(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロキシアルキルデンプン誘導体を調製する方法であって、
（ｉ）式（Ｉ）
【化１】
0005486507.tif 000236
（Ｉ）
で示すヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）を、このＨＡＳの還元末端の炭素原子Ｃ＊を介して、式（ＩＩ）
【化２】
0005486507.tif 000237
（ＩＩ）
で示す架橋化合物のアミノ基Ｍと反応させるステップ
（Ａが式（ＩＩａ）
【化３】
0005486507.tif 000238
に示す残基であり、
Ｚ１およびＺ２がそれぞれ独立して、ＯまたはＳまたはＮＲｘであり、ＲｘがＨまたは低級アルキルまたはＣ（Ｏ）−Ｒｙであり、ＲｙがＣ１−Ｃ６アルキルおよびＣ６−Ｃ１４アリールからなる群よりは選択され、
Ａ１およびＡ２がそれぞれ独立して、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ベンジル、１，１，１−トリクロロエチル、ニトロベンジル、メトキシベンジル、もしくはエトキシベンジルであるか、または式（ＩＩｂ）
【化４】
0005486507.tif 000239
に示す環を形成し、
Ａ１およびＡ２がひとまとめにされて、−（ＣＨ２）２−または−（ＣＨ２）３−または−（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３））−であり、
Ａ３が、Ｈもしくはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ペンチル、ベンジルであるか、またはアミノ基ＭのＮ原子もしくはＬに含まれる好適な原子と共に環を形成し、
Ｃ＊は、前記ＨＡＳのＭとの反応の前に場合によっては酸化される）と、
式（ＩＩＩ）
【化５】
0005486507.tif 000240
（ＩＩＩ）
に示すＨＡＳ誘導体を得るステップ
（Ｘは、前記場合によっては酸化されるＨＡＳの還元末端の炭素原子Ｃ＊を介したアミノ基ＭとＨＡＳとの反応から生じた官能基であり、
前記アミノ基Ｍが式（ＩＩｃ）
【化６】
0005486507.tif 000241
による基であり、
Ｙが、存在しないか、または
【化７】
0005486507.tif 000242
からなる群より選択される化学部分であるかのどちらかであり、
Ｇが、ＯまたはＳまたはＮＨであり、２個存在する場合には、各Ｇが独立して、ＯまたはＳまたはＮＨであり、
Ｒ’が、Ｈまたはヒドロキシ基または１〜１０個の炭素原子を有するアルキル、置換アルキル、アリールおよび置換アリールからなる群より選択される有機残基であり、
ＭおよびＡを架橋するＬが、式（ＩＩｄ）
【化８】
0005486507.tif 000243
による少なくとも１個の構造単位を含むスペーサであり、
Ｌ１およびＬ２がそれぞれ独立して、Ｈまたはアルキルおよび置換アルキルからなる群より選択される有機残基であり、
ｎが１〜２０の整数であり、
ＨＡＳ’が、ヒドロキシアルキルデンプン分子の残部であり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が独立して、水素または直鎖もしくは分枝ヒドロキシアルキル基である）と
を含む方法。
【請求項２】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が独立して、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｈ基であり、ｎが整数である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｎが０、１、２、３、４、５または６である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒドロキシアルキルデンプンがヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）である請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
Ｒｘが、Ｈまたはメチル、エチルもしくはプロピル、またはＣ（Ｏ）−Ｒｙであり、Ｒｙが、置換もしくは非置換であるメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、およびｔｅｒｔ−ブチルからなる群より選択される請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
Ｚ１およびＺ２がＯであり、Ａ３がＨであり、Ａ１およびＡ２がそれぞれエチルであるか、またはＡ１およびＡ２が式（ＩＩｂ）による環を形成して、Ａ１およびＡ２がひとまとめにされて−（ＣＨ２）２−である請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記アミノ基Ｍが、Ｈ２Ｎ−、Ｈ２Ｎ−Ｏ−、Ｈ２Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−、Ｈ３Ｃ−ＮＨ−またはＨ３Ｃ−ＮＨ−Ｏ−である請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記アミノ基Ｍが、Ｈ２Ｎ−、Ｈ２Ｎ−Ｏ−またはＨ２Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
（ｉ）のステップにおいて、ＨＡＳがその酸化還元末端を介して架橋性化合物のＨ２Ｎ−である前記アミノ基Ｍと反応して、前記反応が０〜８０℃の範囲の温度で実施され、Ｘが−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−である請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
（ｉ）のステップにおいて、ＨＡＳが、その非酸化還元末端を介して架橋性化合物のＨ２Ｎ−である前記アミノ基Ｍと反応して、前記反応が４〜７の範囲のｐＨにて２０〜８０℃の範囲の温度で実施され、Ｘが−ＣＨ＝Ｎ−である請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
（ｉ）のステップにおける前記ＨＡＳの反応を、水性系において行う請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
（ｉ）のステップにおいて、前記反応が、ＨＡＳ誘導体を得るために還元剤の存在下で実施され、Ｘが−ＣＨ２−ＮＨ−である請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記還元剤がＮａＣＮＢＨ３である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ｉ）のステップにおいて、ＨＡＳが、その非酸化還元末端を介して架橋性化合物Ｈ２Ｎ−Ｏ−またはＨ２Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−である前記アミノ基Ｍと反応して、前記反応が４．５〜６．５の範囲のｐＨにて５〜８０℃の範囲の温度で実施され、Ｘが−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−または−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−である請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
（ｉ）のステップにおける前記ＨＡＳの反応を、水性系において行う請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＭおよびＡを架橋するＬが、式（ＩＩｄ）
【化９】
0005486507.tif 000244
による構造単位からなるスペーサであり、
ｎが、１〜２０の整数である請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
Ｌが−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ１−であり、ｎが１〜１０の整数である請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
Ｌが−ＣＨ２−ＣＨ２−である請求項１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
Ｌが、少なくとも１個の構造単位−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ１−Ｏ−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ２−を含み、ｎ１は、ｎ２と等しいか又はｎ２とは異なる請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
Ｌが、−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ１−を介して前記架橋性化合物のアミノ基Ｍに結合される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｌが−（（ＣＬ１Ｌ２）２−Ｏ）ｍ−（ＣＬ１Ｌ２）−であり、ｍが１、２または３である請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
Ｌが−（（ＣＨ２）２−Ｏ）ｍ−ＣＨ２−であり、ｍが２または３である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
Ｌが−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−であり、各ｎがそれぞれ独立して、好ましくは１〜４の範囲である請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
Ｌが−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−であり、各ｎがそれぞれ独立して１〜３の範囲である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
Ｌが、−（ＣＨ２）３−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）３−、−（ＣＨ２）３−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）３−、および−（ＣＨ２）２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−からなる群より選択される請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
式（ＩＩ）による前記架橋化合物Ｍ−Ｌ−Ａが、
【化１０】
0005486507.tif 000245
【化１１】
0005486507.tif 000246
【化１２】
0005486507.tif 000247
【化１３】
0005486507.tif 000248
【化１４】
0005486507.tif 000249
【化１５】
0005486507.tif 000250
【化１６】
0005486507.tif 000251
からなる群から選択される請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
式（ＩＩ）による架橋化合物Ｍ−Ｌ−Ａが、
Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＯＣＨ２ＣＨ３）２、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＣＨ２ＣＨ３）２、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＯＣＨ２ＣＨ３）２、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）３−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＯＣＨ２ＣＨ３）２、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）７−ＣＨ（ＯＣＨ２ＣＨ３）２、Ｈ２Ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＣＨ２ＣＨ３）２およびＨ２Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＯＣＨ２ＣＨ３）２からなる群より選択される請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
式（ＩＩ）による前記架橋化合物Ｍ−Ｌ−Ａが１−アミノ−３，３−ジエトキシプロパンである請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
（ｉｉ）式（ＩＩＩ）によるＨＡＳ誘導体を生物活性剤Ｈ２Ｎ−ＢＡ’のアミノ基と、Ａ基を介して、還元的アミノ化によって反応させて、式（ＩＶ）
【化１７】
0005486507.tif 000252
（ＩＶ）
の前記ＨＡＳ誘導体を得るステップをさらに含む請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
（ｉｉ）のステップの前に、式（ＩＩＩ）による前記ＨＡＳ誘導体のＡ基が前記対応するアルデヒドまたはケト基に変換される請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
（ｉｉ）のステップにおいて、前記反応が、還元剤の存在下で、０〜３７℃の範囲の温度および３〜９の範囲のｐＨにて実施され、および（ｉｉ）のステップにおいて、前記ＨＡＳ誘導体の生物活性剤ＢＡに対する前記モル比が、前記ＨＡＳ誘導体の数平均分子量（Ｍｎ）に基づいて、０．１：１〜２００：１当量である請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
（ｉｉ）のステップにおいて、前記反応が水性系にて実施され、還元剤がＮａＣＮＢＨ３であり、温度が０〜２５℃の範囲であり、ｐＨが３〜７の範囲であり、および（ｉｉ）のステップにおいて、前記ＨＡＳ誘導体の生物活性剤ＢＡに対する前記モル比が、前記ＨＡＳ誘導体の数平均分子量（Ｍｎ）に基づいて、１：１〜５０：１当量である請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記生物活性化合物ＢＡが、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ポリペプチドまたはタンパク質の機能性誘導体、断片またはミメティック、小型分子化合物またはオリゴヌクレオチドである請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記タンパク質が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、成長ホルモン（ＧＨ）、Ｆａｂ断片、免疫グロブリンＧ、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、アスパラギナーゼ、レプチン、インターロイキン−２、インターロイキン−１１、α−１−アンチトリプシン、抗体、または抗体断片、または他のタンパク質骨格である請求項２３に記載の方法。
【請求項３５】
式（ＩＩＩ）
【化１８】
0005486507.tif 000253
（ＩＩＩ）
で示すヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）誘導体であって、
Ｘが、式（ＩＩ）
Ｍ−Ｌ−Ａ（ＩＩ）
で示す架橋性化合物のアミノ基Ｍと、式（Ｉ）
【化１９】
0005486507.tif 000254
（Ｉ）
で示すヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）とによるＨＡＳの炭素原子Ｃ＊を介した反応から生じる官能基であり、Ｃ＊が、ＨＡＳとＭとの反応の前に場合によっては酸化され、
（Ａが式（ＩＩａ）
【化２０】
0005486507.tif 000255
に示す残基であり、
Ｚ１およびＺ２がそれぞれ独立して、ＯまたはＳまたはＮＲｘであり、ＲｘがＨまたは低級アルキルまたはＣ（Ｏ）−Ｒｙであり、ＲｙがＣ１−Ｃ６アルキルおよびＣ６−Ｃ１４アリールからなる群よりは選択され、
Ａ１およびＡ２がそれぞれ独立して、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ベンジル、１，１，１−トリクロロエチル、ニトロベンジル、メトキシベンジル、もしくはエトキシベンジルであるか、または式（ＩＩｂ）
【化２１】
0005486507.tif 000256
に示す環を形成し、
Ａ１およびＡ２がひとまとめにされて、−（ＣＨ２）２−または−（ＣＨ２）３−または−（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３））−であり、
Ａ３が、Ｈもしくはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ペンチル、ベンジルであるか、またはアミノ基ＭのＮ原子もしくはＬに含まれる好適な原子と共に環を形成し、
前記アミノ基Ｍが式（ＩＩｃ）
【化２２】
0005486507.tif 000257
による基であり、
Ｙが、存在しないか、または
【化２３】
0005486507.tif 000258
からなる群より選択される化学部分であるかのどちらかであり、
Ｇが、ＯまたはＳまたはＮＨであり、２個存在する場合には、各Ｇが独立して、ＯまたはＳまたはＮＨであり、
Ｒ’が、Ｈまたはヒドロキシ基または１〜１０個の炭素原子を有するアルキル、置換アルキル、アリールおよび置換アリールからなる群より選択される有機残基であり、
ＭおよびＡを架橋するＬが、式（ＩＩｄ）
【化２４】
0005486507.tif 000259
による少なくとも１個の構造単位を含むスペーサであり、
Ｌ１およびＬ２がそれぞれ独立して、Ｈまたはアルキルおよび置換アルキルからなる群より選択される有機残基であり、
ｎが１〜２０の整数であり、
ＨＡＳ’が、前記ヒドロキシアルキルデンプン分子の残部であり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が独立して、水素または直鎖もしくは分枝ヒドロキシアルキル基であるＨＡＳ誘導体。
【請求項３６】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が独立して、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｈ基であり、ｎが整数である請求項３５に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項３７】
ｎが０、１、２、３、４、５または６である請求項３６に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項３８】
前記ヒドロキシアルキルデンプンがヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）である請求項３５〜３７のいずれか一項に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項３９】
Ｒｘが、Ｈまたはメチル、エチルもしくはプロピル、またはＣ（Ｏ）−Ｒｙであり、Ｒｙが、置換もしくは非置換であるメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、およびｔｅｒｔ−ブチルからなる群より選択される請求項３５〜３８に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項４０】
Ｘが、ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ−からなる群より選択される請求項３５〜３９のいずれか一項に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項４１】
Ｘが、−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−および−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−からなる群より選択される請求項４０に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項４２】
ＭおよびＡを架橋するＬが、式（ＩＩｄ）
【化２５】
0005486507.tif 000260
（ＩＩｄ）
による構造単位からなるスペーサであり、
ｎが、１〜２０の整数である請求項３５〜４１のいずれか一項に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項４３】
Ｌが−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ１−であり、ｎが１〜１０の整数である請求項３５〜４２のいずれか一項に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項４４】
Ｌが−ＣＨ２−ＣＨ２−である請求項４３に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項４５】
Ｌが少なくとも１個の構造単位−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ１−Ｏ−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ２−を含み、ｎ１は、ｎ２と等しいかまたは異なる請求項３５〜４１のいずれか一項に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項４６】
Ｌが−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ１−を介して前記架橋性化合物のアミノ基Ｍに結合される請求項４５に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項４７】
Ｌが−（（ＣＬ１Ｌ２）２−Ｏ）ｍ−（ＣＬ１Ｌ２）−であり、ｍが１、２または３である請求項４５または４６に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項４８】
Ｌが−（（ＣＨ２）２−Ｏ）ｍ−ＣＨ２−であり、ｍが２または３である請求項４７に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項４９】
Ｌが−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−であり、各ｎがそれぞれ独立している請求項３５〜４１のいずれか一項に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項５０】
Ｌが−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−であり、各ｎがそれぞれ独立して１〜３の範囲である請求項４９に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項５１】
Ｌが、
−（ＣＨ２）３−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）３−、−（ＣＨ２）３−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）３−、および−（ＣＨ２）２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−、からなる群より選択される請求項４９または５０に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項５２】
構造式
【化２６】
0005486507.tif 000261
を有する請求項３５〜４２のいずれか一項に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【請求項５３】
構造式
【化２７】
0005486507.tif 000262
を有する請求項３５〜４２のいずれか一項に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【請求項５４】
式（ＩＶ）
【化２８】
0005486507.tif 000263
（ＩＶ）
で示すヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）誘導体であって、
Ｘが、アミド基−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ではなく、
Ｘが、式（ＩＩ）
Ｍ−Ｌ−Ａ（ＩＩ）
で示す架橋性化合物のアミノ基Ｍと、式（Ｉ）
【化２９】
0005486507.tif 000264
で示すヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）とによる前記ＨＡＳの炭素原子Ｃ＊を介した反応から生じる官能基であって、Ｃ＊が、前記ＨＡＳとＭの反応の前に場合によっては酸化され、
ＨＡＳ’が、前記ヒドロキシアルキルデンプン分子の残部であり、ならびにＲ１、Ｒ２およびＲ３は独立して、水素または直鎖もしくは分枝ヒドロキシアルキル基であり、
Ａが、式（ＩＩａ）
【化３０】
0005486507.tif 000265
（ＩＩａ）
で示す残基であり
Ｚ１およびＺ２がそれぞれ独立して、ＯまたはＳまたはＮＲｘであり、Ｒｘが、Ｈまたは低級アルキルまたはＣ（Ｏ）−Ｒｙであり、Ｒｙが、Ｃ１−Ｃ６アルキルおよびＣ６−Ｃ１４アリールからなる群よりは選択され、
Ａ１およびＡ２がそれぞれ独立して、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ベンジル、１，１，１−トリクロロエチル、ニトロベンジル、メトキシベンジル、エトキシベンジルであるか、または式（ＩＩｂ）
【化３１】
0005486507.tif 000266
（ＩＩｂ）
（Ａ１およびＡ２がひとまとめにされて、−（ＣＨ２）２−または−（ＣＨ２）３−または−（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３））−である）
で示す環を形成し、
Ａ３が、Ｈもしくはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ペンチル、ベンジルであるか、または前記アミノ基Ｍの前記Ｎ原子もしくはＬに含まれる好適な原子と共に環を形成し、
前記アミノ基Ｍが式（ＩＩｃ）
【化３２】
0005486507.tif 000267
による基であり、
Ｙが、存在しないか、または
【化３３】
0005486507.tif 000268
からなる群より選択される化学部分であるかのどちらかであり、
Ｇが、ＯまたはＳまたはＮＨであり、２個存在する場合には、各Ｇが独立して、ＯまたはＳまたはＮＨであり、
Ｒ’が、Ｈまたはヒドロキシ基または１〜１０個の炭素原子を有するアルキル、置換アルキル、アリールおよび置換アリールからなる群より選択される有機残基であり、
ＭおよびＡを架橋するＬが、式（ＩＩｄ）
【化３４】
0005486507.tif 000269
による少なくとも１個の構造単位を含むスペーサであり、
Ｌ１およびＬ２がそれぞれ独立して、Ｈまたはアルキルおよび置換アルキルからなる群より選択される有機残基であり、
ｎが１〜２０の整数であり、
ＢＡ’が、ＢＡのアミノ基と、ＡとまたはＡに対応するアルデヒド基またはケト基とによる還元的アミノ化を介した反応後に残存する生物活性剤ＢＡ’−ＮＨ２の残部であるＨＡＳ誘導体。
【請求項５５】
式（ＩＩａ）のＲｘが、Ｈまたはメチル、エチルもしくはプロピル、またはＣ（Ｏ）−Ｒｙであり、Ｒｙが、置換もしくは非置換であるメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、およびｔｅｒｔ−ブチルからなる群より選択される請求項５４に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
【請求項５６】
Ｘが、−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−、および−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−からなる群より選択される請求項５４または５５に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項５７】
Ｘが、−ＣＨ２−ＮＨ−および−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−からなる群より選択される請求項５６に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項５８】
ＭおよびＡを架橋するＬが、式（ＩＩｄ）
【化３５】
0005486507.tif 000270
（ＩＩｄ）
による構造単位からなるスペーサであり、
ｎが、１〜２０の整数である請求項５４〜５７のいずれか一項に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項５９】
Ｌが−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ１−であり、ｎが１〜１０の整数である請求項５４〜５８のいずれか一項に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項６０】
Ｌが−ＣＨ２−ＣＨ２−である請求項５９に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項６１】
Ｌが少なくとも１個の構造単位−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ１−Ｏ−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ２−を含み、ｎ１が、ｎ２と等しいかまたは異なる請求項５４〜５７のいずれか一項に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項６２】
Ｌが、−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ１−を介して前記架橋性化合物のアミノ基Ｍに結合される請求項６１に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項６３】
Ｌが−（（ＣＬ１Ｌ２）２−Ｏ）ｍ−（ＣＬ１Ｌ２）−であり、ｍが１、２または３である請求項５４〜５７のいずれか一項に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項６４】
Ｌが−（（ＣＨ２）２−Ｏ）ｍ−ＣＨ２−であり、ｍが２または３である請求項６３に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項６５】
Ｌが−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−であり、各ｎがそれぞれ独立している請求項５４〜５７のいずれか一項に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項６６】
Ｌが−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−であり、各ｎがそれぞれ独立して１〜３の範囲である請求項６５に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項６７】
Ｌが、
−（ＣＨ２）３−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）３−、−（ＣＨ２）３−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）３−、および−（ＣＨ２）２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−からなる群より選択される請求項６５に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項６８】
構造式
【化３６】
0005486507.tif 000271
を有する請求項５４〜５７のいずれか一項に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項６９】
前記生物活性化合物ＢＡが、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ポリペプチドまたはタンパク質の機能性誘導体、断片またはミメティック、小型分子化合物またはオリゴヌクレオチドである請求項５４〜６８のいずれか一項に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項７０】
前記タンパク質が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、成長ホルモン（ＧＨ）、Ｆａｂ断片、免疫グロブリンＧ、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、アスパラギナーゼ、レプチン、インターロイキン−２、インターロイキン−１１、α−１−アンチトリプシン、抗体、または抗体断片、または他のタンパク質骨格である、請求項６９に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項７１】
治療または予防剤としての請求項５４〜７０のいずれか一項に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項７２】
ヒトまたは動物の体を治療する方法で使用するための請求項５４〜７０のいずれか一項に記載のＨＡＳ誘導体。
【請求項７３】
請求項５４〜７０のいずれか一項に記載のＨＡＳ誘導体を治療的有効量で含む製薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体を調製する方法に関し、この方法は、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）を、ＨＡＳの場合により酸化された還元末端を介して、アミノ基とは別に特別に保護されたカルボニル基、すなわちアセタール基またはケタール基を含む架橋性化合物のアミノ基Ｍと反応させるステップを含む。この方法は、このように得たＨＡＳ誘導体を、アルキル化、好ましくは還元的アミノ化を介して、生物活性化合物のアミノ基と反応させることをさらに含むことができる。さらに本発明は、本発明のプロセスによって得られる又は得られたＨＡＳ誘導体に関し、またその特定のＨＡＳ誘導体に関する。本発明は、生物活性化合物を含有するＨＡＳ誘導体を含む製薬組成物に関し、また治療剤または予防剤としてのＨＡＳ誘導体および薬剤の調製のための特定のＨＡＳ誘導体の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、特にヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）は、自然発生型炭水化物ポリマーのアミロペクチンの置換誘導体であり、これはコーンスターチ中に最大９５重量％の濃度で存在し、体内でα−アミラーゼによって分解される。ＨＥＳは特に有利な生物特性を示し、血液量置換剤として診療所の血液療法で使用される（Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｋｒａｎｋｅｎｈａｕｓｐｈａｒｍａｚｉｅ，８（８），２７１−２７８；Ｗｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ／Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．，４１，４９４−４９８）。
【０００３】
ヒドロキシアルキルデンプン誘導体を産生する方法は、当該技術分野において開示されている。
【０００４】
独国特許出願公開第２６１６０８６号明細書には、ヘモグロビンのヒドロキシエチルデンプンへの結合が開示されており、この最初のステップでは、ブロモシアンなどの架橋剤がヒドロキシエチルデンプンに結合され、続いてヘモグロビンが中間生成物に連結されている。
【０００５】
ＨＥＳが使用される１つの重要な分野は、特定の生理効果を得るために例えば循環系に利用されるポリペプチドの安定化である。これらのポリペプチドの具体的な一例はエリスロポエチンであり、これは循環中の赤血球レベルを制御するのに必須である約３４，０００ｋＤａの酸性糖タンパク質である。
【０００６】
ポリペプチドおよび酵素の利用による周知の問題は、これらのタンパク質がしばしば不十分な安定性を示すことである。特にエリスロポエチンは、相対的に短い血漿半減期を有する（Ｓｐｉｖａｋ  ａｎｄ  Ｈｏｇａｎｓ，１９８９，Ｂｌｏｏｄ  ７３，９０；ＭｃＭａｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｂｌｏｏｄ  ７６，１７１８）。これは治療的血漿レベルが急速に消失し、反復静脈内投与を実施する必要があることを意味する。さらに、ある環境において、ペプチドに対する免疫応答が観察される。
【０００７】
ポリペプチドをポリマー分子に結合させると、ポリペプチドの安定性を改善することができ、これらのポリペプチドに対する免疫応答が低減されることが一般に認められている。
【０００８】
国際公開第９４／２８０２４号パンフレットには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾された生理活性ポリペプチドは免疫原性および抗原性の低下を示し、未結合タンパク質よりもかなり長く血流中に循環する、すなわち長いクリアランス速度を有することが開示されている。しかし、ＰＥＧ−薬物結合体はいくつかの欠点を示し、例えばｉｎ  ｖｉｖｏ分解経路の要素が認識できる天然構造を示さない。したがってＰＥＧ結合体とは別に、他の結合体およびタンパク質ポリマレートが生成されている。
【０００９】
国際公開第０２／０８０７９号パンフレットには、活性剤およびヒドロキシアルキルデンプンが直接またはリンカ化合物を介してのどちらかで結合されている、活性剤およびヒドロキシアルキルデンプンの結合体を含む化合物が開示されている。直接結合に関する限り、活性剤およびヒドロキシアルキルデンプンの反応は、少なくとも１０重量％の水を含む水性媒体中で実施する。ヒドロキシアルキルデンプンを架橋性化合物に、保護カルボニル基をさらに含有する架橋性化合物のアミノ基を介して結合することを指示する例は与えられていない。さらに、ＨＡＳ誘導体を示す例が与えられ、ＨＡＳ誘導は、該カルボニル基を介して生物活性剤のアミノ基と反応させることによって得られる。
【００１０】
国際公開第０３／０７４０８７号パンフレットには、ヒドロキシアルキルデンプン分子とタンパク質との間の結合が共有結合であり、ヒドロキシアルキルデンプンの末端アルデヒド基または該アルデヒド基の反応から生じた官能基とタンパク質の官能基との結合の結果である、ヒドロキシアルキルデンプン−タンパク質結合体が開示されている。
【００１１】
国際公開第０３／０７４０８８号パンフレットには、ヒドロキシアルキルデンプン分子と低分子量化合物との間の結合が共有結合であり、ヒドロキシアルキルデンプンの末端アルデヒド基または該アルデヒド基の反応から生じた官能基とタンパク質の官能基との結合の結果である、低分子量化合物とのヒドロキシアルキルデンプン結合体が開示されている。
【００１２】
国際公開第２００５／０１４０２４号パンフレットには、官能化ポリマーがオキシム結合基によってタンパク質に共有結合されている、アミノオキシ基による官能化ポリマーまたはその誘導体、結合体、官能化ポリマーを調製するプロセス、結合体を調製するプロセス、本発明のプロセスにより得られるような官能化ポリマー、プロセスにより得られるような結合体、ならびに少なくとも１つの結合体を含む製薬組成物およびヒトまたは動物の体の予防または治療のための組成物が開示されている。
【００１３】
国際公開第２００５／０９２３９０号パンフレットには、ヒドロキシアルキルデンプンまたはヒドロキシアルキルデンプンの誘導体とタンパク質との間の共有結合によって形成される、ヒドロキシアルキルデンプンとタンパク質との結合体およびこれらの結合体を産生する方法およびこれらの結合体の使用が開示されている。
【００１４】
国際公開第２００４／０２４７７７号パンフレットには、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、特にヒドロキシアルキルデンプンをリンカ化合物の１級または２級アミノ基と反応させるプロセスによって得られるヒドロキシアルキルデンプン誘導体が開示されている。特に好ましい実施形態において、国際公開第２００４／０２４７７７号パンフレットには、ヒドロキシアルキルデンプンをリンカ化合物の１級または２級アミノ基と反応させて、得られた生成物をポリペプチドと、好ましくは糖タンパク質と、特に好ましくはエリスロポエチンと、リンカ化合物の少なくとも１つの他の反応性基を介して反応させるプロセスによって得られる、ヒドロキシデンプン誘導体が開示されている。特に好ましいヒドロキシアルキルデンプンは、ヒドロキシエチルデンプンである。国際公開第２００４／０２４７７７号パンフレットによれば、ヒドロキシアルキルデンプンおよび好ましくはヒドロキシエチルデンプンをリンカ化合物と、反応の前に酸化されていないその還元末端にて反応させる。
【００１５】
国際公開第２００４／０２４７７６号パンフレットには、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体、特にヒドロキシアルキルデンプンを、架橋性化合物の１級または２級アミノ基と、または得られたヒドロキシアルキルデンプン誘導体がさらなる化合物の官能基Ｙと反応することが可能である少なくとも１つの官能基Ｙを有し、さらなる化合物のこの基Ｙがアルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、アセタール基、またはチオール基である２つの架橋性化合物と反応させるプロセスによって得られる、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体が開示されている。特に好ましい実施形態によれば、国際公開第２００４／０２４７７６号パンフレットは、ヒドロキシアルキルデンプンを架橋性化合物の１級または２級アミノ基と反応させて、得られた反応生成物を場合により第２の架橋性化合物とさらに反応させるプロセスによって得られるヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関し、得られたヒドロキシアルキルデンプン誘導体は、さらなる化合物の官能基Ｙと反応することが可能である少なくとも１つの官能基Ｘを有し、この基Ｙは、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、アセタール基、またはチオール基であり、得られた反応生成物を、これらの官能基Ｙの少なくとも１つを含む、ポリペプチドと、好ましくはＡＴ  ＩＩＩ、ＩＦＮ−βまたはエリスロポエチンなどのポリペプチドと、特に好ましくはエリスロポエチンと反応させる。特に好ましいヒドロキシアルキルデンプンは、ヒドロキシエチルデンプンである。国際公開第２００４／０２４７７６号パンフレットにより、ヒドロキシアルキルデンプンおよび好ましくはヒドロキシエチルデンプンをリンカ化合物と、反応の前に場合により酸化されるその還元末端にて反応させる。
【００１６】
国際公開第２００５／０９２９２８号パンフレットには、ヒドロキシアルキルデンプン、好ましくはヒドロキシエチルデンプンとタンパク質との結合体を開示し、これらの結合体は、ヒドロキシアルキルデンプンの、またはヒドロキシアルキルデンプンの誘導体の少なくとも１つのアルデヒド基と、タンパク質の少なくとも１つのアミノ基との間の還元アミノ化反応によって形成されるので、ヒドロキシアルキルデンプンまたはその誘導体はアゾメチン結合またはアミノメチレン結合を介してタンパク質に共有結合される。国際公開第２００５／０９２９２８号パンフレットは、これらの結合体を産生する方法および結合体の詳細な使用にも関する。
【００１７】
米国特許出願公開第２００６／０１９４９４０号明細書には、水溶性ポリマーアルカナールが開示されている。特に、ポリマーと反応させる保護アルデヒド試薬が開示されている。ポリサッカライドが一般的と言及しているが、特に好ましいポリマーはポリエチレングリコールである。米国特許出願公開第２００６／０１９４９４０号明細書には、デンプン、または特にヒドロキシアルキルデンプンなどの修飾デンプンは開示されていない。結果として、米国特許出願公開第２００６／０１９４９４０号明細書は、所与のリンカ化合物をヒドロキシアルキルデンプンに結合する詳細な方法に関する開示を含んでいない。同じことが米国特許第７１５７５４６号明細書、欧州特許出願公開第１５９１４６７号明細書および国際公開第２００４／０２２６３０号パンフレットにも当てはまる。
【００１８】
米国特許第６９１６９６２号明細書には、非保護形および保護形のアミノアセタール架橋性化合物が開示されている。本明細書には、この架橋性化合物のポリエチレングリコール以外のポリマーとの考えられる結合に関連する開示が含まれていない。特に、ヒドロキシアルキルデンプンなどの修飾デンプンはおろか、デンプンも米国特許第６９１６９６２号明細書には開示されていない。結果として、米国特許第６９１６９６２号明細書は、所与のリンカ化合物をヒドロキシアルキルデンプンに結合する詳細な方法に関しての開示を含んでいない。同じことが米国特許第６９５６１３５号明細書および国際公開第０３／０４９６９９号パンフレットにも当てはまる。
【００１９】
米国特許第５９９０２３７号明細書には、保護アルデヒド基を含有する構造が開示されている。これらの構造を含む化合物は好ましくはポリエチレングリコールに結合され、結合は、保護アルデヒド基含有化合物に含まれる官能基としてのハライドを介して実施され、該ハライド基はポリエチレングリコールのヒドロキシ基と反応する。
【発明の概要】
【００２０】
本発明の目的は、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体を得る新規方法を提供することである。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、ＨＡＳを特別な官能化架橋性化合物と反応させることによって得たまたは得られるＨＡＳ誘導体などの新規ＨＡＳ誘導体を提供することである。
【００２２】
本発明のまた別の目的は、ＨＡＳを特別な官能化架橋性化合物と反応させることによって得たまたは得られるＨＡＳ誘導体を、生物活性化合物の好適な官能基と反応させることによって得たまたは得られるＨＡＳ誘導体などの更なる新規のＨＡＳ誘導体を提供することである。
【００２３】
驚くべきことに、特別なＨＡＳ誘導体の調製ために、一方ではアミノ基を介して、ヒドロキシアルキルデンプンの場合により酸化された還元末端に選択的に結合されることが可能であり、他方では、第２の官能基として完全保護カルボニル基、すなわちアセタール基またはケタール基を有する架橋性化合物を使用できることが見出された。遊離アルデヒドもしくはケト基または、例えばヘミアセタール基を官能基として有する架橋性化合物が利用される実施形態と比較して、このような完全保護基を利用することによって、ＨＡＳの架橋性化合物との反応の間に、架橋性化合物分子間に望ましくないオリゴマー化または重合が起こるリスクが大幅に最小化される。予想外に、得られたＨＡＳ誘導体に含まれるアセタールまたはケタール基の脱保護は、アセタール基およびエーテル基などの多くの官能基を特徴とするヒドロキシアルキルデンプン、特にヒドロキシエチルデンプンの特別な化学構造を少なくとも部分的に破壊することなく可能である。したがって、本発明により、生物活性化合物との有効な結合を可能にするＨＡＳ誘導体を提供するために、得られたＨＡＳ誘導体の官能基を、ＨＡＳ構造の少なくとも部分的な破壊を伴わずに脱保護する可能性と併せて、個々の架橋性化合物分子間のオリゴマー化または重合のリスクを最小限に抑えることによって、第１のＨＡＳを調製する極めて効果的な方法を可能にする。
【００２４】
したがって、本発明は、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の調製方法であって、
（ｉ）式（Ｉ）
【化１】
0005486507.tif 000002
で示すヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）を、ＨＡＳの還元末端の炭素原子Ｃ＊を介して、式（ＩＩ）
Ｍ−Ｌ−Ａ（ＩＩ）
（Ａは、アセタール基またはケタール基であり、ならびにＬは、ＭおよびＡを架橋するスペーサであり、式中、Ｃ＊は、ＨＡＳのＭとの反応の前に場合により酸化される）による架橋化合物のアミノ基Ｍと反応させて、式（ＩＩＩ）
【化２】
0005486507.tif 000003
（Ｘは、ＨＡＳの場合によっては酸化された還元末端の炭素原子Ｃ＊を介するアミノ基ＭとＨＡＳとの反応から生じた官能基であり、
ＨＡＳ’は、ヒドロキシアルキルデンプン分子の残部であり、ならびにＲ１、Ｒ２およびＲ３は独立して、水素または直鎖もしくは分枝ヒドロキシアルキル基である）
で示すＨＡＳ誘導体を得るステップを含む方法に関する。
【００２５】
さらに、本発明は、本方法によって得られるまたは得たヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）誘導体に関する。
【００２６】
さらに、本発明は、式（ＩＩＩ）
【化３】
0005486507.tif 000004
で示すヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）誘導体に関し、
Ａは、アセタールまたはケタール基であり、Ｌは、ＸおよびＡを架橋するスペーサであり、
Ｘは、式（ＩＩ）
【化４】
0005486507.tif 000005
で示す架橋化合物のアミノ基Ｍと、式（Ｉ）
【化５】
0005486507.tif 000006
で示すヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）とによるＨＡＳの炭素原子Ｃ＊を介した反応から生じる官能基であり、Ｃ＊は、ＨＡＳのＭとの反応の前に場合によっては酸化され、
ＨＡＳ’は、ヒドロキシアルキルデンプン分子の残部であり、ならびにＲ１、Ｒ２およびＲ３は独立して、水素または直鎖もしくは分枝ヒドロキシアルキル基である。
【００２７】
（ヒドロキシアルキルデンプン）
本発明の状況において、「ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）」という用語は、少なくとも１個のヒドロキシアルキル基によって置換されたデンプン誘導体を指す。本発明の好ましいヒドロキシアルキルデンプンは、式（Ｉ’）
【化６】
0005486507.tif 000007
に示す構造式を有し、
ＨＡＳ’は、ヒドロキシアルキルデンプン分子の残部であり、ならびにＲ１、Ｒ２およびＲ３は独立して、水素、直鎖もしくは分枝ヒドロキシアルキル基、または
【化７】
0005486507.tif 000008
基であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は独立して、水素、およびアルキル基、好ましくは水素およびメチル基であり、
ｍは２〜４であり、残基Ｒ１およびＲ２は、ｍ個のＣＲ１Ｒ２基中で同じかまたは異なることができ、
ｎは０〜２０、好ましくは０〜４であり、
ｏは２〜２０、好ましくは２〜４であり、ここで残基Ｒ３およびＲ４は、ｏ個のＣＲ３Ｒ４基において同じかまたは異なることができる。
【００２８】
好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は独立して、基−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｈ（式中、ｎは、整数、好ましくは０、１、２、３、４、５、または６である）、ならびに特に、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は独立して、水素または２−ヒドロキシエチルである。
【００２９】
式（Ｉ）および（Ｉ’）において、デンプン分子の還元末端は非酸化形で示され、ＨＡＳの末端サッカライド単位は、溶媒に応じて（遊離）アルデヒド形と平衡状態にあり得るヘミアセタール形で示されている。本発明の状況で使用するようなＨＡＳ’の省略形は、ＨＡＳ分子の還元末端に末端サッカライド単位のないＨＡＳ分子を指す。これは、本発明の状況で使用するような「ヒドロキシアルキルデンプン分子の残部」という用語を意味する。
【００３０】
本明細書で使用するような「ヒドロキシアルキルデンプン」という用語は、末端炭水化物部分が式（Ｉ）および（Ｉ’）で簡潔にするために示されたようなヒドロキシアルキル基Ｒ１、Ｒ２および／またはＲ３を含む化合物に限定されないが、末端炭水化物部分および／またはヒドロキシアルキルデンプン分子、ＨＡＳ’の残部のどちらかの、いずれかの箇所に存在する少なくとも１個のヒドロキシ基がヒドロキシアルキル基Ｒ１、Ｒ２および／またはＲ３よって置換される化合物も指す。
【００３１】
２つ以上の異なるヒドロキシアルキル基を含むヒドロキシアルキルデンプンも可能である。
【００３２】
ＨＡＳに含まれる少なくとも１個のヒドロキシアルキル基は、１個以上の、特に２個以上のヒドロキシ基を含有し得る。好ましい実施形態により、ＨＡＳに含まれる少なくとも１個のヒドロキシアルキル基は、１個のヒドロキシ基を含有する。
【００３３】
「ヒドロキシアルキルデンプン」という表現は、アルキル基が１置換または多置換されている誘導体も含む。この状況において、アルキル基がハロゲン、特にフッ素によって、またはアリール基によって置換されることが好ましい。さらに、ヒドロキシアルキル基のヒドロキシ基はエステル化またはエーテル化され得る。
【００３４】
さらに、アルキルの代わりに、直鎖または分枝置換または非置換アルケニル基が使用され得る。
【００３５】
ヒドロキシアルキルデンプンは、デンプンのエーテル誘導体である。該エーテル誘導体に加えて、他のデンプン誘導体も本発明の状況で使用できる。例えば、エステル化ヒドロキシ基を含む誘導体が有用である。これらの誘導体は例えば、２〜１２個の炭素原子を持つ非置換モノもしくはジカルボン酸の誘導体、またはその置換誘導体であり得る。特に有用なのは、２〜６個の炭素原子を持つ非置換モノカルボン酸の誘導体、特に酢酸の誘導体である。この状況では、アセチルデンプン、ブチリルデンプンおよびプロピオニルデンプンが好ましい。
【００３６】
さらに、２〜６個の炭素原子を持つ非置換ジカルボン酸の誘導体が好ましい。
【００３７】
ジカルボン酸の誘導体の場合、ジカルボン酸の２級カルボキシ基もエステル化されることが有用である。さらに、ジカルボン酸のモノアルキルエステルの誘導体も本発明の状況で好適である。
【００３８】
置換モノまたはジカルボン酸では、置換基は好ましくは、置換アルキル残基について上述したのと同じであり得る。
【００３９】
デンプンのエステル化技法は当該技術分野で公知である（例えばＫｌｅｍｍ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．２，１９９８，Ｗｈｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ  ｃｈａｐｔｅｒ  ４．４，Ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（ＩＳＢＮ  ３−５２７−２９４８９−９））を参照。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態により、上述の式（Ｉ）によるヒドロキシアルキルデンプンが利用される。ＨＡＳ’に含まれる他のサッカライド環構造は、明示的に記載されたサッカライド環と同じまたは異なり得て、それらに還元末端がないという点で異なる。
【００４１】
式（Ｉ）による残基Ｒ１、Ｒ２およびＲ３に関する限り、具体的な制限はない。好ましい実施形態により、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立して、水素または各アルキル残基に２〜１０個の炭素原子を有するヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアラルキル基もしくはヒドロキシアルカリル基である。２〜１０個の炭素原子を有する水素およびヒドロキシアルキル基が好ましい。さらに好ましくは、ヒドロキシアルキル基は、２〜６個の炭素原子、さらに好ましくは２〜４個の炭素原子、およびなおさらに好ましくは２〜３個の炭素原子を有する。好ましい実施形態において、ヒドロキシアルキルデンプンは、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３が独立して、水素または基（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｈ（式中、ｎは、整数、好ましくは０、１、２、３、４、５、または６である）であるヒドロキシエチルデンプンである。
【００４２】
したがって「ヒドロキシアルキルデンプン」は好ましくは、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプンおよびヒドロキシブチルデンプンを含み、ここでヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプンは特に好ましく、ヒドロキシエチルデンプンは最も好ましい。
【００４３】
アルキル、アラルキルおよび／またはアルカリル基は、直鎖または分枝であることができ、好適に置換されることができる。
【００４４】
したがって、本発明は、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が独立して、水素または２〜６個の炭素原子を持つ直鎖もしくは分枝ヒドロキシアルキル基である、上述した方法およびＨＡＳ誘導体にも関する。
【００４５】
したがって、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は好ましくは、Ｈ、ヒドロキシヘキシル、ヒドロキシペンチル、ヒドロキシブチル、ヒドロキシプロピル、例えば２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシイソプロピル、ヒドロキシエチル、例えば２−ヒドロキシエチルであることができ、水素および２−ヒドロキシエチル基が特に好ましい。
【００４６】
したがって、本発明は、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が独立して、水素または２−ヒドロキシエチル基である、上述した方法およびＨＡＳ誘導体にも関し、少なくとも１個の残基Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が２−ヒドロキシエチルである実施形態が特に好ましい。
【００４７】
ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）は、本発明のすべての実施形態に最も好ましい。
【００４８】
したがって、本発明は、ポリマーがヒドロキシエチルデンプンであり、誘導体がヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）誘導体である、上述した方法およびＨＡＳ誘導体に関する。
【００４９】
ＨＡＳ、特にＨＥＳは、主に分子量分布、置換度およびＣ２：Ｃ６置換の比によって特徴付けられる。置換度の説明には２つの可能性がある。
【００５０】
ＨＡＳの置換度（ＤＳ）は、すべてのグルコース部分と比較した置換グルコースモノマーの部分に対して相対的に説明される。
【００５１】
ＨＡＳの置換パターンも、グルコース部分１個当りのヒドロキシエチル基の数がカウントされる、モル置換（ＭＳ）として説明することができる。
【００５２】
本発明の状況では、ＨＡＳ、好ましくはＨＥＳの置換パターンは、上述のようにＭＳと呼ばれる（Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｋｒａｎｋｅｎｈａｕｓｐｈａｒｍａｚｉｅ，８（８），２７１−２７８，ｉｎ  ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｐ．２７３も参照）。
【００５３】
ＭＳは、ＨＥＳ分子の完全な加水分解の後にガスクロマトグラフィーによって決定する。各ＨＡＳ、特にＨＥＳ開始物質のＭＳ値を与える。ＭＳ値は本発明のプロセスのステップａ）およびｂ）の誘導体化処置の間に影響されないことを前提としている。
【００５４】
ＨＡＳ、特にＨＥＳ溶液は、各分子が重合度、分枝部位の数およびパターン、ならびに置換パターンで他の分子と異なる、多分散組成物として存在する。したがってＨＡＳ、特にＨＥＳは、分子量が異なる化合物の混合物である。結果として、特定のＨＡＳおよび特にＨＥＳ溶液は、統計的手段を用いて平均分子量によって決定される。この状況ｄえ、Ｍｎは、分子の数に応じて算術平均として計算される。また、Ｍｗ（またはＭＷ）、すなわち重量平均分子量は、ＨＡＳ、特にＨＥＳの質量に依存する単位を表す。
【００５５】
この状況で、数平均分子量は、等式１によって定義される。
【数１】
0005486507.tif 000009
式中、ｎｉは、モル質量Ｍｉの種ｉの分子数である。
【数２】
0005486507.tif 000010
は、値が平均値であることを示すが、線は慣例により通常は省略される。
【００５６】
Ｍｗは、等式２によって定義される重量平均分子量である。
【数３】
0005486507.tif 000011
式中、ｎｉは、モル質量Ｍｉの種ｉの分子数である。
【数４】
0005486507.tif 000012
は、値が平均値であることを示すが、線は慣例により通常は省略される。
【００５７】
好ましくは、本発明で使用するヒドロキシアルキルデンプン、特にヒドロキシエチルデンプンは、１〜約１０００ｋＤａの、さらに好ましくは約１〜約８００ｋＤａの、さらに好ましくは約１〜約５００ｋＤａの平均分子量（重量平均）を有する。ヒドロキシエチルデンプンは、０．１〜３の、好ましくは０．１〜２の、さらに好ましくは０．１〜０．９または０．４〜２の、好ましくは０．４〜１．３の好ましいモル置換、ならびにヒドロキシエチル基に対して２〜２０の範囲の好ましいＣ２：Ｃ６置換の比をさらに示すことができる。
【００５８】
本発明の文脈で使用されるような「平均分子量」という用語は、Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｋｒａｎｋｅｎｈａｕｓｐｈａｒｍａｚｉｅ，８（８），２７１−２７８；ａｎｄＷｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ／Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．，４１，４９４−４９８に記載されたようなＬＡＬＬＳ−（低角レーザ光散乱法）−ＧＰＣ法に従って決定された重量に関する。１０ｋＤａ以下の平均分子量では、さらに、ＬＡＬＬＳ−ＧＰＣによって以前に適格とされた標準を用いて校正を実施した。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態により、利用したヒドロキシエチルデンプンの平均分子量は、約１〜約１０００ｋＤａ、さらに好ましくは約１〜約８００ｋＤａ、さらに好ましくは約１〜約５００ｋＤａ、さらに好ましくは約２〜約４００ｋＤａ、さらに好ましくは約５〜約３００ｋＤａ、さらに好ましくは約１０〜約２００ｋＤａ、特に約５０〜１５０ｋＤａである。
【００６０】
さらに、ＨＡＳおよび特にＨＥＳのモル置換は、好ましくは約０．１〜３、好ましくは約０．４〜約１．３、例えば０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、または１．３である。
【００６１】
約５〜３００ｋＤａ、好ましくは５０〜１５０ｋＤａの平均分子量を有するＨＥＳの例は、０．１〜３の、好ましくは０．４〜１．３、例えば０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、または１．３のモル置換を有するＨＥＳである。
【００６２】
Ｃ２：Ｃ６置換の比に関する限り、該置換は、好ましくは２〜２０の範囲、さらに好ましくは２〜１５の範囲、およびなおさらに好ましくは３〜１２の範囲である。
【００６３】
ヒドロキシアルキルデンプン以外のデンプン
一般に、本発明の方法も実施可能であり、本発明の誘導体も、ヒドロキシアルキルデンプン、特に上述したヒドロキシエチルデンプン以外のデンプンを使用しても調製可能であり、ただし、これらのデンプンも場合により（遊離）アルデヒド形と平衡状態にある、ヘミアセタール形で存在している還元末端を含有し、還元末端が好適に酸化されて各酸化形を与え得るという条件である。特に、高分枝、非置換または低置換デンプン生成物、すなわちアミロペクチンよりも著しく高い分岐度を有し、グリコーゲンのα−１，６分枝の程度を有する、またはこれさえ超過し、置換された場合にわずか０．３までの、好ましくは０．０５〜０．３のモル置換ＭＳを有するデンプンが利用可能である。ＭＳ（モル置換）という用語は、この高分岐、非置換または低置換デンプン生成物の状況で使用するように、アンヒドログルコース単位当りのヒドロキシエチルまたはヒドロキシプロピル基の平均数を意味する。ＭＳは通常、試料中のヒドロキシエチルまたはヒドロキシプロピル基の含有量を決定することおよびその中に存在するアンヒドログルコース単位への計算割当によって測定される。ＭＳは、ガスクロマトグラフィーによっても決定できる。分枝度は、ポリマー中のα−１，４，６−グリコシド結合アンヒドログルコースのｍｏｌ％として、ガスクロマトグラフメチル化分析によって決定できる。分枝度がいずれの場合でも平均値であるのは、本発明の高分枝非置換または低置換デンプン生成物が多分散化合物であるためである。該高分枝、非置換または低置換デンプン生成物中のグルコース単位は、α−１，４およびα−１，６結合を介して結合される。分枝度は、全アンヒドログルコースαの合計のモル％中の−１，４，６−結合グルコース単位の割合を意味する。Ｃ２／Ｃ６比は、Ｃ−２における置換の、Ｃ−６における置換の比を表す。高分枝、非置換または低置換デンプン生成物は、分枝酵素を用いたトランスグルコシド化ステップによって達成可能な６％〜５０％の好ましい分枝度を有する。なおさらに好ましくは、分枝度は、１０〜４５の、さらに好ましくは２０〜４０の範囲、例えば２０、２５、３０、３５、または４０である。２０を超えて４０までの、好ましくは２０を超えて３０までの、例えば２１〜４０の、好ましくは２１〜３０の範囲も好ましい。この目的に使用できる開始物質は、原則として任意のデンプンであるが、好ましくは高い割合のアミロペクチンを有するワックス状デンプンまたはアミロペクチン画分そのものである。デンプン生成物の本発明による使用のために必要である分枝度は、これらの「他のデンプン」に関する限り、アンヒドログルコースのモル％で表した、８％〜２０％の範囲内である。このことは、本発明の目的に使用できるデンプン生成物が平均で１個のα−１．６結合を、したがって１２．５〜５グルコース単位ごとに１個の分枝点を有することを意味する。好ましい高分岐、非置換または低置換デンプン生成物は、１０％を超えて２０％までの、特に１１％〜１８％の分枝度を有する。より高い分枝度は、本発明のデンプン生成物のより高い溶解度および体内でのこれらの溶解したデンプン生成物のより高い生物学的利用能を意味する。分枝度が１０％超の、特に１１％〜１８％の未修飾デンプン生成物が特に選好される。高分枝、非置換または低置換デンプン生成物は、遊離ヒドロキシル基のヒドロキシエチルまたはヒドロキシプロピル基による部分誘導体化が適切に後続する、いわゆる分枝または転移酵素を使用する標的化酵素的構築によって調製できる。この代わりに、いわゆる分枝または転移酵素を使用する酵素的構築によって、ヒドロキシエチル化またはヒドロキシプロピル化デンプンを高分枝、非置換または低置換デンプン生成物に変換することも可能である。１０％までの分枝度を持つ分枝デンプン生成物をコムギデンプンから酵素的に得ることは、それ自体公知であり、例えば国際公開第００／６６６３３号パンフレットに記載されている。好適な分枝または転移酵素およびそれを得ることは、国際公開第００／１８８９３号パンフレット、米国特許第４４５４１６１号明細書、欧州特許出願公開第０４１８９４５号明細書、特開２００１−２９４６０１号公報または米国特許出願公開第２００２／０６５４１０号明細書に記載されている。この後者の刊行物は、４％を超え１０％以上の分枝度を有する未修飾デンプン生成物について記載している。酵素的トランスグリコシル化は、それ自体公知の方式で、例えばワックス状コーンスターチ、高いアミロペクチン含有量を有するジャガイモから得たジャガイモデンプン、またはコメからの、マニオクからの、コムギからの、高いアミロペクチン含有量を有するコムギからの、トウモロコシからの、高いアミロペクチン含有量を有するトウモロコシからの、もしくは高いアミロース含有量を有するトウモロコシからのデンプンを適切な酵素によって、水溶液中で６〜８のｐＨ値および２５〜４０℃の温度の穏和な条件下でインキュベートすることによって実施できる。分子量Ｍｗは、高分枝、非置換または低置換デンプン生成物の状況で使用するように、重量平均分子量を意味する。これは、それ自体公知の方式で各種の方法によって、すなわち光散乱およびＲＩ検出と併せたゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）または高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定できる。置換デンプンに好ましいＣ２／Ｃ６比は、５〜９の範囲内である。高分枝、非置換または低置換デンプン生成物の高い分岐度によって、その水への溶解度は、デンプン生成物を溶解させておくために、ヒドロキシエチルまたはヒドロキシプロピル置換が完全にまたは実質的に分配できるような程度まで上昇する。高分枝、非置換または低置換デンプン生成物の平均分子量は、腹膜の浸透限界による好適な方式で増加させることができる。この場合に使用できる特徴的な変数は、いわゆるボトム画分のＧＰＣ値ＢＦ９０％（より小さい分子画分の割合の尺度としての、ピーク面積の９０％での分子量）でもある。分子量の適切な上昇と同時の、腹膜での急激な吸収低下によって、より高い限外濾過（ＵＦ）効率が達成可能である。同時に、内在性アミラーゼによる分解によって産生され、もはやアミラーゼによってさらに分解することができず、臓器または組織に貯蔵されている高分子量残留断片は、もはや発生しないか、または今やわずかな程度までしか発生しない。
【００６４】
本発明により、ヒドロキシアルキルデンプンは架橋化合物Ｍ−Ｌ−Ａと反応し、式中、Ｍはアミノ基であり、Ａはアセタール基またはケタール基であり、Ｍ基および基Ｌは好適なスペーサによって分離されている。
【００６５】
（アセタールまたはケタール基Ａ）
アセタール基またはケタール基Ａに関する限り、具体的な制限は存在しない。本発明の状況において、「アセタール基」という用語は硫黄アセタールおよび窒素アセタールも含み、「ケタール基」という用語は硫黄ケタールおよび窒素ケタールも含む。さらに、「アセタール基」という用語に関する限り、ヘミアセタールは明示的に除外され、「ケタール基」という用語に関する限り、ヘミケタールは明示的に除外される。
【００６６】
本発明の好ましい実施形態により、架橋化合物Ｍ−Ｌ−ＡのＡ基は、式（ＩＩａ）
【化８】
0005486507.tif 000013
で示す残基であり、
Ｚ１およびＺ２はそれぞれ独立して、ＯまたはＳまたはＮＲｘであり、好ましくはＯであり、ここでＲｘは、Ｈまたは低級アルキル、例えばメチル、エチル、またはプロピル、例えばｎ−プロピルもしくはｉ−プロピル、またはＣ（Ｏ）−Ｒｙであり、ここでＲｙは、好ましくはＣ１−Ｃ６アルキルおよびＣ６−Ｃ１４アリールからなる群よりは選択され、なおさらに好ましくは場合により置換された、好ましくは非置換であるメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、およびｔｅｒｔ−ブチルからなる群より選択され；Ｒｘは好ましくはＨである。
Ａ１およびＡ２はそれぞれ独立して、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ベンジル、１，１，１−トリクロロエチル、ニトロベンジル、メトキシベンジル、エトキシベンジルであり、または式（ＩＩｂ）
【化９】
0005486507.tif 000014
で示す環を形成し
Ａ１およびＡ２はひとまとめにされて、−（ＣＨ２）２−または−（ＣＨ２）３−または−（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３））−であり、ならびに
Ａ３は、Ｈもしくはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ペンチル、ベンジルであり、またはアミノ基ＭのＮ原子もしくはＬに含まれる好適な原子と共に環を形成する。
【００６７】
好ましくは、Ｚ１およびＺ２の少なくとも１つがＯであり、好ましくはＺ１およびＺ２の両方がＯである。
【００６８】
残基Ａ３に関する限り、本発明に従ってアセタール基が好ましく、すなわちＡ３は好ましくはＨである。
【００６９】
Ａがケタール基である場合、Ａ３はメチルであることが好ましい。したがって、本発明により考えられるケタール基Ａは、特に
【化１０】
0005486507.tif 000015
または、
【化１１】
0005486507.tif 000016
または、
【化１２】
0005486507.tif 000017
または、
【化１３】
0005486507.tif 000018
または、
【化１４】
0005486507.tif 000019
または、
【化１５】
0005486507.tif 000020
である。
【００７０】
Ａ３が例えば、アミノ基ＭのＮ原子またはＬに含まれる好適な元素のどちらかと環を形成する場合、本発明により考えられる架橋性化合物は、例えば
【化１６】
0005486507.tif 000021
または、
【化１７】
0005486507.tif 000022
または、
【化１８】
0005486507.tif 000023
である。
【００７１】
本発明による特に好ましい架橋性化合物は
【化１９】
0005486507.tif 000024
であり、すなわちアミノ基Ｍは２級アミンであり、Ｚ１およびＺ２はどちらもＯであり、Ａ１およびＡ２はひとまとめにされて−（ＣＨ２）２−である。
【００７２】
好ましい実施形態により、Ａ１およびＡ２はそれぞれメチルまたはエチル、なおさらに好ましくはエチルである。したがって、本発明による特に好ましいアセタール基Ａは、−ＣＨ（ＯＣＨ３）２または−ＣＨ（ＯＣ２Ｈ５）２、特に−ＣＨ（ＯＣ２Ｈ５）２である。
【００７３】
Ａ１およびＡ２が式（ＩＩｂ）による環を形成するさらなる実施形態により、Ａ１およびＡ２はひとまとめにされて、好ましくは−（ＣＨ２）２−である。本実施形態に関する限り、本発明による特に好ましいアセタール基Ａは、
【化２０】
0005486507.tif 000025
および
【化２１】
0005486507.tif 000026
である。
【００７４】
（アミノ基Ｍ）
アミノ基Ｍに関する限り、アミノ酸が酸化または非酸化還元末端のどちらかと、すなわちＨＡＳ、好ましくはＨＥＳの還元末端サッカライドユニットの炭素原子Ｃ＊を介して、非酸化状態で、すなわちヘミアセタールとしてもしくは遊離アルデヒド基として、または酸化状態で、すなわちラクトンとしてもしくは遊離カルボキシ基として反応できるという条件で、特定の制限は存在しない。「アミノ基」という用語は本願明細書で使用するように、アミノ基、例えばプロトン化アミノ基の、製薬的に許容されるアニオンとの好適な塩、例えば塩化物、硫酸水素塩、硫酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、クエン酸塩、リン酸塩、またはリン酸水素塩も含む。
【００７５】
好ましくは、本発明による架橋化合物Ｍ−Ｌ−Ａのアミノ基は、式（ＩＩｃ）
【化２２】
0005486507.tif 000027
で示す基であり、
Ｙは、存在しないか、または
【化２３】
0005486507.tif 000028
からなる群より選択される化学部分であるかのどちらかであり、Ｇは、ＯまたはＳまたはＮＨであり、２個存在する場合には、各Ｇは独立して、ＯまたはＳまたはＮＨであり、Ｇは好ましくはＯであり、ならびに
Ｒ’は、Ｈまたはヒドロキシ基またはアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アルキルアリール、および置換アルキルアリールからなる群より選択される有機残基である。本明細書において、「アルキル」という用語は、非分枝アルキル残基、分枝アルキル残基、およびシクロアルキル残基に関する。好ましくは、これらの有機残基のそれぞれが１〜１０個の炭素原子を有する。考えられる置換基として、ハロゲン、例えばＦ、ＣｌまたはＢｒが挙げられる。好ましくは、有機残基は非置換炭化水素である。
【００７６】
Ｒ’がヒドロキシ基である場合、本発明の好ましいアミノ基はＨＯ−ＮＨ−であり、すなわちＹは存在しない。
【００７７】
好ましくは、Ｒ’が有機残基である場合、Ｒ’は、アルキルおよび置換アルキルからなる群より選択され、アルキル残基が特に好ましい。なおさらに好ましくは、場合により置換されたアルキル残基は、１〜１０個の、さらに好ましくは１〜６個の、さらに好ましくは１〜４個の、例えば１、２、３、または４個の炭素原子を有する。したがって、本発明による好ましい有機残基は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、またはｔ−ブチルである。特に好ましい実施形態により、有機残基Ｒ’は、メチルまたはエチル、特にメチルである。
【００７８】
したがって、Ｒ’が有機残基である場合、本発明による好ましいアミノ基は、例えばＨ３Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ−、Ｈ３Ｃ−ＮＨ−、Ｈ５Ｃ６−ＮＨ−、Ｈ３Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−、Ｈ３Ｃ−ＮＨ−Ｏ−、Ｈ５Ｃ６−ＮＨ−Ｏ−であり、Ｈ３Ｃ−ＮＨ−、Ｈ５Ｃ６−ＮＨ−およびＨ３Ｃ−ＮＨ−Ｏ−が特に好ましい。
【００７９】
本発明によれば、Ｒ’が独立した残基ではなく、Ｌに含まれる好適な原子と、または架橋性化合物のＡ基の残基Ａ３と環構造を形成することも可能である。これらの構造も、Ｒ’に関して「アルキル」という用語の上述の定義に含まれる。一例として、Ｒ’は、架橋性化合物のＡ基の残基Ａ３と環構造を形成可能であり、Ａはケタール基である。考えられる架橋性化合物は、例えば
【化２４】
0005486507.tif 000029
または、
【化２５】
0005486507.tif 000030
または
【化２６】
0005486507.tif 000031
である。
【００８０】
この場合、本発明に係る特に好ましい架橋性化合物は、
【化２７】
0005486507.tif 000032
であり、すなわちアミノ基Ｍは２級アミンであり、Ｚ１およびＺ２はどちらもＯであり、Ａ１およびＡ２はひとまとめにされて−（ＣＨ２）２−である。
【００８１】
本発明の好ましい実施形態において、Ｒ’はＨである。したがって、本発明の好ましいアミノ基は、
【化２８】
0005486507.tif 000033
であり、式中、Ｇは、ＯまたはＳであり、２個存在する場合は、独立してＯまたはＳであり、Ｏが好ましい。
【００８２】
本発明の特に好ましいアミノ基Ｍは、Ｒ’がＨである場合、Ｈ２Ｎ−、Ｈ２Ｎ−Ｏ−、およびＨ２Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−である。
【００８３】
したがって、本発明は、上述の方法および誘導体にも関し、アミノ基Ｍは、Ｈ２Ｎ−、Ｈ２Ｎ−Ｏ−、Ｈ２Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−、Ｈ３Ｃ−ＮＨ−またはＨ３Ｃ−ＮＨ−Ｏ−、好ましくはＨ２Ｎ−、Ｈ２Ｎ−Ｏ−、またはＨ２Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−である。
【００８４】
（スペーサＬ）
本発明により、架橋性化合物の官能基ＭおよびＡは、好適なスペーサによって分離される。「スペーサ」という用語は本願明細書によって使用するように、ＭおよびＡを架橋する任意の好適な化学部分に関する。
【００８５】
一般に、Ｌが特に新規誘導体の調製のための本発明の方法の実施を可能にして、新規誘導体にその所期の使用に関する限り好適な化学的特性を与える化学的特性を有するという条件で、スペーサＬの化学的性質に関して特定の制限はない。
【００８６】
本発明の好ましい実施形態により、ＭおよびＡを架橋するＬは、式（ＩＩｄ）
【化２９】
0005486507.tif 000034
で示す少なくとも１個の構造単位を含むスペーサであり、
Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、Ｈまたはアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アルキルアリール、置換アルキルアリール、および残基−Ｏ−Ｒ”からなる群より選択される有機残基であり、Ｒ”は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アルキルアリール、置換アルキルアリールからなる群より選択される。
【００８７】
本明細書において、「アルキル」という用語は、非分枝アルキル残基、分枝アルキル残基、およびシクロアルキル残基に関する。好ましい置換基として、ハロゲン、例えばＦ、ＣｌまたはＢｒが挙げられる。
【００８８】
好ましくは、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、Ｈまたはアルキルおよび置換アルキルからなる群より選択される有機残基であり、さらに好ましくは、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、Ｈまたはアルキルであり、なおさらに好ましくは、Ｌ１およびＬ２のどちらもＨである。
【００８９】
好ましくは、Ｌ１およびＬ２が有機残基である場合、Ｌ１およびＬ２のそれぞれが独立して、１〜２０個の、好ましくは１〜１０個の、さらに好ましくは１〜８個の、さらに好ましくは１〜６個の、さらに好ましくは１〜４個の炭素原子を含有することができる。特に好ましいのは、場合により置換された、好ましくは非置換メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル残基などの残基Ｌ１およびＬ２である。本発明により、Ｌ１はＨであることができ、Ｌ２は上で定義したような有機残基であることができる。
【００９０】
整数ｎに関する限り、ｎは、好ましくは１〜２０、好ましくは１〜１０、さらに好ましくは１〜６、さらに好ましくは１〜４、さらに好ましくは２である。
【００９１】
整数ｎが１より大である場合、基（ＣＬ１Ｌ２）は、相互に同じまたは異なり得る。本発明の好ましい実施形態により、相互に直接結合した基（ＣＬ１Ｌ２）は同じ構造を有する。
【００９２】
本発明の好ましい実施形態により、スペーサＬは、Ｌ１およびＬ２が上で定義した通りである式（ＩＩｄ）による構造単位より成る。さらに好ましくは、整数ｎは１〜２０、さらに好ましくは１〜１０、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。なおさらに好ましくは、基（ＣＬ１Ｌ２）のそれぞれは、ＭおよびＡを架橋するスペーサＬが構造
【化３０】
0005486507.tif 000035
を有するように（ＣＨ２）であり、式中、整数ｎは１〜２０、さらに好ましくは１〜１０、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。なおさらに好ましくは、ｎは、１〜６の範囲、さらに好ましくは１〜４の範囲、例えば１、２、３、または４、特に２である。
【００９３】
したがって、本発明の特に好ましい実施形態により、スペーサＬは、−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００９４】
本発明のさらなる実施形態により、架橋性化合物のスペーサＬは、式（ＩＩｄ）
【化３１】
0005486507.tif 000036
で示す少なくとも１個の構造単位を含み、
式中、ｎ、Ｌ１およびＬ２は、好ましくは上で定義した通りであり
【化３２】
0005486507.tif 000037
および式中、Ｌは、−（ＣＬ１Ｌ２）−とは異なる少なくとも１個の化学部分をさらに含む。
【００９５】
本明細書において、スペーサＬが構造単位−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−および−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−をＭ基またはＡ基から分離するさらなる化学部分Ｔからなる実施形態が言及され得る。スペーサＬが構造単位−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−およびＴ１が−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−をＭ基から分離して、Ｔ２が−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−をＡ基から分離する２個のさらなる化学部分からなる実施形態も考えられる。したがって、本発明は、以下の構造の１つを有する架橋化合物による実施形態も含む。
Ｍ−Ｔ−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−Ａ
Ｍ−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−Ｔ−Ａ
Ｍ−Ｔ１−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−Ｔ２−Ａ
【００９６】
化学部分Ｔ、Ｔ１またはＴ２に関して、Ｌが特に新規誘導体の調製のための本発明の方法の実施を可能にして、新規誘導体にその所期の使用に関する限り好適な化学的特性を与える化学的特性を有するという条件で、化学的性質に関して特定の制限はない。
【００９７】
したがって、Ｔ、Ｔ１および／またはＴ２は、場合により置換されたアリール残基、好適なヘテロ原子、好適な官能基などを含み得る。官能基に関する限り、これらの官能基が架橋性化合物の調製から生じる実施形態に言及することができ、この実施形態では少なくとも第１の化合物および少なくとも第２の化合物が相互に反応して化合物Ｍ−Ｌ−Ａを与える。一例として、第１の化合物Ｍ−Ｌ’−Ｗ１および第２の化合物Ｗ２−Ｌ”−Ａを反応させて架橋性化合物Ｍ−Ｌ−Ａを得ることができ、式中、−Ｌ−は−Ｌ’−Ｆ−Ｌ”であり、Ｆは、官能基Ｗ１と官能基Ｗ２との反応から生じた官能基を表し、ここでＬ’およびＬ”の少なくとも一方が構造単位−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−を含む。このような官能基Ｗ１およびＷ２は好適に選択され得る。一例として、基Ｗ１およびＷ２の一方、すなわちＷ１またはＷ２は、以下のリストによる官能基からなる群より選択され得るが、他方の基Ｗ１またはＷ２は、好適に選択され、Ｗ１またはＷ２との化学結合を形成することが可能であり、ここでＷ２またはＷ１は好ましくは、上述の群からも選択される。
−Ｃ−Ｃ二重結合またはＣ−Ｃ三重結合または芳香族Ｃ−Ｃ結合。
−チオ基またはヒドロキシ基。
−アルキルスルホン酸ヒドラジド、アリールスルホン酸ヒドラジド。
−１，２−ジオール。
−１，２−アミノ−チオアルコール。
−アジド。
−１，２−アミノアルコール。
−アミノ基−ＮＨ２またはアミノアルキル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基、もしくはアルカリアミノ基などの構造単位−ＮＨ−を含むアミノ基の誘導体。
−ヒドロキシアミノ基−Ｏ−ＮＨ２またはヒドロキシアルキルアミノ基、ヒドロキシアリールアミノ基、ヒドロキシアラルキルアミノ基、もしくはヒドロキシルアルカリルアミノ基などの構造単位−Ｏ−ＮＨ−を含むヒドロキシアミノ基の誘導体。
−それぞれ構造単位−ＮＨ−Ｏ−を含む、アルコキシアミノ基、アリールオキシアミノ基、アラルキルオキシアミノ基、またはアルカリルオキシアミノ基。
−カルボニル基を有する残基、−Ｑ−Ｃ（＝Ｇ）−Ｍ’、式中、Ｇは、ＯまたはＳであり、Ｍ’は例えば、
−−−ＯＨまたは−ＳＨ。
−−アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、またはアルカリルオキシ基。
−−アルキルチオ基、アリールチオ基、アラルキルチオ基、またはアルカリルチオ基。
−−アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、アラルキルカルボニルオキシ基、アルカリルカルボニルオキシ基。
−−活性化エステル、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどのイミド構造を有するヒドロキシルアミンのエステル。
−−ＮＨ−ＮＨ２、または−ＮＨ−ＮＨ−。
−−ＮＯ２。
−ニトリル基。
−カルボニル基、例えばアルデヒド基またはケト基。
−カルボキシ基。
−−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ基または−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基。
−ビニルハライド基、例えばヨウ化ビニルまたは臭化ビニル基またはトリフレート。
−−Ｃ≡Ｃ−Ｈ。
−−（Ｃ＝ＮＨ２Ｃｌ）−Ｏアルキル
−基−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ２−Ｈａｌ、ここでＨａｌは、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである。
−−ＣＨ＝ＣＨ−ＳＯ２−。
−構造−Ｓ−Ｓ−を含むジスルフィド基。
−
【化３３】
0005486507.tif 000038
基。
−
【化３４】
0005486507.tif 000039
基。
【００９８】
一例として、Ｗ１またはＷ２は、カルボキシ基または活性化エステルであり得て、およびＷ１またはＷ２は、官能基Ｗ１と官能基Ｗ２との反応から生じる官能基を表すＦがアミドまたはエステルであるように、アミノ基またはヒドロキシ基であり得る。
【００９９】
したがって、一例として、構造単位−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−以外に官能基を含む、スペーサＬを有する架橋性化合物は、
Ｍ−Ｌ’−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−Ａ
または
Ｍ−Ｌ’−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−Ａ
または
Ｍ−Ｌ’−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−Ａ
または
Ｍ−Ｌ’−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−Ａ
または
Ｍ−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−Ｌ”−Ａ
または
Ｍ−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｌ”−Ａ
または
Ｍ−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｌ”−Ａ
または
Ｍ−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｌ”−Ａ
などの構造を有し得て、式中、Ｌ’およびＬ”は、構造単位−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−を含むことも含まないこともある。
【０１００】
これらの構造のうち、構造
Ｍ−Ｌ’−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−Ａ
または
Ｍ−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−Ｌ”−Ａ
を有する架橋性化合物が好ましい。
【０１０１】
また、これらの構造の中で、Ｌ’およびＬ”が存在する場合、単位−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−を含有するスペーサが好ましい。これらの場合で、ｎが１〜４の範囲、さらに好ましくは１〜３の範囲、例えば１，２、または３であることがなおさらに好ましい。所与のスペーサが例えば２個の構造単位−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−を含有する場合、各構造単位の添字ｎは同じであることもできまたは異なることもできる。
【０１０２】
したがって、以下の構造を有する以下の架橋性化合物が好ましい。
Ｍ−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−Ａ
式中、各ｎはそれぞれ独立して、好ましくは１〜４の範囲、さらに好ましくは１〜３の範囲、例えば１、２、または３である。したがって、好ましいスペーサＬは、構造
−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−
を有する。
【０１０３】
したがって、特に好ましい-（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−を含有する架橋性化合物は、
Ｍ−（ＣＬ１Ｌ２）３−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＬ１Ｌ２）３−Ａ
または
Ｍ−（ＣＬ１Ｌ２）３−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＬ１Ｌ２）２−Ａ
または
Ｍ−（ＣＬ１Ｌ２）２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＬ１Ｌ２）３−Ａ
または
Ｍ−（ＣＬ１Ｌ２）２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＬ１Ｌ２）２−Ａ［ＲＳ１］
である。
【０１０４】
さらに好ましい-（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−を含有する架橋性化合物は、
Ｍ−（ＣＬ１Ｌ２）３−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＬ１Ｌ２）２−Ａ
または
Ｍ−（ＣＬ１Ｌ２）２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＬ１Ｌ２）２−Ａ
である。
【０１０５】
なおさらに好ましくは、Ｌ１およびＬ２はどちらもＨである。したがって、次の構造を有する架橋性化合物、
Ｍ−（ＣＨ２）３−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ａ
または
Ｍ−（ＣＨ２）３−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ａ
または
Ｍ−（ＣＨ２）２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ａ
または
Ｍ−（ＣＨ２）２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ａ［ＲＳ２］
が特に好ましい。
【０１０６】
次の構造を有する架橋性化合物
Ｍ−（ＣＨ２）３−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ａ
または
Ｍ−（ＣＨ２）２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ａ
が最も好ましい。
【０１０７】
一例として、本発明の好ましい架橋性化合物
【化３５】
0005486507.tif 000040
または
【化３６】
0005486507.tif 000041
または
【化３７】
0005486507.tif 000042
または
【化３８】
0005486507.tif 000043
または
【化３９】
0005486507.tif 000044
である。
【０１０８】
再度一例として、上述の構造を例証するために、本発明の状況で考えられる架橋性化合物は
【化４０】
0005486507.tif 000045
であることができる。
【０１０９】
本発明のさらなる実施形態により、スペーサＬは、１個を超える構造単位−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−を含み得て、ここでこれらの構造単位は、同じでありまたは異なり得て、すなわち構造はｎならびに／またはＬ１および／もしくはＬ２が異なり得て、ここで少なくとも２個のこのような構造単位はＯまたはＳなどのヘテロ原子によって分離され得る。好ましくは、本実施形態により、スペーサＬは、少なくとも１個の構造単位−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ１−Ｏ−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ２−、好ましくは−（ＣＨ２）ｎ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ２を含み、式中、ｎ１は、ｎ２と等しいまたは異なり、および式中、スペーサＬは、−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ１−を介して架橋性化合物、すなわち次のサブ構造
Ｍ−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ１−Ｏ−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ２−
を含む架橋性化合物のアミノ基Ｍに結合される。
【０１１０】
好ましい考えられる実施形態により、
−（（ＣＬ１Ｌ２）ｎ１−Ｏ）ｍ−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ２−
などのスペーサ構造が挙げられ、ｍは１〜２０の、好ましくは１〜１０の、さらに好ましくは１〜６、例えば１、２、３、４、５、または６の整数である。特に好ましくは、ｍは１、２、または３、さらに好ましくは２または３である。好ましくは、ｎ１は２〜４、さらに好ましくは２である。好ましくは、ｎ２は１〜４、さらに好ましくは１または２である。したがって、好ましい構造は、一例として、
−（（ＣＬ１Ｌ２）２−Ｏ）ｍ−（ＣＬ１Ｌ２）−
およびさらに好ましくは
−（（ＣＨ２）２−Ｏ）ｍ−ＣＨ２−
である。
【０１１１】
再度一例として、上述の構造を例証するために、本発明の状況で好ましくは使用される架橋性化合物は
【化４１】
0005486507.tif 000046
または
【化４２】
0005486507.tif 000047
または
【化４３】
0005486507.tif 000048
である。
【０１１２】
本発明のさらなる実施形態により、Ｍ基およびＡ基は、Ｍ基のＮ原子およびケタール基ＡのＣ原子が環を形成するように、その少なくとも一方が−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−を含む２個の好適な化学部分によって分離され得る。好ましい実施形態は、すでに上に示され、構造式
【化４４】
0005486507.tif 000049
を有する。
【０１１３】
本発明の特に好ましい架橋性化合物は、Ｍ基として、基Ｈ２Ｎ−または基Ｈ２Ｎ−Ｏ−または基Ｈ２Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−、特に好ましくはＨ２Ｎ−を、およびＡ基として、アセタール基、好ましくは構造式
【化４５】
0005486507.tif 000050
を有するアセタール基を有する化合物であり、
さらに好ましくは、Ｚ１およびＺ２はＯであり、ならびになおさらに好ましくは、Ａ１およびＡ２はどちらもエチルである。なおさらに好ましくは、スペーサＬは、構造単位−（ＣＬ１Ｌ２）ｎ−から成り、Ｌ１およびＬ２は好ましくはＨであり、および整数ｎはなおさらに好ましくは、１〜２０、好ましくは１〜１０、さらに好ましくは１〜６、さら好ましくは１〜４、さらに好ましくは２である。
【０１１４】
したがって、本発明による好ましい架橋性化合物は、一例として
【化４６】
0005486507.tif 000051
（ａ１）または
【化４７】
0005486507.tif 000052
（ａ２）または
【化４８】
0005486507.tif 000053
（ａ３）または
【化４９】
0005486507.tif 000054
（ａ４）または
【化５０】
0005486507.tif 000055
（ａ５）または
【化５１】
0005486507.tif 000056
（ａ６）または
【化５２】
0005486507.tif 000057
（ａ７）または
【化５３】
0005486507.tif 000058
（ａ８）または
【化５４】
0005486507.tif 000059
（ａ９）または
【化５５】
0005486507.tif 000060
（ａ１０）または
【化５６】
0005486507.tif 000061
（ａ１１）または
【化５７】
0005486507.tif 000062
（ａ１２）または
【化５８】
0005486507.tif 000063
（ａ１３）または
【化５９】
0005486507.tif 000064
（ａ１４）または
【化６０】
0005486507.tif 000065
（ａ１５）または
【化６１】
0005486507.tif 000066
（ａ１６）または
【化６２】
0005486507.tif 000067
（ａ１７）または
【化６３】
0005486507.tif 000068
（ａ１８）または
【化６４】
0005486507.tif 000069
（ａ１９）または
【化６５】
0005486507.tif 000070
（ａ２０）または
【化６６】
0005486507.tif 000071
（ａ２１）
である。
【０１１５】
なおさらに好ましくは、架橋性化合物は、（ａ２）、（ａ４）、（ａ１１）、（ａ１２）、（ａ１４）、（ａ１６）、および（ａ１８）の構造からなる群より選択される。さらに好ましくは、架橋性化合物は、（ａ２）、（ａ１１）、（ａ１２）、（ａ１４）、（ａ１６）、および（ａ１８）の構造からなる群より選択される。特に、架橋性化合物は、（ａ２）、（ａ１１）、（ａ１２）、および（ａ１６）の構造からなる群より選択される。
【０１１６】
架橋性化合物Ｍ−Ｌ−Ａとして特に好ましいのは、１−アミノ−３，３−ジエトキシプロパン、
【化６７】
0005486507.tif 000072
である。
【０１１７】
一例として、本発明により考えられるアミノ−アセタール架橋性化合物は、
【化６８】
0005486507.tif 000073
４，４−ジエトキシ−２−メチルブタン−２−アミン
【化６９】
0005486507.tif 000074
１−（１，３−ジオキサン−２−イル）−２−メチルプロパン−２−アミン
【化７０】
0005486507.tif 000075
１−（１，３−ジオソラン−２−イル）−２−メチルプロパン−２−アミン
【化７１】
0005486507.tif 000076
４，４−ジエトキシ−Ｎ，２−ジメチルブタン−２−アミン
【化７２】
0005486507.tif 000077
１−（１，３−ジオキサン−２−イル）−Ｎ，２−ジメチルメチルプロパン−２−アミン
【化７３】
0005486507.tif 000078
１−（１，３−ジオソラン−２−イル）−Ｎ，２−ジメチルメチルプロパン−２−アミン
【化７４】
0005486507.tif 000079
２，２−ジエトキシ−Ｎ−メチルエタンアミン
【化７５】
0005486507.tif 000080
４，４−ジエトキシブタンイミドヒドラジド
【化７６】
0005486507.tif 000081
３，３−ジメトキシプロパンイミドヒドラジド
である。
【０１１８】
一例として、本発明により考えられるアミノ−ケタール架橋性化合物は、
【化７７】
0005486507.tif 000082
１−オキサ−チア−８−アザスピロ［４．５］デカン
【化７８】
0005486507.tif 000083
１，４−ジチア−８−アザスピロ［４．５］デカン
【化７９】
0005486507.tif 000084
Ｎ−メチル−１−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）メタンアミン
【化８０】
0005486507.tif 000085
１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）エタンアミン
【化８１】
0005486507.tif 000086
４−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）ブタン−１−アミン
【化８２】
0005486507.tif 000087
１−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）ヘキサン−２−アミン
【化８３】
0005486507.tif 000088
２−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）−１−フェニルエタンアミン
【化８４】
0005486507.tif 000089
１−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）プロパン−２−アミン
【化８５】
0005486507.tif 000090
３−メチル−１−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）ブタン−２−アミン
【化８６】
0005486507.tif 000091
２−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）エタンアミン
【化８７】
0005486507.tif 000092
３−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）ペンタン−２−アミン
【化８８】
0005486507.tif 000093
２−１−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）プロパン−２−アミン
【化８９】
0005486507.tif 000094
２−（４−メトキシフェニル）−２−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）エタンアミン
【化９０】
0005486507.tif 000095
２−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−（２−メチル−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）エタンアミン
【化９１】
0005486507.tif 000096
２，２−ジメチル−３−（２−メチル−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）プロパン−１−アミン
【化９２】
0005486507.tif 000097
３−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）−３−フェニルプロパン−１−アミン
【化９３】
0005486507.tif 000098
４−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）−ブタン−２−アミン
【化９４】
0005486507.tif 000099
５−メチル−５−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）ヘキサン−１−アミン
【化９５】
0005486507.tif 000100
２，２−ジメチル−３−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）プロパン−１−アミン
【化９６】
0005486507.tif 000101
７，２−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）ヘプタン−１−アミン
【化９７】
0005486507.tif 000102
２−メチル−４−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）ブタン−２−アミン
【化９８】
0005486507.tif 000103
４−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）ヘキサン−１−アミン
【化９９】
0005486507.tif 000104
４−アミノ−１−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）ペンタン−３−オール
【化１００】
0005486507.tif 000105
３−（２，４−ジメチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）−２，２−ジメチルプロパン−１−アミン
【化１０１】
0005486507.tif 000106
２−メチル−１−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）プロパン−２−アミン
【化１０２】
0005486507.tif 000107
Ｎ−メチル−３−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）ブタン−１−アミン
【化１０３】
0005486507.tif 000108
１−（２，５，５−トリメチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）ヘプタン−４−アミン
【化１０４】
0005486507.tif 000109
３−（２−メチル−１，３−ジチアン−２−イル）プロパン−１−アミン
【化１０５】
0005486507.tif 000110
３，３−ジメチル−１−（２−メチル−１，３−ジチアン−２−イル）ブタン−２−アミン
【化１０６】
0005486507.tif 000111
３−（２−メチル−１，３−ジオキサン−２−イル）ブタン−２−アミン
【化１０７】
0005486507.tif 000112
１−（２−メチル−１，３−ジオキサン−２−イル）ペンタン−２−アミン
【化１０８】
0005486507.tif 000113
３−メチル−１−（２−メチル−１，３−ジオキサン−２−イル）ブタン−２−アミン
【化１０９】
0005486507.tif 000114
１，１，１−トリフルオロ−３−（２−メチル−１，３−ジオキサン−２−イル）プロパン−２−アミン
である。
【０１１９】
（ヒドロキシアルキルデンプン誘導体）
したがって本発明は、上述の方法によって得られるまたは得たヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）誘導体に関する。
【０１２０】
さらに、本発明は、式（ＩＩＩ）
【化１１０】
0005486507.tif 000115
（ＩＩＩ）
のＨＡＳ誘導体に関し、式中、Ａは、アセタールまたはケタール基であり、Ｌは、ＸおよびＡを架橋するスペーサである。
Ｘは、式（ＩＩ）
Ｍ−Ｌ−Ａ
で示す架橋性化合物のアミノ基Ｍと、式（Ｉ）
【化１１１】
0005486507.tif 000116
（Ｉ）
で示すヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）とによるＨＡＳの炭素原子Ｃ＊を介した反応から生じる官能基であり、Ｃ＊は、ＨＡＳのＭとの反応の前に場合によっては酸化され、
ＨＡＳ’は、ヒドロキシアルキルデンプン分子の残部であり、ならびにＲ１、Ｒ２およびＲ３は独立して、水素または直鎖もしくは分枝ヒドロキシアルキル基である。
【０１２１】
ＨＡＳ、好ましくはＨＥＳ、Ｌ、Ａ、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３に関する好ましい実施形態に関する限り、上述した実施形態を特に参照されたい。
【０１２２】
さらに、本発明は、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３が独立して−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｈ基（ｎは、整数、好ましくは０、１、２、３、４、５、または６である）である上述したＨＡＳ誘導体に関する。
【０１２３】
さらに、本発明は、ヒドロキシアルキルデンプンがヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）である上述したＨＡＳ誘導体に関する。
【０１２４】
さらに、本発明は、上述したＨＡＳ誘導体に関し、Ａは、式（ＩＩａ）
【化１１２】
0005486507.tif 000117
（ＩＩａ）
による残基であり、
Ｚ１およびＺ２はそれぞれ独立して、ＯまたはＳまたはＮＲｘ、好ましくはＯであり、Ｒｘは、Ｈまたは低級アルキル、例えばメチル、エチル、またはプロピル、好ましくはＨであり、
Ａ１およびＡ２はそれぞれ独立して、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ベンジル、１，１，１−トリクロロエチル、ニトロベンジル、メトキシベンジル、エトキシベンジルであり、または式（ＩＩｂ）
【化１１３】
0005486507.tif 000118
（Ａ１およびＡ２はひとまとめにされて、−（ＣＨ２）２−または−（ＣＨ２）３−または−（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３））−である）による環を形成し、
Ａ３は、Ｈもしくはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ペンチル、ベンジルであり、またはアミノ基ＭのＮ原子もしくはＬに含まれる好適な原子と共に環を形成し、Ａ３は好ましくはＨである。
【０１２５】
本発明によるＨＡＳ誘導体の基Ｘの正確な化学的性質は、Ｍ基のそれぞれの化学的性質に、ＨＡＳの還元末端の炭素原子Ｃ＊の酸化状態に、ならびに反応条件、例えば反応に利用された溶媒、温度などに依存する。炭素原子Ｃ＊が酸化および非酸化状態で利用される本発明の実施形態により、詳細なおよび好ましい実施例について以下で詳細に議論する。
【０１２６】
好ましくはＸに関する限り、本発明は、Ｘが−ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−、−ＣＨ２−ＮＨ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−、好ましくは−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−、−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−からなる、ならびに−ＣＨ２−ＮＨ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−からなる、さらに好ましくは−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−、および−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−からなる群より選択される上述したＨＡＳ誘導体に関する。
【０１２７】
基Ｘのある実施形態では、ＨＡＳ誘導体に存在するようなＨＡＳの末端サッカライド単位が上の式（ＩＩＩ）による開構造と平衡にあり得る環構造で存在し、環構造および開構造がある平衡分布を有することが考えられる。これらの場合では、および本発明の目的では、上に示したような式（ＩＩＩ）は、環構造と同様に開構造を有し、式（ＩＩＩ）は開構造に対してＨＡＳ誘導体を制限しない。詳細なおよび好ましい実施例について以下で詳細に議論するので、環構造をいくつかの場合で示す。
【０１２８】
さらに、本発明は、ＭおよびＡを架橋するＬが、式（ＩＩｄ）による少なくとも１個の構造単位を含む、好ましくは式（ＩＩｄ）による構造単位からなるスペーサである、上述したＨＡＳ誘導体に関し
【化１１４】
0005486507.tif 000119
式中、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、Ｈまたはアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アルキルアリール、置換アルキルアリール、および残基−Ｏ−Ｒ”（ここでＲ”は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アルキルアリール、置換アルキルアリールからなる群より選択され）からなる群より選択される有機残基、好ましくはＨまたはアルキルおよび置換アルキルからなる群より選択される有機残基、さらに好ましくはＨまたはアルキル、さらに好ましくはＨであり、
式中、ｎは、１〜２０の、好ましくは１〜１０の、さらに好ましくは１〜６の、さらに好ましくは１〜４の、さらに好ましくは２の整数である。
【０１２９】
ＨＡＳ、好ましくはＨＥＳの場合により酸化された還元末端
本発明により、ＨＡＳ、好ましくはＨＥＳは、デンプンの末端還元末端の炭素原子Ｃ＊を介して架橋性化合物のアミノ基と反応することが可能であり、ここでＣ＊は、ＨＡＳとＭとの反応の前に場合により酸化される。
【０１３０】
「ＨＡＳが還元末端を介して反応する」または「ＨＡＳが末端還元末端の炭素原子Ｃ＊を介して反応する」という用語は、本発明の状況で使用するように、ＨＡＳが主にその（場合により選択的に酸化された）還元末端を介して反応するプロセスに関し得る。
【０１３１】
「主にその（場合により選択的に酸化された）還元末端を介して」という用語は、所与の反応に利用されるＨＡＳ分子の統計的に５０％超の、好ましくは少なくとも５５％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも６５％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、およびなおさらに好ましくは少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％がＨＡＳ分子による少なくとも１個の（場合により選択的に酸化された）還元末端を介して反応するプロセスに関し、ここで少なくとも１個の（場合により選択的に酸化された）還元末端を介して反応する所与のＨＡＳ分子が、同じ所与の反応において、該ポリマー分子に含まれ、還元末端でない少なくとも１個のさらなる好適な官能基を介して反応することが可能である。１個以上のＨＡＳ分子が少なくとも１個の（場合により選択的に酸化された）還元末端を介して、および同時にこのＨＡＳ分子に含まれ、（場合により選択的に酸化された）還元末端でない少なくとも１個のさらに好適な官能基を介して反応する場合、これらのＨＡＳ分子の反応した官能基すべての統計的に好ましくは５０％超、好ましくは少なくとも５５％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも６５％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、およびなおさらに好ましくは少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が（選択的に酸化された）還元末端であり、該官能基は（場合により選択的に酸化された）還元末端を含む。
【０１３２】
「還元末端」という用語は、本発明の状況で使用するように、アルデヒド基としておよび／または対応するヘミアセタール形としておよび／またはアセタール基として存在し得るＨＡＳ分子の末端アルデヒド基に関し、アセタール基は以下の構造
【化１１５】
0005486507.tif 000120
を有し、上の式（Ｉ）による残基−ＯＲ３が−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨである場合に、存在できる。
【０１３３】
還元末端が酸化されている場合、酸化された還元末端はカルボキシ基および／または対応するラクトンの形である。
【０１３４】
酸化された還元末端
したがって、本発明の第１の実施形態により、架橋性化合物はアミノ基を介して、ＨＡＳ、好ましくはＨＥＳの末端還元末端の酸化されたＣ＊原子と反応する。
【０１３５】
酸化はヒドロキシアルキルデンプンの酸化還元末端を生じるすべての好適な１つまたは複数の方法に従って実施され得るが、例えば、ここに引用することで本明細書の一部をなすものとするＳｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒらの米国特許第６０８３９０９号明細書の第５欄第６３〜６７行及び第７欄第２５〜３９行、第８欄第５３行〜第９欄第２０行に記載されたようなアルカリ性ヨウ素溶液を使用して好ましくは実施され得る。
【０１３６】
ＨＡＳ、好ましくはＨＥＳを選択的に酸化すると、ＨＡＳ、好ましくはＨＥＳはラクトン
【化１１６】
0005486507.tif 000121
および／またはカルボン酸
【化１１７】
0005486507.tif 000122
またはカルボン酸の好適な塩、例えばアルカリ金属塩、好ましくはナトリウムおよび／またはカリウム塩であり、およびＨＡＳ’は好ましくはＨＥＳ”である。
【０１３７】
本発明の最初の代案に従って、ＨＡＳ、好ましくはＨＥＳのこの形は、架橋性化合物のアミノ基Ｍなどと反応する。
【０１３８】
本発明の第２の代案に従って、その還元末端で選択的に酸化されたＨＡＳ、好ましくはＨＥＳは、最初に好適な化合物と反応して、反応性カルボキシ基を含むＨＡＳ、好ましくはＨＥＳを生じる。
【０１３９】
その還元末端で選択的に酸化されたＨＡＳへの反応性カルボキシ基の導入は、すべての考えられる方法およびすべての好適な化合物によって実施され得る。
【０１４０】
本発明の詳細な方法により、その還元末端で選択的に酸化されたＨＡＳはその酸化還元末端にて少なくとも１つのアルコール、好ましくは少なくとも１つの酸性アルコール、例えば２５℃にて６〜１２または７〜１１の範囲のｐＫＡ値を有する酸性アルコールと反応する。酸性アルコールの分子量は、８０〜５００ｇ／ｍｏｌの、例えば９０〜３００ｇ／ｍｏｌの、または１００〜２００ｇ／ｍｏｌの範囲であり得る。
【０１４１】
好適な酸性アルコールは、酸性プロトンを有するすべてのアルコールＨ−Ｏ−ＲＡであり、酸化されたＨＡＳと反応して、好ましくは式
【化１１８】
0005486507.tif 000123
による、なおさらに好ましくは式
【化１１９】
0005486507.tif 000124
による各反応性ＨＡＳエステルを与えることができる。
【０１４２】
好ましいアルコールは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドもしくはスルホ−Ｎ−Ｎ−ヒドロキシ、好適に置換されたフェノール、例えばｐ−ニトロフェノール、ｏ，ｐ−ジニトロフェノール、ｏ，ｏ’−ジニトロフェノール、トリクロロフェノール、例えば２，４，６−トリクロロフェノールもしくは２，４，５−トリクロロフェノール、トリフルオロフェノール、例えば２，４，６−トリフルオロフェノールもしくは２，４，５−トリフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、またはヒドロキシアゾール、例えばヒドロキシベンゾトリアゾールである。特に好ましいのはＮ−ヒドロキシスクシンイミドであり、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよびスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドが特に好ましい。すべてのアルコールは単独で、またはその２つ以上の好適な組合せとして利用され得る。本発明の状況において、例えば炭酸のジエステルを添加することによって、各アルコールを放出する化合物を利用することも可能である。
【０１４３】
したがって、本発明は、その還元末端で選択的に酸化されたＨＡＳが、酸化ＨＡＳを酸性アルコールと、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび／またはスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させることによって活性化する上述した方法にも関する。
【０１４４】
本発明の好ましい実施形態により、その還元末端で選択的に酸化されたＨＡＳは、少なくとも１つのカルボン酸ジエステルＲＢ−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−ＲＣ（式中、ＲＢおよびＲＣは同じであることもできまたは異なることもできる）と反応する。好ましくは、本方法により、式
【化１２０】
0005486507.tif 000125
による反応性ＨＡＳが得られ、式中、ＨＡＳ’は好ましくはＨＥＳ’である。
【０１４５】
好適な炭酸ジエステル化合物として、そのアルコール成分が独立してＮ−ヒドロキシスクシンイミド、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドもしくはスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、好適に置換されたフェノール、例えばｐ−ニトロフェノール、ｏ，ｐ−ジニトロフェノール、ｏ，ｏ’−ジニトロフェノール、トリクロロフェノール、例えば２，４，６−トリクロロフェノールもしくは２，４，５−トリクロロフェノール、トリフルオロフェノール、例えば２，４，６−トリフルオロフェノールもしくは２，４，５−トリフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、またはヒドロキシアゾール、例えばヒドロキシベンゾトリアゾールである化合物が利用され得る。特に好ましいのはＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネートおよびスルホ−Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネートであり、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネートが特に好ましい。
【０１４６】
したがって、本発明は、その還元末端で選択的に酸化されたＨＡＳが、酸化ＨＡＳをＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネートと反応することによって活性化される上述した方法にも関する。
【０１４７】
酸性アルコールは、酸化ＨＡＳまたは酸化ＨＡＳの塩と、好ましくは５：１〜５０：１の、さらに好ましくは８：１〜２０：１の酸性アルコール、ＨＡＳのモル比で、２〜４０℃の、さらに好ましくは１０〜３０℃の、および特に好ましくは１５〜２５℃の好ましい反応温度にて反応する。反応時間は好ましくは、１〜１０時間の、さらに好ましくは２〜５時間の、さらに好ましくは２〜４時間の、および特に２〜３時間の範囲である。
【０１４８】
炭酸ジエステル化合物は、酸化ＨＡＳまたは酸化ＨＡＳの塩と、一般に１：１〜３：１の、例えば１：１〜１．５：１のジエステル化合物：ＨＡＳのモル比で反応する。反応時間は一般に、０．２〜６時間の、または０．５〜２時間のまたは特に０．７５〜１．２５時間などの０．１〜１２時間の範囲である。
【０１４９】
本発明の好ましい実施形態により、酸化ＨＡＳと酸性アルコールおよび／または炭酸ジエステルとの反応は、少なくとも１つの非プロトン性溶媒中で、例えば０．５重量パーセントを超えない、好ましくは０．１重量パーセントを超えない含水率を有する無水非プロトン性溶媒中で実施される。好適な溶媒は、特に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびその２つ以上の混合物である。反応温度は好ましくは、２〜４０℃の、さらに好ましくは１０〜３０℃の範囲である。
【０１５０】
酸化ＨＡＳを少なくとも１つの酸性アルコールと反応させるために、少なくとも１つのさらなる活性化剤を利用する。
【０１５１】
好適な活性化剤は、特に、カルボニルジイミダゾール、カルボイミド、例えばジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）であり、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）が特に好ましい。
【０１５２】
したがって、本発明は、その還元末端で選択的に酸化されたＨＡＳが、さらなる活性化剤の存在下で酸性アルコールと反応して反応性ＨＡＳエステルを与える上述した方法にも関する。
【０１５３】
本発明の一実施形態により、酸化ＨＡＳと炭酸ジエステルおよび／または酸性アルコールとの反応は、反応混合物を水に１０：１の水の反応混合物に対する体積比で添加することによって決定され得る低塩基活性にて実施される。添加の前に、本質的に緩衝剤を含まない水のｐＨ値は、２５℃にて７である。反応混合物の添加後に、ｐＨ値を測定することによって、反応混合物の塩基活性が得られ、好ましくは９．０以下の、好ましくは８．０以下の、および特に好ましくは７．５以下の値を有する。
【０１５４】
本発明の別の実施形態により、酸化ＨＡＳは、ＥＤＣを含む水の非存在下の無水ＤＭＡ中でＮ−ヒドロキシスクシンイミドとＥＤＣと反応して、式
【化１２１】
0005486507.tif 000126
によるポリマーＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを選択的に与え、
さらに好ましくはＨＡＳ’はＨＥＳ’である。
【０１５５】
この反応によって、ＨＥＳのＯＨ基との反応から生じる副生成物は得られず、ＥＤＣにより生成されたＯ−アシルイソ尿素および酸化ＨＡＳの各Ｎ−アシル尿素へ転位反応は、驚くほど抑制される。
【０１５６】
本発明の別の好ましい実施形態により、酸化ＨＡＳは水の非存在下および活性化剤の非存在下にて無水ＤＭＦ中でＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネートと反応して、式
【化１２２】
0005486507.tif 000127
によるＨＡＳ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを選択的に与え、
さらに好ましくはＨＡＳ’はＨＥＳ’である。
【０１５７】
本発明の別の実施形態により、その還元末端にて選択的に酸化されたＨＡＳは、酸化された還元末端にてアゾリド、例えばカルボニルジイミダゾールまたはカルボニルジベンズイミダゾールと反応して、反応性カルボキシ基を有するポリマーを与える。カルボニルジイミダゾールの場合、式
【化１２３】
0005486507.tif 000128
による反応性イミダゾリドＨＡＳ誘導体が生じ、
式中、ＨＡＳ’は好ましくはＨＥＳ’である。
【０１５８】
上述した、好ましくはＨＡＳと酸性アルコール、カーボネートおよび／またはアゾリドとの反応から生じた、少なくとも１個の反応性カルボキシ基を含む反応性ＨＡＳ誘導体は、次に架橋性化合物Ｍのアミノ基Ｍとさらに反応する。
【０１５９】
上述のように場合によりさらに活性化された酸化還元末端を介した、ＨＡＳとアミノ基Ｍとの反応は、すべての好適な方法に従って実施できる。好ましくは、アミノ基は、１級アミノ基Ｈ２Ｎ−または２級アミノ基である。
【０１６０】
一般に、好ましくは、ある量の、例えば最大１０重量％の水も含有し得る極性非プロトン性溶媒が使用される。好ましい非プロトン性溶媒は特に、ＤＭＳＯまたはＤＭＦである。
【０１６１】
好ましい反応温度範囲の例は０〜８０℃、さらに好ましくは０〜７０℃、さらに好ましくは０〜６０℃、さらに好ましくは０〜５０℃、およびなおさらに好ましくは０〜４０℃である。
【０１６２】
架橋性化合物が好ましい実施形態により、アミノ基ＭとしてＨ２Ｎ−を有する酸化形の還元末端を有するＨＡＳとの反応に使用される場合、ＨＡＳ誘導体は、開始物質として利用されるＨＡＳおよび架橋性化合物がアミド結合を介して結合される本発明のステップ（ｉ）によって得られ、得られたＨＡＳ誘導体はアセタールまたはケト基Ａをさらに含有する。
【０１６３】
したがって、本発明は、（ｉ）において、ＨＡＳがその酸化還元末端を介して架橋性化合物のＨ２Ｎ−であるアミノ基Ｍと反応して、反応が０〜８０℃の範囲の温度で実施され、Ｘが−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−である、上述の方法にも関する。
【０１６４】
したがって本発明は、上述の方法によって得られるまたは得たＨＡＳ誘導体にも関する。
【０１６５】
さらに、本発明は、例えば以下の構造
【化１２４】
0005486507.tif 000129
を有するＨＡＳ誘導体にも関し、
式中、架橋性化合物のアミノ基Ｍが１級アミノ基である場合に、Ｒ’はＨであり、式中、架橋性化合物のアミノ基Ｍが１級アミノ基である場合に、Ｒ’はＨ以外の化学基である。Ｒ’の正確な化学的性質は架橋性化合物に依存し、したがって上の一般に考えられるおよび好ましくは利用される架橋性化合物の議論を参照されたい。
【０１６６】
本発明で利用される上述の好ましい架橋性化合物に従って、以下のＨＡＳ誘導体は、それぞれの場合において、ＨＡＳが−本発明の好ましい実施形態により−ＨＥＳである、一例として好ましい実施形態として挙げられる。
【化１２５】
0005486507.tif 000130
または
【化１２６】
0005486507.tif 000131
または
【化１２７】
0005486507.tif 000132
または
【化１２８】
0005486507.tif 000133
または
【化１２９】
0005486507.tif 000134
または
【化１３０】
0005486507.tif 000135
または
【化１３１】
0005486507.tif 000136
または
【化１３２】
0005486507.tif 000137
または
【化１３３】
0005486507.tif 000138
または
【化１３４】
0005486507.tif 000139
または
【化１３５】
0005486507.tif 000140
または
【化１３６】
0005486507.tif 000141
または
【化１３７】
0005486507.tif 000142
または
【化１３８】
0005486507.tif 000143
または
【化１３９】
0005486507.tif 000144
または
【化１４０】
0005486507.tif 000145
または
【化１４１】
0005486507.tif 000146
または
【化１４２】
0005486507.tif 000147
【０１６７】
構造（ａ２）、（ａ４）、（ａ１１）、（ａ１２）、（ａ１４）、（ａ１６）、および（ａ１８）からなる群より選択される架橋性化合物に基づくＨＡＳ誘導体がさらに好ましい。なおさらに好ましいのは、構造（ａ２）、（ａ１１）、（ａ１２）、（ａ１４）、（ａ１６）、および（ａ１８）からなる群より選択される架橋性化合物に基づくＨＡＳ誘導体である。特に好ましいのは、構造（ａ２）、（ａ１１）、（ａ１２）、および（ａ１６）からなる群より選択される架橋性化合物に基づくＨＡＳ誘導体である。
【０１６８】
特に好ましい実施形態により、本発明は、以下の構造、
【化１４３】
0005486507.tif 000148
を有するＨＥＳ誘導体に関し、
式中、なおさらに好ましくは、ＨＥＳは、約１〜約１０００ｋＤａの、さらに好ましくは約１〜約８００ｋＤａの、さらに好ましくは約１〜約５００ｋＤａの、さらに好ましくは約２〜約４００ｋＤａの、さらに好ましくは約５〜約３００ｋＤａの、さらに好ましくは約１０〜約２００ｋＤａの、特に約５０〜約１５０ｋＤａの平均分子量、０．１〜３の、好ましくは０．４〜１．３の、例えば０．４、０．５、０．６、０．７  ０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、または１．３のモル置換、および２〜２０の範囲の、さらに好ましくは２〜１５の範囲の、およびなおさらに好ましくは３〜１２の範囲のＣ２：Ｃ６置換の比を有する。
【０１６９】
非酸化還元末端
本発明の第２の好ましい実施形態により、架橋性化合物は、アミノ基を介してＨＡＳ、好ましくはＨＥＳの末端還元末端の非酸化Ｃ＊原子と反応する、すなわちＨＡＳ分子の末端アルデヒド基はアルデヒド基として、および／または対応するヘミアセタール形として存在し得る。
【０１７０】
非酸化還元末端を介したＨＡＳとアミノ基Ｍとの反応は、すべての好適な方法に従って実施できる。好ましくは、アミノ基Ｍは、Ｈ２Ｎ−、好適な２級アミノ基ＨＮＲ’−、例えばＨ３Ｃ−ＮＨ−、Ｈ２Ｎ−Ｏ−、または好適な２級ヒドロキシアミノ基ＨＮＲ’−Ｏ−、例えばＨ３Ｃ−ＮＨ−Ｏ−、またはＨ２Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−である。
【０１７１】
好ましくは、アミノ基Ｍは、Ｈ２Ｎ−、Ｈ２Ｎ−Ｏ−、またはＨ２Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−、なおさらに好ましくはＨ２Ｎ−もしくはＨ２Ｎ−Ｏ−、および特にＨ２Ｎ−である。
【０１７２】
本発明の好ましい実施形態により、この反応は水性系で実施される。「水性系」という用語は、本発明の明細書で使用するように、溶媒または含まれる溶媒の重量に基づいて少なくとも１０重量％から、好ましくは少なくとも５０重量％、さらに好ましくは少なくとも８０重量％、なおさらに好ましくは少なくとも９０重量％または最大１００重量％までの範囲で水を含む溶媒の混合物を指す。さらなる溶媒として、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、エタノールまたはメタノールなどの溶媒が挙げられる。
【０１７３】
好ましい実施形態により、ＨＡＳが架橋性化合物と水性媒体中で反応して、架橋性化合物のアミノ基Ｍがヒドロキシルアミンまたはヒドラジドである場合、反応温度は好ましくは５〜４５℃の範囲、さらに好ましくは１０〜３０℃の範囲、および特に好ましくは１５〜２５℃の範囲である。
【０１７４】
本発明の別の好ましい実施形態により、ＨＡＳが架橋性化合物と水性媒体中で反応して、架橋性化合物のアミノ基Ｍが基Ｈ２Ｎ−またはＲ’ＨＮである場合、反応は還元的アミノ化であり、温度は、好ましくは１００℃までの範囲、さらに好ましくは１０〜９０℃の範囲、さらに好ましくは２０〜８０℃の範囲、さらに好ましくは３０〜７０℃の範囲および特に好ましくは４０〜６０℃の範囲である。
【０１７５】
反応過程の間、温度は、好ましくは上述の範囲で変化し得るか、または本質的に一定に維持され得る。
【０１７６】
ＨＡＳと架橋性化合物Ｍとの反応の反応時間は、詳細な要求に適合させることができ、一般に１時間〜７時間の範囲である。例えばアミノ基Ｍがヒドロキシルアミンまたはヒドラジドである場合、反応時間は、好ましくは１時間〜３日間、さらに好ましくは２時間〜４８時間、および特に好ましくは３〜２４時間である。
【０１７７】
例えばＨＡＳと架橋性化合物との反応が還元的アミノ化である場合、反応時間は好ましくは１時間〜７日間、さらに好ましくは４時間から６日間、さらに好ましくは８時間〜５日間の範囲、およびなおさらに好ましくは１６時間〜３日間の範囲である。
【０１７８】
ＨＡＳと架橋性化合物との反応のｐＨ値は、反応物質の化学的性質などの詳細な要求に適合されることができる。例えば架橋性化合物のＭ基がヒドロキシルアミンまたはヒドラジドである場合、ｐＨ値は、好ましくは３〜９の、さらに好ましくは４〜８の、およびなおさらに好ましくは４．５〜６．５の範囲である。
【０１７９】
例えばＨＡＳと架橋性化合物との反応が還元的アミノ化である場合、ｐＨ値は、好ましくは３〜９の、さらに好ましくは３．５〜８の、およびなおさらに好ましくは４〜６の範囲である。
【０１８０】
反応混合物の好適なｐＨ値は、各反応ステップで、少なくとも１つの好適な緩衝剤を添加することによって調整され得る。好ましい緩衝剤剤のうちで酢酸塩緩衝剤、好ましくは酢酸ナトリウム緩衝剤、リン酸塩またはホウ酸塩緩衝剤が挙げられる。
【０１８１】
架橋性化合物が、好ましい実施形態により、アミノ基ＭとしてＨ２Ｎ−を有する非酸化形の還元末端を有するＨＡＳとの反応に使用される場合、ＨＡＳ誘導体は、開始物質として利用されるＨＡＳおよび架橋性化合物がイミン結合を介して結合される本発明のステップ（ｉ）によって得られ、得られたＨＡＳ誘導体はアセタールまたはケト基Ａをさらに含有する。反応が好適な還元剤の存在下にて還元的アミノ化条件下で実施される場合、ＨＡＳ誘導体は、開始物質として利用されるＨＡＳおよび架橋性化合物がアミン結合を介して結合される本発明のステップ（ｉ）によって得られ、得られたＨＡＳ誘導体はアセタールまたはケト基Ａをさらに含有する。
【０１８２】
したがって、本発明は、ステップ（ｉ）において、ＨＡＳが好ましくは水性系において、その非酸化還元末端を介して架橋性化合物のＨ２Ｎ−であるアミノ基Ｍと反応して、反応が４〜７の範囲のｐＨにて２０〜８０℃の範囲の温度で実施され、Ｘが−ＣＨ＝Ｎ−である、上述の方法にも関する。
【０１８３】
さらに、本発明は、ステップ（ｉ）において、反応が還元剤、例えば水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、有機ボラン錯体、例えば４−（ジメチルアミン）ピリジンボラン錯体、Ｎ−エチルジイソプロピルアミンボラン錯体、Ｎ−エチルモルホリンボラン錯体、Ｎ−メチルモルホリンボラン錯体、Ｎ−フェニルモルホリンボラン錯体、ルチジンボラン錯体、トリエチルアミンボラン錯体、またはトリメチルアミンボラン錯体、好ましくはＮａＣＮＢＨ３の存在下で実施されてＨＡＳ誘導体が得られ、Ｘが−ＣＨ２−ＮＨ−である、上述の方法にも関する。
【０１８４】
本発明の還元的アミン化に使用するこれらの還元剤の濃度は、それぞれの場合で反応溶液の体積に関連して、好ましくは０．０１〜２．０ｍｏｌ／ｌの範囲、さらに好ましくは０．０５〜１．５ｍｏｌ／ｌの範囲、およびさらに好ましくは０．１〜１．０ｍｏｌ／ｌの範囲である。
【０１８５】
ＭがＨ２Ｎ−であり、架橋性化合物とＨＡＳとの反応が還元的アミノ化条件下で実施される上述の好ましい実施形態により、架橋性化合物：ＨＡＳのモル比は、好ましくは１：１〜１００：１、さらに好ましくは２：１〜８０：１、さらに好ましくは３：１〜７０：１、さらに好ましくは４：１〜６０：１、およびさらに好ましくは５：１〜５０：１の範囲である。
【０１８６】
ＭがＨ２Ｎ−であり、架橋性化合物とＨＡＳとの反応が還元的アミノ化条件下で実施される上述の好ましい実施形態により、水性系のＨＡＳ、好ましくはＨＥＳの濃度は、それぞれの場合で反応溶液の重量に関連して、好ましくは１〜５０重量％、さらに好ましくは３〜４５重量％、およびさらに好ましくは５〜４０重量％の範囲である。
【０１８７】
架橋性化合物が、好ましい実施形態により、アミノ基ＭとしてＨ２Ｎ−Ｏ−またはＨ２Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−を有する非酸化形の還元末端を有するＨＡＳとの反応に使用される場合、ＨＡＳ誘導体は、開始物質として利用されるＨＡＳおよび架橋性化合物が−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−結合または−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−結合を介して結合され、得られたＨＡＳ誘導体がアセタールまたはケト基Ａをさらに含有する、本発明のステップ（ｉ）によって得られる。反応が好適な還元剤の存在下にて還元条件下で実施される場合、ＨＡＳ誘導体は、開始物質として利用されるＨＡＳおよび架橋性化合物が−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−結合または−ＣＨ２−ＮＨ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−結合を介して結合される本発明のステップ（ｉ）によって得られ、得られたＨＡＳ誘導体がアセタールまたはケト基Ａをさらに含有する。
【０１８８】
したがって本発明は、ステップ（ｉ）において、ＨＡＳが好ましくは水性系において、その非酸化還元末端を介して架橋性化合物のＨ２Ｎ−Ｏ−またはＨ２Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−であるアミノ基Ｍと反応して、反応が４．５〜６．５の範囲のｐＨにて５〜８０℃の範囲の温度で実施され、Ｘが−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−または−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−である、上述の方法にも関する。
【０１８９】
さらに本発明は、ステップ（ｉ）において、反応が還元剤、例えば水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、有機ボラン錯体、例えば４−（ジメチルアミン）ピリジンボラン錯体、Ｎ−エチルジイソプロピルアミンボラン錯体、Ｎ−エチルモルホリンボラン錯体、Ｎ−メチルモルホリンボラン錯体、Ｎ−フェニルモルホリンボラン錯体、ルチジンボラン錯体、トリエチルアミンボラン錯体、またはトリメチルアミンボラン錯体、好ましくはＮａＣＮＢＨ３の存在下で実施されてＨＡＳ誘導体が得られ、Ｘが−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−または−ＣＨ２−ＮＨ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−である、上述の方法にも関する。
【０１９０】
本発明の本反応に使用するこれらの還元剤の濃度は、それぞれの場合で反応溶液の体積に関連して、好ましくは０．００１〜２．０ｍｏｌ／ｌの範囲、さらに好ましくは０．０１〜１．０ｍｏｌ／ｌの範囲、およびさらに好ましくは０．１〜０．８ｍｏｌ／ｌの範囲である。
【０１９１】
ＭがＨ２Ｎ−Ｏ−またはＨ２Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−であり、架橋性化合物とＨＡＳとの反応が還元条件下で実施される上述の好ましい実施形態により、架橋性化合物：ＨＡＳのモル比は、好ましくは１：１〜１００：１、さらに好ましくは２：１〜８０：１、さらに好ましくは３：１〜７０：１、さらに好ましくは４：１〜６０：１、およびさらに好ましくは５：１〜５０：１の範囲である。
【０１９２】
ＭがＨ２Ｎ−であり、架橋性化合物とＨＡＳとの反応が還元的アミノ化条件下で実施される上述の好ましい実施形態により、水性系のＨＡＳ、好ましくはＨＥＳの濃度は、それぞれの場合で反応溶液の重量に関連して、好ましくは１〜５０重量％、さらに好ましくは３〜４５重量％、およびさらに好ましくは５〜４０重量％の範囲である。
【０１９３】
したがって本発明は、上述の方法によって得られるまたは得たＨＡＳ誘導体にも関する。
【０１９４】
さらに、本発明は、例えば以下の構造式
【化１４４】
0005486507.tif 000149
（反応条件および／もしくは架橋性化合物の詳細な化学的性質に応じて、Ｃ−Ｎ二重結合は、ＥもしくはＺ立体配座で存在し得て、そこではある平衡分布を有する両方の形の混合物も存在し得る）、
または、本発明の目的のために上の開構造と同一と見なされ得る、対応する環状の構造式
【化１４５】
0005486507.tif 000150
（反応条件および／もしくは架橋性化合物の詳細な化学的性質に応じて、これらのＨＡＳ誘導体は、エクアトリアル位もしくはアキシアル位のＮ原子と共に存在し得て、そこではある平衡分布を有する両方の形の混合物がまた存在し得る）
【化１４６】
0005486507.tif 000151
または
【化１４７】
0005486507.tif 000152
または対応する環状の構造式
【化１４８】
0005486507.tif 000153
または
【化１４９】
0005486507.tif 000154
または
【化１５０】
0005486507.tif 000155
または対応する環状の構造式
【化１５１】
0005486507.tif 000156
または
【化１５２】
0005486507.tif 000157
を有するＨＡＳ誘導体にも関する。
【０１９５】
上述の好ましい架橋性化合物に従って、以下のＨＡＳ誘導体は、一例として好ましい実施形態として挙げられ、それぞれの場合において、ＨＡＳが−本発明の好ましい実施形態により−ＨＥＳであり、
【化１５３】
0005486507.tif 000158
ここで対応する環状の構造式、すなわち
【化１５４】
0005486507.tif 000159
または
【化１５５】
0005486507.tif 000160
が含まれ、
ここで、対応する環状の構造式、すなわち
【化１５６】
0005486507.tif 000161
または
【化１５７】
0005486507.tif 000162
が含まれ、
ここで、対応する環状の構造式、すなわち
【化１５８】
0005486507.tif 000163
または
【化１５９】
0005486507.tif 000164
が含まれ、
ここで、対応する環状の構造式、すなわち
【化１６０】
0005486507.tif 000165
または
【化１６１】
0005486507.tif 000166
が含まれ、
ここで、対応する環状の構造式、すなわち
【化１６２】
0005486507.tif 000167
または
【化１６３】
0005486507.tif 000168
または
【化１６４】
0005486507.tif 000169
が含まれ、
ここで、対応する環状の構造式、すなわち
【化１６５】
0005486507.tif 000170
ここで、対応する環状の構造式、すなわち
【化１６６】
0005486507.tif 000171
または
【化１６７】
0005486507.tif 000172
が含まれ、
ここで、対応する環状の構造式、すなわち
【化１６８】
0005486507.tif 000173
または
【化１６９】
0005486507.tif 000174
が含まれ、
ここで、対応する環状の構造式、すなわち
【化１７０】
0005486507.tif 000175
または
【化１７１】
0005486507.tif 000176
が含まれ、
ここで、対応する環状の構造式、すなわち
【化１７２】
0005486507.tif 000177
または
【化１７３】
0005486507.tif 000178
が含まれ、
ここで、対応する環状の構造式、すなわち
【化１７４】
0005486507.tif 000179
または
【化１７５】
0005486507.tif 000180
が含まれ、
ここで、対応する環状の構造式、すなわち
【化１７６】
0005486507.tif 000181
または
【化１７７】
0005486507.tif 000182
が含まれ、
ここで、対応する環状の構造式も含まれ、または
【化１７８】
0005486507.tif 000183
または
【化１７９】
0005486507.tif 000184
ここで、対応する環状の構造式、すなわち
【化１８０】
0005486507.tif 000185
または
【化１８１】
0005486507.tif 000186
が含まれ、
ここで、対応する環状の構造式、すなわち
【化１８２】
0005486507.tif 000187
または
【化１８３】
0005486507.tif 000188
が含まれ、
ここで、対応する環状の構造式、すなわち
【化１８４】
0005486507.tif 000189
が含まれる。
【０１９６】
（ａ２）、（ａ４）、（ａ１１）、（ａ１２）、（ａ１４）、（ａ１６）、および（ａ１８）の構造からなる群より選択される架橋性化合物に基づくＨＡＳ誘導体がさらに好ましい。なおさらに好ましいのは、（ａ２）、（ａ１１）、（ａ１２）、（ａ１４）、（ａ１６）、および（ａ１８）の構造からなる群より選択される架橋性化合物に基づくＨＡＳ誘導体である。特に好ましいのは、（ａ２）、（ａ１１）、（ａ１２）、および（ａ１６）の構造からなる群より選択される架橋性化合物に基づくＨＡＳ誘導体である。
【０１９７】
特に好ましい実施形態により、本発明は、以下の構造式、
【化１８５】
0005486507.tif 000190
対応する環状の構造式
【化１８６】
0005486507.tif 000191
および／または
【化１８７】
0005486507.tif 000192
を有するＨＥＳ誘導体に関し、
さらに好ましくは、ＨＥＳは、約１〜約１０００ｋＤａ、さらに好ましくは約１〜約８００ｋＤａ、さらに好ましくは約１〜約５００ｋＤａ、さらに好ましくは約２〜約４００ｋＤａ、さらに好ましくは約５〜約３００ｋＤａ、さらに好ましくは約１０〜約２００ｋＤａ、特に約５０〜約１５０ｋＤａの平均分子量、０．１〜３の、好ましくは０．４〜１．３の、例えば０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、または１．３のモル置換、および２〜２０の範囲の、さらに好ましくは２〜１５の範囲の、およびなおさらに好ましくは３〜１２の範囲のＣ２：Ｃ６置換の比を有する。
【０１９８】
（ＨＡＳに関する他の考えられる実施形態）
完全を期すために、本発明により好ましくはないが、少なくとも２個のアルデヒド基が以下の式によるＨＡＳに導入されるように、ＨＡＳが架橋性化合物との反応の前に酸化されることが考えられることに言及するものとする。
【化１８８】
0005486507.tif 000193
【０１９９】
一般に、ポリマーの少なくとも１個のサッカライド環を酸化して少なくとも１個の、好ましくは少なくとも２個のアルデヒド基を有するサッカライド開環を与えることができる、各酸化剤または酸化剤の組合せが利用され得る。本反応は、酸化されて２個のアルデヒド基を有する開環を与えるＨＡＳのサッカライド環を示す、以下の反応スキームによって例証され得る。
【化１８９】
0005486507.tif 000194
【０２００】
好適な酸化剤は特に、過ヨウ素酸塩、例えばアルカリ金属化ヨウ素酸塩またはその２つ以上の混合物であり、過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素酸カリウムが好ましい。これらのアルデヒド基は架橋性化合物Ｍ−Ｌ−Ａとアミノ基Ｍを介して反応できることが考えられる。
【０２０１】
（単離および／または精製）
一般に、本発明のステップ（ｉ）からのＨＡＳ誘導体は続いて、以下に記載するように反応する。好ましい実施形態により、ステップ（ｉ）からのＨＡＳ誘導体は、反応ステップ（ｉ）の後に好適に精製される。
【０２０２】
ステップ（ｉ）からのＨＡＳ誘導体の精製のために、一例として以下の可能性Ａ）〜Ｃ）を挙げることが可能であり、ここでは可能性Ａ）が好ましい。
Ａ）水または好ましくは０．１〜１００ｍｍｏｌ／ｌの、さらに好ましくは１〜５０ｍｍｏｌ／ｌおよびさらに好ましくは５〜２０ｍｍｏｌ／ｌの、例えば約１０ｍｍｏｌ／ｍｌの濃度、好ましくは２〜１０の、さらに好ましくは４〜１０の、さらに好ましくは６〜１０およびさらに好ましくは８〜１０の範囲、例えば約９のｐＨを有する緩衝水溶液を使用する限外濾過、交換サイクルの回数は、好ましくは１０〜５０、さらに好ましくは１０〜４０およびなおさらに好ましくは１０〜３０、例えば約２０である。
Ｂ）水または好ましくは０．１〜１００ｍｍｏｌ／ｌの、さらに好ましくは１〜５０ｍｍｏｌ／ｌおよびさらに好ましくは５〜２０ｍｍｏｌ／ｌの、例えば約１０ｍｍｏｌ／ｍｌの濃度、２〜１０、さらに好ましくは４〜１０の、さらに好ましくは６〜１０およびさらに好ましくは７〜９の好ましい範囲のｐＨを有する緩衝水溶液を使用する透析、ここで５〜２０重量％の好ましい濃度でＨＡＳ誘導体を含有する溶液が利用され；ならびにここで緩衝剤または水は、ＨＥＳ誘導体溶液に対して特に約１００：１の過剰量で使用される。
Ｃ）エタノールまたはイソプロパノールによる沈殿、遠心分離および約１０重量％の好ましい濃度を有する溶液を得るための水への再溶解、ならびに水または好ましくは０．１〜１００ｍｍｏｌ／ｌの、さらに好ましくは１〜５０ｍｍｏｌ／ｌおよびなおさらに好ましくは５〜２０ｍｍｏｌ／ｌの、例えば約１０ｍｍｏｌ／ｍｌの濃度、２〜１０の、さらに好ましくは４〜１０の、さらに好ましくは６〜１０およびさらに好ましくは７〜９の好ましい範囲のｐＨを有する緩衝水溶液を使用する、続いての限外濾過、交換サイクルの回数は、好ましくは１０〜４０、さらに好ましくは１０〜３０およびなおさらに好ましくは１０〜２０、例えば１０である。
【０２０３】
好ましい精製ステップの後、ＨＡＳ誘導体は好ましくは固体として得られる。本発明のさらに考えられる実施形態により、２〜４０重量％の好ましいＨＡＳ誘導体含有率を有するＨＡＳ誘導体溶液または凍結ＨＡＳ誘導体溶液が挙げられ、ここでこれらの溶液のｐＨは、好ましくは３〜１０の範囲であり、使用した緩衝液の濃度は、好ましくは０．１〜１ｍｏｌ／ｌの範囲である。
【０２０４】
したがって本発明は、（ｉ）の後に、（ｉ）で得たＨＡＳ誘導体を、水または０．１〜１００ｍｍｏｌ／ｌの濃度、２〜１０の範囲のｐＨを有する緩衝水溶液を使用する限外濾過を使用して精製し、交換サイクルの回数が１０〜５０である、上述の方法にも関する。
【０２０５】
（生物活性剤ＢＡとの反応）
さらなる好ましい実施形態により、本発明は、上述のＨＥＳ誘導体
【化１９０】
0005486507.tif 000195
が生物活性化合物ＢＡとアセタールまたはケタール基Ａを介してさらに好適に反応して、Ａ基がＢＡとの反応の前に対応するアルデヒドまたはケト基に好ましくは変換される、方法に関する。
【０２０６】
最も好ましくは、Ａ基、好ましくは対応するアルデヒドまたはケト基は、ＢＡに含まれるアミノ基と、なおさらに好ましくは１級アミノ基と反応する。このような場合に、および本発明の目的のために、ＢＡは、ＢＡ’がＢＡの残部である、Ｈ２Ｎ−ＢＡ’としても表される。
【０２０７】
したがって、本発明は、さらに
（ｉｉ）式（ＩＩＩ）によるＨＡＳ誘導体を生物活性剤Ｈ２Ｎ−ＢＡ’のアミノ基と、Ａ基を介して還元的アミノ化によって反応させて、式（ＩＶ）
【化１９１】
0005486507.tif 000196
（ＩＶ）
によるＨＡＳ誘導体を得るステップをさらに含む上述した方法にも関する。
【０２０８】
本発明の第１の実施形態により、好ましくは精製された（ｉ）から得たＨＡＳ誘導体は、Ａ基の対応するアルデヒドまたはケト基への変換を好適に受け、この変換では得られたＨＡＳ誘導体がＢＡとの反応の前に好適な精製および／または単離ステップを受ける。アルデヒドまたはケト基への変換は好ましくは、酸触媒加水分解反応によって実施される。反応は、好ましくは０〜１００℃の、さらに好ましくは１０〜８０℃の、およびさらに好ましくは２０〜６０℃の温度にて、好ましくは１〜６の、さらに好ましくは１〜５の、さらに好ましくは１〜４の、さらに好ましくは１〜３の、およびなおさらに好ましくは１〜３未満の範囲であるｐＨで実施される。加水分解反応生成物の精製および緩衝液交換は、当業者に周知の方法によって、例えば透析または限外濾過によって達成することができる。変換された物質は、例えば凍結乾燥によって溶液から固体として回収することができる。
【０２０９】
本発明の第２の実施形態により、好ましくは精製された（ｉ）から得たＨＡＳ誘導体は、Ａ基の対応するアルデヒドまたはケト基への変換を好適に受け、この変換では得られたＨＡＳ誘導体が直接、すなわちアルデヒドまたはケト基を含むＨＡＳ誘導体の独立した好適な精製および／または単離ステップなしで、ＢＡと反応する。アルデヒドまたはケト基への変換は好ましくは、酸触媒加水分解反応によって実施される。反応は、好ましくは０〜１００℃の、さらに好ましくは１０〜８０℃の、およびさらに好ましくは２０〜６０℃の温度にて、好ましくは１〜６の、さらに好ましくは１〜５の、さらに好ましくは１〜４の、さらに好ましくは１〜３の、およびなおさらに好ましくは１〜３未満の範囲であるｐＨで実施される。．加水分解反応生成物は、直接またはＢＡとの反応に適合する値にｐＨを調整した後のどちらかに、緩衝溶液中でＢＡと化合することができる。
【０２１０】
したがって、本発明は、（ｉｉ）の前に、式（ＩＩＩ）によるＨＡＳ誘導体のＡ基を対応するアルデヒドまたはケト基に変換する、上述した方法にも関する。
【０２１１】
本発明の第３の考えられる実施形態により、好ましくは精製された、（ｉ）から得たＨＡＳ誘導体は、ＢＡと直接反応する、すなわち独立した好適な精製および／または単離ステップなしで、ならびにＡ基の対応するアルデヒドまたはケト基への変換の独立したステップなしで、Ａ基の対応するアルデヒドまたはケト基へのｉｎ  ｓｉｔｕ変換を可能にする反応条件下で、ＢＡと反応する。アルデヒドまたはケト基への変換は好ましくは、酸触媒加水分解反応によって実施される。反応は、好ましくは０〜１００℃の、さらに好ましくは１０〜８０℃の、およびさらに好ましくは２０〜６０℃の温度にて、好ましくは１〜６の、さらに好ましくは１〜５の、さらに好ましくは１〜４の、さらに好ましくは１〜３の、およびなおさらに好ましくは１〜３未満の範囲であるｐＨで実施される。．加水分解反応生成物は、直接またはＢＡとの反応に適合する値にｐＨを調整した後のどちらかに、緩衝溶液中でＢＡと化合することができる。
【０２１２】
上述の３つの実施形態による方法のどれを実施するかは、例えば利用する生物活性物質ＢＡの詳細な性質に依存する。例えばＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦまたはＩＦＮαなどのタンパク質がＢＡとして利用される場合、上述の第１または第２の実施形態が一般に好適である。
【０２１３】
ステップ（ｉｉ）の反応は、好ましくは水性系で実施される。「水性系」という用語は、本発明の明細書で使用するように、溶媒または含まれる溶媒の重量に基づいて少なくとも１０重量％から、好ましくは少なくとも５０重量％、さらに好ましくは少なくとも８０重量％、なおさらに好ましくは少なくとも９０重量％または最大１００重量％までの範囲で水を含む溶媒の混合物を指す。さらなる溶媒として、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、エタノールまたはメタノールなどの溶媒が挙げられる。
【０２１４】
式（ＩＶ）、すなわち
【化１９２】
0005486507.tif 000197
（ＩＶ）
によるＨＡＳ誘導体の非還元形を得るための条件下で、ステップ（ｉｉ）［ＲＳ３］の反応を実施することが考えられるが、少なくとも１つの好適な還元剤の存在下にて、還元的アミノ化条件下でステップ（ｉｉ）による反応を実施することが特に好ましい。特にこれらの条件下で、ＨＡＳ誘導体のＡ基およびＢＡのＨ２Ｎ基から生じるアルデヒド基またはケト基の反応によって得た基−ＣＨ＝Ｎ−は、−ＣＨ２−ＮＨ−に還元される。
【０２１５】
一例として、以下の還元剤：ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、有機ボラン錯体、４−（ジメチルアミン）ピリジンボラン錯体、Ｎ−エチルジイソプロピルアミンボラン錯体、Ｎ−エチルモルホリンボラン錯体、Ｎ−メチルモルホリンボラン錯体、Ｎ−フェニルモルホリンボラン錯体、ルチジンボラン錯体、トリエチルアミンボラン錯体、またはトリメチルアミンボラン錯体が利用され得る。ＮａＢＨ４およびＮａＣＮＢＨ３が好ましく、ＮａＣＮＢＨ３が特に好ましい。
【０２１６】
一実施形態において、ＨＡＳ誘導体は生物活性剤を含有する水溶液に添加される。好ましくは、続いて少なくとも１つの還元剤、特にＮａＣＮＢＨ３が添加される。
【０２１７】
他の実施形態において、ＨＡＳ誘導体は場合により水溶液中に添加され、次にＢＡが添加される。好ましくは、続いて少なくとも１つの還元剤、特にＮａＣＮＢＨ３が添加される。
【０２１８】
ステップ（ｉｉ）におけるＨＡＳ誘導体と生物活性化合物ＢＡのアミノ基とのの反応は、３〜９の、好ましくは３〜８の、さらに好ましくは３〜７の、さらに好ましくは３〜７以下のｐＨ値にて、例えば３または４または５または６にて好ましくは実施される。反応混合物の好適なｐＨ値は、少なくとも１つの好適な緩衝剤を添加することによって調整され得る。好ましい緩衝剤剤のうちで、酢酸塩緩衝剤、好ましくは酢酸ナトリウム緩衝剤、リン酸塩またはホウ酸塩緩衝剤が挙げられる。
【０２１９】
ステップ（ｉｉ）における、ステップｂ）で得たＨＡＳ誘導体の生物活性化合物ＢＡのアミノ基との反応は、−１０〜１００℃の、好ましくは０〜５０℃の、さらに好ましくは０〜３７℃の、さらに好ましくは０〜２５℃の、例えば０、５、１０、１５、２０、または２５℃の温度にて好ましくは実施される。
【０２２０】
ステップ（ｉｉ）の反応時間は、温度、ＨＡＳ、特にＨＥＳ誘導体および化合物ＢＡの比ならびにＨＡＳ誘導体および化合物ＢＡの絶対濃度に依存する。一般に、５分間〜７日間、好ましくは１時間〜７日間の反応時間が考えられる。
【０２２１】
ステップ（ｉｉ）における得られたＨＡＳ誘導体の化合物ＢＡに対するモル比は、ＨＡＳ誘導体の数平均分子量（Ｍｎ）に基づいて、好ましくは０：１〜２００：１〜２００：１当量、なおさらに好ましくは１：１〜１００：１である。好ましくは、モル比は１：１〜５０：１である。ＢＡがタンパク質、特にＩＦＮαである場合には、低いモル比、例えば５０：１以下、好ましくは１：１〜２０：１、さらに好ましくは１：１〜１０：１、およびなおさらに好ましくは２：１〜９：１、さらに好ましくは３：１〜８：１およびなおさらに好ましくは４：１〜７：１のモル比が考えられる。
【０２２２】
詳細な好ましい実施形態において、ステップ（ｉｉ）で使用するＨＡＳ誘導体の濃度は、それぞれの場合で（ｉｉ）の反応溶液の重量に対して、約１０重量％より高く、特に約１５重量％よりも高い。
【０２２３】
したがって本発明は、（ｉｉ）において、反応が好ましくは水性系にて、還元剤、好ましくはＮａＣＮＢＨ３の存在下で、０〜３７℃の、好ましくは０〜２５℃の範囲の温度および３〜９の、好ましくは３〜７以下の範囲のｐＨにて実施され、（ｉｉ）において、ＨＡＳ誘導体の生物活性剤ＢＡに対するモル比が、ＨＡＳ誘導体の数平均分子量（Ｍｎ）に基づいて、０．１：１〜２００：１当量、好ましくは１：１〜５０：１当量である、上述した方法にも関する。
【０２２４】
（ｉｉ）を行った溶液、好ましくは水溶液のＢＡの好ましい濃度、例えば好ましいタンパク質濃度は、０．１〜１０ｇ／ｌの、さらに好ましくは１〜９ｇ／ｌの範囲である。（ｉｉ）の前の、（ｗ／ｖ）で示した該溶液中のＨＡＳ誘導体の濃度は、好ましくは０．１〜５０％の、さらに好ましくは０．５〜４５％およびさらに好ましくは１〜４０％の範囲である。
【０２２５】
考えられる実施形態により、生物活性剤ＢＡは、水性媒体に、好ましくは緩衝水溶液に、特に酢酸ナトリウム緩衝溶液に溶解され得る。水溶液はさらに添加剤、例えば、特にＳＤＳ、Ｃｈａｐｓ、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００からなる群より選択される洗剤および／または分散剤などの添加剤を含有することができる。洗剤および／または分散剤を使用する場合、それは水溶液の総重量に基づいて、０．００５〜３重量％の、好ましくは０．０５〜３重量％の、好ましくは約０．５重量％の量で好ましくは存在する。
【０２２６】
本発明により少なくとも１つの還元剤が利用され、ＢＡとの反応に利用されるＨＡＳ誘導体中に存在するＸが例えば−ＣＨ＝Ｎ−である場合、−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−、または−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−は、（ｉｉ）の反応に使用する還元的アミノ化条件下で好ましくは還元されて、−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−、または−ＣＨ２−ＮＨ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−である官能基Ｘを生じる。
【０２２７】
本発明はしたがって、上述のような方法によって、特に（ｉｉ）において、反応が好ましくは水性系にて、還元剤、好ましくはＮａＣＮＢＨ３の存在下で、０〜３７℃の、好ましくは０〜２５℃の範囲の温度および３〜９の、さらに好ましくは３〜７の、好ましくは３〜７以下の範囲のｐＨにて実施され、（ｉｉ）において、ＨＡＳ誘導体の生物活性剤ＢＡに対するモル比が、ステップ（ｉｉ）で利用したＨＡＳ誘導体の数平均分子量（Ｍｎ）に基づいて、０．１：１〜２００：１当量、好ましくは１：１〜１０：１当量であり、それぞれの場合でＸがアミド基でないという条件である、上述のような方法によって得たまたは得られるＨＡＳ誘導体に関する。ＨＡＳ誘導体の生物活性剤ＢＡに対する特に好ましいモル比は１０以下、例えば１：１〜９：１、さらに好ましくは１：１〜８：１、さらに好ましくは１：１〜７：１、さらに好ましくは１：１〜６：１およびなおさらに好ましくは１：１〜５：１、例えば約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、または約５：１である。５０：１以下の、さらに好ましくは１０：１以下のモル比などのこのように低いモル比はいくつかの生物活性剤で考えられるが、そえらは例えばタンパク質で好ましく、ここでＩＦＮαが特に好ましい。例えばＧ−ＣＳＦおよびＥＰＯに関する限り、５０：１以下、例えば１：１〜５０：１のモル比が好ましい。一般に、一例として、１：１〜５０：１または２：１〜４０：１または３：１〜３０：１または４：１〜２０：１または５：１〜１５：１の範囲のモル比が挙げられる。
【０２２８】
この場合、タンパク質は本発明による生物活性剤ＢＡとして、特に上に示した好ましいｐＨ範囲にて、特に７以下および３以上のｐＨにて利用されて、ＨＡＳ誘導体をタンパク質のＮ末端に位置するアミノ基と主に反応する。「主に」という用語は、本発明の状況で使用するように、利用可能なＮ末端アミノ基の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％が還元的アミノ化を介して反応する実施形態に関する。利用可能なＮ末端アミノ基の少なくとも９０％または少なくとも９５％または少なくとも９６％または少なくとも９７％または少なくとも９８％または少なくとも９９％を反応させることも可能である。Ｎ末端アミノ基以外のアミノ基への結合は完全に排除できないが、７以下のｐＨでの本発明による還元的アミノ化を介した結合は、Ｎ末端アミノ基にて本質的に選択的に発生する。特に、これらの反応条件は、これらの条件にて安定であるタンパク質で好ましい。タンパク質が例えば酸に不安定である、例えばα１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）である場合、ここで適切な反応条件、特に７．５以下〜５超のｐＨを選択することが好ましい。
【０２２９】
したがって、本発明は、ＢＡ’を含むＨＡＳ誘導体の調製方法、このような方法によって得られるまたは得たＨＡＳ誘導体、および上述した、式（ＩＶ）によるＨＡＳ誘導体にも関し、ここでタンパク質はＮ末端アミノ基および少なくとも１個のさらなるアミノ基を含み、該ＨＡＳ誘導体は主にＮ末端アミノ基に結合するＨＡＳを含む。
【０２３０】
したがって、本発明は式（ＩＶ）
【化１９３】
0005486507.tif 000198
（ＩＶ）
による、ＨＡＳ誘導体にも関する。
【０２３１】
さらに、本発明は、式（ＩＶ）
【化１９４】
0005486507.tif 000199
（ＩＶ）
のヒドロキシアルキルデンプン誘導体にも関し、
式中、Ｘは、式（ＩＩ）
Ｍ−Ｌ−Ａ（ＩＩ）
の架橋性化合物のアミノ基Ｍ（式中、Ｘは、アミド基−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ではない）の、式（Ｉ）
【化１９５】
0005486507.tif 000200
のヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）との、ＨＡＳの炭素原子Ｃ＊を介した反応から生じる官能基であり、式中、Ｃ＊は、ＨＡＳのＭとの反応の前に場合により酸化され、最も好ましくは酸化されない。
式中、ＨＡＳ’は、ヒドロキシアルキルデンプン分子の残部であり、ならびにＲ１、Ｒ２およびＲ３は独立して、水素または直鎖もしくは分枝ヒドロキシアルキル基であり、
式中、Ａは、式（ＩＩａ）
【化１９６】
0005486507.tif 000201
による残基であり、
式中、
Ｚ１およびＺ２はそれぞれ独立して、ＯまたはＳまたはＮＲｘ、好ましくはＯであり、ここでＲｘは、Ｈまたは低級アルキル、例えばメチル、エチル、またはプロピル、例えばｎ−プロピルもしくはｉ−プロピル、またはＣ（Ｏ）−Ｒｙであり、ここでＲｙは、好ましくはＣ１−Ｃ６アルキルおよびＣ６−Ｃ１４アリールからなる群よりは選択され、なおさらに好ましくは場合により置換された、好ましくは非置換であるメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、およびｔｅｒｔ−ブチルからなる群より選択され；Ｒｘは好ましくはＨである。
Ａ１およびＡ２はそれぞれ独立して、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ベンジル、１，１，１−トリクロロエチル、ニトロベンジル、メトキシベンジル、エトキシベンジルであり、または式（ＩＩｂ）
【化１９７】
0005486507.tif 000202
による環を形成し、
式中、Ａ１およびＡ２はひとまとめにされて、−（ＣＨ２）２−または−（ＣＨ２）３−または−（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３））−であり、ならびに
式中、Ａ３は、Ｈもしくはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ペンチル、ベンジルであり、またはアミノ基ＭのＮ原子もしくはＬに含まれる好適な原子と共に環を形成し、Ａ３は好ましくはＨである。
および式中、Ｌは、ＭおよびＡを架橋するスペーサであり、
式中、ＢＡ’は、ＢＡのアミノ基の、還元的アミノ基を介したＡとの、またはＡに対応するアルデヒド基またはケト基との反応後に残存する、生物活性剤ＢＡ’−ＮＨ２の残部である。
【０２３２】
ＨＡＳ、好ましくはＨＥＳ、および架橋性化合物に関する好ましい実施形態に関しては、上の各開示を参照されたい。
【０２３３】
式（ＩＶ）のＨＡＳ誘導体に関する限り、Ｘは、−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−、および−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−、さらに好ましくは−ＣＨ２−ＮＨ−および−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−、最も好ましくは−ＣＨ２−ＮＨ−からなる群より好ましくは選択される。
【０２３４】
さらに式（ＩＶ）のＨＡＳ誘導体に関する限り、ＭおよびＡを架橋するＬは、式（ＩＩｄ）による少なくとも１個の構造単位を含む、好ましくは式（ＩＩｄ）による構造単位からなるスペーサであり
【化１９８】
0005486507.tif 000203
式中、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、Ｈまたはアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アルキルアリール、置換アルキルアリール、および残基−Ｏ−Ｒ”（ここでＲ”は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アルキルアリール、置換アルキルアリールからなる群より選択され）からなる群より選択される有機残基、好ましくはＨまたはアルキルおよび置換アルキルからなる群より選択される有機残基、さらに好ましくはＨまたはアルキル、さらに好ましくはＨであり、
式中、ｎは、１〜２０の、好ましくは１〜１０の、さらに好ましくは１〜６の、さらに好ましくは１〜４の、さらに好ましくは２の整数である。
【０２３５】
「生物活性物質」（ＢＡ）という用語は、本発明の状況で使用するように、これに限定されるわけではないが、ウイルス、細菌、真菌、植物、動物、およびヒトを含む生物の任意の物理的または生化学的特性に影響を及ぼすことができる物質に関する。特に、「生物活性物質」という用語は、本発明の状況で使用するように、ヒトもしくは動物における疾患の診断、治癒、軽減、処置、もしくは予防を目的とした、またはそうでなければヒトまたは動物の身体的または精神的健康を増進する物質に関する。活性物質の例は、これに限定されるわけではないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、小型分子薬、染料、脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、例えば５’−アミノヘキシルスペーサなどの好適なスペーサを有するオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子、およびミセルを含む。好ましくは、本発明による生物活性物質は未変性アミノ基を含有する。
【０２３６】
タンパク質の例は、これに限定されるわけではないが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、例えば組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）またはＥＰＯミメティック、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば組換えヒトＧ−ＣＳＦ（ｒｈＧ−ＣＳＦ）などのＧ−ＣＳＦ、α−インターフェロン（ＩＦＮα）、β−インターフェロン（ＩＦＮβ）またはガンマ−インターフェロン（ＩＦＮガンマ）、例えば組換えヒトＩＦＮαまたはＩＦＮβ（ｒｈＩＦＮαまたはｒｈＩＦＮβ）などのＩＦＮαおよびＩＦＮβ、インターロイキン、例えばＩＬ−１〜ＩＬ−３４、例えば組換えヒトＩＬ−２またはＩＬ−３（ｒｈＩＬ−２またはｒｈＩＬ−３）などのＩＬ−２またはＩＬ−３またはＩＬ−１１、血清タンパク質、例えば第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＩＩ因子、第ＩＩＩ因子、第ＩＶ因子、第Ｖ因子、第ＶＩ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子などの凝固第ＩＩ〜ＸＩＩＩ因子、セリンプロテアーゼ阻害因子、例えばα１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）、活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）、プラスミノゲン活性化因子、例えば組織型プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）、例えばヒト組織プラスミノゲン活性化因子（ｈＴＰＡ）、ＡＴ  ＩＩＩ、例えば組換えヒトＡＴ  ＩＩＩ（ｒｈＡＴ  ＩＩＩ）、ミオグロブリン、アルブミン、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、増殖因子、例えば上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板増殖因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、脳由来増殖因子（ＢＤＧＦ）、神経増殖因子、（ＮＧＦ）、Ｂ細胞増殖因子（ＢＣＧＦ）、脳由来神経栄養増殖因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、トランスフォーミング増殖因子、例えばＴＧＦαまたはＴＧＦβ、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）、成長ホルモン、例えば組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）などのヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦαまたはＴＮＦβ、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、ヘモグロビン、ホルモンまたはプロホルモン、例えばインスリン、ゴナドトロピン、メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、トリプトレリン、視床下部ホルモン、例えば抗利尿ホルモン（ＡＤＨおよびオキシトシンはもちろんのこと、放出ホルモンおよび放出抑制ホルモン、副甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモン、例えばチロキシン、甲状腺刺激ホルモン、チロリベリン、カルシトニン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２など）、エクセンジン、例えばエクセンジン−４、レプチン、例えば組換えヒトレプチン（ｒｈレプチン）、ケンプチド（Ｔｒｐ４−ケンプチド）、バソプレシン、ガストリン、セクレチン、インテグリン、糖タンパク質ホルモン（例えばＬＨ、ＦＳＨなど）、メラノシド刺激ホルモン、リポタンパク質およびアポリポタンパク質、例えばａｐｏ−Ｂ、ａｐｏ−Ｅ、ａｐｏ−Ｌａ、免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびその断片、例えばヒト免疫グロブリンＧ分子に由来するＦａｂ断片（ｈＦａｂ）、マウス免疫グロブリンＧ（ｍＩｇＧ）、ヒルジン、組織経路阻害因子、植物タンパク質、例えばレクチンまたはリシン、ハチ毒、ヘビ毒、イムノトキシン、抗原Ｅ、αプロテイナーゼ阻害因��、ブタクサアレルゲン、メラニン、オリゴリジンタンパク質、ＲＧＤタンパク質またはこれらのタンパク質の１つの場合により対応する受容体；プロラクチンまたはそのミュータント、例えば１２９位の野生型アミノ酸がアルギニンに置換によってされたＧ１２９Ｒ（このミュータントの商標名は「ＬａｃｔｏＶｅｒｔ」である）ならびにこれらのタンパク質または受容体のいずれかの機能性誘導体または断片を含む。
【０２３７】
ポリペプチドは、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、例えば組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば組換えヒトＧ−ＣＳＦ（ｒｈＧ−ＣＳＦ）などのＧ−ＣＳＦ、インターフェロン（ＩＮＦ）、例えば組換えヒトＩＦＮα（ｒｈＩＦＮα）または組換えヒトＩＦＮβ（ｒｈＩＦＮβ）などのＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮガンマ、第ＶＩＩ因子、例えば組換えヒト第ＶＩＩａ因子（ｒｈＦＶＩＩａ）、第ＩＸ因子、例えば組換えヒト第ＩＸ因子（ｒｈＦＩＸ）、成長ホルモン（ＧＨ、例えば組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、Ｆａｂ断片、例えばヒト免疫グロブリンＧ分子に由来するＦａｂ断片（ｈＦａｂ）、免疫グロブリンＧ、例えばマウス免疫グロブリンＧ（ｍＩｇＧ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、アスパラギナーゼ、例えば組換えアスパラギナーゼ（ｒアスパラギナーゼ）、レプチン、例えば組換えヒトレプチン（ｒｈレプチン）、インターロイキン−２、インターロイキン−１１、α−１−アンチトリプシン、抗体、または抗体断片、および他のタンパク質骨格からなる群より好ましくは選択される。
【０２３８】
さらに好ましくは、ポリペプチドは、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、例えば組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば組換えヒトＧ−ＣＳＦ（ｒｈＧ−ＣＳＦ）などのＧ−ＣＳＦ、インターフェロン（ＩＮＦ）、例えば組換えヒトＩＦＮα（ｒｈＩＦＮα）または組換えヒトＩＦＮβ（ｒｈＩＦＮβ）などのＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮガンマ、第ＶＩＩ因子、例えば組換えヒト第ＶＩＩａ因子（ｒｈＦＶＩＩａ）、第ＩＸ因子、例えば組換えヒト第ＩＸ因子（ｒｈＦＩＸ）、成長ホルモン（ＧＨ、例えば組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、Ｆａｂ断片、例えばヒト免疫グロブリンＧ分子に由来するＦａｂ断片（ｈＦａｂ）、免疫グロブリンＧ、例えばマウス免疫グロブリンＧ（ｍＩｇＧ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、アスパラギナーゼ、例えば組換えアスパラギナーゼ（ｒＡｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、レプチン、例えば組換えヒトレプチン（ｒｈＬｅｐｔｉｎ）、インターロイキン−２、インターロイキン−１１、およびα−１−アンチトリプシンからなる群より選択される。
【０２３９】
活性物質は、抗生物質、抗うつ薬、抗糖尿病薬、抗利尿薬、抗コリン作用薬、抗不整脈薬、制吐薬、鎮咳薬、抗てんかん薬、抗ヒスタミン薬、抗真菌薬、抗交感神経緊張薬、抗血栓薬、アンドロゲン、抗アンドロゲン、エストロゲン、抗エストロゲン、抗骨粗鬆症薬、抗腫瘍剤、血管拡張薬、他の降圧剤、解熱剤、鎮痛薬、抗炎症剤、β遮断薬、免疫抑制薬およびビタミンからなる群より好ましくは選択される。
【０２４０】
活性物質のいくつかの追加の非制限的な例は、アレンドロネート、アミカシン、アテノロール、アザチオプリン、シメチジン、クロニジン、コシントロピン、シクロセリン、デスモプレシン、ジヒドロエルゴタミン、ドブタミン、ドーパミン、イプシロン−アミノカプロン酸、エルゴメトリン、エスモロール、ファモチジン、フレカイニド、葉酸、フルシトシン、フロセミド、ガンシクロビル、グルカゴン、ヒドラザリン、イソプロテレノール、ケタミン、ライオスロニン、ＬＨＲＨ、メルパトリシン、メチルドパ、メトプロロール、ネオマイシン、ニモジピン、ナイスタチン、オキシトシン、フェントラミン、フェニレフリン、プロカインアミド、プロカイン、プロプラノロール、リトドリン、ソタロール、テルブタリン、チアミン、チルドロネート、トラゾリン、トリメトプリム、トロメタミン、バソプレシン。アミフォスチン、アミオダロン、アミノカプロン酸、パラアミノ馬尿酸ナトリウム、アミノグルテチミド、アミノレブリン酸、アミノサリチル酸、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、アスパラギナーゼ（例えばＥ．ｃｏｌｉからの例えば組換えアスパラギナーゼ（ｒＡｓｐａｒａｇｉｎａｅ））、アントラサイクリン、ベキサロテン、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カベルゴリン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシン、シラスタチンナトリウム、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、カンプトセシン、１３−シスレチノイン酸、オールトランスレチノイン酸。ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デフェロキサミン、デキサメサゾン、ジクロフェナク、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フェキソフェナジン、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、エピネフリン、Ｌ−ドパ、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、イリノテカン、イトラコナゾール、ゴセレリン、レトロゾール、ロイコボリン、レバミソール、リシノプリル、ロボチロキシンナトリウム、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、重酒石酸メタラミノール、メトトレキセート、メトクロプラミド、メキシレチン、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ナロキソン、ニコチン、ニルタミド、オクトレオチド、オキサリプラチン、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プレドニゾン、プロカルバジン、プロクロルペラジン、オンダンセトロン、ラルチトレキセド、シロリムス、ストレプトゾシン、タクロリムス、タモキシフェン、テモゾロマイド、テニポシド、テストステロン、テトラヒドロカンナビノール、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トレチノイン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ドラセトロン、グラニセトロン；フォルモテロール、フルチカゾン、ロイプロリド、ミダゾラム、アルプラゾラム、アンホテリシンＢ、ポドフィロトキシン、ヌクレオシド抗ウイルス薬、アロイルヒドラゾン、スマトリプタン。マクロリド、例えばエリスロマイシン、オレアンドマイシン、トロレアンドマイシン、ロキシスロマイシン、クラリスロマイシン、ダベルシン、アジスロマイシン、フロリスロマイシン、ジリスロマイシン、ジョサマイシン、スピロマイシン、ミデカマイシン、ロイコマイシン、ミオカマイシン、ロキタマイシン、アンダジスロマイシン、およびスウィノリドＡ。フルオロキノロン、例えばシプロフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、トロバフロキサシン、アラトロフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、エノキサシン、グレパフロキサシン、ガチフロキサシン、ロメフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、ペフロキサシン、アミフロキサシン、フレロキサシン、トスフロキサシン、プルリフロキサシン、イロキサシン、パズフロキサシン、クリナフロキサシンおよびサチフロキサシン。アミノグリコシド、例えばゲンタマイシン、ネチルミシン、パラメシン、トブラマイシン、アミカシン、カナマイシン、ネオマシイン、およびストレプトマイシン、バンコマイシン、テイコプラニン、ランポラニン、ミデプラニン、コリスチン、ダプトマイシン、グラミシジン、コリスチメテート。ポリミキシン、例えばポリミキシンＢ、カプレオマイシン、バシトラシン、ペネム；ペニシリンＧ、ペニシリンＶなどのペニシリナーゼ感受性因子を含むペニシリン；ペニシリナーゼ抵抗性因子、例えばメチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシン、フロキサシン、ナフシリン。グラム陰性微生物活性剤、例えばアンピシリン、アモキシシリン、およびヘタシリン、シリンおよびガラムピシリン。抗緑膿菌性ペニシリン、例えばカルベニシリン、チカルシリン、アズロシリン、メズロシリンおよびピペラシリン；セファロスポリン、例えばセフポドキシム、セフプロジル、セフトブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セファロシン、セファピリン、セファレキシン、セファラドリン、セフォキシチン、セファマンドール、セファゾリン、セファロリジン、セファクロール、セファドロキシル、セファログリシン、セフロキシム、セフォラミド、セフォタキシム、セファトリジン、セファセトリル、セフェピム、セフィキシム、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォテタン、セフィネタゾール、セフタジジム、ロラカルベフ、およびモキサラクタム、モノバクタム、例えばアズトレオナム。ならびにカルバペネム、例えばイミペネム、メロペネム、イセチオン酸ペンタミジン、硫酸アルブテロール、リドカイン、硫酸メタプロテレノール、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、トリアムシノロンアセタミド、ブデソニドアセトニド、フルチカゾン、臭化イプラトロピウム、フルニソリド、クロモリンナトリム、および酒石酸エルゴタミン。タキサン、例えばパクリタキセル。ＳＮ−３８、ならびにチルホスチンである。
【０２４１】
したがって、「小型分子」として当業者に公知の化学化合物も、本発明による生物活性物質と考えられる。「小型分子」という用語は、本発明の明細書で使用するように、タンパク質およびオリゴヌクレオチド以外の、しかし５０アミノ酸までのペプチドを含む、生物活性化学化合物に関する。このような小型分子の代表的な例を以下の段落に挙げる。
【０２４２】
オリゴヌクレオチドの例［ＴＨ６］は、アパタマーおよびｓｉＲＮＡである。ペプチド核酸（ＰＮＡ）も考えられる生物活性物質として挙げられる。
【０２４３】
したがって、本発明は、タンパク質がエリスロポエチン（ＥＰＯ）、例えば組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば組換えヒトＧ−ＣＳＦ（ｒｈＧ−ＣＳＦ）などのＧ−ＣＳＦ、インターフェロン（ＩＮＦ）、例えば組換えヒトＩＦＮα（ｒｈＩＦＮα）または組換えＩＦＮβ（ｒｈＩＦＮβ）などのＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮガンマ、第ＶＩＩ因子、例えば組換えヒト第ＶＩＩａ因子（ｒｈＦＶＩＩａ）、第ＩＸ因子、例えば組換えヒト第ＩＸ因子（ｒｈＦＩＸ）、成長ホルモン（ＧＨ、例えば組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、Ｆａｂ断片、例えばヒト免疫グロブリンＧ分子に由来するＦａｂ断片（ｈＦａｂ）、免疫グロブリンＧ、例えばマウス免疫グロブリンＧ（ｍＩｇＧ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、アスパラギナーゼ、例えば組換えアスパラギナーゼ（ｒＡｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、レプチン、例えば組換えヒトレプチン（ｒｈＬｅｐｔｉｎ）、インターロイキン−２、インターロイキン−１１、α−１−アンチトリプシン、抗体、または抗体断片、または他のタンパク質骨格である上述した方法および上述したＨＡＳ誘導体にも関する。
【０２４４】
「他のタンパク質骨格」という用語は、本発明の状況で使用するように、分子が他の非抗体タンパク質フレームワークに基づいている所与の抗体に類似の結合能力を有する分子に関する。本明細書では、Ａ．Ｓｋｅｒｒａ，Ｔ．Ｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，ａｎｄ  Ｈ．Ｋ．Ｂｉｎｚ（下の参考文献のリストを参照）による論文が挙げられる。
【０２４５】
本発明の生物活性物質（ＢＡ）に関する限り、これらの化合物は、本発明のステージ（ｉｉ）による結合のために１個以上のアミノ基を含み得る。このようなＢＡがこの結合に好適なアミノ基を含まない場合は、ＢＡに（ｉｉ）を受けさせる前に、当業者に公知の方法による好適な官能化によって少なくとも１個のこのようなアミノ酸をＢＡに導入することが考えられる。
【０２４６】
上述の生物活性剤、特に上述の好ましい生物活性剤により、および上述の好ましい架橋性化合物およびそれから得たＨＡＳ誘導体により、以下のＨＡＳ誘導体が一例として、好ましい実施形態として挙げられ、ここでそれぞれの場合において、ＨＡＳは、−本発明の好ましい実施形態により−ＨＥＳである。
【化１９９】
0005486507.tif 000204
または
【化２００】
0005486507.tif 000205
または
【化２０１】
0005486507.tif 000206
または
【化２０２】
0005486507.tif 000207
または
【化２０３】
0005486507.tif 000208
または
【化２０４】
0005486507.tif 000209
または
【化２０５】
0005486507.tif 000210
または
【化２０６】
0005486507.tif 000211
または
【化２０７】
0005486507.tif 000212
または
【化２０８】
0005486507.tif 000213
または
【化２０９】
0005486507.tif 000214
または
【化２１０】
0005486507.tif 000215
または
【化２１１】
0005486507.tif 000216
または
【化２１２】
0005486507.tif 000217
または
【化２１３】
0005486507.tif 000218
または
【化２１４】
0005486507.tif 000219
式中、ＢＡ’はタンパク質、さらに好ましくは、ここでタンパク質は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、例えば組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば組換えヒトＧ−ＣＳＦ（ｒｈＧ−ＣＳＦ）などのＧ−ＣＳＦ、インターフェロン（ＩＮＦ）、例えば組換えヒトＩＦＮα（ｒｈＩＦＮα）または組換えヒトＩＦＮβ（ｒｈＩＦＮβ）などのＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮガンマ、第ＶＩＩ因子、例えば組換えヒト第ＶＩＩａ因子（ｒｈＦＶＩＩａ）、第ＩＸ因子、例えば組換えヒト第ＩＸ因子（ｒｈＦＩＸ）、成長ホルモン（ＧＨ、例えば組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、Ｆａｂ断片、例えばヒト免疫グロブリンＧ分子に由来するＦａｂ断片（ｈＦａｂ）、免疫グロブリンＧ、例えばマウス免疫グロブリンＧ（ｍＩｇＧ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、アスパラギナーゼ、例えば組換えアスパラギナーゼ（ｒＡｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、レプチン、例えば組換えヒトレプチン（ｒｈＬｅｐｔｉｎ）、インターロイキン−２、インターロイキン−１１、α−１−アンチトリプシン、抗体、または抗体断片、および他のタンパク質骨格からなる群より好ましくは選択され、特にここでタンパク質は、ＥＰＯ、ＩＦＮαまたはＧ−ＣＳＦである。なおさらに好ましくは、ＨＡＳ’はＨＥＳ’であり、ここで、なおさらに好ましくは、ＨＥＳは、約１〜約１０００ｋＤａの、さらに好ましくは約１〜約８００ｋＤａの、さらに好ましくは約１〜約５００ｋＤａの、さらに好ましくは約２〜約４００ｋＤａの、さらに好ましくは約５〜約３００ｋＤａの、さらに好ましくは約１０〜約２００ｋＤａの、特に約５０〜約１５０ｋＤａの平均分子量、０．１〜３の、好ましくは０．４〜１．３の、例えば０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、または１．３のモル置換、および２〜２０の範囲の、さらに好ましくは２〜１５の範囲の、およびなおさらに好ましくは３〜１２の範囲のＣ２：Ｃ６置換の比を有する。
【０２４７】
特に好ましい実施形態により、本発明は、式
【化２１５】
0005486507.tif 000220
によるＨＡＳ誘導体に関し、
式中、ＨＡＳは好ましくはＨＥＳであり、ここで、なおさらに好ましくは、ＨＥＳは、約１〜約１０００ｋＤａの、さらに好ましくは約１〜約８００ｋＤａの、さらに好ましくは約１〜約５００ｋＤａの、さらに好ましくは約２〜約４００ｋＤａの、さらに好ましくは約５〜約３００ｋＤａの、さらに好ましくは約１０〜約２００ｋＤａの、特に約５０〜約１５０ｋＤａの平均分子量、０．１〜３の、好ましくは０．４〜１．３の、例えば０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、または１．３のモル置換、および２〜２０の範囲の、さらに好ましくは２〜１５の範囲の、およびなおさらに好ましくは３〜１２の範囲のＣ２：Ｃ６置換の比を有する。
【０２４８】
さらなる特に好ましい実施形態により、本発明は、式
【化２１６】
0005486507.tif 000221
によるＨＡＳ誘導体に関し、
式中、ＨＡＳは好ましくはＨＥＳであり、ここで、なおさらに好ましくは、ＨＥＳは、約１〜約１０００ｋＤａの、さらに好ましくは約１〜約８００ｋＤａの、さらに好ましくは約１〜約５００ｋＤａの、さらに好ましくは約２〜約４００ｋＤａの、さらに好ましくは約５〜約３００ｋＤａの、さらに好ましくは約１０〜約２００ｋＤａの、特に約５０〜約１５０ｋＤａの平均分子量、０．１〜３の、好ましくは０．４〜１．３の、例えば０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、または１．３のモル置換、および２〜２０の範囲の、さらに好ましくは２〜１５の範囲の、およびなおさらに好ましくは３〜１２の範囲のＣ２：Ｃ６置換の比を有する。
【０２４９】
さらなる特に好ましい実施形態により、本発明は、式
【化２１７】
0005486507.tif 000222
によるＨＡＳ誘導体に関し、
式中、ＨＡＳは好ましくはＨＥＳであり、ここで、なおさらに好ましくは、ＨＥＳは、約１〜約１０００ｋＤａの、さらに好ましくは約１〜約８００ｋＤａの、さらに好ましくは約１〜約５００ｋＤａの、さらに好ましくは約２〜約４００ｋＤａの、さらに好ましくは約５〜約３００ｋＤａの、さらに好ましくは約１０〜約２００ｋＤａの、特に約５０〜約１５０ｋＤａの平均分子量、０．１〜３の、好ましくは０．４〜１．３の、例えば０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、または１．３のモル置換、および２〜２０の範囲の、さらに好ましくは２〜１５の範囲の、およびなおさらに好ましくは３〜１２の範囲のＣ２：Ｃ６置換の比を有する。
【０２５０】
さらなる特に好ましい実施形態により、本発明は、式
【化２１８】
0005486507.tif 000223
によるＨＡＳ誘導体に関し、
式中、ＨＡＳは好ましくはＨＥＳであり、ここで、なおさらに好ましくは、ＨＥＳは、約１〜約１０００ｋＤａの、さらに好ましくは約１〜約８００ｋＤａの、さらに好ましくは約１〜約５００ｋＤａの、さらに好ましくは約２〜約４００ｋＤａの、さらに好ましくは約５〜約３００ｋＤａの、さらに好ましくは約１０〜約２００ｋＤａの、特に約５０〜約１５０ｋＤａの平均分子量、０．１〜３の、好ましくは０．４〜１．３の、例えば０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、または１．３のモル置換、および２〜２０の範囲の、さらに好ましくは２〜１５の範囲の、およびなおさらに好ましくは３〜１２の範囲のＣ２：Ｃ６置換の比を有する。
【０２５１】
さらなる特に好ましい実施形態により、本発明は、式
【化２１９】
0005486507.tif 000224
によるＨＡＳ誘導体に関し、
式中、ＨＡＳは好ましくはＨＥＳであり、ここで、なおさらに好ましくは、ＨＥＳは、約１〜約１０００ｋＤａの、さらに好ましくは約１〜約８００ｋＤａの、さらに好ましくは約１〜約５００ｋＤａの、さらに好ましくは約２〜約４００ｋＤａの、さらに好ましくは約５〜約３００ｋＤａの、さらに好ましくは約１０〜約２００ｋＤａの、特に約５０〜約１５０ｋＤａの平均分子量、０．１〜３の、好ましくは０．４〜１．３の、例えば０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、または１．３のモル置換、および２〜２０の範囲の、さらに好ましくは２〜１５の範囲の、およびなおさらに好ましくは３〜１２の範囲のＣ２：Ｃ６置換の比を有する。
【０２５２】
さらなる態様により、本発明は、ヒトまたは動物の体の治療方法で使用するための上述したＢＡ’を含むＨＡＳ誘導体、または上述した方法によって得たもしくは得られる上述したＢＡ’を含むＨＡＳ誘導体に関する。
【０２５３】
さらに、本発明は、治療剤または予防剤としての上述したＢＡ’を含むＨＡＳ誘導体、または上述した方法によって得たもしくは得られる上述したＢＡ’を含むＨＡＳ誘導体に関する。
【０２５４】
さらに、本発明は、上述したＢＡ’を含むＨＡＳ誘導体、または上述した方法によって得たもしくは得られる上述したＢＡ’を含むＨＡＳ誘導体を治療的有効量で含む製薬組成物に関する。
【０２５５】
ＢＡ’を含む本発明のＨＡＳ誘導体は、好適な方法、例えば経腸的、非経口または肺内方法によって投与され得るか、好ましくは静脈内、皮下または髄内経路によって投与され得る。選択される具体的な経路は、治療される症状に依存する。好ましくは誘導体は、当該技術分野で好適であるような（例えばアルブミンを含まないまたは賦形剤としてアルブミンを含む第１世代／未修飾生物薬剤で使用されるような）好適な担体、静脈内、髄内、または皮下用途などの好適な希釈剤と共に投与され得る。必要な投薬量は、治療される症状の重症度、患者の個々の応答、使用される投与方法などに依存する。当業者は、その一般知識に基づいて正確な投薬量を規定することができる。
【０２５６】
上述したＢＡ’を含むＨＡＳ誘導体を含む本発明による製薬組成物に関する限り、ＨＡＳ誘導体は製薬用賦形剤と併せて使用され得る。一般に、ＨＡＳ誘導体は固体形となり、固体形または液体形のどちらかであることが可能な好適な製薬用賦形剤と組合せることができる。賦形剤としては、炭水化物、無機塩、抗菌剤、抗酸化剤、界面活性剤、緩衝剤、酸、塩基、およびその組合せが挙げられる。糖、誘導体化糖、例えばアルジトール、アルドン酸、エステル化糖、および／または糖ポリマーなどの炭水化物は賦形剤として存在し得る。具体的な炭水化物賦形剤は例えば：モノサッカライド、例えばフルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボースなど；ジサッカライド、例えばラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなど；ポリサッカライド、たとばラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなど；およびアルジトール、例えばマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、ピラノシルソルビトール、ミオイノシトールなどを含む。賦形剤は、無機塩または緩衝剤、例えばクエン酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、およびその組合せも含み得る。本発明による製薬組成物は、微生物増殖を予防または阻止するための抗菌剤、例えば塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、チメルソル、およびその組合せも含み得る。本発明による製薬組成物は、抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、亜硫酸水素ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、およびその組合せも含み得る。本発明による製薬組成物は、界面活性剤、例えばポリソルベートまたはプルロニックソルビタンエステル。脂質、例えばリン脂質、例えばレシチンおよび他のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン酸および脂肪エステル。ステロイド、例えばコレステロール。およびキレート剤、例えばＥＤＴＡまたは亜鉛も含むことができる。本発明による製薬組成物は、酸または塩基、例えば塩酸、酢酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、ギ酸、トリクロロ酢酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、硫酸、フマル酸、およびその組合せ、ならびに／または水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、フマル酸カリウム、およびその組合せも含み得る。一般に、賦形剤は、それぞれの場合で製薬組成物の総重量に基づいて、本発明による製薬組成物中に０．００１〜９９．９９９重量％、好ましくは０．０１〜９９．９９重量％、さらに好ましくは０．１〜９９．９重量％の量で存在する。
【０２５７】
別の態様によれば、本発明は、貧血障害またはそれに関する造血機能不全障害もしくは疾患の治療用薬剤の調製のためのＢＡがＥＰＯである上述したＨＡＳ誘導体、好ましくはＨＥＳ誘導体の使用にも関する。
【０２５８】
別の態様によれば、本発明は、造血機能または免疫機能の低下を特徴とする障害の治療のための血友病Ａの治療用薬剤の調製のためのＢＡがＧ−ＣＳＦである上述したＨＡＳ誘導体、好ましくはＨＥＳ誘導体の使用にも関する。好ましい実施形態により、造血機能または免疫機能の低下を特徴とする障害は、化学療法、放射線療法、感染性疾患、重篤な慢性好中球減少症または白血病の結果である。
【０２５９】
別の態様によれば、本発明は、白血病、例えばヘアリーセル白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、癌、例えばカルチノイド腫瘍、悪性黒色腫および肝炎、例えば慢性Ｂ型肝炎および慢性Ｃ型肝炎の治療用薬剤の調製のためのＢＡがＩＦＮαである上述したＨＡＳ誘導体、好ましくはＨＥＳ誘導体の使用にも関する。
【０２６０】
別の態様によれば、本発明は、骨粗鬆症および／または慢性悪性疾患の治療用薬剤の調製のためのＢＡがＩＦＮガンマである上述したＨＡＳ誘導体、好ましくはＨＥＳ誘導体の使用にも関する。
【０２６１】
別の態様によれば、本発明は、骨粗鬆症および／または慢性悪性疾患の治療用薬剤の調製のためのＢＡがＩＬ−２ガンマである上述したＨＡＳ誘導体、好ましくはＨＥＳ誘導体の使用にも関する。
【０２６２】
別の態様によれば、本発明は、骨髄抑制化学療法後の血小板輸血の治療用薬剤の調製のためのＢＡがＩＬ−１１である上述したＨＡＳ誘導体、好ましくはＨＥＳ誘導体の使用にも関する。
【０２６３】
別の態様によれば、本発明は、気腫、嚢胞性線維症、アトピー性皮膚炎、および／または気管支炎の治療用薬剤の調製のためのＢＡがＡ１ＡＴである上述したＨＡＳ誘導体、好ましくはＨＥＳ誘導体の使用にも関する。
【０２６４】
別の態様によれば、本発明は、多発性硬化症、好ましくは再発型多発性硬化症の治療用薬剤の調製のためのＢＡがＩＦＮβである上述したＨＡＳ誘導体、好ましくはＨＥＳ誘導体の使用にも関する。
【０２６５】
別の態様によれば、本発明は、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子に対する阻害因子を持つ血友病ＡまたはＢ患者におけるエピソードの治療用薬剤の調製のためのＢＡが第ＶＩＩ因子である上述したＨＡＳ誘導体、好ましくはＨＥＳ誘導体の使用にも関する。
【０２６６】
別の態様によれば、本発明は、外科手術環境での出血の管理および予防を含む、血友病Ｂ患者における出血性エピソード、例えば先天性第ＩＸ因子欠乏症すなわちクリスマス病の治療用薬剤の調製のためのＢＡが第ＩＸ因子である上述したＨＡＳ誘導体、好ましくはＨＥＳ誘導体の使用にも関する。
【０２６７】
（参考文献のリスト）
−Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｋｒａｎｋｅｎｈａｕｓｐｈａｒｍａｚｉｅ，８（８），２７１−２７８
−Ｗｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ／Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．，４１，４９４−４９８
−独国特許出願公開第２６１６０８６号明細書
−Ｓｐｉｖａｋ  ａｎｄ  Ｈｏｇａｎｓ，１９８９，Ｂｌｏｏｄ  ７３，９０
−ＭｃＭａｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｂｌｏｏｄ  ７６，１７１８
−国際公開第９４／２８０２４号パンフレット
−国際公開第０２／０８０９７９号パンフレット
−国際公開第０３／０７４０８７号パンフレット
−国際公開第０３／０７４０８８号パンフレット
−国際公開第２００５／０１４０２４号パンフレット
−国際公開第２００５／０９２３９０号パンフレット
−国際公開第２００４／０２４７７７号パンフレット
−国際公開第２００４／０２４７７６号パンフレット
−国際公開第２００５／０９２９２８号パンフレット
−米国特許出願公開第２００６／０１９４９４０号明細書
−米国特許第７１５７５４６号明細書
−欧州特許出願公開第１５９１４６７号明細書
−国際公開第２００４／０２２６３０号パンフレット
−米国特許第６９１６９６２号明細書
−米国特許第６９５６１３５号明細書
−国際公開第０３／０４９６９９号パンフレット
−米国特許第５９９０２３７号明細書
−Ｋｌｅｍｍ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．２，１９９８，Ｗｈｉｌｅｙ
−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ  ｃｈａｐｔｅｒ  ４．４，Ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（ＩＳＢＮ  ３−５２７−２９４８９−９
−国際公開第００／６６６３３号パンフレット
−国際公開第００／１８８９３号パンフレット
−米国特許第４４５４１６１号明細書
−欧州特許出願公開第０４１８９４５号明細書
−特開２００１−２９４６０１号公報
−米国特許出願公開第２００２／０６５４１０号明細書
−米国特許第６０８３９０９号明細書
−Ａ．Ｓｋｅｒｒａ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．９（４），２００７，ｐｐ．３３６−３４４−Ｔ．Ｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１０），２００５，ｐｐ．５１４−５２２
−Ｈ．Ｋ．Ｂｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１０），２００５，ｐｐ．１２５７−１２６８
−国際公開第２００５／０８３１０３号パンフレット
−Ｋ．Ｒ．Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５４（２００２）ｐｐ．５７１−５８６
【図面の簡単な説明】
【０２６８】
【図１】ｏｘＨＥＳ５５／０．７−ＩＦＮａ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析  図１は、実施例２によるｏｘＨＥＳ−ＩＦＮａ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分離は、ＮｕＰＡＧＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（１．０ｍｍ）およびＭＯＰＳ泳動用緩衝液と共に製造者の説明書に従って使用して、還元条件下で実施した。ロード：反応混合物としてタンパク質１０μｇ。Ｍ：マーカー、Ｍａｒｋ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。レーン１〜４：実施例２による反応混合物。標的タンパク質（１９ｋＤａ）のＨＥＳ化が成功すると、３０〜＞２００ｋＤａの質量分布の広いスメアバンドとして見えるようになる。
【図２】ｏｘＨＥＳ５５／０．７−ＩＦＮａ結合反応のアニオン交換クロマトグラフィー  図２は、実施例２によるｏｘＨＥＳ５５／０．７−ＩＦＮａ結合反応のイオン交換カラムの、２２１ｎｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ分光法により監視したクロマトグラフィー分離を示す。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった。クロマトグラフィーシステム：Ａｅｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。カラム：Ｈｉ  Ｔｒａｐ  Ｑ  ＨＰ  １ｍｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）溶離液Ａ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ、ｐＨ８．０。溶離液Ｂ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０。運転条件：流量  １ｍｌ／分、２１℃。ランパラメータ：平衡  １０ＣＶ  ０％Ｂ試料ロード洗浄  ２ＣＶ  ０％Ｂ溶離  １６ＣＶ  ０〜５０％Ｂ再生  １０ＣＶ  １００％Ｂ再平衡  ８ＣＶ  ０％Ｂロード：実施例２による、反応混合物としての２ｍｇタンパク質／ｍｌ樹脂、溶離液Ａで２０倍希釈して、ｐＨに調整。貫流液中に、未反応の過剰なＨＥＳが見出される。ＨＥＳ化によって、タンパク質とカラムとの相互作用が弱められ、未修飾タンパク質と比較して結合体の溶離時間の短縮がもたらされた。
【図３】ｏｘＨＥＳ５５／０．７−ＥＰＯ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析  図３は、実施例３によるｏｘＨＥＳ５５／０．７−ＥＰＯ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分離は、ＮｕＰＡＧＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（１．０ｍｍ）およびＭＯＰＳ泳動用緩衝液と共に製造者の説明書に従って使用して、還元条件下で実施した。ロード：反応混合物としてタンパク質１０μｇ。Ｍ：マーカー、Ｍａｒｋ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。レーン１：実施例３による反応混合物。レーン２：結合前のＥＰＯ開始物質。標的タンパク質（〜３５〜４０ｋＤａ）のＨＥＳ化が成功すると、５５〜＞２００ｋＤａの質量分布の広いスメアバンドとして見えるようになる。
【図４】ｏｘＨＥＳ５５／０．７−ＥＰＯ結合反応のカチオン交換クロマトグラフィー  図４は、実施例３によるｏｘＨＥＳ５５／０．７−ＥＰＯ結合反応のイオン交換カラムの、２２１ｎｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ分光法により監視したクロマトグラフィー分離を示す。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった。クロマトグラフィーシステム：Ａｅｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。カラム：ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。溶離液Ａ：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０。溶離液Ｂ：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０。運転条件：流量  ５ｍｌ／分、２１℃。ランパラメータ：平衡  １０ＣＶ  ０％Ｂ試料ロード洗浄１  ２ＣＶ  ０％Ｂ洗浄２  ２ＣＶ  １０％Ｂ溶離  ２１ＣＶ  １０〜５２％Ｂ再生  ８ＣＶ  １００％Ｂ再平衡  ５ＣＶ  ０％Ｂロード：実施例３による、反応混合物としての２ｍｇタンパク質／ｍｌ樹脂、溶離液Ａで１０倍希釈。貫流液中に、未反応の過剰なＨＥＳが見出される。ＨＥＳ化によって、タンパク質とカラムとの相互作用が弱められ、未修飾タンパク質と比較して結合体の溶離時間の短縮がもたらされた。
【図５】ｏｘＨＥＳ１００／１．０−ＩＦＮａ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析  図５は、実施例５によるｏｘＨＥＳ−ＩＦＮａ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分離は、ＮｕＰＡＧＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（１．０ｍｍ）およびＭＯＰＳ泳動用緩衝液と共に製造者の説明書に従って使用して、還元条件下で実施した。ロード：反応混合物としてタンパク質１０μｇ。Ｍ：マーカー、Ｍａｒｋ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。レーン１：実施例５による反応混合物。標的タンパク質（１９ｋＤａ）のＨＥＳ化が成功すると、５０〜＞２００ｋＤａの質量分布の広いスメアバンドとして見えるようになる。
【図６】ｏｘＨＥＳ５５／１．０−ＩＦＮａ結合反応のアニオン交換クロマトグラフィー  図６は、実施例５によるｏｘＨＥＳ５５／１．０−ＩＦＮａ結合反応のイオン交換カラムの、２２１ｎｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ分光法により監視したクロマトグラフィー分離を示す。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった。クロマトグラフィーシステム：Ａｅｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。カラム：Ｈｉ  Ｔｒａｐ  Ｑ  ＨＰ  ５ｍｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）溶離液Ａ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ、ｐＨ８．０。溶離液Ｂ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０。運転条件：流量  １ｍｌ／分、２１℃。ランパラメータ：平衡  １０ＣＶ  ０％Ｂ試料ロード洗浄  ２ＣＶ  ０％Ｂ溶離  １２．５ＣＶ  ０〜５０％Ｂ再生  ５ＣＶ  １００％Ｂ再平衡  ５ＣＶ  ０％Ｂロード：実施例５による、反応混合物としての２ｍｇタンパク質／ｍｌ樹脂、溶離液Ａで２０倍希釈して、ｐＨに調整。貫流液中に、未反応の過剰なＨＥＳが見出される。ＨＥＳ化によって、タンパク質とカラムとの相互作用が弱められ、未修飾タンパク質と比較して結合体の溶離時間の短縮がもたらされた。
【図７】ｏｘＨＥＳ１００／１．０−ＩＦＮａ結合体のペプチドマッピング  図７は、Ｅｎｄｏ−ＬｙｓＣで処理した、実施例５によるＩＥＸ精製ｏｘＨＥＳ−ＩＦＮａ結合体のクロマトグラフィー分離を示す。タンパク質分解は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．６中の７．５％  Ｅｎｄｏ−ＬｙｓＣ、０．０１％  ＳＤＳを使用して３７℃にて一晩実施した。試料は、ＤＴＴおよび塩化グアニジンによって変性させて、ＲＰ−ＨＰＬＣによって、ＴＦＡを含む水／アセトニトリル勾配を用いた４．６×２５０ｍｍ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）ランで分析した。示されたクロマトグラムを２１４ｎｍにて監視した。矢印は、タンパク質（Ａ）と結合体（Ｂ）のクロマトグラムの間の大きな差が見られる領域を示す。Ｌ１およびＬ１／Ｌ２（Ｅｎｄｏ−Ｌｙｓ  Ｃ処置から生じたＮ末端ペプチド）のピークは、結合体試料では大幅に低下するのに対して、他の断片は実質的に影響されないままである。これらのデータは、ＨＥＳの、ＩＦＮａのＮ末端への優先的な結合を示唆している。
【図８】ｏｘＨＥＳ１００／１．０−ＥＰＯ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析  図８は、実施例６によるｏｘＨＥＳ１００／１．０−ＥＰＯ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分離は、ＮｕＰＡＧＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（１．０ｍｍ）およびＭＯＰＳ泳動用緩衝液と共に製造者の説明書に従って使用して、還元条件下で実施した。ロード：反応混合物としてタンパク質１０μｇ。Ｍ：マーカー、Ｍａｒｋ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。レーン１：結合前のＥＰＯ開始物質１０μｇ。レーン２：結合前のＥＰＯ開始物質５μｇ。レーン３：実施例６による反応混合物。標的タンパク質（〜３５〜４０ｋＤａ）のＨＥＳ化が成功すると、７０〜＞２００ｋＤａの質量分布の広いスメアバンドとして見えるようになる。
【図９】ｏｘＨＥＳ１００／１．０−ＥＰＯ結合反応のカチオン交換クロマトグラフィー  図１４は、実施例６によるｏｘＨＥＳ１００／１．０−ＥＰＯ結合反応のイオン交換カラムの、２２１ｎｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ分光法により監視したクロマトグラフィー分離を示す。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった。クロマトグラフィーシステム：Ａｅｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。カラム：２×５ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。溶離液Ａ：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０。溶離液Ｂ：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０。運転条件：流量  ５ｍｌ／分、２１℃。ランパラメータ：平衡  １０ＣＶ  ０％Ｂ試料ロード洗浄１  ２ＣＶ  ０％Ｂ洗浄２  ２ＣＶ  １０％Ｂ溶離  ２１ＣＶ  １０〜５２％Ｂ再生  ２．５ＣＶ  １００％Ｂ再平衡  ５ＣＶ  ０％Ｂロード：実施例６による、反応混合物としての２ｍｇタンパク質／ｍｌ樹脂、溶離液Ａで１０倍希釈。貫流液中に、未反応の過剰なＨＥＳが見出される。ＨＥＳ化によって、タンパク質とカラムとの相互作用が弱められ、未修飾タンパク質と比較して結合体の溶離時間の短縮がもたらされた。
【図１０】ｏｘＨＥＳ１００／１．０−Ｇ−ＧＳＦ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析  図１０は、実施例７によるｏｘＨＥＳ１００／１．０−Ｇ−ＧＳＦ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分離は、ＮｕＰＡＧＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（１．０ｍｍ）およびＭＯＰＳ泳動用緩衝液と共に製造者の説明書に従って使用して、還元条件下で実施した。ロード：反応混合物としてタンパク質１０μｇ。Ｍ：マーカー、Ｍａｒｋ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。レーン１：実施例７による反応混合物。レーン２：結合前のＧ−ＣＳＦ開始物質。標的タンパク質（〜１８ｋＤａ）のＨＥＳ化が成功すると、５０〜＞２００ｋＤａの質量分布の広いスメアバンドとして見えるようになる。
【図１１】ｏｘＨＥＳ１００／１．０−Ｇ−ＧＳＦ結合反応のＲＰ−ＨＰＬＣ分析  図１１は、２２１ｎｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ分光法により監視した、実施例７によるｏｘＨＥＳ１００／１．０−Ｇ−ＧＳＦ結合反応のＲＰ−ＨＰＬＣ分析の部分を示す。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった。クロマトグラフィーシステム：Ｓｕｍｍｉｔ、Ｐ５８０（ＨＰＧ）（Ｄｉｏｎｅｘ）。カラム：Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８、３００Ａ、５μｍ、４．６×１５０ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）。溶離液Ａ：水中の０．１％トリフルオロ酢酸。溶離液Ｂ：アセトニトリルの０．１％トリフルオロ酢酸。運転条件：流量  １ｍｌ／分、２０℃。勾配：０〜５分、５〜５５％Ｂ；５〜１２分、５５〜６８％Ｂ；１２〜１７分、１００％Ｂ；１７〜２２分、５％Ｂ；勾配遅延２．５分。ロード：反応混合物としてタンパク質１０μｇ、タンパク質濃度０．１ｍｇ／ｍｌまで水で希釈。１１．５分の主ピークが、〜１３分にて溶離する遊離Ｇ−ＣＳＦから分離されたＨＥＳタンパク質結合体である。
【図１２】ＨＥＳ１００／１．０−ＩＦＮａ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析  図１２は、実施例１０によるＨＥＳ−ＩＦＮａ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分離は、ＮｕＰＡＧＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（１．０ｍｍ）およびＭＯＰＳ泳動用緩衝液と共に製造者の説明書に従って使用して、還元条件下で実施した。ロード：反応混合物としてタンパク質１０μｇ。Ｍ：マーカー、未染色タンパク質マーカー５〜２００ｋＤａ（Ｓｅｒｖａ）。レーン１：実施例９による反応混合物。標的タンパク質（１９ｋＤａ）のＨＥＳ化が成功すると、５０〜＞２００ｋＤａの質量分布の広いスメアバンドとして見えるようになる。
【図１３】ＨＥＳ１００／１．０−ＩＦＮａ結合反応のアニオン交換クロマトグラフィー  図１３は、実施例１０によるＨＥＳ１００／１．０−ＩＦＮａ結合反応のイオン交換カラムの、２２１ｎｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ分光法により監視したクロマトグラフィー分離を示す。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった。クロマトグラフィーシステム：Ａｅｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。カラム：５ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。溶離液Ａ：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０。溶離液Ｂ：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０。運転条件：流量  ５ｍｌ／分、２１℃。ランパラメータ：平衡  １０ＣＶ  ０％Ｂ試料ロード洗浄１  ２ＣＶ  ０％Ｂ溶離  ２０ＣＶ  ０〜５０％Ｂ再生  １０ＣＶ  １００％Ｂ再平衡  ５ＣＶ  ０％Ｂロード：実施例９による、反応混合物としての３ｍｇタンパク質／ｍｌ樹脂、溶離液Ａで１０倍希釈。貫流液中に、未反応の過剰なＨＥＳが見出される。ＨＥＳ化によって、タンパク質とカラムとの相互作用が弱められ、未修飾タンパク質と比較して結合体の溶離時間の短縮がもたらされた。
【図１４】ＨＥＳ１００／１．０−ＥＰＯ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析  図１４は、実施例１１によるＨＥＳ１００／１．０−ＥＰＯ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分離は、ＮｕＰＡＧＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（１．０ｍｍ）およびＭＯＰＳ泳動用緩衝液と共に製造者の説明書に従って使用して、還元条件下で実施した。ロード：反応混合物としてタンパク質１０μｇ。Ｍ：マーカー、Ｍａｒｋ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。レーン１：ＩＥＸ精製ＨＥＳ  ＥＰＯ結合体。レーン２：実施例１１による反応混合物。レーン３：結合前のＥＰＯ開始物質５μｇ。標的タンパク質（〜３５〜４０ｋＤａ）のＨＥＳ化が成功すると、７０〜＞２００ｋＤａの質量分布の広いスメアバンドとして見えるようになる。
【図１５】ＨＥＳ１００／１．０−ＥＰＯ結合反応のカチオン交換クロマトグラフィー  図１５は、実施例１１によるＨＥＳ１００／１．０−ＥＰＯ結合反応のイオン交換カラムの、２２１ｎｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ分光法により監視したクロマトグラフィー分離を示す。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった。クロマトグラフィーシステム：Ａｅｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。カラム：４×５ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。溶離液Ａ：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０。溶離液Ｂ：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０。運転条件：流量  ５ｍｌ／分、２１℃。ランパラメータ：平衡  ５ＣＶ  ０％Ｂ試料ロード洗浄１  ２ＣＶ  ０％Ｂ溶離  １３ＣＶ  ０〜５２％Ｂ再生  ２．５ＣＶ  １００％Ｂ再平衡  ２．５ＣＶ  ０％Ｂロード：実施例１１による、反応混合物としての３ｍｇタンパク質／ｍｌ樹脂、溶離液Ａで２倍希釈。貫流液中に、未反応の過剰なＨＥＳが見出される。ＨＥＳ化によって、タンパク質とカラムとの相互作用が弱められ、未修飾タンパク質と比較して結合体の溶離時間の短縮がもたらされた。
【図１６】ＨＥＳ１００／１．０−Ｇ−ＧＳＦ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析  図１６は、実施例１２によるＨＥＳ１００／１．０−Ｇ−ＧＳＦ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分離は、ＮｕＰＡＧＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（１．０ｍｍ）およびＭＯＰＳ泳動用緩衝液と共に製造者の説明書に従って使用して、還元条件下で実施した。ロード：反応混合物としてタンパク質１０μｇ。Ｍ：マーカー、Ｍａｒｋ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。レーン１：ＩＥＸ精製ＨＥＳ  Ｇ−ＣＳＦ結合体。レーン２：実施例１２による反応混合物。レーン３：結合前のＧ−ＣＳＦ開始物質５μｇ。標的タンパク質（〜１８ｋＤａ）のＨＥＳ化が成功すると、５０〜＞２００ｋＤａの質量分布の広いスメアバンドとして見えるようになる。
【図１７】ＨＥＳ１００／１．０−Ｇ−ＧＳＦ結合反応のＲＰ−ＨＰＬＣ分析  図１７は、２２１ｎｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ分光法により監視した、実施例１２によるＨＥＳ１００／１．０−Ｇ−ＧＳＦ結合反応のＲＰ−ＨＰＬＣ分析の部分を示す。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった。クロマトグラフィーシステム：Ｓｕｍｍｉｔ、Ｐ５８０（ＨＰＧ）（Ｄｉｏｎｅｘ）。カラム：Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８、３００Ａ、５μｍ、４．６×１５０ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）。溶離液Ａ：水中の０．１％トリフルオロ酢酸。溶離液Ｂ：アセトニトリルの０．１％トリフルオロ酢酸。運転条件：流量  １ｍｌ／分、２０℃。勾配：０〜５分、５〜５５％Ｂ；５〜１２分、５５〜６８％Ｂ；１２〜１７分、１００％Ｂ；１７〜２２分、５％Ｂ；勾配遅延２．５分。ロード：反応混合物としてタンパク質１０μｇ、タンパク質濃度０．１ｍｇ／ｍｌまで水で希釈。１０〜１０．５分の主ピークが、〜１２分にて溶離する遊離Ｇ−ＣＳＦから分離されたＨＥＳタンパク質結合体である。
【図１８】ＨＥＳ１００／１．０−Ｇ−ＣＳＦ結合反応のカチオン交換クロマトグラフィー  図１８は、実施例１２によるＨＥＳ１００／１．０−Ｇ−ＣＳＦ結合反応のイオン交換カラムの、２２１ｎｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ分光法により監視したクロマトグラフィー分離を示す。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった。クロマトグラフィーシステム：Ａｅｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。カラム：２×５ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。溶離液Ａ：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０。溶離液Ｂ：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０。運転条件：流量  ５ｍｌ／分、２１℃。ランパラメータ：平衡  １０ＣＶ  ０％Ｂ試料ロード洗浄  ２ＣＶ  ０％Ｂ溶離  １６ＣＶ  ０〜５０％Ｂ再生  １０ＣＶ  １００％Ｂ再平衡  ８ＣＶ  ０％Ｂロード：実施例１２による、反応混合物としての３ｍｇタンパク質／ｍｌ樹脂、溶離液Ａで２倍希釈。貫流液中に、未反応の過剰なＨＥＳが見出される。ＨＥＳ化によって、タンパク質とカラムとの相互作用が弱められ、未修飾タンパク質と比較して結合体の溶離時間の短縮がもたらされた。
【図１９−２３】各実施例の状況にて言及される。
【図２４】図２４は、２８０ｎｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ分光法により監視した、「追加データ（Ａ．２）」によるｏｘＨＢＳ−ＢＳＡ結合反応のＨＰＧＰＣ分析の部分を示す。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった。クロマトグラフィーシステム：Ｓｈｉｍａｄｓｕ  ＬＣ１０  ＡＤ／  ＵＶ−Ｄｅｔｅｋｔｏｒ：ＴＳＰ  ＵＶ  ２０００カラム：Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６  １０／３００  ＧＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。溶離液：リン酸緩衝液：（Ｎａ２ＨＰＯ４×２Ｈ２Ｏ  ３．８８７ｇ、ＮａＨ２ＰＯ４×２Ｈ２Ｏ  １．９６７ｇ、ＮａＣｌ  １１．６８８ｇ、ＮａＮ３  ０．０５ｇを、クロマトグラフィー（Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｋｏｐｏｅａ  Ｅｕｒｏｐａｅａ）用に総体積１．０ｌまで水に溶解した。０．４５μｍフィルタを利用して溶液を濾過した）運転条件：流量  ０．４ｍｌ／分、２０℃。ロード：反応混合物としてタンパク質０．９ｍｇ、１００μｌにタンパク質濃度９ｍｇ／ｍｌまで溶解。上部は、結合反応前のＢＳＡ開始物質を示す。ピークは、左から右へ３８．０３８、３９．２７７、および４２．２７２である。下部は、ＨＢＳ−ＢＳＡ結合体を示す。ピークは、左から右へ３６．７９５、３９．３４５、および４１．５２１である。
【図２５】ｏｘＨＢＳ−ＩＦＮａ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析  図２５は、「追加データ（Ａ３）」によるｏｘＨＢＳ−ＩＦＮａ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分離は、ＮｕＰＡＧＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（１．０ｍｍ）およびＭＯＰＳ泳動用緩衝液と共に製造者の説明書に従って使用して、還元条件下で実施した。ロード：反応混合物としてタンパク質１０μｇ。Ｍ：マーカー、Ｍａｒｋ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。レーン１〜４：「追加データ（Ａ３）」による反応混合物。標的タンパク質（１９ｋＤａ）のＨＢＳ化が成功すると、３０〜＞２００ｋＤａの質量分布の広いスメアバンドとして見えるようになる。
【図２６】ｏｘＨＢＳ−ＩＦＮａ結合反応のアニオン交換クロマトグラフィー  図２６は、イオン交換カラムを使用する、追加データ（Ａ３）によるＨＢＳ−ＩＦＮａ結合反応の、２２１ｎｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ分光法により監視したクロマトグラフィー分離を示す。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった。クロマトグラフィーシステム：Ａｅｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。カラム：Ｈｉ  Ｔｒａｐ  Ｑ  ＨＰ  １ｍｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）溶離液Ａ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ、ｐＨ８．０。溶離液Ｂ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０。運転条件：流量  １ｍｌ／分、２０℃。ランパラメータ：平衡  １０ＣＶ  ０％Ｂ試料ロード洗浄  ２ＣＶ  ０％Ｂ溶離  １６ＣＶ  ０〜５０％Ｂ再生  １０ＣＶ  １００％Ｂ再平衡  ８ＣＶ  ０％Ｂロード：実施例３による反応混合物、溶離液Ａで２０倍に希釈して、ｐＨ８．０に調整。貫流液中に、未反応の過剰なＨＢＳが見出される。ＨＢＳ化によって、タンパク質とカラムとの相互作用が弱められ、未修飾タンパク質と比較して結合体の溶離時間の短縮がもたらされた。
【図２７】ｏｘＨＢＳ−ＥＰＯ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析  図２７は、「追加データ（Ａ４）」によるｏｘＨＢＳ−ＥＰＯ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分離は、ＮｕＰＡＧＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（１．０ｍｍ）およびＭＯＰＳ泳動用緩衝液と共に製造者の説明書に従って使用して、還元条件下で実施した。ロード：反応混合物としてタンパク質１０μｇ。Ｍ：マーカー、Ｍａｒｋ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。レーン１：「追加データ（Ａ４）」による反応混合物。レーン２：結合前のＥＰＯ開始物質。標的タンパク質（〜３５〜４０ｋＤａ）のＨＢＳ化が成功すると、４５〜＞２００ｋＤａの質量分布の広いスメアバンドとして見えるようになる。
【図２８】ＨＥＳ１００／１．０、リンカ（ａ２）および（Ｔｒｐ４）−ケンプチドを使用する結合反応のＲＰ−ＨＰＬＣ分析  図２８は、２２１ｍｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ分光法によって監視した実施例１８、表３によるＨＥＳ１００／１．０、リンカ（ａ２）および（Ｔｒｐ４）−ケンプチドを使用する結合反応のＲＰ−ＨＰＬＣ分析の部分を示す。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった。クロマトグラフィーシステム：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ  ２０  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ，ＬＣ  ２０ＡＴ（ＬＰＧ）（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）。カラム：Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８、３００Ａ、５μｍ、４．６×１５０ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）。溶離液Ａ：水中の０．１％トリフルオロ酢酸。溶離液Ｂ：アセトニトリルの０．１％トリフルオロ酢酸。運転条件：流量  １ｍｌ／分、２０℃。勾配：０〜１５分、２〜３０％Ｂ；１５〜２０分、３０〜９８％Ｂ；２０〜２７分、２％Ｂ。ロード：反応混合物としてタンパク質５μｇ、タンパク質濃度０．０１５ｇ／ｍｌまで水で希釈。１１．５〜１５分の主ピークが、〜１７分にて溶離する遊離（Ｔｒｐ４）−ケンプチドから分離されたＨＥＳペプチド質結合体である。
【図２９】ＨＥＳ１００／１．０、リンカ（ａ１６）および（Ｔｒｐ４）−ケンプチドを使用する結合反応のＲＰ−ＨＰＬＣ分析  図２９は、２２１ｍｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ分光法によって監視した実施例１８、表５、１３行によるＨＥＳ１００／１．０、リンカ（ａ１６）および（Ｔｒｐ４）−ケンプチドを使用する結合反応のＲＰ−ＨＰＬＣ分析の部分を示す。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった。クロマトグラフィーシステム：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ  ２０  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ，ＬＣ  ２０ＡＴ（ＬＰＧ）（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）。カラム：Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８、３００Ａ、５μｍ、４．６×１５０ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）。溶離液Ａ：水中の０．１％トリフルオロ酢酸。溶離液Ｂ：アセトニトリルの０．１％トリフルオロ酢酸。運転条件：流量  １ｍｌ／分、２０℃。勾配：０〜１５分、２〜３０％Ｂ；１５〜２０分、３０〜９８％Ｂ；２０〜２７分、２％Ｂ。ロード：反応混合物としてタンパク質５μｇ、タンパク質濃度０．０１５ｇ／ｍｌまで水で希釈。１１．５〜１５分の主ピークが、〜１７分にて溶離する遊離（Ｔｒｐ４）−ケンプチドから分離されたＨＥＳペプチド質結合体である。
【図３０】ＨＥＳ１００／１．０、リンカ（ａ１１）および（Ｔｒｐ４）−ケンプチドを使用する結合反応のＲＰ−ＨＰＬＣ分析  図３０は、２２１ｍｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ分光法によって監視した実施例１８、表５、２４行によるＨＥＳ１００／１．０、リンカ（ａ１１）および（Ｔｒｐ４）−ケンプチドを使用する結合反応のＲＰ−ＨＰＬＣ分析の部分を示す。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった。クロマトグラフィーシステム：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ  ２０  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ，ＬＣ  ２０ＡＴ（ＬＰＧ）（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）。カラム：Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８、３００Ａ、５μｍ、４．６×１５０ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）。溶離液Ａ：水中の０．１％トリフルオロ酢酸。溶離液Ｂ：アセトニトリルの０．１％トリフルオロ酢酸。運転条件：流量  １ｍｌ／分、２０℃。勾配：０〜１５分、２〜３０％Ｂ；１５〜２０分、３０〜９８％Ｂ；２０〜２７分、２％Ｂ。ロード：反応混合物としてタンパク質５μｇ、タンパク質濃度０．０１５ｇ／ｍｌまで水で希釈。１１．５〜１５分の主ピークが、〜１７分にて溶離する遊離（Ｔｒｐ４）−ケンプチドから分離されたＨＥＳペプチド質結合体である。
【図３１】ＨＥＳ１００／１．０、リンカ（ａ１２）および（Ｔｒｐ４）−ケンプチドを使用する結合反応のＲＰ−ＨＰＬＣ分析  図３１は、２２１ｍｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ分光法によって監視した実施例１８、表５、３０行によるＨＥＳ１００／１．０、リンカ（ａ１２）および（Ｔｒｐ４）−ケンプチドを使用する結合反応のＲＰ−ＨＰＬＣ分析の部分を示す。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった。クロマトグラフィーシステム：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ  ２０  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ，ＬＣ  ２０ＡＴ、（ＬＰＧ）（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）。カラム：Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８、３００Ａ、５μｍ、４．６×１５０ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）。溶離液Ａ：水中の０．１％トリフルオロ酢酸。溶離液Ｂ：アセトニトリルの０．１％トリフルオロ酢酸。運転条件：流量  １ｍｌ／分、２０℃。勾配：０〜１５分、２〜３０％Ｂ；１５〜２０分、３０〜９８％Ｂ；２０〜２７分、２％Ｂ。ロード：反応混合物としてタンパク質５μｇ、タンパク質濃度０．０１５ｇ／ｍｌまで水で希釈。１１．５〜１５分の主ピークが、〜１７分にて溶離する遊離（Ｔｒｐ４）−ケンプチドから分離されたＨＥＳペプチド質結合体である。
【図３２】ＨＥＳ１００／１．０−Ｇ−ＧＳＦ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析  図３２は、実施例１８によるＨＥＳ１００／１．０−Ｇ−ＧＳＦ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分離は、ＮｕＰＡＧＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（１．０ｍｍ）およびＭＥＳ泳動用緩衝液と共に製造者の説明書に従って使用して、還元条件下で実施した。Ｍ：マーカー、Ｍａｒｋ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。 レーン１：表５、７行による反応混合物（タンパク質１０μｇ添加）。レーン２：表５、１６行による反応混合物（タンパク質１０μｇ添加）。レーン３：表５、２７行による反応混合物（タンパク質１０μｇ添加）。レーン４：表５、３３行による反応混合物（タンパク質１０μｇ添加）。レーン５：結合前のＧ−ＣＳＦ開始物質０．５μｇ。 標的タンパク質（〜１８ｋＤａ）のＨＥＳ化が成功すると、５０〜＞２００ｋＤａの質量分布の広いスメアバンドとして見えるようになる。
【図３３】ＨＥＳ１００／１．０−ＩＦＮａ結合反応およびＨＥＳ１００／１．０−ＥＰＯ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析  図３３は、実施例１８によるＨＥＳ１００／１．０とｒｈＩＦＮαまたはｒｈＥＰＯとの間の結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分離は、ＮｕＰＡＧＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（１．０ｍｍ）およびＭＯＰＳ泳動用緩衝液と共に製造者の説明書に従って使用して、還元条件下で実施した。右側に示す電気泳動分離では、ＭＯＰの代わりにＭＥＳ緩衝液を使用した。代表的なロード：開始物質または反応混合物のどちらかとして、タンパク質１０μｇ。Ｍ：マーカー、Ｍａｒｋ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。レーン１：表５、４行による反応混合物。レーン２：表５、１４行による反応混合物。レーン３：表５、２５行による反応混合物。レーン４：表５、３１行による反応混合物。レーン５：結合前のｒｈＩＦＮα開始物質。標的タンパク質（〜１９ｋＤａ）のＨＥＳ化が成功すると、５０〜＞２００ｋＤａの質量分布の広いスメアバンドとして見えるようになる。レーン６：表５、１５行による反応混合物。レーン７：表５、５行による反応混合物。レーン８：表５、３２行による反応混合物。レーン９：結合前のｒｈＥＰＯ開始物質。レーン１０：表５、２６行による反応混合物。標的タンパク質（〜３５〜４０ｋＤａ）のＨＥＳ化が成功すると、６０〜＞２００ｋＤａの質量分布の広いスメアバンドとして見えるようになる。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【０２６９】
ｏｘＨＥＳ５５／０．７−Ｎ−（３−プロピオアルデヒドジエチルアセタール）の調製
ＨＥＳアルドン酸（ｏｘＨＥＳ）は、分子量５５ｋＤａおよびモル置換０．７のＨＥＳ（ＨＥＳ５５／０．７）のＨＥＳから開始して、国際公開第２００５／０８３１０３号パンフレットの実施例９に記載されているように合成した（該文献において、超分枝デンプン、ＨＢＳについての調製が記載されている）。
【０２７０】
８０℃にて２日間乾燥させたｏｘＨＥＳ  ５５／０．７  ３０ｇを無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）６０ｍｌに溶解させて、溶液を７０℃まで加熱した。無水ＤＭＦ  ５０ｍｌ中の１−アミノ−３，３−ジエトキシプロパン２５ｇを添加して、反応混合物を７０℃にて４８時間加熱した。
【０２７１】
ＤＭＦおよび過剰な１−アミノ−３，３−ジエトキシプロパンは、回転蒸発器を使用して真空中で６０〜８０℃にて除去した。残りの粗固体は、洗浄溶液に色が検出できなくなるまでアセトンで洗浄した。生成物を水５００ｍｌに溶解させて、カットオフが１００００ダルトンの膜を利用して限外濾過によって精製した。未透過物のｐＨが６〜７の値に達したときに、０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を利用して９まで再調整した。この手順を４回反復した。最後に生成物を凍結乾燥させた。
【実施例２】
【０２７２】
ｏｘＨＥＳ  ５５／０．７インターフェロンα２ｂ（ＩＦＮａ）結合体の調製
実施例１で調製したアセタール４００ｍｇに、適切な量の１０ｍＭ  ＨＣｌを添加して、４０％（ｗ／ｖ）の溶液を得た。溶液を２１℃にて２４時間撹拌しながらインキュベートして、アルデヒド官能基を脱保護した。ｐＨ値は、０．１Ｍ  ＮａＯＨの添加によって結合緩衝液で使用する値まで調整した。
【０２７３】
インターフェロンα（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用して組換えＤＮＡ技術によって製造した組換えヒトインターフェロンα−２ｂ、インターフェロンα−２ｂは１６５アミノ酸より成り、天然ヒトインターフェロンα−２ｂ（ｈＩＦＮ−ａｌｐｈａ−２ｂ）と同じアミノ酸配列を示す）を、限外濾過装置を使用して１６ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、好適な結合緩衝液（０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．０）中に移した。
【０２７４】
（Ｍｗに基づいて）１０倍モル過剰のｏｘＨＥＳアルデヒドを６ｍｇ／ｍｌの反応混合物中のタンパク質濃度で使用した。ｏｘＨＥＳアルデヒド濃度は２０％（ｗ／ｖ）であった。脱保護したｏｘＨＥＳアルデヒドをタンパク質溶液と合せて、新たに調製したＮａＣＮＢＨ３溶液（結合緩衝液中０．５Ｍ）の添加によって還元的アミノ化を開始して、２０ｍＭの還元剤の最終濃度を得た。完全に混合した後に、反応物を１０℃にて一晩インキュベートした。
【０２７５】
反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１）およびＣ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ）での逆相クロマトグラフィーによって分析して、結合が成功したことを検証して、結合収率を決定した。溶離は、０．１％  ＴＦＡを含む酸性水／アセトニトリル勾配を使用して実施した。
【０２７６】
ＨＥＳ化インターフェロンαを未反応化合物から、Ａｅｋｔａ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＱ  ＨＰカラムを使用するアニオン交換クロマトグラフィーによって分離した。溶離液Ａは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ、ｐＨ８．０であり、溶離液Ｂは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０であった。結合体および未修飾タンパク質の分離のための勾配は、１６ＣＶにて０％  Ｂ→５０％  Ｂであった（図２）。
【実施例３】
【０２７７】
ｏｘＨＥＳ  ５５／０．７エリスロポエチン（ＥＰＯ）結合体の調製
実施例１で調製したアセタール４００ｍｇに、適切な量の１０ｍＭ  ＨＣｌを添加して、４０％（ｗ／ｖ）の溶液を得た。溶液を２１℃にて２４時間撹拌しながらインキュベートして、アルデヒド官能基を脱保護した。ｐＨ値は、０．１Ｍ  ＮａＯＨの添加によって結合緩衝液で使用する値まで調整した。
【０２７８】
脱保護ｏｘＨＥＳアルデヒドをＥＰＯ（ヒトＥＰＯのアミノ酸配列を有し、市販のＥｒｙｐｏ（登録商標）（Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｊａｎｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ）またはＮｅｏＲｅｃｏｒｍｏｎ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ）と本質的に同じ特徴を有する組換えヒトＥＰＯ）溶液（反応緩衝液の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５中１０ｍｇ／ｍｌ）と合せた。ＯｘＨＥＳアルデヒドを、ＥＰＯ濃度に対して（Ｍｗに基づいて）１０倍のモル過剰で添加した。反応混合物の得られたＥＰＯ濃度は５ｍｇ／ｍｌであり、ｏｘＨＥＳアルデヒド濃度は１０％（ｗ／ｖ）であった。還元的アミノ化反応は、還元剤２０ｍＭの最終濃度を得るために反応緩衝液中で作製した０．５Ｍ  ＮａＣＮＢＨ３溶液の添加によって開始した。完全に混合した後に、反応物を０℃にて一晩インキュベートした。
【０２７９】
反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３）およびＣ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ）での逆相クロマトグラフィーによって分析して、結合が成功したことを検証して、結合収率を決定した。ＲＰ−ＨＰＬＣの溶離は、０．１％  ＴＦＡを含む酸性水／アセトニトリル勾配を使用して実施した。
【０２８０】
ＨＥＳ化ＥＰＯを未反応化合物から、Ａｅｋｔａ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＳＰ  ＨＰカラムを使用するカチオン交換クロマトグラフィーによって分離した。溶離液Ａは、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０であり、溶離液Ｂは、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０であった。結合体および未修飾タンパク質の分離のための勾配は、１０％Ｂ、２ＣＶ、２１ＣＶにて１０％  Ｂ→５２％  Ｂであった（図４）。
【０２８１】
標的タンパク質のＨＥＳ結合部位は、ＩＥＸ精製ＨＥＳタンパク質結合体のペプチドマッピングによって同定した。結合体は好適なプロテアーゼ（２％エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、ｐＨ８．６、３７℃、一晩）を使用して消化し、得られた断片は、ＴＦＡを含む酸性水／アセトニトリル勾配を使用して、Ｃ４カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ）による逆相クロマトグラフィーによって分離した。タンパク質のＨＥＳ化部位は、標的タンパク質単独の対照消化と比較したクロマトグラムの各ペプチドの還元または消失によって間接的に同定できた。
【実施例４】
【０２８２】
ｏｘＨＥＳ１００／１．０−Ｎ−（３−プロピオアルデヒドジエチルアセタール）の調製
ＨＥＳアルドン酸（ｏｘＨＥＳ）は、分子量１００ｋＤａおよびモル置換１．０のＨＥＳ（ＨＥＳ１００／１．０）のＨＥＳから開始して、国際公開第２００５／０８３１０３号パンフレットの実施例Ａに記載されているように合成した（該文献において、超分枝デンプンのＨＢＳについての調製が記載されている）。
【０２８３】
８０℃にて２日間乾燥させたｏｘＨＥＳ１００／１．０  ３０ｇを無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１５０ｍｌに溶解させて、溶液を７０℃まで加熱した。無水ＤＭＦ  ６０ｍｌ中の１−アミノ−３，３−ジエトキシプロパン２５ｇを添加して、反応混合物を７０℃にて４８時間加熱した。
【０２８４】
ＤＭＦおよび過剰な１−アミノ−３，３−ジエトキシプロパンは、回転蒸発器を使用して真空中で６０〜８０℃にて除去した。残りの粗固体は、洗浄溶液に色が検出できなくなるまでアセトンで洗浄した。生成物を水５００ｍｌに溶解させて、カットオフが１０，０００ダルトンの膜を利用して限外濾過によって精製した。未透過物のｐＨが６〜７の値に達したときに、０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を利用して９まで再調整した。この手順を４回反復した。最後に生成物を凍結乾燥させた。
【実施例５】
【０２８５】
酸化ＨＥＳからのＨＥＳ１００／１．０インターフェロンα（ＩＦＮａ）結合体の調製
実施例４で調製したアセタール４００ｍｇに、適切な量の１０ｍＭ  ＨＣｌを添加して、４０％（ｗ／ｖ）の溶液を得た。溶液を２１℃にて一晩撹拌しながらインキュベートして、アルデヒド官能基を脱保護した。ｐＨ値は、０．１Ｍ  ＮａＯＨの添加によって結合緩衝液で使用する値まで調整した。
【０２８６】
インターフェロンα（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用して組換えＤＮＡ技術によって製造した組換えヒトインターフェロンα−２ｂ、インターフェロンα−２ｂは１６５アミノ酸より成り、天然ヒトインターフェロンα−２ｂ（ｈＩＦＮ−ａｌｐｈａ−２ｂ）と同じアミノ酸配列を示す）を、限外濾過装置を使用して１６ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、好適な結合緩衝液（０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．０）中に移した。
【０２８７】
（Ｍｎに基づいて）６倍モル過剰のｏｘＨＥＳアルデヒドを８ｍｇ／ｍｌの反応混合物中の最終タンパク質濃度で使用した；ｏｘＨＥＳアルデヒド濃度は２０％（ｗ／ｖ）であった。脱保護したｏｘＨＥＳアルデヒドをタンパク質溶液と合せて、新たに調製したＮａＣＮＢＨ３溶液（結合緩衝液中０．５Ｍ）の添加によって還元的アミノ化を開始して、２０ｍＭの還元剤の最終濃度を得た。完全に混合した後に、反応物を５℃にて一晩インキュベートした。
【０２８８】
反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図５）およびＣ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ）での逆相クロマトグラフィーによって分析して、結合が成功したことを検証して、結合収率を決定した。溶離は、０．１％  ＴＦＡを含む酸性水／アセトニトリル勾配を使用して実施した。
【０２８９】
ＨＥＳ化インターフェロンαを未反応化合物から、Ａｅｋｔａ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＱ  ＨＰカラムを使用するアニオン交換クロマトグラフィーによって分離した。溶離液Ａは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ、ｐＨ８．０であり、溶離液Ｂは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０であった。結合体および未修飾タンパク質の分離のための勾配は、１２．５ＣＶにて０％  Ｂ→５０％  Ｂであった（図６）。
【０２９０】
標的タンパク質のＨＥＳ結合部位は、ＩＥＸ精製ＨＥＳタンパク質結合体のペプチドマッピングによって同定した。結合体は好適なプロテアーゼ（２％エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、ｐＨ８．６、３７℃、一晩）を使用して消化し、得られた断片は、ＴＦＡを含む酸性水／アセトニトリル勾配を使用して、Ｃ４カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ）による逆相クロマトグラフィーによって分離した。タンパク質のＨＥＳ化部位は、標的タンパク質単独の対照消化と比較した、クロマトグラムの各ペプチドの還元または消失によって間接的に同定できた（図７）。
【実施例６】
【０２９１】
酸化ＨＥＳからのＨＥＳ１００／１．０エリスロポエチン（ＥＰＯ）結合体の調製
実施例４で調製したアセタール４００ｍｇに、適切な量の１０ｍＭ  ＨＣｌを添加して、４０％（ｗ／ｖ）の溶液を得た。溶液を２１℃にて２４時間インキュベートして、アルデヒド官能基を脱保護した。ｐＨ値は、０．１Ｍ  ＮａＯＨの添加によって結合緩衝液で使用する値まで調整した。
【０２９２】
脱保護したｏｘＨＥＳアルデヒドをＥＰＯ（ヒトＥＰＯのアミノ酸配列を有し、市販のＥｒｙｐｏ（登録商標）（Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｊａｎｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ）またはＮｅｏＲｅｃｏｒｍｏｎ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ）と本質的に同じ特徴を有する組換えヒトＥＰＯ）溶液（反応緩衝液の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５中１０ｍｇ／ｍｌ）と合せた。ＯｘＨＥＳアルデヒドを、ＥＰＯ濃度に対して（Ｍｎに基づいて）１５倍モル過剰で添加した。反応混合物の得られたＥＰＯ濃度は３．７ｍｇ／ｍｌであり、ｏｘＨＥＳアルデヒド濃度は１５％（ｗ／ｖ）であった。還元的アミノ化反応は、還元剤２０ｍＭの最終濃度を得るために反応緩衝液中で作製した０．５Ｍ  ＮａＣＮＢＨ３溶液の添加によって開始した。完全に混合した後に、反応物を１０℃にて一晩インキュベートした。
【０２９３】
反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図８）およびＣ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ）での逆相クロマトグラフィーによって分析して、結合が成功したことを検証して、結合収率を決定した。溶離は、０．１％  ＴＦＡを含む酸性水／アセトニトリル勾配を使用して実施した。
【０２９４】
ＨＥＳ化ＥＰＯを未反応化合物から、Ａｅｋｔａ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＳＰ  ＨＰカラムを使用するカチオン交換クロマトグラフィーによって分離した。溶離液Ａは、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０であり、溶離液Ｂは、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０であった。結合体および未修飾タンパク質の分離のための勾配は、１０％Ｂ、２ＣＶ；２１ＣＶにて１０％  Ｂ→５２％  Ｂであった（図９）。
【０２９５】
標的タンパク質のＨＥＳ結合部位は、ＩＥＸ精製ＨＥＳタンパク質結合体のペプチドマッピングによって同定した。結合体は好適なプロテアーゼ（２％エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、ｐＨ８．６、３７℃、一晩）を使用して消化し、得られた断片は、ＴＦＡを含む酸性水／アセトニトリル勾配を使用して、Ｃ４カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ）による逆相クロマトグラフィーによって分離した。タンパク質のＨＥＳ化部位は、標的タンパク質単独の対照消化と比較した、クロマトグラムの各ペプチドの還元または消失によって間接的に同定できた。
【実施例７】
【０２９６】
酸化ＨＥＳからのＨＥＳ１００／１．０顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の調製
実施例４で調製したアセタール４００ｍｇに、適切な量の１０ｍＭ  ＨＣｌを添加して、４０％（ｗ／ｖ）の溶液を得た。溶液を２１℃にて一晩インキュベートして、アルデヒド官能基を脱保護した。ｐＨ値は、０．１Ｍ  ＮａＯＨの添加によって結合緩衝液で使用する値まで調整した。
【０２９７】
脱保護ｏｘＨＥＳアルデヒドをｒｈ−Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ溶液（反応緩衝液の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５中５ｍｇ／ｍｌ。同じアミノ酸配列を有し、Ａｍｇｅｎ、Ｍuｎｃｈｅｎ、Ｄによる市販のＮｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）と本質的に同じ特徴を有するＥ．ｃｏｌｉによって発現されたＧ−ＣＳＦ）と合せた。ＯｘＨＥＳアルデヒドを、Ｇ−ＣＳＦ濃度に対して（Ｍｎに基づいて）３０倍モル過剰で添加した。反応混合物の得られたＧ−ＣＳＦ濃度は１．９ｍｇ／ｍｌであり、ｏｘＨＥＳアルデヒド濃度は２０％（ｗ／ｖ）であった。還元的アミノ化反応は、還元剤２０ｍＭの最終濃度を得るために反応緩衝液中で作製した０．５Ｍ  ＮａＣＮＢＨ３溶液の添加によって開始した。完全に混合した後に、反応物を０℃にて一晩インキュベートした。
【０２９８】
反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１０）およびＣ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ）での逆相クロマトグラフィー（図１１）によって分析して、結合が成功したことを検証して、結合収率を決定した。溶離は、０．１％  ＴＦＡを含む酸性水／アセトニトリル勾配を使用して実施した。
【実施例８】
【０２９９】
ＨＥＳ１００／１．０−Ｎ−（３−プロピオアルデヒドジエチルアセタール）の調製
ＨＥＳ１００／１．０  １５ｇを酢酸ナトリウム緩衝液３５ｇ（ｐＨ＝５およびｃ＝１ｍｏｌ／ｌ）に溶解させて、１−アミノ−３，３−ジエトキシプロパン２．０７ｍｌはもちろんのこと、シアノ水素化ホウ素ナトリウム１．８８５ｇも添加した。反応混合物を６０℃にて１６〜２４時間撹拌して、水１００ｍｌで希釈し、水酸化ナトリウム希釈溶液で中和して、炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ＝９、ｃ＝１０ｍｍｏｌ／ｌ、４５サイクル）に対してはもちろんのこと、最後の５回の交換サイクルでは水に対しても、カットオフ１０，０００Ｄａの膜を使用する限外濾過によってワークアップした。精製および濃縮ＨＥＳ誘導体溶液（約２０重量％）は、カットオフが１０，０００Ｄａの膜を使用して６０℃の水酸化ナトリウム溶液（ｐＨ＝１２）で透析した。その後、生成物を凍結乾燥によって単離した。
【実施例９】
【０３００】
ＨＥＳ１００／１．０−Ｎ−（３−プロピオアルデヒド）の調製
実施例８からのＨＥＳ−Ｎ−（３−プロピオアルデヒドジエチルアセタール）１０ｍｇをｐＨ＝２のＨＣｌ水溶液１００ｍｌ（ｃ＝１０ｍｍｏｌ／ｌ）に溶解して、４０℃にて１６〜２４時間撹拌した。反応混合物は、ｐＨ＝２のＨＣｌ水溶液（１０サイクル）に対してはもちろんのこと、最後の５回の交換サイクルでは水に対しても、カットオフ１０，０００Ｄａの膜を使用する限外濾過によって精製した。生成物の単離は、凍結乾燥によって実施した。
【実施例１０】
【０３０１】
ＨＥＳからのＨＥＳ１００／１．０インターフェロンα（ＩＦＮａ）結合体の調製
実施例８で調製したアセタール４００ｍｇに、適切な量の１０ｍＭ  ＨＣｌを添加して、４０％（ｗ／ｖ）の溶液を得た。溶液を２１℃にて一晩撹拌しながらインキュベートして、アルデヒド官能基を脱保護した。ｐＨ値は、０．１Ｍ  ＮａＯＨの添加によって結合緩衝液で使用する値まで調整した。
【０３０２】
インターフェロンα（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用して組換えＤＮＡ技術によって製造した組換えヒトインターフェロンα−２ｂ、インターフェロンα−２ｂは１６５アミノ酸より成り、天然ヒトインターフェロンα−２ｂ（ｈＩＦＮ−ａｌｐｈａ−２ｂ）と同じアミノ酸配列を示す）を、限外濾過装置を使用して１６ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、好適な結合緩衝液（０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．０）中に移した。
【０３０３】
（Ｍｗに基づいて）５倍モル過剰のＨＥＳアルデヒドを７ｍｇ／ｍｌの反応混合物中の最終タンパク質濃度で使用した；ＨＥＳアルデヒド濃度は１８％（ｗ／ｖ）であった。脱保護したＨＥＳアルデヒドをタンパク質溶液と合せて、新たに調製したＮａＣＮＢＨ３溶液（結合緩衝液中０．５Ｍ）の添加によって還元的アミノ化を開始して、２０ｍＭの還元剤の最終濃度を得た。完全に混合した後に、反応物を５℃にて一晩インキュベートした。
【０３０４】
反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１２）およびＣ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ）での逆相クロマトグラフィーによって分析して、結合が成功したことを検証して、結合収率を決定した。溶離は、０．１％  ＴＦＡを含む酸性水／アセトニトリル勾配を使用して実施した。
【０３０５】
ＨＥＳ化ＩＦＮαを未反応化合物から、Ａｅｋｔａ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＳＰ  ＨＰカラムを使用するカチオン交換クロマトグラフィーによって分離した。溶離液Ａは、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０であり、溶離液Ｂは、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０であった。結合体および未修飾タンパク質の分離のための勾配は、２０ＣＶにて０％  Ｂ→５０％  Ｂであった（図１３）。
【０３０６】
標的タンパク質のＨＥＳ結合部位は、ＩＥＸ精製ＨＥＳタンパク質結合体のペプチドマッピングによって同定した。結合体は好適なプロテアーゼ（２％エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、ｐＨ８．６、３７℃、一晩）を使用して消化し、得られた断片は、ＴＦＡを含む酸性水／アセトニトリル勾配を使用して、Ｃ４カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ）による逆相クロマトグラフィーによって分離した。タンパク質のＨＥＳ化部位は、標的タンパク質単独の対照消化と比較した、クロマトグラムの各ペプチドの還元または消失によって間接的に同定できた。
【実施例１１】
【０３０７】
ＨＥＳからのＨＥＳ１００／１．０エリスロポエチン（ＥＰＯ）結合体の調製
実施例９からの脱保護ＨＥＳアルデヒドをＥＰＯ（ヒトＥＰＯのアミノ酸配列を有し、市販のＥｒｙｐｏ（登録商標）（Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｊａｎｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ）またはＮｅｏＲｅｃｏｒｍｏｎ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ）と本質的に同じ特徴を有する組換えヒトＥＰＯ）溶液（反応緩衝液の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５中１０ｍｇ／ｍｌ）と合せた。ＨＥＳアルデヒドを、ＥＰＯ濃度に対して（Ｍｎに基づいて）４０倍モル過剰で添加した。反応混合物の得られたＥＰＯ濃度は３．２ｍｇ／ｍｌであり、ＨＥＳアルデヒド濃度は３０％（ｗ／ｖ）であった。還元的アミノ化反応は、還元剤２０ｍＭの最終濃度を得るために反応緩衝液中で作製した０．５Ｍ  ＮａＣＮＢＨ３溶液の添加によって開始した。完全に混合した後に、反応物を５℃にて一晩インキュベートした。
【０３０８】
反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１４）およびＣ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ）での逆相クロマトグラフィーによって分析して、結合が成功したことを検証して、結合収率を決定した。溶離は、０．１％  ＴＦＡを含む酸性水／アセトニトリル勾配を使用して実施した。
【０３０９】
ＨＥＳ化ＥＰＯを未反応化合物から、Ａｅｋｔａ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＳＰ  ＨＰカラムを使用するカチオン交換クロマトグラフィーによって分離した。溶離液Ａは、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０であり、溶離液Ｂは、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０であった。結合体および未修飾タンパク質の分離のための勾配は、１３ＣＶにて０％  Ｂ→５２％  Ｂであった（図１５）。
【実施例１２】
【０３１０】
ＨＥＳからのＨＥＳ１００／１．０顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の調製
実施例９からの脱保護ＨＥＳアルデヒドをｒｈ−Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ溶液（反応緩衝液の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５中５ｍｇ／ｍｌ；同じアミノ酸配列を有し、Ａｍｇｅｎ、Ｍuｎｃｈｅｎ、Ｄによる市販のＮｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）と本質的に同じ特徴を有するＥ．ｃｏｌｉによって発現されたＧ−ＣＳＦ）と合せた。ＨＥＳアルデヒドを、Ｇ−ＣＳＦ濃度に対して（Ｍｎに基づいて）４０倍モル過剰で添加した。反応混合物の得られたＧ−ＣＳＦ濃度は１．３ｍｇ／ｍｌであり、ＨＥＳアルデヒド濃度は２０％（ｗ／ｖ）であった。還元的アミノ化反応は、還元剤２０ｍＭの最終濃度を得るために反応緩衝液中で作製した０．５Ｍ  ＮａＣＮＢＨ３溶液の添加によって開始した。完全に混合した後に、反応物を１０℃にて一晩インキュベートした。
【０３１１】
反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＣ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ）での逆相クロマトグラフィーによって分析して、結合収率を決定した。ＲＰ−ＨＰＬＣの溶離は、０．１％  ＴＦＡを含む酸性水／アセトニトリル勾配を使用して実施した。
【０３１２】
反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１６）およびＣ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ）での逆相クロマトグラフィー（図１７）によって分析して、結合が成功したことを検証して、結合収率を決定した。ＲＰ−ＨＰＬＣの溶離は、０．１％  ＴＦＡを含む酸性水／アセトニトリル勾配を使用して実施した。
【０３１３】
ＨＥＳ化Ｇ−ＣＳＦを未反応化合物から、Ａｅｋｔａ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＳＰ  ＨＰカラムを使用するカチオン交換クロマトグラフィーによって分離した。溶離液Ａは、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０であり、溶離液Ｂは、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０であった。結合体および未修飾タンパク質の分離のための勾配は、１５ＣＶにて０％  Ｂ→４０％  Ｂであった（図１８）。
【実施例１３】
【０３１４】
マウスでの薬力学的ｉｎ  ｖｉｖｏバイオアッセイ（実施例１１によるＨＥＳ−ＥＰＯ結合体）
Ｈａｒｌａｎ  Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ  ＧｍｂＨ（Ｂｏｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）より入手した、体重約１８〜２０グラムのＢａｌｂ  Ｃマウスを、室温２１℃および相対湿度５５％のＥｕｒｏ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｔｙｐ  ＩＩＩ（Ｌ×Ｂ×Ｈ  ４２５×２６６×１８５ｍｍ）ケージに集団で収容した（１ケージ当り最大１０匹）。「Ｔａｐｖｅｉ  Ｅｉｎｓｔｒｅｕ」４×４×１ｍｍ（アスペン材）をケージの底敷き材として使用した。さらに木毛を与えた。ケージは週１回、交換および清掃した。飲用水（ｐＨ３．８〜４の硫酸）を自由に与えた。動物ケージに番号を付けた。ケージ内では、動物の耳にマークを付け、さらに色分けした。処置開始の約１週間前の割当日に、最初の検診を実施した。健康な動物のみを使用した。
【０３１５】
実施例１１で得られたようなＨＥＳ  ＥＰＯ結合体、未修飾開始物質（ｒＨｕＥＰＯ）およびＡｍｇｅｎによるＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）は、試料のタンパク質含有率に基づいて１００μｇ／ｋｇ体重の投薬量にて群当り４匹のマウスで、単回ボーラスの皮下容量として試験した。ビヒクル対照としての同体積のＰＢＳが含まれていた。
【０３１６】
複数の時点（第０日、第３日、第６日、第９日、第１３日、第１６日、第２０日、および第２３日）において、全血約３０〜６０μｌの試料を尾静脈または眼球後静脈叢からＮａ−ヘパリンを含有する「Ｈａｅｍａｔｏｋｒｉｔ−Ｋａｐｉｌｌａｒｅｎ」（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ  Ｌａｂｏｒｇｅｒａｅｔｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて採取し、Ｈｅｔｔｉｃｈ  Ｈａｅｍａｔｏｃｒｉｔ  ２１０  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｔｕｔｔｌｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で全血を１０．０００ｒｐｍにて６分間遠心分離して、各全血試料のヘマトクリットを決定した。赤血球生成応答および期間は、時間の関数としてのヘマトクリットの機能変化［％］として監視した（図１９）。
【０３１７】
これらのデータは、ＥＰＯ、Ａｒａｎｅｓｐ（登録商標）またはＥＰＯ結合体を含有する試料すべてがヘマトクリットを上昇させることが可能であることを示している。Ａｒａｎｅｓｐ（登録商標）は開始物質と比較して効力を３〜４倍上昇させることが可能であり、ＨＥＳ  ＥＰＯ結合体はＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）と比較して効力を１．５〜２倍上昇させることが可能であった。
【実施例１４】
【０３１８】
マウスでの薬力学的ｉｎ  ｖｉｖｏバイオアッセイ（実施例５によるＨＥＳ−ＩＦＮα結合体）
実施例５に従って調製した１つのｏｘＨＥＸ１００／１．０インターフェロンα結合体を、実施例１３によるｉｎ  ｖｉｖｏアッセイで試験した。血清試料のＥＣ５０希釈を、静脈内注射後の時間に対して片対数プロットした。半減期は、指数関数適合曲線の傾きから計算した。試料の半減期は８．９時間であった（図２０を参照）。
【０３１９】
実施例５に従って調製したｏｘＨＥＳ１００／１．０インターフェロンα結合体の相対ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性は、図２１に示すイントロンＡと比較して、図２１に示す（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性の決定に関しては、下の実施例１６を参照）。
【実施例１５】
【０３２０】
マウスでの薬力学的ｉｎ  ｖｉｖｏバイオアッセイ（実施例１０によるＨＥＳ−ＩＦＮα結合体）
実施例１０に従って調製した３つのＨＥＸ１００／１．０インターフェロンα結合体を、実施例１３によるｉｎ  ｖｉｖｏアッセイで試験した。血清試料のＥＣ５０希釈の媒体を、静脈内注射後の時間に対して片対数プロットした。半減期は、指数関数適合曲線の傾きから計算した。試料の半減期は９．７時間であった（図２２を参照）。
【０３２１】
未修飾ＩＦＮαでは、血清の抗ウイルス活性が低すぎて血清半減期を計算できなかった。Ｋ．Ｒ．Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖａｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５４（２００２）ｐｐ．５７１−５８６では、ラットにおけるＩＦＮαの半減期（静脈内）は２時間と決定された。
【０３２２】
実施例１０に従って調製した３つのＨＥＳ１００／１．０インターフェロンα結合体の相対ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性は、図２３に示すイントロンＡと比較して、図２１に示す（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性の決定に関しては、下の実施例１６を参照）。
【実施例１６】
【０３２３】
試験手順の説明：インターフェロンα（実施例１４および１５）の抗ウイルス活性
細胞培養培地での試験品目の予備希釈の後に、２倍段階希釈物を調製した。９６ウェル・マイクロタイター・プレートにおいて、希釈したインターフェロンを−１希釈物当り４個複製で−新たにトリプシン処理したＭＤＢＫ細胞に添加した（１ウェル当り４０．０００細胞）。アッセイを３７℃にて２４時間インキュベートした（１ウェル当りの総体積：１７５μｌ）。
【０３２４】
続いて、希釈ＶＳＶ原液５０μＬを各ウェル（正の対照のウェルは除く）に添加すると、感染効率が０．１となった。
【０３２５】
以下の対照を各アッセイに含めた：インターフェロンの代わりにウイルスおよび細胞培養培地を収容した１２ウェル（負の対照）およびインターフェロンおよびウイルスの代わりに細胞培養培地を収容した１２ウェル（正の対照）。
【０３２６】
アッセイを３７℃にて４２時間インキュベートした。
【０３２７】
インキュベーション期間の終りに、各ウェルの細胞培養上清をＭＴＴの溶液５０μＬ（細胞培養物中少なくとも２ｍｇ／ｍＬ）。細胞を３時間インキュベートした。増殖細胞によって形成された紫色ホルマザンは、イソプロパノール／ＨＣｌ溶液１００μＬ（４０ｍＭ  ＨＣｌを含むイソプロパノール）を各ウェルに添加することによって可溶化した。続いて、溶液の吸収値をマイクロタイター・プレート・リーダーで５７０／６３０ｎｍにて測定した。
【０３２８】
インターフェロンおよびＶＳＶの存在下で増殖させたＭＤＢＫ細胞の増殖活性を、インターフェロンの各希釈物について以下のように計算した：
（（インターフェロン処置ウェル４個の平均吸収）−（負の対照の平均吸収））＊１００
（正の対照の平均吸収）−（負の対照の平均吸収）
【０３２９】
インターフェロンαの抗ウイルス活性を、試験品目それぞれの４回の別個のアッセイで決定した。
【０３３０】
上述のアッセイ系において、各結合体ＨＥＳ１００／１．０インターフェロンα結合体（それぞれ実施例１５および１０）およびｏｘＨＥＳ１００／１．０インターフェロンα結合体（それぞれ実施例１４および５）を、未修飾ＩＮＦα開始物質、すなわちイントロンＡと比較して試験した。物質のＣＰＥ濃度を計算した。
【実施例１７】
【０３３１】
本発明によるＨＥＳリンカ誘導体の調製
実施例１７において、本発明のＨＥＳリンカ誘導体を産生した。一方では、所与のリンカ構造に関して、ＨＥＳは平均分子量およびその分子分布について変化した。他方、所与のＨＥＳ開始物質では、リンカの化学的性質が変化した。
【０３３２】
以下の表１および２に示したＨＥＳの量を、激しい撹拌および中程度の加熱（４０℃まで）によって、酢酸ナトリウム緩衝液（１ｍｏｌ／ｌ、ｐＨ＝５）（「緩衝液Ｖ」の適切な量に溶解させた。透明溶液に表示した量のリンカ（ＨＥＳ種のＭｎを基準として４０当量）を添加した。いくつかの場合で、リンカの量は「ＤＭＦリンカ」溶液として添加される。したがって、必要量のリンカを少量のＤＭＦに溶解させて、表２に「ＤＭＦリンカ溶液Ｖ」として示す、生じた透明ＤＭＦリンカ溶液を反応混合物に添加した。最後に、ＮａＣＮＢＨ３量として示された固体ＮａＣＮＢＨ３を撹拌溶液に溶解させると、通例０．６Ｍの最終濃度が得られ、反応混合物を加熱して６０℃にて１８〜２４時間撹拌した。
【０３３３】
反応物をワークアップするために、混合物を超純水によって希釈して、最終濃度約１００ｍｇ／ｍｌ（１０％ｍ／Ｖ）ＨＥＳ誘導体を得て、カットオフが１０ｋＤａの膜および溶媒としての超純水を使用して限外濾過（ＵＦ）または透析（Ｄ）のどちらかによって精製した。リンカ（ａ２）および（ａ３）の場合、１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３緩衝液、ｐＨ＝９と、それに続く超純水を限外濾過に使用した。
【０３３４】
続いての脱保護では、精製ＨＥＳ誘導体溶液（１０％、１００ｍｇ／ｍｌ）を濃ＨＣｌ溶液によって酸性化して、適切な「ｐＨレベル」の「ｃ（ＨＣｌ）」を得た。混合物を撹拌して、４０℃にて反応時間「ｔ」にわたって加熱して、その後、中和して（ＮａＯＨ希釈）、適切な「ワークアップ溶媒」を使用して限外濾過（膜カットオフ１０ｋＤａ）によってワークアップし、最後に凍結乾燥して、白色から黄色がかった粉末を得た。
【０３３５】
誘導体化は、標的分子（ケンプチド、以下の実施例１８、表３、４、および５を参照）への結合の成功によって検証された。リンカ（ａ１５）および（ａ１０）を使用して調製したＨＥＳ誘導体では、誘導体化の成功はスペクトル特性によって確認した。上述のように調製したＨＥＳ誘導体すべてを、実施例１８で表３、４、および５に挙げた標的への結合に使用した。
【０３３６】
表１および２で使用した省略形
Ｄ  透析
ＤＭＦ  ジメチルホルムアミド
ＨＥＳ  ヒドロキシエチルデンプン
ＨＣｌ  塩酸
ＮａＣＮＢＨ３  シアノ水素化ホウ素ナトリウム
ＮａＯＨ  水酸化ナトリウム
ＵＦ  限外濾過
Ｖ  体積
Ｗａｔｅｒ  超純水（ｍｉｌｌｉＱ）
【０３３７】
ＨＥＳ１００／１．０およびリンカ構造（ａ２）のＨＥＳ誘導体は、本発明の実施例８および９に従って調製した。リンカ構造（ａ２）は、上で定義したような構造（ａ２）に、すなわち１−アミノ−３，３−ジエトキシプロパンに関する。
【化２２０】
0005486507.tif 000225
【０３３８】
【表１Ａ】
0005486507.tif 000226
【表１Ｂ】
0005486507.tif 000227
【０３３９】
【表２Ａ】
0005486507.tif 000228
【表２Ｂ】
0005486507.tif 000229
【実施例１８】
【０３４０】
本発明によるＨＥＳリンカ生物活性剤誘導体の調製
以下の表３、４、および５に示すような標的分子の量を適切な反応緩衝液中に移した。ＨＥＳリンカ誘導体の表示量（リンカおよびＨＥＳ種によって定義）を反応緩衝液に溶解させて、標的物質溶液と混合した。ＮａＣＮＢＨ３を−通例、反応緩衝液中の新たに調製した０．５Ｍ原液として−通例２０ｍＭの最終濃度まで添加した。反応混合物を温度制御下で、温度「ｒｘｎ  Ｔ」にて反応時間「ｒｘｎ  ｔ」にわたってインキュベートした。
【０３４１】
最終反応体積（「ｒｘｎ  Ｖ」）ならびに反応物質の得られた濃度および比を表３、４、および５に示す。
【０３４２】
結合反応が成功したことは、クロマトグラフィー分析（ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥ−ＨＰＬＣ）またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ（選択した誘導体について図２８〜３３）によって示された。本明細書に記載したすべての結合反応において、標的ＨＥＳ結合体が検出可能であった。各種の標的分子の反応条件は最適化されなかった。
【０３４３】
使用した省略形
ｒｈＩＦＮα：組換えヒトインターフェロンα２ｂ
ｒｈＥＰＯ：組換えヒトエリスロポエチン
ｒｈＧ−ＣＳＦ：追加のＮ末端メチオニンを含む組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子
ｒｈＦＩＸ：組換えヒト凝固第ＩＸ因子
ｒｈＦＶＩＩａ：組換えヒト凝固第ＶＩＩａ因子
ｒｈＧＨ：組換えヒト成長ホルモン
ｈＦａｂ：ヒト免疫グロブリンＧ分子に由来するＦａｂ断片
ｍＩｇＧ：マウス免疫グロブリンＧ
ＧＬＰ−１：グルカゴン様ペプチド−１；アミノ酸１〜３７
ｒＡｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ：Ｅ．ｃｏｌｉからの組換えアスパラギナーゼ
ＮＨ２−ＤＮＡ：配列ＧＧＣ  ＴＡＣ  ＧＴＣ  ＣＡＧ  ＧＡＧ  ＣＣＡ  ＣＣＴを有する５’−アミノヘキシルスペーサ持つオリゴヌクレオチド
ｒｈＬｅｐｔｉｎ：組換えヒトレプチン
ＡｍｐｈｏＢ：アンホテリシンＢ、ＣＡＳ  Ｎｏ．１３９７−８９−３
Ｋｅｍｐｔｉｄｅ：Ｔｒｐ４−ケンプチド（Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ）、ＣＡＳ  Ｎｏ．８０２２４−１６−４
ＮａＯＡｃ：酢酸ナトリウム含有緩衝液
ＨＥＰＥＳ：４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、ＣＡＳ  Ｎｏ．７３６５−４５−９
【０３４４】
【表３Ａ】
0005486507.tif 000230
【表３Ｂ】
0005486507.tif 000231
【０３４５】
【表４Ａ】
0005486507.tif 000232
【表４Ｂ】
0005486507.tif 000233
【０３４６】
【表５Ａ】
0005486507.tif 000234
【表５Ｂ】
0005486507.tif 000235
【０３４７】
追加データ
（Ａ．１）ＨＢＳ  ７ｋＤａからのｏｘＨＢＳ−Ｎ−（３−プロピオアルデヒドジエチルアセタール）の調製
超分枝デンプン（ＨＢＳ）アルドン酸は、国際公開第２００５／０８３１０３号パンフレットの実施例９に従って、超分枝デンプン（Ｍｗ＝７０００ダルトン（７ｋＤａ）、平均分枝度：１５ｍｏｌ％）から開始して合成した。得られたアルドン酸を８０℃にて２４時間乾燥することによって、対応するラクトンに変換した（省略形「ｏｘＨＢＳ」は、ＨＢＳアルドン酸はもちろんのこと、対応するラクトンも指す）。
【０３４８】
ラクトン５ｇを１−アミノ−３，３−ジエトキシプロパン１５ｍｌおよび無水ＤＭＦ  １０ｍｌに溶解させて、７０℃にて４８時間撹拌した。過剰な１−アミノ−３，３−ジエトキシプロパンおよびＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）を真空下で蒸発させて、得られた薄黄色固体を黄色が消えるまでアセトンで洗浄した。生成物を水に溶解させて、濾液のｐＨが＞６の値に達するまでカットオフが１０００ダルトンの膜を利用する限外濾過によって精製した。
【０３４９】
未透過物を酸性カチオン交換樹脂（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）１２０）２ｇによって処理して、樹脂を濾過し、残りの溶液を凍結乾燥させた。
【０３５０】
化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは１．７ｐｐｍに三重項を、１．２ｐｐｍに多重項を示し、リンカ化合物（１−アミノ−３，３−ジエトキシプロパン）の残基の窒素原子に対するα位のメチル基およびメチレン基を提示する。
【０３５１】
（Ａ．２）ｏｘＨＢＳ  ７ｋＤａ−ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）結合体の調製
（Ａ．１）で調製したアセタール７５０μｇを０．０１Ｎ  ＨＣｌに溶解させた。ｐＨを１Ｎ  ＨＣｌで２．０に調整して、反応混合物を２１℃にて１８時間撹拌した。酢酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．０）中の１％  ＢＳＡ溶液２ｍｌを、先に調製した混合物２００μｌに添加した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム１４０ｍｇを０．１Ｎ酢酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．０）０．５ｍｌに溶解させて、分割量５０ｍｌを反応混合物にただちに添加した。反応混合物を４℃で１５時間貯蔵した。サイズ排除クロマトグラフィーによる反応混合物の分析によって、９０％のＨＢＳ−ＢＳＡ結合体の反応収率が明らかになった。（図２４）
【０３５２】
（Ａ．３）ｏｘＨＢＳ  ６５ｋＤａ−インターフェロンα結合体の調製
（Ａ．１）と同様に調製した６５ｋＤａ  ＨＢＳ−Ｎ−（３−プロピオアルデヒドジエチルアセタール）４００ｍｇに、適切な量の１０ｍＭ  ＨＣｌを添加して、濃度４０％（ｗ／ｖ）およびｐＨ値２の溶液を得た。溶液を２１℃にて一晩撹拌しながらインキュベートして、アルデヒド官能基を脱保護した。ｐＨ値は、結合前に０．１Ｍ  ＮａＯＨの添加によって結合緩衝液で使用する値まで調整した。
【０３５３】
インターフェロンα（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用して組換えＤＮＡ技術によって製造した組換えヒトインターフェロンα−２ｂ、インターフェロンα−２ｂは１６５アミノ酸より成り、天然ヒトインターフェロンα−２ｂ（ｈＩＦＮ−ａｌｐｈａ−２ｂ）と同じアミノ酸配列を示す）は、限外濾過装置を使用して１６ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、好適な結合緩衝液（０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．０）中に移した。
【０３５４】
（Ｍｗに基づいて）１０倍モル過剰のｏｘＨＢＳアルデヒドを６ｍｇ／ｍｌの反応混合物中の最終タンパク質濃度で使用した；ｏｘＨＥＳアルデヒド濃度は２０％（ｗ／ｖ）であった。脱保護したｏｘＨＢＳアルデヒドをタンパク質溶液と合せて、新たに調製したＮａＣＮＢＨ３溶液（結合緩衝液中０．５Ｍ）の添加によって還元的アミノ化を開始して、２０ｍＭの還元剤の最終濃度を得た。
【０３５５】
反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２５）およびＣ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ）での逆相クロマトグラフィーによって分析して、結合が成功したことを検証して、結合収率を決定した。溶離は、０．１％  ＴＦＡを含む酸性水／アセトニトリル勾配を使用して実施した。
【０３５６】
ＨＢＳ−インターフェロンαを未反応化合物から、Ａｅｋｔａ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＱ  ＨＰカラムを使用するアニオン交換クロマトグラフィーによって分離した。溶離液Ａは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ、ｐＨ８．０であり、溶離液Ｂは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０であった。結合体および未修飾タンパク質の分離のための勾配は、１６ＣＶにて０％  Ｂ→５０％  Ｂであった（図２６）。
【０３５７】
（Ａ．４）ｏｘＨＢＳ  ６５エリスロポエチン（ＥＰＯ）結合体の調製
（Ａ．１）と同様に調製した６５ｋＤａ  ＨＢＳ−Ｎ−（３−プロピオアルデヒドジエチルアセタール）４００ｍｇに、適切な量の１０ｍＭ  ＨＣｌを添加して、濃度４０％（ｗ／ｖ）の溶液を得た。溶液を２１℃にて一晩撹拌しながらインキュベートして、アルデヒド官能基を脱保護した。ｐＨ値は、０．１Ｍ  ＮａＯＨの添加によって結合緩衝液で使用する値まで調整した。
【０３５８】
脱保護ｏｘＨＢＳアルデヒドをＥＰＯ（ヒトＥＰＯのアミノ酸配列を有し、市販のＥｒｙｐｏ（登録商標）（Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｊａｎｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ）またはＮｅｏＲｅｃｏｒｍｏｎ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ）と本質的に同じ特徴を有する組換えヒトＥＰＯ）溶液（反応緩衝液の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５中１０ｍｇ／ｍｌ）と合せた。ＯｘＨＢＳアルデヒドを、ＥＰＯ濃度に対して２０倍のモル過剰（Ｍｗに基づいて）で添加した。反応混合物の得られたＥＰＯ濃度は４．６ｍｇ／ｍｌであり、ｏｘＨＢＳアルデヒド濃度は２０％（ｗ／ｖ）であった。還元的アミノ化反応は、還元剤２０ｍＭの最終濃度を得るために反応緩衝液中で作製した０．５Ｍ  ＮａＣＮＢＨ３溶液の添加によって開始した。完全に混合した後に、反応物を１０℃にて一晩インキュベートした。
【０３５９】
反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２７）およびＣ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ）での逆相クロマトグラフィー（図Ａ．４−１）によって分析して、結合が成功したことを検証して、結合収率を決定した。溶離は、０．１％  ＴＦＡを含む酸性水／アセトニトリル勾配を使用して実施した。
【図１】
0005486507.tif 000272
【図２】
0005486507.tif 000273
【図３】
0005486507.tif 000274
【図４】
0005486507.tif 000275
【図５】
0005486507.tif 000276
【図６】
0005486507.tif 000277
【図７】
0005486507.tif 000278
【図８】
0005486507.tif 000279
【図９】
0005486507.tif 000280
【図１０】
0005486507.tif 000281
【図１１】
0005486507.tif 000282
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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