(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分取逆相液体クロマトグラフィーにおいて、タンパク質を少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬ樹脂の濃度でカラムに充填して、該タンパク質と少なくとも一の不要な不純物を含む組成物から精製する方法であって、
（ａ）水と２５−３５（ｗ／ｗ）％のエタノールと０．１−０．３（ｗ／ｗ）％のトリスと０．５−１．０（ｗ／ｗ）％のＫＣｌを含むｐＨ６−８の溶媒で平衡化したカラムに、最高２０ｇ／ｌカラム材料まで、溶解したＩＬ−２１を充填する工程；
（ｂ）最高５カラム容積までの平衡化溶媒によってカラムを洗浄する工程；
（ｃ）５０−７０（ｗ／ｗ）％のエタノールと０．１−０．３（ｗ／ｗ）％のトリスと０．５−１．０（ｗ／ｗ）のＫＣｌを含有するｐＨ６−８の溶出溶媒の０から１００％の直線的勾配でＩＬ−２１を溶出する工程；
（ｄ）ＩＬ−２１含有画分を回収する工程；
（ｅ）最高１０カラム容積までの溶出溶媒でカラムを洗浄する工程；及び
（ｆ）５０−７０％の１−プロパノールを含む溶液でカラムを再生する工程
を含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（発明の分野）
本発明はタンパク質精製に適した新規クロマトグラフィー方法に関する。
（発明の背景）
製薬業界では、精製は医療ニーズのため分子の製造の統合部分である。組換え技術に由来する生物薬剤学的分子及び有機合成に由来する従来型低分子の両方が生産され、両方の場合でクロマトグラフィー精製技術は製造方法で重要な役割を果たす。クロマトグラフ技術はイオン交換、疎水性相互作用などに基づいた分離を含む。逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）では、溶液中の分子は、クロマトグラフ樹脂の疎水性表面又は疎水性リガンドに結合する。溶液と樹脂の間の分子の分配は、表面に疎水性パッチを有する分子と樹脂上の疎水性表面の間の疎水性相互作用の結果として生じる。続いて、露出したパッチと樹脂の間の疎水性相互作用が結合分子と溶媒の間の相互作用よりも劣るポイントで結合分子を解離又は溶出するために、増大する疎水性度の溶媒が使用される。その後、分子を樹脂から放出し、溶出する。分子が異なる疎水性度を有し、そのため溶出溶媒の疎水性度が増大する場合の異なる時点で溶出するならば、同じ溶液中の異なる分子の分離が生じる。
【０００２】
一般に、ＲＰＣは疎水性度において非常に小さな違いを有する分子間を区別することができ、非常に強力な分離ツール及び分析用クロマトグラフィーにおいて適した方法とされている。従ってＲＰＣは分取用途にも応用されるが、ＲＰＣは通常は有機溶媒を含む過酷な作用条件に耐えうる、より小さい分子及びペプチドの精製に使用される。タンパク質のようなより大きい分子は、より容易に変性し、そのため分取ＲＰＣは天然タンパク質に適さないと考えられている（「Reversed Phase Chromatography. Principles and Methods」, Amersham Pharmacia Biotech; 及び  M.A. Vijayalakshmi編「Biochromatography, Theory and Practice」（Taylor & Francis, 2002年）のMTW Hearn「Conformation of polypeptides and protein in reversed phase and lipophilic environments」）。
【０００３】
より大きいタンパク質における分取ＲＰＣの適用の開示は存在する。しかしながら、一般に、これらの適用はかなり小規模の実施であり、比較的小さい粒子サイズのカラム材料による、小さい直径のＲＰＣカラムに、比較的に低タンパク質を充填するものである（半分取、非工業規模／充填と見なされる）。精製に使用される溶媒システムは、典型的に非常に低いｐＨのＴＦＡを有するアセトニトリルであり、付加的塩成分を溶出用に適用することはない。
【０００４】
Wang, YM等（Biochem., 354, 161-168, 2001）は、ヘビ毒からプロテアーゼを精製するためのＲＰＣの使用を開示する。プロテアーゼは分子量約４０ｋＤａを有し、溶出溶媒は０．０７％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を有するアセトニトリルであった。精製はＶＹＤＡＣ  Ｃ４カラム（４．６ｘ２５０ｍｍ）で実施された。
Chlenov, MA等（J Chromatogr. 1993, 631(1-2), 261-267）は、全てが分子量＞３０ｋＤａを有する生物学的に活性な甲状腺刺激ホルモン、黄体ホルモン及び絨毛性ゴナドトロピンを精製するために、中性ｐＨにおけるＲＰＣの使用を開示する。全３つの精製はｐＨ６．８の０．１Ｍリン酸ナトリウム含有溶媒中で、ＶＹＤＡＣ２１４ＴＰ、Ｃ４カラム（４．６ｘ２５０ｍｍ）において実施された。アセトニトリルは溶出溶媒として使用された。充填容量は２０μｌであった。
【０００５】
Teshima GとCanova-Davis E（J Chromatogr. 1992, 625(2), 207-215）は、Ｐｏｌｙｍｅｒ  ＬａｂｓのＰＬＲＰ−Ｓ  ＲＰＣ−カラム（３００Å、１０μｍ、７．５ｘ３００ｍｍ）におけるＨ２Ｏ２処理ヒト成長ホルモンの精製を記載する。精製はｐＨ７．５の２５ｍＭの酢酸アンモニウム中で実施された。タンパク質は３４％から３９％の１-プロパノール勾配で溶出した。精製は４０℃、流速１ｍｌ／分で実施した。
【０００６】
ＲＰＣの分解能及び高い精製度を有する天然タンパク質の精製の必要性のため、例えば治療的用途のため、工業規模のタンパク質分離の分野にＲＰＣを適用する改良された又は代替の手段を提供する方法であって、工業的に適したカラム充填量を使用すること及び精製タンパク質の生物学的活性が十分なレベルを保持することを含む方法が望れている。
【０００７】
（発明の概要）
本発明は驚くべきことに溶出溶媒への塩又はバッファーの添加が、ＲＰＣの分離能を増大することを発見した。従って、本発明は組成物からタンパク質を精製する方法であって、前記組成物の溶液を逆相液体クロマトグラフィーカラムに充填すること及びカラムから該タンパク質をバッファーと塩を含有する溶媒を用いて溶出することを含んでなり、該塩が使用されるバッファーのｐＨにおいて緩衝能を有しない、タンパク質を精製する方法に関する。
【０００８】
（発明の記載）
本発明は逆相クロマトグラフィーによる工業規模のタンパク質分離方法を提供する。一態様において、方法はカラム材料に対し０．１−２００ｍｇ／ｍｌの範囲のカラム充填を適用する。方法はさらに、工業規模におけるタンパク質精製の穏やかな手段、すなわち、充填したタンパク質の十分量が作用条件を生き残り、生物学的活性を保持する方法を提供する。
本発明は、ＲＰＣの手段によってタンパク質を精製する方法であって、ＲＰＣの分離能を増大した方法を提供する。分離能の増大は、よりよい解像度Ｒｓを提供すること、すなわち分離される２つのタンパク質の間の保持時間（増大した選択性）又は保持容量の差異を増大すること又は溶出したタンパク質のピーク幅を減少すること（増大した効率性）を意味する。
0005401097.tif 000002
[上式中、ＶＲ，Ｂ及びＶＲ，Ａはそれぞれ成分Ｂ及びＡの保持容量であり、ＷＢ及びＷＡはそれぞれ成分Ｂ及びＡのピーク幅である。］
保持容量は、カラムを離れたを溶質を含む溶媒の体積である。本発明の方法において、タンパク質はよりシャープなピークで溶出され、本質的によりよい分離又はベースライン分離さえも導く。分離の増大は、ＲＰＣクロマトグラフカラムの充填を増大することを可能にし、そのため溶出プールの精製度を落とすことなしにＲＰＣカラムのサイズを下げることを可能にする。増大した充填は、ＲＰＣクロマトグラフ溶剤の必要性を減らし、従って高価なＲＰＣクロマトグラフ溶剤が大量に使用される工業規模におけるＲＰＣの利用時の全プロセスの経済性を改良する。
【０００９】
「工業規模」なる用語は、使用されるＲＰＣカラムが少なくとも０．１ｌであり、例えば少なくとも０.２ｌ、少なくとも０.５ｌ、少なくとも １ｌ、少なくとも ２ｌ、少なくとも ５ｌ、少なくとも ２０ｌ、少なくとも ５０ｌ又は例えば少なくとも１００ｌである方法を含むことを意味する。
また、「工業規模」はカラムに加えるポリペプチドの量が少なくとも０．０１ ｇであり、例えば少なくとも０．０２ｇ、少なくとも０．０５ｇ、少なくとも０．１ｇ、少なくとも０．２ｇ、少なくとも０．５ｇ、少なくとも１ｇ、少なくとも２ｇ、少なくとも５ｇ、少なくとも１０ｇ、少なくとも２０ｇ、少なくとも５０ｇ、少なくとも１００ｇ、少なくとも１００ｇ、少なくとも２００ｇ、少なくとも５００ｇ、少なくとも１０００ｇ、少なくとも２０００ｇ、少なくとも５０００ｇ、又は例えば少なくとも１００００ｇであることを意味する。
改良された分離はクロマトグラムの視覚的検査によって、例えば保持時間又は保持容量の差異の増大を記録することによって、ベースライン分離によって、又はよりシャープ及びより明確なピークの出現によって、単純に理解されてもよい。また、分離能の増大は理論段数Ｎとして定量化されてもよく、Ｎは以下のように計算されてもよい。
0005401097.tif 000003
[上式中、ＶＲは保持容量であり、Ｗ１／２は半ピーク高時のピーク幅である。］
上式は、無勾配モードの溶出時のＮを記載する。また、Ｎの数は（イオン交換クロマトグラフィーにおける）勾配溶出用にもS Yamamoto（"Ion-exchange Chromatography of Proteins. Chapter two: Theoretical Aspects", Marcel Dekker,  1988）によって、記載されている。異なる長さのカラムの比較を可能にするために、理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）は
0005401097.tif 000004
[上式中、Ｌはカラムの長さである。］
によって計算されてもよい。より低いＨＥＴＰはよりよい分離である。改良された分離は、他では分離できないタンパク質の分離を提供し、分離工程における改良された収量を提供し、又はカラムへの改良された充填、従って方法の経済性の改良を提供する。２つのピークの間隔が近接しているならば、所望の純度を得るために関心のピークの分画のみを収集する必要があるであろう。従って、ピークの分離が改良されたならば、ピークのより大きい分画が収集されるであろう。
【００１０】
本発明はタンパク質と少なくとも一の不要な不純物からなる組成物から該タンパク質を精製する方法であって、該組成物の溶液を逆相液体クロマトグラフィーカラムに充填すること及びカラムから該タンパク質をバッファーと塩を含有する溶媒を用いて溶出することを含んでなり、該塩が使用されるバッファーのｐＨにおいて緩衝能を有しない、タンパク質を精製する方法に関する。
【００１１】
本願明細書において、タンパク質はポリペプチド、すなわちペプチド結合を介して相互結合したアミノ酸を示すことを意図するものである。タンパク質は、補欠分子族（例えばヘム基）のような付加基、及び／又はポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）（例、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、分枝状ＰＥＧｓ）を含むポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、デンドリマー、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン・無水マレイン酸共重合体、ポリスチレン・無水マレイン酸共重合体、及びカルボキシメチルデキストランを含むデキストラン、脂肪酸、シクロデキストリン類、デキストラン類、アルブミン類のようなコンジュゲート基、又は抗体又は任意にＦｃ領域を含む抗体を含んでもよいと理解される。本願明細書で使用される場合「デンドリマー」なる用語は、WO2005/014049, WO2002/020033, GraysonとFrechet (Chem.Rev. 2001, 101, 3819), GilliesとFrechet (J.Amer.Chem.Soc. 2002, 124,14137-14146)に記載のとおり、適切な数のモノマー単位からつくられる構造的に明確な分枝状ポリマーを意味する。デンドリマーの分子量は典型的に７００−１０，０００Ｄａの範囲である。できるだけ生物学的活性を保持するために開発される方法であるので、本発明は生物学的活性を有するタンパク質を精製する場合の使用に有利であるが、該タンパク質を精製することが望まれるならば、該方法は生物学的機能を有さないタンパク質に使用されてもよい。
【００１２】
タンパク質及び１以上の夾雑物を含む組成物からタンパク質を「精製する」なる用語は、組成物から少なくとも一の夾雑物の含有量を減らすことによって、組成物中のタンパク質の精製度の程度を増大させることを意味する。夾雑物は関係する不純物又は関係しない不純物を含んでもよい。関係しない不純物は、制限されないが、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡ、色付き不純物、脂質類、塩類、バッファー類、タンパク質の化学的又は酵素的修飾からの試薬類（例えばヘム基）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）（例、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、分枝状ＰＥＧｓ）を含むポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン・無水マレイン酸共重合体、ポリスチレン・無水マレイン酸共重合体、及びカルボキシメチルデキストランを含むデキストラン、脂肪酸、シクロデキストリン類、デキストラン類、アルブミン類、又は抗体又は任意にＦｃ領域を含む抗体を含んでもよい。本願明細書で使用する「関連する不純物」なる用語は、標的タンパク質と比較して異なる化学的に又は物理的構造を有するが、標的タンパク質と類似する構造を有する不純物を意味する。関連する不純物は、制限されないが、切断型、伸展型(余分なアミノ酸、多様な誘導体等)、脱アミド型、不正確に折り畳まれた型、シアル酸付加を含む望ましくない糖鎖付型、酸化型、ラセミ化から生じた型、内部ポリペプチド鎖にアミノ酸を欠く型、内部ポリペプチド鎖に余分なアミノ酸を有する型、内部ポリペプチド鎖にアミノ酸の置換を有する型、化学的又は酵素的修飾が所望でない他の残基に置き換わった型を含んでもよい。
【００１３】
本願明細書で使用される場合、親タンパク質に関する「誘導体」なる用語は、化学的に修飾された親タンパク質又はその類似体であって、少なくとも一の置換体が親タンパク質又はその類似体に存在しないもの、すなわち共有結合によって修飾されている親タンパク質を意味する。典型的修飾は、アミド、糖、アルキル基、アシル基、エステル、ペグ化及びその類である。
【００１４】
本願明細書で使用される場合、タンパク質に関する「切断型」なる用語は、親タンパク質のアミノ酸の少なくとも２０％、例えば３５％、５０％又は７５％を有するタンパク質の任意の断片を意味する。従って、ヒト血清アルブミンは５８５アミノ酸を有するので、ヒト血清アルブミンの場合、断片は少なくとも１１７アミノ酸からなる。
【００１５】
タンパク質を溶出するために使用される溶媒はバッファーを含む。バッファーは酸（ＨＡ）及び共役塩基（Ａ−）の混合物である。バッファーは、酸又は塩基の添加の結果であるｐＨの変化に抵抗することが可能である。この抵抗性（緩衝能）は、ｐＨが酸ＨＡのｐＫａに近い場合に最大である。実際には、溶液のｐＨが２ｐＨ単位内、例えば酸のｐＫａ値から１ｐＨ単位内にあるならば、酸と共役塩基の混合物はバッファーと見なされる。本発明に適用できるバッファーの例は、酢酸バッファー、リン酸バッファー、クエン酸バッファー、乳酸バッファー、トリスバッファー、ＣＨＡＰＳバッファー、ホウ酸塩バッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、カーボネートバッファー、ヒスチジンバッファー、ＭＥＳバッファー、アスコルビンバッファー、及びこれらの２以上の混合物を含む。ｐＨを調節するために、ＲＰＣ溶媒にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えることは当分野で標準である。ＴＦＡの使用に関する既知の事実である環境的及び職業的健康問題のために、本発明の方法で使用される溶媒においてＴＦＡの省略は、利点であると見なされる。
【００１６】
本発明で使用される典型的バッファー濃度は、０．０２と２０（ｗ／ｗ）％の間であり、例えば０．０５と５（ｗ／ｗ）％の間、例えば０．１と０．２（ｗ／ｗ）％の間である。
本発明で使用される溶媒の典型的ｐＨは、１−１３の範囲内であり、例えば２-１３、例えば３-１３、例えば３.５-１３、例えば４-１３、例えば４.５-１３、例えば５-１３、例えば５.５-１３、例えば６-１３、例えば６.５-１３、例えば７-１３、例えば７.５-１３、例えば８-１３、例えば１-１２、例えば１-１１、例えば１-１０、例えば１-９.５、例えば１-９、例えば１-８.５、例えば２-１０、例えば３-９.５、例えば３.５-９.５、例えば４-９.５、例えば４.５-９.５、例えば５-９.５、例えば５.５-９.５、例えば６-９.５、例えば６.５-９.５、例えば７-９.５、例えば７.５-９.５、例えば８-９.５、例えば３-９、例えば３.５-９、例えば４-９、例えば４.５-９、例えば５-９、例えば５.５-９、例えば６-９、例えば６.５-９、例えば７-９、例えば７.５-９、例えば８-９、例えば３-８.５、例えば３.５-８.５、例えば４-８.５、例えば４.５-８.５、例えば５-８.５、例えば５.５-８.５、例えば６-８.５、例えば６.５-８.５、例えば７-８.５、例えば７.５-８.５、例えば８-８.５、例えば３-８、例えば３.５-８、例えば４-８、例えば４.５-８、例えば５-８、例えば５.５-８、例えば６-８、例えば６.５-８、例えば７-８、例えば７.５-８である。
【００１７】
本発明の方法に記載のとおり、様々な要因が所与のタンパク質の精製をするためのｐＨの選択に影響し、特に、タンパク質のｐＩが重要である。溶液のｐＨと溶解されたタンパク質のｐＩが同じ場合、タンパク質の溶解度は最低で、沈殿の危険性が最高となる。タンパク質の溶解度が問題にならないならば、精製されるタンパク質のｐＩである又は近いｐＨが使用されてもよいが、通常は精製されるタンパク質のｐＩから少なくとも２ｐＨ単位離れたｐＨの使用が望ましい。これは、当然ながら、ｐＨが所与の溶媒中の酸のｐＫａに近い場合、その中で所与の共役酸−塩基対がバッファーとして唯一有効であるバッファーの選択に影響を与える。
【００１８】
タンパク質の溶出に使用される溶媒は溶液中に塩を含む。塩なる用語は、正に荷電したカチオン（Ｘ）及び負に荷電したアニオン（Ｙ）からなるイオン性化合物のために使用され、したがって生成物は中性で、実質荷電がない。両Ｘ及びＹは多価荷電されてもよく、従ってＸ：Ｙの比は１：１とは異なってもよい。
バッファーと共に使用される塩は使用される特定のバッファーで達成されるｐＨにおいて、いかなる有意の緩衝能を持たず、従ってそれ自身がバッファー系の一部ではない。一実施態様において、塩のｐＫａは、使用されるバッファーのｐＫａから少なくとも１ｐＨ単位離れている。更なる実施態様において、塩のｐＫａは、使用されるバッファーのｐＫａから少なくとも１ｐＨ単位離れている。バッファー系と共に使用される塩の選択は必然的にバッファーの選択に依存するが、タンパク質を取り扱う通常のｐＨ範囲における作業の場合、本発明に適用されうる塩の例は、塩化物、臭化物、ヨウ化物の様なハロイド類；硫酸塩；ホウ酸塩；乳酸塩；クエン酸塩及びそれらの２以上の混合物を含む。正に荷電した対イオンの例は、ナトリウム；カリウム；マグネシウム；カルシウム；及びアンモニウムを含む。塩の特異的例は、塩化カリウム；塩化ナトリウム；塩化アンモニア；乳酸カリウムを含む。
本発明で使用される典型的塩濃度は、０．０２と３０（ｗ／ｗ）％の間、例えば０．０５と１０（ｗ／ｗ）％の間、０．１６と１．１（ｗ／ｗ）％の間である。
本発明の方法は、例えば精製されるタンパク質のタイプに依存する温度の範囲で泳動されてもよい。温度が高すぎる場合は、タンパク質は不可逆的に変性され、温度が低すぎる場合は、溶媒の増大した粘性によって機械的問題が生じる。これらの制限の中で温度の調節は、２つのタンパク質の疎水性度が異なる温度依存性を有するならば、２つのタンパク質の分離を増大するために使用されてよい。一般に本発明の方法は温度が０ー８０℃で、例えば１０−６０℃、２０−６０℃、２０−５０℃、又は２０−４０℃で泳動されてもよい。
【００１９】
一実施態様において、本発明の方法で使用される溶媒は、水と有機成分を含む水性溶媒である。典型的有機成分は、アセトニトリル又はアルコールを含む。
一実施態様において有機成分はアルコールであり、一実施態様において溶媒は水とアルコールの混合物である。特に挙げられるものはモノアルコール、すなわちただ１つのアルコール基からなるアルコールである。本発明の方法で使用されうるモノアルコールの例には、メタノール、エタノール、１−プロパノール及び２プロパノール、及びそれらの２以上の混合物が含まれる。アセトニトリルの使用に関連する、既知の事実である環境的及び職業的健康問題のために、アセトニトリルよりもアルコールを使用することは付加的な利点と見なされる。タンパク質は、溶媒の増大する疎水性度によって、すなわち有機化合物の増大する濃度によって溶出される。カラムにタンパク質を充填するために使用される溶媒の濃度は、タンパク質の性質及び有機化合物の疎水性度に依存する。
この溶媒はしばしば、カラムにタンパク質を充填する前にカラムが典型的にはこの溶媒の１以上のカラム容積で洗浄又は平衡化された時、平衡化溶媒と示される。平衡化溶媒中の有機化合物の典型的濃度は０から８０％、例えば１０−７０％、１０−６０％、又は２０−５０％である。濃度は上方に有機成分の変性作用によって制限される。濃度があまりにも高い場合には、タンパク質が不可逆的に変性するかもしれない危険性がある。タンパク質の溶出の間、溶媒中の有機化合物の濃度は、典型的には５−９６％の濃度に、例えば１０−９５％、２０−９０％、３０−９０％、又は４０−８０％に上昇する。
【００２０】
溶媒中の有機成分の濃度の増大（多くの場合、勾配と称される）に由来する溶出は、多くの方法でもたらされる。勾配は直線的勾配、１以上の工程を含む段階的勾配、無勾配又は曲線的勾配である。また、溶出は一定の有機成分濃度による、無勾配様式で実施されてもよい。また、溶出スキームは上記の勾配及び無勾配溶出様式の任意の組み合わせに適用されてもよく、例えば、溶出スキームは直線的勾配に続く無勾配溶出に続く段階的勾配に続く再度の直線的勾配であってもよく、又は直線的勾配に続く別の直線的勾配であってもよい。
【００２１】
逆相カラム材料は、疎水性材料が結合しうる樹脂からなる。典型的な樹脂はシリカ及びポリスチレンであり、疎水性リガンドが任意に付加される。置換された樹脂の場合、樹脂は、典型的には（しかし限定されるものではないが）、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、 Ｃ１６、又はＣ１８ 又はそれらの誘導体のような脂肪族（例、シアノプロピル（ＣＮ-プロピル））、又は分枝状脂肪族、又はフェニルのようなベンゼン系芳香族、又は他の極性又は非極性リガンドから選択される疎水性リガンドで置換される。リガンドはこれらのリガンドの２以上の混合物でもよい。適切なポリスチレン系樹脂は、制限されるものではないが、Rohm Haas(例えば、Amberlite XAD又はAmberchrom CG)、Polymer Labs (例えば、PLRP-S)、ＧＥヘルスケア (例えば、Source RPC)、アプライドバイオシステムズ(例えば、Poros R)によって提供される樹脂を含む。
カラム材料の製造工程及び最適の特徴は、多くの場合、スペーサーと呼ばれる連結基を樹脂とリガンドの間に挿入することを必要とする。
【００２２】
本発明の方法の他のパラメーターは、充填、すなわちカラムに充填されるタンパク質の量、及び流速を含む。これらのパラメーターは当業者が知っている実験を通して最適化されてよい。タンパク質は、典型的には樹脂中少なくとも約０．１ｍｇ／ｍＬの濃度、例えば、樹脂中少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０又は２０ｍｇ／ｍＬ；又は樹脂中０．１−２００ｍｇ／ｍＬの範囲、例えば０．１ー１００ｍｇ／ｍＬ、０．５−１００ｍｇ／ｍＬ、１−５０ｍｇ／ｍＬ又は２−３０ｍｇ／ｍＬの濃度でカラムに充填される；好ましくは充填は樹脂中少なくとも１ｍｇ／ｍＬである。充填された樹脂の体積の計測は、典型的に懸濁液中又は類似の様式で行われる。
【００２３】
タンパク質は、典型的には毎時１−２００カラム容積の流量（ＣＶ／ｈ）で、例えば少なくとも１ＣＶ／ｈ、例えば少なくとも２ＣＶ／ｈ、例えば少なくとも３ＣＶ／ｈ、例えば少なくとも４ＣＶ／ｈ、例えば少なくとも５ＣＶ／ｈ、例えば少なくとも６ＣＶ／ｈ、例えば少なくとも８ＣＶ／ｈ、例えば少なくとも１０ＣＶ／ｈ、例えば少なくとも１２ＣＶ／ｈ、例えば少なくとも２０ＣＶ／ｈ又は例えば少なくとも４０ＣＶ／ｈ又は例えば少なくとも８０ＣＶ／ｈ、例えば８０−１２０ＣＶ／ｈで加えられる。
【００２４】
タンパク質がカラムから溶出される場合、比較的高い濃度の有機成分を有する溶媒に溶解され、その変性効果により時間とともにタンパク質は傷つけられるかもしれない。そのため本発明の一実施態様において、タンパク質は、溶出直後に、例えば希釈、限外ろ過、沈殿、結晶化、脱塩、ゲルろ過によって又はタンパク質を他のクロマトグラフィー溶剤（イオン交換溶剤、疎水性相互作用溶剤、親和性又は金属キレート溶剤）と結合させ、変性溶媒を洗い流し、タンパク質を溶出させることによって、別の溶媒／溶剤に移される。
【００２５】
一実施態様において、本発明の方法によって精製されるタンパク質は１０と２００ｋＤａの間の分子量を有し、例えば１２と１５０ｋＤａの間、又は１２と１２０ｋＤａの間、又は１２と１００ｋＤａの間又は１２と５０ｋＤａの間又は１２と４０の間または１５と４０の間である。特に挙げることのできるものは、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１のようなサイトカイン類、毛様体神経栄養因子, カーディオトロフィン−１、カーディオトロフィン−１様サイトカイン、白血病抑制因子、オンコスタチンＭ, 顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ刺激因子、顆粒球刺激因子、エリスロポエチン、成長ホルモン、プロラクチン、インターフェロンα、インターフェロンγ、幹細胞因子、胎盤ラクトゲン、毛様体神経栄養因子、腫瘍壊死因子、Ｂ細胞活性化因子(ＢＡＦＦ)、及びマクロファージ走化因子である。
【００２６】
一実施態様において、精製されるタンパク質がＲＰＣ精製工程の間少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、７５％、又は９５％の生物学的活性を保有する。生物学的活性は当分野で可能な任意の手段によって計測されることができ、分析の選択は必然的にタンパク質の生物学的活性に依存する。
【００２７】
一実施態様において、本発明の方法は
（ａ）水と２５−３５（ｗ／ｗ）％のエタノールと０．１−０．３（ｗ／ｗ）％のトリスと０．５−１．０（ｗ／ｗ）％のＫＣｌを含むｐＨ６−８の溶媒で平衡化したＲＰＣカラムに、最高２０ｇ／ｌカラム材料まで、ＩＬ−２１を充填する工程；
（ｂ）最高５カラム容積までの平衡化溶媒でカラムを洗浄する工程；
（ｃ）５０−７０（ｗ／ｗ）％のエタノールと０．１−０．３（ｗ／ｗ）％のトリスと、０．５−１．０（ｗ／ｗ）のＫＣｌを含有するｐＨ６−８の溶出溶媒の０から１００％の直線的勾配でＩＬ−２１を溶出する工程；
（ｄ）ＩＬ−２１を含む分画を回収する工程；
（ｅ）最高１０カラム容積までの溶出溶媒でカラムを洗浄する工程；及び
（ｆ）５０−７０％の１-プロパノールを含む溶液でカラムを再生する工程
を含んでなる。
【００２８】
（工業規模の製造および精製）
本発明は、特にタンパク質の工業規模の製造および精製に有用である。この方法では、タンパク質は、典型的に細胞培養又は発酵の手段によって製造される。
従って、本発明は、また所望のタンパク質の製造および精製のための工業規模の製造および精製を提供し、該方法は
（ｉ）細胞培養又は発酵で所望のタンパク質の粗いバルクを製造する工程；及び、
（ｉｉ）一以上の逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）プロセスを利用する精製シークエンスによって該粗いバルクを精製する工程；
を含み、該逆相クロマトグラフィープロセスの少なくとも１つが、上に定義した通りに実施されるものである。
【００２９】
ここで引用される刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての文献は、各文献が、ここの他の箇所でなされる特定の文献の別個に提供された援用にかかわらず、個々にかつ特に出典明示により援用され、その全体(法律により許容される最大範囲)が記載されているかの如く、その全体が同じ範囲まで出典明示によりここに援用される。
【００３０】
発明を記述する文脈における「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」なる用語及び類似の指示対象の使用は、ここで特段の定義がなされるか明らかに内容が矛盾していない限り、単数形と複数形の双方をカバーしていると解釈される。例えば、「化合物」なる語句は、特段の定義がなされていない限り、本発明の様々な「化合物」又は特定の記載された態様を意味するものと理解されなければならない。
【００３１】
特段の定義がなされていない限り、ここで提供される全ての正確な値は、対応する近似値を代表する(例えば、特定の要因又は測定に対して提供される全ての正確な例示的値は、適切な場合、「約」により修飾された対応する近似測定値をまた提供すると考えることができる)。
【００３２】
特段の定義がなされるか明らかに内容が矛盾していない限り、成分又は成分類に関して、「含有する」、「有する」、「含む(including)」又は「含む(containing)」等の用語を使用する任意の態様又は本発明の態様のここでの記載は、その特定の成分又は成分類「からなる」、「本質的になる」、又は「実質的に含有する」類似した態様又は本発明の態様に対するサポートを提供することを意図したものである(例えば、特段の定義がなされるか明らかに内容が矛盾していない限り、特定の成分を含有するとここに記載されている組成物は、その成分からなる組成物を記載しているものと理解されなければならない)。
【００３３】
（一般的方法）
（クロマトグラフ溶媒の調製）
所望の量のバッファー（ｗ／ｗ）％と塩（ｗ／ｗ）％について、重さをはかる。バッファーと塩を溶解するために水を加える。所望の量のアルコール（１００％エタノール、１００％１−プロパノール、１００％２−プロパノール）  を加える。溶媒の全体の重さの９５−９８％まで水を加える。溶媒が室温で及び３０℃で使用される場合は、溶媒のｐＨを室温で調節する。４０℃及び５０℃で使用される溶媒は、それぞれ４０℃及び５０℃でｐＨ調節される。使用前に、ｐＨメーターは室温（２０ー２５℃）においてＩＵＰＡＣ標準液で調整される。１００％まで水を加える。
【００３４】
（ＩＬ-２１濃度の測定）
ＩＬ-２１濃度は、以下に記載の通り、ＲＰ-ＨＰＬＣで測定される：
逆相ＨＰＬＣはジュピターＣ５(Phenomenex, ４．６×５０ｍｍ、粒子サイズ５μｍｍ、孔サイズ３００Å）で泳動した。カラム温度：４０℃。Ａ溶媒：０．１（ｖ／ｖ）％ＴＦＡのミリＱ水溶液。Ｂ溶媒：０．１（ｖ／ｖ）％ＴＦＡのアセトニトリル溶液。勾配プログラム：０−３．５分：９５％Ａ＋５％Ｂ、３．５−４．０分：５９％Ａ＋４１％Ｂ、４．０−１４．０分：５２％Ａ＋４８％Ｂ、１４．０−１４．５分：５％Ａ＋９５％Ｂ、１４．５−１７．０分：５％Ａ＋９５％Ｂ。流速：１．０ｍＬ／分。検出波長：２８０ｎｍ。充填：約２０ｍｇのＩＬ-２１。ＩＬ-２１濃度は、参照基準の面積に対するＩＬ-２１主要ピークの面積の比較によって測定される。
【００３５】
（ＩＬ-２１収量の測定）
収量（％）は分取ＲＰＣカラムに充填したＩＬ−２１の量に比較したＲＰＣ主要ピークのＩＬ−２１の含有量として測定された。主要ピークの含有量(ｍＡＵ×ｍｌ、ここでＡＵは２８０ｎｍで計測される）は分取ＲＰＣクロマトグラムのピークの一体化によって測定される。適用試料の含有量(ｍＡＵ×ｍｌ）は適用試料の２８０ｎｍにおける吸収（４３０ｍＡＵ）に適用容積（ｍｌ）を掛けて求められた。
【実施例】
【００３６】
（実施例１）
塩なしの溶媒によるＣＮ−プロピル置換シリカゲルにおけるＲＰＣ−カラムクロマトグラフィーの実施
１０．６ｍｇのｒｈＩＬ−２１を含む溶液をＣＮ−プロピル置換シリカゲル（粒径１５μｍ、孔サイズ３００Å）を含むカラム(５×１０８ｍｍ)に充填した。充填前に、カラムは４ＣＶ（カラム容積）の２０（ｗ／ｗ）％エタノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリス（ｐＨ７．０）で平衡化した。非結合タンパク質は３ＣＶの２０（ｗ／ｗ）％エタノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリス（ｐＨ７．０）で洗い流した。ｒｈＩＬ−２１は、１２ＣＶの０．２１（ｗ／ｗ）％トリス（ｐＨ７．０）中２０−９６（ｗ／ｗ）％エタノールの直線的勾配で溶出した。
カラムは、８ＣＶの９６（ｗ／ｗ）％エタノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリス（ｐＨ７．０）及び５ＣＶの注射用蒸留水（ＷＦＩ）で洗浄した。カラムは、５ＣＶの６０（ｗ／ｗ）％１−プロパノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリスと０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ（ｐＨ７．０）で再生した。
精製は、室温で、流速毎時３０カラム容積（ＣＶ／ｈ）で実施した。
クロマトグラムは図１に示す。クロマトグラムから、ＩＬ−２１がエタノール勾配による溶出の間、樹脂に結合したままであることがわかる。タンパク質は、１−プロパノール含有再生溶媒で溶出した。
【００３７】
（実施例２）
クロマトグラフ溶媒に塩として、０．１９（ｗ／ｗ）％、０．３７（ｗ／ｗ）％又は０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌをそれぞれ加えた、ＣＮ-プロピル置換シリカゲルにおけるＲＰＣクロマトグラフィーの実施
３つのクロマトグラフ泳動を下記のとおり実施した。３泳動間の違いは、溶媒に加えたＫＣｌの量だけである（表１を参照）。
１０．６ｍｇのｒｈＩＬ−２１を含む溶液をＣＮ−プロピル置換シリカゲル（粒径１５μｍ、孔サイズ３００Å）を含むカラム（５×１０８ｍｍ）に充填した。充填前に、カラムは４ＣＶ（カラム容積）の２０（ｗ／ｗ）％エタノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリスとＸ（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ(Ｘは表１のとおり)（ｐＨ７．０）で平衡化した。非結合タンパク質は３ＣＶの２０（ｗ／ｗ）％エタノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリスとＸ（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ(Ｘは表１のとおり)（ｐＨ７．０）で洗い流した。ｒｈＩＬ-２１は、１２ＣＶの０．２１（ｗ／ｗ）％トリスとＸ（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ(Ｘは表１のとおり)（ｐＨ７．０）に含まれる２０−８０（ｗ／ｗ）％エタノールの直線的勾配で溶出した。カラムは、８ＣＶの８０（ｗ／ｗ）％エタノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリスとＸ（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ(Ｘは表１のとおり)（ｐＨ７．０）及び５ＣＶのＷＦＩで洗浄した。
カラムは、５ＣＶの６０（ｗ／ｗ）％１−プロパノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリスと０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ（ｐＨ７．０）で再生した。
精製は、室温で、流速３０ＣＶ／ｈで実施した。
0005401097.tif 000005
３つのクロマトグラムを図２に示す。主要ピークの一体化は、溶媒中のＫＣＬ量を増やした場合ＩＬ−２１収率は少し増えることを示す（表１参照）。溶媒中のＫＣｌ濃度が上昇した場合、収率の増大のほかに、ＩＬ−２１ピークの保持容量は減少し、ピークは狭くなって、効率性Ｎ（式２によって求められる）の増大を示している（表１参照）。
【００３８】
（実施例３）
クロマトグラフ溶媒に塩として、０（ｗ／ｗ）％又は０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌをそれぞれ加えた、ジメチルブチル置換シリカゲルにおけるＲＰＣクロマトグラフィーの実施
２つのクロマトグラフ泳動を下記のとおり実施した。２泳動間の違いは、溶媒に加えたＫＣｌの量だけである（表２を参照）。
１０．６ｍｇのｒｈＩＬ−２１を含む溶液をジメチルブチル置換シリカゲル（粒径１５μｍ、孔サイズ３００Å）を含むカラム（５ｘ１０５ｍｍ）に充填した。充填前に、カラムは４ＣＶ（カラム容積）の２０（ｗ／ｗ）％エタノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリスとＸ（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ(Ｘは表２のとおり)（ｐＨ７．０）で平衡化した。非結合タンパク質は３ＣＶの２０（ｗ／ｗ）％エタノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリスとＸ（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ(Ｘは表２のとおり)（ｐＨ７．０）で洗い流した。ｒｈＩＬ−２１は、２５ＣＶの０．２１（ｗ／ｗ）％トリスとＸ（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ(Ｘは表１のとおり)（ｐＨ７．０）に含まれる２０−７０（ｗ／ｗ）％エタノールの直線的勾配で溶出した。カラムは、５ＣＶの７０％エタノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリスとＸ（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ(Ｘは表２のとおり)（ｐＨ７．０）及び５ＣＶのＷＦＩで洗浄した。
カラムは、５ＣＶの６０（ｗ／ｗ）％１−プロパノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリスと０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ（ｐＨ７．０）で再生した。
精製は、室温で、流速３０ＣＶ／ｈで実施した。
0005401097.tif 000006
２つのクロマトグラムを図３に示す。クロマトグラムは、保持容量及び主要ピークのピークの形にＫＣｌ依存的な違いを示す。ＫＣｌ濃度が上昇した場合保持容量は減少しピークは狭くなり、溶媒中のＫＣｌ濃度が上昇した場合、効率性Ｎ（式２によって求められる）が増大することを示している（表２を参照）。
【００３９】
（実施例４）
クロマトグラフ溶媒に塩として、０（ｗ／ｗ）％、０．５２（ｗ／ｗ）％又は１．１２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌをそれぞれ加えた、ポリスチレンジビニルベンゼンにおけるＲＰＣクロマトグラフィーの実施
３つのクロマトグラフ泳動を下記のとおり実施した。３泳動間の違いは、溶媒に加えたＫＣｌの量だけである（表３を参照）。
１０．６ｍｇのｒｈＩＬ-２１を含む溶液を、ポリスチレンジビニルベンゼン樹脂、ＰＬＲＰ−Ｓ(ポリマーラボラトリーズ、粒径１５μｍ、孔サイズ３００Å）を含むカラム（４ｘ１２５ｍｍ）に充填した。充填前に、カラムは４ＣＶ（カラム容積）の２０（ｗ／ｗ）％エタノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリスとＸ（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ(Ｘは表３のとおり)（ｐＨ７．０）で平衡化した。非結合タンパク質は３ＣＶの２０（ｗ／ｗ）％エタノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリスとＸ（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ(Ｘは表３のとおり)（ｐＨ７．０）で洗い流した。ｒｈＩＬ-２１は、２５ＣＶの０．２１（ｗ／ｗ）％トリスとＸ（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ(Ｘは表１のとおり)（ｐＨ７．０）に含まれる２０−７０（ｗ／ｗ）％エタノールの直線的勾配で溶出した。カラムは、５ＣＶの７０％エタノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリスとＸ（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ(Ｘは表３のとおり)（ｐＨ７．０）及び５ＣＶのＷＦＩで洗浄した。
カラムは、５ＣＶの６０（ｗ／ｗ）％１−プロパノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリスと０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ（ｐＨ７．０）で再生した。
精製は、室温で、流速３８ＣＶ／ｈで実施した。
0005401097.tif 000007
３つのクロマトグラムを図４に示す。クロマトグラムは、保持容量及び主要ピークのピークの形にＫＣｌ依存的な違いを示す。ＫＣｌ濃度が上昇した場合保持容量は減少しピークは狭くなり、溶媒中のＫＣｌ濃度が上昇した場合、効率性Ｎ（式２によって求められる）が増大することを示している（表３を参照）。溶媒中のＫＣｌ濃度が増大した場合、収率は増大する。
【００４０】
（実施例５）
ＰＨ３．５におけるｒｈＩＬ−２１のＲＰＣ−ＨＰＬＣ精製
２０ｍｇのｒｈＩＬ-２１を含む溶液をＣＮ-プロピル置換シリカゲル(粒径１５μｍ、孔サイズ３００Å）を含むカラム（５ｘ１０５ｍｍ）に充填した。充填前に、カラムは４ＣＶ（カラム容積）の２５（ｗ／ｗ）％エタノールと０．２３（ｗ／ｗ）％酢酸ナトリウム三水和物と０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ（ｐＨ３．５）で平衡化した。非結合タンパク質は３ＣＶの２５（ｗ／ｗ）％エタノールと０．２３（ｗ／ｗ）％酢酸ナトリウム三水和物と０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ（ｐＨ３．５）で洗い流した。ｒｈＩＬ−２１は、２０ＣＶの０．２３（ｗ／ｗ）％酢酸ナトリウム三水和物と０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌとｐＨ３．５に含まれる２５−７０（ｗ／ｗ）％エタノールの直線的勾配で溶出した。カラムは、５ＣＶの７０％エタノールと０．２３（ｗ／ｗ）％酢酸ナトリウム三水和物と０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ（ｐＨ３．５）及び５ＣＶの０．２３（ｗ／ｗ）％酢酸ナトリウム三水和物と０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ（ｐＨ３．５）で洗浄した。精製は、室温で、流速３０ＣＶ／ｈで実施した。
カラムは、５ＣＶの６０（ｗ／ｗ）％１−プロパノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリスと０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ（ｐＨ７．０）で再生した。
ＩＬ−２１を含んでいる主要ピークは比較的幅広いピークに溶出した。小さい再生ピークを基準にして、収率は高いようだ。
【００４１】
（実施例６）
ＰＨ５．０におけるｒｈＩＬ−２１のＲＰＣ−ＨＰＬＣ精製
２０ｍｇのｒｈＩＬ-２１を含む溶液をＣＮ-プロピル置換シリカゲル（粒径１５μｍ、孔サイズ３００Å）を含むカラム（５ｘ１０５ｍｍ）に充填した。充填前に、カラムは４ＣＶ（カラム容積）の２５（ｗ／ｗ）％エタノールと０．２３（ｗ／ｗ）％酢酸ナトリウム三水和物と０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ（ｐＨ５．０）で平衡化した。非結合タンパク質は３ＣＶの２５（ｗ／ｗ）％エタノールと０．２３（ｗ／ｗ）％酢酸ナトリウム三水和物と０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ（ｐＨ５．０）で洗い流した。ｒｈＩＬ−２１は、２０ＣＶの０．２３（ｗ／ｗ）％酢酸ナトリウム三水和物と０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ（ｐＨ５．０）に含まれる２５−７０（ｗ／ｗ）％エタノールの直線的勾配で溶出した。カラムは、５ＣＶの７０％エタノールと０．２３（ｗ／ｗ）％酢酸ナトリウム三水和物と０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ（ｐＨ５．０）及び０．２３（ｗ／ｗ）％酢酸ナトリウム三水和物と０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ（ｐＨ５．０）で洗浄した。精製は、室温で、流速３０ＣＶ／ｈで実施した。
カラムは、５ＣＶの６０（ｗ／ｗ）％１−プロパノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリスと０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ（ｐＨ７．０）で再生した。
ＩＬ-２１は比較的シャープな主要ピークに溶出し、保持容量は実施例４のｐＨ３．５よりも比較的高い。小さい再生ピークを基準にして、収率は高いようだ。
【００４２】
（実施例７）
ｐＨ９．０におけるｒｈＩＬ-２１のＲＰＣ−ＨＰＬＣ精製
８ｍｇのｒｈＩＬ-２１を含む溶液をポリスチレンジビニルベンゼン樹脂、ＰＬＲＰ−Ｓ(ポリマーラボラトリーズ、粒径１５μｍ、孔サイズ３００Å）を含むカラム（４ｘ１２５mm)に充填した。充填前に、カラムは４ＣＶ（カラム容積）の５０（ｗ／ｗ）％エタノールと０．１５（ｗ／ｗ）％ヒスチジンと０．２６（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ（ｐＨ９．０）で平衡化した。非結合タンパク質は３ＣＶの５０（ｗ／ｗ）％エタノールと０．１５（ｗ／ｗ）％ヒスチジンと０．２６（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ（ｐＨ９．０）で洗い流した。ｒｈＩＬ-２１は、１５ＣＶの０．１５（ｗ／ｗ）％ヒスチジンと０．２６（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ（ｐＨ９．０）に含まれる５０−７０（ｗ／ｗ）％エタノールの直線的勾配で溶出した。カラムは、３ＣＶの７０％エタノールと０．１５（ｗ／ｗ）％ヒスチジンと０．２６（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ（ｐＨ９．０）及び５ＣＶのＷＦＩで洗浄した。カラムは、５ＣＶの６０（ｗ／ｗ）％１−プロパノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリスと０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ（ｐＨ７．０）で再生した。精製は、３０℃で、流速１９ＣＶ／ｈで実施した。
ＩＬ-２１は勾配の後期に、比較的幅広いピークに溶出した。収率は約３０％であった。ＩＬ-２１の比較的大きい分画は再生ピークに紛れた。
【００４３】
（実施例８）
ｐＨ７．０、３０℃、４０℃又は５０℃におけるｒｈＩＬ-２１のＲＰＣ−ＨＰＬＣ精製
３つのクロマトグラフ泳動を下記のとおり実施した。３泳動間の違いは、クロマトグラフィーを実施した温度だけである（表４を参照）。
２０ｍｇのｒｈＩＬ-２１を含む溶液をジメチルブチル置換シリカゲル（粒径１５μｍ、孔サイズ３００Å）を含むカラム（５ｘ１０２ｍｍ）に充填した。充填前に、カラムは４ＣＶ（カラム容積）の２５（ｗ／ｗ）％エタノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリスと０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ（ｐＨ７．０）で平衡化した。非結合タンパク質は３ＣＶの５０（ｗ／ｗ）％エタノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリスと０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ（ｐＨ７．０）で洗い流した。ｒｈＩＬ-２１は、２０ＣＶの０．２１（ｗ／ｗ）％トリス、０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ、ｐＨ７．０に含まれる２５−７０（ｗ／ｗ）％エタノールの直線的勾配で溶出した。カラムは、５ＣＶの７０％エタノール、０．２１（ｗ／ｗ）％トリスと０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ（ｐＨ７．０）及び５ＣＶの０．２１（ｗ／ｗ）％トリスと０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ（ｐＨ７．０）で洗浄した。
カラムは、５ＣＶの６０（ｗ／ｗ）％１−プロパノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリスと０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ（ｐＨ７．０）で再生した。精製は、流速３０ＣＶ／ｈ及び表４に示す温度で実施した。
３つの精製の重ね合わせクロマトグラムを図５に示す。クロマトグラムは、温度が３０℃から５０℃に上昇すると、主要ピークが狭く、保持容量が減少することを示している。
0005401097.tif 000008
【００４４】
（実施例９）
クロマトグラフ溶媒中に塩としてＮａＣｌを使用したｒｈＩＬ-２１のＲＰＣ−ＨＰＬＣ精製
１０．６ｍｇのｒｈＩＬ-２１を含む溶液をＣＮ−プロピル置換シリカゲル(粒径１５μｍ、孔サイズ３００Å）を含むカラム（５ｘ１０８ｍｍ）に充填した。充填前に、カラムは４ＣＶ（カラム容積）の２０（ｗ／ｗ）％エタノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリスと０．４１（ｗ／ｗ）％ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で平衡化した。非結合タンパク質は３ＣＶの２０（ｗ／ｗ）％エタノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリスと０．４１（ｗ／ｗ）％ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で洗い流した。ｒｈＩＬ-２１は、２０ＣＶの０．２１（ｗ／ｗ）％トリスと０．４１（ｗ／ｗ）％ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）に含まれる２０−８０（ｗ／ｗ）％エタノールの直線的勾配で溶出した。カラムは、５ＣＶの８０％エタノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリスと０．４１（ｗ／ｗ）％ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）及び５ＣＶの注射用蒸留水（ＷＦＩ）で洗浄した。カラムは、３ＣＶの６０（ｗ／ｗ）％１−プロパノール、０．２１（ｗ／ｗ）％トリスと０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ（ｐＨ７．０）で再生した。精製は、流速３０ＣＶ／ｈ、３０℃で実施した。
ＩＬ-２１は、勾配の中期に明確な高いピークに溶出した。プール容積は約２カラム容積であった。
【００４５】
（実施例１０）
クロマトグラフ溶媒中に塩としてＮＨ４Ｃｌを使用したｒｈＩＬ-２１のＲＰＣ−ＨＰＬＣ精製
１０．６ｍｇのｒｈＩＬ−２１を含む溶液をＣＮ−プロピル置換シリカゲル（粒径１５μｍ、孔サイズ３００Å）を含むカラム（５ｘ１０８mm)に充填した。充填前に、カラムは４ＣＶ（カラム容積）の２０（ｗ／ｗ）％エタノール、０．２１（ｗ／ｗ）％トリスと０．３７（ｗ／ｗ）％ＮＨ４Ｃｌ（ｐＨ７．０）で平衡化した。非結合タンパク質は３ＣＶの２０（ｗ／ｗ）％エタノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリスと０．３７（ｗ／ｗ）％ＮＨ４Ｃｌ（ｐＨ７．０）で洗い流した。ｒｈＩＬ-２１は、２０ＣＶの０．２１（ｗ／ｗ）％トリスと０．３７（ｗ／ｗ）％ＮＨ４ＣｌとｐＨ７．０に含まれる２０−８０（ｗ／ｗ）％エタノールの直線的勾配で溶出した。カラムは、５ＣＶの８０％エタノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリスと０．３７（ｗ／ｗ）％ＮＨ４Ｃｌ（ｐＨ７．０）及び５ＣＶの注射用蒸留水（ＷＦＩ）で洗浄した。カラムは、３ＣＶの６０（ｗ／ｗ）％1-プロパノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリスと０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ（ｐＨ７．０）で再生した。精製は、流速３０ＣＶ／ｈ、３０℃で実施した。
ＩＬ-２１は、勾配の中期に明確な高いピークに溶出した。プール容積は約２カラム容積であった。
【００４６】
（実施例１１）
クロマトグラム溶媒に塩として乳酸カリウムを使用したｒｈＩＬ-２１のＲＰＣ−ＨＰＬＣ精製
１０．６ｍｇのｒｈＩＬ−２１を含む溶液をジメチルブチル置換シリカゲル（粒径１５μｍ、孔サイズ３００Å）を含むカラム（５ｘ１０５ｍｍ)に充填した。充填前に、カラムは４ＣＶ（カラム容積）の２０（ｗ／ｗ）％エタノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリスと０．３２（ｗ／ｗ）％乳酸カリウム（ｐＨ７．０）で平衡化した。非結合タンパク質は３ＣＶの２０（ｗ／ｗ）％エタノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリスと０．３２（ｗ／ｗ）％乳酸カリウム（ｐＨ７．０）で洗い流した。ｒｈＩＬ-２１は、２０ＣＶの０．２１（ｗ／ｗ）％トリスと０．３２（ｗ／ｗ）％乳酸カリウム（ｐＨ７．０）に含まれる２０−７０（ｗ／ｗ）％エタノールの直線的勾配で溶出した。カラムは、５ＣＶの７０（ｗ／ｗ）％エタノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリスと０．３２（ｗ／ｗ）％乳酸カリウム（ｐＨ７．０）及び５ＣＶの注射用蒸留水（ＷＦＩ）で洗浄した。カラムは、３ＣＶの６０（ｗ／ｗ）％１−プロパノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリスと０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ（ｐＨ７．０）で再生した。精製は、流速３０ＣＶ／ｈ、３０℃で実施した。
ＩＬ-２１は、シャープな主要ピークに、約２カラム容積の容積で溶出した。タンパク質は勾配の後期に溶出した。収率は約７５％であった。約２０％のＩＬ-２１は再生ピーク中に失われた。
【００４７】
（実施例１２）
オクタデシル置換シリカゲルにおけるＲＰＣ−ＨＰＬＣの実施
３１．８ｍｇのｒｈＩＬ-２１を含む溶液をオクタデシル置換シリカゲル（粒径１５μｍ、孔サイズ３００Å）を含むカラム（４ｘ２５０ｍｍ）に充填した。充填前に、カラムは４ＣＶ（カラム容積）の４０（ｗ／ｗ）％エタノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリスと０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ（ｐＨ７．０）で平衡化した。非結合タンパク質は１ＣＶの４０（ｗ／ｗ）％エタノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリスと０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ（ｐＨ７．０）で洗い流した。ｒｈＩＬ-２１は、２０ＣＶの０．２１（ｗ／ｗ）％トリスと０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ（ｐＨ７．０）に含まれる４０−７０（ｗ／ｗ）％エタノールの直線的勾配で溶出した。カラムは、３ＣＶの７０（ｗ／ｗ）％エタノールと０．２１（ｗ／ｗ）％トリスと０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌ（ｐＨ７．０）及で洗浄した。精製は、流速６ＣＶ／ｈ、室温で実施した。
ＩＬ-２１は、後方端部のテーリングのために、比較的幅広いピークに溶出した。収率は、約５０％であった。
【００４８】
（実施例１３）
溶媒に塩を加えていないＲＰＣを使用したヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の精製
溶媒Ａは０．６１（ｗ／ｗ）％トリス（ｐＨ７．５）であった。溶媒Ｂは４０（ｗ／ｗ）％１−プロパノールと０．６１（ｗ／ｗ）％トリス（ｐＨ７．５）であった。３ｍｇのフリーズドライｈＧＨを３ｍｌの溶媒Ａに溶解した。その溶液を、ポリスチレンジビニルベンゼン樹脂、ＰＬＲＰ−Ｓ(ポリマーラボラトリーズ、粒径１５μｍ、孔サイズ３００Å）を含むカラム（４ｘ１２５ｍｍ）に充填した。充填前に、カラムは５ＣＶの３０％溶媒Ａ＋７０％溶媒Ｂで平衡化した。非結合タンパク質は３ＣＶの３０％溶媒Ａ＋７０％溶媒Ｂで洗い流した。ｈＧＨは、１０ＣＶの３０％溶媒Ａ＋７０％溶媒Ｂから１００％溶媒Ｂの直線的勾配で溶出した。カラムは、５ＣＶの溶媒Ｂで再生した。精製は、室温で、流速７．５ＣＶ／ｈで実施した。
ｈＧＨは勾配の後期に、明確なピーク（図６の実線）に溶出した。タンパク質は勾配のおおよそ中期に溶出した。
【００４９】
（実施例１４）
溶媒にＫＣｌを加えたＲＰＣを使用したヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の精製
溶媒Ａは０．６１（ｗ／ｗ）％のトリスと０．７５％のＫＣｌ（ｐＨ７．５）であった。溶媒Ｂは４０（ｗ／ｗ）％の１−プロパノールと０．７５％のＫＣｌと０．６１（ｗ／ｗ）％トリス（ｐＨ７．５）であった。３ｍｇのフリーズドライｈＧＨを３ｍｌの０．６１（ｗ／ｗ）％トリス（ｐＨ７．５）溶解した。その溶液を、ポリスチレンジビニルベンゼン樹脂、ＰＬＲＰ−Ｓ(ポリマーラボラトリーズ、粒径１５μｍ、孔サイズ３００Å)を含むカラム（４ｘ１２５ｍｍ）に充填した。充填前に、カラムは５ＣＶの３０％溶媒Ａ＋７０％溶媒Ｂで平衡化した。非結合タンパク質は３ＣＶの３０％溶媒Ａ＋７０％溶媒Ｂで洗い流した。ｈＧＨは、１０ＣＶの３０％溶媒Ａ＋７０％溶媒Ｂから１００％溶媒Ｂの直線的勾配で溶出した。カラムは、５ＣＶの溶媒Ｂで再生した。精製は、室温で、流速７．５ＣＶ／ｈで実施した。
ＩＬ-２１は、勾配の初期に明確なピークに溶出した。実施例１３と比較して、ピークはより狭くより高くなっており、実施例１３のクロマログラフ効率よりも良いことを示す。本泳動と実施例１３の泳動の違いは、本実施例では溶媒にＫＣｌを加えていることだけであり、増大した効率はＫＣｌに原因があることを示している。
【００５０】
（実施例１５）
溶媒にＫＣｌを加えたＲＰＣを使用したヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の精製
本クロマトグラフ泳動は、実施例１３に比較して実施例１４のより高くより狭いピークが、実施例１４において主要ピークがより小さい保持容量で溶出されたことによるものかどうかを調べるために実施した。実施例１４から勾配を、ｈＧＨ主要ピークが実施例１３とほぼ同じ保持容量に溶出するように調節することで実施した。
実施例１４のように、溶媒Ａは０．６１（ｗ／ｗ）％トリスと０．７５％のＫＣｌ（ｐＨ７．５）であった。溶媒Ｂは４０（ｗ／ｗ）％１−プロパノールと０．７５％ＫＣｌと０．６１（ｗ／ｗ）％トリス（ｐＨ７．５）であった。
３ｍｇのフリーズドライｈＧＨを３ｍｌの０．６１（ｗ／ｗ）％トリス（ｐＨ７．５）溶解した。その溶液を、ポリスチレンジビニルベンゼン樹脂、ＰＬＲＰ−Ｓ（ポリマーラボラトリーズ、粒径１５μｍ、孔サイズ３００Å)を含むカラム(４x１２５mm)に充填した。充填前に、カラムは５ＣＶの３５．３％溶媒Ａ＋６４．７％溶媒Ｂで平衡化した。非結合不純物は３ＣＶの３５．３％溶媒Ａ＋６４．７％溶媒Ｂで洗い流した。
ｈＧＨは、１０ＣＶの３５．３％溶媒Ａ＋６４．７％溶媒Ｂから５．３％溶媒Ａ＋９４．７％溶媒Ｂの直線的勾配で溶出した。カラムは、５ＣＶの溶媒Ｂで再生した。精製は、室温で、流速７．５ＣＶ／ｈで実施した。
ＩＬ-２１ピーク（図６の点線）は、明確なピークで、勾配のほぼ中期に、実施例１３（図６を参照）の主要ピークの保持容量に匹敵する保持容量で溶出した。実施例１３と比較して、ピークはより狭くより高くなっており、実施例１３のクロマログラフ効率よりも良いことを示す。実施例１３の場合（溶媒に塩を加えていない）よりもピークはより高くより狭く、このことはクロマトグラフ効率は低い保持容量によるものではなく、塩の添加によるものであることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】クロマトグラフ溶媒に塩を加えていない、ＣＮープロピル置換シリカゲルにおけるＩＬ-２１精製のクロマトグラム。実施例１を参照のこと。
【図２】クロマトグラフ溶媒に塩として、０．１９（ｗ／ｗ）％、０．３７（ｗ／ｗ）％又は０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌをそれぞれ加えた、ＣＮープロピル置換シリカゲルにおける３つのＩＬ-２１精製による重ね合わせクロマトグラム。実施例２を参照のこと。
【図３】クロマトグラフ溶媒に塩として０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌを加えるか又は塩なしの、ジメチルブチル置換シリカゲルにおける２つのＩＬ-２１精製による重ね合わせクロマトグラム。実施例３を参照のこと。
【図４】クロマトグラフ溶媒に塩として、０．１９（ｗ／ｗ）％、０．３７（ｗ／ｗ）％又は０．５２（ｗ／ｗ）％ＫＣｌをそれぞれ加えた、ポリスチレンジビニルベンゼンにおける３つのＩＬ-２１精製による重ね合わせクロマトグラム。実施例４を参照のこと。
【図５】それぞれ３０℃、４０℃及び５０℃における、ジメチルブチル置換シリカゲルにおける３つのＩＬ-２１精製による重ね合わせクロマトグラム。実施例８を参照のこと。
【図６】クロマトグラフ溶媒への塩付加が主要ピークを狭く高くし、従ってクロマトグラフ性能が増大することを示す、実施例１３（実線）及び実施例１５（点線）で得られたクロマトグラムの重ね合わせ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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