(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグノセルロース系バイオマスから得られた糖化液を酵母または細菌を使用して６炭糖からのエタノール生産を行わせながら、同時に不活性ガスを供給しながら２０℃〜３７℃でエタノールを除去し、その後５炭糖発酵菌による５炭糖からのエタノール生産を行わせることを特徴とするエタノール製造方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リグノセルロース系バイオマスを用いて、酵素と酵母または細菌によるエタノール製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
エタノールは、自動車用のガソリン燃料に添加できる理想的な燃料である。バイオマスから製造される99.4％以上の濃度のエタノールは、二酸化炭素の排出削減に直結するガソリン添加剤であるため、間伐材などの木質系バイオマスや稲わらなどの草本系バイオマスなどからのエタノール製造方法が求められている。現状では、エタノール製造のために使用されている原料は、サトウキビまたはビートなどの糖類やトウモロコシまたは他の食用作物の澱粉が主流である。これらの農業資源作物は非常に高価であるため、エタノールの大規模製造用の原料として使用することは難しい。
間伐材などの木質系バイオマスや稲わらなどの草本系バイオマスは、低価格で大量に入手できる再生可能な原料であるため低コストでのバイオエタノール生産の原料として期待される。これらバイオマスの成分はセルロースとヘミセルロースとリグニンである。これらバイオマスから酵素を用いて糖を得るためには、糖変換を行うときの阻害因子であるリグニンを除去するための前処理が不可欠である。そのため現状では、酵素を用いる変換方法でなく濃硫酸または希硫酸を用いたセルロース・ヘミセルロース分解糖化法が多く用いられている。しかし、硫酸法は、セルロース、ヘミセルロースの過分解が発生するため回収できる糖量が減少する。また，分解後にエタノール発酵を行うための硫酸除去処理すなわち硫酸の回収と糖液の中和工程を必要とし、水酸化カルシウムを用いた中和により石膏が副産物として生成し、その処理コストも掛かってしまう。また，回収した硫酸を再使用するための熱エネルギーを大量消費する濃縮工程が必要である。さらに硫酸法で処理された糖化液から完全に硫黄成分を除去できずに硫黄成分を含んだエタノールを製造してしまうことになる危険性もある。また、硫酸を用いるため機械の腐食などにより耐久性が短くなってしまう。（特許文献１）
【０００３】
硫酸法を用いずに木質系バイオマスからグルコースやキシロースなどの単糖を得る方法として、リグニンを効率よく除去する技術及び脱リグニン処理によって得られたセルロースとヘミセルロースの単糖への糖化技術の確立が必要である。脱リグニンにより得られたセルロースとヘミセルロースの糖化は、硫酸法と異なり温和な条件で行なえる酵素糖化が望ましい。さらに得られた糖は中和工程を経ることなく酵母や細菌を用いたエタノール発酵を行うことが出来る。また、酵素によって容易に分解が可能となったセルロースとヘミセルロースは、酵素と酵母や細菌と同時に反応させることにより簡便にエタノールを生産することが出来る。
【０００４】
リグノセルロース系バイオマスの糖化液には、グルコース、マンノース、ガラクトースなどの６炭糖とキシロース、アラビノースなどの５炭糖が含まれる。エタノールを効率よく得るためには、６炭糖、５炭糖をすべて変換することが必要である。
【０００５】
しかし、エタノール生産に使用される酵母は、６炭糖はエタノールに変換できるが、５炭糖を変換することは困難である。
【０００６】
近年、遺伝子組換え技術により、５炭糖からエタノール生産可能な微生物が作られている。例えば、大腸菌やその他の細菌にエタノール変換遺伝子を組み入れ、５炭糖、６炭糖からエタノールを生産できる菌。（特許文献２および３）
【０００７】
しかし、これら遺伝子組み換え菌は、自然界に存在しない菌であるため、工場でエタノール生産を行わせる場合、多くの制約を生じる。例えば、発酵タンクから絶対に漏出しないようにするために気密性の高い設備にする必要がある。また、漏出した場合に備えた付随装置も必要となる。さら、発酵終了時には、完全に殺菌して廃棄しなければならないなどコスト高の要因となる。
【０００８】
また、細菌は、エタノール耐性が低いため高濃度のエタノールを産生することができない。従って、遺伝子組み換え菌で５％以上の高濃度のエタノールを生産させることは困難である。
【特許文献１】特開平11-169188号公報
【特許文献２】特開平5-502366号公報
【特許文献３】特開平6-504436号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで本発明では、リグノセルロース系バイオマスの糖化液を１次発酵で６炭糖からエタノールを生産させながら、同時に不活性ガスを供給しながら産生したエタノールを除去し、６炭糖が無くなってから、自然界より得られた５炭糖発酵酵母を使用して２次発酵で５炭糖からエタノールを生産させる技術を用いたエタノール生産方法を開発することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは前記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、１次発酵で６炭糖からエタノールを生産できる菌を使用して発酵させながら、同時に不活性ガスを供給して産生したエタノールを除去する工程と、前記１段目の工程によって得られた発酵液を菌体の分離をすることなく、５炭糖からエタノールを生産できる菌を使用して２次発酵させながら５炭糖からエタノールを効率良く高濃度で生産できることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて完成したものである。
【００１１】
リグノセルロース系バイオマスの加水分解は、従来から公知の酸加水分解法やアルカリ加水分解法用いることができる。最も好ましいのは、微粉砕されたリグノセルロースを酵素を使用して加水分解するのが良い。粉砕は、リグノセルロース系バイオマスを適切なサイズに粉砕する工程においては、振動式ボールミルあるいはロッドミル，高衝撃力が付加できるミルを用いて１００ミクロン以下、好ましくは５０ミクロン以下まで微粉砕を行なう。
【００１２】
加水分解は、微粉砕された木質系バイオマス原料溶液（５〜３０重量％）にセルラーゼ酵素を０．１〜２０重量％になるように添加して行わせる。
【００１３】
セルロースとヘミセルロースは、グルコースやマンノースなどの６炭糖とキシロース、アラビノースなどの５炭糖で構成されているため、酵素剤は、これらの糖を効率良く生産することが求められる。従って、前記目的を達成するために、複数の酵素剤を用いる場合もある。
【００１４】
１次発酵は、得られた糖化液を使用する。本工程では、酵母や細菌によってエタノールを生産させる。使用する菌は、公知のものを使用できるが、その中でも、サッカロマイセス  セルビシエ(Saccharomyces cerviseae)などが好ましい。酵母は、エタノール耐性が高いため５％以上の濃度のエタノールを生産することができる。
【００１５】
発酵中に産生したエタノールは、発酵中に供給された不活性ガスにより除去されるため、６炭糖が全て変換された時点で発酵液中には、エタノールは溶存していない。また、不活性ガスにより除去されたエタノールは、冷却することにより回収される。ここで使用する不活性ガスは、窒素や二酸化炭素などで好ましくは、発酵中に産生する二酸化炭素を使用することが好ましい。
【００１６】
２次発酵は、１次発酵で得られた発酵液を使用する。本工程では、酵母や細菌によってエタノールを生産させる。使用する菌は、公知のものを使用できるが、その中でも、ピキア  スティピティス(Pichia stipitis)などが好ましい。本酵母は、自然界より分離された５炭糖からエタノールを生産できる菌であり、遺伝子組換え菌のような制約を受けることはない。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、木質系バイオマスと草本系バイオマスなどのようなリグノセルロース系バイオマスの糖化液からの高濃度エタノール製造が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
リグノセルロース系バイオマスを、振動式ボールミルやロッドミル，あるいは高衝撃力を付加できるミルを用いることにより１００ミクロン以下、好ましくは５０ミクロン以下まで微粉砕することができる。
【００１９】
前記の処理によって得られたリグノセルロース系バイオマス微粉砕物原料溶液（５〜３０重量％）にセルラーゼ酵素を０．１〜２０重量％になるように添加し加水分解を行わせる。pH5.0〜pH7.0好ましくはpH5.5、温度は３０℃〜５０℃、好ましくは、３７℃で行なわれる。２日程度の反応で加水分解が行われる。
【００２０】
リグノセルロース系バイオマスの微粉砕物の加水分解に用いる酵素は、比較的安価な市販のものでよく、メイセラーゼ（明治製菓株式会社）、ドリセラーゼ（協和発酵株式会社）、Ａｍａｎｏ  ＡあるいはＴ（アマノエンザイム株式会社）を用いることができる。酵素剤の使用は、単独もしくは組み合わせることにより生成する糖に違いがある場合もあるため、原料によって最適な使用方法がある。さらに原料により使用する酵素量も違うため、０．１〜２０重量％の範囲で最適な量を使用すれば良い。
【００２１】
前記の反応液において、セルラーゼの活性を高く維持するためにはｐＨ（水素イオン濃度）をｐＨ５．０前後にすることが望ましい。このためには、０．１モル/リットル程度の酢酸緩衝液を用いてｐＨを維持することが出来る。
【００２２】
１次発酵は、回分発酵により行うことが出来る。使用する菌は、サッカロマイセス  セルビシエ(Saccharomyces cerviseae)を用いることが好ましい。発酵はpH5.0〜pH7.0好ましくはpH6.5、温度は２０℃〜３７℃、好ましくは、２８℃〜３０℃で行なわせる。発酵中に不活性ガスを発酵液の下部より供給する。使用する不活性ガスは、窒素や二酸化炭素を使用できるが、好ましくは、二酸化炭素が良い。供給量は、0.01  vvm〜0.5vvmで好ましくは0.05vvmが良い。
【００２３】
２次発酵は、回分発酵により行うことが出来る。ここでは、１次発酵で得られた発酵液をそのまま使用することができる。使用する菌は、ピキア  スティピティス(Pichia stipitis)を用いることが好ましい。発酵はpH5.0〜pH7.0好ましくはpH6.5、温度は２０℃〜３７℃、好ましくは、２８℃〜３０℃で行なわせる。
以下、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
２種類の酵母を用いた同時混合発酵によるグルコース・キシロースからのバイオエタノール生産
グルコース40(g/L)、キシロース(16g/L)を含む混合培地及びグルコース70(g/L)、キシロース35(g/L)を含む混合培地におけるP. stipitis とS. cerviseae の同時混合発酵法によるバイオエタノール生産を行った。図１にグルコース40(g/L)、キシロース(16g/L)を含む混合培地を用いた時の経時変化を示した。混合発酵では、発酵速度は、S.cereviseae単独発酵と同じであるが、エタノール生産量は、混合発酵のほうが多くなった。これは、S.cereviseaeによるグルコースからのバイオエタノール生産の後にP. stipitisによるキシロースからのバイオエタノール生産が行われたことによる。また、P. stipitis単独での発酵では、発酵速度が混合発酵よりも遅く、発酵時間も長くなった。従って、グルコース40(g/L)、キシロース(16g/L)の糖濃度では、混合発酵を用いたほうが発酵速度とバイオエタノール収率を高くすることができるため低コスト生産に有利である。次に、図２にグルコース70(g/L)、キシロース35(g/L)を含む混合培地を用いた時の経時変化を示した。発酵速度は、混合発酵とS.cereviseae単独発酵で同じであったが、最終バイオエタノール生産量は、どちらも同じであった。この時の濃度はP. stipitis単独による発酵の時で同じであった。すなわち、混合発酵では、P. stipitisによるキシロースからのバイオエタノール生産が行われなかったことに起因するものである。以上のことより、P. stipitisはアルコール濃度３％で発酵阻害を起こすことが推察された。
【実施例２】
【００２５】
P. stipitisのS. cerevisiae 発酵液を用いたエタノール生産に及ぼす初発エタノール濃度の影響
グルコース、キシロース混合培地でのS.cereviseae発酵液にP.stipitisを植菌した時のエタノール生産に及ぼすエタノール濃度の影響を検討した。発酵液中に産生エタノールが含有された発酵液では、P.stipitisは、3.6%(w/v)のエタノール濃度では、エタノール収率が理論値の18%と発酵が阻害された。合成培地での試験より阻害率が高いことより、エタノール以外の発酵代謝産物による相乗効果が推察された。一方、S.cereviseae発酵液からエタノールを除去したのち、P. stipitis  SS39-1で発酵を行わせたところ、発酵阻害を受けることなくエタノールを生産することができた(図３)。この結果より、２種類の酵母を用いてグルコース、キシロースの混合した培地から高濃度のバイオエタノールを生産するには、はじめにS.cereviseaeを用いてグルコースから高濃度のバイオエタノール生産を行わせ、得られた発酵液からエタノールを取り除き、引き続き、P. stipitisを用いてキシロースからバイオエタノールを生産されることにより効率よくバイオエタノールを得ることができると推察された。
【実施例３】
【００２６】
グルコース、キシロースの入った合成培地によるエタノール生産試験
培地は、前培養用培地（酵母エキス 1%,  ポリペプトン 2%、グルコース2%、キシロース 2%）、キシロース発酵用培地（酵母エキス 1%,  ポリペプトン 2%、キシロース 2〜15%、グルコース2〜15%）を用いた。発酵は以下の方法で行った。すなわち、前培養で得られたS. cerviseaeを、無菌的に集菌・洗浄し、100mlの発酵用培地の入った500mlガス洗浄ビンで２８℃,80rpmで発酵を行った。この時に同時に二酸化炭素ガスを0.04vvmで下部より供給した。グルコース濃度が検出されなくなった時点で、１段階目の発酵が終了した時点で、500ml三角フラスコに移し替え、前培養で得られたP. stipitisを植菌し２８℃,80rpmの振盪発酵を行った。比較試験として、ガスを供給せずにエタノールを除去しない試験も行った。
【００２７】
表１にそれぞれの糖濃度でのエタノール生産について結果を示した。試験区１のグルコース濃度が40(g/L)の場合は、１段階目の発酵終了時にエタノールを除去しなくてもキシロースからエタノールが産生された。しかし、試験区２以下では、グルコース濃度が高くなるにつれて、１段階目の発酵時にエタノールを除去したほうが、  P. stipitis SS39-1による２段階目のキシロースからのエタノール生産がおこなわれることが判明した。図５に、エタノールを除去した際の２段階発酵法の経時変化、図６にエタノール除去を行わなかった場合の２段階発酵法の経時変化を示した。図６では、エタノールが5.8%(w/v)含有している場合には、  P. stipitis SS39-1によるエタノール生産が阻害されるが、図５では、エタノールを除去することによりキシロースからのエタノール生産が行われていることがわかる。従って、本方法によりグルコース、キシロース混合培地で効率よくバイオエタノールを生産することができる。
【００２８】
【表１】
0005504397.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】グルコース40(g/L)、キシロース(16g/L)を含む混合培地でエタノール生産を行わせた時の経時変化
【図２】グルコース70(g/L)、キシロース(35g/L)を含む混合培地でエタノール生産を行わせた時の経時変化
【図３】P. stipitisのS. cerevisiae 発酵液を用いたエタノール生産に及ぼす初発エタノール濃度の影響
【図４】グルコース、キシロースの入った合成培地によるエタノール生産試験      １次発酵時にエタノールを除去しながら発酵を行わせた時の経時変化
【図５】グルコース、キシロースの入った合成培地によるエタノール生産試験      １次発酵時にエタノールせずに発酵を行わせた時の経時変化
【図１】
0005504397.tif 000003
【図２】
0005504397.tif 000004
【図３】
0005504397.tif 000005
【図４】
0005504397.tif 000006
【図５】
0005504397.tif 000007