(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下に示す式(15)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 15
CKEYFYTSSKSSNLAVVFVTRC (15). (SEQ ID NO.15)
を有する、ポリペプチドおよび／またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
以下に示す式(2)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 2
CKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRC (2) (SEQ ID NO.2).
を有する、ポリペプチドおよび／またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
以下に示す式(3)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 3
CKEYFYTSGKSSNPGIVFITRC (3). (SEQ ID NO.3).
を有する、ポリペプチドおよび／またはその薬学的に許容される塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチド、その薬学的に許容される塩、誘導体、および/または結合体、医薬を製造するためのその使用、ならびに該医薬に関する。本ポリペプチドは、単球の漸増を伴う疾患の処置に適している。
【背景技術】
【０００２】
動脈血管の動脈硬化によって、心血管疾患の形態学的バックグラウンドが形成される。ここで、単球の最初の漸増は、初期の動脈硬化病変の発生のために決定的に重要である。内皮への単球の接着、いわゆる単球停止（monocyte arrest）が、動脈硬化、狭窄、および血栓症などの心血管疾患の病因発生の開始の際に起こる。RANTES（regulated on activation, normal T cell expressed and secreted）などのケモカインはこれらのプロセスに関連するシグナル分子であることが知られている。
【０００３】
先行技術において公知の第一次および第二次の予防とは、まず何よりも脂質低下処置、ならびに、アスピリンまたはクロピドグレルなどの処方による血小板の凝集および活性化の阻害である。これらの処方による処置の欠点とは、第一に、これらがごく僅かな特異性しか示さないこと、および第二に、これらの処方がミオパシーおよび出血リスクの増大などの重篤な副作用を伴うことである。
【０００４】
さらに、先行技術においては、RANTESペプチドアンタゴニストの使用が知られている。例えば、DE 100 14 516 A1では、RANTES受容体CCR1に対するアンタゴニストとしてのmetRANTESの使用が開示されている。このアンタゴニストの使用における欠点とは、いくつかの生理学的プロセスにおいてシグナル分子としてケモカインが関与し、これにより、そのようなアンタゴニストの使用によって予測できない数の生理学的プロセスが影響を受け、多くの副作用および結果が起こりうることである。
【発明の開示】
【０００５】
本発明の課題は、先行技術の欠点の少なくとも1つを克服するための作用物質を提供することであった。特に、本発明の課題は、特異性の改善された作用物質を提供することであった。
【０００６】
この課題は、ポリペプチド、その薬学的に許容される塩、誘導体、および/または結合体によって解決され、ここで該ポリペプチドは、以下に示す式(1)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 1
0005385611.tif 000002
を有する：
式中、
X1は、リシン、グルタミン、アルギニン、ヒスチジン、および/もしくはアスパラギンを含む群より選択されるか、またはアミノ酸欠失であり；
X2は、グルタミン酸、アスパラギン酸、および/もしくはグルタミンを含む群より選択されるか、またはアミノ酸欠失であり；
X3は、グリシン、セリン、および/またはアラニンを含む群より選択され；
X4は、リシン、ロイシン、および/またはアルギニンを含む群より選択され；
X5は、セリン、システイン、グリシン、および/またはスレオニンを含む群より選択され；
X6は、セリン、グリシン、および/またはスレオニンを含む群より選択され；
X7は、アスパラギンおよび/またはグルタミンを含む群より選択され；
X8は、プロリン、チロシン、および/またはグリシンを含む群より選択され；
X9は、グリシン、アラニン、および/またはセリンを含む群より選択され；
X10は、イソロイシン、バリン、および/またはアスパラギンを含む群より選択され；
X11は、バリン、イソロイシン、および/またはアスパラギンを含む群より選択され；
X12は、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、および/またはメチオニンを含む群より選択され；
X13は、イソロイシン、バリン、ロイシン、メチオニン、および/またはフェニルアラニンを含む群より選択され；
X14は、スレオニン、グリシン、アラニン、セリン、および/またはチロシンを含む群より選択され；
X15は、アルギニン、リシン、グルタミン、ヒスチジン、および/もしくはアスパラギンを含む群より選択されるか、またはアミノ酸欠失である。
【０００７】
好都合なことに、本発明のポリペプチドは、RANTESと血小板第4因子との間の相互作用に対するアンタゴニストとして適している。
【０００８】
本発明によると、「RANTESと血小板第4因子との間の相互作用に対するアンタゴニスト」という用語は、RANTESと血小板第4因子との間の相互作用に対するアンタゴニストとして作用することのできるペプチド、タンパク質、またはその他の化合物を意味する。
【０００９】
驚くべきことに、本発明によるポリペプチドが、ケモカインであるRANTESと血小板第4因子（PF4）との相互作用により媒介される単球の漸増に対する特異的作用を有しうることが、発見された。本発明のポリペプチドがケモカインの数多くの機能に対してほとんどまたは全く影響しないことは、特別な利点である。例えば内皮上で単球の漸増の選択的阻止が達成できることは、特に有益である。
【００１０】
本発明の意味において、「単球の漸増」という用語は、内皮へのまたは内皮からの単球の移動、例えば内皮組織への、それらの接着および伝播を含む。単球の接着は、単球付着としても知られており、または、例えば血液キャピラリー、微小血管または動脈の流線において、生理学的条件下としての剪断流れにおいて接着が生じた場合の単球停止としても知られている。
【００１１】
ケモカインであるRANTESおよびPF4により媒介される多くの代謝プロセス、例えば免疫系または凝固系に対して、本発明のポリペプチドが高い特異性を提供できることおよび副作用をほとんどまたは全く示さないことは、主要な利点である。特に、本発明のポリペプチドを投与することによって、心血管疾患に対する従来の処方と同様に、出血リスクを回避することができる。
【００１２】
本明細書で使用されるアミノ酸の通例の一文字コードに沿って、本明細書において「C」とは、アミノ酸であるシステインを表し、かつしたがって「Y」はチロシン、「F」はフェニルアラニン、「T」はスレオニン、「S」はセリンを表す。
【００１３】
本明細書のポリペプチドは、アミノ末端およびカルボキシ末端それぞれにシステイン残基を有するが、これらはポリペプチドを環へと形成するために利用可能である。環状ポリペプチドが改善された安定性を有することは、特に有益である。本発明のポリペプチドはより長い有効性を有することができ、かつしたがって、より少量で使用可能である。
【００１４】
本明細書において、「ポリペプチド」という用語は、合成または非合成のペプチド化合物、および、天然タンパク質、未変性型のまたは組み換え体のペプチドまたはタンパク質の、精製され、修飾された断片を意味する。同様に、本発明において「ポリペプチド」という用語は、対応するポリペプチドの薬理学的に許容される塩、薬理学的に許容される誘導体および/または結合体も含む。
【００１５】
好ましい薬理学的に許容される誘導体とは、例えば、エステル、アミド、N-アシルおよび/またはO-アシル誘導体、カルボキシル化、アセチル化、リン酸化、および/またはグリコシル化ポリペプチドである。好ましい結合体とは、例えば、糖またはポリエチレングリコール結合体、ビオチン化された、放射性標識された、または蛍光標識されたポリペプチドである。
【００１６】
好ましくは、本ポリペプチドは25アミノ酸以下の長さを有する。なるべくならば、本ポリペプチドは、15アミノ酸以上〜25アミノ酸以下の範囲内、好ましくは15アミノ酸以上〜22アミノ酸以下の範囲内のいくつかのアミノ酸を有する。研究の際に、本ポリペプチドの長さがその有効性に対して影響を有しうることを立証することができた。特に、この長さのアミノ酸配列が単球停止の阻害を発揮できることは驚くべきことである。
【００１７】
好ましい態様において、本ポリペプチドは、18アミノ酸以上〜23アミノ酸以下の範囲内の、より好ましくは18アミノ酸以上〜22アミノ酸以下の範囲内のいくつかのアミノ酸を有し、特に好ましい態様において、本ポリペプチドは19アミノ酸以上〜22アミノ酸以下の範囲内（の数）を有し、より好ましい態様において、本ポリペプチドは20アミノ酸以上〜21アミノ酸以下の範囲内（の数）を有する。特に非常に好ましくは、本ポリペプチドは22アミノ酸を有する。本発明の意味において「アミノ酸の数」という用語は、当然ながら、ポリペプチドのアミノ酸配列の長さという意味を含む。
【００１８】
本発明のポリペプチドの好ましい態様において、X1はリシンに対応するか、またはX1部位においてアミノ酸配列が欠失しており、特に好ましくは、X1はアミノ酸であるリシンに対応する。さらに、本ポリペプチドの好ましい態様においてX2はアミノ酸であるグルタミン酸に対応するか、またはアミノ酸欠失である。特に好ましくは、X2はアミノ酸であるグルタミン酸に対応する。驚くべきことに、部位X1および/またはX2における欠失を有するポリペプチドは、拮抗作用を示すことができる。X1およびX2がアミノ酸欠失に対応することが提供されうる。
【００１９】
好ましくは、X3は、小さな、中性の、柔軟な（flexible）アミノ酸に対応する。本ポリペプチドの好ましい態様において、X3は、グリシンおよび/またはセリンを含む群より選択され、特に好ましくは、X3はアミノ酸であるグリシンに対応する。これらのアミノ酸が本ポリペプチドの構造の安定性に対して正の影響を有することを立証することができる。本ポリペプチドの改善された安定性は、本ポリペプチドとケモカインPF4との長期の相互作用をもたらしうるので、そのような安定性の増大は特に有益である。したがって、本ポリペプチドの安定化の改善は、本ポリペプチドの拮抗特性を増強することができる。
【００２０】
本ポリペプチドの好ましい態様において、X4はアミノ酸であるリシンに対応する。
【００２１】
好ましくは、X5は、セリン、グリシン、および/またはスレオニンを含む群より選択される。本ポリペプチドの特に好ましい態様において、X5はセリンに対応する。本ポリペプチドのこの態様は、好都合なことに、本ポリペプチドの溶解性の改善につながりうる。本ポリペプチドの改善された溶解性は、特に、本ポリペプチドの水中でのより優れた適用性につながりうる。これによって、水を基剤とする従来の分散法における本ポリペプチドの単純な投与が可能になる。さらに、本ポリペプチドの改善された溶解性のおかげで、体内の水性の系、特に血液におけるポリペプチドの改善された分布を提供することができる。
【００２２】
好ましくは、X6はアミノ酸であるセリンに対応する。本ポリペプチドのさらに好ましい態様において、X7はアミノ酸であるアスパラギンに対応する。
【００２３】
好ましくは、X8は、プロリンおよび/またはチロシンを含む群より選択されるアミノ酸に対応する。特に好ましくは、X8はアミノ酸であるプロリンに対応する。
【００２４】
本ポリペプチドの特に好ましい態様において、X9はグリシンに対応する。本アミノ酸配列のこの位置におけるアミノ酸であるグリシンが驚くべきことに安定なポリペプチド結合をもたらしうることを立証することができる。
【００２５】
好ましくは、X10およびX13はそれぞれ独立して、バリンおよび/またはイソロイシンを含む群より選択される。本ポリペプチドの好ましい態様において、X10はイソロイシンに対応する。本ポリペプチドのさらに好ましい態様において、X13はイソロイシンに対応する。本ポリペプチドの特に好ましい態様において、X10およびX13はイソロイシンに対応する。本ポリペプチドのX10およびX13の位置におけるイソロイシンが本ポリペプチドの立体構造の安定性の改善をもたらしうることを立証することができる。
【００２６】
好ましくは、X11はアミノ酸であるバリンに対応する。好ましくは、X12は、フェニルアラニンおよび/またはチロシンを含む群より選択され、特に好ましくは、X12はアミノ酸であるフェニルアラニンに対応する。好ましくは、X14はアミノ酸であるスレオニンに対応する。
【００２７】
好ましくは、X15はアルギニンに対応し、さらに、本アミノ酸配列の部位X15におけるアミノ酸欠失を提供することができる。好ましいアミノ酸欠失は、X1、X2、および/またはX15を含む。好ましくは、X1、X2、X15のアミノ酸のうち1つを欠失することができるが、しかし、部位X1およびX2においてアミノ酸欠失が提供されることも規定されうる。さらなる態様において、部位X1、X2、およびX15における欠失が提供されうる。本ポリペプチドの好ましい態様において、アミノ酸X3〜X14の領域内に欠失は提供されない。
【００２８】
本ポリペプチドの好ましい態様において、X5はアミノ酸であるセリンに、X9はグリシンに、X10はイソロイシンに、かつ/またはX13はイソロイシンに対応する。本ポリペプチドの特に好ましい態様において、アミノ酸X5はセリンに、X9はグリシンに、X10はイソロイシンに、かつX13はイソロイシンに対応する。アミノ酸X5がセリンに対応し、X9がグリシンに対応し、X10がイソロイシンに対応し、かつX13がイソロイシンに対応するポリペプチドが特に優れた潜在的拮抗能力を有することを立証することができる。
【００２９】
本ポリペプチドのさらに好ましい態様において、アミノ酸X5がセリンに、X9がグリシンに、X10がイソロイシンに、X13がイソロイシンに、X1がアミノ酸欠失に、かつ/またはX15がアミノ酸欠失に対応する。本ポリペプチドの特に好ましい態様において、アミノ酸X5がセリンに、X9がグリシンに、X10がイソロイシンに、X13がイソロイシンに、X1がアミノ酸欠失に、かつX15がアミノ酸欠失に対応する。このポリペプチドは同様に、特に優れた潜在的拮抗能力を有しうる。
【００３０】
本ポリペプチドのさらに別の好ましい態様において、アミノ酸X5がセリンに、X8がチロシンに、X9がグリシンに、X10がイソロイシンに、X13がイソロイシンに、X1がアミノ酸欠失に、かつ/またはX15がアミノ酸欠失に対応する。本ポリペプチドの特に好ましい態様において、アミノ酸X5がセリンに、X8がチロシンに、X9がグリシンに、X10がイソロイシンに、X13がイソロイシンに、X1がアミノ酸欠失に、かつX15がアミノ酸欠失に対応する。
【００３１】
本ポリペプチドの別の好ましい態様において、アミノ酸X3がセリンに、X5がセリンに、X8がチロシンに、X9がグリシンに、X10がイソロイシンに、X13がイソロイシンに、X1がアミノ酸欠失に、かつ/またはX15がアミノ酸欠失に対応する。本ポリペプチドの特に好ましい態様において、アミノ酸X3がセリンに、X5がセリンに、X8がチロシンに、X9がグリシンに、X10がイソロイシンに、X13がイソロイシンに、X1がアミノ酸欠失に、かつX15がアミノ酸欠失に対応する。
【００３２】
本ポリペプチドのさらに別の好ましい態様において、アミノ酸X3がセリンに、X5がセリンに、X8がプロリンに、X9がグリシンに、X10がイソロイシンに、X13がイソロイシンに、X1がアミノ酸欠失に、X2がアミノ酸欠失に、かつ/またはX15がアミノ酸欠失に対応する。本ポリペプチドの特に好ましい態様において、アミノ酸X3がセリンに、X5がセリンに、X8がプロリンに、X9がグリシンに、X10がイソロイシンに、X13がイソロイシンに、X1がアミノ酸欠失に、X2がアミノ酸欠失に、かつX15がアミノ酸欠失に対応する。
【００３３】
本ポリペプチドのさらに好ましい態様において、アミノ酸X3がセリンに、X5がセリンに、X8がチロシンに、X9がグリシンに、X10がイソロイシンに、X12がチロシンに、X13がイソロイシンに、X1がアミノ酸欠失に、X2がアミノ酸欠失に、かつ/またはX15がアミノ酸欠失に対応する。本ポリペプチドの特に好ましい態様において、アミノ酸X3がセリンに、X5がセリンに、X8がチロシンに、X9がグリシンに、X10がイソロイシンに、X12がチロシンに、X13がイソロイシンに、X1がアミノ酸欠失に、X2がアミノ酸欠失に、かつX15がアミノ酸欠失に対応する。
【００３４】
本ポリペプチドのさらに好ましい態様において、本ポリペプチドが、以下に示す式(2)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 2
0005385611.tif 000003
を有し、かつ/または、式(2)に記載のSEQ ID NO: 2のポリペプチドが、式(2)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 2に対して少なくとも1つまたは複数のアミノ酸欠失、アミノ酸置換、および/またはアミノ酸挿入を有することが提供されうる。
【００３５】
好ましくは、アミノ酸置換は、式(2)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 2の9〜20番目のアミノ酸の配列領域である、位置9のアミノ酸であるグリシン〜位置20のスレオニンのアミノ酸配列の領域を含む。好ましくは、グリシン、システイン、プロリン、バリン、フェニルアラニン、および/またはアラニンを含む群より選択されるアミノ酸の1つまたは複数が、セリン、チロシン、イソロイシン、および/またはグリシンを含む群より選択されるアミノ酸で置換される。これらのアミノ酸置換の1つの利点とは、これらが本ポリペプチドの安定性を強化できかつ/または本ポリペプチドの拮抗作用を改善できることである。
【００３６】
好ましくは、これらのアミノ酸置換は、グリシンをセリンで、非末端位置のシステインをセリンで、プロリンをチロシンで、バリンをイソロイシンで、フェニルアラニンをチロシンで、および/または、アラニンをグリシンで置換することを含む置換から選択される。これらのアミノ酸置換は、望ましい任意の様式で互いに組み合わせることができる。
【００３７】
特に、少なくとも式(2)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 2の部位11における非末端位置のシステインをセリンと交換することが好ましい。好都合なことに、そのような置換は本ポリペプチドの溶解性、特に水中での溶解性の改善をもたらしうる。
【００３８】
式(2)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 2のポリペプチドの態様において、好ましくは、グリシンをセリンで、システインをセリンで、および/またはプロリンをチロシンで置換することを含む置換から選択されるアミノ酸置換が、式(2)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 2の、グリシンからプロリンまでの配列領域である9番目〜14番目のアミノ酸を含むことが特に好ましい。好ましくは、この領域はこれらの置換の少なくとも1つを有し、好ましくは少なくとも、式(2)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 2の位置11のシステインがセリンで置換される。さらに、別の好ましい態様において、プロリンをチロシンと交換し、かつ/またはグリシンをセリンと交換する。アミノ酸配列の位置11におけるシステインの置換は、任意で、さらなる置換と、特にプロリンとチロシンの交換および/またはグリシンとセリンの交換と組み合わせることができる。
【００３９】
同様に、アミノ酸置換が、式(2)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 2のポリペプチドの15〜20番目のアミノ酸であるアラニン〜スレオニンの領域を含むことが、これらの態様において好ましい。この領域のアミノ酸の好ましいアミノ酸置換は、アラニンをグリシンで、バリンをイソロイシンで、および/またはフェニルアラニンをチロシンで置換することを含む置換から選択される。特に、アラニンをグリシンと交換することが好ましい。少なくとも式(2)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 2の位置16のバリンをイソロイシンと交換し、好ましくは少なくとも2つのバリンをイソロイシンと交換し、好ましくは位置16および19のバリンをイソロイシンと交換することが好ましい。式(2)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 2の各バリンをイソロイシンで交換することも好ましい。本ポリペプチドのさらに好ましい態様において、フェニルアラニンをチロシンと交換することが提供されうる。
【００４０】
さらに、これらの態様において、式(2)に記載の配列SEQ ID NO: 2の位置15のアラニンをグリシンと交換し、位置16のバリンをイソロイシンと交換し、位置19のバリンをイソロイシンと交換することが好ましい。驚くべきことにこれらの置換によって安定なポリペプチド結合がもたらされることを示すことが可能である。
【００４１】
置換および/またはアミノ酸欠失を、望ましい任意の様式で互いに組み合わせることができ、特に置換を、望ましい任意の様式で互いに組み合わせることができる。
【００４２】
さらに、これらの態様におけるポリペプチドはアミノ酸の欠失を有しうる。好ましいアミノ酸欠失は、アミノ酸であるリシン、グルタミン、および/またはアルギニンの欠失を含む。好ましくは、欠失は、式(2)に記載の配列SEQ ID NO: 2の位置2におけるアミノ酸であるリシン、式(2)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 2の位置3におけるアミノ酸であるグルタミン、および/または位置21におけるアルギニンを含む。欠失は、望ましい任意の様式で互いに組み合わせることができる。1アミノ酸が欠失することが好ましいが、位置2のリシンおよび位置21のアルギニンの両方が欠失することも提供されうる。さらなる態様において、位置2のリシン、位置3のグルタミン、および位置21のアルギニンを欠失することができる。
【００４３】
好ましくは、式(2)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 2の4〜20番目のアミノ酸の領域内に欠失は提供されない。特に好ましい態様において、4〜8番目のアミノ酸の領域内のアミノ酸は、アミノ酸欠失もアミノ酸置換も含まない。研究の際に、式(2)に記載の配列SEQ ID NO: 2の9〜20番目のアミノ酸の領域内に少なくとも2つのアミノ酸置換を、好都合には3つのアミノ酸置換を、さらに好ましくは4つのアミノ酸置換を、さらにより好ましくは5つのアミノ酸置換をこの領域内に有するアミノ酸配列が優れた拮抗特性を有することを立証することができた。
【００４４】
好都合なことに、本態様のポリペプチドのアミノ酸の数は、15アミノ酸以上〜25アミノ酸以下の範囲内であり、好ましくは18アミノ酸以上〜23アミノ酸以下の範囲内であり、特に好ましくは19アミノ酸以上〜22アミノ酸以下の範囲内であり、より好ましくは20アミノ酸以上〜21アミノ酸以下の範囲内であり、さらに特に好ましくは22アミノ酸である。
【００４５】
本発明のポリペプチド、その薬学的に許容される塩、誘導体、および/または結合体の特に適切な態様は、以下の式(3)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 3を有する。
0005385611.tif 000004
【００４６】
研究の際に、式(3)に示すアミノ酸配列SEQ ID NO: 3を有するポリペプチドが特に高い潜在的拮抗能力を有することを示すことができた。特に、本ポリペプチドが特に優れた拮抗作用を有しうることを示すことができた。特に、式(3)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 3を有するポリペプチドが、単球停止の増強を引き起こすRANTESとPF4との相互作用を有意かつ再現性よく阻害できることを示すことができた。
【００４７】
式(3)に示すアミノ酸配列SEQ ID NO: 3のポリペプチドがRANTESとPF4との相互作用に対して特異的に作用できることは、特別な利点である。したがって、ケモカインの機能へのさらなる干渉を緩和できるか、さらには予防できる。これによって、単球の漸増または好酸球などのその他の白血球集団のRANTES依存的漸増を伴う疾患、特に心血管疾患の処置における、本ポリペプチドの標的化使用が可能になる。
【００４８】
本発明のポリペプチド、その薬学的に許容される塩、誘導体、および/または結合体の別の好ましい態様は、以下に示す式(4)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 4を有する。
0005385611.tif 000005
【００４９】
本発明のポリペプチド、その薬学的に許容される塩、誘導体、および/または結合体の別の好ましい態様は、以下に示す式(5)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 5を有する。
0005385611.tif 000006
【００５０】
本発明のポリペプチド、その薬学的に許容される塩、誘導体、および/または結合体のさらに別の好ましい態様は、以下に示す式(6)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 6を有する。
0005385611.tif 000007
【００５１】
本発明のポリペプチド、その薬学的に許容される塩、誘導体、および/または結合体のさらに別の好ましい態様は、以下に示す式(7)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 7を有する。
0005385611.tif 000008
【００５２】
好ましい態様における本ポリペプチドの1つの利点は、これらのポリペプチドが好ましくは改善された安定性を有するという事実にある。このことによって、本ポリペプチドはより高度にその作用部位に達することができ、かつ、タンパク質またはペプチド化合物との安定な相互作用に入ることができる。特に、本ポリペプチドの高い安定性によって、インビボおよびインビトロにおいてこれを使用することができるようになる。好ましい態様における本ポリペプチドの別の利点は、本ポリペプチドが水中での改善された溶解性を有することにある。高い溶解性によって、特に、本ポリペプチドのより単純かつ容易な適用をもたらすことができる。
【００５３】
さらに、それぞれのL-アミノ酸をD-アミノ酸と交換することが提供されうる。このように、安定性のさらなる増大を達成することができる。
【００５４】
通常のペプチド合成法によって、本ポリペプチドを調製することができる。
【００５５】
好都合なことに、本発明のポリペプチドは、RANTESと血小板第4因子との間の相互作用に対するアンタゴニストとして適している。特に、本発明のポリペプチドは、RANTESと血小板第4因子との間の相互作用の阻害を引き起こすことができる。
【００５６】
本発明のポリペプチド、その薬学的に許容される塩、誘導体、および/または結合体を、RANTESと血小板第4因子との間の相互作用に対するアンタゴニストとして使用することができる。
【００５７】
その好都合な特性に基づいて、本発明のポリペプチドは医薬としての使用に適している。
【００５８】
本発明の別の目的は、医薬の製造のための本発明のポリペプチド、特に好ましい態様のポリペプチドの使用に関する。
【００５９】
本発明のポリペプチドは通常の方法により投与されうるが、非経口投与、例えば口腔投与、皮膚投与、皮下投与、および/または静脈内投与が好ましい。例えば、例えば血管挿入物（vascular interponation）の移植前のエクスビボ適用によって、あるいは、例えばカテーテル処置またはステント移植の前または後の血管内適用（intraversal application）によって、本ポリペプチドを投与することができる。
【００６０】
そのような適用に関して、好都合なことに本ポリペプチドの水中での優れた溶解性は大きな利点となる。
【００６１】
さらに、時間制限のあるまたは迅速な療法を除いて、本発明のポリペプチドを比較的長期間投与することが好ましい。本発明のポリペプチドは同様に、長期放出または遅延放出の形態で、例えば蓄積注射または浸透圧ポンプの形態で投与できる。
【００６２】
本発明のポリペプチドは同様に、特定のポリペプチドをコードする核酸の形態で投与できる。この場合、核酸分子を通常のベクター中に含めることができる。好ましくは、特定のポリペプチドをコードするDNA配列を投与する。同様に、本発明のポリペプチドをコードするRNAの投与が提供されうる。
【００６３】
本発明の別の目的は、本発明によるポリペプチドをコードする核酸配列を含む、好ましくは、式(1)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 1、式(2)に記載のSEQ ID NO: 2、式(3)に記載のSEQ ID NO: 3、式(4)に記載のSEQ ID NO: 4、式(5)に記載のSEQ ID NO: 5、式(6)に記載のSEQ ID NO: 6、式(7)に記載のSEQ ID NO: 7のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、核酸である。好ましくは、本発明によって使用される核酸はDNAまたはRNAである。当業者は、上述の式または配列によるポリペプチドをコードするDNA配列に精通している。
【００６４】
式(3)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 3のポリペプチドをコードする核酸分子の一例は、以下に示す式(8)のDNA配列SEQ ID NO: 8を有する。
0005385611.tif 000009
【００６５】
当業者は、式(3)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 3のポリペプチドをコードするその他の配列を認識している。さらに、例えば遺伝暗号の変性によって、核酸配列に変更が存在しうることが公知である。
【００６６】
式(2)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 2のポリペプチドをコードする核酸分子の一例は、以下に示す式(9)のDNA配列SEQ ID NO: 9を有する。
0005385611.tif 000010
【００６７】
式(4)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 4のポリペプチドをコードする核酸分子の一例は、以下に示す式(10)のDNA配列SEQ ID NO: 10を有する。
0005385611.tif 000011
【００６８】
式(5)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 5のポリペプチドをコードする核酸分子の一例は、以下に示す式(11)のDNA配列SEQ ID NO: 11を有する。
0005385611.tif 000012
【００６９】
式(6)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 6のポリペプチドをコードする核酸分子の一例は、以下に示す式(12)のDNA配列SEQ ID NO: 12を有する。
0005385611.tif 000013
【００７０】
式(7)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 7のポリペプチドをコードする核酸分子の一例は、以下に示す式(13)のDNA配列SEQ ID NO: 13を有する。
0005385611.tif 000014
【００７１】
当業者は、式(1)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 1、式(2)に記載のSEQ ID NO: 2、式(3)に記載のSEQ ID NO: 3、式(4)に記載のSEQ ID NO: 4、式(5)に記載のSEQ ID NO: 5、式(6)に記載のSEQ ID NO: 6、および式(7)に記載のSEQ ID NO: 7のポリペプチドをコードする、その他のDNA配列を認識する。同様に、式(1)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 1、式(2)に記載のSEQ ID NO: 2、式(3)に記載のSEQ ID NO: 3、式(4)に記載のSEQ ID NO: 4、式(5)に記載のSEQ ID NO: 5、式(6)に記載のSEQ ID NO: 6、式(7)に記載のSEQ ID NO: 7のポリペプチドをコードするRNA配列が、当業者に公知である。
【００７２】
ヒト投与に関する本発明のポリペプチドの好ましい用量は、10 mg/日/75 kg体重以上〜1000 mg/日/75 kg体重以下の範囲内、好ましくは50 mg/日/75 kg体重以上〜200 mg/日/75 kg体重以下の範囲内、好都合には150 mg/日/75 kg体重の範囲内である。
【００７３】
本発明のポリペプチド、その薬学的に許容される塩、誘導体、および/もしくは結合体、ならびに/または核酸を、特に、治療的および/または予防的処置、単球の漸増を伴う疾患の診断および/または療法のために使用することができる。これらの疾患には、例えば、心血管疾患および/または炎症性疾患、特に、動脈硬化、狭窄、高血圧、および/または移植拒絶反応が含まれる。
【００７４】
特に、哺乳動物、特にヒトの処置のために本発明のポリペプチドおよび/または核酸を使用することができる。
【００７５】
本発明のポリペプチドは、内皮への単球の付着に正の影響を及ぼすことができる。特に、驚くべきことに、本発明のポリペプチドの特に好ましい態様が、RANTESとPF4とのヘテロ親和性（heterophilic）相互作用によって媒介されるそのような単球停止の強化を阻害できることが認められた。好都合なことに、本発明のポリペプチドの特に好ましい態様は、実験において、今までに公知のタンパク質またはペプチド化合物と比較して、RANTESとPF4とのヘテロ親和性相互作用により媒介される単球停止の強化の阻害の改善を示しうる。
【００７６】
動脈硬化や、バルーン拡張術後、アテレクトミー後もしくはバイパス手術後などの手術後または介入後の再狭窄の形成を本発明のポリペプチドの投与によって低減または予防できるという点において、本ポリペプチドの特別な利点が達成される。進行したもしくは臨床の疾患または形態学的な動脈硬化性変化の場合においてさえ、本発明のポリペプチドが活性化内皮におけるさらなる単球漸増を予防または減少できることは、特別な利点である。
【００７７】
特に予防的処置のために、例えば高血圧のリスクを有する患者において本発明のポリペプチドを使用できることは、特別な利点である。特に、一般的なケモカイン媒介プロセスに対して本発明のポリペプチドがほとんどまたは全く影響しないという点で、好都合なことに、そのような予防的使用が可能になる。
【００７８】
したがって、本発明の別の目的は、以下を含む群より選択される疾患の治療的および/または予防的処置のための医薬の製造のための、本発明のポリペプチド、その薬学的に許容される塩、誘導体、および/または結合体の使用に関する：
心血管疾患および/もしくは炎症性疾患、特に、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、不安定プラーク、狭窄、再狭窄、高血圧、関節炎、心筋炎、脳脊髄炎を含む自己免疫疾患、炎症性腸疾患、心筋梗塞や脳血管梗塞などの梗塞後の再灌流障害、移植拒絶反応、および/もしくは乾癬などの皮膚疾患などの、単球の漸増を伴う疾患；ならびに/または
特に喘息もしくは肺炎などのアレルギー疾患に対する好酸球増多症などの、その他の白血球集団のRANTES依存的漸増を伴う疾患。
【００７９】
特にヒトにおけるアテローム硬化性変化の処置において、本発明のポリペプチドの使用により、疾患の経過に対して有益な効果を達成することができる。特に、単球停止による動脈硬化性変化の強化を少なくすることができる。本発明のポリペプチドの別の利点は、これらが臓器および/または組織の移植後の拒絶反応を減少できるかまたはさらに予防できることに起因しうる。
【００８０】
好都合なことに本発明のポリペプチドがほとんどまたは全く副作用を生じないことは、本明細書において特別な利点である。これにより、本発明のポリペプチドを予防的に投与することが可能になる。さらに、例えば高血圧のリスクを有する患者へのまたは動脈硬化性変化の予防における予防的投与が可能になるように、本発明のポリペプチドの特異性によってその他の代謝プロセスの影響を阻害できることは、特別な利点である。
【００８１】
本発明の別の目的は、本発明のポリペプチド、好ましくは式(1)に記載の配列SEQ ID NO: 1のポリペプチド、その薬学的に許容される塩、誘導体、および/または結合体を含む、医薬に関する。式(3)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 3、式(4)に記載のSEQ ID NO: 4、式(5)に記載のSEQ ID NO: 5、式(6)に記載のSEQ ID NO: 6、式(7)に記載のSEQ ID NO: 7のポリペプチドを含む群より選択されるポリペプチドを含む医薬が好ましい。式(3)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 3のポリペプチドを含む医薬が特に好ましい。好都合なことに、本医薬は、上記の式または配列番号のうち1つによるポリペプチドを有するが、本医薬が複数の式または配列番号によるポリペプチドを有することも提供される。
【００８２】
本発明によるポリペプチドを含む医薬を、例えばヒトの、インビボ処置のために特に使用することができる。本発明のポリペプチドを含む医薬の好ましい使用とは、例えば以下の、単球の漸増を伴う疾患の治療的および/または予防的処置である：心血管疾患および/もしくは炎症性疾患、特に、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、不安定プラーク、狭窄、再狭窄、高血圧、関節炎、心筋炎、脳脊髄炎を含む自己免疫疾患、炎症性腸疾患、心筋梗塞や脳血管梗塞などの梗塞後の再灌流障害、移植拒絶反応、および/もしくは乾癬などの皮膚疾患、ならびに/または、特に喘息もしくは肺炎などのアレルギー疾患に対する、好酸球増多症などの、その他の白血球集団のRANTES依存的漸増を伴う疾患。
【００８３】
本発明の別の目的とは、本発明によるポリペプチドをコードする核酸を含む医薬である。この場合、一般的なベクターに核酸分子を含めることができる。
【００８４】
本発明の別の目的は、本発明によるポリペプチド、その薬学的に許容される塩、誘導体、および/または結合体を含む、好ましくは式(3)に記載のアミノ酸配列SEQ ID NO: 3のポリペプチドを含む、単球停止に対する作用物質に関する。
【００８５】
本発明の意味において、「単球停止に対する作用物質」という用語は、該作用物質が、単球停止、例えば内皮への単球の付着を伴う疾患に対して正の影響を有することができるという意味を有する。特に、動脈硬化性プラークの形成を減少させるかさらには予防することができる。好ましくは、本発明のポリペプチドの使用は、単球の漸増ならびに/または活性化内皮および同じく特に動脈硬化性プラークもしくは新生内膜へのその付着を緩和できるか、かつ/または完全にもしくはほぼ完全に予防できるという効果を有しうる。
【００８６】
本発明の説明に役立つ実施例を、以下に示す。
【００８７】
材料および方法
細胞培養
ヒト臍帯由来の内皮細胞（ヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）、PromoCell、Heidelberg）を、内皮細胞増殖培地（PromoCell、Heidelberg）中で培養し、2〜4継代後に使用した。
【００８８】
Mono Mac 6単球細胞（MM6；DSMZ）を、10%ウシ胎児血清、2 mMのL-グルタミン（Biowhittaker）、1 mMのピルビン酸ナトリウム、50μg/mlのゲンタマイシン、および9μg/mlのインスリンを添加したRPMI 1640培地（PAA Laboratories、Pasching、Austria）（MM6培地）中で培養した。細胞を、2×105個/mlの密度で24ウェルプレート中のMM6培地2 mlに播種し、実験に使用するまで、5%CO2を含む加湿雰囲気下、37℃で3〜4日間培養した。
【００８９】
ポリペプチド
式(3)に記載の配列SEQ ID NO: 3のポリペプチド、式(15)に記載の配列SEQ ID NO: 15に記載のそのオルソログ、および、式(14)に記載の配列SEQ ID NO: 14の対照ペプチドを、4-メチルベンズヒドリルアミン樹脂を使用するt-Bocベースの固相ペプチド合成によって化学合成し、逆相HPLCによって精製し、6MグアニジンHCl/Tris（pH8）中でできる限り環を形成させた。エレクトロスプレー質量分析法によって分子量を測定した（Dawson PE, Kent SB. (2000) Annu Rev Biochem. 69: 923-960；Hackeng TM, Griffin JH, Dawson PE. (1999) Proc Natl Acad Sci U.S.A., Vol 96, p. 10068-10073）。
【００９０】
実施例1
式(3)に記載の配列SEQ ID NO: 3のポリペプチドがRANTESとPF4とのヘテロ凝集体（heteroaggregate）の形成に与える阻害効果を解析するためのプラズモン共鳴分析
プラズモン共鳴分析は、HBS-EP緩衝液（10 mM HEPES、150 mM NaCl、0.005% Tween 20、pH 7.4）を用いて実施した。
【００９１】
50μlのエチル(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド/N-ヒドロキシ-スクシンイミド（0.2 M/0.05 M、Pierce Co.）の注入によってC1チップ（Biacore AB、Uppsala、Sweden）のフローセル2つを活性化し、次に、20μlのストレプトアビジン（0.2 mg/ml、Sigma-Aldrich）を活性化表面全体に灌流した。その後、20μlエチレンジアミン（1 M、pH 8、Sigma-Aldrich）の4回の連続注入によって表面を不活性化した。
【００９２】
N末端において、t-Bocベースの固相ペプチド合成およびPF4の天然の化学的ライゲーションを用いてビオチン化ヒトPF4（bPF4）を化学合成した（Dawson PE, Kent SB. (2000) Annu Rev Biochem. 69: 923-960；Hackeng TM, Griffin JH, Dawson PE. (1999) Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 96, p. 10068-10073）。一方のフローチャンバ全体に200μg/mlのbPF4を含むHBS-EPを注入し、レゾナンスユニット（resonance unit；RU）240を記録することによって、bPF4を、C1センサチップのデキストラン表面上に固定化した。2番目のフローチャンバはbPF4で処置せずに、対照とした。
【００９３】
RANTES（0.5μM、組み換えヒトRANTES；Peprotech、Rocky Hill、NJ、USA）と、または、様々な濃度（0μM、10μM、50μM、および100μM）の式(3)に記載の配列SEQ ID NO: 3のポリペプチドと共にHBS-EP緩衝液中で一晩室温にて予めインキュベーションされたRANTES（0.5μM）と、bPF4との結合を、個々のペプチド/RANTES混合物15μlの注入および180秒間の結合の観察によって測定した。配列のカップリングおよび測定は、Biacore 2000（Biacore AB）装置において流速5μl/minで実施した。BIAevaluation 3.0（Biacore AB）ソフトウェアを用いて、RANTES結合のセンサーグラムを、非特異的バックグラウンドシグナルに対して補正し、各注入についての平衡（equilibrium）レゾナンスユニット（RU）を測定した。
【００９４】
式(3)に記載の配列SEQ ID NO: 3のポリペプチドがRANTESとPF4との相互作用の濃度非依存的阻害を引き起こすことができること、および、式(3)に記載の配列SEQ ID NO: 3のペプチドの濃度100μMでの存在下においてRANTESと固定化PF4との結合が最大35%減少したことが判明した。
【００９５】
実施例2
式(3)に記載の配列SEQ ID NO: 3のポリペプチド、式(2)に記載のSEQ ID NO: 2のポリペプチド、および対照ペプチドがRANTESとPF4とのヘテロ凝集体の形成に与える阻害効果を解析するためのプラズモン共鳴分析
別の実験において、実施例1に記載の条件下で、RANTES（0.5μM）、または、0μM、10μM、50μM、および100μMの、式(3)に記載の配列SEQ ID NO: 3のポリペプチド、式(2)に記載のSEQ ID NO: 2のポリペプチド、および以下に示す式(14)に記載のSEQ ID NO: 14の対照ペプチドと共に予めインキュベーションされたRANTES（0.5μM）の結合を調べた。
0005385611.tif 000015
【００９６】
これらの実験において、10μM、50μM、および100μMの濃度に関しては、式(3)に記載の配列SEQ ID NO: 3のポリペプチドは、式(2)に記載のSEQ ID NO: 2のポリペプチドよりもずっと効果的にRANTESとPF4との相互作用を阻害できることが判明した。式(14)に記載のSEQ ID NO: 14の対照ペプチドは、100μMの濃度において、明白な阻害を全く示さなかった。
【００９７】
実施例3
活性化内皮における単球停止の阻害
活性化内皮細胞におけるMono Mac 6単球細胞の相互作用を調べた。
【００９８】
IL-1β（インターロイキン1β、Peprotech、10 ng/ml、12時間）で活性化されたコンフルエントなHUVEC細胞層を含むペトリ皿を、フローチャンバ中に配置した。Mono Mac 6細胞（0.5×106細胞/ml）を適切な比率のHank溶液（10 mM Hepes（Gibco BRL）、pH 7.3、0.5%ウシ血清アルブミン（Serva）を含む、HBSS）中で再懸濁し、氷上で放置した。実験の5分前に、それぞれ最終濃度1 mMのCa2+およびMg2+を、ならびに、60 nMのケモカインRANTES（Peprotech、Rocky Hill、NJ、USA）およびPF4（ChromaTec、Greifswald）、ならびに、それぞれ6μMの、式(2)に記載のSEQ ID NO: 2のポリペプチド、式(3)に記載の配列SEQ ID NO: 3のポリペプチド、または、式(14)に記載の配列SEQ ID NO: 14の対照ペプチドをMM6単球細胞に添加し、37℃まで加熱した。このように前処理した細胞を、次に、Olympus Co.のタイプIX 50の顕微鏡下、1.5 dyn/cm3で、内皮細胞全体に灌流した。4分後に、内皮細胞との相互作用によって付着した単球の数を、ビデオカメラ（3CCD、JVC）およびレコーダーの映像の画像分析を用いて、様々な領域において測定した。対照に対する平均値（n＝5）±標準偏差（p < 0.02）としてデータを評価した。
【００９９】
RANTESとPF4とのヘテロ親和性相互作用による単球停止の増強は、式(3)に記載の配列SEQ ID NO: 3のポリペプチドによって、例えば最大80%まで有意に阻害できたが、式(2)に記載の配列SEQ ID NO: 2のポリペプチドによる阻害はより弱かったことを立証することができた。一方、式(14)に記載の配列SEQ ID NO: 14の対照ペプチドは有意な阻害を示さなかった。
【０１００】
実施例4
アテローム性動脈硬化のマウスモデルにおけるインビボ調査
9〜12週齢の雌性ApoE-/-同腹仔マウス（The Jackson Lab、Bar Harbor、Maine、USA）を、アテローム性動脈硬化のモデルとして使用した。これらに、脂肪に富む飼料（21%脂肪；Altromin C1061）を12週間与えた。この期間に、2つのマウス群に、以下に示す式(15)に記載の配列SEQ ID NO: 15
0005385611.tif 000016
のペプチド（n＝マウス12匹）、または、以下に示す式(14)に記載の配列SEQ ID NO: 14
0005385611.tif 000017
の対照ペプチド（n＝マウス7匹）を50μg含む生理食塩溶液を、週3回腹膜内注射した。非処置群のマウス（n＝12）を、さらなる対照として使用した。
【０１０１】
組織学的分析のためにマウスを屠殺した。実験期間の間、マウスは健康であり、病気の徴候を示さなかった。実験的給餌の開始時および終了後に、血液試料を採取した。血球計算法によって白血球数を測定し、血清を採取して、Infinity Cholesterolキット（Thermo Electron、Melbourne、Australia）を用いてコレステロールレベルを測定した。
【０１０２】
オイルレッドO染色を用いた脂質沈着物の染色（Veillard NR, Kwak B, Pelli G, Mulhaupt F, James RW, Proudfoot AE, Mach F. Antagonism of RANTES receptors reduces atherosclerotic plaque formation in mice. Circ Res. 2004; 94: 253-61）により、大動脈根および胸腹部大動脈におけるアテローム性動脈硬化の程度を決定し、コンピュータ画像解析（Diskus software、Hilgers、Aachen）を用いて定量した。心臓および大動脈根を通る5ミクロン横断切片におけるアテローム硬化性病変の領域を決定した。互いに50μm離れた6切片の脂質染色領域を用いて、各大動脈根についての測定を行った。アテローム硬化性病変の領域を、各切片の弁（valve）の表面全体で割った。腹側正中線に沿って胸腹部大動脈を切開し、オイルレッドO染色を用いて、表面を向いた（en face）プレパラート中の病変領域を染色した。胸腹部表面全体で割った染色領域として、脂質沈着物の割合を計算した。
【０１０３】
式(15)に記載の配列SEQ ID NO: 15のポリペプチドで処置したマウス、式(3)に記載の配列SEQ ID NO: 3のマウスオルソログが、対照ペプチドを投与されたマウスと比較して、アテローム硬化性病変の発達の有意な減少を示すことを立証することができた。さらに、処置マウスにおける弁表面全体に対して、プラークを示す大動脈根の領域も有意に減少したことを立証することができた。病変内のマクロファージ含量が有意に減少したことを示すこともできた。
【０１０４】
したがって、式(3)に記載の配列SEQ ID NO: 3のポリペプチドのマウスオルソログによってインビボにおけるアテローム性動脈硬化の進行を遅延できること、およびしたがって、本発明のポリペプチドの治療的使用が認められることを示すことができた。
【配列表】
0005385611000001.app