(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遠心機に装着された凹部を備えたアダプターの前記凹部内に収容され
て、内部に収容した分散液に遠心処理が施される遠心用袋状容器を用い
た遺伝子導入方法であって、
前記アダプターの凹部に収容可能に形成された凹部と該凹部の開口面
周縁に形成されたフランジ状部とを有する第一の容器壁と、周縁部が前
記第一の容器壁のフランジ状部と互いにシールされて、前記凹部と協働
して分散液の収納空間を構成している柔軟性を有する第二の容器壁とに
より構成された本体と、
前記収納空間に連通するように前記本体に装着されたポートと、を有
し、
前記第一の容器壁の凹部の底面にはベクターを保持しうる物質がコー
トされており、
遠心時に前記第一の容器壁の凹部が前記アダプターの凹部に収容され
て前記第一の容器壁のフランジ部が前記アダプターの凹部の開口面周縁
に位置するよう構成されるとともに、前記第一の容器壁の凹部の底面に
対して垂直な遠心力がかかるように構成された遠心用袋状容器を準備す
る工程と、
ベクターが分散質として分散された分散液を前記収納空間内に収容す
る第一の工程と、
前記遠心用袋状容器の前記凹部の底面に対して垂直な遠心力がかかる
ように前記遠心用袋状容器を、前記アダプターを介して遠心機にセット
する第二の工程と、
前記分散液に遠心力を付加する第三の工程と、
前記第三の工程において付加された遠心力によって、前記ベクターが
前記第一の容器壁の凹部の底面にコートされたベクターを保持しうる物
質に付着又は固定された後、前記ベクターと接触させるように標的細胞
を前記収納空間内に収容する第四の工程と、
を含んでいることを特徴とする遺伝子導入方法。
【請求項２】
遠心機に装着された凹部を備えたアダプターの前記凹部内に収容され
て、内部に収容した分散液に遠心処理が施される遠心用袋状容器を用い
た遺伝子導入方法であって、
前記アダプターの凹部に収容可能に形成された凹部と該凹部の開口面
周縁に形成されたフランジ状部とを有する第一の容器壁と、周縁部が前
記第一の容器壁のフランジ状部と互いにシールされて、前記凹部と協働
して分散液の収納空間を構成している柔軟性を有する第二の容器壁とに
より構成された本体と、
前記収納空間に連通するように前記本体に装着されたポートと、を有
し、
前記第一の容器壁の凹部の底面にはベクターを保持しうる物質がコー
トされており、
遠心時に前記第一の容器壁の凹部が前記アダプターの凹部に収容され
て前記第一の容器壁のフランジ部が前記アダプターの凹部の開口面周縁
に位置するよう構成されるとともに、前記第一の容器壁の凹部の底面に
対して垂直な遠心力がかかるように構成された遠心用袋状容器を準備す
る工程と、
ベクター及び標的細胞が分散質として分散された分散液を前記収納空
間内に収容する第一の工程と、
前記遠心用袋状容器の前記凹部の底面に対して垂直な遠心力がかかる
ように前記遠心用袋状容器を、前記アダプターを介して遠心機にセット
する第二の工程と、
前記分散液に遠心力を付加する第三の工程と、
を含んでいることを特徴とする遺伝子導入方法。
【請求項３】
前記第一の容器壁の凹部の底面に、ベクターおよび／または標的細胞
を保持しうる物質がコートされていることを特徴とする、請求項２に記
載の遺伝子導入方法。
【請求項４】
前記第一の容器壁の凹部の底面が全域に亘って単一平面として形成さ
れ、フランジ状部から凹部の底面間での深さが、凹部の底面の面積の平
方根の５０％以下であることを特徴とする、請求項１ないし請求項３の
何れか一項に記載の遺伝子導入方法。
【請求項５】
前記第二の容器壁が、前記第一の容器壁の前記凹部内に収納可能な凸
部を有することを特徴とする、請求項１ないし請求項４の何れか一項に
記載の遺伝子導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遠心分離機に装着された凹部を備えたアダプターの前記凹
部内に収容されて、内部に収容した分散液に遠心処理が施される袋状容
器であって、遠心時に破袋または破損しにくい前記遠心用袋状容器を使
用した遺伝子導入方法に関する。さらに詳しくは、遠心分離機のアダプ
ターの床面と平行に袋状容器の容器壁面を配置して、容器壁面に垂直な
遠心力がかかるように遠心する時に破袋または破損しにくい遠心用袋状
容器を使用した遺伝子導入方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、液状の医薬品または溶解液を、移送、混合、分離するため
に、袋状容器が使用されている。例えば、点滴用容器として、患者に点
滴するための薬液を収容した袋状容器である、いわゆる、ソフトバッグ
が用いられている。また、少なくとも一つの隔壁を有する一つの袋状容
器の中に２種類以上の薬液を隔離して封入し、使用直前に隔壁を破壊し
て当該薬液を混合してから患者に点滴できるようにした袋状容器である、
いわゆる、ダブルバッグが用いられている。さらに、採取した血液を成
分ごとに複数の容器に分離して収容させて、別の症例の患者に当該成分
を投与することができるようにした複数の袋状容器からなる血液バッグ
も用いられてきている。
【０００３】
その他にも、多岐に渡って、この種の袋状容器は液状の医薬品または
溶解液を取り扱う上で採用されている。
その理由は、一般に、袋状の容器は、内容液の量によって内容積が変
えられるので、内容液を充填したり、排出したりする時に、容器内の空
気を排出したり、容器内に空気を供給したりして、内溶液の充填及び排
出を促進させる必要があるが、上述したような容器にあっては、付属の
ポートを介して、または、そのポートに連結されたチューブ等を介して、
内容液を充填・排出することができるという特徴を持っているからであ
る。この特徴は、前記の操作を内溶液が外気に触れずに実行すること、
すなわち、外気からの微生物等により内容液が汚染されることなく前記
操作を実施することを可能にする、所謂、クローズドシステム化を容易
にするので、この種の容器は、無菌的に、採取、製造された液状の医薬
品を取り扱う容器として適している。
【０００４】
このような理由のもとに、無菌性を要求される容器には、袋状容器を
採用することが好ましい場合が多く、無菌性が要求され、かつ、遠心操
作を必要とする容器についても袋状容器が採用されている。前記血液バ
ッグはその一例である。
すなわち、分散媒である血漿に、分散質である赤血球、白血球、血小
板等が分散した分散液である血液が充填された袋状容器である血液バッ
グは、容器ごと遠心機にかけられて、赤血球、白血球、血小板、血漿等
の成分別に分離され、別々の袋状容器に移送・充填され、成分別に複数
の患者に投与される。
【０００５】
血液バッグは、分散液の各成分を分離回収することを目的とするので、
床面積の狭い縦長の遠心カップに、分散液である血液の入った袋状容器
を、ポート側を上に、ボトム側を下に向けて設置し、遠心される。
このような場合には、遠心力により分散液の表面に形成される液面よ
り下に位置する容器壁は、遠心アダプターの内面に密着し、それ以上、
外側に膨らむことがなく、結果として、容器壁に、壁面に沿った張力が
発生することが少なく、遠心による破袋、ピンホール等は容易には発生
しない。
【０００６】
ところが、無菌性が要求され、かつ、遠心操作を必要とする容器であ
って、遠心する目的が、単に分散液の各成分を分離することだけではな
い場合、例えば、標的細胞に遺伝子を導入する場合には、遠心により、
分散質である標的細胞またはベクターが容器床面に均一に分散するよう
に沈降させて、標的細胞とベクターとが相互に接触し易い環境を提供す
ることによって、遺伝子導入効率を向上させることが行なわれているが
（例えば、特許文献１及び２）、床面積が狭いと、遠心時または接触時
に標的細胞同士が重なってしまい標的細胞とベクターとの接触効率が悪
くなり、遺伝子導入効率が落ちてしまうので、標的細胞が床面に重なら
ずに均一かつ散在した状態で存在できるように床面積を広く取る必要が
ある。
【０００７】
また、この操作を、標的細胞及びベクターの両方に親和性の高いタン
パク質をコーティングした床面上で行うことにより、標的細胞とベクタ
ーとの接触効率を向上させ、さらに、遺伝子導入効率を向上させること
ができる。この場合においても、標的細胞が重なってしまうと、タンパ
ク質がコーティングされた床面との接触が出来ない細胞が現われ、遺伝
子導入効率が下がることになるので、やはり、標的細胞が床面に重なら
ずに分散するように床面積を広く取る必要がある。
【０００８】
袋状容器でこのような遠心時の条件を満たすためには、袋状容器を、
広い床面積を有する遠心機のアダプター上に寝かせて、すなわち、同ア
ダプターの床面と平行に袋状容器の容器壁面を配置して、容器壁面に垂
直な遠心力がかかるようにして遠心する操作が行なわれる。
当然のことながら、袋状容器の容器壁面に標的細胞及びベクターの両
方に親和性の高いタンパク質をコーティングした場合には、タンパク質
がコーティングされた袋状容器の容器壁面が、遠心時の床面になるよう
に配置することになる。
【０００９】
このような遠心時には、袋状容器内の内容液、すなわち、培地にかか
る遠心力は、圧力に変換されて、一方では、袋状容器の容器壁を床面に
垂直な方向に膨らませようとする力を発生するものの、アダプターの床
面に遮られて床面に垂直な方向に袋状容器の容器壁を膨らませることは
できないが、もう一方では、床面と平行方向に膨らませようとする力も
発生させ、袋状容器の両サイドが圧力負荷に晒されるようになる。通常、
この部分は、袋状容器のシール部にあたり、シール剥離またはシ―ル際
の破損により、破袋の原因になり易い。特に、異材質より成る容器壁同
士をシールした場合のように弱いシール強度しか得られないような場合
には、さらに、破袋し易くなる。
【００１０】
特に、遠心操作時または遠心操作後、増殖又は活性化させる必要のあ
る細胞を収容している袋状容器においては、床面の容器壁を形成する素
材と天井の容器壁を形成する素材を変えることによって、より培養性能
を向上させることができる場合があり、この場合、異なる素材をシール
することになるため、必ずしも、シール強度の強いシールが得られると
は限らない。
例えば、床面の容器壁を構成する素材として細胞に対して親和性のあ
る素材を選定し、天井の容器壁を構成する素材としてガス透過性のある
素材を採用するような場合がこれに当る。
【特許文献１】米国特許第５，６４８，２５１号
【特許文献２】国際公開公報第ＷＯ００／０１８３６号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明が解決しようとする課題は、内容液を充填排出するのに、微生
物汚染を起こさないクローズドシステム化が可能で、取扱いが容易な遠
心用袋状容器を使用した遺伝子導入方法を提供することにある。
【００１２】
また、遠心時に遠心力と垂直になるように形成された遠心機のアダプ
ターの床面と平行に容器壁面を配置して、容器壁面に垂直な遠心力がか
かるように遠心しても、容易には、破袋しない遠心用袋状容器を使用し
た遺伝子導入方法を提供することにある。
【００１３】
また、遠心時の遠心力により、分散液中の分散質が沈降しても、沈降
した分散質同士が容易には重ならない程度に広い床面積を有する遠心用
袋状容器を使用した遺伝子導入方法を提供することにある。
【００１４】
また、遠心前の分散液、分散質、分散媒の状態、および、遠心後の沈
降した分散質を倒立顕微鏡で容易に観察できる遠心用袋状容器を使用し
た遺伝子導入方法を提供することにある。
【００１５】
また、遠心力を利用して、標的細胞の増殖性及び活性を維持したまま
標的細胞に遺伝子を効率よく導入することができる遠心用袋状容器を使
用した遺伝子導入方法を提供することにある。
【００１６】
また、遠心力を利用した遺伝子導入操作後、他の容器に移し替えるこ
となく、そのまま培養可能な増殖効率の良い、遠心用袋状容器を使用し
た遺伝子導入方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
請求項１に記載の発明の遠心用袋状容器を使用する遺伝子導入方法は、
遠心機に装着された凹部を備えたアダプターの前記凹部内に収容されて、
内部に収容した分散液に遠心処理が施される遠心用袋状容器を使用する
ものであって、
前記アダプターの凹部に収容可能に形成された凹部と該凹部の開口面
周縁に形成されたフランジ状部とを有する第一の容器壁と、周縁部が前
記第一の容器壁のフランジ状部と互いにシールされて、前記凹部と協働
して前記分散液の収納空間を構成している柔軟性を有する第二の容器壁
とにより構成された本体と、
前記収納空間に連通するように前記本体に装着されたポートと、を有
し、
遠心時に前記第一の容器壁の凹部が前記アダプターの凹部に収容され
て前記第一の容器壁のフランジ部が前記アダプターの凹部の開口面周縁
に位置するよう構成されるとともに、前記第一の容器壁の凹部の底面に
対して垂直な遠心力がかかるように構成された遠心用袋状容器を準備す
る工程と、
ベクターが分散質として分散された分散液を前記収納空間内に収容す
る第一の工程と、
前記遠心用袋状容器の前記凹部の底面に対して垂直な遠心力がかかる
ように前記遠心用袋状容器を、前記アダプターを介して遠心機にセット
する第二の工程と、
前記分散液に遠心力を付加する第三の工程と、
前記第三の工程において付加された遠心力によって、前記ベクターが
前記第一の容器壁の凹部の底面にコートされたベクターを保持しうる物
質に付着又は固定された後、前記ベクターと接触させるように標的細胞
を前記収納空間内に収容する第四の工程と、
を含んでいることを特徴とする。
【００１８】
すなわち、請求項１に記載の発明で使用する遠心用袋状容器は、第一
の容器壁の凹部がアダプターの凹部に収容されて第一の容器壁のフラン
ジ部が前記アダプターの凹部の開口面周縁に位置するよう構成されてい
るので、遠心時に遠心力が垂直にかかる第一の容器壁の凹部の底面の面
積を広くすることを可能にし、遠心時に沈降する分散液中の分散質が、
容器内の特定の場所に集中しないように、すなわち、広く容器の底面に
分散して沈降するようにすると共に、遠心時に分散液中に生じる圧力に
よって、強度の弱いシール際に、過大な圧力が付加されることがないよ
うにしたものである。
【００１９】
ここで、前記遠心時の過大な圧力がシール際にかからない理由を簡単
に説明する。
遠心時に遠心力は前記第一の容器壁の凹部の底面に垂直方向にかかる
ので、凹部内の分散液は、前記フランジ状部を越えて流れ出ない。すな
わち、凹部内に収容された分散液は、フランジ状部に設けられたシール
際に、これを破壊するような影響を与えることがない。
【００２０】
シール際にこれを破壊するような影響を与える圧力は、分散液が凹部
の容量を越えることにより生じるが、この圧力は、遠心時の液面からシ
ール際までの深さに比例するので、シール際が遠心時の液面よりも低位
に位置し、さらには底面と同じ深さに位置する可能性の高い一般の袋状
容器に比べて、本発明で使用する袋状容器では、シール際にかかる圧力
を著しく低減させることができる。
なお、シール際に、影響を与えないようにするには、分散液の量を凹
部の容量より少ない容量にすればよい。なお、遠心時に分散液の表面に
形成される曲面により、分散液がシール際まで溢れ出る場合には、分散
液がシール際まで流れ出さないようにするために、フランジ状部を覆う
押さえ板を使用することができる。押さえ板はプラスチック製のものが
好ましい。
【００２１】
ここで、第一の容器壁を構成する材料としては、樹脂が考えられるが、
その樹脂は硬質であっても、軟質であってもよく、一般の樹脂を使用す
ることができる。例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、
シクロオレフィン系樹脂、スチレン系樹脂、ポリブタジエン系樹脂、及
びそれらのポリマー構成を含む共重合樹脂または混合物の中から選定さ
れる。また、第一の容器壁を、上記樹脂を複合した複合シートで形成し
ても良い。ここでいう複合シートとは、樹脂混合物からなるシート、ラ
ミネートフィルム、樹脂コーティングされた樹脂フィルム、樹脂印刷が
施された樹脂フィルム等複数の樹脂からなるシートを言う。
【００２２】
なお、シクロオレフィン樹脂は、人体または細胞に対して、悪影響を
与えにくい樹脂なので、前記第一の容器壁の内側面の少なくとも一部が
シクロオレフィン樹脂にて形成されていることが好ましい。
また、本発明に係る方法で使用する袋状容器が容器内に収容された分
散液の観察を必要とする用途に使用される場合には、特に、分散液を倒
立顕微鏡で観察する用途に使用される場合には、少なくとも前記凹部の
底面は透明であることが好ましい。
さらに、柔軟性を有する第二の容器壁を構成する材料としては、柔軟
性のある樹脂、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピン系樹脂、シ
クロオレフィン系樹脂、スチレン系樹脂、ポリブタジェン系樹脂、及び
それらのポリマー構成を含む共重合樹脂または混合物の中から、柔軟性、
ガス透過性等を考慮して選定される。また、第一の容器壁と同様に第二
の容器壁も、上記樹脂を複合した複合シートで形成しても良い。
【００２３】
また、ポートも樹脂を用いて形成することができ、その樹脂は、例え
ば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、シクロオレフィン系
樹脂、スチレン系樹脂、ポリブタジエン系樹脂、及びそれらのポリマー
構成を含む共重合樹脂または混合物の中から、第一の容器壁及び第二の
容器壁との接着性または密着性を考慮して選定される。
【００２４】
また、本発明に係る方法で使用する容器に収容される分散液が、細胞
培養または遺伝子導入等に関係する、生きている細胞を含んでいるよう
な場合には、前記第一及び第二の容器壁の少なくとも一方が、ガス透過
性を有していることが好ましい。
なお、前記第一の容器壁の凹部の深さは３ｍｍ以上であることが好ま
しい。３ｍｍ以下の場合、容器の大きさに比べて容量が少なすぎて効率
が著しく悪い等の問題があり好ましくない。
ここで、遠心力が底面に垂直にかかるとは、必ずしも、底面全体にわ
たって遠心力が垂直にかかることを意味するものではなく、少なくとも、
底面の主要部または中心部並びにその近傍の一部に遠心力が垂直にかか
ることを意味する。
【００２５】
なお、上述した第二の容器壁の柔軟性とは、第一の容器壁の凹部の容
積を確保しつつ、空気の出入り無しに分散液が容器内に流入または流出
できる程度に変形可能な容器壁の追従性を意味する。この追従性は、単
に、容器壁を形成する材料の物理的数値によって決まるのではなく、容
器形態、容器内に存在する空気量等によっても変わるので、一概に、容
器壁を形成する材料の物理的数値で制限することは適切ではない。
【００２６】
本発明の応用分野を考慮すれば、ここでいう柔軟性は、容器内に適切
な量の空気が存在する状況下で、分散液が落差程度の圧力、例えば、５
０ｃｍ水柱程度の圧力で、必要量の分散液が、ほぼ全て流入または流出
することを可能にする程度の柔軟性を有すれば良い。
なお、前記の性能は、一方の容器壁のみの性能に限られるものではな
く、対面するもう一方の容器壁の柔軟性からの影響も受けるので、一方
の容器壁の柔軟性を判断する上で、他方の柔軟性も考慮し、総合的に判
断されるべきである。
【００２７】
前記アダプターの凹部の内側寸法は、前記第一の容器壁の凹部の外側
寸法と略同等または若干大きめであるとよい。
【００２８】
すなわち、請求項１に記載の本発明に係る遺伝子導入方法は、上述し
た特徴及び性能を有する遠心用袋状容器に、ベクターが分散された分散
液を収容空間内に収容し、凹部の底面に対して垂直な遠心力がかかるよ
うに袋状容器を遠心機にセットして、分散液に遠心力を付加して遺伝子
導入効率を上げようとするものである。
【００２９】
また、遠隔操作により高い効率でベクターを容器底面にコートされた
ベクターを保持しうる物質に付着せしめることができるため、例えば分
散媒の排出によってベクターを含有する分散液に混入している遺伝子導
入を阻害する成分を除去することも可能となり、遺伝子導入効率の向上
に有用である。
【００３０】
請求項２に記載の遺伝子導入方法は、遠心機に装着された凹部を備え
たアダプターの前記凹部内に収容されて、内部に収容した分散液に遠心
処理が施される遠心用袋状容器を用いた遺伝子導入方法であって、
前記アダプターの凹部に収容可能に形成された凹部と該凹部の開口面
周縁に形成されたフランジ状部とを有する第一の容器壁と、周縁部が前
記第一の容器壁のフランジ状部と互いにシールされて、前記凹部と協働
して分散液の収納空間を構成している柔軟性を有する第二の容器壁とに
より構成された本体と、
前記収納空間に連通するように前記本体に装着されたポートと、を有
し、
前記第一の容器壁の凹部の底面にはベクターを保持しうる物質がコー
トされており、
遠心時に前記第一の容器壁の凹部が前記アダプターの凹部に収容され
て前記第一の容器壁のフランジ部が前記アダプターの凹部の開口面周縁
に位置するよう構成されるとともに、前記第一の容器壁の凹部の底面に
対して垂直な遠心力がかかるように構成された遠心用袋状容器を準備す
る工程と、
ベクター及び標的細胞が分散質として分散された分散液を前記収納空
間内に収容する第一の工程と、
前記遠心用袋状容器の前記凹部の底面に対して垂直な遠心力がかかる
ように前記遠心用袋状容器を、前記アダプターを介して遠心機にセット
する第二の工程と、
前記分散液に遠心力を付加する第三の工程と、
を含んでいることを特徴とする。
【００３１】
請求項３に記載の発明は、請求項２に記載する方法に加え、前記第一
の容器壁の凹部の底面に、ベクターおよび／または標的細胞を保持しう
る物質がコートされていることを特徴とする。
請求項３に記載の遺伝子導入方法によっては、前記第一の容器壁の凹
部の底面に、ベクターおよび／または標的細胞を接着し易い物質をコー
トすることにより、ベクターと標的細胞の接触の頻度を増加させ、効率
よく遺伝子導入を図るようにできる。
【００３２】
ここで、前記ベクターおよび／または標的細胞を保持しうる物質とし
ては、細胞外マトリックスを構成する成分、その誘導体、または、その
フラグメントが例示され、好適には、フィブロネクチン、ラミニン、コ
ラーゲン、ブロテオグリカン又はそれらのフラグメントである。さらに、
ポリリジンやＤＥＡＥ−デキストランのようなウィルス親和性物質、抗
ウィルス抗体、抗標的細胞抗体を使用することもできる。前記の核物質
はそれぞれ単独で使用してもよく、複数のものを混合して使用してもよ
い。
なお、前記フラグメントとして、フィブロネクチンフラグメントであ
るＣＨ−２９６（レトロネクチン（商品名）、タカラバイオ社製）を用
いれば、特にレトロウィルスベクターを使用した場合に効率のよい遺伝
子導入が可能となる。
【００３３】
ここで、遺伝子導入方法の工程の一部に、本発明の工程を採用するケー
スとして、以下のケースが例示される。
１．前記遠心用袋状容器に被収容物としてベクターを収容して遠心し、
次に、標的細胞を収容するケース。
２．前記遠心用袋状容器に被収容物としてベクターを収容して遠心し、
次に、標的細胞を収容し、もう一度、遠心するケース。
３．前記遠心用袋状容器に被収容物としてベクターと標的細胞を収容
し、遠心するケース。
４．前記遠心用袋状容器に被収容物として標的細胞を収容して遠心し、
次に、ベクターを収容するケース。
５．前記遠心用袋状容器に被収容物として標的細胞を収容して遠心し、
次に、ベクターを収容し、もう一度、遠心するケース。
何れのケースも、本発明の範囲に含まれる。
尚、上記１，２，４，５のケースでは、ベクター（ケース１，２）ま
たは標的細胞（ケース４，５）を収容して遠心した後に、被収容物のう
ちの分散媒のみを排出することにより、培地もしくは緩衝液を交換して
もよい。さらに、新たな培地もしくは緩衝液を添加し、ついで排出する
ことにより、ベクターまたは細胞を洗浄することも可能である。
また、遺伝子を導入する場合に、上述したように、ベクターまたは標
的細胞が重ならないで均一に凹部の底面に分散して沈降する方が、遺伝
子導入効果が向上するので、凹部の底面の面積は広いほうが好ましい。
【００３４】
請求項４に記載の発明は、請求項１ないし請求項３の何れか一項に記
載の方法に加え、前記第一の容器壁の凹部の底面が全域に亘って単一平
面として形成され、フランジ状部から凹部の底面間での深さが、凹部の
底面の面積の平方根の５０％以下であることを特徴とする。
請求項４に記載の容器を使用すると、前記凹部の底面が全域に亘って
単一平面として形成されているので、底面の単位面積当たりの分散液の
量が、底面全域に亘って均一になり、沈降物の分散も均一にすることが
できる。なお、フランジ状部は、凹部の底面と平行な面を有している方
が、凹部の容量に対して、より多くの充填容量が確保できるので好まし
い。
【００３５】
なお、ここでいう底面の全域の中には、前記凹部の隅に設けられたア
ール部は含まれない。
また、ここでいう平面には、曲率半径が無限大の面だけでなく、それ
と実質的に同等の効果をもたらす曲率半径を有する平らな面も含まれる
が、さらに、それに加え、遠心時における分散液の液面と同等の曲率を
持つ面までも含まれる。
なお、この平面は、サンド処理、エンボス処理等が施されていても構
わない。
【００３６】
請求項５に記載の発明は、請求項１ないし４の何れか一項に記載の方
法に加え、前記第二の容器壁が、前記第一の容器壁の前記凹部内に収納
可能な凸部を有することを特徴とする。
請求項５に記載の方法によると、前記第二の容器壁に前記第一の容器
壁の前記凹部内に収容可能な凸部を設けることによって、柔軟性のある
前記第二の容器壁は、分散液の充填時及び排出時に、凸部が大きく変形
することが可能なので、分散液の収容及び排出をより確実に、また、容
易に行うことができる。
【００３７】
なお、一般に、袋状容器であっても、例えば、輸液バッグのような場
合、一般に、被収容物である輸液の収納空間の最小容積が０ｍｌより大
きい。そのため、輸液だけをバッグ内に収容したのでは輸液を完全に排
出させることができないので、通常、輸液と一緒に若干の空気を封入す
る。具体的には充填される輸液の量の１０％から１５％の空気を一緒に
封入することによって、排出性を維持している。
本発明で使用する遠心用袋状容器においても、被収容物である分散液
を収納する空間の最小容積は、前記凹部の容積の１５％以内であること
が好ましい。
なお、ここでいう最小容積は、前記収納空間に液体を満たし、これを
落差のみの力で排出する時に、前記収納空間に残留する液体が占める空
間の容積である。
【発明の効果】
【００３８】
以上のとおり、本発明によれば、分散液を充填排出するのに、微生物
汚染を起こさないクローズドシステム化が可能で、取り扱いが容易な遠
心用袋状容器を使用した遺伝子導入方法を提供することができる。
また、凹部の底面に対して垂直な遠心力がかかるように遠心機にセッ
トしても、容易には、破袋しない遠心用袋状容器を使用した遺伝子導入
方法を提供することができる。
【００３９】
また、遠心時の遠心力により、分散液中の分散質が沈降しても、沈降
した分散質同士が容易には重ならない程度に広い床面積を有する遠心用
袋状容器を使用した遺伝子導入方法を提供することができる。
【００４０】
また、遠心前の分散液、分散質、分散媒の状態、および、遠心後の沈
降した分散質を倒立顕微鏡で容易に観察できる遠心用袋状容器を使用し
た遺伝子導入方法を提供することができる。
【００４１】
また、遠心力を利用して、標的細胞の増殖性及び活性を維持したまま
標的細胞に遺伝子を効率よく導入することができる遠心用袋状容器を使
用した遺伝子導入方法を提供することができる。
【００４２】
また、遠心力を利用した遺伝子導入操作後、他の容器に移し替えるこ
となく、そのまま培養可能な増殖効率の良い、遠心用袋状容器を使用し
た遺伝子導入方法を提供することができる。
尚、本発明に係る方法で使用する遠心用袋状容器は、上述したように
遠心する場合に特に大きな効果が期待できるが、遠心する場合に限らず、
単に操作性のよい閉鎖系の培養容器としても使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
本発明の実施の形態を実施例に基づき図面を参照しながら説明する。
［実施例１］
図１及び図２に示すが如く、本実施例の遠心用袋状容器１は、周縁が
周縁シール２によりシール、密封された対面する二つの容器壁、すなわ
ち、第一の容器壁３及び第二の容器壁４と、後述する収納空間６’内に
内容液を充填または同内容液を収納空間６’から排出するために用いら
れる略チューブ状のポート５とからなる容器であって、第一の容器壁３
が、凹部６と、凹部６の周縁に形成されたフランジ状部７を有し、第二
の容器壁４が柔軟性を有する素材により形成されている。上述したよう
に第一の容器壁３と第二の容器壁４とを周縁シール２によりシールする
ことにより、第一の容器壁３の凹部６と第二の容器壁４とにより収納空
間６’が形成されている。
【００４４】
さらに、ポート５の外側端には、本遠心用袋状容器１を密封するため
にキャップ８が嵌着されており、ポート５が設けられた容器１の周縁シ
ール部の部分と反対側の周縁シール部の部分には、内容液を排出する時
に本実施例の遠心用袋状容器１を吊るして内容液を排出するのに資する
懸垂口９が設けられている。
ここで、第一の容器壁３は、多層押出し成形法により成形した厚さが
４０μｍのシクロオレフィン樹脂層（ゼオネックス（商品名）、日本ゼ
オン株式会社製）と厚さが１７０μｍの低密度ポリエチレン樹脂層とか
らなる２層構造のシートを用いて、凹部６の内側、すなわち、容器の内
側の面にシクロオレフィン樹脂層が位置するように、真空成形で縦１０
０ｍｍ、横６０ｍｍ、深さ９ｍｍの凹部６を形成することにより作製し
た。
【００４５】
第二の容器壁４は、エチレン酢酸ビニル共重合体（ウルトラセン（商
品名）、東ソー株式会社製）を用いて、インフレーション成形により厚
さ１１０μｍのシートとして形成した。
次に、第一の容器壁３と第二の容器壁４とを重ね合わせ、その間にポ
ート５の内側端部を挿入してから、それら三者を熱シールすることによ
り第一の容器壁３の周縁部と第二の容器壁４の周縁部とポート５の内側
端部とを一体にシールし、不要な部分をトリミングすることによって本
実施例で使用する遠心用袋状容器１を形成した。
なお、ポート５の溶着は、周縁シールをする前または周縁シールした
後に行うこともできる。
本実施例の遠心用袋状容器１は、下記の評価方法１ないし３により評
価し、以下の結果を得た。
１．空気の出入りなしに充填、排出ができた。
２．繰り返しの使用によっても容器の破損は認められなかった。
３．Ｋ５６２細胞は均一に容器の底面に沈降していることが確認され
た。
【００４６】
評価方法
１．容器の柔軟性の評価
実施例の遠心用袋状容器１に、５０ｍｌの水を充填し、排出し、空気
の出入りなしに充填、排出が可能かどうか確認した。
なお、容器の形態に合わせて適宜、第二の容器壁４を凹ませて、予め、
本実施例で使用する遠心用袋状容器１内に残存する空気量を減らしたり、
本実施例の遠心用袋状容器１内に一定量の空気を注入してから上記操作
を行なった。
【００４７】
２．シール際の破損性の評価
この評価は、容器１の凹部６の外側寸法より若干大きめの内側寸法を
有する凹部を備えたアダプターが装着された遠心機を用いて実施した。
より詳述すると、本実施例の遠心用袋状容器１に、３０ｍｌの水を充填
後、図２に示したように、容器１の凹部６を遠心機のアダプターＸの凹
部Ｘ’内に嵌め込むことにより容器１をアダプターＸにセットして、１，
０００ｇで２時間遠心することにより、遠心用袋状容器１および収容物
に遠心力を負荷して、容器の破損状態を観察した。次に、同容器に５ｍ
ｌの水を加えて液量を３５ｍｌとし、１，０００ｇで２時間遠心するこ
とにより、遠心用袋状容器１および内容液に遠心力を負荷して、容器の
破損状態を観察した。次に、同容器に５ｍｌの水をさらに加えて液量を
４０ｍｌとし、１，０００ｇで２時間遠心することにより、遠心用袋状
容器１および内容液に遠心力を負荷して、容器の破損状態を観察した。
次に、同容器を２，０００ｇで２時間遠心することにより遠心用袋状容
器１および内容液に遠心力を負荷して、容器の破損状態を観察した。
【００４８】
３．沈降する分散質の分散性の評価
実施例の遠心用袋状容器１に内容液としてＫ５６２細胞（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ−２４３）を１０％ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地に１
×１０５／ｍｌになるように分散した分散液を４０ｍｌ充填し、この容器
をアダプターＸの凹部Ｘ’内にセットして、１，０００ｇで１５分間遠
心して、遠心用袋状容器１および内容液に遠心力を負荷した。
遠心終了後、回転操作、振動等を極力与えないように遠心機から取り
出し、倒立顕微鏡で、容器の底面に沈降した細胞の分散質の分散状態を
無作為に１０視野について観察した。
【００４９】
次に、本実施例の遠心用袋状容器１を使用して、以下の手順により標
的細胞に遺伝子導入操作を実施すると共に、遺伝子導入率の測定を行な
った。
１．レトロネクチンコート容器の作製
フィブロネクチンフラグメントであるＣＨ−２９６（レトロネクチン
（商品名）、タカラバイオ社製）を、ＰＢＳで２０μｇ／ｍｌになるよ
うに希釈して、実施例の遠心用袋状容器１に１０ｍｌ注入し、室温で２
時間静置して同ＣＨ−２９６で容器１の内面をコーティングした後、３
０ｍｌのＰＢＳで３回洗浄し、その溶液を除いてレトロネクチンコート
容器とした。
【００５０】
２．レトロウィルスベクターの調整
レトロウィルスベクタープラスミドｐＭＳ−ｅＧＦＰを、以下の手順
で作製した。
まず、ｐＭＴベクター［ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ
ｙ）、第１１巻、９４〜９９頁（２００４）］の３’ＬＴＲ領域につい
て、クロンテック社のｐＭＳＣＶｎｅｏのＭＳＣＶ  ＬＴＲと置換して、
ＭＳＣＶ  ＬＴＲを有するプラスミドベクターｐＭＳを作製した。緑色
蛍光タンパク遺伝子ｅＧＦＰの遺伝子断片をｐＭＳのマルチクローニン
グサイトに挿入し、ｅＧＦＰ発現組換えレトロウィルスベクターｐＭＳ
−ｅＧＦＰを得た。
ｐＭＳ−ｅＧＦＰベクターとＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉ
ｎｇ  Ｋｉｔ  Ｅｃｏ（タカラバイオ社製）を用い、２９３Ｔ細胞での
一過性のウィルス産生を行い、エコトロピックＭＳ−ｅＧＦＰウィルス
を獲得した。こうして得られたエコトロピックＭＳ−ｅＧＦＰウィルス
を、ＧａＬＶレトロウィルスパッケージング細胞ＰＧ１３（ＡＴＣＣ  Ｃ
ＲＬ−１０６８６）にレトロネクチン（タカラバイオ社製）存在下で感
染させ、レトロウィルス産生細胞ＰＧ１３／ＭＳ−ｅＧＦＰを獲得した。
ＰＧ１３／ＭＳ−ｅＧＦＰは、１０％ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ社製）
を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ社製）で培養し、
セミコンフルエントに生育したところで０．１ｍｌ／ｃｍ２の新鮮な無血
清培地ＧＴ−Ｔ−ＲｅｔｒｏＩ（タカラバイオ社製）と交換した。さら
に２４時間経過した後に回収した培地上清を０．４５μｍフィルター（ミ
リポア社製）でろ過してＧＡＬＶ／ＭＳ−ｅＧＦＰウィルス液を得た。
得られたウィルス液は小分けして、−８０℃フリーザーで保存し、以下
の遺伝子導入実験に供した。
【００５１】
３．レトロネクチンコート容器へのレトロウィルスベクターの結合
上記２で調整したレトロウィルスベクターを速やかに融解し、ＧＴ−
Ｔ−ＲｅｔｒｏＩで８倍希釈した後、３０ｍｌを上記１で調整したレト
ロネクチンコート袋状容器１に充填し、遠心機のアダプターＸの凹部Ｘ’
内に、前記の容器をセットして、３２℃、２，０００ｇで２時間遠心し
た。対照として２４穴ノントリートプレートにレトロネクチンをコーテ
ィングし、１ウエルあたりに前記ウィルスベクター０．５ｍｌを加えた
ものを２群用意し、そのうちの１群は３２℃、２，０００ｇで２時間遠
心した。他方の１群は３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで４時間静
置してレトロウィルスベクターを結合させた。
【００５２】
４．遺伝子導入
遠心用袋状容器１については、遠心終了後、内容液を排出し、３０ｍ
ｌの１．５％ＨＳＡ含有ＰＢＳで洗浄し、その洗浄液は排出した。Ｋ５
６２細胞を１０％ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地に１．５ｘ１
０４／ｍｌになるように予め分散させた分散液を容器１の収納空間６’内
に４０ｍｌ充填し、３７℃の温度で、５％ＣＯ２のインキュベーターにて
静置し、標的細胞への遺伝子導入を行なった。２４穴プレートについて
は、内容液を除去し、０．５ｍｌの１．５％ＨＳＡ含有ＰＢＳで洗浄し、
その洗浄液は除去した。４×１０４／ｍｌになるように分散したＫ５６２
培養液をウエルに０．５ｍｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベー
ターにて静置し、標的細胞への遺伝子導入を行った。各々の容器にて遺
伝子導入した細胞を３日間培養後、細胞を剥離して回収し、遺伝子導入
効率を、フローサイトメーターを用いて測定した。２４穴プレートを静
置で使用した場合の遺伝子導入効率に対する各容器での遺伝子導入効率
の相対値を算出した結果を下掲表１に示す。下掲表１に示すが如く、本
実施例の遠心用袋状容器１は、遠心力でレトロウィルスベクターを容器
に結合することによって遺伝子導入効率が飛躍的に上昇した。
【００５３】
【表１】
0005453629.tif 000002
【００５４】
５．レトロウィルスベクター結合容器の保存
前記３で調整したレトロウィルスベクターを結合した遠心用袋状容器
１について、遠心終了後、内容液を排出し、４０ｍｌの１．５％ＨＳＡ
含有ＰＢＳに置換し、４℃にて２４時間、４８時間保存した。保存後、
液を排出し、Ｋ５６２細胞を１０％ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ１６４０
倍地に１．５ｘ１０４／ｍｌになるように予め分散させた分散液を４０ｍ
ｌ充填し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターにて静置し、標的細胞
への遺伝子導入を行った。対照として、レトロウィルスベクターを結合
した遠心用袋状容器１について、４℃保存することなく直ちに遺伝子導
入に供した。対照での遺伝子導入効率に対する各保存時間での遺伝子導
入効率の相対値を算出することによって、残存するレトロウィルスベク
ターの遺伝子導入活性を算出した。その結果を下掲表２に示す。通常、
レトロウィルスベクターの安定性は悪く、その半減期は４℃で９２時間、
０℃で１８〜６４時間、３２℃で１１〜３９時間、３７℃で７〜９時間
とされている［ＭｃＴａｇｇａｒｔ  Ｓ．、Ａ１−Ｒｕｂｅａｉ  Ｍ．、
バイオテクノロジー  プログレス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇ．）、
第１６巻、第５号、第８５９〜８６５頁（２０００年）（非特許文献１）、
Ｋａｐｔｅｉｎ  Ｌ．  Ｃ．ら、ジーン  セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅ
ｒ．）、第４巻、第２号、第１７２〜１７６頁（１９９７年）（非特許
文献２）］が、レトロネクチンでコートした本実施例の遠心用袋状容器
１においては下掲表２に示すが如く、レトロウィルスベクターの保存に
も好適である。
【００５５】
【表２】
0005453629.tif 000003
【００５６】
［実施例２］
図３及び図４に示すが如く、本実施例の遠心用袋状容器１は、実施例
１の構成に加え、第二の容器壁４に、第一の容器壁３の凹部６の内側寸
法より若干小さい外側寸法の凸部１０を真空成形で形成し、第一の容器
壁３の凹部６内に第二の容器壁４の凸部１０を嵌め合わせてから周縁を
シールした以外は、実施例１と同様に形成した。尚、図４中の参照符号
１１は、分散液を示す。
本実施例の遠心用袋状容器１は、実施例１と同様に評価し、実施例１
と同様に遺伝子導入に使用し、遺伝子導入率を調べた。
【００５７】
本実施例の遠心用袋状容器１は、上記の評価方法１ないし３により評
価したが、空気の出入りなしに充填、排出が可能で、遠心後も容器の破
損はなく、分散質も容器の底面に均一に分散していることが観察された。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
以上のように、本発明に係る遺伝子導入方法で使用する袋状容器は、
遠心処理が施された時に、破損することなく、しかも、分散質が容器の
底面に均一に分散されることを可能にするものであるため、この種の容
器としては極めて有用であり、また、そのような容器を用いた遺伝子導
入方法は、効率的な遺伝子導入を可能にさせるため、極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本発明に係る遺伝子導入方法で使用する袋状容器の一例を示す斜視図である。
【図２】図１の袋状容器をＡ-Ａ’を通る垂直な面で切った時の模式断面図である。
【図３】本発明に係る遺伝子導入方法で使用する袋状容器の別の一例を示す模式断面図である。
【図４】図３の袋状容器に分散液が入った状態の模式断面図である。
【符号の説明】
【００６０】
１  袋状容器
２  周縁シール
３  第一の容器壁
４  第二の容器壁
５  ポート
６  第一の容器壁の凹部
６’  内容物収納空間
７  第一の容器壁のフランジ状部
８  キャップ
９  懸垂口
１０  第二の容器壁の凸部
１１  分散液
【図１】
0005453629.tif 000004
【図２】
0005453629.tif 000005
【図３】
0005453629.tif 000006
【図４】
0005453629.tif 000007