(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＩＰ４１遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）および低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）からなる群から選択されたＴＩＰ４１タンパク質の発現または活性抑制剤を含有する癌細胞内ＴＲＡＩＬ感受性増進用組成物。
【請求項２】
前記のＴＩＰ４１タンパク質が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有していることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記の癌が、肝癌、大腸癌、子宮頸癌、腎臓癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、脳腫瘍、肺癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、血液の癌および膵臓癌からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ＴＩＰ４１遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）および低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）からなる群から選択されたＴＩＰ４１タンパク質の発現または活性抑制剤を含有する抗癌補助剤。
【請求項５】
前記のＴＩＰ４１タンパク質が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有していることを特徴とする、請求項４に記載の抗癌補助剤。
【請求項６】
前記の癌が、肝癌、大腸癌、子宮頸癌、腎臓癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、脳腫瘍、肺癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、血液の癌および膵臓癌からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、請求項４に記載の抗癌補助剤。
【請求項７】
前記のＴＩＰ４１タンパク質の発現または活性阻害剤が、ＴＲＡＩＬ感受性を増進させることを特徴とする、請求項４に記載の抗癌補助剤。
【請求項８】
請求項４〜請求項７のいずれか１項に記載の抗癌補助剤を含む、癌の治療または予防用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＩＰ４１の発現または活性抑制剤を含有するＴＲＡＩＬ感受性増進用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌は、人類の健康を脅かす最大の疾病の１つであり、細胞株が一連の突然変異過程を経て、無制限に非調整的な方法で増殖し、不死化して発生する疾病である。癌の発生の原因としては、化学物質、ウイルス、細菌、電離放射線などの環境または外的な要因と先天性の遺伝子突然変異等の内的な要因を挙げることができる（Ｋｌａｕｎｉｇ＆Ｋａｍｅｎｄｕｌｉｓ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．，２００４年、第４４巻、ｐ．２３９−２６７（非特許文献１））。
【０００３】
初期に発見された癌の場合は、手術、放射線療法、化学療法などの治療法があるが、その副作用もまた大きな問題であり、末期癌や転移した癌の場合は、特別な治療法はなく、時限付で人生を終えるような状況である。また、癌に関連する多様な生化学的機序が解明され、それによる治療剤が開発されてきていますが、まだ癌に対する根本的な治療方法は解明されていない。
【０００４】
ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ  ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ）は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に属するサイトカインで、細胞死受容体経路（ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐａｔｈｗａｙ）を活性化させることによってアポトーシスを誘導するリガンドである。ＴＲＡＩＬは、４つの受容体を有していて、その中で細胞死受容体４／５（ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４／５、ＤＲ４／５）は、癌細胞株で、デコイ受容体（ｄｅｃｏｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １／２、ＤｃＲ１／２）は、正常な細胞株で過発現することが知られている。デコイ受容体の場合は、ｃ−ターミナル末端に細胞死ドメインを有しておらず、アポトーシス信号伝達が細胞内に伝えられない。したがって、ＴＲＡＩＬをベースとする治療法は、正常細胞株には副作用がない次世代の抗癌治療法として注目されている。
【０００５】
現在までに報告されている多くの抗癌剤や癌阻害剤は、非特異性による正常組織への深刻な副作用、高い突然変異率による癌細胞株の耐性獲得などの問題点を有している。しかし、１９９７年にＴＲＡＩＬが正常な細胞には活性せず、癌細胞株にのみに作用してアポトーシスを誘導することが発見されて以来、ＴＲＡＩＬは、癌細胞株特異的抗癌剤であるのみならず、既存の抗癌薬に対して抵抗性を獲得した癌細胞株の治療剤としての可能性が浮上してきた。しかし、乳癌、前立腺癌、子宮癌、肺癌、肝癌、脳腫瘍などの癌では、ＴＲＡＩＬ耐性が現れていて、ＴＲＡＩＬを癌細胞株に持続的に処理すると、ＴＲＡＩＬに感受性を示していた癌細胞株も、だんだんＴＲＡＩＬに対して耐性を有するようになることが明らかになった。
【０００６】
ＴＲＡＩＬ耐性の機序は、デコイ受容体１と２の過発現などによる細胞死受容体４／５の作用阻害、細胞内アポトーシス信号伝達の阻害等が予想され、その中でも、細胞内信号伝達体系の変化による耐性の獲得が、より説得力のある機序として認識されている。これらの信号伝達体系の変化は、アポトーシス促進タンパク質（ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の作用を阻害する抗アポトーシスタンパク質（ａｎｔｉａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の過発現が主な原因として報告された。これにより、新規ＴＲＡＩＬの耐性を克服する治療法の発掘によってＴＲＡＩＬ耐性が克服され、癌細胞株特異的アポトーシスを増進させるＴＲＡＩＬセンシタイザー（ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）の開発は必須的に求められる研究分野である。
【０００７】
癌だけでなく、ＴＲＡＩＬが媒介したアポトーシス経路が、リウマチ性関節炎、糖尿病性腎疾患、退行性脳疾患の疾病において重要な役割を果たすことが知られている（大韓リウマチ会誌Ｖｏｌ．１２，  Ｎｏ．２，２００５年、６月（非特許文献２）、Ｊ  ＡＭ  Ｓｃｏ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，２００８年、第１９巻、ｐ．９０４−９１４（非特許文献３）、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．２００３年１月、第１０（１）巻、ｐ．１３４−４１（非特許文献４））。自己免疫疾患の一種である関節炎などにおいて、過多に活性化した免疫細胞の死滅を誘導し、病状の緩和と治療のためにＴＲＡＩＬを用いる多様な試みが行なわれている。したがって、ＴＲＡＩＬは、前記の様々な癌の治療のみならず、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、関節リウマチ、１型糖尿病などのＴ細胞起因性の自己免疫疾患の治療等にも有用に用いることができる。
【０００８】
ＴＩＰ４１遺伝子は、ＴＩＰＲＬ（ＴＯＲ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ−ｌｉｋｅ）とも呼ばれ、酵母から初めて分離された。ＴＩＰ４１タンパク質は、酵母でＴＡＰ４２タンパク質と相互作用することにより、ラパマイシンに反応するＴＯＲ信号伝達体系を陰性的に調節することが知られている（Ｊａｃｉｎｔｏ  Ｅら，Ｍｏｌ  ｃｅｌｌ、２００１年、第８（５）巻、ｐ．１０１７−２６（非特許文献５））。ヒトのＴＩＰ４１遺伝子は、酵母のＴＩＰ４１遺伝子と３７％の相同性を有し、ＮＦ−κ（ｋａｐｐａ）Ｂ信号伝達体系とＭＡＰＫ信号伝達体系を活性化することが知られている（Ｍａｔｓｕｄａ  Ａら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００３年、第２２（２１）巻、ｐ．３３０７−３３１８（非特許文献６））。ヒトのＴＩＰ４１遺伝子の機能は、酵母で表れるＴＩＰ４１遺伝子の機能とは異なり、細胞株の増殖を活性化すると予想されるが、今までヒトのＴＩＰ４１遺伝子の機能として報告された中で、肝癌や胃癌または癌の発生などと関連しては、いかなる報告もないのが実情である。
【０００９】
それで、本発明者らは、従来のＴＲＡＩＬ耐性を示す肝癌細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を処理して、ＴＩＰ４１の発現を抑制した後、ＴＲＡＩＬを処理した時、癌細胞株の特異的アポトーシスが誘導され、それが肝癌のみならず、ＴＲＡＩＬに対する耐性を有する肺癌と大腸癌でもアポトーシスが観察され、腫瘍を移植したマウスにＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡとＴＲＡＩＬを注入した時、腫瘍のサイズが減少、および癌細胞の死滅を誘導する効果を確認することによって、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｋｌａｕｎｉｇ＆Ｋａｍｅｎｄｕｌｉｓ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．，２００４年、第４４巻、ｐ．２３９−２６７
【非特許文献２】大韓リウマチ会誌Ｖｏｌ．１２，  Ｎｏ．２，２００５年、６月
【非特許文献３】Ｊ  ＡＭ  Ｓｃｏ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，２００８年、第１９巻、ｐ．９０４−９１４
【非特許文献４】Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．２００３年１月、第１０（１）巻、ｐ．１３４−４１
【非特許文献５】Ｊａｃｉｎｔｏ  Ｅら，Ｍｏｌ  ｃｅｌｌ、２００１年、第８（５）巻、ｐ．１０１７−２６
【非特許文献６】Ｍａｔｓｕｄａ  Ａら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００３年、第２２（２１）巻、ｐ．３３０７−３３１８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、ＴＩＰ４１タンパク質の発現または活性抑制剤を含有する、ＴＲＡＩＬ感受性増進用組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記の目的を達成するために、本発明は、ＴＩＰ４１タンパク質の発現または活性抑制剤を含有する、ＴＲＡＩＬ感受性の増進用組成物を提供する。
【００１３】
また、本発明は、ＴＩＰ４１タンパク質の発現や活性抑制剤を含有する、抗癌補助剤（補助剤）を提供する。
【００１４】
また、本発明は、本発明の抗癌補助剤を含む癌の治療または予防用組成物を提供する。
【００１５】
また、本発明は、癌の予防や治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００１６】
また、本発明は、薬学的に有効な量のＴＩＰ４１の発現または活性抑制剤をＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスと関連した疾病にかかった個体に投与する工程を含む、ＴＲＡＩＬに対する感受性を改善する方法を提供する。
【００１７】
また、本発明は、薬学的に有効な量のＴＩＰ４１の発現または活性抑制剤を投与するための工程を含む、癌の予防方法を提供する。
【００１８】
また、本発明は、薬学的に有効な量のＴＩＰ４１の発現または活性抑制剤を抗癌補助として、癌にかかった個体に投与する工程を含む、癌の治療方法を提供する。
【００１９】
また、本発明は、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスと関連する疾病の治療時にＴＲＡＩＬ感受性増進のために使用するための、ＴＩＰ４１の発現または活性抑制剤を提供する。
【００２０】
また、本発明は、抗癌補助剤として使用するためのＴＩＰ４１の発現または活性抑制剤を提供する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のＴＲＡＩＬ耐性を示す肝癌細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡを処理し、その発現を抑制した後、ＴＲＡＩＬを処理した時、癌細胞株特異的アポトーシスが誘導され、肝癌のみならず、ＴＲＡＩＬの耐性を有する肺癌、大腸癌にも効果が観察され、腫瘍を移植したマウスにＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡとＴＲＡＩＬを投与した時、腫瘍のサイズが減少して、癌細胞株の死滅を誘導する効果を有するので、ＴＩＰ４１タンパク質の発現または活性抑制剤を含有するＴＲＡＩＬ感受性増進用組成物または抗癌補助剤として有用に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、肝癌組織におけるＴＩＰ４１の発現増加様相とＨｕｈ７肝癌細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせた後、ＴＲＡＩＬを処理してＴＩＰ４１発現抑制を確認した図。図１のＡは、肝癌組織に発現するＴＩＰ４１を示した図。図１のＢは、肝癌組織（ＨＢＶ感染または非感染肝癌組織）とそれに隣接した正常組織におけるＴＩＰ４１の発現量をウエスタンブロットを用いて示した図。図１のＣは、Ｈｕｈ７肝癌細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせ、ＴＲＡＩＬを処理した時のＴＩＰ４１タンパク質の発現抑制を示した図。Ｓｉ−ｃｏｎｔ：対照群ｓｉＲＮＡ、およびｓｉ−ＴＩＰ４１：ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡ。
【図２】図２は、Ｈｕｈ７肝癌細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせ、ＴＲＡＩＬを処理した後に誘導されるアポトーシスを確認した図。図２のＡは、Ｈｕｈ７肝癌細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせ、ＴＲＡＩＬを処理した後、アポトーシスを核染色法を用いて確認した図。Ｓｉ−ｃｏｎｔ：対照群ｓｉＲＮＡ、ｓｉ−１０１７：ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡ。図２のＢは、Ｈｕｈ７肝癌細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせ、ＴＲＡＩＬを時間帯別に処理した後、アネキシンＶ−ＦＩＴｃ／ＰＩ染色法を用いたＦＡＣＳ分析した図。Ｓｉ−ｃｏｎｔ：対照群ｓｉＲＮＡ、ｓｉ−ＴＩＰ４１：ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡ。図２のＣは、Ｈｕｈ７肝癌細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせ、ＴＲＡＩＬを濃度別に処理した後、アネキシンＶ−ＦＩＴｃ／ＰＩ染色法を用いたＦＡＣＳ分析した図。Ｓｉ−ｃｏｎｔ：対照群ｓｉＲＮＡ、ｓｉ−ＴＩＰ４１：ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡ。
【図３】図３は、Ｈｕｈ７肝癌細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせ、ＴＲＡＩＬを処理した後、アポトーシスに関与するタンパク質の発現を確認した図。図３のＡは、Ｈｕｈ７肝癌細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせ、ＴＲＡＩＬを処理した後、カスパーゼ（Ｃａｓｅｐａｓｅ）−３、−８、−９、ＰＡＲＰの活性を確認した図。Ｓｉ−ｃｏｎｔ：対照群ｓｉＲＮＡ、ｓｉ−ＴＩＰ４１：ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡ。図３のＢは、Ｈｕｈ７肝癌細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせ、ＴＲＡＩＬを処理した後、シトクロムＣ（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｃ）が細胞質（ｃｙｔｏｓｏｌ）に放出されることを確認した図。Ｓｉ−ｃｏｎｔ：対照群ｓｉＲＮＡ、およびｓｉ−ＴＩＰ４１：ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡ。
【図４】図４は、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡとＴＲＡＩＬを処理したＨｕｈ７肝癌細胞株のアポトーシス経路でＪＮＫ伝達経路の関連性を確認した図。図４のＡは、Ｈｕｈ７肝癌細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせた後、ＴＲＡＩＬを時間帯別に処理した後、ＪＮＫの活性化を確認した図。Ｓｉ−ｃｏｎｔ：対照群ｓｉＲＮＡ、ｓｉ−ＴＩＰ４１：ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡ。図４のＢは、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡとＴＲＡＩＬを処理したＨｕｈ７肝癌細胞株でのＪＮＫ阻害剤によるアポトーシスの減少を示した図。Ｓｉ−ｃｏｎｔ：対照群ｓｉＲＮＡ、ｓｉ−ＴＩＰ４１：ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡ。ビヒクル（Ｖｅｈｉｃｌｅ）：０．３％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＳＰ６００１２５：ＪＮＫ阻害薬。
【図５】図５は、Ｈｕｈ７肝癌細胞株でＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡとＴＲＡＩＬで誘導されるアポトーシスがｐ５３伝達経路非依存的な信号経路であることを示した図。図５のＡは、Ｈｕｈ７肝癌細胞株でＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡとＴＲＡＩＬで誘導されるアポトーシスがｐ５３伝達経路非依存的な信号経路であることを示した図。Ｓｉ−ｃｏｎｔ：対照群ｓｉＲＮＡ、ｓｉ−ＴＩＰ４１：ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡ。図５のＢは、ｐ５３細胞株（ヌル細胞（ｎｕｌｌ  ｃｅｌｌ））にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせた後、ＴＲＡＩＬ処理によるアポトーシスがｐ５３とは無関係に誘導されることを確認した図。
【図６】図６は、ＴＩＰ４１のタンパク質の発現抑制とＴＲＡＩＬ受容体との関係を示した図。図６のＡは、細胞株別ＴＲＡＩＬ受容体の発現を示した図。図６のＢは、Ｈｕｈ７肝癌細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせ、ＴＲＡＩＬを処理した後、ＴＲＡＩＬ受容体の発現を示した図。Ｓｉ−ｃｏｎｔ：対照群ｓｉＲＮＡ、ｓｉ−ＴＩＰ４１：ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡ。図６のＣは、肝癌の段階別の臨床組織でのＴＲＡＩＬ受容体の発現を示した図。
【図７】図７は、正常細胞株であるＨＡＥＣにＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡとＴＲＡＩＬによってアポトーシスが誘導されていないことを示した図。図７のＡは、正常細胞株であるＨＡＥＣにＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせた後、ＴＲＡＩＬを時間帯別に処理した後に誘導されるアポトーシスを示した図。Ｓｉ−ｃｏｎｔ：対照群ｓｉＲＮＡ、ｓｉ−ＴＩＰ４１：ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡ、Ｈｕｍａｎ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ：ヒト大動脈内皮細胞株。図７のＢは、正常細胞株であるＨＡＥＣにＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせた後、ＴＲＡＩＬを処理した後、アポトーシスに関与するアポトーシス促進性（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）タンパク質の活性を確認した図。Ｓｉ−ｃｏｎｔ：対照群ｓｉＲＮＡ、ｓｉ−ＴＩＰ４１：ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡ。
【図８Ａ】図８は、ＴＩＰ４１のタンパク質発現抑制後、ＴＲＡＩＬを処理した肺癌、大腸癌細胞で増加することを示した図。図８ＡのＡは、Ａ５４９肺癌細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせることにより、ＴＲＡＩＬを時間別に処理した後、カスパーゼ−３、−８、−９およびＰＡＲＰの活性を確認した図。Ｓｉ−ｃｏｎｔ：対照群ｓｉＲＮＡ、ｓｉ−ＴＩＰ４１：ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡ。図８ＡのＢは、ＨＣＴ１１６大腸癌細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせた後、ＴＲＡＩＬを濃度別に処理した後に誘導されるアポトーシスが、対照群ｓｉＲＮＡに比べて増加していることを示した図。Ｓｉ−ｃｏｎｔ：対照群ｓｉＲＮＡ、ｓｉ−ＴＩＰ４１：ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡ。
【図８Ｂ】図８は、ＴＩＰ４１のタンパク質発現抑制後、ＴＲＡＩＬを処理した肺癌、大腸癌細胞で増加することを示した図。図８Ｂは、肺癌細胞株で細胞株の染色分析（８ＢのＡ）とＦＡＣＳ分析（８ＢのＢ、およびＣ）を通じて、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡがＴＲＡＩＬ感受性を増大させ癌細胞の死滅を増加させる結果を示した図。
【図８Ｃ】図８は、ＴＩＰ４１のタンパク質発現抑制後、ＴＲＡＩＬを処理した肺癌、大腸癌細胞で増加することを示した図。図８Ｃは、多様な肝癌細胞株でＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡがＴＲＡＩＬ感受性を増大させ、癌細胞の死滅を増加させる効果を確認した図。
【図９Ａ】図９は、動物実験によるＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡの機能を検証した図。図９Ａは、ヌードマウスに腫瘍を移植して、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡとＴＲＡＩＬを注入した後、腫瘍のサイズが減少することを示した図とグラフ。Ｓｉ−ｃｏｎｔ：対照群ｓｉＲＮＡ、ｓｉ−ＴＩＰ４１：ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡ。
【図９Ｂ】図９は、動物実験によるＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡの機能を検証した図。図９Ｂは、ヌードマウスの腫瘍を染色によって、アポトーシスを示した図。Ｓｉ−ｃｏｎｔ：対照群ｓｉＲＮＡ、ｓｉ−ＴＩＰ４１：ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡ。
【図９Ｃ】図９は、動物実験によるＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡの機能を検証した図。図９Ｃは、ヌードマウスの腫瘍の溶解物からアポトーシスに関与しているカスパーゼ−８タンパク質の活性をウエスタンブロットで示した図。
【図１０】図１０は、ＴＩＰ４１とＰＰ２Ａｃとの相互作用を確認した図。図１０のＡは、ＰＰ２Ａｃを過発現させた後、ＴＩＰ４１とＰＰ２Ａｃとの相互作用を確認したウエスタンブロット結果の分析図。図１０のＢは、ＴＩＰ４１とＰＰ２Ａｃ複合体間、およびＴＩＰ４１とＭＫＫ７間の相互作用を確認した図。
【図１１】図１１は、ＴＩＰ４１とＰＰ２Ａｃ複合体とＭＫＫ７間の相互作用を確認した図。図１１のＡは、ＭＫＫ７を過発現させた後、ＴＩＰ４１とＰＰ２Ａｃ複合体およびＭＫＫ７間の相互作用を確認した図。図１１のＢは、免疫沈降法を用いた、ＴＩＰ４１とＰＰ２Ａｃ複合体およびＭＫＫ７間の相互作用を確認した図。図１１のＣは、試験管内ＧＳＴ免疫沈降法を用いた、ＴＩＰ４１とＰＰ２Ａｃ複合体およびＭＫＫ７間の相互作用を確認した図。
【図１２】図１２は、ＭＫＫ７と相互作用するＴＩＰ４１の結合部位を確認した図。図１２のＡは、ＭＫＫ７と相互作用するＴＩＰ４１の結合部位を確認するために制作されたＴＩＰ４１の断片を示した図。図１２のＢは、ＭＫＫ７と相互作用するＴＩＰ４１の結合部位をウエスタンブロットを通じて示した図。
【図１３】図１３は、ＴＩＰ４１と相互作用するＭＫＫ７の結合部位を確認した図。図１３のＡは、ＴＩＰ４１と相互作用するＭＫＫ７の結合部位を確認するために制作されたＭＫＫ７の断片を示した図。図１３のＢは、ＴＩＰ４１と相互作用するＭＫＫ７の結合部位をウエスタンブロットを通じて示した図。
【図１４】図１４は、ＴＩＰ４１と相互作用するＭＫＫ７によるアポトーシス経路を確認した図。図１４のＡは、ＭＫＫ７発現抑制後に減少するアポトーシスの減少を確認した図。図１４のＢは、ＴＩＰ４１発現抑制後、ＭＫＫ７／ＪＮＫ経路の活性化を示した図。Ｓｉ−ｃｏｎｔ：対照群ｓｉＲＮＡ、ｓｉ−ＭＫＫ７：ＭＫＫ７  ｓｉＲＮＡ。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２４】
本発明は、ＴＩＰ４１タンパク質の発現または活性抑制剤を含有するＴＲＡＩＬ感受性増進用組成物を提供する。
【００２５】
前記のＴＩＰ４１タンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を特徴とすることが好ましいが、これに限定されない。
【００２６】
前記のＴＩＰ４１タンパク質発現または活性阻害剤は、ＴＲＡＩＬセンシタイザー（ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）であることが好ましいが、これに限定されない。
【００２７】
前記のＴＩＰ４１タンパク質の発現抑制剤は、ＴＩＰ４１遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）および低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）からなる群から選択されたいずれか１つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００２８】
前記のＴＩＰ４１タンパク質の活性剤は、ＴＩＰ４１タンパク質に特異的に結合する化合物、ペプチド、ペプチドミメティックス、アプタマー、抗体、および天然物からなる群から選択されるいずれか１つであることを特徴とするが、これに限定されない。
【００２９】
前記の組成物は、ＴＲＡＩＬを用いた癌、炎症性疾患または自己免疫疾患の治療時に使用されることが好ましい。
【００３０】
前記の癌は、肝癌、大腸癌、子宮頸癌、腎臓癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、脳腫瘍、肺癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、血液の癌および膵臓癌からなる群から選択される１つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００３１】
また、前記の炎症性疾患は、皮膚炎、アレルギー、アトピー、結膜炎、歯周炎、鼻炎、中耳炎、咽頭炎、扁桃腺炎、肺炎、胃潰瘍、胃炎、クローン病、大腸炎、痔、痛風、強直性脊椎炎、リウマチ熱、ループス、線維筋痛症（ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ）、乾癬性関節炎、骨関節炎、関節リウマチ、肩関節周囲炎、腱炎、腱鞘炎、腱周囲炎、筋肉炎、肝炎、膀胱炎、腎臓炎、シェーグレン症候群（ｓｊｏｇｒｅｎ'ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、多発性硬化症、急性および慢性の炎症性疾患からなる群から選択される１つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００３２】
また、前記の自己免疫疾患は、関節リウマチ、多発性硬化症、重度の筋無力症、クレブス病、橋本氏甲状腺炎、アジソン病、白斑症、硬皮症、グッドパスチャー症候群、ベーチェット病、クローン病、強直性脊椎炎、ブドウ膜炎、血小板減少性紫斑病、尋常性天疱瘡、幼児糖尿病、自己免疫溶血性貧血、クリオグロブリン血症、副腎白質異栄養症および全身性紅斑性狼瘡からなる群から選択される１つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００３３】
アンチセンスヌクレオチド
アンチセンスヌクレオチドは、ワトソン・クリック型塩基対で定義されることによって、ＤＮＡ、未成熟−ｍＲＮＡまたは成熟したｍＲＮＡの相補的塩基配列に結合（混成化）して、ＤＮＡからタンパク質として遺伝子情報の流れを妨げるものである。標的配列に特定性があるアンチセンスヌクレオチドの性質は、それらを例外的に多機能にする。アンチセンスのヌクレオチドは、モノマー単位の長い鎖であるため、これらの標的ＲＮＡ配列に対して簡単に合成することができる。最近の多くの研究は、標的タンパク質の研究のための生化学的手段としてアンチセンスヌクレオチドの有用性を証明した（Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇら．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ，１９９９年，第８１巻，ｐ．１５３９−１５４４）。オリゴヌクレオチド化学および向上した細胞株吸着、標的結合親和度およびヌクレアーゼ耐性を示すヌクレオチド合成分野で、最近多くの進歩があったため、アンチセンスヌクレオチドの使用は、新しい形の抑制剤として考慮することができる。
【００３４】
ペプチドミネティックス（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍｉｎｅｔｉｃｓ）
前記のペプチドミネティックスは、ＴＩＰ４１活性を率いるＴＩＰ４１タンパク質の結合ドメインを抑制するペプチドまたはペプチドである。非加水分解性ペプチド類似体の重要な残基としては、βターンペプチドコア（Ｎａｇａｉら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ，１９８５年，第２６巻，ｐ．６４７）、ケトメチレンシュードペプチド類（Ｅｗｅｎｓｏｎら，Ｊ  Ｍｅｄ  ｃｈｅｍ，１９８６年，第２９巻，ｐ．２９５；およびＥｗｅｎｓｏｎら，ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ９ｔｈ  ＡｍｅｒｉＣａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）Ｐｉｅｒｃｅ  ｃｈｅｍｉＣａｌ  ｃｏ．Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＩＬ，１９８５年）、アゼピン（Ｈｕｆｆｍａｎら，ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｄ．，ＥＳｃＯＭ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８年）、ベンゾジアゼピン（Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒら，ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ；ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｄ．，ＥＳｃＯＭ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８年）、βアミノアルコール（Ｇｏｒｄｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  ｃｏｍｍｕｎ，１９８５年，第１２６巻，ｐ．４１９）、および置換されたγ−ラクタム環（Ｇａｒｖｅｙら，ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．，Ｍａｒｓｈｅｌｌ  ｅｄ．，ＥＳｃＯＭ   Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８年）を用いて作成することができる。
【００３５】
ＳｉＲＮＡ分子
センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡが二重鎖ＲＮＡ分子を形成し、ここで、センスＲＮＡがＴＩＰ４１  ｍＲＮＡ中の一部の連続ヌクレオチドの標的配列と同一な核酸配列を含むｓｉＲＮＡ分子であることが好ましい。前記のｓｉＲＮＡ分子は、ＴＩＰ４１遺伝子の塩基配列内で選択される１０〜３０個の塩基からなるセンス配列および、前記のセンス配列に相補的に結合するアンチセンス配列からなることが好ましいが、これに限られるわけではなく、ＴＩＰ４１遺伝子の塩基配列を対象に相補的に結合できるセンス配列を有する二重鎖ＲＮＡ分子ならすべて使用可能である。前記のセンス配列は、センス配列と相補的な配列を有していることが最も好ましい。
【００３６】
抗体
ＴＩＰ４１抗体は、ＴＩＰ４１注入によって製造されたもの、または市販され購入したものなどすべて使用可能である。また、前記の抗体は、多クローン抗体、モノクローナル抗体およびエピトープと結合することのできる断片等を含む。
【００３７】
多クローン抗体は、前記ＴＩＰ４１を動物に注入し、その動物から採血して抗体を含む血清を得る従来の方法で生成することができる。このような多クローン抗体は、当業界で知られている任意の方法によって精製することができ、ヤギ、ウサギ、猿、馬、牛、豚、犬などの任意の動物種の宿主から作ることができる。
【００３８】
モノクローナル抗体は、継続的な細胞株の培養による抗体分子の生成を提供するいかなる技術を用いても製造することができる。これらの技術は、これらに限定されるものではないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術およびＥＢＶハイブリドーマ技術が含まる（Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇら，Ｎａｔｕｒｅ，１９７５年，第２５６巻，ｐ．４９５−４９７；Ｋｏｚｂｏｒ  Ｄら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９８５年，第８１巻，ｐ．３１−４２；ｃｏｔｅ  ＲＪら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  ＡＣａｄ  Ｓｃｉ，１９８３年，第８０巻，ｐ．２０２６−２０３０；ｃｏｌｅ  ＳＰら，Ｍｏｌ  ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１９８４年，第６２巻，ｐ．１０９−１２６）。
【００３９】
また、前記のＴＩＰ４１に対する特定結合部位を含んだ抗体の断片を製造することができる。たとえば、これらに限定されるものではないが、Ｆ（ａｂ'）２断片は、抗体分子をペプシンで分解させて製造することができ、Ｆａｂ断片は、Ｆ（ａｂ'）２断片のジスルフィドブリッジを還元させることにより製造することができる。他の方法として、Ｆａｂ発現ライブラリを小さくして、所望する特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片を迅速かつ容易に同定することができる（Ｈｕｓｅ  ＷＤら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９年，第２５４巻，ｐ.１２７５−１２８１）。
【００４０】
前記の抗体は、洗浄や複合体の分離など、それ以降の工程を容易にするために、固形基質（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）に結合することができる。固形基質は、たとえば、合成樹脂、ニトロセルロース、ガラス基板、金属基板、ガラス繊維、微細球体、微細ビーズなどがある。また、前記の合成樹脂には、ポリエステル、ポリ塩化ビニール、ポリスチレン、ポリプロピレン、ＰＶＤＦおよびナイロンなどがある。
【００４１】
アプタマー（Ａｐｔａｍｅｒ）
アプタマーは、それ自体で安定した三次構造を有しながら標的分子に高い親和性と特異性で結合することができる特性を有する単一鎖核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、または変形核酸）である。アプタマーは、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）と呼ばれるアプタマー発掘技術が最初に開発された後（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，ＡＤ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，ＪＷ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９０年，第３４６巻，ｐ.８１８−８２２）、低分子有機物、ペプチド、膜タンパク質まで、多様な標的分子に結合することができる多くのアプタマーが、継続して発掘された。アプタマーは、固有の高い親和性（普通ｐＭ水準）と特異性で標的分子に結合することができるという特性によって、単一抗体と比較され、特に「化学抗体」と呼ばれる程、代替抗体としての高い可能性がある。
【００４２】
本発明の一実験例では、肝癌組織でＴＩＰ４１タンパク質が正常組織に比べて過発現されることを、免疫組織染色法とウエスタンブロットを用いて確認した。また、肝癌細胞株でのＴＩＰ４１発現抑制は、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせた肝癌細胞株で確認することができた（図１を参照）。
【００４３】
本発明の一実験例では、Ｈｕｈ７肝癌細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせて、細胞内ＴＩＰ４１発現量を減少させた後にＴＲＡＩＬを時間別に処理した時、アポトーシスが増加することを、核染色法とＦＡＣＳ分析方法を用いて確認した。また、Ｈｕｈ７肝癌細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせた後、ＴＲＡＩＬを濃度別に処理してアポトーシスを誘導した後、ＦＡＣＳ方法を用いて分析した結果、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡとＴＲＡＩＬを一緒に処理した時、ＴＲＡＩＬのみを処理した時よりアポトーシスが大幅に増加していることを確認することができた（図２を参照）。
【００４４】
本発明の一実験例では、Ｈｕｈ７肝癌細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせた後、ＴＲＡＩＬを時間帯別に処理した時、アポトーシスに関与するタンパク質の発現を観察した結果、カスパーゼ−３、−８、−９およびポリ（ＡＤＰリボース）重合酵素（Ｐｏｌｙ  ＡＤＰ  ｒｉｂｏｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｌａｓｅ、ＰＡＲＰ）が活性化することを確認することができた。また、シトクロムＣの発現が細胞質（ｃｙｔｏｓｏｌ）で確認されたことで、Ｈｕｈ７肝癌細胞株でＴＩＰ４１タンパク質発現抑制とＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスは、外因性経路と内因性経路が混在した形で起こることを確認することができた（図３を参照）。
【００４５】
本発明の一実験例では、Ｈｕｈ７肝癌細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせた後、ＴＲＡＩＬを時間帯別に処理した時に、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）伝達経路の活性化を確認することができた、ＪＮＫ阻害剤を処理した時に、ＴＩＰ４１タンパク質発現の抑制とＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスの減少が観察されるので、このようなＪＮＫ伝達経路がＴＩＰ４１タンパク質発現抑制を通じてＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスに重要な役割を担っていることを知ることができた（図４を参照）。
【００４６】
本発明の一実験例では、ＴＩＰ４１タンパク質発現抑制とＴＲＡＩＬ処理によって誘導されるアポトーシスが正常細胞株の死滅を誘導せず、癌細胞株に特異的に発生することを確認するために、自己アポトーシス経路に関与するｐ５３タンパク質の影響を確認した結果、ｐ５３タンパク質の１５と３９２番セリンにリン酸化が起きることを確認することができた。ただし、ｐ５３欠損ＨＣＴＣ同質遺伝子細胞株（ｐ５３−ｄｅｆｅｃｉｅｎｔ  ＨＣＴ１１６  ｉｓｏｇｅｎｉｃ  ＨＣＣ  ｃｅｌｌ）にＴＩＰ４１タンパク質発現を抑制した後にＴＲＡＩＬを処理してアポトーシスを誘導した時、アポトーシスが誘導されることを確認した。これは、ＴＩＰ４１とＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスは、ｐ５３非依存的経路を通じて起きることを示唆している（図５を参照）。
【００４７】
本発明の一実験例では、細胞株別にＴＲＡＩＬ受容体の発現パターンを確認した結果、肝癌、肺癌細胞株でＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）の発現が正常な細胞株よりも、肝癌、肺癌細胞株で過発現することを確認した。また、肝癌細胞株でＴＩＰ４１タンパク質発現を抑制させた後、肝癌細胞株でＴＲＡＩＬ受容体の発現を確認した結果、ＴＲＡＩＬ受容体の発現が類似であることを確認した。これは、ＴＩＰ４１のタンパク質発現の抑制を通じたアポトーシスの増加が、ＴＲＡＩＬ受容体発現の変化によるものでないことを示唆する（図６を参照）。
【００４８】
本発明の一実験例では、正常な細胞株のＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡとＴＲＡＩＬを処理した後、アポトーシスを観察した結果、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡ処理に関係なく、アポトーシスの差異がなく、アポトーシスに関与するタンパク質の活性に差異がないことを確認することができた。したがって、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせた後、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスは、癌細胞株に特異的に発生することを確認することができた（図７を参照）。
【００４９】
本発明の一実験例では、肝癌以外のＴＲＡＩＬに耐性を有する肺癌、大腸癌細胞株にｓｉＲＮＡを用いたＴＩＰ４１  ４ノックダウン（ｋｎｏｃｋ  ｄｏｗｎ）とＴＲＡＩＬ処理による、アポトーシス誘導が確認された（図８を参照）。
【００５０】
本発明の一実験例では、動物実験によるＴＩＰ４１の機能を確認するために、肝癌細胞株をヌードマウスの背中に移植した後、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡとＴＲＡＩＬを注入して、腫瘍のサイズの減少および癌細胞株の死滅を確認し、アポトーシスに関与するタンパク質の活性が、ＴＲＡＩＬのみを注入した時より、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡとＴＲＡＩＬをともに注入したした時に、アポトーシス関連タンパク質の活性化がさらに増加することを確認することができた（図９を参照）。
【００５１】
また、ＴＲＡＩＬセンシタイザーとしてＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡによって誘導されるアポトーシスの経路を確認するために、ＴＩＰ４１と結合するタンパク質として知られているＭＫＫ７とＰＰ２Ａｃ複合体間の相互作用を確認した（図１０と図１１を参照）。
【００５２】
また、より具体的にＴＩＰ４１と結合するＭＫＫ７の結合部位を確認するために、ＭＫＫ７の多様な部分を含む断片を作成し、その結合部位を確認した（図１２と図１３を参照）。
【００５３】
さらに、ＴＩＰ４１発現の抑制とＴＲＡＩＬ処理によって誘導されるアポトーシスの経路が前記ＴＩＰ４１とＭＫＫ７間の相互作用のためかどうかを確認するために、Ｈｕｈ７肝癌細胞株でＭＫＫ７の発現を抑制した後、アポトーシスを分析した。この場合、アポトーシスが減少する結果を確認することができた。より具体的には、本発明者らは、アポトーシスがＭＫＫ７活性によって誘導されるＪＮＫの活性化によって起こるのかどうか実験した時、ＴＩＰ４１の抑制によるＭＫＫ７／ＪＮＫ信号機序活性化が確認された（図１４を参照）。
【００５４】
したがって、ＴＲＡＩＬ耐性を示す肝癌細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡとＴＲＡＩＬを処理した時、ＴＲＡＩＬに対する耐性がある肝癌、肺癌、大腸癌でもアポトーシスが誘導された。また、腫瘍を移植したマウスにＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡとＴＲＡＩＬを注入した時、腫瘍のサイズの減少および癌細胞の死滅誘導が観察された。したがって、ＴＩＰ４１タンパク質発現または活性阻害剤は、ＴＲＡＩＬ感受性増進用組成物の有効成分として有用に使用することができる。
【００５５】
前記の組成物は、ＴＩＰ４１の発現、または活性阻害剤に同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上含むことができる。
【００５６】
前記の組成物は、臨床投与時に経口または非経口で投与が可能であり、非経口投与時は、腹腔内注射、直腸内注射、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射、子宮内硬膜注射、脳血管内注射や胸部内注射で投与することができ、一般的な医薬品製剤の形で使用することができる。
【００５７】
前記の組成物は、単独で、または手術、放射線療法、ホルモン療法、化学療法および生物学的反応調節剤を使用する方法等と併用して使用することができる。
【００５８】
前記の組成物の一日の投与量は、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇで、好ましくは０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇであり、１日１回ないし数回に分けて投与することが好ましいが、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度等によってその範囲が多様である。
【００５９】
本発明の組成物は、実際の臨床投与時に非経口の多様な剤形で投与することができ、製剤化する場合は、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤や賦形剤を用いて調剤する。非経口投与のための製剤には、殺菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座薬が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどを使用することができる。座薬の基剤としては、ハードファット（ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ））、マクロゴール、ツイーン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを使用することができる。
【００６０】
また、本発明は、ＴＩＰ４１タンパク質の発現や活性抑制剤を含有する抗癌補助剤を提供する。
【００６１】
前記のＴＩＰ４１タンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸を有していることが好ましいか、これに限定されない。
【００６２】
前記のＴＩＰ４１タンパク質発現または活性阻害剤は、ＴＲＡＩＬセンシタイザー（ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）であることが好ましいが、これに限定されない。
【００６３】
前記のＴＩＰ４１タンパク質の発現の抑制剤は、ＴＩＰ４１遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）および低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）からなる群から選択されたいずれか１つであることが好ましいか、これに限定されない。
【００６４】
前記のＴＩＰ４１タンパク質の活性抑制剤は、ＴＩＰ４１タンパク質に特異的に結合する化合物、ペプチド、ペプチドミメティックス、アプタマー、抗体、および天然物からなる群から選択されたいずれか１つであることが好ましいか、これに限定されない。
【００６５】
前記の癌は、肝癌、大腸癌、子宮頸癌、腎癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、癌、肺癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、血液の癌および膵臓癌からなる群から選択されるいずれか一つであることが好ましく、肝癌、肺癌または大腸癌であることがさらに好ましいがこれに限定されず、ＴＲＡＩＬに対する耐性を有する癌はすべて含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００６６】
また、前記の抗癌補助剤において、ＴＩＰ４１タンパク質の発現または活性阻害剤は、ＴＲＡＩＬ感受性を増進することが好ましいが、これに限定されない。
【００６７】
本発明の実験例では、ＴＩＰ４１のタンパク質が肝癌組織で過発現し（図１を参照）、Ｈｕｈ７肝癌細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせた後、ＴＲＡＩＬを時間帯別に処理した場合、アポトーシスがＴＲＡＩＬのみ処理した特よりもさらに増加した（図２を参照）。また、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡとＴＲＡＩＬ媒介アポトーシス経路を調べるためにカスパーゼ−３、−８、−９およびポリ（ＡＤＰリボース）重合酵素活性と、ＪＮＫ伝達経路関連タンパク質およびｐ５３タンパク質を観察した結果、アポトーシスはＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡとＴＲＡＩＬをともに処理した時にＴＲＡＩＬを単独で処理した時よりも、アポトーシスがさらに増加しており、これは癌細胞株特異的アポトーシスであることを確認することができた（図３、図４、図５および図７を参照）。また、ＴＩＰ４１タンパク質の発現を抑制した場合、ＴＲＡＩＬ受容体の発現は変化がないことを確認した（図６を参照）。また、肝癌以外のＴＲＡＩＬに耐性を有する他の細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡとＴＲＡＩＬを処理し、アポトーシスが誘導されることを確認した（図８を参照）。さらに、ヌードマウスの背中に移植した腫瘍のサイズが、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡとＴＲＡＩＬを注入した時に、ＴＩＰ４１、ＴＲＡＩＬ  ｓｉＲＮＡを単独注入した時よりも減少し、腫瘍組織から分離した、癌細胞株のアポトーシスとアポトーシスに関与するタンパク質の活性化が、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡとＴＲＡＩＬを注入した時に最も多く観察された。
【００６８】
したがって、ＴＲＡＩＬ耐性を示す肝癌細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡとＴＲＡＩＬを処理した時、癌細胞株特異的アポトーシスＴＲＡＩＬに対する耐性を有する肝癌、肺癌、大腸癌でもアポトーシスが誘導され、腫瘍を移植したマウスでもＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡとＴＲＡＩＬを注入した時、腫瘍のサイズの減少および癌細胞株の死滅を誘導する効果を有するので、ＴＩＰ４１タンパク質の発現または活性抑制剤を含有する抗癌補助剤として有用に使用できる。
【００６９】
前記の抗癌補助剤は、ＴＩＰ４１の発現または活性阻害剤にさらに同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上含むことができる。
【００７０】
前記の抗癌補助剤は、臨床投与時に経口または非経口で投与が可能であり、非経口投与時は、腹腔内注射、直腸内注射、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射、子宮内硬膜注射、脳血管内注射や胸部内注射で投与することができ、一般的な医薬品製剤の形で使用することができる。
【００７１】
前記の抗癌補助剤は、単独で、または手術、放射線療法、ホルモン療法、化学療法および生物学的反応調節剤を使用する方法等と併用して使用することができる。
【００７２】
前記の抗癌補助剤の一日の投与量は、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇで、好ましくは０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇであり、１日１回ないし数回に分けて投与することが好ましいが、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度等によってその範囲が多様である。
【００７３】
本発明の抗癌補助剤は、実際の臨床投与時に非経口の多様な剤形で投与することができ、製剤化する場合は、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤や賦形剤を用いて調剤する。非経口投与のための製剤には、殺菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座薬が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどを使用することができる。座薬の基剤としては、ハードファット、マクロゴール、ツイーン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを使用することができる。
【００７４】
また、本発明は、本発明の抗癌補助剤を含む癌の治療または予防用組成物を提供する。
【００７５】
本発明の実施例では、本発明のＴＩＰ４１の発現または活性抑制剤をＴＲＡＩＬとともに処理した時、ＴＲＡＩＬに耐性を有する多様な肝癌、肺癌、大腸癌細胞株の癌特異的なアポトーシスが増加した。また、本発明のＴＩＰ４１の発現または活性抑制剤の癌特異的アポトーシスの生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）効果が、腫瘍を移植したヌードモデルで観察された。
【００７６】
したがって、本発明のＴＩＰ４１の発現または活性抑制剤を含有する抗癌補助剤は、癌の治療または予防用組成物の有効成分として有用に使用できる。
【００７７】
前記の癌の治療または予防用組成物は、ＴＩＰ４１の発現または活性阻害剤に同一または類似の機能を有する有効成分を１種以上を含むことができる。
【００７８】
前記の癌の治療または予防用組成物は、臨床投与時に経口または非経口で投与が可能であり、非経口投与時は、腹腔内注射、直腸内注射、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射、子宮内硬膜注射、脳血管内注射や胸部内注射で投与することができ、一般的な医薬品製剤の形で使用することができる。
【００７９】
前記の癌の治療または予防用組成物は、単独で、または手術、放射線療法、ホルモン療法、化学療法および生物学的反応調節剤を使用する方法等と併用して使用することができる。
【００８０】
前記の癌の治療または予防用組成物の一日の投与量は、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇで、好ましくは０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇであり、１日１回ないし数回に分けて投与することが好ましいが、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度等によってその範囲が多様である。
【００８１】
本発明の癌の治療または予防用組成物は、実際の臨床投与時に非経口の多様な剤形で投与することができ、製剤化する場合は、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤や賦形剤を用いて調剤する。非経口投与のための製剤には、殺菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座薬が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどを使用することができる。座薬の基剤としては、ハードファット、マクロゴール、ツイーン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを使用することができる。
【００８２】
また、本発明は、癌の予防や治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００８３】
本発明の癌の予防または治療剤のスクリーニング方法は、下記の工程を含む方法であることが好ましいが、これに限定されない。
（１）実験群として、癌細胞株に被検物質を処理する工程、
（２）工程（１）の処理された細胞でＴＩＰ４１とＰＰ２Ａｃタンパク質間の結合水準またはＴＩＰ４１とＭＫＫ７タンパク質間の結合水準を確認する工程、および
（３）工程（２）のＴＩＰ４１とＰＰ２Ａｃタンパク質間の結合水準またはＴＩＰ４１とＭＫＫ７タンパク質間の結合水準を対照群と比較して減少させる被険物質を選別する工程。
【００８４】
前記の癌は、肝癌、大腸癌、子宮頸癌、腎癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、癌、肺癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、血液の癌や膵臓癌からなる群から選択されるいずれか一つであることが好ましく、肝癌、肺癌または大腸癌であることがさらに好ましいがこれに限定されず、ＴＲＡＩＬに対する耐性を有する癌はすべて含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００８５】
本発明の癌の予防や治療剤のスクリーニング方法において、請求項第１６項において、工程（２）のタンパク質の結合水準は、免疫沈降法（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット法（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＧＳＴ）プルダウン分析、タンパク質チップ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｉｐ）、蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）、蛍光蛋白質再構成法（Ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ、ＢｉＦＣ）および酵母ツーハイブリッド（Ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ、Ｙ２Ｈ）からなる群から選択されたいずれか１つで測定することが好ましいが、これに限定されない。
【００８６】
また、本発明は、癌の予防または治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００８７】
本発明の癌の予防や治療剤のスクリーニング方法は、下記の工程を含む方法であることが好ましいが、これに限定されない。
（１）実験群として、癌細胞株に被検物質を処理する工程、
（２）工程（１）で処理された細胞株でＭＫＫ７タンパク質の活性程度を測定する工程、および  
（３）工程（２）のＭＫＫ７タンパク質の活性を対照群と比較して増加した被険物質を選別する工程を含む、癌の予防または治療剤のスクリーニング方法。
【００８８】
前記の癌の予防または治療剤のスクリーニング方法において、ＭＭＫ７タンパク質の活性程度は、免疫蛍光法、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、質量分析およびタンパク質チップからなる群から選択されたいずれか１つで測定することが好ましいが、これに限定されない。
【００８９】
また、本発明は、癌の予防または治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００９０】
本発明の癌の予防または治療剤のスクリーニング方法は、下記の工程を含む方法であることが好ましいが、これに限定されない。
（１）実験群として、癌細胞株に被検物質を処理する工程、
（２）工程（１）で処理された細胞株でＰＰ２Ａｃタンパク質の発現程度を測定する工程、および
（３）工程（２）のＰＰ２Ａｃタンパク質の発現量を対照群と比較して減少させた被検物質を選別する工程。
【００９１】
前記の癌は、肝癌、大腸癌、子宮頸癌、腎癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、癌、肺癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、血液の癌や膵臓癌からなる群から選択されるいずれか一つであることが好ましく、肝癌、肺癌または大腸癌であることがさらに好ましいがこれに限定されず、ＴＲＡＩＬに対する耐性を有する癌はすべて含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００９２】
本発明の癌の予防または治療剤のスクリーニング方法において、工程（２）のＰＰ２Ａｃタンパク質の発現程度は、逆転写重合酵素の連鎖反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＲＴ−ＰＣＲ）、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学、ウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）および流細胞分析法（ＦＡＣＳ）からなる群から選択されたいずれか１つで測定することが好ましいが、これに限定されない。
【００９３】
また、本発明は、薬学的に有効な量のＴＩＰ４１の発現または活性抑制剤をＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスと関連した疾病にかかった個体に投与する工程を含む、ＴＲＡＩＬへの感受性を増進させる方法を提供する。
【００９４】
前記のＴＩＰ４１タンパク質の発現または活性阻害剤は、ＴＲＡＩＬセンシタイザーであることが好ましいが、これに限定されない。
【００９５】
前記のＴＩＰ４１タンパク質の発現の抑制剤は、ＴＩＰ４１遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡおよび低分子ヘアピン型ＲＮＡからなる群から選択されるいずれか１つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００９６】
前記のＴＩＰ４１タンパク質の活性剤は、ＴＩＰ４１タンパク質に特異的に結合する化合物、ペプチド、ペプチドミメティックス、アプタマー、抗体、および天然物から選択されるいずれか１つであることを特徴とするが、これに限定されない。
【００９７】
前記のＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスと関連する疾病は、癌、炎症性疾患や自己免疫疾患であることが好ましいが、これに限定されない。
【００９８】
前記の癌は、肝癌、大腸癌、子宮頸癌、腎癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、脳腫瘍、肺癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、血液の癌および膵臓癌からなる群から選択される１つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００９９】
また、前記の炎症性疾患は、皮膚炎、アレルギー、アトピー、結膜炎、歯周炎、鼻炎、中耳炎、咽頭炎、扁桃腺炎、肺炎、胃潰瘍、胃炎、クローン病、大腸炎、痔、痛風、強直性脊椎炎、リウマチ熱、ループス、線維筋痛症、乾癬性関節炎、骨関節炎、関節リウマチ、肩関節周囲炎、腱炎、腱鞘炎、腱周囲炎、筋肉炎、肝炎、膀胱炎、腎臓炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、急性および慢性の炎症性疾患からなる群から選択される１つであることが好ましいが、これに限定されない。
【０１００】
また、前記の自己免疫疾患は、関節リウマチ、多発性硬化症、重度の筋無力症、クレブス病、橋本氏甲状腺炎、アジソン病、白斑症、硬皮症、グッドパスチャー症候群、ベーチェット病、クローン病、強直性脊椎炎、ブドウ膜炎、血小板減少性紫斑病、尋常性天疱瘡、幼児糖尿病、自己免疫溶血性貧血、クリオグロブリン血症、副腎白質異栄養症および全身性紅斑性狼瘡からなる群から選択される１つであることが好ましいが、これに限定されない。
【０１０１】
本発明の一実施例では、本発明のＴＩＰ４１の発現または活性抑制剤をＴＲＡＩＬとともに処理した時、ＴＲＡＩＬに耐性を有する多様な肝癌、肺癌、大腸癌細胞株の癌特異的なアポトーシスが増加した。また、本発明のＴＩＰ４１発現または活性抑制剤の癌特異的アポトーシスの生体内（インビボ）効果が腫瘍を移植したヌードモデルで観察された。
【０１０２】
したがって、本発明のＴＩＰ４１の発現または活性阻害剤は、ＴＲＡＩＬに対する感受性を増進させる手段として有用に用いることができる。
【０１０３】
また、本発明は、薬学的に有効な量のＴＩＰ４１の発現または活性抑制剤を個体に投与する工程を含む、癌の予防方法を提供する。
【０１０４】
また、本発明は、薬学的に有効な量のＴＩＰ４１の発現または活性抑制剤を抗癌補助剤として、癌にかかった個体に投与する工程を含む、癌の治療方法を提供する。
【０１０５】
前記の個体は、脊椎動物、好ましくは哺乳類であり、より好ましくは、ラット、ウサギ、ギニアピッグ、ハムスター、犬、猫などの実験動物で、最も好ましいのは、チンパンジー、ゴリラのような類人猿動物である。
【０１０６】
前記のＴＩＰ４１の発現または活性抑制剤の治療学的に有効な量は、いくつかの要素は、例えば投与方法、目的部位、患者の状態によって異なり得る。したがって、人体に使用時の投与量は、安全性と効率性を考慮して適正な量に決定する必要がある。動物実験によって決定された有効な量からヒトに使用される量を推定することも可能である。有効な量の決定時に考慮する事項は、例えば、Ｈａｒｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｌｉｍｂｉｒｄ，ｅｄｓ．，   Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ'ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ  ｅｄ．（２００１年），Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；およびＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ  ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄ．（１９９０年），Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．に記述されている。
【０１０７】
本発明のＴＩＰ４１発現または活性阻害剤は、生物学的製剤に通常使用される担体、希釈剤、賦形剤、またはこれらを二つ以上組み合わせたものを含むことができる。薬学的に許容可能な担体は、ＴＩＰ４１の発現または活性抑制剤を生体内に伝達するのに適合したものなら特別に制限されず、例えば、Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，１３ｔｈ  ｅｄ．，Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．Ｉｎｃ．に記載されている化合物、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝生理食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、およびこれらの成分中、１成分以上を混合して使用でき、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など、他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤をさらに添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。さらに、当分野の適正な方法で、またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ，１８ｔｈ，１９９０年）に開示されている方法を用いて、それぞれの疾患や成分によって好ましく製剤化することができる。
【０１０８】
本発明のＴＩＰ４１発現または活性阻害剤にさらに同一または類似の機能を有する有効成分を１種以上含むことができる。本発明の組成物は、組成物の総重量に対して前記のタンパク質を０．０００１ないし１０重量％、好ましくは０．００１〜１重量％含む。
【０１０９】
本発明のＴＩＰ４１発現または活性阻害剤は、目的とする方法によって非経口投与（たとえば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）したり経口投与したりでき、投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与、投与方法、排泄率と疾患の重症度によってその範囲が多様である。本発明の組成物の一日の投与量は、０．００１μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇで、好ましくは０．０１μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇであり、１回ないし数回に分けて投与することが好ましい。
【０１１０】
また、本発明は、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスと関連する疾病治療時のＴＲＡＩＬ感受性を増進するために使用するためのＴＩＰ４１の発現または活性抑制剤を提供する。
【０１１１】
さらに、本発明は、抗癌補助剤として使用するためのＴＩＰ４１の発現または活性抑制剤を提供する。
【０１１２】
前記のＴＩＰ４１タンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を特徴とすることが好ましいが、これに限定されない。
【０１１３】
前記のＴＩＰ４１タンパク質発現または活性阻害剤は、ＴＲＡＩＬセンシタイザーであることが好ましいが、これに限定されない。
【０１１４】
前記のＴＩＰ４１タンパク質の発現の抑制剤は、ＴＩＰ４１遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡおよび低分子ヘアピン型ＲＮＡからなる群から選択されたいずれか１つであることが好ましいが、これに限定されない。
【０１１５】
また、前記のＴＩＰ４１タンパク質の活性剤は、ＴＩＰ４１タンパク質に特異的に結合する化合物、ペプチド、ペプチドミメティックス、アプタマー、抗体、および天然物から選択されるいずれか１つであることを特徴とするが、これに限定されない。
【０１１６】
前記のＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスと関連する疾病は、癌、炎症性疾患または自己免疫疾患であることが好ましいが、これに限定されない。
【０１１７】
前記の癌は、肝癌、大腸癌、子宮頸癌、腎癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、脳腫瘍、肺癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、血液の癌および膵臓癌からなる群から選択される１つであることが好ましいが、これに限定されない。
【０１１８】
また、前記の炎症性疾患は、皮膚炎、アレルギー、アトピー、結膜炎、歯周炎、鼻炎、中耳炎、咽頭炎、扁桃腺炎、肺炎、胃潰瘍、胃炎、クローン病、大腸炎、痔、痛風、強直性脊椎炎、リウマチ熱、ループス、線維筋痛症、乾癬性関節炎、骨関節炎、関節リウマチ、肩関節周囲炎、腱炎、腱鞘炎、腱周囲炎、筋肉炎、肝炎、膀胱炎、腎臓炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、急性および慢性の炎症性疾患からなる群から選択される１つであることが好ましいが、これに限定されない。
【０１１９】
また、前記の自己免疫疾患は、関節リウマチ、多発性硬化症、重度の筋無力症、クレブス病、橋本氏甲状腺炎、アジソン病、白斑症、硬皮症、グッドパスチャー症候群、ベーチェット病、クローン病、強直性脊椎炎、ブドウ膜炎、血小板減少性紫斑病、尋常性天疱瘡、幼児糖尿病、自己免疫溶血性貧血、クリオグロブリン血症、副腎白質異栄養症および全身性紅斑性狼瘡からなる群から選択される１つであることが好ましいが、これに限定されない。
【０１２０】
以下、本発明を実験例と製造例によって詳しく説明する。ただし、下記の実験例と製造例は、本発明を説明するだけのもので、本発明の内容が下記の実験例と製造例によって限定されるものではない。
【０１２１】
＜実験例１＞肝癌および肺癌組織でのＴＩＰ４１タンパク質発現の確認
＜１−１＞免疫染色方法を用いたＴＩＰ４１発現の確認
患者の肝癌組織（忠南大学校医科大学キム・ジンマン教授チーム）を１０％中性バッファーホルマリン溶液で固定して、パラフィンを添加した後、５μｍ厚に切断した。切断されたセクション（ｓｅｃｔｉｏｎ）を１０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）で、４分間処理した後、３％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）が含まれている０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ、ｐＨ７．４）に３０分間置いた。前記のセクションをＰｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＤＡＫＯ）で、常温で２０分間処理した後、アンチＴＩＰ４１抗体と３０分間反応させた。０．１Ｍ  ＴＢＳＴ（０．０１％  ツイーン２０を含む０．１Ｍ  ＴＢＳ）で洗浄し、セクションをエヌビジョンアンチウサギポリマー（ｎＶｉｓｉｏｎ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｍｅｒ）（ＤＡＫＯ）と３０分間反応させた。ペルオキシダーゼが結合した抗体を３，３'−ジアミノベンジジン色原体基質溶液（３，３  '−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＤＡＢ）ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＤＡＫＯ）と反応させて、可視化した。顕微鏡下で観察して、適切に染色された時、０．１Ｍ  ＴＢＳで洗浄して反応を終了させた後、オリンパスＢＸ５１顕微鏡（オリンパス、日本）を用いて観察し、オリンパスＤＰ７０カメラ（オリンパス、日本）でイメージを得た。
【０１２２】
その結果、一般の肝臓組織に比べて肝癌組織でＴＩＰ４１が過発現することを確認することができた（図１のＡ）。また、肝癌、肺癌患者の周辺正常組織に比べて、ＴＩＰ４１タンパク質がこれらの患者の癌組織で過発現した（表１および表２）。ＴＩＰ４１発現と癌段階間の関係分析は、ＴＩＰ４１陽性発現がＮＳＣＬＣ、肺癌の高い段階と顕著に関連していることを示し（Ｐ＝０．０４５）、これはＴＩＰ４１の発現とＮＳＣＬＣ進行との間の関係を示す（表２）。このデータは、ＴＩＰ４１発現がＨＣＣおよびＮＳＣＬＣ細胞で過発現することを示す。
【０１２３】
（表１）肝癌（ＨＣＣ）臨床組織でのＴＩＰ４１の発現量（ＩＨＣ方法）
0005551793.tif 000002
【０１２４】
（表２）肺癌（非小細胞性肺癌、ＮＳＣＬＣ）の臨床組織での、ＴＩＰ４１の発現量（ＩＨＣ方法）
0005551793.tif 000003
【０１２５】
＜１−２＞ウエスタンブロットを用いたＴＩＰ４１発現の確認
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）によって発病した肝癌患者７人とそうでない肝癌患者７人の肝癌組織および隣接正常組織（忠南大学校医科大学）から抽出されたタンパク質を用いて、ＴＩＰ４１タンパク質発現量をウエスタンブロット方法を用いて確認した。
【０１２６】
組織を溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）［２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）（ｐＨ７．５）、１５０  ｍＭ塩化ナトリウム（Ｎａｃｌ）、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２ｍＭエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、１％トリトンＸ−１００、１０％のグリセロール、プロテアーゼ阻害剤のカクテル、ホスファターゼ阻害剤のカクテルＩ／ＩＩ］に組織を溶解させた後、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞の残骸（ｃｅｌｌ  ｄｅｂｒｉｓ）を削除し、タンパク質を得た。タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて分子量によって分離し、分離されたタンパク質をニトロセルロース膜でトランスファーさせた後、５％のスキムミルクで１時間の非特異的反応を防ぐためにブロックした。１時間後、ニトロセルロース膜は１：２，０００ ＴＩＰ４１（Ｂｅｔｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，米国）および１：５，０００ＧＡＰＤＨ（Ａｂｆｏｒｎｔｉｅｒ，韓国）で４℃で１２時間以上の反応後、０．１％のＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ  ツイーン−２０）で１０分ずつ３回洗浄した後、抗マウス（Ｐｉｅｒｃｅ，米国）および抗ウサギ（Ｐｉｅｒｃｅ，米国）二次抗体を常温で１時間反応させた。それを、０．１％のＴＢＳＴで１０分ずつ３回洗浄して、化学発光試薬を用いて発現を確認した。各組織の定量的対照群にハウスキーピング遺伝子のＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）を用いた。
【０１２７】
その結果、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）によって発病した肝癌患者７人とそうでない肝癌患者７人の肝癌組織でＴＩＰ４１が過発現されていることを確認することができた（図１のＢ）。
【０１２８】
＜１−３＞肝癌細胞株の培養
韓国の細胞株銀行から分譲されたヒトのＨｕｈ７肝癌細胞株は、１０％の牛胎児血清を含んだダルベッコの改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅａｇｌｅ'ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）で３７℃、５％ＣＯ２で培養した。ＳｉＲＮＡをトランスフェクションさせるためにＨｕｈ７肝癌細胞株１×１０６細胞／１００ｍｍ皿に植えて２４時間培養し、その後、トランスフェクションを行なった。
【０１２９】
＜１−４＞ｓｉＲＮＡのトランスフェクション
ＴＩＰ４１のＴＲＡＩＬセンシタイザーとしての機能を確認するためにｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  ＲＮＡｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，米国）を選別して効果的にＴＩＰ４１タンパク質の発現を抑制する配列を構築した。
【０１３０】
前記の＜１−３＞で培養された２×１０５肝癌細胞株を６０ｍｍ培養皿に植えてリポフェクタミンＲＮＡｉｍａｘ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造元の指示に従って、ｓｉＲＮＡ（Ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）をトランスフェクションした。７２時間後に、トランスフェクションさせた細胞はＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）を０、０．５、１、２、３、４、６時間処理した後、細胞株をそれぞれの時間帯に溶解バッファーを用いて、細胞株からタンパク質を得てウエスタンブロットした。溶解バッファー（［２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２ｍＭエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、１％トリトンＸ−１００、１０％のグリセロール、プロテアーゼ阻害剤のカクテル、ホスファターゼ阻害剤のカクテルＩ／ＩＩ］で細胞を溶解させた後、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞の残骸を削除して、タンパク質を得た。タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分子量によって分離した後、分離されたタンパク質をニトロセルロース膜でトランスファーさせた後、５％のスキムミルクで１時間非特異的反応を防ぐためにブロックした。１時間後、ニトロセルロース膜は１：２，０００ ＴＩＰ４１（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）および１：５，０００ チューブリン（Ｓｉｇｍａ  ａｌｄｒｉｃｈ、米国）で４℃で１２時間以上の反応後、０．１％のＴＢＳＴで１０分ずつ３回洗浄した後、抗マウス（Ｐｉｅｒｃｅ、米国）および抗ウサギ（Ｐｉｅｒｃｅ、米国）の二次抗体を常温で１時間反応させた。それを、０．１％のＴＢＳＴで１０分ずつ３回洗浄し、化学発光試薬を用いて発現を確認した。各組織の定量的対照群にハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨを用いた。
【０１３１】
使用されたＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡ配列は、５'−ＣＣＴ  ＡＡＴ  ＧＡＡ  ＡＴＡ  ＴＣＣ  ＣＡＧ  ＴＡＴ−３'（配列番号２）だった。
【０１３２】
その結果、ＴＲＡＩＬ処理の有無に関係なく、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡを処理した後、ＴＩＰ４１タンパク質の発現が完全に抑制されることを確認することができた（図１のＣ）。
【０１３３】
＜実験例２＞ＴＩＰ４１タンパク質発現の抑制とＴＲＡＬ処理によるアポトーシス誘導
＜２−１＞核染色法を用いたＴＩＰ４１タンパク質発現抑制で誘導されるアポトーシス分析
６ウェルプレートで前記実験例＜１−１＞の方法で培養されたＴＩＰ４１発現抑制された細胞株を２×１０５細胞／ウェルずつ分注した。２４時間後、ＴＲＡＩＬを１００ｎｇ／ｍｌで各々０、２、４、６、８時間処理した後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を５μｇ／ｍｌで３０分間室温で染色した。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で核を染色した後、蛍光顕微鏡で死滅した細胞数をカウントして、アポトーシスを測定した。
【０１３４】
その結果、Ｈｕｈ７肝癌細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡとＴＲＡＩＬを同時に処理した時、ＴＲＡＩＬのみを処理した時よりアポトーシスが増加した。ＴＲＡＩＬを処理する時間が長くなるほど、アポトーシスが増加し、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡを処理した群では、対照群にｓｉＲＮＡを処理時より約３０％程度のアポトーシスの増加が観察された。これにより、Ｈｕｈ７肝癌細胞株でＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡの処理は、ＴＲＡＩＬ抵抗を減少させることを確認することができた（図２のＡ）。
【０１３５】
＜２−２＞ＦＡＣＳを用いたＴＩＰ４１タンパク質発現抑制で誘導されるアポトーシスの分析
前記の実験例＜１−１＞の方法で培養したＨｕｈ７肝癌細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせて、細胞内ＴＩＰ４１発現量を減少させた後、ＴＲＡＩＬを１００ｎｇ／ｍｌで処理した後、０、２、４、６、８時間帯にアポトーシスをアネキシンＶ−ＦＩＴｃ／ＰＩ染色法で死滅した細胞株と正常細胞株を区別して染色した後、ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）を用いてアポトーシスを測定した。
【０１３６】
アポトーシスを測定するために、トリプシンＥＤＴＡを用いて細胞株を得た後、ＦＩＴｃ融合したアネキシンＶ（５０μｇ／ｍｌ）とＰＩ（ヨウ化プロピジウム）（５０ｎｇ／ｍｌ）で２０分間染色後、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）を用いて細胞株を分離し、アネキシンＶ−ＦＩＴｃ／ＰＩ染色された細胞株の比率を分析した。
【０１３７】
その結果、ＴＲＡＩＬを時間別に処理した後、アポトーシスが起こることをＦＡＣＳ分析を通じて確認することができた（図２のＢ）、同一の実験方法で、ＴＲＡＩＬを０、２５、５０、１００、２００ｎｇ／ｍｌ濃度別に４時間処理した時、処理濃度によってアポトーシスが増加することを確認することができた（図２のＣ）。
【０１３８】
＜実験例３＞ＴＩＰ４１タンパク質発現の抑制およびＴＲＡＩＬ処理によって誘導されたアポトーシス経路確認
＜３−１＞カスパーゼの活性化
ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡとＴＲＡＩＬを処理した後に誘導されるアポトーシスの経路を確認するために、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせた７２時間後、ＴＲＡＩＬを１００ｎｇ／ｍｌで０、０．５、１、２、４、６時間処理した後、カスパーゼ−３、−９、−９およびポリ（ＡＤＰリボース）重合酵素（ＰＡＲＰ）の発現をウエスタンブロットを用いて測定した。
【０１３９】
前記の実験例＜１−１＞で培養した細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせた７２時間後、ＴＲＡＩＬを１００ｎｇ／ｍｌで時間帯別に処理した。溶解バッファー［２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２ｍＭエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、１％トリトンＸ−１００、１０％のグリセロール、プロテアーゼ阻害剤のカクテル、ホスファターゼ阻害剤のカクテルＩ／ＩＩ］で細胞を溶解させた後、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞の残骸を削除してタンパク質を得た。タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて分子量によって分離した後、分離されたタンパク質をニトロセルロース膜でトランスファーさせた後、５％のスキムミルクで１時間非特異的反応を防ぐためにブロックした。１時間後、ニトロセルロース膜は１：１，０００ カスパーゼ−３、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９および１：２，０００ ＰＡＲＰ（ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）で４℃で１２時間以上の反応させた後、０．１％のＴＢＳＴで１０分ずつ３回洗浄した後、抗マウス（Ｐｉｅｒｃｅ、米国）および抗ウサギ（Ｐｉｅｒｃｅ、米国）の二次抗体を常温で１時間反応させた。これを、０．１％のＴＢＳＴで１０分ずつ３回洗浄し、化学発光試薬を用いて発現を確認した。
【０１４０】
その結果、ＴＩＰ４１タンパク質の発現が抑制された後、ＴＲＡＩＬの時間別処理によってカスパーゼ−９、−８、−３とＰＡＲＰが活性化していることを確認することができた（図３のＡ）。これから、ＴＩＰ４１のタンパク質発現抑制によるアポトーシスがＴＲＡＩＬの濃度および時間に依存的に増加することを確認することができた。
【０１４１】
＜３−２＞ミトコンドリアのシトクロムＣの細胞質への放出
アポトーシスの経路を確認するために、ミトコンドリア（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）のシトクロムＣ（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｃ）が細胞質に放出されるかどうかを確認するために、細胞分画（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）およびウエスタンブロットを用いた。前記の実験例＜１−１＞の方法で培養したＨｕｈ７肝癌細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせて、細胞内ＴＩＰ４１発現量を減少させた後、６０ｍｍ皿にＴＩＰ４１の発現が抑制された細胞株を２×１０６細胞／皿に分注した。２４時間後、ＴＲＡＩＬを１００ｎｇ／ｍｌで、各々０、１、２、４時間処理した後、細胞分画を行なった。細胞分画は、Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）を用いて行ない、キット（ｋｉｔ）は、４種類のバッファーで構成され、各バッファーの使用に応じて細胞質、ミトコンドリア、核および細胞骨格タンパク質の順で細胞分画が分離された。溶出バッファー１（ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  １）５００μｌを各々の細胞株に添加して、４℃で１０分間撹拌した後、遠心分離して細胞質分画を得、溶出バッファー２  ５００μｌを４℃で３０分間撹拌した後、遠心分離してミトコンドリアの分画を得た。分画された細胞質とミトコンドリアにウエスタンブロットを用いた。
【０１４２】
前記の実験例＜１−１＞の培養細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせた７２時間後、ＴＲＡＩＬを０、２、４、６時間に処理した。溶解バッファー（ｌｙｓｉｓバッファー）［２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、２ｍＭエチレングリコール四酢酸、１％トリトンＸ−１００、１０％のグリセロール、プロテアーゼ阻害剤のカクテル、ホスファターゼ阻害剤のカクテルＩ／ＩＩ］で細胞を溶解させた後、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞の残骸を削除してタンパク質を得た。タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて分子量によって分離した後、分離されたタンパク質をニトロセルロース膜にトランスファーさせた後、５％のスキムミルクで１時間非特異的反応を防ぐためにブロックした。細胞質分画マーカーには、チューブリンを用いて、ミトコンドリアはペルオキシレドキシン  ＩＩＩを用いた。１時間後、ニトロセルロース膜は１：１，０００ シトクロムＣ（ＢＤ、米国）、１：５，０００ チューブリン（Ｓｉｇｍａ  ａｌｄｒｉｃｈ，米国）および１：２，０００ ペルオキシレドキシン３（Ａｂｆｒｏｎｔｉｅｒ、韓国）で４℃で１２時間以上反応させた後、０．１％のＴＢＳＴで１０分ずつ３回洗浄した後、抗マウス（Ｐｉｅｒｃｅ、米国）および抗ウサギ（Ｐｉｅｒｃｅ，米国）の二次抗体を１：２，０００の比率で常温で１時間反応させた。これを、０．１％のＴＢＳＴで１０分ずつ３回洗浄し、化学発光試薬を用いて発現を確認した。
【０１４３】
その結果、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡを処理した後、シトクロムＣが細胞質に放出されることを確認することができた（図３のＢ）。つまり、カスパーゼ−８と−９が活性化して、ミトコンドリオン（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ）からの細胞質にシトクロムＣが放出されることを確認した。これらの結果は、Ｈｕｈ７肝癌細胞株でＴＩＰ４１タンパク質発現抑制とＴＲＡＩＬ処理によって誘導されるアポトーシスがカスパーゼ／ミトコンドリア依存性アポトーシス経路と密接に関連していることを示す。
【０１４４】
＜実験例４＞ＴＩＰ４１タンパク質発現抑制およびＴＲＡＩＬ処理で誘導されるＪＮＫ伝達経路の活性
＜４−１＞ＴＩＰ４１タンパク質発現抑制およびＴＲＡＩＬ処理で誘導されるＪＮＫ伝達経路のタンパク質活性
自己アポトーシスの場合、ＪＮＫリン酸化による経路が多くの論文で報告されており、ｐ３８の活性化もまたアポトーシスを誘導する可能性があるという報告があった。
【０１４５】
ＪＮＫおよびｐ３８の活性がアポトーシスを誘導すると報告されている。これにより、前記の＜実験例＞で確認されたＴＩＰ４１タンパク質発現抑制とＴＲＡＩＬ処理で誘導されるアポトーシスとミトゲン活性化プロテインキナーゼ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＭＡＰ）伝達経路、特にＪＮＫとｐ３８との関連性を確認するために、Ｈｕｈ７肝癌細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせた後、ＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）を、０、１、２、４時間処理した。その後、ウエスタンブロットを用いて、ＴＩＰ４１タンパク質発現抑制とＴＲＡＩＬ処理で誘導されるアポトーシスとＪＮＫとｐ３８との関連性を確認した。
【０１４６】
前記の実験例＜１−１＞の培養細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした７２時間後、ＴＲＡＩＬを前記の時間帯別に処理した。溶解バッファー［２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、２ｍＭエチレングリコール四酢酸、１％トリトンＸ−１００、１０％のグリセロール、プロテアーゼ阻害剤のカクテル、ホスファターゼ阻害剤のカクテルＩ／ＩＩ］で細胞を溶解させた後、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞の残骸を削除してタンパク質を得た。タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて分子量によって分離した後、分離したタンパク質をニトロセルロース膜でトランスファーさせた後、５％のスキムミルクで１時間非特異的反応を防ぐためにブロックした。１時間後、ニトロセルロース膜は１：１，０００の比率でｐ−ＭＫＫ７（ｃＳＴ  Ｉｎｃ．，米国）とｐ−ｐ３８（ｃＳＴ  Ｉｎｃ．，米国）を用い、１：１，０００の比率でｐ−ＪＮＫ（ｃＳＴ  Ｉｎｃ．，米国）を用い、１：５，０００の割合でチューブリン（Ｓｉｇｍａ  ａｌｄｒｉｃｈ，米国）を用いて４℃で１２時間以上の反応させた後、０．１％のＴＢＳＴで１０分ずつ３回洗浄し、抗マウス（Ｐｉｅｒｃｅ，米国）および抗ウサギ（Ｐｉｅｒｃｅ，米国）の二次抗体を１：２，０００の比率で常温で１時間反応させた。それを、０．１％のＴＢＳＴで１０分ずつ３回洗浄し、化学発光試薬を用いて発現を確認した。
【０１４７】
その結果、図４のＡに示すように、ＲＮＡｉによるＴＩＰ１の下方調整は、ＴＲＡＩＬによって誘導されるＭＫＫ７／ＪＮＫ活性を延長するために十分であることが分かった（図４のＡ）。
【０１４８】
＜４−２＞ＪＮＫ阻害剤処理によるアポトーシスの減少
ＪＮＫ伝達経路とＴＩＰ４１抑制とＴＲＡＩＬ処理で誘導されるアポトーシス間の関連性を確認するために、実験例＜４−１＞と同一な方法で細胞株を培養し、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡを処理した後、ＪＮＫ阻害剤であるＳＰ６００１２５（１０μｇ／ｍｌ）を１時間処理してＪＮＫ伝達経路を遮断した。ＴＲＡＩＬ刺激で誘導されるアポトーシスをアネキシンＶ−ＦＩＴｃ／ＰＩ染色法を用いたＦＡＣＳ分析法を用いて測定した。
【０１４９】
その結果、ＪＮＫ阻害剤を処理してＪＮＫ伝達経路を遮断した後、ＴＲＡＩＬを処理した実験で、アポトーシスが減少した。これにより、ＪＮＫ伝達経路がＴＩＰ４１タンパク質発現抑制とＴＲＡＩＬ処理で誘導されるアポトーシスに重要な役割を遂行していることが分かった（図４のＢ）。
【０１５０】
＜実験例５＞ＴＩＰ４１タンパク質発現抑制とｐ５３非依存的アポトーシス経路の確認
＜５−１＞肝癌細胞でｐ５３非依存的アポトーシス経路の確認
現在使用されている抗癌剤の最も大きな問題点は、正常細胞株と癌細胞株を区別できず、正常細胞株を殺すという副作用を有しており、このような正常細胞の死滅機序は、ｐ５３経路の活性化を通して起きることが報告された。Ｐ５３依存的アポトーシスを誘導する抗癌剤は、癌細胞株のみならず、正常細胞株にも影響を与えるので、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡを処理した後、ＴＲＡＩＬによって誘導されるアポトーシスがｐ５３を通じて行なわれるのかどうかを確認した。
【０１５１】
ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをＨｕｈ７肝癌細胞株にトランスフェクションした７２時間後、１００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬを０、２、４、および６時間処理した。ホスホｐ５３（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ５３）抗体を用いたウエスタンブロット方法を実行して、アポトーシスがｐ５３伝達経路を経由して行われるかどうかを確認するために、ｐ５３のリン酸化を確認する抗体を用いた。Ｐ−ｐ５３（Ｓｅｒ６）、ｐ−ｐ５３（Ｓｅｒ９）、ｐ−ｐ５３（Ｓｅｒ１５）、ｐ−ｐ５３（Ｓｅｒ２０）、ｐ−ｐ５３（Ｓｅｒ３７）、ｐ−ｐ５３（Ｓｅｒ４６）およびｐ−ｐ５３（Ｓｅｒ３９２）を用いて、ｐ５３のセリン６、９、１５、２０、３７、４６、３９２番のリン酸化を確認した。
【０１５２】
溶解バッファー［２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、２ｍＭエチレングリコール四酢酸、１％トリトンＸ−１００、１０％のグリセロール、プロテアーゼ阻害剤のカクテル、ホスファターゼ阻害剤のカクテルＩ／ＩＩ］に細胞を溶解させた後、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞の残骸を削除してタンパク質を得た。タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて分子量によって分離した後、分離したタンパク質をニトロセルロース膜でトランスファーさせた後、５％のスキムミルクで１時間非特異的反応を防ぐためにブロックした。１時間後、ニトロセルロース膜はすべて１：１，０００の比率でｐ−ｐ５３（Ｓｅｒ６）、ｐ−ｐ５３（Ｓｅｒ９）、ｐ−ｐ５３（Ｓｅｒ１５）、ｐ−ｐ５３（Ｓｅｒ２０）、ｐ−ｐ５３（Ｓｅｒ３７）、ｐ−ｐ５３（Ｓｅｒ４６）とｐ−ｐ５３（Ｓｅｒ３９２）（ｃＳＴ  Ｉｎｃ，米国）で４℃で１２時間以上の反応させた後、０．１％のＴＢＳＴで１０分ずつ３回洗浄し、抗マウス（Ｐｉｅｒｃｅ、米国）および抗ウサギ（Ｐｉｅｒｃｅ，米国）の二次抗体を１：２，０００の比率で常温で１時間反応させた。それを、０．１％のＴＢＳＴで１０分ずつ３回洗浄し、化学発光試薬を用いて発現を確認した。
【０１５３】
その結果、細胞にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡとＴＲＡＩＬ処理した時、ｐ５３タンパク質の１５番と３９２番セリンにリン酸化が起きることを確認することができた（図５のＡ）。セリン１５番のリン酸化は、ＤＮＡ損傷などによるアポトーシスに関与するＡＴＭ（Ａｔａｘｉａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ  ｍｕｔａｔｅｄ）／ＡＴＲ（ＡＴＭ  ａｎｄ  ＲＡＤ３−ｒｅｌａｔｅｄ）経路の活性化またはＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ，ＤＮＡ−ＰＫ）によって起きるようになり、アポトーシスとの関連が報告されていて、Ｓｅｒ３９２番のリン酸化は、核内でｐ５３タンパク質がＤＮＡ配列に結合するのに関与することが知られている。したがって、ＴＩＰ４１タンパク質発現抑制を通じたＴＲＡＩＬによって誘導されるアポトーシスがｐ５３依存的である可能性があるが、ＪＮＫ伝達経路で活性化されるセリンが発現されない結果を考慮する時、ｐ５３の非依存的である可能性も排除することができなかった。
【０１５４】
＜５−２＞ｐ５３欠損細胞の培養
ＨＣＴ１１６細胞株は、正常的にｐ５３タンパク質を作る大腸癌細胞株であり、ＴＲＡＩＬ耐性細胞株にＴＲＡＩＬ単一処理によってアポトーシスが頻繁に発生しないことが知られている。ＨＣＴ１１６  ｐ５３欠如細胞は、Ｄｒ．Ｂ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎによって１９９８年に確立された細胞株で、ｐ５３遺伝子が欠損している（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８年）。前記の細胞株の分譲を受けて実験に用い、細胞株は１０％牛胎児血清、１００ｍｇ／ｍｌ、ストレプトマイシン、そして１００  ＩＵ／ｍｌアンピシリンを含んだＤＭＥＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，米国）培地に、安定な抗生剤マーカーＧ４１８を１００μｇ／ｍｌ添加して、３日周期で継代培養した。
【０１５５】
＜５−３＞ｐ５３欠損細胞株でｐ５３非依存的アポトーシス経路の確認
Ｐ５３非依存的である可能性を確認するために、前記の実験例＜５−２＞制作したＨＣＴ１１６  ｐ５３欠損細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをＨｕｈ７肝癌細胞株の場合と同じ実験方法でトランスフェクションした後、同一な条件でＴＲＡＩＬを処理して、アポトーシスを誘導した後、アネキシンＶ−ＦＩＴｃ／ＰＩ染色法を用いたＦＡＣＳ分析法を行なった。
【０１５６】
その結果、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせた後にＴＲＡＩＬを処理した時、Ｈｕｈ７肝癌細胞株と同様にＨＣＴ１１６  ｐ５３欠損細胞株でもアポトーシスが良く誘導されており、これはＴＩＰ４１のタンパク質発現抑制によるアポトーシスは、ｐ５３非依存的経路を通じてアポトーシスが誘導されることを意味する。したがって、図５のＡに示されたｐ５３セリン１５番の活性化は、ＴＩＰ４１タンパク質発現抑制によるＴＲＡＩＬによって誘導されるアポトーシスに及ぼす影響は微々であり、ｐ５３が核に移動して、転写活性を高めることを推定することができた（図５のＢ）。
【０１５７】
＜実験例６＞ＴＲＡＩＬ受容体の発現様相の測定
＜６−１＞細胞毎週ＴＲＡＩＬ受容体の発現の確認
ＴＲＡＩＬ抵抗性を克服させて、癌細胞株特異的な治療剤としての効能を高めるために、癌細胞株のアポトーシスを増加させる方法として、ＴＲＡＩＬ受容体の発現を増加させる研究結果が報告された。このような研究と関連してＴＩＰ４１遺伝子の発現抑制を通じたアポトーシスとＴＲＡＩＬ受容体との相関関係を確認するために、正常細胞株と肝癌および肺癌細胞株でＴＲＡＩＬ受容体の発現様相を確認した。ＴＲＡＩＬ受容体は４種類に区分され、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３（ＤｃＲ１）およびＴＲＡＩＬ−Ｒ４（ＤｃＲ２）で、Ｒ１とＲ２は、細胞死受容体に作用してＴＲＡＩＬが結合すると、細胞株を自己アポトーシスが起きるように誘導するが、Ｒ３とＲ４はデコイ受容体で、ＴＲＡＩＬがＲ１とＲ２に結合することを阻害してＴＲＡＩＬによるアポトーシスを阻害すると報告されている。
【０１５８】
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、Ｈｕｈ７肝癌細胞株、ＨＡＥＣ正常細胞株（Ｈｕｍａｎ  ａｏｒｔｉｃ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ，ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  社）、Ａ５４９肺癌細胞株（韓国細胞株銀行）をトリゾールを用いてＲＮＡを抽出した後、抽出したＲＮＡ１μｇの逆転写酵素ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを合成し、それを鋳型に、ＴＩＰ４１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（Ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＤＲ）４）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３（ＤｃＲ１）およびＴＲＡＩＬ−Ｒ４（ＤｃＲ２）遺伝子のプライマーを用いて、定量的リアルタイムＰＣＲを行なった。ＰＣＲの結果は、２−ＤＤｃｔ比較法（２−ＤＤｃｔ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ）を通じて各遺伝子の相対的な発現量を確認した。ＴＩＰ４１正方向プライマー（配列番号３：５'−ａｔｔ  ｇａａ  ａｇｃ  ｃａｇ  ａｇａ  ａｃａ  ｇａ−３'）とＴＩＰ４１逆方向プライマー（配列番号４：５'−ｔｃｔ  ｃｇｔ  ｇｔｃ  ａｔｔ  ｃａｔ  ｔｃｔ  ｇａ−３'）、ＤＲ４正方向プライマー（配列番号５：５'−ｃｔｃ  ａｇｃ  ｇｇａ  ａｔｃ  ａａｔ  ｃａｇ  ｃｔｇ  ｔｇ−３'）、ＤＲ４逆方向プライマー（配列番号６：５'−ａｇａ  ｇｇａ  ａｃａ  ｃｇａ  ｃａａ  ｔｃａ  ｇｃｃ  ｔｔａ  ｇ−３'）、ＤＲ５正方向プライマー（配列番号７：５'−ａｔｃ  ａａｇ  ｃｇｇ  ｃｃｃ  ｃｃｔ  ｔｔｔ  ｔｔｔ  ｃａｃ−３'）、ＤＲ５逆方向プライマー（配列番号８：５'−ｃｔｃ  ａｔｔ  ｇｔｃ  ａｃａ  ｃｔｃ  ｃｔｃ  ｇａｃ  ａｇｃ−３'）、ＤｃＲ１正方向プライマー（配列番号９：５'−ｔｃｃ  ｃｃａ  ａｇａ  ｃｃｃ  ｔａａ  ａｇｔ  ｔｃ−３'）、ＤｃＲ１逆方向プライマー（配列番号１０：５'−ｇｇｃ  ａｃｃ  ａａａ  ｔｔｃ  ｔｔｃ  ａａｃ  ａｃ−３'）、ＤｃＲ２正方向プライマー（配列番号１１：５'−ｇｃａ  ｃａｇ  ａｇｇ  ｇｔｇ  ｔｇｇ  ａｔｔ  ａｃ−３'）、およびＤｃＲ２逆方向プライマー（配列番号１２：５'−ｇａｇ  ｃａｇ  ａｔｇ  ｃｃｔ  ｔｔｇ  ａｇｇ  ｔａ−３'）を用いて、定量的リアルタイム  ＰＣＲを行なった。ここで、定量的対照群としてベータ−２−マイクログロブリン（ｂｅｔａ−２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，Ｂ２Ｍ）の正方向プライマー（配列番号１３：５'−ｃｔｃ  ｇｃｔ  ｃｃｇ  ｔｇｇ  ｃｃｔ  ｔａｇ−３'）および逆方向プライマー（配列番号１４：５'−ｃａａ  ａｔｇ  ｃｇｇ  ｃａｔ  ｃｔｔ  ｃａａ−３'）で表されるプライマー対を用いて、定量的リアルタイムＰＣＲを行った。前記のＰＣＲの条件は、９５℃で１０分間で変性させた後、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分の条件で４０サイクル反復した後、７２℃で８分間伸長させた後、常温まで冷やした。定量的リアルタイムＰＣＲの結果は、各試料別のＴＲＡＩＬ受容体発現量をＢ２Ｍ発現量に補正する２−ＤＤｃｔ比較方法で分析した後、正常肝臓組織でのＴＲＡＩＬ受容体発現量に対する肝癌組織での発現量の倍数を図６に示した。
【０１５９】
その結果、ＴＲＡＩＬ耐性癌細胞株の肝癌および肺癌細胞株でＴＲＡＩＬ−Ｒ３（ＤｃＲ１）は、正常細胞株より低く発現し、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４（ＤｃＲ２）は、正常細胞株と類似の水準で発現した。ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）の場合は、正常細胞株に比べて肝癌、肺癌細胞株で発現量が少し高いが全体の発現量は低く、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）は、正常細胞株に比べて、肝癌、肺癌細胞株で過量に発現することを確認した。したがって、一般的に知られているように、細胞死受容体が肝癌、肺癌細胞株で多く発現し、このことからＴＲＡＩＬ耐性が受容体の発現とは関係がないことを確認することができた（図６のＡ）。
【０１６０】
＜６−２＞ＴＩＰ４１タンパク質発現抑制とＴＲＡＩＬを処理後、ＴＲＡＩＬ受容体の発現確認
ＴＩＰ４１タンパク質のノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）で誘導されたアポトーシスとＴＲＡＩＬ受容体との相関関係を確認するために、ＴＲＡＩＬおよびＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡで処理されたＨｕｈ７肝癌細胞株でのＴＲＡＩＬ受容体の発現水準を測定した。ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをＨｕｈ７肝癌細胞株にトランスフェクション７２時間後、１００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬを４時間および６時間処理した。ＴＲＡＩＬを処理した後、定量的リアルタイムＰＣＲを行なうためにＨｕｈ７肝癌細胞株をトリゾールを用いてＲＮＡを抽出した後、抽出したＲＮＡ１μｇの逆転写酵素ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを合成し、それを鋳型に、ＴＩＰ４１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（Ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＤＲ）４）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３（ＤｃＲ１）およびＴＲＡＩＬ−Ｒ４（ＤｃＲ２）遺伝子のプライマーを用いて、定量的リアルタイムＰＣＲを行なった。ＰＣＲの結果は、２−ＤＤｃｔ比較法を用いて、各遺伝子の相対的発現量を測定した。
【０１６１】
その結果、図６のＢに示されているように、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせた群と対照群とを比較してみると、ＴＩＰ４１タンパク質発現抑制後、ＴＲＡＩＬ受容体（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、−Ｒ２、−Ｒ３および−Ｒ４）の発現の差異は、ほとんど表れないことを確認することができた（図６のＢ）。
【０１６２】
＜６−３＞肝癌細胞組織別ＴＲＡＩＬ受容体の発現確認
肝癌組織とそれに隣接する組織で、ＴＲＡＩＬ受容体の発現様相をリアルタイム逆転写重合反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ＰＣＲ）法で測定した。実験に使用した組織は、エドモンソン（Ｅｄｍｏｎｄｓｏｎ）及びステイナー（Ｓｔｅｉｎｅｒ）分類法によってI（ｎ＝５）、II（ｎ＝５）、III（ｎ＝５）およびＩＶ（ｎ＝４）に分類した、各肝癌段階にある患者の肝癌組織（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＨＣＣ）と周辺の正常組織を含む１９の組織を、カトリック医大（Ｃａｔｈｏｌｉｃ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｉｎ  Ｓｅｏｕｌ，韓国）で外科手術前の患者の同意の下で採取した。
【０１６３】
リアルタイム逆転写ＰＣＲは、トリゾールを用いて肝癌組織からＲＮＡを抽出した後、抽出したＲＮＡ１μｇを逆転写酵素ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを合成し、それを鋳型にＴＲＡＩＬ−Ｒ１（Ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＤＲ）４）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３（ＤｃＲ１）およびＴＲＡＩＬ−Ｒ４（ＤｃＲ２）遺伝子のプライマーを用いて、リアルタイムＰＣＲを行なった。ＰＣＲの結果は、２−ＤＤｃｔ比較法によって各遺伝子の相対的発現量を確認した。
【０１６４】
その結果、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）の発現量が正常組織と比較して、肝癌組織で有意な増加を肝癌１段階で最も多く観察され、その次に、肝癌３段階の組織、肝癌２段階および４段階で、発現量の差異が有意に観察された。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）の場合は、肝癌１段階と肝癌５段階で、正常組織に比べて肝癌組織で発現が有意に増加することが確認されたが、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３（ＤｃＲ１）は、ほぼすべての段階で発現量が少なく、正常組織と肝癌組織間の差異が観察されなかった。また、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４（ＤｃＲ２）は、肝癌の２段階でのみ正常組織に比べて肝癌組織で有意に増加することが観察され、それ以外の場合は、正常な組織と同じか、むしろ、正常組織で発現が増加することを確認することができた（図６のＣ）。
【０１６５】
＜実験例７＞正常細胞株でアポトーシスを確認
＜７−１＞ＦＡＣＳ分析によるＴＩＰ４１発現の抑制とＴＲＡＩＬ処理による正常細胞株でのアポトーシス分析
ＴＩＰ４１は、癌細胞株に特異的に発現するが、正常細胞株でも発現するため、ＴＩＰ４１の発現を抑制した時、癌細胞株のように正常細胞株のアポトーシスが誘導される可能性があるため、ＴＩＰ４１タンパク質の発現抑制とＴＲＡＩＬ処理で誘導されるアポトーシスが癌細胞株特異的な反活性であることを確認するために、正常細胞株であるＨＡＥＣにＴＩＰ４１タンパク質発現抑制とＴＲＡＩＬ処理によってアポトーシスを誘導した。
【０１６６】
正常細胞株であるＨＡＥＣにＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせた後７２時間が経過した後、ＴＲＡＩＬを１００ｎｇ／ｍｌで０、２、４時間処理し、アポトーシスを誘導した。死滅した細胞を前記で記載された方法と同一にアネキシンＶ−ＦＩＴｃ／ＰＩ染色で分析した。
【０１６７】
その結果、ＴＲＡＩＬを処理した後、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡの処理の有無に関係なく、アポトーシスする程度に差異がないことを確認することができた。したがって、癌細胞株特異的に過発現するＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせた後、ＴＲＡＩＬを処理して誘導されるアポトーシスが癌細胞株特異的に発生することを確認することができた（図７のＡ）。
【０１６８】
＜７−２＞ＴＩＰ４１発現抑制とＴＲＡＩＬ処理による正常細胞株のアポトーシスタンパク質分析
ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡを前記と同一な実験方法で正常細胞株にトランスフェクションさせた後、カスパーゼ−８、−３、ＪＮＫ、ＰＡＲＰタンパク質の活性化を確認した。正常細胞株に１００ｎｇ／ＴＲＡＩＬを０、２、４時間処理し、その後、アポトーシス促進性タンパク質の発現および活性を前記で記載したウエスタンブロット方法を用いて確認した。
【０１６９】
その結果、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせた後、ＴＩＰ４１タンパクの発現が抑制さることを確認することができたが、その他のアポトーシス伝達経路に関与する、カスパーゼ−８、カスパーゼ−３、ＪＮＫ、ｐＪＮＫ（リン酸化したＪＮＫ、ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ＪＮＫ）の変化が観察されなかった。また、これらのタンパク質が活性化されないことを確認することにより、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡとＴＲＡＩＬによるアポトーシスが癌細胞株特異的な反応であることを確認することができた（図７のＢ）。
【０１７０】
＜実験例８＞癌細胞株でＴＲＡＩＬ発現抑制を通じたＴＩＰ４１媒介アポトーシス
＜８−１＞肺癌細胞株でＴＩＰ４１タンパク質発現抑制を通じたＴＩＰ４１媒介アポトーシス
＜８−１−１＞ウエスタンブロット方法によるＴＩＰ４１タンパク質発現抑制で誘導される肺癌細胞株のアポトーシスの確認
前記の＜実験例＞で用いた肝癌細胞株以外のＴＲＡＩＬ耐性癌細胞株でＴＩＰ４１タンパク質発現抑制によるＴＲＡＩＬの耐性克服するセンシタイザーとしての機能を検証するために、肺癌細胞株のＡ５４９細胞株で肝癌細胞の場合と同じ方法でＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせた後、７２時間経過後に１００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬを０、１、２、３、４時間処理した後、アポトーシスに関連したタンパク質の活性化をウエスタンブロット方法を用いて確認した。
【０１７１】
その結果、肝癌の場合と同様に、ＪＮＫおよびカスパーゼ−８、ＰＡＲＰなどが活性化してアポトーシスが起きることを確認することができた（図８ＡのＡ）。
【０１７２】
＜８−１−２＞核染色法によるＴＩＰ４１のタンパク質発現抑制で誘導される肺癌細胞株のアポトーシスの確認
肺癌細胞株のＡ５４９細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせて、細胞内ＴＩＰ４１発現量を減少させた後、ＴＲＡＩＬを１００ｎｇ／ｍｌで処理した後、０、１、２、４、６時間帯にアポトーシスを核染色法を用いて測定した。
【０１７３】
アポトーシスの測定は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で核を染色した後、蛍光顕微鏡で観察して死滅した細胞株を計数した。６ウェルプレートにＴＩＰ４１発現抑制された細胞株を２×１０５細胞／ウェルずつ分注した。２４時間後、前記の細胞に１００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬを各々０、１、２、４、６時間処理した後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を５μｇ／ｍｌで３０分間室温で染色した。核が染色された細胞株を蛍光顕微鏡で死滅した細胞株を計数して、アポトーシスを測定した。
【０１７４】
その結果、図８ＢのＡに示すように、Ａ５４９肺癌細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡとＴＲＡＩＬを処理した時、ＴＲＡＩＬのみを処理した時よりアポトーシスが増加した。ＴＲＡＩＬを処理する時間が長くなるほど、アポトーシスが増加し、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡを処理した群では、対照群にｓｉＲＮＡを処理時より約３０％程度のアポトーシスの増加が観察された。したがって、Ａ５４９肺癌細胞株でＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡがＴＲＡＩＬ抵抗を減少させることを確認することができた（図８ＢのＡ）。
【０１７５】
＜８−１−３＞ＦＡＣＳ分析方法を用いて肺癌細胞でＴＩＰ４１タンパク質発現抑制を通じたＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスの確認
細胞内ＴＩＰ４１発現量を減少させるために、Ａ５４９細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションして、ＴＲＡＩＬを１００ｎｇ／ｍｌで処理した後、０、１、２、４、６時間帯にアポトーシスをアネキシンＶ−ＦＩＴｃ／ＰＩ染色法で死滅した細胞株と正常細胞株を区別して染色した後、ＦＡＣＳを用いてアポトーシスを測定した。
【０１７６】
アポトーシスを測定するために、細胞株をトリプシンＥＤＴＡを用いて細胞株を得た後、ＦＩＴｃ融合したアネキシンＶ（ａｎｎｅｘｉｎ  ｖ）（５０μｇ／ｍｌ）とＰＩ（５０ｎｇ／ｍｌ）で２０分間染色した後、アネキシンＶ−ＦＩＴｃ／ＰＩ染色された細胞株の比率を分析するためにＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）を用いて、分析した。
【０１７７】
その結果、対照群のｓｉＲＮＡを肺癌細胞株のＡ５４９細胞株に処理したものに比べて、本発明のＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡを処理した時、Ａ５４９細胞株のアポトーシスが顕著に増加することを確認することができた（図８ＢのＢ）。また、図８ＢのＣに示すように、ＴＲＡＩＬ濃度を０、２５、５０、１００および２００ｎｇ／ｍｌで処理し、４時間処理してアポトーシスを観察した結果、ＴＲＡＩＬ処理濃度が高い程、ＴＲＡＩＬとＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡを一緒に処理した時、アポトーシスが増加することを確認することができた（図８ＢのＣ）。
【０１７８】
これらの結果を通じて、本発明のＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡは、ＴＲＡＩＬの耐性を有する肺癌細胞株のＴＲＡＩＬ耐性を減少させ、癌特異的アポトーシスを誘発する効果を有していることを確認することができた。
【０１７９】
＜８−２＞ＴＩＰ４１発現抑制による大腸癌細胞株でのＴＲＡＩＬ媒介アポトーシス
ＨＣＴ１１６大腸癌細胞での場合と同一な方法で、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせた後、７２時間経過後、ＴＲＡＩＬを０、５０、１００ｎｇ／ｍｌで処理し、ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）には、０．３％ＤＭＳＯを処理した後、アポトーシスを誘導する実験を行った。死滅した細胞株を前記記載の方法と同一にアネキシンＶ−ＦＩＴｃ／ＰＩ染色した後、アポトーシスを測定するためにＦＡＣＳ分析法を用いた。
【０１８０】
その結果、ＴＲＡＩＬの処理濃度が高くなる程アポトーシスが増加することを確認することができ、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせた群で、対照群と比較してアポトーシスが増加することを確認することができた。つまり、大腸癌細胞株でも肝癌細胞株の場合と同様に、アポトーシスが誘導されることを確認することにより、ＴＩＰ４１遺伝子はＴＲＡＩＬ耐性を有する癌のＴＲＡＩＬセンシタイザーとして使用が可能であることを確認した（図８ＡのＢ）。
【０１８１】
＜８−３＞ＴＩＰ４１発現抑制を通じた肝癌細胞株でのＴＲＡＩＬ媒介アポトーシス
前記の＜実験例＞で用いたＨｕｈ肝癌細胞株以外のＴＲＡＩＬ耐性癌細胞株でＴＩＰ４１タンパク質発現抑制によるＴＲＡＩＬの耐性を克服するセンシタイザーとしての機能を検証するために、ＨｅｐＧ２（肝臓肝細胞の細胞（ｌｉｖｅｒ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｅｌｌ））細胞とＳＫ−Ｈｅｐ１細胞にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせた後、７２時間経過後、１００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬを０、１、２、４、６時間処理した後、アポトーシスに関連したタンパク質の活性化をウエスタンブロット方法を用いて測定した。
【０１８２】
その結果、図８ＣのＡおよびＢに示すように、ＨｅｐＧ２およびＳＫ−Ｈｅｐ１細胞でＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡによってカスパーゼ−８とＰＡＲＰが活性化してアポトーシスが起きることを確認することができた（図８ＣのＡおよびＢ）。
【０１８３】
＜実験例９＞動物実験によるＴＩＰ４１機能検証
＜９−１＞Ｈｕｈ７肝癌細胞株をヌードマウスに移植
ヌードマウスの右側の背部分に肝癌細胞株のＨｕｈ７肝癌細胞株を２×１０６程度移植した後、腫瘍を一定のサイズ（５０〜１００ｍｍ３）に成長させた。実験は、個体群ごとに７匹ずつ（ｎ＝７）、総２８匹のヌードマウスをＪａｐａｎ  ＳＬｃ  Ｉｎｃ．から購入して行なった。
【０１８４】
＜９−２＞ＴＩＰ４１発現抑制とＴＲＡＩＬ処理による腫瘍サイズの変化の測定
実験例＜９−１＞に記載した方法でＨｕｈ７肝癌細胞株をヌードマウスの背に移植して、腫瘍を形成した後、１２日間、０、４、６、８日に対照  ｓｉＲＮＡ（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ）とＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡをヌードマウスの背に形成した腫瘍に注入し、２、５、７、９、１０、１１日にＴＲＡＩＬを注入した後、１２日にマウスを犠牲にした。５０ｎＭの濃度でリポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ試薬を用いて混合物を作成し、形成された腫瘍に注入し、２、５、７、９、１０、１１日にＴＲＡＩＬを２．５μｇ／ｋｇずつ注入した後、４つのグループ（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ＋ｖｅｈｉｃｌｅ、ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ＋ＴＲＡＩＬ、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡ＋ｖｅｈｉｃｌｅ、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡ＋ＴＲＡＩＬ）に分け、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡとＴＲＡＩＬ処理による腫瘍のサイズを確認した。
【０１８５】
その結果、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡを注入した群でｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡを注入した群と比較して、腫瘍のサイズが減少することを確認することができ、ＴＲＡＩＬを注入した時、ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡに比べてＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡを処理した後、さらに減少する腫瘍サイズを確認することができた（図９Ａ）。
【０１８６】
＜９−３＞癌組織でアポトーシスの観察
ＳｉＲＮＡを処理していないヌードマウスと、ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡを処理したヌードマウスにＴＲＡＩＬを処理した群と、処理しない群に分けて、６群で生成された腫瘍を採取してホルマリンに固定した後、パラフィンに包埋した。５μｍの厚さに切片をつくり、キシレンを用いてパラフィンを除去した後、エタノール濃度による再水和（ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）させた。４％パラホルムアルデヒド溶液を処理して、組織切片を固定し、プロテイナーゼＫ溶液を処理して、組織を透過可能にした後、４％パラホルムアルデヒド溶液に再度固定した後、ＴＵＮＥＬ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｋｉｔ（ｐｒｏｍｅｇａ，米国）を用いて、実験を行なった。平衡バッファーを用いて組織切片を平衡化させ、その間にｒＴｄＴ反応溶液を準備して平衡化した部位にそれを処理した。最後に、ストレプトアビジンＨＲＰ溶液を処理してＤＡＢ混合物を用いて発色反応させた後、光学顕微鏡で観察した。
【０１８７】
その結果、ｓｉＴＩＰ  ＲＮＡをトランスフェクションさせた群でアポトーシスが明確に増加していることを確認することができた（図６のＢ）。
【０１８８】
＜９−４＞腫瘍のアポトーシス測定
４つのグループ（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ＋ｖｅｈｉｃｌｅ、ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ＋ＴＲＡＩＬ、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡ＋ｖｅｈｉｃｌｅ、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡ＋ＴＲＡＩＬ）から採取した腫瘍を溶解させてタンパク質を抽出した後、アポトーシスの標識因子であるカスパーゼ−８抗体を用いて、ウエスタンブロット方法でアポトーシスを確認した。
【０１８９】
その結果、ＴＩＰ４１タンパク質の発現量の減少でＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡの効果を確認することができ、ＴＲＡＩＬ処理によって増加しなかったカスパーゼ−８の活性がＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡトランスフェクションさせた後、発現が明確に増加していることを確認することができた。これにより、ＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡが生体内でも作用することができ、ＴＲＡＩＬに耐性を有する癌に対して効果的にアポトーシスを誘導することにより、ＴＲＡＩＬ耐性克服の効果を有する化学剤として使用できることを確認した（図９Ｃ）。
【０１９０】
＜実験例１０＞ＴＩＰ４１とＰＰ２Ａｃとの相互結合測定
＜１０−１＞発現ベクターの構成
ＴＩＰ４１、ＰＰ２Ａｃ、ＭＫＫ７、α（ａｌｐｈａ）４およびＰＲ６５遺伝子を発現するベクターを製造するために、前記の肝癌細胞株からＲＮＡを分離して、発現ベクターにクローニングした。逆向ＲＮＡ（ｒｅｓｅｒｖｅｄ  ＲＮＡ）を鋳型に用いて、個々の遺伝子に該当するプライマーを用いてＰＣＲを行なった。ＴＩＰ４１正方向プライマー（配列番号  １５：５'−ｃｇ  ｇｇｔ  ａｃｃ  ａａ  ａｔｇ  ａｔｇ  ａｔｃ  ｃａｃ  ｇｇｃ  ｔｔｃ'−３'）とＴＩＰ４１逆方向プライマー（配列番号１６：５'−ｃｃｃ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ｔｔａ  ｔｔｃ  ｃａｃ  ｔｔｇ  ｔｇｔ  ａｃｔ−３'）、ＰＰ２Ａｃ正方向プライマー（配列番号１７：５'−ｃｇ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ａｔｇ  ｇａｃ  ｇａｇ  ａａｇ  ｇｔｇ  ｔｔｃ−３'）、ＰＰ２Ａｃ逆方向プライマー（配列番号１８：５'−ａ  ｔａｇ  ｔｔｔ  ａｇｃ  ｇｇｃ  ｃｇｃ  ｔｔａ  ｃａｇ  ｇａａ  ｇｔａ  ｇｔｃ  ｔｇｇ−３'）、ＭＫＫ７正方向プライマー（配列番号１９：５'−ｃｃｇ  ｃｔｃ  ｇａｇ  ａｔｇ  ｇｃｇ  ｇｃｇ  ｔｃｃ  ｔｃｃ  ｃｔｇ−３'）、ＭＫＫ７逆方向プライマー（配列番号２０：５'−ｇｇ  ｇｇｔ  ａｃｃ  ｃｃｔ  ｇａａ  ｇａａ  ｇｇｇ  ｃａｇ  ｇｔｇ−３'）、α４正方向プライマー（配列番号２１：５'−ｃｇ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ａｔｇ  ｇｃｔ  ｇｃｔ  ｇａｇ  ｇａｃ  ｇａｇ−３'）、α４逆方向プライマー（配列番号２２：５'−ａ  ｔａｇ  ｔｔｔ  ａｇｃ  ｇｇｃ  ｃｇｃ  ｔｃａ  ｇｃｃ  ｃａｔ  ｇｔｔ  ｃｔｇ  ｔｃｇ−３'）、ＰＲ６５正方向プライマー（配列番号２３：５'−ｃｇ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ａｔｇ  ｇｃｇ  ｇｃｇ  ｇｃｃ  ｇａｃ  ｇｇｃ−３'）、およびＰＲ６５逆方向プライマー（配列番号２４：５'−ａ  ｔａｇ  ｔｔｔ  ａｇｃ  ｇｇｃ  ｃｇｃ  ｔｃａ  ｇｇｃ  ｇａｇ  ａｇａ  ｃａｇ  ａａｃ−３'）を用いてＰＣＲを行なった。前記のＰＣＲの条件は、９５℃で３分間で変性させた後、９５℃で１分、５８℃で１分、７２℃で１分３０秒の条件で３０サイクル反復した後、７２℃で１０分間伸長した後、４℃に冷やした。
【０１９１】
ＴＩＰ４１に対するベクターの場合は、抽出されたＰＣＲ産物をＫｐｎＩとＢａｍＨＩ制限酵素で切断し、その後、ｐＨＡベクター（ｐｃＤＮＡ３．１；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のベクターにＨＡタグ（ＨＡ  ｔａｇ）を挿入製造したベクター）に挿入した。使用したプライマーには、ＫｐｎＩとＢａｍＨＩ制限部位が含まれていた。ＰＰ２Ａｃ、ＰＲ６５、ＭＫＫ７、α４の場合、ＢａｍＨＩとＮｏｔ  Ｉ制限酵素認知部位を含むプライマーを用いて増幅させた後、生成されたＰＣＲ産物を精製した後、ＢａｍＨＩとＮｏｔ  Ｉ制限酵素でカットした後、ｐＧＳＴベクター（ｐＥＢＧベクター）（Ｍａｙｅｒら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５年，第５（３）巻，ｐ．２９６−３０５）、また組換えタンパク質を製造するために、前述と同一のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＭＫＫ７およびＰＰ２Ａｃに対するＰＣＲ産物をＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターであるｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）ベクターに各々挿入し、ＴＩＰ４１に対するＰＣＲ産物は、ｐＧＥＸ４Ｔ−１（ＧＥ  ｈｅｌｔｈｃａｒｅ社）ベクターに挿入した。前記のプロセスによって、ｐＥＴ２１−ＭＫＫ７、ｐＥＴ２１−ＰＰ２Ａｃ、およびｐＥＧＸ４Ｔ−ＴＩＰ４１を製造した。
【０１９２】
＜１０−２＞ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株の培養
韓国細胞株銀行から分譲されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞株に１０％の牛胎児血清を含んだダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で３７℃、５％ＣＯ２で培養した。ＳｉＲＮＡをトランスフェクションするためにＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を１×１０６細胞／１００ｍｍ皿に植えて２４時間培養し、その後、トランスフェクションを行なった。
【０１９３】
＜１０−３＞ＴＩＰ４１とＰＰ２Ａｃとの相互結合確認
本発明者らは、前記の実験を通じて、ＴＩＰ４１発現抑制およびＴＲＡＩＬ処理によるアポトーシスの原因が、ＪＮＫの継続的な活性化の結果であることを解明したが、それは、ＴＩＰ４１の発現抑制がＪＮＫ活性化作用機序を誘導するということを意味する。ＴＩＰ４１と結合することが知られているタンパク質によってＪＮＫ活性が調整されるかどうかを確認するために、最近の報告で、ＴＩＰ４１と結合することが知られたタンパク質ホスファターゼ２Ａｃ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ２Ａｃ、ＰＰ２Ａｃ）を発現させる発現ベクターを、前記の実験例＜１０−１＞で製造した。
【０１９４】
ＰＰ２Ａｃタンパク質は、セリン／スレオニンホスファターゼで、いくつかのタンパク質のＳｅｒ／Ｔｈｒアミノ酸にリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）しているリン酸塩を除去する機能を実行する。ＰＰ２Ａｃタンパク質の基質としてＦｏｘｏ１、ＮＦ−κＢ（ｐ６５）、ＡＭＰＫ、ＭＫＫ４などが知られている。
【０１９５】
まず、ＴＩＰ４１と結合することが知られているＰＰ２Ａｃとの結合を確認するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を２×１０５で１００ｍｍの培養皿に分注した後、前記の細胞株にリポフェクタミンＬＴＸ試薬を用いて実験例＜１０−１＞で製造したＰＰ２Ａｃ発現ベクターを細胞にトランスフェクションさせてＰＰ２Ａｃを過発現させた。トランスフェクションした細胞から細胞溶解物を抽出して、ＧＳＴプルダウン分析を行なった。ＧＳＴプルダウン分析は、細胞溶解物１ｍｇ／ｍｌにＧＳＨ−ビーズ４０μｌを添加した後、４℃で１２時間注意深く撹拌した後、ＰＢＳＴ［０．１％のツイーン２０を含むＰＢＳ］バッファーを１ｍｌずつ入れて洗浄し、それを６回反復した。その後、洗浄されたビーズに１×サンプルバッファー（ウエスタンブロット用）を１００μｌずつ添加した後、９５℃ヒーティングブロックで５分間沸かした後、氷で２分間冷却した。その後、各々の抗体を用いて、前記記載と同一な条件で、ウエスタンブロットを行なった。
【０１９６】
その結果、図１０のＡに示すように、ＴＩＰ４１は陽性対照群として提供されたα４と同様に、ＰＰ２Ａｃと結合することを確認することができた。また、ＧＳＴプルダウン前、全体細胞溶解物（ＷｃＬ）を通じて各発現ベクターの発現量も確認した（図１０のＡ）。
【０１９７】
＜１０−４＞ＴＩＰ４１とＰＰ２Ａｃ複合体の相互作用確認
ＴＩＰ４１とＪＮＫキナーゼとして知られているＰＰ２Ａｃとの結合を確認するために、実験例＜１０−１＞で製造された発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞株に前記と同一な方法でトランスフェクションさせた後、ＧＳＴプルダウンしてウエスタンブロットを行なった。
【０１９８】
その結果、図１０のＢに示すように、ＴＩＰ４１とＰＰ２Ａｃ複合体の結合すなわち、ＰＰ２Ａｃ、ＰＲ６５とα４の結合を確認できた（図１０のＢ）。
【０１９９】
＜実験例１１＞ＴＩＰ４１とＭＫＫ７間の相互作用確認
＜１１−１＞ＭＫＫ７過発現後、ＴＩＰ４１とＭＫＫ７間の相互作用確認
ＴＩＰ４１とＪＮＫキナーゼとして知られているＭＫＫ７との間の結合を確認するために、前記の＜実験例１０＞で製造したＭＫＫ７発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションさせて過発現させた後、＜実験例１０＞と同一な方法でＧＳＴプルダウン分析を行なった。
【０２００】
その結果、図１１のＡに示すように、ＴＩＰ４１とＭＫＫ７の結合を確認することができた（図１１のＡ）。
【０２０１】
＜１１−２＞免疫沈降法を用いたＴＩＰ４１とＭＫＫ７の相互作用確認
ＴＩＰ４１とＭＫＫ７間の相互作用を確認するために、各々の抗体を用いて、免疫沈降法を行なった後、ウエスタンブロットを行なってＴＩＰ４１とＭＫＫ７間の結合を確認した。免疫沈降法は、沈降させたタンパク質の抗体を細胞溶解物１ｍｇに２μｇずつ入れて、４℃で２時間反応させた後、プロテインＧセファロースビーズ３０μｌずつ入れて、４℃で１２時間反応させる。その後、ＰＢＳＴ［０．１％のツイーン２０を含むＰＢＳ］バッファーを１ｍｌずつ入れて洗浄し、それを４回反復した。その後、洗浄されたビーズに１×サンプルバッファー（ウエスタンブロット用）１００μｌずつ添加した後、９５℃ヒーティングブロックで５分間沸かした後、氷で２分間冷却した。その後、ＭＫＫ７、ＴＩＰ４１の抗体を用いて、ウエスタンブロットを行なった。
【０２０２】
その結果、図１１のＢに示すように、ＴＩＰ４１がＭＫＫ７と結合することを確認することができた（図１１のＢ）。
【０２０３】
＜実験例１２＞ＴＩＰ４１とＰＰ２ＡｃまたはＴＩＰ４１とＭＫＫ７間の相互作用確認
ＴＩＰ４１とＰＰ２ＡｃおよびＭＫＫ７間の相互作用をより正確に確認するために、細胞内でＴＩＰ４１とＭＫＫ７の相互作用ではない、Ｅ．ｃｏｌｉで組換えタンパク質を合成し、合成されたタンパク質を１：１の反応率に反応させるＧＳＴプルダウン分析を行なった。組換えタンパク質は、前記の実験例＜１０−１＞で製造されたＥ．ｃｏｌｉ用発現ベクターをＢＬ２１  Ｅ．ｃｏｌｉ菌株に形質転換させて製造した。誘導は、形質転換したＥ．ｃｏｌｉをＬＢ培地に接種して、Ｏ．Ｄ値が０．４〜０．６の間になるように培養した後、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度が１ｍＭになるように添加した後、２時間３０℃で培養した。その後、超音波破砕を用いて溶解物を得てＧＳＴプルダウンに用いた。
【０２０４】
その結果、図１１のＣに示すように、ＴＩＰ４１とＭＫＫ７が直接的に相互結合することを確認することができ、また、ＴＩＰ４１とＰＰ２Ａｃが直接的に相互結合することを確認した（図１１のＣ）。
【０２０５】
また、ＴＩＰ４１とＰＰ２ＡｃおよびＭＫＫ７間の相互作用は、実験例＜１０−４＞と同様に、行なった結果でも確認された（図１０のＢ）。
【０２０６】
＜実験例１３＞ＭＫＫ７と結合するＴＩＰ４１の結合部位の確認
ＭＫＫ７と結合するＴＩＰ４１の結合部位を確認するために、ＴＩＰ４１の断片発現ベクターを前記＜実験例１０＞に記載されている方法でクローニングした。
【０２０７】
図１２のＡに示すように、全長ＴＩＰ４１をＤ１〜Ｄ６の六つの断片に分離し、それぞれに対応する下記のプライマーを用いて増幅させた後、ｐＨＡ発現ベクターに挿入した。ＴＩＰ４１−Ｄ１正方向プライマー（配列番号１５）とＴＩＰ４１−Ｄ１逆方向プライマー（配列番号２５：５'−ｃｇ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ｃａｇ  ｇｃｔ  ｔｇａ  ａａｃ  ｔｃｃ  ａｔｇ−３'）、ＴＩＰ４１−Ｄ２正方向プライマー（配列番号１５）、ＴＩＰ４１−Ｄ２逆方向プライマー（配列番号２６：５'−ｃｇ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ｇ  ｇａａ  ｇｇｔ  ｇｇａ  ａｃａ  ｔｇｃ  ａｔｃ−３'）、ＴＩＰ４１−Ｄ３正方向プライマー（配列番号２７：５'−ｇｇ  ｇｇｔ  ａｃｃ  ａｔｇ  ｃｔｔ  ａａａ  ｇｔｇ  ｇｃｃ  ｔｇｔ  ｇ−３'）、ＴＩＰ４１−Ｄ３逆方向プライマー（配列番号１６）、ＴＩＰ４１−Ｄ４正方向プライマー（配列番号２８：５'−ｃｇ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ａｔｇ  ｃｔｔ  ａａａ  ｇｔｇ  ｇｃｃ  ｔｇｔ−３'）、ＴＩＰ４１−Ｄ４逆方向プライマー（配列番号２９：５'−ｃｃｇ  ｃｔｃ  ｇａｇ  ｃａｇ  ｇｃｔ  ｔｇａ  ａａｃ  ｔｃｃ  ａｔｇ−３'）、ＴＩＰ４１−Ｄ５正方向プライマー（配列番号１５）およびＴＩＰ４１−Ｄ５逆方向プライマー（配列番号３０：５'−ｃｇ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ｇｔｇ  ｔｔｃ  ａｃｃ  ｃｔｃ  ｃｇｔ  ｃｃｔ−３'）、ＴＩＰ４１−Ｄ６正方向プライマー（配列番号３１：５'−ｃｇ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ａａａ  ｔｔｇ  ａａａ  ｇｃｃ  ａｇａ  ｇａａ  ｃ−３'）およびＴＩＰ４１−Ｄ６逆方向プライマー（配列番号１６）を用いてＰＣＲを行った。
【０２０８】
Ｄ１〜Ｄ６のＴＩＰ４１断片を発現するベクターを過発現させるために、ＨＥＫ２９３Ｔ  ３×１０６細胞株を１００ｍｍ培養皿に植えた後、リポフェクタミンＬＴＸ試薬を用いて、クローニングされたＴＩＰ４１  Ｄ１〜Ｄ６断片発現ベクターを細胞株に各々トランスフェクションした。トランスフェクションした細胞から細胞溶解物を抽出し、ＧＳＴプルダウン分析を行なった。ＧＳＴプルダウン分析は、前記と同一な方法で実行した。
【０２０９】
その結果、図１２のＢに示すように、ＭＫＫ７と結合する断片は、全長ＴＩＰ４１タンパク質と断片Ｄ３とＤ６だった。したがって、ＭＫＫ７は、記載されたＴＩＰ４１タンパク質（配列番号１）のＮ末端から、２３０番〜２７２番部位に結合することを確認することができた（図１２）。
【０２１０】
＜実験例１４＞ＴＩＰ４１と結合するＭＫＫ７の結合部位確認
ＴＩＰ４１と結合するＭＫＫ７の結合部位を確認するために、ＭＫＫ７断片発現ベクターを前記＜実験例１０＞に記載されている方法でクローニングした。ＭＫＫ７−Ｄ１正方向プライマー（配列番号３２：５'−ｃｇ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ｃｇｃ  ａｇｃ  ａｔｇ  ｇａｇ  ａｇｃ  ａｔｔ−３'）とＭＫＫ７−Ｄ１逆方向プライマー（配列番号２０）、ＭＫＫ７−Ｄ５正方向プライマー（配列番号３３：５'−ｃｇ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ｇｃｃ  ｇｇｃ  ｔｇｔ  ｇｃｃ  ｇｃｃ  ｔａｃ−３'）、ＭＫＫ７−Ｄ５逆方向プライマー（配列番号２０）、ＭＫＫ７−Ｄ６正方向プライマー（配列番号１９）、ＭＫＫ７−Ｄ６逆方向プライマー（配列番号３４：５'−ａｔ  ａｇｔ  ｔｔａ  ｇｃｇ  ｇｃ  ｃｇ  ｃｔａ  ａａｔ  ｇｃｇ  ｃｔｃ  ｇｇｇ  ｇａｔ  ｇｇｇ−３'）を用いてＰＣＲを行なった。図１３のＡに示すように、全長ＭＫＫ７をＤ１、Ｄ５およびＤ６の３つの断片に分けて、それぞれに該当する前記のプライマーを用いて増幅させた後、ｐＧＳＴ発現ベクターに挿入した。
【０２１１】
Ｄ１、Ｄ５およびＤ６のＭＫＫ７断片を発現するベクターを過発現させるために、ＨＥＫ２９３Ｔ  ３×１０６細胞株を１００ｍｍ培養皿に植えた後、リポフェクタミンＬＴＸ試薬を用いて、クローニングされたＭＫＫ７  Ｄ１、Ｄ５およびＤ６断片発現ベクターを細胞株に各々トランスフェクションした。トランスフェクションした細胞から細胞溶解物を抽出し、ＧＳＴプルダウン分析を行なった。ＧＳＴプルダウン分析は、前記と同一な方法で行なった。
【０２１２】
その結果、図１３のＢに示すように、ＴＩＰ４１に対するＭＫＫ７の結合断片は、全長ＭＫＫ７タンパク質と断片Ｄ６だった。したがって、ＴＩＰ４１は、ＭＫＫ７（配列番号３５）のアミノ酸配列でＮ末端１番〜８５番部位に結合することが分かった（図１３のＢ）。
【０２１３】
＜実験例１５＞ＭＫＫ７／ＪＮＫ経路によって媒介されたアポトーシス
＜１５−１＞ＭＫＫ７発現抑制によるアポトーシスの減少
アポトーシス耐性がＭＫＫ７とＴＩＰ４１間の相互作用によって媒介されることを確認するために、ＭＫＫ７に対するｓｉＲＮＡによるアポトーシス耐性の減少を調べた。
【０２１４】
Ｈｕｈ７肝癌細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡ、ＭＫＫ７  ｓｉＲＮＡ各々および混合して導入した後、ＴＲＡＩＬを１００ｎｇ／ｍｌの濃度で０、３、６時間刺激を与えた後に、アポトーシスをアネキシンＶ−ＦＩＴｃ／ＰＩ染色法を用いたＦＡＣＳ分析法を用いて測定した。
【０２１５】
その結果、図１４のＡに示すように、ＭＫＫ７発現抑制によってアポトーシスが減少することを確認することができた。これにより、ＴＩＰ４１タンパク質発現抑制とＴＲＡＩＬ処理で誘導されるアポトーシスは、ＭＫＫ７の役割が重要であることを確認することができた（図１４のＡ）。
【０２１６】
＜１５−２＞ＴＩＰ４１発現抑制によるＭＫＫ７／ＪＮＫ経路活性化
実際にＴＩＰ４１発現抑制が直接的にＭＫＫ７の活性化に関与して、それによってＭＫＫ７下部信号伝達に与える影響を確認するために、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）共免疫キナーゼ（ｉｍｍｕｎｏ−ｃｏ−ｋｉｎａｓｅ）分析を行なった。共免疫キナーゼの分析は、免疫沈降法の一種で、ＭＫＫ７を沈降させた後、それを分離して試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）状態で人為的にＭＫＫ７の基質およびＭＫＫ７の下部信号伝達に関与する基質を同時に定量的に添加して、リン酸化される程度を確認する実験方法である。前記のような方法でＭＫＫ７抗体を用いて免疫沈降をさせ、ＭＫＫ７タンパク質に結合しているプロテインＧビーズを得た後、キナーゼバッファーにＭＫＫ７の基質である組換えＧＳＴ−ＪＮＫ１とＪＮＫ１の基質であるＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎおよび標識因子して同位元素（−３２Ｐ）を入れて、３７℃で３０分間反応させた。その後、１×タンパク質ローディングダイ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｄｙｅ）を添加した後、９５℃で５分間沸かした。１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに電気泳動した後、ゲルドライヤー機でゲルを乾燥させた後、ＢＡＳリーダー（放射線測定機器、富士通、日本）で感光した。
【０２１７】
その結果、図１４のＢに示すように、ＴＩＰ４１発現抑制によってＭＫＫ７が活性化し、ＭＫＫ７の基質であるＧＳＴ−ＪＮＫ１をリン酸化させ、また活性化したＪＮＫ１はＪＮＫの下部経路の基質ＧＳＴ−ｃ−ｊｕｎタンパク質をリン酸化させた。したがって、ＴＩＰ４１タンパク質発現抑制とＴＲＡＩＬ処理でＭＫＫ７が活性化され、それによりＪＮＫ伝達経路が活性化されることを証明した（図１４のＢ）。
【０２１８】
下記に本発明の組成物のための製造例を提示する。
【０２１９】
＜製造例１＞薬学的製剤の製造
＜１−１＞散剤の製造
ＴＩＰ４１タンパク質発現または活性阻害剤        ２ｇ
乳糖                                            １ｇ
前記の成分を混合し、気密包に充填して散剤を製造した。
【０２２０】
＜１−２＞錠剤の製造
ＴＩＰ４１タンパク質発現または活性阻害剤        １００ｍｇ
トウモロコシ澱粉                                １００ｍｇ
乳糖                                            １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                        ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法によって、打錠して錠剤を製造した。
【０２２１】
＜１−３＞カプセル剤の製造
ＴＩＰ４１タンパク質発現または活性阻害剤         １００ｍｇ
トウモロコシ澱粉                                 １００ｍｇ
乳糖                                             １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                         ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常のカプセル剤の製造方法によって、ゼラチンカプセルに充填して、カプセル剤を製造した。
【０２２２】
＜１−４＞丸薬の製造
ＴＩＰ４１タンパク質発現または活性阻害剤          １ｇ
乳糖                                              １．５ｇ
グリセリン                                        １ｇ
キシリトール                                      ０．５ｇ
前記の成分を混合した後、通常の方法によって１丸薬当り４ｇになるように製造した。
【０２２３】
＜１−５＞顆粒製造
ＴＩＰ４１タンパク質発現または活性阻害剤          １５０ｍｇ
大豆エキス                                        ５０ｍｇ
ブドウ糖                                          ２００ｍｇ
澱粉                                              ６００ｍｇ
前記の原料を混合し、３０％のエタノール１００ｍｇを追加して、６０℃で乾燥して顆粒形成した後、包に充填した。
【産業上の利用可能性】
【０２２４】
前記でみたように、ＴＲＡＩＬ耐性を示す肝癌細胞株にＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡとＴＲＡＩＬを処理した時、癌細胞株特異的アポトーシスが誘導され、それは肝癌のみならず、ＴＲＡＩＬ耐性の肺癌および大腸癌でもアポトーシスを誘導し、腫瘍を移植したマウスにＴＩＰ４１  ｓｉＲＮＡとＴＲＡＩＬを注入した時、腫瘍のサイズ減少および癌細胞株の死滅を誘導する効果を有しているので、ＴＩＰ４１タンパク質の発現または活性抑制剤を含有するＴＲＡＩＬ感受性増進用組成物または抗癌補助剤として有用に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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