(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＲＥＴ計測装置であって、
ドナー蛍光物質で標識されたプローブ要素Ｘとアクセプタ蛍光物質で標識されたプローブ要素Ｙとを含み、前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙが接近あるいは結合したときＦＲＥＴが発生するＦＲＥＴプローブと、前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させる接近・結合特性あるいは前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとが接近あるいは結合した状態から前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを分離させる分離特性を有するか否かが未知である検査対象物と、を含む検査サンプルが流れる管路と、
前記管路に、変調信号を用いて強度変調したレーザ光を出射する光源部と、
前記強度変調した前記レーザ光を前記検査サンプル中の前記ＦＲＥＴプローブに照射することにより前記ＦＲＥＴプローブの発する蛍光を受光して、蛍光信号を出力する受光部と、
前記蛍光信号と前記変調信号とを用いて、前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の前記変調信号に対する位相差を第１の位相差として求め、さらに、前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光強度と、前記アクセプタ蛍光物質が発するアクセプタ蛍光の蛍光強度とを求め、求めた前記第１の位相差から得られる前記ドナー蛍光の蛍光寿命と、前記ドナー蛍光の蛍光強度及び前記アクセプタ蛍光の蛍光強度とを用いて、前記検査対象物が前記接近・結合特性あるいは前記分離特性を有するか否かを判定する分析部と、を有し、
前記光源部において前記変調信号に用いる変調周波数は、前記ＦＲＥＴが発生するときの前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の前記変調信号に対する第２の位相差と、前記ＦＲＥＴが発生しないときの前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の前記変調信号に対する第３の位相差との差を最大にする最適変調周波数に調整されている、ことを特徴とするＦＲＥＴ計測装置。
【請求項２】
前記ＦＲＥＴ計測装置は、さらに、前記変調周波数を調整する周波数調整部を有し、
前記周波数調整部は、
前記ＦＲＥＴプローブを含み、前記ＦＲＥＴプローブの前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させたポジティブコントロールサンプルを前記検査サンプルの替わりに用いて、前記変調周波数を変更しながら、前記管路、前記光源部、前記受光部及び前記分析部を通して求められる前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の前記変調信号に対する位相差を前記第２の位相差として取得し、
さらに、前記ＦＲＥＴプローブを含み、前記ＦＲＥＴプローブの前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させないネガティブコントロールサンプルを前記検査サンプルの替わりに用いて、前記変調周波数を変更しながら、前記管路、前記光源部、前記受光部及び前記分析部を通して求められる前記ドナー蛍光物質の発するドナー蛍光の前記変調信号に対する位相差を前記第３の位相差として取得し、
前記第２の位相差と前記第３の位相差の差から前記最適変調周波数を見つける、請求項１に記載のＦＲＥＴ計測装置。
【請求項３】
前記ポジティブコントロールサンプルを、ＦＲＥＴが発生するＦＲＥＴサンプル群のそれぞれのサンプルとして用いて、前記第２の位相差あるいは前記第２の位相差から得られる蛍光寿命τFRETを求めることにより、前記ＦＲＥＴサンプル群における、前記第２の位相差あるいは前記蛍光寿命τFRETの平均値Ａｖｅ１と標準偏差Ｓｄ１を求め、
さらに、前記ネガティブコントロールサンプルを、ＦＲＥＴが発生しない非フレットサンプル群のそれぞれのサンプルとして用いて、前記第３の位相差あるいは前記第３の位相差から得られる蛍光寿命τNON-FRETを求めることにより、前記非ＦＲＥＴサンプル群における、前記第３の位相差あるいは前記蛍光寿命τNON-FRETの平均値Ａｖｅ２と標準偏差Ｓｄ２を求めたとき、
前記最適変調周波数における下記式で定まる値Ｚが０より大きく１未満である、請求項２に記載のＦＲＥＴ計測装置。
Ｚ＝１−３・（Ｓｄ１＋Ｓｄ２）／｜Ａｖｅ１−Ａｖｅ２｜
【請求項４】
前記ドナー蛍光物質は、蛍光寿命及び蛍光強度の情報を含む蛍光パラメータの値が既知である複数種類の蛍光成分を発し、
前記ＦＲＥＴ計測装置は、さらに、前記変調周波数を調整する周波数調整部を有し、
前記周波数調整部は、前記蛍光パラメータの値を用いて前記変調周波数を変更しながら前記ドナー蛍光の前記変調信号に対する前記第２の位相差及び前記第３の位相差をシミュレーション計算し、このシミュレーション計算の結果に基づいて、前記最適変調周波数を見つける、請求項１に記載のＦＲＥＴ計測装置。
【請求項５】
前記蛍光パラメータの値は、蛍光寿命顕微法を用いて同定されたものである、請求項４に記載のＦＲＥＴ計測装置。
【請求項６】
前記分析部は、
前記ＦＲＥＴプローブを用いて前記ＦＲＥＴが発生するときの前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光寿命τFRETのとり得る範囲と、
前記ＦＲＥＴが発生しないとき前記ドナー蛍光物質が発する前記ドナー蛍光の蛍光寿命τNON-FRETのとり得る範囲と、
前記ＦＲＥＴが発生するとき前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光強度に対する前記アクセプタ蛍光物質が発するアクセプタ蛍光の蛍光強度の比ＲFRETのとり得る範囲と、
前記ＦＲＥＴが発生しないとき前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光強度に対する前記アクセプタ蛍光物質が発するアクセプタ蛍光の蛍光強度の比ＲNON-FRETのとり得る範囲と、を予め取得し、
前記分析部は、前記検査サンプルを用いて求めた前記第１の位相差と前記最適変調周波数とを用いて前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光寿命τsampleを算出するとともに、さらに、前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光強度に対する前記アクセプタ蛍光物質が発するアクセプタ蛍光の蛍光強度の比Ｒsampleを算出し、
算出した前記蛍光寿命τsample及び前記蛍光強度の比Ｒsampleから、前記蛍光寿命τFRETのとり得る範囲と、前記蛍光寿命τNON-FRETのとり得る範囲と、前記比ＲFRETのとり得る範囲と、前記比ＲNON-FRETのとり得る範囲とに基いて、前記検査対象物の前記接近・結合特性あるいは前記分離特性の有無を判定する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＦＲＥＴ計測装置。
【請求項７】
前記分析部は、
前記ＦＲＥＴプローブを含み、前記ＦＲＥＴプローブの前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させたポジティブコントロールサンプルを前記検査サンプルの替わりに用いて、前記管路、前記光源部、前記受光部及び前記分析部を通して求められる前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の前記変調信号に対する位相差を前記第２の位相差として求め、前記第２の位相差と前記変調周波数から、前記ＦＲＥＴが発生するとき前記ドナー蛍光物質が発する前記ドナー蛍光の蛍光寿命τFRETを複数求め、
さらに、前記ポジティブコントロールサンプルを前記検査サンプルの替わりに用いて、前記管路、前記光源部、前記受光部及び前記分析部を通して求められる前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光強度と前記アクセプタ蛍光物質が発するアクセプタ蛍光の蛍光強度から前記比ＲFRETを複数求めることにより、前記蛍光寿命τFRETのとり得る範囲及び前記比ＲFRETのとり得る範囲を求め、
さらに、前記ＦＲＥＴプローブを含み、前記ＦＲＥＴプローブの前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを近接あるいは結合させないネガティブコントロールサンプルを前記検査サンプルの替わりに用いて、前記管路、前記光源部、前記受光部及び前記分析部を通して計測される前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の前記変調信号に対する位相差を前記第３の位相差として求め、前記第３の位相差と前記変調周波数から、前記ＦＲＥＴが発生しないとき前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光緩和寿命τNON-FRETを複数求め、
さらに、前記ネガティブコントロールサンプルを前記検査サンプルの替わりに用いて、前記管路、前記光源部、前記受光部及び前記分析部を通して求められる前記ドナー蛍光の蛍光強度と前記アクセプタ蛍光物質が発するアクセプタ蛍光の蛍光強度から前記比ＲNON-FRETを複数求めることにより、前記蛍光寿命τFRETのとり得る範囲及び前記比ＲNON-FRETのとり得る範囲を求める、請求項６に記載のＦＲＥＴ計測装置。
【請求項８】
管路、光源部、受光部、及び分析部を有する装置を用いて行うＦＲＥＴ計測方法であって、
ドナー蛍光物質を含むプローブ要素Ｘとアクセプタ蛍光物質を含むプローブ要素Ｙとを含み、前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙが接近あるいは結合したときＦＲＥＴが発生するＦＲＥＴプローブと、前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させる特性あるいは前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙが接近あるいは結合した状態から前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを分離する特性を有するか否かが未知である検査対象物と、を含む検査サンプルを管路に流す工程と、
光源部が前記管路に、変調信号を用いて強度変調したレーザ光を出射する工程と、
前記強度変調した前記レーザ光を前記検査サンプル中のＦＲＥＴプローブに照射することにより前記ＦＲＥＴプローブが発する蛍光を受光部が受光して、蛍光信号を出力する工程と、
前記蛍光信号と前記変調信号とを用いて、分析部が、前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の前記変調信号に対する位相差を第１の位相差として求め、さらに、前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光強度と、前記アクセプタ蛍光物質が発するアクセプタ蛍光の蛍光強度とを求め、求めた前記第１の位相差から得られる前記ドナー蛍光の蛍光寿命と前記ドナー蛍光の蛍光強度及び前記アクセプタ蛍光の蛍光強度とを用いて、前記検査対象物が前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させる接近・結合特性、あるいは分離させる分離特性を有するか否かを判定する工程と、を有し、
前記レーザ光の強度変調のために前記変調信号に用いる変調周波数は、前記ＦＲＥＴが発生するとき前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の前記変調信号に対する第２の位相差と、前記ＦＲＥＴが発生しないとき前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の前記変調信号に対する第３の位相差との差を最大にする最適変調周波数に調整されている、ことを特徴とするＦＲＥＴ計測方法。
【請求項９】
前記ＦＲＥＴ計測方法は、さらに、前記変調周波数を調整する工程を有し、
前記変調周波数を調整するとき、
前記ＦＲＥＴプローブを含み、前記ＦＲＥＴプローブの前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させたポジティブコントロールサンプルを前記検査サンプルの替わりに用いて、前記変調周波数を変更しながら、前記管路、前記光源部、前記受光部及び前記分析部を通して求められる前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の前記変調信号に対する位相差を前記第２の位相差として取得し、
さらに、前記ＦＲＥＴプローブを含み、前記ＦＲＥＴプローブの前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させないネガティブコントロールサンプルを前記検査サンプルの替わりに用いて、前記変調周波数を変更しながら、前記管路、前記光源部、前記受光部及び前記分析部を通して求められる前記ドナー蛍光物質の発するドナー蛍光の前記変調信号に対する位相差を前記第３の位相差として取得し、
前記第２の位相差と前記第３の位相差の差から前記最適変調周波数を見つける、請求項８に記載のＦＲＥＴ計測方法。
【請求項１０】
前記ポジティブコントロールサンプルを、ＦＲＥＴが発生するＦＲＥＴサンプル群のそれぞれのサンプルとして用いて、前記第２の位相差あるいは前記第２の位相差から得られる蛍光寿命τFRETを求めることにより、前記ＦＲＥＴサンプル群における、前記第２の位相差あるいは前記蛍光寿命τFRETの平均値Ａｖｅ１と標準偏差Ｓｄ１を求め、
さらに、前記ネガティブコントロールサンプルを、ＦＲＥＴが発生しない非ＦＲＥＴサンプル群のそれぞれのサンプルとして用いて、前記第３の位相差あるいは前記第３の位相差から得られる蛍光寿命τNON-FRETを求めることにより、前記非ＦＲＥＴサンプル群における、前記第３の位相差あるいは前記蛍光寿命τNON-FRETの平均値Ａｖｅ２と標準偏差Ｓｄ２を求めたとき、
前記最適変調周波数における下記式で定まる値Ｚが０より大きく１未満である、請求項９に記載のＦＲＥＴ計測方法。
Ｚ＝１−３・（Ｓｄ１＋Ｓｄ２）／｜Ａｖｅ１−Ａｖｅ２｜
【請求項１１】
前記ドナー蛍光物質は、蛍光寿命及び蛍光強度の情報を含む蛍光パラメータの値が既知である複数種類の蛍光成分を発し、
前記ＦＲＥＴ計測方法は、さらに、前記変調周波数を調整する工程を有し、
前記変調周波数を調整するとき、前記蛍光パラメータの値を用いて前記変調周波数を変更しながら前記変調信号に対する前記ドナー蛍光の前記第２の位相差及び前記第３の位相差をシミュレーション計算し、このシミュレーション計算の結果に基づいて、前記最適変調周波数を見つける、請求項８に記載のＦＲＥＴ計測方法。
【請求項１２】
前記蛍光パラメータの値は、蛍光寿命顕微法を用いて同定されたものである、請求項１０に記載のＦＲＥＴ計測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドナー蛍光物質を含むプローブ要素Ｘとアクセプタ蛍光物質を含むプローブ要素Ｙとを含み、プローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙが接近あるいは結合したときＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer:蛍光共鳴エネルギー移動）が発生するＦＲＥＴプローブを用いたＦＲＥＴ計測装置及びＦＲＥＴ計測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、医療、創薬、食品産業におけるポストゲノム関連技術として、タンパク質（以降、タンパクともいう）の機能解析が重要となっている。特に、細胞の作用を解析するために、生細胞における生体物質であるタンパク質と、他のタンパク質や低分子化合物との間の相互作用（結合、分離）の研究が必要である。
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）現象を利用して、生細胞における生体物質であるタンパク質と、他のタンパク質や低分子化合物との間の相互作用の解析が行われている。ＦＲＥＴ現象により生じる蛍光を測定することにより、数ナノメータの領域での分子間の相互作用を測定することができる。ＦＲＥＴは、ドナー蛍光物質が照射されたレーザ光により励起したとき、蛍光を発することなく接近しているアクセプタ蛍光物質に励起エネルギーの一部が移動して、アクセプタ蛍光物質が蛍光を発する現象をいう。【０００３】
従来、タンパク質等の生体物質に蛍光物質を与えてＦＲＥＴの発生の有無を調べるとき、レーザ光を照射した蛍光物質が発する蛍光強度の変化に基いてＦＲＥＴの発生の有無を調べる方法が用いられてきた。この方法では、具体的には、ドナー蛍光物質から励起エネルギーの一部が移動することにより、ドナー蛍光物質の発するドナー蛍光の蛍光強度が低下する低減量、アクセプタ蛍光物質が、移動した励起エネルギーを用いてアクセプタ蛍光を発することにより蛍光強度が増加する増加量が計測される。しかし、この方法では、上記低減量及び増加量は、測定対象物に含まれるドナー蛍光物質やアクセプタ蛍光物質の量（標識量）に応じて変化するため、必ずしもＦＲＥＴの発生の有無を正しく判定することができなかった。【０００４】
これに対して、ドナー蛍光物質やアクセプタ蛍光物質が測定対象物に含まれる標識量に影響を受け難い方法として、ドナー蛍光物質の発するドナー蛍光の蛍光寿命を計測し、この蛍光寿命の変化によってＦＲＥＴの発生の有無を判定する方法が知られている（特許文献１）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−２４０４２４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記方法では、蛍光寿命の変化を、ドナー蛍光の蛍光強度が低下する低減量及びアクセプタ蛍光の蛍光強度の増加量とともに用いることによってＦＲＥＴの発生の有無をより正確に判定することができる。上記方法では、ドナー蛍光物質の発するドナー蛍光の種類が１種類（蛍光寿命が同じ）であれば正確に蛍光寿命の変化を捉えて、ＦＲＥＴの発生の有無を判定することができる。しかし、ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光が、異なる蛍光寿命を持つ複数種類の蛍光成分を含んでいる場合、正確にＦＲＥＴの発生の有無を判定することができない場合があった。特に、生体物質等を計測対象とする場合、標識として用いるドナー蛍光物質やアクセプタ蛍光物質は蛍光タンパクが用いられる。しかし、蛍光タンパクには複数種類の蛍光成分、すなわち複数種類の蛍光寿命を持った蛍光成分を発するため、蛍光タンパクをドナー蛍光物質に用いると、正確にＦＲＥＴの発生の有無を判定することができない場合があった。【０００７】
そこで、本発明は、ＦＲＥＴの発生の有無を正確に判定することができるＦＲＥＴ計測装置及びＦＲＥＴ計測方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様は、ＦＲＥＴ計測装置である。当該装置は、
ドナー蛍光物質で標識されたプローブ要素Ｘとアクセプタ蛍光物質で標識されたプローブ要素Ｙとを含み、前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙが接近あるいは結合したときＦＲＥＴが発生するＦＲＥＴプローブと、前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させる接近・結合特性あるいは前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとが接近あるいは結合した状態から前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを分離させる分離特性を有するか否かが未知である検査対象物と、を含む検査サンプルが流れる管路と、
前記管路に、変調信号を用いて強度変調したレーザ光を出射する光源部と、
前記強度変調した前記レーザ光を前記検査サンプル中の前記ＦＲＥＴプローブに照射することにより前記ＦＲＥＴプローブの発する蛍光を受光して、蛍光信号を出力する受光部と、
前記蛍光信号と前記変調信号とを用いて、前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の前記変調信号に対する位相差を第１の位相差として求め、さらに、前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光強度と、前記アクセプタ蛍光物質が発するアクセプタ蛍光の蛍光強度とを求め、求めた前記第１の位相差から得られる前記ドナー蛍光の蛍光寿命と、前記ドナー蛍光の蛍光強度及び前記アクセプタ蛍光の蛍光強度とを用いて、前記検査対象物が前記接近・結合特性あるいは前記分離特性を有するか否かを判定する分析部と、を有する。
前記光源部において前記変調信号に用いる変調周波数は、前記ＦＲＥＴが発生するときの前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の前記変調信号に対する第２の位相差と、前記ＦＲＥＴが発生しないときの前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の前記変調信号に対する第３の位相差との差を最大にする最適変調周波数に調整されている。【０００９】
前記ＦＲＥＴ計測装置は、さらに、前記変調周波数を調整する周波数調整部を有することが好ましい。その際、前記周波数調整部は、
前記ＦＲＥＴプローブを含み、前記ＦＲＥＴプローブの前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させたポジティブコントロールサンプルを前記検査サンプルの替わりに用いて、前記変調周波数を変更しながら、前記管路、前記光源部、前記受光部及び前記分析部を通して求められる前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の前記変調信号に対する位相差を前記第２の位相差として取得する。
前記周波数調整部は、さらに、前記ＦＲＥＴプローブを含み、前記ＦＲＥＴプローブの前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させないネガティブコントロールサンプルを前記検査サンプルの替わりに用いて、前記変調周波数を変更しながら、前記管路、前記光源部、前記受光部及び前記分析部を通して求められる前記ドナー蛍光物質の発するドナー蛍光の前記変調信号に対する位相差を前記第３の位相差として取得する。
前記周波数調整部は、前記第２の位相差と前記第３の位相差の差から前記最適変調周波数を見つける。【００１０】
このとき、前記ポジティブコントロールサンプルを、ＦＲＥＴが発生するＦＲＥＴサンプル群のそれぞれのサンプルとして用いて、前記第２の位相差あるいは前記第２の位相差から得られる蛍光寿命τFRETを求めることにより、前記ＦＲＥＴサンプル群における、前記第２の位相差あるいは前記蛍光寿命τFRETの平均値Ａｖｅ１と標準偏差Ｓｄ１を求め、
さらに、前記ネガティブコントロールサンプルを、ＦＲＥＴが発生しない非フレットサンプル群のそれぞれのサンプルとして用いて、前記第３の位相差あるいは前記第３の位相差から得られる蛍光寿命τNON-FRETを求めることにより、前記非ＦＲＥＴサンプル群における、前記第３の位相差あるいは前記蛍光寿命τNON-FRETの平均値Ａｖｅ２と標準偏差Ｓｄ２を求めたとき、前記最適変調周波数における下記式で定まる値Ｚが０より大きく１未満である、ことが好ましい。
Ｚ＝１−３・（Ｓｄ１＋Ｓｄ２）／｜Ａｖｅ１−Ａｖｅ２｜。【００１１】
前記ドナー蛍光物質は、例えば、蛍光寿命及び蛍光強度の情報を含む蛍光パラメータの値が既知である複数種類の蛍光成分を発する。この場合、前記ＦＲＥＴ計測装置は、さらに、前記変調周波数を調整する周波数調整部を有することが好ましい。
前記周波数調整部は、前記蛍光パラメータの値を用いて前記変調周波数を変更しながら前記変調信号に対する前記ドナー蛍光の前記第２の位相差及び前記第３の位相差をシミュレーション計算し、このシミュレーション計算の結果に基づいて、前記最適変調周波数を見つける。【００１２】
このとき、前記蛍光パラメータの値は、蛍光寿命顕微法を用いて同定されたものであることが好ましい。【００１３】
前記分析部は、以下の処理を行うことが好ましい。すなわち、前記分析部は、
前記ＦＲＥＴプローブを用いて前記ＦＲＥＴが発生するときの前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光寿命τFRETのとり得る範囲と、
前記ＦＲＥＴが発生しないとき前記ドナー蛍光物質が発する前記ドナー蛍光の蛍光寿命τNON-FRETのとり得る範囲と、
前記ＦＲＥＴが発生するとき前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光強度に対する前記アクセプタ蛍光物質が発するアクセプタ蛍光の蛍光強度の比ＲFRETのとり得る範囲と、
前記ＦＲＥＴが発生しないとき前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光強度に対する前記アクセプタ蛍光物質が発するアクセプタ蛍光の蛍光強度の比ＲNON-FRETのとり得る範囲と、を予め取得する。
前記分析部は、前記検査サンプルを用いて求めた前記第１の位相差と前記最適変調周波数とを用いて前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光寿命τsampleを算出するとともに、さらに、前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光強度に対する前記アクセプタ蛍光物質が発するアクセプタ蛍光の蛍光強度の比Ｒsampleを算出し、
算出した前記蛍光寿命τsample及び前記蛍光強度の比Ｒsampleから、前記蛍光寿命τFRETのとり得る範囲と、前記蛍光寿命τNON-FRETのとり得る範囲と、前記比ＲFRETのとり得る範囲と、前記比ＲNON-FRETのとり得る範囲とに基いて、前記検査対象物の前記接近・結合特性あるいは前記分離特性の有無を判定する。【００１４】
その際、前記分析部は、
前記ＦＲＥＴプローブを含み、前記ＦＲＥＴプローブの前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させたポジティブコントロールサンプルを前記検査サンプルの替わりに用いて、前記管路、前記光源部、前記受光部及び前記分析部を通して求められる前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の前記変調信号に対する位相差を前記第２の位相差として求め、前記第２の位相差と前記変調周波数から、前記ＦＲＥＴが発生するとき前記ドナー蛍光物質が発する前記ドナー蛍光の蛍光寿命τFRETを複数求め、
さらに、前記ポジティブコントロールサンプルを前記検査サンプルの替わりに用いて、前記管路、前記光源部、前記受光部及び前記分析部を通して求められる前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光強度と前記アクセプタ蛍光物質が発するアクセプタ蛍光の蛍光強度から前記比ＲFRETを複数求めることにより、前記蛍光寿命τFRETのとり得る範囲及び前記比ＲFRETのとり得る範囲を求める。
さらに、前記ＦＲＥＴプローブを含み、前記ＦＲＥＴプローブの前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを近接あるいは結合させないネガティブコントロールサンプルを前記検査サンプルの替わりに用いて、前記管路、前記光源部、前記受光部及び前記分析部を通して計測される前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の前記変調信号に対する位相差を前記第３の位相差として求め、前記第３の位相差と前記変調周波数から、前記ＦＲＥＴが発生しないとき前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光緩和寿命τNON-FRETを複数求め、
前記分析部は、さらに、前記ネガティブコントロールサンプルを前記検査サンプルの替わりに用いて、前記管路、前記光源部、前記受光部及び前記分析部を通して求められる前記ドナー蛍光の蛍光強度と前記アクセプタ蛍光物質が発するアクセプタ蛍光の蛍光強度から前記比ＲNON-FRETを複数求めることにより、前記蛍光寿命τFRETのとり得る範囲及び前記比ＲNON-FRETのとり得る範囲を求める。【００１５】
また、本発明の他の一態様は、管路、光源部、受光部、及び分析部を有する装置を用いて行うＦＲＥＴ計測方法である。当該方法は、
ドナー蛍光物質を含むプローブ要素Ｘとアクセプタ蛍光物質を含むプローブ要素Ｙとを含み、前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙが接近あるいは結合したときＦＲＥＴが発生するＦＲＥＴプローブと、前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させる特性あるいは前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙが接近あるいは結合した状態から前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを分離する特性を有するか否かが未知である検査対象物と、を含む検査サンプルを管路に流す工程と、
光源部が前記管路に、変調信号を用いて強度変調したレーザ光を出射する工程と、
前記強度変調した前記レーザ光を前記検査サンプル中のＦＲＥＴプローブに照射することにより前記ＦＲＥＴプローブが発する蛍光を受光部が受光して、蛍光信号を出力する工程と、
前記蛍光信号と前記変調信号とを用いて、分析部が、前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の前記変調信号に対する位相差を第１の位相差として求め、さらに、前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の蛍光強度と、前記アクセプタ蛍光物質が発するアクセプタ蛍光の蛍光強度とを求め、求めた前記第１の位相差から得られる前記ドナー蛍光の蛍光寿命と前記ドナー蛍光の蛍光強度及び前記アクセプタ蛍光の蛍光強度とを用いて、前記検査対象物が前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させる接近・結合特性、あるいは分離させる分離特性を有するか否かを判定する工程と、を有する。
前記レーザ光の強度変調のために前記変調信号に用いる変調周波数は、前記ＦＲＥＴが発生するとき前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の前記変調信号に対する第２の位相差と、前記ＦＲＥＴが発生しないとき前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の前記変調信号に対する第３の位相差との差を最大にする最適変調周波数に調整されている。【００１６】
前記ＦＲＥＴ計測方法は、さらに、前記変調周波数を調整する工程を有することが好ましい。
前記変調周波数を調整するとき、
前記ＦＲＥＴプローブを含み、前記ＦＲＥＴプローブの前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させたポジティブコントロールサンプルを前記検査サンプルの替わりに用いて、前記変調周波数を変更しながら、前記管路、前記光源部、前記受光部及び前記分析部を通して求められる前記ドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の前記変調信号に対する位相差を前記第２の位相差として取得し、
さらに、前記ＦＲＥＴプローブを含み、前記ＦＲＥＴプローブの前記プローブ要素Ｘと前記プローブ要素Ｙとを接近あるいは結合させないネガティブコントロールサンプルを前記検査サンプルの替わりに用いて、前記変調周波数を変更しながら、前記管路、前記光源部、前記受光部及び前記分析部を通して求められる前記ドナー蛍光物質の発するドナー蛍光の前記変調信号に対する位相差を前記第３の位相差として取得し、
前記第２の位相差と前記第３の位相差の差から前記最適変調周波数を見つける。【００１７】
このとき、前記ポジティブコントロールサンプルを、ＦＲＥＴが発生するＦＲＥＴサンプル群のそれぞれのサンプルとして用いて、前記第２の位相差あるいは前記第２の位相差から得られる蛍光寿命τFRETを求めることにより、前記ＦＲＥＴサンプル群における、前記第２の位相差あるいは前記ＦＲＥＴ蛍光寿命の平均値Ａｖｅ１と標準偏差Ｓｄ１を求め、
さらに、前記ネガティブコントロールサンプルを、ＦＲＥＴが発生しない非ＦＲＥＴサンプル群のそれぞれのサンプルとして用いて、前記第３の位相差あるいは前記第３の位相差から得られる蛍光寿命τNON-FRETを求めることにより、前記非ＦＲＥＴサンプル群における、前記第３の位相差あるいは前記蛍光寿命τNON-FRETの平均値Ａｖｅ２と標準偏差Ｓｄ２を求めたとき、前記最適変調周波数における下記式で定まる値Ｚが０より大きく１未満である、ことが好ましい。
Ｚ＝１−３・（Ｓｄ１＋Ｓｄ２）／｜Ａｖｅ１−Ａｖｅ２｜。【００１８】
前記ドナー蛍光物質は、蛍光寿命及び蛍光強度の情報を含む蛍光パラメータの値が既知である複数種類の蛍光成分を発する場合、前記ＦＲＥＴ計測方法は、さらに、前記変調周波数を調整する工程を有することが好ましい。
前記変調周波数を調整するとき、前記蛍光パラメータの値を用いて前記変調周波数を変更しながら前記変調信号に対する前記ドナー蛍光の前記第２の位相差及び前記第３の位相差をシミュレーション計算し、このシミュレーション計算の結果に基づいて、前記最適変調周波数を見つけることが好ましい。【００１９】
その際、前記蛍光パラメータの値は、蛍光寿命顕微法を用いて同定されたものであることが好ましい。
【発明の効果】
【００２０】
上述のＦＲＥＴ計測装置及びＦＲＥＴ計測方法では、ＦＲＥＴの発生の有無を正確に判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】（ａ）〜（ｃ）は、計測プローブの種々の状態を説明する図である。
【図２】図１に示す計測プローブのドナー蛍光物質及びアクセプタ蛍光物質のエネルギー吸収スペクトルと蛍光放射スペクトルの一例を示す図である。
【図３】本発明のＦＲＥＴ計測装置の一実施形態であるフローサイトメータの概略構成図である。
【図４】本実施形態の受光部の一例を示す概略構成図である。
【図５】本実施形態の制御・処理部の一例を示す概略構成図である。
【図６】本実施形態の分析部の一例を示す概略構成図である。
【図７】（ａ）は、変調周波数を２８ＭＨｚとしたときに本実施形態のフローサイトメータで計測された位相差頻度グラムであり、（ｂ）は、変調周波数を１５０ＭＨｚとしたときに本実施形態のフローサイトメータで計測された位相差頻度グラムの一例である。
【図８】（ａ）は、周知の蛍光寿命顕微法を用いて計測し同定されたドナー蛍光の蛍光パラメータの例を示す図であり、（ｂ）は、（ａ）に示す蛍光パラメータの値を用いてシミュレーション計算して得られた第２の位相差および第３の位相差の周波数特性の一例を示す図である。
【図９】本実施形態のＦＲＥＴ計測方法の一例のフローを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明のＦＲＥＴ計測装置及びＦＲＥＴ計測方法について詳細に説明する。
【００２３】
［計測プローブ］
本実施形態で用いる計測プローブは、ＦＲＥＴ計測装置の一実施形態である後述するフローサイトメータ１０で用いるプローブである。この計測プローブは、ドナー蛍光物質で標識されたプローブ要素Ｘとアクセプタ蛍光物質で標識されたプローブ要素Ｙとを含むＦＲＥＴプローブである。プローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙが接近して（あるいは結合）してドナー蛍光物質とアクセプタ蛍光物質が近接したとき（例えば数ｎｍの範囲内に位置するとき）、ＦＲＥＴが発生する。本実施形態のフローサイトメータ１０は、このＦＲＥＴプローブを、検査対象物（例えば薬剤）とともに含んだ検査サンプルを用いて、ＦＲＥＴの発生の有無を判定する。検査サンプルは、例えば、計測プローブ及び検査対象物を取り込んだ生体細胞である。検査サンプルは、計測プローブ及び検査対象物を、生体細胞を介さず検査サンプル中に直接含んだ懸濁液であってもよい。
この計測プローブを用いることにより、検査対象物は、プローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとを接近（あるいは結合）させる接近・結合特性、あるいはプローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙが接近（結合）した状態からプローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとを分離させる分離特性を有するか否かを調べることができる。例えば、薬剤が、プローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとの接近（あるいは結合）を誘発する接近・結合特性、あるいは、プローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとの接近（あるいは結合）を阻止する分離特性を有するかを調べることができる。また、生体細胞内、例えば細胞核内に取り込まれた検査プローブと検査対象物との間の作用の強弱を、生体細胞の中で調べることができる。また、生体細胞の環境が変化することによって、あるいは生体細胞が例えば細胞核内である物質を生成することによって、検査プローブと検査対象物との間の作用が変化するか否かを調べることもできる。
なお、本実施形態のプローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとは、２つの別体の要素で１つのプローブ本体が形成されてもよいし、１つのプローブ本体の一部がプローブ要素Ｘ、プローブ要素Ｙとして形成されてもよい。１つのプローブ本体の一部がプローブ要素Ｘ、プローブ要素Ｙであり、プローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとが接近（あるいは結合）する場合、１つのプローブ本体の屈曲角度が大きくなって折れ曲がった形状に変形することによってプローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとが互いに接近（あるいは結合）する。プローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとが分離する場合、１つのプローブ本体が折れ曲がった状態から屈曲角度が小さくなるように変形することによってプローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとが互いに分離することになる。
【００２４】
図１（ａ）〜（ｃ）は、計測プローブ１の種々の状態を説明する図である。計測プローブ１は、ドナー蛍光物質２で標識したプローブ要素Ｘとアクセプタ蛍光物質３で標識したプローブ要素Ｙとを含む。
図１（ａ）では、ドナー蛍光物質２で標識したプローブ要素Ｘと、アクセプタ蛍光物質Ｙで標識したプローブ要素Ｙとが互いに分離された状態を示している。この状態で検査対象物４が与えられると、図１（ｂ）に示すように、プローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙが接近（あるいは結合）し、これによりドナー蛍光物質２とアクセプタ蛍光物質３がＦＲＥＴを発生させる程度に近接する。さらに、図１（ｂ）の状態において、さらに、別の検査対象物５を与えると、標識されたプローブ要素Ｘと、アクセプタ蛍光物質Ｙで標識されたプローブ要素Ｙとは、ドナー蛍光物質２とアクセプタ蛍光物質３がＦＲＥＴを発生しない程度に分離される。本実施形態では、プローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとを接近（あるいは結合）させる接近・結合特性、あるいはプローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとが接近（あるいは結合）した状態からプローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとを分離させる分離特性を有することが未知である検査対象物４，５のような検査対象物を、ＦＲＥＴ計測装置の検査対象として用いる。勿論、ＦＲＥＴは、ドナー蛍光物質２にレーザ光が照射されることにより発生する。
また、図１（ａ）〜（ｃ）では、プローブ要素Ｘ，Ｙにそれぞれドナー蛍光物質２及びアクセプタ蛍光物質３が紐付けされるように標識されるが、紐付けの方法は特に限定されず、どのような方法でドナー蛍光物質２及びアクセプタ蛍光物質３が標識されてもよい。
【００２５】
図２は、ドナー蛍光物質２及びアクセプタ蛍光物質３のエネルギー吸収スペクトルと蛍光放射スペクトルの一例を示す図である。ドナー蛍光物質２には、例えばＣＦＰ（Cyan Fluorescent Protein）が用いられ、アクセプタ蛍光物質３には、例えばＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）が用いられ得る。
曲線Ａ１はドナー蛍光物質２のエネルギー吸収スペクトルの一例であり、曲線Ａ２はドナー蛍光物質２の蛍光放射スペクトルの一例である。また、曲線Ｂ１はアクセプタ蛍光物質３のエネルギー吸収スペクトルの一例であり、曲線Ｂ２はアクセプタ蛍光物質３の蛍光放射スペクトルの一例である。
図２に示されるように、ドナー蛍光物質２が主にエネルギーを吸収する波長領域は、４０５ｎｍ〜４５０ｎｍである。また、アクセプタ蛍光物質３が主にエネルギーを吸収する波長領域は、４７０ｎｍ〜５３０ｎｍである。
【００２６】
一般に、ドナー蛍光物質２とアクセプタ蛍光物質３との距離が２ｎｍ以下である場合、レーザ光の照射によりドナー蛍光物質２が吸収したエネルギーの一部が、クーロン相互作用によりアクセプタ蛍光物質３へ移動する。アクセプタ蛍光物質３は、クーロン相互作用によりドナー蛍光物質２から移動したエネルギーを吸収することにより励起され、蛍光を発する。この現象が蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）である。この場合、ドナー蛍光物質２の蛍光放射スペクトルである曲線Ａ２は、アクセプタ蛍光物質３のエネルギー吸収スペクトルである曲線Ｂ１と波長領域でより多く重なっていることがＦＲＥＴを強く発生させる点で好ましい。
このような計測プローブ１を用いるとき、後述するフローサイトメータ１０で用いるレーザ光の強度変調に用いる変調信号の変調周波数を、後述する第２の位相差と後述する第３の位相差との差を最大にする最適変調周波数に設定する。第２の位相差とは、計測プローブ１においてＦＲＥＴが発生するときのドナー蛍光の上記変調信号に対する位相差である。第３の位相差とは、計測プローブ１においてＦＲＥＴが発生しないときのドナー蛍光の上記変調信号に対する位相差である。これにより、フローサイトメータ１０は、ＦＲＥＴの発生の有無を正確に判定することができる。以降の説明では、ドナー蛍光物質２が発する蛍光はドナー蛍光といい、アクセプタ蛍光物質２が発する蛍光はアクセプタ蛍光という。
【００２７】
［ＦＲＥＴ計測装置］
図３は、本発明のＦＲＥＴ計測装置の一実施形態であるフローサイトメータ１０の概略構成図である。
本実施形態のフローサイトメータ１０は、例えば、計測プローブ１と検査対象物５を含んだ検査サンプルにレーザ光を照射し、検査サンプル中の計測プローブ１が発する蛍光を計測する。計測された蛍光信号を用いることにより、フローサイトメータ１０は、ＦＲＥＴの判定を行う。
図３に示されるように、フローサイトメータ１０は、管路２０と、光源部３０と、受光部４０，５０と、制御・処理部１００と、分析部１５０と、を備える。
【００２８】
管路２０は、高速流を形成するシース液とともに検査サンプルを同時に流し、計測プローブ１を含む検査サンプルが一列に流れるラミナーシースフローを形成する。管路２０の途中には、レーザ光の照射位置があり、測定点を形成している。この測定点で、計測プローブ１を含む検査サンプルが順次レーザ光の照射を受けて蛍光を発する。管路２０の出口には、検査サンプルを回収する回収容器２２が設けられている。
検査サンプルに含まれる計測プローブ１は、図１（ｂ）に示すように、プローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとが接近（あるいは結合）してドナー蛍光物質２とアクセプタ蛍光物質３とが近接した状態（ＦＲＥＴは発生する状態）にあり、この状態の計測プローブ１に検査対象物５が与えられたとき、図１（ｃ）に示すように、プローブ要素Ｘ及びプローブ要素Ｙとが分離されてドナー蛍光物質２とアクセプタ蛍光物質３との間でＦＲＥＴが生じない状態に変化したか否かをフローサイトメータ１０は判定する。
この他に、説明はしないが、図１（ａ）に示すように、プローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとが分離した状態において、検査対象物４が与えられたとき、図１（ｂ）に示すように、プローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとが接近（あるいは結合）してドナー蛍光物質２とアクセプタ蛍光物質３とが近接し、ＦＲＥＴが生じる状態に変化したか否かを、フローサイトメータ１０が判定することもできる。
【００２９】
光源部３０は、変調信号を用いて強度変調したレーザ光を管路２０の測定点を通過する計測プローブ１に照射する。計測プローブ１にレーザ光が照射されることにより、ドナー蛍光物質２が主にエネルギーを吸収する。例えば、ドナー蛍光物質２がＣＦＰ（Cyan Fluorescent Protein）、アクセプタ蛍光物質３がＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）である場合、ドナー蛍光物質２が主にエネルギーを吸収する波長４０５ｎｍ〜４５０ｎｍのレーザ光が用いられる。光源部３０は、例えば、半導体レーザを含む。光源部３０が出射するレーザ光の出力は、例えば、５ｍＷ〜１００ｍＷである。光源部３０から出射したレーザ光の照射を受けた計測プローブ１は、蛍光を発し、この蛍光は受光部５０で受光される。
【００３０】
受光部４０は、管路２０を挟んで光源部３０と対向するように配置されている。受光部４０は、測定点を通過する計測プローブ１によってレーザ光が前方散乱することにより、計測プローブ１が測定点を通過する旨の検出信号を出力する光電変換器を備える。受光部４０から出力される信号は、制御・処理部１００に供給される。受光部４０から制御・処理部１００に供給される信号は、計測プローブ１が管路２０中の測定点を通過するタイミングを知らせ、制御・処理部１００の処理及び制御を開始させるトリガ信号として用いられる。
【００３１】
受光部５０は、測定点を通り、光源部３０から出射されるレーザ光の出射方向に対して直交する平面と、測定点を通り、管路２０中の計測プローブ１の移動方向に対して直交する平面との交線上に配置されている。受光部５０は、測定点にてレーザ光を照射された計測プローブ１が発する蛍光を受光する光電子増倍管やアバランシェフォトダイオード等の光電変換器を備える。
【００３２】
図４は、本実施形態の受光部５０の一例を示す概略構成図である。図４に示されるように、受光部５０は、レンズ系５１と、ダイクロイックミラー５２と、バンドパスフィルター５３，５４と、光電変換器５５，５６と、を備える。
レンズ系５１は、計測プローブ１が発する蛍光を集束させる。ダイクロイックミラー５２は、アクセプタ蛍光物質３が発する蛍光を透過し、ドナー蛍光物質２が発する蛍光を反射させるように、反射、透過の波長特性が定められている。
【００３３】
バンドパスフィルター５３，５４は、光電変換器５５，５６の受光面の前面に設けられる。バンドパスフィルター５３，５４は、所定の波長帯域の蛍光のみを透過させる。具体的には、バンドパスフィルター５３は、ドナー蛍光物質２が発するドナー蛍光の波長帯域（図２においてＡで示される帯域）の光を透過するように設定されている。また、バンドパスフィルター５４は、アクセプタ蛍光物質３が発するアクセプタ蛍光の波長帯域（図２においてＢで示される帯域）の光を透過するように設定されている。
【００３４】
光電変換器５５，５６は、受光した光を電気信号に変換する。光電変換器５５，５６は、例えば、光電子増倍管を備えたセンサである。光電変換器５５，５６が受光する蛍光の蛍光強度は、ドナー蛍光物質２、アクセプタ蛍光物質３の蛍光発光過程に起因して、強度変調されたレーザ光に対して位相が遅れて変動する。そのため、光電変換器５５，５６は、強度変調されたレーザ光に対する位相差の情報を持った光信号を受光し、電気信号に変換する。光電変換器５５，５６から出力された信号、すなわち蛍光信号は、制御・処理部１００に供給される。
【００３５】
図５は、本実施形態の制御・処理部１００の一例を示す概略構成図である。図５に示されるように、制御・処理部１００は、信号生成部１１０と、信号処理部１２０と、コントローラ１３０と、を備える。
信号生成部１１０は、レーザ光の強度を時間変調するための変調信号を生成する。変調信号は、例えば、所定の周波数の正弦波信号であり、例えば１０ＭＨｚ〜４００ＭＨｚの範囲の周波数に設定される。
信号生成部１１０は、発振器１１２と、パワースプリッタ１１４と、増幅器１１６，１１８と、を備える。発振器１１２により生成された変調信号は、パワースプリッタ１１４により分けられ、光源部３０と信号処理部１２０とに供給される。信号生成部１１０が変調信号を信号処理部１２０に供給するのは、後述するように、変調信号に対するドナー蛍光物質２の発したドナー蛍光の位相差、より具体的には、変調信号に対する蛍光信号の位相差を求めるための参照信号として用いるためである。また、変調信号は、光源部３０が出射するレーザ光の振幅を変調するための信号として用いられる。
【００３６】
処理部１２０は、蛍光信号と変調信号とを用いて、計測プローブ１が発するドナー蛍光の変調信号に対する位相差（第１の位相差）の情報を求める。信号処理部１２０は、増幅器１２２，１２４と、位相差検出器１２６と、ローパスフィルタ１２８と、を備える。
増幅器１２２，１２４は、光電変換器５５，５６から出力される信号を増幅し、増幅した信号を位相差検出器１２６に出力する。
【００３７】
位相差検出器１２６は、光電変換器５５，５６から出力されたドナー蛍光及びアクセプタ蛍光の蛍光信号のそれぞれについて、変調信号（参照信号）に対する位相差を検出する。位相差検出器１２６は、不図示のＩＱミキサを備えている。ＩＱミキサは、参照信号と蛍光信号とを乗算することにより、蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）と高周波成分を含む処理信号を算出する。また、ＩＱミキサは、参照信号の位相を９０度シフトさせた信号と蛍光信号とを乗算することにより、蛍光信号のｓｉｎ成分（虚数部）と高周波成分を含む処理信号を算出する。
ローパスフィルタ１２８は、位相差検出器１２６から出力された蛍光信号のｃｏｓ成分とｓｉｎ成分と高周波成分を含む信号から、高周波成分を取り除き、蛍光信号のｃｏｓ成分とｓｉｎ成分を取り出す。これにより、処理部１２０は、ドナー蛍光の変調信号に対する位相差（第１の位相差）の情報を得る。
【００３８】
コントローラ１３０は、後述する分析部１５０からの変調周波数の指示に従って、信号生成部１１０が正弦波信号を変調信号として生成するように、信号生成部１１０を制御する。また、コントローラ１３０は、信号処理部１２０により出力された蛍光信号のｃｏｓ成分とｓｉｎ成分をＡＤ変換する。
【００３９】
コントローラ１３０は、増幅器１３４と、Ａ／Ｄ変換器１３６と、システム制御器１３８と、を備える。増幅器１３４は、処理部１２０から送られた蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の処理信号を増幅し、Ａ／Ｄ変換器１３６に出力する。Ａ／Ｄ変換器１３６は、蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の処理信号をサンプリングし、分析装置１５０に供給する。システム制御器１３８は、計測部４０から出力されるトリガ信号の入力を受ける。また、システム制御器１３８は、発振器１１２とＡ／Ｄ変換器１３６を制御する。
【００４０】
分析部１５０は、コントローラ１３０から供給されたドナー蛍光の蛍光信号及びアクセプタ蛍光の蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）、ｓｉｎ成分（虚数部）の処理信号から、蛍光寿命、蛍光強度を算出する。
分析部１５０は、コンピュータ上で所定のプログラムを起動させることにより構成される装置である。図６は、本実施形態の分析部１５０の一例を示す概略構成図である。図６に示されるように、分析部１５０は、ＣＰＵ１５２と、メモリ１５４と、入出力ポート１５６と、を有する。分析部１５０は、メモリ１５４に記憶されたプログラムを起動することにより、蛍光寿命算出部１６０と、蛍光強度算出部１６１と、ＦＲＥＴ判定部１６２と、周波数調整部１６４と、をソフトウェアモジュールとして形成する。
また分析部１５０には、入出力ポート１５６を通して、ディスプレイ２００が接続されている。また、分析部１５０は、入出力ポート１５６を通して、コントローラ１３０とも接続されている。
【００４１】
ＣＰＵ１５２は、コンピュータに設けられた演算プロセッサである。ＣＰＵ１５２は、蛍光寿命算出部１６０、蛍光強度算出部１６１、ＦＲＥＴ判定部１６２、周波数調整部１６４の各種計算を実質的に実行する。
メモリ１５４は、コンピュータ上で実行することにより、蛍光寿命算出部１６０、蛍光強度算出部１６１、ＦＲＥＴ判定部１６２、周波数調整部１６４をソフトウェアモジュールとして形成するプログラムを格納したＲＯＭと、これらの各部により算出された処理結果や入出力ポート１５６から供給されたデータを記憶するＲＡＭと、を備える。
【００４２】
入出力ポート１５６は、コントローラ１３０から供給されるドナー蛍光及びアクセプタ蛍光の蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）、ｓｉｎ成分（虚数部）の値の入力を受ける。また、入出力ポート１５６は、各部により算出された処理結果をディスプレイ２００に出力する。
ディスプレイ２００は、各部により求められた各種情報や処理結果などを表示する。
【００４３】
蛍光寿命算出部１６０は、コントローラ１３０から供給されるドナー蛍光の蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）、ｓｉｎ成分（虚数部）の値を用いて、ドナー蛍光物質２が発するドナー蛍光の蛍光寿命を算出する。例えば、蛍光寿命算出部１６０は、コントローラ１３０から供給される蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分の値から、変調信号に対する蛍光信号の位相差（第１の位相差）θを求める。また、蛍光寿命算出部１６０は、求めた位相差θを用いて、ドナー蛍光物質２の蛍光寿命を算出する。具体的に、蛍光寿命算出部１６０は、式τsample ＝−ｔａｎθ／（２πｆ）に基づいて、位相差θのｔａｎ成分を変調信号の角周波数２πｆ（ｆは変調周波数）で除算することにより、計測プローブ１のドナー蛍光の蛍光寿命τsampleを取得する。蛍光寿命τsampleは、レーザ光の照射により発せられる蛍光成分が、１次遅れ系の緩和応答であるとしたときの蛍光緩和時定数で表される。
【００４４】
蛍光強度算出部１６１は、コントローラ１３０から供給されるドナー蛍光の蛍光信号及びアクセプタ蛍光の蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）、ｓｉｎ成分（虚数部）の値の入力を用いて、ドナー蛍光の蛍光強度及びアクセプタ蛍光の蛍光強度を算出する。具体的には、蛍光強度算出部１６１は、ドナー蛍光及びアクセプタ蛍光それぞれの蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）及びｓｉｎ成分（虚数部）の値の２乗加算和の平方根を求めることで、蛍光強度を算出する。
【００４５】
ＦＲＥＴ判定部１６２は、蛍光寿命算出部１６０で得られた蛍光寿命τsampleと、ドナー蛍光及びアクセプタ蛍光の蛍光強度とを用いて、検査対象物５が分離特性を有するか否かを判定する。具体的には、蛍光寿命τsampleと、ドナー蛍光の蛍光強度に対するアクセプタ蛍光の蛍光強度の比であるレシオメトリＲsampleとを組として、この組が後述する蛍光寿命τFRETのとり得る範囲及びレシオメトリＲFRETのとり得る範囲に位置するか、あるいは、蛍光寿命τNON-FRETのとり得る範囲及びレシオメトリＲNON-FRETのとり得る範囲に位置するか、を判定することにより、検査対象物５が分離特性を有するか否かを判定する。勿論、図１（ａ）に示す状態のプローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙを有する計測プローブ１に検査対象物４を与えた場合、検査対象物４が接近・結合特性を有するか否かを判定することもできる。
ＦＲＥＴ判定部１６２は、複数の計測プローブ１を用いてＦＲＥＴが発生するときのドナー蛍光の蛍光寿命τFRETのとり得る範囲と、複数の計測プローブ１を用いてＦＲＥＴが発生しないときのドナー蛍光の蛍光寿命τNON-FRETのとり得る範囲を予め定めておく。さらに、ドナー蛍光の蛍光強度に対するアクセプタ蛍光の蛍光強度の比（以降、レシオメトリという）に関して、ＦＲＥＴが発生するときのレシオメトリＲFRETのとり得る範囲と、複数の計測プローブ１を用いてＦＲＥＴが発生しないときのレシオメトリＲNON-FRETのとり得る範囲を予め定めておく。このように、蛍光寿命やレシオメトリのとり得る範囲を定めるのは、ＦＥＲＴ蛍光計測において、蛍光寿命及びレシオメトリの値は、複数の計測プローブ１毎にばらつくため、統計的に判定をする必要があるからである。したがって、ＦＲＥＴ判定部１６２は、蛍光寿命算出部１６０で得られた蛍光寿命τsampleとレシオメトリＲsampleの組を複数取得し、この複数の組が、蛍光寿命τFRETのとり得る範囲及びレシオメトリＲFRETのとり得る範囲に位置するか、あるいは、蛍光寿命τNON-FRETのとり得る範囲及びレシオメトリＲNON-FRETのとり得る範囲に位置するか、を調べて、ＦＲＥＴの有無を統計的に判定する。
【００４６】
すなわち、ＦＲＥＴ判定部１６２は、ドナー蛍光の蛍光寿命τsampleと、ドナー蛍光の蛍光強度及びアクセプタ蛍光の蛍光強度とを用いて、検査対象物５の特性の有無を判定する。ＦＲＥＴが無いと判定されたとき、ＦＲＥＴ判定部１６２は、図１（ｃ）に示す検査対象物５が分離特性を有すると判定する。ＦＲＥＴが有ると判定されたとき、ＦＲＥＴ判定部１６２は、図１（ｃ）に示す検査対象物５は分離特性を有しないと判定する。
【００４７】
ＦＲＥＴが発生するときのドナー蛍光の蛍光寿命τFRETのとり得る範囲は、以下の方法で定められ得る。すなわち、計測プローブ１を含んだポジティブコントロールサンプルを検査サンプルの替わりに用いて、フローサイトメータ１０を通して計測されるドナー蛍光の変調信号に対する位相差をフローサイトメータ１０が第２の位相差として求める。フローサイトメータ１０は、この第２の位相差と変調周波数から、ＦＲＥＴが発生するときの複数のドナー蛍光の蛍光寿命τFRETを複数求め、この複数の蛍光寿命τFRETの分布から、蛍光寿命τFRETのとり得る範囲を定める。
また、ＦＲＥＴが発生するときのレシオメトリＲFRETのとり得る範囲も、以下の方法で定められ得る。すなわち、計測プローブ１を含んだポジティブコントロールサンプルを検査サンプルの替わりに用いて、フローサイトメータ１０を通して計測されるドナー蛍光の蛍光強度とアクセプタ蛍光の蛍光強度の比であるレシオメトリＲFRETをフローサイトメータ１０は複数求め、この複数のレシオメトリＲFRETの分布からフローサイトメータ１０はレシオメトリＲFRETのとり得る範囲を定める。ポジティブコントロールサンプルとは、計測プローブ１のプローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとを接近（あるいは結合）させてドナー蛍光物質２とアクセプタ蛍光物質３とを、ＦＲＥＴが生じる程度に近接させたサンプルをいう。ポジティブコントロールサンプルは、例えば、プローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとを含むサンプルに、プローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとを確実に接近（あるいは結合）させることが知られている物質を含有させることにより作製され得る。
【００４８】
ＦＲＥＴが発生しないときのドナー蛍光の蛍光寿命τNON-FRETのとり得る範囲も、蛍光寿命τFRETのとり得る範囲と同様に定めることができる。この場合、上記ポジティブコントロールサンプルの替わりに、ネガティブコントロールサンプルを用いる。ＦＲＥＴが発生しないときのレシオメトリＲNON-FRETのとり得る範囲も、レシオメトリＲFRETのとり得る範囲と同様に定めることができる。この場合、上記ポジティブコントロールサンプルの替わりに、ネガティブコントロールサンプルを用いる。
ネガティブコントロールサンプルとは、計測プローブ１のプローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとを分離してドナー蛍光物質２とアクセプタ蛍光物質３とを、ＦＲＥＴが生じない程度に離間させたサンプルをいう。ネガティブコントロールサンプル液は、例えば、プローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとを含むサンプル液に、プローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとを確実に分離させることが知られている物質を含有させることにより作製され得る。
【００４９】
周波数調整部１６４は、計測プローブ１と検査対象物５を含んだ検査サンプルを用いてフローサイトメータ１０によりＦＲＥＴの計測を行う前に、計測プローブ１においてＦＲＥＴが発生するときのドナー蛍光の変調信号に対する位相差（第２の位相差）と、計測プローブ１においてＦＲＥＴが発生しないときのドナー蛍光の変調信号に対する位相差（第３の位相差）との差を最大にする最適変調周波数の情報を求める。ここで、上記第２の位相差と上記第３の位相差の差を最大にする周波数の５０〜２００％（±１オクターブ）の範囲内の周波数を最適周波数とする。すなわち、最適周波数は、上記第２の位相差と上記第３の位相差の差を最大にする周波数の５０〜２００％の範囲内に含まれる。好ましくは、最適周波数は、上記第２の位相差と上記第３の位相差の差を最大にする周波数の７５％〜１５０％の範囲内、さらには、上記最大にする周波数の８０％〜１２０％の範囲内に含まれる。周波数調整部１６４は、求めた最適変調周波数の情報を、入出力ポート１５６を通して、コントローラ１３０に送る。コントローラ１３０は、この最適変調周波数の指示に従って、信号生成部１１０が最適変調周波数を持つ正弦波信号を変調信号として生成するように、信号生成部１１０を制御する。これにより、計測プローブ１に照射されるレーザ光の強度変調の変調周波数は、最適変調周波数に調整される。
このような最適変調周波数は、予めフローサイトメータ１０を用いた計測により見つけ出すことができる。また、ドナー蛍光物質２が固有に保持する既知となっている蛍光寿命及び蛍光強度の情報を含む蛍光パラメータの値を用いて、ドナー蛍光の変調信号に対する位相差を、変調周波数を変更しながらシミュレーション計算し、このシミュレーション計算の結果に基づいて、最適変調周波数を見つけ出すこともできる。
【００５０】
フローサイトメータ１０を用いた計測により最適変調周波数を見つけ出す場合、以下に示すＺの値を求めることが好ましい。
具体的には、ポジティブコントロールサンプルを複数含むＦＲＥＴが発生するＦＲＥＴサンプル群と、ネガティブコントロールサンプルを複数含むＦＲＥＴが発生しない非フレットサンプル群とを用意する。
ポジティブコントロールサンプルを、ＦＲＥＴサンプル群のそれぞれのサンプルとして用いて、フローサイトメータ１０で計測する。この計測結果から、ＦＲＥＴが発生するときのドナー蛍光の変調信号に対する位相差（第２の位相差）あるいはこの位相差から得られる蛍光寿命τFRETを蛍光寿命算出部１６０は求める。これにより、ＦＲＥＴ判定部１６２は、ＦＲＥＴサンプル群における、第２の位相差あるいは蛍光寿命τFRETの平均値Ａｖｅ１と標準偏差Ｓｄ１を求める。さらに、ネガティブコントロールサンプルを、非フレットサンプル群のそれぞれのサンプルとして用いて、フローサイトメータ１０を用いて計測する。この計測結果から、ＦＲＥＴが発生しないときのドナー蛍光の変調信号に対する位相差（第３の位相差）あるいはこの第３の位相差から得られる蛍光寿命τNON-FRETを蛍光寿命算出部１６０は求める。これにより、ＦＲＥＴ判定部１６２は、非フレットサンプル群における、第３の位相差あるいは蛍光寿命τNON-FRETの平均値Ａｖｅ２と標準偏差Ｓｄ２を求める。このとき、ＦＲＥＴ判定部１６２が求める最適変調周波数において、下記式で定まる値Ｚが０より大きく１未満であることが好ましい。
Ｚ＝１−３・（Ｓｄ１＋Ｓｄ２）／｜Ａｖｅ１−Ａｖｅ２｜
【００５１】
本実施形態で得られる位相差あるいは蛍光寿命はばらついている。したがって、このばらつきを考慮して、統計的な信頼性を持つような最適変調周波数を定めることが好ましい。一般に、サンプルの位相差あるいは蛍光寿命のばらつきが正規分布に従う場合、平均値−３×標準偏差から平均値＋３×標準偏差までの範囲には、全サンプルの位相差あるいは蛍光寿命の９９．７４％が含まれている。したがって、ＦＲＥＴサンプル群のうち第２の位相差あるいは蛍光寿命τFRETの９９．７４％が含まれるいわゆる３シグマの範囲の端と、非フレットサンプル群の第３の位相差あるいは蛍光寿命τNON-FRETの９９．７４％が含まれるいわゆる３シグマの範囲の端との間の距離（最も近い距離）である｜Ａｖｅ１−Ａｖｅ２｜−３・（Ｓｄ１＋Ｓｄ２）が、平均値間の距離｜Ａｖｅ１−Ａｖｅ２｜に対してどの程度の大きさを有するかを、上記Ｚの値は表す。このＺの値は、１である場合、Ｓｄ１＋Ｓｄ２は０であり、バラツキがないことを示す。Ｚの値が０である場合、ＦＲＥＴサンプル群のうち第２の位相差あるいは蛍光寿命τFRETの３シグマの範囲の上端（あるいは下端）と、第３の位相差あるいは蛍光寿命τNON-FRETの３シグマの範囲の下端（あるいは上端）とが重なることを意味する。したがって、本実施形態で用いる最適周波数において、Ｚの値は、０より大きく１未満であることが好ましく、より好ましくは、０．２以上１未満、さらにより好ましくは、０．５以上１未満である。
このようにＺの値を、サンプルの計測結果のばらつきに関する信頼性の指標として用いることができる。また、上述したように、上記第２の位相差と第３の位相差の差を最大にする周波数の５０〜２００％の範囲内の周波数を最適周波数とするので、この範囲内の周波数の中で、Ｚの値がより大きいものを用いることが好ましい。
【００５２】
このように、フローサイトメータ１０が、上記第２の位相差と上記第３の位相差との差を最大にする最適変調周波数をレーザ光の強度変調の変調周波数に用いるのは、ＦＲＥＴの有無の誤判定を低減するためである。特に、ドナー蛍光が、異なる蛍光寿命を持つ複数種類の蛍光成分を含む場合、算出される蛍光寿命τsampleの値は実際よりも高く算出される場合が多く、蛍光寿命τsampleの値の変化によってＦＲＥＴの発生の有無を見出すのは難しい場合がある。一般に、ＦＲＥＴが発生すると、ドナー蛍光の蛍光寿命τFRETの値は小さくなるので蛍光寿命τsampleの値の低下によりＦＲＥＴが発生したと判断することができる。しかし、ドナー蛍光が異なる蛍光寿命を持つ複数種類の蛍光成分を含む場合、ＦＲＥＴ発生時においても算出される蛍光寿命τsampleの値の変化は、ドナー蛍光が１つの蛍光寿命をもつ単一の蛍光成分のみを含む場合に比べて小さくなる。このため、蛍光寿命τsampleの値の低下によりＦＲＥＴが発生したと判断することが難しくなる場合がある。このため、フローサイトメータ１０は、上記第２の位相差と上記第３の位相差との差を最大にする最適変調周波数をレーザ光の強度変調の変調周波数に用いることで、ＦＲＥＴの有無による蛍光寿命τsampleの変化を大きくする。これにより、フローサイトメータ１０は、ＦＲＥＴの発生の有無を正確に判定することができる。
【００５３】
図７（ａ）は、変調周波数を２８ＭＨｚとしたときにフローサイトメータ１０で計測された位相差頻度グラムである。図７（ｂ）は、変調周波数を１５０ＭＨｚとしたときにフローサイトメータ１０で計測された位相差頻度グラムである。図７（ａ），（ｂ）における第２の位相差は、いずれも計測プローブ１を含むポジティブコントロールサンプルを用いたときの位相差である。図７（ａ），（ｂ）における第３の位相差は、いずれも計測プローブ１を含むネガティブコントロールサンプルを用いたときの位相差である。
変調周波数を２８ＭＨｚとしたときの、最大頻度における第２の位相差と第３の位相差の差は、図７（ａ）に示すように、略０．０４ラジアンである。一方、変調周波数を１５０ＭＨｚとしたときの、最大頻度における第２の位相差と第３の位相差の差は、図７（ｂ）に示すように、略０．１０ラジアンである。このように、変調周波数によって第２の位相差と第３の位相差の差は変化することがわかる。
【００５４】
図８（ａ）は、周知の蛍光寿命顕微法を用いてドナー蛍光を計測し、ドナー蛍光物質２が発するドナー蛍光が１次遅れ系の緩和応答であるとして同定されたドナー蛍光の蛍光パラメータの値の一例を示している。ドナー蛍光は、２種類の異なる蛍光寿命を有する２種類の蛍光成分（第１の蛍光成分、第２の蛍光成分）を有している。この例では、第２の蛍光成分においてＦＲＥＴが発生し、第２の蛍光成分における蛍光寿命τ2が１．０（ナノ秒）から０．３（ナノ秒）に大きく低減している。蛍光寿命顕微法は、例えば、”Multiple frequency fluorescence lifetime imaging microscopy” A.SQUIRE etal. ,Journal of Microscopy, vol.197,Pt2, February2000, pp.136-149 に開示されている。
ここでαi（ｉ＝１又は２）は、第１の蛍光成分及び第２の蛍光成分の蛍光強度の相対比を示している。したがって第１の蛍光成分の蛍光強度はα1×ｅｘｐ（−ｔ／τ1）と表され、第２の蛍光成分の蛍光強度はα2×ｅｘｐ（−ｔ／τ2）と表される。
このようなドナー蛍光強度の時間変化を、周知の蛍光寿命顕微法を用いて計測し、計測したドナー蛍光の蛍光強度の時間応答を、α1×ｅｘｐ（−ｔ／τ1）＋α2×ｅｘｐ（−ｔ／τ2）の式によってカーブフィットすることにより、α1、τ1、α2及びτ2の値を算出することができる。図８（ａ）は、こうして取得され既知となった蛍光パラメータの値である。したがって、これらの蛍光パラメータの値を用いて、変調周波数に対する第２の位相差と第３の位相差を変化を算出することができる。具体的には、下記式（１）に従って変調周波数ｆに対する位相差を算出することができる。
【００５５】
【数１】
0005585973.tif 000002
【００５６】
このような蛍光パラメータの値は、ドナー蛍光物質２及びアクセプタ蛍光物質３の種類毎に、予めメモリ１５４に記憶しておき、周波数調整部１６４が、計測プローブ１に用いるドナー蛍光物質２及びアクセプタ蛍光物質３の種類に応じて、メモリ１５４から蛍光パラメータの値を呼び出して、変調周波数ｆに対する位相差を算出することができる。
図８（ｂ）は、上記式（１）に従って計算された第２の位相差および第３の位相差の一例を示している。この場合、周波数２８０ＭＨｚにおいて、第２の位相差および第３の位相差の差が最大になる。したがって、周波数調整部１６４は、蛍光寿命及び蛍光強度の情報を含む蛍光パラメータの値が既知である複数種類の蛍光成分を発する蛍光物質をドナー蛍光物質２として用いる場合、蛍光パラメータの値を用いて第２の位相差及び第３の位相差を、変調周波数を変更しながら計算し、この計算の結果に基づいて、第２の位相差と第３の位相差との差を最大にする最適変調周波数を見つけることができる。
【００５７】
なお、図８（ａ）に示す第１の蛍光成分及び第２の蛍光成分を有するドナー蛍光の場合、フローサイトメータ１０の計測では、下記式に従って平均蛍光寿命τAVEが蛍光寿命τsampleとして求められる。
平均蛍光寿命τAVE＝ｆ1・τ1＋ｆ2・τ2
ここで、ｆ1＝α1・τ1／（α1・τ1＋α2・τ2）であり、ｆ2＝α2・τ2／（α1・τ1＋α2・τ2）である。
したがって、フローサイトメータ１０の計測では、図８（ａ）に示す例の場合、上記平均寿命τAVEは、ＮＯＮ−ＦＲＥＴ時では２．５（ｎ秒）となり、ＦＲＥＴ発生時では、２．２３（ｎ秒）となる。これは、第２の蛍光成分において、ＦＲＥＴの発生により、第２の蛍光成分の蛍光寿命τ2が１．０（ｎ秒）から０．３（ｎ秒）に変化しても、フローサイトメータ１０で計測される蛍光寿命は２．５（ｎ秒）から２．２３（ｎ秒）にしか変化せず、蛍光寿命の変化幅が小さい。本実施形態では、この変化幅が小さい蛍光寿命の変化幅を大きくするために、レーザ光を強度変調するときの変調周波数を、上述した最適変調周波数に調整している。
【００５８】
このように、本実施形態では、レーザ光の強度変調に用いる変調周波数は、ＦＲＥＴが発生するときのドナー蛍光の変調信号に対する第２の位相差と、ＦＲＥＴが発生しないときのドナー蛍光の変調信号に対する第３の位相差との差を最大にする最適変調周波数に調整されているので、ＦＲＥＴの発生の有無を正確に判定することができる。特に、フローサイトメータを用いて、短時間に計測できるので、従来の蛍光寿命顕微法を用いる場合に比べて、短時間に検査対象物の分離特性あるいは接近・結合特性を調べることができる。
【００５９】
また、本実施形態は、ポジティブコントロールサンプル及びネガティブコントロールサンプルを用いて、フローサイトメータ１０で計測されるドナー蛍光の変調信号に対する位相差（ＮＯＮ−ＦＲＥＴ時、ＦＲＥＴ発生時の位相差）をそれぞれ求め、求めた２つの位相差の差からフローサイトメータ１０に対応した最適変調周波数を見つけるので、フローサイトメータ１０は検査サンプルを用いてＦＲＥＴの発生の有無、ひいては検査対象物の分離特性あるいは接近・結合特性をより正確に判定することができる。
【００６０】
また、周波数調整部１６４は、計測プローブ１の蛍光パラメータを用いてドナー蛍光の変調信号に対する位相差（ＮＯＮ−ＦＲＥＴ時、ＦＲＥＴ発生時の位相差）のそれぞれを、変調周波数を変更しながら計算し、この計算の結果に基づいて、最適変調周波数を見つけるので、フローサイトメータ１０における事前の計測を行うことなく、計算によって最適周波数を簡便に取得することができる。
【００６１】
さらに、本実施形態は、計測プローブ１のドナー蛍光の蛍光寿命τFRETのとり得る範囲と、ＦＲＥＴが発生しないときのナー蛍光の蛍光寿命τNON-FRETのとり得る範囲と、ＦＲＥＴが発生するときのレシオメトリＲFRETのとり得る範囲と、ＦＲＥＴが発生しないときのレシオメトリＲNON-FRETのとり得る範囲と、を予め取得しておく。ＦＲＥＴ判定部１６２は、これらのとり得る範囲を用いて、検査対象物５の特性の有無を判定するので、より正確な判定が可能になる。
なお、蛍光寿命τFRETのとり得る範囲、蛍光寿命τNON-FRETのとり得る範囲、レシオメトリＲFRETのとり得る範囲、及び、レシオメトリＲNON-FRETのとり得る範囲を、計測プローブ１を含んだポジティブコントロールサンプル及びネガティブコントロールサンプルを用いてフローサイトメータ１０で計測して取得することにより、同じフローサイトメータ１０で計測した検査対象物５の特性をより正確に判定することができる。
【００６２】
［ＦＲＥＴ計測方法］
図９は、本実施形態のＦＲＥＴ計測方法の一例のフローを示す図である。図９に示すフローは、図１（ｂ）に示す状態にある計測プローブ１に検査対象物５を与えたとき、検査対象物５は、図１（ｃ）に示すような特性を有するか、すなわち、検査対象物５は、分離特性を有するか否かを判定する例を用いて説明する。
【００６３】
まず、図１（ｂ）に示すように、プローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙとが接近（あるいは結合）し、ドナー蛍光物質２とアクセプタ蛍光物質３とが近接し、ＦＲＥＴが発生する状態に位置する状態にある計測プローブ１が用意される。この計測プローブ１と検査対象物５とを含んだ検査サンプルが作製され、フローサイトメータ１０は、この検査サンプルを管路２０内に流す（ステップＳ１０）。
【００６４】
一方、フローサイトメータ１０の分析部１５０の周波数調整部１６４が、計測プローブ１においてＦＲＥＴが発生するときのドナー蛍光の変調信号に対する位相差（第２の位相差）と、計測プローブ１においてＦＲＥＴが発生しないときのドナー蛍光の変調信号に対する位相差（第３の位相差）との差を最大にする最適変調周波数を見つけだし、この最適変調周波数の情報を、コントローラ１３０に送る。コントローラ１３０は、発振器１１２に指示を出して、最適変調周波数の変調信号を作成する。これにより、フローサイトメータ１０は、レーザ光の変調周波数を最適変調周波数に調整する（ステップＳ２０）。
【００６５】
上記最適周波数は、フローサイトメータ１０が実際に、ポジディブコントロールサンプル及びネガティブコントロールサンプルを用いて、変調周波数を変更しながら蛍光を計測することが好ましい。この場合、フローサイトメータ１０を用いて求められるドナー蛍光物質が発するドナー蛍光の変調信号に対する位相差を、周波数調整部１６４が第２の位相差及び第３の位相差として取得し、第２の位相差と第３の位相差の差から最適変調周波数を見つけ出す。このとき、ポジディブコントロールサンプルを複数含むＦＲＥＴサンプル群及びネガティブコントロールサンプルを複数含む非ＦＲＥＴサンプル群のサンプルを計測対象とし、このときの平均値及び標準偏差を求めて、最適周波数における計測時の信頼性を表す指標として上述したＺの値を求めてもよい。この場合、最適周波数時のＺの値が０より大きく１未満であることが好ましい。
あるいは、ドナー蛍光物質が、蛍光寿命及び蛍光強度の情報を含む蛍光パラメータの値が既知である複数種類の蛍光成分を発する場合、周波数調整部１６４が、蛍光パラメータの値を用いて変調周波数を変更しながらドナー蛍光の変調信号に対する位相差（上記第２の位相差及び上記第３の位相差）をシミュレーション計算し、このシミュレーション計算の結果に基づいて、最適変調周波数を見つけ出すことも好ましい。上記蛍光パラメータの値は、例えば蛍光寿命顕微法を用いて同定されることが好ましい。
【００６６】
光源部３０は、最適変調周波数を持つ変調信号に基いて強度変調する。これにより、光源部３０は、最適変調周波数で強度変調されたレーザ光を管路２０に出射する（ステップＳ３０）。
受光部５０は、強度変調したレーザ光を検査サンプル中の計測プローブ１に照射することにより計測プローブ１のドナー蛍光物質２が発するドナー蛍光及びアクセプタ蛍光物質３が発するアクセプタ蛍光を受光して、蛍光信号を出力する（ステップＳ４０）。
信号処理部１２０は、受光部５０が出力した蛍光信号を信号処理して、蛍光信号のｃｏｓ成分とｓｉｎ成分を生成する。すなわち、信号処理部１２０は、計測プローブ１が発するドナー蛍光の変調信号に対する位相差（第１の位相差）の情報を生成する。
【００６７】
さらに、分析部１５０の蛍光寿命算出部１６０は、蛍光信号のｃｏｓ成分とｓｉｎ成分を用いてドナー蛍光の変調信号に対する位相差（第１の位相差）を求め、この位相差からドナー蛍光の蛍光寿命τSAMPLEを算出して取得する。さらに、分析部１５０の蛍光強度算出部１６１は、ドナー蛍光の蛍光強度とアクセプタ蛍光の蛍光強度とを算出する。これにより、分析部１５０は、ドナー蛍光強度に対するアクセプタ蛍光強度のレシオメトリＲSAMPLEを算出する。すなわち、分析部１５０は、ドナー蛍光の蛍光寿命τSAMPLEと、レシオメトリＲSAMPLEを算出する（ステップＳ５０）。本実施形態では、検査サンプル中の計測プローブ１が管路２０の計測点を通過してレーザ光の照射を受けるたびに、蛍光寿命τSAMPLEとレシオメトリＲSAMPLEが算出されるので、検査サンプル全体の計測プローブ１の計測を終了したとき、極めて多数の蛍光寿命τSAMPLEと比ＲSAMPLEのデータが得られる。したがって、分析部１５０は、蛍光寿命τSAMPLEと比ＲSAMPLEに関する多数のデータを用いて、ＦＲＥＴの発生を統計的に判定する。すなわち、ＦＲＥＴ判定部１６２は、ＦＲＥＴの発生頻度（％）が予め定められた所定値以上であるか否かを判定する（ステップＳ６０）。
ＦＲＥＴの発生頻度（％）は、具体的には、検査サンプルを用いて取得した複数の蛍光寿命τSAMPLEとレシオメトリＲSAMPLEが、予め定められた蛍光寿命τFRETのとり得る範囲及びレシオメトリＲFRETのとり得る範囲に含まれるデータ数の、全データ数に対する割合である。さらに、より確実な判定とするために、複数の蛍光寿命τSAMPLEとレシオメトリＲSAMPLEが、予め定められた蛍光寿命τNON-FRETのとり得る範囲及びレシオメトリＲNON-FRETのとり得る範囲に含まれるデータ数の、全データ数に対する割合が予め定められた値より高いか否かを判定に加えることが好ましい。
【００６８】
蛍光寿命τFRETのとり得る範囲、レシオメトリＲFRETのとり得る範囲、蛍光寿命τNON-FRETのとり得る範囲、及びレシオメトリＲNON-FRETのとり得る範囲は、予め、ポジティブコントロールサンプル及びネガティブコントロールサンプルを用いて、フローサイトメータ１０でドナー蛍光の蛍光寿命とドナー蛍光の蛍光強度とアクセプタ蛍光の蛍光強度を計測することにより、上記４つのとり得る範囲を定めておくことが好ましい。
【００６９】
ＦＲＥＴ判定部１６２は、判定結果が肯定である場合、計測プローブ１においてＦＲＥＴが発生すると判断し（ステップＳ７０）、検査対象物５は、計測プローブ１のプローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙを分離させる分離特性を有さない、と判定する（ステップＳ８０）。一方、判定結果が否定である場合、ＦＲＥＴ判定部１６２は、計測プローブ１においてＦＲＥＴが発生しないと判断し（ステップＳ９０）、検査対象物５は、計測プローブ１のプローブ要素Ｘとプローブ要素Ｙの分離特性を有する、と判定する（ステップＳ１００）。この判定結果は、ディスプレイ２００に出力される。
こうして、フローサイトメータ１０は、検査対象物５が計測プローブ１の分離特性を有するか否かを短時間に判定することができる。
【００７０】
本実施形態のＦＲＥＴ計測方法は、例えば、白血病の分子標的治療薬の感受性試験の開発に好適に用いることができる。慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）は、遺伝子の異常（９番と２２番の染色体の転座）により、異常タンパク（ＢＣＲ−ＡＢＬ）が細胞内に発生し、発症する慢性骨髄性増殖疾患である。例えば、計測プローブ１のプローブ要素Ｘ及びプローブ要素Ｙとして、ＦＲＥＴを可能とする２種以上の分子により修飾され、ＢＣＲ−ＡＢＬによってリン酸化される基質タンパク質又は被リン酸化部位を含むそのペプチド断片からなる、ＢＣＲ−ＡＢＬのチロシンキナーゼ活性を検出するための試薬が用いられる。この試薬には、例えばＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＤｓＲｅｄ及びそれらの変異体よりなる群から選択される蛍光タンパクが連結される。この試薬を用いて本実施形態のＦＲＥＴ計測方法でＦＲＥＴの有無を判定することにより、検査対象物５としてのチロシンキナーゼ阻害薬剤を効率よくスクリーニングすることができる。このような試薬については、特開２００９−２７８９４２号公報に記載されている。
【００７１】
以上、本発明のＦＲＥＴ計測装置及びＦＲＥＴ計測方法について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態および例に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。
【符号の説明】
【００７２】
１  計測プローブ
２  ドナー蛍光物質
３  アクセプタ蛍光物質
４，５  検査対象物
１０  フローサイトメータ
２０  管路
２２  回収容器
３０  光源部
４０，５０  受光部
５１  レンズ系
５２  ダイクロイックミラー
５３，５４  バンドパスフィルター
５５，５６  光電変換器
１００  制御・処理部
１１０  信号生成部
１１２  発振器
１１４  パワースプリッタ
１１６，１１８  増幅器
１２０  信号処理部
１２２，１２４  増幅器
１２６  位相差検出器
１２８  ローパスフィルタ
１３０  コントローラ
１３４  増幅器
１３６  Ａ／Ｄ変換器
１３８  システム制御器
１５０  分析装置
１５２  ＣＰＵ
１５４  メモリ
１５６  入出力ポート
１６０  蛍光寿命算出部
１６１  蛍光強度算出部
１６２  ＦＲＥＴ判定部
１６４  周波数調整部
２００  ディスプレイ
Ｘ，Ｙ  プローブ要素
【図１】
0005585973.tif 000003
【図２】
0005585973.tif 000004
【図３】
0005585973.tif 000005
【図４】
0005585973.tif 000006
【図５】
0005585973.tif 000007
【図６】
0005585973.tif 000008
【図７】
0005585973.tif 000009
【図８】
0005585973.tif 000010
【図９】
0005585973.tif 000011