(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３及び４で示される塩基配列から構成されるCD9-siRNA又は該塩基配列を含むCD9-shRNA、又はそれをコードする核酸を発現可能なように連結した発現ベクターからなるCD9発現抑制剤で構成される、血管新生を病因とする眼疾患を治療するための血管新生抑制剤。
【請求項２】
前記眼疾患が、糖尿病網膜症又は加齢黄斑変性である、請求項１に記載の血管新生抑制剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の血管新生抑制剤及び製薬上許容可能な担体を含む血管新生抑制組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生抑制剤、及びこれを含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管形成に関与する疾患は、血管の消退による虚血性疾患と、血管の形成増強による血管新生疾患の二つに大別される。このうち、血管新生疾患としては、これまでに各医療分野において５０種類以上の疾病が報告されている。例えば、眼疾患では糖尿病網膜症（Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）及び加齢黄斑変性（ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ＡＭＤ）、癌では各種固形腫瘍、脈管系疾患では血管線維腫及びアテローム硬化性プラーク、皮膚疾患では乾癬及び血管腫、骨関節疾患ではリウマチ様関節炎及び変形性関節症、並びに生殖器系疾患では卵胞嚢胞及び卵巣肥大症候群が挙げられる。
前記糖尿病網膜症及び加齢黄斑変性は、成人において視機能の低下や中途失明等の深刻な症状をもたらす進行性網膜疾患である。これらの疾患に共通する原因の一つとして、網膜における血管新生の発生が知られており、その進行に伴い病態が悪化し、重症化することが判明している（非特許文献１、２）。
上記疾患は、近年増加傾向にあることから、眼科分野ではその有効な治療法の開発が求められている。現在行われている主な治療法には、レーザー光凝固法や光線力学療法（Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ：ＰＤＴ）がある。
レーザー光凝固法は、網膜上の新生血管部位又は虚血部位にレーザー光を照射し、その熱で当該部位を凝固することにより新生血管を閉塞させて、病態の進行を抑える方法である。この方法は、網膜細胞の熱凝固により稀に視力低下を引き起こすことや、病変サイズが大きい場合又は中心窩に新生血管ができている場合には使用できないという欠点がある。
光線力学療法は、特定の波長の光に反応する薬剤を患者に注射した後、低出力レーザー光を患部に照射して、レーザー光凝固法と同様に新生血管を閉塞させる方法である。この方法は、レーザー照射した箇所の周辺組織へのダメージがほとんどないため中心窩に新生血管がある場合にも使用可能ではあるが、１回の処置では効果が弱く、複数回にわたる治療が必要という欠点がある。
上記物理的治療法以外に、最近ではベバシズマブ等の薬剤による治療法も報告されている。ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ：商品名アバスチン（登録商標））は、血管新生において最も重要な因子の一つであり、血管新生促進因子として機能するＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：血管内皮細胞増殖因子）に対する中和抗体である。ベバシズマブは、ＶＥＧＦの機能を抑えることによって血管新生を抑制する一定の効果が認められている。しかし、１回の処理での効果持続期間が１〜３ヶ月と短く、注入中止による再発性が高いという欠点が未解決のままである（非特許文献３〜５）。また、再発性を防止するためには本薬剤を定期的に投与する必要があるが、眼球に直接注射する必要性があるため、投与回数の多いことが侵襲性の高さ及び患者の精神的負担面での問題となっている。さらに、標的となるＶＥＧＦは、本来正常な血管を維持する上で必須の因子であり、長期のＶＥＧＦ抑制は、例えば、正常血管の狭細化、脆弱化等の副作用が懸念されている。一方で、ＶＥＧＦ以外の血管新生促進因子も知られている。例えば、ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：肝細胞増殖因子）は、ＶＥＧＦと同等かそれ以上に強力な血管新生作用をもつ増殖因子である（非特許文献６）。ＨＧＦは、ＶＥＧＦとは異なる受容体を介して細胞内に血管新生促進のシグナルを送っており、それ故、その血管新生促進のメカニズムもＶＥＧＦとは異なる。したがって、ＶＥＧＦの中和抗体ではＨＧＦ等の他の血管新生促進因子の作用を阻害することはできず、その治療効果と有用性は限定されたものとなっている（非特許文献６）。ＶＥＧＦのみならず、ＨＧＦを含む他の血管新生促進因子による血管新生を総合的に抑制できる汎用的な血管新生阻害剤は未だに開発されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｍａｒｔｉｎ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．２：１１７−１４５
【非特許文献２】Ｆｅｒｒｉｓ  ＩＩＩ，Ｆ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０２，Ｉｓｓｕｅ  １１：１６４０−１６４２
【非特許文献３】Ｙｅｎｅｒｅｌ  Ｎ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｏｃｕｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．，Ｊｕｎ；２４（３）：３６２−３６３
【非特許文献４】Ｋｏｐｅｌ  Ａ．Ｃ．，２００８，Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｓｕｒｇ  Ｌａｓｅｒｓ  Ｉｍａｇｉｎｇ．，Ｍａｒ−Ａｐｒ；３９（２）：１５３−１５４
【非特許文献５】Ｊｏｎａｓ  Ｊ．Ｂ．，２００７，Ｊ  Ｏｃｕｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．，Ｊｕｎ；２３（３）：２４０−２４２
【非特許文献６】Ｙｏｕ  Ｗ．Ｋ．ａｎｄ  Ｍａｃｄｏｎａｌｄ  Ｄ．Ｍ．，２００８，ＢＭＢ  Ｒｅｐ．Ｄｅｃ  ３１；４１（１２）：８３３−９
【発明の概要】
【０００４】
以上のように、現在用いられている糖尿病網膜症及び加齢黄斑変性等の治療方法は、いずれも根治的かつ効果的な治療法とは言えず、これらの疾患の失明率は未だに高い。それ故、より効率的で、治療又は薬剤の効果持続時間が長く、かつ副作用がほとんどないか又はたとえあっても無視できる程度の治療方法が、依然として強く望まれている。
そこで、本発明ではこれらの問題を解決できる新規の血管新生抑制効果を有する薬剤及び医薬組成物を開発し、提供することを目的とする。
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、上記の４回膜貫通型タンパク質（テトラスパニン：ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ）ファミリーに属する膜タンパク質ＣＤ９の発現又は機能を阻害することによって血管新生が抑制されることを見出し、この効果により前記課題を解決することができることを明らかにした。本願発明は、当該知見に基づいてなされたものであり、すなわち以下を提供することである。
（１）膜タンパク質ＣＤ９の抑制剤で構成される血管新生抑制剤。
（２）前記ＣＤ９抑制剤がＣＤ９の発現を抑制する、（１）に記載の血管新生抑制剤。
（３）前記ＣＤ９抑制剤がＣＤ９をコードする遺伝子の転写産物を標的とする、（１）又は（２）に記載の血管新生抑制剤。
（４）前記ＣＤ９抑制剤がＣＤ９のＲＮＡ干渉剤、ＣＤ９アンチセンス核酸又はＣＤ９−Ｕ１アダプターである、（３）に記載の血管新生抑制剤。
（５）前記ＣＤ９抑制剤がＣＤ９のＲＮＡ干渉剤、ＣＤ９アンチセンス核酸又はＣＤ９−Ｕ１アダプターをコードする核酸を発現可能なように連結した発現ベクターである、（１）又は（２）に記載の血管新生抑制剤。
（６）前記ＣＤ９のＲＮＡ干渉剤が、ＣＤ９−ｓｉＲＮＡ又はＣＤ９−ｓｈＲＮＡである、（４）又は（５）に記載の血管新生抑制剤。
（７）前記ｓｉＲＮＡが配列番号３及び４で示される塩基配列から構成される、（６）に記載の血管新生抑制剤。
（８）前記発現ベクターが配列番号５及び／又は６で示される塩基配列を含む、（５）に記載の血管新生抑制剤。
（９）前記ＣＤ９抑制剤がＣＤ９アプタマー又は抗ＣＤ９抗体である、（１）に記載の血管新生抑制剤。
（１０）血管新生疾患又は癌の治療用である、（１）〜（９）のいずれか１項に記載の血管新生抑制剤。
（１１）前記血管新生疾患が血管新生を病因とする眼疾患である、（１０）に記載の血管新生抑制剤。
（１２）前記眼疾患が、糖尿病網膜症又は加齢黄斑変性である、（１１）に記載の血管新生抑制剤。
（１３）前記（１）〜（１２）に記載の少なくとも１以上の血管新生抑制剤及び製薬上許容可能な担体を含む血管新生抑制組成物。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００９−１０５１７０号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
図１は、ＨＭＶＥＣを用いた細胞遊走誘導因子による細胞遊走結果
図２は、ＣＤ９−ｓｉＲＮＡによる内在性ＣＤ９の抑制効果を示すウェスタンブロッティング
図３は、ＣＤ９−ｓｉＲＮＡによるＨＭＶＥＣ細胞の遊走能の変化
図４は、ＣＤ９−ｓｉＲＮＡによるＨＭＶＥＣ細胞の浸潤能の変化
図５は、ＣＤ９−ｓｉＲＮＡによるラット眼球の角膜における血管新生抑制効果
図６は、ＣＤ９−ｓｉＲＮＡによるラット眼球の角膜における血管新生抑制効果
図７は、ＣＤ９−ｓｉＲＮＡによるラット眼球の脈絡膜における血管新生抑制効果
図８は、ＣＤ９−ｓｉＲＮＡによるラット眼球の脈絡膜における血管新生抑制効果
【発明を実施するための形態】
【０００６】
１．血管新生抑制剤
本発明の一の態様は、ＣＤ９の抑制剤で構成される血管新生抑制剤である。
「血管新生抑制剤」とは、血管新生を抑制するために使用される薬剤をいう。ここでいう「血管新生」とは、ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：血管内皮細胞増殖因子）ファミリーやアンジオポエチンファミリーのような血管新生促進因子によって誘導される血管ネットワークの新たな形成及びその増強、並びにそれらと密接に関連する現象（例えば、血管内皮細胞の増殖及び遊走、並びに血管透過性の亢進）を意味する。血管新生には、創傷部位及び性周期に伴う子宮内膜等で見られるような生理的血管新生と、腫瘍組織及び炎症部位等で見られるような病的血管新生があるが、本発明でいう血管新生はそのいずれも包含する。好ましくは、病的血管新生である。
「ＣＤ９」とは、前述のように４回膜貫通型タンパク質（テトラスパニン）ファミリーに属する膜タンパク質である。テトラスパニンファミリーは、海綿から哺乳動物に至る動物のみならず、糸状菌から被子植物に至る植物でも広く知られている。生体内において、ＣＤ９は、腫瘍細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞をはじめとする様々な細胞の細胞膜表面に存在することが知られている。特に血管内皮細胞においては、同じファミリーに属するＣＤ８１及びＣＤ１５１と共にインテグリンβ１に結合することが報告されており（Ｙａｎｅｚ−Ｍｏ  Ｍ．＆  Ａｌｆｒａｎｃａ  Ａ．，１９９８，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１４１，Ｎｏ．３，Ｍａｙ  ４，７９１−８０４）、細胞接着の調節、細胞間の情報伝達、細胞融合及び細胞遊走等に関与することが明らかとなっている（Ｍａｅｓｈｉｍａ  Ｋ  ａｎｄ  Ｙａｈａｔａ  Ｋ．，２００６，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１９（２１）：４４４２−４４５１）。このようにＣＤ９の細胞レベルにおける現象及び関連する分子等については、複数の報告があるが、生体内におけるＣＤ９の具体的かつ詳細な機能に関しては未だに不明な点が多い（Ｍａｅｃｋｅｒ  Ｈ．Ｔ．，１９９７，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．Ｍａｙ；１１（６）：４２８−４４２）。個体レベルにおけるＣＤ９の唯一の機能としては、ＣＤ９が受精において卵子と精子の融合に関与することがＣＤ９ノックアウトマウスを用いた研究結果から明らかになっている（Ｍｉｙａｄｏ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１４９：１２８９−１２９６）。しかしながら、ＣＤ９は、生体内の様々な細胞で発現しているにも関わらず、前記不融合による不妊以外の表現型は観察されておらず、その生体内機能は、依然として未知のままである。
本明細書に記載のＣＤ９は、いずれの生物種由来のものであってもよいが、好ましくは哺乳動物由来、より好ましくは霊長類由来、一層好ましくはヒト由来である。特に、本発明の血管新生抑制剤を血管新生機序に関連する疾患の治療、予防又は再発防止を目的としてヒトに適用する場合には、標的とするＣＤ９はヒト由来、すなわちヒトＣＤ９が望ましい。ただし、ヒトに適用する場合であっても、ヒトＣＤ９のアミノ酸配列と全長又は標的とする一部領域のアミノ酸配列が同一である生物由来のＣＤ９あるいはヒトＣＤ９をコードする核酸の塩基配列と全長又は標的とする一部領域の塩基配列が同一である生物由来のＣＤ９をコードする核酸については、この限りではない。ここでいう一部領域とは、ヒトＣＤ９の場合であれば、例えば、免疫原となり得るペプチドの長さ（例えば、５アミノ酸以上全長アミノ酸未満）を有する領域であり、ヒトＣＤ９をコードする核酸の場合であれば、例えば、免疫原となり得るペプチドをコードする塩基数又はｓｉＲＮＡの一方の鎖を構成する長さを有する領域である。
「ヒトＣＤ９」の野生型アミノ酸配列及びそれをコードするヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）から入手可能である。例えば、前記アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００１７６０（配列番号１で示す）として、また、前記ヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿００１７６９（配列番号２で示す）として登録されている。本発明では、前記野生型ＣＤ９及びその野生型遺伝子の他にそれらの天然変異体を含む。ここでいう「天然変異体」とは、自然界に存在する変異体であって、例えば、前記アミノ酸配列又はヌクレオチド配列において、それぞれ１個又は数個のアミノ酸又はヌクレオチドが欠失、置換又は付加されたもの、前記アミノ酸配列又はヌクレオチド配列とそれぞれ９５％以上、好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するもの等をいう。ここで「同一性」とは、２つのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列にギャップを導入して又は導入しないでアラインメントさせたときに、それぞれ、一方のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列の全アミノ酸残基数又は全塩基数に対する他方のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一アミノ酸残基又は同一塩基数の割合（％）をいう。「数個」とは、２〜１０個、例えば、２〜７個、２〜５個、２〜４個、２〜３個をいう。天然変異体の具体例としては、ＳＮＰ（一塩基多型）等の多型に基づく変異体、スプライス変異体、アミノ酸縮重に基づく変異体等が挙げられる。
本明細書の「ＣＤ９の抑制剤（ＣＤ９抑制剤）」とは、生体、組織又は細胞内においてＣＤ９の発現又は機能を阻害又は抑制することのできる物質をいう。例えば、ＣＤ９をコードする遺伝子（以下、ＣＤ９遺伝子とする）の発現を阻害する若しくは抑制する物質、発現したＣＤ９の細胞内輸送を阻害する若しくは抑制する物質又はＣＤ９のタンパク質機能を失活させる、阻害する、抑制する若しくは競合的に排他する物質のいずれであってもよい。ＣＤ９遺伝子の発現を阻害する若しくは抑制する物質であれば、例えば、ＣＤ９遺伝子の転写産物を標的とする物質が挙げられる。また、ＣＤ９のタンパク質機能を失活させる、阻害する、抑制する若しくは競合的に排他する物質であれば、例えば、ＣＤ９アプタマー及び抗ＣＤ９抗体が挙げられる。
ＣＤ９抑制剤は、ＣＤ９の発現又は機能を抑制する物質であれば、その構成成分については特に限定しない。例えば、タンパク質（抗体を含む）、核酸（当該分野で公知の核酸類似体を含む）、低分子化合物又はそれらの組み合わせで構成されていてもよい。
前述のように、本発明は、ＣＤ９の発現又は機能を抑制することにより血管新生が抑制されるという知見に基づく。それ故、本発明の血管新生抑制剤において、ＣＤ９抑制剤は、血管新生抑制剤を構成する有効成分として作用する。
以下、ＣＤ９遺伝子の転写産物を標的とする物質、ＣＤ９アプタマー及び抗ＣＤ９抗体について、それぞれ具体的に説明をする。
１−１．ＣＤ９遺伝子の転写産物を標的とする物質
「ＣＤ９遺伝子の転写産物」とは、野生型ＣＤ９遺伝子又はその天然変異体から転写されたＣＤ９のｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ前駆体及び成熟ｍＲＮＡを含む）（以下、ＣＤ９  ｍＲＮＡとする）をいう。本明細書において、ＣＤ９  ｍＲＮＡは、ＣＤ９の機能を保持するアミノ酸領域をコードしたヌクレオチド領域を包含していれば足り、必ずしもＣＤ９の全長をコードしている必要はない。ＣＤ９の機能阻害又は抑制を目的とするためである。
「ＣＤ９遺伝子の転写産物を標的とする物質」とは、ＣＤ９  ｍＲＮＡが転写された後、翻訳されるまでの間にＣＤ９の発現を阻害又は抑制する物質である。例えば、核内においてＣＤ９  ｍＲＮＡの転写後、ＣＤ９  ｍＲＮＡのｍＲＮＡスプライシングを阻害又は抑制する物質、成熟ＣＤ９  ｍＲＮＡの核外輸送を阻害又は抑制する物質、核外においてＣＤ９  ｍＲＮＡを分解する（サイレンシングを含む）物質又はＣＤ９  ｍＲＮＡの翻訳を阻害する物質が挙げられる。このうち、ＣＤ９  ｍＲＮＡを分解する物質及び／又はＣＤ９  ｍＲＮＡの翻訳を阻害する物質としては、例えば、ＣＤ９のＲＮＡ干渉剤、ＣＤ９アンチセンス核酸、ＣＤ９−Ｕ１アダプター又はそれらをコードするＤＮＡを発現可能なように連結した発現ベクター、あるいはモルフォリノオリゴ等が挙げられる。以下、ＣＤ９のＲＮＡ干渉剤、ＣＤ９アンチセンス核酸、ＣＤ９−Ｕ１アダプター又はそれらをコードするＤＮＡを発現可能なように連結した発現ベクターついて説明をする。
１−１−１．ＣＤ９のＲＮＡ干渉剤
一の実施形態で、本発明におけるＣＤ９抑制剤は、ＣＤ９ＲＮＡ干渉剤である。「ＲＮＡ干渉剤」とは、生体内においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＲＮＡｉ）を誘導し、標的とする遺伝子の転写産物の分解を介してその遺伝子の発現を抑制（サイレンシング）することができる物質をいう。例えば、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）又はｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ）が挙げられる。したがって、「ＣＤ９のＲＮＡ干渉剤」とは、ＣＤ９に対して遺伝子のサイレンシングを誘導することのできる物質であり、本発明においては、例えば、ＣＤ９−ｓｉＲＮＡ（１）又はＣＤ９−ｓｈＲＮＡ（２）が該当する。以下、それぞれについて詳細に説明をする。
なお、ＲＮＡ干渉については、例えば、Ｂａｓｓ  Ｂ．Ｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２３５−２３８；Ｓｈａｒｐ  Ｐ．Ａ．，２００１，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５，４８５−４９０；Ｚａｍｏｒｅ  Ｐ．Ｄ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６，１２６５−１２６９；Ｄｅｒｎｂｕｒｇ，Ａ．Ｆ．＆  Ｋａｒｐｅｎ，Ｇ．Ｈ．，２００２，Ｃｅｌｌ，１１１，１５９−１６２）を参照されたい。
（１）ＣＤ９−ｓｉＲＮＡ
一の実施形態で、本発明におけるＣＤ９抑制剤は、ＣＤ９−ｓｉＲＮＡ、すなわちＣＤ９遺伝子の転写産物を標的とするｓｉＲＮＡである。「ｓｉＲＮＡ」とは、標的とする遺伝子の一部に対応する塩基配列を有するセンス鎖及びそのアンチセンス鎖からなる小分子二本鎖ＲＮＡである。ｓｉＲＮＡを細胞（真核細胞）へ導入することによってＲＮＡ干渉を誘導することができる。
ＣＤ９−ｓｉＲＮＡの設計は、公知のｓｉＲＮＡ設計法に従って行うことができる。例えば、改訂ＲＮＡｉ実験プロトコール（羊土社．２００４年）又はＲＮＡｉ法とアンチセンス法（講談社．２００５年）に記載の方法に従って設計することができる。また、ｓｉＲＮＡを受託製造販売しているメーカー（例えば、インビトロジェン社）には、目的遺伝子の情報をｗｅｂ上で入力するだけで適切なｓｉＲＮＡ配列候補を即座に探索できるプラグラムをｗｅｂ上で提供しているところもあるので、これを利用してｓｉＲＮＡの設計を行うこともできる。
ＣＤ９−ｓｉＲＮＡ設計の具体例を挙げると、ＣＤ９遺伝子の塩基配列（例えば、ヒトＣＤ９であれば、配列番号２で示される塩基配列）からＲＮＡセンス鎖の塩基配列として、１５塩基以上３５塩基以下、好ましくは１５塩基以上３０塩基以下、より好ましくは１８塩基以上２５塩基以下の連続した塩基配列領域を選択する。このとき選択する領域の塩基配列は、標的とするＣＤ９遺伝子の塩基配列と完全に一致させるように留意する。たとえ１塩基であっても当該領域内にミスマッチが存在するとＲＮＡｉ効果が得られず、ＣＤ９抑制剤として機能し得ないためである。それ故、選択領域内にはＣＤ９遺伝子の既知の変異箇所（例えば、ＳＮＰを含む）を包含しないように設計することが好ましい。ただし、意図的にそのような変異塩基を有するＣＤ９遺伝子を特異的に抑制することを目的とする場合は、この限りではない。ＲＮＡアンチセンス鎖の塩基配列は、選択した前記ＲＮＡセンス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列とする。なお、ｓｉＲＮＡの調製に際しては、センス鎖、アンチセンス鎖共に選択領域内のＴ（チミン）塩基をＵ（ウラシル）塩基に変換しておく。
前記選択領域は、ＣＤ９をコードする塩基配列内又はそれに相補する塩基配列内に存在する領域であって、ＣＤ９に特異的な配列であれば特に限定はしない。好ましくは開始コドンから少なくとも５０塩基、より好ましくは７０塩基〜１００塩基よりも下流の領域である。これは、開始コドンから少なくとも１００塩基が、ＲＮＡｉの阻害要因となり得る転写調節因子等の結合部位を包含する又はそれに隣接するためである。さらに、ＲＮＡセンス鎖の候補領域内においてＡＡ（アデニン‐アデニン）を５’側に有する塩基配列領域を選択することが好ましい。選択した領域内のＧＣ（グアニン‐シトシン）含有量は、好ましくは２０〜８０％、より好ましくは３０〜７０％、一層好ましくは４０〜６０％である。加えて、選択した領域のＲＮＡセンス鎖及びＲＮＡアンチセンス鎖の３’末端側にＴＴ（チミン‐チミン）又はＵＵ（ウラシル‐ウラシル）、好ましくはＴＴを付加することが好ましい。これは、ＲＮＡｉ効率を高めることができるからである（Ｔｕｓｃｈｌ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，１３（２４）：３１９１−７）。ヒトＣＤ９−ｓｉＲＮＡとして好ましいＲＮＡセンス鎖及びアンチセンス鎖は、例えば、限定はしないが、それぞれ配列番号３及び４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。このヒトＣＤ９−ｓｉＲＮＡは、配列番号２で示される全長ヒトＣＤ９遺伝子の塩基配列の１２６〜１４４番に対応する塩基配列をセンス鎖に、またそれに相補する塩基配列をアンチセンス鎖にそれぞれ含む。当該領域は、ＣＤ９の細胞外ドメインＥＣ２においてＣＤ９に特異的であり、かつ構造上重要とされる可変領域をコードする。
ＣＤ９−ｓｉＲＮＡは、設計された塩基配列に基づいて、化学的合成法又は当該分野で公知のインビトロＲＮＡ転写法によって調製することができる。好ましくは、化学的合成法である。インビトロＲＮＡ転写法と比べて調製手順が簡便で自動化が容易であり、一定の質のｓｉＲＮＡを多量に得ることができるからである。ｓｉＲＮＡの調製は、現在、多くのライフサイエンス系メーカー（例えば、タカラバイオ社、インビトロジェン社等）が受託製造サービスを行っており、それらを利用することもできる。
ＣＤ９−ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子に対する抑制効果の一般性が高い点において、後述する抗ＣＤ９抗体と比較して有利である。一般に、抗体は、同一のリガンドを用いて作製されたモノクローナル抗体間でさえも標的に対する抑制効果に著しい差異が見られ、ときには抗体間で全く逆の作用効果を示す場合も知られている。したがって、通常、標的とするタンパク質の異なる領域をリガンドとして作製された場合、それぞれ抗体毎にその効果を検証しなければならない。一方、ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の塩基配列上の任意領域を選択しても、同一標的遺伝子に対して作製された各ｓｉＲＮＡ分子が一定以上の抑制効果を有することが知られている。また、各ｓｉＲＮＡ分子は、同一のＲＮＡサイレンシング機構、すなわちＲＮＡ干渉によって標的遺伝子の発現を抑制することから、通常、抗体のようにｓｉＲＮＡ分子間で逆の作用効果を示す場合はない。
さらに、ＲＮＡｉ医薬は、抗体医薬よりも治療効果と安全性の面で優れていることが実験及び臨床試験でも証明されている。例えば、２００７年にＯｐｋｏ  Ｈｅａｌｔｈ社はＶＥＧＦ標的ｓｉＲＮＡ医薬であるベバシラニブ（Ｂｅｖａｓｉｒａｎｉｂ）の加齢黄斑変性症に対する第ＩＩＩ相臨床試験を行った際に、抗ＶＥＧＦ抗体医薬ルセンティス（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）との治療効果の検討を行っている。その結果、ｓｉＲＮＡ医薬であるベバシラニブの安全性と認容性が抗体医薬のルセンティスより優れていることが証明され、加齢黄斑変性症を有効に治療できるものとして評価された（実験医学，２００８，Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．１０（増刊）：１６５１−１６５６）。また、後述するｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡを発現可能なように挿入した発現ベクターを生体内に投与した場合、そのベクターが生体内で維持され、コードするｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡを発現し続ける限り、ＲＮＡ干渉の効果を享受することができる。それ故、ＲＮＡ干渉を利用するＣＤ９−ｓｉＲＮＡ等であれば、抗ＣＤ９抗体よりも注入回数を減じることができる。血管新生疾患及び癌の治療において、特に糖尿病網膜症及び加齢黄斑変性等のような眼疾患の治療において、血管新生抑制剤を注射によって注入する場合、その注入回数は少しでも少ない方が侵襲性や細菌感染率の軽減の点からも有利である。したがって、本発明のＲＮＡ干渉を利用するＣＤ９−ｓｉＲＮＡ等は、既存の抗ＶＥＧＦ抗体であるベバシズマブに比べて有利な効果を有する。
加えて、既存のＶＥＧＦ抗体医薬は、ＶＥＧＦが関与する血管新生にのみ治療効果を奏するものであって、ＨＧＦ等の他の血管新生促進因子の作用までは抑制できない。したがって、血管新生抑制剤としての治療効果と有用性は限定される。また、全ての血管新生促進因子に対する抗体を作製し、投与する方法も現実的ではない。加えて、幾つかの抗体を同時に使用することは安全面からも問題がある。ＶＥＧＦだけでなく、ＨＧＦ等の他の血管新生促進因子による血管新生をも抑制できる汎用性のある血管新生阻害剤は未だに開発されていないが、最も理想的な医薬は、このように機序の異なる血管新生を一つの医薬で「一般化」して阻害できる医薬である。
（２）ＣＤ９−ｓｈＲＮＡ
一の実施形態で、本発明におけるＣＤ９抑制剤は、ＣＤ９−ｓｈＲＮＡ、すなわちＣＤ９遺伝子の転写産物を標的とするｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）である。「ｓｈＲＮＡ」とは、標的とする遺伝子の一部に対応する塩基配列のセンス鎖とそのアンチセンス鎖が短いスペーサ配列で連結された一本鎖ＲＮＡである。ｓｈＲＮＡは、一分子内でセンス領域とアンチセンス領域が互いに塩基対合し、同時に前記スペーサ配列がループ構造をとることによって、分子全体としてヘアピン型のステム−ループ構造を有する。ｓｈＲＮＡが細胞内に導入されると、ループ構造部分が切断されて二本鎖ＲＮＡ分子、すなわちｓｉＲＮＡが生成される。生じたｓｉＲＮＡは、前項で述べたｓｉＲＮＡと同様のＲＮＡ干渉機構によって標的遺伝子の発現を抑制することができる。
ＣＤ９−ｓｈＲＮＡの設計は、例えば、まずＣＤ９をコードする塩基配列（例えば、ヒトＣＤ９であれば、配列番号２で示される塩基配列）よりＲＮＡセンス鎖に相当する領域の塩基配列として、通常１９塩基以上２３塩基以下、好ましくは２０塩基以上２２塩基以下、より好ましくは２１塩基の連続した配列を選択し、それをセンス領域とする。このとき選択する領域の塩基配列は、前記ＣＤ９−ｓｉＲＮＡの設計と同様でよい。そして、そのセンス領域に相補する塩基配列をアンチセンス領域とする。また、各領域の３’末端側は、ＴＴ又はＵＵを付加することを要しない。ヒトＣＤ９−ｓｉＲＮＡの場合、好ましいセンス領域及びアンチセンス領域は、例えば、それぞれ配列番号５及び６で示される塩基配列である。続いて、選択された前記ＲＮＡのセンス領域の３’末端と前記アンチセンス鎖の５’末端とをスペーサ配列で連結する。スペーサ配列は、通常３〜２４塩基、好ましくは、４〜１５塩基からなる任意の塩基配列とすることができる。したがって、ＣＤ９−ｓｈＲＮＡは、全体として、通常４１〜８０塩基、好ましくは４５〜７０塩基、より好ましくは４８〜６５塩基で構成することができる。
ＣＤ９−ｓｈＲＮＡは、設計された塩基配列に基づいて、化学的合成法又は当該分野で公知のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ転写法によって調製することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。
１−１−２．ＣＤ９アンチセンス核酸
一の実施形態で、本発明におけるＣＤ９抑制剤は、ＣＤ９アンチセンス核酸、すなわち、ＣＤ９遺伝子の転写産物を標的とするアンチセンス核酸である。ここで言う核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡのみならず、例えば、ＰＮＡやＬＮＡのような核酸類似体も含む。本発明で使用する「ＣＤ９アンチセンス核酸」は、ＣＤ９  ｍＲＮＡの全体若しくはその部分に相補的な配列を有する核酸分子であり、細胞内においてＣＤ９  ｍＲＮＡに結合して、その発現（又は、タンパク質への翻訳）を抑制することができる。
本発明のアンチセンス核酸は、当該分野における公知の合成又は転写技術を用いて作製することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。
１−１−３．ＣＤ９−Ｕ１アダプター
一の実施形態で、本発明におけるＣＤ９抑制剤はＣＤ９−Ｕ１アダプター、すなわち、ＣＤ９遺伝子の転写産物を標的とするＵ１アダプターである。「Ｕ１アダプター」とは、約２５塩基からなる二機能性のオリゴヌクレオチドであって、標的遺伝子のｍＲＮＡ前駆体における３’末エクソンに相補的な５’側の「標的ドメイン」とＵ１  ｓｎＲＮＡの５’領域に相補的な配列を有する３’側の「Ｕ１ドメイン」を含む（Ｇｏｒａｃｚｎｉａｋ  Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ  ２７，ｐ２５７−２６３，）。Ｕ１アダプターを導入するとＵ１  ｓｎＲＮＡを含むＵ１核内低分子リボ核蛋白質（Ｕ１  ｓｎＲＮＰ）が標的遺伝子のｍＲＮＡ前駆体のポリＡシグナル周辺に結合し、該ｍＲＮＡのポリアデニル化を特異的に阻害する。その結果、標的遺伝子のｍＲＮＡ前駆体は不安定化し、その後、核内で分解されることによって、遺伝子のサイレンシングが生じる。したがって、ＣＤ９遺伝子を標的としたＵ１アダプターを設計すれば、ＣＤ９の発現を特異的に抑制することができる。
１−１−４．発現ベクター
一の実施形態で、本発明におけるＣＤ９抑制剤は、ＣＤ９のＲＮＡ干渉剤（例えば、ＣＤ９−ｓｉＲＮＡ又はＣＤ９−ｓｈＲＮＡを含む）、ＣＤ９アンチセンス核酸及びＣＤ９−Ｕ１アダプターをコードするＤＮＡを発現可能なように連結した発現ベクターである。本ベクターを目的の細胞に導入した場合、それが細胞内で維持されている限りｓｉＲＮＡ等の効果を所定の細胞に供給し続けることができる。それ故、侵襲性を一層低くすることができる。
（１）ＣＤ９−ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡを発現可能なように連結した発現ベクター
「ＣＤ９−ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ」とは、ＣＤ９−ｓｉＲＮＡを構成するＲＮＡセンス鎖及びＲＮＡアンチセンス鎖のそれぞれをコードするＤＮＡ断片をいう。具体的には、限定はしないが、配列番号３及び４又は配列番号５及び６で示される塩基配列を含むＤＮＡ断片である。本発現ベクターは、ＣＤ９−ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ断片をそれぞれ別個に、すなわちトランスで、発現ベクターに挿入したものである。各ＤＮＡ断片は、複数の発現ベクターにそれぞれ挿入してもよいし、一の発現ベクター内でそれぞれ別個のＤＮＡ断片として発現可能なように挿入してもよい。各ＤＮＡ断片は、発現ベクター中のプロモータの下流にそれぞれのＲＮＡ鎖を発現可能なように連結されている。一般にｓｉＲＮＡの転写には、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩＩ）系のプロモータ、特にＵ６及びＨ１等のプロモータが用いられることが多い。これは、Ｐｏｌ  ＩＩＩ系プロモータの転写量がＰｏｌ  ＩＩ系に比べて多く、該プロモータが短いＲＮＡを効率よく転写できるためである。ただし、必ずしもこれらのプロモータに限定されるものではない。例えば、生体内の所定の部位でのみ発現を誘導する部位特異的プロモータを使用することもできる。これらは必要に応じて、適宜選択すればよい。また、一の発現ベクターにセンス鎖及びアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ断片をそれぞれ独立に発現可能なように挿入する場合、各鎖が同程度で発現するように、プロモータは、同一の又は同程度の発現活性を有する異なるプロモータを用いることが好ましい。
本発明で使用される発現ベクターは、ヒトに投与する場合、公知のベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス等のウイルス、あるいは非ウイルスベクターを基礎とするベクター）を使用することができる。前記各ＤＮＡ断片を挿入するのに使用する発現ベクターは、同一種であってもよいし、異なる種類のものであってもよい。目的、作用箇所等の様々な条件に応じて、適宜選択すればよい。
センス鎖及びアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ断片をそれぞれ挿入した別個の発現ベクターを用いて血管新生疾患又は癌の治療を行う場合、各発現ベクターを共に、好ましくは等量で投与する。投与された細胞内において、ＣＤ９−ｓｉＲＮＡが機能するためには、それぞれの発現ベクターからセンス鎖及びアンチセンス鎖が転写される必要があるためである。
（２）ＣＤ９−ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡを発現可能なように連結した発現ベクター
本発現ベクターは、ＣＤ９−ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ断片を発現ベクターに挿入したものである。ＣＤ９−ｓｉＲＮＡを構成するセンス領域及びアンチセンス領域がスペーサ配列を介して一本のＤＮＡ分子内に、すなわちシスで存在する。例えば、配列番号５及び／又は６で示される塩基配列を含み、配列番号５の３’末端と配列番号６の５’末端がスペーサ配列を介して連結されている。細胞への導入は、通常、この１種の発現ベクターで足り、より効率的にＣＤ９−ｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ効果を導入細胞に付与することができるので便利である。発現ベクターは、前記ＣＤ９−ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡを連結した発現ベクターと同様のものを用い、同様の方法で発現可能なようにそのベクター内に挿入することができる。
これらの発現ベクターは、各メーカーから様々な種類のものが市販されており、また、目的のｓｈＲＮＡ（本発明ではＣＤ９−ｓｈＲＮＡ）の設計及びそれをコードするＤＮＡを挿入した発現ベクターの構築を、それらのメーカーに委託することも可能である。したがって、そのようなサービスを利用してもよい。
（３）ＣＤ９アンチセンス核酸コードするＤＮＡを発現可能なように連結した発現ベクター
本発現ベクターは、ＣＤ９アンチセンス核酸をコードするＤＮＡ断片を発現ベクターに挿入したものである。本発現ベクターは、前記ＣＤ９−ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡを発現可能なように連結した発現ベクターの一方、すなわち、ＣＤ９のＲＮＡアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ断片を挿入した発現ベクターに相当する。一般にアンチセンスＲＮＡの転写には、ＣＭＶプロモータ等のようにその制御下にある核酸を構成的に発現できるプロモータが用いられることが多い。もちろん、必ずしもこのようなプロモータに限定されるものではない。前述のように、例えば、生体内の所定の部位でのみ発現を誘導する部位特異的プロモータを使用することもできる。これらは必要に応じて、適宜選択すればよい。
（４）ＣＤ９−Ｕ１アダプターをコードするＤＮＡを発現可能なように連結した発現ベクター
「ＣＤ９−Ｕ１アダプターをコードするＤＮＡ」とは、ＣＤ９−Ｕ１アダプターを構成するオリゴヌクレオチド配列をコードするＤＮＡ断片をいう。本発現ベクターは、前記ＣＤ９−Ｕ１アダプターをコードするＤＮＡを発現可能なように発現ベクターに挿入したものである。使用する発現ベクターやプロモータ等については、基本的には、前記ＣＤ９−ｓｉＲＮＡ又はＣＤ９−ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡを発現可能なように連結した発現ベクターで使用したものと同様のものが利用できる。
上記のように、ＣＤ９遺伝子の発現を阻害する若しくは抑制するＣＤ９のＲＮＡ干渉剤（例えば、ＣＤ９−ｓｉＲＮＡ又はＣＤ９−ｓｈＲＮＡ）、ＣＤ９核酸、ＣＤ９−Ｕ１アダプター又はそれらをコードするＤＮＡを発現可能なように連結した発現ベクターは、ＣＤ９タンパク質の機能自体を根源的に抑制することができるため、本発明の血管新生抑制剤として特に好ましい。
１−２．ＣＤ９アプタマー
一の実施形態で、本発明におけるＣＤ９抑制剤は、ＣＤ９アプタマーである。
「アプタマー」とは、標的物質と特異的に結合する能力を持ったリガンド分子をいう。アプタマーは、分子の種類により、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）アプタマーとペプチドアプタマーに大別することができる。いずれのアプタマーも、その分子が有する立体構造によって標的物質（例えば、タンパク質）と直接結合し、標的物質の機能を特異的に抑制することができる。本発明のＣＤ９アプタマーは、ＣＤ９抑制剤として作用することから、ＣＤ９タンパク質（主として、ＣＤ９の細胞外ドメイン）を主な標的分子とする。そのような分子と結合するものであれば、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）アプタマー及びペプチドアプタマー等、その種類は問わない。
ＣＤ９アプタマーは、標的物質と直接結合することから、作用機序が簡単で、細胞外でも作用させることができる。また、後述する抗ＣＤ９抗体よりも高い特異性と親和性により標的分子と強固に結合させることができる。免疫原性や毒性も低く、かつ３〜４週間程度の短期間で作製可能という点において抗ＣＤ９抗体よりも優れている。さらに、核酸アプタマーは、化学合成により大量に製造することも可能である。
本発明のＣＤ９アプタマーは、ＣＤ９又はその断片を標的分子として、当該分野で公知の方法により作製することができる。一例を挙げると、ＲＮＡアプタマーの場合にはＳＥＬＥＸ（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を用いて作製することができる。ＳＥＬＥＸとは、ランダム配列のＲＮＡライブラリーから標的分子であるＣＤ９に結合する配列を選択し、それらを逆転写、ＰＣＲ反応によって増幅し、それを鋳型として転写を行い、次のラウンドのライブラリーにするという一連のサイクルを数〜数十ラウンド繰り返した後、より結合力の強いＲＮＡを選択する方法である。最終的に得られた、ＲＮＡをＣＤ９−ＲＮＡアプタマーとして利用する。アプタマーに関しては、例えば、Ｊａｎａｓｅｎａ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：１６２８−１６５０（１９９９）を参照されたい。
前述のように、ＣＤ９は膜タンパク質であることから、ＣＤ９アプタマーの標的分子となるＣＤ９上の領域としては細胞外又は細胞内ドメイン又はそれらの一部領域、好ましくは細胞外ドメイン又はその一部領域を選択することが好ましい。
１−３．抗ＣＤ９抗体
一の実施形態で、本発明におけるＣＤ９抑制剤は、抗ＣＤ９抗体又はその断片である。好ましくは抗ヒトＣＤ９抗体又はその断片である。ここでいう「抗体」とは、免疫グロブリン若しくはその断片に由来するフレームワーク領域（ＦＲ：ｆｒａｍｅ  ｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）を含み、抗原に特異的に結合し、かつそれを認識することのできるポリペプチドをいう。したがって、本発明の「抗ＣＤ９抗体」とは、ＣＤ９若しくはその断片に特異的に結合し、かつＣＤ９若しくはその断片を認識できるポリペプチドをいう。同様に「抗ヒトＣＤ９抗体」とは、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるヒトＣＤ９若しくはその天然変異体又はそれらの断片に特異的に結合し、かつヒトＣＤ９若しくはその天然変異体又はそれらの断片を認識できるポリペプチドをいう。ここでいう「それらの断片」とは、（ヒト）ＣＤ９若しくはその天然変異体の一部領域であって、（ヒト）ＣＤ９若しくはその天然変異体のエピトープを少なくとも１つ有し、本発明の抗体又はその断片によって認識され得るポリペプチド断片をいう。本断片は、（ヒト）ＣＤ９の全長アミノ酸配列の３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、一層好ましくは７０％以上、より一層好ましくは８０％以上又は９０％以上を有する。また、前記「特異的に結合」とは、標的抗原（例えば、抗ヒトＣＤ９抗体であればヒトＣＤ９若しくはその天然変異体又はそれらの断片）のみと結合することを意味する。
本発明の抗ＣＤ９抗体は、鳥及び哺乳動物を含めたあらゆる動物由来とすることができる。例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ロバ、ヒツジ、ラクダ、ウマ、ニワトリ又はヒト等が挙げられる。
本発明において「抗体」は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を含む。ただし、本発明の血管新生抑制剤がヒトに投与することを目的とした組成物である場合には、本発明の「抗体」は、化学的に合成した又は組換えＤＮＡ法によって合成した組換え抗体であることが望ましい。なぜなら、ヒト以外の生物に由来する抗ＣＤ９抗体の定常領域は、ヒト体内において抗原性を有するため、当該抗体に対して免疫反応を起こしてしまい、本発明の目的を達成し得ないからである。本明細書において前記「組換え抗体」とは、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体及び合成抗体をいう。
「キメラ抗体」とは、ある抗体の定常領域を他の抗体の定常領域で置換した抗体である。本発明においては、ヒト以外を動物由来である抗ヒトＣＤ９抗体の定常領域をヒト由来の適当な定常領域と置換した抗体を意味する。例えば、抗ヒトＣＤ９マウスモノクローナル抗体の定常領域をヒト抗体の定常領域で置換した抗体が該当する。
「ヒト化抗体」とは、ある抗体（通常、非ヒト抗体、例えば、マウス抗体）由来のＣＤＲ群（すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）とヒト抗体のＦＲ群（すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）及び定常領域とを人為的に組合せたモザイク抗体である。本発明の場合であれば、例えば、抗ヒトＣＤ９マウスモノクローナル抗体のＣＤＲ群と、任意のヒト抗体のＦＲ群及び定常領域とを組合せた抗体が該当する。このようなヒト化抗体は、ＣＤＲグラフト抗体（Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）Ｖｏｌ．３２１，５２２）とも呼ばれている。
「合成抗体」とは、例えば、組換えＤＮＡ法を用いて新たに合成された抗体若しくは抗体断片をいう。具体的には、限定はしないが、本発明の抗体の一以上のＶＬ及び一以上のＶＨを適当な長さと配列を有するリンカーペプチド等を介して人工的に連結させた一量体ポリペプチド分子又はその多量体ポリペプチドが該当する。一量体ポリペプチド分子としては、例えば、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ：ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４−１９９５，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ参照）が該当する。免疫グロブリン分子において、一本鎖Ｆｖは、軽鎖と重鎖に位置する可変領域（すなわち、それぞれＶＬ及びＶＨ）を十分な長さの柔軟性リンカーによって連結し、１本のポリペプチド鎖に包含した構造を有する合成抗体である。一本鎖Ｆｖ内において両可変領域は、互いに自己集合して１つの機能的な抗原結合部位を形成することができる。一本鎖Ｆｖは、それをコードする組換えＤＮＡを、公知技術を用いてファージゲノム等に組み込み、発現させることで得ることができる。また前記多量体ポリペプチドとしては、例えば、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）又はテトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）等が該当する。ダイアボディは、一本鎖Ｆｖの二量体構造を基礎とする構造を有した分子である（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８）。二価の抗体断片であるダイアボディにおいて、各抗原結合部位は、同一エピトープと結合する必要はなく、それぞれが異なるエピトープを認識し、結合する二重特異性を有していても構わない。例えば、一方の抗原結合部位がＣＤ９のＥＣ１に存在するエピトープを認識し、他方の抗原結合部位がＣＤ９のＥＣ２に存在するエピトープを認識するダイアボディであってもよい。トリアボディ及びテトラボディは、ダイアボディと同様に一本鎖Ｆｖ構造を基本としたその三量体及び四量体構造を有する。それぞれ、三価及び四価の抗体断片であり、多重特異性抗体であってもよい。
本明細書で使用する場合、「抗ＣＤ９抗体又はその断片」における「その断片」とは、上述した抗体の部分領域であって、該抗体が有する抗原特異的結合活性と実質的に同等の活性を有するポリペプチド鎖又はその複合体をいう。例えば、前述の抗原結合部位を少なくとも１つ包含する抗ＣＤ９抗体部分、すなわち、少なくとも１つのＶＬと少なくとも一つのＶＨを有するポリペプチド鎖又はその複合体が該当する。具体例としては、免疫グロブリンを様々なペプチダーゼで切断することによって生じる抗体断片等が挙げられる。より具体的な例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’等が挙げられる。
抗ＣＤ９抗体は、当該分野で公知の方法によって作製すればよい。又はこれらの技術は、当該分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。
２．血管新生疾患又は癌の治療用としての血管新生抑制剤。
本発明の血管新生抑制剤及びこれを含有する後述の血管新生抑制組成物は、血管新生疾患又は癌の治療用として使用することができる。本発明の血管新生抑制剤及びこれを含有する血管新生抑制組成物は、それを体内投与することによって血管新生を抑制できる。したがって、本発明の血管新生抑制剤及びこれを含有する血管新生抑制組成物によれば、血管新生の発生、進行を原因とする疾患、特に糖尿病網膜症、加齢黄斑変性において、その治療目的とした使用が可能である。
本発明において「血管新生疾患」とは、血管新生により発症する及び／又は血管新生の進行により症状が悪化する疾患を意味する。例えば、前述のように、眼疾患では糖尿病網膜症及び加齢黄斑変性、脈管系疾患では血管線維腫及びアテローム硬化性プラーク、皮膚疾患では乾癬及び血管腫、骨関節疾患ではリウマチ様関節炎及び変形性関節症、並びに生殖器系疾患では卵胞嚢胞及び卵巣肥大症候群が挙げられる。
本発明において前記「癌」は、各種固形腫瘍を意味する。例えば、上咽頭腫、甲状腺腫瘍、中枢神経系腫瘍（例えば、神経芽細胞腫、星状細胞腫又は多形性膠芽腫）、黒色腫、脈管腫瘍、血管腫瘍（例えば、血管腫、血管肉腫）、上皮性腫瘍、非上皮性腫瘍、血腫、白血病、リンパ腫、子宮頸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、大腸癌、肝癌、泌尿生殖器癌、卵巣癌、精巣癌、骨肉腫、軟骨肉腫、胃癌又は膵臓癌が挙げられる。
３．血管新生抑制組成物
本発明の一の態様は、少なくとも１以上の前記血管新生抑制剤を有効成分として含有し、かつ製薬上許容可能な担体を含む血管新生抑制組成物である。
３−１．製薬上許容可能な担体
「製薬上許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する溶媒及び／又は添加剤をいう。
前記溶媒には、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。これらは、殺菌されていることが望ましく、必要に応じて血液と等張に調整されていることが好ましい。
また、前記添加剤には、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、滑沢剤等が挙げられる。
賦形剤としては、例えば、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖（より具体的には、限定はしないが、グルコース、スクロース、ラクトース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストリン、マルトデキストリン、デンプン及びセルロースを含む）、金属塩（例えば、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム若しくはリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム）、クエン酸、酒石酸、グリシン、低、中、高分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、プルロニック、カオリン、ケイ酸、あるいはそれらの組み合わせが挙げられる。結合剤としては、例えば、トウモロコシ、コムギ、コメ、若しくはジャガイモのデンプンを用いたデンプン糊、単シロップ、グルコース液、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セラック及び／又はポリビニルピロリドン等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、前記デンプンや、乳糖、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド又はそれらの塩が挙げられる。充填剤としては、例えば、前記糖及び／又はリン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウム、若しくはリン酸水素カルシウム）が挙げられる。乳化剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが挙げられる。流動添加調節剤及び滑沢剤としては、例えば、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが挙げられる。
このような担体は、主として前記剤形形成を容易にし、また剤形及び薬剤効果を維持するために用いられるものであり、必要に応じて適宜使用すればよい。上記の添加剤の他、必要であれば矯味矯臭剤、可溶化剤、懸濁剤、希釈剤、界面活性剤、安定剤、吸収促進剤、増量剤、付湿剤、保湿剤、吸着剤、崩壊抑制剤、コーティング剤、着色剤、保存剤、抗酸化剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤等を含むこともできる。
本発明の医薬組成物は、前記血管新生抑制剤が有する薬理効果を失わない範囲において、他の薬剤を含有することもできる。例えば、注射剤の場合であれば、抗生物質を所定量含有していても良い。
３−２．血管新生抑制組成物の製造
本発明の血管新生抑制組成物の製造方法については、原則として当業者に公知の製剤化方法を応用すればよい。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｅｒｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）に記載された方法を用いることができる。
本発明の血管新生抑制組成物の剤形は、包含する血管新生抑制剤又は他の有効成分を不活化させない形態であれば特に限定しない。例えば、液体、固体又は半固体のいずれであってもよい。具体的な剤形としては、例えば、注射剤、懸濁剤、乳剤、点眼剤、点鼻剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、シップ剤及び座剤等の非経口剤形又は液剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、舌下剤、トローチ剤等の経口剤形が挙げられる。血管新生抑制剤がＣＤ９のＲＮＡ干渉剤（例えば、ＣＤ９−ｓｉＲＮＡ又はＣＤ９−ｓｈＲＮＡ）、ＣＤ９アンチセンス核酸、ＣＤ９−Ｕ１アダプター又はそれらをコードするＤＮＡを発現可能なように連結した発現ベクター、ＣＤ９アプタマー及び／又は抗ＣＤ９抗体の場合には、剤形は注射剤であることが好ましい。
本発明の血管新生抑制組成物の製造において、血管新生抑制組成物中の血管新生抑制剤の含有率は、その抑制剤の種類及び／又は効果の強さ、並びに血管新生抑制組成物の剤形、使用する担体、希釈剤及び／又は賦形剤の種類、製薬上許容される範囲等の様々な条件によって異なる。これらは、当該分野の公知技術に基づいて、適宜選択される。例えば、注射剤として調製する場合には、薬学的に許容可能な担体であるヌクレアーゼフリーの水に溶解し、好ましくは等張性の溶液（例えば、生理食塩水）を調製する上で充分な量の食塩、グルコース又はグリセリン及び通常の溶解補助剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤等も配合して当該分野で慣用されている方法により製造することができる。ＣＤ９抑制剤が配列番号３及び４からなるＣＤ９−ｓｉＲＮＡであって、血管新生抑制剤の剤形が注射剤の場合であれば、血管新生抑制剤の含有率は、一投与単位あたり通常０．１％（ｗ／ｖ）〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）である。具体的には、例えば、１回１ｍｌの注射剤を製造する場合、前記血管新生抑制剤を通常１μｇ〜２００μｇ含んでいればよい。
一の実施形態において、本発明の血管新生抑制剤は、製薬上許容可能な範囲内において、一の血管新生抑制剤に二以上の血管新生抑制剤を含むことができる。例えば、二組以上のＣＤ９−ｓｉＲＮＡ又は二種以上のＣＤ９−ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡを発現可能なように連結した一以上の発現ベクターを有効成分として含有する血管新生抑制組成物が挙げられる。さらに、一以上のＣＤ９−ｓｉＲＮＡ及び一以上の抗ＣＤ９抗体を有効成分として含有してもよい。この場合、ＣＤ９を抗ＣＤ９抗体により直接的に（すなわち、タンパク質の機能レベルで）及びＣＤ９−ｓｉＲＮＡにより間接的に（すなわち、発現レベルで）抑制可能であることから、ＣＤ９−ｓｉＲＮＡや抗ＣＤ９抗体を単独で使用する場合と比べてより効果的な結果が期待できる。また、本発明の血管新生抑制組成物は、製薬上許容可能な範囲内において一以上の本発明の血管新生抑制剤と、一以上の他の血管新生抑制効果を有する製剤とを含む複合製剤とすることもできる。ここでいう他の血管新生抑制効果を有する製剤とは、血管新生の抑制効果が立証されている公知の製剤をいう。例えば、ベバシズマブが挙げられる。ベバシズマブのように本発明の血管新生抑制剤とは標的物質が異なる（ベバシズマブはＶＥＧＦを標的とする抗ＶＥＧＦ抗体である）が、同一の作用効果（血管新生抑制作用）を有する製剤との併用は、血管新生を誘導し促進する複数の因子を多面的に抑制できることから、それらを単独で使用する場合と比べより効果的な結果が期待できる。
４．血管新生抑制剤又は血管新生抑制組成物の投与方法
本発明の他の実施形態は、本発明の血管新生抑制剤又は血管新生抑制組成物を血管新生疾患又は癌の治療のために製薬上有効な量を生体に投与することである。投与する対象となる生体は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
本明細書で使用する場合、「製薬上有効な量」とは、本発明の血管新生抑制剤又は血管新生抑制組成物に含有される血管新生抑制剤が血管新生疾患又は癌を治療可能な用量、具体的には新たな血管新生を抑制及び阻害することができる用量であって、かつ投与する生体に対して有害な副作用（例えば、正常組織におけるＣＤ９の機能を阻害する等）がほとんどない又は全くない用量を言う。その具体的な量は、使用される剤形、被験体（特に、被験者）の情報及び投与経路によって異なる。ヒトに製剤を投与する場合には、製薬上有効な量の範囲及び好適な投与経路は、一般に細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータに基づいて策定される。最終的な投与量は、個々の被験者に応じて医師の判断により決定され、調整される。その際に、勘案される被験者の情報には、病気の進行度若しくは重症度、全身の健康状態、年齢、体重、性別、食生活、薬剤感受性及び治療に対する耐性等が含まれる。
本発明の血管新生抑制剤は、全身投与又は局所的投与のいずれであってもよい。疾患の種類、発症箇所又は進行度等に応じて適宜選択することができる。例えば、加齢黄斑変性のように病巣部が特定されている場合であれば、限定はしないが、局所的投与が好ましい。治療すべき箇所（組織又は器官）に本発明の血管新生抑制剤を十分量投与することができ、また他の組織に影響を及ぼしにくいからである。一方、転移性癌のように治療箇所を特定できない場合には、限定はしないが、全身投与が好ましい。血流を介して本発明の血管新生抑制剤を全身に行き渡らせることで、診断で発見できない病変部にも投与が可能となるからである。
本発明の血管新生抑制剤は、含有される有効成分が失活しないあらゆる適当な方法で投与することができる。例えば、非経口（例えば、注射、エアロゾル、塗布、点眼、点鼻）又は経口のいずれであってもよい。好ましくは、注射である。注射の場合、導入部位は特に限定しない。例えば、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、骨髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内又は舌下等のあらゆる部位又は組織が挙げられる。好ましくは、病変部位又はその周辺部に局所的に直接注射することである。例えば、病変部が特定可能な加齢黄斑変性又は糖尿病性網膜症においては、この局所的注射、すなわち眼球への直接的な注射が有効である。また、全身投与を目的とする場合には、限定はしないが静脈内注射が好ましい。血流を介して本発明の血管新生抑制剤を全身に行き渡らせることが可能であり、また侵襲性が比較的低く、患者に与える負担が小さいからである。
以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明する、ただし、これらの実施例は例示に過ぎず、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【実施例１】
【０００７】
ＨＭＶＥＣ（Ｈｕｍａｎ  Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ：ヒト皮膚微小血管内皮細胞）において細胞遊走を効率的に誘導できる細胞遊走誘導因子の検証
（方法）
細胞遊走誘導因子として、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ；Ｒ＆Ｄ社）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ；Ｒ＆Ｄ社）、ヘパリン結合性上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ：Ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ＥＧＦ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；Ｒ＆Ｄ社）、ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ；ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）の４つの増殖因子を用いてＨＭＶＥＣの細胞遊走の比較を行った。細胞遊走は、Ｉｎｓｅｒｔ  ｃｈａｍｂｅｒ（２４ウェル、孔サイズ：８．０μｍ；ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社）を用いて評価した。Ｉｎｓｅｒｔ  ｃｈａｍｂｅｒの上室に５．０×１０４細胞／２００μｌ（２％  ＦＢＳ含有ＥＧＭ−２ＭＶ培地（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社））を入れ、下室には上記増殖因子をそれぞれ２０ｎｇ／ｍｌずつ加えた２％  ＦＢＳ含有ＥＧＭ−２ＭＶを入れた。増殖因子を非添加のサンプルを対照とした。各増殖因子群について、それぞれ３回実験を行った（ｎ＝３）。開始４、８、１２時間後に、Ｉｎｓｅｒｔ  ｃｈａｍｂｅｒの上室及び下室間にある膜を通過し、下室に移動した細胞をＤｉｆｆ  Ｑｕｉｋ（Ｓｙｓｍｅｘ社）で染色し（固定液、染色液にそれぞれ２分間浸ける）、顕微鏡（ＤＰ−７０；Ｏｌｙｍｐｕｓ社）を用いて４０倍で５視野（１視野：１．７ｍｍ×２．２ｍｍ）の細胞数を数え、１視野あたりの平均細胞数を算出した。
（結果）
結果を図１に示す。ＶＥＧＦ及びＨＧＦでは細胞遊走の亢進が経時的に認められた。一方、ＨＢ−ＥＧＦ、ｂＦＧＦについては、対照と比較して有意な差は認められなかった。
前記４つの増殖因子は、いずれも様々な細胞において細胞運動能や増殖能を誘導することが知られている。なかでもＶＥＧＦ及びＨＧＦは、血管新生において重要な役割を担うとされる因子であり（Ｓｈｉｂｕｙａ  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｖｏｌ２６，２５−３５及びＢｕｓｓｏｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ，１９９２，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９，ＮＯ．３）、今回の実験でもそれが証明された。そこで、以下の実験ではＨＭＶＥＣの遊走誘導因子としてＶＥＧＦ及びＨＧＦを用いることとした。
【実施例２】
【０００８】
ＨＭＶＥＣのＣＤ９−ｓｉＲＮＡによるＣＤ９サイレンシングの確認
（方法）
ｓｉＲＮＡの設計
ヒトＣＤ９  ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ配列番号３及び４で示される塩基配列を有するＲＮＡとした。このｓｉＲＮＡの塩基配列は、ＣＤ９の発現を抑制できることが報告されている（２００６，Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．１０５，Ｎｏ．７，２８５２−２８６０）。対照用ｓｉＲＮＡには、核膜タンパク質であるヒトＬａｍｉｎＡ／Ｃ  ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ及びランダムな塩基配列を有するｓｉＲＮＡ（ランダム−ｓｉＲＮＡ）を用いた。ＬａｍｉｎＡ／Ｃ  ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖の塩基配列は、それぞれ配列番号７及び８に示す。このＬａｍｉｎＡ／Ｃ−ｓｉＲＮＡは、センス鎖に、全長ＬａｍｉｎＡ／Ｃ遺伝子の塩基配列（ＮＭ＿１７０７０７）における８５９〜８７７番に対応する塩基配列を含む。本領域を含むＬａｍｉｎＡ／Ｃ−ｓｉＲＮＡは、ＬａｍｉｎＡ／Ｃを特異的に機能抑制することが知られている（Ｍａｅｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１９（２１）：４４４２−４４５１）。また、ランダム−ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖の塩基配列をそれぞれ配列番号９及び１０で示す。前記いずれのｓｉＲＮＡもＴａｋａｒａ  Ｂｉｏ株式会社に委託して合成したものを使用した。
ＨＭＶＥＣ細胞のｓｉＲＮＡ処理
各ｓｉＲＮＡをＨＭＶＥＣに導入した。具体的には、ＨＭＶＥＣ  ０．６×１０６細胞／１１ｍｌ（抗生剤不含ＥＧＭ−２ＭＶ培地（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社））をディッシュ（１０ｃｍディッシュＩＷＡＫＩ社）に播種し、３７℃で１２時間、５％  ＣＯ２インキュベータで前培養した。前培養後、６００ｐｍｏｌの前記各ｓｉＲＮＡを加えた１ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と、３５μｌのリポフェクトアミンＲＮＡｉＭＡＸ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を加えた１ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ血清使用量低減培地（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とを混合した後、室温で２０分放置した。対照用としてｓｉＲＮＡを加えない１ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地と３５μｌのリポフェクトアミンＲＮＡｉＭＡＸを加えた１ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ血清使用量低減培地とを混合したものも同時に調製した。続いて、前記混合液を前記ディッシュに加えた。３７℃、５％  ＣＯ２インキュベータで６時間インキュベートした後、抗生剤入りのＥＧＭ−２ＭＶで培地交換し、さらに４８時間培養した。
細胞の回収
前記培養後に氷上において各ディッシュを５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、溶解バッファ（１５ｍＭ  ＣＨＡＰＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８）、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５））を３００ｍｌ加えた。氷上に５分間置いた後、細胞をスクレイパ（ＳＵＭＩＬＯＮ社）で剥離して、細胞破砕液をエッペンドルフチューブに回収した。チューブを氷中で２０分間冷却した後、１５０００ｒｐｍで２０分間遠心した。上清を別のチューブに移した後、−８０℃で保存した。各サンプルは、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いてタンパク定量を行い、サンプルバッファ（０．１Ｍ  ＳＤＳ、１．２Ｍグリセロール、０．４ｍＭブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）、０．７Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８））を加えて１０ｍｇ／１５μｌとなるように調製した。
タンパクの電気泳動
泳動槽（ミニプロティアンＴｅｔｒａセル、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。上記で調製した各サンプルを１５μｌ（タンパク量約１０ｍｇ）ずつ５〜２０％勾配のレディーゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、１７ウェル）の各ウェルに積載し、パワーサプライ（ＭｙＰｏｗｅｒ５００、ＡＴＴＯ社）を５００Ｖ、３０ｍＡに設定して４５分間泳動した。泳動後、Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ  ＳＤ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて１５Ｖ、２００ｍＡの条件下で７０分間通電し、ゲル中のタンパクをＰＶＤＦメンブレンに転写した。１０％スキムミルクで１時間ブロッキングした後、５％スキムミルクで５００倍に希釈したマウス抗ヒトＣＤ９抗体ＭＭ２／５７、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）を、またタンパク質量及び転写の対照として５％スキムミルクで１０００倍に希釈したマウス抗ヒトα−チューブリン抗体（Ｓｉｇｍａ社）を一次抗体として用い、さらに５％スキムミルクで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社）を二次抗体として、それぞれサンプル中のＣＤ９及びα−チューブリンを検出した。前記ＰＶＤＦメンブレンを５００μｌのＣｈｅｍｉ−Ｌｕｍｉ  ｏｎｅ（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ社）に５分間浸し、ＨＲＰ活性により生じた発光をＸ線フィルムに取り込み、画像化した。
（結果）
結果を図２に示す。ＣＤ９−ｓｉＲＮＡは、血管内皮細胞におけるＣＤ９の発現が低下していた。一方、ＣＤ９を標的としていないＬａｍｉｎＡ／Ｃ−ｓｉＲＮＡ及びランダム−ｓｉＲＮＡでは、ＣＤ９の発現抑制は認められなかった。この結果から、本実施例で用いたＣＤ９−ｓｉＲＮＡによるＣＤ９発現抑制効果が立証された。
【実施例３】
【０００９】
ＣＤ９をノックダウンしたＨＭＶＥＣの細胞遊走の検討
（方法）
ｓｉＲＮＡの設計、合成及び処理
いずれも実施例２と同様の方法によって調製した。
細胞遊走
細胞遊走は、実施例１と同様にＩｎｓｅｒｔ  ｃｈａｍｂｅｒ（２４ウェル、孔サイズ：８．０μｍ；ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社）を用いて評価した。上室に５．０×１０４細胞／２００μｌ（２％  ＦＢＳ含有ＥＧＭ−２ＭＶ培地（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社））を入れ、下室にはＶＥＧＦ又はＨＧＦを２０ｎｇ／ｍｌずつ加えた２％  ＦＢＳ含有ＥＧＭ−２ＭＶを入れた。各ＲＮＡｉサンプルについて、それぞれ２回ずつ実験を行った（各サンプルｎ＝３）。開始４、８、１２時間後にＩｎｓｅｒｔ  ｃｈａｍｂｅｒの膜を通過し、下室に移動した細胞を実施例１と同様にＤｉｆｆ  Ｑｕｉｋ（Ｓｙｓｍｅｘ社）で染色後、顕微鏡（ＤＰ−７０；Ｏｌｙｍｐｕｓ社）を用いて１００倍（６６０μｍ×８７６μｍ）で、５視野を観察し、１視野あたりの平均細胞数を算出した。
（結果）結果を図３に示す。ＣＤ９−ｓｉＲＮＡは、ＶＥＧＦ及びＨＧＦによる細胞遊走の亢進（ｓｉＲＮＡ未処理参照）を顕著に抑制した。一方、ＬａｍｉｎＡ／Ｃ−ｓｉＲＮＡ及びランダム−ｓｉＲＮＡは、ＶＥＧＦ及びＨＧＦによる細胞遊走亢進をいずれも抑制することができなかった。標的ｍＲＮＡとは無関係にｓｉＲＮＡ自体に血管新生抑制効果があることを示す報告がある（Ｋｌｅｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ：ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４５２，２００８）が、本結果のＣＤ９−ｓｉＲＮＡの抑制効果は、ＬａｍｉｎＡ／Ｃ−ｓｉＲＮＡ及びランダム−ｓｉＲＮＡと比較しても顕著であった。したがって、本実験の細胞遊走の抑制は、単なる非特異的ｓｉＲＮＡの導入によるものではなく、ＣＤ９−ｓｉＲＮＡの導入に基づくＣＤ９の特異的抑制による血管新生抑制効果であることを強く示唆している。
【実施例４】
【００１０】
ＣＤ９をノックダウンしたＨＭＶＥＣの浸潤能の検討
（方法）
ｓｉＲＮＡの設計、合成及び処理
いずれも実施例２と同様の方法によって調製した。
細胞浸潤
細胞浸潤は、Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｉｎｓｅｒｔ  ｃｈａｍｂｅｒ（２４ウェル、孔サイズ：８．０μｍ；膜マトリゲルコーティング：ＢＤ  Ｂｉｏｃｏａｔ社）を用いて評価した。このｃｈａｍｂｅｒの上室に５．０×１０４細胞／５００μｌ（２％  ＦＢＥＧＭ含有−２ＭＶ培地（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社））を入れ、下室には２０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ又はＨＧＦ（Ｒ＆Ｄ社）を加えた２％  ＦＢＳ含有ＥＧＭ−２ＭＶ培地を入れた。各ＲＮＡｉサンプルについて、それぞれ１回ずつ実験した（各サンプルｎ＝３）。開始１６時間後に前記ｃｈａｍｂｅｒの膜を通過した細胞をＤｉｆｆ  Ｑｕｉｋ（Ｓｙｓｍｅｘ社）で染色し、顕微鏡（ＤＰ−７０；Ｏｌｙｍｐｕｓ社）を用いて１００倍で、５視野の細胞数を数え、１視野あたりの平均細胞数を算出した。
（結果）結果を図４に示す。ＶＥＧＦ又はＨＧＦにより細胞浸潤は亢進された（ｓｉＲＮＡ未処理サンプル）。ＣＤ９−ｓｉＲＮＡは、この亢進を顕著に抑制した。一方、ＬａｍｉｎＡ／Ｃ−ｓｉＲＮＡ、及びランダム−ｓｉＲＮＡは、ＨＧＦによる細胞浸潤の亢進を抑制することができなかった。この結果は、ＣＤ９−ｓｉＲＮＡによるＣＤ９の抑制が血管新生において亢進される細胞浸潤を抑制できることを強く示唆している。
【実施例５】
【００１１】
ラットを用いたＣＤ９ノックダウン治療法による治療効果の検証（１）：インビボ血管新生抑制効果の検証
（方法）
ｓｉＲＮＡの設計、及び合成
実施例２と同様の方法によって調製した。なお、本実施例では実験動物としてラットを使用するが、ラットＣＤ９遺伝子のヒトＣＤ９遺伝子の配列番号３及び４に対応する領域の塩基配列は、ヒトＣＤ９遺伝子と完全に一致することから配列番号３及び４で示される塩基配列からなるｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、ラットＣＤ９  ｍＲＮＡも標的とすることができる。
血管新生モデルラットの作製
本発明のｓｉＲＮＡによるインビトロ実験でみられた血管内皮細胞に対する遊走・浸潤能の抑制効果が、「インビボ」において血管新生抑制効果となることを実証するために、まず生体眼球内の角膜で血管新生の抑制効果を検証する角膜マイクロポケットアンギオジェネシスアッセイ法を行った。本アッセイ法は、無血管組織である角膜を用いることで背景血管の影響がないこと、眼球表面の観察による評価のため生存状態下での血管新生領域の定量が可能であること、さらに、同一研究者による処置においてその誤差が少ないことから、インビボでの血管新生に対する新規物質の作用・効果を明確に評価できる優れた実験系として血管新生の実験に広く用いられている（Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，Ｖｏｌ２，Ｎｏ．１０）。また、ｓｉＲＮＡを用いた実験でも、ＰＢＳを溶媒とするｓｉＲＮＡの結膜下への注入によってその効果を立証するのに用いられている（Ｂｕｍｓｏｅｋ  ｅｔ  ａｌ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１６５，Ｎｏ．６，２００４）。
血管新生誘導因子のＶＥＧＦあるいはＨＧＦのいずれかを含有するペレットをラットの角膜に埋め込んだ血管新生モデルラットを作製した。ペレットは、５０μｇのＨＧＦ又はＶＥＧＦ（１６０ｎｇのペレット用）と１０ｍｇのスクラルファート（Ｓｈｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を６０ｍｇのハイドロンポリマー（１２０ｍｇ／１ｍｌエタノール；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社））と混合し、次に当該混合物を１５×１５ｍｍ２のメッシュ（Ｔａｎａｋａ  Ｓａｎｊｉｒｏ  Ｃｏ．、Ｆｕｋｕｏｋａ、Ｊａｐａｎ）に塗り込んだ後、１．０×１．０×０．２ｍｍ３に裁断して調製した。Ｂｒｏｗｎ−Ｎｏｒｗａｙラット（オス、８週齢）において、角膜ポケットを右眼の角膜の結膜輪部から１．５ｍｍの部分に作製した。この角膜ポケットに前記ペレットを挿入した。
血管新生モデルラットのｓｉＲＮＡ処理
対照としてランダム−ｓｉＲＮＡ注入群と、ｓｉＲＮＡを含まないＰＢＳのみを注入した群を調製した。実験は、各サンプルについて、それぞれラット９〜１２匹に対して行った。ペレット挿入７日後に、以下の式を用いて、結膜における血管面積を算出し、血管新生を評価した。
血管面積（ｍｍ２）＝０．０２π×血管長＊（ｍｍ）×クロックアワー＊＊
＊血管長＝角膜輪部から最長の血管の長さ
＊＊クロックアワーとは、血管新生部分の分布角度を時間単位で表した数値であり、クロックアワー＝３０°をｇｒａｄｅ１とする。
血管面積を算出後、平均値の精度を増すためにＪｏｈｎ  ＴｕｋｅｙのＴｒｉｍ  ｍｅａｎ法によって２０％（上下それぞれ１０％）を削除し平均値及び標準誤差を求めた。
（結果）
結果を図５及び６に示す。ＣＤ９−ｓｉＲＮＡ処理したラットでは、ｓｉＲＮＡ未処理のラットと比較して、ＨＧＦ又はＶＥＧＦによって亢進される結膜上の血管新生が有意に抑制された。一方、ランダム−ｓｉＲＮＡ処理のラットの血管新生に抑制は認められず、ｓｉＲＮＡ未処理のラットと有意差は認められなかった。この結果から、インビボにおいても本発明の血管新生抑制剤でＣＤ９を抑制することにより血管新生を抑制でき、さらにそれがｓｉＲＮＡ自体による効果ではなく、ＣＤ９抑制によるものであることが立証された。
さらに、ＣＤ９−ｓｉＲＮＡがＶＥＧＦ誘導の血管新生だけでなくＨＧＦ誘導の血管新生をも同様に阻害できたという結果は、既存技術と比べてＣＤ９−ｓｉＲＮＡが医薬として極めて優位で有望であることを立証している。前述のように、既存の技術で最も有望視されているＶＥＧＦ抗体医薬は、ＶＥＧＦが関与する血管新生に対してのみ有効であり、ＨＧＦなどの他の血管新生促進因子の作用を阻害することは不可能であるため、その薬剤としての治療効果と有用性は限定されているものである。よって、ＶＥＧＦだけでなくＨＧＦなどの他の血管新生促進因子による血管新生を「一般化して」阻害するＣＤ９−ｓｉＲＮＡは、医薬の効能と適応の広さという有用性において既存技術を凌ぐものである。
【実施例６】
【００１２】
マウスを用いたＣＤ９ノックダウン治療法による治療効果の検証（２）：血管新生疾病モデルにおける網膜での治療効果の検証
（方法）
ｓｉＲＮＡの設計、及び合成
実施例２と同様の方法によって調製した。
血管新生モデルマウスの作製
実施例５で実証した本発明の血管新生抑制剤のインビボ血管新生抑制効果、特に治療効果をさらに実証するために、眼における血管新生疾患の主たる血管新生部位が網膜である点を鑑み、新たな実験系として網膜光凝固（ｐｈｏｔｏｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）法による「網膜血管新生疾患モデル動物」を用いた、さらなる治療実験を行った。本方法は、網膜の一部に強いレーザー光を照射することによって脈絡膜から網膜への血管新生を誘発することができる。具体的に説明をすると、眼底は、眼底内部表面から大きく分けて網膜、網膜色素上皮、ブルッフ膜及び脈絡膜で構成されている。レーザー光は、過剰な照射によって網膜及びブルッフ膜を貫通して、脈絡膜まで達する。レーザー光によって傷害された脈絡膜では脈絡膜新生血管（ＣＮＶ：ｃｈｏｒｏｉｄａｌ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）が生じる。したがって、網膜光凝固法は、網膜における血管新生のモデル術、特に血管新生を病態とする眼疾患に対する血管新生抑制剤の新規候補物質の治療効果の検証のための最適な動物モデルとされている（Ｓｈｅｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１３；２２５−２３４；２００６；）。
Ｃ５７ＢＬ６マウス（オス、８〜１１週齢）の網膜に、レーザー（Ｎｏｖｕｓ  ｖａｒｉａ；Ｌｕｍｅｎｉｓ社製）を用いて１２０ｍＷ、７５μｍ、０．１秒で眼球１つあたり４〜５スポットで網膜光凝固を施行した。凝固処理約１時間後にｓｉＲＮＡ（本発明のＣＤ９−ｓｉＲＮＡ又は対照としてのランダムｓｉＲＮＡ）又は対照としてのｓｉＲＮＡを含まないＰＢＳバッファのみ（ｓｉＲＮＡ未処理）をそれぞれ硝子体腔内に３μｌ＝６０ｐｍｏｌ／ｅｙｅで注射した。当該処理日を施術１日目とした。なお、本実施例で使用したＣＤ９−ｓｉＲＮＡは、マウスＣＤ９−ｓｉＲＮＡである。このｓｉＲＮＡの設計、及び合成については、実施例２に記載の方法に準じた。ただし、ヒトＣＤ９遺伝子の配列番号３及び４に対応するマウスＣＤ９遺伝子領域の塩基配列には１塩基の相違が存在するため、マウスＣＤ９−ｓｉＲＮＡの合成には配列番号１１及び１２で示される塩基配列をそれぞれセンス鎖及びアンチセンス鎖として用いた。
続いて、施術７日目に、上記と同様の条件で硝子体腔内に２回目のｓｉＲＮＡ又はＰＢＳバッファを注射した。
施術１４日後、マウスを開腹し、血管造影剤として０．３ｍｌの５０ｍｇ／ｍｌフルオレスセインを拍動中の心臓の心尖部に注入した。フルオレスセインを血流で全身に行き渡らせた後、眼球を摘出した。摘出した眼球をホルマリンで固定し、３時間後に花弁状に切り開いて、角膜、水晶体を除去し、スライドグラスにマウントした。一番上の表面に当たる部分は、蛍光を遮断する網膜色素上皮であるため、脈絡膜のほとんどの血管は観察できないが、レーザーを照射した部分には穴が空いているため、その下にある脈絡膜を観察することができる。このように、レーザー照射したスポットにおけるＣＮＶ部を観察し、画像撮影後、Ｉｍａｇｅ  Ｊを用いてＣＮＶ部の面積を算出した。各サンプルにおけるＣＮＶ部の平均面積を前記実施例５と同様の方法で算出し、スチューデントｔ検定により統計処理を行った。
（結果）
図７は、各サンプルにおいてレーザー照射したーのスポット周辺の蛍光画像を、また図８は、各サンプルにおけるＣＮＶ部の面積の統計結果を示す。なお、図７における各画像は等倍率である。
図７におけるフルオレスセインによる蛍光は、脈絡膜における血管を表す。正常状態の脈絡膜では、通常、淡い蛍光を呈する網目状の血管が観察される（例えば、ＣＤ９−ｓｉＲＮＡの白破線円外）。これに対して、網膜光凝固法で強レーザー光を照射された網膜下の脈絡膜では、照射スポットを中心として円状の強い蛍光領域（例えば、ＣＤ９−ｓｉＲＮＡの白破線円内）が観察された。これは、強レーザー光の照射により脈絡膜に複数の血管が新たに誘発され、それらが絡み合ったものであり、円面積が大きいほど網膜光凝固法により血管新生が広範囲にわたって誘発されたことを示す。ランダムｓｉＲＮＡ処理及びｓｉＲＮＡ未処理のサンプルでは、比較的広範囲にわたる血管新生が観察された。一方、ＣＤ９−ｓｉＲＮＡ処理したサンプルでは、レーザー光照射部に強い蛍光を呈する円状領域は観察されたものの、その面積は他の二つのサンプルと比較すると有意に小さいことが明らかとなった（図８）。これは、すなわち、網膜光凝固法による脈絡膜血管新生をＣＤ９−ｓｉＲＮＡが抑制したことを示している。したがって、本発明のＣＤ９−ｓｉＲＮＡは、角膜のみならず脈絡膜／網膜における血管新生も広く抑制し得ることが証明された。
（結論）
上記実施例５及び６で示した２つの異なる動物モデル実験系による結果から、本発明の血管新生抑制剤であるＣＤ９ｓｉＲＮＡの血管新生抑制効果、及びそれに基づく治療効果が明確に実証された。
すなわち、ＶＥＧＦやＨＧＦという既に特定された２つの強力な血管新生誘導因子を用いてインビボ効果が明確に検出できる角膜モデルで実験することにより、ＣＤ９ｓｉＲＮＡの作用と効果が科学的に明確かつ正確に実証された。また、複数の血管新生因子が関与する点及び網膜での血管新生である点において、実際の血管新生による眼疾患により近い、網膜光凝固法による網膜血管新生疾患モデルにより本発明の治療効果を実証した。これによって、本発明の血管新生抑制剤の血管新生抑制効果が再確認され、加えて、その治療剤としての具体的な有効性も実証された。
さらに、異なる病変部位（角膜と脈絡膜／網膜）、及び異なる血管新生の誘導作用（ＶＥＧＦ及びＨＧＦのような特定された２種類の異なる血管新生増殖因子だけでなく、光凝固法という複数の血管新生因子が関与するモデル）で有意な血管新生抑制効果と治療効果を実証できたことにより、その「血管新生抑制効果」や「血管新生抑制剤としての有用性」に対する本発明の血管新生抑制剤の普遍性も実証された。
【産業上の利用可能性】
【００１３】
本発明によれば、膜タンパク質ＣＤ９の抑制剤で構成される新規血管新生抑制剤又は当該血管新生抑制剤を含有する血管新生抑制組成物を提供することができる。
本発明の血管新生抑制剤及び血管新生抑制組成物によれば、糖尿病網膜症又は加齢黄斑変性等の血管新生を病因とする血管新生疾患又は癌の治療あるいはその症状を軽減することができる。
本発明の血管新生抑制剤及び血管新生抑制組成物の主要な標的分子であるＣＤ９は、ノックアウトマウスの研究からその発現又は機能を抑制しても生体内において顕著な異常は認められない。それ故、本発明の血管新生抑制剤及び血管新生抑制組成物は、ベバシズマブとは異なり、長期間抑制しても副作用がほとんど問題にならないか又は生じないことが予想される。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図２】
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【図６】
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【図７】
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