(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一のPUFA PKSシステムと比べて、ω-3のPUFA 対 ω-6のPUFAの異なる比率をもたらすキメラPUFA PKSシステムを作出するために、第一のPUFA PKSシステム由来のFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ2(DH2)ドメインが、異なる第二のPUFA PKSシステム由来のDH2ドメインと置き換えられる、キメラPUFA PKSシステム。
【請求項２】
第一のPUFA PKSシステム由来のDH2ドメインを含むタンパク質が、第二のPUFA PKSシステム由来のDH2ドメインを含むタンパク質と置き換えられる、請求項1記載のキメラPUFA PKSシステム。
【請求項３】
第一または第二のPUFA PKSシステム由来のDH2ドメインが、シゾキトリウム(Schizochytrium)またはスラウストキトリウム(Thraustochytrium)由来のDH2ドメインを含む、請求項1または２記載のキメラPUFA PKSシステム。
【請求項４】
第一のPUFA PKSシステムがシゾキトリウムPUFA PKSシステムであり、かつ
第二のPUFA PKSシステムがスラウストキトリウムPUFA PKSシステムである、
請求項1〜３のいずれか一項記載のキメラPUFA PKSシステム。
【請求項５】
第一のPUFA PKSシステムがシゾキトリウムPUFA PKSシステムであり、かつ
シゾキトリウムPUFA PKSシステム由来のOrfCが、異なるスラウストキトリド(Thraustochytrid)由来のOrfCと置き換えられる、
請求項1〜３のいずれか一項記載のキメラPUFA PKSシステム。
【請求項６】
第一のPUFA PKSシステムがシゾキトリウムPUFA PKSシステムであり、かつ
シゾキトリウムPUFA PKSシステム由来のOrfCが、スラウストキトリウム23B由来のOrfCと置き換えられる、
請求項1〜３のいずれか一項記載のキメラPUFA PKSシステム。
【請求項７】
スラウストキトリウム23B由来のOrfCが、シゾキトリウムのコドン使用（codon usage）のために最適化された核酸配列によりコードされる、請求項6記載のキメラPUFA PKSシステム。
【請求項８】
核酸配列がSEQ ID NO:70を含む、請求項7記載のキメラPUFA PKSシステム。
【請求項９】
シゾキトリウムPUFA PKSシステム由来のOrfAが、スラウストキトリウム23B由来のOrfAと置き換えられる、請求項6記載のキメラPUFA PKSシステム。
【請求項１０】
スラウストキトリウム23B由来のOrfAが、シゾキトリウムのコドン使用のために最適化された核酸配列によりコードされる、請求項9記載のキメラPUFA PKSシステム。
【請求項１１】
核酸配列がSEQ ID NO:71を含む、請求項10記載のキメラPUFA PKSシステム。
【請求項１２】
シゾキトリウムPUFA PKSシステム由来のOrfBが、スラウストキトリウム23B由来のOrfBと置き換えられる、請求項6記載のキメラPUFA PKSシステム。
【請求項１３】
スラウストキトリウム23B由来のOrfBが、シゾキトリウムのコドン使用のために最適化された核酸配列によりコードされる、請求項12記載のキメラPUFA PKSシステム。
【請求項１４】
核酸配列がSEQ ID NO:72を含む、請求項13記載のキメラPUFA PKSシステム。
【請求項１５】
第一のPUFA PKSシステムがシゾキトリウムPUFA PKSシステムであり、かつ
シゾキトリウムPUFA PKSシステム由来のOrfCのDH2ドメインが、スラウストキトリウム23B由来のDH2ドメインと置き換えられる、
請求項1〜３のいずれか一項記載のキメラPUFA PKSシステム。
【請求項１６】
スラウストキトリウム23B由来のDH2ドメインを含む核酸配列が、SEQ ID NO:73を含む、請求項15記載のキメラPUFA PKSシステム。
【請求項１７】
スラウストキトリウム23B由来のDH2が、シゾキトリウムのコドン使用のために最適化された核酸配列によりコードされる、請求項15記載のキメラPUFA PKSシステム。
【請求項１８】
スラウストキトリウム23B由来のDH2ドメインを含む核酸配列が、SEQ ID NO:75を含む、請求項17記載のキメラPUFA PKSシステム。
【請求項１９】
キメラPUFA PKSシステムが、
(a) SEQ ID NO:74と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質；
(b) SEQ ID NO:74のアミノ酸配列を含むタンパク質；
(c) SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:74；
(d) SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:62；または
(e) SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:74
を含む、請求項1記載のキメラPUFA PKSシステム。
【請求項２０】
キメラPUFA PKSシステムが、
(a) SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:70；
(b) SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:73；
(c) SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:75；または
(d) SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:70
を含む核酸分子によってコードされる、請求項1記載のキメラPUFA PKSシステム。
【請求項２１】
生物において請求項1記載のキメラPUFA PKSシステムを発現させる段階を含む、第一のPUFA PKSシステムにより産生される多価不飽和脂肪酸(PUFA)のω-3 対 ω-6の比率を変化させる方法。
【請求項２２】
キメラPUFA PKSシステムが微生物によって発現される、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
微生物がシゾキトリウムまたは酵母である、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
キメラPUFA PKSシステムが植物によって発現される、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
請求項1、19、または20記載のキメラPUFA PKSシステムを含む、遺伝的に改変された微生物または植物もしくは植物の一部。
【請求項２６】
以下の段階を含む、PUFAの産生を増大させ、かつ第一のPUFA PKSシステムにより産生される多価不飽和脂肪酸(PUFA)のω-3 対 ω-6の比率を変化させる、方法：
キメラPUFA PKSシステムを生物において発現させる段階であって、
第一のPUFA PKSシステムと比べて、ω-3のPUFA 対 ω-6のPUFAの異なる比率をもたらすキメラPUFA PKSシステムを作出するために、第一のPUFA PKSシステム由来のFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ2(DH2)ドメインが、異なる第二のPUFA PKSシステム由来のDH2ドメインと置き換えられ、かつ、
第二のPUFA PKSシステム由来のDH2ドメインが、第一のPUFA PKSシステムが由来する生物のコドン使用のために最適化されている、段階。
【請求項２７】
SEQ ID NO:74と少なくとも95%同一であるキメラOrfCタンパク質をコードする単離核酸分子。
【請求項２８】
SEQ ID NO:73と少なくとも95%同一である核酸配列を含む、請求項27記載の単離核酸分子。
【請求項２９】
核酸配列が、核酸分子を発現させる予定の生物のコドン使用のために最適化される、請求項27記載の単離核酸分子。
【請求項３０】
核酸配列が、キメラタンパク質の一部分が由来する生物のコドン使用のために最適化される、請求項27記載の単離核酸分子。
【請求項３１】
核酸配列が、SEQ ID NO:75と少なくとも95%同一である、請求項27記載の単離核酸分子。
【請求項３２】
請求項27記載の核酸分子を含む組換え核酸分子。
【請求項３３】
請求項27記載の核酸分子でトランスフェクトされている組換え宿主細胞。
【請求項３４】
細胞が微生物または植物細胞である、請求項33記載の組換え宿主細胞。
【請求項３５】
微生物がシゾキトリウム、細菌、または酵母である、請求項34記載の組換え宿主細胞。
【請求項３６】
請求項34記載の植物細胞を含む、遺伝的に改変された植物またはその一部。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
以下の特許出願の各々は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。2007年3月21日付で出願された米国特許出願第11/689,438号; 2004年10月13日付で出願された米国特許出願第10/965,017号、現在米国特許第7,217,856号; 2004年3月26日付で出願された米国特許出願第10/810,352号、現在米国特許第7,211,418号; 2003年3月26日付で出願された米国特許仮出願第60/457,979号; 2002年4月16日付で出願された米国特許出願第10/124,800号; 2001年4月16日付で出願された米国特許仮出願第60/284,066号; 2001年6月15日付で出願された米国特許仮出願第60/298,796号; 2001年9月18日付で出願された米国特許仮出願第60/323,269号; 1999年1月14日付で出願された米国特許出願第09/231,899号、現在米国特許第6,566,583号; 2007年1月29日付で出願された米国特許出願第11/668,333号; 2006年6月12日付で出願された米国特許出願第11/452,096号; 2006年3月21日付で出願された米国特許仮出願第60/784,616号; 2005年6月10日付で出願された米国特許仮出願第60/689,167号; 2006年6月12日付で出願された米国特許出願第11/452,138号; 2006年3月21日付で出願された米国特許仮出願第60/784,616号; 2005年6月10日付で出願された米国特許仮出願第60/689,167号; 1998年6月4日付で出願された米国特許出願第09/090,793号、現在米国特許第6,140,486号。
【０００２】
発明の分野
本発明は、キメラ多価不飽和脂肪酸(PUFA)ポリケチドシンターゼ(PKS)システムに関し、詳細には、シゾキトリウム(Schizochytrium)およびスラウストキトリウム(Thraustochytrium)由来のキメラPUFA PKSシステムに関する。より詳細には、本発明は、このようなPUFA PKSシステムをコードする核酸に関し、これらのPUFA PKSシステムに関し、このようなPUFA PKSシステムを含む遺伝的に改変された生物に関し、ならびに本明細書において開示されるこのようなPUFA PKSシステムを作出および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ポリケチドシンターゼ(PKS)システムは、脂肪酸シンターゼ(FAS)システムと関係のある酵素複合体として当技術分野で一般的に知られているが、これは往々にして、典型的には脂肪酸とほとんど類似性を示さない特化した産物を産生するように高度に改変されている。しかし、現在では、本明細書において互換的にPUFA PKSシステム、PUFAシンターゼシステム、またはPUFA産生のためのPKSシステムとも呼ばれるPKS様のシステムは、アセチル-CoAおよびマロニル-CoAから多価不飽和脂肪酸(PUFA)を合成できる海洋細菌およびある種の真核生物に存在することが示されている。シュワネラ(Shewanella)および別の海洋細菌であるビブリオマリナス(Vibrio marinus)におけるPUFA合成のためのPUFA PKS経路は、米国特許第6,140,486号(特許文献1)に詳細に記述されている。真核生物スラウストキトリド(Thraustochytrid)のシゾキトリウムにおけるPUFA合成のためのPUFA PKS経路は、米国特許第6,566,583号(特許文献2)に詳細に記述されている。シゾキトリウムにおけるPUFA PKSシステムのさらなる記述およびスラウストキトリウムにおけるPUFA PKSシステムの同定を含む、スラウストキトリアレス(Thraustochytriales)のメンバーなどの真核生物におけるPUFA合成のためのPUFA PKS経路は、これらのシステムの使用法に関する詳細を含む、2002年12月19日付で公開された米国特許出願公開第20020194641号(特許文献3)、および2007年4月19日付で公開された米国特許出願公開第20070089199号(特許文献4)に詳細に記述されている。2004年11月25日付で公開された米国特許出願公開第20040235127号(特許文献5)は、スラウストキトリウムにおけるPUFA PKSシステムの詳細な構造的記述、ならびにそのようなシステムを用いたエイコサペンタエン酸(C20:5、ω-3)(EPA)および他のPUFAの生産に関するさらなる詳細を開示している。2005年5月12日付で公開された米国特許出願公開第20050100995号(特許文献6)は、シュワネラオレヤナ(Shewanella olleyana)およびシュワネラジャポニカ(Shewanella japonica)におけるPUFA PKSシステムの構造的および機能的な記述、ならびにそのようなシステムの使用法を開示している。これらの出願はまた、微生物および植物を含む生物の遺伝的改変も、PUFA PKS経路を含む遺伝子ならびにそのような生物によるPUFAの産生とともに開示している。さらに、PCT特許公報番号WO 05/097982(特許文献7)はウルケニア(Ulkenia)におけるPUFA PKSシステムを開示しており、米国特許出願公開第20050014231号(特許文献8)はスラウストキトリウムアウレウム(Thraustochytrium aureum)由来のPUFA PKS遺伝子およびタンパク質を開示している。以上に特定した出願はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００４】
研究者らは、I型(モジュール型または反復型)、II型、およびIII型と通常呼ばれる3つの基本型のうちの1つに分類して、文献に従来より記述されているポリケチドシンターゼ(PKS)システムを活用することを試みている。明確にする目的で、I型モジュールPKSシステムはこれまで単純に「モジュール」PKSシステムとも呼ばれ、I型反復PKSシステムはこれまで単純に「I型」PKSシステムとも呼ばれていたことに留意されたい。II型システムは、各々が個別の酵素反応を行う分離可能なタンパク質によって特徴づけられる。これらの酵素は協調的に働いて最終産物を産生しており、このシステムの各個々の酵素は、通常、最終産物の産生に何度か関与する。この型のシステムは、植物および細菌に見られる脂肪酸シンターゼ(FAS)システムに類似した方法で作動する。I型反復PKSシステムは、最終産物を産生するために酵素が反復様式で使われるという点でII型システムに類似している。I型反復システムは、酵素活性が分離可能なタンパク質に付随する代わり、もっと大きなタンパク質のドメインとして生じるという点でII型とは異なる。このシステムは、動物および真菌に見られるI型FASシステムと類似している。
【０００５】
II型システムとは対照的に、I型モジュールPKSシステムでは、各酵素ドメインは最終産物の産生で1度しか使われない。これらのドメインは非常に大きなタンパク質に見られ、各反応の産物はPKSタンパク質の別のドメイン上に移される。さらに、上記のPKSシステムでは、炭素-炭素二重結合が最終産物に組み入れられる場合、これは通常、トランス配置になる。
【０００６】
III型システムは最近になって発見され、縮合酵素の植物カルコンシンターゼファミリーに属する。III型PKSはI型およびII型PKSシステムとは異なり、反復の縮合反応で遊離アシル-CoA基質を利用して、通常、複素環の最終産物を産生する。
【０００７】
多価不飽和脂肪酸(PUFA)は、栄養学的、薬学的、産業的、およびその他の目的に有用であると考えられている。天然供給源からのおよび化学的合成からの現在のPUFAの供給は、実需には十分でない。現在主要なPUFA供給源は海水魚からであるが、しかし、魚種資源は減少しつつあり、これは持続可能な資源にはなりえない。さらに、重金属と有毒な有機分子の両方からの汚染が、海水魚に由来する油分での深刻な問題である。油料種子作物に由来する植物油は比較的安価であり、魚油に付随する汚染の問題がない。しかしながら、商業的に開発された植物油に見られるPUFAは典型的には、リノール酸(デルタ9および12位中、2個の二重結合を有する18個の炭素-18:2デルタ9,12)およびリノレン酸(18:3 デルタ9,12,15)に限定される。PUFA合成のための従来の経路(すなわち「標準的」経路または「古典的」経路)では、中鎖長の飽和脂肪酸(脂肪酸シンターゼ(FAS)システムの産物)が、一連の伸長反応および不飽和化反応によって修飾される。伸長反応の基質は、脂肪族アシル-CoA (伸長される脂肪酸鎖)およびマロニル-CoA (各伸長反応のたびに付加される2個の炭素の源)である。エロンガーゼ反応の産物は、直鎖状鎖に2つの炭素が付加された脂肪族アシル-CoAである。デサチュラーゼは、酸素依存的反応における2つの水素の引き抜きにより、既存の脂肪酸鎖の中にシス二重結合を作り出す。デサチュラーゼの基質は、リン脂質(例えば、ホスフォチジルコリン)のグリセロール骨格に対してエステル化される、アシル-CoA (ある種の動物において)または脂肪酸である。
【０００８】
それゆえ、リノール酸およびリノレン酸から、より不飽和度が高くかつ長鎖のPUFAを生成させる脂肪酸合成のためには、多数の別個のデサチュラーゼおよびエロンガーゼ酵素が必要であるため、EPAおよびドコサヘキサエン酸(DHA)などのPUFAの発現のために植物宿主細胞を操作するには、合成を達成するために、いくつかの別個の酵素の発現が必要になると思われる。さらに、このようなPUFAの利用可能な量での産生のためには、さらなる操作の取り組みも必要と思われる。このため、商業的な量のPUFAの生産を可能にするために、これらの脂肪酸を天然に産生する種から(例えば、PUFA PKSシステムから) PUFA生合成に関与する遺伝材料を入手すること、および、操作しうる異種のシステムにおいて、単離された材料を単独で、または組み合わせて発現させることは興味深い。
【０００９】
内因的に産生される脂肪酸の改変によって油料種子作物にPUFAを産生させるために多くの取り組みがなされてきた。脂肪酸エロンガーゼおよびデサチュラーゼに対するさまざまな個々の遺伝子を用いたこれらの植物の遺伝的改変により、EPAなどのPUFAを測定可能なレベルで含むものの、より短鎖かつ不飽和度の低い混合性PUFAをも有意なレベルで含む葉または種子が作製されている(Qi et al., Nature Biotech. 22:739 (2004)(非特許文献1); PCT公開番号WO 04/071467(特許文献9); Abbadi et al., Plant Cell 16:1 (2004)(非特許文献2)); Napier and Sayanova, Proceedings of the Nutrition Society (2005), 64:387-393(非特許文献3); Robert et al., Functional Plant Biology (2005) 32:473-479(非特許文献4); または米国特許出願公開第2004/0172682号(特許文献10)。
【００１０】
微生物および植物双方によるPUFA産生の改善は、非常に望ましい商業的目標である。それゆえ、所望のPUFAに富む多量の脂質(例えば、トリアシルグリセロール(TAG)およびリン脂質(PL))を、特に微生物および油料種子植物などの、商業的に有用な生物において効率的かつ効果的に産生させる方法が当技術分野において依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第6,140,486号
【特許文献２】米国特許第6,566,583号
【特許文献３】米国特許出願公開第20020194641号
【特許文献４】米国特許出願公開第20070089199号
【特許文献５】米国特許出願公開第20040235127号
【特許文献６】米国特許出願公開第20050100995号
【特許文献７】WO 05/097982
【特許文献８】米国特許出願公開第20050014231号
【特許文献９】WO 04/071467
【特許文献１０】米国特許出願公開第2004/0172682号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Qi et al., Nature Biotech. 22:739 (2004)
【非特許文献２】Abbadi et al., Plant Cell 16:1 (2004)
【非特許文献３】Napier and Sayanova, Proceedings of the Nutrition Society (2005), 64:387-393
【非特許文献４】Robert et al., Functional Plant Biology (2005) 32:473-479
【発明の概要】
【００１３】
本発明の1つの態様は、第一のPUFA PKSシステムと比べて異なる比率のω-3 対 ω-6のPUFAを産生するキメラPUFA PKSシステムを作出するために、第一のPUFA PKSシステム由来のFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメインが、異なる第二のPUFA PKSシステム由来のDHドメインと置き換えられる、キメラPUFA PKSシステムに関する。1つの局面では、第一のPUFA PKSシステム由来のDHドメインを含むタンパク質が、第二のPUFA PKSシステム由来のDHドメインを含む相同タンパク質と置き換えられる。1つの局面では、第一または第二のPUFA PKSシステム由来のDHドメインは、シゾキトリウムまたはスラウストキトリウム由来のDH2ドメインに相当する。1つの局面では、第一のPUFA PKSシステムはシゾキトリウムPUFA PKSシステムであり、かつ第二のPUFA PKSシステムはスラウストキトリウムPUFA PKSシステムである。1つの局面では、第一のPUFA PKSシステムはシゾキトリウムPUFA PKSシステムであり、かつシゾキトリウムPUFA PKSシステム由来のOrfCが異なるスラウストキトリド由来のOrfCと置き換えられる。
【００１４】
この態様の1つの局面では、第一のPUFA PKSシステムはシゾキトリウムPUFA PKSシステムであり、かつシゾキトリウムPUFA PKSシステム由来のOrfCがスラウストキトリウム23B由来のOrfCと置き換えられる。1つの局面では、そのようなスラウストキトリウム23B由来のOrfCは、シゾキトリウムのコドン使用（codon usage）のために最適化された核酸配列によりコードされる。例示的な核酸配列はSEQ ID NO:70を含む。さらなる局面では、シゾキトリウムPUFA PKSシステム由来のOrfAがスラウストキトリウム23B由来のOrfAと置き換えられる。1つの局面では、そのようなスラウストキトリウム23B由来のOrfAは、シゾキトリウムのコドン使用のために最適化された核酸配列によりコードされる。例示的な核酸配列はSEQ ID NO:71を含む。さらなる局面では、シゾキトリウムPUFA PKSシステム由来のOrfBがスラウストキトリウム23B由来のOrfBと置き換えられる。1つの局面では、そのようなスラウストキトリウム23B由来のOrfBは、シゾキトリウムのコドン使用のために最適化された核酸配列によりコードされる。例示的な核酸配列はSEQ ID NO:72を含む。OrfA、BおよびCの他の組み合わせは、本開示に基づいて当業者には明らかであると思われる。
【００１５】
この態様の別の局面では、第一のPUFA PKSシステムは、シゾキトリウムPUFA PKSシステムであり、シゾキトリウムPUFA PKSシステム由来のOrfCのDH2ドメインがスラウストキトリウム23B由来のDH2ドメインと置き換えられる。1つの局面では、スラウストキトリウム23B由来のDH2ドメインを含む例示的な核酸配列は、SEQ ID NO:73を含む。1つの局面では、スラウストキトリウム23B由来のDH2ドメインは、シゾキトリウムのコドン使用のために最適化された核酸配列によりコードされる。そのような、スラウストキトリウム23B由来のDH2ドメインを含む核酸配列は、SEQ ID NO:75を含む核酸配列によって例示される。
【００１６】
この態様の別の局面において、キメラPUFA PKSシステムは、SEQ ID NO:74と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。1つの局面では、キメラPUFA PKSシステムは、SEQ ID NO:74のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。1つの局面では、キメラPUFA PKSシステムはSEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:74を含む。別の局面では、キメラPUFA PKSシステムはSEQ ID NO:39、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:62を含む。別の局面では、キメラPUFA PKSシステムはSEQ ID NO:39、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:74を含む。別の局面では、キメラPUFA PKSシステムは、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:70を含む核酸分子によってコードされる。別の局面では、キメラPUFA PKSシステムは、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:73を含む核酸分子によってコードされる。別の局面では、キメラPUFA PKSシステムは、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:75を含む核酸分子によってコードされる。別の局面では、キメラPUFA PKSシステムは、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:70を含む核酸分子によってコードされる。
【００１７】
本発明の別の態様は、生物において上記のキメラPUFA PKSシステムのいずれかを発現させる段階を含む、第一のPUFA PKSシステムにより産生される多価不飽和脂肪酸(PUFA)のω-3 対 ω-6の比率を変化させる方法に関する。1つの局面では、キメラPUFA PKSシステムは微生物によって発現される。1つの局面では、微生物はシゾキトリウムである。別の局面では、微生物は酵母である。1つの局面では、キメラPUFA PKSシステムは植物によって発現される。
【００１８】
本発明の別の態様は、上記のキメラPUFA PKSシステムのいずれかを含む、遺伝的に改変された微生物または植物もしくは植物の一部に関する。
【００１９】
本発明の別の態様は、PUFAの産生を増大させる、および第一のPUFA PKSシステムにより産生される多価不飽和脂肪酸(PUFA)のω-3 対 ω-6の比率を変化させる方法に関する。この方法は、第一のPUFA PKSシステムと比べて異なる比率のω-3 対 ω-6のPUFAを産生するキメラPUFA PKSシステムを作出するために、第一のPUFA PKSシステム由来のFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメインが、異なる第二のPUFA PKSシステム由来のDHドメインと置き換えられる、キメラPUFA PKSシステムを生物において発現させる段階を含む。第二のPUFA PKSシステム由来のDHドメインは、第一のPUFA PKSシステムが由来する生物のコドン使用のために最適化される。
【００２０】
本発明の別の態様は、SEQ ID NO:74と少なくとも95%同一であるキメラOrfCタンパク質をコードする単離核酸分子に関する。1つの局面では、単離核酸分子は、SEQ ID NO:73と少なくとも95%同一である核酸配列を含む。1つの局面では、核酸配列は、核酸分子を発現させる予定の生物のコドン使用のために最適化される。一例として、核酸配列は、キメラタンパク質の一部分が由来する生物のコドン使用のために最適化されうる。1つの態様では、核酸配列はSEQ ID NO:75と少なくとも95%同一である。
【００２１】
本発明の別の態様は、上記の核酸分子のいずれかを含む、組換え核酸分子に関する。
【００２２】
本発明の別の態様は、上記の核酸分子のいずれかでトランスフェクトされている組換え宿主細胞に関する。1つの局面では、細胞は微生物である。1つの局面では、微生物はシゾキトリウムである。1つの局面では、微生物は細菌である。1つの局面では、微生物は酵母である。1つの局面では、細胞は植物細胞である。
【００２３】
本発明の別の態様は、上記の組換え宿主細胞のいずれかを含む、遺伝的に改変された植物またはその一部に関する。
【００２４】
本発明の別の態様は、(a) 少なくとも1つのエノイル-ACPレダクターゼ(ER)ドメイン; (b) 少なくとも4つのACPドメイン; (c) 少なくとも2つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン; (d) 少なくとも1つのアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメイン; (e) 少なくとも1つのβ-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR)ドメイン; (f) 少なくとも2つのFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメイン; (g) 少なくとも1つの鎖伸長因子(CLF)ドメイン; および(h) 少なくとも1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)ドメインを含む、キメラPUFA PKSシステムに関する。DHドメインの少なくとも1つは第一のPUFA PKSシステム由来であり、ドメイン(a)〜(h)の残りは、第二の異なるPUFA PKSシステム由来である。
【００２５】
本発明の別の態様は、PUFA PKSシステムを発現する生物によるPUFA産生を増大させる方法に関する。この方法は、PUFA PKSシステムにおける少なくとも1つのタンパク質をコードする核酸分子を、その生物のまたは関連生物の最適化されたコドン使用のために改変する段階を含む。1つの局面では、生物は、異種の組換えPUFA PKSシステムを発現する。1つの局面では、生物はシゾキトリウムであり、内因性PUFA PKSシステムにおける少なくとも1つのタンパク質をコードする核酸分子は、シゾキトリウムのコドン使用のために最適化される。
[請求項1001]
第一のPUFA PKSシステムと比べて異なる比率のω-3 対 ω-6のPUFAを産生するキメラPUFA PKSシステムを作出するために、第一のPUFA PKSシステム由来のFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメインが、異なる第二のPUFA PKSシステム由来のDHドメインと置き換えられる、キメラPUFA PKSシステム。
[請求項1002]
第一のPUFA PKSシステム由来のDHドメインを含むタンパク質が、第二のPUFA PKSシステム由来のDHドメインを含む相同タンパク質と置き換えられる、請求項1001記載のキメラPUFA PKSシステム。
[請求項1003]
第一または第二のPUFA PKSシステム由来のDHドメインが、シゾキトリウム(Schizochytrium)またはスラウストキトリウム(Thraustochytrium)由来のDH2ドメインに相当する、請求項1001記載のキメラPUFA PKSシステム。
[請求項1004]
第一のPUFA PKSシステムがシゾキトリウムPUFA PKSシステムであり、かつ
第二のPUFA PKSシステムがスラウストキトリウムPUFA PKSシステムである、
請求項1001記載のキメラPUFA PKSシステム。
[請求項1005]
第一のPUFA PKSシステムがシゾキトリウムPUFA PKSシステムであり、かつ
シゾキトリウムPUFA PKSシステム由来のOrfCが、異なるスラウストキトリド(Thraustochytrid)由来のOrfCと置き換えられる、
請求項1001記載のキメラPUFA PKSシステム。
[請求項1006]
第一のPUFA PKSシステムがシゾキトリウムPUFA PKSシステムであり、かつ
シゾキトリウムPUFA PKSシステム由来のOrfCが、スラウストキトリウム23B由来のOrfCと置き換えられる、
請求項1001記載のキメラPUFA PKSシステム。
[請求項1007]
スラウストキトリウム23B由来のOrfCが、シゾキトリウムのコドン使用（codon usage）のために最適化された核酸配列によりコードされる、請求項1006記載のキメラPUFA PKSシステム。
[請求項1008]
核酸配列がSEQ ID NO:70を含む、請求項1007記載のキメラPUFA PKSシステム。
[請求項1009]
シゾキトリウムPUFA PKSシステム由来のOrfAが、スラウストキトリウム23B由来のOrfAと置き換えられる、請求項1006記載のキメラPUFA PKSシステム。
[請求項1010]
スラウストキトリウム23B由来のOrfAが、シゾキトリウムのコドン使用のために最適化された核酸配列によりコードされる、請求項1009記載のキメラPUFA PKSシステム。
[請求項1011]
核酸配列がSEQ ID NO:71を含む、請求項1010記載のキメラPUFA PKSシステム。
[請求項1012]
シゾキトリウムPUFA PKSシステム由来のOrfBが、スラウストキトリウム23B由来のOrfBと置き換えられる、請求項1006記載のキメラPUFA PKSシステム。
[請求項1013]
スラウストキトリウム23B由来のOrfBが、シゾキトリウムのコドン使用のために最適化された核酸配列によりコードされる、請求項1012記載のキメラPUFA PKSシステム。
[請求項1014]
核酸配列がSEQ ID NO:72を含む、請求項1013記載のキメラPUFA PKSシステム。
[請求項1015]
第一のPUFA PKSシステムがシゾキトリウムPUFA PKSシステムであり、かつ
シゾキトリウムPUFA PKSシステム由来のOrfCのDH2ドメインが、スラウストキトリウム23B由来のDH2ドメインと置き換えられる、
請求項1001記載のキメラPUFA PKSシステム。
[請求項1016]
スラウストキトリウム23B由来のDH2ドメインを含む核酸配列が、SEQ ID NO:73を含む、請求項1015記載のキメラPUFA PKSシステム。
[請求項1017]
スラウストキトリウム23B由来のDH2が、シゾキトリウムのコドン使用のために最適化された核酸配列によりコードされる、請求項1015記載のキメラPUFA PKSシステム。
[請求項1018]
スラウストキトリウム23B由来のDH2ドメインを含む核酸配列が、SEQ ID NO:75を含む、請求項1017記載のキメラPUFA PKSシステム。
[請求項1019]
キメラPUFA PKSシステムが、SEQ ID NO:74と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質を含む、請求項1001記載のキメラPUFA PKSシステム。
[請求項1020]
キメラPUFA PKSシステムが、SEQ ID NO:74のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む、請求項1001記載のキメラPUFA PKSシステム。
[請求項1021]
キメラPUFA PKSシステムが、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:74を含む、請求項1001記載のキメラPUFA PKSシステム。
[請求項1022]
キメラPUFA PKSシステムが、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:62を含む、請求項1001記載のキメラPUFA PKSシステム。
[請求項1023]
キメラPUFA PKSシステムが、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:74を含む、請求項1001記載のキメラPUFA PKSシステム。
[請求項1024]
キメラPUFA PKSシステムが、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:70を含む核酸分子によってコードされる、請求項1001記載のキメラPUFA PKSシステム。
[請求項1025]
キメラPUFA PKSシステムが、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:73を含む核酸分子によってコードされる、請求項1001記載のキメラPUFA PKSシステム。
[請求項1026]
キメラPUFA PKSシステムが、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:75を含む核酸分子によってコードされる、請求項1001記載のキメラPUFA PKSシステム。
[請求項1027]
キメラPUFA PKSシステムが、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:70を含む核酸分子によってコードされる、請求項1001記載のキメラPUFA PKSシステム。
[請求項1028]
生物において請求項1001記載のキメラPUFA PKSシステムを発現させる段階を含む、第一のPUFA PKSシステムにより産生される多価不飽和脂肪酸(PUFA)のω-3 対 ω-6の比率を変化させる方法。
[請求項1029]
キメラPUFA PKSシステムが微生物によって発現される、請求項1028記載の方法。
[請求項1030]
微生物がシゾキトリウムである、請求項1029記載の方法。
[請求項1031]
微生物が酵母である、請求項1029記載の方法。
[請求項1032]
キメラPUFA PKSシステムが植物によって発現される、請求項1028記載の方法。
[請求項1033]
請求項1001記載のキメラPUFA PKSシステムを含む、遺伝的に改変された微生物または植物もしくは植物の一部。
[請求項1034]
請求項1019記載のキメラPUFA PKSシステムを含む、遺伝的に改変された微生物または植物もしくは植物の一部。
[請求項1035]
請求項1021記載のキメラPUFA PKSシステムを含む、遺伝的に改変された微生物または植物もしくは植物の一部。
[請求項1036]
請求項1022記載のキメラPUFA PKSシステムを含む、遺伝的に改変された微生物または植物もしくは植物の一部。
[請求項1037]
請求項1023記載のキメラPUFA PKSシステムを含む、遺伝的に改変された微生物または植物もしくは植物の一部。
[請求項1038]
請求項1024記載のキメラPUFA PKSシステムを含む、遺伝的に改変された微生物または植物もしくは植物の一部。
[請求項1039]
請求項1025記載のキメラPUFA PKSシステムを含む、遺伝的に改変された微生物または植物もしくは植物の一部。
[請求項1040]
請求項1026記載のキメラPUFA PKSシステムを含む、遺伝的に改変された微生物または植物もしくは植物の一部。
[請求項1041]
請求項1027記載のキメラPUFA PKSシステムを含む、遺伝的に改変された微生物または植物もしくは植物の一部。
[請求項1042]
以下の段階を含む、PUFAの産生を増大させるおよび第一のPUFA PKSシステムにより産生される多価不飽和脂肪酸(PUFA)のω-3 対 ω-6の比率を変化させる方法：
第一のPUFA PKSシステムと比べて異なる比率のω-3 対 ω-6のPUFAを産生するキメラPUFA PKSシステムを作出するために、第一のPUFA PKSシステム由来のFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメインが、異なる第二のPUFA PKSシステム由来のDHドメインと置き換えられ、かつ、
第二のPUFA PKSシステム由来のDHドメインが、第一のPUFA PKSシステムが由来する生物のコドン使用のために最適化されている、
キメラPUFA PKSシステムを生物において発現させる段階。
[請求項1043]
SEQ ID NO:74と少なくとも95%同一であるキメラOrfCタンパク質をコードする単離核酸分子。
[請求項1044]
SEQ ID NO:73と少なくとも95%同一である核酸配列を含む、請求項1043記載の単離核酸分子。
[請求項1045]
核酸配列が、核酸分子を発現させる予定の生物のコドン使用のために最適化される、請求項1043記載の単離核酸分子。
[請求項1046]
核酸配列が、キメラタンパク質の一部分が由来する生物のコドン使用のために最適化される、請求項1043記載の単離核酸分子。
[請求項1047]
核酸配列が、SEQ ID NO:75と少なくとも95%同一である、請求項1043記載の単離核酸分子。
[請求項1048]
請求項1043記載の核酸分子を含む組換え核酸分子。
[請求項1049]
請求項1043記載の核酸分子でトランスフェクトされている組換え宿主細胞。
[請求項1050]
細胞が微生物である、請求項1049記載の組換え宿主細胞。
[請求項1051]
微生物がシゾキトリウムである、請求項1050記載の組換え宿主細胞。
[請求項1052]
微生物が細菌である、請求項1050記載の組換え宿主細胞。
[請求項1053]
微生物が酵母である、請求項1050記載の組換え宿主細胞。
[請求項1054]
細胞が植物細胞である、請求項1049記載の組換え宿主細胞。
[請求項1055]
請求項1054記載の組換え宿主細胞を含む、遺伝的に改変された植物またはその一部。
[請求項1056]
DHドメインの少なくとも1つが第一のPUFA PKSシステム由来であり、かつ、
ドメイン(a)〜(h)の残りが、第二の異なるPUFA PKSシステム由来である、
以下を含むキメラPUFA PKSシステム：
a) 少なくとも1つのエノイル-ACPレダクターゼ(ER)ドメイン;
b) 少なくとも4つのACPドメイン;
c) 少なくとも2つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン;
d) 少なくとも1つのアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメイン;
e) 少なくとも1つのβ-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR)ドメイン;
f) 少なくとも2つのFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメイン;
g) 少なくとも1つの鎖伸長因子(CLF)ドメイン; および
h) 少なくとも1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)ドメイン。
[請求項1057]
PUFA PKSシステムにおける少なくとも1つのタンパク質をコードする核酸分子を、PUFA PKSシステムを発現する生物のまたは関連生物の最適化されたコドン使用のために改変する段階
を含む、該生物によるPUFA産生を増大させる方法。
[請求項1058]
生物が、異種の組換えPUFA PKSシステムを発現する、請求項1057記載の方法。
[請求項1059]
生物がシゾキトリウムであり、かつ
内因性PUFA PKSシステムにおける少なくとも1つのタンパク質をコードする核酸分子が、シゾキトリウムのコドン使用のために最適化される、
請求項1057記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】シゾキトリウムPUFA PKSシステムのドメイン構造の図式表示である。
【図２Ａ】スラウストキトリウム23B由来のOrfCをコードする、シゾキトリウムコドンで最適化された合成核酸配列を含むプラスミド(pThOrfC_synPS)、およびこの過程によって作出される中間体プラスミドの構築の段階1を示す略図である。
【図２Ｂ】スラウストキトリウム23B由来のOrfCをコードする、シゾキトリウムコドンで最適化された合成核酸配列を含むプラスミド(pThOrfC_synPS)、およびこの過程によって作出される中間体プラスミドの構築の段階2を示す略図である。
【図３Ａ】スラウストキトリウム23B由来の天然DH2ドメインを含むシゾキトリウムOrfCをコードするプラスミド(pDS49)、およびこの過程によって作出される中間体プラスミドの構築の段階1〜6を示す略図である。
【図３Ｂ】スラウストキトリウム23B由来の天然DH2ドメインを含むシゾキトリウムOrfCをコードするプラスミド(pDS49)、およびこの過程によって作出される中間体プラスミドの構築の段階7を示す略図である。
【図３Ｃ】スラウストキトリウム23B由来の天然DH2ドメインを含むシゾキトリウムOrfCをコードするプラスミド(pDS49)、およびこの過程によって作出される中間体プラスミドの構築の段階8〜9を示す略図である。
【図４Ａ】スラウストキトリウム23B由来の、シゾキトリウムコドンで最適化された合成DH2ドメインを含むシゾキトリウムOrfCをコードするプラスミド(pDD24)、およびこの過程によって作出される中間体プラスミドの構築における第一工程としてのプラスミドDD21の構築を示す略図である。
【図４Ｂ】スラウストキトリウム23B由来の、シゾキトリウムコドンで最適化された合成DH2ドメインを含むシゾキトリウムOrfCをコードするプラスミド(pDD24)、およびこの過程によって作出される中間体プラスミドの構築における第二工程としてのプラスミドDD22の構築を示す略図である。
【図４Ｃ】スラウストキトリウム23B由来の、シゾキトリウムコドンで最適化された合成DH2ドメインを含むシゾキトリウムOrfCをコードするプラスミド(pDD24)、およびこの過程によって作出される中間体プラスミドの構築における最終工程としてのプラスミドpDD24の構築を示す略図である。
【図５】対照酵母ならびにシゾキトリウムOrfsA、OrfsB、OrfCおよびHet Iを発現する酵母のFAMEプロファイルである。
【図６】標的PUFAの産生を図解するために拡大された、図5からの酵母に対するFAMEプロファイルである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明は全体として、スラウストキトリド(例えば、シゾキトリウムおよびスラウストキトリウム)、ラビリンチュリド(Labyrinthulid)、海洋細菌、ならびに他のPUFA PKS含有生物由来のPUFA PKSシステムを含む、PUFAシンターゼシステムとしても知られる、多価不飽和脂肪酸(PUFA)ポリケチドシンターゼ(PKS)システム、ならびにそれから産生されるキメラPUFA PKSのタンパク質およびシステムに関する。本発明は、そのようなPUFA PKSシステムを含む遺伝的に改変された生物に関し、生物活性分子を含む関心対象の産物の産生のためにそのようなシステムを作出および使用する方法に関する。1つの好ましい態様では、本発明は、本発明のPUFA PKSシステムを発現するように遺伝的に改変されている、微生物においてまたは油料種子植物もしくは植物の部分においてPUFAを産生させる方法に関する。微生物または植物によって産生される油は、PUFA PKSシステムによって産生される少なくとも1つのPUFAを含有し、植物の場合、FASシステムの産物の改変によって産生される脂肪酸産物である、より短鎖かつ不飽和度の低い混合性PUFAを実質的に含まない。本発明は具体的には、PUFA PKSシステムによって産生されるPUFAの量およびPUFAの比率、ならびに本発明の1つの局面では、ω-3 対 ω-6 PUFAの比率または1つのPUFA 対 もう1つのPUFAの比率(例えば、DHA 対 EPAの比率)を変化させる方法を含み、本明細書において詳細に例示および記述されるように、これをいずれかのPUFA PKS構築体および/または遺伝的に改変された生物の作出および使用に適用することができる。
【００２８】
第一に、本発明者らは、本明細書において、複数のPUFAが産生される場合に、PUFA PKSシステムによって産生されるPUFAの比率を変化させるのに必要であり十分でもあるPUFA PKSシステムのドメインについて記述し、この発見を用いた新規のキメラ構築体、新規のキメラPUFA PKSシステム、新規の生物、および改変された量のPUFAを産生させるための新規の方法を提供する。第二に、本発明者らは、本明細書において、生物によるPUFAの産生を増大させるために異種宿主において(または内因性宿主において) PUFA PKSの発現を最適化するための方法、改変、ならびに種々のキメラPUFA PKSシステムおよび構築体について記述する。本発明は、生物におけるPUFAの産生を増強および指令するために、これらの2つの発見を単独でまたはともに使用することに関する詳細な説明を含む。
【００２９】
より詳細には、本発明のある種の態様に関して、本発明者らおよびその仲間らによる先の研究(米国特許出願公開第20050100995号の実施例8を参照のこと)から、スラウストキトリウム23B orfCコード領域(本明細書においてSEQ ID NO:62で表される)がorfCゲノム遺伝子座においてシゾキトリウムorfCコード領域に機能的に取って代わりうることが実証された。これは、シゾキトリウムorfCコード領域の、その代わりに抗生物質耐性カセットを含む正確な欠失(ΔorfC::ZEOで表示)を最初に作出し、DHAに対する絶対的な成長要求性およびゼオシン(商標)耐性を有する菌株(B32-Z1で表示)を生み出すことによって突き止められた。Th.23B orfCコード領域がシゾキトリウムorfC上流と下流の非コード領域との間に正確にクローニングされたプラスミドを、次いで構築した。このTh.23B orfC構築体によるシゾキトリウムΔorfC::ZEO菌株の形質転換は、欠失の補完、および原栄養性(非DHA要求性)のゼオシン感受性形質転換体を生じた。これらの形質転換体は、Th.23B orfCコード領域がシゾキトリウムのものに正確に置き換わるような、orfC遺伝子座での二重交差組換え事象から、すなわち、遺伝子置換から生じたことが分かった。これらの形質転換体の脂肪酸含量の分析から、DHA/DPAの比率が約2.3 (野生型シゾキトリウムATCC20888での)から約8.3 (おおよそTh.23Bのそれ)に変化していたことが示された。この結果により、orfC遺伝子(シゾキトリウムおよびスラウストキトリウムでは、3つのドメインDH1、DH2およびERを含む)は、PUFA産物のn-3/n-6 (ω-3/ω-6)比を決めるうえで主要な役割を果たすことが示唆された。しかしながら、Th.23B orfCを含む菌株における全PUFA産生量は、かなりのものではあるが、野生型シゾキトリウム宿主のそれよりも低かった(約60%)。
【００３０】
これらの2つのorfCコード領域の試験によって、本発明者らは、シゾキトリウムとスラウストキトリウムとの間でコドン使用のパターンが顕著に異なるためにTh.23B遺伝子がシゾキトリウムでは発現されにくいと考えるに至った。本発明者らは、今回、コドン使用がシゾキトリウムのパターンのために最適化された「合成」Th.23B orfCコドン領域(すなわち、合成的に作出されたコドン領域)を用いることにより、DHAの産生は増強される一方で、非合成Th.23B orfCで見られたn-3/n-6比の増大は維持される(実施例1および4参照)ことを発見した。
【００３１】
本発明者らはまた、シゾキトリウムおよびスラウストキトリウムのOrfCタンパク質のなかに同定可能なドメイン: デヒドラターゼ1 (DH1)、デヒドラターゼ2 (DH2)およびエノイルレダクターゼ(ER)が存在することを既述し(例えば、米国特許出願公開第20020194641号、前記; 米国特許出願公開第20040235127号、前記を参照のこと)、OrfC中のドメインの1つまたは複数が、PUFA PKSシステムによって産生される脂肪酸の種類および/または比率の制御に関与しているものと考えられることを教示した。ここで、本発明者らは、シゾキトリウム、大腸菌(E. coli)および酵母のシステムにおいて、DH2ドメインだけがω-3 対 ω-6 (n-3/n-6)の脂肪酸比率に及ぼすPUFA PKSシステムの影響のほとんどまたはすべてに関与していることを実証する。具体的には、本発明者らは最初に、各種スラウストキトリウム23B OrfCドメインを用いてシゾキトリウムOrfC中の対応するドメインに取って代えるという実験を行った(データ不掲載)。本発明者らは、シゾキトリウムOrfC-ERドメインの、スラウストキトリウム由来のそれとの置換は、DHA/DPAの比率を野生型シゾキトリウム(歴史的には、およそ2.3)と比べてあまり変化させないことを見出した。しかしながら、シゾキトリウムDHドメインの両方の、スラウストキトリウム由来のその対応するドメインとの置換は、DHA/DPAの比率を野生型スラウストキトリウム23Bのそれ(歴史的には、およそ8.3〜10)の方へ著しく増大し、シゾキトリウムDH2ドメインだけのスラウストキトリウム23B由来のそれとの置換でも、事実上同じ結果を達成するのに十分であった。実施例2、3、4、5および6は、PUFA PKSシステムにおけるω-3 対 ω-6 (n-3/n-6)の脂肪酸比率に及ぼすDH2ドメインの影響を示す種々の実験結果をもたらす。
【００３２】
本発明者らはまた、宿主生物によるPUFAの産生を増大させるための種々のキメラPUFA PKSシステムの使用について既述し、ある種のキメラPUFA PKSの組み合わせ(例えば、シゾキトリウムおよびスラウストキトリウム由来のOrfの特定の組み合わせで構成されるキメラPUFA PKSシステム)が天然生物よりもまたは他のキメラPUFA PKSシステムよりも有意に高いPUFAの産生、1例を挙げれば、DHAの産生を有するという意外な発見をした。例えば、本発明者らは、スラウストキトリウム23B由来のOrfAおよびOrfCならびにシゾキトリウム由来のOrfBで構成されるキメラPUFA PKSシステムが、シゾキトリウム宿主生物において発現される場合に、天然のシゾキトリウムよりもまたはこれらの2つの生物に由来する他のキメラPUFA PKSシステムよりも有意に多くの脂肪酸を、具体的には有意に多くのDHAを産生することを実証する(実施例8)。したがって、本発明は、いくつかの野生型(非キメラ) PUFAシンターゼと比べて、増大したPUFAの産生および改善したn-3/n-6の比率を有するいくつかの異なるPUFA PKSシステムの作出に関する実質的な指針を提供する。
【００３３】
本明細書において用いられる場合、PUFA PKSシステム(これはPUFAシンターゼシステム、PUFAシンターゼ、またはPUFA産生のためのPKS様のシステムと呼ぶこともできる)は一般に、以下の識別的な特徴を有する。
(1)それはPUFA、特に長鎖PUFAを、システムの天然産物として産生すること;および
(2)それは、選択されたサイクルにおけるトランス-シス異性化およびエノイル還元反応を含む、脂肪酸鎖の反復的処理と非反復的処理との両方を遂行する複合体として構築される複数の多機能性タンパク質を含むこと。
加えて、PUFAシンターゼ酵素に存在するACPドメインは、補因子(4-ホスホパンテテイン)の結合による活性化も必要とする。この補因子の結合は、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)によって行われる。宿主生物の内因性PPTaseがPUFAシンターゼのACPドメインを活性化することができない場合には、その機能を遂行しうるPPTaseを与えることが必要である。本発明者らは、ネンジュモ(Nostoc)種のHet I酵素が、PUFAシンターゼのACPドメインを活性化するための例示的でかつ適切なPPTaseであるとして同定している。PUFA PKSシステムまたはPUFAシンターゼへの言及は、生物においてPUFAを産生するように複合体中で働く遺伝子およびそれらにコードされる産物のすべてをまとめていう。それゆえ、PUFA PKSシステムは具体的には、天然産物がPUFAであるPKSシステムのことをいう。
【００３４】
より具体的には、本明細書において言及されるPUFA PKSシステムは、多価不飽和脂肪酸(PUFA)、特に長鎖PUFAを産物として産生する。例えば、PUFA PKSシステムを内因的に(天然に)含む生物は、このシステムを用いてPUFAを作り出す。本発明によれば、PUFAとは、炭素鎖の長さが少なくとも16個の炭素、より好ましくは少なくとも18個の炭素、より好ましくは少なくとも20個の炭素、より好ましくは22個またはそれ以上の炭素であり、少なくとも3つまたはそれ以上の二重結合、好ましくは4つまたはそれ以上、より好ましくは5つまたはそれ以上、さらにより好ましくは6つまたはそれ以上の二重結合を有し、すべての二重結合がシス配置にある脂肪酸のことである。本明細書における長鎖多価不飽和脂肪酸(LCPUFA)への言及は、より詳細には、炭素鎖の長さが18およびそれ以上、好ましくは炭素鎖の長さが20およびそれ以上であり、3つまたはそれ以上の二重結合を含む脂肪酸のことをいう。ω-6系列のLCPUFAには、以下が含まれる: γ-リノレン酸(C18:3)、ジ-ホモ-γ-リノレン酸(C20:3n-6)、アラキドン酸(C20:4n-6)、アドレン酸(adrenic acid) (ドコサテトラエン酸またはDTAとも呼ばれる) (C22:4n-6)およびドコサペンタエン酸(C22:5n-6)が含まれる。ω-3系列のLCPUFAには以下が含まれる: α-リノレン酸(C18:3)、エイコサトリエン酸(C20:3n-3)、エイコサテトラエン酸(C20:4n-3)、エイコサペンタエン酸(C20:5n-3)、ドコサペンタエン酸(C22:5n-3)およびドコサヘキサエン酸(C22:6n-3)。LCPUFAにはまた、C28:8(n-3)を非限定的に含む、22個を上回る炭素および4つまたはそれ以上の二重結合を有する脂肪酸も含まれうる。
【００３５】
第二に、本発明によるPUFA PKSシステムは、選択されたサイクルにおけるトランス-シス異性化およびエノイル還元反応を含む、脂肪酸鎖の反復的処理と非反復的処理との両方を遂行する複合体として構築される複数の多機能性タンパク質(さらに単機能性タンパク質が、特に海洋細菌由来のPUFA PKSシステムに関して含まれうる)を含む。これらのタンパク質は、本明細書において、コアPUFA PKS酵素複合体またはコアPUFA PKSシステムということもできる。これらのタンパク質の内部に含まれるドメインおよびモチーフの一般的な機能は当技術分野において個々に公知であり、海洋細菌および真核生物由来のさまざまなPUFA PKSシステムに関して詳細に記述されている(例えば、米国特許第6,140,486号; 米国特許第6,566,583号; Metz et al., Science 293:290-293 (2001); 米国特許出願公開第20020194641号; 米国特許出願公開第20040235127号; 米国特許出願公開第20050100995号およびPCT公開第WO 2006/135866号を参照)。これらのドメインは、単一のタンパク質として(すなわち、ドメインおよびタンパク質は同義である)、または上述したように単一のタンパク質の中の2つもしくはそれ以上の(複数の)ドメインの1つとして見いだされる。
【００３６】
海洋細菌におけるPUFA PKSシステムの発見(米国特許第6,140,486号を参照のこと)の前には、PKSシステムが反復性および選択性の酵素反応のこの組合せをもつことは知られておらず、それらは、シス配置で炭素-炭素二重結合を形成することができるとは考えられていなかった。しかしながら、本発明により記述されるPUFA PKSシステムは、シス二重結合を導入する能力、およびサイクルの反応順序を変える能力を有している。
【００３７】
本発明者らは、PUFA PKSシステムのこれらの特徴を用いて、以前に記述された(I型反復もしくはモジュール、II型、またはIII型)PKSシステムによって産生されることができなかった一連の生物活性分子を産生することを提案する。これらの生物活性分子は、限定されるものではないが、多価不飽和脂肪酸(PUFA)、抗生物質または他の生物活性化合物を含み、それらの多くを下記で考察する。例えば、本明細書において記述されるPUFA PKS遺伝子構造の知識を用いて、多数の方法のいずれかを、そのPUFA PKS遺伝子を改変するかまたは他のPKSシステムを含む他の合成システムとこれらの遺伝子の部分を結合して、新規の産物が産生されるように用いる。反復性および選択性の両方の反応を行うこの特定のタイプのシステムに本来備わっている能力は、類似の方法をその他のタイプのPKSシステムに適用したなら見出すことができなかった産物を、このシステムがもたらすことを可能にすると考えられる。
【００３８】
好ましくは、本発明のPUFA PKSシステムは、典型的には3つまたはそれ以上のタンパク質に含まれる、少なくとも以下の生物活性ドメインを含む: (a)少なくとも1個のエノイル-ACPレダクターゼ(ER)ドメイン; (b) 複数のアシルキャリアータンパク質(ACP)ドメイン(例えば、少なくとも1個〜4個の、好ましくは少なくとも5個のACPドメイン、いくつかの態様では最大で6個、7個、8個、9個、10個または10個を上回るACPドメイン); (c) 少なくとも2個のβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン; (d) 少なくとも1個のアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメイン; (e) 少なくとも1個のβ-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR)ドメイン; (f) 少なくとも2個のFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメイン; (g) 少なくとも1個の鎖長因子(CLF)ドメイン; (h) 少なくとも1個のマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)ドメイン。1つの態様では、本発明によるPUFA PKSシステムはまた、デヒドラターゼ(DH)の保存的活性部位モチーフを含む少なくとも1個の領域も含む。
【００３９】
1つの態様では、シゾキトリウムPUFA PKSシステムは、少なくとも以下の生物活性ドメインを含む: (a) 2個のエノイル-ACPレダクターゼ(ER)ドメイン; (b) 4個または5個〜10個またはそれ以上のアシルキャリアータンパク質(ACP)ドメイン、1つの局面では9個のACPドメイン; (c) 2個のβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン; (d) 1個のアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメイン; (e) 1個のβ-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR)ドメイン; (f) 2個のFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメイン; (g) 1個の鎖長因子(CLF)ドメイン; および(h) 1個のマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)ドメイン。1つの態様では、本発明によるシゾキトリウムPUFA PKSシステムはまた、FabA様DHドメインの一部ではない、デヒドラターゼ(DH)の保存的活性部位モチーフを含む少なくとも1個の領域またはドメインも含む。これらのドメインの構造的および機能的な特徴は、当技術分野において個別的に一般に知られており、本発明のPUFA PKSシステムに関して以下で詳細に記述される。
【００４０】
別の好ましい態様では、スラウストキトリウムPUFA PKSシステムは、少なくとも以下の生物活性ドメインを含む: (a) 2個のエノイル-ACPレダクターゼ(ER)ドメイン; (b) 4個または5個〜10個またはそれ以上のアシルキャリアータンパク質(ACP)ドメイン、1つの局面では8個のACPドメイン; (c) 2個のβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン; (d) 1個のアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメイン; (e) 1個のβ-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR)ドメイン; (f) 2個のFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメイン; (g) 1個の鎖長因子(CLF)ドメイン; および(h) 1個のマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)ドメイン。1つの態様では、本発明によるスラウストキトリウムPUFA PKSシステムはまた、FabA様DHドメインの一部ではない、デヒドラターゼ(DH)の保存的活性部位モチーフを含む少なくとも1個の領域またはドメインも含む。これらのドメインの構造的および機能的な特徴は、当技術分野において個別的に一般に知られており、本発明のPUFA PKSシステムに関して以下で詳細に記述される。
【００４１】
PUFA PKSシステムは、1つまたは複数のアクセサリータンパク質をさらに含んでもよく、それらは、上記のコアPUFA PKSシステムの部分ではない(すなわち、PUFAシンターゼ酵素複合体それ自体の部分ではない)と考えられるタンパク質として本明細書において定義されるが、ある種の宿主生物(例えば、植物)ではとりわけ、本発明のコアPUFAシンターゼ酵素複合体を用いたPUFA産生のために、もしくは少なくとも効率的なPUFA産生のために必要でありうる、または必要である。例えば、PUFAを産生するためには、PUFA PKSシステムは、4'-ホスホパンテテイニル部分を補酵素Aからアシルキャリアータンパク質(ACP)ドメインに転移させるアクセサリータンパク質とともに働かなくてはならない。このため、PUFA PKSシステムは、少なくとも1つの4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)ドメインを含むと考えることができ、またはそのようなドメインはPUFA PKSシステムにとってのアクセサリードメインまたはタンパク質であると考えることができる。本発明によるPUFA PKSシステムを発現させるために生物(例えば、微生物または植物)を遺伝的に改変する場合に、ある種の宿主生物は、PUFAを産生するためにPUFA PKSとともに働く必要のあるアクセサリータンパク質(例えば、PPTase)を内因的に発現する可能性がある。しかし、ある種の生物は、生物が同種アクセサリータンパク質をたとえ内因的に産生しても、生物によるPUFAの産生を可能にするおよび/または強化するために、本明細書において記述した1つまたは複数のアクセサリータンパク質をコードする核酸分子によって形質転換することができる(すなわち、ある種の異種アクセサリータンパク質は、宿主細胞の内因性アクセサリータンパク質よりも、形質転換されたPUFAシンターゼタンパク質の方がより効果的または効率的に働く可能性がある)。本発明および先行出願は、アクセサリーPPTaseを含む本発明のPUFA PKSシステムによって遺伝的に改変された細菌および酵母の例を提供する。アクセサリーPPTaseを含む本発明のPUFA PKSシステムによって遺伝的に改変された植物が記述されている(例えば、米国特許出願公開第20070089199号を参照のこと)。PPTaseの構造的および機能的な特徴は、以下でさらに詳細に記述される。
【００４２】
真核生物における長鎖PUFA (LCPUFA)の合成のための「標準的」または「古典的」な経路は、中鎖長の飽和または単不飽和脂肪酸(例えば、上記のFASシステムの産物)の修飾を伴う。これらの修飾は、伸長工程および不飽和化工程からなる。伸長反応の基質は、脂肪族アシル-CoA (伸長される脂肪酸鎖)およびマロニル-CoA (各伸長反応のたびに付加される2個の炭素の源)である。エロンガーゼ反応の産物は、直鎖状鎖に2つの炭素が付加された脂肪族アシル-CoAである。遊離脂肪酸(FFA)は、この反応サイクルにおいて通常は生じない。デサチュラーゼは、酸素依存的反応における2つの水素の引き抜きにより、既存の脂肪酸鎖の中にシス二重結合を作り出す。デサチュラーゼの基質は、PL (例えば、ホスフォチジルコリン)のグリセロール骨格に対してエステル化される、アシル-CoA (ある種の動物において)または脂肪酸である。この場合もやはり、FFAはこの反応機構において生じない。そのため、FFAが「標準的」または「古典的」なLCPUFA合成経路において生じるのは、ある種のFASシステムからの脂肪酸の遊離の間だけである。上記のように、これらは、典型的には、炭素16個または18個の脂肪酸であり、通常は、飽和または単不飽和脂肪酸であり、EPAまたはDHAなどのさらに長鎖のPUFAではない。長鎖PUFAの産生のためのこのスキームの結果の一つは、この経路における中間体が多くの場合に蓄積し、このシステムによって産生される新規の脂肪酸の大部分に当たることが多いということである。
【００４３】
それゆえ、本発明によれば、PUFAの産生のための「標準的」または「古典的」な経路への言及は、中鎖長の飽和脂肪酸(脂肪酸シンターゼ(FAS)システムの産物)が一連の伸長反応および不飽和化反応によって修飾される脂肪酸合成経路のことをいう。伸長反応の基質は脂肪族アシル-CoA (伸長される脂肪酸鎖)およびマロニル-CoA (各伸長反応のたびに付加される2個の炭素の源)である。エロンガーゼ反応の産物は、直鎖状鎖に2つの炭素が付加された脂肪族アシル-CoAである。デサチュラーゼは、酸素依存的反応における2つの水素の引き抜きにより、既存の脂肪酸鎖の中にシス二重結合を作り出す。そのような経路およびそのような経路に関与する遺伝子は文献で周知である。
【００４４】
本明細書において用いられる場合、「脂質」という用語は、リン脂質(PL); 遊離脂肪酸; 脂肪酸エステル; トリアシルグリセロール(TAG); ジアシルグリセリド; モノアシルグリセリド; ホスファチド; ロウ(アルコールと脂肪酸のエステル); ステロールおよびステロールエステル; カロテノイド; キサントフィル(例えば、オキシカロテノイド); 炭化水素; ならびに当業者に公知であるその他の脂質を含む。「多価不飽和脂肪酸」および「PUFA」という用語は、遊離脂肪酸型だけでなく、TAG型およびPL型などの、その他の型も同様に含む。
【００４５】
生物/宿主によるPUFA PKSタンパク質、ドメインまたはシステムの発現に関して、「異種」生物または「異種」宿主への言及は、PUFA PKSシステムの少なくとも1つのタンパク質、ドメインまたは部分が生物によって天然に(内因的に)発現されるタンパク質、ドメインまたは部分ではないことを意味するが、PUFA PKSシステムは、宿主生物によって天然に発現されるタンパク質、ドメインまたはその部分を含むことができる(例えば、宿主生物に由来するおよび異なる生物または異なるタンパク質に由来する配列を含む本明細書において記述のキメラタンパク質)。
【００４６】
さまざまなキメラタンパク質をコードするある種の例示的な核酸分子(構築体)が本明細書において記述される(実施例参照)。本発明によれば「キメラタンパク質」とは、2つまたはそれ以上の完全なまたは部分的な遺伝子または核酸配列をともにスプライシングまたは連結(ライゲーション)することによって産生される核酸配列によりコードされる遺伝子操作タンパク質である。「キメラPUFA PKSシステム」とは、2つまたはそれ以上の異なるPKSシステムからのキメラタンパク質および/またはドメインを含むタンパク質および/またはドメインを含むPUFA PKSシステムである。例えば、実施例では、シゾキトリウムPUFA PKS OrfAおよびOrfBならびにスラウストキトリウムPUFA PKS OrfCで構成されるキメラPUFA PKSシステムについて記述する。実施例ではまた、シゾキトリウムのPUFA PKS OrfA、OrfB、およびDH2ドメインを除くOrfCのすべてで構成され、DH2ドメインがスラウストキトリウムPUFA PKS由来のPUFA PKS DH2ドメインである、キメラPUFA PKSシステムについても記述する。この後者のキメラPUFA PKSシステムは、したがってキメラタンパク質(キメラOrfCタンパク質)を含む。同様のキメラはシゾキトリウムのコドン使用のために最適化されたスラウストキトリウム核酸配列を用いても記述されており、PUFA PKSシステムによって産生される産物を変化させるために使用できる遺伝子操作の組み合わせを例証している(実施例参照)。実施例では種々の他のキメラPUFA PKSシステムについても記述する。
【００４７】
本明細書において用いられる場合、「コドン最適化」またはその派生的な語句は、配列中の1つまたは複数のコドンを、核酸配列を含む核酸分子を発現させる予定の特定生物の核酸配列において最も頻繁に使用されるコドンと置き換えるように所与のタンパク質をコードする核酸配列を修飾する(改変する、変える、突然変異させる)過程をいう。コドンバイアスおよびコドン最適化の概念は、当業者によって理解されている。より詳細には、所与のコドンが遺伝暗号のなかに現れる程度は、生物間で(例えば、属内の種間を含めて)かなり変わることがある。生物が低い確率で使用する、または同一のアミノ酸に対する別のコドンよりも使用されることが少ないどのコドンも、タンパク質の発現に関する問題を引き起こすことがある。したがって、使用されている核酸配列のコドン出現頻度が宿主発現システム/生物のものに(例えば、アミノ酸配列は変化させないで、稀有もしくは稀なまたは使用頻度の低いコドンを、宿主システムの天然のコドンバイアスをさらに厳密に反映する他のコドンと置き換えることによって)適合される場合、タンパク質の発現が劇的に改善することがある。
【００４８】
本発明者らは、本明細書において、核酸配列のコドン使用をシゾキトリウムのもののために最適化する方法について記述するが、これは本発明におけるコドン最適化の使用のほんの一例にすぎない。本発明によれば、所与のタンパク質(例えば、PUFA PKSタンパク質)をコードする核酸分子のヌクレオチド配列を、核酸分子を発現させる予定の宿主細胞または生物の最適な(最適化された)コドン使用のために、または実際には、異なる生物の最適化されたコドン使用のために(例えば、合成、突然変異、組換え技術などにより)改変することができる(例えば、植物における発現のためにスラウストキトリウムPUFA PKSタンパク質をコードする核酸分子を、シゾキトリウムのコドン使用のために最適化することができる)。実施例の表1は、シゾキトリウムのために最適化されたコドン使用を例証している。
【００４９】
さらに、本発明者らは、本明細書において、所与のタンパク質をコードする核酸分子の核酸配列を、核酸配列が導出された、獲得されたまたは得られたのと同じ宿主用に、その宿主における(または別の宿主における)発現のために、最適化することも企図する。本発明のこの後者の態様は、例えば、生物由来のタンパク質(例えば、シゾキトリウム由来のPUFA PKSタンパク質)をコードする核酸分子を(例えば、核酸配列を再合成することにより、およびある種のヌクレオチドを置き換えることにより)改変して、その生物(この例では、シゾキトリウム)が好むコドン使用を増強する(コドン使用を最適化する)、一種の「指向的」または「加速的」進化に当たる。次いでこの核酸分子を、シゾキトリウムにおいて(組換え核酸分子として)または別の宿主細胞もしくは生物において(例えば、植物において)発現させることができる。この態様では、生物由来の所与の核酸配列は、その生物に対して判定されうる最適なコドン(コドンバイアス)を用いなくてもよいことが企図される。したがって、核酸配列を再合成して、その生物におけるタンパク質の発現を改善することもできる。
【００５０】
本発明において有用な、PUFA PKSシステムおよびそれらのタンパク質またはドメインには、細菌性および非細菌性PUFA PKSシステムの両方が含まれる。非細菌性PUFA PKSシステムとは、真核生物または古細菌といった細菌ではない生物由来の、またはそれから派生したPUFA PKSシステムのことである。真核生物は、細胞の分化の程度に基づいて原核生物とは区別され、真核生物の方がより高度に分化している。一般に、原核生物は、核膜を持たず、細胞分裂の間に有糸分裂を示さず、染色体を1つだけ有し、その細胞質中に70Sリボソームを含み、ミトコンドリア、小胞体、葉緑体、リソソームおよびゴルジ体を有さず、存在する場合には単一の細線維で構成される鞭毛を有してもよい。これに対して、真核生物は、核膜を有し、細胞分裂の間に有糸分裂を示し、多くの染色体を有し、その細胞質中に80Sリボソームを含み、ミトコンドリア、小胞体、葉緑体(藻類において)、リソソームおよびゴルジ体を含み、存在する場合には多くの細線維で構成される鞭毛を有してもよい。一般に、細菌は原核生物である一方、藻類、真菌類、原生生物、原生動物および高等植物は真核生物である。本発明によれば、細菌PUFA PKSの機能性ドメインを有する非細菌性PUFA PKSの機能性ドメイン、さらには他のPKSシステム(I型反復またはモジュール、II型またはIII型)またはFASシステム由来のPKS機能性ドメインまたはタンパク質を組み入れた、遺伝的に改変された生物を作出することができる。
【００５１】
本発明によれば、3-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)生物活性(機能)を有するドメインまたはタンパク質は、FAS(およびPKS)伸長反応サイクルの初期段階を行う酵素として特徴づけられる。「β-ケトアシル-ACPシンターゼ」という用語は、「3-ケトアシル-ACPシンターゼ」、「β-ケト・アシル-ACPシンターゼ」および「ケト-アシルACPシンターゼ」という用語、ならびに類似の派生語と同義的に用いることができる。伸長することになっているアシル基は、チオエステル結合によりその酵素の活性部位でのシステイン残基に連結されている。多段階反応において、アシル-酵素は、マロニル-ACPとの縮合を受けて、-ケトアシル-ACP、CO2および遊離の酵素を形成する。KSは、伸長サイクルにおいて鍵となる役割を果たし、多くのシステムにおいて、反応サイクルの他の酵素より強い基質特異性をもっていることが示された。例えば、大腸菌は、3つの別個のKS酵素を有する。それぞれ、その生物の生理機能においてそれ自体特定の役割をもつ(Magnuson et al., Microbiol. Rev. 57, 522 (1993))。本明細書に記述の海洋細菌およびスラウストキトリドで記述されているPUFA-PKSシステムの2つのKSドメインは、一続きのPUFA生合成反応において別個の役割を有する可能性がある。酵素の1つのクラスとして、KSは詳細に特徴づけられている。多くの実証済みのKS遺伝子の配列が公知であり、その活性部位モチーフが同定され、いくつかの結晶構造が決定されている。タンパク質(またはタンパク質のドメイン)は、公知のKS配列との相同性により、酵素のKSファミリーに属すると容易に同定することができる。
【００５２】
本発明によれば、マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)生物活性(機能)を有するドメインまたはタンパク質は、マロニル部分をマロニル-CoAからACPに転移させるものとして特徴づけられる。「マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ」という用語は、「マロニルアシルトランスフェラーゼ」および類似の派生語と同義的に用いることができる。活性部位モチーフ(GxSxG)に加えて、これらの酵素は、それらをMAT酵素と同定させる鍵となる位置に、RおよびQアミノ酸による拡張モチーフを有する(例えば、以下に述べるATドメインとは対照的に)。いくつかのPKSシステム(しかし、PUFA PKSドメインではない)において、MATドメインは、メチル-マロネートまたはエチル-マロネートをACP基に(対応するCoAエステルから)選好的に取り付け、それにより、直鎖状炭素鎖に分枝を導入する。MATドメインは、公知のMAT配列とのそれらの相同性およびそれらの拡張モチーフ構造によって認識されうる。
【００５３】
本発明によれば、アシルキャリアータンパク質(ACP)生物活性(機能)を有するドメインまたはタンパク質は、タンパク質の共有結合した補因子に対するチオエステル結合を介して脂肪アシル鎖を成長させるための担体として機能する、小型ポリペプチド(典型的には、80個〜100個のアミノ酸の長さ)として特徴づけられる。それらは単独の単位として、またはより大きなタンパク質の内部のドメインとして存在する。ACPは、ACPの高度に保存されたセリン残基へのCoAのホスホパンテテイニル部分の転移によって、不活性のアポ型から機能性のホロ型へと変換される。アシル基は、ホスホパンテテイニル部分の遊離末端でのチオエステル結合によってACPに結合される。ACPは、放射性パンテテインによる標識化および公知のACPとの配列相同性によって同定することができる。上述したモチーフ(LGIDS＊)の変形物の存在もACPの特徴的サインである。
【００５４】
本発明によれば、3-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR)生物活性(機能)ともいわれるケトレダクターゼ活性を有するドメインまたはタンパク質は、3-ケトアシル型のACPのピリジン-ヌクレオチド依存的還元を触媒するものとして特徴づけられる。それはデノボ脂肪酸生合成伸長サイクルにおける最初の還元工程であり、ポリケチド生合成においてしばしば行われる反応である。「β-ケトアシル-ACPレダクターゼ」という用語は、「ケトレダクターゼ」、「3-ケトアシル-ACPレダクターゼ」、「ケト-アシルACPレダクターゼ」という用語およびその用語の類似の派生語と同義的に用いることができる。顕著な配列類似性が、エノイルACPレダクターゼ(ER)の1つのファミリー、FASの他のレダクターゼ(しかし、PUFA PKSシステムに存在するERファミリーではない)および短鎖アルコールデヒドロゲナーゼファミリーに観察される。以上に示したPUFA PKS領域のPfam解析により、そのコア領域における短鎖アルコールデヒドロゲナーゼファミリーとの相同性が明らかになっている。同じ領域のBlast解析により、コア領域における公知のKR酵素とのマッチのほか、特徴づけられた他のPUFA PKSシステム由来のドメインとの相同性のある拡張領域が明らかになっている。
【００５５】
本発明によれば、ドメインまたはタンパク質は、以下の根拠に基づいて鎖伸長因子(CLF)といわれる。CLFは当初、II型(解離した酵素) PKSシステムの特徴として記述され、伸長サイクルの数を決定し、それゆえに最終産物の鎖の長さの決定に役割を果たすものと仮定された。CLFアミノ酸配列は、KSドメインと相同性を示す(かつ、KSタンパク質とヘテロ二量体を形成すると考えられる)が、それらは活性部位システインを欠いている。PKSシステムにおけるCLFの役割は議論の的となっている。新たな証拠(C. Bisang et al., Nature 401, 502 (1999))により、PKSシステムのプライミング(伸長させるための最初のアシル基を供給すること)における役割が示唆されている。この役割において、CLFドメインはマロネート(マロニル-ACPのような)からカルボキシル基を除去し、それによりKS活性部位に転移されうる酢酸基を形成すると考えられる。したがって、この酢酸基は、最初の伸長(縮合)反応を受けることのできる「プライミング」分子として作用する。II型CLFの相同体は、いくつかのモジュール式PKSシステムにおいて「ローディング(loading)」ドメインとして同定されている。CLFの配列特徴を有するドメインは、現在同定されているすべてのPUFA PKSシステムに見いだされており、それぞれの場合に多ドメインタンパク質の部分として見いだされる。
【００５６】
「アシルトランスフェラーゼ」または「AT」への言及は、多数の別個のアシル転移反応を行うことができる酵素の一般的なクラスのことをいう。「アシルトランスフェラーゼ」という用語は、「アシル・トランスフェラーゼ」という用語と同義的に用いることができる。本明細書に記述したPUFA PKSシステムで同定されているATドメインは互いに対して、および現在調べられている他のPUFA PKSシステムのすべてに存在するドメインと良好な相同性を示し、特定の機能が同定されているいくつかのアシルトランスフェラーゼ(例えば、マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ、MAT)と非常に弱い相同性を示す。MATと弱い相同性があるにもかかわらず、このATドメインは、それがそのような酵素に特徴的な拡張モチーフ構造を持たないことから、MATとして機能するとは考えられていない(上記のMATドメインの記述を参照)。本開示の目的において、PUFA PKSシステムにおけるATドメインに関して考えられる機能には、以下が非限定的に含まれる: ORFA ACPドメインから水への脂肪族アシル基の転移(すなわち、チオエステラーゼ‐脂肪族アシル基を遊離脂肪酸として放出する)、CoAなどのアクセプターへの脂肪族アシル基の転移、さまざまなACPドメイン間でのアシル基の転移、または親油性アクセプター分子(例えば、リゾホスファチジン酸)への脂肪族アシル基の転移。
【００５７】
本発明によれば、このドメインは、エノイルレダクターゼ(ER)生物活性を有する。ER酵素は、脂肪族アシル-ACPにおけるトランス二重結合(DH活性により導入された)を還元し、結果としてそれらの炭素を完全に飽和させる。PUFA-PKSシステムにおけるそのERドメインは、ER酵素の新たに特徴づけられたファミリーと相同性を示す(Heath et al., Nature 406, 145 (2000))。HeathおよびRockは、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)から関心対象の遺伝子をクローニングし、その遺伝子から発現されたタンパク質を精製して、それがER活性を有することをインビトロアッセイで示すことによって、ER酵素のこの新たなクラスを同定した。現在調べられているPUFA PKSシステムはすべて、肺炎連鎖球菌のERタンパク質と相同性を示すシゾキトリウムERドメインと非常に高い配列相同性を有する、少なくとも1つのドメインを含む。
【００５８】
本発明によれば、デヒドラーゼまたはデヒドラターゼ(DH)活性を有するタンパク質またはドメインは脱水反応を触媒する。本明細書において一般的に用いられる場合、DH活性への言及は、典型的には、FabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)生物活性のことをいう。FabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)生物活性は、β-ケトアシル-ACPからHOHを除去し、炭素鎖にトランス二重結合を最初に生じさせる。「FabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ」という用語は、「FabA様β-ヒドロキシ・アシル-ACPデヒドラーゼ」、「β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ」、「デヒドラーゼ」という用語および類似の派生語と同義的に用いることができる。PUFA PKSシステムのDHドメインは、そのFASシステムと関連する細菌DH酵素に対して(他のPKSシステムのDHドメインに対してよりも)相同性を示す。細菌DHのサブセットであるFabA様DHは、シス-トランスイソメラーゼ活性を有する(Heath et al., J. Biol. Chem., 271, 27795 (1996))。これは、FabA様DHタンパク質に対する相同性であり、本明細書に記述したDHドメインの1つまたはすべてがPUFA PKS産物におけるシス二重結合の挿入の原因となることを示している。
【００５９】
また、本発明の有用なPUFA PKSタンパク質が、本明細書において非FabA様DH活性または非FabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)生物活性と総称される、FabA様(例えば、上記のシス-トランス活性はFabA様活性と関連する)とは特徴づけられないデヒドラターゼ活性を有してもよい。より具体的には、保存的活性部位モチーフ(ほぼ13アミノ酸長: L＊xxHxxxGxxxxP; ＊このモチーフでは、LをIとすることもできる)が、PKSシステムにおけるデヒドラターゼドメインに見いだされる(Donadio S, Katz L. Gene. 1992 Feb 1;111(1):51-60)。本明細書においてデヒドラターゼ(DH)の保存的活性部位モチーフまたはDHモチーフともいわれる、この保存的モチーフは、これまでに記述されているすべての公知のPUFA-PKS配列の類似の領域および本明細書に記述したPUFA PKS配列の中に見いだされるが、このモチーフはごく最近になって発見されたと考えられる。この保存的モチーフは、PUFA-PKS配列中のまだ特徴づけられていない高相同性領域の内部にある。提唱されているPUFA-PKSを介したPUFAの生合成は、非FabA様の脱水を必要とし、このモチーフはその反応に関連している可能性がある。
【００６０】
例証を目的として、ある種のPUFA PKSシステムの構造について、以下に詳細に述べる。しかし、本発明は、これらのPUFA PKSシステムの使用には限定されないことが理解されるべきである。例えば、細菌PUFA PKSシステムの詳細な説明は、米国特許第6,140,486号および米国特許出願公開第20050100995号のなかで見いだすこと可能であり、他のPUFA PKS遺伝子またはシステムの説明は、PCT特許公報番号WO 05/097982および米国特許出願公開第20050014231号のなかで見いだされる。
【００６１】
シゾキトリウムPUFA PKSシステム
シゾキトリウムは、DHAとドコサペンタエン酸(DPA; 22:5 ω-6)とが豊富な、大量のトリアシルグリセロール、例えば乾燥重量で30% DHA + DPAを蓄積するスラウストキトリド海洋微生物である(Barclay et al, J. Appl. Phycol. 6, 123 (1994))。伸長/不飽和化経路により20-炭素および22-炭素PUFAを合成する真核生物において、18-炭素、20-炭素および22-炭素中間体のプールは比較的大きいため、[14C]-アセテートを使用するインビボでの標識化実験により、予想された中間体についての前駆体-産物動力学が明らかにされる(Gellerman et al., Biochim. Biophys. Acta 573:23 (1979))。さらに、そのような生物へ外因的に供給された放射標識化中間体は、最終PUFA産物へ変換される。本発明者らにより、[1-14C]-アセテートがシゾキトリウム細胞により急速に取り込まれて脂肪酸へと組み入れられたが、最短の標識化時間(1分)で、DHAは脂肪酸において回収された標識の31%を含んでおり、この割合は、[14C]-アセテート取り込みの10分〜15分およびその後の培養増殖の24時間の間、本質的に変化しないままであったことが示された(米国特許出願公開第20020194641号、前記を参照のこと)。同様に、DPAは、実験中ずっと標識の10%を示した。16-炭素脂肪酸または18-炭素脂肪酸とその22-炭素多価不飽和脂肪酸との間の前駆体-産物の関係についての証拠はない。これらの結果は、中間体のきわめて少ない(おそらく、酵素結合型の)プールを伴う[14C]-アセテートからのDHAの急速な合成と矛盾しない。
【００６２】
図1は、シゾキトリウムPUFA PKSシステム由来の3つの読み取り枠の図式表示であり、このPUFA PKSシステムのドメイン構造を含む。シゾキトリウムのコアPUFA PKSシステムを形成する読み取り枠は3つ存在する。各読み取り枠のドメイン構造は以下の通りである。
【００６３】
シゾキトリウムの読み取り枠A (OrfA):
OrfAに関する全ヌクレオチド配列は、本明細書にSEQ ID NO:1として表されている。OrfAは、本明細書にSEQ ID NO:2として表されている2910アミノ酸の配列をコードする、8730ヌクレオチドの配列(終止コドンを含めず)である。OrfAの内部には12個のドメインがある: (a) 1個のβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン; (b) 1個のマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)ドメイン; (c) 9個のアシルキャリアータンパク質(ACP)ドメイン; および(d) 1個のケトレダクターゼ(KR)ドメイン。シゾキトリウム種ATCC 20888株、およびシゾキトリウム種N230D株と命名されたATCC 20888株の娘株の両方から、OrfAをコードするゲノムDNAクローン(プラスミド)が単離され、配列決定されている。N230Dは、化学物質(NTG; 1-メチル-3-ニトロ-1-ニトロソグアニジン)により突然変異誘発させたシゾキトリウムATCC 20888を、脂肪酸含量の変化についてスクリーニングしたものから無作為に選択した、1,000を超える生存菌のうちの1つであった。この特定の菌株をそのDHA生産性の改善について評価した。
【００６４】
シゾキトリウム種ATCC 20888株から単離された、本明細書においてJK1126として記述されるゲノムクローンは、本発明者らの知る限りでは、SEQ ID NO:1の1〜8730位に及ぶヌクレオチド配列を含み、対応するアミノ酸配列SEQ ID NO:2をコードする。ゲノムクローンpJK1126 (シゾキトリウムATCC 20888株由来の「OrfA」遺伝子を含む大腸菌プラスミドベクターの形態では、pJK1126 OrfAゲノムクローンと命名される)は、American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2006年6月8日に寄託され、ATCCアクセッション番号PTA-7648が割り当てられている。pJK1126 OrfAゲノムクローンのヌクレオチド配列およびこのプラスミドによってコードされるアミノ酸配列は本発明に含まれる。
【００６５】
シゾキトリウム種N230D株から単離された、本明細書においてpJK306 OrfAゲノムクローンおよびpJK320 OrfAゲノムクローンとして記述される2つのゲノムクローンはともに(部分的重複クローン)、本発明者らの知る限りでは、SEQ ID NO:1のヌクレオチド配列を含み、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列をコードする。ゲノムクローンpJK306 (シゾキトリウム種N230D株由来のOrfA遺伝子の5'部分を含む大腸菌プラスミドの形態では、pJK306 OrfAゲノムクローンと命名される(pJK320と2.2kBが重複))は、American Type Culture Collection(ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2006年6月8日に寄託され、ATCCアクセッション番号PTA-7641が割り当てられている。pJK306 OrfAゲノムクローンのヌクレオチド配列およびこのプラスミドによってコードされるアミノ酸配列は本発明に含まれる。ゲノムクローンpJK320 (シゾキトリウム種N230D株由来のOrfA遺伝子の3'部分を含む大腸菌プラスミドの形態では、pJK320 OrfAゲノムクローンと命名される(pJK306と2.2kBが重複))は、American Type Culture Collection(ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2006年6月8日に寄託され、ATCCアクセッション番号PTA-7644が割り当てられている。pJK320 OrfAゲノムクローンのヌクレオチド配列およびこのプラスミドによってコードされるアミノ酸配列は、本発明に含まれる。
【００６６】
OrfAにおける第一のドメインはKSドメインであり、これは本明細書においてORFA-KSともいわれ、ORFA-KSドメインをコードする配列を含むヌクレオチド配列は本明細書にSEQ ID NO:7として表されている(SEQ ID NO:1の1〜1500位)。ORFA-KSドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書にSEQ ID NO:8として表されている(SEQ ID NO:2の1〜500位)。ORFA-KSドメインは活性部位モチーフ: DXAC＊(＊アシル結合部位C215)を含むことを留意されたい。また、シゾキトリウムKS領域の末端にある特徴的モチーフであるGFGGも、SEQ ID NO:2におけるこのドメインに存在し、したがってSEQ ID NO:8に存在する。
【００６７】
OrfAにおける第二のドメインはMATドメインであり、これは本明細書においてORFA-MATともいわれ、ORFA-MATドメインをコードする配列を含むヌクレオチド配列は本明細書にSEQ ID NO:9として表されている(SEQ ID NO:1の1723〜3000位)。ORFA-MATドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書にSEQ ID NO:10として表されている(SEQ ID NO:2の575〜1000位)。MATドメインは、93位にアスパラギン酸を含み、94位にヒスチジンを含む(それぞれSEQ ID NO:2の667位および668位に対応)。ORFA-MATドメインは、本明細書にSEQ ID NO:11として表されている活性部位モチーフ: GHS＊XG (＊アシル結合部位S706)を含むことを留意されたい。
【００６８】
OrfAのドメイン3〜11は9つのタンデムなACPドメインであり、これは本明細書においてORFA-ACPともいわれる(配列における第一のドメインはORFA-ACP1であり、第二のドメインはORFA-ACP2であり、第三のドメインはORFA-ACP3であり、以下も同様)。第一のACPドメインであるORFA-ACP1は、SEQ ID NO:1 (OrfA)の約3343位から約3600位に及ぶヌクレオチド配列の内部に含まれる。ORFA-ACP1ドメインをコードする配列を含むヌクレオチド配列は、本明細書にSEQ ID NO:12として表されている(SEQ ID NO:1の3343〜3600位)。第一のACPドメインを含むアミノ酸配列は、SEQ ID NO:2の約1115位〜約1200位に及ぶ。ORFA-ACP1ドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書にSEQ ID NO:13として表されている(SEQ ID NO:2の1115〜1200位)。ORFA-ACP1ドメインは、本明細書ではSEQ ID NO:14によって表されている活性部位モチーフ: LGIDS＊(＊パンテテイン結合モチーフS1157)を含むことを留意されたい。
【００６９】
9つのACPドメインはすべて、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が高度に保存的であり、このため、各ドメインの配列を個別の配列識別子によって本明細書中に表してはいない。しかし、本明細書に開示した情報に基づいて、当業者は、他の8つのACPドメインのそれぞれを含む配列を容易に決定することができる。9つのACPドメインはいずれも、SEQ ID NO:1の約3283位〜約6288位のOrfAの領域に及び、これはSEQ ID NO:2の約1095〜約2096位のアミノ酸位置に対応する。9つのすべてのドメインを含むACP領域全体に関するヌクレオチド配列は、本明細書にSEQ ID NO:16として表されている。SEQ ID NO:16によって表される領域は、個々のACPドメインの間のリンカーセグメントを含む。9つのドメインの反復の間隔は、SEQ ID NO:16のおよそ330ヌクレオチド毎である(隣接する活性部位のセリン間を計測したアミノ酸の実際の数は、104〜116アミノ酸の範囲である)。9つのACPドメインのそれぞれは、パンテテイン結合モチーフLGIDS＊(本明細書ではSEQ ID NO:14によって表されている)を含み、ここでS＊はパンテテイン結合部位セリン(S)である。パンテテイン結合部位セリン(S)は、各ACPドメイン配列の中央近くに位置する。ACPドメイン領域の各末端と各ACPドメインとの間にはプロリン(P)およびアラニン(A)に高度に富んだ領域があり、これはリンカー領域と考えられる。例えば、ACPドメイン1と2との間には、配列:
0005551584.tif 000002
があり、これは本明細書にSEQ ID NO:15として表されている。SEQ ID NO:2のアミノ酸配列に関して、9つのACPドメインのそれぞれについての活性部位セリン残基(すなわち、パンテテイン結合部位)の位置は、以下の通りである: ACP1＝S1157; ACP2＝S1266; ACP3＝S1377; ACP4＝S1488; ACP5＝S1604; ACP6＝S1715; ACP7＝S1819; ACP8＝S1930; およびACP9＝S2034。ACPドメインの平均サイズがリンカーを除いて約85アミノ酸、リンカーを含めて約110アミノ酸であり、活性部位セリンがほぼドメインの中央にあることを考慮して、当業者は、OrfAにおける9つのACPドメインのそれぞれの位置を容易に決定することができる。
【００７０】
OrfAにおけるドメイン12はKRドメインであり、これは本明細書においてORFA-KRともいわれ、ORFA-KRドメインを含む配列を含むヌクレオチド配列は、本明細書にSEQ ID NO:17として表されている(SEQ ID NO:1の6598〜8730位)。ORFA-KRドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書にSEQ ID NO:18として表されている(SEQ ID NO:2の2200〜2910位)。KRドメインの内部には、短鎖アルデヒドデヒドロゲナーゼ(KRはこのファミリーのメンバーである)と相同性を有するコア領域がある。このコア領域は、SEQ ID NO:1の約7198位〜約7500位に及び、SEQ ID NO:2のアミノ酸位置2400〜2500位に対応する。
【００７１】
シゾキトリウムの読み取り枠B (OrfB):
OrfBに関する全ヌクレオチド配列は、本明細書にSEQ ID NO:3として表されている。OrfBは、本明細書にSEQ ID NO:4として表されている2059アミノ酸の配列をコードする、6177ヌクレオチドの配列(終止コドンを含めず)である。OrfBの内部には、4つのドメインがある: (a) 1つの-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン; (b) 1つの鎖長因子(CLF)ドメイン; (c) 1つのアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメイン; および(d) 1つのエノイルACP-レダクターゼ(ER)ドメイン。
【００７２】
シゾキトリウム種ATCC 20888株、およびシゾキトリウム種N230D株と命名されたATCC 20888株の娘株の両方から、OrfBをコードするゲノムDNAクローン(プラスミド)が単離され、配列決定されている。
【００７３】
シゾキトリウム種ATCC 20888株から単離された、本明細書においてpJK1129として記述されるゲノムクローンは、本発明者らの知る限りでは、SEQ ID NO:3のヌクレオチド配列を含み、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列をコードする。ゲノムクローンpJK1129(シゾキトリウムATCC 20888株由来の「OrfB」遺伝子を含む大腸菌プラスミドベクターの形態では、pJK1129 OrfBゲノムクローンと命名される)は、American Type Culture Collection(ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2006年6月8日に寄託されており、ATCCアクセッション番号PTA-7649が割り当てられている。pJK1126 OrfBゲノムクローンのヌクレオチド配列およびこのプラスミドによってコードされるアミノ酸配列は、本発明に含まれる。
【００７４】
シゾキトリウム種N230D株から単離された、本明細書においてpJK324 OrfBゲノムクローンとして記述されるゲノムクローンは、本発明者らの知る限りでは、SEQ ID NO:3のヌクレオチド配列を含み、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列をコードする。ゲノムクローンpJK324 (シゾキトリウム種N230D株由来のOrfB遺伝子配列を含む大腸菌プラスミドの形態では、pJK324 OrfBゲノムクローンと命名される)は、American Type Culture Collection(ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2006年6月8日に寄託されており、ATCCアクセッション番号PTA-7643が割り当てられている。pJK324 OrfBゲノムクローンのヌクレオチド配列およびこのプラスミドによってコードされるアミノ酸配列は、本発明に含まれる。
【００７５】
OrfBにおける第一のドメインはKSドメインであり、これは本明細書においてORFB-KSともいわれ、ORFB-KSドメインをコードする配列を含むヌクレオチド配列は、本明細書にSEQ ID NO:19として表されている(SEQ ID NO:3の1〜1350位)。ORFB-KSドメインを含むアミノ酸配列は本明細書にSEQ ID NO:20として表されている(SEQ ID NO:4の1〜450位)。このKSドメインは、SEQ ID NO:20の371位に(同じくSEQ ID NO:20の371位にも)バリンを含む。ORFB-KSドメインは活性部位モチーフ: DXAC＊(＊アシル結合部位C196)を含むことを留意されたい。また、このKS領域の末端にある特徴的モチーフであるGFGGも、SEQ ID NO:4におけるこのドメインに存在し、したがってSEQ ID NO:20に存在する。
【００７６】
OrfBにおける第二のドメインはCLFドメインであり、これは本明細書においてORFB-CLFともいわれ、ORFB-CLFドメインをコードする配列を含むヌクレオチド配列は本明細書にSEQ ID NO:21として表されている(SEQ ID NO:3の1378〜2700位)。ORFB-CLFドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書にSEQ ID NO:22として表されている(SEQ ID NO:4の460〜900位)。ORFB-CLFドメインは、アシル結合性システインを伴わないKS活性部位モチーフを含むことを留意されたい。
【００７７】
OrfBにおける第三のドメインはATドメインであり、これは本明細書においてORFB-ATともいわれ、ORFB-ATドメインをコードする配列を含むヌクレオチド配列は、本明細書にSEQ ID NO:23として表されている(SEQ ID NO:3の2701〜4200位)。ORFB-ATドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書にSEQ ID NO:24として表されている(SEQ ID NO:4の901〜1400位)。ORFB-ATドメインは、アシルトランスフェラーゼ(AT)タンパク質に特徴的な活性部位モチーフGxS＊xG (＊アシル結合部位S1140)を含むことを留意されたい。
【００７８】
OrfBにおける第四のドメインはERドメインであり、これは本明細書においてORFB-ERともいわれ、ORFB-ERドメインをコードする配列を含むヌクレオチド配列は、本明細書にSEQ ID NO:25として表されている(SEQ ID NO:3の4648〜6177位)。ORFB-ERドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書にSEQ ID NO:26として表されている(SEQ ID NO:4の1550〜2059位)。
【００７９】
シゾキトリウムの読み取り枠C (OrfC):
OrfCに関する全ヌクレオチド配列は、本明細書にSEQ ID NO:5として表されている。OrfCは、本明細書にSEQ ID NO:6として表されている1502アミノ酸の配列をコードする、4506ヌクレオチドの配列(終止コドンを含めず)である。OrfCの内部には、3つのドメインがある: (a) 2つのFabA様-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメイン; および(b) 1つのエノイルACP-レダクターゼ(ER)ドメイン。
【００８０】
シゾキトリウム種ATCC 20888株、およびシゾキトリウム種N230D株と命名されたATCC 20888株の娘株の両方から、OrfCをコードするゲノムDNAクローン(プラスミド)が、単離され、配列決定されている。
【００８１】
シゾキトリウム種ATCC 20888株から単離された、本明細書においてpJK1131として記述されるゲノムクローンは、本発明者らの知る限りでは、SEQ ID NO:5のヌクレオチド配列を含み、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列をコードする。ゲノムクローンpJK1131 (シゾキトリウムATCC 20888株由来の「OrfC」遺伝子を含む大腸菌プラスミドベクターの形態では、pJK1131 OrfCゲノムクローンと命名される)は、American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2006年6月8日に寄託されており、ATCCアクセッション番号PTA-7650が割り当てられている。pJK1131 OrfCゲノムクローンのヌクレオチド配列およびこのプラスミドによってコードされるアミノ酸配列は、本発明に含まれる。
【００８２】
シゾキトリウム種N230D株から単離された、本明細書においてpBR002 OrfCゲノムクローンとして記述されるゲノムクローンは、本発明者らの知る限りでは、SEQ ID NO:5のヌクレオチド配列を含み、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列をコードする。ゲノムクローンpBR002 (シゾキトリウム種N230D株由来のOrfC遺伝子配列を含む大腸菌プラスミドベクターの形態では、pBR002 OrfCゲノムクローンと命名される)は、American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2006年6月8日に寄託されており、ATCCアクセッション番号PTA-7642が割り当てられている。pBR002 OrfCゲノムクローンのヌクレオチド配列およびこのプラスミドによってコードされるアミノ酸配列は、本発明に含まれる。
【００８３】
OrfCにおける第一のドメインはDHドメインであり、これは本明細書においてORFC-DH1ともいわれる。これは、OrfCにおける2つのDHドメインの1つであり、このためDH1と命名されている。ORFC-DH1ドメインをコードする配列を含むヌクレオチド配列は、本明細書にSEQ ID NO:27として表されている(SEQ ID NO:5の1〜1350位)。ORFC-DH1ドメインを含むアミノ酸配列は本明細書にSEQ ID NO:28として表されている(SEQ ID NO:6の1〜450位)。
【００８４】
OrfCにおける第二のドメインはDHドメインであり、これは本明細書においてORFC-DH2ともいわれる。これはOrfCにおける2つのDHドメインの第二のものであり、このためDH2と命名されている。ORFC-DH2ドメインをコードする配列を含むヌクレオチド配列は、本明細書にSEQ ID NO:29として表されている(SEQ ID NO:5の1351〜2847位)。ORFC-DH2ドメインを含むアミノ酸配列は本明細書にSEQ ID NO:30として表されている(SEQ ID NO:6の451〜949位)。このDHドメインは、SEQ ID NO:30の426〜440位にアミノ酸
0005551584.tif 000003
(SEQ ID NO:6の876〜890位)を含む。
【００８５】
OrfCにおける第三のドメインはERドメインであり、これは本明細書においてORFC-ERともいわれ、ORFC-ERドメインをコードする配列を含むヌクレオチド配列は、本明細書にSEQ ID NO:31として表されている(SEQ ID NO:5の2995〜4506位)。ORFC-ERドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書にSEQ ID NO:32として表されている(SEQ ID NO:6の999〜1502位)。
【００８６】
スラウストキトリウムPUFA PKSシステム
スラウストキトリウム23BのコアPUFA PKSシステムを形成する読み取り枠は、3つ存在する。ドメイン構成は、スラウストキトリウムTh. 23BのOrf Aが8個の隣接ACPドメインを有する一方で、シゾキトリウムのOrf Aが9個の隣接ACPドメインを有することを除いて、シゾキトリウムのドメイン構成と同じである。各読み取り枠のドメイン構造は、以下の通りである。
【００８７】
スラウストキトリウム23Bの読み取り枠A (OrfA):
Th. 23B OrfAに関する全ヌクレオチド配列は、本明細書にSEQ ID NO:38として表されている。Th. 23B OrfAは、本明細書にSEQ ID NO:39として表されている2811アミノ酸の配列をコードする8433ヌクレオチドの配列(終止コドンを含めず)である。SEQ ID NO:38は、Th. 23B OrfAにおける以下のドメインをコードする: (a) 1つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン; (b) 1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)ドメイン; (c) 8つのアシルキャリアータンパク質(ACP)ドメイン; および(d) 1つのβ-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR)ドメイン。
【００８８】
スラウストキトリウム23Bから単離された、本明細書においてTh23BOrfA_pBR812.1およびTh23BOrfA_pBR811 (OrfAゲノムクローン)として記述される2つのゲノムクローンはともに(部分的重複クローン)、本発明者らの知る限りでは、SEQ ID NO:38のヌクレオチド配列を含み、SEQ ID NO:39のアミノ酸配列をコードする。ゲノムクローンTh23BOrfA_pBR812.1 (スラウストキトリウム23B由来のOrfA遺伝子配列を含む大腸菌プラスミドベクターの形態では、Th23BOrfA_pBR812.1ゲノムクローンと命名される)は、American Type Culture Collection(ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2007年3月1日に寄託され、ATCCアクセッション番号PTA-8232が割り当てられている。OrfAゲノムクローンの1つであるTh23BOrfA_pBR812.1のヌクレオチド配列、およびこのプラスミドによってコードされるアミノ酸配列は本発明に含まれる。ゲノムクローンTh23BOrfA_pBR811 (スラウストキトリウム23B由来のOrfA遺伝子配列を含む大腸菌プラスミドベクターの形態では、Th23BOrfA_pBR811ゲノムクローンと命名される)は、American Type Culture Collection(ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2007年3月1日に寄託され、ATCCアクセッション番号PTA-8231が割り当てられている。1つのOrfAゲノムクローンであるTh23BOrfA_pBR811のヌクレオチド配列、およびこのプラスミドによってコードされるアミノ酸配列は本発明に含まれる。
【００８９】
Th. 23B OrfAにおける第一のドメインはKSドメインであり、これは、本明細書においてTh. 23B OrfA-KSともいわれ、本明細書にSEQ ID NO:40として表されている、SEQ ID NO:38の約1位〜約1500位に及ぶヌクレオチド配列の内部に含まれる。Th. 23B KSドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書にSEQ ID NO:41として表されている、SEQ ID NO:39の約1位〜約500位に及ぶ領域である。SEQ ID NO:39のこの領域は、SEQ ID NO:39の1位〜約450位(同じくSEQ ID NO:41の1位〜約450位)に及ぶ、FabB (β-ケトアシル-ACPシンターゼ)に対するPfamマッチを有する。Th. 23B OrfA-KSドメインは活性部位モチーフ: DXAC＊(＊アシル結合部位C207)を含むことを留意されたい。また、Th. 23B KS領域の末端にある特徴的モチーフであるGFGGも、SEQ ID NO:39の453〜456位(同じくSEQ ID NO:41の453〜456位)に存在する。
【００９０】
Th. 23B OrfAにおける第二のドメインはMATドメインであり、これは、本明細書においてTh. 23B OrfA-MATともいわれ、本明細書にSEQ ID NO:42として表されている、SEQ ID NO:38の約1503位〜約3000位に及ぶヌクレオチド配列の内部に含まれる。Th. 23B MATドメインを含む領域は、本明細書でSEQ ID NO:43によって表されている、約501位〜約1000位に及ぶSEQ ID NO:39の領域である。SEQ ID NO:39のこの領域は、SEQ ID NO:39の約580位〜約900位(SEQ ID NO:43の80〜400位)に及ぶ、FabD (マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ)に対するPfamマッチを有する。Th. 23B OrfA-MATドメインは、SEQ ID NO:39の695〜699位によって表されている活性部位モチーフ: GHS＊XG (＊アシル結合部位S697)を含むことを留意されたい。
【００９１】
Th. 23B OrfAのドメイン3〜10は8つのタンデムなACPドメインであり、これは本明細書においてTh. 23B OrfA-ACPともいわれる(配列における第一のドメインはOrfA-ACP1であり、第二のドメインはOrfA-ACP2であり、第三のドメインOrfA-ACP3であり、以下も同様)。第一のTh. 23B ACPドメインであるTh. 23B OrfA-ACP1は、本明細書にSEQ ID NO:44として表されている、SEQ ID NO:38 (OrfA)の約3205位〜約3555位に及ぶヌクレオチド配列の内部に含まれる。第一のTh. 23B ACPドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書でSEQ ID NO:45によって表されている、SEQ ID NO:39の約1069位〜約1185位に及ぶSEQ ID NO:39の領域である。
【００９２】
Th. 23B OrfAにおける8つのACPドメインは、互いに隣接しており、ホスホパンテテイン結合部位モチーフ、LGXDS＊(SEQ ID NO:46によって表されている)の存在によって同定され、ここでS＊はホスホパンテテイン結合部位である。SEQ ID NO:39に関して、8つのS＊部位のそれぞれのアミノ酸位置は、1128 (ACP1)、1244 (ACP2)、1360 (ACP3)、1476 (ACP4)、1592 (ACP5)、1708 (ACP6)、1824 (ACP7)および1940 (ACP8)である。8つのTh. 23B ACPドメインはすべて、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が高度に保存的であり、このため、各ドメインの配列を個別の配列識別子によって本明細書中に表してはいない。しかし、本明細書に開示した情報に基づいて、当業者は、SEQ ID NO:38およびSEQ ID NO:39における他の7つのACPドメインのそれぞれを含む配列を容易に決定することができる。
【００９３】
8つのTh. 23B ACPドメインはいずれも、SEQ ID NO:38の約3205位から約5994位までのTh. 23B OrfAの領域に及び、これはSEQ ID NO:39の約1069〜約1998位のアミノ酸位置に対応する。8つのすべてのドメインを含むACP領域全体に関するヌクレオチド配列は、本明細書にSEQ ID NO:47として表されている。SEQ ID NO:47は、本明細書でSEQ ID NO:48によって表されているアミノ酸配列をコードする。SEQ ID NO:48は、個々のACPドメインの間のリンカーセグメントを含む。8つのドメインに関する反復の間隔は、SEQ ID NO:48のおよそ116アミノ酸毎であり、各ドメインは活性部位モチーフ(上記)の中心に位置する約116個のアミノ酸からなると考えることができる。
【００９４】
Th. 23B OrfAにおける最後のドメインはKRドメインであり、これは本明細書においてTh. 23B OrfA-KRともいわれ、本明細書でSEQ ID NO:49によって表されている、SEQ ID NO:38の約6001位〜約8433位に及ぶヌクレオチド配列の内部に位置する。Th. 23B KRドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書でSEQ ID NO:50によって表されている、SEQ ID NO:39の約2001位〜約2811位に及ぶSEQ ID NO:39の領域である。SEQ ID NO:39のこの領域は、SEQ ID NO:39の約2300位〜約2550位(SEQ ID NO:50の300〜550位)に及ぶ、FabG (β-ケトアシル-ACPレダクターゼ)に対するPfamマッチを有する。
【００９５】
スラウストキトリウム23Bの読み取り枠B (OrfB):
Th. 23B OrfBに関する全ヌクレオチド配列は、本明細書にSEQ ID NO:51として表されており、これは本明細書にSEQ ID NO:52として表されている1935アミノ酸の配列をコードする、5805ヌクレオチドの配列(終止コドンを含めず)である。SEQ ID NO:51は、Th. 23B OrfBにおける以下のドメインをコードする: (a) 1つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン; (b) 1つの鎖長因子(CLF)ドメイン; (c) 1つのアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメイン; および(d) 1つのエノイル-ACPレダクターゼ(ER)ドメイン。
【００９６】
スラウストキトリウム23Bから単離された、本明細書においてTh23BOrfB_pBR800 (OrfBゲノムクローン)として記述されるゲノムクローンは、本発明者らの知る限りでは、SEQ ID NO:51のヌクレオチド配列を含み、SEQ ID NO:52のアミノ酸配列をコードする。ゲノムクローンTh23BOrfB_pBR800 (スラウストキトリウム23B由来のOrfB遺伝子配列を含む大腸菌ベクターの形態では、Th23BOrfB_pBR800ゲノムクローンと命名される)は、American Type Culture Collection(ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2007年3月1日に寄託され、ATCCアクセッション番号PTA-8227が割り当てられている。OrfBゲノムクローンであるTh23BOrfB_pBR800のヌクレオチド配列、およびこのプラスミドによってコードされるアミノ酸配列は本発明に含まれる。
【００９７】
Th. 23B OrfBにおける第一のドメインはKSドメインであり、これは、本明細書においてTh. 23B OrfB-KSともいわれ、本明細書にSEQ ID NO:53として表されている、SEQ ID NO:51 (Th. 23B OrfB)の約1位〜約1500位に及ぶヌクレオチド配列の内部に含まれる。Th. 23B KSドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書にSEQ ID NO:54として表されている、SEQ ID NO:52の約1位〜約500位に及ぶSEQ ID NO:52の領域である。SEQ ID NO:52のこの領域は、約1位〜約450位(SEQ ID NO:54の1〜450位)に及ぶ、FabB (β-ケトアシル-ACPシンターゼ)に対するPfamマッチを有する。Th. 23B OrfB-KSドメインは活性部位モチーフ: DXAC＊を含み、ここでC＊はアシル基結合の部位であり、C＊はSEQ ID NO:52の201位にあることを留意されたい。また、KS領域の末端にある特徴的モチーフであるGFGGも、SEQ ID NO:52のアミノ酸434〜437位に存在する。
【００９８】
Th. 23B OrfBにおける第二のドメインはCLFドメインであり、これは、本明細書においてTh. 23B OrfB-CLFともいわれ、本明細書にSEQ ID NO:55として表されている、SEQ ID NO:51 (OrfB)の約1501位〜約3000位に及ぶヌクレオチド配列の内部に含まれる。CLFドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書にSEQ ID NO:56として表されている、SEQ ID NO:52の約501位〜約1000位に及ぶSEQ ID NO:52の領域である。SEQ ID NO:52のこの領域は、約550位〜約910位(SEQ ID NO:56の50〜410位)に及ぶ、FabB (β-ケトアシル-ACPシンターゼ)に対するPfamマッチを有する。CLFはKSタンパク質との相同性を有するが、これはKSタンパク質においてアシル基が結合する活性部位システインを欠いている。
【００９９】
Th. 23B OrfBにおける第三のドメインはATドメインであり、これは、本明細書においてTh. 23B OrfB-ATともいわれ、本明細書にSEQ ID NO:58として表されている、SEQ ID NO:51 (Th. 23B OrfB)の約3001位〜約4500位に及ぶヌクレオチド配列の内部に含まれる。Th. 23B ATドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書にSEQ ID NO:58として表されている、SEQ ID NO:52の約1001位〜約1500位に及ぶSEQ ID NO:52の領域である。SEQ ID NO:52のこの領域は、約1100位〜約1375位(SEQ ID NO:58の100〜375位)に及ぶ、FabD (マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ)に対するPfamマッチを有する。PUFAシンターゼのこのATドメインはMATタンパク質との相同性を有するが、これはMATの拡張モチーフ(鍵となるアルギニンおよびグルタミン残基)を欠いており、マロニル-CoAの転移には関与しないと考えられる。アシルトランスフェラーゼのGXS＊XGモチーフは存在し、ここでS＊はアシル結合の部位であり、SEQ ID NO:52に関しては1123位に位置する。
【０１００】
Th. 23B OrfBにおける第四のドメインはERドメインであり、これは本明細書においてTh. 23B OrfB-ERともいわれ、本明細書にSEQ ID NO:59として表されている、SEQ ID NO:51 (OrfB)の約4501位〜約5805位に及ぶヌクレオチド配列の内部に含まれる。Th. 23B ERドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書にSEQ ID NO:60として表されている、SEQ ID NO:52の約1501位〜約1935位に及ぶSEQ ID NO:52の領域である。SEQ ID NO:52のこの領域は、約1501位〜約1810位(SEQ ID NO:60の1〜310位)に及ぶ、2-ニトロプロパンジオキシゲナーゼに関連したジオキシゲナーゼのファミリーに対するPfamマッチを有する。このドメインがERとして機能することを、肺炎連鎖球菌由来の新たに特徴づけられたER酵素に対する相同性からさらに予測することができる。
【０１０１】
スラウストキトリウム23Bの読み取り枠C (OrfC):
Th. 23B OrfCに関する全ヌクレオチド配列は、本明細書にSEQ ID NO:61として表されており、これは本明細書にSEQ ID NO:62として表されている1470アミノ酸の配列をコードする、4410ヌクレオチドの配列(終止コドンを含めず)である。SEQ ID NO:61は、Th. 23B OrfCにおける以下のドメインをコードする: (a) 両方ともFabAタンパク質(トランス-2-デセノイル-ACPの合成およびこの産物のシス-3-デセノイル-ACPへの可逆的異性化を触媒する酵素)との相同性を有する、2つのFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメイン; および(b) シゾキトリウムOrfBのERドメインに対する高度の相同性を有する、1つのエノイル-ACPレダクターゼ(ER)ドメイン。
【０１０２】
スラウストキトリウム23Bから単離された、本明細書においてTh23BOrfC_pBR709A (OrfCゲノムクローン)として記述されるゲノムクローンは、本発明者らの知る限りでは、SEQ ID NO:61のヌクレオチド配列を含み、SEQ ID NO:62のアミノ酸配列をコードする。ゲノムクローンTh23BOrfC_pBR709A (スラウストキトリウム23B由来のOrfC遺伝子配列を含む大腸菌プラスミドベクターの形態では、Th23BOrfC_pBR709Aゲノムクローンと命名される)は、American Type Culture Collection(ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2007年3月1日に寄託され、ATCCアクセッション番号PTA-8228が割り当てられている。OrfCゲノムクローンであるTh23BOrfC_pBR709Aのヌクレオチド配列、およびこのプラスミドによってコードされるアミノ酸配列は、本発明に含まれる。
【０１０３】
Th. 23B OrfCにおける第一のドメインはDHドメインであり、これは、本明細書においてTh. 23B OrfC-DH1ともいわれ、本明細書にSEQ ID NO:63として表されている、SEQ ID NO:61の約1位〜約1500位(OrfC)に及ぶヌクレオチド配列の内部に含まれる。Th. 23B DH1ドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書にSEQ ID NO:64として表されている、SEQ ID NO:62の約1位〜約500位に及ぶSEQ ID NO:62の領域である。SEQ ID NO:62のこの領域は、上述したように、約275位〜約400位(SEQ ID NO:64の275〜400位)に及ぶ、FabAに対するPfamマッチを有する。
【０１０４】
Th. 23B OrfCにおける第二のドメインもDHドメインであり、これは、本明細書においてTh. 23B OrfC-DH2ともいわれ、本明細書にSEQ ID NO:65として表されている、SEQ ID NO:61 (OrfC)の約1501位〜約3000位に及ぶヌクレオチド配列の内部に含まれる。Th. 23B DH2ドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書にSEQ ID NO:66として表されている、SEQ ID NO:62の約501位〜約1000位に及ぶSEQ ID NO:62の領域である。SEQ ID NO:62のこの領域は、上述したように、約800位〜約925位(SEQ ID NO:66の300〜425位)に及ぶ、FabAに対するPfamマッチを有する。
【０１０５】
Th. 23B OrfCにおける第三のドメインはERドメインであり、これは、本明細書においてTh. 23B OrfC-ERともいわれ、本明細書にSEQ ID NO:67として表されている、SEQ ID NO:61の約3001位〜約4410位(OrfC)に及ぶヌクレオチド配列の内部に含まれる。Th. 23B ERドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書にSEQ ID NO:68として表されている、SEQ ID NO:62の約1001位〜約1470位に及ぶSEQ ID NO:62の領域である。SEQ ID NO:62のこの領域は、上述したように、約1025位〜約1320位(SEQ ID NO:68の25〜320位)に及ぶ、2-ニトロプロパンジオキシゲナーゼに関連したジオキシゲナーゼに対するPfamマッチを有する。このドメインがERとして機能することも、肺炎連鎖球菌由来の新たに特徴づけられたER酵素に対する相同性からさらに予測することができる。
【０１０６】
合成によるコドン最適化構築体
本発明はまた、そのコードされるアミノ酸配列が天然の、野生型の、または供給源のアミノ酸配列に関して変化しない、異種生物(異種宿主)のために最適化されたコドン使用を主に有する、本明細書において記述した核酸配列のいずれかの再合成されたバージョンも含む。最適なコドン使用のために核酸配列を再合成することは、PUFA PKSシステム由来の核酸分子で形質転換される異種宿主でのPUFAの産生を改善するのに有効な方法であることを、本発明者らは発見した。PUFA PKSシステムにおけるすべての核酸分子の再合成は、異種宿主における最適な発現およびPUFAの産生にとって必ずしも必要ではない。実際に、本発明者らは、ごく一部の核酸分子の再合成だけでもPUFAの産生を改善するのに十分であることを見いだした。例えば、シゾキトリウムOrfAおよびBの再合成によって酵母におけるPUFAシンターゼの発現およびPUFAの産生が改善されたが、天然のシゾキトリウムOrfCおよび天然のネンジュモ(Nostoc) HetI PPTaseの使用でも十分であった。さらに、ある異種宿主での使用に向けた構築体のコドン最適化が、異なる異種宿主でのPUFAの産生を改善するのに有用なこともある(例えば、シゾキトリウムでの使用に向けたスラウストキトリウム由来のOrfCコード配列のコドン使用の最適化が、植物などの、別の異種宿主生物でのPUFAの産生を高めるのに有効なこともある)。
【０１０７】
さらに、合成によるコドン最適化構築体の使用は、1つのPUFA PKSシステム由来の(例えば、第一の生物由来の)ドメインまたはタンパク質がもう1つのPUFA PKSシステム(例えば、第二の生物由来の)に導入されるような、キメラPUFA PKS構築体および/またはキメラPUFA PKSシステムの作出においても有用でありうる。そのようなシステムにおいては、(例えば、キメラ構築体および/またはキメラPUFA PKSシステムの使用によって) PUFAプロファイルを操作できるだけでなく、合成によるコドン最適化キメラ構築体の使用によってPUFA産生を改善することもできる。実際に、二つの考え(キメラおよびコドン最適化)の組み合わせにより、PUFAプロファイルおよび/またはPUFA産生に関して相乗的な結果を生み出すことができる。宿主のためにコドン最適化されている配列も、宿主のためにコドン最適化されていないものも含むキメラシステムが本発明に含まれる。
【０１０８】
ある種のコドン最適化配列を例として以下に記述する。他のコドン最適化配列は以下の説明にしたがって当業者には明らかであると思われる。
【０１０９】
sOrfA
sOrfAと命名されたSEQ ID NO:35は、酵母における最適化コドン使用のために再合成された、シゾキトリウム由来OrfAをコードする核酸配列(SEQ ID NO:1)を表す。SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:35は、それぞれSEQ ID NO:2をコードする。
【０１１０】
sOrfB
sOrfBと命名されたSEQ ID NO:36は、酵母における最適化コドン使用のために再合成された、シゾキトリウム由来OrfBをコードする核酸配列(SEQ ID NO:3)を表す。SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:36は、それぞれSEQ ID NO:4をコードする。
【０１１１】
OrfB＊
OrfB＊(pJK962)と命名されたSEQ ID NO:37は、シゾキトリウム由来OrfB (SEQ ID NO:4)をコードする核酸配列を表し、この核酸配列は、植物細胞における使用のためにSEQ ID NO:3 (SEQ ID NO:4をコードするヌクレオチド配列)の一部分の内部に再合成され、以下に記述の、OrfB＊(pJK780)ともいわれる、大腸菌における最適化されたコドン使用のために最初に開発された極めて類似した配列に由来する。OrfB＊はいずれの型(大腸菌用および植物用)も、SacII断片(SEQ ID NO:3における特有の部位)に対するBspHI再合成(SEQ ID NO:3のヌクレオチド4415)を除いて、SEQ ID NO:3と同一である。どちらのバージョン(大腸菌および植物)も、orfBの元のゲノム配列(SEQ ID NO:3)と比較して、遺伝子の開始部付近に他の2つのコドン改変を有する。第一に、第4のコドンであるアルギニン(R)が、ゲノム配列におけるCGGからorfB＊ではCGCに変化している。第二に、第5のコドンであるアスパラギン(N)が、ゲノム配列におけるAATからorfB＊ではAACに変化している。SEQ ID NO:37を作り出すための植物ベクター中へのこの遺伝子のクローニングを容易にするために、大腸菌orfB＊配列中の、遺伝子の開始部から20塩基の箇所にPstI部位(CTGCAG)も人為的に作製した。この変化は、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を変化させなかった。SEQ ID NO:37もSEQ ID NO:3 (ならびに以下のSEQ ID NO:69に記述の、大腸菌用OrfB＊型)もSEQ ID NO:4をコードする。
【０１１２】
OrfB＊(pJK780)と命名されたSEQ ID NO:69は、大腸菌における使用のためにSEQ ID NO:3 (SEQ ID NO:4をコードするヌクレオチド配列)の一部分の内部に再合成された、シゾキトリウム由来OrfB (SEQ ID NO:4)をコードする核酸配列を表す。OrfB＊構築体の配列はいずれの型(大腸菌用および植物用)も上述されている。SEQ ID NO:69およびSEQ ID NO:3は、SEQ ID NO:4をコードする。
【０１１３】
本明細書においてOrfB＊_pJK780として記述されるプラスミドは、本発明者らの知る限りでは、SEQ ID NO:69のヌクレオチド配列を含み、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列をコードする。プラスミドOrfB＊_pJK780 (大腸菌プラスミドベクターの形態では、OrfB＊_pJK780クローンと命名される)は、American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2007年3月1日に寄託されており、ATCCアクセッション番号PTA-8225が割り当てられている。OrfB＊_pJK780のヌクレオチド配列およびこのプラスミドによってコードされるアミノ酸配列は本発明に含まれる。
【０１１４】
pThOrfC-synPS
SEQ ID NO:70は、シゾキトリウムにおける最適化コドン使用のために再合成された、スラウストキトリウム23B OrfCをコードする核酸配列(SEQ ID NO:62をコードするSEQ ID NO:61)を表す。SEQ ID NO:70の2000-6412位は、スラウストキトリウム23B OrfCタンパク質のコード領域(終止コドンを含む)を表す。SEQ ID NO:70の1-1999位および6413-8394位はそれぞれ、上流および下流のシゾキトリウムOrfC配列(非コード領域)を表す。pThOrfC-synPSと命名されたSEQ ID NO:70を含むプラスミドの構築は、実施例1で詳細に記述されている。SEQ ID NO:70およびSEQ ID NO:61はそれぞれSEQ ID NO:62をコードする。pThOrfC-synPSは、シゾキトリウムorfCのコード領域(CDS) (SEQ ID NO;5)を、上記で考察したように再合成されたスラウストキトリウム23B OrfCのコード領域(SEQ ID NO:70)で正確に置き換えるよう設計されている。この構築体で形質転換された生物の作出および使用は、以下でおよび実施例で詳細に記述されている。
【０１１５】
上記でpThOrfC-synPSとして記述されるプラスミドは、本発明者らの知る限りでは、SEQ ID NO:70のヌクレオチド配列を含み、対応するアミノ酸配列SEQ ID NO:62をコードする。プラスミドpThOrfC-synPS (シゾキトリウムまたは他の異種宿主における発現のために最適化された合成による「パーフェクトステッチ(perfect stitch)」のスラウストキトリウム23B PUFA PKS OrfCコドンを含む大腸菌プラスミドベクターの形態では、pThOrfC-synPSと命名される)は、American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2007年3月1日に寄託され、ATCCアクセッション番号PTA-8229が割り当てられている。pThOrfC-synPSのヌクレオチド配列、およびこのプラスミドによってコードされるアミノ酸配列は本発明に含まれる。
【０１１６】
pDD26
SEQ ID NO:71は、シゾキトリウムにおける最適化コドン使用のために再合成された、スラウストキトリウム23B OrfAをコードする核酸配列(SEQ ID NO:39をコードするSEQ ID NO:38)を表す。SEQ ID NO:71の2044-10479位は、スラウストキトリウム23B OrfAタンパク質のコード領域(終止コドンを含む)を表す。SEQ ID NO:71の1-2043位および10480-12495位はそれぞれ、上流および下流のシゾキトリウムOrfA配列(非コード領域)を表す。pDD26と命名されたSEQ ID NO:71を含むプラスミドの構築は、実施例8で詳細に記述されている。SEQ ID NO:71およびSEQ ID NO:38はそれぞれSEQ ID NO:39をコードする。pDD26は、シゾキトリウムorfAのコード領域(CDS) (SEQ ID NO:1)を、上記で考察したように再合成されたスラウストキトリウム23B orfCのコード領域(SEQ ID NO:71)で正確に置き換えるよう設計されている。この構築体で形質転換された生物の作出および使用は、以下でおよび実施例で詳細に記述されている。
【０１１７】
上記でpDD26として記述されるプラスミドは、本発明者らの知る限りでは、SEQ ID NO:71のヌクレオチド配列を含み、対応するアミノ酸配列SEQ ID NO:39をコードする。プラスミドpDD26 (大腸菌プラスミドベクターの形態では、pDD26と命名される)は、American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2007年5月8日に寄託され、ATCCアクセッション番号PTA-8411が割り当てられている。pDD26のヌクレオチド配列、およびこのプラスミドによってコードされるアミノ酸配列は本発明に含まれる。
【０１１８】
pDD32
SEQ ID NO:72は、シゾキトリウムにおける最適化コドン使用のために再合成された、スラウストキトリウム23B OrfBをコードする核酸配列(SEQ ID NO:52をコードするSEQ ID NO:51)を表す。SEQ ID NO:72の1452-7259位は、スラウストキトリウム23B OrfBタンパク質のコード領域(終止コドンを含む)を表す。SEQ ID NO:72の1-1451位および7260-8647位はそれぞれ、上流および下流のシゾキトリウムOrfB配列(非コード領域)を表す。pDD32と命名されたSEQ ID NO:72を含むプラスミドの構築は、実施例8で詳細に記述されている。SEQ ID NO:72およびSEQ ID NO:51はそれぞれSEQ ID NO:52をコードする。pDD32は、シゾキトリウムorfBのコード領域(CDS) (SEQ ID NO:3)を、上記で考察したように再合成されたスラウストキトリウム23B OrfCのコード領域(SEQ ID NO:72)で正確に置き換えるよう設計されている。この構築体で形質転換された生物の作出および使用は、以下でおよび実施例で詳細に記述されている。
【０１１９】
上記でpDD32として記述されるプラスミドは、本発明者らの知る限りでは、SEQ ID NO:72のヌクレオチド配列を含み、対応するアミノ酸配列SEQ ID NO:52をコードする。プラスミドpDD32 (大腸菌プラスミドベクターの形態では、pDD32と命名される)は、American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2007年5月8日に寄託され、ATCCアクセッション番号PTA-8412が割り当てられている。pDD32のヌクレオチド配列、およびこのプラスミドによってコードされるアミノ酸配列は本発明に含まれる。
【０１２０】
キメラPUFA PKS構築体
本発明はまた、キメラPUFA PKSタンパク質を産生するために、本明細書において記述されるものなどの、2つまたはそれ以上の異なるPUFA PKS核酸配列の部分を用いたキメラ構築体も含む。本発明者らは本明細書においていくつかの異なる例のなかで、異なる生物由来のPUFA PKSタンパク質のドメインまたは部分を「混ぜ合わせかつ適合させること」(すなわち、2つまたはそれ以上の異なる生物由来のドメインまたはポリペプチドで構成されるキメラPUFA PKSタンパク質を作出すること)により、天然の(天然に存在する) PUFA PKSシステムと比べて、このようなキメラタンパク質を含むPUFA PKSシステムを発現する生物によって産生されるPUFAのプロファイルを改変できることを実証する。例えば、本発明者らは本明細書において、得られるキメラOrfCタンパク質がシゾキトリウム由来のDH1およびERドメイン、ならびにスラウストキトリウム由来のDH2ドメインを含むように、シゾキトリウムタンパク質のOrfCタンパク質の中にスラウストキトリウムPUFA PKSシステム由来のDH2ドメインを使用することを記述する。このキメラ構築体を1つの構築体におけるコドン最適化された(シゾキトリウムのために)スラウストキトリウムDH2ドメイン、およびもう1つの構築体における天然のスラウストキトリウムDH2ドメインの使用によってさらに改変するが、これらは、本明細書において記述されるさまざまな改変の柔軟性および効果を実証している。
【０１２１】
ある種のキメラ構築体を例として以下に記述する。他のキメラ構築体は、この記述にしたがって当業者には明らかであると思われる。
【０１２２】
pDS49
SEQ ID NO:73は、DH2ドメイン(SEQ ID NO:30)がスラウストキトリウム23B OrfC (SEQ ID NO:62)由来のDH2ドメイン(SEQ ID NO:66を含む配列)と置き換えられた、シゾキトリウムOrfCタンパク質(SEQ ID NO:6)を含むキメラタンパク質をコードする核酸配列を表す。このキメラ構築体において、スラウストキトリウム由来のDH2コード配列は天然の(非コドン最適化)配列である。pDS49と命名されたSEQ ID NO:73を含むプラスミドの構築は、実施例2で詳細に記述されている。pDS49においてSEQ ID NO:73に隣接するシゾキトリウムOrfC上流および下流の非コード配列は、SEQ ID NO:70に関して上述したもの(SEQ ID NO:73には示されていない)と同じものである。SEQ ID NO:73はSEQ ID NO:74のアミノ酸配列をコードする。SEQ ID NO:74を参照して、キメラOrfCポリペプチドは、長さが1493アミノ酸残基である。SEQ ID NO:74のアミノ酸番号516-1041として定義されるDH2領域は、Th.23B OrfCタンパク質のDH2領域、すなわち、SEQ ID NO:66の全部およびSEQ ID NO:62由来のいくつかの隣接するアミノ酸配列を含む、SEQ ID NO:62のアミノ酸番号491-1016のアミノ酸配列からなる。キメラOrfCアミノ酸配列の残部に関して、SEQ ID NO:74の残基番号1-515および1042-1493は、それぞれ、SEQ ID NO:6のシゾキトリウムOrfCの残基番号1-515および1051-1502と同一である。この構築体で形質転換された生物の作出および使用は、以下でおよび実施例で詳細に記述される。
【０１２３】
上記でpDS49として記述されるプラスミドは、本発明者らの知る限りでは、SEQ ID NO:73のヌクレオチド配列を含み、対応するアミノ酸配列SEQ ID NO:74をコードする。プラスミドpDS49 (大腸菌プラスミドベクターの形態では、pDS49と命名される)は、American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2007年3月1日に寄託され、ATCCアクセッション番号PTA-8230が割り当てられている。pDS49のヌクレオチド配列、およびこのプラスミドによってコードされるアミノ酸配列は本発明に含まれる。
【０１２４】
pDD24
SEQ ID NO:75は、DH2ドメイン(SEQ ID NO:30)がスラウストキトリウム23B OrfC (SEQ ID NO:62)由来のDH2ドメイン(SEQ ID NO:66を含む配列)と置き換えられた、シゾキトリウムOrfCタンパク質(SEQ ID NO:6)を含むキメラタンパク質をコードする別の核酸配列を表す。このキメラ構築体において、スラウストキトリウム由来のDH2コード配列はシゾキトリウムで用いるためにコドン最適化された配列である。pDD24と命名されたSEQ ID NO:75を含むプラスミドの構築は、実施例3で詳細に記述されている。pDD24においてSEQ ID NO:75に隣接するシゾキトリウムOrfC上流および下流の非コード配列は、SEQ ID NO:70に関して上述したもの(SEQ ID NO:75には示されていない)と同じものである。SEQ ID NO:75はSEQ ID NO:74のアミノ酸配列をコードする。SEQ ID NO:74は、同様にSEQ ID NO:74をコードするSEQ ID NO:73に関して上記で詳細に記述されている。しかしながら、この構築体において、上記で考察したようにSEQ ID NO:74のアミノ酸番号516-1041をコードするヌクレオチド配列は、プラスミドpThOrfC-synPSに含まれ、かつシゾキトリウムでの遺伝子の発現に好ましいコドンを利用した、スラウストキトリウム.23B OrfCの「合成による遺伝子配列」から得られた(実施例1およびSEQ ID NO:70を参照のこと)。この構築体で形質転換された生物の作出および使用は、以下でおよび実施例で詳細に記述される。
【０１２５】
上記でpDD24として記述されるプラスミドは、本発明者らの知る限りでは、SEQ ID NO:75のヌクレオチド配列を含み、対応するアミノ酸配列SEQ ID NO:74をコードする。プラスミドpDD24 (大腸菌プラスミドベクターの形態では、pDD24と命名される)は、American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2007年3月1日に寄託され、ATCCアクセッション番号PTA-8226が割り当てられている。pDD24のヌクレオチド配列、およびこのプラスミドによってコードされるアミノ酸配列は本発明に含まれる。
【０１２６】
キメラPUFA PKSシステム
上記のコドン最適化およびキメラ構築体の使用に加えて、本発明は、キメラPUFA PKSシステムの産生および使用を含む。キメラPUFA PKSシステムは上記のキメラ構築体の使用を含み、ここで、キメラPUFA PKSタンパク質がPUFA PKSシステムにおいて作出および使用されるが、このようなシステムは、得られるPUFA PKSシステムが2つまたはそれ以上の異なるPUFA PKSシステム由来のタンパク質を含むように、1つまたは複数のPUFA PKSシステム由来の1つまたは複数のタンパク質全体が別のPUFA PKSシステム由来の対応するタンパク質全体に交換されまたは加えられたPUFA PKSシステムも包含する。そのようなシステムは、上記(例えば、キメラタンパク質、および総タンパク質の置換)のように、キメラタンパク質の使用も含むことができる。例えば、上記でpTh23B_synPSとして記述される(シゾキトリウムのコドン使用のために最適化された、スラウストキトリウム23B OrfCコード配列を含む)構築体を、シゾキトリウムPUFA PKSシステムに代入して、天然のシゾキトリウムOrfCコード配列を完全に置き換え、それによってキメラPUFA PKSシステムを作出することができる。別の例として、天然のスラウストキトリウム23B OrfCコード配列(コドン最適化されていない)を、シゾキトリウムPUFA PKSシステムに代入して、天然のシゾキトリウムOrfCコード配列を完全に置き換え、それによって別のキメラPUFA PKSシステムを作出することができる。さらに別の例として、天然のスラウストキトリウム23B OrfAコード配列およびOrfCコード配列(コドン最適化された、またはコドン最適化されていない)を、シゾキトリウムPUFA PKSシステムに代入して、それぞれ天然のスラウストキトリウムOrfAコード配列およびOrfCコード配列を完全に置き換え、それによってさらに別のキメラPUFA PKSシステムを作出することができる。これらのおよび他のキメラPUFA PKSシステムは、以下の実施例において記述される。実施例に含まれるのは、以下で構成されるキメラPUFA PKSシステムを発現するシゾキトリウム宿主である: (1) シゾキトリウム(S) OrfA、SOrfB、およびスラウストキトリウム(Th) OrfC; (2) SOrfA、ThOrfB、およびSOrfC; (3) ThOrfA、SOrfB、およびSOrfC; (4) SOrfA、ThOrfB、およびThOrfC; (5) ThOrfA、SOrfB、およびThOrfC; (6) ThOrfA、ThOrfB、およびSOrfC; ならびに(7) ThOrfA、ThOrfB、およびThOrfC。
【０１２７】
本明細書において提供される考察および例示的な実験に基づき、宿主コドン使用に向けたPUFA PKS核酸分子の選択的再合成により、ならびに/またはPUFAの産生のためのPUFA PKSシステムを内因的に持たない宿主生物においてなど、さまざまな宿主生物においてキメラPUFA PKS構築体および/もしくはキメラPUFA PKSシステムを用いることにより、PUFAの産生を改善するおよび/または改変することが可能になる。
【０１２８】
ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)
本発明によれば、異種宿主におけるPUFA産生および/もしくは蓄積、または内因性宿主におけるPUFA産生および/もしくは蓄積の改善のためのPUFA PKSシステムでは、さまざまなアクセサリータンパク質を用いてもよく、それらは、上記のコアPUFA PKSシステムの部分ではない(すなわち、PUFAシンターゼ酵素複合体それ自体の部分ではない)と考えられるタンパク質として本明細書において定義されるが、本発明のコアPUFAシンターゼ酵素複合体を用いたPUFA産生のために、もしくは少なくとも効率的なPUFA産生のために必要でありうるかまたは必要である。
【０１２９】
PUFAを産生するためには、PUFA PKSシステムは、4'-ホスホパンテテイニル部分を補酵素Aからアシルキャリアータンパク質(ACP)ドメインに転移させるアクセサリータンパク質とともに働かなくてはならない。このため、PUFA PKSシステムは少なくとも1つの4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)ドメインを含むと考えることができるか、またはそのようなドメインはPUFA PKSシステムにとってのアクセサリードメインまたはタンパク質であると考えることができる。PPTaseの構造的および機能的な特徴は、例えば、米国特許出願公開第20020194641号; 米国特許出願公開第20040235127号; および米国特許出願公開第20050100995号に詳細に記述されている。
【０１３０】
本発明によれば、4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase）生物活性(機能）を有するドメインまたはタンパク質は、4'-ホスホパンテテイニル部分を補酵素Aからアシルキャリアータンパク質(ACP)に転移させる酵素として特徴づけられる。ACPの不変セリン残基へのこの転移は、不活性なアポ型をホロ型に活性化する。ポリケチドおよび脂肪酸のいずれの合成においても、ホスホパンテテイン基は、成長中のアシル鎖とチオエステルを形成する。PPTaseは、脂肪酸合成、ポリケチド合成および非リボソーム性ペプチド合成において十分に特徴づけられている酵素のファミリーである。多くのPPTaseの配列が公知であり、結晶構造が決定されている上に(例えば、Reuter K, Mofid MR, Marahiel MA, Ficner R. 「Crystal structure of the surfactin synthetase-activating enzyme sfp: a prototype of the 4'-phosphopantetheinyl transferase superfamily」 EMBO J. 1999 Dec 1;18(23):6823-31)、活性に重要であるアミノ酸残基の突然変異分析も行われている(Mofid MR, Finking R, Essen LO, Marahiel MA. 「Structure-based mutational analysis of the 4'-phosphopantetheinyl transferases Sfp from Bacillus subtilis: carrier protein recognition and reaction mechanism」 Biochemistry. 2004 Apr 13;43(14):4128-36)。PPTaseにおけるこれらの不変かつ高度に保存されたアミノ酸は、上記の両方のシュワネラ菌株由来のpfaE ORFの範囲内に含まれる。
【０１３１】
本明細書に記述したOrfA ACPドメインを基質として認識することが以前に実証されている1つの異種PPTaseは、ネンジュモ種PCC 7120 (以前はアナベナ(Anabaena)種PCC 7120と呼ばれた)のHetIタンパク質である。HetIは、ネンジュモにおいて、その生物の異質細胞に存在する糖-脂質層の構成要素である長鎖ヒドロキシ脂肪酸の合成に関与することが知られている遺伝子クラスター内に存在する(Black and Wolk, 1994, J. Bacteriol. 176, 2282-2292; Campbell et al., 1997, Arch. Microbiol. 167, 251-258)。HetIは、そのクラスター内に存在するタンパク質Hgl EのACPドメインを活性化する可能性が高い。Hgl Eの2つのACPドメインは、シゾキトリウムOrfAに見られるACPドメインに対して高度の配列相同性を有する。SEQ ID NO:34はネンジュモHetIタンパク質のアミノ酸配列を表しており、これは、シゾキトリウムおよびスラウストキトリウム由来のPUFA PKSシステムを含む、本明細書に記述したPUFA PKSシステムとともに用いうる機能性PPTaseである。SEQ ID NO:34はSEQ ID NO:33によってコードされる。HetIの内因性開始コドンは同定されていない(推定されるタンパク質にはメチオニンが全く存在しない)。読み取り枠の5'末端付近に、いくつかの有望な代替的開始コドン(例えば、TTGおよびATT)が存在する。メチオニンコドン(ATG)は配列中に存在しない。しかし、最も5'側の有望な代替的開始コドン(TTG)をメチオニンコドン(ATG、NdeI制限酵素認識部位の一部として)と置き換えるためのPCRを用い、コード配列の3'末端にXhoI部位を導入することでHetI発現構築体の構築を完了したところ、コードされるPPTase (SEQ ID NO:34)は機能的であったことが示されている。
【０１３２】
本明細書に記述したOrfA ACPドメインを基質として認識することが以前に示されているもう1つの異種PPTaseは、枯草菌(Bacillus subtilis)に由来するsfpである。Sfpは、十分に特徴づけられており、広範囲にわたる基質を認識する能力のために広く用いられている。公開されている配列情報(Nakana, et al., 1992, Molecular and General Genetics 232: 313-321)に基づき、コード領域を、規定された上流および下流の隣接DNA配列とともに、pACYC-184クローニングベクター中にクローニングすることにより、sfpに関する発現ベクターがすでに作製されている。この構築体は、大腸菌においてシゾキトリウムOrf A、B＊およびCと共発現されて、適切な条件下で、それらの細胞におけるDHAの蓄積をもたらす能力によって実証されているように、機能性PPTaseをコードする(米国特許出願公開第20040235127号を参照のこと)。
【０１３３】
本発明によるPUFA PKSシステムを発現させるために生物(例えば、微生物または植物)を遺伝的に改変する場合に、ある種の宿主生物は、PUFAを産生するためにPUFA PKSとともに働く必要のあるアクセサリータンパク質(例えば、PPTase)を内因的に発現する可能性がある。しかし、ある種の生物は、生物が同種アクセサリータンパク質をたとえ内因的に産生しても、生物によるPUFAの産生を可能にする、および/または強化するために、本明細書に記述した1つまたは複数のアクセサリータンパク質をコードする核酸分子によって形質転換することができる(すなわち、ある種の異種アクセサリータンパク質は、宿主細胞の内因性アクセサリータンパク質よりも、形質転換されたPUFAシンターゼタンパク質の方がより効果的または効率的に働く可能性がある)。1つの態様では、そのようなアクセサリータンパク質は、アクセサリーPPTaseを含む。
【０１３４】
本発明の1つの態様は、PUFA PKSシステム由来の核酸配列、その相同体、その断片、および/またはそのような核酸配列のいずれかと相補的である核酸配列を含む単離された核酸分子に関する。1つの局面において、本発明は、以下のものからなる群より選択される核酸配列を含む単離された核酸分子に関する: 
(a) SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:62、およびそれらの生物活性断片からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列;
(b)
0005551584.tif 000004
およびそれらの生物活性断片からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列; 
(c) アミノ酸配列が多価不飽和脂肪酸(PUFA)ポリケチドシンターゼ(PKS)システムの少なくとも1つ、2つ、3つもしくはそれ以上のドメインの生物活性を有する、(a)のアミノ酸配列のいずれかの少なくとも500個の連続したアミノ酸と少なくとも約60%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列; 
(d) アミノ酸配列が多価不飽和脂肪酸(PUFA)ポリケチドシンターゼ(PKS)システムの少なくとも1つのドメインの生物活性を有する、(b)のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも約60%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列; または
(e) (a)、(b)、(c)、もしくは(d)の核酸配列と完全に相補的である核酸配列。
さらなる態様では、PUFA PKSドメインのいくつかについての上記の活性部位ドメインまたは他の機能性モチーフをコードする配列を含む核酸配列は、本発明に含まれる。
【０１３５】
本発明の特に好ましい態様は、本明細書に記述のPUFA PKSシステムにおいて有用なキメラタンパク質をコードする単離された核酸分子を含む。本発明は、特有の質を有する新規のPUFA PKSシステムを作出するために、1つのPUFA PKSシステムからのまたは由来の任意のドメインまたはタンパク質を、もう1つのPUFA PKSシステムからのまたは由来のドメインにおいておよび/またはタンパク質とともに使用することを含む。
【０１３６】
例えば、本発明の1つの態様は、DH2ドメインの導入(例えば、1つの態様では、宿主における内因性のDH2ドメインまたは類似のドメインの代用による)によって、システムにより産生されるPUFAの比率、および詳細には、システムにより産生されるω-3 対 ω-6 PUFAの比率を改変する、異なる生物からのタンパク質/ドメインで構成されたPUFA PKSシステムを改変するためにPUFA PKSシステムからのDH2ドメインを使用することに関する。この態様を以下で詳細に記述する。
【０１３７】
いくつかの好ましい核酸分子は、SEQ ID NO:74のアミノ酸配列をコードする核酸配列、およびその生物活性断片、多価不飽和脂肪酸(PUFA)ポリケチドシンターゼ(PKS)システムの少なくとも1つ、2つ、3つもしくはそれ以上のドメインの生物活性を有する、SEQ ID NO:74と少なくとも約60%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列、または上記の核酸配列と完全に相補的である核酸配列を含む。1つの態様では、核酸分子は、SEQ ID NO:73およびSEQ ID NO:75より選択される核酸配列を含む。1つの態様では、核酸分子は、pDS49およびpDD24の群より選択されるプラスミドによってコードされるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。1つの態様では、核酸分子は、キメラOrfCタンパク質をコードするpDS49およびpDD24の群より選択されるプラスミドの核酸配列を含む。
【０１３８】
他の好ましい態様では、核酸配列を発現させる予定の宿主などの、異なる生物のコドン使用のために核酸配列が最適化される、1つのPUFA PKSシステムからのPUFA PKSタンパク質もしくはドメインまたはその相同体をコードする核酸配列を含む核酸分子を含む。そのような核酸配列の例は、本明細書において記述されており、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71およびSEQ ID NO:72、ならびにSEQ ID NO:75によって表される核酸配列を含むが、これらに限定されることはない。任意のPUFA PKSタンパク質またはドメイン、および詳細には、本明細書において記述されるアミノ酸配列のいずれかをコードする、コドン最適化された核酸配列は本発明に含まれる。1つの態様では、そのような核酸分子は、pThOrfC-synPS、pDD26、pDD32またはpDD24の群より選択されるプラスミドによってコードされるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。1つの態様では、核酸分子は、PUFA PKSシステムにおいて有用なタンパク質またはキメラタンパク質をコードするpThOrfC-synPS、pDD26、pDD32またはpDD24より選択されるプラスミドの核酸配列を含む。
【０１３９】
本発明によれば、PUFA PKSシステムの少なくとも1つのドメインの生物活性を有するアミノ酸配列は、シゾキトリウムおよびスラウストキトリウムPUFA PKSシステムによって例示されるように、ならびに前記の、米国特許第6,140,486号、米国特許第6,566,583号、米国特許出願公開第20020194641号、米国特許出願公開第20070089199号、米国特許出願公開第20040235127号、米国特許出願公開第20050100995号、PCT特許公報番号WO 05/097982、または米国特許出願公開第20050014231号において記述されているPUFA PKSシステムのいずれかにおけるタンパク質およびドメインのいずれかの記述の生物活性によってさらに例示されるように、本明細書において詳細に記述されるPUFA PKSシステムの少なくとも1つのドメインの生物活性を有するアミノ酸配列である。
【０１４０】
したがって、本発明の単離された核酸分子は、任意のPUFA PKS読み取り枠の翻訳産物、PUFA PKSドメイン、その生物活性断片、または生物活性を有する天然のPUFA PKS読み取り枠もしくはドメインの任意の相同体をコードすることができる。所与のタンパク質またはドメインの相同体は、1個または数個に限定されないが、少なくとも1個または数個のアミノ酸が欠失(例えば、ペプチドまたは断片のような、タンパク質の切断型)、挿入、反転、置換および/または誘導体化(例えば、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミチン酸化、アミド化および/またはグリコシルホスファチジルイノシトールの付加による)されている点において天然に存在する参照アミノ酸配列(すなわち、参照タンパク質またはドメインの)と異なるアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチドである。PUFA PKSタンパク質またはドメインの好ましい相同体は、以下で詳細に記述される。相同体は、合成によって産生された相同体、所与のタンパク質もしくはドメインの天然に存在する対立遺伝子変異体、またはその参照配列が由来する生物以外の生物からの相同的配列を含みうることを留意されたい。
【０１４１】
一般的に、タンパク質またはドメインの生物活性または生物作用とは、インビボ(すなわち、そのタンパク質の自然生理的環境において)もしくはインビトロ(すなわち、実験室条件下)で測定または観察される、そのタンパク質またはドメインの天然に存在する型に帰するそのタンパク質またはドメインにより示されるかまたは行われる任意の機能をいう。PUFA PKSシステムおよびPUFA PKSシステムを構成している個々のタンパク質/ドメインの生物活性は、本明細書の他の箇所に詳細に記述されている。相同体または模倣体(以下で考察される)においてなど、タンパク質またはドメインの改変は、結果として、その天然に存在するタンパク質もしくはドメインと同じ生物活性を有するタンパク質もしくはドメイン、またはその天然に存在するタンパク質もしくはドメインと比較して減少したもしくは増加した生物活性を有するタンパク質もしくはドメインを生じうる。タンパク質またはドメインの発現の減少または活性の減少を生じる改変は、タンパク質またはドメインの不活化(完全または部分的な)、下方制御、または低下した作用ということができる。同様に、タンパク質またはドメインの発現の増加または活性の増加を生じる改変は、タンパク質またはドメインの増幅、過剰産生、活性化、増強、上方制御または増大した作用ということができる。PUFA PKSシステムの機能性ドメインは、生物機能を行う能力がある(すなわち、生物活性を有する)ドメイン(すなわち、ドメインはタンパク質の部分でありうる)である。
【０１４２】
本発明によれば、単離された核酸分子は、その自然環境から取り出された(すなわち、人的操作に供された)核酸分子であり、その自然環境は、その核酸分子が本来見いだされるゲノムまたは染色体である。したがって「単離された」とは、必ずしも、その核酸分子が精製されたという程度までを反映しているとは限らず、その核酸分子が本来見いだされるゲノム全体または染色体全体をその分子が含んでいないことを示す。単離された核酸分子は遺伝子を含みうる。遺伝子を含む単離された核酸分子は、そのような遺伝子を含む染色体の断片ではなく、むしろ、その遺伝子に関連するコード領域および制御領域を含み、典型的には、同じ染色体上に天然に見いだされる追加的な遺伝子を含まないが、核酸分子のなかには、必ずしもPUFA PKS遺伝子またはシステムの一部ではない、隣接/連結遺伝子を含むものもある。単離された核酸分子はまた、通常ではその特定の核酸配列に本来隣接していない追加的な核酸(すなわち、異種配列)に隣接されている(すなわち、その配列の5'末端および/または3'末端で)特定の核酸配列を含む。単離された核酸分子は、DNA、RNA (例えば、mRNA)、またはDNAもしくはRNAのいずれかの誘導体(例えば、cDNA)を含みうる。「核酸分子」という語句はそもそも物質的な核酸分子をいい、「核酸配列」という語句はそもそも核酸分子上のヌクレオチドの配列をいうが、この2つの語句は、タンパク質もしくはタンパク質のドメインをコードする能力がある核酸分子、または核酸配列については特に、同義的に用いることができる。
【０１４３】
好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、組換えDNA技術(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅、クローニング)または化学的合成を用いて産生される。単離された核酸分子は、天然の対立遺伝子の変異体およびそのような改変が本明細書に記述されるようなPUFA PKSシステム生物活性に望ましい効果を与えるような様式においてヌクレオチドが挿入、欠失、置換、および/または反転された改変核酸分子を含むがこれらに限定されない、天然の核酸分子ならびにその相同体を含む。タンパク質相同体(例えば、核酸相同体によりコードされるタンパク質)は上記で詳細に考察されている。
【０１４４】
核酸分子相同体は、当業者に公知のいくつかの方法を用いて産生されうる(例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989を参照のこと)。例えば、核酸分子は、部位特異的突然変異誘発、突然変異を誘発するための核酸分子の化学的処理、核酸断片の制限酵素切断、核酸断片のライゲーション、核酸配列の選択された領域のPCR増幅および/または突然変異誘発、オリゴヌクレオチド混合物の合成および核酸分子の混合物を「構築する」ための混合群のライゲーション、ならびにそれらの組合せなどの、古典的な突然変異誘発技術および組換えDNA技術を含むがこれらに限定されない、さまざまな技術を用いて改変されうる。核酸分子相同体は、核酸によりコードされるタンパク質の機能のスクリーニングによりおよび/または野生型遺伝子とのハイブリダイゼーションにより、改変された核酸の混合物より選択されうる。
【０１４５】
本発明の核酸分子の最小サイズは、本発明において有用な核酸分子の相補配列と(例えば、中程度、高度または非常に高度なストリンジェンシー条件下で)安定的なハイブリッドを形成しうるプローブもしくはオリゴヌクレオチドプライマーを形成するのに十分なサイズであるか、または本発明によるPUFA PKSシステムの少なくとも1つのドメインの生物活性を有するアミノ酸配列をコードするのに十分なサイズのものである。このため、そのようなタンパク質をコードする核酸分子のサイズは、核酸組成および核酸分子と相補配列との間の相同性の割合または同一性の割合、ならびにハイブリダイゼーション条件それ自体(例えば、温度、塩濃度およびホルムアミド濃度)に依存しうる。オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブとして用いられる核酸分子の最小サイズは、典型的には、核酸分子がGCに富む場合には少なくとも約12〜約15ヌクレオチドの長さであり、それらがATに富む場合には少なくとも約15〜約18塩基の長さである。本発明の核酸分子の最大サイズに関しては、核酸分子が、PUFA PKSシステムのドメインの生物活性断片、PUFA PKSシステムの全体のドメイン、PUFA PKSシステムの読み取り枠(Orf)内のいくつかのドメイン、PUFA PKSシステムの全体のOrf、またはPUFA PKSシステムの複数のOrfをコードするのに十分な配列を含みうるという点で、実用的な限界以外には制限はない。
【０１４６】
本発明の1つの態様では、単離核酸分子は、
0005551584.tif 000005
の群より選択されるアミノ酸配列またはそれらの生物活性断片をコードする核酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。1つの局面では、核酸配列は、
0005551584.tif 000006
より選択される。
【０１４７】
本発明の1つの態様では、任意の上記PUFA PKSアミノ酸配列、ならびにそのような配列の相同体のいずれかを、その所定のアミノ酸配列のC末端および/またはN末端のそれぞれに隣接する、少なくとも1個から最大で約20個までの追加的な異種アミノ酸を伴って作製することができる。その結果生じたタンパク質またはポリペプチドは、所定のアミノ酸配列「から本質的になる」ということができる。本発明によれば、異種アミノ酸とは、所定のアミノ酸配列に隣接することが自然下では見いだされない(すなわち、インビボで天然には見いだされない)アミノ酸の配列、または所定のアミノ酸配列をコードする天然の核酸配列に隣接するヌクレオチドが遺伝子に存在する場合に、仮に天然の配列中のそのようなヌクレオチドが所定のアミノ酸配列の由来である生物に関する標準的なコドン使用を用いて翻訳されたとして、それによってはコードされないと考えられるアミノ酸の配列のことである。同様に、「から本質的になる」という語句は、本明細書で核酸配列に言及して用いられる場合、所定のアミノ酸配列をコードする核酸配列の5'末端および/または3'末端のそれぞれに少なくとも1個から最大で約60個までの追加的な異種ヌクレオチドが隣接しうる、所定のアミノ酸配列をコードする核酸配列のことをいう。異種ヌクレオチドは、それが天然の遺伝子に存在する場合に、所定のアミノ酸配列をコードする核酸配列に隣接することが自然下では見いだされない(すなわち、インビボで天然には見いだされない)。
【０１４８】
本発明はまた、PUFA PKSシステムの少なくとも1つのドメインの生物活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離核酸分子も含む。1つの局面では、そのような核酸配列は、上記のPUFA PKSタンパク質またはドメインのいずれかの相同体をコードし、この相同体は、本明細書において前述のPUFA PKSシステムの少なくとも1つ(または2つ、3つ、4つもしくはそれ以上)のドメインの生物活性を有する。
【０１４９】
本発明の1つの局面では、本発明に含まれるPUFA PKSタンパク質またはドメインの相同体は、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:62またはSEQ ID NO:74より選択されるアミノ酸配列の少なくとも500個の連続したアミノ酸と少なくとも約60%同一であるアミノ酸配列を含み、前記のアミノ酸配列は、PUFA PKSシステムの少なくとも1つのドメインの生物活性を有する。さらなる局面では、相同体のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:62もしくはSEQ ID NO:74のいずれかの、少なくとも約600個の連続したアミノ酸と、およびより好ましくは少なくとも約700個の連続したアミノ酸と、およびより好ましくは少なくとも約800個の連続したアミノ酸と、およびより好ましくは少なくとも約900個の連続したアミノ酸と、およびより好ましくは少なくとも約1000個の連続したアミノ酸と、およびより好ましくは少なくとも約1100個の連続したアミノ酸と、およびより好ましくは少なくとも約1200個の連続したアミノ酸と、およびより好ましくは少なくとも約1300個の連続したアミノ酸と、およびより好ましくは少なくとも約1400個の連続したアミノ酸と、およびより好ましくは少なくとも約1500個の連続したアミノ酸と、またはSEQ ID NO:6、SEQ ID NO:62もしくはSEQ ID NO:74の完全長と少なくとも約60%同一である。さらなる局面では、相同体のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:39もしくはSEQ ID NO:52のいずれかの、少なくとも約1600個の連続したアミノ酸と、およびより好ましくは少なくとも約1700個の連続したアミノ酸と、およびより好ましくは少なくとも約1800個の連続したアミノ酸と、およびより好ましくは少なくとも約1900個の連続したアミノ酸と、およびより好ましくは少なくとも約2000個の連続したアミノ酸と、またはSEQ ID NO:4もしくはSEQ ID NO:52の完全長と少なくとも約60%同一である。さらなる局面では、相同体のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:39の、少なくとも約2100個の連続したアミノ酸と、およびより好ましくは少なくとも約2200個の連続したアミノ酸と、およびより好ましくは少なくとも約2300個の連続したアミノ酸と、およびより好ましくは少なくとも約2400個の連続したアミノ酸と、およびより好ましくは少なくとも約2500個の連続したアミノ酸と、およびより好ましくは少なくとも約2600個の連続したアミノ酸と、およびより好ましくは少なくとも約2700個の連続したアミノ酸と、およびより好ましくは少なくとも約2800個の連続したアミノ酸と、およびさらにより好ましくは完全長と、少なくとも約60%同一である。
【０１５０】
別の局面では、本発明に含まれるPUFA PKSタンパク質またはドメインの相同体は、上記の段落に記述の連続したアミノ酸の長さのいずれかにわたって、上記のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも約65%同一、およびより好ましくは少なくとも約70%同一、およびより好ましくは少なくとも約75%同一、およびより好ましくは少なくとも約80%同一、およびより好ましくは少なくとも約85%同一、およびより好ましくは少なくとも約90%同一、およびより好ましくは少なくとも約95%同一、およびより好ましくは少なくとも約96%同一、およびより好ましくは少なくとも約97%同一、およびより好ましくは少なくとも約98%同一、およびより好ましくは少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、このアミノ酸配列はPUFA PKSシステムの少なくとも1つのドメインの生物活性を有する。
【０１５１】
本発明の1つの局面では、本発明に含まれるPUFA PKSタンパク質またはドメインの相同体は、
0005551584.tif 000007
より選択されるアミノ酸配列またはこのようなアミノ酸配列のいずれかの組み合わせを含むアミノ酸配列と少なくとも約60%同一であるアミノ酸配列を含み、このアミノ酸配列は、PUFA PKSシステムまたはそのアクセサリータンパク質の少なくとも1つのドメインの生物活性を有する。さらなる局面では、相同体のアミノ酸配列は、上記のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも約65%同一、およびより好ましくは少なくとも約70%同一、およびより好ましくは少なくとも約75%同一、およびより好ましくは少なくとも約80%同一、およびより好ましくは少なくとも約85%同一、およびより好ましくは少なくとも約90%同一、およびより好ましくは少なくとも約95%同一、およびより好ましくは少なくとも約96%同一、およびより好ましくは少なくとも約97%同一、およびより好ましくは少なくとも約98%同一、およびより好ましくは少なくとも約99%同一であり、このアミノ酸配列は、PUFA PKSシステムまたはそのアクセサリータンパク質の少なくとも1つのドメインの生物活性を有する。
【０１５２】
本発明によれば、本明細書に記述した核酸またはアミノ酸配列に関する「隣接した」または「連続した」という用語は、間断のない配列として連結されていることを意味する。例えば、第一の配列が第二の配列の30個の隣接した(または連続した)アミノ酸を含むとは、その第一の配列が、第二の配列における30個のアミノ酸残基の間断のない配列と100%同一である30個のアミノ酸残基の間断のない配列を含むことを意味する。同様に、第一の配列が第二の配列と「100%の同一性」を有するとは、その第一配列が、ヌクレオチドまたはアミノ酸間にギャップを含まずにその第二の配列と正確にマッチすることを意味する。
【０１５３】
本明細書において用いられる場合、別に明記されない限り、同一性の割合(%)への言及は、以下のものを用いて行われる相同性の評価をいう。
(1) アミノ酸検索についてはblastp、核酸検索についてはblastn、ならびにすべての6個の読み取り枠における核酸検索および翻訳されたアミノ酸の検索についてはblastXをすべて標準デフォルトパラメータで用いるBLAST2.0ベーシック(Basic) BLAST相同性検索、ここで問合せ配列はデフォルトにより低複雑性領域についてフィルタリングされる(全体が参照により本明細書に組み入れられる、Altschul, S. F., Madden, T. L., Schaaffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W.およびLipman, D. J. (1997)「Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs」Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記述されている); 
(2) BLAST2アライメント(下記のパラメータを用いる); および/または
(3) 標準デフォルトパラメータでのPSI-BLAST (位置特異的反復BLAST)。
BLAST2.0ベーシック(Basic) BLASTとBLAST2間の標準パラメータにおけるいくらかの相違のせいで、2つの特定の配列がBLAST2プログラムを用いて有意な相同性をもつとして認識されえたとしても、問合せ配列としてその配列のうちの1つを用いるBLAST2.0ベーシック(Basic) BLASTにおいて行われた検索では二番目の配列をトップ整合において同定しない場合があることを留意すべきである。さらに、PSI-BLASTは、「プロファイル」検索の自動化した使いやすいバージョンを提供しており、配列相同体を捜すための感度の高い方法である。そのプログラムは、まず、ギャップド(gapped) BLASTデータベース検索を行う。PSI-BLASTプログラムは、位置特異的スコアマトリックスを構成するために戻されたいずれの有意なアライメントからの情報も使用し、データベース検索の次のラウンドのためにその問合せ配列を取り換える。それゆえ、これらのプログラムのいずれか1つを使用することにより、同一性の割合が決定されうることが理解されるはずである。
【０１５４】
2つの特定の配列は、全体が参照により本明細書に組み入れられるTatusovaおよびMadden, (1999)「Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences」, FEMS Microbiol Lett. 174:247-250に記述されているように、BLAST2を用いて互いに整列されることができる。BLAST2配列アライメントは、その結果生じるアライメントにギャップの導入(欠失および挿入)を許してその2つの配列間でギャップドBLAST検索(BLAST2.0)を行うBLAST2.0アルゴリズムを用いるblastpまたはblastnにおいて行われる。本明細書において明確にする目的で、BLAST2配列アライメントは、以下の標準デフォルトパラメータを用いて行われる。
blastnの場合、以下の0 BLOSUM62マトリックスを用いる。
一致についての報酬 = 1
不一致についてのペナルティ = -2
オープンギャップ(5)および伸長ギャップ(2)ペナルティ
ギャップx_ドロップオフ(50)期待(10)ワードサイズ(11)フィルタ(オン)
blastpの場合、以下の0 BLOSUM62マトリックスを用いる。
オープンギャップ(11)および伸長ギャップ(1)ペナルティ
ギャップx_ドロップオフ(50)期待(10)ワードサイズ(3)フィルタ(オン)
【０１５５】
本発明の別の態様では、本発明のPUFA PKSシステムの少なくとも1つのドメインの生物活性を有するアミノ酸配列は、アミノ酸配列をコードする核酸配列が、天然に存在するPUFA PKSタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸分子に(すなわち、天然に存在するPUFA PKSタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸鎖の相補体に) (すなわち、それと)中程度、高度または非常に高度なストリンジェンシー条件(以下に記述)の下でハイブリダイズできる天然に存在するPUFA PKSタンパク質またはポリペプチドと十分に類似するアミノ酸配列を含む。好ましくは、本発明のPUFA PKSシステムの少なくとも1つのドメインの生物活性を有するアミノ酸配列は、本明細書において記述されるアミノ酸配列のいずれかによって表されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列の相補体に中程度、高度または非常に高度なストリンジェンシー条件の下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされる。
【０１５６】
本発明の別の態様では、本発明のヌクレオチド配列は、シゾキトリウム由来のヌクレオチド配列から単離される(から得られる)、その配列に同一である、ヌクレオチド配列、またはそれ由来のヌクレオチド配列の相同体であり、このシゾキトリウム由来のヌクレオチド配列(シゾキトリウム由来のDNA分子の両鎖を含む)は、
0005551584.tif 000008
のいずれかによって表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に中程度、高度、または非常に高度なストリンジェンシー条件の下でハイブリダイズする。1つの態様では、シゾキトリウムはシゾキトリウムATCC 20888株である。別の態様では、シゾキトリウムは、シゾキトリウム20888株の娘株であり、その突然変異株(例えば、N230D)を含む。1つの態様では、核酸配列は、
0005551584.tif 000009
より選択されるヌクレオチド配列に中程度、高度、または非常に高度なストリンジェンシー条件の下でハイブリダイズする。
【０１５７】
本発明の別の態様では、本発明のヌクレオチド配列は、スラウストキトリウム由来のヌクレオチド配列から単離される(から得られる)、その配列に同一である、ヌクレオチド配列、またはそれ由来のヌクレオチド配列の相同体であり、このスラウストキトリウム由来のヌクレオチド配列(スラウストキトリウム由来のDNA分子の両鎖を含む)は、
0005551584.tif 000010
のいずれかによって表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に中程度、高度、または非常に高度なストリンジェンシー条件の下でハイブリダイズする。1つの態様では、スラウストキトリウムはスラウストキトリウム23B株(ATCC 20892)である。1つの態様では、核酸配列は、
0005551584.tif 000011
より選択されるヌクレオチド配列に中程度、高度、または非常に高度なストリンジェンシー条件の下でハイブリダイズする。
【０１５８】
別の態様では、本発明のヌクレオチド配列は、真核生物(例えば、スラウストキトリドもしくはラビリンチュリド)または海洋細菌由来のヌクレオチド配列から単離される(から得られる)、その配列に同一である、ヌクレオチド配列、またはそれ由来のヌクレオチド配列の相同体であり、このヌクレオチド配列は、本明細書において表されるアミノ酸配列のいずれかをコードするヌクレオチド配列に中程度、高度、または非常に高度なストリンジェンシー条件の下でハイブリダイズする。
【０１５９】
別の態様では、本発明のヌクレオチド配列は、本明細書において記述されるアクセサリータンパク質をコードするいずれかのヌクレオチド配列(DNA分子の両鎖を含む)から単離される(から得られる)、その配列に同一である、ヌクレオチド配列、またはそのいずれかのヌクレオチド配列の相同体であり、ここで、1つの態様では、このヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:34によって表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に中程度、高度、または非常に高度なストリンジェンシー条件の下でハイブリダイズする。1つの態様では、核酸配列は、SEQ ID NO:33によって表されるヌクレオチド配列に中程度、高度、または非常に高度なストリンジェンシー条件の下でハイブリダイズする。
【０１６０】
別の態様では、本発明のヌクレオチド配列は、本明細書において記述されるいずれかのコドン最適化ヌクレオチド配列またはキメラヌクレオチド配列(DNA分子の両鎖を含む)から単離される(から得られる)、その配列に同一である、ヌクレオチド配列、またはそれらのヌクレオチド配列の相同体であり、ここで、1つの態様では、このヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:74によって表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に中程度、高度、または非常に高度なストリンジェンシー条件の下でハイブリダイズする。1つの態様では、核酸配列は、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73またはSEQ ID NO:75より選択されるヌクレオチド配列に中程度、高度、または非常に高度なストリンジェンシー条件の下でハイブリダイズする。
【０１６１】
相補配列を推定するための方法は当業者に公知である。アミノ酸配列決定および核酸配列決定の技術は完全に誤りがないわけではないため、本明細書に提示した配列は、最善であっても、本発明のPUFA PKSドメインおよびタンパク質の、またはこのようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の見かけ上の配列を表していることに留意すべきである。
【０１６２】
本明細書において用いられる場合、ハイブリダイゼーション条件とは、類似した核酸分子を同定するために核酸分子が用いられる標準的なハイブリダイゼーション条件のことをいう。そのような標準的な条件は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press 1989 に開示されている。Sambrookら、同上は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる(特に9.31-9.62頁を参照されたい)。さらに、ヌクレオチドのミスマッチの程度を変えることを可能にするハイブリダイゼーションを達成するための適切なハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を計算する式が、例えば、Meinkoth et al., 1984, Anal. Biochem. 138, 267-284に開示され、Meinkothら、同上は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１６３】
より詳細には、中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件とは、本明細書において言及される場合、そのハイブリダイゼーション反応において探索（probe）のために用いられる核酸分子と少なくとも約70%の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を可能にする条件(すなわち、ヌクレオチドの約30%またはそれ未満のミスマッチを許容する条件)のことをいう。高度なストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件とは、本明細書において言及される場合、そのハイブリダイゼーション反応において探索のために用いられる核酸分子と少なくとも約80%の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を可能にする条件(すなわち、ヌクレオチドの約20%またはそれ未満のミスマッチを許容する条件)のことをいう。非常に高度なストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件とは、本明細書において言及される場合、そのハイブリダイゼーション反応において探索のために用いられる核酸分子と少なくとも約90%の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を可能にする条件(すなわち、ヌクレオチドの約10%またはそれ未満のミスマッチを許容する条件)のことをいう。以上に考察したように、当業者は、これらのヌクレオチドミスマッチの特定のレベルを達成するための適切なハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を計算するために、Meinkothら、同上における式を使用することができる。そのような条件は、DNA:RNAまたはDNA:DNAのハイブリッドのいずれが形成されるかに応じて異なると考えられる。DNA:DNAハイブリッドに関して計算される融解温度は、DNA:RNAハイブリッドに関してよりも10℃低い。特定の態様では、DNA:DNAハイブリッドに関するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、6X SSC (0.9 M Na+)のイオン強度で、約20℃〜約35℃の間の温度(低度のストリンジェンシー)、より好ましくは約28℃〜約40℃の間の温度(よりストリンジェント)、さらにより好ましくは約35℃〜約45℃の間の温度(さらによりストリンジェント)でのハイブリダイゼーションを、適切な洗浄条件とともに含む。特定の態様では、DNA:RNAハイブリッドに関するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、6X SSC (0.9 M Na+)のイオン強度で、約30℃〜約45℃の間の温度、より好ましくは約38℃〜約50℃の間の温度、さらにより好ましくは約45℃〜約55℃の間の温度でのハイブリダイゼーションを、同様にストリンジェントな洗浄条件とともに含む。これらの値は、約100ヌクレオチドよりも大きい分子、0%ホルムアミドおよび約40%のG＋C含有量についての融解温度の計算に基づいている。または、Tmを、Sambrookら、前記、9.31〜9.62頁に示されているように経験的に計算することもできる。一般に、洗浄条件は、可能な限りストリンジェントであるべきであり、選択されたハイブリダイゼーション条件に対して適切であるべきである。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、特定のハイブリッドの算出Tmよりも約20℃〜約25℃低い、塩および温度条件の組み合わせを含むことができ、洗浄条件は典型的には、その特定のハイブリッドの算出Tmよりも約12℃〜約20℃低い、塩および温度条件の組み合わせを含む。DNA:DNAハイブリッドでの使用に適するハイブリダイゼーション条件の1つの例は、約42℃で6X SSC (50%ホルムアミド)中での2時間〜24時間のハイブリダイゼーション、続いて室温で約2X SSC中での1回またはそれ以上の洗浄を含む洗浄段階、続いてより高い温度およびより低いイオン強度での追加の洗浄(例えば、約37℃で約0.1X〜0.5X SSC中での少なくとも1回の洗浄、続いて約68℃で約0.1X〜0.5X SSC中での少なくとも1回の洗浄)を含む。
【０１６４】
本発明の別の態様は、pJK1126 (ATCCアクセッション番号PTA-7648)、pJK1129 (ATCCアクセッション番号PTA-7649)、pJK1131 (ATCCアクセッション番号PTA-7650)、pJK306 (ATCCアクセッション番号PTA-7641)、pJK320 (ATCCアクセッション番号PTA-7644)、pJK324 (ATCCアクセッション番号PTA-7643)、pBR002 (ATCCアクセッション番号PTA-7642)、Th23BOrfA_pBR812.1 (ATCCアクセッション番号PTA-8232) Th23BOrfA_pBR811 (ATCCアクセッション番号PTA-8231)、Th23BOrfB_pBR800 (ATCCアクセッション番号PTA-8227)またはTh23BOrfC_pBR709A (ATCCアクセッション番号PTA-8228)より選択されるプラスミドの核酸配列に同一であるまたは(上記に定義したように)その核酸配列の相同体である、核酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる核酸分子を含む。
【０１６５】
別の態様では、本発明は、pThOrfC-synPS (ATCCアクセッション番号PTA-8229)、pDS49 (ATCCアクセッション番号PTA-8230)、pDD24 (ATCCアクセッション番号PTA-8226)、pDD26 (ATCCアクセッション番号PTA-8411)、pDD32 (ATCCアクセッション番号PTA-8412)またはOrfB＊_pJK780 (ATCCアクセッション番号PTA-8225)より選択されるプラスミドの核酸配列に同一であるまたは(上記に定義したように)その核酸配列の相同体である、核酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる核酸分子を含む。
【０１６６】
本発明の別の態様は、pJK1126 (ATCCアクセッション番号PTA-7648)、pJK1129 (ATCCアクセッション番号PTA-7649)、pJK1131 (ATCCアクセッション番号PTA-7650)、pJK306 (ATCCアクセッション番号PTA-7641)、pJK320 (ATCCアクセッション番号PTA-7644)、pJK324 (ATCCアクセッション番号PTA-7643)、pBR002 (ATCCアクセッション番号PTA-7642)、Th23BOrfA_pBR812.1 (ATCCアクセッション番号PTA-8232) Th23BOrfA_pBR811 (ATCCアクセッション番号PTA-8231)、Th23BOrfB_pBR800 (ATCCアクセッション番号PTA-8227)またはTh23BOrfC_pBR709A (ATCCアクセッション番号PTA-8228)より選択されるプラスミドによってコードされるアミノ酸配列に同一であるまたは(上記に定義したように)そのアミノ酸配列の相同体であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる核酸分子を含む。
【０１６７】
別の態様では、本発明は、pThOrfC-synPS (ATCCアクセッション番号PTA-8229)、pDS49 (ATCCアクセッション番号PTA-8230)、pDD24 (ATCCアクセッション番号PTA-8226)、pDD26 (ATCCアクセッション番号PTA-8411)、pDD32 (ATCCアクセッション番号PTA-8412)またはOrfB＊_pJK780 (ATCCアクセッション番号PTA-8225)より選択されるプラスミドによってコードされるアミノ酸配列に同一であるまたは(上記に定義したように)そのアミノ酸配列の相同体であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる核酸分子を含む。
【０１６８】
本発明の別の態様は、組換えベクター、および本明細書において記述されるPUFA PKSシステムの少なくとも1つのドメインまたはタンパク質の生物活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸分子を含む、組換え核酸分子を含む。そのような核酸配列およびドメインまたはタンパク質は以上に詳細に記述されている。本発明によれば、組換えベクターは、選択した核酸配列を操作するための、およびそのような核酸配列を宿主細胞に導入するためのツールとして用いられる、操作された(すなわち、人工的に作製された)核酸分子である。組換えベクターはこのため、組換え細胞を形成させるために選択した核酸配列を発現させること、および/または宿主細胞に送達することなどによって、選択した核酸配列のクローニング、配列決定および/または別の方法による操作に用いるのに適している。そのようなベクターは、典型的には、クローニングまたは送達する予定の核酸配列に隣接することが天然には見いだされない核酸配列である異種核酸配列を含むが、ベクターはまた、本発明の核酸分子に隣接して天然に見いだされる、または本発明のその核酸分子の発現のために有用である調節性核酸配列(例えば、プロモーター、非翻訳領域)も含みうる(以下で詳細に考察する)。ベクターは、RNAまたはDNAのいずれか、原核生物性または真核生物性のいずれかであってもよく、典型的にはプラスミドである。ベクターは、染色体外要素(例えば、プラスミド)として維持されうる、またはそれは組換え生物(例えば、微生物または植物)の染色体に組み込まれうる。ベクター全体が宿主細胞内のしかるべき所に留まることもできるか、またはある特定の条件下では、プラスミドDNAが除去されて本発明の核酸分子が残るようにすることもできる。組み込まれた核酸分子は、染色体のプロモーター制御下、天然のもしくはプラスミド性のプロモーター制御下、または複数のプロモーターの組み合わせの制御下におかれうる。核酸分子の単一または複数のコピーを染色体に組み込むことができる。本発明の組換えベクターは、少なくとも1つの選択マーカーを含みうる。
【０１６９】
1つの態様では、本発明の組換え核酸分子において用いられる組換えベクターは、発現ベクターである。本明細書において用いられる場合、「発現ベクター」という語句は、コードされる産物(例えば、関心対象のタンパク質)の産生のために適したベクターをいうために用いられる。この態様では、産生させる予定の産物(例えば、PUFA PKSドメイン)をコードする核酸配列は、組換え核酸分子を産生するための組換えベクターに挿入される。産生させる予定のタンパク質をコードする核酸配列は、その核酸配列を、組換え宿主細胞内での核酸配列の転写および翻訳を可能にするベクター中の制御配列と機能的に連結させる様式で、ベクターに挿入される。
【０１７０】
別の態様では、本発明の組換え核酸分子において用いられる組換えベクターは、ターゲティングベクターである。本明細書において用いられる場合、「ターゲティングベクター」という語句は、特定の核酸分子を組換え宿主細胞に送達するために用いられるベクターをいうために用いられ、ここで核酸分子は、宿主細胞または微生物内で内因性遺伝子を欠失させるまたは不活性化させるために用いられる(すなわち、標的化された遺伝子破壊またはノックアウト技術のために用いられる)。そのようなベクターは、「ノックアウト」ベクターとしても当技術分野において公知であると思われる。この態様の1つの局面では、ベクターの一部分、しかしより典型的にはベクターに挿入された核酸分子(すなわち、インサート)は、宿主細胞における標的遺伝子(すなわち、欠失または不活性化させるためにターゲティングを受ける遺伝子)の核酸配列と相同性を示す核酸配列を有する。ベクターインサートの核酸配列は、標的遺伝子に結合して標的遺伝子およびインサートが相同組換えを行い、それによって、内因性標的遺伝子が欠失、不活性化または減弱化(すなわち、内因性標的遺伝子の少なくとも一部分が突然変異または欠失することにより)されるように設計されている。
【０１７１】
典型的には、組換え核酸分子は、1つまたは複数の転写制御配列に機能的に連結された本発明の少なくとも1つの核酸分子を含む。本明細書において用いられる場合、「組換え分子」または「組換え核酸分子」という語句は主として、転写制御配列に機能的に連結された核酸分子または核酸配列をいうが、そのような核酸分子が本明細書で考察した組換え分子である場合には、「核酸分子」という語句と互換的に用いることができる。本発明によれば、「機能的に連結された」という語句は、分子が宿主細胞にトランスフェクトされた(すなわち、形質転換された、形質導入された、トランスフェクトされた、結合された、または導かれた)場合に発現されうるような様式で、核酸分子を転写制御配列に連結することをいう。転写制御配列は、転写の開始、伸長または終結を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよびリプレッサー配列のように転写開始を制御するものである。適した転写制御配列は、組換え核酸分子が導入される宿主細胞または生物において機能しうる任意の転写制御配列を含む。
【０１７２】
本発明の組換え核酸分子はまた、翻訳調節配列、複製起点といったさらなる制御配列、および組換え細胞と適合性のある他の制御配列も含みうる。1つの態様では、本発明の組換え分子は、宿主細胞染色体に組み込まれるものも含めて、発現されるタンパク質がそのタンパク質を産生する細胞から分泌されることを可能にする分泌シグナル(すなわち、シグナルセグメント核酸配列)も含む。適したシグナルセグメントは、発現されるタンパク質に天然に付随するシグナルセグメント、または本発明によるタンパク質の分泌を指令しうる任意の異種シグナルセグメントを含む。別の態様では、本発明の組換え分子は、発現されるタンパク質が宿主細胞の膜に送達されて挿入されることを可能にするリーダー配列を含む。適したリーダー配列は、タンパク質に天然に付随するリーダー配列、または細胞膜へのタンパク質の送達および挿入を指令しうる任意の異種リーダー配列を含む。
【０１７３】
本発明者らは、シゾキトリウムおよびスラウストキトリウムPUFA PKSのOrfAおよびBがゲノムにおいておよび配列決定されたOrf間の領域において密接に関連していることを見いだした。シゾキトリウムにおいて、Orfは、逆方向に配向されており、4244塩基対が開始(ATG)コドンを分け隔てている(すなわち、それらは次のように並べられている: 3'0rfA5'-4244bp-5'OrfB3')。4244 bpの遺伝子間領域を調べても明らかなOrfは全く明らかにされなかった(BlastX検索で有意なマッチは見られなかった)。OrfAもOrfBもともに、少なくとも油産生の間に、シゾキトリウムにおいて高度に発現されており、活性なプロモーター要素がこの遺伝子間領域に組み込まれていることを示唆している。これらの遺伝要素は、遺伝子導入の用途で二方向性プロモーター配列として有用性があるものと考えられる。例えば、好ましい態様では、この領域をクローニングし、各末端に関心対象の任意の遺伝子を配置し、この構築体をシゾキトリウム(またはプロモーターが機能すると示すことのできる他の宿主)に導入することができる。調節性要素は、適切な条件の下で、2つの導入遺伝子の協調的な高レベルの発現をもたらすものと予測される。シゾキトリウムPUFA PKSの調節性要素(例えば、プロモーター)を含む調節性領域の完全なヌクレオチド配列は、本明細書でSEQ ID NO:76として表されている。
【０１７４】
類似の様式で、OrfCは、シゾキトリウムにおいて油産生の間に高度に発現されており、その開始コドン上流の領域には調節性要素が存在すると予想される。OrfC上流のゲノムDNAの領域をクローニングし、配列決定し、本明細書で(SEQ ID NO:77)として表している。この配列はOrfC開始コドンのすぐ上流に3886 ntを含む。この領域を調べても明らかなOrfは全く明らかにされなかった(すなわち、BlastX検索で有意なマッチは見られなかった)。この領域に含まれる調節性要素は、適切な条件の下で、それらの後ろに配置された遺伝子の高レベルの発現をもたらすものと考えられる。さらに、適切な条件の下で、発現のレベルをA-B遺伝子間領域の制御下の遺伝子(SEQ ID NO:76)に合わせることもできる。
【０１７５】
このため、1つの態様では、本明細書で開示の本発明において有用な組換え核酸分子は、SEQ ID NO:76および/またはSEQ ID NO:77のなかに含まれたPUFA PKS調節性領域を含むことができる。そのような調節性領域は、少なくとも基底のPUFA PKS転写活性(少なくとも基底のプロモーター活性)を有するSEQ ID NO:76および/またはSEQ ID NO:77の任意の部分(断片)を含むことができる。
【０１７６】
本発明の1つまたは複数の組換え分子を用いて、本発明のコードされる産物(例えば、PUFA PKSドメイン、タンパク質、またはシステム)を産生させることができる。1つの態様では、コードされる産物は、タンパク質を産生させるのに効果的な条件下で、本明細書に記述したような核酸分子を発現させることによって産生される。コードされるタンパク質を産生させるのに好ましい方法は、宿主細胞に1つまたは複数の組換え分子をトランスフェクトして、組換え細胞を形成させることによる。トランスフェクトするのに適した宿主細胞には、トランスフェクトされうる任意の細菌、真菌(例えば、酵母)、昆虫、植物または動物の細胞が含まれるが、これらに限定されることはない。宿主細胞は、非トランスフェクト細胞または少なくとも1つの他の組換え核酸分子によって既にトランスフェクトされた細胞のいずれかでありうる。
【０１７７】
本発明によれば、「トランスフェクション」という用語は、外因性核酸分子(すなわち、組換え核酸分子)を細胞に挿入しうる任意の方法をいうために用いられる。「形質転換」という用語は、そのような用語が藻類、細菌および酵母などの微生物細胞への核酸分子の導入をいうために用いられる場合、「トランスフェクション」という用語と互換的に用いることができる。微生物システムでは、「形質転換」という用語は、微生物による外因性核酸の獲得に起因する遺伝性変化を記述するために用いられ、「トランスフェクション」という用語と本質的に同義である。しかし、動物細胞では、形質転換はもう1つの意味を獲得しており、それは例えば、がん化した後の培養下の細胞の増殖特性の変化をいうことができる。このため、混乱を避けるために、「トランスフェクション」という用語は、動物細胞への外因性核酸の導入に関して用いられることが好ましく、「トランスフェクション」という用語は、この用語が細胞への外因性核酸の導入に関係する限りにおいて、動物細胞、植物細胞のトランスフェクションおよび微生物細胞の形質転換を全般的に含むように本明細書において用いられるものとする。それゆえ、トランスフェクションの技術には、形質転換、粒子衝突、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、感染、およびプロトプラスト融合が含まれるが、これらに限定されることはない。
【０１７８】
当業者は、組換えDNA技術の使用が、例えば、宿主細胞内の核酸分子のコピー数、そのような核酸分子が転写される効率、その結果として生じる転写物が翻訳される効率、および翻訳後の改変の効率を操作することによって、トランスフェクトされた核酸分子の発現の制御を改善しうることを理解すると考えられる。さらに、天然のプロモーターに比べて発現レベルを向上させるために、プロモーター配列を遺伝的に操作することも考えられる。核酸分子の発現を制御するために有用な組換え技術には、1つまたは複数の宿主細胞染色体への核酸分子の組み込み、プラスミドへのベクター安定性配列の付加、転写制御シグナル(例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー)の置換または改変、翻訳制御シグナル(例えば、リボソーム結合部位、シャイン-ダルガノ配列)の置換または改変、宿主細胞のコドン使用に対応させるための核酸分子の改変、および転写物を不安定化する配列の除去が含まれるが、これらに限定されることはない。
【０１７９】
組換え核酸分子および宿主細胞のトランスフェクションに関しての上記の一般的な考察は、PUFA PKS由来の少なくとも1つのドメインの生物活性を有する任意のアミノ酸配列をコードするもの、他のPKSシステム由来のアミノ酸配列をコードするもの、および他のタンパク質またはドメインをコードするものを含む、本明細書において考察されているいずれの組換え核酸分子にも適用されるものとする。
【０１８０】
本発明はまた、本明細書において記述のPUFA PKSシステム(およびそのタンパク質またはドメイン)のいずれかに構造、ドメイン構成および/または機能が相同である、本明細書において具体的に記述したもの以外の微生物由来のPUFA PKSシステム(およびそのタンパク質またはドメイン)に関する。さらに、本発明は、本発明によるPUFA PKSシステムのさまざまな用途(例えば、遺伝的に改変された生物および生物活性分子を産生する方法)においてこれらの微生物およびこれらの微生物由来のPUFA PKSシステムまたはその成分(例えば、DH2ドメイン)を使用することにも関する。PUFA PKSシステムを含む微生物の同定のためのスクリーニング過程は、米国特許出願公開第20020194641号、前記に詳細に記述されている。本明細書において記述するPUFA PKSタンパク質およびドメインの構造および機能、ならびにそれをコードするヌクレオチド配列に関する知識は、このようなタンパク質またはポリヌクレオチドの相同体の同定、確認および/または単離のための有用なツールである。
【０１８１】
本発明によれば、「スラウストキトリド」という用語は、スラウストキトリアシエ(Thraustochytriaceae)科を含む、スラウストキトリアレス目の任意のメンバーのことをいい、「ラビリンチュリド」という用語は、ラビリンチュラシエ(Labyrinthulaceae) 科を含む、ラビリンチュラ(Labyrinthulales)目の任意のメンバーのことをいう。ラビリンチュラシエ科のメンバーは一時、スラウストキトリアレス目のメンバーであると考えられていたが、そのような生物の分類法のさらに最近の改訂により、この科は現在ではラビリンチュラ目のメンバーであると考えられており、ラビリンチュラおよびスラウストキトリアレスは両方ともラビリンチュラ菌門(phylum Labyrinthulomycota)のメンバーと考えられている。進展の結果、スラストキトリドおよびラビリンチュリドの分類は頻繁に改訂されている。しかし、分類学の理論家は、現在は一般に、これらの微生物の両方の群を、ストラメノパイル(Stramenopile)の系譜に属する藻類または藻類様原生生物に位置づけている。スラウストキトリドおよびラビリンチュリドの現在の分類法上の位置づけは以下のようにまとめることができる。
界: ストラメノパイル(Stramenopila) (クロミスタ(Chromista))
門: ラビリンチュラ菌門
網: ラビリンチュラ網(Labyrinthulomycetes)
目: ラビリンチュラ目
科: ラビリンチュラシエ科
目: スラウストキトリアレス目
科: スラウストキトリアシエ科
【０１８２】
しかしながら、分類法上の不確定性は残るため、本発明においてスラウストキトリドとして記述した菌株には以下の生物が含まれると考えることが、本発明の目的には最善であると考えられる。
目: スラウストキトリアレス;
科: スラウストキトリアシエ; 
属: スラウストキトリウム(種: アルヂメンタレ(arudimentale)、アウレウム、ベンチコラ(benthicola)、グロボサム(globosum)、キネイ(kinnei)、モチバム(motivum)、マルチルジメンテール(multirudimentale)、パキデルマム(pachydermum)、プロリフェルム(proliferum)、ローゼウム(roseum)、ストリアツム(striatum))、ウルケニア(種: アメーボイデア(amoeboidea)、ケルゲレンシス(kerguelensis)、ミヌタ(minuta)、プロファンダ(profunda)、ラジアタ(radiata)、サイレンス(sailens)、サルカリアナ(sarkariana)、シゾキトロプス(schizochytrops)、ビスルゲンシス(visurgensis)、ヨーケンシス(yorkensis))、シゾキトリウム(種: アグレガツム(aggregatum)、リムナセウム(limnaceum)、マングロベイ(mangrovei)、ミヌツム(minutum)、オクトスポルム(octosporum))、ジャポノキトリウム(Japonochytrium) (種: マリナム(marinum))、アプラノキトリウム(Aplanochytrium) (種: ハリオチディス(haliotidis)、ケルグエレンシス(kerguelensis)、プロファンダ(profunda)、ストッキノイ(stocchinoi))、アルトルニア(Althornia) (種: クロウキイ(crouchii))またはエリナ(Elina) (種: マリサルバ(marisalba)、シノリフィカ(sinorifica))。ウルケニア属に関する原記述は論文審査を要するジャーナル誌には掲載されていないため、この属およびそれに属すると位置づけられた種の正当性については若干疑問が残っていることに留意すべきである。本発明の目的において、ウルケニアに属するとして記述された種は、スラウストキトリウムのメンバーであるとみなすことが考えられる。
【０１８３】
本発明においてラビリンチュリドとして記述した菌株には、以下の生物が含まれる。
目: ラビリンチュラ、
科: ラビリンチュラシエ、
属: ラビリンチュラ(種: アルジェリエンシス(algeriensis)、コエノシスチス(coenocystis)、シャトニイ(chattonii)、マクロシスチス(macrocystis)、マクロシスチス-アトランティカ(macrocystis atlantica)、マクロシスチス-マクロシスチス(macrocystis macrocystis)、マリナ(marina)、ミヌタ(minuta)、ロスコフェンシス(roscoffensis)、バルカノビイ(valkanovii)、ビテリナ(vitellina)、ビテリナ-パシフィカ(vitellina pacifica)、ビテリナ-ビテリナ(vitellina vitellina)、ゾプフィイ(zopfii))、ラビリンチュロイデス(Labyrinthuloides) (種: ハロチディス(haliotidis)、ヨルケンシス(yorkensis))、ラビリントミキサ(Labyrinthomyxa) (種: マリナ(marina))、ディプロフリス(Diplophrys) (種: アーケリ(archeri))、ピロソラス(Pyrrhosorus) (種: マリヌス(marinus))、ソロジプロフリス(Sorodiplophrys) (種: ステルコレア(stercorea))またはクラミドミクサ(Chlamydomyxa) (種: ラビリンチュロイデス、モンタナ(montana)) (しかし、ピロソラス(Pyrrhosorus)、ソロジプロフリス(Sorodiplophrys)またはクラミドミクサの正確な分類法上の位置づけについては現時点で合意は得られていない)。
【０１８４】
本発明のPUFA PKSシステムを用いて有意に高い収量のさまざまな生物活性分子を産生するために、生物、好ましくは微生物または植物もしくは植物の部分(例えば、植物細胞)を遺伝的に改変して、PUFA PKSシステムの活性に影響を与えることができる。1つの局面では、そのような生物は、PUFA PKSシステムを内因的に含みかつ発現することができ、遺伝的改変は内因性PUFA PKSシステムの機能性ドメインの1つまたは複数の遺伝的改変であることができ、それによってこの改変はPUFA PKSシステムの活性に何らかの影響を及ぼす。別の局面では、そのような生物はPUFA PKSシステムを内因的に含みかつ発現することができ、遺伝的改変は少なくとも1つの外因性核酸配列(例えば、組換え核酸分子)の導入であることができ、ここで、この外因性核酸配列はその同一のもしくはもう一つのPKS由来の少なくとも1つの生物活性ドメインもしくはタンパク質および/または前記のPUFA PKSシステムの活性に影響を与えるタンパク質(例えば、以下で考察する、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase))をコードする。別の局面では、生物は必ずしもPUFA PKSシステムを内因的に(天然に)含んでいないが、PUFA PKSシステムの少なくとも1つのドメインの生物活性を有するアミノ酸配列をコードする少なくとも1つの組換え核酸分子を導入するために遺伝的に改変される。この局面では、PUFA PKS活性は、生物においてPUFA PKS活性を導入または増大することにより影響を受ける。これらの局面のそれぞれに関連するさまざまな態様を以下でさらに詳細に考察する。
【０１８５】
それゆえ、本発明によれば、1つの態様は、多価不飽和脂肪酸(PUFA)ポリケチドシンターゼ(PKS)システムの少なくとも1つの生物活性ドメインを含むPKSシステムを発現する、遺伝的に改変された微生物に関する。PUFA PKSシステムの少なくとも1つのドメインは、本明細書において記述される核酸配列によってコードされる。遺伝的改変は生物においてPKSシステムの活性に影響を与える。遺伝的に改変された微生物は、上記に定義した核酸配列のいずれか1つもしくは複数、および/または上記で詳細に記述したPUFA PKS ORFもしくはドメインのいずれかの他の相同体のいずれかを含むことができる。
【０１８６】
本明細書において用いられる場合、遺伝的に改変された微生物は、遺伝的に改変された細菌、原生生物、微小藻類、真菌、またはその他の微生物、および特に、本明細書において記述されるスラウストキトリアレス目の属のいずれか(例えば、スラウストキトリド)を含むことができる。そのような遺伝的に改変された微生物は、所望の結果(すなわち、PUFA PKSシステムまたはその成分によるPUFA PKS活性および/または所望の産物の産生の増大または改変)が達成されるように、その通常(すなわち、野生または天然)型から改変された(すなわち、変異または変化した)ゲノムを有する。微生物の遺伝的改変は、古典的な系統開発および/または分子遺伝学的技術を用いて達成することができる。そのような技術は当技術分野において公知であり、微生物について、例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Pressで一般的に開示されている。この文献Sambrook et al., 同上は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。遺伝的に改変された微生物は、そのような改変がその微生物内に望ましい効果を与えるような様式において、核酸分子が挿入、欠失または改変された(すなわち、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、置換および/または反転により、変異された)微生物を含みうる。
【０１８７】
本発明によって改変するのに好ましい微生物宿主細胞には、任意の細菌、原生生物、微小藻類、真菌、または原生動物が含まれるが、これらに限定されることはない。1つの局面では、遺伝的に改変するのに好ましい微生物には、スラウストキトリアレス目の任意の微生物またはラビリンチュラ目の任意の微生物が含まれるが、これらに限定されることはない。本発明で用いるのに特に好ましい宿主細胞には、スラウストキトリウム、ウルケニア、シゾキトリウム、ジャポノキトリウム(Japonochytrium)、アプラノキトリウム、アルトルニア、エリナ、ラビリンチュラ、ラビリンチュロイデス、ラビリントミキサ、ディプロフリス、ピロソラス、ソロジプロフリスまたはクラミドミクサを含むが、これらに限定されない、属由来の微生物が含まれうる。遺伝的改変に適した宿主微生物の他の例としては、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス(Saccharomyces carlsbergensis)を含む酵母、もしくはカンジダ(Candida)、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)のようなその他の酵母、またはその他の真菌、例えば、アスペルギルス(Aspergillus)、ノイロスポラ(Neurospora)、ペニシリウム(Penicillium)のような繊維状真菌などが挙げられるが、これらに限定されることはない。細菌細胞を宿主として用いることもできる。これには、発酵工程で有用とできる大腸菌(Escherichia coli)が含まれる。あるいは、ラクトバチルス(Lactobacillus)種またはバチルス(Bacillus)種のような宿主を宿主として用いることができる。
【０１８８】
本発明の別の態様は、植物がPUFAを産生するように、少なくともコアPUFA PKS酵素複合体および、1つの態様では、少なくとも1つのPUFA PKSアクセサリータンパク質(例えば、PPTase)を含む、遺伝的に改変された植物または植物の部分(例えば、ここで植物は本明細書において記述されるPUFA PKSシステムを発現するように遺伝的に改変されている)に関する。好ましくは、植物は油料種子植物であり、ここで油料種子または油料種子中の油はPUFA PKSシステムによって産生されるPUFAを含む。そのような油は、PUFA PKSシステムの産物である、検出可能な量の少なくとも1つの標的PUFAまたは主PUFAを含む。植物はPUFA PKSシステムを内因的に含まないことが知られており、このため、本発明のPUFA PKSシステムは、類いまれな脂肪酸産生能力を有する植物を作出するための機会となる。同一の植物において、EPA、DHA、DPA（n-3および/またはn-6）、ARA、GLA、SDAおよび他のものを含む、1つまたは複数のPUFAを産生するように植物を遺伝的に操作することは、本発明の特に好ましい態様である。本発明は、いくつかの「人工的に設計された油(designer oil)」のいずれか1つをさまざまな比率および形態で作出する能力を与える。
【０１８９】
植物の遺伝子工学のための方法は当技術分野において周知である。例えば、生物的および物理的な形質転換プロトコルを含む、植物形質転換のためのさまざまな方法が開発されている。例えば、Miki et al., 「Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants」Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B.R. and Thompson, J.E. Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) pp. 67-88を参照されたい。さらに、植物細胞または組織の形質転換および植物の再生のためのベクターおよびインビトロ培養方法も入手可能である。例えば、Gruber et al., 「Vectors for Plant Transformation」 Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B.R. and Thompson, J.E. Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) pp. 89-119を参照されたい。
【０１９０】
植物に発現ベクターを導入するために最も広く利用されている方法は、アグロバクテリウム(Agrobacterium)の天然の形質転換システムに基づく。例えば、Horsch et al., Science 227:1229 (1985)を参照されたい。A.ツメファシエンス(A. tumefaciens)およびA.リゾゲネス(A. rhizogenes)は、植物細胞を遺伝的に形質転換する植物病原性の土壌細菌である。A.ツメファシエンスおよびA.リゾゲネスのそれぞれTiおよびRiプラスミドは、植物の遺伝的形質転換に関与する遺伝子を保有する。例えば、Kado, C.I., Crit. Rev. Plant. Sci. 10:1 (1991)を参照されたい。アグロバクテリウムベクターシステムおよびアグロバクテリウムを介した遺伝子導入の方法に関する記述は、Gruber et al., 前記、Miki et al., 前記、Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238 (1989)、ならびに米国特許第4,940,838号および同第5,464,763号を含む、多くの参考文献によって提供されている。
【０１９１】
植物形質転換のもう1つの一般に適用可能な方法は、DNAが微小発射体(microprojectile)の表面で運搬される、微小発射体を介した形質転換である。発現ベクターは、植物細胞壁および膜を貫通させるのに十分なスピードにまで微小発射体を加速する遺伝子銃装置を用いて植物組織に導入される。Sanford et al., Part. Sci. Technol. 5:27 (1987)、Sanford, J.C., Trends Biotech. 6:299 (1988)、Sanford, J.C., Physiol. Plant 79:206 (1990)、Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992)。
【０１９２】
植物に対するDNAの物理学的送達のためのもう1つの方法は、標的細胞の超音波処理である。Zhang et al., Bio/Technology 9:996 (1991)。または、リポソームまたはスフェロプラスト融合が、発現ベクターを植物に導入するために用いられている。Deshayes et al., EMBO J., 4:2731 (1985)、Christou et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 84:3962 (1987)。CaCl2沈降、ポリビニルアルコールまたはポリ-L-オルニチンを用いたプロトプラストへのDNAの直接的な取込みも報告されている。Hain et al., Mol. Gen. Genet. 199:161 (1985)およびDraper et al., Plant Cell Physiol. 23:451 (1982)。プロトプラストならびに全細胞および組織のエレクトロポレーションも記述されている。Donn et al., Abstracts of VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, p. 53 (1990); D'Halluin et al., Plant Cell 4:1495-1505 (1992)およびSpencer et al., Plant Mol. Biol. 24:51-61 (1994)。
【０１９３】
植物細胞への遺伝的構築体の導入の後、植物細胞を成長させ、苗条および根のような分化組織の出現により、成熟した植物が作出される。典型的には、複数の植物が作出される。植物を再生するための方法論は一般に、当業者に公知であり、例えばPlant Cell and Tissue Culture, 1994, Vasil and Thorpe Eds. Kluwer Academic Publishersのなかで、およびPlant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology 111, 1999 Hall Eds Humana Press)のなかで見いだすことができる。
【０１９４】
本明細書において用いられる場合、遺伝的に改変された植物には、高等植物、特に任意の消費可能な植物または本発明の所望の生物活性分子を産生させるのに有用な植物を含む、任意の遺伝的に改変された植物が含まれうる。「植物の部分」とは、本明細書において用いられる場合、種子(未熟または成熟)、油、花粉、胚、花、果実、苗条、葉、根、茎、外植片などを含むが、これらに限定されない、植物の任意の部分を含む。遺伝的に改変された植物は、所望の結果(例えば、PUFA PKS活性およびPUFAの産生)が達成されるように、その通常(すなわち、野生または天然)型から改変された(すなわち、変異または変化した)ゲノムを有する。植物の遺伝的改変は、古典的な系統開発および/または分子遺伝学的技術を用いて達成することができる。所望のアミノ酸配列をコードする組換え核酸分子がその植物のゲノムに組み入れられているトランスジェニック植物を作出するための方法は、当技術分野において公知である。本発明によって遺伝的に改変するのに好ましい植物は、ヒトを含む動物による消費に適した植物であることが好ましい。
【０１９５】
本発明によって遺伝的に改変するのに好ましい植物(すなわち、植物宿主細胞)には、双子葉植物および単子葉植物の両方を含む任意の高等植物、特に作物植物、とりわけその油のために用いられる植物を含む、消費可能な植物が含まれる。そのような植物は、例えば、キャノーラ、ダイズ、ナタネ、アマニ、トウキビ、ベニバナ、ヒマワリおよびタバコを含むことができるが、これらに限定されることはない。このように、任意の植物種または植物細胞を選択することができる。本明細書において用いられる特定の細胞、およびそれから成長されるまたは導出される植物には、キャノーラ(ブラシカ・ラパL. (Brassica rapa L.); ダイズ(グリシンマックス(Glycine max)); ナタネ(ブラシカ種(Brassica spp.)); アマニ/アマ(リナム・ウシタチシマム(Linum usitatissimum)); トウモロコシ(トウキビ) (ジー・メイズ(Zea mays)); ベニバナ(カルタマス・チンクトリウス(Carthamus tinctorius)); ヒマワリ(ヘリアンタス・アンヌス(Helianthus annuus)); タバコ(ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)); シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、ブラジル・ナッツ(Brazil nut) (ベソレチア・エクセルサ(Betholettia excelsa)); トウゴマの種子(リシナス・コミュニス(Riccinus communis)); ココナツ(コカス・ヌシフェラ(Cocus nucifera)); コリアンダー(コリアンドラム・サティバム(Coriandrum sativum)); メン(ゴシピウム種(Gossypium spp)); ラッカセイ(アラキス・ヒポガエア(Arachis hypogaea)); ホホバ(シモンドシア・キネンシス(Simmondsia chinensis)); カラシナ(ブラシカ種(Brassica spp.)およびシナピス・アルバ(Sinapis alba)); パーム油(エラエイス・ギネエイス(Elaeis guineeis)); オリーブ(オレア・ユーパエア(Olea eurpaea)); コメ(オリザ・サティバ(Oryza sativa)); カボチャ(ククルビタ・マキシマ(Cucurbita maxima)); オオムギ(ホルデウム・ウルガレ(Hordeum vulgare)); コムギ(トラエチカム・エスチバム(Traeticum aestivum)); ならびにウキクサ(レムナシアエ種(Lemnaceae sp))から得られる細胞が含まれるが、これらに限定されることはない。本発明によれば植物種内の遺伝的背景は変わりうることに留意すべきである。
【０１９６】
他の好ましい植物には、医薬剤、香味剤、栄養補助剤、機能的食品成分もしくは美容的活性物質として用いられる化合物を産生することが知られているような植物、またはこれらの化合物/作用物質を産生するように遺伝的に操作された植物が含まれる。
【０１９７】
さらなる態様では、植物細胞培養物を本発明によって用いることができる。そのような態様では、植物細胞は通常の農作業によって分化した植物に成長せず、栽培されないが、その代わりに液体培地中で増殖および維持される。
【０１９８】
本発明によれば、遺伝的に改変された微生物または植物には、組換え技術を用いて改変された微生物または植物が含まれる。本明細書において用いられる場合、遺伝子発現の低下、遺伝子の機能の低下、遺伝子産物(すなわち、遺伝子によりコードされるタンパク質)の機能の低下をもたらす遺伝的改変は、遺伝子の不活性化(完全または部分的)、欠失、中断、遮断または下方制御ということができる。例えば、そのような遺伝子によってコードされるタンパク質の機能の低下をもたらす遺伝子における遺伝的改変は、遺伝子の完全な欠失(すなわち、遺伝子が存在しないため、タンパク質が存在しない)、タンパク質の不完全な翻訳をもたらすもしくはタンパク質の翻訳をもたらさない(例えば、タンパク質が発現されない)遺伝子における突然変異、またはタンパク質の本来の機能を低下させるもしくは消失させる(例えば、低下した酵素活性もしくは作用を有する、または酵素活性もしくは作用を有しないタンパク質が発現される)遺伝子における突然変異の結果でありうる。遺伝子発現または機能の増加をもたらす遺伝的改変は、遺伝子の増幅、過剰産生、過剰発現、活性化、増強、付加または上方制御ということができる。
【０１９９】
本発明による微生物または植物の遺伝的改変は、PKSシステムが内因性および生物への組換え核酸分子の導入により遺伝的に改変されて内因性であれ、または組換え技術によって完全に供与されているのであれ、植物により発現されるPKSシステムの活性に影響を及ぼすことが好ましい。本発明によれば、「PKSシステムの活性に影響を及ぼす」ことは、遺伝的改変のない場合と比べて、生物により発現されるPKSシステムの任意の検出可能なまたは測定可能な変化または改変をもたらす任意の遺伝的改変を含む。PKSシステムの検出可能な変化または改変は、生物が測定可能/検出可能なPKSシステムの活性を持つような、生物へのPKSシステムの活性の導入(すなわち、生物は遺伝的改変の前にはPKSシステムを含んでいなかった)、PKSシステムの活性が改変されるような、生物により内因的に発現されるPKSシステムとは異なるPKSシステム由来の機能性ドメインの生物への導入(例えば、1つのPUFA PKSシステム由来のDH2ドメインを異なる生物のPUFA PKSシステムに導入する)、PKSシステムにより産生される生物活性分子の量の変化(例えば、システムが遺伝的改変のない場合と比べてより多く(増加した量)のまたはより少ない(減少した量の)所定の産物を産生する)、PKSシステムにより産生される生物活性分子の種類の変化(例えば、システムが新たなもしくは異なる産物、またはシステムにより天然に産生される産物の変種を産生する)、および/あるいはPKSシステムにより産生される複数の生物活性分子の比率の変化(例えば、システムが、あるPUFAと別のPUFAとの異なる比率をもたらす、遺伝的改変のない場合と比べて完全に異なる脂質プロファイルをもたらす、または天然の立体配置と比べてトリアシルグリセロールにおいて異なる位置にさまざまなPUFAを配置する)を含むことができるが、これらに限定されることはない。そのような遺伝的改変は、任意の種類の遺伝的改変を含み、具体的には、組換え技術によりおよび古典的な突然変異誘発により作出される改変を含む。
【０２００】
PUFA PKSシステムにおける機能性ドメインまたはタンパク質の活性を増加させることの言及は、そのドメインまたはタンパク質システムの増加した機能性を生じるそのドメインまたはタンパク質を含む(またはそのドメインもしくはタンパク質が導入されることになっている)生物におけるいずれの遺伝的改変をもいい、そのドメインまたはタンパク質のより高い活性(例えば、特異的活性またはインビボでの酵素活性)、そのドメインまたはタンパク質システムの低下した抑制または分解、およびそのドメインまたはタンパク質の過剰発現を含むことができることを留意すべきである。例えば、遺伝子コピー数は増加されうるか、発現レベルはその天然のプロモーターのレベルより高い発現レベルを与えるプロモーターの使用により増加されうるか、または遺伝子は、その遺伝子によりコードされるドメインもしくはタンパク質の活性を増加させるように遺伝子操作もしくは古典的な突然変異誘発により変化されうる。
【０２０１】
同様に、PUFA PKSシステムにおける機能性ドメインまたはタンパク質の活性を減少させることの言及は、そのドメインまたはタンパク質の減少した機能性を生じるそのようなドメインまたはタンパク質を含む(またはそのドメインもしくはタンパク質が導入されることになっている)生物におけるいずれの遺伝的改変をもいい、そのドメインまたはタンパク質の減少した活性、そのドメインまたはタンパク質の増加した抑制または分解、およびそのドメインまたはタンパク質の発現の低下もしくは消失を含む。例えば、本発明のドメインまたはタンパク質の作用は、そのドメインもしくはタンパク質の産生を遮断することもしくは低下させること、そのドメインもしくはタンパク質をコードする遺伝子もしくはその部分を「ノックアウトすること」、ドメインもしくはタンパク質活性を低下させること、またはそのドメインもしくはタンパク質の活性を阻害することにより減少されうる。ドメインまたはタンパク質の産生を遮断することまたは低下させることは、増殖培地において誘導化合物の存在を必要とするプロモーターの制御下にそのドメインまたはタンパク質をコードする遺伝子を配置することを含みうる。その誘導物質が培地から涸渇してしまうような条件を確立することにより、そのドメインまたはタンパク質をコードする遺伝子の発現(およびそれゆえに、タンパク質合成の発現)を止めることができる。ドメインまたはタンパク質の活性を遮断することまたは低下させることはまた、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,743,546号に記述される方法と類似した切除技術方法を用いることを含みうる。この方法を用いるために、対象となるそのタンパク質をコードする遺伝子は、そのゲノムからのその遺伝子の特定の制御された切除が可能となる特定の遺伝子配列の間にクローニングされる。切除は、例えば、米国特許第4,743,546号のように、培養の培養温度における転換により、またはいくらかの他の物質的もしくは栄養的シグナルにより促進することができる。
【０２０２】
本発明の1つの態様では、遺伝的改変は、内因的に(天然に)発現されるPUFA PKSシステムのタンパク質またはドメインをコードする核酸配列の改変を含み、それによって、そのようなシステムを天然に含む微生物は、例えば、古典的な突然変異誘発および選択技術ならびに/または遺伝子操作技術を含む分子遺伝学的技術により遺伝的に改変される。遺伝子操作技術は、例えば、内因性遺伝子の一部分を欠失させるための、または内因性遺伝子の一部分を異種配列と交換するためのターゲッティング組換えベクターの使用を含むことができる。宿主ゲノムに導入できる異種配列の例としては、異なるPUFA PKSシステム(細菌性または非細菌性)、I型PKSシステム(反復もしくはモジュール)、II型PKSシステム、またはIII型PKSシステムなどの別のPKSシステム由来の少なくとも1つの機能性ドメインをコードする配列が挙げられる。宿主のゲノムに導入するための他の異種配列は、コアPKSシステムのドメインではないが、内因性PKSシステムの活性に影響を与えうるタンパク質または機能性ドメインをコードする配列を含む。例えば、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードする核酸分子を宿主ゲノムに導入することができる(以下で考察する)。内因性PUFA PKSシステムに対して作出されうる特異的な改変を以下で詳細に考察する。
【０２０３】
本発明のこの態様の別の局面では、遺伝的改変は、(1) PUFA PKSシステムの少なくとも1つのドメインの生物活性を有するアミノ酸配列をコードする組換え核酸分子の同種もしくは異種宿主細胞もしくは生物への導入; および/または(2) PUFA PKSシステムの活性に影響を及ぼすタンパク質もしくは機能性ドメインをコードする組換え核酸分子の宿主細胞もしくは生物への導入を含む。宿主は、(1) 宿主細胞にPUFA PKSシステムのすべての機能性ドメインが導入される、PUFAの産生のためのいずれのPKSシステムも発現しない宿主細胞または生物; (2) 細胞または宿主に少なくとも1つのさらなるPUFA PKSドメインまたはタンパク質が導入される、PUFAの産生のためのPKSシステム(内因性もしくは組換え)を発現する宿主細胞を含むことができる。言い換えれば、本発明は、生物が本明細書において記述される少なくとも1つのPUFA PKSドメインもしくはタンパク質を含むかまたは本明細書において記述の再合成されたおよび/もしくはキメラPUFA PKSドメインもしくはタンパク質を産生するように改変されている、任意の遺伝的に改変された細胞または生物(例えば、微生物もしくは植物)を含むよう意図される。
【０２０４】
それゆえ、本明細書において提供される指針、ならびに本明細書において記述されるおよび本発明の前から知られているPUFA PKSシステムに関する記述を用いて、例えば、本明細書において詳細に記述されるキメラタンパク質および/またはキメラPUFA PKSシステムの作出による遺伝子混合(または核酸分子の混合)を用いて、PUFA PKSシステムを発現する生物による、PUFA産物の範囲、その比率、およびその産生レベルを拡げることができる。例えば、本明細書において提供される教示を用いて、産生されるPUFAの量を改善すること、ω-3対ω-6 PUFAの比率を含む1つのPUFAのもう1つのものとの比率を変化させること、ならびにEPA、DPA (n-3またはn-6)、DHA、ARA、GLA、SDAおよびその他のものを含むようPUFA PKS産物の範囲を拡大させることも、抗生物質、その他の薬学的化合物、およびその他の所望の産物を含む多種多様な生物活性分子を産生させることもできる。これらの改善を達成するための方法には、さまざまな生物由来の遺伝子の混合だけではなく、本明細書において開示されるPUFA PKS遺伝子および核酸分子を遺伝的に改変するさまざまな方法も含まれる。本明細書において記述されるPUFA PKSシステムの遺伝的な根拠およびドメイン構造に関する知識によって、新規の遺伝的に改変された生物を設計するための基礎が提供される。例として、PUFA PKSシステムの種々の可能な操作は、遺伝的改変および生物活性分子の産生に関して前記の、米国特許出願公開第20020194641号、米国特許出願公開第20040235127号、および米国特許出願公開第20050100995号のなかで考察されている。しかしながら、本発明は、宿主生物によるPUFA産生レベルの操作および宿主生物により産生されるPUFAの比率の操作に関する新規の態様を提供する。
【０２０５】
したがって、本発明に含まれるのは、生物において、本発明によるPUFA PKSシステムの少なくとも1つの機能性ドメインの生物活性を有するアミノ酸配列をコードする少なくとも1つの核酸配列を遺伝的に改変することにより、および/またはそのようなアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの組換え核酸分子を発現することにより、微生物または植物の細胞を遺伝的に改変するための方法である。そのような配列のさまざまな態様、生物を遺伝的に改変するための方法、および特異的な改変は、上記で詳細に記述されている。典型的には、その方法は、特定の生物活性分子を産生する特定の遺伝的に改変された生物を作出するために用いられる。
【０２０６】
本発明の1つの態様では、突然変異誘発プログラムを選択的スクリーニング工程と組み合わせて、関心対象の生物活性分子を得ることができると考えられる。これは、生物活性化合物の範囲を探索するための方法を含む。この探索は、シス二重結合を有するそれらの分子の産生に制限されるものではない。突然変異誘発法には、化学的突然変異誘発、遺伝子シャッフリング、特定の酵素ドメインをコードする遺伝子の領域のスイッチング、またはそれらの遺伝子の特定の領域に制限された突然変異誘発、およびその他の方法が含まれうるが、これらに限定されることはない。
【０２０７】
例えば、高処理の突然変異誘発法を用いて、所望の生物活性分子の産生に影響を及ぼすまたはその産生を最適化することができる。効果的なモデルシステムが開発されたら、高処理の様式でこれらの遺伝子を改変することができよう。これらの技術の利用は二つのレベルで構想されうる。第一に、関心対象の産物(例えば、ARA)の産生についての十分に選択的なスクリーニングを工夫できれば、それを(例えば、上記で考察したものなどの他の戦略の代わりに、またはそれに合わせて)用いシステムを変化させてこの産物を産生するように試みることができる。さらに、上記で概略を述べた戦略が、結果として、関心対象の産物を産生する遺伝子のセットを生じたなら、その高処理技術を次いで、そのシステムを最適化するために用いることができる。例えば、導入されたドメインが比較的低い温度でのみ機能するなら、選択方法を工夫して、その制限を取り除くことを可能にすることができる。
【０２０８】
天然の(内因性の、自然の) PUFA PKSシステムに導入しうる、無作為または定方向のいずれかでの、多くの遺伝的改変は結果として、酵素機能の不活化を生じうることが認識される。本発明の好ましい態様は、産物を産生するPUFA PKSシステムの能力を遮断しないそれらの改変のみを選択するためのシステムを含む。例えば、大腸菌のFabB-株は、不飽和脂肪酸を合成することができず、増殖するためには、その通常の不飽和脂肪酸の代わりに用いることができる脂肪酸を培地に補充することが必要になる(Metz et al., 2001、前記を参照のこと)。しかしながら、その株が機能的なPUFA-PKSシステム(すなわち、その大腸菌宿主においてPUFA産物を産生するもの−(Metz et al., 2001、前記、図2A)を参照のこと)で形質転換される場合には、この(培地に補充することの)必要性をなくすことができる。このとき、形質転換されるFabB-株は補充なしで増殖するために機能的なPUFA PKSシステム(不飽和脂肪酸を産生するための)を必要とする。この例において鍵となる要素は、広範囲の不飽和脂肪酸の産生で(分枝鎖脂肪酸のような、不飽和脂肪酸置換体でも)十分なことである。それゆえ、本発明の別の好ましい態様では、本明細書において開示されるPUFA PKS遺伝子の1つまたは複数において多数の突然変異を作出し、その後、適切に改変されたFabB-株を形質転換し(例えば、ERドメインを含む発現構築体において突然変異を作出し、別個のプラスミド上に、または染色体へと組み込まれた他の必須ドメインを有するFabB-株を形質転換し)、培地に補充しなくても増殖する(すなわち、FabB-の欠損を相補しうる分子を産生する能力をまだ保有している)それらの形質転換体のみを選択することができる。活性なPKSシステムのこの選択的サブセットにおいて産生される特定の化合物を探索(例えば脂肪酸ではGCを使用)するために、さらなるスクリーニング法を開発することができる。関心対象の生物活性分子についてのいくつかの類似の選択的スクリーニング法を構想することができよう。
【０２０９】
本発明の1つの態様では、遺伝的に改変された生物は、野生型生物と比べて、内因性PKSシステムにより産生される少なくとも1つの産物を変化させる改変を有する。そのような改変された生物を作出するために用いられる新規の構築体も、このような構築体を用いて作出されるタンパク質および生物、ならびにこのような改変に関連する方法もすべて本発明に含まれる。
【０２１０】
1つの好ましい態様では、遺伝的に改変された生物は、シゾキトリウムまたはスラウストキトリウムのDH2ドメインに相当するβ-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメインにおける遺伝的改変を含むPUFA PKSシステムを発現し、ここでこの改変は、改変のない場合と比べて、PUFA PKSシステムにより産生される、長鎖脂肪酸の比率、詳細には、ω-3 対 ω-6長鎖脂肪酸の比率を変化させる。この態様の1つの局面では、この改変は、ドメインの全部または一部の欠失、異なる生物(例えば、異なる比率および/または量のPUFAを天然に産生する異なる生物)由来の相同なドメインまたはその部分によるドメインの全部または一部の置換、ならびにドメインの突然変異からなる群より選択される。
【０２１１】
より具体的には、本明細書において説明されるように、シゾキトリウムおよびスラウストキトリウムPUFA PKS構造(ドメイン構成)と他のPUFA PKSシステムの構造との比較から、ドメインの順序を変化させておよび新たなドメインを取り込んで、例えば、新規の最終産物を作出する、または最終産物の比率を変化させる自然の能力が明らかである。さらに、現在では、遺伝子を実験室で操作して、実施例において記述されるように、新たな産物を作出することもできる。本発明者らは、今回、この能力を利用できること、およびそれを用いて新規のPUFAプロファイルおよび産生量を有する新規の生物を作出できることを実証した。本明細書において記述されるのは、最終産物に影響を及ぼす定方向または無作為のいずれかの様式でのPUFA PKSシステムの操作である。例えば、好ましい態様では、第二のPUFA PKSシステムによって産生されるPUFAの比率を変化させるために、詳細には、第二のPUFA PKSシステムによって産生されるω-3 対 ω-6脂肪酸の比率を操作するために、第一のPUFA PKSシステムのDH (FabA様)ドメインまたはその生物活性部分、具体的には、本明細書において記述されるDH2ドメインを、異なる第二のPUFA PKSシステムにおける相同なDHドメインまたはその生物活性部分に代えて使用する。第一のPUFA PKSシステム由来のそのようなDH2ドメインを含むタンパク質全体またはその任意の生物活性部分(例えば、スラウストキトリウム23B由来のOrfC)を、第二のPUFA PKSシステムにおける相同なタンパク質またはその部分の代わりに用いることによって、類似の結果を達成することができる。本明細書において記述される例ではシゾキトリウムおよびスラウストキトリウム由来のPUFA PKSシステムを用いるが、DH2タンパク質またはDH2様ドメインの改変によるPUFAの産生のための任意のPKSまたはPKS様のシステムの類似の操作は、本発明に含まれる。そのような改変は、単独でまたはPUFA PKSシステムに対する他の改変と併せて行うことができる。
【０２１２】
したがって、本発明の1つの態様は、キメラPUFA PKSシステムおよびこのようなキメラPUFA PKSシステムを発現する生物を含む。1つの局面では、キメラPUFA PKSシステムは、第一のPUFA PKSシステムを含み、(例えば、本明細書において記述されるシゾキトリウムまたはスラウストキトリウム由来の) DH2ドメインまたはその生物活性部分に相当するこの第一のPUFA PKSシステムのドメインまたはタンパク質が、第二の異なるPUFA PKSシステム由来のDH2ドメインもしくはタンパク質またはその生物活性部分で改変または置換されている。「異なるPUFA PKSシステム」とは、異なる菌株、種、属もしくは生物由来のPUFA PKSシステム、または場合により天然もしくは野生型PUFA PKSシステムの相同体を意味する。このキメラタンパク質を産生することの目的は、PUFA PKSシステムにより産生されるPUFAの比率、詳細には、ω-3 対 ω-6 PUFAの比率を変化させることである。それゆえ、異なるPUFA PKSシステムの選択は、第一のPUFA PKSシステムとは異なるまたはそれよりも望ましい比率のPUFAを産生する第二のシステムの選択に基づくべきである。
【０２１３】
本発明の1つの局面では、そのようなキメラPUFA PKSシステムは、本明細書において記述のシゾキトリウムOrfA (SEQ ID NO:2)およびOrfB (SEQ ID NO:4)タンパク質、ならびにスラウストキトリウムOrfC (SEQ ID NO:62)タンパク質を含む。そのようなキメラPUFA PKSシステムを発現するシゾキトリウム、大腸菌、および酵母生物は、そのようなキメラPUFA PKSシステムを発現する植物および植物の部分に加えて、実施例に記述されており、本発明に含まれる。実施例に例示された、他の態様では、シゾキトリウムおよびスラウストキトリウムOrfA、BおよびCのすべての組み合わせを含むキメラPUFA PKSシステムが産生される。
【０２１４】
本発明の別の局面では、キメラPUFA PKSシステムは、本明細書において記述のシゾキトリウムOrfA (SEQ ID NO:2)およびOrfB (SEQ ID NO:4)タンパク質、ならびにキメラOrfCタンパク質(SEQ ID NO:73によってコードされる、SEQ ID NO:74により本明細書において表される核酸配列によってコードされる)を含む。キメラOrfCポリペプチドは長さが1493アミノ酸残基である。SEQ ID NO:74のアミノ酸番号516-1041として定義されるDH2領域は、Th.23B OrfCタンパク質のDH2領域、すなわち、SEQ ID NO:66の全部およびSEQ ID NO:62由来のいくつかの隣接するアミノ酸配列を含む、SEQ ID NO:62のアミノ酸番号491-1016のアミノ酸配列からなる。キメラOrfCアミノ酸配列の残部に関して、SEQ ID NO:74の残基番号1-515および1042-1493は、それぞれ、SEQ ID NO:6のシゾキトリウムOrfCの残基番号1-515および1051-1502と同一である。
【０２１５】
本発明の別の態様では、遺伝的に改変された細胞または生物は、キメラPUFA PKSシステムを含むPUFA PKSシステムまたはその部分を発現するように改変されており、ここでこのPUFA PKSシステムまたはその部分をコードする核酸配列は、宿主細胞または生物の好ましいコドン使用を利用するために全体的にまたは部分的に最適化される。この態様は、以下で例示されており、そのような改変を作出することによって生物活性分子(例えば、PUFA)の産生がいかにして増大されうるかを例証する。この態様を本明細書において記述される他の遺伝的改変(例えば、キメラPUFA PKSおよびタンパク質の態様)とともに利用して、宿主生物における生物活性分子の産生を改善することができる。
【０２１６】
この態様の1つの局面では、キメラPUFA PKSシステムは、本明細書において記述のシゾキトリウムOrfA (SEQ ID NO:2)およびOrfB (SEQ ID NO:4)タンパク質、ならびに本明細書において記述のスラウストキトリウムOrfC (SEQ ID NO:62)タンパク質を含み、ここでSEQ ID NO:62をコードする核酸配列が宿主のコドン使用のために最適化される。シゾキトリウムにおける発現のために最適化されたそのような分子の例が、本明細書においてSEQ ID NO:70により表されるスラウストキトリウムOrfCをコードするそのような核酸配列(合成による、またはコドン最適化された、OrfC)により、実施例に記述されている。別の態様では、スラウストキトリウムOrfA (SEQ ID NO:39)および/またはスラウストキトリウムOrfB (SEQ ID NO:52)を、シゾキトリウムにおける発現のために、シゾキトリウムOrfA、Bおよび/もしくはCのいずれか1つもしくは複数と、および/またはスラウストキトリウムOrfCと組み合わせることができる。この場合もやはり、この例において、スラウストキトリウムOrfAおよび/またはスラウストキトリウムOrfBをコードする核酸分子を、宿主のコドン使用のために最適化することができる。シゾキトリウムにおける発現のために最適化されたそのような分子の例は、本明細書においてSEQ ID NO:71により表されるスラウストキトリウムOrfAをコードする核酸配列(合成によるOrfAまたはコドン最適化されたOrfA)により、および本明細書においてSEQ ID NO:72により表されるスラウストキトリウムOrfBをコードする核酸配列(合成によるOrfBまたはコドン最適化されたOrfB)により、実施例に記述されている。
【０２１７】
この態様の別の局面では、キメラPUFA PKSシステムは、本明細書において記述のシゾキトリウムOrfA (SEQ ID NO:2)およびOrfB (SEQ ID NO:4)タンパク質、ならびにキメラのOrfCタンパク質および部分的にコドン最適化されたOrfCタンパク質(本明細書においてSEQ ID NO:75により表される核酸配列によってコードされる)を含む。SEQ ID NO:75によってコードされるタンパク質は、SEQ ID NO:73に関して前述した、SEQ ID NO:74によっても表される。しかしながら、この場合は、スラウストキトリウムに由来する、SEQ ID NO:66 (DH2ドメイン)をコードする核酸配列の部分が、実施例において記述されるようにシゾキトリウムにおける発現のために最適化されている。
【０２１８】
大腸菌、酵母および植物で用いるコドン最適化された他の核酸配列は、以上におよび実施例のなかで以下に記述されている。
【０２１９】
別の態様では、遺伝的に改変された生物は、PUFA PKSシステムにより産生される脂肪酸の鎖長を調節するタンパク質をコードする組換え核酸分子で生物をトランスフェクトすることによって改変された。例えば、PUFA PKSシステムにより産生される脂肪酸の鎖長を調節するタンパク質は、C20単位および/またはC22単位の合成を指令する鎖長因子でありうる。
【０２２０】
別の態様では、遺伝的に改変された生物は、エノイル-ACPレダクターゼ(ER)ドメインにおける改変を含むPUFA PKSシステムを発現し、ここでこの改変は結果的に、改変のない場合と比べて異なる化合物の産生をもたらす。この態様の1つの局面では、改変はERドメインの全部または一部の欠失、ERドメインに代えて異なる生物由来のERドメインを用いること、およびERドメインの突然変異からなる群より選択される。
【０２２１】
本発明の1つの態様では、遺伝的に改変された生物は、遺伝的改変のない天然生物とは異なる多価不飽和脂肪酸(PUFA)プロファイルを生じる。
【０２２２】
生物活性分子を産生するのに有用なその他多くの遺伝的改変は、本開示を考慮すれば、当業者には明らかであり、さまざまな他の改変が本明細書において先に考察されている。本発明は、所望の生物活性分子の産生をもたらす本明細書において記述のPUFA PKSシステムに関連する任意の遺伝的改変を企図する。
【０２２３】
上記のように、本発明の1つの態様では、遺伝的に改変された微生物または植物などの、遺伝的に改変された生物は、所望の生物活性分子(産物)を合成する能力の増強を有する生物または特異的な産物を合成する(例えば、PUFAを合成する、異なるプロファイルのPUFAを合成する、または特異的な抗生物質を合成する)新たに導入された能力を有する生物を含む。本発明によれば、産物を「合成する能力の増強」とは、微生物または植物が同じ条件の下で、培養されたまたは増殖された野生型の微生物または植物と比べ、(以前にはなかった産物の任意の産生を含め)増加した量の産物を産生するような、産物の合成に関連する経路における任意の増強、または上方制御のことをいう。そのような遺伝的に改変された生物を作出する方法は、上記で詳細に記述されている。1つの好ましい態様では、本発明は、植物がPUFAを産生するように、少なくともコアPUFA PKS酵素複合体および、1つの態様では、少なくとも1つのPUFA PKSアクセサリータンパク質(例えば、PPTase)を含む、遺伝的に改変された植物または植物の部分(例えば、ここで植物は本明細書において記述される、キメラPUFA PKSシステムを含むPUFA PKSシステムを発現するように遺伝的に改変されている)に関する。好ましくは、植物は油料種子植物であり、ここで油料種子または油料種子中の油はPUFA PKSシステムによって産生されるPUFAを含む。そのような油は、PUFA PKSシステムの産物である、検出可能な量の少なくとも1つの標的PUFAまたは主PUFAを含む。
【０２２４】
本発明者らは、シゾキトリウム由来のPUFA PKSシステムおよびPUFA PKSのアクセサリー酵素である4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)をコードする遺伝子を発現するように遺伝的に改変された植物におけるPUFAの産生を実証した(例えば、米国特許出願公開第20070089199号、前記を参照のこと)。これらの植物によって産生される油は、PUFA PKS遺伝子の由来となったシゾキトリウムによって産生される主たるPUFA (主PUFA)である、DHA(ドコサヘキサエン酸(C22:6、n-3))およびDPA (ドコサペンタエン酸(C22:5、n-6)の両方を有意な量で含む。意義深いこととして、PUFA PKS経路を用いてPUFAを産生する植物からの油が、上記の「標準的」経路によって同じPUFAを産生するように遺伝的に操作された植物とは異なる脂肪酸プロファイルを有する。詳細には、PUFA PKS経路によって特定のPUFAを産生するように遺伝的に操作された植物からの油は、標準的PUFA合成経路の使用の結果として産生される油の中に蓄積するさまざまな中間産物および副産物を実質的に含まない。この特徴については以下で詳細に考察する。
【０２２５】
より詳細には、「標準的」経路(上記の)によって植物において長鎖PUFAを産生させるための取り組みは、この合成経路によって要求される同じ基本的なアプローチを採用している。これらの取り組みは、さまざまなエロンガーゼおよびデサチュラーゼをコードする遺伝子の導入による、植物の内因性の脂肪酸の改変に依拠している。植物は典型的には、そのプラスチド内のII型脂肪酸シンターゼ(FAS)を介して、18炭素脂肪酸(例えば、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸)を産生する。多くの場合は、その脂肪酸がACPと結合する時に単一の二重結合が形成され、続いて、アシル-ACPチオエステラーゼの作用によってオレイン酸(18:1)がACPから切断される。遊離脂肪酸は、プラスチドから搬出されてアシル-CoAへと変換される。18:1はエステル化されてホスファチジルコリン(PC)となることができ、最大でさらに2つのシス二重結合が付加されうる。新たに導入されたエロンガーゼは、アシル-CoAプール中の基質を利用して、炭素2個ずつの増分で炭素を付加することができる。新たに導入されたデサチュラーゼは、エステル化されてPCとなった脂肪酸、またはアシル-CoAプール中のもののいずれかを、酵素の源に応じて利用する。しかし、長鎖PUFA生成に関するこの方式の1つの帰結は、経路において中間体または副産物が蓄積し、標的長鎖PUFAではなくそれらが往々にして植物油における新規脂肪酸の大半に相当することである。
【０２２６】
例えば、上記のような標準的または古典的な経路を用いて、標的PUFA産物(すなわち、標準的な経路を用いることによって、生成のための標的とされるPUFA産物、生成させようと試みられるPUFA産物または生成させようと企てられるPUFA産物)が、例えばDHAまたはEPA(例えば、FASシステムの産物からDHAまたはEPAを生成すると考えられるエロンガーゼおよびデサチュラーゼを用いて、生成される)である場合は、DHAまたはEPAに加えて種々の中間産物および副産物が生成されると考えられ、これらの中間体または副産物は往々にして、経路によって生成される産物の大半に相当し、産生生物における脂質中に少なくとも有意な量で存在すると考えられる。そのような中間体および副産物には、標的PUFAまたは主PUFAよりも少数の炭素および/または二重結合を有する脂肪酸が非限定的に含まれ、標的PUFAまたは主PUFAと同じ数の炭素を有しうるものの特異な位置に二重結合を有する特異な脂肪酸副産物も含まれうる。例として、標準的経路を用いたEPAの産生(例えば、米国特許出願公開第2004/0172682号を参照)において、経路の標的PUFAはEPA(すなわち、EPAを産生するFASシステムの産物に対して特異的に作用するエロンガーゼおよびデサチュラーゼの使用に起因する)であるものの、システムによって産生される油には、以下を含む種々の中間体および副産物が含まれる: γ-リノレン酸(GLA; 18:3、n-6); ステアリドン酸(STAまたはSDA; 18:4、n-3); ジホモ-γ-リノレン酸(DGLAまたはHGLA; 20:3、n-6)、アラキドン酸(ARA、C20:4、n-6); エイコサトリエン酸(ETA; 20:3、n-9)およびさまざまな他の中間体または副産物、例えば、20:0; 20:1(Δ5); 20:1(Δ11); 20:2(Δ8,11); 20:2(Δ11,14); 20:3(Δ5,11,14); 20:3(Δ11,14,17); ミード酸(20:3; Δ5,8,11); または20:4(Δ5,1,14,17)など。システムの中間体には、遺伝的改変の標的でない長鎖PUFAも含まれうる(例えば、DHAを産生するための標準的経路の酵素システムは、実際には、DHAよりも中間産物としてのEPAをより多く産生する可能性がある)。
【０２２７】
それに対して、本発明のPUFA PKSシンターゼは、FASシステムの脂肪酸産物を利用しない。その代わりに、それは最終的なPUFA産物(主PUFA産物)を、FASおよびエロンガーゼ(マロニル-CoA)によって利用されるのと同じ低分子量の前駆体分子から産生する。したがって、合成サイクルにおける中間体は有意な量では放出されず、PUFA産物(本明細書においては主PUFA産物ともいわれる)は脂質のリン脂質(PL)およびトリアシルグリセロール(TAG)画分に効率的に移行する。実際に、PUFA PKSシステムは2つの標的PUFA産物または主PUFA産物を産生するが(例えば、シゾキトリウム由来のPUFA PKSシステムはDHAおよびDPA n-6の両方を主産物として産生する)、DPAはDHAを産生するための経路における中間体ではない。そうではなくて、それぞれが同じPUFA PKSシステムにおける別個の産物である。このため、本発明のPUFA PKS遺伝子は、植物などの異種宿主においてPUFA、特にLCPUFAを含む油を産生させる優れた手段であり、この場合に油は「標準的」なPUFA経路によって産生される油に混入する副産物も中間体も実質的に含まない(以下に定義する)。
【０２２８】
したがって、本明細書において記述したような植物の遺伝子操作を介して、多価不飽和脂肪酸を、ひいては、そのような植物から得られる、これらのPUFAを含む油(例えば、そのような植物の油料種子から得られる)を産生することは、本発明の1つの目的である。本発明によって産生されうるPUFAの例としてはDHA (ドコサヘキサエン酸(C22:6、n-3))、ARA (エイコサテトラエン酸またはアラキドン酸(C20:4、n-6))、DPA (ドコサペンタエン酸(C22:5、n-6またはn-3))およびEPA (エイコサペンタエン酸(C20:5、n-3))が挙げられるが、これらに限定されることはない。本発明は、PUFAを産生する、本発明のポリケチドシンターゼシステム、およびその成分の使用を通じての、本発明者らによる遺伝的に改変された植物の開発により、1つまたは複数の所望の(標的または主) PUFAに富む商業的に価値のある脂質の産生を可能にする。
【０２２９】
本発明によれば、「主PUFA」、「標的PUFA」、「意図したPUFA」または「所望のPUFA」への言及は、PUFAを産生するために用いられる酵素経路の意図した、または標的とする産物である特定の1つまたは複数のPUFAのことをいう。例えば、FASシステムの産物を改変するためにエロンガーゼおよびデサチュラーゼを用いる場合には、一緒に用いた場合に標的または所望のPUFA (例えば、DHAまたはEPA)を産生する、エロンガーゼおよびデサチュラーゼの特定の組み合わせを選択することができる。以上に考察したように、標準的経路によって産生されるそのような標的または所望のPUFAは、そのシステムによって産生される産物の大半を実際には占める中間体および副産物の形成のため、システムによって産生される全脂肪酸に占めるパーセンテージとしてのPUFAの量という点では、実際には「主」PUFAではない。しかし、システムにおいて用いられるエロンガーゼまたはデサチュラーゼによって産生される標的または意図したPUFA産物に言及する場合であっても、「主PUFA」という用語を用いてもよい。
【０２３０】
本発明において好ましいようにPUFA PKSシステムを用いる場合、特定の生物に由来する所定のPUFA PKSシステムは、特定の生物由来のPUFA PKSシステムの選択が指定の標的PUFAまたは主PUFAの産生をもたらすと考えられるように、特定のPUFAを産生すると考えられる。例えば、シゾキトリウム由来のPUFA PKSシステムの使用は、標的PUFAまたは主PUFAとしてのDHAおよびDPAn-6の産生をもたらすと考えられる。一方、さまざまなシュワネラ種由来のPUFA PKSシステムの使用は、標的PUFAまたは主PUFAとしてのEPAの産生をもたらすと考えられる。主PUFAまたは標的PUFAの比は、特定のPUFA PKSシステムの選択、およびそれが発現される具体的な条件に対してそのシステムがどのように応答するかに応じて異なりうることを留意されたい。例えば、スラウストキトリウム23B (ATCC番号20892)由来のPUFA PKSシステムも、標的PUFAまたは主PUFAとしてのDHAおよびDPAn-6の産生をもたらすと考えられるが、しかし、スラウストキトリウム23Bの場合には、DHAとDPAn-6との比は約10:1であり(約8:1〜約40:1の範囲にわたりうる)、一方、シゾキトリウムでは、この比は典型的には約2.5:1である。したがって、スラウストキトリウムのPUFA PKSシステムまたはタンパク質もしくはドメインの使用は、標的PUFAがたとえ同じであっても、シゾキトリウムと比較して、生物によって産生されるPUFAの比を変化させることができる。しかしながら、上記の詳細の通り、さまざまなタンパク質およびドメインの、他のPUFA PKSシステムまたは他のPKSシステム(PUFA以外の生物活性分子を産生する)由来のタンパク質およびドメインとの使用を組み合わせて(「混ぜ合わせかつ適合させて」)、キメラタンパク質および/またはキメラPUFA PKSシステム(上記の)を作出し、異なるPUFAの種類、量、および/または1つのPUFAのもう1つのものとの比率を含む異なるPUFAプロファイルの作出をもたらすことができる。
【０２３１】
本発明のPUFA PKSシステムを用いる場合、植物などの生物により産生される油は、標的PUFA産物または主PUFA産物ではない、かつ、野生型の生物において内因性FASシステムにより天然には産生されない、中間体または副産物を実質的に含まない(例えば、野生型の植物はFASシステムを介して、18炭素PUFAのようないくぶん短鎖のまたは中鎖のPUFAを産生するが、しかしPUFA PKSシステムによる遺伝的改変の結果として植物において産生される新しい、またはさらなる、脂肪酸が含まれる)。言い換えれば、野生型植物(遺伝的に改変されていない)または指定された遺伝的改変の受け手として用いられる親植物に由来する全脂肪酸のプロファイルと比べて、本発明のPUFA PKSシステム(またはその成分)で遺伝的に改変された植物により産生される全脂肪酸のプロファイルにおける追加的な脂肪酸の大部分には、PUFA PKSシステムの標的のまたは意図したPUFA産物が含まれる(すなわち、遺伝的に改変された植物により産生される全脂肪酸中の追加的な脂肪酸の大半は、標的としたPUFAである)。
【０２３２】
本発明によれば、PUFAを産生する酵素システムの「中間産物」または「副産物」への言及は、システムの標的PUFAまたは主PUFAの産生の結果として酵素システムによって産生されるが、主PUFAまたは標的PUFAではない任意の産物、特に脂肪酸産物のことをいう。1つの態様では、中間産物および副産物には、野生型植物によって、または指定された遺伝的改変の受け手として用いられる親植物によって天然に産生されるが、野生型植物によって、または指定された遺伝的改変の受け手として用いられる親植物によって産生されるレベルと比較して、遺伝的改変の結果としてより上回るレベルで産生されることからここでは中間産物または副産物として分類される、標的でない脂肪酸が含まれうる。以上に考察したように、中間産物および副産物はPUFA合成のための標準的経路において特に意味が大きく、PUFA PKS経路においては実質的に意味が小さい。1つの酵素システムの主PUFAまたは標的PUFAは、主または標的産物が異なるPUFAである異なる酵素システムの中間体でありうることを留意されたいが、PUFA PKSシステムは中間体の産生を実質的に回避するため、これは特にPUFA産生の標準的経路の産物について言えることである。例えば、EPAを産生するための標準的経路を用いる場合には、GLA、DGLAおよびSDAなどの脂肪酸が中間産物として有意な量で産生される(例えば、米国特許出願公開第2004/0172682号はこの点を例証している)。同様に、米国特許出願公開第2004/0172682号によっても例証されているように、DHAを産生するための標準的経路を用いる場合には、上述した脂肪鎖に加えて、ETAおよびEPA (上記の第1の例における標的PUFAであることに注目)が有意な量で産生され、実際に、全脂肪酸産物に占める比率として標的PUFAそれ自体よりも有意に多い量で存在しうる。この後者の点は米国特許出願公開第2004/0172682号でも示されており、そこでは、標準的経路によってDHAを産生するように操作された植物が、全脂肪酸に占めるパーセンテージとして、標的としたDHAよりも多くのEPAを産生した。
【０２３３】
さらに、PUFAを合成するためのシステムの中間産物もしくは副産物を「実質的に含まない」、または実質的な量で存在する中間産物もしくは副産物を有しないとは、PUFAを産生するための酵素システムの導入または存在の結果として、遺伝的に改変された植物(および/または植物の部分および/または種子油画分)において産生された、任意の中間産物または副産物の脂肪酸(標的でないPUFA) (すなわち、野生型植物または指定された遺伝的改変の受け手として用いられる親植物によっては産生されない)が、植物によって産生される全脂肪酸の約10重量%未満、およびより好ましくは植物によって産生される全脂肪酸の約9重量%未満、およびより好ましくは約8重量%未満、およびより好ましくは約7重量%未満、およびより好ましくは約6重量%未満、およびより好ましくは約5重量%未満、およびより好ましくは約4重量%未満、およびより好ましくは約3重量%未満、およびより好ましくは約2重量%未満、およびより好ましくは約1重量%未満、およびより好ましくは植物によって産生される全脂肪酸の約0.5重量%未満で存在することを意味する。
【０２３４】
好ましい態様では、PUFAを合成するためのシステムの中間産物もしくは副産物を「実質的に含まない」、または実質的な量で存在する中間産物もしくは副産物を有しないとは、PUFAを産生するための酵素システムの結果として、遺伝的に改変された植物(および/または植物の部分および/または種子油画分)において産生された、任意の中間産物または副産物の脂肪酸(すなわち、野生型植物または標的PUFAの産生のための指定された遺伝的改変の受け手として用いられる親植物によっては産生されない)が、植物によって産生される追加的な全脂肪酸(追加的な脂肪酸は、野生型植物または標的PUFAの産生のための指定された遺伝的改変の受け手として用いられる親植物によって天然に産生される脂肪酸または脂肪酸のレベルと定義される)の約10重量%未満、およびより好ましくは、植物によって産生される追加的な全脂肪酸の約9重量%未満、およびより好ましくは約8重量%未満、およびより好ましくは約7重量%未満、およびより好ましくは約6重量%未満、およびより好ましくは約5重量%未満、およびより好ましくは約4重量%未満、およびより好ましくは約3重量%未満、およびより好ましくは約2重量%未満、およびより好ましくは約1重量%未満で存在することを意味する。したがって、標準的経路を介してPUFAを産生するように遺伝的に改変された植物の脂肪酸プロファイルとは対照的に、PUFA PKSシステムによる遺伝的改変に起因する脂肪酸産物の大半は、標的としたまたは意図した脂肪酸産物であると考えられる。
【０２３５】
PUFA PKSシステムの標的産物が、本明細書において記述される本発明のPUFA PKSシステムによって産生されるDHAまたはDPA (n-6もしくはn-3)などの、長鎖PUFAである場合、そのようなPUFA PKSで遺伝的に改変された植物の全脂質中に実質的な量では存在しない中間産物および副産物には、γ-リノレン酸(GLA; 18:3、n-6); ステアリドン酸(STAまたはSDA; 18:4、n-3); ジホモ-γ-リノレン酸(DGLAまたはHGLA; 20:3、n-6)、アラキドン酸(ARA、C20:4、n-6); エイコサトリエン酸(ETA; 20:3、n-9)およびさまざまな他の中間産物または副産物、例えば20:0; 20:1 (Δ5); 20:1 (Δ11); 20:2 (Δ8,11); 20:2 (Δ11,14); 20:3 (Δ5,11,14); 20:3 (Δ11,14,17); ミード酸(20:3; Δ5,8,11); または20:4 (Δ5,1,14,17)などが含まれうるが、これらに限定されることはない。加えて、標的産物がDHAなどの特定のPUFAである場合には、遺伝的に改変された植物の全脂質中に実質的な量では存在しない中間産物および副産物には、この例におけるEPAのような、異なるPUFA PKSシステムの天然産物である他のPUFAを含む他のPUFAも含まれる。いくつかのシステムでは、PUFA PKSシステムは、C22およびC20の両方のPUFAなどの複数のPUFAを作出することができ、PUFAのそのような組み合わせは標的産物となりうる一方で、他のPUFAが中間産物または副産物となりうる。(本明細書において記述されるPUFA PKSシステムの成分を用いて油が産生される態様に関して)本発明のPUFA PKSシステムを、所望であれば、標的PUFAとしてGLA、SDAまたはDGLAを含みうるPUFAを産生させるために用いることもできることに留意すべきである。
【０２３６】
本明細書において記述したようなPUFA PKSシステムの遺伝的基盤およびドメイン構造に関する知識を用いて、本発明者らは、そのようなPUFA PKSシステムをコードする構築体を設計および作出しており、PUFA PKSシステムを発現するトランスジェニック植物を作出することに成功した。これらのトランスジェニック植物は、PUFAを含む油を産生し、その油は標準的PUFA経路において蓄積する中間産物を実質的に含まない(米国特許出願公開第20070089199号、前記を参照のこと)。本発明者らはまた、トランスジェニック植物の作出の前に、概念実証実験として、大腸菌において、および同様に別の真核生物である酵母においてPUFAを産生させるための構築体の使用についても実証している(米国特許出願公開第20070089199号、前記)。それらの例は、標的PUFAとしてDHAおよびDPAn-6を生成するPUFA PKSシステムによる酵母および植物の形質転換がいずれも、これらのPUFAの両方を植物および酵母の全脂肪酸における主要な追加的な脂肪酸として産生すること(すなわち、野生型植物で産生される脂肪酸は差し引かれる)、ならびに、野生型植物の脂肪酸中に存在しない他の脂肪酸はいずれも事実上検出不能であったことを実証している。本発明の遺伝的に改変された植物ならびにその部分および油の具体的な特徴については、本明細書の他の箇所に詳細に記述されている。
【０２３７】
したがって、本発明の1つの態様は、本発明の遺伝的に改変された微生物または遺伝的に改変された植物(上記で詳細に記述される)を増殖させるまたは培養することにより、所望の生物活性分子(産物または化合物ともいわれる)を産生するための方法である。そのような方法は、本明細書において既述のようにおよび本発明により、遺伝的改変を有する微生物または植物をそれぞれ、増殖培地もしくは発酵培地中で培養する段階、または土壌などの適した環境中で増殖させる段階を含む。好ましい態様では、本発明の生物活性分子を産生するための方法は、生物活性分子を産生させるのに効果的な条件の下で、本明細書において記述の多価不飽和脂肪酸(PUFA)ポリケチドシンターゼ(PKS)システムの少なくとも1つの生物活性ドメインを含むPKSシステムを発現する遺伝的に改変された生物を培養する段階を含む。
【０２３８】
本発明の所望の生物活性化合物の産生の方法において、遺伝的に改変された微生物は、生物活性化合物を産生させるのに効果的な条件の下で、適した培地中で培養または増殖される。適切なまたは有効な培地とは、本発明の遺伝的に改変された微生物が、培養される場合、所望の産物を産生することができる任意の培地のことをいう。そのような培地は、典型的には、同化可能な炭素、窒素およびリン酸源を含む水性培地である。そのような培地は、適切な塩、ミネラル、金属およびその他の栄養素を含むこともできる。本発明の微生物は、従来の発酵バイオリアクタ中で培養することができる。微生物は、バッチ、流加培養、細胞再利用、および連続発酵を含むがこれらに限定されない、任意の発酵工程により培養することができる。本発明による潜在的な宿主微生物に好ましい増殖条件は、当技術分野において周知である。遺伝的に改変された微生物により産生された所望の生物活性分子は、従来の分離および精製技術を用いて発酵培地から回収することができる。例えば、発酵培地をろ過または遠心分離して、微生物、細胞残屑およびその他の粒状物質を除去することができ、例えば、イオン交換、クロマトグラフィー、抽出、溶剤抽出、膜分離、電気透析法、逆浸透法、蒸留、化学的誘導体化および結晶化などの従来の方法により、産物を無細胞上清から回収することができる。あるいは、所望の化合物を産生する微生物、またはその抽出物およびさまざまな画分を、産物からの微生物成分の除去なしに用いることもできる。
【０２３９】
本発明の所望の生物活性化合物の産生のための方法において、遺伝的に改変された植物または植物の部分(植物細胞を含む)は、増殖培地中で培養されるか、または必要に応じて、土壌のような適した培地中で増殖される。適切なまたは有効な、増殖培地または培養培地は、上記で詳細に考察されている。高等植物に適した増殖培地は、土壌、砂、根の成長を補助するその他任意の粒状培地(例えば、バーミキュライト、パーライトなど)または水耕栽培、ならびに適した光、水および高等植物の増殖を最適化する栄養補給剤を含むが、これらに限定されない、植物のための任意の増殖培地を含む。本発明の遺伝的に改変された植物は、本発明によって遺伝的に改変されているPUFA PKSシステムの活性を通じてかなりの量の所望の産物を産生するように操作される。化合物は、植物から化合物を抽出する精製工程を通じて回収することができる。好ましい態様では、化合物は植物を収穫することによって回収される。特に好ましい態様では、PUFAは植物または植物の部分からの(例えば、油料種子からの)油を収穫することによって植物または植物の部分から回収される。この態様では、植物はその自然の状態で消費されてもよく、または消費可能な製品へさらに加工処理されてもよい。
【０２４０】
本発明による生物活性分子は、生物活性を有し、かつ本明細書において記述される非細菌性PUFA PKSシステムの少なくとも1つの機能ドメインの生物活性を有する少なくとも1つのアミノ酸配列を含むPKSシステムにより産生可能な任意の分子(化合物、産物など)を含む。そのような生物活性分子は、多価不飽和脂肪酸(PUFA)、抗炎症製剤、化学療法剤、活性賦形剤、骨粗鬆症治療薬、抗鬱薬、抗痙攣薬、抗ヘリコバクター・ピロリ(Heliobactor pylori)薬、神経変性疾患の治療用薬物、変性肝疾患の治療用薬物、抗生物質、およびコレステロール低下製剤を含むことができるが、これらに限定されることはない。本発明の非細菌性PUFA PKSシステムの1つの利点は、シス配置に炭素-炭素二重結合を導入し、分子が3炭素ごとに二重結合を含んでいるそのようなシステムの能力である。この能力をさまざまな化合物を産生するために利用することができる。
【０２４１】
微生物に関して、関心対象の生物活性化合物は、微生物の乾燥重量の約0.05%を超える、および好ましくは約0.1%を超える、およびより好ましくは約0.25%を超える、およびより好ましくは約0.5%を超える、およびより好ましくは約0.75%を超える、およびより好ましくは約1%を超える、およびより好ましくは約2.5%を超える、およびより好ましくは約5%を超える、およびより好ましくは約10%を超える、およびより好ましくは約15%を超える、およびさらにより好ましくは約20%を超える量で、遺伝的に改変された微生物により産生されることが好ましい。脂質化合物の場合、そのような化合物は、微生物の乾燥重量の約5%を超える量で産生されることが好ましい。抗生物質またはもっと少ない量で合成される化合物などの、その他の生物活性化合物は、当業者に公知の量で産生されることができ、そのような化合物を保有する菌株は、本明細書において記述される種類の新規なPKSシステムを予想通り含有すると同定される。
【０２４２】
いくつかの態様では、特定の生物活性分子(化合物)は細胞中に蓄積するのではなく、微生物によって分泌される。それゆえ、そのような生物活性分子は一般に培地から回収され、産生された分子の濃度は、微生物および培養のサイズに応じて変わり、細胞乾燥重量によるよりもむしろ、g/Lで測定することができる。
【０２４３】
好ましくは、本発明の遺伝的に改変された生物(例えば、微生物または植物)は、EPA (C20:5、n-3)、DHA (C22:6、n-3)、DPA (C22:5、n-6またはn-3)、ARA (C20:4、n-6)、GLA (C18:3、n-6)、ALA (C18:3、n-3)、および/またはSDA (C18:4、n-3))を非限定的に含む、1つまたは複数の多価不飽和脂肪酸、より好ましくは、EPA (C20:5、n-3)、DHA (C22:6、n-3)、DPA (C22:5、n-6またはn-3)またはDTA (C22:4、n-6)を非限定的に含む、1つまたは複数の長鎖脂肪酸(LCPUFA)を産生する。1つの特に好ましい態様では、本発明の遺伝的に改変された生物は、EPA (C20:5、n-3)、DHA (C22:6、n-3)および/またはDPA (C22:5、n-6またはn-3)を非限定的に含む、1つまたは複数の多価不飽和脂肪酸を産生する。
【０２４４】
好ましくは、本発明の遺伝的に改変された生物は、少なくとも1つのPUFA (標的PUFA)を産生し、ここで生物(または生物が油料種子植物であれば、成熟種子、もしくはそのような種子由来の油などの、PUFAを蓄積する生物の部分)における全脂肪酸プロファイルが検出可能な量のこのPUFAを含む。好ましくは、PUFAは、少なくとも20炭素PUFAであり、少なくとも3つの二重結合、およびより好ましくは少なくとも4つの二重結合、およびさらにより好ましくは、少なくとも5つの二重結合を含む。1つの態様では、PUFAは、検出可能な量または有意な量で生物(例えば、遺伝的改変が存在しない野生型生物、または指定された遺伝的改変の受け手として用いられる親生物)により天然には産生されないPUFAである。
【０２４５】
好ましくは、生物(またはPUFAを蓄積する生物の部分)における全脂肪酸プロファイルは、標的PUFAを全脂肪酸の少なくとも0.1重量%含み、およびより好ましくは、少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸(標的PUFA)を、全脂肪酸の少なくとも約0.2重量%、およびより好ましくは少なくとも約0.3重量%、およびより好ましくは少なくとも約0.4重量%、およびより好ましくは少なくとも約0.5重量%、およびより好ましくは少なくとも約1重量%、およびより好ましくは少なくとも約2重量%、およびより好ましくは少なくとも約3重量%、およびより好ましくは少なくとも約4重量%、およびより好ましくは少なくとも約5重量%、およびより好ましくは少なくとも約10重量%、およびより好ましくは少なくとも約15重量%、およびより好ましくは少なくとも約20重量%、およびより好ましくは少なくとも約25重量%、およびより好ましくは少なくとも約30重量%、およびより好ましくは少なくとも約35重量%、およびより好ましくは少なくとも約40重量%、およびより好ましくは少なくとも約45重量%、およびより好ましくは少なくとも約50重量%、およびより好ましくは少なくとも約55重量%、およびより好ましくは少なくとも約60重量%、およびより好ましくは少なくとも約65重量%、およびより好ましくは少なくとも約70重量%、およびより好ましくは少なくとも約75重量%、およびより好ましくは75重量%超、あるいは標的PUFAの0.1重量%から75重量%または75重量%超(最大で100重量%または約100重量%)までの0.1重量%刻みでの任意のパーセンテージで含む。本明細書において一般的に用いられる場合、PUFA産生のパーセンテージ量への言及は、別に指定する場合を除き、生物によって産生される全脂肪酸に対する重量比である(例えば、場合によっては、重量比でのパーセンテージは、PUFA PKSシステムなどの酵素複合体によって産生される全脂肪酸に対するものである)。1つの態様では、植物によって産生される全脂肪酸は、脂肪酸メチルエステル(FAME)調製物のガスクロマトグラフィー(GC)分析によって決定される重量パーセントとして提示される。
【０２４６】
上記のように、これらの植物によって産生される全脂肪酸が、標的PUFAを産生する酵素複合体によって産生される標的PUFA以外の、任意の脂肪酸を約10重量%未満含む(またはそれ以上で含まない)ことは、上記の植物(および/または植物の部分または種子油画分)によって産生される全脂肪酸のさらなる特徴である。好ましくは、標的PUFA以外の、標的PUFAを産生する酵素複合体によって(例えば、標的PUFAを産生する酵素または酵素複合体による植物の遺伝的改変の結果として)産生される任意の脂肪酸は、植物によって産生される全脂肪酸の約9重量%未満、およびより好ましくは約8重量%未満、およびより好ましくは約7重量%未満、およびより好ましくは約6重量%未満、およびより好ましくは約5重量%未満、およびより好ましくは約4重量%未満、およびより好ましくは約3重量%未満、およびより好ましくは約2重量%未満、およびより好ましくは約1重量%未満で存在する。
【０２４７】
別の態様では、標的PUFA以外の、標的PUFAを産生する酵素複合体によって産生される任意の脂肪酸は、植物において標的PUFAを産生する酵素複合体によって産生される全脂肪酸の約10重量%未満で存在し(またはそれ以上で含まない) (すなわち、この測定は、標的PUFAを産生する酵素複合体によって産生されるような全脂肪酸に限定される)、およびより好ましくは、植物において標的PUFAを産生する酵素複合体によって産生される全脂肪酸の約9重量%未満、およびより好ましくは約8重量%未満、およびより好ましくは約7重量%未満、およびより好ましくは約6重量%未満、およびより好ましくは約5重量%未満、およびより好ましくは約4重量%未満、およびより好ましくは約3重量%未満、およびより好ましくは約2重量%未満、およびより好ましくは約1重量%未満、およびより好ましくは約0.5重量%未満で存在する。
【０２４８】
本発明のこの態様の別の局面では、植物(および/または植物の部分もしくは種子油画分)によって産生される全脂肪酸は、標的PUFA、または野生型植物(遺伝的に改変されていない)に、もしくは指定された(最初のもしくは一連の)遺伝的改変の受け手として用いられる親植物に存在するPUFA以外の18個またはそれ以上の炭素を有するPUFAを、植物によって産生される全脂肪酸の10重量%未満含む(またはそれ以上で含まない)。さらなる局面では、植物(および/または植物の部分もしくは種子油画分)によって産生される全脂肪酸は、標的PUFA、または野生型植物(遺伝的に改変されていない)に、もしくは指定された遺伝的改変の受け手として用いられる親植物に存在するPUFA以外の18個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを、植物によって産生される全脂肪酸の9重量%未満、または18個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを8重量%未満、または18個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを7重量%未満、または18個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを6重量%未満、または18個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを5重量%未満、または18個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを4重量%未満、または18個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを3重量%未満、または18個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを2重量%未満、または18個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを1重量%未満含む。
【０２４９】
本発明のこの態様の別の局面では、植物(および/または植物の部分もしくは種子油画分)によって産生される全脂肪酸は、標的PUFA、または野生型植物(遺伝的に改変されていない)に、もしくは指定された(最初のもしくは一連の)遺伝的改変の受け手として用いられる親植物に存在するPUFA以外の20個またはそれ以上の炭素を有するPUFAを、植物によって産生される全脂肪酸の10重量%未満含む(またはそれ以上で含まない)。さらなる局面では、植物(および/または植物の部分もしくは種子油画分)によって産生される全脂肪酸は、標的PUFA、または野生型植物(遺伝的に改変されていない)に、もしくは指定された遺伝的改変の受け手として用いられる親植物に存在するPUFA以外の20個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを、植物によって産生される全脂肪酸の9重量%未満、または20個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを8重量%未満、または20個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを7重量%未満、または20個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを6重量%未満、または20個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを5重量%未満、または20個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを4重量%未満、または20個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを3重量%未満、または20個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを2重量%未満、または20個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを1重量%未満含む。
【０２５０】
1つの態様では、植物(および/または植物の部分もしくは種子油画分)における全脂肪酸は、以下の任意の1つまたは複数より選択される脂肪酸を、植物によって産生される全脂肪酸の約10重量%未満、およびより好ましくは約9重量%未満、およびより好ましくは約8重量%未満、およびより好ましくは約7重量%未満、およびより好ましくは約6重量%未満、およびより好ましくは約5重量%未満、およびより好ましくは約4重量%未満、およびより好ましくは約3重量%未満、およびより好ましくは約2重量%未満、およびより好ましくは約1重量%未満含む: γ-リノレン酸(GLA;18:3、n-6); ステアリドン酸(STAまたはSDA; 18:4、n-3); ジホモ-γ-リノレン酸(DGLAまたはHGLA; 20:3、n-6)、アラキドン酸(ARA、C20:4、n-6); エイコサトリエン酸(ETA; 20:3、n-9)およびさまざまな他の脂肪酸、例えば20:0; 20:1 (Δ5); 20:1 (Δ11); 20:2 (Δ8,11); 20:2 (Δ11,14); 20:3 (Δ5,11,14); 20:3 (Δ11,14,17); ミード酸(20:3; Δ5,8,11); または20:4 (Δ5,1,14,17)など。
【０２５１】
別の態様では、植物において長鎖PUFAを産生する酵素システムによって産生される脂肪酸は、以下より選択される脂肪酸: γ-リノレン酸(GLA; 18:3、n-6); ステアリドン酸(STAまたはSDA; 18:4、n-3); ジホモ-γ-リノレン酸(DGLAまたはHGLA; 20:3、n-6)、アラキドン酸(ARA、C20:4、n-6); エイコサトリエン酸(ETA; 20:3、n-9)およびさまざまな他の脂肪酸、例えば20:0; 20:1 (Δ5); 20:1 (Δ11); 20:2 (Δ8,11); 20:2 (Δ11,14); 20:3 (Δ5,11,14); 20:3 (Δ11,14,17); ミード酸(20:3; Δ5,8,11); または20:4 (Δ5,1,14,17)などを、植物によって産生される全脂肪酸に占めるパーセンテージとして約10重量%未満含み、およびより好ましくは、以下より選択される脂肪酸を、約9重量%未満、およびより好ましくは約8重量%未満、およびより好ましくは約7重量%未満、およびより好ましくは約6重量%未満、およびより好ましくは約5重量%未満、およびより好ましくは約4重量%未満、およびより好ましくは約3重量%未満、およびより好ましくは約2重量%未満、およびより好ましくは約1重量%未満含む: γ-リノレン酸(GLA; 18:3、n-6); ステアリドン酸(STAまたはSDA; 18:4、n-3); ジホモ-γ-リノレン酸(DGLAまたはHGLA; 20:3、n-6)、アラキドン酸(ARA、C20:4、n-6); エイコサトリエン酸(ETA; 20:3、n-9)およびさまざまな他の脂肪酸、例えば、20:0; 20:1 (Δ5); 20:1 (Δ11); 20:2 (Δ8,11); 20:2 (Δ11,14); 20:3 (Δ5,11,14); 20:3 (Δ11,14,17); ミード酸(20:3; Δ5,8,11); または20:4 (Δ5,1,14,17)など。
【０２５２】
別の態様では、植物において長鎖PUFAを産生する酵素システムによって産生される脂肪酸は、以下のPUFA: γ-リノレン酸(GLA; 18:3、n-6)、18個の炭素および4つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、20個の炭素および3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、ならびに22個の炭素および2つまたは3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFAのすべてを、植物によって産生される全脂肪酸に占めるパーセンテージとして約10重量%未満含み、およびより好ましくは、以下のPUFA: γ-リノレン酸(GLA； 18:3、n-6)、18個の炭素および4つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、20個の炭素および3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、ならびに22個の炭素および2つまたは3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFAのすべてを、約9重量%未満、およびより好ましくは約8重量%未満、およびより好ましくは約7重量%未満、およびより好ましくは約6重量%未満、およびより好ましくは約5重量%未満、およびより好ましくは約4重量%未満、およびより好ましくは約3重量%未満、およびより好ましくは約2重量%未満、およびより好ましくは約1重量%未満含む。
【０２５３】
別の態様では、植物において長鎖PUFAを産生する酵素システムによって産生される脂肪酸は、以下のPUFA: γ-リノレン酸(GLA; 18:3、n-6)、18個の炭素および4つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、20個の炭素および3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、ならびに22個の炭素および2つまたは3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFAのそれぞれを、植物によって産生される全脂肪酸に占めるパーセンテージとして約10重量%未満含み、およびより好ましくは、以下のPUFA: γ-リノレン酸(GLA; 18:3、n-6)、18個の炭素および4つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、20個の炭素および3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、ならびに22個の炭素および2つまたは3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFAのそれぞれを、約9重量%未満、およびより好ましくは約8重量%未満、およびより好ましくは約7重量%未満、およびより好ましくは約6重量%未満、およびより好ましくは約5重量%未満、およびより好ましくは約4重量%未満、およびより好ましくは約3重量%未満、およびより好ましくは約2重量%未満、およびより好ましくは約1重量%未満含む。
【０２５４】
別の態様では、植物において長鎖PUFAを産生する酵素システムによって産生される脂肪酸は、以下のPUFA: γ-リノレン酸(GLA; 18:3、n-6)、18個の炭素および4つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、20個の炭素および3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、ならびに22個の炭素および2つまたは3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFAのうち任意の1つまたは複数を、植物によって産生される全脂肪酸に占めるパーセンテージとして約10重量%未満含み、およびより好ましくは、以下のPUFA: γ-リノレン酸(GLA; 18:3、n-6)、18個の炭素および4つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、20個の炭素および3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、ならびに22個の炭素および2つまたは3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFAのうち任意の1つまたは複数を、約9重量%未満、およびより好ましくは約8重量%未満、およびより好ましくは約7重量%未満、およびより好ましくは約6重量%未満、およびより好ましくは約5重量%未満、およびより好ましくは約4重量%未満、およびより好ましくは約3重量%未満、およびより好ましくは約2重量%未満、およびより好ましくは約1重量%未満含む。
【０２５５】
本発明のこの態様の1つの局面では、植物は少なくとも2つの標的PUFAを産生し、植物またはPUFAを蓄積する植物の部分(油料種子からの油を含む)における全脂肪酸プロファイルは、検出可能な量のこれらのPUFAを含む。この態様において、PUFAは好ましくは、それぞれ少なくとも20炭素PUFAであり、しかも少なくとも3つの二重結合を含み、および好ましくは少なくとも4つの二重結合、およびさらにより好ましくは少なくとも5つの二重結合を含む。そのようなPUFAは、最も好ましくは、DHA、DPAn-6およびEPAより選択される。1つの局面では、植物はDHAおよびDPAn-6を産生し、DHAとDPAn-6との比は約1:10〜約10:1であり、それらの間の任意の比を含む。1つの態様では、DHAとDPAとの比は約1:1〜約3:1であり、もう1つの態様では約2.5:1である。1つの態様では、植物はDHAおよびEPAを産生する。
【０２５６】
本発明はさらに、上記の植物によって産生される任意の種子、ならびに任意の植物の部分、植物によって産生される油または植物によって産生される種子を含む。本発明はまた、本明細書において記述した植物、植物の部分、種子または油を用いて産生される任意の産物も含む。
【０２５７】
本発明の1つの態様は、本明細書において記述のPUFA PKSシステムの少なくとも1つの生物活性ドメインをコードする核酸配列を含む少なくとも1つの組換え核酸分子を発現する組換え宿主細胞によって産生された油を前記の最終産物に添加する段階を含む、少なくとも1つの脂肪酸を含む最終産物を改変するための方法に関する。
【０２５８】
好ましくは、最終産物は、食品、栄養補助食品、医薬製剤、ヒト化動物乳および乳幼児用調合乳からなる群より選択される。適用な医薬製剤には、抗炎症製剤、化学療法剤、活性賦形剤、骨粗鬆症治療薬、抗鬱薬、抗痙攣薬、抗ヘリコバクター・ピロリ薬、神経変性疾患の治療用薬物、変性肝疾患の治療用薬物、抗生物質、およびコレステロール低下製剤が含まれるが、これらに限定されることはない。1つの態様では、最終産物は、以下からなる群より選択される病状を処置するために用いられる: 慢性炎症、急性炎症、胃腸障害、がん、悪液質、心臓再狭窄、神経変性疾患、肝臓の変性疾患、血中脂質疾患、骨粗鬆症、骨関節炎、自己免疫疾患、子癇前症、早産、加齢性黄斑症、肺疾患およびペルオキシソーム病。
【０２５９】
適した食品には、上質なベーカリー製品、パンおよびロールパン、朝食用シリアル、加工および非加工チーズ、香辛料(ケチャップ、マヨネーズなど)、乳製品(ミルク、ヨーグルト)、プリンおよびゼラチンデザート、炭酸飲料、茶、粉末飲料ミックス、加工魚製品、果物飲料、チューインガム、固形型菓子類、冷凍乳製品、加工肉製品、ナッツおよびナッツのスプレッド、パスタ、加工家禽肉製品、肉汁およびソース、ポテトチップスおよび他のチップスまたはクリスプ、チョコレートおよび他の菓子類、スープおよびスープミックス、大豆製品(ミルク、飲料、クリーム、漂白剤)、植物油をベースとするスプレッド、ならびに野菜飲料が含まれるが、これらに限定されることはない。
【０２６０】
本発明のさらに別の態様は、ヒト化動物乳を産生するための方法に関する。この方法は、本明細書において記述されるPUFA PKSシステムの少なくとも1つの生物活性ドメインをコードする核酸配列を含む少なくとも1つの組換え核酸分子を用いて泌乳動物の泌乳細胞を遺伝的に改変する段階を含む。
【０２６１】
宿主細胞を遺伝的に改変するための方法および遺伝的に改変された非ヒト泌乳動物を作出するための方法は、当技術分野において公知である。改変するための宿主動物の例としては、導入遺伝子発現個体群の迅速な拡大のため遺伝子操作およびクローニングに従順な、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ヤクなどが挙げられる。動物の場合、PKS様導入遺伝子は、遺伝子制御領域の改変を通じて、標的の細胞小器官、組織および体液での発現に適応させることができる。特に関心対象となるのは、宿主動物の乳房中でのPUFAの産生である。
【０２６２】
本明細書において引用される各刊行物または参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２６３】
以下の例は、例証のために提供されており、本発明の範囲を限定することを意図していない。
【０２６４】
実施例
実施例1
以下の実施例は、シゾキトリウムにおいて使用するための合成Th.23B OrfCクローニングベクターの構築を記載する。
【０２６５】
シゾキトリウム（例えば、ATCC20888またはシゾキトリウムN230D）由来の4種の大きい遺伝子（orfA、orfB、orfC、およびFAS；米国特許出願公開第20020194641号、米国特許出願公開第20070089199号、または米国特許出願公開第20050191679号に記載）についてのコドン使用データを組み合わせた。シゾキトリウムATCC20888は高レベルの脂肪酸を産生する場合には、これらの遺伝子は高発現されていることが予想される。（所定のアミノ酸のためのコドンのうち）約3％未満の出現率のコドンを排除し、残りのコドンの相対的な使用を調整した。表1は、シゾキトリウムのコドン使用、調整された使用、および非合成Th.23B orfCについてのコドン使用を示す。スラウストキトリウム23B orfCのコーディング領域を設計し、合成するため、これらのコドン使用データを分析するためにDNA2.0（Menlo Park, CA）を使用した。合成遺伝子のその後の操作を容易にすると考えられる制限酵素認識部位をコードするヌクレオチドをコーディング領域の両端に付加した。（SEQ ID NO:62のコードされたアミノ酸を変化させることなく）ある種の制限酵素認識配列を排除または付加するために、少数のコドンを調整した（例については下記参照）。結果として得られた合成配列を、プラスミドベクター内に、DNA2.0により開発した。それは「pThOrfC synth」として図2Bに示される。表1は、合成コーディング領域のコドン使用を示す。
【０２６６】
（表１）
0005551584.tif 000012
0005551584.tif 000013
0005551584.tif 000014
【０２６７】
上記のように、本発明者らによる以前の研究（米国特許出願公開第20050100995号の実施例8を参照のこと）は、Th.23Bコーディング領域との「パーフェクトステッチ」が作成されるよう、（非合成）Th.23B orfCコーディング領域がシゾキトリウムorfCの上流非コーディング領域と下流非コーディング領域との間にクローニングされたプラスミドの作出をもたらした。この過程における中間プラスミドが、合成Th.23B orfCコーディング領域をクローニングするために使用され得る（図2Aおよび2Bを参照のこと）。これらの中間構築物のうちの一つを最も容易に利用するために、本発明者らは、「パーフェクトステッチ」ジャンクションを作出し、かつシゾキトリウムorfC上流／下流領域内の制限部位を利用するための283bpヌクレオチド配列を設計し、DNA2.0により合成し、その後のクローニング反応のため合成Th.23B orfC遺伝子へと設計した。この短いDNA配列は「Th23B synth orfC INT」と名付けられ、プラスミド「pThOrfCステッチINT」内に含有されていた。
【０２６８】
283bp「Th23B synth orfC INT」は、5つのセグメントからなる。第1のセグメントは、シゾキトリウムorfCのSpeI部位からATG開始コドンまで（ATG開始コドンは含まない）の、シゾキトリウムorfC上流（非コーディング）領域の最後の102bpからなる（SEQ ID NO:77参照）。第2のセグメントは、合成Th.23B orfCコーディング領域（SEQ ID NO:61）の最初の9bpからなり、設計されたSanDI部位（GGGTCCC）とオーバーラップする開始ATGを含有している。これらのセグメントは上流「パーフェクトステッチ」ジャンクションを作出する。第3のセグメントは、スペーサーとして機能する6bp BamHI制限部位（GGATCC）である。第4のセグメントは、設計されたClaI部位からTAA終止コドンまでの、Th.23B orfCコーディング領域（SEQ ID NO:61）の最後の45bpからなる。第5のセグメントは、シゾキトリウムorfC（非コーディング）下流領域の「逆」BsmI部位まで（終止コドンは含まない）の最初の121bpからなる。「順」方向の「Th23B synth orfC INT」断片の最後の6ヌクレオチドは、5'>GCATTC>3'である。逆相補鎖5'>GAATGC>3'は、BsmIの認識配列である。第4および第5のセグメントは、下流「パーフェクトステッチ」ジャンクションを作出する。
【０２６９】
合成Th.23B orfCコーディング配列の「パーフェクトステッチ」バージョンの構築の詳細は、以下に与えられる（図2Aおよび2Bも参照のこと）。
【０２７０】
工程1（図2A）
pThOrfCステッチINTからの「Th23B synth orfC INT」断片を、SpeIおよびBsmI制限酵素による消化により除去し、断片をアガロースゲル電気泳動（GeneClean Turbo kit, QBioGene）により精製した。同様に、pBlueScriptII SK(+)へクローニングされたBamHI認識部位スペーサーにより分離されたシゾキトリウムorfCの各約2000bpの上流領域および下流領域を含有しているpREZ22（米国特許出願公開第20050100995号参照）に由来する大きいSpeI/BsmIベクター断片を入手した。これらの2個の断片をライゲーションし、大腸菌XL-1 Blue（Stratagene, La Jolla, CA）に形質転換した。所望のプラスミド「pREZ22 orfC INT」を含有しているクローンを、制限消化および部分DNA配列決定により同定した。このプラスミドは、それぞれ合成orfCコーディング領域の5-プライム領域および3-プライム領域にパーフェクトステッチが施されたシゾキトリウムorfCの上流領域および下流領域に含有しているが、コーディング領域の大部分を欠いている。
【０２７１】
工程2（図2B）
（上記のような）SanDIおよびClaI制限酵素による消化、ならびに所望のDNA断片の精製により、「pThOrfC synth」から、合成Th.23B orfCコーディング領域の大部分を入手した。この断片を、（上記のように）pREZ22 orfC INTから同様に入手されたベクター断片とライゲーションし、大腸菌へとクローニングした。得られたプラスミド「pThOrfC-synPS」は、シゾキトリウムorfC遺伝子の上流領域および下流領域にパーフェクトステッチが施された全長合成Th.23B orfCコーディング領域を含有している。pThOrfC-synPSのコーディング領域のヌクレオチド配列は、本明細書においてSEQ ID NO:70により表される。SEQ ID NO:70は、SEQ ID NO:62をコードする。本明細書中に既に記載されたように、pThOrfC-synPSはATCCアクセッション番号PTA-8229として寄託されている。
【０２７２】
実施例2
以下の実施例は、スラウストキトリウム23B由来のDH2ドメインを含むシゾキトリウムOrfCをコードする構築物の作出を記載する。
【０２７３】
PCRに基づくオーバーラップ伸長（「オーバーラップ伸長によるスプライシング（Splicing by Overlap Extension）」または「SOEing」 （Horton, R.M., (1993) In Vitro Recombination and Mutagenesis of DNA. SOEing together tailor-made genes. Methods in molecular Biology Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications Chapter 25 pp 251-266 (B .A. White, Ed.) Humana Press, Totawa, NJ））および制限クローニングの組み合わせにより、シゾキトリウムATCC20888 OrfC（SEQ ID NO:30）のDH2領域を、特定の5-プライムおよび3-プライムの交差点において、スラウストキトリウム23B ATCC20892（SEQ ID NO:66）由来のものと交換した。
【０２７４】
より具体的には、この実施例において、本発明者らは、1493アミノ酸残基長のハイブリッド（キメラ）OrfCポリペプチド（本明細書においてSEQ ID NO:74により表されるアミノ酸配列）をコードする核酸分子を構築した。このハイブリッドのアミノ酸516-1041として定義されるDH2領域は、Th.23B OrfCタンパク質のDH2領域のアミノ酸配列；即ち、（本明細書においてスラウストキトリウム23BのDH2ドメインとして記載される）SEQ ID NO:66の全部を含むSEQ ID NO:62のアミノ酸491-1016からなる。ハイブリッドOrfCアミノ酸配列の残り、SEQ ID NO:74の残基1-515および1042-1493は、SEQ ID NO:6のシゾキトリウムOrfCの残基1-515および1051-1502とそれぞれ同一である。
【０２７５】
このキメラタンパク質をコードするプラスミドの構築は、図3A〜3Cに例示される。
【０２７６】
工程1
未修飾シゾキトリウムorfC遺伝子を鋳型として使用して、DH2領域の上流のおよそ1.5KbのシゾキトリウムorfCリーディングフレームを増幅するために、プライマーprREZ197（SEQ ID NO:78）およびprREZ198（SEQ ID NO:79）を使用した。
0005551584.tif 000015
【０２７７】
プライマーprREZ197は、開始ATGコドンにおいてNdeI部位（下線）を作出した。逆方向プライマーprREZ198（35mer）は、シゾキトリウムOrfC配列と相同の20bp（太字）およびTh.23B OrfC配列と相同の15bpにより作成された5-プライム交差点を含有していた。PCR条件：50μL反応、1μL PfuUltraポリメラーゼ（Stratagene）および1×PfuUltra緩衝液、2％DMSO、各0.5μM dNTP、各0.4μM prRZ197およびprRZ198、10ng 鋳型（クローニングされたシゾキトリウムorfCコーディング領域）、94℃1分の初期変性、20サイクルの94℃1分の変性、52℃1分のアニーリング、72℃90秒の伸長、および10分の最終伸長。PCR産物を、QIAquick（登録商標）Gel Extractionキット（Qiagen, Valencia, CA）を使用して、アガロースゲル電気泳動の後、精製した。
【０２７８】
工程2
Th.23B orfC遺伝子を鋳型として使用して、Th.23B DH2領域（およそ1.5Kb）を増幅するために、プライマーprREZ199（SEQ ID NO:80）およびprREZ200（SEQ ID NO:81）を使用した。
0005551584.tif 000016
プライマーprREZ199（37mer）は、Th.23B orfC（DH2）配列と相同の22bpおよびシゾキトリウムorfC配列と相同の15bp（太字）により作成された5-プライム交差点を含有していた。これらの後者の15bpは、prREZ198とのオーバーラップ、従って、工程1のPCR産物とのオーバーラップも提供した。逆方向プライマーprREZ200は、Th.23B orfCの3-プライム交差点に天然のBstZ17I部位を組み入れた（下線）。プライマーprREZ199およびprREZ200が、鋳型としてのクローニングされたTh.23B orfCコーディング領域10ngと共に使用された点を除いて、PCR条件および断片精製は上記と同様であった。
【０２７９】
工程3
シゾキトリウムorfCコーディング領域およびTh.23B DH2領域の5-プライム末端間の全長融合を作出するために、オーバーラップ伸長を使用した。鋳型としての工程1の産物（prREZ197×prREZ198）および工程2の産物（prREZ199×prREZ200）、ならびに外側プライマーprREZ197およびprREZ200を用いて、PCRを実施した。PCR条件：50μL反応、1μL PfuUltraポリメラーゼ（Stratagene）および1×PfuUltra緩衝液、2％DMSO、各0.5μM dNTP、各0.4μM prRZ197およびprRZ200、各50ng 工程1および2からのPCR産物、94℃1分の初期変性、20サイクルの94℃1分の変性、52℃1分のアニーリング、72℃3.5分の伸長、および10分の最終伸長。PCR産物を工程1と同様に精製した。
【０２８０】
工程4
製造業者の推奨する条件を使用して、工程3のPCR反応の産物を、pCR-BluntII-TOPO（Invitrogen）へクローニングし、TOP10 E.coli（Invitrogen）へ形質転換し、pREZ171を作出した。インサートDNAの配列が設計通りであることを確認した。
【０２８１】
工程5
それぞれのベクター配列の中の制限部位を使用して、pREZ171の中のクローニングされたDNAを、XbaI/SpeI断片として、ベクターpBC KS(+)（Stratagene）に移し、pREZ175を作出した。
【０２８２】
工程6
プラスミドpREZ175をBstZ17Iにより消化（直鎖化）し、次いで、NdeIにより部分消化した。融合したシゾキトリウムorfC 5-プライム領域およびTh.23B DH2領域を表す約6Kbの断片を、pREZ172 NdeI/BstZ17Iベクター断片へクローニングし、pREZ177を作出した。プラスミドpREZ172は、開始ATGコドンがNdeI部位を組み入れるよう大腸菌発現ベクターpColADuet-1（Novagen）へクローニングされたシゾキトリウムorfCコーディング領域全体を含有している。それは、pREZ101（実施例5参照）に由来し、3-プライム交差点にアミノ酸中性BstZ17I部位を挿入するために部位特異的変異誘発（Quik Change kit, Stratagene）により修飾されていた。具体的には、アミノ酸1051位のTACチロシンコドンがTATに修飾された。
【０２８３】
工程7
DNA配列決定によるpREZ177の分析により、BstZ17I部位における単一の塩基対が欠失していることが発見された。具体的には、予想される<GTATAC>が、代わりに<GTAAC>となっていた。このエラーを修正するために、pDS26由来の正確なBstZ17I交差点を含有しているPciI制限断片を、pREZ177の中の欠陥PciI断片と交換するために使用した。プラスミドpDS26は、以前に他の目的のために作出されたハイブリッドorfCコーディング領域を含有している。従って、得られたプラスミドpREZ179は、主に、シゾキトリウム由来であるが、DH2領域のTh.23B由来のものへの正確な交換を含有しているorfCコーディング領域全体（本明細書においてSEQ ID NO:74により表されるアミノ酸配列）を含有している。プラスミドpREZ179は、さらに、大腸菌においてハイブリッド遺伝子の機能を研究するための独特のツールを表し、他の生物のための発現ベクターの開発のための出発点を提供する。
【０２８４】
以下の付加的な工程（図3C参照）は、pREZ179から、シゾキトリウムにおける遺伝子交換のためのベクターへの、ハイブリッド遺伝子の転移を記載する。
【０２８５】
工程8
（未修飾）シゾキトリウムorfCコーディング領域＋上流および下流の隣接配列の短い部分を、NheI/BspEI断片としてpBR002（orfCゲノム領域のクローン）から単離した。次いで、この断片を、NheI/BspEIで消化されたpREZ31（米国特許出願公開第20050100995号の実施例8に記載されたpREZ33に機能的に等価）のベクター部分へクローニングした。得られたプラスミドpDS48は、（未修飾）シゾキトリウムorfCコーディング領域＋orfC遺伝子座における遺伝子交換を駆動するために使用されたのと同一の上流および下流の配列を含有している。
【０２８６】
工程9
交換されたTh.23B DH2領域全体を含有しているハイブリッドorfCリーディングフレームの部分を、PstI/PflMI断片としてpREZ179から単離した。この断片をPstI/PflMI消化pDS48のベクター部分へクローニングし、pDS49を得た。その結果として、プラスミドpDS49は、pREZ33と同一の環境でハイブリッドorfCを含有している（「パーフェクトステッチ」遺伝子交換としての全長Th.23B orfCコーディング領域；米国特許出願公開第20050100995号の実施例8を参照すること）。pDS49のコーディング領域のヌクレオチド配列は、本明細書においてSEQ ID NO:73により表される。SEQ ID NO:73は、SEQ ID NO:74をコードする。プラスミドpDS49は、本明細書において既に詳細に記載されたようにATCCアクセッション番号PTA-8230として寄託された。
【０２８７】
実施例3
以下の実施例は、シゾキトリウムコドン使用のために最適化するために再合成されたスラウストキトリウム23B由来のDH2ドメインを含むシゾキトリウムOrfCをコードする構築物の構築を記載する。
【０２８８】
この実施例において、本発明者らは、1493アミノ酸残基長のハイブリッドOrfCポリペプチド（SEQ ID NO:74）をコードする核酸分子を構築した。このハイブリッドのアミノ酸516-1041として定義されるDH2領域は、Th.23B OrfCタンパク質のDH2領域のアミノ酸配列；即ち、（本明細書においてスラウストキトリウム23BのDH2ドメインとして記載される）SEQ ID NO:66の全部を含む、SEQ ID NO:62のアミノ酸491-1016からなる。ハイブリッドOrfCアミノ酸配列の残り、SEQ ID NO:74の残基1-515および1042-1493は、SEQ ID NO:6のシゾキトリウムOrfC残基1-515および1051-1502とそれぞれ同一である。さらに、この構築物において、アミノ酸516-1041をコードするDNA配列は、プラスミドpThOrfC synthおよびpThOrfC_synPS（実施例1およびSEQ ID NO:70を参照のこと）に含有され、シゾキトリウムにおける遺伝子発現のため好ましいコドンを用いる、Th.23BのOrfCの「合成遺伝子配列」に由来した。構築の詳細は、図4A〜4Cに例示され、以下に記載される。
【０２８９】
T23B OrfCポリペプチドのDH2領域をコードするDNA配列を、オリゴヌクレオチドプライマー
0005551584.tif 000017
を使用して、pThOrfC synthからPCR（Rxn 59/60）により増幅した。「順方向」またはセンス鎖プライマーdhd59は、Th.23B OrfCタンパク質のアミノ酸残基491-501（WHPMSKLPGNP；SEQ ID NO:62の491-501位）をコードするDNA配列とオーバーラップしている。「逆方向」またはアンチセンス鎖プライマーdhd60は、Th.23B OrfCタンパク質のアミノ酸残基1008-1017（
0005551584.tif 000018
；SEQ ID NO:62の1008-1017位）をコードするDNA配列とオーバーラップしている。プライマーdhd60は、上記のdhd60配列の中の囲まれた残基により示される、pThOrfC synth配列との2個のミスマッチを含有している。これらの変化は、その後のクローニング工程を容易にするため上記のdhd60配列の二重下線部分により示されるBstZ17I制限エンドヌクレアーゼ部位を作出し、ハイブリッドタンパク質のコーディング配列へ2個の「サイレント変異」：CTT（L）からCTG（L）およびTAC（Y）からTAT（Y）も導入した。この増幅は、各0.5μMのdhd59およびdhd60、200μM dNTP、2単位のPfuUltra（商標）high-fidelity DNAポリメラーゼ（Stratagene, LaJolla, CA）、ならびに1ngのpThOrfC synth DNAを含有している反応容量40μlの1×PfuUltra（商標）HF反応緩衝液（Stratagene, LaJolla, CA）で実施された。サイクリングパラメータは以下の通りであった：1×［1分＠94℃］、28×［（1分＠94℃）、（0.5分＠60℃）、（1.5分＠72℃）］、1×［8.5分＠72℃］、および保持＠4℃。反応は、Perkin Elmer GeneAmp（登録商標）PCR System 2400サーモサイクラー（Applied Biosystems, Foster City, CA）において実施された。
【０２９０】
pREZ179によりコードされたハイブリッドOrfCタンパク質のアミノ酸残基331-522をコードするDNA配列を、オリゴヌクレオチドプライマー
0005551584.tif 000019
を使用して、pREZ179からPCR（Rxn 57/58）により増幅した。「順方向」またはセンス鎖プライマーdhd57は、pREZ179によりコードされたハイブリッドOrfCタンパク質のアミノ酸残基330-339（
0005551584.tif 000020
；SEQ ID NO:74の330-339位）をコードするDNA配列とオーバーラップしている。「逆方向」またはアンチセンス鎖プライマーdhd58は、ハイブリッドOrfCタンパク質のアミノ酸残基513-523（
0005551584.tif 000021
；SEQ ID NO:74の513-523位）をコードするDNA配列とオーバーラップしている。順方向プライマーdhd57の5'末端は、pREZ179に含有されているハイブリッドOrfCコーディング配列の中に存在するPstI部位とオーバーラップしている。この増幅は、各0.5μMのdhd57およびdhd58、200μM dNTP、2単位のPfuUltra（商標）high-fidelity DNAポリメラーゼ（Stratagene, LaJolla, CA）、ならびに1ngのpREZ179 DNAを含有している反応容量40μlの1×PfuUltra（商標）HF反応緩衝液（Stratagene, LaJolla, CA）で実施された。サイクリングパラメータは以下の通りであった：1×［1分＠94℃］、28×［（1分＠94℃）、（0.5分＠60℃）、（1.5分＠72℃）］、1×［8.5分＠72℃］、および保持＠4℃。反応は、Perkin Elmer GeneAmp System 2400サーモサイクラーにおいて実施された。
【０２９１】
57/58および59/60の反応の各々の4マイクロリットルを、1.2％アガロースゲル上で実行した。それぞれの場合に予想される産物サイズと一致しているDNAバンドが観察された：57/58産物については578bpおよび59/60産物については1578bp。これらのバンドをゲルから切り出し、供給元のプロトコルに従ってQIAquick（登録商標）Gel Extraction Kit（QIAGEN, Inc. Valencia, CA）を使用して、アガローススライスからDNAを回収した。PCR産物は溶出緩衝液40μl中に回収された。
【０２９２】
逆方向プライマーdhd58の5'の20ヌクレオチド（上記下線）は、dhd59の5'の20ヌクレオチド（上記下線）の逆相補鎖を含む。その結果として、Rxn 57/58産物の3'末端とRxn 59/60産物の5'末端との間には20bpの同一オーバーラップが存在し、このオーバーラップは、PCR「Splicing by Overlap Extension」または「SOEing」の技術による、これらの2つの産物のその後のPCRスプライシングを可能にする［Horton, R.M., (1993) In Vitro Recombination and Mutagenesis of DNA. SOEing together tailor-made genes. Methods in molecular Biology Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications Chapter 25 pp 251-266 (B. A. White, Ed.) Humana Press, Totawa, NJ］。次いで、このスプライシングされた断片は、その末端（BstZ17IおよびPstI）または末端の近く（BsiWI）に有用な制限部位を含有している。
【０２９３】
PCRスプライシング反応（Rxn 57/60）は、以下のように実施された。反応容量40μlの1×PfuUltra（商標）HF反応緩衝液は、各0.5μMのdhd57およびdhd60、200μM dNTP、2単位のPfuUltra（商標）high-fidelity DNAポリメラーゼ（Stratagene, LaJolla, CA）、ならびにゲル精製PCR産物57/58および59/60の各々の50倍希釈物0.8μlを含有していた。アニーリング温度を66〜70℃の間で1℃ずつ変動させる一連のPCRサイクリング反応を実施した。他のサイクリングパラメータは一定であった：1×［1分＠98℃］、33×［（1分＠98℃）、（1分＠66〜70℃）、（2.5分＠72℃）］、1×［7.5分＠72℃］、および保持＠6℃。反応は、RoboCycler（登録商標）Temperature Cycler（Stratagene, LaJolla, CA）において実施された。これらの反応のアリコートを、1％アガロースゲル上で実行したところ、全ての反応が、予想された産物とサイズが一致する産物（2136 bp）を含有していることが観察されたが、全てのアニーリング温度でその他のバンドも観察された。従って、67℃、68℃、および69℃におけるアニーリングによる3つの反応をプールし、1％アガロースゲル上で実行し、関心対象のおよそ2.1kbのバンドを切り取り、供給元のプロトコルに従ってQIAquick（登録商標）Gel Extraction Kit（QIAGEN, Inc. Valencia, CA）を使用してDNA断片を回収した。溶出したDNAを、溶出緩衝液30μlに回収し、供給元のプロトコルに従ってZero Blunt（登録商標）TOPO（登録商標）PCR Cloning Kit（Invitrogen Corp., Carlsbad, CA）を使用して、PCR断片クローニングベクターpCR（登録商標）-Blunt II TOPO（登録商標）（Invitrogen Corp., Carlsbad, CA）へクローニングした。TOPOクローニング反応の産物を、供給元のプロトコルに従ってOne Shot（登録商標）TOP1O Chemically Competent E. coli（Invitrogen）を形質転換するために使用した。得られた形質転換体のうちの8個を一夜培養し、プラスミドDNAを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化およびアガロースゲル電気泳動により分析した。8個のうち7個が、クローニングされた2.1kb PCR産物57/60を含有していることが見出された。1つの単離物のクローニングされたPCR 57/60産物を配列決定したところ、予想された配列と正確に一致することが示された。DNA配列決定は、Big Dye Terminator化学およびAmpliTaq-FS DNA Polymerase（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて、Applied Biosystems Automated 3730 DNA Analyzerを使用して、出来高払い制で、Biotechnology Resource Center of Cornell University（Ithaca, New York）により実施された。配列について確証されたインサートを含有しているプラスミドをpDD21と名付け、下記のさらなる構築工程において使用した。
【０２９４】
シゾキトリウムコドン使用のために最適化されたTh.23B DH2ドメインをコードするDNAセグメントをpDD21から切り出し、それが構築物の中に存在する天然のTh.23B DH2ドメインコーディング配列を交換するように、pREZ179（実施例2を参照）へクローニングした。得られたプラスミドpDD22は以下のように構築された。精製されたpDD21 DNAを、供給元のプロトコルに従って、BsiWIおよびBstZ17I（New England BioLabs, Beverly MA）により消化した。続いて、反応物を、供給元のプロトコルに従ってQIAquick（登録商標）Spin Purification ProcedureおよびQIAquick（登録商標）PCR Purification Kit （QIAGEN Inc., Valencia, CA）を使用した処理に供した。精製された消化産物を、1％アガロースゲル上で実行し、1940bp BsiWI-BstZ17I断片を切り出し、供給元のプロトコルに従ってQIAEX II Gel Extraction Kit（QIAGEN Inc., Valencia, CA）を使用してアガロースから溶出させた。精製されたpREZ179 DNAもBsiWIおよびBstZ17Iで消化し、続いて、供給元のプロトコルに従ってAntarctic Phosphatase（New England BioLabs, Beverly, MA）により処理した。ホスファターゼ消化産物も、上記のようなQUIquick（登録商標）手法を使用した処理に供し、0.7％アガロースゲル上で実行した。およそ6.1kbのBsiWI-BstZ17Iベクター断片をゲルから切り出し、上記のQIAEX II Gel Extraction Kitを使用してアガロースから溶出させた。これらの2個の断片をT4 Ligaseを使用して1×T4 Ligase Reaction Buffer（いずれも、New England BioLabs（Beverly, MA））においてライゲーションした。ライゲーション産物を、供給元のプロトコルに従ってOne Shot（登録商標）TOPl0 Chemically Competent E.coli（Invitrogen）を形質転換するために使用した。得られた形質転換体のうちの3個に由来するプラスミドDNAを、制限エンドヌクレアーゼ消化およびアガロースゲル電気泳動により分析したところ、3個全てが予想された組換え体の構造を有することが見出された。1つのプラスミドをpDD22と名付け、さらなる構築において用いた。
【０２９５】
シゾキトリウムが好むコドンによりコードされたTh.23B DH2領域を含有しているハイブリッドOrfCをコードするDNAの、シゾキトリウムゲノムへの導入を容易にするために、DH2領域をコードする配列にかかるPstI-PflMI DNAセグメントをpDD22から切り出し、シゾキトリウムにおけるorfC遺伝子座の配列における遺伝子交換のために設計されたベクターpDS48（実施例2参照）へクローニングした。その後の遺伝子交換において使用された、得られたプラスミドpDD24は、以下のように構築された。T23B DH2ドメインをコードし、最適化されたコドン使用を有するDNAセグメントをpDD22から切り出し、それが構築物の中に存在する天然のシゾキトリウムDH2ドメインコーディング配列を交換するよう、pDS48へクローニングした。精製されたpDD22 DNAを、供給元のプロトコルに従って、PstI、PflMI、およびClaI（New England BioLabs, Beverly MA）により消化した。ClaIによる消化は、もし切断されなければ関心対象のおよそ3.2kbのPstI-PflMI断片の位置の近くに移動すると考えられる、PflMI-PflMI断片を切断した。続いて、反応物を、供給元プロトコルに従ってQIAquick（登録商標）Spin Purification ProcedureおよびQIAquick（登録商標）PCR Purification Kit（QIAGEN Inc., Valencia, CA）を使用した処理に供した。精製された消化産物を0.7％アガロースゲル上で実行し、関心対象のおよそ3.2kbのPstI-PflMI断片を切り出し、、供給元プロトコルに従ってQIAEX II Gel Extraction Kit（QIAGEN Inc., Valencia, CA）を使用してアガロースから溶出させた。精製されたpDS48 DNAを同様にPflMIおよびPstIにより消化し、上記のようなQIAquick（登録商標）処理に供し、0.7％アガロースゲ上で実行した。およそ8.0kbのPstI-PflMIベクター断片をゲルから切り出し、上記のQIAEX II Gel Extraction Kitを使用してアガロースから溶出させた。これらの2個の断片を、T4 Ligaseを使用して1×T4 Ligase Reaction Buffer（いずれもNew England BioLabs（Beverly, MA））においてライゲーションした。ライゲーション産物を、供給元のプロトコルに従ってOne Shot（登録商標）TOP10 Chemically Competent E.coli（Invitrogen）を形質転換するために使用した。得られた形質転換体を30℃で100μg/mlのアンピシリンを含有しているLB培地の液体培養において一夜培養した。液体培養における37℃におけるこれらの形質転換体の繁殖は、いくつかの状況の下でプラスミドの不安定性をもたらすことが見出された。得られた形質転換体のうちの3個に由来するプラスミドDNAを、制限エンドヌクレアーゼ消化およびアガロースゲル電気泳動により分析したところ、3個全てが、予想された組換え体の構造を有することが見出された。1つのプラスミドをpDD24と名付け、付加的な制限エンドヌクレアーゼ分析に供し、シゾキトリウムにおける遺伝子交換実験において利用した（実施例4参照）。pDD24のコーディング領域のヌクレオチド配列は、本明細書においてSEQ ID NO:75により表される。SEQ ID NO:75はSEQ ID NO:74をコードする。プラスミドpDD24は、本明細書において既に記載されたようにATCCアクセッション番号PTA-8226として寄託された。
【０２９６】
実施例4
以下の実施例は、上記実施例1〜3に記載された様々なTh.23B orfC構築物のシゾキトリウムにおける発現、およびそのような生物により産生されるPUFAの分析を記載する。
【０２９７】
シゾキトリウムにおける変異体Th.23B orfC遺伝子の発現
シゾキトリウムorfCコーディング領域の正確な欠失を有するシゾキトリウムであるシゾキトリウム株B32-Z1（上記および米国特許出願公開第20050100995号の実施例8を参照のこと）を、以前に記載された技術を使用して（米国特許出願公開第2003/0166207号を参照のこと）、粒子ボンバーメントにより、プラスミドpThOrfC-synPS（全長合成Th.23B orfC；実施例1参照）、pDS49（非合成Th.23B DH2領域；実施例2参照）、およびpDD24（合成Th.23B DH2領域；実施例3参照）により形質転換した。原栄養性Zeocin（商標）感受性形質転換体を入手した。そのような形質転換体は、選択された株についてのサザンブロットおよび／またはPCRにより確認されるような二重交差遺伝子交換事象から発生した。
【０２９８】
簡単に説明すると、粒子ボンバーメントは、BioRad（Hercules, CA）Biolistic（登録商標）PDS-1000/He Particle Delivery Systemを利用した。形質転換のためのシゾキトリウム株を、OD600＝1〜2.5（BioPhotometer, Eppendorf）になるまで、旋回プラットフォーム（200rpm）上で、M2B培地（適宜、DHAを追加）中で29〜30℃で培養した。細胞を遠心分離（3000rpm、5分）により収集し、OD600＝30で無菌の7.5g/L Na2SO4に再懸濁させた。容量150μLの懸濁細胞を、M2B寒天（DHA不含）を含有しているペトリ皿上の環状パッチ（6cm直径）内に播いた。PUFA栄養要求体の増殖のために、40％(w/v)ランダムメチル化β-シクロデキストリン（CTD Inc, High Springs, FL.）中の25mM DHAのストックから0.25mMでDHAをM2Bに補足した。DHA栄養要求性の補完のためのボンバーメントを実施する際には、DHAを寒天培地から省略した。ボンバーメントは、1100psiラプチャーディスク、ディスクリテイニングキャップとマクロキャリアカバーリッドとの間の0.25inギャップ、および中央位置にあるストッピングスクリーンサポートを使用して、層流フードにおいて実施された。ターゲットシェルフはL2（6cm）位置にある。照射されたDHA栄養要求性シゾキトリウム株を含有しているペトリ皿を、（原栄養体であると予期される）コロニーが発達するまで（3〜5日）、29〜30℃でインキュベートした。ランダムに選んだコロニーを、M2B寒天プレートに線状に播種した。培養の後、いくつかのよく単離されたコロニーを、Zeocin（登録商標）（50μg/mL）を含むM2BプレートおよびZeocin（登録商標）を含まないM2Bプレートに移した。Zeocin感受性DHA原栄養体（遺伝子交換事象を示唆する）を、さらなる研究のため選択した。
【０２９９】
脂肪酸分析のためのシゾキトリウムの増殖
M50-20培地50mLを含有している三角フラスコ（250mL）に、示された株のクリオバイアルの内容物（1mL）を接種した。フラスコを、72時間、200rpmで回転するシェーカーの上で29〜30℃でインキュベートした。SSFM培地を含有している同様のフラスコに、M50-20培養物0.5mLを接種し、5日間、上記と同様にインキュベートした。細胞を、等量の70％イソプロパノールによるブロスの希釈の後、遠心分離（4000g、5分）により採集した。得られた細胞ペレットを、最初の容量の35％イソプロパノール水に懸濁させ、再遠心分離した。洗浄した細胞ペレットを、直ちに-70℃で凍結させた後、凍結乾燥を行った。酸性メタノールを使用して脂肪酸メチルエステル（FAME）を調製し、それらをヘキサンへ抽出し、気-液クロマトグラフィーによって分析することにより、乾燥バイオマスの脂肪酸含有量を決定した。
【０３００】
M50-20培地
M50-20培地1リットル当たりの成分は以下の通りである：12.5g NaCl、2.5g MgSO4・7H2O、0.5g KCl、0.05g CaCl2、20.0gグルコース、20.0gグルタミン酸Na、0.4g KH2PO4、1.0g酵母抽出物、0.4g NaHCO3、5ml PII微量金属（200×PII微量金属溶液は、1リットル当たり以下のものを含有している：6.0g Na2EDTA、0.29g FeCl3・6H2O、6.84g H3BO3、0.86g MnCl2・4H2O、60mg ZnCl2、26mg CoCl2・6H2O、52mg NiSO4・6H2O、2mg CuSO4・5H2O、および5mg NaMoO4・2H2O、pH8.0）、1ml PIIビタミンミックス（1000×PIIビタミンミックスは、1リットル当たり以下のものを含有している：100mgチアミン、0.5mgビオチン、および0.5mgビタミンB12）、pH7.0。
【０３０１】
SSFM培地
SSFM培地の1リットル当たりの成分は以下の通りである：13.62g Na2SO4、0.72g K2SO4、0.56g KCl、2.27g MgSO4・7H2O、0.19g CaCl2、0.0565g KH2PO4、0.57g (NH4)2SO4、0.13gグルタミン酸Na、100mM MES（4-モルホリンエタンスルホン酸）pH6.0、50.0gグルコース、0.16mgビタミンB12、9.75mgチアミン、3.33mgパントテン酸カルシウム、10.3mg FeSO4・7H2O、3.1mg MnCl2・4H2O、1.93mg ZnSO4・7H2O、0.04mg CoCl2・6H2O、0.04mg NaMoO4・2H2O、2.07mg CuSO4・5H2O、2.07mg NiSO4・6H2O、2.0mgクエン酸。
【０３０２】
M2B培地
M2B培地の成分は以下の通りである（1リットル当たり）：グルコース10g、(NH4)2SO4 0.8g、Na2SO4 5.0g、MgSO4・7H2O 2.0g、KH2PO4 0.5g、KCl 0.5g、CaCl2・2H2O 0.1g、ビタミンB12 0.05mg、チアミン・HCl 0.2mg、パントテン酸カルシウム0.2mg、FeSO4・7H2O 3.0mg、MnCl2・4H2O 1.0mg、ZnSO4・7H2O 0.8mg、CoCl2・6H2O 0.02mg、Na2MoO4・2H2O 0.01mg、CuSO4・5H2O 0.6mg、NiSO4・6H2O 0.8mg、MES緩衝液0.1M、pH6.0（NaOHにより調整）。
【０３０３】
組換えシゾキトリウム株のPUFA分析
表2は、シゾキトリウムATCC20888、および（実施例1〜3に記載された）天然のorfCコーディング領域が、スラウストキトリウム23BのorfCコーディング領域の全部または一部に交換された誘導体株の全脂肪酸含量、DHA含量、およびDPAn-6含量（FAME（脂肪酸メチルエステル）として表される）を示す。シゾキトリウムATCC20888 orfCコーディング領域全体のTh.23B（B34-1株）由来のものへの交換は、（Th.23Bのものにより近い）より高いDHA/DPAn-6比率、より少ない全PUFA含量をもたらす。タンパク質発現がより低い全PUFA含量の原因である可能性が高いことは、増強されたDHA/DPAn-6比率が維持されている一方、PUFA産生が野生型のレベルより増加した、コドン最適化（合成）Th.23B orfCコーディング領域（例えば、株B67-5；pThOrfC_syn-PSによる形質転換）の使用により、証明される。シゾキトリウムDH2領域のみのスラウストキトリウムのものへの置換は、類似したパターンを示す。コドン最適化Th.23B DH2領域を有する株（B69-2；pDD24による形質転換）は、非最適化DH2領域を有する株（B105-1A1； pDS49による形質転換）より高いPUFAを与える。しかしながら、株B105-1A1（非最適化DH2領域）におけるDHA/DPA比率は、顕著に高かった。
【０３０４】
興味深いことに、B69-6株は高レベルのDHAおよび比較的高いDHA/DPA比率を産生する。この株は、B69-2株を産生したのと同一のプラスミドpDD24による株B32-Z1の形質転換に起因した。しかしながら、相違の正確な性質は未知であるが、B69-6株は（PCR分析により決定されたように）修飾されたorfCコーディング領域の正確な組み込み／遺伝子交換を有していない。
【０３０５】
これらのデータより、最大のDHA産生を達成するためにはB69-2株を用いて、または最大のDHA/DPA比率が望まれる場合には、B69-6株もしくはB105-1A1株を用いて、生産規模の発酵を開発することができる。
【０３０６】
（表２）orfC変異体の概要
0005551584.tif 000022
Dcw  乾燥細胞重量
FAME  脂肪酸メチルエステル
Th.23B  スラウストキトリウムsp.23B；ATCC20892
【０３０７】
実施例5
以下の実施例は、多重プラスミドシステムによる大腸菌におけるDHAおよびDPAの産生を記載し、さらに、PUFA PKSシステムのDH2ドメインが、システムによる脂肪酸産生の比率を制御することを例示する。
【０３０８】
本発明者らは、シゾキトリウム由来のOrfA、OrfB*、OrfC、およびノストック（Nostoc）（米国特許出願公開第20050100995号の41頁、実施例3）由来のHetIを発現するT7誘導可能システムの使用による、大腸菌におけるDHAおよびDPAの産生を、以前に証明した。先の実施例において、OrfA、OrfB*、およびOrfCは、単一のプラスミドに含有されていた。遺伝子操作がより容易なシステムを作出するために、シゾキトリウム由来の個々のコーディング領域を、複数の標的遺伝子の共発現のために設計された適合性発現プラスミドのセットにクローニングした。標的遺伝子の発現は、このDuetシリーズのプラスミド（Novagen）において、誘導可能T7プロモーターにより同様に駆動される。シゾキトリウムorfAを、pBR115L1由来のNdeI-XbaI断片として発現ベクターpETDuet-1へクローニングし、pREZ91を作出した（pBR115L1は、米国特許出願公開第20050100995号の41頁、実施例3における最終発現プラスミドの作成において参照される）。シゾキトリウムorfB*を、pJK780由来のNdeI-XbaI断片として発現ベクターpCDFDuet-1へクローニングし、pREZ96を作出した（pJK780は、米国特許出願公開第20050100995号の41頁、実施例3における最終発現プラスミドの作成において参照される）。シゾキトリウムorfCを、pJK510由来のNdeI-XbaI断片としてpColADuet-1へクローニングし、pREZ101を作出した（pJK510は、米国特許出願公開第20050100995号の41頁、実施例3における最終発現プラスミドの作成において参照される）。必要とされたアクセサリー遺伝子、ホスホパンテテイントランスフェラーゼ（PPTase）をコードするhetIは、以前に記載された（米国特許出願公開第20050100995号の41頁、実施例3）、pACYC184に基づくプラスミドpJK737の上に供給された。それぞれプラスミドpREZ91、pREZ96、pREZ101、およびpJK737に別々に含有されたOrfA、OrfB*、OrfC、およびhetIを、誘導可能T7 RNAポリメラーゼを含有している大腸菌株BLR(DE3)（Novagen）に形質転換した。
【０３０９】
これらの多重プラスミド株を使用して、25℃および30℃の両方で、ルリアブロス（LB）中で培養された大腸菌細胞において、DHAおよびDPAの産生が検出された（下記表3参照）。単一のコロニーを、所定の株において各プラスミドを維持するために抗生物質が補足されたLBブロスへ接種し、所望の温度（25℃または30℃）で一夜培養した。次いで、容量300μLのこれらの培養物を、適切な抗生物質を含む30mL LBの主培養物に接種するために使用した。OD600（BioPhotometer, Eppendorf）が0.45〜0.55になるまで、主培養物を示された温度で培養し、その時点で、培養物を1mMの最終濃度のIPTGにより誘導した。次いで、培養物をこれらの発現条件の下で24時間維持し、その後、細胞を遠心分離により収集し、FAME分析のために調製した。シゾキトリウムorfCを保持している株について、30℃で産生された（全FAMEの割合としての）PUFAの典型的なレベルは、10％DHAおよび6％DPA（16％全PUFA）であった。1.7というDHA/DPA比率は、シゾキトリウムにおいて見られたものに近い（下記表2参照）。
【０３１０】
大腸菌におけるDHAおよびDPAの産生のために必要とされるシゾキトリウム遺伝子の、別々のプラスミドにおける発現は、PUFA生合成遺伝子をより容易に研究し操作する能力を、本発明者らに提供した。米国特許出願公開第2005/0100995号、実施例8に記載されたように、シゾキトリウムにおいて、orfCの、スラウストキトリウム23B由来の相同遺伝子との交換は、DHA対DPA比率のシフトによりPUFAプロファイルを改変することが証明された。シゾキトリウムorfC発現プラスミド（pREZ101）を、類似のスラウストキトリウム23B orfC発現プラスミド（pREZ142）と交換する、類似した実験を、上記の大腸菌多重プラスミド発現システムにより実施した。
【０３１１】
pREZ142を作出するために、pREZ31由来のTh.23B orfCコーディング領域を、NcoI/SalI断片としてDuetベクターpColADuet-1へクローニングした。プラスミドpREZ31は、BamHI制限部位（下記下線）が開始ATG（下記小文字）の直ぐ上流に工作された、（上記実施例1および米国特許出願公開第2005/0100995号の実施例8に記載された）「パーフェクトステッチ」遺伝子交換ベクターpREZ33の変異体である。この工作は、pREZ31において、BamHI部位の最後の2塩基およびTh.23B orfCコーディング領域の最初の4塩基から構成される開始ATGを含有しているNcoI制限部位（下記イタリック体）を偶然に作出した。
0005551584.tif 000023
【０３１２】
このクローニングにおいて使用されたSalI制限部位は、シゾキトリウムorfC下流領域に元からあり、TAA終止コドンの約250bp下流である。この大腸菌発現システムにおけるTh.23B orfCとシゾキトリウムorfCとの交換は、1.5から6.8へのDHA対DPA比率のシフトを含む改変されたPUFAプロファイルをもたらし、株が25℃で培養され誘導された時、DHA＋DPAの総量が10％から4％へと低下した（下記表参照）。
【０３１３】
DHA対DPAの比率の制御を担っている遺伝子の領域またはドメインを決定するために、ハイブリッドorfCコーディング領域を作成した。発現プラスミドpREZ179中のハイブリッドorfCは、スラウストキトリウム23B orfCに由来し、上流および下流にシゾキトリウムorfC配列が隣接している中央DH2領域を含有している（実施例2参照）。上記のシステムにおいて、pREZ101の代わりにpREZ179が発現された場合に、6.5というDHA対DPA比率が見られたが、25℃で発現され誘導された場合に、全PUFA量は9％であった（下記表参照）。この大腸菌モデル発現におけるDHA対DPA比率のシフト、および収率の維持は、orfCの中央DH2領域がPUFA生合成におけるDHA対DPA比率の大部分または全部を制御することを示した。次いで、この構築物を、付加的な隣接DNAにより修飾し天然のorfCを交換するためにシゾキトリウムに形質転換したところ、DHA対DPA比率の類似したシフトが見られ、産生の減少は見られなかった（実施例4参照）。同様に、ハイブリッドorfCを酵母システムにおいて発現させたところ、DHA対DPA比率のシフトが再び見られた（実施例6参照）。
【０３１４】
（表３）
0005551584.tif 000024
【０３１５】
多重発現プラスミドシステムの使用
大腸菌および酵母多重プラスミド発現モデルシステムを、PUFA生合成におけるDHA対DPA比率の制御におけるorfC、特に、DH2領域の役割を解明するために使用した上記の実施例は、これらの異種のシステムの有用性を証明する。大腸菌および酵母において見られた結果は、DHA/DPA比率に対するorfC起源の相対的な効果に関してシゾキトリウムにおいて見られたものに平行している。同様に、PUFA鎖長、脂肪酸飽和度、および二重結合の位置付けを含むPUFA生合成のその他の局面を調査し、工作するための大腸菌および酵母における多重プラスミド発現モデルシステムが、本明細書に記載される。これらのシステムは、ヒドロキシル化およびグリコシル化のようなその他の型の脂肪酸修飾に関与している遺伝子の容易な発現も可能にすると考えられる。同様に、（米国特許出願公開第2005/0100995号、実施例2に記載されたShewanella japonicaクラスターについて行われたような）単一の生物に由来する、または複数の生物に由来するその他のPUFA生合成遺伝子が、研究を容易にするために、この大腸菌システムへクローニングされ得る。
【０３１６】
実施例6
以下の実施例は、シゾキトリウムのPUFAシンターゼサブユニットA、B、およびC、ならびにノストックhetIを、酵母において発現させる方法を記載し、さらに、PUFA PKSシステムのDH2ドメインがシステムによる脂肪酸産生の比率を制御することを例示する。
【０３１７】
パートA
予備的な発現実験は、天然のコーディング領域を使用して、酵母において、全長タンパク質としてシゾキトリウムOrfCおよびHetIが産生され得ることを示した。対照的に、シゾキトリウムOrfAおよびOrfBの天然のコーディング領域の発現は、検出可能な量の予想タンパク質の産生をもたらさなかった。問題は、mRNAの翻訳に関連していると考えられた。（ノーザンブロットは、正確なサイズのmRNAの存在を示した。）従って、それらの2つのコーディング領域の合成バージョンを、酵母における発現を改善することを目標として作成した。合成遺伝子によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列は、天然の遺伝子によりコードされるものと同一である（すなわち、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:4）。orfAおよびorfBの最初の遺伝子設計および完全遺伝子合成は、Blue Heron Biotechnology, Inc.（Bothell, WA）により実施された。コドン最適化は、S.セレビシエ（cerevisiae）のコドン優先を考慮に入れた。（sOrfAおよびsOrfBと名付けられた）合成コーディング領域の完全な配列は、SEQ ID NO:35（sOrfA）およびSEQ ID NO:36（sOrfB）として記載される。酵母形質転換ベクターにおけるクローニングを容易にするために、各合成コーディング領域に以下のようにDNAを付け加えた。
上流配列（SEQ ID NO: 87）
0005551584.tif 000025
下流配列（SEQ ID NO: 88）
0005551584.tif 000026
【０３１８】
開始コドンおよび終止コドンの位置には下線が引かれ、HindIII（上流）およびXbaI（下流）の制限酵素認識部位は、太字で示されている。
【０３１９】
S.セレビシエ株InvSC1（MATa his3-Δ1, leu2, trp1-289, ura3-52）（Invitrogen, Carlsbad, CA）を、これらの実験のため使用した。株は供給元の推奨通りに維持され形質転換された。形質転換体は、製造業者（Invitrogen）の指示通りに、グルコース固形培地、ラフィノースブロス、およびガラクトース誘導培地で培養された。全ての酵母培地成分がQ-BIOgene（Carlsbad, CA）から購入された。
【０３２０】
シゾキトリウムPUFAシンターゼ遺伝子およびhetIを、以下の形質転換ベクターへクローニングした：pYES-Leu*（sOrfA；SEQ ID NO:35）、pYES3-Tryp（sOrfB；SEQ ID NO:36）、pYES2/CT（OrfC；SEQ ID NO:5）、およびpYES-His*（hetI；SEQ ID NO:33）。これらのベクターの作出を、以下に詳細に記載する。ベクターおよび遺伝子のうちのいくつかは、特定のクローニングおよび発現の要件に適応するよう修飾された（以下に詳細に記載される）。特定の実験に依って適切な選択培地が使用された。遺伝子はそれぞれの場合にGAL1プロモーターの後ろにクローニングされ、発現は、Invitrogenにより提供されるガイドラインに従って、ガラクトースを含有している培地に洗浄された細胞を再懸濁させることにより誘導された。細胞は30℃で培養され、誘導培地に移された後、示された時間に（遠心分離により）採集された。細胞ペレットが凍結乾燥され、FAMEが酸性メタノールを使用して調製され、ヘキサンに抽出され、GCにより分析された。
【０３２１】
sOrfA発現構築物：
sOrfAは、以下のように構築されたカスタマイズされたベクターpYES-Leu/CTへクローニングされた。pYES6/CTベクター（Invitrogen）を、ブラストサイジン耐性遺伝子を含有しているそのDNAの領域を、leu2遺伝子を含有しているDNAセグメントに交換することにより修飾した（ロイシンを欠く培地での選択のため）。BglIIおよびNheIによりpYES6/CTを消化し、得られたおよそ4913bpのベクター断片をゲル精製することにより、ブラストサイジン遺伝子を除去した。leu2遺伝子は、酵母ベクターpRS425（ATCC77106, GenBank＃U03452）より入手された。プライマーPO-Leu5'（SEQ ID NO:89）およびPO-Leu3'（SEQ ID NO:90）を、pRS425を鋳型として用いたPCR反応において使用し、leu2遺伝子を含有しているおよそ1812bpのDNA断片（pRS425のbp664〜2475）を作成した。
0005551584.tif 000027
クローニングを容易にするために、制限酵素認識部位をプライマーに組み入れた（5'NheIおよび3'BamHI、下線部）。PCR断片をBamHIおよびNheIにより消化し、pYES6/CT BglII/NheI消化物から入手された4913bpベクター断片とライゲーションし、pYES6-Leuを形成させた。このベクターを、sOrfAの挿入に備えてHindIIIおよびXbaIにより消化した。sOrfAおよび適切な隣接DNAを含有しているアオサギ由来のプラスミドを、HindIIIおよびXbaIにより消化した。完全なsOrfAを含む8.8kbの断片を、ゲル精製し、準備されたpYES6-Leuベクターとライゲーションし、pBR882（pYES6-Leu:sOrfA）を形成させた。
【０３２２】
sOrfB発現構築物：
本発明者らは、トリプトファン選択マーカーを有するpYES3酵母発現ベクターへsOrfBをクローニングすることを望んだ。pYES3ベクターは、第2のXbaI制限部位（第2の部位はtrp1遺伝子内にある）を含有しているため、その制限酵素を都合よくsOrf B DNA断片の導入のために使用することはできなかった。sOrfBの下流のXbaI部位を含有している領域を、以下のように、（pYES3における遺伝子挿入クローニング部位としても利用可能な）独特のNotI部位を導入するために修飾した。アオサギ由来のsOrfB断片を含有しているプラスミドを、HindIIIおよびXbaIにより消化し、関心対象の得られた6.2kbの断片をゲル精製した。その断片を、同酵素により切断されたpYES2/CT（Invitrogen）とライゲーションし、プラスミドpBR879を得た。このプラスミドを、独特のXbaI部位で切断することにより開環した。自己相補的なオリゴリンカー
0005551584.tif 000028
を使用して、独特のNotI部位（下線；また、それはXbaI部位を排除した）を作出した。これによりプラスミドpJK894が得られた。この構築物をHindIIIおよびNotIにより消化し、関心対象の得られた6.2kbの断片をゲル精製した。その断片を、同酵素により切断されたpYES3/CT（Invitrogen）とライゲーションし、pJK908（pYES3:sOrfB）を形成させた。
【０３２３】
OrfC発現構築物：
天然のorfCは、以前に細菌発現ベクターにクローニングされており、これが酵母発現のための遺伝子の起源として役立った。細菌ベクターは、pBluescript II KS（Stratagene）であり、コーディング領域＋隣接DNAをベクターのEcoRI部位（5'）およびXbaI部位（3'）へクローニングした。インサートDNAは、ATG開始コドンの一部としてNdeI制限部位を、XbaI部位の直前にTAA終止コドンを含んでいた。細菌リボソーム結合部位配列は、EcoRI部位と開始コドンを含有しているNdeI部位との間の領域に含まれていた。酵母ベクターへのクローニングの前に、リボソーム結合部位DNAを除去し、酵母システムにおける発現のための適切なDNAと交換した。orfCを保持しているpBluescriptプラスミドを、EcoRIおよびNdeIにより消化し、オリゴヌクレオチドリンカー
0005551584.tif 000029
とライゲーションした。（pKCFLと名付けられた）得られたプラスミドを、HindIII（pBluescript KSポリリンカー内のEcoRI部位の直ぐ上流）およびXbaIにより消化し、およそ4526bpの断片を遊離させた。この断片を、HindIII/XbaIで消化されたpYES2/CTとライゲーションし、pYES2/ORFCwt（pYES2:OrfC）を作成した。
【０３２４】
HetI構築物：
PPTaseをコードするノストック由来のhetI遺伝子は、以下のように構築されたカスタマイズされたベクター、pYES6-His/CTへクローニングされた。pYES6/CTベクター（Invitrogen）を、ブラストサイジン耐性遺伝子を含有しているDNA領域を、his3遺伝子を含有しているDNAセグメントと交換することにより修飾した（ヒスチジンを欠く培地における選択のため）。BglIIおよびNheIによりpYES6/CTを消化し、得られたおよそ4913bpのベクター断片をゲル精製することにより、ブラストサイジン遺伝子を除去した。his3遺伝子を、プライマーPO-His5'（SEQ ID NO:92）およびPO-His3（SEQ ID NO:93）を使用して、酵母ベクターpRS423（ATCC77104,GenBank＃U03454）から増幅した。
0005551584.tif 000030
これにより、his3遺伝子を含有しているpRS423プラスミドのおよそ1251bpの領域が作成された。クローニングを容易にするために、制限酵素認識部位（5'SpeIおよび3'BamHI、下線部）をプライマーに組み入れた。PCR断片をSpeIおよびBamHIにより消化し、pYES6/CTから入手されたおよそ4913bpのベクター断片とライゲーションし、pYES6-Hisを形成させた。このベクターを、hetI遺伝子の挿入に備えてBamHIおよびXbaIにより消化した。
【０３２５】
hetI遺伝子は、以前にクローニングされ、大腸菌におけるPUFA産生のためシゾキトリウムPUFAシンターゼ遺伝子と共に使用された（米国特許出願公開第20040235127号、実施例2）。その出願において示されたように、読み取り枠内にメチオニンコドンは存在しないが、5'末端の近くにいくつかの可能性のある代替開始コドン（TTGおよびATT）が存在する（Black and Wolk, 1994, JBC 176, 2282-2292）。ノストックゲノムDNAからOrfを増幅するためにPCRを使用した。5'プライマーは、メチオニンコドン（ATG）を作出するために最も5'側のTTGコドンの最初のTがAに交換されるよう設計された。3'プライマーは、TGA終止コドンを含んでいた。ノストックヌクレオチド配列のbp3994〜3282から拡張された増幅された領域は、GenBank＃L22883として寄託された（ヌクレオチド3994は、ATGコドンが形成されるよう改変されたTTGコドンの2番目のTである）。この増幅されたhetI Orfを、大腸菌における発現のための隣接調節要素と共にpACYC184ベクターにクローニングした。このhetI Orfのクローンを鋳型DNAとして使用して、pYES6-Hisへのクローニングに備えて遺伝子を増幅した。プライマーHetI 5'（SEQ ID NO:94）およびHetI 3'（SEQ ID NO:95）を、hetI Orfを含有している740bp断片を作出するために使用した。
0005551584.tif 000031
クローニングを容易にするために、制限酵素認識部位（5'BamHIおよび3'XbaI、下線部）をプライマーに組み入れた。ATGメチオニン開始コドン（5'プライマー）およびTGA終止コドン（3'プライマーの中の逆方向TCAトリプレットとして示される）は、太字で示されている。PCR産物をBamHIおよびXbaIにより消化し、事前に準備されたpYES6-Hisベクターへライゲーションし、pYES-His/Het/CT（pYES6-His:HetI）を形成させた。
【０３２６】
酵母におけるpYES6-Leu:sOrfA、pYES3:sOrfB、pYES2:OrfC、およびpYES6-His:HetIの発現の結果
図7は、シゾキトリウムPUFAシンターゼシステム（sOrfA、sOrfB、OrfC、およびhetI）を発現している酵母細胞に由来するFAMEのGCプロファイルと、（sOrfA遺伝子を欠く）対照細胞（そのような酵母株は、本明細書において、それぞれBRY4.5株およびBRY3.3株と表記される）から入手されたものとの比較を示す。細胞は誘導からおよそ20時間後に収集された。完全なPUFAシンターゼシステムを発現する株のプロファイルにおいて、2つの新規のFAMEピークが出現したことが分かる。これらの2つのピークは、信頼できる標準との溶出時間の比較、続いてMSの分析により、DPAn-6およびDHAとして同定された。シゾキトリウムPUFAシンターゼの特徴決定から予測されるように、プロファイル中にはDHAおよびDPAn-6以外に他の新規のピークは認められない。図8は、PUFA FAMEを含有している図8のGCクロマトグラムの領域を示す。対照細胞およびPUFAシンターゼを発現する細胞の両方が、DHA FAMEの近くに溶出するピークを含有している。これは、（質量スペクトル分析により）C26:0 FAMEとして同定され、スフィンゴ脂質に由来する可能性が高い。それはDHAピークの近くに溶出するが、分解はDHAの定量に干渉しない程度に十分である。DPAn-6ピークは、FAMEプロファイル中の他の内因性酵母脂質からよく分離されている。BRY4.5株のこの特定の例において、シゾキトリウムPUFAシンターゼシステムを発現している細胞は、2.4％DHAおよび2.0％DPAn-6（全FAMEの割合として；下記表4参照）を蓄積した。DHAおよびDPAn-6の合計は、細胞において測定された脂肪酸の4.4％である。細胞において観察されたDHA対DPAn-6の比率は、およそ1.2：1であった。
【０３２７】
酵母におけるシゾキトリウムPUFAシンターゼの発現を示す上に提示された結果は、以前の出願において提唱された経路の確認を提供し、酵母において、また植物においても予想され得る脂肪酸プロファイルの改変に関する予測も提供する。
【０３２８】
パートB
スラウストキトリウム23BのorfC相同体に由来するDH2領域を含有しているOrfCをコードするハイブリッド遺伝子と組み合わせられた酵母におけるシゾキトリウムのPUFAシンターゼOrfA、OrfB、およびノストックHetIの発現、ならびにこれらの細胞において産生されるPUFAに対する効果
酵母におけるハイブリッドシゾキトリウム/Th.23B OrfC遺伝子の発現：
本願の他のセクションに記載されるように、本発明者らは、PUFAシンターゼのn-3対n-6 PUFA産物の比率の主要な決定要素が、OrfCタンパク質、より具体的にはそのタンパク質のDH2領域に存在することを発見した。シゾキトリウム由来PUFAシンターゼ遺伝子と組み合わせられたTh.23B由来OrfC相同体を使用した大腸菌およびシゾキトリウム両方における遺伝子交換実験は、これらの混合システムにより産生されるDHA対DPAn-6比率の改変をもたらした。大腸菌において、PUFAシンターゼの産物は遊離脂肪酸として蓄積し、宿主生物の脂質合成酵素による酵素の一次産物の蓄積に対する影響はないと推測される。シゾキトリウムにおいては、PUFA産物はエステル化脂質に蓄積するが、内因性の脂質合成酵素はDHAおよびDPAn-6の両方に容易に適合することができる可能性が高い。なぜなら、それらは未修飾宿主の脂質画分の主成分であるためである。酵母における混合PUFAシンターゼシステムの発現は、異種真核生物宿主（例えば、植物）のためのモデルを提供すると考えられる。
【０３２９】
非合成Th.23B orfC遺伝子および完全合成Th.23B orfC遺伝子を酵母において発現させる試みは、予想されたタンパク質を検出することができなかったため、不成功であった。対照的に、ハイブリッドorfC構築物の発現（下記）は、活性タンパク質の産生をもたらした。
【０３３０】
pYES2におけるハイブリッドシゾキトリウム/Th.23B OrfC：
DH2領域をコードするDNAのセクションおよび隣接DNAを除去するために、天然のシゾキトリウムorfCを含有しているプラスミドpYES2:OrfC（上記）を、BsiWIおよびPmlIにより消化した。除去された領域は、シゾキトリウムorfC配列（SEQ ID NO:5）のおよそ1179bp（BsiWI部位）からおよそ3256bp（PmlI部位）までであった。（orfCの5'および3'部分と共にベクターを含有している）得られた8.4kbの断片をゲル精製した。ハイブリッドシゾキトリウム/Th.23B orfCを含有している既に記載されたプラスミド（pREZ179＝pColA DUET-Schizo.orfC-Th.23B DH2ハイブリッド）（実施例2参照）を、BsiWIおよびPmlIにより消化し、Th.23B DH2領域および隣接シゾキトリウムDNAを含有している2kbの断片をゲル精製した。2個の精製された断片をライゲーションし、pYES2:OrfC-23BDH2を形成させた。
【０３３１】
類似の戦略をpYES2:OrfC-s23BDH2を作出するために使用した。この場合、合成Th.23B DH2領域の起源として使用されたプラスミド（pDD22；実施例3参照）は、Th.23B DH2ドメインをコードするDNAが、より密接にシゾキトリウムの優先と一致するようコドンが修飾された合成コーディング領域に由来する、ハイブリッドorfCであった（実施例3参照）。
【０３３２】
酵母におけるpYES6-Leu:sOrfA、pYES3:sOrfB、pYES6-His:HetI、およびPYES2:OrfC-23BDH2、またはpYES2:OrfC-s23BDH2の発現の結果：
表4は、シゾキトリウムサブユニットAおよびBならびにノストックHetIと共にハイブリッドOrfC構築物を発現している酵母において産生されたPUFAを示す。上記パートAにおいて観察されたように、これらの酵母試料において検出された唯一の新規のピークは、DHAおよびDPAn-6であった。増殖条件および試料調製は上記の通りであった。関連するPUFAデータのみが示される（面積％として与えられたFAMEとして）。BRY4.21と標識された試料は、天然のTh.23B DH2領域と共にハイブリッドorfCを含有しており、BRY4.23と標識された試料は、合成遺伝子に由来するTh.23B DH2領域と共にハイブリッドorfCを含有している。BRY4.21株については2つの試料（aおよびb、独立の単離物に由来）が試験され、BRY4.23株の1つの単離物が試験された。シゾキトリウムorfCを発現している細胞と比較して、いずれかの型のハイブリッドorfCを発現している細胞は、より高いDHA/DPAn-6比率を有する（天然のTh.23B DH2を有するものについては平均およそ2.6、および合成Th.23B DH2を有する試料についてはおよそ2.9という値）。酵母におけるハイブリッドorfC遺伝子の発現は、明白に、天然のシゾキトリウムorfC遺伝子を発現している酵母に比べてDHA対DPAn-6比率の増加をもたらした。Th.23B細胞またはハイブリッドorfCを発現しているシゾキトリウムにおけるDHA/DPAn-6比率が、はるかに高い（およそ8〜10）という事実は、DPAn-6に対するDHAの蓄積への偏りにその他の因子が寄与していることを示す。酵母においてその比率が増加したという観察は、この構築物が異種真核生物宿主（例えば、酵母または植物）におけるPUFAシンターゼシステムの発現についての有用なモデルであることを示す。
【０３３３】
（表４）
0005551584.tif 000032
【０３３４】
実施例7
以下の実施例は、実施例4に記載された様々な遺伝学的に修飾されたシゾキトリウム株を使用した発酵規模実験におけるPUFAの産生を証明する。
【０３３５】
実験1
典型的な発酵条件の下で2リットルの発酵槽を使用して、野生型シゾキトリウム（ATCC20888）の2つの培養物およびトランスジェニックシゾキトリウム（B67-5、天然のシゾキトリウムorfCコーディング領域の代わりにコドン最適化（合成）Th.23B orfCコーディング領域を有する；実施例4参照）の2つの培養物を、脂肪酸プロファイルを比較するために培養した。各株を、炭素、窒素、リン、塩、微量金属、およびビタミンを含有している培地において発酵させた。各発酵槽に、典型的な種培養物を接種し、次いで80時間培養し、培養の間、炭素源および窒素源の両方を供給した。窒素源は、増殖期の間にのみ供給され消費され、炭素源は、発酵の間中、供給され消費された。80時間後、各発酵槽からの試料を遠心分離し、凍結乾燥し、脂肪酸含量についてガスクロマトグラフィーにより分析した。
典型的な発酵条件：
温度：28〜30℃
pH：5.0〜7.5
撹拌：100〜300cps
気流：0.25〜2.0vvm
グルコース：5〜35g/L（濃度）
接種原：7.5％〜15％
結果は下記表5に示される通りであった。
【０３３６】
（表５）
0005551584.tif 000033
【０３３７】
表5に示されるように、天然のシゾキトリウムコーディング領域の代わりに合成スラウストキトリウム23B orfCコーディング領域を含有している株B67-5は、野生型シゾキトリウム株より多いDHAを産生し、大きなDHA対DPAn-6の比率を有していた。
【０３３８】
実験2
典型的な発酵条件の下で10リットルの発酵槽を使用して、野生型シゾキトリウム（ATCC20888）の1つの培養物、およびトランスジェニックシゾキトリウム（B105-1A1；天然のシゾキトリウムDH2領域の代わりに非コドン最適化（スラウストキトリウム天然）Th.23B DH2コーディング領域を含有している；実施例4参照）の1つの培養物を、脂肪酸プロファイルを比較するために培養した。各株を、炭素、窒素、リン、塩、微量金属、およびビタミンを含有している培地において培養した。各発酵槽に典型的な種培養物を接種し、次いで72時間培養し、培養の間、炭素源および窒素源の両方を供給した。窒素源は、増殖期の間にのみ供給され消費され、炭素源は、発酵の間中、供給され消費された。72時間後、各発酵槽からの試料を遠心分離し、凍結乾燥し、脂肪酸含量についてガスクロマトグラフィーにより分析した。
典型的な発酵条件：
温度：28〜30℃
pH：5.0〜7.5
撹拌：100〜300cps
気流：0.25〜2.0vvm
グルコース：5〜35g/L（濃度）
接種原：7.5％〜15％
結果は表6に示される。
【０３３９】
（表６）
0005551584.tif 000034
【０３４０】
表6は、シゾキトリウムDH2領域の代わりにスラウストキトリウム23B DH2領域を含む株が、より高いDHA/DPAn-6の比率を有していることを示し、このことは、本明細書に記載されたキメラPUFA PKSシステムの使用により達成される改善されたDHA比率を、再び例示している。
【０３４１】
実施例8
この実施例は、シゾキトリウムにおいて発現された合成のコドン最適化されたTh.23B orfA、orf B、およびorfCのコーディング領域の全ての組み合わせの構築および評価を記載する。
【０３４２】
シゾキトリウムorfCコーディング領域のTh.23B合成コドン最適化orfCコーディング領域との正確な交換の方法の詳細な説明は、上に与えられた（実施例1および4）。当業者は、これらの技術が、一般に、大部分の関心対象の遺伝子に適用され得ることを認識する。当業者は、そのような遺伝子の設計および交換が、これらの方法の変法またはその他の方法の全部により達成され得ることをさらに認識する。例えば、複数の遺伝子／コーディング領域を同時に欠失させ、同時に交換することができる。シゾキトリウムにおいて、orfA遺伝子およびofB遺伝子は、（SEQ ID NO:76を含む）遺伝子間領域により分離され、ゲノムにおいて共に近くに見出される（「連結されている」）。（遺伝子間領域と共に）これらの2つのコーディング領域を、orfCについて以前に記載されたものと類似の方法（米国特許出願公開第20050100995号）により、同時に欠失させることができる。次いで、上記実施例1および4に記載されたものに類似の方法を、（シゾキトリウム遺伝子間領域全体を含む）合成コドン最適化Th.23B orfAおよびorfBコーディング領域の、シゾキトリウムorfA/orfB遺伝子座への「パーフェクトステッチ」交換を同時に作出するために使用することができる。B80-1およびB80-20（表7）のような株は、このようにして作出された。
【０３４３】
もう一つの例において、著しい欠失構造＋第2の選択可能マーカーを保持しているプラスミドが、まず、単一の交差事象により、標的遺伝子座に完全に組換えられる「ツーステップ」法により、コーディング領域欠失が作出され得る。次いで、第2の選択可能マーカーが失われ、欠失構造が最初の遺伝子構造の代わりに残るよう、欠失構造の反対側の部位における単一の交差事象により、組換え体構造が「分離」する（Rothstein R., 「Targeting, Disruption, Replacement, and Allele Rescue: Integrative DNA Transformation in Yeast」, pp281-301 Methods in Enzymology, vol. 194 (1991), Elsevier/Academic Press, Amsterdam）。B71-1株（表7）の前駆体は、このようにして作出された。
【０３４４】
ここに概説された方法により、合成の（コドン最適化された）Th.23B orfA、orfB、およびorfCのコーディング領域の全ての組み合わせに、同族のシゾキトリウムコーディング領域が交換された1セットのシゾキトリウム株が作出された。Th.23B遺伝子を含有していないセットメンバーは野生型シゾキトリウムATCC20888であり、（全長）合成コドン最適化Th.23B orfCコーディング領域のみを含有しているセットメンバーB67-5は、上記実施例4および表1に記載された。8株のこのセットを、上記実施例4に記載されるようなSSFM培地における増殖の間の脂肪酸産生について評価した。データは表7に与えられる。
【０３４５】
プラスミドpDD26は、シゾキトリウムorfA遺伝子の上流領域および下流領域にパーフェクトステッチが施された全長合成Th.23B orfAコーディング領域を含有している。pDD26のコーディング領域のヌクレオチド配列は、本明細書においてSEQ ID NO:71により表される。SEQ ID NO:71はSEQ ID NO:39をコードする。pDD26は、既に本明細書に記載されたように、ATCCアクセッション番号PTA-8411として寄託されている。
【０３４６】
プラスミドpDD32は、シゾキトリウムorfB遺伝子の上流領域および下流領域にパーフェクトステッチが施された全長合成Th.23B orfBコーディング領域を含有している。pDD32のコーディング領域のヌクレオチド配列は、本明細書においてSEQ ID NO:72により表される。SEQ ID NO:72はSEQ ID NO:52をコードする。pDD32は、既に本明細書に記載されたように、ATCCアクセッション番号PTA-8412として寄託されている。
【０３４７】
全ての3種の合成コドン最適化Th.23B orfコーディング領域のタンパク質産物は、シゾキトリウムにおいて機能し、起源に関わらず他のPUFAシンターゼ成分と相互作用することに成功した。Th.23B OrfCタンパク質（B67-5株）の発現は、天然Th.23B株のものに近い値へのDHA/DPA比率の増加を引き起こす（実施例4において既に証明された結果）。この現象は、Th.23B OrfCタンパク質を発現している全ての組み合わせ（B67-5、B79-11、B79-1、およびB80-20）について見られる。驚くべきことに、合成コドン最適化Th.23B orfC＋合成コドン最適化Th.23B orfAコーディング領域の組み合わせ（B79-1株）は、高いDHA/DPA比率を維持しつつ、最高レベルのDHA産生へと通じる。このシゾキトリウム株における増加したDHA産生は、Th.23B OrfCにより引き起こされた増加したn-3/n-6比率、およびTh.23B OrfAのTh.23B OrfCとの相互作用により引き起こされた増加した全PUFA産生の両方によるものであると考えられる。
【０３４８】
これらのデータは、異なる生物に由来するPUFAシンターゼ複合体の成分が、共機能することに成功し、起源生物の特定の特徴を新たな宿主に付与することができることを証明している。さらに、PUFAシンターゼ成分の起源および発現レベルの操作は、標的脂肪酸の新規のプロファイル、より高い生産性、およびより低いコストヘ通じることができる。
【０３４９】
（表７）
0005551584.tif 000035
【０３５０】
本明細書中に引用された参照は、各々、参照により完全に本明細書に組み入れられる。
【０３５１】
本発明の様々な態様が詳細に記載されたが、それらの態様の修飾および適応が当業者に想到されるであろうことは明白である。しかしながら、そのような修飾および適応は、以下の特許請求の範囲に示されるような本発明の範囲内にあることが、明白に理解されるべきである。
【図１】
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【図２Ａ】
0005551584.tif 000037
【図２Ｂ】
0005551584.tif 000038
【図３Ａ】
0005551584.tif 000039
【図３Ｂ】
0005551584.tif 000040
【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
0005551584.tif 000042
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
0005551584.tif 000045
【図６】
0005551584.tif 000046
【配列表】
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