(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ-セクレターゼによりプロセシングをうけたEphA4によるスパイン形成に影響を与える化合物をスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
（i）γセクレターゼにより開裂された細胞内EphA4を発現したスパイン形成細胞を培養し、
（ii）前記（i）で培養されたスパイン形成細胞に対し、候補化合物の存在下および非存在下におけるスパインの数を測定し； 
（iii）前記（ii）で測定されたスパインの数に基づき、当該スパインの数に影響を与える候補化合物を選択し；
（iｖ）前記（iii）で選択された候補化合物を、γ-セクレターゼによりプロセシングをうけたEphA4によるスパイン形成に影響を与える化合物であると同定する、
ことを含む、上記方法。
【請求項２】
前記（ii）で測定されたスパインの数において、γ-セクレターゼにより開裂されたEphA4の発現後におけるスパインの数がγ-セクレターゼにより開裂されたEphA4の発現前におけるスパインの数と比べて増加していた場合、当該候補化合物を、γ-セクレターゼにより開裂されたEphA4を介してスパイン形成を活性化する化合物であると評価することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（ii）で測定されたスパインの数において、γ-セクレターゼにより開裂されたEphA4の発現後のスパインの数がγ-セクレターゼにより開裂されたEphA4の発現前のスパインの数と比べて減少していた場合、当該候補化合物を、EphA4を介してスパイン形成を阻害する化合物であると評価することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
γ-セクレターゼによりプロセシングをうけたEphA4によるスパイン形成に影響を与える化合物をスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
（i）γセクレターゼにより開裂された細胞内EphA4を発現したRac発現細胞を培養し、
（ii）前記（i）で培養されたRac発現細胞に対し、候補化合物の存在下および非存在下におけるRac活性を測定し； 
（iii）前記（ii）の測定において、Rac活性に影響を与える候補化合物を選択し；
（iｖ）前記（iii）で選択された候補化合物を、γ-セクレターゼによりプロセシングをうけたEphA4によるスパイン形成に影響を与える化合物であると同定する、
ことを含む、上記方法。
【請求項５】
前記（ii）で測定されたRac活性において、候補化合物の存在下におけるRac活性が候補化合物の非存在下におけるRac活性と比べて増加していた場合、当該候補化合物を、γ-セクレターゼにより開裂されたEphA4を介してスパイン形成を活性化する化合物であると評価することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記（ii）で測定されたRac活性において、候補化合物の存在下におけるRac活性が候補化合物の非存在下におけるRac活性と比べて減少していた場合、当該候補化合物を、EphA4を介してスパイン形成を阻害する化合物であると評価することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
γ-セクレターゼによりプロセシングをうけたEphA4によるRac活性に影響を与える化合物をスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
（i）γセクレターゼにより開裂された細胞内EphA4を発現したRac発現細胞を培養し、
（ii）前記（i）で培養されたRac発現細胞に対し、候補化合物の存在下および非存在下におけるRac活性を測定し； 
（iii）前記（ii）の測定において、Rac活性に影響を与える候補化合物を選択し；
（iｖ）前記（iii）で選択された候補化合物を、γ-セクレターゼによりプロセシングをうけたEphA4によるRac活性に影響を与える化合物であると同定する、
ことを含む、上記方法。
【請求項８】
前記（ii）で測定されたRac活性において、候補化合物の存在下におけるRac活性が候補化合物の非存在下におけるRac活性と比べて増加していた場合、当該候補化合物を、γ-セクレターゼにより開裂されたEphA4を介してRacを活性化する化合物であると評価することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記（ii）で測定されたRac活性において、候補化合物の存在下におけるRac活性が候補化合物の非存在下におけるRac活性と比べて減少していた場合、当該候補化合物を、EphA4を介してRac活性を阻害する化合物であると評価することを含む、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、EphA4ポリペプチドおよびその用途に関し、特に新規活性を有するEphA4ポリペプチドおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
γ-セクレターゼは、プレセニリン（Presenilin）、ニカストリン（Nicastrin）、Aph-1及びPen-2を基本構成成分として含む複合タンパク質（アスパラギン酸プロテアーゼ）である。触媒ドメインであるプレセニリンは、家族性アルツハイマー病（AD）の原因遺伝子として同定されている。γ-セクレターゼは、一回膜貫通型のタンパク質を基質にしている。最も代表的な基質としてアミロイド前駆体タンパク質（APP：amyloid precursor protein）、ノッチ（Notch）が知られている。APPは、β-セクレターゼによるβ-部位の開裂、γ-セクレターゼによるγ-部位の開裂によるプロセシングを受けてアミロイドβタンパク質（Aβ：Amyloid βprotein）となる。生成されるAβは、アミノ酸（C末端側）の切断部位によって長さの異なるペプチドに分類される。このうち疎水性が強く、凝集しやすい（β−シート構造をとりやすい）性質を有するAβ42は、神経毒性を示すことから、この現象がアルツハイマー病の主因ではないかと考えられてきた。しかし、最近、Aβをまったく産生できないプレセニリン１ (PS1)およびプレセニリン2 (PS2)のダブルノックアウトマウスが、シナプスの減少、神経細胞死といったAD様の表現型を示すことが報告され、APP とは独立したAD発症の存在も示唆されている（非特許文献１）。【０００３】
一方、Eph receptor A4（EphA4）は、レセプター型チロシンキナーゼファミリーの一つであり、ポストシナプスの形態形成を制御している分子である。ノックアウト、またはドミナント−ネガティブ（dominant negative）変異体の発現により、樹状突起の上に小さなとげ状の隆起であるスパイン（Spine）の数が減少し、スパインの形が細長くなることが知られている（非特許文献２）。記憶や学習の過程がスパインの数や形に反映されていることは一般的に提唱されている。【０００４】
神経活動に関係していることが知られている分子として、Rasスーパーファミリーに属する低分子量GTP結合蛋白質であるRhoファミリー蛋白質が細胞内骨格、特にアクチンの再構成を制御している分子ファミリーとして知られている。Rhoファミリー蛋白質の代表的な分子として、RhoA, Cdc42, Rac1が挙げられ、これらの分子は中枢神経系で強く発現していることが知られている。特に、アクチンの再構成がさかんに行なわれているスパインでは、RhoA, Cdc42, Rac1が中心的な役割を担っており、これらのシグナル伝達経路が破綻すると、スパインは減弱し、様々な神経障害が引き起こされることが知られている（非特許文献３）。とりわけ、Racを介したシグナル伝達経路は、スパイン形成を促進する働きを持っており、そのシグナルを阻害するとスパインの減弱化が起こることが報告されている（非特許文献５）。EphA4においてはRhoファミリー分子の活性調節に関与していることがすでに報告されており、EphA4レセプターのリガンドであるephrinA（エフリンA）と結合した状態、すなわち、γ-セクレターゼによるプロセシングを受けていない状態では、Racを介したシグナル伝達経路を阻害して、スパイン形成を阻害することが知られている（非特許文献４）。この他にも、Racは、アルツハイマー病発症と深く関係していることも知られており、Racにより活性調節受けるp21-activated kinase(PAK)は、アルツハイマー病の脳において、発現量の低下、ならびに活性の低下が報告されている（非特許文献６）。【０００５】
しかしながら、これまでEphA4とγ-セクレターゼの関係は一切報告されておらず、γ-セクレターゼがEphA4をプロセシングすることについてはこれまで報告がなされていない。加えて、γ-セクレターゼによりプロセシングされたEphA4断片の同定や該断片が生体内で与える影響、特にγ-セクレターゼによるプロセシングによりRhoファミリー分子の活性やスパイン形成に与える影響についても報告が一切なされていない。
【特許文献１】Saura CA, Choi SY, Beglopoulos V, Malkani S, Zhang D, Shankaranarayana Rao BS, Chattarji S, Kelleher RJ 3rd, Kandel ER, Duff K, Kirkwood A, and Shen J.  Loss of presenilin function causes impairments of memory and synaptic plasticity followed by age-dependent neurodegeneration. Neuron. 2004 Apr 8;42(1):23-36.
【非特許文献２】Murai KK, Nguyen LN, Irie F, Yamaguchi Y, Pasquale EB. Control of hippocampal dendritic spine morphology through ephrin-A3/EphA4 signaling.. Nat Neurosci. 2003 Feb;6(2):153-60.
【非特許文献３】Ramakers GJ. Rho proteins, mental retardation and the cellular basis of cognition. Trends Neurosci. 2002 Apr;25(4):191-9.
【非特許文献４】Shamah SM, Lin MZ, Goldberg JL, Estrach S, Sahin M, Hu L, Bazalakova M, Neve RL, Corfas G, Debant A, Greenberg ME.EphA receptors regulate growth cone dynamics through the novel  guanine nucleotide exchange factor ephexin.Cell. 2001 Apr 20;105(2):233-44.
【非特許文献５】Tashiro A, Yuste R.Regulation of dendritic spine motility and stability by Rac1 and Rho kinase: evidence for two forms of spine motility.Mol Cell Neurosci. 2004 Jul;26(3):429-40.
【非特許文献６】Zhao L, Ma QL, Calon F, Harris-White ME, Yang F, Lim GP, Morihara T, Ubeda OJ, Ambegaokar S, Hansen JE, Weisbart RH, Teter B, Frautschy SA, Cole GM.Role of p21-activated kinase pathway defects in the cognitive deficits of Alzheimer disease.Nat Neurosci. 2006 Feb;9(2):234-42. Epub 2006 Jan 15.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新規活性を有するEphA4ポリペプチドおよびその用途として、γ-セクレターゼにより開裂されたEphA4断片、特に該断片のうち細胞内側の断片をコードするポリペプチド及び該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びに該ポリペプチドに対する特異的な抗体を提供することを目的とする。また、γ-セクレターゼによるEphA4のプロセシングに影響を与える化合物をスクリーニングする方法、γ-セクレターゼによりプロセシングをうけたEphA4によるスパイン形成に影響を与える化合物をスクリーニングする方法、及びγ-セクレターゼによりプロセシングをうけたEphA4によるRacの活性に影響を与える化合物をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、HEK293細胞内および海馬初代培養神経細胞内でEphA4がγ-セクレターゼにより開裂することをγ-セクレターゼ阻害剤(2S)-2-{[(3,5-Difluorophenyl)acetyl]amino}-N-[(3S)-1-methyl-2-oxo-5-phenyl-2,3-dihydro-1H-1,4-benzodiazepin-3-yl]propanamideを用いることで証明した。また、開裂したEphA4に対して特異的な抗体またはEphA4のC末端のタグに対する特異的な抗体を用いることで、γ-セクレターゼによるEphA4の開裂を検出することができることを見出した。【０００８】
さらに、海馬初代培養神経細胞にγ-セクレターゼにより開裂されたEphA4細胞内断片を強制発現させ、強制発現させる前後の神経細胞のスパインの数を検出することで、γ-セクレターゼにより開裂されたEphA4細胞内断片がスパイン形成を活性化することを初めて見出した。【０００９】
さらに、NIH3T3細胞にγ-セクレターゼにより開裂されたEphA4細胞内断片を強制発現させ、強制発現させる前後のNIH3T3細胞におけるアクチン細胞骨格の構造変化を観察することで、γ-セクレターゼにより開裂されたEphA4細胞内断片がNIH3T3細胞の細胞膜上にラメポディアと呼ばれる構造体を形成することを初めて見出した。【００１０】
また、NIH3T3細胞にγ-セクレターゼにより開裂されたEphA4細胞内断片とRac1の17番目のスレオニンをアスパラギンに変換させて得られたドミナントネガティブ体であるRac1N17を同時に強制発現させると、γ-セクレターゼにより開裂されたEphA4細胞内断片の強制発現により形成されたラメポディア構造が消失し、γ-セクレターゼにより開裂されたEphA4細胞内断片はRac1を活性化させることを初めて見出した。【００１１】
また、γ-セクレターゼにより開裂されたEphA4細胞内断片に相当する領域を初めて見出すとともに、当該領域のうちRac1の活性化やスパイン形成に必要な領域を初めて決定した。【００１２】
すなわち、本発明者は、EphA4の開裂が、γ-セクレターゼ阻害剤によって抑制されることを示すことで、EphA4に対するγ-セクレターゼの分解活性（特に、開裂促進活性または開裂阻害活性）を利用したEphA4を用いたスクリーニング方法が有効であることを示した。【００１３】
また、γ-セクレターゼにより開裂されたEphA4細胞内断片を神経細胞に発現させると、発現後の神経細胞のスパインの数が増加することで、γ-セクレターゼにより開裂されたEphA4細胞内断片がスパイン形成を活性化することを示し、開裂されたEphA4細胞内断片によるスパイン形成活性を利用したスクリーニング方法が有効であることを示した。【００１４】
また、γ-セクレターゼにより開裂されたEphA4細胞内断片を神経細胞に発現させると、発現後の神経細胞のラメポリディア構造の形成が促進することで、γ-セクレターゼにより開裂されたEphA4細胞内断片がRac活性を促進することを示し、開裂されたEphA4細胞内断片によるRac活性を利用したスクリーニング方法が有効であることを示した。【００１５】
また、γ-セクレターゼによるEphA4の開裂反応を行い、反応産物からEphA4のC末端のタグに対する特異的な抗体を用いてアフィニテイー精製されたタグ付EphA4タンパク質断片をSDS-PAGEを用いて分離し、タグ付EphA4タンパク質断片を含むゲル片を切り取った。切り取ったゲル片に対し、プロテアーゼを用いたゲル内消化法を行った。得られたペプチド片に対しLC-MS/MS解析を行い、切断部位を含むペプチドを見出し、タンデムMSスペクトルから解析を行うことで、EphA4のγ-セクレターゼにより開裂される位置のアミノ酸配列を初めて決定した。【００１６】
また、γ-セクレターゼにより開裂された細胞内断片のアミノ酸配列をN末端側から順に欠失させて、該変異体のRac活性化能を測定することで、γ-セクレターゼにより開裂された細胞内断片と同様のRac活性化能を有する配列を初めて見出し、γ-セクレターゼにより開裂されたEphA4の細胞内断片や該断片と同様にRacを活性化させる断片が有効であることを示した。【００１７】
また、Racが活性化されると、スパインの形成が促進されることから、γ-セクレターゼにより開裂されたEphA4の細胞内断片や該断片と同様にスパインの形成を促進する断片が有効であることを示した。【００１８】
また、γ-セクレターゼにより開裂されたEphA4に対して特異的な抗体を示した。【００１９】
本発明のスクリーニング方法によって得られる、γ-セクレターゼの開裂阻害剤は、γ-セクレターゼを通じてEphA4のプロセシングを減少させる化合物であるとともに、γ-セクレターゼによりプロセシングされたEphA4細胞内断片を通じてスパイン形成を減少させる化合物である。【００２０】
また、本発明のスクリーニング方法によって得られる、γ-セクレターゼの開裂促進剤は、γ-セクレターゼを通じてEphA4のプロセシングを上昇させる化合物であるとともに、γ-セクレターゼによりプロセシングされたEphA4細胞内断片を通じてスパイン形成を活性化させる化合物である。【００２１】
また、本発明のスクリーニング方法によって得られるγ-セクレターゼによりプロセシングされたEphA4細胞内断片によるスパイン形成阻害剤は、γ-セクレターゼによりプロセシングされたEphA4細胞内断片の産生抑制によりスパインの数を減少させてスパイン形成を阻害させる化合物である。【００２２】
また、本発明のスクリーニング方法によって得られるγ-セクレターゼによりプロセシングされたEphA4細胞内断片によるスパイン形成促進剤は、γ-セクレターゼによりプロセシングされたEphA4細胞内断片の産生促進によりスパインの数を増加させてスパイン形成を促進させる化合物である。【００２３】
また、本発明のスクリーニング方法によって得られるγ-セクレターゼによりプロセシングされたEphA4細胞内断片の分解抑制剤は、γ-セクレターゼによりプロセシングされて生じたEphA4細胞内断片の分解を抑制する化合物である。EphA4細胞内断片の分解を抑制する化合物は、EphA4細胞内断片の実効的な量を増加させてスパイン形成を促進する化合物であり、γ-セクレターゼによりプロセシングされたEphA4細胞内断片の分解抑制を通じてスパイン形成を活性化させる化合物である。【００２４】
また、本発明のスクリーニング方法によって得られるγ-セクレターゼによりプロセシングされたEphA4細胞内断片によるRacの活性剤は、γ-セクレターゼによりプロセシングされたEphA4細胞内断片の産生の促進によりRac活性を促進させる化合物であるとともに、Racを活性化させることでスパインの数を増加させてスパイン形成を促進させる化合物である。【００２５】
また、本発明のスクリーニング方法によって得られるγ-セクレターゼによりプロセシングされたEphA4細胞内断片によるRacの阻害剤は、γ-セクレターゼによりプロセシングされたEphA4細胞内断片の産生の抑制によりRac活性を阻害させる化合物であるとともに、Rac活性を阻害することでスパインの数を減少させてスパイン形成を抑制させる化合物である。【００２６】
本発明により、γ-セクレターゼによるスパイン形成、γ-セクレターゼによりプロセシングされたEphA4細胞内断片によるスパイン形成、またはγ-セクレターゼによりプロセシングされたEphA4細胞内断片の分解に選択的に作用する化合物、あるいはγ-セクレターゼによりプロセシングされたEphA4細胞内断片、または該断片に対する特異的な抗体、特にγ-セクレターゼの開裂促進剤、スパイン形成促進剤、またはγ-セクレターゼによりプロセシングされたEphA4細胞内断片の分解抑制剤、あるいはγ-セクレターゼによりプロセシングされたEphA4細胞内断片、または該断片に対する特異的な抗体を選択することで、所望の記憶障害、特に認知症（好ましくはAD）の治療薬の創出が可能になる。【００２７】
すなわち、本発明は以下の態様を提供する。
（１）配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの部分配列からなるポリヌクレオチドであって、
N末端側が配列番号２のアミノ酸配列の564位から621位の間で開始するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（２）以下の（a）及び（ｂ）のいずれかの活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする（１）記載のポリヌクレオチド。【００２８】
（a）スパイン形成を促進する
（ｂ）Racを活性化する
（３）配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの部分配列からなるポリヌクレオチドであって、
以下の（a）および（ｂ）のいずれかのアミノ酸配列をコードするとともに、以下の（ｃ）および（ｄ）のいずれかの活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。【００２９】
（a）N末端側が配列番号２のアミノ酸配列の564位から621位の間で開始するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列と少なくとも９５％以上の相同性を有する塩基配列
（ｂ）N末端側が配列番号２のアミノ酸配列の564位から621位の間で開始するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（ｃ）スパイン形成を促進する
（ｄ）Racを活性化する
（４）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリヌクレオチド。【００３０】
（ａ）配列番号2n (nは45〜83の整数を表す。）から選択された配列番号のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号2n-1 (nは45〜83の整数を表す。）から選択された配列番号の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともに、以下の（ｄ）又は（ｅ）の活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｄ）スパイン形成を促進する
（ｅ）Racを活性化する
（５）配列番号８９,９１及び１９５から選択された配列番号の塩基配列でコードされるポリヌクレオチド。
（６）融合タンパク質をコードするアミノ酸配列をもつ（１）〜（５）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
（７）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドの一部配列であって、
N末端側が配列番号２のアミノ酸配列の564位から621位の間で開始するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（８）以下の（a）及び（ｂ）のいずれかの活性を有する（７）記載のポリペプチド。【００３１】
（a）スパイン形成を促進する
（ｂ）Racを活性化する
（９）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分配列からなるポリぺプチドであって、
以下の（a）および（ｂ）のいずれかのアミノ酸配列を有するとともに、以下の（ｃ）および（ｄ）のいずれかの活性を有するポリペプチド。【００３２】
（a）N末端側が配列番号２のアミノ酸配列の564位から621位の間で開始するアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列；
（ｂ）N末端側が配列番号２のアミノ酸配列の564位から621位の間で開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列；
（ｃ）スパイン形成を促進する；
（ｄ）Racを活性化する；
（１０）以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド。【００３３】
（ａ）配列番号2n (nは45〜83の整数を表す。）から選択された配列番号のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号2n (nは45〜83の整数を表す。）から選択された配列番号のアミノ酸配列からなるポリペプチドと少なくとも８０％以上の相同性を有するとともに、以下の（ｃ）又は（ｄ）の活性を有するポリペプチド
（ｃ）スパイン形成を促進する；
（ｄ）Racを活性化する；
（１１）配列番号９０,９２及び１９６から選択された配列番号のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（１２）融合タンパク質をコードするアミノ酸配列を有する、（７）〜（１０）のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（１３）（７）〜（１２）のいずれか１項に記載のポリペプチドに対する抗体。
（１４）（１）〜（６）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと、（１３）に記載の抗体とを含む、キット。
（１５）（７）〜（１２）のいずれか１項に記載のポリペプチドと、（１３）に記載の抗体とを含む、キット。
（１６）γ-セクレターゼによるEphA4のプロセシングに影響を与える化合物をスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
(i) 候補化合物の存在下および非存在下で、γ-セクレターゼまたはその生物学的に活性な断片を含む第１の生物学的組成物と、EphA4を含む第２の生物学的組成物とを接触させ；
（ii）候補化合物の存在下および非存在下におけるスパイン形成細胞のスパインの数をそれぞれ測定し；
（iii）前記（ii）で測定されたスパインの数に基づき、当該スパインの数に影響を与える候補化合物を選択し；
（iv）前記（iii）で選択された候補化合物を、γ-セクレターゼによるEphA4のプロセシングに影響を与える化合物であると同定する、
ことを含む、上記方法。
（１７）前記（ii）で測定されたスパインの数において、候補化合物の存在下におけるスパインの数が候補化合物の非存在下におけるスパインの数と比べて増加していた場合、当該候補化合物を、γ-セクレターゼを介してEphA4のプロセシングを活性化する化合物であると同定することを含む、（１６）に記載の方法。
（１８）前記（ii）で測定されたスパインの数において、候補化合物の存在下におけるスパインの数が候補化合物の非存在下におけるスパインの数と比べて減少していた場合、当該候補化合物を、γ-セクレターゼを介してEphA4のプロセシングを阻害する化合物であると同定することを含む（１６）に記載の方法。
（１９）γ-セクレターゼによりプロセシングをうけたEphA4によるスパイン形成に影響を与える化合物をスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
（i）γセクレターゼにより開裂された細胞内EphA4を発現したスパイン形成細胞を培養し、
（ii）前記（i）で培養されたスパイン形成細胞に対し、候補化合物の存在下および非存在下におけるスパインの数を測定し； 
（iii）前記（ii）で測定されたスパインの数に基づき、当該スパインの数に影響を与える候補化合物を選択し；
（iｖ）前記（iii）で選択された候補化合物を、γ-セクレターゼによりプロセシングをうけたEphA4によるスパイン形成に影響を与える化合物であると同定する、
ことを含む、上記方法。
（２０）前記（ii）で測定されたスパインの数において、γ-セクレターゼにより開裂されたEphA4の発現後におけるスパインの数がγ-セクレターゼにより開裂されたEphA4の発現前におけるスパインの数と比べて増加していた場合、当該候補化合物を、γ-セクレターゼにより開裂されたEphA4を介してスパイン形成を活性化する化合物であると評価することを含む、（１９）に記載の方法。
（２１）前記（ii）で測定されたスパインの数において、γ-セクレターゼにより開裂されたEphA4の発現後のスパインの数がγ-セクレターゼにより開裂されたEphA4の発現前のスパインの数と比べて減少していた場合、当該候補化合物を、EphA4を介してスパイン形成を阻害する化合物であると評価することを含む、（１９）に記載の方法。
（２２）γ-セクレターゼによりプロセシングをうけたEphA4によるスパイン形成に影響を与える化合物をスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
（i）γセクレターゼにより開裂された細胞内EphA4を発現したRac発現細胞を培養し、
（ii）前記（i）で培養されたRac発現細胞に対し、候補化合物の存在下および非存在下におけるRac活性を測定し； 
（iii）前記（ii）の測定において、Rac活性に影響を与える候補化合物を選択し；
（iｖ）前記（iii）で選択された候補化合物を、γ-セクレターゼによりプロセシングをうけたEphA4によるスパイン形成に影響を与える化合物であると同定する、
ことを含む、上記方法。
（２３）前記（ii）で測定されたRac活性において、候補化合物の存在下におけるRac活性が候補化合物の非存在下におけるRac活性と比べて増加していた場合、当該候補化合物を、γ-セクレターゼにより開裂されたEphA4を介してスパイン形成を活性化する化合物であると評価することを含む、（２２）に記載の方法。
（２４）前記（ii）で測定されたRac活性において、候補化合物の存在下におけるRac活性が候補化合物の非存在下におけるRac活性と比べて減少していた場合、当該候補化合物を、EphA4を介してスパイン形成を阻害する化合物であると評価することを含む、（２２）に記載の方法。
（２５）γ-セクレターゼによりプロセシングをうけたEphA4によるRac活性に影響を与える化合物をスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
（i）γセクレターゼにより開裂された細胞内EphA4を発現したRac発現細胞を培養し、
（ii）前記（i）で培養されたRac発現細胞に対し、候補化合物の存在下および非存在下におけるRac活性を測定し； 
（iii）前記（ii）の測定において、Rac活性に影響を与える候補化合物を選択し；
（iｖ）前記（iii）で選択された候補化合物を、γ-セクレターゼによりプロセシングをうけたEphA4によるRac活性に影響を与える化合物であると同定する、
ことを含む、上記方法。
（２６）前記（ii）で測定されたRac活性において、候補化合物の存在下におけるRac活性が候補化合物の非存在下におけるRac活性と比べて増加していた場合、当該候補化合物を、γ-セクレターゼにより開裂されたEphA4を介してRacを活性化する化合物であると評価することを含む、（２５）に記載の方法。
（２７）前記（ii）で測定されたRac活性において、候補化合物の存在下におけるRac活性が候補化合物の非存在下におけるRac活性と比べて減少していた場合、当該候補化合物を、EphA4を介してRac活性を阻害する化合物であると評価することを含む、（２５）に記載の方法。
【発明の効果】
【００３４】
本発明により、γ-セクレターゼによりプロセシングされたEphA4ポリペプチドおよび該ペプチドに対する特異的な抗体が提供される。【００３５】
また、γ-セクレターゼによるEphA4のプロセシングに影響を与える化合物をスクリーニングする方法、及びγ-セクレターゼによりプロセシングをうけたEphA4によるスパイン形成に影響を与える化合物をスクリーニングする方法、γ-セクレターゼによりプロセシングをうけたEphA4によるRacの活性に影響を与える化合物をスクリーニングする方法、γ-セクレターゼにより開裂されたEphA4の細胞内断片をコードするポリヌクレオチド及び該ヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、及び該断片によるRacを活性化させる領域をコードするポリヌクレオチド及び該ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが提供される。本発明の方法によりスクリーニングされた化合物は、所望の記憶障害、特に認知症（好ましくはAD）の治療薬の創出が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】EphA4をトランスフェクションした293/EBNA-1細胞株を用いたEphA4プロセシング解析結果を示す図である。
【図２】ラット海馬初代培養神経細胞を用いたEphA4プロセシング解析結果を示す図である。
【図３】γセクレターゼによるEphA4切断部位を質量分析法を用いて同定した結果を示す図である。
【図４】ラット海馬初代培養神経細胞を用いたEphA4細胞内断片の過剰発現によるスパイン形成解析結果を示す図である。
【図５】γセクレターゼによるEphA4切断断片の過剰発現によるスパイン形成解析結果を示す図である。
【図６】各種EphA4細胞内断片をNIH3T3細胞に発現させたときのラメリポディア形成解析結果を示す図である。
【図７】γセクレターゼによるEphA4切断断片をNIH3T3細胞に発現させたときのラメリポリディア形成の解析結果を示す図である
【図８】EphA4細胞内断片のRac1活性化領域の解析結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる米国仮出願60/991,312号（2007年11月30日出願）の明細書及び図面の内容を包含する。【００３８】
本明細書において「患者」とは、動物、好ましくは哺乳動物である。【００３９】
本明細書において「哺乳動物」とは、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（たとえばマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、イヌ、ウマ、ウシ、サルなど）を含む、哺乳動物として分類されるあらゆる動物を意味する。好ましくは、本明細書における哺乳動物はヒトである。この場合、「患者」という用語は、成人および小児を含み、かつ男性および女性を含む。小児は新生児、幼児、および青年を含む。【００４０】
本明細書において「γ-セクレターゼ」とは、APPをその膜貫通領域内で開裂（分解）することによって、Aβの産生を司る酵素または複数分子からなる複合体を意味する。当該複数分子は、プレセニリン（Presenilin）、ニカストリン（Nicastrin）、Aph-1またはPen-2の少なくとも1つの分子を含む。たとえば、
マウスPresenilin１（NM_008943）、ラットPresenilin1（D82363）、ヒトPresenilin1（NM_000021）、マウスPresenilin2（NM_011183）、ラットPresenilin2（NM_031087）、ヒトPresenilin2（NM_000447）、マウスNicastrin（NM_021607）、ラットNicastrin（NM_174864）、ヒトNicastrin（NM_015331）、マウスAph-1（NM_146104）、ラットAph-1（NM_001014255）、ヒトAph-1（NM_016022）、マウスPen-2（NM_025498）、ラットPen-2（NM_001008764）、ヒトPen-2（NM_172341）などが本発明のγ-セクレターゼに含まれる。本発明のγ-セクレターゼは、少なくとも生体内で機能するγ-セクレターゼと同様の酵素活性を有していれば、各構成分子は完全長であっても、その部分配列であってもよい。また、本発明のγ-セクレターゼは、γ-セクレターゼの変異体であってもよい。γ-セクレターゼの変異体は、完全長の各構成分子に1〜複数個（好ましくは1または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されてもよい、あるいはこれらの組合せによるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、かつ生体内で機能するγ-セクレターゼと同様の酵素活性を有するポリペプチドである。【００４１】
本明細書において、「EphA4の開裂」とは、γ-セクレターゼによってEphA4が切断を受けて切断前の長さよりも短い断片になることを意味する。「EphA4未分解物」とは、γ-セクレターゼによってEphA4が開裂しない結果として生成されるポリペプチドであり、γ-セクレターゼにより分解される前のものを意味する。【００４２】
また、「γ-セクレターゼの生物学的に活性な断片」は、生体内で機能するγ-セクレターゼと同様の酵素活性を有する断片であり、たとえば、APPやEphA4を開裂することができる断片を意味する。【００４３】
本明細書において、用語「γ-セクレターゼ」は、「γ-セクレターゼの生物学的に活性な断片」の意味を含めて用いられる場合がある。【００４４】
本明細書において「EphA4」とは、シナプス形成および／または維持の制御因子である公知のポリペプチドである（Murai KK et al., Nat Neurosci. 2003 Feb;6(2):153-60.）。たとえば、ヒトEphA4（NM_004438.3、BC026327）、カニクイザル（Macaca mulatta）EphA4（XM_001106493.1、XM_001106620、XM_001106561、XM_001106876、 XM_001106943、XM_001106806、チンパンジー（Pan troglodytes）EphA4（XM_001164636.1、XM_001164828、XM_526042、XM_001164899、XM_001164862、 XM_001164676）、ラットEphA4（XM_244186）、マウスEphA4（NM_007936.3、BC052164、X65138、BC004782、AK132203）、ハイイロジネズミオポッサム（Monodelphis domestica）EphA4（XM_001365826）、イエイヌ（Canis familiaris）EphA4（XM_536084）、ニワトリ（Gallus gallus ）EphA4（NM_204781）、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）EphA4（NM_001085992、L26099、NM_001096714）、ゼブラフィッシュ（Danio rerio）EphA4（NM_001005919、XM_001342436）などが本発明のEphA4に含まれる。好ましくは、哺乳動物のEphA4である。EphA4は、構造上、γ-セクレターゼ開裂部位、膜貫通ドメイン、キナーゼ活性部位を含み、そのリガンドは、EphrinAファミリーである（Aoto, J et al., Brain Res 2006 11）。本発明において、EphA4は前記動物由来のポリペプチド、組み換えポリペプチド、または合成ポリペプチドのいずれであってもよい。本発明において、EphA4は、好ましくは、少なくともEphA4のγ-セクレターゼ開裂部位を含んでさえすれば、完全長であっても、その部分配列であってもよい。EphA4の変異体は、完全長のEphA4に1〜複数個（好ましくは1または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されてもよい、あるいはこれらの組合せによるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、かつEphA4と機能的に実質的に同一なポリペプチドである。「EphA4と機能的に実質的に同一なポリペプチド」は、EphA4の有する活性、たとえば、γ-セクレターゼ依存的に開裂活性を有するポリペプチドを意味する。【００４５】
各種動物由来のEphA4の塩基配列又はアミノ酸配列との対応関係を表1に示す。また、各種動物由来のγ-セクレターゼの塩基配列またはアミノ酸配列との対応関係を表2に示す。【００４６】
【表１】
0005508857.tif 000002
【００４７】
【表２】
0005508857.tif 000003
本明細書において「置換」とは、好ましくは、ペプチドの活性を実質的に改変しないように、1または複数個（好ましくは1または数個）のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換える保存的置換を意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行なうことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。【００４８】
前記の欠失、置換、挿入および／または付加されてもよいアミノ酸の数は、たとえば1〜30個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜2個である。【００４９】
前記の同一性は、配列番号2からなるポリペプチドと、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、そして最も好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、EphA4と実質的に同じ活性（たとえば、ポストシナプスの形態を変化させる、特に、EphrinA依存的な形態変化を起こす活性）を有するのであれば、前記動物由来のポリペプチド、組み換えポリペプチド、または合成ポリペプチドのいずれであってもよい。前記の同一性は、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、たとえば全米バイオテクノロジー情報センター（NCBI）の相同性アルゴリズムBLAST（Basic local alignment search tool)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算出することができる。【００５０】
当該EphA4は、他のポリペプチドと融合させた融合ポリペプチド、たとえばタグもしくは標識物を付加したポリペプチド、それ以外の修飾を施されたポリペプチドの形態であってもよい。これらのポリペプチドは、遺伝子組み換え技術、部位指定突然変異誘発、突然変異誘発剤処理（たとえばヒドロキシルアミン）、または自動化したペプチド合成によって得ることができる。EphA4のγ-セクレターゼ開裂部位を少なくとも含むあらゆるEphA4誘導体が本発明には含まれる。これらのポリペプチドは、EphA4を検出、精製する上で特に有用である。【００５１】
当該EphA4のタグ付きポリペプチドとして特に有用な系としては、ヘマグルチニン（HA）系、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）系、マルトース結合タンパク質系、6×ヒスチジン系、8×ヒスチジン系などが挙げられる。【００５２】
γ-セクレターゼによるEphA4の開裂をモニターするため、抗EphA4抗体、EphA4が開裂する結果として生成されるEphA4開裂産物を認識する抗体、好ましくはEphA4の細胞内領域を認識する抗体、さらに好ましくはEphA4のC末端領域を認識する抗体を用いることができる。EphA4のタグ付きポリペプチド開裂産物を検出する場合は、選択されたタグを認識する抗体を用いることができる。たとえば、EphA4のC末端にHAタグを付けた場合、抗HAタグ抗体を用いて検出することができる。この場合、EphA4が開裂する結果として生成されるEphA4のC末端の存在と濃度を明らかにすることができる。【００５３】
前記標識またはそれ以外の検出可能な部分を組み込む修飾としては、標識は、たとえばビオチン標識、放射性標識、蛍光標識、化学的発光標識などがある。本発明のどのEphA4も、これら標識のうちの1つ、2つ、またはそれ以上を備えることができる。【００５４】
本発明の好ましい態様のEphA4は、ラットEphA4であり、たとえば配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。さらに本発明の好ましい態様のEphA4は、ラットEphA4のHAタグ付きポリペプチドである。たとえば、ラットEphA4のC末端にHAタグをさらに備えたポリペプチド(配列番号4)である（実施例１）。もちろん、ヒトEphA4配列の全体または一部、たとえば配列番号6、8のアミノ酸配列もラットEphA4と同様に用いることができる。【００５５】
本発明ではさらに、前記EphA4をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。当該EphA4をコードするポリヌクレオチドの一例は、ラットEphA4をコードするポリヌクレオチドであり、たとえば配列番号1のポリヌクレオチドである。さらに本発明の好ましい態様のEphA4をコードするポリヌクレオチドは、ラットEphA4のHAタグ付きポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。たとえば、ラットEphA4のC末端にHAタグをさらに備えたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号3）である（実施例１）。もちろん、ヒトEphA4配列の全体または一部、たとえば配列番号5、7のヌクレオチド配列もラットEphA4と同様に用いることができる。  【００５６】
本明細書において「生物学的組成物」とは、γ-セクレターゼまたはEphA4を含む組成物であれば特に限られず、たとえば、無細胞の再構成系、哺乳動物またはその一部、あるいはAPPを過剰発現するように操作したトランスジェニック非ヒト哺乳動物またはその一部などである。【００５７】
本明細書において「γ-セクレターゼまたはその生物学的に活性な断片を含む第１の生物学的組成物」または「EphA4を含む第２の生物学的組成物」において、γ-セクレターゼおよび/またはEphA4は、内因性のものであっても、外因性のものであってもよい。内因性の場合は、前記動物の一部に由来するγ-セクレターゼまたはEphA4を含む組成物であれば特に限られない。前記動物の一部は、たとえば前記動物の組織、その細胞、その細胞膜分画、その精製された膜などが挙げられる。当該細胞は、たとえば中枢神経系の細胞、脳由来の神経細胞、大脳皮質由来の神経細胞、大脳皮質由来の初代培養神経細胞、海馬由来の初代培養神経細胞などの神経細胞、グリア細胞などが挙げられる。また当該細胞は、γ-セクレターゼまたはEphA4は、哺乳動物またはその一部に含有されたままの状態であってもよいし、哺乳動物から調製された細胞溶解物のγ-セクレターゼ分画またはEphA4分画であってもよい。当該細胞溶解物は、たとえばγ-セクレターゼまたはEphA4を含有する細胞を低張液もしくは界面活性剤による溶解、または超音波破砕もしくは物理的な破砕により調製されたものであってもよく、場合によっては、カラムなどの精製手段を処置したものであってもよい。外因性の場合は、γ-セクレターゼを構成する各分子をコードするポリヌクレオチドまたはEphA4をコードするポリヌクレオチドを含む各発現ベクターの全てまたはその一部を用いて、宿主細胞に発現させた場合の、γ-セクレターゼ発現細胞またはEphA4発現細胞であってもよいし、またはγ-セクレターゼ発現細胞に由来する細胞溶解物のγ-セクレターゼ分画またはEphA4発現細胞に由来する細胞溶解物のγ-セクレターゼ分画であってもよい。当該細胞溶解物は、たとえばγ-セクレターゼまたはEphA4を含有する細胞を低張液もしくは界面活性剤による溶解、または超音波破砕もしくは物理的な破砕により調製されたものであってもよく、場合によっては、カラムなどの精製手段を処置したものであってもよい。当該発現ベクターは、宿主細胞に形質転換またはトランスフェクションされ、一過性に遺伝子を発現するもの、または宿主細胞のゲノムに組み込まれ、安定に遺伝子を発現するものであってもよい。【００５８】
本明細書において「形質転換」または「トランスフェクション」とは、真核細胞のDNA含量を変化させるあらゆる方法を意味する。たとえばリン酸カルシウムトランスフェクション、プロトプラスト融合トランスフェクション、エレクトロポレーショントランスフェクション、DEAE−デキストラン処理トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、ポリブレントランスフェクション、直接マイクロインジェクショントランスフェクションなどが挙げられる（Sambrook，et al.，Molecular Cloning 3：16.30-16.31（1989））。【００５９】
前記形質転換またはトランスフェクションに使用される発現ベクターは、γ-セクレターゼを構成する各分子をコードするポリヌクレオチドまたはEphA4をコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、当該ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるプラスミドを挙げることができる。たとえば、哺乳動物の細胞では、強い転写活性を与えるのにCMV前初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター（たとえばMLVやMMTVからのLTR）、SV40、RSV LTR、HIV-1 LTR、HIV-2 LTRのプロモーター、アデノウイルスのプロモーター（たとえばE1A領域、E2A領域、MLP領域からのもの）、AAV LTR、カリフラワー・モザイク・ウイルス、HSV-TK、トリ肉腫ウイルスのプロモーターなどがある。【００６０】
前記形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞も、γ-セクレターゼを構成する各分子をコードするポリヌクレオチドまたはEphA4をコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、たとえば当該ポリヌクレオチドが宿主細胞の染色体に組み込まれた形質転換体であることもできるし、当該ポリヌクレオチドを含むプラスミドの形で含有する形質転換体であることもできるし、またはγ-セクレターゼまたはEphA4を発現していない形質転換体であることもできる。当該形質転換体は、たとえば前記プラスミドにより、あるいは、前記ポリヌクレオチドそれ自体により、所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。【００６１】
前記発現ベクターを形質転換またはトランスフェクションされる宿主細胞は、遺伝子を発現することができる細胞または細胞株であればよく、公知の培養細胞が挙げられる。たとえば哺乳動物の細胞または細胞株として、HEK293細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、線維芽細胞、一次内皮細胞（HUVEC細胞）、ヒト神経膠腫細胞、Hela細胞、COS細胞、PC12細胞、リンパ芽球、メラノーマ細胞、ハイブリドーマ細胞、卵母細胞、胚性幹細胞など、または公知の微生物として、たとえば大腸菌、酵母など、または昆虫細胞（たとえばBmN4細胞）などが挙げられる。前記細胞は、内因性のものであっても外因性のものであっても特に限定されないが、γ-セクレターゼ、EphA4、EphA4の細胞外領域を切断する酵素（MMP：matrix metalloproteinase）、γ-セクレターゼの他の基質（たとえば、APPまたはノッチなど）のいずれかのうち少なくとも一つを発現している細胞であれば、どの細胞でもよい。【００６２】
前記発現ベクターとしては、たとえば大腸菌に対しては、pUC、pTV、pGEX、pKK、またはpTrcHisを；酵母に対しては、pEMBLYまたはpYES2を；CHO細胞、HEK293細胞およびCOS細胞に対しては、pcDNA3、pMAMneoまたはpBabe Puroを；BmN4細胞に対しては、カイコ核多角体ウイルス（BmNPV）のポリヘドリンプロモーターを有するベクター（たとえばpBK283）を挙げることができる。【００６３】
前記のγ-セクレターゼおよび／またはEphA4を含有する細胞は、γ-セクレターゼおよび／またはEphA4を細胞膜表面に発現している限り、特に限定されるものではないが、たとえば、内因性のγ-セクレターゼおよび内因性のEphA4を発現する細胞、一方が内因性で他方が外因性であるγ-セクレターゼおよびEphA4を発現する細胞、あるいは外因性のγ-セクレターゼおよび外因性のEphA4を共に発現する細胞は、γ-セクレターゼおよび／またはEphA4の発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできる。または、適当な細胞に、γ-セクレターゼを構成する各分子をコードするRNAおよび／またはEphA4をコードするRNAを注入し、γ-セクレターゼおよび／またはEphA4の発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできる。【００６４】
前記細胞膜画分は、たとえば本発明のγ-セクレターゼまたはEphA4を発現する細胞を破砕した後、細胞膜が多く含まれる画分を分離することにより得ることができる。細胞の破砕方法としては、たとえばホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーまたはポリトロンによる破砕、超音波による破砕、あるいは、フレンチプレスなどで加圧しながら細いノズルから細胞を噴出させることによる破砕などを挙げることができる。また、細胞膜の分画方法としては、たとえば遠心力による分画法、たとえば分画遠心分離法または密度勾配遠心分離法を挙げることができる。【００６５】
精製する場合、公知のタンパク質精製法を利用することができる。その方法には、1つの段階として、細胞を粗分画してポリペプチド分画と非ポリペプチド分画に分ける操作が含まれる。本発明のγ-セクレターゼまたはEphA4が他のポリペプチドから分離されると、クロマトグラフィ法または電気泳動法を利用して所望のγ-セクレターゼまたはEphA4をさらに精製し、部分的精製または完全精製（または精製による均一化）する。純粋なペプチドの調製、精製に特に適した分析法は、たとえば硫酸アンモニウム、PEG、抗体などを用いた沈降、または熱変性を行なった後の遠心分離；クロマトグラフィ・ステップ（たとえばイオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフィ、アフィニティ・クロマトグラフィ、高速タンパク質液体クロマトグラフィ（FPLC）、高性能液体クロマトグラフィ（HPLC）または固定化金属アフィニティ・クロマトグラフィ（IMAC））、等電点電気泳動、ゲル電気泳動、SDS（Sodium dodecyl sulfate）-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）、これらの方法と他の方法の組み合わせなどの方法がある。あるいは、予めγ-セクレターゼまたはEphA4にタグを付けておき、当該タグを認識するタンパク質が結合している精製カラムに通すことで、所望のγ-セクレターゼまたはEphA4をカラム内に吸着させ、適当な流出溶媒を流すことで、カラムから脱着させて精製する。さまざまな精製ステップを実施する順番を変えても、あるいはいくつかのステップを省略してもよい。分画の純度を評価する好ましい1つの方法は、分画の比活性を計算し、それを最初の抽出液の比活性と比較し、純度の大きさを計算して評価するというものである。【００６６】
本明細書において「γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4」とは、上述の「EphA4」が上述の「γ-セクレターゼ」によりプロセシングされて生じる断片のうち、細胞内領域側のEphA4断片（ EphA4 Intracellar domain ）あるいは当該断片と実質的に同等なアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、以下、単に細胞内EphA4ともいう。【００６７】
本明細書において「APP」とは、β−アミロイド前駆体タンパク質（βAPP）またはその突然変異体を意味する。APPは、多くの哺乳動物の多種多様な細胞で発現される一回膜貫通型タンパク質であり、そのC末端領域にAβ領域を含むペプチドを意味する。ヒトにおいては第21番染色体のロングアームに位置する同名の遺伝子によってコードされ、3個の主要なアイソタイプが存在する（APP695、APP751およびAPP770）。APP695、APP751およびAPP770はそれぞれ、695、751および770個のアミノ酸残基からなる。たとえば、ヒトAPP695（NM_201414、NP_958817、P05067-4）、ヒトAPP751（NM_201413、NP_958816、P05067-8）、ヒトAPP770（NM_000484、NP_000475、P05067-1、P05067）、マウスAPP695（NM_007471、NP_031497、P12023-2）、マウスAPP751（P12023-3）、マウスAPP770（AY267348、AAP23169、P12023-1、P12023）、ラットAPP695（P08592-2）、ラットAPP751（P08592-7）、ラットAPP770（NM_019288、NP_062161、P08592-1、P08592）が挙げられる。APP突然変異体は、スウェーデンFAD二重突然変異体、ロンドン突然変異体、バリン717→フェニルアラニン突然変異体、バリン717→イソロイシン突然変異体、バリン717→グリシン突然変異体が挙げられる。【００６８】
本明細書において「Aβ」とは、β−アミロイドタンパク質、アミロイドβタンパク質、β−アミロイドペプチド、アミロイドβペプチドまたはアミロイドベータという用語を意味する。たとえば、AβはヒトAPP695アミノ酸アイソタイプの約33個〜約44個のアミノ酸残基からなるペプチドであり、そして好ましくはAPPの597位〜640位のアミノ酸残基の一部または全部を含むあらゆるペプチドを含むものであって、APPのN末端タンパク質分解、続いてC末端のタンパク質分解によって産生される全てのペプチドを意味する。Aβ40、Aβ42は、それぞれ40アミノ酸残基、42アミノ酸残基を含むペプチドである。【００６９】
本明細書において「ノッチ」（Notch）とは、細胞表面受容体のノッチ・ファミリーに属するγ-セクレターゼの競合する基質である。たとえば、ヒトノッチ１（AF308602.1）、マウスノッチ1 （NM_008714.2）、ラットノッチ1（NM_001105721.1）が挙げられる。造血においてノッチ-1は重要な機能を担っているため、ノッチ-1のプロセシングを抑制すると、免疫不全と貧血になる可能性がある。【００７０】
本明細書において「化合物」とは、γ-セクレターゼの活性、好ましくは哺乳動物のγ-セクレターゼの活性を変化させることのできるあらゆる分子であればどのような化合物であってもよいが、たとえば遺伝子ライブラリーの発現産物、天然または合成低分子化合物ライブラリー、核酸（オリゴDNA、オリゴRNA）、天然または合成ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質（細菌の代謝により放出される物質を含む）、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）抽出液、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）培養上清、精製または部分精製ペプチド、海洋生物、植物または動物など由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーに含まれる1つまたは複数の化合物である。前記化合物は新規な化合物であってもよく、公知の化合物であってもよい。さらに、前記化合物は、従来の化学的手段、物理的手段および／または生化学的手段により改変したものであってもよく、たとえばアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの直接的化学修飾またはランダムな化学修飾に付して構造的類似体に改変したものであってもよい。前記化合物は、前記化合物のファーマコフォア検索、コンピューターを用いた構造比較プログラムなどにより同定される化合物であってもよい。当該候補化合物は塩を形成してもよく、さらに当該候補化合物およびその塩は溶媒和物（水和物含む）を形成していてもよい。【００７１】
さらに、化合物は、APPのプロセシングおよび／またはノッチのプロセシングに関係する公知のγ-セクレターゼ促進剤またはγ-セクレターゼ抑制剤、あるいはその構造的類似体であってもよい。γ-セクレターゼの活性および／またはAPPのプロセシングおよび／またはノッチのプロセシングを促進または阻害する公知の化合物を、合理的な薬剤設計を通じて設計することのできる化合物であってもよい。これらの化合物としては、たとえばDAPT （N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester）、CM256（N-[(1,1dimethylethoxy) carbonyl]-L-valyl- (4S, 5S) -4-amino-2, 2-difluoro-5-methyl-3-oxoheptanoyl-L-valyl-L-lsoleucine methyl ester)、(2S)-2-{[(3,5-Difluorophenyl)acetyl]amino}-N-[(3S)-1-methyl-2-oxo-5-phenyl-2,3-dihydro-1H-1,4-benzodiazepin-3-yl]propanamide(Alexis Biochemicals)などが挙げられる。【００７２】
本明細書において「γ-セクレターゼによるEphA4のプロセシングに影響を与える化合物」とは、γ-セクレターゼによるEphA4の開裂活性を阻害する化合物（γ-セクレターゼ阻害剤）、あるいはγ-セクレターゼによるEphA4の開裂活性を促進する化合物（γ-セクレターゼ促進剤）のいずれかを意味する。ここで、γ-セクレターゼ阻害剤には、アンタゴニストが含まれ、γ-セクレターゼ促進剤には、アゴニストが含まれる。γ-セクレターゼ阻害剤およびγ-セクレターゼ促進剤には、γ-セクレターゼのEphA4開裂産物の切断部位を変化させ、ペプチドの長さの異なるEphA4開裂産物を生成させる化合物も含まれる。【００７３】
本明細書において「γ-セクレターゼによりプロセシングをうけたEphA4によるスパイン形成に影響を与える化合物」とは、γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4によりスパインの形成活性を促進する化合物、あるいはγ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4によりスパインの形成活性を阻害する化合物のいずれかを意味する。γ-セクレターゼにより開裂されたEphA4によるスパインの形成活性を促進または阻害する化合物には、γ-セクレターゼにより開裂されたEphA4の分解を阻害または促進する化合物が含まれる。EphA4は、ユビキチン経路に関わる物質と細胞内で結合することが知られており、当該結合を阻害する化合物は、γ-セクレターゼにより開裂されたEphA4によるスパインの形成活性を促進する化合物になりうる。【００７４】
本明細書において、「γ-セクレターゼによりプロセシングをうけたEphA4によるRacの活性に影響を与える化合物」とは、γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4によりRacを活性化する化合物、あるいはγ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4によりRacを阻害する化合物のいずれかを意味する。【００７５】
本明細書において「塩」とは、薬学的に許容される塩を示し、前記化合物と薬学的に許容される塩を形成するものであれば特に限定されない。具体的には、たとえば好ましくはハロゲン化水素酸塩（たとえばフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩など）、無機酸塩（たとえば硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩など）、有機カルボン酸塩（たとえば酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩など）、有機スルホン酸塩（たとえばメタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩など）、アミノ酸塩（たとえばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩など）、四級アミン塩、アルカリ金属塩（たとえばリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（たとえばマグネシウム塩、カルシウム塩など）などが挙げられる。【００７６】
本明細書において「スパイン」とは、化学シナプスを構成する微細構造であり、シナプス後部の樹状突起上に形成される棘状隆起物（棘状突起）をいう（Hering et al., Nat Rev Neurosci. 2001 Dec;2(12):880-8.参照。）。一般に、成熟した脳では、2種類のシナプス（針状突起；Dendritic Filopodiaと棘状突起；Dendritic Spine）が存在しており、記憶・学習が行われる時に針状突起から棘状突起へ移行していくことで、スパインが記憶や学習の過程に関与することが提唱されている。【００７７】
本明細書において「治療」とは、一般的に、所望の薬理学的効果および/または生理学的効果を得ることを意味する。効果は、疾病および／または症状を完全にまたは部分的に防止する点では予防的であり、疾病および/または疾病に起因する悪影響の部分的または完全な治癒という点では治療的である。本明細書において「治療」とは、患者、特にヒトの疾病の任意の治療を含み、たとえば以下の（a）〜（c）の少なくとも一つの治療を含む： 
（a）疾病または症状の素因を持ちうるが、まだ持っていると診断されていない患者において、疾病または症状が起こることを予防すること；
（b）疾病症状を阻害する、すなわち、その進行を阻止または遅延すること；
（c）疾病症状を緩和すること、すなわち、疾病または症状の後退、消失、または症状の進行の逆転を引き起こすこと。【００７８】
たとえば、ADの臨床学的症状としては、進行性見当識障害、記憶喪失、および失語症が挙げられ、最終的には、無能力、言語喪失および無動が起こる。ADの病理学的徴候としては、たとえば、神経原繊維変化、老人斑およびアミロイド血管障害の存在が挙げられる。ADの進行を予防するとは、ADの臨床学的症状および／または病理学的徴候の開始もしくはそれ以上の進行を予防することを意味すると解釈される。たとえば、ADの臨床学的症状または病理学的徴候を有していない患者は、臨床学的症状または病理学的徴候の進行を予防することができる。さらに、軽症のADを患う患者は、それより重症のAD形態を発生するのを予防することができる。ADの進行を遅延させるとは、AD関連症状および／または病理学的徴候の開始時点を遅らせること、あるいは、臨床学的症状および病理学的徴候の進行速度により決定されるADの進行速度を遅くすることを意味すると解釈される。ADの進行を逆転させるとは、AD症状の重症度を軽減する、すなわち、患者のAD症状を重症から、より軽症へと変化させることを意味すると解釈される。その際、軽症への変化は、臨床学的症状または病理学的徴候の減少により示される。【００７９】
患者のAD診断は、公知の種々の方法を用いて実施することができる。典型的には、臨床および病理学的評価を組み合わせて、ADを診断する。たとえば、ADの進行または重症度は、ミニ精神状態検査（Mini Mental State Examination）（MMSE）（Mohsら（1996）Int Psychogeriatr 8：195-203）、アルツハイマー病評価スケール−認識要素（ADAS-cog）（Galaskoら（1997）Alzheimer Dis Assoc Disord, 11 suppl 2：S33-9）、アルツハイマー病共同研究−日常生活動作スケール（ADCS-ADL）（McKhannら（1984）Neurology 34：939-944）、国立神経伝達障害研究所（National Institute of Neurologic Communicative Disorders）および発作−アルツハイマー病および関連障害協会（Stroke-Alzheimer’s Disease and Related Disorders Association）（NINCDS-ADRDA）基準（Folsteinら（1975）J Psychiatr Res 12：189-198、McKhannら（1984）Neurology 34：939-944、）を用いて、判定することができる。さらに、脳の様々な領域について評価し、老人斑や神経原繊維変化の頻度の推定を可能にする方法を用いることができる（Braakら（1991）Acta Neuropathol 82：239-259；Khachaturian（1985）Arch Neuro 42：1097-1105；Mirraら（1991）Neurology 41：479-486；ならびに、Mirraら（1993）Arch Pathol Lab Med 117：132-144）。【００８０】
本発明の方法により、第一の態様として、EphA4の開裂を調べるin vitroアッセイ法と、そのようなアッセイ法を利用して、候補化合物が、γ-セクレターゼに影響を与える化合物であるか否かを二次評価する方法（スクリーニング方法）が提供される。第一の態様では、以下の方法が提供される。本態様の方法では、γ-セクレターゼの新規基質EphA4を利用することが特徴である。本態様の方法は、適切な細胞系の中またはセルフリー系（細胞を含まない系）で行なうことができる。本態様の方法は、γ-セクレターゼとEphA4を候補化合物の存在または非存在下でインキュベーションし、γ-セクレターゼによるEphA4の開裂を評価することができる。【００８１】
第１の態様であるγ-セクレターゼによるEphA4のプロセシングに影響を与える化合物をスクリーニングする方法は以下の工程（ステップ）を含む。【００８２】
(i)候補化合物の存在下および非存在下で、γ-セクレターゼまたはその生物学的に活性なその断片を含む第１の生物学的組成物と、EphA4を含む第２の生物学的組成物とを接触させ；
(ii)当該候補化合物の存在下と非存在下で、当該EphA4の開裂を測定し；
(iii)γ-セクレターゼによる当該EphA4の開裂に影響を与える当該候補化合物を選択し；そして
(iv)前記(iii)で得られた候補化合物を、γ-セクレターゼによるEphA4のプロセシングに影響を与える化合物であると同定する。【００８３】
本態様の方法は、γ-セクレターゼとEphA4を含む適切な細胞系、またはγ-セクレターゼとEphA4を含むセルフリー系（細胞を含まない系）で実施することができる。γ-セクレターゼとEphA4を含む細胞系では、内在性遺伝子発現細胞系であってもよいが、外来性遺伝子を含む細胞系のいずれであってもよい。候補化合物の存在下と非存在下で、γ-セクレターゼとEphA4を含む細胞を適切な培地で培養し、γ-セクレターゼ活性によるEphA4の開裂可能となる反応条件でインキュベーションすることができる。外来性遺伝子を含む細胞系の場合は、その遺伝子が発現できる培養条件で実施することができる。他のγ-セクレターゼの基質が開裂する条件、たとえば当該基質がAPPである場合の当業者に公知の反応条件を適用することもできる。内在性遺伝子発現細胞系では、初代培養神経細胞の場合、たとえば、MEM(Invitrogen)培地に, 5%FBS(Hyclone), 1X B27 Supplement (Invitrogen ), 0.5mM L-Glutamine (Invitrogen), 25μg/ml Insulin (SIGMA), 8μM AraC(SIGMA)を加えた5％ CO2、37℃の培養条件である。外来性遺伝子を含む系では、HEK293細胞株の場合、たとえば、10% FBS(Hyclone) / DMEM(Invitrogen) で5％ CO2、37℃の培養条件である。細胞を含まない系では、候補化合物の存在下と非存在下で、γ-セクレターゼまたはその生物学的に活性なその断片を含む第１の生物学的組成物（たとえば、γ-セクレターゼを含む細胞膜分画）を、EphA4を含む第２の生物学的組成物（たとえば、EphA4を含む細胞膜分画）と混合することによってインキュベーションすることができる。これらはγ-セクレターゼ活性によるEphA4の開裂可能となる反応条件、たとえば10 mM HEPES, pH7.4, 150 mM NaCl, 10% glycerol, 5 mM EDTA, 5 mM 1,10-phenanthroline, 10 μg/ml phosphoramidon, Complete protease inhibitor cocktail (Roche Biochemicals) （Tomita et al., Molecular Neurodegeneration 2006 1:2）で混合するか、または他のγ-セクレターゼの基質が開裂する条件、たとえば当該基質がAPPである場合の当業者に公知の反応条件を適用し混合することができる。γ-セクレターゼまたはEphA4は、精製されたγ-セクレターゼまたはEphA4、その生物学的に活性な断片、そのアナログ、その変異体のいずれであってもよい。【００８４】
候補化合物は、一般的には、約1nM〜1mM、通常約10μM〜1mMの範囲の濃度で添加することができる。γ-セクレターゼのEphA4開裂活性を変化させるモジュレーターを同定するため、候補化合物の存在下と非存在下で上記の各ステップを実施し、候補化合物の存在下でのγ-セクレターゼのEphA4開裂活性を、候補化合物の非存在下での活性と比較することによってその候補化合物の能力を評価することで、γ-セクレターゼによるEphA4の開裂を変化させる化合物を同定する。候補化合物の存在下でEphA4の量または程度がいくらかでも変化するというのは、候補化合物の存在下でγ-セクレターゼのEphA4開裂活性が変化したことの指標であり、γ-セクレターゼの活性のモジュレーターとなる化合物が同定されたことになる。たとえば、コントロールと比べてEphA4開裂産物を増加させる化合物は、γ-セクレターゼのタンパク質分解活性の促進剤であると評価される。一方、コントロールと比べてEphA4開裂産物を減少させる化合物は、γ-セクレターゼのタンパク質分解活性の阻害剤であると評価される。本発明の方法により得られるγ-セクレターゼの促進剤またはそのモジュレーターは、ADの治療に有用である可能性がある。また、本発明の方法により得られるγーセクレターゼの阻害剤は、シナプス、特にスパインの過形成を伴う疾患の治療に有用である可能性がある。【００８５】
EphA4がタグ付の場合は、そのタグに対する結合物、たとえば抗体、を用いて検出することができる。たとえば、EphA4のC末端にヘマグルチニンタグが付与されたペプチドの場合は、公知の抗HA抗体で検出することができる。【００８６】
EphA4の開裂の解析は、EphA4のN末端断片とC末端断片の一方または両方か、開裂を示す指標を測定する。γ-セクレターゼによるEphA4の開裂の解析は、抗EphA4抗体、またはEphA4が開裂する結果として生成されるEphA4開裂産物を認識する抗体、好ましくはEphA4の細胞内領域を認識する抗体を用いることができる。EphA4のタグ付きポリペプチド開裂産物を検出する場合は、選択されたタグに対する抗体を用いることができる。たとえば、EphA4のC末端にHAタグを付けた場合、抗HAタグ抗体を用いて検出することができる。この場合、EphA4が開裂する結果として生成されるEphA4のC末端の存在と濃度を明らかにすることができる。EphA4またはタグ付のEphA4が標識された場合は、その標識の消光状態を検出することができる。【００８７】
EphA4の抗体は、EphA4を認識する抗体であれば特に限定されないが、好ましくはEphA4の細胞内領域を認識する抗体である。たとえば、Tremblay et al., J. Comp. Neurol 501 691-702に記載の抗体、または市販の抗ラットEphA4抗体（Upstate、Zymed、Santacruze）を利用することができる。また、当業者であれば免疫原（抗原）を免疫し、モノクローナル抗体の既存の一般的な製造方法に従って製造することができる。たとえば、当該抗原を、必要に応じてフロイントアジュバント（Freund's Adjuvant）とともに、非ヒト哺乳動物に免疫する。ポリクローナル抗体は、当該免疫感作動物から得た血清から取得することができる。またモノクローナル抗体は、当該免疫感作動物から得た当該抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）から融合細胞（ハイブリドーマ）を調製し、当該ハイブリドーマをクローン化し、当該哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造される。ハイブリドーマからのモノクローナル抗体 の製造は、ハイブリドーマをin vitro、または非ヒト哺乳動物、好ましくはマウスまたはラット、より好ましくはマウスの腹水中などでのin vivoで行い、得られた培養上清、または当該哺乳動物の腹水から単離することにより行うことができる。モノクローナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あるいは腹水を、飽和硫酸アンモニウム、ユーグロブリン沈澱法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（DEAEまたはDE52など）、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインＡカラム等のアフィニティカラムクロマトグラフィーに供すること等により行うことができる。当該モノクローナル抗体には、当該抗体を構成する重鎖および／または軽鎖の各々のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有する重鎖および／または軽鎖からなるモノクローナル抗体も包含される。【００８８】
また、本発明の別の態様において、上述された本発明の第１の態様と並行に、同時に、または前後して、候補化合物が、APPおよび／またはノッチのプロセシングに影響を与えるか否かを評価することができる。たとえば、上述された本態様の方法と並行に、同時に、または前後して、APPまたはAPPγ-セクレターゼ開裂部位を含むポリペプチドの開裂を測定する工程を含むことができる。また、さらに、ノッチまたはノッチγ-セクレターゼ開裂部位を含むポリペプチドの開裂を測定する工程を含むことができる。これにより、たとえば、候補化合物が、APPおよび／またはノッチのプロセシングに比較してEphA4のプロセシングに選択的に作用するか否かを評価することができる。具体的には、候補化合物が、EphA4のプロセシングにのみ選択的に作用する化合物、APPのプロセシングにのみ選択的に作用する化合物、ノッチのプロセシングにのみ選択的に作用する化合物、APPおよびEphA4のプロセシングに選択的に作用する化合物、ノッチおよびEphA4のプロセシングに選択的に作用する化合物、またはAPP、ノッチおよびEphA4のプロセシングに選択的に作用する化合物を同定することができる。【００８９】
創薬の候補化合物としては、健常な動物の生体内での代謝活性と同様に作用する化合物あるいは当該代謝を調節する化合物が好ましい。たとえば、γ-セクレターゼによるAPP開裂活性の抑制によってAβ42の産生を抑制し、γ-セクレターゼによるEphA4開裂活性を抑制せず、かつγ-セクレターゼによるノッチ開裂活性は抑制しない化合物が好ましい。また、たとえば、γ-セクレターゼによるAPP開裂活性の促進によってAβ40の産生を促進してAβ42の産生を抑制し、γ-セクレターゼによるEphA4開裂活性の促進によってEphA4の分解を促進し、かつγ-セクレターゼによるノッチ開裂活性は抑制しない化合物が好ましい。【００９０】
このγ-セクレターゼによるAPP、ノッチ、またはAPPもしくはノッチのγ-セクレターゼ開裂部位を含むポリペプチドの開裂を測定する方法は、当業者に公知のアッセイ法を適用することができる（Song et al. PNAS 1999 96 6959-6963, Moehlmann et al. PNAS 2002 99 8025-8030）。たとえば、候補化合物の存在下および非存在下で、γ-セクレターゼまたはその生物学的に活性なその断片を含む第１の生物学的組成物を、APPまたはAPPγ-セクレターゼ開裂部位を含むポリペプチドを含む生物学的組成物、あるいはノッチまたはノッチγ-セクレターゼ開裂部位を含むポリペプチドを含む生物学的組成物に接触させ、当該APPまたはAPPγ-セクレターゼ開裂部位を含むポリペプチド、あるいはノッチまたはノッチγ-セクレターゼ開裂部位を含むポリペプチドの開裂を測定することができる。当該測定は、APPまたはAPPγ-セクレターゼ開裂部位を含むポリペプチド、あるいはノッチまたはノッチγ-セクレターゼ開裂部位を含むポリペプチドの開裂産物を測定するとよい。たとえばAPPまたはAPPγ-セクレターゼ開裂部位を含むポリペプチドの開裂産物としては、Aβが挙げられ、その量を測定し、候補化合物の存在下および非存在下での量的変動を比較するとよい。また、APPまたはAPPγ-セクレターゼ開裂部位を含むポリペプチド、あるいはノッチまたはノッチγ-セクレターゼ開裂部位を含むポリペプチドの開裂産物を認識する公知の抗体を用いて開裂の程度、開裂産物の量を測定することができる。APPまたはAPPγ-セクレターゼ開裂部位を含むポリペプチドの開裂産物を認識する抗体としては、市販品（SIGMA、Chemicon）を用いることができる。測定方法は、たとえばWestern Blotにより行なうことができる。ノッチまたはノッチγ-セクレターゼ開裂部位を含むポリペプチドの開裂産物を認識する抗体としては、市販品（Santacruze）を用いることができる。測定方法は、たとえばWestern Blotにより行なうことができる。【００９１】
本態様には、本態様の方法によって同定される化合物を用いて、ポストシナプスの形態、あるいは神経伝達の機能を評価する方法も含まれる。たとえば、前記ポストシナプスの形態の評価は、スパイン（Spine）の数、スパインの形状を評価する方法である（Pak D et al. Neuron 2001 31. 289-303）。また、神経伝達機能の評価は、たとえば、培養細胞や培養スライスを用いて、シナプス膜上でおこる電気的な変化を、評価する方法である (Saura et al., Neuron 2004 42 23-36)。【００９２】
本態様の方法には、多数の化合物を同時に試験する当業者に公知のハイスループット・スクリーニング（HTS）法も含まれる（US5876946、US5902732、JayawickremeとKost,Curr. Opin. Biotechnol., 8, pp.629-634, 1997, HoustonとBanks, Curr. Opin. Biotechnol., 8, pp.734-740, 1997）。【００９３】
本態様の方法には、公知のモデル動物の利用も含まれる。本発明のin vitroの方法によって選択された化合物を、たとえばAPPのプロセシングおよび／またはADの非ヒトモデルを利用して、その化合物の生体内における効果を解析することができる。たとえばAPPトランスジェニック非ヒト動物モデルは当該分野で周知であり、たとえばTg2576マウス（J. Neurosci. 21(2), 372-381, 2001、J. Clin. Invest., 112, 440-449, 2003）である。たとえば、Tg2576マウスに公知のγ-セクレターゼ阻害剤であるDAPT、(2S)-2-{[(3,5-Difluorophenyl)acetyl]amino}-N-[(3S)-1-methyl-2-oxo-5-phenyl-2,3-dihydro-1H-1,4-benzodiazepin-3-yl]propanamide（Alexis Biochemicals）、もしくは本発明の化合物を投与したときの脳内、脳脊髄液中、血清中の各Aβ量を測定する方法（J. Pharmacol. Exp. Ther. 305, 864-871, 2003）による評価、γ-セクレターゼの活性が変化したことの脳の変化（たとえばAβの産生量変化、脳の萎縮程度）の病理学的検査、生存率、運動量、または摂食量を評価する方法などがある。【００９４】
また、本発明の方法により、第二、第三の態様として、ポストシナプスの形態あるいは神経伝達の機能を評価する方法を利用して、γ-セクレターゼに影響を与える化合物であるか否かを二次評価する方法（スクリーニング方法）と、スパイン形成に影響を与える化合物であるか否かを二次評価する方法（スクリーニング方法）とが提供される。第二、第三の態様では、以下の方法が提供される。【００９５】
第二の態様の方法でも、第一の態様と同様、EphA4を利用することが特徴である。第二の態様の方法は、適切な細胞系の中で行うことができる。【００９６】
第二の態様の方法は、γ-セクレターゼとEphA4を候補化合物の存在下または非存在下でインキュベーションし、スパイン形成細胞のスパインの数を測定することでスパイン形成を評価することができる。【００９７】
第二の態様であるスクリーニングする方法は以下の工程（ステップ）を含む。【００９８】
(i) 候補化合物の存在下および非存在下で、γ-セクレターゼとEphA4を接触させ；
（ii）候補化合物の存在下および非存在下におけるスパイン形成細胞のスパインの数を測定し；
（iii）前記（ii）で測定されたスパインの数に基づき、当該スパインの数に影響を与える候補化合物を選択し；
（iv）前記（iii）で選択された候補化合物を、γ-セクレターゼによるEphA4のプロセシングに影響を与える化合物であると同定する。【００９９】
第二の態様の方法は、γ-セクレターゼとEphA4の接触による細胞内シグナル伝達を介してスパインを形成する過程が観察可能な細胞系で実施することが可能であり、第１の態様における「γ-セクレターゼとEphA4を含む適切な細胞系」とスパイン形成細胞を含む細胞系で実施することができる。この場合において、「γ-セクレターゼとEphA4を含む適切な細胞系」とスパイン形成細胞は別細胞で構成されていてもよいし、同一の細胞で構成されていてもよい。「スパイン形成細胞」とは、スパインを形成することが可能な細胞であり、たとえば、中枢神経系における興奮性シナプスをもつ神経細胞などが挙げられる。【０１００】
本態様における好ましい細胞系としては、たとえば初代培養神経細胞、脳切片スライス培養細胞などが挙げられる。当該細胞系は、初代培養神経細胞の場合、後述する実施例２を参照して得ることが可能であり、脳切片スライス培養細胞は、海馬の場合、例えば以下のようにして得ることが可能である。【０１０１】
生後8-9日齢のラットの全脳を取り出し、GBSS溶液（HBSS(SIGMA)/MEM(Invitrogen)/Horse serum(SIGMA)=1:2:1）を入れたビーカーに入れ、1分程度全脳を冷却させる。冷却後、全脳をビーカーから取り出してステージへ載せ、小脳と大脳の吻側側半分を切り落とした後、接着剤を用いてステージに固定する。固定後の組織片から海馬を切り出す。得られた切片（300-400μm）を予め準備したウェル上のメンブレンに載せ、メンブレン上で培養した初代培養細胞を使用することも可能である（Stoppini, L., Buchs, P.-A. and Muller, D. J. Neurosci. Methods.37 (1991) 173-182、Gahwiler, B. H. Trends Neurosci. 11 (1988) 484-489、Sakaguti, T., Okada, M. and Kawasaki, K. Neurosci. Res. 20 (1994) 157-164参照。）。【０１０２】
第二態様において測定されるスパインは、針状突起および／または棘状突起の段階にあるシナプス上のスパインであり、好ましくは、針状突起および棘状突起の段階にあるシナプス上のスパインである。針状突起および棘状突起の段階にあるシナプスは、実際に記憶や学習が行われる時に存在する形態のシナプスであり、当該シナプス上のスパインを測定することで、生体内で機能している状態にあるシナプスあるいはその前段階にあるシナプスにおけるスパインを測定することができる。【０１０３】
スパインの数の測定に際しては、スパインに特異的に発現する分子を認識する抗体を用いたり、スパインに特異的に発現する分子にタグを付けたポリペプチドを認識する抗体を用いたり、または、細胞自体が標識されたスパイン形成細胞を用いることでスパインの検出が可能である。【０１０４】
細胞自体が標識されたスパイン形成細胞を用いる場合には、当該標識を検出することが可能な顕微鏡を用いてスパイン形成細胞上の棘状突起物を目印にスパインの検出が行われる。この場合における標識としてはEGFPが挙げられる。【０１０５】
スパインに特異的に発現する分子を認識する抗体を用いる場合、スパインに特異的に発現する分子を認識する抗体として、たとえば、抗PSD-95（ Postsynaptic Density-95）抗体, 抗Glutamate Receptor1抗体, 抗Actin抗体, 抗Homer抗体, 抗Shank抗体などが挙げられる。【０１０６】
また、スパインに特異的に発現する分子にタグを付けたポリペプチドを検出する場合は、選択されたタグに対する抗体を用いることができる。スパインに特異的に発現する分子としてPSD-95を選択して、PSD-95のC末端にEGFPタグを付けた場合、抗EGFPタグ抗体を用いて検出することができる。この場合、PSD-95のC末端の存在と濃度を明らかにすることができる。【０１０７】
γ-セクレターゼのEphA4開裂活性を変化させるモジュレーターを同定するため、候補化合物の存在下と非存在下で上記の各ステップを実施し、候補化合物の存在下でのスパイン形成活性を候補化合物の非存在下での活性と比較することによってその候補化合物の能力を評価することで、γ-セクレターゼによるEphA4開裂を変化させる化合物を同定する。候補化合物の存在下でスパインの数がいくらかでも変化するというのは、候補化合物の存在下でγ-セクレターゼのEphA4開裂活性が変化したことの指標であり、γ-セクレターゼの活性のモジュレーターとなる化合物が同定されたことになる。たとえば、コントロールと比べてスパインの数を増加させる化合物は、γ-セクレターゼのタンパク質分解活性のモジュレーターまたはγ-セクレターゼのタンパク質分解活性の促進剤であると評価される。一方、コントロールと比べてスパインの数を減少させる化合物は、γ-セクレターゼのタンパク質分解阻害活性のモジュレーターまたはγ-セクレターゼのタンパク質分解活性の阻害剤であると評価される。【０１０８】
これまでアルツハイマーの主因と考えられてきたAβ42 には、γ-セクレターゼの切断位置によって長さの異なるペプチドが存在し、これらのペプチドでは、細胞毒性を生じるβシート構造を形成しにくいことから、健常な動物の生体内ではAPPがγ-セクレターゼにより適切な位置で切断されており、Aβ42はAPPがγ-セクレターゼにより適切な位置で切断されないことで生じる産物であると考えられている。つまり、ADを始めとする認知症の治療には、APPを適切な位置で切断するγ-セクレターゼのタンパク質分解活性の促進剤が有用であると考えられている。【０１０９】
したがって、本発明の方法により得られるγ-セクレターゼのタンパク質分解活性の促進剤は、認知症、特にADの治療に有用である可能性がある。【０１１０】
一方、シナプスの過剰な形成、特にスパインの過形成を伴う疾患の治療には、γ‐セクレターゼのタンパク質分解活性の阻害剤が有用であると考えられ、本発明の方法により得られるγ‐セクレターゼのタンパク質分解活性の阻害剤が当該疾患の治療に有用である可能性がある。【０１１１】
なお、第二の態様で特に説明のない語句は、上記第一の態様における同一語句を適宜参照することができる。【０１１２】
第三の態様の方法では、γセクレターゼによりプロセシングを受けた（開裂された）細胞内EphA4を利用することが特徴である。第三の態様の方法は、適切な細胞系の中で行うことができる。第三の態様の方法は、細胞内EphA4を発現する前後の細胞をインキュベーションし、細胞内EphA4を発現する前後の細胞のスパインの数を測定することでスパイン形成を評価することができる。【０１１３】
第三の態様であるスクリーニングする方法は以下の工程（ステップ）を含む。【０１１４】
・  γセクレターゼにより開裂された細胞内EphA4を発現したスパイン形成細胞を培養し、
・  前記（i）で培養されたスパイン形成細胞に対し、候補化合物の存在下または非存在下でスパインの数を測定し； 
（iii）前記（ii）で測定されたスパインの数に基づき、当該スパインの数に影響を与える候補化合物を選択し；
（iｖ）前記（iii）で選択された候補化合物を、γ-セクレターゼによりプロセシングをうけたEphA4によるスパイン形成に影響を与える化合物であると同定する。【０１１５】
第三の態様の方法は、γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4の存在による細胞内シグナル伝達を介してスパインを形成する過程を観察し得る細胞系で実施することが可能であり、第二の態様で適用される細胞系に限られず、γ-セクレターゼにより開裂されたEphA4細胞内断片の発現によりスパイン形成をする細胞を含む細胞系であればどのような細胞系を用いてもよい。【０１１６】
γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4を発現した細胞には、
(a) γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4の発現が外因性遺伝子由来であり、当該細胞内EphA4を発現する前の細胞と発現した後の細胞で構成される場合、および
(b) γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4の発現が内在性遺伝子由来であり、当該細胞内EphA4を発現する前の細胞と発現した後の細胞で構成される場合
のいずれか一方又は両者が含まれる。【０１１７】
γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4が外因性遺伝子由来の場合は、γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4は、後述の第７態様が適用され、γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4の遺伝子が発現できる培養条件あるいはスパイン形成が可能な培養条件で実施することができる。初代培養神経細胞の場合、たとえば、MEM(Invitrogen)培地に, 5%FBS(Hyclone), 1X B27 Supplement (Invitrogen ), 0.5mM L-Glutamine (Invitrogen), 25μg/ml Insulin (SIGMA), 8μM AraC(SIGMA)を加えた5％ CO2、37℃の培養条件である。HEK293細胞株の場合、たとえば、10% FBS(Hyclone) / DMEM(Invitrogen) で5％ CO2、37℃の培養条件である。【０１１８】
γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4が内在性遺伝子由来の場合では、EphA4がγ-セクレターゼにより開裂される条件またはスパインが形成される条件を検討し、開裂前後の条件にある細胞またはスパイン形成前後の条件にある細胞をγ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4を発現する前後の細胞として用いればよい。【０１１９】
測定対象となるスパインや、その測定方法は上記第二の態様と同様である。【０１２０】
γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4によりスパイン形成活性を変化させるモジュレーターを同定するため、候補化合物の存在下または非存在下で上記の各ステップを実施し、γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4の発現後でのスパイン形成活性をγ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4の発現前での活性と比較することによってその候補化合物の能力を評価することで、γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4によりスパイン形成活性を変化させる化合物を同定する。γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4の発現後でスパインの数がいくらかでも変化するというのは、γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4によりスパイン形成活性が変化したことの指標であり、γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4によるスパイン形成の活性のモジュレーターとなる化合物が同定されたことになる。たとえば、コントロールと比べてスパインの数を増加させる化合物は、スパイン形成促進剤であると評価される。一方、コントロールと比べてスパインの数を減少させる化合物は、スパイン形成阻害剤であると評価される。【０１２１】
また、スパイン形成促進剤は、γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4の分解を抑制する化合物であってもよい。γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4の分解を抑制する化合物は、γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4の実効的な量を増加させるのでスパインの形成活性を促進する化合物になりえる。このような働きをする化合物としては、たとえば細胞内でユビキチン経路に関わる物質との結合を阻害する化合物が挙げられる。【０１２２】
一方、スパイン形成阻害剤は、γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4の分解を促進する化合物であってもよい。γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4の分解を促進する化合物は、γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4の実効的な量を減少させるのでスパインの形成活性を阻害する化合物になりえる。このような働きをする化合物としては、たとえば細胞内でユビキチン経路に関わる物質との結合を促進する化合物が挙げられる。【０１２３】
本発明の方法により得られるスパイン形成促進剤は、認知症、特にADの治療に有用である可能性がある。【０１２４】
一方、本発明の方法により得られるスパイン形成促進剤は、シナプスの過剰な形成、特にスパインの過形成を伴う疾患の治療に有用である可能性がある。【０１２５】
なお、第三の態様で特に説明のない語句は、上記第二の態様における同一語句を適宜参照することができる。【０１２６】
本発明の方法により、第四の態様として、γ-セクレターゼによるEphA4の開裂位置を調べるin vitroアッセイ法と、そのようなアッセイ法を利用してγ-セクレターゼによるEphA4のプロセシングに影響を与える化合物であるか否かを二次評価する方法（スクリーニング方法）が提供される。第４の態様では、以下の方法が提供される。本態様の方法では、第一の態様と同様、EphA4を利用することが特徴である。本態様の方法は、適切な細胞系の中またはセルフリー系（細胞を含まない系）で行なうことができる。本態様の方法は、γ-セクレターゼとEphA4を候補化合物の存在または非存在下でインキュベーションし、γ-セクレターゼによるEphA4の開裂位置調整を評価することができる。【０１２７】
第４の態様であるγ-セクレターゼによるEphA4のプロセシングに影響を与える化合物をスクリーニングする方法は以下の工程（ステップ）を含む。【０１２８】
(i) 候補化合物の存在下で、γ-セクレターゼまたはその生物学的に活性なその断片を含む第１の生物学的組成物とEphA4を含む第２の生物学的組成物とを接触させ；
（ii）γ-セクレターゼにより開裂されたEphA4を含む第２の生物学的組成物を回収し；
（iii）前記（ii）で回収された生物学的組成物のアミノ酸配列を同定し；
（iv）前記（iii）で同定されたアミノ酸配列が、候補化合物の非存在下で前記接触処理したときのEphA4のアミノ配列と異なる場合に、当該候補化合物を、EphA4の開裂位置を調節する化合物であると同定する。【０１２９】
本態様の方法は、第一の態様で用いられる「γ-セクレターゼとEphA4を含む適切な細胞系、またはγ-セクレターゼとEphA4を含むセルフリー系」で実施可能である。当該系において好ましい態様のEphA4は、第一の態様における融合ポリペプチド、タグもしくは標識物を付加したポリペプチド、それ以外の修飾が施されたポリペプチドであり、より好ましくは、EphA4の細胞内領域側にタグを付けたポリペプチドである。かかるペプチドとして、好ましくはラット細胞内EphA4のタグ付きポリペプチドであり、たとえばラット細胞内EphA4のC末端にHAタグを備えたポリペプチド（配列番号９４）である。もちろん、ラット以外の動物、好ましくはヒトのタグ付き細胞内EphA4配列の全体または一部、たとえば配列番号１００のアミノ酸配列もラットEphA4のタグ付きポリペプチドと同様に用いることができる。【０１３０】
具体的には、候補化合物の存在下で上記の各ステップを実施し、候補化合物の存在下でのγ-セクレターゼによるタグ付きEphA4の配列を候補化合物の非存在下での配列と比較することによってEphA4がγ-セクレターゼにより分解される位置を評価することで、その候補化合物がγ-セクレターゼによるEphA4の開裂位置を調節する化合物であると同定する。複数の候補化合物で上記ステップを行い、得られたγ-セクレターゼによるタグ付きEphA4の配列が同定された複数の化合物間で異なる場合、γ-セクレターゼにより異なるアミノ酸配列をもつEphA4分解物が得られたことになり、γ-セクレターゼによるEphA4の開裂位置を調整する複数の化合物を同定したことになる。【０１３１】
本発明の方法により得られるγ-セクレターゼによる開裂位置調整剤は、認知症、特にADの治療に有用である可能性がある。【０１３２】
EphA4を含む第２の生物学的組成物は、選択されたタグに対する結合物、たとえば抗体を用いて検出することができ、EphA4のC末端にHAタグを付けた場合、抗HAタグ抗体を用いて検出することができる。当該組成物の回収は、タグを利用して免疫沈降法やウェスタンブロット法により回収することができる。【０１３３】
アミノ酸配列の同定手法は特に限定されるものではなく、当業者に周知の任意の手法を用いることができるが、質量分析を用いて行うことが好ましい。【０１３４】
回収されたEphA4を含む第２の生物学的組成物の質量分析は、例えばタグとの結合を利用して回収後の組成物を精製し、好ましくは精製後にプロテアーゼ処理を行った後、質量分析を行えばよい。精製、プロテアーゼ処理、質量分析は公知の方法、装置等を適宜使用すればよい。【０１３５】
質量分析がなされた当該生物学的組成物のアミノ配列の決定に際しては、EphA4の配列と質量分析で得られた分子量をもとにγ-セクレターゼにより開裂されたEphA4の配列が定まる。これに伴い、γ-セクレターゼによるEphA4の開裂位置も決定される。【０１３６】
EphA4の開裂位置を調節する化合物であるか否かの同定に際しては、質量分析がなされた当該生物学的組成物のアミノ酸配列と比較して、候補化合物の非存在下におけるEphA4のアミノ配列が異なる場合に、当該候補化合物がEphA4の開裂位置を調節する化合物であると同定する。【０１３７】
上述された本態様の方法と並行に、同時に、または前後して、候補化合物が、APPおよび／またはノッチのプロセシングに影響を与えるか否かを評価することができる。たとえば、上述された本態様の方法と並行に、同時に、または前後して、APPまたはAPPγ-セクレターゼ開裂部位を含むポリペプチドの開裂を測定する工程を含むことができる。また、さらに、ノッチまたはノッチγ-セクレターゼ開裂部位を含むポリペプチドの開裂を測定する工程を含むことができる。これにより、たとえば、候補化合物が、APPおよび／またはノッチのプロセシングに比較してEphA4のプロセシングに選択的に作用するか否かを評価することができる。【０１３８】
このようにして同定されたγ-セクレターゼによるEphA4の開裂位置を調整する複数の化合物は、in vitroにおいてスパインを形成させる化合物であることが好ましく、in vivoにおいて記憶を改善させる化合物が好ましい。【０１３９】
本態様には、本態様の方法によって同定される化合物を用いて、ポストシナプスの形態、あるいは神経伝達の機能を評価する方法も含まれる。【０１４０】
本態様の方法には、多数の化合物を同時に試験する当業者に公知のハイスループット・スクリーニング（HTS）法も含まれる。【０１４１】
本態様の方法には、公知のモデル動物の利用も含まれる。本発明のin vitroの方法によって選択された化合物を、たとえばADの非ヒトモデルを利用して、その化合物の生体内における効果を解析することができる。【０１４２】
なお、第四の態様で特に説明のない語句は、上記第一の態様における同一語句を適宜参照することができる。【０１４３】
また、本発明の方法により、第五、第六の態様として、Racの活性を評価する方法を利用して、Racの活性に影響を与える化合物であるか否かを二次評価する方法（スクリーニング方法）と、スパイン形成に影響を与える化合物であるか否かを二次評価する方法（スクリーニング方法）とが提供される。第五、第六の態様では、以下の方法が提供される。【０１４４】
第五の態様では、以下の方法が提供される。本態様の方法では、第三の態様と同様、γセクレターゼによりプロセシングを受けた（開裂された）細胞内EphA4を利用することが特徴である。【０１４５】
第五の態様の方法では、γセクレターゼによりプロセシングを受けた（開裂された）細胞内EphA4を利用することが特徴である。第五の態様の方法は、適切な細胞系の中で行うことができる。第五の態様の方法は、細胞内EphA4を発現したRac発現細胞をインキュベーションし、候補化合物の存在下および非存在下における細胞のRacの活性を測定することでRacの活性に対する影響を評価することができる。【０１４６】
第五の態様であるスクリーニングする方法は以下の工程（ステップ）を含む。【０１４７】
（i）γセクレターゼにより開裂された細胞内EphA4を発現したRac発現細胞を培養し、
（ii）前記（i）で培養されたRac発現細胞に対し、候補化合物の存在下および非存在下におけるRac活性を測定し； 
（iii）前記（ii）の測定において、Racの活性に影響を与える候補化合物を選択し；
（iｖ）前記（iii）で選択された候補化合物を、γ-セクレターゼによりプロセシングをうけたEphA4によるRacの活性に影響を与える化合物であると同定する。【０１４８】
第五の態様の方法は、γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4の存在による細胞内シグナル伝達を介してRacの活性が変化する過程を観察し得る細胞系で実施することが可能であり、γ-セクレターゼにより開裂されたEphA4細胞内断片の発現によりRacの活性変化を観察する細胞を含む細胞系であればどのような細胞系を用いてもよい。γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4の発現は、他の態様と同様、外因性遺伝子および内在性遺伝子のいずれか一方の由来又は両者の由来のどちらでも構わない。本態様における好ましい細胞系としては、たとえばγ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4を遺伝子導入したRac発現細胞などが挙げられる。Rac発現細胞は、アクチン細胞骨格の再編成に関与する付着細胞群にみられ、たとえば繊維芽細胞が挙げられる。本態様で使用される細胞系の培養条件は、γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4の遺伝子が発現できるとともに、Racが活性化される培養条件で実施することができる。NIH3T3細胞にγ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4を遺伝子導入した場合、たとえば、MEM(Invitrogen)培地に, 10%CBS(フロー), Antibiotic-Antimycotic (Invitrogen)を加えた5％ CO2、37℃の培養条件である。【０１４９】
γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4によりRac活性に影響を与える化合物を同定するため、上記の各ステップを実施し、候補化合物の存在下と非存在下でのRac活性を比較することによってその候補化合物の能力を評価し、γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4によりRacの活性を変化させる化合物を同定する。候補化合物の存在と非存在の状態でRacの活性がいくらかでも変化するというのは、γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4は候補化合物の存在によりRacの活性が変化したことの指標であり、γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4によるRacを活性させる化合物あるいはγ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4によるRacを阻害する化合物が同定されたことになる。たとえば、コントロールと比べてRacの活性を増加させる化合物は、Racの活性剤であると評価される。一方、コントロールと比べてRacの活性を減少させる化合物は、Racの阻害剤であると評価される。【０１５０】
また、Racの活性剤は、γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4の分解を抑制する化合物であってもよい。Racの阻害剤は、γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4の分解を促進する化合物であってもよい。【０１５１】
本発明の方法により得られるRacの活性剤は、認知症、特にADの治療に有用である可能性がある。【０１５２】
なお、第五の態様で特に説明のない語句は、上記第三の態様における同一語句を適宜参照することができる。【０１５３】
また、Racが活性化されるとスパインが形成されることはPenzes P. et.al., Trends Cell Biol. 2008 Sep;18(9):405-13. Epub 2008 Aug 11.にすでに報告されていることからγ-セクレターゼによりプロセシングを受けた（開裂された）細胞内EphA4はRacを活性化させた後スパイン形成を誘導することが容易に推定される。よって、以下の第六の態様が提供可能となる。【０１５４】
第六の態様では、以下の方法が提供される。本態様の方法では、第五の態様と同様、γセクレターゼによりプロセシングを受けた（開裂された）細胞内EphA4を利用することが特徴である。第五の態様と同様、適切な細胞系の中で行うことができ、細胞内EphA4を発現したRac発現細胞をインキュベーションし、候補化合物の存在下および非存在下における細胞のRacの活性を測定することでスパイン形成を評価することができる。【０１５５】
第五の態様であるスクリーニングする方法は以下の工程（ステップ）を含む。【０１５６】
（i）γセクレターゼにより開裂された細胞内EphA4を発現したRac発現細胞を培養し、
（ii）前記（i）で培養されたRac発現細胞に対し、候補化合物の存在下および非存在下におけるRac活性を測定し； 
（iii）前記（ii）の測定において、Racの活性に影響を与える候補化合物を選択し；
（iｖ）前記（iii）で選択された候補化合物を、γ-セクレターゼによりプロセシングをうけたEphA4によるスパイン形成に影響を与える化合物であると同定する。【０１５７】
第六の態様の方法は、γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4によりスパイン形成に影響を与えるモジュレーターを同定するため、第五の態様の方法のステップ（iｖ）において選択された候補化合物を、γ-セクレターゼによりプロセシングをうけたEphA4によるRacの活性に影響を与える化合物であると同定する代わりに、γ-セクレターゼによりプロセシングをうけたEphA4によるスパイン形成に影響を与える化合物と同定する以外は同様の方法で行うことができる。【０１５８】
ここで、候補化合物の存在と非存在の状態でRacの活性がいくらかでも変化するというのは、γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4は候補化合物の存在によりRacの活性の変化を介してスパインを形成させることの指標となり、γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4によるスパイン形成を活性化する化合物、あるいはγ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4によるスパイン形成活性を阻害する化合物が同定されたことになる。たとえば、コントロールと比べてRac活性を増加させる化合物は、スパイン形成促進剤であると評価される。一方、コントロールと比べてRacの活性を減少させる化合物は、スパイン形成阻害剤であると評価される。【０１５９】
本発明の方法により得られるスパイン形成促進剤は、認知症、特にADの治療に有用である可能性がある。【０１６０】
一方、本発明の方法により得られるスパイン形成促進剤は、シナプスの過剰な形成、特にスパインの過形成を伴う疾患の治療に有用である可能性がある。【０１６１】
なお、第六の態様で特に説明のない語句は、上記第五の態様における同一語句を適宜参照することができる。【０１６２】
本発明の方法によって同定される化合物を含む医薬組成物、好ましくは本発明のAD治療剤は、患者に、種々の形態、経口または非経口（たとえば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与）のいずれかの投与経路で投与することができる。従って、本発明の化合物を含有する医薬組成物は、単独で用いることも可能であるが、投与経路に応じて慣用される方法により薬学的に許容され得る担体を用いて適当な剤形に製剤化することが可能である。【０１６３】
好ましい剤形としては、たとえば錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤などによる経口剤、吸入剤、坐剤、注射剤（点滴剤を含む）、軟膏剤、点眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤、リポソーム剤などによる非経口剤が挙げられる。【０１６４】
これらの製剤の製剤化に用いる担体には、たとえば通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、pH調整剤、防腐剤、抗酸化剤、増量剤、湿潤化剤、表面活性化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、無痛化剤などを使用することができ、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して常法により製剤化することが可能である。使用可能な無毒性のこれらの成分としては、たとえば大豆油、牛脂、合成グリセライドなどの動植物油；たとえば流動パラフィン、スクワラン、固形パラフィンなどの炭化水素；たとえばミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピルなどのエステル油；たとえばセトステアリルアルコール、ベヘニルアルコールなどの高級アルコール；シリコン樹脂；シリコン油；たとえばポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーなどの界面活性剤；たとえばヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロースなどの水溶性高分子；たとえばエタノール、イソプロパノールなどの低級アルコール；たとえばグリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトール、ポリエチレングリコールなどの多価アルコール（ポリオール）；たとえばグルコース、ショ糖などの糖；たとえば無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、ケイ酸アルミニウムなどの無機粉体；塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムなどの無機塩；精製水などが挙げられる。【０１６５】
賦形剤としては、たとえば乳糖、果糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビット、結晶セルロース、二酸化ケイ素などが、結合剤としては、たとえばポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール・ポリオキシエチレン・ブロックポリマー、メグルミンなどが、崩壊剤としては、たとえば澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン、カルボキシメチルセルロース・カルシウムなどが、滑沢剤としては、たとえばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油などが、着色剤としては医薬品に添加することが許可されているものが、矯味矯臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香散、ハッカ油、竜脳、桂皮末などが、それぞれ用いられる。上記の成分は、それらの塩またはその溶媒和物であってもよい。【０１６６】
たとえば経口製剤は、本発明の化合物に賦形剤、さらに必要に応じてたとえば結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法によりたとえば散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤などとする。錠剤・顆粒剤の場合には、たとえば糖衣、その他必要により適宜コーティングすることはもちろん差支えない。シロップ剤や注射用製剤などの場合は、たとえばpH調整剤、溶解剤、等張化剤などとともに、また必要に応じて溶解補助剤、安定化剤などを加えて、常法により製剤化する。また、外用剤の場合は、特に製法が限定されず、常法により製造することができる。使用する基剤原料としては、医薬品、医薬部外品、化粧品などに通常使用される各種原料を用いることが可能であり、たとえば動植物油、鉱物油、エステル油、ワックス類、高級アルコール類、脂肪酸類、シリコン油、界面活性剤、リン脂質類、アルコール類、多価アルコール類、水溶性高分子類、粘土鉱物類、精製水などの原料が挙げられ、必要に応じ、pH調整剤、抗酸化剤、キレート剤、防腐防黴剤、着色料、香料などを添加することができる。さらに、必要に応じて血流促進剤、殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、アミノ酸、保湿剤、角質溶解剤などの成分を配合することもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、1〜90重量%の間で変動され得る。本発明に使用する化合物類、本発明に使用するペプチド類または本発明に使用するポリヌクレオチド類を前記治療に使用する場合は、少なくとも90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上に精製されたものを使用するのが好ましい。【０１６７】
本発明の化合物を含有する本発明の医薬組成物の有効な投与量は、たとえば症状の程度、年齢、性別、体重、投与形態、塩の種類、疾患の具体的な種類などに応じて異なるが、通常、成人の場合は体重60kg、1日あたり経口投与では約30μg〜10g、好ましくは100μg〜5g、さらに好ましくは100μg〜100mgをそれぞれ1回または数回に分けて投与し、注射投与では約３０μg〜1g、好ましくは100μg〜500mg、さらに好ましくは100μg〜30mgをそれぞれ1回または数回に分けて投与する。投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動することが予測される。たとえば経口投与は静脈注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想される。小児に投与される場合は、用量は成人に投与される量よりも少ない可能性がある。こうした投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。【０１６８】
第7の態様として「γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4（以下、単に細胞内EphA4ともいう）。」を提供する。【０１６９】
「γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4」とは、EphA4がγ-セクレターゼによりプロセシングされて生じる断片のうち、細胞内領域側のEphA4断片を含むポリペプチドである。【０１７０】
本発明においては、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを提供する。【０１７１】
（ａ）配列番号2n (nは45〜83の整数を表す。）から選択された配列番号のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号2n (nは45〜83の整数を表す。）から選択された配列番号のアミノ酸配列からなるポリペプチドと少なくとも８０％以上の相同性を有するとともに、以下の（ｃ）又は（ｄ）の活性を有するポリペプチド
（ｃ）スパイン形成を促進する；
（ｄ）Racを活性化する；
たとえば、配列番号90に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる（実施例３）。【０１７２】
また、「γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4」は、EphA4がγ-セクレターゼによりプロセシングされて生じる断片のうち、細胞内領域側のEphA4断片と実質的に同一なポリペプチドが含まれる。実質的に同一なポリペプチドには、EphA4がγ-セクレターゼによりプロセシングされて生じる断片のうち、細胞内領域側のEphA4断片をコードするポリペプチドに1〜複数個（好ましくは1または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されてもよい、あるいはこれらの組合せによるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、かつ細胞内EphA4と機能的に実質的に同一なポリペプチドである変異体が含まれる。【０１７３】
前記の同等性は、配列番号90に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、そして最も好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、細胞内EphA4と実質的に同じ活性（たとえば、ポストシナプスの形態または機能変化）を有するのであれば、前記動物由来のポリペプチド、組み換えポリペプチド、または合成ポリペプチドのいずれであってもよい。あるいは、配列番号90に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。【０１７４】
前記の同一性は、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、たとえば全米バイオテクノロジー情報センター（NCBI）の相同性アルゴリズムBLAST（Basic local alignment search tool）http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いる事により算出することができる。【０１７５】
あるいは、EphA4がγ-セクレターゼによりプロセシングされて生じる細胞内領域側のEphA4断片のうち、細胞質内の領域をコードするポリペプチドであってもよい。【０１７６】
例えば、配列番号92に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、そして最も好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、細胞内EphA4と実質的に同じ活性（たとえば、ポストシナプスの形態または機能変化）を有するのであれば、前記動物由来のポリペプチド、組み換えポリペプチド、または合成ポリペプチドのいずれであってもよい。あるいは、配列番号92に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。【０１７７】
当該細胞内EphA4は、他のポリペプチドと融合させた融合ポリペプチド、たとえばタグもしくは標識物を付加したポリペプチド、それ以外の修飾を施されたポリペプチドの形態であってもよい。これらのポリペプチドは、遺伝子組み換え技術、部位指定突然変異誘発、突然変異誘発剤処理（たとえばヒドロキシルアミン）、または自動化したペプチド合成によって得ることができる。【０１７８】
本発明の好ましい態様のγ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4は、表３に示す通りであるが、好ましくはラット細胞内EphA4であり、たとえば配列番号90または92のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。さらに本発明の好ましい態様の細胞内EphA4は、ラット細胞内EphA4のHAタグ付きポリペプチドである。たとえば、ラット細胞内EphA4のC末端にHAタグをさらに備えたポリペプチド(配列番号94)が挙げられる（実施例４）。もちろん、ラット以外の細胞内EphA4配列の全体または一部、たとえば表３に記載の配列番号、より具体的には、配列番号９６、９８、１００、１０２，１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１４２，１４４，１４６，１４８，１５０,１５２，１５４，１５６，１５８，１６０，１６２，１６４、１６６、１１６，１１８、１２０,１２２，１２４，１２６，１２８，１３０、１３２，１３４，１３６，１３８および１４０、ならびに配列番号１４６（HAタグ付加）から選ばれるアミノ酸配列もラット細胞内EphA4と同様に用いることができ、好ましくはヒトの細胞内EphA4配列の全体または一部である。【０１７９】
【表３】
0005508857.tif 000004
本発明ではさらに、前記γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明の細胞内EphA4をコードするヌクレオチド配列の好ましい態様は表３に示す通りである。当該細胞内EphA4をコードするポリヌクレオチドの一例は、ラット細胞内EphA4をコードするポリヌクレオチドであり、たとえば配列番号89のポリヌクレオチドである。さらに本発明の好ましい態様の細胞内EphA4をコードするポリヌクレオチドは、配列番号89または91であり、ラット細胞内EphA4のHAタグ付きポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも好ましい。このようなポリヌクレオチドとして、たとえば、ラット細胞内EphA4のC末端にHAタグをさらに備えたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号93）が挙げられる（実施例４）。もちろん、ラット以外の細胞内EphA4配列の全体または一部、たとえば配列番号９５、９７、９９，１０１，１０３，１０５，１０７,１０９，１１１，１１３，１４１，１４３，１４５，１４７，１４９,１５１，１５３，１５５，１５７，１５９，１６１，１６３、１６５，１１５，１１７,１１９，１２１，１２３，１２５，１２７,１２９，１３１，１３３，１３５、１３７および１３９、ならびに配列番号１４５（HAタグ付加）から選ばれるヌクレオチド配列もラット細胞内EphA4と同様に用いることができ、好ましくはヒトの細胞内EphA4配列の全体または一部である。【０１８０】
本発明のさらに好ましい態様の細胞内EphA4は、Racを介したシグナル伝達経路を上昇（活性化）させる細胞内EphA4である。本明細書において「Rac」とは、Rasスーパーファミリーに属する低分子量GTP結合タンパク質に属するファミリーを構成するGTPaseであり、Rac1,2,3をいう。特に好ましくはRac1をいう。【０１８１】
本明細書において、「Rac活性を有する細胞内EphA4」とは、上述の「細胞内EphA4」のうち、Racを介したシグナル伝達経路を活性化させるポリペプチドあるいはスパイン形成を促すポリペプチドである（以下、Rac活性を有するポリペプチドともいう）。Rac活性を有する細胞内EphA4は、上述の「細胞内EphA4」の配列に対して、少なくともRacによりリン酸化を受ける自己リン酸化部位とATP結合部位の配列が保存されたポリペプチドである（実施例６）。【０１８２】
本発明の好ましい態様のRac活性を有する細胞内EphA4は、ラットのRac活性を有する細胞内EphA4である。【０１８３】
たとえば、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの一部配列であって、N末端側が配列番号２のアミノ酸配列の564位から621位の間、好ましくは564位から587位の間で開始するアミノ酸配列からなるポリペプチドと、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の相同性を有するポリペプチドである。より好ましくは、上記のポリペプチドに加え、以下の（a）及び（ｂ）のいずれかの活性を有するポリペプチドである。【０１８４】
（a）スパイン形成を促進する；
（ｂ）Racを活性化する；
あるいは、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分配列からなるポリぺプチドであって、以下の（a）および（ｂ）のいずれかのアミノ酸配列を有するとともに、以下の（ｃ）および（ｄ）のいずれかの活性を有するポリペプチドであってもよい。  【０１８５】
（a）N末端側が配列番号２のアミノ酸配列の564位から621位の間、好ましくは564位から587位の間で開始するアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列；
（ｂ）N末端側が配列番号２のアミノ酸配列の564位から621位の間、好ましくは564位から587位の間で開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列；
（ｃ）スパイン形成を促進する；
（ｄ）Racを活性化する；
上記の配列において、C末端の配列は、配列番号２のアミノ酸配列のC末端であることが好ましい。【０１８６】
より好ましい態様のRac活性を有する細胞内EphA4は、配列番号90、92及び196から選択された配列番号のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。【０１８７】
上述の条件を満たすものであれば、前記動物以外に由来のポリペプチド、組み換えポリペプチド、または合成ポリペプチドのいずれであってもよい。ストリンジェントな条件は前述と同様の条件である。【０１８８】
また、Rac活性を有する細胞内EphA4は、その形態が他のポリペプチドとの融合ポリペプチド、たとえばタグ等標識物を付加したポリペプチド、または修飾済みのポリペプチドであってもよい。【０１８９】
さらに本発明の好ましい態様のRac活性を有する細胞内EphA4は、ラットのRac活性を有する細胞内EphA4のHAタグ付きポリペプチドである。たとえば、上述のラットのRac活性を有する細胞内EphA4のC末端にHAタグをさらに備えたポリペプチド（配列番号198,94及び168）が挙げられる(実施例６〜８)。【０１９０】
もちろん、ラット以外のRac活性を有する細胞内EphA4配列の全体または一部もラットのRac活性を有する細胞内EphA4と同様に用いることができる。以下に、ラット以外のRac活性を有する細胞内EphA4について例示する。【０１９１】
たとえば、マウス（AAH04782.1）の場合、配列番号176で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの一部配列であって、N末端側が配列番号176のアミノ酸配列の505位から562位の間、好ましくは505位から527位の間で開始するアミノ酸配列からなるポリペプチドと、好ましくは80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上、さらにより好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上、そして最も好ましくは99％以上の相同性を有するポリペプチドである。より好ましくは、上記のポリペプチドに加え、以下の（a）及び（ｂ）のいずれかの活性を有するポリペプチドである。【０１９２】
（a）スパイン形成を促進する；
（ｂ）Racを活性化する；
あるいは、配列番号176のアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分配列からなるポリぺプチドであって、以下の（a）および（ｂ）のいずれかのアミノ酸配列を有するとともに、以下の（ｃ）および（ｄ）のいずれかの活性を有するポリペプチドであってもよい。      【０１９３】
（a）N末端側が配列番号176のアミノ酸配列の505位から562位の間、好ましくは505位から527位の間で開始するアミノ酸配列と少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列；
（ｂ）N末端側が配列番号176のアミノ酸配列の505位から562位の間、好ましくは505位から527位の間で開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列；
（ｃ）スパイン形成を促進する；
（ｄ）Racを活性化する；
あるいは、マウス（NP_031962.2）の場合、配列番号178で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの一部配列であって、N末端側が配列番号178のアミノ酸配列の564位から621位の間、好ましくは564位から586位の間で開始するアミノ酸配列からなるポリペプチドと、好ましくは80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上、さらにより好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上、そして最も好ましくは99％以上の相同性を有するポリペプチドである。より好ましくは、上記のポリペプチドに加え、以下の（a）及び（ｂ）のいずれかの活性を有するポリペプチドである。【０１９４】
（a）スパイン形成を促進する；
（ｂ）Racを活性化する；
あるいは、配列番号178のアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分配列からなるポリぺプチドであって、以下の（a）および（ｂ）のいずれかのアミノ酸配列を有するとともに、以下の（ｃ）および（ｄ）のいずれかの活性を有するポリペプチドであってもよい。      【０１９５】
（a）N末端側が配列番号178のアミノ酸配列の564位から621位の間、好ましくは564位から586位の間で開始するアミノ酸配列と少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列；
（ｂ）N末端側が配列番号178のアミノ酸配列の564位から621位の間、好ましくは564位から586位の間で開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列；
（ｃ）スパイン形成を促進する；
（ｄ）Racを活性化する；
また、ヒト（NP_004429.1）の場合、配列番号180で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの一部配列であって、N末端側が配列番号180のアミノ酸配列の564位から621位の間、好ましくは564位から586位の間で開始するアミノ酸配列からなるポリペプチドと、好ましくは80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上、さらにより好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上、そして最も好ましくは99％以上の相同性を有するポリペプチドである。より好ましくは、上記のポリペプチドに加え、以下の（a）及び（ｂ）のいずれかの活性を有するポリペプチドである。【０１９６】
（a）スパイン形成を促進する；
（ｂ）Racを活性化する；
あるいは、配列番号180のアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分配列からなるポリぺプチドであって、以下の（a）および（ｂ）のいずれかのアミノ酸配列を有するとともに、以下の（ｃ）および（ｄ）のいずれかの活性を有するポリペプチドであってもよい。      【０１９７】
（a）N末端側が配列番号180のアミノ酸配列の564位から621位の間、好ましくは564位から586位の間で開始するアミノ酸配列と少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列；
（ｂ）N末端側が配列番号180のアミノ酸配列の564位から621位の間、好ましくは564位から586位の間で開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列；
（ｃ）スパイン形成を促進する；
（ｄ）Racを活性化する；
あるいは、ヒト（BAG35298.1）の場合、配列番号182で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの一部配列であって、N末端側が配列番号182のアミノ酸配列の564位から621位の間、好ましくは564位から586位の間で開始するアミノ酸配列からなるポリペプチドと、好ましくは80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上、さらにより好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上、そして最も好ましくは99％以上の相同性を有するポリペプチドである。より好ましくは、上記のポリペプチドに加え、以下の（a）及び（ｂ）のいずれかの活性を有するポリペプチドである。【０１９８】
（a）スパイン形成を促進する；
（ｂ）Racを活性化する；
あるいは、配列番号182のアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分配列からなるポリぺプチドであって、以下の（a）および（ｂ）のいずれかのアミノ酸配列を有するとともに、以下の（ｃ）および（ｄ）のいずれかの活性を有するポリペプチドであってもよい。      【０１９９】
（a）N末端側が配列番号182のアミノ酸配列の564位から621位の間、好ましくは564位から586位の間で開始するアミノ酸配列と少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列；
（ｂ）N末端側が配列番号182のアミノ酸配列の564位から621位の間、好ましくは564位から586位の間で開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列；
（ｃ）スパイン形成を促進する；
（ｄ）Racを活性化する；
また、アカゲザル（XP_001106430.1）の場合、配列番号184で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの一部配列であって、N末端側が配列番号184のアミノ酸配列の505位から562位の間、好ましくは505位から527位の間で開始するアミノ酸配列からなるポリペプチドと、好ましくは80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上、さらにより好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上、そして最も好ましくは99％以上の相同性を有するポリペプチドである。より好ましくは、上記のポリペプチドに加え、以下の（a）及び（ｂ）のいずれかの活性を有するポリペプチドである。【０２００】
（a）スパイン形成を促進する；
（ｂ）Racを活性化する；
あるいは、配列番号184のアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分配列からなるポリぺプチドであって、以下の（a）および（ｂ）のいずれかのアミノ酸配列を有するとともに、以下の（ｃ）および（ｄ）のいずれかの活性を有するポリペプチドであってもよい。      【０２０１】
（a）N末端側が配列番号184のアミノ酸配列の505位から562位の間、好ましくは505位から527位の間で開始するアミノ酸配列と少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列；
（ｂ）N末端側が配列番号184のアミノ酸配列の505位から562位の間、好ましくは505位から527位の間で開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列；
（ｃ）スパイン形成を促進する；
（ｄ）Racを活性化する；
あるいは、アカゲザル（XP_001106876.1）の場合、配列番号42で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの一部配列であって、N末端側が配列番号42のアミノ酸配列の564位から627位の間、好ましくは564位から586位の間で開始するアミノ酸配列からなるポリペプチドと、好ましくは80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上、さらにより好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上、そして最も好ましくは99％以上の相同性を有するポリペプチドである。より好ましくは、上記のポリペプチドに加え、以下の（a）及び（ｂ）のいずれかの活性を有するポリペプチドである。【０２０２】
（a）スパイン形成を促進する；
（ｂ）Racを活性化する；
あるいは、配列番号42のアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分配列からなるポリぺプチドであって、以下の（a）および（ｂ）のいずれかのアミノ酸配列を有するとともに、以下の（ｃ）および（ｄ）のいずれかの活性を有するポリペプチドであってもよい。  【０２０３】
（a）N末端側が配列番号42のアミノ酸配列の564位から627位の間、好ましくは564位から586位の間で開始するアミノ酸配列と少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列；
（ｂ）N末端側が配列番号42のアミノ酸配列の564位から627位の間、好ましくは564位から586位の間で開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列；
（ｃ）スパイン形成を促進する；
（ｄ）Racを活性化する；
また、チンパンジー（XP_526042.2）の場合、配列番号28で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの一部配列であって、N末端側が配列番号28のアミノ酸配列の505位から562位の間、好ましくは505位から527位の間で開始するアミノ酸配列からなるポリペプチドと、好ましくは80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上、さらにより好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上、そして最も好ましくは99％以上の相同性を有するポリペプチドである。より好ましくは、上記のポリペプチドに加え、以下の（a）及び（ｂ）のいずれかの活性を有するポリペプチドである。【０２０４】
（a）スパイン形成を促進する；
（ｂ）Racを活性化する；
あるいは、配列番号28のアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分配列からなるポリぺプチドであって、以下の（a）および（ｂ）のいずれかのアミノ酸配列を有するとともに、以下の（ｃ）および（ｄ）のいずれかの活性を有するポリペプチドであってもよい。  【０２０５】
（a）N末端側が配列番号28のアミノ酸配列の505位から562位の間、好ましくは505位から527位の間で開始するアミノ酸配列と少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列；
（ｂ）N末端側が配列番号28のアミノ酸配列の505位から562位の間、好ましくは505位から527位の間で開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列；
（ｃ）スパイン形成を促進する；
（ｄ）Racを活性化する；
また、イヌ（XP_536084.2）の場合、配列番号22で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの一部配列であって、N末端側が配列番号22のアミノ酸配列の605位から662位の間、好ましくは605位から627位の間で開始するアミノ酸配列からなるポリペプチドと、好ましくは80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上、さらにより好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上、そして最も好ましくは99％以上の相同性を有するポリペプチドである。より好ましくは、上記のポリペプチドに加え、以下の（a）及び（ｂ）のいずれかの活性を有するポリペプチドである。【０２０６】
（a）スパイン形成を促進する；
（ｂ）Racを活性化する；
あるいは、配列番号22のアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分配列からなるポリぺプチドであって、以下の（a）および（ｂ）のいずれかのアミノ酸配列を有するとともに、以下の（ｃ）および（ｄ）のいずれかの活性を有するポリペプチドであってもよい。  【０２０７】
（a）N末端側が配列番号22のアミノ酸配列の605位から662位の間、好ましくは605位から627位の間で開始するアミノ酸配列と少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列；
（ｂ）N末端側が配列番号22のアミノ酸配列の605位から662位の間、好ましくは605位から627位の間で開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列；
（ｃ）スパイン形成を促進する；
（ｄ）Racを活性化する；
また、ウマ（XP_001494588.1）の場合、配列番号186で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの一部配列であって、N末端側が配列番号186のアミノ酸配列の564位から621位の間、好ましくは564位から586位の間で開始するアミノ酸配列からなるポリペプチドと、好ましくは80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上、さらにより好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上、そして最も好ましくは99％以上の相同性を有するポリペプチドである。より好ましくは、上記のポリペプチドに加え、以下の（a）及び（ｂ）のいずれかの活性を有するポリペプチドである。【０２０８】
（a）スパイン形成を促進する；
（ｂ）Racを活性化する；
あるいは、配列番号186のアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分配列からなるポリぺプチドであって、以下の（a）および（ｂ）のいずれかのアミノ酸配列を有するとともに、以下の（ｃ）および（ｄ）のいずれかの活性を有するポリペプチドであってもよい。      【０２０９】
（a）N末端側が配列番号186のアミノ酸配列の564位から621位の間、好ましくは564位から586位の間で開始するアミノ酸配列と少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列；
（ｂ）N末端側が配列番号186のアミノ酸配列の564位から621位の間、好ましくは564位から586位の間で開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列；
（ｃ）スパイン形成を促進する；
（ｄ）Racを活性化する；
また、ニワトリ（CAA79509.1）の場合、配列番号188で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの一部配列であって、N末端側が配列番号188のアミノ酸配列の427位から484位の間、好ましくは427位から449位の間で開始するアミノ酸配列からなるポリペプチドと、好ましくは80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上、さらにより好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上、そして最も好ましくは99％以上の相同性を有するポリペプチドである。より好ましくは、上記のポリペプチドに加え、以下の（a）及び（ｂ）のいずれかの活性を有するポリペプチドである。【０２１０】
（a）スパイン形成を促進する；
（ｂ）Racを活性化する；
あるいは、配列番号188のアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分配列からなるポリぺプチドであって、以下の（a）および（ｂ）のいずれかのアミノ酸配列を有するとともに、以下の（ｃ）および（ｄ）のいずれかの活性を有するポリペプチドであってもよい。      【０２１１】
（a）N末端側が配列番号188のアミノ酸配列の427位から484位の間、好ましくは427位から484位の間で開始するアミノ酸配列と少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列；
（ｂ）N末端側が配列番号188のアミノ酸配列の427位から484位の間、好ましくは427位から484位の間で開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列；
（ｃ）スパイン形成を促進する；
（ｄ）Racを活性化する；
また、ブタ（NP_001128439.1）の場合、配列番号190で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの一部配列であって、N末端側が配列番号190のアミノ酸配列の564位から621位の間、好ましくは564位から586位の間で開始するアミノ酸配列からなるポリペプチドと、好ましくは80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上、さらにより好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上、そして最も好ましくは99％以上の相同性を有するポリペプチドである。より好ましくは、上記のポリペプチドに加え、以下の（a）及び（ｂ）のいずれかの活性を有するポリペプチドである。【０２１２】
（a）スパイン形成を促進する；
（ｂ）Racを活性化する；
あるいは、配列番号190のアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分配列からなるポリぺプチドであって、以下の（a）および（ｂ）のいずれかのアミノ酸配列を有するとともに、以下の（ｃ）および（ｄ）のいずれかの活性を有するポリペプチドであってもよい。      【０２１３】
（a）N末端側が配列番号190のアミノ酸配列の564位から621位の間、好ましくは564位から586位の間で開始するアミノ酸配列と少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列；
（ｂ）N末端側が配列番号190のアミノ酸配列の564位から621位の間、好ましくは564位から586位の間で開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列；
（ｃ）スパイン形成を促進する；
（ｄ）Racを活性化する；
また、カモノハシ（XP_001506050.1）の場合、配列番号192で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの一部配列であって、N末端側が配列番号192のアミノ酸配列の564位から621位の間、好ましくは564位から586位の間で開始するアミノ酸配列からなるポリペプチドと、好ましくは80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上、さらにより好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上、そして最も好ましくは99％以上の相同性を有するポリペプチドである。より好ましくは、上記のポリペプチドに加え、以下の（a）及び（ｂ）のいずれかの活性を有するポリペプチドである。【０２１４】
（a）スパイン形成を促進する；
（ｂ）Racを活性化する；
あるいは、配列番号192のアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分配列からなるポリぺプチドであって、以下の（a）および（ｂ）のいずれかのアミノ酸配列を有するとともに、以下の（ｃ）および（ｄ）のいずれかの活性を有するポリペプチドであってもよい。      【０２１５】
（a）N末端側が配列番号192のアミノ酸配列の564位から621位の間、好ましくは564位から586位の間で開始するアミノ酸配列と少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列；
（ｂ）N末端側が配列番号192のアミノ酸配列の564位から621位の間、好ましくは564位から586位の間で開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列；
（ｃ）スパイン形成を促進する；
（ｄ）Racを活性化する；
また、カエル（NP_001079461.1）の場合、配列番号194で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの一部配列であって、N末端側が配列番号194のアミノ酸配列の563位から619位の間、好ましくは563位から585位の間で開始するアミノ酸配列からなるポリペプチドと、好ましくは80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上、さらにより好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上、そして最も好ましくは99％以上の相同性を有するポリペプチドである。より好ましくは、上記のポリペプチドに加え、以下の（a）及び（ｂ）のいずれかの活性を有するポリペプチドである。【０２１６】
（a）スパイン形成を促進する；
（ｂ）Racを活性化する；
あるいは、配列番号194のアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分配列からなるポリぺプチドであって、以下の（a）および（ｂ）のいずれかのアミノ酸配列有するとともに、以下の（ｃ）および（ｄ）のいずれかの活性を有するポリペプチドであってもよい。  【０２１７】
（a）N末端側が配列番号194のアミノ酸配列の563位から619位の間、好ましくは563位から585位の間で開始するアミノ酸配列と少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列；
（ｂ）N末端側が配列番号194のアミノ酸配列の563位から619位の間、好ましくは563位から585位の間で開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列；
（ｃ）スパイン形成を促進する；
（ｄ）Racを活性化する；
上記の例示は、γ-セクレターゼにより切断されたラットEphA4（XM_244186.3）のうち、細胞内側の断片の配列に対して９５％以上の相同性を有する配列を算出することで得られたものである。【０２１８】
さらに好ましい態様は、ヒトのRac活性を有する細胞内EphA4配列の全体または一部である。【０２１９】
本発明ではさらに、Rac活性を有する細胞内EphA4をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを提供する。【０２２０】
本発明においては、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリヌクレオチドを提供する。【０２２１】
（ａ）配列番号2n (nは45〜83の整数を表す。）から選択された配列番号のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号2n-1 (nは45〜83の整数を表す。）から選択された配列番号の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとともに、以下の（ｄ）又は（ｅ）の活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｄ）スパイン形成を促進する
（ｅ）Racを活性化する
Rac活性を有する細胞内EphA4をコードする塩基配列の一例は、ラットのRac活性を有する細胞内EphA4をコードするポリヌクレオチドである。【０２２２】
たとえば配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの部分配列からなるポリヌクレオチドであって、
N末端側が配列番号２のアミノ酸配列の564位から621位の間、好ましくは564位から587位の間で開始するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。より好ましくは、以下の（a）及び（ｂ）のいずれかの活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。【０２２３】
（a）スパイン形成を促進する；
（ｂ）Racを活性化する；
あるいは、配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの部分配列からなるポリヌクレオチドであって、
以下の（a）および（ｂ）のいずれかのアミノ酸配列をコードするとともに、以下の（ｃ）および（ｄ）のいずれかの活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。【０２２４】
（a）N末端側が配列番号２のアミノ酸配列の564位から621位の間、好ましくは564位から587位の間で開始するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列と少なくとも９５％以上の相同性を有する塩基配列；
（ｂ）N末端側が配列番号２のアミノ酸配列の564位から621位の間、好ましくは564位から587位の間で開始するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列；
（ｃ）スパイン形成を促進する；
（ｄ）Racを活性化する；
より好ましくは、配列番号89, 91及び195から選択された配列番号の塩基配列でコードされるポリヌクレオチドである。【０２２５】
さらに本発明の好ましい態様のRac活性を有する細胞内EphA4をコードするポリヌクレオチドは、Rac活性を有するラット細胞内EphA4のHAタグ付きポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。たとえば、上述のラットのRac活性を有する細胞内EphA4のC末端にHAタグをさらに備えたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号93,167及び197）が挙げられる（実施例６〜８）。【０２２６】
もちろん、ラット以外のRac活性を有する細胞内EphA4配列の全体または一部、たとえば、上記に例示したラット以外のRac活性を有する細胞内EphA4のアミノ酸配列に対応する塩基配列でコードされるポリヌクレオチドもラットのRac活性を有する細胞内EphA4と同様に用いることができる。【０２２７】
さらに好ましい態様は、ヒトのRac活性を有する細胞内EphA4配列の全体または一部である。【０２２８】
本発明のγ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4は、以下の方法により決定することが可能である。【０２２９】
γ-セクレターゼによるEphA4の開裂反応を行い、反応産物からEphA4のC末端のタグに対する特異的な抗体を用いてアフィニテイー精製されたタグ付EphA4タンパク質断片をSDS-PAGEを用いて分離し、タグ付EphA4タンパク質断片を含むゲル片を切り取った。切り取ったゲル片に対し、プロテアーゼを用いたゲル内消化法を行った。得られたペプチド片に対しLC-MS/MS解析を行い、切断部位を含むペプチドを見出し、タンデムMSスペクトルから解析を行うことで、EphA4のγ-セクレターゼにより開裂される位置のアミノ酸配列を初めて決定した。【０２３０】
なお、γ-セクレターゼにより開裂されたEphA4細胞内断片は、様々な膜タンパク質の相同性を基に、公知のタンパク質ファミリーとドメインに関するデータベースや膜貫通領域解析ソフトを用いてその配列の決定を試みたが、複数の開裂位置が想定され、特定することはできなかった。【０２３１】
第８の態様として「γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4に対する抗体（以下、本発明のタンパク質に対する抗体と略記する場合がある）。」を提供する。【０２３２】
細胞内EphA4に対する抗体は、細胞内EphA4配列の全体または一部のポリペプチドを認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。特に好ましい態様としては、細胞内EphA4配列の全体または一部のポリペプチドを特異的に認識する抗体である。【０２３３】
「細胞内EphA4配列の全体または一部のポリペプチドを特異的に認識する抗体」には、全長のEphA4ポリペプチドなどγセクレターゼにより分解されていないEphA4ポリペプチドを認識しないが、細胞内EphA4配列の全体または一部のポリペプチドを認識する抗体や、細胞内EphA4配列の全体または一部のポリペプチドを認識し、かつ、全長のEphA4ポリペプチドを認識する抗体よりも結合アフィニティが１０〜５０倍、特に好ましくは２０〜５０倍高い抗体が含まれる。【０２３４】
細胞内EphA4に対する抗体は、細胞内EphA4を抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質等は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なうことができる。温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが用いられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。【０２３５】
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質等と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (1975)〕に従い実施できる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。【０２３６】
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物由来の骨髄腫細胞が用いられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施することができる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質等抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質等を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが用いられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。【０２３７】
例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
（ｂ）モノクロナール抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質等抗原）とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のポリクローナル抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。【０２３８】
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。【０２３９】
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。【０２４０】
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。【０２４１】
また、細胞内EphA4配列の全体または一部のポリペプチドを特異的に認識する抗体は以下の方法で作成することが可能である。【０２４２】
例えば、全長のEphA4ポリペプチドを認識する抗体よりも結合アフィニティが高い抗体を得る場合、細胞内EphA4配列の全体、あるいは、一部を動物に免疫し、抗体価が上がったことを確認した後、抗血清を回収し、免疫に使用したペプチドを用いてアフィニティ精製を行う。【０２４３】
γセクレターゼにより分解されていないEphA4ポリペプチドを認識しないが、細胞内EphA4配列の全体または一部のポリペプチドを認識する抗体を得る場合、γ-セクレターゼにより切断されたEphA4ペプチド（以下、切断ペプチドという）を用いて動物に免疫し、抗血清を回収する。回収された抗血清とγ-セクレターゼにより切断されていないEphA4ペプチド（以下、未切断ペプチドという）、例えば全長のEphA4ペプチドとを反応させ、未切断ペプチドに反応する抗体を除く。その後、切断ペプチドを用いて精製することで、未切断ペプチドを認識しないが、切断ペプチドを認識する抗体を精製する。【０２４４】
本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡとしては、本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの塩基配列またはその一部の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、該タンパク質または部分ペプチドの発現を抑制し得る作用を有するオリゴヌクレオチドまたはその誘導体であれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。
該ＤＮＡまたはｍＲＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの相補鎖）の全塩基配列または部分塩基配列と約４０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明のＤＮＡまたはｍＲＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、本発明のタンパク質等のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約４０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上の相同性を有するアンチセンスＤＮＡが好適である。これらのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
本発明の細胞内EphA4は、例えば、Ｒac活性（特にRａｃ1活性）、スパイン形成活性などの作用を有している。したがって、本発明の細胞内EphA4はさまざまな用途に用いることができる。【０２４５】
以下に、本発明の細胞内EphA4（以下、本発明のタンパク質と略記する場合がある）、細胞内EphA4をコードするポリヌクレオチド（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）、細胞内EphA4に対する抗体（本発明の抗体と略記する場合がある）およびアンチセンスＤＮＡの用途を説明する。
（１）各種疾病の治療・予防剤などの医薬
例えば、生体内においてγ-セクレターゼによるEphA4のプロセシングが減少あるいは欠損しているために、細胞における、Ｒacの活性化またはスパインの形成が十分に、あるいは正常に発揮されない患者がいる場合に、（イ）本発明のＤＮＡを該患者に投与し、生体内で本発明のタンパク質等を発現させることによって、（ロ）細胞に本発明のＤＮＡを挿入し、本発明のタンパク質等を発現させた後に、該細胞を患者に移植することによって、（ハ）本発明のタンパク質等を該患者に投与することなどによって、該患者における本発明のタンパク質等の役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。
したがって、本発明のタンパク質および本発明のＤＮＡは、例えば、認知症、特にADの疾病の治療・予防剤などの医薬として有用である。【０２４６】
本発明のＤＮＡを上記の治療・予防剤として使用する場合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従ってヒトまたは温血動物に投与することができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。【０２４７】
本発明のタンパク質を上記の治療・予防剤として使用する場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、より好ましく９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
本発明のタンパク質等を上記の医薬として使用する場合は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のタンパク質等あるいはＤＮＡを生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。本発明のＤＮＡを用いる場合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。【０２４８】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調整された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。【０２４９】
本発明のＤＮＡが挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、通常、非経口的に使用される。【０２５０】
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。【０２５１】
本発明のタンパク質等の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、癌治療目的で本発明のタンパク質等を経口投与する場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき該タンパク質等を約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該タンパク質等の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、癌治療目的で本発明のタンパク質等を注射剤の形で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該タンパク質等を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を患部に注射することにより投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。【０２５２】
第９の態様として、キットを提供する。【０２５３】
本発明は、γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4をコードするポリヌクレオチドと、該細胞内EphA4を特異的に認識する抗体とを含む、キットを提供する。【０２５４】
本発明のキットは、γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4をコードするポリヌクレオチドと、該細胞内EphA4を特異的に認識する抗体を含むものである。さらに、当該キットには、顕微鏡観察、イムノブロッティング、ウエスタンブロッティング技術に用いられる器具（たとえば、反応容器、ブロッティングメンブレンなど）、試薬（たとえば、緩衝液、培養液など）、説明書などを含んでいてもよい。【０２５５】
本発明は、γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4と、該細胞内EphA4を特異的に認識する抗体とを含む、キットを提供する。【０２５６】
本発明のキットは、γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4と、該細胞内EphA4を特異的に認識する抗体を含むものである。さらに、当該キットには、顕微鏡観察、イムノブロッティング、ウエスタンブロッティング技術に用いられる器具（たとえば、反応容器、ブロッティングメンブレンなど）、試薬（たとえば、緩衝液、培養液など）、説明書などを含んでいてもよい。【０２５７】
本発明は、γ-セクレターゼによるEphA4のプロセシングを測定するための検査キットおよびγ-セクレターゼによるスパイン形成を測定するための検査キットを提供する。【０２５８】
本発明のキットは、γ-セクレターゼまたはそれを含む生物学的組成物と、EphA4を含む生物学的組成物とを含むものである。さらに、当該キットには、EphA4以外のγ-セクレターゼの基質（たとえば、APPおよび／またはノッチ）、またはそれを含む生物学的組成物などを含んでいてもよい。当該キットには、複数のγ-セクレターゼの基質を含むことが好ましく、EphA4に加え、APPおよび／またはノッチが含まれることが好ましい。さらに、当該キットには、イムノブロッティング、ウエスタンブロッティング技術に用いられる器具（たとえば、反応容器、ブロッティングメンブレンなど）、試薬（たとえば、緩衝液、培養液、抗EphA4抗体など）、説明書などを含んでいてもよい。        【０２５９】
本発明は、γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4によるスパイン形成を測定するための検査キットおよびγ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4によるRac活性を測定するための検査キットを提供する。【０２６０】
本発明のキットは、γ-セクレターゼにより開裂された細胞内EphA4を含むものである。さらに、当該キットには、顕微鏡観察、イムノブロッティング、ウエスタンブロッティング技術に用いられる器具（たとえば、反応容器、ブロッティングメンブレンなど）、試薬（たとえば、緩衝液、培養液、抗細胞内EphA4抗体など）、説明書などを含んでいてもよい。      【０２６１】
Examples
以下、さらに実施例、製造例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではなく、当業者への完全な開示を提供するために示すものである。また、記載されたこれら実験が全てまたは唯一行われた実験であることを意味または暗示するものでもない。ここで使用された数値（たとえば、量、温度、濃度など）に関して正確さを保証するための努力がなされたが、ある程度の実験誤差および偏差が考慮され、本発明の範囲を逸脱しない範囲で変化させてもよい
【実施例１】
【０２６２】
EphA4遺伝子をトランスフェクションした293/EBNA-1細胞株を用いたEphA4プロセシング解析
γ-セクレターゼ阻害剤存在下のもと、EphA4のC末端にHAタグを付加させた遺伝子発現HEK293細胞を用い、EphA4がγ-セクレターゼの基質であるかを評価した。γ-セクレターゼ阻害剤は、 (2S)-2-{[(3,5-Difluorophenyl)acetyl]amino}-N-[(3S)-1-methyl-2-oxo-5-phenyl-2,3-dihydro-1H-1,4-benzodiazepin-3-yl]propanamide (以下、「Compound E」とも称する。) (Alexis Biochemicals) を用いた。
１．実験条件および実験方法
（１）ラットEphA4遺伝子のクローニング
ラットの脳からRNAをTrisol(Invitrogen)を用いて精製し、1st strand cDNAをRNA PCR Kit(TaKaRa)を用いて合成した。最終合成1st strand cDNA産物1ulを使って、
Primer１ XhoI site付加：GAGCTCGAGGCCACCATGGCTGGGATTTTCTATTTCATC（配列番号204）, 
primer２ NotI site付加：GAGGCGGCCGCGACAGGAACCATCCTGCCATGCATC（配列番号205）
を用いてpfu (stratagene)で増幅した。PCRサイクルは、95℃ 2minの反応の後、（95℃ 45sec⇒60℃ 45sec⇒72℃ 6min）のサイクルを35サイクル行い、最後に72℃10minの反応を行った。PCR産物をQuiaquick PCR purification kit (QIAGEN)で精製し、XhoI(TaKaRa), NotI(TaKaRa)で酵素処理後、pBluescript(Stratagene)にクローニングした。
（２）ラットEphA4遺伝子のC末端にHAタグを付加させた遺伝子および発現ベクターの構築
pcDNA(Invitrogen)をXhoI(TaKaRa)およびNotI(TaKaRa)で酵素処理し、前記（１）で得られたpBluescriptからXhoI(TaKaRa)およびNotI(TaKaRa)で酵素処理したEphA4を挿入し発現ベクターを作製した。当該発現ベクターは、組み込まれたEphA4のC末端にHAタグが付加されるように構築した。EphA4-HAのDNA配列は、DNAシークエンサー（Applied Biosystems社  3130xl）によって解読した。そのDNA配列を以下に示す。ラットEphA4（XM_244186.4）と比べて、861位の塩基がcからtに変異していた（以下この変異の態様を「c→t」と表記する。他の変異についても同様に表記する。）。また、得られたDNA配列は、ラットEphA4（XM_244186.4）と比べて、1110位のa→t、1278位のa→g、1320位のa→g、1623位のc→t、1626位のc→t、2208位のc→t、2265位のc→t、の点で異なっていたが、アミノ酸では100%一致していることを確認した。当該発現ベクターは、Endofree Plasmid Maxi Kit(QIAGEN)を用いて大量調製した。  
EphA4-HA DNA配列(配列番号3)
配列番号３におけるヌクレオチド配列において、第2968番のgから第2997番のtまでの配列は、HAタグをコードするヌクレオチド配列である。
EphA4-HA アミノ酸配列(配列番号4)
（３）ラットEphA4遺伝子のC末端にHAタグを付加させた遺伝子発現細胞の作製
293/EBNA-1細胞株（Invitrogen）を10% FBS(Hyclone) / DMEM(Invitrogen) で５％CO2、37℃の条件下で培養し、ラットEphA4のC末端にHAタグを付加させた遺伝子をLipofectamine2000 (Invitrogen)でトランスフェクションした。同条件で1日培養した後、50nM Compound E (Alexis Biochemicals)を培養液に添加した。さらに同条件で1日培養した後、前記トランスフェクションされたHEK293細胞をPBS(SIGMA)で回収し、Sonicator(TAITEC VP-5S)を用いて、Sonicationし細胞を破砕した。Protein assay kit(BioRad)を用いてタンパク質量を定量した。Compound Eを添加した細胞とCompound Eを添加しなかった細胞から得られたタンパク質をそれぞれ2μgずつSDS-PAGEし、抗HA抗体（Roche）(最終濃度0.2μg/ml)を用いてウェスタンブロットした。【０２６３】

２．実験結果
図１にその結果を示す。【０２６４】
図１において、左レーンは、Compound E未処理サンプル、右レーンはCompound E処理サンプルである。Fullは、分解前のEphA4の完全長に相当する。CTF（C terminal fragment）は、EphA4の膜貫通領域からC末端領域に相当する。Compound Eを添加すると、50kDa付近のバンド（CTF）が特異的に蓄積された。このバンドはEphA4の膜貫通領域からC末端領域までの大きさに等しいことから、EphA4は、HEK293細胞内でγ-セクレターゼによって切断されているということが明らかとなった。【０２６５】
γ-セクレターゼの基質は、最初に細胞外領域が別のプロテアーゼによって切断され、その消化断片であるCTF（膜貫通領域（547位のアミノ酸残基）からC末端まで)の膜貫通領域をγ-セクレターゼが、さらに切断する。最終分解産物(細胞内領域)は、速やかにプロテアソームで分解される。最初の切断反応から、最後のプロテアソームの分解反応までが非常に速いので、基質をウェスタンブロットで検出すると一本のバンドとして検出される。しかし、γ-セクレターゼ阻害剤で処理すると、特異的にCTFの蓄積が検出されることが見出された。
【実施例２】
【０２６６】
ラット海馬初代培養神経細胞を用いたEphA4プロセシング解析
γ-セクレターゼ阻害剤存在下のもと、ラット海馬初代培養神経細胞を用い、EphA4がγ-セクレターゼの基質であるかを評価した。γ-セクレターゼ阻害剤は、 (2S)-2-{[(3,5-Difluorophenyl)acetyl]amino}-N-[(3S)-1-methyl-2-oxo-5-phenyl-2,3-dihydro-1H-1,4-benzodiazepin-3-yl]propanamide  (Compound E) (Alexis Biochemicals) を用いた。
１．実験条件および実験方法
（１）初代培養神経細胞の調製
胎生18日齢のSD系ラット（チャールズリバー社）より海馬を単離し培養に供した。具体的には、エーテル麻酔下、妊娠ラットより無菌的に胎仔を摘出した。その胎仔より脳を摘出し、それらを20% FBS(Hyclone) /HBSS(SIGMA)に浸した。その摘出した脳から、実体顕微鏡下で海馬を採取した。採取した海馬を、0.25 %トリプシン（trypsin）（Invitrogen）および0.5mg/ml DNase (SIGMA)を含有した酵素溶液中、37 ℃、10分間の酵素処理することにより、細胞を分散させた。この際、酵素反応は20% FBS(Hyclone) /HBSS(SIGMA)を加えることで停止させた。得られた細胞は、HBSS(SIGMA)を2 ml加えた。HBSS(SIGMA)が加えられた細胞塊を、緩やかなピペッティング操作により細胞を再分散させた。この神経細胞懸濁液を培地にて希釈し、10cm dishに初期細胞密度、1.5×106 cells/ dishにて播種した。培地にはMEM(Invitrogen)培地に, 10%FBS(Hyclone), 1X B27 Supplement (Invitrogen ), 2mM L-Glutamine (Invitrogen), 25μg/ml Insulin (SIGMA) を添加したものを用いた。播種した細胞は５％CO2、95％空気、37℃インキュベーター中にて3日培養した後、グリア細胞の増殖を抑制させるために培地半分量をCytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride (AraC)含有培地と交換した。AraC含有培地には、MEM(Invitrogen)培地に, 5%FBS(Hyclone), 1X B27 Supplement (Invitrogen ), 0.5mM L-Glutamine (Invitrogen), 25μg/ml Insulin (SIGMA), 8uM AraC(SIGMA)を添加したものを用いた。培養２週間後、Compound E(final 50nM)を添加し、さらに１週間培養し、PBSで回収した後、タンパク質定量し、それぞれ10ugずつSDS-PAGEし、抗EphA4抗体(Upstate社)(1/500希釈)を用いて、ウェスタンブロットした。【０２６７】
２．実験結果
図２にその結果を示す。【０２６８】
図２においおて、左レーンは、Compound E未処理サンプル、右レーンはCompound E処理サンプルである。Fullは、分解前のEphA4の完全長に相当する。CTFは、EphA4の膜貫通領域からC末端領域に相当する。Compound Eを添加すると、50kDa付近のバンド（CTF）が特異的に蓄積された。このバンドはEphA4の膜貫通領域からC末端領域までの大きさに等しいことから、EphA4は、海馬神経細胞内でγ-セクレターゼによって切断されているということが明らかとなった。
【実施例３】
【０２６９】
γセクレターゼによるEphA4切断部位の質量分析法を用いた同定
γセクレターゼによりEphA4のどの部位で切断されているかの解析、同定を行った。
１．実験条件及び方法
293/EBNA-1細胞株（Invitrogen）を10% FBS(Hyclone) / DMEM(Invitrogen) で５％CO2、37℃の条件下で培養し、ラットEphA4の529-stopのＮ末端にシグナルシークエンスを付加させ、さらにＣ末端にHAタグを付加させた遺伝子（配列番号199）をLipofectamine2000 (Invitrogen)でトランスフェクションした。同条件で1日培養した後、50mM PIPES, 5mM MgCl2, 5mM CaCl2, 150mM KClで細胞を回収し、細胞膜を破砕するように適宜ホモジネーションした。その後、この破砕液を遠心して核分画を取り除き、さらに超遠心し、細胞質分画と細胞膜分画を分離させた。細胞を回収した際と同じbufferに細胞膜分画を懸濁し、37℃2時間放置した。この間、γセクレターゼによるEphA4の切断反応が進み、buffer内に切断断片が蓄積した。反応後、超遠心し、その上清をanti HA抗体で免疫沈降し、γセクレターゼにより切断されたEphA4断片を得た。得られたEphA4断片をSDS-PAGEし、anti HA抗体で検出されるバンドを含むゲル片を切り取り、質量分析に使用した。【０２７０】
質量分析に先駆け、切り取ったゲル片に対し、ゲル内消化法を用いて処理を行った。すなわち、ゲル中でタンパク質をDTT（Calbiochem）により還元し、ヨードアセトアミド（WAKO）によりシステイン残基をアルキル化した後、トリプシン（Promega）により３７℃で一晩断片化を行った後、ペプチドを抽出した。得られたペプチド混合物を、EmporeC18-HD 膜（3M）で脱塩した後、LC-MS/MS解析を行った。LC-MS/MS解析は、島津高速液体クロマトグラフ用prominence pump(島津製作所)、 HTC-PALオートサンプラー (CTC Analytics)、及びOrbitrap-XL質量分析装置（Thermofisher）を用いた。ペプチド分離及びエレクトロスプレーにはReproSil-Pur C18（Dr.Maisch GmbH）を詰めた自家製ナノスプレイヤー（100μm内径、6μm口径）を用いた。LC-MS/MS移動相Aは、0.2% 酢酸、移動相Bは、0.2%酢酸、80%アセトニトリルを用いた。ペプチド及びタンパク質同定にはGPM（The Grobal Proteome Machine Organization）を用い、NCBInr及びEphA4配列データベースに対して自動データベース検索、解析を行った。【０２７１】
シグナルシークエンス＋クローニングサイト＋529-stop+HA   DNA配列（配列番号199）
ATGTCTGCACTTCTGATCCTAGCTCTTGTTGGAGCTGCAGTTGCTGGATCGGAATTCACGCGTGTCGAGgtcactaccaatacagtgccttcccgaatcattggtgatggggccaactctaccgtcctgctggtctccgtctctggcagtgtagtactcgtggtcattctcattgcggcatttgtgatcagccgtagacggagtaagtacagccaagcaaagcaagaagcagatgaagagaagcatttgaatcaaggtgttagaacatacgtggatccctttacatatgaagaccccaaccaggcagttcgagaatttgccaaagaaatcgatgcctcctgcattaaaatcgaaaaggtcattggagttggcgaatttggagaagtctgcagtgggcgtctcaaagtgcccggcaagagagagatctgtgtggccatcaagactctgaaagctggttatactgacaagcagaggagagacttcctgagcgaggccagcatcatgggacagtttgaccacccaaacataatccacctggaaggcgttgtcaccaaatgtaaaccagtaatgatcatcacggagtacatggagaacggctccttggacgctttcctcaggaagaatgatggccgatttacagtcattcagctggtgggcatgctccgaggcattggctcggggatgaagtatttatctgatatgagctatgtgcatcgagacctggctgccaggaacattctggtaaatagcaacttggtctgcaaggtgtctgatttcggcatgtccagggtgcttgaggatgacccggaagcagcctatactaccaggggcggcaagattcccatccggtggactgcaccagaagcaattgcgtatcgtaaatttacctcagccagtgacgtctggagctacggaatcgttatgtgggaagtgatgtcatatggagagaggccgtactgggatatgtccaatcaagatgtgatcaaagccatcgaggaagggtaccggctacccccgccaatggactgccccattgccctccatcagttaatgctggactgttggcagaaagagagaagcgacaggcctaaatttgggcagatcgtcaacatgttggacaaactcatccgcaaccccaacagcctgaagaggacagggccagagagttccagaccaaacacagccttgttagatcccagctcccctgaattctccgccgtagtatcagtgggtgactggctgcaggccatcaaaatggaccggtataaggacaacttcacagccgccgggtacacgacactagaagctgtggttcacatgagccaggatgacctggcgcgaattggcatcaccgcaatcacgcaccagaataagattttgagcagcgtccaggcgatgcgaacccagatgcagcagatgcatggcaggatggttcctgtcGCGGCCGCAATGGACTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTTAG
２．実験結果
LC-MS/MS解析の結果、切断部位を含むペプチドを見出し、タンデムマススペクトルから配列が確認され（図３参照）、切断部位を同定した。その結果、配列番号２のアミノ酸配列の563位のロイシン（L）と564位のイソロイシン（I）の間で切断されることが明らかとなった。
【実施例４】
【０２７２】
EphA4細胞内断片の過剰発現によるスパイン形成解析
EphA4は、g-secretaseによって細胞内断片が切り出される。g-secretaseによる細胞内断片の産生が生理的にどのような意味があるのかを明らかにする目的で、EphA4の細胞内断片を発現するベクターを作製し、スパイン形成に対する効果を解析した。
１．実験条件および実験方法
（１）EphA4細胞内断片発現ベクターの構築
ラットEphA4 cDNAを鋳型として、EphA4の細胞内領域(571アミノ酸-Stop)に相当する領域を
Primer３ XhoI site付加：GAGCTCGAGCGTAGACGGAGTAAGTACAGCCAA（配列番号206）,
primer２
を用いてpfu (stratagene)で増幅した。PCRサイクルは、95℃ 2minの反応後、（95℃ 45sec⇒60℃ 45sec⇒72℃ 4min）のサイクルを25サイクル行い、最後に72℃ 7minの反応を行った。PCR産物をQuiaquick PCR purification kit (QIAGEN)で精製し、XhoI(TaKaRa), NotI(TaKaRa)で酵素処理後、pBluescript(Stratagene)にクローニングした。DNA配列は、DNAシークエンサー（Applied Biosystems社  3130xl）を用いて確認した。【０２７３】
pCAG（配列番号202）をXhoI(TaKaRa)およびNotI(TaKaRa)で酵素処理し、前記で得られたpBluescriptからXhoI(TaKaRa)およびNotI(TaKaRa)で細胞内断片を切り出し、その断片をpCAGに挿入した。pCAGは、Gene108,193-200,1991、特許2824433号公報、特許2824434号公報等を参考に作製することが可能であり、得られたEphA4細胞内断片発現ベクターは、組み込まれた細胞内断片のN末端にHAタグが付加されるように構築した。【０２７４】
pCAG DNA配列（配列番号202）
HA-EphA4細胞内断片  DNA配列（配列番号93）
配列番号93のヌクレオチド配列において、5’末端の第１番のaから第45番のgまでの配列は、HAタグをコーするヌクレオチド配列であり、第46番以降の配列はEphA4細胞内断片をコードするヌクレオチド配列である。【０２７５】
HA-EphA4細胞内断片  アミノ酸配列（配列番号94）
（2）EphA4細胞内断片の遺伝子導入
実施例2と同様の方法で、ラット海馬初代培養神経細胞を培養し、培養後9日後にLipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いて、マニュアルにしたがって遺伝子導入実験を行なった。スパインの形態を可視化するためにpcDNA3.1Syn1 GFP（配列番号306）を共遺伝子導入した。12日後、細胞を2％パラホルムアルデヒド(WaKo)で固定し、0.25% TritonX-100で処理し、ブロックエース(雪印乳業)を用いてブロッキングを行なった。ブロッキング後、ウサギ抗GFP抗体(Invitrogen)、ラット抗HA抗体(Roche)で処理し、その後、FITC結合抗ウサギ IgG抗体(Jackson)、Cy3結合抗マウスIgG抗体(Jackson)、Cy5結合抗ラットIgG抗体(Jackson)で反応させた。調整した染色サンプルは、共焦点レーザー顕微鏡(LSM510)で観察した。GFPを発現させたことによって可視化されたSpine(Dendriteに形成された突起物)の数を計測した。画像データは画像解析ソフトMetamorph(Molecular Devices社)を用いて定量した。なお、pcDNA3.1Syn1 GFPは、以下の方法により得られるものである。【０２７６】
pDRIVE-Synapsinプラスミドベクター（Invivogen）を鋳型にして、PCR法によりSynapsin-1 promoter配列を含むヌクレオチド鎖を増幅することでSynapsin-1 promoter配列を取得した。pcDNA3.1(+)プラスミドベクター（Invitrogen）のCMV promoterを制限酵素処理により抜き出し、ライゲーション法によりSynapsin-1 promoterに置き換え、pcDNA3.1Syn1プラスミドベクターを作製した。pIRES2-EGFPプラスミドベクター（Clontech）を鋳型にして、PCR法によりEGFP配列を含むヌクレオチド鎖を増幅することでEGFP配列を取得した。上記で得られたpcDNA3.1Syn1のSynapsin-1 promoter下流のマルチクローニングサイトに、EGFP配列をライゲーション法により挿入し、pcDNA3.1Syn1GFP（配列番号306）を作製した。【０２７７】
pcDNA3.1Syn1 GFP DNA配列（配列番号203）
２．実験結果
図４にその結果を示す。【０２７８】
図４において、HAはEphA4細胞内断片をトランスフェクションしていない神経細胞のサンプルであり、HA-EICDは、EphA4細胞内断片をトランスフェクションした神経細胞のサンプルである。EphA4の細胞内断片を神経細胞に発現させると、Spineの数が増加することが明らかになった。EphA4細胞内断片をトランスフェクションしていない神経細胞に対し、EphA4細胞内断片をトランスフェクションした神経細胞では、スパイン数が増加しているため、海馬神経細胞内でγ-セクレターゼによって開裂されたEphA4は、スパイン形成を活性化させるということが明らかとなった。
【実施例５】
【０２７９】
γセクレターゼにより切断されたEphA4断片の過剰発現によるスパイン形成解析

１．実験条件および実験方法
上記実施例４において、HA-EphA4細胞内断片の代わりに、実施例３で特定した切断位置をもとに、切断された断片のうち細胞内側領域のEphA4断片のC末端にHAタグを付加させた遺伝子（配列番号197）をトランスフェクションし、同様にスパイン形成解析を行った。【０２８０】
HA-γ-fragment  DNA配列（配列番号197）
ATGGACTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTACGCGT GTCGAC
attgcggcatttgtgatcagccgtagacggagtaagtacagccaagcaaagcaagaagcagatgaagagaagcatttgaatcaaggtgttagaacatacgtggatccctttacatatgaagaccccaaccaggcagttcgagaatttgccaaagaaatcgatgcctcctgcattaaaatcgaaaaggtcattggagttggcgaatttggagaagtctgcagtgggcgtctcaaagtgcccggcaagagagagatctgtgtggccatcaagactctgaaagctggttatactgacaagcagaggagagacttcctgagcgaggccagcatcatgggacagtttgaccacccaaacataatccacctggaaggcgttgtcaccaaatgtaaaccagtaatgatcatcacggagtacatggagaacggctccttggacgctttcctcaggaagaatgatggccgatttacagtcattcagctggtgggcatgctccgaggcattggctcggggatgaagtatttatctgatatgagctatgtgcatcgagacctggctgccaggaacattctggtaaatagcaacttggtctgcaaggtgtctgatttcggcatgtccagggtgcttgaggatgacccggaagcagcctatactaccaggggcggcaagattcccatccggtggactgcaccagaagcaattgcgtatcgtaaatttacctcagccagtgacgtctggagctacggaatcgttatgtgggaagtgatgtcatatggagagaggccgtactgggatatgtccaatcaagatgtgatcaaagccatcgaggaagggtaccggctacccccgccaatggactgccccattgccctccatcagttaatgctggactgttggcagaaagagagaagcgacaggcctaaatttgggcagatcgtcaacatgttggacaaactcatccgcaaccccaacagcctgaagaggacagggccagagagttccagaccaaacacagccttgttagatcccagctcccctgaattctccgccgtagtatcagtgggtgactggctgcaggccatcaaaatggaccggtataaggacaacttcacagccgccgggtacacgacactagaagctgtggttcacatgagccaggatgacctggcgcgaattggcatcaccgcaatcacgcaccagaataagattttgagcagcgtccaggcgatgcgaacccagatgcagcagatgcatggcaggatggttcctgtctga
（ヌクレオチド配列の5’末端の大文字表記は、HAタグをコードするヌクレオチド配列であり、3’末端の小文字表記は、γ-セクレターゼにより切断されたEphA4細胞内断片をコードするヌクレオチド配列である。）
HA-γ-fragment  アミノ酸配列（配列番号198）
MDYPYDVPDYATRVD
IAAFVISRRRSKYSQAKQEADEEKHLNQGVRTYVDPFTYEDPNQAVREFAKEIDASCIKIEKVIGVGEFGEVCSGRLKVPGKREICVAIKTLKAGYTDKQRRDFLSEASIMGQFDHPNIIHLEGVVTKCKPVMIITEYMENGSLDAFLRKNDGRFTVIQLVGMLRGIGSGMKYLSDMSYVHRDLAARNILVNSNLVCKVSDFGMSRVLEDDPEAAYTTRGGKIPIRWTAPEAIAYRKFTSASDVWSYGIVMWEVMSYGERPYWDMSNQDVIKAIEEGYRLPPPMDCPIALHQLMLDCWQKERSDRPKFGQIVNMLDKLIRNPNSLKRTGPESSRPNTALLDPSSPEFSAVVSVGDWLQAIKMDRYKDNFTAAGYTTLEAVVHMSQDDLARIGITAITHQNKILSSVQAMRTQMQQMHGRMVPV

２．実験結果
図５にその結果を示す。【０２８１】
図５において、HAはγセクレターゼにより切断されたEphA4断片をトランスフェクションしていない神経細胞のサンプルであり、HA-γ-fragmentは、γセクレターゼにより切断されたEphA4断片をトランスフェクションした神経細胞のサンプルである。γセクレターゼにより切断されたEphA4断片を神経細胞に発現させると、Spineの数が増加することが明らかになった。すなわち、EphA4の細胞内断片は、γセクレターゼにより切断されたEphA4断片と同様にスパイン形成を活性化させるということが明らかとなった。
【実施例６】
【０２８２】
EICDのRhoファミリーを介したシグナル伝達経路への効果
γ-セクレターゼによって産生されるEICDがRhoファミリー分子のシグナル伝達機構に関わるか、また、どの分子の活性化に関わるか、NIH3T3細胞に遺伝子導入し、Rhoファミリー分子が関わるアクチン細胞骨格の再編成における効果について解析した。その際、RhoAが活性化される場合には、細胞底面にストレスファイバーと呼ばれるアクチン繊維が形成され、Cdc42の場合には、細胞膜にフィロポディアと呼ばれる突起構造が形成され、また、Rac1の場合には、細胞膜にラメリポディアと呼ばれる構造体が形成されることが既に知られていることから、これらの形成を指標として該効果を検討した。
１．実験条件および実験方法
（１）発現ベクターの構築
実施例１で作製した1st strand cDNAを鋳型として、Rat Rac1のcDNAを
primer４ SalI site付加：GAGGTCGACATGCAGGCCATCAAGTGTGTGGTG（配列番号207）, 
primer ５ NotI site付加：GAGGCGGCCGCTTACAACAGCAGGCATTTTCTCT（配列番号208）
を用いてpfu (stratagene)で増幅した。PCRサイクルは、95℃ 2minの反応の後、（95℃ 45sec⇒60℃ 45sec⇒72℃ 2min ）のサイクルを35サイクル行い、最後に72℃ 7minの反応を行った。PCR産物をQuiaquick PCR purification kit (QIAGEN)で精製し、SalI(TaKaRa), NotI(TaKaRa)で酵素処理後、pBluescript(Stratagene)にクローニングした。クローニング後のDNA配列は、DNAシークエンサー（Applied Biosystems社  3130xl）を用いて確認した。さらに、dominant negative Rac1を作製するために、GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen)を用いて17番目のスレオニンをアスパラギンに変換させた。変異させたcDNAは、DNAシークエンサー（Applied Biosystems社  3130xl）を用いて確認した。【０２８３】
一方、pCAG（配列番号202）をSalI(TaKaRa)およびNotI(TaKaRa)で酵素処理し、前記で得られたpBluescriptからXhoI(TaKaRa)およびNotI(TaKaRa)で細胞内断片を切り出し、その断片をpCAGに挿入した。pCAGは、Gene108,193-200,1991、特許2824433号公報、特許2824434号公報等を参考に作製することが可能であり、得られた各種細胞内断片発現ベクターは、組み込まれた細胞内断片のN末端にMycタグが付加されるように構築した。
（２）EICD、ならびにEICD+Rac1N17のNIH3T3細胞への遺伝子導入、ならびにアクチン細胞骨格の変化の解析
NIH3T3細胞（ATCC）を10% CBS(フロー) / Antibiotic-Antimycotic (Invitrogen) / DMEM(Invitrogen) となるように5％CO2、37℃の条件下で培養し、HA-EICD（配列番号93）、ならびにEICD+Rac1N17（配列番号200）をLipofectamine2000 (Invitrogen)でトランスフェクションした。18時間後、poly-L-lysin (SIGMA)をコートした13mm cover glassを入れたwellに、細胞をまき直した。さらに18時間後、細胞を2％パラホルムアルデヒド(WaKo)で固定し、0.25% TritonX-100で処理し、ブロックエース(雪印乳業)を用いてブロッキングを行なった。ブロッキング後、ラット抗HA抗体(Roche)で処理し、その後、FITC結合抗ラットIgG抗体(Jackson)、Alexa Fluor phalloidin 546(Molecular probes)で反応させた。調整した染色サンプルを共焦点レーザー顕微鏡(LSM510)で観察し、ラメリポディア構造の形成を定量化した。【０２８４】
EICD+Rac1N17  DNA配列（配列番号200）
ATGGAGCAGAAGCTTATCAGCGAGGAGGACCTGGAATTCACGCGTGTCGAC
atgcaggccatcaagtgtgtggtggtgggagacggagccgttggtaaaaactgcctgctcatcagttacacgaccaatgcgttccctggagagtacatccccaccgtctttgacaactattctgccaatgttatggtagatggaaaaccagtgaatctgggcctctgggacacagctggacaggaagattatgacagactgcgtcccctctcctacccgcaaacagacgtgttcttaatttgcttttcccttgtgagtcctgcatcatttgaaaatgtccgtgcaaagtggtatcctgaagtacgacaccactgtcccaatactcccatcatcctagtggggacgaagcttgatcttagggatgataaggacacgattgagaagctgaaggagaagaagctgactcccattacctacccgcaggggctagccatggcgaaagagatcggtgctgtcaaatacctggagtgctcagcactcacacagcgaggactcaagacagtgtttgatgaagctatccgagccgttctctgtccccctcctgttaagaagaggaagagaaaatgcctgctgttgtaa
（ヌクレオチド配列の5’末端の大文字表記は、Mycタグをコードするヌクレオチド配列であり、3’末端の小文字表記は、EphA4細胞内断片をコードするヌクレオチド配列である。また、太字は変異を入れたヌクレオチドである。）
EICD+Rac1N17  アミノ酸配列（配列番号201）
MEQKLISEEDLEFTRVDMQAIKCVVVGDGAVGKNCLLISYTTNAFPGEYIPTVFDNYSANVMVDGKPVNLGLWDTAGQEDYDRLRPLSYPQTDVFLICFSLVSPASFENVRAKWYPEVRHHCPNTPIILVGTKLDLRDDKDTIEKLKEKKLTPITYPQGLAMAKEIGAVKYLECSALTQRGLKTVFDEAIRAVLCPPPVKKRKRKCLLL
２．実験結果
図６にその結果を示す。【０２８５】
図６中、HAはEphA4細胞内断片をトランスフェクションしていないNIH3T3細胞のサンプルであり、HA−EICDはEphA4細胞内断片をトランスフェクションしたNIH3T3細胞のサンプルであり、HA−EICD＋Rac1N17はEphA4細胞内断片とRac1のドミナントネガティブフォームであるRac1N17を同時にトランスフェクションしたNIH3T3細胞のサンプルである。【０２８６】
EphA4細胞内断片をトランスフェクションすると、ラメリポディア形成が促進される（図６参照。）。すなわち、EphA4の細胞内断片をNIH3T3細胞に発現させると、ラメリポディア構造が形成および／または形成促進されることがわかった。【０２８７】
一方、EphA4細胞内断片とRacのドミナントネガティブフォームであるRac1N17を同時にトランスフェクションすると、このラメリポディア形成促進能は完全に消失した（図６参照。）。すなわち、EICDは、Rac1を活性化させていることが明らかとなった。
【実施例７】
【０２８８】
γセクレターゼにより切断されたEphA4断片のRhoファミリーを介したシグナル伝達経路への効果
１．実験条件および実験方法
上記実施例６において、HA-EphA4細胞内断片の代わりに、実施例５で使用したEphA4断片（配列番号197）をトランスフェクションし、同様にラメリポリディア形成解析を行った。
２．実験結果
図７にその結果を示す。【０２８９】
図７中、HAはγセクレターゼにより切断されたEphA4断片をトランスフェクションしていないNIH3T3細胞のサンプルであり、HA-γ-fragmentはγセクレターゼにより切断されたEphA4断片をトランスフェクションしたNIH3T3細胞のサンプルであり、HA-γ-fragment＋Rac1N17はγセクレターゼにより切断されたEphA4断片とRac1のドミナントネガティブフォームであるRac1N17を同時にトランスフェクションしたNIH3T3細胞のサンプルである。【０２９０】
γセクレターゼにより切断されたEphA4断片をトランスフェクションすると、ラメリポディア形成が促進される（図７参照。）。すなわち、γセクレターゼにより切断されたEphA4断片をNIH3T3細胞に発現させると、ラメリポディア構造が形成および／または形成促進されることがわかった。【０２９１】
一方、γセクレターゼにより切断されたEphA4断片とRacのドミナントネガティブフォームであるRac1N17を同時にトランスフェクションすると、このラメリポディア形成促進能は完全に消失した（図７参照。）。すなわち、EphA4の細胞内断片は、γセクレターゼにより切断されたEphA4断片と同様にRac1を活性化させるということが明らかとなった。
【実施例８】
【０２９２】
Rac1を介したシグナル伝達経路に関わるEICDの必要ドメインの決定
g-secretaseによって産生されるEICDのどの領域がRac1の活性化に必要か解析を行なった。
１．実験条件および実験方法
（１）発現ベクターの構築
EphA4 cDNAを鋳型として、EphA4の各種細胞内領域(HA-EICD D1：587アミノ酸-Stop, HA-EICD D2：622アミノ酸-Stop, HA-EICD D3：661アミノ酸-Stop, HA-EICD D4：701アミノ酸-Stop)に相当する領域をそれぞれ
Primer６ SalI site付加：GAGGTCGACAAGCATTTGAATCAAGGTGTTAG（配列番号209）,
Primer７ SalI site付加：GAGGTCGACAAAATCGAAAAGGTCATTGGAG（配列番号210）, 
Primer８ SalI site付加：GAGGTCGACGACAAGCAGAGGAGAGACTTCC（配列番号211）, 
Primer９ SalI site付加：GAGGTCGACTACATGGAGAACGGCTCCTTGG（配列番号212）と
前述のprimer 2を用いてpfu (stratagene)で増幅した。PCRサイクルは、95℃ 2minの反応後、（ 95℃45sec⇒60℃ 45sec⇒72℃ 4min）のサイクルを25サイクル行い、最後に72℃ 7minの反応を行った。PCR産物をQuiaquick PCR purification kit (QIAGEN)で精製し、SalI(TaKaRa), NotI(TaKaRa)で酵素処理後、pBluescript(Stratagene)にクローニングした。DNA配列は、DNAシークエンサー（Applied Biosystems社  3130xl）を用いて確認した。【０２９３】
pCAG（配列番号11）をSalI(TaKaRa)およびNotI(TaKaRa)で酵素処理し、前記で得られたpBluescriptからXhoI(TaKaRa)およびNotI(TaKaRa)で細胞内断片を切り出し、その断片をpCAGに挿入した。得られた各種細胞内断片発現ベクターは、組み込まれた細胞内断片のN末端にHAタグが付加されるように構築した。【０２９４】
（２）各種細胞内断片のNIH3T3細胞への遺伝子導入、ならびにアクチン細胞骨格の変化の解析
NIH3T3細胞に対し、HA、HA-EICD（配列番号９３）および上記（１）で作製した各種EICD変異体（HA-EICD D1〜HA-EICD D4）を実施例６，７と同様の方法でそれぞれトランスフェクションし、ラメリポディアを形成する細胞の割合を調べた。なお、以下の各種EICD変異体において、ヌクレオチド配列の5’末端の大文字表記は、HAタグをコードするヌクレオチド配列であり、3’末端の小文字表記は、EphA4細胞内断片をコードするヌクレオチド配列である。【０２９５】
HA-EICD D1  DNA配列（配列番号167）
ATGGACTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTACGCGT GTCGAC
aagcatttgaatcaaggtgttagaacatacgtggatccctttacatatgaagaccccaaccaggcagttcgagaatttgccaaagaaatcgatgcctcctgcattaaaatcgaaaaggtcattggagttggcgaatttggagaagtctgcagtgggcgtctcaaagtgcccggcaagagagagatctgtgtggccatcaagactctgaaagctggttatactgacaagcagaggagagacttcctgagcgaggccagcatcatgggacagtttgaccacccaaacataatccacctggaaggcgttgtcaccaaatgtaaaccagtaatgatcatcacggagtacatggagaacggctccttggacgctttcctcaggaagaatgatggccgatttacagtcattcagctggtgggcatgctccgaggcattggctcggggatgaagtatttatctgatatgagctatgtgcatcgagacctggctgccaggaacattctggtaaatagcaacttggtctgcaaggtgtctgatttcggcatgtccagggtgcttgaggatgacccggaagcagcctatactaccaggggcggcaagattcccatccggtggactgcaccagaagcaattgcgtatcgtaaatttacctcagccagtgacgtctggagctacggaatcgttatgtgggaagtgatgtcatatggagagaggccgtactgggatatgtccaatcaagatgtgatcaaagccatcgaggaagggtaccggctacccccgccaatggactgccccattgccctccatcagttaatgctggactgttggcagaaagagagaagcgacaggcctaaatttgggcagatcgtcaacatgttggacaaactcatccgcaaccccaacagcctgaagaggacagggccagagagttccagaccaaacacagccttgttagatcccagctcccctgaattctccgccgtagtatcagtgggtgactggctgcaggccatcaaaatggaccggtataaggacaacttcacagccgccgggtacacgacactagaagctgtggttcacatgagccaggatgacctggcgcgaattggcatcaccgcaatcacgcaccagaataagattttgagcagcgtccaggcgatgcgaacccagatgcagcagatgcatggcaggatggttcctgtctga
HA-EICD D1  アミノ酸配列（配列番号168）
MDYPYDVPDYATRVDKHLNQGVRTYVDPFTYEDPNQAVREFAKEIDASCIKIEKVIGVGEFGEVCSGRLKVPGKREICVAIKTLKAGYTDKQRRDFLSEASIMGQFDHPNIIHLEGVVTKCKPVMIITEYMENGSLDAFLRKNDGRFTVIQLVGMLRGIGSGMKYLSDMSYVHRDLAARNILVNSNLVCKVSDFGMSRVLEDDPEAAYTTRGGKIPIRWTAPEAIAYRKFTSASDVWSYGIVMWEVMSYGERPYWDMSNQDVIKAIEEGYRLPPPMDCPIALHQLMLDCWQKERSDRPKFGQIVNMLDKLIRNPNSLKRTGPESSRPNTALLDPSSPEFSAVVSVGDWLQAIKMDRYKDNFTAAGYTTLEAVVHMSQDDLARIGITAITHQNKILSSVQAMRTQMQQMHGRMVPV
HA-EICD D2  DNA配列（配列番号169）
ATGGACTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTACGCGT GTCGAC
aaaatcgaaaaggtcattggagttggcgaatttggagaagtctgcagtgggcgtctcaaagtgcccggcaagagagagatctgtgtggccatcaagactctgaaagctggttatactgacaagcagaggagagacttcctgagcgaggccagcatcatgggacagtttgaccacccaaacataatccacctggaaggcgttgtcaccaaatgtaaaccagtaatgatcatcacggagtacatggagaacggctccttggacgctttcctcaggaagaatgatggccgatttacagtcattcagctggtgggcatgctccgaggcattggctcggggatgaagtatttatctgatatgagctatgtgcatcgagacctggctgccaggaacattctggtaaatagcaacttggtctgcaaggtgtctgatttcggcatgtccagggtgcttgaggatgacccggaagcagcctatactaccaggggcggcaagattcccatccggtggactgcaccagaagcaattgcgtatcgtaaatttacctcagccagtgacgtctggagctacggaatcgttatgtgggaagtgatgtcatatggagagaggccgtactgggatatgtccaatcaagatgtgatcaaagccatcgaggaagggtaccggctacccccgccaatggactgccccattgccctccatcagttaatgctggactgttggcagaaagagagaagcgacaggcctaaatttgggcagatcgtcaacatgttggacaaactcatccgcaaccccaacagcctgaagaggacagggccagagagttccagaccaaacacagccttgttagatcccagctcccctgaattctccgccgtagtatcagtgggtgactggctgcaggccatcaaaatggaccggtataaggacaacttcacagccgccgggtacacgacactagaagctgtggttcacatgagccaggatgacctggcgcgaattggcatcaccgcaatcacgcaccagaataagattttgagcagcgtccaggcgatgcgaacccagatgcagcagatgcatggcaggatggttcctgtctga
HA-EICD D2  アミノ酸配列（配列番号170）
MDYPYDVPDYATRVDKIEKVIGVGEFGEVCSGRLKVPGKREICVAIKTLKAGYTDKQRRDFLSEASIMGQFDHPNIIHLEGVVTKCKPVMIITEYMENGSLDAFLRKNDGRFTVIQLVGMLRGIGSGMKYLSDMSYVHRDLAARNILVNSNLVCKVSDFGMSRVLEDDPEAAYTTRGGKIPIRWTAPEAIAYRKFTSASDVWSYGIVMWEVMSYGERPYWDMSNQDVIKAIEEGYRLPPPMDCPIALHQLMLDCWQKERSDRPKFGQIVNMLDKLIRNPNSLKRTGPESSRPNTALLDPSSPEFSAVVSVGDWLQAIKMDRYKDNFTAAGYTTLEAVVHMSQDDLARIGITAITHQNKILSSVQAMRTQMQQMHGRMVPV
HA-EICD D3  DNA配列（配列番号171） 
ATGGACTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTACGCGT GTCGAC
gacaagcagaggagagacttcctgagcgaggccagcatcatgggacagtttgaccacccaaacataatccacctggaaggcgttgtcaccaaatgtaaaccagtaatgatcatcacggagtacatggagaacggctccttggacgctttcctcaggaagaatgatggccgatttacagtcattcagctggtgggcatgctccgaggcattggctcggggatgaagtatttatctgatatgagctatgtgcatcgagacctggctgccaggaacattctggtaaatagcaacttggtctgcaaggtgtctgatttcggcatgtccagggtgcttgaggatgacccggaagcagcctatactaccaggggcggcaagattcccatccggtggactgcaccagaagcaattgcgtatcgtaaatttacctcagccagtgacgtctggagctacggaatcgttatgtgggaagtgatgtcatatggagagaggccgtactgggatatgtccaatcaagatgtgatcaaagccatcgaggaagggtaccggctacccccgccaatggactgccccattgccctccatcagttaatgctggactgttggcagaaagagagaagcgacaggcctaaatttgggcagatcgtcaacatgttggacaaactcatccgcaaccccaacagcctgaagaggacagggccagagagttccagaccaaacacagccttgttagatcccagctcccctgaattctccgccgtagtatcagtgggtgactggctgcaggccatcaaaatggaccggtataaggacaacttcacagccgccgggtacacgacactagaagctgtggttcacatgagccaggatgacctggcgcgaattggcatcaccgcaatcacgcaccagaataagattttgagcagcgtccaggcgatgcgaacccagatgcagcagatgcatggcaggatggttcctgtctga
HA-EICD D3  アミノ酸配列（配列番号172）
MDYPYDVPDYATRVDDKQRRDFLSEASIMGQFDHPNIIHLEGVVTKCKPVMIITEYMENGSLDAFLRKNDGRFTVIQLVGMLRGIGSGMKYLSDMSYVHRDLAARNILVNSNLVCKVSDFGMSRVLEDDPEAAYTTRGGKIPIRWTAPEAIAYRKFTSASDVWSYGIVMWEVMSYGERPYWDMSNQDVIKAIEEGYRLPPPMDCPIALHQLMLDCWQKERSDRPKFGQIVNMLDKLIRNPNSLKRTGPESSRPNTALLDPSSPEFSAVVSVGDWLQAIKMDRYKDNFTAAGYTTLEAVVHMSQDDLARIGITAITHQNKILSSVQAMRTQMQQMHGRMVPV
HA-EICD D4  DNA配列（配列番号173）
ATGGACTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTACGCGT GTCGAC
tacatggagaacggctccttggacgctttcctcaggaagaatgatggccgatttacagtcattcagctggtgggcatgctccgaggcattggctcggggatgaagtatttatctgatatgagctatgtgcatcgagacctggctgccaggaacattctggtaaatagcaacttggtctgcaaggtgtctgatttcggcatgtccagggtgcttgaggatgacccggaagcagcctatactaccaggggcggcaagattcccatccggtggactgcaccagaagcaattgcgtatcgtaaatttacctcagccagtgacgtctggagctacggaatcgttatgtgggaagtgatgtcatatggagagaggccgtactgggatatgtccaatcaagatgtgatcaaagccatcgaggaagggtaccggctacccccgccaatggactgccccattgccctccatcagttaatgctggactgttggcagaaagagagaagcgacaggcctaaatttgggcagatcgtcaacatgttggacaaactcatccgcaaccccaacagcctgaagaggacagggccagagagttccagaccaaacacagccttgttagatcccagctcccctgaattctccgccgtagtatcagtgggtgactggctgcaggccatcaaaatggaccggtataaggacaacttcacagccgccgggtacacgacactagaagctgtggttcacatgagccaggatgacctggcgcgaattggcatcaccgcaatcacgcaccagaataagattttgagcagcgtccaggcgatgcgaacccagatgcagcagatgcatggcaggatggttcctgtctga
HA-EICD D4  アミノ酸配列（配列番号174）
MDYPYDVPDYATRVDYMENGSLDAFLRKNDGRFTVIQLVGMLRGIGSGMKYLSDMSYVHRDLAARNILVNSNLVCKVSDFGMSRVLEDDPEAAYTTRGGKIPIRWTAPEAIAYRKFTSASDVWSYGIVMWEVMSYGERPYWDMSNQDVIKAIEEGYRLPPPMDCPIALHQLMLDCWQKERSDRPKFGQIVNMLDKLIRNPNSLKRTGPESSRPNTALLDPSSPEFSAVVSVGDWLQAIKMDRYKDNFTAAGYTTLEAVVHMSQDDLARIGITAITHQNKILSSVQAMRTQMQQMHGRMVPV
EICD D1  DNA配列（配列番号195）
aagcatttgaatcaaggtgttagaacatacgtggatccctttacatatgaagaccccaaccaggcagttcgagaatttgccaaagaaatcgatgcctcctgcattaaaatcgaaaaggtcattggagttggcgaatttggagaagtctgcagtgggcgtctcaaagtgcccggcaagagagagatctgtgtggccatcaagactctgaaagctggttatactgacaagcagaggagagacttcctgagcgaggccagcatcatgggacagtttgaccacccaaacataatccacctggaaggcgttgtcaccaaatgtaaaccagtaatgatcatcacggagtacatggagaacggctccttggacgctttcctcaggaagaatgatggccgatttacagtcattcagctggtgggcatgctccgaggcattggctcggggatgaagtatttatctgatatgagctatgtgcatcgagacctggctgccaggaacattctggtaaatagcaacttggtctgcaaggtgtctgatttcggcatgtccagggtgcttgaggatgacccggaagcagcctatactaccaggggcggcaagattcccatccggtggactgcaccagaagcaattgcgtatcgtaaatttacctcagccagtgacgtctggagctacggaatcgttatgtgggaagtgatgtcatatggagagaggccgtactgggatatgtccaatcaagatgtgatcaaagccatcgaggaagggtaccggctacccccgccaatggactgccccattgccctccatcagttaatgctggactgttggcagaaagagagaagcgacaggcctaaatttgggcagatcgtcaacatgttggacaaactcatccgcaaccccaacagcctgaagaggacagggccagagagttccagaccaaacacagccttgttagatcccagctcccctgaattctccgccgtagtatcagtgggtgactggctgcaggccatcaaaatggaccggtataaggacaacttcacagccgccgggtacacgacactagaagctgtggttcacatgagccaggatgacctggcgcgaattggcatcaccgcaatcacgcaccagaataagattttgagcagcgtccaggcgatgcgaacccagatgcagcagatgcatggcaggatggttcctgtctga
EICD D1  アミノ酸配列（配列番号196）
KHLNQGVRTYVDPFTYEDPNQAVREFAKEIDASCIKIEKVIGVGEFGEVCSGRLKVPGKREICVAIKTLKAGYTDKQRRDFLSEASIMGQFDHPNIIHLEGVVTKCKPVMIITEYMENGSLDAFLRKNDGRFTVIQLVGMLRGIGSGMKYLSDMSYVHRDLAARNILVNSNLVCKVSDFGMSRVLEDDPEAAYTTRGGKIPIRWTAPEAIAYRKFTSASDVWSYGIVMWEVMSYGERPYWDMSNQDVIKAIEEGYRLPPPMDCPIALHQLMLDCWQKERSDRPKFGQIVNMLDKLIRNPNSLKRTGPESSRPNTALLDPSSPEFSAVVSVGDWLQAIKMDRYKDNFTAAGYTTLEAVVHMSQDDLARIGITAITHQNKILSSVQAMRTQMQQMHGRMVPV
２．実験結果
図８にその結果を示す。図中、HA、E4ICD、E4ICDD1、E4ICDD２、E4ICDD３、E4ICDD４は、それぞれHA、HA-EICD、HA-EICDD1、HA-EICDD2、HA-EIC D3、HA-EICDD4をトランスフェクションしたものを意味する。【０２９６】
EICD D1は、ラメリポディアを形成する細胞が増加しているが、EICD D2、EICD D3、EICD D4では、HAと同程度であった（図８参照。）。【０２９７】
よって、HA-EICD D2,3,4が、ラメリポディア形成能をまったく持たないことから、γ-セクレターゼにより切断された断片のうち、N末側はHA-EICD D1までの領域(587アミノ酸-Stop)が最低限必要であることがわかった。すなわち、配列番号２の配列において、Rac1が活性化されるのに必要な領域は、N末が５６４位〜６２１位で開始する配列、好ましくは５６４位〜５８７位で開始する配列であることが明らかとなった。また、HA-EICD D２の配列は、自己リン酸化ドメインとキナーゼドメインに相当する領域を欠失させた配列であることからRac1の活性化には、切断された断片のうち、少なくとも両ドメインが保存されていることが必要であることが明らかとなった。    【０２９８】
本明細書中で使用される専門用語は、単に特定の態様を説明することを目的として用いられ、限定することを意図したものではない。【０２９９】
他に特に定義されない限り、本明細書中で用いられる全ての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する通常の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用されうるが、好ましい方法および材料について以上の記載を参照できる。【０３００】
本明細書中で言及された全ての出版物は、たとえば、ここで記載された発明と関連して用いられた出版物中に記載される、細胞系、構築物および方法を記載および開示する目的で、その全体が本明細書中に参照として組み入れられ、あるいは、本発明の化合物同定方法、スクリーニング方法およびそれらの技術のための方法および組成物の開示に関して、参照として本明細書に組み入れられ、本発明の実施のために用いることができる。
【産業上の利用可能性】
【０３０１】
本発明により、新規活性を有するEphA4ポリペプチドおよびその用途が提供される。本発明は、γ-セクレターゼによりプロセシングされた細胞内EphA4細胞内ポリペプチドおよび該ペプチドに対する特異的な抗体を提供するとともに、γ-セクレターゼによるEphA4の開裂およびスパイン形成、γ-セクレターゼによりプロセシングされたEphA4細胞内断片によるスパイン形成およびRac活性、あるいはγ-セクレターゼによりプロセシングされたEphA4細胞内断片の分解に選択的に作用する化合物を選択することができ、これにより、所望の記憶障害、特に認知症（好ましくはAD）の治療薬の創出が可能になる。
【配列表フリーテキスト】
【０３０２】
配列番号199：合成DNA
配列番号202〜212：合成DNA
【図３】
0005508857.tif 000005
【図４】
0005508857.tif 000006
【図５】
0005508857.tif 000007
【図７】
0005508857.tif 000008
【図１】
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【図２】
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【図６】
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【図８】
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【配列表】
0005508857000001.app