(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト心筋トロポニンＩ（ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｉ）に特異的に結合するＤＮＡアプタマーであって、前記ＤＮＡアプタマーは配列番号５の塩基配列を有することを特徴とする、ＤＮＡアプタマー。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡアプタマーを含む急性心血管疾患診断用組成物。 
【請求項３】
請求項１に記載のＤＮＡアプタマーを含む、急性心血管疾患診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト心筋トロポニンＩ（ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｉ）に特異的に結合するＤＮＡアプタマー、これを含む急性心血管疾患診断用組成物および診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
トロポニン（ｔｒｏｐｏｎｉｎ）は、Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉ、Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔ、Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｃの３つの小単位から構成されており、アクチンフィラメント上のトロポミオシンとの結合によって筋細胞の収縮と弛緩を調節するタンパク質複合体である。この複合体は細胞質内のＣａ２＋水準が増加すると、Ｃａ２＋とＴｒｏｐｏｎｉｎ Ｃとの結合によって構造的な変化を起こし、これによりアクチンとミオシンとの結合部位を作って筋肉の収縮を起こす役目をしている。このような現象は、骨格筋と心筋の両方ともに作用し、特に心筋に作用するＴｒｏｐｏｎｉｎ Ｉ、Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔは骨格筋に発現するものとはアミノ酸の長さが異なって区分される。
【０００３】
また、心筋トロポニンＩ（ｃａｄｉａｃ  ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｉ）の場合、急性心血管疾患でその発現量が急激に増加するものと知られており、このようなタンパク質の検出は急性心血管疾患の初期診断において非常に重要である。 
【０００４】
一方、アプタマーは、特定の物質に対して高い特異性と親和度を持つ１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）またはＲＮＡである。アプタマーは、特定の物質に対する親和度が非常に高く、安定性があるため、最近多く開発されており、これを用いた治療剤および診断用センサーへの応用が盛んに行われている。
【０００５】
アプタマーの合成は比較的単純な方法で可能である。細胞、タンパク質および小さい有機物質までも標的物質になれるため、これを用いた新規検出方法の開発が可能であり、既に開発されている抗体に比べてその特性および安定性が非常に高いため、治療剤の開発、並びに薬物伝達システムおよび診断用バイオセンサーへの応用が可能である。
【０００６】
既に開発されている抗体を用いた方法は、生体の免疫システムを利用する方式なので、比較的多くの時間および高い費用がかかるという欠点がある。また、タンパク質であるから、その安定性がアプタマーに比べて低下するという欠点があるので、高感度センサーの開発に制約がある。
【０００７】
トロポニンＩ検出システムにおいても抗体を用いた方法が開発されているが、前述した理由により多くの制約があるので、急性心血管疾患の初期診断のためにはより安定かつ低コストの検出システムが求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ヒト心筋トロポニンＩ（ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｉ）に特異的に結合するＤＮＡアプタマー、これを含む急性心血管疾患診断用組成物および診断キットを提供することを目的とする。
【０００９】
ところが、本発明が解決しようとする技術的課題は前述した課題に限定されず、言及されていない他の課題は下記の記載から当業者に明確に理解できるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明によれば、ヒト心筋トロポニンＩ（ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｉ）に特異的に結合するＤＮＡアプタマーであって、前記ＤＮＡアプタマーは配列番号１〜配列番号６のいずれか一つの塩基配列を有することを特徴とする、ＤＮＡアプタマーが提供される。
【００１１】
さらに、本発明によれば、前記ヒト心筋トロポニンＩに特異的に結合するＤＮＡアプタマーを含む急性心血管疾患診断用組成物が提供される。
【００１２】
また、本発明は、前記ヒト心筋トロポニンＩに特異的に結合するＤＮＡアプタマーを用いることを特徴とする、急性心血管疾患診断キットを提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のヒト心筋トロポニンＩに特異的に結合するＤＮＡアプタマーは、既存の急性心血管疾患診断用抗体より特異性および安定性に優れるという利点を持っている。また、本発明のアプタマーを用いてヒト心筋トロポニンＩの濃度を敏感かつ正確に測定することが可能なバイオセンサーを開発すると、急性心血管疾患診断の早期診断にさらに効果的に応用することができ、診断の正確性を増加させるのに大きく役立つものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉタンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。
【図２】Ｔｒｏｐｏｎｉｎ複合体の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果をである。
【図３】Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉタンパク質を分離した後、ゲル濾過（ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム）によって精製した結果である。
【図４】Ｔｒｏｐｏｎｉｎ複合体タンパク質を分離した後、ゲル濾過（ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム）によって精製した結果である。
【図５】Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉに特異的なアプタマー選別段階によってＵＶ分光光度計を用いてｓｓＤＮＡとＴｒｏｐｏｎｉｎ Ｉとの結合程度を測定した結果を示すグラフである。
【図６】配列番号１および配列番号２で示されるＨｕｍａｎ ｃａｒｄｉａｃ Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉに特異的に結合するＤＮＡアプタマーの２次構造を示す。
【図７】配列番号３および配列番号４で示されるＨｕｍａｎ ｃａｒｄｉａｃ Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉに特異的に結合するＤＮＡアプタマーの２次構造を示す。
【図８】配列番号５および配列番号６で示されるＨｕｍａｎ ｃａｒｄｉａｃ Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉに特異的に結合するＤＮＡアプタマーの２次構造を示す
【図９】トロポニンＩタンパク質と配列番号１で示されるアプタマーとの結合力を測定するためのＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）結果を示す。
【図１０】トロポニンＩタンパク質と配列番号２で示されるアプタマーとの結合力を測定するためのＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）結果を示す。
【図１１】トロポニンＩタンパク質と配列番号３で示されるアプタマーとの結合力を測定するためのＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）結果を示す。
【図１２】トロポニンＩタンパク質と配列番号４で示されるアプタマーとの結合力を測定するためのＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）結果を示す。
【図１３】トロポニンＩタンパク質と配列番号５で示されるアプタマーとの結合力を測定するためのＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）結果を示す。
【図１４】トロポニンＩタンパク質と配列番号６で示されるアプタマーとの結合力を測定するためのＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）結果を示す。
【図１５】トロポニンＩタンパク質と抗体との結合力を測定するためのＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）結果を示す。
【図１６】トロポニン複合体タンパク質と配列番号１で示されるアプタマーとの結合力を測定するためのＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）結果を示す。
【図１７】トロポニン複合体タンパク質と配列番号２で示されるアプタマーとの結合力を測定するためのＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）結果を示す。
【図１８】トロポニン複合体タンパク質と配列番号３で示されるアプタマーとの結合力を測定するためのＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）結果を示す。
【図１９】トロポニン複合体タンパク質と配列番号４で示されるアプタマーとの結合力を測定するためのＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）結果を示す。
【図２０】トロポニン複合体タンパク質と配列番号５で示されるアプタマーとの結合力を測定するためのＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）結果を示す。
【図２１】トロポニン複合体タンパク質と配列番号６で示されるアプタマーとの結合力を測定するためのＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明者は、心筋トロポニンＩに対する抗体に代えることが可能なアプタマーを開発するために、ヒト心筋トロポニンＩをバクテリア発現システムで発現および精製し、これを用いてＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｏｆ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）技法を用いてアプタマーを選別し、ＤＮＡアプタマーの配列および構造を確立することにより、本発明を完成するに至った。
【００１６】
具体的に、本発明は、ヒト心筋トロポニンＩに特異的に結合するＤＮＡアプタマーであって、前記ＤＮＡアプタマーは配列番号１〜配列番号６のいずれか一つの塩基配列を有することを特徴とするＤＮＡアプタマーを提供する。
【００１７】
また、本発明は、前記ＤＮＡアプタマーを含む急性心血管疾患診断用組成物および診断キットを提供する。
【００１８】
本発明の組成物は、前記ＤＮＡアプタマー以外に、薬理学的または生理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤をさらに含んでもよい。
【００１９】
このような組成物に含まれ得る適切な担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、珪酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、非結質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱物油などを挙げることができる。前記組成物は、薬剤化する場合、通常の充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含んでもよい。
【００２０】
以下、本発明の理解を助けるために好適な実施例を提示する。ところが、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。
以下、参考形態の例を付記する。
１．ヒト心筋トロポニンＩ（ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｉ）に特異的に結合するＤＮＡアプタマーであって、前記ＤＮＡアプタマーは配列番号１〜配列番号６のいずれか一つの塩基配列を有することを特徴とする、ＤＮＡアプタマー。
２．１．に記載のＤＮＡアプタマーを含む急性心血管疾患診断用組成物。
３．１．に記載のＤＮＡアプタマーを用いることを特徴とする、急性心血管疾患診断キット。
【実施例】
【００２１】
実施例１：Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉ、Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔ、Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｃ遺伝子のクローニング
ヒト心筋トロポニンＩ、トロポニンＴ、トロポニンＣ（ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｉ，  ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｔ，  ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｃ）に対する遺伝子を増幅するために、トロポニンＩの場合、ＢａｍＨＩ制限酵素認識配列を含む５'プライマー（ＧＧＡＴＣＣ ＡＴＧ ＧＣＧ ＧＡＴ ＧＧＧ ＡＧＣ ＡＧ）、およびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識配列を含む３'プライマー（ＡＡＧＣＴＴ ＴＣＡ ＡＡＡ ＣＴＴ ＴＴＴ ＣＴＴ ＧＣＧ Ｇ）を使用した。また、トロポニンＴの場合は、ＥｃｏＲＩ制限酵素認識配列を含む５'プライマー（ＧＡＡＴＴＣ ＡＴＧ ＴＣＴ ＧＡＣ ＡＴＡ ＧＡＡ ＧＡＧ ＧＴＧ ＧＴＧ）とＸｈｏＩ制限酵素認識配列を含む３'プライマー（ＣＴＣＧＡＧ ＣＴＡ ＴＴＴ ＣＣＡ ＧＣＧ ＣＣＣ ＧＧＴ）を使用し、トロポニンＣの場合は、トロポニンＴと同様の制限酵素を用いて５'プライマー（ＧＡＡＴＴＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＧＡＣ ＡＴＣ ＴＡＣ ＡＡＧ ＧＣＴ ＧＣ）と３'プライマー（ＣＴＣＧＡＧ ＣＴＡ ＣＴＣ ＣＡＣ ＡＣＣ ＣＴＴ ＣＡＴ ＧＡＡ ＣＴＣ）を使用した。
【００２２】
遺伝子増幅のための鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として、ＨＥＫ２９３細胞から得たｃＤＮＡを使用し、ｉ−ｐｆｕ重合酵素（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）過程によって増幅した。ポリメラーゼ連鎖反応の各段階は次のとおりである：１）鋳型の二本鎖ＤＮＡを解離させる段階（９５℃で１分）、２）鋳型とプライマーとが結合する段階（５８℃で３０秒）、および３）新しい鎖を合成する段階（７２℃で１分）。これらの１）〜３）段階を１サイクルとし、３０サイクル繰り返し行った。
【００２３】
増幅されたヒト心筋トロポニンＩ、トロポニンＣ（ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｉ，  ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｃ）遺伝子は、制限酵素切断反応およびＤＮＡライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応によって、（Ｈｉｓ）６−ｔａｇの含まれたｐＥＴ２８ａベクターにクローニングし、トロポニンＴの場合は、ｐＥＴ２１ａベクターにクローニングした。また、トロポニンＩとトロポニンＣはＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換し、トロポニンＴはトロポニンＩと共同発現のために２つのクローニングされた遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＧ細胞に共に形質転換した。
【００２４】
実施例２：Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉタンパク質の発現
ヒト心筋トロポニンＩ遺伝子が形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞は、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ）培地で培養するが、ＵＶ６００ｎｍで光学密度（ＯＤ、ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）値が０．６に到達するまで３７℃で培養した。その後、タンパク質の発現を誘導するために、最終濃度が０．２ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加した後、１８℃で１６時間培養した。タンパク質の発現はＳＤＳ−ＰＡＧＥ  （ｓｏｄｉｕｍ−ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）で確認した。細胞は遠心分離機で培地と分離させた後、ＰＢＳ（１０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）バッファで１回洗浄した。発現させたＴｒｏｐｏｎｉｎ Ｉタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果を図１に示した。
【００２５】
図１に示したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、１番目のレーン（Ｍ）はマーカータンパク質のサイズを示し、２番目のレーン（ｂｆ）はＩＰＴＧを用いて発現を誘導する前の状態を示す。３番目および４番目のレーン（ａｆ）に示すように、ＩＰＴＧを入れた後、約２８ＫＤのサイズでＴｒｏｐｏｎｉｎ Ｉタンパク質が発現したことを確認することができた。
【００２６】
実施例３：Ｔｒｏｐｏｎｉｎ複合体の発現
ヒト心筋トロポニンＴ、トロポニンＩ（ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｔ，  ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｉ）遺伝子が共に形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＧ細胞、およびトロポニンＣ遺伝子が形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）は、トロポニンＩの発現と同様にＬＢ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ）培地で培養するが、ＵＶ６０ｎｍで光学密度（ＯＤ、ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）値が０．６に達するまで３７℃で培養した。その後、タンパク質の発現を誘導するために、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を最終濃度が０．２ｍＭとなるように添加した後、１８℃で１６時間培養した。タンパク質の発現はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）で確認した。細胞は遠心分離機で培地と分離させた後、ＰＢＳ（１０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）バッファで１回洗浄した。発現させたトロポニンＴ、トロポニンＩ、トロポニンＣタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果を図２に示した。
【００２７】
図２に示したＳＤＳ ＰＡＧＥゲルにおいて、１番目のレーン（Ｍ）はマーカー（ｍａｒｋｅｒ）タンパク質のサイズを示し、２番目のレーン（ｂｆ）はＩＰＴＧを用いて発現を誘導する前の状態を示す。３番目のレーン（ａｆ）に示すように、ＩＰＴＧを入れた後、それぞれのサイズでトロポニンＩ、トロポニンＴ、トロポニンＣタンパク質が発現したことを確認することができた。
【００２８】
実施例４：Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉタンパク質の精製
バクテリア細胞Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現したヒト心筋トロポニンＩタンパク質を高純度で精製するために、細胞溶菌バッファ（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ β−メルカプトエタノール、３％グリセロール、０．０１％ ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）に細胞を溶かした後、ソニケーター（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いて１０分間超音波粉砕することにより、細胞を破壊した。水溶液状のタンパク質と細胞を分離するために、１５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。
【００２９】
また、高純度のタンパク質を得るために、Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｎｉ−Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）と（Ｈｉｓ）６−ｔａｇアミノ酸が結合する特性を利用した。具体的に、ＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にＮｉ−ＮＴＡカラムを連結し、水溶液状のｃａｒｄｉａｃ ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉをカラムに流すことにより結合させた。Ｎｉ−ＮＴＡカラムに結合したタンパク質の（Ｈｉｓ）６−ｔａｇはイミダゾール（ｉｍｍｉｄａｚｏｌｅ）の化合物と競争的に結合するから、標的タンパク質をカラムで分離させるために溶出バッファ（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ β−メルカプトエタノール、３％グリセロール、０．０１％ ｔｗｅｅｎ２０、３００ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）を順次流すことにより、ｃａｒｄｉａｃ ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉを高純度で分離することができた。
【００３０】
分離されたタンパク質からさらに純度の高いタンパク質を得るために、タンパク質を大きさによって分離するカラムとしてのｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムをＦＰＬＣに連結した後、大きさによってタンパク質をもう１回分離した。バッファ中に含まれたイミダゾールを除去するために、最終バッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ β−メルカプトエタノール、３％グリセロール、０．０１％ ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ８．０）を用いて分離精製し、その結果を図３に示した。
【００３１】
図３のＳＤＳ ＰＡＧＥゲルにおいて、１番目のレーンはタンパク質の大きさを示し、２番目のレーンは精製過程を全て済ませた後のタンパク質の状態を示す。精製過程を済ませた後、高純度のＴｒｏｐｏｎｉｎ Ｉをサイズ２５ＫＤａで確認した。
【００３２】
実施例５：Ｔｒｏｐｏｎｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ（Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔ、Ｃ、Ｉ）の精製
トロポニンＴ、トロポニンＩ、トロポニンＣの複合体タンパク質を高純度で精製するために、トロポニンＴ、トロポニンＩが発現された細胞を溶菌バッファ（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ β−メルカプトエタノール、５％グリセロール、ｐＨ８．０）に細胞を溶かした後、超音波粉砕機（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いて細胞を破壊し、遠心分離を介して水溶液状のタンパク質を分離した。
また、トロポニンＩの精製過程と同様に、Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｎｉ−Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）と（Ｈｉｓ）６−ｔａｇアミノ酸とが結合する特性を利用した。具体的に、ＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にＮｉ−ＮＴＡカラムを連結し、水溶液状のトロポニンＴ、トロポニンＩをカラムに流すことにより結合させた。標的タンパク質をカラムで分離させるために、溶出バッファ（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ β−メルカプトエタノール、５％グリセロール、３００ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）を、順次濃度を上げながらカラムに流すことにより、トロポニンＩ、トロポニンＴを分離することができた。
【００３３】
トロポニンＩ、トロポニンＴの（Ｈｉｓ）６−ｔａｇをＴＥＶ（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓ） ｐｒｏｔｅａｓｅで処理して除去した。具体的に、（Ｈｉｓ）６−ｔａｇの後ろにあるＴＥＶ ｐｒｏｔｅａｓｅを認識し、切断する反応のために、ＴＥＶ ｐｒｏｔｅａｓｅとタンパク質を２０℃で６時間反応させた。
【００３４】
ＴＥＶ ｐｒｏｔｅａｓｅによって（Ｈｉｓ）６−ｔａｇが除去されたトロポニンＩ、トロポニンＴは、Ｇ−２５カラムを用いて溶出バッファにあるイミダゾールを除去した後、さらにＮｉ−ＮＴＡカラムに流すことにより、タンパク質から離れた（Ｈｉｓ）６−ｔａｇと分離して純粋なトロポニンＩ、トロポニンＴのみを得ることができた。
【００３５】
また、トロポニンＣの場合は、上述したようにＮｉ−ＮＴＡカラムを介して（Ｈｉｓ）６−ｔａｇが含まれた状態で精製し、Ｇ−２５カラムを介してイミダゾールを除去した。
【００３６】
トロポニン複合体状態のタンパク質を得るために、前記精製された（Ｈｉｓ）６−ｔａｇが含まれたトロポニンＣをＮｉ−ＮＴＡに結合させた後、カラムにトロポニンＩ、トロポニンＴタンパク質をカラムに流してカラム上で複合体を形成するように誘導した。結合しない余剰のトロポニンＩ、トロポニンＴタンパク質はそのままカラムを通過した。トロポニン複合体が形成された状態のタンパク質はカラムで溶出バッファを用いて得ることができた。
【００３７】
トロポニン複合体からさらに純度の高いタンパク質を得るために、タンパク質をサイズによって分離するＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＨＬカラムをＦＰＬＣに連結した後、サイズによってタンパク質をもう１回分離した。バッファ中に含まれたイミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）を除去するために、最終バッファ（ｆｉｎａｌ  ｂｕｆｆｅｒ）（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ β−メルカプトエタノール、５％グリセロール、ｐＨ８．０）を用いて分離精製し、その結果を図４に示した。
【００３８】
図４のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、１番目のレーンはタンパク質のサイズを示し、２番目のレーンは精製過程を全て済ませた後のタンパク質の状態を示す。
【００３９】
実施例６：ＳＥＬＥＸを用いたＴｒｏｐｏｎｉｎ Ｉタンパク質に対するアプタマーの探索
【００４０】
<６−１>ｓｓＤＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ）ライブラリーの製造
両末端にＰＣＲ増幅およびクローニングのためのプライマーの結合配列を有し、中央に４０個のランダムＤＮＡ塩基配列を含む９０個の配列を有する合成されたライブラリー（５'−ＣＡＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡ−Ｎ４０−ＣＴＧＧＣＴＣＧＡＡＣＡＡＧＣＴＴＧＣ−３'）を設計した。
【００４１】
また、ＰＣＲ増幅およびｓｓＤＮＡ生成のために、５'プライマー（５'−ＣＡＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＣＧＧＡ−３'）、３'プライマー（５'−ＧＣＡＡＧＣＴＴＧＴＴＣＧＡＧＣＣＡＧ−３'）、およびビオチンが結合した３'プライマー（５'−Ｂｉｏｔｉｎ−ＧＣＡＡＧＣＴＴＧＴＴＣＧＡＧＣＣＡＧ−３'）を使用した。本発明で使用された全てのオリゴヌクレオチドはバイオニック社（韓国）で合成およびＰＡＧＥ精製した。
【００４２】
<６−２>ｈｕｍａｎ ｃａｒｄｉａｃ Ｔｒｏｐｏｎｉｎ ＩのＮｉ−ＮＴＡ磁性ビーズ（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄ）への固定化
精製されたヒト心筋トロポニンＩは、表面にコバルトでコートされており、タンパク質のＨｉｓ−ｔａｇと結合する磁性ビーズとしてのＤｙｎａｌｂｅａｄ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ノルウェー）を用いてビーズに固定した。
【００４３】
具体的に、タンパク質結合バッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３％グリセロール、０．０１％ ｔｗｅｅｎ２０、５ｍＭ ＭｇＣｌ、ｐＨ８．０）１５０μＬに溶けているタンパク質１５０ｐｍｏｌｅと２０μＬのビーズを外部磁石を用いて結合バッファで洗浄した後、１時間室温で反応してビーズに固定化させた。
【００４４】
<６−３>ｈｕｍａｎ ｃａｒｄｉａｃ ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉに特異的なアプタマーの選別
ヒト心筋トロポニンＩに特異的なアプタマーを選別するために、磁性を用いた特異的分離方法を行った。
【００４５】
まず、ｓｓＤＮＡの最も安定な構造形成のために、１００μＬの結合バッファに溶けているｓｓＤＮＡライブラリー（１ｎｍｏｌｅ）を９０℃で３分間培養した後、４℃で１時間全培養した。その後、先立って磁性ビーズ（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄ）に固定化されたＴｒｏｐｏｎｉｎ Ｉタンパク質と混合して共に弱く振盪しながら１時間反応させた。次いで、ビーズに結合したＴｒｏｐｏｎｉｎ Ｉタンパク質と結合しないｓｓＤＮＡを除去するために、結合バッファでビーズを２回洗浄した。
【００４６】
その後、磁性ビーズによってタンパク質と結合したｓｓＤＮＡを分離するために、溶出バッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３％グリセロール、０．０１％ ｔｗｅｅｎ２０、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、３００ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）を用いてタンパク質およびタンパク質に結合したｓｓＤＮＡを溶出させた。溶出したｓｓＤＮＡはエタノールを用いて沈澱させた後、１００μＬの蒸留水に溶解した後、５'プライマー、ビオチンが結合した３'プライマー、およびｉ−ｐｆｕ重合酵素（イントロンバイオテクノロジー、韓国）を用いてＰＣＲによって増幅させた。その後、選別過程のためのｓｓＤＮＡを生成するために、ビオチンが結合したＰＣＲ産物をビオチンと結合するストレプトアビジンがコートされた磁性ビーズと共にカップリングバッファ（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％）条件で１時間培養した。培養の後、ｓｓＤＮＡのみを分離するために、１００μＬの１００ｍＭ ＮａＯＨと５分間培養し、外部磁石を用いて選別されたｓｓＤＮＡを得ることができた。
【００４７】
一番目に選別されたｓｓＤＮＡを用いて反復的に選別した。この際、厳しい選別のためにｓｓＤＮＡの量およびＴｒｏｐｏｎｉｎ Ｉの濃度を漸次減少させながら行った。反復選別で溶出したｓｓＤＮＡに対してＵＶ分光光度計（ＵＶスペクトロメーター、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ Ｌｉｂｒａ Ｓ２２ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）で濃度を測定し、残っているｓｓＤＮＡのＴｒｏｐｏｎｉｎ Ｉとの結合程度を確認しながら、選別過程を行った。その結果（％）を図５に示した。
【００４８】
具体的に、図５はアプタマーの選別過程で磁性ビーズに固定化されたタンパク質と結合するアプタマーの結合程度を示す。すなわち、入れたアプタマーの濃度による結合したアプタマーの濃度を計算し、これをパーセント（％）化した。図５から分かるように、各選別過程で順次結合するアプタマーＤＮＡが増加することを確認した。
【００４９】
<６−４>アプタマーの配列および構造分析
１２番目の反復選別されたｓｓＤＮＡは、変形していない５'プライマーと３'プライマーを用いてＰＣＲ過程によって増幅させ、ｐＥＮＴＲ／ＴＯＰＯベクター（ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）にクローニングした後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）に形質転換させた。ｓｓＤＮＡの挿入されたクローンをｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＧｅｎｅＡｌｌ、韓国）を用いて精製した後、塩基配列を分析（ＣＯＳＭＯ Ｇｅｎｅｔｅｃｈ、韓国）した。その結果、下記表１に示すように、配列番号１〜配列番号６で示されるｓｓＮＡ配列を分析することができた。
【００５０】
また、選別されたｓｓＤＮＡの構造的類似性を分析するために、Ｍｆｏｌｄプログラム（http://mfold.bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/dna-form1.cgi）を用いて２次構造を分析することができ、図６〜図８に示すように、連続的なＴ、Ｃ配列の反復によるｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ構造を共通的に含んでいることが分かった。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
実施例７：ＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を用いたタンパク質とアプタマーとの結合力の測定
ＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）は、金などの金属で現れる光−電子効果として、特定波長の光が金属に照射されると、大部分の光エネルギーが自由電子に転移される共鳴現象が起こる。その結果として、表面波が生ずるときに現れる現象をＳＰＲといい、金属と接合された試料の表面における物質組成の変化によって共鳴波長の移動を観察することにより、その結合力を測定することができる。Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉ、Ｔｒｏｐｏｎｉｎ複合体と結合するアプタマーとの結合力を測定するために、Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｎｉ−Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）がコートされている表面チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、スウェーデン）を用いてＳＰＲを測定することにより、その結合力を確認した。
【００５３】
Ｎｉ−ＮＴＡチップにＴｒｏｐｏｎｉｎ Ｉタンパク質（２００ｎＭ）を流し、結合したタンパク質にそれぞれのアプタマーＤＮＡを結合させた。ここで、アプタマーＤＮＡは２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ濃度で実験した。アプタマーの効率性を立証するために、市販の抗体（ａｂｃａｍ、英国）とｃａｒｄｉａｃ Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉとの結合力を前記と同様の方法で測定した結果、Ｋｄ値が２０．１ｎＭであって、本発明のアプタマーＫｄ値がさらに低いことを確認した。
【００５４】
前記ＳＰＲ結果およびＫｄ値を下記の図９〜図１５および下記表２に示した。
【００５５】
【表２】
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【００５６】
前記と同様の方法でトロポニン複合体とアプタマーが結合するか否かとその結合力を測定した。ここで、アプタマーＤＮＡは２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ濃度で実験した。その結果、トロポニン複合体の場合も、トロポニンＩアプタマーと効果的に結合することを確認したと共に、Ｋｄ値がトロポニンＩのみ結合するのと同様又はそれよりやや高く示されることを確認した。
【００５７】
前記ＳＰＲ結果およびＫｄ値を下記の図１６〜図２１および下記表３に示した。
【００５８】
【表３】
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【００５９】
前述した本発明の説明は例示のためのもので、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想または必須的な特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変更し得ることを理解することができるであろう。よって、上述した実施例はすべての面で例示的なもので、限定的なものではないと理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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