(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上の官能基を含む１つの結合によってポリマーリガンドがポリマー担体に結合されている、ポリマー担体上に固定化されたポリマーリガンドを含むクロマトグラフィーのための吸着剤材料であって、
前記ポリマー担体がアルデヒド、活性エステル、活性化アルコール、エポキシド、カルボナート、カルボカチオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される反応性基を有し、
前記ポリマー担体はポリマー骨格を含むポリマーリガンドと反応させられ、それにより、ポリマー骨格とポリマー担体との間に１つの結合を形成しており、各結合が１以上の官能基を含み、
前記ポリマーリガンドは、１以上の官能基を有する少なくとも１種のビニルモノマーを含むモノマー混合物を、二官能性連鎖移動剤の存在下で重合することにより製造され、
かかる連鎖移動剤がフリーラジカル連鎖移動を可能にする基と、ポリマー担体の前記反応性基と反応して共有結合を形成する官能基を含む、吸着剤材料。
【請求項２】
ポリマー担体との反応を受けうる基が、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、アルデヒド、活性エステル、活性化アルコール、エポキシド、カルボナート、カルボカチオン、および合成同等物、これらの組み合わせ、アルコール、アミン、カルボアニオンおよび合成同等物、チオール、カルボキシラート、並びにこれらの組み合わせ、または不飽和二重結合から選択される、請求項１に記載の吸着剤材料。
【請求項３】
ポリマー担体が約０．５〜約５００μｍの体積平均粒子サイズを有する、請求項１に記載の吸着剤材料。
【請求項４】
ポリマー骨格を含むポリマーリガンドとポリマー担体とが反応させられ、それにより、ポリマー骨格とポリマー担体との間に１つの結合を形成しており、各結合が１以上の官能基を含む、ポリマー担体上にポリマーリガンドを固定化することを含む、クロマトグラフィーのための吸着剤材料を製造する方法であって、
前記ポリマー担体がアルデヒド、活性エステル、活性化アルコール、エポキシド、カルボナート、カルボカチオンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される反応性基を有し、
前記ポリマーリガンドは、１以上の官能基を有する少なくとも１種のビニルモノマーを含むモノマー混合物を、二官能性連鎖移動剤の存在下で重合することにより製造され、
かかる連鎖移動剤がフリーラジカル連鎖移動を可能にする基と、ポリマー担体の前記反応性基と反応して共有結合を形成する官能基を含む、方法。
【請求項５】
ポリマー担体との反応を受けうる基がアルコール、アミン、カルボアニオンもしくは合成同等物、チオール、カルボキシラート、またはこれらの組み合わせを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ポリマー担体が約０．５〜約５００μｍの体積平均粒子サイズを有する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ポリマーリガンドが溶液として、ポリマー担体の懸濁物に添加される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載のクロマトグラフィーのための吸着剤材料と、混合物とを接触させることを含む、混合物から化合物を分離する方法。
【請求項９】
前記ポリマー担体がアルデヒド、エポキシド、カルボナートおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される反応性基を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリマー担体がエポキシドからなる群から選択される反応性基を有する、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は共有結合したポリマー鎖を有する多孔質ポリマー媒体を製造する方法に関する。この媒体はクロマトグラフ精製に適用されることができ、改良されたタンパク質結合容量、反応速度、及び選択性を有する多孔質基材、並びにこれを製造する方法および使用する方法をもたらしうる。
【背景技術】
【０００２】
生体から得られる治療用タンパク質は現在のヘルスケアにおいてますます重要な役割を果たしている。これらのタンパク質は従来の医薬品を超える多くの利点、例えば、疾病ターゲットに対して増大した特異性および有効性を提供する。哺乳類の免疫系は疾病の脅威を制御し除去するために広範囲のタンパク質を使用する。遺伝子及びタンパク質工学の出現は多くの「設計された」または組み替えタンパク質治療の開発を可能にしてきた。これら治療は単一のタンパク質、化学修飾タンパク質、タンパク質フラグメントまたはタンパク質複合体をベースにすることができる。クロマトグラフ分離はこれらバイオ医薬品の製造に広範囲に使用される。この産業界が成熟するにつれて、分離を向上させるための新たな／進歩した技術及び方法の実施は、これらの薬剤をより多くの患者により低コストで提供する能力を生物治療プロデューサーに提供するであろう。
【０００３】
タンパク質を精製するのに使用される一般的なクロマトグラフ方法には、特に、アフィニティー、バイオアフィニティー、イオン交換、逆相、疎水性相互作用、親水性相互作用、サイズ排除および混合モード（上記カテゴリーの組み合わせを備える樹脂）が挙げられる。これらの種類のクロマトグラフィー手順のそれぞれの適用および効率はクロマトグラフィーシステムの固定相（クロマトグラフィー媒体）と溶質分子と（それぞれ移動液相と相互作用する）の間の表面−表面相互作用の選択性に頼っている。広範囲の固定相クロマトグラフィー担体材料が市販されている。
【０００４】
不純物から生成物を成功裏に分離することの鍵は多くの場合、固定相、ベースマトリックス（化学組成および孔構造）、およびリガンド特性（リガンド種類、リガンド密度、リガンド分布、リガンド長さおよび材料組成）、並びに移動相もしくは溶液特性（緩衝剤種類、ｐＨおよび導電率）の正しい組み合わせに頼っている。ベースマトリックスおよびリガンドの具体的な設計は、いくつかの鍵となる特性、例えば、タンパク質結合容量、選択性、床透過性、化学的安定性もしくはスループットによって特徴付けられうるクロマトグラフィー媒体を生じさせる。精製方法には、生成物を主に結合すること（結合および溶離）、不純物を主に結合すること（フロースルー）、および上記の組み合わせ（いわゆる、弱い分配など）が挙げられる。精製タンパク質製品をもたらす着実な分離を可能にし、かつ確実にするために、上記教示のクロマトグラフィー媒体特性を制御することがこれら技術の設計において重要である。
【０００５】
タンパク質分離は様々な多孔質基材またはベースマトリックス上で達成されうる。樹脂もしくはビーズ構造のための一般的な材料には、ポリサッカライド（アガロース、セルロース）、合成ポリマー（ポリスチレン、ポリメタクリラートおよびポリアクリルアミド）、並びにセラミックス（シリカ、ジルコニアおよび制御された多孔質ガラス）が挙げられる。
【０００６】
膜およびモノリス材料もクロマトグラフィーのために、特にフロースルー用途において一般的に使用される。典型的な膜組成には合成ポリマー、例えば、ポリフッ化ビニリデン、ポリエチレン、ポリエーテルスルホン、ナイロンおよびポリサッカライド、例えば、セルロースが挙げられる。モノリスはポリスチレン、ポリサッカライド、ポリメタクリラート、並びに他の合成ポリマー、ポリサッカライドおよびセラミックスから開発されてきた。膜およびモノリスクロマトグラフィーは、これらの材料が同じ「コンベクティブ（ｃｏｎｖｅｃｔｉｖｅ）孔」内にタンパク質を吸着する点でビーズとは異なり、このコンベクティブ孔は膜およびモノリス材料の透過性を制御する。典型的な膜およびモノリスコンベクティブ孔サイズは、約０．６μｍ〜約１０μｍの範囲である。これらの基材へのリガンド付加は、この文献に概説された技術をはじめとする様々な充分に開発された技術を通じて達成されうる。
【０００７】
タンパク質結合容量を向上させ、樹脂選択性を改変するためのリガンド「エキステンダー（ｅｘｔｅｎｄｅｒｓ）」の使用は、機能性ポリマー鎖をベースマトリックスに、例えば、ベースマトリックス表面から離れるように伸ばすグラフト化によるなどして結合させることを伴う。リガンドエキステンダーは典型的にはより大きな結合容量作り出す、というのは、このリガンドエキステンダーは官能基利用性を増大させ、そこでは標的分子結合が表面上での単層吸着のものを上回るからである。このリガンド技術のこのような使用の一つは米国特許出願公開第２００４／００５９０４０号に開示されている。米国特許出願公開第２００４／００５９０４０号は担体上にコーティングされたポリマーを含むクロマトグラフィーのための吸着材料を開示し、ここでポリマー骨格は１以上のアミド基を含む１以上の結合によって担体に結合されている。米国特許出願公開第２００４／００５９０４０号はポリマーが担体と反応させられて共有結合を形成することをさらに開示する。この方法は粒子表面上に表面コーティングを提供するのに有用であり、それによりその粒子表面は移動相との相互作用から保護される（例えば、シリカ粒子が高ｐＨの移動相に溶かされるのを防ぐために）。この方法はリガンドが粒子、例えば、ビーズの表面をコーティングするのを可能にするが、穴の中まで広がるリガンドを提供せず、生体分子のための高い容量を提供しない。
【０００８】
多孔質材料表面へのポリマーエキステンダーの付加は向上したタンパク質結合容量、結合反応速度およびタンパク質選択性の潜在的変化を提供する。しかし、タンパク質分離がより求められることになるにつれて、新規のポリマー構造を作り出すために新規かつより効果的な技術および方法を開発することがより重要となってきている。よって、タンパク質分離に使用される多孔質ポリマー基材の向上したもしくは改変されたタンパク質選択性および向上したタンパク質結合容量を有する多孔質ポリマー基材を開発することが望ましいであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／００５９０４０号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
向上したタンパク質結合容量および樹脂選択性を有し、タンパク質分離に有用な、新規な多孔質ポリマー基材についての上記必要性に応じて、ポリマー担体と後での反応が可能な官能性末端基を用いてポリマーエキステンダーリガンドが形成される、多孔質ポリマー基材上にポリマーエキステンダーをグラフト化する新規な方法が開発された。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、共有結合によってポリマー担体にポリマーリガンドを固定化する方法に関する。本発明の方法が行われると、より一般的なラジカルグラフト化技術中に起こる副反応を低減もしくは最小限にし、それにより、得られる官能化ポリマー媒体の安定性を向上させる。
本発明は、共有結合したポリマーリガンド鎖を有するマクロポーラスポリマー媒体を製造する方法にさらに関する。この媒体はクロマトグラフ精製に適用されうる。
一形態においては、本発明は、１以上の官能基を含む１以上の結合によってポリマーリガンドがポリマー担体に結合されている、ポリマー担体上に固定化されたポリマーリガンドを含むクロマトグラフィーのための吸着剤材料を提供する。
第２の形態においては、本発明は、ポリマー骨格を含むポリマーリガンドとポリマー担体とが反応させられ、それにより、ポリマー骨格とポリマー担体との間に１以上の結合を形成しており、各結合が１以上の官能基を含む、ポリマー担体上にポリマーリガンドを固定化することを含む、クロマトグラフィーのための吸着剤材料を製造する方法を提供する。
第３の形態においては、本発明は、１以上の官能基を含む１以上の結合によってポリマー骨格が担体上に結合されている、ポリマー担体に固定化されたポリマーリガンドを含むクロマトグラフィーのための吸着剤材料と混合物とを接触させることを含む、混合物から化合物を分離する方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書において使用される場合、用語「好ましくは」、「より好ましくは」および「最も好ましくは」は、優れているとみなされるモードを示唆することを意図するものではなく、より広い範囲またはグループの好適なより狭い範囲を具体化することを意味する。
本明細書に含まれる全ての範囲は包括的で、かつ組み合わせ可能である。
【００１３】
本明細書において使用される場合、多孔質とは、典型的には約２００Å〜３，０００Åである「拡散孔」を介してタンパク質を吸着する材料を意味する。ポリマー樹脂粒子を製造するための本発明の方法のある実施形態においては、全ての後続モノマーの全重量に対するポロゲンの重量の比率は０．１以上；０．２５以上；または０．５以上である。ポリマー樹脂粒子を製造する本発明の方法のある実施形態においては、全ての後続モノマーの全重量に対するポロゲンの重量の比率は１０以下；５以下；または、２．５以下である。
【００１４】
本発明のポリマー担体には、少なくとも１つの反応性基を有する少なくとも１種のビニルモノマーを含むモノマー混合物を重合することにより好適に製造されるあらゆるポリマービーズが挙げられる。反応性基の好適な例としては、求電子性基、もしくは求電子性基に変換可能な基、もしくは求核基、もしくは求核基に変換可能な基が挙げられる。
【００１５】
本発明のポリマー担体は懸濁、乳化もしくは分散重合によって製造されうる。本発明のポリマー担体を製造するのに使用される好適なビニルモノマーには、これに限定されないが、単一のビニル基を有するもの、複数のビニル基を有するもの、およびこれらの混合物が挙げられる。好適なビニルモノマーには、例えば、カルボン酸ビニル、ビニルウレタンモノマー、ビニル芳香族モノマー、（メタ）アクリラートエステル、置換（メタ）アクリラートエステル、（メタ）アクリルアミドおよびこれらの混合物が挙げられる。カルボン酸ビニルの好適な一例は酢酸ビニルである。ビニルウレタンモノマーの好適な一例はトリアリルイソシアヌラートである。好適なビニル芳香族モノマーの例としては、スチレン、ジビニルベンゼン、およびこれらの置換体（例えば、アルファ−メチルスチレンなど）が挙げられる。好適な置換（メタ）アクリラートエステルには、例えば、（メタ）アクリル酸と多価アルコールとのエステル、例えば、グリシジルメタクリラート、エチレングリコールジメタクリラート、ヒドロキシエチルメタクリラート、グリセロールジメタクリラート、ジメチルアミノエチルメタクリラートおよびこれらの混合物などが挙げられる。いくつかの好適な置換（メタ）アクリルアミドには（３−アミノプロピル）メタクリルアミドヒドロクロリド、およびヒドロキシエチルメタクリルアミドがある。
【００１６】
ポリマー担体材料は粒子状材料、またはかけら、シート、ロッド、チューブもしくはキャピラリーコーティングの形態であることができる。好ましくは、担体材料は粒子状材料であり、好適には、約０．５〜約５００μｍ、好ましくは約０．７〜約２００μｍ、最も好ましくは約１０〜約１２０μｍの体積平均粒子サイズを有する。この粒子は好ましくは実質的に球状である。粒子状材料は好適には孔を含む。粒子状担体材料の孔サイズ、孔体積、および比表面積は、使用される担体材料の種類、担体に結合されるポリマーの特性、および使用の際に望まれる分離特性に応じて変動しうる。孔サイズは好適には約２０〜約４０００Å、好ましくは約５０〜約１５００Åである。パーフュージョン（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）孔については、孔サイズは好適には約２０００〜約８００００Å、好ましくは約５０００〜約５００００Åである。孔体積は好適には、約０．１〜約４ｍｌ／ｇ、好ましくは約０．３〜約２ｍｌ／ｇ、最も好ましくは約０．５〜約１．５ｍｌ／ｇである。比表面積は好適には約１〜約１０００ｍ２／ｇ、好ましくは約２５〜約７００ｍ２／ｇ、最も好ましくは約５０〜約３００ｍ２／ｇである。
【００１７】
ポリマーリガンドの少なくとも１つの反応性基は本発明のポリマー担体に共有結合される。本発明のポリマー担体との反応を受けうるポリマーリガンド上の好適な反応性基には、これに限定されないが、求電子性基、例えば、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、アルデヒド、活性エステル、活性化アルコール、エポキシド、カルボナート、カルボカチオン、および合成同等物、ならびにこれらの組み合わせ、または求核性基、例えば、アルコール、アミン、カルボアニオンおよび合成同等物、チオール、およびカルボキシラート、並びにこれらの組み合わせ、または不飽和二重結合のようなフリーラジカル受容体が挙げられる。
【００１８】
本発明のポリマーリガンドとの反応を受けるポリマー担体上に存在する好適な反応性基には、これに限定されないが、求電子性基、例えば、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、アルデヒド、活性エステル、活性化アルコール、エポキシド、カルボナート、カルボカチオン、および合成同等物、ならびにこれらの組み合わせ、または求核性基、例えば、アルコール、アミン、カルボアニオンおよび合成同等物、チオール、およびカルボキシラート、並びにこれらの組み合わせ、または不飽和二重結合のようなフリーラジカル受容体が挙げられる。
【００１９】
本明細書において使用されうるポリマーリガンドを含むポリマーの例には、これに限定されないが、アクリル、メタクリル、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリサッカライドおよびこれらの混合物が挙げられる。
【００２０】
本明細書において使用されうるポリマーリガンド上の官能基には、これに限定されないが、イオン交換基、疎水性相互作用基、親水性相互作用基、チオフィリック相互作用基、金属アフィニティー基、アフィニティー基、バイオアフィニティー基、混合モード基（上述のものの組み合わせ）が挙げられる。本明細書において使用されうる好適な官能性ポリマーリガンドの例には、これに限定されないが、強カチオン交換基、例えば、スルホプロピル、スルホン酸；強アニオン交換基、例えば、トリメチルアンモニウムクロリド；弱カチオン交換基、例えば、カルボン酸；弱アニオン交換基、例えば、Ｎ，ＮジエチルアミノもしくはＤＥＡＥ；疎水性相互作用基、例えば、フェニル、ブチル、プロピル、ヘキシル；並びにアフィニティー基、例えば、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、およびタンパク質Ｌ、並びに別の官能基にさらに変換可能な非官能性モノマーもしくは中間モノマー（例えば、イオン交換もしくはアフィニティーリガンドに変換されるグリシジルメタクリラート）、並びにこれらの混合物が挙げられる。
【００２１】
ある実施形態においては、官能性ポリマーリガンドは二官能性（ｄｕａｌ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）連鎖移動剤の存在下での官能性モノマーフリーラジカル重合を介して生じさせられる。連鎖移動剤はポリマーリガンドの分子量に影響し、ポリマー担体との反応を可能にする用に添加される。重合中の二官能性連鎖移動剤とモノマーとの反応は官能性末端基で末端形成されたポリマーリガンドを生じさせる。好適な二官能性連鎖移動剤はフリーラジカル連鎖移動を可能にする基と、ポリマー担体とポリマーリガンドとの反応に好適な官能基の双方を含む。好適な連鎖移動剤には、例えば、ハロメタン、ジスルフィド、チオール（メルカプタンとも称される）、および金属錯体が挙げられる。さらなる好適な連鎖移動剤には、少なくとも１つの容易に引き抜き可能な水素原子を有する様々な他の化合物、及びその混合物が挙げられる。好適な反応性基には、これに限定されないが、求電子性基、例えば、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、アルデヒド、活性エステル、活性化アルコール、エポキシド、カルボナート、カルボカチオン、および合成同等物、ならびにこれらの組み合わせ、または求核性基、例えば、アルコール、アミン、カルボアニオンおよび合成同等物、チオール、およびカルボキシラート、並びにこれらの組み合わせ、または不飽和二重結合のようなフリーラジカル受容体が挙げられる。連鎖移動剤は１回以上の添加でまたは連続的に、線形的にまたはそうではなく、全反応期間のほとんどもしくは全てにわたって、または反応期間の限定された部分で添加されうる。連鎖移動剤は反応に０．０１％〜５％、より好ましくは０．１％〜１％の濃度で添加されうる。
【００２２】
架橋剤、分岐剤および非官能性モノマーはポリマーリガンドの形態もしくは相互作用を制御する目的のために、ポリマーリガンド上に結合されうる。しかし、ポリマーリガンド上のこれら架橋剤もしくは分岐剤は好適には５％未満、より好ましくは１％未満の低い水準で存在する。好適な架橋剤もしくは分岐剤には、これに限定されないが、モノマー、例えば、エチレングリコールジメタクリラート、ジビニルベンゼン、トリメチルプロピルトリメタクリラート、およびメチレンビスアクリルアミド、または多官能性連鎖移動剤が挙げられる。
【００２３】
本明細書において使用されうる「フリーラジカル開始剤」の例には、これに限定されないが、ビニルモノマーと反応することができポリマーリガンドを形成することができるあらゆるフリーラジカル開始剤、例えば、ペルオキシド、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、クメンヒドロペルオキシド；ペルオキシアセタート、例えば、過酢酸、クロロ過安息香酸；過硫酸塩、例えば、過硫酸アンモニウム、過硫酸ナトリウム、カリウムペルオキソジスルファート、アゾ開始剤、例えば、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）、イルガキュア（Ｉｒｇａｃｕｒｅ登録商標）２９５９（ニューヨーク州ホースロンのチバガイギー）、２，２’−アゾビス（２−アミジノ−プロパン）ヒドロクロリドなど、並びにこれらの混合物が挙げられる。グラフト化反応は当該技術分野において知られている方法、好ましくは熱開始（加熱）、もしくはＵＶ照射で開始されうる。フリーラジカル開始剤は水溶性もしくは油溶性でありうる。フリーラジカル開始剤は反応に０．０１％〜１５％、より好ましくは０．１％〜２％の濃度で添加される。
【００２４】
ポリマーリガンドはポリマー担体に好適に共有結合される。ポリマーリガンドはポリマー担体の懸濁物に溶液として好適に添加される。次いで、ポリマーリガンドは当業者に知られた方法によって、好適にろ別され、洗浄され、および交互に乾燥させられる。反応中の温度は好適には約２５℃〜約９０℃、好ましくは約５０℃〜約８０℃である。ある実施形態においては、混合物は不活性雰囲気下に維持される。
【００２５】
本発明はクロマトグラフ分離方法におけるクロマトグラフィーのために吸着剤材料の使用をさらに含む。このようなクロマトグラフ分離方法は、例えば、イオン交換、疎水性相互作用、親水性相互作用、チオフィリック相互作用、金属アフィニティー、アフィニティー、バイオアフィニティー、および混合モード（上述のものの組み合わせ）、超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）、および擬似移動床（ＳＭＢ）でありうる。
【００２６】
本発明はクロマトグラフ分離方法におけるクロマトグラフィーのために吸着剤材料の使用をさらに含む。このようなクロマトグラフ分離方法は、例えば、低圧液体クロマトグラフィー、中圧液体クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）、および擬似移動床（ＳＭＢ）でありうる。
【００２７】
本発明は、本発明に従うクロマトグラフィーのための吸着剤材料と混合物を接触させることを含む、混合物から化合物を分離する方法をさらに含む。
【００２８】
本発明の主たる利点は、分子、より具体的には生体分子のクロマトグラフィー捕捉および／または精製のためのあらかじめ製造されたポリマーリガンドグラフト化を使用する高容量イオン交換樹脂の形成である。
【実施例】
【００２９】
実施例において含まれる材料は以下のソースから得られた。
ＧＥヘルスケア：Ｑ−セファロース商標
フィッシャーサイエンティフィック：ＨＣｌ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
シグマ−アルドリッチ：ＢＳＡ、シリンジフィルター、（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウム、２−アミノエタンチオールヒドロクロリド、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）
【００３０】
実施例１
ポリマーリガンドの製造
０．１１１ｇの２−アミノエタンチオールヒドロクロリド（ＡＥＴ・ＨＣｌ）および０．１８６ｇの２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）ジヒドロクロリド（ＡＢＭＰＡ・２ＨＣｌ）が別々の秤量皿に秤量され、３８ｇのすすぎ水と共に、２５０ｍＬの丸底フラスコに入れられた。３０ｇの（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド（ＡＡＰＴＭＡＣ）および３２ｇの水がこのフラスコに直接秤量された。温度計およびＮ２バブラーを伴う水で満たされた凝縮器がこのフラスコに取り付けられた。材料がフラスコに入れられた後で、反応混合物は７８℃で５時間攪拌された。
【００３１】
実施例２−吸収剤材料の生成（ポリマーリガンドとポリマー担体との反応）
実施例１において生じた冷却されたポリマーリガンド溶液９０ｇ、および１０．６ｇのポリＧＭＡ−ＧｌｙＤＭＡ湿潤ケーキが丸底フラスコに入れられた。Ｎ２雰囲気下で、スラリー溶液はオーバーヘッドスターラー（２００ｒｐｍ）を用いて６５℃で１６時間攪拌された。得られた冷却した懸濁物はろ過され、水で洗浄（４回×２００ｍＬ）された。アニオン交換樹脂が水性スラリー溶液として貯蔵された。このアニオン交換樹脂についてのウシ血清からのアルブミン（ＢＳＡ）容量は１５５ｍｇ／ｍＬである。
【００３２】
吸収剤材料についてのＢＳＡ容量試験
溶液１の調製（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．６１）
１２．１ｇのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを２Ｌの容量フラスコに入れた。次いで、Ｎ／１００のＨＣｌ溶液を添加して、２リットルの印までフラスコを満たした。容量フラスコに蓋をした後でこの内容物を振とうした。この溶液を５分間静置し、溶液の体積を再度チェックした。２Ｌの印まで体積を調節するために追加のＨＣｌを入れた。ｐＨをチェックすると８．６１であった。この溶液を冷蔵し、ラベル（溶液１）した。
【００３３】
溶液２の調製（２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液）
０．８０６ｇのＢＳＡがガラスジャーに秤量され、４０３ｇの溶液１に添加された。この内容物は手作業で穏やかに混合されて溶解させられた。ＢＳＡの完全な溶解を確実にするためにこの溶液を０．５時間静置した。この溶液をラベルした（溶液２）。
【００３４】
空気を捕捉するのを妨げるために、１ｍｌのＤＩ水が１本のＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐクロマトグラフィーカラムにゆっくりと添加された。油性インクペンで水の高さの印を付けた。カラムからエンドプラグ取り除いた。カラムは排気フード内のマニホルドに接続された。より多くのＤＩ水がカラムに添加され、空気の捕捉を妨げるためにカラムの底に留まる水のレベルが１〜２ｃｍになるまで穏やかな真空がカラムに適用された。
【００３５】
スラリーアニオン交換樹脂溶液がカラムに添加された。樹脂上方の水のヘッドが常に維持された。充填された床が印を付けられた１ｍｌの高さに到達するまで、移送ピペットで希釈された樹脂スラリーをゆっくりと添加することにより、カラム内に樹脂の１ｍｌの樹脂が量り入れられた。樹脂上方の溶液１〜２ｃｍ以外の全てを除去するために穏やかな真空が適用された。樹脂のレベルが１ｍｌの印より下になったら、追加の真空をかけながら、さらなる樹脂スラリーが添加された。樹脂床に空気が入らないように注意すべきである（床が空気にさらされる前に真空を停止する）。必要な場合には、樹脂床が空気にされされないように維持するために追加の量のＤＩ水が使用された。充填された１ｍｌの樹脂は約１０ｍｌのＤＩ水ですすがれ、スラリー溶液を置き換え、水のレベルが充填床の１〜２ｃｍ上方になるまで液体が排出された。次いで、充填された１ｍｌの樹脂は１０ｍｌの溶液１でフラッシュされた。真空が適用されて全ての溶液１はカラムから吸引され、空気は１分間にわたってカラムを通して吸引された。湿潤ケーキを収容するディスポーサブルカラムはマニホルドから取り外された。
【００３６】
カラムからの湿潤ケーキは、スパチュラを用いて、２００ｍＬのＢＳＡ溶液２（次の工程から）の少量を含む８オンスのガラスジャーに移された。２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液２の２００ｍｌがガラスジャーに移された。ガラスジャーにキャップをした。ジャーをパラフィルムで密封した。ガラスジャーは振とう器上に水平に置かれ、サンプルは１８時間穏やかに振とうされた。
【００３７】
１８時間後、サンプルは振とう器から取り外され、樹脂は１５分間沈降させられた。１５分後、８オンスのジャーを開けて、５ｍｌシリンジを用いてジャーから３ｍＬのサンプルを取り出した。シリンジに０．２２μｍのフィルターを取り付けて、次いでこのシリンジに圧力をかけて、ＢＳＡ溶液をゆっくりとフィルターを通してディスポーサブルＵＶキュベットに押し出した。ＢＳＡ結合容量は、１８時間のインキュベーション後のろ過された上澄ＢＳＡ溶液の２７８ｎｍＵＶ吸光度から決定された。