(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の段階を含む毛嚢幹細胞の分離方法：
（ａ）毛嚢含有頭皮由来の組織を細切した後に（Ｉ）ＤＮＡ分解酵素(DNase)及びタンパク質分解酵素(protease)を含むタンパク質複合体、及びディスパーゼ(dispase)を含む培地で１次分解する段階、及び（ＩＩ）コラゲナーゼの含まれた培地で組織を２次分解する段階；
（ｂ）前記分解された組織を回収した後、Ｍ１９９培地とＦ１２培地を１：１の体積比で混合したＭ１９９／Ｆ１２培地に、インシュリン０．１〜１．０μｇ／ｍｌ、トランスフェリン０．１〜１．０μｇ／ｍｌ、ペニシリン５０〜１５０ｕｎｉｔ、ストレプトマイシン０．０５〜０．１５ｍｇ／ｍｌ、ネオマイシン０．１〜０．５μｇ／ｍｌ、ｒＥＧＦ(Epidermal Growth Factor)１〜１００ｎｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ(BASIC FIBROBLAST GROWTH FACTOR)１〜１００ｎｇ／ｍｌ、ノルモシン１０〜２００μｇ／ｍｌ、ウシ胎仔血清０．０１〜０．３ｍｌ／ｍｌ（１〜３０体積％）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン０．１〜１０ｍＭが添加された、血清１〜３０体積％を含む培地で培養する段階；
（ｃ）前記組織が培養器に付着されれば、Ｍ１９９培地とＦ１２培地を１：１の体積比で混合したＭ１９９／Ｆ１２培地に、インシュリン０．１〜１．０μｇ／ｍｌ、トランスフェリン０．１〜１．０μｇ／ｍｌ、ペニシリン５０〜１５０ｕｎｉｔ、ストレプトマイシン０．０５〜０．１５ｍｇ／ｍｌ、ネオマイシン０．１〜０．５μｇ／ｍｌ、ｒＥＧＦ(Epidermal Growth Factor)１〜１００ｎｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ(BASIC FIBROBLAST GROWTH FACTOR)１〜１００ｎｇ／ｍｌ、ノルモシン１０〜２００μｇ／ｍｌ、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン０．１〜１０ｍＭを添加した無血清培地で培養した後、ノルモシンを含んでいない、アスコルビン酸０．１〜１０ｍＭを含む無血清培地に交換した後に再培養する段階；及び
（ｄ）前記再培養された組織から培養増殖された頭皮細胞を回収した後、回収した細胞から、ＣＤ３４陽性の免疫学的特性を有する毛嚢幹細胞を分離する段階。
【請求項２】
前記分離される毛嚢幹細胞の免疫表現型抗原はＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３及びＣＤ２９から選択される一つ以上の免疫学的特性を表すことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毛嚢幹細胞を分離する方法及び発毛誘導用の組成物に係り、さらに詳細には、 毛嚢含有頭皮由来の組織を化学的に分解した後、血清培地及び無血清培地で培養する過程を経て、ＣＤ３４陽性の免疫学的な特徴を有する毛嚢幹細胞を分離する方法及びそれによって分離されたＣＤ３４陽性毛嚢幹細胞を有効成分として含む発毛誘導用の組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、美容への関心が高まりつつ、脱毛症の治療への関心も高まっている。脱毛症とは、正常に毛髪があるべき所に毛髪がない状態を言う。脱毛は、臨床的に傷を伴う瘢痕性脱毛と、毛髪のみが抜ける非瘢痕性脱毛とに分けられる。瘢痕性脱毛の場合、毛嚢が破壊されるので、毛髪が再生しないが、毛髪は、毛嚢という所で作られ、各毛嚢は、周期的に活動及び停止の過程を経る。各毛嚢は、一生１０〜２０回の毛嚢成長周期(hair follicle growth cycle)を有する(Cotsarelis G. et al., Cell, 61(7):1329, 1990)。通常の場合、髪の毛の８５〜９０％は成長期にあり、年を取るにつれて成長期毛嚢の数が減る。したがって、１０〜１５％の毛嚢が退行期または休止期にあり、一日に平均約５０〜６０本の髪の毛が正常に抜け、一日に１００本以上の髪の毛が抜ければ、脱毛症が疑われる。
【０００３】
脱毛の治療法として様々な方法が紹介されているが、現在最も多く使用されている手術方法は、残っている自身の髪の毛を利用して脱毛部分に移植する自己毛髪移植手術であり、時々縫ったような跡が残るという問題点があった。
【０００４】
また、薬物治療としては、現在飲み薬であるプロペシアと、塗り薬であるミノキシジルの二つのみが米国食品医薬品庁（Food and Drug Administration：FDA）で認められたが、プロペシアの治療効果は、投与当時にはその薬効が有効であるが、薬の服用が中断されれば、数ヵ月後に薬を飲む前の状態に戻って、脱毛が再び始まる(Bouhanna P., Dermatol. Surg., 29(11):1130, 2003; Thiboutot D., Arch. Dermatol., 135(11):1417, 1999)。一方、ミノキシジルは、男女共に使用可能な脱毛治療剤である(Bouhanna P., Dermatol. Surg., 29(11):1130, 2003; Messenger A.G. & Rundegren J., Br J. Dermatol., 150(2):186, 2004)。しかし、このような薬物治療は、性機能障害などの多くの副作用を伴うと報告されている(Messenger A.G. & Rundegren J., Br J. Dermatol., 150(2):186, 2004)。
【０００５】
最近期待されている治療方法として、遺伝子を利用した治療方法が挙げられる。全身で脱毛が起こる疾患に関与する遺伝因子が発見されて発表されたことにより(Ahmad W. et al., Science, 279(5351):720, 1998)、このような遺伝子構造を利用して毛嚢に直接的に所望のＤＮＡコードを伝達する方法または遺伝子の発現を遮断する治療法が開発されている。しかし、このような治療の効能、治療コスト、安全性、次世代に及ぶ影響などについては未だ十分に明らかになっておらず、このため、脱毛に関与する遺伝因子を明らかにするとしても、それを利用した治療方法が安全に現実化するまでは相当の期間がかかると思われる。
【０００６】
また、成長期にある毛髪の球根特性が毛髪に付いたまま摘出された後、その毛嚢細胞を培養し、それを摘出した部分に移植する毛髪再生方法が開示されているが（米国特許公開第６，３９９，０５７号公報）、その効果はそれほど効率的でないと見なされる。
【０００７】
一方、成体幹細胞は、多様な疾病の細胞治療剤として脚光を浴びているが、ここで成体幹細胞とは、“成体から得られる自己再生可能(self-renewal)であり、かつ自己維持機能(self-maintenance) 及び多分化能を表す成体のすべての臓器からの細胞”と定義される。これまで広範に臨床分野で成体幹細胞の性格及び操作が応用されているが、例えば、眼球の内側に角膜上皮幹細胞の同定は角膜移植の新たな技術の発展を実現し(Cotsarelis G. et al., Cell, 57;201, 1989; Tsai R.J. et al., N. Engl. J. Med., 343, 86, 2000)、造血幹細胞の特徴によって自己組織の部分的な幹細胞の移植及び遺伝子治療をもたらした(Bernstein I.D. et al., Blood Cells, 20, 15, 1994)。また、表皮での幹細胞の概念は、３０年前から既に論議されてきた(Potten C.S., Cell Tiss. Kinet., 7: 77, 1974)。最近、細胞培養研究に基づいた試験管内の研究(Barrandon Y & Green H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 2303, 1987; Rochat A. et al., Cell, 76: 1063, 1994)及びマウスでの生体内研究の結果は、表皮層小嚢内の特定の部分(at specific locations in the interfollicular epidermis)と、毛嚢の外部毛根鞘の上部(in the upper regions of the outer root sheath of the hair follicle)、すなわち突出部分（bulge region）と呼ばれる所と、成長期毛嚢の胚芽基質に含まれた類似幹細胞と共に皮膚幹細胞の多少複雑な分布及び有機的構造を提案してきた(Al-Barwari S.E. & Potten C.S., Intl. J. Radiat. Biol., 30:201, 1976; Morris R.J. et al., Cancer Res., 46: 3061, 1986; Cotsarelis G. et al., Cell, 61:1329, 1990; Lavker R.M. et al., J. Invest. Derm., 101:16, 1993; Morris R.J. & Potten C.S., J. Invest. Derm., 112: 470, 1999; Blanpain C. et al., Cell, 3;118(5):635, 2004)。
【０００８】
この分割された三つの皮膚幹細胞間の相互連関性については、毛嚢突出部分(bulge region)が、究極の幹細胞の最も可能性のある集団であると考えられている。また、この毛嚢突出部分(bulge region)での毛嚢幹細胞は、マウスでは、ＣＤ３４細胞表面のタンパク質を発現すると一貫して報告されている(Trempus C.S. et al., J. Invest. Dermatol., 120(4):501, 2003)。ところが、ヒトにおける毛嚢突出部分の細胞は、ＣＤ３４を発現しないと報告されている。しかし、このようなＣＤ３４陰性細胞が毛嚢内で髪の毛を作るか否かについては未だ確認されていない。また、このような毛嚢幹細胞の明確な培養法が確立されておらず、幹細胞のマーカーは不明であった。また、一部の毛嚢内に毛嚢幹細胞が存在するということが知られているとしても、実際禿頭の治療のために多量の幹細胞が必要であった。しかし、分離された幹細胞を臨床に適用できるほどの量に増殖させる技術は十分ではなかった。幹細胞のマーカータンパク質もまだ、明確には、同定されておらず、幹細胞を利用した脱毛治療方法は依然として確立されていなかった。
【０００９】
そこで、本発明者らは、毛嚢細胞の培養法、及び毛嚢幹細胞の同定法を開発し、幹細胞を脱毛症、無毛症の治療などの美容及び医薬分野に利用するために鋭意努力した結果、毛嚢含有頭皮由来の組織を培養することによって毛嚢幹細胞を分離し、分離した毛嚢幹細胞を適用した。そして、それが、従来の技術に比べて毛嚢幹細胞の高い収率を有する効率的な方法であるということ、及び分離した毛嚢幹細胞を含む組成物が発毛誘導、すなわち脱毛症の治療に効果的であるということを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の詳細な説明】
【００１０】
《発明の要約》
本発明の目的は、毛嚢含有頭皮由来の組織を培養して毛嚢幹細胞を分離する方法を提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、前記方法によって得られた毛嚢幹細胞を有効成分とする発毛誘導用の組成物を提供することにある。
【００１２】
前記目的を解決するために、本発明は、（ａ）毛嚢含有頭皮由来の組織を細切した後に化学的に分解する段階と、（ｂ）前記化学的に分解された組織を回収した後、血清１〜３０体積％を含む培地で培養する段階と、（ｃ）前記組織が培養器に付着されれば、培地を無血清培地に交換した後に再培養する段階と、（ｄ）前記再培養された組織から培養増殖された頭皮細胞を回収した後、回収した細胞からＣＤ３４陽性の免疫学的特性を有する毛嚢幹細胞を分離する段階と、を含む毛嚢幹細胞の分離方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、前記分離されたＣＤ３４陽性毛嚢幹細胞を有効成分として含む発毛誘導用の組成物を提供する。
【００１４】
本発明の他の特徴及び具現例は、下記の詳細な説明及び特許請求の範囲からさらに明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ノルモシン（Normocin）を含まないデファインド・ケラチノサイト（Defined keratinocytes）無血清培地で培養時、細胞培養用の培養ディッシュに最初に付着し始めた細胞の形状を示す写真である。二つの写真は、同じフラスコの異なる部分を撮った写真である（×１００）。
【図２】ノルモシンを含まないデファインド・ケラチノサイト無血清培地で培養時、前記培養ディッシュに最初に付着し始めた細胞の第一次継代後の細胞の形状を示す写真である。二つの写真は、同じフラスコの異なる部分を撮った写真である（×１００）。
【図３】ノルモシンを含まないデファインド・ケラチノサイト無血清培地で培養時、最初は培養ディッシュに付着しなかったが、移し換えた後に培養ディッシュに付いた細胞の形状を示す写真である。二つの写真は、同じフラスコの異なる部分を撮った写真である（×１００）。
【図４】初期培養から３日後に細胞を回収して、継代培養してから１〜８日間毎日細胞数を計算した後、各日付別に平均及び標準偏差値を求めて毛嚢細胞の成長曲線を示したグラフである。
【図５】ＭＡＣＳ(Magnetic Cell Sorting)を利用したＣＤ３４陽性細胞の分離方法を模式的に示す図である。
【図６】ＣＤ３４陽性細胞の分離に使用されたＭＡＣＳ機器を示す図である。
【図７】ＦＡＣＳ(fluorescence activated cell sorting)の技法を利用した毛嚢幹細胞の免疫学的特性の結果を示すグラフである。
【図８】毛嚢幹細胞の非投与対照群（Ａ）及び毛嚢幹細胞投与群（Ｂ）のマウスを示す写真である。
【図９】毛嚢幹細胞の非投与対照群（Ａ）及び毛嚢幹細胞投与群（Ｂ）のマウスの頭皮組織にＨＥ染色を施した結果を示す写真である。
【図１０】毛嚢幹細胞の投与群（Ａ、Ｂ）及び毛嚢幹細胞非投与対照群（Ｃ、Ｄ）のヒト特異プローブを利用したin situハイブリダイゼーションの結果を示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
一観点において、本発明は、毛嚢含有頭皮由来の組織から毛嚢幹細胞を分離する方法に関する。
【００１７】
本発明のある実施態様においては、毛嚢幹細胞は、次の段階を経て分離されることができる：（ａ）毛髪移植手術によって得られた毛嚢含有頭皮由来の組織を細切した後に化学的に分解する段階；（ｂ）前記化学的に分解された組織を回収した後、１〜３０体積％の血清含有培地で培養する段階；（ｃ）前記組織が培養器に付着されれば、培地を無血清培地に交換した後に再培養する段階；及び（ｄ）前記再培養された組織から培養増殖された頭皮細胞を回収した後、回収した細胞からＣＤ３４陽性の免疫学的特性を有する毛嚢幹細胞を分離する段階。
【００１８】
さらに詳細には、前記（ａ）段階の化学的な分解は、（Ｉ）ＤＮＡ分解酵素(DNase)及びタンパク質分解酵素(protease)を含むタンパク質複合体、及びディスパーゼ(dispase)を含む培地で１次分解する段階；及び（ＩＩ）コラゲナーゼの含まれた培地で２次分解する段階を含むことができる。
【００１９】
本発明において、前記（ｂ）段階の１〜３０体積％の血清含有培地は、Ｍ１９９培地とＦ１２培地を１：１の体積比で混合したＭ１９９／Ｆ１２培地に、インシュリン０．１〜１．０μｇ／ｍｌ、トランスフェリン０．１〜１．０μｇ／ｍｌ、ペニシリン５０〜１５０ｕｎｉｔ、ストレプトマイシン０．０５〜０．１５ｍｇ／ｍｌ、ネオマイシン０．１〜０．５μｇ／ｍｌ、ｒＥＧＦ(Epidermal Growth Factor)１〜１００ｎｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ(BASIC FIBROBLAST GROWTH FACTOR)１〜１００ｎｇ／ｍｌ、ノルモシン１０〜２００μｇ／ｍｌ、ウシ胎仔血清０．０１〜０．３ｍｌ／ｍｌ（１〜３０体積％）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン０．１〜１０ｍＭを添加した培地を使用することができる。
【００２０】
また、本発明において、前記（ｃ）段階の無血清培地は、ノルモシンを含んでいない無血清培地であることを特徴とし、さらに詳細には、前記ノルモシンを含んでいない無血清培地は、アスコルビン酸０．１〜１０ｍＭを含む無血清ケラチノサイト用培地を使用することが好ましい。
【００２１】
一方、本発明において、前記（ｃ）段階は、前記ノルモシンを含んでいない無血清培地で培養する前、ノルモシンを含む無血清培地で培養する段階をさらに含むことができる。このとき、ノルモシンを含む無血清培地は、Ｍ１９９培地とＦ１２培地を１：１の体積比で混合したＭ１９９／Ｆ１２培地に、インシュリン０．１〜１．０μｇ／ｍｌ、トランスフェリン０．１〜１．０μｇ／ｍｌ、ペニシリン５０〜１５０ｕｎｉｔ、ストレプトマイシン０．０５〜０．１５ｍｇ／ｍｌ、ネオマイシン０．１〜０．５μｇ／ｍｌ、ｒＥＧＦ(Epidermal Growth Factor)１〜１００ｎｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ(BASIC FIBROBLAST GROWTH FACTOR)１〜１００ｎｇ／ｍｌ、ノルモシン１０〜２００μｇ／ｍｌ、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン０．１〜１０ｍＭを添加した培地であることが好ましい。
【００２２】
毛嚢幹細胞は、すべての哺乳類の頭皮組織から分離して使用可能であり、このとき、頭皮組織は、毛嚢を含まねばならない。このとき、好ましくは、ヒトの頭皮組織の場合、最近行われている外科的毛髪移植術から得られる毛嚢含有頭皮由来の組織を使用することができる。外科的毛髪移植術の場合、毛髪が一生抜けない頭の側部及び後部（供与部）で頭皮を切開して取り出した後、拡大鏡を利用して毛嚢群（１〜４本の毛髪）あるいは複数の毛嚢群（３〜６本の毛髪）に分離し、分離された移植片は、脱毛の部分と細くなった毛髪の間の部分（受取部）とに移植されるが、このとき、移植片の残余物である頭皮由来の組織を本発明で利用することができる。
【００２３】
頭皮由来の組織から毛嚢幹細胞を分離するためには、まず、毛嚢含有頭皮由来の組織を細切した後、細切された組織に化学的分解過程を行う。１次化学的分解は、ディスパーゼ、並びにＤＮＡ分解酵素(DNase)及びタンパク質分解酵素（protease）を含むタンパク質複合体との含まれた培地で行う。このとき、前記培地は、これに限定されるものではないが、ウシ胎仔血清０．０１〜０．３ｍｌ／ｍｌ（１〜３０体積％）、ノルモシン１０〜２００μｇ／ｍｌ、ペニシリン５０〜１５０ｕｎｉｔ、ストレプトマイシン０．０５〜０．１５ｍｇ／ｍｌ、ネオマイシン０．１〜０．５μｇ／ｍｌの含まれたＤＭＥＭ培地に、ディスパーゼ０．１〜２ｍｇ／ｍｌ、並びにＤＮＡ分解酵素(DNase)及びタンパク質分解酵素（protease）を含むタンパク質複合体０．０１〜０．１ｍｌ／ｍｌ（１〜１０体積％）とが添加された培地が好ましい。ここで、ＤＮＡ分解酵素(DNase)及びタンパク質分解酵素（protease）を含むタンパク質複合体は商業的に入手可能であり、アキュマックス(accumax; Chemicon cat＃ SCR006)を使用することができるが、これに限定されるものではない。
【００２４】
その後、コラゲナーゼの含まれた培地で２次化学的分解を行う。このとき、前記コラゲナーゼの含まれた培地は、ウシ胎仔血清、ノルモシン、ペニシリン−ストレプトマイシンの含まれたＤＭＥＭ培地に、コラゲナーゼタイプＩＡが添加されたものが好ましい。前記ＤＭＥＭ培地は、これに限定されるものではないが、ウシ胎仔血清０．０１〜０．３ｍｌ／ｍｌ（１〜３０体積％）、ノルモシン１０〜２００μｇ／ｍｌ、ペニシリン５０〜１５０ｕｎｉｔ、ストレプトマイシン０．０５〜０．１５ｍｇ／ｍｌ、ネオマイシン０．１〜０．５μｇ／ｍｌが含まれたものが好ましく、前記コラゲナーゼタイプＩＡは、０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ添加されることが好ましい。また、このとき、細切された組織の化学的分解（１次化学的分解及び２次化学的分解）は、５０〜２００ｍ／ｍｉｎ、３０〜４０℃で０．５〜２４時間重力対流培養器（gravity convection incubator）で行うことが好ましい。
【００２５】
その次、化学分解された組織（頭皮細胞）を回収して、血清、好ましくは、ウシ胎仔血清１〜３０体積％の含まれた培地で培養する。このとき、使用される培地は、Ｍ１９９／Ｆ１２が好ましい。その後、切開された組織がフラスコに付着すれば、血清を含まない培地に交換する。一般的に３日〜１ヶ月が過ぎれば、ノルモシンを含まない無血清培地に交換する。
【００２６】
前記頭皮細胞の培養時、最初に使用されるＭ１９９／Ｆ１２培地はこれに限定されるものではないが、Ｍ１９９とＦ１２を１：１の体積比で混合した後、インシュリン０．１〜１．０μｇ／ｍｌ、トランスフェリン０．１〜１．０μｇ／ｍｌ、ペニシリン５０〜１５０ｕｎｉｔ、ストレプトマイシン０．０５〜０．１５ｍｇ／ｍｌ、ネオマイシン０．１〜０．５μｇ／ｍｌ、ｒＥＧＦ(Epidermal Growth Factor)１〜１００ｎｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ(BASIC FIBROBLAST GROWTH FACTOR)１〜１００ｎｇ／ｍｌ、ノルモシン１０〜２００μｇ／ｍｌ、ウシ胎仔血清０．０１〜０．３ｍｌ／ｍｌ（１〜３０体積％）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン０．１〜１０ｍＭを添加した培地が好ましく、細胞が付着された後に使用される培地は、市販の無血清ケラチノサイト用培地にアスコルビン酸０．１〜１０ｍＭを含むものが好ましい。ここで、前記無血清ケラチノサイト用培地は商業的に入手可能であり、これに限定されるものではないが、デファインド・ケラチノサイト（Defined keratinocytes）無血清培地(Gibco cat＃ 10785-012)が使用されることができる。
【００２７】
培地を交換してから約二日後（図１）に細胞が培養ディッシュに付着し始めれば、浮かんでいる組織及び細胞をさらに大きいフラスコに移す。最初に付着し始めた細胞にトリプシンで処理した後に継代し、約５〜１５日後にフラスコで約７０〜９０％コンフルエントに育てる。これから細胞は、２〜３日に一回ずつリン酸緩衝食塩水で２回洗浄した後、同じ培地に交換する。
【００２８】
その後、培養された頭皮細胞を回収して、その中のＣＤ３４陽性細胞を分離して毛嚢幹細胞を分離する。このとき、前記培養された頭皮細胞からＣＤ３４陽性細胞を分離する方法は、周知のＭＡＣＳ(Magnetic Cell sorting)を利用して行うことができる。ＭＡＣＳ機器は、例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．から商業的に入手可能である。
【００２９】
ＭＡＣＳを利用したＣＤ３４陽性細胞を分離する方法を模式的に図５に示す。
【００３０】
先ず、一旦回収された頭皮細胞を大まかに単一化しておき、ＭＡＣＳバッファー、ブロッキング試薬、及びマイクロビーズを順次に入れる。各試薬の量は、ＭＡＣＳバッファー：１５０〜１０００μｌ、ブロッキング試薬：５０〜５００μｌ、マイクロビーズ：５０〜５００μｌであり、培養時間は、３０分〜４時間である。このとき、ブロッキング試薬及びマイクロビーズを取り扱う全過程では蛍光灯を消すことにする。混合液の入ったチューブをアルミホイルで包み、４℃で３０分〜４時間培養する。その後、アルミホイルを外して、混合液の約１０倍体積のＭＡＣＳバッファーをチューブに追加してピペットでよく交ぜた後、１２００ｒｐｍ、５〜６分間遠心分離して上澄み液を取り除く。ＭＡＣＳバッファーを細胞の数に合わせて入れ、ピペットでペレットを懸濁する。このとき、ＭＡＣＳバッファーの量は５００μｌである。ＭＡＣＳバッファーと混合された細胞の入ったチューブは氷に入れておき、ＭＡＣＳ機器をセッティングし、ＭＡＣＳカラム及び磁石をセッティングする（図６）。セッティングの概略的な順序は次の通りである。‘ＣＤ＋’と‘ＣＤ−’とマークしたコニカル・チューブをそれぞれ１個ずつ用意する。黒色のベース（鋼鉄）を適当な場所に置き、緑色の磁石を適当な高さに付着する。カラムが汚染しないように注意してカラムのみを取り出して磁石の溝に挿入する。
【００３１】
用意したチューブのうち‘ＣＤ３４−’とマークしたチューブをカラムから落ちる細胞を受けるように位置させる。用意が終わったらＭＡＣＳバッファー１５０〜１０００μｌを先ずカラムに流す。ＭＡＣＳバッファーがほぼ流れ終わったとき、氷に入れて置いた細胞混合液５００μｌ（細胞２×１０８当り）をカラムに入れる。細胞混合液は、徐々にカラムに沿って流れ、カラムの下側に落ちる細胞はＣＤ３４−細胞である。ＣＤ３４陽性細胞は、ＭＡＣＳカラムの中間の黒い部分に残っている。カラムの収容能力程度の細胞が収容された混合液を流したら、最後にＭＡＣＳバッファー約５００μｌを入れて、カラム内に残留しているＣＤ３４−細胞を全て流す。ＭＡＣＳカラムを磁石から取り出して、カラムと共に入っていたスティックをカラムの上部に挿し込んでから押して、‘ＣＤ３４＋’とマークしたチューブに入れる。培地をカラムに注いでスティックで再び押し、カラムを通過して出る培地を受けて、その中に含まれたＣＤ３４陽性細胞を得る。
【００３２】
本発明の方法によって分離される毛嚢幹細胞の免疫表現型抗原はＣＤ３４陽性を示し、また、ＣＤ４４陽性、ＣＤ４５陽性、ＣＤ１３３陽性、ＣＤ２９陽性のうち何れか一つまたは複数の免疫学的特性を示す。
【００３３】
このように分離されたＣＤ３４陽性細胞である毛嚢幹細胞を頭皮組織に皮下注射で投与すれば、毛嚢細胞で分化が起こる。さらに、このように分化された毛嚢細胞は、髪の毛を作り続ける能力、すなわち発毛を誘導する能力を有する。本発明において‘発毛誘導’は、脱毛部分または無毛部分に毛嚢を形成して毛が生えるように誘導する能力を言う。したがって、前記分離された毛嚢幹細胞は、禿頭の治療用として使用されることができる。
【００３４】
したがって、本発明は、他の態様で、前記方法で分離されたＣＤ３４陽性毛嚢幹細胞を有効成分として含む発毛誘導用組成物を提供する。
【００３５】
このとき、前記組成物内に含まれる活性成分である前記毛嚢幹細胞の投与量はこれに限定されるものではないが、１×１０３以上、好ましくは、１×１０３〜１×１０９、さらに好ましくは、１×１０３〜１×１０１２細胞の量とする。投与方式は、皮下注射方式が好ましく、１回または数回に分けて投与することができる。しかし、実際の投与量は、患者の年齢、性別、体重及び患者の重症度などの多様な関連因子によって決されるべきであると理解されねばならず、したがって、前記投与量は、いかなる意味においても本発明の範囲を限定するものではない。また、本発明の発毛誘導用組成物は、前記分離された毛嚢幹細胞を担体、賦形剤及び希釈剤と共に混合して製造されることができる。例えば、前記毛嚢幹細胞は、培地または滅菌生理食塩水と共に混合されることができる。
【００３６】
また、このとき、前記毛嚢幹細胞が投与される頭皮組織は、本来摘出された対象者の頭皮組織であるか、または他の対象者の頭皮組織であることができる。好ましくは、本来摘出された対象者の頭皮組織である。また、前記頭皮組織は、哺乳類のものが好ましい。本発明に使用されうる哺乳類は、ヒト、鼠、豚、牛、馬、犬、猫などを含む。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されると解釈されないということは当業者には明らかである。
【００３８】
実施例１：毛嚢幹細胞の分離
（１）頭皮細胞の培養
外科毛髪移植手術を受けた患者から回収した皮下組織を含んだ後頭部の頭皮のうち、外科手術後の残余物である頭皮由来組織を取得した。取得した毛嚢を含んだ頭皮を１０体積％（０．１ｍｌ／ｍｌ）のウシ胎仔血清、ノルモシン（１００μｇ／ｍｌ）、ペニシリン１００ｕｎｉｔ、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ネオマイシン（０．２５μｇ／ｍｌ）の含まれたＤＭＥＭ培地に入れた。前記摘出された頭皮を滅菌されたフォーセップで取り出して、ペトリ皿上に乗せ、ブレードをスカルペルに挟んで頭皮組織を細く切った。切開後にはアキュマックス(accumax; Chemicon cat＃ SCR006)及びディスパーゼの含まれたＤＭＥＭ培地（０．１ｍｌ／ｍｌ（１０体積％）のウシ胎仔血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔ、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ネオマイシン（０．２５μｇ／ｍｌ）、ノルモシン（１００μｇ／ｍｌ）にアキュマックス(accumax; Chemicon cat＃ SCR006)２体積％（０．０２ｍｌ／ｍｌ）及びディスパーゼ０．４ｍｇ／ｍｌの含まれた培地）にペトリ皿にある切開された組織を入れてフラスコに移した。フラスコに入った組織を１３０ｍ／ｍｉｎ、３７℃で３０分間重力対流培養器で１次化学的分解作業を行った。
【００３９】
次に、化学的に分解された組織を遠心分離で回収して、リン酸緩衝食塩水で３回洗浄した。洗浄された組織は、コラゲナーゼの含まれた培地（１０体積％のウシ胎仔血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔ、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ネオマイシン（０．２５μｇ／ｍｌ）、ノルモシン（１００μｇ／ｍｌ）の含まれたＤＭＥＭ培地に２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼタイプＩＡを添加した培地）で１３０ｍ／ｍｉｎ、３７℃で３０分間重力対流培養器で２次化学的分解作業を行った。化学的分解された組織を遠心分離で回収して、再びリン酸緩衝食塩水で３回洗浄した。この過程を経て回収された組織を、Ｍ１９９／Ｆ１２の血清培地（Ｍ１９９とＦ１２を１：１の体積比で混合した後、インシュリン（０．６２μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（０．６２μｇ／ｍｌ）、ペニシリン１００ｕｎｉｔ、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ネオマイシン（０．２５μｇ／ｍｌ）、ｒＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ノルモシン（１００μｇ／ｍｌ）、０．１ｍｌ／ｍｌ（１０体積％）のウシ胎仔血清、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（１ｍＭ）を添加した培地）の入った２５フラスコで培養した。組織が培養ディッシュに付着し始めれば（約３日経過）、ウシ胎仔血清を含まないＭ１９９／Ｆ１２無血清培地（前記Ｍ１９９／Ｆ１２血清培地からウシ胎仔血清のみが除かれた培地）に交換した。
【００４０】
一週間経過後、ノルモシンを含まないデファインド・ケラチノサイト無血清培地（アスコルビン酸０．２ｍＭを添加したデファインド・ケラチノサイト無血清液状培地(Gibco cat＃ 10785-012)）に交換し、二日後に培養ディッシュに最初に付着し始めた細胞の形状を示す写真を図１に示した。図１の二つの写真は、同じフラスコの異なる部分を撮った写真である（×１００）。
【００４１】
培地を交換してから約二日後（図１）に細胞が培養ディッシュに付着し始めれば、浮かんでいる組織及び細胞を７５フラスコに移した。
【００４２】
最初に付着し始めた細胞をトリプシン処理後に継代して、約５日〜７日後にフラスコで約７０〜９０％コンフルエントに育てた。第一次継代後の細胞の形状を示す写真を図２に示した。図２の二つの写真は、同じフラスコの異なる部分を撮った写真である（×１００）。これから全てのフラスコの培地は、２日〜３日に一回ずつリン酸緩衝食塩水で２回洗浄した後、同じ培地に交換した。７５フラスコに移してから約７日後に、２５フラスコに付着した細胞をトリプシン処理後に７５フラスコで継代（１番細胞）し、最初に移した７５フラスコに付着していない細胞を再び移した（培養ディッシュに付いている細胞−２番細胞、浮かんでいる細胞−３番細胞）。１番細胞（図２）と２番細胞（図３）とのフラスコに細胞が約９０％コンフルエントに育ったとき、
すべての細胞を回収した。
【００４３】
最初に２５フラスコで培養するときに浮かんでいる細胞を７５フラスコに移した。その７５フラスコで付着し始めて、培養してから２週後に約９０％コンフルエントに育った。初めに培養ディッシュに付着せずに、移した後に培養ディッシュに付着した細胞の形状を示す写真を図３に示した。二つの写真は、同じフラスコの異なる部分を撮った写真である（×１００）。
【００４４】
（２）毛嚢細胞の成長曲線
初期培養後、３日が経過した細胞にトリプシンで処理した後、その細胞を回収して４個の６−ウェルプレートに、各ウェル当り１×１０４個の細胞を接種した。その後、この細胞を培養してから１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日後にそれぞれ３個のウェルの細胞数をそれぞれ計算した後、各日付別に平均及び標準偏差値を求め、その成長曲線を図４に示した。
【００４５】
（３）頭皮細胞から幹細胞の分離
市販のＭＡＣＳ(Magnetic Cell Sorting) (Miltenyi Biotec Inc.)を利用してＣＤ３４陽性細胞を分離した。ＭＡＣＳを利用したＣＤ３４陽性細胞を分離する方法を図５に示した。
【００４６】
前述の方法で培養された頭皮細胞をトリプシンで回収して、その細胞を遠心分離（約１２００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）してペレットを残し、培地を取り除いた。適量（約１０ｍｌ）の培地を細胞の入ったチューブに入れて、ピペットでペレットを再浮遊させた。
【００４７】
再び遠心分離してペレットを残し、培地は取り除いた。ピペッティングする前に手でチューブをタッピングし、まず大まかに単一化しておき、ピペットでピペッティングすることが好ましい。ＭＡＣＳバッファー、ブロッキング試薬及びマイクロビーズを順次に入れた。各試薬の量は、ＭＡＣＳバッファー：１５０〜３００μｌ、ブロッキング試薬：５０〜１００μｌ、マイクロビーズ：５０〜１００μｌであり、培養時間は、３０分〜４時間にした。このとき、ブロッキング試薬及びマイクロビーズを取り扱う全過程では蛍光灯を消した。混合液の入ったチューブをアルミホイルで包み、４℃で３０分〜４時間培養した。その後、アルミホイルを外して混合液の約１０倍体積のＭＡＣＳバッファーをチューブに追加し、ピペットでよく交ぜた後、１２００ｒｐｍ、５〜６分間遠心分離して上澄み液を取り除いた。ＭＡＣＳバッファーを細胞の数に合わせて入れて、ピペットでペレットを懸濁した。このときのＭＡＣＳバッファーの量は５００μｌであった。ＭＡＣＳバッファーと混合された細胞の入ったチューブは氷に入れておき、カラム及びＭＡＣＳキットをセッティングした。三角形の緑色の磁石は、黒色のベースのいずれかの所に付けてもよく、適宜セッティングした。
【００４８】
図６にＭＡＣＳ機器を示す。ＣＤ３４のマイクロビーズで標識された細胞が用意されれば、ＭＡＣＳ機器をセッティング（図６の（Ａ））し、ＭＡＣＳカラム及び磁石（図６の（Ｂ））を適宜セッティングした。
【００４９】
セッティングの概略的な順序は次の通りである。‘ＣＤ＋’と‘ＣＤ−’とマークした５０ｍｌのチューブをそれぞれ１個ずつ用意する。黒色のベース（鋼鉄）を適当な所に置き、緑色の磁石を適当な高さに付着する。カラムを汚染させないように注意して、カラムのみを取り出して磁石の溝に挟む。
【００５０】
用意されたチューブのうち、‘ＣＤ３４−’とマークしたチューブを、カラムから落ちる細胞を受けるように位置させた。用意が終わったら、先ずＭＡＣＳバッファー２００〜５００μｌをカラムに流した。ＭＡＣＳバッファーがほぼ流れ終わったとき、氷に入れて置いた細胞混合液５００μｌ（細胞２×１０８当り）をカラムに入れる。細胞混合液は、徐々にカラムに沿って流れ、カラムの下側に落ちる細胞はＣＤ３４−細胞である。ＣＤ３４＋細胞は、ＭＡＣＳカラムの中間の黒色の部分に残っている。カラムの収容能力程度の細胞が収容された混合液を流したら、最後にＭＡＣＳバッファー約５００μｌを入れて、カラム内に残留しているＣＤ３４−細胞を全て流した。ＭＡＣＳカラムを磁石から取り出して、カラムと共に入っていたスティックをカラムの上部に挿し込んでから押して、‘ＣＤ３４＋’とマークしたチューブに入れた（まるで、注射器を使用するように）。培地（目的とする細胞に該当する培地）をカラムに約２００〜３００μｌ注いで、スティックで再び押し、カラムを通過して出る培地を‘ＣＤ３４＋’に受けた。培地１０ｍｌをＣＤ３４陽性細胞の入ったチューブに入れた。培地を入れるとき、チューブの壁に均一に培地をかけて、スティックでカラムを押すときに飛散した細胞を全て洗い落として回収するようにし、ＣＤ３４陽性細胞を得た。このとき、回収されたＣＤ３４陽性細胞の細胞数は約１×１０７〜２×１０７であり、この細胞を１５００ｒｐｍ、５〜６分間遠心分離して上澄み液を取り除いた。チューブに入っていたＣＤ３４陽性細胞は、滅菌生理食塩水１００μｌで再浮遊して５００μｌの注射器で移した。
【００５１】
一方、ＭＡＣＳを利用して、このように回収されたＣＤ３４陽性細胞の収率を次のような数式で計算した。
【００５２】
収率（％）＝        ＣＤ３４＋  細胞数        ×  １００
ＭＡＣＳ通過前の総細胞数
【００５３】
その結果を表１に示す。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
実施例２：毛嚢幹細胞の免疫学的特性
前記の幹細胞分離方法で獲得したＣＤ３４陽性細胞の免疫学的特性を調べるために、ＦＡＣＳ(fluorescence activated cell sorting)分析を実施し、その結果を図７に示した。本実施例で免疫表現型の解析対象とした抗原は、ＣＤ３４陽性（Ｂ）、ＣＤ４４陽性（Ｃ）、ＣＤ４５陽性（Ｄ）、ＣＤ１３３陽性（Ｅ）、ＣＤ２９陽性（Ｆ）から選択される何れか一つまたは複数の免疫学的特性を表した。前記実施例１の３）で同定した細胞を１×１０５個用意して、２％のＦＢＳを含むＰＢＳ溶液で洗浄し、各抗原に対する抗体と室温で反応させた。抗原の発現の有無は、フローサイトメトリー(Flow Cytometry)を利用して確認した。
【００５６】
その結果、図７に示すように、本発明のヒト由来毛嚢幹細胞は、間葉幹細胞の代表的な抗体であるＣＤ３４（Ｂ）に対しては９０％以上、ＣＤ４４（Ｃ）に対しては８０％以上、ＣＤ４５（Ｄ）に対しては６０％以上、ＣＤ１３３（Ｅ）に対しては７０％以上、ＣＤ２９（Ｆ）に対しては９０％以上の陽性反応を表した。対照群（Ａ）は、抗体と反応させていない場合である。
【００５７】
実施例３：毛嚢幹細胞を有効成分として含む組成物の投与後の影響
（１）毛嚢幹細胞の投与及びマウスの観察
１×１０５個のＣＤ３４陽性細胞を入れた注射器を氷に入れた後、ヌードマウスに皮下注射で投与する。細胞が投与されたマウスの状態と比較するために、対照群として細胞投与されない動物の写真を撮影した。試験に使用した動物は次の通りである。
【００５８】
（１）動物種（系統）：BALB/cAnNCrjBgi−nuマウス
（２）性別及び入手時の週齢：めす、６週齢
（３）供給源：株式会社オリエント
（４）入手動物数：めす２５匹
（５）検疫及び順化期間：実験室に順化させる期間を約１週間とし、その期間中に一般の症状を観察して健康な動物のみを試験に提供した。
（６）使用動物数：めす２０匹
（７）試験時の週齢：めす７週齢
（８）群分離法：無作為法
（９）飼育条件
−環境条件：本試験は、温度２２±３℃、相対湿度５０±１０％、換気回数１０〜１２回／ｈｒ、照明時間１２時間（０７：００〜１９：００）、照度１５０〜２００ｌｕｘに設定されたソウル大学校の獣医科大学実験室（８５洞７２７号）内のＨＥＰＡフィルターの装着されたＭＩ  ｒａｃｋで実施した。
−飼育箱、飼育密度及び飼育箱の識別
順化期間及び試験期間中にポリカーボネートＭＩケージ（２６×４２×１８ｃｍ、ミョンジン機械製）で５匹を飼育箱で飼育した。飼育箱には、試験番号、動物番号及び投与量を書き込んだタグ（tag）を付けた。
−飼料及び飮水の給与
順化期間に飼料は、高圧蒸気滅菌された実験動物用固形飼料（（株）ピュリナ）を自由摂取させ、飮水は、高圧蒸気滅菌された上水道を自由摂取させた。
【００５９】
【表２】
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【００６０】
前記のように無作為に群分離したヌードマウスに本発明の毛嚢幹細胞を投与した後、１５日間実験動物の皮膚を観察したところ、毛が生えた日付けを区分して記録し、試験開始前及び終了時点で試験動物の体重を測定し、投与日を０日にしたとき、試験が終わった１６日目に剖検した。試験中に測定された試験動物の体重などに関する資料の統計学的分析のために、ワンウェイＡＮＯＶＡを実施して群間有意性を検定し、有意性が認められれば、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを行って、対照群−試験群間の統計学的有意性を検定した（ｐ＜０．０５）。
【００６１】
前記実験の結果、毛嚢幹細胞の非投与対照群（以下、対照群）と毛嚢幹細胞の投与群（以下、投与群）とのマウス写真を図８に示した。対照群のヌードマウスには毛がなかったが（Ａ）、投与群のヌードマウス（Ｂ）では、投与群とも９日から１２日目になる日に、頭部に集中的な毛が確認された。
【００６２】
（２）マウス頭皮切片のＨＥ染色
各群のヌードマウスの頭皮部分を切開して、その切片を１０％のホルマリン溶液に固定させた後、パラフィン包埋して０．２ｕｍに切片化した後、スライド上でヘマトキシリン（hematoxylin）及びエオシン（eosin）の染色法を利用して組織標本を作って比較した。
【００６３】
対照群及び実験群マウスの頭皮組織のＨＥ染色結果を図９に示した。図９から分かるように、対照群ヌードマウス（Ａ）には毛根がなかったが、投与群（Ｂ）では、頭皮組織から毛が生えてくる毛根を確認することができた。
【００６４】
（３）マウス頭皮切片のin situハイブリダイゼーション
前記ＨＥ染色法と同様に、各群のヌードマウスの頭皮部分を切開して、４％のリン酸パラホルムアルデヒド溶液に１．５％のスクロース溶液を混合した固定液で各個体の頭皮組織を固定した。３０％のリン酸スクロース溶液に頭皮組織が沈むまで４℃で放置した後、各組織をパラフィン包埋して、組織切片器を利用して５μｍの厚さに頭皮切片を製作した後、予め用意したプレハイダイゼーション溶液（５０％のフォルムアミド、4X SSC, 50mM DDT, 4X Denhart’s soln, ‘X TED, 100μｇ/ml denatured salmon sperm DNA, 250μｇ/ml yeast RNA)で４２℃で１時間反応させた。ＤＩＧラベルされたＤＮＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）を入れ、プレハイダイゼーション溶液を２４時間反応させて、ＤＩＧラベルされたヒト特異ＤＮＡプローブをヌードマウスの頭皮細胞ｍＲＮＡに結合させた。大腿部の組織を２Ｘ、１Ｘ、０．５ＸＳＳＣ溶液にそれぞれ１０分間２回ずつ洗浄した後、スライドガラスに固定させて室温で２時間乾燥させた。
【００６５】
前記実験の結果、図１０に示すように、対照群（Ｃ、Ｄ）では、ヒト特異プローブによって標識されていないが、投与群の個体では、外部毛根鞘の周り（Ａ）と毛嚢の周り（Ｂ）とで標識されていることを確認することができた。
【００６６】
本発明者らは、マウスの毛嚢の外部毛根鞘の上部(in the upper regions of the outer root sheath of the hair follicle)、すなわち、突出部分(bulge region)と呼ばれる所でＣＤ３４細胞表面タンパク質を発現する幹細胞が存在するという研究結果(Trempus C.S. et al., J. Invest Dermatol. 120(4):501, 2003)に基づいて、ヒト生体から直接的に頭皮組織を抽出して、ＣＤ３４細胞表面タンパク質を発現する毛嚢幹細胞を同定した。さらに、この毛嚢幹細胞の生体内(in vivo)の効果を調べるために、この細胞をマウスに皮下注射で投与し、投与してから１０日後にマウスの頭部で毛が生えることが確認された。また、毛が生える組織をＨＥ染色法を利用して対照群の組織との差異を確認することができた。
【００６７】
毛嚢幹細胞に関する研究が多く行われているが、いまだに標準化された細胞培養法及び幹細胞の分離法がない。本発明は、毛嚢含有頭皮由来の組織での頭皮細胞の培養法と、その細胞から毛嚢幹細胞を同定する方法とを提示し、その培養法によると、毛嚢細胞の増殖及び毛嚢細胞から毛嚢幹細胞の収率が約２０〜５０％になるという点で、従来の技術に比べてさらに効率的な方法であり、更にマウスでの毛嚢幹細胞の発毛効果を確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
以上、前述のように、本発明によって得られた毛嚢由来幹細胞は、成人の自己性成体幹細胞に分類され、自己複製能及び成体の毛嚢細胞に分化する能力を有し、かつ発毛能力を有し、脱毛の新規な細胞治療剤として利用することができる。
【００６９】
また、本発明は、従来の技術に比べて収率に優れた毛嚢細胞の培養及び毛嚢幹細胞の同定法を提供する。
【００７０】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業者にとっては、このような具体的記述は単に好ましい実施様態であり、これによって本発明の範囲が限定されないという点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、特許請求の範囲とそれらの等価物によって定義される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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