(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
篩板細胞におけるアポトーシス特異的ｅＩＦ−５Ａ１の発現を抑制するための医薬組成物であって、ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ−５Ａを標的とするｓｉＲＮＡを含み、ここで当該ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ−５Ａが、配列番号４１に記載されており、そして当該医薬組成物が、in vitroで篩板細胞に投与されるか、又はｉｎ  ｖｉｖｏで篩板細胞に直接投与される、前記医薬組成物。
【請求項２】
前記篩板細胞が、ヒト由来である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号３０を標的とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号３１を標的とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号３２を標的とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号３３を標的とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ−５Ａの発現抑制が、篩板細胞においてアポトーシスを低減する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号３０を標的とする、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号３１を標的とする、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号３２を標的とする、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号３３を標的とする、請求項７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、アポトーシス特異的真核生物開始因子-５Ａ(ｅＩＦ-５Ａ)、つまりアポトーシス因子５Ａ若しくは因子５Ａ１又はアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａと呼ばれるもの、及びデオキシハイプシン・シンターゼ(ＤＨＳ)に関する。本発明は、アポトーシス因子５Ａ及びＤＨＳの核酸及びポリペプチド、並びにアポトーシス因子５Ａ及びＤＨＳの発現抑制方法に関する。
【０００２】
関連出願
本出願は、２００３年３月１０日に出願された継続中の米国出願第10/383,614号であり、２００２年１０月２３日に出願された継続中の米国出願第10/277,969号であり、２００２年７月２３日に出願された米国出願第10/200,148号であり、２００２年５月７日に出願された米国出願第10/141,647号であり、２００１年７月２３日に出願された米国出願第9/909,796号であり、これら全ての出願は、本明細書中にその全てを援用される。本出願はまた、２００３年３月５日に出願された米国仮出願60/451,677号；２００３年６月６日に出願された米国仮出願第60/476,194号、２００３年９月２２日に出願された60/504,731号に優先権を主張する。これら全ての出願は、本明細書中にその全てを援用される。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
アポトーシスは、明確な形態的特徴、例えば細胞収縮、クロマチン凝集、核の断片化、及び膜小胞により特徴付けられる遺伝的にプログラムされた細胞の事象である(Kerr et al. (1972) Br. J. Cancer, 26,239-257 ; Wyllie et al. (1980) hit. Rev. Cytol., 68,251-306)。アポトーシスは、通常の組織発生及び恒常性において重要な役割を果たし、そしてアポトーシスプログラムの欠落が、神経変性及び自己免疫疾患から新生物までの範囲の広範なヒト疾患に寄与すると考えられている(Thompson (1995) Science, 267,1456-1462 ; Mullauer et al. (2001) Mutat. Res, 488, 211-231）。アポトーシス細胞の形態的特徴は、明確に特徴づけされているが、この過程を制御する分子経路は、解明され始めてきたに過ぎない。
【０００４】
アポトーシスにおいて重要な役割を担うと考えられているタンパク質の一群は、カスパーゼと呼ばれるシステイン・プロテアーゼ・ファミリーであり、アポトーシスの多くの経路に必要とされるようである(Creagh & Martin (2001) Biochem. Soc. Trans, 29,696-701 ; Dales et al. (2001) Leuk. Lymphoma, 41,247-253）。カスパーゼは、種々の細胞内タンパク質を切断することにより、アポトーシス刺激に応答してアポトーシスを引き起こし、これにより細胞収縮、膜小胞形成、及びＤＮＡ断片化を含むアポトーシスの古典的特徴がもたらされる(Chang & Yang (2000) Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64,821-846）。
【０００５】
アポトーシス促進性タンパク質、例えばＢａｘ又はＢａｋはまた、カスパーゼ活性化分子、例えばミトコンドリア・シトクロームｃを放出することによりアポトーシス経路において重要な役割を果たし、それによりアポトーシスを介した細胞死を促進する(Martinou & Green (2001) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 2,63-67; Zou et al. (1997) Cell, 90,405-413）。 抗-アポトーシス・タンパク質、例えばＢｃｌ-２は、アポトーシス促進性タンパク質、Ｂａｘ及びＢａｋの活性を拮抗作用することにより細胞の生存を促進する(Tsujimoto (1998) Genes Cells, 3,697-707 ; Kroemer (1997) Nature Med., 3, 614-620）。Ｂａｘ：Ｂｃｌ-２の比は、細胞の運命を決定付ける一の様式であると考えられ、過剰量のＢａｘは、アポトーシスを促進し、そして過剰量のＢｃｌ-２は、細胞の生存を促進する(Salomons et al. (1997) Int. J. Cancer, 71,959-965 ; Wallace-Brodeur & Lowe (1999) Cell Mol. Life Sci., 55,64-75）。
【０００６】
アポトーシスに関与する他の主要タンパク質は、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３によりコードされるタンパク質である。このタンパク質は、細胞成長を制御する転写因子であり、そして損傷を受けた及び遺伝的に不安定な細胞において、おそらくＢａｘの上方制御を介してアポトーシスを誘導する(Bold et al. (1997) Surgical Oncology, 6,133-142 ; Ronen et al., 1996; Schuler & Green (2001) Biochem. Soc. Trans., 29, 684-688 ; Ryan et al. (2001) Curr.Opin. Cell Biol., 13,332-337 ; Zornig et al. (2001) Biochem. Biophys. Acta, 1551, F1-F37）。
【０００７】
アポトーシスを起している細胞を特徴付ける明確な形態的特徴により、アポトーシスの開始及び進行を評価するための多くの方法が生み出されてきた。アポトーシスを起している細胞の検出に使用できる該細胞の１のそうした特徴は、フリッパーゼの活性化であり、原形質膜の内部小胞(inner leaflet)に通常局在するホスファチジルセリン、リン脂質の外局在化をもたらす(Fadok et al. (1992) J. Immunol., 149,4029-4035）。外局在化されたホスファチジルセリンを有するアポトーシスを起している細胞は、蛍光色素に結合されたホスファチジルセリン結合性タンパク質、アネキシンＶにより検出されうる。アポトーシス・プロセスの間生じる特徴的なＤＮＡ断片化は、ＤＮＡ断片の晒された３’-ＯＨを、蛍光標識されたデオキシヌクレオチドで標識することにより検出されうる。核酸に結合する蛍光色素、例えばヘキスト33258は、クロマチン凝集及びアポトーシスを起している細胞における核断片化を検出するために使用されうる。細胞集合におけるアポトーシスの程度は、細胞抽出物において存在するカスパーゼのタンパク質分解活性の程度からも推察されうる。
【０００８】
遺伝的に定義されたプロセスとして、アポトーシスは、他の発生プログラムと同様に、突然変異によって乱されうる。アポトーシス経路の変化は、癌を含む多くの疾病プロセスにおいて主要な役割を担うことが信じられている(Wyllie et al. (1980) Irait. Rev. Cytol., 68,251-306 ; Thompson (1995) Science, 267,1456-1462 ; Sen & D'Incalci (1992) FEBSLetters, 307,122-127 ; McDonnell et al. (1995) Seminars in Cancer and Biology, 6, 53-60）。癌の発生と進行の研究は、伝統的に細胞増殖に焦点を当ててきた。しかしながら、腫瘍形成においてアポトーシスが担う重要な役割が最近明らかにされてきた。実際、アポトーシスについて現在知られていることの多くは、腫瘍モデルを使用して知られるようになった。なぜなら、アポトーシスの制御は、腫瘍細胞において何らかの方法により常に変化されているからである(Bold et al. (1997) Surgical Oncology, 6, 133-142）。
【０００９】
アポトーシスは、腫瘍発生の間、種々のシグナルにより引き起こされうる。細胞外シグナルは、成長又は生存因子の減少、低酸素状態、及び電離放射線を含む。アポトーシスを引き起こしうる内部シグナルは、ＤＮＡ損傷、テロメアの短縮、及び不適切な増殖シグナルをもたらす発癌性の突然変異を含む(Lowe & Lin (2000) Carcinogenesis, 21, 485-495）。悪性腫瘍を治療するために使用される電離放射線及びほとんど全ての細胞傷害性の化学療法薬は、内在性のアポトーシスメカニズムを引き起こすことにより作用して、細胞死を導くと考えられている(Rowan & Fisher (1997) Leukemia, 11,457-465 ; Kerr et al. (1994) Cancer, 73,2013-2026 ; Martin & Schwartz (1997) Oncology Research, 9,1-5)。
【００１０】
癌の進行の初期において、腫瘍細胞は、アポトーシスを誘導する薬剤(例えば、電離放射線又は化学療法薬)に感受性であるということが、証拠により示される。しかしながら、腫瘍が進行するにつれて、細胞は、アポトーシスの刺激に対して抵抗性を発達させる(Naik et al. (1996) Genes and Development, 10,2105-2116)。これにより、初期の癌がより進行した癌よりも治療によりよく反応するという理由が説明されるかもしれない。後期の癌が、化学療法及び放射線治療に抵抗性を発達させる能力は、腫瘍細胞がアポトーシス刺激に応答する能力を制限するアポトーシス経路に関連しているようである(Reed et al. (1996) Journal of Cellular Biology, 60,23-32 ; Meyn et al. (1996) Cancer Metastasis Reviews, 15, 119-131 ; Hannun (1997) Blood, 89, 1845-1853; Reed (1995) Toxicology Letters, 82-83, 155-158 ; Hickman (1996) European Journal of Cancer, 32A, 921-926)。化学療法に対する抵抗性は、慢性リンパ性白血病及び大腸癌の各々において、抗アポトーシス性の遺伝子ｂｃｌ-２の過発現、及びアポトーシスを促進するｂａｘ遺伝子の欠失又は突然変異に関連してきた。
【００１１】
腫瘍細胞が播種性転移を首尾よく行う能力はまた、アポトーシス経路の変化に関連するようである(Bold et al. (1997) Surgical Oncology, 6,133-142）。例えば、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３の突然変異は、７０％の腫瘍において生じると考えられている(Evan et al. (1995) Curr : Opin. Cell Biol., 7,825-834)。ｐ５３を不活性化する突然変異は、ＤＮＡ損傷に応答してアポトーシスを誘導する細胞の能力を制限し、細胞をさらなる突然変異を受けやすいものにする(Ko & Prives (1996) Genes and Development, 10,1054-1072)。
【００１２】
それゆえ、アポトーシスは、悪性形質転換及び転移の発生及び進行に密接に関連し、そして関連するアポトーシス経路をよりよく理解することにより、遺伝子治療アプローチを通したアポトーシス経路の調節による癌治療のための新規の潜在的標的がもたらされうる(Bold et al. (1997) Surgical Oncology, 6, 133-142)。
【００１３】
本発明は、アポトーシスの誘導直前に上方制御されるｅＩＦ-５Ａ・ｃＤＮＡのクローニングに関する。このアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａは、アポトーシスにより引き起こされる病状において、本発明の適切な標的となるようである。なぜなら、ｅＩＦ-５Ａは、アポトーシス経路に関与する下流エフェクター及び転写因子を転写後制御するレベルで作用するようであるからである。特異的に、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａは、アポトーシスの下流エフェクター及び転写因子をコードするｍＲＮＡの核から細胞質への移動を選択的に促進するようであり、続いて細胞質においてｍＲＮＡは翻訳される。アポトーシスを開始する最終的な決定は、内部及び外部におけるアポトーシスを促進するシグナルとアポトーシスを抑制するシグナルとの間の複合相互作用から生じるようである(Lowe & Lin (2000) Carcinogenesis, 21,485-495)。アポトーシスの下流エフェクター及び転写因子の翻訳を促進する能力を介して、アポトーシス関連ｅＩＦ-５Ａは、シグナル間のバランスをアポトーシスの側に傾けるようである。
【００１４】
以前に記載されたように、抗癌剤がアポトーシスを誘導し、そしてアポトーシス経路の変化が、薬剤誘導性の細胞死を弱め得るということが認められた(Schmitt & Lowe (1999) J. Pathol., 187,127-137)。例えば、多くの抗癌剤はｐ５３を上方制御し、そしてｐ５３を欠失した腫瘍細胞は、これらの薬剤に対し抵抗性を発達させる。しかしながら、ほとんど多くの化学療法薬は、投与量が十分であるならばｐ５３に依存せずアポトーシスを誘導することができ、このことは、薬剤抵抗性の腫瘍においてさえ、アポトーシスへの経路が完全にブロックされているわけではないということを示している(Wallace-Brodeur & Lowe (1999) Cell Mol. Life Sci., 55,64- 75)。このことにより、アポトーシスｅＩＦ-５Ａは突然変異した遺伝子を訂正しないが、アポトーシスｅＩＦ-５Ａの誘導は、ｐ５３依存性の経路を迂回し、そして代わりの経路を促進することによりアポトーシスを誘導できるかもしれないということが示される。
【００１５】
アポトーシス関連ｅＩＦ-５Ａは、通常の近接する細胞に影響をほとんど与えないか又は全く与えない一方で、癌細胞を選択的に標的する潜在能力を有する。腫瘍細胞において発現される分裂促進的癌遺伝子が、通常細胞では存在しない特定種類のｍＲＮＡの形態でアポトーシス・シグナルを提供することのために、上記能力が生じる(Lowe et al. (1993) Cell, 74, 954-967; Lowe & Lin (2000) Carcinogenesis, 21,485-495)。例えば、ｐ５３突然変異腫瘍細胞における野生型ｐ５３の修復は、直接的にアポトーシスを誘導し、そして腫瘍細胞系列及び異種移植において薬剤感受性を増大させる(Spitz et al., 1996; Badie et al. 1998))。
【００１６】
アポトーシス-ｅＩＦ-５Ａの選択性は、アポトーシス-ｅＩＦ-５Ａが、核から細胞質へのアポトーシスの下流エフェクター及び転写因子のｍＲＮＡの移動を仲介することにより、アポトーシスの下流エフェクター及び転写因子のｍＲＮＡの翻訳を選択的に促進するという事実から生じる。こうして、アポトーシスｅＩＦ-５Ａが効果を有するためには、これらのエフェクター及び転写因子についてのｍＲＮＡが、転写されていなければならない。これらのｍＲＮＡは、癌細胞において転写されるが、近接する通常の細胞において転写されないかぎり、アポトーシスｅＩＦ-５Ａが癌細胞でアポトーシスを促進するが、通常細胞ではあるとしても最小効果しか有しないということが予期される。こうして、腫瘍細胞において、アポトーシス関連ｅＩＦ-５Ａでアポトーシスを起す潜在能力を修復することにより、癌患者が受ける毒性及び副作用は、腫瘍細胞の選択的に標的するため低減されうる。アポトーシスｅＩＦ-５Ａの誘導はまた、腫瘍細胞の抗癌剤への応答を増強し、それにより薬剤耐性腫瘍に対するこれらの薬剤の有効性を改良する可能性を有する。次に、アポトーシスｅＩＦ-５Ａの誘導は、有効性を有する抗癌剤のより少ない投与量と、患者に対する低減された毒性をもたらしうる。
【００１７】
アポトーシス経路における変化はまた、緑内障による盲目を引き起こす網膜神経節細胞の変性に、重要な役割を果たすと信じられている。緑内障は、増大した眼内圧(ＩＯＰ)が、視神経の損傷及び進行性の盲目を引き起こす目の病気の群を表す。緑内障は、現在、視神経への損傷を低減するために、ＩＯＰを制御する薬剤又は外科手術、或いはニューロ・プロテクター(neuro-protector)の使用によって管理されるが、緑内障眼におけるアポトーシスによる変性から網膜神経節細胞を保護する必要性が残る。
【００１８】
サイトカインはまた、アポトーシス経路に関わっている。生物学的なシステムは、システムの制御のため細胞間相互作用を必要とし、そして一般的に多種多様のサイトカインが細胞間のクロストークに関与している。サイトカインは、多種の刺激に応答して多くの異なる細胞型により産生されるメディエーターである。サイトカインは、多くの異なる細胞型に多くの異なる効果を発揮できる多面的な分子であるが、特に免疫応答並びに造血細胞の増殖及び分化を調節する点で重要である。標的細胞へのサイトカインの作用は、固有のサイトカイン、相対濃度、及び他のメディエーターの存在に依存して、細胞の生存、増殖、活性化、分化、又はアポトーシスを促進できる。
【００１９】
自己免疫疾患(乾癬、リューマチ様関節炎、クローン病)を治療するために、抗サイトカインを使用することは、一般的に受け入れられてきている。炎症促進性サイトカイン、ＩＬ-１及びＴＮＦは、これらの慢性疾患の病状に大きな役割を果たし、そしてこれら２種のサイトカインの生理活性を低減する抗サイトカイン治療は、治療効果を提供することができる(Dinarello and Abraham, 2002)。
【００２０】
インターロイキン１(ＩＬ-１)は、局所的及び全身性の炎症反応を仲介する重要なサイトカインであり、そしてＩＬ-１は、脈管炎、骨粗鬆症、神経変性疾患、糖尿病、ループス腎炎、及び自己免疫疾患、例えばリューマチ様関節炎を含む多くの疾患の発症においてＴＮＦと相乗作用を与えることができる。メラノーマ細胞で注射された際のＩＬ-１βノックアウトマウスの転移及び血管形成に対する抵抗性によって、腫瘍血管形成及び侵襲性におけるＩＬ-１βの重要性が示された (Voronov et al., 2003)。
【００２１】
インターロイキン１８(ＩＬ-１８)は、ＩＬ-１ファミリーの最近発見されたメンバーであり、そしてＩＬ-１の構造、受容体、及び機能に関係を有する。ＩＬ-１８は、インターフェロン-γ(ＩＦＮ-γ)、ＴＮＦ-α、及びＩＬ-１を誘導するその能力の結果として炎症性及び自己免疫疾患に関与する中心サイトカイン(central cytokine)である。IL-１β及びIL-１８は両方とも、心筋虚血の期間における心機能不全に寄与すると知られているサイトカインであるＴＮＦ-αの産生を誘導することができる(Maekawa et al., 2002))。ＩＬ−１８結合タンパク質で中和することによるＩＬ−１８の阻害が、表面灌流されたヒト心房心筋の虚血／再灌流モデルにおける虚血誘導性心筋機能障害を低減することが発見された(Dinarello 2001）。マウスＩＬ-１８結合タンパク質を使用するＩＬ-１８の中和は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−アルファ、及びＩＬ−１β転写レベルを低減でき、そしてコラーゲン誘導性関節炎マウスモデルにおいて関節の損傷を低減することができた(Banda et al., 2003)。ＩＬ-１８結合タンパク質をマウス・メラノーマモデルに注射することによりうまく転移が抑制されたので、ＩＬ-１８産生又は利用可能性の低下によって転移性癌を制御する利点が証明されうる(Carrascal et al., 2003)。炎症促進性サイトカインとしての重要性をさらに指し示すものとして、ＩＬ-１８の血漿レベルは、慢性肝臓疾患を患う患者において上昇し、そして増大したレベルは、疾患の重篤度と相関した(Ludwiczek et al., 2002)。同様にＩＬ-１８及びＴＮＦ-αは、腎障害を患う糖尿病患者の血清において増加した(Moriwaki et al., 2003)。外傷性脳損傷の後に生じる神経炎症はまた、炎症促進性のサイトカインにより仲介され、そしてＩＬ-１８結合タンパク質によるＩＬ-１８の阻害は、脳外傷後のマウスにおいて神経の回復を改善した(Yatsiv et al., 2002)。
【００２２】
サイトカインのＴＮＦファミリーのメンバーであるＴＮＦ-αは、造血細胞への共分裂促進効果から、炎症応答の誘導、及び多くの細胞型における細胞死の誘導に及ぶ多面的な効果を有する炎症促進性サイトカインである。ＴＮＦ-αは、通常、細菌のリポ多糖、寄生生物、ウイルス、悪性細胞、及びサイトカインにより誘導され、そして感染及び癌から細胞を保護するために通常有利に作用する。しかしながら、ＴＮＦ-αの不適切な誘導は、急性及び慢性の炎症、例えば、自己免疫疾患からもたらされる疾患に対して主に関与するものであり、そして癌、ＡＩＤＳ、心臓疾患、及び敗血症にも関与しうる(Aggarwal and Natarajan, 1996; Sharma and Anker, 2002に総説される)。実験動物モデルの疾患 (つまり、敗血症ショック及びリューマチ様関節炎)、並びにヒト疾病(つまり、炎症性腸疾患、及び急性移植片対宿主疾患)は、ＴＮＦ-αをブロックする有利な効果を示した (Wallach et al., 1999)。ＴＮＦ-αの抑制は、クローン病(van Deventer, 1999)及びリュウマチ様関節炎(Richard-Miceli and Dougados, 2001)などの自己免疫疾患を患う患者の症状を軽減する点で有効であった。Ｂリンパ球の生存及び成長を促進するＴＮＦ-αの能力は、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病(Ｂ-ＣＬＬ)の発症において、役割を果たすと考えられ、そしてＢ-ＣＬＬにおけるＴ細胞により発現されるＴＮＦ-αのレベルは、腫瘍の質量及び疾患ステージと正に相関した (Bojarska-Junak et al., 2002)。インターロイキン１-β(ＩＬ-１β)は、ＴＮＦ-α産生を誘導することが知られているサイトカインである。
【００２３】
デオキシハイプシン・シンターゼ(ＤＨＳ)及びハイプシンを含む真核生物翻訳開始因子-５Ａ(ｅＩＦ-５Ａ)は、細胞成長及び分化を含む多くの細胞プロセスで、重要な役割を果たすことが知られている。極めて稀なアミノ酸であるハイプシンは、全ての試験された真核生物及び古細菌において見つかっているが、真性細菌では見つかっておらず、そしてｅＩＦ-５Ａは、唯一知られているハイプシンを含むタンパク質である(Park (1988) J. Biol. Chem., 263,7447-7449 ; Schumann & Klink (1989) System. Appl. Microbiol., 11,103-107 ; Bartig et al. (1990) System. Appl. Microbiol., 13,112-116 ; Gordon et al. (1987a) J. Biol. Chem., 262,16585- 16589)。活性ｅＩＦ-５Ａは、２つの翻訳後ステップで形成される。第一ステップは、デオキシハイプシン・シンターゼにより触媒作用されるｅＩＦ-５Ａ前駆体の或るリジンのα-アミノ基に、スペルミジンの４-アミノブチル成分を移すことにより、デオキシハイプシン残基を形成することである。第二ステップは、デオキシハイプシン・ヒドロキシラーゼにより４-アミノブチル成分を水酸化して、ハイプシンを形成することを含む。
【００２４】
ｅＩＦ-５Ａのアミノ酸配列が種の間でよく保存されており、そしてｅＩＦ-５Ａにおけるハイプシン残基の周辺のアミノ酸配列が厳密に保存されており、以上の事からこの修飾が生存するために重要であることが提案される(Park et al. (1993) Biofactors, 4,95-104)。この仮定は、今日まで酵母において見つかったｅＩＦ-５Ａのアイソフォームの両方の不活性化、又はＤＨＳ遺伝子活性化状態で第一ステップを触媒するＤＨＳ遺伝子の不活性化が、細胞分裂を阻害したという観察によりさらに支持される(Schnier et al. (1991) Mol. Cell. Biol., 11,3105-3114 ; Sasaki et al. (1996) FEBS Lett., 384,151-154 ; Park et al. (1998) J. Biol. Chem., 273,1677-1683)。しかしながら、酵母においてｅＩＦ-５Ａタンパク質を枯渇することは、全体のタンパク質合成において少しの減少をもたらすのみであり、ｅＩＦ-５Ａが、タンパク質の全体の合成よりはむしろ、特異的なｍＲＮＡのサブセット翻訳に必要とされているということを示唆する(Kang et al. (1993), "Effect of initiation factor eIF-5A depletion on cell proliferation and protein synthesis, "in Tuite, M. (ed）, Protein Synthesis and Targeting in Yeast, NATO Series H)。ｅＩＦ-５Ａに結合するリガンドは、高度に保存されたモチーフを共有するという最近の発見は、ｅＩＦ-５Ａの重要性を支持する(Xu & Chen (2001) J. Biol. Chem., 276,2555-2561)。さらに、改変されたｅＩＦ-５Ａのハイプシン残基は、ＲＮＡへの配列特異的な結合に必須であり、そしてこの結合がリボヌクレアーゼからの保護を提供しないということが発見された。
【００２５】
さらに、ｅＩＦ-５Ａの細胞内欠損が、核における特異的ｍＲＮＡの有意な増加をもたらし、ｅＩＦ-５Ａが、核から細胞質へのｍＲＮＡの特異的クラスを輸送することに関与しうるということを指し示す。(Liu & Tartakoff (1997) Supplement to Molecular Biology of the Cell, 8,426a. Abstract No. 2476,37th American Society for Cell Biology Annual Meeting)。核孔付随核内フィラメント(nuclear pore-associated intranuclear filament)でのｅＩＦ-５Ａの増大、及びその一般的核輸送受容体との相互作用により、ｅＩＦ-５Ａが、ポリソームの要素というよりはむしろ、核・細胞質間輸送タンパク質であるということがさらに提案される(Rosorius et al. (1999) J. Cell Science, 112,2369-2380)。
【００２６】
ｅＩＦ-５Ａについての第一ｃＤＮＡは、１９８９年に、Smit-McBride et al.,により
ヒトからクローニングされ、そしてそれからｅＩＦ-５ＡのｃＤＮＡ又は遺伝子は、種々の真核生物、例えば酵母、ラット、ニワトリの胚、アルファルファ、及びトマトなどからクローニングされた(Smit-McBride et al. (1989a) J. Biol. Chem., 264,1578-1583 ; Schnier et al. (1991) (酵母); Sano, A. (1995) in Imahori, M. et al. (eds), Polyamines, Basic and Clinical Aspects, VNU Science Press, The Netherlands, 81-88 (ラット); Rinaudo & Park (1992) FASEB J., 6, A453 (ニワトリ胚); Pay et al. (1991) Plant Mol. Biol., 17,927-929 (アルファルファ); Wang et al. (2001) J. Biol. Chem., 276,17541- 17549 (トマト)。 
【００２７】
ｅＩＦ-５Ａ・ｍＲＮＡの発現は、種々のヒト組織及び哺乳動物細胞系列で探索された。例えば、ｅＩＦ-５Ａ発現の変化は、血清飢餓に続いて血清添加後、ヒト線維芽細胞において調べられた(Pang & Chen (1994) J. Cell Physiol., 160, 531-538)。デオキシハイプシン・シンターゼ活性が年齢依存的に減少すること、及びｅＩＦ-５Ａの前駆体を多く含むことが、感覚器の線維芽細胞において観測された。しかしながら、アイソフォームの差異の平均化を反映する可能性は、測定されなかった(Chen & Chen (1997b) J. Cell Physio., 170, 248-254)。
【００２８】
研究により、ｅＩＦ-５Ａが、ウイルスタンパク質、例えば、ヒト免疫不全ウイルス１型Ｒｅｖタンパク質、及びＴ細胞白血病ウイルス１型Ｒｅｘタンパク質などのウイルスタンパク質の細胞標的でありうるということが示された(Ruhl et al. (1993) J. Cell Biol., 123,1309-1320 ; Katahira et al. (1995) J. Virol., 69,3125-3133)。以前の研究により、ｅＩＦ-５Ａが、他のＲＮＡ-結合タンパク質、例えばＲｅｖと相互作用することにより、ＲＮＡを標的し得るということが示され、これらのウイルスタンパク質がｅＩＦ-５ＡをウイルスＲＮＡプロセッシングにリクルートするということが示唆された(Liu et al. (1997) Biol. Signals, 6, 166-174)。
【００２９】
こうして、ｅＩＦ５Ａ及びＤＨＳは周知であるが、どうやってこれらのタンパク質がアポトーシス経路に関与するかを理解する必要性、並びにアポトーシス及びサイトカイン発現を調節することができるサイトカイン刺激を理解する必要性が残っている。本発明は、この必要性を満たすものである。
【発明の概要】
【００３０】
発明の要約
本発明は、アポトーシス因子５Ａ１又は単純に５Ａ１と呼ばれる、アポトーシス特異的真核生物開始因子５Ａ(ｅＩＦ-５Ａ)に関する。本発明はまた、アポトーシス因子５Ａ１核酸及びポリペプチド、並びにアンチセンス・ヌクレオチド又はｓｉＲＮＡを使用して因子５Ａ１の発現を抑制するアポトーシスの阻害又は抑制方法にも関する。本発明はまた、アポトーシス因子５Ａ１の発現を抑制することにより、炎症促進性サイトカインの発現を抑制または阻害することにも関する。さらに、本発明は、アポトーシス因子５Ａ１の発現を抑制することによって、ｐ５３の発現を抑制又は阻害することに関する。本発明はまた、アンチセンス・ヌクレオチド又はｓｉＲＮＡを使用して、アポトーシス因子５Ａ１の発現を阻害又は抑制することにより、Ｂｃｌ-２の発現を増大させる方法にも関する。本発明はまた、ヒト上皮細胞において、サイトカイン、特にＴＮＦ-αの産生を抑制する方法を提供する。本発明の他の実施態様では、アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ１で標的されたアンチセンス・オリゴヌクレオチドの使用により、アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ１の発現を抑制することにより、緑内障の眼において網膜神経節細胞を抑制する方法が提供される。本発明はまた、アンチセンス・オリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡでｅＩＦ-５Ａの発現を制御することにより、樹上細胞成熟及びＰＢＭＣ活性化の割合を制御する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの３’末端のヌクレオチド配列（配列番号１１）及び派生アミノ酸配列（配列番号１２）を表す。
【図２】図２は、ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｃＤＮＡの５’末端のヌクレオチド配列（配列番号１５）及び派生アミノ酸配列（配列番号１６）を表す。
【図３】ラット黄体アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの全長ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を表す。アミノ酸配列は、配列番号２に示されている。
【図４】ラット・アポトーシス-特異的ＤＨＳ・ｃＤＮＡの３’末端のヌクレオチド配列（配列番号６）及び派生アミノ酸配列（配列番号７）を表す。
【図５】図５は、ラット黄体アポトーシス-特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｃＤＮＡの全長ヌクレオチド配列（配列番号２０）と、ヒトｅＩＦ-５Ａ(受託番号：BC000751又はNM_001970,配列番号３)との配列比較である。
【図６】図６は、ラット黄体アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｃＤＮＡの全長ヌクレオチド配列（配列番号２０）と、ヒトｅＩＦ-５Ａのヌクレオチド配列(受託番号NM-020390,配列番号４)との配列比較である。
【図７】図７は、ラット黄体アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｃＤＮＡの全長ヌクレオチド配列（配列番号２０）と、マウスｅＩＦ-５Ａのヌクレオチド配列(受託番号BC003889)との配列比較である。マウス・ヌクレオチド配列(受託番号BC003889)は配列番号５である。
【図８】図８は、ラット黄体アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの派生全長アミノ酸配列（配列番号２）とヒトｅＩＦ-５Ａの派生アミノ酸配列（配列番号２１）(受託番号BC000751又はNM001970)との配列比較である。
【図９】図９は、ラット黄体アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの派生全長アミノ酸配列（配列番号２）と、ヒトｅＩＦ-５Ａの派生アミノ酸配列（配列番号２２）(受託番号NM020390)との配列比較である。
【図１０】図１０は、ラット黄体アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの派生全長アミノ酸配列（配列番号２）と、マウスｅＩＦ５Ａの派生アミノ酸配列（配列番号２３）(受託番号BC003889)との配列比較である。
【図１１】図１１は、ラット黄体アポトーシス特異的ＤＨＳ・ｃＤＮＡの部分長ヌクレオチド配列（配列番号６の１〜４５３番の残基）と、ヒトＤＨＳのヌクレオチド配列(受託番号BC000333、配列番号８)との配列比較である。
【図１２】図１２は、ラット黄体アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｃＤＮＡの制限酵素マップである。
【図１３】図１３は、部分長ラット・アポトーシス特異的ＤＨＳ・ｃＤＮＡの制限酵素マップである。
【図１４】図１４は、32Ｐ-ｄＣＴＰで標識されたラット黄体アポトーシス-特異的ｅＩＦ-５ＡのｃＤＮＡの３’末端でプローブされた全量ＲＮＡのノーザン・ブロット(図１４Ａ)と臭化エチジウム染色されたゲル(図１４Ｂ)である。
【図１５】図１５は、32Ｐ-ｄＣＴＰで標識されたラット黄体アポトーシス特異的ＤＨＳのｃＤＮＡの３’末端でプローブされた全量ＲＮＡのノーザン・ブロット(図１５Ａ)と臭化エチジウム染色されたゲル(図１５Ｂ)である。
【図１６】図１６は、過排卵されたラットの黄体におけるアポトーシスの度合いが、ＰＧＦ-２αで注射された後に試験されたＤＮＡラダー化実験を表す。
【図１７】図１７は、アポトーシスを起すラット黄体から単離されたゲノムＤＮＡのアガロースゲルであり、ラットをＰＧＦ-２αで処置した後のＤＮＡラダー化を示す。
【図１８】図１８は、過排卵されたラット黄体の分散細胞においてアポトーシスの度合いが、ＰＧＦ-２αを投与する前にスペルミジンで処置されたラット(ＰＧＦ-２α)において試験されたＤＮＡラダー化実験を表す。
【図１９】図１９は、過排卵されたラットの黄体におけるアポトーシスの度合いが、スペルミジン及び/又はＰＧＦ-２αで処置されたラットで試験されたＤＮＡラダー化実験を表す。
【図２０】図２０は、32Ｐ-ｄＣＴＰ-標識されたラットの黄体アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｃＤＮＡの部分長でプローブされたラット・ゲノムＤＮＡのサザン・ブロットである。
【図２１】図２１は、哺乳動物エピトープ・タグ発現ベクター、ｐＨＭ６(Roche  Molecular  Biochemicals)を表す。
【図２２】図２２は、血清を取り除くことによりアポトーシスを誘導した後にＣＯＳ-７細胞から単離された全量ＲＮＡであって、32Ｐ-ｄＣＴＰ-標識されたラット黄体アポトーシス特異的ＤＨＳ・ｃＤＮＡの３’非翻訳領域でプローブされたＲＮＡのノーザン・ブロット(図２２Ａ)と臭化エチジウム染色されたゲル(図２２Ｂ)である。
【図２３】図２３は、ＣＯＳ-７細胞の一過的トランスフェクションの方法を記載するフローチャートである。
【図２４】図２４は、ｐＨＭ６でトランスフェクションした後に、ＣＯＳ-７細胞において、一過的に発現された外来タンパク質をウエスタンブロットしたものである。
【図２５】図２５は、ＣＯＳ-７細胞がラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの全長をセンス方向で含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされた際に、増大したカスパーゼ活性により示されるアポトーシスの増加を記載する。
【図２６】図２６は、ＣＯＳ-７細胞がラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの全長をセンス方向で含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされた際に、増大されたＤＮＡ断片により示されるアポトーシスの増加を記載する。
【図２７】図２７は、ＣＯＳ-７細胞がラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの全長をセンス方向で含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされた際に、増大された核断片により示されるアポトーシスの検出を記載する。
【図２８】図２８は、ＣＯＳ-７細胞がラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの全長をセンス方向で含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされた際に、増大された核断片により示されるアポトーシスの増加を記載する。
【図２９】図２９は、ＣＯＳ-７細胞がラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの全長をセンス方向で含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされた際に、ホスファチジルセリンを露出することにより示されるアポトーシスの検出を記載する。
【図３０】図３０は、ＣＯＳ-７細胞がラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの全長をセンス方向で含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされた際に、増大されたホスファチジルセリンの露出により示されるアポトーシスの増加を記載する。
【図３１】図３１は、ＣＯＳ-７細胞がラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの全長をセンス方向で含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされた際に、増大された核断片により示されるアポトーシスの増加を記載する。
【図３２】図３２は、ＣＯＳ７細胞がラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの全長をセンス方向に含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされた際のアポトーシスの増加を記載する。
【図３３】図３３は、ＣＯＳ７細胞がラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの全長をセンス方向に含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされた際の、Ｂｃｌ-２の下方制御を記載する。図３３Ａは、クマシー・ブルー染色されたタンパク質ブロット；図３３Ｂは対応するウエスタン・ブロットである。
【図３４】図３４は、ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの全長を、アンチセン方向で含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされたＣＯＳ-７細胞のクマシーブルー染色されたタンパク質ブロット及びＢｃｌ-２をプローブとして使用した対応するウエスタンブロットである。
【図３５】図３５は、ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの全長を、センス方向で含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされたＣＯＳ-７細胞のクマシーブルー染色されたタンパク質ブロット及びｃ-Ｍｙｃをプローブとして使用した対応するウエスタンブロットである。
【図３６】図３６は、ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの全長を、センス方向で含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされたＣＯＳ-７細胞のクマシーブルー染色されたタンパク質ブロット及びｐ５３をプローブとして使用した対応するウエスタンブロットである。
【図３７Ａ】ＣＯＳ-７細胞においてｐＨＭ６-ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの全長の発現のクマシーブルー染色されたタンパク質ブロット及び抗-[ＨＡ]-ペルオキシダーゼ・プローブを使用する対応するウエスタン・ブロットであり、並びにＣＯＳ-７細胞においてｐＨＭ６-ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの全長の発現のクマシーブルー染色されたタンパク質ブロット及びｐ５３プローブを使用した際の対応するウエスタンブロットである。
【図３７Ｂ】ＣＯＳ-７細胞においてｐＨＭ６-ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの全長の発現のクマシーブルー染色されたタンパク質ブロット及び抗-[ＨＡ]-ペルオキシダーゼ・プローブを使用する対応するウエスタン・ブロットであり、並びにＣＯＳ-７細胞においてｐＨＭ６-ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの全長の発現のクマシーブルー染色されたタンパク質ブロット及びｐ５３プローブを使用した際の対応するウエスタンブロットである。
【図３７Ｃ】ＣＯＳ-７細胞においてｐＨＭ６-ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの全長の発現のクマシーブルー染色されたタンパク質ブロット及び抗-[ＨＡ]-ペルオキシダーゼ・プローブを使用する対応するウエスタン・ブロットであり、並びにＣＯＳ-７細胞においてｐＨＭ６-ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの全長の発現のクマシーブルー染色されたタンパク質ブロット及びｐ５３プローブを使用した際の対応するウエスタンブロットである。
【図３８】図３８は、ＲＫＯ細胞から単離されたヒトｅＩＦ−５Ａ２（配列番号２４）と、ヒトｅＩＦ−５Ａ２配列（配列番号２２）(Genbank  受託番号XM_113401)との配列比較である。コンセンサス配列は、配列番号２８に示されている。
【図３９】図３９は、一過的なトランスフェクションの後の、ＲＫＯ及びＲＫＯ-Ｅ６細胞中で生じるアポトーシスの割合(％)を記載するグラフである。ＲＫＯ及びＲＫＯ-Ｅ６細胞は、ｐＨＭ６-ＬａｃＺ又はｐＨＭ６-ｅＩＦ５Ａ１で一過的にトランスフェクションされた。アクチノマイシンＤで処理され、そしてｐＨＭ６-ｅＩＦ５Ａ１でトランスフェクションされたＲＫＯ細胞は、アクチノマイシンＤで処理されずにｐＨＭ６-ＬａｃＺでトランスフェクションされた細胞に対して、アポトーシスの２４０％の増加を示した。アクチノマイシンＤで処理され、そしてｐＨＭ６-ｅＩＦ５Ａ１でトランスフェクションされたＲＫＯ-Ｅ６細胞は、アクチノマイシンＤで処理されていないｐＨＭ６-ＬａｃＺでトランスフェクションされた細胞に対してアポトーシスの１０５％の増加を示した。
【図４０】図４０は、一過的なトランスフェクションの後に、ＲＫＯ細胞において起こるアポトーシスの割合(％)を記載するグラフである。ＲＫＯ細胞は、ｐＨＭ６-ＬａｃＺ、ｐＨＭ６-ｅＩＦ５Ａ１、ｐＨＭ６-ｅＩＦ５Ａ２、又はｐＨＭ６-切り詰めたｅＩＦ５Ａ１で一過的にトランスフェクションされた。ｐＨＭ６-ｅＩＦ５Ａ１でトランスフェクションされた細胞は、ｐＨＭ６-ＬａｃＺでトランスフェクションされたコントロール細胞に対して、アポトーシスの２５％の増加を示した。この増加は、ｐＨＭ６−ｅＩＦ５Ａ２又はｐＨＭ６切り詰めたｅＩＦ５Ａ１でトランスフェクションされた細胞では明らかではなかった。
【図４１】図４１は、一過的トランスフェクションの後で、ＲＫＯ細胞において起こるアポトーシスの割合(％)を記載したグラフである。ＲＫＯ細胞は、トランスフェクションされないままであるか、又はｐＨＭ６-ＬａｃＺ若しくはｐＨ６-ｅＩＦ５Ａ１で一過的にトランスフェクションされた。トランスフェクション効率を修正した後に、ｐＨＭ６-ｅＩＦ５Ａ１でトランスフェクションされた細胞の６０％は、アポトーシスを起した。
【図４２Ａ】図４２は、一過的なトランスフェクションの後のＲＫＯ細胞のアポトーシスのフローサイトメトリー分析の結果を表す。ＲＫＯ細胞は、トランスフェクションされないまま残すか、又はｐＨＭ６−ＬａｃＺ、ｐＨＭ６−ｅＩＦ５Ａ１、ｐＨＭ６−ｅＩＦ５Ａ２、又はｐＨＭ６−切り詰めたｅＩＦ５Ａ１で一過的にトランスフェクションされた。表は、各ゲートのピークの下の面積に基いて計算されたアポトーシスを起している細胞の割合(％）を表す。トランスフェクションされていない細胞におけるアポトーシスのバックグラウンドおよびトランスフェクション効率について補正をした後に、ｐＨＭ６−ｅＩＦ５Ａ１でトランスフェクションされた細胞の８０％が、アポトーシスを表した。ｐＨＭ６−ＬａｃＺ、ｐＨＭ６−ｅＩＦ５Ａ２、又はｐＨＭ６−切り詰めたｅＩＦ５Ａ１でトランスフェクションされた細胞は、アポトーシスのバックグラウンドレベルのみを表した。
【図４２Ｂ】図４２は、一過的なトランスフェクションの後のＲＫＯ細胞のアポトーシスのフローサイトメトリー分析の結果を表す。ＲＫＯ細胞は、トランスフェクションされないまま残すか、又はｐＨＭ６−ＬａｃＺ、ｐＨＭ６−ｅＩＦ５Ａ１、ｐＨＭ６−ｅＩＦ５Ａ２、又はｐＨＭ６−切り詰めたｅＩＦ５Ａ１で一過的にトランスフェクションされた。表は、各ゲートのピークの下の面積に基いて計算されたアポトーシスを起している細胞の割合(％）を表す。トランスフェクションされていない細胞におけるアポトーシスのバックグラウンドおよびトランスフェクション効率について補正をした後に、ｐＨＭ６−ｅＩＦ５Ａ１でトランスフェクションされた細胞の８０％が、アポトーシスを表した。ｐＨＭ６−ＬａｃＺ、ｐＨＭ６−ｅＩＦ５Ａ２、又はｐＨＭ６−切り詰めたｅＩＦ５Ａ１でトランスフェクションされた細胞は、アポトーシスのバックグラウンドレベルのみを表した。
【図４３】図４３は、０.２５μｇ/ｍｌのアクチノマイシンＤで０、３、７、２４、及び４８時間処理されたＲＫＯ細胞から抽出されたタンパク質のウエスタンブロットを提供する。上パネルは、抗-ｐ５３を一次抗体として使用するウエスタンブロットを表す。真中のパネルは、抗-ｅＩＦ５Ａ１を一次抗体として使用するウエスタンブロットを表す。下パネルは、抗-ｅＩＦ５Ａ１ブロット用に使用された膜であって、ロード量が等しいことを示すために化学発光検出の後にクマシー・ブルーで染色された膜を表す。ｐ５３及びｅＩＦ５Ａ１は、両方ともアクチノマイシンＤで処理することにより上方制御される。
【図４４】図４４は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ(ｅＩＦ５ａ)及び増殖ｅＩＦ-５Ａ(ｅＩＦ５ｂ)の両者が、心臓組織で発現されるということを示す棒グラフである。心臓組織は、冠動脈バイパス・グラフと(ＣＡＢＧ)を受けている患者から採られた。ｅＩＦ５ａの遺伝子発現レベル(薄灰色のバー)は、ｅＩＦ５ｂ(濃灰色のバー)と比較される。Ｘ軸は、患者識別番号である。Ｙ軸は、１８ｓのｐｇ/ｎｇ  (リボソームＲＮＡ１８Ｓ(ナノグラム)あたりのメッセンジャーＲＮＡ(ピコグラム))である。
【図４５】図４５は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ(ｅＩＦ５ａ)及びｅＩＦ-５Ａ(ｅＩＦ５ｂ)の増殖の両者が、心臓組織において発現されるということを示す棒グラフである。心臓組織は、弁置換手術を受けている患者から採られた。ｅＩＦ５ａ(薄灰色のバー)の遺伝子発現レベルは、ｅＩＦ５ｂ(濃灰色のバー)と比較される。Ｘ軸は患者識別番号である。Ｙ軸は、１８ｓのｐｇ/ｎｇ(リボソームＲＮＡ１８Ｓ(ナノグラム)あたりのメッセンジャーＲＮＡ(ピコグラム)である。
【図４６】図４６は、虚血前心臓組織及び虚血後心臓組織において、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ(ｅＩＦ５ａ)と増殖ｅＩＦ-５Ａ(ｅＩＦ５ｂ)のリアルタイムＰＣＲにより計測された遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。Ｙ軸は、１８ｓのｐｇ/ｎｇ(リボソームＲＮＡ１８ｓ(ナノグラム)あたりのメッセンジャーＲＮＡ(ピコグラム))である。
【図４７】図４７は、心臓組織で行われた実験を図式的に示す。
【図４８】図４８は、虚血が誘導される前及び後における心臓のＥＫＧを示す。
【図４９】図４９は、図４７に示された実験の装備を備えた研究室のベンチを示す。
【図５０Ａ】図５０Ａ-Ｆは、アポトーシス因子ｅＩＦ-５ａ(ｅＩＦ-５ａ１又は表上でＩＦ５ａ１として記載される)のレベルがＩＬ-１β及びＩＬ-１８のレベルと相関する患者のデーターを記録する。図５０Ａは、冠動脈バイパス・グラフト(ＣＡＢＧ)患者から得たデーターの表である。
【図５０Ｂ】図５０Ｂは、弁置換手術患者から得たデーターの表である。
【図５０Ｃ】図５０Ｃは、ＣＡＢＧタンパク質におけるアポトーシス因子ｅＩＦ-５ａ(因子５ａ１)のＩＬ-１８への相関を表すグラフである。
【図５０Ｄ】図５０Ｄは、ＣＡＢＧ患者において、増殖ｅＩＦ-５ａ(因子ａ２)のＩＬ-１８への相関を表すグラフである。
【図５０Ｅ】図５０Ｅは、弁置換手術患者において、アポトーシス因子ｅＩＦ-５ａ(因子５ａ１)のＩＬ-１８への相関を表すグラフである。
【図５０Ｆ】図５０Ｆは、弁置換手術患者における増殖ｅＩＦ-５ａ(因子ａ２)のＩＬ-１８への相関を表すグラフである。
【図５１】図５１は、図５０Ａ-Ｆにおいて使用される患者データーが得られる患者データーの表である。
【図５１Ａ】図５１は、図５０Ａ-Ｆにおいて使用される患者データーが得られる患者データーの表である。
【図５１Ｂ】図５１は、図５０Ａ-Ｆにおいて使用される患者データーが得られる患者データーの表である。
【図５１Ｃ】図５１は、図５０Ａ-Ｆにおいて使用される患者データーが得られる患者データーの表である。
【図５１Ｄ】図５１は、図５０Ａ-Ｆにおいて使用される患者データーが得られる患者データーの表である。
【図５２】図５２は、(アポトーシス因子５Ａに対する)アンチセンス・オリゴ１、２、及び３で処理された後においてＲＫＯ細胞により産生されるタンパク質のレベルを示す。ＲＫＯ細胞は、アンチセンス・アポトーシス因子５Ａヌクレオチドでトランスフェクションした後、より少ないアポトーシス因子５Ａ及びｐ５３を産生した。
【図５３Ａ】図５３は、蛍光標識されたアンチセンス・オリゴヌクレオチドの取り込みを示す。
【図５３Ｂ】図５３は、蛍光標識されたアンチセンス・オリゴヌクレオチドの取り込みを示す。
【図５４】図５４〜５８は、アンチセンス・アポトーシス因子５Ａオリゴヌクレオチドで処理しなかった細胞と比較して、アンチセンス・アポトーシス因子５Ａ・オリゴヌクレオチドで処理された細胞において、アポトーシスを受ける細胞の割合(％)が減少することを示す。
【図５５】図５４〜５８は、アンチセンス・アポトーシス因子５Ａオリゴヌクレオチドで処理しなかった細胞と比較して、アンチセンス・アポトーシス因子５Ａ・オリゴヌクレオチドで処理された細胞において、アポトーシスを受ける細胞の割合(％)が減少することを示す。
【図５６】図５４〜５８は、アンチセンス・アポトーシス因子５Ａオリゴヌクレオチドで処理しなかった細胞と比較して、アンチセンス・アポトーシス因子５Ａ・オリゴヌクレオチドで処理された細胞において、アポトーシスを受ける細胞の割合(％)が減少することを示す。
【図５７】図５４〜５８は、アンチセンス・アポトーシス因子５Ａオリゴヌクレオチドで処理しなかった細胞と比較して、アンチセンス・アポトーシス因子５Ａ・オリゴヌクレオチドで処理された細胞において、アポトーシスを受ける細胞の割合(％)が減少することを示す。
【図５８】図５４〜５８は、アンチセンス・アポトーシス因子５Ａオリゴヌクレオチドで処理しなかった細胞と比較して、アンチセンス・アポトーシス因子５Ａ・オリゴヌクレオチドで処理された細胞において、アポトーシスを受ける細胞の割合(％)が減少することを示す。
【図５９】図５９は、篩板細胞をＴＮＦ-α及び/又はカンプトテシンで処理することにより、アポトーシスを起している細胞の数が増加されることを示す。
【図６０】図６０及び６１は、アンチセンス・アポトーシス因子５Ａオリゴヌクレオチドでトランスフェクションされていない細胞に比較して、アンチセンス・アポトーシス因子５Ａオリゴヌクレオチドで処理された細胞において、アポトーシスを起している細胞の割合(％)が減少することを示す。
【図６１】図６０及び６１は、アンチセンス・アポトーシス因子５Ａオリゴヌクレオチドでトランスフェクションされていない細胞に比較して、アンチセンス・アポトーシス因子５Ａオリゴヌクレオチドで処理された細胞において、アポトーシスを起している細胞の割合(％)が減少することを示す。
【図６２】図６２は、血清あり又は血清なしのいずれかで、篩板細胞が標識されたｓｉＲＮＡを取り込むということを示す。
【図６３】図６３は、アポトーシス因子５ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞が、より少ないアポトーシス因子５ａタンパク質しか産生せず、そして加えてより多いＢｃｌ-２タンパク質を産生することを示す。アポトーシス因子５Ａ発現の減少は、ＢＣＬ-２発現の増加と相関する。
【図６４】アポトーシス因子５ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞は、より少ないアポトーシス因子５ａタンパク質を産生する。
【図６５】図６５〜６７は、アポトーシス因子５ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞がアンプトテシン(amptothecin)及びＴＮＦ-αに晒された後、アポトーシスを起す細胞の割合(％)が低いことを示す。
【図６６】図６５〜６７は、アポトーシス因子５ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞がアンプトテシン(amptothecin)及びＴＮＦ-αに晒された後、アポトーシスを起す細胞の割合(％)が低いことを示す。
【図６７】図６５〜６７は、アポトーシス因子５ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞がアンプトテシン(amptothecin)及びＴＮＦ-αに晒された後、アポトーシスを起す細胞の割合(％)が低いことを示す。
【図６８】図６８は、図６７及び実施例１３で記載される実験に由来された、ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされ、そしてカンプトテシン及びＴＮＦ-αで処理された篩板細胞系列＃５０６であってヘキスト染色されたものの写真である。アポトーシスを起す細胞は、より明るく染色された細胞として見られる。これらの細胞は、クロマチン凝集のため小さい核を有し、そして小さくかつ不規則な形である。
【図６９】図６９は、アポトーシス因子５Ａでトランスフェクションされ、ＩＬ-１に晒されたＨｅｐＧ２細胞が、トランスフェクションされていない細胞より少ないＴＮＦ-αを分泌するということを示す。
【図７０】図７０は、ヒト・アポトーシス因子５ａの配列(配列番号２９)及び本発明の５種のｓｉＲＮＡの配列(配列番号３０、３１、３２、３３及び３４)を示す。
【図７１】図７１は、ヒト・アポトーシス因子５ａの配列(配列番号２９)及び本発明の３種のアンチセンスポリヌクレオチドの配列(配列番号６３〜６５、それぞれ、登場順に)、並びに、３種の標的ポリヌクレオチドの配列(配列番号３６、３８及び４０、それぞれ、登場順に)を示す。
【図７２】図７２は、ヒトｅＩＦ−５Ａ１に対して標的された３個のアンチセンス・オリゴヌクレオチド(配列番号２５〜２７、それぞれ、登場順に)の結合位置を示す。全長ヌクレオチド配列は、配列番号１９である。
【図７３Ａ】図７３ａ及びｂは、ヒトｅＩＦ５Ａ２(増殖因子ｅＩＦ５Ａ)に対するヒトｅＩＦ５Ａ１(アポトーシス因子５Ａ)のヌクレオチド・配列比較(配列番号４１及び４２、それぞれ、登場順に)及びアミノ酸配列比較(配列番号４３及び２２、それぞれ、登場順に)を示す。
【図７３Ｂ】図７３ａ及びｂは、ヒトｅＩＦ５Ａ２(増殖因子ｅＩＦ５Ａ)に対するヒトｅＩＦ５Ａ１(アポトーシス因子５Ａ)のヌクレオチド・配列比較(配列番号４１及び４２、それぞれ、登場順に)及びアミノ酸配列比較(配列番号４３及び２２、それぞれ、登場順に)を示す。
【図７４Ａ】図７４Ａは、ｅＩＦ５Ａ１に対するｓｉＲＮＡが、抑制されないならば、トランスフェクションされたＨＴ-２９細胞においてＴＮＦ-αの産生を低減したウエスタン・ブロットの写真を提供する。
【図７４Ｂ】図７４Ｂは、ＥＬＩＳＡの結果を提供する。
【図７５】図７５は、ＥＬＩＳＡの結果を提供する。ＴＮＦ-α産生は、ｅＩＦ５Ａ１に対するｓｉＲＮＡで処理された細胞において、コントロール細胞に比べて減少した。
【図７６】図７６は、Ｕ-９３７分化実験のタイムコースを示す。実施例１６を参照のこと。
【図７７】図７７は、ｅＩＦ５Ａ-１が、単球分化及びそれに続くＴＮＦ-αの分泌の間、上方制御されるということを示すウエスタン・ブロットの結果を示す。
【図７８】図７８は、幹細胞分化を表し、並びにサイトカイン産生抑制するためのｅＩＦ-５Ａ１に対するｓｉＲＮＡの使用を示す。
【図７９】図７９は、ＩＬ-８がＴＮＦ-αに応答して並びにインターフェロンに応答して産生されるということを示す棒グラフである。このグラフは、ｅＩＦ５Ａに対するｓｉＲＮＡがインターフェロンに応答して産生されるほとんど全てのＩＬ-８をブロックし、並びにインターフェロン及びＴＮＦの併用治療の結果として産生されるＩＬ-８の有意な量もブロックしたということを示す。
【図８０】図８０は、ＩＬ-８がＴＮＦ-アルファに応答して、並びにインターフェロンに応答して産生されるということを示す他の棒グラフである。このグラフは、ｅＩＦ５Ａに対するｓｉＲＮＡがインターフェロンに応答して産生されるほとんど全てのＩＬ-８をブロックし、並びに有意な量のＩＬ-８がインターフェロンとＴＮＦとの併用療法の結果として産生されるＩＬ-８の有意な量もブロックするということを示す。
【図８１】図８１は、ＩＦＮガンマで８時間及び２４時間処理されたＨＴ２９細胞のウエスタン・ブロットである。該ブロットは、ＨＴ-２９細胞において、インターフェロンガンマに応答するアポトーシスｅＩＦ５Ａの上方制御(８時間で４倍)を示す。
【図８２Ａ】図８２は、免疫蛍光検査による篩板細胞の特徴付けである。８３歳の男性の視神経乳頭から単離された篩板細胞  (#506)が、免疫蛍光検査により特徴付けられた。一次抗体は、ａ)アクチン；ｂ)フィブロネクチン；ｃ)ラミニン；及びｄ)ＧＦＡＰであった。全ての写真を４００倍の倍率で撮影した。
【図８２Ｂ】図８２は、免疫蛍光検査による篩板細胞の特徴付けである。８３歳の男性の視神経乳頭から単離された篩板細胞  (#506)が、免疫蛍光検査により特徴付けられた。一次抗体は、ａ)アクチン；ｂ)フィブロネクチン；ｃ)ラミニン；及びｄ)ＧＦＡＰであった。全ての写真を４００倍の倍率で撮影した。
【図８２Ｃ】図８２は、免疫蛍光検査による篩板細胞の特徴付けである。８３歳の男性の視神経乳頭から単離された篩板細胞  (#506)が、免疫蛍光検査により特徴付けられた。一次抗体は、ａ)アクチン；ｂ)フィブロネクチン；ｃ)ラミニン；及びｄ)ＧＦＡＰであった。全ての写真を４００倍の倍率で撮影した。
【図８２Ｄ】図８２は、免疫蛍光検査による篩板細胞の特徴付けである。８３歳の男性の視神経乳頭から単離された篩板細胞  (#506)が、免疫蛍光検査により特徴付けられた。一次抗体は、ａ)アクチン；ｂ)フィブロネクチン；ｃ)ラミニン；及びｄ)ＧＦＡＰであった。全ての写真を４００倍の倍率で撮影した。
【図８３】カンプトテシン及びＴＮＦ-αでの処理に応答した篩板細胞系列＃５０６のアポトーシスである。篩板細胞系列＃５０６細胞を８ウェル培養スライド上に、１ウェルあたり４００００細胞で蒔いた。３日後、コンフルエントのＬＣ細胞に、１０ｎｇ/ｍｌのＴＮＦ-α、５０μＭカンプトテシン、又は１０ｎｇ/ｍｌのＴＮＦ-α+５０μＭカンプトテシンで処理した。等量のＤＭＳＯ、カンプトテシンの溶媒コントロールを、未処理のコントロール細胞に加えた。処理後４８時間にて、ヘキスト33258で染色し、そしてＵＶフィルターを使用して蛍光顕微鏡により観測した。明るく染色され、凝集され又は断片化された核を有する細胞をアポトーシスを起している細胞として計数した。
【図８４】カンプトテシン又はＴＮＦ-α+カンプトテシン処理の間の、ｅＩＦ５Ａの発現。篩板細胞＃506は、２４ウェルプレート上に、１ウェルあたり４００００細胞で蒔いた。３日後、ＬＣ細胞を５０μＭカンプトテシン又は１０ｎｇ/ｍｌＴＮＦ-α+５０μＭカンプトテシンで処理し、そしてタンパク質ライセートを１、４、８、及び２４時間後に採取した。等量のＤＭＳＯを、溶媒コントロールとしてコントロール細胞に加え、そして細胞ライセートを１及び２４時間後に採取した。各サンプル由来の５μｇのタンパク質を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜へと転写し、そして抗-ｅＩＦ５Ａ抗体でウエスタンブロットした。結合された抗体を、化学発光により検出し、そしてＸ線フイルムに露光した。膜を次に剥がして、そして抗-βアクチンを内部ロード量コントロールとして再ブロットした。
【図８５】ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした後の篩板細胞系列＃５０６及び＃５１７におけるｅＩＦ５Ａの発現。篩板細胞＃５０６及び５１７細胞は、２４ウェルプレート上に、１ウェルあたり１００００細胞で蒔いた。３日後、ＬＣ細胞を、ＧＡＰＤＨｓｉＲＮＡ、ｅＩＦ５Ａ・ｓｉＲＮＡ＃１-４、又はコントロールｓｉＲＮＡ＃５でトランスフェクションした。トランスフェクション後３日、タンパク質ライセートを、回収し、そして各サンプル由来の５μｇのタンパク質を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜へ転写し、そして抗-ｅＩＦ５Ａ抗体でウエスタンブロットした。結合された抗体を、化学発光により検出し、そしてＸ線フイルムに露光した。膜を次に剥がして、そして抗-βアクチンを内部コントロールとして再ブロッティングした。
【図８６】ｅＩＦ５ＡｓｉＲＮＡでトランスフェクションし、そしてＴＮＦ-α及びカンプトテシンで処理した篩板細胞系列＃５０６細胞のアポトーシス。篩板細胞系列＃５０６を、８ウェル培養スライド上に一ウェルあたり７５００個の細胞で蒔いた。３日後、ＬＣ細胞をＧＡＰＤＨ・ｓｉＲＮＡ、ｅＩＦ５Ａ・ｓｉＲＮＡ＃１〜４、又はコントロールｓｉＲＮＡ＃５でトランスフェクションした。７２時間後、トランスフェクションされた細胞を、１０ｎｇ/ｍｌＴＮＦ-α＋５０μＭカンプトテシンで処理した。２４時間後、細胞をヘキスト３３２５８で染色し、そしてＵＶフィルターを使用して蛍光顕微鏡により観察した。明るく染色され、凝縮し、又は断片化した核を有する細胞を、アポトーシスを起しているものとして計測した。このグラフは、ｎ＝４の独立した実験の平均を表す。
【図８７】ｅＩＦ５Ａ・ｓｉＲＮＡ＃１でトランスフェクションされ、そしてＴＮＦ-α及びカンプトテシンで処理された篩板細胞系列＃５１７細胞のアポトーシス。篩板細胞系列＃５１７細胞を、８ウェル培養スライド上で１ウェルあたり７５００で蒔いた。３日後、ＬＣ細胞をｅＩＦ５Ａ・ｓｉＲＮＡ＃１又はコントロールｓｉＲＮＡ＃５でトランスフェクションした。トランスフェクション後７２時間で、トランスフェクションされた細胞を、１０ｎｇ／ｍｌ・ＴＮＦ-α＋５０μＭカンプトテシンで処理した。２４時間後、細胞をヘキスト３３２５８で染色し、そしてＵＶフィルターを使用して蛍光顕微鏡により観察した。明るく染色され、濃縮され、又は断片化された核を有する細胞をアポトーシスを行っている細胞として計数した。２個の独立した実験の結果が、ここに表される。
【図８８】ｅＩＦ５Ａ・ｓｉＲＮＡ＃１でトランスフェクションされ、そしてＴＮＦ-α及びカンプトテシンで処理された篩板細胞系列＃５０６細胞のＴＵＮＥＬ標識。篩板細胞系列＃５０６細胞を、８ウェル培養スライド上で、１ウェルあたり７５００細胞を蒔いた。３日後、ＬＣ細胞をｅＩＦ５Ａ・ｓｉＲＮＡ＃１又はコントロールｓｉＲＮＡ＃５でトランスフェクションした。トランスフェクション後７２時間で、トランスフェクションされた細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ-α＋５０μＭカンプトテシンで処理した。２４時間後、細胞をヘキスト３３２５８で染色し、そしてＤＮＡ断片を、末端デオキシヌクレオチド・トランスフェラーゼ-仲介性ｄＵＴＰ-ジゴキシゲニン末端標識(ＲＵＮＥＬ)法を使用してｉｎ  ｓｉｔｕで評価した。パネルＡは、アポトーシスを起す細胞の断片化されたＤＮＡのＴＵＮＥＬ標識を可視化する蛍光フィルターを使用して、蛍光顕微鏡により観測したスライドを表す。パネルＢは、ヘキスト染色された核を可視化するＵＶフィルターを通すことにより観察された同じスライドを表す。結果は、２個の独立した実験の代表的なものである。全ての写真は、４００倍の倍率で撮影された。
【図８９Ａ】図８９は、ｅＩＦ−５Ａ１に対するｓｉＲＮＡの設計を表す(配列番号４４〜５８、それぞれ、登場順に)。上記ｓｉＲＮＡは、それぞれ、配列番号４５、４８、５１、５４及び５７の配列を有する。全長ポリヌクレオチド配列は、配列番号２９で表される。
【図８９Ｂ】図８９は、ｅＩＦ−５Ａ１(配列番号４４〜５８、それぞれ、登場順に)に対するｓｉＲＮＡの設計を表す。上記ｓｉＲＮＡは、それぞれ、配列番号４５、４８、５１、５４及び５７の配列を有する。全長ポリヌクレオチド配列は、配列番号２９で表される。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
発明の詳細な説明
真核生物開始因子５ａ(ｅＩＦ-５Ａ)の幾つかのアイソフォームが単離され、そして公表されたデーターバンクに存在する。これらのアイソフォームが、機能的に重複していると考えられた。本発明者は、アポトーシスの誘導の直前に１つのアイソフォームが上方制御されるということを発見し、本発明者はこのアイソフォームをアポトーシス因子５Ａ、又はアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ、又は因子５Ａ１、又はｅＩＦ５Ａ１と名付けた。本発明の対象は、アポトーシス因子５並びにｅＩＦ-５Ａの活性化に関与するＤＨＳである。
【００３３】
アポトーシス因子５Ａは、アポトーシスが引き起こす病状を介入するために適した標的であるようだ。なぜなら、アポトーシス因子５Ａは、アポトーシス経路に関与する下流のエフェクター及び転写因子の転写後調節のレベルで作用するようだからである。特異的に、アポトーシス因子５Ａは、アポトーシスの下流エフェクター及び転写因子をコードするｍＲＮＡの核から細胞質へのｍＲＮＡの移動を選択的に促進するようであり、続いて細胞質でｍＲＮＡは翻訳される。アポトーシスを開始するための最終的な決定は、内部と外部のアポトーシス促進性シグナルとアポトーシス抑制性シグナルとの間の複雑な相互作用から生じるようである(Lowe & Lin (2000) Carcinogenesis, 21,485-495)。アポトーシスの下流エフェクター及び転写因子の翻訳を促進する能力を介して、アポトーシス因子５Ａは、シグナル間のバランスをアポトーシスの側に傾けるようである。
【００３４】
従って、本発明は、アポトーシス因子５Ａ又はＤＨＳの発現を抑制又は低減する薬剤を投与することにより細胞のアポトーシスを抑制又は低減する方法を提供する。アポトーシス因子５Ａ又はＤＨＳの発現を抑制又は低減できる１の薬剤は、アンチセンス・オリゴヌクレオチドである。
【００３５】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、in vitro及びin vivoで、遺伝子特異的な抑制を達成するために首尾よく使用されてきた。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、短いＤＮＡ(又はＤＮＡアナログ)の合成鎖であって、特異的ＤＮＡ又はＲＮＡ標的のアンチセンスである(つまり相補的である)鎖である。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、標的に結合し、そして転写、翻訳、又はスプライシングのレベルで発現を止めることにより、ＤＮＡ又はＲＮＡ標的によりコードされるタンパク質の発現を阻止するように設計される。分解に抵抗性である改変骨格(Blake et al., 1985)を使用することにより、例えばオリゴヌクレオチド中のホスホジエステル結合を、ホスホロチオエート結合へと置換して、ヌクレアーゼ分解を妨害すること(Matzura and Eckstein, 1968)により、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、細胞培養及び疾患の動物モデルの両方において首尾よく使用されてきている(Hogrefe, 1999)。
【００３６】
好ましくは、本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、アポトーシス因子５Ａポリペプチド又はアポトーシス特異的ＤＨＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する。本発明者は、種々の細胞系列に、以下に記載されるアポトーシス因子５Ａポリペプチドのタンパク質をコードするアンチセンス・ヌクレオチドをトランスフェクションし、そしてアポトーシスを起す細胞の数を計測した。アンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションされた細胞は、アンチセンス・オリゴでトランスフェクションされていない細胞と比較して、アポトーシスを起している細胞の数の減少を示した。図５４-５８は、アンチセンス・アポトーシス因子５Ａオリゴヌクレオチドで処理された細胞において、アンチセンス・アポトーシス因子５Ａオリゴヌクレオチドでトランスフェクションされていない細胞に比較して、アポトーシスを起している細胞の割合(％)の低下を示した。
【００３７】
本発明は、アポトーシス因子５Ａポリペプチド又はＤＨＳポリペプチドをコードする多くの適切な核酸配列の使用を考慮する。例えば、配列番号１、３、４、５、１１、１５、１９、２０、及び２１(アポトーシス因子５Ａ核酸配列)、配列番号６及び８(アポトーシス特異的ＤＨＳ核酸配列)、配列番号１２及び１６(アポトーシス因子５Ａ配列)、及び配列番号７(アポトーシス特異的ＤＨＳポリペプチド配列)、或いはそれらの一部は、適切な配列を提供する。他の好ましいアポトーシス因子５Ａアンチセンスポリヌクレオチド配列は、配列番号６３〜６５を含む。更なるアンチセンス・ヌクレオチドは、上で列挙されたものと実質的な配列同一性(つまり９０％の相同性)を有するヌクレオチド、又はかなり厳しい条件下で、列挙された配列番号にハイブリッド形成する配列を有するヌクレオチドを含む。さらに、他の適切な配列は、当該技術分野に周知の方法に従って、既知の配列をプローブとして使用して見つけられた。
【００３８】
本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、又はハイブリッドであってもよい。オリゴヌクレオチドは、安定性、ヌクレアーゼ抵抗性などを増大するために、当該技術分野に周知方法によって改変されてもよい。これらの改変は、当該技術分野に周知であり、非限定的にオリゴヌクレオチドの骨格を改変し、糖部分を改変し、又は塩基を改変することを含む。種々のＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド又は「ギャップ」オリゴヌクレオチドと通常呼ばれる構築物も、これらの改変に含まれる。
【００３９】
本発明は、アポトーシス因子５Ａ又はＤＨＳの発現を抑制又は低減することができる他の薬剤を提供する。１のそうした薬剤は、ｓｉＲＮＡである。低分子抑制ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)は、アンチセンス・オリゴヌクレオチドの実行可能な代替物として現れてきた。なぜなら、アンチセンス・オリゴヌクレオチドで達成される抑制レベルと同じか又はそれより優れた抑制レベルを達成するために、より少ない濃度しか必要としないからである(Thompson, 2002)。長い二本鎖ＲＮＡは、種々の生物、例えば植物、線虫、及びショウジョウバエにおいて、特異的な遺伝子発現をサイレンシングするために使用されてきた。ダイサーと呼ばれるＲＮａｓｅ-ＩＩＩファミリーの酵素は、これらの長い二本鎖ＲＮＡを２１〜２３ヌクレオチドの低分子干渉ＲＮＡへとプロセッシングし、該低分子干渉ＲＮＡは、次にＲＮＡ誘導サイレンシング複合体(ＲＩＳＣ)中に組み入れられる。ｓｉＲＮＡがほどかれると、ＲＩＳＣを活性化し、そして一本鎖ｓｉＲＮＡが、塩基対形成により内在性のｍＲＮＡへと複合体形成することを導く。ＲＩＳＣにより内在性ｍＲＮＡが認識されることにより、内在性ｍＲＮＡは切断され、そして結果として、翻訳に利用できないものとしてしまう。長い二本鎖ＲＮＡを哺乳動物細胞に導入することにより、強力な抗ウイルス応答がもたらされ、この過程はｓｉＲＮＡを使用することによりバイパスされ得る(Elbashir et al., 2001)。ｓｉＲＮＡは、細胞培養物において広く使用され、そして通常、９０％以上の特異的遺伝子発現の減少を達成する。
【００４０】
ｓｉＲＮＡの使用は、疾患の動物モデルにおける遺伝子発現を抑制する点で一般的になってきている。最近の研究により、ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡは、水力学的な注射デリバリー技術(Lewis et al., 2002)を使用して、出生後のマウスにおいて、広範囲な組織において共トランスフェクションされたプラスミドからのルシフェラーゼ発現を阻害することができるということが示された。マウスの尻尾静脈内に水力学的に注射されたＦａｓ、ＴＮＦファミリーの受容体に対するｓｉＲＮＡは、８０％超の幹細胞にトランスフェクションフェクションされ、そして最後の注射後１０日まで、肝臓におけるＦａｓ発現を９０％減少させることができた(Song  et al., 2003)。ＦａｓのｓｉＲＮＡはまた、肝臓の線維形成及び劇症肝炎からマウスを保護することもできた。致死量のリポ多糖で処置されたマウスにおける敗血症の発達は、ＴＮＦα(Sorensen et al., 2003)に対するｓｉＲＮＡの使用により抑制された。ｓｉＲＮＡは、細胞培養物において及びin vivoでその長く続く有効性、in vivoで細胞にトランスフェクションできるその能力、並びに血清中での分解抵抗性の観点から、in vivoにおいて特異的遺伝子発現を抑制するためのとても強力な薬剤となる可能性を有する(Bertrand et al., 2002)。
【００４１】
本発明者は、細胞をアポトーシス因子５ＡのｓｉＲＮＡでトランスフェクションし、そしてアポトーシス因子５Ａの発現に関する効果を研究した。図６４は、アポトーシス因子５ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞が、より少ないアポトーシス因子５ａタンパク質を産生するということを示す。図６４〜６７は、アポトーシス因子５ＡのｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞が、アポトーシス因子５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされていない細胞に比較して、アンプトテシン及びＴＮＦ-αに晒された後にアポトーシスを起す細胞の低い割合を有するということを示す。
【００４２】
好ましいｓｉＲＮＡは、配列番号３０、３１、３２、３３及び３４を有するｓｉＲＮＡを含む。更なるｓｉＲＮＡは、列挙された配列に実質的な配列同一性  (つまり９０％の相同性)を有するｓｉＲＮＡを含むか、又は列挙された配列番号に、高度に厳密な条件下でハイブリッド形成する配列を有するｓｉＲＮＡを含む。図６４は、アポトーシス因子５ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞は、より少ないアポトーシス因子５ａタンパク質を産生することを示す。
【００４３】
多くの重要なヒト疾患は、アポトーシスの制御異常により引き起こされる。これらの異常は、細胞数の病的増加(例えば、癌）か又は損害を受けるほどの細胞の減少(例えば、変性疾患)のいずれかになりうる。非制限的な例として、本発明の方法及び組成物は、以下のアポトーシスに関連する疾病及び疾患：神経学的/神経変性疾患(例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性外側硬化症(ルー・ゲーリッグ病)、自己免疫疾患(例えば、リューマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、多発性硬化症)、デュシェンヌ筋ジストロフィー(ＤＭＤ)、運動ニューロン疾患、虚血、心臓虚血、慢性心不全、卒中、乳児性脊髄筋肉萎縮症、心停止、腎不全、アトピー性皮膚炎、敗血症及び感染性ショック、エイズ、肝炎、緑内障、糖尿病(１型及び２型)、喘息、網膜色素変性症、骨粗鬆症、異種移植拒絶、並びに火傷傷害を予防又は治療するために使用されうる。
【００４４】
アポトーシスの制御の異常により引き起こされるそうした疾患の１つは緑内障である。緑内障は、視神経の損傷から生じる目の病気群であり、進行性の盲目をもたらす。アポトーシスは、この視神経損傷の直接的な原因であると示されてきた。
【００４５】
緑内障研究の分野における初期の研究により、ＩＯＰの上昇が篩板のレベルで軸索輸送の妨害を導き、その後に網膜神経節細胞が死ぬということが示唆された(Quigley及びAnderson (1976) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 15,606-16 ; Minckler, Bunt,及びKlock, (1978) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 17,33-50 ; Anderson及びHendrickson, (1974) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 13,771-83 ; Quigley et al., (1980) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 19,505-17)。緑内障の動物モデル及び死後のヒト組織の研究により、緑内障の網膜神経節細胞の死は、アポトーシスにより引き起こされるということが示唆された(Garcia-Valenzuela e. al., (1995) Exp. Eye Res., 61,33-44 ; Quigley et al., (1995) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci, 36,774-786 ; Monard, (1998) In : Haefliger IO, Flammer J (eds) Nitric Oxide and Endothelin in the Pathogenesis of Glauconia, New York, NY, Lippincott-Raven, 213-220)。増大したＩＯＰの結果としての軸索輸送の妨害は、栄養素の欠乏により、網膜神経節細胞死に寄与するかもしれない(Quigley, (1995) Aust N Z J Ophthalmol, 23 (2), 85-91)。緑内障の眼における視神経乳頭星状細胞はまた、いくつかの神経毒性物質の増大したレベルをもたらすことが発見された。例えば、腫瘍壊死因子-α(ＴＮＦ-α)産生の増大(Yan et al., (2000) Arch. Ophthalmol., 118,666-673)、及び一酸化窒素合成(Neufeld et al., (1997) Arch. Ophthalmol., 115,497-503)、一酸化窒素を上昇させる酵素は、緑内障の目の視神経乳頭において見つかった。さらに、一酸化窒素合成の誘導型(ｉＮＯＳ)及びＴＮＦ-αの発現増加は、遺伝的網膜疾患のラットのモデルにおいて観察された(Cotinet et al., (1997) Glia, 20,59-69 ; de Kozak et al., (1997) Ocul. Immunol. Inflamm., 5,85-94 ; Goureau et al., (1999) J. Neurochem, 72,2506-2515)。緑内障視神経乳頭において、過剰量の一酸化窒素は、網膜神経節細胞の軸作の変性に関連した(Arthur及びNeufeld, (1999) Surv Ophthalmol, 43 (Suppl 1), S129-S135)。最後に、模擬的な虚血又は静水圧の増加に応答する網膜グリア細胞によるＴＮＦ-αの産生の増大は、共培養された網膜神経節細胞においてアポトーシスを誘導することが示された(Tezel and Wax, (2000) J Neurosci., 20 (23), 8693-8700)。
【００４６】
アポトーシスによる変性から網膜神経節細胞を守ることは、緑内障が原因の盲目に対する新たな治療の可能性として研究中である。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、網膜の神経節細胞をアポトーシスによる細胞死から保護するために、幾つかのグループによって使用されて、アポトーシス過程における鍵となるタンパク質を標的した。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、特異的なＤＮＡ又はＲＮＡ標識にアンチセンス(又は相補的)である、短い、ＤＮＡ(又はＤＮＡアナログ)の合成鎖である。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、標的に結合し、転写、翻訳、又はスプライシングのレベルで発現を停止することにより、ＤＮＡ又はＲＮＡ標的によりコードされるタンパク質の発現を阻害するように設計される。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを薬として使用するハードルの１つは、ヌクレアーゼにより血液及び細胞中でオリゴヌクレオチドを急速に分解されることである。この問題は、分解に抵抗性の改変された骨格を使用することにより、例えば、オリゴヌクレオチド中のホスホジエステル結合を、ホスホロチオエート結合へと置換して(Matzura and Eckstein,(1968) Eur. J. Biochem.,3, 448−452)、ヌクレアーゼ分解を遅延させることにより取り組まれてきた(Blake et al., (1985) Biochemistry, 24,6139-6145)。
【００４７】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、眼疾患の動物モデルにおいて首尾よく使用されてきた。一時的な網膜全体の虚血のモデルにおいて、カスパーゼ２の発現は、虚血の間、先ず網膜内顆粒層及び網膜神経節細胞層において増大した。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを使用してカスパーゼを抑制することにより、網膜電図により測定される有意な組織病理学的及び機能的な改善が導かれた(Singh et al., (2001) J ; Neurochem., 77 (2), 466-75)。他の試験によって、視神経が切断される際、網膜神経節細胞は、アポトーシス促進性のＢａｘを上方制御し、そしてアポトーシスを引き起こすことが示された。Ｂａｘアンチセンス・オリゴヌクレオチドを、ラットの側頭上網膜(temporal superior retina)に繰り返し注射することにより、Ｂａｘの局所的発現を抑制し、生存する網膜神経節細胞の数を増大し、視神経のトランスアクションを起した(Isenmann et al., (1999) Cell Death Differ., 6 (7). 673-82）。
【００４８】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドを、網膜神経節細胞へとデリバリーすることは、オリゴヌクレオチドをリポソーム中に封入し、次にリポソームが、融合によりセンダイウイルス(HVJ;センダイウイルス)のエンベロープでコートされる(ＨＶＪリポソーム)ことによって改良される。ＨＶＪリポソーム中に封入されたＦＩＴＣ標識アンチセンス・オリゴヌクレオチドを、マウスに硝子体注射することにより、神経節層において４４％の細胞で高い蛍光をもたらした。この蛍光は３日間続いたが、その一方、剥き出しのＦＩＴＣ標識アンチセンス・オリゴヌクレオチドの蛍光は１日後に消失した(Hangai et al., (1998) Arch Ophthalmol, 116 (7), 976）。
【００４９】
本発明のアポトーシスを抑制又は調節する方法は、目の細胞、例えば非限定的に、星状細胞、網膜神経節、網膜グリア細胞、及び篩板細胞（Lamina cribrosa cell）においてアポトーシスを調節することに向けられる。緑内障の網膜神経節細胞の死は、アポトーシスにより起こる。こうして、網膜神経節細胞を、アポトーシスによる変性から保護することにより網膜神経節細胞においてアポトーシスを抑制する方法は、緑内障が原因となる盲目を保護する新規の治療を提供する。
【００５０】
本発明は、アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ１の発現を抑制することにより、緑内障の目において網膜の神経節細胞死を予防する方法を提供する。アポトーシス-特異的ｅＩＦ５Ａ１の発現を抑制することによりアポトーシスが低減される。アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ１は、アポトーシス・プロセスの全体を制御していると思える強力な遺伝子である。こうして、視神経乳頭においてアポトーシスを制御することにより、アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ１の発現阻害が緑内障の治療を提供することが示唆された。
【００５１】
アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ１の発現抑制は、ヒト・アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ１を標的とするアンチセンス・オリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡを、目の細胞、例えば非限定的に篩板、星状細胞、網膜神経節、又は網膜グリア細胞に投与することにより達成される。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、上で定義されたとおりであり、つまり、アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ１ポリペプチドの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を有する。ヒト・アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ１に対して標的されるアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ヒト・アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ１ポリペプチドの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を有する。好ましいアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、配列番号２６又は２７を含み、或いはかなり厳格な状況下で配列番号２６又は２７に相補的な配列に結合するオリゴヌクレオチドを含む。
【００５２】
本発明の別の実施態様は、篩板細胞、星状細胞、網膜神経節細胞、又は網膜グリア細胞において、アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ１の発現を抑制する方法を提供する。ヒト・アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ１に対して標的されたアンチセンス・オリゴヌクレオチド、例えば非限定的に配列番号２６及び２７は、篩板細胞、星状細胞、網膜神経節細胞、又は網膜グリア細胞に投与される。これらの細胞はヒトの細胞であってよい。
【００５３】
アポトーシスにおける役割を有することに加えて、ｅＩＦ５Ａは、免疫応答においても役割を有しうる。本発明者は、虚血心臓組織におけるアポトーシス因子５Ａレベルが、２種のサイトカイン(インターロイキン１-β“ＩＬ-β”及びインターロイキン１８“ＩＬ-１８”)レベルの上昇と相関することを発見し、そうしてさらに、アポトーシス因子５Ａが虚血心臓組織に存在することから、アポトーシス因子５Ａが細胞死に関与することを証明した。さらに、このアポトーシス因子５Ａ／インターロイキンの相関は、非虚血心臓組織においては見られなかった。図５０Ａ-Ｆ、及び５１を参照のこと。ＰＣＲ計測を使用して、アポトーシス因子５Ａ、増殖ｅＩＦ-５ａ(ｅＩＦ５Ａ２-もう一方の既知のアイソフォーム、又は幾つかの図でｅＩＦ５ｂとして記載される)、ＩＬ-１β、及びＩＬ-１８のレベルを、(冠動脈バイパス・グラフト及び弁(僧帽弁及び心房弁)置換手術を受けた患者由来の)種々の虚血性心臓組織において計測し、そして比較した。
【００５４】
アポトーシスｅＩＦ-５ａを強力なインターロイキンへと相関することによって、虚血における炎症及びアポトーシス経路が、アポトーシス因子５Ａのレベルの制御を介して制御されうるということが示唆される。アポトーシス因子５Ａが免疫応答に関与するというさらなる証拠は、ヒト末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)が、通常かなり低いレベルのｅＩＦ５Ａを発現するという事実によって提案されるが、Ｔ-リンパ球特異的刺激で刺激する際、ｅＩＦ５Ａの発現は、劇的に増大する(Bevec et al., 1994)。これにより、Ｔ細胞増殖及び／又は活性化におけるアポトーシス因子５Ａの役割が提案される。活性化Ｔ細胞は、広範なサイトカインを産生することができるので、アポトーシス因子５ＡがサイトカインｍＲＮＡの核細胞質間輸送体として必要とされている可能性もある。
【００５５】
他の研究が、ヒト・末梢血液単核細胞及び種々の成熟刺激剤で処理された血液細胞において、ｅＩＦ-５Ａ・ｍＲＮＡ及び細胞表面マーカーの発現に着目した(Bevec et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 10829- 10833. (1994))。ｅＩＦ-５Ａ・ｍＲＮＡ発現は、Ｔ細胞活性化も誘導する種々の刺激により、ＰＢＭＣにおいて誘導された(Bevec et al., 1994)。ＨＩＶ-１患者において、健康なドナーと比較して高いレベルのＰＢＭＣ・ｅＩＦ-５Ａ・ｍＲＮＡ発現が観測された。この研究の著者は、ｅＩＦ-５ＡｍＲＮＡが誘導され、その結果、ｅＩＦ-５ＡがＴ細胞活性化及びＨＩＶ-１複製に必要である重要なｍＲＮＡを核細胞質間輸送して作用できることを提案することによって、彼らの結果を解釈した(Bevec et al., 1994)。ｅＩＦ５Ａは、ＨＩＶ・Ｒｅｖタンパク質に対する細胞内結合因子であることが示され、そしてＨＩＶ複製に必要とされることが示された(Ruhl et al. 1993)。
【００５６】
本発明者は、特異的な刺激に応じてサイトカインをおそらく産生すると知られている細胞系列を使用して、in vitroで、サイトカインｍＲＮＡを核細胞質間輸送して作用することによりサイトカインの翻訳を促進するｅＩＦ５Ａ１の能力を研究した。いくつかの最近の研究は、ヒト肝臓細胞系列が、他のサイトカインの産生を誘導することによりサイトカイン刺激に応答できるということを見つけた。ＩＬ-１βに応答して、ＨｅｐＧ２細胞は、投与量依存的な様式でＴＮＦ-αのｍＲＮＡとタンパク質を即座に産生する(Frede et al., 1996; Rowell et al., 1997; Wordemann et al., 1998)。こうして、ＨｅｐＧ２細胞は、ＴＮＦ-α産生の制御を研究するためのモデル・システムとして使用された。ＨｅｐＧ２細胞におけるｅＩＦ5Ａ１発現の抑制は、アポトーシス因子５Ａに対するアンチセンス・ヌクレオチドでトランスフェクションされた後で、この細胞におけるＴＮＦαの産生の減少を招くことを本発明者が示した。
【００５７】
こうして、本発明の１の態様は、細胞におけるサイトカインのレベルを低減する方法を提供する。該方法は、アポトーシス因子５Ａ１の発現を抑制することができる細胞へ薬剤を投与することを含む。アポトーシス因子５Ａ１の発現を低減することは、サイトカインの発現の低下を招き、そうして細胞により産生されるサイトカインの量の低下を導く。サイトカインは、好ましくは炎症促進性のサイトカインであり、非限定的にＩＬ-１、ＩＬ-１８、ＩＬ-６、及びＴＮＦ-αを含む。
【００５８】
アポトーシス因子５Ａの発現を低下できる薬剤は、アポトーシス因子５Ａに相補的な配列を有するアンチセンス・ヌクレオチドであってよい。好ましくは、アンチセンス・ヌクレオチドは、配列番号６３〜６５からなる群から選ばれる配列を有するか、又は高度に厳密な条件下で、配列番号６３〜６５からなる群から選ばれる配列にハイブリッド形成するアンチセンス・ヌクレオチドである。
【００５９】
薬剤は、アポトーシス因子５Ａに相補的な配列を有するｓｉＲＮＡを含んでも良い。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、配列番号３０、３１、３２、３３及び３４からなる群から選ばれる配列を有するか、又は配列番号３０、３１、３２、３３及び３４からなる群から選ばれる配列に、かなり厳格な条件下でハイブリッド形成するｓｉＲＮＡである。図６５〜６７は、アポトーシス因子５ＡのｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞が、アンプトテシン及びＴＮＦ-αに晒された後にアポトーシスを受ける細胞の低い割合を有するということを示した。薬剤はまた、アンチセンスＤＨＳヌクレオチドを含んでも良い。
【００６０】
本発明はまた、配列番号６３〜６５からなる群から選ばれる配列を有するポリヌクレオチドにも向けられるか、又は配列番号６３〜６５からなる群から選ばれる配列に高度に厳密な条件下でハイブリッド形成するアンチセンス・ヌクレオチドである。
【００６１】
本発明はまた、配列番号３０、３１、３２、３３及び３４からなる群から選ばれる配列を有するｓｉＲＮＡに向けられるか、又は配列番号３０、３１、３２、３３及び３４からなる群から選ばれる配列に高度に厳密な条件下でハイブリッド形成するｓｉＲＮＡである。
【００６２】
本発明はまた、ｐ５３の発現を低減する方法にも向けられる。本発明はアポトーシス因子５Ａの発現を抑制できる薬剤、例えばアンチセンス・ポリヌクレオチド、又は上で記載されるｓｉＲＮＡを投与することを含む。アポトーシス因子５Ａ１の発現を低減することにより、図５２及び実施例１１に示されるｐ５３の発現が低減される。
【００６３】
本発明はまた、Ｂｃｌ-２の発現を増加する方法にも向けられる。該方法は、アポトーシス因子５Ａの発現を低減することができる薬剤を投与することを必要とする。好ましい薬剤は、上で記載されたアンチセンス・オリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡである。アポトーシス因子５Ａ１の発現低下は、図６３及び実施例１３に示されるＢｃｌ-２の発現を増大させる。アポトーシス因子５ａのｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞が、より少ない量のアポトーシス因子５Ａ１タンパク質を産生し、そしてさらにより多くのＢｃｌ-２タンパク質を産生するという事を、図６３が示した。アポトーシス因子５Ａ１発現の減少は、Ｂｃｌ-２発現の増加と相関する。
【００６４】
本発明はまた、ＴＮＦ-αのレベルを低減することを必要とする患者においてＴＮＦ-αのレベルを低減する方法であって、上記のアンチセンス・ポリヌクレオチド又はｓｉＲＮＡを該患者に投与することを含む方法を提供する。図６９及び実施例１４で示されるように、本発明のアンチセンス因子５Ａオリゴヌクレオチドでトランスフェクションされた細胞は、ＩＬ-１で誘導した後に、そうしたアンチセンス・オリゴヌクレオチドでトランスフェクションされない細胞より少ないＴＮＦ-αを産生した。
【００６５】
本発明は、ヒト上皮細胞におけるＴＮＦ-αのレベルを低減する方法を提供する。図７４Ａ及びＢ、並びに図７５、そして実施例１５において記載されるように、ヒト上皮細胞におけるＴＮＦ-αの産生を完全に抑制しない場合、ｅＩＦ５Ａ１の発現の低減又は抑制は疾患を引き起こす。ｅＩＦ５Ａ１に対するｓｉＲＮＡは、ｅＩＦ５Ａ１の発現を抑制するために使用された。この発現抑制は、ＴＮＦ-αの産生を低減又は抑制するだけではなく、サイトカイン誘導性アポトーシスから細胞を保護する。ｅＩＦ５Ａ１の発現を低減することにより、ＴＮＦ-αの産生は低減される。この双方の効果は、炎症性腸疾患、例えばクローン病及び潰瘍性大腸炎を患う患者を治療する方法を提供する。これらの病気はＴＮＦ-αにより引き起こされる炎症の増化と関連する。
【００６６】
こうして、本発明は、増大されたＩＬ-１、ＴＮＦ-α、ＩＬ６１又はＩＬ-１８レベルにより特徴付けられる病状を治療する方法であって、該病状を有する哺乳動物に、アポトーシス因子５Ａの発現を低減する薬剤を投与することを含む方法を提供する。
【００６７】
ＩＬ-１、ＴＮＦ-α、又はＩＬ-６レベルの増加により特徴付けられた既知の病状は、非限定的に、リウマチ様関節炎及び骨関節炎、喘息、アレルギー、動脈性炎症、クローン病、炎症性腸疾患(ibd)、潰瘍性大腸炎、冠血管心疾患、嚢胞性線維症、糖尿病、ループス、多発性硬化症、グレーブス病、歯周病、緑内障及び黄斑変性症、円錐角膜を含む眼球表面の疾患、器官虚血-心臓、腎臓、再灌流損傷、敗血症、多発性骨髄腫、器官移植片拒絶、乾癬及び湿疹を含む。
【００６８】
最近の研究は、細胞の分化及び活性化におけるｅＩＦ-５Ａの重要な役割を示唆した。未成熟の樹上細胞が、分化及び成熟を誘導されたとき、ｅＩＦ-５Ａ・ｍＲＮＡレベルは、ＣＤ８３タンパク質発現と一致する(Kruse et al., J. Exp. Med. 191 (9): 1581-1589 (2000))。樹上細胞は、ヘルパー及びキラーＴ細胞を感作して、Ｔ細胞性免疫を誘導する抗原提示細胞である(Steinman, 1991)。未成熟の樹上細胞は、Ｔ細胞を刺激する能力を欠き、そしてＴ細胞を活性化することができる細胞へと成熟するために適切な刺激(つまり、炎症性サイトカイン及び／又は微生物産物)を必要とする。成熟細胞におけるＣＤ８３の合成及び表面発現は、ヘルパー及びキラーＴ細胞を感作し、そしてＴ細胞性免疫を誘導する点に重大に関与する。未成熟樹上細胞は、ハイプシン化の阻害剤(ＧＣ７)及びそうしてｅＩＦ-５Ａ活性化の阻害剤で前以って処理されるとき、ＣＤ８３の表面発現は阻害された(Kruse et al., 2000)。本研究の著者は、ｅＩＦ-５Ａが実質的にＣＤ８３ｍＲＮＡの核細胞質間輸送に必須であり、そしてハイプシン化及びそうしてｅＩＦ５Ａを妨害することにより、ＣＤ８３発現及び樹上細胞成熟が妨害される、本発明の結果を解釈した (Kruse et al., 2000)。 
【００６９】
免疫系においてｅＩＦ５Ａの役割を示唆するこれらの研究の両方において(Bevec et al., 1994 ; Kruse et al., 2000)、どちらのｅＩＦ５Ａのアイソフォームを著者が試験したかを特定していないし又は同定していない、またそうする理由付けを持っていなかった。上で間単に記載されるように、ヒトは、ｅＩＦ５Ａの２個のアイソフォーム、ｅＩＦ５Ａ１(アポトーシス因子５Ａ１)とｅＩＦ５Ａ２を有することが知られており、両方ともが、別々の染色体上にコードされる。本発明者の発見の前では、これらのアイソフォームの両方が、機能的に重複していると信じられていた。Bevec et al.,により記載されるオリゴヌクレオチドであって、刺激されたＰＢＭＣにおいてｅＩＦ５Ａ・ｍＲＮＡを検出するために使用されたオリゴヌクレオチドは、ヒトｅＩＦ５Ａ１と１００％の相同性を有し、そして該研究は、ｅＩＦ５Ａ２のクローニング前に行われた。同様にKruse et al.,により記載されるプライマーであって、樹上細胞が成熟する間に逆転写ポリメラーゼ・チェーン反応によりｅＩＦ５Ａを検出するために使用されたプライマーは、ヒトｅＩＦ５Ａ１に対して１００％の相同性を有した。
【００７０】
本発明は、ｅＩＦ５Ａ１の発現を制御して、樹上細胞成熟及びＰＢＭＣ活性化の割合を制御することに関し、該制御は次にＴ細胞性免疫免疫の割合をコントロールしうる。本発明者は、Ｕ-９３７細胞系列を使用して、単球を接着マクロファージへと分化させる際のｅＩＦ-５Ａ１の役割を試験した(Bevec et al., 1994)。なぜなら、Ｕ-９３７は、ｅＩＦ５Ａ・ｍＲＮＡを発現することが知られているからである。Ｕ-９３７は、懸濁状態で成長し、ＰＭＡで刺激した際に、接着し、そしてマクロファージへと分化するヒト単球細胞系列である。培地交換によりＰＭＡを取り除いたとき、細胞は、無活動状態になり、そして次にサイトカインを産生できるようになる(Barrios- Rodiles et al., J. Immunol. 163: 963-969 (1999))。多くの細菌の外膜上に見つかる因子であり、一般的な炎症性応答を誘導することが知られているリポ多糖(ＬＰＳ)に応答して、マクロファージは、ＴＮＦ-αとＩＬ-１βを産生する(Barrios-Rodiles et al., 1999)。幹細胞の分化のチャート及び結果として生じるサイトカインの産生のチャートを示す図７８を参照のこと。Ｕ-９３７細胞はまた、ＬＰＳ刺激の後にＩＬ-６及びＩＬ-１０を産生する(Izeboud et al., J. Receptor & Signal Transduction Research, 19 (1-4): 191-202. (1999))。
【００７１】
Ｕ-９３７細胞を使用して、単球の分化及びＴＮＦ-αの分泌の間、 ｅＩＦ-５Ａ１は上方制御されるということが示された。図７７を参照のこと。従って、本発明の１の態様は、マクロファージの成熟を抑制又は遅延して、サイトカインの産生を抑制又は低減する方法が提供される。本方法は、ＤＨＳ又はｅＩＦ-５Ａ１の発現を低減できる薬剤を提供することを含む。ＤＨＳの発現を低減又は除去することにより、ｅＩＦ-５Ａ１活性化は、低減され又は除去される。ｅＩＦ-５Ａ１は、単球分化及びＴＮＦ-α分泌の間上方制御されるので、ｅＩＦ−５Ａ１は、単球分化及びＴＮＦ−α分泌が生じるために必要であると信じられている。こうして、ｅＩＦ-５Ａ１の活性を低減又は除去することにより、又はｅＩＦ-５Ａ１発現を直接低減又は除去することにより、単球分化及びＴＮＦ-α分泌は、低減又は除去され得る。ＤＨＳ又はｅＩＦ-５Ａ１の発現を低減できる薬剤のいずれかが使用され、そして該薬剤は非限定的に本明細書中に記載されるアンチセンス・オリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡを含む。
【００７２】
本明細書中に使用されるとき、「実質的に同一の配列」又は「実質的に相同性である」という用語は、該配列が他の配列と実質的な構造的又は機能的な同等性を示すということを指す為に使用される。実質的に配列同一性又は実質的に相同性を有する配列間の構造的又は機能的な差のいずれかは、最小である；つまり、この差は、所望の適用形態において意図されたように機能する配列の能力に影響を与えない。差異は、例えば、異なる種間でにおいてコドン使用が生来異なることが原因でありうる。かなりの量の配列の重複が存在し、又は２以上の異なる配列間の類似性が存在するなら、或いは異なる配列が類似の物理的性質を示すなら、配列の長さ又は構造の点で異なるとしても、構造的な差異は、最小であると考えられる。そうした特徴は、例えば、確定された条件下でハイブリッド形成する能力、又はタンパク質の場合、免疫学的交差反応、類似の酵素学的活性などを含む。当業者は、技術分野に周知の方法によって、これらの特徴の各々を容易に測定できる。
【００７３】
さらに、２個のヌクレオチド配列が、その間で少なくとも７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、及び最も好ましくは約９５％以上の配列類似性を有するならば、２個のヌクレオチド配列は「実質的に相補的」である。２個のアミノ酸配列が、活性、又は機能的な関係、ポリペプチドの部分との間で、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の類似性を有するならば、２個のアミノ酸配列は実質的に相同である。
【００７４】
２個の配列を同一割合を測定するために、配列は、最適比較目的(例えば、最適配列比較では、ギャップは第一及び第二アミノ酸配列又は核酸配列のうちの１つ又は両方に導入されうるし、そして比較目的では、非相同配列は無視され得る）で、整列される。好ましい実施態様では、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の長さの参照配列は、比較目的のため整列される。次に対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置でのアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第一配列における位置が、第二配列の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドにより占められるとき、分子は、その位置で同一である(ここで使用されるとき、アミノ酸又は核酸の「同一」は、アミノ酸又は核酸「ホモロジー」と同一である)。２個の配列間の同一性の割合(％)は、これらの配列により共有される同一位置の数の関数であり、２個の配列の最適配列比較のために導入される必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮に入れる。
【００７５】
配列の比較及び、二つの配列間の同一性及び類似性の割合の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成されうる(Computational Molecular Biology, Lesk, A. M.,著., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991)。
【００７６】
本発明の核酸及びタンパク質配列は、さらに「クエリー配列(query sequence)」として使用されて、配列データーベースに対する検索を行って、例えば他のファミリーメンバー又は関連配列を同定する。そうした検索は、Altschul, et al. (1990) J Mol Biol. 215: 403-10のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム(バージョン２.０)を使用して行われうる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラムで行われうる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラムで行われて、本発明のタンパク質と相同なアミノ酸配列を得る。比較目的のため、ギャップのある配列比較を得るために、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402に記載されるギャップＢＬＡＳＴが使用される。ＢＬＡＳＴ及びギャップＢＬＡＳＴプログラムを使用するとき、それぞれのプログラム(例えばＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ)のデフォルトのプログラムが使用されうる。
【００７７】
核酸の「機能的な誘導体」という用語は、本明細書中で使用されて、遺伝子又はヌクレオチド配列のホモログ又はアナログを意味する。機能的な誘導体は、与えられた遺伝子の機能の少なくとも１部を保持し、それにより本発明に従ってその用途を許容する。本明細書中に記載されるアポトーシス因子５Ａポリペプチドの「機能的な誘導体」は、アポトーシス因子５Ａの断片、バリアント、アナログ、又は化学的誘導体であって、少なくともアポトーシス因子５Ａの活性又はアポトーシス因子５Ａに特異的な抗体と免疫学的交差反応を保持するものである。アポトーシス因子５Ａポリペプチドは、分子のサブセットのいずれかを指す。
【００７８】
機能的なバリアントは、機能において何の変化をもたらさないか又は有意でない変化しかもたらさない類似アミノ酸の置換も含みうる。機能に必須なアミノ酸は、当該技術分野において周知な方法、例えば部位特異的突然変異誘発法又はアラニン-スキャン突然変異誘導法(Cunningham et al. (1989) Science 244: 1081-1085)により同定されうる。後者の方法は、分子の全ての残基で、単一のアラニン突然変異を誘導する。得られた突然変異分子は、次に生理活性、例えばキナーゼ活性などについて試験され、又はin vitro増殖活性などのアッセイで試験される。パートナー/基質結合の結合に決定的な部位は、結晶化、核磁気共鳴法、又は光親和性標識(Smith et al.,(1992),J. Mol. Biol. 224: 899-904; de Vos et al. (1992) Science 255: 306-312)によっても決定されうる。
【００７９】
「バリアント」は、遺伝子全体又はその断片のいずれかに実質的に類似する分子を指し、例えば１以上の置換されたヌクレオチドを有するが、特定の遺伝子とハイブリッド形成するか、又は未変性のＤＮＡとハイブリッド形成するｍＲＮＡ転写物をコードする能力を維持するヌクレオチド置換バリアントを指す。「ホモログ」は、異なる動物属又は種由来の断片又はバリアント配列を指す。「アナログ」は、分子全体、バリアント、又はそれらの断片に実質的に類似するか、又はそれらに関して機能する非天然分子を指す。
【００８０】
バリアント・ペプチドは、天然バリアント並びに当該技術分野に周知の方法により製造されるものを含む。そうしたバリアントは、分子技術及び本明細書中に開示される配列情報を使用することにより容易に同定/作成されうる。さらに、そうしたバリアントは、本発明のｅＩＦ５Ａ又はＤＨＳタンパク質に対する配列及び/又は構造ホモロジーに基いて、他のタンパク質から容易に区別されうる。存在するホモロジー／同一性の程度は、そのタンパク質が機能的バリアントであるか又は非機能的バリアントであるか、パラログ／ファミリーにおいて存在する相異量、及びオルソログ間の進化距離に基く。
【００８１】
本発明のｅＩＦ-５Ａ又はＤＨＳの非天然バリアントが、組換え技術を使用して容易に作成され得る。そうしたバリアントは、非限定的にタンパク質のアミノ酸配列中での欠失、添加及び置換を含む。例えば、置換の１のクラスは、保存されたアミノ酸置換である。そうした置換は、タンパク質中の或アミノ酸を、同様の特徴の他のアミノ酸により置換することである。典型的に、保存的置換として見られるのは、脂肪族アミノ酸、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅの間で１のアミノ酸を別のアミノ酸に置き換えること；ヒドロキシル残基ＳｅｒとＴｈｒとの交換；酸性残基ＡｓｐとＧｌｕの交換；アミド残基ＡｓｎとＧｌｎとの間の置換；塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇの交換；及び芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒの間の置き換えである。どのアミノ酸変化が、表現型の上でサイレントであるかに関する手引きは、Bowie et al., Science 247: 1306-1310 (1990)に見られる。
【００８２】
本明細書中で使用される「ハイブリダイゼーション」という用語は、プローブ配列及び標的配列の性質に基いて当業者に容易に明らかである適切な厳密条件で核酸がハイブリダイゼーションすることを意味するために一般的に使用される。ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件は、当該技術分野に周知であり、そしてインキュベーション時間、温度、及び／又は溶液のイオン強度により所望される厳密度に依存して条件を調節することは、容易に達成される。例えば、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第二版, Cold Spring Harbour Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989を参照のこと。
【００８３】
条件の選択は、ハイブリッド形成される配列の長さ、特に、プローブ配列の長さ、核酸の相対ＧＣ含量、及び許容される不適正塩基対の量により決定される。低い相補性を有する鎖の間での部分的なハイブリダイゼーションが所望されるとき、厳密度の低い条件が好ましい。完全又は完全に近い相補性が所望されるとき、厳密度の高い条件が好まれる。典型的に厳密度の高い条件では、ハイブリダイゼーション溶液は、６×Ｓ.Ｓ.Ｃ、０.０１Ｍ・ＥＤＴＡ、１×デンハート溶液及び０.５％ＳＤＳを含む。ハイブリダイゼーションは、クローン化されたＤＮＡの断片について、約６８℃で３〜４時間、真核生物の全ＤＮＡについて約６８℃で１２〜１６時間行った。低い厳密度では、ハイブリダイゼーションの温度は、二本鎖の融点(Ｔｍ)以下である約４２℃まで減らされる。Ｔｍは、ＧＣ含量及び二本鎖の長さ、並びに溶液のイオン強度の関数であると知られている。
【００８４】
本明細書中で使用されるとき、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子の「対応する部分にハイブリッド形成する」というフレーズは、該分子、例えば、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又はいずれかのヌクレオチド配列(センス又はアンチセンスの向き）が、別の核酸分子配列であって、おおよそ同じ大きさでありかつ適切な条件下で該分子に対してハイブリダイゼーションする十分な配列類似性を有する配列を認識し、そしてハイブリッド形成することを意味する。例えば、１００ヌクレオチド長のセンス分子は、２つの配列間に７０％以上の配列類似性が存在する限り、核酸配列のおおよそ１００ヌクレオチド部分を認識しそしてハイブリッド形成する。「対応する部分」の大きさは、ハイブリダイゼーションにおけるいくらかのミスマッチを許容するので、「対応する部分」は、それにハイブリッド形成する分子よりも小さくてもよいし又は大きくてもよく、例えば、２０〜３０％大きいか又は小さく、好ましくは１２〜１５％以下の範囲で大きいか又は小さいということが理解される。
【００８５】
さらに、ポリペプチドの機能的なバリアントは、機能において変化がないか又は取るに足らない変化をもたらす類似アミノ酸の置換も含みうる。機能に必須であるアミノ酸は、当該技術分野に周知である方法、例えば部位特異的突然変異誘導法又はアラニン-スキャン突然変異誘導法(Cunningham et al., Science 244: 1081-1085 (1989))により同定され得る。後者の方法は、分子における全ての残基で単一アラニン突然変異を誘導する。得られた変異分子は、次に生理活性について又はアッセイにおいて試験される。
【００８６】
例えば、アポトーシス因子５Ａのアナログは、非天然タンパク質又はそのタンパク質全体又は断片のいずれかに実質的に類似するペプチドミメティクスを指す。アポトーシス５Ａ因子の化学誘導体は、通常ペプチド又はペプチド断片の一部ではないさらなる化学成分を含む。ペプチドの標的アミノ酸残基を有機誘導体化剤であって、選択された側鎖又は末端残基と反応できるものと反応することにより、改変はペプチド又はその断片中に導入される。
【００８７】
本発明の核酸及びポリペプチドは、予防又は治療の目的で動物に使用される場合、医薬として許容される担体をさらに含む組成物の形態で投与される。適切な医薬として許容される担体は、例えば１以上の水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、並びにそれらの組合せを含む。医薬として許容される担体は、さらに少量の補助物質、例えば湿潤剤又は乳濁剤、保存剤、又は緩衝剤をさらに含むことができ、これらは結合タンパク質の有効期間又は有効性を高める。注射組成物は、当該技術分野に周知であり、哺乳動物に投与された後に、素早く、持続性の、又は遅延した活性成分の放出を提供するために剤形されうる。
【００８８】
本発明の組成物は、様々な形態でありうる。これらは、例えば、固体、半固体、及び液体投与形態、例えば錠剤、ピル、粉末、液体溶液、分散液又は懸濁液、リポソーム、坐薬、注射及び輸液溶液を含む。好ましい形態は、投与及び治療適用の意図されたモードに依存する。
【００８９】
そうした組成物は、医薬分野において周知の様式で製造される。組成物を製造する際、活性成分は、通常担体と混合されるか、又は担体で希釈されるか、及び／又はカプセル、サチェット、紙、又は他の容器の形で剤形されうる。担体が、希釈剤として用いられるとき、担体は、固体、半固体、又は溶媒として働く液体物質、賦形剤、活性成分のための培地でありうる。こうして、組成物は、錠剤、ロゼンジ、サチェット、カプセル、エリクシル、懸濁液、(固体として又は液体培地内の)エアロゾル、例えば活性化合物を重量で１０％まで含む軟膏、軟及び硬ゼラチンカプセル、坐薬、注射液、懸濁液、滅菌パック粉末、及び経皮パッチの形であり得る。
【００９０】
ここで本発明を一般的に記載すると、例示の方法により提供される以下の実施例を参考にして同じことがより容易に理解されるだろう。実施例は、本発明を理解する際に、手助けとなるように記載されるが、その範囲をいずれの方法において制限することを意図されないし、そのように解釈されるべきではない。そうした方法は、当業者に周知であり、そして多くの文献に記載されている。慣用方法、例えばベクター及びプラスミドの構築に使用される方法、ベクター及びプラスミドなどにポリペプチドをコードする核酸を挿入する方法、プラスミドの宿主細胞への導入、及び遺伝子及び遺伝子産物の発現及びその決定などの慣用方法の詳細な記載は、多くの刊行物、例えばSambrook, J. et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Pressから得られる。本明細書中で挙げられる参考文献は、その全てを本明細書中に援用される。
【実施例】
【００９１】
実施例１
ＤＮＡラダー化によるラット黄体のアポトーシスの可視化
アポトーシスの程度をＤＮＡラダー化により測定した。ゲノムＤＮＡを分散黄体細胞から、又は切除した黄体組織から、QIAamp DNA Blood Kit(Qiagen)を使用して、製品説明書に従って単離した。ＰＧＦ-２αで処理することによりアポトーシスを誘導する前、アポトーシスの誘導後１時間、及び２４時間で、黄体組織を切除した。５００ｎｇのＤＮＡを、０.２μＣｉ[α-32Ｐ]ｄＣＴＰ、１ｍＭトリス、０.５ｍＭ・ＥＤＴＡ、３ユニットのクレノー酵素、及び０.２ｐＭづつのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰと室温で３０分インキュベーションすることにより、単離されたＤＮＡを末端標識した。取り込まれていないヌクレオチドを、Sambrook et al.,に従ってサンプルを１ｍｌのSepadex G50カラムに通すことにより取り除いた。サンプルを次にトリス-酢酸-ＥＤＴＡ(１.８％)ゲル電気泳動により分離した。ゲルを３０分間、室温にて吸引下で乾燥して、そして-８０℃で２４時間Ｘ線フィルムに露光した。
【００９２】
１の実験では、過排卵処理されたラット黄体におけるアポトーシスの程度を、ＰＧＦ-２αを注射した０、１、又は２４時間後で試験した。０時間のコントロールにおいて、卵巣は、ＰＧＦ-２α注射することなく取り出された。アポトーシスに関連するヌクレアーゼ活性を反映する低分子量のＤＮＡ断片のラダーは、ＰＧＦ-２αで処理する前に切除されたコントロールの黄体組織において明確ではなかったが、アポトーシスの誘導後１時間内に認められるようになり、そしてアポトーシスの誘導後２４時間でより強調される。これらは図１６に示される。この図では、上のパネルが、32Ｐ-ｄＣＴＰ-標識されたラット黄体アポトーシス特異的ＤＨＳのｃＤＮＡの３’非翻訳領域でプローブされたノーザン・ブロットのオートラジオグラフィーである。下のパネルは、全てのＲＮＡを臭化エチジウム染色したゲルである。各レーンは、１０μｇのＲＮＡを含む。このデーターにより、ｅＩＦ-５Ａ転写産物が、血清の使用を止めた後に下方制御されるということを示す。
【００９３】
別の実施態様では、対応するコントロール動物は、ＰＧＦ-２αの代わりに生理食塩水で処理された。生理食塩水又はＰＧＦ-２αで処理後１５分で、黄体を動物から取り出した。ゲノムＤＮＡを、動物から組織を取り出した後３時間及び５時間で、黄体から単離した。ＤＮＡラダー及び増大された末端標識されたゲノムＤＮＡは、ＰＧＦ-２α処理された動物から組織を取り出した後６時間で明確であったが、組織から取り出した３時間後では、明らかではなかった。図１７を参照のこと。アポトーシスを反映するＤＮＡラダーはまた、黄体をＰＧＦ-２αで処理後１５分で切除し、そしてＥＢＳＳ(Gibco)中のin vitro条件下で６時間維持した時にも明らかである。アポトーシスと関連するヌクレアーゼ活性はまた、ゲノムＤＮＡの末端標識が過度に多いことからも明らかである。
【００９４】
別の実験では、５００μｇのＰＧＦ-２αで皮下注射することにより、過排卵を誘導した。コントロールのラットを、等量の生理食塩水溶液で処理した。１５〜３０分後、卵巣を取り出し、そしてコラゲナーゼで細分化した。ＰＧＦ-２αで処理されたラット由来の分散された細胞を、１０ｍｍグルタミン+１０ｍｍスペルミジンで１時間インキュベーションし、そしてスペルミジンを含まない１０ｍｍグルタミンでさらに５時間インキュベーションするか(レーン２)、又は１０ｍｍグルタミン+１０ｍｍスペルミジンで１時間インキュベーションし、そしてさらに１０ｍｍグルタミン+１ｍｍスペルミジンで５時間インキュベーションした(レーン３)。生理食塩水で処置されたラット由来のコントロール細胞を、コラゲナーゼで分散させ、そして１時間インキュベーションし、さらに５時間グルタミンのみの中でインキュベーションした(レーン１)。各サンプル由来の５００ナノグラムのＤＮＡを、クレノー酵素を使用して[α-32Ｐ]-ｄＣＴＰで標識し、１.８％のアガロースゲルで分離させて、フィルムに２４時間露光した。結果を図１８に示した。
【００９５】
さらに別の実施態様では、過排卵処理されたラットを、５００μｇのＰＧＦ-２αを皮下注射する２４、１２、及び２時間前に、０.３３３ｍｇ/１００ｇ体重の等しい投与量で３回デリバリーして、１００ｍｇ/１００体重ｇのスペルミジンを皮下に注射した。コントロール・ラットを、３のセット：注射なし；スペルミジンを３回注射するが、ＰＧＦ-２αの注射なし；及びＰＧＦ-２α処理前に同じ量の生理食塩水の３回注射する群に分けた。プロスタグランジン処理後１時間３５分で、又は３時間４５分で卵巣をラットから取り出し、そしてＤＮＡの単離に使用した。各サンプル由来のＤＮＡ５００ｎｇを、クレノー酵素を使用して[α-32Ｐ]-ｄＣＴＰで標識し、１.８％アガロースゲル上で分離し、そしてフィルムに２４時間露光した。レーン１、注射なし(レーン３〜５と同じ時に動物を屠殺した)；レーン２、スペルミジンで３回注射(レーン３〜５と同じ時に動物を屠殺した)；レーン３、生理食塩水の３回注射の後にＰＧＦ-２αを注射(動物をＰＧＦ-２αで処理後１時間３５分で屠殺した)；レーン４、スペルミジンの３回注射の後にＰＧＦ２αを注射(ＰＧＦ-２αで処理後１時間３５分で動物を屠殺した)；レーン５、スペルミジンの３回注射の後にＰＧＦ２-αで注射(動物をＰＧＦ-２αで処理後１時間３５分で屠殺した)；レーン６、スペルミジンの３回注射の後にＰＧＦ-２αを注射(動物をＰＧＦ-２αで処理後３時間４５分で屠殺した)；レーン７、スペルミジンの３回注射の後にＰＧＦ-２αを注射(動物をＰＧＦ-２αで処理後３時間４５分で屠殺した)。結果を図１９に示す。
【００９６】
ＲＮＡ単離
ＰＧＦ-２αでアポトーシスを誘導した後、様々な時間でラットから取り出した黄体から全量ＲＮＡを単離した。簡潔に記すと、組織(５ｇ)を液体窒素中で粉末にした。粉末は、３０ｍｌのグアニジウム緩衝液(４Ｍグアニジウム・イソチオシアネート、２.５ｍＭ・ＮａＯＡｃ、ｐＨ８.５、０.８％β-メルカプトエタノール)と混合した。混合体をミラクロス(Miracloth)の４層を通してろ過し、そして４℃１００００ｇで３０分間遠心した。上清を次に、１１２００ｇで２０時間、塩化セシウム密度勾配遠心にかけた。ペレット化されたＲＮＡを７５％エタノールで洗浄し、６００ｍｌのＤＥＰＣ処理水中に再懸濁し、そしてＲＮＡを-７０℃にて１.５ｍｌの９５％エタノール及び６０ｍｌの３Ｍ・ＮａＯＡｃで沈殿させた。
【００９７】
ゲノムＤＮＡ単離及びラダー化
製品説明書に従ってQIAamp DNA Blood Kit (Qiagen)を使用して、抽出された黄体組織又は分散された黄体細胞からゲノムＤＮＡを単離した。５００ｎｇのＤＮＡを０.２μＣｉ［α-32Ｐ］ｄＣＴＰ、１ｍＭトリス、０.５ｍＭ・ＥＤＴＡ、３ユニットのクレノー酵素、及び０.２ｐＭづつのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰと、室温で３０分間インキュベーションすることにより、ＤＮＡを末端標識した。Maniatis et al.,により記載された方法に従って、サンプルを１ｍｌセファデックスＧ-５０カラムを通すことにより、取り込みされていないヌクレオチドを取り除いた。サンプルを次にトリス-酢酸ＥＤＴＡ(２％)ゲル電気泳動により分離した。ゲルを吸引下で３０分間乾燥し、そしてＸ線フィルムに-８０℃で２４時間露光した。
【００９８】
プラスミドＤＮＡ単離、ＤＮＡシーケンス
上記Sambrook et al.,により記載されるアルカリ溶解法を使用して、プラスミドＤＮＡを単離した。全長の陽性ｃＤＮＡクローンを、ジデオキシ・シーケンス法(Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467)を使用してシーケンスした。オープンリーディング・フレームをＢＬＳＴ検索(GenBank, Bethesda, MD)を使用してコンパイルし、そして分析し、そして配列比較をＢＣＭサーチ・ランチャー：多配列比較・パターン誘導性の多配列比較法(F. Corpet, Nuc. Acids Res., 16: 10881-10890, (1987)を参照のこと)を使用してシーケンスした。シーケンス及びシーケンス比較を図５-１１に示す。
【００９９】
ラット黄体ＲＮＡのノーザン・ブロット・ハイブリダイゼーション
アポトーシスの種々のステージでのラット黄体から単離された２０ｍｇの全ＲＮＡを、１％変性ホルムアルデヒド・アガロース・ゲル上で分離し、そしてナイロン膜上に固定した。ランダム・プライマー・キット(Boehringer)を使用して32Ｐ-ｄＣＴＰで標識された全長ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｃＤＮＡ(配列番号１)を使用して、膜をプローブした(７×１０7ｃｐｍ)。代わりに、ランダム・プライマー・キット(Boehringer)を使用して32Ｐ-ｄＣＴＰで標識された全長ラットアポトーシス特異的ＤＨＳ・ｃＤＮＡ(配列番号６)を使用して膜をプローブした(７×１０7ｃｐｍ)。膜を１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで室温で１回、そして０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで６５℃にて３回洗浄した。膜を乾燥し、そして-７０℃で一晩Ｘ線フィルムに露光した。
【０１００】
上記のように、ｅＩＦ-５Ａ及びＤＨＳは、両方ともラット組織をアポトーシスさせる際に上方制御される。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現は、ＰＧＦ-２αで処理することによりアポトーシスを誘導した後に有意に増大される。つまり、時間０で低く、処理後１時間以内にかなり増加し、処理後８時間以内でさらに増加し、そして処理後２４時間以内で少し増加した(図１４)。ＤＨＳの発現は、時間０で低く、処理後１時間でかなり増加し、処理後８時間以内でさらに増加し、そして処理後２４時間以内でさらに少し増加した(図１５)。
【０１０１】
酵母、真菌、及びヒトｅＩＦ-５Ａ配列を使用した、ラット黄体ＲＴ-ＰＣＲ産物の作成
アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの遺伝子の３’末端に対応する部分長のアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ配列(配列番号１１)を、酵母、真菌、及びヒトｅＩＦ-５Ａ配列から設計されたオリゴヌクレオチド・プライマー対を使用するＲＴ-ＰＣＲにより、アポトーシスを起しているラット黄体ＲＮＡテンプレートから作成した。ラットｅＩＦ-５Ａ遺伝子の３’末端を単離するために使用される上流のプライマーは、２０ヌクレオチドの縮重プライマー：５’ＴＣＳＡＡＲＡＣＨＧＧＮＡＡＧＣＡＹＧＧ３’(配列番号９)である。ここで、Ｓは、Ｃ及びＧから選ばれ；ＲはＡ及びＧから選ばれ；ＨはＡ、Ｔ、及びＣから選ばれ；ＹはＣ及びＴから選ばれ、そしてＮは任意の核酸である。ラットｅＩＦ-５Ａ遺伝子の３’末端を単離するために使用される下流のプライマーは、４２ヌクレオチド：５’ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＣＣＡＴＧＧＣＴＣＧＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３’(配列番号１０)を含む。リバース・トランスクリプターゼ・ポリメラーゼ・チェーン反応(ＲＴ-ＰＣＲ)を行った。簡潔に記載すると、下流プライマー５ｍｇを使用し、ｃＤＮＡの主鎖を合成した。上流及び下流のプライマーの両方を使用して、ＲＴ-ＰＣＲにおいて、主鎖をテンプレートとして使用した。
【０１０２】
アガロースゲル上でＲＴ-ＰＣＲ産物を分離することにより、９００ｂｐ断片が存在することがわかった。該９００ｂｐの断片を、平滑末端ライゲーションを使用して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ(商標)(Stratagene Cloning Systems, LaJolla, CA)中にサブクローニングし、配列を決定した(配列番号１１）。３’末端のｃＤＮＡ配列は、配列番号１１であり、そして３’末端のアミノ酸配列は配列番号１２である。図１-２を参照のこと。
【０１０３】
アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ遺伝子の５’末端に対応し、かつ３’末端の配列と重なる部分長のアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ配列(配列番号１５)を、ＲＴ-ＰＣＲにより、アポトーシスを起しているラット黄体ＲＮＡテンプレートから作成した。５’プライマーは、以下の配列：５’ＣＡＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＴＧＧＡＡＴＣＧＡＡＧＣ３’(配列番号１３)を有する２４ｍｅｒであり、該配列は、ヒトｅＩＦ-５Ａ配列から設計された。３’プライマーは、以下の配列：５’ＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＣＣＴＴＧＡＴＴＧＣＡＡＣＡＧＣＴＧＣＣ３’(配列番号１４)を有する３０ｍｅｒであり、該配列は、３’末端ＲＴ-ＰＣＲ断片に従って設計された。リバース・トランスクリプターゼ・ポリメラーゼ・チェーン・リアクション(ＲＴ-ＰＣＲ)を行った。簡潔に記載すると、５ｍｇの下流プライマーを使用して、ｃＤＮＡの主鎖を合成した。上流及び下流プライマーの両者を使用するＲＴ-ＰＣＲにおいてテンプレートとして使用した。
【０１０４】
アガロース・ゲル上でのＲＴ-ＰＣＲ産物の分離は、５００ｂｐの断片を明らかにし、上流及び下流に存在するＸｂａＩ及びＸｈｏＩクローニング・サイトを使用して、該断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ(商標) (Stratagene Cloning Systems, LaJolla, CA)中にサブクローニングし、そしてシーケンスした(配列番号１５)。５’末端のｃＤＮＡ配列は、配列番号１５であり、そして５’末端のアミノ酸配列は配列番号１６である。図２を参照のこと。
【０１０５】
ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの３’末端及び５’末端の配列(配列番号１１と配列番号１５のそれぞれ)は、重なり合い、そして全長ｃＤＮＡ配列を与えた(配列番号１）。全長配列を整列し、そしてＧｅｎＢａｎｋデータ・ベースの配列と比較した。図１-２を参照のこと。ｃＤＮＡクローンは、１６.８ＫＤａの計算された分子量を有する１５４個のアミノ酸のポリペプチド(配列番号２)をコードする。ＲＴ-ＰＣＲにより得られたラットアポトーシス特異的黄体ｅＩＦ-５Ａ遺伝子の全長ｃＤＮＡについてのヌクレオチド配列、配列番号１は、図３に示され、そして対応する派生アミノ酸配列は、配列番号９である。得られたｅＩＦ-５Ａのアミノ酸配列の全長は、ヒト及びマウスｅＩＦ-５ａ配列と配列比較される。図７-９を参照のこと。
【０１０６】
ヒトＤＨＳ配列に基いたプライマーを使用した、アポトーシスを起しているラット黄体のＲＴ-ＰＣＲの作成
アポトーシス特異的ＤＨＳ遺伝子の３’末端に対応する部分長のアポトーシス特異的ＤＨＳ配列(配列番号６)をヒトＤＨＳ配列から設計されたオリゴヌクレオチド・プライマーのペアを使用するＲＴ-ＰＣＲにより、アポトーシスを起しているラット黄体ＲＮＡテンプレートから作成した。５’プライマーは、以下の配列５’ＧＴＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＧＧＣＣＣ３’(配列番号１７)を有する２０ｍｅｒであり;３'プライマーは、以下の配列５’ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＣＣＡＴＧＧＣＴＣＧＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３’(配列番号１８)を有する４２ｍｅｒである。リバース・トランスクリプターゼ・ポリメラーゼ・チェーン反応(ＲＴ-ＰＣＲ)を行った。簡潔に記載すると、５ｍｇの下流プライマーを使用して、ｃＤＮＡの主鎖を合成した。上流及び下流プライマーの両者を使用するＲＴ-ＰＣＲで、主鎖をテンプレートとして使用した。
【０１０７】
ＲＴ-ＰＣＲの産物をアガロース・ゲル上で分離することにより、６０６ｂｐの断片の存在を明らかにした。該断片を、平滑末端ライゲーションを使用してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ(商標)(Stratagene Cloning Systems, LaJolla, CA) 中にサブクローニングし、そしてシーケンスした(配列番号６)。ＲＴ-ＰＣＲにより得られるラット・アポトーシス特異的黄体ＤＨＳ遺伝子の部分長ｃＤＮＡに対するヌクレオチド配列を、図４に記載し、そして対応する派生アミノ酸配列は、配列番号７である。
【０１０８】
ゲノムＤＮＡの単離及びサザン分析
サザンブロッティング用のゲノムＤＮＡを、切除したラット卵巣から単離した。約１００ｍｇの卵巣組織を、小片に分割し、そして１５ｍｌチューブ内に入れた。１ｍｌのＰＢＳを加え、組織懸濁液をゆっくり振盪し、次にピペットを用いてＰＢＳを取り除くことにより、組織を２回ＰＢＳで洗浄した。組織を２.０６ｍｌＤＮＡ緩衝液(０.２Ｍトリス-ＨＣｌ・ｐＨ８.０及び０.１ｍＭ・ＥＤＴＡ)中に再懸濁し、そして２４０μｌの１０％ＳＤＳ及び１００μｌのプロテイナーゼＫ(Boehringer Manheim ; 10 mg/ml)を加えた。組織を４５℃の振盪水浴中に一晩配置した。次の日、別の１００μｌのプロテイナーゼＫ(１０ｍｇ/ｍｌ)を加え、そして組織懸濁液をさらに４時間４５℃にて水浴中でインキュベーションした。インキュベーションした後に、組織懸濁液を等量のフェノール：クロロホルム：イソ-アミル・アルコール(２５：２４：１)で一回抽出し、そして等量のクロロホルム：イソアミルアルコール(２４：１)で抽出した。抽出に続いて、１/１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム(ｐＨ５.２)と２倍量のエタノールを加えた。ブンゼンバーナーを使用して密閉されそしてフック型にされたガラス・ピペットを使用して、ＤＮＡスレッドを溶液からとり、そしてＤＮＡをきれいなマイクロ遠心チューブ中にいれた。ＤＮＡを７０％エタノールで一回洗浄し、そして１０分間風乾した。ＤＮＡペレットを５００μｌの１０ｍＭトリス-ＨＣｌ(ｐＨ８.０)中に溶解し、１０μｌ・ＲＮａｓｅＡ(１０ｍｇ/ｍｌ)を加え、そしてＤＮＡを３７℃で１時間インキュベーションした。ＤＮＡをフェノール：クロロホルム：イソ-アミルアルコール(２５：２４；１)で抽出し、そしてＤＮＡを１/１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム(ｐＨ５.２)及び２倍量のエタノールを加えることにより沈殿させた。ＤＮＡを４℃１３０００×ｇで１０分間遠心することにＤＮＡをペレット化した。ＤＮＡペレットを７０％エタノールで１回洗浄し、そしてＤＮＡを４℃で一晩回転させることにより、２００μｌの１０ｍＭ・トリス-ＨＣｌ(ｐＨ８.０)中に溶解した。
【０１０９】
サザンブロット分析では、ラット卵巣から単離されたゲノムＤＮＡを、内部の遺伝子を切断しないか、又は１回だけ切断する種々の制限酵素で切断した。これを達成するために、１０μｇのゲノムＤＮＡ、２０μｌの１０×反応緩衝液、及び１００Ｕの制限酵素を総反応量２００μｌで５〜６時間反応させた。切断されたＤＮＡを０.７％アガロース・ゲル上にロードし、そして４０ボルトで６時間又は１５ボルトで一晩電気泳動にかけた。電気泳動後、ゲルを１０分間０.２Ｎ・ＨＣｌ中で脱プリン化し、その後変性溶液(０.５Ｍ・ＮａＯＨ、１.５Ｍ・ＮａＣｌ)中で１５分間２回洗浄し、そして中和緩衝液(１.５Ｍ・ＮａＣｌ、０.５Ｍトリス・ＨＣｌ、ｐＨ７.４)中で１５分間２回洗浄した。ＤＮＡをナイロン膜に転写し、そして膜をハイブリダイゼーション溶液(４０％ホルムアミド、６×ＳＳＣ、５×デンハート溶液(１×デンハート溶液は、０.２％フィコール、０.０２％ＰＶＰ、及び０.０２％ＢＳＡ)、０.５％ＳＤＳ、及び１.５ｍｇ変性サケ精子ＤＮＡ)中でプレハイブリダイゼーションした。ラットｅＩＦ-５Ａ・ｃＤＮＡの３’ＵＴＲにおける７００ｂｐのＰＣＲ断片(６５０ｂｐの３’ＵＴＲ及び５０ｂｐのコード領域)を[α-32Ｐ]-ｄＣＴＰでランダム・プライミングをすることにより標識し、そして１×１０6ｃｐｍ/ｍｌで膜に加えた。
【０１１０】
同様に、ラットＤＨＳ・ｃＤＮＡの６０６ｂｐのＰＣＲ断片(４５０ｂｐのコード領域及び１５６ｂｐの３’ＵＴＲ)を、[α-32Ｐ]-ｄＣＴＰでランダム・プライム標識し、そして１×１０6ｃｐｍ/ｍｌで加えて、第二の同一膜へと加えた。ブロットを一晩４２℃でハイブリッド形成させ、そして２×ＳＳＣ及び０.１％ＳＤＳで４２℃にて２回洗浄し、そして１×ＳＳＣ及び０.１％ＳＤＳで４２℃にて２回洗浄した。ブロットを次にフィルムに３〜１０日間露光した。
【０１１１】
図２０に示されるようにラット黄体ゲノムＤＮＡを、制限酵素で切断し、そして32Ｐ-ｄＣＴＰ-標識された全長ｅＩＦ-５Ａ・ｃＤＮＡでプローブした。高い厳密性条件下でのハイブリダイゼーションにより、全長ｃＤＮＡプローブが、各制限酵素で切断されたＤＮＡサンプルについて、幾つかの制限断片にハイブリダイゼーションすることを明らかにされ、このことは、ｅＩＦ-５Ａの幾つかのアイソフォームが存在することを示唆する。特に注目すべきなのは、ラット・ゲノムＤＮＡを、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａのオープン・リーディング・フレーム内に制限酵素部位を有するＥｃｏＲＶで切断したとき、ｅＩＦ-５Ａのアポトーシス特異的アイソフォームの２個の制限酵素断片が、サザンブロットにおいて検出できるということである。この２個の断片を、図２０において二個の矢印で示す。アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａのアイソフォームに対応する制限酵素断片をＥｃｏＲ１及びＢａｍＨ１と記されたレーンにおいて１の矢印により示す。ここで、ＥｃｏＲ１及びＢａｍＨ１は、オープン・リーディング・フレーム内に切断部位が存在しない制限酵素である。これらの結果により、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａが、ラットにおいてシングルコピーの遺伝子であるということが示唆された。図５〜１３において示されるように、ｅＩＦ-５Ａ遺伝子は、種を通じて高度に保存されており、そしていずれかの種におけるアイソフォーム間においてかなりの程度、保存することが予期される。
【０１１２】
図２１は、32Ｐ-ｄＣＴＰ標識された部分長ラット黄体アポトーシス特異的ＤＨＳ・ｃＤＮＡでプローブされたラット・ゲノムＤＮＡのサザン・ブロットを示す。ゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲＶで切断した。ここで該制限酵素は、プローブとして使用される部分長ｃＤＮＡを切断しない。２個の切断断片が明らかであり、該遺伝子の２つのコピーが存在するか、又はこの遺伝子がＥｃｏＲＶサイトを伴うイントロンを含むということが示唆される。
【０１１３】
実施例２
本実施例は、アポトーシス因子５Ａ及びＤＨＳでのアポトーシスの調節を示す。
ＣＯＳ-７細胞の培養及びＲＮＡの単離
ＣＯＳ-７、つまり野生型Ｔ抗原をコードするＳＶ４０の突然変異体で形質転換されたアフリカミドリザル腎臓線維芽細胞様細胞系列をトランスフェクションに基く全ての実験に使用した。ＣＯＳ-７細胞を、１リットルあたり０.５８４ｇのＬ-グルタミン、１リットルあたり４.５ｇのグルコース、及び０.３７％重炭酸ナトリウムを伴うダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ)中で培養した。該培養培地に１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)及び１００ユニットのペニシリン/ストレプトマイシンを加えた。細胞を、５％ＣＯ2及び９５％空気の加湿環境内で成長させた。細胞を３〜４日毎に、接着細胞を０.２５％トリプシン及び１ｍＭ・ＥＤＴＡの溶液で引き剥がすことにより継代した。引き剥がされた細胞を、新鮮な培地が入った新たな培養ディッシュ中に１：１０の分割比で分配した。
【０１１４】
ＲＮＡの単離に使用されるＣＯＳ-７細胞を、１５０ｍｍ組織培養処理されたディッシュ(Corning)中で成長させた。細胞を、トリプシンＥＤＴＡの溶液で引き剥がすことにより回収した。引き剥がされた細胞を、遠心チューブ中に回収し、そして細胞を３０００ｒｐｍで５分間遠心することによりペレット化した。上清を取り除き、そして細胞ペレットを、液体窒素中で急冷凍した。ＲＮＡを冷凍細胞から、製品説明書に従ってジーン・エリュート哺乳動物トータルＲＮＡミニプレップ・キット(GenElute・Mammalian TotalRNA・Miniprep・Kit)(Sigma)を使用して単離した。
【０１１５】
組換えプラスミドの構築及びＣＯＳ-７細胞のトランスフェクション
ラット・アポトーシスｅＩＦ-５Ａの全長コード配列をセンスの向きに含み、かつラット・アポトーシスｅＩＦ-５Ａの３’非翻訳領域(ＵＴＲ)をアンチセンスの向きに含む組換えプラスミドを、哺乳動物エピトープ・タグ発現ベクター、ｐＨＭ６(Roche  Molecular  Biochemicals)を使用して構築され、該プラスミドは、図２１に例示される。該ベクターは、以下の：ＣＭＶプロモーター-ヒト・サイトメガロウイルス前初期プロモーター/エンハンサー；ＨＡ-インフルエンザ・ヘマグルチニン由来のノナペプチド・エピトープ・タグ；ＢＧＨｐＡ-ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル；ｆ１ｏｒｉ-Ｆ１開始点；ＳＶ４０ｏｒｉ-ＳＶ４０初期プロモーター及び開始点；ネオマイシン-ネオマイシン耐性(Ｇ４１８)遺伝子；ＳＶ４０ｐＡ-ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル；ＣｏｌＥ１-ＣｏｌＥ１開始点；アンピシリン-アンピシリン耐性遺伝子を含む。ラット・アポトーシスｅＩＦ-５Ａ及びラット・アポトーシスｅＩＦ-５Ａの３’ＵＴＲの全長コード配列は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中のオリジナルのラットｅＩＦ-５Ａ・ＲＴ-ＰＣＲ断片(配列番号１）からＰＣＲにより増幅された。全長ｅＩＦ-５Ａを増幅するために、使用されるプライマーは、以下の：フォワード５’ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＧＧＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＧＧ３’（配列番号５９）(Ｈｉｎｄ３)とリバース５’ＣＴＧＡＡＴＴＣＣＡＧＴＴＡＴＴＴＴＧＣＣＡＴＧＧ３’（配列番号６０）(ＥｃｏＲ１)である。ラットｅＩＦ-５Ａの３’ＵＴＲを増殖させるために、使用されるプライマーは、以下の：フォワード５’ＡＡＴＧＡＡＴＴＣＣＧＣＣＡＴＧＡＣＡＧＡＧＧＡＧＧＣ３’（配列番号６１）(ＥｃｏＲ１)とリバース５’ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＣＣＡＴＧＧＣＴＣＧＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３’（配列番号６２）(Ｈｉｎｄ３)である。
【０１１６】
アガロース・ゲル電気泳動後に単離された全長ラット・ｅＩＦ-５Ａ・ＰＣＲ産物は、４３０ｂｐの長さであり、一方３’ＵＴＲラットｅＩＦ-５Ａ・ＰＣＲ産物は６９７ｂｐの長さであった。ＰＣＲ産物の両者は、ｐＨＭ６のＨｉｎｄ３及びＥｃｏＲ１サイトにサブクローンされて、ｐＨＭ６-全長ｅＩＦ-５Ａ及びｐＨＭ６-アンチセンス３’ＵＴＲｅＩＦ５Ａを作った。全長ラットｅＩＦ-５Ａ・ＰＣＲ産物を、抗-[ＨＡ]-ペルオキシダーゼ抗体を使用して組換えタンパク質の検出を許容するように、多重クローニング部位の上流のインフルエンザ・ヘマグルチニン(ＨＡ)由来のノナペプチド・エピトープタグとフレーム内にサブクローニングした。発現は、ヒト・サイトメガロウイルス前初期プロモーター/エンハンサーにより行われて、哺乳動物細胞系列において高い発現レベルを保証する。該プラスミドはまた、安定な形質転換体の選別を可能にするネオマイシン-抵抗性(Ｇ４１８)遺伝子、ＳＶ４０巨大Ｔ抗原を発現する細胞、例えばＣＯＳ-７内でエピソーム複製を許容するＳＶ４０初期プロモーター及び開始点を特徴とする。
【０１１７】
トランスフェクション実験において使用されるＣＯＳ-７細胞を、タンパク質抽出に使用される細胞については２４ウェル細胞培養プレート(Corning)内で、或いは染色に使用される細胞については４チャンバー培養スライド(Falcon)内で培養した。細胞を１０％FBSを加えたが、ペニシリン/ストレプトマイシンを欠いたＤＭＥＭ中で、５０〜７０％コンフルエントになるまで成長させた。２４ウェル・プレートの１ウェル又は培養スライドに十分なトランスフェクション培地を、０.３２μｇのプラスミドＤＮＡを４２.５μｌの無血清ＤＭＥＭ中に希釈し、そして室温で５分間インキュベーションした。５分後、リポフェクタミン(LipofectAMINE)混合液をＤＮＡ混合液に加え、そして室温で３０〜６０分間インキュベーションした。トランスフェクションされる細胞を、トランスフェクション培地を重層する前に、無血清ＤＭＥＭで１回洗浄し、そして細胞を成長チャンバー中に４時間戻した。
【０１１８】
インキュベーション後、０.１７ｍｌのＤＭＥＭ+２０％ＦＢＳを細胞に加えた。ウエスタン・ブロット分析用の染色又は回収に先立ってアポトーシスを起すように誘導される前に、細胞をさらに４０時間培養した。コントロールとして、プラスミドＤＮＡをトランスフェクション培地から取り除いた偽トランスフェクションを行った。
【０１１９】
タンパク質抽出及びウエスタン・ブロッティング
細胞をＰＢＳ(８ｇ/Ｌ・ＮａＣｌ、０.２ｇ/Ｌ・ＫＣｌ、１.４４ｇ/Ｌ・Ｎａ2ＨＰＯ4、及び０.２４ｇ/Ｌ・ＫＨ2ＰＯ4)中で２回洗浄し、次に１５０μｌの熱ＳＤＳゲル添加液(５０ｍＭトリスＨＣｌ・ｐＨ６.８、１００ｍＭジチオスレイトール、２％ＳＤＳ、０.１％ブロモフェノール・ブルー、及び１０％グリセロール)を加えることにより、トランスフェクションされた細胞からタンパク質をウエスタン・ブロッティング用に単離した。細胞ライセートをマイクロ遠心チューブ内に回収し、９５℃で１０分間熱し、そして次に１３０００×ｇで１０分間遠心した。上清を新たなマイクロ遠心チューブに移し、そして-２０℃で使用するまで貯蔵した。
【０１２０】
ウエスタン・ブロッティング用に、２.５又は５μｇの全タンパク質を、１２％ＳＤＳ-ポリアクリルアミド・ゲル上で分離した。分離したタンパク質を、ポリビニリデン・ジフロリド膜に転写した。該膜を次に１時間、ブロッキング溶液(５％スキムミルク粉末、０.０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ)中でインキュベーションし、そしてＰＢＳ-Ｔ(ＰＢＳ+０.０５％Ｔｗｅｅｎ-２０)で１５分間３回洗浄した。膜を一晩ＰＢＳ-Ｔ中で、４℃で保存した。次の日に室温まで温め、膜を３０秒間１μｇ/ｍｌのポリビニル・アルコール中でブロッキングした。膜を脱イオン水で５回洗浄し、そしてＰＢＳ中の５％ミルクの溶液中で３０分間ブロッキングした。一次抗体をＰＢＳ中５％ミルクの溶液中で、膜とインキュベーションする前に、３０分間プレインキュベーションした。
【０１２１】
幾つかの一次抗体を使用した。抗-[ＨＡ]-ペルオキシダーゼ抗体(Roche Molecular Biochemicals)を、１：５０００の希釈度で使用して、組換えタンパク質の発現を検出した。この抗体が、ペルオキシダーゼに結合されているので、二次抗体は必要がなく、そしてブロットを洗浄し、そして化学発光により現像された。使用された他の一次抗体は、Oncogeneから購入したモノクローナル抗体であって、ｐ５３を認識するもの(Ａｂ-６)、Ｂｃｌ-２を認識するもの(Ａｂ-１)、及びｃ-Ｍｙｃを認識するもの(Ａｂ-２)である。ｐ５３に対するモノクローナル抗体を０.１μｇ/ｍｌの希釈度で使用し、そしてＢｃｌ-２及びｃ-Ｍｙｃに対するモノクローナル抗体は、０.８３μｇ/ｍｌの希釈度で使用した。一次抗体で６０〜９０分間インキュベーションした後に、膜をＰＢＳ-Ｔ中で１５分間３回洗浄した。二次抗体を１％ミルクを含むＰＢＳ中に希釈し、そして膜と６０〜９０分間インキュベーションした。ｐ５３(Ａｂ-６)を一次抗体として使用したとき、使用される二次抗体は、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ (Rockland)であり、１：１０００の希釈度であった。 Ｂｃｌ-２(Ａｂ-１)及びｃ-Ｍｙｃ(Ａｂ-２)を一次抗体として使用するとき、ペルオキシダーゼ結合ラビット抗マウスＩｇＧを、１：５０００の希釈度で使用した。二次抗体とインキュベーションした後に、膜をＰＢＳ-Ｔ中で３回洗浄した。
【０１２２】
ブロットを現像するために２種の検出方法、比色法と化学発光法を使用した。比色法は、ｐ５３(Ａｂ-６)を一次抗体として、アルカリホスファターゼ結合二次抗体と組み合わせて使用するときのみ、使用した。結合された抗体を、暗所で、０.３３ｍｇ/ｍｌニトロ・ブルー・テトラゾリウム、０.１６５ｍｇ/ｍｌ５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル・ホスフェート、１００ｍＭ・ＮａＣｌ、５ｍＭ・ＭｇＣｌ2、及び１００ｍＭ・トリス-ＨＣｌ(ｐＨ９.５)の溶液中でインキュベーションすることにより可視化された。呈色反応は、ブロットを２ｍＭ・ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中でインキュベーションすることにより停止された。化学発光検出法は、抗-[ＨＡ]-ペルオキシダーゼ、Ｂｃｌ-２(Ａｂ-１)、及びｃ-Ｍｙｃ(Ａｂ-２)を含む他の一次抗体全てについて使用された。ＥＣＬプラス・ウエスタン・ブロッティング検出キット(ECL Plus Western blotting detection kit )(Amersham Pharmacia Biotech)を使用して、ペルキシダーゼ結合抗体を検出した。簡潔に記載すると、膜を軽く乾燥状態でブロットし、次に暗所で試薬Ａと試薬Ｂの４０：１混合液と５分間インキュベーションした。膜を乾燥状態でブロットし、アセテート/シートの間に置き、そして１０秒〜１０分で時間を変えて、Ｘ線フィルムに露光した。
【０１２３】
ＣＯＳ７細胞におけるアポトーシスの誘導
トランスフェクションされたＣＯＳ-７細胞においてアポトーシスを誘導するために、２種の方法、血清飢餓及びアクチノマイシンＤ、ストレプトマイシスｓｐ(streptomyces sp)(Calbiochem)処理を使用した。両方の処理において、培地をトランスフェクション後４０時間で取り除いた。血清飢餓実験においては、培地を、血清-及び抗生物質を伴わないＤＭＥＭと置換した。１０％ＦＢＳを加えた抗生物質を伴わないＤＭＥＭをコントロールとして使用した。アクチノマイシンＤによるアポトーシス誘導では、培地を１０％ＦＢＳ及びメタノール中に溶解した１μｇ/ｍｌアクチノマイシンＤを加えた抗生物質を含まないＤＭＥＭと置換された。コントロール細胞を、１０％ＦＢＳ及び等量のメタノールを加えた抗生物質を含まないＤＭＥＭ中で成長させた。両方の方法では、アポトーシスを起している細胞の割合(％)を、ヘキスト又はアネキシンＶ-Ｃｙ-３で染色することにより４８時間後に測定した。アポトーシスの誘導を、図２２において示されるようにノーザンブロット分析により確認した。
【０１２４】
ヘキスト染色
核断片化及び凝集などの形態的特徴に基いたアポトーシスを起している細胞を同定するために、核染色であるヘキストを使用して、トランスフェクションされたＣＯＳ-７の細胞の核を標識した。３：１の無水メタノール及び氷酢酸からなる固定液を、使用直前に調製した。等量の固定液を、培養スライド上で成長しているＣＯＳ-７細胞の培地に加え、そして２分間インキュベーションした。培地/固定液の混合液を細胞から取り除いて、捨て、そして１ｍｌの固定液を細胞に加えた。５分後、固定液をすて、そして１ｍｌの新たな固定液を細胞に加えて５分間インキュベーションした。固定液を捨て、細胞を４分間風乾し、その後１ｍｌのヘキスト染色液(０.５μｇ/ｍｌへキスト３３２５８を含むＰＢＳ)を加えた。暗所で１０分のインキュベーションの後、染色溶液を捨て、そしてスライドを脱イオン水で１分間３回洗浄した。洗浄後、１ｍｌのマックルバイン(McIlvine's)緩衝液(０.０２１Ｍクエン酸、０.０５８Ｍ・Ｎａ2ＨＰＯ4７Ｈ2Ｏ；ｐＨ５.６)を細胞に加え、そして細胞を暗所で２０分間インキュベーションした。緩衝液を捨て、そして細胞を暗所で５分間風乾し、そして培養スライドのウェルを区切るチャンバーを取り除いた。蛍光用ベクタシールド(Vectashield)標本用培地(Vector Laboratories)の数滴をスライドに加え、そしてカバーガラスを被せた。染色された細胞をＵＶフィルターを使用する蛍光顕微鏡の下で観察した。明るく染色されるか又は断片化された核を有する細胞を、アポトーシスを起している細胞として計測した。
【０１２５】
アネキシンＶ-Ｃｙ３染色
アネキシンＶ-Ｃｙ３アポトーシス検出キット(Sigma)は、アポトーシス細胞上の外表面に現われたホスファチジルセリンを蛍光標識するために使用された。該キットを、以下の改変を伴った製品プロトコルに従って使用した。簡潔に記載すると、４個のチャンバー培養スライド上で成長するトランスフェクションされたＣＯＳ-７細胞を、ＰＢＳで二回洗浄し、そして１×結合緩衝液で３回洗浄した。１５０μｌの染色溶液(１×結合緩衝液中の１μｇ/ｍｌＡｎｎＣｙ３)を加え、そして細胞を暗所で１０分間インキュベーションした。染色溶液を次に取り除き、そして細胞を１×結合緩衝液で５回洗浄した。チャンバー壁を培養スライドから取り除き、そして数滴の１×結合緩衝液を細胞上に配置し、そしてカバーガラスを被せた。染色された細胞を、緑色のフィルターを使用する蛍光顕微鏡により分析して、陽性染色された(アポトーシスを起している)細胞の赤色蛍光を可視化した。全細胞数を、可視光の下で細胞数を計数することにより測定した。
【０１２６】
実施例３
本実施例は、アポトーシス因子５Ａ及びＤＨＳでの、アポトーシスの調節を示す。
一般的方法及び前の実施例において記載される方法を使用して、図２３は、ＣＯＳ-７細胞の一過性トランスフェクションの方法を記載するフローチャートであり、ここで無血清培地中の細胞を、プラスミドＤＮＡを含むリポフェクタミン中で４時間インキュベーションし、血清を加え、そして細胞をさらに４０時間インキュベーションした。細胞を次に、分析前にさらに４８時間血清を含む通常培地中でインキュベーションするか(つまり更なる処理なし)、分析前に血清を４８時間欠乏させてアポトーシスを誘導するか、又はアクチノマイシンＤで４８時間処理して分析前にアポトーシスを誘導した。
【０１２７】
図２２は、ｐＨＭ６でトランスフェクションした後、ＣＯＳ-７細胞中における外来タンパク質の一過的な発現を示すウエスタンブロットである。偽トランスフェクション、或いはｐＨＭ６-ＬａｃＺ、ｐＨＭ６-アンチセンス３’ｒＦ５Ａ(ｐＨＭ６-アンチセンス３’ＵＴＲアポトーシスｅＩＦ-５Ａ)、又はｐＨＭ６-センスｒＦ５Ａ(ｐＨＭ６-全長ラットアポトーシスｅＩＦ-５Ａ)でトランスフェクションされた４８時間あとで、タンパク質をＣＯＳ-７細胞から単離した。各サンプルからの５μｇのタンパク質をＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分画し、ＰＶＤＦ膜に転写し、そして抗-[ＨＡ]-ペルオキシダーゼでウエスタンブロットした。結合抗体を、化学発光により検出し、そしてＸ線フイルムに３０秒間露光した。ＬａｃＺ(レーン２)及びセンス・ラット・アポトーシスｅＩＦ-５Ａ(レーン４)の発現は、明らかに見ることができる。
【０１２８】
上で記載されるように、ＣＯＳ-７細胞は、偽トランスフェクションされるか、或いはｐＨＭ６-センスｒＦ５Ａ(ｐＨＭ６-全長ラットｅＩＦ-５Ａ)でトランスフェクションされる。トランスフェクション後４０時間で、４８時間血清を取り除くことによりアポトーシスを引き起こすように、細胞を誘導した。トランスフェクションされた細胞抽出液におけるカスパーゼのタンパク質分解活性を、蛍光定量的に均一なカスパーゼ・アッセイ・キット(fluorometric homogenous caspase assay kit)(Roche Diagnostics)を使用して計測した。ＤＮＡ断片を、ＦｒａｇＥＬ・ＤＮＡ断片アポトーシス検出キット(FragEl DNA Fragmentation Apotosis Detection Kit)(Oncogene)を使用して計測した。該キットは、ＤＮＡ断片の晒された３’ＯＨ末端を蛍光標識されたデオキシヌクレオチドで標識する。
【０１２９】
更なるＣＯＳ-７細胞を、偽トランスフェクションし、或いは ｐＨＭ６-センスｒＦ５Ａ(ｐＨＭ６-全長ラットｅＩＦ-５Ａ)でトランスフェクションした。トランスフェクション後４０時間で、細胞を血清を含む通常培地中でさらに４８時間成長させるか、４８時間血清を取り除くことによりアポトーシスを誘導させるか、又は４８時間０.５μｇ/ｍｌのアクチノマイシンＤで処理することによりアポトーシスを誘導させた。アポトーシスに付随する核の断片化を表すヘキスト３３２５８で細胞を染色するか、又はアポトーシスに付随するホスファチジルセリンの露出を表すアネキシンＶ-Ｃｙ３で染色した。染色された細胞を、緑色フィルターを使用する蛍光顕微鏡により観測し、そしてアポトーシスを起している細胞の割合(％)測定するために計数した。全細胞数を、可視光のもとで計数した。
【０１３０】
図２５は、ＣＯＳ-７細胞が全長ラット・アポトーシス誘導性ｅＩＦ-５Ａをセンスの向きで含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされたとき、増加されたカスパーゼ活性により反映されるアポトーシスの増加を表す。アポトーシス誘導性ｅＩＦ-５Ａの発現は、カスパーゼ活性の６０％増加をもたらす。
【０１３１】
図２６は、ＣＯＳ-７細胞が、全長ラット・アポトーシス誘導性ｅＩＦ-５Ａをセンスの向きに含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされたとき、増大されたＤＮＡの断片により反映されるアポトーシスの増加を表す。ラット・アポトーシス誘導性ｅＩＦ-５Ａの発現は、ＤＮＡ断片の２７３％の増加をもたらした。図２７は、ＣＯＳ-７細胞が全長ラット・アポトーシス誘導性ｅＩＦ-５Ａをセンスの向きに含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされたとき、増大された核断片により反映されるアポトーシスの検出を表す。ラット・アポトーシス誘導性ｅＩＦ-５Ａを発現する細胞において、断片化された核がより多く発生する。図２８は、ＣＯＳ-７細胞が、全長ラット・アポトーシス誘導性ｅＩＦ-５Ａをセンスの向きで含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされたとき、増加した核断片化により反映されるアポトーシスの増加を表す。ラット・アポトーシス誘導性ｅＩＦ-５Ａの発現は、非血清飢餓及び血清飢餓サンプルのコントロールに対して、それぞれ２７％及び６３％増加した。
【０１３２】
図２９は、ＣＯＳ-７細胞が全長ラットアポトーシス誘導性ｅＩＦ-５Ａをセンスの向きに含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされた場合の、ホスファチジルセリンの露出により反映されるアポトーシスの検出を表す。図３０は、ＣＯＳ-７細胞が全長ラット・アポトーシス誘導性ｅＩＦ-５Ａをセンスの向きに含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされるとき、ホスファチジルセリンの露出の増加により反映されるアポトーシスの増加を表す。アポトーシス誘導性ｅＩＦ-５Ａの発現は、非血清飢餓及び血清飢餓サンプルのコントロールに対して、ホスファチジルセリンの露出の１４０％及び１９８％の増加をもたらした。
【０１３３】
図３１は、ＣＯＳ-７細胞が全長ラットアポトーシス誘導性ｅＩＦ-５Ａをセンスの向きに含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされたとき、増大した核断片により反映されるアポトーシスの増加を表す。ラット・アポトーシス誘導性ｅＩＦ-５Ａの発現は、未処理及び処理サンプルにおけるコントロールに対して、それぞれ１１５％及び６２％の核断片の増加をもたらした。図３２は、全長ラットアポトーシス誘導性ｅＩＦ-５Ａをセンスの向きに含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされるＣＯＳ-７細胞が、アポトーシスを起すための更なる処理を受ける条件下、又は受けない条件下でのアポトーシスの増加の比較を表す。
【０１３４】
実施例４
本実施例は、アポトーシス因子５Ａ及びＤＨＳの投与後の、アポトーシス活性の調節を表す。
ＣＯＳ-７細胞は、偽トランスフェクションされるか、ｐＨＭ６-ＬａｃＺでトランスフェクションされるか、又はｐＨＭ６-センスｒＦ５Ａ(ｐＨＭ６-全長ラットｅＩＦ-５Ａ)でトランスフェクションされ、そして４０時間インキュベーションされた。各サンプルから抽出されるタンパク質５μｇのサンプルを、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分画し、ＰＶＤＦ膜へと転写し、そしてＢｃｌ-２を認識するモノクローナル抗体でウエスタン・ブロットした。ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスＩｇＧを二次抗体として使用し、そして結合した抗体を化学発光及びＸ線フィルムへの露光により検出した。結果を図３２において示す。ｐＨＭ６-ＬａｃＺでトランスフェクションされた細胞において検出できるＢｃｌ−２より少ないＢｃｌ-２を、ｐＨＭ６-センス-ｒＦ５Ａでトランスフェクションされた細胞で検出した。これより、Ｂｃｌ-２は、下方制御されている。
【０１３５】
さらなるＣＯＳ-７細胞は、偽トランスフェクションされるか、ｐＨＭ６-アンチセンス３’ｒＦ５Ａでトランスフェクションされるか、又はｐＨＭ６-センスｒＦ５Ａ(ｐＨＭ６全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ)でトランスフェクションされた。トランスフェクション後４０時間で、血清を４８時間取り除くことによりアポトーシスを誘導した。各サンプル由来のタンパク質抽出液サンプル５μｇを、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分画して、ＰＶＤＦ膜に転写し、そしてＢｃｌ-２を認識するモノクローナル抗体でウエスタンブロットした。ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスＩｇＧを二次抗体として使用し、そして結合された抗体を、化学発光及びＸ線フィルムへの露光により検出した。
【０１３６】
さらに、ＣＯＳ-７細胞を、偽トランスフェクションするか、ｐＨＭ６-ＬａｃＺでトランスフェクションするか、又はｐＨＭ６-センスｒＦ５Ａ(ｐＨＭ６-全長ラットｅＩＦ-５Ａ)でトランスフェクションし、そして４０時間インキュベーションした。各サンプルから抽出されたタンパク質のサンプル５μｇをＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分画し、ＰＶＤＦ膜へ転写し、そしてｐ５３を認識するモノクローナル抗体でウエスタン・ブロットした。アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧを二次抗体として使用し、そして結合された抗体を、比色分析により検出した。
【０１３７】
最後に、ＣＯＳ-７細胞を偽トランスフェクションするか、ｐＨＭ６-ＬａｃＺでトランスフェクションするか、またはｐＨＭ６-センスｒＦ５Ａ(ｐＨＭ６-全長ラットｅＩＦ-５Ａ)でトランスフェクションし、そして４０時間インキュベーションした。各サンプル由来のタンパク質抽出物のサンプル５μｇを、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分画し、ＰＶＤＦ膜に転写し、そしてｐ５３を認識するモノクローナル抗体でプローブした。対応するタンパク質のブロットを、抗[ＨＡ]-ペルオキシダーゼでプローブして、ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ発現のレベルを測定した。アルカリホスファターゼ結合ヤギ-抗-マウスＩｇＧを二次抗体として使用し、そして結合された抗体を化学発光により検出した。
【０１３８】
図３３は、ＣＯＳ-７細胞が、全長ラット・アポトーシス誘導性ｅＩＦ-５Ａをセンスの向きに含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされるとき、Ｂｃｌ-２の下方制御を表す。上のパネルは、クマシー・ブルーで染色されたタンパク質ブロットを表し；下のパネルは、対応するウエスタン・ブロットを表す。ｐＨＭ６-ＬａｃＺでトランスフェクションされた細胞において検出できるＢｃｌ-２に比較して、より少ないＢｃｌ-２がｐＨＭ６-センスｒＦ５Ａでトランスフェクションされた細胞で検出できる。
【０１３９】
図３４は、ＣＯＳ-７細胞が全長ラット・アポトーシス誘導性ｅＩＦ-５Ａをアンチセンスの向きに含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされる場合におけるＢｃｌ-２の上方制御を表す。上のパネルは、クマシー・ブルーで染色されたタンパク質ブロットを表し；下のパネルは、対応するウエスタン・ブロットを表す。偽トランスフェクションされた又はｐＨＭ６-センスｒＦ５Ａでトランスフェクションされた細胞において検出できるＢｃｌ-２に比較して、より多くのＢｃｌ２が、ｐＨＭ６-アンチセンス３’ｒＦ５Ａでトランスフェクションされた細胞で検出できる。
【０１４０】
図３５は、ＣＯＳ-７細胞が全長ラット・アポトーシス誘導性ｅＩＦ-５Ａをセンスの向きに含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされるとき、ｃ-Ｍｙｃの上方制御を表す。上のパネルは、クマシー・ブルーで染色されたタンパク質ブロットを表し；下のパネルは、対応するウエスタン・ブロットを表す。ｐＨＭ６-ＬａｃＺ又は偽コントロールでトランスフェクションされた細胞において検出できるｃ-Ｍｙｃと比較して、より多くのｃ-Ｍｙｃが、ｐＨＭ６-センスｒＦ５Ａでトランスフェクションされた細胞において検出できる。
【０１４１】
図３６は、ＣＯＳ-７細胞が全長ラット・アポトーシス誘導性ｅＩＦ-５Ａをセンスの向きに含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされるとき、ｐ５３の上方制御を表す。上のパネルは、クマシー・ブルーで染色されたタンパク質ブロットを表し；下のパネルは、対応するウエスタン・ブロットを表す。ｐＨＭ６-ＬａｃＺ又は偽コントロールでトランスフェクションされた細胞において検出できるｐ５３と比較して、より多くのｐ５３が、ｐＨＭ６-センスｒＦ５Ａでトランスフェクションされた細胞において検出できる。
【０１４２】
図３７は、ＣＯＳ-７細胞において、ｐＨＭ６-全長ラット・アポトーシス-誘導性ｅＩＦ-５Ａの発現の際、Ｐ５３上方制御の依存性を表す。抗-[ＨＡ]-ペルオキシダーゼでプローブされたウエスタン・ブロットにおいて、上のパネルは、クマシー・ブルーで染色されたタンパク質ブロットを表し、そして下のパネルは、対応するウエスタン・ブロットを表す。第二のトランスフェクションにおいてより、多くのラットアポトーシス誘導性ｅＩＦ-５Ａが第一トランスフェクションにおいて検出できる。抗-ｐ５３でプローブされたウエスタンブロットにおいて、Ａにおける上のパネルは、対応するクマシーブルー染色されたタンパク質ブロットを表し、そして下のパネルは、ｐ５３でのウエスタンブロットを表す。第一トランスフェクションでは、ｐＨＭ６-ＬａｃＺ又は偽コントロールでトランスフェクションされた細胞において検出できるｃ-Ｍｙｃと比較して、より多くのｐ５３がが、ｐＨＭ６-センスｒＦ５Ａでトランスフェクションされた細胞において検出できる。ラット・アポトーシス-誘導性ｅＩＦ-５Ａの発現が少ない第二のトランスフェクションでは、ｐＨＭ６-センスｒＦ５Ａ、ｐＨＭ６-ＬａｃＺ、又は偽コントロールでトランスフェクションされた細胞間におけるｐ５３レベルの検出可能な差異はない。
【０１４３】
実施例５
図４７は、ヒト心臓の鼓動及び続いて誘導された心臓発作を模倣するために、心臓組織において行われる実験を表す。図４９は、研究室のベンチの配置を示す。弁置換手術の間にヒト心臓組織の切片を電極に取り付けた。小さい重りを心臓組織につけて、心臓鼓動の強さを計測することを容易にした。電極は、電気刺激を提供して、組織を鼓動させ始めた。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ(ｅＩＦ-５ａ)及び増殖ｅＩＦ-５Ａ(ｅＩＦ５ｂ)の両方の遺伝子発現レベルを、虚血が誘導される前に、心臓組織において計測した。図４６を参照のこと。虚血前心臓組織において、ｅＩＦ-５ａ及び５ｅＩＦ５ｂの両方のレベルが低く、そしてそのレベルは、相対バランスにあった。この時間のあいだ、酸素及び二酸化炭素を、干渉液中の心臓に、９２.５％及び７.５％でそれぞれデリバリーした。心臓組織をこうして、通常の酸素レベルに晒し、そしてアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ(ｅＩＦ-５ａ)及び増殖ｅＩＦ-５Ａ(ｅＩＦ５ｂ)の発現レベルを計測した。後に、酸素レベルを減らし、そして窒素レベルを増加させて、低酸素状態及び虚血を誘導し、そして最終的に「心臓発作」を誘導した。心臓組織は鼓動を止めた。酸素レベルを次に通常に戻し、心臓組織を再び電気刺激でパルスをかけて、心臓鼓動を再び開始させた。「心臓発作」の後、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５ａ及び増殖ｅＩＦ-５Ａ(ｅＩＦ５ｂ)の発現レベルを再び計測した。今回は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａレベルの発現レベルは有意に増加したが、一方増殖ｅＩＦ-５Ａ(ｅＩＦ５ｂ)の発現レベルの増加は、著しく少なかった。図４６を参照のこと。
【０１４４】
「心臓発作」の後、より少ない圧縮/取り付けられた重りの移動により示されるように、強く鼓動せず、該心臓組織細胞が、アポトーシス-特異的ｅＩＦ-５Ａの存在のために急速に殺されたということが示された。
【０１４５】
ＥＫＧの結果は、図４８に表した。パネルの左側に、通常の心臓の鼓動を表した(虚血前心臓組織)。「心臓発作」(直線)及び心臓鼓動の再開の後、ＥＫＧは、筋肉細胞死のため活動性の低下を示す。ＥＫＧは、心臓鼓動の強さの相対的な減少を示す。
【０１４６】
実施例６：ヒト細胞系列培養条件
ヒト篩板及び樹状細胞
ヒトの両目を、Canada, Ontario Divisionのアイバンクから死後４８時間以内に得た。(付着された極を伴う)視神経乳頭を取り出し、そして抗生物質／抗真菌剤、グルタミン、及び１０％ＦＢＳを含むダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ)中に３時間置いた。視神経乳頭(ＯＮＨ)ボタンを、各組織サンプルから回収し、そして解剖ハサミで細かく切って、４の小片にした。移植片を１２.５ｃｍ2プラスチック製培養フラスコ内のＤＭＥＭ培地中で培養した。生育できた移植片について１月間成長を観測した。細胞が９０％コンフルエントに達すると、トリプシン処理され、そして分化継代培養に供して、篩板(ＬＣ)及び星状細胞集合を産生した。特異的に、ＬＣ細胞を、ゲンタマイシン、グルタミン、及び１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭを入れた２５ｃｍ2フラスコ内で継代した。ここで、星状細胞を、ＦＢＳを含まないＥＢＭ完全培地(Clontics)を含んだ２５ｃｍ2フラスコ内で成長させた。ＦＢＳを、１０日の継代の後に、星状細胞に加えた。細胞を、維持し、そしてこのプロトコルにより、継代した。
【０１４７】
異なる継代により得た細胞集合を、８ウェル培養スライド上で、異なる蛍光抗体を使用することにより、同一性及び集合の均一性について特徴づけした。細胞を１０％ホルマリン溶液中で固定し、そしてダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩水(ＤＰＢＳ)で３回洗浄した。２％脱脂乳を含むＤＰＢＳでブロッキングしたのちに、抗体を１％ＢＳＡを含むＤＰＢＳ中で希釈し、そして６個のウェルに細胞を加えた。残った２個のウェルを、１％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)溶液のみで、及びコントロールとして一次抗体なしで処理した。細胞を、一次抗体で、１時間室温でインキュベーションし、そして３回ＤＰＢＳで洗浄した。適切な二次抗体を１％ＢＳＡを含むＤＰＢＳ中に希釈し、各ウェルに加え、そして１時間インキュベーションした。ＤＰＢＳで洗浄した後に、培養スライドのウェルを区切るチャンバーを、スライドから取り除き、そしてスライドを２回蒸留水に浸し、次に風乾した。蛍光標本培地(Fluoromount)(Vector Laboratories)を各スライドに加え、そして２２×６０ｍｍのカバーガラスを被せた。
【０１４８】
免疫蛍光染色を、適切なフィルターを備える蛍光顕微鏡の下で観察し、そして一次抗体で処理されていないコントロール・ウェルと比較した。全ての一次抗体を、他に記載がない限りSigmaから得た。全ての二次抗体をMolecular Prove社から購入した。ＬＣ細胞を同定するために使用される一次抗体は、抗-コラーゲンＩ、抗-コラーゲンＩＶ、抗ラミニン、及び抗-細胞フィブロネクチンであった。星状細胞を同定するために使用した一次抗体は、以下：抗-ガラクトセレブロシド(Chemicon International)、抗-Ａ２Ｂ５(Chemicon International)、抗-ＮＣＡＭ、抗-ヒト・フォン・ウィルブランド因子であった。両方の細胞集合に使用される更なる抗体は、抗グリア線維(ＧＦＡＰ）及び抗α-平滑筋アクチンを含む。細胞集合が、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ラミニン、細胞フィブロネクチン、α平滑筋アクチンについて陽性に染色され、かつグリア線維(ＧＦＡＰ)について陰性に染色される場合、細胞集合はＬＣ細胞から構成されるということが確定される。細胞集合は、ＮＣＡＭ、グリア線維(ＧＦＡＰ)について陽性に染色され、かつガラクトセレブロシ、Ａ２Ｂ５、ヒトフォン・ウィルブランド因子、及びアルファ平滑筋アクチンについて陰性に染色される場合、該細胞集合は、星状細胞から構成されるということが確定される。
【０１４９】
この予備試験において、３セットのヒトの目を使用して、培養を開始する。ＬＣ細胞系列＃５０６、＃５１７、及び＃５２４を、８３歳男性、１７歳男性、及び２６歳女性の視神経乳頭から確立した。全てのＬＣ細胞系列は、完全に十分に特徴付けられており、そして９０％を超えるＬＣ細胞を含むことが分かっている。
【０１５０】
ＲＫＯ細胞培養
ＲＫＯ(American Type Culture Collection CRL-2577)、野生型ｐ５３を発現するヒト大腸癌細胞系列を使用して、アンチセンス・オリゴヌクレオチドが、ｅＩＦ５Ａ１タンパク質発現を抑制する能力について試験した。ＲＫＯを、非必須アミノ酸、アールの塩、及びＬグルタミンを伴う最小必須イーグル培地(ＭＥＭ)中で培養した。培養培地に１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)、そして１００ユニットのペニシリン/ストレプトマイシンを加えた。細胞を、５％ＣＯ2、及び９５％空気の加湿環境内で３７℃にて成長させた。接着細胞を、０.２５％トリプシン及び１ｍＭ・ＥＤＴＡの溶液で引き剥がすことにより、細胞を３〜４日ごとに継代した。引き剥がした細胞を、１：１０〜１：１２の分割比で、新たな培地を含む新たな培養ディッシュに加えた。
【０１５１】
ＨｅｐＧ２細胞培養
ヒトｅＩＦ５Ａ１に対するアンチセンス・オリゴがＩＬ-１での処理に応答するＴＮＦ-αの産生を抑制する能力を試験するために、ＨｅｐＧ２、ヒト肝細胞癌細胞系列を使用した。ＨｅｐＧ２細胞を、ゲンタマイシン、グルタミン、及び１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ中で培養し、そして５％ＣＯ2及び９５％空気の加湿環境中で、３７℃にて成長させた。
【０１５２】
実施例７
アポトーシスの誘導
アクチノマイシンＤ、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、カンプトテシン、及びトポイソメラーゼ阻害剤をそれぞれ使用して、ＲＫＯ及び篩板細胞においてアポトーシスを誘導した。アクチノマイシンＤを０.２５μｇ/ｍｌで使用し、そしてカンプトテシンを２０、４０、又は５０μＭの濃度で使用した。アポトーシスはまた、篩板細胞において、カンプトテシン(５０μＭ)とＴＮＦ-α(１０ｎｇ/ｍｌ)の組合せを使用して誘導された。カンプトテシンとＴＮＦ-αの組合せは、単独のカンプトテシン又はＴＮＦαのいずれかよりは、アポトーシスを誘導する点でより有効であることが分かった。
【０１５３】
アンチセンス・オリゴヌクレオチド
ヒトｅＩＦ-５Ａ１に対して標的された３個のアンチセンス・オリゴヌクレオチドのセットを、Molecular  Research  Labsにより設計し、そしてそこから購入した。ヒトｅＩＦ-５Ａ１に対して標的された第一アンチセンス・オリゴヌクレオチド(＃１)は、５’ＣＣＴ  ＧＴＣ  ＴＣＧ  ＡＡＧ  ＴＣＣ  ＡＡＧ  ＴＣ３’（配列番号６３）であった。ヒトｅＩＦ５Ａ１に対して標的された第二アンチセンスの配列(＃２)は、５’ＧＧＡ  ＣＣＴ  ＴＧＧ  ＣＧＴ  ＧＧＣ  ＣＧＴ  ＧＣ３’（配列番号６４）であった。ヒトｅＩＦ５Ａ１に対して標的される第三アンチセンス・オリゴヌクレオチドの配列は、５’ＣＴＣ  ＧＴＡ  ＣＣＴ  ＣＣＣ  ＣＧＣ  ＴＣＴ  ＣＣ３’（配列番号６５）であった。コントロールのオリゴヌクレオチドは、以下の配列：５’ＣＧＴ  ＡＣＣ  ＧＧＴ  ＡＣＧ  ＧＴＴ  ＣＣＡ  ＧＧ  ３’（配列番号６６）であった。蛍光イソチオシアネート(ＦＩＴＣ)-標識アンチセンス・オリゴヌクレオチド(Molecular  Research  Labs)は、トランスフェクション効率をモニターするために使用されて、そして以下の配列：５’ＧＧＡ  ＣＣＴ  ＴＧＧ  ＣＧＴ  ＧＧＣ  ＣＧＴ  ＧＣＸ３’（配列番号６７）を有し、ここでXはＦＩＴＣ標識された。全てのアンチセンス/オリゴヌクレオチドを完全にホスホロチオエート化した。
【０１５４】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドのトランスフェクション
ｅＩＦ５Ａ１タンパク質発現を阻害するｅＩＦ５Ａ１アンチセンス・オリゴヌクレオチドの能力は、ＲＫＯ細胞において試験された。ＲＫＯ細胞に、トランスフェクション試薬、オリゴフェクタミン(Invitrogen)を使用して、アンチセンス・オリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間前に、細胞に１０％ＦＢＳを加えたが、ペニシリン/ストレプトマイシンを欠くＭＥＭ培地中で、１ウェルあたり１５７０００で２４ウェルプレートに分配した。２４時間後、細胞は通常、おおよそ５０％コンフルエントに達した。ＲＫＯ細胞は、偽トランスフェクションされるか、又は１００ｎＭ又は２００ｎＭのアンチセンス・オリゴヌクレオチドでトランスフェクションされた。２４ウェル・プレートの１ウェルあたりに十分なトランスフェクション培地は、０、１.２５、又は２.５μｌのアンチセンス・オリゴヌクレオチドの２０μＭストックを、無血清ＭＥＭで４２.５μｌの最終体積に希釈し、そして室温で１５分間混合液をインキュベーションすることにより調製した。１.５μｌのオリゴフェクタミンを、６μｌの無血清ＭＥＭ中に希釈し、そして室温で７.５分間インキュベーションした。５分後、希釈されたオリゴフェクタミン混合液を、ＤＮＡ混合液に加え、そしてともに２０分間室温でインキュベーションした。細胞を無血清ＭＥＭで１回洗浄し、その後２００μｌのＭＥＭを細胞に加え、そして５０μｌのトランスフェクション培地を加えた。細胞を４時間成長チャンバー内に戻した。インキュベーション後、１２５μｌのＭＥＭ＋３０％ＦＢＳを細胞に加えた。細胞を次にさらに４８時間培養し、０.２５μｇ／ｍｌアクチノマイシンＤで２４時間処理し、次に細胞抽出液をウエスタンブロット分析用に回収した。
【０１５５】
１００及び２００ｎＭアンチセンス・オリゴヌクレオチド及びオリゴフェクタミンを使用し、ＲＫＯ細胞について記載された方法と同じ方法を使用して、篩板細胞のトランスフェクションを試験した。しかしながら、篩板細胞の有効なトランスフェクションは、１μＭ〜１０μＭで無血清培地中に希釈されたアンチセンス・オリゴヌクレオチドを細胞に２４時間加え、その後、全体として２〜５日間、２４時間ごとに培地を、血清を含む培地中に希釈された新たなアンチセンス・オリゴヌクレオチドに置き換えることによって単純に達成された。
【０１５６】
アンチセンス・オリゴヌクレオチド・トランスフェクションの効率は、ｅＩＦ５Ａ１アンチセンス・オリゴヌクレオチド＃２と同じ配列を有するが、３’末端でＦＩＴＣに結合されたＦＩＴＣ標識アンチセンス・オリゴヌクレオチドでトランスフェクションを行うことにより、最適化しそしてモニターした。ＲＫＯ及び篩板細胞を、８ウェル培養スライド上で、ＦＩＴＣ標識アンチセンス・オリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、そして３.７％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中で１０分間固定した。ウェルを取り除き、そして標本培地(Vectashield)を加え、続いてカバーガラスを載せた。細胞を次に蛍光顕微鏡上のＵＶ光の下で、蛍光フィルター(グリーンH５４６、フィルターセット４８９１５)を使用して可視化し、そして鮮緑色の蛍光を発する細胞を、当該オリゴヌクレオチドを取り込んだと決定した。
【０１５７】
アポトーシスの検出
篩板細胞をアンチセンス・オリゴヌクレオチドでトランスフェクションし、そしてカンプトテシンでアポトーシスを誘導した後に、コントロール・アンチセンス・オリゴヌクレオチド又はアンチセンス・オリゴヌクレオチド・eIF５A配列番号２６で処理された細胞においてアポトーシスを起す細胞の割合(％)を測定した。二つの方法-ヘキスト染色及びDeadEnd(商標)蛍光定量ＴＵＮＥＬを、アポトーシスを起している篩板細胞を検出するために使用した。核断片化及び凝集などの形態学的特徴に基いてアポトーシスを起している細胞を同定するために、核染色であるヘキストを使用して篩板細胞の核を染色した。３：１の無水メタノール及び氷酢酸の混合液からなる固定液を、使用直前に調製した。等量の固定液を培養スライド上で成長する細胞の培地に加え、そして２分間インキュベーションした。培地／固定液混合液を細胞から取り除いて廃棄し、そして１ｍｌの固定液を細胞に加えた。５分後、固定液を捨て、そして１ｍｌの新たな固定液を加え、細胞を５分間インキュベーションした。固定液を捨て、そして細胞を４分間風乾し、その後１ｍｌのヘキスト染色液(０.５μｇ／ｍｌへキスト３３２５８を含むＰＢＳ)を加えた。暗所で１０分間インキュベーション後、染色溶液を捨て、培養スライドのウェルを区切るチャンバーを取り除き、そしてスライドを１分間脱イオン水で３回洗浄した。洗浄後、数滴のマックルバイン緩衝液(０.０２１Ｍクエン酸、０.０５８Ｍ・Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ；ｐＨ５.６)を細胞に加え、そしてカバーガラスを被せた。染色された細胞を、ＵＶフィルターを使用して蛍光顕微鏡の下で可視化した。明るく染色された細胞又は断片化された核を有する細胞を、アポトーシスを起している細胞として数えた。１ウェルあたり最低２００個の細胞を計数した。
【０１５８】
アポトーシスを起している細胞の特徴であるＤＮＡの断片化を検出するために、DeadEnd(商標)蛍光定量ＴＵＮＥＬ(Promega)を使用した。ヘキスト染色の後に、細胞スライドを蒸留水で簡単に洗浄し、そしてさらにスライドをＰＢＳ(１３７ｍＭ・ＮａＣｌ、２.６８ｍＭ・ＫＣｌ、１.４７ｍＭ・ＫＨ2ＰＯ4、８.１ｍＭ・Ｎａ2ＨＰＯ4)中に５分間二回スライドを浸し、洗浄と洗浄との間でスライドをペーパータオル上で拭いた。細胞を０．２％トライトンＸ−１００を含むＰＢＳ中に５分間浸すことにより透過処理した。次に、スライドをＰＢＳ中に５分間２回浸すことにより再び洗浄し、そして洗浄と洗浄の間でペーパータオル上でスライドを拭き取った。１ウェルあたり２５μｌの平衡緩衝液[２００ｍＭカコジル酸カリウム(ｐＨ６.６)、２５ｍＭトリス-ＨＣｌ(ｐＨ６.６)、０.２ｍＭジチオスレイトール、０.２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、及び２.５ｍＭ塩化コバルト]を加えて、そして５〜１０分間インキュベーションした。平衡化の間、３０μｌの反応混合液を各ウェルについて、４５：５：１の比率の平衡緩衝液、ヌクレオチドミックス[５０μＭフルオレセイン-１２-ｄＵＴＰ、１００μＭ・ｄＡＴＰ、１０ｍＭ・トリス-ＨＣｌ(ｐＨ７.６)、および１ｍＭ・ＥＤＴＡ]、及び末端デオキシヌクレオチド・トランスフェラーゼ酵素(Ｔｄｔ、２５Ｕ／μｌ)を混合することにより調製した。平衡緩衝液中でインキュベーションした後に、３０μｌの反応混合液を１ウェルあたりに加え、そしてカバーガラスを被せた。反応を暗所にて３７℃で１時間進ませた。スライドを、２×ＳＳＣ[０.３Ｍ・ＮａＣｌ、及び３０ｍＭクエン酸ナトリウム(ｐＨ７.０)]中に浸し、そして１５分間インキュベーションすることにより反応を終わらせた。スライドを次にＰＢＳ中に浸すことにより５分間３回洗浄した。ＰＢＳをキムワイプで、ウェルの周りを吸い取ることにより取り除き、そして標本培地(Oncogene Reearch Project、Ja1750-4ML)を各ウェルに加え、そしてスライドにカバーガラスを被せた。ヘキスト染色された核を計数するために、ＵＶフィルター(ＵＶ-Ｇ３６５、フィルターセット４８７９０２)を使用して、細胞を蛍光顕微鏡の下で観察した。明るく染色された核又は断片化された核を有する細胞の全てをアポトーシスを起している細胞として数えた。同じ視野を使用して、次に蛍光フィルター(グリーンH546、フィルターセット48915)を使用して観察し、そして鮮緑色の蛍光を発する核の全てをアポトーシスを起している細胞として計数した。フルオレセイン・フィルターを使用して計数された鮮緑色の核の数をＵＶフィルターの下計数された核の総数で割ることにより、視野においてアポトーシスを起している細胞の割合(％)を計算した。１ウェルあたり、最低でも２００細胞を計数した。
【０１５９】
図５４〜５７は、これらの研究の結果を示す。アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ１でトランスフェクションされたサンプルにおけるアポトーシスを起している細胞の割合(％)は、コントロール・オリゴヌクレオチドでトランスフェクションされた細胞の場合より明らかにずっと少ない。
【０１６０】
タンパク質抽出及びウエスタン・ブロッティング
トランスフェクションされたＲＫＯ細胞を、細胞をＰＢＳで洗浄し、１ウェルあたり４０μｌの熱溶解緩衝液[０.５％ＳＤＳ、１ｍＭジチオスレイトール、５０ｍＭトリス-ＨＣＬ(ｐＨ８.０)を加えることによりウエスタン・ブロット分析用に回収した。細胞を掻き剥がし、そして得られた抽出物を遠心チューブへと移し、５分間煮沸し、そして-２０℃で貯蔵した。バイオラッド・タンパク質アッセイ(Bio-Rad protein Assay)(Bio-Rad)を、製品説明書に従って使用して、タンパク質を定量した。
【０１６１】
ウエスタン・ブロッティング用に、５μｇの全タンパク質を、１２％ＳＤＳ-ポリアクリルアミド・ゲル上で分離した。分離されたタンパク質をポリビニリデン・ジフロリド膜へと転写した。次に膜をブロッキング溶液(５％スキムミルク粉末を含むＰＢＳ)中で１時間インキュベーションし、そして０.０５％Ｔｗｅｅｎ-２０／ＰＢＳ中で１５分間、３回洗浄した。膜を一晩ＰＢＳ-Ｔ中で４℃にて貯蔵した。次の日、室温に温めた後に、膜を１μｇ／ｍｌポリビニル・アルコール中で３０秒間ブロックした。膜を脱イオン水で５回洗浄し、次に５％ミルクを含む０.０２５％Ｔｗｅｅｎ-２０／ＰＢＳの溶液中で３０分間ブロッキングした。膜とインキュベーションする前に、一次抗体を５％ミルクを含む０.０２５％Ｔｗｅｅｎ-２０／ＰＢＳ中でプレインキュベーションした。
【０１６２】
幾つかの一次抗体を使用した。ｐ５３を認識するOncogeneから購入したモノクローナル抗体(Ａｂ-６)並びにヒトｅＩＦ５Ａ１のｃ末端に相同性を有する合成ペプチド(アミノ-ＣＲＬＰＥＧＤＬＧＫＥＩＥＱＫＹＤ-カルボキシ)(配列番号６８)に対するポリクローナル抗体であって、トリにおいて産生された抗体(Gallus  Immunotech)を使用した。抗-β-アクチン抗体(Oncogene)を使用して、等量のタンパク質をロードしたことを示した。ｐ５３に対するモノクローナル抗体を、０.０５μg／ｍｌの希釈度で使用し、ｅＩＦ−５Ａ１に対する抗体を、１：１０００の希釈度で使用し、そしてアクチンに対する抗体を１：２００００の希釈度で使用した。一次抗体で６０〜９０分間インキュベーションした後、膜を０.０５％Ｔｗｅｅｎ-２０／ＰＢＳ中で１５分間、３回洗浄した。次に、二次抗体を１％ミルクを含む０.０２５％Ｔｗｅｅｎ-２０／ＰＢＳ中に希釈し、そして膜と６０〜９０分インキュベーションした。ｐ５３(Ａｂ-６)を一次抗体として使用したとき、使用される二次抗体は、ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスＩｇＧ(Sigma）であり、１：５０００の希釈度であった。抗ｅＩＦ-５Ａ１を一次抗体として使用したとき、ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗トリＩｇＹ(Gallus  Immunotech)を１：５０００の希釈度で使用した。アクチンについて使用される二次抗体は、１：５０００の希釈度で使用されるペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＭであった。二次抗体でインキュベーション後、膜をＰＢＳ-Ｔで３回洗浄した。
【０１６３】
ＥＣＬプラス・ウエスタン・ブロッティング検出キット(Amersham Pharmacia Biotech)を使用して、結合されたペルオキシダーゼ結合抗体を検出した。簡潔に記載すると、膜を軽く拭き取って乾かし、次に暗所で、試薬Ａと試薬Ｂの４０：１混合体と５分間インキュベーションした。膜を拭き取って乾かし、アセテートのシートの間に配置し、そして１０秒〜３０分で変化する期間、Ｘ線フィルムに露光した。膜を剥離緩衝液[１００ｍＭ・２-メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ、及び６２.５ｍＭトリス-ＨＣｌ(ｐＨ６.７)]に沈め、そして５０℃で３０分間インキュベーションすることにより、膜を剥離させた。次に膜を脱イオン水で洗浄し、そして多量の０.０５％Ｔｗｅｅｎ-２０／ＰＢＳで１０分間２回洗浄した。膜を剥離させ、そして３回再ブロットした。
【０１６４】
実施例８
ｓｉＲＮＡの構築
ヒトｅＩＦ−５Ａ１に対する低分子抑制ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)を使用して、ＲＫＯ及び篩板細胞において、ｅＩＦ−５Ａ１の発現を特異的に抑制した。６種のｓｉＲＮＡを、サイレンサー(Ｓｉｌｅｎｃｅｒ)(商標)ｓｉＲＮＡ構築キット(Ambion  Inc)を使用してin  vitro転写により作成した。４種のｓｉＲＮＡを、ヒトｅＩＦ５Ａ１に対して作成した(ｓｉＲＮＡ(＃１〜＃４)（配列番号３０〜３３）。図７０を参照。２種のｓｉＲＮＡ、キット内に提供されるＧＡＰＤＨに対するｓｉＲＮＡ、及びｅＩＦ−５Ａ１特異的ｓｉＲＮＡ＃１（配列番号３０）の逆配列を有するが、それ自身はｅＩＦ５Ａ１を標的としないｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃５)（配列番号３４）を、コントロールとして使用した。これらのｓｉＲＮＡを製品プロトコルに従って作成した。簡潔に記載すると、Ｔ７プロモーター・プライマーとアニールさせ、そしてクレノー断片でのフィルイン反応(fill-in  reaction)後に、所望のｓｉＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドを、Ｔ７ＲＮＡ・ポリメラーゼのテンプレートとして使用して、ｓｉＲＮＡの個々の鎖を作成した。センス及びアンチセンス鎖の両方について転写反応後に、反応物を混合し、そして２本のｓｉＲＮＡ鎖をアニールし、ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅで処理し、そして次にカラム精製した。ｓｉＲＮＡを作成するために使用されるＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列(Ｔ７プライマーがアニールする部位に下線を引いた)は：
ｓｉＲＮＡ  ＃１  アンチセンス  ５’ＡＡＡＧＧＡＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＴＣ３’（配列番号６９）と
ｓｉＲＮＡ  ＃１  センス５’ＡＡＴＣＡＧＣＴＧＧＡＡＧＴＣＡＴＴＣＣＴＣＣＴＧＴＣＴＣ３’（配列番号７０）；
ｓｉＲＮＡ  ＃２  アンチセンス  ５’ＡＡＧＡＴＣＧＴＣＧＡＧＡＴＧＴＣＴＡＣＴＣＣＴＧＴＣＴＣ３’（配列番号７１）と
ｓｉＲＮＡ  ＃２  センス５’ＡＡＡＧＴＡＧＡＣＡＴＣＴＣＧＡＣＧＡＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣ３’（配列番号７２）；
ｓｉＲＮＡ  ＃３  アンチセンス  ５’ＡＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴＧＧＴＴＧＧＴＡＴＴＣＣＴＧＴＣＴＣ３’（配列番号７３）と
ｓｉＲＮＡ  ＃３  センス  ５’ＡＡＡＡＴＡＣＣＡＡＣＣＡＧＡＴＧＧＡＣＣＣＣＴＧＴＣＴＣ３’（配列番号７４）；
ｓｉＲＮＡ  ＃４  アンチセンス  ５’ＡＡＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＡＣＡＣＣＴＧＴＣＴＣ３’（配列番号７５）と
ｓｉＲＮＡ  ＃４  センス  ５’ＡＡＴＧＴＧＴＡＧＧＡＧＧＡＧＴＣＣＡＧＣＣＣＴＧＴＣＴＣ３’（配列番号７６）；
ｓｉＲＮＡ  ＃５  アンチセンス  ５’ＡＡＡＧＴＣＧＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＡＧＧＡＣＣＴＧＴＣＴＣ３’（配列番号７７）と
ｓｉＲＮＡ  ＃５  センス  ５’ＡＡＴＣＣＴＴＡＣＴＧＡＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＣＴＧＴＣＴＣ３’（配列番号７８）．
であった。
【０１６５】
ｓｉＲＮＡをＲＫＯ及び篩板細胞中への取り込みをモニターするために、サイレンサー(商標)ｓｉＲＮＡ標識キット-ＦＡＭ(Ambion)を使用して、ＧＡＰＤＨのｓｉＲＮＡをＦＡＭで標識した。８ウェル培養スライド上でトランスフェクションした後に、細胞をＰＳＳで洗浄し、３.７％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中で１０分間固定した。ウェルを取り除き、そして標本培地(Vectashield)を加えた後、カバーガラスを被せた。ＦＡＭ標識ｓｉＲＮＡの取り込みは、フルオレセイン・フィルターを使用してＵＶ光の下蛍光顕微鏡下で可視化された。ＧＡＰＤＨ・ｓｉＲＮＡを製品プロトコルに従って標識した。
【０１６６】
ｓｉＲＮＡのトランスフェクション
ＲＫＯ細胞及び篩板細胞を、同じトランスフェクション・プロトコルを使用して、ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。トランスフェクションする前の日に、ＲＫＯ細胞を、８ウェル培養スライド又は２４ウェル・プレート上に、それぞれ１ウェルあたり４６０００及び１０５８００細胞密度で蒔いた。細胞集密度が４０〜７０％であるとき、篩板細胞はトランスフェクションされ、そして一般的に篩板細胞は、１ウェルあたり７５００〜１０００細胞で、トランスフェクションの３日前に８ウェル培養スライド上に蒔かれた。８ウェル培養スライドの１ウェルに十分な量のトランスフェクション培地は、２５.５ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡストックを、Ｏｐｔｉ-Ｍｅｍ(Ｓｉｇｍａ)中に最終体積２１.２μｌまで希釈することにより調製した。０．４２５μｌのリポフェクタミン２０００を終量２１．２μｌのＯｐｔｉ−Ｍｅｍに７〜１０分間室温にてインキュベーションした。希釈されたリポフェクタミン２０００混合体を、次に希釈ｓｉＲＮＡ混合液に加え、そして室温で２０〜３０分間インキュベーションした。細胞を無血清培地で一回洗浄し、その後１３５μｌの無血清培地を細胞に加え、そして４２.４μｌのトランスフェクション培地を加えた。細胞を成長チャンバーに４時間戻した。インキュベーションの後、６５μｌの無血清培地＋３０％ＦＢＳを細胞に加えた。ウエスタン・ブロット分析について使用される細胞中へのｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、８ウェルスライドでトランスフェクションした条件と同じ条件であるが、体積を２.３倍に増加させた条件を使用して、２４ウェルプレートで行われた。
【０１６７】
トランスフェクションに続いて、ウエスタン・ブロット分析用の細胞抽出液を集める前に、ＲＫＯ及び篩板細胞を７２時間インキュベーションした。アポトーシスをブロックするｅＩＦ５Ａ１に対するｓｉＲＮＡの有効性を測定するために、篩板細胞を５０μＭのカンプトテシン(Sigma)及び１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ-α(Leinco Technologies)で処理して、トランスフェクション後４８又は７２時間でアポトーシスを誘導した。アポトーシスを起している細胞の割合(％)を測定するために、２４又は４８時間後で、細胞をヘキストで染色した。
【０１６８】
実施例９
アポトーシスの検出
篩板細胞をアンチセンス・オリゴヌクレオチドでトランスフェクションし、そしてカンプトテシンでアポトーシスを誘導した後に、コントロール・アンチセンス・オリゴヌクレオチド又はアンチセンス・オリゴヌクレオチドｅＩＦ５Ａ＃２で処理された細胞においてアポトーシスを起す細胞の割合(％)を測定した。二つの方法-ヘキスト染色及びDeadEnd(商標)蛍光定量ＴＵＮＥＬを、アポトーシスを起している篩板細胞を検出するために使用した。核断片化及び凝集などの形態学的特徴に基いてアポトーシスを起している細胞を同定するために、核染色であるヘキストを使用して篩板細胞の核を染色した。３：１の無水メタノール及び氷酢酸の混合液からなる固定液を、使用直前に調製した。等量の固定液を培養スライド上で成長する細胞の培地に加え、そして２分間インキュベーションした。培地／固定液混合液を細胞から取り除いて廃棄し、そして１ｍｌの固定液を細胞に加えた。５分後、固定液を捨て、そして１ｍｌの新たな固定液を加え、細胞を５分間インキュベーションした。固定液を捨て、そして細胞を４分間風乾し、その後１ｍｌのヘキスト染色液(０.５μｇ／ｍｌへキスト３３２５８を含むＰＢＳ)を加えた。暗所で１０分間インキュベーション後、染色溶液を捨て、培養スライドのウェルを区切るチャンバーを取り除き、そしてスライドを１分間脱イオン水で３回洗浄した。洗浄後、数滴のマックルバイン緩衝液(０.０２１Ｍクエン酸、０.０５８Ｍ・Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ；ｐＨ５.６)を細胞に加え、そしてカバーガラスを被せた。染色された細胞を、ＵＶフィルターを使用して蛍光顕微鏡の下で可視化した。明るく染色された細胞又は断片化された核を有する細胞を、アポトーシスを起している細胞として数えた。１ウェルあたり最低２００個の細胞を計数した。
【０１６９】
アポトーシスを起している細胞の特徴であるＤＮＡの断片化を検出するために、DeadEnd蛍光定量ＴＵＮＥＬ(Promega)を使用した。ヘキスト染色の後に、細胞スライドを蒸留水で簡単に洗浄し、そしてさらにスライドをＰＢＳ(１３７ｍＭ・ＮａＣｌ、２.６８ｍＭ・ＫＣｌ、１.４７ｍＭ・ＫＨ2ＰＯ4、８.１ｍＭ・Ｎａ2ＨＰＯ4)中に５分間二回スライドを浸し、洗浄と洗浄との間でスライドをペーパータオル上で拭いた。細胞を０．２％トライトンＸ−１００を含むＰＢＳ中に５分間浸すことにより透過処理した。次に、スライドをＰＢＳ中に５分間２回浸すことにより再び洗浄し、そして洗浄と洗浄の間でペーパータオル上でスライドを拭き取った。１ウェルあたり２５μｌの平衡緩衝液[２００ｍＭカコジル酸カリウム(ｐＨ６.６)、２５ｍＭトリス-ＨＣｌ(ｐＨ６.６)、０.２ｍＭジチオスレイトール、０.２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、及び２.５ｍＭ塩化コバルト]を加えて、そして５〜１０分間インキュベーションした。平衡化の間、３０μｌの反応混合液を各ウェルについて、４５：５：１の比率の平衡緩衝液、ヌクレオチドミックス[５０μＭフルオレセイン-１２-ｄＵＴＰ、１００μＭ・ｄＡＴＰ、１０ｍＭ・トリス-ＨＣｌ(ｐＨ７.６)、および１ｍＭ・ＥＤＴＡ]、及び末端デオキシヌクレオチド・トランスフェラーゼ酵素(Ｔｄｔ、２５Ｕ／μｌ)を混合することにより調製した。平衡緩衝液中でインキュベーションした後に、３０μｌの反応混合液を１ウェルあたりに加え、そしてカバーガラスを被せた。反応を暗所にて３７℃で１時間進ませた。スライドを、２×ＳＳＣ[０.３Ｍ・ＮａＣｌ、及び３０ｍＭクエン酸ナトリウム(ｐＨ７.０)]中に浸し、そして１５分間インキュベーションすることにより反応を終わらせた。スライドを次にＰＢＳ中に浸すことにより５分間３回洗浄した。ＰＢＳをキムワイプで、ウェルの周りを吸い取ることにより取り除き、そして標本培地(Oncogene Reearch Project、Ja1750-4ML)を各ウェルに加え、そしてスライドにカバーガラスを被せた。ヘキスト染色された核を計数するために、ＵＶフィルター(ＵＶ-Ｇ３６５、フィルターセット４８７９０２)を使用して、細胞を蛍光顕微鏡の下で観察した。明るく染色された核又は断片化された核を有する細胞の全てをアポトーシスを起している細胞として数えた。同じ視野を使用して、次に蛍光フィルター(グリーンH546、フィルターセット48915)を使用して観察し、そして鮮緑色の蛍光を発する核の全てをアポトーシスを起している細胞として計数した。フルオレセイン・フィルターを使用して計数された鮮緑色の核の数をＵＶフィルターの下計数された核の総数で割ることにより、視野においてアポトーシスを起している細胞の割合(％)を計算した。１ウェルあたり、最低でも２００細胞を計数した。
【０１７０】
タンパク質抽出及びウエスタン・ブロッティング
トランスフェクションされたＲＫＯ細胞を、細胞をＰＢＳで洗浄し、１ウェルあたり４０μｌの熱溶解緩衝液[０.５％ＳＤＳ、１ｍＭジチオスレイトール、５０ｍＭトリス-ＨＣＬ(ｐＨ８.０)を加えることによりウエスタン・ブロット分析用に回収した。細胞を掻き剥がし、そして得られた抽出物をエッペンドルフ・チューブへと移し、５分間煮沸し、そして-２０℃で貯蔵した。バイオラッド・タンパク質アッセイ(Bio-Rad protein Assay)(Bio-Rad)を、製品説明書に従って使用して、タンパク質を定量した。
【０１７１】
ウエスタン・ブロッティング用に、５μｇの全タンパク質を、１２％ＳＤＳ-ポリアクリルアミド・ゲル上で分離した。分離されたタンパク質をポリビニリデン・ジフロリド膜へと転写した。次に膜をブロッキング溶液(５％スキムミルク粉末を含むＰＢＳ)中で１時間インキュベーションし、そして０.０５％Ｔｗｅｅｎ-２０／ＰＢＳ中で１５分間、３回洗浄した。膜を一晩ＰＢＳ-Ｔ中で４℃にて貯蔵した。次の日、室温に温めた後に、膜を１μｇ／ｍｌポリビニル・アルコール中で３０秒間ブロックした。膜を脱イオン水で５回洗浄し、次に５％ミルクを含む０.０２５％Ｔｗｅｅｎ-２０／ＰＢＳの溶液中で３０分間ブロッキングした。膜とインキュベーションする前に、一次抗体を５％ミルクを含む０.０２５％Ｔｗｅｅｎ-２０／ＰＢＳ中でプレインキュベーションした。
【０１７２】
幾つかの一次抗体を使用した。ｐ５３を認識するOncogeneから購入したモノクローナル抗体(Ａｂ-６；Oncogene)、ヒトｂｃｌ-２を認識するモノクローナル抗体(Oncogene)、並びにヒトｅＩＦ５Ａ１のｃ末端に相同性を有する合成ペプチド(アミノ-ＣＲＬＰＥＧＤＬＧＫＥＩＥＱＫＹＤ-カルボキシ)（配列番号６８）に対するポリクローナル抗体であって、トリにおいて産生された抗体(Gallus  Immunotech)を使用した。抗-β-アクチン抗体(Oncogene)を使用して、等量のタンパク質をロードしたことを示した。ｐ５３に対するモノクローナル抗体を０.０５μg／ｍｌの希釈度で使用し、ｂｃｌ-２に対する抗体を１：３５００の希釈度で使用し、ｅＩＦ５Ａ１に対する抗体を１：１０００の希釈度で使用し、そしてアクチンに対する抗体を１：２００００の希釈度で使用した。一次抗体で６０〜９０分間インキュベーションした後、膜を０.０５％Ｔｗｅｅｎ-２０／ＰＢＳ中で１５分間、３回洗浄した。次に、二次抗体を１％ミルクを含む０.０２５％Ｔｗｅｅｎ-２０／ＰＢＳ中に希釈し、そして膜と６０〜９０分インキュベーションした。ｐ５３(Ａｂ-６)を一次抗体として使用したとき、使用される二次抗体は、ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスＩｇＧ(Sigma）であり、１：５０００の希釈度であった。抗ｅＩＦ-５Ａ１を一次抗体として使用したとき、ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗トリＩｇＹ(Gallus  Immunotech)を１：５０００の希釈度で使用した。アクチンと供に使用される二次抗体は、１：５０００の希釈度で使用されるペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＭであった。二次抗体でインキュベーション後、膜をＰＢＳ-Ｔで３回洗浄した。
【０１７３】
ＥＣＬプラス・ウエスタン・ブロッティング検出キット(Amersham Pharmacia Biotech)を使用して、結合されたペルオキシダーゼ結合抗体を検出した。簡潔に記載すると、膜を軽く拭き取って乾かし、次に暗所で、試薬Ａと試薬Ｂの４０：１混合体とインキュベーションした。膜を拭き取って乾かし、アセテートのシートの間に配置し、そして１０秒〜３０分で変化する期間、Ｘ線フィルムに露光した。膜を剥離緩衝液[１００ｍＭ・２-メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ、及び６２.５ｍＭトリス-ＨＣｌ(ｐＨ６.７)]に沈め、そして５０℃で３０分間インキュベーションすることにより、膜を剥離させた。次に膜を脱イオン水で洗浄し、そして多量の０.０５％Ｔｗｅｅｎ-２０／ＰＢＳで１０分間２回洗浄した。膜を剥離させ、そして３回再ブロットした。
【０１７４】
実施例１０
ＨｅｐＧ２のＴＮＦ-α産生の定量
ＨｅｐＧ２細胞を、１ウェルあたり２００００細胞で、４８ウェルプレートに蒔いた。７２時間後、培地を取り除き、そして、２.５μＭのコントロール・アンチセンス・オリゴヌクレオチド又は２.５μＭアンチセンス・オリゴヌクレオチドｅＩＦ−５Ａ１＃２（配列番号２６）を含む新たな培地を細胞に加えた。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを含む新たな培地を、２４時間後に加えた。オリゴヌクレオチドと合計４８時間のインキュベーションの後、培地をインターロイキン１β(ＩＬ-１β、１０００ｐｇ／ｍｌ；Leinco  Technologies)を含む培地と置き換え、そして６時間インキュベーションした。ＴＮＦ-α定量用に培地を回収し、そして凍結した(-２０℃)。未処理の細胞(アンチセンス・オリゴヌクレオチド及びＩＬ-１βを含まない)及びＩＬ-１βのみで処理された細胞との、平行して行った更なるインキュベーションを、コントロールに使用した。全ての処理を二回行った。培地中に放出されたＴＮＦ-αを、製品プロトコルに従ってＥＬＩＳＡアッセイ(Assey  Designs  Inc）により計測した。
【０１７５】
実施例１１
以下の実験により、アンチセンス・アポトーシス因子５Ａヌクレオチドが、アポトーシス因子５Ａ並びにｐ５３の発現を抑制することができるということが示された。
【０１７６】
ＲＫＯ細胞を未トランスフェクションのままにするか、偽トランスフェクションするか、又は２００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｅＩＦ５Ａ１＃１、＃２、又は＃３（配列番号２５、２６、及び２７）でトランスフェクションした。ＲＫＯ細胞を１００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドｅＩＦ−５Ａ１＃２（配列番号２６）でトランスフェクションした。トランスフェクション後４８時間で、細胞を０.２５μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤで処理した。２４時間後、細胞抽出液を回収し、そして各サンプル由来の５μｇのタンパク質を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜へ転写し、そしてｅＩＦ−５Ａ１に対する抗体でウエスタン・ブロットした。化学発光検出後、膜を剥離し、そしてｐ５３に対する抗体で再プローブした。化学発光検出の後、膜を再び剥離し、そしてアクチンに対する抗体で再プローブした。(アポトーシス因子５Ａに対する)アンチセンスオリゴ１、２、及び３（それぞれ、配列番号２５、２６及び２７）で処理された後、ＲＫＯ細胞により産生されるタンパク質のレベルを示す図５２を参照のこと。ＲＫＯ細胞は、アンチセンス・アポトーシス因子５Ａヌクレオチドでトランスフェクションされた後では、より少ない量のアポトーシス因子５Ａ並びにより少ない量のｐ５３を産生した。
【０１７７】
実施例１２
以下の実験により、アンチセンスアポトーシス因子５Ａヌクレオチドがアポトーシスを低減することができるということが示される。
１の実施態様では、篩板細胞系列＃５０６は、(Ａ)オリゴフェクタミン・トランスフェクション試薬を使用して、１００ｎＭのＦＩＴＣ標識されたアンチセンス・オリゴヌクレオチドでトランスフェクションされるか、又は(Ｂ)無血清培地中に直接希釈される１０μＭの剥き出しのＦＩＴＣ標識アンチセンス・オリゴヌクレオチドでトランスフェクションされた。２４時間後、１０％ＦＢＳを含む新たな培地及び１０μＭに希釈される新たなアンチセンス・オリゴヌクレオチドを、細胞に加えた。細胞、(Ａ)及び(Ｂ)を全体で４８時間後に固定し、そしてフルオレセイン・フィルターを使用して、ＵＶ光の下で蛍光顕微鏡上で可視化した。図５３は、蛍光標識されたアンチセンス・オリゴヌクレオチドの取り込みを示す。
【０１７８】
他の実験において、篩板細胞系列＃５０６を、１０μＭのコントロール・アンチセンス・オリゴヌクレオチド又はアンチセンス・オリゴヌクレオチドｅＩＦ−５Ａ１＃２（配列番号２６）で、合計４日間トランスフェクションした。アンチセンス・オリゴヌクレオチド処理を開始後４８時間で、細胞を２０μＭ又は４０μＭのカンプトテシンで４８時間処理した。アンチセンス・オリゴヌクレオチド及びカンプトテシンを含む培地を、毎日交換した。アポトーシスを起こしている細胞の割合(％)を、細胞をヘキスト及びＴＵＮＥＬで標識することにより測定した。図５４を参照のこと。
【０１７９】
別の実験では、篩板細胞系列＃５０６を、１０μＭのコントロール・アンチセンス・オリゴヌクレオチド又はアンチセンス・オリゴヌクレオチドｅＩＦ−５Ａ１＃２（配列番号２６）でトランスフェクションした。２４時間後、培地を交換し、そして新たなアンチセンスオリゴヌクレオチドを加えた。アンチセンス・オリゴヌクレオチド処理を始めた後４８時間で、アンチセンス・オリゴヌクレオチドを取り除き、そして細胞を２０μＭカンプトテシンで３日間処理した。カンプトテシンを含む培地を毎日交換した。アポトーシスを起している細胞の割合(％)を、細胞をヘキスト及びＴＵＮＥＬで標識することにより測定した。図５５を参照のこと。
【０１８０】
さらに別の実験において、篩板細胞系列＃５１７を１μＭのコントロール・アンチセンス・オリゴヌクレオチド又はアンチセンス・オリゴヌクレオチドｅＩＦ−５Ａ１＃２（配列番号２６）で、合計５日間トランスフェクションした。アンチセンス・オリゴヌクレオチド処理を開始後４８時間で、細胞を２０μＭカンプトテシンで３又は４日処理した。アンチセンス・オリゴヌクレオチド及びカンプトテシンを含む培地を、毎日交換した。アポトーシスを起こしている細胞の割合(％)を細胞をヘキスト及びＴＵＮＥＬで標識することにより測定した。図５６を参照のこと。
【０１８１】
別の実験では、篩板細胞系列＃５１７を、２.５μＭのコントロール・アンチセンス・オリゴヌクレオチド又はアンチセンス・オリゴヌクレオチドｅＩＦ−５Ａ１＃２（配列番号２６）で、合計５日間トランスフェクションした。アンチセンス・オリゴヌクレオチド処理を開始後４８時間で、細胞を４０μＭのカンプトテシンで３日間処理した。アンチセンス・オリゴヌクレオチド及びカンプトテシンを含む培地を毎日交換した。アポトーシスを起している細胞の割合(％)を、細胞をヘキストで標識することにより計測した。図５７を参照のこと。
【０１８２】
別の実験では、篩板細胞系列＃５１７を１μＭ又は２.５μＭのいずれかのコントロール・アンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンス・オリゴヌクレオチドｅＩＦ−５Ａ１＃２（配列番号２６）で合計５日間トランスフェクションした。アンチセンス・オリゴヌクレオチド処理を開始後４８時間で、細胞を４０μＭカンプトテシンで３日間処理した。アンチセンスオリゴヌクレオチド及びカンプトテシンを含む培地を毎日交換した。アポトーシスを起している細胞の割合(％)を細胞をヘキストで標識することにより検出した。図５８を参照のこと。
【０１８３】
別の実験では、篩板細胞＃５１７を未処理のままにするか、或いは１０ｎｇ／ｍｌ・ＴＮＦ-α、５０μＭカンプトテシン、又は１０ｎｇ／ｍｌ・ＴＮＦ-α及び５０μＭカンプトテシンで処理した。アポトーシスを起している細胞の割合を、細胞をヘキストで標識することにより測定した。図５９を参照のこと。
【０１８４】
別の実験では、篩板細胞系列＃５０６及び＃５１７を２.５μＭ又は５μＭのいずれかのコントロールアンチセンス・オリゴヌクレオチド又はアンチセンス・オリゴヌクレオチドｅＩＦ−５Ａ１＃２（配列番号２６）のいずれかで合計２日間トランスフェクションした。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを含む新たな培地を２４時間後に加えた。アンチセンス・オリゴヌクレオチドの開始後４８時間で、細胞を５０μＭのカンプトテシン及び１０ｎｇ／ｍｌ・ＴＮＦ-αで２日間処理した。アポトーシスを起している細胞の割合(％)を、細胞をヘキストで標識することにより測定した。図６０を参照のこと。
【０１８５】
別の実験では、篩板細胞系列＃５０６、＃５１７、及び＃５２４を、２.５μＭのコントロール・アンチセンス・オリゴヌクレオチド又はアンチセンス・オリゴヌクレオチドｅＩＦ−５Ａ１＃２（配列番号２６）のいずれかで、合計２日間トランスフェクションした。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを含む新たな培地を、２４時間後に加えた。アンチセンス・オリゴヌクレオチド処理を開始後４８時間で、細胞を５０μＭカンプトテシン及び１０ｎｇ／ｍｌＴＮＦ-αで２日間処理した。アポトーシスを起している細胞の割合(％)を、細胞をヘキストで標識することにより測定した。図６１を参照のこと。
【０１８６】
実施例１３
以下の実験により、アポトーシス因子５Ａを標的としたｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞が、より少ない量のアポトーシス因子５Ａを発現することが示された。該実験はまた、アポトーシス因子５Ａを標的としたｓｉＲＮＡが、アポトーシスを低減することができるいうことを示す。
【０１８７】
一の実験では、篩板細胞系列＃５１７を、トランスフェクションの間、血清有り(Ａ)又は血清なし(Ｂ)のリポフェクタミン２０００・トランスフェクション試薬を使用して、１００ｎＭ・ＦＡＭ標識ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。(Ａ)及び(Ｂ)の細胞を、合計２４時間後に固定し、そしてフルオレセイン・フィルターを使用するＵＶ光の下で蛍光顕微鏡上で可視化した。図６２を参照のこと。
【０１８８】
別の実験では、ＲＫＯ細胞を、トランスフェクションの間血清の存在又は非存在下のいずれかで、１００ｎＭ・ｓｉＲＮＡとトランスフェクションした。６種のｓｉＲＮＡ、つまり２個のコントロールｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃５（配列番号３４）及びＧＡＰＤＨに対して標的されたｓｉＲＮＡ)と４種のｅＩＦ−５Ａを標的としたｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃１〜＃４（配列番号３０〜３３）)をトランスフェクションした。トランスフェクション後７２時間で、細胞抽出液を回収し、そして各サンプルからの５μｇのタンパク質を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、そしてｅＩＦ−５Ａ１に対する抗体でウエスタン・ブロットした。化学発光検出の後、膜を剥離し、そしてｂｃｌ-２に対する抗体で再プローブした。化学発光検出の後に、膜を再び剥離し、そしてアクチンに対する抗体で再プローブした。図６３を参照のこと。
【０１８９】
別の実験では、篩板細胞系列＃５０６及び＃５１７を、１００ｎＭｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。６種のｓｉＲＮＡ、つまり２種のコントロール(ｓｉＲＮＡ＃５（配列番号３４）及びＧＡＰＤＨを標的とするｓｉＲＮＡ)及び４種のｅＩＦ−５Ａ１を標的とするｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃１〜＃４（配列番号３０〜３３）)をトランスフェクションした。トランスフェクション後７２時間で、細胞抽出液を回収し、そして各サンプル由来の５μｇのタンパク質を、ＳＡＳ-ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜へと転写し、そしてｅＩＦ−５Ａ１に対する抗体でウエスタン・ブロットした。化学発光検出の後に、膜を剥離し、そしてアクチンに対する抗体で再プローブした。図６４を参照のこと。
【０１９０】
別の実験では、篩板細胞系列＃５０６を１００ｎｍのｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。６種のｓｉＲＮＡ、つまり２種のコントロールｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃５（配列番号３４）及びＧＡＰＤＨを標的とするｓｉＲＮＡ)及び４種のｅＩＦ−５Ａ１を標的とするｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃１〜＃４（配列番号３０〜３３）)をトランスフェクションした。トランスフェクション後４８時間で、培地を５０μＭカンプトテシン及び１０ｎｇ／ｍｌ・ＴＮＦ-αを含む培地と置換した。２４時間後、アポトーシスを起している細胞の割合(％)を、細胞をヘキストで標識することにより測定した。図６５を参照のこと。
【０１９１】
別の実験では、篩板細胞系列＃５０６を、１００ｎｍのｓｉＲＮＡとトランスフェクションした。６種のｓｉＲＮＡ、つまり２種のコントロールｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃５（配列番号３４）及びＧＡＰＤＨを標的とするｓｉＲＮＡ)及び４種のｅＩＦ−５Ａ１を標的とするｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃１〜＃４（配列番号３０〜３３）)でトランスフェクションした。トランスフェクション後７２時間で、培地を５０μＭのカンプトテシン及び１０ｎｇ／ｍｌ・ＴＮＦ-αを含む培地と置き換えられた。２４時間後、アポトーシス細胞の割合(％)を、細胞をヘキストで標識することにより測定した。図６６を参照のこと。
【０１９２】
別の実験では、篩板細胞系列＃５０６をトランスフェクションされないままにするか、又は１００ｎｍのｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。６種のｓｉＲＮＡ、つまり２種のコントロールｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃５（配列番号３４）及びＧＡＰＤＨを標的とするｓｉＲＮＡ)及びｅＩＦ−５Ａ１を標的とする４種類のｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃１〜＃４（配列番号３０〜３３）)をトランスフェクションした。トランスフェクション後７２時間後、培地を５０μＭカンプトテシン及び１０ｎｇ／ｍｌ・ＴＮＦ-αを含む培地と置き換えた。新たな培地をトランスフェクションされていない、未処理コントロール細胞に加えた。４８時間後、アポトーシス細胞の割合(％)を細胞を、ヘキストで標識することにより測定した。図６７を参照のこと。
【０１９３】
図６７及び実施例１３に記載された実験由来のｓｉＲＮＡでトランスフェクションされ、そしてカンプトテシン及びＴＮＦαで処理された篩板細胞系列＃５０６であってヘキスト染色されたものの写真にういては、図６８を参照のこと。
【０１９４】
実施例１４
ヒト細胞系列をアポトーシス因子５Ａに対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドで処理することにより、細胞のＴＮＦ-αの産生が少なくなることが本実施例により示される。
ＨｅｐＧ２細胞を、合計２日間、２.５μＭのコントロール・アンチセンス・オリゴヌクレオチド又はアンチセンス・オリゴヌクレオチドｅＩＦ５Ａ１＃２で処理した。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを含む新たな培地を、２４時間後に加えた。さらなる細胞を２日間未処理のまま置いておいた。処理の開始後４８時間で、細胞をＩＬ-１β(１０００ｐｇ／ｍｌ)で６時間処理した。実験の終わりに、ＴＮＦ-α定量用に、培地を回収し、そして冷凍した(-２０℃)。培地中に放出されるＴＮＦ-αを、Assay Designs Inc.から購入したＥＬＩＳＡアッセイを使用して計測した。
【０１９５】
実施例１５
ＨＴ-２９細胞(ヒト・大腸腺癌)を、ｅＩＦ−５Ａ１に対するｓｉＲＮＡ又は逆配列を有するコントロール・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。使用されたｓｉＲＮＡは、以下の通りである。
６９０位(３’ＵＴＲ)％Ｇ／Ｃ＝４８
５’ＡＡＧＣＵＧＧＡＣＵＣＣＵＣＣＵＡＣＡＣＡ３’（配列番号７９）
使用されたコントロールｓｉＲＮＡは以下のとおりである。
％Ｇ／Ｃ＝３９
５’ＡＡＡＣＡＣＡＵＣＣＵＣＣＵＣＡＧＧＵＣＧ３’（配列番号８０）
【０１９６】
４８時間後、細胞をインターフェロン-ガンマ(ＩＦＮ-ガンマ)で１６時間処理した。１６時間後、細胞を新たな培地で洗浄し、そしてリポ多糖(ＬＰＳ)で８又は２４時間処理した。各時間点において(８又は２４時間)、細胞培養培地を細胞から取り除き、冷凍し、そして培地中に存在するＴＮＦ-αを、ＥＬＩＳＡにより定量した。細胞ライセートを回収し、タンパク質について定量し、そしてＴＮＦ-α値を、ｐｇ／ｍｇタンパク質へと調節した(異なるウェルにおける細胞数の差を調節した)。ウエスタン・ブロット及びＥＬＩＳＡの結果を図７４Ａ及びＢに提供する。図７５は、細胞が高密度であることを除いて同じである実験の結果である。
【０１９７】
実施例１６
Ｕ-９３７細胞系列の組織培養条件
Ｕ-９３７は、懸濁状態で成長し、そしてＰＭＡで刺激された際に、接着を開始し、そしてマクロファージへと分化するヒト単球細胞系列(ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ-１５９３.２)である(これらの細胞はＡＴＣＣから直接得たものではない)。細胞を、２ｍＭ・Ｌ-グルタミン、１.５ｇ/Ｌ炭酸水素ナトリウム、４.５ｇ/Ｌグルコース、１０ｍＭ・ＨＥＰＥＳ、１.０ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０内で、３７℃・ＣＯ2(５％)のインキュベーター内にて維持した。週に二回細胞を新たな培地に分け(分割比１：４又は１：５)、そして細胞密度をつねに１０5及び２×１０6細胞/ｍｌの間に維持した。細胞を、組織培養処理Ｔ２５フラスコ中で、懸濁状態で培養し、そして実験を２４ウェル・プレート内で行った。
【０１９８】
タイムコース実験
実験の開始２日前に、細胞密度を、３×１０5細胞／ｍｌ培地に調節した。実験の日に、細胞を対数期で回収した。細胞懸濁液を、１５ｍｌチューブに移し、そして４００×ｇで１０分間、室温で遠心した。上清を吸引し、そして細胞ペレットを新たな培地で洗浄／再懸濁した。細胞を再び４００×ｇで１-分間遠心し、上清を吸引し、そして細胞ペレットを最終的に新たな培地で最終的に再懸濁した。等量の細胞懸濁液及びトリパン／ブルー溶液(０.４％トリパン・ブルー色素を含むＰＢＳ)を混合し、そして血球計数版及び顕微鏡を使用して生細胞を計数した。細胞を４×１０5細胞／ｍｌに希釈した。
【０１９９】
ＰＭＡ又はＤＭＳＯ(溶媒コントロール)のいずれかを各ウェルに加えることにより、２４ウェル・プレートを準備した。１ｍｌの細胞懸濁液を各ウェルに加え、その結果各ウェルは、４０００００細胞、０.１％ＤＭＳＯ＋／-１６２ｎＭ・ＰＭＡを含んだ。細胞を、３７℃・ＣＯ2(５％)インキュベーター内で維持した。区分けされたウェルの細胞を、０、２４、４８、７２、９６、９９及び１０２時間で回収した。実験時間点及び添加の要約について、図７６を参照のこと。
【０２００】
培地を７２時間で交換した。幾つかの細胞が接着し、そして残りは懸濁状態であったので、接着細胞がバラバラになることを避けるために注意を払った。各ウェルからの培地を注意深く対応するマイクロ遠心チューブに移し、そしてチューブを１４０００×ｇで３分間遠心した。チューブを吸引処理し、細胞ペレットを、新たな培地(１ｍｌ、(-)ＤＭＳＯ、(-)ＰＭＡ)中で懸濁し、そしてそれらの元のウェルに戻した。細胞は、ＰＭＡを伴わない新たな培地中で静止し始めた。９６時間で、ＬＰＳ(１００ｎｇ／ｍｌ)を加え、そして細胞を３ｈか９９ｈ)及び６ｈ(１０２ｈ)後に回収した。
【０２０１】
時間点において、懸濁細胞及び培地を各ウェルから遠心チューブ中に移した。細胞を１４０００×ｇで３分間ペレット化した。培地(上清)をきれいなチューブに移し、そしてＥＬＩＳＡ／サイトカイン分析用に貯蔵した(-２０℃)。ウェル内に残っている細胞をＰＢＳで洗浄し(１ｍｌ、３７℃)、そしてこのＰＢＳを使用して、対応するマイクロ遠心チューブ内の細胞ペレットを洗浄した。細胞を、１４０００×ｇで３分間再びペレット化した。細胞を煮沸溶解緩衝液(５０ｍＭ・トリスｐＨ７.４及び２％ＳＤＳ)で溶解した。各ウェルからの接着細胞及び懸濁細胞を取っておいた。サンプルを煮沸し、そして次に-２０℃で貯蔵した。
【０２０２】
ウエスタン・ブロット
各細胞サンプルにおけるタンパク質濃度を、ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン)を標準タンパク質として使用して、ＢＣＡ(ビシンコニン酸)法により測定した。タンパク質サンプル(５μｇ全量タンパク質)を１２％ＳＤＳ-ＰＡＧＥ電気泳動により分離し、そしてＰＶＤＦ膜へと転写した。膜をポリビニル・アルコール(１μｇ／ｍｌ、３０秒)でブロッキングし、そして５％スキム・ミルクを含むＰＢＳ-ｔ(１時間)ブロッキングした。膜を、ヒトｅＩＦ-５Ａに対するマウス・モノクローナル抗体(ＢＤ Biosciences cat＃611976；５％スキムミルクを含むPBS-t中1：20000で１時間)でプローブした。膜をＰＢＳ-ｔで３×１０分洗浄した。二次抗体は、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体(Sigma、１：５０００、１％スキムミルク、１ｈ）であった。タンパク質のバンドを、化学発光により可視化した(ＥＣＬ検出システム、Amersham Pharmacia Biotech)。
【０２０３】
同等の量のタンパク質を各ゲル・レーンにロードしたことを示すために、膜を剥離し、そしてアクチンについて再プローブ化した。膜を剥離し(１００ｍM・２メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ、６２.５ｍＭトリス-ＨＣｌ・ｐＨ６.７；５０℃で３０分間)、洗浄し、次に上記のようにブロッキングした。膜をアクチン・一次抗体(マウス中で作成したアクチン・モノクローナル抗体；Oncogene, Ab-1；５％スキムミルク中に１：２００００)でプローブした。二次抗体、洗浄、及び検出は上記と同様であった。
【０２０４】
図７７は、ｅＩＦ５Ａが、単球(Ｕ-３９７)が分化する間上方制御され、そしてその後にＴＮＦ-αが分泌されることを示す。
【０２０５】
実施例１７：ｅＩＦ５Ａ・ｓｉＲＮＡによる、インターフェロン・ガンマに応答したＩｌ-８産生の抑制
ＨＴ-２９(ヒト結腸腺癌)細胞を、アポトーシスｅＩＦ５Ａに対するｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。トランスフェクション後約４８時間で培地を交換し、その結果、幾つかの試験サンプルは、インターフェロン・ガンマを伴う培地を有し、そして幾つかのサンプルはインターフェロン・ガンマを伴わない培地を有した。インターフェロン・ガンマの添加後１６時間で、細胞を洗浄し、そしてＴＮＦαを伴う又は伴わない培地を、細胞に加えた。ＩＬ-８のＥＬＩＳＡ検出に使用する(培地)及び細胞ライセートを、８又は２４時間後に回収した。
【０２０６】
図７９及び８０は、ＩＬ-８がＴＮＦ-アルファに応答して、並びにインターフェロンに応答して産生されることを示す。ＴＮＦ処理の前に、インターフェロン・ガンマで細胞を刺激することにより、細胞は、単独の処理よりも多いＩＬ８を産生するようになる。これは、インターフェロンに応答するＴＮＦ受容体の知られている上方制御のためのようであり、該細胞をインターフェロンで「刺激」することによって、該細胞がより多くの受容体を有するようになるので、細胞がＴＮＦによりよく応答することが可能になる。ｅＩＦ５Ａに対するｓｉＲＮＡは、ＴＮＦのみに応答したＩＬ-８の産生に影響を与えない(前述の実験)が、該ｓｉＲＮＡは、インターフェロンに応答するほとんど全てのＩＬ-８並びにインターフェロン及びＴＮＦの併用処理の結果として産生されたＩＬ-８のかなりの量をブロックした。これらの結果は、アポトーシスｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡの使用によって、該ｓｉＲＮＡは、ＩＬ-８を導くインターフェロン・シグナル経路を有するが、ＴＮＦ経路を有さないということを示した。図８１は、ＨＴ-２９細胞においてインターフェロンガンマに応答するアポトーシスｅＩＦ５Ａの上方制御(８時間で４倍)を示すウエスタンである。
【０２０７】
実施例１８
ヒト篩板細胞培養
ヒトの両目を、Canada, Ontario Divisionのアイバンクから死後４８時間以内に得た。(付着された極を伴う)視神経乳頭を取り出し、そして抗生物質／抗真菌剤、グルタミン、及び１０％ＦＢＳを含むダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ)中に３時間置いた。視神経乳頭(ＯＮＨ)ボタンを、各組織サンプルから回収し、そして解剖ハサミで細かく切って、４の小片にした。移植片を１２.５ｃｍ2プラスチック製培養フラスコ内のＤＭＥＭ培地中で培養した。生育できた移植片について１月間成長を観測した。細胞が９０％コンフルエントに達すると、トリプシン処理され、そして分化継代培養に供して、篩板(ＬＣ)及び星状細胞集合を産生した。ＬＣ細胞を、ゲンタマイシン、グルタミン、及び１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭを入れた２５ｃｍ2フラスコ内で継代することにより濃縮した。このプロトコルのように、細胞を維持し、そして継代培養した。
【０２０８】
異なる継代により得た細胞集合を、８ウェル培養スライド上で、異なる蛍光抗体を使用することにより、同一性及び集合の均一性について特徴づけした。細胞を１０％ホルマリン溶液中で固定し、そしてダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩水(ＤＰＢＳ)で３回洗浄した。２％脱脂乳を含むＤＰＢＳでブロッキングしたのちに、抗体を１％ＢＳＡを含むＤＰＢＳ中で希釈し、そして６個のウェルに加えた。残った２個のウェルを、１％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)溶液のみで、及びコントロールとして二次抗体のみで処理した。細胞を、一次抗体で、１時間室温でインキュベーションし、そして３回ＤＰＢＳで洗浄した。適切な二次抗体を１％ＢＳＡを含むＤＰＢＳ中に希釈し、各ウェルに加え、そして１時間インキュベーションした。スライドを水で洗浄し、風乾し、そして蛍光標本培地 (Vector Laboratories)を各スライドに加えた。免疫蛍光染色を、適切なフィルターを備える蛍光顕微鏡の下で観察し、そして一次抗体で処理されていないコントロール・ウェルと比較した。全ての一次抗体を、他に記載がない限りSigmaから得た。全ての二次抗体をMolecular Prove社から購入した。ＬＣ細胞を同定するために使用される一次抗体は、抗-コラーゲンＩ、抗-コラーゲンＩＶ、抗ラミニン、及び抗-細胞フィブロネクチン、抗グリア線維酸性タンパク質(GFAP)、及び抗アルファ-平滑筋アクチンであった。細胞集合が、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ラミニン、細胞フィブロネクチン、α平滑筋アクチンについて陽性に染色され、かつグリア線維(ＧＦＡＰ)について陰性に染色される場合、細胞集合はＬＣ細胞から構成されるということが確定される。この試験において、２セットのヒトの目を使用して、培養を開始する。ＬＣ細胞系列＃５０６及び＃５１７を、８３歳男性及び１７歳男性の視神経乳頭からそれぞれ確立した。全てのＬＣ細胞系列は、十分に特徴付けられており、そして９０％を超えるＬＣ細胞を含むことが分かった。
【０２０９】
ＬＣ細胞のトランスフェクション
５０μＭのカンプトテシン(Sigma)及び１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ-α(Leinco Technologies)の組合せを使用して、篩板細胞に誘導した。カンプトテシン及びＴＮＦ-αの併用は、アポトーシスを誘導する点で、カンプトテシン又はＴＮＦ-αいずれかのみより有効であることが分かった。
【０２１０】
ｓｉＲＮＡの構築及びトランスフェクション
ヒトｅＩＦ５Ａ１に対する低分子抑制ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)を使用して、篩板細胞において、ｅＩＦ５Ａ１の発現を特異的に抑制した。６種のｓｉＲＮＡを、サイレンサー(Ｓｉｌｅｎｃｅｒ)(商標)ｓｉＲＮＡ構築キット(Ambion  Inc)を使用してin  vitro転写により作成した。４種のｓｉＲＮＡを、ヒトｅＩＦ５Ａ１に対して作成した(ｓｉＲＮＡ(＃１〜＃４)。２種のｓｉＲＮＡ、キット内に提供されるＧＡＰＤＨに対するｓｉＲＮＡ、及びｅＩＦ５Ａ１特異的ｓｉＲＮＡ＃１の逆配列を有するが、それ自身はｅＩＦ５Ａを標的としないｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃５)を、コントロールとして使用した。ｓｉＲＮＡを製品プロトコルに従って作成した。ｅＩＦ５Ａ及びコントロールｓｉＲＮＡ標的は、以下の配列を有した：
ｓｉＲＮＡ＃１  ５’ＡＡＡＧＧＡＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＡ３’（配列番号８１）；
ｓｉＲＮＡ＃２  ５’ＡＡＧＡＴＣＧＴＣＧＡＧＡＴＧＴＣＴＡＣＴ３’（配列番号８２）；
ｓｉＲＮＡ＃３  ５’ＡＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴＧＧＴＴＧＧＴＡＴＴ３’（配列番号８３）；
ｓｉＲＮＡ＃４  ５’ＡＡＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＡＣＡ３’（配列番号８４）；
ｓｉＲＮＡ＃５  ５’ＡＡＡＧＴＣＧＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＡＧＧＡ３’（配列番号８５）。
篩板細胞に、リポフェクタミン２０００を使用してｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。細胞集密度が４０〜７０％であるとき、篩板細胞はトランスフェクションされ、そして一般的に篩板細胞は、１ウェルあたり７５００細胞で、トランスフェクションの３日前に８ウェル培養スライド上に蒔かれた。８ウェル培養スライドの１ウェルに十分な量のトランスフェクション培地は、２５.５ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡを、Ｏｐｔｉ-Ｍｅｍ(Ｓｉｇｍａ)中に最終体積２１.２μｌまで希釈することにより調製した。０．４２５μｌのリポフェクタミン２０００を終量２１．２μｌのＯｐｔｉ−Ｍｅｍに７〜１０分間室温にてインキュベーションした。希釈されたリポフェクタミン２０００混合体を、次に希釈されたｓｉＲＮＡ混合液に加え、そして室温で２０〜３０分間インキュベーションした。細胞を無血清培地で一回洗浄し、その後１３５μｌの無血清培地を細胞に加え、そして４２.４μｌのトランスフェクション培地を加えた。細胞を成長チャンバーに４時間戻した。インキュベーションの後、６５μｌの無血清培地プラス３０％ＦＢＳを細胞に加えた。ウエスタン・ブロット分析について使用される細胞中へのｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、８ウェルスライドでトランスフェクションした条件と同じ条件であるが、体積を２.３倍に増加させた条件を使用して、２４ウェルプレートで行われた。トランスフェクションの後に、５０μＭのカンプトテシン(Ｓｉｇｍａ)及び１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ-α(Leinco  Technologies)で処理する前に、篩板細胞を７２時間インキュベーションして、アポトーシスを誘導した。細胞ライセートを次にウエスタンブロッティング用に回収するか、又は細胞をアポトーシスについて試験した。
【０２１１】
アポトーシス細胞の検出
アポトーシスを起している細胞の割合(％)を測定するために、ＴＮＦ-α及びカンプトテシンで２４時間処理されたトランスフェクションされた細胞を、ヘキスト３３２５８で染色した。簡潔に記載すると細胞を、３：１の無水メタノール及び氷酢酸の混合液で固定し、次にヘキスト染色液 (０.５μｇ／ｍｌへキスト３３２５８を含むＰＢＳ)を加えた。暗所で１０分間インキュベーション後、染色溶液を捨て、培養スライドのウェルを区切るチャンバーを取り除き、そしてスライドを１分間脱イオン水で３回洗浄した。洗浄後、数滴のマックルバイン緩衝液(０.０２１Ｍクエン酸、０.０５８Ｍ・Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ；ｐＨ５.６)を細胞に加え、そしてカバーガラスを被せた。染色された細胞を、ＵＶフィルターを使用して蛍光顕微鏡の下で可視化した。明るく染色された細胞又は断片化された核を有する細胞を、アポトーシスを起している細胞として数えた。１ウェルあたり最低２００個の細胞を計数した。アポトーシスを起している細胞の特徴であるＤＮＡの断片化を検出するために、DeadEnd蛍光定量ＴＵＮＥＬ(Promega)も使用した。ヘキスト染色の後に、細胞スライドを蒸留水で簡単に洗浄し、そしてさらにスライドをＰＢＳ(１３７ｍＭ・ＮａＣｌ、２.６８ｍＭ・ＫＣｌ、１.４７ｍＭ・ＫＨ2ＰＯ4、８.１ｍＭ・Ｎａ2ＨＰＯ4)中に５分間二回スライドを浸し、洗浄と洗浄との間でスライドをペーパータオル上で拭いた。細胞を０．２％トライトンＸ−１００を含むＰＢＳ中に５分間浸すことにより透過処理した。次に、スライドをＰＢＳ中に５分間２回浸すことにより再び洗浄し、そして洗浄と洗浄の間でペーパータオル上でスライドを拭き取った。１ウェルあたり２５μｌの平衡緩衝液[２００ｍＭカコジル酸カリウム(ｐＨ６.６)、２５ｍＭトリス-ＨＣｌ(ｐＨ６.６)、０.２ｍＭジチオスレイトール、０.２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、及び２.５ｍＭ塩化コバルト]を加えて、そして５〜１０分間インキュベーションした。平衡化の間、３０μｌの反応混合液を各ウェルについて、４５：５：１の比率の平衡緩衝液、ヌクレオチドミックス[５０μＭフルオレセイン-１２-ｄＵＴＰ、１００μＭ・ｄＡＴＰ、１０ｍＭ・トリス-ＨＣｌ(ｐＨ７.６)、および１ｍＭ・ＥＤＴＡ]、及び末端デオキシヌクレオチド・トランスフェラーゼ酵素(Ｔｄｔ、２５Ｕ／μｌ)を混合することにより調製した。平衡緩衝液中でインキュベーションした後に、３０μｌの反応混合液を１ウェルあたりに加え、そしてカバーガラスを被せた。反応を暗所にて３７℃で１時間進ませた。スライドを、２×ＳＳＣ[０.３Ｍ・ＮａＣｌ、及び３０ｍＭクエン酸ナトリウム(ｐＨ７.０)]中に浸し、そして１５分間インキュベーションすることにより反応を終わらせた。スライドを次にＰＢＳ中に浸すことにより５分間３回洗浄した。ＰＢＳをキムワイプで、ウェルの周りを吸い取ることにより取り除き、そして標本培地(Oncogene Reearch Project、Ja1750-4ML)を各ウェルに加え、そしてスライドにカバーガラスを被せた。ヘキスト染色された核を計数するために、ＵＶフィルター(ＵＶ-Ｇ３６５、フィルターセット４８７９０２)を使用して、細胞を蛍光顕微鏡の下で観察した。明るく染色された核又は断片化された核を有する細胞の全てをアポトーシスを起している細胞として数えた。���じ視野を使用して、次に蛍光フィルター(グリーンH546、フィルターセット48915)を使用して観察し、そして鮮緑色の蛍光を発する核の全てをアポトーシスを起している細胞として計数した。フルオレセイン・フィルターを使用して計数された鮮緑色の核の数をＵＶフィルターの下計数された核の総数で割ることにより、視野においてアポトーシスを起している細胞の割合(％)を計算した。１ウェルあたり、最低でも２００細胞を計数した。
【０２１２】
タンパク質抽出及びウエスタン・ブロット分析
細胞をＰＢＳ(８ｇ/Ｌ・ＮａＣｌ、０.２ｇ/Ｌ・ＫＣｌ、１.４４ｇ/Ｌ・Ｎａ2ＨＰＯ4、及び０.２４ｇ/Ｌ・ＫＨ2ＰＯ4)中で２回洗浄し、次に５０μｌの溶解緩衝液[２％ＳＤＳ、５０ｍＭトリス-ＨＣｌ(ｐＨ７.４)]を加えることにより、２４ウェル・プレート内で成長している篩板細胞からタンパク質をウエスタン・ブロッティング用に単離した。細胞ライセートをマイクロ遠心チューブ内に回収し、５分間煮沸し、そして-２０℃で使用するまで貯蔵した。タンパク質濃度を、ビシンコニン酸キット(ＢＣＡ；Sigma)を使用して測定した。ウエスタン・ブロッティング用に、５μｇの全タンパク質を、１２％ＳＤＳ-ポリアクリルアミド・ゲル上で分離した。分離したタンパク質を、ポリビニリデン・ジフロリド膜に転写した。該膜を次に１時間、ブロッキング溶液(５％スキムミルク粉末、０.０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ)中でインキュベーションし、そしてＰＢＳ-Ｔ(ＰＢＳ+０.０５％Ｔｗｅｅｎ-２０)で１５分間３回洗浄した。膜を一晩ＰＢＳ-Ｔ中で、４℃で保存した。次の日に室温まで温め、膜を３０秒間１μｇ/ｍｌのポリビニル・アルコール中でブロッキングした。膜を脱イオン水で５回洗浄し、そしてＰＢＳ中の５％ミルクの溶液中で３０分間ブロッキングした。一次抗体をＰＢＳ中５％ミルクの溶液中で、膜とインキュベーションする前に、３０分間プレインキュベーションした。使用された一次抗体は、１：２００００での抗-ｅＩＦ５Ａ(ＢＤ Transduction Laboratories)及び抗β-アクチン(Oncogene)であった。膜をＰＢＳ-Ｔ中で３回洗浄し、そして１％ミルクを含むＰＢＳ中に希釈された適切なＨＲＰ-結合二次抗体と１時間インキュベーションした。ブロットを洗浄し、そしてＥＣＬプラス・ウエスタン・ブロッティング検出キット(Amersham Pharmacia Biotech)を使用して、結合されたペルオキシダーゼ結合抗体を検出した。
【０２１３】
結果
２種の篩板細胞(Lamina cribrosa; ＬＣ)細胞系列を、８３歳(＃５０６)〜１７歳(＃５１７)の範囲の男性ドナーから得た視神経乳頭から樹立した。ヒト篩板から単離された細胞は、他の研究で観察された目立った核を有する広く平らな形態を有した(Lambert et al., 2001)。他の群の性質決定と一致して、ＬＣ細胞は、α平滑筋アクチン(図８２ａ)、並びに多くの細胞外マトリックスタンパク質、例えば細胞フィブロネクチン(図８２ｂ)、ラミニン(図８２ｃ)、コラーゲンＩ及びコラーゲンＩＶ(データー未掲載)に対する免疫反応性を示した(Clark et al., 1995; Hernandez et al., 1998 ; Hernandez and Yang, 2000; Lambert et al. ; 2001)。ＬＣ細胞がグリア線維酸性タンパク質(ＧＦＡＰ)に対して免疫反応性を示さないことは、以前の発見と一致して観測された(図８２ｄ)(Lambert et al., 2001)。これらの結果は、単離された細胞が、視神経乳頭星状細胞というよりはむしろＬＣ細胞であるという同定を指示した。
【０２１４】
ＴＮＦ-αが、緑内障発症プロセスの間、重要な役割を果たすということが信じられているので、ＴＮＦ-αの細胞傷害性効果に対するＬＣ細胞の感受性を試験した。コンフルエントＬＣ細胞を、カンプトテシン、ＴＮＦ-α、又はカンプトテシン及びＴＮＦ-αに３８時間晒した(図８３)。ヘキスト染色は、ＴＮＦ-αのみが、ＬＣ細胞に対する細胞傷害性がなかったということを示した。カンプトテシンでの処理は、ＬＣ細胞のおおよそ３０％の細胞死をもたらした。しかしながら、ＬＣ細胞がカンプトテシン及びＴＮＦ-αの両者で処理されたとき、ＬＣ細胞アポトーシスの相乗的増加が観察され、４８時間で４５％のＬＣ細胞死をもたらした。カンプトテシンによりアポトーシスを刺激したとき、ＬＣ細胞がＴＮＦ-αの細胞傷害性効果に応答できるということを、これらの結果は示した。
【０２１５】
ｅＩＦ５Ａは、細胞分裂に必須であると知られており、そしてアポトーシスに関与することが最近示唆された核細胞質輸送タンパク質である。我々は、カンプトテシン、又はカンプトテシン＋ＴＮＦ-αによりアポトーシスを引き起こされたＬＣ細胞において、ｅＩＦ-５Ａタンパク質の発現を試験した。ｅＩＦ-５Ａの発現は、カンプトテシンで処理した際には、かすかに減少したことを除いて、有意には変化しなかった(図８４Ａ)。しかしながら、ｅＩＦ５Ａタンパク質の有意な上方制御は、カンプトテシン＋ＴＮＦ-α処理の８時間後及び２４時間後で観測された。ｅＩＦ-５Ａ発現が、ＴＮＦ-αに晒されることにより特異的に誘導され、そしてｅＩＦ-５Ａの発現がアポトーシスの誘導に相関することがこれらの結果により示された。このことは、ＴＮＦ-α受容体結合の下流のアポトーシス経路におけるｅＩＦ５Ａの役割を指摘する。
【０２１６】
ＬＣ細胞におけるＴＮＦ-α誘導性アポトーシスの間、ｅＩＦ５Ａ発現の重要性を試験するために、ｅＩＦ５Ａを標的する４種のｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃１〜＃４)が設計され、in vitroトランスクリプションにより合成された。ｅＩＦ５Ａタンパク質発現を抑制する点でのｓｉＲＮＡの有効性を決定するために、ＬＣ細胞系列＃５０６及び＃５１７を、ｓｉＲＮＡの各々でトランスフェクションし、そして細胞ライセートにおいてｅＩＦ５Ａタンパク質の発現を、７２時間後に試験した(図８５)。比較のため、細胞をＧＡＰＤＨに対するｓｉＲＮＡ及び／又はｓｉＲＮＡ＃１と同じ化学組成を有するが、ｅＩＦ５Ａを認識しないコントロールｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃５)でトランスフェクションした。ｅＩＦ５Ａに対する全てのｓｉＲＮＡは、両方のＬＣ細胞系列において有意にｅＩＦ５Ａ発現を抑制することができた(図８５)。ＧＡＰＤＨ・ｓｉＲＮＡを、さらなるコントロールとして使用した。なぜなら、ｓｉＲＮＡ＃１の逆配列を単に有し、細胞内標的を有さないコントロールｓｉＲＮＡ＃５と違って、ＧＡＰＤＨ・ｓｉＲＮＡは、その標的タンパク質ＧＡＰＤＨの発現を抑制することができる活性型のｓｉＲＮＡであった(データー未掲載)。ｅＩＦ５Ａに対する４種全てのｓｉＲＮＡもまた、ＴＮＦ-α及びカンプトテシンで２４時間処理することにより誘導されたアポトーシスから、トランスフェクションされたＬＣ細胞(＃５０６)を防御することができた(図８６)。ヘキスト染色を使用して細胞死を検出すると、ｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃１〜＃４)は、ＬＣ細胞のアポトーシスを、５９％(ｓｉＲＮＡ＃１)、３５％(ｓｉＲＮＡ＃２)、５０％(ｓｉＲＮＡ＃３)、及び６９％(ｓｉＲＮＡ＃４)低減することができることが分かった。興味深いことに、ＧＡＰＤＨに対するｓｉＲＮＡは、ＬＣ細胞のアポトーシスを４２％低減することができた(図８６)。ＧＡＰＤＨは、糖分解酵素としてのその役割のほかに、細胞内機能を有していることが知られており、例えば細胞ニューロンのアポトーシスの間の提案された機能を含む(Ishitani and Chuang, 1996; Ishitani et al., 1996a; Ishitani et al., 1996b)。類似の実験において、ｓｉＲＮＡ＃１は、ＴＮＦ-α及びカンプトテシンに応答するＬＣ系列＃５１７のアポトーシスを５３％低減することができ、それによりｅＩＦ５Ａ・ｓｉＲＮＡは、異なる視神経乳頭から単離されたＬＣ細胞を防御するということが示される(図８７)。これらの結果により、ｅＩＦ５Ａは、アポトーシスの間に機能を有し、そしてＬＣ細胞中にＴＮＦ-α-誘導性アポトーシスを導く経路において重要な介在物でありうることが示される。
【０２１７】
ＴＮＦ-α及びカンプトテシンに晒されたＬＣ細胞が、古典的なアポトーシスにより死ぬということを確かめるために、末端デオキシヌクレオチド・トランスフェラーゼ媒介性ｄＵＴＰジゴキシゲニン・ニック末端標識(ＴＵＮＥＬ)を使用してＤＮＡ断片化をｉｎ ｓｉｔｕで評価した。ｅＩＦ５ＡｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃１)又はコントロールｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃５)のいずれかでトランスフェクションされた３日後、ＬＣ細胞(＃５０６)をＴＮＦ-α及びカンプトテシンで２４時間処理した。細胞をまた、ヘキストで染色して、核を可視化した。コントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞の４６％がＴＵＮＥＬ染色に対し陽性であり、一方ｅＩＦ５Ａ・ｓｉＲＮＡ＃１でトランスフェクションされた細胞の８％が陽性に標識され、このことから、ｅＩＦ５ＡｓｉＲＮＡがアポトーシスからの８０％超の保護を与えたということが示される(図８８)。同様の結果を、ｅＩＦ５ＡｓｉＲＮＡ＃４で得た。該ｅＩＦ５Ａ・ｓｉＲＮＡ＃４はコントロールｓｉＲＮＡに対してアポトーシスからの６０％超の保護を与えた(データー未掲載)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０Ａ】
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【図５０Ｂ】
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【図５０Ｃ】
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【図５０Ｄ】
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【図５０Ｅ】
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【図５０Ｆ】
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【図５１】
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【図５１Ａ】
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【図５１Ｂ】
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【図５１Ｃ】
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【図５１Ｄ】
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【図５２】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３Ａ】
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【図７３Ｂ】
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【図７４Ａ】
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【図７４Ｂ】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２Ａ】
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【図８２Ｂ】
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【図８２Ｃ】
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【図８２Ｄ】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９Ａ】
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【図８９Ｂ】
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【配列表】
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