(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｓｉｇＧ遺伝子から少なくとも１５０ヌクレオチドが欠失し、ｓｉｇＧタンパク質のアミノ酸６７から８０をコードするｓｉｇＧ遺伝子の機能性領域およびアミノ酸２２９から２４８をコードするｓｉｇＧ遺伝子の機能性領域のそれぞれの少なくとも一部を欠失していることを特徴とし、組換えβ−ラクタマーゼを産生するよう形質転換されている非胞子形成枯草菌株であって、該非胞子形成枯草菌株におけるβ−ラクタマーゼの産生が、野生株枯草菌株におけるβ−ラクタマーゼの産生よりも多い、非胞子形成枯草菌株。
【請求項２】
ｓｉｇＧ遺伝子全体が欠失していることを特徴とする、請求項１に記載の枯草菌株。
【請求項３】
選抜マーカー遺伝子が欠失部位に挿入されていることを特徴とする、請求項１から２のいずれかに記載の枯草菌株。
【請求項４】
選抜マーカー遺伝子の下流の少なくとも２０ヌクレオチド長のオーバーラップ領域と相同的な、少なくとも２０ヌクレオチド長のオーバーラップ領域が選抜マーカー遺伝子の上流に存在することを特徴とする、請求項３に記載の枯草菌株。
【請求項５】
配列番号９を含むことを特徴とする、請求項４に記載の枯草菌株。
【請求項６】
枯草菌株のｓｉｇＧ遺伝子から少なくとも１５０ヌクレオチドを欠失させることによって、ｓｉｇＧタンパク質のアミノ酸６７から８０をコードするｓｉｇＧ遺伝子の機能性領域およびアミノ酸２２９から２４８をコードするｓｉｇＧ遺伝子の機能性領域のそれぞれの少なくとも一部をｓｉｇＧ遺伝子から欠失させること、および組換えβ−ラクタマーゼを産生するよう該枯草菌株を形質転換することを含むことを特徴とする、非胞子形成枯草菌株の調製方法であって、該非胞子形成枯草菌株におけるβ−ラクタマーゼの産生が、野生株枯草菌株におけるβ−ラクタマーゼの産生よりも多い、調製方法。
【請求項７】
欠失させるべき遺伝子領域の隣接領域および選抜マーカー遺伝子を含むインサートをオーバーラップ伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）技術によって調製すること、欠失させるべき枯草菌株を該インサートで形質転換すること、そして形質転換体を選抜することによる方法であり、該インサートが所望の遺伝子領域が欠失するように細菌の染色体に組み込まれることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
欠失させるべき遺伝子領域の隣接領域の間に選抜マーカー遺伝子を含む直鎖状ＤＮＡインサートをオーバーラップ伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）技術により調製すること、欠失させるべき枯草菌株を該インサートで形質転換すること、そして形質転換体をスクリーニングすることによる方法であり、インサートが相同的二重組換えの結果組み込まれることにより、所望の遺伝子領域が欠失することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
オーバーラップ伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）技術が、少なくとも２０ヌクレオチド長のオーバーラップ領域を有するプライマーを利用することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
選抜マーカー遺伝子の上流に、選抜マーカー遺伝子の下流において反復する少なくとも２０ヌクレオチド長のオーバーラップ領域を有する、直鎖状ＤＮＡインサートを利用することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
直鎖状ＤＮＡインサート中の、欠失させるべき領域の上流の隣接領域、選抜マーカー遺伝子、および欠失させるべき領域の下流の隣接領域がすべて実質的に同じ長さである直鎖状ＤＮＡインサートを利用することを特徴とする、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
３ｋｂ長の直鎖状ＤＮＡインサートを利用することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
組換えβ−ラクタマーゼを産生するための産生生物としての請求項１から５のいずれかに記載の非胞子形成枯草菌株の使用。
【請求項１４】
生物学的に調製される産物の調製方法であって、該産物を、β−ラクタマーゼをコードするＤＮＡによって形質転換され、該ＤＮＡがそのなかで発現する請求項１から５の何れかに記載の非胞子形成枯草菌株を用いて調製し、生成した組換えβ−ラクタマーゼを回収することを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非胞子形成枯草菌（Bacillus subtilis）株、その調製方法およびその産生生物としての使用に関する。さらに、本発明は非胞子形成細菌を用いることによる生物学的に調製される産物の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バシラス属の細菌は、工業的に重要な様々な酵素の産生において広く用いられている。もっとも重要な産生宿主は、バシラス・アミロリクエファシエンス（B. amyloliquefaciens）とバシラス・リチェニフォルミス（B. licheniformis）であり、これらは例えばプロテアーゼやアミラーゼの産生菌として用いられている。特に細菌が遺伝子操作された物である場合、環境へと廃出される前に不活性化する必要がある細菌マスが工業的過程により多量に産生されている。胞子形成した産生細胞の廃棄には、非胞子形成細胞の場合と比べてより強力な加工が要求される。バシラス属の胞子は栄養細胞よりかなり耐熱性が高く、それゆえ熱処理によるそれらの廃棄には、高温及び長時間の処理が必要である。かかる処理により、装置とその製造における作動コストが上昇する。それゆえ非胞子形成バシラス属株の使用が望ましい。本発明は産生生物としての枯草菌の使用を大幅に改良する、胞子形成の問題の解決手段を提供する。
【０００３】
胞子形成は多段階（ＩからＶＩＩ）現象であり、母細胞のなかで最初に前胞子（pre-spore）が生じる一定の生育条件にて始まる。最終的に、母細胞は死に、生育した胞子が放出される。胞子は母細胞と比べて耐乾性および耐熱性が高く、したがって好ましくない条件における細菌の生存を確保する。好適な条件において、胞子は活性化されて細菌細胞の分裂が再開する。胞子形成に影響を与える遺伝子突然変異によって、胞子形成の様々な段階が確かめられており、現在では、胞子形成に影響を与える遺伝子は１２５以上知られている（Stragier and Losick、1996）。
【０００４】
胞子を形成することができないバシラス属細菌を用いたタンパク質の産生が国際特許出願第ＷＯ９７／０３１８５号に開示されており、例えば、胞子形成遺伝子に突然変異をかけることによって胞子形成させなくすることが提案されている。この文献は、バシラス・リチェニフォルミスからの胞子形成遺伝子ｓｐｏＩＩＡＣの欠失について記載している。欠失は温度感受性プラスミドを用いて行い、これにＳＯＥ（オーバーラップ伸長によるスプライシング）技術を用いて調製したＰＣＲ産物を導入し、この産物においてｓｐｏＩＩＡＣ遺伝子の両側の領域が、中央のｓｐｏＩＩＡＣ遺伝子が切り出されるように連結される。ＳＯＥ技術は例えば米国特許第５０２３１７１号に開示されている。インビトロ欠失構造はプラスミドを用いて細菌細胞のなかに導入することができ、遊離のプラスミドの複製は温度を上昇させることによって阻止することができ、このようにして、染色体中にプラスミドが挿入された組換え細菌が得られる。所望の遺伝子の欠失は、特定の様式で染色体からプラスミドが脱離した場合に起こる。しかし上記国際特許出願において記載された技術では、枯草菌細菌からｓｐｏＩＩＡＣ遺伝子を欠失させることはできなかった。プラスミドの脱離段階での組換えは常にｓｐｏＩＩＡＣ遺伝子がインタクトに維持されるままで起こった。
【０００５】
しかし、非胞子形成枯草菌株は、他の文献にも記載されている。欧州特許第１６４１１７号は、ｓｐｏＩＩＡ遺伝子に突然変異を有する枯草菌株に関し、欧州特許第４９２２７４号は、ｓｐｏＩＩＤ遺伝子に突然変異を有する枯草菌株に関し、米国特許第４４５０２３５号および第４４５０２３６号は、ｓｐｏＯＡ遺伝子において欠失を有する枯草菌株に関する。これら遺伝子は胞子形成段階ＩＩ以前に関与する。
【０００６】
胞子形成の次の段階（ＩＩＩ）の既知の遺伝子の１つは、シグマ−Ｇ因子をコードするｓｉｇＧ遺伝子（＝ｓｐｏＩＩＩＧ遺伝子）であり、この因子はＲＮＡポリメラーゼに結合し、ＲＮＡポリメラーゼは、前胞子におけるある種の胞子形成遺伝子のプロモーターに結合することができる。このシグマ−Ｇ因子は胞子形成の第３段階に必要であり、少なくとも１９の遺伝子の転写を制御することが知られている（Ishii et al.、2001）。シグマ−Ｇ制御系に関与する遺伝子産物は、胞子の生存能と再発芽を向上させる（Haldenwang、1995）。
【０００７】
FouglerとErrington (1989)は、自然に生じたｓｉｇＧ突然変異体である、枯草菌６４６株について記載している。この突然変異について唯一知られていることは、プロモーターと３０の最初のコドンの外側にあることである。この情報は、染色体に挿入された活性のｓｐｏＩＩＩＧ−ｌａｃＺ融合体から得られた。このような自然発生またはランダムに作られた突然変異体の場合、突然変異の位置や正確な作用は通常不明である。かかる株の逆突然変異の可能性、即ち、胞子形成が逆転して元に戻る可能性は、制御し得ず、様々な抑制突然変異の可能性も高い。突然変異の位置が未知であるため、改変されたタンパク質が生じているかも通常知ることはできない。さらに、別の遺伝子における突然変異が、例えば、元の突然変異の効果を抑制しうる。例えばIlling et al. (1990)によって、挿入を作ることによってｓｉｇＧ遺伝子を不活性化させる試みがなされた。例えば、組込み(integration)プラスミドにｓｉｇＧからの３２０塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ−Ｐｓｔｌ断片をクローニングして組込みの結果として非胞子形成枯草菌株Ｎ１５（ｔｒｐＣ２  ｓｐｏＩＩＩＧ：：ｐＳＧＭＵ４２２）を得た。しかしこの組込みプラスミドは、クロラムフェニコールによる選択圧無しでは染色体から脱離し、したがってこのタイプの株は産生宿主としては適さない。
【０００８】
Karmazyn-Campelliら(1989)は、コドン１６６と１６７の間に１．５−ｋｂのクロラムフェニコール耐性カセット（ｃａｔ）（ｓｐｏＩＩＩＧ：：ｃａｔ）を挿入することによるｓｉｇＧ遺伝子の不活性化について記載している。しかしこの挿入は、ｓｉｇＧ遺伝子が切断されても染色体中に保持されるようになされた。したがって、逆突然変異の危険がある。ｃａｔ挿入によって不活性化された株が再組換えできないとしても、欠失によってｓｉｇＧ遺伝子の活性が回復して株の胞子形成が正常に戻ることがあり得る。
【０００９】
Karmazyn-Campelliら(1989)は、さらに。ｓｉｇＧ遺伝子のコドン１８と４２の間の７０塩基対の断片を欠失させた。しかしこの欠失（ｓｐｏＩＩＩＧ△１）の胞子形成に対する効果はいまだに不明である。というのは、欠失の間に、クローニングベクターとして用いたｐＵＣ８から該コドンの間に別の１８塩基対のＨａｅＩＩＩ断片が予期せず現れたからである。この別の断片は最初から直ちに終止コドンを有しており、７０塩基対の欠失が胞子形成を止めるのに十分であったのか定かでない。この別の断片がなければ、少なくとも部分的に機能するシグマ因子が欠失後にも生じたであろう。特に欠失は標的プロモーターへの結合に重要であると考えられている領域を含まないからである。言い換えると、ｓｉｇＧ遺伝子の不活性化が欠失によって生じたのか、単に別の終止コドンによって生じたのか不明であった。
【００１０】
Kim J.-H.らは２００１年に、ｓｐｏＩＩＩＧ遺伝子において欠失を有する枯草菌突然変異体について開示している。問題の欠失は１ヌクレオチド長にすぎず、該遺伝子の機能領域の外側にあった（ｓｉｇＧ遺伝子のヌクレオチド３９７の、チミジン（Ｔ）を欠失させた）。カナマイシン−耐性（ｋａｎａｒ）を欠失部位の後に挿入し、これによって胞子形成能が低下した突然変異体を作成した。株の安定性に関する情報はない。しかし１つのヌクレオチドの復帰突然変異頻度は有意であり、それゆえこの種の株は外来タンパク質の産生宿主としては推奨されない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
以前に公表された文献はほとんど、胞子形成の様々な段階について調査し、突然変異体を選抜するものであり、その安定性についての要求については記載していない。したがって、既存の枯草菌細菌のｓｉｇＧ突然変異体はいずれも産生株として適するものではなく、永続性、即ち非可逆的な、胞子形成が要求される。本発明はこのたび完全に非胞子形成であって、産生株として好適な安定な枯草菌株を提供する。さらに、所望の産物の産生またはその特性に望ましくない効果を与えないように、胞子形成を欠失させる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の概要）
本発明は、ｓｉｇＧ遺伝子から少なくとも１５０ヌクレオチドが欠失していることを特徴とする非胞子形成枯草菌株に関する。ここで記載する欠失は、議論の余地無く、胞子形成の防止におけるｓｉｇＧ欠失の効果を示すことができる初めてものである。さらに、遺伝子欠失において、いかにして欠失が生物体のその他の機能に影響を及ぼすか、あるいは、生物体全体としての生存能力に影響を及ぼすか、ということを予測することは困難である。しかし本発明は、ｓｉｇＧ遺伝子の欠失は、欠失した細菌のその他の必須の機能、例えば、組換えポリペプチドの産生能に影響を与えなかったことを示す。
【００１３】
本発明はまた、非胞子形成枯草菌株の調製方法を提供し、該方法は、枯草菌株のｓｉｇＧ遺伝子から少なくとも１５０ヌクレオチドを欠失させることを特徴とする。さらに、本発明は、上記非胞子形成枯草菌株の産生生物としての使用に関する。さらに本発明は、生物学的に調製される産物の調製方法も含み、該方法は、該産物が本発明の非胞子形成枯草菌株を用いて調製されるということを特徴とする。
【００１４】
本発明の好適な態様は、従属請求項において記載される。
【００１５】
（図面の簡単な説明）
図１は、ｓｉｇＧ遺伝子の欠失の模式図である。
図２は、非胞子形成枯草菌株ＲＳ３０３の欠失領域のヌクレオチド配列を示す。
図３は、胞子形成（ＲＳ２０１）および非胞子形成（ＲＳ３１０）枯草菌株の生育（破線）および１００ｍｌ撹拌培養におけるβ−ラクタマーゼ（ＢＬＰ）の産生（実線）を示す。
【００１６】
（発明の詳細な記載）
本発明の枯草菌はｓｉｇＧ遺伝子の有意な断片を欠失させることによって非胞子形成のものにされたものである。有意な断片の欠失は少なくともおよそ１５０、好ましくは少なくともおよそ３００ヌクレオチドの欠失を意味する。ｓｉｇＧ遺伝子は少なくとも２つの機能性の領域を有する。即ち、これら領域はタンパク質の活性のために重要であり、一方はおそらくＲＮＡポリメラーゼのコア断片に結合するドメインをコードし、これは第６７アミノ酸から開始して第８０アミノ酸で終結する。このドメインは、その他の既知のシグマ因子配列と枯草菌細菌のシグマ−Ｇ因子のアミノ酸配列を比較することによって規定される。もう１つの重要な機能性の領域はＨ−Ｔ−Ｈ（ヘリックス−ターン−ヘリックス）モチーフであり、これはＤＮＡへのタンパク質の結合部位に存在し、これもまた類似性に基づいて規定され、ＳｉｇＧタンパク質のアミノ酸２２９から２４８である。欠失させるべき領域は好ましくはＳｉｇＧタンパク質のアミノ酸６７および２４８をコードするヌクレオチドの間の領域である。より好ましくは、欠失は、ｓｉｇＧ遺伝子の２つの機能性領域のいずれかの少なくとも一部を含むようし、該領域はｓｉｇＧタンパク質のアミノ酸６７から８０またはアミノ酸２２９から２４８をコードする。特に、欠失はｓｉｇＧ遺伝子の該二つの機能性領域の両者の少なくとも一部を含む。あるいは、欠失は機能性領域の間にあってもよく、この場合機能性領域のいずれかの発現が阻害される、および／またはこれらの間の距離がネイティブなシグマ−Ｇ因子様分子を変化させてシグマ−Ｇ因子のＲＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡへの結合が阻害されるようにする。１つの態様によると、少なくとも６００、特に少なくとも６７０ヌクレオチドがｓｉｇＧ遺伝子から欠失される。例えば、ヌクレオチド３９から７１５を欠失させるのが好ましい。ｓｉｇＧ遺伝子全体および該遺伝子のプロモーター領域を欠失させることも可能である。
【００１７】
ｓｉｇＧ遺伝子は様々な手段によって欠失させることができる。好ましくは、インサートをまずＳＯＥ（オーバーラップ伸長による遺伝子スプライシング）技術によって調製する。これは、インサートに要求されるヌクレオチド断片をまずＰＣＲ反応によって増幅し、そのプライマーが、ＰＣＲ反応において増幅される断片が、相補的配列、即ちオーバーラップ領域を用いることによる第二のＰＣＲ反応を介して連結されるように設計されるものである。好ましいインサートは、欠失させる遺伝子の隣接領域と少なくとも１つの選抜マーカー遺伝子を含む。ここで隣接領域とは、欠失させるべき遺伝子領域の上流および下流に隣接し、それ自体は欠失されない領域のことをいう。選抜マーカー遺伝子とは、例えば特定の代謝産物の形成または抗生物質耐性に関与する酵素などのあらゆる選抜可能な特性をコードする遺伝子である。
【００１８】
調製されるインサートはプラスミドであってもよいが、好ましくは直鎖状ＤＮＡであり、この場合、選抜マーカー遺伝子は隣接領域の間に位置する。ついで枯草菌をこのインサート、即ち、「交換カセット」で形質転換する。交換カセットの末端は欠失させるべき遺伝子の隣接領域に相同的である。相同的領域の２つの同時の交差の結果として、インサートは、欠失したｓｉｇＧ遺伝子の代わりに細菌の染色体に組み込まれる。かかる相同的二重組換えを用いて行う欠失については、例えば米国特許第４９６３４８７号に記載されている。このようにして選抜マーカー遺伝子は欠失したｓｉｇＧ遺伝子領域を置換する。ｓｉｇＧ遺伝子が欠失した所望の形質転換体は、ついで選抜マーカー遺伝子によって決まる選択圧に細菌を供することによってスクリーニングできる。本発明の非胞子形成細菌は安定であって、たとえ挿入された選抜マーカー遺伝子が染色体から欠失したとしても胞子形成能を再獲得することはできない。
【００１９】
上記のｓｉｇＧ遺伝子欠失を図１にさらに詳細に示す。３つのＤＮＡ産物、ＡＢ、ＣＤおよびＥＦをそれぞれプライマーＡとＢ、ＣとＤ、およびＥとＦを用いるＰＣＲ反応によって調製する。産物ＡＢとＥＦは枯草菌細菌の染色体ＤＮＡから調製され、産物ＣＤは例えば、好適なプラスミドから調製される。ＡＢはｓｉｇＧ遺伝子の上流の隣接領域であり（ｓｐｏＩＩＧＡの末端およびｓｉｇＥ）、ＥＦはｓｉｇＧ遺伝子の下流の隣接領域である（ｙｌｍＡの最初）。産物ＣＤは選抜マーカー遺伝子であり、この場合は例えばプラスミドｐＨＶ１４（Ehrlich、1978）またはｐＣ１９４（Horinouchi and Weisblum、1982）から得られるクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）である。ＰＣＲに用いるプライマーは、得られるＰＣＲ産物、ＡＢ、ＣＤおよびＥＦが部分的にオーバーラップする相補的配列によって連結できるものである。したがってプライマーＢとＣおよびプライマーＤとＥはそれぞれ、部分的に相補的である。３つのＰＣＲ産物は二段階で連結できる。図１によると、第一にＡＢ＋ＣＤとＣＤ＋ＥＦが連結され、その後得られたＰＣＲ産物ＡＤとＣＦが相同的領域を用いて連結される。相同的領域はＣＤの長さを有し、所望のインサートＡＦが得られ、したがってこれは（５’から３’の順に）ｓｉｇＧ遺伝子隣接領域（例えば、ｓｉｇＥ）、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）およびｓｉｇＧ遺伝子の第二の隣接領域（ｙｌｍＡの最初）を含む。あるいは対応するインサートは第一に例えばＡＤを調製し、それを産物ＥＦに連結することにより、または第一にＣＦを調製し、それを産物ＡＢに連結することによっても構築することができる。ついで枯草菌細菌を得られたインサートＡＦで形質転換し、所望の形質転換体をクロラムフェニコールの存在下で選抜する。
【００２０】
上記プライマーは、選抜マーカー遺伝子の上流のオーバーラップ領域が選抜マーカー遺伝子の下流のオーバーラップ領域に相同的になるように設計することもできる。これによって挿入されたｃａｔ遺伝子を欠失領域から後で欠失させることが可能となる。ｃａｔ遺伝子の欠失は、産物ＡＢとＥＦをオーバーラップ領域を用いたＰＣＲ反応によって連結して産物ＡＢＥＦが生じるようにして起こすことができ、これを用いてＳｉｇＧ−、Ｃａｔ＋形質転換体を形質転換して形質転換体からｃａｔ遺伝子を欠失させる。該相同的オーバーラップ領域はまた、配列におけるオーバーラップ領域の繰り返しによる相同的組換えによってｃａｔ遺伝子を欠失させることも可能にする。
【００２１】
ＳＯＥ技術に用いるプライマーの設計における一般規則は以下の通りであり、例えばSambrook and Russell (2001)に要約されている。ＤＮＡ断片を互いに連結させるためには、ＰＣＲにおいて十分に高いアニーリング温度を用いて特異性を確保するために（McPherson and Moller、2000）、オーバーラップ領域は少なくとも２０から２５ヌクレオチド長でなければならないということに特に注意されたい。より複雑でないＤＮＡ、例えばプラスミドを染色体ＤＮＡのかわりにテンプレートとして用いる場合は、およそ１５ヌクレオチドのより短いオーバーラップ領域も使用できる。合成プライマーを用いる場合、その最大長は現在の技術によるとおよそ１００ヌクレオチドである。変性させて一本鎖にされたＤＮＡ断片、ＰＣＲで作成したＤＮＡ断片または高分子ＤＮＡから制限酵素または機械的にスプライシングされたＤＮＡ断片もプライマーとして用いることができ、この場合プライマーの最大長は正確には決定できないが、数千ヌクレオチドとすることができよう。欠失に用いるＤＮＡ断片の連結が成功するかは、ＰＣＲ産物の純度にも依存する。ある遺伝子またはその部分を欠失させる場合、最終ＳＯＥ産物のＰＣＲ反応が、最初に使用した完全な遺伝子がインタクトであるテンプレートを含まないようにすることが重要である。
【００２２】
枯草菌において、染色体とプラスミドにおける相同的ＤＮＡ領域の間の組換えは有効である。枯草菌中で増幅しないプラスミドにおける１５０塩基対の相同的ＤＮＡが組込みに十分である（Ferrari and Hoch、1989）ということが示唆されている。Khasanov ら (1992)は熱感受性レプリコンを備えたプラスミドを用い、７０ヌクレオチドが相同的組換えを用いて起こる組込みに十分であることを示した。１回の交差によって染色体に組み込まれる上述のプラスミドは、その組込みに相同的組換えが２つの部位で同時に起こることが必要である直鎖状ＤＮＡとは異なる。直鎖状ＳＯＥ技術によって生じたＤＮＡを用いて形質転換する場合、従来の形質転換方法により染色体中のＳＯＥ断片の組込みの検出を可能にするために相同的領域は７０から１５０ヌクレオチドより長くなければならない。直鎖状ＤＮＡインサートの、欠失すべき遺伝子に隣接する領域に相同的な領域は、少なくとも数千塩基対からなり、あるいは少なくとも千塩基対からなる。
【００２３】
相同的領域の最大長は主にＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼの性質に基づいて決定される。現在のＰＣＲ酵素によると数十キロ塩基対のＤＮＡ断片を増幅することができるが、同時に産生されるＤＮＡ断片における突然変異の可能性が増加する。しかし、実際的な相同的領域の最大長は、おそらくおよそ５キロベース（ｋｂ）である。ＤＮＡインサートの欠失させる領域の上流の隣接領域、選抜マーカー遺伝子および欠失させる領域の下流の隣接領域が実質的にすべて同じ長さであることが特に推奨される。もっとも好ましくは、相同的領域の長さはおよそ１ｋｂであり、直鎖状インサートの全長はおよそ３ｋｂである。
【００２４】
遺伝子の欠失は二段階相同的組換えを用いて行うこともできる。この方法はラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）（Biswas et al.、1993）について記載されており、バシラス・リチェニフォルミス（B. licheniformis）のｓｐｏＩＩＡＣ遺伝子が同方法により欠失されている（国際特許出願第ＷＯ９７／０３１８５号）。両者はともにその複製が熱感受性であり、抗生物質耐性マーカーを備えるプラスミドを利用する。欠失させるべき領域の隣接領域がまず、ｐＥ１９４などの枯草菌細菌に適したプラスミドに同じ方向で順次挿入される。プラスミドの複製が可能である３２℃の温度でコンピテント細菌に形質転換し、得られた形質転換体を４５℃で培養し、ここで染色体への組込みが起こった細菌のみがクロラムフェニコール培地で生育できる。組込みの結果、２対の相同的領域が染色体中に形成され、その間で、３２℃でクロラムフェニコール無しで形質転換体を培養したときに、第二の組換えが起こりうる。相同的な対の１つの間の組換えによってプラスミドの脱離と染色体中のプラスミドにおける相同的領域の間の領域の欠失がともに起こる。用いる相同的領域の長さは７０から２５００塩基対とすればよい。記載されるように、同じ株からいくつかの連続する欠失を行うことが可能であり、これは抗生物質選抜マーカーなどの余計な物が何も染色体中に残っていないからである。
【００２５】
プラスミド中の２つの相同的領域を用いるとさらに所望の欠失を起こすことができる。欠失の両側の隣接領域とそれらの間の選抜マーカーを含む欠失構造を、枯草菌細菌では複製できないプラスミド（例えば、ｐＪＨ１０１）に挿入するかあるいはその複製が温度に依存するプラスミド（ｐＥ１９４）に挿入すればよい。得られたプラスミドをコンピテント細菌に形質転換し、耐性の形質転換体をスクリーニングする。かかる方法は通常、両方の相同的領域を介するのではなく１つの相同的領域を介して組換えが起こった形質転換体を識別するために２つの選抜マーカーの使用を必要とする。
【００２６】
実質的にｓｉｇＧ遺伝子が欠失した非胞子形成枯草菌細菌は、様々な生物学的に調製される産物の産生株として好適である。生物学的に調製される産物とは、生物体が産生することができる化合物のことを意味する。通常、それは生物学的に活性な化合物である。好ましくはこの産物は細胞によって細胞外に分泌される。産物は細菌の天然産物でもよいし、遺伝子操作の結果として形成される産物でもよい。遺伝子操作を用いて代謝経路を操作することもでき、細菌に新規な酵素を導入して、その単離が有用である既存または新規代謝産物を蓄積させることもできる。
【００２７】
調製される産物は、例えば医薬用途のポリペプチド、例えば、細菌に基づくβ−ラクタマーゼや、乳腺（mammary）伝達物質、例えば、ペプチドホルモンやインターフェロンである。非胞子形成細菌は工業的に重要な酵素の産生宿主としても好適であり、かかる酵素としては、プロテアーゼ、アミラーゼ、プルラナーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ、β−ラクタマーゼ、キシロースイソメラーゼおよびベータグルカナーゼが挙げられる。さらに、糖類、ヌクレオシド、酸、ビタミン、アミノ酸および界面活性剤、即ち表面張力を低下させるリポペプチドまたはラムノース脂質を産生することもできる。
【００２８】
１つの態様によると、所望のポリペプチド、例えばβ−ラクタマーゼをコードするＤＮＡを、非胞子形成枯草菌株に挿入し、ＤＮＡを細胞中で発現させ、得られた組換えポリペプチドを細胞または増殖培地から回収する。所望のポリペプチドまたは代謝産物の発現に必要なＤＮＡの導入は、自然のコンピテンスまたはエレクトロポーレーションを用いた形質転換などの技術や、枯草菌細菌に好適なあらゆる技術によって行うことができる。
【実施例】
【００２９】
細菌株およびプラスミド
実施例において用いる細菌株とプラスミドの特性を表１に挙げる。宿主生物の枯草菌１６８ｓｉｇＧ遺伝子とその隣接領域の配列は、データバンクから得た（Micado データベース、http://locus/jouy.inra.fr）。ｃａｔ遺伝子をコードする領域はプラスミドｐＳＪ２７３９Ｅ由来であって黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のプラスミドｐＣ１９４のものと同一である（GenBank 登録番号VO1277）。産生ベクターｐＲＳＨ１０は、バシラス・リチェニフォルミスのβ−ラクタマーゼｐｅｎＰをコードするプラスミドである。該プラスミドにおける、ｐｅｎＰは分泌ベクターｐＫＴＨ１４１（Ｌundstrom、1985）のＨｉｎｄＩＩＩクローニングサイトに導入される。ベクターのα−アミラーゼプロモーターとシグナル配列をコードする断片は、バシラス・アミロリクエファシエンス由来である。
【表１】
0005486142.tif 000002
【００３０】
増殖条件
細菌株をルリア・ブロス（ＬＢ）培地（Harwood and Cutting、1991）、５ｇ／ｌイーストエクストラクト（Difco）、１０ｇ／ｌトリプトン（Oxoid）および１０ｇ／ｌ  ＮａＣｌ（Merck）で、＋３７℃、２５０ｒｐｍにて撹拌培養した。タンパク質産生をモニタリングする場合、細胞を濃縮ＬＢ培地（１０ｇ／ｌイーストエクストラクト、２０ｇ／ｌトリプトンおよび１０ｇ／ｌ  ＮａＣｌ）で培養した。クロラムフェニコール（Ｃｍ）５μｇ／ｍｌおよびカナマイシン（Ｋｍ）１０μｇ／ｍｌを細菌培養における選抜のために用いた。
【００３１】
ＤＮＡ技術
常套の方法によるＤＮＡ技術を用いた（Sambrook et al.、1989）。染色体ＤＮＡをMarmur(1961)の指示に従って単離した。プラスミドＤＮＡを細菌細胞からイオン交換カラム（QIAGEN Plasimid Midi Kit）を用いて製造業者の指示に従って単離した（Qiagen Plasimid Purification Handbook July/1999）。この指示から逸脱して、リゾチーム処理をプロトコールに追加してペプチドグルカン層を分解し、この処理において１ｍｇ／ｍｌリゾチームをバッファーＰ１に添加し、細胞をこのバッファー中で３７℃で３０分間インキュベートした。精製したプラスミドを３０から１００μｌの滅菌水に溶解した。プラスミド調製物のＤＮＡ含量は５０から５００ｎｇ／μｌであった。
【００３２】
胞子形成試験
ｓｉｇＧ欠失の胞子形成に対する効果を、胞子形成培地で細菌細胞を培養し、細胞を熱処理（＋８５℃、１０分間）することによって試験した（Harwood and Cutting、1991）。用いた処理は栄養細胞を殺すものであるが、胞子を殺すには十分でない。処理後に生育したコロニー数は胞子の量を示す。
【００３３】
対数増殖期の細菌細胞を胞子形成培地（シャファー（Schaeffer）の胞子形成培地、ＳＳ：８ｇ栄養液、１ｇ  ＫＣｌ、０．１２ｇ  ＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、０．５ｍｌ  １Ｍ  ＮａＯＨ、１ｍｌ  Ｃａ（ＮＯ３）２ｘ４Ｈ２Ｏ、１ｍｌ  ０．０１Ｍ  ＭｎＣｌ２ｘ４Ｈ２Ｏ、１ｍｌ  ０．０００１Ｍ  ＦｅＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ）に１：１００にて播種し、２４時間培養した（＋３７℃、２５０ｒｐｍ）。細菌増殖中の細胞密度を計算するために、段階希釈（１０−１から１０−９）を希釈バッファー（５ｍｌ  ０．１Ｍリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．４、２．５ｍｌ  １Ｍ  ＫＣｌ溶液、５ｍｌ  １０ｍＭ  ＭｇＳＯ４溶液、３７．５ｍｌ滅菌水）中に作成し、１０−５から１０−９の希釈液をＬＢプレートに播いた（１００μｌ／プレート）。プレートを３７℃で恒温槽で一晩インキュベートし、ミリリットルあたりのコロニー数を計算した。
【００３４】
胞子の量を判定するために、細胞を熱処理した。細胞を１０分間＋８５℃に温度制御浴にて加熱した。熱処理後、細胞をＬＢプレートに播いた。プレートを＋３７℃で１７時間インキュベートした。プレート上で生育したコロニー数を計算した（ｍｌあたり）。胞子形成試験において、野生株１６８を対照株として用い、被験株と同様に処理した。
【００３５】
ｓｉｇＧ遺伝子欠失の調製
ｓｉｇＧ遺伝子欠失をＰＣＲとＳＯＥ技術を用いて構築した直鎖状組換えＤＮＡ断片によって野生株枯草菌１６８を形質転換することによって行った（Horton et al.、1989、および米国特許第５０２３１７１号）。行った欠失のフローチャートを図１に示す。ＰＣＲ反応のプライマーは、ＰＣＲ産物が相補的配列を用いた第２のＰＣＲ反応によって連結されるように設計した。表２にＰＣＲ反応に用いたプライマーを挙げる。この表において、プライマー中の相互に相補的な領域を太字と下線で示した。プライマーにおいて用いた相補的領域は、２０ヌクレオチドの領域であって、ｓｉｇＧ遺伝子のヌクレオチド１９から開始する。プライマーＢはｓｉｇＧ遺伝子の開始コドンからのこの領域をコードする。プライマーＢとＤおよびＣとＥはそれぞれ部分的に相同的である。
【表２】
0005486142.tif 000003
【００３６】
ＰＣＲ反応混合物（１００μｌ）中に、２０から５０ｎｇのＤＮＡをテンプレートとして、３０ｐｍｏｌの各プライマー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ（Boehringer Mannheim GmbH、Germany）、０．５μｌのエキスパンド（Expand）酵素（Boehringer Mannheim GmbH、Germany）および１０μｌの１０ｘエキスパンドバッファーを用いた。５０μｌのミネラルオイルを反応混合物表面にピペットにより添加し、反応をPTC-100 Programmable Thermal Controller (MJ Research、Inc.)を用いて行った。ＰＣＲ反応は以下からなる基本プログラムを用いて行った：変性工程（９４℃、４分）および連続する２サイクル（９４℃、１分；５０℃、４５秒；７２℃、４分）および２５サイクル（９４℃、１分；７０℃、４５秒；７２℃、４分）、そして７２℃、１０分のインキュベーション。プライマーのアニーリング温度は各反応に適するように最適化した。ＰＣＲ反応の最終産物を反応混合物から、製造業者の指示（QIAquick Spin Handbook/April 2000）に従って精製し（Qiagen Giaquick ＰＣＲ精製キット、Qiagen GmbH、Germany）、水中（５０μｌ）に溶出させた。精製産物の最終ＤＮＡ濃度は３０から５０ｎｇ／μｌであった。ＰＣＲ反応の最終産物を、１％アガロースゲル電気泳動によって分析した。
【００３７】
ｓｉｇＧ遺伝子欠失の調製において、最初の工程は、それぞれプライマーＡとＢおよびＥとＦを用いたＰＣＲによってｓｉｇＧの隣接領域をコードする産物ＡＢ（１０４７ヌクレオチド、ｎｔ）およびＥＦ（１０６９ｎｔ）を調製することであった。ＰＣＲ反応において、２０ｎｇの野生株１６８の精製染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いた。ｃａｔ遺伝子をコードする１０５４ヌクレオチド長の領域ＣＤをプライマーＣとＤを用いて増幅した。ｐＨＶ１４からのｃａｔ遺伝子が挿入されている、５０ｎｇの精製プラスミドｐＳＪ２７３９ＥをＰＣＲ反応においてテンプレートとして用いた。本発明において用いるｐＳＪ２７９３Ｅから増幅されるＰＣＲ産物は、配列Ｖ０１２７７（GenBank）に記載されているｃａｔ遺伝子およびその周囲と同じ領域を含み、ヌクレオチド９７３から開始してヌクレオチド１９８５にて終結する。産物ＡＢとＣＤを基本プログラムによって増幅した。反応ＥＦの場合、基本プログラムのアニーリング温度は４５℃に下げた。
【００３８】
次の工程において、２．１キロベース長のＰＣＲ産物ＡＤ（２０８１ｎｔ）とＣＦ（２１０３ｎｔ）を２種類の反応によって調製した。反応混合物から精製したＰＣＲ産物をＳＯＥ反応におけるテンプレートとした。ＰＣＲ産物ＡＢとＣＤを２０ｎｔ長の相補的領域を用いて連結した。反応混合物はおよそ３０ｎｇの両方の最終産物を含んでおり、ＰＣＲ反応を基本プログラムにしたがってプライマーＡとＤを用いて行った。第二のＳＯＥ反応において、ＣＤとＥＦを相補的領域を用いて連結して産物ＣＦとした。この反応混合物において、およそ３０ｎｇの両方の産物ＣＤとＥＦをテンプレートとして用い、プライマーＣとＦの濃度をそれぞれ３０ｐｍｏｌとした。この反応において、２５サイクルの基本プログラムを異なる条件で行った（９４℃、１分；７６℃、４５秒；７２℃、４分）。
【００３９】
組換えＤＮＡであるＡＦ（３１３０ｎｔ）を最終産物ＡＤとＣＦから調製した。これら産物を、ｃａｔ遺伝子をコードする、産物ＣＤと同じ長さを有する領域を利用して互いに連結した。この１キロベース長の領域は産物ＡＤとＣＦにおいて相補的である。ＰＣＲ反応のために、上記のＰＣＲ反応の反応混合物から精製した最終産物ＡＤとＣＦをおよそ１００ｎｇと、３０ｐｍｏｌのプライマーＡとＦを含有する反応混合物を調製した。産物ＡＦは基本プログラムによって増幅した。
【００４０】
ｓｉｇＧ遺伝子の欠失を直鎖状の組換えＤＮＡであるＡＦを用いることによって、野生株のコンピテントセルを形質転換することにより調製した。コンピテントセルの調製（Gryzan et al.、1978）は、プレートからの枯草菌１６８細胞を６００μｌのＧＭＩ培地（改変最少培地：０．５ｍｌ  ２０％グルコース、０．１ｍｌ  １０％カザミノ酸、０．１２ｍｌ  １０％イーストエクストラクト、２．０ｍｌ  ５００μｇ／ｍｌトリプトン、０．０３ｍｌ  １Ｍ  ＭｇＣｌ２、１７．２５ｍｌ  ＳＭＳ（Spizizen Minimal Salts））に懸濁することによって開始し、これを用いて１０ｍｌのＧＭＩ培地に、吸光度（Klett-Summerson photometer）がおよそ３０となるように播種した。細胞を撹拌培養にて初期定常期となるまでインキュベートした（３７℃、２５０ｒｐｍ）。培養物を１００ｍｌの最少培地ＧＭＩＩ（改変最少培地：０．５ｍｌ  ２０％グルコース、０．１ｍｌ  １０％カザミノ酸、０．１２ｍｌ  １０％イーストエクストラクト、１．８７５ｍｌ  ２００ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ３）２、１４３．１ｍｌ  ＳＭＳ）に移し、同じ条件で９０分間培養した。細胞を遠心分離し（７０００ｘｇ、５分）、７ｍｌの上清に懸濁した。
【００４１】
野生株枯草菌のコンピテントセルを直鎖状のＰＣＲ産物ＡＦを用いて形質転換した。１０μｌ（ＤＮＡ＞２μｇ）のＰＣＲ反応産物を形質転換に用いた。形質転換において、１０μｌの組換えＤＮＡであるＡＦとｃａｔ遺伝子を誘導するための０．０５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを５００μｌの形質転換溶液（Gryczan et al.、1978）に添加した。細胞を＋３７℃で、３０分間（１８０ｒｐｍ）インキュベートし、細胞を、選抜用に５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに播いた。この形質転換によって３つの形質転換コロニーが生じた。非胞子形成ｓｉｇＧ−欠失株をＲＳ３０３と命名した。
【００４２】
配列決定によるＳｉｇＧ遺伝子欠失コンストラクトの確認
欠失領域の安定性を欠失領域とその隣接領域における細菌の染色体ＤＮＡ配列決定により確認した。ＰＣＲ産物を染色体ＤＮＡから調製し、配列決定した。凍結乾燥したプライマー（Amersham Pharmacia Biotech）を１００μｌの水に溶解し、３μＭ（３ｐｍｏｌ／μｌ）の希釈液をＰＣＲ反応のためのプライマーから調製した。５μＭ（５ｐｍｏｌ／μｌ）の希釈液を配列決定のためのプライマーから調製した。
【００４３】
非胞子形成株ＲＳ３０３とＲＳ３１０の欠失領域の安定性の確認
株ＲＳ３０３とＲＳ３１０の染色体ＤＮＡからの欠失領域の配列決定に必要であったＰＣＲ産物に用いたプライマーを以下に示す。配列におけるプライマーの位置は図２に示す。
SQ1-F 5’TGCGTTAAACCGGATCACGT3’
SQ2-R 5’TGCACTGCACTCAGACCGA3’
SQ3-F 5 ’GTAGCGGATATGATGGGGA3’
SQ4-R 5’CCTGCTGTAATAATGGGTAGA3’
SQ5-F 5’CATGGACTTCATTTACTGGG3
SQ6-F 5 ’GGTATCCTAGTTCGTACAAAG3 ’
SQ7-R 5’GGAGTCCGATGTACTCCGC3’
【００４４】
非胞子形成株ＲＳ３０３とＲＳ３１０のｓｉｇＧ欠失領域の安定性をプライマーＳＱ１−ＦからＳＱ７−Ｒを用いて増幅した３つのＰＣＲ産物の配列決定により確認した：ＳＲＳ１２、ＳＲＳ３４およびＳＲＳ５６７。以下の表はＰＣＲ産物のサイズとＰＣＲ反応の配列決定に用いたプライマーを示す。
0005486142.tif 000004
【００４５】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動（１％ゲル）によって分析した。産物ＳＲＳ１２を反応混合物から製造業者の指示(QIAquick Spin Handbook/April 2000）に従って精製し（Qiagen Giaquick PCR 精製キット、Qiagen GmbH、Germany)、水中（５０μｌ）に溶出させた。産物ＳＲＳ３４とＳＲＳ５６７を、産物中に不純物が存在したためアガロースゲルから単離した。ゲルからの精製は市販のカラム（Qiagen Gel Extraction kit）を用いて製造業者の指示（QIAquick Spin Handbook/April 2000）に従って行い、産物を水中（５０μｌ）に溶出させた。精製した産物の最終ＤＮＡ濃度は３０から５０ｎｇ／μｌであった。
【００４６】
非胞子形成株ＲＳ３０３とＲＳ３１０の欠失領域のヌクレオチド配列を配列番号９に示す。図２もまた、ｓｉｇＧ遺伝子領域における非胞子形成枯草菌株の配列を示す。染色体から欠失した領域は野生株１６８の配列における領域１６０５０６３〜１６０５７３９（Micado データベース、http://locus/jouy.inra.fr）に対応する。７８０ヌクレオチドのｓｉｇＧ遺伝子をコードする領域から、６７７ヌクレオチドが欠失によって除かれていた。欠失部位に挿入されたｃａｔ遺伝子を含有する領域（灰色で強調）は、プラスミドｐＣ１９４（Genbank 登録番号V01277）の配列のヌクレオチド９７３から１９８５に対応する。欠失を行うために作られたＳＯＥ断片はｃａｔ領域の隣接領域に２１塩基対長の反復配列（太字）を含んでいた。配列決定された領域はヌクレオチド１６０３９６１（↓）から開始し、最後の配列決定されたヌクレオチドは１６０６８５１（↑）である。プライマーＳＱ１からＳＱ７を用いてＲＳ３０３株の配列決定を行った。これらプライマーを用いてＰＣＲ産物を調製し、これを同じプライマーを用いて配列決定した。ＰＣＲ産物の増幅に用いたプライマーに対応する配列（Ｆプライマー）とそれに相補的な配列（Ｒプライマー）に下線を施してある。ＳＯＥ反応に用いたプライマーＡからＦを線上の破線によって示す。ｓｉｇＧとｃａｔ遺伝子の開始コドンは斜体で示し、ｓｉｇＧ遺伝子の終止コドンは（＊ＥＮＤ）として示し、ｃａｔ遺伝子の終止コドンは（＊）として示す。遺伝子バンクの配列と異なるそれぞれのヌクレオチドは二重下線で示す。欠失後、最初の３８ヌクレオチドと最後の６５ヌクレオチドはｓｉｇＧ遺伝子に残る。ｃａｔ遺伝子の挿入後、２１ヌクレオチド長のオーバーラップ領域が反復し、これはｓｉｇＧ遺伝子の最初におけるものと同じ配列を有する。
【００４７】
公表された枯草菌配列（Kunst et al.、1997）との相違が配列決定において判明した。同じ配列の相違が野生株１６８染色体のｓｉｇＧ遺伝子隣接領域を配列決定した場合にもみられた。配列におけるこの相違を図２の欠失領域の配列に示す。しかし、組込みに用いた相同的領域は野生株枯草菌１６８の配列決定の結果と同じであった。
【００４８】
胞子形成に対するｓｉｇＧ遺伝子欠失の効果
胞子形成に対するｓｉｇＧ欠失の効果を、胞子形成培地にてｓｉｇＧ−欠失枯草菌株ＲＳ３０３を培養し、栄養細胞を＋８５℃で熱処理することによって試験した。欠失の安定性はＲＳ３０３を選択圧下（クロラムフェニコール５μｇ／ｍｌ、ＳＳ培養液）および選抜無しで培養することによってモニターした。熱処理後、細胞をＬＢプレートに播いた。野生株１６８を対照株として用い、同様に処理した。野生株１６８の培養液には、１ミリリットルあたり２．１ｘ１０８の胞子があった。ＲＳ３０３は全く胞子を産生しなかった（表３）。ＳＳ培養液中で選抜無しでＲＳ３０３細胞を培養した場合も胞子は産生されなかった。このことから、ｓｉｇＧ遺伝子の欠失が細菌の胞子形成を妨げ、そしてｓｉｇＧ欠失は安定であると結論づけられる。
【表３】
0005486142.tif 000005
【００４９】
β−ラクタマーゼの産生プラスミド、ｐＲＳＨ１０の構築
外来タンパク質の増殖培地への分泌をバシラス・リチェニフォルミス７４９／Ｃ細菌のβ−ラクタマーゼ遺伝子を分泌ベクターｐＫＴＨ１４１（Lundstrom、1985）に挿入することによって調査した。このベクターにおいては、外来タンパク質の分泌はα−アミラーゼプロモーターおよびバシラス・アミロリクエファシエンスのシグナル配列によって制御される。外来タンパク質をコードする領域の所望の断片を、シグナル配列を有する正しいリーディングフレームにてＨｉｎｄＩＩＩクローニングサイトに挿入することができ、それによってタンパク質が増殖培地に分泌される。挿入は以下に簡単に説明するように行った：染色体ＤＮＡ（Marmur、1961）をバシラス・リチェニフォルミス細菌７４９／Ｃから単離し、ＰＣＲ反応におけるテンプレートとして使用した。８１７塩基対長のＰＣＲ産物がＰＥＬ−１４１Ｆ（配列番号７）およびＰＥＮ−１４１Ｒ（配列番号８）プライマーによってテンプレートから増幅され、産物はいわゆる小エキソペニシリナーゼ（small exopenicillinase）をコードする領域を含み、GenBank配列V00093のヌクレオチド１２９から９２１（およびSwiss-Prot配列P00808のアミノ酸４３から３０７）に対応していた。１００μｌのＰＣＲ反応混合物は、１０ｎｇテンプレートＤＮＡ、０．３μＭプライマー、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０μｌ酵素製造業者のバッファー、１．５μｌエキスパンド酵素（３．５Ｕ／μｌ、Boehringer Mannheim）を含むものであった。ＰＣＲプログラムは最初の９４℃４分の加熱、ついで２８回の、９４℃４０秒、５０℃２０秒、７２℃１分、そして最後に７２℃５分からなるものであった。得られたＰＣＲ産物を精製し、プライマーに付加されたＨｉｎｄＩＩＩ制限部位によってｐＫＴＨ１４１に挿入し、そして産生プラスミドｐＲＳＨ１０を得た。プラスミドｐＲＳＨ１０のβ−ラクタマーゼをコードする領域を配列決定したところ、その配列は遺伝子バンクの配列と相違しなかった。枯草菌１６８とＲＳ３０３をｐＲＳＨ１０で形質転換し（Gryczan et al.、1978）、それぞれ細菌株ＲＳ２０１とＲＳ３１０を得た。
【００５０】
β−ラクタマーゼ過剰産生株における非胞子形成および欠失の安定性に対するｓｉｇＧ遺伝子欠失の効果
産生ベクターｐＲＳＨ１０による非胞子形成コンピテント株ＲＳ３０３の形質転換によって産生株ＲＳ３１０が生じた。ｓｉｇＧ遺伝子の欠失は細菌の能力（competence）に影響を与えなかった。新しい産生株の胞子形成とｓｉｇＧ遺伝子の安定性をクロラムフェニコールで選抜せずに胞子形成培地でＲＳ３１０株を培養することによってモニターした。胞子形成の発達を、２４時間培養物をＳＳ培地に再播種することによってさらに数増殖周期にわたってモニターした。本明細書において増殖周期とは、新しい胞子形成培地に１：１００にて播種した２４時間の増殖を意味する。胞子形成を３増殖周期にわたってモニターした。細胞をＩからＩＩＩの増殖から取り出して熱処理した。熱処理後、細胞をＬＢプレートまたはＬＢクロラムフェニコールプレートに播いた。
【００５１】
培養中に、野生株１６８では平均２．８ｘ１０８の胞子が生じた。ＲＳ３１０欠失株では全く胞子は生じなかった（表４）。クロラムフェニコール選抜無しでＳＳ培地で細胞を培養した場合、ＲＳ３１０株の非胞子形成が維持されたという事実は、安定性を示すものであると考えられる。選抜ＬＢプレート（クロラムフェニコール５μｇ／ｍｌ）での栄養細胞数もＬＢプレート上の細胞数と同じに維持された。この試験により、欠失とｃａｔ遺伝子の挿入のコンストラクトは安定であることが示された。
【表４】
0005486142.tif 000006
【００５２】
表５はＲＳ３１０株の胞子形成をモニターした第２の増殖における栄養細胞と胞子形成細胞の数を示す。この際、栄養細胞数はクロラムフェニコール含量がより低いプレートにおけるＲＳ３１０培養物において判定した。プレート中のクロラムフェニコール濃度が高ければ、細菌の増殖が非常に遅かったため、培地中のクロラムフェニコール量を低くすることにより、選択圧を低くした。コロニーは小さいままであり、おそらくすべての栄養細胞が現れたわけではなかった。より比較可能な結果を得るために、選択圧をプレート中のクロラムフェニコールを１μｇ／ｍｌにまで低くした。クロラムフェニコールプレートにおける栄養細胞数はＬＢプレートと同程度に維持された。対照株として用いた野生株１６８は平均して３．５ｘ１０８胞子／ｍｌを産生した。ＲＳ３１０は培養物中に胞子を形成しなかった。したがって、これらの結果も、ｓｉｇＧ遺伝子欠失の効果をよく示している。産生株は完全に非胞子形成であり非常に安定である。
【表５】
0005486142.tif 000007
【００５３】
非胞子形成株のβ−ラクタマーゼ産生
新しい非胞子形成細菌株、ＲＳ３１０のβ−ラクタマーゼ（ＢＬＰ）産生を、産生プラスミドｐＲＳＨ１０で形質転換した野生株１６８、即ち株ＲＳ２０１におけるβ−ラクタマーゼの産生レベルと比較した。β−ラクタマーゼ産生は１００ｍｌの撹拌培養においてモニターした。増殖培養液のβ−ラクタマーゼ活性はO’Callaghan ら(1972)によって開発された方法に従って色素生産性基質であるニトロセフィン（nitrocefin）を用いて分光測定によって測定した。４８６ｎｍでの吸光度変化を活性単位ＢＵに変換した。ＢＵ：３０℃で１時間あたりベンジルペニシリン１μｍｏｌ分解する単位。変換には、実験的に決定した係数２６．３を用いた。この活性単位をついで、β−ラクタマーゼμｇ／ｍｌ単位に変換した。この変換には３４０ＢＵ／μｇタンパク質のβ−ラクタマーゼ比活性を用いた（Simons et al.、1978）。選抜のためにカナマイシン１０μｇ／ｍｌを含む濃縮ＬＢ培地を増殖培地として用いた。０．１ｍｌの対数増殖期の細胞を１００ｍｌの増殖培養液に播種し、細胞を２ｌの撹拌ビンで培養した（＋３７℃、２５０ｒｐｍ）。増殖を２５時間にわたって吸光度（ＯＤ６００ｎｍ）を測定することによってモニターした。結果を図３に示す。細菌株ＲＳ３１０とＲＳ２０１は対数増殖期において同様の増殖速度を有しており、最高のＯＤ６００ｎｍ値は１１時間目に達成された。両方の株の増殖培養液はおよそ２５０μｇ／ｍｌのβ−ラクタマーゼを含有していた。１１時間後に、細菌密度は減少し始め、培養の最後にはＲＳ３１０株のＯＤ６００ｎｍ値は７．６であり、ＲＳ２０１株については８．１であった。しかし増殖培養液中のβ−ラクタマーゼ含量は増加し、培養の最後には新しい非胞子形成産生株ＲＳ３１０については４３０μｇ／ｍｌ、そしてＲＳ２０１株については３８０μｇ／ｍｌであった。さらに増殖培養液に分泌されるタンパク質のプロフィールに対するｓｉｇＧ遺伝子欠失の効果をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル泳動によって調べたところ、クーマシーブルー染色したゲル（１５％アクリルアミド）において非胞子形成株と野生株との相違は検出されなかった。得られた結果に基づくと、ｓｉｇＧ遺伝子欠失は細菌増殖または分泌タンパク質産生を妨げはしないようである。
【００５４】
技術は進展しているが当業者にとって本発明の基本概念は様々な手段で実施することができることは明白である。本発明とその態様は上記実施例に限定されるものではなく、特許請求の範囲の枠内で様々な形態をとりうる。
【００５５】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、ｓｉｇＧ遺伝子の欠失の模式図である。
【図２】図２は、非胞子形成枯草菌株ＲＳ３０３の欠失領域のヌクレオチド配列を示す。
【図３】図３は、胞子形成（ＲＳ２０１）および非胞子形成（ＲＳ３１０）枯草菌株の生育（破線）および１００ｍｌ撹拌培養におけるβ−ラクタマーゼ（ＢＬＰ）の産生（実線）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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