(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ジフテリア毒素Ａ（ＤＴＡ）をコードする第一オープンリーディングフレームであって、Ｈ１９特異的な転写調節配列と機能的に連結する第一オープンリーディングフレームと、
ｂ）ジフテリア毒素Ａ（ＤＴＡ）をコードする第二オープニングリーディングフレームであって、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４およびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３配列から選択するＩＧＦ−ＩＩ転写調節配列と機能的に連結する第二オープンリーディングフレームと、を含むか、または、
ａ）ジフテリア毒素Ａ（ＤＴＡ）をコードする第一オープンリーディングフレームであって、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４転写調節配列と機能的に連結する第一オープンリーディングフレームと、
ｂ）ジフテリア毒素Ａ（ＤＴＡ）をコードする第二オープニングリーディングフレームであって、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３転写調節配列と機能的に連結する第二オープンリーディングフレームと、を含み、
前記第一オープンリーディングフレームと前記第二オープンリーディングフレームとが順に連結されている、核酸。
【請求項２】
前記Ｈ１９特異的な転写調節配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−２のいずれかに規定の核酸配列を含むプロモーターである請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４転写調節配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に規定の核酸配列を含むプロモーターである請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
前記ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３転写調節配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７から選択される核酸配列を有するプロモーターである、請求項１に記載の核酸。
【請求項５】
前記核酸はプラスミドである請求項１に記載の核酸。
【請求項６】
請求項１に記載の核酸を含む真核発現ベクター。
【請求項７】
前記ジフテリア毒素Ａ（ＤＴＡ）はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に規定の配列を含む請求項１に記載の核酸。
【請求項８】
前記第一オープンリーディングフレームがＨ１９特異的な転写調節配列と機能的に連結し、前記第二オープンリーディングフレームがＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４転写調節配列と機能的に連結する請求項１記載の核酸。
【請求項９】
前記核酸はさらにジフテリア毒素Ａ（ＤＴＡ）をコードする第三オープニングフレームを含み、前記第三オープニングフレームはＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３転写調節配列と機能的に連結してなる請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
前記第一オープンリーディングフレームがＨ１９特異的な転写調節配列と機能的に連結し、前記第二オープンリーディングフレームがＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３転写調節配列と機能的に連結する請求項１記載の核酸。
【請求項１１】
前記第一オープンリーディングフレームがＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３転写調節配列と機能的に連結し、前記第二オープンリーディングフレームがＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４転写調節配列と機能的に連結する請求項１記載の核酸。
【請求項１２】
Ｈ１９プロモーターによって促される転写産物、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターによって促される転写産物または、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターによって促される転写産物を発現する腫瘍細胞を有する、ヒトの腫瘍を治療するために使用される、請求項１に記載の核酸を有効成分とする、医薬組成物。
【請求項１３】
前記腫瘍が癌である請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記腫瘍が膀胱癌、肝癌、卵巣癌、膵癌である請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
Ｈ１９プロモーターによって促される転写産物、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターによって促される転写産物または、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターによって促される転写産物を発現する腫瘍細胞を有する、ヒトの腫瘍の進行を阻害するために使用される、請求項１に記載の核酸を有効成分とする、医薬組成物。
【請求項１６】
前記腫瘍が癌である請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記腫瘍は膀胱癌、肝癌、卵巣癌、膵癌である請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
Ｈ１９プロモーターによって促される転写産物、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターによって促される転写産物または、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターによって促される転写産物を発現する腫瘍細胞を有する、ヒトの腫瘍の転移を阻害するために使用される、請求項１に記載の核酸を有効成分とする、医薬組成物。
【請求項１９】
前記腫瘍が癌である請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記腫瘍は膀胱癌、肝癌、卵巣癌、膵癌である請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターによって促される転写産物または、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターによって促される転写産物を発現する腫瘍細胞を有する、ヒトの腫瘍を治療するため、ヒトの腫瘍の進行を阻害するため、またはヒトの腫瘍の転移を阻害するために使用される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記腫瘍が癌である請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記腫瘍は膀胱癌、肝癌、卵巣癌、膵癌である請求項２２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌治療の分野を目的とするものであり、特にＨ１９および／またはＩＧＦＩＩを発現する腫瘍を治療することに役立つ新規な核酸構造体を目的とするものである。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍形成は癌で起こる現象であり、これは細胞成長および細胞分化を抑制する正常な制御機構が損なわれ、進行性増殖を生じる。この様な制御メカニズムの障害は、腫瘍が体の不可欠な領域で増殖および占有する。腫瘍が組織周辺に浸潤し、遠い部位に到達されると（転移）、結果としてその個体の死に至るであろう。
【０００３】
癌治療の所望の目的は、正常な細胞に有害な影響を及ぼさずに、癌細胞を優先的に取り除くことである。この目的を達成するために、外科手術、放射線療法および化学療法を含む、いくつかの方法が試されてきた。
【０００４】
局所治療、例えば放射線療法および外科手術は、外科手術の技術や高用量の放射線治療によって利用できる体の部位で、腫瘍量を減少させる手段である。しかしながら、より少ない副作用で、より効果的な局所治療を必要とする。さらに、これらの治療は、ほとんどの癌患者で最終的に発見される、播種性または循環型の腫瘍細胞の破壊には応用できない。腫瘍細胞の拡散を防止するためには、全身療法が用いられる。
【０００５】
そのような全身療法の一つは化学療法である。化学療法は、播種性の悪性癌の主な治療法である。しかしながら、化学療法薬は、多くの一般的な固形腫瘍を含む、多種類の癌治療の有効性で制限される。この制限は、一つには多くの腫瘍細胞において固有または後天性の薬剤耐性によるものである。化学療法薬の使用に対する他の欠点は、それらの重度な副作用である。これらは、骨髄抑制、嘔気、嘔吐、脱毛、口腔の潰瘍を含むものである。明らかに、化学療法薬が悪性腫瘍細胞を死滅させることができる効率を向上させるとともに、全身毒性を回避できる新規な方法が必要である。
【０００６】
Ｈ１９の診断および治療
Ｈ１９遺伝子は、人間でインプリントされることが知られているいくつかの遺伝子の一つである(ハースト等、1996、Nature Genetics 12:234 237)。胚形成のごく初期に、Ｈ１９を、両方の染色体対立遺伝子で発現する(DeGroot等、1994、Trophoblast 8:285 302)。その後まもなく、父由来の対立遺伝子のサイレンシングが生じ、そして母由来の受け継がれた対立遺伝子のみが転写される。
【０００７】
Ｈ１９は胚形成の間で多量に発現し、トランス作用座遺伝子ｒａｆによって肝臓でアルファフェトプロテインと同等に抑制された遺伝子として最初に同定された(Pachnis等、1984、“Locus unlinked to alpha-fetoprotein under the control of the murine raf and Rif genes”, Proc Natl Acad Sci.81:5523 5527)。さらに、Ｈ１９は、組織分化の間に単離遺伝子発現を意図したスクリーン法を用いて、いくつかのグループで独立に複製された。例えば、Ｈ１９のマウス相同体は、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の分化の間に最初に活性がある遺伝子スクリーンで同定された(Davis等、1987、“Expression of a single transfected cDNAconverts fibroblasts to myoblasts”, Cell 51:987 1000)。同様に、ネズミ科のＨ１９は、幹細胞分化の間および移植時に発現することを示された(Poirier等、1991、“The murine H19 gene is activated during embryonic stem cell differentiation 生体外 and at the time of implantation in the developing embryo”, Development 113:1105 1114)。人間のＨ１９遺伝子の転写はまた、人間の細胞栄養芽層から胎盤を分別する際に発見された(Rachmilewitz等、1992、Molec. Reprod. Dev. 32: 196 202)。
【０００８】
Ｈ１９  ＲＮＡの転写は、多くの異なる胚組織で胎児の生命および胎盤の発達にわたって生じ、Ｈ１９の低いレベルの転写が、例えば、ネズミの成体筋肉および肝臓において報告されるが、Ｈ１９の発現は出世後に抑制される(BrunkowとTilghman、1991、“Ectopic expression of the H19 gene in mice causes prenatal lethality”, Genes Dev. 5: 1092 1101)。5:1092 1101)。
【０００９】
Ｈ１９転写は、出生前にＨ１９を発現する組織に由来する腫瘍で示されるように、癌細胞で再活性できる(Ariel等、1997“The product of the imprinted H19 gene is an oncofetal RNA”, Mol Pathol. 50:34 44)。さらに、Ｈ１９  ＲＮＡは若干の腫瘍、特定の星状細胞腫および神経節神経芽腫において出生後に発現し、それはＨ１９を発現することが知られていない神経組織に由来する（アリエル等上記）。Ｈ１９  ＲＮＡが多くの種類の腫瘍および癌を発現すると仮定すると、アリエル等はＨ１９  ＲＮＡが癌胎児性のＲＮＡであると推測し、人間の腫瘍形成に対する腫瘍標識としてＨ１９を調査することを提案した。
【００１０】
Ｈ１９は８４％の人間の膀胱癌腫で有意に発現していて、その発現は腫瘍損失分化で低下する。腫瘍悪性度から独立して、Ｈ１９発現レベルが初期の腫瘍再発と有意に相同する(Ayesh, B等2003、Mol Ther, 2003. 7(4): p.535-41)。
【００１１】
Ｈ１９  ＲＮＡの有無のみ異なる２つの均質な細胞集団の遺伝子発現パターンの比較は、Ｈ１９  ＲＮＡの大量の下流の作用因子を識別した。これらの中には、腫瘍形成過程の諸相において重要な役割を果たすことが以前に報告された遺伝子グループがある。Ｈ１９  ＲＮＡの存在は、細胞の浸潤、遊走性、および血管形成能力を、これらの経路で機能する遺伝子を高発現することによって増強し、そして癌転移カスケードの少なくとも初期段階工程に貢献することができる。更なる研究は、肝細胞成長の要因／拡散に応答する遺伝子（ＨＧＦ／ＳＦ）となることによって、癌進行のおよび腫瘍転移を進行する際に、Ｈ１９の潜在的役割を強調する。
【００１２】
癌細胞におけるＨ１９遺伝子の特異的な発現は、癌を診断するための臨床応用で、その使用を促される。例えば、米国特許第５，９５５，２７３号公報は、腫瘍特異性の標識としてＨ１９遺伝子を使用することを教示する。国際公開第２００４／０２４９５７号は、癌であると疑われる患者において、残余の癌細胞または固形腫瘍に由来する微小転移の存在の検出のためにＨ１９の使用を開示する。
【００１３】
ＩＧＦ−ＩＩＩＧＦ−ＩＩ
インスリンのような成長因子−ＩＩ（ＩＧＦＩＩ）は、移行上皮癌のような大部分の膀胱癌腫で発現する(TCC; Ariel, I.等、The imprinted H19 gene is a marker of early recurrence in human bladder carcinoma. Mol Pathol, 2000. 53(6): p.320-3)。生物学的活性は、細胞表面受容体であるＩＧＦ−Ｉ受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）、ＩＧＦ−ＩＩ受容体（ＩＧＦ−２Ｒ）、およびインスリン受容体（ＩＲ）との結合によって媒介する。ＩＧＦ受容体は、胎児および成人動物の全ての組織のほとんどで存在する。ＩＧＦ−２Ｒは最も高い親和性でＩＧＦ−ＩＩと結合するのに対して、ＩＧＦ−１ＲおよびＩＲはそれらのそれぞれのリガンドより高い親和性を有するが、ＩＧＦ−ＩＩより低い親和性を有する。ＩＧＦ−ＩＩは、Ｒａｓ／有糸分裂促進物質の活性プロテインキナーゼ、フォスファチジルイノシトール−３−キナーゼ／Ａｋｔ／ＦＯＸＯ、およびＳ６Ｋ／哺乳類のラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）によって、ＩＧＦ１Ｒを経て送る有力な胎および腫瘍の成長要因であり、ｍＴＯＲは細胞増殖、細胞生存、遺伝子発現および細胞成長を修正する経路に信号を送るものである。
【００１４】
ＩＧＦ−ＩＩは、他のインプリンティング遺伝子であり、その発現はその親の起源に依存する。しかしながらＨ１９と対称的に、ＩＧＦ−ＩＩは、マウスおよび人間の両方において母由来としてインプリントされ、従って、父由来として受け継がれた対立遺伝子を発現する(レーニア等、1993、“Relaxation of imprinted genes in human cancer”, Nature 362:747 749)。人間のＩＧＦ−ＩＩ遺伝子は、複雑な転写パターンを呈する。組織特異的で発生的に特異的な方法で活性化する４つのＩＧＦ−ＩＩプロモーターがある。ＩＧＦ−ＩＩプロモータ（すなわちＰ２、Ｐ３およびＰ４）のうちの３つのみが、胎児の発育の間および癌組織で、インプリンティングの活性がある。ＩＧＦ−ＩＩ遺伝子のＰ３プロモーターは、肝硬変および肝臓癌の進行に関係する(Seo et al., 1998, “Different protein-binding patterns in the P3 promoter region of the human insulin-like growth factor II gene in the human liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma tissues”, J Korean Med Sci.13: 171 178)。
【００１５】
第４のＩＧＦ−ＩＩプロモータ（すなわち  Ｐ１）は、インプリンティングでなく、成人の肝臓および脈絡膜叢において活性である(Holthuizen等、1993、“Transcriptional regulation of the major promoters of the human IGF-II gene”, Mol Reprod Dev. 35:391 393)。
【００１６】
ＩＧＦ−ＩＩのインプリンティングの損失は、ウィルム腫瘍に関係する(小川等、1993“Relaxation of insulin-like growth factor II gene imprinting implicated in Wilm’s tumour”, Nature 362:749 751)。この所見は、多くの研究者にインプリンティングの損失およびインプリンティング遺伝子の両アレル発現は、成長障害および癌の発達に関係すると推測させた(レーニア等、1993、Nature 362:747 749; Glassman et al., 1996, “Relaxation of imprinting in carcinogenesis”, Cancer Genet Cytogenet. 89:69 73)。
【００１７】
ＩＧＦ−ＩＩシグナルシステムの後成的修飾および突然変異は、例えば人間の結腸直腸腫瘍などの癌で生じる。(ハッサンAB、マコーレーVM、The insulin-like growth factor system as a therapeutic target in colorectal cancer.Ann Oncol2002;13:349-56)。ＩＧＦ−ＩＩの供給は発現増加することが多く、遺伝子表現の連続分析は、ＩＧＦ−ＩＩが例えば人間の膀胱癌および結腸直腸癌などの、多くの癌細胞系および腫瘍の共通に過剰発現する遺伝子として示した(Zhang L, Zhou W, Velculescu VE, et al.Gene expression profiles in normal and cancer cells.Science 1997;276:1268-72)。
【００１８】
国際公開９９／１８１９５号および米国特許第７，０４１，６５４号は、特異的な発現の異種配列、特に遺伝子が細胞障害性産物（例えばジフテリア毒素）をコードすることを、癌特異的なプロモーターの制御下の腫瘍細胞において（例えば、Ｈ１９プロモーターおよびエンハンサー、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーター、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーター、またはＩＧＦ−１プロモーター）教示する。
【００１９】
国際公開０４／０３１３５９は、細胞にＨ１９モジュレータの有効量の投与することを含み、新血管形成に関与する細胞での血管形成制御遺伝子の発現を調整する方法を教示する。
【００２０】
国際公開２００７／０３４４８７は、（ｉ）第１の核酸配列はＴＮＦαをコードし；（ｉｉ）第２の核酸配列はジフテリア毒素をコードし；（ｉｉｉ）少なくとも一つの付加的な核酸配列が癌特異的なプロモーター（例えばＨ１９、ＩＧＦ１、ＩＧＦＩＩ  Ｐ３またはＩＧＦＩＩ  Ｐ４プロモーター）を含み、ＴＮＦαおよびジフテリア毒素は癌特異的なプロモーターの発現制御に基づく配列をコードすることを含む核酸構造体を開示する。また、構造体の系、同上の方法および使用を提供する。
【００２１】
国際公開２００７／００７３１７号は、癌細胞のＨ１９  ｍＲＮＡのレベルを下方制御することができる単離オリゴヌクレオチド、付加的な抗癌性の治療薬と結合してＨ１９  ｍＲＮＡを発現低下することができる薬品を含む製造物および同上のものを投与することによって、癌を治療する方法を開示する。国際公開２００７／００７３１７号は、抗癌剤を請求項のオリゴヌクレオチドと同時投与することができることを開示する。
【００２２】
国際公開２００８／０８７６４１号は、抑制ＲＮＡなどのＨ１９−サイレンシング核酸薬品を用いて、慢性関節リウマチを治療する組成物および方法を開示する。
【００２３】
国際公開２００８／０８７６４２号は、抑制ＲＮＡなどのＨ１９−サイレンシング核酸薬品を用いて、癌治療およびＨ１９遺伝子の高発現と関係する他の状態の治療用の組成物および方法を開示する。
【００２４】
国際公開２００８／０９９３９６号は、抑制ＲＮＡなどのＨ１９−サイレンシング核酸薬品を用いて、再狭窄を治療する組成物および方法を開示する。
【００２５】
上記の参考文献では、単一の構造物で多数のジフテリア毒素を発現するオープンリーディングフレームを含み、ジフテリア毒素は複数のプロモーターを発現することを開示または示唆していない。抗癌治療の構造物から細胞毒性または細胞増殖抑制の遺伝子発現に関して、単一のプロモーター（例えばＨ１９プロモーターまたはＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３もしくはＰ４プロモーター）のみの使用はいくつかの未解決な課題がある。一例として、ある特定の種の癌（例えば膀胱癌、表在性膀胱癌、等）のすべての腫瘍は、Ｈ１９プロモーターまたはＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３もしくはＰ４プロモーターを経る発現で陽性であるというわけではない。したがって、この種の治療は、腫瘍突然変異生成を評価しなかったとしても、相当の割合の患者で失敗するにちがいない。この種の構造物の反応の判定は、費用が高くて、個々の腫瘍の遺伝子型の同定する工程が困難であることを含むだろう。
【００２６】
腫瘍は、有意なゲノム不安定性および異質性を呈すことは知られている。したがって、Ｈ１９を発現する腫瘍を持つ個体でさえ、例えば、突然変異を経てＨ１９発現の低下または終了する相当の数の癌細胞を含む可能性がある。従って、このような患者において、単一のプロモーターから細胞毒性または細胞増殖抑制遺伝子を発現することは、これらの突然変異を含む細胞が生存するときに急速に後退や急速に増殖させる腫瘍回復を一時的および部分的に生じる。
【００２７】
癌治療に実用的な、さらなる安全性および効果的な治療様態の開発への満たされていない医学的必要性がある。
【００２８】
この項目または本願の他の部分での、参考文献の包含または詳細は、その参照が本発明の従来技術として考えられる容認を含んでいない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
本発明は癌治療の分野に関するものであり、特にＨ１９および／またはインスリン様成長因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）を発現する腫瘍の治療に役立つ新規な核酸構造物および発現ベクターに関するものである。本発明はさらに、本発明の核酸構造を用いる組成物、方法およびキットを提供する。
【００３０】
とりわけ、本発明の新規ベクターは、Ｈ１９−，ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３−およびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４−から派生した配列から選択した複数の癌特有なプロモーターから、細胞毒性の薬品、例えばジフテリア毒素の発現を可能にする複数の発現カセットからなる核酸構造を含む。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
本発明の第一の態様は、
（ａ）細胞毒性または細胞増殖抑制遺伝子産物で第一のオープンリーディングフレームであって、第一の転写制御配列と機能的に連結する第一のオープンリーディングフレームと；
（ｂ）細胞毒性または細胞増殖抑制遺伝子製品で第二のオープンリーディングフレームであって、第二の転写制御配列と機能的に連結する第二のオープンリーディングフレームと；を含み
第一の転写制御配列および第２の転写制御配列は異なり、ｉ）Ｈ−１９に特異的な転写制御配列および、ｉｉ）ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３およびＧＦ−ＩＩ  Ｐ４から選択するＩＧＦ−ＩＩ転写制御配列で構成する群から選択する核酸構造物を提供する。
【００３２】
例えば、転写制御配列は
第一の転写制御配列はＨ１９に特異的な転写制御配列、および第二の転写制御配列はＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４  転写制御配列；
第一の転写制御配列はＨ１９に特異的な転写制御配列、および第二の転写制御配列はＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４  転写制御配列；
第一の転写制御配列はＨ１９に特異的な転写制御配列、および第二の転写制御配列はＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３転写制御配列；またはｉｉｉ）第一の転写制御配列はＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４の転写制御配列、および第二の転写制御配列はＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３転写制御配列である。
【００３３】
任意で、前記構造物は細胞毒性または細胞増殖抑制の遺伝子産物をコードする第三のオープンリーディングフレームをさらに含み、第三のオープンリーディングフレームはＨ１９特異的な転写制御配列ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３転写制御配列、およびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４転写制御配列から選択する第一のＩＧＦ−ＩＩ転写制御配列と機能的に連結する。
【００３４】
別の態様において、本発明はａ）ジフテリア毒素をコードする第一のオープンリーディングフレームであって、Ｈ１９に特異的な転写制御配列を機能的に連結する第一のオープンリーディングフレームと、ｂ）ジフテリア毒素をコードする第二のオープンリーディングフレームであって、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４およびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３配列から選択する第一のＩＧＦ−ＩＩ転写制御配列を機能的に連結する第二のオープンリーディングフレームとを含む。
【００３５】
第一の実施形態において、前記核酸構造体は、ジフテリア毒素をコードする第三のオープンリーディングフレームを更に含み、前記第三のオープンリーディングフレームはＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４およびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３配列から選択する第二のＩＧＦ−ＩＩ転写制御配列と機能的に連結するものであって、第一のＩＧＦ−ＩＩ転写制御配列と第二のＩＧＦ−ＩＩ転写制御配列は異なる。例えば、第二のオープンリーディングフレームは、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４転写制御配列と機能的に連結して、第三のオープンリーディングフレームはＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３転写制御配列と機能的に連結し、または選択的に第二のオープンリーディングフレームはＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３転写制御配列と機能的に連結したり、第三のオープンリーディングフレームは、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４転写制御配列と機能的に連結することができる。
【００３６】
別の態様において、本発明はａ）ジフテリア毒素をコードする第一のオープンリーディングフレームであって、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３転写制御配列と機能的に連結する前記第一のオープンリーディングフレームと、ｂ）ジフテリア毒素をコードする第二のオープンリーディングフレームであって、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４転写制御配列と機能的に連結する前記第二のオープンリーディングフレームとを含む核酸構造を提供する。
【００３７】
他の実施形態において、前記核酸構造はジフテリア毒素をコードする第三のオープンリーディングフレームを更に含み、前記第三のオープンリーディングフレームをＨ１９特異的な転写制御配列と機能的に連結する。
【００３８】
本発明の構造において、ジフテリア毒素は、例えばジフテリア毒素Ａ鎖（ジフテリア毒素Ａ、ＤＴＡ）であり、毒素は以下に詳述するようなＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７アミノ酸配列を含む。
【００３９】
各種実施形態によれば、転写制御配列は、本願明細書において詳述するように、癌細胞で選択的（または、他の実施例では優先的）に発現を誘発または改良する制御配列（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）であることができる。
【００４０】
「ＩＧＦ−ＩＩ転写を制御する配列」という用語は、他の実施形態において、特異的（または異なった）方法によって転写を制御する配列を示し、染色体、例えばヒト染色体上で、ＩＧＦ−ＩＩ遺伝子と関連することを見出した。特定の実施形態によると、「ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３転写制御配列」および「ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４転写制御配列」はＰ３およびＰ４（それぞれの）プロモーターをいう。他の実施形態において、その用語はＰ３またはＰ４（それぞれの）プロモーターから由来する転写制御配列をいう。他の実施形態において、その用語は本願明細書において開示したＰ３−またはＰ４（それぞれ）特異的な転写制御配列をいう。各々の可能性は、本発明の別々の実施例を示す。
【００４１】
例えば、限定されるものではないが、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４転写制御配列は、以下に詳述するようなＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に記載の核酸配列を含むプロモーターであることができる。ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターの非制限的な実施例は、以下に詳述するようなＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８、  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２、および  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １７から選ぶ配列に記載の核酸配列を含む。
【００４２】
「Ｈ１９特異的転写制御配列」は、他の実施形態において、特異的（または異なった）方法によって、転写を制御する配列を示し、染色体、例えばヒト染色体上の、Ｈ１９遺伝子と関連することを見出した。他の実施形態において、その用語は、Ｈ１９特異的なプロモーターとして示す。他の実施形態において、その用語は、Ｈ１９プロモーターに由来する転写制御配列をいう。他の実施形態において、その用語は、本願明細書に開示するＨ１９特異的な転写制御配列の一つをいう。各々の可能性は、本発明の別々の実施例を示す。例えば、限定されないが、Ｈ１９特異的な転写制御配列は、詳細は以下に詳述するような、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１−２に記載した核酸配列を含むプロモーターであることができる。
【００４３】
本発明は、このような構造がとりわけＰ３および／またはＰ４プロモーターから、Ｈ１９および／またはＩＧＦ−ＩＩを発現させる悪性腫瘍を対象とした、特に効果的で安全な治療として最初に開示した。好都合にも、本発明の構造がより多くの細胞および／またはより高い割合の患者において反応を誘発し、これまでの既知の治療と比較して改良した癌治療を提供することを開示する。
【００４４】
他の実施形態において、前記核酸構造はプラスミドである。他の実施形態において、本発明は、本発明の核酸構造を含む真核生物発現ベクターを提供する。
【００４５】
他の実施形態において、本発明は腫瘍を治療する方法を、それを必要とする被験者に提供し、本発明の核酸構造物（例えば核酸構造の治療有効量）を被験者に投与することを含み、これによってその必要性がある被験者の腫瘍を治療するものである。
【００４６】
他の実施形態において、本発明は腫瘍進行を阻害する方法を、それを必要とする被験者に提供し、本発明の核酸構造物（例えば核酸構造の治療有効量）を被験者に投与することを含み、これによってその必要性がある被験者の腫瘍進行を阻害する。
【００４７】
他の実施形態において、本発明は腫瘍転移を阻害する方法を、それを必要とする被験者に提供し、本発明の核酸構造（例えば核酸構造の治療有効量）を被験者に投与することを含み、これによってその必要性がある被験者の腫瘍転移を阻害する。
【００４８】
他の実施形態において、本発明は腫瘍性の障害を伴う症状を減少または軽減する方法を、それを必要とする被験者に提供し、本発明の核酸構造（例えば核酸構造の治療の有効量）を被験者に投与することを含み、これによってその必要性がある被験者の腫瘍を減少または軽減する。
【００４９】
本発明の方法では、前記被験者は、一の実施形態において、腫瘍細胞の少なくとも一部でＨ１９  ＲＮＡの発現で特徴づけられる、例えば前記腫瘍の細胞はＨ１９プロモーターによって指令される転写産物、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターによって指令される転写産物、および／または、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターによって指令される転写産物を発現できる
【００５０】
本発明の構造物はまた、Ｐ３および／またはＰ４プロモーターから、Ｈ１９を発現および／またはＩＧＦ−ＩＩを発現する腫瘍のため、それを必要とする被験者に一つ以上の治療方針を含むキットまたは薬剤パックという形態であることができる。したがって、他の態様において，ｉ）本発明の核酸構造物；およびｉｉ）それを必要とする被験者（例えば癌で苦しむ被験者）に前記核酸構造物を投与する指示を含むキットを提供する。
【００５１】
本発明の組成物、方法およびキットは、Ｐ３および／またはＰ４プロモーターによるＨ１９の発現および／またはＩＧＦ−ＩＩの発現に関わる様々な悪性腫瘍の治療で役立つ。他の実施形態において、腫瘍は固形腫瘍である。他の実施形態において、腫瘍は癌である。様々な具体例において、腫瘍は、膀胱癌、肝臓新生物（例えば肝臓癌）、肺腺癌（小細胞、非小細胞肺癌）、食道癌、卵巣癌、横紋筋肉腫癌、子宮頸癌、頭部および頸部扁平上皮癌、結腸直腸、子宮および睾丸性細胞腫瘍、髄芽細胞腫、神経膠芽腫およびアデノ皮質の腫瘍を含むが、これに限定されるものではない。
【００５２】
記載する好ましい実施形態において更なる特徴によれば、腫瘍を、膀胱癌、肝臓癌および結腸癌からなる群から選択する。他の実施形態において、腫瘍を、膀胱癌、肝臓癌、卵巣癌および膵癌からなる群から選択する。他の実施形態において、腫瘍を、膀胱癌、肝臓癌、卵巣癌、膵癌、乳癌、前立腺癌、頸部癌、結腸癌および肺癌からなる群から選択する。他の具体例において、被験者は、表在性膀胱癌に患っている。各々の可能性は、本発明の別々の実施例を示す。
【００５３】
典型的な転移腫瘍は、例えば結腸直腸癌は、肝臓に転移および乳癌に転移を含む。特定の実施形態において、本発明の組み合わせを、肝転移の形成を予防または阻害するために用いる。
【００５４】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の説明および図面より明白になるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】二重プロモーターＨ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡ発現ベクターの構造の概略図を示す図である。それぞれのＤＴＡコード配列は、ＩＧＦ−ＩＩ−Ｐ４およびＨ１９プロモーター配列の転写調節下で、Ｋａｎａ（Ｒ）−カナマイシン耐性遺伝子である。
【図２Ａ】Ｔ２４Ｐ細胞内でＨ１９、Ｐ４およびＨ１９＋Ｐ４制御配列を有するＤＴＡ発現構造の相対的な生体外活性を示す。ヒトＴ２４Ｐ細胞を、２μｇのＬｕｃＳＶ４０および、示した濃度のＨ１９−ＤＴＡ、Ｐ４−ＤＴＡまたはＨ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡで共トランスフェクションした。Ａ．ルシフェラーゼ活性は、ＬｕｃＳＶ４０単独でトランスフェクションした細胞を様々な投与量で比較した。Ｙ軸（Ａ−Ｃに対する）：ルシフェラーゼ活性（コントロールの％）。Ｘ軸（Ａ−Ｂに対する）：μｇプラスミド／ウェル。この図および図の全体にわたるエラーバーは、１つの標準的平均誤差を反映する。
【図２Ｂ】Ｔ２４Ｐ細胞内でＨ１９、Ｐ４およびＨ１９＋Ｐ４制御配列を有するＤＴＡ発現構造の相対的な生体外活性を示す。ヒトＴ２４Ｐ細胞を、２μｇのＬｕｃＳＶ４０および、示した濃度のＨ１９−ＤＴＡ、Ｐ４−ＤＴＡまたはＨ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡで共トランスフェクションした。Ｂ．（Ａ）に記載する実験の付加的な再現。Ｙ軸（Ａ−Ｃに対する）：ルシフェラーゼ活性（コントロールの％）。Ｘ軸（Ａ−Ｂに対する）：μｇプラスミド／ウェル。この図および図の全体にわたるエラーバーは、１つの標準的平均誤差を反映する。
【図２Ｃ】Ｔ２４Ｐ細胞内でＨ１９、Ｐ４およびＨ１９＋Ｐ４制御配列を有するＤＴＡ発現構造の相対的な生体外活性を示す。ヒトＴ２４Ｐ細胞を、２μｇのＬｕｃＳＶ４０および、示した濃度のＨ１９−ＤＴＡ、Ｐ４−ＤＴＡまたはＨ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡで共トランスフェクションした。Ｃ．０．００５μｇのデータの棒グラフを示す。Ｙ軸（Ａ−Ｃに対する）：ルシフェラーゼ活性（コントロールの％）。Ｘ軸（Ａ−Ｂに対する）：μｇプラスミド／ウェル。この図および図の全体にわたるエラーバーは、１つの標準的平均誤差を反映する。
【図３Ａ】ＵＭＵＣ３細胞におけるＤＴＡを発現する構造の相対的な活性。実験を図２に記載したように実行した；軸は図２と同じである。Ａ．ルシフェラーゼ活性は、ＬｕｃＳＶ４０単独でトランスフェクションした細胞と様々な投与量で比較した。
【図３Ｂ】ＵＭＵＣ３細胞におけるＤＴＡを発現する構造の相対的な活性。実験を図２に記載したように実行した；軸は図２と同じである。Ｂ．（Ａ）に記載した実験の付加的な再現。
【図３Ｃ】ＵＭＵＣ３細胞におけるＤＴＡを発現する構造の相対的な活性。実験を図２に記載したように実行した；軸は図２と同じである。Ｃ．０．００５μｇのデータの棒グラフを示す。
【図４Ａ】Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるＤＴＡを発現する構造の相対的な活性。実験を図２に記載したように実行した；軸は図２と同じである。Ａ．ルシフェラーゼ活性は、ＬｕｃＳＶ４０単独でトランスフェクションした細胞と様々な投与量で比較した。
【図４Ｂ】Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるＤＴＡを発現する構造の相対的な活性。実験を図２に記載したように実行した；軸は図２と同じである。Ｂ．０．００５μｇのデータの棒グラフ。
【図５Ａ】ＥＳ−２細胞におけるＤＴＡを発現する構造の相対的な活性。実験を図２に記載したように実行した；軸は図２と同じである。Ａ．ルシフェラーゼ活性は、ＬｕｃＳＶ４０単独でトランスフェクションした細胞と様々な投与量で比較した。
【図５Ｂ】ＥＳ−２細胞におけるＤＴＡを発現する構造の相対的な活性。実験を図２に記載したように実行した；軸は図２と同じである。Ｂ．０．００５μｇのデータの棒グラフ。
【図６Ａ】ＰＣ−１細胞におけるＤＴＡを発現する構造の相対的な活性。実験を図２に記載したように実行した；軸は図２と同じである。Ａ．ルシフェラーゼ活性は、ＬｕｃＳＶ４０単独でトランスフェクションした細胞と様々な投与量で比較した。
【図６Ｂ】ＰＣ−１細胞におけるＤＴＡを発現する構造の相対的な活性。実験を図２に記載したように実行した；軸は図２と同じである。Ｂ．０．００５μｇのデータの棒グラフ。
【図７Ａ】ＣＲＬ−１４６９細胞におけるＤＴＡを発現する構造の相対的な活性。実験を図２に記載したように実行した；軸は図２と同じである。Ａ．ルシフェラーゼ活性は、ＬｕｃＳＶ４０単独でトランスフェクションした細胞と様々な投与量で比較した。
【図７Ｂ】ＣＲＬ−１４６９細胞におけるＤＴＡを発現する構造の相対的な活性。実験を図２に記載したように実行した；軸は図２と同じである。Ｂ．０．００５μｇのデータの棒グラフ。
【図８Ａ】Ｔ２４Ｐ細胞内でＰ３、Ｐ４、およびＰ３＋Ｐ４制御配列でＤＴＡ発現構造の相対的な生体外活性。ヒトＴ２４Ｐ細胞を、２μｇのＬｕｃＳＶ４０および示した濃度のＰ３−ＤＴＡ，Ｐ４−ＤＴＡ、またはＰ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡで共トランスフェクションした。Ａ．ルシフェラーゼ活性は、ＬｕｃＳＶ４０単独でトランスフェクションした細胞と様々な投与量で比較した。Ｙ軸（Ａ−Ｂに対する）：ルシフェラーゼ活性（コントロールの％）。Ｘ軸（Ａに対する）：μｇプラスミド／ウェル。軸は図２と同じである。
【図８Ｂ】Ｔ２４Ｐ細胞内でＰ３、Ｐ４、およびＰ３＋Ｐ４制御配列でＤＴＡ発現構造の相対的な生体外活性。ヒトＴ２４Ｐ細胞を、２μｇのＬｕｃＳＶ４０および示した濃度のＰ３−ＤＴＡ，Ｐ４−ＤＴＡ、またはＰ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡで共トランスフェクションした。Ｂ．０．００５μｇのデータの棒グラフ。Ｙ軸（Ａ−Ｂに対する）：ルシフェラーゼ活性（コントロールの％）。Ｘ軸（Ａに対する）：μｇプラスミド／ウェル。軸は図２と同じである。
【図９Ａ】ＨＴ−１３７６細胞におけるＤＴＡを発現する構造の相対的な活性。実験を図８に記載したように実行した；軸は図８と同じである。Ａ．ルシフェラーゼ活性は、ＬｕｃＳＶ４０単独でトランスフェクションした細胞と様々な投与量で比較した。
【図９Ｂ】ＨＴ−１３７６細胞におけるＤＴＡを発現する構造の相対的な活性。実験を図８に記載したように実行した；軸は図８と同じである。Ｂ．０．００５μｇのデータの棒グラフ。
【図１０Ａ】Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるＤＴＡを発現する構造の相対的な活性。実験を図８に記載したように実行した；軸は図８と同じである。Ａ．ルシフェラーゼ活性は、ＬｕｃＳＶ４０単独でトランスフェクションした細胞と様々な投与量で比較した。
【図１０Ｂ】Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるＤＴＡを発現する構造の相対的な活性。実験を図８に記載したように実行した；軸は図８と同じである。Ｂ．０．００５μｇのデータの棒グラフ。
【図１１Ａ】ＥＳ−２細胞におけるＤＴＡを発現する構造の相対的な活性。実験を図８に記載したように実行した；軸は図８と同じである。Ａ．ルシフェラーゼ活性は、ＬｕｃＳＶ４０単独でトランスフェクションした細胞と様々な投与量で比較した。
【図１１Ｂ】ＥＳ−２細胞におけるＤＴＡを発現する構造の相対的な活性。実験を図８に記載したように実行した；軸は図８と同じである。Ｂ．０．００５μｇのデータの棒グラフ。
【図１２Ａ】ＰＣ−１細胞におけるＤＴＡを発現する構造の相対的な活性。実験を図８に記載したように実行した；軸は図８と同じである。Ａ．ルシフェラーゼ活性は、ＬｕｃＳＶ４０単独でトランスフェクションした細胞と様々な投与量で比較した。
【図１２Ｂ】ＰＣ−１細胞におけるＤＴＡを発現する構造の相対的な活性。実験を図８に記載したように実行した；軸は図８と同じである。Ｂ．０．００５μｇのデータの棒グラフ。
【図１３Ａ】ＣＲＬ−１４６９細胞におけるＤＴＡを発現する構造の相対的な活性。実験を図８に記載したように実行した；軸は図８と同じである。Ａ．ルシフェラーゼ活性は、ＬｕｃＳＶ４０単独でトランスフェクションした細胞と様々な投与量で比較した。
【図１３Ｂ】ＣＲＬ−１４６９細胞におけるＤＴＡを発現する構造の相対的な活性。実験を図８に記載したように実行した；軸は図８と同じである。Ｂ．０．００５μｇのデータの棒グラフ。
【図１４Ａ】Ｔ２４Ｐ細胞におけるＰ３、Ｐ４およびＰ３＋Ｐ４制御配列を有するＤＴＡを発現する構造で、生体外活性を相対的に比較。Ｔ２４Ｐ細胞を、２μｇのＬｕｃＳＶ４０および示した濃度のＨ１９−ＤＴＡ、Ｐ３−ＤＴＡ、またはＨ１９−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡで共トランスフェクションした。Ａ．ルシフェラーゼ活性は、ＬｕｃＳＶ４０単独でトランスフェクションした細胞を様々な投与量で比較した。Ｙ軸（Ａ−Ｂに対する）ルシフェラーゼ活性（コントロールの％）。Ｘ軸（Ａに対する）：μｇプラスミド／ウェル。軸は図２と同じである。
【図１４Ｂ】Ｔ２４Ｐ細胞におけるＰ３、Ｐ４およびＰ３＋Ｐ４制御配列を有するＤＴＡを発現する構造で、生体外活性を相対的に比較。Ｔ２４Ｐ細胞を、２μｇのＬｕｃＳＶ４０および示した濃度のＨ１９−ＤＴＡ、Ｐ３−ＤＴＡ、またはＨ１９−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡで共トランスフェクションした。Ｂ．０．００５μｇのデータの棒グラフ。Ｙ軸（Ａ−Ｂに対する）ルシフェラーゼ活性（コントロールの％）。Ｘ軸（Ａに対する）：μｇプラスミド／ウェル。軸は図２と同じである。
【図１５Ａ】Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡと、Ｐ４−促進およびＨ１９促進構造の組み合わせとのＴ２４Ｐ細胞で、生体外活性を相対的に比較。Ｔ２４Ｐ細胞を、２μｇのＬｕｃＳＶ４０および示した濃度のＨ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡまたは、等量のＰ４−ＤＴＡ＋Ｈ１９−ＤＴＡで共トランスフェクションした。Ｙ軸（Ａ−Ｂに対する）：ルシフェラーゼ活性（コントロールの％）。Ｘ軸（Ａに対する）：μｇプラスミド／ウェル
【図１５Ｂ】Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡと、Ｐ４−促進およびＨ１９促進構造の組み合わせとのＴ２４Ｐ細胞で、生体外活性を相対的に比較。Ｔ２４Ｐ細胞を、２μｇのＬｕｃＳＶ４０および示した濃度のＨ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡまたは、等量のＰ４−ＤＴＡ＋Ｈ１９−ＤＴＡで共トランスフェクションした。Ｙ軸（Ａ−Ｂに対する）：ルシフェラーゼ活性（コントロールの％）。Ｘ軸（Ａに対する）：μｇプラスミド／ウェル
【図１６Ａ】Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡと、Ｐ４促進およびＨ１９で促進される組み合わせ構造とのＨｅｐ３Ｂ細胞で、生体外活性を相対的に比較。実験を図１５に記載したように実行した；軸は図１５と同じである。Ａ．ルシフェラーゼ活性は、ＬｕｃＳＶ４０単独でトランスフェクションした細胞と様々な投与量で比較した。
【図１６Ｂ】Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡと、Ｐ４促進およびＨ１９で促進される組み合わせ構造とのＨｅｐ３Ｂ細胞で、生体外活性を相対的に比較。実験を図１５に記載したように実行した；軸は図１５と同じである。Ｂ．０．００５μｇのデータの棒グラフ。
【図１７Ａ】Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡと、Ｐ４促進およびＨ１９で促進される組み合わせ構造とのＥＳ−２細胞で、生体外活性を相対的に比較。実験を図１５に記載したように実行した；軸は図１５と同じである。Ａ．ルシフェラーゼ活性は、ＬｕｃＳＶ４０単独でトランスフェクションした細胞と様々な投与量で比較した。
【図１７Ｂ】Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡと、Ｐ４促進およびＨ１９で促進される組み合わせ構造とのＥＳ−２細胞で、生体外活性を相対的に比較。実験を図１５に記載したように実行した；軸は図１５と同じである。Ｂ．０．００５μｇのデータの棒グラフ。
【図１８Ａ】Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡと、Ｐ４で促進およびＨ１９で促進構造の組み合わせとのＰＣ−１細胞で、生体外活性を相対的に比較。実験を図１５に記載したように実行した；軸は図１５と同じである。Ａ．ルシフェラーゼ活性は、ＬｕｃＳＶ４０単独でトランスフェクションした細胞と様々な投与量で比較した。
【図１８Ｂ】Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡと、Ｐ４で促進およびＨ１９で促進構造の組み合わせとのＰＣ−１細胞で、生体外活性を相対的に比較。実験を図１５に記載したように実行した；軸は図１５と同じである。Ｂ．０．００５μｇのデータの棒グラフ。
【図１９Ａ】Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡと、Ｐ４で促進およびＨ１９で促進構造の組み合わせとのＣＲＬ−１４６９細胞で、生体外活性を相対的な比較。実験を図１５に記載するように実行した；軸は図１５と同じである。Ａ．ルシフェラーゼ活性は、ＬｕｃＳＶ４０単独でトランスフェクションした細胞と様々な投与量で比較した。
【図１９Ｂ】Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡと、Ｐ４で促進およびＨ１９で促進構造の組み合わせとのＣＲＬ−１４６９細胞で、生体外活性を相対的な比較。実験を図１５に記載するように実行した；軸は図１５と同じである。Ｂ．０．００５μｇのデータの棒グラフ。
【図２０Ａ】Ｐ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡと、Ｐ３で促進およびＰ−４で促進構造の組み合わせとのＨＴ−１３７６細胞で、生体外活性を相対的な比較。ＨＴ−１３７６細胞を、２μｇのＬｕｃＳＶ４０および示した濃度または、等量のＰ３−ＤＴＡ＋Ｐ４−ＤＴＡで共トランスフェクションした。Ａ．ルシフェラーゼ活性は、ＬｕｃＳＶ４０単独でトランスフェクションした細胞と様々な投与量で比較した。軸は図１５と同じである。
【図２０Ｂ】Ｐ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡと、Ｐ３で促進およびＰ−４で促進構造の組み合わせとのＨＴ−１３７６細胞で、生体外活性を相対的な比較。ＨＴ−１３７６細胞を、２μｇのＬｕｃＳＶ４０および示した濃度または、等量のＰ３−ＤＴＡ＋Ｐ４−ＤＴＡで共トランスフェクションした。Ｂ．０．００５μｇのデータの棒グラフ。軸は図１５と同じである。
【図２１Ａ】Ｐ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡと、Ｐ３で促進およびＰ−４で促進構造の組み合わせとのＥＳ−２細胞で、生体外活性の相対的な比較。ＥＳ−２細胞を、２μｇのＬｕｃＳＶ４０および示した濃度のＰ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡまたは、等量のＰ３−ＤＴＡ＋Ｐ４−ＤＴＡで共トランスフェクションした。Ａ．ルシフェラーゼ活性は、ＬｕｃＳＶ４０単独でトランスフェクションした細胞と様々な投与量で比較した。
【図２１Ｂ】Ｐ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡと、Ｐ３で促進およびＰ−４で促進構造の組み合わせとのＥＳ−２細胞で、生体外活性の相対的な比較。ＥＳ−２細胞を、２μｇのＬｕｃＳＶ４０および示した濃度のＰ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡまたは、等量のＰ３−ＤＴＡ＋Ｐ４−ＤＴＡで共トランスフェクションした。Ｂ．０．００５μｇのデータの棒グラフ。軸は図１５と同じである。
【図２２】０．００５μｇのＰ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡと、それぞれ０．００５μｇのＰ３で促進およびＰ４で促進構造の組み合わせとのＨｅｐ−３Ｂ細胞で、生体外活性の相対的な比較である。実験を図２１に記載したように実行した；軸は図１５Ｂと同じである。
【図２３Ａ】ＨＴ−１３７６細胞でＤＴＡを発現する構造の相対的な活性である。実験を図１５で記載したように実施した。軸は図１５Ａと同じである。Ａ．ルシフェラーゼ活性は、ＬｕｃＳＶ４０単独でトランスフェクションした細胞と様々な投与量で比較した。
【図２３Ｂ】ＨＴ−１３７６細胞でＤＴＡを発現する構造の相対的な活性である。実験を図１５で記載したように実施した。軸は図１５Ａと同じである。Ｂ．（Ａ）に記載する実験の付加的な再現。Ｃ．０．００５μｇのデータの棒グラフを示す。
【図２４Ａ】０．００５μｇのＰ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡと、それぞれ０．００５μｇのＰ３で促進およびＰ４で促進構造の組み合わせとのＨｅｐ−３Ｂ細胞で、相対的なｉｎ−ｖｉｔｒｏ活性を比較。Ａ．ルシフェラーゼ活性は、ＬｕｃＳＶ４０単独でトランスフェクションした細胞と様々な投与量で比較した。軸は図１５と同じである。
【図２４Ｂ】０．００５μｇのＰ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡと、それぞれ０．００５μｇのＰ３で促進およびＰ４で促進構造の組み合わせとのＨｅｐ−３Ｂ細胞で、相対的なｉｎ−ｖｉｔｒｏ活性を比較。Ｂ．０．００５μｇのデータの棒グラフを示す。実験を図２１に記載するように実行した。軸は図１５と同じである。
【図２５】２５μｇのＨ１９−ＤＴＡの注射の生体内の抗腫瘍効果。Ｙ軸：腫瘍体積増加の倍率。Ｘ軸：時間（日）。
【図２６】２５μｇのＰ４−ＤＴＡの注射の生体内の抗腫瘍効果。Ｙ軸：腫瘍体積増加の倍率。Ｘ軸：時間（日）。
【図２７】２５μｇのＨ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡの注射の生体内の抗腫瘍効果。Ｙ軸：腫瘍体積増加の倍率。Ｘ軸：時間（日）。
【図２８】Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡ処理したマウスの生体外の腫瘍量。
【図２９】Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡ処理したマウスの生体外の腫瘍量。
【図３０】２５μｇのＨ１９−ＤＴＡおよびＰ４−ＤＴＡの注射の生体内における抗腫瘍効果。Ｙ軸：腫瘍体積増加の倍率。Ｘ軸：時間（日）。
【図３１】Ｔ２４Ｐ膀胱癌モデルデータの概要を示す。
【図３２】ＨＴ−１３７６モデルで、２５μｇのＨ１９−ＤＴＡおよびＰ４−ＤＴＡの注射における生体内の抗腫瘍効果を示す。Ｙ軸：腫瘍体積増加の倍率。Ｘ軸：時間（日）。
【図３３】ＨＴ−１３７６モデルで、２５μｇのＨ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡの注射における生体内の抗腫瘍効果を示す。Ｙ軸：腫瘍体積増加の倍率。Ｘ軸：時間（日）。
【図３４】２５μｇのＰ３−ＤＴＡの注射における生体内の抗腫瘍効果。Ｙ軸：腫瘍体積増加の倍率。Ｘ軸：時間（日）。
【図３５】２５μｇのＰ４−ＤＴＡの注射における生体内の抗腫瘍効果。Ｙ軸：腫瘍体積増加の倍率。Ｘ軸：時間（日）。
【図３６】２５μｇのＰ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡの注射における生体内の抗腫瘍効果。Ｙ軸：腫瘍体積増加の倍率。Ｘ軸：時間（日）。
【図３７】２５μｇのＰ３−ＤＴＡおよびＰ４−ＤＴＡの注射における生体内の抗腫瘍効果。Ｙ軸：腫瘍体積増加の倍率。Ｘ軸：時間（日）。
【図３８】２５μｇのＰ３−ＤＴＡの投入における生体内の抗腫瘍効果。Ｙ軸：腫瘍体積増加の倍率。Ｘ軸：時間（日）。
【図３９】２５μｇのＨ１９−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡの注射における生体内の抗腫瘍効果。Ｙ軸：腫瘍体積増加の倍率。Ｘ軸：時間（日）。
【図４０Ａ】ＨＴ−１３７６細胞におけるＤＴＡを発現する構造の相対的な活性。実験を図２に記載したように実行した；軸は図２と同じである。Ａ．ルシフェラーゼ活性は、ＬｕｃＳＶ４０単独でトランスフェクションした細胞と様々な投与量で比較した。
【図４０Ｂ】ＨＴ−１３７６細胞におけるＤＴＡを発現する構造の相対的な活性。実験を図２に記載したように実行した；軸は図２と同じである。Ｂ．０．００５μｇのデータの棒グラフ。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
本発明は癌治療の分野に関するものであり、特にＨ１９発現および／またはインスリン類似成長因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）の発現する腫瘍に役立つ新規な治療法に関するものである。
【００５７】
特に、本発明の新規ベクターは、複数のプロモーター、Ｈ１９、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３およびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４から選択する細胞毒性の薬剤の発現を可能にする多数の発現カセットを含む構造を含む。
【００５８】
したがって、本発明の実施形態において、
（ａ）細胞毒性または細胞増殖抑制遺伝子産物で第一のオープンリーディングフレームであって、第一の転写制御配列と機能的に連結する第一のオープンリーディングフレームと；
（ｂ）細胞毒性または細胞増殖調節遺伝子産物（例えば同じ遺伝子産物またはその異型）をコードする第二のオープンリーディングフレームであって、第二の癌特異的な転写調節配列と機能的に連結する第二のオープンリーディングフレームとを含み、
第一の転写調節配列および第二の転写調節配列は異なったものであり、ｉ）Ｈ１９特異的な転写調節配列（例えばＨ１９プロモータ）およびｉｉ）ＩＧＦ−ＩＩ転写調節配列（例えばＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３またはＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーター）からなる群から選択してなる核酸構造物を提供する。
【００５９】
すなわち、前記構造物は少なくとも２つの異なる翻訳制御配列を含み、各々が異なる調節配列（Ｈ１９、Ｐ４またはＰ３）に由来し、各々が細胞毒性または細胞増殖抑制遺伝子産物をコードする別々の配列に機能的に連結する。例えば、２つの翻訳調節配列は、
ｉ）第一の転写制御配列はＨ１９に特異的な転写制御配列、および第二の転写制御配列はＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４  転写制御配列；
ｉ）第一の転写制御配列はＨ１９に特異的な転写制御配列、および第二の転写制御配列はＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４  転写制御配列；
ｉｉ）第一の転写制御配列はＨ１９に特異的な転写制御配列、および第二の転写制御配列はＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３転写制御配列；または
ｉｉｉ）第一の転写制御配列はＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４の転写制御配列、および第二の転写制御配列はＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３転写制御配列であることができる。
【００６０】
多数の発現カセットは異なった転写調節配列と機能的に連結し、細胞毒性物質をコードするそれぞれのオープンリーディングフレームから独立した転写調節することが可能である事を理解すべきである。したがって、構造物内のオープンリーディングフレームは本発明の様々な実施形態で異なることができ、例えば、その構造体を第一の発現カセットが第二の発現カセットに対して上流または下流であるように設計することができる。
【００６１】
一の実施形態において、本発明は、細胞毒性または細胞増殖調節遺伝子産物をコードする第一のオープンリーディングフレームであって、Ｈ１９特異的な転写調節配列と機能的に連結する第一のオープンリーディングフレームと；細胞毒性または細胞増殖抑制遺伝子産物をコードする第二のオープンリーディングフレームであって、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３転写調節配列と機能的に連結する第二のオープンリーディングフレームとを含む単一の核酸分子を提供する。他の実施形態において、核酸分子は、細胞毒性または細胞増殖抑制遺伝子産物を含む第三のオープンリーディングフレームを更に含み、前記第三のオープンリーディングフレームはＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４転写調節配列と機能的に連結する。各々の可能性は、本発明の別々の実施例を示す。
【００６２】
他の実施形態において、本発明は、細胞毒性または細胞増殖調節遺伝子産物をコードする第一のオープンリーディングフレームであって、Ｈ１９特異的な転写調節配列と機能的に連結する第一のオープンリーディングフレームと；細胞毒性または細胞増殖抑制遺伝子産物をコードする第二のオープンリーディングフレームであって、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４転写調節配列と機能的に連結する第二のオープンリーディングフレームとを含む単一の核酸分子を提供する。他の実施形態において、核酸分子は、細胞毒性または細胞増殖抑制遺伝子産物を含む第三のオープンリーディングフレームを更に含み、前記第三のオープンリーディングフレームはＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３転写調節配列と機能的に連結する。各々の可能性は、本発明の別々の実施例を示す。
【００６３】
他の実施形態において、本発明は、細胞毒性または細胞増殖調節遺伝子産物をコードする第一のオープンリーディングフレームであって、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４特異的な転写調節配列と機能的に連結する第一のオープンリーディングフレームと；細胞毒性または細胞増殖抑制遺伝子産物をコードする第二のオープンリーディングフレームであって、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３転写調節配列と機能的に連結する第二のオープンリーディングフレームとを含むは単一の核酸分子を提供する。他の実施形態において、核酸分子は、細胞毒性または細胞増殖抑制遺伝子産物を含む第三のオープンリーディングフレームを更に含み、前記第三のオープンリーディングフレームはＨ１９転写調節配列と機能的に連結する。各々の可能性は、本発明の別々の実施例を示す。
【００６４】
本発明の典型的な構造は、Ｈ１９およびＰ４プロモーター、Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡを別々に発現制御に基づいて細胞毒性の薬剤（ＤＴＡ）を発現することは、図１で表し、本願明細書で更に記載する（実施例１）。Ｐ４およびＰ３プロモーター（Ｐ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡ）並びにＨ１９およびＰ３プロモータ（Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡ）の別々な発現制御に基づいてＤＴＡを発現する本発明の典型的な構造を、それぞれ実施例５および実施例６における実験の詳細な説明部に同様に記載する。これらの構造を、下記で詳細に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１１、２４および１８にそれぞれ記載するような核酸配列によって示す。
【００６５】
本願明細書において示すように、それぞれが異なる腫瘍特異的なプロモーターの転写制御に基づいてＤＴＡを発現する、二つの異なった配列、すなわちベクターＨ１９およびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターを含む単一発現ベクターの投与は、それぞれの構造（Ｈ１９またはＰ４プロモーターの制御下でＤＴＡを発現）を別々に投与したときと比較して、多種多様な癌細胞の消滅が増加する結果であった（実施例１−４）。さらに、結果は単一のプロモーター構造を組み合わせて投与するものと比べて、優れた添加となることを示した（実施例７）。２つの異なる遺伝子を含む単一発現ベクターの改良された能力は同様に生体内試験で裏付けられた（実施例１０）。
【００６６】
さらに、それぞれが異なる腫瘍特異的なプロモーターの転写制御に基づいてＤＴＡを発現する、二つの異なった配列、すなわちベクターＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３およびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターを含む単一発現ベクターの投与は、それぞれの構造（Ｐ３またはＰ４プロモーターの制御下でＤＴＡを発現）を別々に投与したときと比較して、多種多様な癌細胞の消滅が増加する結果であった（実施例５）。さらに、結果は単一のプロモーター構造を組み合わせたものと比べて、優れた添加となることを示した（実施例８）。２つの異なる遺伝子を含む単一発現ベクターの改良された能力は同様に生体内試験で裏付けられた（実施例１１）。
【００６７】
さらに、それぞれが異なる腫瘍特異的なプロモーターの転写制御に基づいてＤＴＡを発現する、二つの異なった配列、すなわちベクターＨ１９およびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターを含む単一発現ベクターの投与は、それぞれの構造（Ｐ３またはＨ１９プロモーター下でＤＴＡを発現制御する）を別々に投与したときと比較して、多種多様な癌細胞の消滅が増加する結果であった（実施例６）。２つの異なる遺伝子を含む単一発現ベクターの改良された能力は同様に生体内試験で裏付けられた（実施例１２）。
【００６８】
本発明の方法および組成による細胞増殖抑制遺伝子産物は、本発明の一般的に好ましい実施形態によると、ジフテリア毒素である。他の実施形態において、双方配列は同じジフテリア毒素をコードする。他の実施形態において、それぞれの配列は異なった変異体のジフテリア毒素をコードする。他の実施形態において、ジフテリア毒素はＤＴＡである。各々の可能性は、本発明の別々の実施例を示す。
【００６９】
他の実施形態において、その構造はＴＮＦ  αをコードする付加的なオープンリーディングフレームを含み、この付加的なオープンリーディングフレームはＨ１９特異的な転写抑制配列、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３転写調節配列、またはＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４転写抑制配列から選ぶ付加的な転写抑制配列と機能的に連結する。
【００７０】
他の実施形態において、細胞毒性遺伝子産物はチミジンキナーゼである。他の実施形態において、細胞毒性遺伝子産物はシュードモナス毒素である。他の実施形態において、細胞毒性遺伝子産物はリシンである。他の実施形態において、細胞毒性遺伝子産物はコレラ毒素である。他の実施形態において、細胞毒性遺伝子産物は網膜芽腫遺伝子産物である。他の実施形態において、細胞毒性遺伝子産物はｐ５３である。他の実施形態において、細胞毒性遺伝子産物は網膜芽腫遺伝子産物である。
【００７１】
他の実施形態において、細胞毒性の薬品は、殺腫瘍、すなわち、腫瘍細胞で非腫瘍細胞と比べてより高い毒性がある。各々の可能性は、本発明の別々の実施例を示す。
【００７２】
本発明の方法および組成による細胞増殖抑制遺伝子産物は、他の実施形態において、ｐ２１である。他の実施形態において、細胞毒性遺伝子産物はｐ２７である。他の実施形態において、細胞毒性遺伝子産物はｐ５３である。他の実施形態において、細胞毒性遺伝子産物はｐ５３１７５Ｐである。他の実施形態において、細胞毒性遺伝子産物はｐ５７である。他の実施形態において、細胞毒性遺伝子産物はｐ１５である。他の実施形態において、細胞毒性遺伝子産物はｐ１６である。他の実施形態において、細胞毒性遺伝子産物はｐ１８である。他の実施形態において、細胞毒性遺伝子産物はｐ１９である。他の実施形態において、細胞毒性遺伝子産物はｐ７３である。他の実施形態において、細胞毒性遺伝子産物はＧＡＤＤ４５である。他の実施形態において、細胞毒性遺伝子産物はＡＰＣ１である。他の実施形態において、細胞毒性遺伝子産物はｐ７３ＲＢ１である。他の実施形態において、細胞毒性遺伝子産物はＷＴ１である。他の実施形態において、細胞毒性遺伝子産物はＮＦ１である。他の実施形態において、細胞毒性遺伝子産物はＶＨである。他の実施形態において、細胞毒性遺伝子産物はｐ５３である。他の実施形態において、細胞毒性の薬品は、殺腫瘍、すなわち、腫瘍細胞で非腫瘍細胞と比べてより高い毒性がある。各々の可能性は、本発明の別々の実施例を示す。細胞毒性または細胞増殖抑制の薬剤をコードする核酸配列は既知技術、例えば以下に例証するような方法で得ることができる。
【００７３】
他の実施形態において、本発明は、本発明の核酸構造および薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤を含む薬学的組成物を提供する。各々の可能性は、本発明の別々の実施例を示す。
【００７４】
他の実施形態において、本発明は、本発明の核酸構造を含む真核性発現構造およびベクターを提供する。
【００７５】
他の実施形態において、本発明は腫瘍を治療する方法を、その必要性がある被験者において提供し、本発明の核酸構造を被験者に投与することを含み、これによってその必要性がある被験者の腫瘍を治療するものである。他の実施形態において、その構造は、Ｈ１９プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターから、同様の細胞毒性遺伝子産物を発現する二つの別々な核酸配列構造を含む。他の実施形態において、二つの別々な核酸配列は、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターから同じ細胞毒性遺伝子産物を発現する。他の実施形態において、Ｈ１９プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターからそれぞれ二つの核酸配列は同じ細胞毒性遺伝子産物を発現する。他の実施形態において、細胞毒性産物はジフテリア毒素である。他の実施形態において、治療に有効量の核酸構造を投与する。他の実施形態において、腫瘍は、Ｐ３および／またはＰ４プロモーターからＨ１９  ＲＮＡおよび／またはＩＧＦ−ＩＩを発現することを特徴とする。各々の可能性は、本発明の別々の実施例を示す。
【００７６】
他の実施形態において、本発明は被験者で腫瘍進行を阻害する方法をその必要性において提供し、本発明の核酸構造を被験者に投与することを含み、これによってその必要性がある被験者の腫瘍を阻害するものである。他の実施形態において、その構造は、Ｈ１９プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターから、同様の細胞毒性遺伝子産物を発現する二つの別々な核酸配列構造を含む。他の実施形態において、二つの別々な核酸配列は、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターから同じ細胞毒性遺伝子産物を発現する。他の実施形態において、二つの別々な核酸配列構造は、Ｈ１９プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターから同じ細胞毒性遺伝子産物を発現する。他の実施形態において、細胞毒性産物はジフテリア毒素である。他の実施形態において、治療に有効量の核酸構造を投与する。他の実施形態において、腫瘍は、Ｐ３および／またはＰ４プロモーターから、Ｈ１９  ＲＮＡおよび／またはＩＧＦ−ＩＩを発現することを特徴とする。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【００７７】
他の実施形態において、本発明は被験者で腫瘍転移を阻害する方法をその必要性において提供し、本発明の核酸構造を被験者に投与することを含み、これによってその必要性がある被験者の腫瘍を阻害するものである。他の実施形態において、その構造は、Ｈ１９プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターから、同様の細胞毒性遺伝子産物を発現する二つの別々な核酸配列構造を含む。他の実施形態において、二つの別々な核酸配列構造は、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターから細胞毒性遺伝子産物を発現する。他の実施形態において、二つの別々な核酸配列構造は、Ｈ１９プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターから同じ細胞毒性遺伝子産物を発現する。他の実施形態において、細胞毒性産物はジフテリア毒素である。他の実施形態において、治療に有効量の核酸構造を投与する。他の実施形態において、腫瘍は、Ｐ３および／またはＰ４プロモーターから、Ｈ１９  ＲＮＡおよび／またはＩＧＦ−ＩＩを発現することを特徴とする。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【００７８】
他の実施形態において、本発明は、被験者で腫瘍性疾患と関連する症状を減少または軽減する方法をその必要性において提供し、本発明の核酸構造を被験者に投与することを含み、これによってその必要性がある被験者の腫瘍性疾患と関連する症状を減少または軽減するものである。他の実施形態において、その構造は、Ｈ１９プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターから、同様の細胞毒性遺伝子産物を発現する二つの別々な核酸配列構造を含む。他の実施形態において、二つの別々な核酸配列構造は、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターから同じ細胞毒性遺伝子産物を発現する。他の実施形態において、二つの別々な核酸配列構造は、Ｈ１９プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターから同じ細胞毒性遺伝子産物を発現する。他の実施形態において、細胞毒性産物はジフテリア毒素である。他の実施形態において、治療に有効量の核酸構造を投与する。他の実施形態において、腫瘍は、Ｐ３および／またはＰ４プロモーターから、Ｈ１９  ＲＮＡおよび／またはＩＧＦ−ＩＩを発現することを特徴とする。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【００７９】
他の実施形態において、本発明は、本発明の核酸構造の使用を、被験者で腫瘍を治療する薬剤を製造に関して提供する。他の実施形態において、その構造は、Ｈ１９プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターから、同様の細胞毒性遺伝子産物を発現する二つの別々な核酸配列構造を含む。他の実施形態において、二つの別々な核酸配列構造は、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターから同じ細胞毒性遺伝子産物を発現する。他の実施形態において、二つの別々な核酸配列構造は、Ｈ１９プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターから同じ細胞毒性遺伝子産物を発現する。他の実施形態において、細胞毒性産物はジフテリア毒素である。他の実施形態において、治療に有効量の核酸構造を投与する。他の実施形態において、腫瘍は、Ｐ３および／またはＰ４プロモーターから、Ｈ１９  ＲＮＡおよび／またはＩＧＦ−ＩＩを発現することを特徴とする。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【００８０】
他の実施形態において、本発明は、本発明の核酸構造の使用を、被験者で腫瘍進行を阻害する薬剤を製造に関して提供する。他の実施形態において、その構造は、Ｈ１９プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターから、同様の細胞毒性遺伝子産物を発現する二つの別々な核酸配列構造を含む。他の実施形態において、二つの別々な核酸配列構造は、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターから細胞毒性遺伝子産物を発現する。他の実施形態において、二つの別々な核酸配列構造は、Ｈ１９プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターから同じ細胞毒性遺伝子産物を発現する。他の実施形態において、細胞毒性産物はジフテリア毒素である。他の実施形態において、治療に有効量の核酸構造を投与する。他の実施形態において、腫瘍は、Ｐ３および／またはＰ４プロモーターから、Ｈ１９  ＲＮＡおよび／またはＩＧＦ−ＩＩを発現することを特徴とする。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【００８１】
他の実施形態において、本発明は、被験者で腫瘍転移を阻害する薬剤の製造に関して、本発明の核酸構造の使用を提供する。他の実施形態において、その構造は、Ｈ１９プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターから、同様の細胞毒性遺伝子産物を発現する二つの別々な核酸配列構造を含む。他の実施形態において、二つの別々な核酸配列構造は、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターから同じ細胞毒性遺伝子産物を発現する。他の実施形態において、二つの別々な核酸配列構造は、Ｈ１９プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターから同じ細胞毒性遺伝子産物を発現する。他の実施形態において、細胞毒性産物はジフテリア毒素である。他の実施形態において、治療に有効量の核酸構造を投与する。他の実施形態において、腫瘍は、Ｐ３および／またはＰ４プロモーターから、Ｈ１９  ＲＮＡおよび／またはＩＧＦ−ＩＩを発現することを特徴とする。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【００８２】
他の実施形態において、本発明は、本発明の核酸構造の使用を、被験者で腫瘍性疾患の症状を減少または軽減する薬剤を製造に関して提供する。他の実施形態において、その構造は、Ｈ１９プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターから、同様の細胞毒性遺伝子産物を発現する二つの別々な核酸配列構造を含む。他の実施形態において、二つの別々な核酸配列構造は、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターから同じ細胞毒性遺伝子産物を発現する。他の実施形態において、二つの別々な核酸配列構造は、Ｈ１９プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターから同じ細胞毒性遺伝子産物を発現する。他の実施形態において、治療に有効量の核酸構造を投与する。他の実施形態において、腫瘍は、Ｐ３および／またはＰ４プロモーターはＨ１９  ＲＮＡおよび／またはＩＧＦ−ＩＩを発現することを特徴とする。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【００８３】
他の実施形態において、本発明は、本発明の核酸構造を含み、被験者で腫瘍を治療する組成物を提供する。他の実施形態において、その構造は、Ｈ１９プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターから、同様の細胞毒性遺伝子産物を発現する二つの別々な核酸配列構造を含む。他の実施形態において、二つの別々な核酸配列構造は、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターから同じ細胞毒性遺伝子産物を発現する。他の実施形態において、二つの別々な核酸配列構造は、Ｈ１９プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターから同じ細胞毒性遺伝子産物を発現する。他の実施形態において、治療に有効量の核酸構造を投与する。他の実施形態において、腫瘍は、Ｐ３および／またはＰ４プロモーターから、Ｈ１９  ＲＮＡおよび／またはＩＧＦ−ＩＩを発現することを特徴とする。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【００８４】
他の実施形態において、本発明は、本発明の核酸構造を含み、被験者で腫瘍進行を阻害する組成物を提供する。他の実施形態において、その構造は、Ｈ１９プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターから、同様の細胞毒性遺伝子産物を発現する二つの別々な核酸配列構造を含む。他の実施形態において、二つの別々な核酸配列構造は、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターから細胞毒性遺伝子産物を発現する。他の実施形態において、二つの別々な核酸配列構造は、Ｈ１９プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターから同じ細胞毒性遺伝子産物を発現する。他の実施形態において、細胞毒性産物はジフテリア毒素である。他の実施形態において、治療に有効量の核酸構造を投与する。他の実施形態において、腫瘍は、Ｐ３および／またはＰ４プロモーターが、Ｈ１９  ＲＮＡおよび／またはＩＧＦ−ＩＩを発現することを特徴とする。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【００８５】
他の実施形態において、本発明は、本発明の核酸構造を含み、被験者で腫瘍転移を阻害する組成物を提供する。他の実施形態において、その構造は、Ｈ１９プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターから、同様の細胞毒性遺伝子産物を発現する二つの別々な核酸配列構造を含む。他の実施形態において、二つの別々な核酸配列構造は、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターから同じ細胞毒性遺伝子産物を発現する。他の実施形態において、二つの別々な核酸配列構造は、Ｈ１９プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターから同じ細胞毒性遺伝子産物を発現する。他の実施形態において、細胞毒性産物はジフテリア毒素である。他の実施形態において、治療に有効量の核酸構造を投与する。他の実施形態において、腫瘍は、Ｐ３および／またはＰ４プロモーターが、Ｈ１９  ＲＮＡおよび／またはＩＧＦ−ＩＩを発現することを特徴とする。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【００８６】
他の実施形態において、本発明は、本発明の核酸構造を含み、被験者で腫瘍性障害の症状を減少または軽減する組成物を提供する。他の実施形態において、その構造は、Ｈ１９プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターから、同様の細胞毒性遺伝子産物を発現する二つの別々な核酸配列構造を含む。他の実施形態において、二つの別々な核酸配列構造は、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターから、同じ細胞毒性遺伝子産物を発現する。他の実施形態において、二つの別々な核酸配列構造は、Ｈ１９プロモーターおよびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターから同じ細胞毒性遺伝子産物を発現する。他の実施形態において、治療に有効量の核酸構造を投与する。他の実施形態において、腫瘍は、Ｐ３および／またはＰ４プロモーターが、Ｈ１９  ＲＮＡおよび／またはＩＧＦ−ＩＩを発現することを特徴とする。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【００８７】
本発明の幾つかの実施形態において、本発明の方法および組成物の腫瘍疾患は癌であり、例えば膀胱癌、肝臓癌、卵巣癌および膵癌である。他の実施形態において、本発明の方法および組成物の腫瘍疾患は、膀胱癌である。他の実施形態において、腫瘍疾患は肝臓癌である。他の実施形態において、腫瘍疾患は卵巣癌である。他の実施形態において、腫瘍疾患は膵臓癌である。他の実施形態において、腫瘍疾患は結腸癌である。他の実施形態において、腫瘍疾患は他の種の固形癌である。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【００８８】
他の実施形態において、本発明の方法のＨ１９特異的な転写調節配列はＨ１９プロモーターを含む。他の実施形態において、Ｈ１９プロモーターは本願明細書に記載した配列のような核酸配列を含む。他の実施形態において、Ｈ１９プロモーターは本願明細書に記載した配列のような核酸配列を含む。他の実施形態において、Ｈ１９プロモーターは本願明細書に記載した配列のような核酸配列から成る。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【００８９】
他の実施形態において、本発明の方法のＨ１９特異的な転写調節配列は、Ｈ１９エンハンサーを含む。他の実施形態において、Ｈ１９エンハンサーは本願明細書に記載した配列のような核酸配列を含む。他の実施形態において、Ｈ１９エンハンサーは本願明細書に記載した配列のような核酸配列の断片を含む。他の実施形態において、Ｈ１９エンハンサーは本願明細書に記載した配列のような核酸配列から成る。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【００９０】
他の実施形態において、本発明の方法のＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３転写調節配列は、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターである。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターは本願明細書に記載した配列のような核酸配列を含む。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターは本願明細書に記載した配列のような核酸配列を含む。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターは本願明細書に記載した配列のような核酸配列から成る。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【００９１】
他の実施形態において、本発明の方法のＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３転写調節配列は、Ｈ１９エンハンサーを含む。他の実施形態において、Ｈ１９エンハンサーは本願明細書に記載した配列のような核酸配列を含む。他の実施形態において、Ｈ１９エンハンサーは本願明細書に記載した配列のような核酸配列の断片を含む。他の実施形態において、Ｈ１９エンハンサーは本願明細書に記載した配列のような核酸配列から成る。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【００９２】
他の実施形態において、本発明の方法のＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４転写調節配列は、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターである。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターは本願明細書に記載した配列のような核酸配列を含む。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターは本願明細書に記載した配列のような核酸配列の断片を含む。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターは本願明細書に記載した配列のような核酸配列から成る。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【００９３】
他の実施形態において、本発明の方法のＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４転写調節配列は、Ｈ１９エンハンサーを含む。他の実施形態において、Ｈ１９エンハンサーは本願明細書に記載した配列のような核酸配列を含む。他の実施形態において、Ｈ１９エンハンサーは本願明細書に記載した配列のような核酸配列の断片を含む。他の実施形態において、Ｈ１９エンハンサーは本願明細書に記載した配列のような核酸配列から成る。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【００９４】
核酸構造
本願明細書で使用した「核酸構造」または「構造」という用語は、本発明の細胞毒性または細胞増殖抑制の遺伝子産物（例えばジフテリア毒素、ＤＴ）をコードする核酸配列であり、この核酸配列はプロモーターと機能的に連結し、他の転写調節配列と任意に連結する。本発明の構造において、ＤＴをコードする核酸配列は、少なくとも一つのＨ１９特異的な転写調節配列、Ｐ３転写調節配列および／またはＰ４転写調節配列と機能的に連結する。
【００９５】
本発明の方法の核酸構造物および組成物は、他の実施態様において、真核生物発現ベクターである。他の実施形態において、核酸構造はプラスミドである。他の実施形態において、核酸構造は癌細胞で発現調節が可能な他の種類の発現ベクターである。それぞれの可能性は本発明の別々な実施形態を示す。
【００９６】
「機能的に連結」という用語は、宿主細胞にトランスフェクションされた（すなわち、形質転換、形質導入、感染、またはトランスフェクトされた）とき、分子を発現できるような方法で転写制御配列に連結した核酸配列をいう。転写制御配列は、転写の開始、伸長および終結を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、プロモーター、エンハンサー、オペレータおよびリプレッサー等の転写開始を制御するものである。
【００９７】
他の実施形態において、本発明の方法の核酸分子および組成物はＤＮＡ分子である。他の実施形態において、前記分子はＲＮＡ分子である。他の実施形態において、前記分子は既知の技術の他の種類の核酸分子である。それぞれの可能性は本発明の別々な実施形態を示す。
【００９８】
本願明細書で使用するような、「ベクター」という用語は、異種ポリヌクレオチドに機能的に連結できる調節配列を含み、ターゲット細胞に投与する構造をいう。ベクターはウイルス発現ベクター、プラスミドまたは裸のＤＮＡの構造であることができ、構造、選択、安定性、浸透などに必要な付加的な配列を任意的に含む。
【００９９】
本願明細書で使用するような、「異型」という用語は、薬学的に許容可能な塩、ホモログ、アナログ、または本発明に役立つ核酸配列断片（例えば、ベクター配列、転写抑制配列、クーロンポリヌクレオチドの関連物等）をいう。「異型」という用語に含まれるのは、科学的に修正した自然および合成ヌクレオチド分子である。また「異型」という用語に含まれるのは、分子のヌクレオチド配列で保存的置換である。さらに、分子のヌクレオチド配列内での非保存的置換は、配列がその必須の機能を実質的に保持する限り、本願明細書で使用した「異型」を含むものである。
【０１００】
他の実施形態において、「異型」とは、例えば、本願明細書で使用したような、細胞毒性または細胞増殖抑制遺伝子産物の「異型」であり、他の異型の同産物、例えば細胞毒性または細胞増殖抑制遺伝子である従来技術で認識した遺伝子をいう。遺伝子配列およびそれらの産物は、米国国立センター生命工学情報のＰｕｂＭｅｄデータベースのような公共データベースで特定の遺伝子の配列であるとして通常分類される；したがって、それは、例えば、本発明の細胞毒性または細胞増殖抑制の遺伝子産物の異型を識別する従来技術で、平均的技術のものの技術で容易な範囲内である。
【０１０１】
他の実施形態において、「異型」とは例えば、本発明の細胞毒性または細胞増殖抑制の遺伝子産物であり、少なくとも９０％相同性があり、または他の実施形態において、少なくとも９２％、９４％、９６％、９８％、または９９％の配列相同性がある。それぞれの可能性は本発明の別々な実施形態を示す。
【０１０２】
本願明細書で使用したような、「ジフテリア毒素」（ＤＴまたはＤＴＸ）という用語は、ジフテリア毒素または、少なくともジフテリア毒素の活性部を含むその断片をいい、細胞死を誘導、さもなければ被験者の腫瘍性障害を改善するように作用することができる。ＤＴは二つのポリペプチド断片、ＡおよびＢを含む[Zdanovskaia, M.V.; Zdanovsky, A.G.; Yankovsky, N.K. “Diphtheria toxin NAD affinity and ADP ribosyltransferaseactivity are reduced at tryptophan 153 substitutions for alanine or phenylalanine.” Research in Microbiology, 2000, 151, 557-562; Bennet, M.J.; Choe, S.; Eisenberg, D. “Refined structure of dimeric diphtheria toxin at 2.0 angstrom resolution.” Protein Science, 1994, 3, 1444-1463]。断片Ａ（ＤＴＡ）は触媒領域（Ｃ）から成り、一方、断片Ｂはレセプタ領域（Ｒ）および膜貫通領域（Ｔ）から成る。Ｒ領域は細胞表面上のＨＢ−ＥＧＦレセプタと結合するレセプタ部位を含む[Raab, Gerhard; Klagsbrun, Michael “Heparin-binding EGF-like growth factor” Biochimica et BiophysicaActa (BBA)/Reviews on Cancer 1997, 1333, F179-F199]。そして結合毒素は、エンドサイトーシスによって細胞質に入る。そしてα‐シートのＣ末端疎水性配列は、Ｔ領域として知られ、膜内にそれ自身を埋め込み、Ｎ末端のＣ領域が切断され、細胞質内に移動を生じる。一旦切断されると、Ｃ領域は活性酵素になり、ＡＤＰ−リボース−ＥＦ−２の作成をタンパク質合成転位ペプチドの転位ＥＦ−２およびＮＡＤ＋から触媒作用を及ぼす(Hudson TH et al, Quantal entry of diphtheria toxin to the cytosol. J Biol Chem. 1985 Mar 10;260(5): 2675-80)。単一のＣ領域は、ＥＦ−２の細胞の全ての供給を数時間で使用して、タンパク質合成を停止させ、細胞死を生じることができる。本発明は、組み換え型、好ましくは毒素の細胞内発現を想定するので、最小のＣ領域を使用することができる。本発明のこの態様の現在公知の好ましい実施形態によれば、毒素はジフテリアＡ鎖毒素（ＤＴＡ）である。
【０１０３】
他の実施形態において、ＤＴＡをＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に記載したような核酸配列にコードする。ａｔｇｇａｔｃｃｔｇａｔｇａｔｇｔｔｇｔｔｇａｔｔｃｔｔｃｔａａａｔｃｔｔｔｔｇｔｇａｔｇｇａａａａｃｔｔｔｔｃｔｔｃｇｔａｃｃａｃｇｇｇａｃｔａａａｃｃｔｇｇｔｔａｔｇｔａｇａｔｔｃｃａｔｔｃａａａａａｇｇｔａｔａｃａａａａｇｃｃａａａａｔｃｔｇｇｔａｃａｃａａｇｇａａａｔｔａｔｇａｃｇａｔｇａｔｔｇｇａａａｇｇｇｔｔｔｔａｔａｇｔａｃｃｇａｃａａｔａａａｔａｃｇａｃｇｃｔｇｃｇｇｇａｔａｃｔｃｔｇｔａｇａｔａａｔｇａａａａｃｃｃｇｃｔｃｔｃｔｇｇａａａａｇｃｔｇｇａｇｇｃｇｔｇｇｔｃａａａｇｔｇａｃｇｔａｔｃｃａｇｇａｃｔｇａｃｇａａｇｇｔｔｃｔｃｇｃａｃｔａａａａｇｔｇｇａｔａａｔｇｃｃｇａａａｃｔａｔｔａａｇａａａｇａｇｔｔａｇｇｔｔｔａａｇｔｃｔｃａｃｔｇａａｃｃｇｔｔｇａｔｇｇａｇｃａａｇｔｃｇｇａａｃｇｇａａｇａｇｔｔｔａｔｃａａａａｇｇｔｔｃｇｇｔｇａｔｇｇｔｇｃｔｔｃｇｃｇｔｇｔａｇｔｇｃｔｃａｇｃｃｔｔｃｃｃｔｔｃｇｃｔｇａｇｇｇｇａｇｔｔｃｔａｇｃｇｔｔｇａａｔａｔａｔｔａａｔａａｃｔｇｇｇａａｃａｇｇｃｇａａａｇｃｇｔｔａａｇｃｇｔａｇａａｃｔｔｇａｇａｔｔａａｔｔｔｔｇａａａｃｃｃｇｔｇｇａａａａｃｇｔｇｇｃｃａａｇａｔｇｃｇａｔｇｔａｔｇａｇｔａｔａｔｇｇｃｔｃａａｇｃｃｔｇｔｇｃａｇｇａａａｔｃｇｔｇｔｃａｇｇｃｇａｔｃｔｔｔｇｔｇａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
他の実施形態において、ＤＴＡをコードする配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に記載したような核酸配列を含む。他の実施形態において、ＤＴＡをコードする配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に記載したような核酸配列から成る。他の実施形態において、ＤＴＡをコードする配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に記載したような核酸配列のホモログである。他の実施形態において、ＤＴＡをコードする配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に記載したような核酸配列の異型である。他の実施形態において、ＤＴＡをコードする配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に記載したような核酸配列の断片である。他の実施形態において、ＤＴＡをコードする配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に記載したような核酸配列の断片のホモログである。他の実施形態において、ＤＴＡをコードする配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に記載したような核酸配列の相同の断片の異型である。それぞれの可能性は本発明の別々な実施形態を示す。
【０１０４】
他の実施形態において、ＤＴＡのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に記載したようなものである：
ＭＤＰＤＤＶＶＤＳＳＫＳＦＶＭＥＮＦＳＳＹＨＧＴＫＰＧＹＶＤＳＩＱＫＧＩＱＫＰＫＳＧＴＱＧＮＹＤＤＤＷＫＧＦＹＳＴＤＮＫＹＤＡＡＧＹＳＶＤＮＥＮＰＬＳＧＫＡＧＧＶＶＫＶＴＹＰＧＬＴＫＶＬＡＬＫＶＤＮＡＥＴＩＫＫＥＬＧＬＳＬＴＥＰＬＭＥＱＶＧＴＥＥＦＩＫＲＦＧＤＧＡＳＲＶＶＬＳＬＰＦＡＥＧＳＳＳＶＥＹＩＮＮＷＥＱＡＫＡＬＳＶＥＬＥＩＮＦＥＴＲＧＫＲＧＱＤＡＭＹＥＹＭＡＱＡＣＡＧＮＲＶＲＲＳＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）
他の実施形態において、ＤＴＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に記載したような核酸配列を含む。他の実施形態において、ＤＴＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に記載したような核酸配列から成る。他の実施形態において、ＤＴＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のホモログである。他の実施形態において、ＤＴＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の異型である。他の実施形態において、ＤＴＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の断片である。他の実施形態において、ＤＴＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の断片のホモログである。他の実施形態において、ＤＴＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の断片の異型である。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【０１０５】
他の実施形態において、ＤＴＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７と少なくとも９０％の相同がある。他の実施形態において、ＤＴＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７と少なくとも９２％の相同がある。他の実施形態において、ＤＴＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７と少なくとも９４％の相同がある。他の実施形態において、ＤＴＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７と少なくとも９５％の相同がある。他の実施形態において、ＤＴＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７と少なくとも９６％の相同がある。他の実施形態において、ＤＴＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７と少なくとも９７％の相同がある。他の実施形態において、ＤＴＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７と少なくとも９８％の相同がある。他の実施形態において、ＤＴＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７と少なくとも９９％の相同がある。他の実施形態において、ＤＴＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７と９９％の相同がある。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【０１０６】
本発明の構造は同じ構造で、複数の発現カセットを含み、細胞毒性または細胞増殖抑制の遺伝子産物の発現を以下の三つの転写調節配列の少なくとも二つを導く：Ｈ１９、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３およびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４調節配列、例えば遺伝子産物をコードする核酸配列は、少なくとも二つのこれらの配列の転写制御に基づくものである。本願明細書で使用するように、「Ｈ１９（またはＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３もしくはＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４）発現制御に基づく」（または転写制御）という用語は、Ｈ１９（またはＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３もしくはＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４）プロモーター配列または、そこから誘導された配列からコードされる配列の転写をいい、それらの発現パターンを制御するためにそこに機能的に連結する（空間的および時間的発現パターンを含む）。
【０１０７】
他の実施形態において、本発明の方法および組成物の調節配列は、Ｈ１９、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３、またはＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４転写調節配列に由来する。本願明細書で使用するように、「Ｈ１９、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３またはＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４転写制御配列から由来する」制御配列の説明は、Ｈ１９またはＩＧＦ−ＩＩのコード配列の発現を調整および／または制御する遺伝子領域から「誘導」（下記参照）される配列をいう。このように、配列制御は、Ｈ１９、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３またはＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４配列のプロモーターまたはエンハンサーから由来するものを含むが、これに限定されるものではない。
【０１０８】
「誘導する」という用語は、転写制御配列（例えば、プロモータおよびエンハンサー）が、遺伝子の完全な天然の制御配列、天然の制御配列の部分、天然の制御配列のキメラ構造、一つ以上の天然の制御配列の組み合わせの構造または、例えば、少なくとも一つのヌクレオチドの欠落、添加または置換によって得られる天然の制御配列の異型であることができる事実をいう。異型制御配列はヌクレオチドの修正を含むことができる。誘導する配列は、好ましくは、それに機能的に連結してコードする配列の発現の制御／調整（例えば、増加）する性質を示す。
【０１０９】
本願明細書に記載するのは、本発明の核酸構造において細胞毒性または細胞増殖抑制の遺伝子産物を特異的に発現させるように使用することができるＨ１９調節配列である。本発明で有用なＨ１９調節配列はなかでも、Ｈ１９プロモーター領域の上流およびＨ１９エンハンサー領域の下流を含む。一定の実施形態において、本発明に従って使用することができるＨ１９プロモーターおよびエンハンサー配列は、本願明細書で詳述したような米国特許第６，３０６，８３３号に記載されるものを含むが、これに限定されるものではない。
【０１１０】
本発明の組成物のＨ１９特異的な翻訳調節配列は、他の実施形態において、Ｈ１９プロモーターである。他の実施形態において、Ｈ１９プロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１〜２のうちのいずれかの核酸配列を含む。他の実施形態において、Ｈ１９プロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１−２のうちのいずれかの核酸配列から成る。
【０１１１】
一のＨ１９プロモーター領域の核酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示す：
ｃｔｇｃａｇｇｇｃｃｃｃａａｃａａｃｃｃｔｃａｃｃａａａｇｇｃｃａａｇｇｔｇｇｔｇａｃｃｇａｃｇｇａｃｃｃａｃａｇｃｇｇｇｇｔｇｇｃｔｇｇｇｇｇａｇｔｃｇａａａｃｔｃｇｃｃａｇｔｃｔｃｃａｃｔｃｃａｃｔｃｃｃａａｃｃｇｔｇｇｔｇｃｃｃｃａｃｇｃｇｇｇｃｃｔｇｇｇａｇａｇｔｃｔｇｔｇａｇｇｃｃｇｃｃｃａｃｃｇｃｔｔｇｔｃａｇｔａｇａｇｔｇｃｇｃｃｃｇｃｇａｇｃｃｇｔａａｇｃａｃａｇｃｃｃｇｇｃａａｃａｔｇｃｇｇｔｃｔｔｃａｇａｃａｇｇａａａｇｔｇｇｃｃｇｃｇａａｔｇｇｇａｃｃｇｇｇｇｔｇｃｃｃａｇｃｇｇｃｔｇｔｇｇｇｇａｃｔｃｔｇｔｃｃｔｇｃｇｇａａａｃｃｇｃｇｇｔｇａｃｇａｇｃａｃａａｇｃｔｃｇｇｔｃａａｃｔｇｇａｔｇｇｇａａｔｃｇｇｃｃｔｇｇｇｇｇｇｃｔｇｇｃａｃｃｇｃｇｃｃｃａｃｃａｇｇｇｇｇｔｔｔｇｃｇｇｃａｃｔｔｃｃｃｔｃｔｇｃｃｃｃｔｃａｇｃａｃｃｃｃａｃｃｃｃｔａｃｔｃｔｃｃａｇｇａａｃｇｔｇａｇｇｔｃｔｇａｇｃｃｇｔｇａｔｇｇｔｇｇｃａｇｇａａｇｇｇｇｃｃｃｔｃｔｇｔｇｃｃａｔｃｃｇａｇｔｃｃｃｃａｇｇｇａｃｃｃｇｃａｇｃｔｇｇｃｃｃｃｃａｇｃｃａｔｇｔｇｃａａａｇｔａｔｇｔｇｃａｇｇｇｃｇｃｔｇｇｃａｇｇｃａｇｇｇａｇｃａｇｃａｇｇｃａｔｇｇｔｇｔｃｃｃｃｔｇａｇｇｇｇａｇａｃａｇｔｇｇｔｃｔｇｇｇａｇｇｇａｇａｇｇｔｃｃｔｇｇａｃｃｃｔｇａｇｇｇａｇｇｔｇａｔｇｇｇｇｃａａｔｇｃｔｃａｇｃｃｃｔｇｔｃｔｃｃｇｇａｔｇｃｃａａａｇｇａｇｇｇｇｔｇｃｇｇｇｇａｇｇｃｃｇｔｃｔｔｔｇｇａｇａａｔｔｃｃａｇｇａｔｇｇｇｔｇｃｔｇｇｇｔｇａｇａｇａｇａｃｇｔｇｔｇｃｔｇｇａａｃｔｇｔｃｃａｇｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｇｃｃｃｔｇｃｇｇｇｇｇｃｃｃｔｃｇｇｇａｇｇｇｃｃｃｔｇｃｔｃｔｇａｔｔｇｇｃｃｇｇｃａｇｇｇｃａｇｇｇｇｃｇｇｇａａｔｔｃｔｇｇｃｇｇｇｃｃａｃｃｃｃａｇｔｔａｇａａａａａｇｃｃｃｇｇｇｃｔａｇｇａｃｃｇａｇｇａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のホモログである。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の異型である。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の断片である。他の実施形態において、Ｈ１９はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の断片のホモログである。他の実施形態において、Ｈ１９はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の断片の異型である。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【０１１２】
他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と６０％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と６５％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と７０％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と７２％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と７４％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と７６％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と７８％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と８０％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と８２％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と８４％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と８６％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と８８％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と９０％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と９２％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と９４％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と９５％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と９６％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と９７％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と９８％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と９９％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と９９％以上の相同がある。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【０１１３】
この８３１核酸配列は、キャップ側の−８３７から−７のヌクレオチドまで伸長する（ブラナン等にて記載  １９９０）。コンセンサスＴＡＴＡ配列はヌクレオチド−２７から−３５で生じる。二つのコンセンサスＡＰ２結合部位（８／９マッチ）は、転写開始からおよそ−５００および−４０ヌクレオチドの上流で生じる。ホモログ遺伝子のコードする部位の上流に配置するとき、調節部位のおよそ８３１ベースペアは、内因性のＨ１９を示す癌細胞で、機能的に連結する異種遺伝子の発現を導くのに十分である。他の実施形態において、ヌクレオチド−８１９から＋１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）との間の付加的Ｈ１９プロモーター部位は、癌細胞で機能的に連結される異種遺伝子の発現を導くのに十分である：
ｇａｃａａｃｃｃｔｃａｃｃａａｇｇｇｃｃａａｇｇｔｇｇｔｇａｃｃｇａｃｇｇａｃｃｃａｃａｇｃｇｇｇｇｔｇｇｃｔｇｇｇｇｇａｇｔｃｇａａａｃｔｃｇｃｃａｇｔｃｔｃｃａｃｔｃｃａｃｔｃｃｃａａｃｃｇｔｇｇｔｇｃｃｃｃａｃｇｃｇｇｇｃｃｔｇｇｇａｇａｇｔｃｔｇｔｇａｇｇｃｃｇｃｃｃａｃｃｇｃｔｔｇｔｃａｇｔａｇａｇｔｇｃｇｃｃｃｇｃｇａｇｃｃｇｔａａｇｃａｃａｇｃｃｃｇｇｃａａｃａｔｇｃｇｇｔｃｔｔｃａｇａｃａｇｇａａａｇｔｇｇｃｃｇｃｇａａｔｇｇｇａｃｃｇｇｇｇｔｇｃｃｃａｇｃｇｇｃｔｇｔｇｇｇｇａｃｔｃｔｇｔｃｃｔｇｃｇｇａａａｃｃｇｃｇｇｔｇａｃｇａｇｃａｃａａｇｃｔｃｇｇｔｃａａｃｔｇｇａｔｇｇｇａａｔｃｇｇｃｃｔｇｇｇｇｇｇｃｔｇｇｃａｃｃｇｃｇｃｃｃａｃｃａｇｇｇｇｇｔｔｔｇｃｇｇｃａｃｔｔｃｃｃｔｃｔｇｃｃｃｃｔｃａｇｃａｃｃｃｃａｃｃｃｃｔａｃｔｃｔｃｃａｇｇａａｃｇｔｇａｇｔｔｃｔｇａｇｃｃｇｔｇａｔｇｇｔｇｇｃａｇｇａａｇｇｇｇｃｃｃｔｃｔｇｔｇｃｃａｔｃｃｇａｇｔｃｃｃｃａｇｇｇａｃｃｃｇｃａｇｃｔｇｇｃｃｃｃｃａｇｃｃａｔｇｔｇｃａａａｇｔａｔｇｔｇｃａｇｇｇｃｇｃｔｇｇｃａｇｇｃａｇｇｇａｇｃａｇｃａｇｇｃａｔｇｇｔｇｔｃｃｃｃｔｇａｇｇｇｇａｇａｃａｇｔｇｇｔｃｔｇｇｇａｇｇｇａｇａａｇｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｇａｇｇｇａｇｇｔｇａｔｇｇｇｇｃａａｔｇｃｔｃａｇｃｃｃｔｇｔｃｔｃｃｇｇａｔｇｃｃａａａｇｇａｇｇｇｇｔｇｃｇｇｇｇａｇｇｃｃｇｔｃｔｔｔｇｇａｇａａｔｔｃｃａｇｇａｔｇｇｇｔｇｃｔｇｇｇｔｇａｇａｇａｇａｃｇｔｇｔｇｃｔｇｇａａｃｔｇｔｃｃａｇｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｇｃｃｃｔｇｃｇｇｇｇｇｃｃｃｔｃｇｇｇａｇｇｇｃｃｃｔｇｃｔｃｔｇａｔｔｇｇｃｃｇｇｃａｇｇｇｃａｇｇｇｇｃｇｇｇａａｔｔｃｔｇｇｇｃｇｇｇｇｃｃａｃｃｃｃａｇｔｔａｇａａａａａｇｃｃｃｇｇｇｃｔａｇｇａｃｃｇａｇｇａｇｃａｇｇｇｔｇａｇｇｇａｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のホモログである。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の異型である。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の断片である。他の実施形態において、Ｈ１９はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の断片のホモログである。他の実施形態において、Ｈ１９はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の断片の異型である。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【０１１４】
他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と６０％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と６５％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と７０％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と７２％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と７４％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と７６％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と７８％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と８０％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と８２％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と８４％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と８６％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と８８％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と９０％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と９２％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と９４％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と９５％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と９６％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と９７％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と９８％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と９９％の相同がある。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と９９％以上の相同がある。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【０１１５】
ヒトＨ１９遺伝子の下流エンハンサー領域は、本発明のＨ１９プロモーター／ＤＴＡ構造に任意に追加して、ＤＴＡ分子の細胞特異的な発現の改良したレベルで提供することができる。エンハンサー配列から予測されるように、下流エンハンサーは、Ｈ１９プロモーターの制御下で異種遺伝子のコードする領域から、逆転または直接の配置（内在性Ｈ１９遺伝子におけるＨ１９エンハンサーの配置に関連して）の下流いずれかで配置するときに、その効果を発揮することができる。
【０１１６】
他の実施形態において、Ｈ１９エンハンサー配列は以下の配列を含む：
ｃａａｇｇａｃａｔｇｇａａｔｔｔｃｇｇａｃｃｔｔｃｔｇｔｃｃｃｃａｃｃｃｔｃｔｃｔｇｃｔｇａｇｃｃｔａｇｇａａｃｃｔｃｔｇａｇｃａｇｃａｇｇａａｇｇｃｃｔｔｇｇｇｔｃｔａｇａｇｃｃｔａｇａａａｔｇｇａｃｃｃｃｃａｃｇｔｃｃａｃｃｔｇｃｃｃａｇｃｃｔａｇａｃｃｃｃｃａｇｃａｔｔｇａａｇｇｇｔｇｇｔｃａｇａｃｔｔｃｃｔｇｔｇａｇａｇｇａａｇｃｃａｃｔａａｇｃｇｇｇａｔｇｇａｃａｃｃａｔｃｇｃｃｃａｃｔｃｃａｃｃｃｇｇｃｃｃｔｇｃｃｃａｇｃｃｃｔｇｃｃｃａｇｔｃｃａｇｃｃｃａｇｔｃｃａｇｃｃｃａｇｃｃｃｔｇｃｃｃｔｔｃｃｃａｇｃｃｃｔｇｃｃｃａｇｃｃｃａｇｃｔｃａｔｃｃｃｔｇｃｃｃｔａｃｃｃａｇｃｃｃａｇｃｃｃｔｇｔｃｃｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃａｇｃｃｃａｇｃｃｃａｇｃｃｃａｇｃｃｃｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｔｔｃｃｃａｇｃｃｃｔｇａｃｃｔｔｃｃｃａｇｃｃｃｔｇｃｃｃａｇｃｃｃａｇｃｔｃａｔｃｃｃｔｇｃｃｃｔａｃｃｃａｇｃｔｃａｇｃｃｃｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃａｇｃｃｃｔａｃｃｃａｇｃｃｃａｇｃｃｃｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃａｇｃｔｃａｇｃｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｃｃａｇｃｃｃａｇｃｃｃａｇｃｃｃａｇｃａｔｇｃｇｔｔｃｔｃｔｇｇａｔｇｇｔｇａｇｃａｃａｇｇｃｔｔｇａｃｃｔｔａｇａａａｇａｇｇｃｔｇｇｃａａｃｇａｇｇｇｃｔｇａｇｇｃｃａｃｃａｇｇｃｃａｃｔｇｇｇｔｇｃｔｃａｃｇｇｇｔｃａｇａｃａａｇｃｃｃａｇａｇｃｃｔｇｃｔｃｃｃｃｔｇｃｃａｃｇｇｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇｔｃａｃｃｇｃｃａｇｃａｔｇｃｔｇｔｇｇａｔｇｔｇｃａｔｇｇｃｃｔｃａｇｇｇｃｔｇｃｔｇｇｃｔｃｃａｇｇｃｔｇｃｃｃｃｃｇｃｃｃｔｇｇｃｔｃｃｃｇａｇｇｃｃａｃｃｃｃｔｃｔｔａｔｇｃｃａｔｇａａｃｃｃｔｇｔｇｃｃａｃａｃｃｃａｃｃｔｃｔｇａｇｃｔｇｔｃｃｃｃｇｃｔｃｃｔｇｃｃｇｃｃｔｇｃａｃｃｃｃｃｔｇａｇｃａｇｃｃｃｃｃｔｇｔｇｔｇｔｔｔｃａｔｇｇｇａｇｔｃｔｔａｇｃａａｇｇａａｇｇｇｇａｇｃｔｃｇａａｔｔｃｃｔｇｃａｇｃｃｃｇｇｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）
他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のホモログである。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の異型である。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の断片である。他の実施形態において、Ｈ１９はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の断片のホモログである。「ホモログ」とは、本願明細書に開示した相同性の任意の度合いをいうことができる。他の実施形態において、Ｈ１９はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の断片の異型である。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【０１１７】
他の実施形態において、Ｈ１９エンハンサー配列は以下の配列を含む：
ｃｃｇｇｇｔａｃｃｇａｇｃｔｃｃｃａｇｇａａｇａｔａａａｔｇａｔｔｔｃｃｔｃｃｔｃｔｃｔａｇａｇａｔｇｇｇｇｇｔｇｇｇａｔｃｔｇａｇｃａｃｔｃａｇａｇｃｃａａｇｇｇｃｇｃａｇｔｇｇｇｔｃｃｇｇｇｃｇｇｇｇｇｃｃｃｔｃｃｔｃｇｇｃｃｃｔｃｃｃａａｃａｔｇｇｇｇｇｃｃａｇｇａｇｇｔｃａｇｃｃｃｃｔｃａａｃｃｔｇｇａｃｃｃｃｇｇｃｔｇｇｇｔｃｔｃａｇｇｇａａｔｇｇｔｃｔｃｃｃｃｃａｇｔｇｇｃｃｃａｇｃｔｔｇｃｔｔｇｔｇｔｔｔｔｃａｇａｔｇｇｇｔｇｔｇｃａｔｇｇｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇａｔｇｃｃｔｇａｃａａｇｃｃｃｃａｇａｇａｇｃｃａａａｇａｃｃｔｇａｇｔｇｇａｇａｔｃｔｔｇｔｇａｃｔｔｃｔｃａａａａｇｇｇｇｇａｔｔｇｇａａｇｇｔｔｃｇａｇａａａｇａｇｃｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｃｔｔｇｃｔｃｔｃｃｃｔｔａａｇｇｃｔｇｔｇｇｔａａｃｃａｃａｃｔａｇｇｃａｔａｇｃａｔａｇｇｃｃｔｇｃｇｃｃｃｃｇｔｃｃｃｔｃｃｔｔｃｃｃｔｃｃｔｃｃｇｃｇｃｃｔｃｔｃｃｔｔｔｃｔｃｔｔｔｃｔｃｃｃｃｃｃｔｃｔａｃｃｃｃｇｃｔｃｃｃｔｇｇｃｃｔｇｃｔｃｃｔｇｇｔｇａｃａｃｃｇｔｔｇｇｃｃｃｃｃｔｔｃｃａｇｇｇｃｔｇａｇｇｇａａｇｃｃａｇｃｇｇｇｇｇｃｃｃｃｔｔｃｃｔｇａａａｇｃｃｃａｃｃｔｇｃａｇｇｃｃｇｇｃｔｔｇｃｔｇｇｇａａｇｇｇｇｃｔｇｃｔｃｔｃｇｃａｇａｇｇｃｔｃｃｃｇｃｃｃｇｃｃｃｔｇｃａｇｃｃｇｔｔｔｃｃｔｇｇａａｇｃａｇｔｃｇｃｔｇｔｇｇｇｔａｔｔｃｔｇｔｔｃｃｔｔｇｔｃａｇｃａｃｔｇｔｇｃｔｔｇｃａａａｇａａａｇｃａｇａｃａｃｔｇｔｇｃｔｃｃｔｔｇｔｃｃｔｔａｇｇｇａｇｃｃｃｃｇｃｔｃｃａｔｃａｃｃｃａａｃａｃｃｔｇｇｃｔｇｇａｃａｃａｇｇｃｇｇｇａｇｇｃｃｇｇｇｔｃｃｇｃｇｇｇｇａｇｃｇｇｃｇｃｇｇｇｇｃｔｇｇｇｇｃｃｇｇａｃｃａｔｔａａａｃａｃａｃａｃｇｇｇｃｇｃｃａｇｇｃａｃｔｇｃａｇｇｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｇｃｃｃａｇｃｇｃｃｔｃｔｇｃｔｃａｃａｇｇｃａｃｇｔｇｃｃａａｇｃｃｃｃｔａｇｇｃｃａｇｇａｇｇｃｃａｇｃａｇｔｇｇｇｔｇｃａｇａａｃａａｇｃｔｃｃｔｇｇｇａａｇｇｇｇｇｔｇｃａｇｇｇｃｇｇａｃｃｃｃｃｇｇｇｇａｇａａｇｇｇｃｔｇｇｃａｇｇｇｃｔｇｔｇｇｇｇｇａｃｇｃｔｇａｃｃｇｔｇｇｇｃｃｃｃａｃｇｔｔｇｃａｇａａａａｃｔｇｇｎｔｇｃｃｔｇｇｃｔｇｇａａｇａｔｇｇｇｇｇａｇａｔｇｃｃａａｇｃｃｔｃｔｇａｇｇｃａｇｃａｃｇａｇｃａｇｇｇｔｇｃａｔｇｇａｇｇｃｃｇｇｇｇｃｇｃｇｇｇｇａｇｇｃｔｇｃａｃｔｇｃａｇｃａｔｇｃａｃｃｃｃａａａｇｃｃｃａｎａｇｇｇａｇｔｇｇａｇａｃｃａｇｇｃｃｃｔｇｇａａｔｃｇａｇａａｇｔａｇａａａｇｇｃｇｇｃｔｔｇｇａｇｇｃｃｔｃｇｇａａｃｃｇｇｃｔｇａｃｃｔｃｃａａｃａｇａｇｔｇｇｇｔｃｔｃｃａｇｃｃｔｇｇｃｔｃｔｇｃｃｃｔｇｃｃｇｃａｇｇｔｃｃｃｃｔｃｃｃｃｔｃａｔｔａｃｃａｇｇｃｃｔａｇａｇｃｃｔｃｃａｇｔｃｃｃｇｇｔｇｇｃｃｃｃｃａｇｃｃｃｇａｇｇｇｔｇａａｃｇｇｃｃｔｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃｇｔｇｇｇａｃａｇａｇｇｇｃａｃｇｔｔｃａｔｃａａｇａｇｔｇｇｃｔｃｃｃａａｇｇｇａｃａｃｇｔｇｇｃｔｇｔｔｔｇｃａｇｔｔｃａｃａｇｇａａｇｃａｔｔｃｇａｇａｔａａｇｇａｇｃｔｔｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｔｇｇｇｃａｃｇｇａｇｃｃａｇｃａｇｇｇｇｇｇｃｔｇｔｇｇｇｇｃａｇｃｃｃａｇｇｇｔｇｃａａｇｇｃｃａｇｇｃｔｇｔｇｇｇｇｃｔｇｃａｇｃｔｇｃｃｔｔｇｇｇｃｃｃｃａｃｔｃｃｃａｇｇｃｃｔｔｔｇｃｇｇｇａｇｇｔｇｇｇａｇｇｃｇｇｇａｇｇｃｇｇｃａｇｃｔｇｃａｃａｇｔｇｇｃｃｃｃａｇｇｃｇａｇｇｃｔｃｔｃａｇｃｃｃｃａｇｔｃｇｃｔｃｔｃｃｇｇｇｔｇｇｇｃａｇｃｃｃａａｇａｇｇｇｔｃｔｇｇｃｔｇａｇｃｃｔｃｃｃａｃａｔｃｔｇｇｇａｃｔｃｃａｔｃａｃｃｃａａｃａａｃｔｔａａｔｔａａｇｇｃｔｇａａｔｔｔｃａｃｇｔｇｔｃｃｔｇｔｇａｃｔｔｇｇｇｔａｇａｃａａａｇｃｃｃｃｔｇｔｃｃａａａｇｇｇｇｃａｇｃｃａｇｃｃｔａａｇｇｃａｇｔｇｇｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇｇｔｇｇｃｇｇｇｃｇａｃｇｇｇｇｇａｇａｔｇｇａｃａａｃａｇｇａｃｃｇａｇｇｇｔｇｔｇｃｇｇｇｃｇａｔｇｇｇｇｇａｇａｔｇｇａｃａａｃａｇｇａｃｃｇａｇｇｇｔｇｔｇｃｇｇｇｃｇａｔｇｇｇｇｇａｇａｔｇｇａｃａａｃａｇｇａｃｃｇａｇｇｇｔｇｔｇｃｇｇｇａｃａｃｇｃａｔｇｔｃａｃｔｃａｔｇｃａｃｇｃｃａａｔｇｇｇｇｇｇｃｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇｇａｇｃａｇａｃａｇａｃｔｇｇｇｃｔｇｇｇｃｔｇｇｇｃｇｇｇａａｇｇａｃｇｇｇｃａｇａｔｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のホモログである。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の異型である。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の断片である。他の実施形態において、Ｈ１９はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の断片のホモログである。「ホモログ」とは、本願明細書に開示した相同性の任意の度合いをいうことができる。他の実施形態において、Ｈ１９はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の断片の異型である。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【０１１８】
他の実施形態において、Ｈ１９エンハンサー配列は以下の配列を含む：
ｃｃｇｇｇｔａｃｃｇａｇｃｔｃｃｃａｇｇａａｇａｔａａａｔｇａｔｔｔｃｃｔｃｃｔｃｔｃｔａｇａｇａｔｇｇｇｇｇｔｇｇｇａｔｃｔｇａｇｃａｃｔｃａｇａｇｃｃａａｇｇｇｃｇｃａｇｔｇｇｇｔｃｃｇｇｇｃｇｇｇｇｇｃｃｃｔｃｃｔｃｇｇｃｃｃｔｃｃｃａａｃａｔｇｇｇｇｇｃｃａｇｇａｇｇｔｃａｇｃｃｃｃｔｃａａｃｃｔｇｇａｃｃｃｃｇｇｃｔｇｇｇｔｃｔｃａｇｇｇａａｔｇｇｔｃｔｃｃｃｃｃａｇｔｇｇｃｃｃａｇｃｔｔｇｃｔｔｇｔｇｔｔｔｔｃａｇａｔｇｇｇｔｇｔｇｃａｔｇｇｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇａｔｇｃｃｔｇａｃａａｇｃｃｃｃａｇａｇａｇｃｃａａａｇａｃｃｔｇａｇｔｇｇａｇａｔｃｔｔｇｔｇａｃｔｔｃｔｃａａａａｇｇｇｇｇａｔｔｇｇａａｇｇｔｔｃｇａｇａａａｇａｇｃｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｃｔｔｇｃｔｃｔｃｃｃｔｔａａｇｇｃｔｇｔｇｇｔａａｃｃａｃａｃｔａｇｇｃａｔａｇｃａｔａｇｇｃｃｔｇｃｇｃｃｃｃｇｔｃｃｃｔｃｃｔｔｃｃｃｔｃｃｔｃｃｇｃｇｃｃｔｃｔｃｃｔｔｔｃｔｃｔｔｔｃｔｃｃｃｃｃｃｔｃｔａｃｃｃｃｇｃｔｃｃｃｔｇｇｃｃｔｇｃｔｃｃｔｇｇｔｇａｃａｃｃｇｔｔｇｇｃｃｃｃｃｔｔｃｃａｇｇｇｃｔｇａｇｇｇａａｇｃｃａｇｃｇｇｇｇｇｃｃｃｃｔｔｃｃｔｇａａａｇｃｃｃａｃｃｔｇｃａｇｇｃｃｇｇｃｔｔｇｃｔｇｇｇａａｇｇｇｇｃｔｇｃｔｃｔｃｇｃａｇａｇｇｃｔｃｃｃｇｃｃｃｇｃｃｃｔｇｃａｇｃｃｇｔｔｔｃｃｔｇｇａａｇｃａｇｔｃｇｃｔｇｔｇｇｇｔａｔｔｃｔｇｔｔｃｃｔｔｇｔｃａｇｃａｃｔｇｔｇｃｔｔｇｃａａａｇａａａｇｃａｇａｃａｃｔｇｔｇｃｔｃｃｔｔｇｔｃｃｔｔａｇｇｇａｇｃｃｃｃｇｃｔｃｃａｔｃａｃｃｃａａｃａｃｃｔｇｇｃｔｇｇａｃａｃａｇｇｃｇｇｇａｇｇｃｃｇｇｇｔｃｃｇｃｇｇｇｇａｇｃｇｇｃｇｃｇｇｇｇｃｔｇｇｇｇｃｃｇｇａｃｃａｔｔａａａｃａｃａｃａｃｇｇｇｃｇｃｃａｇｇｃａｃｔｇｃａｇｇｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｇｃｃｃａｇｃｇｃｃｔｃｔｇｃｔｃａｃａｇｇｃａｃｇｔｇｃｃａａｇｃｃｃｃｔａｇｇｃｃａｇｇａｇｇｃｃａｇｃａｇｔｇｇｇｔｇｃａｇａａｃａａｇｃｔｃｃｔｇｇｇａａｇｇｇｇｇｔｇｃａｇｇｇｃｇｇａｃｃｃｃｃｇｇｇｇａｇａａｇｇｇｃｔｇｇｃａｇｇｇｃｔｇｔｇｇｇｇｇａｃｇｃｔｇａｃｃｇｔｇｇｇｃｃｃｃａｃｇｔｔｇｃａｇａａａａｃｔｇｇｎｔｇｃｃｔｇｇｃｔｇｇａａｇａｔｇｇｇｇｇａｇａｔｇｃｃａａｇｃｃｔｃｔｇａｇｇｃａｇｃａｃｇａｇｃａｇｇｇｔｇｃａｔｇｇａｇｇｃｃｇｇｇｇｃｇｃｇｇｇｇａｇｇｃｔｇｃａｃｔｇｃａｇｃａｔｇｃａｃｃｃｃａａａｇｃｃｃａｎａｇｇｇａｇｔｇｇａｇａｃｃａｇｇｃｃｃｔｇｇａａｔｃｇａｇａａｇｔａｇａａａｇｇｃｇｇｃｔｔｇｇａｇｇｃｃｔｃｇｇａａｃｃｇｇｃｔｇａｃｃｔｃｃａａｃａｇａｇｔｇｇｇｇｃｃｇｇｃｃｃｔｇｇａｇｇｃａａａｇａｇｇｔｇｃｃｃｇｇｇｇｔｃｃｇｇｃｃｃｔｇｃｃｔｇｇｇｇｇａｇｃｔａｔｇｔｇｔｃａｔｇｇｇｃａａｇｃｃａｃａｇｇａｔａｔｇｔａｇｃｃｃｇｃｔｃｔｇａｇｃｃｔａｔｇｇａｃｃｃａｇｇｇｃａｇｇｇｃｔｇｃａａｇｇｃａｇｇｇｃａｇｇｇｇａｇａｃａｇｃａｃｇｇｇｇｇａｇｃａａｇｇａｇｃａｇａｇａｇｇｇｇｇｃｃｔｃａｇｇｃｔｃｔｃｃｃａｇｇａｇｇａａｃａｔｔｃｔｃｃｃｇａｃａｇｇａｇｇａａｇａｇａｃｇｇｃｃｃａｇｇｇｇｔｇａｃｔｇｔｇｇｇｇａｇｃｃａｔｇｇｔｇｇｃａｇｃｔｇｇｇｇｔｃｇｔｇｇｃａｇａｔｇｇｇａｇａｇａｇｇｃｔｇｇｃｇａｇｇｔｇａａｇｇｔｇｃａｇｇｇｇｔｃａｇｇｇｃｔｃｔｇｇｇｇｃｃｃａｃａｔｇｃｃｔｇｔｇｇｇａｇｃａｇｇｃａｇｇｃｃｃａｇｇｇｃｔｃｔｃｃｇｃｃａｃｔｃｃｃｃａｃｔｃｃｃｇｃｔｔｇｇｃｔｃａｔａｇｇｃｔｇｇｇｃｃｃａａｇｇｇｔｇｇｇｇｔｇｇｇａｔｇａｇｃａｇｇａｇａｔｇｇｇｇｃｃｃａｇｇｇｇｇｃａａｇｃａｇｇｇｃｃｃｃａａａｇａｃａｔｔｔａｇａａａａａｃｃｇｇｔｔｔａｔｇｃａｇｇｃａｇｃａｔｔｃａｇａｇｃａｇｇｃｇｇｃｇｔｇｃｇｔｇｇｃｇｇｇｇｇｃｃｃｔｇｇｇａｇｃａｃａｇａｇａｇｇｃａｃａｃｇｔａｇｇｇｃｃｃｃｃｇａｇｇｇｇｃｔｃｃｃｃａｔｔｇｇｃｃｇｇｃａｇｔｇａｃａｔｃａｃｃｃｃｔｇｔｇｔｃａａｃａｇｔｇａｔｇｔｃｔｇｃａｇｃｔｃｃｇｇｃｃａｇｃｃａｇｇｇｔｔｔａｔｇｇａｇｃｇａｇａｃｃｃａｇｃｃｃｇｇｃｃｔｇｇｇｃｃｃｔｃａｃｔｃｃｃｃａｇｇｃｃｃａｃａｃａｃｔａｇｃｃｃａｃｔｇｔｔｃａｇｇｇｔｃｃｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇｃａｔｇｇｃｃｔｇｇｇｇｇｔｃｃｔｇｇｃａｃｃｇｃｔｇｃｔｃｃｔｃｔｇｃｃｃａｃｃｃｔａａｃｔｔｃｃｃｇｇｃａｔｃｇｃｇｇｃｔｇｃｃｃｃｃｔｃｔｇａｇｃｇｔｃｃｃｃａａｃｃａｇｔａａｇｔｇｔｇｇｇｇｃｃｃａｇｃａｇｇｃｃｔｇｃｃｇｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃｔｃｔａｇａｇａｇａａａｃｇｔｇｇａｇｇｔｃｃｔｇｇｇｇｃｔｇｇｇｇｇｃｇｃｔｃａｔａｇｃｃｃｔｇｔｇａｃａｃａｇｇｔｇｃａｔｇｇｇｇｔｃａｇｇｇｇｔｃｃｃａｇａａｔｇｇｃｃｃｃｔｇｇｇａａｇｇａｃｃｔｃａｇｃｔｇｇｇｃｃｇｇｃｇｇｃｔｃｔａｇｇｃｔｔｃａｇｇｇｇｔｃｔｇｔｃｔｇｃａｃａｇｇｇｇｎｔａｇｃｃｃｃｔｃｃｃａｇａｃｃｔｃｔｇｔｇａａｇｃｃａｇｔａｃｇｇｇｃｃｔｃｃｃｃｔｃｃｃｔｇｃｃｃｃｇｔｇｃｔｃｔｇｔｃｃｇｇｔｇｃｔｔｃｃｔｇｇａｃｔｇｃａｃｔｇｃｇｇｇｃｃａｃｔｇｇｔｇａｇａｇｇｇｔｇｇａｃａｇｇｇａａｇｇｇｃｃｇｃｃｇｔｇｇｔｇｃｃｔｇｔｔｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｔｇｇｃｔｇｔｇｔｇｇｔｃｃｃｃｔｃｃａａｇｔａｇｇｇａｃａａｃｃｃｔｔｃｔｇａｇｇｇｃｔｔｇｇｇｇｇｃａｃｃｃｔｇｇｇｇｔｔｇｃｃａｇｇｇｃｃｔｃｃｃａｇａｇｃｃｃｔｇｔｇａｇｃｃｃｃｔｇｇｇｇｇｇｔｃｔｇｇｃｃｔｇａｔｇｃｃｃｃｃｃｔｃｃａｃｇｔｃｃａｇｇｇｃｃｇｇｃｔｇｔｇｇｃｃｃａｇａａｃｃｃｃａｇｃｔｔｃｃｃａｇｃａｇｇｃｃｇｇｔｇｔｇｃｇｇｔｇｇｔｇａｃｃｃａｇｇａｇａｇｇｃｃｔｃｇｃｃｔｃｃａｃｔｇａｇｇｇｇｃｃａｃｃｇａｃｃｔｃｔｇｔｃａｇａｃｃａｃａｇａｇａｃｃｃｃｃａａｇｇａｇｔｃｔｇａａｇｇｃｔｇｇａｇａｃｃｃｇｇｇｇｃｔｇｇｇａｃｃａｇｇｔｇｇｇａｃｔｔｔｃｃｃａｃｇｇａｇｃｃｇｔｃｃｃｃａｇｇｃｃｃａｇｃｔｇｇｇｇａｃａｃｇｔｃｃｃｃｃｔｔｃｔｃｔｃｃａｇａｃａｃａｃｃｃｔｇｃｃｔｇｃｃａｃｃａｇｇａｃａｃａｃｃｇｇｃｃｔｇｔｔｇｇｇｇｇｔｃｔｃｔｔｔｔａａｇｔｇｃｔｔｇｃｃａｃｔｃｔｇａｇｇｔｇａｃｔｇｔｃｃｃｔｔｔｃｃａａａｇａｇｇｔｔｔｃｔｇｇｇｇｃｃｃａｇｇｔｇｇｇａｔｇｃｇｔｃｇｇｃｃｔｇａｇｃａｇｇａｇｇａｔｃｔｇｇｇｃｃｇｃｃａｇｇｇｇｃｔｇｇｇｇａｃｔｇｔｃｔｃｃｔｇｇｇｇａａｇｇａａｇｃｇｃｃｔｇｇｇａｇｃｇｔｇｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃａｇｇａｃｃａｔｃｃａｇｇｇａｇｇｃｃｃｇｔｃｔｇｔｇｇｇｇｃａａｇｃｇｇｇａａｇｇｇａｇｃｇｇｃｔｇｇａｇａｇｇｃｔｔｇｇｃｃｇｃｃｃｃｃｇｃｃｃｔｇｃｃｔｃｃｃａｔｔｃｃｔｔａｇｃｔｃｃａｔｇｃｃｔｇｔｃａａｃｃｔｃｔｇｔｃａｃｃｃａｇｔｇａｇｔｇａｔｇｔｃｃａｇｇｇｇｃｃｃｔｇｇａａａｇｇｔｃａｃａｇｃａｔｇｔｔｔｇａｇｃｇｇｇｇｔｇａｇａｇａｇａｇｇｇｇａａａｇｇｃｇｇｇｇｇｃｇｇｇｇａａａａｇｔａｃｇｔｇｇａｇｇａａｇｃｔｔｔａｇｇｃｃｃａａｇｇａａｇｇａｇａｃａｇｇｇｔｔｃｔｇｇｇａｇｇｇａｇｇｇａｇｃｃａｃｔｇｇｇｇｃｃｇｃｃｇｇｇａａｇｇｔｃｃｃｔｇｃｔｔｇｃｔｇｃｔｇｃｃａｃｃｃａｇａａｃｃｃｔｃｇｃｃｔｃｔｔａｇｃｔａｇｃｃｃｃｃｇｃａｇｃｃｃｃａｇｃｃｔｔｔｃｔｇｇｃｎｔｇｔｇｇｃｃｃｔｃｔｃｃｃｃｃａｔｃｃｃｃａｇｇｔｇｔｃｃｔｇｔｇｃａａｃｃａｇｇｃｃｔｔｇｇａｃｃｃａａａｃｃｃｔｃｃｔｇｃｃｃｃｃｔｃｃｔｃｔｃｃｃｔｃｃｔｃａｃｃｃｔｃｃｃａａｔｇｃａｇｔｇｇｔｃｔｃｃａｇｃｃｔｇｇｃｔｃｔｇｃｃｃｔｇｃｃｇｃａｇｇｔｃｃｃｃｔｃｃｃｃｔｃａｔｔａｃｃａｇｇｃｃｔａｇａｇｃｃｔｃｃａｇｔｃｃｃｇｇｔｇｇｃｃｃｃｃａｇｃｃｃｇａｇｇｇｔｇａａｃｇｇｃｃｔｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃｇｔｇｇｇａｃａｇａｇｇｇｃａｃｇｔｔｃａｔｃａａｇａｇｔｇｇｃｔｃｃｃａａｇｇｇａｃａｃｇｔｇｇｃｔｇｔｔｔｇｃａｇｔｔｃａｃａｇｇａａｇｃａｔｔｃｇａｇａｔａａｇｇａｇｃｔｔｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｔｇｇｇｃａｃｇｇａｇｃｃａｇｃａｇｇｇｇｇｇｃｔｇｔｇｇｇｇｃａｇｃｃｃａｇｇｇｔｇｃａａｇｇｃｃａｇｇｃｔｇｔｇｇｇｇｃｔｇｃａｇｃｔｇｃｃｔｔｇｇｇｃｃｃｃａｃｔｃｃｃａｇｇｃｃｔｔｔｇｃｇｇｇａｇｇｔｇｇｇａｇｇｃｇｇｇａｇｇｃｇｇｃａｇｃｔｇｃａｃａｇｔｇｇｃｃｃｃａｇｇｃｇａｇｇｃｔｃｔｃａｇｃｃｃｃａｇｔｃｇｃｔｃｔｃｃｇｇｇｔｇｇｇｃａｇｃｃｃａａｇａｇｇｇｔｃｔｇｇｃｔｇａｇｃｃｔｃｃｃａｃａｔｃｔｇｇｇａｃｔｃｃａｔｃａｃｃｃａａｃａａｃｔｔａａｔｔａａｇｇｃｔｇａａｔｔｔｃａｃｇｔｇｔｃｃｔｇｔｇａｃｔｔｇｇｇｔａｇａｃａａａｇｃｃｃｃｔｇｔｃｃａａａｇｇｇｇｃａｇｃｃａｇｃｃｔａａｇｇｃａｇｔｇｇｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇｇｔｇｇｃｇｇｇｃｇａｃｇｇｇｇｇａｇａｔｇｇａｃａａｃａｇｇａｃｃｇａｇｇｇｔｇｔｇｃｇｇｇｃｇａｔｇｇｇｇｇａｇａｔｇｇａｃａａｃａｇｇａｃｃｇａｇｇｇｔｇｔｇｃｇｇｇｃｇａｔｇｇｇｇｇａｇａｔｇｇａｃａａｃａｇｇａｃｃｇａｇｇｇｔｇｔｇｃｇｇｇａｃａｃｇｃａｔｇｔｃａｃｔｃａｔｇｃａｃｇｃｃａａｔｇｇｇｇｇｇｃｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇｇａｇｃａｇａｃａｇａｃｔｇｇｇｃｔｇｇｇｃｔｇｇｇｃｇｇｇａａｇｇａｃｇｇｇｃａｇａｔｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ��５）
他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のホモログである。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の異型である。他の実施形態において、Ｈ１９配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の断片である。他の実施形態において、Ｈ１９はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の断片のホモログである。「ホモログ」とは、本願明細書に開示した相同性の任意の度合いをいうことができる。他の実施形態において、Ｈ１９はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の断片の異型である。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【０１１９】
他の実施形態において、このエンハンサーの断片、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：３−５のうちのいずれかに記載の配列は、遺伝子発現を促進するために使用することができる。一の実施形態において、エンハンサーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：３〜５のうちのいずれかに記載の配列から成る。
【０１２０】
さらに本願明細書に記載したように、本発明の核酸構造を使用して特異的な細胞毒性および細胞増殖の遺伝子産物を導くことができるＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３調節配列である。他の実施形態において、本発明の組成のＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３転写調節配列は、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターである。他の実施形態において、Ｐ３プロモーターはＩＧＦ−ＩＩ遺伝子の核酸配列−１２２９から＋１４０に相応する（ＩＧＦ−ＩＩの遺伝子配列の一例を、染色体１１，ＮＣ＿００００１１．８，塩基対  ２１０６９２６．．２１１６５７８で発見する）。
【０１２１】
他の実施形態において、本発明の方法および組成物のＩＧＦ−ＩＩの遺伝子配列は以下である：
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【０１２２】
他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に記載したような核酸配列を含む。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ配列の核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に記載したような核酸配列から成る。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に相同である。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の異型である。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の断片である。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の断片のホモログである。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の断片の異型である。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【０１２３】
本発明の方法のＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３転写調節配列は、他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターである（本願明細書で“Ｐ３”としても示す）。他の実施形態において、Ｐ３プロモーターの配列は以下である：
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【０１２４】
他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に記載したような核酸配列を含む。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターの核酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８から成る。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に相同である。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の異型である。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の断片である。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の断片のホモログである。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の断片の異型である。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【０１２５】
他の実施形態において、Ｐ３プロモーターの配列は以下である：
ｇａｃｇｇｇｇｇｔｇｇｇｃｇｇｇｇｃｃａｇｇａｔｇｇａｇａｇｇｇｇｃｃｇａｇｔｔｇｇｃａｇｇａｇｔｃａｔｇｇｃａｇａｃｇｃｃａｃａｔｔｃｇｃｇａｃａｃｔｃｔｃｃｃｃａｃａｃｃｃｃｃｔｃｔｇｇｃｔｃｔｇｔｃｃｇｃａａｃａｔｔｔｃｃａａａｃａｇｇａｇｔｃｃｃｇｇｇａｇａｇｇｇｇｇａｇａｇｇｇｇｃｔｇｃｔｇｇｔｃｔｇａｇｇｃｔａａｇａａｇｇｇｃａｇａｇｃｃｔｔｃｇａｃｃｃｇｇａｇａｇａｇｇｃｃｇｃｇｇｃｃｃｃｔｇｃｃｃａｇｔｇｇｇｃａｇｃｇｔｇｇａａｇｔｔｔｃｃａｔａｃａａｇｇａｇｇｔｇｇｇａａｇｇａｇａｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｔｔｃａｃｔｇｃｃｃｔｇｔｇｃａｇａｇａｔｇａｇｃｃｇｇｇｇｇｔｇｃａｇｇａｔｇｇｇａｇｃｃｃａｔｇｇｃａｃｔｔｃｇｃｔａｃｇｇｇａｔｇｇｔｃａｇｇｇｃｔｃｃｃｇｇｔｔｇｇｇｇｇｔｇｃａｇｇａｇａｇａａｇａｇａｃｔｇｇｃｔｇｇｇａｇｇａｇｇｇａｇａｇｇｇｃｇｇｇａｇｃａａａｇｇｃｇｃｇｇｇｇｇａｇｔｇｇｔｃａｇｃａｇｇｇａｇａｇｇｇｇｔｇｇｇｇｇｇｔａｇｇｇｔｇｇａｇｃｃｃｇｇｇｃｔｇｇｇａｇｇａｇｔｃｇｇｃｔｃａｃａｃａｔａａａａｇｃｔｇａｇｇｃａｃｔｇａｃｃａｇｃｃｔｇｃａａａｃｔｇｇａｃａｔｔａｇｃｔｔｃｔｃｃｔｇｔｇａａａｇａｇａｃｔｔｃｃａｇｃｔｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｔｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｇｃｃｃｃａｇｃｇａｇｃｃｔｔｃｔｇｃｔｇａｇｃｔｇｔａｇｇｔａａｃｃａｇｇｇｃｃｇｔｇｇａｔｇａｇａｃｔｃｔｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）
【０１２６】
他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に記載したような核酸配列を含む。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターの核酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２から成る。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に相同である。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の異型である。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の断片である。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の断片のホモログである。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の断片の異型である。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【０１２７】
他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターはそのＳｐ１結合部位を含む。他の実施形態において、Ｓｐ１結合部位はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の残基１０−１８である。他の実施形態において、Ｓｐ１結合部位はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の残基３８８−３９９である。他の実施形態において、Ｓｐ１結合部位はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２で発見される他のＳｐ１結合部位である。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターはＴＡＴＡボックスを含む。他の実施形態において、ＴＡＴＡボックスはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の残基４７６−４８２である。他の実施形態において、ＴＡＴＡボックスはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２で発見される他のＴＡＴＡボックスである。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【０１２８】
他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７から選択する配列に対して少なくとも６０％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２と少なくとも６５％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２と少なくとも７０％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２と少なくとも７２％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２と少なくとも７４％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２と少なくとも７６％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２と少なくとも７８％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２と少なくとも８０％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２と少なくとも８２％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２と少なくとも８４％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２と少なくとも８６％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２と少なくとも８８％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２と少なくとも９０％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２と少なくとも９２％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２と少なくとも９４％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２と少なくとも９５％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２と少なくとも９６％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２と少なくとも９７％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２と少なくとも９８％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２と少なくとも９９％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２と９９％以上の相同がある。各々の可能性は、本発明の別��の実施形態を示す。
【０１２９】
他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターはＰ３開始部位と関連して、−２９１〜＋１３０で発見されるプロモーター要素を含む。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターはＰ３開始部位と関連して、−１２３２〜−８１２で発見されるプロモーター要素を含む。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターはＰ３開始部位と関連して、−２３８〜＋１４０で発見されるプロモーター要素を含む。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターはＰ３開始部位と関連して、残基−５１５に対する５’で発見されるプロモーター要素を含む。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターはＰ３開始部位と関連して、残基−２３８に対する５’で発見されるプロモーター要素を含む。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【０１３０】
さらに本願明細書に記載のように、本発明の核酸構造を使用して細胞毒性および細胞増殖の遺伝子産物の特異的な発現を導くことができるＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４調節配列である。他の実施形態において、本発明の組成のＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４調節配列はＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターである（本願明細書では「Ｐ４」とも示す）。他の実施形態において、Ｐ４プロモーターの配列を、以下に記載するようにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９で記載する。
【０１３１】
他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に記載したような核酸配列を含む。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターの核酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９から成る。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のホモログである。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の異型である。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の断片である。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の断片のホモログである。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の断片の異型である。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【０１３２】
他の実施形態において、Ｐ４プロモーターの配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３で記載する：
ｇｇａｔｃｃｃｃａａａａｔｇｔｇｔｔｃｃｔｔｇｃｔｔｔｃａｔｃｔｇｃｃａａｔｔｔｔａｃｇｔａａｔａｔｇｇｃｔｃｔａｃｇｇｃａａａａｔｔｃｃｃａａｔｔｔｃａｔａｔｇｇａｇａａｔｔｔｔｃｔｔｔａａｃｔａｃｃｃｃｔｃｃｔｃａｃａａａｔｔｇｇｔｃｃｃｃｃａａｇｃｔａｇｃｔｇｇｃｃｃｃｔａｔｔｔｇａｇａｃｃｔｃｔｔｔｃｔｃｔａｔｇｔｔｃｃｃａａｔｔｇｃａｔｇｇａｇｃａａｃｔｔｃｔｃｔｃａｔｃｃｃｃｃａａａｃｃｔｇｔａａｔｃｔａｔｔｔｔｔｃｔｇｇａｇｔｃｔｃｇａｇｔｔｔａｇｔｃａｔｔａａｔｃａｃｇｇｔｔｃｃｃａｃａｔｔａａｃｇｇａｇｔｃｃｃｃｇｇｇｇｔｃｃｃｃｔｃｃｔｃｃａｇｇａｃａｃｃｃａｔｔｃｇｃｔａａｇｃｃｃｇｃａａｇｇｃａｇａａａｇａａｃｔｃｔｇｃｃｔｔｇｃｇｔｔｃｃｃｃａａａａｔｔｔｇｇｇｃａｔｔｇｔｔｃｃｇｇｃｔｃｇｃｃｇｇｃｃａｃｃｃａｃｔｇｃａｇｃｔｔｃｃｃｃａａｃｃｃｃｇｃｇｃａｃａｇｃｇｇｇｃａｃｔｇｇｔｔｔｃｇｇｇｃｃｔｃｔｃｔｇｔｃｔｃｃｔａｃｇａａｇｔｃｃｃｃａｇａｇｃａａｃｔｃｇｇａｔｔｔｇｇｇａａａｔｔｔｃｔｃｔｃｔａｇｃｇｔｔｇｃｃｃａａａｃａｃａｃｔｔｇｇｇｔｃｇｇｃｃｇｃｇｃｇｃｃｃｔｃａｇｇａｃｇｔｇｇａｃａｇｇｇａｇｇｇｃｔｔｃｃｃｃｇｔｇｔｃｃａｇｇａａａｇｃｇａｃｃｇｇｇｃａｔｔｇｃｃｃｃｃａｇｔｃｔｃｃｃｃｃａａａｔｔｔｇｇｇｃａｔｔｇｔｃｃｃｃｇｇｇｔｃｔｔｃｃａａｃｇｇａｃｔｇｇｇｃｇｔｔｇｃｔｃｃｃｇｇａｃａｃｔｇａｇｇａｃｔｇｇｃｃｃｃｇｇｇｇｔｃｔｃｇｃｔｃａｃｃｔｔｃａｇｃａｇｃｇｔｃｃａｃｃｇｃｃｔｇｃｃａｃａｇａｇｃｇｔｔｃｇａｔｃｇｃｔｃｇｃｔｇｃｃｔｇａｇｃｔｃｃｔｇｇｔｇｃｇｃｃｃｇｃｇｇａｃｇｃａｇｃｃｔｃｃａｇｃｔｔｃｇｃｇｇｔｇａｇｃｔｃｃｃｃｇｃｃｇｃｇｃｃｇａｔｃｃｃｃｔｃｃｇｃｃｔｃｔｇｃｇｃｃｃｃｔｇａｃｃｇｇｃｔｃｔｃｇｇｃｃｃｇｃａｔｃｔｇｃｔｇｃｔｇｔｃｃｃｇｃｃｇｇｔｇｃｔｇｇｃｇｃｔｃｇｔｃｔｃｃｇｇｃｔｇｃｃｇｃｃｇｇｇｇａｇｇｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）
【０１３３】
他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に記載したような核酸配列を含む。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターの核酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３から成る。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に相同である。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の異型である。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の断片である。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の断片のホモログである。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の断片の異型である。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【０１３４】
他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３から選択する配列と少なくとも６０％以上の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３と少なくとも６５％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３と少なくとも７０％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３と少なくとも７２％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３と少なくとも７４％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３と少なくとも７６％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３と少なくとも７８％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３と少なくとも８０％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３と少なくとも８２％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３と少なくとも８４％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３と少なくとも８６％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３と少なくとも８８％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３と少なくとも９０％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３と少なくとも９２％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３と少なくとも９４％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３と少なくとも９５％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３と少なくとも９６％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３と少なくとも９７％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３と少なくとも９８％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３と少なくとも９９％の相同がある。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３と９９％以上の相同がある。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【０１３５】
他の実施形態において、Ｐ４プロモーターはＩＧＦ−Ｐ４開始部位と関連して、ＩＧＦ−ＩＩ遺伝子の核酸配列−５４６から＋１０２と一致する。
【０１３６】
他の実施形態において、癌細胞で発現するゲノム的にインプリントされるおよび、インプリントされない遺伝子からの、これらの調節配列は、所望の腫瘍特異的な発現を得るために必要である最小の調節配列を規定するために更に詳細に記載する。例えば、プロモーター領域は付加、置換、欠損によって変化し、腫瘍特異的発現機能の保持を評価する。様々な部位のＨ１９下流のエンハンサーをＨ１９プロモーターから転写を改良する能力をそれぞれ試験することができる。
【０１３７】
本発明の方法および組成物のＴＮＦ−αプロテインを、他の実施形態において、下記の配列を有する核酸分子配列によってコードする。
ｔｃａｔｇａｇｃａｃｃｇａｇａｇｃａｔｇａｔｃａｇｇｇａｔｇｔｇｇａｇｃｔｇｇｃｃｇａｇｇａｇｇｃｃｃｔｇｃｃｃａａｇａａａａｃａｇｇｃｇｇｃｃｃｔｃａｇｇｇｃａｇｃａｇａａｇａｔｇｃｃｔｇｔｔｃｃｔｇａｇｃｃｔｇｔｔｃａｇｃｔｔｃｃｔｇａｔｃｇｔｇｇｃｃｇｇａｇｃｃａｃｃａｃｃｃｔｇｔｔｃｔｇｃｃｔｇｃｔｇａａｃｔｔｃｇｇｃｇｔｇａｔｃｇｇｃｃｃｃｃａｇａｇａｇａｇｇａｇｔｔｃｃｃｃａｇａｇａｃｃｔｇａｇｃｃｔｇａｔｃｔｃｃｃｃｃｃｔｇｇｃｃｃａｇｇｃｔｇｔｇａｇａａｇｃａｇｃａｇｃａｇａａｃｃｃｃｃａｇｃｇａｃａａｇｃｃｃｇｔｇｇｃｃｃａｃｇｔｇｇｔｇｇｃｃａａｃｃｃｃｃａｇｇｃｃｇａｇｇｇｃｃａｇｃｔｇｃａｇｔｇｇｃｔｇａａｃａｇａａｇａｇｃｃａａｃｇｃｃｃｔｇｃｔｇｇｃｃａａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｃｔｇａｇａｇａｃａａｃｃａｇｃｔｇｇｔｇｇｔｇｃｃｃａｇｃｇａｇｇｇｃｃｔｇｔａｃｃｔｇａｔｃｔａｃａｇｃｃａｇｇｔｇｃｔｇｔｔｃａａｇｇｇｃｃａｇｇｇｃｔｇｃｃｃｃａｇｃａｃｃｃａｃｇｔｇｃｔｇｃｔｇａｃｃｃａｃａｃｃａｔｃａｇｃａｇａａｔｃｇｃｃｇｔｇｔｃｃｔａｃｃａｇａｃｃａａｇｇｔｇａａｃｃｔｇｃｔｇｔｃｃｇｃｃａｔｃａａｇａｇｃｃｃｔｔｇｃｃａｇａｇａｇａｇａｃｃｃｃｃｇａｇｇｇｃｇｃｃｇａｇｇｃｃａａｇｃｃｃｔｇｇｔａｃｇａｇｃｃｔａｔｃｔａｃｃｔｇｇｇｃｇｇｃｇｔｇｔｔｃｃａｇｃｔｇｇａｇａａｇｇｇｃｇａｃａｇａｃｔｇａｇｃｇｃｃｇａｇａｔｃａａｃａｇａｃｃｃｇａｃｔａｃｃｔｇｇａｔｔｔｃｇｃｃｇａｇａｇｃｇｇｃｃａｇｇｔｇｔａｃｔｔｃｇｇｃａｔｃａｔｃｇｃｃｃｔｇｔｇａｔａａｔｃｔａｇａａｃｃａｔｇｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）
他の実施形態において、ＴＮＦ−αをコードする核酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４からなる。他の実施形態において、ＴＮＦ−αをコードする配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に相同である。他の実施形態において、ＴＮＦ−αをコードする配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の異型である。他の実施形態において、ＴＮＦ−αをコードする配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の断片である。他の実施形態において、ＴＮＦ−αをコードする配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の断片のホモログである。他の実施形態において、ＴＮＦ−αをコードする配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の断片の異型である。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【０１３８】
他の実施形態において、ＴＮＦ−αのアミノ酸配列は以下の通りである：
ＭＳＴＥＳＭＩＲＤＶＥＬＡＥＥＡＬＰＫＫＴＧＧＰＱＧＳＲＲＣＬＦＬＳＬＦＳＦＬＩＶＡＧＡＴＴＬＦＣＬＬＮＦＧＶＩＧＰＱＲＥＥＦＰＲＤＬＳＬＩＳＰＬＡＱＡＶＲＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡＮＰＱＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲＡＮＡＬＬＡＮＧＶＥＬＲＤＮＱＬＶＶＰＳＥＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＫＧＱＧＣＰＳＴＨＶＬＬＴＨＴＩＳＲＩＡＶＳＹＱＴＫＶＮＬＬＳＡＩＫＳＰＣＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＥＰＩＹＬＧＧＶＦＱＬＥＫＧＤＲＬＳＡＥＩＮＲＰＤＹＬＤＦＡＥＳＧＱＶＹＦＧＩＩＡＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）
他の実施形態において、ＴＮＦ−αの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５から成る。他の実施形態において、ＴＮＦ−αの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に相同である。他の実施形態において、ＴＮＦ−αの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５の異型である。他の実施形態において、ＴＮＦ−αの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５の断片である。他の実施形態において、ＴＮＦ−αの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５の断片のホモログである。他の実施形態において、ＴＮＦ−αの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５の断片の異型である。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【０１３９】
本発明の調節配列における変化（例えば、細胞毒性または細胞増殖抑制の遺伝子産物をコードする配列）を、当業者のよく知られもので種々の化学的および酵素的方法を使用して生成することができる。例えば、制限酵素認識部位によって定められる配列の部位を欠失させることができる。オリゴヌクレオチドを標的とした突然変異は、規定する方法で配列を変更および／または配列内の特定の領域に制限酵素認識部位を導入することを使用することができる。さらに、欠失突然変異体は、Ｂａｌ３１、ＥｘｏＩＩＩおよびＳ１ヌクレアーゼのようなＤＮＡヌクレアーゼを用いて作成することができる。制御配列の次第に大きくなる欠失を、増加した時間の間にヌクレアーゼとＤＮＡをインキュベートすることで作成できる。
【０１４０】
改良した配列を、それらの能力が必須とされる機能、例えば適当な宿主細胞で異型コードする配列の腫瘍特異的な発現を導く機能で評価する。腫瘍特異的な発現を誘導するそれらの能力を保持するいかなる修飾した調節配列は、更に使用するために本発明の核酸構造内に組み込むことは、本発明の範囲である。
【０１４１】
本発明の構造は、公知技術の標準的な組み換えおよび合成方法を使用して製造することができる。単離した核酸配列はその自然源から、全ての（すなわち、完全な）遺伝子またはその部分のいずれかで得ることができる。核酸分子はまた、組み換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニング）または化学合成(例えば、Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning:ALaboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York; Ausubel, et al., 1989, Chapters 2 and 4を参照)を使用して作成することができる。核酸配列は自然の核酸配列およびそのホモログであり、自然な対立遺伝子の異型および修飾する核酸配列であって、前記修飾は本発明の機能的なオリゴヌクレオチドをコードする核酸分子の能力を実質的に妨害しないような方法で、ヌクレオチドが挿入、欠失、置換および／または反転することを含むが、これに限定されるものではない。
【０１４２】
核酸分子のアナログを、当業者に知られる多くの方法で作成することができる(例えば、Sambrook et al., 2001, ibid参照)。例えば、核酸分子は多数の技術を用いて修飾することができるが、代表的な突然変異生成技術および組み替えＤＮＡ技術、例えば部位特異的変異誘発、突然変異を誘導する核酸分子の化学処理、核酸断片の制限酵素切断、核酸断片の連結、核酸配列の選択された部位のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅および／または突然変異生成、核酸分子の混合物を「構築する」オリゴヌクレオチド混合物および混合物群の連結の合成並びにその組み合わせ混合物を含むが、これに限定されるものではない。例えば、核酸分子のアナログは、例えば下記に記載するような方法で、腫瘍進行に関する核酸によってコードするオリゴヌクレオチドの機能をスクリーニングすることで修飾した核酸の混合物から選択することができる。
【０１４３】
任意に、前記構造は、癌特異的（例えば、Ｈ１９特異的）な転写制御下で、一つ以上の配列をコードする付加的な遺伝子産物を含む。その構造はまた、当業者に知られるような、他の調節配列または選択可能な標識を含むことができる。核酸構造（本願明細書で「発現ベクター」とも示す）または本発明の構造システムは、このベクターが原核生物、真核生物、または好ましくはその両方（例えば、シャトルベクター）で複製および同化するために適切である付加的な配列を含むことができる。さらに、典型的なクローニングベクターはまた、転写および翻訳開始配列、転写および翻訳終止ならびにポリアデニル化シグナル含むことができる。
【０１４４】
エンハンサー要素は、結合される相同または異型のプロモーターから１０００倍まで転写を促進することができる。エンハンサーは転写開始部位から下流または上流に配置されると活性である。ウイルスに由来する多くのエンハンサー要素は幅広い宿主範囲を有し、種々の組織で活性がある。例えば、ＳＶ４０の初期遺伝子エンハンサーは様々な細胞種に適合する。本発明に適する他のエンハンサーは、ポリオーマウイルス、ヒトまたはマウスのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、マウス白血病ウイルスのような様々なレトロウイルスからの長期間の繰り返し、マウスまたはＲｏｕｓ肉腫ウイルスおよびＨＩＶに由来するものを含む。
【０１４５】
発現ベクターの構造において、プロモーターを、その自然な環境で転写開始部位からのように、異型転写開始部位からおよそ同じ距離に好ましくは配置する。しかしながら、当業者によく知られるように、この距離の若干の違いは、プロモーター機能を失うことなく、適応することができる。
【０１４６】
ポリアデニル化配列をまた、ＲＮＡの安定性を増加させるために発現ベクターを付加することができる。二つの異なった配列要素は正確で効率的なポリアデニル化に必要である：ポリアデニル化部位の下流に位置するＧＵまたはＵに豊富な配列および、１１〜３０のヌクレオチド上流に位置する６つのヌクレオチドの上位の保存配列ＡＡＵＡＡＡ。本発明に適した典型的な終了およびポリアデニル化の信号はＳＶ４０に由来するものを含む。
【０１４７】
既に記載する要素に加えて、本発明の発現ベクターは、クローン化の核酸の発現レベルを上昇または、組み換えＤＮＡをもたらす細胞の識別を促進することを目的とする他の特異的な要素を含む。例えば、多くの動物のウイルスは、ウイルスゲノムの追加の染色体複合体を感受性細胞種で促進するＤＮＡ配列を含むことができる。これらのウィルスレプリコンを有するプラスミドは、適切な要素をプラスミドまたは宿主細胞のゲノムのいずれかにもたらされる遺伝子によって提供する限り、エピソームに複製される。
【０１４８】
ベクターは真核生物のレプリコンを含むことも含まないこともできる。真核生物のレプリコンが存在する場合には、ベクターは適切に選択したマーカーを用いて真核細胞で増幅できる。ベクターは真核生物レプリコンを含まない場合には、エピソームの増幅は可能でない。代わりに、組み換えＤＮＡを工学細胞のゲノム内に組み込み、プロモーターは所望の核酸の発現することを導く。
【０１４９】
哺乳類発現ベクターの例は、インビトロジェンから入手可能なｐｃＤＮＡ３，ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−），ｐＧＬ３，ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−），ｐＳｅｃＴａｇ２，ｐＤｉｓｐｌａｙ，ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ，ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ，ｐＣＲ３．１，ｐＳｉｎＲｅｐ５，ＤＨ２６Ｓ，ＤＨＢＢ，ｐＮＭＴ１，ｐＮＭＴ４１およびｐＮＭＴ８１，Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能なｐＣＩ，Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手可能なｐＭｂａｃ，ｐＰｂａｃ，ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能なｐＴＲＥＳおよびそれらの誘導体である。これらは本発明のベクターの構造の骨格である。
【０１５０】
レトロウイルスのような真核ウイルスからの調節要素を含む発現ベクターをまた使用することができる。ＳＶ４０ベクターは、例えば、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２を含む。ウシ乳頭腫ウイルスに由来するベクターはｐＢＶ−１ＭＴＨＡを含み、エプスタイン・バール・ウイルスに由来するベクターはｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５を含む。他の典型的なベクターは、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、および他のいずれかのベクターを含み、この他のいずれかのベクターはＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモータ、マウス乳ガンウイルスプロモータ、ラウス肉腫ウイルスプロモータ、ポリヘドリンプロモータ、または真核生物細胞で発現が効率的に示す他のプロモーターの指示でタンパク質の発現を可能にするものである。これらは本発明のベクターの構造のベクター骨格としてもたらすことができる。
【０１５１】
上述の通り、ウイルスは、多くの場合、ホスト防御機構を回避するために進化した、非常に特異的な感染因子である。通常は、ウイルスは特異的な細胞種で感染して増殖する。ウイルスベクターの標的特異性はその自然な特異性を用いて、予め定められる細胞種を特異的に標的とし、組み換え遺伝子を感染細胞内に導入する。したがって、本発明で使われるベクター種は形質転換される細胞種に依存するだろう。形質転換される細胞種に従う適切なベクターを選択する能力は、通常の当業者の能力の範囲内で可能であるため、選択要件の一般的な説明を本願明細書で提供しない。骨髄細胞はヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−１）を使用して標的とすることができ、腎臓細胞はバキュロウイルスAutographa californica核多角体ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の存在下での異種プロモーターを使用することができ、Liang, C.Y.等（２００４）に記載される（２００４）。高性能遺伝子はバキュロウイルスベクターを用いて哺乳類の肝臓細胞内へ導入することができる。Arch Virol 149,51-60.
【０１５２】
組み換えウイルスベクターは、それらが水平感染（lateral infection）および標的特異性に有利に提供するので、本発明の遺伝子の生体内発現で役立つ。水平感染はレトロウイルスのライフサイクルに固有であり、例えば、単一感染細胞が分裂して近隣細胞を感染する多くの後代ウイルス粒子を作る過程である。その結果は広域の細胞の迅速な感染であり、そのほとんどは当初のウイルス粒子による最初に感染するものではない。これは感染因子が娘後代によるのみで拡散する垂直感染と対称的である。ウイルスベクターは水平に感染することができないものを作成できる。これは所望目的が標的細胞の局所的な数のみで特異的遺伝子を導入することである場合に役立つ。
【０１５３】
様々な方法は、本発明の発現ベクターを細胞内に導入するために使用することができる。このような方法はSambrook et al, ibid; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989); Chang et al., Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995); Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988); and Gilboa et at. [Biotechniques4 (6): 504-512, 1986に一般的に記載されていて、例えば、安定または一時的なトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび組み換えウイルスベクターでの感染を含む。さらに、ポジティブ−ネガティブセレクション方法については米国特許５，４６４，７６４号および米国特許５，４８７，９９２号を参照する。
【０１５４】
遺伝子治療
遺伝子治療方法は、本発明に従って使用することで癌を予防または治療することができる。遺伝子治療は、被験者で発現される核酸または発現できる核酸に投与して実行される治療をいう。
【０１５５】
従来技術で利用可能な遺伝子治療の方法のいずれも本発明に従って使用することができる。大型哺乳動物で疾患を改善する遺伝子治療ベクターの長期間有効利用を示した。例えば、レーバー先天性黒内障、網膜色素上皮のある遺伝子（ＲＰＥ６５）の突然変異による盲目を生じる症状を患う犬に、野生型遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）を）の投与は、遺伝子欠損をうまく修正した(Ackland et al., 2001, Nature Genetics 28:92)。野生型ＲＰＥ６５遺伝子の発現をＲＴ  ＰＣＲで確認し、機能回復を網膜の電気生理学研究および治療された動物の公平な観察によって立証した。治療は少なくとも４ヶ月間効果的であることを示した。
【０１５６】
遺伝子治療は糖尿病の合併症治療に役立つことも証明した。
【０１５７】
機能的な治療脈管形成による遺伝子治療
ＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）および他のタンパク質は、心筋虚血、高血圧、アテローム性動脈硬化症および再狭窄のような多遺伝子性および複雑な疾患を治療するための臨床治験である(Pachori AS et al, Gene therapy: role in myocardial protection. Handb Exp Pharmacol. 2006;(176 Pt 2): 335-50)。さらに、ＶＥＧＦ発現プラスミドは、１３人の患者で行われた重篤な肢虚血を有する糖尿病患者で、ＡＮＧ１の筋肉内の送達をプラセボと比較して、フェーズＩＩＩの研究で効果を有することが示された(Kusumanto et al., Molecular Therapy 3: S73)。
【０１５８】
遺伝子治療は、Ｘ染色体の遺伝される疾患、すなわち重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）および慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）を治療するために効率良く使用して、Blaese RM, Immunol Res. 2007;38(1-3): 274-84で検討された。
【０１５９】
さらに、最近の研究は、ｐ５３が通常および悪性の組織で、治療的および効率よく発現されることを示した(Fischer U, Janssen K, Schulze-Osthoff K, BioDrugs. 2007;21(5): 273-97)。
【０１６０】
したがって、本発明のベクターを用いた遺伝子治療方法は、一以上の転写調節配列と機能的に連結した異種のポリヌクレオチドを含み、癌および過剰増殖性疾患の予防または治療に用いることができる。
【０１６１】
本発明のベクターを生体内で（例えば、直接被験者内に）投与することができる。したがって、一の実施形態において、本発明のベクターは標的組織または細胞派生部位内に直接導入することができる。他の実施形態において、本発明のベクターは標的組織内に、例えば高分子製剤のように移植組織で導入できる（米国特許第５，７０２，７１７号参照）。他の実施形態において、本発明のベクターは所望の細胞または組織を対象とする。
【０１６２】
一定の実施形態において、生体内の核酸移植技術（例えば、生体内の遺伝子治療）はウイルス性または非ウイルス性の構造、例えばアデノウイルス、レンチウイルス、ヘルペスシンプレックスＩウイルス、またはアデノ関連のウイルス（ＡＡＶ）、および脂質に基づくシステムによるトランスフェクションを含む。
【０１６３】
本発明のベクターは標的組織内に裸ＤＮＡとして導入することができる。他の実施形態において、本発明のベクターは微粒子衝撃、例えば微粒子遺伝子銃（ＤｕＰｏｎｔ）を用いて細胞内に導入することができる。プラスミドＤＮＡを、例えばカチオン性ポリマー、カチオン性リポソーム（例えば、リポフェクチン、Ｄ．Ｄ．Ａ．Ｂのようなコレステロールの誘導体およびカチオン性のリン脂質）の助け、誘導（例えば、抗体接合）、ポリリシン結合体、グラミシジンＳ、人工的なウイルスエンベロープまたは他の細胞内のキャリア、および裸遺伝子構造の直接の注射、電気穿孔法、生体内で行われるＣａＰＯ４沈殿およびポリエチレンイミンに基づく非ウイルス性の遺伝子導入システムで送達することができる。癌遺伝子治療の核酸転移および発現のシステムの検討はEur. J. Phar. Biopharm. 60 (2):247-66; Aigner (2006) J. Biotechnol. 254:12-25; Christopher and Wong (2006) Curr. Pharm. Des. 1995-2006; and Wolff (2005) ActaMyol.24:202-8を含む。
【０１６４】
腫瘍細胞の遺伝子の発現を測定
腫瘍および細胞株で、Ｈ１９、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３およびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４で促進される発現は、例えばＲＮＡ分析、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成、またはレポーター遺伝子構造の技術で決定することができる。さらに、活性ＩＧＦ−１遺伝子発現で腫瘍細胞を、遺伝子療法でＩＧＦ−１プロモーターを使用して同様に確定および標的とし、異種のポリヌクレオチドの発現を導くことができる。
【０１６５】
ほとんどのＲＮＡ分析の応用、関心のある転写遺伝子に特異的に対合させる標識プローブを、既知技術の多くの技術を使用して調整する。標識プローブはＨ１９核酸配列と相補的な少なくとも１５−３０残基を含み、より好ましくはＨ１９転写物と相補的な少なくとも５０−１５０残基を含む。特に好ましくはＨ１９発現用のハイブリダイゼーションプローブは、ポリＡ部位の約８００残基上流からポリＡ部位までのＨ１９メッセージの３’末端と相補的なポリヌクレオチドである。
【０１６６】
本発明の特定の実施形態において、標識アンチセンスのＲＮＡプローブを、Ｔ７またはＴ３発現プラスミドを使用して生体外で作成した。Ｈ１９プローブはまた、核酸標識の存在下で、例えばPrime-It kit(StratageneTM, La Jolla, Calif; Catalog No. 300392)を用いてランダムプライミングで標識することができる。あるいは、標的プローブはＨ１９コード領域のｃＤＮＡクローンおよび、コード領域の領域を増幅して設計するプライマーを使用してＰＣＲ反応、または標準のニックトランスレーション反応で作成できる。
【０１６７】
ポリヌクレオチドプローブに適したラベルは、放射性同位元素（例えば、３５Ｓおよび３２Ｐ）、蛍光、発光、カラータグおよび酵素成分を組み込んだヌクレオチドを含む。
【０１６８】
標識プローブを、米国特許５，９５５，２７３号に記載のような標準な技術を使用して細胞または組織のサンプルにｉｎ  ｓｉｔｕでハイブリダイズし、本願明細書に組み込むものとする。あるいは、十分な量の適切な細胞を得ることができると、標準のＲＮＡ分析（例えばノーザン分析、ＲＮａｓｅ保護またはプライマー拡張）を、関心のある遺伝子のｍＲＮＡ発現量を決定するように実行することができる。
【０１６９】
さらに、このような遺伝子発現分析は「ｉｎ  ｓｉｔｕ」、すなわち核酸精製が必要でないような生険または切除から得られる患者組織の組織部分（固定および／または凍結）で実行することができる。上述のもののような核酸薬剤を、前記ｉｎ  ｓｉｔｕ方法用のプローブおよび／またはプライマーを使用することができる(Nuovo, 1992, “PCR In Situ Hybridization:Protocols And Applications,” Raven Press, NY参照)。
【０１７０】
細胞種または腫瘍が異種のポリヌクレオチドと機能的に連結する特定の転写調節配列を含む発現の構造を、特異的に活性化することが可能であるかを確定する代替の方法は、細胞内に前記発現構造をトランスフェクトすることである。これらの目的のために、異種のポリヌクレオチドは好ましくは標識遺伝子産物である。標識の遺伝子産物に関する分析での陽性結果は、細胞または細胞株が転写調節配列から発現を活性化することが可能であることが明らかになる。
【０１７１】
さらに、様々な増幅方法は、わずかな量のＲＮＡを細密に検出して、腫瘍がＨ１９および／またはＩＧＦ−ＩＩを発現するかどうかを確認するためにも使用することができる。そのような方法で、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲおよびｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ（“ｎｅｓｔｅｄ”ＰＣＲ、およびｎｅｓｔｅｄＲＴ−ＰＣＲに参照する全て）、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）および３ＳＲ（自家持続配列複製法）を含む。好ましい実施形態によると、ＲＴ−ＰＣＲおよびｎｅｓｔｅｄＲＴ−ＰＣＲを使用した。増殖産物を、ゲル上で分離するような従来技術で使用する方法によって識別する。
【０１７２】
医薬品の組成物およびキット
他の実施形態において、本発明は、本発明の核酸構造および、任意の一種以上の薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤を含む医薬品組成物である。
【０１７３】
一の態様によると、本発明は、ｉ）細胞毒性遺伝子タンパク質をコードする少なくとも二つ以上の核酸配列を含む核酸構造であって、一の核酸配列はＨ１９特異的な転写調節配列と機能的に連結して、他の核酸配列はＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４転写調節配列と機能的に連結するものと、ｉｉ）薬学的許容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とを含む医薬品組成物を提供する。
【０１７４】
他の態様において、本発明は、細胞毒性遺伝子タンパク質をコードする少なくとも二つ以上の核酸配列の核酸配列を含む核酸構造であって、一の核酸配列はＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３転写調節配列と機能的に連結して、他の核酸配列はＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４転写調節配列と機能的に連結するものと、ｉｉ）薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とを含む医薬品組成物を提供する。
【０１７５】
他の態様において、本発明は、細胞毒性遺伝子タンパク質をコードする少なくとも二つ以上の核酸配列の核酸配列を含む核酸構造であって、一の核酸配列はＨ１９特異的な転写調節配列と機能的に連結して、他の核酸配列はＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３転写調節配列と機能的に連結するものと、ｉｉ）薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とを含む医薬品組成物を提供する。
【０１７６】
一の実施形態によると、本発明は、ｉ）ジフテリア毒素をコードする第一オープンリーディングフレームであって、Ｈ１９特異的な転写調節配列と機能的に連結する第一オープンリーディングフレームおよび、ジフテリア毒素をコードする第二オープンリーディングフレームであって、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４転写調節配列と機能的に連結する第二オープンリーディングフレームを含むを含む核酸構造と、ｉｉ）薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とを含む医薬品組成物を提供する。他の実施形態において、前記核酸構造はジフテリア毒素をコードする第三のオープンリーディングフレームを更に含み、前記第三のオープンリーディングフレームはＨ１９特異的な転写制御配列と機能的に連結する。
【０１７７】
他の実施形態において、本発明は、ｉ）ジフテリア毒素をコードする第一オープンリーディングフレームであって、Ｈ１９特異的な転写調節配列と機能的に連結する第一オープンリーディングフレームおよび、ジフテリア毒素をコードする第二オープンリーディングフレームであって、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３転写調節配列と機能的に連結する第二オープンリーディングフレームを含む核酸構造と、ｉｉ）薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とを含む医薬品組成物を提供する。他の実施形態において、前記核酸構造はさらにジフテリア毒素をコードする第三オープンリーディングフレームを含み、前記第三オープンリーディングフレームはＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４転写調節配列と機能的に連結する。
【０１７８】
他の実施形態において、本発明は、ｉ）ジフテリア毒素をコードする第一オープンリーディングフレームであって、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３転写調節配列と機能的に連結する第一オープンリーディングフレームおよび、ジフテリア毒素をコードする第二オープンリーディングフレームであって、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４転写調節配列と機能的に連結する第二オープンリーディングフレームを含む核酸構造と、ｉｉ）薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とを含む医薬品組成物を提供する。他の実施形態において、前記核酸構造はジフテリア毒素をコードする第三のオープンリーディングフレームを更に含み、前記第三のオープンリーディングフレームはＨ１９特異的な転写制御配列と機能的に連結する。
【０１７９】
他の実施形態において、ジフテリア毒素はジフテリア毒素Ａ（ＤＴＡ）である。他の実施形態において、前記ジフテリア毒素はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に規定の配列を含む。
【０１８０】
他の実施形態において、Ｈ１９特異的な転写調節配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯS：１−２に規定の核酸配列を含むプロモーターである。
【０１８１】
他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４転写調節配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に規定の核酸配列を含むプロモーターである。
【０１８２】
他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３転写調節配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７から選択した配列に規定の核酸配列を含むプロモーターである。
【０１８３】
他の実施形態において、前記核酸構造はプラスミドまたは真核発現ベクターである。
【０１８４】
他の実施形態において、単位用量の形態で本発明の核酸構造単位を有する容器を具える個々の哺乳類用で、抗腫瘍治療の治療単位を含む医薬品パックを提供する。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、本発明の構造物は簡単に投与できる形態で提供する。他の実施形態において、本発明の構造物は濃縮形態のパックで、任意に最終的な溶液を作る希釈剤で提供する。さらに他の実施形態において、製品は本発明の固体の形態で役立つ化合物および、任意に本発明に役立つ化合物で適切な溶媒またはキャリアを有する別々な容器を含む。
【０１８６】
さらに他の実施形態において、上記パック／キットは他の構成要素を含み、例えば製品を希釈、混合および／または投与する方法、他の容器、シリンジ、針等である。他のこの様なパック／キットの構成要素は、従来技術のもので容易に明らかになるだろう。
【０１８７】
特定の実施形態において、キットは本願明細書で記載したように、癌、特に腫瘍を患った被験者に前記核酸構造を投与する方法において、少なくとも腫瘍の細胞の一部で、Ｐ３および／またはＰ４プロモーターから、Ｈ１９  ＲＮＡの発現および／またはＩＧＦ−ＩＩ発現を特徴とする。
【０１８８】
本願明細書で使用するように、「医薬的組成物」とは本願明細書に記載の一つ以上の活性成分例えばＤＴＡ分子をコードする構造を、生理的に適切なキャリアおよび賦形剤のような他の構成要素との調整を示す。医薬組成物の目的は被験者に化合物を投与することを促進することである。
【０１８９】
以下に、「治療に許容可能なキャリア」および「医薬的に許容可能なキャリア」の用語は、ほとんど同じ意味で使われ、生物に重大な刺激を与える原因とならなくて、生物活性および投与した化合の妨げないキャリアまたは希釈剤を示す。本願明細書で使用するように、「薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤」は、単一の補助原料または様々な混合物および治療に不活性成分の組み合わせである。
【０１９０】
本願明細書で、「賦形剤」という語句は、活性成分を投与することを更に促進する医薬品組成物に加えた不活性な成分である。例えば、賦形剤は特に核酸薬剤を投与するのに適切な賦形剤の例は、限定されるものではないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖および澱粉、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールを含む。
【０１９１】
本発明の他の実施形態において、治療組成物は薬学的に許容可能なキャリアを含む。本願明細書で使用したように「キャリア」とは治療薬剤を配達するための薬学的な賦形剤として適切ないずれかの物質を示し、例えば生体内または生体外の部位に適した本発明の核酸分子である。このように、キャリアは、本発明の核酸分子を含む薬学的に許容可能な治療組成物の賦形剤として作用することができる。特に核酸薬剤の投与に適切な好適なキャリアは、細胞に核酸分子の到達に応じて、核酸分子が細胞内に浸入し、細胞で発現できる形態で、本発明の核酸分子核酸分子を維持することができる。本発明のキャリアは：（１）運搬するが、核酸分子を細胞に特異的に標的とすることがない賦形剤または処方（本願明細書において、非ターゲティングキャリアと示す）；および、（２）核酸分子を被験者の特異的な部位また特異的な細胞に到達する賦形剤または処方（すなわり、ターゲティングキャリア）を含む。非ターゲティングキャリアの例は、水、リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液、ブドウ糖溶液、血清を含んだ溶液、ハンク溶液、他の水溶性の生理的平衡液、油、エステル類およびグリコールを含むが、これに限定されるものではない。水溶性のキャリアは、例えば化学安定性および等張性を改良することによって受容者の生理的状態に近似することを必要とする適切な補助物質を含むことができる。
【０１９２】
適切な補助物質は、例えば、酢酸ナトリウム塩、塩化ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムおよびリン酸塩緩衝液、トリス緩衝液および重炭酸塩緩衝液を製造するために用いる他の物質を含む。補助物質はまた、防腐剤、例えばチメロサール、ｍ−およびｏ−クレゾール、ホルマリンおよびベンゾールアルコールを含むことができる。好適なエアゾール送達のための補助物質は、被験者に非中毒性の界面活性剤物質で、例えば約６〜約２２の炭素原子を含む脂肪酸のエステル類または部分的エステルを含む。エステルの例はカプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリック酸およびオレイン酸を含む。他のキャリアは金属の粒子（例えば金の粒子）を含み、例えば皮膚への微粒子銃で使用することができる。本発明の治療組成物は従来の方法によって滅菌することができる。
【０１９３】
ターゲティングキャリアは本願明細書で「送達媒体」として示す。本発明の送達媒体は、本発明の治療組成物を被験者の標的部位に送達することができる。「標的部位」とは、治療組成物を送達することが望ましい被験者の部位をいう。核酸薬剤を投与するのに特に適切な送達媒体の例は、人口的および自然な脂質を含む送達媒体を含むが、これに制限されない。自然な脂質を含む送達媒体は、細胞および細胞の膜を含む。人工的な脂質を含む送達媒体はリボソームおよびミセルを含む。本発明の送達媒体は被験者の特定部位を標的として改良することで、その部位で本発明の核酸分子を標的として使用することができる。適切な修飾は送達媒体の脂質部位の化学式を操作および／または送達媒体を好ましい部位、例えば好ましい細胞種に特異的にターゲットできる化合物の導入する事を含む。特にターゲティングは、細胞表面上で分子に媒体内の化合物の相互作用によって特定の細胞と、送達媒体を結合させることである。適切な標的化合物は、選択的（すなわち特異的）に特定部位で他の分子と結合できるリガンドを含む。この種のリガンドの例は、抗体、抗原、レセプターおよび受容体リガンドを含む。例えば、標的細胞の表面で見つかる抗原に特異的な抗体を、リポソーム送達媒体の外面に導入し、標的細胞に送達媒体を標的に送達できる。送達媒体の脂質部位の化学式を操作することは、送達媒体細胞外または細胞内の標的を調節することができる。例えば、化学製品はリボソームの脂質二重層の電荷を変えるリボソームの脂質の式に加えて、リボソームが特定の電化特性を有する細胞と融合することができる。
【０１９４】
特定の実施形態において、核酸物質を投与する特に適切な送達媒体はリボソームである。リボソームは、本発明の核酸分子を被験者の好ましい部位に送達する十分な間、被験者に安定して残存する。本発明のリポソームは、好ましくは少なくとも約３０分、より好ましくは少なくとも約１時間、さらに好ましくは少なくとも約２４時間投与して被験者で安定することである。
【０１９５】
本発明のリポソームは、本発明の核酸分子を、被験者の特定または選択した部位に標的とすることができる脂質組成物である。
【０１９６】
本発明で用いる適切なリポソームは、いかなるリポソームも含む。本発明の好ましいリポソームは、例えば従来技術で知られる遺伝子送達方法で通常に使われるこれらのリポソームを含む。一定の実施形態において、より好適なリポソームは、ポリカチオン脂質組成物を有するリポソームおよび／またはポリエチレングリコールに接合したコレステロール骨格を有するリポソームを含む。
【０１９７】
好ましくは、医薬品組成物はさらにＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＣ−Ｃｈｏｌのようなトランスフェクション薬物である(Tonkinson et al., 1996)。トランスフェクション薬物の好ましい例はボリエステル繊維（エチルアミン）（ＰＥＩ）である。
【０１９８】
使用できる核酸物質を投与するために特に適切な他の薬剤は、例えばカチオン脂質、ポリリジンおよびデンドリマーである。あるいは、裸ＤＮＡを投与することができる。
【０１９９】
治療上の用途
別の態様において、本発明は、腫瘍を治療する方法を、それを必要とする被験者に提供し、治療上有効量の本発明の核酸分子を投与することを含み、前記被験者は、腫瘍細胞の少なくとも一部でＰ３および／またはＰ４プロモーターから、Ｈ１９  ＲＮＡおよび／またはＩＧＦ−ＩＩの発現を特徴とする腫瘍を患う。
【０２００】
他の態様において、本発明は、腫瘍進行を阻害する方法を、それを必要とする被験者に提供し、治療上有効量の本発明の核酸分子を投与することを含み、前記被験者は、腫瘍細胞の少なくとも一部でＰ３および／またはＰ４プロモーターから、Ｈ１９  ＲＮＡおよび／またはＩＧＦ−ＩＩの発現を特徴とする腫瘍を患う。
【０２０１】
他の実施形態において、本発明は、腫瘍転移を阻害する方法を、それを必要とする被験者に提供し、治療に有効量な本発明の核酸分子を投与することを含み、前記被験者は、腫瘍細胞少なくとも一部でＰ３および／またはＰ４プロモーターから、Ｈ１９  ＲＮＡおよび／またはＩＧＦ−ＩＩを発現することを特徴とする腫瘍を患う。
【０２０２】
他の態様において、本発明は、腫瘍性障害に関わる症状を軽減または緩和する方法を、それを必要とする被験者に提供し、被験者は腫瘍細胞の少なくとも一部でＰ３および／またはＰ４プロモーターから、Ｈ１９  ＲＮＡおよび／またはＩＧＦ−ＩＩの発現を特徴とする腫瘍を患い、その方法は、治療に有効量な本発明の核酸分子を被験者に投与することである。
【０２０３】
他の実施形態において、核酸構造は、ジフテリア毒素をコードする第一のオープンリーディングフレームであって、Ｈ１９特異的な転写調節配列に機能的に連結する第一のオープンリーディングフレームと、ジフテリア毒素をコードする第二オープンリーディングフレームであって、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４転写調節配列と機能的に連結する第二リーディングフレームとを含む。他の実施形態において、前記腫瘍細胞は、Ｈ１９プロモーターおよび／またはＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターによって指令される転写産物を発現する。他の実施形態において、前記核酸構造は、ジフテリア毒素をコードする第三のオープンリーディングフレームを含み、前記第三のオープンリーディングフレームはＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３転写調節配列と機能的に連結する。
【０２０４】
他の実施形態において、核酸構造は、ジフテリア毒素をコードする第一のオープンリーディングフレームであって、Ｈ１９特異的な転写調節配列に機能的に連結する第一のオープンリーディングフレームと、ジフテリア毒素をコードする第二オープンリーディングフレームであって、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３転写調節配列と機能的に連結する第二リーディングフレームとを含む。他の実施形態において、前記腫瘍の細胞はＨ１９プロモーターによって指令される転写産物および／またはＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターによって指令される転写産物を発現する。他の実施形態において、前記核酸構造はさらに、ジフテリア毒素をコードする第三オープンリーディングフレームを含み、前記第三オープンリーディングフレームはＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４転写調節配列と機能的に連結する。
【０２０５】
他の実施形態において、核酸構造は、ジフテリア毒素をコードする第一のオープンリーディングフレームであって、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３転写調節配列に機能的に連結する第一のオープンリーディングフレームと、ジフテリア毒素をコードする第二オープンリーディングフレームであって、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４転写調節配列と機能的に連結する第二リーディングフレームとを含む。他の実施形態において、前記腫瘍の細胞は、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターによって指令される転写産物および／またはＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターによって指令される転写産物を発現することができる。他の実施形態において、前記核酸構造はジフテリア毒素をコードする第三のオープンリーディングフレームを更に含み、前記第三のオープンリーディングフレームはＨ１９特異的な転写制御配列と機能的に連結する。
【０２０６】
他の実施形態において、ジフテリア毒素はジフテリア毒素Ａ（ＤＴＡ）である。他の実施形態において、前記ジフテリア毒素はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に規定の配列を含む。
【０２０７】
他の実施形態において、Ｈ１９特異的な転写調節配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１−２に規定の核酸配列プロモーターを含む。
【０２０８】
他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４転写調節配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に規定の核酸配列を含むプロモーターである。
【０２０９】
他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３転写調節配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７から選択した核酸配列を含むプロモーターである。
【０２１０】
本発明は治療薬に対する被験者の感度を高める方法に関し、それを必要とする被験者に本発明の核酸分子の有効量を投与することを含む。
【０２１１】
本願明細書で使用するように、癌を「治療」（または被験者を癌で治療）することは、有益または所望の結果を得る工程をいい、癌の一つ以上の症状を軽減または改善、疾患の範囲の減少、疾患進行を遅延または減速、病状の改善、緩和または安定化、部分的なまたは完全な暖解、長期にわたる生存および従来技術で知られる他の有益な結果を含むが、これに限定されない。
【０２１２】
他の実施形態において、被験者はヒトである。
【０２１３】
他の実施形態において、本発明の方法に従って治療することができる腫瘍は、腫瘍開始または進行の間、Ｐ３および／またはＰ４プロモーターから、Ｈ１９  ＲＮＡおよび／またはＩＧＦ−ＩＩを発現するものである。他の実施形態において、本発明の標的腫瘍の細胞は、Ｈ１９プロモーターによって指令される転写因子（例えばＨ１９転写因子）および、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターによって指令される転写因子（例えばＩＧＦ−ＩＩ転写因子）を内因的に発現する。他の実施形態において、標的腫瘍の細胞は、Ｈ１９プロモーターによって指令される転写因子およびＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターによって指令される転写因子（例えばＩＧＦ−ＩＩ転写因子）を内因的に発現する。他の実施形態において、標的腫瘍の細胞はＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターによって指令される転写因子およびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターによって指令される転写因子を内因的に発現する。他の実施形態において、標的腫瘍はＰ３で促進されるＩＧＦ−ＩＩ転写因子、Ｐ４で促進されるＩＧＦ−ＩＩ転写因子、およびＨ１９転写因子を内因的に発現する細胞である。他の実施形態において、内因的に標的腫瘍は、ＩＧＦ−ＩＩ−Ｐ３、ＩＧＦ−ＩＩ−Ｐ４およびＨ１９で促進される転写因子の少なくとも二つを発現する。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【０２１４】
他の実施形態において、標的腫瘍を、Ｐ３もしくはＰ４プロモーター、またはその両方の制御に基づいて、Ｈ１９の発現および／またはＩＧＦ−ＩＩの発現で遺伝子型が同定する。他の実施形態において、標的腫瘍を遺伝子型が同定しない。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【０２１５】
例えば、幾つかの実施形態において、腫瘍を、ウィルム腫瘍、肝芽腫、胎児性横紋筋肉腫、性細胞腫瘍および栄養芽の腫瘍、睾丸性細胞腫瘍、睾丸精上皮腫、奇形腫、卵巣の未発達の奇形腫、仙尾骨腫瘍、絨毛膜癌腫、胎盤絨毛細胞の異常増殖、膀胱癌、肝臓癌、卵巣の癌、頸部癌、肺癌、乳癌、頭部および首の扁平上皮癌、食道癌、甲状腺癌、神経性腫瘍、星状細胞腫、神経節芽細胞腫、神経芽腫、骨肉腫、黒色腫、膵臓癌、前立腺ガン、子宮癌、腎臓細胞癌、結腸直腸癌、大腸癌、髄芽細胞腫、神経膠芽腫、副腎皮質腫瘍、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、頭部および頸部の癌、口腔癌、妊娠性絨毛腫瘍、髄膜腫ならびに肝癌から選択する。幾つかの特定の実施形態において、腫瘍を、頭部および頸部の癌、口腔癌、ならびに妊娠性絨毛腫瘍から選択する。
【０２１６】
他の実施形態において、被験者はベックウィス−ウィーデルマン症候群（ＢＷＳ）を患っていて、このようにウィルムの腫瘍または肝芽腫のようなＨ１９および／またはＩＧＦ−ＩＩに関する腫瘍を発病する傾向がある。
【０２１７】
他の実施形態において、標的腫瘍は固形腫瘍である。他の実施形態において、標的腫瘍は癌である。特定の実施形態において、腫瘍は、膀胱がん（例えば膀胱癌）、肝癌（例えば肝細胞癌）卵巣癌（例えば明細胞癌）、膵癌（例えば膵臓管癌、類上皮癌）である。
【０２１８】
特定の他の好ましい実施形態において、腫瘍を膀胱癌、肝臓癌、卵巣癌および膵癌から成る群から選択する。他の実施形態において、標的腫瘍は膀胱癌である。他の実施形態において、標的腫瘍は肝臓癌である。他の実施形態において、標的腫瘍は結腸癌である。他の実施形態において、標的腫瘍は表在性膀胱癌である。他の実施形態において、標的腫瘍は頸部癌である。他の実施形態において、標的腫瘍は肺癌である。他の実施形態において、標的腫瘍は肺腺癌である。他の実施形態において、標的腫瘍は小細胞肺癌である。他の実施形態において、標的腫瘍は乳癌である。他の実施形態において、標的腫瘍は頭部および首の扁平上皮癌である。他の実施形態において、標的腫瘍は腎臓細胞癌である。他の実施形態において、標的腫瘍は食道癌である。他の実施形態において、標的腫瘍は膵癌である。他の実施形態において、標的腫瘍は肝芽腫である。他の実施形態において、標的腫瘍は横紋筋肉腫である。他の実施形態において、標的腫瘍は甲状腺癌である。他の実施形態において、標的腫瘍は神経節芽細胞種である。他の実施形態において、標的腫瘍は卵巣癌である。他の実施形態において、標的腫瘍は扁平上皮細胞気管支癌である。他の実施形態において、標的腫瘍は肝臓腫瘍である。他の実施形態において、腫瘍は結腸直腸癌である。他の実施形態において、標的腫瘍は子宮内膜癌である。他の実施形態において、腫瘍は睾丸腫瘍である。他の実施形態において、標的腫瘍は睾丸性細胞腫瘍である。他の実施形態において、標的腫瘍は扁平上皮細胞気管支癌である。他の実施形態において、標的腫瘍は前立腺癌である。他の実施形態において、標的腫瘍はウィルム腫瘍である。他の実施形態において、標的腫瘍は星状細胞腫である。他の実施形態において、標的腫瘍は神経節芽細胞種である。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【０２１９】
他の実施形態において、本発明の方法にある標的疾患は細胞増殖性疾患であり、少なくとも幾つかの細胞はＨ１９プロモーターおよび／またはＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターの制御に基づいて、転写因子を発現することができる。他の実施形態において、標的疾患は細胞増殖性疾患であり、少なくとも幾つかの細胞はＨ１９プロモーターおよび／またはＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターの制御に基づいて、転写因子を発現できる。他の実施形態において、標的疾患は細胞増殖性疾患であり、少なくとも幾つかの細胞はＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターおよび／またはＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターの制御に基づいて、転写因子を発現できる。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【０２２０】
他の実施形態において、本発明の方法は被験者から得た腫瘍細胞で、Ｈ１９  ＲＮＡおよび／またはＩＧＦ−ＩＩ  ＲＮＡの存在を確認する工程を含み、少なくとも腫瘍細胞の一部で、ＲＮＡの存在は前記腫瘍が本発明の方法で治療できることを示す。例えばＨ１９  ＲＮＡおよび／またはＩＧＦ−ＩＩ  ＲＮＡは、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲ、ＬＣＲおよび３ＳＲ、および検出可能な部位を含んだプローブでのハイブリダイゼーションのような技術で知られる方法で検出できる。他の実施形態において、ＲＮＡの存在を、腫瘍由来の細胞もしくは組織のサンプル、または別の実施形態において、体液の細胞を含む標本、一次性腫瘍部位と接触のあった洗浄液、または一次腫瘍部位以外の組織または器官で確認できる（例えば、腫瘍転移を検出するために）。
【０２２１】
典型的な転移腫瘍は、例えば肝臓癌に転移および乳癌に転移した結腸直腸癌を含む。特定の実施形態において、本発明の構造物を、肝転移の形成を予防または阻害するために用いる。
【０２２２】
被験者の疾患を治療するために、本発明の薬学的組成物を、組成物は被験者の疾患を治療できるような効果的な方法で被験者に投与する。本発明によると、疾患の治療は、疾患および／または関連する軽減、および／または、第一疾患の発生から生じる第二疾患の発症を妨げることを示す。
【０２２３】
ここで、本願明細書で示す「治療に有効量」の用語は、本発明の核酸構造を被験者に、前記被験者に投与するとき、その被験者を治療する有効である量で投与することを意味する。
【０２２４】
有効な投与手順（例えば、医薬品組成物を効果的方法で投与）は、適切な服用量のパラメーターおよび疾患治療を生じる投与様式を含む。有効量パラメーターおよび投与様式は特定の疾患に関する技術における標準方法を使用して確認できる。そのような方法は、例えば、生存率、副作用（毒性等）、および疾患の進行または後退を含む。
【０２２５】
本発明によると、適切な一回の服用量の大きさは、適切な時間を通じて一回以上の投与するとき被験者の疾患を治療できる服用量である。例えば、適切な一回の服用量の大きさはそれを必要とする被験者で腫瘍細胞量を減らすよう誘導することができる。直接注射の技術で使用するために適切な本発明の医薬品組成物の服用は、被験者の大きさに基づいて全身投与で適切な一回分の投与量を決定することを従来技術の一つを使用することができる。
【０２２６】
適切な投与経路は、例えば、経口、直腸、経粘膜、特に経鼻、腸または腸管外の投与を含み、筋肉内、皮下および脊髄内の注射ならびに、髄膜内、直接心室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、動脈内、膀胱内（膀胱内部）または眼内注射を含む。
【０２２７】
あるいは、全身でなく局所の方法の調製物を、例えば、患者の体の特異的な部位内に直接注射する調製物の注射を経てまたは、膀胱、子宮等の体腔内に直接投与することによって投与することができる。他の特定の実施形態において、病変内投与、例えば腫瘍内投入が考えられる。
【０２２８】
腸管外、皮内、または皮下の適用に用いられる溶液または懸濁液は、以下の構成要素を含むことができ、例えば注射用水のような無菌の希釈剤、食塩液、不揮発性油、ポリエチレングリコール類、グリセリン、プロピレングリコール（または他の合成溶媒類）、抗菌薬（例えばベンジルアルコール、メチルパラベン類）、酸化防止剤（例えばアスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム）、キレート剤（例えばエチレンジアミン四酢酸）、緩衝液（例えば酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩）、および、等張調整剤（例えば塩化ナトリウム、ブドウ糖）である。ｐＨは例えば塩酸または水酸化ナトリウムの様な酸類または塩基類で調製できる。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または多数回投与バイアル内に封入することができる。
【０２２９】
非経口投与に適した医薬品組成物は、水溶性および非水溶性の無菌注射可能な溶液または懸濁液で、酸化防止剤、バッファ、静菌剤および、組成物を目的とした受容者の血液で実質的に等張化する溶質を含むが、これに限定されない。この様な組成物はまた、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセリンおよび植物油を含むことができる。即時調合注射の溶液および懸濁液は、無菌の粉末、顆粒剤および錠剤から調合できる。この様な組成物は、治療に有効量の本発明のベクターおよび／または他の治療薬剤を、適切な量のキャリア共に含み、被験者に適切な量の形態で投与すべきである。製剤は、投与様式に適切でなければならない。
【０２３０】
ある種の実施形態において、本発明の組成物は癌のみまたは、癌に対して他の確立もしくは実験上の治療法で治療するために使用できる。本発明との組み合わせに適している癌治療の治療方法は、化学療法、放射線療法、光線治療および光力学の治療、外科手術、栄養療法、切除治療、放射線療法および化学療法との併用、近接照射療法、陽子線治療、免疫治療、細胞療法ならびに光子ビーム照射療法(photon beam radiosurgical therapy)を含むが、これに制限されない。
【０２３１】
本発明の構造物と共に投与できる抗がん剤は以下を含むが、これ制限されず、アシビシン；アクラルビシン；塩酸アコダゾール；アクロニン；アドリアマイシン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；アメタントロン酢酸塩；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；塩酸ビサントレン；ビスナフィドジメシレート；ビゼレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシ；カルステロン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；塩酸カルビシン；カルゼレシン；セデフィンゴール；クロラムブシル；クラドリビン；シスプラチン；クラドリビン；クリスナトールメシレート；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；塩酸ダウノルビシン；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；デザグアニンメシレート；ジアジクオン；ドセタキセル；ドキソルビシン；塩酸ドキソルビシン；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；ドロテストステロンプロピオナート；ドゥアゾマイシン；エダトレキサート；エフロルニチン塩酸塩；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロメート；エピプロピジン；塩酸エピルビシン；エルブロゾール；塩酸エソルビシン；エストラムスチン；エストラムスチン・リン酸エストラムスチンナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン；塩酸ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フロキシウリジン；フルダラビンリン酸塩；フルオロウラシル；フルロシタビン；ホスキドン；フォストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；塩酸ゲムシタビン；水酸化尿素；塩酸イダルビシン；イホスファミド；イルモホシン；インターフェロンα−２ａ；インターフェロンα−２ｂ；インターフェロンα−ｎ１；インターフェロンα−ｎ３；インターフェロンβ−１ａ；インターフェロンγ−１ｂ；イプロプラチン；塩酸イリノテカン；酢酸ランレオチド；レトロゾール；酢酸ロイプロリド；リアロゾール塩酸塩；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；塩酸ロソキサントロン；マソプロコール；マイタンシン；塩酸メクロレタミン；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲステロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；マイトジリン；ミトマルシン；マイトマイシン；ミトスペル；ミトタン；塩酸ミトキサントロン；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペグアスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；硫酸ペプロマイシン；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；塩酸ピロキサントロン；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；プロカルバジン塩酸塩；ピューロマイシン；塩酸ピューロマイシン；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；塩酸サフィンゴール；セムスチン；シムトレゼン；スパルホサートナトリウム；スパルソマイシン；塩酸スピロゲルマニウム；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル；タリソマイシン；タキソール；テコガランナトリウム；テガフール；塩酸テロキサントロン；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；塩酸トポテカン；クエン酸トレミフェン；酢酸トレストロン；トリシリビンホスファート；トリメトレキセート；グルクロン酸トリメトレキセート；トリプトレリン；塩酸ツブロゾール；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン；硫酸ビングリシナート；硫酸ビンロイロシン；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンロシジン；硫酸ビンゾリジン；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；および塩酸ゾルビシン。付加的な抗悪性腫瘍薬は“AntineoplasticAgents” (Calabresi, P. and Chabner, B.A.)の第52章およびGoodman and GilmanのThe Pharmacological Basis of Therapeutics, Eighth Edition, 1990, McGraw-Hill, Inc. (Health Professions Division)、序文、ページ１２０２−１２６３に記載されたものを含む。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を示す。
【０２３２】
以下の実施例を、本発明の幾つかの実施形態をより詳細に例示するために示す。しかしながら、それらは、本発明の広い範囲を制限するように解釈すべきではない。
【実施例】
【０２３３】
実験の詳細部分
多数のプロモータ・ベクトルの概要
二重プロモーター発現ベクターを、単一の構造で二つの異なる遺伝子の発現するＤＴＡ毒素を処理して、二つの調節配列から以下の様に作成した。
Ｈ１９＋ＩＧＦ−ＩＩ−Ｐ４プロモーター（以後“Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡ”；図１に示す）
ＩＧＦ−ＩＩ−Ｐ３＋ＩＧＦ−ＩＩ−Ｐ４プロモーター（以後“Ｐ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡ”；として記載する）
Ｈ１９＋ＩＧＦ−ＩＩ−Ｐ３プロモーター；（以後“Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡ”；として記載する）
【０２３４】
トランスフェクション
トランスフェクションを、製造会社により勧められた生体外ｊｅｔＰＥＩＴＭトランスフェクション薬剤(Polyplus Transfection)を用いて実施した。４８時間後、細胞を収集して、ルシフェラーゼ活性をLuciferase Assay Systemキット(Promega)を用いて測定した。光出力を、Lumac Biocounter装置を用いて測定した。溶解物の総タンパク質含有量を、Ｂｉｏ−Ｒａｄのタンパク質アッセイ薬剤を用いて測定し、結果は総タンパク質に標準化して光単位／μｇタンパク質で示した。ＳＶ４０転写制御下でルシフェラーゼを発現するプラスミドである、LucSV40(Promega)は、ＳＶ４０プロモーターおよびエンハンサーを含む時に、トランスフェクションの効率に対して陽性対照として使用し、Ｌｕｃ１を含むが調製配列(Promega)が欠如するプラスミドは基礎の非特異性ルシフェラーゼ発現を決定するために陰性対照として示す（これは、全ての細胞株でごくわずかだった）。全ての実験を三回繰り返した。
【０２３５】
Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡの作成
合成ＤＴＡカセットおよび合成Ｐ４カセットを、ＰＣＲ産物からそれぞれ組み立て、ＳａｃＩおよびＫｐｎＩ制限酵素認識部位を用いてｐＧＡ４(ampR, available from GeneArt, Regensburg, Germany)内にサブクローンした。プラスミドＤＮＡを、形質転換のＫ１２  ＸＬ１０ゴールドバクテリアから、精製（Pure YieldTM Plasmid Midiprep, Promega)して、濃度をＵＶ分光計で測定した。最終構造を塩基配列によって検査して、それぞれ０７０４８７０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）および０７０４８６７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）と名づけた。配列一致は、１００％であった。
【０２３６】
用いられたＰ４プロモーター配列は以下の通りである。
ａｃｔｔｃｃｃｇｇｔｃｇｇｔｃｔｇｔｇｇｇｔｇｃａｇｇｇｇｇｔｇｃｃｇｃｃｔｃａｃａｔｇｔｇｔｇａｔｔｃｇｔｇｃｃｔｔｇｃｇｇｇｃｃｃｔｇｇｃｃｔｃｃｇｇｇｇｔｇｃｔｇｇｇｔａａｃｇａｇｇａｇｇｇｇｃｇｃｇｇａｇｃｃｇｃａｇａａｇｃｃｃａｃｃｃｔｇｇｔａｔｇｔｔｇａｃｇｃｇｇｔｇｃｃａｇｃｇａｇａｃｃｇｃｇａｇａｇｇａａｇａｃｇｇｇｇｇｔｇｇｇｃｇｇｇｇｃｃａｇｇａｔｇｇａｇａｇｇｇｇｃｃｇａｇｔｔｇｇｃａｇｇａｇｔｃａｔｇｇｃａｇａｃｇｃｃａｃａｔｔｃｇｃｇａｃａｔｃｔｃｃｃｃｃａｃａｃｃｃｃｃｔｃｔｇｇｃｔｃｔｇｔｃｃｇｃａａｃａｔｔｔｃｃａａａｃａｇｇａｇｔｃｃｃｇｇｇａｇａｇｇｇｇｇａｇａｇｇｇｇｃｔｇｃｔｇｇｔｃｔｇａｇｇｃｔａａｇａａｇｇｇｃａｇａｇｃｃｔｔｃｇａｃｃｃｇｇａｇａｇａｇｇｃｃｇｃｇｇｃｃｃｃｔｇｃｃｃａｇｔｇｇｇｃａｇｃｇｔｇｇａａｇｔｔｔｃｃａｔａｃａａｇｇａｇｇｔｇｇｇａａｇｇａｇａｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｔｔｃａｃｔｇｃｃｃｔｇｔｇｃａｇａｇａｔｇａｇｃｃｇｇｇｇｇｔｇｃａｇｇａｔｇｇｇａｇｃｃｃａｔｇｇｃａｃｔｔｃｇｃｔａｃｇｇｇａｔｇｇｔｃｃａｇｇｇｃｔｃｃｃｇｇｔｔｇｇｇｇｇｔｇｃａｇｇａｇａｇａａｇａｇａｃｔｇｇｃｔｇｇｇａｇｇａｇｇｇａｇａｇｇｇｃｇｇｇａｇｃａａａｇｇｃｇｃｇｇｇｇｇａｇｔｇｇｔｃａｇｃａｇｇｇａｇａｇｇｇｇｔｇｇｇｇｇｇｔａｇｇｇｔｇｇａｇｃｃｃｇｇｇｃｔｇｇｇａｇｇａｇｔｃｇｇｃｔｃａｃａｃａｔａａａａｇｃｔｇａｇｇｃａｃｔｇａｃｃａｇｃｃｔｇｃａａａｃｔｇｇａｃａｔｔａｇｃｔｔｃｔｃｃｔｇｔｇａａａｇａｇａｃｔｔｃｃａｇｃｔｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｔｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｇｃｃｃｃａｇｃｇａｇｃｃｔｔｃｔｇｃｔｇａｇｃｔｇｔａｇｇｇｇｇａｔｃｔｔｃｔａｇａｇｔｃｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）
【０２３７】
次に、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４プロモーターから単独でＤＴＡを発現するベクターを作成した。このベクターを作成するに当たって、ＤＴＡ配列を、０７０４８７０から増幅して、ＮｈｅＩおよびＫｐｎＩ制限酵素認識部位を用いて、０７０４８６７内にサブクローンした。プラスミドＤＮＡを形質転換したＫ１２  ＫＨ１０Ｂバクテリアから精製して、ＵＶ分光計で濃度を測定した。最終構造（０７０４８７７）を配列で確認した。配列一致は１００％だった。
【０２３８】
Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡベクター作成するに当たって、Ｐ４−ＤＴＡカセットを０７０４８７７から増幅して、ＤＴＡをＨ１９プロモーターから発現するベクターを、ＮｏｔＩおよびＫｐｎＩ制限酵素認識部位を用いて、０５２９６６内にサブクローンした。０５２９６６をこれ以降“Ｈ１９−ＤＴＡ”として示し、以下の配列を有する：
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【０２３９】
プラスミドＤＮＡを、形質転換したＫ１２  ＫＨ１０Ｂバクテリアから精製して、ＵＶ分光計で濃度を測定した。最終構造を配列で決定した。配列一致は１００％だった。
【０２４０】
Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡ配列は以下の通りである：
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【０２４１】
Ｐ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡの作成
Ｐ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡ構造を、Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡ構造を作成するために使用したものと非常に類似した方法を用いて作成した。最終構造を配列で決定した。配列一致は、１００％であった。ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３プロモーターは以下の配列を有する：
ｇｇｃｃａｔｇｃａｇｇｔａｇｇａｔｔｔｇａｇｃｔｇｔｇｔｔｔｃｃｃｇｃｃｃｔｇａｔｃｃｔｃｔｃｔｃｃｔｃｔｇｇｃｇｇｃｃｇｇａｇｃｃｔｃｃｇｔａｇｇｃｔｃｃａａｇｃｃｔｇｇｃｃｃａｇａｔｔｃｇｇｃｇｇｃｇｃａｇｃｃｇｇｃｃｔｔｃｃｇｃｇｃｇｔｃｃｇｃａｃｃｔａｇｃｇｇｇｇｇｃｔｃｃｇｇｇｇｃｔｃｃｇｇｃｇｃｇｇｃａｃｃｇｇｇｇｇｇｃｇｃｔｃｇｇｇａｔｃｔｇｇｃｔｇａｇｇｃｔｃｃａａｇｇｃｃｃｇｃｇｔｇｇｃｃｇｇｃｔｃｃｔｃｃｔｇｃｔｇｇｇｇｃａｇｇｔｇｇｃｇｇｃｔｇｃｇｃｇｃｃｃｃｇｃｃｃｇａｇｃｃｃａｇｇｇｇｃｃｃｃｃｔｃａｇｃｃｇｃａａｃａａｃｃａｇｃａａｇｇａｃｃｃｃｃｃｇａｃｔｃａｇｃｃｃｃａａｇｃｃａｃｃｔｇｃａｔｃｔｇｃａｃｔｃａｇａｃｇｇｇｇｃｇｃａｃｃｃｇｃａｇｔｇｃａｇｃｃｔｃｃｔｇｇｔｇｇｇｇｃｇｃｔｇｇｇａｇｃｃｃｇｃｃｔｇｃｃｃｃｔｇｃｃｔｇｃｃｃｇｇａｇａｃｃｃｃａｇｃｔｃａｃｇａｇｃａｃａｇｇｃｃｇｃｃｃｇｇｇｃａｃｃｃｃａｇａａａｃｃｃｇｇｇａｔｇｇｇｇｃｃｃｃｔｇａａｔｔｃｔｃｔａｇｇａｃｇｇｇｃａｔｔｃａｇｃａｔｇｇｃｃｔｔｇｇｃｇｃｔｃｔｇｃｇｇｃｔｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃｃａｃｃｃａｇｃｃｔｃｇｃｃｃｃｃｇｃｇｃａｃｃｃｃｃｃａｇｃｃｃｃｔｇｃｇａｃｃｇｃｃｇｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｇｇｇｇｃｃｃｃａｇｇｇｃｃｃｃａｇｃｃｃｇｃａｃｃｃｃｃｃｇｃｃｃｃｇｃｔｃｔｔｇｇｃｔｃｇｇｇｔｔｇｃｇｇｇｇｇｃｇｇｇｃｃｇｇｇｇｇｃｇｇｇｇｃｇａｇｇｇｃｔｃｃｇｃｇｇｇｃｇｃｃｃａｔｔｇｇｃｇｃｇｇｇｃｇｃｇａｇｇｃｃａｇｃｇｇｃｃｃｃｇｃｇｃｇｇｃｃｃｔｇｇｇｃｃｇｃｇｇｃｔｇｇｃｇｃｇａｃｔａｔａａｇａｇｃｃｇｇｇｃｇｔｇｇｇｃｇｃｃｃｇｃａｇｔｔｃｇｃｃｔｇｃｔｃｔｃｃｇｇｃｇｇａｇｃｔｇｃｇｔｇａｇｇｃｃｃｇｇｃｃｇｇｃｃｃｃｇｇｃｃｃｃｃｃｃｃｔｔｃｃｇｇｃｃｇｃｃｃｃｃｇｃｃｔｃｃｔｇｇｃｃｃａｃｇｃｃｔｇｃｃｃｇｃｇｃｔｃｔｇｃｃｃａｃｃａｇｃｇｃｃｔｃｃａｔｃｇｇｇｃａａｇｇｃｇｇｃｃｃｃｇｃｇｔｃｇａｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １７）
【０２４２】
Ｐ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡは以下の配列を有する：
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【０２４３】
Ｐ３−ＤＴＡは、Ｐ３プロモーターのみによってＤＴＡを発現し、配列は以下の通りである：
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【０２４４】
Ｐ４−ＤＴＡは、Ｐ４プロモーターによってＤＴＡを発現するプラスミドであり、Ｐ３プロモーターをＰ４プロモーターと置換することによって作成した（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）。
【０２４５】
さらに、調節構造のＰ４−Ｌｕｃ−Ｐ３−Ｌｕｃを同じ様な手法を用いて作成した。Ｐ４−Ｌｕｃ−Ｐ３−Ｌｕｃの配列は以下のとおりである：
ｇｇｔｇｃｇｇｇｃｃｔｃｔｔｃｇｃｔａｔｔａｃｇｃｃａｇｃｃｃａａｇｃｔａｃｃａｔｇａｔａａｇｔａａｇｔａａｔａｔｔａａｇｇｔａｃｇｇｇａｇｇｔａｃｔｔｇｇａｇｃｇｇｃｃｇｃａａｔａａａａｔａｔｃｔｔｔａｔｔｔｔｃａｔｔａｃａｔｃｔｇｔｇｔｇｔｔｇｇｔｔｔｔｔｔｇｔｇｔｇａａｔｃｇａｔａｇｔａｃｔａａｃａｔａｃｇｃｔｃｔｃｃａｔｃａａａａｃａａａａｃｇａａａｃａａａａｃａａａｃｔａｇｃａａａａｔａｇｇｃｔｇｔｃｃｃｃａｇｔｇｃａａｇｔｇｃａｇｇｔｇｃｃａｇａａｃａｔｔｔｃｔｃｔａｔｃｇａｔａａｃｔｔｃｃｃｇｇｔｃｇｇｔｃｔｇｔｇｇｇｔｇｃａｇｇｇｇｇｔｇｃｃｇｃｃｔｃａｃａｔｇｔｇｔｇａｔｔｃｇｔｇｃｃｔｔｇｃｇｇｇｃｃｃｔｇｇｃｃｔｃｃｇｇｇｇｔｇｃｔｇｇｇｔａａｃｇａｇｇａｇｇｇｇｃｇｃｇｇａｇｃｃｇｃａｇａａｇｃｃｃａｃｃｃｔｇｇｔａｔｇｔｔｇａｃｇｃｇｇｔｇｃｃａｇｃｇａｇａｃｃｇｃｇａｇａｇｇａａｇａｃｇｇｇｇｇｔｇｇｇｃｇｇｇｇｃｃａｇｇａｔｇｇａｇａｇｇｇｇｃｃｇａｇｔｔｇｇｃａｇｇａｇｔｃａｔｇｇｃａｇａｃｇｃｃａｃａｔｔｃｇｃｇａｃａｔｃｔｃｃｃｃｃａｃａｃｃｃｃｃｔｃｔｇｇｃｔｃｔｇｔｃｃｇｃａａｃａｔｔｔｃｃａａａｃａｇｇａｇｔｃｃｃｇｇｇａｇａｇｇｇｇｇａｇａｇｇｇｇｃｔｇｃｔｇｇｔｃｔｇａｇｇｃｔａａｇａａｇｇｇｃａｇａｇｃｃｔｔｃｇａｃｃｃｇｇａｇａｇａｇｇｃｃｇｃｇｇｃｃｃｃｔｇｃｃｃａｇｔｇｇｇｃａｇｃｇｔｇｇａａｇｔｔｔｃｃａｔａｃａａｇｇａｇｇｔｇｇｇａａｇｇａｇａｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｔｔｃａｃｔｇｃｃｃｔｇｔｇｃａｇａｇａｔｇａｇｃｃｇｇｇｇｇｔｇｃａｇｇａｔｇｇｇａｇｃｃｃａｔｇｇｃａｃｔｔｃｇｃｔａｃｇｇｇａｔｇｇｔｃｃａｇｇｇｃｔｃｃｃｇｇｔｔｇｇｇｇｇｔｇｃａｇｇａｇａｇａａｇａｇａｃｔｇｇｃｔｇｇｇａｇｇａｇｇｇａｇａｇｇｇｃｇｇｇａｇｃａａａｇｇｃｇｃｇｇｇｇｇａｇｔｇｇｔｃａｇｃａｇｇｇａｇａｇｇｇｇｔｇｇｇｇｇｇｔａｇｇｇｔｇｇａｇｃｃｃｇｇｇｃｔｇｇｇａｇｇａｇｔｃｇｇｃｔｃａｃａｃａｔａａａａｇｃｔｇａｇｇｃａｃｔｇａｃｃａｇｃｃｔｇｃａａａｃｔｇｇａｃａｔｔａｇｃｔｔｃｔｃｃｔｇｔｇａａａｇａｇａｃｔｔｃｃａｇｃｔｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｔｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｇｃｃｃｃａｇｃｇａｇｃｃｔｔｃｔｇｃｔｇａｇｃｔｇｔａｇｇｇｇｇａｔｃｔｔｃｔａｇａｇｔｃｇｇｃｔａｇｃｇｇｃａｔｔｃｃｇｇｔａｃｔｇｔｔｇｇｔａａａｇｃｃａｃｃａｔｇｇａａｇａｃｇｃｃａａａａａｃａｔａａａｇａａａｇｇｃｃｃｇｇｃｇｃｃａｔｔｃｔａｔｃｃｇｃｔｇｇａａｇａｔｇｇａａｃｃｇｃｔｇｇａｇａｇｃａａｃｔｇｃａｔａａｇｇｃｔａｔｇａａｇａｇａｔａｃｇｃｃｃｔｇｇｔｔｃｃｔｇｇａａｃａａｔｔｇｃｔｔｔｔａｃａｇａｔｇｃａｃａｔａｔｃｇａｇｇｔｇｇａｃａｔｃａｃｔｔａｃｇｃｔｇａｇｔａｃｔｔｃｇａａａｔｇｔｃｃｇｔｔｃｇｇｔｔｇｇｃａｇａａｇｃｔａｔｇａａａｃｇａｔａｔｇｇｇｃｔｇａａｔａｃａａａｔｃａｃａｇａａｔｃｇｔｃｇｔａｔｇｃａｇｔｇａａａａｃｔｃｔｃｔｔｃａａｔｔｃｔｔｔａｔｇｃｃｇｇｔｇｔｔｇｇｇｃｇｃｇｔｔａｔｔｔａｔｃｇｇａｇｔｔｇｃａｇｔｔｇｃｇｃｃｃｇｃｇａａｃｇａｃａｔｔｔａｔａａｔｇａａｃｇｔｇａａｔｔｇｃｔｃａａｃａｇｔａｔｇｇｇｃａｔｔｔｃｇｃａｇｃｃｔａｃｃｇｔｇｇｔｇｔｔｃｇｔｔｔｃｃａａａａａｇｇｇｇｔｔｇｃａａａａａａｔｔｔｔｇａａｃｇｔｇｃａａａａａａａｇｃｔｃｃｃａａｔｃａｔｃｃａａａａａａｔｔａｔｔａｔｃａｔｇｇａｔｔｃｔａａａａｃｇｇａｔｔａｃｃａｇｇｇａｔｔｔｃａｇｔｃｇａｔｇｔａｃａｃｇｔｔｃｇｔｃａｃａｔｃｔｃａｔｃｔａｃｃｔｃｃｃｇｇｔｔｔｔａａｔｇａａｔａｃｇａｔｔｔｔｇｔｇｃｃａｇａｇｔｃｃｔｔｃｇａｔａｇｇｇａｃａａｇａｃａａｔｔｇｃａｃｔｇａｔｃａｔｇａａｃｔｃｃｔｃｔｇｇａｔｃｔａｃｔｇｇｔｃｔｇｃｃｔａａａｇｇｔｇｔｃｇｃｔｃｔｇｃｃｔｃａｔａｇａａｃｔｇｃｃｔｇｃｇｔｇａｇａｔｔｃｔｃｇｃａｔｇｃｃａｇａｇａｔｃｃｔａｔｔｔｔｔｇｇｃａａｔｃａａａｔｃａｔｔｃｃｇｇａｔａｃｔｇｃｇａｔｔｔｔａａｇｔｇｔｔｇｔｔｃｃａｔｔｃｃａｔｃａｃｇｇｔｔｔｔｇｇａａｔｇｔｔｔａｃｔａｃａｃｔｃｇｇａｔａｔｔｔｇａｔａｔｇｔｇｇａｔｔｔｃｇａｇｔｃｇｔｃｔｔａａｔｇｔａｔａｇａｔｔｔｇａａｇａａｇａｇｃｔｇｔｔｔｃｔｇａｇｇａｇｃｃｔｔｃａｇｇａｔｔａｃａａｇａｔｔｃａａａｇｔｇｃｇｃｔｇｃｔｇｇｔｇｃｃａａｃｃｃｔａｔｔｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｇｃｃａａａａｇｃａｃｔｃｔｇａｔｔｇａｃａａａｔａｃｇａｔｔｔａｔｃｔａａｔｔｔａｃａｃｇａａａｔｔｇｃｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇｃｔｃｃｃｃｔｃｔｃｔａａｇｇａａｇｔｃｇｇｇｇａａｇｃｇｇｔｔｇｃｃａａｇａｇｇｔｔｃｃａｔｃｔｇｃｃａｇｇｔａｔｃａｇｇｃａａｇｇａｔａｔｇｇｇｃｔｃａｃｔｇａｇａｃｔａｃａｔｃａｇｃｔａｔｔｃｔｇａｔｔａｃａｃｃｃｇａｇｇｇｇｇａｔｇａｔａａａｃｃｇｇｇｃｇｃｇｇｔｃｇｇｔａａａｇｔｔｇｔｔｃｃａｔｔｔｔｔｔｇａａｇｃｇａａｇｇｔｔｇｔｇｇａｔｃｔｇｇａｔａｃｃｇｇｇａａａａｃｇｃｔｇｇｇｃｇｔｔａａｔｃａａａｇａｇｇｃｇａａｃｔｇｔｇｔｇｔｇａｇａｇｇｔｃｃｔａｔｇａｔｔａｔｇｔｃｃｇｇｔｔａｔｇｔａａａｃａａｔｃｃｇｇａａｇｃｇａｃｃａａｃｇｃｃｔｔｇａｔｔｇａｃａａｇｇａｔｇｇａｔｇｇｃｔａｃａｔｔｃｔｇｇａｇａｃａｔａｇｃｔｔａｃｔｇｇｇａｃｇａａｇａｃｇａａｃａｃｔｔｃｔｔｃａｔｃｇｔｔｇａｃｃｇｃｃｔｇａａｇｔｃｔｃｔｇａｔｔａａｇｔａｃａａａｇｇｃｔａｔｃａｇｇｔｇｇｃｔｃｃｃｇｃｔｇａａｔｔｇｇａａｔｃｃａｔｃｔｔｇｃｔｃｃａａｃａｃｃｃｃａａｃａｔｃｔｔｃｇａｃｇｃａｇｇｔｇｔｃｇｃａｇｇｔｃｔｔｃｃｃｇａｃｇａｔｇａｃｇｃｃｇｇｔｇａａｃｔｔｃｃｃｇｃｃｇｃｃｇｔｔｇｔｔｇｔｔｔｔｇｇａｇｃａｃｇｇａａａｇａｃｇａｔｇａｃｇｇａａａａａｇａｇａｔｃｇｔｇｇａｔｔａｃｇｔｃｇｃｃａｇｔｃａａｇｔａａｃａａｃｃｇｃｇａａａａａｇｔｔｇｃｇｃｇｇａｇｇａｇｔｔｇｔｇｔｔｔｇｔｇｇａｃｇａａｇｔａｃｃｇａａａｇｇｔｃｔｔａｃｃｇｇａａａａｃｔｃｇａｃｇｃａａｇａａａａａｔｃａｇａｇａｇａｔｃｃｔｃａｔａａａｇｇｃｃａａｇａａｇｇｇｃｇｇａａａｇａｔｃｇｃｃｇｔｇｔａａｔｃｔｃｇａｇｇｇｃｃａｔｇｃａｇｇｔａｇｇａｔｔｔｇａｇｃｔｇｔｇｔｔｔｃｃｃｇｃｃｃｔｇａｔｃｃｔｃｔｃｔｃｃｔｃｔｇｇｃｇｇｃｃｇｇａｇｃｃｔｃｃｇｔａｇｇｃｔｃｃａａｇｃｃｔｇｇｃｃｃａｇａｔｔｃｇｇｃｇｇｃｇｃａｇｃｃｇｇｃｃｔｔｃｃｇｃｇｃｇｔｃｃｇｃａｃｃｔａｇｃｇｇｇｇｇｃｔｃｃｇｇｇｇｃｔｃｃｇｇｃｇｃｇｇｃａｃｃｇｇｇｇｇｇｃｇｃｔｃｇｇｇａｔｃｔｇｇｃｔｇａｇｇｃｔｃｃａａｇｇｃｃｃｇｃｇｔｇｇｃｃｇｇｃｔｃｃｔｃｃｔｇｃｔｇｇｇｇｃａｇｇｔｇｇｃｇｇｃｔｇｃｇｃｇｃｃｃｃｇｃｃｃｇａｇｃｃｃａｇｇｇｇｃｃｃｃｃｔｃａｇｃｃｇｃａａｃａａｃｃａｇｃａａｇｇａｃｃｃｃｃｃｇａｃｔｃａｇｃｃｃｃａａｇｃｃａｃｃｔｇｃａｔｃｔｇｃａｃｔｃａｇａｃｇｇｇｇｃｇｃａｃｃｃｇｃａｇｔｇｃａｇｃｃｔｃｃｔｇｇｔｇｇｇｇｃｇｃｔｇｇｇａｇｃｃｃｇｃｃｔｇｃｃｃｃｔｇｃｃｔｇｃｃｃｇｇａｇａｃｃｃｃａｇｃｔｃａｃｇａｇｃａｃａｇｇｃｃｇｃｃｃｇｇｇｃａｃｃｃｃａｇａａａｃｃｃｇｇｇａｔｇｇｇｇｃｃｃｃｔｇａａｔｔｃｔｃｔａｇｇａｃｇｇｇｃａｔｔｃａｇｃａｔｇｇｃｃｔｔｇｇｃｇｃｔｃｔｇｃｇｇｃｔｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃｃａｃｃｃａｇｃｃｔｃｇｃｃｃｃｃｇｃｇｃａｃｃｃｃｃｃａｇｃｃｃｃｔｇｃｇａｃｃｇｃｃｇｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｇｇｇｇｃｃｃｃａｇｇｇｃｃｃｃａｇｃｃｃｇｃａｃｃｃｃｃｃｇｃｃｃｃｇｃｔｃｔｔｇｇｃｔｃｇｇｇｔｔｇｃｇｇｇｇｇｃｇｇｇｃｃｇｇｇｇｇｃｇｇｇｇｃｇａｇｇｇｃｔｃｃｇｃｇｇｇｃｇｃｃｃａｔｔｇｇｃｇｃｇｇｇｃｇｃｇａｇｇｃｃａｇｃｇｇｃｃｃｃｇｃｇｃｇｇｃｃｃｔｇｇｇｃｃｇｃｇｇｃｔｇｇｃｇｃｇａｃｔａｔａａｇａｇｃｃｇｇｇｃｇｔｇｇｇｃｇｃｃｃｇｃａｇｔｔｃｇｃｃｔｇｃｔｃｔｃｃｇｇｃｇｇａｇｃｔｇｃｇｔｇａｇｇｃｃｃｇｇｃｃｇｇｃｃｃｃｇｇｃｃｃｃｃｃｃｃｔｔｃｃｇｇｃｃｇｃｃｃｃｃｇｃｃｔｃｃｔｇｇｃｃｃａｃｇｃｃｔｇｃｃｃｇｃｇｃｔｃｔｇｃｃｃａｃｃａｇｃｇｃｃｔｃｃａｔｃｇｇｇｃａａｇｇｃｇｇｃｃｃｃｇｃｇｔｃｇａｃａａｇｃｔｔｇｇｃａｔｔｃｃｇｇｔａｃｔｇｔｔｇｇｔａａａｇｃｃａｃｃａｔｇｇａａｇａｃｇｃｃａａａａａｃａｔａａａｇａａａｇｇｃｃｃｇｇｃｇｃｃａｔｔｃｔａｔｃｃｇｃｔｇｇａａｇａｔｇｇａａｃｃｇｃｔｇｇａｇａｇｃａａｃｔｇｃａｔａａｇｇｃｔａｔｇａａｇａｇａｔａｃｇｃｃｃｔｇｇｔｔｃｃｔｇｇａａｃａａｔｔｇｃｔｔｔｔａｃａｇａｔｇｃａｃａｔａｔｃｇａｇｇｔｇｇａｃａｔｃａｃｔｔａｃｇｃｔｇａｇｔａｃｔｔｃｇａａａｔｇｔｃｃｇｔｔｃｇｇｔｔｇｇｃａｇａａｇｃｔａｔｇａａａｃｇａｔａｔｇｇｇｃｔｇａａｔａｃａａａｔｃａｃａｇａａｔｃｇｔｃｇｔａｔｇｃａｇｔｇａａａａｃｔｃｔｃｔｔｃａａｔｔｃｔｔｔａｔｇｃｃｇｇｔｇｔｔｇｇｇｃｇｃｇｔｔａｔｔｔａｔｃｇｇａｇｔｔｇｃａｇｔｔｇｃｇｃｃｃｇｃｇａａｃｇａｃａｔｔｔａｔａａｔｇａａｃｇｔｇａａｔｔｇｃｔｃａａｃａｇｔａｔｇｇｇｃａｔｔｔｃｇｃａｇｃｃｔａｃｃｇｔｇｇｔｇｔｔｃｇｔｔｔｃｃａａａａａｇｇｇｇｔｔｇｃａａａａａａｔｔｔｔｇａａｃｇｔｇｃａａａａａａａｇｃｔｃｃｃａａｔｃａｔｃｃａａａａａａｔｔａｔｔａｔｃａｔｇｇａｔｔｃｔａａａａｃｇｇａｔｔａｃｃａｇｇｇａｔｔｔｃａｇｔｃｇａｔｇｔａｃａｃｇｔｔｃｇｔｃａｃａｔｃｔｃａｔｃｔａｃｃｔｃｃｃｇｇｔｔｔｔａａｔｇａａｔａｃｇａｔｔｔｔｇｔｇｃｃａｇａｇｔｃｃｔｔｃｇａｔａｇｇｇａｃａａｇａｃａａｔｔｇｃａｃｔｇａｔｃａｔｇａａｃｔｃｃｔｃｔｇｇａｔｃｔａｃｔｇｇｔｃｔｇｃｃｔａａａｇｇｔｇｔｃｇｃｔｃｔｇｃｃｔｃａｔａｇａａｃｔｇｃｃｔｇｃｇｔｇａｇａｔｔｃｔｃｇｃａｔｇｃｃａｇａｇａｔｃｃｔａｔｔｔｔｔｇｇｃａａｔｃａａａｔｃａｔｔｃｃｇｇａｔａｃｔｇｃｇａｔｔｔｔａａｇｔｇｔｔｇｔｔｃｃａｔｔｃｃａｔｃａｃｇｇｔｔｔｔｇｇａａｔｇｔｔｔａｃｔａｃａｃｔｃｇｇａｔａｔｔｔｇａｔａｔｇｔｇｇａｔｔｔｃｇａｇｔｃｇｔｃｔｔａａｔｇｔａｔａｇａｔｔｔｇａａｇａａｇａｇｃｔｇｔｔｔｃｔｇａｇｇａｇｃｃｔｔｃａｇｇａｔｔａｃａａｇａｔｔｃａａａｇｔｇｃｇｃｔｇｃｔｇｇｔｇｃｃａａｃｃｃｔａｔｔｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｇｃｃａａａａｇｃａｃｔｃｔｇａｔｔｇａｃａａａｔａｃｇａｔｔｔａｔｃｔａａｔｔｔａｃａｃｇａａａｔｔｇｃｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇｃｔｃｃｃｃｔｃｔｃｔａａｇｇａａｇｔｃｇｇｇｇａａｇｃｇｇｔｔｇｃｃａａｇａｇｇｔｔｃｃａｔｃｔｇｃｃａｇｇｔａｔｃａｇｇｃａａｇｇａｔａｔｇｇｇｃｔｃａｃｔｇａｇａｃｔａｃａｔｃａｇｃｔａｔｔｃｔｇａｔｔａｃａｃｃｃｇａｇｇｇｇｇａｔｇａｔａａａｃｃｇｇｇｃｇｃｇｇｔｃｇｇｔａａａｇｔｔｇｔｔｃｃａｔｔｔｔｔｔｇａａｇｃｇａａｇｇｔｔｇｔｇｇａｔｃｔｇｇａｔａｃｃｇｇｇａａａａｃｇｃｔｇｇｇｃｇｔｔａａｔｃａａａｇａｇｇｃｇａａｃｔｇｔｇｔｇｔｇａｇａｇｇｔｃｃｔａｔｇａｔｔａｔｇｔｃｃｇｇｔｔａｔｇｔａａａｃａａｔｃｃｇｇａａｇｃｇａｃｃａａｃｇｃｃｔｔｇａｔｔｇａｃａａｇｇａｔｇｇａｔｇｇｃｔａｃａｔｔｃｔｇｇａｇａｃａｔａｇｃｔｔａｃｔｇｇｇａｃｇａａｇａｃｇａａｃａｃｔｔｃｔｔｃａｔｃｇｔｔｇａｃｃｇｃｃｔｇａａｇｔｃｔｃｔｇａｔｔａａｇｔａｃａａａｇｇｃｔａｔｃａｇｇｔｇｇｃｔｃｃ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【０２４６】
Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡの作成
Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡ構造を、Ｈ１９／Ｐ４構造を作成するために使用したものと非常に類似した手法で作成した。最終構造を配列で決定した。配列の一致は、１００％であった。
【０２４７】
Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡ配列は以下の通りである：
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【０２４８】
さらに、調節構造のＨ１９−Ｌｕｃ−Ｐ３−Ｌｕｃを、同じ様な手法を用いて作成した。Ｈ１９−Ｌｕｃ−Ｐ３−Ｌｕｃの配列は以下の通りである：
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【０２４９】
実施例１：Ｈ１９およびＰ４プロモーターから別々に発現するＤＴＡ遺伝子を含む単一構造による優れた抗膀胱癌活性構造
最初に、二重プロモーター構造のＨ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡの抗癌治療効果を、三つの異なるヒトの膀胱癌線を溶解するそれの能力を確認することに従って生体外で試験し、単一プロモーター構造と比較した。抗腫瘍活性を、ルシフェラーゼ活性の阻害を測定することによって決定して、その後ＬｕｃＳＶ４０を共トランスフェクションした。Ｔ２４Ｐ、Ｕｍｕｃ３およびＨＴ−１３７６膀胱ガン細胞株を、Ｈ１９−ＤＴＡ、Ｐ４−ＤＴＡ、またはＨ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡと、示した濃度および２μｇのＬｕｃＳＶ４０で共トランスフェクションした。トランスフェクションした細胞の生存の指標としてルシフェラーゼ活性を確認して、ＬｕｃＳＶ４０のみでトランスフェクションした細胞のものと比較した。Ｈ１９−ＤＴＡおよびＰ４−ＤＴＡはＤＴＡ遺伝子の発現を促進して、したがってルシフェラーゼ活性を容量反応様式で減少することができる。しかしながら、Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡは、Ｔ２４Ｐ細胞で、それぞれの単一プロモーター構造と比較して、より優れた癌細胞株溶解効率を示した。非常に類似した結果を、実験がＵＭＵＣ３細胞（図３Ａ−Ｃ）およびＨＴ−１３７６（図４０Ａ−Ｂ）で繰り返すときに得た。
【０２５０】
したがって、ＤＴＡ発現ベクターは、同一構造でＨ１９およびＰ４からＤＴＡ毒素を発現する二つの別々の遺伝子を処理し、いずれの遺伝子のみで行う発現ベクターと比較して、様々なヒトの膀胱ガン細胞株を溶解するのに非常に優れた能力を示す。
【０２５１】
実施例２：Ｈ１９およびＰ４プロモーターから別々に発現するＤＴＡ遺伝子を含む単一構造による優れた抗肝臓癌活性
実施例１に記載した構造の抗癌治療効果を、Ｈｅｐ３Ｂヒト肝臓癌細胞（肝細胞癌）に関して、生体外で試験した。膀胱癌細胞株で見られるように、二重プロモーター構造のＨ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡは、各々の単一プロモーター構造と比較して、癌細胞線を溶解させる際に非常に優れた効率を示した（図４Ａ−Ｂ）。
【０２５２】
したがって、本発明のＨ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡの二重プロモーター発現ベクターは、いずれの遺伝子のみと比較して、肝臓癌細胞を溶解する能力が非常に優れていることを示した。
【０２５３】
実施例３：Ｈ１９およびＰ４プロモーターから別々に発現するＤＴＡ遺伝子を含む単一構造による優れた抗膀胱癌活性構造
実施例１に記載したような構造の抗癌治療効果を、ＥＳ−２ヒト卵巣癌細胞（明細胞癌）に関して、生体外で試験した。膀胱癌細胞系で見られるように、二重プロモーター構造Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡは、各々の単一プロモーター構造と比較して、癌細胞線を溶解させる際に非常に優れた効率を示した（図５Ａ−Ｂ）。
【０２５４】
したがって、本発明のＨ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡ二重プロモーター発現ベクターは、いずれの遺伝子のみと比較して、卵巣癌細胞を溶解するのに非常に優れた能力を示す能力を示した。
【０２５５】
実施例４：Ｈ１９およびＰ４プロモーターから別々に発現するＤＴＡ遺伝子を含む単一構造による優れた抗膵癌活性構造
実施例１に記載するような構造の抗癌治療効果を、生体外で、ＰＣ−１ハムスター膵癌（膵管癌）およびＣＲＬ−１４６９ヒト膵癌（上皮癌）で試験した。膀胱癌細胞株で見られるように、二重プロモーター構造Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡは、ハムスター（図６Ａ−Ｂ）およびヒト（図７Ａ−Ｂ）の膵癌細胞株とそれぞれの単一プロモーター構造と比べて、癌細胞線を溶解させる際に非常に優れた効率を示した。
【０２５６】
したがって、本発明のＨ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡ二重プロモーター発現ベクターは、いずれの遺伝子のみと比較して、膵癌細胞を溶解するのに非常に優れた能力を示す能力を示した。
【０２５７】
全体として、Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡ発現ベクターは、腫瘍細胞の広域スペクトルに対して試験した時に、いずれの遺伝子のみで行う発現ベクターと比較して、非常に優れた能力を示した。これらの癌細胞株の各々にわたるこれらの結果の一貫性は、通常の癌に対して本発明のＨ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡ構造の優れた能力を示した。
【０２５８】
実施例５：六つの異なる癌種に対して、それぞれＰ３およびＰ４で促進するＤＴＡ遺伝子を含んだ単一構造による優れた活性
次に、二重プロモーター発現構造でＩＧＦ−ＩＩ−Ｐ３およびＩＧＦ−ＩＩ−Ｐ４プロモーターからＤＴＡを発現し、Ｐ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡの活性を、二つの異なるヒト膀胱癌細胞系（Ｔ２４ＰおよびＨＴ−１３７６）に対して試験をし、対応した単一のプロモーター構造で比較した。細胞を、２μｇのＬｕｃＳＶ４０およびＰ３−ＤＴＡ、Ｐ４−ＤＴＡ、またはＰ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡと図に示した濃度で共トランスフェクションした。ルシフェラーゼ活性を測定して、ＬｕｃＳＶ４０のみでトランスフェクションした細胞と比較した。Ｐ３−ＤＴＡおよびＰ４−ＤＴＡはＤＴＡ遺伝子発現を促進することができ、したがって両細胞株において用量反応方法でルシフェラーゼ活性を減少した。しかしながら、二重プロモーター構造Ｐ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡは、それぞれの単一プロモーター構造と比較して、Ｔ２４Ｐ細胞（図８Ａ−Ｂ）およびＨＴ−１３７６細胞（図９Ａ−Ｂ）において、癌細胞株を溶解させる優れた効率を示した。非常に類似の結果をＨｅｐ３Ｂヒト肝臓癌細胞で同様に得た（図１０Ａ−Ｂ）。非常に類似の結果をＥＳ−２ヒト卵巣腺癌細胞で同様に得た（図１１Ａ−Ｂ）。非常に類似の結果をＰＣ−１ハムスター膵癌細胞（図１２Ａ−Ｂ）およびＣＲＬ−１４６９ヒト膵癌細胞（図１３Ａ−Ｂ）で同様に得た。
【０２５９】
したがって、ＤＴＡ発現ベクターは、ＩＧＦ−ＩＩ−Ｐ３およびＩＧＦ−ＩＩ−Ｐ４からＤＴＡ毒素発現する二つの別々な遺伝子を同じ構造を有するものであり、いずれかの遺伝子のみと比較して、六種の癌細胞株に対して試験したとき、非常に優位な能力を一貫して示す。腫瘍細胞の広いスペクトルにわたるこれらの結果の一貫性は、一般の癌に対して本発明のＰ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡ構造の優れた能力を示した。
【０２６０】
実施例６：膀胱癌細胞に対して、それぞれＨ１９およびＰ３で促進されるＤＴＡ遺伝子を含んだ単一構造による優れた活性
次に、二重プロモーター発現構造Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡの能力を、ヒト膀胱癌細胞株Ｔ２４Ｐに対して試験し、対応する単一プロモーター構造と比較した。
【０２６１】
その構造の治療効果は生体外でヒト膀胱癌細胞株を溶解させるそれらの能力を確認することにより試験し、ＬｕｃＳＶ４０と共トランスフェクションして、ルシフェラーゼ活性の阻害を測定することにより確認した。ヒト膀胱癌細胞株Ｔ２４Ｐを２μｇのＬｕｃＳＶ４０およびＨ１９−ＤＴＡ、Ｐ３−ＤＴＡまたはＨ１９−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡと図に示した濃度で共トランスフェクションした。ルシフェラーゼ活性を測定して、ＬｕｃＳＶ４０のみでトランスフェクションした細胞のものと比較した。Ｈ１９−ＤＴＡおよびＰ３−ＤＴＡはＤＴＡ遺伝子発現を促進することができ、このように全ての三種の細胞株で用量反応方法でルシフェラーゼ活性を減少した。しかしながら、二重プロモーター構造Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡは、各々の単一プロモーター構造と比較して、癌細胞株で溶解させる際に優れた効率を示した（図１４Ａ−Ｂ）。
【０２６２】
したがって、ＤＴＡ発現ベクターは、同じ構造でＨ１９およびＩＧＦ−ＩＩ−Ｐ３からＤＴＡ毒素を発現する二つのそれぞれの遺伝子で処理し、膀胱癌細胞に対して試験すると、いずれかの遺伝子のみで行う発現ベクターと比較して、非常に優れる能力を示した。
【０２６３】
実施例７：Ｈ１９およびＰ４プロモーターから、それぞれ発現したＤＴＡ遺伝子は、単一構造で存在する時より添加を上回る抗癌活性を示した
次に、本発明の二重プロモーター構造Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡの、相加を上回る抗癌効果の存在を、ヒト膀胱癌細胞株Ｔ２４ＰおよびＨＴ−１３７６、ヒト卵巣癌細胞株ＥＳ−２、ヒト肝癌細胞株Ｈｅｐ３Ｂ、ハムスター膵臓細胞株ＰＣ−１、およびヒト膵臓癌細胞株ＣＲＬ−１４６９で試験した。Ｔ２４Ｐ、ＥＳ−２、Ｈｅｐ３Ｂ、ＰＣ−１およびＣＲＬ−１４６９を、２μｇのＬｕｃＳＶ４０および（ａ）単一プロモーター構造Ｈ１９−ＤＴＡ＋Ｐ４−ＤＴＡ組み合わせの図に示した濃度または、（ｂ）単一プロモーター構造の一つに関してＨ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡと同量のいずれかで共トランスフェクションした。従って単一プロモーター構造の両方を投与するサンプルで共トランスフェクションしたＤＮＡの総量は、Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡをトランスフェクションした細胞より二倍であった。ルシフェラーゼ活性を測定して、ＬｕｃＳＶ４０のみでトランスフェクションした細胞のものと比較した。二重プロモーター構造Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡは、両方の単一プロモーター構造（Ｈ１９−ＤＴＡ＋Ｐ４−ＤＴＡ）の組み合わせた活性と比較して、Ｔ２４Ｐ細胞で癌細胞株を溶解する際に優れた効率を示した（図１５Ａ−Ｂ）。非常に似た結果を、Ｈｅｐ３Ｂヒト肝癌細胞（図１６Ａ−Ｂ）、ＥＳ−２ヒト卵巣癌細胞（図１７Ａ−Ｂ）、ＰＣ−１ハムスター膵臓細胞（図１８Ａ−Ｂ）、ＣＲＬ−１４６９ヒト膵癌細胞（図１９Ａ−Ｂ）およびＨＴ−１３７６細胞（図２３Ａ−Ｂ）で得た。
【０２６４】
したがって、単一発現ベクターの存在するＨ１９で促進およびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４で促進されたＤＴＡをコードする遺伝子は、広いスペクトルの腫瘍細胞に対して試験したときにいずれかの遺伝子のみで行う発現ベクターと比較して、相加を上回る抗癌活性を示した。これらの癌細胞系で、各々のこれらの結果を通して、本発明のＨ１９／Ｐ４構造では、通常の癌と比較して、優れていることを示した。
【０２６５】
実施例８：Ｐ３およびＰ４プロモーターからそれぞれ発現したＤＴＡ遺伝子は、単一構造で存在するときより相加を上回る抗癌活性を示した
次に、Ｐ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡの二重プロモータープラスミドの添加を上回る抗癌活性をＨＴ−１３７６、ＥＳ−２、Ｈｅｐ３Ｂ、ＰＣ−１およびＣＲＬ−１４６９で、前記実施例に記載したように試験した。二重プロモーター構造Ｐ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡは、両者の単一プロモーター構造Ｐ３−ＤＴＡ＋Ｐ４−ＤＴＡの組み合わせた活性と比較して、ＨＴ−１３７６細胞で、癌細胞株の溶解する優れた効率を示した（図２０Ａ−Ｂ）。非常に似た結果を、ＥＳ−２細胞（図２１Ａ−Ｂ）、Ｈｅｐ３Ｂ細胞（図２２）、ＣＲＬ−１４６９（図２４Ａ−Ｂ）で得た。
【０２６６】
したがって、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ３−で促進およびＩＧＦ−ＩＩ  Ｐ４−で促進されたＤＴＡをコードする遺伝子は、広いスペクトルの腫瘍細胞に対して試験したときにいずれかの遺伝子のみで行う発現ベクターと比較して、相加を上回る抗癌活性を示した。これらの癌細胞株の各々にわたってこれらの結果の一貫性は、通常の癌に対して、本発明のＰ３−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡ構造の優れている能力を実証する。
【０２６７】
実施例９：膀胱癌動物モデル
皮下の膀胱腫瘍の異所性モデル
リン酸塩緩衝食塩水内の２×１０６  Ｔ２４Ｐまたは３×１０６  ＨＴ−１３７６ヒト膀胱癌細胞は、６〜７週目のメスヌードマウスの背内の皮下に注射して、異所性膀胱腫瘍を確立した。接種１０日後、測定可能な腫瘍は、Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡ、Ｐ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡおよびＨ１９−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡ発現ベクターで処理したものに現れた。
【０２６８】
異所性皮下の腫瘍の処理
動物を、同一サイズの群に分けた（ｎ＝６）。２５μｇ／腫瘍の発現ベクター（それぞれＰ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡ、Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡ、またはＨ１９−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡ）またはコントロールベクター（それぞれＰ４−Ｌｕｃ−Ｐ３−Ｌｕｃ、Ｈ１９−Ｌｕｃ−Ｐ４−Ｌｕｃ、またはＨ１９−Ｌｕｃ−Ｐ３−Ｌｕｃ）の３回の注射を各々の腫瘍内に施した。各々の時点で、腫瘍の寸法を測径器を用いて測定し、腫瘍容積を幅２×長さ×０．５の公式で計算した。動物を最後の注射の３日後に屠殺し、腫瘍を切除し、それらの体外（ｅｘ−ｖｉｖｏ）重量および容積を測定した。
【０２６９】
実施例１０：Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡ構造は、いくつかの生体内の膀胱癌モデルで相加より高い抗癌活性を示した
Ｔ２４Ｐの結果
Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡの抗癌治療活性を、生体内の膀胱癌モデルで試験した。Ｔ２４Ｐヒト膀胱癌細胞を、異所性膀胱癌のモデル化するために、無胸腺メスマウスの背の皮下内に注射した。１０日後、マウスはかなりの異所性腫瘍を発病した。ベクターの治療効力は、各々異所性膀胱癌腫瘍内に、発現ベクターまたはコントロールベクター（Ｈ１９−Ｌｕｃ、Ｐ４−Ｌｕｃ、およびＨ１９−Ｌｕｃ−Ｐ４−Ｌｕｃ、それぞれＨ１９プロモーター、Ｐ４プロモーターまたは両プロモーターに基づいてルシフェラーゼを発現させる）の２５μｇを３回の注射で直接投与した。腫瘍の大きさを測定して、腫瘍の生体内の大きさの増加割合をそれぞれの処理後に計算した。
【０２７０】
Ｈ１９−ＤＴＡ（図２５）およびＰ４−ＤＴＡ（図２６）を中二日で三回注射し、Ｈ１９−ＬｕｃおよびＰ４−Ｌｕｃとそれぞれ比較して、それぞれ少なくとも４９％および５７％で腫瘍の発達を阻害した。しかしながら、二重プロモータープラスミドＨ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡを中二日で三回注射は、Ｈ１９−Ｌｕｃ−Ｐ４−Ｌｕｃ処理と比較して少なくとも７０％で腫瘍進行の阻害した（図２７）。したがって、二重プロモーター構造は、それぞれ単一プロモーター構造（Ｈ１９−ＤＴＡおよびＰ４−ＤＴＡ）と比較して、生体内の腫瘍進行を阻害する能力を改良した。
【０２７１】
Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡとＨ１９−Ｌｕｃ−Ｐ４−Ｌｕｃ群との違いを確認すると、腫瘍を切断して、それらの重量および用量を生体外で測定した。Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡで処理したマウスは、Ｈ１９−Ｌｕｃ−Ｐ４−Ｌｕｃ処理と比較して、生体外の腫瘍容積が少なくとも６１％減少（図２８）および、生体外の腫瘍重量が少なくとも５４％減少（図２９）した事を示した。
【０２７２】
Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡの生体内の抗癌活性が相加を上回るかどうか試験するために、Ｔ２４Ｐ腫瘍を含むマウスの付加的な群を、２５μｇそれぞれ単一プロモーター構造、Ｈ１９−ＤＴＡ＋Ｐ４−ＤＴＡの組み合わせたものを３回の注射で処理した。従って投与したＤＮＡの共トランスフェクションの総量は、Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡ群より二倍であった。図３０で分かるように、Ｈ１９−ＤＴＡおよびＰ４−ＤＴＡプラスミドの両方を投与するマウスでの腫瘍進行を、Ｈ１９−Ｌｕｃ＋Ｐ４−Ｌｕｃ組み合わせで処理したマウスと比較して、６３％阻害した。改良した効果は、二重プロモーター構造Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡで処理したマウスで見られ、腫瘍進行をコントロールプラスミドＨ１９−Ｌｕｃ−Ｐ４−Ｌｕｃで処理したマウスと比較して７０％阻害した。したがって、Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡベクターは、相加より高い生体内抗癌活性を示した。
【０２７３】
図３１は全てのＴ２４Ｐ膀胱癌モデルのデータを要約する。Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡは明らかにそれぞれの単一プロモータープラスミドのみより優れた活性があり、さらにそれらの組み合わせの活性より優れていた。 
【０２７４】
ＨＴ−１３７６の結果
Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡの処理の能力を、他の膀胱癌モデルであるＨＴ−１３７６で試験した。実験をＴ２４Ｐモデルで記述したように行った。ＨＴ−１３７６腫瘍を含むマウスを、それぞれ２５μｇのＨ１９−ＤＴＡおよびＰ４−ＤＴＡの組み合わせまたは、２５μｇのＨ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡを処理した。Ｈ１９−ＤＴＡおよびＰ４−ＤＴＡの組み合わせの投与は、Ｈ１９−Ｌｕｃ＋Ｐ４−Ｌｕｃ処理腫瘍と比較して、少なくとも６４．５％腫瘍進行を阻害する（図３２）一方、Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡではＨ１９−Ｌｕｃ−Ｐ４−Ｌｕｃ処理と比較して少なくとも６７％腫瘍進行を阻害する（図３３）ことを示した。したがって、Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡは、単一プロモーター構造の組み合わせ活性と比較して、抗腫瘍活性の向上を示した。
【０２７５】
実施例１１：Ｐ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡ構造は、生体内膀胱癌で抗癌活性の相加が高いことを示した
次に、Ｐ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡの抗癌治療活性を、上記実施例９−１０に記載したＴ２４Ｐ生体内の膀胱癌モデルで試験した。実験を上述のように実行した。
【０２７６】
中二日でＰ３−ＤＴＡの三回の注射は、Ｐ３−Ｌｕｃ処理と比較して、腫瘍進行を少なくとも５０．５％阻害した（図３４）、一方同じ方法でＰ４−ＤＴＡ投与はＰ４−Ｌｕｃ処理と比較して腫瘍進行を少なくとも５７％阻害した（図３５）。対称的に、中二日で二重プロモータープラスミドＰ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡの三回の注射は、Ｐ３−Ｌｕｃ／Ｐ４−Ｌｕｃと比較して、腫瘍進行を少なくとも７０％阻害した。したがって、Ｐ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡは、それぞれの単一プロモーター構造（Ｐ３−ＤＴＡおよびＰ４−ＤＴＡ）と比較して、抗腫瘍活性の向上を示した。
【０２７７】
Ｐ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡの生体内抗癌活性は相加より高いかどうか試験するために、Ｔ２４Ｐ腫瘍を含むマウスの付加的群を、２５μｇのそれぞれ単一プロモーター構造Ｐ３−ＤＴＡ−Ｐ４−ＤＴＡを組み合わせたものの３回の注射で処理した。従って投与したＤＮＡ共トランスフェクションの総量はＰ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡ群より二倍であった。腫瘍進行をＰ３−Ｌｕｃ＋Ｐ４−Ｌｕｃの組み合わせの処理と比較して少なくとも６３．３％阻害し（図３７）、７０％未満の量をＰ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡ処理（図３６）で観察した。したがって、Ｐ４−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡベクターを生体内抗癌活性は相加より高いことを示した。
【０２７８】
実施例１２：Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡ発現ベクターによる生体内腫瘍進行の阻害
次に、二重プロモータープラスミドＨ１９−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡの抗癌治療活性を、上記実施例９−１０で記載した生体内膀胱癌モデルＴ２４Ｐで試験した。実験を上述のように行った。
【０２７９】
中二日でＨ１９−ＤＴＡの三回の注射は、Ｈ１９−Ｌｕｃ処理と比較して、腫瘍進行を少なくとも４９％阻害し（図２５）、同様に投与したＰ３−ＤＴＡはＰ３−Ｌｕｃ処理と比較して、腫瘍進行を少なくとも５０．５％阻害した。対称的に、中二日でＨ１９−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡの３回の注射は、Ｈ１９−Ｌｕｃ−Ｐ３−Ｌｕｃ処理と比較して、腫瘍進行を少なくとも５９％阻害した。したがって、Ｈ１９−ＤＴＡ−Ｐ３−ＤＴＡはそれぞれの単一プロモーター構造（Ｈ１９−ＤＴＡおよびＰ３−ＤＴＡ）と比較して、抗腫瘍活性の向上を示した。
【０２８０】
概して、本願明細書で提示した結果は、本発明の多数プロモーター構造が、その対応する単一構造と比較して、向上し、相加より高い腫瘍進行阻害機能を示した。
【０２８１】
上述の説明の特定実施形態は、本発明の一般的な性質を明らかにするのに十分であり、他のものは、現在の知識を適用して、実験および一般的な概念から逸脱せずに、前記実施形態を様々な適応に修正および／または適合させることができ、それ故、このような適応および修正は、開示した実施形態の意味および均等物の範囲内を包含すべきであり、意図するものである。本願明細書で用いられる用語または術語は説明を目的するものであり、制限するものでないことを理解すべきである。様々な開示した機能を行うための手段、材料および方法は本発明から逸脱せず、様々な他の形態をとることができる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【配列表】
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