(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上のメラノコルチン受容体のリガンドとして作用するペプチドを含む溶液の医薬組成物。であって、前記のペプチドが以下のもの：
Ac-Arg-シクロ(Cys-D-Ala-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys)-NH2;
Ac-D-Arg-シクロ(Cys-D-Ala-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys)-NH2;
Ac-Tyr-Arg-シクロ(Cys-D-Ala-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys)-NH2;
Ac-Tyr-D-Arg-シクロ(Cys-D-Ala-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys)-NH2;または
ヒダントイン(Arg-Gly)-シクロ(Cys-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys)-NH2;
またはその医薬的に許容できる塩であり、
前記ペプチドが対象への皮下または筋肉内投与の後デポーを形成し、
前記デポーがゆっくりと溶解してペプチドを体液および血流中に放出し、
前記溶液は、有機性ＰＥＧ２００またはＰＥＧ４００構成要素を有する水溶液であり、ここでＰＥＧの水に対する体積対体積比が１：９９から９９：１までである、
前記医薬組成物。
【請求項２】
前記のペプチドがAc-Arg-シクロ(Cys-D-Ala-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys)-NH2である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記の医薬的に許容できる塩がパモ酸塩である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
さらに第２の有機性構成要素を含み、有機性構成要素がアルコール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、またはＤＭＡである請求項１〜３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記のペプチドをＰＥＧ２００またはＰＥＧ４００水溶液中で溶解させ、ここでＰＥＧの水に対する体積対体積比が約１：９から約１：１までである、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記のアルコールがエタノールまたはイソプロピルアルコールである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記のペプチドの重量対体積濃度が約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約６００ｍｇ／ｍＬである、請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記の組成物のｐＨが約３．０〜約８．０である、請求項１〜７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記のArg-シクロ(Cys-D-Ala-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys)-NH2のパモ酸塩をＰＥＧ４００／水溶液中で溶解させ、ここでＰＥＧ４００の水に対する体積対体積比が約１：１であり、そのペプチドの重量対体積濃度が約２００ｍｇ／ｍＬである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記のArg-シクロ(Cys-D-Ala-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys)-NH2のパモ酸塩をＰＥＧ２００／水溶液中で溶解させ、ここでＰＥＧ２００の水に対する体積対体積比が約１：１であり、そのペプチドの重量対体積濃度が約２００ｍｇ／ｍＬである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記のArg-シクロ(Cys-D-Ala-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys)-NH2のパモ酸塩をＰＥＧ４００／ＰＢＳ溶液中で溶解させ、ここでＰＥＧ４００のＰＢＳに対する体積対体積比が約１：１であり、そのペプチドの重量対体積濃度が約３００ｍｇ／ｍＬである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記のArg-シクロ(Cys-D-Ala-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys)-NH2のパモ酸塩をＰＥＧ４００／生理食塩水溶液中で溶解させ、ここでＰＥＧ４００の生理食塩水溶液に対する体積対体積比が約１：１であり、そのペプチドの重量対体積濃度が約３００ｍｇ／ｍＬである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
さらに保存剤を含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記の保存剤が、ｍ−クレゾール、フェノール、ベンジルアルコール、およびメチルパラベンからなるグループから選択される、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記の保存剤が約０．０１ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬまでの濃度で存在する、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
さらに等張剤を含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記の等張剤が約０．０１ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬまでの濃度で存在する、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
さらに安定剤を含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記の安定剤がイミダゾール、アルギニンおよびヒスチジンからなるグループから選択される、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
さらに界面活性剤を含む、請求項１〜１９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２１】
さらにキレート剤を含む、請求項１〜２０のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２２】
さらに緩衝剤を含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記の緩衝剤がトリス、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、グリシン、アスパラギン酸、およびビス−トリスからなるグループから選択される、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
さらに二価金属を含む、請求項１〜２３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記の二価金属が亜鉛である、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記の溶液が透明な液体である、請求項１〜２５のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラノコルチン受容体（ＭＣ−Ｒ）の内の１種類以上のリガンドであるペプチド、またはその医薬的に許容できる塩類を含有する組成物、そのような組成物を調製するための方法、および哺乳類を処置するためにそのような組成物を用いる方法における向上に関する。特に、本発明はメラノコルチン受容体亜型４（ＭＣ４−Ｒ）のリガンドであるAc-Arg-シクロ(Cys-D-Ala-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys)-NH2のパモ酸塩を含む医薬組成物に関し、ここで、対象への皮下または筋肉内投与の後、そのペプチドは生理的ｐＨにおいてデポーを形成し、それはゆっくりと溶解して体液および血流中へと放出される。本発明は、さらに有機性構成要素、例えばジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）または１０００より低い平均分子量を有するプロピレングリコール（ＰＥＧ）を含んでいてよい。
【背景技術】
【０００２】
メラノコルチン類はプロホルモンであるプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ；長さ１３１アミノ酸）の翻訳後プロセシングにより形成される調節ペプチドのファミリーである。ＰＯＭＣは３つのクラスのホルモンへとプロセシングされる；メラノコルチン類、副腎皮質刺激ホルモン、および様々なエンドルフィン類（例えばリポトロピン）(Cone, et al., Recent Prog. Horm. Res., 51:287-317, (1996); Cone et al., Ann. N.Y.Acad. Sci., 31:342-363, (1993))。
【０００３】
メラノコルチン類は脳、副腎、皮膚、精巣、脾臓、腎臓、卵巣、肺、甲状腺、肝臓、結腸、小腸および膵臓を含む多種多様な正常なヒト組織で見付かっている(Tatro, J. B. et al., Endocrinol. 121:1900-1907 (1987); Mountjoy, K. G. et al., Science 257:1248-1251 (1992); Chhajlani, V. et al., FEBS Lett. 309:417-420 (1992); Gantz, I. et al. J. Biol. Chem. 268:8246-8250 (1993)およびGantz, I. et al., J. Biol. Chem. 268:15174-15179 (1993))。
【０００４】
メラノコルチンペプチド類は、行動および記憶の制御、神経栄養および解熱特性に影響を及ぼすこと、ならびに免疫系の調節に影響を及ぼすことを含む多種多様な生理活性を示すことが示されている。副腎皮質機能への（副腎皮質刺激ホルモンまたは“ＡＣＴＨ”）、およびメラニン細胞への（メラニン細胞刺激ホルモンまたは“ＭＳＨ”）それらのよく知られた作用は別として、メラノコルチン類は心臓血管系、鎮痛、体温調節ならびにプロラクチン、黄体形成ホルモンおよび生体アミン類を含む他の神経液性因子の放出を制御していることも示されている(De Wied, D. et al., Methods Achiev. Exp. Pathol. 15:167-199 (1991); De Wied, D. et al., Physiol. Rev. 62:977-1059 (1982); Guber, K.A. et al., Am. J. Physiol. 257:R681-R694 (1989); Walker J.M. et al., Science 210:1247-1249 (1980); Murphy, M. T. et al., Science 221:192-193 (1983); Ellerkmann, E. et al., Endocrinol. 130:133-138 (1992)およびVersteeg, D. H. G. et al., Life Sci. 38:835-840 (1986))。
【０００５】
メラノコルチン類の結合部位は、涙腺および顎下腺、膵臓、脂肪、膀胱、十二指腸、脾臓、脳および生殖腺組織、ならびに悪性黒色腫を含む多くの異なる組織タイプに分布していることも示されている。現在までに５種類のメラノコルチン受容体が特性づけられている。これらには、メラニン細胞特異的受容体（ＭＣ１−Ｒ）、副腎皮質特異的ＡＣＴＨ受容体（ＭＣ２−Ｒ）、メラノコルチン−３受容体（ＭＣ３−Ｒ）、メラノコルチン−４受容体（ＭＣ４−Ｒ）およびメラノコルチン−５受容体（ＭＣ５−Ｒ）が含まれる。そのメラノコルチン受容体の全てが、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）のクラスのペプチドホルモンに応答する(Cone, R. D. et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 680:342-363 (1993); Cone, R. D. et al., Recent Prog. Horm. Res., 51:287-318 (1996))。
【０００６】
当技術でメラニン細胞刺激ホルモン受容体（ＭＳＨ−Ｒ）、メラノトロピン受容体またはメラノコルチン−１受容体として知られているＭＣ１−Ｒは、Ｇタンパク質共役型受容体のファミリーに属する３１５アミノ酸の膜貫通タンパク質である。ＭＣ１−ＲはＭＳＨおよびＡＣＴＨの両方に関する受容体である。ＭＣ１−Ｒの活性は、アデニル酸シクラーゼを活性化するＧタンパク質により仲介される。ＭＣ１−Ｒ受容体は、メラニン細胞および副腎皮質組織、ならびに様々な他の組織、例えば副腎、白血球、肺、リンパ節、卵巣、精巣、下垂体、胎盤、脾臓および子宮で見られる。副腎皮質刺激ホルモン受容体（ＡＣＴＨ−Ｒ）とも呼ばれるＭＣ２−Ｒは、メラニン細胞および副腎皮質組織で見られる２９７アミノ酸の膜貫通タンパク質である。ＭＣ２−ＲはＡＣＴＨの副腎皮質刺激作用を仲介する。ヒトでは、ＭＣ３−Ｒは脳組織で見られる３６０ＡＡのタンパク質であり；マウスおよびラットでは、ＭＣ３−Ｒは３２３ＡＡのタンパク質である。ＭＣ４−Ｒは３３２アミノ酸の膜貫通タンパク質であり、それは脳ならびに胎盤および腸組織でも発現している。ＭＣ５−Ｒは、副腎、胃、肺および脾臓において、ならびに非常に低いレベルで脳において発現する、３２５アミノ酸の膜貫通タンパク質である。ＭＣ５−Ｒは副腎皮質の３つの層、主にアルドステロン産生糸球帯細胞でも発現している。
【０００７】
しかし、その５種類の既知のメラノコルチン受容体はそれらの機能が異なる。例えばＭＣ１−Ｒは、ＭＣ１−Ｒの強力なアゴニストであるα−ＭＳＨに応答して色素形成を制御するＧタンパク質共役型受容体である。ＭＣ１−Ｒ受容体の作動（Ａｇｏｎｉｓｍ）は結果としてメラニン細胞の刺激をもたらし、それはユーメラニンを生じさせ、皮膚の癌の危険性を増大させる。ＭＣ１−Ｒの作動は神経学的作用を有する可能性もある。ＭＣ２−Ｒ活性の刺激は、結果として副腎組織の癌腫を生じさせる可能性がある。最近の薬理学的確認により、中枢のＭＣ４−Ｒ受容体はメラノコルチンのアゴニストおよびアンタゴニストに関してそれぞれ報告された食欲低下および食欲促進作用の主要な仲介因子であることが確証された。ＭＣ３−ＲおよびＭＣ５−Ｒの作動の作用はまだ知られていない。
【０００８】
肥満および悪液質のような体重の障害を処置するための新規の療法の設計のための標的として、メラノコルチン（ＭＣ−Ｒ）受容体に大きな関心が持たれてきた。遺伝学的および薬理学的証拠の両方が、中枢のＭＣ４−Ｒ受容体を主要な標的として指し示している(Giraudo, S. Q. et al., Brain Res., 809:302-306 (1998); Farooqi, I. S. et al., NE J Med., 348:1085-1095 (2003); MacNeil, D. J. et al., Eu. J. Pharm., 44:141-157 (2002); MacNeil, D. J. et al., Eu. J. Pharm., 450:93-109 (2002); Kask, A. et al., NeuroReport, 10:707-711 (1999))。受容体選択的アゴニストおよびアンタゴニストについての現在の進歩は、メラノコルチン受容体の活性化、特にＭＣ４−Ｒの療法的可能性を明示している。
【０００９】
１種類以上のメラノコルチン受容体を活性化するアゴニスト、アンタゴニストまたは他のリガンド化合物は、それを必要とする、またはその危険にさらされている対象において、以下のものを含む多種多様な適応症を処置するのに有用であろう：急性および慢性の炎症性疾患、例えば一般的炎症(米国特許第６，６１３，８７４号; Catania, A. et al., Pharm. Rev., 56:1-29 (2004))、炎症性腸疾患(米国特許第６，７１３，４８７号; Catania, A. et al., Pharm. Rev., 56:1-29 (2004))、脳炎症(Catania, A. et al., Pharm. Rev., 56:1-29 (2004))、敗血症(米国特許第６，６１３，８７４号;米国特許第６，７１３，４８７号; Catania, A. et al., Pharm. Rev., 56:1-29 (2004))、および敗血症性ショック(米国特許第６，６１３，８７４号; Catania, A. et al., Pharm. Rev., 56:1-29 (2004));自己免疫性構成要素を有する疾患、例えばリウマチ性関節炎(米国特許第６，７１３，４８７号; Catania, A. et al., Pharm. Rev., 56:1-29 (2004))、痛風性関節炎(Catania, A. et al., Pharm. Rev., 56:1-29 (2004), Getting, S. J. et al., Curr. Opin. Investig. Drugs, 2:1064-1069 (2001))、および多発性硬化症((米国特許第６，７１３，４８７号);体重増加を伴う代謝性疾患および医学的状態、例えば肥満(米国特許第６，６１３，８７４号;米国特許第６，６００，０１５号; Fehm, H. L. et al., J. Clin. Endo. 2 Metab., 86:1144-1148 (2001); Hansen, M. J. et al., Brain Res., 1039:137-145 (2005); Ye, Z. et al., Peptides, 26:2017-2025 (2005); Farooqi, I. S. et al., NE J Med., 348:1085-1095 (2003); MacNeil, D. J. et al., Eu. J. Pharm., 44:141-157 (2002); MacNeil, D. J. et al., Eu. J. Pharm., 450:93-109 (2002); Kask, A. et al., NeuroReport, 10:707-711 (1999); Schwartz, M. W., J. Clin. Invest., 108:963-964 (2001), Gura, T., Science, 287:1738-1740 (2000), Raffin-Sanson, M. L., Eu. J. Endo., 144:207-208 (2001), Hamilton, B. S. et al., Obesity Res. 10:182-187 (2002))、摂食障害(米国特許第６，７２０，３２４号; Fehm, H. L. et al., J. Clin. Endo. 2 Metab., 86:1144-1148 (2001); Pontillo, J. et al., Bioorganic 2 Med. Chem. Ltrs., 15:2541-2546 (2005))およびプラダー−ウィリ症候群（Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）(GE, Y. et al., Brain Research, 957:42-45 (2002));体重減少を伴う代謝性の疾患および医学的状態、例えば食欲低下(米国特許第６，６１３，８７４号; Wisse, B. R. et al., Endo., 142:3292-3301 (2001))、食欲異常亢進(米国特許第６，７２０，３２４号)、ＡＩＤＳ衰弱(Marsilje, T. H. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 14:3721-3725 (2004); Markison, S. et al., Endocrinology, 146:2766-2773 (2005))、悪液質(米国特許第６，６１３，８７４号; Lechan, R. M. et al., Endo., 142:3288-3291 (2001); Pontillo, J. et al., Bioorganic 2 Med. Chem. Ltrs., 15:2541-2546 (2005))、癌性悪液質(米国特許第６，６３９，１２３号)および虚弱高齢者における衰弱(米国特許第６，６３９，１２３号);糖尿病(米国特許第６，７１３，４８７号)ならびに糖尿病学的に（ｄｉａｂｅｔａｌｏｇｉｃａｌ）関連する病気および糖尿病の合併症、例えば網膜障害(米国特許第６，５２５，０１９号);新生物性増殖(米国特許第６，７１３，４８７号)、例えば皮膚癌(Sturm, R.A., Melanoma Res., 12:405-416 (2002); Bastiens, M. T. et al., Am. J. Hum. Genet., 68:884-894 (2001))、および前立腺癌(Luscombe, C. J. et al., British J. Cancer, 85:1504-1509 (2001);生殖または性的な医学的状態、例えば女性における子宮内膜症(米国特許第６，７１３，４８７号)および子宮出血(米国特許第６，６１３，８７４号)、性的機能障害(米国特許第６，７２０，３２４号; Van der Ploeg, L. H. T. et al., PNAS, 99:11381-11386 (2002), Molinoff, P. B. et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 994:96-102 (2003), Hopps, C. V. et al., BJU International, 92:534-538 (2003))、勃起機能障害((米国特許第６，６１３，８７４号; Diamond, L. E. et al., Urology, 65:755-759 (2005), Wessells, H. et al., Int. J. Impotence Res., 12:S74-S79 (2000), Andersson, K-E. et al., Int. J. Impotence Res., 14:S82-S92 (2002), Bertolini, A. et. al., Sexual Behavior: Pharmacology and Biochemistry, Raven Press, NY, p 247-257 (1975); Wessells, H. et al., Neuroscience, 118:755-762 (2003), Wessells, H. et al., Urology, 56:641-646 (2000), Shadiack, A. M. et al., Society for Neuroscience Abstract, (2003); Wessells, H. et al., J. Urology, 160:389-393 (1998), Rosen, R. C. et al., Int. J. Impotence Res., 16:135-142 (2004), Wessells, H. et al., Peptides, 26:1972-1977 (2005))、ならびに男性における性的応答の減少(米国特許第６，７１３，４８７号; Fourcroy, J. L., Drugs, 63:1445-1457 (2003));生体に対する処置または傷害の結果として生じる疾患または病気、例えば臓器移植拒絶(米国特許第６，７１３，４８７号; Catania, A. et al., Pharm. Rev., 56:1-29 (2004))、虚血および再潅流傷害(Mioni, C. et al., Eu. J. Pharm., 477:227-234 (2003); Catania, A. et al., Pharm. Rev., 56:1-29 (2004))、脊髄損傷の処置および創傷治癒を促進するための処置(Sharma H. S. et al., Acta. Nerochir. Suppl., 86:399-405 (2003); Sharma H.S., Ann. N.Y. Acad. Sci. 1053: 407-421 (2005);米国特許第６，５２５，０１９号)、ならびに化学療法、放射線療法、一時的または永続的な固定により引き起こされる体重減少(Harris, R. B. et al., Physiol. Behav., 73:599-608 (2001))または透析；心血管の疾患または病気、例えば出血性ショック(Catania, A. et al., Pharm. Rev., 56:1-29 (2004))、心原性ショック(米国特許第６，６１３，８７４号)、低血液量性ショック(米国特許第６，６１３，８７４号)、心血管障害(米国特許第６，６１３，８７４号)、および心性悪液質(Markison, S. et al., Endocrinology, 146:2766-2773 (2005);肺の疾患または病気、例えば急性呼吸窮迫症候群(米国特許第６，３５０，４３０号; Catania, A. et al., Pharm. Rev., 56:1-29 (2004))、慢性閉塞性肺疾患(米国特許第６，７１３，４８７号)、喘息(米国特許第６，７１３，４８７号)および肺線維症；免疫寛容を増進すること(Luger, T. A. et al., Pathobiology, 67:318-321 (1999))および免疫系に対する攻撃、例えば特定のアレルギー(米国特許第６，７１３，４８７号)または臓器移植拒絶(米国特許第６，７１３，４８７号; Catania, A. et al., Pharm. Rev., 56:1-29 (2004))と関係する免疫系に対する攻撃と戦うこと;皮膚科学的疾患および病気、例えば乾癬(米国特許第６，７１３，４８７号)、皮膚色素沈着喪失(米国特許第６，７１３，４８７号; Ye, Z. et al., Peptides, 26:2017-2025 (2005))、アクネ(Hatta, N. et al., J. Invest. Dermatol., 116:564-570 (2001); Bohm, M. et al., J. Invest. Dermatol., 118:533-539 (2002))、ケロイド形成(米国特許第６，５２５，０１９号)および皮膚癌(Sturm, R.A., Melanoma Res., 12:405-416 (2002); Bastiens, M. T. et al., Am. J. Hum. Genet., 68:884-894 (2001))の処置;行動、中枢神経系または神経の病気および障害、例えば不安(米国特許第６，７２０，３２４号; Pontillo, J. et al., Bioorganic 2 Med. Chem. Ltrs., 15:2541-2546 (2005))、抑うつ(Chaki, S. et al., Peptides, 26:1952-1964 (2005), Bednarek, M. A. et al., Expert Opinion Ther. Patents, 14:327-336 (2004);米国特許第６，７２０，３２４号)、記憶および記憶機能障害(米国特許第６，６１３，８７４号; Voisey, J. et al., Curr. Drug Targets, 4:586-597 (2003))、痛覚の調節(米国特許第６，６１３，８７４号; Bertolini, A. et al., J. Endocrinol. Invest., 4:241-251 (1981); Vrinten, D. et al., J. Neuroscience, 20:8131-8137 (2000))および神経障害的な痛みの処置(Pontillo, J. et al., Bioorganic 2 Med. Chem. Ltrs., 15:2541-2546 (2005));アルコール消費、アルコール乱用および／またはアルコール中毒と関係する病気および疾患(ＷＯ  ０５／０６０９８５; Navarro, M. et al., Alcohol Clin. Exp. Res., 29:949-957 (2005));ならびに腎臓の病気または疾患、例えば腎性悪液質(Markison, S. et al., Endocrinology, 146:2766-2773 (2005))またはナトリウム排泄増加(米国特許第６，６１３，８７４号)の処置。
【００１０】
１種類以上のメラノコルチン受容体を活性化するリガンド化合物は、それを必要とする対象において、チロキシンの放出(米国特許第６，６１３，８７４号)、アルドステロンの合成および放出(米国特許第６，６１３，８７４号)、体温(米国特許第６，６１３，８７４号)、血圧(米国特許第６，６１３，８７４号)、心拍(米国特許第６，６１３，８７４号)、血管緊張(米国特許第６，６１３，８７４号)、脳血流(米国特許第６，６１３，８７４号)、血糖値(米国特許第６，６１３，８７４号)、骨の代謝、骨の形成または発達(Dumont, L. M. et al., Peptides, 26:1929-1935 (2005)、卵巣重量(米国特許第６，６１３，８７４号)、胎盤発達(米国特許第６，６１３，８７４号)、プロラクチンおよびＦＳＨの分泌(米国特許第６，６１３，８７４号)、子宮内胎児成長(米国特許第６，６１３，８７４号)、分娩(米国特許第６，６１３，８７４号)、精子形成(米国特許第６，６１３，８７４号)、皮脂およびフェロモンの分泌(米国特許第６，６１３，８７４号)、神経保護(米国特許第６，６３９，１２３号)および神経成長(米国特許第６，６１３，８７４号)を含む多種多様な正常化または恒常性活性を調節するのに、ならびに動機付け(米国特許第６，６１３，８７４号)、学習(米国特許第６，６１３，８７４号)および他の行動(米国特許第６，６１３，８７４号)を調節するのに有用であろう。
【００１１】
１回の皮下注射において向上した薬物動態パラメーターを有する許容できる持続放出プロフィールを提供する、メラノコルチン受容体の内の１種類以上のリガンド、特にＭＣ４−Ｒに選択的に結合するリガンドであるペプチドを含有する組成物の向上した配合物に関する必要性が存在する。理想的には、そのような向上した持続放出配合物は、出願者自身の先行する国際公開第ＷＯ２００７／００８７０４号、第ＷＯ２００８／１４７５５６号および第ＷＯ２００８／１５６６７７号において開示されているようなメラノコルチン受容体の内の１種類以上に関するリガンドとして作用する新規ペプチドを含む。さらに、本発明の配合物の他の療法的作用の中には、より均一な放出プロフィールと関係する弱められた副作用および向上した有効性がある。加えて、本発明は溶液を提供し、それは透明な溶液であってよく、またはそうでなくてもよく、賦形剤を欠いており、従って製造プロセスを単純にする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第６，６１３，８７４号
【特許文献２】米国特許第６，７１３，４８７号
【特許文献３】米国特許第６，６００，０１５号
【特許文献４】米国特許第６，７２０，３２４号
【特許文献５】米国特許第６，６３９，１２３号
【特許文献６】米国特許第６，５２５，０１９号
【特許文献７】米国特許第６，３５０，４３０号
【特許文献８】ＷＯ  ０５／０６０９８５
【特許文献９】ＷＯ２００７／００８７０４
【特許文献１０】ＷＯ２００８／１４７５５６
【特許文献１１】ＷＯ２００８／１５６６７７
【非特許文献】
【００１３】
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【非特許文献６４】Vrinten, D. et al., J. Neuroscience, 20:8131-8137 (2000)
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【非特許文献６６】Dumont, L. M. et al., Peptides, 26:1929-1935 (2005)
【発明の概要】
【００１４】
本発明の発明者らは、メラノコルチン受容体の内の１種類以上のリガンドとして作用するペプチドのパモ酸塩を含む医薬組成物の配合物はインビボでの遅い放出に理想的な溶解性を示すという驚くべき発見をした。特に好ましいのは、以下“実施例１”と呼ぶ、メラノコルチン受容体亜型４のリガンドである次のペプチドであり：Ac-Arg-シクロ(Cys-D-Ala-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys)-NH2、ここで、対象への皮下または筋肉内投与の後、そのペプチドは生理的ｐＨにおいてデポーを形成し、それはゆっくりと溶解して体液および血流中へと放出され、それにより結果として弱められた副作用および向上した有効性をもたらす。
【００１５】
本発明は、下記において以下の段落で、および特許請求の範囲において要約することができる。
（１）１観点において、本発明は、メラノコルチン受容体の内の１種類以上のリガンドとして作用するペプチドまたはその医薬的に許容できる塩を含む溶液、ゲルもしくは半固体、または懸濁液の医薬組成物に向けられており、ここでそのペプチドは対象への皮下または筋肉内投与の後デポーを形成する。
【００１６】
（２）段落１に記載の医薬組成物、ここで、前記の溶液中の前記のペプチドは投与後に注射部位においてデポーを形成し、それはゆっくりと溶解して体液および血流中に放出され、ここで前記の溶液は純粋な水溶液、純粋な有機性溶液、有機性構成要素を有する水溶液、無機性構成要素を有する水溶液、または有機性および無機性構成要素の両方を有する水溶液である。
【００１７】
（３）前記のペプチドが実施例１、すなわちAc-Arg-シクロ(Cys-D-Ala-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys)-NH2である、段落１または段落２に記載の医薬組成物。
（４）前記のペプチドがパモ酸塩の形である、前記の段落のいずれか１個に記載の医薬組成物。
【００１８】
（５）さらに前記のペプチドの水溶液中での溶解性を増大させる、またはゲルまたは半固体の粘性を減少させる有機性構成要素を含む、前記の段落のいずれか１個に記載の医薬組成物。
【００１９】
（６）前記の有機性構成要素が有機性ポリマー、アルコール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、またはＤＭＡである、段落５に記載の医薬組成物。
（７）前記の有機性ポリマーがＰＥＧである、段落６に記載の医薬組成物。
【００２０】
（８）前記のＰＥＧが約２００から約１０，０００までの平均分子量を有する、段落７に記載の医薬組成物。
（９）前記のペプチドをＰＥＧ２００またはＰＥＧ４００水溶液中で溶解させ、ここでＰＥＧの水に対する体積対体積比が約１：９９から約９９：１までである、段落８に記載の医薬組成物。
【００２１】
（１０）前記のペプチドをＰＥＧ２００またはＰＥＧ４００水溶液中で溶解させ、ここでＰＥＧの水に対する体積対体積比が約１：９から約１：１までである、段落９に記載の医薬組成物。
【００２２】
（１１）前記のアルコールがエタノールまたはイソプロピルアルコールである、段落６に記載の医薬組成物。
（１２）前記のペプチドの重量対体積濃度が約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約６００ｍｇ／ｍＬである、前記の段落のいずれか１個に記載の医薬組成物。
【００２３】
（１３）前記の組成物のｐＨが約３．０〜約８．０である、前記の段落のいずれか１個に記載の医薬組成物。
（１４）前記のArg-シクロ(Cys-D-Ala-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys)-NH2のパモ酸塩をＰＥＧ４００／水溶液中で溶解させ、ここでＰＥＧ４００の水に対する体積対体積比が約１：１であり、そのペプチドの重量対体積濃度が約２００ｍｇ／ｍＬである、段落１３に記載の医薬組成物。
【００２４】
（１５）前記のArg-シクロ(Cys-D-Ala-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys)-NH2のパモ酸塩をＰＥＧ２００／水溶液中で溶解させ、ここでＰＥＧ２００の水に対する体積対体積比が約１：１であり、そのペプチドの重量対体積濃度が約２００ｍｇ／ｍＬである、段落１３に記載の医薬組成物。
【００２５】
（１６）前記のArg-シクロ(Cys-D-Ala-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys)-NH2のパモ酸塩をＰＥＧ４００／ＰＢＳ溶液中で溶解させ、ここでＰＥＧ４００のＰＢＳに対する体積対体積比が約１：１であり、そのペプチドの重量対体積濃度が約３００ｍｇ／ｍＬである、段落１３に記載の医薬組成物。
【００２６】
（１７）前記のArg-シクロ(Cys-D-Ala-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys)-NH2のパモ酸塩をＰＥＧ４００／生理食塩水溶液中で溶解させ、ここでＰＥＧ４００の生理食塩水溶液に対する体積対体積比が約１：１であり、そのペプチドの重量対体積濃度が約３００ｍｇ／ｍＬである、段落１３に記載の医薬組成物。
【００２７】
（１８）さらに保存剤を含む、前記の段落のいずれか１個に記載の医薬組成物。
（１９）前記の保存剤が、ｍ−クレゾール、フェノール、ベンジルアルコール、およびメチルパラベンからなるグループから選択される、段落１８に記載の医薬組成物。
【００２８】
（２０）前記の保存剤が約０．０１ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬまでの濃度で存在する、段落１９に記載の医薬組成物。
（２１）さらに等張剤を含む、前記の段落のいずれか１個に記載の医薬組成物。
【００２９】
（２２）前記の等張剤が約０．０１ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬまでの濃度で存在する、段落２１に記載の医薬組成物。
（２３）さらに安定剤を含む、前記の段落のいずれか１個に記載の医薬組成物。
【００３０】
（２４）前記の安定剤がイミダゾール、アルギニンおよびヒスチジンからなるグループから選択される、段落２３に記載の医薬組成物。
（２５）さらに界面活性剤を含む、前記の段落のいずれか１個に記載の医薬組成物。
【００３１】
（２６）さらにキレート剤を含む、前記の段落のいずれか１個に記載の医薬組成物。
（２７）さらに緩衝剤を含む、前記の段落のいずれか１個に記載の医薬組成物。
（２８）前記の緩衝剤がトリス、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、グリシン、アスパラギン酸、およびビス−トリスからなるグループから選択される、段落２７に記載の医薬組成物。
【００３２】
（２９）さらに二価金属を含む、前記の段落のいずれか１個に記載の医薬組成物。
（３０）前記の二価金属が亜鉛である、段落２９に記載の医薬組成物。
（３１）前記の溶液が透明な液体である、前記の段落のいずれか１個に記載の医薬組成物。
【００３３】
本発明の好ましい態様は、実施例１、すなわちＭＣＲ−ＲのリガンドであるAc-Arg-シクロ(Cys-D-Ala-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys)-NH2に向けられているが、本発明は実施例１に決して限定されない。本発明のペプチドには、例えば、第ＷＯ２００７／００８７０４号、第ＷＯ２００８／１４７５５６号および第ＷＯ２００８／１５６６７７号として公開されている出願者自身の先行する国際公開番号において開示されているような、メラノコルチン受容体の内の１種類以上に関するリガンドとして作用する全てのそれらのペプチドが含まれる。これらの刊行物を、あたかもそれぞれの独立した刊行物の開示が本明細書において明確に提供されたのと同じ程度まで、本明細書に援用する。
【００３４】
これらの刊行物からの以下の化合物も、本発明の医薬組成物を構成するために好都合に用いられてよい：
実施例２：Ac-D-Arg-シクロ(Cys-D-Ala-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys)-NH2;
実施例３：Ac-Tyr-Arg-シクロ(Cys-D-Ala-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys)-NH2;
実施例４：Ac-Tyr-D-Arg-シクロ(Cys-D-Ala-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys)-NH2;および
実施例５：ヒダントイン(Arg-Gly)-シクロ(Cys-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys)-NH2。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、２００ｍｇ／ｍＬ（２０％  ｗ／ｖ）の実施例１のパモ酸塩（５０％  ＰＥＧ４００および５０％水（ｖ／ｖ）の溶媒中で溶解させた）を含む配合物の、２．５ｍｇ／ｋｇ体重で投与されたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットへの１回の皮下投与の後に得られた薬物動態プロフィールの完全な時間経過プロット（中央値）を、それぞれ通常の目盛りで、および対数目盛りで示す。
【図２】図２Ａおよび図２Ｂは、２００ｍｇ／ｍＬ（２０％  ｗ／ｖ）の実施例１のパモ酸塩（５０％  ＰＥＧ２００および５０％水（ｖ／ｖ）の溶媒中で溶解させた）を含む配合物の、２．５ｍｇ／ｋｇ体重で投与されたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットへの１回の皮下投与の後に得られた薬物動態プロフィールの完全な時間経過プロット（中央値）を、それぞれ通常の目盛りで、および対数目盛りで示す。
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、３００ｍｇ／ｍＬ（３０％  ｗ／ｖ）の実施例１のパモ酸塩（５０％  ＰＥＧ４００および５０％  ＰＢＳ（ｖ／ｖ）の溶媒中で溶解させた）を含む配合物の、３．７５ｍｇ／ｋｇ体重で投与されたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットへの１回の皮下投与の後に得られた薬物動態プロフィールの完全な時間経過プロット（中央値）を、それぞれ通常の目盛りで、および対数目盛りで示す。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、３００ｍｇ／ｍＬ（３０％  ｗ／ｖ）の実施例１のパモ酸塩（５０％  ＰＥＧ４００および５０％生理食塩水（ｖ／ｖ）の溶媒中で溶解させた）を含む配合物の、３．７５ｍｇ／ｋｇ体重で投与されたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットへの１回の皮下投与の後に得られた薬物動態プロフィールの完全な時間経過プロット（中央値）を、それぞれ通常の目盛りで、および対数目盛りで示す。
【図５】図５Ａおよび図５Ｂは、実施例１の酢酸塩（生理食塩水／２％熱非働化マウス血清／５％  ＤＭＡ／２％  ｔｗｅｅｎ−８０溶媒中で溶解させた）を含む配合物の、０．５ｍｇ／ｋｇ体重で投与されたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットへの１回の皮下投与の後に得られた薬物動態プロフィールの完全な時間経過プロット（中央値）を、それぞれ通常の目盛りで、および対数目盛りで示す。
【図６Ａ】図６Ａおよび図６Ｂは、図１Ａ〜図５Ａで通常の目盛りで、同様に図１Ｂ〜５Ｂで対数目盛りで示したものと同じ薬物動態プロフィールの完全な時間経過プロット（中央値）を、本明細書で記述するような実験において用いられた異なる配合物の並べ合わせた比較として示す。
【図６Ｂ】図６Ａおよび図６Ｂは、図１Ａ〜図５Ａで通常の目盛りで、同様に図１Ｂ〜図５Ｂで対数目盛りで示したものと同じ薬物動態プロフィールの完全な時間経過プロット（中央値）を、本明細書で記述したような実験において用いられた異なる配合物の並べ合わせた比較として示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本明細書においてペプチドを定義するために用いられる命名法は当技術で典型的に用いられる命名法であり、ここでＮ末端のアミノ基が左に見え、Ｃ末端のカルボキシル基が右に見える。そのアミノ酸が異性体の形を有する場合、別途明確に示さない限り、それは表されているアミノ酸のＬ型である。別途定義しない限り、全ての本明細書で用いられる技術的および科学的用語は、この発明が属する技術の当業者に一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。
【００３７】
本明細書で用いられる略語を次のように定義する：
Ac：  アセチル
AlaまたはA：  アラニン
ArgまたはR：  アルギニン
CysまたはC：  システイン
GluまたはE：  グルタミン酸
GlyまたはG：  グリシン
HisまたはH：  ヒスチジン
PheまたはF：  フェニルアラニン
TrpまたはW：  トリプトファン
TyrまたはY：  チロシン
別途示さない限り、この開示における全てのアミノ酸の略語（例えばAla）は-NH-C(R)(R’)-CO-の構造を表し、ここでRおよびR’はそれぞれ独立して水素またはアミノ酸の側鎖（例えば、Alaに関してはR = CH3およびR’ = H）であり、またはRおよびR’は繋がれて環系を形成していてよい。
【００３８】
例えばAc-Arg-シクロ(Cys-D-Ala-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys)-NH2中の名称“NH2”は、そのペプチドのＣ末端がアミド化されていることを示す。
“-シクロ(Cys-Cys)-”は次の構造を意味する：
【００３９】
【化１】
0005486690.tif 000002
。
【００４０】
本明細書でパラメーターおよび量と関連して用いられる用語“約”は、そのパラメーターまたは量がその明記されたパラメーターまたは量の±５％以内であることを意味する。
本明細書において用いられる特定の他の略語を次のように定義する：
Boc:  tert-ブチルオキシカルボニル
BSA:  ウシ血清アルブミン
DCM:  ジクロロメタン
DIPEA:  ジイソプロピルエチルアミン
DMF:  ジメチルホルムアミド
DTT:  ジチオスレイトール
Fmoc:  9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
HBTU:  2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート
HOBt:  1-ヒドロキシ-ベンゾトリアゾール
HPLC:  高速液体クロマトグラフィー
IBMX:  イソブチルメチルキサンチン
パモ酸ナトリウム:  次の構造を有するパモ酸二ナトリウム塩
【００４１】
【化２】
0005486690.tif 000003
LC-MS:  液体クロマトグラフィー質量分析
LOQ:  定量限界
MRM:  多重反応モニタリング
NMP:  N-メチルピロリドン
PBS:  リン酸緩衝生理食塩水
PEG:  ポリ(エチレングリコール)、それは次の構造を有する：
【００４２】
【化３】
0005486690.tif 000004
ここで、ｎは１〜２，０００の整数である。
【００４３】
PEG200:  約２００Ｄａの平均分子量を有するポリ(エチレングリコール)
PEG400:  約４００Ｄａの平均分子量を有するポリ(エチレングリコール)
TFA:  トリフルオロ酢酸
TIS:  トリイソプロピルシラン
Tris-HCl:  トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩
Trt:  トリチル。
【実施例】
【００４４】
合成
この発明のペプチドは、標準的な固相ペプチド合成により調製することができる。例えば、Stewart, J.M., et al., Solid Phase Synthesis (Pierce Chemical Co., 第２版 1984)を参照。以下の実施例は、この発明のペプチドを作るための合成法を記述し、その方法は当業者に周知である。他の方法も当業者に既知である。その実施例は説明のために提供するのであって、本発明の範囲を限定することを意味するものでは決して無い。
【００４５】
実施例１、すなわちAc-Arg-シクロ(Cys-D-Ala-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys)-NH2の合成
【００４６】
【化４】
0005486690.tif 000005
上記の構造を有する表題のペプチドを、Apexペプチド合成機(Aapptec;米国ケンタッキー州ルイスビル)上でFmoc化学を用いて組み立てた。220 mgの0.91 mmol/g (0.20 mmoles)RinkアミドMBHA樹脂(Polymer Laboratories;米国マサチューセッツ州アマースト)を反応ウェルの中に置き、合成の前に3.0 mLのDMF中で予め膨潤させた。サイクル１に関して、その樹脂を3-mL分のDMF中25%ピペリジンで２回、それぞれ５および１０分間処理し、続いて3-mLのDMFで４回洗浄した−それぞれの洗浄は、3 mLの溶媒の添加、１分間の混合、および１分間空にする、で構成されていた。アミノ酸のストックを、NMP中で0.45M HOBTを含有する0.45M溶液として調製した。HBTUをNMP中0.45M溶液として調製し、DIPEAをNMP中2.73M溶液として調製した。その樹脂に、2 mLの第１アミノ酸(0.9 mmoles, Fmoc-Cys(Trt)-OH) (Novabiochem;米国カリフォルニア州サンディエゴ)を、2 mL (0.9 mmoles)のHBTUおよび1.5 mL (4.1 mmoles)のDIPEAと共に添加した。１時間絶え間なく攪拌した後、そのカップリング試薬を樹脂から排出し(drained)、そのカップリングの工程を繰り返した。アミノ酸のアシル化の後、その樹脂を3-mL分割量（aliquots）のDMFで１分間×２回洗浄した。そのペプチドを組み立てるプロセス（脱ブロック/洗浄/アシレート/洗浄）を、サイクル２〜９に関して、サイクル１に関して記述したプロセスと同じで繰り返した。次のアミノ酸を用いた：サイクル2) Fmoc-Trp(Boc)-OH (Genzyme;米国マサチューセッツ州ケンブリッジ); サイクル3) Fmoc-Arg(Pbf)-OH (Novabiochem); サイクル4) Fmoc-DPhe-OH (Genzyme); サイクル5) Fmoc-His(Trt)-OH (Novabiochem); サイクル6) Fmoc-D-Ala-OH (Genzyme); サイクル7) Fmoc-Cys(Trt)-OH, (Novabiochem); およびサイクル8) Fmoc-Arg(Pbf)-OH (Genzyme)。そのＮ末端Fmocを、上記のようにDMF中25%ピペリジンを用いて除去し、続いて3-mLのDMFでの洗浄を１分間×４回行った。Ｎ末端のアセチル化を、0.5 mLのNMP中3M DIPEAを1.45 mLのNMP中0.45M無水酢酸と共に樹脂に添加することにより実施した。その樹脂を３０分間混合し、アセチル化を繰り返した。その樹脂を3 mLのDMFで合計５回洗浄し、続いてそれぞれ5 mLのDCMで５回洗浄した。
【００４７】
そのペプチドを切断および脱保護するため、5mLの次の試薬をその樹脂に添加した：2% TIS/5% 水/5% (w/v) DTT/88% TFA。その溶液を３．５時間混合させた。濾液を40 mLの冷無水エチルエーテル中に集めた。沈殿物を冷却遠心機で3500 rpmで１０分間遠心分離してペレットにした。エーテルをデカントし、ペプチドを新しいエーテル中で再懸濁した。そのエーテルでの仕上げを３回行った。最後のエーテルでの洗浄の後、そのペプチドを空気乾燥させて残留するエーテルを除去した。
【００４８】
そのペプチドを10%アセトニトリル中で溶解させ、質量分析および30x4.6cm C18カラム(Vydac;米国カリフォルニア州ヘスペリア)を３０分間にわたる2〜60%アセトニトリル(0.1% TFA)の勾配で用いる逆相HPLCにより分析した。この分析は生成物が約53%の純度であることを確認した。電子スプレーイオン化を用いる質量分析は、望まれる線状生成物に相当する1118.4の質量を含有する主生成物を同定した。その粗生成物(約100 mg)を5%酢酸中で2mg/mLの濃度に希釈した。この溶液に、強く攪拌しながら0.5Mヨウ素/メタノールを淡黄色になるまで滴加した。その溶液をさらに１０分間強く攪拌した。次いで、連続的な混合の下で1.0Mチオ硫酸ナトリウムをその混合物が無色になるまで添加することにより、過剰なヨウ素を停止した（quenched）。そのペプチドを質量分析およびHPLCにより再度検査した。質量分析は1116.4の質量を有する主な種を同定し、それは酸化が成功して環状ペプチドが形成されたことを示していた。そのペプチド溶液を、C18カラムを備えた分取HPLC上で、類似の溶離勾配を用いて精製した。その精製された生成物を、HPLCにより純度に関して(>95%)、および質量分析により（1116.9、それは予想される質量である1117.3と一致する）再度分析し、続いて凍結乾燥した。凍結乾燥の後、28 mgの精製された生成物が得られ、これは24%の収率に相当する。
【００４９】
他の例示されたペプチドを、実質的に上記の合成プロセスに関して記述した手順に従って合成した。選択された例示されたペプチドに関する物理的データを表１に示す。
【００５０】
【表１】
0005486690.tif 000006
実施例１のパモ酸塩の調製
実施例１の酢酸塩(200 mg, 0.18 mmole)を10 mLの水中で溶解させた。パモ酸ナトリウム(155 mg, 0.36 mmole)を10 mLの水中で溶解させた。その２つの溶液を合わせてよく混合した。沈殿を3000 rpmで２０分間の遠心分離により集め、水で３回洗浄し、凍結乾燥により乾燥させた。
【００５１】
インビトロ試験
本発明の化合物は、下記の手順に従ってメラノコルチン受容体の内の１種類以上のリガンドとしての活性に関して試験することができ、試験した。当業者は、本発明の化合物のメラノコルチン受容体分子への結合活性をアッセイするために、本明細書で記述した手順に類似の手順を用いてよいことを知っているであろう。
【００５２】
放射リガンド結合アッセイ
インビトロ受容体結合アッセイのために用いられる細胞膜を、hMC-R受容体亜型１、３、４または５を安定して発現するトランスジェニックCHO-K1細胞から得た。望まれるhMC-R受容体亜型を発現するCHO-K1細胞を、氷冷したpH 7.4の50mM Tris-HCl中で超音波処理し(Branson（登録商標），コネチカット州、米国;設定７、おおよそ３０秒間)、次いでおおよそ４℃の温度において39,000 gで１０分間遠心分離した。そのペレットを同じ緩衝液中で再懸濁し、おおよそ４℃の温度において50,000 gで１０分間遠心分離した。細胞膜を含有する洗浄したペレットを、おおよそ−８０℃で保管した。
【００５３】
[125I](Tyr2)-(Nle4-D-Phe7)α-MSH ([125I]-NDP-α-MSH; Amersham Biosciences（登録商標），米国ニュージャージー州ピスカタウェイ)結合の競合阻害を、ポリプロピレン96ウェルプレートにおいて実施した。上記のように調製した細胞膜(1〜10μｇタンパク質/ウェル)を、0.2% BSA、5 mM MgCl2、1 mM CaCl2および0.1 mg/mLバシトラシンを含有するpH 7.4の50 mM Tris-HCl中で、増大する濃度の試験化合物および0.1〜0.3 nM [125I]-NDP-α-MSHと共に、おおよそ３７℃においておおよそ９０〜１２０分間保温した。結合した[125I]-NDP-α-MSHリガンドを遊離の[125I]-NDP-α-MSHから、Packard Filtermate（登録商標）ハーベスター(Millipore，米国マサチューセッツ州ダンバース)を用いて、0.1 % (w/v)ポリエチレンイミン(PEI)に予め浸したGF/Cグラスファイバーフィルタープレート(Unifilter（登録商標），米国コネチカット州メリデン)を通す濾過により分離した。フィルターをおおよそ０〜４℃の温度においてpH 7.4の50 mM Tris-HClで３回洗浄し、次いでPackard Topcount（登録商標）シンチレーションカウンター(GMI, Inc.，米国ミネソタ州ラムゼイ)を用いて放射活性に関してアッセイした。結合データを、コンピューター支援非線形回帰分析(XL fit; IDBS，米国マサチューセッツ州バーリントン)により分析した。
【００５４】
好ましい態様の選ばれたものを、上記で論じたアッセイを用いて試験し、その結合定数（nMでのKi）を表２で報告する。
【００５５】
【表２】
0005486690.tif 000007
環状AMPバイオアッセイ
細胞内の環状AMP (cAMP)レベルを、電気化学発光(ECL)アッセイ(Meso Scale Discovery，米国メリーランド州ゲイザースバーグ;以下“MSD”と呼ぶ)により決定した。hMC-R受容体亜型を安定して発現するCHO-K1細胞を、RMPI 1640（登録商標）アッセイ緩衝液(RMPI 1640緩衝液は0.5mM IBMX、および0.2%タンパク質カクテル(MSDブロッカーA)を含有する)中で懸濁した。hMC受容体亜型１、３、４または５を安定して発現するトランスジェニックCHO-K1細胞を、組み込まれた（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）炭素電極を含有し、抗cAMP抗体でコートされた384-ウェルMulti-Arrayプレート(MSD)中で、おおよそ7,000細胞/ウェルの密度で分配した。増大する濃度の試験化合物を添加し、その細胞をおおよそ３７℃でおおよそ４０分間保温した。この保温の後、0.2%タンパク質カクテルおよび2.5 nM TAG（商標）ルテニウム標識cAMP (MSD)を含有する溶解緩衝液(ph 7.3の、MgCl2およびTriton X-100（登録商標）を含むHEPES緩衝生理食塩水溶液)を添加し、細胞を室温でおおよそ９０分間保温した。その第２の保温期間の終わりに、読み取り緩衝液(ph 7.8の、ECL共反応物およびTriton X-100を含有するTris緩衝溶液)を添加し、Sector Imager 6000読み取り装置（登録商標）(MSD)を用いたECL検出により、細胞溶解物中のcAMPレベルを直ちに決定した。データをコンピューター支援非線形回帰分析(XL fit; IDBS)を用いて分析し、EC50値またはKb値のどちらかとして報告した。
【００５６】
EC50は、最大反応応答の50%、例えば上記のアッセイを用いて決定されるようなcAMPの最大レベルの50%を得るのに必要なアゴニスト化合物の濃度を表す。Kb値はアンタゴニストの強度を反映し、Schild分析により決定される。簡潔には、増大する濃度のアンタゴニストの存在下で、アゴニストの濃度−反応曲線を実施する。Kb値はアゴニストに関する濃度−反応曲線において２倍のシフトを生じるであろうアンタゴニストの濃度である。それはｙ軸上でSchildプロット上の線をゼロに外挿することにより計算される。
【００５７】
化合物の選ばれたものを上記で論じたアッセイを用いて試験し、その結果を表３で報告する。
【００５８】
【表３】
0005486690.tif 000008
可溶性試験
実施例１のパモ酸塩の配合物の調製
実施例１のパモ酸塩（５０ｍｇ）を微量遠心チューブの中に量って入れ、１２５μＬのＰＥＧ４００および１２５μＬの水をその後に添加した。溶解を促進するため、その混合物を超音波処理した。透明な溶液が得られる可能性があり、得られた。
【００５９】
実施例１の酢酸塩の可溶性を、特定の量のそのペプチドを量り、それを適切な体積の水、生理食塩水、またはＰＢＳ中で溶解させることにより決定し、その結果を表４Ａで示す。
【００６０】
【表４】
0005486690.tif 000009
実施例１のパモ酸塩の溶解度を、そのペプチドを水またはＰＢＳ中で混合し、続いて上清中の濃度をＨＰＬＣで決定することにより決定し、その結果を表４Ｂで示す。
【００６１】
【表５】
0005486690.tif 000010
実施例１の脂肪酸塩の配合物の薬物動態試験
実施例１の以下の“配合物１〜６”を調製した：
（１）“配合物１”：５０％  ＰＥＧ４００および５０％水（ｖ／ｖ）の溶液中で２００ｍｇ／ｍＬ（２０％  ｗ／ｖ）の濃度で溶解させた実施例１のパモ酸塩。
【００６２】
（２）“配合物２”：５０％  ＰＥＧ２００および５０％水（ｖ／ｖ）の溶液中で２００ｍｇ／ｍＬ（２０％  ｗ／ｖ）の濃度で溶解させた実施例１のパモ酸塩。
（３）“配合物３”：５０％  ＰＥＧ４００および５０％  ＰＢＳ（ｖ／ｖ）の溶液中で３００ｍｇ／ｍＬ（３０％  ｗ／ｖ）の濃度で溶解させた実施例１のパモ酸塩。
【００６３】
（４）“配合物４”：５０％  ＰＥＧ４００および５０％生理食塩水（ｖ／ｖ）の溶液中で３００ｍｇ／ｍＬ（３０％  ｗ／ｖ）の濃度で溶解させた実施例１のパモ酸塩。
（５）“配合物５”：生理食塩水／２％熱非働化マウス血清／５％  ＤＭＡ／２％  ｔｗｅｅｎ−８０溶液中で溶解させた実施例１の酢酸塩。
【００６４】
投与
配合物１および２に関して、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに５μＬ／ラットもしくは１．０ｍｇ／ラットのどちらかの固定された量、または２．５ｍｇ／ｋｇ体重の変動可能な量で皮下注射により投与した。
【００６５】
配合物３および４に関して、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに５μＬ／ラットもしくは１．５ｍｇ／ラットのどちらかの固定された量、または３．７５ｍｇ／ｋｇ体重の変動可能な量で皮下注射により投与した。
【００６６】
配合物５に関して、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに０．５ｍｇ／ｋｇ体重の変動可能な量で皮下注射により投与した。
試料の調製
配合物１および２に関して、１００μＬの血漿を５μＬのギ酸で酸性化し、３００μＬのアセトニトリルで沈殿させた。その上清を遠心分離により集め、ｓｐｅｅｄ−ｖａｃにより乾燥させた。その乾燥したペレットを１００μＬの水中で溶解させ、次いでそれを遠心分離した。その調製物の５０μＬを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のために注入した。
【００６７】
配合物３および４に関して、２００μＬの血漿を１０μＬのギ酸で酸性化し、６００μＬのアセトニトリルで沈殿させた。その上清を遠心分離により集め、ｓｐｅｅｄ−ｖａｃにより乾燥させた。その乾燥したペレットを１５０μＬの水中で溶解させ、次いでそれを遠心分離した。その調製物の５０μＬを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のために注入した。
【００６８】
配合物５に関して、２００μＬの血漿を１０μＬのギ酸で酸性化し、６００μＬのアセトニトリルで沈殿させた。その上清を遠心分離により集め、ｓｐｅｅｄ−ｖａｃにより乾燥させた。その乾燥したペレットを１５０μＬの３０％アセトニトリル中で溶解させ、次いでそれを遠心分離した。その調製物の５０μＬを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のために注入した。
【００６９】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
配合物１および２に関して、Ｔｕｒｂｏ  Ｉｏｎｓｐｒａｙプローブを備えたＡＰＩ４０００質量分析システムを用いてＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を実施した。５５９．５および１１０．１のイオン対での分子イオン検出のＭＲＭモードを用いた。ＨＰＬＣ分離を、Ｌｕｎａ  Ｃ８（２）  ２×３０ｍｍ  ３μカラムで、０．３ｍＬ／分の流速において１０分間で０％Ｂから８０％Ｂまで動かして実施した。緩衝液Ａは水中１％ギ酸であり、緩衝液Ｂはアセトニトリル中１％ギ酸である。ＬＯＱは５ｎｇ／ｍＬであった。
【００７０】
配合物３および４に関して、Ｔｕｒｂｏ  Ｉｏｎｓｐｒａｙプローブを備えたＡＰＩ４０００質量分析システムを用いてＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を実施した。５５９．５および１１０．１のイオン対での分子イオン検出のＭＲＭモードを用いた。ＨＰＬＣ分離を、Ｌｕｎａ  Ｃ８（２）  ２×３０ｍｍ  ３μカラムで、０．３ｍＬ／分の流速において１０分間で０％Ｂから８０％Ｂまで動かして実施した。緩衝液Ａは水中１％ギ酸であり、緩衝液Ｂはアセトニトリル中１％ギ酸である。ＬＯＱは２ｎｇ／ｍＬであった。
【００７１】
配合物５に関して、Ｔｕｒｂｏ  Ｉｏｎｓｐｒａｙプローブを備えたＡＰＩ４０００質量分析システムを用いてＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を実施した。５５９．５および１１０．１のイオン対での分子イオン検出のＭＲＭモードを用いた。ＨＰＬＣ分離を、Ｌｕｎａ  Ｃ８（２）  ２×３０ｍｍ  ３μカラムで、０．３ｍＬ／分の流速において１０分間で０％Ｂから９０％Ｂまで動かして実施した。緩衝液Ａは水中１％ギ酸であり、緩衝液Ｂはアセトニトリル中１％ギ酸である。ＬＯＱは１ｎｇ／ｍＬであった。
【００７２】
結果および要約
配合物１〜５で投与された実施例１の血漿濃度をその標準的なキャリブレーションプロットを用いて計算し、その結果を表５に示す。
【００７３】
【表６】
0005486690.tif 000011
配合物１の薬物動態プロフィールの完全な時間経過プロットを、図１Ａにおいて通常の目盛りで、そして図１Ｂにおいて対数目盛りで示す。
【００７４】
配合物２の薬物動態プロフィールの完全な時間経過プロットを、図２Ａにおいて通常の目盛りで、そして図２Ｂにおいて対数目盛りで示す。
配合物３の薬物動態プロフィールの完全な時間経過プロットを、図３Ａにおいて通常の目盛りで、そして図３Ｂにおいて対数目盛りで示す。
【００７５】
配合物４の薬物動態プロフィールの完全な時間経過プロットを、図４Ａにおいて通常の目盛りで、そして図４Ｂにおいて対数目盛りで示す。
配合物５の薬物動態プロフィールの完全な時間経過プロットを、図５Ａにおいて通常の目盛りで、そして図５Ｂにおいて対数目盛りで示す。
【００７６】
図６Ａおよび図６Ｂは、図１Ａ〜図５Ａで通常の目盛りで、同様に図１Ｂ〜図５Ｂで対数目盛りで示したものと同じ薬物動態プロフィールの完全な時間経過プロット（中央値）を、本明細書で記述したような実験において用いられた異なる配合物の並べ合わせた比較として示す。
【００７７】
配合物１〜５で投与された実施例１のいくつかの薬物動態パラメーターを表６に示す。
【００７８】
【表７】
0005486690.tif 000012
その結果は、本明細書で記述したような本発明に従う実施例１の配合物が、向上した薬物動態パラメーターおよびより均一な放出プロフィールを有する許容できる持続放出配合物を提供することを示し、それは結果として弱められた副作用および向上した有効性をもたらすことができる。例えば、配合物１は１回の皮下注射の後、著しく低いＣｍａｘおよび長いＴｍａｘを有するおおよそ２４時間の放出プロフィールを有することが示されている。さらに、表６で示したように、実施例１のパモ酸塩配合物、すなわち配合物１〜４の全てが実施例１の酢酸塩配合物、すなわち配合物５と比較して著しく増大したＴ１／２を有することが示されている。
【００７９】
本発明の追加の態様は前記の開示から明らかであると考えられ、本明細書で完全に記述され、下記の特許請求の範囲で定義される通りの本発明に含まれることを意図する。
【図１】
0005486690.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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