(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（−）−Δ９−トランス−テトラヒドロカンナビノールを、（−）−Δ９−トランス−テトラヒドロカンナビノールを含むカンナビノイドの混合物から分離する方法であって、  
前記方法が、調製用分離方法であり、前記混合物に対して、少なくとも一つのクロマトグラフィー工程を行うことを含んでなり、
前記クロマトグラフィー工程が、二酸化炭素を含んでなる移動相が、アミローストリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）を含んでなる固定相中を通過することを含んでなり、
前記カンナビノイドの混合物に含まれる不純物が、下記化学式で表される化合物の少なくとも一種を含んでなるものである、方法。
【化１】
0005566565.tif 000003
【請求項２】
前記移動相が、二酸化炭素および一種以上の変性剤の混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記移動相が、二酸化炭素とエタノールの混合物である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
二酸化炭素と液体変性剤の比が９５：５〜７５：２５である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記アミローストリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）が、シリカゲル、ジルコニウム、アルミナ、セラミックおよび他のシリカから選択された基材上に固定される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記固定相が、マクロ細孔シリカゲル上に担持された前記アミローストリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
移動相がアキラル固定相中を通過する別のクロマトグラフィー工程を含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記アキラル固定相が、シリカ担体上に固定された２−エチルピリジンシロキサンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記アキラル固定相を使用する前記別のクロマトグラフィー工程が、前記アミローストリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）を含んでなる前記固定相を使用する前記クロマトグラフィー工程の前に行われるものである、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記アミローストリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）を含んでなる前記固定相を使用する前記クロマトグラフィー工程が、前記アキラル固定相を使用する前記別のクロマトグラフィー工程の前に行われるものである、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１１】
（−）−Δ９−トランス−テトラヒドロカンナビノールを含んでなる薬学的製品の製造方法であって、
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法により、（−）−Δ９−トランス−テトラヒドロカンナビノールを含んでなるカンナビノイドの混合物から（−）−Δ９−トランス−テトラヒドロカンナビノールを分離する工程と、及び
前記（−）−Δ９−トランス−テトラヒドロカンナビノールを薬学的キャリヤーと組合せて、前記薬学的製品を形成する工程とを含んでなる、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（−）−Δ９−トランス−テトラヒドロカンナビノールの精製方法に関する。この化合物を、クロマトグラフィー技術を使用してカンナビノイドの混合物から分離する。
【０００２】
（−）−Δ９−トランス−テトラヒドロカンナビノールは、マリファナの活性成分である。この物質は、ＡＩＤＳおよび癌化学療法患者の間で食欲刺激用に吸入または経口薬として治療的に使用される。テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）は、マリファナ（植物Cannabis Sativaの葉および頭花の混合物）から単離することができる。あるいは、ＴＨＣは、例えば国際特許第ＷＯ０２／０９６８９９号明細書に記載されているように、合成経路によって得ることができる。薬物製品への処方には、鏡像異性体的に純粋なＴＨＣが必要であるが、ＴＨＣの精製は、単離により、または合成により製造されるものでも、簡単なことではない。本発明者らは、鏡像異性体的に純粋な（−）−Δ９−トランス−テトラヒドロカンナビノール（（−）−Δ９−ＴＨＣ）を製造する方法を提供しようとするものである。
【０００３】
（−）−Δ９−ＴＨＣを他のカンナビノイド化合物から分離するために、クロマトグラフィー技術が使用されている。薬物試料中のタイマ物質を同定することは、超臨界流体クロマトグラフィーを使用して達成されている。そのような方法は、Baeckstroem et al (Science & Justice, 1997, 37(2), 91-97)、Cole (「Analysis of Cannabis by Supercritical Fluid Chromatography with Ultraviolet Detection」, 145-148頁、「Supercritical Fluid Methods and Protocols」、WilliamsおよびClifford編集）、Veress (Journal of Chromatography A, 668 (1994), 285-291)およびLater et al. (Journal of Chromatographic Science, 1986, 24, 249-253)により記載されている。これらの方法では、非常に小さな試料（典型的にはμｇ量）を分析しており、（−）−Δ９−ＴＨＣが検出工程の際に（例えば火炎イオン化検出により、または化学的イオン化質量分光法により）破壊されることが多い。これらのクロマトグラフィー法は、（−）−Δ９−ＴＨＣを他のカンナビノイド化合物から分離することはできるが、薬学的製品に配合するための、鏡像異性体的に純粋な（−）−Δ９−ＴＨＣを十分な量で製造するには全く不適当である。
【０００５】
Levin et al (Journal of Chromatography A, 654 (1993), 53-64)は、カンナビノイド化合物の鏡像異性体混合物を分離する分析手順を開発している。このクロマトグラフィー方法は、マクロ細孔シリカゲル上に担持されたアミローストリス（３，５−ジメチルカルバメート）を基材とするDaicel Chiralpak（商品名）ADを使用する。この移動相は、エタノールまたはプロパノールを含むｎ−ヘキサンである。この鏡像異性体選択的分析は、試料の光学的純度を決定するが、有用な量の分離された鏡像異性体を与えていない。
【０００６】
クロマトグラフィー手順は、カンナビノイド化合物の試料を分析するのに使用されているが、鏡像異性体的に純粋な（−）−Δ９−ＴＨＣの効果的な調製用分離は立証されていない。本発明者らは、薬学的製品に配合する量の鏡像異性体的に純粋な（−）−Δ９−ＴＨＣの製造に使用できるクロマトグラフィー製法を考案した。
【０００７】
従って、本発明は、（−）−Δ９−トランス−テトラヒドロカンナビノールをカンナビノイドの混合物から分離するための、移動相が固定相中を通過する少なくとも一つのクロマトグラフィー工程を含んでなる調製用分離製法であって、固定相が誘導体化された多糖を含んでなり、移動相が二酸化炭素を含んでなる方法を提供する。
【０００８】
本発明者らは、誘導体化された多糖の固定相を二酸化炭素含有移動相と組み合わせたクロマトグラフィー製法により、（−）−Δ９−ＴＨＣの効果的な調製用分離が達成されることを見出した。「調製用分離製法」とは、少なくとも０．１ｇの精製された製品、好ましくは少なくとも１ｇの精製された製品を、妥当な時間枠内、すなわち１日未満で提供できる製法を意味する。
【０００９】
好ましくは、本発明における移動相は、二酸化炭素および一種以上の変性剤の混合物である。変性剤は、すべての液体溶剤、例えばアルコール、酢酸エチル、アセトニトリルまたは塩化メチレン、でよい。変性剤は、固定相と相容性があるべきである、例えば酢酸エチルおよび塩化メチレンは、Chiralpak ADカラムを破壊するので、このカラムとは併用できない。変性剤は、Ｃ１〜Ｃ５アルコールが好適であり、最も好ましくはエタノールである。二酸化炭素とエタノールの移動相が、特に有利であることが分かっている。国際特許第ＷＯ０２／０９６８９９号明細書に概略が記載されている合成経路により（−）−Δ９−ＴＨＣを製造する場合、不純物の一種は、「ＤＰＡ−イソ」（化学的構造については図１参照）である。移動相が二酸化炭素／エタノールである場合、ＤＰＡ−イソは（−）−Δ９−ＴＨＣの前に溶離する。主要成分の前に溶離する少量不純物は、置換クロマトグラフィーの効果により、通常は集中するので、ＤＰＡ−イソのすべてを除去することが可能であった。別のヘプタン／エタノール移動相を使用すると、ＤＰＡ−イソは（−）−Δ９−ＴＨＣの後に溶離した。主要成分の尾部に溶離する少量成分を分離するのは著しく困難であるので、二酸化炭素／エタノール移動相は、ヘプタン／エタノールと比較して大幅に改良された製法を提供する。
【００１０】
二酸化炭素は容易に除去できるので、（−）−Δ９−ＴＨＣ製品を、変性剤を溶剤とする溶液として得ることができる。従って、（−）−Δ９−ＴＨＣが安定している変性剤を選択するのが望ましい。
【００１１】
二酸化炭素と変性剤の、重量（ｇ）と体積（ｃｍ３）比は、１００：１〜５０：５０が好適であり、好ましくは９５：５〜７５：２５、最も好ましくは８５：１５〜７５：２５である。二酸化炭素と変性剤の比は、クロマトグラフィー製法の途中で変えることができる。
【００１２】
固定相は、誘導体化された多糖を含んでなり、固体のキラル固定相である。誘導体化された多糖は、基材、例えばシリカゲル、ジルコニウム、アルミナ、セラミックまたは他のシリカ、上に固定するのが好適であり、好ましくはシリカゲル上に固定する。誘導体化された多糖の例には、アミロース系、セルロース系、キトサン、キシラン、カードラン(curdlan)、デキストランおよびイヌラン(inulan)区分の多糖類が挙げられる。アミロース多糖が好ましい。特に好ましい固定相は、マクロ細孔シリカゲル上に担持されたアミローストリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）であり、これはDaicel Chemical Co.製のChiralpak（商品名）ADとして市販されている。別の好ましい固定相は、Chiralpak（商品名）IAであり、これはChiralpak（商品名）ADと類似しているが、固定されたキラルセレクタを有するので、より広範囲の溶剤を使用できる。
【００１３】
固定相は、カプセル封入された、誘導体化された多糖であり、多糖群は基材に結合していないのが好ましい。カプセル封入された固定相は、（−）−Δ９−ＴＨＣから（−）−Δ８−ＴＨＣへの分解を阻止できると考えられる。
【００１４】
本発明の好ましい実施態様で、本方法は、移動相が固定相中を通過する別のクロマトグラフィー工程を含んでなり、その際、固定相は、アキラル固定相であり、シリカゲルおよび誘導体化されたシリカゲルから選択されるのが好適であり、そのシリカは、アミノプロピルシロキサン、ジオール置換されたプロピルシロキサンまたは２−エチルピリジンシロキサン基で誘導体化されている。シリカ担体上に固定された２−エチルピリジンシロキサン（下に示す）が、ある種のアキラル固定相で観察されるような、（−）−Δ９−ＴＨＣが分解して（−）−Δ８−ＴＨＣを形成することがないので、好ましいアキラル固定相である。
【化１】
0005566565.tif 000002
【００１５】
この別のクロマトグラフィー工程により、カンナビノイドの混合物から不純物の（−）−Δ９−ａｂｎ−ＴＨＣ（化学構造に関しては図１参照）が確実に除去される。
【００１６】
この別のクロマトグラフィー工程で、移動相は二酸化炭素を含んでなるのが好適であり、好ましくは二酸化炭素と一種以上の変性剤の混合物である。変性剤は、どのような液体溶剤でもよいが、Ｃ１〜Ｃ５アルコールが好適であり、最も好ましくはエタノールである。二酸化炭素と変性剤の、重量（ｇ）と体積（ｃｍ３）比は、１００：１〜５０：５０が好適であり、好ましくは１００：１〜７５：２５、最も好ましくは９５：５〜９０：１０である。二酸化炭素と変性剤の比は、クロマトグラフィー製法の途中で変えることができる。
【００１７】
第一クロマトグラフィー工程は、アキラル固定相、好ましくはシリカ担体上に固定された２−エチルピリジンシロキサン、を使用し、第二クロマトグラフィー工程は、誘導体化された多糖固定相、最も好ましくはマクロ細孔シリカゲル上に担持されたアミローストリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）、を使用するのが好適である。アミロース系相は、粗製カンナビノイド原料中に存在する恐れがある溶剤不純物により破壊されることがあるのに対し、２−エチルピリジンシロキサンはより堅牢であることが分かっているので、アミロース系固定相は、２−エチルピリジンシロキサン相の後に使用するのが好ましい。しかし、２つの工程を反転させる、すなわち２−エチルピリジンシロキサン相をアミロース系相の後に使用しても、純粋な（−）−Δ９−ＴＨＣを達成することができる。
【００１８】
好適なクロマトグラフィー装置は当業者には良く知られている。超臨界流体クロマトグラフィーに好適な装置、例えばNovasep Supersep 10 SFCまたはNovasep Supersep 100 SFC、を使用するのが好ましい。カンナビノイドの混合物を含む粗製原料を、移動相が、カラム中に配置された固定相中を流れる装置の中に周期的に注入する。カラム出口で検出した後、原料の精製された画分が様々なトラップに向けられる。二酸化炭素は精製された画分から分離され、好ましくは循環使用される。カラム出口における検出は、適切な波長におけるＵＶ吸収の測定により、行うことができる。
【００１９】
カラム直径は０．５ｃｍ〜５０ｃｍが好適であり、カラム長は５ｃｍ〜５０ｃｍが好適である。固定相の粒子径は、典型的には５〜５０μｍである。
【００２０】
本方法は、温度５〜４５℃、および高圧、例えば８０バール〜３００バールで行うのが好適である。典型的な流量は、カラムの直径によって異なり、例えば１０ｇ〜４ｋｇ／分でよい。
【００２１】
別の態様で、本発明は、（−）−Δ９−ＴＨＣを含んでなる薬学的製品の製造方法であって、本発明の調製用分離製法によってカンナビノイドの混合物から（−）−Δ９−ＴＨＣを分離する第一工程、および（−）−Δ９−ＴＨＣを製剤学的キャリヤーと組合せ、薬学的製品を形成する別の工程を含んでなる、方法を提供する。好適な製剤学的キャリヤーは、当業者には公知である。
【００２２】
下記の例は、本発明を説明するためであって、本発明を制限するものではない。
【００２３】
粗製原料
（−）−Δ９−トランス−テトラヒドロカンナビノールは、国際特許第ＷＯ０２／０９６８９９号明細書に記載されているようにして調製した。反応粗製物は、図１に（−）−Δ９−ＴＨＣと共に示す様々なカンナビノイド不純物を含んでいた。この反応粗製物をエタノールに溶解させ、粗製原料を得た。
【００２４】
例１
２−エチルピリジンシロキサンカラムおよびChiralpak ADカラムを使用する２工程精製
クロマトグラフィー装置
Novasep Supersep 10 SFCを両クロマトグラフィー工程に使用した。２種類の固定相、すなわちPrinceton Chromatography Inc製の、粒子径１０μｍを有する２−エチルピリジンシロキサン固定相、およびDaicel Chemical Co.製の、粒子径２０μｍを有するChiralpak AD固定相（マクロ細孔シリカゲル上に担持されたアミローストリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート））を使用した。クロマトグラフィー工程は、２５℃、圧力１００バールで行った。
【００２５】
工程１  ２−エチルピリジンシロキサンカラムを使用するクロマトグラフィー分離
粗製原料を、０．２マイクロメートルフィルター(Whatman PTFE w/GMF)を通して濾過し、２−エチルピリジンシロキサン固定相を含むクロマトグラフィーカラム（長さ２５ｃｍ、内径２．１ｃｍ）上に、９２％二酸化炭素および８％エタノールの移動相を使用し、カラム流量４０ｇ／分で注入した。カラム上へのカラム注入は、０．８５ｍｌの粗製原料を５秒間注入で行った。４８時間で１２８回のカラム注入後、エタノール系溶液を、（−）−Δ９−ＴＨＣ濃度薬２５ｇ／ｌで回収した。３０℃、真空下の回転蒸発でエタノールを除去した後、半精製（−）−Δ９−トランス−ＴＨＣ約２２．５ｇが回収され、純度は９５％を超えていた。
【００２６】
工程２  Chiralpak ADカラムを使用するクロマトグラフィー分離
半精製（−）−Δ９−ＴＨＣを無水エタノール中に濃度約３００ｇ／ｌに再溶解させ、８０％二酸化炭素および２０％エタノールの移動相を使用してChiralpak ADカラム（長さ２５ｃｍ、内径２．１ｃｍ）上にカラム流量４０ｇ／分で注入するための原料を調製した。半精製原料を０．８５ｍｌ（５秒間にわたる）ずつ６０回注入した後、エタノール系溶液を回収し（約２．２リットル）、後日の溶剤蒸発用に冷凍装置中に保存した。精製された（−）−Δ９−トランス−ＴＨＣ（純度＞９９．５％）の推定回収量は〜１５グラムであった。
【００２７】
例２
Chiralpak ADカラムおよび２−エチルピリジンシロキサンカラムを使用する２工程精製
クロマトグラフィー装置
装置は、例１で使用したものと同一であった。
【００２８】
工程１  Chiralpak ADカラムを使用するクロマトグラフィー分離
粗製原料を、０．２マイクロメートルフィルター(Whatman PTFE w/GMF)を通して濾過し、Chiralpak AD固定相を含むクロマトグラフィーカラム（長さ２５ｃｍ、内径２．１ｃｍ）上に、８０％二酸化炭素および２０％エタノールの移動相を使用し、カラム流量４０ｇ／分で注入した。０．８５ｍｌずつ３５回カラム注入した後、半精製（−）−Δ９−トランス−ＴＨＣ（純度９７．４％）６ｇが集められた。残留する不純物の大部分は（−）−Δ９−ａｂｎ−ＴＨＣ（２．５％ＡＵＣ）であることが分かった。
【００２９】
工程２  ２−エチルピリジンシロキサンカラムを使用するクロマトグラフィー分離
半精製（−）−Δ９−ＴＨＣを、９２％二酸化炭素および８％エタノールの移動相を使用してChiralpak ADカラム（長さ２５ｃｍ、内径２．１ｃｍ）上にカラム流量２０ｇ／分で注入した。半精製原料を５ｍｌ／分で３秒間カラム注入した後、（−）−Δ９−ａｂｎ−ＴＨＣ不純物は０．０５％ＡＵＣ未満に低下した。
【００３０】
比較例１
Chiralpak ADカラムおよびヘキサン／エタノール移動相を使用する１工程精製
クロマトグラフィー装置は、例１で使用したものと同一であった。粗製原料を、０．２マイクロメートルフィルター(Whatman PTFE w/GMF)を通して濾過し、Chiralpak AD固定相を含むクロマトグラフィーカラム（長さ２５ｃｍ、内径１ｃｍ）上に、９５％ヘキサンおよび５％エタノールの移動相を使用し、カラム流量４．８ｍｌ／分で注入した。ＤＰＡ−イソから（−）−Δ９−トランス−ＴＨＣを調製用精製することはできなかった。
【００３１】
例３
２−エチルピリジンシロキサンカラムおよびChiralpak ADカラムを使用する、スケールアップした２工程精製
クロマトグラフィー装置
Novasep Supersep 100 SFCを両クロマトグラフィー工程に使用した。２種類の固定相、すなわちPrinceton Chromatography Inc製の、粒子径１０μｍを有する２−エチルピリジンシロキサン固定相、およびDaicel Chemical Co.製の、粒子径２０μｍを有するChiralpak AD固定相（マクロ細孔シリカゲル上に担持されたアミローストリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート））を使用した。
【００３２】
工程１  ２−エチルピリジンシロキサンカラムを使用するクロマトグラフィー分離
Novasep Supersep 100 SFCに、２−エチルピリジン結合されたシリカで床長さ２５０ｍｍに充填した、内径１００ｍｍの動的軸方向圧縮（ＤＡＣ）カラムを取り付けた。液体二酸化炭素(Airgas, Instrument Grade)および無水エタノール(Warner Graham, USP Grade)の約９６：４wt/wt混合物を移動相として使用した。操作条件は、
カラム温度３０℃
カラム圧１２５バール
液体ＣＯ２流量１７７０ｇ／分
エタノール流量８０ｇ／分
検出ＵＶ２４５ｎｍ
エタノール溶離剤中の製品を蒸発により濃縮し、琥珀色の溶液を得た。（−）−Δ９−トランス−ＴＨＣは、純度＞９６％で単離された。
【００３３】
工程２  Chiralpak ADカラムを使用するクロマトグラフィー分離
Novasep Supersep 100 SFCに、Chiralpak ADで床長さ２５０ｍｍに充填した、内径１００ｍｍの動的軸方向圧縮（ＤＡＣ）カラムを取り付けた。液体二酸化炭素(Airgas, Instrument Grade)および無水エタノール(Warner Graham, USP Grade)の約８６：１４wt/wt混合物を移動相として使用した。ＳＦＣ操作条件は、
カラム温度２５℃
カラム圧１２５バール
液体ＣＯ２流量８５８ｇ／分
エタノール流量１４２ｇ／分
検出ＵＶ２４５ｎｍ
エタノール溶離剤中の製品を蒸発により濃縮し、無色の溶液を得た。（−）−Δ９−トランス−ＴＨＣは、純度＞９９％で単離された。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、（−）−Δ９−トランス−ＴＨＣを様々なカンナビノイド不純物と共に示す図である。
【図１】
0005566565.tif 000004