(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シュードザイマ・フベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株（FERM P-20987)またはシュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）KM-160株（FERM P-21481）をグルコースまたはグリセロールを炭素源として含有し、かつ油脂を含有しない培地にて培養し、培養物中から4-O-β-D-マンノピラノシル-(2R, 3S)-エリスリトールまたは4-O-β-D-マンノピラノシル-(2S, 3R)-エリスリトールを採取することを特徴とする、マンノシルエリスリトール異性体の製造方法であって、培養開始時の培養液中のグルコースまたはグリセロール濃度が１０〜２０重量％である、上記製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シュードザイマ属に属する微生物を利用し、植物油脂やバイオマス資源などを利用した物質・エネルギー生産系において副生される安価な物質を原料として付加価値の高いマンノシルエリスリトール異性体を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マンノシルエリスリトールは、保湿作用が強く、化粧品、医薬品の成分として有用なものとして知られている。マンノシルエリスリトールの生産方法としては、マンノピラノシルグルコースを出発材料として４−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−Ｄ−エリスリトールを化学的に合成する方法が知られているが、この方法は多段階の反応から成るので非効率的である（例えば、非特許文献１を参照）。その他に、糖脂質の一種であるマンノシルエリスリトールリピッドを加水分解して製造する方法も知られているが、この方法は高機能糖脂質であるマンノシルエリスリトールリピッドを消費することに加え、培養プロセスと化学プロセスから成る工程を経る必要がある。これに対し、微生物を利用した培養プロセスのみから成るマンノシルエリスリトール生産方法は、実プロセスに最も適した手法であり、これまでグルコースを炭素源とする培地中で黒穂病菌（Ustilago sp．PRL627)を培養して生産する例（非特許文献２）や糖及び／又は糖アルコールを炭素源とする培地中でキャンディダ属菌(Candida sp.S-10)を培養して生産する例（特許文献１）などが報告される。このような微生物を利用した培養プロセスでは、微生物培養条件の最適化によるマンノシルエリスリトールの生産効率（生産速度、対原料収率、及び収率）の向上が試みられている。しかし、いずれの方法も、炭素源として糖または糖アルコールを含有する培地を用いて微生物を培養してマンノシルエリスリトールを生産するものであり、対糖収率が十分ではなく、特に、糖アルコールは原料コストがかかる。また、培養スケール拡大の生産効率に対する影響についても何ら検討されていない。
【０００３】
また、マンノシルエリスリトールには二つの異性体（4-O-β-D-マンノピラノシル-(2S, 3R)-エリスリトールおよび4-O-β-D-マンノピラノシル-(2R, 3S)-エリスリトール）が存在するが、上記の化学的合成方法は4-O-β-D-マンノピラノシル-(2S, 3R)-エリスリトールを製造する方法であり、また微生物培養による製造方法で得られたマンノシルエリスリトールはこれら異性体の混合物であり、その区別も全くされていない。
【０００４】
一方、近年、地球環境問題解決のために石油代替・再生産可能資源である植物油脂原料を活用した技術、事業に注目が集まっている。植物油脂原料からの物質生産は京都議定書に示された規定においても、二酸化炭素の排出量がゼロカウントとされている。しかし、植物油脂原料の利用に伴い、グリセロールが副生するため、その有効活用が急務の課題となっている。例えば、バイオディーゼル燃料は、一般的に植物油をメチルエステル化し、ディーゼル機関用燃料としたものであるが（例えば、特許文献２、３を参照）、副産物としてグリセロールが生じる。バイオディーゼル燃料利用において、このグリセロールなどの有効利用は今後の課題となっている。これまでグリセロールの利用技術としては、例えば、１，３−プロパンジオール（例えば、非特許文献３、特許文献４を参照）やコハク酸（例えば、非特許文献４、特許文献５を参照）をグリセロールから微生物転換によって製造する方法が提案されており、これらの技術は、グリセロールから新しい機能性物質や、多種の有用製品へ変換可能な基幹化合物を生産するという点で有効なグリセロールの利用技術といえる。このように、グリセロールは植物油脂利用の副生成物として生じるため、安価な原料であり、今後ますます積極的なグリセロールの利用技術の開発が進められてくることが予想される。
【０００５】
また、二酸化炭素の排出量の削減には、化石燃料からバイオマスエネルギーへの転換が進められ、なかでも建設廃木材、古紙等の木質系バイオマスは供給量が最も多く、代表的なバイオマス資源である。たとえば木質系バイオマスから生産されるグルコースを原料としてエタノール（バイオエタノール）を製造する技術があるが、グルコースはエタノールのみならず、新しい機能性物質生産の原料としての利用が期待される。
【０００６】
【特許文献１】特開昭６３−６３３９０号公報
【特許文献２】特開２００２−２３３３９３号公報
【特許文献３】特開２００５−２２０２２７号公報
【特許文献４】特開２００３−５０７０２２号公報
【特許文献５】特開２００５−２１１０４１号公報
【非特許文献１】P．A．J．Gorin et al.：Can．J．Chem., 39, 2474（1961)
【非特許文献２】B．Boothroyd et al.：Can．J．Biochem．Physiol., 34，10（1951)
【非特許文献３】Th.．Willke，K．-D．Vorlop： Appl．Microbiol．Biotechnol., 66，131（2004)
【非特許文献４】C．L．Pyung，G．L．Woo，Y．L．Sang，N．C．Ho：Biotechnol．Bioeng., 72，41（2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のように、従来のマンノシルエリスリトールの製造方法では、マンノシルエリスリトールは、一つの異性体のみか、または二つの異性体の混合物としてしか得ることはできなかった。また、植物油脂やバイオマス資源を利用した物質・エネルギー生産系において副生され、安価な物質を有効利用することが望まれていた。
【０００８】
従って、本発明の課題は、マンノシルエリスリトールの各異性体を生産する能力を有する微生物を探索し、これを用いて、マンノシルエリスリトールの各異性体を効率的かつ選択的に製造する方法を提供することにある。また、本発明のさらなる課題は、マンノシルエリスリトールの製造における原料コストを低減することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、シュードザイマ属に属する微生物の中に、グルコースまたはグリセロールからマンノシルエリスリトール異性体それぞれを多量に産生できる微生物を見出し、本発明を完成した。
【００１０】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
(1)  シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物をグルコースまたはグリセロールを炭素源として含有する培地にて培養し、培養物中からマンノシルエリスリトール異性体を採取することを特徴とする、マンノシルエリスリトール異性体の製造方法。
(2)  マンノシルエリスリトール異性体が、4-O-β-D-マンノピラノシル-(2R, 3S)-エリスリトールまたは4-O-β-D-マンノピラノシル-(2S, 3R)-エリスリトールである、(1)に記載のマンノシルエリスリトール異性体の製造方法。
(3)  シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物が、シュードザイマ・フベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）に属する菌株であることを特徴とする、(1)に記載のマンノシルエリスリトール異性体の製造方法。
【００１１】
(4)  シュードザイマ・フベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）に属する菌株が、シュードザイマ・フベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株（FERM P-20987)である、(3)に記載のマンノシルエリスリトール異性体の製造方法。
(5)  シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物が、シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）に属する菌株であることを特徴とする、(1)に記載のマンノシルエリスリトール異性体の製造方法。
(6)  シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）に属する菌株が、シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）KM-160株（FERM P-21481）である、(5)に記載のマンノシルエリスリトール異性体の製造方法。
【００１２】
(7)  培養開始時の培養液中のグルコースまたはグリセロール濃度が、５〜２０重量％であることを特徴とする、(1)〜(6)のいずれかに記載のマンノシルエリスリトール異性体の製造方法。
(8)  シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）KM-160株（FERM P-21481）。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法によれば、シュードザイマ属に属する微生物を利用して安価なグルコースまたはグリセロールからマンノシルエリスリトールを高い生産効率で製造することができる。また、本発明に用いるシュードザイマ属に属する微生物は、マンノシルエリスリトールの各異性体を混合物でなくそれぞれを個別に生産することができるので、使用目的などに応じて、マンノシルエリスリトールの各異性体を選択的に製造することもできる。また、本発明は、バイオディーゼル燃料の製造に伴って増加しつつある、副産物としてのグリセロールを有効利用して、化粧品や医薬品の機能的成分として有用なマンノシルエリスリトールを量産できる点で、特に画期的である。さらに、マンノシルエリスリトールは小腸の微鞭毛に局在するα−グルコシダーゼの分解を受けず、ノンカロリーである点で食品添加物として有用であり、この面でも、マンノシルエリスリトールの量産を可能にする本発明の技術的意義は大きい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．目的生産物
本発明のマンノシルエリスリトール異性体の製造方法による生産されるマンノシルエリスリトール（ＭＥ）は、下記式(I)で表される4-O-β-D-マンノピラノシル-(2S, 3R)- エリスリトール（以下、ＭＥ−Ａという場合がある。）または下記式（II）で表される4-O-β-D-マンノピラノシル-(2R, 3S)-エリスリトール（以下、ＭＥ−Ｂという場合がある。）の２種のマンノシルエリスリトール異性体である。
【００１５】
【化１】
0005418999.tif 000002
【００１６】
【化２】
0005418999.tif 000003
【００１７】
従来の微生物学的製造法においては、マンノシルエリスリトールはこれら異性体の混合物として得られていたが、本発明においては、これら異性体の一方を選択的に製造できる。
【００１８】
２．使用微生物
本発明のマンノシルエリスリトールの製造に使用する微生物は、シュードザイマ属に属し、グルコースまたはグリセロールのいずれからでもマンノシルエリスリトールを生産する能力を有する微生物であれば特に限定はされないが、たとえば、シュードザイマ・フベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）に属する菌株またはシュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）に属する菌株が好ましい。シュードザイマ・フベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）に属する菌株としては、具体的には、シュードザイマ・フベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis） KM-59株（FERM P-20987)が挙げられ、シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）に属する菌株としては、具体的には、シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）KM-160株が挙げられる。
【００１９】
シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）KM-160株は、本発明者らが日本で採取した植物（葉）サンプルから分離した株である。本菌株は、ＹＭ寒天培地上にて２５℃８日間培養で、直径が５〜１０ｍｍ程度のコロニーを形成する（形：円形、隆起状態：扁平状、周縁：全縁、表面の形状：スムーズ、透明度：不透明、粘ちょう度：バター様）。また、子嚢胞子の形成は認められない。
【００２０】
また、本菌株の26S rDNAの塩基配列を決定し、DNAデータベース(DDBJ)にアクセスして、FASTAプログラムを用いて、26S rDNAの塩基配列の相同性検索を行った結果、シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis） およびウスチラゴ・スペルモホラ (Ustilago spermophora)と本菌株の26S rDNA の相同性は100％ であった。形態観察および生理性状試験の結果、本菌株はシュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）に帰属された。本菌株は、平成19（2007）年12月26日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（IPOD）（茨城県つくば市東１−１−３）に受託番号FERM P-21481として寄託されている。
【００２１】
シュードザイマ・フベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis） KM-59株（FERM P-20987)は、グルコースまたはグリセロールを基質としてＭＥ−Ａを、一方、シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）KM-160株は、グルコースまたはグリセロールを基質としてＭＥ−Ｂを高効率で生産できる。
【００２２】
上記のシュードザイマ・フベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）及びシュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）に属する菌株の培地、培地条件は同様であり、同様の培地、培養条件でＭＥ−ＡまたはＭＥ−Ｂを生産することができる。したがって、本発明によれば、本質的に培地、培養条件を基本的に変更することなく、上記の菌株を培養することにより、マンノシルエリスリトールの各異性体（ＭＥ―ＡまたはＭＥ−Ｂ）のいずれかを選択的に生産することが可能である。
【００２３】
３．マンノシルエリスリトールの製造
上記微生物菌株をグルコースまたはグリセロールを含む培地にて培養することにより培養物中に前記式(I)または(II)で表されるマンノシルエリスリトールの各異性体、すなわちＭＥ−ＡまたはＭＥ−Ｂを生産することができる。
【００２４】
上記培養に用いる培地には、グルコースまたはグリセロールを微生物の炭素源及び基質として含有させるが、このほかの条件については、特に制限はなく、適宜選定することができる。例えば、酵母に対して一般に用いられる培地を使用でき、このような培地として、例えば、ＹＰＤ培地（イーストイクストラクト１０ｇ、 ポリペプトン２０ｇ、及びグルコース１００ｇ）を挙げることができる。
【００２５】
また、上記の炭素源以外に、通常の酵母の培養において栄養源なる炭素源、たとえば、有機酸（酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸等）を用いてもよい。
【００２６】
マンノシルエリスリトールの生産量を増加させるためには原料であるグルコースまたはグリセロールの供給量を増加させることが好ましい。これは、原料であるグルコースまたはグリセロールを酵母が基礎代謝のために炭素源として利用するため、基礎代謝に必要な炭素源の供給を十分行う必要があるためと考えられる。良好なマンノシルエリスリトールの生産速度、生産量、及び収率を得る上で、培養開始時の培養液中のグルコースまたはグリセロール濃度は５〜３０重量％、好ましくは１０〜２０重量％である。
【００２７】
培地に添加する上記の炭素源以外の他の成分としては、当該技術分野で通常用いられる窒素源、無機塩類、及び必要な栄養源等が用いられる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、またはペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、コーンスチープリカー等の含窒素化合物が用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、硝酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００２８】
培養温度は、２２〜２８℃が好ましく、２５℃が特に好ましい。培養日数としては、マンノシルエリスリトール生産量に応じて適宜設定すればよいが、３〜２０日間が好ましい。培養方法としては、振盪培養、通気撹拌培養等の公知の一般的な微生物の培養方法を適用することができる。良好な微生物の生育及びマンノシルエリスリトールの生産のためには、培養液に酸素を供給することが好ましく、そのためには、ジャーファメンターを用いる場合では、空気を通気しながら撹拌するか、振とう培養を行えばよい。
【００２９】
上記菌株を用いてマンノシルエリスリトールをさらに大量に生産するための培地または培養条件については、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば、種培養、本培養及びマンノシルエリスリトール生産培養の順にスケールアップしていくことが好ましい。
【００３０】
これらの培養における、具体的な培地組成、培養条件を例示すると以下のとおりである。
(1)種培養；グルコース５０〜２００ｇ／Ｌ、好ましくは１００ｇ／Ｌ、酵母エキス０．５〜２ｇ／Ｌ、好ましくは１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１〜５ｇ／Ｌ、好ましくは３ｇ／Ｌリン酸２水素カリウム０．１〜１ｇ／Ｌ、好ましくは０．２５〜０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．１〜１ｇ／Ｌ、好ましくは０．２５〜０．５／Ｌの組成の液体培地２ｍＬが入った試験管に保存菌株を１白金耳接種し、２２〜２８℃で１〜３日間振とう培養を行う。 
【００３１】
(2)本培養；グルコースまたはグリセロール５０〜３００ｇ／Ｌ、好ましくは１００〜２００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは１００ｇ／Ｌ、酵母エキス１〜６ｇ／Ｌ、好ましくは３〜６ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１〜５ｇ／Ｌ、好ましくは３ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．１〜１ｇ／Ｌ、好ましくは０．２５〜０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．１〜１ｇ／Ｌ、好ましくは０．２５〜０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地２０〜３０ｍＬが入った坂口フラスコに上記の種培養を行った培養液を接種して、２２〜２８℃で１〜１０日間振とう培養を行う。
【００３２】
(3)マンノシルエリスリトール生産培養；グルコースまたはグリセロール５０〜２００ｇ／Ｌ、好ましくは１００ｇ／Ｌ、酵母エキス１〜６ｇ／Ｌ、好ましくは３〜６ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１〜５ｇ／Ｌ、好ましくは３ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．１〜１ｇ／Ｌ、好ましくは０．２５〜０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．１〜１ｇ／Ｌ、好ましくは０．２５〜０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地１．０Ｌが入ったジャーファメンターに上記の本培養を行った培養液を接種して、２２〜２８℃で６００〜１０００ｒｐｍの撹拌速度で３〜２０日間培養する。この培養においては、培養途中からグルコースまたはグリセロールを培養容器中に流下させて、培地中のグルコースまたはグリセロール濃度を５０〜２００ｇ／Ｌ、好ましくは１００ｇ／Ｌに保持することが好ましい。
【００３３】
微生物菌株の培地への使用量は、例えば、菌体を接種する場合、培地１Ｌあたり、１０〜２００ｍl、好ましくは５０〜１００ｍlの種培養液あるいは本培養液中に含まれる量であればよい。
【００３４】
本発明における培養は、培養液中の所望のマンノシルエリスリトール生成量が最高に達した時点で終了させることができるように、培養液中の目的とするマンノシルエリスリトールをガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等の周知の方法により測定しながら行うことが好ましい。
【００３５】
培養液中に蓄積されたマンノシルエリスリトールの各異性体、すなわちＭＥ−ＡまたはＭＥ−Ｂを採取するには、培養液から遠心分離等の手段で菌体を除去した後、抽出、ゲル濾過、濃縮等の定法に従って精製すればよく、菌株の相違により精製手段に特段の違いはなく、これらにより、マンノシルエリスリトールの各異性体を効率よく生産することができる。
【００３６】
上記培養において、微生物の形態は、特に限定されず、微生物の菌体、菌体処理物（例えば、菌体破砕物）などをいう。
【００３７】
微生物の菌体または菌体処理物は固定化して用いることもできる。固定化法としては、従来公知の担体結合法、架橋化法、包括法などの方法が挙げられる。担体結合法では、担体に菌体を固定化させるが、固定化は物理的吸着、イオン結合、共有結合のいずれであってもよい。担体としては多糖（アセチルセルロース、アガロース）、無機物質（多孔質ガラス、金属酸化物）、合成高分子（ポリアクリルアミド、ポリスチレン）等が用いられる。架橋化法では、グルタルアルデヒド等の二官能性試薬を用いて菌体同士を架橋、結合させることによって固定化する。また、包括法では、多糖（アルギン酸、カラギーナン）、ポリアクリルアミド、コラーゲン、ポリウレタン等の高分子ゲルの格子や半透膜カプセルに菌体を包み込むことによって固定化する。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３９】
（実施例１）マンノシルエリスリトールを生産する微生物の探索
保存培地（麦芽エキス３ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌグルコース１０ｇ／Ｌ、寒天３０ｇ／Ｌ）に保存しておいた数種のシュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物を用いて以下の培養を行った。
【００４０】
（培養Ａ）
上記微生物をグルコース１００ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム３ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．２５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．２５ｇ／Ｌの組成の液体培地２ｍＬが入った試験管に１白金耳接種し、２５℃で振とう培養を２日間行った。
【００４１】
（培養Ｂ）
次いで、菌体培養液をグルコース１００ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム ０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地２０ｍＬが入った坂口フラスコに接種して、２５℃で振とう培養を７日間行った。
【００４２】
培養Ｂで得られた菌体培養液を遠心分離し、その培養上清をペーパークロマトグラフィーに供した。ペーパークロマトグラフィーは、1−プロパノール：酢酸エチル：水＝７：１：２を展開溶媒として用い、過ヨウ素酸カリウムおよび硫酸マンガン−テトラベース試薬（依田：日本化学雑誌、７３、１８（１９５２））にて生じる糖成分のスポットを観察した。また、標準として用いたマンノシルエリスリトールは、マンノシルエリスリトールリピッドを加水分解して得られたマンノシルエリスリトールを用いた。これらの結果を図１に示す。
【００４３】
図１に示されるように、シュードザイマ・フベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株とシュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）KM-160株はマンノシルエリスリトールに相当するスポットが検出された（レーン１０、１４）。この結果は、シュードザイマ・フベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株とシュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）KM-160株は、グルコースを炭素源とする培地で培養することによって、マンノシルエリスリトールを生産可能であることを示す。
【００４４】
（実施例２）マンノシルエリスリトール高生産菌のマンノシルエリスリトール生産量
シュードザイマ・フベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株（FERM P-20987)とシュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）KM-160株（FERM P-21481)を用いて、培養Ｂの培養を７日間に代えて１０日間行う以外は実施例１と同様にして培養Ａ、培養Ｂを行った。培養液を採取し、培養液中に含まれるマンノシルエリスリトールの濃度を高速液体クロマトグラフィーにて定量した。高速液体クロマトグラフィーは、ＳＨ１０１１カラム（昭和電工製）を用い、０．０１ｍＭの硫酸を移動相として行った。高速液体クロマトグラフィーの結果のチャートを図２に示す。マンノシルエリスリトール、マンノース、エリスリトール、グルコース量は、それぞれ標品を用いて作成した検量線に基づいて定量した。シュードザイマ・フベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株は１０日間で１８．７ｇ/Ｌのマンノシルエリスリトールを生産し、シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）KM-160株は１０日間で１１．８ｇ/Ｌのマンノシルエリスリトールを生産した。
【００４５】
（実施例３）グリセロールを炭素源としたマンノシルエリスリトールの生産
シュードザイマ・フベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株（FERM P-20987)とシュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）KM-160株（FERM P-21481)を用い、培養Ｂの液体培地中のグルコース１００ｇ／Ｌに代えてグリセロール１００ｇ／Ｌを用いる以外は実施例１と同様にして培養Ａを２日間行った後、培養Ｂを７日間行った。得られた菌体培養液を遠心分離し、その培養上清をフィルターろ過後、高速液体クロマトグラフィーにて分析定量した。高速液体クロマトグラフィーの結果のチャートを図３に示す。マンノシルエリスリトール、マンノース、エリスリトール、グリセロール量は、それぞれ標品を用いて作成した検量線に基づいて定量した。図３に示されるように、シュードザイマ・フベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株およびシュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）KM-160株は、グリセロールを炭素源として、マンノシルエリスリトールを生産することが明らかである。
【００４６】
（実施例４）マンノシルエリスリトールの分離精製および構造解析
シュードザイマ・フベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株（FERM P-20987)を用いて、実施例１と同様にして培養Ａを２日間行った後、培養Ｂを７日間行った。得られた菌体培養液をゲル濾過カラムクロマトグラフィーに供し、マンノシルエリスリトールの単離精製を行った。当該カラムクロマトグラフィーは、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−２を１．５ｃｍ×９０ｃｍのカラムに充填したものを用い、培養液３ｍＬをアプライした後、蒸留水を流速１０ｍＬ/ｈで流し、溶出してきた画分を分取して行った。糖成分の溶出は、糖濃度計を用いて測定した。当該カラムクロマトグラフィーの結果を図４に示す。図４に示されるように、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーによって、培地中に含まれる糖成分が分画された。各画分を高速液体クロマトグラフィー分析に供した結果、溶出ピークＡはマンノシルエリスリトール、溶出ピークＢはグルコースであることがわかった。
【００４７】
また、シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）KM-160株（FERM P-21481)を用いて、実施例１と同様にして培養Ａを２日間行った後、培養Ｂを７日間行った。得られた菌体培養液を活性炭カラムクロマトグラフィーに供し、マンノシルエリスリトールの単離精製を行った。当該カラムクロマトグラフィーは、２．３ｃｍ×７ｃｍのカラムに充填したものを用い、培養液１ｍＬをアプライした後、蒸留水を流速５０ｍＬ/ｈで１００ｍＬ流した後、１％エタノールを流速５０ｍＬ/ｈで１００ｍＬ流すことで行った。各画分の高速液体クロマトグラフィーチャートを図５に示す。図５に示されるように、蒸留水溶出画分にはマンノシルエリスリトールが含まれず、エタノール溶出画分に濃縮された。
【００４８】
上記の各分画操作で得られた画分のうち、図４の抽出ピークＡ周辺の画分を分取した試料と図５のエタノール溶出画分からエタノールを減圧濃縮によって除いた後の試料を用い、ＮＭＲ分析にて含有される糖成分の構造を決定した。その結果をそれぞれ表１および表２に示す。
【００４９】
【表１】
0005418999.tif 000004
【００５０】
【表２】
0005418999.tif 000005
【００５１】
これらの結果より、得られた糖成分は何れもマンノシルエリスリトールであることが確認できた。さらに、エリスリトール部の１Ｈ−ＮＭＲの結果（D．Crich et al.：Tetrahedron, 58, 35 (2002))から、シュードザイマ・フベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株由来のマンノシルエリスリトールはＭＥ−Ａ（4-O-β-D-マンノピラノシル-(2S, 3R)-エリスリトール）、シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）KM-160株由来のマンノシルエリスリトールはＭＥ−Ｂ（4-O-β-D-マンノピラノシル-(2R, 3S)-エリスリトール）であることがわかった。このことから、上記２種の微生物を使い分けることで、マンノシルエリスリトールの構造異性体を選択的に生産することが可能であるといえる。
【００５２】
（実施例５）シュードザイマ・フベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株のマンノシルエリスリトール生産条件の検討
(1) 条件１
シュードザイマ・フベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株（FERM P-20987)を用いて、実施例１と同様にして培養Ａを２日間行った後、培養Ｂを、グルコース１００ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム３ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム ０．２５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．２５ｇ／Ｌの組成の液体培地を用いて８日間行った。培養の３、６、８日後に培養液を分取し、培養液中に含まれる菌体量（乾燥重量, ｇ／Ｌ）、残存グルコース濃度（ｇ／Ｌ）、マンノシルエリスリトール濃度を測定した。その結果を図６に示す。図６に示されるように、KM-59株は、１７ｇ／Ｌのマンノシルエリスリトールを培地中に蓄積し、対糖収率は１７％であった。
【００５３】
(2) 条件２
シュードザイマ・フベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株（FERM P-20987)を用いて、実施例１と同様にして培養Ａを２日間行った後、培養Ｂを、グルコース２００ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム３ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム ０．２５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．２５ｇ／Ｌの組成の液体培地を用いて１０日間行った。培養の３、６、９、１２、１５日後に培養液を分取し、培養液中に含まれる菌体量（乾燥重量, ｇ／Ｌ）、残存グルコース濃度（ｇ／Ｌ）、マンノシルエリスリトール濃度を測定した。その結果を図７に示す。図７に示されるように、KM-59株は、３６ｇ／Ｌのマンノシルエリスリトールを培地中に蓄積し、対糖収率は２１％であった。
【００５４】
(3) 条件３
シュードザイマ・フベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株（FERM P-20987)を用いて、実施例１と同様にして培養Ａを２日間行った後、培養Ｂを、グリセロール１００ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム３ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム ０．２５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．２５ｇ／Ｌの組成の液体培地を用いて１０日間行った。培養の３、６、９、１２日後に培養液を分取し、培養液中に含まれる菌体量（乾燥重量, ｇ／Ｌ）、残存グリセロール濃度（ｇ／Ｌ）、マンノシルエリスリトール濃度を測定した。その結果を図８に示す。図８に示されるように、KM-59株は、１３ｇ／Ｌのマンノシルエリスリトールを培地中に蓄積し、対糖収率は１４％であり、対糖収率はグルコースを唯一の炭素源とした場合に匹敵することがわかる。
【００５５】
（実施例６）シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）KM-160株のマンノシルエリスリトール生産条件の検討
(1) 条件１
シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）KM-160株（FERM P-21481)を用いて、実施例１と同様にして培養Ａを２日間行った後、培養Ｂを、グルコース１００ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム３ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム ０．２５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．２５ｇ／Ｌの組成の液体培地を用いて１１日間行った。培養の３、６、９，１１日後に培養液を分取し、培養液中に含まれる菌体量（乾燥重量, ｇ／Ｌ）、残存グルコース濃度（ｇ／Ｌ）、マンノシルエリスリトール濃度を測定した。その結果を図９に示す。図９に示されるように、KM-160株は、１７ｇ／Ｌのマンノシルエリスリトールを培地中に蓄積し、対糖収率は１９％であった。
【００５６】
(2) 条件２
シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）KM-160株（FERM P-21481)を用いて、実施例１と同様にして培養Ａを２日間行った後、培養Ｂを、グリセロール１００ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム３ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム ０．２５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．２５ｇ／Ｌの組成の液体培地を用いて１８日間行った。培養の３、６、９、１２、１５、１８日後に培養液を分取し、培養液中に含まれる菌体量（乾燥重量, ｇ／Ｌ）、残存グリセロール濃度（ｇ／Ｌ）、マンノシルエリスリトール濃度を測定した。その結果を図１０に示す。図１０に示されるように、KM-160株は、１３ｇ／Ｌのマンノシルエリスリトールを培地中に蓄積し、対糖収率は１７％であり、対糖収率はグルコースを唯一の炭素源とした場合に匹敵することがわかる。
【００５７】
(3) 条件３
シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）KM-160株（FERM P-21481)を用いて、実施例１と同様にして培養Ａを２日間行った後、培養Ｂを、グルコース１００ｇ／Ｌ、酵母エキス１〜６ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム３ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム ０．２５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．２５ｇ／Ｌの組成の液体培地を用いて７日間行った。培養の７日後に培養液を分取し、培養液中に含まれる菌体量（乾燥重量, ｇ／Ｌ）、残存グルコース濃度（ｇ／Ｌ）、マンノシルエリスリトール濃度を測定した。その結果を図１１に示す。図１１に示されるように、KM-160株は、６ｇ／Ｌの酵母エキス濃度で培養した時、２０ｇ／Ｌのマンノシルエリスリトールを７日間で培地中に蓄積し、生産量の向上ならびに培養日数の短縮の効果が認められた。
【００５８】
（実施例７）  マンノシルエリスリトールのラット小腸糖質分解酵素に対する耐性
ラット小腸由来の消化酵素を用いて以下の実験を行った。５００ｍＭのマンノシルエリスリトール（ME-A）またはシュクロース溶液０．１ｍｌを試験管に取り、これに０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を０．１２５ｍｌ、ラット小腸糖分解酵素を０．０５ｍｌ（０．１Ｕ）、蒸留水０．２２５ｍＬの合計０．５ｍｌとし、これを酵素液を添加してから３７℃、最大２４時間反応させ、１００℃で１０分間過熱して酵素反応を止めた。反応液中のシュクロース濃度は、遊離したグルコース濃度をグルコースＣＩＩ−テストワコー（グルコース濃度測定キット）を用いて定量した値に基づいて算出した。反応液中のマンノシルエリスリトール（ME-A）濃度は、高速液体クロマトグラフィーにて定量した。その結果を図１２に示す。これによると、マンノシルエリスリトール（ME-A）がラットの小腸糖質分解酵素の作用を受けていないことが明らかである。
【００５９】
（実施例８）マンノシルエリスリトール高生産菌によるマンノシルエリスリトール生産培養
シュードザイマ・フベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株（FERM P-20987)とシュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）KM-160株（FERM P-21481)を用いて、培養Ｂの培養を７日間に代えて３日間行う以外は実施例１と同様にして培養Ａ、培養Ｂを行った。グルコースまたはグリセロール１００ｇ／Ｌ、酵母エキス２〜６ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム３ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．２５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．２５ｇ／Ｌの組成の液体培地０．８Ｌが入ったジャーファメンターに上記の培養Ｂを行った培養液を接種して、２２〜２８℃で６００〜１０００ｒｐｍの撹拌速度で６日間培養した。この培養においては、培養途中からグルコースまたはグリセロールを含む上記培地を培養容器中に流下した。培養液を、採取し、培養液中に含まれるマンノシルエリスリトールの濃度を高速液体クロマトグラフィーにて定量した。培養途中の培養液を分取し、培養液中に含まれる残存グルコース濃度（ｇ／Ｌ）およびマンノシルエリスリトール濃度を測定した。その結果を図１３〜１６に示す。図１３に示されるように、KM-59株は、６日間で２００ｇ／Ｌのグルコースから１１．１ｇ／Ｌのマンノシルエリスリトールを培地中に蓄積し、対糖収率は６．２％であった。また、図１４に示されるように、KM-59株は、６日間で１００ｇ／Ｌのグリセロールから０．５ｇ／Ｌのマンノシルエリスリトールを培地中に蓄積し、対糖収率は０．６％であった。また、図１５に示されるように、KM-160株は、６日間で３００ｇ／Ｌのグルコースから３８．０ｇ／Ｌのマンノシルエリスリトールを培地中に蓄積し、対糖収率は１３％であった。また、図１６に示されるように、KM-160株は、６日間で２００ｇ／Ｌのグリセロールから２０．１ｇ／Ｌのマンノシルエリスリトールを培地中に蓄積し、対糖収率は１０．１％であった。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物の培養液中に含有されるマンノシルエリスリトールをペーパークロマトグラフィーによって検出した結果を示す写真である。
【図２】シュードザイマ・フベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株とシュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）KM-160株のグルコース培養液の高速液体クロマトグラフィーによる分析結果を示すチャートである。
【図３】シュードザイマ・フベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株とシュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）KM-160株のグリセロール培養液の高速液体クロマトグラフィーによる分析結果を示すチャートである。
【図４】シュードザイマ・フベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株の培養液をゲル濾過クロマトグラフィーに供し、マンノシルエリスリトールを分画した結果を示す図である。
【図５】シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）KM-160株の培養液を活性炭クロマトグラフィーに供し、マンノシルエリスリトールを分画した結果を示す図である。
【図６】シュードザイマ・フベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株を１０％グルコース含有培地で培養した際の、培地中のマンノシルエリスリトール濃度、菌体量および残存グルコース濃度を示す図である。
【図７】シュードザイマ・フベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株を２０％グルコース含有培地で培養した際の、培地中のマンノシルエリスリトール濃度、菌体量および残存グルコース濃度を示す図である。
【図８】シュードザイマ・フベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株を１０％グリセロール含有培地で培養した際の、培地中のマンノシルエリスリトール濃度、菌体量および残存グリセロール濃度を示す図である。
【図９】シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）KM-160株を１０％グルコース含有培地で培養した際の、培地中のマンノシルエリスリトール濃度、菌体量および残存グルコース濃度を示す図である。
【図１０】シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）KM-160株を１０％グリセロール含有培地で培養した際の、培地中のマンノシルエリスリトール濃度、菌体量および残存グリセロール濃度を示す図である。
【図１１】シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）KM-160株を１０％グルコース含有培地で培養した際の、培地中の酵母エキス濃度がマンノシルエリスリトールの生産量に及ぼす影響を示す図である。
【図１２】マンノシルエリスリトールがラット小腸糖質分解酵素に対する耐性を有することを示す図である。
【図１３】シュードザイマ・フベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59 株をグルコース含有培地でマンノシルエリスリトール生産培養した結果を示す図である。
【図１４】シュードザイマ・フベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59 株をグリセロール含有培地でマンノシルエリスリトール生産培養した結果を示す図である。
【図１５】シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）KM-160 株をグルコース含有培地でマンノシルエリスリトール生産培養した結果を示す図である。
【図１６】シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）KM-160 株をグリセロール含有培地でマンノシルエリスリトール生産培養した結果を示す図である。
【図１】
0005418999.tif 000006
【図２】
0005418999.tif 000007
【図３】
0005418999.tif 000008
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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