(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−デオキシグルコースおよびグルコース、ここで２−デオキシグルコースのグルコースに対する比率が等しいかあるいは１：９以下である、を含む細胞培養培地であって、当該細胞培養培地が血清を含まない細胞培養培地。
【請求項２】
２−デオキシグルコースが１リットルあたり約０．２５グラム〜１グラムで存在する請求項１記載の培地。
【請求項３】
さらにグルタミンを約１３ｍＭ未満で含む請求項１記載の培地。
【請求項４】
培地がさらにグルコースを約８ｇ／Ｌ以上含む請求項１記載の培地。
【請求項５】
細胞培養培地が、（ｉ）累積アミノ酸濃度が約７０ｍＭよりも大きく、（ｉｉ）累積グルタミン
対 累積アスパラギンモル比が約２未満、（ｉｉｉ）累積グルタミン 対 累積全アミノ酸モル比が約０．２未満、（ｉｖ）累積無機イオン 対 累積全アミノ酸モル比が約０．４〜１、（ｖ）累積グルタミンおよび累積アスパラギンの合わせた濃度が約１６〜３６ｍＭ、およびその組み合わせからなる群から選択される培地特性を有する請求項１記載の培地。
【請求項６】
さらにマンガンを約１０〜６００ｎＭで含む請求項１記載の培地。
【請求項７】
培地が規定される請求項１記載の培地。
【請求項８】
２−デオキシグルコースおよびグルコース、ここで２−デオキシグルコースのグルコースに対する比率が等しいかあるいは１：９以下である、を含む細胞培養培地中で、目的のポリペプチドをコードしている遺伝子を含有する哺乳動物細胞を培養し、該遺伝子が細胞培養条件下で発現される工程、
第１の期間、第１の温度範囲で培養物を維持する工程、
培養物を第２の温度範囲にシフトし、ここに、第２の温度範囲の少なくとも１つの温度が第１の温度範囲の最も低温よりも低い工程、および
ポリペプチドの発現が可能になるのに十分な条件下および時間で第２の期間、培養物を維持し、ここに、培養物の乳酸レベルが、解糖阻害物質を欠くほかは同一の培地中、同一の条件下で観察される乳酸レベルよりも低くなる工程、
を含む細胞培養におけるポリペプチドの産生方法。
【請求項９】
２−デオキシグルコースが細胞培地中、１リットルあたり約０．２５グラム〜１グラムで存在する請求項８記載の方法。
【請求項１０】
さらにグルタミンを約１３ｍＭ未満で含む請求項８記載の方法。
【請求項１１】
細胞培養培地がさらにグルコースを含み、ここにグルコースレベルが約８ｇ／Ｌ以上で維持される請求項８記載の方法。
【請求項１２】
細胞培養培地が、（ｉ）累積アミノ酸濃度が約７０ｍＭより大きく、（ｉｉ）累積グルタミン 対
累積アスパラギンモル比が約２未満、（ｉｉｉ）累積グルタミン 対 累積全アミノ酸モル比が約０．２未満、（ｉｖ）累積無機イオン 対 累積全アミノ酸モル比が約０．４〜１、（ｖ）累積グルタミンおよび累積アスパラギンの合わせた濃度が約１６〜３６ｍＭ、およびその組み合わせからなる群から選択される培地特性を有する請求項８記載の方法。
【請求項１３】
さらにマンガンを約１０〜６００ｎＭで含む請求項８記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも５００リットルの培養物を提供することを含む、請求項１１または８記載の方法。
【請求項１５】
さらに補足成分が提供される請求項８記載の方法。
【請求項１６】
補足成分がフィード培地中に提供される請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
補足成分が２−デオキシグルコースを含む請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
補足成分が、ホルモンおよび／または他の増殖因子、特定のイオン（例えば、ナトリム、塩化物、カルシウム、マグネシウム、およびホスフェート）、バッファー、ビタミン類、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、微量元素（通常、非常に低い最終濃度で存在する無機化合物）、アミノ酸類、脂質、グルコースまたは他のエネルギー源、およびその組み合わせからなる群から選択される請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
第１の温度範囲が摂氏３０〜４２度である請求項８記載の方法。
【請求項２０】
第２の温度範囲が摂氏２５〜４１度である請求項８記載の方法。
【請求項２１】
シフト工程が、培養物の生存細胞密度が約６ｘ１０６細胞／ｍＬ〜１２ｘ１０６細胞／ｍＬの範囲内にあるときにシフトして、その結果、細胞が第２の期間中に乳酸を取り込み始めるようになることを特徴とする、請求項８記載の方法。
【請求項２２】
シフト工程が、培養物の乳酸濃度が約８グラム／リットル未満のときにシフトして、その結果、細胞が第２の期間中に乳酸を取り込み始めるようになることを特徴とする、請求項８記載の方法。
【請求項２３】
培養物を第３の温度または温度範囲にシフトすることを含む、第１のシフト工程後の第２のシフト工程であって、ここに、第３の温度範囲の少なくとも１つの温度が第２の温度範囲の最低温度よりも低い工程を含む請求項８記載の方法。
【請求項２４】
第３の温度範囲が摂氏２５〜４０度である請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ポリペプチドが単離および精製される請求項８〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ポリペプチドが、酵素、受容体、抗体、ホルモン、調節因子、抗原、結合剤、凝固因子、増殖因子、およびその組み合わせからなる群から選択される請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
ポリペプチドが抗体である請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
抗体が抗−ＡＢｅｔａ抗体である請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
抗体が、解糖阻害物質を欠くほかは同一の培地中で同一の条件下で産生された抗体よりも、強く、特異的に、または強く且つ特異的にエピトープに結合する請求項１８または２８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００６年１１月３日に出願されたアメリカ合衆国仮特許出願第６０／５８６，６１５号（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）と同時係属中であり、少なくとも１人の共通の発明者を有し、かつ、優先権主張している。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
タンパク質およびポリペプチドは、益々重要な商業的治療剤となってきている。多くの場合、これらのタンパク質およびポリペプチドは、目的の特定のタンパク質またはポリペプチドを異常に高レベルに産生するように操作された、および／または選択された細胞から、細胞培養において生産される。細胞培養条件の調節および最適化は、タンパク質およびポリペプチドの商業的生産の成功に極めて重要である。
【０００３】
細胞培養で生産される多くのタンパク質およびポリペプチドは、細胞を一定期間培養し、次いで、培養を終了し、産生したタンパク質またはポリペプチドを単離するバッチまたはフェッドバッチプロセスにおいて製造される。別法では、タンパク質またはポリペプチドは、培養を終了せず、新たな栄養分および他の成分を周期的に培養物に加え、その間、発現したタンパク質またはポリペプチドを周期的に回収する潅流細胞培養プロセスで生産することができる。生産されるタンパク質またはポリペプチドの最終的な量および質は、細胞培養条件によって著しく影響を及ぼされる。例えば、伝統的なバッチおよびフェッドバッチ培養プロセスは、しばしば、細胞成長または生存、および目的のタンパク質またはポリペプチドの産生または安定性に不利な影響を及ぼす代謝廃棄産物の産生をもたらす。これらの不利益な廃棄産物には、グルコース代謝産物である乳酸塩がある。乳酸蓄積は、細胞培養物のｐＨを減少させることが分かっており、細胞生存能力および生産能力の両方に不利益である（Ｇｏｒｆｉｅｎら、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，  Ｂｉｏｐｈａｒｍ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ａｐｒｉｌ  ２００３参照）。細胞培養プロセスにおけるタンパク質およびポリペプチドの産生を改善するために種々の努力がなされてきたが、さらなる改善の要望が依然としてある。
【０００４】
さらに、細胞、特に哺乳動物細胞を培養する際に使用するための規定培地（すなわち、既知の個々の成分から構成され、かつ、血清または他の動物性副産物を欠く培地）の開発において著しい努力がなされてきた。細胞成長特徴は、血清由来の培地と比べて、規定培地において非常に異なる。不利益な廃棄産物の蓄積が減少または排除された規定培地における細胞培養によって、タンパク質およびポリペプチドを生産するための改善された系の開発に対する特別の要望がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｇｏｒｆｉｅｎら、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，  Ｂｉｏｐｈａｒｍ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ａｐｒｉｌ  ２００３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本発明は、細胞培養におけるタンパク質および／またはポリペプチドの大規模生産のための改善された方法および組成物を提供する。ある特定の具体例において、解糖阻害物質を含有する細胞培養培地が提供される。ある特定の具体例において、グルコース類似物２−デオキシグルコースを含有する細胞培養培地が提供される。ある特定の具体例において、ジ（２−エチルヘキシル）ホスフェート、トリブチルホスフェート、ドデシルホスフェート、（ジフェニルメチル）−リン酸の２−ジメチルアミノエチルエステル、ヨウ化［２−（ジフェニルホスフィニルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウム、ヨードアセテートおよび／またはフルオロアセテートを含有する細胞培養培地が提供される。ある特定の具体例において、グルタミンが約１３ｍＭ未満の濃度で存在する解糖阻害物質を含有する細胞培養培地が提供される。ある特定の具体例において、グルタミンが約４ｍＭ未満の濃度で存在する解糖阻害物質を含有する細胞培養培地が提供される。ある特定の具体例において、本発明の細胞培養培地は、目的のタンパク質またはポリペプチドを発現する哺乳動物細胞を増殖させるために使用される。
【０００７】
ある特定の具体例において、本発明は、解糖阻害物質、例えば、２−デオキシグルコース、ジ（２−エチルヘキシル）ホスフェート、トリブチルホスフェート、ドデシルホスフェート、（ジフェニルメチル）−リン酸の２−ジメチルアミノエチルエステル、ヨウ化［２−（ジフェニルホスフィニルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウム、ヨードアセテートおよび／またはフルオロアセテートを含有する培地を利用する商業的規模（例えば、５００Ｌ以上）の培養方法を提供する。ある特定の具体例において、開示される培養方法は、細胞培養の過程間、１以上の温度シフトを含んでいてもよい。本明細書の教示によると、かかる方法の使用は、高レベルのタンパク質生産を可能にし、ある種の望ましくない因子（限定するものではないが、乳酸塩を包含する）の蓄積を減少させる。
【０００８】
当業者は、本発明の培地処方が規定および複合培地の両方を包含することを理解するであろう。ある特定の具体例において、培養培地は、培地の組成が既知であり、調節されている規定培地である。
【０００９】
ある特定の具体例において、米国特許出願第１１／２１３，３０８号、第１１／２１３，３１７号および第１１／２１３，６３３号（各々、２００５年８月２５日出願）（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）に記載のいずれかの細胞培養方法にしたがって細胞を生育させる。いくつかの具体例において、米国仮特許出願第６０／８３０，６５８号（２００６年７月１３日出願）（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）に記載の１以上の条件下で細胞を生育させる。
【００１０】
本発明の細胞培養は、所望により、栄養分および／または、例えば、ホルモンおよび／または他の成長因子、イオン（例えば、ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウム、および／またはホスフェート）、バッファー、ビタミン類、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、微量元素（通常、非常に低い最終濃度で存在する無機化合物）、アミノ酸類、脂質、および／またはグルコースまたは他のエネルギー源を包含する他の培地成分で補足してもよい。ある特定の具体例において、１以上の化学インダクタント（inductant）、例えば、ヘキサメチレン−ビス（アセトアミド）（「ＨＭＢＡ」）および酪酸ナトリウム（「ＮａＢ」）で培地を補足することは有益である。これらの任意の補足物は、培養の開始時に加えてもよく、または枯渇した栄養分を補充するために、または別の目的で、もっと後の時点で加えてもよい。一般に、本発明にしたがって、補足を最小限にするための最初の培地組成を選択することが望ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、皿において、２−デオキシグルコースの存在下におけるα−ＧＤＦ−８細胞の細胞成長を示す。
【図２】図２は、２−デオキシグルコースを用いた場合および用いない場合の１Ｌバイオリアクター中におけるα−ＧＤＦ−８細胞の細胞成長を示す。
【図３】図３は、２−デオキシグルコースを用いた場合および用いない場合の１Ｌバイオリアクター中におけるα−ＧＤＦ−８細胞の生存能力を示す。
【図４】図４は、２−デオキシグルコースを用いた場合および用いない場合の１Ｌバイオリアクター中におけるα−ＧＤＦ−８細胞の力価を示す。
【図５】図５は、２−デオキシグルコースを用いた場合および用いない場合の１Ｌバイオリアクター中におけるα−ＧＤＦ−８細胞の乳酸蓄積を示す。
【図６】図６は、２−デオキシグルコースを用いた場合および用いない場合の１Ｌバイオリアクター中におけるα−ＧＤＦ−８細胞の細胞成長を示す。
【図７】図７は、２−デオキシグルコースを用いた場合および用いない場合の１Ｌバイオリアクター中におけるα−ＧＤＦ−８細胞の力価を示す。
【図８】図８は、２−デオキシグルコースを用いた場合および用いない場合の１Ｌバイオリアクター中におけるα−ＧＤＦ−８細胞の乳酸蓄積を示す。
【図９】図９は、２−デオキシグルコースを用いた場合および用いない場合の１Ｌバイオリアクター中におけるα−ＧＤＦ−８細胞のグルコース取り込みを示す。
【図１０】図１０は、２−デオキシグルコースの存在下および不在下におけるα−ＧＤＦ−８細胞の毎日の生存細胞密度を示す。
【図１１】図１１は、２−デオキシグルコースの存在下および不在下におけるα−ＧＤＦ−８細胞の毎日の力価を示す。
【図１２】図１２は、２−デオキシグルコースの存在下および不在下におけるα−ＧＤＦ−８細胞の毎日の乳酸レベルを示す。
【図１３】図１３は、２−デオキシグルコースの存在下および不在下におけるα−ＧＤＦ−８細胞の毎日のグルコースレベルを示す。
【図１４】図１４は、２−デオキシグルコースの存在下および不在下におけるα−ＧＤＦ−８細胞の毎日の比生産性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
定義
「アミノ酸」
「アミノ酸」なる語は、本明細書中で使用される場合、ポリペプチドの生成に通常使用される２０個の天然アミノ酸、該アミノ酸の類似物または誘導体あるいはいずれかの非天然アミノ酸のいずれかをいう。本発明のアミノ酸は、培地中において細胞培養物に提供される。培地中に提供されるアミノ酸は、塩または水和物形態として提供されうる。
【００１３】
本明細書中で使用される場合、「抗体」なる語は、少なくとも１つ、典型的には２つのＶＨドメインまたはその部分、および／または少なくとも１つ、典型的には２つのＶＬドメインまたはその部分を含むタンパク質を包含する。ある特定の具体例において、抗体は、２つの重鎖免疫グロブリンおよび２つの軽鎖免疫グロブリンからなる４量体であり、ここに、該重鎖免疫グロブリンおよび軽鎖免疫グロブリンは、例えば、ジスルフィド結合によって、相互連結されている。抗体、またはその一部は、限定するものではないが、齧歯類、霊長類（例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類）、ラクダを包含するいずれかの起源から得ることができ、同様に、本明細書中により詳細に記載されるように、組み換え生産、例えば、キメラ、ヒト化および／またはイン・ビトロ生産されることができる。
【００１４】
抗体の「抗原結合フラグメント」なる語に含まれる結合フラグメントの例は、限定するものではないが、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる１価のフラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域にてジスルフィド結合によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント、（ｖｉ）ラクダ科の、またはラクダ化された重鎖可変ドメイン（ＶＨＨ）、（ｖｉｉ）単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、（ｖｉｉｉ）二重特異性抗体、および（ｉｘ）Ｆｃ領域に融合した免疫グロブリン分子の１以上のフラグメントを包含する。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、それらは、組み換え法を用いて、ＶＬおよびＶＨ領域が一対になって１価の分子を形成する単一のタンパク質鎖として作成されることを可能にする合成リンカーによって結合することができる（単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる）（例えば、Ｂｉｒｄら、（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−２６、Ｈｕｓｔｏｎら、（１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８５：５８７９−８３）参照）。かかる単一鎖抗体は、また、抗体の「抗原結合フラグメント」なる語に包含されることが意図される。これらのフラグメントは、当業者に既知の通常の技術を用いて得てもよく、該フラグメントは、無傷抗体と同じように機能について評価される。
【００１５】
「抗原結合フラグメント」なる語は、所望により、例えば、安定性、エフェクター細胞機能または補体結合の１以上を強化する部分を包含する。例えば、抗原結合フラグメントは、さらに、ペグ（peg）化された部分、アルブミン、または重鎖および／または軽鎖定常領域を包含することができる。
【００１６】
「二重特異性」または「二重機能性」抗体以外に、抗体は、その結合部位の各々が同一性を有することは理解される。「二重特異性」または「二重機能性」抗体は、２つの異なる重／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの結合を包含する種々の方法によって生産することができる（例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ＆  Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１５４７−１５５３（１９９２）参照）。
【００１７】
抗体またはその抗原結合フラグメントを得るために、当業者に既知の多くの方法が利用可能である。例えば、モノクローナル抗体は、既知の方法にしたがって、ハイブリドーマの作成によって生産してもよい。該方法で形成されたハイブリドーマは、典型的には、標準的な方法、例えば、酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および表面プラズモン共鳴（ＢｉａｃｏｒｅＴＭ（登録商標））分析を用いてスクリーンして、特定の抗原に特異的に結合する抗体を産生する１以上のハイブリドーマを同定する。特定の抗原のいずれかの形態は、免疫原、例えば、組み換え抗原、天然形態、そのいずれかの変種またはフラグメント、ならびにその抗原性ペプチドとして使用してもよい。
【００１８】
抗体を作成する１の例示的方法は、タンパク質発現ライブラリー、例えば、ファージまたはリボソームディスプレーライブラリーをスクリーニングすることを包含する。ファージディスプレーは、例えば、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号、Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５−１３１７、ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９１／１７２７１、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９２／１５６７９、ＷＯ９３／０１２８８、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／０９６９０およびＷＯ９０／０２８０９に記載されている。
【００１９】
ディスプレーライブラリーの使用のほかに、特定の抗原を用いて非ヒト動物、例えば、齧歯類、例えば、マウス、ハムスターまたはラットを免疫化することができる。ある特定の具体例において、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を包含する。例えば、マウス抗体産生に欠陥のあるマウス系統をヒトＩｇ座の大きなフラグメントで操作することができる。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する遺伝子から由来の抗原特異的モノクローナル抗体を生産および選択してもよい。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ（登録商標）、Ｇｒｅｅｎら、（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１、ＵＳ２００３−００７０１８５、ＷＯ９６／３４０９６（１９９６年１０月３１日公開）およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８号（１９９６年４月２９日出願）を参照のこと。
【００２０】
ある特定の具体例において、モノクローナル抗体は、非ヒト動物から得られ、次いで、修飾、例えば、ヒト化、脱免疫化、キメラ化され、当該分野で既知の組み換えＤＮＡ技術を用いて生産されうる。キメラ抗体を作成するための種々のアプローチが記載されている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１，１９８５、Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２，１９８５、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号、Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号、Ｔａｎａｇｕｃｈｉら、欧州特許公開第ＥＰ１７１４９６号、欧州特許公開第０１７３４９４号、英国特許第ＧＢ２１７７０９６Ｂ号を参照のこと。ヒト化抗体は、また、例えば、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現するが、内因性マウス免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現することのできないトランスジェニックマウスを用いて生産してもよい。Ｗｉｎｔｅｒは、本明細書に記載のヒト化抗体を調製するために使用されうるＣＤＲ−グラフィティング法を例示する（米国特許第５，２２５，５３９号）。特定のヒト抗体のＣＤＲの全てを非ヒトＣＤＲの少なくとも一部で置き換えてもよく、またはＣＤＲのいくつかだけを非ヒトＣＤＲで置き換えてもよい。ヒト化抗体の所定の抗原への結合に必要なＣＤＲの数を置き換えさえすればよい。
【００２１】
ヒト化抗体またはそのフラグメントは、抗原結合に直接関与しないＦｖ可変ドメインの配列を、ヒトＦｖ可変ドメイン由来の等価配列で置き換えることによって作成することができる。ヒト化抗体またはそのフラグメントを作成するための例示的方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７、Ｏｉら、（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４、ならびにＵＳ５，５８５，０８９、ＵＳ５，６９３，７６１、ＵＳ５，６９３，７６２、ＵＳ５，８５９，２０５、およびＵＳ６，４０７，２１３によって提供される。かかる方法は、重鎖または軽鎖の少なくとも１つ由来の免疫グロブリンＦｖ可変ドメインの全てまたは一部をコードする核酸配列を単離、操作および発現させることを包含する。かかる核酸は、上記のように、所定の標的に対して抗体を産生するハイブリドーマから、ならびに他の供給源から得てもよい。ヒト化抗体分子をコードしている組み換えＤＮＡは、次いで、適当な発現ベクター中にクローン化することができる。
【００２２】
ある特定の具体例において、ヒト化抗体は、保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖細胞系置換および／または復帰変異の導入によって最適化される。かかる改変された免疫グロブリン分子は、当該分野で既知のいくつかの技術のいずれかによって作成することができ（例えば、Ｔｅｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：７３０８−７３１２，１９８３、Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４：７２７９，１９８３、Ｏｌｓｓｏｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９２：３−１６，１９８２参照）、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０６１９３号またはＥＰ０２３９４００の技術にしたがって作成してもよい。
【００２３】
抗体またはそのフラグメントは、また、ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７に開示される方法によって、ヒトＴ細胞エピトープの特異的欠失または「脱免疫化（deimmunization）」によって修飾してもよい。簡単に言えば、抗体の重鎖および軽鎖可変ドメインは、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドについて分析することができ、これらのペプチドは、潜在的Ｔ−細胞エピトープを示す（ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７に定義される）。潜在的Ｔ−細胞エピトープの検出の場合、「ペプチドスレッディング（threading）」と呼ばれるコンピューターモデリングアプローチを応用することができ、さらに、ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７に記載のように、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースをＶＨおよびＶＬ配列に存在するモチーフについて検索することができる。これらのモチーフは１８個の主要ＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲアロタイプのいずれかに結合し、かくして、潜在的Ｔ細胞エピトープを構成する。検出された潜在的Ｔ−細胞エピトープは、可変ドメイン中の少数のアミノ酸残基を置換することによって、または好ましくは、単一アミノ酸置換によって除去することができる。典型的には、保存的置換を作成する。しばしば、限定するものではないが、ヒト生殖細胞系抗体配列中のある位置に共通するアミノ酸を用いてもよい。ヒト生殖細胞系配列は、例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８、Ｃｏｏｋ，Ｇ．Ｐ．ら、（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  Ｖｏｌ．１６（５）：２３７−２４２、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｄ．ら、（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９−８１７、およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎら、（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：４６２８−４６３８に開示されている。Ｖ  ＢＡＳＥディレクトリーは、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的なディレクトリーを提供する（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ら、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫによって編集）。これらの配列は、ヒト配列の供給源として、例えば、フレームワーク領域およびＣＤＲのためのヒト配列の供給源として、使用することができる。コンセンサスヒトフレームワーク領域は、また、例えば、ＵＳ６，３００，０６４に記載されるように使用することができる。
【００２４】
ある特定の具体例において、抗体は、改変された免疫グロブリン定常またはＦｃ領域を含有することができる。例えば、本明細書中の教示にしたがって生産される抗体は、補体および／またはＦｃ受容体のようなエフェクター分子により強力に、またはより特異的に結合することができ、それは、抗体のいくつかの免疫機能、例えば、エフェクター細胞活性、溶解、補体媒介性活性、抗体クリアランスおよび抗体半減期を調節することができる。抗体（例えば、ＩｇＧ抗体）のＦｃ領域に結合する典型的なＦｃ受容体は、限定するものではないが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎサブクラスの受容体を包含し、それらは、これらの受容体の対立遺伝子変種および選択的スプライス形態を包含する。Ｆｃ受容体は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２，１９９１、Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４，１９９４、およびｄｅ  Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１，１９９５に概説されている。
【００２５】
「バッチ培養」
「バッチ培養」なる語は、本明細書中で使用される場合、細胞を培養する際に最終的に使用される全ての成分（培地（下記の「培地」を参照のこと）および細胞自体を包含する）が培養プロセスの開始時に提供される細胞培養方法をいう。バッチ培養は、典型的には、ある時点で止められ、培地中の細胞および／または成分を回収し、所望により精製する。
【００２６】
「バイオリアクター」
「バイオリアクター」なる語は、本明細書中で使用される場合、細胞培養物の生育に有用ないずれかの容器をいう。バイオリアクターは、細胞の培養に有用であるかぎり、いずれのサイズであってもよい。典型的には、バイオリアクターは、少なくとも１リットルであり、１０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、８，０００、１０，０００、１２，０００リットル以上、または中間のいずれの容量であってもよい。バイオリアクターの内部条件は、限定するものではないが、ｐＨおよび温度を包含するが、所望により、培養期間中に調節される。バイオリアクターは、本発明の培養条件下で培地中、細胞培養物を懸濁されたまま保持するのに適当ないずれかの材料（ガラス、プラスチックまたは金属を包含する）で構成されることができる。「生産バイオリアクター」なる語は、本明細書中で使用される場合、目的のポリペプチドまたはタンパク質の生産に使用される最終的なバイオリアクターをいう。生産バイオリアクターの容量は、典型的に、少なくとも５００リットルであり、１，０００、２，５００、５，０００、８，０００、１０，０００、１２，０００リットル以上、またはその中間のいずれの容量であってもよい。当業者は、本発明の実施に有用な適当なバイオリアクターを承知し、選択することができるであろう。
【００２７】
「細胞密度」
「細胞密度」なる語は、本明細書中で使用される場合、所定の培地容量に存在する細胞の数をいう。
【００２８】
「細胞生存力」
「細胞生存力」なる語は、本明細書中で使用される場合、培養条件または実験バリエーションの所定の設定下、培養中の細胞の生存能をいう。該用語は、本明細書中で使用される場合、特定の時点で、培養中の全細胞数（生きている細胞および死んでいる細胞）に関連して、その時点で生きている細胞の部分をいう。
【００２９】
「複合培地」
「複合培地」なる語は、本明細書中で使用される場合、その正体または量が未知であるか、または制御されていない少なくとも１つの成分を含有する培地をいう。
【００３０】
「培養物」「細胞培養物」
これらの用語は、本明細書中で使用される場合、細胞集団の生存および／または生育に適当な条件下、培地（下記の「培地」の定義を参照のこと）中に懸濁された細胞集団をいう。当業者に明らかなように、これらの用語は、また、本明細書中で使用される場合、細胞集団をおよび細胞集団が懸濁された培地を含む組み合わせをいう。ある特定の具体例において、細胞培養物は哺乳動物細胞培養物である。
【００３１】
「規定培地」
「規定培地」なる語は、本明細書中で使用される場合、培地の組成が既知であり、かつ、制御されている培地をいう。
【００３２】
「フェッドバッチ培養」
「フェッドバッチ培養」なる語は、本明細書中で使用される場合、培養プロセスの開始時または開始に続いて、付加的な成分が培養物に提供される細胞培養方法をいう。提供される成分は、典型的には、培養プロセスの間に枯渇した細胞のための栄養補給物を含む。さらに、または別法では、付加的な成分は、補足成分（下記の「補足成分」の定義を参照のこと）を包含しうる。ある特定の具体例において、付加的な成分は、フィード培地（下記の「フィード培地」の定義を参照のこと）中に提供されうる。フェッドバッチ培養は、典型的には、ある時点で終了し、培地中の細胞および／または成分は、回収され、所望により、精製される。
【００３３】
「フィード培地」
「フィード培地」なる語は、本明細書中で使用される場合、細胞培養の開始後に加えられる生育する哺乳動物細胞を養う栄養分を含有する溶液をいう。フィード培地は、最初の細胞培養培地中に提供されるのと同一の成分を含有しうる。別法では、フィード培地は、最初の細胞培養培地中に提供された成分を超える１以上の付加的な成分を含有していてもよい。さらに、または別法では、フィード培地は、最初の細胞培養培地中に提供された１以上の成分を欠くものであってもよい。ある特定の具体例において、フィード培地の１以上の成分は、最初の細胞培養培地中に提供された成分の濃度またはレベルと同一または類似の濃度またはレベルで提供される。ある特定の具体例において、フィード培地の１以上の成分は、最初の細胞培養培地中に提供された成分の濃度またはレベルと異なる濃度またはレベルで提供される。ある特定の具体例において、フィード培地は、補足成分（下記の「補足成分」の定義を参照のこと）を含有する。
【００３４】
「フラグメント」
「フラグメント」なる語は、本明細書中で使用される場合、ポリペプチドをいい、所定のポリペプチドに特有の、または特徴的な該ポリペプチドのいずれかの分離した部分として定義される。該用語は、本明細書中で使用される場合、また、少なくとも全長ポリペプチドのうち画分を保持する所定のポリペプチドのいずれかの分離した部分をいう。ある特定の具体例において、保持された活性画分は、該全長ポリペプチドの活性の少なくとも１０％である。ある特定の具体例において、保持された活性画分は、該全長ポリペプチドの活性の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％である。ある特定の具体例において、保持された活性画分は、該全長ポリペプチドの活性の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。ある特定の具体例において、保持された活性画分は、該全長ポリペプチドの活性の１００％以上である。別法では、またはさらに、該用語は、本明細書中で使用される場合、全長ポリペプチドに見出される少なくとも確立された配列エレメントを含む所定のポリペプチドのいずれかの部分をいう。ある具体例において、該配列エレメントは、全長ポリペプチドの少なくとも約４−５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以上のアミノ酸にわたる。
【００３５】
「遺伝子」
「遺伝子」なる語は、本明細書中で使用される場合、少なくともある部分が分離した最終産物、典型的には、限定するものではないが、ポリペプチドをコードするいずれかのヌクレオチド配列、ＤＮＡまたはＲＮＡをいう。所望により、該用語は、ポリペプチドまたは他の分離した最終産物をコードするコーディング配列のみをいうのではなく、基底レベルの発現を調節するコーディング配列の前および／または後の領域（下記の「遺伝子調節エレメント」の定義を参照のこと）、ならびに個々のコーディングセグメント（「エクソン」）間の介在配列（「イントロン」）を包含することもある。
【００３６】
「遺伝子調節エレメント」
「遺伝子調節エレメント」なる語は、本明細書中で使用される場合、作動可能に連結した遺伝子の産物の発現を調節するいずれかの配列エレメントをいう。遺伝子調節エレメントは、遺伝子産物の発現レベルを増加または減少させることによって機能してもよく、コーディング配列の前、中または後ろに位置していてもよい。遺伝子調節エレメントは、例えば、転写の開始、延長または終止、ｍＲＮＡスプライシング、ｍＲＮＡエディティング、ｍＲＮＡ安定性、細胞内でのｍＲＮＡ局在化、翻訳の開始、延長または終止、あるいは遺伝子発現のいずれか他の段階を調節することによって、遺伝子発現のいずれかの段階で作用しうる。遺伝子調節エレメントは、個々にまたは互いに共同して機能しうる。
【００３７】
「解糖」
「解糖」なる語は、本明細書中で使用される場合、細胞によるグルコースの代謝的酸化をいう。解糖の間、グルコースは、乳酸塩またはピルビン酸塩のいずれかに酸化する。好気性条件下、主要産物はピルビン酸塩である。酸素が枯渇した時、主要な解糖産物は乳酸塩である。本発明のある種の目的は、解糖の通常プロセスを改変することによって、細胞培養中の乳酸産生または蓄積を防止または遅くすることにある。ある特定の具体例において、乳酸産生または蓄積は、解糖阻害物質、例えば、２−デオキシグルコース、ジ（２−エチルヘキシル）ホスフェート、トリブチルホスフェート、ドデシルホスフェート、（ジフェニルメチル）−リン酸の２−ジメチルアミノエチルエステル、ヨウ化［２−（ジフェニルホスフィニルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウム、ヨードアセテート、および／またはフルオロアセテートを含む細胞培養物中で細胞を生育させることによって、防止または遅くされる。
【００３８】
「解糖阻害物質」
「解糖阻害物質」なる語は、本明細書中で使用される場合、グルコースの解糖およびそれに続く乳酸産生または蓄積を阻害する、あるいはネガティブに改変する物質（例えば、化合物、ポリペプチド、薬物、代謝産物など）をいう。ある特定の具体例において、かかる解糖阻害物質は、細胞培養培地中に提供される。ある特定の具体例において、解糖阻害物質は、２−デオキシグルコースである。ある特定の具体例において、解糖阻害物質は、ジ（２−エチルヘキシル）ホスフェート、トリブチルホスフェート、ドデシルホスフェート、（ジフェニルメチル）−リン酸の２−ジメチルアミノエチルエステル、ヨウ化［２−（ジフェニルホスフィニルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウム、ヨードアセテートおよび／またはフルオロアセテートである。当業者は、過度の実験をすることなく、本発明の方法および組成物にしたがって用いられうる解糖阻害物質を認識または決定することができるであろう。
【００３９】
「宿主細胞」
「宿主細胞」なる語は、本明細書中で使用される場合、目的のタンパク質またはポリペプチドを生産するために、本発明にしたがって培養において生育される細胞をいう。ある特定の具体例において、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。
【００４０】
「ハイブリドーマ」
「ハイブリドーマ」なる語は、本明細書中で使用される場合、不死化細胞および抗体産生細胞の融合から生じる細胞または細胞の子孫をいう。得られるハイブリドーマは、抗体を産生する不死化細胞である。ハイブリドーマを作成するために使用される個々の細胞は、いずれかの哺乳動物起源に由来することができ、限定するものではないが、ラット、ブタ、ウサギ、ヒツジ、ヤギおよびヒトを包含する。該用語は、トリオーマ細胞系統を包含し、それは、ヘテロハイブリッドメラノーマ融合物の子孫（ヒト細胞とネズミメラノーマ細胞系統との間の融合産物）が次いでプラズマ細胞と融合する時に生じる。さらに、該用語は、抗体を産生するいずれかの不死化ハイブリッド細胞系統、例えば、クアドローマを包含することを意味する（例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ，５３７：３０５３，１９８３参照）。
【００４１】
「積分生存細胞密度」、「ＩＶＣＤ」
「積分生存細胞密度」または「ＩＶＣＤ」なる語は、本明細書中で使用される場合、培養が実行される時間量を乗じた培養過程にわたる生存細胞の平均密度をいう。産生したポリペプチドおよび／またはタンパク質の量が培養過程にわたって存在する生存細胞数に比例する場合、積分生存細胞密度は、培養過程にわたって産生したポリペプチドおよび／またはタンパク質の量を概算する有用なツールである。
【００４２】
「培地」、「細胞培養培地」、「培養培地」
これらの用語は、本明細書中で使用される場合、生育している細胞を養う栄養分を含有する溶液をいう。ある特定の具体例において、培養培地は、哺乳動物細胞を生育するために有用である。典型的には、培養培地は、最小限の生育および／または生存のために細胞によって要求される必須および非必須アミノ酸、ビタミン類、エネルギー源、脂質、および微量元素を提供する。培養培地は、また、生育および／または生存を最少速度以上に促進する補足成分（下記の「補足成分」の定義を参照のこと）を含有していてもよく、限定するものではないが、ホルモンおよび／または他の成長因子、特定のイオン（例えば、ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウム、およびホスフェート）、バッファー、ビタミン類、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、微量元素（通常、非常に低い最終濃度で存在する無機化合物）、アミノ酸、脂質、および／またはグルコースまたは他のエネルギー源を包含する。ある特定の具体例において、培地は、有利には、細胞生存および増殖に最適なｐＨおよび塩濃度に処方される。ある特定の具体例において、培地は、細胞培養の開始後に加えられるフィード培地である（上記の「フィード培地」の定義を参照のこと）。ある特定の具体例において、細胞培養培地は、開始時の栄養溶液および細胞培養開始後に加えられるいずれかのフィード培地の混合物である。
【００４３】
「代謝廃棄産物」
「代謝廃棄産物」なる語は、本明細書中で使用される場合、特に、所望の組み換えポリペプチドまたはタンパク質の発現または活性に関連して、同様に細胞培養に不利益な正常または非正常代謝過程の結果として、細胞培養物によって生産された化合物をいう。例えば、代謝廃棄産物は、細胞培養物の生育または生存に不利益であり、産生される組み換えポリペプチドまたはタンパク質の量を減らし、発現されるポリペプチドまたはタンパク質の折り畳み、安定性、グリコシル化または他の翻訳後修飾を改変し、または他のあらゆる方法で、細胞および／または組み換えポリペプチドまたはタンパク質の発現または活性に不利益でありうる。例示的な代謝廃棄産物は、グルコース代謝の結果として生じる乳酸塩、およびグルタミン代謝の結果として生じるアンモニウムを包含する。細胞培養物は、１以上の代謝廃棄産物を生じうる。本発明の１の目標は、細胞培養物において、代謝廃棄産物の産生を遅らせ、減少させ、または除去することである。
【００４４】
「ポリペプチド」
「ポリペプチド」なる語は、本明細書中で使用される場合、ペプチド結合を介してアミノ酸が連結してなる連続した鎖をいう。該用語は、いずれかの長さのアミノ酸鎖を示すために使用されるが、当業者は、該用語が長い鎖に限定されず、ペプチド結合を介して連結した２個のアミノ酸を含む最短の鎖を示すことができることを理解するであろう。当業者に既知であるように、ポリペプチドは、加工および／または修飾されていてもよい。例えば、ポリペプチドは、グリコシル化されていてもよい。本発明にしたがって発現されるべきポリペプチドは、ポリペプチド治療剤であることができる。ポリペプチド治療剤は、体内の領域に対して生物学的影響を有するポリペプチドであって、該領域において作用するか、または中間体を介して間接的に該領域に作用する。ポリペプチド治療剤の例は、下記に詳細に論じる。
【００４５】
「タンパク質」
「タンパク質」なる語は、本明細書中で使用される場合、分離した単位として機能する１以上のポリペプチドをいう。単一のポリペプチドが分離した機能性単位であり、分離した機能性単位を形成するために他のポリペプチドと永続的または一時的な物理的結合を要求しない場合、「ポリペプチド」および「タンパク質」なる語は、交換可能に使用されうる。分離した機能性単位が互いに物理的に結合する複数のポリペプチドから構成される場合、「タンパク質」なる語は、本明細書中で使用される場合、物理的にカップリングし、分離した単位として一緒に機能する複数のポリペプチドをいう。本発明にしたがって発現されるべきタンパク質は、タンパク質治療剤であることができる。タンパク質治療剤は、体内の領域に対して生物学的影響を有するポリペプチドであって、該領域において作用するか、または中間体を介して間接的に該領域に作用する。ポリペプチド治療剤の例は、下記に詳細に論じる。
【００４６】
「組み換え発現したポリペプチド」および「組み換えポリペプチド」
これらの用語は、本明細書中で使用される場合、人工的にそのポリペプチドが発現するように操作された宿主細胞から発現したポリペプチドをいう。ある特定の具体例において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。ある特定の具体例において、該操作は、１以上の遺伝子修飾を含んでいてもよい。例えば、宿主細胞は、発現されるべきポリペプチドをコードしている１以上の異種遺伝子の導入によって遺伝子修飾されうる。異種組み換え発現ポリペプチドは、宿主細胞において通常発現されるポリペプチドと同一または類似であることができる。異種組み換え発現ポリペプチドは、また、宿主細胞にとって外来物であることができ、例えば、宿主細胞において通常発現されるポリペプチドにとって異種であることができる。ある特定の具体例において、異種組み換え発現ポリペプチドは、キメラである。例えば、ポリペプチドの部分は、宿主細胞において通常発現されるポリペプチドと同一または類似であるアミノ酸配列を含有していてもよいが、他の部分は、宿主細胞にとって外来であるアミノ酸配列を含有する。さらに、または別法では、ポリペプチドは、宿主細胞に通常発現される２以上の異なるポリペプチド由来のアミノ酸配列を含有しうる。さらに、ポリペプチドは、宿主細胞にとって外来である２以上のポリペプチドから由来するアミノ酸配列を含有しうる。いくつかの具体例において、宿主細胞は、１以上の内在性遺伝子の活性化またはアップレギュレーションによって遺伝子修飾される。
【００４７】
「補足成分」
「補足成分」なる語は、本明細書中で使用される場合、生育および／または生存を最少速度以上に促進する補足成分をいい、限定するものではないが、ホルモンおよび／または他の成長因子、特定のイオン（例えば、ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウム、およびホスフェート）、バッファー、ビタミン類、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、微量元素（通常、非常に低い最終濃度で存在する無機化合物）、アミノ酸、脂質、および／またはグルコースまたは他のエネルギー源を包含する。ある特定の具体例において、補足成分は、最初の細胞培養物に加えられる。ある特定の具体例において、補足成分は、細胞培養の開始後に加えられる。
【００４８】
「力価」
「力価」なる語は、本明細書中で使用される場合、所定量の培地容量中における、細胞培養物によって生産される組み換え発現したポリペプチドまたはタンパク質の総量をいう。力価は、典型的には、１ミリリットルの培地あたりのポリペプチドまたはタンパク質のミリグラムまたはマイクログラムの単位で表される。
【００４９】
ある特定の具体例の詳細な説明
本発明は、細胞培養によるタンパク質および／またはポリペプチドの生産のための改善された方法および培地処方を提供する。ある特定の具体例において、本発明は、細胞培養物中における代謝廃棄産物の産生を最小限にする方法を提供する。ある特定の具体例において、本発明は、代謝廃棄産物である乳酸塩の産生を最小限にする方法を提供する。乳酸塩は、細胞成長、生存力、および／またはタンパク質産生または質に不利益であることが示された。以前の研究では、培養期間中、グルコースレベルを低く維持することによって、細胞培養中の乳酸レベルが低いまま維持されうることが明らかにされた（Ｃｒｕｚら、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｓｈｉｆｔｓ  ｂｙ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ＢＨＫ  Ｃｅｌｌｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，６６（２）：１０４−１３，１９９９）。しかしながら、グルコースレベルの連続的モニタリングおよび調整は、タンパク質またはポリペプチドの大規模生産にとって実用できではない。本発明は、培養物のグルコースレベルを連続的にモニターし、調整する必要性を回避する細胞培養によるタンパク質および／またはポリペプチドの生産のための改善された方法および培地処方を提供する。ある特定の具体例において、細胞培養は、バッチまたはフェッドバッチ培養である。
【００５０】
本発明のある特定の組成物は、解糖阻害物質を含む細胞培養培地を包含する。ある特定の具体例において、かかる解糖阻害物質は、２−デオキシグルコース、ジ（２−エチルヘキシル）ホスフェート、トリブチルホスフェート、ドデシルホスフェート、（ジフェニルメチル）−リン酸の２−ジメチルアミノエチルエステル、ヨウ化［２−（ジフェニルホスフィニルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウム、ヨードアセテートおよび／またはフルオロアセテートを包含する。いくつかの具体例によると、培養物の代謝廃棄産物のレベルは、かかる解糖阻害物質を欠くことを除いて同一の培地中、同一の条件下で生産される代謝廃棄産物のレベルよりも低い。いくつかの具体例によると、培養物の乳酸レベルは、かかる解糖阻害物質を欠くことを除いて同一の培地中、同一の条件下で生産される乳酸レベルよりも低い。
【００５１】
本発明の他の具体例を下記に詳細に論じる。しかしながら、当業者は、これらの具体例に対する種々の修飾が本願請求の範囲の範囲内にあることを理解するであろう。特許請求の範囲およびその等価物は本発明の範囲を定義付けるが、本願発明は、特定の具体例の記載に限定されるべきではなく、該記載によって限定されるものではない。
【００５２】
細胞
細胞培養が可能で、かつ、タンパク質またはポリペプチドの発現が可能ないずれの宿主細胞を本発明にしたがって利用してもよい。ある特定の具体例において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。本発明にしたがって使用されうる哺乳動物細胞の非限定的な例は、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫系統（ＮＳＯ／ｌ，ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ：８５１１０５０３）、ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６（ＣｒｕＣｅｌｌ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））、ＳＶ４０で形質転換したサル腎臓ＣＶ１系統（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ヒト胚腎臓系統（２９３細胞または懸濁培養中の生育のためにサブクローン化した２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１（１９８０））、サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１  ５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４−６８（１９８２））、ＭＲＣ  ５細胞、ＦＳ４細胞、およびヒトヘパトーマ系統（ＨｅｐＧ２）を包含する。
【００５３】
さらに、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する多数の市販および非市販のハイブリドーマ細胞系統を本発明にしたがって利用してもよい。当業者は、ハイブリドーマ細胞系統が異なる栄養要求性を有するかもしれないこと、および／または最適な生育およびポリペプチドまたはタンパク質発現のために異なる培養条件を必要とするかもしれないことを理解し、必要に応じて、条件を修飾することができるであろう。
【００５４】
上記のように、多くの例において、高レベルの目的のタンパク質またはポリペプチドを産生するように、細胞を選択または操作する。しばしば、細胞は、例えば、目的のタンパク質またはポリペプチドをコードしている遺伝子の導入によって、および／または目的のポリペプチドまたはタンパク質をコードしている遺伝子（内在性または導入のいずれか）の発現を調節する調節エレメントの導入によって、高レベルのタンパク質を産生するように操作される。
【００５５】
ある特定のポリペプチドは、細胞成長、細胞生存力または何らかの方法で目的のポリペプチドまたはタンパク質の産生を最終的に制限する細胞の何らかの他の特徴に対して不利益な効果を有しうる。特定のポリペプチドを発現するように操作された１の特定の型の細胞の集団のなかでさえ、ある種の個々の細胞がよく生育し、および／または目的のポリペプチドをより多く生産するような細胞集団内のばらつきが存在しうる。ある特定の具体例において、細胞系統は、細胞を培養するために選択される特定の条件下での力強い生育のために、実行者によって経験的に選択される。ある特定の具体例において、特定のポリペプチドを発現するように操作された個々の細胞は、細胞生育、最終的な細胞密度、細胞生存能力パーセント、発現したポリペプチドの力価またはこれらのいずれかの組み合わせ、または実行者が重要であると考えるいずれか他の条件に基づいて、大規模生産のために選択される。
【００５６】
細胞の培養
本発明は、ポリペプチドの発現が可能ないいずれかの細胞培養方法または系と共に用いてもよい。例えば、細胞は、バッチまたはフェッドバッチ培養において生育させてもよく、ここに、ポリペプチドの十分な発現後に培養を終了し、その後、発現したポリペプチドを回収し、所望により精製する。別法では、細胞は、潅流培養において生育させてもよく、ここに、培養を終了せず、新たな栄養分および他の成分を周期的または連続的に培養物に加え、その間、発現したポリペプチドは、周期的または連続的に回収される。
【００５７】
細胞は、実行者によって選択されたいずれかの好都合な容量で生育させればよい。例えば、細胞は、２、３ミリリットル〜数リットルの範囲の容量の小規模反応容器内で生育させてもよい。別法では、細胞は、最小で約１リットル〜１０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、８，０００、１０，０００、１２，０００リットルまたはそれ以上、あるいはその間のいずれかの容量の市販のバイオリアクター中で大規模に生育させてもよい。
【００５８】
細胞培養の温度は、主に、細胞培養物が生存することができる温度範囲、高レベルのポリペプチドが産生する温度範囲、代謝廃棄産物の産生または蓄積が最小限になる温度範囲、および／またはこれらのいずれかの組み合わせ、または実行者が重要であると考えるいずれか他の条件に基づいて選択されるであろう。非限定的な一例として、ＣＨＯ細胞は、約３７℃でよく生育し、高レベルのタンパク質またはポリペプチドを生産する。一般に、ほとんどの哺乳動物細胞は、約２５℃〜４２℃でよく生育し、および／または高レベルのタンパク質またはポリペプチドを産生することができるが、本発明の開示によって教示される方法は、これらの温度に限定されない。ある特定の哺乳動物細胞は、約３５℃〜４０℃でよく生育し、および／または高レベルのタンパク質またはポリペプチドを生産することができる。ある特定の具体例において、細胞培養は、細胞培養過程中の１以上の時点で、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、または４５℃で生育する。当業者は、細胞の必要性および実行者の生産要求に依存して、細胞を生育させるための適当な温度を選択することができるであろう。
【００５９】
さらに、培養は、培養過程の間に１以上の温度シフトに付してもよい。培養温度がシフトする場合、温度シフトは、比較的漸進的であってもよい。例えば、温度変化が完了するまで数時間または数日かかってもよい。別法では、温度シフトは、比較的急速であってもよい。温度は、培養過程の間に絶え間なく増加または減少していてもよい。別法では、温度は、培養過程の間の種々の時点で分離した量が増加または減少してもよい。その後の温度または温度範囲は、最初または以前の温度または温度範囲より低くてもよく、または高くてもよい。当業者は、複数の分離した温度シフトがこれらの具体例に包含されることを理解するであろう。例えば、温度が一旦シフトすれば（高温または低温または温度範囲のいずれか）、ある一定期間、細胞を該温度または温度範囲で維持し、その後、温度を再び新たな温度または温度範囲にシフトしてもよく、その温度は、以前の温度または温度範囲より高温であっても、低温であってもよい。各分離したシフト後の培養物の温度は一定であるか、またはある一定の温度範囲内で維持されてもよい。
【００６０】
温度範囲の最初の温度と同様に、温度シフト後の細胞培養物の温度または温度範囲は、細胞培養物が生存することができる温度波に、高レベルのポリペプチドが産生する温度範囲、代謝廃棄産物の産生または蓄積が最小限になる温度範囲、および／またはこれらのいずれかの組み合わせ、または実行者が重要であると考えるいずれか他の条件に基づいて選択されるであろう。一般に、ほとんどの哺乳動物細胞は、約２５℃〜４２℃で生存可能であり、高レベルのタンパク質またはポリペプチドを生産することができるが、本発明の開示によって教示される方法は、これらの温度に限定されない。ある特定の具体例において、哺乳動物細胞は、約２５℃〜３５℃で生存可能であり、高レベルのタンパク質またはポリペプチドを生産することができる。ある特定の具体例において、細胞培養物は、温度シフト後に１回以上、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、または４５℃で生育させる。当業者は、細胞の特定の必要性および実行者の特定の生産要求に依存して、温度シフト後に細胞を生育させるための適当な温度を選択することができるであろう。細胞は、実行者の要求および細胞自体の要求に依存して、いずれかの期間生育させればよい。
【００６１】
ある特定の具体例において、バッチおよびフェッドバッチ反応は、発現したポリペプチドが実行者の要求によって決定される十分に高い力価に達したらすぐに終止させる。非限定的例として、細胞培養は、ポリペプチド力価が１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、２０００ｍｇ／Ｌまたはそれ以上のときに終止させてもよい。当業者は、バッチおよび／またはフェッドバッチ培養物を回収してもよい１以上の適当な力価を選択できるであろう。さらに、または別法では、バッチおよびフェッドバッチ反応は、細胞が実行者の要求によって決定される十分に高い密度に達したらすぐに終了させる。例えば、培養は、細胞が最大生存細胞密度の１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９パーセントに達したらすぐに終了してもよい。
【００６２】
ある特定の具体例において、乳酸塩およびアンモニウムなどの代謝廃棄産物の望ましくない産生または蓄積を防止するために、バッチおよび／またはフェッドバッチ細胞培養を終了させる。ある特定の具体例において、細胞培養は、乳酸塩が培養物中に望ましくないレベルまで蓄積する前に終了させる。非限定的例として、細胞培養は、乳酸塩が８、７、６、５、４、３、２または１ｇ／Ｌに達する前に終了してもよい。ある特定の具体例において、本発明の方法および組成物にしたがって生育させた細胞培養物は、代謝廃棄産物の産生または蓄積が最小限になるので、伝統的な培養法を用いて可能になるよりも長時間生育させることができる。
【００６３】
ある特定の具体例において、バッチおよびフェッドバッチ反応は、実行者の要求によって決定される十分に高いレベルに細胞密度が達したらすぐに終了させる。例えば、細胞培養は、細胞密度が１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００または１２００万細胞／ｍＬまたはその以上に達したらすぐに終了させてもよい。ある特定の具体例において、バッチおよびフェッドバッチ反応は、細胞密度が１００万細胞／ｍＬに達する前に終了させる。ある特定の具体例において、本発明の方法および組成にしたがって生育させる細胞培養物は、伝統的な培養方法を用いて可能になるよりも高い細胞密度まで生育させることができる。
【００６４】
ある特定の場合、細胞培養物に、その後の産生段階中に、細胞によって枯渇または代謝された栄養分または他の培地成分を補足することが有益または必要な場合がある。非限定的な例として、細胞培養物にホルモンおよび／または他の成長因子、特定のイオン（例えば、ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウム、およびホスフェート）、バッファー、ビタミン類、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、微量元素（通常、非常に低い最終濃度で存在する無機化合物）、アミノ酸、脂質、またはグルコースまたは他のエネルギー源を補足することが有益または必要な場合がある。これらの補足成分は、全てを細胞培養物に一度に加えてもよく、または一連の添加で細胞培養物に提供してもよい。
【００６５】
ある特定の具体例において、細胞は、米国特許出願第１１／２１３，３０８号、第１１／２１３，３１７号および第１１／２１３，６３３号（各々、２００５年８月２５日に出願）（出典明示により、全体として、本明細書の一部とされる）に記載の細胞培養方法のいずれかにしたがって生育させる。例えば、ある特定の具体例において、細胞は、累積アミノ酸濃度が約７０ｍＭを超える培養培地中で生育させてもよい。ある特定の具体例において、細胞は、累積グルタミン 対 累積アスパラギンモル比が約２未満である培養培地中で生育させてもよい。ある特定の具体例において、細胞は、累積グルタミン 対 累積総アミノ酸モル比が約０．２未満である培養培地中で生育させてもよい。ある特定の具体例において、細胞は、累積無機イオン 対 累積総アミノ酸モル比が約０．４〜１である培養培地中で生育させてもよい。ある特定の具体例において、細胞は、累積グルタミンおよび累積アルパラギンの合わせた濃度が約１６〜３６ｍＭである培養培地中で生育させてもよい。ある特定の具体例において、細胞は、２、３、４または５個全ての上記培地条件を含む培養培地中で生育させてもよい。
【００６６】
いくつかの具体例において、細胞は、米国仮出願第６０／８３０，６５８号（２００６年７月１３日出願）（出典明示により全体として本明細書の一部とされる）に記載の１以上の条件下で生育させる。例えば、いくつかの具体例において、細胞は、約１０〜６００ｎＭの濃度でマンガンを含有する培養培地中で生育させる。いくつかの具体例において、細胞は、約２０〜１００ｎＭの濃度でマンガンを含有する培養培地中で生育させる。いくつかの具体例において、細胞は、約４０ｎＭの濃度でマンガンを含有する培地中で生育させる。
【００６７】
当業者は、限定するものではないが、生育速度、細胞生存力、細胞培養物の最終細胞密度、乳酸塩およびアンモニウムなどの不利益な代謝副産物の最終濃度、発現したポリペプチドの最終的な力価、またはこれらのいずれかの組み合わせ、または実行者が重要であると考える他の条件を包含する細胞培養物のある種の特性を最適化するために、特定の細胞培養条件を調整することができるであろう。
【００６８】
培地組成物
幅広い種類の生育培地のうちいずれも、本願発明に使用されうる。ある特定の具体例において、細胞は、種々の化学的に規定された培地のいずれかにおいて生育され、ここに、該培地成分は、既知であり、かつ、調節されている。ある特定の具体例において、細胞は、種々の複合培地中で生育され、ここに、該培地成分の全てが既知であるわけではなく、および／または調節されているわけではない。
【００６９】
哺乳動物細胞培養用化学規定生育培地を包含する細胞培養のための化学的に規定された生育培地は、この数年にわたって幅広く開発され、発表されている。規定培地の全成分は、よく特徴付けられており、そのように規定された培地は、血清または加水分解物などの複合添加物を含有しない。初期の培地処方は、細胞成長および生存力の維持を可能にするために開発され、タンパク質産生にはほとんど、または全く配慮していなかった。より近年になって、培地処方は、組み換えタンパク質および／またはポリペプチドを生産するより生産性の高い細胞培養物を支持するという明確な目的で開発された。
【００７０】
規定培地は、典型的には、水中における既知濃度で約５０種の化学物質からなる。ほとんどの規定培地は、１以上のよく特徴付けられたタンパク質、例えば、インシュリン、ＩＧＦ−１、トランスフェリンまたはＢＳＡも含有するが、他は、タンパク質成分を必要とせず、故に、タンパク質不含規定培地と呼ばれる。規定培地の化学成分は、一般に、５つの幅広いカテゴリー、すなわち、アミノ酸類、ビタミン類、無機塩類、微量元素、および明確な類別化を無視するその他雑多なカテゴリーに分類される。
【００７１】
規定または複合の全ての培地は、生育している細胞のためのエネルギー源を含む。しばしば、エネルギー源は、グルコース、化学式Ｃ６Ｈ１２Ｏ６を有する単純な単糖類である。Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最少必須培地（［ＭＥＭ］，Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（［ＤＭＥＭ］，Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地を包含する伝統的な培地処方は、比較的高レベルのグルコースを含有していた。グルコースは、細胞の主な代謝エネルギー源であるので、伝統的には大量に必要とされると考えられていた。しかしながら、グルコースの迅速な消費は、乳酸塩の蓄積を導く。乳酸塩は、不利益な代謝廃棄産物であり、細胞培養における細胞成長および生産性の既知の阻害剤である（Ｇｏｒｆｉｅｎら、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，  Ｂｉｏｐｈａｒｍ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ａｐｒｉｌ  ２００３；Ｌａｏ  ａｎｄ  Ｔｏｔｈ，Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ａｎｄ  ｌａｃｔａｔｅ  ｏｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｐｒｏｇ．１３（５）：６８８−６９１，１９９７参照）。
【００７２】
本発明は、ある特定の細胞培養法および培地処方が培養における代謝廃棄産物、例えば、乳酸塩の蓄積を最小限にし、逆転さえするという知見を包含する。Ｒｏｔｈらは、２−デオキシグルコースをラットに与えた場合、全食物摂取量を減らすことなくグルコース／エネルギーの流れを減少させることを明らかにした（Ｃａｌｏｒｉｃ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｒｉｍａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎｓ，  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ９２８：３０５−１５，  ２００１）。２−デオキシグルコースは、糖の２位のヒドロキシル基が水素原子で置き換わっているグルコースの構造類似体である。該開示は、限定するものではないが、２−デオキシグルコースを包含する解糖阻害物質を含有する培地処方が細胞培養において細胞を生育させるために使用される場合、乳酸塩を包含する代謝廃棄産物の蓄積の減少をもたらすことを明らかにする。特定の理論に縛られることは望ましくないが、かかる解糖阻害物質を開始培地中に提供することによって、何らかの方法で解糖が遅くなるか、または改変され、かくして、培養物中の乳酸蓄積の遅延または防止が可能である。かかる解糖阻害物質を含有する本発明の培地処方は、また、細胞成長および／または生存力に有益な影響を与え、その結果、より高い全ＩＶＣＤをもたらす。
【００７３】
ある特定の具体例において、本発明にしたがって使用されるべき解糖阻害物質は、２−デオキシグルコースを含む。ある特定の具体例において、２−デオキシグルコースは、１リットルあたり、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０グラムまたはそれ以上の濃度で提供される。ある特定の具体例において、細胞培養中における２−デオキシグルコースのグルコースに対する比率は、１／５０、１／４５、１／４０、１／３９、１／３８、１／３７、１／３６、１／３５、１／３４、１／３３、１／３２、１／３１、１／３０、１／２９、１／２８、１／２７、１／２６、１／２５、１／２４、１／２３、１／２２、１／２１、１／２０、１／１９、１／１８、１／１７、１／１６、１／１５、１／１４、１／１３、１／１２、１／１１、１／１０、１／９、１／８、１／７、１／６、１／５、１／４、１／３、１／２、１／１またはそれ以上またはそれ以下のいずれかの比率である。当業者は、細胞培養培地中における２−デオキシグルコースの上記の濃度および比率がバッチ培養、フェッドバッチ培養、または潅流培養を用いて達成されうることを理解するであろう。
【００７４】
本発明は、また、グルタミン濃度が制限される培地処方を包含する。ある特定の具体例において、細胞培養培地中のグルタミンの濃度は、約１３ｍＭ未満に制限される。ある特定の具体例において、細胞培養培地中のグルタミン濃度は、約４ｍＭ未満に制限される。
【００７５】
代謝廃棄産物（例えば、乳酸塩）は、細胞が培養中で生育するにつれて経時的に蓄積する。上記のように、本明細書に記載の教示にしたがって生育された細胞培養物は、より高温での開始生育段階後、より低温に温度シフトしてもよい。グルタミン濃度が制限される開始培地を用いたときの興味深く有益な結果は、細胞培養物が低温にシフトするときに乳酸レベルの増加が止まり、実際、減少し始めることである（例えば、実施例３および４参照）。特定の理論に縛られることは望ましくないが、本発明によって教示されるような低グルタミン条件下で生育された細胞は、実際に、乳酸を消費および／または処理し始めうる。
【００７６】
本明細書に記載の教示によると、一般に、全ＩＶＣＤが高い細胞培養物を生育させることが望ましい。グルタミン濃度が制限された培養培地を提供し、開始生育段階後に細胞培養物をより低温にシフトすることによって、培養物中の乳酸レベルが減少し始め、潜在的に、より生存能力の高い、および／またはより密集した細胞培養が可能となる。該手法の１つの問題は、温度シフトが遅すぎると、細胞が乳酸塩を取り込めなくなり、その結果、より生存能力の低い、および／またはより低密度の細胞培養物がもたらされることである。かくして、乳酸が決定的なレベルまで蓄積する前に、培養物をより低温にシフトすることが望ましい。しかしながら、細胞をより低温にあまりにも早くにシフトした場合の負の効果は、細胞成長が結果として遅くなることである。かくして、伝統的な細胞培養方法は、実行者に、到底理想的とは言えない２つの選択肢から選択させる。すなわち、１）培養物を早期にシフトし、その結果、乳酸の全蓄積量が低くなるが（および、低グルタミン条件下で生育させる場合、その後の減少）、早期の温度シフト後に細胞生育速度が減少する。または２）培養物をより後期にシフトし、細胞生育速度の増加をもたらすが、乳酸の全蓄積量が高くなる。
【００７７】
本発明の開示は、解糖阻害物質、例えば、２−デオキシグルコースを含有する細胞培養培地中で細胞を生育させることの１の利益が、かかる解糖阻害物質を欠く比較培養培地中よりも遅い速度で乳酸が蓄積することであることを明らかにする。結果として、培養物がかかる解糖阻害物質を欠いた場合に可能となるよりも遅い時点で、培養物をより低温にシフトしてもよく、その結果、細胞はシフト後であっても、乳酸塩を取り込み始めるであろう。かくして、本明細書中に記載の特定の本願発明の培地および方法を利用することによって、シフト時に細胞密度がより高くなり、全ＩＶＣＤが増加するであろう。
【００７８】
本発明の開示は、シフト後に細胞が乳酸塩を確実に取り込むようにするために、培養物をいつシフトすべきかを決定するにあたり、少なくとも２つの因子、すなわち、シフト時の乳酸濃度およびシフト時の細胞密度が重要でありうることを教示する（例えば、実施例３参照）。特定の細胞系統は、種々の量の乳酸塩を生産し、または培養物中に蓄積された乳酸塩に対してより耐性であったり、またはより耐性が乏しい場合がある。にもかかわらず、本明細書に記載の本発明の方法および培地組成物の利用が所定の細胞培養において、乳酸のより低い全蓄積をもたらし、かくして、より遅い時点で培養物をより低温にシフトさせ、培養物の全ＩＶＣＤを増加させることが可能である。当業者は、使用される細胞系統の特徴、生産されるべきタンパク質またはポリペプチドの特徴、培地中における他の成分の存在または不存在、または実験的な要求および／または他の要求に望ましいいずれか他の因子に基づいて、培養物をより低温にシフトする正確な時点を選択することができるであろう。
【００７９】
本明細書中に開示される本発明の培地処方は、必要に応じ、または所望により、ホルモンおよび／または他の成長因子、特定のイオン（例えば、ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウム、およびホスフェート）、バッファー、ビタミン類、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、微量元素（通常、非常に低い最終濃度で存在する無機化合物）、アミノ酸類、脂質、タンパク質加水分解物またはグルコースまたは他のエネルギー源で補足してもよい。本発明のある特定の具体例において、培地を化学インダクタント、例えば、ヘキサメチレン−ビス（アセトアミド）（「ＨＭＢＡ」）および酪酸ナトリウム（「ＮａＢ」）で補足することが有益でありうる。これらの任意の補足物は、培養の開始時に加えてもよく、または枯渇した栄養分の補充のために、または別の理由で、より後の時点で加えてもよい。当業者は、本発明の培養処方に含まれてもよいいずれかの望ましい、または必要な補足物を承知し、実験的な要求および／または他の要求に基づいて、加えるべき特定の補足物をを選択することができるであろう。
【００８０】
ポリペプチド
宿主細胞において発現可能なポリペプチドは、本明細書に開示される方法および組成物にしたがって生産されうる。ポリペプチドは、宿主細胞にとって内在性の遺伝子から、または宿主細胞中に導入された異種遺伝子から発現されてもよい。ポリペプチドは、天然物であってもよく、または別法では、人工的に操作または選択された配列を有していてもよい。産生されるべきポリペプチドは、個々に天然のポリペプチドフラグメントから構成されていてもよい。さらに、または別法では、操作されたポリペプチドは、非天然の１以上のフラグメントを含んでいてもよい。
【００８１】
望ましくは本発明にしたがって発現されうるポリペプチドは、しばしば、興味深い、または有用な生物学的または化学的活性に基づいて選択される。ある特定の具体例において、本発明の方法および／または組成物は、タンパク質治療剤またはポリペプチド治療剤を発現するために用いられる。例えば、本発明は、医薬上または商業上関連する酵素、受容体、抗体、ホルモン、調節因子、抗原、結合剤などを発現させるために用いてもよい。本発明にしたがって生産することのできるポリペプチドおよびタンパク質の下記リストは、本来、単なる例示であって、制限的記載であると解釈されるべきではない。当業者は、いずれのポリペプチドまたはタンパク質が本発明にしたがって発現されうるかを理解し、または特定の要求に基づいて生産されるべき特定のポリペチドを選択できるであろう。
【００８２】
凝固因子
凝固因子は、医薬的および／または商業的物質として有効であることが示されている。血友病などの疾患の治療における組み換え凝固因子の重要性を鑑みると、本発明の方法および組成物にしたがって組み換え技術によって生産される凝固因子の発現は、特に興味深い。本発明にしたがって生産できる非限定的な凝固因子は、凝固因子ＩＸ（因子ＩＸまたは「ＦＩＸ」）である。ＦＩＸは、一本鎖糖蛋白であり、その欠如は、Ｂ型血友病、患者の血液が凝固できない障害をもたらす。かくして、出血をもたらすいずれの小さな創傷でも、潜在的に生死に関わる事象である。
【００８３】
ＦＩＸは、活性化ペプチドの放出によって２本鎖セリンプロテアーゼ（因子ＩＸａ）に活性化されることのできる１本鎖チモーゲンとして合成される。因子ＩＸａの触媒的ドメインは、重鎖に位置する（Ｃｈａｎｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：４，１９９７参照、出典明示により本明細書の一部とされる）。ＦＩＸは、Ｎ−結合型およびＯ−結合型炭水化物を包含する複数のグリコシル化部位を有する。セリン６１にある１の特定のＯ−結合型構造（Ｓｉａ−α２，３−Ｇａｌ−β１，４−ＧｌｃＮＡｃ−β１，３−Ｆｕｃ−α１−Ｏ−Ｓｅｒ）は、かつて、ＦＩＸに独特であると考えられていたが、その後、哺乳動物およびショウジョウバエにおけるＮｏｔｃｈタンパク質を包含する２、３個の他の分子において見出された（Ｍａｌｏｎｅｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５（１３），２０００）。細胞培養においてチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって産生されたＦＩＸは、セリン６１オリゴ糖鎖においていくつかの変化性を示す。これらの異なる糖型および他の可能性のある糖型は、ヒトまたは動物に投与された場合に凝固を誘導する異なる能力を有することがあり、および／または血液中で異なる安定性を有することがあり、その結果、あまり有効でない凝固をもたらす。
【００８４】
Ｂ型血友病から臨床上区別がつかないＡ型血友病は、ヒト凝固因子ＶＩＩＩ、１本鎖チモーゲンとして合成され、次いで、２本鎖活性型に変換する別の糖蛋白における欠陥によって引き起こされる。本発明は、また、凝固因子ＶＩＩＩのグリコシル化パターンを調節または改変して、その凝固活性を変調するために用いてもよい。本発明にしたがって生産でき、そのグリコシル化パターンが調節または改変されることのできる他の糖蛋白凝固因子は、例えば、限定するものではないが、組織因子およびフォン・ウィルブランド（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子を包含する。
【００８５】
抗体
抗体は、特定の抗原に特異的に結合する能力を有するタンパク質である。医薬的または他の商業的物質として現在使用または研究下にある多数の抗体を鑑みると、本発明の方法および組成物にしたがう抗体の生産は、特に興味深い。
【００８６】
宿主細胞中に発現されることのできるいずれの抗体も、本発明にしたがって使用されうる。ある特定の具体例において、発現されるべき抗体は、モノクローナル抗体である。ある特定の具体例において、モノクローナル抗体は、キメラ抗体である。当該分野で知られているように、キメラ抗体は、１以上の生物から由来のアミノ酸フラグメントを含有する。キメラ抗体分子は、例えば、ヒト定常領域と共に、マウス、ラット、または他の種の抗体由来の抗原結合ドメインを含むことができる。キメラ抗体を作成するための種々のアプローチが記載されている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８１：６８５１，１９８５、Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２，１９８５、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号、Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号、Ｔａｎａｇｕｃｈｉら、欧州特許公開第ＥＰ１７１４９６号、欧州特許公開第０１７３４９４号、英国特許第ＧＢ２１７７０９６Ｂ号（各々、出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）を参照のこと。
【００８７】
ある特定の具体例において、モノクローナル抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体は、アミノ酸残基の大部分がヒト抗体から由来し、かくして、ヒト対象にデリバリーした場合にいずれかの潜在的な免疫反応を最小限にするキメラ抗体である。ヒト化抗体において、超可変領域中のアミノ酸残基は、所望の抗原特異性またはアフィニティーを授与する非ヒト種由来の残基に置き換わっている。ある特定の具体例において、ヒト化抗体は、ヒト抗体に対して、少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９パーセントまたはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の具体例において、ヒト化抗体は、保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖細胞系置換（germline substitution）および／または復帰変異の導入によって最適化される。かかる改変された免疫グロブリン分子は、当該分野において既知のいくつかの技術のいずれかによって作成することができ（例えば、Ｔｅｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：７３０８−７３１２，１９８３；Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４：７２７９，１９８３；Ｏｌｓｓｏｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９２：３−１６，１９８２）、ＰＣＴ公報第ＷＯ９２／０６１９３号またはＥＰ０２３９４００（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）にしたがって作成してもよい。
【００８８】
非限定的な一例としてではあるが、本明細書の教示にしたがって生産されうる抗体は、抗−ＡＢｅｔａ抗体である。抗−ＡＢｅｔａ抗体は、アルツハイマー病（「ＡＤ」）の治療において、特に有望な可能性のある治療方法である。ＡＤは、老人性認知症をもたらす進行性疾患である（一般に、Ｓｅｌｋｏｅ，ＴＩＮＳ  １６：４０３，１９９３；Ｈａｒｄｙら、ＷＯ  ９２／１３０６９；Ｓｅｌｋｏｅ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５３：４３８，１９９４；Ｄｕｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７３：４７６，１９９５；Ｇａｍｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７３：５２３，１９９５参照、各々、出典明示により本明細書の一部とされる）。おおまかに言うと、該疾患は２つのカテゴリー、すなわち、老齢（６５＋歳）に起こる後期発症および老年期よりかなり前（すなわち、３５歳〜６０歳）に発症する早期発症に分類される。どちらのタイプの疾患も、病理は同じであるが、より早い年齢で開始する場合、異常性がより重篤かつ幅広い傾向にある。該疾患は、脳における少なくとも２つの型の病変、神経原繊維錯綜および老人斑によって特徴付けられる。神経原繊維錯綜は、対になって互いに巻き付いた２つのフィラメントからなる微小管関連タウタンパク質の細胞内沈着である。老人斑（すなわち、アミロイド斑）は、直径１５０μｍまでの乱れた神経網からなり、その中央に、脳組織の切片の顕微鏡分析によって見ることのできる細胞外アミロイド沈着がある領域である。脳内のアミロイド斑の蓄積は、また、ダウン症候群および他の認識障害にも関連する。
【００８９】
斑の主要な構成要素は、ＡＢｅｔａまたはＢｅｔａ−アミロイドと呼ばれるペプチドである。ＡＢｅｔａペプチドは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と呼ばれる大きな膜貫通型糖蛋白の３９−４３個のアミノ酸からなる４−ｋＤａの内部フラグメントである。種々のセクレターゼ酵素によるＡＰＰのタンパク質分解プロセシングの結果として、ＡＢｅｔａは、主として、長さ４０アミノ酸の短い形態および４２−４３アミノ酸の長い形態で見出される。ＡＰＰの疎水性膜貫通型ドメインの部分は、ＡＢｅｔａのカルボキシ末端で見出され、特に長い形態の場合、ＡＢｅｔａの斑に凝集できる能力の原因となりうる。脳におけるアミロイド斑の蓄積は、最終的に、神経細胞死を導く。該型の神経劣化に関連する身体的症状は、アルツハイマー病の特徴である。
【００９０】
ＡＰＰタンパク質内でのいくつかの変異は、ＡＤの存在に相関している（例えば、Ｇｏａｔｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：７０４，１９９１（バニリン７１７〜イソロイシン）、Ｃｈａｒｔｉｅｒ  Ｈａｒｌａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：８４４，１９９１（バニリン７１７〜グリシン）、Ｍｕｒｒｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：９７，１９９１（バニリン７１７〜フェニルアラニン）、Ｍｕｌｌａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１：３４５，１９９２（リジン５９５−メチオニン５９６をアスパラギン５９５−ロイシン５９６に変化する二重変異）参照、各々、出典明示により全体として本明細書の一部とされる）。かかる変異は、ＡＰＰのＡＢｅｔａへのプロセシング、特に、ＡＰＰの増加した量の長い形態のＡＢｅｔａ（すなわち、ＡＢｅｔａ１−４２およびＡＢｅｔａ１  ４３）へのプロセシングの増加または改変によって、ＡＤを引き起こすと考えられる。他の遺伝子、例えば、プレセニリン遺伝子、ＰＳ１およびＰＳ２の変異は、ＡＰＰのプロセシングに間接的に影響を及ぼして、増加した量の長い形態のＡＢｅｔａを生成すると考えられる（Ｈａｒｄｙ，ＴＩＮＳ  ２０：  １５４，１９９７参照、出典明示により全体として本明細書の一部とされる）。
【００９１】
マウスモデルは、ＡＤにおけるアミロイド斑の重要性を決定するために首尾よく使用されている（Ｇａｍｅｓら、上掲；Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１５５０，１９９７、出典明示により全体として本明細書の一部とされる）。特に、ＰＤＡＰＰトランスジェニックマウス（変異型のヒトＡＰＰを発現し、若年でアルツハイマー病を発症する）に長い形態のＡＢｅｔａを注射した場合、アルツハイマー病の進行減少およびＡＢｅｔａペプチドに対する抗体力価の増加の両方を表す（Ｓｃｈｅｎｋら、Ｎａｔｕｒｅ  ４００，１７３，１９９９、出典明示により全体として本明細書の一部とされる）。上記した観察は、ＡＢｅｔａ、特に、長い形態のＡＢｅｔａがアルツハイマー病の原因要素であることを示す。
【００９２】
ＡＢｅｔａペプチドは、溶液中に存在することができ、ＣＮＳ（例えば、ＣＳＦ）およびプラズマにおいて検出することができる。ある特定の条件下、可溶性ＡＢｅｔａは、ＡＤ患者の老人斑および脳血管に見出される繊維性で毒性のベータシート形態に変換される。ＡＢｅｔａに対するモノクローナル抗体での免疫化を含む治療が研究されている。能動および受容の両方の免疫化がＡＤマウスモデルにおいて試験された。能動免疫化は、脳における斑の負荷をいくらか減少させたが、経鼻投与の場合だけである。ＰＤＡＰＰトランスジェニックマウスの受動免疫化もまた、研究されている（Ｂａｒｄら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：９１６−１９，２０００、出典明示により全体として本明細書の一部とされる）。ＡＢｅｔａのアミノ末端および中央ドメインを認識する抗体は、ＡＢｅｔａ沈着の食作用を刺激したが、一方、カルボキシ末端ドメイン近くのドメインに対する抗体は刺激しなかった。
【００９３】
受動または能動免疫化後のＡＢｅｔａのクリアランスのメカニズムは、継続した研究下にある。２つのメカニズム、すなわち、中枢分解および末梢分解が有効なクリアランスのために提唱された。中枢分解メカニズムは、血液脳関門を横切り、斑に結合し、先在する斑のクリアランスを誘導することのできる抗体に依存する。クリアランスは、Ｆｃ−受容体媒介性食作用によって促進されることが示された（Ｂａｒｄら、上掲）。ＡＢｅｔａクリアランスの末梢分解メカニズムは、抗体投与時に、脳、ＣＳＦおよびプラズマ間のＡＢｅｔａの動的平衡が崩壊し、それにより、１のコンパートメントから別のコンパートメントへＡＢｅｔａの輸送を導くことに依存する。中枢誘導性のＡＢｅｔａは、ＣＳＦおよびプラズマ中に輸送され、そこで分解される。近年の研究では、脳におけるアミロイド沈着の減少さえ伴わずに、可溶性で非結合型ＡＢｅｔａがＡＤに関連する記憶障害に関与すると結論づけた。ＡＢｅｔａクリアランスのこれらの経路の作用および／または相互作用を決定するために、さらなる研究が必要とされる（Ｄｏｄｅｌら、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  Ｖｏｌ．  ２：２１５，  ２００３、出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）。
【００９４】
抗−ＡＢｅｔａ抗体は、ＡＢｅｔａまたはアミロイド斑を構成する他の成分に結合し、浄化しうるので、潜在的に有望なＡＤ治療経路である。本明細書の教示にしたがって生産される抗−ＡＢｅｔａ抗体は、例えば、より効果的にアミロイド斑の成分に結合し、浄化することによって、２、３またはそれ以下の重篤な副作用を伴ってアミロイド斑を浄化することによって、またはアミロイド斑の形成または構築を妨げることによって、ＡＤまたは他の関連疾患をより良好に治療するように働きうる。ある特定の具体例において、本明細書の教示にしたがって生産される抗−ＡＢｅｔａ抗体は、モノクローナル抗体である。
【００９５】
ある特定の具体例において、本明細書の教示にしたがって生産される抗−ＡＢｅｔａ抗体は、ＡＢｅｔａの可溶性形態に結合することなく、凝集形態に特異的に結合する。ある特定の具体例において、本明細書の教示にしたがって生産される抗−ＡＢｅｔａ抗体は、抗−ＡＢｅｔａの凝集形態に結合しない条件下で、抗−ＡＢｅｔａの可溶性形態に結合する。ある特定の具体例において、本明細書の教示にしたがって生産される抗−ＡＢｅｔａ抗体は、凝集形態および可溶性形態の両方に結合する。ある特定の具体例において、本明細書の教示にしたがって生産される抗−ＡＢｅｔａ抗体は、斑中のＡＢｅｔａに結合する。ある特定の具体例において、本明細書の教示にしたがって生産される抗−ＡＢｅｔａ抗体は、血液脳関門を横切る。ある特定の具体例において、本明細書の教示にしたがって生産される抗−ＡＢｅｔａ抗体は、対象に負荷されるアミロイドを減少させる。ある特定の具体例において、本明細書の教示にしたがって生産される抗−ＡＢｅｔａ抗体は、対象における神経炎性ジストロフィー（neuritic dystrophy）を減少させる。ある特定の具体例において、抗−ＡＢｅｔａ抗体は、シナプス構築（例えば、シナプトフィジン）を維持することができる。
【００９６】
いくつかの具体例によると、本明細書の教示にしたがって生産される抗−ＡＢｅｔａ抗体は、ＡＢｅｔａの残基１３−２８内のエピトープに結合する（天然ＡＢｅｔａの最初のＮ末端残基を１とする）。いくつかの具体例において、本明細書の教示にしたがって生産される抗−ＡＢｅｔａ抗体は、ＡＢｅｔａの残基１９−２２内のエピトープに結合する。いくつかの具体例において、種々の抗−ＡＢｅｔａエピトープに対する結合特異性を有する複数のモノクローナル抗体を用いる。例えば、いくつかの具体例において、ＡＢｅｔａの残基１９−２２内のエピトープに特異的な抗体は、ＡＢｅｔａの残基１９−２２の外側のエピトープに対して特異的な抗体と共同投与される。かかる抗体は、連続的または同時に投与することができる。ＡＢｅｔａ以外のアミロイド成分に対する抗体も使用することができる（例えば、投与または共同投与される）。
【００９７】
ある特定の具体例において、本明細書の教示にしたがって生産される抗−ＡＢｅｔａ抗体は、別法で生産された抗−ＡＢｅｔａ抗体よりも強くまたは特異的にＡＢｅｔａエピトープに結合する。抗体のエピトープ特異性は、既知の技術によって、例えば、種々のメンバーが種々のＡＢｅｔａサブ配列を表示するファージディスプレーライブラリーを形成することによって、決定できる。次いで、ファージディスプレーライブラリーは、試験下で抗体に特異的に結合しているメンバーについて選択されうる。配列のファミリーが単離される。典型的には、かかるファミリーは、共通のコア配列を含有し、異なるメンバーにおいてフランキング配列の長さが異なる。抗体に対する特異的な結合を示す最も短いコア配列は、典型的には、抗体によって結合されるエピトープを規定する。別法では、またはさらに、抗体は、そのエピトープ特異性がすでに決定された抗体を用いる競合アッセイにおいてエピトープ特異性について試験されうる。例えば、ＡＢｅｔａに対する結合について１５Ｃ１１抗体と競合する抗体は、１５Ｃ１１と同一または類似のエピトープ、すなわち、残基ＡＢｅｔａ１９−２２内に結合すると考えられる。ある特定の具体例において、エピトープ特異性について抗体をスクリーニングすることは、治療効力の有用な予知因子である。例えば、ＡＢｅｔａの残基１３−２８（例えば、Ａβ１９−２２）内のエピトープに結合することが決定された抗体は、おそらく、本発明の方法にしたがってアルツハイマー病を予防および治療するのに有効である。
【００９８】
ＡＢｅｔａの他の領域に結合することなく、ＡＢｅｔａの好ましいセグメントに特異的に結合する抗体は、他の領域に結合するモノクローナル抗体または無傷ＡＢｅｔａに対するポリクローナル血清と比較して、いくつかの利益を有する。特に、等しい質量の投与量の場合、好ましいセグメントに特異的に結合する抗体の投与量は、アミロイド斑のクリアランスにおいて有効な、より高モル量の抗体を含有する。また、好ましいセグメントに特異的に結合している抗体は、無傷ＡＰＰポリペプチドに対するクリアランス応答を誘導することなく、アミロイド沈着に対するクリアランス応答を誘導し、それにより、潜在的な副作用を減少しうる。
【００９９】
ある特定の具体例において、上記のモノクローナル、キメラ、１本鎖またはヒト化抗体は、天然のいずれの種におけるいずれの抗体においても、自然に生じないアミノ酸残基を含有しうる。これらの外来残基は、例えば、モノクローナル、キメラ、１本鎖またはヒト化抗体において新規または修飾された特異性、アフィニティーまたはエフェクター機能を与えるために利用できる。
【０１００】
酵素
医薬的および／または商業的物質として有効であることが示され、望ましくは本発明の教示にしたがって生産されることのできる別のクラスのポリペプチドには、酵素がある。疾患の治療ならびに他の商業的および医薬的使用における組み換え酵素の重要性を鑑みると、本発明にしたがう酵素の生産は、特に興味深い。
【０１０１】
非限定的な一例としてではあるが、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＲ）の欠如は、ゴーシェ病として知られる病態をもたらし、それは、ある種の細胞のリソソームにおけるグルコセレブロシドの蓄積によって引き起こされる。ゴーシェ病の対象は、脾腫、肝腫脹、骨障害、血小板減少症および貧血を包含する一連の症状を示す。ＦｒｉｅｄｍａｎおよびＨａｙｅｓは、主要アミノ酸配列において単一置換を含有する組み換えＧＣＲ（ｒＧＣＲ）が改変されたグリコシル化パターン、特に、天然ＧＣＲと比べてフコースおよびＮ−アセチルグルコサミン残基の増加を示したことを明らかにした（米国特許番号第５，５４９，８９２号参照）（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）。かくして、本発明の方法にしたがうＧＣＲの生産が意図される。当業者は、本発明の方法にしたがって生産されうる他の望ましい酵素を承知しているであろう。
【０１０２】
成長因子および他のシグナル伝達分子
医薬的および／または商業的物質として有効であることが示され、望ましくは本発明の教示にしたがって生産されることのできる別のクラスのポリペプチドには、成長因子および他のシグナル伝達分子がある。成長因子および他のシグナル伝達分子の生物学的重要性および潜在的な治療剤としてのその重要性を鑑みれば、本発明の方法および組成物にしたがうこれらの分子の生産は、特に興味深い。成長因子は、典型的には、細胞によって分泌され、他の細胞上の受容体に結合して活性化し、それにより、受容体細胞における代謝または発育変化を起こす糖蛋白である。
【０１０３】
哺乳動物成長因子および他のシグナル伝達分子の非限定的な例は、サイトカイン、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦｓ）、例えば、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ、形質転換成長因子（ＴＧＦｓ）、例えば、ＴＧＦ−アルファ、およびＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３、ＴＧＦ−ベータ４またはＴＧＦ−ベータ５を包含するＴＧＦ−ベータ、インシュリン様生長因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、デス（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インシュリン様成長因子結合タンパク質、ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８、およびＣＤ−１９；エリトロポイエチン、骨誘導因子、抗毒素、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インターフェロン、例えば、インターフェロン−アルファ、−ベータ、および−ガンマ、コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦ、インターロイキン（ＴＬｓ）、例えば、ＩＬ−１ないしＩＬ−１０、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファおよびベータ、インシュリンＡ−鎖、インシュリンＢ−鎖、プロインシュリン、卵胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、グルカゴン、凝固因子、例えば、因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子、およびフォン・ウィルブランド因子、抗凝固因子、例えば、プロテインＣ、心房性ナトリウム利尿因子、肺表面活性剤、プラスミノーゲンアクチベーター、例えば、ウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、ボンベシン、トロンビン、造血成長因子、エンケファリナーゼ、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｎｏｒｍａｌｌｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）、ミュラー管抑制物質、レラキシンＡ−鎖、レラキシンＢ−鎖、プロレラキシン、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６）、または神経成長因子、例えば、ＮＧＦ−ベータを包含する。当業者は、本発明にしたがって発現されることのできる他の成長因子またはシグナル伝達因子を承知しているであろう。
【０１０４】
受容体
医薬的および／または商業的物質として有効であることが示され、望ましくは本発明の教示にしたがって生産されることのできるポリペプチドの別のクラスには、受容体がある。受容体の生物学的重要性および潜在的な治療剤としてのその重要性を鑑みれば、本発明の方法および組成物にしたがうこれらの分子の生産は、特に興味深い。受容体は、典型的には、細胞外シグナル伝達リガンドを認識することによって機能する膜貫通型糖蛋白である。受容体は、しばしば、リガンド認識ドメインのほかに、プロテインキナーゼドメインを有する。該プロテインキナーゼドメインは、リガンド結合時に標的細胞内分子をリン酸化することによってシグナル伝達経路を開始し、それにより、細胞内での発育的変化または代謝的変化をもたらす。
【０１０５】
ある特定の具体例において、腫瘍壊死因子阻害剤は、腫瘍壊死因子アルファおよびベータ受容体（ＴＮＦＲ−１；ＥＰ  ４１７，５６３、１９９１年３月２０日公開；およびＴＮＦＲ−２，ＥＰ  ４１７，０１４、１９９１年３月２０公開）（各々、出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）の形態において、本発明の系および方法にしたがって発現される（概説に関し、Ｎａｉｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｓｐｒａｎｇ，  Ｊ  Ｉｎｆｌａｍｍ．４７（１−２）：１−７，１９９５−９６参照）（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）。いくつかの具体例によると、腫瘍壊死因子阻害剤は、可溶性ＴＮＦ受容体を含む。ある特定の具体例において、腫瘍壊死因子阻害剤は、可溶性ＴＮＦＲ−Ｉｇを含む。ある特定の具体例において、本発明のＴＮＦ阻害剤は、ＴＮＦＲＩおよびＴＮＦＲＩＩの可溶性形態である。ある特定の具体例において、本発明のＴＮＦ阻害剤は、可溶性ＴＮＦ結合タンパク質である。ある特定の具体例において、本発明のＴＮＦ阻害剤は、ＴＮＦＲ−Ｉｇ融合タンパク質、例えば、ＴＮＦＲ−Ｆｃまたはエタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）である。本明細書中で使用される場合、「エタネルセプト」なる語は、ｐ７５  ＴＮＦ−α受容体の細胞外部分の２つの分子からなる２量体であって、各分子がヒトＩｇＧ１の２３５アミノ酸Ｆｃ部分からなるＴＮＦＲ−Ｆｃをいう。
【０１０６】
ある特定の具体例において、本発明にしたがって生産されるべき受容体は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫｓ）である。ＲＴＫファミリーは、種々の機能的な多くの細胞型にとって欠かせない受容体を包含する（例えば、ＹａｒｄｅｎおよびＵｌｌｒｉｃｈ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：４３３−４７８，１９８８、ＵｌｌｒｉｃｈおよびＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、Ｃｅｌｌ  ６１：２４３−２５４，１９９０参照）（出典明示により本明細書の一部とされる）。ＲＴＫｓの非限定的な例は、腫瘍壊死因子アルファおよびベータ受容体（ＴＮＦＲ−１；ＥＰ  ４１７，５６３、１９９１年３月２０日公開；およびＴＮＦＲ−２，ＥＰ  ４１７，０１４、１９９１年３月２０日公開；概説に関し、ＮａｉｓｍｉｔｈおよびＳｐｒａｎｇ、Ｊ  Ｉｎｆｌａｍｍ．４７（１−２）：１−７，  １９９５−９６参照）（出典明示により本明細書の一部とされる）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体ファミリー、上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦ）ファミリーのメンバー、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体、免疫グロブリンおよびＥＧＦ相同ドメイン−１（ＴＩＥ−１）およびＴＩＥ−２受容体を伴うチロシンキナーゼ（Ｓａｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７６（６５３５）：７０−７４，１９９５）（出典明示により本明細書の一部とされる）およびｃ−Ｍｅｔ受容体を包含し、そのいくつかは、直接または間接的に血管形成を促進することが示唆される（ＭｕｓｔｏｎｅｎおよびＡｌｉｔａｌｏ、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２９：８９５−８９８，１９９５）。ＲＴＫ’ｓの他の非限定的な例は、胎児肝キナーゼ１（ＦＬＫ−１）（時々、キナーゼ挿入ドメイン含有受容体（ＫＤＲ）と称する（Ｔｅｒｍａｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ６：１６７７−８３，１９９１）か、または血管内皮細胞成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ−２）と称する）、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−１（Ｆｌｔ−１）（ＤｅＶｒｉｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５；９８９−９９１，１９９２；Ｓｈｉｂｕｙａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５：５１９−５２４，１９９０）、時々、血管内皮細胞成長因子１（ＶＥＧＦＲ−１）と称する）、ニューロフィリン−１、エンドグリン、エンドシアリン、およびＡｘｌを包含する。当業者は、本発明のある特定の方法および組成物にしたがって発現されることのできる他の受容体を承知しているであろう。
【０１０７】
ある特定の具体例において、本発明にしたがって生産されるべき受容体は、Ｇ−プロテイン結合型受容体（ＧＰＣＲ）である。ＧＰＣＲは、薬物作用および開発の主要な標的である。実際、受容体は現在知られている薬物の半分以上をもたらしており（Ｄｒｅｗｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １４：１５１６，  １９９６）、ＧＰＣＲｓは、臨床的に処方される薬物の３０％がＧＰＣＲを拮抗または作動するという治療的介入のための最も重要な標的を示す（Ｍｉｌｌｉｇａｎ，Ｇ．およびＲｅｅｓ、Ｓ．，ＴＩＰＳ，２０：１１８−１２４，１９９９）。これらの受容体は確立された治療標的としての証明された歴史を有しているので、本発明にしたがうＧＰＣＲｓの生産は、また、特に興味深い。
【０１０８】
ＧＰＣＲｓは、７回膜貫通型ドメインを有するタンパク質である。ＧＰＣＲへのリガンドの結合時に、シグナルが細胞内で変換され、その結果、細胞の生物学的または生理学的特性の変化がもたらされる。ＧＰＣＲｓは、Ｇ−プロテインおよびエフェクター（Ｇ−プロテインによって変調される細胞内酵素およびチャネル）と共に、細胞内セカンドメッセンジャーの状態を細胞外インプットへ連絡するモジュラーシングナル伝達系の成分である。これらの遺伝子および遺伝子産物は、疾患の潜在的な原因物質である。
【０１０９】
ＧＰＣＲタンパク質スーパーファミリーは、現在、２５０種を超える、遺伝子重複（または他のプロセス）によって生じた変種を示す受容体、パラログ（異なる種由来の同じ受容体であるオルソログの反対として）を含有する。該スーパーファミリーは、５つのファミリーに分けることができる。すなわち、ロドプシンおよびベータ２−アドレナリン受容体によって類型化され、現在２００を超える独特のメンバーによって代表されるファミリーＩ；近年特徴付けられた副甲状腺ホルモン／カルシトニン／セクレチン受容体ファミリーである、ファミリーＩＩ；哺乳動物における代謝型グルタミン酸受容体ファミリーであるファミリーＩＩＩ；Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍの走化性および発育において重要なｃＡＭＰ受容体ファミリーであるファミリーＩＶ；およびＳＴＥ２などの真菌交配フェロモン受容体であるファミリーＶ。
【０１１０】
ＧＰＣＲｓは、生体アミン、炎症の脂質メディエーター、ペプチドホルモン、および感覚シグナルメディエーターのための受容体を包含する。ＧＰＣＲは、受容体がその細胞外リガンドに結合した時に活性化になる。ＧＰＣＲのコンフォメーション変化は、リガンド−受容体相互作用に由来するが、ＧプロテインのＧＰＣＲ細胞内ドメインに対する結合アフィニティーに影響を及ぼす。これにより、Ｇプロテインに対する増加したアフィニティーでＧＴＰが結合できるようになる。
【０１１１】
ＧＴＰによるＧプロテインの活性化は、Ｇプロテインαサブユニットとアデニレートシクラーゼまたは他のセカンドメッセンジャー分子ジェネレーターとの相互作用を導く。該相互作用は、アデニレートシクラーゼの活性を調節し、したがって、セカンドメッセンジャー分子、ｃＡＭＰの産生を調節する。ｃＡＭＰは、他の細胞内タンパク質のリン酸化および活性化を調節する。別法では、他のセカンドメッセンジャー分子、例えば、ｃＧＭＰまたはエイコシノイド（ｅｉｃｏｓｉｎｏｉｄ）の細胞レベルが、ＧＰＣＲの活性によってアップレギュレートまたはダウンレギュレートされうる。Ｇプロテインαサブユニットは、ＧＴＰａｓｅによるＧＴＰの加水分解によって失活し、α、βおよびγサブユニットが再び結合する。次いで、ヘテロ３量体Ｇプロテインがアデニレートシクラーゼまたは他セカンドメッセンジャー分子ジェネレーターから解離する。ＧＰＣＲの活性は、また、細胞内および細胞外ドメインまたはループのリン酸化によって調節されうる。
【０１１２】
グルタミン酸受容体は、神経伝達において重要なＧＰＣＲｓの群を形成する。グルタミン酸塩は、ＣＮＳにおける主要な神経伝達物質であり、神経可塑性、認識、記憶、学習およびいくつかの神経学的障害、例えば、癲癇、卒中および神経変性において重要な役割を有すると考えられる（Ｗａｔｓｏｎ，Ｓ．およびＳ．Ａｒｋｉｎｓｔａｌｌ，  Ｔｈｅ  Ｇ−  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ，  ｐｐ．  １３０−１３２，  １９９４）。血管作動性腸管ポリペプチド（ＶＩＰ）ファミリーは、その作用がＧＰＣＲｓによって媒介される関連するポリペプチドの群である。該ファミリーの主要メンバーは、ＶＩＰ自体、セクレチン、および成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）である。ＶＩＰは、平滑筋の弛緩、種々の組織におけるセクレチンの刺激または阻害、種々の免疫細胞活性の調節、およびＣＮＳにおける種々の興奮性および阻害性活性を包含する幅広いプロフィールの生理学的作用を有する。セクレチンは、膵臓および腸における酵素およびイオンの分泌を刺激し、脳においても少量存在する。
【０１１３】
一般に、本発明の実行者は、目的のポリペプチドを選択し、その正確なアミノ酸配列を知るであろう。本発明にしたがって発現されるべきいくつかの所定のタンパク質は、それ自体の特定の特徴を有し、培養細胞の細胞密度または生存力に影響を及ぼし、同一の培養条件下で生育される別のポリペプチドまたはタンパク質よりも低レベルで発現されうる。当業者は、適宜、本明細書に記載の培地および方法を修飾して、細胞成長および／または所定の発現されたポリペプチドまたはタンパク質の生産を最適化できるであろう。
【０１１４】
宿主細胞中へのポリペプチドの発現のための遺伝子の導入
ある特定の具体例において、細胞中に導入される核酸分子は、本発明にしたがって発現されるのが望ましいポリペプチドをコードする。ある特定の具体例において、核酸分子は、細胞による所望のポリペプチドの発現を誘導する遺伝子産物をコードしていてもよい。例えば、導入される遺伝材料は、内在性または異種ポリペプチドの転写を活性化する転写因子をコードしていてもよい。別法では、またはさらに、導入核酸分子は、細胞によって発現されるポリペプチドの翻訳または安定性を増加しうる。
【０１１５】
目的のポリペプチドの発現を達成するために十分な核酸を哺乳動物宿主細胞中に導入するのに適当な方法は、当該分野で既知である。例えば、Ｇｅｔｈｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，２９３：６２０−６２５，１９８１；Ｍａｎｔｅｉら、Ｎａｔｕｒｅ，２８１：４０−４６，１９７９；Ｌｅｖｉｎｓｏｎら、ＥＰ  １１７，０６０；およびＥＰ  １１７，０５８（各々、出典明示により本明細書の一部とされる）を参照のこと。哺乳動物細胞の場合、遺伝材料を細胞中に導入する一般的な方法は、Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｒｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ５２：４５６−４５７，１９７８のリン酸カルシウム沈降法またはＨａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎ，Ｆｏｃｕｓ  １５：７３，１９９３のｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）法を包含する。哺乳動物細胞宿主系形質転換の一般的な態様は、Ａｘｅｌによって、米国特許第４，３９９，２１６号（１９８３年４月１６日発行）に記載されている。遺伝材料を哺乳動物細胞中に導入するための種々の技術については、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １８５：５２７−５３７，  １９９０およびＭａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ，  ３３６：３４８−３５２，  １９８８を参照のこと。
【０１１６】
ある特定の具体例において、導入されるべき核酸は、裸の（ｎａｋｅｄ）核酸分子の形態である。これらの具体例のいくつかの態様において、細胞中に導入される核酸分子は、ポリペプチドをコードしている核酸および必要な遺伝子調節エレメントのみからなる。これらの具体例のいくつかの態様において、ポリペプチド（必要な調節エレメントを包含する）をコードしている核酸は、プラスミドベクター内に含有される。哺乳動物細胞におけるポリペプチドの発現に適当なベクターの非限定的な代表例は、ｐＣＤＮＡ１；ｐＣＤ（Ｏｋａｙａｍａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：１１３６−１１４２，１９８５参照）；ｐＭＣｌｎｅｏ  ポリ−Ａ（Ｔｈｏｍａｓら、Ｃｅｌｌ  ５１：５０３−５１２，１９８７参照）；バキュロウイルスベクター、例えば、ｐＡＣ  ３７３またはｐＡＣ  ６１０；ＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，  Ｂ．，  Ｎａｔｕｒｅ    ３２９：８４０，  １９８７）およびｐＭＴ２ＰＣ  （Ｋａｕｆｍａｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  ６：１８７−１９５，  １９８７）を包含する。ある特定の具体例において、細胞中に導入されるべき核酸分子は、ウイルスベクター内に含有される。例えば、ポリペプチドをコードしている核酸は、ウイルスゲノム（または、部分ウイルスゲノム）中に挿入されうる。ポリペプチドの発現を指示する調節エレメントは、ウイルスゲノム中に挿入された核酸と共に含まれることができ（すなわち、ウイルスゲノム中に挿入された遺伝子に結合される）、またはウイルスゲノム自体によって提供されることができる。
【０１１７】
裸のＤＮＡは、ＤＮＡおよびリン酸カルシウムを含有している沈澱を形成することによって、細胞中に導入されることができる。さらに、または別法では、裸のＤＮＡは、また、ＤＮＡおよびＤＥＡＥ−デキストランの混合物を形成し、次いで、該混合物を細胞と一緒にインキュベートするか、または細胞およびＤＮＡを適当なバッファー中で一緒にインキュベートし、次いで、該細胞を高圧電気パルスに付すこと（すなわち、エレクトロポレーション）によって、細胞中に導入することができる。いくつかの具体例において、裸のＤＮＡは、ＤＮＡをカチオン性脂質を含有するリポソーム懸濁と混合することによって、細胞中に導入される。ＤＮＡ／リポソーム複合体を、次いで、細胞と一緒にインキュベートする。裸のＤＮＡは、また、例えばマイクロインジェクションによって、細胞中に直接注入することができる。
【０１１８】
さらに、または別法では、裸のＤＮＡは、ＤＮＡをカチオン、例えば、ポリリジンと複合体化し、それを細胞表面受容体のためのリガンドに結合することによって細胞中に導入することができる（例えば、Ｗｕ，Ｇ．およびＷｕ，Ｃ．Ｈ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１，１９８８；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７，１９９２；および米国特許第５，１６６，３２０号参照）。ＤＮＡ−リガンド複合体の受容体への結合は、受容体媒介性エンドサイトーシスによるＤＮＡの取り込みを容易にする。
【０１１９】
特定の核酸配列、例えば、ポリペプチドをコードしているｃＤＮＡを含有するウイルスベクターの使用は、核酸配列を細胞中に導入するための一般的なアプローチである。ウイルスベクターでの細胞の感染は、大部分の細胞が核酸を受容するという利益を有し、それにより、核酸を受容した細胞の選択の必要性を回避することができる。さらに、例えば、ウイルスベクター中に含有されるｃＤＮＡによって、ウイルスベクター内でコードされる分子は、一般に、ウイルスベクター核酸を取り込んだ細胞において効率良く発現される。
【０１２０】
欠損性レトロウイルスは、遺伝子療法の目的で遺伝子移入における使用について、よく特徴付けられている（概説に関し、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，Ｂｌｏｏｄ  ７６：２７１，１９９０を参照のこと）。レトロウイルスゲノム中に挿入された目的のポリペプチドをコードしている核酸を有する組み換えレトロウイルスを構築することができる。さらに、レトロウイルスゲノムの部分は、レトロウイルス複製が欠損するように除去することができる。次いで、複製欠損性レトロウイルスをビリオン中にパッケージし、それを用いて、標準的な技術によりヘルパーウイルスの使用によって標的細胞を感染させることができる。
【０１２１】
アデノウイルスのゲノムは、目的のポリペプチドをコードし、発現するが、正常な溶解ウイルスライフサイクルにおけるその複製能に関して不活性化されるように操作することができる。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６，１９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４，１９９１；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５，１９９２を参照のこと。アデノウイルス株Ａｄ型５  ｄｌ３２４または他のアデノウイルス株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７等）から由来する適当なアデノウイルスベクターは、当該分野でよく知られている。組み換えアデノウイルスは、それらが有効な遺伝子デリバリービヒクルであるために分裂細胞を必要としないことにおいて有益であり、気道上皮（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２，上掲）、内皮細胞（Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６４８２−６４８６，１９９２）、肝細胞（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２８１２−２８１６，１９９３）および筋細胞（Ｑｕａｎｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２５８１−２５８４，１９９２）を包含する幅広く種々の細胞型を感染させるために使用することができる。さらに、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびそこに含有される外来性ＤＮＡ）は、宿主細胞ゲノム中に組み込まれないが、エピソームのままであり、それにより、導入ＤＮＡが宿主細胞ゲノム（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）中に組み込まれるようになる挿入変異の結果として起こることのできる潜在的な問題を回避する。さらに、外来性ＤＮＡに関するアデノウイルスゲノムの収容能力は、他の遺伝子デリバリーベクターと比べて大きい（８キロベースまで）（Ｂｅｒｋｎｅｒら、上掲；Ｈａｊ−ＡｈｍａｎｄおよびＧｒａｈａｍ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７，１９８６）。現在使用される大抵の複製欠損性アデノウイルスベクターは、ウイルス性Ｅ１およびＥ３遺伝子の全てまたは部分について欠失しているが、アデノウイルスの遺伝材料の８０％も保持する。
【０１２２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、有効な複製および増殖ライフサイクルのためにヘルパーウイルスとして別のウイルス、例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスを必要とする天然欠損性ウイルスである。（概説に関し、Ｍｕｚｙｃｚｋａら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ．  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５８：９７−１２９，  １９９２を参照のこと。）それは、また、そのＤＮＡを非分裂細胞中に組み込みうる２、３のウイルスのうち１つであり、高頻度の安定な組込を示す（例えば、Ｆｌｏｔｔｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９−３５６，１９９２；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８，１９８９；およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３−１９７３，１９８９参照）。３００塩基対という小さいＡＡＶを含有するベクターをパッケージすることができ、組み込むことができる。外因性ＤＮＡのためのスペースは、約４．５ｋｂに限られている。ＡＡＶベクター、例えば、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５：３２５１−３２６０，  １９８５）に記載のベクターを用いて、ＤＮＡを細胞中に導入することができる。ＡＡＶベクターを用いて、種々の核酸が種々の細胞型に導入されている（例えば、Ｈｅｒｍｏｎａｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６４６６−６４７０，１９８４；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１，１９８５；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２−３９，１９８８；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１−６１９，１９８４；およびＦｌｏｔｔｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１−３７９０，１９９３参照）。
【０１２３】
核酸分子を細胞集団中へ導入するために使用される方法が細胞の大きな集団の修飾および細胞によるポリペプチドの効率的な発現をもたらす場合、細胞の修飾された集団は、さらに単離または集団内での個々の細胞のサブクローニングをすることなく、使用してもよい。すなわち、細胞の集団によるポリペプチドの十分な生産があり、その結果、さらなる細胞単離は必要なく、該集団をすぐに使用してポリペプチドの生産のための細胞培養に接種することができる。いくつかの具体例において、ポリペプチドを効率的に生産する単一細胞由来の細胞の均質集団を単離および拡大することが望ましい。
【０１２４】
目的のポリペプチドをコードする細胞中に核酸分子を導入する代わりに、導入核酸は、別のポリペプチド、タンパク質または細胞によって内因的に生産されるタンパク質またはポリペプチドの発現レベルを誘導または増加する調節エレメントをコードしていてもよい。例えば、細胞は、特定のポリペプチドを発現することができる場合があるが、さらなる細胞処理を用いることなく、そうすることはできない場合がある。同様に、細胞は、所望の目的に不十分な量のポリペプチドを発現する場合がある。かくして、目的のポリペプチドの発現を刺激する物質を用いて、細胞によるポリペプチドの発現を誘導または増加させることができる。例えば、導入された核酸分子は、目的のポリペプチドの転写を活性化またはアップレギュレートする転写因子をコードしていてもよい。次いで、かかる転写因子の発現は、目的のポリペプチドの発現またはより強固な発現を導く。同様に、導入された核酸分子は、１以上の転写リプレッサーを目的のポリペプチドの調節領域から取り去る（titrate away）１以上の調節エレメントを含有していてもよい。
【０１２５】
ある特定の具体例において、ポリペプチドの発現を指示する核酸を安定に宿主細胞中に導入する。ある特定の具体例において、ポリペプチドの発現を指示する核酸は、一時的に宿主細胞中に導入される。当業者は、実験要求に基づいて、細胞中に核酸を安定に導入するか、または一時的に導入するかを選択することができるであろう。
【０１２６】
目的のポリペプチドをコードしている遺伝子は、１以上の調節遺伝子調節エレメントに結合していてもよい。いくつかの具体例において、遺伝子調節エレメントは、ポリペプチドの構成的発現を指示する。いくつかの具体例において、目的のポリペプチドをコードしている遺伝子の誘導性発現を提供する遺伝子調節エレメントを使用することができる。誘導性遺伝子調節エレメント（例えば、誘導性プロモーター）の使用は、細胞中のポリペプチドの産生の変調を可能にする。真核生物細胞において使用するための潜在的に有用な誘導性遺伝子調節エレメントの非制限的な例は、ホルモン調節エレメント（例えば、Ｍａｄｅｒ，Ｓ．およびＷｈｉｔｅ，Ｊ．Ｈ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５６０３−５６０７，１９９３参照）、合成リガンド調節エレメント（例えば、Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１０１９−１０２４，１９９３）および電離放射線調節エレメント（例えば、Ｍａｎｏｍｅ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：１０６０７−１０６１３，１９９３；Ｄａｔｔａ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０１４９−１０１５３，１９９２）を包含する。当該分野で知られた付加的な細胞特異的系または他の調節系を本明細書に記載の方法および組成物にしたがって用いてもよい。
【０１２７】
当業者は、本発明の教示にしたがって、細胞に目的のポリペプチドを発現させる遺伝子を導入する方法を選択し、所望により適宜修飾することができるであろう。
【０１２８】
発現したポリペプチドの単離
ある特定の具体例において、本発明にしたがって発現されるタンパク質またはポリペプチドを単離および／または精製することが望ましい。ある特定の具体例において、発現したポリペプチドまたはタンパク質は、培地中に分泌され、かくして、例えば、精製工程における第１段階として、遠心分離または濾過によって細胞および他の固体を除去してもよい。
【０１２９】
いくつかの具体例において、発現したポリペプチドまたはタンパク質は、宿主細胞の表面に結合する。かかる具体例において、培地を除去し、ポリペプチドまたはタンパク質を発現している宿主細胞を精製工程の第１段階として溶解する。哺乳動物宿主細胞の溶解は、ガラスビーズによる物理的破壊および高ｐＨ条件への曝露を包含するいくつかの当業者に既知の手段によって達成することができる。
【０１３０】
ポリペプチドまたはタンパク質は、限定するものではないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、サイズ排除、およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）、ゲル濾過、遠心分離、または差別的溶解度、エタノール沈澱、またはタンパク質の精製のためのいずれか他の利用可能な技術を包含する標準的な方法によって、単離および精製されうる（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．およびＨａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．（ｅｄｓ．），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９；およびＤｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．（編），Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌ  １８２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７参照）（各々、出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）。特に、イムノアフィニティークロマトグラフィーの場合、タンパク質は、該タンパク質に対して生じた抗体であって、固定支持体に固定された抗体を含むアフィニティーカラムに結合させることによって単離されうる。別法では、アフィニティータグ、例えば、インフルエンザコート配列、ポリヒスチジン、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを標準的な組み換え技術によってタンパク質に結合させて、適当なアフィニティーカラムに通すことにより容易な精製を可能にすることができる。当業者は、発現したポリペプチドを単離するのに有用な他の既知のアフィニティータグを承知しているであろう。精製過程の間のポリペプチドまたはタンパク質の分解を減少または排除するために、プロテアーゼ阻害剤、例えば、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ロイペプチン、ペプスタチンまたはアプロチニンをいずれかの段階または全段階で加えてもよい。プロテアーゼ阻害剤の使用は、しばしば、発現されたポリペプチドまたはタンパク質を単離および精製するために、細胞を溶解しなければならないときに有益である。
【０１３１】
当業者には、正確な精製技術は、精製されるべきポリペプチドまたはタンパク質の特徴、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞の特徴、および細胞を生育させた培地の組成に依存して変更してもよいことが明らかであろう。
【０１３２】
免疫原性組成物
本明細書の教示にしたがって生産されるタンパク質またはポリペプチドは、また、免疫原性組成物において、例えばワクチンとして使用してもよい。一般に、本発明の免疫原性組成物の成分について適当な「有効量」または投与量の選択は、典型的には、限定するものではないが、使用される免疫原性組成物中の選択されたポリペプチドの同一性、ポリペプチドのグリコシル化パターン、および対象の物理的状態を包含する、特に、免疫される対象の全体的な健康状態、年齢および体重を包含する種々の因子に基づく。当該分野で知られるように、特定の投与方法および経路ならびに免疫原性組成物中の付加的な成分の存在もまた、ＤＮＡプラスミド組成物の投与量および量に影響を及ぼしうる。かかる有効投与量の選択および上方向または下方向の調整は、当該分野の技術範囲内である。限定するものではないが、保護的応答を包含する免疫応答を誘導するために、または有意な副作用を伴わずに患者において外因性の影響を生じるために必要とされる免疫原性組成物の量は、これらの因子に依存して変化する。適当な投与量は、当業者によって容易に決定される。
【０１３３】
本発明のある特定の免疫原性組成物は、アジュバントを含有していてもよい。アジュバントは、免疫源または抗原と一緒に投与した場合に免疫応答を増強する物質である。いくつかのサイトカインまたはリンフォカインは、免疫変調活性を有することが示され、かくして、アジュバントとして使用され、限定するものではないが、インターロイキン１−α、１−β、２、４、５、６、７、８、１０、１２（例えば、米国特許第５，７２３，１２７号参照）（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）、１３、１４、１５、１６、１７および１８（およびその変異形態）、インターフェロン−α、βおよびγ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（例えば、米国特許第５，０７８，９９６号参照）（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、ＧＳＦ、および腫瘍壊死因子αおよびβを包含する。本発明において有用なまた別の他のアジュバントは、ケモカインを包含し、限定するものではないが、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびＲＡＮＴＥＳを包含する。接着分子、例えば、セクレチン、例えば、Ｌ−セクレチン、Ｐ−セクレチンおよびＥ−セクレチンもまた、アジュバントとして有用でありうる。また他の有用なアジュバントは、限定するものではないが、ムチン様分子、例えば、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１およびＭａｄＣＡＭ−１、インテグリンファミリーのメンバー、例えば、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１およびｐ１５０．９５、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー、例えば、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭｓ、例えば、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３、ＣＤ２およびＬＦＡ−３、共刺激分子、例えば、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、神経生長因子、繊維芽細胞成長因子、上皮細胞成長因子、Ｂ７．２、ＰＤＧＦ、ＢＬ−１、および血管内皮成長因子を包含する成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、およびＤＲ６を包含する受容体分子を包含する。また別のアジュバント分子は、カスパーゼ（ＩＣＥ）を包含する。国際特許公開第ＷＯ９８／１７７９９号および第ＷＯ９９／４３８３９号（各々、出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）も参照のこと。
【０１３４】
コレラ毒素（ＣＴ）およびその変異体もまた、アジュバントとして有用であり、公開された国際特許出願第ＷＯ００／１８４３４号に記載（ここに、アミノ酸位置２９のグルタミン酸が別のアミノ酸（アスパラギン酸以外、例えば、ヒスチジン）で置き換わっている）のものを包含する。類似のＣＴｓまたは変異体は、公開された国際特許第ＷＯ０２／０９８３６８号に記載される（ここに、単独で、またはアミノ酸位置６８のセリンの別のアミノ酸による置換と共に、アミノ酸位置１６のイソロイシンが別のアミノ酸で置き換わり、および／またはアミノ酸位置７２のバリンが別のアミノ酸で置き換わっている）。他のＣＴ毒素は、公開された国際特許出願第ＷＯ０２／０９８３６９号に記載される（ここに、アミノ酸位置２５のアルギニンが別のアミノ酸で置き換わり；および／またはアミノ酸位置４９にアミノ酸が挿入され；および／または２つのアミノ酸がアミノ酸位置３５および３６に挿入されている）。これらの参考文献の各々は、全体として本明細書の一部とされる。
【０１３５】
ある特定の具体例において、本発明の免疫原性組成物は、限定するものではないが、鼻腔内、経口、直腸、非経口、皮内、経皮（例えば、国際特許公開第ＷＯ９８／２０７３４号参照）（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）、筋内、腹腔内、皮下、静脈内および動脈内を包含する種々の経路によって、ヒトまたは非ヒト脊椎動物に投与される。適当な経路は、使用される免疫原性組成物の性質、患者の年齢、体重、性別および全体的な健康状態の評価、免疫原性組成物中に存在する抗原、および／または当業者に既知の他の因子に依存して選択されうる。
【０１３６】
ある特定の具体例において、免疫原性組成物は、複数回投与する。免疫原性組成物投与の順序および個々の投与間の時間間隔は、限定するものではないが、宿主の物理的特徴および該方法の適用に対する宿主の正確な応答を包含する当業者に既知の関連する因子に基づいて、当業者によって選択されうる。
【０１３７】
医薬処方
ある特定の具体例において、生産されたポリペプチドまたはタンパク質は、薬理活性を有し、医薬の製造に有用であろう。上記のように、本願発明の組成物は、対象に投与してもよく、または、まず、限定するものではないが、非経口、静脈内、筋内、皮内、皮下、経口、バッカル、舌下、鼻、気管支、眼、経皮（局所）、経粘膜、直腸、および膣経路を包含するいずれかの利用可能な経路によってデリバリーするために処方されてもよい。本発明の医薬組成物は、典型的には、哺乳動物細胞系統から発現された精製したポリペプチドまたはタンパク質、デリバリー剤（すなわち、上記のカチオン性ポリマー、ペプチド分子輸送体、界面活性剤など）を医薬上許容される担体と含む。本明細書中で使用される場合、「医薬上許容される担体」なる語は、医薬投与に適合性の溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを包含する。補足活性化合物もまた、本発明の組成物中に配合することができる。例えば、本発明にしたがって生産されたタンパク質またはポリペプチドを全身性薬物療法のための薬物、例えば、毒素、低分子量細胞毒剤、生物学的応答修飾剤、および放射性核種にコンジュゲートしてもよい（例えば、Ｋｕｎｚら、Ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ−ｃａｒｒｉｅｒ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，ＵＳ２００４００８２７６４  Ａ１参照）。本発明にしたがって医薬組成物を調製するのに有用な付加的な成分は、例えば、フレーバー剤、滑沢剤、可溶化剤、懸濁化剤、増量剤、潤滑剤、圧縮補助剤、結合剤、錠剤崩壊剤、カプセル被包材料、乳化剤、バッファー、保存料、甘味料、増粘剤、着色料、粘度調節剤、安定化剤、または浸透圧調節剤、またはその組み合わせを包含する。
【０１３８】
別法またはさらに、本発明にしたがって生産されるタンパク質またはポリペプチドは、１以上の付加的な医薬活性剤と共に（同時または連続的に）投与してもよい。これらの医薬活性剤の例示リストは、ｔｈｅ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，５５  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ，２００１（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）に見出すことができる。これらの挙げられた薬剤の多くの場合、医薬上有効な投与量および方針は、当該分野で知られており、多くは、ｔｈｅ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ自体に示されている。
【０１３９】
固体医薬組成物は、１以上の固体担体、および所望により、１以上の他の添加剤、例えば、フレーバー剤、滑沢剤、可溶化剤、懸濁化剤、増量剤、潤滑剤、圧縮補助剤、結合剤または錠剤崩壊剤またはカプセル化被包材料を含有していてもよい。適当な固体担体は、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖類、ラクトース、デキストリン、デンプン、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、低融点ワックスまたはイオン交換樹脂、またはその組み合わせを包含する。粉末医薬組成物において、担体は、微粉化固体であってもよく、微粉化された活性成分と混合する。錠剤において、活性成分は、一般に、適当な割合で必要な圧縮性を有する担体、および所望により、他の添加剤と混合し、所望の形状およびサイズに圧縮する。
【０１４０】
液体医薬組成物は、本発明にしたがって発現されたポリペプチドまたはタンパク質、および溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシルまたは加圧組成物を形成するための１以上の液体担体を含有していてもよい。医薬上許容される液体担体は、例えば、水、有機溶媒、医薬上許容される油脂、またはその組み合わせを包含する。液体担体は、他の適当な医薬添加剤、例えば、可溶化剤、乳化剤、バッファー、保存料、甘味料、フレーバー剤、懸濁化剤、増粘剤、着色料、粘度調節剤、安定化剤または浸透圧調節剤、またはその組み合わせを含有することができる。液体処方が小児科用途を目的とする場合、一般的に、アルコールを含むことを避けるか、またはアルコールの量を制限することが望ましい。
【０１４１】
経口または非経口投与に適当な液体担体の例は、水（所望により、セルロース誘導体、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロースなどの添加剤を含有する）、アルコールまたはその誘導体（一価アルコールまたは多価アルコール、例えば、グリコールを包含する）または油（例えば、分別ココヤシ油および落花生油）を包含する。非経口投与の場合、担体は、また、油性エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルであることができる。加圧組成物のための液体担体は、ハロゲン化炭化水素または他の医薬上許容されるプロペラントであることができる。
【０１４２】
滅菌溶液または懸濁液である液体医薬組成物は、例えば、筋内、腹腔内、硬膜外、髄腔内、静脈内または皮下注射によって、非経口投与することができる。経口または経粘膜投与のための医薬組成物は、液体または固体組成形態のいずれであってもよい。
【０１４３】
ある特定の具体例において、医薬組成物は、意図される投与経路と適合性であるように処方される。非経口、皮内、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分、すなわち、滅菌希釈剤、例えば、注射用水、セーライン溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒、抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム、キレート化剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸、バッファー、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、および等張性を調整するための薬剤、例えば、塩化ナトリウム、またはデキストロースを含むことができる。ｐＨは、酸または塩基、例えば、塩酸および／または水酸化ナトリウムで調整することができる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てのシリンジまたは複数回投与用のバイアル中に封入することができる。
【０１４４】
注射での使用に適当な医薬組成物は、典型的には、滅菌水性溶液（水溶性）または分散液ならびに滅菌注射可能溶液または分散液の即席調製物のための滅菌粉末を包含する。静脈内投与の場合、適当な担体は、生理学的セーライン、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝化セーライン（ＰＢＳ）を包含する。全ての場合、組成物は、滅菌されているべきであり、容易な通針性が存在する程度まで流動性でなければならない。有利には、ある特定の医薬処方は、製造および貯蔵条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されていなければならない。一般に、関連する担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適当な混合物を含有する溶媒または分散媒体であることができる。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合、所望の粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持されることができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成されることができる。ある特定の場合、等張剤、例えば、糖類、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物中に含むことが有用であろう。注射可能な組成物の長期の吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによって、もたらされることができる。
【０１４５】
滅菌注射溶液は、必要な量の精製したポリペプチドまたはタンパク質を適当な溶媒中に、上記の成分の１つまたは組み合わせと共に配合し、必要ならば、次いで、濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、哺乳動物細胞系統から発現された精製ポリペプチドまたはタンパク質を、塩基性分散媒体および上記の必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に配合することによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、有利な調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、活性成分および予め滅菌濾過した溶液から由来するいずれかの付加的な所望の成分の粉末を生じる。
【０１４６】
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。経口治療薬投与の目的で、精製ポリペプチドまたはタンパク質を賦形剤と共に配合し、錠剤、トローチまたはカプセル、例えば、ゼラチンカプセルの形態において使用することができる。経口組成物は、また、例えば、口腔洗浄剤として使用するために、流体担体を用いて調製することもできる。医薬上適合性の結合剤、および／またはアジュバント材料を組成物の一部として含むことができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、下記の材料のいずれか、または同様の性質の化合物：微結晶性セルロース、トラガカントガムまたはゼラチンなどの結合剤、デンプンまたはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、プリモゲル（Primogel）、またはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムまたはステロテス（Sterotes）などの滑沢剤、コロイド状二酸化珪素などの潤滑剤、シュークロースまたはサッカリンなどの甘味剤、またはペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジフレーバーなどのフレーバー剤を含有することができる。かかる調製物は、例えば、子供への投与、錠剤の嚥下が危険な個体、または動物への投与を容易にするために、所望により、混合チュアブルまたは液体処方あるいは食物材料または液体であってもよい。経口デリバリー用処方は、有利には、胃腸管内での安定性を改善するための薬剤および／または吸収を増強するための薬剤を配合していてもよい。
【０１４７】
吸入による投与の場合、哺乳動物細胞系統から発現された精製ポリペプチドまたはタンパク質およびデリバリー剤を含む本発明の組成物は、また、鼻腔内投与または吸入により投与されることができ、便利には、乾燥粉末吸入器の形態、あるいは適当なプロペラント、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、ヒドロフルオロアルカン、例えば、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ  １３４ＡＴＭ）または１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ  ２２７ＥＡＴＭ）、二酸化炭素または他の適当な気体の使用を伴う、または伴わない加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザーもしくはネブライザーからのエーロゾルスプレー提供の形態でデリバリーされる。加圧エーロゾルの場合、投与単位は、計量された、例えば、治療上有効量をデリバリーするためのバルブを提供することによって決定されうる。本発明は、特に、鼻用スプレー、吸入器、または上気道および／または下気道への他の直接的デリバリーを用いる本発明の組成物のデリバリーを意図する。インフルエンザウイルスに対して向けられたＤＮＡワクチンの鼻腔内投与は、ＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘導することが示され、このことは、該経路によってデリバリーされたときに、呼吸管における少なくともいくつかの細胞がＤＮＡを取り込むことができ、本発明のデリバリー剤が細胞性取り込みを増強することを示す。ある特定の具体例によると、哺乳動物細胞系統から発現された精製ポリペプチドおよびデリバリー剤を含む組成物は、エーロゾル投与のための大きな多孔性粒子として処方される。
【０１４８】
修飾された放出性および拍動的な放出性経口投与形態は、放出速度修飾剤として作用する賦形剤を含有していてもよく、これらは、該装置本体を被覆し、および／または装置本体中に含まれている。放出速度修飾剤は、限定するものではないが、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、セルロースアセテート、ポリエチレンオキシド、キサンタンガム、カルボマー、アンモニオメタクリレートコポリマー、水素化ひまし油、カルナウバ蝋、パラフィンワックス、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸コポリマーおよびその混合物を包含する。修飾された放出性および拍動的な放出性経口投与形態は、放出速度修飾賦形剤の１つまたは組み合わせを含有しうる。放出速度修飾賦形剤は、どちらも、投与形態内、すなわち、マトリックス内、および／または投与形態上、すなわち、表面またはコーティング上に存在していてもよい。
【０１４９】
全身性投与は、また、経粘膜または経皮手段によることができる。経粘膜または経皮投与の場合、浸透されるべき障壁に適当な浸透剤を処方中に用いる。かかる浸透剤は、当該分野で一般に知られており、例えば、経粘膜投与の場合、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を包含する。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは座剤の使用によって達成されることができる。経皮投与の場合、精製ポリペプチドまたはタンパク質およびデリバリー剤は、例えば、下記：鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水の１以上との混合物中、懸濁または溶解された活性化合物を含有する適当な軟膏として処方することができる。別法では、それらは、例えば、下記：鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水の１以上との混合物中、懸濁または溶解された適当なローションまたはクリーム、として処方されることができる。
【０１５０】
別法では、化合物は、座剤または膣座剤の形態で投与することができ、またはそれらは、ゲル、ヒドロゲル、ローションまたは他のグリセリド、溶液、クリーム、軟膏または散布剤の形態で局所的に塗布されてもよい。
【０１５１】
いくつかの具体例において、組成物は、インプラントおよびマイクロカプセル化したデリバリーシステムを包含する放出制御処方など、身体からの迅速排除に対するポリペプチドまたはタンパク質を保護するであろう担体と共に調製される。一般に、本発明の組成物は、放出が迅速、遅延、修飾、抑制、脈動化、または制御されたデリバリーのために処方してもよい。生物分解性の生体適合性ポリマー、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸を使用することができる。かかる処方の調製方法は、当業者に明らかであろう。適当な材料は、また、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから商業的に入手できる。リポソーム懸濁（ウイルス性抗原に対するモノクローナル抗体で感染させた細胞を標的とするリポソームを含む）は、また、医薬上許容される担体として使用することができる。これらは、米国特許第４，５２２，８１１号に記載のように、当業者に既知の方法にしたがって調製することができる。
【０１５２】
本発明にしたがって製造されたタンパク質およびポリペプチドは、また、シクロデキストリンと組み合わせて使用してもよい。シクロデキストリンは、ある特定の分子との包接錯体および非包接錯体を形成することが知られている。シクロデキストリン錯体の形成は、タンパク質またはポリペプチドの溶解性、溶解速度、バイオアベイラビリティーおよび／または安定性を修飾しうる。シクロデキストリン錯体は、一般に、大抵の投与形態および投与経路に有用である。タンパク質またはポリペプチドとの直接的な錯体化とは別に、シクロデキストリンは、補助添加剤として、例えば、担体、希釈剤または可溶化剤として使用されうる。アルファ−、ベータ−およびガンマ−シクロデキストリンが最も一般的に使用され、適当な例は、公開された国際特許出願第ＷＯ９１／１１１７２号、第ＷＯ９４／０２５１８号および第ＷＯ９８／５５１４８号に記載されている。
【０１５３】
いくつかの具体例において、本発明の医薬組成物は、単位投与形態、例えば、錠剤またはカプセルにおいて提供される。容易な投与および投与量の均一性のために、単位投与形態における経口または非経口組成物を処方するのが有益でありうる。かかる形態において、組成物は、適量のポリペプチドまたはタンパク質を含有する単位投与量においてさらに分割する。単位投与形態は、パッケージした組成物であることができ、例えば、パック入りの粉末、バイアル、アンプル、予め充填したシリンジまたは液体入りのサシェであることができる。単位投与形態は、例えば、カプセルまたは錠剤自体であることができ、またはパッケージ形態の適当な数のいずれかのかかる組成物であることができる。当業者に明らかなように、治療上有効な単位投与量が、例えば、投与方法、ポリペプチドまたはタンパク質の強度、および／またはレシピエントの重量および医薬組成物中の他の成分の正体を包含するいくつかの因子に依存する。
【０１５４】
本発明にしたがって発現されるポリペプチドまたはタンパク質は、必要に応じて種々の間隔で種々の期間にわたり、例えば、週に１回を約１〜１０週間、２〜８週間、約３〜７週間、約４、５または６週間など、投与することができる。当業者には、限定するものではないが、疾患または障害の重篤度、以前の治療、患者の全体的な健康状態および／または年齢、および存在する他の疾患を包含するある特定の因子が対象を効果的に治療するために必要とされる投与量および時機に影響を及ぼすことができることが明らかであろう。本明細書中に記載のポリペプチドまたはタンパク質での対象の治療は、単一治療または一連の治療を含んでいてもよい。さらに、当然のことながら、適当な投与量がポリペプチドまたはタンパク質の強度に依存しうること、および例えば、予め選択された所望の応答が達成されるまで投与量を増やして投与することによって、特定のレシピエントに合わせていてもよい。当然のことながら、いずれかの特定の動物に特異的な投与レベルは、使用される特定のポリペプチドまたはタンパク質の活性、対象の年齢、体重、全体的な健康状態、性別および食餌、投与の時間、投与の経路、排出速度、いずれかの薬物の組み合わせ、および変調されるべき発現または活性の度合いを包含する種々の因子に依存しうる。
【０１５５】
本発明は、非ヒト動物の治療のための本発明の組成物の使用を包含する。したがって、投与量および投与方法は、獣医薬理学および医薬の既知の原理にしたがって選択すればよい。例えば、Ａｄａｍｓ，Ｒ．（編），Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；ＩＳＢＮ：０８１３８１７４３９；２００１に、手引きを見出すことができる。
【０１５６】
本発明の医薬組成物は、投与指示書と共に容器、パックまたはディスペンサーに含ませることができる。
【実施例】
【０１５７】
実施例１：培養皿におけるα−ＧＤＦ−８細胞の細胞成長に対する２−デオキシグルコースの影響
序文：
乳酸塩は、細胞培養における細胞成長の既知の阻害剤である（ＬａｏおよびＴｏｔｈ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｐｒｏｇ．１３（５）：６８８−６９１，１９９７参照）。細胞培養中のグルコースの量が減少すると、生産される乳酸塩の量が同時に減少する。２−デオキシグルコースは、糖の２位のヒドロキシル基が水素部分に置き変わっているグルコースの構造類似体である。Ｒｏｔｈらは、２−デオキシグルコースをラットに与えたとき、全食物取り込み量を減少させることなく、グルコース／エネルギーの流れを減少させることを明らかにした（Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，９２８：３０５−１５，２００１）。該実施例では、哺乳動物細胞培養物への２−デオキシグルコースの添加が培養皿における細胞の成長に不利益であるかどうかを決定するために実験を行った。
【０１５８】
材料および方法：
成長および分化因子８に対するモノクローナル抗体を発現するように操作されたチャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞（「α−ＧＤＦ−８細胞」）（Ｖｅｌｄｍａｎら、Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  ＧＤＦ−８  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｆｏｒ，ＵＳ２００４０１４２３８２  Ａ１参照）を培養皿において、種々の濃度の２−デオキシグルコースと共に、最終的な開始濃度９ｇ／Ｌまでグルコースを補足した培地１中で生育させた。表１は、培地１の組成を示す。
【０１５９】
【表１】
0005401319.tif 000002
【０１６０】
結果および結論：
細胞培養皿中におけるα−ＧＤＦ−８細胞の比成長率を図１に示す。２−デオキシグルコースの不在下で生育させた細胞は、約０．０３ ｌ／ｈの比成長率（「μ」）を示した。増加量の２−デオキシグルコースの添加により、用量依存的に比成長率が減少した。例えば、１ｇ／Ｌの２−デオキシグルコース（２−デオキシグルコース：グルコース比が１：９）の存在下で生育させた細胞は、０．０２ ｌ／ｈを少し上回る比成長率を示したが、２．５ｇ／Ｌの２−デオキシグルコースの存在下で生育させた細胞は、約０．０１５ ｌ／ｈの比成長率を示し、２−デオキシグルコースの不在下で生育させた細胞のおおよそ半分であった。かくして、２−デオキシグルコースの存在は細胞成長を阻害するようであり、約１：９より大きい２−デオキシグルコース 対 グルコース比は、比成長率を２−デオキシグルコースの不在下で観察される成長率の半分以下のレベルに減少させる。
【０１６１】
実施例２：培養皿におけるα−ＧＤＦ−８細胞の乳酸に対する２−デオキシグルコースの影響
序文：
実施例１は、培養皿において生育させた細胞培養物が、低濃度で与えられた２−デオキシグルコースによく耐性があることを明らかにした。該実施例では、２−デオキシグルコースの存在が培養皿において生育させた細胞培養物中の乳酸蓄積に対して影響を及ぼすかどうかを試験するために、実験を行った。
【０１６２】
材料および方法；
α−ＧＤＦ−８細胞を培養皿中、種々の濃度の２−デオキシグルコースと共に約６ｇ／Ｌグルコースを含有する培地１中で生育させた。いくつかのα−ＧＤＦ−８培養物には、任意で、最終的な開始濃度９ｇ／Ｌまでグルコースを補足した。細胞を２回継代し、各継代後、３日間生育させた。３日目の最後に、継代した培養物の各々を生存能力、細胞密度、グルコースレベル、乳酸レベルおよびα−ＧＤＦ−８力価について測定した。比力価生産率（「Ｑｐ」）および比乳酸取り込み率（「Ｑｌａｃｔ」）を計算した。Ｑｌａｃｔは、下記のように計算された。すなわち、
（（最終的な乳酸レベル−開始乳酸レベル）／（最終細胞密度−開始細胞密度））ｘ成長率ｘ２４
ここに、乳酸レベルはｇ／Ｌで測定され、細胞密度は、１０６細胞／ｍｌで測定され、成長率は、ｌ／ｈで測定され、最終Ｑｌａｃｔは、ｍｇ／ｅ６／日で計算される。Ｑｐは、下記のように計算された。すなわち、
（（最終力価−開始力価）／（最終細胞密度−開始細胞密度））ｘ成長率ｘ２４
ここに、力価はｍｇ／Ｌで測定され、細胞密度は１０６細胞／ｍｌで測定され、成長率は１／ｈとして測定され、Ｑｐはμｇ／ｅ６／日として計算される。
【０１６３】
結果：
表２は、２回継代したα−ＧＤＦ−８細胞培養物の開始および最終細胞密度、生存能力、最終グルコースおよび乳酸濃度、比成長率、力価、ＱｌａｃｔおよびＱｐを示す。表から分かるように、細胞の生存能力は、少なくとも１：６の２−デオキシグルコース 対 グルコース比まで、細胞培養物中の２−デオキシグルコースの存在によってあまり影響を受けない（表２、「ｖｉａｂ」と標識した列）。しかしながら、細胞の比成長率は、用量依存的に、２−デオキシグルコースの存在によって負の影響を受ける（表２、「μ」と標識した列）。第１および第２継代の対照培養物は、各々、比成長率０．０３２および０．０３７を示すが、１ｇ／Ｌの２−デオキシグルコースの存在下で生育させた培養物は、比成長率０．０２７（第１継代、９ｇ／Ｌグルコース）、０．０２８（第２継代、９ｇ／Ｌグルコース）および０．０２７（第２継代、６ｇ／Ｌグルコース）を示す。かくして、実施例１の結果と同様に、細胞培養物中の２−デオキシグルコースの存在は、比成長率を阻害する。
【０１６４】
細胞培養物中の２−デオキシグルコースの存在は、また、用量依存的に、培養物中の乳酸塩の蓄積を減少させた。表２に示されるように（「ｌａｃｔ」と標識した列）、第１継代において、２−デオキシグルコースを欠く対照培養物中に蓄積した乳酸レベルは１．８８ｇ／Ｌであったが、１ｇ／Ｌの２−デオキシグルコース（９ｇ／Ｌのグルコースと共に）の存在下、乳酸塩が０．９ｇ／Ｌのレベルに蓄積した。同様に、第２継代において、２−デオキシグルコースを欠く対照培養物中、乳酸塩が２．３９ｇ／Ｌのレベルまで蓄積し、一方、１ｇ／Ｌの２−デオキシグルコースの存在下、乳酸塩は、０．９８ｇ／Ｌ（９ｇ／Ｌのグルコースと共に）または０．６８ｇ／Ｌ（６ｇ／Ｌのグルコースと共に）のレベルに蓄積しただけであった。さらに、表２から分かるように、２−デオキシグルコース 対 グルコース比が増加するにつれて、細胞培養物中の全乳酸量が減少するだけではなく、比乳酸生産率（「Ｑｌａｃｔ」）も減少した。第１継代において、２−デオキシグルコースを含有しない対照培養物は０．９４８のＱｌａｃｔを有していたが、１：９の２−デオキシグルコース 対 グルコース比を有する培養物中、Ｑｌａｃｔは０．５５３に落ちた。同様に、第２継代において、２−デオキシグルコースを含有しない対照培養物は、０．５８２のＱｌａｃｔを有していたが、１：９の２−デオキシグルコース 対 グルコース比を有する培養物中、Ｑｌａｃｔは０．２９０に落ちた。
【０１６５】
細胞培養物中の２−デオキシグルコースの存在は、また、α−ＧＤＦ−８力価を用量依存的に減少させた。表２に示されるように（「ｔｉｔｅｒ」と標識した列）、第２継代において、α−ＧＤＦ−８は、２−デオキシグルコースを欠く対照培養物中、６７．３ｍｇ／Ｌのレベルに蓄積したが、１ｇ／Ｌの２−デオキシグルコース（６ｇ／Ｌのグルコースと共に）の存在下、α−ＧＤＦ−８は、２８．２２ｍｇ／Ｌのレベルに蓄積しただけであった。さらに、表２から分かるように、２−デオキシグルコース 対 グルコース比が増加するにつれて、細胞培養物中の全力価が減少しただけでなく、比力価生産率（「Ｑｐ」）も減少した。第２継代において、２−デオキシグルコースを含有しない対照培養物は、１６．３７６のＱｐを有したが、１：６の２−デオキシグルコース 対 グルコース比を有する培養物中、Ｑｐは１２．０３８に落ちた。
【０１６６】
【表２】
0005401319.tif 000003
注釈：第１列の数字は、ｇ／Ｌデオキシグルコース 対 ｇ／Ｌグルコース比を示す。
かくして、０．２５／９は、０．２５ｇ／Ｌのデオキシグルコースおよび９ｇ／Ｌのグルコースを示す。
【０１６７】
結論：
実施例１の結果と同様に、細胞培養物中の２−デオキシグルコースの存在は、用量依存的に細胞成長を阻害した。結果として、最終的な細胞密度は、２−デオキシグルコースを補足した培養物中でより低く、発現したα−ＧＤＦ−８の力価は、培養物中の２−デオキシグルコース 対 グルコース比に正比例して減少した。しかしながら、２−デオキシグルコースの存在は、細胞培養物中の細胞の生存能力には、ほとんど影響がないか、または全く影響がないようであった。重要なことには、細胞培養物中の２−デオキシグルコースの存在は、用量依存的に乳酸蓄積を阻害した。乳酸塩は、高い細胞密度での細胞成長および生存能力の既知の阻害剤であるので、これらの結果は、２−デオキシグルコースを細胞培養物に添加すると、より高い最終細胞密度またはより高い細胞密度のより健康な細胞培養物をもたらしうることを明らかにする。
【０１６８】
実施例３：バイオリアクター中におけるα−ＧＤＦ−８細胞の細胞成長および生産性に対する２−デオキシグルコースの影響
序文：
実施例１および２は、培養皿において生育された細胞培養物が低濃度で加えられた２−デオキシグルコースによく耐性があり、２−デオキシグルコースの存在下で乳酸蓄積が減少することを明らかにした。該実施例では、２−デオキシグルコースがバイオリアクター中で生育させた細胞培養中で産生した乳酸塩の量を減少させるかどうか、および２−デオキシグルコースの存在が、特に細胞培養が長期間生育される場合に、成長率の減少のほかに他の有益または不利益な効果を有するかどうかを決定するために実験を行った。
【０１６９】
材料および方法；
α−ＧＤＦ−８細胞を１Ｌバイオリアクター中、培地２中で生育させ、培地３を与えた。培地２および培地３の組成を表３に示す。培養物のいくつかには、０．５ｇ／Ｌの２−デオキシグルコースを培養開始時に補足した。４日目（早期シフト）または６日目（後期シフト）のいずれかに、培養物を３７℃から３１℃にシフトした。バイオリアクター中で生育させる細胞培養物のための実験条件および栄養補給計画を表４に纏める。
【０１７０】
【表３−１】
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【０１７１】
【表３−２】
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【０１７２】
【表３−３】
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【０１７３】
【表４】
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【０１７４】
結果：
図２、３、４および５は、表４に記載の４つの条件下、生産バイオリアクター中で生育させたα−ＧＤＦ−８細胞の毎日の細胞密度、生存能力、乳酸濃度および力価を示す。図２から分かるように、２−デオキシグルコースの存在下で生育させ、後期シフトした細胞の細胞密度は、約４日目に、他の３つの条件のいずれよりも有意に高くなり始めた。さらに２−デオキシグルコースの存在下に生育させた後期シフトした細胞の生存能力は、２−デオキシグルコースの不在下で生育させた後期シフトした細胞の生存能力よりも有意に高かった。図４および図５の比較は、α−ＧＤＦ−８の全力価が培養物中の乳酸量と逆相関することを示す。２つの早期シフト培養物（２−デオキシグルコースを含有するものと、欠如するもの）は、各々、培養終了時までに最低の乳酸レベルを有し、各々、最高の全力価を有した。発明者らは、２−デオキシグルコースを含有した早期シフトした培養物は、２−デオキシグルコースを欠く早期シフトした培養物よりもわずかに低い乳酸レベルを有し、相応して、わずかに高い最終力価を有したことに注目する。同様に、２−デオキシグルコースを含有する後期シフト培養物は、２−デオキシグルコースを欠く後期シフト培養物よりもわずかに低い乳酸レベルを有し、相応して、わずかに高い最終力価を有した。早期シフト培養物は、両方とも、温度シフト日である約４日目に乳酸レベルの減少開始を示した。しかしながら、後期シフト培養物は、両方とも、シフト後に乳酸レベルの減少を示さず、培養周期を通して、乳酸レベルが増加し続けた。
【０１７５】
結論：
実施例１および２における培養皿で２、３日だけ生育させた細胞培養物において見られる細胞密度に対する不利な影響とは対照的に、該実施例は、バイオリアクター中で１２日間生育させた細胞培養物中の２−デオキシグルコースの存在が、２−デオキシグルコースの不在下で生育させた細胞培養物、または２−デオキシグルコースの存在下で生育させたが、２日早く温度シフトした細胞培養物のいずれかよりも、培養終止時に有意に高い細胞密度をもたらすことを明らかにした。さらに、２−デオキシグルコースを含有する後期シフト培養物は、２−デオキシグルコースを欠く後期シフト培養物よりも有意に高い生存能力を示した。さらに、２−デオキシグルコースを含有する培地中で生育させた細胞培養物は、２−デオキシグルコースを欠く培地中で生育させた対応する培養物よりも、得られる乳酸レベルが低かった。しかしながら、重要なことに、早期シフト培養物は、両方とも、温度シフト後に全乳酸レベルの減少を示したが、後期シフト培養物は、両方とも、培養の過程を通して乳酸塩を蓄積し続けた。早期培養物のシフト時の乳酸レベルは、後期シフト培養物のシフト時の乳酸レベルをはるかに下回っていた。かくして、シフト時の乳酸レベルにより、培養中の細胞が乳酸塩を取り込み始めるかどうかを決定することが可能である。しかしながら、２−デオキシグルコースを欠く後期シフト培養物の乳酸レベルは、シフト時に、２日早くシフトした培養物のシフト時の乳酸レベルより有意に高かったが（図４参照、約１０ｇ／Ｌ 対 約４−５ｇ／Ｌ）、２−デオキシグルコースを含有する後期シフト培養物の乳酸レベルは、有意に高くなかった（図４参照、約６ｇ／Ｌ 対 約４−５ｇ／Ｌ）。しかしながら、後期シフトした２−デオキシグルコースを含有する培養物の細胞密度は、有意に高かった（図２参照、約１８ｘｅ６／ｍＬ 対 １２ｘｅ６／ｍＬ）。かくして、シフト時の乳酸レベルのほかに、該実施例は、シフト時の細胞密度もまた、培養物中の細胞が乳酸塩を取り込み始めるどうかの決定において役割を果たしうることを明らかにする。
【０１７６】
最終的に、該実施例は、培養物の力価が培養物中の乳酸レベルに逆相関することを明らかにする。かくして、乳酸塩を取り込み始めた早期シフト培養物は、最も高い最終力価を有し、一方、乳酸塩を蓄積し続けた後期シフト培養物は、最も低い最終力価を有した。それにもかかわらず、２−デオキシグルコースを含有する後期シフト培養物が有意に高い細胞密度を有していた。かくして、過剰な乳酸レベルは、２−デオキシグルコースを含有する培地中で生育させた後期シフト細胞の生産性に影響を及ぼすようである。
【０１７７】
実施例４：バイオリアクター中におけるα−ＧＤＦ−８細胞の細胞成長および生産性に対する２−デオキシグルコースの影響
序文：
実施例３は、バイオリアクター中で１２日間生育させた細胞培養物中における２−デオキシグルコースの存在が、２−デオキシグルコースの不在下で生育させた細胞培養物、または２−デオキシグルコースの存在下で生育させたが、２日早く温度シフトした細胞培養物のいずれかよりも、培養終止時に有意に高い細胞密度をもたらすことを明らかにした。さらに、２−デオキシグルコース含有培養物は、２−デオキシグルコースを欠く対応する培養物よりも低い程度に乳酸塩を蓄積した。しかしながら、シフト時の高乳酸レベルおよび／または高細胞密度のために、後期シフト培養物の力価は、有意に減少した。該実施例では、シフト時の乳酸レベルおよび／または細胞密度を改変することによって、後期シフト培養物の力価を復活させることを試みる。
【０１７８】
材料および方法：
α−ＧＤＦ−８細胞を１Ｌバイオリアクター中、培地２中で生育させ、培地３で補足した。培養物のいくつかには、培養開始時に０．５ｇ／Ｌの２−デオキシグルコースで補足した。細胞には、３ｇ／Ｌのグルコースまたは０．３ｇ／Ｌの２−デオキシグルコースのいずれかが４日目に与えられ、５日目に、１０容量％フィード培地または０．２ｇ／Ｌの２−デオキシグルコースで補足した１０容量％フィード培地を与えた。培養物は、５日目（早期）または６日目（後期）のいずれかに３７℃から３１℃にシフトさせた。７日目および１０日目に付加的なフィードを供給した。バイオリアクター中で生育させる細胞培養物のための実験条件を表５に纏める。
【０１７９】
【表５】
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【０１８０】
結果：
図６、７および８は、表５に記載の４つの条件下、生産バイオリアクター中で生育させたα−ＧＤＦ−８細胞の毎日の細胞密度、乳酸濃度および力価を示す。実施例３に見られる結果と同様に、図６は、２−デオキシグルコースの存在下で生育させた後期シフト細胞の細胞密度が、他の３つの条件のいずれよりも、約５日目で有意に高くなり始めることを示す。図７は、全細胞培養物が低温にシフト後に乳酸レベルの減少を被ったことを示す。さらに、後期にシフトした２−デオキシグルコースを含有する細胞培養物は、２−デオキシグルコースの存在の有無に拘わらず、早期にシフトした細胞培養物より低い最終乳酸濃度を有した。さらに、全乳酸レベルは、２−デオキシグルコースの存在下または不在下のいずれかで生育させた後期シフト細胞培養物間で類似であった。しかしながら、図６は、２−デオキシグルコースの存在下で生育させた後期シフト細胞培養物がより多くの細胞を含有したことを示すので、２−デオキシグルコース培養物中の細胞が２−デオキシグルコースの不在下で生育させた細胞より少量の乳酸塩を生産したか、または何らかの方法で、２−デオキシグルコースもしくは両方の不在下で生育させた細胞より大きな程度まで既存の乳酸塩を代謝したということになる。図８は、α−ＧＤＦ−８の全力価が４つ全ての培養条件について同様であったことを示す。しかしながら、２−デオキシグルコースの存在下で生育させた後期シフト細胞の全細胞密度がより高かったので（図６参照）、後期シフト２−デオキシグルコース細胞は、他の３つの培養条件下で生育させた細胞より、細胞当たり、より少量のα−ＧＤＦ−８を生産しているようである。
【０１８１】
図９は、表５に記載の４つの条件下で生育させたα−ＧＤＦ−８細胞のグルコース取り込み量を示す。培養培地中の２−デオキシグルコースの存在は、グルコース取り込み量の減少をもたらした（図９の第３および第４バー参照）。さらに、２−デオキシグルコースの存在下で生育させた後期シフト細胞は、２−デオキシグルコースの存在下で生育させた早期シフト細胞より低い率でグルコースを取り込んだ。
【０１８２】
結論：
実施例３に見られる結果と同様に、該実施例は、バイオリアクター中で１２日間生育させた細胞培養物中における２−デオキシグルコースの存在が２−デオキシグルコースの不在下で生育させた細胞培養物、または２−デオキシグルコースの存在下で生育させたが、１日早く温度シフトした細胞培養物のいずれかよりも、培養終止時に有意に高い細胞密度をもたらしたことを明らかにする。重要なことに、２−デオキシグルコースの存在下で生育させた細胞は、２−デオキシグルコースの不在下で生育させた細胞よりも、少ない乳酸産生をもたらし、および／または大きな程度まで乳酸塩を消費したようである（図６に示される２つの試料の細胞密度を図７に示される全乳酸蓄積と比較する）。また、２−デオキシグルコースの存在下で生育させた後期シフト細胞培養物は、２−デオキシグルコースの存在下または不在下のいずれかで生育させた早期シフト細胞培養物よりも低い全乳酸レベルを有したことに注目すべきである。最終的に、細胞当たりのα−ＧＤＦ−８産生量は、後期シフト２−デオキシグルコース培養物におけるよりも低いが（図６に示される２つの試料の細胞密度を図８に示される全α−ＧＤＦ−８力価と比較する）、全α−ＧＤＦ−８力価は、２−デオキシグルコースの不在下で生育させた細胞培養物のα−ＧＤＦ−８力価に類似しているので、２−デオキシグルコースの存在は、全細胞密度に対して正の影響を与えるが、実施例３の結果とは対照的に、最終的なα−ＧＤＦ−８力価に対して不利な効果を有しないことが明らかになった。かくして、本発明は、乳酸が温度シフト後に取り込まれるように培養条件を操作することによって、２−デオキシグルコースを含有する後期シフト培養物の細胞密度を、対応する負の影響を全α−ＧＤＦ−８力価に及ぼすことなく、増加させることができることを明らかにする。
【０１８３】
実施例５：高グルコースの存在下、バイオリアクター中におけるα−ＧＤＦ−８細胞の細胞成長および生産性に対する２−デオキシグルコースの影響
序文：
実施例４は、生産バイオリアクター中における２−デオキシグルコースの存在が、細胞を後期に温度シフトした場合、１２日間の最後に、全細胞密度の増加をもたらすことを明らかにした。全α−ＧＤＦ−８力価は、２−デオキシグルコースの不在下で生育させた細胞培養物のα−ＧＤＦ−８力価に類似するが、細胞当たりのα−ＧＤＦ−８産生は有意に低かった。該実施例では、培養物を付加的なグルコースで周期的に補足することによって、細胞当たりのα−ＧＤＦ−８産生を増加することができるかどうかを決定するために実験を行った。
【０１８４】
材料および方法：
α−ＧＤＦ−８細胞を１Ｌバイオリアクター中、培地２で生育させ、培地３で補足した。開始時の培養培地には、０．５ｇ／Ｌの２−デオキシグルコースを補足するか、または補足しなかった。３、５、７、１０および１２日目に、グルコースレベルが約８ｇ／Ｌを超えるように、細胞に補給した。２−デオキシグルコースを欠く培養物は、４日目に３７℃から３１℃にシフトし、一方、２−デオキシグルコースを含有する培養物は、５日目に３７℃〜３１℃にシフトした。
【０１８５】
結果：
図１０、１１、１２、１３および１４は、各々、２−デオキシグルコースの存在下または不在下で生育させたα−ＧＤＦ−８細胞について、毎日の生存細胞密度、力価、乳酸、グルコースレベルおよび比細胞生産性を示す。図１０に示されるように、２つの培養物の細胞密度は、培養の開始時および終止時に同様であるが、２−デオキシグルコースを補足した培養物の細胞密度は、培養の中期段階において、わずかに高かった。図１１は、全α−ＧＤＦ−８力価が２つの培養物間でも類似するが、２−デオキシグルコースを補足した培養物のα−ＧＤＦ−８力価は、１４日にわずかに高いことを示す。かくして、高レベルのグルコースの存在下、実施例３および４で見られる細胞当たりの力価の減少は、排除されたようである。２−デオキシグルコースを含有するか、または欠如する細胞培養物間のα−ＧＤＦ−８産生の類似性は、α−ＧＤＦ−８の毎日の比細胞生産性を示す図１４においても示される。上記３つの実施例において示されたデータと一貫して、図１２は、２−デオキシグルコースを含有する細胞培養中の乳酸蓄積が２−デオキシグルコースを欠く細胞培養物中よりも有意に低いことを示す。図１３は、培養過程にわたる毎日のグルコースレベルを示す。３、５、７、１０および１２日目の急激な増加は、フィード培地の添加に対応した。
【０１８６】
結論：
該実施例は、高レベルのグルコースの存在下、実施例４および５において見られた２−デオキシグルコースの存在下における細胞当たりのα−ＧＤＦ−８産生量の減少が排除されることを明らかにする。さらに、高レベルのグルコースの存在下であっても、２−デオキシグルコースの存在に起因する培養培地中の乳酸レベルの有益な減少が存続する。かくして、２−デオキシグルコースの存在下で生育させた細胞は、１日遅くに温度シフトすることができ、その結果、２−デオキシグルコースの不在下で生育させた細胞よりも、高い全積分生存細胞密度をもたらした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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