(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
pH-応答性マイクロゲル粒子の分散物を含み、前記マイクロゲル粒子が、pH変化に暴露する前に、1ｎｍから10μｍの粒子径を有する、損傷を受けたまたは変質した荷重−支持組織；損傷を受けたまたは変質した関節；損傷を受けたまたは変質した脊椎、若しくは椎間板（IVDs）；または関節炎、背痛、腰痛、坐骨神経痛、頸部脊椎症、頸部痛、脊椎後湾症、脊椎側湾症、変性関節疾患、変形性関節症、脊椎分離症、脊椎すべり症、椎間板脱、失敗した脊椎外科手術、若しくは脊柱不安定症を治療するための医薬として使用される組成物であって、
前記マイクロゲル粒子が、以下の式IVにより定義される共重合ポリマー粒子を含み：
ポリ(B-co-P-co-X)          (式IV)
（該式IVにおいて、PはpH-応答性コモノマーであり、Bは疎水性コモノマーであり、またXは官能性の架橋性コモノマーである）
該pH-応答性コモノマー：Pは、以下の式IIによって定義される：
R1R2C=CR3R4              (式II)
（該式IIにおいて、(a) R1, R2およびR3は、夫々独立にH；CH3；直鎖または分岐鎖アルキル基；またはN-アルキル基からなる群から選択され；
(b) R4は、夫々独立に、以下に列挙するものからなる群から独立に選択される：
(i) カルボン酸；COOH；またはR5-COOH基、ここでR5はCH2；C6H4基；C6H3R6基、ここで、R6は、CH3、ハロゲン原子、またはアミド基、または CH3、ハロゲン原子、またはアミド基の２以上で置換された他のフェニル基から選択される置換基を含む）
該疎水性コモノマー：Bは、以下の式Vによって定義される：
R51R52C=CR53R54            (式V)
（ここで、(a) R51およびR52 は、H、CH3、直鎖または分岐アルキル基、N-アルキル基からなる群から独立に選択され、また
(b) R53およびR54のうちの一方は、H、CH3、または直鎖または分岐アルキル基から選択され、R53およびR54のうちの他方は、式：-C(=O)-OR55で示されるエステルから選択され、ここでR55はCH3、直鎖または分岐アルキル基、またはN-アルキル基を含む）
該官能性の架橋性コモノマー：Xは、以下の式(III)によって定義される：
【化１】
0005551873.tif 000006
（ここで、(a) R21、R22、R23、R31、R32およびR33は、H、CH3、直鎖または分岐アルキル基、または10C単位までのN-アルキル基から独立に選択でき、および
(b) R24は以下に列挙するものからなる群から独立に選択できる：
(i) -C(=O)-O-R34-O-C(=O)-、ここでR34は、-CH2-、-CH2CH2-、長さにおいて20C単位までであり得る直鎖または分岐アルキル基；-C6H4-；またはC6H3R35を含み、ここで R35は、アルキル基、ハロゲン原子、またはアミド基；あるいは2以上のアルキル基、ハロゲン原子、またはアミド基で置換された、他のフェニル基であり、
(ii) -C(=O)-O-R36-C(=O)-、ここでR36 は-(CH2CH2O)n-であり、nは、1〜30であり、
(iii) -C(=O)-O-R37R38R37-、ここでR37は、ラクトン、-[(CH2)5C(=O)-O]m-、ラクチド、-[CH(CH3)C(=O)-O]m-、グリコライド、-[CH2C(=O)-O]m-、ここで、mは、1〜50であり、またR38は、-(CH2CH2O)n-であり、ここでnは、1〜30であり、
(iv) -C(=O)-O-R39-、ここでR39は、ラクトン、-[(CH2)5C(=O)-O]m-、ラクチド、-[CH(CH3)C(=O)-O]m-、グリコライド、-[CH2C(=O)-O]m-であり、ここでmは1〜100であり、
(v) -C(=O)-O-R40-、ここでR40は、-CH2-, -CH2CH2-または長さにおいて20C連鎖までの、直鎖または分岐メチレン鎖、-C6H4-；C6H3R41であり、ここでR41は、アルキル基、ハロゲン原子またはアミド基、または2以上のアルキル基、ハロゲン原子またはアミド基で置換された他のフェニル基である）
【請求項２】
前記pH変化に暴露する前に、前記組成物のpHが、治療すべき組織のpHよりも低い、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
前記pH変化に暴露する前に、前記組成物のpHが、約4.5〜6.0なる範囲内にある、請求項1または2記載の組成物。
【請求項４】
前記pH変化に暴露する前には、前記組成物が、実質的に流体である、請求項1〜3の何れか1項に記載の組成物。
【請求項５】
前記pH変化に暴露する前には、前記マイクロゲル粒子が、実質的に潰れた形状を取る、請求項1〜4の何れか1項に記載の組成物。
【請求項６】
前記pH変化に暴露する前に、前記粒子内の含水率が、水約30％(w/w)未満であり、前記マイクロゲル粒子の径が、約20〜500nmなる範囲内にある、請求項1〜5の何れか1項に記載の組成物。
【請求項７】
前記pH変化に暴露した後の前記マイクロゲル粒子のpHが、約6.0〜7.5なる範囲内にある、請求項1〜6の何れか1項に記載の組成物。
【請求項８】
前記マイクロゲル粒子の径が、該pH変化に応答して増大するか、あるいは実質的に膨潤した形状を取る、請求項1〜7の何れか1項に記載の組成物。
【請求項９】
前記マイクロゲル粒子が膨潤状態にある場合に、該粒子が、少なくとも約95％(w/w)の水を含む、請求項8記載の組成物。
【請求項１０】
前記pH変化に暴露した後の前記マイクロゲル粒子の平均径が、少なくとも200％だけ増大するのに適したものであり、前記pH変化に暴露した後の前記マイクロゲル粒子の径が、約200〜400nmなる範囲内にある、請求項1〜9の何れか1項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物中の粒子の構造変化が、ゲル化段階を含み、前記pH変化に暴露した後に、前記組成物がゲル形状にある、請求項1〜10記載の組成物。
【請求項１２】
膨潤粒子が、実質的に高濃度の可動Na+またはK+イオンを含む、請求項8〜11の何れか1項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記粒子を、フリーラジカル乳化重合を利用して製造する、請求項1〜12の何れか1項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記pH-応答性コモノマーが、
(a) 酸性コモノマーであり、かつ酸性基のpKaが、6.0〜7.0なる範囲内にある、請求項1記載の組成物。
【請求項１５】
式IIで規定される前記pH-応答性コモノマーにおいて、R1及びR2のそれぞれがHであり;R3がCH3であり;R4がCOOHである、請求項1〜14の何れか1項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記官能性の架橋性コモノマーが、エチレングリコールジメタクリレートまたは1,4-ブタンジオールジアクリレートを含む、請求項1、14、または15記載の組成物。
【請求項１７】
前記疎水性コモノマーが、メチルメタクリレートまたはエチルアクリレートを含む、請求項1から16の何れか1項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記マイクロゲル粒子が、ポリ(メチルメタクリレート/メタクリル酸/エチレングリコールジメタクリレート)またはポリ(エチルアクリレート/メタクリル酸/1,4-ブタンジオールジアクリレート)を含むポリマーを含有する、請求項1〜17の何れか1項に記載の組成物。
【請求項１９】
少なくとも1種の髄核細胞および/または少なくとも1種の幹細胞および/または少なくとも1種の哺乳動物細胞を含む、請求項1〜18の何れか1項に記載の組成物。
【請求項２０】
適当な哺乳動物細胞が、軟骨細胞を含む、請求項19記載の組成物。
【請求項２１】
適当な哺乳動物細胞が、自己由来のまたは内因性の軟骨細胞を含む、請求項20記載の組成物。
【請求項２２】
適当な幹細胞が間葉性幹細胞、および造血幹細胞からなる群から選択される幹細胞を含む、請求項19〜21の何れか1項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロゲル粒子に関連し、また特にpHの変動に応答するマイクロゲル粒子、およびこのような粒子の、軟組織の修復方法における利用に関するものである。本発明は、損傷を受けたまたは不適当に形成された荷重-支持組織（load-bearing tissue）、例えば椎間板の修復方法における利用を包含する。
【背景技術】
【０００２】
軟組織の、生体力学的な荷重を十分に支持する能力は、健康並びに安寧にとって必須のものであり、また軟組織の該荷重-支持要件は、その位置に依存する。関節(例えば、踵、膝および股関節)および椎間板(IVD)において見られる組織に対する該荷重-支持要件は、他の軟組織(例えば、ヒト胸部組織)に対する要件よりもかなり高く、例えば、ヒトIVD内で経験する圧力は、座っている際における約0.5MPaから、20kgの荷重を持ち上げる際の約2.3MPaまでの範囲で変動する。
該IVDの主な荷重-支持組織は、円板型の髄核(NP)、即ち椎間板の中心部を構成する、環状のリングによって包囲された軟質海綿状の物質である。該NPは、コラーゲンおよびプロテオグリカンを含むマトリックス内の、軟骨細胞(軟骨生成細胞)からなっている。関節の骨部端部を覆っている組織である、関節部軟骨は、該NPにおいて見出されるものと同様な組成を持つ。該プロテオグリカンは、高い負電荷密度を有し、また高いNP膨潤圧の原因をなす。該NPは、天然のイオン性ヒドロゲルであり、また成人においては、約75％の水を含む。該プロテオグリカンの含有率は、退化(変質)のために、加齢に伴って減少する。この過程は、荷重の作用下での、「裂溝」形成および低い椎間板高さの維持能力をもたらす。該裂溝は、ミリメートルオーダーの内径を持つ、3-次元チャンネル同士を、相互に接続する。
【０００３】
脊椎の下方部分における全IVDの97％以上が、50年に及ぶ加齢により変質する。このことは、慢性的な背痛をもたらしまた、この年齢の大部分の人々において、運動性を低下する。腰痛は、英国(UK)における病気休暇の主な原因となっている。
損傷を受けたIVDの最も一般的な治療は、疾患のある椎間板自体を標的とはせず、寧ろ症状の緩和を目的としている。外科的な介入も、一般的に利用されるが、椎間板の除去または脊椎融合術の利用を包含する。これらの方法は、痛みを緩和するが、脊椎の生体力学特性を大幅に変更してしまい、しかも隣接する椎間板の変質を、しばしば加速する。従って、外科処置は、最後の手段として利用される。更に、このような技術は、長期間に渡る入院、および治療中の患者における、かなりの病的状態を伴う、主な外科手術である。
【０００４】
該IVDの変質を修復し、あるいは予防する上記問題に応用される、物質科学的な方法は、該変質したNPの、該変質部位において重合し得る分子によるターゲッティング（targeting）を包含する。その一例は、該IVDの該NPにおける、ポリ(エチレングリコール)テトラアクリレートの、その場での（in situ）重合を含む。もう一つの例は、該NPにキトサンを注入し、これを重合させる工程を含む。キトサンは、低pHにおいて水に溶解性の、正に帯電した多糖である。これは、該pHが増大すると、溶液-ゲル相転移を起こす。従って、ここで意図しているのは、キトサンを低pH溶液として注入し、次いでインビボにおいてより高いpHに暴露された際に、ゲルを生成できることである。インビボで生成される該ゲルは、帯電しておらず、また該注入された溶液の全体積を占有する、ポリマーの網状構造を形成する。従って、キトサンは、その場での重合によって、マクロゲルとなる。
【０００５】
しかし、その場での重合の臨床的設定における使用を、少なくとも問題あるものとする、該重合に関連する多くの問題がある。その場での重合に係る主な問題は、多くの重合反応が、有害なモノマーおよび開始剤の使用を含む、フリーラジカル重合である点にある。このようなモノマーおよび開始剤は、インビボで使用するには、著しく不適切である可能性がある。共有結合の生成を含む、その場での重合に係る更なる問題は、架橋度が、インビボでは正確に調節できないことにある。その上、妨害反応の高い可能性があり、並びに細胞損傷を引起す有力な候補としての、未反応物質(ポリマー等)が存在するという問題が、常に存在する。
もう一つの方法は、エマルション液滴内での共有結合の形成を利用して、10μmを越える径を持つ、架橋ポリマー粒子を形成することである。しかし、この方法に係る重大な問題は、この方法が大きな粒子のみに限定され、またその粒子径分布が必然的に広くなる点にある。また、該分散相の粘度を低く維持する必要性のために、該液滴内で達成することのできる、該ポリマーの最大体積分率に係る制限もある。
【発明の開示】
【０００６】
従って、本発明の目的の一つは、本明細書において明らかにされたものであれ、あるいはその他において明らかにされたものであれ、1またはそれ以上の公知技術の問題点を排除または軽減することにあり、またマイクロゲル粒子を用いて、損傷を受けたまたは変質した荷重-支持組織を修復する、改良方法を提供することにある。
IVD等の荷重-支持組織を修復するのに利用する、改善技術に対する主な課題は、該損傷を受けたまたは変質した組織の修復を可能とする、注入可能な物質を提供することであることが、理解されよう。また、このような物質に関する主な基準は、その機械的な特性が、その回りの組織の機械的特性と適合することであることをも、理解すべきである。
本発明者等は、如何なる物質が、軟組織の修復のために利用可能であるかを検討すべく、多大な努力を払った。その研究法の一つは、以下においてより詳細に説明されるであろうマイクロゲル粒子が、荷重-支持軟組織の該機械的諸特性を修復する上で、効果的であるか否かを検討することであった。
【０００７】
マイクロゲル粒子は公知であり、微視的な架橋されたポリマー粒子からなっている。このようなマイクロゲル粒子は、インテリジェント薬物放出系として作用させるべく、開発された。該粒子は、負に帯電したカルボキシレート基を含み、そのためにこれらはpH-応答性であり、また中性pHにおいて膨潤することができる。該粒子が膨潤した場合、これらはそこに担持された(payload)薬物分子を放出する。正に帯電したアンモニウム基を含み、かつ中性pHにおいて膨潤し得るマイクロゲル粒子も、公知である。
しかし、これまで、このようなpH-応答性マイクロゲル粒子を、損傷を受けたまたは変質した組織、または軟組織の機械的な特性を修復する目的で使用することを目論んだ者は皆無であった。本発明者等は、高濃度のカルボン酸を含む、pH-応答性マイクロゲル粒子の濃厚な分散液が、低pH(例えば、pH約4.0)において注入可能な流体を与えることができ、該流体は、より高い生理的なpH(即ち、約7.4)において膨潤し、結果としてゲルを形成するものと仮定した。本発明者等は、該分散液中の該膨潤粒子内の膨潤圧力が、椎間板(IVD)組織、および同様に身体中の他の荷重-支持組織において見られるものと同様に、荷重を支持するために利用できるものと理由付けた。該膨潤圧力は、生理的pHにおける、該マイクロゲルの網状構造のイオン化の結果として、該粒子内部に発生した、高い浸透圧に起因するものである。アニオン性カルボン酸-含有マイクロゲル粒子の場合には、このイオン化は、カルボン酸基の脱プロトン化により起る。
【０００８】
驚いたことに、本発明者等は、このようなpH-応答性マイクロゲルが、インビボでの軟組織の修復のために極めて適したものであり、また以下においてより詳しく論じるように、公知技術(例えば、その場での重合に基く方法)を凌駕する、大幅な改善をもたらすことができることを確認することができた。
従って、本発明の第一の局面によれば、pH-応答性マイクロゲル粒子を含み、該粒子が、pHの変動に応答して、構造変化を行うのに適したものであることを特徴とする、組成物の、損傷を受けたまたは変質した軟組織によって特徴付けられる疾患を治療するための、医薬を製造するための使用法を提供する。
【０００９】
本発明は、実施例に示された研究に基くものである。該実施例および図6に示したように、本発明者等は、エチルアクリレート、メタクリル酸およびブタンジオールジアクリレートコモノマー単位を含む、pH-応答性マイクロゲル粒子の分散液を調製した。この分散液は、フォトン相関(photon correlation)分光光度法(PCS)および走査型電子顕微鏡法(SEM)を利用して特徴付けを行った。後者の技術は、該ゲル粒子が、平均径約65nmおよび低い多分散性(約11％なる変動係数)を持つことを示した。該PCSデータは、図1に示されており、また本発明者等は、該分散液中の該粒子の径が、該粒子が暴露されているpHに依存することを観測した。使用に際して、該分散液は、約4.0なるpHに維持し、次いで変質したウシのIVD(図2に示したように)に注入した。該ウシのIVDは、コラーゲナーゼ処理を用いて、制御条件下で変質させた。ウシのIVDが、ヒトIVDに対する確立された動物モデルであることを理解するであろう。
【００１０】
該IVDを、次に塩基性(アルカリ)条件(pH約6.6または好ましくはpH約7.0なる生理的条件に近付くようにpHを増大させる)に暴露するが、この条件は、該分散液中の該マイクロゲル粒子の膨潤を引起し、また図2に示したようにゲルを生成する。該IVDを、検討したところ、驚いたことに、本発明者等は本発明のマイクロゲルが、該IVDの構造において大幅に改善され、しかも変質の点で低下することに気付いた。(図4および5に示したように、圧縮データは、該流体マイクロゲル分散物の注入が、次にゲル化を生じ、かつ変質したIVDの機械的な特性を回復することを明らかに示している)。本発明者等は、pH-応答性マイクロゲル粒子およびその分散物を用いた、この新規な研究が、任意の軟組織、例えば皮膚下部の組織および軟骨に対して適用できるものと確信する。
本発明者等は、生体物質としてマイクロゲル粒子を利用する、完全に新規な方法を明らかにした。本発明者等は、先ず、少なくとも1種の、好ましくは複数のpH-応答性マイクロゲル粒子を含有する組成物が、医薬の製造において利用できることを明らかにした。該医薬は、本発明の第一の局面において定義したような、損傷を受けたまたは変質した軟組織を修復または復元するのに、効果的に利用できる。更に、該第一の局面の医薬は、損傷を受けたまたは変質した軟組織によって特徴付けられる疾患に罹患している個体を治療する方法において使用できる。
【００１１】
従って、第二の局面によれば、損傷を受けたまたは変質した軟組織によって特徴付けられる状態を被っている対象を治療する方法を提供し、この方法は、このような治療を必要とする対象に、治療上有効な量の、pH-応答性マイクロゲル粒子を含む組成物を投与することを含み、ここで該粒子は、pHにおける変動に応答して、構造変化を生じるのに適したものである。
あるいはまた、該第二の局面に従う該方法において使用する該組成物、あるいは該第一の局面において製造した医薬は、例えば注入により、極めて簡単に、治療すべき該組織に投与することができる。従って、これは、最小限度の侵襲的な治療である。結果として、本発明による、損傷を受けたまたは変質した軟組織によって特徴付けられる疾患を治療するための、該組成物の使用は、一般的に利用されている、より一層侵襲的な外科学的方法よりも、一層良好な解決策であることが理解されよう。治療は、より迅速であり、また治療すべき該対象の回復期間は、大幅に減じられる。
【００１２】
「マイクロゲル粒子」なる用語によって、我々は、複数の架橋されたコモノマーを含み、重合反応の結果として各粒子全体に渡るポリマーネットワークを形成している、粒子を意味する。このような重合が、本発明による粒子の製造中に行われ、またその場では起らないことを理解すべきである。該マイクロゲル粒子は、好ましくは、「良」溶媒中で、あるいはpH変化に応答して、構造変化を起こし、かつゲル(またはマイクロゲル)を形成する、架橋されたポリマー粒子である。これは、pH-誘発型のマクロゲル化段階と呼ぶことができ、そこでは、治療中の組織内で、その場で該ゲル化が起る。良溶媒は、膨張する粒子を形成する、ポリマーネットワークを生成するものである。良溶媒に関連して、該溶媒-ポリマー系に対するフローリー-ハギンス(Flory-Huggins)の相互作用パラメータは、好ましくは0.5未満である。
【００１３】
該マイクロゲル粒子自体は、約106〜1010Da(例えば、106〜109Da)なる範囲内の分子量を持つ、一種の巨大分子(即ち、架橋ポリマー)であると考えることができる。しかし、該マイクロゲル粒子を製造する際に使用される個々のコモノマーは、約5Da〜5,000Daなる範囲、より好ましくは約10Da〜1,000Daなる範囲、より一層好ましくは約50Da〜500Daなる範囲、および最も好ましくは約75Da〜400Daなる範囲内の分子量を持つことができる。最も好ましい態様においては、該重合反応において使用されるコモノマーは、約100Da〜300Daなる範囲内の分子量を持つ。
好ましくは、該マイクロゲル粒子は、該架橋ポリマーに対する主な分散媒として、水を含む。含水率は、事実上変えることができ、またpHおよび該媒体の塩濃度(即ち、イオン強度)の減少に伴って増大する。従って、該粒子の含水率は、該対象に投与する前に、またはその後に、即ちpHにおける変化に暴露する前またはその後の何れにおいて測定したかに依存するであろう。
【００１４】
該組成物は、複数のpH-応答性マイクロゲル粒子、および好ましくはその分散物を含むことが好ましい。該分散物は、好ましくはpHにおける変化に応答して、粒状ゲルを生成するのに適している。従って、個々の粒子は、好ましくは膨潤粒子内に殆どの該流体を収容し、また相互に押圧されて、巨視的なゲルを形成する程度まで、膨潤するのに適している。この膨潤状態において、該粒子は、前に隣接していた粒子を移動させることができないために、所定の位置に効率的にトラップされる。マイクロゲル粒子は、また「ゲル-マイクロ粒子」とも呼ぶことができる。
「pH-応答性」なる用語により、我々は、該マイクロゲル粒子が、pHにおける変化(即ち、増加または減少)に暴露された際に、構造変化を行うように作用し得ることを意味する。
好ましくは、該粒子は、その構造を調節するように、pHにおける変化に応答する、pH-応答性手段を含む。一態様において、該pH-応答性手段は、正に帯電した種または官能基を含むことができる。この態様において、該pH-応答性手段は、塩基性であり、また約2.0〜9.0なる範囲、より好ましくは、約4.5〜7.5なる範囲、更に一層好ましくは約5.0〜7.0なる範囲、および最も好ましくは約5.5〜6.5なる範囲内のpKb値を持つことができる。
【００１５】
しかし、好ましい一態様において、該pH-応答性手段は、負に帯電した種または官能基を含み、酸性である。この態様において、該pH-応答性手段のpKa値は、1.0〜12.0なる範囲、より好ましくは、3.0〜10.0なる範囲、更に一層好ましくは5.0〜8.0なる範囲、および最も好ましくは6.0〜7.0なる範囲内にある。
好ましくは、本発明の組成物は、複数のマイクロゲル粒子を含む。該複数の粒子は、2種以上の同一の型のマイクロゲル粒子からなるものであり得、即ち同一のコモノマーが、同一の架橋ポリマーを製造するのに使用されていることを理解すべきである。しかし、同様に、該複数の粒子は、少なくとも2種(またはそれ以上)の型の異なる粒子からなるものであっても良いことも意図されており、即ち異なるコモノマーが、異なる架橋ポリマーを製造するのに使用されている。
【００１６】
好ましくは、投与前の該組成物のpHは、好ましくは生理的pH条件下にある、治療すべき組織のpHよりも低い。従って、pHにおける変化に暴露する前の該マイクロゲル粒子のpHは、好ましくは約4.0〜7.0なる範囲、より好ましくは約4.5〜6.0なる範囲、および最も好ましくは約5.0〜6.0なる範囲内にある。本発明の組成物は、該マイクロゲル粒子のコロイド状分散物を含むことができる。好ましくは、pHにおける変化に暴露する前には、該組成物は実質的に流体である。これは、該粒子が、該組成物中で、潰れた形状をとった結果である。従って、pHにおける変化に暴露する前に、該マイクロゲル粒子は、実質上潰れた形状または構造をとっていることが好ましい。
【００１７】
該「潰れた形状」なる用語により、我々は、該粒子が、そのサイズにおいて実質的に減じられ、pH変化に暴露した後の該粒子の平均径と比較して、pH変化に暴露する前には、より小さな平均径を持つことを意味する。該潰れた形状の限界は、注入された際の、該粒子が全く水を含まない状態にある場合の形状である。例えば、該組成物の注入前(即ち、該組成物が、注入可能な状態にある)に、該粒子の含水率は、該粒子が維持されている低pHのために、好ましくは低い値にある。従って、該マイクロゲル粒子は、好ましくは該組成物の投与前(即ち、該pH変化に暴露する前)には、約70％(w/w)未満の水、より好ましくは約50％(w/w)未満の水、好ましくは約30％(w/w)未満の水、およびより一層好ましくは約20％(w/w)未満の水、および最も好ましくは約10％(w/w)未満の水を含む。しかし、好ましい態様(与えられた実施例におけるような)において、該粒子は、投与前には、低割合(約40％(w/w)未満)の水分を含む。この含水率は、該粒子内の水に相対的なものであることを理解するであろう。該粒子は、実質的に水性の媒体中に懸濁することができる。
【００１８】
該粒子の径は、その含水率に依存し、該含水率が、更にpH依存性であることを理解するであろう。pH変化に暴露する前(投与前)の、該マイクロゲル粒子径は、好ましくは約100μm未満、より好ましくは、約50μm未満、およびより一層好ましくは約20μm未満である。しかし、好ましい態様においては、pH変化に暴露する前の、該マイクロゲル粒子径は、約10μm未満であることが好ましく、より好ましくは、約5μm未満であり、およびより一層好ましくは約1μm未満である。最も好ましい粒子は、ナノメータのオーダーであり、即ちpH変化に暴露する前の、該マイクロゲル粒子径は、好ましくは約1nm〜1,000nmなる範囲、より好ましくは、約10nm〜750nmなる範囲、より一層好ましくは約20〜500nmなる範囲、および最も好ましくは約50〜100nmなる範囲内にある。
【００１９】
使用に際しては、該組成物を、pH変化に暴露するように、対象に投与する。該対象に投与した後の、該組成物、従って該マイクロゲル粒子のpHは、治療すべき特定の組織に依存することが理解されよう。pH変化に暴露した後の、該マイクロゲル粒子のpHは、5.5〜8.0なる範囲、より好ましくは約6.0〜7.8なる範囲、および最も好ましくは約6.0〜7.5なる範囲内であり得る。好ましくは、該組成物の投与に引続き、該粒子のpHは、好ましくは生理的なpH、即ちpH約7.4にある。しかし、該組成物を投与した、幾つかの損傷を受けた組織は、「正常な」生理的なpHとは異なるpHを持つ可能性がある。例えば、椎間板(IVD)のpHは、約6.6である。従って、治療すべき対象に投与した後の、該粒子のpHは、好ましくは約5.0-8.0なる範囲、およびより好ましくは約5.5-7.8なる範囲、および最も好ましくは約6.0-7.5なる範囲、更に最も好ましくは約6.6である。
【００２０】
従って、該粒子を、pH変化に暴露した後、該マイクロゲル粒子は、構造変化を起こすことが理解されるであろう。該「構造変化」なる用語によって、我々は、該マイクロゲル粒子の平均径が、pH変化に応答して変化することを意味する。該粒子の平均径は、pH変化に応答して増減し得る。これは、該マイクロゲル粒子内の該ポリマーの化学的な組成に依存するであろう。pHにおける変化は、pHにおける増減の何れかを含むことができ、この変化が、該粒子における該構造変化を引起すことを理解するであろう。
一態様において、少なくとも1種のマイクロゲル粒子の径は、pHにおける変化、例えばその低下に応答して減少するか、あるいは潰れた形状をとることができる。しかし、該マイクロゲル粒子の径は、pHにおける変化、例えばその増加に応答して増大するか、あるいは実質的に膨潤した形状または構造をとることが好ましい。該用語「膨潤した形状」によって、我々は、該粒子が、該pH変化前、即ち該組成物を該対象に投与する前の該粒子の平均径と比較して、実質的に拡大され、結果として該pH変化に暴露した後(投与後)に、より大きな平均径を持つことを意味する。
【００２１】
この膨潤は、水の該粒子への流入によって引起されることを理解するであろう。従って、投与に引続き、即ち該粒子が膨潤状態にある場合(例えば、図1に示されているように)に、該マイクロゲル粒子は、好ましくは少なくとも約70％(w/w)の水、より好ましくは、少なくとも約85％(w/w)の水、好ましくは約90％(w/w)の水、より一層好ましくは少なくとも約95％(w/w)の水、および最も好ましくは少なくとも約99％(w/w)の水を含む。該粒子内の水の量が、pHに依存するものであることが理解されよう。従って、低pH(例えば、pH約2.0)においては、該含水率は、約5％(w/w)未満であり得る。
pH変化に暴露した後の、該マイクロゲル粒子の平均径は、相応しくは少なくとも50％、より相応しくは少なくとも200％、より相応しくは少なくとも300％、より一層相応しくは少なくとも400％だけ増大させるのに適している。pH変化に暴露した後の、該マイクロゲル粒子の平均径は、少なくとも600％、より相応しくは少なくとも800％、より一層相応しくは少なくとも1,000％、および更に一層相応しくは少なくとも1,200％だけ増大させるのに適したものであることが好ましい。
【００２２】
例えば、pH変化に暴露した後の、該マイクロゲル粒子の径は、好ましくは約1nm〜1000nmなる範囲、より好ましくは、約50nm〜750nmなる範囲、より一層好ましくは約100〜600nmなる範囲、および最も好ましくは約200〜400nmなる範囲内にある。
このpH変化(即ち、pHにおける増加)に暴露した際の、少なくとも1種の粒子のこの膨潤作用の結果として、好ましくは、該組成物は、実質的に流体形状から、ゲル状の構造に変化するのに適したものである。従って、該pH変化の主な作用は、該粒子の分散物が、投与の際のpHにおいて低い粘度を有し、またこの粘度が、一旦該pHが生理的pHに達した際には、大幅に増大し、かつ荷重-支持ゲルを形成することである。該マイクロゲル粒子自体が、ポリマーネットワークであり、即ち該粒子がゲル化したマイクロ粒子であることが理解されよう。しかし、該粒子が、濃厚な分散物である場合(例えば、対象に投与した後に)、該粒子は、pH増加に応答して膨潤し、かつ該分散物自体は、流体からゲルに変化する。この得られるゲルは、ゲル化マイクロゲル分散物と呼ぶことができる。該分散物のゲル化は、粒子間の空間が不足した結果である。従って、該組成物中の該粒子の該構造変化は、ゲル化段階を含むことが好ましく、該段階は、好ましくは該治療すべき組織内で、その場で起ることが好ましい。有利には、該組成物がこのゲル構造内にある場合に、該ターゲット組織に荷重-支持効果を付与でき、結果的に疾患状態の治療が可能となることを理解するであろう。
【００２３】
本発明者等は、該マイクロゲル粒子およびこれから作られたマイクロゲルが、これらの、荷重-支持物質、および特に注入可能な荷重-支持物質としての使用を、著しく好ましいものとする、多数の構造上の特徴を持つものと確信する。第一に、該マイクロゲル粒子、および結果としてpH変化に暴露した際に得られる該ゲルは、実質上アニオン性である。殆どのタンパク質は、生理的pHにおいて正味の負電荷を持つ(即ち、これらはアニオン性である)ので、該pH変化に暴露した際に、該組成物によって生成されるこのようなアニオン性のマイクロゲルに対する該タンパク質の吸着は、静電的に反対の関係にある。第二に、該マイクロゲル粒子は、完全に膨潤した状態において、少なくとも約90％(w/w)の水、およびより好ましくは、少なくとも99％(w/w)の水を含むことが好ましく、従って零に近い界面張力を持つであろう。従って、本発明者等は、如何なる仮説にも拘泥するつもりはないが、これらファクタ両者は、治療すべき該対象に投与した際に、該組成物のあらゆる潜在的な細胞毒性を最小化するものと信じる。これは、該第一の局面の医薬および該第二の局面の方法に関する、顕著な利点である。
【００２４】
好ましくは、該膨潤した粒子は、実質的に高い濃度の可動イオン（mobile ion）を含んでいる。これらのイオンは、生理的pHにおいて、該カルボン酸基を中和する、対イオンを由来とするものである。これらイオンは、第I群のアルカリ金属イオンまたは第II群のアルカリ土類金属イオンを含むことができる。しかし、該イオンは、身体中に高濃度にて存在する、Na+またはK+イオンであることが好ましい。しかし、身体中に存在する他のカチオンも、この規則を満足することが理解されよう。本発明者等は、該マイクロゲル粒子のpKa値を越えるpH値における、該高濃度の、該膨潤粒子中の可動イオンが、高い膨潤圧をもたらすものと考える。
有利なことに、該pH変化に暴露した後の該膨潤粒子は、極めて大きいので、例えば細胞壁および非-変質組織を介する透過によって、投与部位から移動することができない。従って、該粒子は、該投与部位に閉じ込められ、結果としてその荷重-支持能力を一層極大化する。これが、本発明の組成物の、もう一つの顕著な利点である。
【００２５】
従って、上記説明から、本発明の一重要な要素は、該第一の局面による医薬の製造のために、あるいは該第二の局面の方法において使用する、上記組成物において利用される、該マイクロゲル粒子の特性および組成であることが理解されよう。本発明によって使用される該pH-応答性マイクロゲル粒子は、通常利用されている重合技術の何れかを使用して製造可能であることが理解されよう。例えば、該粒子は、フリーラジカル乳化重合法(Rodriquez, B. E., Wolfe, M. SおよびFryd, M., Macromolecules, 1994, 27: 6642)を利用して製造することができる。
好ましくは、該粒子は、複数のモノマーまたはコモノマー間の重合反応で得られる、架橋されたポリマー鎖を含む。本発明で使用する該粒子は、治療すべき該対象に投与する前に架橋され、また有利には、投与後には如何なる追加の架橋も受けないものであることが好ましい。しかし、好ましくは、該粒子は、該架橋段階前には、如何なるポリマーをも含まない。
【００２６】
該「コモノマー」なる用語により、我々は、重合反応において、少なくとも1種の他のモノマーと共重合するモノマーを意味する。該コモノマーは、適当な条件下で、共重合して、コポリマー鎖(ポリマー鎖と呼ぶ)を形成するように、好ましくは開始剤の存在下で、相互に接触する。該コポリマー鎖は、溶液から析出して、核粒子を形成する。コモノマーは、これらの成長中の核粒子に付加して、フリーラジカル重合により、より大きな粒子を形成する。この過程が継続され、コモノマー鎖(これらは架橋される)を含む該ポリマー粒子は、より大きくなる。この過程が完了すると、一つの大きなポリマー鎖が得られ、これは本発明のマイクロゲル粒子を構成する。
かくして、該マイクロゲル粒子は、該粒子全体を占有する、ポリマーネットワークを形成する、複数の架橋されたコモノマー単位を含む。これは、該様々なコモノマー間の重合反応の結果として起る。適当なモノマーは、当業者にとって公知であり、また好ましいモノマーは、以下に記載するものである。
【００２７】
本発明のマイクロゲルを製造する他の方法は、以下に列挙する重合方法を含むことができる：
(A) 該マイクロゲル粒子は、懸濁重合法を利用して製造することができる。この方法は、マイクロメータサイズの粒子の生成を結果する。この態様においては、有機溶媒-可溶性の開始剤を使用することができる(例えば、アゾイソブチロニトリル)。
(B) マイクロゲル粒子を製造するためのもう一つの方法は、逆マイクロエマルション重合法を含むことができる。この方法は、ナノメータサイズの粒子の製造を結果する。有機溶媒可溶性開始剤を用いることができる。AOT(ナトリウムジ-2-エチルヘキシルスルホサクシネート)等の界面活性剤を用いて、有機溶媒(例えば、トルエン)を、マイクロエマルションとして水に分散させる。
実施例は、本発明において使用する粒子の好ましい製造方法の詳細を与える。
【００２８】
本発明の好ましい態様において、該粒子は、エチルアクリレート(EA)、メタクリル酸(MAA)、および1,4-ブタンジオールジアクリレート(BDDA)を含むコモノマー混合物を準備し、ポリマー：ポリ(EA/MAA/BDDA)を製造することにより調製される。好ましくは、該混合物は、適当な界面活性剤、および好ましくは適当なバッファーを含む。一旦、該混合物を調製したら、該重合反応を開始する。例えば、熱またはラジカル-生成放射線による照射を利用する場合には、開始剤を使用する必要のないことを理解すべきである。一例は、γ-線照射であり、これにより該重合反応が開始する。しかし、開始剤または重合開始性試薬を用いて、重合を誘発することが好ましい。
本発明の好ましい他の態様においては、該粒子は、メチルメタクリレート(MMA)、メタクリル酸(MAA)、およびエチレングリコールジメタクリレート(EGDMa)を含むコモノマー混合物を準備し、ポリマー：ポリ(MMA/MAA/EGDMa)を形成することにより製造される。好ましくは、該混合物は、適当な界面活性剤、および好ましくは適当なバッファーを含む。一旦、該混合物を調製したら、該重合反応を開始する。ポリ(MMA/MAA/EGDMa)に対する該成分は、骨セメント[Zhang等, Journal of Biomaterials Research, 1999, 46: 279]およびコンタクトレンズ[Hiratani等, Biomaterials, 25, 1105, 2994]等の生物医学的デバイスにおいて、既に利用されている。従って、このようなマイクロゲルは、ヒト組織に対して生体適合性であることが公知であることから、特に有用である。
【００２９】
本発明では、該マイクロゲル粒子が、所謂多層粒子を含むことができることも意図しており、該多層粒子は、本明細書に定義したような、架橋されたポリマーの2以上の相を含む。従って、該粒子は、適当なコモノマーを用いて作成した内側コアを含むことができ、次いで1またはそれ以上の外側シェルが、好ましくは他のフリーラジカルまたは非-フリーラジカル重合法を利用して、該内側コア上にグラフトすることのできる、これらのモノマーまたは他の型のモノマーを用いて、該内側コア上で重合することにより積層される。この工程を多数回に渡り繰り返して、該粒子上の層の数(即ち、シェル数)を増すことが可能である。該内側コアとして、他のポリマー、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリラクトン、乳酸とグリコール酸とのコポリマーまたはこれらの組み合わせを使用することも可能であり、また次いでこれらの粒子を、以下において定義するような、pH-応答性マイクロゲル架橋ポリマーを含む、外側シェルを成長させるための種として使用することが可能である。
【００３０】
該粒子を製造する該フリーラジカル法は、他の重合反応、例えば化学的(非-フリーラジカル)重合を凌駕する多数の利点を持つ。例えば、同一の化学現象を、広範なモノマーに対して利用できる。更に、粒径は、広い範囲に渡り変えることができる。その上、該粒子の粒度分布は、狭いものである。更に、この技術は、多層粒子、即ちコア-シェル粒子を製造するために利用できる。
該マイクロゲル粒子の主な要素が、pH-応答性コモノマー、および該コモノマーを架橋する手段であることが、理解されよう。従って、該マイクロゲル粒子は、pH-応答性コモノマーおよび官能性の架橋性コモノマーを含むことが好ましい。従って、該マイクロゲル粒子は、共重合ポリマー粒子を含むことが好ましく、該ポリマー粒子は、以下の式Iによって定義される：
ポリ(P-co-X)          (式I)
該式Iにおいて、PはpH-応答性コモノマーであり、またXは官能性の架橋性コモノマーである。明確化のために、該マイクロゲル粒子を構成する該ポリマーに関して、ここで使用する命名法は、当業者には公知であろう、R. J. YoungおよびP. A. Lovell, ポリマー入門(Introduction to Polymers), 第2版, チャップマン＆ホール(Chapman and Hall), 1997. (pp. 8-10)から採用した。
【００３１】
該用語「ポリ」は、該粒子がコポリマーであることを示す。
該用語「pH-応答性コモノマー」により、我々は、酸性でも塩基性でもよい、少なくとも一つの官能基を含み、またコポリマー鎖またはネットワークに組込まれた場合に、pH変化に応答して、有意な配座変化を引起す、モノマーを意味する。ここに定義された該pH-応答性手段が、該pH-応答性コモノマーを含むことが理解されよう。
好ましくは、該pH-応答性コモノマーは、有意なレベル、例えば5モル％を越える量で、該コポリマーに組込まれる。該pH-応答性コモノマーが酸性である態様においては、該酸性基のpKaは、1.0〜12.0なる範囲内であり得る。しかし、好ましくは、該pKaは、6.0〜7.0なる範囲内にある。該pH-応答性コモノマーが塩基性である態様においては、該塩基性基のpKbは、2.0〜12.0なる範囲内であり得る。しかし、好ましくは、pKbは、5.5〜6.5なる範囲内にある。
該用語「官能性の架橋性コモノマー」により、我々は、フリーラジカル重合により、連鎖付加を受け易い、2またはそれ以上の二重結合を含むモノマーを意味する。
【００３２】
該pH-応答性コモノマー：Pは、複数の塩基性繰返し単位を含むことができる。しかし、好ましくは、該pH-応答性コモノマー：Pは、複数の酸性繰返し単位を含む。
該pH-応答性コモノマー：Pは、以下の式によって定義することができる：
R1R2C=CR3R4              (式II)
ここで、(a) R1, R2およびR3は、夫々独立にH、CH3、直鎖または分岐鎖アルキル基、ジアルキル基、またはN-アルキル基からなる群から選択され、
(b) R4は、夫々独立に、以下に列挙するものからなる群から選択される独立に選択できる：(i) カルボン酸基、COOHまたはR5-COOH基、ここでR5はCH2、直鎖または分岐メチレン(-CH2-)基、ジアルキル基、C6H4基、または置換C6H3R6基を表し、またR6は、置換基、例えばCH3、ハロゲン原子、またはアミド基、または 2以上のこれら置換基を含む、他のジ-またはトリ-置換フェニル基を含み、
(ii) -C(=O)-OR7型のアミノアクリレート基、ここでR7は、-R8NR9R10(ここで、R8は、-CH2-、-CH2CH2-または長さ10鎖までの直鎖または分岐鎖メチレン鎖であり得る)、または-C6H4-、C6H3R11(ここで、R11は、置換基、例えばCH3、ハロゲン原子、アミド基または2以上のこれら置換基を含む他のジ-またはトリ-置換フェニル基を含み)、またR9およびR10は、以下に列挙する基：H、CH3、CH2CH3、直鎖または分岐アルキル基、ジアルキル基、例えば10C単位までのN-アルキル基から独立に選択でき、
(iii) -C(=O)-NH-C(CH3)2-CH2-SO3H、
(iv) 加水分解によってカルボン酸に分解されるエステル基、即ち-O-C(=O)-R11(ここで、R11は、-C(CH3)3または20C単位までの直鎖または分岐アルキル基である)、
(v) NR12R13型のアミノ基(ここで、R12およびR13は、H、CH3、直鎖または分岐アルキル基、ジアルキル基、または20C単位までのN-アルキル基から独立に選択できる)。
【００３３】
しかし、Pが、pH-応答性コモノマー、例えば置換されたアクリル酸を含むことが特に好ましい。従って、Pは、アクリル酸を含むことができる。結果として、好ましくは、Pは、メタクリル酸(MAA)を含む。
好ましくは、該官能性の架橋性コモノマー：Xは、複数の架橋されたポリマー鎖を含む。該架橋性コモノマー：Xは、以下の式(III)によって定義することができる：
式III：
【００３４】
【化１】
0005551873.tif 000002
【００３５】
ここで、(a) R21、R22、R23、R31、R32およびR33は、H、CH3、直鎖または分岐アルキル基、ジアルキル基、または10C単位までのN-アルキル基から独立に選択でき、および
(b) R24は以下に列挙するものからなる群から独立に選択できる：(i) -C(=O)-O-R34-O-C(=O)-、ここでR34は、-CH2-、-CH2CH2-または直鎖または分岐アルキル基、例えば長さにおいて20C単位までであり得る、メチレン鎖、あるいは-C6H4-、またはC6H3R35を含むことができ、ここで R35は置換基、例えばCH3等のアルキル基、ハロゲン原子、またはアミド基、あるいは2以上のこれら置換基を含む、他のジ-またはトリ-置換フェニル基を含み、
(ii) -C(=O)-O-R36-C(=O)-、ここでR36 は-(CH2CH2O)n-であり得、nは、1〜30なる範囲内であり得、
(iii) -C(=O)-O-R37R38R37-、ここでR37は、分解性のエステル結合、例えばラクトン、-[(CH2)5C(=O)-O]m-、ラクチド、[CH(CH3)C(=O)-O]m-、グリコライド、[CH2C(=O)-O]m-(ここで、mは、1〜50なる範囲内にあり、またR38は、-(CH2CH2O)n-であり得、ここでnは、1〜30なる範囲内にあり、
(iv) -C(=O)-O-R39-、ここでR39は、分解性のエステル結合、例えばラクトン、[(CH2)5C(=O)-O]m-、ラクチド、[CH(CH3)C(=O)-O]m-、グリコライド、[CH2C(=O)-O]m-を含むことができ、ここでmは1〜100なる範囲内にあり、
(v) アリルアクリレート、例えば-C(=O)-O-R40-、ここでR40は、-CH2-, -CH2CH2-または長さにおいて20C連鎖までの、直鎖または分岐メチレン鎖、-C6H4-、C6H3R41、ここでR41は、置換基、例えばアルキル基、CH3、ハロゲン原子またはアミド基または2以上のこれら置換基を含む他のジ-またはトリ-置換フェニル基を含むことができ、
(vi) ビニルベンゼン、例えばC6H4またはC6H3R42、ここでR42は置換基、例えばアルキル基、CH3、ハロゲン原子またはアミド基(上記(iii)を参照のこと)、または2以上のこれら置換基を含む他の置換フェニル基を含み、
【００３６】
(vii) アクリルアミド、例えばC(=O)-NR43-R44-NR45C(=O)-、ここでR43およびR44は、H、CH3、直鎖または分岐アルキル基、ジアルキル基、10C単位までのN-アルキル基からなる群から独立に選択でき、またR44は-CH2-、-CH2CH2-または長さにおいて20C連鎖までの、直鎖または分岐メチレン鎖、あるいは-C6H4-、C6H3R41を含むことができ、ここでR41は、置換基、例えばアルキル基、CH3、ハロゲン原子またはアミド基または2以上のこれら置換基を含む他のジ-またはトリ-置換フェニル基を含み、
(viii) 3官能性の架橋性モノマー、ここでR24は、上記(b)において列挙した基の何れかを含み；並びにR21R22C=CR23、ここでR21、R22およびR23は、上記(a)に記載したものであり、
(ix) 4官能性の架橋性モノマー、ここでR24は、上記(b)において列挙した基の何れかを含み；並びにR21R22C=CR23およびR31R32C=CR33、ここでR21、R22、R23、R31、R32およびR33 は、上記(a)に記載したものであり、および
(x) R24は、上記(b)において列挙した基の任意の組合せを含むことができる。
【００３７】
しかし、Xは、官能性(好ましくはジまたはそれ以上の多官能性)の架橋性コモノマー、例えば置換された官能性アクリレートを含むことが好ましい。従って、Xはアリルメタクリレートまたはジビニルベンゼンを含むことができる。従って、Xはブタンジオールジアクリレート(BDDA)を含むことができる。しかし、好ましくは、Xは、エチレングリコールジメタクリレート(EGDMa)を含む。
該官能性の架橋性コモノマーは、該末端ビニル基間に、他の基を含むことができ、例えばポリ(エチレングリコール)ジメタクリレートであり得る。あるいはまた、該架橋は、粒子の製造後に、コモノマー間の反応により形成し得る。
該マイクロゲル粒子は、疎水性のコモノマーを含むことが好ましい。従って、該マイクロゲル粒子は、共重合ポリマー粒子を含むことが好ましく、該ポリマー粒子は、以下の式IVによって定義することができる：
ポリ(B-co-P-co-X)          (式IV)
該式IVにおいて、PおよびXは上記式Iにおいて定義したとおりであり、またBは疎水性コモノマーである。
【００３８】
該用語「疎水性コモノマー」によって、我々は、各ホモポリマーが、実質的に水に対して不溶性であるモノマーを意味する。
好ましくは、該疎水性コモノマー：Bは、複数の疎水性繰返し単位を含む。該疎水性コモノマー：Bは、以下の式Vによって定義することができる：
R51R52C=CR53R54            (式V)
ここで、(a) R51およびR52 は、H、CH3、直鎖または分岐アルキル基、ジアルキル基、N-アルキル基からなる群から独立に選択され、また
(b) R53およびR54は、以下に列挙するものからなる群から独立に選択できる：
(i) H、CH3、または直鎖または分岐アルキル基、
(ii) 式：-C(=O)-OR55で示されるエステル、ここでR55はCH3、直鎖または分岐アルキル基、ジアルキル基、またはN-アルキル基を含み、
(iii) 式：CONR56R57で示されるアミド、ここでR56およびR57は、H、CH3、直鎖または分岐アルキル基、ジアルキル基、またはN-アルキル基から独立に選択でき、
(iv) C6H5またはC6H4R58、ここでR58は、置換基、例えばCH3、ハロゲン原子、アミド基(上記(iii)を参照のこと)を含むことができ、ここで他の置換フェニル基は、2以上のこれら置換基を含むことができ、
(v) 式：-O-C(=O)-R59で示されるエステル、ここでR59は、直鎖または分岐アルキル基、例えばCH3を含むことができ、
(vi) 式：-NR60R61で示されるアミン、ここでR60およびR61は、H、CH3、直鎖または分岐アルキル基、ジアルキル基、またはN-アルキル基から独立に選択でき、
(vii) 上記1,2-ジ置換型、ここでR51、R52、R53、およびR54は、上記(a)および(b)において定義した通りである。
【００３９】
Bは、スチレンまたはその誘導体を含むことができる。しかし、Bはアクリレートを含むことが特に好ましく、結果的に該ホモポリマーおよび従ってマイクロゲル粒子は、実質的に水に対して不溶であることが好ましい。故に、Bは、エチルアクリレート(EA)を含むことができる。しかし、最も好ましくは、Bは、メチルメタクリレート(MMA)を含む。このことは、実施例に記載されており、また図6に示されている。
該アルキル基またはアルキル鎖は、C1-C20鎖、および好ましくはC1-C15鎖を含むことができる。該アルキル基またはアルキル鎖は、C1-C10鎖、およびより好ましくはC1-C6鎖、および最も好ましくはC1-C3鎖を含み得ることが、意図されている。該鎖は、直鎖または分岐鎖であり得る。しかし、好ましくは、該鎖は直鎖である。該アルキル基またはアルキル鎖は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、またはペンチル鎖であり得る。
故に、好ましい態様において、該マイクロゲル粒子は、エチルアクリレート(即ち、EA、これは上記疎水性コモノマーBである)、メタクリル酸(即ち、MAA、これは上記pH-応答性コモノマーPである)、および1,4-ブタンジオールジアクリレート(即ち、BDDA、これは上記官能性の架橋性コモノマーXである)を含む。従って、好ましい粒子は、ポリ(EA/MAA/BDDA)を含む。
【００４０】
該マイクロゲル粒子の該化合物ポリ(EA/MAA/BDDA)は、最大質量％でEA(疎水性モノマー)を約95％、最小質量％でMAA(pH-応答性モノマー)を約5％、および最小質量％でBDDA(架橋性モノマー)を約0.1％含むことができる。しかし、該マイクロゲル粒子の該好ましい化合物[ポリ(EA/MAA/BDDA)]は、全モノマーの質量を基準として、約65.9％のEA、約33.1％のMAA、および約1.0％のBDDAを含む。これは、65.9/33.1/1.0なる質量比：EA/MAA/BDDAとして定義でき、あるいはモル比：EA/MAA/BDDAとしては、130.4/76.0/1.0である。
好ましい他の態様においては、該マイクロゲル粒子は、メチルメタクリレート(即ち、MMA、これは上記疎水性コモノマーBである)、メタクリル酸(即ち、MAA、これは上記pH-応答性コモノマーPである)、およびエチレングリコールジメタクリレート(即ち、EGDMA、これは官能性の架橋性コモノマーXである)を含む。従って、もう一つの好ましい粒子は、ポリ(MMA/MAA/EGDMa)を含む。
【００４１】
該マイクロゲル粒子の該化合物ポリ(MMA/MAA/EGDMa)は、最大質量％でMMA(疎水性モノマー)を約95％、最小質量％でMAA(pH-応答性モノマー)を約5％、および最小質量％でEGDMa(架橋性モノマー)を約0.1％含むことができる。しかし、該マイクロゲル粒子の該好ましい化合物[ポリ(EA/MAA/EGDMa)]は、全モノマーの質量を基準として、約66.8％のMMA、約32.8％のMAA、および約0.4％のBDDAを含む。これは167/82/1.0なる質量比：MMA/MAA/EGDMaとして定義でき、あるいはモル比：MMA/MAA/EGDMaは、320/185/1.0である。
上記の如く、該コモノマーは、プリカーサ混合物を生成するために混合することができ、該混合物は、開始剤と接触させて、重合反応を開始させることが可能である。該マイクロゲル粒子の製造において、アニオン性の開始剤を使用した場合、該開始剤は、該開始剤から持ち込まれた、アニオン種を含有する化合物の生成をもたらし、該アニオン種は、該コポリマーネットワークに共有結合により結合されている。
また、該マイクロゲル粒子が、混合電荷を持つ粒子を製造するために、B、PおよびXの組合せを含み得ることも意図されている。
【００４２】
該アニオン性の種は、該開始剤中の反応性単結合を、ホモリシス的分断(即ち、ホモリシス)により形成される。ホモリシスは、熱または光照射(例えば、UV-光)によって引起すことができる。該フラグメントは、モノマーと反応して、フリーラジカル重合を開始する。該好ましい態様において、該開始剤は水溶性のものである。
該アニオン性の種は、例えば無機化硫酸開始剤、例えば[M]S2O82-を使用した場合には、フラグメント、例えば-OSO3-であり得、ここでMは、K+、Na+またはNH4+、または二価のカチオンである。
あるいはまた、パーオキシド開始剤を使用して、重合を開始することも可能である。この開始剤は、R70-O-O-R71として定義され、ここでR70またはR71は、H、CH3、直鎖または分岐鎖アルキル基、ジアルキル基、10C単位までのN-アルキル基、またはC6H5、またはC6H4R72からなる群から独立に選択でき、ここでR72は、置換基、例えばアルキル基、CH3、またはハロゲン原子、または2以上のこれら置換基を含む、他の置換されたフェニル基を含む。
【００４３】
あるいはまた、カチオン性アミン開始剤を使用することも可能であり、これは、以下の式VIによって定義できる：
[R80R81R82C-N=N-R83R84R85] x HCl              (式VI)
ここで、R80、R81、R83およびR84は、H、CH3、直鎖または分岐鎖アルキル基、ジアルキル基、10C単位までのN-アルキル基からなる群から独立に選択でき、またR82およびR85は、C(=NR86)NH2であり得、ここでR86は、H、CH3、直鎖または分岐鎖アルキル基からなる群から独立に選択できる。例えば、具体的な例は、プロパンイミドアミド、2,2'-アゾビス[2-メチル-、ジヒドロクロリド]である。この開始剤は、V50としても知られている。
【００４４】
あるいはまた、有機アニオン性アゾ開始剤を使用することも可能であり、これは、以下の式VIIにより定義することができる：
[R90R91(CN)C-N=N-(CN)R92R93]                (式VII)
ここで、R90およびR92は、H、CH3、直鎖または分岐鎖アルキル基、ジアルキル基、10C単位までのN-アルキル基からなる群から独立に選択でき、またR91およびR93は、CR94COOH(ここで、R94は、-CH2-、-CH2CH2-または長さにおいて20Cまでの直鎖または分岐メチレン鎖であり得る)、または-C6H4-、C6H3R95(ここで、R95は、置換基、例えばアルキル基、CH3、ハロゲン原子、アミド基、または2以上のこれら置換基を含む、他のジ-またはトリ-置換フェニル基を含む)であり得る。例えば、具体的な例は、アゾビスシアノペンタン酸(4,4'-アゾビス(4-シアノバレリン酸としても知られている)である。
該アニオン性の種は、低pKa値を持つアニオン性の種、例えば該ポリマー鎖に共有結合により結合した硫酸根(-OSO3-)を含むことが好ましい。これらの基は、重合中に、該開始剤と該モノマーとの間の反応により形成される。しかし、該アニオン性の種は、また硫酸根を含有するコモノマー、例えば2-アクリルアミド-2-メチルプロパンサルフェートの配合によっても生じ得る。しかし、該アニオン性の種は、-OSO3-であることが最も好ましく、これは、過硫酸アンモニウムのホモリシスフラグメントから生じる。
【００４５】
好ましくは、該粒子の製造方法は、該マイクロゲル粒子の製造に際して、界面活性剤の使用を含む。該界面活性剤は、実質的にノニオン性であり得る。例えば、このような界面活性剤は、酸性または塩基性Pモノマーおよびアニオン性またはカチオン性開始剤を使用した場合に、使用することができる。しかし、ノニオン性界面活性剤は、他の組合せと共に使用することも可能である。
該界面活性剤は、以下の式VIIIによって定義できる：
R99R100-O-R101R102            (式VIII)
ここで、(a) R100は、-CH2-、-CH2CH2-または長さにおいて40Cまでの直鎖または分岐メチレン鎖、または-C6H4-、C6H3R103 を含むことができ、ここでR103は置換基、例えばアルキル基、CH3、ハロゲン原子、またはアミド基、または2以上のこれら置換基を含む、他のジ-またはトリ-置換フェニル基を含み、
(b) R99およびR102は、H、CH3、直鎖または分岐鎖アルキル基、ジアルキル基、10C単位までのN-アルキル基からなる群から独立に選択でき、あるいは
(c) R101は、-(CH2CH2O)n-を含むことができ、ここでnは1〜30なる範囲内にある。
【００４６】
上記の化合物を例示する例は、CH3(CH2)11(OCH2CH2)23OHであり、これはブリー(Brij) 35として知られている。該界面活性剤は、実質上アニオン性であり得る。例えば、これは、酸性Pモノマーおよびアニオン性開始剤を使用した場合に、使用することができる。しかし、該界面活性剤は、他の組合せで使用することができる。
該界面活性剤が、アニオン性の界面活性剤である場合、以下の式IXにより定義できる：
[R110R111R112Y]p-[カチオン]p+            (式IX)
ここで、(a) R110は、H、CH3、直鎖または分岐鎖アルキル基、ジアルキル基、10C単位までのN-アルキル基からなる群から独立に選択でき、
(b) R111は、-CH2-、-CH2CH2-または長さにおいて40Cまでの直鎖または分岐メチレン鎖、または-C6H4-、C6H3R103 を含むことができ、ここでR103は置換基、例えばアルキル基、CH3、ハロゲン原子、またはアミド基、または2以上のこれら置換基を含む、他のジ-またはトリ-置換フェニル基を含み、
(c) 場合により、R112は、-(CH2CH2O)n-であり得、nは1〜30なる範囲内にあり、この単位は、また該界面活性剤の構造から完全に排除することもでき、また
(d) Yは、アニオン性官能基、例えば-OSO3-, -SO3-、-COO-、-PO3-であり得る。
【００４７】
該カチオンの全電荷は、該アニオン性の鎖の全電荷と釣合っている。これは、Na+、NH4+または他の一価または二価のアニオンであり得る。好ましい界面活性剤は、CH3(CH2)11OSO3-Na+ またはナトリウムドデシルベンゼンスルホネート: CH3(CH2)11C6H4-OSO3-Na+である。
該界面活性剤は、実質上カチオン性であり得る。例えば、これは、塩基性Pモノマーおよびカチオン性開始剤を使用した場合に、使用されるであろう。しかし、これは、他の組合せで使用できる。該界面活性剤が、カチオン性界面活性剤である場合、該界面活性剤は、以下の式Xによって定義できる：
[R120R121NR122R123]n+[アニオン]n-            (式X)
ここで、(a) R120、R122およびR123は、H、CH3、直鎖または分岐鎖アルキル基、ジアルキル基、10C単位までのN-アルキル基からなる群から独立に選択でき、および
(b) R121は、-CH2-、-CH2CH2-または長さにおいて40Cまでの直鎖または分岐メチレン鎖、または-C6H4-、C6H3R124 であり得、ここでR124は置換基、例えばアルキル基、CH3、ハロゲン原子、またはアミド基、または2以上のこれら置換基を含む、他のジ-またはトリ-置換フェニル基を含む。
【００４８】
好ましくは、該アニオンの全電荷は、該カチオン鎖の全電荷と釣合っている。該アニオンは、ハライド(Cl-、Br-)または他の一価または二価のアニオン種であり得る。その好ましい一例は、セチルトリメチルアンモニウムブロミド：CH3(CH2)15N(CH3)3+Br-である。
更に、該界面活性剤は、ポリマー界面活性剤を含むことができる。適当なポリマー界面活性剤、(a) ポリエチレンオキシド(PEO)を主成分とするもの、および(b) ポリエチレンオキシド(PEO)とポリプロピレンオキシド(PPO)とを主成分とする、所謂プルロニック、即ちPEO-PPO-PEOを含む。有利には、これら型の界面活性剤両者は、身体における使用が、FDAにより承認されている。他の代替品は、(c) ポリエチレンオキシド(PEO)を主成分とするポリオキシヒマシ油界面活性剤である。
【００４９】
該マイクロゲル粒子を製造するために使用される該方法は、製造中に、適当なバッファーを使用することが好ましい。このバッファーを使用する目的は、pHを、コロイドの安定性を助ける領域内に、即ちpH>3に維持することである。使用できる適当なバッファーは、MH2PO4およびM2HPO4の混合物であり、ここでMはNa+またはK+あるいは他の一価のカチオンから独立に選択できる。あるいはまた、M2B2O7溶液も使用することができ、ここでMは上に定義したとおりである。好ましいバッファーは、K2HPO4である。
以下の表1は、ポリマー：ポリ(EA/MAA/BDDA)を主成分とする、好ましいマイクロゲル粒子の成分の一態様を示すものである。
【００５０】
【表１】
0005551873.tif 000003
【００５１】
ポリ(EA/MAA/BDDA)における異なるモノマーの比は、変更できることを理解するであろう。EA(疎水性モノマー)の最大質量％は、約95％であり、MAA(pH-応答性モノマー)の最小質量％は、約5％であり、またBDDA(架橋性モノマー)の最小質量％は、約0.1％であることは好ましい。
ポリ(EA/MAA/BDDA)は、全モノマーの質量を基準として、約65.9％のEA、33.1％のMAAおよび1.0％のBDDA(あるいは、質量比：EA/MAA/BDDAとしては、65.2/32.7/1.0であり、またはモル比：EA/MAA/BDDAとしては、130.4/76.0/1.0である)を含むことが好ましい。
以下の表2および3は、ポリマー：ポリ(MMA/MAA/EGDMa)を主成分とするもう一つの好ましいマイクロゲル粒子の成分に関する、2種の変形(ここでは、マイクロゲル2Aおよび2Bと呼ぶ)を示す。
【００５２】
【表２】
0005551873.tif 000004
【００５３】
【表３】
0005551873.tif 000005
【００５４】
従って、上記第一の局面および上記第二の局面において使用する該組成物は、上に定義したようなマイクロゲル粒子を含み、ここで該コモノマーは、EA、MAA、MMA、EGDMa、およびBDDAから選択される3種のモノマーの混合物を含む。該コモノマーは、コモノマーのプレミックスを形成するために、一緒に混合することが好ましい。次いで、過硫酸アンモニウム等の好ましい開始剤を、界面活性剤SDSおよびバッファー：リン酸水素二カリウムの存在下で添加する。この例は、本発明のpH-応答性マイクロゲル粒子を製造するための好ましい態様の明確な詳細を与える。
本発明者等は、該第一の局面の医薬または該第二の局面方法が、ある対象における、任意の損傷を受けたまたは変質した軟組織を修復するために利用できるものと考える。治療可能な、適当な軟組織の例は、皮膚、筋肉、間膜(靭帯)、または脂肪組織を包含する。このような損傷を受けたまたは変質した軟組織は、急性または慢性何れかであり得る、創傷を含む可能性がある。しかし、該治療すべき軟組織は、損傷を受けたまたは変質した荷重-支持組織を含むことが好ましい。当業者は、治療を要する可能性のある、身体内の主要な荷重-支持組織が、任意の関節部、例えば股関節、肘関節、足首関節（ankle joint）、膝関節、手関節等を含むことを理解するであろう。
【００５５】
しかし、該第一の局面の医薬または該第二の局面方法を、損傷を受けたまたは変質した脊椎板、または椎間板(IVD)の治療に用いることが、最も好ましい。好ましくは、該第二の局面方法は、本発明の組成物を、該IVD、および好ましくはその髄核(NP)に直接投与することを含む。従って、有利には、この方法を用いれば、如何なる外科手術も必要とされない。より好ましくは、該組成物は、プロテオグリカンの含有量が加齢に伴って減少した場合に形成される裂溝内に、直接投与することができる。更に、該組成物または医薬は、該ターゲット組織内に、注射によって投与できることが好ましい。
治療すべき荷重-支持組織のpHが、投与前の該組成物のpHとは著しく異なるpH値にあることが特に好ましく、この場合、該組成物の投与の際に、pHにおける変化が、該マイクロゲル粒子の構造における変化を誘発し、また好ましくは、該粒子の膨潤を引起して、ゲルを形成する。例えば、該組成物または医薬を、対象のIVDに投与した場合には、該IVDの平均のpHは、約6.6であることが知られている。従って、該粒子が、6.6未満のpHに維持されており、結果として該IVDに投与した場合に、該粒子が膨潤し、また該組成物のゲル化を引起すことが好ましい。好ましくは、該粒子は、その投与前には、約5.0〜6.6なる範囲、より好ましくは約5.5〜6.6なる範囲、およびより一層好ましくは約6.0〜6.6なる範囲に維持される。従って、インビボにて6.6未満から約6.6までpHを高めると、該粒子内への水の流入が生じて、該粒子は膨潤し、結果としてゲルを形成する。
【００５６】
しかし、この方法の一態様においては、該マイクロゲル粒子を含有する該組成物と、酸または塩基とを接触させて、結果としてこのpHにおける変化が、インビボでのゲル化を促進することが好ましいことであり得る。ゲル化を引起すために、該粒子のpHを低下させたい場合には、酸が添加され、またゲル化を引起すために、該粒子のpHを高めたい場合には、アルカリが添加されることを理解するであろう。該マイクロゲル粒子を含有する、該組成物が投与される前、またはその後に、該ターゲット組織に酸またはアルカリを投与できることが理解されよう。従って、この方法は、更に該対象に、適当量のアルカリを投与する工程を含むことができ、この場合、ゲル化は、該組成物と接触した際に促進される。該アルカリは、ゲル化が起るように、該組成物を添加する前に、あるいはゲル化が起るように、該組成物を添加した後に、該組織に添加することができる。あるいはまた、同時投与手順を利用することも可能であり、この場合、該マイクロゲル粒子分散液を含有する、該組成物およびアルカリ両者は、実質的に同時に投与される。これは、例えば特別に誂えた注射針によって達成される。
【００５７】
しかし、該組成物がIVDに投与される場合、該IVDの緩衝作用が、そのpHを6.6まで徐々に増大して、自動的にゲル化を起こすので、アルカリの投与が必須ではないことに気付くことは重要である。このような自動的なゲル化は、該対象に外因的に如何なるアルカリをも添加する必要がないので、著しく有利である。
従って、該組成物の該対象への投与の結果として、好ましいことに、椎間板の高さおよび該IVDのヤング率における増大が見られ、またその機械的強度が、効果的に修復される。有利なことに、これは、該IVDにおける不規則な形状の裂溝内部を満たすことのできる、最小限度に侵襲的な方法である。従って、この最小限に侵襲的な方法は、如何なる主要な外科的介入をも含まず、それ故に、治療すべき該対象の回復時間が、大幅に短縮されることを意味する。更に、本発明の組成物において使用した該粒子は、使用前に予備成型(即ち、該ポリマーが架橋)されるので、何らかのインビボでの重合を引き起こすために、いかなる開始剤も、あるいは追加のモノマーも投与する必要がない。この方法のもう一つの利点は、如何なる健全な組織をも除去する必要がないことにある。このことは、顕微解剖(microdisectomy)および髄核組織の除去を含む、核置換(nucleus replacement)技術と、直接的な対比をなしている。
【００５８】
もう一つの態様において、該第一の局面の医薬および該第二の局面の方法において使用される該組成物は、少なくとも1種の髄核細胞および/または少なくとも1種の幹細胞および/または少なくとも1種の哺乳動物細胞を含むことができる。
該組成物に添加することのできる、適当な哺乳動物細胞の例は、軟骨細胞(例えば、自己由来の（autologous）または内因性の（autogenous）該細胞)を包含する。該組成物に添加することのできる、適当な幹細胞の例は、間葉性造血細胞等であり、例えば胚性およびクローニング幹細胞を含む。加えて、該組成物は、更にコラーゲンおよび/またはプロテオグリカンを含むことができる。
該組成物への髄核細胞の添加が、該対象の回復速度を高めるであろうことが、理解されよう。従って、本発明の更なる利点は、NP組織の再成長を容易にするために、生細胞(例えば、NP細胞または幹細胞)と、該マイクロゲル粒子分散液を含有する該組成物との混合を可能とすることにある。従って、本発明の方法は、生物学的修復系と、機械的支持体との結合を可能とする。
【００５９】
該第一の局面の医薬および該第二の局面の方法によって治療できる、好ましい疾患状態は、関節炎、椎間板の変質、背痛、腰痛、坐骨神経痛、頸部脊椎症、頸部痛、脊椎後湾症、脊椎側湾症、変性関節疾患（degenerative joint disease）、変形性関節症（osteoarthritis）、脊椎分離症、脊椎すべり症、椎間板脱（prolapsed intervertebral disc）、失敗した脊椎外科手術（failed spine surgery）、および脊柱不安定症を含む。該疾患状態は、慢性または急性、例えば慢性または急性背痛であり得る。
最も好ましい態様において、本発明の第一の局面において使用する該組成物は、好ましくはpH変化に暴露する前に、コロイド的に安定である(即ち、該マイクロゲル粒子は、コロイド的な規模で分散している)。好ましくは、該粒子は、pH変化に暴露する前には、実質的に潰れた状態にある。従って、好ましくは、該組成物は、生理的pH未満(即ち、投与前)において、実質上液体であり、従って該対象に注入することができる。しかし、一旦該対象に投与、例えば該NP内に注入した後には、該組成物がコロイド的な安定状態を維持することは必須ではない。該粒子が、生理的pH、即ちpH約7.4において、負に帯電していることが好ましい。従って、好ましくは、該粒子は、生理的pHに暴露された際に、膨潤するように機能できる。従って、投与後に、該組成物は、好ましくはゲルを形成し、該ゲルは生理的pHにおいて流動しない。好ましくは、該組成物は、損傷を受けたまたは変質したIVDを治療するのに利用される。
【００６０】
従って、本発明の好ましい態様において、該組成物および結果的に該粒子は、投与前には、約4.0〜6.0なる範囲、および好ましくは約5.5なる値に維持される。故に、好ましくは、pH変化に暴露する前の、該粒子の径は、約50〜100nmなる範囲内、および最も好ましくは約65nm(操作型電子顕微鏡で測定)なる値である。故に、該組成物は、実質的に流体であり、従って修復を必要とする組織に、例えば該IVDのNPの裂溝に注入することによって、投与することができる。該IVDにおけるpHは約6.6であり、またそのために、投与前の約5.5から投与後の約6.6への、pHにおける増加は、約300〜350nmなる範囲の値まで、および最も好ましくは約320nmなる値まで、該粒子の径を増大させる。この径において、該組成物は、該組織内でゲルを形成し、また結果として、該IVDに荷重-支持特性を与える。
該粒子の膨潤圧は、該マイクロゲル-担持軟組織の有効ヤング率を高めるために、pHを利用して調節することができる。更に、本発明者等は、これらマイクロゲルのpKa値を、該粒子の化学的な組成を変えることによって、調節可能であるはずだと考える。この調節は、該損傷を受けた荷重-支持組織のpHにおいて、これら材料の荷重-支持特性の微調整を可能とするであろう。
【００６１】
本発明の組成物が、単独療法(即ち、損傷を受けたまたは変質した軟組織および好ましくは荷重-支持組織によって特徴付けられる疾患を予防および/または治療するための、本発明のマイクロゲル粒子の単独での使用)において利用可能であることを理解するであろう。あるいはまた、本発明のマイクロゲル粒子は、アジュバントとして、あるいは公知の治療法との組合せで利用することができる。
該マイクロゲル粒子を含有する本発明の組成物は、特に該組成物を使用する様式に依存して、多数の異なる形状を持つことができる。即ち、例えば該組成物は、液体、軟膏、クリーム、エーロゾル、スプレイ、ミセル、経皮パッチ、または水和状態または湿潤状態において、治療すべき対象に投与することのできる、あらゆる他の適当な形状をとることができる。該対象は、動物またはヒトであり得る。該組成物の賦形剤は、投与を受ける該対象によって十分に許容され、また好ましくは該組成物を、結果として少なくとも1種のマイクロゲル粒子を、該ターゲット軟組織に放出することを可能とする、ものである必要があることを理解するであろう。
【００６２】
本発明による該マイクロゲル粒子を含有する組成物は、様々な方法で使用することができる。好ましくは、該組成物は、注射により投与することができる。
該マイクロゲル粒子を含有する組成物は、緩慢なまたは遅延放出デバイス内に組込むことができる。あるいはまた、薬物分子等の治療剤を、該マイクロゲル粒子内に配合することができ、また該薬剤を徐放することも可能である。このようなデバイスは、例えば該ターゲット荷重-支持組織上にまたはその中に装入することができ、また該組成物または治療薬は、数分間、数日間または更に数ヶ月間に渡って放出することができる。このようなデバイスは、本発明によるマイクロゲル粒子を含む(または該粒子中に治療薬を含む)組成物を用いた、通常頻繁な投与(例えば、少なくとも毎日の投与)を要するであろう、長期間に渡る治療を要する場合に、特に有利であり得る。
【００６３】
該組成物の量、および結果的に必要なマイクロゲル粒子の量または数が、治療すべき荷重-支持組織の損傷の程度によって影響されることが理解されよう。更に、該組成物の量は、その生物学的な活性および生物学的利用率によっても影響され、これは、また投与様式、使用する該マイクロゲル粒子の物性、および該マイクロゲル粒子が、単独療法として、あるいは組合せ療法として使用されるか否かに依存する。投与頻度は、また上記ファクタ、および特に該治療すべき対象内における、該マイクロゲル粒子の半減期に依存するであろう。
投与すべき最適の用量は、当業者が決定することができ、また使用中のマイクロゲル粒子、該処方の濃度、投与様式、および該疾患状態の進行度と共に変化するであろう。治療すべき特定の対象に依存する付随的なファクタは、用量を調節する必要性をもたらし、該ファクタは、対象の年齢、体重、性別、食餌、および投与時間を包含する。
【００６４】
公知の手順、例えば製薬業界で通常利用されている手順(例えば、インビボ実験、臨床的試験等)は、本発明による該マイクロゲル粒子の特定の処方、および正確な治療養生(例えば、該組成物、および結果的にマイクロゲル粒子の毎日の、週間のまたは月間の投与量、および投与頻度)を設定するのに利用できる。
該組成物、および結果的にマイクロゲル粒子の用量は、該ターゲット組織、および治療すべき該疾患に大きく依存することが理解されよう。しかし、一般的には、本発明の組成物の体重1kg当たり0.01μg〜0.5gなる範囲内の一日当たりの用量を、使用された特定のマイクロゲル粒子に依存して、損傷を受けた荷重-支持組織により特徴付けられる疾患の、予防および/または治療のために使用することができる。より好ましくは、該一日当たりの用量は、0.01mg/kg体重〜200mg/kg体重なる範囲、および最も好ましくは約1mg/kg〜100mg/kgなる範囲内にある。
【００６５】
使用すべき医薬または組成物の実際の濃度は、該分散物の全質量に対する、マイクロゲルの量(質量％)として表すことができる。故に、該分散物の全質量に対する、該マイクロゲルの濃度は、1〜70質量％なる範囲にある。より好ましくは、該濃度は、10〜40質量％なる範囲、およびより好ましくは、投与に際して、15〜25質量％なる範囲にある。好ましい態様は、該分散物の全質量に対して、20質量％のマイクロゲルの使用を含む。
該組成物の使用が、損傷を受けたまたは変質したIVD、および好ましくはそのNPを治療する上で好ましいことを理解すべきである。故に、該変質したNPに注入される組成物(これは、水およびポリマー粒子を含む)の質量は、最終的なマイクロゲル分散物の量(質量％)が、マイクロゲル分散物を含む該NPの全質量の0.5〜70質量％なる範囲となるようなものである。該マイクロゲル分散物が、注入されたマイクロゲルを含むNPの質量の、10〜30質量％なる範囲を占めることが、より好ましい。
【００６６】
毎日の用量は、一回の投与(例えば、一回の1日当たりの注射)として与えることができる。あるいはまた、使用する該組成物は、1日の間に2またはそれ以上の回数に渡り投与する必要がある可能性もある。一例として、本発明の組成物は、5mg〜7000mg(即ち、体重を70kgと仮定して)なる範囲の1日当たり2回(または該状態の重篤度に依存して、それ以上)の用量として、投与することができる。治療を受ける患者は、目覚めている時に第一回目の用量を、および次いで夜に第二回目の用量を、あるいはその後3または4時間間隔で摂取することができる。しかし、徐放性デバイスを利用して、反復的な用量の投与の必要なしに、患者に、該組成物の最適な用量を与えることが最も好ましい。脊椎内に注射することが好ましい。注射を適切に行うためには、熟練した臨床医が必要であり、また唯一回の注入を行うことが好ましい。しかし、2回以上の注入が必要とされることもあり得る。
【００６７】
本発明は、治療上有効な量の、本発明のマイクロゲル粒子および場合により製薬上許容される賦形剤を含む、薬理組成物を提供する。一態様において、該マイクロゲル粒子の質量(乾燥質量基準で計算)は、約0.01mg〜約800mgなる範囲内にある。他の態様において、該粒子の量は、約0.01mg〜約500mgなる範囲内にある。別の態様において、該粒子の量は、約0.01mg〜約250mgなる範囲内にある。他の態様において、該粒子の量は、約0.1mg〜約60mgなる範囲内にある。更に別の態様では、該粒子の量は、約0.1mg〜約20mgなる範囲内にある。
本発明は、更に治療上有効な量の、本発明のマイクロゲル粒子および製薬上許容される賦形剤の組合せを含む、薬理組成物の製法を提供する。該用語「治療上有効な量」とは、対象に投与した際に、損傷を受けたまたは変質した軟組織によって特徴付けられる疾患の、予防および/または治療作用をもたらす、本発明のマイクロゲル粒子の任意の量である。しかし、該マイクロゲル粒子の型および量は、該粒子の治療上の効力に寄与するであろうことが理解されよう。該用語「対象」とは、任意の脊椎動物、哺乳動物、家畜またはヒトであり得る。
【００６８】
本明細書で使用する、該用語「製薬上許容される賦形剤」とは、薬理組成物を処方するに際して有用な、当業者には公知の任意の生理的賦形剤である。好ましい態様において、該製薬的賦形剤は、液体であり、また該薬理組成物は、分散液の形状にある。
液状賦形剤は、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ、エリキシル剤、および加圧組成物の製造において使用される。故に、該マイクロゲル粒子は、製薬上許容される液状賦形剤、例えば水、有機溶剤、これら二者の混合物、または製薬上許容される油脂に、分散または懸濁することができる。該液状賦形剤は、他の適当な製薬添加剤、例えば可溶化剤、乳化剤、バッファー、保存剤、沈殿防止剤、増量剤、着色剤、粘度調節剤、安定剤または浸透圧調節剤を含むことができる。
腸管外投与用の液状賦形剤の適当な例は、水(部分的に、上記のような添加剤、例えばセルロース誘導体、好ましくはナトリウムカルボキシメチルセルロース溶液を含む)、アルコール(一価のアルコールおよび多価アルコール、例えばグリコールを含む)およびこれらの誘導体、およびオイル(例えば、分別ココナッツ油および落花生油)を包含する。腸管外投与のためには、該賦形剤は、また油状エステル、例えばエチルオレエートおよびイソプロピルミリステートであってもよい。無菌液状賦形剤は、腸管外投与のための、無菌液体形状にある組成物において有用である。加圧組成物用の該液状賦形剤は、ハロゲン化炭化水素または他の製薬上許容される噴射剤であり得る。
【００６９】
無菌液剤または懸濁剤である、液状薬理組成物は、例えば筋肉内、鞘内、硬膜外、腹腔内、皮下、および特に静脈内注射によって使用することができる。故に、該マイクロゲル粒子を含む組成物は、無菌水、塩水、または他の適当な無菌注射可能な媒体を使用して、投与の時点において分散または懸濁することのできる、無菌固体組成物として調製することができる。賦形剤は、必要な、かつ不活性なバインダ、沈殿防止剤、潤滑剤、保存剤、染料、および被覆をも含むものとする。
本発明の組成物は、他の溶質または沈殿防止剤(例えば、該溶液を等張性とするのに十分な量の塩水またはグルコース)、胆汁酸塩、アカシアゴム、ゼラチン、ソルビタンモノオレエート、ポリソルベート80(ソルビトールのオレエートエステルおよびエチレンオキシドと共重合された、その無水物)等を含む、無菌液剤または懸濁剤として投与することができる。
更なる局面においては、複数の架橋されたポリマーを含む、pH-応答性該マイクロゲル粒子が提供され、ここで少なくとも1種の該ポリマーは、化学種を含み、該化学種は、pH変化に応答して該粒子の膨潤を引起すような、pHに対して応答性のものである。
【００７０】
好ましくは、該粒子は、その径において、10μm未満、および好ましくは1μm未満である。本発明者等は、これまで、誰もこのようなpH応答性粒子を、上記のような医学的用途(即ち、軟組織の修復)において使用していないものと確信している。従って、更なる局面においては、複数の架橋されたポリマーを含有する、医薬として使用するための、pH-応答性該マイクロゲル粒子が提供され、少なくとも1種の該ポリマーは、化学種を含み、該化学種は、pH変化に応答して、該粒子の膨潤を引起すのに適したものである。
本明細書に記載するこのような粒子は、損傷を受けたまたは変質した軟組織によって特徴付けられる、任意の疾患を治療するための、特定の医学的用途を持つであろう。故に、更に別の局面においては、損傷を受けたまたは変質した軟組織によって特徴付けられる、疾患を治療用の医薬を製造するための、複数の架橋されたポリマーを含有する、pH-応答性該マイクロゲル粒子が提供され、ここで、少なくとも1種の該ポリマーは、化学種を含み、該化学種は、pH変化に応答して、該粒子の膨潤を引起すのに適したものである。
【００７１】
好ましくは、該軟組織は、上記IVD等の荷重-支持組織を含む。
ここに(あらゆる添付した特許請求の範囲、要約および図面を包含する)記載した全ての特徴、および/またはこれらに開示したあらゆる方法または工程のすべての段階は、上記局面の任意の組合せの何れかと組合わせることができるが、少なくとも幾つかのこのような特徴および/または段階が、相互に相容れないものであるような組合せを除外する。
本発明の特に好ましい態様を以下に示す。
［１］
pH-応答性マイクロゲル粒子を含み、該粒子が、pHの変動に応答して、構造変化を行うのに適したものであることを特徴とする組成物の、損傷を受けたまたは変質した軟組織によって特徴付けられる疾患を治療するための、医薬を製造するための使用。
［２］
前記組成物が、複数のpH-応答性マイクロゲル粒子を含む分散物を含有する、［1］記載の使用。
［３］
前記pH変化に暴露する前に、前記組成物のpHが、該治療すべき組織のpHよりも低い、［1］または［2］記載の使用。
［４］
前記pH変化に暴露する前に、前記組成物のpHが、約4.5〜6.0なる範囲内にある、［1］〜［3］の何れか1項に記載の使用。
［５］
前記pH変化に暴露する前には、前記組成物が、実質的に流体である、［1］〜［4］の何れか1項に記載の使用。
［６］
前記pH変化に暴露する前には、前記マイクロゲル粒子が、実質的に潰れた形状を取る、［1］〜［5］の何れか1項に記載の使用。
［７］
前記pH変化に暴露する前に、前記粒子内の含水率が、水約30％(w/w)未満である、［1］〜［6］の何れか1項に記載の使用。
［８］
前記pH変化に暴露する前に、前記マイクロゲル粒子の径が、約20〜500nmなる範囲内にある、［1］〜［7］の何れか1項に記載の使用。
［９］
前記pH変化に暴露した後の前記マイクロゲル粒子のpHが、約6.0〜7.5なる範囲内にある、［1］〜［8］の何れか1項に記載の使用。
［１０］
前記マイクロゲル粒子の径が、該pH変化に応答して増大するか、あるいは実質的に膨潤した形状を取る、［1］〜［9］の何れか1項に記載の使用。
［１１］
前記マイクロゲル粒子が膨潤状態にある場合に、該粒子が、少なくとも約95％(w/w)の水を含む、［10］記載の使用。
［１２］
前記pH変化に暴露した後の前記マイクロゲル粒子の平均径が、少なくとも200％だけ増大するのに適したものである、［1］〜［11］の何れか1項に記載の使用。
［１３］
前記pH変化に暴露した後の前記マイクロゲル粒子の径が、約200〜400nmなる範囲内にある、［1］〜［12］の何れか1項に記載の使用。
［１４］
前記組成物中の粒子の構造変化が、ゲル化段階を含む、［1］〜［13］の何れか1項に記載の使用。
［１５］
前記pH変化に暴露した後に、前記組成物がゲル形状にある、［14］記載の使用。
［１６］
前記膨潤粒子が、実質的に高濃度の可動イオンを含む、［10］〜［15］の何れか1項に記載の使用。
［１７］
前記イオンが、Na+またはK+イオンである、［16］記載の使用。
［１８］
前記粒子を、フリーラジカル乳化重合を利用して製造する、［1］〜［17］の何れか1項に記載の使用。
［１９］
前記マイクロゲル粒子が、共重合されたポリマー粒子を含み、該共重合されたポリマーが、以下の式I：
ポリ(P-co-X)          (式I)
により定義され、該式Iにおいて、PはpH-応答性コモノマーであり、またXは官能性の架橋性コモノマーである、［1］〜［18］の何れか1項に記載の使用。
［２０］
前記pH-応答性コモノマーが、酸性コモノマーであり、かつ前記酸性基のpKaが、6.0〜7.0なる範囲内にある、［19］記載の使用。
［２１］
前記pH-応答性コモノマーが、塩基性コモノマーであり、かつ前記塩基性基のpKbが、5.5〜6.5なる範囲内にある、［19］記載の使用。
［２２］
前記pH-応答性コモノマーが、置換アクリル酸を含む、［19］〜［21］の何れか1項に記載の使用。
［２３］
前記pH-応答性コモノマーが、置換メタクリル酸を含む、［19］〜［22］の何れか1項に記載の使用。
［２４］
前記官能性の架橋性コモノマーが、エチレングリコールジメタクリレートまたは1,4-ブタンジオールジアクリレートを含む、［19］〜［23］の何れか1項に記載の使用。
［２５］
前記マイクロゲル粒子が、疎水性コモノマーを含み、かつ以下の式IV：
ポリ(B-co-P-co-X)          (式IV)
により定義され、該式IVにおいて、PはpH-応答性コモノマーであり、Bは疎水性コモノマーであり、またXは官能性の架橋性コモノマーである、［1］〜［24］の何れか1項に記載の使用。
［２６］
前記疎水性コモノマーが、メチルメタクリレートまたはエチルアクリレートを含む、［25］記載の使用。
［２７］
前記マイクロゲル粒子が、ポリ(MMA/MAA/EGDMa)またはポリ(EA/MAA/BDDA)を含むポリマーを含有する、［1］〜［26］の何れか1項に記載の使用。
［２８］
前記組成物が、少なくとも1種の髄核細胞および/または少なくとも1種の幹細胞および/または少なくとも1種の哺乳動物細胞を含む、［1］〜［27］の何れか1項に記載の使用。
［２９］
適当な哺乳動物細胞が、軟骨細胞(例えば、自己由来のまたは内因性の該細胞)を含む、［28］記載の使用。
［３０］
適当な幹細胞が間葉性、および造血幹細胞を含む、［28］または［29］記載の使用。
［３１］
前記医薬が、損傷を受けたまたは変質した皮膚、筋肉、靭帯または脂肪組織を治療するのに使用される、［1］〜［30］の何れか1項に記載の使用。
［３２］
前記医薬が、損傷を受けたまたは変質した荷重-支持組織を治療するのに使用される、［1］〜［31］の何れか1項に記載の使用。
［３３］
前記医薬が、損傷を受けたまたは変質した関節、例えば股関節、肘関節、足首関節、膝関節、手関節等を治療するのに使用される、［1］〜［32］の何れか1項に記載の使用。
［３４］
前記医薬が、損傷を受けたまたは変質した脊椎板、または椎間板(IVD)を治療するのに使用される、［1］〜［33］の何れか1項に記載の使用。
［３５］
前記医薬が、関節炎、椎間板の変質、背痛、腰痛、坐骨神経痛、頸部脊椎症、頸部痛、脊椎後湾症、脊椎側湾症、変性関節疾患、変形性関節症、脊椎分離症、脊椎すべり症、椎間板脱、失敗した脊椎外科手術、または脊柱不安定症を治療するのに使用される、［1］〜［34］の何れか1項に記載の使用。
［３６］
損傷を受けたまたは変質した軟組織によって特徴付けられる疾患を患っている対象の治療方法であって、このような治療を要する対象に、pH-応答性マイクロゲル粒子を含有する組成物を、治療上有効な量で投与することを含み、該粒子が、pHにおける変動に応答して、構造変化を起こすのに適したものであることを特徴とする、前記方法。
［３７］
前記組成物が、［1］〜［35］の何れか1項において定義したものである、［36］記載の方法。
［３８］
［1］〜［30］の何れか1項において定義した、医薬として使用するためのマイクロゲル。
【実施例】
【００７２】
本発明を、更に良く理解するために、また本発明の態様が、如何にして実施できるかを示すために、以下の実施例および添付した模式的な図を参照する。
実施例
本発明者等は、一連のpH-応答性ポリマーゲルの微粒子を調製し、先ず図1に示したように、これらの特徴付けを行い、次いで図2に示したように、該微粒子が、損傷を受けた椎間板を修復するのに利用できるか否かを理解するために、検討を行った。これらの微粒子は、新たに屠殺した動物であるウシの尻尾から得た、椎骨単位の髄核内に注入し、次いで該単位の高さを測定して、図3-5に示したように、治療後のその圧縮値を測定した。図6は、該マクロゲルを製造するのに使用した、好ましい材料を示す。
【００７３】
材料および方法：
(i) pH-応答性マイクロゲルの製造：
(a) マイクロゲル1(表1を参照のこと)：
ポリ(EA/MAA/BDDA)マイクロゲルを、種-供給乳化重合(Macromolecules, 1994, 27: 6642)を利用して調製した。エチルアクリレート(EA) (アルドリッチ(Aldrich)社製、143.5g)、メタクリル酸(MAA) (アルドリッチ社製、72.0g)および1,4-ブタンジオールジアクリレート(BDDA) (アルドリッチ社製、2.2g)を含有するモノマー混合物を調製し、また12.5％の該混合物を、予めパージし、攪拌された、ドデシル硫酸ナトリウム溶液(BDH、500gの水に1.75gを分散させた)に添加し、これを80℃に加熱した。該モノマーは、使用に先立って、アルミニウムカラムに通した。K2HPO4(7％水性溶液3g)および過硫酸アンモニウム(5％水性溶液2.95g)を、窒素ガス雰囲気を維持しつつ、迅速に添加した。僅かに青色の濁りの出現後、残りのモノマー混合物を、90分間の期間に渡り、連続的な速度にて添加した。追加の開始剤(5％水性溶液3.3g)を添加し、該温度を、更に2時間に渡り維持した。得られたマイクロゲルを、ミリ-Q(Milli-Q)品位の水に対して、徹底的に透析した。潰れた状態にある該粒子の平均粒径は、約65nmであった。その膨潤状態における径は、pH=7.4において約220nmであった。
【００７４】
(b) マイクロゲル2A (表2を参照のこと)：
ポリ(MMA/MAA/EGDMa)マイクロゲル(マイクロゲル2A)を、種-供給乳化重合を利用して調製した。メチルメタクリレート(MMA) (アルドリッチ社製、139.3g)、メタクリル酸(MAA) (アルドリッチ社製、60.1g)およびエチレングリコールジメタクリレート(EGDMa) (アルドリッチ社製、2.1g)を含有する、種モノマー混合物を調製し、この混合物の25.2g(全モノマーの8.8％)を、予めパージ(N2)し、攪拌された、ドデシル硫酸ナトリウム溶液(BDH、500gの水に1.75gを分散させた)に添加し、これを継続的に80℃に加熱した。K2HPO4(7％水性溶液2.55g)および過硫酸アンモニウム(3％(w/w)水性溶液4.50g)を、窒素ガス雰囲気を維持しつつ、迅速に添加した。MMA(273.1g)、MAA(134.0g)およびEGDMa(1.7g)を含む供給モノマー混合物を調製した。僅かに青色の濁りの出現後、264g(全モノマーの91.2％)の該供給モノマー混合物を、90分間の期間に渡り、連続的な速度にて添加した。追加の過硫酸アンモニウム(3％水性溶液2.73g)を添加し、該温度を、更に2時間に渡り維持した。得られたマイクロゲルを、ミリ-Q品位の水に対して、徹底的に透析した。潰れた状態にある該粒子の平均粒径は、約100nmであった。その膨潤状態における径は、pH=7.4において約260nmであった。
【００７５】
(c) マイクロゲル2B (表3を参照のこと)：
マイクロゲル2Aを製造するのに使用した方法(上記)の変法を利用した。ポリ(MMA/MAA/EGDMa)マイクロゲルを、種-供給乳化重合を利用して調製した。メチルメタクリレート(MMA) (アルドリッチ社製、125.6g)、メタクリル酸(MAA) (アルドリッチ社製、58.7g)およびエチレングリコールジメタクリレート(EGDMa) (アルドリッチ社製、1.94g)を含有する、種モノマー混合物を調製し、この混合物の14.0g(7.5％)を、予めパージ(N2)し、攪拌された、ドデシル硫酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムの溶液(夫々BDH、0.14gおよびアルドリッチ社製、0.44g、200gの水に分散させた)に添加し、これを継続的に80℃に加熱した。K2HPO4(7％(w/w)水性溶液2.56g)および過硫酸アンモニウム(5％(w/w)水性溶液2.57g)を、窒素ガス雰囲気を維持しつつ、迅速に添加した。残りのモノマー混合物172g(92.5％)を、攪拌したドデシル硫酸ナトリウム溶液(BDH、300gの水に0.17gを分散させた)に添加した。1時間反応させた後、一定の攪拌状態にある、該供給モノマー混合物を、105分間なる期間に渡り、一定の割合で該反応に添加した。該反応温度を、更に2時間に渡り維持した。得られたマイクロゲルを、徹底的に遠心分離処理し、ミリ-Q品位の水で洗浄した。潰れた状態にある該粒子の平均粒径は、約250nmであった。その膨潤状態における径は、pH=7.5において約220nm(pH=8.1において1425nm)であった。
【００７６】
(ii) マイクロゲルの特徴付け：
フォトン相関分光分析測定を、0.03質量％のマイクロゲルを含む分散物を用いて行った。これらの測定は、20mWのHeNeを備えた、BI-9000ブルックハーベン(Brookhaven)光散乱装置(ブルックハーベンインスツルメントコーポレーション(Brookhaven Instrument Cooperation)社製)を使用して行い、検出器は散乱角90°に設定した。
(iii) 組織の調製およびマイクロゲル注入手順：
全ての実験は、新たに屠殺した動物であるウシの尻尾から得た、椎骨単位を使用して行ったが、該動物は、2歳未満であった。これらの尻尾は、屠殺場から入手し、屠殺当日に切開し、かつ使用前に193Kにて凍結状態で保存した。他の研究のために、IVDの凍結が、その機械的な諸特性に悪影響を及ぼさないことを確認した。研究前に、該単位を、解凍し、室温にて6時間、リン酸緩衝塩水(0.15M)中で水和させた。研究用の単位は、軟骨の終板を介して注意深く切断し、結果的にその髄核(および周囲の組織)は、2つの平行な終板間にあった。この手順中に、外部に付着した筋肉および間膜を除去した。該NPの断面積は、解剖により計算し、また該NPの高さは、該単位のX-線写真から決定した。該椎骨片の高さは、側面から観測した際の、凸型終板の中心から測定した。該単位を洗浄し、またPBS中に保存した。未処理のサンプルを除き、全てのNPを、コラーゲナーゼ注射(濃度10mg/mLにて)により処理し、また変質を、37℃にて18時間進行させた。該単位は、タイプ(Type) 1コラーゲナーゼ注射液(1％(w/w))の注入によって変質した。該単位は、この変質段階中、PBS中に37℃にて18時間保存した。
【００７７】
(iv) 注入手順：
該マイクロゲル分散液(20％(w/w))を、該変質したNPに注入(約0.4mL)した。これに続いて、濃厚水酸化ナトリウム溶液(約0.1mL)を該NPの同一の領域に注入した。これは、該過程のpHの平衡化を促進するために行った。また、比較のために、塩基を添加すること無しに、マイクロゲル分散液を注入した。全注入マイクロゲル体積は、この場合約0.5mLであった。インビボでの応用のために、水酸化ナトリウムの注入は、体液の自然の緩衝作用が、経時に伴って、pHを増大するので、必要とされないことに注意すべきである。荷重測定の前に、該注入孔を、スーパーグルー(Super Glue)を用いて封止した。該荷重測定は、マイクロゲル注入の2時間以内に行った。
【００７８】
(v) 圧縮測定：
注入されたマイクロゲルを含有する該ウシの椎骨単位を、1kNの荷重セルを備えた、サーボ-油圧式テスト装置(ツビックローエル-アムスター(Zwick Roell-Amster)社製)を用いて、圧縮荷重下においた。この単位は、特別仕様の荷重セルを有し、該セルは、平坦なステンレススチール表面と、該上部の終板を配置するための、盛上がったリムとを有する、円筒状のプランジャーからなっている。該下部の終板は、パースペックス(Perspex)浴の床上に配置された。該椎板に適用された最大の荷重は、1kNであった。これは、正常な条件下で、ヒトIVDの経験する応力範囲をカバーする、応力を与えた。該圧縮測定は、該単位を十分にPBS中に浸漬しつつ行った。使用した第一の荷重サイクル(サイクル1)は、状態調節サイクルであり、これにより、該IVDから過剰量の水分が除去された。全ての単位は、同一の方法で処理された。圧縮応力は、約0.2なる歪が達成されるまで、サイクル1期間中に適用した。より高い応力を、その後のサイクル中(図3を参照)に使用した。かなりの注意を払って、該圧縮測定前およびその最中に、該構造を、確実に並行に維持した。実験的な配列は、一軸圧縮に対応するものであった。圧縮中には、動径方向における膨張に関する制限は無いので、該応力対歪プロットの勾配は、ヤング率に関する値を与えた(J. Appl. Polym. Sci. 1968, 12, 1147)。これらの歪の値は、圧縮サイクルを開始する直前に測定された変移から、これを高さで割ることにより算出した。
【００７９】
(vi) 細胞生存率の研究：
全てのゲル化されたマイクロゲル分散物は、細胞生存率研究前の少なくとも24時間前に調製した。寒天(1.5質量％)を、マイクロ波加熱により、脱イオン水中に溶解し、次いで冷却して、均質なゲルを形成した。これは、コントロールとして使用した。該ゲル化されたマイクロゲル分散物は、十分な量の2M NaOH溶液を添加して、φp=0.10を持つ、硬い、膨潤したゲルを形成することによって調製した。接着性の培養したヒト関節繊維輪(AF)細胞を使用して、細胞生存率をテストした。該細胞をリン酸緩衝塩水(PBS)で、媒体がなくなるまで洗浄した。これら細胞を、5mLのトリプシンと共に2分間インキュベートし、次いで5mLの完全培地(DMEM)で失活させた。自由に浮遊するAF細胞を含有する、生成した該懸濁液を、遠心分離処理し、また得られた上澄液を除去し、該細胞ペレットを、約5mLの新たな培地に再度懸濁させた。これらの細胞を、24時間に渡り、組織培養ウエルの底部において生育させ、次いでゲル化したマイクロゲルのサンプルを、培地の存在下でこれらの上部に配置した。これは、該ゲルと該細胞との接触を保証した。所定の暴露時間の経過後、光学顕微鏡を使用して、該ウエルプレートの背後から、該細胞を観察した。
【００８０】
結果：
図1を参照すると、pHの関数として、該マイクロゲル粒子(1、2Aおよび2B)の流体力学的な径(d、nm単位で測定)の変動が示されている。これらのデータは、0.001M NaNO3中に分散された粒子を用いて記録された。図1は、該粒子が、pH=4.0における約75nmからpH=10における約300nmまで、pHに伴う粒子径の実質的な増加を示したことを明らかにしている。該マイクロゲルに関するpKaの値は、約7.0であるものと評価された。このことは、該EAまたはMMAモノマーに起因するものである。pH-応答性ポリマーに関するpKa値は、膨潤に対抗する、該疎水性基の凝集のために、疎水性基の含有率に伴って増大するものと考えられる。0.10なる体積分率(φp)をもつポリマーを含有するマイクロゲル分散物の相転移も、同様にpHの関数として検討した。これらの分散物は、pH=4においてコロイド的に安定であった。流体-ゲル転移は、粒子の膨潤のために、pH=6.0以上で発生した。振動式レオロジー研究(図示せず)は、103Paを越える弾性率および0.15未満のtanδ値を持つ、強力な物理的ゲルが生成することを明らかにした。
【００８１】
ウシ尻尾の椎骨単位を、IVDモデルとして使用した。というのは、これらがヒトIVDと類似する構造を持ち、また該単位は、有意な生物力学的応力の作用に掛けることができ、また変質することなしに得ることができるからである。再現可能な程度の変質が、髄核へのコラーゲナーゼ(コラーゲン開裂酵素)の注入によって導入された。該マイクロゲル分散物(pH=4.0)は、引続き該変質されたNP(0.20なるφp値を使用)に注入した。長期間に及ぶかなりの自然な組織分解が確実に存在するために、該マイクロゲルを、該モデルIVDのpH(約7.4)と平衡化することは、実現不能であった。故に、濃厚なNaOH溶液(1Mまたは2M)を、マイクロゲル注入の直後に、該NPの同一の領域に注入して、中和を促進させた。これは、0.16なる名目上のφp値を与えた。塩基(アルカリ)の注入が、身体内においては必ずしも必要ではないことを理解すべきであり、該身体においては、該pHの、該IVDのpHに対する段階的な平衡化が起るであろう。該IVDのpHは、約6.6である(Spine, 1992, 17: 1079)。
【００８２】
該圧縮研究後の測定は、該マイクロゲルを含有する該NPおよび注入された1Mまたは2MのNaOHが、夫々6.5および7.0なるpH値を持つことを示した。該NPの体積の関数としての、該マイクロゲルおよび塩基の全注入体積は、約0.25であった。
図2を参照すると、切開し、かつ該マイクロゲルを注入した後の、ウシの椎骨単位の写真が示されている。該ゲル化されたマイクロゲルは、矢印で示されている。この場合において、1MのNaOHが、マイクロゲル1の注入直後に注入され、6.5なる最終pHを与えた。故に、図2は、ゲル化されたマイクロゲル相が、この処置されたNPにおいて、明らかに効果があることが示された。
【００８３】
該ウシの単位は、周期的な様式で、約1mm/分なる速度にて、単軸的に圧縮された。図3を参照すると、荷重の印加および印加荷重解除の際の、応力変化に伴う相対的な高さ(Hr)の変化が示されている。該マイクロゲル含有ウシ椎骨単位は、pH=6.5に調節された。矢印は、荷重印加および印加荷重解除サイクルを示す。故に、図3は、マイクロゲル1を含み、pH 6.5を持つ、選択されたサイクル由来の、該相対的高さ(Hr)対応力データを示す。該相対的高さは、上に定義されている。該圧縮応力は、単位断面積当たりの印加荷重である。これは該椎間板の断面積に基くものであり、測定後解剖することにより測定された。該Hrの値は、与えられた荷重の作用下にて測定した椎骨単位の高さの、荷重印加前に測定されたその高さに対する比である。該圧縮応力は、該荷重と該NPの初期断面積とから計算された。図3から、ヒステリシスおよびクリープ現象が存在することを理解することができる。これらの作用は、未処理のウシIVDを用いた、関連する研究において観測された。
【００８４】
ヒステリシスは、該荷重印加および印加荷重解除サイクルにおける、重なり合いの欠如である。該ヒステリシスは、印加荷重解除の際の水の取込による線形の膨潤速度が、該荷重が解除される速度よりも約1mm/分遅いことによるものである。該クリープは、これら測定の全時間尺度において、不可逆的に発生する組織の変形の結果である。これは、IVDに関して周知の事象である。このクリープは、時間に依存する。生きたIVDにおいては、このクリープは、通常は、十分な時間が許される場合には、荷重を解除した後に、完全に回復される。これが、ヒトの身長が、睡眠の結果として、何故増加するかに関する理由である。
図4を参照すると、様々なpH値において、PBSおよびマイクロゲル1を注入したウシ椎骨単位に関するサイクル数の関数としての、(a) 測定された相対的な高さの変動(Hr値の変化)および(b) 0.5MPaにて測定された名目上の弾性率の変動を示す。これらの値は、変移対荷重のデータおよびIVDの寸法から得た。該Hr値および弾性率値は、軽度の運動中にIVDが経験するもの(即ち、約0.5MPa)に相当する、荷重(圧縮)応力下で測定された。コントロールデータも、正常(未処理)単位(即ち、該図の丸印で示されたもの)および注入されたPBS溶液を含有するNP(φp=0.16)(即ち、該図中の三角印で示されたもの)に関しても提示されている。
【００８５】
図4aから、マイクロゲルの注入が、該モデルIVDの相対的な椎間板の高さを、正常な値に回復することを理解することができる。アルカリ/塩基(pH=6.5および7.0)で処理された、該マイクロゲルは、初めの数サイクル後に、クリープの停止を示した。これは、該相対的な椎間板の高さが、実質的に低下する、該PBSを用いたコントロールとは、顕著に異なっていた。マイクロゲル(および塩基)注入後の、該pH(4.0からの)増加が、該マイクロゲル粒子の膨潤を引起し、また該変質したNP内の裂溝を満たす。該マイクロゲルの膨潤圧は、更に圧縮するように作用して、抵抗力を発生する。
【００８６】
該ヤング率は、単位断面積当たりの、該テスト検体上に作用する延伸力対単位長さ当たりの伸びの比である。図4bに示された、該ヤング率値は、各応力対歪曲線(図示せず)の瞬間的な勾配から算出した。均質な材料に対しては、各値は、軸方向の圧縮におけるヤング率に相当する。しかし、これらは、不均質な単位に関する名目上の弾性率であると考えられる。該弾性率は、一般的に荷重印加サイクル数が増大するにつれて、増大することを理解することができる。NPに対する該弾性率は、固体組織マトリックスの弾性率および荷重の作用下で徐々に排除される、トラップされた水による静水圧からの寄与を含むものと考えられる。サイクル数の増加に伴う弾性率における増加は、水の喪失および圧縮された組織およびマイクロゲルからのより大きな寄与に帰せられる。図4bから、該マイクロゲルが損傷を受けたNPの弾性率を、正常な組織に関する弾性率に匹敵するあるいは更に実質上それよりも良好な弾性率値にまで増大することを理解することができる。僅かに1回の荷重印加サイクル後に、優れた荷重-支持能力と共に、一定の弾性率を達成するので、pH=7.0の系に関する結果は顕著なものである。図4aおよび4bに示したデータは、また機械的諸特性が、pHによって調節し得ることを示している。あるいはまた、pHが固定された場合(身体内で見られる状態)、マイクロゲル組成を介するpKaの調節は、該弾性率の調節に利用できるものと考えられる。該pKa値は、EAの含有率の低下に伴って、約5.5に近づくはずである。
【００８７】
図4aから、マイクロゲル注入によるHr値における改善が、5回の荷重印加サイクル後に約0.14であったことを理解することができる。これらの結果が、ヒトIVDにおいて見出されたとすると、この場合、50歳を越えるヒトにおける平均椎間板高さが約6-7であり、従ってマイクロゲル注入は、軽い運動中(圧縮応力は約0.5MPa)に、約1mmだけ椎間板高さを増すことができる。この大きさの椎間板高さの増大は、変質した椎間板による背痛を患うヒトに対して、著しい差異をなす。
図5は、図4aと同様であり、圧縮サイクルの関数として、0.5MPaにて測定した、椎間板高さの関連性(荷重が印加されていない椎間板の高さに対する相対的な高さ)を示す。本図に示されたコントロールは、正常な椎間板(正常)、PBSを注入した椎間板(PBS)、および如何なる注入も受けていない椎間板(コラーゲナーゼ)である。該マイクロゲルは、塩基の添加無しに(マイクロゲル)、またpHを6.5および7.0に調節するために、塩基を添加して注入された。該データは、荷重印加の下にマイクロゲルを添加した際に、椎間板高さが明確に改善されたことを示す。pHを6.5および7.0に高めると、椎間板高さにおける最大の改善が得られる。
【００８８】
図7は、該ゲル化されたマイクロゲルまたは寒天(コントロール)と接触させた後、24時間経過した際に、該ウエルプレートの背後から観察した、該AF細胞の光学顕微鏡写真を示す。これらの像(図7(b)-(d))は、寒天に暴露したもの(図7(a))と同様な形態を持つ細胞を示す。このことは、該細胞が、接触の24時間後においても生存していたことを示す。対照的に、該細胞の界面活性剤に対する暴露は、接触後1時間以内に該細胞を死亡させ、また観測される形態は、丸くなる。ここには示さなかったが、他の実験においては、該AF細胞は、マイクロゲル1、2Aおよび2Bの、ゲル化されたマイクロゲル分散液と接触させた場合、少なくとも5日間生存性を維持した。これらの結果は、該ゲル化されたマイクロゲル分散液が、ヒトIVD組織に対して生体適合性であることを示している。
【００８９】
結論：
本発明者等は、pH-応答性マイクロゲルが、単に注入を利用して、変質したNPの椎間板高さおよび弾性率を回復させるのに利用できることを、最初に立証した。これは、生体物質としてマイクロゲルを使用する、全く新規な方法である。該微粒子の膨潤圧力は、pHを利用して調節し、結果として該マイクロゲルを投与したNPの弾性率を高めることができる。本発明者等は、組成上の変更を利用して、これらマイクロゲルのpKa値を調節できるはずであると考える。該pKa値の調節は、該NPのpH、または他の任意の組織のpHにおいて、これら材料の荷重-支持特性の微調整を可能とするであろう。
該IVDのpHが約6.6であることから、該マイクロゲル粒子が、6.6以下のpHに維持された場合には、これを投与した際に、該粒子が自動的に膨潤し、またゲルを生成する点に、本発明の主要な利点があることを理解するであろう。故に、治療すべき組織に、アルカリを添加する必要がない。
【００９０】
本研究から、注入可能な、応答性マイクロゲルが、他の軟組織型(例えば、軟骨)、または関節(例えば、膝および股関節)における生物力学的荷重を支持するのに利用可能であるという結論が導かれる。本発明者等は、また組成および処方の変更が、該マイクロゲルの荷重-支持特性を変更するために利用できるものと確信する。
更に、図7に示した研究は、ヒトの細胞が、本発明によるマイクロゲルの存在下で生存性であり、またその結果として、該組成物が、ヒトからなる対象における使用に対して、生体適合性であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】pHの関数としての、本発明のマイクロゲル粒子1、2Aおよび2Bの流体力学的な径の変動を示す。これらのデータは、0.001M NaNO3溶液中に分散された、粒子を用いて記録した。
【図２】切開後のウシのIVD単位の写真である。該ゲル化されたマイクロゲルは、矢印で示されている。この場合、1M NaOH溶液は、該マイクロゲルの注入直後に注入され、最終pH6.5を与える。
【図３】荷重印加および印加荷重を解除した際の、応力の増大に伴う、相対的な椎間板高さの変化を示す。マイクロゲルを含有する該ウシのIVD単位は、pH=6.5に調節された。矢印は、荷重印加および印加荷重解除サイクルを示す。該相対的な高さは、荷重が印加される前の、該IVD単位の高さに対する、所定の圧縮応力の下で測定した、該IVD単位の高さである。
【図４】PBSおよびマイクロゲルを注入した、ウシの単位に関する、サイクル数の関数として、0.5MPaにおいて測定した、(a)相対的な高さおよび(b)名目上の弾性率の変動を示す図である。コントロールは、正常な椎間板(正常)、およびPBSを注入した椎間板(PBS)である。説明図は、pH値を示す。誤差バーが、明確化のために一種のデータに対して示されている。
【図５】PBSおよびマイクロゲルを注入したウシの単位に関する、サイクル数の関数として、0.5MPaにおいて測定した、相対的な高さ(Hr値)の変動を示す。コントロールは、正常な椎間板(正常)、PBSを注入した椎間板(PBS)および如何なる注入も無いもの(コラーゲナーゼ)である。
【図６】本発明のマイクロゲル粒子を製造するために使用した、モノマーの詳細を示す。
【図７】(a)寒天、(b)マイクロゲル1、(c)マイクロゲル2A、および(d)マイクロゲル2Bと接触状態にある、椎間板繊維輪(AF)細胞の光学顕微鏡写真である。これらの顕微鏡写真は、接触の24時間後に撮影された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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