(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で示される化合物。
【化１】
0005585960.tif 000017
（式中、Ｒ2はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基、ハロゲン原子、又は水素原子を示す。）
【請求項２】
下記式（１Ａ）で示される化合物。
【化２】
0005585960.tif 000018
【請求項３】
下記式（２）で示される化合物。
【化３】
0005585960.tif 000019
（式中、Ｒ2はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基、ハロゲン原子、又は水素原子を示し、Ｒ3は炭素数１から６のアルキル基、アリール基、又は水素原子を示し、Ｒ4は酸素原子を含む基または水素原子を示し、Ｒ3とＲ4は結合して環を形成していてもよい。）
【請求項４】
下記式（２Ａ）で示される化合物。
【化４】
0005585960.tif 000020
（式中、Ｒ2はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基、ハロゲン原子、又は水素原子を示す。）
【請求項５】
下記式（２Ｂ）で示される化合物。
【化５】
0005585960.tif 000021
【請求項６】
請求項１から５の何れかに記載の化合物を含むチオール検出試薬。
【請求項７】
請求項１から５の何れかに記載の化合物とチオール基を有する化合物とをインビトロで反応させることによって生成する蛍光を検出することを含む、インビトロにおけるチオールの検出方法。
【請求項８】
請求項１から５の何れかに記載の化合物とチオール基を有する化合物との反応を細胞内で行う、請求項７に記載のインビトロにおけるチオールの検出方法。
【請求項９】
チオール基を有する化合物が生体分子である、請求項７又は８に記載のインビトロにおけるチオールの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チオール、特にタンパク質などの生体分子中に存在するチオールを検出することができる新規化合物、並びに上記化合物を用いたチオール検出試薬及びチオールの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞のチオールは、生物系で重要な役割を担う。チオール濃度の変化は、毒物及び疾患と関連のある酸化ストレスに関連している。グルタチオンは、最も豊富な細胞チオールであり、抗酸化剤として作用して、細胞を多くの発癌物質から保護する。ホモシステインは、心臓血管疾患及びアルツハイマー病などの疾患の危険因子である。システイン残基中のチオール基は、ジスルフィド結合の形成を通じてタンパク質の三次元構造に関与している。システインの欠損は、重篤な健康問題を引き起こす可能性がある。従って、細胞内チオールの検出は、細胞の機能を調べるために非常に重要である。【０００３】
Ellman試薬は、古くから広く使用されているチオール検出試薬である（非特許文献１）。しかしながら、この試薬のアッセイは吸光度変化に基づくものであるため、in vitroでのみ使用可能である。感受性蛍光プローブを含む幾つかのチオール検出方法が報告されている。２，４−ジニトロベンゼンスルホニルエステルで保護されたフルオレセイン誘導体が報告されている（非特許文献２及び３）。このプローブは、生物学的チオールと反応して、短い反応時間で高い蛍光強度を与える。しかし、このプローブは、スルホニルエステルが水溶液中で加水分解されてしまうため、バックグラウンド蛍光を発生させる可能性があるという問題がある。【０００４】
最近、２，４−ジニトロベンゼンスルホンアミド（ＤＮＢ）基を有する蛍光プローブが報告されている（非特許文献４及び５）。スルホンアミド基は、加水分解に耐性であり、バックグラウンド蛍光も発生しない。【０００５】
【非特許文献１】Ellman, G. L. Arch. Biochem. Biophys. 1959, 82, 70.
【非特許文献２】Maeda, H.; Matsuno, H.; Ushida, M.; Katayama, K.; Saeki, K.; Itoh, N. Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 2922.;
【非特許文献３】Maeda, H.; Katayama, K.; Matsuno, H.; Uno, T. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 1810.
【非特許文献４】Jiang, W.; Fu, Q.; Fan, H.; Ho, J.; Wang, W. Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 8445.
【非特許文献５】Bouffard, J.; Kim, Y.; Swager, T. M.; Weissleder, R.; Hilderbrand, S. A. Org. Lett. 2008, 10, 37.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、in vivoでも使用可能であると同時に、加水分解によるバックグラウンド蛍光の発生という問題を解消した、新規なチオール検出試薬及びそれを用いたチオール検出方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、汎用され安価なローダミンまたはクレシルバイオレット  を、２，４−ジニトロスルホニル基で保護することにより、新規な蛍光発生型化合物を合成することに成功した。本発明の蛍光発生型化合物は、チオールと特異的に反応し、蛍光を発生することができるため、生細胞内でのチオールを可視化することができる。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。【０００８】
本発明によれば、下記式（１）で示される化合物が提供される。
【化１】
0005585960.tif 000002
（式中、Ｒ2はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基、ハロゲン原子、又は水素原子を示す。）【０００９】
好ましくは、下記式（１Ａ）で示される化合物が提供される。
【化２】
0005585960.tif 000003
【００１０】
本発明によればさらに、下記式（２）で示される化合物が提供される。
【化３】
0005585960.tif 000004
（式中、Ｒ2はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基、ハロゲン原子、又は水素原子を示し、Ｒ3は炭素数１から６のアルキル基、アリール基、又は水素原子を示し、Ｒ4は酸素原子を含む基または水素原子を示し、Ｒ3とＲ4は結合して環を形成していてもよい。）【００１１】
好ましくは、下記式（２Ａ）で示される化合物が提供される。
【化４】
0005585960.tif 000005
（式中、Ｒ2はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基、ハロゲン原子、又は水素原子を示す。）【００１２】
さらに好ましくは、下記式（２Ｂ）で示される化合物が提供される。
【化５】
0005585960.tif 000006
【００１３】
本発明によればさらに、上記した本発明の化合物を含むチオール検出試薬が提供される。
本発明によればさらに、上記した本発明の化合物とチオール基を有する化合物とを反応させることによって生成する蛍光を検出することを含む、チオールの検出方法が提供される。
好ましくは、本発明の化合物とチオール基を有する化合物との反応を細胞内で行う。
好ましくは、チオール基を有する化合物は生体分子である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の蛍光発生型化合物は、チオールと特異的に反応し、蛍光を発生することができるため、生細胞内でのチオールを可視化することができるためのチオール検出試薬として有用である。特に、本発明の蛍光発生型化合物を含むチオール検出試薬を用いることによって、細胞内におけるチオールの局在を調べることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明では、ローダミンから新規な蛍光プローブを作成した（式２Ｂ）。ローダミン色素は蛍光が強く、photo bleaching（光感受性の喪失）に耐性を有していることから、生体分子の蛍光標識として最も広く使用されている。４５０から７００ｎｍの発光範囲を有する一群のローダミン誘導体が存在する。本発明の蛍光プローブは、多くのローダミン誘導体に適用でき、生物学的チオールに対する多色の蛍光検出試薬を製造することができる。【００１６】
蛍光発生プローブの化学には、２，４−ニジトロベンゼンスルホンアミド基に対するチオール基の求核攻撃と、それによるスルホンアミド結合の切断が関与する。その後、開環ラクトン型のローダミンが蛍光シグナルを放出する（反応式1）。本発明のプローブは、市販のローダミン１１０から一段階で合成した。出発化合物を、ＤＭＦ中でＫＯｔ−Ｂｕの存在下において２，４−ジニトロベンゼンスルホニルクロライドで１６時間処理して、目的のプローブを収率１０％で得た。【００１７】
【化６】
0005585960.tif 000007
【００１８】
反応式１：蛍光発生プローブの反応機構
プローブの２，４−ニジトロベンゼンスルホンアミド基がチオールとの反応により切断されてローダミンが生成し、蛍光シグナルが生成する。【００１９】
上記では、ローダミンを基本骨格とする緑色蛍光プローブを開発した。しかし、イメージングにおいては、より長波長側の蛍光、つまり赤色蛍光化合物が有用である。そこで、クレシルバイオレット（CV）を基本骨格とする赤色蛍光プローブ（DNｓ-CV）を設計した(式１Ａ)。このプローブは、CVの一つのアミノ基をジニトロベンゼンスルホニル(DNs)基で保護するだけで消光する。そして、チオール類が存在すると求核置換反応によって保護基であるDNsが除去され、蛍光が発生する。このプローブは、クレシルバイオレットに、KOt-BuとClSO2Ph(NO2)2 を加えて、反応させることによって製造した。【００２０】
【化７】
0005585960.tif 000008
【００２１】
反応式２：蛍光発生プローブの反応機構
プローブの２，４−ニジトロベンゼンスルホンアミド基がチオールとの反応により切断されてクレシルバイオレットが生成し、蛍光シグナルが発生する。【００２２】
本発明の化合物は、下記式（１）で示される化合物である。
【化８】
0005585960.tif 000009
（式中、Ｒ2はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基、ハロゲン原子、又は水素原子を示す。）【００２３】
好ましくは、本発明の化合物は、下記式（１Ａ）で示される化合物である。
【化９】
0005585960.tif 000010
【００２４】
本発明の化合物（プローブ）は、下記式（２）で示される化合物である。
【化１０】
0005585960.tif 000011
（式中、Ｒ2はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基、ハロゲン原子、又は水素原子を示し、Ｒ3は炭素数１から６のアルキル基、アリール基、又は水素原子を示し、Ｒ4は酸素原子を含む基または水素原子を示し、Ｒ3とＲ4は結合して環を形成していてもよい。）【００２５】
好ましくは、本発明の化合物は下記式（２Ａ）又は（２Ｂ）で示される化合物である。
【化１１】
0005585960.tif 000012
（式中、Ｒ2はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基、ハロゲン原子、又は水素原子を示す。）【００２６】
【化１２】
0005585960.tif 000013
【００２７】
本発明において、炭素数１から６のアルキル基としては、直鎖又は分岐鎖の何れでもよく、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、又はヘキシル基を挙げることができる。【００２８】
本発明において、ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子を挙げることができる。
本発明において、アリール基としては、フェニル基、又はナフチル基を挙げることができる。
本発明において、酸素原子を含む基としては、−Ｏ−、又は−ＯＣＯ−などを挙げることができる。【００２９】
本発明の式（１）で示される化合物（式（１Ａ）で示される化合物も含まれる）または本発明の式（２）で示される化合物（式（２Ａ）又は式（２Ｂ）で示される化合物も含まれる）を、チオール基を有する化合物と反応させると、上記反応式１の反応により蛍光を発する。従って、例えば、細胞を上記化合物と一緒にインキュベートし、細胞の蛍光画像を取得することにより、細胞内におけるチオールの局在を調べることが可能である。【００３０】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３１】
（実施例Ａ）
合成例Ａ１：本発明のプローブの合成
【化１３】
0005585960.tif 000014
【００３２】
ＤＭＦ（2ml）中のローダミン110（110.9mg, 0.28mmol）溶液に、ＴＨＦ（2ml）中のKOt-Bu（92.2mg, 0.82mmol, 3eq）溶液を０℃で滴下した。３０分後、反応液に、2,4-dinitrobenzenesulfonyl chloride（220.2mg, 0.83mmol, 3eq）を添加した。室温で２時間後、反応液に、2,4-dinitrobenzenesulfonyl chloride（223mg, 0.84mmol, 3eq）を添加した。１６時間後、反応液を酢酸エチルで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液で分液した。有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥した後、減圧濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して上記化合物２（20.7mg, 0.03mmol, 10％）を得た。【００３３】
1H-NMR (400MHz, CDCl3/CD3OD) :δ 8.47-8.46 (d, 2H, J= 2.2), 8.37-8.34 (dd, 2H, J= 2.2, 11.0), 8.19-8.17 (d, 2H, J= 8.8), 7.91-7.89 (d, 1H, J= 7.1), 7.61-7.53 (m, 2H), 7.04-7.01 (m, 3H), 6.74-6.72 (dd, 2H, J= 2.2, 11.0), 6.53-6.51 (d, 2H, J= 8.5).
13C-NMR (99.5 MHz, CDCl3/CD3OD) δ 168.97, 151.38, 149.84, 148.06, 137.38, 135.28, 133.07, 130.11, 129.16, 127.12, 126.62, 125.99, 125.10, 123.58, 120.31, 116.52, 115.68, 108.70.
QSTAR(Applied Biosystems/MDS SCIEX)(ESI-Q-TOF): [M-H]-C32H17N6O15S2: calcd. 789.0193; Found 789.0176【００３４】
実施例Ａ１：蛍光測定
（方法）
反応は、100ｎＭのプローブ（化合物２）と10ｍＭのシステインを用いて、50ｍＭ Tris-HCl(pH7.4)中で３７℃で３０分間行った。蛍光スペクトルは、蛍光スペクトル計（FP-6500; JASCO）により取得した。４９０ｎｍの励起による蛍光を、スキャン範囲４５０−６５０ｎｍで取得した。【００３５】
（結果）
蛍光応答を調べるために、（合成例Ａ１で合成した）プローブを、Tris-HCl緩衝液(50 mM, pH 7.4)中で、システインと一緒に、又はシステインなしで、溶液中でインキュベートした。得られた吸収スペクトル及び蛍光スペクトルを図１に示す。システインなしの溶液は、ＤＮＢ基に由来する５１６ｎｍに最大吸収を示した。システインをプローブ溶液に添加した場合、最大吸収ピークは、ＤＮＢ基の切断により、４９８ｎｍの短波長側にシフトした（図１ａ）。蛍光特性も調べた。４９０ｎｍの励起では有意な蛍光は、システインなしのプローブでは観察されなかった。しかし、溶液にシステインを添加した後では、強い蛍光が５２０ｎｍ付近に生じ、蛍光は約3500倍に増加した（図１ｂ）。【００３６】
実施例Ａ２：プローブとチオールとの反応性
（方法）
プローブ（化合物２）と数種のチオールとの反応性を、５２２ｎｍにおける蛍光強度の増加を測定することによって調べた。反応は、１μＭのプローブと1ｍＭのチオールを用いて、50ｍＭ Tris-HCl(pH7.4)中で３７℃で３０分間行った。【００３７】
また、比較例として、下記式  （３）：
【化１４】
0005585960.tif 000015
を有する化合物をプローブとして用いて、上記と同様に反応性を調べた。【００３８】
（結果）
本プローブを生物学的チオールの検出に応用する際には、選択性は重要な問題である。プローブはチオールに特異的に応答し、他の生物学的物質に対するシグナルを生成すべきではない。選択性を調べるために、プローブを幾つかの生物学的物質で処理し、蛍光シグナルを測定した。チオールに対するプローブの選択性は、生理条件下で生体関連物質を用いて５２２ｎｍの蛍光をモニターすることによって検証した。図２に示す通り、有意な蛍光強度の増加が、システイン、ホスホロチオエート、ジチオトレイトール及びグルタチオンについて観察された(５０〜２００倍)。しかしながら、２−メルカプトエタノール（ＭＥ）との反応は、蛍光強度の増加は僅かであった (１１倍)。２−メルカプトエタノールのpKa値は、他のチオールの値よりも高い値である９．５である。従って、ＤＮＢ基との反応は遅いはずである。予想通り、プローブは、グリシン、アスコルビン酸又は過酸化水素などの他の生物学的物質に対して活性を示さなかった。 本プローブは、生物学的環境において非常に安定であった。例えば、プローブを50 mM Tris 緩衝液(pH 7.4)中で55℃で24時間加熱した後でも、蛍光シグナルの増加は検出されなかった。以上より、本発明のプローブは、生物学的チオールに対する優れた選択性を示し、不要な蛍光シグナルは生じないことが確認された。【００３９】
また、比較のために用いた式（３）の化合物の場合、ホスホロチオエートとのみ反応し(約950倍)、それ以外のチオール基とは反応が見られなかった（図４）。【００４０】
実施例Ａ３：蛍光顕微鏡観察
（方法）
生細胞試験のために、HeLa細胞を３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下においてＭＥＭ中で生育させた。細胞を、２５μＭのプローブ（化合物２）（1:100 DMSO/PBS(-), v/v）の存在下で３７℃で１５分間インキュベートした。コントロール実験として、細胞をPBS(-)中の1mM N−メチルマレイミドで３７℃で６０分間処理し、PBS(-)緩衝液で３回洗浄した後、細胞を２５μＭのプローブ（1:100 DMSO/PBS(-), v/v）の存在下で３７℃で１５分間インキュベートした。【００４１】
蛍光画像は、デジタルカメラ（Cool Snap HQ; Roper Scientific）及び画像ソフトウエア（MetaMorph; Molecular Devices）を用いて、水銀ランプを備えた蛍光顕微鏡（Axiovert 200M; Carl Zeiss）により取得した。顕微鏡の設定は、以下の通りである。励起；470/40 バンドパスフィルター, 発光; 525/50 バンドパスフィルター, 照射時間300 msec.【００４２】
（結果）
本発明のプローブの最も重要な用途は、生細胞のチオールのモニタリングである。この可能性を調べるために、HeLa細胞中の生物学的チオールを画像化することを試みた。明視野像及び蛍光画像の写真を蛍光顕微鏡で撮った結果を図３に示す。本発明のプローブ（25μＭ）と一緒に１５分間インキュベートした場合、細胞は有意な蛍光シグナルを示した（図３ｄ）。強いシグナルは細胞質に局在していた。一方、核は弱い蛍光シグナルを示した。対照的に、細胞をチオールブロッキング剤であるＮ−メチルマレイミドで前処理してから本発明のプローブで同様にインキュベートした場合には、蛍光シグナルは観察されなかった（図３ｂ）。この結果より、本発明のプローブは細胞膜を浸透し、生細胞のチオール量の変化を画像化できることが示された。即ち、本発明の蛍光プローブは、チオールに応答したシグナルを生成でき、生細胞内の生物学的チオールのイメージングに応用可能である。【００４３】
（実施例Ｂ）
合成例Ｂ１：本発明のプローブの合成
【化１５】
0005585960.tif 000016
【００４４】
クレシルバイオレット ( 250 mg, 0.691 mmol ) をDMF 7mLに溶解し、氷冷した。そこに、THF 1mL に溶解した KOt-Bu ( 155 mg, 1.38 mmol ) を滴下し、アルゴン雰囲気下1時間撹拌した後、ClSO2Ph(NO2)2 ( 368 mmol, 1.38 mmol ) を加え、1時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、飽和重曹水、水で分液した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧蒸留により溶媒を除去した。残渣をシルカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物４ ( 30 mg, 0.061mmol, 9% )を得た。【００４５】
1H-NMR (300 MHz, DMSO ) : δ8.85-8.84( 1H, d, J= 1.3 Hz, Ar ), 8.71-8.69 ( 1H, d, J=8.0 Hz, Ar ) 8.60-8.57 ( 1H, d, J= 10.6 Hz, Ar ) 8.45-8.43 ( 1H, d, J= 8.76 Hz, Ar ) 8.36-8.34 ( 1H, d, J= 8.1 Hz, Ar ) 7.89-7.71 ( 5H, m, Ar) 7.19 ( 1H, s, Ar ) 7.03-7.00 ( 1H, d, J=11.0 Hz, Ar ) 6.76-6.75 ( 1H, d, J=2.2 Hz, Ar )
13C-NMR (99.5 MHz, DMSO ) : δ174.22, 163.10, 158.89, 151.77, 150.20, 148.64, 147.27, 139.76, 133.99, 133.22, 131.75, 131.45, 130.48, 129.40, 127.26, 125.50, 123.44, 122.66, 120.03, 117.49, 99.42, 97.17
QSTAR(Applied Biosystems/MDS SCIEX)(ESI-Q-TOF): [M+H]+ C22H14IN5O7S : calcd. 492.0608; Found 492.0604.【００４６】
実施例Ｂ１：溶液中での蛍光測定
（方法）
プローブ（化合物４）100 nM とGSH 10 mM を50 mM Tris-HCl(pH 7.4)中で37℃、30分間反応させた後、分光蛍光光度計(FP-6500; JASCO)を用いて測定を行った(励起波長540 nm) 。【００４７】
（結果）
合成したプローブ（化合物４）の蛍光特性をGSH（Glutathione）と反応させることにより検討した。540nmの励起光で蛍光スペクトルを測定したところ、DNｓ-CV単体では蛍光を発生しないが、GSHを反応させることでDNs基が脱保護され、620nmに蛍光強度の増加が観察された(図５)。【００４８】
実施例Ｂ２：フローサイトメトリー
（方法 ）
HL60にプローブ（化合物４）100 μMを加え、37℃、15分間反応させた後、フローサイトメトリーにより測定をおこなった。HL60にチオール類のブロッキング剤であるN-メチルマレイミド(N-MMI)1mMを加え、37℃、30分間反応させた後、プローブ100 μMを加え、37℃、15分間反応させフローサイトメトリーにより測定を行った。【００４９】
（結果）
フローサイトメトリーを用いて、DNｓ-CVによる生細胞内でのGSHの定量を試みた結果を図６に示す。HL60 細胞をGSHのブロッキング剤であるN-メチルマレイミド（N-MMI）で処理した後にDNｓ-CVを導入したもの（+N-MMI）よりも、細胞にDNｓ-CVのみを導入した方(-N-MMI)が、蛍光強度が高かった。本プローブ（化合物４）では、定量的な測定が可能であった。この結果は、DNｓ-CVが選択的に生細胞内GSHと反応し蛍光を発生することを示している。以上の結果から、新規蛍光化合物であるDNｓ-CVは、有用な細胞内GSH活性検出剤であることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１ａは、20 mM Cysあり（実線）及びなし（点線）での50 mM Tris-HCl (pH 7.4)中の20 μMプローブの吸収スペクトルを示し、図１ｂは、50 mM Tris-HCl (pH 7.4)中で３７℃で３０分間インキュベーションした後の、10 mM Cysあり（実線）及びなし（点線）での100 nMプローブの蛍光スペクトルを示す。蛍光は、490nmの励起でモニターした。
【図２】図２は、50 mM Tris-HCl (pH 7.4)中において１ｍＭのチオールの存在下における１μＭのプローブの蛍光強度を示す。チオールの添加後、溶液を３７℃で３０分間インキュベートした。５２２ｎｍの蛍光を、４９０ｎｍでの励起によりモニターした。３’−thio dT は ３’−ホスホロチオエート−２’−デオキシチミジン；ＤＴＴはジチオトレイトール；ＧＳＨはグルタチオン、Ｌ−GlyはＬ−グリシン、Vcはアスコルビン酸を示す。
【図３】図３は、HeLa細胞の蛍光画像を示す。 (a, b)Ｎ−メチルマレイミド(1 mM)で37℃で60分間前処理してから、プローブ(25 μM)と一緒に37℃で15分間インキュベートした細胞のコントロール画像； (c, d) プローブ(25 μM)と一緒に37℃で15分間インキュベートした細胞の画像； (a, c) 明視野像； (b, d) 蛍光画像：  顕微鏡の設定は以下の通りである。励起；470/40 バンドパスフィルター, 発光; 525/50 バンドパスフィルター, 照射時間300 msec.
【図４】図４は、50 mM Tris-HCl (pH 7.4)中において１ｍＭのチオールの存在下における１μＭのプローブ（比較用の化合物）の蛍光強度を示す。チオールの添加後、溶液を３７℃で３０分間インキュベートした。５２２ｎｍの蛍光を、４９０ｎｍでの励起によりモニターした。３’−thio dT は ３’−ホスホロチオエート−２’−デオキシチミジン；ＤＴＴはジチオトレイトール；ＧＳＨはグルタチオン、Ｌ−GlyはＬ−グリシン、Vcはアスコルビン酸を示す。
【図５】図５は、プローブ（化合物４）100 nM とGSH 10 mM を50 mM Tris-HCl(pH 7.4)中で37℃、30分間反応させた後、分光蛍光光度計を用いて測定を行った(励起波長540 nm)結果を示す。
【図６】図６は、HL60にプローブ（化合物４）100 μMを加え、37℃、15分間反応させた後、フローサイトメトリーにより測定を行った結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図３】
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