(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
相補的なセンスおよびアンチセンス領域を含み、
- アンチセンス領域が、ヒトハンチンチン転写産物に相補的な19の連続したヌクレオチドを有し、前記ヌクレオチドが、配列番号１〜３からなる群より選択される配列によりコードされ、
- センスおよびアンチセンス領域が、互いに相補的で二重鎖を形成する19の連続したヌクレオチドを有し、
- 内因性野生型および外因性ヒト変異ハンチンチン遺伝子の発現を、前記ハンチンチン遺伝子の両方を発現している非ヒト哺乳動物の細胞において阻害する、
単離された二本鎖短干渉核酸分子。
【請求項２】
センス領域が、配列番号４〜６からなる群より選択される配列によりコードされる19の連続したヌクレオチドを含む、請求項１に記載の二本鎖短干渉核酸分子。
【請求項３】
それぞれ19〜30ヌクレオチドの２つの別々のオリゴヌクレオチドから組み立てられ、19塩基対の二重鎖構造を形成する、請求項１または２に記載の二本鎖短干渉核酸分子。
【請求項４】
31〜50ヌクレオチドの単一のオリゴヌクレオチドから組み立てられ、19塩基対の二重鎖構造および4〜10ヌクレオチドのループ構造を有するヘアピンを形成する、請求項１または２に記載の二本鎖短干渉核酸分子。
【請求項５】
ループが、配列番号７によりコードされる、請求項４に記載の二本鎖短干渉核酸分子。
【請求項６】
配列番号８〜１０からなる群より選択される配列によりコードされる、請求項５に記載の二本鎖短干渉核酸分子。
【請求項７】
一方または両方の3'末端が、1〜3の突出ヌクレオチドを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の二本鎖短干渉核酸分子。
【請求項８】
両方の末端が平滑である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の二本鎖短干渉核酸分子。
【請求項９】
RNA分子である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の二本鎖短干渉核酸分子。
【請求項１０】
１つ以上の改変されたピリミジンおよび／またはプリンヌクレオチドを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の二本鎖短干渉核酸分子。
【請求項１１】
少なくとも１つの改変されたヌクレオチド間リンケージを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の二本鎖短干渉核酸分子。
【請求項１２】
前記非ヒト哺乳動物が、マウスまたはラットである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の二本鎖短干渉核酸分子。
【請求項１３】
転写開始領域と、転写終止領域と、請求項１〜９のいずれか１項に記載の少なくとも１つの短干渉核酸分子をコードする核酸配列とを含み、
前記核酸配列が、宿主細胞において短干渉核酸分子の発現および／または送達を可能にする様式で前記開始領域に作動可能に連結する、転写ユニット。
【請求項１４】
転写開始領域がドキシサイクリン制御プロモーターを含む、請求項１３に記載の転写ユニット。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の転写ユニットを含む、発現ベクター。
【請求項１６】
複製欠陥性で、多様性弱毒化レンチウイルスベクターである、請求項１５に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載のベクターにより改変された細胞。
【請求項１８】
許容できる担体中に、請求項１〜１２のいずれか1項に記載の少なくとも１つの短干渉核酸分子または前記短干渉核酸分子をコードする請求項１５もしくは１６に記載の発現ベクターを含む、医薬組成物。
【請求項１９】
ハンチントン病の予防または治療用医薬品の製造のための、請求項１〜１２のいずれか1項に記載の短干渉核酸分子または前記短干渉核酸分子をコードする請求項１５もしくは１６に記載の発現ベクターの使用。
【請求項２０】
げっ歯類モデルにおけるハンチントン病の研究のための、請求項１〜１２のいずれか1項に記載の短干渉核酸分子または前記短干渉核酸分子をコードする請求項１５もしくは１６に記載の発現ベクターの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、RNA干渉により変異および内因性野生型ハンチンチン遺伝子を抑制的に調節する短核酸分子ならびにハンチントン病の治療およびげっ歯類モデルにおけるハンチントン病の研究のためのそれらの応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハンチントン病（HD）は、精神症状発現、認知障害、および非自発的舞踏病様運動により特徴付けられる、致死性の常染色体優性神経変性障害である（Vonsattel, J.P.およびDiFiglia, M., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 1998, 57, 369-384）。ハンチントン病の根底となる変異は、ハンチンチン遺伝子（htt）の第１エクソンのCAGヌクレオチド反復の伸長であり、httタンパク質のN末端領域に延長ポリグルタミン（ポリQ）域を有する変異httタンパク質を産生する。35以上のCAG反復数は、HDを一般に引き起こし、発症年齢は伸長の長さと逆比例に関連する。これはポリグルタミン反復障害に共通の特徴である（グループ, T.H.s.D.C.R, Cell, 1993, 72, 971-983）。該疾患は、通常、中年において進展するが、60以上のCAG反復長では若年発症ケースも起こり得る。兆候の発症から10〜15年後に、一般的に死亡する。
【０００３】
脳全体におけるハンチンチン（htt）の広範な発現にもかかわらず、影響を受ける領域は、線条内のニューロンのサブセットであるGABA作動性とげ状ニューロンに限定されている。障害のより進行した段階では、他の脳領域、特に大脳皮質において、神経病理学的変化が起こる。
【０００４】
疾患の発症もしくは進行を遅らせるための治療または予防的処置は得られていない。しかしながら、ハンチントン病の細胞および動物モデルで実施された研究により、変異htt神経毒性の分子的基礎についての重要な手がかりが提供された。プロテアソーム分解の欠陥、変化した遺伝子転写、タンパク質のミスフォールディング、Ca2+異常、細胞間シグナリングの欠損、およびアポトーシスカスケードの活性化は、全てハンチントン病の病因に関係する（Petersenら, Exp. Neurol., 1999, 157, 1-18）。これらのメカニズムは、全て潜在的な治療標的を示し得る。しかしながら、原因因子である変異htt自体のレベルの減少は、ハンチントン病の病因を阻害するための最終的で最大の直接アプローチを示す。
【０００５】
RNAiは、短二本鎖RNAにより媒介される転写後遺伝子サイレンシングの形態である（Brummelkampら, Science, 2002, 296, 550-553; Hannon, G.J., Nature, 2002, 418, 244-251; McManus, M.T.およびSharp, P.A., Nat. Rev. Genet., 2002, 3, 737-747）。19〜23 bpの短二本鎖RNA分子（siRNA）は、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）を介して、同種の相同mRNAの分解を誘導する。RNAポリメラーゼIIまたはIIIプロモーターによりDNA鋳型から合成された低分子ヘアピンRNA（shRNA）の低分子干渉RNA（siRNA）への転換は、細胞リボヌクレアーゼIII、ダイサー（Dicer）により成し遂げられる（Dykxhoornら, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 2003, 4, 457-467; Hammond, S.M., FEBS Lett., 2005, 579, 5822-5829; Hannon, G.J.およびRossi, J.J., Nature, 2004, 431, 371-378）。
【０００６】
中枢神経系（CNS）における持続的で長期間のsiRNAの発現を確実にし、血液脳関門の存在に関連する送達の問題を克服するために、遺伝子移行アプローチが研究されてきた。哺乳動物細胞におけるsiRNAsの安定発現のための発現系が開発されてきた（Brummelkampら, Science, 2002, 296, 550-553; Suiら, P.N.A.S., 2002, 99, 5515-5520; Bartonら, P.N.A.S., 2002, 99, 14943-14945）。RNA pol IIまたはRNA pol IIIプロモーター（U6およびH1）は、shRNAまたはsiRNAsを発現させるために、ウイルスベクターにおいて用いられてきた（Bartonら, P.N.A.S., 2002, 99, 14943-14945; Devroe, E.およびSilver, P.A., BMC Biotechnol., 2002, 2, 15-; Shenら, Hum. Gene Ther., 2002, 13, 2197-2201）。siRNAsをコードするレンチウイルスベクターにより、ニューロンを含む哺乳動物細胞内で長期間の遺伝子サイレンシングが行われることが示された（Abbasら, Hum. Gene Ther., 2002, 13, 2197-2201; Rubinsonら, Nat. Genet., 2003, 33, 401-406; Stewartら, RNA, 2003, 9, 493-501; Tiscorniaら, P.N.A.S., 2003, 100, 1844-1848; Bridgeら, Nat. Genet., 2003, 34, 263-264; Mattaら, Cancer Biol.Ther., 2003, 2, 206-210; Krichevsky, A.M.およびKosik, K.S., P.N.A.S., 2002, 99, 11926-11929）。
【０００７】
発現ベクターにおけるsiRNAの設計および組み込みの可能性により、この治療的アプローチは魅力的になる。優性疾患、1、3型脊髄小脳失調およびハンチントン病への原理の証拠が示されてきた（Sah, D.W.Y., Life Sciences, 2006; Denovan-Wright, E.M.およびDavidson, B.L., Gene Therapy, 20 October 2005, 1-7; Chenら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2005, 329, 646-652; Harperら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2005, 102, 5820-5825; Huang, B.およびKochanek, S., Hum. Gene Ther., 2005, 16, 618-626; Machidaら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2006, 343, 190-197; Omiら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2005, 338, 1229-1235; Rodriguez-Lebronら, Mol. Ther., 2005, 12, 618-633; Wangら, Neurosci. Res., 2005, 53, 241-219; Xiaら, Nat. Med., 2004, 10, 816-820; Xiaら, Nat. Biotechnol., 2002, 20, 1006-1010; 国際PCT出願WO 2006/031267, WO 2005/116212, WO 2005/105995）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これらの有望な結果にもかかわらず、ポリQ障害、特にハンチントン病へのsiRNAの臨床応用を考慮する前に、いくつかの問題を検討する必要がある。
【０００９】
第１の問題は、冒された患者における野生型httの発現を保存するための対立遺伝子特異的サイレンシングの可能性のある必要性である。今日まで、インビトロまたはポリQ疾患のトランスジェニックマウスモデルにおいて行われた全ての研究は、内因性マウス野生型htt対立遺伝子ではなく、ヒト変異転写産物を特に標的とするsiRNAを用いた。ハンチントン病においては、変異httの優勢の機能獲得（gain-of-function）効果が示された。しかしながら、野生型httも成熟したニューロンの生存に役割を果たすこと、および機能喪失（loss-of-function）も疾患の過程に寄与し得ることが研究により示された（Cattaneo, E., News Physiol. Sci., 2003, 18, 34-37）。興味深いことに、野生型htt発現の50％の減少（１つの機能的htt対立遺伝子）は、マウス（Duyaoら, Science, 1995, 269, 407-410; Zeithinら, Nat. Genet., 1995, 11, 155-163）およびヒト（Ambroseら, Somat. Cell. Mol. Genet., 1994, 20, 27-38; Persichettiら, Neurobiol. Dis., 1996, 3, 183-190）においてニューロンの生存に影響しない。しかしながら、成体マウスにおけるhttタンパク質の84％の減少となる条件的遺伝子不活性化により、線条体および皮質のニューロン神経変性が引き起こされる（Dragatsisら, Nat. Genet., 2000, 26, 300-306）。同時に起こる正常内因性野生型httのサイレンシングが有害な効果を有するのかどうかという疑問はこれまでに検討されておらず、また臨床的開発に対して重大な問題を示す。このように、成熟した脳において野生型htt発現の長期間の減少が許容され得るか否かを決定することは重要である。選択的に変異htt対立遺伝子を標的とするsiRNAは最も安全な方策を示すと同時に、全体的なhttサイレンシングアプローチはハンチントン病患者の個々の治療法および遺伝子試験を開発するコストを避けるだろう。
【００１０】
第２の問題は、大脳領域において、変異htt mRNAの長期間かつ強いサイレンシングを確実にする効力のある発現系を有する必要性である。ハンチントン病トランスジェニックモデルでの研究は、httを標的にするsiRNA（sihtt）の送達に伴う行動および機能の回復についての情報を提供する。線条でのhttの局所的で不完全な不活性化が、疾患の進行を遅らせ、またハンチントン病患者の認識低下および行動障害の改善に十分であるかどうか、または付加的な脳構造は考慮されるべきかどうかは、これから立証されるだろう。SCA1トランスジェニックマウスにおいて病気の進行が、アタキシン（ataxin）を標的とするAAV-siRNAベクターでの小脳の部分的感染で緩和したことを示したXiaらの研究（Nature Biotechnology, 2002, 20, 1006-1010）により、有望な結果が提供される。
【００１１】
最後に、ハンチントン病のような慢性神経変性疾患において、siRNAの薬理学的調節は、安全な方策として特に重要である。必要であればsiRNA発現を止め、httを標的とするsiRNAの脳における長期間かつ連続的発現に起因する潜在的副作用を制御することが好ましい。さらに、siRNAの条件的発現は、脳におけるsiRNAの動態（kinetic）および長期間の効果をさらに分析するのに特に重要である。薬理学的に制御されたプロモーターは、遺伝子発現を制御する最も効力のあるツールの１つである（Gossen, M.およびBujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 5547-5551; Gossenら, Science, 1995, 268, 1766-1769）。これらの中でも、テトラサイクリン調節性の系は、テトラサイクリンのアナログであるドキシサイクリンが血液脳関門を通過するので、CNSへの使用に特に適している（Barzaら, Antimicrob. Agents Chemother., 1975, 8, 713-720）。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
げっ歯類モデルにおいて内因性野生型httのサイレンシングの影響を調査するために、発明者らは、様々な種に特異性のある低分子干渉RNA（shRNA）を設計した。内因性野生型および／またはヒト変異htt mRNAを特に標的とするshRNA（sihtt）の調節された発現を可能にするドキシサイクリン調節性レンチウイルスベクターが、sihtt治療およびこの系の可逆性を調節するために作製された。ハンチントン病のげっ歯類モデルの線条における種特異的（ヒトならびに／またはラットおよび／もしくはマウス）shRNAの長期間の発現は、治療効果の評価に用いられ、発明者らがhttの全身的（general）サイレンシングまたは疾患対立遺伝子の特異的抑制的調節を模倣する方策を試験することを可能にした。
【００１３】
試験された少なくとも３つのshRNA（sihtt1.1（エクソン２）、sihtt3（エクソン２）およびsihtt6（エクソン４））は、ラットおよびマウスモデルにおいて85％以上のDARPP-32発現の回復およびhtt封入体（inclusions）の完全に近い除去とともに、ハンチントン病の病変を劇的に減少させた。CNSにおける高い形質導入効率および転移ベクターの3'LTRにおけるH1-shRNA発現カセットの組み込みにより得られる強い遺伝子発現レベルを導くレンチウイルスベクターの使用は、アプローチの有効性に寄与する。さらに、このアプローチが、９ヶ月まで持続したsihttの発現となったことが示された。このタイプの長期間の送達が、HDのような慢性神経変性疾患の順調な治療に必須であろう。
【００１４】
脳におけるsihtt条件的発現の概念の証拠は、ハンチントン病のげっ歯類モデルにおいて、htt標的siRNAのドキシサイクリン調節性発現を達成するTetR-KRABトランスリプレッサーおよびH1ポリメラーゼIIIプロモーターで示された。この系は３つのプラスミドに依存したという事実にもかかわらず、sihtt発現の厳重な調節が得られた。この系は、ハンチントン病の病変の可逆性の評価に用いられ、それゆえ、ハンチントン病における治療的介入の窓（window）についての情報を提供する。-DOX/+DOX動物において得られる結果は、ハンチントン病症状の発症後のsihtt治療の開始は、線条体マーカーDARPP-32の発現の喪失の顕著な減少およびhtt封入体の不完全な除去により評価されるように、ポリQ毒性の減少にまだ有効であることを示した。
【００１５】
全体的サイレンシングの影響の問題を検討するインビボ研究により、成熟した線条体ニューロンにおいて、正常レベルの25〜35％の正常htt発現の減少が９ヶ月までよく許容されることが示された。マウスおよびラットの線条における様々な種特異性のあるsiRNAの発現は、指向された選択性にしたがって内因性httの抑制的調節を誘導し、げっ歯類における内因性および／または変異httの抑制的調節は、減少した治療効果または増加した線条体の脆弱性と関連しなかった。毒性の兆候、線条の変性または線条体マーカーもしくはsiRNAベクター内に存在するLacZレポーター遺伝子の発現の喪失は、げっ歯類の脳における長期間のsiRNAの発現後は観察されなかった。マイクロアレイ解析により、成体マウスにおいて内因性野生型httがサイレンシングされる場合、httの既知の機能に関連するいくつかの経路が変化することが示された。それにもかかわらず、これらの結果は、成体マウスにおける内因性httの局所（線条）の長期間かつ不完全な不活性化を実行できることを示す。胚発生直後のニューロンの大部分でのhtt遺伝子の完全な不活性化が、脳全体でのhtt発現の激減および早期致死に関連したHD条件的ノックアウトマウスとは反対に（Dragatsisら, Nat. Genet., 2000, 26, 300-306）、処理された動物の線条におけるhtt転写産物の残存レベルは、生物学的機能を維持するのに十分であるかもしれない。
【００１６】
要するに、これらの結果が示したことは：（i）変異httのサイレンシングは、げっ歯類においてハンチントン病様神経病変を劇的に減少させたこと、（ii）ハンチントン病病変の発症後に開始されたsihtt治療は、まだ効果があり、げっ歯類におけるハンチントン病様神経病変を劇的に減少させること、（iii）外因性変異httおよび内因性野生型転写産物は、どちらもインビボにおいて効率よくサイレンシングされること、（iv）内因性httのサイレンシングは、既知のhtt機能に関連した分子的経路の転写的（transcriptomic）変化を顕著に引き起こすこと、（v）内因性野生型httのこの不完全な不活性化は、ハンチントン病病変を悪化させないこと、および（vi）このサイレンシングは、GABA作動性ニューロン生存を変えないか、または短期間および中期間の治療後の65〜75％のサイレンシングレベルであるsihttの治療効果を変えないことである。
【００１７】
これらのデータは、HDに対するレンチウイルス媒介性サイレンシングの効果を立証し、野生型httの不完全な不活性化の長期間の影響を初めて示した。
これらを合わせて考えると、これらの結果は、ハンチントン病を抑える治療ツールとしてのsiRNAの可能性を立証し、野生型および変異httの同時に起こるサイレンシングが、ハンチントン病患者への適切かつ実行可能なアプローチとして考え得ることを示唆する。
【００１８】
それゆえ、本発明は、
相補的なセンスおよびアンチセンス領域を含み、
- アンチセンス領域が、ヒトhtt転写産物に相補的な15から19以下の連続したヌクレオチドを有し、前記ヌクレオチドが、配列番号１〜３からなる群より選択される配列によりコードされ、
- センスおよびアンチセンス領域が、互いに相補的で二重鎖を形成する少なくとも15の連続したヌクレオチドを有し、
- 二本鎖短干渉核酸分子が、内因性野生型および外因性ヒト変異htt遺伝子の発現を、前記htt遺伝子の両方を発現している非ヒト哺乳動物の細胞において阻害する、
単離された二本鎖短干渉核酸分子を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、httに対する４つのshRNAの確認（validation）を示す。（A）shRNA構築物を、ヒトhtt転写産物の5'末端の配列を認識するように設計した。sihtt1.1およびsihtt3（これらはエクソン２の配列を標的とする）ならびにsihtt6（これはエクソン３および４の配列を標的とする）を、ヒトhttタンパク質の最初の171アミノ酸を発現する動物モデルで用い、一方、sihtt13（これはエクソン８および９の配列を標的とする）を、ヒトhttタンパク質の最初の853アミノ酸を発現する動物モデルで用いた。ヒト、ラットおよびマウスhtt mRNAの間の配列相同性により、shRNAは異なる種特異性を有する。sihtt1.1はヒトhttのみを認識し、sihtt3およびsihtt6はマウスおよびヒト配列の両方を認識し、「ユニバーサルな（universal）」sihtt13はヒト、ラットおよびマウスhtt転写産物を認識する。（B）この検討で用いられるレンチウイルスベクターである。httタンパク質の最初の171（htt171-82Q）または853（htt853-82Q）アミノ酸を過剰発現するために用いられるレンチウイルスベクターの略図である。ヒトhtt cDNAを、SIN-W-PGK転移ベクター中のPGKプロモーターの下流にクローニングした。shRNAを発現するレンチウイルスベクターの略図：異なるshRNA配列を、テトラサイクリン調節性エレメント（TRE）のSIN 3'LTR下流にH1プロモーターを含むSIN-CWP-nls-LacZ/GFP-LTR-TREベクター中に挿入した。導入された細胞を、PGKプロモーターの制御下のLacZまたはGFPレポーター遺伝子で同定した。C．htt853-19Qおよびsihtt 1.1、3、6、13または陰性対照siGFPを共発現する293T細胞内でのhtt mRNAのサイレンシングを示す定量的リアルタイムPCR解析である。内因性β-アクチンmRNAを、リン酸カルシウムによるトランスフェクション後72時間のhtt mRNAレベルの標準化および定量解析のための内部対照として用いた。結果を相対的htt mRNAレベル±SEM（n=4 htt853-19Q + siGFP、n=6 htt853-19Q + sihtt3、n=7 htt853-19Q + sihtt6または13、n=8 htt853-19Q + sihtt1.1）の平均値として示した。一元配置の（one-way）ANOVA、F（5,32）=14.69、P***<0.001。htt853-19Q±siGFPグループと全てのsihttグループとの間のNewman-Keuls事後比較（Post-hoc comparisons）は非常に有意（P***<0.001）であるが、htt853-19Qおよびhtt853-19Q/siGFPグループとの間には有意な差異はない。
【図２】図２は、ハンチントン病のラットモデルでのshRNAの治療効果を示す。DARPP-32免疫染色でモニターされる病変が誘導されたラット線条における82のグルタミン反復を有するヒトhttの最初の171アミノ酸のレンチウイルスによる発現である。（A）sihtt1.1の発現によりDARPP-32発現の喪失は止まったが、対照siGFPの発現では効果がない。（B）htt171-82Q 発現により誘導されるDARPP-32の抑制的調節の定量化である（グループ当たりn=9、平均値 SEM、P***<0.001）。一元配置のANOVA、F（5,48）=52.97、P***<0.001。sihtt1.1、3および6に対するhtt171-82Qの事後比較はP***<0.001。sihtt13およびsiGFPに対するhtt171-82Qの事後比較は有意差なし。（C）異なるshRNA構築物に対するLacZレポーター遺伝子発現である。（D〜E）EM48およびユビキチン抗体を用いてhtt封入体の形成を評価した。どちらの染色も、htt171-82QおよびsiGFPを共に注射した動物においてユビキチン化されたhtt封入体の蓄積を示した。sihtt1.1の発現により、免疫反応性細胞の数は劇的に減少した。（F）htt封入体の数の定量化は、ユビキチン染色に基づいた（htt171-82Q、htt171-82Q+sihtt6、htt171-82Q+sihtt13およびhtt171-82Q+siGFPは、グループ当たりn=9であり、htt171-82Q+sihtt1.1およびhtt171-82Q+sihtt3は、グループ当たりn=8である。平均値 SEM、P***<0.001）。一元配置のANOVA、F（5,46）=25.16、P***<0.001。sihtt1.1、3および6に対するhtt171-82Qの事後比較はP***<0.001。sihtt13およびsiGFPに対するhtt171-82Qの事後比較は有意差なし。
【図３】図３は、siRNAの調節された発現を示す。（A〜B）テトラサイクリン調節性発現に用いられるレンチウイルスベクターに基づく系の概略図である。（A）ドキシサイクリンの存在下（+DOX）では、tTR-KRABは、shRNAの発現を推進するH1プロモーターの上流に位置するテトラサイクリン応答性エレメント（TRE）に結合しない。それゆえ、siRNAおよびLacZレポーター遺伝子が発現される。（B）ドキシサイクリンの非存在下（-DOX）では、tTR-KRABはTREに結合し、H1によるsiRNAおよびLacZレポーター遺伝子発現を抑制する。
【図４】図４は、FACS解析によるsiGFP調節性発現のインビトロでの確認を示す。（A〜B）siGFPおよびKRABレンチウイルスベクターを導入されたGFP発現293T細胞のFACS解析である。該細胞を、-DOX（A）および+DOX（B）の条件下で7日目にモニターした。３重感染させた（triple-infected）（GFP/siGFP/KRAB）細胞では、トランスリプレッサー活性がドキシサイクリンにより阻害された場合（+DOX）のみ、サイレンシングが発生した。（C〜D）系の可逆性を評価するために、２回目のFACS解析の前に、細胞を、DOX条件を切り替えて10日間維持した。（C）-DOX/+DOXおよび（D）+DOX/-DOXにおいて示されるトランスリプレッサーKRABの発現サイクルである。-DOXから+DOX条件への切り替えにより、３重感染させた（GFP/siGFP/KRAB）細胞におけるサイレンシングを発生できたが、+DOXから-DOX条件への切り替えによりsiGFPの発現および媒介されるGFPサイレンシングが阻害される。
【図５】図５は、インビボでのsiRNAの調節された発現の実験の範例を示す。成体ラットに定位に（stereotaxically）、sihtt1.1/KRABを発現するレンチウイルスベクターを左線条に共に注射し、htt171-82Q/sihtt1.1/KRABを発現するベクターを右線条に３重に注射した（triple-injected）（n=24）。そして、該動物を8匹ずつの３つのグループに分けた。２ヶ月間、２つのグループをsihtt が発現しない-DOX条件下に維持し、それによりハンチントン病病変の出現を誘導した。３つ目のグループは、ドキシサイクリンで処理（+DOX）して、sihttおよびLacZ発現を誘導し、それによりハンチントン病病変を予防した。２ヶ月後、+DOX動物および-DOXグループのラットの半分を犠牲にした。残っている-DOX動物にDOX処理をもう２ヶ月間行って、遅れたHD治療を模倣した。
【図６】図６は、HDの神経病変に対するsiRNAの条件的発現の効果を示す。（A）DARPP-32染色を用いて、線条体の病変の出現をモニターした。注射の２ヶ月後では、-DOX条件下で局所のDARPP-32発現の喪失が観察されたが、sihtt1.1の発現（+DOX条件）は、DARPP-32抑制的調節をほぼ完全に阻害する。注射の４ヶ月後では、sihtt1.1およびトランスリプレッサーKRABの発現は、DARPP-32発現を変化させない。-DOX/+DOXグループでは、２ヶ月後のsihtt1.1の発現誘導により、DARPP-32発現が顕著に減少した。（B）DARPP-32発現の定量的解析である（定位導入の間のミスターゲッティングのためn=6である82Q/sihtt1.1/KRABグループを除き、グループ当たりn=8、平均値 SEM、P***<0.001）。一元配置のANOVA、F（3, 26）=34.14、P<0.001。82Q/sihtt1.1/KRAB +DOXまたは82Q/sihtt1.1/KRAB -DOX/+DOXに対する82Q/sihtt1.1/KRAB -DOXの事後比較は非常に有意である；P***<0.001。（C）LacZレポーター遺伝子を用いて、sihtt1.1ベクターを感染させた細胞をモニターした。htt封入体の形成を、EM48およびユビキチン抗体で評価した。多数のユビキチン化された封入体が、２ヶ月目に-DOX動物で観察された。EM48/Ub陽性の凝集物の残りは、LacZ染色により評価されるように、+DOXおよび-DOX/+DOX動物に存在した。（D）htt封入体の数の定量的解析を、ユビキチン染色された切片から行った（-DOX、-DOX/+DOXについてグループ当たりn=7および+DOXについてグループ当たりn=6、平均値 SEM、P**<0.01）。一元配置のANOVA、F（2,17）=5.39、P**<0.01。-DOXおよび-DOX/+DOXに対する+DOXの事後比較 P**<0.01。
【図７】インビボでのshRNAの種選択性を示す。野生型マウスおよびラットにおける内因性htt転写産物を認識するように、shRNAを設計した。マウスおよびラットの線条におけるこれらのベクターの注射後、4C8抗体を用いる内因性htt染色を用いて、shRNAの選択性を評価した。（A）マウス線条におけるsihtt1.1、3、6、13または対照siGFPの発現である。図より予測されるように、sihtt3、6および13は、内因性マウスhtt mRNAの発現を抑制的に調節する。ヒトの転写産物に特異的なsihtt1.1または対照siGFPでは、htt発現の喪失は観察されなかった。LacZ酵素的染色を用いて、感染細胞を同定した。B）ラット線条におけるsihtt1.1、3、6、13または対照siGFPの発現である。「ユニバーサルな」sihtt13ベクターは、4C8染色によりモニターされるように、内因性ラットhtt mRNAの発現を抑制的に調節する。sihtt1.1（ヒト特異的）、sihtt3、6（ヒトおよびマウス特異的）および対照siGFPは、内因性ラットhtt発現に影響を与えない。LacZ酵素的染色により、形質導入効率は全ての実験グループにおいて同様であることが示された。（C）sihtt3、6、13を注射したマウスにおける4C8染色の喪失およびsihtt1.1および対照siGFPベクターでは抑制的調節がないことを示す、より高倍率の図である。（D）sihtt1.1、6または13を注射したマウスの線条および対照線条体からのレーザ顕微解剖サンプルについてのRT-PCRである。結果を、相対的htt mRNAレベルの平均値±SEM として示す（対照のグループはn=7、sihtt1.1および13はグループ当たりn= 6、および sihtt6のグループはn=5）。一元配置のANOVA、F（3,20）=21.2、P***<0.001。sihtt6およびsihtt13に対する対照のBonferroni/Dunn事後比較は非常に有意である、 P***<0.001。sihtt1.1に対する対照およびsihtt6またはsihtt13に対するsihtt1.1の事後比較は有意である、P**<0.01。
【図８】図８は、内因性httサイレンシングに引き続く遺伝子発現における相対変化を示す。（A）sihtt6およびshtt13を注射したマウスではhtt発現レベルは顕著に減少したが、ヒト特異的sihtt1では効果がなかったことを示す、レーザ捕捉顕微解剖された線条体サンプルに対するマイクロアレイ解析である。（B）サンプルグループ間で顕著に異なる生物学的経路を示す、他と異なって発現する遺伝子に対するIngenuity Pathway Analysisである。
【図９】図９は、マウスにおける変異選択的httサイレンシングに対する全体の長期間の効果を示す。外因性変異httの長期間のサイレンシングおよび／または内因性野生型タンパク質のサイレンシングを、sihtt1.1（ヒト、変異htt特異的）およびsihtt6（これは正常内因性マウスhttおよび外因性変異httの両方を標的とする）をコードするレンチウイルスベクターを注射したマウスにおいて評価した。sihtt6グループにおいて、動物の左線条にsihtt6を単独で注射し、右にsihtt6/htt171-82Qを共に注射した。sihtt1.1グループにおいて、動物の左線条にsihtt1.1/htt171-82Qベクターを共に注射し、htt171-82Qを右に注射した。sihtt6処理動物を１および９ヶ月目に犠牲にし、sihtt1.1処理動物を９ヶ月目に犠牲にした。（A）１ヶ月目において、sihtt6 +/- htt171-82Qを発現する細胞は、DARPP-32染色で少しも変化も示さなかった。sihtt1.1およびsihtt6の発現をLacZ染色によりモニターしたところ、マウス線条の広範な領域を含んでいた。（B）９ヶ月目において、sihtt1.1および6の発現によって、htt171-82QによるDARPP-32発現の喪失が妨げられた。htt封入体を検出するユビキチン染色は、htt171-82Qを発現するニューロンの多数に見られたが、sihtt1.1または6を発現する動物の線条体ではほとんど見られなかった。
【図１０】図１０は、マウスにおける長期間の全体または変異httのサイレンシングを示す。長期間の外因性変異httのサイレンシングおよび／または内因性野生型タンパク質のサイレンシングを、sihtt1.1（ヒト、変異htt特異的）およびsihtt6（これは正常内因性マウスhttおよび外因性変異体の両方を標的とする）をコードするレンチウイルスベクターを注射したマウスにおいて評価した。sihtt6グループにおいて、動物の左線条にsihtt6を単独で導入し、右にsihtt6/htt171-82Qを共に注射した。sihtt1.1グループにおいて、動物の左線条にsihtt1.1/htt171-82Qベクターを共に注射し、htt171-82Qを右に注射した。sihtt6処理動物を３ヶ月目に犠牲にし、sihtt1.1処理動物を３ヶ月目に犠牲にした。３ヶ月目において、sihtt1.1および6の発現によって、htt171-82Qにより誘導されるDARPP-32発現の喪失が妨げられた。ユビキチン染色は、htt171-82Qを発現するニューロンの多数においてhtt封入体の存在を示したが、sihtt1.1または6を共発現する動物の線条体ではほとんどなかった。
【図１１】図１１は、HDのラットモデルにおけるshRNAの治療効果を示す。ラット線条における82のグルタミン反復を有するヒトhttの最初の171アミノ酸（htt171-82Q）のレンチウイルスによる発現は、DARPP-32抗体で検出される病変を誘導した。（A）sihtt3および6の発現によりDARPP-32発現の喪失が止められたが、対照siGFPの発現は効果がなかった。重要なことに、htt171-82Q発現ラットにおけるsihtt13による内因性ラットhttの抑制的調節は、DARPP-32染色により評価される病変に対して効果がなかった。（B）異なるshRNA構築物でのLacZレポーター遺伝子発現である。（C〜D）EM48およびユビキチン抗体を用いて、htt封入体の形成を評価した。どちらの染色も、htt171-82QおよびsiGFPを共に注射した動物においてユビキチン化されたhtt封入体の蓄積を示したが、sihtt3および6の発現により、免疫反応性細胞の数は劇的に減少した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義
- 「短核酸分子」とは、長さが100ヌクレオチド以下、好ましくは長さが80ヌクレオチド以下、最も好ましくは長さが50ヌクレオチド以下の核酸分子を指す。
- 「干渉核酸分子またはsiNA分子」とは、ElbashirらによるNature 2001, 411, 494-および国際PCT出願WO 01/75164に初めて記載されたようなsiNAの細胞内導入により、配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを誘導し得る短核酸分子の二重鎖を指す。siNAは興味対象の遺伝子を標的とし、siNA分子の二重鎖部分のヌクレオチド配列が標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的である。
【００２１】
- 「二重鎖」とは、核酸分子の二つの領域間の相補的対形成により形成される構造を指す。
- 「核酸」とは、デオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）ならびに糖、リン酸および塩基（アデニン、シトシン、グアニン、チミンもしくはウラシル）を含む天然ヌクレオチド、天然ヌクレオチドの既知のアナログあるいは糖、リン酸、および／または塩基部分が改変されたヌクレオチドを含む混合核酸を指す。
- 「配列番号Xの配列によりコードされるヌクレオチド」とは、配列番号XのDNA配列のデオキシリボヌクレオチドまたは配列番号XのDNA配列のデオキシリボヌクレオチド（a、g、c、t）に対応するリボヌクレオチド（a、g、c、u）を指す。
【００２２】
- 「相補的」とは、従来のワトソン−クリックの塩基対形成または従来にないタイプの塩基対形成により、核酸の水素結合を形成する能力を指す。本発明の核酸分子に関しては、核酸分子とその相補的配列との結合自由エネルギーは、核酸の適切な機能、例えばRNAi活性を生じさせ得るのに十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの測定は、当該技術で公知である（例えば、Turnerら, 1987, CSH Symp. Quant. Biol., 1987, LII, pp 123-133, Frierら, P.N.A.S., 1986, 83, 9373-9377; Turnerら, J. Am. Chem. Soc., 1987, 109, 3783-3785を参照されたい）。パーセント相補性とは、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン−クリックの塩基対）を形成できる核酸分子における連続する残基のパーセンテージを示す（例えば、第１のヌクレオチドにおいて合計10ヌクレオチドのうち、5、6、7、8、9または10ヌクレオチドが、10ヌクレオチドの第２の核酸配列と塩基対を形成することは、それぞれ50％、60％、70％、80％、90％および100％の相補性であることを示す）。「完全に相補的」とは、核酸配列の全ての連続する残基が、第２の核酸配列中の同数の連続する残基と水素結合することを意味する。
【００２３】
- 「転写産物」とは、DNA配列の転写を触媒するRNAポリメラーゼから生じる産物を指し；第１次転写産物、成熟RNAおよびmRNAを含む。
- 「内因性遺伝子」とは、宿主生物／細胞のゲノム中の自然な位置にある天然遺伝子を指す。
- 「外因性遺伝子」とは、特定の宿主生物／細胞と関係のない起源の遺伝子を指す。
- 「野生型」とは、自然界において見られる通常の遺伝子を指す。
【００２４】
- 「htt遺伝子」または「ハンチンチン遺伝子」とは、ハンチントン病（HD）に関連するハンチンチンタンパク質（htt）をコードする遺伝子を指す。ヒトhtt遺伝子の配列は、NCBIデータベースにおいてアクセッション番号NC_000004に相当する。他の哺乳動物のhtt遺伝子の配列も、該配列データベースから利用可能である。
- 「変異htt遺伝子」または「疾患htt遺伝子」とは、第１エクソンにおいて35以上のCAG反復伸長を有し、ハンチントン病を引き起こす延長ポリグルタミン（ポリQ）域を有する変異httタンパク質を産生するhtt遺伝子を指す。
- 「ベクター」とは、連結された別の核酸分子を輸送できる核酸分子を指す。
【００２５】
本発明によるsiNA分子は、ヒトhtt mRNA配列NCBIアクセッション番号NM_002111または配列番号１１を参照すれば、442位〜460位（エクソン２）、619位〜637位（エクソン４）または1207位〜1225位（エクソン８〜９）に対応するヒトhtt転写産物の１つの領域を標的とする。
【００２６】
【表１】
0005401451.tif 000002
【００２７】
本発明によるsiNA分子は、htt mRNAおよびタンパク質の両方を発現するヒト細胞において、野生型および変異ヒトhttの両方のmRNAおよびタンパク質のレベルを少なくとも40％、好ましくは60％、より好ましくは80％減少させる。さらに、該siNA分子は、htt mRNAおよびタンパク質の両方を発現する少なくとも１つの非ヒト哺乳動物細胞において、野生型内因性および変異ヒトhtt mRNAおよびタンパク質のレベルを少なくとも40％、好ましくは60％、より好ましくは80％減少させる。ヒト細胞は、エクソン１において35以上のCAG反復を有する変異ヒトhtt対立遺伝子を有する細胞、または変異ヒト遺伝子もしくは当該技術で公知のそれらのN末端断片を含むDNA構築物により形質転換された細胞であり得る。例えば、DNA構築物は、82のCAG反復とともにhttタンパク質の最初の171アミノ酸をコードする（N171-82Qまたはhtt171-82Q）。非ヒト哺乳動物細胞は、上記のとおり、変異ヒト遺伝子またはそれらのN末端断片を含むDNA構築物により形質転換された細胞である。該細胞は、げっ歯類からのもの、好ましくはラットまたはマウスからのものであり得る。例えば、該細胞は、トランスジェニックマウスまたはトランスジェニックラットからのものである。
【００２８】
エクソン２を標的とするsiNAおよびエクソン４を標的とするsiNAは、ヒトおよびマウスに特異的である；それらは、内因性ヒトおよびマウスhtt遺伝子ならびに変異ヒトhtt遺伝子を抑制的に調節するが、内因性ラットhtt遺伝子にはしない。
エクソン８〜９を標的とするsiNAは、ヒト、マウスおよびラットに特異的である；このsiNAは、内因性ヒト、マウスおよびラットhtt遺伝子ならびに変異ヒトhtt遺伝子を抑制的に調節する。
【００２９】
内因性野生型およびヒト変異htt遺伝子の両方のサイレンシングは、当該技術において公知の方法、例えばリアルタイム定量的RT-PCR、FACSまたは免疫組織学的解析により、RNAまたはタンパク質レベルで評価される。
【００３０】
本発明の実施形態の１つによれば、siNA分子のセンス領域は、配列番号４〜６からなる群より選択される配列によりコードされる少なくとも15の連続したヌクレオチドを含む。
【００３１】
本発明の別の実施形態によれば、siNA分子は、それぞれ15〜約30（例えば、約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30）ヌクレオチドの２つの別々のオリゴヌクレオチドからなり、第１の鎖はセンス領域（センス鎖）を含み、第２の鎖はアンチセンス領域（アンチセンス鎖）を含み、前記の第１および第２の鎖が少なくとも15塩基対、好ましくは19塩基対の（相称または非相称の）二重鎖または二本鎖構造を形成する。例えば、それぞれ、アンチセンス鎖は配列番号１〜３の配列を含むか、またはそれからなり、センス鎖は配列番号４〜６の配列を含むか、またはそれからなる。
【００３２】
本発明の別の実施形態によれば、siNA分子の相補的なセンスおよびアンチセンス領域は、核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーによって接続される。非ヌクレオチドリンカーは、無塩基ヌクレオチド、アプタマー、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素、または他の高分子化合物を含む。例えば、siNA分子は、31〜約50（例えば、約31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50）ヌクレオチドの単一（直鎖または環状）のオリゴヌクレオチドから組み立てられ、センスおよびアンチセンス領域がポリヌクレオチドループにより作動可能に連結されて、二重鎖構造および１つ以上のループ構造を含む構造を形成する。該siNA分子は、相称または非相称のヘアピン状の２次構造（shNA）を形成するための１つの二重鎖構造および１つのループ構造を含むことが有利である。これらの構造において、該二重鎖は、少なくとも15塩基対、好ましくは19塩基対からなる。該ループ構造は、4、5または6ヌクレオチドのような4〜10ヌクレオチドを含む。該ループは、配列番号７（5'-ttcaagaga-3'）によりコードされることが有利である。例えば、該siNAは、配列番号８〜１０からなる群より選択される配列によりコードされるshNAである。
【００３３】
【表２】
0005401451.tif 000003
【００３４】
本発明の別の実施形態によれば、siNA分子は、一方または両方の末端が、1〜約3（例えば、約1、2、または3）の突出ヌクレオチドを含む。突出ヌクレオチドは、各鎖の3'末端にあることが有利で、好ましくは2'-デオキシヌクレオチド、好ましくは2'-デオキシチミジンのような2'-デオキシピリミジンである。例えば、該siNA分子は、それぞれ21ヌクレオチドの第１および第２の鎖からなり、該第１および第２の鎖が、二重鎖の両方の3'末端にtt突出を有する19塩基対の二重鎖を形成する。あるいは、該siNA分子は、19 bpの二重鎖および4〜10ヌクレオチドのループ鎖を有し、ヘアピン構造の3'末端がtt突出を有するshNAからなる。
【００３５】
本発明の別の実施形態によれば、siNA分子は、平滑末端を含み、両方の末端が平滑である。例えば、該siNA分子は、それぞれ19ヌクレオチドの第１および第２の鎖からなり、該第１および第２の鎖が、二重鎖の両方の末端が平滑である19塩基対の二重鎖を形成する。あるいは、該siNA分子は、19 bpの二重鎖および4〜10ヌクレオチドのループ鎖を有し、ヘアピン構造の両方の末端が平滑であるshNAからなる。
【００３６】
本発明の別の実施形態によれば、siNA分子は、該siNA分子の活性を調節してRNA干渉を媒介するための、バルジ、ループまたはウォッブル塩基対を含む。
【００３７】
本発明の別の実施形態によれば、siNA分子は、ヌクレオチドの位置の約5％〜100％（例えば、ヌクレオチドの位置の約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または100%）で、リボヌクレオチド（2'-OHヌクレオチド）を含む。例えば、該siNAは、RNA分子（siRNA分子）である。あるいは、該siNA分子は、デオキシヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの両方を含む混合核酸分子である。
【００３８】
本発明の別の実施形態によれば、siNA分子は、インビボでのヌクレアーゼによる分解への抵抗性を増し、かつ／または細胞への取り込みを改善する1つ以上の改変を含む。該siNA分子は、糖、リン酸、および／もしくは塩基部分で改変されたヌクレオチド、ならびに／または5'または3'末端の改変、あるいはヌクレオチド間のリンケージを含み得る。例えば、該siNA分子は、1つ以上の改変されたピリミジンおよび／またはプリンヌクレオチドを、好ましくは二本鎖siNAの各鎖に含む。より好ましくは、前記改変されたヌクレオチドが、2'-O-メチルヌクレオチド、2'-O-メトキシエチルヌクレオチド、2'-デオキシヌクレオチドおよび2'-デオキシ2'-フルオロヌクレオチドのようなデオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基のヌクレオチド、非環状ヌクレオチドならびに5-C-メチルヌクレオチドからなる群より選択される。本発明のsiNA分子は、約5％〜約100％改変されたヌクレオチド（例えば、約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または100%改変されたヌクレオチド）を一般的に含み得る。所定のsiNA分子中に存在する改変されたヌクレオチドの実際のパーセンテージは、該siNA分子中に存在するヌクレオチドの総数に依存する。改変率は、センス鎖、アンチセンス鎖またはセンスおよびアンチセンス鎖の両方に存在するヌクレオチドの総数に基づき得る。
【００３９】
本発明の別の実施形態によれば、センス領域を含むsiNAの鎖（センス鎖）は、該鎖の5'末端、3'末端、または5'および3'末端の両方に末端キャップ部分、好ましくは無塩基のデオキシ部分またはグリセリル部分を含む。
本発明の別の実施形態によれば、アンチセンス領域を含むsiNAの鎖（アンチセンス鎖）は、5'末端にリン酸基を含む。
本発明の別の実施形態によれば、siNA分子は、ホスホロチオエートリンケージのような、少なくとも1つの改変されたヌクレオチド間リンケージを含む。
【００４０】
本発明は、上記で定義されたとおり、合成、半合成または組み換え型siNAを含む。
【００４１】
本発明によるsiNA分子は、5'末端のジメトキシトリチルおよび3'末端のホスホルアミダイトのような公知の核酸保護基およびカップリング基を用いる、公知のオリゴヌクレオチド合成法を用いる化学合成によって製造され得る。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性基、例えば、2'-アミノ、2'-C-アリル、2'-フルオロ、2'-O-メチル、2'-Hを用いる改変によって安定性を増すように改変され得る（UsmanおよびCedergren, TIBS, 1992, 17, 34 およびUsmanら, Nucleic Acids Symp. Ser., 1994, 31, 163を参照）。そのような改変オリゴヌクレオチドの例は、制限されずに：2' F-CTP、2' F-UTP、2' NH2-CTP、2' NH2-UTP、2' N3-CTP、2-チオCTP、2-チオUTP、4-チオUTP、5-ヨードCTP、5-ヨードUTP、5-ブロモUTP、2-クロロATP、アデノシン5'-(1-チオトリフォスフェート)、シチジン5'-(1-チオトリフォスフェート)、グアノシン-5'-(1-チオトリフォスフェート)、ウリジン-5'-(1-チオトリフォスフェート)、擬似UTP、5-(3-アミノアリル)-UTPおよび5-(3-アミノアリル)-dUTPを含む。siNA構築物は、一般的な方法を用いるゲル電気泳動または高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）によって精製でき、水に再懸濁できる。
【００４２】
本発明による化学的に合成されたsiNA分子は、別々に合成された二つの別個のオリゴヌクレオチドからなり得る。あるいは、該siNA分子の両鎖は、切断可能なリンカー、例えばスクシニルベースのリンカーを用いて、直列に合成できる。
あるいは、本発明のsiNA分子は、当業者に知られた市販のDNAまたはRNAベクターに挿入された転写ユニットから（インビトロまたはインビボにおいて）発現させることができる。
【００４３】
本発明はまた、転写開始領域、転写終止領域、および少なくとも1つの本発明によるsiNA分子をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列が、宿主細胞、例えば標的細胞（ニューロン）において該siNA分子の発現および／または輸送を可能にする様式で、前記の開始および終止領域に作動可能に連結する転写ユニットを提供する。
核酸配列は、siNA分子の一方もしくは両方の鎖、または自己ハイブリダイズして二重鎖siNAとなる自己相補的な単一の鎖をコードし得る。
【００４４】
転写開始領域は、ウイルスプロモーター（SV40、CMV、RSV、アデノウイルス）を含む、真核生物のRNAポリメラーゼIIまたはIII（pol IIまたはIII）のプロモーターからであり得る。これらのプロモーターからの転写産物は、全ての細胞において高レベルに発現されるからである。あるいは、適切な細胞内で原核生物のRNAポリメラーゼ酵素が発現されるのであれば、原核生物のRNAポリメラーゼプロモーターを使用し得る。好ましいプロモーターは、マウスU6 RNA、ヒトH1 RNAおよびアデノウイルスVA RNAであり、これらは細胞内で所望のsiNAを高濃度にすることに役立つ。
【００４５】
また、プロモーターは、構成性であるか、調節可能（条件的発現）であるか、または組織特異的であり得る。
好ましいプロモーターは、例えばテトラサイクリン調節性プロモーターのような調節可能プロモーターである（Gossen, M.およびBujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 5547-5551; Gossenら, Science, 1995, 268, 1766-1769; Deuschleら, Mol. Cell. Biol., 1995, 15, 1907-1914）。より好ましくは、プロモーターは、特にCNSへの使用に適するドキシサイクリン調節性プロモーターである。テトラサイクリンのアナログであるドキシサイクリンは、脳血液関門を通過するからである。
【００４６】
転写終止領域は、真核生物のRNAポリメラーゼ、好ましくはpol IIまたはpol IIIにより認識され、例えば、それはTTTTT配列である。
本発明は、少なくとも１つの本発明のsiNA分子をコードする核酸を含む発現ベクターにも関する。発現ベクターは、該siNA分子の一方もしくは両方の鎖、または自己ハイブリダイズして二重鎖siNAとなる自己相補的な単一の鎖をコードし得る。本発明のsiNA分子をコードする核酸は、好ましくは上記で定義される転写ユニット中に挿入される。発現ベクターは、例えばアクチベーター／リプレッサーのような該siNAの条件的発現に必須の因子もコードし得る。
【００４７】
siNA分子発現に適するDNAまたはRNAベクターの多くは、当業者に知られ、かつ市販されている（Deglonら, J. Gene Med., 2005, 7, 530-539）。組み換え型ベクターは、DNAプラスミドまたはウイルスベクターであり得る。siNA発現ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスまたはアルファウイルスに基づいて構築され得るが、これらに限られない。siNA分子を発現可能な組み換え型ベクターは、インビボで送達され、かつ標的細胞内に残存できる。あるいは、ウイルスベクターを、siNA分子の一過性発現を提供するために用い得る。
【００４８】
レンチウイルス（Naldiniら, Science, 1996, 272, 263-267; Naldiniら, P.N.A.S., 1996, 93, 11382-11388）は、標的細胞内に残存し、そしてsiNA分子の長期間の発現を提供し、その結果として、ニューロンを含む哺乳動物細胞において長期間の遺伝子サイレンシングをするので、好ましいベクターの一例である。より好ましいベクターは、多様性（multiply）弱毒化レンチウイルス（Zuffereyら, Nat. Biotechnol., 1997, 15, 871-875）および導入遺伝子（transgene）発現を増やすように改変された複製欠陥レンチウイルスベクター（SIN-WおよびSIN.cPPT-Wベクター; Dullら, J. Virol., 1998, 72, 8463-8471; Zuffereyら, J. Virol., 1999, 73, 2886-2892; Follenziら, Nat. Genet., 2000, 25, 217-222; Deglonら, Human Gene Therapy, 2000, 11, 179-190; de Almeidaら, J. Neurosci., 2002, 22, 3473-3483）である。テトラサイクリン調節性レンチウイルスベクターは、例えばWiznerowicz, M.およびTrono, D., J. Virol., 2003, 77, 8957-8961; Regulierら, Human Mol. Genetics, 2003, 12, 2827-2836; Regulierら, Human Gene Therapy, 2002, 13, 1981-1990に記載されている。
【００４９】
本発明は、上記で定義されるベクターにより改変された、真核生物または原核生物の宿主細胞も提供する。
本発明は、げっ歯類モデル、例えばラットまたはマウスにおけるハンチントン病の研究のための少なくとも１つのsiNA分子または上記で定義されるベクターの使用にも関する。
ハンチントン病のげっ歯類モデルは、当該技術で公知である（Regulierら, Methods in Molecular Biology, 2007, 277, 199-213; Bates G.P.およびGonitel R., Mol. Biotechnol., 2006, 32, 147-158; Azzouzら, J. Gene Med., 2004, 6, 951-962; Deglon, N.およびHantraye, P., J. Gene Med., 2005, 7, 530-539）。
【００５０】
エクソン２またはエクソン４を標的とするsiNA（ヒトおよびマウス特異的）またはエクソン８〜９を標的とするsiNA（ヒト、マウスおよびラット特異的）は、ニューロン生存、疾患の進行およびsiNAの治療効果に対する、内因性htt遺伝子サイレンシングの効果の研究のためにHDのマウスモデルで用いられる。
【００５１】
エクソン８〜９を標的とするsiNA（ヒト、マウスおよびラット特異的）は、ニューロン生存、疾患の進行およびsiNAの治療効力に対する、内因性htt遺伝子サイレンシングの効果の研究のためにHDのラットモデルでも用いられる。
さらに、エクソン８〜９は、変異ヒトhtt遺伝子（htt171-82Q）のより短いバージョンには存在しないので、エクソン８〜９を標的とするsiNAを対照として用いて、ヒトhtt171-82Q遺伝子を疾患htt遺伝子として用いるマウスまたはラットモデルにおけるニューロン生存および疾患の進行に対する、内因性htt遺伝子単独のサイレンシングを評価する。
【００５２】
これらの動物研究において、当該技術において公知のヒト特異的siNAを対照として用いて、ヒト変異htt遺伝子単独のサイレンシングを評価できる。げっ歯類モデルにおいてインビボでHDの症状を改善できる、エクソン２を標的とするヒトsiNAは、これまでに記載されている（国際PCT出願WO 2006/031267およびHarperら, P.N.A.S., 2005, 102, 5820-5825）。配列aagaactttcagctaccaatctcttgaattggtagctgaaagttctt（配列番号１２）によりコードされるshRNAのようなヒトhtt転写産物の420位〜438位を標的とするsiNAを含む、エクソン２を標的とする他のsiNAを用いることができる。
【００５３】
本発明は、ハンチントン病の予防用または治療用医薬品の製造のための、上記で定義されるsiNA分子またはベクターの使用にも関する。
本発明は、安定剤、緩衝液などのような許容できる担体中に、上記で定義される少なくとも１つのsiNA分子または前記siNA分子をコードする発現ベクターを含む医薬組成物も提供する。
【００５４】
医薬組成物または製剤は、細胞またはヒトを含む対象への投与、例えば、全身または局所の投与に適する形態のことである。適する形態は、部分的には、使用法または侵入経路に依存し、例えば経口、吸入または注射による。これらの組成物または製剤は、医薬組成物の製造のための当該技術で周知のいかなる方法によっても製造される。
【００５５】
本発明は、医薬品としての上記で定義されるsiNA分子またはベクターも提供する。
ハンチントン病を治療またはモデリングする目的のために、上記で定義されるsiNA分子またはベクターは、標的細胞（ニューロン）へのsiNA／ベクターのインビボでの送達を可能にする少なくとも１つの化合物と会合する。該化合物は、ペプチド、抗体、トランスポーター、脂質（中性もしくはカチオン性）、疎水性部分またはポリマー（カチオン性（PEI）もしくは非カチオン性（PEG））であり得る。ニューロンへの送達を促進するために、siNA／ベクターを、ペネトラチン1（Penetratin 1）に連結できるか（Davidsonら, J. Neuroscience, 2004, 24, 10040-10046）、またはコレステロールにコンジュゲートできる（Chaseら, Society for Neuroscience Abstract, 2005）。血液脳関門を通過できるようにするために、siNA／ベクターを、Pep:Trans（商標）（http://www.syntem.com/english/techpeptrans.html）のようなペプチドまたは転移受容体に対するモノクローナル抗体と会合できるが、限定されない。血行における半減期を延長するために、siNA／ベクターをPEGに連結できる。標的細胞を特異的に標的とできるようにするために、siNA／ベクターを、細胞表面抗原または受容体、例えばペプチドまたは前記抗原／受容体に特異的抗体に会合できる。そのような受容体の例は、アデノシンA1／A2、ドパミンD1／D2、カンナビノイドCB1およびNR2B型N-メチルD-アスパラギン酸（NMDA）受容体である。
【００５６】
好ましくは、siNA／ベクターを、標的細胞（ニューロン）へのsiNA／ベクターのインビボでの送達を促進する化合物の配合と会合する。より好ましくは、siNA／ベクターと化合物を、マイクロスフェア、ナノ粒子またはリポソームに処方する。
【００５７】
有効量は、疾患または病状の発生を予防し、阻止し、または治療（ある程度の症状を、好ましくは全ての症状を緩和）するために必要な用量である。siNAの医薬有効量は、医療技術の当業者が認識する、用いられる組成物、投与経路、想定される個体の身体的特徴、併用薬物、およびその他の要因に依存する。一般的に、体重当たりの有効成分の一日量は、0.1 mg／kgと100 mg／kgの間の量が投与される。
【００５８】
本発明のsiNA分子を、脳内（クモ膜下腔内、脳室内）、非経口（経皮、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内および脊椎内(intrarachian)、経口、舌下、または吸入から選択される単一または複数の経路から、ヒトまたは動物（げっ歯類モデル）に投与し得る。好ましくは、脳内に投与する。
【００５９】
本発明の実施は、そうでないと記載しない限り、当該技術の範囲内の、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、導入遺伝子生物学、微生物学、組み換えDNA、および免疫学の従来技術を使用する。そのような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, (Sambrookら, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編, 1984); Mulliら、米国特許第4,683,195号; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins編, 1984); Transcription And Translation (B. D. HamesおよびS. J. Higgins編, 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984), Methods In ENZYMOLOGY (J. AbelsonおよびM. Simon,編集主任, Academic Press, Inc., New York)のシリーズ, 特に第154巻および第155巻 (Wuら編) ならびに第185巻, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel編); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. MillerおよびM. P. Calos編, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayerおよび Walker編, Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, 第I巻〜第IV巻 (D. M. WeirおよびC. C. Blackwell編, 1986);および Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)を参照されたい。
【００６０】
上記の特徴に加えて、本発明は、本発明によるsiNA分子およびそれらの使用を説明する実施例、および添付図面を参照する記載から明らかになる他の特徴をさらに含む。
【実施例】
【００６１】
実施例１：sihttレンチウイルスベクターの開発
1）原材料および方法
a）プラスミド
ヒトhtt mRNAを標的とする４つのshRNAを公知のアルゴリズムで設計した。最初の３つの配列は、ヒトhtt遺伝子のエクソン１〜４に一致し（correspond）（sihtt1.1、3、および6）、もう１つはエクソン８〜９に一致する（sihtt13）。sihtt3および6はヒトおよびマウス特異的であり、sihtt13は「ユニバーサル」（ヒト、マウスおよびラット）である。センス鎖、ループ、アンチセンス鎖、終止コドンおよびH1プロモーターからの17ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを合成した。対照として、EGFPを標的とするshRNA（siGFP）を用いた。
【００６２】
- siGFP（配列番号１３）：
ctagtttccaaaaaaagctgaccctgaagttcatctcttgaatgaacttcagggtcagcttggggatctgtggtctcatacagaac
- sihtt1.1（配列番号１４）：
ctagtttccaaaaaaagaactttcagctaccaatctcttgaattggtagctgaaagttcttggggatctgtggtctcatacagaac
- sihtt3（配列番号１５）：
ctagtttccaaaaaagaccgtgtgaatcattgttctcttgaaacaatgattcacacggtctggggatctgtggtctcatacagaac
- sihtt6（配列番号１６）：
ctagtttccaaaaaagctttgatggattctaattctcttgaaattagaatccatcaaagctggggatctgtggtctcatacagaac
- sitt13（配列番号１７）：
ctagtttccaaaaagcagcttgtccaggtttattctcttgaaataaacctggacaagctgcggggatctgtggtctcatacagaac
【００６３】
これらのオリゴおよびプライマーH1-3F：caccgaacgctgacgtcatcaacccg（配列番号１８）を用いて、Brummelkampら, Science, 2002, 296, 550-3に記載されるようにH1プロモーター（Genbank：X16612、ヌクレオチド146-366）を含むpBC-H1プラスミド（pBCプラスミド；STRATAGENE）に対してPCR反応を行った。
【００６４】
PCR産物を、pENTR/D-TOPOプラスミド（ゲートウェイテクノロジー、INVITROGEN）にクローニングした。そして、製造業者の説明書に従って、H1-shRNAカセットを、LRクロナーゼ組み換え系でSIN-cPPT-PGK-nls-LacZ-WPRE-LTR-TRE-ゲートウェイベクター（SIN-CWP-LacZ-TRE-ゲートウェイ）に移した。このレンチウイルスベクターは、第１の発現カセットを、cPPT配列（Follenziら, Nat. Genet., 2000, 25, 217-222）とマウスホスホグリセレートキナーゼIプロモーター（PGK）の制御下にある核局在性β-ガラクトシダーゼcDNA（nls-LacZ）との後に含む。第２の発現カセットは、SIN 3'LTR（唯一のNotIサイトが、EcoRV-PvuIIが削除された3' U3領域中に挿入された）中に置かれ、CMV最小プロモーターのない改変テトラサイクリン応答性エレメント（TRE）を有し（pTRE-Tight-DsRed2からのXhoI-StuI；BD BIOSCIENCES）、ゲートウェイカセット（RFA-Aコンバージョンカセット；INVITROGEN）がこれに続く。
【００６５】
インビボで内因性httの定量的解析を行うために、sihttを、β-ガラクトシダーゼの代わりにGFPレポーター遺伝子を含むレンチウイルスベクター（SIN-cPPT-PGK-GFP-WPRE-LTRゲートウェイベクター= SIN-CWP-GFP-ゲートウェイ）にクローニングした。SIN-W-PGK-TetR(B/E)-KRABベクターを、ドキシサイクリン調節性shRNA発現のために用いた。tetR(B/E)-KRAB断片を、pCMV-tetR(B/E)-KRABプラスミド（Forsterら, Nucleic Acids Res., 1999, 27, 708-710）およびtTRK-1F caccatgtctagattagataaaagt（配列番号１９）、tTRK-2R ggatccttaaactgatgatttg（配列番号２０）のオリゴを用いたPCRにより得た。 該断片を、pENTR/D-TOPOベクター（INVITROGEN）にクローニングした。そして、LRクロナーゼ反応を、pENTR/D-TOPO-tetR(B/E)-KRABおよびSIN-W-PGK-ゲートウェイベクター)で行った（RFA-AコンバージョンカセットはPGKプロモーターとWPREエレメントとの間である）。
【００６６】
b）レンチウイルスベクターの製造
様々なshRNA、19（19Q、野生型）または82（82Q、変異）のCAG反復を有するヒトハンチンチンの最初の171または853アミノ酸（de Almeidaら, J Neurosci, 2002, 22, 3473-3483）およびKRABトランスリプレッサーをコードするレンチウイルスベクターは、これまでに報告されるように（Hottingerら, J Neurosci, 2000, 20, 5587-5593）、293T細胞内で産生され、超遠心分離により濃縮され、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）/1%ウシ血清アルブミン（BSA）中に再懸濁された。ウイルスバッチ粒子含有量を、p24抗原ELISA（RETROtek, Gentaur, Paris, France）により測定した。ストックを用時まで-80°Cで保存した。
【００６７】
c）RT-PCR
HEK 293T細胞を、37℃の5％ CO2／空気雰囲気下、10％牛胎仔血清（FBS）、100 U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを補ったDMEM中で培養した。トランスフェクションの前日に、293T細胞を６ウェルプレート（Falcon、BECTON DICKINSON）に、１ウェル当たり800'000個の密度で培養した。該細胞に、リン酸カルシウムでSIN-W-PGK-htt853-19Q（1μg）およびsihttまたはsiGFPベクター（5μg）を共トランスフェクションした。トランスフェクションの72時間後、全RNAをTrizol試薬（INVITROGEN）で抽出した。リアルタイム定量的RT-PCRを、400 ngの全RNAからランダムプライマーで得た0.4％のcDNAで３重に行った。Platinum SYBR Green qPCR super Mix-UDG（INVITROGEN）、ならびにどちらも10μMのフォワード（htt-3F tgc cag cac tca aga agg aca c（配列番号２１））およびリバース（htt-2R cac gcc aag aat cag cag agt gg（配列番号２２））プライマーを含む20μlの反応量でPCRを行った。
【００６８】
ABI PRISM 7000サーマルサイクラーに、最初の変性ステップ（95℃、2分）、続く40回の増幅サイクル（95°C、15秒；60°C、1分）でプログラムを組み込んだ。各標的の増幅率を、cDNA希釈のサイクル閾値（Ct）の数から評価し、一定であると想定されるヒトβ-アクチン（BACTIN-1F：tgaaggtgacagcagtcggttg（配列番号２３）；BACTIN-2R：ggcttttaggatggcaagggac（配列番号２４））の発現レベルを参照することにより補正した。対照と実験サンプルとの間の差を、2-ΔΔCt法を用いて算出した（Livak, K.J.およびSchmittgen, T.D., Methods, 2001, 25, 402-408）。LacZオリゴを内部標準として用いて、トランスフェクションの効率を評価した（LACZ1F：ccttactgccgcctgttttgac（配列番号２５）；LACZ-2R：tgatgttgaactggaagtcgcc（配列番号２６））。RT-PCR解析は、2回の独立実験からの4サンプルについて行われたsiGFPでの対照を除いて、2〜3回の独立したトランスフェクションからの6〜8サンプルについて行われた。データを、相対的htt mRNAレベル±SEMを示す標準化した値の平均値として表した。統計的解析を、一元配置の分散解析（ANOVA）とそれに続くNewman-Keuls事後検定を用いて行った（Statistica 5.1, Statsoft Inc., USA）。有意水準をP < 0.05に設定した。
【００６９】
2）結果
ヒトhtt mRNAを標的とする４つのshRNAを設計した（図１A）。ハンチントン病の動物モデルにおける確認を容易にするために、ヒト転写産物の5'における配列を、特にそれらのうちの３つ（sihtt1.1、3および6）について選択した。４つ目のsiRNAであるsihtt13は、ヒトhtt遺伝子のエクソン８〜９にある配列を標的とする。これらのshRNAを、3'LTRにおいてH1プロモーターの上流にテトラサイクリン調節性オペレーターを有するIN-W-PGK-nsl-LacZ-LTR-TRE-H1レンチウイルスベクターにクローニングした（図１B）。宿主細胞DNAにおいて3'LTRは、レンチウイルスゲノム挿入により複製されるので、感染細胞内でのshRNA発現カセットの２つのコピーの存在によって、より高率のsiRNA合成が誘導され得る。また、形質導入された細胞を同定するために、LacZまたはGFPレポーター遺伝子を、内部のPGKプロモーターの下流にクローニングした。htt853-19Qプラスミドおよびsihtt1.1、3、6、13またはsiGFPベクターでの293T細胞の共トランスフェクションを用いて、これらのshRNAがhttをサイレンシングする効率を評価した。３日後、細胞を回収し、全RNAを単離した。サイバーグリーン（Syber green）による定量的RT-PCR解析により、全てのsihttが、対照サンプル（htt853-19Q単独またはsiGFP）と比較して、htt mRNAレベルを80％以上減少させたことが示された（図１C）。LacZオリゴでのRT-PCR反応により、レンチウイルスによる減少がsiRNAの効率を反映したこと、およびトランスフェクション効率の変動ではないことが確かめられた。
【００７０】
実施例２：変異httのサイレンシングよるラットハンチントン病モデルにおける神経病変の改善
1）原材料および方法
a）インビボ実験
動物
成体の180〜200 gの雌性ウィスターラットを用いた（Iffa Credo/Charles River, Les Oncins, France）。該動物を温度制御された部屋に収容し、12時間ごとの昼夜サイクルで維持した。餌および水道水を任意に与えた。本実験は、実験動物の管理および使用に関する欧州共同体の指令（86/609/EEC）に従って行われた。
【００７１】
レンチウイルスの注射
実施例１で記載したように調製された濃縮ウイルスストックを、氷上で融解し、ピペッティングを繰り返して再懸濁した。ラットを、ケタミン、キシラジン（xylazine）溶液（75 mg/kgケタミン+ 10mg/kgキシラジン、i.p）を用いて麻酔にかけた。レンチウイルスベクターを、ポリエチレンカテーテルでハミルトンシリンジ（HAMILTON）に連結した34ゲージ注射用針（blunt-tip needle）を用いてラットの線条に定位に注射した。定位的座標は：吻側からブレグマ（bregma）へ0.5 mm、側方から中線へ3 mmおよび頭骨表面から5 mmである。ウイルス粒子含有量を、480 ng p24抗原に合わせた。ウイルスベクターを、自動注射機（STOELTING Co.）により0.2μl/分で注射し、針をさらに5分間そのままにしておいた。
皮膚を、創傷片オートクリップ（wound chips autoclips）（PHYMEP）を用いて閉じた。
【００７２】
b）組織学的処理
レンチウイルス注射の２週間から６ヶ月後に、動物に過量のペントバルビタールナトリウムを与え、心臓を通るようにリン酸溶液を潅流し、それに続いて4％パラホルムアルデヒド（PAF、FLUKA、SIGMA）および10%ピクリン酸で固定した。脳を取り出し、4％ PAFおよび10%ピクリン酸での24時間の固定後、最後に25％スクロース、0.1 Mリン酸緩衝液中で48時間の凍結防止をした。-20℃の凍結ステージを有するスレッジミクロトーム（SM2400、LEICA MICROSYSTEMS AG）を用いて、25μmの脳の冠状切片を切った。全線条からの切片を集め、96ウェルプレートに0.12μMアジ化ナトリウムを補ったPBS中、自由に動く状態で入れ、4℃で保管した。
【００７３】
これまでに記載された以下のプロトコール（Bensadounら, Eur J Neurosci, 2001, 14, 1753-61）に従って、注射したラットおよびマウスからの線条体切片を、分子量32 kDaのドパミンおよびcAMP調節性リンタンパク質（DARPP-32、1:5000、CHEMICON INTERNATIONAL INC）の免疫組織化学で処理した。NGSに加えて10％ウシ胎仔血清（FCS、GIBCO、INVITROGEN）を含むブロッキング溶液を用いるユビキチン（Ub、1:1000、DAKOCYTOMATION）に、同じプロトコールを用いた。4C8抗体（MAB2166、1:2000、CHEMICON INTERNATIONAL INC.）での内因性httの検出およびEM48抗体（MAB5374、1:2000、CHEMICON INTERNATIONAL INC.）での変異httの検出のために、薄片を1％シアノ水素化ホウ素ナトリウム中に30分間プレインキュベートし、PBS、0.4% Triton X100（TX）中で２回リンスした。１次抗体をPBS中、室温で一晩インキュベートした。薄片をPBS、0.4% TXで６回洗浄した後、２次抗体を室温で２時間接触させた。ビオチン化されたウサギ抗ヤギ抗体またはウマ抗マウス抗体（ラット吸収）（1:200；VECTOR LABORATORIES INC）を、それぞれユビキチンおよびEM48の検出に用いた。結合した抗体を、3,3'ジアミノベンジジン（DAB Metal Concentrate；PIERCE）およびABC amplification システム（Vectastain ABCキット；VECTOR LABORATORIES）で可視化した。切片をマウントし、エタノールおよびトルオール溶液に２回通すことにより脱水し、Eukitt（登録商標）（O. Kindler、GMBH & CO）でカバーをかけた。LacZ酵素的染色のために、切片をPBS中で２回リンスし、4 mM フェロシン化カリウム、4 mM フェリシアン化カリウム、40 mM MgCl2、0.4 mg/ml 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-O-ガラクトシダーゼ（X-Gal）中で、37℃で２時間インキュベートした。反応をPBSで停止した。
【００７４】
c）インビボデータ解析
インビボでの実験では、DARPP-32発現の喪失を、動物当たり12枚の切片（切片間は150μm）をスライドスキャナでデジタル化し、イメージ解析ソフトウェア（Image J, Version 1.32j, National Institutes of Health）で、病変面積をmm2で定量化することにより解析した。各切片中の病変面積を、周囲の組織と比べてDARPP-32染色の乏しい領域の面積により測定した。各動物の病変のサイズを、8〜12枚の切片のおける病変面積の平均値として表した。
各グループの病変面積を、平均値±SEMで表した。統計学的解析を、一元配置の分散解析（ANOVA）とそれに続くNewman-Keuls事後検定を用いて行った（Statistica 5.1, STATSOFT INC.）。有意水準をP < 0.05に設定した。
【００７５】
d）封入体形成の定量化
ユビキチン陽性htt封入体の数の評価では、（300μmで分けられた）線条の5〜10の連続した冠状切片を、自動電動式ステージおよび収集システムを搭載したZeiss Axioplan2イメージング顕微鏡（Fluovision, IMSTAR）を用いたx10対物レンズでスキャンした。全切片からのユビキチン陽性対象の分割を、これまでに報告されているように（Palfiら, Mol. Ther., 2007, 15, 1444-1451）、光強度の閾値での二値化（thresholding）とそれに続く対象のサイズおよび形状のフィルタリングを用いて得た。この手順により、見かけの断面積が2μm2より大きい全てのユビキチン陽性対象を確実に検出し、断面積を測定した。全てのイメージでは、視野のXまたはY境界の１つに接する対象を除いた。1〜1,677対象／切片を計数した（検討される切片に依存する）。ユビキチン封入体を有する対象の予測される全ての数（Ne）を、Ne=RxNs（式中、Nsは全切片について計数した対象の合計、R（1：12、例えば12切片毎の1）は線条のサンプリング画分である）として算出した。線条体ニューロン中のほとんどのユビキチン陽性の対象は、線条での等方性配向で円状（1に近い平均円形指標（rotundity index））であったので、生の細胞計数の数を、アバークロンビー因子（Abercrombie factor）25を用いて補正した。この因子（A）を、各実験グループに対して、A=T/(T+h)（式中、hは検出された全ての対象から算出した対象の高さの平均値、Tは切片の厚さ（25μm））として予測した（値は、0.88〜0.92）。ユビキチン陽性対象（Nc）の補正された数を、Nc=A x Ne として算出した。値を平均値±SDとして表した。統計学的解析を、一元配置の分散解析（ANOVA）とそれに続くBonferroni/Dunn事後検定を用いて行った（Statview 4.0, Abbacus Concepts, Berkeley, CA）。P < 0.05の値を有意であるとした。
【００７６】
2）結果
82のCAG反復を有するヒトhttのN末端断片を過剰発現するラット（htt171-82Q；de Almeidaら, J. Neurosci., 2002, 22, 3473-3483）を用いて、siRNA発現により変異httの線条体レベルおよびハンチントン病の病変の進行が減少したかどうかを評価した（図２および１１）。注射の2ヶ月後、注射されていない線条と比較して、ヒトhtt171-82Qの発現により、DARPP-32発現の典型的な喪失（DARP-32の乏しい領域の断面積の平均値= 0.68 mm2±0.05）が誘導された（図２A＆２B）。sihtt1.1、3および6のレンチウイルスによる発現により、このDARPP-32発現の喪失はほとんど完全に妨げられた（病変面積は、それぞれ0.06 mm2±0.01、0.10 mm2±0.05および0.03 mm2±0.01）（図２A＆２B；図１１A）。DARPP-32レベルはsiGFP発現に従って変化しなかったので（0.73 mm2±0.07）、この病変面積の激減（＞85%）は、sihttの発現に特異的である。LacZ染色により、形質導入効率が異なる実験グループにおいて同様であることが示された（図２C；図１１B）。広範かつ高いLacZ発現がsihtt1.1、3および6ベクターで観察され、siGFPベクターでは広いが強くない染色であった。この後者の場合では、レポーター遺伝子発現の部分的な喪失は、これらの動物におけるハンチントン病の病変の進行のためであった（図２C；図１１C）。2週間目に犠牲にしたsiGFP動物からの線条体切片に対するLacZ染色により、この解釈が確かめられた。
【００７７】
そして、htt封入体の数またはサイズに対するshRNA処理の影響を検討した。これまでに報告されているように（de Almeidaら, J Neurosci, 2002, 22, 3473-3483）、ヒトhtt171-82Qを過剰発現するラットにおいて、変異htt封入体に対するEM48およびユビキチン染色は、感染したニューロンの核に主に局在していた（図２D＆２E；図１１C＆１１D）。ユビキチン染色により、EM48データは完全に確証された。htt171-82Q/siGFPを受けたhtt171-82Qラットおよび動物におけるEM48／ユビキチン染色の比較により、htt封入体の分布およびサイズに違いがないことが明らかになった（図２D）。対照的に、非常に顕著なhtt封入体数の減少が、sihtt1.1、3および6で観察された（図２E＆２F；図１１D）。これらの結果から、sihtt1.1、3および6の長期間の発現により、成体ラットの線条においてハンチントン病の病変の特異的かつ顕著な減少がもたらされることが示された。
【００７８】
実施例３：インビトロでのsihttのドキシサイクリン調節性発現
1）原材料および方法
HEK 293T細胞を、６ウェルプレート（FALCON、BECTON DICKINSON）に、１ウェル当たり800'000個の密度で培養した。翌日、該細胞を、ドキシサイクリン（1μg/ml、 SIGMA-ALDRICH）の存在下または非存在下で、種々のレンチウイルスベクター（250 ng p24抗原／ベクター）で感染させた。細胞を、SIN-W-PGK-EGFP（増強された緑色蛍光タンパク質、GFP）、SIN-CWP-nls-LacZ-TRE-H1-siGFP（siGFP）およびトランスリプレッサーSIN-W-PGK-tetR(B/E)-KRAB（KRAB）で共感染（co-infected）させた（比1：1：1）。GFPおよびsiGFP発現ベクターで共感染させた細胞、GFPをコードするベクターで感染させた細胞および非感染細胞を対照として用いた。感染の７日後、293T細胞を回収し、FACS解析に付した。トリプシン処理後、細胞をPBSでリンスし、PBS中に1％のホルムアルデヒドで固定した。細胞計数を、CellQuestソフトウェア（BECTON DICKINSON）を用いたFACSCalibur（商標）アナライザーで２重または３重に行った。各サンプルについて、10'000事象を解析した。GFP発現細胞の平均蛍光強度（MFI）を、データの標準化のための内部標準として用いた。異なるサンプルのMFIの平均値を用いて、siRNAの効力を測定した。データを、４つの独立した実験からの平均値±SEMとして表した。感染の７日後、半分のサンプルの培養条件を改変して（DOXなしで培養したサンプル中へのDOXの追加およびDOX中に維持された培養物におけるDOXの除去）、ドキシサイクリン調節性の可逆性を解析した。新たなFACS解析を10日後に行った（n=2）。
【００７９】
2）結果
siRNAの条件的発現の開発のための第１工程として、siRNAを発現するレンチウイルスベクターにおいて、テトラサイクリンオペレーターをH1プロモーターの上流に組み込んだ。そして、ドキシサイクリン（DOX）の存在下または非存在下におけるTetR-KRABトランスリプレッサー（KRAB）の共発現を用いて、siRNA発現を調節した（Wiznerowicz, M.およびTrono, D., J Virol, 2003, 77, 8957-61）。図３に記載されるように、DOXの存在により、トランスリプレッサーのその応答性エレメント（TRE）への結合が阻害され、siRNA分子の発現を可能にする。DOXの非存在下では、トランスリプレッサーにより、siRNAおよびLacZ遺伝子の発現は抑制されている。この系を、siGFPおよび／またはKRABをコードするベクターで共感染されたGFP発現293T細胞に対して試験した（図４）。FACS解析を、DOXの非存在下（図４A）またはDOXの存在下（図４B）で７日間維持された培養物に対して行った。非感染（図４Aおよび４B）ならびにGFP感染細胞（図４Aおよび４B）を対照として用いた。平均蛍光強度（MFI）は、GFPレポーター遺伝子およびsiGFPを発現する細胞において顕著に減少した（図４Aおよび４B）。３重感染させた細胞（GFP/siGFP/KRAB）では、DOXの追加により、トランスリプレッサーが不活性化され、GFPのサイレンシングを誘導した（図４B；青い曲線）。DOXの非存在下では、MFIはGFP単独を感染させた対照細胞よりも低かったが、トランスリプレッサーは活性であり、GFP発現は維持された（図４A）。これは、系の固有の漏れやすさおよび３つのベクターにおける該系の不和（split）を反映しているかもしれない。この系の可逆性を示すために、DOX処理を７日後に切り替え、新たなFACS解析を10日後に行った（図４Cおよび４D）。FACSのグラフの完全な反転が、細胞へのDOX処理の切り替えの10日後に観察された。この実験により、shRNAのドキシサイクリン調節性発現の証拠および原理が示された。
【００８０】
実施例４：ラットにおけるハンチントン病の病変の兆候段階でのsiRNAの送達により神経保護効果が誘導された
1）原材料および方法
動物
用いたラットは、実施例２に記載のものであった。テトラサイクリン調節性実験では、該動物に、飲用水中にドキシサイクリン200 mg/l（DOX、SIGMA CHEMICAL CO.）およびスクロース15 g/lの溶液を与えた。
レンチウイルスの注射
実験手順は、実施例２に記載されるとおりであった；２重および３重の感染では、ウイルス粒子含有量をそれぞれ500および338 ng p24抗原に合わせた。
組織学的処理
実験手順は、実施例２に記載されるとおりであった。
【００８１】
2）結果
sihtt1.1を選択して、インビボでのsiRNAの条件的調節を確認した。sihtt1.1を選択して、ハンチントン病の病変の出現後に開始された場合にsihttの効力が変化するかどうかを評価した。この目的のために、htt-171-82Q、sihtt1.1およびKRABを発現するレンチウイルスベクターの混合物（1：1：1の比）を、ラットの右線条に注射した。sihtt1.1およびKRABベクターを、タンパク質毒性および発現レベルの対照として、左線条に注射した（図５）。最初の２つのグループ（グループ当たりn=8）をドキシサイクリンなしで維持し（-DOX；「OFF」）、３つ目のグループにドキシサイクリンを与えた（+DOX；「ON」）。２ヵ月後、「ON」グループ（+DOX）の動物および「OFF」グループ（-DOX）からの動物の半分を犠牲にした。そして、残りの動物について、DOX投与を、続く２ヶ月間切り替えた（-DOX/+DOX）。sihtt1.1の発現およびテトラサイクリントランスリプレッサー（KRAB）の機能性を、LacZレポーター遺伝子で間接的にモニターした（図６C）。「ON」動物では、注射した部位の広範囲でLacZ染色が観察された。「OFF」条件では、これまでに報告されるように（図２；Wiznerowicz, M.およびTrono, D., J Virol, 2003, 77, 8957-8961）、KRABトランスリプレッサーによって、クロマチンのリモデリングおよびLacZ発現の抑制が誘導された。
【００８２】
２ヶ月目において、「OFF」動物（siRNA発現なし）のみが、左線条におけるDARPP-32発現の喪失（0.72 mm2±0.07）（図６A＆６B）とともに典型的HD病変を示した（図２A＆２B）。しかしながら、残りのDARPP-32発現が病変範囲において少し観察された（図６A）。これは、「OFF」条件におけるsihtt1.1の基底の発現、および全てのニューロンがhtt171-82Q, sihtt1.1およびKRABを共発現するわけではなかったという事実を反映する。「ON」グループでのみ、siRNA処理の効力は、図２で報告した結果、（0.03 mm2±0.01までの）病変サイズの激減（図６B）およびユビキチン陽性封入体のより低い数（78.1±6.6％；図６D）と一致する。重要なことに、病変発症の2ヶ月後のsihtt1.1処理の開始は、DARPP-32の発現の喪失を顕著に減少させ（0.25 mm2±0.03）、htt封入体の不完全な除去に関連する（34.1±8.4％；図６B＆６C＆６D）。さらに、これらのデータは、ポリQ誘導性線条体病変の可逆性を確立し、神経病変的疾患の発症後に開始された治療が、ポリQによる毒性の減少にまだ有効であることを示した。
【００８３】
実施例５：内因性野生型httを標的とするshRNAの設計および確認
1）原材料および方法
動物
ラットは、実施例２に記載のものを用いた。26 gの雌性のC57/BL6成体マウス（IFFA CREDO/CHARLES RIVER）を用いた。該動物を実施例１に記載のように飼育した。
レンチウイルスの注射
ラットへの実験手順は、実施例２に記載されるとおりであった。マウスへの実験手順は、（i）定位的座標は：吻側からブレグマへ0.6 mm、側方から中線へ1.8 mmおよび頭骨表面から3.5 mmであったこと；（ii）濃縮ウイルスを、160 ng p24抗原に合わせたこと、および（iii）皮膚を、4-0 Prolene（登録商標）縫合糸（Ethicon、Johnson and Johnson、Brussels、Belgium）を用いて閉じたことを除いて、ラットについて実施例２に記載されるのと同様であった。
組織学的処理
実験手順は、実施例２に記載されるとおりであった。
【００８４】
マウスにおけるレーザ顕微解剖およびRT-PCR
2マイクロリットルのSIN-CWP-GFP-sihtt1.1（n=6）、SIN-CWP-GFP-sihtt6（n=6）、およびSIN-CWP-GFP-sihtt13（n=6）を、成体マウスの線条に注射した。該動物を、注射の16週間後に、ペントバルビタールの過量投与（150mg/kg、静脈内に；Sanofi、France）により犠牲にした。脳を直ちに取り出し、冷2-メチルブタン中で凍らせ、冷凍ミクロトーム上で冠状平面で切断し（14μm切片）、-80℃で保存した。切片の脱水を、勾配エタノール（75％、95％、100％、100％）中で30秒およびキシレン中で5分のインキュベーションを用いて行った。薄片を、新しい乾燥剤とともに真空乾燥機中に置き、PixCell（登録商標）IIe Arcturus（登録商標）機器でのレーザ捕捉顕微解剖（Laser Capture Microdissection（LCM））を実行するまで室温で保存した。GFPレポーター遺伝子の緑色蛍光を、ベクターで感染させた線条の範囲を同定するために用いた。LCMレーザ捕捉顕微解剖系は、30μm、46mWかつ3.3 ミリ秒の持続時間でのレーザスポットサイズを用いる。
【００８５】
（熱可塑性フィルム上への）レーザ顕微解剖の完全さの視覚的制御の後、捕捉された組織を、Rneasy Microキット（Qiagen、Hilden、Germany）を製造業者の説明書に従って用いて抽出した。核酸濃度をQuant-iT（商標）RNAアッセイキット（Molecular Probes（商標）Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）により測定し、保全性（integrity）をAgilent RNA 6000 Pico Labchip（Agilent Technologies、Wadbrown、Germany）を用いて測定した。30 ngの全RNAを、RT-PCRの出発物質として用いた。より高い効力およびRNAの質のために解剖時間を制限する目的で、我々は、動物当たりおよそ80〜180 ngの全RNAを生ずるのに十分な組織（8〜20枚の切片）のみ解剖した。これはRT-PCRおよびマイクロアレイ解析の両方に十分である。
【００８６】
逆転写を次のように行った：1μlのオリゴdTをサンプルに加え、70℃で、5分インキュベートした。そして、6マイクロリットルのMIX（ABgene Reverse-iT MAX RTase混合）を加え（4μlの緩衝液、1μlの10 mM dNTP、1μlの酵素Reverse -iT max RTase 混合）、該サンプルを42℃で60分間インキュベートした。PCR反応を、FastStart DNA Master SYBR Green Iキット（Roche、Diagnostics GmbH、Mannheim、Germany）、sihtt13の配列の周囲の領域を標的とするオリゴのセット（htt C：ggggtgacacggaaagaaat（配列番号２７）およびD：tcagtgcttgcaggagttca（配列番号２８））で行った。
【００８７】
反応を次のように行った：20μl中に1.5μlのlight cycler DNA Master SYBER Green、3〜5 mM MgCl2、0.4μMプライマー、95℃で8分、68℃で5分および72℃で8分を45サイクル。シクロフィリン（cyclophilin）遺伝子を内部標準として用いた（オリゴ：CYCLO-1F：atggcaaatgctggaccaaa（配列番号２９）；CYCLO-2R：gccttctttcaccttcccaaa（配列番号３０））。増幅グラフでPCR産物の交差点（cross-point（Ct））値を確認した。Ct値により、サンプルの蛍光が、増幅サイクルにおけるバックグラウンドの蛍光より高いレベルまで増加したサイクルが示された。正しい産物が増幅されていることを証明するために、融解曲線解析をPCR増幅の後に、その特異的な融解温度（Tm）を検討することにより行った。相対的定量化を、標準曲線法により行った。外部標準曲線を得るために、校正用サンプルの希釈系列（外部標準）を各実験に含めた。その曲線を、インプット標準化のための各サンプルにおける標的およびハウスキーピング遺伝子（内因性対照）の両方の定量化に用いた。相対的定量化を、RealQuantソフトウェア（バージョン1.01、Roche）を用いて行った。データの計算は、LightCycler（登録商標）ソフトウェアにより得られたCP値に基づく。結果を、校正の標的／参照の比で除したサンプルの標的／参照の比として算出した。これにより、サンプルの不均質性および検出のばらつきが補正される。
【００８８】
2）結果
次の実験のセットは、siRNA構築物の種選択性を利用して、成体の動物において内因性httの不完全な抑制的調節が許容されるかどうかを調べ、対立遺伝子特異的httサイレンシングの可能な必要性についての情報を提供する。配列同一性に基づいて、sihtt1.1はヒトhtt転写産物のみを標的とし、sihtt3およびsihtt6はヒトおよびマウスhtt（ラット配列とは1〜2ミスマッチである）を標的とし、保存された配列を標的とするsihtt13は、RNAiによるヒト、ラットおよびマウスhtt転写産物の減少を引き起こすだろう。sihttのこの予測された選択性を確かめるために、これらのベクターを正常マウスおよびラットの線条に注射した。手術の３週間後の線条体切片の免疫組織化学的解析により、内因性htt転写産物に対するsiRNAの種選択性が立証された（図７）。LacZレポーター遺伝子により形質導入されたニューロンの同定が可能になり、4C8抗体を内因性httタンパク質の検出に用いた。全ての場合において、LacZ陽性細胞が注射部位の周辺に存在し、免疫反応性における顕著な違いはshRNA間で観察されなかった（図７Aおよび７B）。予期されたとおり、siGFPおよびsihtt1.1ベクターでは、マウスおよびラットhttの内因性レベルに対する効果がない（図７Aおよび７B）。sihtt13により、内因性マウスおよびラットhttの抑制的調節が誘導された（図７Aおよび７B）。減少したhtt免疫反応性も、sihtt 3、および6を注射されたマウスの線条において観察されたが、これらのsiRNAでは、配列中の1〜2ミスマッチの存在のため、ラットにおいて効果がない。これらのデータを、LacZ/httの2重染色および共焦点解析により確かめた。
【００８９】
インビボでのサイレンシングのレベルのさらなる定量のために、GFPレポーター遺伝子およびsihtt1.1、sihtt6またはsihtt13を発現する新たなベクターを開発した。これらのベクターを成体マウスに注射し、レーザ顕微解剖およびRT-PCR解析を、注射の16週間後の線条体切片に対して行った。正常レベルの24±3.5％および26±4.9％の内因性httのサイレンシングが、それぞれsihtt6およびsihtt13で得られたが、ヒト特異的であるsihtt1.1では野生型マウスhttに対する影響は限られていた（63±11.8％）（図７D）。これらのデータはまた、これらのベクターが外因性に投与された変異httだけでなく（図２および１１）、内因性htt転写産物も効率的にサイレンシングすることを示す。
【００９０】
実施例６：ラットおよびマウスにおける変異および野生型htt対立遺伝子の非選択的ノックダウンと選択的ノックダウンとの比較
1）原材料および方法
動物
ラットは、実施例２に記載のものを用いた。26 gの雌性のC57/BL6成体マウス（IFFA CREDO/CHARLES RIVER）を用いた。該動物を実施例１に記載のように飼育した。
レンチウイルスの注射
ラットへの実験手順は、実施例２に記載されるとおりであった。マウスへの実験手順は、（i）定位的座標は：吻側からブレグマへ0.6 mm、側方から中線へ1.8 mmおよび頭骨表面から3.5 mmであったこと；（ii）濃縮ウイルスを、単一および２重感染のために、それぞれ160および130 ng p24抗原に合わせたこと、および（iii）皮膚を、4-0 Prolene（登録商標）縫合糸（Ethicon、Johnson and Johnson、Brussels、Belgium）を用いて閉じたことを除いて、ラットについて実施例２に記載されるのと同様であった。
【００９１】
組織学的処理
実験手順は、実施例２に記載されるとおりであった。
インビボデータ解析
実験手順は、実施例２に記載されるとおりであった。
コードリンクマイクロアレイ
処理およびマイクロアレイ解析を、技術的プレートフォーム（plateform）profileXpert （www.profilexpert.fr）で行った。
【００９２】
RNA増幅
全RNA（15 ng）を、２回のインビトロ転写（dIVT）により増幅し、製造業者のプロトコールに従ってMessage AmpTM II aRNAキット（AMBION）でビオチン標識した。増幅の前に、異なる濃度の合成mRNAのスパイク（spikes）を全てのサンプルに加えた；これらの陽性対照を用いて、工程の質を確かめた。RNA収量をUV分光光度計で測定し、ナノチップに対する質をAgilent 2100 Bioanalyzer（AGILENT）で測定した。
【００９３】
アレイハイブリダイゼーションおよび処理
10マイクログラムのビオチン標識化aRNAを、20μlの最終体積中に5μlの断片化緩衝液を用いて断片化し、そして、240μlのAmersham hybridization溶液（GE HEALTHCARE EUROPE GMBH）と混合し、55000個のヒトオリゴヌクレオチド遺伝子プローブを含むCodeLink Uniset Human Whole Genomeバイオアレイまたは36000個のラットオリゴヌクレオチド遺伝子プローブを含むCodeLink Uniset Rat Whole Genomeバイオアレイ（どちらもGE HEALTHCARE EUROPE GMBHから）に注入した。アレイを、インキュベーター内で、37℃、300 rpmで一晩ハイブリダイズした。スライドをストリンジェントTNT緩衝液で、46℃で１時間洗浄し、そしてストレプトアビジン-cy5（GE HEALTHCARE）検出工程を行った。各スライドを、3.4 mlのストレプトアビジン-cy5溶液中に30分間インキュベートし、そして240 mlのTNT緩衝液で４回洗浄し、0.2 % Triton X-100を含む240 mlの水で２回リンスし、600 rpmでの遠心分離により乾燥した。該スライドを、635 mmのレーザセット、100％のレーザパワーおよび60％の高電子倍増管電圧量でのGenepix 4000Bスキャナ（AXON）およびGenepixソフトウェアを用いてスキャンした。スキャンイメージファイルを、アレイ上の各スポットの未処理および標準化ハイブリダイゼーションシグナルの両方を提供するCodeLink expressionソフトウェア バージョン4.0（GE HEALTHCARE）を用いて解析した。
【００９４】
マイクロアレイデータ解析
アレイの未処理のハイブリダイゼーションシグナルの相対的強度は、異なる実験で変わる。それゆえ、CodeLinkソフトウェアを用いて、よりよいアレイ間（cross-array）比較のために、各アレイの未処理のハイブリダイゼーションシグナルをアレイの中央値に標準化した（標準化後、中央値強度は１である）。検出の閾値を、アレイ中の100個の陰性対照の標準化したシグナル強度を用いて算出した；この閾値以下のシグナル強度のスポットを、「無し（absent）」として参照する。処理の質を、陽性シグナル分布のスキャッタープロットを作成することにより評価した。そして、シグナル強度を、2を底とする対数の値に変換した。統計学的比較およびフィルタリングを、Genespringソフトウェア7.0（AGILENT）を用いて行った。Ingenuity Pathway Analysis（MOUNTAIN VIEW）を機能解析に用いた。
【００９５】
LacZ発現の定量化
切片を平台スキャナ（ImageScanner、GE HEALTHCARE EUROPE）で8ビットのグレースケールイメージとしてデジタル化し、相対的光学密度をイメージ解析ソフト（MCID、INTERFOCUS IMAGING）を用いて測定した。データを、注射部位の中央に位置する４枚の切片から算出した平均値ODとして表した。興味対象の領域（ROI）を、LacZ染色に従って描いた。データを、注射部位の中央に位置する、動物当たり４枚の切片のROIから算出した平均値ODとして表した。
【００９６】
2）結果
成体の脳における内因性httサイレンシングの結果を評価するために、RNA発現のマイクロアレイ解析を、sihtt1.1、sihtt6またはsihtt13（SIN-CWP-GFP-sihtt）を発現するレンチウイルスベクターを注射した成体マウスからレーザ捕捉顕微解剖した脳切片について行った。 GFPレポーター遺伝子を用いて、感染細胞を同定した。マウスhtt mRNAレベルのマイクロアレイ定量化は、３つのsiRNAの選択性に一致した（図８A）。マウスhttにおける顕著な減少がsihtt6およびsihtt13で観察されたが、ヒト特異的sihtt1.1では効果がなかった（図８A）。他と異なって発現する遺伝子に対するingenuity pathway analysisの使用により、対照レンチウイルスベクターsihtt1.1の注射は、線条体発現プロファイルにおけるささやかな変化にのみ関連することが明らかとなった。これらの微妙な変化は、外科的手順に対する局所瘢痕化／創傷治癒反応と矛盾しないが、インターフェロン調節性遺伝子AOS、PKRおよびLTRに対する効果の欠如により示されるような、インターフェロン反応のRNAiが媒介する活性化を含まなかった（Bridgeら, Nat. Genet., 2003, 34, 263-264）。
【００９７】
対照的に、sihtt6およびsihtt13の発現は、特定の非炎症性遺伝子の発現における顕著な変化を誘導した。sihtt6およびsihtt13の発現プロファイルは大いに関連しており、サイレンシング効果は非常に特異的であり、そして「オフ-ターゲット」効果は非常に限られていることを示している。さらに、発現がhttサイレンシングにより変化する特定の遺伝子が、Gタンパク質共役受容体シグナリング、シナプス長期増強／抑制、軸索誘導、cAMP媒介シグナリング、ならびにカルシウムおよびグルタミン酸シグナリング（Cattaneoら, Nat. Rev. Neurosci., 2005, 6, 919-930 ; Harjesら, Trends Biochem. Sci., 2003, 28, 425-433）を含む既知のhtt機能に関連する分子経路に関係することが観察された。
【００９８】
HDの状況における内因性ラットhttのそのような抑制的調節の機能的結果を調べるために、第１の実験を行って、成体ラットを、ヒトhtt171-82Qおよびsihtt13またはヒトhtt171-82Qのみをコードするベクターで共感染させた。sihtt13は、htt171-82Qベクター中には存在しないエクソン８および９中の配列を標的とする（図１A）。この実験の範例で、変異ヒトhtt171-82Qを発現する動物において、野生型ラットhttの選択的サイレンシングが達成される。注射の２ヶ月後、該動物を犠牲にし、内因性sihttサイレンシングの効果を解析した。DARPP-32発現に基づくGABA作動性ニューロンの生存（htt171-82Q：0.68 mm2±0.05；htt171-82Qおよびsihtt13：0.70 mm2±0.06）またはhtt封入体負荷（load）（図２A、２B、２Dおよび２E）の点では、htt171-82Q/sihtt13およびhtt171-82Qグループとの間に違いは見られなかった。これらのデータは、内因性httの不完全な不活性化が、ハンチントン病の病変の進行に重大な影響を有さないことを示している。
【００９９】
さらに、疾患対立遺伝子の選択的ノックダウンに対する野生型および変異httの全体的不活性化の長期間の影響を評価するために、httのヒト型に対するsihtt1.1の選択性およびヒトおよびマウスの内因性httの両方を認識するsihtt6の非選択性を用いた。これらのsiRNAをヒトhtt171-82Qと共にマウスの線条に注射し、注射の１、３および９ヶ月後に該動物を犠牲にした。どちらのsihttもハンチントン病病変を、ある程度まで劇的に減少させた（DARPP-32およびユビキチン染色により評価した）（図９A＆９Bおよび１０）。 LacZ陽性細胞数もまた、両方のグループにおいて同様であった。これは、内因性マウスhttのサイレンシングによってはGABA作動性の生存に影響しないことを支持する（図９A＆９Bおよび１０）。これらの結果により、sihtt6発現レベルは限定されない（例えば、変異httのサイレンシングは、同時に起こる野生型httのサイレンシングにより阻害されない）ことも示される。要するに、これらのデータにより、同時に起こる対立遺伝子特異的ではないサイレンシングがHD病変に対して有効であること、および野生型httの不完全な不活性化がよく許容されることが示唆される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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