(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＰＴＫ７に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合部分であって、以下：
配列番号１２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
配列番号１６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
配列番号２０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
配列番号２５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
配列番号３１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および、
配列番号３７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、
抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２】
ヒトＰＴＫ７に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合部分であって、以下：
配列番号１４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
配列番号１８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
配列番号２２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
配列番号２８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
配列番号３４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および、
配列番号４０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、
抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３】
ヒトＰＴＫ７に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合部分であって、以下：
配列番号１３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
配列番号１７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
配列番号２１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
配列番号２６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
配列番号３２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および、
配列番号３８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、
抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４】
それぞれ配列番号２および配列番号７に示される重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５】
それぞれ配列番号４および配列番号１０に示される重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、請求項２に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項６】
それぞれ配列番号３および配列番号８に示される重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、請求項３に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項７】
単離されたヒトのモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体またはその抗原結合部分が：
ヒトＰＴＫ７に特異的に結合し；かつ
配列番号１２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号２０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号２５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号３１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号３７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、
抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８】
単離されたヒトのモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体またはその抗原結合部分が：
ヒトＰＴＫ７に特異的に結合し；かつ
配列番号１４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号２２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号２８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号３４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号４０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、
抗体またはその抗原結合部分。
【請求項９】
単離されたヒトのモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体またはその抗原結合部分が：
ヒトＰＴＫ７に特異的に結合し；かつ
配列番号１３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号２１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号２６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号３２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号３８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、
抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１０】
単離されたヒトのモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体またはその抗原結合部分が：
ヒトＰＴＫ７に特異的に結合し；かつ
それぞれ配列番号２および配列番号７に示される重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、
抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１１】
単離されたヒトのモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体またはその抗原結合部分が：
ヒトＰＴＫ７に特異的に結合し；かつ
それぞれ配列番号４および配列番号１０に示される重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、
抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１２】
単離されたヒトのモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体またはその抗原結合部分が：
ヒトＰＴＫ７に特異的に結合し；かつ
それぞれ配列番号３および配列番号８に示される重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、
抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１３】
治療剤に結合している、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分を含む、免疫結合体であって、該治療剤は、細胞毒素または放射性同位元素である、免疫結合体。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分、あるいは請求項１３に記載の免疫結合体、および製薬学的に受容可能な担体を含む組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分をコードする、単離された核酸分子。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１８】
インビトロで抗ＰＴＫ７抗体を調製するための方法であって、請求項１７に記載の宿主細胞において該抗体を発現する工程、および、該宿主細胞から該抗体を単離する工程を含む、方法。
【請求項１９】
ＰＴＫ７を発現する腫瘍細胞の増殖によって特徴づけられる癌を治療または予防する方法において使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２０】
前記癌が、結腸癌、肺癌、乳癌、すい臓癌、メラノーマ、急性骨髄性白血病、腎臓癌、膀胱癌、卵巣癌、および前立腺癌からなる群より選択される、請求項１９に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願）
この出願は、２００５年１２月８日に出願され、その全体が本明細書において参考として援用される、米国仮特許出願第６０／７４８，３７３号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、細胞外環境からの生物学的シグナルを、細胞内部に伝える、膜貫通シグナル伝達タンパクである。ＲＴＫシグナルの調節は、細胞増殖、分化、軸索成長、上皮増殖、発達、接着、移動、およびアポトーシスの調節にとって重要である（非特許文献１；非特許文献２）。ＲＴＫは、いくつかの形状の癌の発達と進行に関与することが知られる。大抵のＲＴＫ−関連癌では、遺伝子の突然変異ではなく、むしろ受容体タンパクの増幅が起こっている（非特許文献３）。
【０００３】
受容体タンパクチロシンキナーゼファミリーの一員である、タンパク質チロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）が、最初に、正常なヒトのメラノサイトから単離され、ＲＴ−ＰＣＲによってクローン化された（非特許文献４；非特許文献５）。それとは別に、該遺伝子は、ヒトの結腸癌由来細胞株からクローン化され、結腸癌キナーゼ４（ＣＣＫ４）と名づけられた（非特許文献６）。ＰＴＫ７は、検出可能な、チロシンキナーゼ触媒活性を欠くが、シグナル変換活性を保持し、恐らく、細胞接着分子として機能すると考えられる、ＲＴＫサブセットに属する。
【０００４】
ＰＴＫ７のｍＲＮＡは、結腸癌由来細胞株においては様々に発現されるが、ヒト成人の結腸組織においては発現されないことが認められている（非特許文献６）。ＰＴＫ７発現はさらに、いくつかのメラノーマ細胞株およびメラノーマ生検標本にも見られた（非特許文献７）。別のスプライス形態が、ヘパトーマおよび結腸癌細胞に発現されるのが認められた（非特許文献８）。さらに、ＰＴＫ７は、急性骨髄性白血病サンプルにおいてきわめて過剰に発現されることが認められた（非特許文献９）。特許文献１に記載されるように、免疫組織学によって、ＰＲＫ７の腫瘍特異的染色が、乳房、結腸、肺、すい臓、腎臓、および膀胱の癌において観察された。
【０００５】
したがって、ＰＴＫ７を認識する薬剤、およびそのような薬剤を用いる方法が望まれている。
【特許文献１】国際公開第０４／１７９９２号パンフレット
【非特許文献１】Ｐｒｅｎｚｅｌら、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｌａｔ．Ｃａｎｃｅｒ（２００１）８：１１−３１
【非特許文献２】Ｈｕｂｂａｒｄ  ａｎｄ  Ｔｉｌｌ  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０００）６９：３７３−９８
【非特許文献３】Ｋｏｂｕｓ  ａｎｄ  Ｆｌｅｍｉｎｇ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００５）４４：１４６４−７０
【非特許文献４】Ｌｅｅら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９３）８：３４０３−１０
【非特許文献５】Ｐａｒｋら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９６）１１９：２３５−９
【非特許文献６】Ｍｏｓｓｉｅら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９５）１１：２１７９−８４
【非特許文献７】Ｅａｓｔｙら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９７）７１：１０６１−５
【非特許文献８】Ｊｕｎｇら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ（２００２）１５７９：１５３−６３
【非特許文献９】Ｍｕｌｌｅｒ−Ｔｉｄｏｗら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００４）１０：１２４１−９
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、ＰＴＫ７に結合し、数多くの望ましい特性を発揮する、単離されたモノクローナル抗体、特に、ヒトのモノクローナル抗体を提供する。そのような特性として、ヒトＰＴＫ７に対する、およびウィルムス腫瘍細胞に対する高い親和性の結合が挙げられる。さらに、本発明の抗体および組成物の使用による、各種ＰＴＫ７介在性疾患の治療法が提供される。
【０００７】
一局面では、本発明は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって：
前記抗体が
（ａ）ヒトのＰＴＫ７に特異的に結合し；かつ、
（ｂ）ウィルムス腫瘍細胞株（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１４４１）に結合する、抗体またはその抗原結合部分に関する。
【０００８】
抗体はヒト抗体であることが好ましいが、別の実施態様では、抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体であってもよい。
【０００９】
より好ましい実施態様では、抗体は、４．０ｎＭ以下のＥＣ５０においてウィルムス腫瘍細胞に結合するか、または、３．５ｎＭ以下のＥＣ５０においてウィルムス腫瘍細胞に結合する。
【００１０】
もう一つの実施態様では、抗体は、Ａ−４３１（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５５５）、Ｓａｏｓ−２（ＡＴＣＣアクセッション番号ＨＴＢ−８５）、ＳＫＯＶ−３（ＡＴＣＣアクセッション番号ＨＴＢ−７７）、ＰＣ３（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１４３５）、ＤＭＳ１１４（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−２０６６）、ＡＣＨＮ（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１６１１）、ＬＮＣａＰ（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１７４０）、ＤＵ１４５（ＡＴＣＣアクセッション番号ＨＴＢ−８１）、ＬｏＶｏ（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＣＬ−２２９）、およびＭＩＡ  ＰａＣａ−２（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１４２０）細胞株からなる群より選択される癌細胞株に結合する。
【００１１】
もう一つの実施態様では、本発明は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分であって、該抗体は、ＰＴＫ７に結合するために、参照抗体と交差競合（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐｅｔｅ）し、この参照抗体が：
（ａ）ヒトのＰＴＫ７に特異的に結合し；
（ｂ）ウィルムス腫瘍細胞株（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１４４１）に結合する、該抗体、またはその抗原結合性部分を提供する。
【００１２】
様々の実施態様において、参照抗体は：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および、
（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、
または、参照抗体は：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および、
（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、
または、参照抗体は：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および、
（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、
または、参照抗体は：
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および、
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、
または、参照抗体は：
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および、
（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、
または、参照抗体は：
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および、
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００１３】
一局面において、本発明は、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、ヒトのＶＨ３−３０．３遺伝子の産物である、または該遺伝子から得られる重鎖可変領域を含み、前記抗体は、ＰＴＫ７に特異的に結合する、抗体、またはその抗原結合部分に関する。本発明はさらに、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、ヒトのＶＨＤＰ４４遺伝子の産物である、または該遺伝子から得られる重鎖可変領域を含み、ＰＴＫ７に特異的に結合する、抗体、またはその抗原結合部分を提供する。本発明はさらに、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、ヒトのＶＨ３−３３遺伝子の産物である、または該遺伝子から得られる重鎖可変領域を含み、ＰＴＫ７に特異的に結合する、抗体、またはその抗原結合部分を提供する。本発明はさらに、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、ヒトのＶＫＬ１５遺伝子の産物である、または該遺伝子から得られる軽鎖可変領域を含み、ＰＴＫ７に特異的に結合する、抗体、またはその抗原結合部分を提供する。本発明はさらに、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、ヒトのＶＫＡ１０遺伝子の産物である、または該遺伝子から得られる軽鎖可変領域を含み、ＰＴＫ７に特異的に結合する、抗体、またはその抗原結合部分を提供する。本発明はさらに、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、ヒトのＶＫＡ２７遺伝子の産物である、または該遺伝子から得られる軽鎖可変領域を含み、ＰＴＫ７に特異的に結合する、抗体、またはその抗原結合部分を提供する。本発明はさらに、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、ヒトのＶＫＬ６遺伝子の産物である、または該遺伝子から得られる軽鎖可変領域を含み、ＰＴＫ７に特異的に結合する、抗体、またはその抗原結合部分を提供する。
【００１４】
好ましい組み合わせは：
（ａ）配列番号１１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号２９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および、
（ｆ）配列番号３５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【００１５】
もう一つの好ましい組み合わせは：
（ａ）配列番号１１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号３０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および、
（ｆ）配列番号３６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【００１６】
もう一つの好ましい組み合わせは：
（ａ）配列番号１２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号２０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号３１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および、
（ｆ）配列番号３７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【００１７】
もう一つの好ましい組み合わせは：
（ａ）配列番号１３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号２１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号３２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および、
（ｆ）配列番号３８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【００１８】
もう一つの好ましい組み合わせは：
（ａ）配列番号１３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号２１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号３３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および、
（ｆ）配列番号３９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【００１９】
もう一つの好ましい組み合わせは：
（ａ）配列番号１４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号２２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号３４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および、
（ｆ）配列番号４０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【００２０】
本発明の、他の、好ましい抗体、またはその抗原結合部分は：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および、
（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００２１】
もう一つの、好ましい組み合わせは：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および、
（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００２２】
もう一つの、好ましい組み合わせは：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および、
（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００２３】
もう一つの、好ましい組み合わせは：
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および、
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００２４】
もう一つの、好ましい組み合わせは：
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および、
（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００２５】
もう一つの、好ましい組み合わせは：
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および、
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００２６】
本発明の抗体は、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプの、例えば、完全長抗体であってもよい。それとは別に、抗体は、抗体断片、例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’２断片、あるいは一本鎖抗体であってもよい。
【００２７】
本発明はさらに、治療剤、例えば、細胞毒素または放射性同位元素に結合した本発明の抗体、またはその抗原結合部分を含む免疫結合体を提供する。本発明はさらに、本発明の抗体、またはその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する第２機能成分に結合される、本発明の前記抗体、またはその抗原結合部分を含む、二重特異的分子を提供する。
【００２８】
さらに、本発明の抗体、またはその抗原結合部分、あるいは本発明の免疫結合体、または二重特異的分子、および製薬学的に受容可能な担体を含む組成物が提供される。
【００２９】
本発明の抗体、またはその抗原結合部分をコードする核酸分子も、そのような核酸を含む発現ベクター、およびそのような発現ベクターを含む宿主細胞同様、本発明によって包含される。さらに、本発明は、ヒトの免疫グロブリン重鎖および軽鎖導入遺伝子を含み、本発明の抗体を発現する遺伝子導入マウスの他、そのようなマウスから調製され、本発明の抗体を生産するハイブリドーマも提供する。
【００３０】
さらに別の局面では、本発明は、ＰＴＫ７を発現する腫瘍細胞の増殖によって特徴づけられる疾患の治療または予防法であって、本発明の抗体、またはその抗原結合部分を、該疾患の治療または予防に有効な量において被験体に投与することを含む方法を提供する。疾患は、例えば、癌、例えば、結腸癌（小腸癌を含む）、肺癌、乳癌、すい臓癌、メラノーマ（例えば、転移性悪性メラノーマ）、急性骨髄性白血病、腎臓癌、膀胱癌、卵巣癌、および前立腺癌であってもよい。
【００３１】
好ましい実施態様では、本発明は、抗ＰＴＫ７抗体を用いてインビボで癌を治療する方法を提供する。この抗ＰＴＫ７抗体は、マウス、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体であってもよい。本発明の方法を用いて治療することが可能な、他の癌の例としては、腎臓癌（例えば、腎細胞癌）、グリア芽細胞腫、脳腫瘍、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を含む慢性または急性白血病、成人Ｔ細胞白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球白血病、慢性リンパ球白血病、リンパ腫（例えば、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、リンパ球リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、結節型核切れ込み小細胞リンパ腫、抹消Ｔ細胞リンパ腫、レナートリンパ腫、免疫芽細胞リンパ腫、Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、内芽細胞／中心細胞（ｃｂ／ｃｃ）濾胞性リンパ腫癌、Ｂ細胞株瀰漫性大細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞リンパ節症（ＡＩＬＤ）様Ｔ細胞リンパ腫、およびＨＩＶ関連体腔性リンパ腫）、胎生期癌、鼻咽頭の未分化癌（例えば、シュミンケ腫瘍）、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症およびその他のＢ細胞リンパ腫、鼻咽頭癌、骨癌、皮膚癌、頭部または頸部の癌、皮膚または眼内の悪性メラノーマ、子宮癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、膣癌、陰門癌、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、幼児期の固体腫瘍、膀胱癌、腎臓または尿管の癌、腎盤癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、脳下垂体腺癌、類表皮癌、扁平上皮細胞癌、アスベストス誘発癌、例えば、中皮腫を含む環境誘発癌、ならびに上記癌の組み合わせが挙げられる。
【００３２】
本発明の、他の特徴および利点は、下記の詳細な説明および実施例、ただしこれらを限定的なものと考えてはならない、から明らかとなろう。本出願全体を通じて引用される、全ての参照文献、Ｇｅｎｂａｎｋ記事、特許および公開特許出願は、引用により本明細書に含めることをここに明言する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
（発明の詳細な説明）
一局面において、本発明は、ＰＴＫ７に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体、特に、ヒトのモノクローナル抗体に関する。ある実施態様では、本発明の抗体は、一つ以上の所望の機能性、例えば、ＰＴＫ７に対する高親和性結合、および／あるいは、インビトロまたはインビボにおいて腫瘍細胞増殖に対する抑制能力を示す。ある実施態様では、本発明の抗体は、重鎖および軽鎖生殖系配列から得られ、および／または、特定の構造的特徴、例えば、特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ領域を含む。本発明は、単離抗体と、そのような抗体を産生する方法、そのような抗体を含む免疫結合体および二重特異性分子、ならびに、本発明の抗体、免疫結合体、または二重特異性分子を含む製薬組成物を提供する。本発明はさらに、抗体の使用法、例えば、癌などの疾患を治療する方法に関する。
【００３４】
本発明をより容易に理解することが可能となるように、先ずいくつかの用語を定義する。さらに別の定義が、本詳細な説明全体を通じて記載される。
【００３５】
用語“ＰＴＫ７”および“ＣＣＫ４”は相互交換的に使用され、ヒトＰＴＫ７の変種、アイソタイプ、および同族分子を含む。したがって、本発明のヒト抗体は、ある場合には、ヒト以外の動物種由来のＰＴＫ７と交差反応してもよい。ある実施態様では、抗体は、一つ以上のヒトＰＴＫ７に対して完全に特異的であってもよく、同族分子または他の型の非ヒト交差反応性を示さなくともよい。例示のヒトＰＴＫ７の完全なアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２８２１を有する（配列番号５８）。
【００３６】
「免疫反応」という用語は、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、捕食細胞、顆粒球、ならびに、上記細胞または肝臓によって生産される可溶性巨大分子（例えば、抗体、サイトカイン、および補体を含む分子）の活動であって、侵入病原体、病原体に感染した細胞または組織、癌細胞、または、自己免疫または病的炎症の場合は、ヒトの正常細胞または組織、の選択的傷害、破壊、または、それらの人体からの排除をもたらす活動を指す。
【００３７】
「シグナル伝達経路」は、細胞の一部分から細胞の別部分へのシグナル伝達を担当する、各種シグナル伝達分子の間の生化学的関係を指す。本明細書で用いる場合、「細胞表面受容体」という語句は、例えば、シグナルを受容し、そのようなシグナルを、細胞の原形質膜を横切って伝達することが可能な分子、および分子複合体を含む。本発明の「細胞表面受容体」の一例は、ＰＴＫ７受容体である。
【００３８】
本明細書で言及される「抗体」という用語は、抗体全体、および、その任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）、またはその単一鎖を含む。「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互に接続される、少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖、または抗原結合部分を含む糖タンパクを指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略称される）、および重鎖定常域から構成される。重鎖定常域は、三つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略称される）、および軽鎖定常域から構成される。軽鎖定常域は、一つのドメインＣＬから構成される。ＶＨおよびＶＬ域は、枠組み構造領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的保存される領域の間に分散される、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変領域にさらに細分される。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に下記の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置される三つのＣＤＲおよび四つのＦＲから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用を持つ結合ドメインを含む。抗体の定常域は、宿主の組織または因子、例えば、免疫系の各種細胞（例えば、エフェクター細胞）、および古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）に対する、該免疫グロブリンの結合を仲介する。
【００３９】
本明細書で用いる、抗体の「抗原結合部分」（または、単に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えば、ＰＴＫ７）に特異的に結合する能力を保持する抗体の一つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長の抗体の断片によって実行が可能であることを示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語の中に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、すなわち、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインから成る一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、すなわち、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって結合される、二つのＦａｂ断片から成る２価の断片；（ｉｉｉ）Ｆａｂ’断片、これは、Ｆａｂと事実上同じであるが、ヒンジ領域の一部を有する（ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｐａｕｌ  ｅｄ．，３．ｓｕｐ．ｒｄ．ｅｄ．１９９３）；（ｉｖ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄ断片；（ｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖ断片；（ｖｉ）ＶＨドメインから成るｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；（ｖｉｉ）単離された相補性決定域（ＣＤＲ）；および、（ｖｉｉｉ）ナノ抗体、すなわち、単一可変ドメインおよび二つの定常ドメインを含む、重鎖可変領域が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の二つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、組み換え法を用い、合成リンカーによって接合し、単一のタンパク鎖として、すなわち、その中において、ＶＬおよびＶＨ領域が対を為して一価の分子を形成する単一タンパク鎖（単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と呼ばれる、例えば、Ｂｉｒｄら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照されたい）として製造されてもよい。このような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることが意図される。これらの抗体断片は、当業者には周知の従来技術を用いて入手され、断片は、天然の抗体の場合と同様にして有用性についてスクリーニングされる。
【００４０】
本明細書で用いる「単離抗体」とは、異なる抗原特異性を有する、他の抗体を実質的に含まない抗体（例えば、ＰＴＫ７に特異的に結合する単離抗体は、ＰＴＫ７以外の抗原に結合する抗体を実質的に含まない）を指すことが意図される。しかしながら、ＰＴＫ７に特異的に結合する単離抗体は、他の抗原、例えば、他の動物種のＰＴＫ７分子に対し交差反応性を有してもよい。さらに、単離抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まなくともよい。
【００４１】
本明細書で用いる「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成物である抗体分子の調製品を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対し、単一の結合特異性および親和性を示す。
【００４２】
本明細書で用いる「ヒト抗体」という用語は、枠組み構造およびＣＤＲの両領域が、ヒトの生殖系列免疫グロブリン配列に由来する、可変領域を有する抗体を含むことが意図される。さらに、抗体が定常域を含む場合、その定常域も、ヒトの生殖系列免疫グロブリン配列由来のものである。本発明のヒト抗体は、ヒトの生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロのランダムまたは部位特異的突然変異発生、あるいはインビボの体性突然変異によって導入される突然変異）を含んでもよい。しかしながら、本明細書で用いられる「ヒト抗体」という用語は、別の哺乳動物種、例えば、マウスの生殖系列由来のＣＤＲ配列が、ヒトの枠組み構造配列に植え付けられる抗体を含むことは意図されない。
【００４３】
「ヒト・モノクローナル抗体」という用語は、枠組み構造およびＣＤＲの両領域が、ヒトの生殖系列免疫グロブリン配列由来である可変領域を有する、単一結合特異性を示す抗体を指す。一実施態様では、ヒト・モノクローナル抗体は、非ヒト遺伝子導入動物、例えば、遺伝子導入マウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマであって、恒久化された細胞に融合された、ヒトの重鎖導入遺伝子およびヒトの軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するハイブリドーマによって生産される。
【００４４】
本明細書で用いる「組み換えヒト抗体」という用語は、組み換え手段によって調製、発現、創製、または単離される全てのヒト抗体を含み、例えば、（ａ）ヒトの免疫グロブリン遺伝子に対し、遺伝子導入的に、または染色体横断的に導入された動物（例えば、マウス）から単離される抗体、（ｂ）ヒトの抗体を発現するように転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離される抗体、（ｃ）組み換え体、ヒトの組み換え抗体ライブラリーから単離される抗体、および、（ｄ）ヒトの免疫グロブリン遺伝子配列をスプライシングして他のＤＮＡ配列を生成することを含む、任意の他の手段によって調製、発現、創製、または単離される抗体が挙げられる。このような、ヒトの組み換え抗体は、その枠組み構造およびＣＤＲ領域が、ヒトの生殖系列免疫グロブリン配列由来である可変領域を有する。しかしながら、ある実施態様では、このような組み換えヒト抗体に対しインビトロ突然変異発生（あるいは、ヒトのＩｇ配列を遺伝子導入された動物を用いる場合は、インビボ体性突然変異発生）を実施し、それによって、組み換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域が、ヒトの生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列から得られ、関連しながらも、天然ではインビボのヒトの抗体生殖系列レパートリーの中には含まれない配列となるようにされてもよい。
【００４５】
本明細書で用いられる「アイソタイプ」とは、重鎖定常域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。
【００４６】
「ある抗原を認識する抗体」、および「ある抗原に対して特異的な抗体」という語句は、本明細書では、「ある抗原に対して特異的に結合する抗体」という用語と相互交換的に使用される。
【００４７】
「ヒト抗体誘導体」という用語は、ヒトの抗体の、任意の修飾形、例えば、抗体と、別の因子または抗体との結合体を指す。
【００４８】
「ヒト化抗体」という用語は、別の哺乳動物種、例えば、マウスの生殖系列から得られたＣＤＲ配列が、ヒトの枠組み構造配列に植え付けられた抗体を指すことが意図される。このヒト枠組み構造配列内に、さらに新たな枠組み領域修飾を加えてもよい。
【００４９】
「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列が一動物種から得られ、定常域配列が、別の動物種から得られた抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体から得られ、定常域配列がヒト抗体から得られた抗体を指すことが意図される。
【００５０】
本明細書で用いる、「ヒトのＰＴＫ７に特異的に結合する」抗体とは、１ｘ１０−７Ｍ以下、より好ましくは５ｘ１０−８Ｍ以下、より好ましくは１ｘ１０−８Ｍ以下、より好ましくは５ｘ１０−９Ｍ以下のＫＤにおいて、ヒトのＰＴＫ７に結合する抗体を指すことが意図される。
【００５１】
本明細書で用いるタンパクまたは細胞に対し「実質的に結合しない」という用語は、該タンパクまたは細胞に対し結合しない、または高い親和性をもって結合しないこと、すなわち、該タンパクまたは細胞に対し、１ｘ１０−６Ｍ以上、より好ましくは１ｘ１０−５Ｍ以上、より好ましくは１ｘ１０−４Ｍ以上、より好ましくは１ｘ１０−３Ｍ以上、さらに好ましくは１ｘ１０−２Ｍ以上のＫＤにおいて結合することを意味する。
【００５２】
本明細書で用いる“Ｋａｓｓｏｃ”または“Ｋａ”という用語は、ある特定の抗体−抗原相互作用の会合率を指すことが意図され、一方、本明細書で用いる“Ｋｄｉｓ”または“Ｋｄ”という用語は、ある特定の抗体−抗原相互作用の解離率を指すことが意図される。本明細書で用いる“ＫＤ”という用語は、ＫｄのＫａに対する比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される、解離定数を指すことが意図される。抗体のＫＤ値は、従来技術において確立された方法を用いて定めることが可能である。抗体のＫＤを定めるための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴によるもの、好ましくは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムによるものである。
【００５３】
本明細書で用いる、ＩｇＧ抗体における「高い親和性」という用語は、標的抗原に対し、１０−８Ｍ以下、より好ましくは１０−９Ｍ以下、さらに好ましくは１０−１０Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。しかしながら、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプにおいて変動してよい。例えば、ＩｇＭアイソタイプにおける「高親和性」結合は、１０−７Ｍ以下、より好ましくは１０−８Ｍ以下、さらに好ましくは１０−９Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。
【００５４】
本明細書で用いる「被験体」という用語は、任意の、ヒトまたは非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳類および非哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。
【００５５】
本発明の各種局面が、下記のサブセクションにさらに詳細に記載される。
【００５６】
抗ＰＴＫ７抗体
本発明の抗体は、該抗体の、特定の機能的特性または性質によって特徴づけられる。例えば、この抗体は、ＰＴＫ７に対して特異的に結合する。本発明の抗体は、ＰＴＫ７に対し、高い親和度で、例えば、１ｘ１０−７Ｍ以下のＫＤにおいて結合するのが好ましい。本発明の抗ＰＴＫ７抗体は、下記の特徴の内の一つ以上を示すことが好ましい。
【００５７】
（ａ）ヒトのＰＴＫ７に対して特異的に結合する；または、
（ｂ）ウィルムスの腫瘍細胞株（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１４４１）に対して結合する。
好ましくは、抗体は、ヒトのＰＴＫ７に対し５ｘ１０−８Ｍ以下のＫＤにおいて結合する、ヒトのＰＴＫ７に対し１ｘ１０−８Ｍ以下のＫＤにおいて結合する、ヒトのＰＴＫ７に対し５ｘ１０−９Ｍ以下のＫＤにおいて結合する、または、ヒトのＰＴＫ７に対し１ｘ１０−８Ｍから１ｘ１０−１０Ｍ以下のＫＤにおいて結合する。好ましくは、該抗体は、ウィルムス腫瘍細胞に対し、４．０ｎＭ以下のＥＣ５０において結合するか、または、ウィルムス腫瘍細胞に対し、３．５ｎＭ以下のＥＣ５０において結合する。ＰＴＫ７に対する抗体の結合能力を評価するための標準的アッセイは、従来技術で既知であるが、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、およびＲＩＡを含む。抗体の結合速度特性（例えば、結合親和度）も、従来技術で既知の標準アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、スキャッチャードおよびＢｉａｃｏｒｅ分析によるアッセイによって評価することが可能である。別の一例として、本発明の抗体は、腎臓癌腫瘍細胞株、例えば、ウィルムス腫瘍細胞株に対して結合してもよい。前述の特徴の内のいずれかの特徴を評価するのに好適なアッセイが、実施例に詳述される。
【００５８】
モノクローナル抗体３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａ、および７Ｃ８
本発明の好ましい抗体は、実施例１に記載されるように単離され、構造的に特徴が解明された、ヒト・モノクローナル抗体３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａ、および７Ｃ８である。当業者であれば、抗体３Ｇ８および３Ｇ８ａは、抗体１２Ｃ６および１２Ｃ６ａ同様、その軽鎖配列では異なるものの、同じ重鎖配列を有することが了解されるであろう。３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａ、および７Ｃ８のＶＨアミノ酸配列を、配列番号１（３Ｇ８および３Ｇ８ａ）、２（４Ｄ５）、３（１２Ｃ６および１２Ｃ６ａ）、および４（７Ｃ８）に示す。３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａ、および７Ｃ８のＶＬアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号５、６、７、８、９、および１０に示す。
【００５９】
これらの抗体のそれぞれが、ＰＴＫ７に結合することが可能なのであるから、これらＶＨおよびＶＬ配列を「混ぜ合わせ、一致させて」、本発明の、他の、抗ＰＴＫ７結合分子を創出することが可能である。このような「混ぜ合わせ、一致させた」抗体のＰＴＫ７結合は、前述の、および実施例中の結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を用いることによって試験することが可能である。ＶＨおよびＶＬ鎖を混ぜ合わせ、一致させる場合は、ある特定のＶＨ／ＶＬペアのＶＨ配列が、構造的には近似のＶＨ配列によって置換されるのが好ましい。同様に、ある特定のＶＨ／ＶＬペアのＶＬ配列が、構造的には近似のＶＬ配列によって置換されるのが好ましい。
【００６０】
したがって、一局面において、本発明は、下記：
（ａ）配列番号１、２、３、および４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および、
（ｂ）配列番号５、６、７、８、９、および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含み、ＰＴＫ７、好ましくはヒトＰＴＫ７に特異的に結合することを特徴とする単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。
【００６１】
好ましい重鎖および軽鎖の組み合わせは：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および、（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および、（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および、（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または、
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および、（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または、
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および、（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または、
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および、（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む。
【００６２】
もう一つの局面では、本発明は、３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａ、および７Ｃ８の、重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、またはそれらの組み合わせを含む抗体を提供する。３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａ、および７Ｃ８の、ＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１１（３Ｇ８および３Ｇ８ａ）、１２（４Ｄ５）、１３（１２Ｃ６および１２Ｃ６ａ）、および１４（７Ｃ８）に示される。３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａ、および７Ｃ８の、ＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号１５（３Ｇ８および３Ｇ８ａ）、１６（４Ｄ５）、１７（１２Ｃ６および１２Ｃ６ａ）、および１８（７Ｃ８）に示される。３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａ、および７Ｃ８の、ＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号１９（３Ｇ８および３Ｇ８ａ）、２０（４Ｄ５）、２１（１２Ｃ６および１２Ｃ６ａ）、および２２（７Ｃ８）に示される。３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａ、および７Ｃ８の、ＶＫＣＤＲ１のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、および２８に示される。３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａ、および７Ｃ８の、ＶＫＣＤＲ２のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２９、３０、３１、３２、３３、および３４に示される。３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａ、および７Ｃ８の、ＶＫＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、および４０に示される。ＣＤＲ領域の境界は、Ｋａｂａｔシステム（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）を用いて定める。
【００６３】
これらの抗体のそれぞれが、ＰＴＫ７に結合することが可能であり、かつ、抗原結合の特異性は主にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域によって与えられるのであるから、これらＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列、およびＶＫＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を「混ぜ合わせ、一致させ」て（すなわち、異なる抗体由来のＣＤＲ同士を、ただし各抗体は、ＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、および、ＶＫＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含まなければならないが、混ぜ合わせ、一致させることが可能である）、本発明の、他の、抗ＰＴＫ７結合分子を創出することが可能である。このような「混ぜ合わせ、一致させた」抗体のＰＴＫ７結合は、前述の、および実施例中の結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ分析）を用いることによって試験することが可能である。ＶＨＣＤＲ配列同士を混ぜ合わせ、一致させる場合は、ある特定のＶＨ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列が、構造的には近似のＣＤＲ配列（単数または複数）によって置換されるのが好ましい。同様に、ＶＫＣＤＲ配列同士を混ぜ合わせ、一致させる場合は、ある特定のＶＫ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列が、構造的には近似のＣＤＲ配列（単複）によって置換されるのが好ましい。モノクローナル抗体３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａ、および７Ｃ８に関して本明細書に開示される構造的に近似の配列によって、一つ以上のＶＨおよびＶＬＣＤＲ領域配列を置換することで新規ＶＨおよびＶＬ配列の創出が可能であることは当業者には自明であろう。
【００６４】
したがって、もう一つの局面において、本発明は、下記：
（ａ）配列番号１１、１２、１３、および１４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１５、１６、１７、および１８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１９、２０、２１、および２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２３、２４、２５、２６、２７、および２８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号２９、３０、３１、３２、３３、および３４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および、
（ｆ）配列番号３５、３６、３７、３８、３９、および４０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、
を含み、ＰＴＫ７、好ましくはヒトＰＴＫ７に特異的に結合することを特徴とする単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。
【００６５】
ある好ましい実施態様では、抗体は、下記：
（ａ）配列番号１１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号２９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および、
（ｆ）配列番号３５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、
を含む。
【００６６】
もう一つの好ましい実施態様では、抗体は、下記：
（ａ）配列番号１１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号３０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および、
（ｆ）配列番号３６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、
を含む。
【００６７】
もう一つの好ましい実施態様では、抗体は、下記：
（ａ）配列番号１２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号２０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号３１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および、
（ｆ）配列番号３７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、
を含む。
【００６８】
もう一つの好ましい実施態様では、抗体は、下記：
（ａ）配列番号１３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号２１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号３２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および、
（ｆ）配列番号３８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、
を含む。
【００６９】
もう一つの好ましい実施態様では、抗体は、下記：
（ａ）配列番号１３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号２１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号３３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および、
（ｆ）配列番号３９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、
を含む。
【００７０】
もう一つの好ましい実施態様では、抗体は、下記：
（ａ）配列番号１４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号２２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号３４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および、
（ｆ）配列番号４０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、
を含む。
【００７１】
ＣＤＲ３ドメインが、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２ドメイン（単複）とは独立に、単独で認識抗原に対する抗体の結合特異性を決定することが可能であること、および、共通のＣＤＲ３配列に基づく同じ結合特異性を有する、複数の抗体を予測可能的に生成することが可能であることは従来技術において周知である。例えば、Ｋｌｉｍｋａら、，  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ８２（２）：２５２−２６０（２０００）（マウスの抗ＣＤ３０抗体Ｋｉ−４の、重鎖可変ドメインＣＤＲ３のみを用いて、ヒト化抗ＣＤ３０抗体を生産する方法を記載する）；Ｂｅｉｂｏｅｒら、，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：８３３−８４９（２０００）（親マウスＭＯＣ−３１抗ＥＧＰ−２抗体の重鎖ＣＤＲ２配列のみの使用による、組み換え上皮性糖タンパク−２（ＥＧＰ−２）抗体を記載する）；Ｒａｄｅｒら、，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：８９１０−８９１５（１９９８）（マウス抗インテグリンανβ３抗体ＬＭ６０９の重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ３ドメイン使用による、ヒト化抗インテグリンανβ３抗体群であって、各抗体が、ＣＤＲ３ドメインの外側に異なる一定の配列を含み、親マウス抗体のものと同じエピトープに対し、親マウス抗体以上の親和度をもって結合することが可能な配列を含むことを特徴とする、一連の抗インテグリンανβ３抗体を記載する）；Ｂａｒｂａｓら、，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：２５２９−２５３３（１９９５）（ヒトの胎盤ＤＮＡに対して特異的な三つのＦａｂ（ＳＩ−１、ＳＩ−４０、およびＳＩ−３２）の重鎖ＣＤＲ３配列を、抗破傷風毒素Ｆａｂの重鎖へ植え付けて既存の重鎖ＣＤＲ３を置換したことを記載し、かつ、ＣＤＲ３ドメインが単独で結合特異性を付与することを証明した）；および、Ｄｉｔｚｅｌら、，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：７３９−７４９（１９９６）（親の多重特異的Ｆａｂ  ＬＮＡ３の重鎖ＣＤＲ３のみの、単一特異的ＩｇＧ破傷風毒素結合性Ｆａｂ  ｐ３１３抗体に対する転移が、親のＦａｂの結合特異性を保持するのに十分であることを見た移植実験を記載する）を参照されたい。
【００７２】
したがって、本発明は、ヒト、または非ヒト動物から得られた抗体の、一つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含み、ＰＴＫ７に特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体を提供する。ある局面では、本発明は、非ヒト抗体、例えば、マウスまたはラット抗体の、一つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含み、ＰＴＫ７に特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体を提供する。ある実施態様では、本発明の、このような抗体は、非ヒト抗体の、一つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインであって、（ａ）同じエピトープに対する結合のために競合することが可能な；（ｂ）同じ機能的特徴を保持する；（ｃ）同じエピトープに結合することが可能な；および／または（ｄ）対応する非ヒト親抗体と近似の結合親和度を有するＣＤＲ３を含む。
【００７３】
他の局面では、本発明は、ヒト抗体、例えば、非ヒト動物から得られたヒト抗体由来の、一つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含み、ＰＴＫ７に特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体を提供する。他の局面では、本発明は、第１ヒト抗体、例えば、非ヒト動物から得られたヒト抗体由来の、一つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体であって、第１ヒト抗体が、ＰＴＫ７に特異的に結合することが可能であり、かつ、第１ヒト抗体のＣＤＲ３ドメインが、ＰＴＫ７に対する結合特異性を欠如するヒト抗体のＣＤＲ３ドメインを置換して、ＰＴＫ７に特異的に結合することが可能な第２ヒト抗体を生成することを特徴とする、モノクローナル抗体を提供する。ある実施態様では、本発明の、このような抗体は、第１ヒト抗体の、一つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインであって、（ａ）同じエピトープに対する結合のために競合することが可能な；（ｂ）同じ機能的特徴を保持する；（ｃ）同じエピトープに結合することが可能な；および／または（ｄ）対応する非ヒト親抗体と近似の結合親和度を有するＣＤＲ３を含む。好ましい実施態様では、第１ヒト抗体は、３Ｇ８、＃ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａ、または７Ｃ８である。
【００７４】
特定の生殖系列配列を有する抗体
ある実施態様では、本発明の抗体は、特定の生殖系列重鎖免疫グロブリン遺伝子由来の重鎖可変領域、および／または特定の生殖系列重鎖免疫グロブリン遺伝子由来の軽鎖可変領域を含む。
【００７５】
例えば、ある好ましい実施態様では、本発明は、ヒトのＶＨ３−３０．３遺伝子の産物であるか、または該遺伝子から得られる重鎖可変領域を含み、ＰＴＫ７に、好ましくはヒトのＰＴＫ７に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。もう一つの好ましい実施態様では、本発明は、ヒトのＶＨ３−３３遺伝子の産物であるか、または該遺伝子から得られる重鎖可変領域を含み、ＰＴＫ７に、好ましくはヒトのＰＴＫ７に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。さらにもう一つの好ましい実施態様では、本発明は、ヒトのＶＫＬ１５遺伝子の産物であるか、または該遺伝子から得られる軽鎖可変領域を含み、ＰＴＫ７に、好ましくはヒトのＰＴＫ７に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。さらにもう一つの好ましい実施態様では、本発明は、ヒトのＶＫＡ１０遺伝子の産物であるか、または該遺伝子から得られる軽鎖可変領域を含み、ＰＴＫ７に、好ましくはヒトのＰＴＫ７に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。さらにもう一つの好ましい実施態様では、本発明は、ヒトのＶＫＡ２７遺伝子の産物であるか、または該遺伝子から得られる軽鎖可変領域を含み、ＰＴＫ７に、好ましくはヒトのＰＴＫ７に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。さらにもう一つの好ましい実施態様では、本発明は、ヒトのＶＫＬ６遺伝子の産物であるか、または該遺伝子から得られる軽鎖可変領域を含み、ＰＴＫ７に、好ましくはヒトのＰＴＫ７に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。さらにもう一つの好ましい実施態様では、本発明は、下記：
（ａ）ヒトのＶＨ３−３０．３、ＤＰ４４、または３−３３遺伝子（それぞれ、配列番号５１、５２、または５３に記載されるアミノ酸配列をコードする）の産物であるか、または該遺伝子から得られる重鎖可変領域；
（ｂ）ヒトのＶＫＬ１５、Ａ１０、Ａ２７、またはＬ６遺伝子（それぞれ、配列番号５４、５５、５６、または５７に記載されるアミノ酸配列をコードする）の産物であるか、または該遺伝子から得られる軽鎖可変領域、を含み、かつ、
（ｃ）ＰＴＫ７に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。
【００７６】
それぞれ、ＶＨ３−３０．３およびＶＫＬ１５のＶＨおよびＶＫを有する抗体の例としては、３Ｇ８および３Ｇ８ａがある。それぞれ、ＶＨ３−３０．３およびＶＫＡ１０のＶＨおよびＶＫを有する抗体の例としては、４Ｄ５がある。それぞれ、ＶＨＤＰ４４およびＶＫＡ２７のＶＨおよびＶＫを有する抗体の例としては、１２Ｃ６がある。それぞれ、ＶＨＤＰ４４およびＶＫＬ１５のＶＨおよびＶＫを有する抗体の例としては、１２Ｃ６ａがある。それぞれ、ＶＨ３−３３およびＶＫＬ６のＶＨおよびＶＫを有する抗体の例としては、７Ｃ８がある。
【００７７】
本発明で使用するヒト抗体は、該抗体の可変領域が、ヒトの生殖系列免疫グロブリン遺伝子を用いるシステムから得られたものである場合、特定の生殖系列配列「の産物である」か、または該配列「から得られる」重鎖または軽鎖可変領域を含む。このようなシステムは、ヒトの免疫グロブリン遺伝子を担うトランスジェニックマウスを、対象抗原によって免疫化するか、または、ファージにおいて提示された、ヒトの免疫グロブリン遺伝子ライブラリーを、対象抗原によってスクリーニングすることを含む。ヒトの生殖系列免疫グロブリン配列「の産物である」か、または該配列「から得られる」ヒト抗体は、該ヒト抗体のアミノ酸配列を、ヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、該ヒト抗体の配列に対し、その配列がもっとも近似する（すなわち、最大％同一度）、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選ぶことによって特定される。ある特定のヒトの生殖系列免疫グロブリン配列「の産物である」か、または該配列「から得られる」ヒト抗体は、生殖系列配列と比べた場合、例えば、天然の体性突然変異、または、部位指向性突然変異の意図的導入によって、いくつかのアミノ酸異同を含んでもよい。しかしながら、選ばれるヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対し、通常、アミノ酸配列が少なくとも９０％同一であり、他の動物種の生殖系列の免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖系列配列）と比べた場合、そのヒト抗体を、ヒトのものと特定するアミノ酸残基を含む。ある場合、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対し、アミノ酸配列が、少なくとも９５％、場合によっては少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一であってもよい。ある特定のヒトの生殖系列配列から得られるヒト抗体は、通常、該ヒトの生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とは、１０アミノ酸以下の相違しか示さない。ある場合、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対し、５以下、または場合によっては４、３、２、または１アミノ酸以下の相違しか示さない。
【００７８】
同種抗体
さらに別の実施態様では、本発明の抗体は、本明細書に記載される好ましい抗体のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を含み、本発明の抗ＰＴＫ７抗体の所望の機能的性質を保持する、重鎖および軽鎖可変領域を含む。
【００７９】
例えば、本発明は、重鎖可変領域、および軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体であって、
（ａ）該重鎖可変領域が、配列番号１、２、３、および４からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を含み；
（ｂ）該軽鎖可変領域が、配列番号５、６、７、８、９、および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を含み；かつ、
該抗体が、下記の特性：
（ｃ）抗体は、１ｘ１０−７Ｍ以下のＫＤにおいてヒトのＰＴＫ７に結合する；
（ｄ）抗体は、ウィルムスの腫瘍細胞株に結合する
の内の一つ以上を示す、ことを特徴とする単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。
【００８０】
他の実施態様では、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、前述の配列に対し８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同であってもよい。前述の配列のＶＨおよびＶＬ領域に対し高い相同性（すなわち、８０％以上）を持つＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体は、配列番号４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、および５０をコードする核酸の突然変異発生（例えば、部位指向性またはＰＣＲ介在突然変異発生）を誘発し、次いで、本明細書に記載される機能アッセイを用いて、保持機能（すなわち、前述の（ｃ）および（ｄ）に記載した機能）についてコード変更抗体を調べることによって獲得することが可能である。
【００８１】
本明細書で用いる場合、二つのアミノ酸配列間の相同性パーセントは、二つの配列の間の同一性パーセントと等価である。二つの配列間の同一性パーセントは、その二つの配列の最適整列のために導入する必要のある、ギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れた場合の、これらの配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一位置の数／位置の合計数×１００）。二つの配列間の配列比較、および同一性％の決定は、下記の非限定的実施例に記載される数学的アルゴリスムを用いて実現することが可能である。
【００８２】
二つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７（１９８８））のアルゴリスムに基づき、ＰＡＭ２０重み付け残基表、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を用いて決定することが可能である。さらに、二つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリスムに基づき、Ｂｌｏｓｓａｍ  ６２行列式またはＰＡＭ２５０行列式、およびギャップ重み１６、１４、１２、１０、８、６、または４、およびギャップ長重み１、２、３、４、５、または６を用いて決定することが可能である。
【００８３】
それに加えてさらに、またはそれとは別に、本発明のタンパク配列は、例えば、関連配列を特定するために、公開データベースに対し検索を実行するための「検索配列」として使用することが可能である。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実行することが可能である。スコア＝５０、単語長＝３のＸＢＬＡＳＴプログラムによってＢＬＡＳＴタンパク検索を実行して、本発明の抗体分子に対して相同なアミノ酸配列を得ることが可能である。比較目的のためのギャップ入り整列を獲得するためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されるように、ギャップ入りＢＬＡＳＴを利用することが可能である。ＢＬＡＳＴおよびギャップ入りＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォールトパラメータを使用することが可能である。（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい）。
【００８４】
保存的修飾を有する抗体
ある実施態様では、本発明の抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み、これらのＣＤＲ配列の内の一つ以上が、本明細書に記載される好ましい抗体に基づく、特定のアミノ酸配列（例えば、３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａ、または７Ｃ８）、または、その保存的修飾を含み、かつ、該抗体は、本発明の抗ＰＴＫ７抗体の所望の機能的特性を保持する。したがって、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体であって、
（ａ）重鎖可変領域ＣＤＲ３配列が、配列番号１９、２０、２１、および２２のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列、およびその保存的修飾を含み；
（ｂ）軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列が、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、および４０のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列、およびその保存的修飾を含み；かつ、
該抗体が、下記の特性：
（ｃ）ヒトのＰＴＫ７に特異的に結合する；および、
（ｄ）ウィルムスの腫瘍細胞株（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１４４１）に結合する、
の内の一つ以上を示す、ことを特徴とする単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。
【００８５】
ある好ましい実施態様では、重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号１５、１６、１７、および１８のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列、およびその保存的修飾を含み；軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号２９、３０、３１、３２、３３、および３４のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列、およびその保存的修飾を含む。もう一つの好ましい実施態様では、重鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、配列番号１１、１２、１３、および１４のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列、およびその保存的修飾を含み；軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、および２８のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列、およびその保存的修飾を含む。
【００８６】
本明細書で用いる「保存的配列修飾」という用語は、そのアミノ酸配列を含む抗体の結合特性に大きく影響を及ぼさない、または変えないアミノ酸修飾を指すことが意図される。このような保存的修飾としては、アミノ酸置換、付加、および欠失が挙げられる。修飾は、従来技術で既知の標準技術、例えば、部位指向性突然変異発生およびＰＣＲ−介在突然変異発生によって、本発明の抗体の中に導入することが可能である。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が、類似側鎖を有するアミノ酸残基によって置換される置換である。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは従来技術で定められている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。したがって、本発明の抗体のＣＤＲ領域中の一つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基によって置換することが可能であり、かつ、本明細書に記載する機能的アッセイを用いて、保持機能に関して（すなわち、前述の（ｃ）および（ｄ）に記載される機能）、この変更抗体を試験することが可能である。
【００８７】
本発明の抗ＰＴＫ７抗体と同じエピトープに結合する抗体
もう一つの実施態様では、本発明は、本発明のＰＴＫ７モノクローナル抗体の内のいずれかと同じ、ヒトＰＴＫ７のエピトープに結合する抗体（すなわち、本発明のモノクローナル抗体のいずれかと、ＰＴＫ７に対する結合について交差競合する能力を持つ抗体）を提供する。好ましい実施態様では、交差競合実験のための参照抗体は、モノクローナル抗体３Ｇ８（それぞれ、配列番号１および５に示すＶＨおよびＶＬ配列を有する）、または、モノクローナル抗体３Ｇ８ａ（それぞれ、配列番号１および６に示すＶＨおよびＶＬ配列を有する）、または、モノクローナル抗体４Ｄ５（それぞれ、配列番号２および７に示すＶＨおよびＶＬ配列を有する）、または、モノクローナル抗体１２Ｃ６（それぞれ、配列番号３および８に示すＶＨおよびＶＬ配列を有する）、または、モノクローナル抗体１２Ｃ６ａ（それぞれ、配列番号３および９に示すＶＨおよびＶＬ配列を有する）、または、モノクローナル抗体７Ｃ８（それぞれ、配列番号４および１０に示すＶＨおよびＶＬ配列を有する）であってもよい。交差競合するこのような抗体同士は、標準的ＰＴＫ７結合アッセイにおいて、それらが、３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６ａ、または７Ｃ８と交差競合する能力に基づいて特定することが可能である。例えば、本発明の抗体同士の交差競合を実証するために、ＢＩＡｃｏｒｅ分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、またはフローサイトメトリーを使用してもよい。例えば、３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａ、または７Ｃ８の、ヒトＰＴＫ７に対する結合を抑制する、試験抗体の能力は、該試験抗体が、ヒトＰＴＫ７に対する結合において３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａ、または７Ｃ８と競合することが可能であること、したがって、該試験抗体は、ヒトＰＴＫ７において、３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａ、または７Ｃ８と同じエピトープに結合することを実証する。ある好ましい実施態様では、ヒトＰＴＫ７において、３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａ、または７Ｃ８と同じエピトープに結合する抗体は、ヒトのモノクローナル抗体である。このようなヒト・モノクローナル抗体は、実施例に記載するやり方に従って調製、単離することが可能である。
【００８８】
加工および修飾抗体
本発明の抗体はさらに、本明細書に開示されるＶＨおよび／またはＶＬ配列の内の一つ以上を有する抗体を開始材料として用い、これを加工して、この開始抗体とは異なる特性を持つ修飾抗体を形成することによって調製することが可能である。抗体は、一または両可変領域（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）における、例えば、一つ以上のＣＤＲ領域および／または一つ以上の枠組み構造領域における一つ以上の残基を修飾することによって加工することが可能である。それに加えてさらに、またはそれとは別に、抗体は、定常域（単複）における残基を修飾することによって、例えば、抗体の、エフェクター機能（単複）を変えることによって加工することが可能である。
【００８９】
実行が可能な、可変領域加工の一タイプは、ＣＤＲ移植である。抗体は、主に、６個の重鎖および軽鎖相補性決定域（ＣＤＲ）に配されるアミノ酸残基を通じて
標的抗原と相互作用を持つ。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲ外の配列よりも、個々の抗体間においてより多様である。ＣＤＲ配列は、大抵の抗体−抗原相互作用に与るので、特定の天然抗体の特性を模倣する組み換え抗体を、それとは異なる特性を持つ異なる抗体由来の枠組み構造配列に移植させた、該特定の天然抗体のＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって発現させることが可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｅ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９−１００３３；Ｗｉｎｔｅｒに付与された米国特許第５，２２５，５３９号；Ｑｕｅｅｎら、に付与された米国特許第５，５３０，１０１；５，６９３，７６２；および６，１８０，３７０号を参照されたい）。
【００９０】
したがって、本発明の、もう一つの実施態様は、それぞれ、配列番号１１、１２、１３、および１４、配列番号１５、１６、１７、および１８、および配列番号１９、２０、２１、および２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、および、それぞれ、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、および２８、配列番号２９、３０、３１、３２、３３、および３４、および配列番号３５、３６、３７、３８、３９、および４０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分に関する。したがって、このような抗体は、モノクローナル抗体３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａ、または７Ｃ８のＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲ配列を含みながら、これらの抗体のものとは異なる枠組み構造配列を含んでもよい。
【００９１】
このような枠組み構造配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む、公開データベースまたは公刊参考文献から入手することが可能である。例えば、ヒトの重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、“ＶＢａｓｅ”ヒト生殖系列データベース（インターネットにおいてｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅから入手することが可能）の外、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）“Ｔｈｅ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ＶＨ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａｂｏｕｔ  Ｆｉｆｔｙ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ＶＨ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｌｏｏｐｓ”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；および、Ｃｏｘ，Ｊ．Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）“Ａ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ  ＶＨ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｂｉａｓ  ｉｎ  ｔｈｅｉｒ  Ｕｓａｇｅ”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６の中にも見出すことが可能である。なお、これらの各内容を、引用により本明細書に含めることを明言する。もう一つの例として、ヒトの重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列が、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースの中に見出すことが可能である。例えば、ＨＣｏ７  ＨｕＭＡｂマウスに見られる、下記の重鎖生殖系列配列は、その付帯する、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号において入手することが可能である：１−６９（ＮＧ＿００１０１０９、ＮＴ＿０２４６３７、およびＢＣ０７０３３３）、３−３３（ＮＧ＿００１０１０９およびＮＴ＿０２４６３７）、および３−７（ＮＧ＿００１０１０９およびＮＴ＿０２４６３７）。もう一つの例として、ＨＣｏ１２  ＨｕＭＡｂマウスに見られる、下記の重鎖生殖系列配列は、その付帯する、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号において入手することが可能である：１−６９（ＮＧ＿００１０１０９、ＮＴ＿０２４６３７、およびＢＣ０７０３３３）、５−５１（ＮＧ＿００１０１０９およびＮＴ＿０２４６３７）、４−３４（ＮＧ＿００１０１０９およびＮＴ＿０２４６３７）、３−３０．３（？）、および３−２３（ＡＪ４０６６７８）。
【００９２】
抗体のタンパク配列は、従来技術で周知の、ギャップ入りＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５：３３８９−３４０２）と呼ばれる、配列類似性探索法の内の一つを用いて、タンパク配列の集積データベースと比較される。ＢＬＡＳＴは、抗体配列とデータベース配列の間の統計的に有意な整列は、整列単語から成る、高得点のペアセグメント（ＨＳＰ）を含む可能性が高いという、発見的アルゴリスムである。延長または刈り込みによってスコアをそれ以上改善することができないセグメントペアをヒットと呼ぶ。簡単に言うと、ＶＢＡＳＥ起源（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ１／ｌｉｓｔ２．ｐｈｐ）のヌクレオチド配列を翻訳し、ＦＲ１からＦＲ３枠組み構造領域までそれらの領域を含めて保持する。データベース配列は、９８残基の平均長を有する。タンパクの全長において正確に一致する二重配列は排除する。遮断した低複雑度フィルターを除き、デフォールトの標準パラメータ付きｂｌａｓｔｐプログラム、およびＢＬＯＳＵＭ６２の置換行列式によるタンパクのＢＬＡＳＴ探索により、配列一致を与える、上位５ヒットが抽出される。このヌクレオチド配列を、６個の全ての枠組み構造について翻訳するが、データベース配列の一致セグメントにおいて終止コドンを含まない枠組みは、ヒットの可能性を有すると見なす。これは、次に、ＢＬＡＳＴプログラムｔｂｌａｓｔｘによって確認される。このプログラムは、６個全ての枠組み構造において抗体配列を翻訳し、それら翻訳物を、６個全ての枠組み構造において動的に翻訳されるＶＢＡＳＥヌクレオチド配列と比較する。
【００９３】
抗体配列と、タンパクデータベースの間における同一体は、配列の全長に亘る、正確なアミノ酸の一致である。陽性体（同一体＋置換一致）は、同一ではないが、ＢＬＯＳＵＭ６２置換行列式によって導かれるアミノ酸置換である。もしも抗体配列が、データベース配列の二つに対し、同じ同一度で一致する場合、もっとも大きな陽性体数を持つヒットが、一致配列ヒットであると定められることになる。
【００９４】
本発明の抗体に使用される、好ましい枠組み構造配列は、本発明の選ばれた抗体によって使用される枠組み構造に構造的に近似のもの、例えば、本発明の好ましいモノクローナル抗体によって使用される、ＶＨ３−３０．３枠組み構造配列（配列番号５１）、および／またはＶＨＤＰ４４枠組み構造配列（配列番号５２）、ＶＨ３−３３枠組み構造配列（配列番号５３）、および／またはＶＫＬ１５枠組み構造配列（配列番号５４）、および／またはＶＫＡ１０枠組み構造配列（配列番号５５）、および／またはＶＫＬ１５枠組み構造配列（配列番号５４）、および／またはＶＫＡ２７枠組み構造配列（配列番号５６）、および／またはＶＫＬ１５枠組み構造配列（配列番号５４）、および／またはＶＫＬ６枠組み構造配列（配列番号５７）に近似のものである。ＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列、およびＶＫＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それから枠組み構造配列が得られた、生殖系列免疫グロブリン遺伝子に見られるものと同一の配列を有する枠組み構造領域に移植することが可能であり、あるいは、該ＣＤＲ配列は、該生殖系列配列と比べて、一つ以上の突然変異を含む枠組み構造領域に移植することが可能である。例えば、ある場合、抗体の抗原結合能力を維持するか、または強化するためには、枠組み構造領域内の残基を突然変異させることが有利であることが見出されている（例えば、Ｑｕｅｅｎらに付与された米国特許第５，５３０，１０１；５，５８５，０８９；５，６９３，７６２；および６，１８０，３７０号を参照されたい）。
【００９５】
もう一つのタイプの可変領域修飾は、ＶＨおよび／またはＶＫＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を、対象抗体の、一つ以上の結合特性（例えば、親和度）を向上させるように突然変異させることである。突然変異（単複）を導入するために、部位指向性突然変異発生またはＰＣＲ−介在性突然変異発生を実行することが可能であり、かつ、抗体結合、または、他の、興味の機能的特性に及ぼす作用は、本明細書に記載され、実施例に提示されるインビトロ、またはインビボアッセイで評価することが可能である。保存的修飾（前述のような）を導入することが好ましい。突然変異は、アミノ酸の置換、付加、または欠失であってよいが、置換であることが好ましい。さらに、通常、ＣＤＲ内で変えられるのは、１、２、３、４、または５個以下の残基である。
【００９６】
したがって、もう一つの実施態様では、本発明は、（ａ）配列番号１１、１２、１３、および１４からなる群より選択されるアミノ酸配列、または、配列番号１１、１２、１３、および１４と比べて１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換、欠失、または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域；（ｂ）配列番号１５、１６、１７、および１８からなる群より選択されるアミノ酸配列、または、配列番号１５、１６、１７、および１８と比べて１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換、欠失、または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域；（ｃ）配列番号１９、２０、２１、および２２からなる群より選択されるアミノ酸配列、または、配列番号１９、２０、２１、および２２と比べて１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換、欠失、または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域；（ｄ）配列番号２３、２４、２５、２６、２７、および２８からなる群より選択されるアミノ酸配列、または、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、および２８と比べて１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換、欠失、または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＫＣＤＲ１領域；（ｅ）配列番号２９、３０、３１、３２、３３、および３４からなる群より選択されるアミノ酸配列、または、配列番号２９、３０、３１、３２、３３、および３４と比べて１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換、欠失、または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＫＣＤＲ２領域；および、（ｆ）配列番号３５、３６、３７、３８、３９、および４０からなる群より選択されるアミノ酸配列、または、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、および４０と比べて１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換、欠失、または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＫＣＤＲ３領域、を含む重鎖可変領域を含む、単離抗ＰＴＫ７モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。
【００９７】
本発明の加工抗体は、修飾が、例えば、該抗体の特性の改善のために、ＶＨおよび／またはＶＫ内の枠組み構造残基に対して実施される抗体を含む。通常、このような枠組み構造の修飾は、抗体の免疫原性を下げるために行われる。例えば、一つの方法は、一つ以上の枠組み構造残基を「復帰突然変異」して対応する生殖系列配列に戻すことである。さらに詳細に言うと、体性突然変異を経過した抗体は、該抗体がそれから得られた生殖系列配列と異なる枠組み構造残基を含んでもよい。このような残基は、該抗体の枠組み構造配列を、該抗体が得られた生殖系列配列と比較することによって特定される。
【００９８】
例えば、３Ｇ８（および３Ｇ８ａ）については、ＶＨの（ＦＲ１内部の）アミノ酸残基＃２８はイソロイシンであるが、対応するＶＨ３−３０．３生殖系列配列におけるその残基はトレオニンである。この枠組み構造領域配列をその生殖系列形に戻すためには、体性突然変異を、例えば、部位指向性突然変異発生、またはＰＣＲ介在突然変異発生によって生殖系列配列に「復帰突然変異」させることが可能である（例えば、３Ｇ８（および３Ｇ８ａ）のＶＨのＦＲ１の残基＃２８を、イソロイシンからトレオニンに「復帰突然変異」させることが可能である）。
【００９９】
もう一つの例として、１２Ｃ６（および１２Ｃ６ａ）については、ＶＨの（ＦＲ２内部の）アミノ酸残基＃４４はトレオニンであるが、対応するＶＨＤＰ４４生殖系列配列におけるその残基はグリシンである。この枠組み構造領域配列をその生殖系列形に戻すためには、１２Ｃ６（および１２Ｃ６ａ）のＶＨの残基＃４４（ＦＲ２の残基＃９）を、トレオニンからグリシンに「復帰突然変異」させることが可能である。このような「復帰突然変異された」抗体も、本発明に包含されることが意図される。
【０１００】
もう一つのタイプの枠組み構造修飾は、枠組み構造領域内の、場合によっては一つ以上のＣＤＲ領域内の一つ以上の残基を突然変異させ、Ｔ細胞エピトープを除去し、そうすることによって該抗体の免疫原性を下げることを含む。この方法は、「脱免疫化」とも呼ばれ、Ｃａｒｒらによる米国特許出願公開第２００３０１５０４３号にさらに詳細に記載される。
【０１０１】
枠組み構造またはＣＤＲ領域において行われる修飾に加えて、または該修飾とは別に、本発明の抗体は、通常、抗体の、一つ以上の機能的特性を変えるために、例えば、血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合、および／または抗原依存性細胞毒性を変えるために、Ｆｃ領域内に修飾を含むように加工されてもよい。さらに、本発明の抗体は、この場合も抗体の一つ以上の機能的特性を変えるために、化学的に修飾しても（例えば、一つ以上の化学的成分を該抗体に付着させても）、または、その糖化を変えるように修飾してもよい。これらの修飾はそれぞれ下記にさらに詳述する。Ｆｃ領域の残基のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵ示数のものである。
【０１０２】
一実施態様では、ＣＨ１のヒンジ領域が、該ヒンジ領域のシステイン残基の数が変更されるように、例えば、増加、または減少するように修飾される。この方法については、さらに詳細が、Ｂｏｄｍｅｒらによる米国特許第５，６７７，４２５号に記載される。ＣＨ１のヒンジ領域におけるシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖の密着を促進するために、または、抗体の安定性を上げるか、または下げるために変えられる。
【０１０３】
もう一つの実施態様では、抗体のＦｃヒンジ領域は、該抗体の生物学的半減期を下げるために突然変異させられる。さらに具体的には、一つ以上のアミノ酸突然変異が、Ｆｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３境界領域に導入され、その導入によって、その抗体の、黄色ブドウ球菌タンパクＡ（ＳｐＡ）結合能は、元のＦｃ−ヒンジドメインのＳｐＡ結合能に比べて損なわれる。この方法については、さらに詳細が、Ｗａｒｄらによる米国特許第６，１６５，７４５号に記載される。
【０１０４】
もう一つの実施態様では、抗体は、その生物学的半減期を延ばすために修飾させられる。様々な方法が可能である。例えば、下記の突然変異：Ｗａｒｄらに付与された米国特許第６，２７７，３７５に記載されるＴ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆの一つ以上を導入することが可能である。それとは別に、生物学的半減期を延長するためには、Ｐｒｅｓｔａらによる米国特許第５，８６９，０４６および６，１２１，０２２号に記載されるように、抗体を、ＣＨ１またはＣＬ領域内で変え、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの二つのループから採取した、救済受容体結合エピトープを含むようにすることも可能である。
【０１０５】
さらに別の実施態様では、抗体のエフェクター機能（単複）を変えるために、少なくとも一つのアミノ酸残基を、異なるアミノ酸残基によって置換することによってＦｃ領域を変える。たとえば、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０、および３２２から選ばれる一つ以上のアミノ酸残基を、異なるアミノ酸残基によって置換し、その置換によって、エフェクターリガンドに対する該抗体の親和度は変えられるが、親抗体の抗原結合能は保持されるようにすることが可能である。それに対する親和度が変えられるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体、または補体のＣ１成分であってもよい。この方法については、さらに詳細が、共にＷａｒｄらによる米国特許第５，６２４，８２１および５，６４８，２６０号に記載される。
【０１０６】
別の例では、アミノ酸残基３２９、３３１、および３２２から選ばれる一つ以上のアミノ酸残基が、異なるアミノ酸残基によって置換され、その置換によって、抗体のＣ１ｑ結合性が変えられ、および／または、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）が低下、または除去されるようにすることが可能である。この方法については、さらに詳細が、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらによる米国特許第６，１９４，５５１号に記載される。
【０１０７】
もう一つの例では、アミノ酸位置２３１および２３９における一つ以上のアミノ酸残基が変えられ、それによって、抗体の補体固定能力が変えられる。この方法については、さらに詳細が、Ｂｏｄｍｅｒらによる国際公開第９４／２９３５１号に記載される。
【０１０８】
さらにもう一つの例では、Ｆｃ領域が、抗体の、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）の仲介能力を増すために、および／または、下記の位置：２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８、または４３９における一つ以上のアミノ酸を修飾することによって、Ｆｃγ受容体に対する抗体の親和度を増すために、修飾される。この方法については、さらに詳細が、Ｐｒｅｓｔａによる国際公開第００／４２０７２号に記載される。さらに、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃＲｎに対する、ヒトＩｇＧ１における結合部位は、既にマップされ、結合性を強化した変異種も記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４を参照されたい）。位置２５６、２９０、２９８、３３３、３３４、および３３９における特異的突然変異が、ＦｃγＲＩＩＩに対する結合を高めることが示された。さらに、下記の組み合わせ突然変異が、ＦｃγＲＩＩＩ結合を改善することが示された：Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４Ａ、およびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ。
【０１０９】
さらにもう一つの実施態様では、抗体の糖化が修飾される。例えば、非糖化抗体を製造することが可能である（すなわち、この抗体は糖化を欠く）。糖化は、例えば、抗体の抗原に対する親和性を増すために変えることが可能である。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の糖化の一つ以上の位置を変えることによって実現することが可能である。一つ以上のアミノ酸置換を実行して、例えば、一つ以上の可変領域枠組み構造糖化部位を排除し、そうすることによってその部位の糖化の欠如をもたらすようにすることが可能である。このような糖化欠如は、抗原に対する抗体の親和度を高めることがある。このような方法については、さらに詳細が、Ｃｏらによる米国特許第５，７１４，３５０および６，３５０，８６１号に記載される。
【０１１０】
それに加えてさらに、またはそれとは別に、糖化タイプを変更させた抗体、例えば、フコシル残基数を低下させた低フコシル化抗体、または、バイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を増加させた抗体を製造することが可能である。このような糖化パターンの変更は、抗体のＡＤＣＣ能力を上昇させることが実証されている。このような炭水化物修飾は、例えば、糖化機序を変えられた宿主細胞において抗体を発現させることによって実現することが可能である。糖化機序を変えられた細胞は、従来技術に記載されており、それらを、本発明の組み換え抗体を発現する宿主細胞として使用し、それによって糖化が変えられた抗体の生産が可能である。例えば、細胞株Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９は、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８を欠如する（アルファ（１，６）フコシルトランスフェラーゼ）ので、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９細胞株において発現される抗体は、その炭水化物においてフコースを欠く。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９  ＦＵＴ８−／−細胞株は、二つの置換ベクターを用いてＣＨＯ／ＤＧ４４細胞中のＦＵＴ８遺伝子を標的破壊することによって創製された（Ｙａｍａｎｅらによる米国特許第２００４０１１０７０４号、およびＹａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら、（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８７：６１４−２２を参照されたい）。もう一つの例として、Ｈａｎａｉらによる欧州特許第１，１７６，１９５号は、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を機能的に破壊され、そのためこの細胞株において発現される抗体は、アルファ１，６結合関連酵素を低下または排除することによって低フコシル化を示すようになる、細胞株を記載する。Ｈａｎａｉらはまた、抗体のＦｃ領域に結合するＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加する酵素活性を低下させた、または、該酵素活性を持たない細胞株、例えば、ラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２）についても記載する。Ｐｒｅｓｔａによる国際公開第０３／０３５８３５号は、ＣＨＯ細胞株変種、Ｌｅｃ１３細胞を記載する。この細胞では、Ａｓｎ（２９７）−結合炭水化物にフコースを付着する能力が低下し、そのため、その宿主細胞において発現される抗体のフコシル化の低下も誘発される（さらに、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０を参照されたい）。Ｕｍａｎａらによる国際公開第９９／５４３４２号は、糖タンパク修飾性グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ  ＩＩＩ）を発現するように加工された細胞株を記載する。この細胞株では、その中に発現される抗体が、バイセクティングＧｌｃＮａｃ構造の増大を示し、そのため抗体のＡＤＣＣ活性の上昇がもたらされる（さらに、Ｕｍａｎａら、（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０を参照されたい）。それとは別に、抗体のフコース残基は、フコシダーゼ酵素を用いて切り離してもよい。例えば、フコシダーゼ、アルファ−Ｌ−フコシダーゼは、抗体からフコシル残基を取り除く（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ，Ａ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５１６−２３）。
【０１１１】
本発明の考慮の対象となる、本発明の抗体のもう一つの修飾は、ＰＥＧ付加である。抗体は、例えば、該抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を延長するためにＰＥＧ付加することが可能である。抗体にＰＥＧ付加するためには、通常、該抗体、またはその断片を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、ＰＥＧの反応性エステル、またはアルデヒド誘導体と、一つ以上のＰＥＧ基が、該抗体または抗体断片に付着することが可能となる条件下で反応させる。ＰＥＧ付加は、反応性ＰＥＧ分子（または、類似の、水溶性、反応性ポリマー）によるアシル化、またはアルキル化反応を通じて行われることが好ましい。本明細書で用いる「ポリエチレングリコール」という用語は、他のタンパクついても誘導体形成するために使用される、任意の形状のＰＥＧ、例えば、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−、またはアリールオキシ−ポリエチレングリコール、またはポリエチレングリコール−マレイミドを含有することが意図される。ある実施態様では、ＰＥＧ付加される抗体は、非糖化抗体である。タンパクにＰＥＧ付加するための方法は、従来技術で既知であり、本発明の抗体に適用することが可能である。例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａらによる欧州特許第０１５４３１６号およびＩｓｈｉｋａｗａらによる欧州特許第０４０１３８４号を参照されたい。
【０１１２】
抗体の物理的特性
本発明の抗体は、抗ＰＴＫ７抗体の各種物理的特性によってさらに特徴づけられてもよい。これらの物理的特性に基づいて異なるクラスの抗体を検出および／または区別するために様々なアッセイを使用してよい。
【０１１３】
ある実施態様では、本発明の抗体は、軽鎖または重鎖可変領域のいずれかに一つ以上の糖化部位を含んでもよい。可変領域における一つ以上の糖化部位の存在は、該抗体の抗原性の増加、または、抗原結合性の変化による抗体ｐＫの変化をもたらす（Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ（１９７２）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ４１：６７３−７０２；Ｇａｌａ  ＦＡ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＬ（２００４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２：５４８９−９４；Ｗａｌｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６８：１０９９−１０９；Ｓｐｉｒｏ  ＲＧ（２００２）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２：４３Ｒ−５６Ｒ；Ｐａｒｅｋｈ  ｅｔ  ａｌ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１６：４２５−７；Ｍｉｍｕｒａら、（２０００）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３７：６９７−７０６）。糖化は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含むモチーフに出現することが知られる。可変領域糖化は、抗体を切断してＦａｂを生産するグライコブロットを用いて調べ、次いで、過ヨウ素酸酸化およびシッフ塩基の形成を測定するアッセイを用いて糖化の有無を調べてもよい。それとは別に、可変領域の糖化は、Ｆａｂのサッカリドを切断してモノサッカリドに変換し、個々のサッカリド含量を分析するＤｉｏｎｅｘ光クロマトグラフィー（Ｄｉｎｏｅｘ−ＬＣ）を用いて調べてもよい。ある場合、可変領域糖化を含まない抗ＰＴＫ７抗体を用意することが好ましい。これは、可変領域に糖化モチーフを含まない抗体を選ぶことによって、または、従来技術で周知の標準技術を用いて糖化モチーフ内の残基を突然変異させることによって実現することが可能である。
【０１１４】
ある好ましい実施態様では、本発明の抗体は、アスパラギン異性体形成部位を含まない。脱アミド化、またはイソアスパラギン酸作用が、それぞれ、Ｎ−Ｇ、またはＤ−Ｇ配列において起こってもよい。この脱アミド化またはイソアスパラギン酸作用は、イソアスパラギン酸の創出を招き、これは、主鎖ではなく、側鎖のカルボキシ末端に捩れ構造を創出することによって抗体の安定性を下げる。イソアスパラギン酸の創出は、イソアスパラギン酸の有無を調べるために逆相ＨＰＬＣを用いるｉｓｏ−ｑｕａｎｔアッセイによって測定することが可能である。
【０１１５】
各抗体は、一意の等電点（ｐＩ）を有するが、一般に、抗体は、通常６と９．５の間のｐＨ範囲に納まり、ＩｇＧ４抗体のｐＩは、通常、６−８のｐＨ範囲に納まる。抗体は、この範囲の外にはみ出るｐＩを有してもよい。その作用は一般に未知であるが、正常範囲をはみ出すｐＩを有する抗体は、インビボ条件下では、若干のフォールド形成不備および不安定性を有する可能性があると考えられている。等電点は、ｐＨ勾配を創出する、毛管型等電点電気泳動アッセイを用いて調べ、正確度を高めるためにレーザー焦点機能を利用してもよい（Ｊａｎｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２３：１６０５−１１；Ｍａら、（２００１）Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ  ５３：Ｓ７５−８９；Ｈｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ  ８００：３５５−６７）。ある場合、正常範囲に納まるｐＩ値を含む抗ＰＴＫ７抗体を用意することが好ましい。これは、正常範囲にｐＩを有する抗体を選ぶことによって、または、従来技術で周知の標準技術を用いて表面荷電残基を突然変異させることによって実現することが可能である。
【０１１６】
各抗体は、融点を持ち、これは、熱安定性を示す（Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ  Ｒ  ａｎｄ  Ｍａｎｎｉｎｇ  ＭＣ（２００２）Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３：３６１−７１）。より高い熱安定性は、インビボにおける、抗体の、より大きな全体的安定性を示す。抗体の融点は、差動式走査型熱量計（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２０：１９５２−６０；Ｇｈｉｒｌａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ６８：４７−５２）などの技術を用いて測定してもよい。ＴＭ１は、抗体の最初のフォールド解除温度を示す。ＴＭ２は、抗体の完全なフォールド解除温度を示す。一般に、本発明の抗体のＴＭ１は、６０℃を上回るか、好ましくは６５℃、さらに好ましくは７０℃を上回ることが好ましい。それとは別に、抗体の熱安定性は、円二色性（Ｍｕｒｒａｙら、（２００２）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｓｃｉ  ４０：３４３−９）を用いて測定してもよい。
【０１１７】
好ましい実施態様では、急速に変性することのない抗体が選ばれる。抗ＰＴＫ７抗体の断片化は、従来技術でよく理解されるように、毛細管電気泳動（ＣＥ）およびＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いて測定してもよい（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＡＪ  ａｎｄ  Ｈｕｇｈｅｓ  ＤＥ（１９９５）Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ６７：３６２６−３２）。
【０１１８】
もう一つの好ましい実施態様では、最小の凝集作用を有する抗体が選ばれる。凝集は、有害な免疫反応、および／または、変化した、または不都合な薬物動態学的特性を誘発する場合がある。一般に、抗体は、２５％以下、好ましくは２０％以下、さらに好ましくは５％以下の凝集であれば受容可能である。凝集は、従来技術で周知のいくつかの技術、例えば、サイズ排除カラム（ＳＥＣ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、および、モノマー、ダイマー、トリマー、またはマルチマーを特定するための光散乱を含む技術を用いて測定してもよい。
【０１１９】
抗体の加工法
前述のように、本明細書に開示される、ＶＨおよびＶＫ配列を有する抗ＰＴＫ７抗体は、このＶＨおよび／またはＶＫ配列、または、それに付着する定常域（単複）を修飾することによって、新規抗ＰＴＫ７抗体を創製するために使用することが可能である。したがって、本発明の、もう一つの局面では、本発明の抗ＰＴＫ７抗体、例えば、３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａ、または７Ｃ８の構造的特徴を用いて、本発明の抗体の、少なくとも一つの機能的特性、例えば、ヒトＰＴＫ７に対する結合性を保持する、構造的に関連する抗ＰＴＫ７抗体が創製される。前述したように、例えば、３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａ、または７Ｃ８の、一つ以上のＣＤＲ領域、またはその突然変異を、既知の枠組み構造、および／または他のＣＤＲと組み換え手法によって組み合わせて、本発明の、さらに別の、組み換え手法によって加工された、抗ＰＴＫ７抗体を創製することが可能である。他のタイプの修飾としては、前節に記載されたものが挙げられる。この加工法のための開始材料は、本発明において提供されるＶＨおよび／またはＶＫ配列の内の一つ以上、または、その、一つ以上のＣＤＲ領域である。加工抗体を創製するためには、本発明において提供されるＶＨおよび／またはＶＫ配列の内の一つ以上、または、その、一つ以上のＣＤＲ領域を実際に調製する（すなわち、タンパクとして発現する）必要はない。むしろ、配列（単複）の中に含まれる情報を開始材料として用いて、起源配列（単複）から誘導される「第二世代」配列（単複）を創製し、次いで、この「第二世代」配列（単複）が調製され、タンパクとして発現される。
【０１２０】
したがって、もう一つの実施態様では、本発明は、抗ＰＴＫ７抗体を調製する方法であって、
（ａ）（ｉ）配列番号１１、１２、１３、および１４からなる群より選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１５、１６、１７、および１８からなる群より選択されるＣＤＲ２配列、および／または、配列番号１９、２０、２１、および２２からなる群より選択されるＣＤＲ３配列を含む、重鎖可変領域抗体配列；および／または、（ｉｉ）配列番号２３、２４、２５、２６、２７、および２８からなる群より選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２９、３０、３１、３２、３３、および３４からなる群より選択されるＣＤＲ２配列、および／または、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、および４０からなる群より選択されるＣＤＲ３配列を含む、軽鎖可変領域抗体配列を準備すること；
（ｂ）重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配列における少なくとも一つのアミノ酸残基を変えて、少なくとも一つが変更された抗体配列を創製すること；および、
（ｃ）この変更抗体配列をタンパクとして発現すること、
を含む方法を提供する。
【０１２１】
この変更抗体配列を調製し、発現するために、標準的分子生物学技術を用いることが可能である。
【０１２２】
この変更抗体配列（単複）によってコードされる抗体は、本明細書に記載される抗ＰＴＫ７抗体の機能的特性の内の一つ、いくつか、または全てを保持するものであり、その機能的特性としては、下記：
（ａ）抗体は、１×１０−７Ｍ以下のＫＤにおいてヒトのＰＴＫ７に結合する；
（ｂ）抗体は、ウィルムス腫瘍細胞株に結合する、
が挙げられるが、ただし、これらに限定されない。
【０１２３】
この変更抗体の機能的特性は、従来技術において利用可能な標準アッセイ、および／または本明細書に記載される標準アッセイ、例えば、実施例に記載されるもの（例えば、フローサイトメトリー、結合アッセイ）を用いて評価することが可能である。
【０１２４】
本発明の抗体加工法のある実施態様では、抗ＰＴＫ７抗体コード配列の全て、またはその一部に亘って、ランダムに、または選択的に突然変異を導入し、得られた、修飾された抗ＰＴＫ７抗体を、本明細書に記載するやり方で、結合活性、および／または他の機能的特性についてスクリーニングすることが可能である。突然変異法は従来技術に記載される。例えば、Ｓｈｏｒｔによる国際公開第０２／０９２７８０号は、飽和突然変異発生、合成ライゲーションアッセンブリ、またはそれらの組み合わせによって、抗体突然変異を創出およびスクリーニングする方法を記載する。それとは別に、Ｌａｚａｒによる国際公開第０３／０７４６７９号は、抗体の物理化学的特性を最適化するための、コンピュータによるスクリーニング法による方法を記載する。
【０１２５】
本発明の抗体をコードする核酸分子
本発明のもう一つの局面は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関する。この核酸は、全体細胞中にあっても、細胞分解物にあっても、あるいは、部分的に精製された形状か、またはほぼ純粋な形状として存在してもよい。核酸は、他の細胞成分、または他の汚染物質、例えば、他の細胞核酸またはタンパクから、標準技術、例えば、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動を含む標準技術、または、他の、従来技術で周知の技術によって分離精製されると、「単離」、または「ほぼ純化」される。Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、イントロン配列を含んでもよいし、または含まなくともよい。好ましい実施態様では、核酸はｃＤＮＡ分子である。
【０１２６】
本発明の核酸は、標準的分子生物学技術を用いて入手することが可能である。ハイブリドーマ（例えば、下記にさらに記載する、ヒトの免疫グロブリン遺伝子を担持するトランスジェニックマウスから調製したハイブリドーマ）によって発現される抗体では、該ハイブリドーマによって製造される抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的ＰＣＲ増幅、またはｃＤＮＡクローニング技術を用いて入手することが可能である。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから（例えば、ファージディスプレイライブラリーを用いて）得られる抗体では、抗体をコードする核酸は、そのライブラリーから回収することが可能である。
【０１２７】
本発明の好ましい核酸分子は、３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａ、または７Ｃ８モノクローナル抗体の、ＶＨおよびＶＬ配列をコードするものである。３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａ、および７Ｃ８のＶＨ配列をコードするＤＮＡ配列は、配列番号４１（３Ｇ８および３Ｇ８ａ）、４２（４Ｄ５）、４３（１２Ｃ６および１２Ｃ６ａ）、および４４（７Ｃ８）に示される。３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａ、および７Ｃ８のＶＬ配列をコードするＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号４５、４６、４７、４８、４９、および５０に示される。
【０１２８】
ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が入手されたならば、例えば、この可変領域遺伝子を、抗体鎖全長遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子、またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、これらの断片を、標準的組み換えＤＮＡ技術を用いてさらに操作することが可能である。これらの操作において、ＶＬまたはＶＨコードＤＮＡ断片は、抗体定常域、または屈曲性リンカーなどの、別のタンパクをコードする、別のＤＮＡ断片に動作可能的に結合される。この文脈において使用される「動作可能的に連結される」という用語は、二つのＤＮＡ断片が、この二つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列同士がインフレーム状態を保持するように連結されることを意味することが意図される。
【０１２９】
ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、このＶＨコードＤＮＡを、重鎖定常域（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）をコードする、別のＤＮＡ分子に動作可能的に連結することによって、重鎖全長遺伝子に変換することが可能である。ヒトの重鎖定常域遺伝子の配列は、従来技術で既知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的ＰＣＲ増幅によって入手することが可能である。重鎖定常定常域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常域であり得るが、最も好もしくは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常域であり得る。Ｆａｂ断片の重鎖遺伝子のために、ＶＨをコードするＤＮＡが、重鎖ＣＨ１定常域のみをコードする別のＤＮＡ分子に動作可能に連結されても良い。
【０１３０】
ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、このＶＬコードＤＮＡを、軽鎖定常域（ＣＨ）をコードする、別のＤＮＡ分子に動作可能的に連結することによって、軽鎖全長遺伝子に変換することが可能である。ヒトの軽鎖定常域遺伝子の配列は、従来技術で既知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的ＰＣＲ増幅によって入手することが可能である。軽鎖定常域は、カッパまたはラムダ定常域であってもよいが、カッパ定常域であることがもっとも好ましい。
【０１３１】
ｓｃＦｖ遺伝子を創出するためには、ＶＨ−およびＶＬ−コードＤＮＡ断片は、屈曲性リンカーをコードするもう一つの断片、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする断片に動作可能的に連結され、その連結は、ＶＬおよびＶＨ領域が屈曲性リンカーによって接合された、隣接単一鎖タンパクとして発現されるように行われる（例えば、Ｂｉｒｄら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４を参照されたい）。
【０１３２】
本発明のモノクローナル抗体の生産
本発明のモノクローナル抗体（複数）（ｍＡｂｓ）は、従来型のモノクローナル抗体製法を含めた各種技術、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）のＮａｔｕｒｅ  ２５６：４９５の、標準的体性細胞ハイブリダイゼーション技術によって生産することが可能である。体性細胞ハイブリダイゼーション技術が好ましいけれども、原理的には、他の、モノクローナル抗体生産法、例えば、Ｂリンパ球のウィルスまたは癌遺伝子変換を採用することが可能である。
【０１３３】
ハイブリドーマを調製するための好ましい動物システムは、マウスシステムである。マウスにおけるハイブリドーマ生産のための手順は、きわめてよく確立されている。免疫化プロトコール、および、融合用免疫化脾臓細胞の単離技術は、従来技術で既知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄細胞）、および融合手順も既知である。
【０１３４】
本発明のキメラまたはヒト化抗体は、前述のようにして調製された、マウスモノクローナル抗体の配列に基づいて調製することが可能である。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、標準的分子生物学技術を用いて、対象とするマウスハイブリドーマから得て、非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含むように加工することが可能である。例えば、キメラ抗体を創製するためには、従来技術で既知の方法を用いて、マウス可変領域をヒトの定常域に連結することが可能である（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙらに付与された米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。ヒト化抗体を創製するためには、従来技術で既知の方法を用いて、マウスのＣＤＲ領域を、ヒトの枠組み構造に挿入することが可能である（例えば、Ｗｉｎｔｅｒに付与された米国特許第５，２２５，５３９号、および、Ｑｕｅｅｎらに付与された米国特許第５，５３０，１０１；５，５８５，０８９；５，６９３，７６２、および６，１８０，３７０号を参照されたい）。
【０１３５】
ある好ましい実施態様では、本発明の抗体は、ヒトのモノクローナル抗体である。ＰＴＫ７に向けられた、このようなヒトのモノクローナル抗体は、マウスのシステムではなく、ヒトの免疫システムの一部を担う、遺伝子導入（トランスジェニック）または染色体導入マウスを用いて生成することが可能である。これらのトランスジェニックおよび染色体導入マウスは、それぞれ、本明細書においてＨｕＭＡｂマウスと呼ばれるマウス、およびＫＭマウス（登録商標）を含み、本明細書ではまとめて「ヒトＩｇマウス」と呼ばれる。
【０１３６】
このＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）は、内因性μおよびκ鎖座位を不活性化する標的突然変異と共に、再編成されていない、ヒトの重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードする、ヒトの、免疫グロブリン遺伝子ミニ座位を含む（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９を参照されたい）。従って、このマウスでは、マウスＩｇＭまたはκの発現の低下が示されるが、免疫化に反応し、導入されたヒトの、重鎖および軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチおよび体性突然変異を経て、高い親和性を有するＩｇＧκモノクローナルを生成する（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）上記；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９−１０１に総説される；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｄ．（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３、およびＨａｒｄｉｎｇ，Ｆ．ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６）。ＨｕＭａｂマウスの調製および使用、および、このマウスによって担持されるゲノム修飾はさらに、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：６２８７−６２９５；Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５：６４７−６５６；Ｔｕａｉｌｌｏｎら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：３７２０−３７２４；Ｃｈｏｉら、（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１１７−１２３；Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８２１−８３０；Ｔｕａｉｌｌｏｎら、（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０；Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：５７９−５９１；ａｎｄ  Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１に記載される。なお、これらの全ての内容を、その全体のまま、引用により指定して本明細書に含めることにする。さらに、全てＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙに付与された、米国特許第５，５４５，８０６、５，５６９，８２５、５，６２５，１２６、５，６３３，４２５、５，７８９，６５０、５，８７７，３９７、５，６６１，０１６、５，８１４，３１８、５，８７４，２９９、および５，７７０，４２９号；Ｓｕｒａｎｉらに付与された米国特許第５，５４５，８０７号；全てＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙに付与された国際公開第９２／０３９１８、９３／１２２２７、９４／２５５８５、９７／１３３５２、９８／２４８８４、および９９／４５９６２号、および、Ｋｏｒｍａｎらに付与された国際公開第０１／１４４２４号を参照されたい。
【０１３７】
もう一つの実施態様では、導入遺伝子および導入染色体上にヒトの免疫グロブリン配列を担持するマウス、例えば、ヒトの重鎖導入遺伝子およびヒトの軽鎖導入染色体を担持するマウスを用いて、本発明のヒト抗体を育成することが可能である。本明細書では「ＫＭマウス（登録商標）」と呼ばれる、このようなマウスは、Ｉｓｈｉｄａらに付与された国際公開第０２／４３４７８号に詳述される。
【０１３８】
ヒトの免疫グロブリン遺伝子を発現する、さらに別のトランスジェニック動物が、従来技術において利用可能であり、本発明の抗ＰＴＫ７抗体の育成に使用が可能である。例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）と呼ばれる、代替トランスジェニックシステムを使用することが可能である。このようなマウスは、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらに付与された米国特許第５，９３９，５９８；６，０７５，１８１；６，１１４，５９８；６，１５０，５８４；および６，１６２，９６３号に記載される。
【０１３９】
さらに、ヒトの免疫グロブリン遺伝子を発現する、代替導入染色体動物システムが従来技術において利用可能であり、本発明の抗ＰＴＫ７抗体の育成に使用が可能である。例えば、「ＴＣマウス」と呼ばれる、ヒトの重鎖導入染色体およびヒトの軽鎖導入染色体の両方を担持するマウスの使用が可能である。このようなマウスは、Ｔｏｍｉｚｕｋａら、（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：７２２−７２７に記載される。さらに、ヒトの重鎖および軽鎖導入染色体を担持するウシが従来技術に記載されており（Ｋｕｒｏｉｗａら、（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：８８９−８９４）、本発明の抗ＰＴＫ７抗体の育成に使用が可能である。
【０１４０】
本発明のヒト・モノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を用いて調製することが可能である。ヒトの抗体を単離するための、このようなファージディスプレイ法は、従来技術において確立されている。例えば、Ｌａｄｎｅｒらに付与された米国特許第５，２２３，４０９、５，４０３，４８４、および５，５７１，６９８号；Ｄｏｗｅｒらに付与された米国特許第５，４２７，９０８、および５，５８０，７１７号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらに付与された米国特許第５，９６９，１０８、および６，１７２，１９７号；およびＧｒｉｆｆｉｔｈｓらに付与された米国特許第５，８８５，７９３、６，５２１，４０４、６，５４４，７３１、６，５５５，３１３、６，５８２，９１５、および６，５９３，０８１号を参照されたい。
【０１４１】
本発明のヒト・モノクローナル抗体はまた、免疫化されるとヒト抗体反応を惹起するように、ヒトの免疫細胞が再建されたＳＣＩＤマウスを用いて調製することが可能である。このようなマウスは、例えば、Ｗｉｌｓｏｎらに付与された米国特許第５，４７６，９９６および５，６９８，７６７号に記載される。
【０１４２】
ヒトＩｇマウスの免疫化
本発明のヒト抗体を育成するためにヒトＩｇマウスを使用する場合、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１；および、国際公開第９８／２４８８４および０１／１４４２４号に記載されるように、ＰＴＫ７抗原、および／または組み換えＰＴＫ７、またはＰＴＫ７融合タンパクの精製または濃縮調製品によって、そのようなマウスを免疫化することが可能である。第１回の投与時、マウスは６−１６週齢であることが好ましい。例えば、ヒトＩｇマウスを腹腔内投与によって免疫化するには、ＰＴＫ７の精製または組み換え調製品（５−５０μｇ）を使用することが可能である。
【０１４３】
ＰＴＫ７に対する、完全にモノクローナルなヒト抗体を生成するための手順について、その詳細が、下記の実施例１に記載される。様々な抗原による経験の蓄積から、最初に、フロインドの完全アジュバントに溶解した抗原によって腹腔内（ＩＰ）投与によって免疫化し、次いで、フロインドの不完全アジュバントに溶解した抗原によって１週置きにＩＰ免疫化（最大合計６回まで）すると、トランスジェニックマウスは反応することが示される。しかしながら、フロインド以外のアジュバントでも有効であることが認められている。さらに、アジュバントを欠く全体細胞も、免疫原性が高いことが認められている。免疫反応は、免疫化プロトコールの進行中、血漿サンプルを後眼球出血を通じて入手することによって監視することが可能である。ＥＬＩＳＡ（後述のような）によって血漿をスクリーニングし、十分な力価の、ヒトの抗ＰＴＫ７免疫グロブリンを有するマウスが、融合のために使用される。屠殺し、脾臓を除去する３日前に、マウスに抗原を静注してブーストしてもよい。各免疫化ごとに、２−３回の融合の実行が必要とされることが予想される。各抗原ごとに、通常、６から２４匹のマウスが免疫化される。通常、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２株の両方が使用される。さらに、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２の両導入遺伝子を一緒に育成し、二つの異なるヒトの重鎖導入遺伝子（Ｈｃｏ７／ＨＣｏ１２）を有する単一マウスを形成することが可能である。それとは別に、またはそれに加えてさらに、実施例１に記載するように、ＫＭマウス（登録商標）系統を使用することも可能である。
【０１４４】
本発明のヒト・モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマの生成
本発明のヒト・モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを生成するには、免疫化マウスから得られる脾臓細胞および／またはリンパ節細胞を単離して、適切な恒久細胞株、例えば、マウス骨髄腫細胞株に融合させることが可能である。得られたハイブリドーマを、抗原特異的抗体の生産についてスクリーニングすることが可能である。例えば、免疫化マウスから得られた脾臓リンパ球の単一細胞縣濁液を、５０％ＰＥＧによって、１／６数の、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌型マウス骨髄細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８０）と融合させることが可能である。細胞を、平底マイクロタイタープレートに約２×１０５で撒き、次いで、２０％胎児クローン血清、１８％“６５３”条件化媒体、５％ｏｒｉｇｅｎ（ＩＧＥＮ）、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭの２−メルカプトエタノール、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン、および１Ｘ  ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ；ＨＡＴは、融合の２４時間後に加える）を含む選択培地で２週間インキュベートする。約２週間後、ＨＡＴをＨＴで置換した培地で細胞を培養することが可能である。次に、ＥＬＩＳＡによって個々のウェルを、ヒトのＩｇＭおよびＩｇＧモノクローナル抗体についてスクリーニングすることが可能である。広範なハイブリドーマ増殖が起こると、通常、１０−１４日後に培養液の観察が可能となる。抗体分泌性ハイブリドーマを改めて撒き、再度スクリーングし、ヒトのＩｇＧについて依然として陽性であるならば、このモノクローナル抗体を、限界希釈によって少なくとも２回サブクローンすることが可能である。次に、安定なサブクローンを培養して、その特徴解明のために、組織培養媒体において少量の抗体を生成する。
【０１４５】
ヒトのモノクローナル抗体を精製するには、選ばれたハイブリドーマを、２リットルのスピナーフラスコ中で増殖させ、モノクローナル抗体精製に備える。上清をろ過し、濃縮し、次いで、タンパクＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州）によるアフィニティクロマトグラフィーを行う。溶出ＩｇＧは、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーによってチェックし、純度を確認する。このバッファー液は、ＰＢＳに交換することが可能であり、濃度は、１．４３の吸光係数を用いＯＤ２８０によって定量することが可能である。このモノクローナル抗体は、分液し、−８０℃において保存することが可能である。
【０１４６】
本発明のモノクローナル抗体を生産するトランスフェクトーマの生成
本発明の抗体はさらに、例えば、従来技術で周知の、組み換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション法の組み合わせを用いて（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２）、宿主細胞トランスフェクトーマ細胞において生産することが可能である。
【０１４７】
例えば、抗体、またはその抗体断片を発現するために、部分的、または全長の、軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを、標準的分子生物学技術（例えば、対象抗体を発現するハイブリドーマを用いた、ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング）を用いて入手し、かつ、このＤＮＡを、この遺伝子が、転写および翻訳調節配列に動作可能的に連結するように発現ベクターに挿入することが可能である。この文脈において、「動作可能的に連結」という用語は、抗体遺伝子が、ベクターに連結され、その連結は、該ベクター内の転写および翻訳調節配列が、該抗体遺伝子の転写および翻訳の調節という意図される機能を助長するやり方で行われることを意味することが意図される。発現ベクターおよび発現調節配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選ばれる。抗体の軽鎖遺伝子および抗体の重鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入することが可能であるが、より一般的には、二つの遺伝子は、同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は、標準法（例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的制限部位の連結、または、制限部位が無い場合は、平滑末端連結）によって発現ベクター中に挿入される。本明細書に記載される抗体の軽鎖および重鎖可変領域を用い、下記によって、任意の抗体アイソタイプの、完全長抗体遺伝子を創製することが可能である。すなわち、所望のアイソタイプの重鎖定常域および軽鎖定常域を既にコードする発現ベクターの中に、それらの可変領域のコード遺伝子を挿入し、かつ、挿入を、ＶＨセグメントが、該ベクター内のＣＨセグメント（単複）に動作可能的に連結するように、ＶＫセグメントが、該ベクター内のＣＬセグメントに動作可能的に連結するように行うことによって、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を創製することが可能である。さらに、またはそれとは別に、組み換え発現ベクターは、抗体鎖の、宿主細胞からの分泌を促進する、シグナルペプチドをコードしてもよい。この抗体鎖遺伝子は、該シグナルペプチドが、抗体鎖遺伝子のアミノ末端に対しインフレームとなるようにベクターにクローンすることが可能である。このシグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドであってもよいし、または異種のシグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク由来のシグナルペプチド）であってもよい。
【０１４８】
抗体鎖遺伝子の外に、本発明の組み換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を調節する調節配列を担う。この「調節配列」という用語は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を調節する、プロモーター、エンハンサー、および、その他の発現調節要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０））に記載される。当業者であれば、調節配列の選択を含めた、発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパクの発現レベルなどの因子に依存することが了解されるであろう。哺乳類宿主細胞の好ましい調節配列としては、哺乳類細胞において高レベルのタンパク発現を指令するウィルス要素、例えば、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）、アデノウィルス（例えば、アデノウィルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）、およびポリオーマから得られるプロモーターおよび／またはエンハンサーが挙げられる。それとは別に、非ウィルス性の調節配列、例えば、ユビキチンプロモーター、またはβ−グロビンプロモーターを使用してもよい。さらに、異なる供給源から得られた配列から構成される調節要素、例えば、ＳＶ４０の早期プロモーターの配列、およびヒト１型Ｔ細胞白血球ウィルスの、長い末端反復列を含むＳＲαシステム（Ｔａｋｅｂｅ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６−４７２）を用いてもよい。
【０１４９】
抗体鎖遺伝子および調節配列の外に、本発明の組み換え発現ベクターは、さらに別の配列、例えば、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）、および選択可能マーカー遺伝子を担ってもよい。この選択可能遺伝子マーカーは、ベクターが導入された宿主細胞の選択をやり易くする（例えば、全てＡｘｅｌらによる、米国特許第４，３９９，２１６、４，６３４，６６５、および５，１７９，０１７号を参照）。例えば、通常、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に対し、薬剤、例えば、Ｇ４１８、ヒグロマイシン、またはメトトレキセートに対する耐性を付与する。好ましい選択可能マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅下にｄｈｆｒ−宿主細胞に使用）、およびネオ遺伝子（Ｇ４１８選択用）が挙げられる。
【０１５０】
軽鎖および重鎖を発現するために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクター（単複）が、標準技術によって宿主細胞にトランスフェクトされる。用語「トランスフェクション」について様々な形が使用されるが、これらは、前核または真核宿主細胞の中に外来ＤＮＡを導入するために一般に使用される多様な技術、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどの技術を包含することが意図される。本発明の抗体は、理論的には、前核、または真核細胞のいずれにおいても発現することが可能であるが、真核細胞における抗体の発現が、もっとも好ましくは哺乳類宿主細胞における発現がもっとも好ましい。なぜなら、真核細胞、特に哺乳類細胞の方が、前核細胞よりも、適切に折りたたまれ、免疫学的に活性な抗体を組み立て、かつ、分泌する可能性が高いからである。抗体遺伝子の前核細胞性発現は、活性抗体の高収率生産には無効であることが報告されている（Ｂｏｓｓ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ  Ｗｏｏｄ，Ｃ．Ｒ．（１９８５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ６：１２−１３）。
【０１５１】
本発明の組み換え抗体を発現するのに好ましい哺乳類宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されるようなＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用される、Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載されるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、およびＳＰ２細胞が挙げられる。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞と共に使用する場合、もう一つの好ましい発現システムは、国際公開第８７／０４４６２号および第８９／０１０３６号、および欧州特許第３３８，８４１号に開示されるＧＳ遺伝子発現システムである。抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞に導入されると、この宿主細胞において抗体の発現を可能とするのに十分な期間、より好ましくは、宿主細胞が育成される培養媒体中に抗体を分泌するのに十分な期間宿主細胞を培養することによって抗体が生産される。抗体は、標準的タンパク精製法を用いて培養媒体から回収することが可能である。
【０１５２】
抗原にたいする抗体結合の特徴解明
本発明の抗体は、ＰＴＫ７に対する結合に関して、例えば、標準的ＥＬＩＳＡによって試験することが可能である。簡単に言うと、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳに溶解した０．２５μｇ／ｍｌの精製ＰＴＫ７をコートし、次いで、ウシ血清アルブミンの５％ＰＢＳ液でブロックする。抗体の希釈液（例えば、ＰＴＫ７免疫化マウスから得た血漿の希釈液）を各ウェルに加え、３７℃で１−２時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次いで、アルカリフォスファターゼに接合させた二次試薬（例えば、ヒト抗体では、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的ポリクローナル試薬）と３７℃で１時間インキュベートする。洗浄後、プレートを、ｐＮＰＰ基質（１ｍｇ／ｍｌ）によって現像し、４０５−６５０のＯＤにおいて分析する。最高力価を発揮するマウスを融合に使用することが好ましい。
【０１５３】
前述の通りのＥＬＩＳＡアッセイをさらに用いて、ＰＴＫ７免疫原と陽性反応を示すハイブリドーマを求めてスクリーニングする。ＰＴＫ７に対する結合において高いアビディティーを示すハイブリドーマをサブクローンし、さらに特徴解明を行う。各ハイブリドーマから、親細胞の反応性を保持する（ＥＬＩＳＡによって）一クローンを選び、５−１０バイアルの細胞バンクを製造し−１４０℃で保存し、抗体精製に備える。
【０１５４】
抗ＰＴＫ７抗体を精製するために、選ばれたハイブリドーマを、モノクローナル抗体精製用の、２リットルのスピナーフラスコにおいて育成してもよい。上清をろ過して濃縮し、次いで、タンパクＡセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州）によるアフィニティクロマトグラフィーを行ってもよい。溶出ＩｇＧは、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーによってチェックし、純度を確認してもよい。このバッファー液は、ＰＢＳに交換することが可能であり、濃度は、１．４３の吸光係数を用いＯＤ２８０によって定量することが可能である。このモノクローナル抗体は、分液し、−８０℃において保存することが可能である。
【０１５５】
選ばれた抗ＰＴＫ７モノクローナル抗体が、一意のエピトープに対して結合するかどうかを決めるために、各抗体を、市販の試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州）を用いてビオチニル化することが可能である。未標識モノクローナル抗体、およびビオチニル化モノクローナル抗体による競合実験を、前述のような、ＰＴＫ７塗布のＥＬＩＳＡプレートを用いて行うことが可能である。ビオチニル化ｍＡｂ結合は、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼプローブによって検出することが可能である。
【０１５６】
精製抗体のアイソタイプを決めるために、特定のアイソタイプの抗体に対して特異的な試薬を用いて、アイソタイプＥＬＩＳＡを実行することが可能である。例えば、ヒトのモノクローナル抗体のアイソタイプを決めるために、マイクロタイタープレートのウェルに、１μｇ／ｍｌの抗ヒト免疫グロブリンをコートし、４℃で一晩インキュベートすることが可能である。１％ＢＳＡによってブロックした後、プレートを、１μｇ／ｍｌ以下の試験モノクローナル抗体、または精製アイソタイプコントロールと、周囲温で１から２時間反応させる。次いで、ウェルを、ヒトＩｇＧ１、またはヒトＩｇＭ特異的アルカリフォスファターゼ接合プローブと反応させることが可能である。プレートを現像し、前述のように分析する。
【０１５７】
ヒトの抗ＰＴＫ７ＩｇＧはさらに、ウェスタンブロッティングによってＰＴＫ７抗原に対する反応性について試験することが可能である。簡単に言うと、ＰＴＫ７を調製し、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動で処理することが可能である。電気泳動後、分離された抗原をニトロセルロース膜に転送し、１０％子牛血清でブロックし、試験されるモノクローナル抗体をプローブとして調べる。ヒトのＩｇＧ結合は、抗ヒトＩｇＧアルカリフォスファターゼを用いて検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質錠剤（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，セントルイス、ミズーリ州）で現像する。
【０１５８】
免疫結合体
もう一つの局面では、本発明は、治療成分、例えば、細胞毒素、薬剤（例えば、免疫抑制剤）、または放射性毒素などの成分に接合される、抗ＰＴＫ７、またはその断片を、その特徴とする。このような結合体は、本明細書では「免疫結合体」と呼ばれる。一つ以上の細胞毒素を含む免疫結合体は、「免疫毒素」と呼ばれる。細胞毒素、または細胞傷害剤は、細胞にとって破滅的な（例えば、細胞を殺す）ものであれば、どのような薬剤であってもよい。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトザントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロパノロール、およびプロマイシン、およびそれらの類縁体または相同体が挙げられる。治療薬剤としてはさらに、例えば、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブチル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン類（例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）、およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、およびビンブラスチン）が挙げられる。
【０１５９】
本発明の抗体に接合することが可能な、治療的細胞毒素の、他の、好ましい例としては、ドゥオカルマイシン、カリチェアミシン、マイタンシン、およびアウリスタチン、およびそれらの誘導体が挙げられる。カリチェアミシン・抗体結合体の例が市販されている（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）；Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ）。治療的細胞毒素の例は、例えば、米国特許第６５４８５３０および６２８１３５４号、および米国特許出願第２００３／００６４９８４、２００３／００７３８５２、および２００３／００５０３３１号の中に見出される。
【０１６０】
細胞毒素は、従来技術で利用可能なリンカー技術を用いて本発明の抗体に接合することが可能である。細胞毒素を抗体に接合するために使用されるリンカータイプの例としては、ヒドラゾン類、チオエーテル類、エステル類、ジスルフィド類、およびペプチド含有リンカーが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。リンカーは、例えば、リソソーム区画内の低ｐＨによって切断され易いか、または、例えば、カテプシン（例えば、カテプシンＢ、Ｃ、Ｄ）などの腫瘍組織において優先的に発現されるプロテアーゼによって切断され易いものを選ぶことも可能である。
【０１６１】
細胞毒素のタイプ、リンカー、および、抗体に治療薬剤を接合させるための方法に関するさらに詳細な考察については、Ｓａｉｔｏ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５５：１９９−２１５；Ｔｒａｉｌ，Ｐ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：３２８−３３７；Ｐａｙｎｅ，Ｇ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３：２０７−２１２；Ａｌｌｅｎ，Ｔ．Ｍ．（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２：７５０−７６３；Ｐａｓｔａｎ，Ｉ．ａｎｄ  Ｋｒｅｉｔｍａｎ，Ｒ．Ｊ．（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ  ３：１０８９−１０９１；Ｓｅｎｔｅｒ，Ｐ．Ｄ．ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ｊ．（２００１）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．５３：２４７−２６４を参照されたい。
【０１６２】
本発明の抗体はさらに、別に放射性免疫結合体とも呼ばれる、細胞傷害性放射性薬品を生成するために放射性同位元素に接合させることも可能である。診断的または治療的使用のために抗体に接合が可能な、放射性同位元素の例としては、ヨウ素１３１、インジウム１１１、イットリウム９０、およびルテチウム１７７が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。放射性免疫結合体の調製法は、従来技術において確立されている。放射性免疫結合体は、Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）およびＢｅｘｘａｒ（登録商標）（Ｃｏｒｉｘａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含む例が市販されており、本発明の抗体を用いた放射性結合体の調製には同様の方法の使用が可能である。
【０１６３】
本発明の抗体結合体は、任意の生物学的反応を修飾するために使用することが可能であり、薬剤成分は、古典的な、化学療法剤に限定されるものと考えてはならない。例えば、薬剤成分は、所望の生物学的活性を有するタンパクまたはポリペプチドであってもよい。このようなタンパクとしては、例えば、酵素的に活性な毒素、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナスエキソトキシン、またはジフテリア毒素などの毒素、またはその活性断片、腫瘍壊死因子、またはインターフェロンγなどのタンパク、または、例えば、リンフォカイン、インターロイキン−１（“ＩＬ−１”）、インターロイキン−２（“ＩＬ−２”）、インターロイキン−６（“ＩＬ−６”）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（“ＧＭ−ＳＣＦ”）、顆粒球コロニー刺激因子（“Ｇ−ＣＳＦ”）、または他の増殖因子などの生物学的反応修飾因子が挙げられてもよい。
【０１６４】
抗体にこのような治療成分を接合するための技術は、よく知られており、例えば、Ａｒｎｏｎら、，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄら、（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、（ｅｄｓ．）ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａら、（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎら、（ｅｄｓ．），ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５），ａｎｄ  Ｔｈｏｒｐｅら、，“Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８（１９８２）を参照されたい。
【０１６５】
二重特異性分子
もう一つの局面では、本発明は、本発明の抗ＰＴＫ７抗体、またはその断片を含む二重特異性分子をその特徴とする。本発明の抗体、またはその、抗原結合性断片は、誘導体形成し、または、もう一つの機能的分子、例えば、もう一つのペプチドまたはタンパク（例えば、もう一つの抗体、または受容体に対するリガンド）に連結されて、少なくとも二つの、異なる結合部位、または標的分子に結合する、二重特異性分子を生成することが可能である。事実、本発明の抗体は、誘導体形成するか、または、一つを超える、他の機能的分子に連結されて、二つを超える異なる結合部位および／または標的分子に結合する多重特異性分子を生成してもよい。このような多重特異性分子はまた、本明細書で用いる「二重特異性分子」という用語によって包含されることが意図される。本発明の二重特異性分子を創製するために、本発明の抗体を、一つ以上の、他の結合分子、例えば、もう一つの抗体、抗体断片、ペプチド、または結合性類似体に、二重特異性分子が得られるように機能的に連結（例えば、化学的結合、遺伝学的融合、非共有的会合、またはその他の結合）させることが可能である。
【０１６６】
したがって、本発明は、ＰＴＫ７に対する、少なくとも一つの第１結合特異性、および、第２の標的エピトープに対する、第２結合特異性を含む、二重特異性分子を含む。本発明のある特定の実施態様では、第二標的エピトープは、Ｆｃ受容体、例えば、ヒトのＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、またはヒトのＦｃα受容体（ＣＤ８９）である。したがって、本発明は、ＦｃγＲまたはＦｃαＲ発現エフェクター細胞（例えば、単球、マクロファージ、または多形核細胞（ＰＭＮ））と、ＰＴＫ７を発現する標的細胞との両方に結合することが可能な二重特異性分子を含む。これら二重特異性分子は、ＰＴＫ７発現細胞をエフェクター細胞に向け、Ｆｃ受容体介在性エフェクター細胞活性、例えば、ＰＴＫ７発現細胞の食作用、抗体依存性細胞性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）、サイトカイン放出、またはスーパーオキシド陰イオンの生成を起動する。
【０１６７】
二重特異性分子が多重特異性である、本発明の実施態様では、分子は、抗Ｆｃ結合特異性および抗ＰＴＫ７結合特異性の外に、さらに第３の結合特異性を含むことが可能である。一実施態様では、第３結合特異性は、抗エンハンスメント因子（ＥＦ）部分、例えば、細胞傷害性に関与する表面タンパクに結合し、そうすることによって標的細胞に対する免疫反応を高める分子である。この「抗エンハンスメント因子部分」は、抗体、機能的抗体断片、または、リガンドであって、任意の分子、例えば、抗原または受容体に結合し、そうすることによって、Ｆｃ受容体、または標的細胞抗原に対する結合決定基の作用を強化するリガンドであってもよい。この「抗エンハンスメント因子部分」は、Ｆｃ受容体または標的細胞抗原に結合してよい。それとは別に、抗エンハンスメント因子部分は、第１および第２結合特異性が結合する実体とは異なる実体に結合することが可能である。例えば、抗エンハンスメント因子部分は、細胞傷害性Ｔ細胞に（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＩＣＡＭ−１を介して、または、標的細胞に対する免疫反応を増大させる他の免疫細胞を介して）結合することが可能である。
【０１６８】
一実施態様では、本発明の二重特異性分子は、結合特異性として、少なくとも一つの抗体、または、その抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、または単一鎖Ｆｖを含む抗体断片を含む。抗体はまた、軽鎖または重鎖二量体、または、その任意の最小断片、例えば、Ｆｖ、または、Ｌａｄｎｅｒらの米国特許第４，９４６，７７８号に記載されるような単一鎖構築体であってもよい。なお、この米国特許の内容を引用により本明細書に含めることを明言する。
【０１６９】
一実施態様では、Ｆｃγ受容体に対する結合特異性は、その結合が、ヒトの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）によって阻止されないモノクローナル抗体によって与えられる。本明細書で用いる「ＩｇＧ受容体」という用語は、染色体１に配される８個のγ鎖遺伝子の内のいずれかを指す。これらの遺伝子は、三つのＦｃγ受容体クラス：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に分類される、合計１２個の膜貫通または可溶性受容体アイソタイプをコードする。一つの好ましい実施態様では、Ｆｃγ受容体は、ヒトの高親和性ＦｃγＲＩである。このヒトＦｃγＲＩは、ＩｇＧモノマーに対し高い親和性（１０８−１０９Ｍ−１）を示す、７２ｋＤａの分子である。
【０１７０】
いくつかの好ましい抗Ｆｃγモノクローナル抗体の生産法および特徴解明法が、Ｆａｎｇｅｒらによって、国際公開第８８／０００５２号および米国特許第４，９５４，６１７号に記載される。これらの教示全体を、引用により本明細書に含める。これらの抗体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、またはＦｃγＲＩＩＩから成るエピトープに、受容体のＦｃγ結合部位とは異なる部位において結合し、したがって、その結合は、ＩｇＧの生理的レベルによってほとんど阻止されない。本発明に有用な、特異的抗ＦｃγＲＩ抗体は、ｍＡｂ２２、ｍＡｂ３２、ｍＡｂ６２、およびｍＡｂ１９７である。ｍＡｂ３２を生産するハイブリドーマは、米国基準菌株保存機関、ＡＴＣＣアクセッション番号ＨＢ９４６９から入手することが可能である。別の実施態様では、抗Ｆｃγ受容体抗体は、モノクローナル抗体２２のヒト化形（Ｈ２２）である。Ｈ２２の生産法および特徴解明は、Ｇｒａｚｉａｎｏ，Ｒ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５５（１０）：４９９６−５００２および国際公開第９４／１０３３２号に記載される。Ｈ２２抗体産生細胞株は、米国基準菌株保存機関にＨＡ０２２ＣＬ１という表示の下に寄託されており、アクセッション番号ＣＲＬ１１１７７を有する。
【０１７１】
さらに別の好ましい実施態様では、Ｆｃ受容体に対する結合特異性は、ヒトのＩｇＡ受容体、例えば、Ｆｃ−アルファ受容体（ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９））に結合する抗体によって与えられ、かつ、その結合は、ヒトの免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）によって阻止されないことが好ましい。「ＩｇＡ受容体」という用語は、染色体１９に配置される一α遺伝子（ＦｃαＲＩ）の遺伝子産物を含むことが意図される。この遺伝子は、５５から１１０ｋＤａの、いくつかの、選択的にスプライスされる膜貫通アイソタイプをコードすることが知られる。ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）は、単球／マクロファージ、好酸性および好中性顆粒球においては構成的に発現されるが、非エフェクター細胞集団においては発現されない。ＦｃαＲＩは、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２の両方に対して中等度の親和性（≒５×１０７Ｍ−１）を有するが、この親和性は、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインに暴露されると増大する（Ｍｏｒｔｏｎ，Ｈ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６：４２３−４４０）。Ａ３、Ａ５９、Ａ６２、およびＡ７７として特定され、ＩｇＡリガンド結合ドメイン以外の場所でＦｃαＲＩに結合する、四つのＦｃαＲＩ−特異的モノクローナル抗体が記載されている（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１７６４）。
【０１７２】
ＦｃαＲＩおよびＦｃγＲＩは、本発明の二重特異性分子として使用するのに好適な起動受容体である。なぜなら、それらは、（１）主に、免疫エフェクター細胞、例えば、単球、ＰＭＮ、マクロファージ、および樹状細胞において発現される；（２）高レベルで発現される（例えば、細胞当たり５，０００−１００，０００）；（３）細胞傷害性（例えば、ＡＤＣＣ、食作用）の仲介因子である；（４）自身を標的とする、自己抗原を含む抗原提示の強化を仲介するからである。
【０１７３】
ヒトのモノクローナル抗体が好ましいが、本発明の二重特異性分子として用いることが可能な、他の抗体として、マウス、キメラ、およびヒト化モノクローナル抗体がある。
【０１７４】
本発明の二重特異性分子は、構成的結合特異性、例えば、抗ＦｃＲおよび抗ＰＴＫ７結合特異性を、従来技術で既知の方法を用いて接合することによって調製することが可能である。例えば、二重特異性分子の、各結合特異性は、別々に生成し、次いで、互いに接合させることが可能である。この結合性がタンパクまたはペプチドである場合、共有的接合のために、様々の結合剤、または架橋結合剤を使用することが可能である。架橋剤の例としては、タンパクＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシニミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、およびスルフォスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルフォ−ＳＭＣＣ）が挙げられる（例えば、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙら、（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１６８６；Ｌｉｕ，ＭＡら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：８６４８を参照されたい）。他の方法としては、Ｐａｕｌｕｓ（１９８５）Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓ．Ｍｉｔｔ．Ｎｏ．７８，１１８−１３２；Ｂｒｅｎｎａｎら、（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１−８３）、およびＧｌｅｎｎｉｅら、（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２３６７−２３７５）に記載されるものが挙げられる。好ましい接合剤は、ＳＡＴＡおよびスルフォ−ＳＭＣＣであり、両方ともＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，イリノイ州）から入手することが可能である。
【０１７５】
結合特異性が抗体である場合、二つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介して接合することが可能である。特に好ましい実施態様では、ヒンジ領域は、接合前に、奇数の、好ましくは一つのスルフヒドリル残基を含むように修飾される。
【０１７６】
それとは別に、二つの結合特異性は、同じベクターにおいてコードし、同じ宿主細胞において発現し、組み立てることが可能である。この方法は、二重特異性分子が、ｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２、またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパクである場合特に有用である。本発明の二重特異性分子は、一本鎖抗体および結合決定基を含む単一鎖分子、または、二つの結合決定基を含む単一鎖二重特異性分子であってもよい。二重特異性分子は、少なくとも二つの単一鎖分子を含んでもよい。二重特異性分子を調製するための方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号；米国特許第５，４５５，０３０号；米国特許第４，８８１，１７５号；米国特許第５，１３２，４０５号；米国特許第５，０９１，５１３号；米国特許第５，４７６，７８６号；米国特許第５，０１３，６５３号；米国特許第５，２５８，４９８号；および、米国特許第５，４８２，８５８号に記載される。
【０１７７】
二重特異性分子の、それぞれの特異的標的に対する結合は、例えば、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば、増殖抑制）、またはウェスタンブロットアッセイによって確認することが可能である。これらのアッセイはそれぞれ、一般に、特定の対象タンパク−抗体複合体の存在を、該対象複合体に対して特異的な標識試薬（例えば、抗体）を用いることによって検出する。例えば、ＦｃＲ−抗体複合体は、例えば、該抗体−ＦｃＲ複合体を認識し、特異的に結合する、酵素連結抗体または抗体断片を用いて検出することが可能である。それとは別に、この複合体は、他の、様々のイムノアッセイの内のいずれかを用いて検出することが可能である。例えば、抗体は、放射標識し、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）に使用することが可能である（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｉｄｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｍａｒｃｈ，１９８６を参照されたい、なお、この文献を引用により本明細書に含める）。放射性同位元素は、γカウンターまたはシンチレーションカウンター、またはオートラジオグラフィーの使用のような手段を用いて検出することが可能である。
【０１７８】
製薬組成物
もう一つの局面では、本発明は、製薬学的に受容可能な担体と共に処方される、本発明のモノクローナル抗体、またはモノクローナル抗体同士の組み合わせ、または、その抗原結合部分（単複）を含む組成物、例えば、製薬組成物を提供する。このような組成物は、一抗体、または抗体同士（例えば、二つ以上の、異なる抗体）の組み合わせ、または、免疫結合体、または本発明の二重特異性分子を含んでもよい。例えば、本発明の製薬組成物は、標的抗原における異なるエピトープに結合するか、または、相補的活性を有する抗体同士（または免疫結合体、または二重特異性分子）の組み合わせを含むことが可能である。
【０１７９】
本発明の製薬組成物はさらに、併用療法、すなわち、他剤と組み合わせた療法において投与することが可能である。例えば、併用療法は、少なくとも一つの、他の抗炎症剤または免疫抑制剤と組み合わせた、本発明の抗ＰＴＫ７抗体を含むことが可能である。併用療法に使用が可能な治療薬剤の例については、そのさらに詳細が、下記の、本発明の抗体の使用に関するセクションに記載される。
【０１８０】
本明細書で用いる「製薬学的に受容可能な担体」は、生理学的に適合する、任意の、全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張液および吸収遅延剤などを含む。担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口的、脊髄、または表皮投与（例えば、注入または輸液）に好適であることが好ましい。投与ルートに応じて、活性化合物、すなわち、抗体、免疫結合体、または二重特異性分子は、該化合物を不活性化するおそれのある、酸の作用およびその他の天然条件から該化合物を保護するために、物質でコートされてもよい。
【０１８１】
本発明の製薬化合物は、一つ以上の製薬学的に受容可能な塩を含んでもよい。「製薬学的に受容可能な塩」とは、親化合物の生物活性は保持するが、回避すべき有毒作用を付与することのない塩を指す（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照されたい）。このような塩の例としては、酸添加塩、および塩基添加塩が挙げられる。酸添加塩としては、非毒性無機酸、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などから得られるものの外、非毒性有機酸、例えば、脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカノイン酸、ヒドロキシアルカノイン酸、芳香酸、脂肪族および芳香族スルフォン酸などから得られるものが挙げられる。塩基添加塩としては、アルカリ土金属、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどから得られるものの外、非毒性有機アミン類、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、クロリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどから得られるものが挙げられる。
【０１８２】
本発明の製薬組成物はさらに、製薬学的に受容可能な抗酸化剤を含んでもよい。製薬学的に受容可能な抗酸化剤としては、（１）水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）脂溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビルパルミチン酸エステル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなど；（３）金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが挙げられる。
【０１８３】
本発明の製薬組成物において用いてもよい、好適な水溶性および非水溶性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、および、それらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、および、オレイン酸エチルなどの、注入可能な有機エステルが挙げられる。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散剤の場合は要求される粒径を維持することによって、および、界面活性剤の使用によって維持することが可能である。
【０１８４】
これらの組成物はさらに、補助剤、例えば、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤を含んでもよい。微生物の存在の防止は、上記の滅菌手順、および各種抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることによって確保されてもよい。さらに、等張剤、例えば、糖類、塩化ナトリウムなどを組成物の中に含めることが好ましい場合がある。さらに、注入性の製剤形状の吸収延長を、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによって実現してもよい。
【０１８５】
製薬学的に受容可能な担体としては、滅菌水溶液または分散液、および、注入可能な滅菌水溶液または分散液のインスタント調製用の滅菌粉末が挙げられる。製薬学的活性物質のために、このような媒体および薬剤を使用することは従来技術で既知である。従来の、いずれの媒体または薬剤であっても、それが活性化合物と不適合でない限り、本発明の製薬組成物におけるその使用は考慮の対象になる。さらに、補助的活性化合物を組成物の中に含めることも可能である。
【０１８６】
治療組成物は、通常、製造および保存条件下で、無菌で安定でなければならない。組成物は、溶液、微小乳液、リポソーム、または、高い薬剤濃度に好適な、他の、規則的構造として処方することが可能である。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、および、それらの好適な混合物を含む溶媒、または分散媒体であってもよい。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散剤の場合は要求される粒径を維持することによって、および、界面活性剤の使用によって維持することが可能である。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、マンニトールなどのポリアルコール類、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物の中に含めることが好ましい。注入性組成物の吸収の延長は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物の中に含めることによって実現することが可能である。
【０１８７】
無菌の注入液は、必要に応じて上に列挙した一つの成分、または複数成分の組み合わせと共に、必要量の活性化合物を適切な溶媒に取り込み、次いで、滅菌化マイクロフィルトレーションを行うことによって調製することが可能である。一般に、分散液は、基本的分散媒体、および、上に列挙したものの内から選ばれた、必要な、他の成分を含む無菌ベヒクルの中に、活性化合物を取り込むことによって調製される。無菌注入液調製用の無菌粉末の場合、好ましい調製法は、真空乾燥および凍結乾燥（リオフィリゼーション）であって、これらは、あらかじめろ過滅菌された溶液から、活性成分、プラス、任意の、所望の、添加成分から成る散剤を生成する。
【０１８８】
単一剤形を生産するために、担体材料と組み合わせることが可能な活性成分の量は、治療される被験体、および特定の投与方式に応じて変動する。単一剤形を生産するために、担体材料と組み合わせることが可能な活性成分の量は、一般に、治療効果を実現する組成物の量である。一般に、１００パーセントの内、この量は、製薬学的に受容可能な担体と組み合わせた、活性成分が約０．０１パーセントから約９９パーセント、好ましくは約０．１パーセントから約７０パーセント、もっとも好ましくは約１パーセントから約３０パーセントの範囲にある。
【０１８９】
投与スケジュールは、所望の最適反応（例えば、治療反応）を実現するように調整される。例えば、単一ボーラスが投与されてもよいし、ある時間に亘って数回に分割された用量が投与されてもよいし、または、用量は、治療状況の切迫度による指示に応じて比例的に減少または増加されてもよい。投与の容易さおよび用量の均一性のために、非経口組成物を単位剤形として処方することは特に有利である。本明細書で用いる、単位剤形とは、被験体を治療するための単位用量として好適な、物理的遊離単位を指す。各単位は、必要な製薬担体と関連して所望の治療作用を実現するように計算された、指定量の活性化合物を含む。本発明の単位剤形の仕様は、（ａ）活性化合物の独特の特徴、および実現が期待される特定の治療作用、および（ｂ）個別の患者の感受性の治療のために活性化合物を調合する技術に内在する限界、によって定められ、かつそれらに直接依存する。
【０１９０】
抗体の投与に関しては、用量は、宿主の体重１ｋｇ当たり約０．０００１から１００ｍｇ、より一般的には０．０１から５ｍｇの範囲である。例えば、用量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、または１０ｍｇ／ｋｇ体重、または１−１０ｍｇ／ｋｇの範囲内にあってもよい。例示の治療スケジュールは、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１ヶ月に１回、３ヶ月に１回、または３から６ヶ月置きに１回を投与を要する。本発明のＰＴＫ７抗体について好ましい投与スケジュールは、静注投与による１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重で、該抗体を、下記の投与スケジュール：（ｉ）４週間に１回を６回投与、次いで３ヶ月に１回；（ｉｉ）３週間に１回；（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇ体重を１回、次いで１ｍｇ／ｋｇ体重を３週間に１回、の内の一つを用いて投与する。
【０１９１】
ある実施態様では、異なる結合特異性を有する、二つ以上のモノクローナル抗体が同時に投与される。この場合、投与される各抗体の用量は、指定の範囲内に納まる。抗体は、通常、複数回投与される。単回投与の間の間隔は、例えば、１週、１ヶ月、３ヶ月、または１年であってもよい。間隔はまた、患者における、標的抗原に対する抗体の血中レベルの測定によって指示されるがままに、不規則であってもよい。ある方法では、用量は、約１−１０００μｇ／ｍｌの抗体血漿濃度を実現するように、ある方法では約２５−３００μｇ／ｍｌを実現するように調整される。
【０１９２】
それとは別に、抗体は、持続放出処方として投与することも可能である。この場合、より低頻度の投与が必要とされる。用量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変動する。一般に、ヒトの抗体は、最長の半減期を示し、次いで、ヒト化抗体、キメラ抗体、および非ヒト抗体の順になる。投与用量および頻度は、治療が予防的か、または治療的かに応じて変動してよい。予防用途では、比較的低い用量が、長期間に亘って比較的低頻度の間隔で投与される。患者の中には、残りの生涯に亘って治療を受けつづける人もいる。治療用途では、場合によって、病気の進行が抑えられるか、終結されるまで、好ましくは、患者が、病症の部分的、または完全な寛解を示すまで、比較的短い間隔における比較的高い用量が必要とされる。その後、この患者に対し予防的投与スケジュールにそって投与することが可能である。
【０１９３】
本発明の製薬組成物における活性成分の実際の投与レベルは、患者に毒性を及ぼすことなく、ある特定の患者、組成物、および投与方式において所望の治療反応を実現するのに有効な、活性成分の量を獲得するように変動させてもよい。選ばれる投与レベルは、様々な薬理動態学因子、例えば、用いられる本発明の特定組成物、または、そのエステル、塩、またはアミドの活性、投与ルート、投与時間、用いられる特定化合物の排出速度、治療の持続時間、用いられる特定組成物と組み合わせて使用される他の薬剤、化合物、および／または物質、治療される患者の年齢、性別、体重、病態、一般的健康、および既往歴、および医学で周知の同様の因子を含む各種因子に依存する。
【０１９４】
本発明の抗ＰＴＫ７抗体の「治療的有効用量」は、病症の重度の低下、病症不在期間の頻度および持続時間の増加、または、病気の苦痛による障害または不能の防止をもたらすことが好ましい。例えば、腫瘍の治療では、「治療的有効用量」は、細胞増殖または腫瘍増殖を、未治療の被験体に比べて、好ましくは少なくなくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、さらに好ましくは少なくとも約８０％抑制する。化合物の、腫瘍増殖抑制能力は、ヒトの腫瘍における効力を予測することが可能な動物モデルシステムにおいて評価することが可能である。それとは別に、組成物の、この特性は、該化合物の抑制能力を、当業者には既知のアッセイによるインビトロ抑制として調べることによって評価することが可能である。治療的有効量の治療化合物は、腫瘍サイズを縮小するか、または、他のやり方で被験体の症状を緩和することが可能である。当業者であれば、被験体のサイズ、被験体の症状の重度、および、選択された特定の組成物または投与ルートなどの因子に基づいてそのような量を決めることが可能であろう。
【０１９５】
本発明の組成物は、従来技術で既知の様々な方法の内の一つ以上を用い、一つ以上の投与ルートを通じて投与することが可能である。当業者には理解されるように、投与ルートおよび／または方式は、所望の結果に応じて変動する。本発明の抗体にとって好ましい投与ルートとしては、例えば、注入または輸液による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、またはその他の非経口的投与ルートが挙げられる。本明細書で用いる「非経口的投与」という語句は、経口的および局所投与以外の、通常、注入による投与方式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、硬膜下腔内、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、関節包下、くも膜下、脊髄内、硬膜上腔内、胸骨内注入および輸液を含むが、ただしこれらに限定されない。
【０１９６】
それとは別に、本発明の抗体は、非・非経口ルート、例えば、局所、表皮、または粘膜投与ルート、例えば、鼻腔内、経口、経膣、直腸内、舌下、または局所ルートを通じて投与することも可能である。
【０１９７】
活性化合物は、該化合物が急速に放出されないように保護する担体と共に、例えば、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル封入型送達システムを含む調節放出処方として調製することが可能である。生物分解性、生物適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニール、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸の使用が可能である。このような処方の調製のためには、たくさんの方法が、特許取得されているか、または、広く当業者に知られる。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｔｏｎｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。
【０１９８】
治療組成物は、従来技術で既知の医療装置によって投与することが可能である。例えば、好ましい実施態様では、本発明の治療組成物は、例えば、米国特許第５，３９９，１６３；５，３８３，８５１；５，３１２，３３５；５，０６４，４１３；４，９４１，８８０；４，７９０，８２４；または４，５９６，５５６号に開示される装置のような、針無しの皮下注入装置によって投与することが可能である。本発明において有用な、周知のインプラントおよびモジュールの例としては、下記：薬品を調節速度で投与するための、埋め込み可能なマイクロ輸液ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号；皮膚を通じて薬品を投与するための治療装置を開示する米国特許第４，４８６，１９４号；薬品を正確な輸液速度で送達するための、投薬輸液ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号；薬剤の連続送達のための、流量可変埋め込み型輸液装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号；複数チェンバー区画を有する、浸透圧薬剤送達システムを開示する米国特許第４，４３９，１９６号；および、浸透圧性薬剤送達システムを開示する米国特許第４，４７５，１９６号が挙げられる。これらの特許は、引用により本明細書に含められる。他の、多くの、同様のインプラント、送達システム、およびモジュールが当業者には既知である。
【０１９９】
ある実施態様では、本発明のヒト・モノクローナル抗体は、インビボにおける適正な分布を確保するために処方することが可能である。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、高い親水性を持つ多くの成分を排除する。本発明の治療化合物のＢＢＢ横断を確保するために（要すれば）、それらの化合物をリポソーム内に含まれるように処方することが可能である。リポソームの製造法に関しては、例えば、米国特許第４，５２２，８１１；５，３７４，５４８；および５，３９９，３３１号を参照されたい。リポソームは、指定の細胞または器官に選択的に輸送されて、標的薬剤の送達を強化する、一つ以上の成分を含んでもよい（例えば、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５）。例示の標的性成分としては、葉酸塩またはビオチン（例えば、Ｌｏｗらに付与された米国特許第５，４１６，０１６号を参照）；マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａら、，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕ．１５３：１０３８）；抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎら、（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓら、（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｏｒｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０）；界面活性タンパクＡ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅら、（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４）；ｐ１２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒら、（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０）；さらに、Ｋ．Ｋｅｉｎａｎｅｎ；Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４６：１２３；Ｊ．Ｊ．Ｋｉｌｌｉｏｎ；Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２７３を参照されたい、が挙げられる。
【０２００】
本発明の使用および方法
本発明の抗体、抗体組成物、および方法は、ＰＴＫ７介在性障害の診断および治療を含む、多くの、インビトロおよびインビボの診断および治療において有用性を有する。ある好ましい実施態様では、本発明の抗体はヒト抗体である。例えば、これらの分子は、各種の障害を治療、予防、および診断するために、インビトロ、すなわち、体外で培養細胞に、または、ヒトの被験者に、例えば、インビボで投与することが可能である。本明細書で用いる「被験体」という用語は、ヒトまたは非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳類および非哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、および爬虫類を含む。好ましい被験体は、ＰＴＫ７活性によって仲介される障害を有するヒトの患者が挙げられる。この方法は、異常なＰＴＫ７発現と関連する障害を有するヒトの患者を治療するのに特に好適である。ＰＴＫ７に対する抗体を、もう一つの薬剤と共に投与する場合、これら二つは、どちらの順序で投与してもよいし、または同時に投与してもよい。
【０２０１】
本発明の抗体はＰＴＫ７に対して特異的結合性を有するのであるから、本発明の抗体を用いて、細胞表面におけるＰＴＫ７発現を特異的に検出し、さらに、免疫アフィニティー精製によってＰＴＫ７を精製することが可能である。
【０２０２】
本発明はさらに、サンプルにおいて、ヒトのＰＴＫ７抗原の存在を検出するか、または、ヒトのＰＴＫ７抗原の量を測定するための方法であって、該サンプル、およびコントロールサンプルを、ヒトのＰＴＫ７に特異的に結合する、ヒトのモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分に、該抗体または該部分と、ヒトのＰＴＫ７との間で複合体が形成されることを可能とする条件下で接触することを含む方法を提供する。次に、複合体の形成が検出されるが、その際、コントロールサンプルと比べ、サンプルにおける複合体形成に差が認められるとき、それは、サンプルにおけるヒトのＰＴＫ７抗原の存在を示すものとされる。
【０２０３】
ＰＴＫ７は、結腸癌由来細胞株では発現されるが、ヒトの成人の結腸組織での発現は認められなかった（Ｍｏｓｓｉｅら、（１９９５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １１：２１７９−８４）。ＰＴＫ７の発現はさらに、いくつかのメラノーマ細胞株およびメラノーマ生検標本に見られた（Ｅａｓｔｙ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７１：１０６１−５）。さらに、ＰＴＫ７は、急性骨髄性白血病サンプルにおいてきわめて過剰に発現されることが認められた（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｔｉｄｏｗら、，（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：１２４１−９）。抗ＰＴＫ７抗体は、癌性腫瘍の増殖を抑制するために単独で使用してもよい。それとは別に、抗ＰＴＫ７抗体は、他の免疫原薬剤、標準的癌治療、または、後述する他の抗体と結びつけて使用してもよい。
【０２０４】
本発明の抗体によって、その増殖が抑制される可能性のある、好ましい癌として、通常、免疫療法に対して反応性を有する癌が挙げられる。治療用として好ましい癌の非限定的例としては、結腸癌（小腸癌を含む）、肺癌、乳癌、すい臓癌、メラノーマ（例えば、転移性の悪性メラノーマ）、急性骨髄性白血病、腎臓癌、膀胱癌、卵巣癌、および前立腺癌が挙げられる。本発明の方法を用いて治療してもよい他の癌の例としては、腎臓癌（例えば、腎細胞癌）、グリア芽細胞腫、脳腫瘍、慢性または急性白血病、例えば、急性リンパ球白血病（ＡＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球白血病、慢性リンパ球白血病、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、リンパ球リンパ腫、一次ＣＮＳリンパ腫、Ｔ−細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、結節性核切れ込み小細胞リンパ腫、抹消性Ｔ細胞リンパ腫、レナートリンパ腫、免疫芽細胞リンパ腫、Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、ｅｎｔｒｏｂｌａｓｔｉｃ／ｃｅｎｔｒｏｃｙｔｉｃ（ｃｂ／ｃｃ）濾胞性リンパ腫癌、Ｂ細胞株の瀰漫性大細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞リンパ節症（ＡＩＬＤ）様Ｔ細胞リンパ腫およびＨＩＶ関連体腔性リンパ腫）、胎生期癌、鼻咽頭の未分化癌（例えば、シュミンケ腫瘍）、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレーム・マクログロブリン血症、およびその他のＢ細胞リンパ腫を含む白血病、鼻咽頭癌、骨癌、皮膚癌、頭部または頸部の癌、皮膚または眼球内の悪性メラノーマ、子宮癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、睾丸癌、子宮癌、卵管の癌、子宮内膜の癌、子宮頸部の癌、膣の癌、女性外陰部の癌、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟部組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、小児期の固体腫瘍、膀胱の癌、腎臓または尿道の癌、腎盤の癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、腫瘍の血管新生、脊髄腫瘍、脳幹グリオーマ、脳下垂体腺癌、類表皮癌、扁平細胞癌、環境的に誘発される癌、例えば、アスベストスによって引き起こされるもの、例えば、中皮腫を含む癌、および、前記癌の組み合わせが挙げられる。
【０２０５】
さらに、ＰＴＫ７は、各種の腫瘍細胞において発現されるのであるから、本発明のヒト抗体、抗体組成物、および方法は、腫瘍性の障害、例えば、ＰＴＫ７を発現する腫瘍細胞の存在によって特徴づけられる障害、例えば、結腸癌（小腸癌を含む）、メラノーマ（例えば、転移性の悪性メラノーマ）、急性骨髄性白血病、肺癌、乳癌、膀胱癌、すい臓癌、卵巣癌、および前立腺癌を含む障害を抱える被験体を治療するために使用することが可能である。腫瘍性障害を抱える、他の被験体の例としては、腎臓癌（例えば、腎細胞癌）、グリア芽細胞腫、脳腫瘍、慢性または急性白血病、例えば、急性リンパ球白血病（ＡＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球白血病、慢性リンパ球白血病、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、リンパ球リンパ腫、一次ＣＮＳリンパ腫、Ｔ−細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、結節性核切れ込み小細胞リンパ腫、抹消性Ｔ細胞リンパ腫、レナートリンパ腫、免疫芽細胞リンパ腫、Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、ｅｎｔｒｏｂｌａｓｔｉｃ／ｃｅｎｔｒｏｃｙｔｉｃ（ｃｂ／ｃｃ）濾胞性リンパ腫癌、Ｂ細胞株の瀰漫性大細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞リンパ節症（ＡＩＬＤ）様Ｔ細胞リンパ腫およびＨＩＶ関連体腔性リンパ腫）、胎生期癌、鼻咽頭の未分化癌（例えば、シュミンケ腫瘍）、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレーム・マクログロブリン血症、およびその他のＢ細胞リンパ腫を含む白血病、鼻咽頭癌、骨癌、皮膚癌、頭部または頸部の癌、皮膚または眼球内の悪性メラノーマ、子宮癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、睾丸癌、子宮癌、卵管の癌、子宮内膜の癌、子宮頸部の癌、膣の癌、女性外陰部の癌、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟部組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、小児期の固体腫瘍、膀胱の癌、腎臓または尿道の癌、腎盤の癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、腫瘍の血管新生、脊髄腫瘍、脳幹グリオーマ、脳下垂体腺癌、類表皮癌、扁平細胞癌、環境的に誘発される癌、例えば、アスベストスによって引き起こされるもの、例えば、中皮腫を含む癌、および、前記癌の組み合わせが挙げられる。
【０２０６】
したがって、一実施態様では、本発明は、被験体における腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、該被験体に、治療有効量の抗ＰＴＫ７抗体またはその抗原結合部分を投与することを含む方法を提供する。抗体は、ヒトの抗ＰＴＫ７抗体であることが好ましい（例えば、本明細書に記載される、ヒトの抗ヒトＰＴＫ７抗体の内の任意のもの）。さらに、またはそれとは別に、抗体は、キメラ、またはヒト化抗ＰＴＫ７抗体であってもよい。
【０２０７】
一実施態様では、本発明の抗体（例えば、ヒトのモノクローナル抗体、多重および二重特異性分子および組成物）は、ＰＴＫ７レベル、または、その膜表面にＰＴＫ７を含む細胞のレベル、すなわち、次に、ある種の病気症状に結びつけることが可能なレベルを検出するために使用することが可能である。それとは別に、これらの抗体は、ＰＴＫ７機能を抑制または阻止し、それらは次に、ある種の病気症状の予防または寛解に結びつけられ、それによってＰＴＫ７をその病気の介在因子として示すように使用することが可能である。これは、実験サンプル、およびコントロールサンプルを、抗ＰＴＫ抗体に、該抗体とＰＴＫ７との間で複合体が形成されることを可能とする条件下で接触させることによって実現される。抗体およびＰＴＫ７の間に形成される複合体は、それがいずれのものであれ、全て検出され、実験サンプルとコントロールの間で比較される。
【０２０８】
もう一つの実施態様では、本発明の抗体（例えば、ヒト抗体、多重および二重特異性分子および組成物）は、先ず、インビトロにおける治療または診断用途と関連する結合活性に関して試験することが可能である。例えば、本発明の組成物は、下記の実施例に記載されるフローサイトメトリーアッセイを用いて試験することが可能である。
【０２０９】
本発明の抗体（例えば、ヒト抗体、多重および二重特異性分子、免疫結合体、および組成物）は、ＰＴＫ７−関連疾患の治療および診断においてもさらに別の有用性を持つ。例えば、本発明のヒト・モノクローナル抗体、多重または二重特異性分子、および免疫結合体は、インビボまたはインビトロにおいて、下記の生物活性：ＰＴＫ７を発現する細胞の増殖の抑制および／または該細胞の斃死；ヒトエフェクター細胞の存在下にＰＴＫ７を発現する細胞の食作用またはＡＤＣＣの仲介；または、ＰＴＫ７に対するＰＴＫ７リガンドの結合の阻止、の内の一つ以上を誘発するのに使用することが可能である。
【０２１０】
ある特定の実施態様では、本発明の抗体（例えば、ヒト抗体、多重および二重特異性分子および組成物）は、インビボにおいて、様々なＰＴＫ７関連疾患を治療、予防、または診断するのに使用される。ＰＴＫ７関連疾患の例としては、特に、結腸癌（小腸癌を含む）、メラノーマ（例えば、転移性の悪性メラノーマ）、急性骨髄性白血病、肺癌、乳癌、膀胱癌、すい臓癌、卵巣癌、および前立腺癌が挙げられる。
【０２１１】
本発明の抗体組成物（例えば、ヒト・モノクローナル抗体、多重および二重特異性分子および免疫結合体）を、インビボおよびインビトロにおいて投与するための好適ルートは、従来技術で周知であり、当業者であれば選択することが可能である。例えば、この抗体組成物は、注入（例えば、静脈内または皮下）によって投与することが可能である。使用される分子の適切な用量は、被験体の年齢および体重、および、抗体組成物の濃度および／または処方に依存する。
【０２１２】
前述したように、本発明の抗ＰＴＫ７抗体は、他の、一つ以上の治療剤、例えば、細胞傷害剤、放射線傷害剤、または免疫抑制剤と共時投与することが可能である。抗体は、該治療剤と連結されてもよいし（免疫複合体として）、または、該治療剤とは別に投与することも可能である。後者の場合（分離投与）、抗体は、該治療剤の前に、後に、または同時に投与することが可能であり、あるいは、他の、既知の療法、例えば、抗癌療法、例えば、放射線照射と共時投与することも可能である。このような治療剤としては、特に、抗腫瘍剤、例えば、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチンブレオマイシン硫酸塩、カルムスチン、クロラムブシル、およびシクロフォスファミドヒドロキシ尿素が挙げられるが、これは、それ自体では、患者に対し有毒、または毒性下レベルにおいてのみ有効である。シスプラチンは、４週に１回、１回用量当たり１００ｍｇとして静脈内投与され、アドリアマイシンは、２１日置きに１回、ｍｌ用量当たり６０−７５ｍｇとして静脈内投与される。本発明の、ヒトの抗ＰＴＫ７抗体、またはその抗原結合断片と、化学療法剤との共時投与は、ヒトの腫瘍細胞に対し細胞傷害作用をもたらす、異なる機序を介して動作する、二つの抗癌剤を提供する。このような共時投与は、薬剤の耐性の発達、または、抗体に対し無反応とする、腫瘍細胞の抗原性の変化によって生じる問題を解決することが可能である。
【０２１３】
一実施態様では、本発明の免疫結合体は、化合物（例えば、治療剤、標識、細胞毒素、放射性毒素、免疫抑制剤など）を、そのような化合物を抗体に連結することによって、ＰＴＫ７細胞表面受容体を有する細胞に向けて照準するために使用することが可能である。例えば、抗ＰＴＫ７抗体は、米国特許第６，２８１，３５４および６，５４８，５３０号；米国特許出願公開第２００３００５０３３１、２００３００６４９８４、２００３００７３８５２、および２００４００８７４９７に記載されるか、または、国際公開第０３／０２２８０６号に公刊される毒素化合物の内の任意のものに接合することが可能である。なお、これらの文書の全体を引用により本明細書に含める。本発明はさらに、体外でまたはインビボで、ＰＴＫ７を発現する細胞の局在を定めるための方法（例えば、検出可能な標識、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子によって）を提供する。それとは別に、免疫結合体は、細胞毒素または放射性毒素をＰＴＫ７に向けて照準することによって、ＰＴＫ７細胞表面受容体を有する細胞を殺すために使用することが可能である。
【０２１４】
さらに、標的特異的エフェクター細胞、例えば、本発明の組成物（例えば、ヒト抗体、多重および二重特異性分子）に連結されるエフェクター細胞も、治療剤として使用することが可能である。標的照準のためのエフェクター細胞は、ヒトの白血球、例えば、マクロファージ、好中球、または単球であってもよい。他の細胞としては、好酸球、ナチュラルキラー細胞、および他の、ＩｇＧ−またはＩｇＡ受容体担持細胞が挙げられる。要すれば、エフェクター細胞は、治療される被験体から得られてもよい。標的特異性エフェクター細胞は、生理学的に受容可能な溶液における細胞縣濁液として投与することが可能である。投与される細胞の数は、１０８−１０９の桁であってもよいが、治療目的に応じて変動する。一般に、その量は、標的細胞、例えば、ＰＴＫ７を発現する腫瘍細胞における局在を実現し、例えば、食作用によって細胞死をもたらすのに十分なものである。投与ルートもまた変動してよい。
【０２１５】
標的特異性エフェクター細胞による治療は、標的とされる細胞の除去のための、他の技術と組み合わせて実行することが可能である。例えば、本発明の組成物（例えば、ヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子）および／または、これらの組成物を装備したエフェクター細胞による抗腫瘍治療は、化学療法と組み合わせて使用することが可能である。さらに、腫瘍細胞の排除に向けて二つの異なる細胞傷害性エフェクター集団を方向づけるために、組み合わせ免疫治療を用いてもよい。例えば、抗ＦｃガンマＲＩ、または抗ＣＤ３と連結させた抗ＰＴＫ７抗体を、ＩｇＧ−、またはＩｇＡ受容体特異性結合剤と組み合わせて用いてもよい。
【０２１６】
本発明の、二重特異性および多重特異性分子はまた、エフェクターにおけるＦｃγＲまたはＦｃγＲレベルを、該細胞表面における受容体をキャップすること、および除去することによって変調するのに使用することも可能である。この目的のためには、抗Ｆｃ受容体混合物を使用することも可能である。
【０２１７】
さらに、補体結合部位、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＭの補体結合部分を有する、本発明の組成物（例えば、ヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子および免疫結合体）は、補体の存在下に使用することが可能である。一実施態様では、本発明の結合剤および適切なエフェクター細胞による、標的細胞を含む細胞集団の、体外処理は、補体、または補体含有血清の添加によって補足することが可能である。本発明の結合剤によってコートされた標的細胞の食作用は、補体タンパクの結合によって強化することが可能である。さらに、もう一つの実施態様では、本発明の組成物（例えば、ヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子）によってコートされた標的細胞は、補体によって分解することが可能である。さらにもう一つの実施態様では、本発明の組成物は補体を活性化しない。
【０２１８】
さらに、本発明の組成物（例えば、ヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子および免疫結合体）は、補体と共に投与することが可能である。したがって、ヒト抗体、多重特異性または二重特異性分子、および血清または補体を含む組成物は、本発明の範囲内にある。これらの組成物は、該補体が、ヒト抗体、多重特異性または二重特性分子に近接して局在するという点で有利である。それとは別に、本発明のヒト抗体、多重特異性または二重特異性分子、および補体または血清は、別々に投与することも可能である。
【０２１９】
したがって、本発明の抗体組成物によって治療される患者に対しては、さらにもう一つの、ヒト抗体の治療作用を強化または増強する治療剤、例えば、細胞傷害剤または放射線傷害剤を（本発明のヒト抗体の投与前、と同時、またはその後に）投与することが可能である。
【０２２０】
他の実施態様では、被験体は、例えば、該被験体をサイトカインで治療することによってＦｃγまたはＦｃγ受容体の発現または活性を変調する、例えば、強化または抑制する薬剤でさらに治療することが可能である。多重特異性分子による治療中に、投与するのが好ましいサイトカインとしては、顆粒細胞コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒細胞−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が挙げられる。
【０２２１】
本発明の組成物（例えば、ヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子）はさらに、ＦｃγＲまたはＰＴＫ７を発現する細胞を標的とし、例えば、それらの細胞を標識するために使用することが可能である。そのような使用のために、結合剤は、検出可能な分子に連結される。したがって、本発明は、ＦｃγＲなどのＦｃ受容体、またはＰＴＫ７を発現する細胞の局在を、体外で、またはインビトロで定めるための方法を提供する。検出可能な標識は、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であってもよい。
【０２２２】
さらに、本発明の範囲内にあるものとして、本発明の抗体組成物（例えば、ヒト抗体、二重特異性または多重特異性分子または免疫結合体）、および使用説明を含むキットがある。このキットはさらに、一つ以上の追加試薬、例えば、免疫抑制試薬、細胞傷害剤または放射性傷害剤、または、一つ以上の、本発明の、追加のヒト抗体（例えば、ＰＴＫ７抗原における、第１ヒト抗体とは異なるエピトープに結合する相補活性を有するヒト抗体）を含むことが可能である。キットは、通常、キットの内容物の意図される使用を示す標識を含む。標識という用語は、キットの上に、またはキットと共に支給される、または、他のやり方でキットに付属する、任意の書面または記録資料を含む。
【０２２３】
本発明はさらに、下記の実施例によって具体的に説明される。なお、これらの実施例を、本発明をさらに限定するものと考えてはならない。本明細書を通じて引用される、全ての図面、および全ての参考文献、特許、および公開特許出願は、引用により本明細書に含めることを明言する。
【実施例】
【０２２４】
（実施例１：ＰＴＫ７に対するヒトのモノクローナル抗体の生成）
抗原
免疫化プロトコールは、抗原として、（ｉ）ｍｙｃおよびｈｉｓタグと共にＰＴＫ７の細胞外部分を含む、組み換え融合タンパク、および、（ｉｉ）膜に結合した完全長ＰＴＫ７の両方を用いた。両抗原とも、ＣＨＯ細胞株に対し組み換えトランスフェクション法を用いて生成した。
【０２２５】
トランスジェニックＨｕＭａｂおよびＫＭマウス（登録商標）
ＰＴＫ７に対する、完全にヒトのモノクローナル抗体を、それぞれ、ヒトの抗体遺伝子を発現する、ＨｕＭａｂトランスジェニックマウスのＨＣｏ７およびＨＣｏ１２系統、および、染色体導入トランスジェニックマウスのＫＭ系統を用いて調製した。これらのマウス系統それぞれにおいて、マウスの内因性の、カッパ軽鎖遺伝子は、Ｃｈｅｎら、（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８１１−８２０に記載されるやり方でホモとして破壊し、マウスの内因性の重鎖遺伝子は、国際公開第０１／０９１８７号の実施例１に記載されるやり方でホモとして破壊した。これらのマウス系統は、それぞれ、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１の記載するやり方にしたがって、ヒトの、カッパ軽鎖導入遺伝子ＫＣｏ５を担う。ＨＣｏ７系統は、米国特許第５，７７０，４２９；５，５４５；８０６；５，６２５，８２５；および５，５４５，８０７号に記載する通りに、ＨＣｏ７ヒト重鎖導入遺伝子を担う。ＨＣｏ１２系統は、国際公開第０１／０９１８７号の実施例２、または国際公開第０１／１４４２４の実施例２に記載される通り、ＨＣｏ１２ヒト重鎖導入遺伝子を担う。ＫＭ系統は、国際公開第０２／４３４７８号に記載される通りＳＣ２０導入染色体を含む。
【０２２６】
ＨｕＭａｂおよびＫＭ免疫化
ＰＴＫ７に対する完全にヒトのモノクローナル抗体を生成するために、抗原として、精製組み換えＰＴＫ７融合タンパク、およびＰＴＫ７をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を用いて、ＨｕＭａｂマウスおよびＫＭマウス（登録商標）を免疫化した。ＨｕＭａｂマウスにおける一般的免疫化スキームは、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１、および国際公開第９８／２４８８４に記載される。マウスは、最初の抗原注入時６−１６週齢であった。ＰＴＫ７融合タンパク抗原の精製組み換え調製品（５−５０μｇ）、および、５−１０×１０６細胞を用いて、腹腔内、皮下（Ｓｃ）、または経・足底パッド注入により、ＨｕＭａｂおよびＫＭマウス（登録商標）を免疫化した。
【０２２７】
トランスジェニックマウスは、フロインドの完全アジュバント、またはＲｉｂｉアジュバントに溶解した抗原によってＩＰで２回、次いで３−２１日置いて、フロインドの不完全アジュバントまたはＲｉｂｉアジュバントに溶解した抗原によってＩＰで免疫化した（合計で最大１１回の免疫化）。免疫反応は、後眼窩出血によって監視した。血漿を、ＥＬＩＳＡ（後述）でスクリーニングし、ヒトの抗ＰＴＫ７免疫グロブリンについて十分な力価を有するマウスを融合のために用いた。マウスは、３日間抗原の静注でブーストし、その後屠殺し、脾臓を除去した。通常、各抗原について１０−３５回の融合を行った。各抗原について、数ダースのマウスを免疫化した。
【０２２８】
抗ＰＴＫ７抗体を生産するＨｕＭａｂまたはＫＭマウス（登録商標）
ＰＴＫ７に結合する抗体を生産するＨｕＭａｂまたはＫＭマウス（登録商標）を選択するために、免疫化マウスから得られた血清を、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）によって記載されるやり方にしたがってＥＬＩＳＡで試験した。簡単に言うと、マイクロタイタープレートを、トランスフェクトしたＣＨＯ細胞から得られた、精製組み換えＰＴＫ７融合タンパクのＰＢＳ液１−２μｇ／ｍｌで１００μｌ／ウェルとなるようにコートし、４℃で一晩インキュベートし、次いで、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎに溶解した５％子牛血清２００μｌ／ウェルでブロックした。ＰＴＫ７免疫化マウスから得られた血清の希釈液を、各ウェルに加え、周囲温で１−２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次いで、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に接合させた、ヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体と共に、室温で１時間インキュベーとした。洗浄後、プレートを、ＡＢＴＳ基質（Ｓｉｇｍａ、Ａ−１８８８、０．２２ｍｇ／ｍｌ）で現像し、ＯＤ４１５−４９５において分光光度計測によって分析した。抗ＰＴＫ７抗体についてもっとも高い力価を発揮したマウスを融合のために用いた。融合は後述のように行い、ハイブリドーマ上清は、ＥＬＩＳＡによってその抗ＰＴＫ７活性について調べた。
【０２２９】
ＰＴＫ７に対するヒト・モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマの生成
標準的プロトコールに基づき、ＰＥＧによって、ＨｕＭａｂマウスから分離したマウス脾臓細胞をマウスの骨髄腫細胞株に融合した。次に、得られたハイブリドーマを、抗原特異的抗体の生産についてスクリーニングした。免疫化マウスから得られた脾臓細胞の、単一細胞縣濁液を、１／４数の、非分泌性ＳＰ２／０マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８１）に対し、５０％ＰＥＧ（Ｓｉｇｍａ）によって融合させた。細胞を、約１×１０５／ウェルで平底マイクロタイタープレートに撒き、次いで、１０％子牛血清、１０％Ｐ３８８Ｄ１（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ  ＴＩＢ−６３）調整媒体、３−５％ｏｒｉｇｅｎ（ＩＧＥＮ）のＤＭＥＭ液（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，ＣＲＬ１００１３、高濃度グルコース、Ｌ−グルタミン、およびピルビン酸ナトリウム含有）、プラス、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭの２−メルカプトエタノール、５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン、および１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ，ＣＲＬ  Ｐ−７１８５）を含む選択培地に約２週間インキュベートした。１−２週後、ＨＡＴをＨＴで置換した培養液において細胞を培養した。次に、ヒトの抗ＰＴＫ７モノクローナルＩｇＧ抗体の有無について、個々のウェルをＥＬＩＳＡ（前述）によってスクリーニングした。盛んなハイブリドーマ増殖が出現したならば、通常、１０−１４日後培養液を監視した。抗体分泌ハイブリドーマを再度撒き、再びスクリーニングし、ヒトのＩｇＧに関して依然として陽性であれば、抗ＰＴＫ７モノクローナル抗体を、少なくとも２回、限界希釈法によってサブクローンした。次に、安定なサブクローンをインビトロ培養し、組織培養液に溶解した少量の抗体を生成し、その後の特徴解明に備えた。
【０２３０】
さらに詳細な分析のために、ハイブリドーマクローン３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａ、および７Ｃ８を選んだ。
【０２３１】
（実施例２：ヒトのモノクローナル抗体３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａ、および７Ｃ８の構造的特徴の解明）
標準的ＰＣＲ技術を用いて、それぞれ、３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａ、および７Ｃ８ハイブリドーマから、３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａ、および７Ｃ８の、重鎖および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列を得、標準的ＤＮＡ配列技術を用いて配列決定した。
【０２３２】
３Ｇ８の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、図１Ａおよび、それぞれ、配列番号４１および１に示す。
【０２３３】
３Ｇ８の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、図１Ｂおよび、それぞれ、配列番号４５および５に示す。
【０２３４】
この３Ｇ８重鎖免疫グロブリン配列を、既知の、ヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列と比較したところ、３Ｇ８重鎖は、ヒト生殖系列ＶＨ３−３０．３のＶＨセグメント、未表示Ｄセグメント、およびヒト生殖系列ＪＨ４ｂのＪＨセグメントを利用することが明らかにされた。生殖系列ＶＨ３−３０．３配列に対する３Ｇ８  ＶＨの整列を図５に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いてさらに３Ｇ８  ＶＨ配列を分析したところ、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域の境界は、図１Ａおよび５、および、それぞれ、配列番号１１、１５、および１９に示すように定められた。
【０２３５】
３Ｇ８軽鎖免疫グロブリン配列を、既知の、ヒトの生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列と比較したところ、３Ｇ８軽鎖は、ヒト生殖系列ＶＫ  Ｌ１５のＶＬセグメント、およびヒトの生殖系列ＪＫ１のＪＫセグメントを利用することが明らかにされた。生殖系列ＶＫ  Ｌ１５配列に対する３Ｇ８  ＶＬの整列を図９に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いてさらに３Ｇ８  ＶＬ配列を分析したところ、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域の境界は、図１Ｂおよび９、および、それぞれ、配列番号２３、２９、および３５に示すように定められた。
【０２３６】
３Ｇ８ａの重鎖可変領域の、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図１Ａ、および、それぞれ、配列番号４１および１に示される。
【０２３７】
３Ｇ８ａの軽鎖可変領域の、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図１Ｃ、および、それぞれ、配列番号４６および６に示される。
【０２３８】
３Ｇ８ａ重鎖免疫グロブリン配列を、既知の、ヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列と比較したところ、３Ｇ８ａ重鎖は、ヒト生殖系列ＶＨ３−３０．３のＶＨセグメント、未表示Ｄセグメント、およびヒト生殖系列ＪＨ４ｂのＪＨセグメントを利用することが明らかにされた。生殖系列ＶＨ３−３０．３配列に対する３Ｇ８ａ  ＶＨの整列を図５に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いてさらに３Ｇ８ａ  ＶＨ配列を分析したところ、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域の境界は、図１Ａおよび５、および、それぞれ、配列番号１１、１５、および１９に示すように定められた。
【０２３９】
３Ｇ８ａ軽鎖免疫グロブリン配列を、既知の、ヒトの生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列と比較したところ、３Ｇ８ａ軽鎖は、ヒト生殖系列ＶＫ  Ｌ１５のＶＬセグメント、およびヒト生殖系列ＪＫ３のＪＫセグメントを利用することが明らかにされた。生殖系列ＶＫ  Ｌ１５配列に対する３Ｇ８ａ  ＶＬの整列を図９に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いてさらに３Ｇ８ａ  ＶＬ配列を分析したところ、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域の境界は、図１Ｃおよび９、および、それぞれ、配列番号２４、３０、および３６に示すように定められた。
【０２４０】
４Ｄ５の重鎖可変領域の、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図２Ａ、および、それぞれ、配列番号４２および２に示される。
【０２４１】
４Ｄ５の軽鎖可変領域の、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図２Ｂ、および、それぞれ、配列番号４７および７に示される。
【０２４２】
４Ｄ５重鎖免疫グロブリン配列を、既知の、ヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列と比較したところ、４Ｄ５重鎖は、ヒト生殖系列ＶＨ３−３０．３のＶＨセグメント、未表示Ｄセグメント、およびヒト生殖系列ＪＨ４ｂのＪＨセグメントを利用することが明らかにされた。生殖系列ＶＨ３−３０．３配列に対する４Ｄ５  ＶＨの整列を図６に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いてさらに４Ｄ５  ＶＨ配列を分析したところ、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域の境界は、図２Ａおよび６、および、それぞれ、配列番号１２、１６、および２０に示すように定められた。
【０２４３】
４Ｄ５軽鎖免疫グロブリン配列を、既知の、ヒトの生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列と比較したところ、４Ｄ５軽鎖は、ヒト生殖系列ＶＫ  Ａ１０のＶＬセグメント、およびヒト生殖系列ＪＫ５のＪＫセグメントを利用することが明らかにされた。生殖系列ＶＫ  Ａ１０配列に対する４Ｄ５  ＶＬの整列を図１０に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いてさらに４Ｄ５  ＶＬ配列を分析したところ、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域の境界は、図２Ｂおよび１０、および、それぞれ、配列番号２５、３１、および３７に示すように定められた。
【０２４４】
１２Ｃ６の重鎖可変領域の、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図３Ａ、および、それぞれ、配列番号４３および３に示される。
【０２４５】
１２Ｃ６の軽鎖可変領域の、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図３Ｂ、および、それぞれ、配列番号４８および８に示される。
【０２４６】
１２Ｃ６重鎖免疫グロブリン配列を、既知の、ヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列と比較したところ、１２Ｃ６重鎖は、ヒト生殖系列ＶＨ  ＤＰ４４のＶＨセグメント、未表示Ｄセグメント、およびヒト生殖系列ＪＨ４ｂのＪＨセグメントを利用することが明らかにされた。生殖系列ＶＨ  ＤＰ４４配列に対する１２Ｃ６  ＶＨ配列の整列を図７に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いてさらに１２Ｃ６  ＶＨ配列を分析したところ、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域の境界は、図３Ａおよび７、および、それぞれ、配列番号１３、１７、および２１に示すように定められた。
【０２４７】
１２Ｃ６軽鎖免疫グロブリン配列を、既知の、ヒトの生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列と比較したところ、１２Ｃ６軽鎖は、ヒト生殖系列ＶＫ  Ａ２７のＶＬセグメント、およびヒト生殖系列ＪＫ２のＪＫセグメントを利用することが明らかにされた。生殖系列ＶＫ  Ａ２７配列に対する１２Ｃ６  ＶＬの整列を図１１に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いてさらに１２Ｃ６  ＶＬ配列を分析したところ、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域の境界は、図３Ｂおよび１１、および、それぞれ、配列番号２６、３２、および３８に示すように定められた。
【０２４８】
１２Ｃ６ａの重鎖可変領域の、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図３Ａ、および、それぞれ、配列番号４３および３に示される。
【０２４９】
１２Ｃ６ａの軽鎖可変領域の、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図３Ｃ、および、それぞれ、配列番号４９および９に示される。
【０２５０】
１２Ｃ６ａ重鎖免疫グロブリン配列を、既知の、ヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列と比較したところ、１２Ｃ６ａ重鎖は、ヒト生殖系列ＶＨ  ＤＰ４４のＶＨセグメント、未表示Ｄセグメント、およびヒト生殖系列ＪＨ４ｂのＪＨセグメントを利用することが明らかにされた。生殖系列ＶＨ  ＤＰ４４配列に対する１２Ｃ６ａ  ＶＨ配列の整列を図７に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いてさらに１２Ｃ６ａ  ＶＨ配列を分析したところ、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域の境界は、図３Ａおよび７、および、それぞれ、配列番号１３、１７、および２１に示すように定められた。
【０２５１】
１２Ｃ６ａ軽鎖免疫グロブリン配列を、既知の、ヒトの生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列と比較したところ、１２Ｃ６ａ軽鎖は、ヒト生殖系列ＶＫ  Ｌ１５のＶＬセグメント、およびヒト生殖系列ＪＫ２のＪＫセグメントを利用することが明らかにされた。生殖系列ＶＫ  Ｌ１５配列に対する１２Ｃ６ａ  ＶＬの整列を図１２に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いてさらに１２Ｃ６ａ  ＶＬ配列を分析したところ、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域の境界は、図３Ｃおよび１２、および、それぞれ、配列番号２７、３３、および３９に示すように定められた。
【０２５２】
７Ｃ８の重鎖可変領域の、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図４Ａ、および、それぞれ、配列番号４４および４に示される。
【０２５３】
７Ｃ８の軽鎖可変領域の、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図４Ｂ、および、それぞれ、配列番号５０および１０に示される。
【０２５４】
７Ｃ８重鎖免疫グロブリン配列を、既知の、ヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列と比較したところ、７Ｃ８重鎖は、ヒト生殖系列ＶＨ  ３−３３のＶＨセグメント、ヒトの生殖系列３−３３のＤセグメント、およびヒト生殖系列ＪＨ６ｂのＪＨセグメントを利用することが明らかにされた。生殖系列ＶＨ  ３−３３配列に対する７Ｃ８  ＶＨ配列の整列を図８に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いてさらに７Ｃ８  ＶＨ配列を分析したところ、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域の境界は、図４Ａおよび８、および、それぞれ、配列番号１４、１８、および２２に示すように定められた。
【０２５５】
７Ｃ８軽鎖免疫グロブリン配列を、既知の、ヒトの生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列と比較したところ、７Ｃ８軽鎖は、ヒト生殖系列ＶＫ  Ｌ６のＶＬセグメント、およびヒト生殖系列ＪＫ３のＪＫセグメントを利用することが明らかにされた。生殖系列ＶＫ  Ｌ６配列に対する７Ｃ８  ＶＬの整列を図１３に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いてさらに７Ｃ８  ＶＬ配列を分析したところ、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域の境界は、図４Ｂおよび１３、および、それぞれ、配列番号２８、３４、および４０に示すように定められた。
【０２５６】
（実施例３：ｍＡｂ  １２Ｃ６の突然変異、および生殖系列の別様使用）
上の実施例２で論じたように、モノクローナル抗体１２Ｃ６および１２Ｃ６ａは、ＨｕＭａｂマウス（登録商標）系統のＨＣｏ７導入遺伝子の中に存在する、ヒトのＤＰ−４４生殖系列から得られた重鎖可変領域を利用する。ＤＰ−４４は、天然の、ヒト免疫グロブリンレパートリーにおいて利用される生殖系列配列ではないので、１２Ｃ６および１２Ｃ６ａのＶＨ配列は、その免疫原性の可能性を下げるために突然変異させるのが有利であると考えられる。好ましくは、１２Ｃ６または１２Ｃ６ａ  ＶＨ配列の、一つ以上の枠組み構造残基を、天然のヒトの免疫グロブリンレパートリーに利用される、構造的に関連するＶＨ生殖系列配列の枠組み構造中に存在する残基（単複）と一致するように突然変異させる。例えば、図７は、１２Ｃ６および１２Ｃ６ａ  ＶＨ配列の、ＤＰ４４生殖系列との、さらに、二つの構造的に関連するヒトの生殖系列配列ＶＨ３−２３およびＶＨ３−７との整列を示す。これらの配列は相互に関連するのであるから、ヒトのＰＴＫ７に特異的に結合し、ＶＨ３−２３またはＶＨ３−７生殖系列配列由来のＶＨ領域を利用するヒト抗体を選択することが可能であると予測することができる。さらに、１２Ｃ６または１２Ｃ６  ＶＨ配列内部の一つ以上の残基において、ＶＨ３−２３またはＶＨ３−７配列における対応位置の残基（単複）と異なる残基を、ＶＨ３−２３またはＶＨ３−７中に存在する残基（単複）へ、または、その、保存的アミノ酸置換基へ突然変異させることが可能である。
【０２５７】
（実施例４：抗ＰＴＫ７ヒト・モノクローナル抗体の結合特異性および結合動態の解明）
本実施例では、抗ＰＴＫ７抗体の結合親和性および結合動態を、Ｂｉａｃｏｒｅ分析によって調べた。結合特性および交差競合性は、フローサイトメトリーによって調べた。
【０２５８】
フローサイトメトリーによる結合特異性
細胞表面に組み換えヒトＰＴＫ７を発現するＨＥＫ３細胞株を開発し、これを用い、フローサイトメトリーによってＰＴＫ７ヒト・モノクローナル抗体の特異性を定量した。膜貫通形のＰＴＫ７をコードする、完全長ｃＤＮＡを含む発現プラスミドによってＨＥＫ３細胞をトランスフェクトした。７Ｃ８抗ＰＴＫ７ヒト・モノクローナル抗体の結合を、１０μｇ／ｍｌの濃度の抗ＰＴＫ７ヒト・モノクローナル抗体と該トランスフェクト細胞をインキュベートすることによって評価した。細胞を洗浄し、結合は、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ  Ａｂによって検出した。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、カリフォルニア州）を用いて実行した。結果を図１４に示す。抗ＰＴＫ７ヒト・モノクローナル抗体７Ｃ８は、ＰＴＫ７によってトランスフェクトされたＨＥＫ３細胞には結合するが、ヒトのＰＴＫ７によってトランスフェクトされていないＨＥＫ３細胞には結合しなかった。このデータは、ＰＴＫ７に対する、抗ＰＴＫ７ヒト・モノクローナル抗体の特異性を示す。
【０２５９】
ＥＬＩＳＡによる結合特異性
抗ＰＴＫ７抗体の結合はさらに、ＰＴＫ７に対する結合特異性を調べるために標準的ＥＬＩＳＡによって評価した。
【０２６０】
ＰＴＫ７の組み換え細胞外ドメインを、様々の濃度の、抗ＰＴＫ７ヒト・モノクローナル抗体３Ｇ８、４Ｄ５、１２Ｃ６、および１２Ｃ６ａに対する結合について試験した。ＥＬＩＳＡの標準的手順を実行した。抗ＰＴＫ７ヒト・モノクローナル抗体を１０μｇ／ｍｌの開始濃度で加え、１：２希釈度で連続希釈した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と接合した、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（カッパ鎖特異的）ポリクローナル抗体を二次抗体として用いた。結果を図１５に示す。抗ＰＴＫ７ヒト・モノクローナル抗体３Ｇ８、４Ｄ５、１２Ｃ６、および１２Ｃ６ａはそれぞれ、ＰＴＫ７に結合した。このデータは、ＰＴＫ７に対する、抗ＰＴＫ７ヒト・モノクローナル抗体の特異性を証明する。
【０２６１】
抗ＰＴＫ７抗体のエピトープマッピング
フローサイトメトリーを、抗ＰＴＫ７  ＨｕＭＡｂのエピトープ分類を決めるために用いた。ＰＴＫ７の膜貫通形をコードする、完全長ｃＤＮＡを含む発現プラスミドを用いて、ウィルムス腫瘍細胞Ｇ−４０１（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１４４１）をトランスフェクトした。１×１０５トランスフェクト細胞を、１０μｇ／ｍｌの、冷却抗ＰＴＫ７ヒト・モノクローナル抗体とインキュベートし、次いで、１０μｇ／ｍｌの蛍光体接合抗ＰＴＫ７ヒト・モノクローナル抗体を添加して、抗ＰＴＫ７ヒト・モノクローナル抗体のエピトープ結合を評価した。結合は、ＦＩＴＣ−標識抗ヒトＩｇＧ  Ａｂによって検出した。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、カリフォルニア州）を用いて実行した。データ分析の際、抗ＰＴＫ７抗体を、三つのエピトープ群に分類した。７Ｄ１１を含むＡ群、３Ｇ８および３Ｇ８ａを含むＢ群、および、７Ｃ８、１２Ｃ６、および１２Ｃ６ａを含むＣ群である。
【０２６２】
（実施例５：ヒトの癌細胞表面に発現されるＰＴＫ７に結合する抗ＰＴＫ７抗体の特徴）
腎芽細胞腫ウィルムス腫瘍細胞株Ｇ−４０１（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１４４１）を、種々の濃度におけるＨｕＭＡｂ抗ＰＴＫ７ヒト・モノクローナル抗体１２Ｃ６および７Ｃ８の結合について試験した。１×１０５細胞を、開始濃度３０μｇ／ｍｌで、１：２希釈度で連続希釈した抗体とインキュベートすることによって、抗ＰＴＫ７ヒト・モノクローナル抗体の結合を評価した。細胞を洗浄し、結合は、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ  Ａｂによって検出した。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、カリフォルニア州）を用いて実行した。結果を図１６に示す。抗ＰＴＫ７モノクローナル抗体１２Ｃ６および７Ｃ８は、平均染色蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定したところ、濃度依存性に腎芽細胞腫ウィルムス腫瘍細胞に結合した。抗ＰＴＫ７モノクローナル抗体１２Ｃ６および７Ｃ８のＥＣ５０値は、それぞれ、４．０３５ｎＭおよび３．４２８ｎＭであった。
【０２６３】
これらのデータは、抗ＰＴＫ７  ＨｕＭＡｂが、腎臓癌細胞株に結合することを証明する。
【０２６４】
（実施例６：癌細胞株に対するヒト抗ＰＴＫ７抗体の結合）
抗ＰＴＫ７抗体を、各種癌細胞株に対する結合についてフローサイトメトリーによって試験した。
【０２６５】
一組の癌細胞株に対する、３Ｇ８、１２Ｃ６ａ、４Ｄ５、および１２Ｃ６抗ＰＴＫ７ヒト・モノクローナル抗体の結合を、癌細胞株を１０μｇ／ｍｌの濃度の抗ＰＴＫ７ヒト・モノクローナル抗体とインキュベートすることによって評価した。試験した癌細胞株は、Ａ−４３１（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５５５）、ウィルムス腫瘍細胞Ｇ−４０１（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１４４１）、Ｓａｏｓ−２（ＡＴＣＣアクセッション番号ＨＴＢ−８５）、ＳＫＯＶ−３（ＡＴＣＣアクセッション番号ＨＴＢ−７７）、ＰＣ３（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１４３５）、ＤＭＳ１１４（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−２０６６）、ＡＣＨＮ（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１６１１）、ＬＮＣａＰ（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１７４０）、ＤＵ１４５（ＡＴＣＣアクセッション番号ＨＴＢ−８１）、ＬｏＶｏ（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＣＬ−２２９）、およびＭＩＡＰａＣａ−２（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１４２０）であった。放射性同位元素コントロール抗体を陰性コントロールとして用いた。細胞は洗浄し、結合は、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ  Ａｂによって検出した。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、カリフォルニア州）を用いて実行した。結果を図１７に示す。抗ＰＴＫ７モノクローナル抗体３Ｇ８、１２Ｃ６ａ、４Ｄ５、および１２Ｃ６は、平均染色蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定したところ、癌細胞株Ａ−４３１、ウィルムス腫瘍細胞Ｇ−４０１、Ｓａｏｓ−２、ＳＫＯＶ−３、ＰＣ３、ＤＭＳ１１４、ＡＣＨＮ、ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５、ＬｏＶｏ、および、ＭＩＡ  ＰａＣａに結合した。これらのデータは、抗ＰＴＫ７  ＨｕＭＡｂが、細胞表面ＰＴＫ７を発現する、ある範囲の癌細胞に結合することを証明する。
【０２６６】
（実施例７：ヒトのＴ、Ｂ、および樹状細胞に対する抗ＰＴＫ７の結合）
抗ＰＴＫ７抗体を、その細胞表面にＰＴＫ７を発現する、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、およびヒトの造血骨髄樹状細胞に対する結合について、フローサイトメトリーによって試験した。
【０２６７】
ヒトのＴ細胞を、ヒトの抗ＰＴＫ７モノクローナル抗体との結合前に、Ｔ細胞におけるＰＴＫ７発現を誘発するために、抗ＣＤ３抗体によって活性化した。７ｃ８抗ＰＴＫ７ヒト・モノクローナル抗体の結合を、前記細胞を１０μｇ／ｍｌの濃度の抗ＰＴＫ７ヒト・モノクローナル抗体とインキュベートすることによって評価した。ある実験では、ＴおよびＢ細胞特異性マーカーに結合する既知の抗体を、陽性コントロールとして用いた。細胞は洗浄し、結合は、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ  Ａｂによって検出した。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、カリフォルニア州）を用いて実行した。結果を図１８（活性化ヒトＴ細胞およびＢ細胞）、および図１９（樹状細胞）に示す。抗ＰＴＫ７モノクローナル抗体７Ｃ８は、平均染色蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定したところ、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞および樹状細胞には結合したが、Ｂ細胞には結合しなかった。これらのデータは、抗ＰＴＫ７  ＨｕＭＡｂが、ヒトのＴ細胞および樹状細胞に結合することを証明する。
【０２６８】
（実施例８：抗ＰＴＫ７モノクローナル抗体の内部取り込み）
抗ＰＴＫ７  ＨｕＭＡｂを、Ｈｕｍ−Ｚａｐ内部取り込みアッセイによって、ＰＴＫ７発現細胞株への内部取り込み能力について試験した。Ｈｕｍ−Ｚａｐアッセイは、サポリン毒素に接合させたヒトＩｇＧに対して親和性を有する二次抗体の結合を通じて、ヒトの一次抗体の内部取り込みについて試験する。
【０２６９】
ＰＴＫ７発現癌細胞株ウィルムス腫瘍Ｇ−４０１（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１４４１）、Ａ−４３１（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５５５）、およびＰＣ３（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１４３５）を、１００μｌウェルに、１×１０４細胞／ウェルで直接撒いた。ウェルに対し、抗ＰＴＫ７  ＨｕＭＡｂ抗体３Ｇ８、４Ｄ５、１２Ｃ６、または７Ｃ８を、開始濃度３０μｇ／ｍｌで加え、１：２希釈度で連続希釈の下に結合を定量した。ＰＴＫ７に対して非特異的な、アイソタイプコントロール抗体を陰性コントロールとして用いた。１１ｎＭｎの濃度でＨｕｍ−Ｚａｐ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，サンデイェゴ、カリフォルニア州、ＩＴ−２２−２５）を加え、プレートを７２時間インキュベートした。次に、プレートを、１．０μＣｉの３Ｈ−チミジンに２４時間パルス暴露し、収集し、Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔシンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍｅｒｉｄｅｎ、コネチカット州）で読み取った。結果を図２０Ａ−Ｄに示す。抗ＰＴＫ７モノクローナル抗体３Ｇ８、４Ｄ５、１２Ｃ６および７Ｃ８は、ＰＴＫ７発現ウィルムス腫瘍癌細胞株の３Ｈ−チミジンの取り込みにおいて抗体濃度依存性の低下を示した。抗ＰＴＫ７抗体１２Ｃ６および７Ｃ８は、ＰＴＫ７発現癌細胞株Ａ−４３１およびＰＣ３の３Ｈ−チミジンの取り込みにおいて抗体濃度依存性の低下を示した。ウィルムスの腫瘍細胞における抗ＰＴＫ７抗体３Ｇ８、４Ｄ５、１２Ｃ６、および７Ｃ８のＥＤ５０値は、それぞれ、０．６４３７ｎＭ、０．２５１６ｎＭ、０．２５１６ｎＭ、または０．１７８８ｎＭであった。Ａ−４３１細胞における抗ＰＴＫ７抗体１２Ｃ６および７Ｃ８のＥＤ５０値は、それぞれ、０．１６５７ｎＭおよび０．１８２６ｎＭであった。ＰＣ３腫瘍細胞における抗ＰＴＫ７抗体１２Ｃ６および７Ｃ８のＥＤ５０値は、それぞれ、０．３１７５ｎＭおよび０．２６４８ｎＭであった。このデータは、抗ＰＴＫ７抗体３Ｇ８、４Ｄ５、１２Ｃ６、および７Ｃ８が、癌細胞の中に取り込まれることを証明する。
【０２７０】
（実施例９：ヒト癌細胞株に対する、毒素接合抗ＰＴＫ７抗体の細胞殺作用の評価）
この実施例では、細胞増殖アッセイにおいて、毒素に接合された抗ＰＴＫ７モノクローナル抗体を、ＰＴＫ７＋ヒト癌細胞株に対する殺能力について試験した。
【０２７１】
抗ＰＴＫ７  ＨｕＭＡｂ抗体１２Ｃ６を、リンカー、例えば、ペプチジル、ヒドラゾン、またはジスルフィドリンカーを介して毒素に接合した。本発明の抗体に接合してもよい毒素化合物の例は、２００５年９月２６日提出の、代理人整理番号第０４２８０／１００Ｍ６２９ＵＳ３号にファイルされた出願に記載される。ＰＴＫ７発現ウィルムス腫瘍ヒト腎臓癌細胞株Ｇ−４０１（ＡＴＣＣアクセッション番号第ＣＲＬ−１４４１）を、１００μｌウェルに１０４細胞／ウェルで撒き３時間インキュベートした。このウェルに、抗ＰＴＫ７抗体−毒素結合体を開始濃度３０μｇ／ｍｌで加え、１：３連続希釈の下に結合を定量した。プレートを４８時間インキュベートした。次に、培養の終了前に、プレートを、１．０μＣｉの３Ｈ−チミジンに２４時間パルス暴露し、収集し、Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔシンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で読み取った。図２１は、１２Ｃ６ａ−結合体の、ウィルムス腫瘍細胞に及ぼす作用を示す。抗ＰＴＫ７抗体１２Ｃ６ａは、ＰＴＫ７発現性ウィルムス腫瘍ヒト腎臓癌細胞株の３Ｈ−チミジンの取り込みにおいて抗体−毒素濃度依存性の低下を示した。
【０２７２】
このデータは、毒素に接合された抗ＰＴＫ７抗体が、ヒトの腎臓癌細胞に対し特異的細胞傷害性を示すことを証明する。
【０２７３】
（実施例１０：ヒトの腫瘍細胞株に対する、毒素接合抗ＰＴＫ７抗体の細胞殺作用の評価）
この実施例では、細胞増殖アッセイにおいて、毒素に接合された抗ＰＴＫ７モノクローナル抗体を、ＰＴＫ７について、低レベル、中間レベル、または高レベルの細胞表面発現を呈するＰＴＫ＋ヒト癌細胞株に対する殺能力について試験した。
【０２７４】
抗ＰＴＫ７  ＨｕＭＡｂ抗体１２Ｃ６を、リンカー、例えば、ペプチジル、ヒドラゾン、またはジスルフィドリンカーを介して毒素に接合した。本発明の抗体に接合してもよい毒素化合物の例は、２００５年９月２６日提出の、代理人整理番号第０４２８０／１００Ｍ６２９ＵＳ３号にファイルされた出願に記載される。ＰＴＫ７発現ヒト癌細胞株Ａ−４３１、ＳＫＯＶ３、およびＬｏＶｏを、１００μｌウェルに１０４細胞／ウェルで撒いた。これらの細胞株は、以前に、標準的ＦＡＣＳアッセイにおいてＰＴＫ７の細胞表面発現について試験した。Ａ−４３１細胞株は、最高レベルの細胞表面ＰＴＫ７を発現し、ＬｏＶｏ細胞株は、最低レベルの細胞表面ＰＴＫ７を発現した。これらのウェルに、抗ＰＴＫ７抗体−毒素結合体を開始濃度２０ｎＭで加え、１：２連続希釈の下に結合を定量した。アイソタイプコントロール抗体を陰性コントロールとしても用いた。プレートを３時間インキュベートし、未結合（遊離）抗体−毒素結合体を洗浄除去した。プレートを９６時間続けてインキュベートし、殺細胞活性（ＦＵ、蛍光単位）は、ＢＩＯ−ＴＥＫリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ，バーモント州、米国）を用いたプロトコール（Ｐｒｏｍｅｇａ，ウィスコンシン州、米国、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．２８８）にしたがってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光アッセイにおける細胞の生存率によって測定した。結果を図２２に示す。抗ＰＴＫ７抗体−毒素結合体は、ＰＴＫ７発現性Ａ４３１高度、ＳＫＯＶ３中間、およびＬｏＶｏ低度における増殖アッセイにおいて抗体−毒素濃度依存性の低下を示した。
【０２７５】
このデータは、毒素に接合された抗ＰＴＫ７抗体が、ヒトの各種癌細胞に対し特異的細胞傷害性を示すことを証明する。
【０２７６】
（実施例１１：３Ｇ８、１２Ｃ６ａ、２Ｅ１１に関する免疫組織化学）
抗ＰＴＫ７  ＨｕＭＡｂ  ３Ｇ８、１２Ｃ６ａ、および２Ｅ１１が、ＰＴＫ７を認識する能力を、肺癌、乳癌、膀胱癌、すい臓癌、結腸癌、卵巣癌、小腸癌、および前立腺癌から得た臨床的バイオプシー標本を用いて免疫組織化学によって調べた。
【０２７７】
免疫組織化学のために、５μｍの凍結切片を用いた（Ａｒｄａｉｓ  Ｉｎｃ，米国）。３０分乾燥した後、切片をアセトンで固定し（室温で１０分）、５分間空気乾燥した。スライドをＰＢＳで濯ぎ、次いで、ＰＢＳに溶解した１０％正常ヤギ血清と２０分準備インキュベートし、その後、１０％正常ヤギ血清を含む、ＰＢＳに溶解した１０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ化抗体と、室温で３０分インキュベートした。次に、スライドを、ＰＢＳで３回洗浄し、マウスの抗ＦＩＴＣ（１０μｇ／ｍｌ  ＤＡＫＯ）と室温で３０分インキュベートした。スライドを再びＰＢＳで洗浄し、ヤギ抗マウスＨＲＰ結合体（ＤＡＫＯ）と室温で３０分インキュベートした。スライドを再びＰＢＳで３×洗浄した。基質としてジアミノベンジジン（Ｓｉｇｍａ）を用いたところ、褐色の染色が得られた。蒸留水による洗浄後、スライドを、ヘマトキシリンによって１分間カウンターステインした。その後、スライドを、流れる蒸留水中で１０秒洗浄し、グリセルゲル（ＤＡＫＯ）にマウントした。臨床的バイオプシー標本の免疫組織化学的染色から、肺癌、乳癌、膀胱癌、すい臓癌、結腸癌、卵巣癌、小腸癌および前立腺癌の切片において陽性染色が示された。正常組織は、ＰＴＫ７染色について常に陰性であったが、悪性組織では、癌活性化線維芽細胞および癌性上皮細胞の両方が、ＰＴＫ７染色に対して陽性であることが観察された。癌活性化線維芽細胞が実際に線維芽細胞であることは、膀胱癌および乳癌切片において線維芽細胞活性化タンパク抗体（ＦＡＰ、Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、米国）による染色によって確認された。ＦＡＰは、癌活性化線維芽細胞の周知のマーカーである（Ｈｏｆｈｅｉｎｚら、（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２６：４４−４８）。
【０２７８】
（実施例１２：侵入アッセイ）
この実施例では、ＰＴＫ７に向けられた抗体の、ＰＴＫ７によってトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株における細胞侵入に及ぼす作用能力について試験した。
【０２７９】
アッセイは、ＨＴＳ  ９６−Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ  Ｉｎｓｅｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号３５１１６２，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州）を用い該システムのプロトコールにしたがって行った。ＣＨＯ親細胞株、完全長ＰＴＫ７によってトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、またはコントロールＨＥＫ２９３細胞を、挿入体へ加える前に、抗ＰＴＫ７  ＨｕＭａｂのプール、または、アイソタイプコントロール抗体と混合した。この混合物（細胞＋Ａｂプール）を、侵入プレートの挿入体ウェルに加えた。５％ＣＯ２下３７℃で２４時間インキュベーションした後、細胞を蛍光染色によって標識し、膜の基底部まで侵入した細胞を、蛍光プレートリーダーを用いて定量化した。結果を図２３に示す。このデータは、抗ＰＴＫ７抗体が、細胞表面にＰＴＫ７を発現する細胞の侵入移動を抑制することを証明する。
【０２８０】
（実施例１３：天然の、および細胞毒素に接合された、抗ＰＴＫ７抗体による、すい臓癌細胞のインビボ異種移植モデルの治療）
この実施例は、抗体の、腫瘍増殖に対するインビボ作用を調べるために行われた、すい臓細胞癌腫瘍を移植されたマウスの、毒素に接合された抗ＰＴＫ７抗体によるインビボ治療を開示する。
【０２８１】
ＨＰＡＣ（ヒトすい臓腺癌、ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−２１１９）、または、他の好適なすい臓癌細胞を、標準的実験室手順を用いてインビトロで拡張した。６−８週齢の、雄性Ｎｃｒ無胸腺ヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｈｕｄｓｏｎ、ニューヨーク州）の右脇腹皮下に、１匹当たり、０．２ｍｌのＰＢＳ／Ｍａｔｒｉｇｅｌに縣濁した２．５×１０６個のＨＰＡＣ細胞を移植した。マウスは、移植後週に２度、体重測定し、電子キャリパーを用いて腫瘍を三次元的に測定した。腫瘍体積を、高さ×幅×長さ／２として計算した。ＨＰＡＣ腫瘍の平均が９０ｍｍ３のマウスを、ランダムに治療群に割り当てた。これらのマウスに、ＰＢＳベヒクル、天然抗ＰＴＫ７抗体、または毒素接合抗ＰＴＫ７  ＨｕＭＡｂを、表示の用量において０日目に単回静脈内投与として与えた。本発明の抗体に接合させてよい毒素化合物の例は、係属中の米国特許出願第１１／１３４，８２６号、およびＭＥＤＸ−００３４ＵＳ４と表示される、係属中の米国特許出願に記載される。投与後６１日間、マウスは、腫瘍増殖について監視された。腫瘍が、腫瘍終末点（２０００ｍｍ３）に達した場合、または潰瘍化した場合、安楽死させた。毒素に接合された抗ＰＴＫ７抗体は、腫瘍増殖の進行を遅らせた。結果を図２４に示す。抗ＰＴＫ７毒素結合体の抗腫瘍作用は、用量依存性であり、最大作用は、０．３μモル／ｋｇに見られた。抗ＰＴＫ７毒素結合体による治療はよく耐容され、被験体は、５％を超える、体重減少中央値を経験することはなかった（データ図示せず）。したがって、抗ＰＴＫ７抗体−毒素結合体による治療は、すい臓癌腫瘍増殖に対し直接的インビボ抑制作用を有する。
【０２８２】
（実施例１４：天然の、および細胞毒素接合の抗ＰＴＫ７抗体による、乳癌細胞インビボ異種移植モデルの治療）
この実施例は、抗体の、腫瘍増殖に対するインビボ作用を調べるために行われた、アドリアマイシン耐性乳癌腫瘍を移植されたマウスの、毒素に接合された抗ＰＴＫ７抗体によるインビボ治療を開示する。
【０２８３】
ＭＣＦ７−ａｄｒ（アドリアマイシンに対して耐性を持つヒトの乳癌細胞株）を、標準的実験室手順を用いてインビトロで拡張した。６−８週齢の、雌性ＣＢ１７．ＳＣＩＤマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｈｕｄｓｏｎ、ニューヨーク州）の頸部皮下に、１．７ｍｇの、９０日放出エストロゲンペレット、３．０ｍｍサイズ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｓａｒａｓｏｔａ、フロリダ州）を移植した。次いで、右脇腹皮下に、１匹当たり、０．２ｍｌのＰＢＳ／Ｍａｔｒｉｇｅｌに縣濁した１０×１０６個のＭＣＦ７−Ａｄｒ細胞を移植した。マウスは、移植後週に２度、体重測定し、電子キャリパーを用いて腫瘍を三次元的に測定した。腫瘍体積を、高さ×幅×長さ／２として計算した。ＭＣＦ７−ａｄｒ腫瘍の平均が１６０ｍｍ３のマウスを、ランダムに治療群に割り当てた。これらのマウスに、ＰＢＳベヒクル、天然抗ＰＴＫ７抗体、または毒素接合抗ＰＴＫ７  ＨｕＭＡｂを、０日目に、０．１μモル／ｋｇの単回静脈内投与として与えた。本発明の抗体に接合させてよい毒素化合物の例は、係属中の米国特許出願第１１／１３４，８２６号、およびＭＥＤＸ−００３４ＵＳ４と表示される、係属中の米国特許出願に記載される。投与後６３日間、マウスは、腫瘍増殖について監視された。マウスは、腫瘍が潰瘍化した時点で安楽死させた。結果を図２５に示す。抗ＰＴＫ７抗体毒素結合体は、腫瘍増殖の進行を遅らせた。したがって、抗ＰＴＫ７抗体−毒素結合体による治療は、乳癌腫瘍増殖に対し直接的インビボ抑制作用を有する。
【０２８４】
【化１】
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【０２８５】
【化２】
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【図面の簡単な説明】
【０２８６】
【図１Ａ】図１Ａは、ヒト・モノクローナル抗体３Ｇ８および３Ｇ８ａの重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号４１）およびアミノ酸配列（配列番号１）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１１）、ＣＤＲ２（配列番号１５）、およびＣＤＲ３（配列番号１９）領域が区別され、Ｖ、Ｄ、およびＪ生殖系列誘導体が示される。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ヒト・モノクローナル抗体３Ｇ８の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号４５）およびアミノ酸配列（配列番号５）を示す。ＣＤＲ１（配列番号２３）、ＣＤＲ２（配列番号２９）、およびＣＤＲ３（配列番号３５）領域が区別され、ＶおよびＪ生殖系列誘導体が示される。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ヒト・モノクローナル抗体３Ｇ８ａの軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号４６）およびアミノ酸配列（配列番号６）を示す。ＣＤＲ１（配列番号２４）、ＣＤＲ２（配列番号３０）、およびＣＤＲ３（配列番号３６）領域が区別され、ＶおよびＪ生殖系列誘導体が示される。
【図２Ａ】図２Ａは、ヒト・モノクローナル抗体４Ｄ５の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号４２）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１２）、ＣＤＲ２（配列番号１６）、およびＣＤＲ３（配列番号２０）領域が区別され、Ｖ、Ｄ、およびＪ生殖系列誘導体が示される。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ヒト・モノクローナル抗体４Ｄ５の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号４７）およびアミノ酸配列（配列番号７）を示す。ＣＤＲ１（配列番号２５）、ＣＤＲ２（配列番号３１）、およびＣＤＲ３（配列番号３７）領域が区別され、ＶおよびＪ生殖系列誘導体が示される。
【図３Ａ】図３Ａは、ヒト・モノクローナル抗体１２Ｃ６の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号４３）およびアミノ酸配列（配列番号３）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１３）、ＣＤＲ２（配列番号１７）、およびＣＤＲ３（配列番号２１）領域が区別され、Ｖ、Ｄ、およびＪ生殖系列誘導体が示される。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ヒト・モノクローナル抗体１２Ｃ６の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号４８）およびアミノ酸配列（配列番号８）を示す。ＣＤＲ１（配列番号２６）、ＣＤＲ２（配列番号３２）、およびＣＤＲ３（配列番号３８）領域が区別され、ＶおよびＪ生殖系列誘導体が示される。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ヒト・モノクローナル抗体１２Ｃ６ａの軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号４９）およびアミノ酸配列（配列番号９）を示す。ＣＤＲ１（配列番号２７）、ＣＤＲ２（配列番号３３）、およびＣＤＲ３（配列番号３９）領域が区別され、ＶおよびＪ生殖系列誘導体が示される。
【図４Ａ】図４Ａは、ヒト・モノクローナル抗体７Ｃ８の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号４４）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１４）、ＣＤＲ２（配列番号１８）、およびＣＤＲ３（配列番号２２）領域が区別され、Ｖ、Ｄ、およびＪ生殖系列誘導体が示される。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ヒト・モノクローナル抗体７Ｃ８の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号５０）およびアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。ＣＤＲ１（配列番号２８）、ＣＤＲ２（配列番号３４）、およびＣＤＲ３（配列番号４０）領域が区別され、ＶおよびＪ生殖系列誘導体が示される。
【図５】図５は、ヒト生殖系列ＶＨ３−３０．３アミノ酸配列（配列番号５１）（ＪＨ４ｂ生殖系列は、配列番号５９として開示される）と並べた、３Ｇ８の重鎖可変領域（配列番号１）および３Ｇ８ａの重鎖可変領域（配列番号１）のアミノ酸配列の整列を示す。
【図６】図６は、ヒト生殖系列ＶＨ３−３０．３アミノ酸配列（配列番号５１）（ＪＨ４ｂ生殖系列は、配列番号６０として開示される）と並べた、４Ｄ５の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２）の整列を示す。
【図７】図７は、ヒト生殖系列ＶＨＤＰ４４アミノ酸配列（配列番号５２）（３−７、３−２３、およびＪＨ４ｂ生殖系列は、それぞれ、配列番号６１−６３として開示される）と並べた、１２Ｃ６の重鎖可変領域（配列番号３）および１２Ｃ６ａの重鎖可変領域（配列番号２）のアミノ酸配列の整列を示す。
【図８】図８は、ヒト生殖系列ＶＨ３−３３アミノ酸配列（配列番号５３）（ＪＨ６ｂ生殖系列は、配列番号６４として開示される）と並べた、７Ｃ８の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号４）の整列を示す。
【図９】図９は、ヒト生殖系列ＶＫ  Ｌ１５アミノ酸配列（配列番号５４）（ＪＫ１生殖系列は配列番号６５として開示される）と並べた、３Ｇ８の軽鎖可変領域（配列番号５）および３Ｇ８ａの軽鎖可変領域（配列番号６）のアミノ酸配列の整列を示す。
【図１０】図１０は、ヒト生殖系列ＶＫ  Ａ１０アミノ酸配列（配列番号５５）（ＪＫ５生殖系列は配列番号６６として開示される）と並べた、４Ｄ５の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号７）の整列を示す。
【図１１】図１１は、ヒト生殖系列ＶＫ  Ａ２７アミノ酸配列（配列番号５６）（ＪＫ２生殖系列は配列番号６７として開示される）と並べた、１２Ｃ６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号８）の整列を示す。
【図１２】図１２は、ヒト生殖系列ＶＫ  Ｌ１５アミノ酸配列（配列番号５４）（ＪＫ２生殖系列は配列番号６８として開示される）と並べた、１２Ｃ６ａの軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号９）の整列を示す。
【図１３】図１３は、ヒト生殖系列ＶＫ  Ｌ６アミノ酸配列（配列番号５７）（ＪＫ３生殖系列は配列番号６９として開示される）と並べた、７Ｃ８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１０）の整列を示す。
【図１４】図１４は、ヒトのＰＴＫ７に対して向けられる、ヒト・モノクローナル抗体７Ｃ８が、完全長のヒトＰＴＫ７によってトランスフェクトされたＨＥＫ３細胞の表面に結合することを明らかにする、フローサイトメトリー実験の結果を示す。
【図１５】図１５は、ヒトのＰＴＫ７に対する、ヒトのモノクローナル抗体がＰＴＫ７に特異的に結合することを明らかにするＥＬＩＳＡ実験の結果を示す。
【図１６】図１６は、ヒトのＰＴＫ７に対して向けられる抗体が、ウィルムス腫瘍細胞の表面に結合することを明らかにする、フローサイトメトリー実験の結果を示す。
【図１７】図１７は、ヒトのＰＴＫ７に対して向けられる抗体が、各種癌細胞株の細胞表面に結合することを明らかにする、フローサイトメトリー実験の結果を示す。
【図１８】図１８は、ヒトのＰＴＫ７に対して向けられる抗体が、樹状細胞の表面に結合することを明らかにする、フローサイトメトリー実験の結果を示す。
【図１９】図１９は、ヒトのＰＴＫ７に対して向けられる抗体が、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球には結合するが、Ｂリンパ球には結合しないことを明らかにする、フローサイトメトリー実験の結果を示す。
【図２０Ａ】図２０は、ヒトのＰＴＫ７に対するヒトのモノクローナル抗体が、ＰＴＫ７＋細胞の中に進入が可能であることを明らかにする、Ｈｕｍ−Ｚａｐ内部取り込み実験の結果を示す。（Ａ）ウィルムス腫瘍細胞におけるヒト抗体３Ｇ８、４Ｄ５、および７Ｃ８の取り込み。
【図２０Ｂ】図２０は、ヒトのＰＴＫ７に対するヒトのモノクローナル抗体が、ＰＴＫ７＋細胞の中に進入が可能であることを明らかにする、Ｈｕｍ−Ｚａｐ内部取り込み実験の結果を示す。（Ｂ）ウィルムス腫瘍細胞におけるヒト抗体１２Ｃ６の取り込み。
【図２０Ｃ】図２０は、ヒトのＰＴＫ７に対するヒトのモノクローナル抗体が、ＰＴＫ７＋細胞の中に進入が可能であることを明らかにする、Ｈｕｍ−Ｚａｐ内部取り込み実験の結果を示す。（Ｃ）Ａ−４３１腫瘍細胞におけるヒト抗体７Ｃ８および１２Ｃ６の取り込み。
【図２０Ｄ】図２０は、ヒトのＰＴＫ７に対するヒトのモノクローナル抗体が、ＰＴＫ７＋細胞の中に進入が可能であることを明らかにする、Ｈｕｍ−Ｚａｐ内部取り込み実験の結果を示す。（Ｄ）ＰＣ３腫瘍細胞におけるヒト抗体７Ｃ８および１２Ｃ６の取り込み。
【図２１】図２１は、毒素に接合された抗ＰＴＫ７ヒト・モノクローナル抗体が、ヒトの腎臓癌細胞株を殺すことを明らかにする細胞増殖アッセイの結果を示す。
【図２２】図２２は、毒素に接合された抗ＰＴＫ７ヒト・モノクローナル抗体が、低レベルから高レベルのＰＴＫ７を発現する細胞株を殺すことを明らかにする細胞増殖アッセイの結果を示す。
【図２３】図２３は、抗ＰＴＫ７抗体が、細胞表面にＰＴＫ７を発現する細胞の侵入移動を抑制することを明らかにする侵入アッセイの結果を示す。
【図２４】図２４は、毒素に接合された抗ＰＴＫ７抗体が、すい臓癌の腫瘍増殖の進行を遅らせることを明らかにする、腫瘍のインビボ異種移植実験の結果を示す。
【図２５】図２５は、毒素に接合された抗ＰＴＫ７抗体が、乳癌の腫瘍増殖の進行を遅らせることを明らかにする、腫瘍のインビボ異種移植実験の結果を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
0005401639.tif 000010
【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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