(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポトーシス、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）によってＣＤ３８＋細胞を死滅させることができることを特徴とする、ＣＤ３８に特異的に結合する抗体であって、
前記抗体は、配列番号１、２及び３によって表されるアミノ酸配列を有する３つの連続する相補性決定領域を含む少なくとも１つの重鎖、並びに配列番号４、５及び６によって表されるアミノ酸配列を有する３つの連続する相補性決定領域を含む少なくとも１つの軽鎖を含み；並びに
前記抗体が、配列番号３８からなるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び配列番号５０からなるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む；
ことを特徴とする抗体。
【請求項２】
アポトーシス、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）によってＣＤ３８＋細胞を死滅させることができることを特徴とする、ＣＤ３８に特異的に結合する抗体であって、
前記抗体は、配列番号７、８及び９によって表されるアミノ酸配列を有する３つの連続する相補性決定領域を含む少なくとも１つの重鎖、並びに配列番号１０、１１及び１２によって表されるアミノ酸配列を有する３つの連続する相補性決定領域を含む少なくとも１つの軽鎖を含み；並びに
前記抗体が、配列番号４０からなるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び配列番号５２からなるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む；
ことを特徴とする抗体。
【請求項３】
アポトーシス、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）によってＣＤ３８＋細胞を死滅させることができることを特徴とする、ＣＤ３８に特異的に結合する抗体であって、
前記抗体は、配列番号１３、１４及び１５によって表されるアミノ酸配列を有する３つの連続する相補性決定領域を含む少なくとも１つの重鎖、並びに配列番号１６、１７及び１８によって表されるアミノ酸配列を有する３つの連続する相補性決定領域を含む少なくとも１つの軽鎖を含み；並びに
前記抗体が、配列番号４２からなるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び配列番号５４からなるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む；
ことを特徴とする抗体。
【請求項４】
アポトーシス、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）によってＣＤ３８＋細胞を死滅させることができることを特徴とする、ＣＤ３８に特異的に結合する抗体であって、
前記抗体は、配列番号１９、２０及び２１によって表されるアミノ酸配列を有する３つの連続する相補性決定領域を含む少なくとも１つの重鎖、並びに配列番号２２、２３及び２４によって表されるアミノ酸配列を有する３つの連続する相補性決定領域を含む少なくとも１つの軽鎖を含み；並びに
前記抗体が、配列番号４４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び配列番号５６からなるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む；
ことを特徴とする抗体。
【請求項５】
アポトーシス、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）によってＣＤ３８＋細胞を死滅させることができることを特徴とする、ＣＤ３８に特異的に結合する抗体であって、
前記抗体は、配列番号２５、２６及び２７によって表されるアミノ酸配列を有する３つの連続する相補性決定領域を含む少なくとも１つの重鎖、並びに配列番号２８、２９及び３０によって表されるアミノ酸配列を有する３つの連続する相補性決定領域を含む少なくとも１つの軽鎖を含み；並びに
前記抗体が、配列番号４６からなるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び配列番号５８からなるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む；
ことを特徴とする抗体。
【請求項６】
アポトーシス、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）によってＣＤ３８＋細胞を死滅させることができることを特徴とする、ＣＤ３８に特異的に結合する抗体であって、
前記抗体は、配列番号３１、３２及び３３によって表されるアミノ酸配列を有する３つの連続する相補性決定領域を含む少なくとも１つの重鎖、並びに配列番号３４、３５及び３６によって表されるアミノ酸配列を有する３つの連続する相補性決定領域を含む少なくとも１つの軽鎖を含み；並びに
前記抗体が、配列番号４８からなるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び配列番号６０からなるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む；
ことを特徴とする抗体。
【請求項７】
前記抗体が、寄託番号ＰＴＡ−７６６７、ＰＴＡ−７６６９、ＰＴＡ−７６７０、ＰＴＡ−７６６６、ＰＴＡ−７６６８及びＰＴＡ−７６７１下で、２００６年６月２１日に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（１０８０１Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，２０１１０−２２０９，ＵＳＡ）に寄託されたハイブリドーマ細胞株の群から選択されるハイブリドーマ細胞株によって産生されることを特徴とする、請求項１から６の何れか一項に記載の抗体。
【請求項８】
アポトーシス、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）によってＣＤ３８＋細胞を死滅させることができることを特徴とする、ＣＤ３８に特異的に結合するヒト化された又は再表面化された抗体であって、
前記抗体は、配列番号６６によって表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号６２及び６４の群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む；
ことを特徴とするヒト化された又は再表面化された抗体。
【請求項９】
アポトーシス、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）によってＣＤ３８＋細胞を死滅させることができることを特徴とする、ＣＤ３８に特異的に結合するヒト化された又は再表面化された抗体であって、
前記抗体は、配列番号７２によって表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号６８及び７０の群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む；
ことを特徴とするヒト化された又は再表面化された抗体。
【請求項１０】
配列番号６２によって表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び配列番号６６によって表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含むことを特徴とする、ヒト化された又は再表面化された抗体。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ＣＤ３８は、長いＣ末端細胞外ドメインと短いＮ末端細胞質ドメインとを有する４５ｋＤのＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ３８タンパク質は、ＮＡＤ＋の環状ＡＤＰ−リボース（ｃＡＤＰＲ）への転化を触媒することができ、及びｃＡＤＰＲのＡＤＰ−リボースへの加水分解も触媒することができる二機能表面酵素である。個体発生の間、ＣＤ３８は、ＣＤ３４＋前駆幹細胞及び系統によって前駆化されたリンパ系の前駆細胞、赤血球及び骨髄性細胞の前駆細胞上に出現する。ＣＤ３８の発現は、Ｔ及びＢ細胞の発育の異なる段階において、変動する発現レベルにて、ほとんどの場合、リンパ球系統中に維持される。
【０００２】
ＣＤ３８は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、Ｂ慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、Ｂ及びＴ急性リンパ性（ＡＬＬ）、Ｔリンパ腫（ＴＣＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む多くの造血器悪性腫瘍中で、及び様々な造血器悪性腫瘍に由来する細胞株中で上方制御される。他方、造血系の多くの原始的な多能性幹細胞はＣＤ３８−である。造血器悪性腫瘍中でのＣＤ３８発現及び疾病の進行とのその相関は、ＣＤ３８を抗体治療のための魅力的な標的とする。
【０００３】
ＣＤ３８は、Ｃａ２＋動員に（Ｍ．Ｍｏｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，ＦＡＳＥＢＪ．，１２：５８１−５９２；Ｍ．Ｔ．Ｚｉｌｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，９７：２８４０−２８４５）並びにリンパ球系細胞及び骨髄系細胞又は細胞株中の多数のシグナル伝達分子（ホスホリパーゼＣ−γ、ＺＡＰ−７０、ｓｙｋ及びｃ−ｃｂｌを含む。）のチロシンリン酸化を通じたシグナル伝達に（Ａ．Ｆｕｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２３：２４０７−２４１１；Ｍ．Ｍｏｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，ＦＡＳＥＢＪ．，１２：５８１−５９２；Ａ．Ｆｕｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４５：２３９０−２３９６；Ｍ．Ｚｕｂｉａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５９：１９３−２０５；Ｓ．Ｄｅａｇｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｂｌｌｏｄ１０２：２１４６−２１５５；Ｅ．Ｔｏｄｉｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｂｌｏｏｄ，９５：５３５−５４２；Ｍ．Ｋｏｎｏｐｌｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６１：４７０２−４７０８；Ｍ．Ｔ．Ｚｉｌｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，９７：２８４０−２８４５；Ａ．Ｋｉｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５９：１８４−１９２；Ａ．Ｋｉｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６２：１９５２−１９５８；Ｒ．Ｍａｌｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，ｌｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３：３９７−４０９）に関与することが報告されている。これらの観察に基づいて、ＣＤ３８は、リンパ球系細胞及び骨髄系細胞の正常な発育の間に、これらの細胞の成熟及び活性化において重要なシグナル伝達分子であると提唱された。
【０００４】
特に、これらのシグナル伝達研究の多くが、ＣＤ３８を異所性に過剰発現する細胞株及び生理的なリガンドでない抗ＣＤ３８モノクローナル抗体を使用しているので、シグナル伝達及び造血におけるＣＤ３８の正確な役割は未だ不明である。ＣＤ３８タンパク質は、Ｃａ２＋動員を誘導することができる分子であるｃＡＤＰＲ（Ｈ．Ｃ．Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２６４：１６０８−１６１５；Ｈ．Ｃ．Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ａａｒｈｕｓ，１９９１，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｕｌ，２：２０３−２０９）を産生する酵素活性を有するので、モノクローナル抗体によるＣＤ３８の連結は、ｃＡＤＰＲの産生を増加させることによって、リンパ球中でのＣａ２＋の動員及びシグナル伝達の引き金を引くことが提唱されている（Ｈ．Ｃ．Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ，４１９：４１１−４１９）。この仮説とは逆に、ＣＤ３８タンパク質の末端切断及び点変異分析によって、ＣＤ３８タンパク質の細胞質尾部及びその酵素活性は何れも、抗ＣＤ３８抗体によって媒介されるシグナル伝達に必要でないことが示された（Ａ．Ｋｉｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６２：１９５２−１９５８；Ｆ．Ｅ．Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６２：２６９３−２７０２；Ｓ．Ｈｏｓｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５８，７４１−７４７）。
【０００５】
ＣＤ３８の機能に対する最高の証拠は、自然免疫を欠如し、樹状細胞の遊走の欠如故に、Ｔ細胞依存性の液性応答が低下しているＣＤ３８−／−ノックアウトマウスから得られる（Ｓ．Ｐａｒｔｉｄａ−Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０：２７９−２９１；Ｓ．Ｐａｒｔｉｄａ−Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔ  Ｍｅｄ，７：１２０９−１２１６）。ヒト及びマウスの間で、造血の間のＣＤ３８発現パターンは大幅に異なるので、すなわち、ａ）ヒトの未熟な前駆幹細胞とは異なり、マウス中の類似の前駆幹細胞は、ＣＤ３８の高いレベルを発現し（Ｔ．Ｄ．Ｒａｎｄａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｂｌｏｏｄ，８７：４０５７−４０６７；Ｒ．Ｎ．Ｄａｇｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，４：６９−７４）、ｂ）ヒトＢ細胞の発育の間、ＣＤ３８発現の高いレベルが胚中心Ｂ細胞及び形質細胞中で見出される（Ｆ．Ｍ．Ｕｃｋｕｎ，１９９０，Ｂｌｏｏｄ，７６：１９０８−１９２３；Ｍ．Ｋｕｍａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１８１：１１０１−１１１０）のに対して、マウスでは、対応する細胞中のＣＤ３８発現レベルは低い（Ａ．Ｍ．Ｏｌｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＪＩｍｕｎｎｏｌ，１５８：１１０８−１１１５；Ａ．Ｒｉｄｄｅｒｓｔａｄ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．Ｔａｒｌｉｎｔｏｎ１９９８，ＪＩｍｍｕｎｏｌ，１６０：４６８８−４６９５）ので、マウスにおけるＣＤ３８の機能がヒトにおけるＣＤ３８の機能と同じであるかは明確でない。
【０００６】
様々な腫瘍細胞及び細胞株に対して異なる増殖特性を有する幾つかの抗ヒトＣＤ３８抗体が文献中に記載されている。例えば、マウスＦａｂ及びヒトＩｇＧ１ＦｃとのキメラＯＫＴ１０抗体は、ＭＭ患者又は正常固体の何れかから得た末梢血単核エフェクター細胞の存在下で、リンパ腫細胞に対して、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を極めて効率的に媒介する（Ｆ．Ｋ．Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９１，Ｂｌｏｏｄ，７７：１０７１−１０７９）。抗ＣＤ３８抗体ＡＴ１３／５のＣＤＲ移植されたヒト化様式は、ＣＤ３８陽性細胞株に対して強力なＡＤＣＣ活性を有することが示されている（ＵＳ０９／７９７，９４１Ａ１）。ヒトモノクローナル抗ＣＤ３８抗体は、ＡＤＣＣ及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）によるＣＤ３８陽性細胞株のインビトロでの死滅を媒介すること、並びにＭＭ細胞株ＲＰＭＩ−８２２６を有するＳＣＩＤマウス中での腫瘍増殖を遅らせることが見出されている（ＷＯ２００５／１０３０８３Ａ２）。他方、幾つかの抗ＣＤ３８抗体ＩＢ４、ＳＵＮ−４Ｂ７及びＯＫＴ１０は、正常個体由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖を誘導したが、ＩＢ６、ＡＴ１又はＡＴ２は誘導しなかった（Ｃ．Ｍ．Ａｕｓｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，５６：５３９−５４７）。
【０００７】
従来技術の抗体の幾つかは、ＣＤ３８＋Ｂ細胞中でのアポトーシスの引き金を引き得ることが示されている。しかしながら、それらは、間質細胞又は間質由来のサイトカインの存在下でのみアポトーシスの引き金を引き得るに過ぎない。作動性の抗ＣＤ３８抗体（ＩＢ４）は、ヒト胚中心（ＧＣ）Ｂ細胞のアポトーシスを抑制し（Ｓ．Ｚｕｐｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９４，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２４：１２１８−１２２２）、及びＫＧ−１及びＨＬ−６０ＡＭＬ細胞の増殖を誘導する（Ｍ．Ｋｏｎｏｐｌｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６１：４７０２−４７０８）が、ＪｕｒｋａｔＴリンパ芽球細胞中でアポトーシスを誘導する（Ｍ．Ｍｏｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，ＦＡＳＥＢ  Ｊ，１２：５８１−５９２）ことが報告されている。別の抗ＣＤ３８抗体Ｔ１６は、ＡＬＬ患者からの未熟なリンパ球系細胞及び白血病性のリンパ芽球細胞（Ｍ．Ｋｕｍａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１８１：１１０１−１１１０）及びＡＭＬ患者からの白血病性骨髄芽球細胞（Ｅ．Ｔｏｄｉｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｂｌｏｏｄ，９５：５３５−５４２）のアポトーシスを誘導したが、Ｔ１６は、間質細胞又は間質由来のサイトカイン（ＩＬ−７、ＩＬ−３、幹細胞因子）の存在下でのみアポトーシスを誘導した。
【０００８】
他方、幾つかの従来の抗体は、架橋後にアポトーシスを誘導するが、単独で温置されたときには、一切のアポトーシス活性を完全に欠如している（ＷＯ２００６／０９９８７５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願第０９／７９７，９４１号明細書
【特許文献２】国際公開第２００５／１０３０８３号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００６／０９９８７５号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｍ．Ｍｏｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，ＦＡＳＥＢＪ．，１２：５８１−５９２
【非特許文献２】Ｍ．Ｔ．Ｚｉｌｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，９７：２８４０−２８４５
【非特許文献３】Ａ．Ｆｕｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２３：２４０７−２４１１
【非特許文献４】Ｍ．Ｍｏｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，ＦＡＳＥＢＪ．，１２：５８１−５９２
【非特許文献５】Ａ．Ｆｕｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４５：２３９０−２３９６
【非特許文献６】Ｍ．Ｚｕｂｉａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５９：１９３−２０５
【非特許文献７】Ｓ．Ｄｅａｇｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｂｌｌｏｄ１０２：２１４６−２１５５
【非特許文献８】Ｅ．Ｔｏｄｉｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｂｌｏｏｄ，９５：５３５−５４２
【非特許文献９】Ｍ．Ｋｏｎｏｐｌｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６１：４７０２−４７０８
【非特許文献１０】Ｍ．Ｔ．Ｚｉｌｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，９７：２８４０−２８４５
【非特許文献１１】Ａ．Ｋｉｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５９：１８４−１９２
【非特許文献１２】Ａ．Ｋｉｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６２：１９５２−１９５８
【非特許文献１３】Ｒ．Ｍａｌｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，ｌｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３：３９７−４０９
【非特許文献１４】Ｈ．Ｃ．Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２６４：１６０８−１６１５
【非特許文献１５】Ｈ．Ｃ．Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ａａｒｈｕｓ，１９９１，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｕｌ，２：２０３−２０９
【非特許文献１６】Ｈ．Ｃ．Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ，４１９：４１１−４１９
【非特許文献１７】Ａ．Ｋｉｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６２：１９５２−１９５８
【非特許文献１８】Ｆ．Ｅ．Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６２：２６９３−２７０２
【非特許文献１９】Ｓ．Ｈｏｓｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５８，７４１−７４７
【非特許文献２０】Ｓ．Ｐａｒｔｉｄａ−Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０：２７９−２９１
【非特許文献２１】Ｓ．Ｐａｒｔｉｄａ−Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔ  Ｍｅｄ，７：１２０９−１２１６
【非特許文献２２】Ｔ．Ｄ．Ｒａｎｄａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｂｌｏｏｄ，８７：４０５７−４０６７
【非特許文献２３】Ｒ．Ｎ．Ｄａｇｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，４：６９−７４
【非特許文献２４】Ｆ．Ｍ．Ｕｃｋｕｎ，１９９０，Ｂｌｏｏｄ，７６：１９０８−１９２３
【非特許文献２５】Ｍ．Ｋｕｍａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１８１：１１０１−１１１０
【非特許文献２６】Ａ．Ｍ．Ｏｌｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＪＩｍｕｎｎｏｌ，１５８：１１０８−１１１５
【非特許文献２７】Ａ．Ｒｉｄｄｅｒｓｔａｄ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．Ｔａｒｌｉｎｔｏｎ１９９８，ＪＩｍｍｕｎｏｌ，１６０：４６８８−４６９５
【非特許文献２８】Ｆ．Ｋ．Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａ  １９９１，Ｂｌｏｏｄ，７７：１０７１−１０７９
【非特許文献２９】Ｃ．Ｍ．Ａｕｓｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，５６：５３９−５４７
【非特許文献３０】Ｓ．Ｚｕｐｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９４，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２４：１２１８−１２２２
【非特許文献３１】Ｍ．Ｋｏｎｏｐｌｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６１：４７０２−４７０８
【非特許文献３２】Ｍ．Ｍｏｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，ＦＡＳＥＢ  Ｊ，１２：５８１−５９２
【非特許文献３３】Ｍ．Ｋｕｍａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１８１：１１０１−１１１０
【非特許文献３４】Ｅ．Ｔｏｄｉｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｂｌｏｏｄ，９５：５３５−５４２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ＣＤ３８は様々な造血器悪性腫瘍に対する抗体治療のための魅力的な標的なので、本発明者らは、ＣＤ３８陽性の悪性造血細胞に対する以下の３つの細胞傷害活性、すなわち、アポトーシス、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの誘導の高い効力に関して、抗ヒトＣＤ３８抗体の多数を作製し、スクリーニングした。本発明は、３つの異なる細胞傷害性機序、すなわち、アポトーシス、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの誘導によってＣＤ３８＋細胞を死滅させることができる新規抗ＣＤ３８抗体を記載する。特筆すべきことに、本発明は、間質細胞又は間質由来のサイトカインの不存在下でさえ、ＣＤ３８＋細胞のアポトーシスを直接的に誘導することができる初めての抗ＣＤ３８抗体を開示する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の要旨
ＣＤ３８を特異的に結合し、アポトーシスによってＣＤ３８＋細胞を死滅させることができる抗体を提供することが本発明の目的である。幾つかの従来技術の抗体は架橋された場合にのみアポトーシスを惹起することができ、その他の場合には、一切のアポトーシス活性を欠如しているのに対して、本発明の抗体は、単独で温置された場合でさえ、ＣＤ３８＋細胞のアポトーシス細胞死を誘導することができる。本発明の一態様において、本発明の抗体は、ＡＤＣＣ又はＣＤＣによって、ＣＤ３８＋Ｂ細胞を死滅させることができる。さらに別の態様において、本発明の抗体は、上記機序、すなわち、アポトーシス、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの少なくとも２つによって、ＣＤ３８＋細胞を死滅させることができる。特筆すべきことに、本発明の抗体は、３つの異なる全ての機序：アポトーシス、ＡＤＣＣ及びＣＤＣによってＣＤ３８＋Ｂ細胞を死滅させることが示された最初の抗ＣＤ３８抗体である。本発明のさらなる実施形態において、前記抗体は、間質細胞又は間質由来のサイトカインの不存在下でさえ、アポトーシスによって、ＣＤ３８＋Ｂ細胞を死滅させることができる。
【００１３】
本発明の抗体は、特に、リンパ腫細胞、白血病細胞及び多発性骨髄腫細胞を含む悪性ＣＤ３８＋Ｂ細胞を死滅させることができる。幾つかの実施形態において、ＣＤ３８＋Ｂ細胞は、ＮＨＬ、ＢＬ、ＭＭ、Ｂ−ＣＬＬ、ＡＬＬ、ＴＣＬ、ＡＭＬ、ＨＣＬ、ＨＬ又はＣＭＬ細胞である。
【００１４】
本発明の一態様において、本発明の抗体は、間質細胞又は間質由来のサイトカインの不存在下において、アポトーシスにより、Ｄａｕｄｉリンパ腫細胞の少なくとも２４％及び／又はラモスリンパ腫細胞の少なくとも７％及び／又はＭＯＬＰ−８多発性骨髄腫細胞の１１％及び／又はＳＵ−ＤＨＬ−８リンパ腫細胞の３６％及び／又はＤＮＤ−４１白血病細胞の６２％及び／又はＮＵ−ＤＵＬ−１リンパ腫細胞の２７％及び／又はＪＶＭ−１３白血病細胞の９％及び／又はＨＣ−１白血病細胞の４％を死滅させることができる。
【００１５】
本発明の抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであり得る。好ましいのは、モノクローナル抗ＣＤ３８抗体である。より好ましい実施形態において、軽鎖及び重鎖可変領域の両方のアミン酸配列に関して本明細書において完全に性質決定されている３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９から選択されるマウス抗体、軽鎖及び重鎖可変領域に対する遺伝子のｃＤＮＡ配列、それらのＣＤＲ（相補性決定領域）の同定、それらの表面アミノ酸の同定及び組換え形態でそれらを発現させるための手段が提供される。
【００１６】
本発明は、３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９から選択されるマウス抗ＣＤ３８モノクローナル抗体のキメラ様式を含む。公知のヒト抗体表面とより密接に似るようにするために、抗体又はそのエピトープ結合断片の可変領域フレームワークの表面露出された残基が軽鎖及び重鎖の両方において置換されている３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９抗体の再表面化された又はヒト化された様式も含まれる。本発明のヒト化された抗体及びそのエピトープ結合断片は、これらが投与されるヒト対象中で、マウス様式より少ない免疫原性（又は完全に非免疫原性）であるという点で改善された特性を有する。従って、本発明のヒト化された３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９抗体及びこれらのエピトープ結合断片の様々な様式は、ヒトに対して免疫原性を示さずにＣＤ３８を特異的に認識する。
【００１７】
本発明の３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９抗体のヒト化された様式は、軽鎖及び重鎖可変領域の両方の各アミノ酸配列、軽鎖及び重鎖可変領域に対する遺伝子のＤＮＡ配列、ＣＤＲ（相補性決定領域）の同定、それらの可変領域フレームワーク表面アミノ酸残基の同定及び組換え形態でそれらを発現させるための手段の開示に関して、本明細書中で完全に性質決定されている。
【００１８】
本発明は、（１）ＣＤ３８を認識及び結合する細胞結合因子並びに（２）細胞傷害性因子を含む細胞傷害性連結体間の連結体の使用も想定する。細胞傷害性連結体において、本発明の細胞傷害性連結体が効果的な殺傷剤を形成するように、細胞結合因子はＣＤ３８に対して高い親和性を有し、細胞傷害性因子はＣＤ３８を発現する細胞に対して細胞傷害性の高い程度を有する。
【００１９】
好ましい実施形態において、細胞結合因子は、細胞傷害性因子が直接又は切断可能な若しくは切断不能なリンカーを介して抗体又はそのエピトープ結合断片に共有結合されている、抗ＣＤ３８抗体（例えば、３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９）又はそのエピトープ結合断片、より好ましくはヒト化された抗ＣＤ３８抗体（例えば、３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９）又はそのエピトープ結合断片である。より好ましい実施形態において、細胞結合因子はヒト化された３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９抗体又はそのエピトープ結合断片であり、並びに細胞傷害性因子はタキソール、マイタンシノイド、トマイマイシン誘導体、レプトマイシン誘導体、ＣＣ−１０６５又はＣＣ−１０６５類縁体である。
【００２０】
より好ましくは、細胞結合因子は、ヒト化された抗ＣＤ３８抗体３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９であり、並びに細胞傷害性因子はＤＭ１又はＤＭ４などのマイタイシン化合物である。
【００２１】
本発明は、ＣＤ３８を結合する能力を保持する抗ＣＤ３８抗体の断片の使用も包含する。本発明の別の態様において、抗ＣＤ３８抗体の機能的均等物の使用が想定される。
【００２２】
本発明は、ＣＤ３８を発現する細胞の増殖を阻害するための方法も含む。好ましい実施形態において、ＣＤ３８を発現する細胞の増殖を阻害するための方法はインビボで行われ、細胞の死をもたらすが、インビトロ及びエキソビボでの利用も含まれる。
【００２３】
本発明は、抗ＣＤ３８抗体又は抗ＣＤ３８抗体−細胞傷害性因子連結体及び医薬として許容される担体又は賦形剤を含む治療用組成物も提供する。幾つかの実施形態において、治療用組成物は第二の治療剤を含む。この第二の治療剤は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、組織因子（ＴＦ）、プロテインＣ、プロテインＳ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリン、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）若しくは血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のアンタゴニスト又はＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体、ｃ−ＭＥＴ及び他の受容体チロシンキナーゼを含む上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、組織因子（ＴＦ）、プロテインＣ、プロテインＳ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリン、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）若しくは血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する受容体のアンタゴニストを含む群から選択することができる。この第二の治療剤は、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９、ＣＤ８０、ＣＤ１０３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８及びＣＤ１５２を含む表面抗原分類（ＣＤ）の抗原を標的とする抗体を含む群から選択することも可能である。この第二の治療剤は、化学療法剤又は免疫調節剤の群からも選択することができる。
【００２４】
本発明は、治療用組成物を用いて、癌又は炎症性疾患（自己免疫疾患を含む。）を有する対象を治療する方法をさらに含む。幾つかの実施形態において、癌は、ＮＨＬ、ＢＬ、ＭＭ、Ｂ−ＣＬＬ、ＡＬＬ、ＴＣＬ、ＡＭＬ、ＨＣＬ、ＨＬ及びＣＭＬからなる群から選択される。別の実施形態において、自己免疫疾患は、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、胃炎、橋本甲状腺炎、強直性脊椎炎、Ｃ型肝炎関連クリオグロブリン血症性血管炎、慢性局所性脳炎、類天疱瘡、血友病Ａ、膜性増殖性糸球体腎炎、シェーグレン症候群、成人及び若年性皮膚筋炎、成人多発性筋炎、慢性蕁麻疹、原発性胆汁性肝硬変、突発性血小板減少性紫斑病、視神経脊髄炎、グレーブス甲状腺異常病、類天疱瘡、膜性増殖性糸球体腎炎、チャーグ・ストラウス症候群及び喘息からなる群から選択される。好ましい実施形態において、細胞傷害性連結体は抗ＣＤ３８抗体及び細胞傷害性因子を含む。より好ましい実施形態において、細胞傷害性連結体はヒト化された３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９抗体−ＤＭ１連結体、ヒト化された３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９抗体−ＤＭ４又はヒト化された３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９抗体−タキサン連結体を含み、連結体は医薬として許容される担体又は賦形剤とともに投与される。
【００２５】
本発明の別の態様において、生物学的試料中のＣＤ３８タンパク質を検出するために、抗ＣＤ３８抗体が使用される。好ましい実施形態において、前記抗体は腫瘍組織中のＣＤ３８レベルを測定するために使用される。
【００２６】
本発明は、抗ＣＤ３８抗体又は抗ＣＤ３８抗体−細胞傷害性因子連結体及び使用のための指示書を含むキットも含む。好ましい実施形態において、抗ＣＤ３８抗体は、ヒト化された３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９抗体であり、細胞傷害性因子はＤＭ１若しくはＤＭ４などのマイタンシン化合物、トマイマイシン誘導体、レプトマイシン誘導体又はタキサンであり、指示書は癌を有する対象の治療において連結体を使用するための指示書である。連結体が凍結乾燥された状態又は濃縮された形態である場合、キットは、希釈剤など、医薬として許容される製剤の調製に必要な成分及び製剤の投与に必要な成分も含み得る。
【００２７】
別段の記載がなければ、本明細書中に引用されている全ての参考文献及び特許は、参照により組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】図１Ａは、ヒトＣＤ３８を発現する３００−１９細胞及びＣＤ３８陽性ラモスリンパ腫細胞への、精製されたマウス抗ＣＤ３８抗体３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８の特異的結合のＦＡＣＳ分析を示している。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ヒトＣＤ３８を発現する３００−１９細胞及びＣＤ３８陽性ラモスリンパ腫細胞への、精製されたマウス抗ＣＤ３８抗体３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１、３８ＳＢ３９及び対照抗ＣＤ３８抗体ＡＴ１３／５の特異的結合のＦＡＣＳ分析を示している。
【図２】図２は、ラモス細胞を用いて確立された３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９の結合滴定曲線を示している。
【図３】図３は、３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１９又はＡＴ１３／５（１０ｎＭ）との２４時間の温置後にアポトーシスを起こしているラモス細胞のＦＡＣＳドットプロット（ＦＬ４−Ｈ；ＴＯ−ＰＲＯ−３染色；ｙ軸及びＦＬ１−Ｈ；アネキシンＶ−ＦＩＴＣ染色；ｘ軸）を示している。
【図４Ａ】図４Ａは、３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１、３８ＳＢ３９、３８ＳＢ７、３８ＳＢ２３、ＩＢ４、ＡＴ１３／５、ＯＫＴ１０又はＳＵＮ−４Ｂ７との２４時間の温置後にアポトーシスを起こしているラモス細胞の平均パーセントを示している。２つ組みの試料から得られたアネキシンＶ陽性細胞の平均パーセント（ｙ軸；ＴＰ−ＰＲＯ−３陽性及び陰性細胞の両方を含む。）をプロットした。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４Ａと同じ抗体の組とともに２４時間温置した後にアポトーシスを起こしているダウディ細胞の平均パーセントを示している。
【図４Ｃ】図４Ｃは、図４Ａと同じ抗体の組とともに２４時間温置した後にアポトーシスを起こしているＭｏｌｐ−８細胞の平均パーセントを示している。
【図５Ａ】図５Ａは、ｈｕ３８ＳＢ１９−ＬＣを発現させるために使用されたヒト発現ベクターの模式図を示している。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ｈｕ３８ＳＢ１９−ＨＣを発現させるために使用されたヒト発現ベクターの模式図を示している。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ｈｕ３８ＳＢ１９ＬＣ及びｈｕＳＢ１９ＨＣをともに発現させるために使用されたヒト発現ベクターの模式図を示している。
【図６Ａ】図６Ａは、抗体ｃｈ３８ＳＢ１３、ｃｈ３８ＳＢ１８及びｃｈ３８ＳＢ１９によって媒介される、ラモス細胞に対するＡＤＣＣ活性を示している。
【図６Ｂ】図６Ｂは、抗体ｃｈ３８ＳＢ３０、ｃｈ３８ＳＢ３１及びｃｈ３８ＳＢ３９によって媒介される、ラモス細胞に対するＡＤＣＣ活性を示している。
【図７Ａ】図７Ａは、抗体ｃｈ３８ＳＢ１８、ｃｈ３８ＳＢ１９、ｃｈ３８ＳＢ３１及び非結合キメラヒトＩｇＧ１対照抗体によって媒介される、ＬＰ−１多発性骨髄腫細胞に対するＡＤＣＣ活性を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、抗体ｃｈ３８ＳＢ１９及びマウス３８ＳＢ１９によって媒介される、ダウディ細胞に対するＡＤＣＣ活性を比較する。
【図８Ａ】図８Ａは、ｃｈ３８ＳＢ１９抗体によって及び非結合キメラヒトＩｇＧ１対照抗体によって媒介される、ＮＡＬＭ−６Ｂ−ＡＬＬ細胞に対するＡＤＣＣ活性を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ｃｈ３８ＳＢ１９抗体によって及び非結合キメラヒトＩｇＧ１対照抗体によって媒介される、ＭＯＬＴ−４Ｔ−ＡＬＬ細胞に対するＡＤＣＣ活性を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、抗体ｃｈ３８ＳＢ１３、ｃｈ３８ＳＢ１８、ｃｈ３８ＳＢ１９、ｃｈ３８ＳＢ３０及びｃｈ３８ＳＢ３９によって媒介される、Ｒａｊｉ−ＩＭＧ細胞に対するＣＤＣ活性を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、抗体ｃｈ３８ＳＢ１９及びｃｈ３８ＳＢ３１によって媒介される、Ｒａｊｉ−ＩＭＧ細胞に対するＣＤＣ活性を示す。
【図１０】図１０は、抗体ｃｈ３８ＳＢ１８、ｃｈ３８ＳＢ１９、ｃｈ３８ＳＢ３１及び非結合キメラヒトＩｇＧ１対照抗体によって媒介される、ＬＰ−１多発性骨髄腫に対するＣＤＣ活性を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、抗体ｃｈ３８ＳＢ１３、ｃｈ３８ＳＢ１９及びｃｈ３８ＳＢ３９によって媒介される、ダウディ細胞に対するＣＤＣ活性を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、抗体ｃｈ３８ＳＢ１８及びｃｈ３８ＳＢ３０によって媒介される、ダウディ細胞に対するＣＤＣ活性を示す。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、抗体ｃｈ３８ＳＢ１９及びｃｈ３８ＳＢ３１によって媒介される、ダウディ細胞に対するＣＤＣ活性を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ラモス細胞への結合に対するｃｈ３８ＳＢ１９、ｈｕ３８ＳＢ１９ｖ１．００及びｈｕ３８ＳＢ１９ｖ１．２０の結合滴定曲線を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ビオチン化されたマウス３８ＳＢ１９抗体のラモス細胞への結合を競合する能力に関して、ｃｈ３８ＳＢ１９、ｈｕ３８ＳＢ１９ｖ１．００及びｈｕ３８ＳＢ１９ｖ１．００を比較する結合曲線を示す。
【図１３】図１３は、ｃｈ３８ＳＢ１９、ｈｕ３８ＳＢ１９ｖ１．００又はｈｕ３８ＳＢ１９ｖ１．２０抗体との温置の２４時間後にアポトーシスを起こしているダウディ細胞の平均パーセントを示している。
【図１４】図１４は、抗体ｃｈ３８ＳＢ１９、ｈｕ３８ＳＢ１９ｖ１．００、ｈｕ３８ＳＢ１９ｖ１．２０によって、並びに非結合キメラヒトＩｇＧ１対照抗体によって媒介される、ＬＰ−１多発性骨髄腫に対するＡＤＣＣ活性を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、抗体ｃｈ３８ＳＢ１９、ｈｕ３８ＳＢ１９ｖ１．００及びｈｕ３８ＳＢ１９ｖ１．２０によって媒介される、Ｒａｊｉ−ＩＭＧリンパ腫細胞に対するＣＤＣ活性を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、抗体ｃｈ３８ＳＢ１９、ｈｕ３８ＳＢ１９ｖ１．００及びｈｕ３８ＳＢ１９ｖ１．２０によって媒介される、ＬＰ−１多発性骨髄腫細胞に対するＣＤＣ活性を示す。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、抗体ｃｈ３８ＳＢ１９、ｈｕ３８ＳＢ１９ｖ１．００及びｈｕ３８ＳＢ１９ｖ１．２０によって媒介される、ＤＮＤ−４１Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病細胞に対するＣＤＣ活性を示す。
【図１６】図１６は、ＳＵ−ＤＨＬ−８びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞、ＮＵ−ＤＵＬ−１Ｂ細胞性リンパ腫細胞、ＤＮＤ−４１Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病細胞、ＪＶＭ−１３Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病細胞及びＨＣ−１有毛細胞白血病細胞に対するｈｕ３８ＳＢ１９ｖ１．００抗体との温置から２４時間後におけるアネキシンＶ陽性細胞の平均パーセントを示す。
【図１７】図１７は、確立された播種性ヒトラモス腫瘍を有するＳＣＩＤマウスのパーセント生存を示す。示されているように、マウス３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１若しくは３８ＳＢ３９抗体又はＰＢＳで、マウスを処理した。
【図１８】図１８は、確立された播種性ヒトダウディ腫瘍を有するＳＣＩＤマウスのパーセント生存を示す。示されているように、ｈｕ３８ＳＢ１９又はｍｕ３８ＳＢ１９抗体又はＰＢＳで、マウスを処理した。
【図１９】図１９は、ＮＣＩ−Ｈ９２９多発性骨髄腫異種移植片腫瘍を有するＳＣＩＤマウスの平均腫瘍容積を示す。示されているように、ｈｕ３８ＳＢ１９、非結合対照ＩｇＧ１抗体又はＰＢＳで、マウスを処理した。
【図２０】図２０は、ＭＯＬＰ−８多発性骨髄腫異種移植片腫瘍を有するＳＣＩＤマウスの平均腫瘍容積を示す。示されているように、ｈｕ３８ＳＢ１９、ｍｕ３８ＳＢ１９、非結合対照ＩｇＧ１抗体又はＰＢＳで、マウスを処理した。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
発明の詳細な説明
ＣＤ３８を特異的に結合することができる新規抗体が、本明細書において提供される。特に、本発明者らは、細胞表面上のＣＤ３８に特異的に結合し、アポトーシスによってＣＤ３８＋細胞を死滅させる新規抗体を発見した。本発明の一態様において、抗ＣＤ３８抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ；ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）によってＣＤ３８＋細胞も死滅させることができる。別の態様において、本発明の抗ＣＤ３８抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）によってＣＤ３８＋細胞を死滅させることができる。さらに別の態様において、本発明の抗ＣＤ３８抗体は、上記機序、すなわち、アポトーシス、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの少なくとも２つによって、ＣＤ３８＋細胞を死滅させることができる。特に、好ましい実施形態において、本発明の抗ＣＤ３８抗体は、アポトーシス、ＡＤＣＣ及びＣＤＣによってＣＤ３８＋細胞を死滅させることができる。従って、本発明は、３つの異なる機序によってＣＤ３８＋細胞を死滅させることができる第一の抗ＣＤ３８抗体を提供する。
【００３０】
ＣＤ３８を結合し、ＣＤ３８＋細胞中でアポトーシス細胞死の引き金を引くことができる抗体は以前に記載されているが（Ｍ．Ｋｕｍａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１８１：１１０１−１１１０；Ｅ．Ｔｏｄｉｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｂｌｏｏｄ，９５：５３５−５４２）、本発明の抗体は、間質細胞又は間質由来のサイトカインの不存在下でアポトーシス活性が示されている初めての抗体である。本明細書において使用される「間質」は、結合組織、血管及び炎症性細胞を含む腫瘍の非悪性支持組織を表す。間質細胞は、癌細胞の挙動を与えることができる成長因子及び他の物質（サイトカインを含む。）を産生する。本明細書において使用される「サイトカイン」という用語は、免疫、炎症及び造血を媒介及び制御する小さな分泌タンパク質（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−６、ＩＦＮγ、ＩＬ−３、ＩＬ−７及びＧＭ−ＣＳＦ）を表す。従来技術の抗体は間質細胞又は間質由来のサイトカインの不存在下でアポトーシス細胞死の引き金を引くことができないことが、本明細書において示されている。これに対して、本発明の抗ＣＤ３８抗体は、同じ条件下で、強力なアポトーシス活性を示す。
【００３１】
別の態様において、本発明の抗体は、３×１０−９Ｍ又はそれ以下のＫＤで、ＣＤ３８タンパク質に結合することができる。
【００３２】
本明細書において使用される「ＣＤ３８」という用語は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号ＮＰ ００１７６６のようなアミノ酸配列を含むＩＩ型膜貫通タンパク質を表す。「ＣＤ３８＋細胞」は、ＣＤ３８タンパク質を発現する細胞である。好ましくは、ＣＤ３８＋細胞は哺乳動物の細胞である。
【００３３】
本発明の一実施形態において、ＣＤ３８＋細胞は悪性細胞である。別の実施形態において、ＣＤ３８＋細胞はＢ細胞である。好ましい実施形態において、ＣＤ３８＋細胞は造血器の悪性腫瘍に由来する腫瘍細胞である。より好ましい実施形態において、ＣＤ３８＋細胞はリンパ腫細胞、白血病細胞又は多発性骨髄腫細胞である。さらなる好ましい実施形態において、ＣＤ３８＋細胞は、ＮＨＬ、ＢＬ、ＭＭ、Ｂ−ＣＬＬ、ＡＬＬ、ＴＣＬ、ＡＭＬ、ＨＣＬ、ＨＬ又はＣＭＬ細胞である。
【００３４】
従って、一実施形態において、本発明は、間質細胞又は間質由来のサイトカインの不存在下で、ダウディリンパ腫細胞の少なくとも２４％を死滅させることができる抗ＣＤ３８抗体を提供する。別の実施形態において、本発明の抗ＣＤ３８抗体は、間質細胞又は間質由来のサイトカインの不存在下で、ラモスリンパ腫細胞の少なくとも７％を死滅させることができる。別の実施形態において、本発明の抗ＣＤ３８抗体は、間質細胞又は間質由来のサイトカインの不存在下で、ＭＯＬＰ−８多発性骨髄腫細胞の少なくとも１１％を死滅させることができる。別の実施形態において、本発明の抗ＣＤ３８抗体は、間質細胞又は間質由来のサイトカインの不存在下で、ＳＵ−ＤＨＬ−８リンパ腫細胞の少なくとも３６％を死滅させることができる。別の実施形態において、本発明の抗ＣＤ３８抗体は、間質細胞又は間質由来のサイトカインの不存在下で、ＮＵ−ＤＵＬ−１リンパ腫細胞の少なくとも２７％を死滅させることができる。別の実施形態において、本発明の抗ＣＤ３８抗体は、間質細胞又は間質由来のサイトカインの不存在下で、ＤＮＤ−４１白血病細胞の少なくとも６２％を死滅させることができる。別の実施形態において、本発明の抗ＣＤ３８抗体は、間質細胞又は間質由来のサイトカインの不存在下で、ＪＶＭ−１３白血病細胞の少なくとも９％を死滅させることができる。別の実施形態において、本発明の抗ＣＤ３８抗体は、間質細胞又は間質由来のサイトカインの不存在下で、ＨＣ−１白血病細胞の少なくとも４％を死滅させることができる。
【００３５】
抗体
本明細書において、「抗体」という用語は最も広義に使用され、具体的には、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥなどのあらゆるイソタイプのモノクローナル抗体（完全長のモノクローナル抗体を含む。）、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体、キメラ抗体及び抗体断片を包含する。特異的な抗原と反応する抗体は、ファージ若しくは類似のベクター中での組換え抗体のライブラリーの選択などの組換え法によって、又は抗原若しくは抗原をコードする核酸で動物を免疫化することによって作製することができる。
【００３６】
典型的なＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合によって連結されている２つの同一の重鎖と２つの同一の軽鎖から構成されている。各重鎖及び軽鎖は、定常領域及び可変領域を含有する。各可変領域は、抗原のエピトープを結合するのに主に必要とされる「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）又は「超可変領域」と称される３つのセグメントを含有する。これらは、通常、Ｎ末端から順番に付番され、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と称される。可変領域のより高度に保存された部分は、「フレームワーク領域」と称される。
【００３７】
本明細書において使用される「ＶＨ」又は「ＶＨ」は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２断片の重鎖を含む、抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域を表す。「ＶＬ」又は「ＶＬ」という表記は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２断片の軽鎖を含む、抗体の免疫グロブリン軽鎖の可変領域を表す。
【００３８】
「ポリクローナル抗体」とは、１若しくはそれ以上の他の同一でない抗体の間で又は存在下で産生された抗体である。一般に、ポリクローナル抗体は、同一でない抗体を産生する幾つかの他のＢリンパ球の存在下で、Ｂリンパ球から産生される。通常、ポリクローナル抗体は、免疫化された動物から直接得られる。
【００３９】
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体である。すなわち、該集団を形成する抗体は、僅かな量で存在する可能性がある天然に存在する変異を除いて本質的に同一である。これらの抗体は単一のエピトープに対して誘導され、従って高度に特異的である。
【００４０】
「エピトープ」は、抗体が結合する抗原上の部位である。抗原がタンパク質又は多糖などのポリマーである場合には、エピトープは、近接する残基によって、又は抗原性ポリマーの折りたたみによって近接した状態となった近接していない残基によって形成され得る。タンパク質中において、近接するアミノ酸によって形成されるエピトープは、変性溶媒へ曝露されても通例保持されるのに対して、近接していないアミノ酸によって形成されたエピトープは、前記曝露下において通例失われる。
【００４１】
本明細書において使用される「ＫＤ」という用語は、特定の抗体／抗原相互作用の解離定数を表す。
【００４２】
本発明は、新規マウス抗ＣＤ３８抗体、本明細書では、軽鎖及び重鎖の両方のアミノ酸配列に関して完全に性質決定されている３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９、ＣＤＲの同定、表面アミノ酸の同定及び組換え形態でそれらを発現させるための手段から開始する。抗体３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９の軽鎖及び重鎖の並びにヒト化された様式の一次アミノ酸及びＤＮＡ配列が本明細書に開示されている。
【００４３】
３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９マウス抗ＣＤ３８抗体を産生するハイブリドーマ細胞株は、それぞれ、ＰＴＡ−７６６７、ＰＴＡ−７６６９、ＰＴＡ−７６７０、ＰＴＡ−７６６６、ＰＴＡ−７６６８及びＰＴＡ−７６７１の寄託番号で、２００６年６月２１日に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｉｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，２０１１０−２２０９，ＵＳＡ）に寄託された。
【００４４】
本発明の範囲は、これらの配列を含む抗体及び断片に限定されない。代わりに、ＣＤ３８に特異的に結合し、アポトーシス、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣによってＣＤ３８＋細胞を死滅させることができる全ての抗体及び断片は、本発明の範囲に属する。従って、抗体及び抗体断片は、これらの足場、ＣＤＲ、軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列において、抗体３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９又はヒト化された誘導体と異なり得、なお本発明の範囲に属する。
【００４５】
一実施形態において、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５及び３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する１つ又はそれ以上のＣＤＲを含む抗体又はそのエピトープ結合断片を提供する。好ましい実施形態において、本発明の抗体は、少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含み、前記重鎖は配列番号１、２、３、７、８、９、１３、１４、１５、１９、２０、２１、２５、２６、２７、３１、３２及び３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する３つの連続するＣＤＲを含み、並びに前記軽鎖は配列番号４、５、６、１０、１１、１２、１６、１７、１８、２２、２３、２４、２８、２９、３０、３４、３５及び３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する３つの連続するＣＤＲを含む。
【００４６】
さらに好ましい実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１、２、３、４、５及び６の群から選択されるアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。さらにより好ましい実施形態において、少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含み、前記重鎖が配列番号１、２及び３からなるアミノ酸配列を有する３つの連続するＣＤＲを含み、並びに前記軽鎖が配列番号４、５及び６からなるアミノ酸配列を有する３つの連続するＣＤＲを含む、３８ＳＢ１３抗体が提供される。
【００４７】
別のより好ましい実施形態において、本発明の抗体は、配列番号７、８、９、１０、１１及び１２の群から選択されるアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。さらにより好ましい実施形態において、少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含み、前記重鎖が配列番号７、８及び９からなるアミノ酸配列を有する３つの連続するＣＤＲを含み、並びに前記軽鎖が配列番号１０、１１及び１２からなるアミノ酸配列を有する３つの連続するＣＤＲを含む、３８ＳＢ１８抗体が提供される。
【００４８】
別のより好ましい実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７及び１８の群から選択されるアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。さらにより好ましい実施形態において、少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含み、前記重鎖が配列番号１３、１４及び１５からなるアミノ酸配列を有する３つの連続するＣＤＲを含み、並びに前記軽鎖が配列番号１６、１７及び１８からなるアミノ酸配列を有する３つの連続するＣＤＲを含む、３８ＳＢ１９抗体が提供される。
【００４９】
別のより好ましい実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４の群から選択されるアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。さらにより好ましい実施形態において、少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含み、前記重鎖が配列番号１９、２０及び２１からなるアミノ酸配列を有する３つの連続するＣＤＲを含み、並びに前記軽鎖が配列番号２２、２３及び２４からなるアミノ酸配列を有する３つの連続するＣＤＲを含む、３８ＳＢ３０抗体が提供される。
【００５０】
別のより好ましい実施形態において、本発明の抗体は、配列番号２５、２６、２７、２８、２９及び３０の群から選択されるアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。さらにより好ましい実施形態において、少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含み、前記重鎖が配列番号２５、２６及び２７からなるアミノ酸配列を有する３つの連続するＣＤＲを含み、並びに前記軽鎖が配列番号２８、２９及び３０からなるアミノ酸配列を有する３つの連続するＣＤＲを含む、３８ＳＢ３１抗体が提供される。
【００５１】
別のより好ましい実施形態において、本発明の抗体は、３１、３２、３３、３４、３５及び３６の群から選択されるアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。さらにより好ましい実施形態において、少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含み、前記重鎖が配列番号３１、３２及び３３からなるアミノ酸配列を有する３つの連続するＣＤＲを含み、並びに前記軽鎖が配列番号３４、３５及び３６からなるアミノ酸配列を有する３つの連続するＣＤＲを含む、３８ＳＢ３９抗体が提供される。
【００５２】
別の実施形態において、本発明の抗ＣＤ３８抗体は、配列番号３８、４０、４２、４４、４６及び４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬを含む。より好ましい実施形態において、配列番号３８からなるアミノ酸配列を有するＶＬを含む３８ＳＢ１３抗体が提供される。より好ましい実施形態において、配列番号４０からなるアミノ酸配列を有するＶＬを含む３８ＳＢ１８抗体が提供される。より好ましい実施形態において、配列番号４２からなるアミノ酸配列を有するＶＬを含む３８ＳＢ１９抗体が提供される。より好ましい実施形態において、配列番号４４からなるアミノ酸配列を有するＶＬを含む３８ＳＢ３０抗体が提供される。より好ましい実施形態において、配列番号４６からなるアミン酸配列を有するＶＬを含む３８ＳＢ１３抗体が提供される。より好ましい実施形態において、配列番号４８からなるアミン酸配列を有するＶＬを含む３８ＳＢ３９抗体が提供される。
【００５３】
別の実施形態において、本発明の抗体は、配列番号５０、５２、５４、５６、５８及び６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨを含む。より好ましい実施形態において、配列番号５０からなるアミノ酸配列を有するＶＨを含む３８ＳＢ１３抗体が提供される。より好ましい実施形態において、配列番号５２からなるアミノ酸配列を有するＶＨを含む３８ＳＢ１８抗体が提供される。より好ましい実施形態において、配列番号５４からなるアミノ酸配列を有するＶＨを含む３８ＳＢ１９抗体が提供される。より好ましい実施形態において、配列番号５６からなるアミノ酸配列を有するＶＨを含む３８ＳＢ３０抗体が提供される。より好ましい実施形態において、配列番号５８からなるアミノ酸配列を有するＶＨを含む３８ＳＢ３１抗体が提供される。より好ましい実施形態において、配列番号６０からなるアミノ酸配列を有するＶＨを含む３８ＳＢ３９抗体が提供される。
【００５４】
キメラ及びヒト化３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９抗体
本明細書において使用される「キメラ抗体」とは、可変領域が異なる種の定常領域に連結され、又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属するように、定常領域又はその一部が改変され、置換され又は交換されている抗体である。「キメラ抗体」とは、定常領域が異なる種の可変領域に連結され、又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属するように、可変領域又はその一部が改変され、置換され又は交換されている抗体も表す。キメラ抗体を作製する方法は、本分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１２０２；Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４：２１４；Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２５：１９１−２０２；米国特許第５，８０７，７１５号；米国特許第４，８１６，５６７号；及び米国特許第４，８１６，３９７号（これらの全体が、参照により、本明細書中に組み込まれる。）を参照されたい。
【００５５】
本発明の一実施形態において３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９のキメラ様式が提供される。特に、前記キメラ様式は少なくとも１つのヒト定常領域を含有する。より好ましい実施形態において、このヒト定常領域はヒトＩｇＧ１／κ定常領域である。
【００５６】
本明細書において使用される「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最少配列を含有するキメラ抗体を表す。ヒト化の最終目標は、抗体の完全な抗原結合親和性及び特異性を維持しながら、ヒト中に導入するためのマウス抗体などの異種抗体の免疫原性を低下させることである。ヒト化抗体又は他の哺乳動物による非拒絶のために適合された抗体は、再表面化及びＣＤＲ移植などの幾つかの技術を用いて作製され得る。本明細書において使用される再表面化技術は、抗体可変領域の非ＣＤＲ表面を改変させて標的宿主の公知の抗体の表面に似せるために、分子モデル化、統計解析及び突然変異導入の組み合わせを使用する。ＣＤＲ移植技術は、例えば、マウス抗体の相補性決定領域をヒトフレームワークドメイン中に置換することを含む。例えば、ＷＯ９２／２２６５３号を参照されたい。ヒト化されたキメラ抗体は、対応するヒト抗体領域から実質的に又は専ら由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の定常領域及び可変領域並びにヒト以外の哺乳動物から実質的に又は専ら由来するＣＤＲを好ましく有する。
【００５７】
抗体の再表面化のための戦略及び方法並びに異なる宿主内での抗体の免疫原性を低下させるための他の方法は、米国特許第５，６３９，６４１号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）に開示されている。簡潔に述べれば、好ましい方法において、（１）重鎖及び軽鎖可変領域フレームワークの表面露出された位置の組を与えるために、抗体重鎖及び軽鎖可変領域のプールの位置併置が作製され（ここで、全ての可変領域に対する併置位置は、少なくとも約９８％同一である。）；（２）重鎖及び軽鎖可変領域フレームワークの表念露出されたアミノ酸残基の組が、げっ歯類抗体（又はその断片）に対して確定され；（３）げっ歯類の表面露出されたアミノ酸残基の前記組と最も同一性が近い重鎖及び軽鎖可変領域フレームワークの表面露出されたアミノ酸残基の組が同定され；（４）げっ歯類抗体の相補性決定領域の何れかの残基の何れかの原子の５オングストローム以内に位置するアミノ酸を除き、工程（２）において確定された重鎖及び軽鎖可変領域フレームワークの表面露出されたアミノ酸残基の組が、工程（３）において同定された重鎖及び軽鎖可変領域フレームワークの表面露出されたアミノ酸の前記組と置換され；並びに（５）結合特異性を有するヒト化されたげっ歯類抗体が産生される。
【００５８】
抗体は、ＣＤＲ移植（ＥＰ０２３９４００；ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，５３０，１０１号及び米国特許第５，５８５，０８９号）、ベニアリング又は再表面化（ＥＰ０５９２１０６；ＥＰ０５１９５９６；Ｐａｄｌａｎ  Ｅ．Ａ．，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２８（４／５）：４８９−４９８，１９９１；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７（６）：８０５−８１４；Ｒｏｇｕｓｋａ  Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＰＮＡＳ９１：９６９−９７３）及び鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）などの様々な他の技術を用いてヒト化することが可能である。ヒト抗体は、ファージディスプレイ法など、本分野で公知の様々な方法によって作製することが可能である。米国特許第４，４４４，８８７号；米国特許第４，７１６，１１１号；米国特許第５，５４５，８０６号及び米国特許第５，８１４，３１８号；並びに国際特許出願公開番号ＷＯ９８／４６６４５；ＷＯ９８／５０４３３；ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９８／１６６５４；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；及びＷＯ９１／１０７４１も参照されたい（前記参考文献は、それらの全体が、参照により本明細書に組み込まれる。）。
【００５９】
本発明は、ＣＤ３８を認識し、アポトーシス、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣによってＣＤ３８＋細胞を死滅させるヒト化された抗体又はその断片を提供する。さらなる実施形態において、ヒト化された抗体又はそのエピトープ結合断片は、３つの機序全てによって、前記ＣＤ３８＋細胞を死滅させる能力を有する。さらに別の実施形態において、本発明のヒト化抗体又はそのエピトープ結合断片は、間質細胞又は間質由来のサイトカインの不存在下でさえ、アポトーシスによって、前記ＣＤ３８＋細胞を死滅させることができる。
【００６０】
このようなヒト化抗体の好ましい実施形態は、ヒト化された３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１若しくは３８ＳＢ３９抗体又はこれらのエピトープ結合断片である。
【００６１】
より好ましい実施形態において、公知のヒト抗体表面とより密接に似るようにするために、抗体又はその断片の表面露出された残基が軽鎖及び重鎖の両方において置換されている３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９抗体の再表面化された又はヒト化された様式が提供される。本発明のヒト化された３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９抗体又はこれらのエピトープ結合断片は、改善された特性を有する。例えば、ヒト化された３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９抗体又はこれらのエピトープ結合断片は、ＣＤ３８タンパク質を特異的に認識する。より好ましくは、ヒト化された３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９抗体又はこれらのエピトープ結合断片は、アポトーシス、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣによって、ＣＤ３８＋細胞を死滅させるさらなる能力を有する。
【００６２】
３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９抗体のヒト化された様式は、軽鎖及び重鎖可変領域の両方のアミノ酸配列、軽鎖及び重鎖可変領域に対する遺伝子のＤＮＡ配列、ＣＤＲの同定、それらの表面アミノ酸の同定及び組換え形態でそれらを発現させるための手段の開示に関しても、本明細書において完全に性質決定されている。しかしながら、本発明の範囲は、これらの配列を含む抗体及び断片に限定されない。代わりに、ＣＤ３８に特異的に結合し、アポトーシス、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣによってＣＤ３８＋細胞を死滅させることができる全ての抗体及び断片が、本発明の範囲に属する。好ましくは、このような抗体は、３つの機序の全てによって、ＣＤ３８＋細胞を死滅させることができる。従って、本発明の抗体及びエピトープ結合抗体断片は、それらの足場、ＣＤＲ及び／又は軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列において、３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９抗体又はヒト化されたこれらの誘導体と異なることができ、なお本発明の範囲に属する。
【００６３】
３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９抗体のＣＤＲはモデル化によって同定され、これらの分子構造が予測された。同じく、ＣＤＲはエピトープ認識のために重要であるが、ＣＤＲは本発明の抗体及び断片にとって不可欠でない。従って、例えば、本発明の抗体の親和性成熟によって生成される改善された特性を有する抗体及び断片が提供される。
【００６４】
３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の配列並びにこれらのＣＤＲの配列は以前には公知でなく、本願中に記載されている。このような情報は、３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９抗体のヒト化された様式を作製するために使用することができる。これらのヒト化された抗ＣＤ３８抗体又はそれらの誘導体は、本発明の細胞結合因子としても使用され得る。
【００６５】
従って、一実施形態において、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５及び３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する１つ又はそれ以上のＣＤＲを含むヒト化抗体又はそのエピトープ結合断片を提供する。好ましい実施形態において、本発明のヒト化抗体は、少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含み、前記重鎖は配列番号１、２、３、７、８、９、１３、１４、１５、１９、２０、２１、２５、２６、２７、３１、３２及び３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する３つの連続するＣＤＲを含み、並びに前記軽鎖は配列番号４、５、６、１０、１１、１２、１６、１７、１８、２２、２３、２４、２８、３０、３４、３５及び３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する３つの連続するＣＤＲを含む。さらなる好ましい実施形態において、少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含み、前記重鎖が配列番号１、２及び３によって表されるアミノ酸配列を有する３つの連続する相補性決定領域を含み、並びに前記軽鎖が配列番号４、５及び６によって表されるアミノ酸配列を有する３つの連続する相補性決定領域を含む、３８ＳＢ１３のヒト化された様式が提供される。別のさらなる好ましい実施形態において、少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含み、前記重鎖が配列番号７、８及び９によって表されるアミノ酸配列を有する３つの連続する相補性決定領域を含み、並びに前記軽鎖が配列番号１０、１１及び１２によって表されるアミノ酸配列を有する３つの連続する相補性決定領域を含む、３８ＳＢ１８抗体のヒト化された様式が提供される。別のさらなる好ましい実施形態において、少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含み、前記重鎖が配列番号１３、１４及び１５によって表されるアミノ酸配列を有する３つの連続する相補性決定領域を含み、並びに前記軽鎖が配列番号１６、１７及び１８によって表されるアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域を含む、３８ＳＢ１９のヒト化された様式が提供される。別のさらなる好ましい実施形態において、少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含み、前記重鎖が配列番号１９、２０及び２１によって表されるアミノ酸配列を有する３つの連続する相補性決定領域を含み、並びに前記軽鎖が配列番号２２、２３及び２４によって表されるアミノ酸配列を有する３つの連続する相補性決定領域を含む、３８ＳＢ３０のヒト化された様式が提供される。別のさらなる好ましい実施形態において、少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含み、前記重鎖が配列番号２５、２６及び２７によって表されるアミノ酸配列を有する３つの連続する相補性決定領域を含み、並びに前記軽鎖が配列番号２８、２９及び３０によって表されるアミノ酸配列を有する３つの連続する相補性決定領域を含む、３８ＳＢ３１のヒト化された様式が提供される。別のさらなる好ましい実施形態において、少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含み、前記重鎖が配列番号３１、３２及び３３によって表されるアミノ酸配列を有する３つの連続する相補性決定領域を含み、並びに前記軽鎖が配列番号３４、３５及び３６によって表されるアミノ酸配列を有する３つの連続する相補性決定領域を含む、３８ＳＢ３９のヒト化された様式が提供される。
【００６６】
一実施形態において、本発明は、配列番号６６及び７２の群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨを含む、ヒト化された抗体又はその断片を提供する。好ましい実施形態において、配列番号６６によって表されるアミノ酸配列を有するＶＨを含むヒト化された３８ＳＢ１９抗体が提供される。別の好ましい実施形態において、配列番号７２によって表されるアミノ酸配列を有するＶＨを含むヒト化された３８ＳＢ３１抗体が提供される。
【００６７】
別の実施形態において、本発明は、配列番号６２、６４、６８及び７０の群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬを含むヒト化抗体又はその断片を提供する。好ましい実施形態において、配列番号６２及び６４の群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬを含むヒト化された３８ＳＢ１９抗体が提供される。別の好ましい実施形態において、配列番号６８及び７０の群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬを含むヒト化された３８ＳＢ３１抗体が提供される。
【００６８】
本発明のヒト化された３８ＳＢ１９抗体及びそのエピトープ結合断片は、元のマウス残基からヒト抗体２８Ｅ４中の対応するフレームワーク表面残基へ変更されたマウス表面フレームワーク残基を表す表１Ａ及び１Ｂ中の灰色の残基によって規定される１つ又はそれ以上の位置に軽鎖及び／又は重鎖アミノ酸残基中にも置換を含み得る。表１Ｂ中のアスタリスクが付された（＊）残基は、ヒト化された３８ＳＢ１９重鎖バリアント（配列番号６５）中のマウス逆突然変異に対応する。逆突然変異のための残基はＣＤＲに近接しており、米国特許第５，６３９，６４１号に記載されているように選択され、又は以前のヒト化の試みにおいて、抗原結合親和性の減少をもたらした残基の選択と同様にして選択された（Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，米国特許出願公開２００３／０２３５５８２及び２００５／０１１８１８３）。
【００６９】
同様に、本発明のヒト化された３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９抗体又はこれらのエピトープ結合断片は、軽鎖及び／又は重鎖アミノ酸残基中に置換を含むこともできる。
【００７０】
ポリヌクレオチド、ベクター及び宿主細胞
本発明の抗ＣＤ３８抗体をコードする核酸が提供される。一実施形態において、核酸分子は抗ＣＤ３８免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖をコードする。好ましい実施形態において、単一の核酸が抗ＣＤ３８免疫グロブリンの重鎖をコードし、別の核酸分子が抗ＣＤ３８免疫グロブリンの軽鎖をコードする。
【００７１】
本発明の別の態様において、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０及び７２の群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９及び７１からなる群から選択される。本発明は、前記ポリヌクレオチド自体に限定されず、前記ポリヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を示す全てのポリヌクレオチドも含む。
【００７２】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。一実施形態において、ベクターは抗ＣＤ３８免疫グロブリンの重鎖をコードするポリヌクレオチドを含有する。別の実施形態において、前記ポリヌクレオチドは抗ＣＤ３８免疫グロブリンの軽鎖をコードする。本発明は、融合タンパク質、修飾された抗体、抗体断片及びこれらのプローブをコードするポリヌクレオチド分子を含むベクターも提供する。
【００７３】
本発明の抗ＣＤ３８抗体の重鎖及び／又は軽鎖を発現させるために、前記重鎖及び／又は軽鎖及をコードするポリヌクレオチドは、遺伝子が転写及び翻訳配列へ作用可能に連結されるように、発現ベクター中に挿入される。発現ベクターには、プラスミド、ＹＡＣ、コスミド、レトロウイルス、ＥＢＶ由来のエピソーム及び前記重鎖及び／又は軽鎖の発現を確保するために便利であることが当業者に知られている全ての他のベクターが含まれる。当業者は、異なるベクター中に又は同じベクター中に、重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチドをクローニングできることを認識する。好ましい実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、同じベクター中にクローニングされる。
【００７４】
本発明のポリヌクレオチド及びこれらの分子を含むベクターは、適切な哺乳動物宿主細胞の形質転換のために使用することができる。形質転換は、ポリヌクレオチドを細胞宿主中に導入するためのあらゆる公知の方法によって実施することができる。このような方法は当業者に周知であり、デキストランによって媒介される形質転換、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレンによって媒介される形質移入、プロトプラスト融合、電気穿孔、リポソーム中へのポリヌクレオチドの封入、微粒子銃注射及び核内へのＤＮＡの直接的微少注入が含まれる。
【００７５】
抗体断片
本発明の抗体は、上記完全長の抗体及びそのエピトープ結合断片の両方を含む。本明細書において使用される「抗体断片」には、一般に、「エピトープ結合断片」と称される、完全長抗体によって認識されるエピトープに結合する能力を保持する抗体のあらゆる部分が含まれる。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合されたＦｖ（ｄｓＦｖ）及びＶＬ又はＶＨ領域の何れかを含む断片が含まれるが、これらに限定されない。一本鎖抗体を含むエピトープ結合断片は、単独で、又は以下のもの：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの全部若しくは一部と組み合わせて可変領域を含み得る。
【００７６】
このような断片は、一方又は両方のＦａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片を含有し得る。好ましくは、抗体断片は完全な抗体の全ての６つのＣＤＲを含有するが、３つ、４つ又は５つのＣＤＲなどのこのような領域の全てより少ない領域を含有する断片も機能的である。さらに、前記断片は、以下の免疫グロブリンのクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥ及びこれらのサブクラスの何れか１つの要素であり得、又は何れか１つの要素を組み合わせ得る。
【００７７】
Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、パパイン（Ｆａｂ断片）又はペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片）などの酵素を用いて、タンパク質分解性切断によって作製され得る。
【００７８】
「一本鎖ＦＶ」（「ｓｃＦｖ」）断片は、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）の少なくとも１つの断片に連結された抗体重鎖可変領域（ＶＨ）の少なくとも１つの断片を含有するエピトープ結合断片である。一本鎖抗体断片が由来する完全な抗体の標的分子結合特異性を維持するように、一旦、ＶＬ及びＶＨ領域が連結されたら、リンカーは、ＶＬ及びＶＨ領域の適切な三次元折りたたみが確実に起こるように選択される短い柔軟なペプチドであり得る。ＶＬ又はＶＨ配列のカルボキシル末端は、リンカーによって、相補的なＶＬ又はＶＨ配列のアミノ酸末端に共有結合され得る。
【００７９】
本発明の一本鎖抗体断片は、本明細書中に記載されている完全な抗体の可変又は相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも１つを有するが、抗体の定常ドメインの幾つか又は全部を欠如するアミノ酸配列を含有する。これらの定常ドメインは抗原結合のために必要でないが、完全な抗体の構造の主要な部分を構成する。従って、一本鎖抗体断片は、定常ドメインの一部又は全部を含有する抗体の使用に関連する問題の幾つかを克服し得る。例えば、一本鎖抗体断片は、生物学的分子と重鎖定常領域の間に望ましくない相互作用又は他の望ましくない生物学的活性を有さない傾向がある。さらに、一本鎖抗体断片は、完全な抗体よりかなり小さく、従って、完全な抗体より大きな毛細血管透過性を有し得、一本鎖抗体断片が標的抗原結合部位へより効率的に局在化し、結合できるようにする。また、抗体断片は、原核細胞中において、比較的大規模に作製することができ、従って、抗体断片の産生が促進される。さらに、一本鎖抗体断片の比較的小さなサイズのために、完全な抗体より、レシピエント中での免疫応答を誘発する可能性がより小さくなる。
【００８０】
一本鎖抗体断片は、分子クローニング、抗体ファージディスプレイライブラリー又は当業者に周知の類似の技術によって作製され得る。これらのタンパク質は、例えば、真核細胞又は細菌を含む原核細胞中で作製され得る。本発明のエピトープ結合断片は、本分野で公知の様々なファージディスプレイ法を用いて作製することも可能である。ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインは、これらをコードしているポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面上にディスプレイされる。特に、このようなファージは、レパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒト又はマウス）から発現されるエピトープ結合ドメインをディスプレイするために使用することが可能である。目的の抗原を結合するエピトープ結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、例えば、固体表面若しくはビーズに結合若しくは捕捉された標識抗原を用いて、選択又は同定することが可能である。これらの方法で使用されるファージは、典型的には、ファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質の何れかに組み換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖ又はジスルフィドで安定化されたＦｖ抗体ドメインとともにファージから発現されたｆｄ及びＭ１３結合ドメインを含む糸状ファージである。
【００８１】
本発明のエピトープ結合断片を作製するために使用することが可能なファージディスプレイ法の例には、「Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１８２：４１−５０；Ａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１８４：１７７−１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８；Ｐｅｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ，１８７：９−１８；Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ５７：１９１−２８０；ＷＯ１９９２／００１０４７；ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；並びに米国特許第５，６９８，４２６号；米国特許第５，２２３，４０９号；米国特許第５，４０３，４８４号；米国特許第５，５８０，７１７号；米国特許第５，４２７，９０８号；米国特許第５，７５０，７５３号；米国特許第５，８２１，０４７号；米国特許第５，５７１，６９８号；米国特許第５，４２７，９０８号；米国特許第５，５１６，６３７号；米国特許第５，７８０，２２５号；米国特許第５，６５８，７２７号；米国特許第５，７３３，７４３号及び米国特許第５，９６９，１０８号（これらの各々は、その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）に開示されているものが含まれる。
【００８２】
ファージ選択後、例えば、以下に詳しく記載されているように組換えＤＮＡ技術を用いて、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母及び細菌を含む選択された宿主中での発現を通じて、エピトープ結合断片を作製するために、断片をコードするファージの領域を単離し、使用することができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片を組み換え的に作製するための技術は、ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１２（６）：８６４−８６９；Ｓａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９５，ＡＪＲＩ，３４：２６−３４；及びＢｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１０４１−１０４３に開示されているものなど、本分野において公知の方法を用いて使用することも可能である（前記参考文献は、その全体が、参照により組み込まれる。）。一本鎖Ｆｖ及び抗体を作製するために使用することができる技術の例には、米国特許第４，９４６，７７８号及び米国特許第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３：４６−８８；Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，ＰＮＡＳ  ９０：７９９５−７９９９；Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４０に記載されているものが含まれる。
【００８３】
機能的均等物
抗ＣＤ３８抗体及びヒト化された抗ＣＤ３８受容体抗体の機能的均等物も、本発明の範囲に含まれる。「機能的均等物」という用語には、例えば、相同的配列を有する抗体、キメラ抗体、人工の抗体及び修飾された抗体が含まれ、それぞれの機能的均等物は、ＣＤ３８タンパク質へのその結合能によって定義される。当業者は、「抗体断片」と称される分子の群と「機能的均等物」と称される群に重複が存在することを理解する。機能的均等物を作製する方法は当業者に公知であり、例えば、ＷＯ９３／２１３１９、ＥＰ２３９，４００；ＷＯ８９／０９６２２；ＥＰ３３８，７４５；及びＥＰ３３２，４２４（これらは、それぞれの全体が、参照により組み込まれる。）に開示されている。
【００８４】
相同的配列を有する抗体とは、本発明の抗ＣＤ３８抗体及びヒト化された抗ＣＤ３８抗体のアミノ酸配列と配列相同性を有するアミノ酸を有する抗体である。好ましくは、相同性は、本発明の抗ＣＤ３８抗体及びヒト化された抗ＣＤ３８抗体の可変領域のアミノ酸配列との相同性である。本明細書においてアミノ酸配列に対して適用される「配列相同性」は、例えば、「Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４−２４４８」に従うＦＡＳＴＡ検索法によって、別のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２、９３％又は９４％の配列相同性、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有する配列として定義される。
【００８５】
人工の抗体には、ｓｃＦｖ断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及びｍｒｕが含まれ（Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ，３４９：２９３−２９９；Ｈｕｄｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．，１９９９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１１：５４８−５５７による概説を参照されたい。）、これらの各々は抗原結合能を有する。一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）において、抗体のＶＨ及びＶＬドメインは柔軟なペプチドによって連結される。典型的には、このリンカーペプチドは約１５アミノ酸残基の長さである。リンカーがこれよりずっと小さい場合には、例えば、５アミノ酸である場合には、二価のｓｃＦｖ二量体であるダイアボディが形成される。リンカーが３アミノ酸残基未満まで縮小される場合には、トリアボディ及びテトラボディと称される三量体及び四量体構造が形成される。抗体の最も小さな結合単位はＣＤＲであり、典型的には、別々に使用できるのに十分な特異的認識及び結合を有する重鎖のＣＤＲ２である。このような断片は、分子認識単位又はｍｒｕと称される。幾つかのこのようなｍｒｕは、短いリンカーポリペプチドと一緒に連結することができ、従って、単一のｍｒｕより高い結合活性を有する人工の結合タンパク質を形成する。
【００８６】
本発明の機能的均等物には、修飾された抗体、例えば、分子の何れかの種類の、抗体への共有結合によって修飾された抗体も含まれる。例えば、修飾された抗体には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ｐｅｇ化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク分解性切断、細胞リガンド又は他のタンパク質への結合などによって修飾された抗体が含まれる。前記共有結合は、抗体が抗イディオタイプ応答を生じるのを妨げない。これらの修飾は、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などの（但し、これらに限定されない。）公知の技術によって実施され得る。さらに、修飾された抗体は、１つ又はそれ以上の非古典的なアミノ酸を含有し得る。
【００８７】
機能的均等物は、異なるフレームワーク内の異なる鎖上の異なるＣＤＲを交換することによって作製され得る。従って、例えば、異なる重鎖の置換によって、ＣＤＲの所定の組に対して抗体の異なるクラスが可能であり、これにより、例えば、ＩｇＧ１から４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１から２、ＩｇＤ、ＩｇＥ抗体の種類及びイソタイプが産生され得る。同様に、本発明の範囲に属する人工の抗体は、完全に合成のフレームワーク内にＣＤＲの所定の組を埋めることによって作製され得る。
【００８８】
機能的均等物は、本分野において公知の多様な方法を用いる、ＣＤＲの特定の組に隣接する可変及び／又は定常領域配列内の変異、欠失及び／又は挿入によって容易に作製され得る。本発明の抗体断片及び機能的均等物は、３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１又は３８ＳＢ３９抗体と比べた場合に、ＣＤ３８への結合の検出可能な程度を有する分子を包含する。結合の検出可能な程度には、マウス３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１又は３８ＳＢ３９抗体のＣＤ３８への結合能の少なくとも１０から１００％、好ましくは少なくとも５０％、６０％又は７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の範囲内の全ての値が含まれる。
【００８９】
改良された抗体
ＣＤＲは、エピトープ認識及び抗体結合のために最も重要である。しかしながら、抗体がそのコグネートエピトープを認識及び結合する能力を妨害せずに、ＣＤＲを含む残基に対して変更を施し得る。例えば、エピトープ認識に対して影響を及ぼさず、エピトープに対する抗体の結合親和性をなお増加させる変化を施し得る。
【００９０】
従って、好ましくは増加した親和性で、ＣＤ３８も特異的に認識及び結合するマウス及びヒト化抗体の両者の改善された様式も、本発明の範囲に含まれる。
【００９１】
一次抗体配列の知識、結合及び発現のレベルなどの抗体の特性に基づいて、抗体の配列中の様々な位置に１つ又はそれ以上のアミノ酸の変化を導入する効果が、幾つかの研究によって調査されている（Ｙａｎｇ，Ｗ．Ｐ．ｅｔａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４：３９２−４０３；Ｒａｄｅｒ，Ｃ．ｅｔａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：８９１０−８９１５；Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．ｅｔａｌ．，１９９８，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：５３５−５３９）。
【００９２】
これらの研究では、オリゴヌクレオチドによって媒介される部位特異的変異導入、カセット変異導入、変異性ＰＣＲ、ＤＮＡシャフリング又はＥ．コリの変異誘発株などの方法を用いて、ＣＤＲ１，ＣＤＲ２、ＣＤＲ３又はフレームワーク領域中の重鎖及び軽鎖遺伝子の配列を変化させることによって、一次抗体の均等物が作製された（Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：５３５−５３９；Ａｄｅｙ，Ｎ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃｈａｐｔｅｒ  １６，ｐｐ．２７７−２９１，ｉｎ“Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｅｄｓ．Ｋａｙ，Ｂ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）。一次抗体の配列を変化させるこれらの方法は、二次抗体の改善された親和性をもたらした（Ｇｒａｍ，Ｈ．ｅｔａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：３５７６−３５８０；Ｂｏｄｅｒ，Ｅ．Ｔ．ｅｔａｌ．，２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：１０７０１−１０７０５；Ｄａｖｉｅｓ，Ｊ．ａｎｄＲｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．，１９９６，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ，２：１６９−１７９；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．ｅｔａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６：７７−８８；Ｓｈｏｒｔ，Ｍ．Ｋ．ｅｔａｌ．，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：１６３６５−１６３７０；Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｋ．ｅｔａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：２７６２２−２７６２８）。
【００９３】
抗体の１つ又はそれ以上のアミノ酸残基を変化させる類似の誘導化された戦略によって、本発明に記載されている抗体配列は、ＣＤ３８に対する改善された親和性を含む、改善された機能を有する抗ＣＤ３８抗体を開発するために使用することができる。
【００９４】
好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させる置換、（２）酸化に対する感受性を低下させる置換、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させる置換、並びに（４）このような類縁体の他の物理化学的又は機能的特性を付与又は修飾する置換である。類縁体は、天然に存在するペプチド配列以外の配列の様々な変異タンパク質を含み得る。例えば、単一又は複数のアミノ酸置換（好ましくは、保存的アミノ酸置換）は、天然に存在する配列中に（好ましくは、分子間接触を形成するポリペプチド表面ドメインの部分中に）作製し得る。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質的に変化させるべきではない（例えば、置換アミノ酸は、親配列中に生じるヘリックスを破壊する傾向を示すべきではなく、又は親配列を特徴付ける二次構造の他の種類を崩壊させるべきでない。）。本分野で認められたポリペプチド二次構造及び三次構造の例は、「Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））；及びＴｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５」に記載されており、これらは各々、参照により本明細書中に組み込まれる。
【００９５】
改良された抗体には、動物免疫化、ハイブリドーマ形成及び特異的な特徴を有する抗体に対する選択の標準的技術によって調製された、改良された特徴を有する抗体も含まれる。
【００９６】
本発明の改良された抗体には、特に、増強された機能的特性を有する抗体が含まれる。特に興味深いのは、ＡＤＣＣなどの細胞の細胞傷害性エフェクター機能を媒介するための増強された能力を有する抗体である。このような抗体は、抗体の定常フレームワーク中に単一の又は複数の置換を施して、Ｆｃ受容体とのその相互作用を変化させることによって取得され得る。このような変異体を設計するための方法は、例えば、Ｌａｚａｒ他（２００６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０３（１１）：４００５−４０１０）及びＯｋａｚａｋｉ他（２００４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６（５）：１２３９−４９）に見出すことができる。ＷＯ０３／０７４６７９、ＷＯ２００４／０２９２０７、ＷＯ２００４／０９９２４９、ＷＯ２００６／０４７３５０、ＷＯ２００６／０１９４４７、ＷＯ２００６／１０５３３８、ＷＯ２００７／０４１６３５も参照されたい。改良された抗体の作製のために特異的に操作された細胞株を使用することも可能である。特に、これらの株は、グリコシル化経路の変化された制御を有しており、フコシル化が乏しく、又は完全に脱フコシル化されている抗体をもたらす。このような細胞株及びそれらを操作するための方法は、例えば、「Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（５）：３４６６−３４７３），Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（８）：５０３２−５０３６；２００６，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９３（５）：８５１−６１），ＥＰ１３３１２６６，ＥＰ１４９８４９０，ＥＰ１４９８４９１，ＥＰ１６７６９１０，ＥＰ１７９２９８７及びＷＯ９９／５４３４２」に開示されている。
【００９７】
本発明は、細胞傷害性連結体も含む。これらの細胞傷害性連結体は、２つの主要な成分である細胞結合因子及び細胞傷害性因子を含む。
【００９８】
本明細書において使用される「細胞結合因子」という用語は、細胞表面上のＣＤ３８タンパク質を特異的に認識し、結合する因子を表す。一実施形態において、細胞結合因子は、非特異的な結合から生じる副作用を殆ど伴わずに、標的化された様式で連結体を作用させるように、ＣＤ３８を特異的に認識する。
【００９９】
別の実施形態において、連結体の細胞傷害性薬物部分を細胞に対して作用させるのに十分な時間、及び／又は連結体が細胞によって内部に取り込まれるのに十分な時間、連結体が標的細胞と接触するように、本発明の細胞結合因子はＣＤ３８タンパク質も特異的に認識する。
【０１００】
好ましい実施形態において、細胞傷害性連結体は、細胞結合因子として、抗ＣＤ３８抗体を含み、より好ましくは、マウス３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１又は３８ＳＢ３９抗体ＣＤ３８モノクローナル抗体を含む。別の好ましい実施形態において、細胞結合因子は前記抗ＣＤ３８抗体のキメラ様式である。より好ましい実施形態において、細胞傷害性連結体は、ヒト化された３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９抗体又はこれらのエピトープ結合断片を含む。３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９抗体は、ＣＤ３８を特異的に認識することができ、標的化された様式で、細胞傷害性因子を癌細胞などの異常な細胞又は組織へ誘導する。
【０１０１】
本発明の細胞傷害性連結体の第二の成分は、細胞傷害性因子である。本明細書において使用される「細胞傷害性因子」という用語は、細胞の機能若しくは増殖を低減若しくは遮断し、及び／又は細胞の破壊を引き起こす物質を表す。
【０１０２】
好ましい実施形態において、細胞傷害性因子は、小薬物、プロドラッグ、タキソイド、ＤＭ１又はＤＭ４などのマイタンシノイド、トマイマイシン誘導体、レプトマイシン誘導体、ＣＣ−１０６５又はＣＣ−１０６５類縁体である。好ましい実施形態において、本発明の細胞結合因子は、直接又は切断可能な若しくは切断不能なリンカーを介して細胞傷害性因子に共有結合されている。
【０１０３】
細胞結合因子、細胞傷害性因子及びリンカーは、以下でより詳しく論述されている。
【０１０４】
細胞結合因子
治療剤としての本発明の化合物の有効性は、適切な細胞結合因子の注意深い選択に依存する。細胞結合因子は、現在知られており又は公知となるあらゆる種類のものであり得、ペプチド及び非ペプチドが含まれる。細胞結合因子は、特異的な又は非特異的な様式で、細胞を結合することができるあらゆる化合物であり得る。一般に、これらは、抗体（特に、モノクローナル抗体）、リンホカイン、ホルモン、成長因子、ビタミン、栄養素輸送分子（トランスフェリンなど）又は他のあらゆる細胞結合分子又は物質であり得る。
【０１０５】
使用可能な細胞結合因子のより具体的な例には、以下のものが含まれる。
【０１０６】
ａ）ポリクローナル抗体；
ｂ）モノクローナル抗体；
ｃ）Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｖなどの抗体の断片（Ｐａｒｈａｍ，１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３１：２８９５−２９０２；Ｓｐｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９７４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１３：４７０−４７８；Ｎｉｓｏｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９６０，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，８９：２３０−２４４）。
【０１０７】
特に、３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９から選択される抗ＣＤ３８モノクローナル抗体を、本発明の細胞結合因子として使用することができる。同様に、前記細胞結合因子は、３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９モノクローナル抗体の１つのキメラ様式であり得る。好ましくは、ヒト化された抗ＣＤ３８抗体は、本発明の細胞結合因子として使用される。より好ましくは、ヒト化された抗ＣＤ３８抗体は、ヒト化された又は再表面化された３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９抗体から選択される。
【０１０８】
細胞傷害性因子
別の実施形態において、薬物をＣＤ３８タンパク質に標的誘導することによって、抗原発現細胞に対して特異的な細胞傷害性を有するプロドラッグを形成するために、ヒト化抗体又はそのエピトープ結合断片は、マイタンシノイドなどの薬物に連結させることができる。このような抗体及び高度に毒性を有する小薬物（例えば、マイタンシノイド、タキサン、トマイマイシン誘導体、レプトマイシン誘導体及びＣＣ−１０６５類縁体）を含む細胞傷害性連結体は、リンパ腫、白血病及び多発性骨髄腫などの腫瘍の治療ための治療剤として使用することができる。
【０１０９】
本発明の細胞傷害性連結体中で使用される細胞傷害性因子は、細胞の死をもたらす、又は細胞死を誘導する、又は何らかの様式で、細胞の生存性を減少させるあらゆる化合物であり得る。好ましい細胞傷害性因子には、例えば、以下に定義されている、マイタンシノイド及びマイタンシノイド類縁体、タキソイド、トマイマイシン誘導体、レプトマイシン誘導体、ＣＣ−１０６５及びＣＣ−１０６５類縁体、ドラスタチン及びドラスタチン類縁体が含まれる。これらの細胞傷害性因子は、本明細書に開示されているような抗体、抗体断片、機能的均等物、改良された抗体及びこれらの類縁体に連結される。
【０１１０】
細胞傷害性連結体は、インビトロ法によって調製され得る。薬物又はプロドラッグを抗体に連結させるために、連結基が使用される。適切な連結基は本分野において周知であり、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチダーゼ不安定性基及びエステラーゼ不安定性基が含まれる。好ましい連結基は、ジスルフィド基及びチオエーテル基である。例えば、ジスルフィド交換反応を用いて、又は抗体と薬物又はプロドラッグとの間にチオエーテル結合を形成させることによって、連結体を構築することができる。
【０１１１】
マイタンシノイド
細胞傷害性連結体を形成するために本発明において使用され得る細胞傷害性因子としては、マイタンシノイド及びマイタンシノイド類縁体がある。適切なマイタンシノイドの例には、マイタンシノール及びマイタンシノール類縁体が含まれる。マイタンシノイドは、微小管形成を阻害し、及び哺乳動物細胞に対して高度に毒性である薬物である。
【０１１２】
適切なマイタンシノール類縁体の例には、修飾された芳香環を有するもの及び他の位置に修飾を有するものが含まれる。このような適切なマイタンシノイドは、米国特許第４，４２４，２１９号；米国特許第４，２５６，７４６号；米国特許第４，２９４，７５７号；米国特許第４，３０７，０１６号；米国特許第４，３１３，９４６号；米国特許第４，３１５，９２９号；米国特許第４，３３１，５９８号；米国特許第４，３６１，６５０号；米国特許第４，３６２，６６３号；米国特許第４，３６４，８６６号；米国特許第４，４５０，２５４号；米国特許第４，３２２，３４８号；米国特許第４，３７１，５３３号；米国特許第６，３３３，４１０号；米国特許第５，４７５，０９２号；米国特許第５，５８５，４９９号；米国特許第５，８４６，５４５号に開示されている。
【０１１３】
修飾された芳香環を有するマイタンシノールの適切な類縁体の具体例には、以下のものが含まれる。
（１）Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，２５６，７４６号）（アンサミトシンＰ２のＬＡＨ還元によって調製される。）；
（２）Ｃ−２０−ヒドロキシ（又はＣ−２０−デメチル）＋／−Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，３６１，６５０号及び米国特許第４，３０７，０１６号）（ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）若しくはアクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）を用いた脱メチル化又はＬＡＨを用いた脱塩素化によって調製される。）；及び
（３）Ｃ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ（−ＯＣＯＲ）、＋／−デクロロ（米国特許第４，２９４，７５７号）（塩化アシルを用いたアシル化によって調製される。）。
【０１１４】
他の位置の修飾を有するマイタンシノールの適切な類縁体の具体例には、以下のものが含まれる。
（１）Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号）（マイタンシノールのＨ２Ｓ又はＰ２Ｓ５との反応によって調製される。）；
（２）Ｃ−１４−アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ２ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号）；
（３）Ｃ−１４−ヒドロキシメチル又はアシルオキシメチル（ＣＨ２ＯＨ又はＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号）（Ｎｏｃａｒｄｉａから調製される。）；
（４）Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号）（ストレプトミセスによるマイタンシノールの転化によって調製される。）；
（５）Ｃ−１５−メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号及び米国特許第４，３１５，９２９号）（トレウィア・ヌディフロラ（Ｔｒｅｗｉａ  ｎｕｄｉｆｌｏｒａ）から単離される。）；
（６）Ｃ−１８−Ｎ−デメチル（米国特許第４，３６２，６３３号及び米国特許第４，３２２，３４８号）（ストレプトミセスによるマイタンシノールの脱メチル化によって調製される。）；及び
（７）４，５−デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号）（マイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元によって調製される。）。
【０１１５】
好ましい実施形態において、本発明の細胞傷害性連結体は、以前には、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシンと称されていたチオール含有マイタンシノイド（ＤＭ１）を細胞傷害性因子として使用する。ＤＭ１は、以下の構造式（Ｉ）によって表される。
【０１１６】
【化１】
0005607364.tif 000002
【０１１７】
別の好ましい実施形態において、本発明の細胞傷害性連結体は、チオール含有マイタンシノイドであるＮ２’−デアセチル−Ｎ−２’−（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシンを細胞傷害性因子として使用する。ＤＭ４は、以下の構造式（ＩＩ）によって表される。
【０１１８】
【化２】
0005607364.tif 000003
【０１１９】
本発明のさらなる実施形態において、硫黄原子を有する炭素原子上にモノアルキル又はジアルキル置換を有するチオール及びジスルフィド含有マイタンシノイドを含む他のマイタンシンを使用し得る。これらには、Ｃ−３、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシ又はＣ−２０デスメチルに、立体障害されたスルフヒドリル基を有するアシル基を有するアシル化されたアミノ酸側鎖を有するマイタンシノイドが含まれ、チオール官能性を有するアシル基の炭素原子は１つ又は２つの置換基を有し、前記置換基は、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖又は分岐アルキル又はアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換されたフェニル又は複素環式芳香族若しくはヘテロシクロアルキル基であり、並びに、さらに、置換基の１つはＨであり得、及びアシル基はカルボニル官能性と硫黄原子の間に少なくとも３つの炭素原子の直鎖長を有する。
【０１２０】
このようなさらなるマイタンシンには、式（ＩＩＩ）によって表される化合物が含まれる。
【０１２１】
【化３】
0005607364.tif 000004
（式中
Ｙ’は、（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ９＝ＣＲ１０）ｐ（Ｃ≡Ｃ）ｑＡｒ（ＣＲ５Ｒ６）ｍＤｕ（ＣＲ１１＝ＣＲ１２）ｒ（Ｃ≡Ｃ）ｓＢｔ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺを表し
（Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分岐若しくは環状アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換されたフェニル又は複素環式芳香族又はヘテロシクロアルキル基であり、及びさらにＲ２はＨであり得；
Ａ、Ｂ、Ｄは、３から１０個の炭素原子を有するシクロアルキル又はシクロアルケニル、単純な又は置換された、アリール又は複素環式芳香族若しくはヘテロシクロアルキル基であり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１１及びＲ１２は、各々独立に、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分岐若しくは環状アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換されたフェニル又は複素環式芳香族又はヘテロシクロアルキル基であり；
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ及びｔは、各々独立に０であり、又は１から５の整数であり（但し、何れの一回においても、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ及びｔの少なくとも２つは０でない。）；並びに
Ｚは、Ｈ、ＳＲ又は−ＣＯＲ（Ｒは、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分岐若しくは環状アルキル若しくはアルケニル又は単純な若しくは置換されたアリール若しくは複素環式芳香族又はヘテロシクロアルキル基である。）である。）
【０１２２】
式（ＩＩＩ）の好ましい実施形態には、
Ｒ１がＨであり、Ｒ２がメチルであり、及びＺがＨである、
Ｒ１及びＲ２がメチルであり、並びにＺがＨである、
Ｒ１がＨであり、Ｒ２がメチルであり、及びＺが−ＳＣＨ３である、
Ｒ１及びＲ２がメチルであり、並びにＺが−ＳＣＨ３である、
式（ＩＩＩ）の化合物が含まれる。
【０１２３】
このようなさらなるマイタンシンには、式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）又は（ＩＶ−Ｄ，Ｌ）によって表される化合物も含まれる。
【０１２４】
【化４】
0005607364.tif 000005
（式中
Ｙは、（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ５Ｒ６）ｍ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺを表し
（Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分岐若しくは環状アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換されたフェニル又は複素環式芳香族又はヘテロシクロアルキル基であり、及びさらにＲ２はＨであり得；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、各々独立に、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分岐若しくは環状アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換されたフェニル又は複素環式芳香族又はヘテロシクロアルキル基であり；
ｌ、ｍ及びｎは、各々独立に、１から５の整数であり、及びさらに、ｎは０であり得；
Ｚは、Ｈ、ＳＲ又は−ＣＯＲ（Ｒは、１から１０個の炭素原子を有する直鎖若しくは分岐アルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する環状アルキル若しくはアルケニル又は単純な若しくは置換されたアリール若しくは複素環式芳香族又はヘテロシクロアルキル基である。）；並びに
Ｍａｙは、Ｃ−３、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシ又はＣ−２０デスメチルに側鎖を有するマイタンシノイドを表す。）
【０１２５】
式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）及び（ＩＶ−Ｄ，Ｌ）の好ましい実施形態には、
Ｒ１がＨであり、Ｒ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８が各々Ｈであり、ｌ及びｍが各々１であり、ｎが０であり、並びにＺがＨである、
Ｒ１及びＲ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８が各々Ｈであり、ｌ及びｍが１であり、ｎが０であり、並びにＺがＨである、
Ｒ１がＨであり、Ｒ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８が各々Ｈであり、ｌ及びｍが各々１であり、ｎが０であり、並びにＺが−ＳＣＨ３である、
Ｒ１及びＲ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８が各々Ｈであり、ｌ及びｍが１であり、ｎが０であり、並びにＺが−ＳＣＨ３である、
式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）及び（ＩＶ−Ｄ，Ｌ）の化合物が含まれる。
【０１２６】
好ましくは、細胞傷害性因子は、式（ＩＶ−Ｌ）によって表される。
【０１２７】
このようなさらなるマイタンシンには、式（Ｖ）によって表される化合物も含まれる。
【０１２８】
【化５】
0005607364.tif 000006
（式中、
Ｙは、（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ５Ｒ６）ｍ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺを表し
（Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分岐若しくは環状アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換されたフェニル又は複素環式芳香族又はヘテロシクロアルキル基であり、及びさらにＲ２はＨであり得；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、Ｒ７及びＲ８は、各々独立に、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分岐若しくは環状アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換されたフェニル又は複素環式芳香族又はヘテロシクロアルキル基であり；
ｌ、ｍ及びｎは、各々独立に、１から５の整数であり、及びさらに、ｎは０であり得る。）；並びに
Ｚは、Ｈ、ＳＲ又は−ＣＯＲ（Ｒは、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分岐若しくは環状アルキル若しくはアルケニル又は単純な若しくは置換されたアリール若しくは複素環式芳香族若しくはヘテロシクロアルキル基である。）である。）
【０１２９】
式（Ｖ）の好ましい実施形態には、
Ｒ１はＨであり、Ｒ２はメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は各々Ｈであり、ｌ及びｍは各々１であり、ｎは０であり、並びにＺはＨである、
Ｒ１及びＲ２はメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は各々Ｈであり、ｌ及びｍは１であり、ｎは０であり、並びにＺはＨである、
Ｒ１はＨであり、Ｒ２はメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は各々Ｈであり、ｌ及びｍは各々１であり、ｎは０であり、並びにＺは−ＳＣＨ３である、
Ｒ１及びＲ２はメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は各々Ｈであり、ｌ及びｍは１であり、ｎは０であり、並びにＺは−ＳＣＨ３である、
式（Ｖ）の化合物が含まれる。
【０１３０】
さらに、このようなさらなるマイタンシンには、式（ＶＩ−Ｌ）、（ＶＩ−Ｄ）又は（ＶＩ−Ｄ，Ｌ）によって表される化合物が含まれる。
【０１３１】
【化６】
0005607364.tif 000007
（式中
Ｙ２は、（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ５Ｒ６）ｍ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺ２を表し
（Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分岐若しくは環状アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換されたフェニル又は複素環式芳香族又はヘテロシクロアルキル基であり、及びさらにＲ２はＨであり得；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、Ｒ７及びＲ８は、各々独立に、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖環状アルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分岐若しくは環状アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換されたフェニル又は複素環式芳香族若しくはヘテロシクロアルキル基であり；
ｌ、ｍ及びｎは、各々独立に、１から５の整数であり、及びさらに、ｎは０であり得；
Ｚ２は、ＳＲ又はＣＯＲ（Ｒは、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分岐若しくは環状アルキル若しくはアルケニル又は単純な若しくは置換されたアリール若しくは複素環式芳香族又はヘテロシクロアルキル基である。）である。）；並びに
Ｍａｙは、マイタンシノイドである。）
【０１３２】
このようなさらなるマイタンシンには、式（ＶＩＩ）によって表される化合物も含まれる。
【０１３３】
【化７】
0005607364.tif 000008
（式中
Ｙ２’は、（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ９＝ＣＲ１０）ｐ（Ｃ≡Ｃ）ｑＡｒ（ＣＲ５Ｒ６）ｍＤｕ（ＣＲ１１＝ＣＲ１２）ｒ（Ｃ≡Ｃ）ｓＢｔ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺ２を表す
（Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖分岐若しくはアルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する環状アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換されたフェニル又は複素環式芳香族又はヘテロシクロアルキル基であり、及びさらにＲ２はＨであり得；
Ａ、Ｂ及びＤは、各々独立に、３から１０個の炭素原子を有するシクロアルキル又はシクロアルケニル、単純な又は置換された、アリール又は複素環式芳香族若しくはヘテロシクロアルキル基であり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１１及びＲ１２は、各々独立に、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分岐若しくは環状アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換されたフェニル又は複素環式芳香族又はヘテロシクロアルキル基であり；
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ及びｔは、各々独立に０であり、又は１から５の整数であり（但し、何れの一回においても、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ及びｔの少なくとも２つは０でない。）；及び
Ｚ２は、ＳＲ又は−ＣＯＲ（Ｒは、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル若しくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分岐若しくは環状アルキル若しくはアルケニル又は単純な若しくは置換されたアリール若しくは複素環式芳香族又はヘテロシクロアルキル基である。）である。）。）
【０１３４】
式（ＶＩＩ）の好ましい実施形態には、Ｒ１がＨであり、及びＲ２がメチルである式（ＶＩＩ）の化合物が含まれる。
【０１３５】
上記マイタンシノイドは、抗ＣＤ３８抗体３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１若しくは３８ＳＢ３９又はこれらの相同体若しくは断片に連結させることができ、前記抗体は、マイタンシノイドのＣ−３、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシ又はＣ−２０デスメチルに見出されるアシル化されたアミノ酸側鎖のアシル基の上に存在するチオール又はジスルフィド官能基を用いてマイタンシノイドに連結されており、アシル化されたアミノ酸側鎖のアシル基は、１つ又は２つの置換基を有する炭素原子に位置するそのチオール又はジスルフィド官能性を有し、前記置換基はＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分岐又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換されたフェニル又は複素環式芳香族若しくはヘテロシクロアルキル基であり、並びにさらに、置換基の１つはＨであり得、並びにアシル基はカルボニル官能性と硫黄原子の間に少なくとも３つの炭素原子の直鎖長を有する。
【０１３６】
本発明の好ましい連結体は、式（ＶＩＩＩ）のマイタンシノイドに連結された抗抗ＣＤ３８抗体３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１若しくは３８ＳＢ３９又はこれらの相同体若しくは断片を含むものである。
【０１３７】
【化８】
0005607364.tif 000009
（式中
Ｙ１’は、（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ９＝ＣＲ１０）ｐ（Ｃ≡Ｃ）ｑＡｒ（ＣＲ５Ｒ６）ｍＤｕ（ＣＲ１１＝ＣＲ１２）ｒ（Ｃ≡Ｃ）ｓＢｔ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２Ｓ−を表す
（Ａ、Ｂ及びＤは、各々独立に、３から１０個の炭素原子を有するシクロアルキル又はシクロアルケニル、単純な又は置換された、アリール又は複素環式芳香族又はヘテロシクロアルキル基であり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１１及びＲ１２は、各々独立に、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分岐又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換されたフェニル又は複素環式芳香族又はヘテロシクロアルキル基であり；並びに
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ及びｔは、各々独立に０であり、又は１から５の整数であり（但し、何れの一回においても、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ及びｔの少なくとも２つは０でない。）。）
【０１３８】
好ましくは、Ｒ１はＨであり、及びＲ２はメチルであり、又はＲ１及びＲ２はメチルである。
【０１３９】
本発明のさらに好ましい連結体は、式（ＩＸ−Ｌ）、（ＩＸ−Ｄ）又は（ＩＸ−Ｄ，Ｌ）のマイタンシノイドに連結された抗ＣＤ３８抗体３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１若しくは３８ＳＢ３９又はこれらの相同体若しくは断片を含むものである。
【０１４０】
【化９】
0005607364.tif 000010
（Ｙ１は、（ＣＲ７Ｒ８）ｌ（ＣＲ５Ｒ６）ｍ（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＲ１Ｒ２Ｓ−を表し
（Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分岐又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換されたフェニル、複素環式芳香族又はヘテロシクロアルキル基であり、及びさらにＲ２はＨであり得；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、Ｒ７及びＲ８は、各々独立に、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分岐若しくは環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換されたフェニル又は複素環式芳香族又はヘテロシクロアルキル基であり；
ｌ、ｍ及びｎは、各々独立に、１から５の整数であり、及びさらに、ｎは０であり得る。）；並びに
Ｍａｙは、Ｃ−３、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシ又はＣ−２０デスメチルに側鎖を有するマイタンシノールを表す。）
【０１４１】
式（ＩＸ−Ｌ）、（ＩＸ−Ｄ）及び（ＩＸ−Ｄ，Ｌ）の好ましい実施形態には、
Ｒ１がＨであり、及びＲ２がメチルであり、又はＲ１及びＲ２がメチルである、
Ｒ１がＨであり、Ｒ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８が各々Ｈであり、ｌ及びｍが各々１であり、ｎがＯである、
Ｒ１及びＲ２がメチルであり；Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８が各々Ｈであり；ｌ及びｍが１であり；ｎが０である、
式（ＩＸ−Ｌ）、（ＩＸ−Ｄ）及び（ＩＸ−Ｄ，Ｌ）の化合物が含まれる。
【０１４２】
好ましくは、細胞傷害性因子は、式（ＩＸ−Ｌ）によって表される。
【０１４３】
本発明のさらなる好ましい連結体は、式（Ｘ）のマイタンシノイドに連結された抗ＣＤ３８抗体３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１若しくは３８ＳＢ３９又はこれらの相同体若しくは断片を含むものである。
【０１４４】
【化１０】
0005607364.tif 000011
（置換基は、上記式（ＩＸ）に定義されているとおりである。）
【０１４５】
特に好ましいのは、Ｒ１がＨであり、Ｒ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８が各々Ｈであり、ｌ及びｍが各々１であり、並びにｎが０である、上記化合物の何れかである。
【０１４６】
さらに特に好ましいのは、Ｒ１及びＲ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８が各々Ｈであり、ｌ及びｍが各々１であり、並びにｎが０である、上記化合物の何れかである。
【０１４７】
さらに、Ｌ−アミノアシル立体異性体が好ましい。
【０１４８】
２００４年５月２０日に出願された係属中の米国特許出願第１０／８４９，１３６号に教示されているマイタンシノイドの各々は、本発明の細胞傷害性連結体においても使用され得る。米国特許出願第１０／８４９，１３６号の開示全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。
【０１４９】
ジスルフィド含有連結基
３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１又は３８ＳＢ３９抗体などの細胞結合因子にマイタンシノイドを連結するために、マイタンシノイドは連結部分を含む。この連結部分は、特定の部位で完全に活性なマイタンシノイドの放出を可能とする化学的結合を含有する。適切な化学結合は本分野において周知であり、ジスルフィド結合、酸不安定性結合、光不安定性結合、ペプチダーゼ不安定性結合及びエステラーゼ不安定性結合が含まれる。好ましいのは、ジスルフィド結合である。
【０１５０】
この連結部分は、反応性の化学基も含む。好ましい実施形態において、反応性の化学基は、ジスルフィド結合連結部分を介して、マイタンシノイドに共有結合させることができる。
【０１５１】
特に好ましい反応性化学基は、Ｎ−スクシンイミジルエステル及びＮ−スルホスクシンイミジルエステルである。
【０１５２】
反応性化学基を含有する連結部分を含む特に好ましいマイタンシノイドは、連結部分がジスルフィド結合を含有し、及び化学的反応性基がＮ−スクシンイミジル又はＮ−スルホスクシンイミジルエステルを含む、マイタンシノールのＣ−３エステル及びその類縁体である。
【０１５３】
マイタンシノイド上の多くの位置が、連結部分を化学的に連結するための位置としての役割を果たすことができる。例えば、ヒドロキシル基を有するＣ−３位置、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位置、ヒドロキシで修飾されたＣ−１５位置及びヒドロキシ基を有するＣ−２０位は全て、有用であると予想される。しかしながら、Ｃ−３位が好ましく、マイタンシノールのＣ−３位置が特に好ましい。
【０１５４】
連結部分を有するマイタンシノールのエステルの合成はジスルフィド結合含有連結部分に関して記載されているが、（上述のような）他の化学的結合を有する連結部分も、他のマイタンシノイドと同様に、本発明とともに使用することが可能であることを当業者は理解する。他の化学的結合の具体例には、酸不安定性結合、光不安定性結合、ペプチダーゼ不安定性結合及びエステラーゼ不安定性結合が含まれる。米国特許第５，２０８，０２０号の開示（本明細書に組み込まれる。）は、このような結合を有するマイタンシノイドの作製を教示する。
【０１５５】
反応性基を有するジスルフィド部分を有するマイタンシノイド及びマイタンシノイド誘導体の合成は、米国特許第６，４４１，１６３号及び米国特許第６，３３３，４１０号並びに米国特許出願１０／１６１，６５１号（これらの各々は、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
【０１５６】
細胞傷害性連結体を作製するために、ＤＭ１などの反応性基を含有するマイタンシノイドを、３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１又は３８ＳＢ３９抗体などの抗体と反応させる。これらの連結体は、ＨＰＬＣによって又はゲルろ過によって精製され得る。
【０１５７】
このような抗体−マイタンシノイド連結体を作製するための幾つかの優れたスキームが、米国特許第６，３３３，４１０号並びに米国特許出願０９／８６７，５９８号、１０／１６１，６５１号及び１０／０２４，２９０号（これらの各々は、その全体が本明細書に組み込まれる。）に提供されている。
【０１５８】
一般に、水性緩衝液中の抗体の溶液を、反応性基を有するジスルフィド部分を有するマイタンシノイドのモル過剰とともに温置し得る。反応性混合物は、過剰のアミン（エタノールアミン、タウリンなど）の添加によって反応停止させることができる。次いで、ゲルろ過によって、マイタンシノイド−抗体連結体を精製し得る。
【０１５９】
抗体分子当りの結合されたマイタンシノイド部分の数は、２５２ｎｍと２８０ｎｍの吸光度の比を分光光度学的に測定することによって決定することができる。１から１０のマイタンシノイド分子／抗体分子の平均が好ましい。
【０１６０】
マイタンシノイド薬物との抗体の連結体は、インビトロでの様々な望ましくない細胞株の増殖を抑える能力に関して評価することができる。例えば、ヒトリンパ腫細胞株ダウディ、ヒトリンパ腫細胞株ラモス、ヒト多発性骨髄腫細胞株ＭＯＬＰ−８及びヒトＴ急性リンパ性白血病株ＭＯＬＴ−４などの細胞株は、これらの化合物の細胞傷害性の評価のために容易に使用することができる。評価されるべき細胞を、２４時間、化合物に曝露し、公知の方法による直接的なアッセイにおいて、細胞の生存割合を測定することができる。次いで、アッセイの結果から、ＩＣ５０値を計算することができる。
【０１６１】
ＰＥＧ含有連結基
マイタンシノイドは、米国特許出願１０／０２４，２９０号に記載されているように、ＰＥＧ連結基を用いて、細胞結合因子に連結させることもできる。これらのＰＥＧ連結基は水及び非水性溶媒の両方に可溶性であり、１つ又はそれ以上の細胞傷害性因子を細胞結合因子に連結するために使用することができる。典型的にはＰＥＧ連結基には、一方の末端に位置する官能性スルフヒドリル基又はジスルフィド基及び他方の末端に位置する活性エステルを通じて、リンカーの反対側末端の細胞傷害性因子及び細胞結合因子に結合するヘテロ二官能性ＰＥＧリンカーが含まれる。
【０１６２】
ＰＥＧ連結基を用いて細胞傷害性連結体を合成する一般的な例として、具体的な詳細に関して米国特許出願１０／０２４，２９０号が再度参照される。合成は、反応性ＰＥＧ部分を有する１つ又はそれ以上の細胞傷害性因子の細胞結合因子との反応から始まり、各反応性ＰＥＧ部分の末端活性エステルが細胞結合因子のアミノ酸残基によって置換され、ＰＥＧ連結基を通じて細胞結合因子に共有結合された１つ又はそれ以上の細胞傷害性因子を含む細胞傷害性連結体が得られる。
【０１６３】
タキサン
本発明の細胞傷害性連結体において使用される細胞傷害性因子は、タキサン又はその誘導体でもあり得る。
【０１６４】
タキサンは、細胞傷害性の天然産物であるパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）及び半合成誘導体であるドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）を含む化合物のファミリーであり、２つの化合物は、癌の治療において広く使用されている。タキサンはチュブリンの脱重合を阻害する有糸分裂紡錘体の毒であり、細胞死をもたらす。ドセタキセル及びパクリタキセルは癌の治療において有用な薬剤であるが、それらの抗腫瘍活性は、正常な細胞に対するそれらの非特異的な毒性のために限定される。さらに、パクリタキセル及びドセタキセルそのもののような化合物は、細胞結合因子の連結体中で使用するのに十分に強力ではない。
【０１６５】
細胞傷害性連結体の調製において使用するための好ましいタキサンは、式（ＸＩ）のタキサンである。
【０１６６】
【化１１】
0005607364.tif 000012
【０１６７】
本発明の細胞傷害性連結体中で使用され得るタキサンを合成するための方法は、抗体などの細胞結合因子へタキサンを連結するための方法とともに、米国特許第５，４１６，０６４号、米国特許第５，４７５，０９２号、米国特許第６，３４０，７０１号、米国特許第６，３７２，７３８号及び米国特許第６，４３６，９３１号、並びに米国特許出願第１０／０２４，２９０、１０／１４４，０４２号、１０／２０７，８１４、１０／２１０，１１２及び１０／３６９，５６３号中で詳しく記載されている。
【０１６８】
トマイマイシン誘導体
本発明の細胞傷害性は、トマイマイシン誘導体でもあり得る。トマイマイシン誘導体は、ピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）であり、ＤＮＡの副溝中のグアニンのＮ２に共有結合することによって生物学的特性を発揮する化合物の公知のクラスである。ＰＢＤには、アントラマイシン、ネオトラマイシン及びＤＣ−８１などの多数の副溝結合剤が含まれる。
【０１６９】
高い細胞傷害性を保持し、細胞結合因子へ効果的に連結され得る新規トマイマイシン誘導体は、国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ２００７／０００１４２に記載されており、その内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。細胞結合因子−トマイマイシン誘導体複合体は、トマイマイシン誘導体の細胞傷害性作用の全量が望ましくない細胞のみに対して、標的誘導された様式で適用されるようにして、従って、標的とされない健康な細胞に対する損傷に起因する副作用を回避することを可能とする。
【０１７０】
本発明の細胞傷害性因子は、連結基を介して、３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１又は３８ＳＢ３９抗体などの細胞結合因子に連結された１つ又はそれ以上のトマイマイシン誘導体を含む。連結基は、慣用の方法を通じて、トマイマイシン誘導体に共有結合された化学的部分の一部である。好ましい実施形態において、化学部分は、ジスルフィド結合を介して、トマイマイシン誘導体に共有結合させることができる。
【０１７１】
本発明において有用なトマイマイシン誘導体は、以下に示されている式（ＸＩＩ）を有する。
【０１７２】
【化１２】
0005607364.tif 000013
（−−−−は、場合によって存在する単結合を表し；
−−−−は、単結合又は二重結合の何れかを表し；
但し、−−−−が、単結合を表す場合には、Ｕ及びＵ’（同一又は別異である。）は独立にＨを表し、並びにＷ及びＷ’（同一又は別異である。）は、ＯＨ、−ＯＲなどのエーテル、エステル（例えば、−ＯＣＯＲなどの酢酸エステル）、−ＯＣＯＯＲなどの炭酸エステル、−ＯＣＯＮＲＲ’などのカルバミン酸エステル、Ｎ１０及びＣ１１が環の一部であるような環状カルバミン酸エステル、−ＮＲＣＯＮＲＲ’などの尿素、−ＯＣＳＮＨＲなどのチオカルバミン酸エステル、Ｎ１０及びＣ１１が環の一部であるような環状チオカルバミン酸エステル、−ＳＨ、−ＳＲなどのスルフィド、−ＳＯＲなどのスルホキシド、−ＳＯＯＲなどのスルホン、−ＳＯ３−などのスルホナート、−ＮＲＳＯＯＲなどのスルホンアミド、−ＮＲＲ’などのアミン、Ｎ１０及びＣ１１が環の一部であるような場合によって環状のアミン、−ＮＲＯＲ’などのヒドロキシルアミン誘導体、−ＮＲＣＯＲなどのアミド、−Ｎ３などのアジド、シアノ、ハロ、トリアルキル又はトリアリールホスホニウム、アミノ酸由来の基からなる群から独立に選択され；好ましくは、Ｗ及びＷ’は、同一又は別異であり、並びにＯＨ、Ｏｍｅ、Ｏｅｔ、ＮＨＣＯＮＨ２、ＳＭｅであり；
並びに、−−−−が二重結合を表す場合には、、Ｕ及びＵ’は存在せず、並びにＷ及びＷ’はＨを表し；
・Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１’、Ｒ２’は同一又は別異であり、並びに１つ若しくはそれ以上のＨａｌ、ＣＮ、ＮＲＲ’、ＣＦ３、ＯＲ、Ａｒｙｌ、Ｈｅｔ、Ｓ（Ｏ）ｑＲにより場合によって置換されたハロゲン化物若しくはアルキルから独立に選択され、又はＲ１及びＲ２並びにＲ１’及びＲ２’は、両者で、それぞれ基＝Ｂ及び＝Ｂ’を含有する二重結合を形成する。）
［好ましくは、Ｒ１及びＲ２並びにＲ１’及びＲ２’は、両者で、それぞれ、基＝Ｂ及び＝Ｂ’を含有する二重結合を形成する。
・Ｂ及びＢ’は同一又は別異であり、並びに１つ若しくはそれ以上のＨａｌ、ＣＮ、ＮＲＲ’、ＣＦ３、ＯＲ、アリール、Ｈｅｔ、Ｓ（Ｏ）ｑＲにより場合によって置換されているアルケニルから独立に選択され、又はＢ及びＢ’は酸素原子を表す。
好ましくは、Ｂ＝Ｂ’である。
より好ましくは、Ｂ＝Ｂ’は、＝ＣＨ２又は＝ＣＨ−ＣＨ３である。
・Ｘ、Ｘ’は同一又は別異であり、１つ又はそれ以上の−Ｏ−、−ＮＲ−、−（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）ｑ−から独立に選択される。
好ましくは、Ｘ＝Ｘ’である。
より好ましくは、ＸはＸ’＝Ｏである。
・Ａ、Ａ’は同一又は別異であり、酸素、窒素又は硫黄原子を場合によって含有するアルキル又はアルケニルから独立に選択され、各々１つ若しくはそれ以上のＨａｌ、ＣＮ、ＮＲＲ’、ＣＦ３、ＯＲ、Ｓ（Ｏ）ｑＲ、アリール、Ｈｅｔ、アルキル、アルケニルにより、場合によって置換されている。
好ましくは、Ａ＝Ａ’である。
より好ましくは、Ａ＝Ａ’＝置換されていない直鎖アルキルである。
・Ｙ、Ｙ’は同一又は別異であり、Ｈ、ＯＲから独立に選択される。
好ましくは、Ｙ＝Ｙ’である。
より好ましくは、Ｙ＝Ｙ’＝Ｏアルキルであり、より好ましくはＯメチルである。
・Ｔは、−ＮＲ−、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｑ−又は４から１０員の、アリール、シクロアルキル、複素環又はヘテロアリールであり（各々、１つ又はそれ以上のＨａｌ、ＣＮ、ＮＲＲ’、ＣＦ３、Ｒ、ＯＲ、Ｓ（Ｏ）ｑＲ及び／又はリンカーにより、場合によって置換されている。）又は１つ若しくはそれ以上のＨａｌ、ＣＮ、ＮＲＲ’、ＣＦ３、ＯＲ、Ｓ（Ｏ）ｑＲ及び／又はリンカーにより場合によって置換された分岐アルキル又は１つ若しくはそれ以上のＨａｌ、ＣＮ、ＮＲＲ’、ＣＦ３、ＯＲ、Ｓ（Ｏ）ｑＲ及び／又はリンカーによって置換された直鎖アルキルである。
好ましくは、Ｔは４から１０員のアリール又はヘテロアリールであり、より好ましくは、１つ又はそれ以上のリンカーにより場合によって置換された、フェニル又はピリジルである。
前記リンカーは、連結基を含む。適切な連結基は本分野において周知であり、チオール、スルフィド、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチダーゼ不安定性基及びエステラーゼ不安定性基が含まれる。好ましいのは、ジスルフィド基及びチオエーテル基である。
連結基がチオール−、スルフィド（又はいわゆるチオエーテル−Ｓ−）又はジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）−含有基である場合には、チオール、スルフィド又はジスルフィド基を有する側鎖は直鎖又は分岐の芳香族又は複素環であり得る。当業者は、適切な側鎖を容易に同定することができる。
好ましくは、前記リンカーは、式：
−Ｇ−Ｄ−（Ｚ）ｐ−Ｓ−Ｚ’−である。
（式中、
Ｇは、単結合若しくは二重結合、−Ｏ−、−Ｓ−又はＮＲ−であり；
Ｄは、単結合又は−Ｅ−、−Ｅ−ＮＲ−、−Ｅ−ＮＲ−Ｆ−、−Ｅ−Ｏ−、−Ｅ−Ｏ−Ｆ−、−Ｅ−ＮＲ−ＣＯ−、−Ｅ−ＮＲ−ＣＯ−Ｆ−、−Ｅ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｅ−、−Ｅ−ＣＯ−Ｆ、−Ｅ−Ｓ−、−Ｅ−Ｓ−Ｆ−、−Ｅ−ＮＲ−Ｃ−Ｓ−、−Ｅ−ＮＲ−ＣＳ−Ｆ−であり；
Ｅ及びＦは同一又は別異であり、直鎖又は分岐の、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉアルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−アルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉ−アルキル−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉ−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉシクロアルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉ複素環（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉアリール（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉヘテロアリール（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−アルキル−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉアルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−アルキル−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉ−、−アルキル−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉシクロアルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−アルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉ複素環（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−アルキル−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉアリール（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−アルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉヘテロアリール（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、シクロアルキル−アルキル−、−アルキル−シクロアルキル−、−複素環−アルキル−、−アルキル−複素環−、−アルキル−アリール−、−アリール−アルキル−、−アルキル−ヘテロアリール−、−ヘテロアリール−アルキル−から独立に選択され;
（ｉ及びｊ（同一又は別異である。）は整数であり、０、１から２０００から独立に選択され；
Ｚは、直鎖又は分岐アルキルであり： 
ｐは、０又は1であり；
Ｚ’は、Ｈを表し、ＣＯＲ、Ｒ２０又はＳＲ２０などのチオール保護基を表し、Ｒ２０はＨ、メチル、アルキル、場合によって置換された、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール若しくは複素環を表し、但し、Ｚ’がＨである場合には、前記化合物はＰＢＤ部分の１つのイミン結合−ＮＨ＝上のチオール基−ＳＨの付加から生じる分子内環化によって形成される対応する化合物と平衡状態にある。）。
・ｎ、ｎ’（同一又は別異である。）は、０又は１である。
・ｑは、０、1又は２である。
・Ｒ、Ｒ’は同一又は別異であり、Ｈ、アルキル、アリールから独立に選択される（各々、Ｈａｌ、ＣＮ、ＮＲＲ’、ＣＦ３、Ｒ、ＯＲ、Ｓ（Ｏ）ｑＲ、アリール、Ｈｅｔにより場合によって置換されている。）。］
又は医薬として許容されるそれらの塩、水和物若しくは水和された塩若しくはこれらの化合物の多形結晶構造若しくはこれらの光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくは鏡像異性体である。
【０１７３】
幾何異性体及び立体異性体を有する一般式（ＸＩＩ）の化合物も、本発明の一部である。
【０１７４】
式（ＸＩＩ）のトマイマイシン誘導体のＮ−１０，Ｃ−１１二重結合は、水、アルコール、チオール、一級又は二級アミン、尿素及び他の求核試薬の存在下で、対応するイミン付加物へ、可逆的な様式で容易に転化され得ることが知られている。このプロセスは可逆的であり、非プロトン性有機溶媒中、真空中又は高温で、脱水剤の存在下で、対応するトマイマイシン誘導体を容易に再生することができる（Ｚ．Ｔｏｚｕｋａ，１９８３，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，３６：２７６）。
【０１７５】
従って、一般式（ＸＩＩＩ）のトマイマイシン誘導体の可逆的誘導体も、本発明において使用することができる。
【０１７６】
【化１３】
0005607364.tif 000014
（Ａ、Ｘ、Ｙ、ｎ、Ｔ、Ａ’、Ｘ’、Ｙ’、ｎ’、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１’、Ｒ２’は、式（ＸＩＩ）に定義されており、Ｗ、Ｗ’は同一又は別異であり、ＯＨ、−ＯＲなどのエーテル、エステル（例えば、酢酸エステル）、−ＯＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＯＣＯＯＲなどの炭酸エステル、−ＯＣＯＮＲＲ’などのカルバミン酸エステル、Ｎ１０及びＣ１１が環の一部であるような環状カルバミン酸エステル、−ＮＲＣＯＮＲＲ’などの尿素、−ＯＣＳＮＨＲなどのチオカルバミン酸エステル、Ｎ１０及びＣ１１が環の一部であるような環状チオカルバミン酸エステルなど、−ＳＨ、−ＳＲなどのスルフィド、−ＳＯＲなどのスルホキシド、−ＳＯＯＲなどのスルホン、−ＳＯ３−などのスルホナート、−ＮＲＳＯＯＲなどのスルホンアミド、−ＮＲＲ’などのアミン、Ｎ１０及びＣ１１が環の一部であるような場合によって環状のアミン、−ＮＲＯＲ’などのヒドロキシルアミン誘導体、−ＮＲＣＯＲ、−ＮＲＣＯＮＲＲ’などのアミド、−Ｎ３などのアジド、シアノ、ハロ、トリアルキル又はトリアリールホスホニウム、アミノ酸由来の基からなる群から独立に選択される。）好ましくは、Ｗ及びＷ’は同一又は別異であり、並びにＯＨ、Ｏｍｅ、Ｏｅｔ、ＮＨＣＯＮＨ２、ＳＭｅである。）
【０１７７】
従って、式（ＸＩＩＩ）の化合物は、溶媒が水である場合には、水を含む溶媒和物として考えることができ、これらの溶媒和物は特に有用であり得る。
【０１７８】
好ましい実施形態において、本発明のトマイマイシン誘導体は、以下からなる群から選択される。
８，８’−［１，３−ベンゼンジイルビス（メチレンオキシ）］−ビス［（Ｓ）−２−エト−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
８，８’−［５−メトキシ−１，３−ベンゼンジイルビス（メチレンオキシ）］−ビス［（Ｓ）−２−エト−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
８，８’−［１，５−ペンタンジイルビス（オキシ）］−ビス［（Ｓ）−２−エト−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
８，８’−［１，４−ブタンジイルビス（オキシ）］−ビス［（Ｓ）−２−エト−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
８，８’−［３−メチル−１，５−ペンタンジイルビス（オキシ）］−ビス［（Ｓ）−２−エト−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
８，８’−［２，６−ピリジンジイルビス（オキシ）］−ビス［（Ｓ）−２−エト−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
８，８’−［４−（３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノプロピルオキシ）−２，６−ピリジンジイルビス−（メチレンオキシ）］−ビス［（Ｓ）−２−エト−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
８，８’−［５−（３−アミノプロピルオキシ）−１，３−ベンゼンジイルビス（メチレンオキシ）］−ビス［（Ｓ）−２−エト−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
８，８’−［５−（Ｎ−メチル−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノプロピル）−１，３−ベンゼンジイルビス−（メチレンオキシ）］−ビス［（Ｓ）−２−エト−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
８，８’−｛５−［３−（４−メチル−４−メチルジスルファニル−ペンタノイルアミノ）プロピルオキシ］−１，３−ベンゼンジイルビス（メチレンオキシ）｝−ビス［（Ｓ）−２−エト−（Ｅ）−イリデン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
８，８’−［５−アセチルチオメチル−１，３−ベンゼンジイルビス（メチレンオキシ−ビス［（Ｓ）−２−メチレン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
ビス−｛２−［（Ｓ）−２−メチレン−７−メトキシ−５−オキソ−１，３，，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−８−イルオキシ］−エチル｝−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
８，８’−［３−（２−アセチルチオエチル）−１，５−ペンタンジイルビス（オキシ）］−ビス［（Ｓ）−２−メチレン−７−メトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
８，８’−［５−（Ｎ−４−メルカプト−４，４−ジメチルブタノイル）アミノ−１，３−ベンゼンジイルビス（メチレンオキシ）］−ビス［７−メトキシ−２−メチレン−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
８，８’−［５−（Ｎ−４−メチルジチオ−４，４−ジメチルブタノイル）−アミノ−１，３−ベンゼンジイルビス（メチレンオキシ）］−ビス［７−メトキシ−２−メチレン−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
８，８’−［５−（Ｎ−メチル−Ｎ−（２−メルカプト−２，２−ジメチルエチル）アミノ−１，３−ベンゼンジイル（メチレンオキシ）］−ビス［７−メトキシ−２−メチレン−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
８，８’−［５−（Ｎ−メチル−Ｎ−（２−メチルジチオ−２，２−ジメチルエチル）アミノ−１，３−ベンゼンジイル（メチレンオキシ）］−ビス［７−メトキシ−２−メチレン−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
８，８’−［（４−（２−（４−メルカプト−４−メチル）−ペンタンアミド−エトキシ）−ピリジン−２，６−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エト−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
８，８’−［（１−（２−（４−メチル−４−メチルジスルファニル）−ペンタンアミド−エトキシ）−ベンゼン−３，５−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エト−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
８，８’−［（４−（３−（４−メチル−４−メチルジスルファニル）−ペンタンアミド−プロポキシ）−ピリジン−２，６−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エト−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
８，８’−［（４−（４−（４−メチル−４−メチルジスルファニル）−ペンタンアミド−ブトキシ）−ピリジン−２，６−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エト−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
８，８’−［（４−（３−［４−（４−メチル−４−メチルジスルファニル−ペンタノイル）−ピペラジン−１−イル］−プロピル）−ピリジン−２，６−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エト−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
８，８’−［（１−（３−［４−（４−メチル−４−メチルジスルファニル−ペンタノイル）−ピペラジン−１−イル］−プロピル）−ベンゼン−３，５−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エト−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
８，８’−［（４−（２−｛２−［２−（４−メチル−４−メチルジスルファニル−ペンタノイルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ピリジン−２，６−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エト−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
８，８’−［（１−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（４−メチル−４−メチルジスルファニル−ペンタノイルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ベンゼン−３，５−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エト−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
８，８’−［（１−（２−｛２−［２−（４−メチル−４−メチルジスルファニル−ペンタノイルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ベンゼン−３，５−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エト−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
８，８’−［（４−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（４−メチル−４−メチルジスルファニル−ペンタノイルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ピリジン−２，６−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エト−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
８，８’−［（１−（２−［メチル−（２−メチル−２−メチルジスルファニル−プロピル）−アミノ］−エトキシ）−ベンゼン−３，５−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エト−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
８，８’−［（４−（３−［メチル−（４−メチル−４−メチルジスルファニル−ペンタノイル）−アミノ］−プロピル）−ピリジン−２，６−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エト−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
８，８’−［（４−（３−［メチル−（２−メチル−２−メチルジスルファニル−プロピル）−アミノ］−プロピル）−ピリジン−２，６−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エト−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
８，８’−［（１−（４−メチル−４−メチルジスルファニル）−ペンタンアミド）−ベンゼン−３，５−ジメチル）−ジオキシ］−ビス［（Ｓ）−２−エト−（Ｅ）−イリデン−７−ジメトキシ−１，２，３，１１ａ−テトラヒドロ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン］
並びに対応するメルカプト誘導体又は医薬として許容されるそれらの塩、水和物若しくは水和された塩若しくはこれらの化合物の多形結晶構造若しくはこれらの光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくは鏡像異性体である。
【０１７９】
好ましい化合物は、式：
【０１８０】
【化１４】
0005607364.tif 000015
の化合物である。
（式中、Ｘ、Ｘ’、Ａ、Ａ’、Ｙ、Ｙ’、Ｔ、ｎ、ｎ’は、上記定義のとおりである。）
【０１８１】
式（ＸＩＩ）の化合物は、当業者に周知の多数の方法で調製され得る。化合物は、当業者に理解されているように、例えば、下記の方法の適用若しくは改変又はこれらに対する変形によって合成することができる。適切な修飾及び置換は、当業者に自明及び周知であり、又は科学文献から容易に取得可能である。特に、このような方法は、「Ｒ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９９」に見出すことができる。
【０１８２】
本発明において使用され得るトマイマイシン誘導体を合成するための方法は、国際出願ＰＣＴ／ＩＢ２００７／０００１４２号に記載されている。本発明の化合物は、様々な合成経路によって調製され得る。試薬及び出発材料は市販されており、又は当業者によって、周知の技術により容易に合成される（例えば、ＷＯ００／１２５０８、ＷＯ００／１２５０７、ＷＯ２００５／０４０１７０、ＷＯ２００５／０８５２６０、ＦＲ１５１６７４３、Ｍ．Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４２：３７９３−３８０６を参照されたい。)。
【０１８３】
本発明の連結体分子は、あらゆる技術を用いて形成され得る。本発明のトマイマイシン誘導体は、酸不安定性リンカーを介して、又は光不安定性リンカーによって、抗体又は他の細胞結合因子へ連結され得る。誘導体は、適切な配列を有するペプチドと縮合され、その後、ペプチダーゼ不安定性リンカーを生成させるために、細胞結合因子へ連結することができる。連結体は、第一級ヒドロキシル基を含有するように調製することが可能であり、第一級ヒドロキシル基は、細胞内のエステラーゼによって切断されて、遊離の誘導体を解離させ得る連結体を生成するために、スクシニル化され、細胞結合因子へ連結することができる。好ましくは、誘導体は、遊離の又は保護されたチオール基を含有するように合成され、次いで、１つ又はそれ以上のジスルフィド又はチオール含有誘導体は、ジスルフィド結合又はチオエーテル連結を介して、細胞結合因子へ各々共有結合される。
【０１８４】
連結の多くの方法が、米国特許第５，４１６，０６４号及び米国特許第５，４７５，０９２号に教示されている。トマイマイシン誘導体は、遊離のアミノ基を与えるように修飾され、次いで、酸不安定性リンカー又は光不安定性リンカーを介して、抗体又は他の細胞結合因子へ連結され得る。遊離のアミノ基又はカルボキシル基を有するトマイマイシン誘導体は、ペプチドと縮合され、その後、ペプチダーゼ不安定性リンカーを生成させるために、細胞結合因子へ連結することができる。リンカー上に遊離のヒドロキシル基を有するトマイマイシン誘導体は、細胞内のエステラーゼによって切断されて、遊離の薬物を解離させ得る連結体を生成するために、スクシニル化され、細胞結合因子へ連結することができる。最も好ましくは、トマイマイシン誘導体は、遊離の又は保護されたチオール基を生じるように処理され、次いで、ジスルフィド又はチオール含有トマイマイシン二量体は、ジスルフィド結合を介して、細胞結合因子へ連結される。
【０１８５】
好ましくは、モノクローナル抗体又は細胞結合因子−トマイマイシン誘導体連結体は、上述のようなジスルフィド結合を介して連結されている、トマイマイシン誘導体を送達することができるものである。このような細胞結合連結体は、スクシンイミジルピリジル−ジチオプロピオナート（ＳＰＤＰ）で、モノクローナル抗体を修飾することによるなどの公知の方法によって調製される（Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１７３：７２３−７３７）。生じたチオピリジル基は、次いで、チオール含有トマイマイシン誘導体での処理によって置換されて、ジスルフィド結合された連結体を生成する。あるいは、アリールジチオ−トマイマイシン誘導体の場合には、細胞結合連結体の形成は、予め抗体分子中に導入されたスルフヒドリル基による、トマイマイシン誘導体のアリール−チオールの直接的置換によって実施される。ジスルフィド架橋を介して連結された１から１０個のトマイマイシン誘導体薬物を含有する連結体は、何れかの方法によって、容易に調製される。
【０１８６】
より具体的には、２ｍＭＥＤＴＡを含有する０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５中の２．５ｍｇ／ｍＬの濃度のジチオ−ニトロピリジル修飾された抗体の溶液が、チオール含有トマイマイシン誘導体（１．３モル当量／ジチオピリジル基）で処理される。修飾された抗体からのチオ−ニトロピリジンの放出は、３２５ｎｍで分光光度的にモニターされ、約１６時間で完了する。抗体−トマイマイシン誘導体連結体は精製され、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５又はＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ３００のカラムを通したゲルろ過によって、未反応の薬物及び他の低分子量の物質が除去される。抗体分子当りの結合されたトマイマイシン誘導体部分の数は、２３０ｎｍと２７５ｎｍの吸光度の比を測定することによって決定することができる。１から１０個のトマイマイシン誘導体分子／抗体分子の平均が、この方法によって、ジスルフィド結合を介して連結され得る。
【０１８７】
抗原を発現する細胞への結合親和性に対する連結の影響は、「Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９３：８６１８−８６２３」によって以前に記載された方法を用いて決定することができる。細胞株に対するトマイマイシン誘導体及びそれらの抗体連結体の細胞傷害性は、「Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５：３６４８−３６５１」に記載されているように、細胞増殖曲線の逆外挿によって測定することができる。接着性細胞株に対するこれらの化合物の細胞傷害性は、「Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０２：１３１２−１３１９」に記載されているクローン原性アッセイによって測定することができる。
【０１８８】
レプトマイシン誘導体
本発明の細胞傷害性は、レプトマイシン誘導体でもあり得る。本発明において、「レプトマイシン誘導体」は、「Ｋａｌｅｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ８：９８１−１００３）」に定義されているレプトマイシンファミリーの一員を表し、レプトマイシンＡ及びレプトマイシンＢ、カリスタチン、ラトジャドンＡ及びラトジャドンＢなどのラトジャドン、アンギノマイシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄなどのアンギノマイシン、カズサマイシン、レプトールスタチン、レプトフラニンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄなどのレプトフラニン類が含まれる。レプトマイシンＡ及びＢの誘導体が好ましい。
【０１８９】
より具体的には、本発明の誘導体は、式（Ｉ）のもの
【０１９０】
【化１５】
0005607364.tif 000016
（式中、
Ｒａ及びＲａ’はＨ又は−Ａｌｋであり、好ましくは、Ｒａは−Ａｌｋ、好ましくはメチルであり、及びＲａ’はＨであり；
Ｒ１７は、ＯＲ、ＣＮ、ＮＲＲ’、ペルフルオロアルキルにより、場合によって置換されたアルキルであり；好ましくは、Ｒ１７はアルキルであり、より好ましくはメチル又はエチルであり；
Ｒ９は、ＯＲ、ＣＮ、ＮＲＲ’、ペルフルオロアルキルにより、場合によって置換されたアルキルであり；好ましくは、Ｒ９はアルキルで、より好ましくはメチルあり；
Ｘは、−Ｏ−又は−ＮＲ−であり；好ましくは、Ｘは−ＮＲ−であり;
Ｙは−Ｕ−、−ＮＲ−Ｕ−、−Ｏ−Ｕ−、−ＮＲ−ＣＯ−Ｕ−、−Ｕ−ＮＲ−ＣＯ−、−Ｕ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｕ−であり；
好ましくは、Ｘが−Ｏ−である場合には、Ｙは、−Ｕ−、−ＮＲ−Ｕ−、−Ｕ−ＮＲ−ＣＯ−であり；
Ｕは、直鎖又は分岐の、−Ａｌｋ−、−Ａｌｋ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−Ａｌｋ−、−Ａｌｋ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−Ａｌｋ−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−、−シクロアルキル−、−複素環−、−シクロアルキル−Ａｌｋ−、−Ａｌｋ−シクロアルキル−、−複素環−Ａｌｋ−、−Ａｌｋ−複素環から選択され；
ｍは、1ないし２０００から選択される整数であり；
好ましくは、Ｕは、直鎖又は分岐−Ａｌｋであり：
Ｚは、−Ａｌｋ−であり；
ｎは、０又は1であり；好ましくは、ｎは、０であり；
Ｔは、Ｈを表し、Ａｃ、Ｒ１若しくはＳＲ１などのチオール保護基（Ｒ１は、Ｈ、メチル、Ａｌｋ、シクロアルキル、場合によって置換された、アリール又は複素環を表す。）を表し、又はＴは、
【０１９１】
【化１６】
0005607364.tif 000017
（式中、Ｒａ、Ｒａ’、Ｒ１７、Ｒ９、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ｎは、上に定義されているとおりである。）
好ましくは、ＴはＨ又はＳＲ１（Ｒ１はＡｌｋ、より好ましくはメチルを表す。）であり；
Ｒ、Ｒ’（同一又は別異である。）は、Ｈ又はアルキルであり；
Ａｌｋは、直鎖又は分岐アルキルを表し、好ましくは、Ａｌｋは−（ＣＨ２−ｑ（ＣＨ３）ｑ）ｐ−（ｐは１から１０の整数を表し、及びｑは０から２の整数を表す。）を表し；好ましくは、Ａｌｋは、−（ＣＨ２）−又は−Ｃ（ＣＨ３）２−を表す。）
又は医薬として許容されるこれらの塩、水和物若しくは水和された塩若しくはこれらの化合物の多形結晶構造若しくはこれらの光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくは鏡像異性体である。
【０１９２】
好ましい化合物は、以下から選択され得る。
（２Ｅ，１０Ｅ，１２Ｅ，１６Ｚ，１８Ｅ）−（Ｒ）−６−ヒドロキシ−３，５，７，９，１１，１５，１７−ヘプタメチル−１９−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−８−オキソ−ノナデカ−２，１０，１２，１６，１８−ペンタエン酸の（２−メチルスルファニル−エチル）−アミド
（２Ｅ，１０Ｅ，１２Ｅ，１６Ｚ，１８Ｅ）−（Ｒ）−６−ヒドロキシ−３，５，７，９，１１，１５，１７−ヘプタメチル−１９−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−８−オキソ−ノナデカ−２，１０，１２，１６，１８−ペンタエン酸］のビス−［（２−メルカプトエチル）−アミド
（２Ｅ，１０Ｅ，１２Ｅ，１６Ｚ，１８Ｅ）−（Ｒ）−６−ヒドロキシ−３，５，７，９，１１，１５，１７−ヘプタメチル−１９−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−８−オキソ−ノナデカ−２，１０，１２，１６，１８−ペンタエン酸の（２−メルカプト−エチル）−アミド
（２Ｅ，１０Ｅ，１２Ｅ，１６Ｚ，１８Ｅ）−（Ｒ）−６−ヒドロキシ−３，５，７，９，１１，１５，１７−ヘプタメチル−１９−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−８−オキソ−ノナデカ−２，１０，１２，１６，１８−ペンタエン酸の（２−メチルジスルファニル−エチル）−アミド
（２Ｅ，１０Ｅ，１２Ｅ，１６Ｚ，１８Ｅ）−（Ｒ）−６−ヒドロキシ−３，５，７，９，１１，１５，１７−ヘプタメチル−１９−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−８−オキソ−ノナデカ−２，１０，１２，１６，１８−ペンタエン酸の（２−メチル−２−メチルジスルファニル−プロピル）−アミド
（２Ｅ，１０Ｅ，１２Ｅ，１６Ｚ，１８Ｅ）−（Ｒ）−６−ヒドロキシ−３，５，７，９，１１，１５，１７−ヘプタメチル−１９−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−８−オキソ−ノナデカ−２，１０，１２，１６，１８−ペンタエン酸の（２−メルカプト−２−メチル−プロピル）−アミド
又は医薬として許容されるこれらの塩、水和物若しくは水和された塩若しくはこれらの化合物の多形結晶構造若しくはこれらの光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくは鏡像異性体。
【０１９３】
誘導体を細胞結合因子に連結するために、誘導剤は、ジスルフィド結合、スルフィド（又は、本明細書において、チオエーテル基と称される。）結合、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチダーゼ不安定性基又はエステラーゼ不安定性基などの連結を介して、誘導体が細胞結合因子へ連結できるようにする部分（連結基）を含まなければならない。誘導体は、例えば、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチダーゼ不安定性基又はエステラーゼ不安定性基を介して、レプトマイシン誘導体を細胞結合因子に連結させるために必要な部分を含有するように調製される。水溶液中での溶解度をさらに増強させるために、連結基はポリエチレングリコールスペーサーを含有することができる。標的とされる細胞の還元的環境が、細胞傷害性の増加を伴って、スルフィド又はジスルフィドの切断及び誘導体の放出をもたらすので、好ましくは、スルフィド又はジスルフィド結合が使用される。
【０１９４】
本発明の化合物は、様々な合成経路によって調製され得る。試薬及び出発材料は市販されており、又は当業者によって、周知の技術により容易に合成される。本発明の細胞傷害性連結体において使用され得るレプトマイシン誘導体を合成するための方法は、抗体などの細胞結合因子へ前記レプトマイシン誘導体を連結させるための方法と一緒に、欧州特許出願第０６２９０９４８．６（その内容は、参照により、本明細書に組み込まれている。）に詳しく記載されている。
【０１９５】
ＣＣ−１０６５類縁体
本発明の細胞傷害性連結体で使用される細胞傷害性因子は、ＣＣ−１０６５又はその誘導体でもあり得る。
【０１９６】
ＣＣ−１０６５は、ストレプトミセス・ゼレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｚｅｌｅｎｓｉｓ）の培養ブロスから単離される強力な抗腫瘍抗生物質である。ＣＣ−１０６５は、ドキソルビシン、メトトレキサート及びビンクリスチンなどの、一般的に使用されている抗癌薬より、インビトロで約１０００倍強力である（Ｂ．Ｋ．Ｂｈｕｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４２，３５３２−３５３７）。ＣＣ−１０６５及びその類縁体は、米国特許第６，３７２，７３８号、米国特許第６，３４０，７０１号、米国特許第５，８４６，５４５号及び米国特許第５，５８５，４９９号に開示されている。
【０１９７】
ＣＣ−１０６５の細胞傷害効力は、そのアルキル化活性及びそのＤＮＡ結合活性又はＤＮＡ挿入活性と相関付けられている。これらの２つの活性は、分子の別個の部分に存在する。従って、アルキル化活性はシクロプロパピロロインドール（ＣＰＩ）サブユニット中に含有され、ＤＮＡ結合活性は２つのピロロインドールサブユニット中に存在する。
【０１９８】
ＣＣ−１０６５は細胞傷害性因子としてある種の魅力的な特徴を有しているが、治療的な使用に限界を有する。ＣＣ−１０６５のマウスへの投与は、１２．５μｇ／ｋｇの単回静脈内投与から５０日後に死亡をもたらす遅延した肝臓毒性を引き起こした（Ｖ．Ｌ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，ＸＸＩＸ：３１９−３３４）。このため、遅延毒性を引き起こさない類縁体を開発する努力が促され、ＣＣ−１０６５をモデルとするより単純な類縁体の合成が記載されている（Ｍ．Ａ．Ｗａｒｐｅｈｏｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３１：５９０−６０３）。
【０１９９】
類縁体の別の系列では、ＣＰＩ部分がシクロプロパベンゾインドール（ＣＢＩ）部分によって置換された（Ｄ．Ｌ．Ｂｏｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５５：５８２３−５８３３；Ｄ．Ｌ．Ｂｏｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，ＢｉｏＯｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１：１１５−１２０）。これらの化合物は、マウス中での遅延毒性を引き起こさずに、親薬物の高いインビトロ効力を維持する。ＣＣ−１０６５のように、これらの化合物は、細胞死を引き起こすために、共有結合的にＤＮＡの副溝に結合するアルキル化剤である。しかしながら、最も有望な類縁体であるアドゼレシン及びカルゼレシンの臨床的評価は、失望的な結果に終わった（Ｂ．Ｆ．Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ，１３：３２１−３２６；Ｉ．Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，２：１７１７−１７２３）。これらの薬物は、高い全身毒性のために、乏しい治療効果を示す。
【０２００】
ＣＣ−１０６５類縁体の治療的効力は、腫瘍部位への標的化された送達を通じてインビボでの分布を変化させることによって大幅に改善することができ、標的とされていない組織へのより低い毒性をもたらし、従って、より低い全身毒性をもたらす。この最終目標を達成するために、腫瘍細胞を特異的に標的とする細胞結合因子とのＣＣ−１０６５の類縁体及び誘導体の連結体が記載されている（米国特許第５，４７５，０９２号；米国特許第５，５８５，４９９号；米国特許第５，８４６，５４５号）。これらの連結体は、インビトロにおいて高い標的特異的細胞傷害性を典型的に示し、マウスのヒト腫瘍異種移植モデルでは、卓越した抗腫瘍活性を典型的に示す（Ｒ．Ｖ．Ｊ．Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５：４０７９−４０８４）。
【０２０１】
最近、水性溶媒中で増強された溶解度を有するＣＣ−１０６５類縁体のプロドラッグが記載された（欧州特許出願第０６２９０３７９．４号）。これらのプロドラッグでは、分子のアルキル化部分のフェノール基が、酸性水溶液中での保存時に薬物を安定化し、保護されていない類縁体と比べて増加した水溶性を薬物に付与する官能基で保護されている。保護基は、生理的ｐＨで、容易にインビボで切断されて、対応する活性な薬物を与える。ＥＰ０６２９０３７９．４に記載されているプロドラッグでは、生理的ｐＨで電荷を有し、従って、増大された水溶性を有するフェニルカルバマートを含有するスルホン酸として、フェノール性置換基が保護されている。水溶性をさらに増大させるために、インドリルサブユニットとジスルフィド基などの切断可能な結合との間のリンカー中に、場合によって、ポリエチレングリコールスペーサーを導入することが可能である。このスペーサーの導入は、薬物の効力を変化させない。
【０２０２】
本発明の細胞傷害性連結体において使用され得るＣＣ−１０６５類縁体を合成するための方法は、抗体などの細胞結合因子へ前記類縁体を連結させるための方法と一緒に、欧州特許出願第０６２９０３７９．４（その内容は、参照により、本明細書に組み込まれている。）並びに米国特許第５，４７５，０９２、米国特許第５，８４６，５４５号、米国特許第５，５８５，４９９号、米国特許第６，５３４，６６０号及び米国特許第６，５８６，６１８号、並びに米国特許出願第１０／１１６，０５３号及び第１０／２６５，４５２号に詳しく記載されている。
【０２０３】
他の薬物
メトトレキサート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、カリケアマイシン、チュブリシン及びチュブリシン類縁体、デュオカルマイシン及びデュオカルマイシン類縁体、ドラスタチン及びドラスタチン類縁体などの薬物も、本発明の連結体の調製に適している。血清アルブミンなどの中間担体分子を通じて、薬物分子を抗体分子に連結することも可能である。例えば、米国特許出願０９／７４０９９１号に記載されているようなドキサルビシン及びダウノルビシン化合物も、有用な細胞傷害性因子であり得る。
【０２０４】
治療的組成物
本発明は、本発明の化合物の治療的有効量及び医薬として許容される担体を含む、哺乳動物中の過剰増殖性疾患又は炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療のための治療的組成物にも関する。一実施形態において、前記医薬組成物は、膀胱、乳房、大腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、子宮頸部、甲状腺及び皮膚の癌腫（扁平上皮細胞癌を含む。）を含む癌腫；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫などのリンパ球系列の造血器腫瘍；急性及び慢性骨髄性白血病及び前骨髄球性白血病などの骨髄系列の造血器腫瘍；繊維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉由来の腫瘍；悪性黒色腫、精上皮腫、奇形癌腫、神経芽細胞種及び神経膠腫を含む他の腫瘍；星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫及びシュワン細胞腫を含む中枢及び末梢神経系の腫瘍；繊維肉腫、横紋筋肉腫及び骨肉腫を含む間葉起源の腫瘍；並びに悪性黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞癌及び奇形癌腫を含む他の腫瘍、並びにその中でＣＤ３８が主に発現されていることが今後決定される他の癌を含む（但し、これらに限定されない。）癌の治療用である。好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物は、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、有毛細胞白血病、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病又は急性リンパ性白血病などの、その中でＣＤ３８が発現されている癌及びその中でＣＤ３８が主に発現されていることが今後決定される他の癌の治療のために使用される。別の実施形態において、本発明の医薬組成物は、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、胃炎、橋本甲状腺炎、強直性脊椎炎、Ｃ型肝炎関連クリオグロブリン血症性血管炎、慢性局所性脳炎、類天疱瘡、血友病Ａ、膜性増殖性糸球体腎炎、シェーグレン症候群、成人及び若年性皮膚筋炎、成人多発性筋炎、慢性蕁麻疹、原発性胆汁性肝硬変、突発性血小板減少性紫斑病、視神経脊髄炎、グレーブス甲状腺異常病、類天疱瘡、膜性増殖性糸球体腎炎、チャーグ・ストラウス症候群及び喘息などの自己免疫疾患を治療するために使用することができる。別の実施形態において、前記医薬組成物は、例えば、腎移植拒絶、肝移植拒絶、肺移植拒絶、心臓移植拒絶及び骨髄移植拒絶などの移植拒絶；移植片対宿主病；ｍＶ感染、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳなどのウイルス感染；並びにジアルジア症、アメーバ症、住血吸虫症及び当業者によって決定されるその他の寄生生物感染症などの寄生生物感染症のような他の疾患に関する。
【０２０５】
本発明は、
ａ）本発明の抗体、抗体断片又は抗体連結体の有効量及び；
ｂ）不活性又は生理的に活性であり得る、医薬として許容される担体
を含む、医薬組成物を提供する。
【０２０６】
本明細書において使用される「医薬として許容される担体」には、生理的に適合性がある、あらゆる全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤などが含まれる。適切な担体、希釈剤及び／又は賦形剤の例には、水、生理的食塩水、リン酸緩衝化された生理的食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの１つ又はそれ以上及びこれらの組み合わせが含まれる。多くの場合、組成物中に、糖、ポリアルコール又は塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましい。特に、適切な担体の適切な例には、（１）約１ｍｇ／ｍＬから２５ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンを含有する又は含有しないダルベッコのリン酸緩衝化生理的食塩水、ｐＨ約７．４、（２）０．９％生理的食塩水（０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）及び（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロースが含まれ、トリプタミンなどの抗酸化剤及びＴｗｅｅｎ２０などの安定化剤も含有し得る。
【０２０７】
本明細書の組成物は、治療されている具体的な疾患に対して必要とされるさらなる治療剤も含有し得る。好ましくは、本発明の抗体、抗体断片又は抗体連結体及び補助的な活性化合物は、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する。好ましい実施形態において、さらなる治療剤は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、組織因子（ＴＦ）、プロテインＣ、プロテインＳ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリン、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）若しくは血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のアンタゴニスト又はＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体、ｃ−ＭＥＴ及び他の受容体チロシンキナーゼを含む上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、組織因子（ＴＦ）、プロテインＣ、プロテインＳ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリン、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）若しくは血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する受容体のアンタゴニストである。好ましい実施形態において、さらなる治療剤は、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９、ＣＤ８０、ＣＤ１０３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８及びＣＤ１５２を含む表面抗原分類（ＣＤ）の抗原を標的とする薬剤である。好ましい実施形態において、さらなる治療剤は化学療法剤又は免疫調節剤である。
【０２０８】
本発明の組成物は、様々な形態であり得る。これらには、例えば、液体、半固体及び固体剤形が含まれるが、好ましい形態は、予定される投与の様式及び治療用途に依存する。典型的な好ましい組成物は、注射可能な又は注入可能な液体の形態である。投与の好ましい様式は、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下）である。好ましい実施形態において、本発明の組成物は、大量瞬時投与として、又はある期間にわたる連続的注入によって、静脈内に投与される。別の好ましい実施形態において、本発明の組成物は、局所的及び全身的な治療効果を発揮させるために、筋肉内、皮下、関節内、滑膜内、腫瘍内、腫瘍周囲、病変内又は病変周囲経路によって注射される。
【０２０９】
非経口投与用の無菌組成物は、適切な溶媒中に、必要とされる量で、本発明の抗体、抗体断片又は抗体連結体を取り込ませた後に、精密ろ過による滅菌によって調製することができる。溶媒又はビヒクルとして、水、生理的食塩水、リン酸緩衝化された生理的食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの及びこれらの組み合わせを使用し得る。多くの場合、組成物中に、糖、ポリアルコール又は塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましい。これらの組成物は、佐剤、特に、湿潤剤、等張化剤、乳化剤、分散剤及び安定化剤も含有し得る。非経口投与用の無菌組成物は、無菌水又は他の何らかの無菌注射可能溶媒中へ、使用時に溶解させ得る無菌固体組成物の形態でも調製し得る。
【０２１０】
本発明の抗体、抗体断片又は抗体連結体は、経口的に投与することもできる。経口投与用の固体組成物として、錠剤、丸薬、粉末（ゼラチンカプセル、小袋）又は顆粒を使用し得る。これらの組成物において、本発明の活性成分は、デンプン、セルロース、スクロース、ラクトース又はシリカなどの１つ又はそれ以上の不活性希釈剤と、アルゴン流下で混合される。これらの組成物は、希釈剤以外の物質、例えば、ステアリン酸マグネシウム又はタルクなどの１つ以上の潤滑剤、着色剤、コーティング（糖衣錠）又は光沢も含み得る。
【０２１１】
経口投与用の液体組成物として、水、エタノール、グリセロール、植物油又は液体パラフィンなどの不活性希釈剤を含有する、医薬として許容される溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ及びエリキシルを使用し得る。これらの組成物は、希釈剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、濃縮剤、香味剤及び安定化産物以外の物質を含み得る。
【０２１２】
投与量は、所望の効果、治療の期間、使用される投与経路に依存し、一般に、投与量は、成人に関しては、経口的に、５ｍｇ／日と１０００ｍｇ／日の間であり、単位投薬量は活性物質の１ｍｇから２５０ｍｇの範囲である。一般的に、医師は、年齢、体重及び治療されるべき対象に特異的な他の全ての要因に応じて、適切な投与量を決定する。
【０２１３】
治療的使用法
別の実施形態において、本発明は、ＣＤ３８を結合し、アポトーシス、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣによってＣＤ３８＋細胞を死滅させることができる抗体を、ＣＤ３８＋細胞の死滅を必要としている患者に投与することによって、ＣＤ３８＋細胞を死滅させる方法を提供する。本発明の抗体、抗体断片又は細胞傷害性連結体の種類の何れもが、治療的に使用され得る。従って、本発明は、抗ＣＤ３８モノクローナル抗体、その断片又はその細胞傷害性連結体の、医薬としての使用を含む。
【０２１４】
好ましい実施形態において、本発明の抗体、抗体断片又は細胞傷害性連結体は、哺乳動物中の過剰増殖性疾患又は炎症性疾患又は自己免疫性疾患の治療のために使用される。より好ましい実施形態において、上に開示されており、本発明の抗体、抗体断片又は細胞傷害性連結体を含有する医薬組成物の１つは、哺乳動物中の過剰増殖性疾患の治療のために使用される。一実施形態において、疾患は癌である。特に、癌は転移性の癌である。
【０２１５】
従って、本発明の医薬組成物は、膀胱、乳房、大腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、子宮頸部、甲状腺及び皮膚の癌腫（扁平上皮細胞癌を含む。）を含む癌腫；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫などのリンパ球系列の造血器腫瘍；急性及び慢性骨髄性白血病及び前骨髄球性白血病などの骨髄系列の造血器腫瘍；繊維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉由来の腫瘍；悪性黒色腫、精上皮腫、奇形癌腫、神経芽細胞種及び神経膠腫を含む他の腫瘍；星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫及びシュワン細胞腫を含む中枢及び末梢神経系の腫瘍；繊維肉腫、横紋筋肉腫及び骨肉腫を含む間葉起源の腫瘍；並びに悪性黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞癌及び奇形癌腫を含む他の腫瘍、並びにその中でＣＤ３８が発現されていることが今後決定される他の癌を含む（但し、これらに限定されない。）様々な癌の治療又は予防において有用である。好ましくは、疾患は、ＣＤ３８がその中で発現されているＮＨＬ、ＢＬ、ＭＭ、Ｂ−ＣＬＬ、ＡＬＬ、ＴＣＬ、ＡＭＬ、ＨＣＬ、ＨＬ又はＣＭＬであり、ＣＤ３８がその中で主に発現されている今後決定されるべき他の癌である。別の実施形態において、本発明の医薬組成物は、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、胃炎、橋本甲状腺炎、強直性脊椎炎、Ｃ型肝炎関連クリオグロブリン血症性血管炎、慢性局所性脳炎、類天疱瘡、血友病Ａ、膜性増殖性糸球体腎炎、シェーグレン症候群、成人及び若年性皮膚筋炎、成人多発性筋炎、慢性蕁麻疹、原発性胆汁性肝硬変、突発性血小板減少性紫斑病、視神経脊髄炎、グレーブス甲状腺異常病、類天疱瘡、膜性増殖性糸球体腎炎、チャーグ・ストラウス症候群及び喘息などの自己免疫疾患を治療するために使用することができる。別の実施形態において、前記医薬組成物は、例えば、腎移植拒絶、肝移植拒絶、肺移植拒絶、心臓移植拒絶及び骨髄移植拒絶などの移植拒絶；移植片対宿主病；ｍＶ感染、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳなどのウイルス感染；並びにジアルジア症、アメーバ症、住血吸虫症及び当業者によって決定されるその他の寄生生物感染症などの寄生生物感染症のような他の疾患に関する。
【０２１６】
同様に、本発明は、標的細胞又は標的細胞を含有する組織を、本発明の抗体、抗体断片若しくは抗体連結体の有効量と、又は単独で若しくは他の細胞傷害性因子若しくは治療剤と組み合わせて細胞傷害性連結体を含む抗体、抗体断片若しくは治療剤と接触させることを含む、選択された細胞集団の成長を阻害するための方法を提供する。好ましい実施形態において、さらなる治療剤は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、組織因子（ＴＦ）、プロテインＣ、プロテインＳ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリン、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）若しくは血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のアンタゴニスト又はＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体、ｃ−ＭＥＴ及び他の受容体チロシンキナーゼを含む上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、組織因子（ＴＦ）、プロテインＣ、プロテインＳ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリン、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）若しくは血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する受容体のアンタゴニストである。好ましい実施形態において、さらなる治療剤は、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９、ＣＤ８０、ＣＤ１０３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８及びＣＤ１５２を含む表面抗原分類（ＣＤ）の抗原を標的とする薬剤である。好ましい実施形態において、さらなる治療剤は化学療法剤又は免疫調節剤である。
【０２１７】
選択された細胞集団の増殖を阻害する方法は、インビトロ、インビボ又はエキソビボで実施することができる。本明細書において使用される「増殖を阻害する」とは、短期間であるか、又は長期間であるかを問わず、細胞の増殖を遅らせること、細胞の生存性を減少させること、細胞の死を引き起こすこと、細胞を溶解させること及び細胞死を誘導することを意味する。
【０２１８】
インビトロでの使用の例には、病気に罹患した細胞又は悪性細胞を死滅させるために、同じ患者中への移植の前に自家性骨髄を処理すること、適格性Ｔ細胞を死滅させ、及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を抑制するためにその移植の前に骨髄を処理すること、標的抗原を発現しない所望のバリアントを除く全ての細胞を死滅させるために、細胞培養物を処理すること、又は望ましくない抗原を発現するバリアントを死滅させることが含まれる。
【０２１９】
非臨床的なインビトロでの使用の条件は、当業者によって容易に決定される。
【０２２０】
エキソビボでの臨床的な使用の例は、癌の治療又は自己免疫疾患の治療における自家移植の前に、骨髄から腫瘍細胞若しくはリンパ球系細胞を取り出すこと、又は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を抑制するために、移植の前に、自家若しくは同種異系の骨髄若しくは組織からＴ細胞及び他のリンパ球系細胞を取り出すことである。治療は、以下のように実施することができる。患者又は他の個体から骨髄を採取し、次いで、本発明の細胞傷害性因子が添加された血清を含有する培地中で温置する。濃度は、約３７℃で約３０分から約４８時間、約１０μＭから１ｐＭの範囲である。濃度及び温置の時間の正確な条件、すなわち用量は当業者によって容易に決定される。温置後、血清を含有する培地で骨髄細胞を洗浄し、公知の方法に従って、静脈内注入によって患者に戻される。患者が、骨髄の採取時と処理された細胞の再注入時との間に、切除的化学療法又は全身照射の計画などの他の治療を受ける状況において、処理された骨髄細胞は、標準的な医療機器を用いて、液体窒素中に凍結保存される。
【０２２１】
臨床的なインビボでの使用に関しては、本発明の抗体、エピトープ結合抗体断片又は細胞傷害性連結体は、無菌性及びエンドトキシンレベルに関して検査された溶液として供給される。細胞傷害性連結体投与の適切なプロトコールの例は、以下のとおりである。各週の静脈内大量瞬時投与として４週間、連結体を毎週与える。大量瞬時投与は、ヒト血清アルブミンの５から１０ｍＬを添加することができる正常な生理的食塩水５０から１００ｍＬ中に与えられる。投薬量は、静脈内投与当り１０μｇから１００ｍｇ（１００ｎｇから１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲）である。より好ましくは、投薬量は５０μｇから３０ｍｇの範囲である。最も好ましくは、投薬量は１ｍｇから２０ｍｇの範囲である。治療の４週後に、患者は毎週治療を受け続けることができる。投与経路、賦形剤、希釈剤、投薬量、回数などに関する具体的な臨床プロトコールは、臨床的な状況の保証として、当業者によって決定され得る。
【０２２２】
診断薬
本発明の抗体又は抗体断片は、インビトロ又はインビボで、生物学的試料中のＣＤ３８を検出するためにも使用することができる。一実施形態において、本発明の抗ＣＤ３８抗体は、組織中の又は組織から得られた細胞中のＣＤ３８のレベルを測定するために使用される。好ましい実施形態において、組織は罹患した組織である。前記方法の好ましい実施形態において、組織は腫瘍又はその生検である。前記方法の好ましい実施形態において、まず、組織又はその生検が患者から切り出され、次いで、本発明の抗体又は抗体断片を用いたイムノアッセイにおいて、組織又は生検中のＣＤ３８のレベルを測定することができる。別の好ましい実施形態において、ＣＤ３８のレベルは、凍結し、又は固定することができる組織又はその生検の試料上で測定される。同じ方法は、ＣＤ３８の細胞表面レベル又はＣＤ３８の細胞局在化など、ＣＤ３８タンパク質の他の特性を決定するために使用することができる。
【０２２３】
癌を有することが知られた又は癌を有することが疑われている対象中の癌を診断するために、上記方法を使用することが可能であり、前記患者中で測定されたＣＤ３８のレベルは、正常な基準対象又は標準のものと比較される。次いで、前記方法は、腫瘍がＣＤ３８を発現しているかどうかを決定するために使用することができ、これは、本発明の抗体、抗体断片又は抗体連結体での治療に対して、腫瘍が十分に応答することを示唆し得る。好ましくは、腫瘍は、ＣＤ３８がその中で発現されているＮＨＬ、ＢＬ、ＭＭ、Ｂ−ＣＬＬ、ＡＬＬ、ＴＣＬ、ＡＭＬ、ＨＣＬ、ＨＬ又はＣＭＬであり、ＣＤ３８がその中で主に発現されている今後決定されるべき他の癌である。
【０２２４】
さらに、本発明は、研究又は診断用途において使用するためにさらに標識されている、モノクローナル抗体、ヒト化抗体及びこれらのエピトープ結合断片を提供する。好ましい実施形態において、標識は放射線標識、フルオロフォア、発色団、造影剤又は金属イオンである。
【０２２５】
前記標識された抗体又はそのエピトープ結合断片が、癌又は炎症性疾患又は自己免疫疾患を有することが疑われる対象に投与され、前記対象の体内の標識の分布が測定又はモニターされる、診断方法も提供される。
【０２２６】
キット
本発明は、例えば、記載されている細胞傷害性連結体と、及び特定の細胞種を死滅させるために細胞傷害性連結体を使用するための指示書とを含むキットも含む。指示書は、インビトロ、インビボ又はエキソビボで、細胞傷害性連結体を使用するための指示を含み得る。
【０２２７】
典型的には、キットは、細胞傷害性連結体を含有する区画を有する。細胞傷害性連結体は、凍結乾燥された形態、液体形態又はキット中に含められるために修正可能な他の形態であり得る。キットは、キット中の指示書上に記載されている方法を実施するために必要とされるさらなる要素、凍結乾燥された粉末を再構成するための滅菌された溶液、患者に投与する前に、細胞傷害性連結体と組み合わせるためのさらなる因子及び患者への連結体の投与を補助するツールも含有し得る。
【０２２８】
実施例
ここで、以下の実施例を参照することにより本発明を記載するが、以下の実施例は例示に過ぎず、本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【０２２９】
マウスＣＤ３８抗体
ヒトＣＤ３８の高いレベルを安定的に発現するＢａｌｂ／ｃマウスから得られた前Ｂ細胞株である３００−１９細胞（Ｍ．Ｇ．Ｒｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１７：３５３−３５５）を、Ｂａｌｂ／ｃＶＡＦマウスの免疫化のために使用した。ＩｍｍｎｏＧｅｎ，Ｉｎｃ．で使用された標準的な免疫化プロトコールにより、２から３週ごとに、マウス当り約５×１０６個のＣＤ３８発現３００−１９細胞で、マウスの皮下に免疫した。ハイブリドーマ作製のために屠殺する３日前に、抗原をさらに投与して、免疫化されたマウスに強化免疫を施した。標準的な動物プロトコールに従って、マウスから得た脾臓を集め、ＲＰＭＩ−１６４０培地中に単一の細胞懸濁液を得るために、２つの凍結された滅菌顕微鏡スライドの間にすり潰した。脾臓細胞をペレット状にし、洗浄し、ポリエチレングリコール−１５００（Ｒｏｃｈｅ７８３６４１）を用いることによって、マウス骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（Ｊ．Ｆ．Ｋｅａｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．１９７９，ＪＩｍｍｕｎｏｌ，１２３：１５４８−１５５０）と融合させた。ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０選択培地（ＳｉｇｍａＨ−０２６２）中に、融合された細胞を再懸濁し、３７℃（５％ＣＯ２）で、９６ウェルの平底培養プレート（Ｃｏｍｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ３５９６、ウェル当り細胞懸濁液２００μＬ）中での増殖に関して選択した。温置の５日後に、各ウェルから、培養上清１００μＬを除去し、ヒポキサンチン−チミジン（ＨＴ）補充物を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（ＳｉｇｍａＨ−０１３７）１００μＬと交換した。ハイブリドーマクローンが抗体スクリーニングを行える状態になるまで、３７℃（５％ＣＯ２）での温置を継続した。「Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ａｎｄ  Ｈ．Ｖｕｎａｋｉｓ（Ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２１，“Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ”；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｆｌｏｒｉｄａ）」及び「Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ（“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”；１９８８；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）」に記載されているものを含む、免疫化及びハイブリドーマ作製の他の技術も使用することができる。
【０２３０】
Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ又はＦＡＣＳＡｒｒａｙ装置を用いた蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって、ＣＤ３８を発現する３００−１９細胞に結合するが、親３００−１９細胞には結合しないマウスモノクローナル抗体の分泌に関して、ハイブリドーマから得た培養上清を（ＦＩＴＣ又はＰＥ連結抗マウスＩｇＧ抗血清を用いて）スクリーニングした。陽性結果が得られたハイブリドーマクローンをサブクローニングし、市販のイソタイプ決定試薬（Ｒｏｃｈｅ１４９３０２７）を用いて、分泌された各抗ＣＤ３８抗体のイソタイプを同定した。標準的なプロトコールを用いるプロテインＡ又はＧクロマトグラフィーにより、ＣＤ３８結合に対して陽性であった計２９の抗体を精製し、次いで、さらに性質決定を行った。
【実施例２】
【０２３１】
抗ＣＤ３８抗体の結合特性
抗ＣＤ３８抗体３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９のＣＤ３８発現３００−１９細胞への結合及び親３００−１９細胞への結合の不存在を示すＦＡＣＳヒストグラムが図１に示されている。３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１又は３８ＳＢ３９抗体（１０ｎＭ）を、２％の正常なヤギ血清を補充した氷冷されたＲＰＭＩ−１６４０培地１００μＬ中で、ＣＤ３８を発現する３００−１９細胞又は親３００−１９細胞（１から２×１０５細胞／試料）の何れかとともに３時間温置した。次いで、細胞をペレット状にし、洗浄し、ＦＩＴＣ連結ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、１００μＬ、２％の正常なヤギ血清が補充された冷ＲＰＭＩ−１６４０培地中に６μｇ／ｍＬ）とともに氷上で１時間温置した。細胞を再度ペレット状にし、洗浄し、１％ホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ２００μＬ中に再懸濁し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを備えたＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメータ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【０２３２】
３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１又は３８ＳＢ３９とともに温置されたＣＤ３８発現３００−１９細胞のＦＡＣＳヒストグラムは、対応する陰性対照（ＦＩＴＣ連結ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体のみとともに温置された細胞）のものと比べて、強力な蛍光シフトを示した（図１）。また、これらの抗体の何れかとともに親３００−１９細胞を温置したときには、有意な蛍光シフトは検出されなかった。陽性対照抗ＣＤ３８抗体ＡＴ１３／５（Ｓｅｒｏｔｅｃ，ＭＡＣ１０１９）を使用すると、類似の結果が得られた。
【０２３３】
Ｒａｍｏｓ（ＡＴＣＣＣＲＬ１５９６）リンパ腫細胞を３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１又は３８ＳＢ３９とともに温置したときにも、強力な蛍光シフトが観察された（図１）。Ｒａｍｏｓ細胞への結合に関する３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９の見かけの解離定数（ＫＤ）に対する値は、Ｓ字状用量応答曲線に対する非線形回帰法を用いて（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｚｍ，ｖｅｒｓｉｏｎ４，ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、図２に示されているＦＡＣＳ分析曲線から推定した。値は、それぞれ、以下のとおりであった。０．１０ｎＭ、０．１０ｎＭ、０．１２ｎＭ、０．１６ｎＭ、０．１１ｎＭ及び３．０３ｎＭ。
【実施例３】
【０２３４】
３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９抗体によるラモス及びダウディリンパ腫細胞のアポトーシスの誘導
抗ＣＤ３８抗体３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９抗体は、ラモス及びダウディ（ＡＴＣＣＣＣＬ−２１３）リンパ腫細胞株並びにＭＯＬＰ−８多発性骨髄腫細胞株（ＤＳＭＺＡＣＣ５６９）のアポトーシスを誘導した。アポトーシスの程度は、アネキシンＶ（ＢｉｏｓｏｕｒｃｅＰＨＮ１０１８）のＦＩＴＣ連結物及びＴＯ−ＰＲＯ−３（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴ３６０５）での染色後に、ＦＡＣＳ分析によって測定した。アネキシンＶは、完全な状態の細胞の細胞膜二重層の外側に位置するホスファチジルセリンを結合するが、内側に位置するホスファチジルセリンを結合しない。健康な正常細胞では、ホスファチジルセリンは膜二重層の内側に発現され、形質膜の内側から外側小葉へのホスファチジルセリンの移行はアポトーシスの最も初期の検出可能なシグナルの１つである。従って、アネキシンＶの結合は、アポトーシスの誘導に対するシグナルである。ＴＯ−ＰＲＯ−３は、アポトーシスの後期段階で起こるように膜の完全性が破れたときに、形質膜を貫通することができるに過ぎない単量体のシアニン核酸染色である。
【０２３５】
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭＬ−グルタミン及び５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンが補充されたＲＭＰＩ−１６４０培地（以下、完全ＲＭＰＩ−１６４０培地と表記される。）中、２４ウェルプレート中に、指数関数的に増殖している細胞を、約２×１０５細胞／ｍＬで播種した。別段の記載がなければ、一般に、細胞は完全ＲＭＰＩ−１６４０培地中で増殖させた。５％ＣＯ２を含有する加湿された大気中、３７℃で２４時間、抗ＣＤ３８抗体（１０ｎＭ）とともに細胞を温置した。次いで、細胞をペレット状にして、ＰＢＳ５００μＬで２回洗浄し、（アネキシンＶ−ＦＩＴＣキット中に提供されていた）アネキシンＶ−ＦＩＴＣ５μＬを含有する結合緩衝液１００μＬ中に再懸濁し、氷上で１５分間温置した。次いで、結合緩衝液及びＴＯ−ＰＲＯ−３（１μＭの最終濃度になるように）４００μＬを混合物に添加し、ＦＩＴＣ及びＴＯ−ＰＲＯ−３の細胞に付随する蛍光を、ＦＡＣＳによって直ちに測定した。各試料に対して、４，０００の現象を収集した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いて、ＴＯ−ＰＲＯ−３の蛍光（ＦＬ４−Ｈ；ｙ軸）及びアネキシンＶ−ＦＩＴＣの蛍光（ＦＬ１−Ｈ；ｘ軸）に対するドットプロットを作成した。
【０２３６】
結果が、図３及び４に示されている。図３は、様々な抗ＣＤ３８抗体との２４時間の温置後における、ダウディ細胞に対するこのようなドットプロットの例を与える。２つ組みの試料から得られたアネキシンＶ陽性細胞（ＴＯ−ＰＲＯ−３陽性細胞と陰性細胞の両方を含む。）の平均パーセントがこれらのプロットから求められ、図４に示されている。予想外のことに、３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９は、強力なアポトーシス活性を示した。非処理細胞の僅か約６％と比べて、これらの抗体の何れかに曝露されたダウディ細胞の３０％超がアネキシンＶ陽性であった（図３及び４Ａ）。３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９は、１０ｎＭの同じ濃度で検査された従来技術のマウスＣＤ３８抗体（ＡＴ１３／５、ＯＫＴ１０、ＩＢ４及びＳＵＮ−４Ｂ７、非処理対照値を差し引いた後、１０％未満がアネキシンＶ陽性）及び本発明者らの研究室で作製された２つの他の抗ＣＤ３８抗体（３８ＳＢ７及び３８ＳＢ２３、非処理対照より高くない。すなわち、約６％がアネキシンＶ陽性）より少なくとも２．４倍強力なアポトーシス活性（非処理対照値を差し引いた後では２４％）を示した（図４Ａ）。ＡＴ１３／５はＳｅｒｏｔｅｃ（ＭＣＡ１０１９）から購入し、ＯＫＴ１０はハイブリドーマ（ＡＴＣＣＣＲＬ−８０２２）から作製し、精製した（ＡＴＣＣＣＲＬ−８０２２）。ＩＢ４及びＳＵＮ−４Ｂ７は、イタリアのＴｕｒｉｎ大学のＦ．Ｍａｌａｖａｓｉ教授から頂いた。同様に、３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９抗ＣＤ３８抗体は、従来技術のマウスＣＤ３８抗体ＡＴ１３／５、ＯＫＴ１０、ＩＢ４及びＳＵＮ−４Ｂ７又は２つの他の新しい抗ＣＤ３８抗体３８ＳＢ７及び３８ＳＢ２３より（非処理対照値を差し引いた後、２％未満がアネキシンＶ陽性）、別のリンパ腫細胞株であるラモスに対して、少なくとも３．５倍強力なアポトーシス促進活性を示した（非処理対照値を差し引いた後、７％又はそれ以上がアネキシンＶ陽性）（図４Ｂ）。最後に、３８ＳＢ１３，３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９抗ＣＤ３８抗体は、多発性骨髄腫細胞株ＭＯＬＰ−８に対して、強力なアポトーシス促進活性を示した（図４Ｃ）。非処理細胞の約３９％と比べて、これらの抗体で処理されたＭＯＬＰ−８細胞の約５０％がアネキシンＶ陽性であった。これに対して、従来技術のマウスＣＤ３８抗体の何れか（ＡＴ１３／５、ＯＫＴ１０、ＩＢ４及びＳＵＮ−４Ｂ７）又は２つの他の新しい抗ＣＤ３８抗体３８ＳＢ７及び３８ＳＢ２３での処理は、アポトーシス細胞の割合に増加をもたらさなかった。
【実施例４】
【０２３７】
抗Ｃ３８抗体３８ＳＢ１９抗体の軽鎖及び重鎖のクローニング及び配列決定
３８ＳＢ１９抗体を産生するハイブリドーマ細胞からのＲＮＡの調製
ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いて、３８ＳＢ１９抗体を産生する５×１０６個のハイブリドーマ細胞から、全ＲＮＡの調製物を得た。簡潔に述べると、５×１０６個の細胞をペレット状にし、（１％β−メルカプトエタノールを含有する）ＲＬＴ緩衝液３５０μＬ中に再懸濁した。
【０２３８】
２１．５ゲージの針及び注射器を約１０から２０回通過させることによって、又は懸濁液がもはや粘性でなくなるまで、懸濁液を均質化した。よく混合された均質化液に、エタノール（７０％エタノール水溶液３５０μＬ）を添加した。溶液をスピンカラムに移し、２ｍＬの収集管の中に入れ、８０００×ｇ超で１５秒間遠心した。ＲＰＥ緩衝液５００μＬでカラムを２回洗浄し、次いで、新鮮な管に移し、ＲＮアーゼを含まない水３０μＬ及び１分の遠心を用いて溶出した。第二の１分の溶出遠心のために、溶出液（３０μＬ）をカラムに戻した。溶出液３０μＬの分取試料を水で希釈し、ＲＮＡ定量のために、２６０ｎｍでの紫外線吸収を測定するために使用した。
【０２３９】
逆転写酵素（ＲＴ）反応を用いたｃＤＮＡ調製
ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩキットを用いて、可変領域３８ＳＢ１９抗体ｃＤＮＡを全ＲＮＡから作製した。Ｑｉａｎｅａｓｙミニプレップから得られた全ＲＮＡの最大５μｇを用いて、キットのプロトコールに正確に従った。簡潔に述べると、ＲＮアーゼを含まない無菌蒸留水を用いて、このＲＮＡ、ランダムプライマー１μＬ及びｄＮＴＰミックス１μＬを１２μＬとして、６５℃で５分間温置した。次いで、少なくとも１分間、この混合物を氷の上に置いた。次に、５×反応緩衝液４μＬ、０．１ＭＤＴＴ２μＬ及びＲＮアーゼＯＵＴ１μＬを添加し、ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈサーマルサイクラー中で、混合物を２５℃で２分間温置した。ＳｕｐｒｅｓｃｒｉｐｔＩＩ酵素１μＬを添加できるようにサーマルサイクラーを停止し、次いで、２５℃でさらに１０分間、再開した後、５５℃へ５０分間シフトした。７０℃まで１５分間加熱することによって、反応を熱不活化させ、ＲＮアーゼＨ１μＬを添加し、３７℃で２０分間温置することによって、ＲＮＡを除去した。
【０２４０】
縮重ＰＣＲ反応
ハイブリドーマ細胞から得られたｃＤＮＡに対する第一巡の縮重ＰＣＲ反応に対する操作は、Ｗａｎｇ他（２０００）及びＣｏ他（１９９２）に記載されている方法に基づいた。この巡に対するプライマー（表２）は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩプラスミド中へのクローニングを促進するために制限部位を含有する。
【０２４１】
ＰＣＲ反応成分（表３）を薄壁のＰＣＲ管中において、氷上で混合し、次いで、９４℃で予め加熱され、停止されたＭＪリサーチのサーマルサイクラーに移した。反応は、Ｗａｎｇ他２０００から得られたプログラムを用いて、以下のように実施した。
【０２４２】
名称：Ｗａｎｇ４５
９４℃、３分
９４℃、１５秒
９４℃、１分
７２℃、２分
２へ移動、２９回
７２℃、６分
４℃、永久
終了
【０２４３】
次いで、１％低溶融アガロースゲル上でＰＣＲ反応混合物を走行させ、３００から４００塩基対のバンドを切り出し、ＺｙｍｏＤＮＡミニカラムを用いて精製し、配列決定のために、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓに送った。両方向から３８ＳＢ１９可変領域ｃＤＮＡを作製するための配列決定プライマーとして、それぞれ、５’及び３’ＰＣＲプライマーを使用した。
【０２４４】
５’末端配列のクローニング
３８ＳＢ１９可変領域軽鎖及び重鎖ｃＤＮＡ配列をクローニングするために使用される縮重プライマーは５’末端配列を変化させるので、完全な配列を解明するために、配列決定のさらなる努力が必要であった。３８ＳＢ１９配列が得られたマウス生殖系列配列に対して、ＮＣＢＩＩｇＢｌａｓｔのサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を検索するために上記方法から得た準備的ｃＤＮＡ配列を使用した。新しいＰＣＲ反応がＰＣＲプライマーによる変化を受けていない完全な可変領域ｃＤＮＡを与えることができるように、マウス抗体のリーダー配列に徐冷するようにＰＣＲプライマーを設計した（表３）。ＰＣＲ反応、バンド精製及び配列決定は、上述のように行った。
【０２４５】
配列確認のためのペプチド分析
完全長抗体ｃＤＮＡ配列を得るために、可変領域に対するｃＤＮＡ配列情報を生殖系列定常領域配列と組み合わせた。次いで、重鎖及び軽鎖の分子量を計算し、マウス３８ＳＢ１９抗体のＬＣ／ＭＳ分析によって得られた分子量と比較した。
【０２４６】
表４は、ＬＣ／ＭＳによって測定された値と一緒に、３８ＳＢ１９ＬＣ及びＨＣに対するｃＤＮＡ配列から計算された質量を与える。分子量の測定は、３８ＳＢ１９軽鎖及び重鎖の両方に対するｃＤＮＡ配列と合致している。
【実施例５】
【０２４７】
ｈｕ３８ＳＢ１９抗体の組換え発現
ｈｕ３８ＳＢ１９に対する可変領域配列は、ＢｌｕｅＨｅｒｏｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって、コドン最適化され、合成された。この配列には、一重鎖及び直列二重鎖の哺乳動物発現プラスミド中の各定常配列とインフレームにクローニングするための制限酵素部位が隣接している。軽鎖可変領域は、ｐｓ３８ＳＢ１９ＬＣＺｖ１．０及びｐｓ３８ＳＢ１９ｖ１．００両プラスミド中のＥｃｏＲＩ及びＢｓｉＷＩ部位中にクローニングされる（図５Ａ及び５Ｃ）。重鎖可変領域は、ｐｓ３８ＳＢ１９ＨＣＮｖ１．０及びｐｓ３８ＳＢ１９ｖ１．００両プラスミド中のＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａ１部位中にクローニングされる（図５Ｂ及び５Ｃ）。これらのプラスミドは、哺乳動物細胞中での一過性の又は安定な形質移入においてｈｕ３８ＳＢ１９を発現させるために使用することができる。他のキメラ抗体及びヒト化抗体を作製するために、類似の発現ベクター構築物を使用した。
【０２４８】
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中でｈｕ３８Ｓ１９を発現させるための一過性形質移入が、ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得たＣａＰＯ４試薬を用いて行われた。供給されたプロトコールは、発現収率を増大させるために若干改変した。簡潔に述べると、形質移入の２４時間前に、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）で被覆された１０ｃｍの組織培養皿の上に、２×１０６個のＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を播種した。形質移入は、ＰＢＳで細胞を洗浄し、培地を、１％ＵｌｔｒａＬｏｗＩｇＧＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を加えたＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１０ｍＬと交換することによって開始した。渦巻き攪拌しながら、溶液Ａ（１０μｇＤＮＡ、Ｃａ２＋溶液８６．８μＬ及び５００μＬになるようにＨ２Ｏ）を溶液Ｂに滴加した。室温で１分間、混合物を温置し、混合物１ｍＬを各１０ｃｍプレートに滴加した。形質移入から約１６時間後に、培地を、１％ＵｌｔｒａＬｏｗＩｇＧＦＢＳを加えた新鮮なＤＭＥＭ１０ｍＬと交換した。約２４時間後に、２ｍＭ酪酸ナトリウムを各１０ｃｍプレートに添加した。４日後に、形質移入を採集した。
【０２４９】
１ＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０の１／１０容量の添加によって、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーのために上清を調製した。０．２２μｍフィルター膜を通してｐＨ調整された上清をろ過し、結合緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．３）で平衡化されたプロテインＡセファロースカラム（ＨｉＴｒａｐＰｒｏｔｅｉｎＡＨＰ、１ｍＬ、ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に搭載した。ＤＮＡなどの細胞材料由来のきょう雑を低下させるために、試料搭載の間に、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅプレカラム（１０ｍＬ）をプロテインＡカラムの上流に接続した。試料の搭載後、プレカラムを外し、洗浄及び溶出のためにプロテインＡカラムの配置を逆にした。２８０ｎｍの吸収が存在しない、安定なベースラインが得られるまで、結合緩衝液でカラムを洗浄した。０．５ｍＬ／分の流速を用いて、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ２．８を含有する０．１Ｍ酢酸緩衝液で抗体を溶出した。約０．２５ｍＬの画分を集め、１ＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０の１／１０容量の添加によって中和した。ＰＢＳに対して２回、ピーク画分を一晩透析し、ＯＤ２８０での吸光度によって、精製された抗体を定量した。若干異なる操作でプロテインＧカラムを使用して、ヒト化抗体及びキメラ抗体も精製することが可能である。
【０２５０】
記載されている全てのキメラ及びヒト化抗ＣＤ３８抗体は、上述のものと同様の操作で発現され及び精製された。
【実施例６】
【０２５１】
キメラ抗ＣＤ３８抗体の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性
ヒトＩｇＧ１定常領域を有するキメラ抗体又はヒト化抗体として、幾つかの抗ＣＤ３８抗体がＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を有することが以前に示されているので（Ｊ．Ｈ．Ｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５５：９２５−９３７；Ｆ．Ｋ．Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９１，Ｂｌｏｏｄ，７７：１０７１−１０７９；ＷＯ２００５／１０３０８３）、マウス可変領域及びヒトＩｇＧ１／Ｉｇκ定常領域からなる３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９のキメラ様式を作製し、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性に関して検査した。標的細胞としてラモス細胞を使用し、及びエフェクター細胞としてヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を使用して、まず、ＡＤＣＣに関して、ｃｈ３８ＳＢ１３、ｃｈ３８ＳＢ１８、ｃｈ３８ＳＢ１９、ｃｈ３８ＳＢ３０、ｃｈ３８ＳＢ３１及びｃｈ３８ＳＢ３９を検査した。細胞溶解を測定するために、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出アッセイを使用した（Ｒ．Ｌ．Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７６：６５９１−６６０４）。
【０２５２】
ＮＫＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔＩＩ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ）に対する改変されたプロトコールを用いて、まず、ＮＫ細胞をヒト血液（正常なドナー由来；ＲｅｓｅａｒｃｈＢｌｏｏｄＣｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｉｇｈｔｏｎ，ＭＡから購入）から単離した。Ｈａｎｋの平衡化された塩溶液（ＨＢＳＳ）で、血液を２から３倍希釈した。希釈された血液２５ｍＬを、円錐体チューブ５０ｍＬ中のＦｉｃｏｌｌＰａｑｕｅ２５ｍＬ上に注意深く重層し、１９℃で４５分間、４００ｇで遠心した。界面から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を集め、新しい５０ｍＬのコニカルチューブ中に移し、ＨＢＳＳで一回洗浄した。ＮＫ−単離緩衝液２ｍＬ中にＰＢＭＣを再懸濁し、次いで、Ｂｉｏｔｉｎ−ＡｎｔｉｂｏｄｙＣｏｃｋｔａｉｌ（ＮＫ−ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ、１３０−０９１−１５２、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈから）５００μＬを細胞懸濁液に添加した。Ｂｉｏｔｉｎ−ＡｎｔｉｂｏｄｙＣｏｃｋｔａｉｌは、ＮＫ細胞を除くリンパ球に結合するビオチン化された抗体を含有する。４℃で１０分間、混合物を温置し、次いで、ＮＫ−単離緩衝液（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、１ｍＭＥＤＴＡ）１．５ｍＬ及び抗ビオチンミクロビーズ１ｍＬを添加した。細胞−抗体混合物を、４℃でさらに１５分間温置した。次に、ＮＫ単離緩衝液５０ｍＬで細胞を一回洗浄し、ＮＫ単離緩衝液３ｍＬ中に再懸濁した。次いで、ＮＫ単離緩衝液３ｍＬで、ＭＡＣＳＬＳカラム（ＭＡＣＳセパレータ機上、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ）を事前洗浄した。次いで、ＬＳカラム上に、細胞懸濁物を搭載した。流出物（標識されていない細胞を有する画分）を、新しい５０ｍＬコニカルチューブの中に集めた。ＮＫ−単離緩衝液３ｍＬで、カラムを３回洗浄した。同じチューブの中に流出物全体を集め、ＮＫ単離緩衝液５０ｍＬで１回洗浄した。５％ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンが補充されたＲＰＭＩ−１６４０の３０ｍＬ中に、ＮＫ細胞を播種した。
【０２５３】
０．１％ＢＳＡ、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４及び５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンが補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地（以下、ＲＨＢＰ培地と表記）中のｃｈ３８ＳＢ１３、ｃｈ３８ＳＢ１８、ｃｈ３８ＳＢ１９、ｃｈ３８ＳＢ３０、ｃｈ３８ＳＢ３１及びｃｈ３８ＳＢ３９抗体の様々な濃度を、丸底９６ウェルプレート中に分取した（５０μＬ／ウェル）。ＲＨＢＰ培地中に、１０６細胞／ｍＬで、標的ラモス細胞を再懸濁し、抗体希釈物を含有する各ウェルに添加した（１００μＬ／ウェル）。標的細胞及び抗体希釈物を含有するプレートを、３７℃で３０分間温置した。次いで、典型的には標的細胞１：ＮＫ細胞３から６の比率で、標的細胞を含有するウェルに、ＮＫ細胞（５０μＬ／ウェル）を添加した。ＮＫ細胞を加えた対照ウェルに、ＲＨＢＰ培地（５０μＬ／ウェル）を添加した。また、可能な最大ＬＤＨ放出を測定するために、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液（ＲＰＭＩ−１６４０培地、１０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）２０μＬを、抗体なしに、標的細胞のみを含有する３つのウェルに添加した。３７℃で４時間、混合物を温置し、次いで、１２００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清１００μＬを新しい平底９６ウェルプレートに注意深く移した。ＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ｒｏｃｈｅ１６４４７９３）から得たＬＤＨ反応混合物を各ウェルに添加し（１００μＬ／ウェル）、室温で５から３０分間温置した。試料の光学密度を４９０ｎｍで測定した（ＯＤ４９０）。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００処理された試料のＯＤ４９０値に対して１００％の溶解を割り当て、標的細胞のみを含有する非処理対照試料のＯＤ４９０値に０％を割り当てることによって、各試料のパーセント特異的溶解を決定した。ＮＫ細胞のみを含有する試料は、無視できるＯＤ４９０の読み取りを与えた。
【０２５４】
ラモス標的細胞及びＮＫエフェクター細胞を用いて検査を行うと、キメラ抗ＣＤ３８抗体は極めて強力なＡＤＣＣ活性を示した（図６）。Ｓ字状用量応答曲線を用いた非線形回帰法によって、ＥＣ５０値を推測し、ｃｈ３８ＳＢ１３に対して０．００１３μｇ／ｍＬ、ｃｈ３８ＳＢ１８に対して０．００１３μｇ／ｍＬ、ｃｈ３８ＳＢ１９に対して０．００１８μｇ／ｍＬ、ｃｈ３８ＳＢ３０に対して０．００２２μｇ／ｍＬ、ｃｈ３８ＳＢ３１に対して０．００１２μｇ／ｍＬ、ｃｈ３８ＳＢ３９に対して０．１１３２μｇ／ｍＬであることが明らかとなった。キメラ抗ＣＤ３８抗体も、ＬＰ−１（ＤＳＭＺＡＣＣ４１）多発性骨髄腫細胞に対して強力なＡＤＣＣ活性を示した（ＥＣ５０値：ｃｈ３８ＳＢ１８に対して０．０００５６μｇ／ｍＬ；ｃｈ３８ＳＢ１９に対して０．０００３４μｇ／ｍＬ；ｃｈ３８ＳＢ３１に対して０．０００２４μｇ／ｍＬ）（図７Ａ）。ｃｈ３８ＳＢ１９は、ダウディリンパ腫細胞（図７Ｂ）、ＮＡＬＭ−６Ｂ−ＡＬＬ細胞ＤＳＭＺＡＣＣ１２８）（図８Ａ）及びＭＯＬＴ−４Ｔ−ＡＬＬ細胞（ＡＴＴＣＣＲＬ−１５８２）（図８Ｂ）をＡＤＣＣによって効率的に死滅させ、極めて強力なアポトーシス活性を有する抗ＣＤ３８抗体が様々な造血器の悪性腫瘍に由来する様々な腫瘍細胞に対しても強力なＡＤＣＣ活性を有することを示唆した。また、同じ実験において、非結合ＩｇＧ１対照抗体（リツキシマブ、Ｂｉｏｇｅｎｌｄｅｃ）（図７Ａ、８Ａ及び８Ｂ）又はｍｕ３８ＳＢ１９（図７Ｂ）は、有意なＡＤＣＣ活性を持たなかった。
【実施例７】
【０２５５】
キメラ抗ＣＤ３８抗体のＣＤＣ活性
ｃｈ３８ＳＢ１３、ｃｈ３８ＳＢ１８、ｃｈ３８ＳＢ１９、ｃｈ３８ＳＢ３０、ｃｈ３８ＳＢ３１及びｃｈ３８ＳＢ３９のＣＤＣ活性は、（Ｈ．Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０２：１６３−１７１）から改変された方法に基づいて測定した。ヒト補体は、実験の直後に、製造業者の指示通りに精製された滅菌水で再構成された後、ＲＨＢＰ培地で５倍希釈された、凍結乾燥されたヒト補体血清（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＳ１７６４）であった。ＲＨＢＰ培地中に１０６細胞／ｍＬで懸濁された標的細胞を、平底９６ウェル組織培養プレートのウェル中に分注した（５０μＬ／ウェル）。次いで、ＲＨＢＰ培地中の抗ＣＤ３８抗体の様々な濃度（１０ｎＭから０．００１ｎＭ）の５０μＬを添加し（試料当り１抗体）、次いで、補体溶液５０μＬ／ウェルを添加した。次いで、５％ＣＯ２を含有する加湿された大気中において、３７℃で２時間、プレートを温置し、その後、細胞の生存性を測定するために、ＲＨＢＰ中に希釈された４０％ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ試薬５０μＬ（ＢｉｏｓｏｕｒｃｅＤＡＬ１１００）（１０％最終）を各ウェルに添加した。Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅは、生きた細胞の還元能をモニターする。５４０／５９０ｎｍで蛍光（相対蛍光単位ＲＦＵで）測定する前に、３７℃で、５から１８時間、プレートを温置した。各試料に対するＲＦＵ値からバックグラウンドＲＦＵ値（培地のみを有し、一切の細胞を加えていないウェル）を差し引くことによって、バックグラウンド蛍光に対して実験値をまず補正し、次いで、補正されたＲＦＵ値を非処理細胞試料の補正されたＲＦＵ値で除することによって、各試料に対する特異的な細胞生存性のパーセントを測定した。
【０２５６】
５％の最終希釈でヒト補体を使用して、Ｒａｊｉ−ＩＭＧ細胞を用いて、キメラ抗ＣＤ３８抗体試料のＣＤＣ活性を検査すると、キメラＣＤ３８抗体は、極めて強力なＣＤＣ活性を示した（図９）。Ｒａｊｉ−ＩＭＧは、Ｒａｊｉ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−８６）から誘導された細胞であり、膜補体阻害剤ＣＤ５５及びＣＤ５９のより低いレベルを発現する。図８に示されているＳ字状用量応答曲線からの非線形回帰によって、ＥＣ５０値を推定した。ＥＣ５０値は、以下のとおりである。ｃｈ３８ＳＢ１３に関しては０．００５μｇ／ｍＬ、ｃｈ３８ＳＢ１８に関しては０．０１０１μｇ／ｍＬ、ｃｈ３８ＳＢ１９に関しては０．０２８μｇ／ｍＬ、ｃｈ３８ＳＢ３０に関しては０．０２０μｇ／ｍＬ、ｃｈ３８ＳＢ３１に関しては０．０１０μｇ／ｍＬ及びｃｈ３８ＳＢ３９に関しては０．４００μｇ／ｍＬ。キメラ抗ＣＤ３８抗体は、ＬＰ−１多発性骨髄腫細胞に対しても、強力なＣＤＣ活性を示した（ＥＣ５０値：ｃｈ３８ＳＢ１８に関しては０．０３２μｇ／ｍＬ、ｃｈ３８ＳＢ１９に関しては０．０３０μｇ／ｍＬ、ｃｈ３８ＳＢ３１に関しては０．０４３μｇ／ｍＬ）のに対して、非結合性キメラ対照ＩｇＧ１（リツキシマブ、Ｂｉｏｇｅｎｌｄｅｃ）は全くＣＤＣ活性を有さなかった（図１０）。ダウディリンパ腫細胞に対してキメラＣＤ３８抗体を検査した場合、異なる抗ＣＤ３８抗体のＣＤＣ活性は異なっていた（図１１）。ダウディ細胞の比生存性は、補体の存在下でのｃｈ３８ＳＢ１９の１．２５μｇ／ｍＬとの温置後には１５％未満であったのに対して、補体の存在下でｃｈ３８ＳＢ１８又はｃｈ３８ＳＢ３９（１．２５μｇ／ｍＬ又はそれ以上の高濃度）とともにそれらを温置した後の、これらの細胞の比生存性には僅かな減少が存在するにすぎなかった（それぞれ、比生存性は８５％及び９１％であった。）。また、補体の存在下で、ｃｈ３８ＳＢ１３、ｃｈ３８ＳＢ３０及びｃｈ３８ＳＢ３１の１．２５μｇ／ｍＬ又はこれより高い濃度とともにダウディ細胞を温置した場合には、比生存性の穏やかな減少が観察されるに過ぎなかった（それぞれ、比生存性は６５％、４５％及び５３％であった。）。
【実施例８】
【０２５７】
ヒト化抗ＣＤ３８抗体の結合親和性並びにアポトーシス、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性
ヒト化３８ＳＢ１９の２つの様式（ｈｕ３８ＳＢ１９ｖ１．００及びｖ１．２０）及びキメラ３８ＳＢ１９は、ラモス細胞を用いて検査したときに、それぞれ、０．２３ｎＭ、０．２５ｎＭ及び０．１８ｎＭのＫＤ値という類似の結合親和性を示した（図１２Ａ）。キメラ及びヒト化３８ＳＢ１９抗体の結合親和性は、ビオチン化されたマウス３８ＳＢ１９抗体の結合との競合能が測定される競合結合アッセイにおいても比較された。ビオチン標識されたマウス３８ＳＢ１９抗体（３×１０−１０Ｍ）を、ｃｈ３８ＳＢ１９、ｈｕ３８ＳＢ１９ｖ１．００又はｈｕ３８ＳＢ１９ｖ１．２０の様々な濃度と混合した。ラモス細胞とともに、抗体混合物を温置し、ＦＡＣＳ分析によるＦＩＴＣ連結ストレプトアビジンを用いて、細胞に結合したビオチン化されたマウス３８ＳＢ１９の量を測定した。ｈｕ３８ＳＢ１９ｖ１．００、ｈｕ３８ＳＢ１９ｖ１．２０及びｃｈ３８ＳＢ１９は、ビオチン化されたマウス３８ＳＢ１９の結合と等しく良好に競合し（図１２Ｂ）、ヒト化によって、結合親和性が影響を受けないことが再度示された。ダウディ細胞のアポトーシスを誘導する能力に関して、ｃｈ３８ＳＢ１９、ｈｕ３８ＳＢ１９ｖ１．００及びｈｕ３８ＳＢ１９ｖ１．２０（１０−８から１０−１１Ｍ）を比較すると、これらは同様のアポトーシス活性を示した（図１３）。さらに、ｈｕ３８ＳＢ１９ｖ１．００及びｖ１．２０は、ＬＰ−１細胞中で、ｃｈ３８ＳＢ１９と同様のＡＤＣＣも示し（図１４）、並びにＲａｊｉ−ＩＭＧ及びＬＰ−１細胞中で、ｃｈ３８ＳＢ１９と同様のＣＤＣ能を示した（図１５）。ｈｕ３８ＳＢ１９ｖ１．００は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病細胞株ＤＮＤ−４１（ＤＳＭＺ５２５）中で、ｃｈ３８ＳＢ１９と同様のＣＤＣ活性も示した（図１５）。細胞株の多様な組においてアポトーシスを誘導する能力に関して、ｈｕ３８ＳＢ１９ｖ１．００をさらに検査した（図１６）。ｈｕ３８ＳＢ１９ｖ１．００（１０−８Ｍ）での処理は、Ｂ細胞リンパ腫細胞株ＳＵ−ＤＨＬ−８（ＤＳＭＺＡＣＣ５７３）（非処理対照での７％からｈｕ３８ＳＢ１９処理細胞での９７％へ）及びＮＵ−ＤＵＬ−１（ＤＳＭＺＡＣＣ５７９）（非処理対照での１０％からｈｕ３８ＳＢ１９処理細胞での３７％へ）及びＴ−ＡＬＬ細胞株ＤＮＤ−４１（非処理対照での７％からｈｕ３８ＳＢ１９処理細胞での６９％へ）中にアネキシンＶ陽性細胞の劇的な増加をもたらした。さらに、ｈｕ３８ＳＢ１９ｖ１．００（１０−８Ｍ）での処理は、Ｂ細胞リンパ球性白血病細胞株ＪＶＭ−１３（ＤＳＭＺＡＣＣ１９）（非処理対照での８％からｈｕ３８ＳＢ１９処理細胞での１７％へ）及び有毛細胞白血病細胞株ＨＣ−１（ＤＳＭＺＡＣＣ３０１）（非処理対照での６％からｈｕ３８ＳＢ１９処理細胞での１０％へ）中のアネキシンＶ陽性細胞の割合を増加させた。
【０２５８】
同様に、ヒト化３８ＳＢ３１の２つの様式（ｈｕ３８ＳＢ３１ｖ１．１及びｖ１．２）並びにキメラ３８ＳＢ３１は、ラモス細胞を用いて検査したときに、それぞれ、０．１３ｎＭ、０．１１ｎＭ及び０．１２ｎＭのＫＤ値を有し、類似の結合親和性を示した。キメラ及びヒト化３８ＳＢ３１抗体の結合親和性は、上記のような競合結合アッセイでも比較され、等しく優れた成績を発揮した。幾つかの細胞株中でアポトーシスを誘導する能力に関して、ｈｕ３８ＳＢ３１ｖ１．１をさらに検査した。ヒト化抗体は、ラモス、ダウディ、Ｍｏｌｐ−８及びＳＵ−ＤＨＬ−８細胞に対して、ｃｈ３８ＳＢ３１と同様のアポトーシス活性を示した。さらに、これらの細胞株中で、ｈｕ３８ＳＢ３１ｖ１．１は、ｃｈ３８ＳＢ３１と同様のＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性も示した。
【実施例９】
【０２５９】
３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９のインビボでの有効性
ラモスリンパ腫細胞を用いて確立された免疫欠損マウス（雌のＣＢ．１７ＳＣＩＤ）中の生存ヒト異種移植腫瘍モデルにおいて、３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１及び３８ＳＢ３９のインビボ抗腫瘍活性を調べた。側方尾静脈を通じて、無血清培地０．１ｍＬ中の２×１０６個のラモス細胞を雌のＣＢ．１７ＳＣＩＤマウスに接種した。腫瘍細胞接種から７日後に、体重に基づいて、マウスを７つのグループに無作為に割り当てた。６匹のマウスを有する３８ＳＢ３１処理群及び８匹のマウスを有する３８ＳＢ３９処理群を除き、グループ当り１０匹のマウスが存在した。細胞接種から７日後に開始し、連続３週間、週に２回、４０ｍｇ／ｋｇの用量で、抗体をマウスに静脈内投与した。片方又は両方の後脚が麻痺し、体重の低下が前処理の値から２０％を超え、又は動物の病状が重くなり、食物と水を摂取できなくなったら、マウスを屠殺した。３８ＳＢ１３、３８ＳＢ１８、３８ＳＢ１９、３８ＳＢ３０、３８ＳＢ３１又は３８ＳＢ３９での処理は、ＰＢＳ処理されたマウスと比べて、マウスの生存を有意に延長した（図１７）。ＰＢＳ処理されたマウスの生存中央値は２２日であり、抗体処理されたグループの生存中央値は２８から３３日の範囲であった。
【０２６０】
免疫欠損マウス中のさらなるヒト異種移植腫瘍モデルにおいて、ｍｕ３８ＳＢ１９及びｈｕ３８ＳＢ１９のインビボでの抗腫瘍活性をさらに調べた。ダウディリンパ腫生存モデルに関しては、側方尾静脈を通じて、無血清培地０．１ｍＬ中の５×１０６個のダウディ細胞をＳＣＩＤマウスに接種した。研究は、上述のように実施した。ｍｕ３８ＳＢ１９又はｈｕ３８ＳＢ３９での処理は、ＰＢＳ処理されたマウスと比べて、マウスの生存を有意に延長した（図１８）。ＰＢＳ処理されたマウスの生存中央値は２２日であったのに対して、抗体処理されたマウスの生存中央値は４７日であった。
【０２６１】
ＮＣＩ−Ｈ９２９多発性骨髄腫腫瘍モデルに関しては、１０７個の細胞をＳＣＩＤマウスに皮下接種した。６日目に腫瘍がｐａｌｐａｂｌｅになった時点で、体重に従って、動物を無作為に１０のグループに割り当て、抗体処理を開始した。ｈｕ３８ＳＢ１９抗体又は非結合キメラＩｇＧ１対照抗体（リツキシマブ、Ｂｉｏｇｅｎｌｄｅｃ）を、３週連続して、週に２回、４０ｍｇ／ｋｇの用量で、マウスに静脈内投与した。腫瘍容積をモニターし、腫瘍のサイズが２０００ｍｍ３に達したら、又は腫瘍が壊死性になったら、動物を屠殺した。ＰＢＳ処理群は８９日目に、キメラＩｇＧ１対照抗体群は８４日目に、１０００ｍｍ３の平均腫瘍容積に達した（図１９）。ｈｕ３８ＳＢ１９での処理は、１０匹の動物全てにおいて、腫瘍増殖を完全に抑制した。これに対して、ＰＢＳ処理群では２匹の動物及びキメラＩｇＧ１対照抗体では３匹の動物が腫瘍の退行を示したに過ぎなかった。
【０２６２】
ＭＯＬＰ−８多発性骨髄腫腫瘍モデルに関しては、１０７個の細胞をＳＣＩＤマウスに皮下接種した。４日目に腫瘍が触知可能になった時点で、体重に従って、動物を無作為に１０のグループに割り当て、抗体処理を開始した。ｈｕ３８ＳＢ１９抗体又はｍｕ３８ＳＢ１９抗体又はキメラＩｇＧ１対照抗体を、３週連続して、週に２回、４０ｍｇ／ｋｇの用量で、マウスに静脈内投与した。腫瘍容積をモニターし、腫瘍のサイズが２０００ｍｍ３に達したら、又は腫瘍が壊死性になったら、動物を屠殺した。ＰＢＳ処理群は２２日目に、キメラＩｇＧ１対照抗体群は２３日目に、５００ｍｍ３の平均腫瘍容積に達した（図２０）。これらの群中の腫瘍は何れも退行しなかった。これに対して、ｈｕ３８ＳＢ１９又はｍｕ３８ＳＢ１９での処理は、それぞれ、１０匹の動物のうち８匹又は１０匹の動物のうち６匹に腫瘍の退行をもたらした。
【０２６３】
【表１】
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【０２６４】
【表２】
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【０２６５】
【表３】
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【０２６６】
【表４】
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【０２６７】
【表５】
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【０２６８】
【表６】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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