをコリネバクテリウム中での発現に適したコドンに改変した。
まずＤＮＡ合成機を用いて、配列番号１０〜３３で示す配列を合成した。
次に配列番号１０〜１３で表される塩基配列からなるＤＮＡをアニールさせて得られた約200bpのＤＮＡ断片をSalIとHindIIIで消化した後、市販の大腸菌ベクターpUC119のSalI−HindIII部位に導入し、pSC1を取得した。さらに配列番号１４〜１９で表される塩基配列からなるＤＮＡをアニールさせて得られた約280bpのＤＮＡ断片をSphIとHindIIIで消化した後、pSC1のSphI−HindIII部位に挿入しpSC2を取得した。【０１０９】
次に配列番号２０〜２３で表される塩基配列からなるＤＮＡ合成をアニールさせて得られた約200bpのＤＮＡ断片をSalIとBamHIで消化後、pUC119のSalI−BamHI部に導入したpSC3を取得した。さらに配列番号２４〜２７で表される塩基配列からなるＤＮＡをアニールさせて得られた約200bpのＤＮＡ断片をSalIとEcoRVで消化した後、pSC3 のSalI−EcoRV部位に導入したpSC4を取得した。さらに配列番号２８〜３３で表される塩基配列からなるＤＮＡをアニールさせて得られた約200bpのＤＮＡ断片をSalIとEco81Iで消化した後、pSC4のSalI−Eco81I部位に導入しpSC5を取得した。【０１１０】
最後にpSC2をSalIとBglIIで消化した後、得られた約490bpのＤＮＡ断片をpSC5のSalI−BglII部位に導入することによりpUC119のSalI−BamHI部位に約1.2kbの挿入配列を持つプラスミドpSC6を作製した。pSC6作製の過程を図１に示した。
pSC6をBamHIとSalIで消化した後、約1.2kbのＤＮＡ断片を分取し、BamHIとSalIで消化したpRI109に連結し、pSYN2-39codを取得した。【０１１１】
pSYN2-39codをエレクトロポレーション法(WO 00/44886)によってCorynebacterium ammoniagenes ATCC21264株に導入した。
得られた形質転換株をC. ammoniagenes ATCC21264/pSYN2-39codと命名し、VII-aから化合物（VIII-a）への転換活性を以下のようにして測定した。
すなわち、C. ammoniagenes ATCC21264/pSYN2-39codをカナマイシン100μg/mLを含む3mL のASB培地[グルコース 5%, (NH4)2SO4 0.5%, KH2PO40.1%, K2HPO4 0.1%, MgSO4・7H2O 0.1%, 酵母エキス1%, ポリペプトン1%, 尿素0.1%, FeSO4 20mg/L, MnSO4 40mg/L, ZnSO4 10mg/L, CuSO4 2mg/L, L-システイン塩酸塩20mg/L, βアラニン15mg/L, ビオチン100mg/L, チアミン15mg/L, アデニン100mg/L, グアニン100mg/L (pH7.2)]が入った試験管に植菌し、30℃で一晩振とう培養した。得られた培養物のうち0.2 mLをカナマイシン100μg/mLを含む1.8mL のAPB培地[グルコース4%, (NH4)2SO40.35%, KH2PO4 0.43%, K2HPO4 1.45%, MgSO4・7H2O 0.4%, コーンスティープリカー 2%, FeSO4 10mg/L, MnSO4 4mg/L, ZnSO4 20mg/L, CuSO4 0.5mg/L, L-システイン塩酸塩20mg/L, パントテン酸カルシウム10mg/L, ビオチン60μg/L, チアミン15mg/L, アデニン90mg/L, グアニン90mg/L (pH7.2)]が入った試験管に添加し、30℃で５時間振とう培養した後、実施例１で調製した化合物（VII-b）を終濃度500mg/Lになるよう添加して、更に30℃で20時間振とう培養した。得られた培養液中の化合物（VIII-a）および（VII-a）を実施例２と同様に測定した（表３）。【０１１２】
【表３】
0005631534.tif 000024
【実施例５】
【０１１３】
第一世代変異型遺伝子の作製
C. ammoniagenes ATCC21264/pSYN2-39codの化合物（VII-a）から化合物（VIII-a）への転換率を向上させるため、エラープローンＰＣＲ法でpSYN2-39cod中のyjiB遺伝子に相当する遺伝子のコーディング領域に変異を導入した。
即ち、pSC6を鋳型にし、配列番号４１および４２で表される塩基配列をプライマーセットに用いて0.3mmol/lのMnCl2を含む反応液中でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、96℃で1分間保温した後、95℃で30秒間、58℃で30秒間、72℃で2分間からなる工程を25回行い、その後72℃で10分間保温する条件で行った。該ＰＣＲにより、約1.2kbのＤＮＡ部分にランダムに変異が導入されたＤＮＡ断片を取得した。【０１１４】
該ＤＮＡ断片をSalIとBamHIで切断後、SalIとBamHIで切断したpSYN2-39codのベクター部分と連結して組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡをエレクトロポレーション法を用いて大腸菌DH10Bに導入した。
得られた形質転換株のコロニーを、96穴タイタープレートを用いてLB培地（バクトトリプトン １％, 酵母エキス 0.5％, NaCl 1％）中でそれぞれ培養した後、培養物を混合し、アルカリ法にてプラスミドを抽出した。このランダム変異遺伝子を保有するプラスミドをC. ammoniagenes ATCC21264株にエレクトロポレーション法によって導入し、ランダム変異が導入された遺伝子を有する組換え株ライブラリーを作製した。【０１１５】
上記ライブラリーの各株を実施例４に記載した方法で培養し、化合物（VII-a）から化合物（VIII-a）への転換活性を測定した。数千株を反応試験に供し、高い転換活性を示す４株を選択した。それぞれの株の有するプラスミドをpEP77、pEP129、pEP139およびpEP268と名づけた。これら４株の試験結果を上記表３に示した。
表３に示すとおり、pSYN2-39cod保有株に比べ、大幅に転換速度、転換率が向上していた。【０１１６】
pEP77、pEP129、pEP139およびpEP268をそれぞれ単離し、yjiB遺伝子相当部分のコーディング領域の塩基配列を決定した。各プラスミドはpSYN2-39codに対して表４に示すような変異を有していた。【０１１７】
【表４】
0005631534.tif 000025
【０１１８】
表４に示すとおり、pEP77、pEP129、pEP139およびpEP268が有する変異には、化合物（VII-a）から化合物（VIII-a）への転換効率向上に有利にはたらく変異が含まれることが明らかになった。
【実施例６】
【０１１９】
第二世代変異型遺伝子の作製
より高い転換効率をもつ変異型pSYN2-39codを得るため、pEP77、pEP129、pEP139およびpEP268の有する変異を組み合わせた。
pEP77をSalIとBamHIで消化し、約1.2kbのＤＮＡ断片を取得した。これをSalIとBamHIで消化した大腸菌のベクターpHSG299（タカラバイオ社製）と連結し、大腸菌DH5αを形質転換することによって、組換え体ＤＮＡを作製した。【０１２０】
同様の手順で、pEP129、pEP139およびpEP268中の約1.2kbのSalI-BamHI消化ＤＮＡ断片を、それぞれpHSG299のSalI-BamHIサイトに挿入し、p129、p139およびp268をそれぞれ作製した。
p268をEcoRVとBamHIで消化して得られた約3.7kbのＤＮＡ断片と、p139をEcoRVとBamHIで消化して得られた約0.2kbのＤＮＡ断片とを連結して組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡを用いて大腸菌DH5αを形質転換することによって、p268上の約0.2kbのEcoRV-BamHI領域がp139由来のEcoRV-BamHI領域で置換されたp268aを作製した。【０１２１】
同様の手順でp268aの約0.05kbのNcoI-HpaI領域をp139由来の約0.05kbのNcoI-HpaI領域で置換してp346を、p268aの約0.5kbのBglII-EcoRV領域をp77由来の約0.5kbのBglII-EcoRV領域で置換してp509を、p268aの約0.5kbのBglII-EcoRV領域をp139由来の約0.5kbのBglII-EcoRV領域で置換してp709を、p268aの約1.4kbのCfr10I-Cfr10I(片方はベクター側に存在)領域をp129由来の約1.4kbのCfr10I-Cfr10I領域で置換してp849を作成した。【０１２２】
上記で取得したp346、p509、p709およびp849を、それぞれSalIおよびBamHIで消化し、約1.2kbのSalI-BamHIＤＮＡ断片を取得し、SalIとBamHIで消化したpRI109と連結して組換え体ＤＮＡを作製した後、該組換え体ＤＮＡを用いて大腸菌DH5αを形質転換することによって、pES346、pES509、pES709およびpES849を作製した。
上記プラスミドをC. ammoniagenes ATCC21264株にエレクトロポレーション法によって導入し、形質転換株を取得した。各形質転換株を実施例２に記載した方法で培養し、化合物（VII-a）から化合物（VIII-a）への転換活性を測定した（表３）。【０１２３】
表３に示すとおり、いずれの株も第一世代変異型遺伝子を保有する形質転換株より高い転換率を示したことから、変異の組み合わせによって転換効率をさらに向上させることが可能であることが明らかになった。
【実施例７】
【０１２４】
第三世代変異型遺伝子の作製
実施例３の結果から、pSYN2-39codが有する約1.2kbのSalI-BamHI断片にコードされる化合物（VII-a）から化合物（VIII-a）への転換を触媒する酵素の83番目のセリン残基をアスパラギンに置換することで転換効率が向上する可能性が示唆されている。そこで実施例６で作製したプラスミドにさらに該置換変異を導入した。【０１２５】
pES346を鋳型とし、配列番号４３および４４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、96℃で1分間保温した後、96℃で1分間、58℃で1分間、72℃で1分間からなる工程を25サイクル行い、その後72℃で10分間保温する条件で行った。
該ＰＣＲで得られた約330bpの増幅ＤＮＡ断片をSalIとHpaIで消化し、pES346の対応するSalI-HpaI部分と置換することでpES78-1を作製した。pES78-1は化合物（VII-a）から化合物（VIII-a）への転換を触媒する酵素の83番目のセリン残基がアスパラギンに変わっている以外はpES346と同じである。【０１２６】
同様にしてpES849から化合物（VII-a）から化合物（VIII-a）への転換を触媒する酵素の83番目のセリン残基がアスパラギンに変わっているpES849-1を作成した。
さらにpES503の約0.3kbのSalI-HpaI領域をpES78-1由来の約0.3kbのSalI-HpaI領域で置換したpES503-1も作製した。
pES78-1、pES849-1およびpES503-1を、それぞれC. ammoniagenes ATCC21264株にエレクトロポレーション法によって導入し、形質転換株を取得した。各形質転換株を実施例２に記載した方法で培養し、化合物（VII-a）から化合物（VIII-a）への転換活性を測定した。結果は上記表３に示した。【０１２７】
表３に示すとおり、83番目のセリンをアスパラギンに置換した酵素、およびpES78-1とpES849-1が有する変異を組み合わせた酵素の化合物（VII-a）から化合物（VIII-a）への転換効率が向上している。
以上の結果から、yjiB遺伝子を改変することで化合物（VII-a）から（VIII-a）への転換速度、転換効率を向上させることができること、こうした性質の変化をもたらす変異は相加的な効果を有することが明らかになった。したがって、上記した各変異の任意の組み合わせを有する酵素もまた、優れた転換速度または／および転換効率を有すると予想できる。
【産業上の利用可能性】
【０１２８】
本願発明の蛋白質を用いることにより、HMG-CoAレダクターゼを阻害し、血清コレステロールの低下作用を有する化合物を工業的に有利に製造することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１２９】
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配列番号４４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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