(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヤクシマアジサイの抽出物を含有することを特徴とするエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤。
【請求項２】
ヤクシマアジサイの抽出物を含有することを特徴とする幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤。
【請求項３】
ヤクシマアジサイの抽出物を含有することを特徴とする塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤。
【請求項４】
ヤクシマアジサイの抽出物を含有することを特徴とするグルタチオン産生促進剤。
【請求項５】
ヤクシマアジサイの抽出物を含有することを特徴とするフィラグリン産生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラニン産生抑制剤、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、グルタチオン産生促進剤、過酸化水素に対するダメージ抑制剤、及びフィラグリン産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚においてメラニンは、紫外線から生体を保護する役目も果たしているが、過剰生成や不均一な蓄積は、皮膚の黒化やシミの原因となる。一般に、メラニンは色素細胞の中で生合成される酵素チロシナーゼの働きによって、チロシンからドーパ、ドーパからドーパキノンに変化し、次いで、５，６−ジヒドロキシインドフェノール等の中間体を経て形成される。したがって、皮膚の色黒（皮膚色素沈着症）を予防・改善するため、即ち美白のためには、メラニンの産生を抑制すること、或いは既に産生したメラニンを淡色漂白することが有効であると考えられる。
【０００３】
これまでの美白剤の開発は、メラニン生成の律速酵素であるチロシナーゼに注力して進められてきた。しかし、最近、紫外線ＵＶ−Ｂ照射後に表皮ケラチノサイトからの産生が上昇し、色素細胞（メラノサイト）を活性化するサイトカインとして、α−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、エンドセリン−１（ＥＴ−１）、一酸化窒素、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、ｂＦＧＦ）、顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、幹細胞増殖因子（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ、ＳＣＦ）等が報告されており、これらが関与する情報伝達系を遮断することにより、メラニン産生を抑制して美白効果を導く物質の開発が盛んに行われるようになってきている。
【０００４】
前記エンドセリン−１（ＥＴ−１）の色素細胞（メラノサイト）への作用を阻害する生薬の抽出物として、例えば、カミツレ抽出物及びアルテア抽出物が報告されている（非特許文献１参照）。
【０００５】
前記幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）は、角化細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、骨髄ストローマ細胞等から産生されるタンパク質である。前記ＳＣＦは、多能性造血幹細胞、生殖細胞、肥満細胞、巨核球系前駆細胞、顆粒球・マクロファージ系前駆細胞、色素細胞等の増殖や分化を促進する作用を有することが知られている。また、前記ＳＣＦは、シミ部位や紫外線照射等によって発現が亢進することが知られている（非特許文献２参照）。前記ＳＣＦとしては、２７３個のアミノ酸残基からなる膜結合型ＳＣＦと、タンパク質分解酵素の作用により切断され、膜から遊離する分泌型ＳＣＦとが知られている。膜結合型ＳＣＦは、角化細胞等に結合したまま色素細胞のＳＣＦレセプターに結合し、色素細胞の増殖を促進する。また、分泌型ＳＣＦは、その結合部位にて切断され、細胞膜から遊離し、色素細胞のＳＣＦレセプターに結合することによって、色素細胞の増殖を促進する。
【０００６】
前記塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）は、ＦＧＦ−２とも呼ばれ、紫外線照射により角化細胞からの遊離が促進され、遊離されたｂＦＧＦが色素細胞に作用してメラニン合成を促進し、かつ色素細胞の細胞分裂をも促進すると考えられている（非特許文献３参照）。
【０００７】
このようにＳＣＦ及びｂＦＧＦの異常産生は、色素細胞の異常増殖につながり、メラニン産生を亢進させ、シミ、ソバカス、くすみ等の原因となると考えられる。したがって、ＳＣＦ及びｂＦＧＦの発現上昇を抑制することは、色素細胞の増殖を抑制し、皮膚におけるメラニンの過剰産生を抑制し、日焼け後の色素沈着、シミ、ソバカス等の予防又は抑制に有用であると考えられる。
【０００８】
また、グルタチオンは、グルタミン酸、システイン、及びグリシンの３つのアミノ酸からなるトリペプチドであり、細胞内の主要なシステイン残基を有する化合物である。細胞内におけるグルタチオンの役割はラジカルの捕捉、酸化還元による細胞機能の調節、各種酵素のＳＨ供与体であり、抗酸化成分としても知られている。グルタチオンの作用発現はそのシステイン残基に由来すると考えられている。しかし、皮膚中のグルタチオン量は、加齢に伴って低下することが報告されており、このことが皮膚における酸化防御能を低下させ、細胞のＤＮＡ及びタンパク質などの構成成分にダメージを与える一因であると考えられている。
このように皮膚においてグルタチオンの産生を促進することは、加齢により衰える酸化ストレスの防御を高め、かつ紫外線による酸化ストレスに対する傷害を抑制することにつながり、皮膚の老化の予防、治療、あるいはシミ等の色素沈着に対する改善が期待できると考えられる。そこで、グルタチオン産生促進作用を有するものとして、例えばビルベリー抽出物又はウォルナット抽出物（特許文献１参照）、クチナシ属植物の抽出物（特許文献２参照）、などが開示されている。
【０００９】
また、天然保湿因子（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｍｏｉｓｔｕｒｉｚｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒｓ；ＮＭＦ）の主成分であるアミノ酸は、ケラトヒアリン顆粒に由来するフィラグリンが角質層内で分解されて産生される。このフィラグリンは、角質層直下の顆粒層に存在する表皮ケラチノサイトでプロフィラグリンとして発現する。その後、直ちにリン酸化し、ケラトヒアリン顆粒に蓄積され、脱リン酸，加水分解を経てフィラグリンへと分解され、角質層に移行して、ケラチンフィラメントの凝集効率を高め、角質細胞の内部構築に関与することが報告されている（非特許文献４参照）。
近年、フィラグリンが皮膚の水分保持に非常に重要かつ必要不可欠であること、及び乾燥などの条件によってフィラグリンの合成力が低下し、角質層におけるアミノ酸量が低下することが報告されている（非特許文献５参照）。
このように表皮ケラチノサイトにおいて、プロフィラグリンｍＲＮＡの発現促進を通じて、フィラグリンの合成を促進させて角質層内のアミノ酸量を増大させ、角質層の水分環境を本質的に改善できることが期待される。
このため、フィラグリン合成促進剤としては、例えば、カンゾウ抽出物（特許文献３参照）、天然植物中に含まれるフラバノン配糖体として知られるリクイリチン（特許文献４参照）、プロフィラグリン及びフィラグリン蛋白産生促進剤の少なくともいずれかとして、Ｃｉｔｒｕｓ属に属する植物エキス又は酵母エキス（特許文献５参照）、などが提案されている。
【００１０】
また、過酸化水素は活性酸素の一つであり、このような活性酸素は食細胞の殺菌機構にとって必須であり、ウイルスや癌細胞の除去に重要な働きを果たしている。しかし、前記活性酸素の過剰な生成は生体内の膜及び組織を構成する生体内分子を攻撃し、各種疾患を誘発する。これらの中でも、皮膚は紫外線等の環境因子の刺激を直接受けるため、スーパーオキサイドが生成し易い器官であるから、スーパーオキサイド濃度の上昇により、例えば、コラーゲン等の生体組織を分解、変性、又は架橋したり、また油脂類を酸化して細胞に障害を与える過酸化脂質を生成して、皮膚のしわを形成したり、皮膚の弾力性低下等の老化、炎症、肌の色素沈着を引き起こすという問題がある。
そこで、過酸化水素に対するダメージ抑制作用を有するものとして、例えば紅藤の抽出物（特許文献６参照）、ミリントニア・ホルテンシス（Ｍｉｌｌｉｎｇｔｏｎｉａ ｈｏｒｔｅｎｓｉｓ）の抽出物、リーア・マクロフィラ（Ｌｅｅａ ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ）の抽出物、コダリオカリクス・モトリウス（Ｃｏｄａｒｉｏｃａｌｙｘ ｍｏｔｏｒｉｕｓ）の抽出物、マルティニア・アンヌア（Ｍａｒｔｙｎｉａ ａｎｎｕａ）の抽出物、ピットスポルム・ナパウレンセ（Ｐｉｔｔｏｓｐｏｒｕｍ ｎａｐａｕｌｅｎｓｅ）の抽出物、ヘスペレトゥサ・クレヌラータ（Ｈｅｓｐｅｒｅｔｈｕｓａ ｃｒｅｎｕｌａｔａ）の抽出物、プテロスペルムム・ディベルシフォリウム（Ｐｔｅｒｏｓｐｅｒｍｕｍｕ ｄｉｖｅｒｓｉｆｏｌｉｕｍ）の抽出物、グレウィア・エリオカルパ（Ｇｒｅｗｉａ ｅｒｉｏｃａｒｐａ）の抽出物、ツンベルギア・ラウリフォリア（Ｔｈｕｎｂｅｒｇｉａ ｌａｕｒｉｆｏｌｉａ）の抽出物、又はプレムナ・インテグリフォリア（Ｐｒｅｍｎａ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）の抽出物（特許文献７参照）などが開示されている。
【００１１】
このように、メラニン産生抑制作用、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制作用、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制作用、グルタチオン産生促進作用、過酸化水素に対するダメージ抑制作用、及びフィラグリン産生促進作用を有する物質は、非常に有用であることが考えられる。しかしながら、現在までのところ、前記したような作用を有し、かつ安全性が高く、そのため、皮膚化粧料、美容用飲食品、研究用試薬などの成分として広く利用が可能な優れた物質は、未だ提供されておらず、その速やかな提供が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００６−２４１０６２号公報
【特許文献２】特開２００６−３４７９３４号公報
【特許文献３】特開２００２−３６３０５４号公報
【特許文献４】特開２００３−１４６８８６号公報
【特許文献５】特開２００１−２６１５６８号公報
【特許文献６】特開２００９−０９１３０２号公報
【特許文献７】特開２００９−２９８７１２号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】「フレグランスジャーナル」，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．９，ｐ．６５〜７１，２０００年発行
【非特許文献２】Ｈａｃｈｉｙａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，  Ｎｏ．１１６，  ２００１，  ｐ．５７８−５８６
【非特許文献３】Ｈａｌａｂａｎ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  Ｎｏ．１０７，  １９８８，  ｐ．１６１１−１６１９
【非特許文献４】フレグランスジャーナル臨時増刊  Ｖｏｌ．１７、ｐ１４−１９、２０００年発行
【非特許文献５】「Ａｒｃｈ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ.  Ｒｅｓ．」Ｖｏｌ．２８８、ｐ．４４２−４４６、１９９６年発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、第１に、優れたメラニン産生抑制作用を有し、かつ安全性の高いメラニン産生抑制剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、第２に、優れたエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用を有し、かつ安全性の高いエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、第３に、優れた幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制作用を有し、かつ安全性の高い幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、第４に、優れた塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制作用を有し、かつ安全性の高い塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、第５に、優れたグルタチオン産生促進作用を有し、かつ安全性の高いグルタチオン産生促進剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、第６に、優れた過酸化水素に対するダメージ抑制作用を有し、かつ安全性の高い過酸化水素に対するダメージ抑制剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、第７に、優れたフィラグリン産生促進作用を有し、かつ安全性の高いフィラグリン産生促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記課題を解決するために本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、ヤクシマアジサイの抽出物が、優れたメラニン産生抑制作用、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制作用、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制作用、グルタチオン産生促進作用、過酸化水素に対するダメージ抑制作用、及びフィラグリン産生促進作用を有することを知見した。
【００１６】
本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  ヤクシマアジサイの抽出物を含有することを特徴とするメラニン産生抑制剤である。
＜２＞  ヤクシマアジサイの抽出物を含有することを特徴とするエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤である。
＜３＞  ヤクシマアジサイの抽出物を含有することを特徴とする幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤である。
＜４＞  ヤクシマアジサイの抽出物を含有することを特徴とする塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤である。
＜５＞  ヤクシマアジサイの抽出物を含有することを特徴とするグルタチオン産生促進剤である。
＜６＞  ヤクシマアジサイの抽出物を含有することを特徴とする過酸化水素に対するダメージ抑制剤である。
＜７＞  ヤクシマアジサイの抽出物を含有することを特徴とするフィラグリン産生促進剤である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によると、従来における諸問題を解決することができ、前記目的を達成することができる。
即ち、本発明によると、第１に、優れたメラニン産生抑制作用を有し、かつ安全性の高いメラニン産生抑制剤を提供することができる。
また、本発明によると、第２に、優れたエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用を有し、かつ安全性の高いエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤を提供することができる。
また、本発明によると、第３に、優れた幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制作用を有し、かつ安全性の高い幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤を提供することができる。
また、本発明によると、第４に、優れた塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制作用を有し、かつ安全性の高い塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤を提供することができる。
また、本発明によると、第５に、優れたグルタチオン産生促進作用を有し、かつ安全性の高いグルタチオン産生促進剤を提供することができる。
また、本発明によると、第６に、優れた過酸化水素に対するダメージ抑制作用を有し、かつ安全性の高い過酸化水素に対するダメージ抑制剤を提供することができる。
また、本発明によると、第７に、優れたフィラグリン産生促進作用を有し、かつ安全性の高いフィラグリン産生促進剤を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明のメラニン産生抑制剤、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、グルタチオン産生促進剤、過酸化水素に対するダメージ抑制剤、及びフィラグリン産生促進剤は、ヤクシマアジサイの抽出物を含有してなり、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。
【００１９】
前記ヤクシマアジサイの抽出物が含有する、前記各作用（メラニン産生抑制作用、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制作用、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制作用、グルタチオン産生促進作用、過酸化水素に対するダメージ抑制作用、及びフィラグリン産生促進作用）を発揮する物質の詳細については不明であるが、前記ヤクシマアジサイの抽出物がこのような優れた作用を有することは、従来には知られておらず、本発明者らによる新たな知見である。
【００２０】
前記ヤクシマアジサイは、学名：Ｈｙｄｒａｎｇｅａ ｇｒｏｓｓｅｓｅｒｒａｔａ又はＨｙｄｒａｎｇｅａ ｋａｗａｇｏｅｎａと称され、アジサイ科の植物であり、屋久島の固有種であり、高さ１ｍ内外の落葉低木である。
抽出原料として使用する前記ヤクシマアジサイの部位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、花、蕾、茎、葉、枝、枝葉、幹、又はこれらの混合物などが挙げられ、これらの中でも、葉が特に好ましい。
【００２１】
抽出原料である前記ヤクシマアジサイは、例えば、乾燥した後に、そのままの状態で又は粗砕機等を用いて粉砕した状態で、溶媒抽出に供することができる。中でも、前記抽出原料としては、採取後ただちに乾燥し、粉砕したものが好ましい。前記乾燥は、例えば、天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。なお、前記ヤクシマアジサイは、ヘキサン、ベンゼン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、前記ヤクシマアジサイの極性溶媒による抽出処理を、効率よく行うことができる。
【００２２】
前記ヤクシマアジサイの抽出物は、植物の抽出に一般に用いられる方法を利用することによって、容易に得ることができる。また、前記ヤクシマアジサイの抽出物としては、市販品を使用してもよい。なお、前記ヤクシマアジサイの抽出物には、前記ヤクシマアジサイの抽出液、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００２３】
前記抽出に用いる溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、親水性有機溶媒、又はこれらの混合溶媒を、室温又は溶媒の沸点以下の温度で用いることが好ましい。前記ヤクシマアジサイに含まれるメラニン産生抑制作用、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制作用、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制作用、グルタチオン産生促進作用、過酸化水素に対するダメージ抑制作用、及びフィラグリン産生促進作用を示す成分は、極性溶媒を抽出溶媒とする抽出処理によって、容易に抽出することができる。
【００２４】
前記抽出溶媒として使用し得る水としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。したがって、前記抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００２５】
前記抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられ、該親水性有機溶媒と水との混合溶媒なども用いることができる。なお、前記水と前記親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する際には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して１質量部〜９０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１質量部〜４０質量部を混合したものを使用することが好ましい。また、多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１質量部〜９０質量部を混合したものを使用することが好ましい。
【００２６】
抽出原料である前記ヤクシマアジサイから、メラニン産生抑制作用、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制作用、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制作用、グルタチオン産生促進作用、過酸化水素に対するダメージ抑制作用、及びフィラグリン産生促進作用を有するヤクシマアジサイの抽出物を抽出するにあたって、特殊な抽出方法を採用する必要はなく、室温又は還流加熱下で、任意の抽出装置を用いて抽出することができる。
具体的には、抽出溶媒を満たした処理槽内に、前記抽出原料を投入し、更に必要に応じて時々攪拌しながら、３０分間〜４時間静置して可溶性成分を溶出した後、ろ過して固形物を除去し、得られた抽出液から抽出溶媒を留去し、乾燥することにより抽出物を得ることができる。抽出溶媒量は、通常、抽出原料の５倍量〜１５倍量（質量比）である。抽出条件は、抽出溶媒として水を用いた場合には、通常５０℃〜９５℃にて１時間〜４時間程度である。また、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いた場合には、通常４０℃〜８０℃にて３０分間〜４時間程度である。なお、溶媒で抽出することにより得られる抽出液は、抽出溶媒が安全性の高いものであれば、そのまま本発明のメラニン産生抑制剤、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、グルタチオン産生促進剤、過酸化水素に対するダメージ抑制剤、及びフィラグリン産生促進剤の有効成分として用いることができる。
【００２７】
抽出により得られる前記ヤクシマアジサイの抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るため、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。なお、得られる前記ヤクシマアジサイの抽出液は、そのままでもメラニン産生抑制剤、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、グルタチオン産生促進剤、過酸化水素に対するダメージ抑制剤、及びフィラグリン産生促進剤の有効成分として使用することができるが、濃縮液又はその乾燥物としたものの方が利用しやすい。抽出液の乾燥物を得るにあたっては、常法を利用することができ、また、吸湿性を改善するためにデキストリン、シクロデキストリン等のキャリアーを添加してもよい。また、抽出原料である前記ヤクシマアジサイは特有の匂いと味を有している場合があり、そのため、前記ヤクシマアジサイの抽出物に対しては、生理活性の低下を招かない範囲で、脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能であるが、例えば皮膚化粧料に添加する場合などには大量に使用するものではないから、未精製のままでも実用上支障はない。なお、精製は、具体的には、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等によって行うことができる。
【００２８】
以上のようにして得られる前記ヤクシマアジサイの抽出物は、優れたメラニン産生抑制作用、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制作用、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制作用、グルタチオン産生促進作用、過酸化水素に対するダメージ抑制作用、及びフィラグリン産生促進作用を有し、これらの作用に基づき、本発明のメラニン産生抑制剤、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、グルタチオン産生促進剤、過酸化水素に対するダメージ抑制剤、及びフィラグリン産生促進剤の有効成分として好適に利用可能なものである。
【００２９】
前記メラニン産生抑制剤、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、グルタチオン産生促進剤、過酸化水素に対するダメージ抑制剤、及びフィラグリン産生促進剤中の前記ヤクシマアジサイの抽出物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、また、前記メラニン産生抑制剤、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、グルタチオン産生促進剤、過酸化水素に対するダメージ抑制剤、及びフィラグリン産生促進剤は、前記ヤクシマアジサイの抽出物そのものであってもよい。
【００３０】
また、前記メラニン産生抑制剤、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、グルタチオン産生促進剤、過酸化水素に対するダメージ抑制剤、及びフィラグリン産生促進剤中に含まれ得る、前記ヤクシマアジサイの抽出物以外のその他の成分としても、本発明の効果を損なわない範囲内であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ヤクシマアジサイの抽出物を所望の濃度に希釈等するための、生理食塩液などが挙げられる。
また、前記メラニン産生抑制剤、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、グルタチオン産生促進剤、過酸化水素に対するダメージ抑制剤、及びフィラグリン産生促進剤は、前記その他の成分として、メラニン産生抑制剤、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、グルタチオン産生促進剤、過酸化水素に対するダメージ抑制剤、及びフィラグリン産生促進剤を有する、前記ヤクシマアジサイの抽出物以外の天然抽出物等を含んでいてもよい。前記メラニン産生抑制剤、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、グルタチオン産生促進剤、過酸化水素に対するダメージ抑制剤、及びフィラグリン産生促進剤中の前記その他の成分の含有量にも、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３１】
また、前記メラニン産生抑制剤、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、グルタチオン産生促進剤、過酸化水素に対するダメージ抑制剤、及びフィラグリン産生促進剤は、必要に応じて製剤化することにより、粉末状、顆粒状、錠剤状等、任意の剤形とすることができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯臭剤等を用いることができる。
【００３２】
前記メラニン産生抑制剤は、有効成分として含有されるヤクシマアジサイの抽出物の作用により、メラニン産生抑制作用を発揮する。
前記エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤は、有効成分として含有されるヤクシマアジサイの抽出物の作用により、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用を発揮する。
前記幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤は、有効成分として含有されるヤクシマアジサイの抽出物の作用により、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制作用を発揮する。
前記塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤は、有効成分として含有されるヤクシマアジサイの抽出物の作用により、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制作用を発揮する。
前記グルタチオン産生促進剤は、有効成分として含有されるヤクシマアジサイの抽出物の作用により、グルタチオン産生促進作用を発揮する。
前記過酸化水素に対するダメージ抑制剤は、有効成分として含有されるヤクシマアジサイの抽出物の作用により、過酸化水素に対するダメージ抑制作用を発揮する。
前記フィラグリン産生促進剤は、有効成分として含有されるヤクシマアジサイの抽出物の作用により、フィラグリン産生促進作用を発揮する。
【００３３】
本発明のメラニン産生抑制剤によると、優れたメラニン産生抑制作用を通じて、例えば、皮膚の色黒（皮膚色素沈着症）を予防・改善し、美白効果を得ることが可能となる。ただし、本発明のメラニン産生抑制剤は、これらの用途以外にもメラニン産生抑制作用を発揮することに意義のある総ての用途に用いることができる。
【００３４】
本発明のエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤によると、優れたエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用を通じて、例えば、エンドセリン−１が関与する情報伝達系を遮断することにより、メラニン産生を抑制して美白効果を得ることが可能となる。ただし、本発明のエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤は、これらの用途以外にもエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用を発揮することに意義のある総ての用途に用いることができる。
【００３５】
本発明の幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤によると、優れた幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制作用を通じて、例えば、色素細胞の増殖を抑制し、皮膚におけるメラニンの過剰産生を抑制し、日焼け後の色素沈着、シミ、ソバカス等を予防又は抑制して美白効果を得ることが可能となる。ただし、本発明の幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤は、これらの用途以外にも幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制作用を発揮することに意義のある総ての用途に用いることができる。
【００３６】
本発明の塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤によると、優れた塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制作用を通じて、例えば、色素細胞の増殖を抑制し、皮膚におけるメラニンの過剰産生を抑制し、日焼け後の色素沈着、シミ、ソバカス等を予防又は抑制して美白効果を得ることが可能となる。ただし、本発明の塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤は、これらの用途以外にも塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制作用を発揮することに意義のある総ての用途に用いることができる。
【００３７】
本発明のグルタチオン産生促進剤によると、優れたグルタチオン産生促進作用を通じて、例えば、加齢により衰える酸化ストレスの防御を高め、かつ紫外線による酸化ストレスに対する傷害を抑制し、皮膚の老化の予防・改善、あるいは、シミ等の色素沈着を改善し、美白効果を得ることが可能となる。ただし、本発明のグルタチオン産生促進剤は、これらの用途以外にもグルタチオン産生促進作用を発揮することに意義のある総ての用途に用いることができる。
【００３８】
本発明の過酸化水素に対するダメージ抑制剤によると、優れた過酸化水素に対するダメージ抑制作用を通じて、過酸化水素から生じる活性酸素により、皮膚のしわを形成したり、皮膚の弾力性低下等の老化、炎症、肌の色素沈着を予防することができる。ただし、本発明の過酸化水素に対するダメージ抑制剤は、これらの用途以外にも過酸化水素に対するダメージ抑制作用を発揮することに意義のある総ての用途に用いることができる。
【００３９】
本発明のフィラグリン産生促進剤によると、優れたフィラグリン産生促進作用を通じて、例えば、角質層内のアミノ酸量を増大させ、角質層の水分環境を改善し、皮膚の老化を予防・改善することが可能となる。ただし、本発明のフィラグリン産生促進剤は、これらの用途以外にもフィラグリン産生促進作用を発揮することに意義のある総ての用途に用いることができる。
【００４０】
なお、本発明のメラニン産生抑制剤、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、グルタチオン産生促進剤、過酸化水素に対するダメージ抑制剤、及びフィラグリン産生促進剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、サル等）に対して適用することもできる。
【００４１】
本発明のメラニン産生抑制剤、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、グルタチオン産生促進剤、過酸化水素に対するダメージ抑制剤、及びフィラグリン産生促進剤は、優れた作用を有するとともに、皮膚に適用した場合の使用感と安全性に優れているため、例えば、皮膚化粧料に配合するのに好適である。ここで、前記皮膚化粧料としては、その区分に制限はなく、皮膚化粧料、医薬部外品、医薬品等を幅広く含むものであり、具体的には、例えば、軟膏、クリーム、乳液、美容液、ローション、パック、ファンデーション、リップクリーム、入浴剤、ヘアートニック、ヘアーローション、石鹸、ボディシャンプー等が挙げられる。
【００４２】
また、本発明のメラニン産生抑制剤、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、グルタチオン産生促進剤、過酸化水素に対するダメージ抑制剤、及びフィラグリン産生促進剤は、優れた作用を有するとともに、経口的に摂取した場合の安全性にも優れているため、例えば、美容用飲食品に配合するのに好適である。ここで、前記美容用飲食品としては、その区分に制限はなく、経口的に摂取される一般食品、健康食品、保健機能食品、医薬部外品、医薬品等を幅広く含むものである。
【００４３】
また、本発明のメラニン産生抑制剤、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、グルタチオン産生促進剤、過酸化水素に対するダメージ抑制剤、及びフィラグリン産生促進剤は、優れた作用を有するので、グルタチオン、フィラグリン、メラニン、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、エンドセリン−１ｍＲＮＡ、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）に関連する疾患の研究のための試薬としても好適に利用可能である。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００４５】
（製造例１）
ヤクシマアジサイの葉の乾燥物を粗砕したもの１００ｇに対し、水２，０００ｍＬを加え、還流抽出器により９０℃で１時間加熱抽出を２回行い、熱時濾過した。その後、得られた抽出液を４０℃で減圧下に濃縮し、凍結乾燥機で乾燥して、ヤクシマアジサイの水抽出物（粉末）を得た。得られたヤクシマアジサイの水抽出物の収率を表１に示す。
【００４６】
（製造例２）
ヤクシマアジサイの葉の乾燥物を粗砕したもの１００ｇに対し、５０質量％エタノール２，０００ｍＬを加え、還流抽出器により、１時間加熱抽出を２回行い、熱時濾過した。その後、得られた抽出液を４０℃で減圧下に濃縮し、凍結乾燥機で乾燥して、ヤクシマアジサイの５０質量％エタノール抽出物（粉末）を得た。得られたヤクシマアジサイの５０質量％抽出物の収率を表１に示す。
【００４７】
【表１】
0005566733.tif 000002
【００４８】
（実施例１）
−Ｂ１６メラノーマ細胞に対するメラニン産生抑制作用試験−
Ｂ１６メラノーマ細胞を、１０質量％のＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１０質量％ＦＢＳ及び１ｍｍｏｌ／Ｌのテオフィリン含有ダルベッコＭＥＭ培地で２５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に希釈した後、４８ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌ当たり３００μＬずつ播種し、６時間培養した。培養終了後、１０質量％ＦＢＳ及び１ｍｍｏｌ／Ｌのテオフィリン含有ダルベッコＭＥＭ培地で溶解した被験試料を各ｗｅｌｌに３００μＬ添加し、４日間培養した。培養終了後、各ｗｅｌｌから培地を取り除き、１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ溶液２００μＬを添加して超音波破砕器により細胞を破壊し、波長４７５ｎｍにおける吸光度を測定し、メラニン産生量とした。
空試験として、１０質量％のＦＢＳ及び１ｍｍｏｌ／Ｌのテオフィリン含有ダルベッコＭＥＭ培地のみで培養した細胞を同様の方法で試験した。
そして、これらの結果から、下記数式１により、メラニン産生抑制作用を算出した。試料濃度１２．５μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬでの結果を表２に示す。
＜数式１＞
メラニン産生抑制率（％）＝{１−（Ｂ／Ｄ）／（Ａ／Ｃ）}×１００
ただし、前記数式１中、Ａは、被験試料無添加での４７５ｎｍにおける吸光度、Ｂは、被験試料添加での４７５ｎｍにおける吸光度、Ｃは、被験試料無添加での５４０ｎｍにおける吸光度、Ｄは、被験試料添加での５４０ｎｍにおける吸光度を表す。
【００４９】
次に、各試料溶液の濃度を段階的に減少させて上記メラニン産生抑制率の測定を行い、各濃度におけるメラニン産生抑制率（％）を求め、その結果から内挿法により、メラニン産生を５０％抑制する試料濃度ＩＣ５０（μｇ／ｍＬ）を求めた。結果を表２に示す。
【００５０】
【表２】
0005566733.tif 000003
表２の結果から、ヤクシマアジサイの抽出物は、非常に強いメラニン産生抑制作用を有することが認められた。
【００５１】
（実施例２）
−エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用試験−
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ；ＮＨＥＫ）を８０ｃｍ２フラスコで正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２）において、３７℃、５％ＣＯ２下で前培養し、トリプシン処理により細胞を集めた。
ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２を用いて３５ｍｍシャーレ（ＦＡＬＣＯＮ社製）に４０×１０４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／シャーレずつ播き、３７℃、５％ＣＯ２下で一晩培養した。２４時間後に培養液を捨て、ＨＥＰＥＳ緩衝液１ｍＬを加え、ＵＶ−Ｂ照射（５０ｍＪ／ｃｍ２）を行い、その後ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２で必要濃度に溶解した試験試料を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。培養後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ；Ｃａｔ．Ｎｏ．３１１−０２５０１）にてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるようにｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。
このｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型とし、エンドセリン−１及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）（Ｃｅｐｈｅｉｄ社製）を用いて、ＴａＫａＲａ  ＳＹＢＲ（Ｒ）  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）（ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＲＲ０６３Ａ）によるリアルタイム２ステップＲＴ−ＰＣＲ反応により行った。
エンドセリン−１のｍＲＮＡの発現量は、「紫外線未照射、被験試料無添加」、「紫外線照射、被験試料無添加」、及び「紫外線照射、被験試料添加」でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求め、更に「紫外線未照射、被験試料無添加」の補正値を１００とした時の「紫外線照射、被験試料無添加」、及び「紫外線照射、被験試料添加」の補正値を算出した。
そして、これらの結果から、下記数式２により、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現上昇抑制率を算出した。試料濃度１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬでの結果を表３に示す。
＜数式２＞
エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現上昇抑制率（％）
＝{（Ａ−Ｂ）−（Ａ−Ｃ）}／（Ａ−Ｂ）×１００
ただし、前記数式２中、Ａは、紫外線未照射・被験試料無添加時の補正値、Ｂは、紫外線照射・被験試料無添加時の補正値、Ｃは、紫外線照射・被験試料添加時の補正値である。
【００５２】
【表３】
0005566733.tif 000004
表３の結果から、ヤクシマアジサイの抽出物は、優れたエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を有することが認められた。
【００５３】
（実施例３）
−幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用試験−
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ；ＮＨＥＫ）を８０ｃｍ２フラスコで正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２）において、３７℃、５％ＣＯ２下で前培養し、トリプシン処理により細胞を集めた。
ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２を用いて３５ｍｍシャーレ（ＦＡＬＣＯＮ社製）に４０×１０４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬシャーレずつ播き、３７℃、５％ＣＯ２下で一晩培養した。２４時間後に培養液を捨て、ＨＥＰＥＳ緩衝液１ｍＬを加えＵＶ−Ｂ照射（５０ｍＪ／ｃｍ２）を行った。その後、ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２で必要濃度に溶解した試験試料を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。培養後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ；Ｃａｔ．Ｎｏ．３１１−０２５０１）にてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるようにｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。
このｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型とし、ＳＣＦ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ）及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）（Ｃｅｐｈｅｉｄ社製）を用いて、ＴａＫａＲａ  ＳＹＢＲ（Ｒ）  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）（ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＲＲ０６３Ａ）によるリアルタイム２ステップＲＴ−ＰＣＲ反応により行った。
ＳＣＦのｍＲＮＡの発現量は、「紫外線未照射、被験試料無添加」、「紫外線照射、被験試料無添加」、及び「紫外線照射、被験試料添加」でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求め、更に「紫外線未照射、被験試料無添加」の補正値を１００とした時の「紫外線照射、被験試料無添加」、及び「紫外線照射、被験試料添加」の補正値を算出した。
そして、これらの結果から、下記数式３により、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現上昇抑制率を算出した。試料濃度１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬでの結果を表４に示す。
＜数式３＞
幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現上昇抑制率（％）
＝{（Ａ−Ｂ）−（Ａ−Ｃ）}／（Ａ−Ｂ）×１００
ただし、前記数式３中、Ａは「紫外線未照射、被験試料無添加」時の補正値、Ｂは「紫外線照射、被験試料無添加」時の補正値、Ｃは「紫外線照射、被験試料添加」時の補正値をそれぞれ表す。
【００５４】
【表４】
0005566733.tif 000005
表４の結果から、ヤクシマアジサイの水抽出物は、弱いＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を有することが認められた。また、ヤクシマアジサイの５０質量％エタノール抽出物は中程度のＳＣＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を有することが認められた。
【００５５】
（実施例４）
−塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用試験−
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ；ＮＨＥＫ）を８０ｃｍ２フラスコで正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２）において、３７℃、５％ＣＯ２下で前培養し、トリプシン処理により細胞を集めた。
ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２を用いて３５ｍｍシャーレ（ＦＡＬＣＯＮ社製）に４０×１０４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬシャーレずつ播き、３７℃、５％ＣＯ２下で一晩培養した。２４時間後に培養液を捨て、ＨＥＰＥＳ緩衝液１ｍＬを加えＵＶ−Ｂ照射（５０ｍＪ／ｃｍ２）を行った。その後、ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２で必要濃度に溶解した試験試料を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。培養後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ；Ｃａｔ．Ｎｏ．３１１−０２５０１）にてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるようにｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。
このｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型とし、ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ；塩基性線維芽細胞増殖因子)及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）（Ｃｅｐｈｅｉｄ社製）を用いて、ＴａＫａＲａ  ＳＹＢＲ（Ｒ）  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）（ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＲＲ０６３Ａ）によるリアルタイム２ステップＲＴ−ＰＣＲ反応により行った。
ｂＦＧＦのｍＲＮＡの発現量は、「紫外線未照射、被験試料無添加」、「紫外線照射、被験試料無添加」、及び「紫外線照射、被験試料添加」でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求め、更に「紫外線未照射、被験試料無添加」の補正値を１００とした時の「紫外線照射、被験試料無添加」、及び「紫外線照射、被験試料添加」の補正値を算出した。
そして、これらの結果から、下記数式４により、ｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制率を算出した。試料濃度１μｇ／ｍＬでの結果を表５に示す。
＜数式４＞
ｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制率（％）
＝{（Ａ−Ｂ）−（Ａ−Ｃ）}／（Ａ−Ｂ）×１００
ただし、前記数式４中、Ａは、紫外線未照射・被験試料無添加時の補正値、Ｂは、紫外線照射・被験試料無添加時の補正値、Ｃは、紫外線照射・被験試料添加時の補正値を表す。
【００５６】
【表５】
0005566733.tif 000006
表５の結果から、ヤクシマアジサイの５０質量％エタノール抽出物は、低濃度において、強いｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用が認められた。
【００５７】
（実施例５）
−グルタチオン産生促進作用試験（ヒト正常皮膚線維芽細胞）−
ヒト正常皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を１０質量％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭ培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に１０質量％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭ培地で希釈した後、４８ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌ当たり２００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養後、１質量％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭ培地で溶解した被験試料を各ｗｅｌｌに２００μＬ添加し、２４時間培養した。培養終了後、各ｗｅｌｌから培地を抜き、４００μＬのＰＢＳ（−）にて洗浄後、１５０μＬのＭ−ＰＥＲ（Ｒ）（ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて細胞を溶解した。このうちの１００μＬを用いて総グルタチオンの定量を行った。
即ち、９６ｗｅｌｌプレートに溶解した細胞抽出液１００μＬ、０．１Ｍのリン酸緩衝液５０μＬ、２ｍＭのＮＡＤＰＨを２５μＬ及びグルタチオンレダクターゼ２５μＬ（終濃度１７．５ｕｎｉｔ／ｍＬ）を加え、３７℃で１０分間加温した後、１０ｍＭの５，５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（２−ｎｉｔｏｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）２５μＬを加え、５分間後までの波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、ＯＤ／ｍｉｎを求めた。総グルタチオン濃度は酸化型グルタチオンを用いて作成した検量線をもとに算出した。
得られた値は総タンパク量当たりのグルタチオン量に補正した後、下記数式５に従いグルタチオン産生促進率を算出した。試料濃度１２．５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、及び２００μｇ／ｍＬでの結果を表６に示す。
＜数式５＞
グルタチオン産生促進率（％）＝（Ｂ／Ａ）×１００
ただし、前記数式５中、Ａは、被験試料を添加しない細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量（対照）、Ｂは、被験試料を添加した細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量を表す。
【００５８】
【表６】
0005566733.tif 000007
表６の結果から、ヤクシマアジサイの抽出物は、強いグルタチオン産生促進作用を有することが確認された。また、ヤクシマアジサイの水抽出物に比べてヤクシマアジサイの５０質量％エタノール抽出物のほうがグルタチオン産生促進作用はやや強かった。
【００５９】
（実施例６）
−グルタチオン産生促進作用試験（Ｂ１６メラノーマ細胞）−
Ｂ１６メラノーマ細胞を１０質量％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１０質量％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地で１０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に希釈した後、４８ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌ当たり２００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、１質量％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地で溶解した被験試料を各ｗｅｌｌに２００μＬ添加し、２４時間培養した。培養後、１質量％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭ培地で溶解した被験試料を各ｗｅｌｌに２００μＬ添加し、２４時間培養した。培養終了後、各ｗｅｌｌから培地を抜き、４００μＬのＰＢＳ（−）にて洗浄後、１５０μＬのＭ−ＰＥＲ（Ｒ）（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて細胞を溶解した。このうちの１００μＬを用いて総グルタチオンの定量を行った。即ち、９６ｗｅｌｌプレートに溶解した細胞抽出液１００μＬ、０．１Ｍリン酸緩衝液５０μＬ、２ｍＭのＮＡＤＰＨを２５μＬ及びグルタチオンレダクターゼ２５μＬ（終濃度１７．５ｕｎｉｔ／ｍＬ）を加え、３７℃で１０分間加温した後、１０ｍＭの５，５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ)２５μＬを加え、５分間後までの波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、ＯＤ／ｍｉｎを求めた。総グルタチオン濃度は酸化型グルタチオンを用いて作成した検量線をもとに算出した。得られた値は総タンパク量当たりのグルタチオン量に補正した後、下記数式６に従いグルタチオン産生促進率を算出した。結果を表７に示す。
＜数式６＞
グルタチオン産生促進率（％）＝（Ｂ／Ａ）×１００
ただし、前記数式６中、Ａは、被験試料を添加しない細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量（対照）、Ｂは、被験試料を添加した細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量を表す。
【００６０】
【表７】
0005566733.tif 000008
表７の結果から、ヤクシマアジサイの抽出物は、グルタチオン産生促進作用を有することが確認された。
【００６１】
（実施例７）
−過酸化水素に対するダメージ抑制作用試験−
ヒト正常皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を１０質量％のＦＢＳ含有α−ＭＥＭ培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるように５質量％のＦＢＳ含有α−ＭＥＭ培地で希釈した後、４８ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌ当たり２００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、培地を抜き、１質量％のＦＢＳ含有α−ＭＥＭ培地で溶解した被験試料を各ｗｅｌｌに２００μＬ添加し、２４時間培養した。培養終了後、培地を抜き、４００μＬのＰＢＳ（−）で洗浄した。洗浄後、ハンクス緩衝液に溶解した過酸化水素（１ｍｍｏｌ／Ｌ）或いはハンクス緩衝液のみを各ｗｅｌｌに２００μＬ添加し、２時間培養した。培養後、４００μＬのＰＢＳ（−）で洗浄し、終濃度０．０５ｍｇ／ｍＬで１質量％のＦＢＳ含有α−ＭＥＭ培地に溶解したニュートラルレッドを各ｗｅｌｌに２００μＬ添加した。２．５時間培養した後、ニュートラルレッド溶液を捨て、エタノール・酢酸溶液（エタノール：酢酸：水＝５０：１：４９）を各ｗｅｌｌに３００μＬ添加し、色素を抽出した。抽出後、波長５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。
そして、これらの結果から、下記数式７により、過酸化水素ダメージ抑制率を算出した。試料濃度２５μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、及び４００μｇ／ｍＬでの結果を表８に示す。
＜数式７＞
過酸化水素ダメージ抑制率（％）＝{１−（Ｃ−Ａ）／（Ｃ−Ｂ）}×１００
ただし、前記数式７中、Ａは、過酸化水素処理・被験試料処理の波長５４０ｎｍにおける吸光度、Ｂは、過酸化水素処理・被験試料無処理の波長５４０ｎｍにおける吸光度、Ｃは、過酸化水素無処理・被験試料無処理の波長５４０ｎｍにおける吸光度を表す。
【００６２】
【表８】
0005566733.tif 000009
表８の結果から、ヤクシマアジサイ抽出物は、弱い過酸化水素ダメージ抑制作用を有することが確認された。
【００６３】
（実施例８）
−プロフィラグリン及びフィラグリン産生促進作用試験−
正常ヒト新生児皮膚表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を８０ｃｍ２のフラスコで正常ヒト表皮角化細胞培地（ＫＧＭ）にて３７℃、５％ＣＯ２下で培養し、常法により細胞を集めた。得られた細胞を同培地にて１．５×１０５個／ｍＬになるように調整し、２ｍＬずつ６穴コラーゲンコートプレートに播種して５％ＣＯ２下、３７℃で３日間培養した。培養後、０．５質量％のＤＭＳＯに溶解した試験試料を含む、又は含まない（コントロール）ＫＧＭを２ｍＬに交換し、３７℃、５％ＣＯ２下で５日間培養した。培養終了後、常法により総タンパクの調製を行った。
【００６４】
＜ウエスタンブロッティング＞
１０μｇ／ｌａｎｅに調整したサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開し、ＰＶＤＦ膜に転写した。５質量％のスキムミルクを含むＰＢＳ（−）でブロッキングを行った後、抗ヒトフィラグリンモノクローナル抗体（Ｈａｒｂｏｒ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ビオチン標識抗マウスＩｇ（Ｗｈｏｌｅ  Ａｂ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）を０．１質量％のＴｗｅｅｎ２０、０．３質量％のスキムミルクを含むＰＢＳ（−）で１，０００倍に希釈して順次反応させ、ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）の発光によりプロフィラグリン及びフィラグリンを検出した。検出したバンドをＫＯＤＡＫ  １Ｄ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＥＤＡＳ２９０  Ｖｅｒｓｉｏｎ３．５にて定量的に測定した。結果は、試験試料添加及び無添加で培養した細胞のそれぞれから調製したタンパク１０μｇ中のプロフィラグリン及びフィラグリンのＮｅｔ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（バンド強度）を用いて、試料濃度１２．５μｇ／ｍＬ、及び５０μｇ／ｍＬでのプロフィラグリン及びフィラグリン産生促進率を、下記数式８から求めた。結果を表９に示す。
＜数式８＞
プロフィラグリン及びフィラグリン産生促進率（％）＝（Ａ／Ｂ）×１００
ただし、前記数式８中、Ａは、被験試料添加時のＮｅｔ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、Ｂは、被験試料無添加時（コントロール）のＮｅｔ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙである。
【００６５】
【表９】
0005566733.tif 000010
表９の結果から、ヤクシマアジサイ水抽出物は、試料濃度１２．５μｇ／ｍＬで弱いプロフィラグリン及びフィラグリン産生促進作用を有することが認められた。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明のメラニン産生抑制剤、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制剤、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制剤、グルタチオン産生促進剤、過酸化水素に対するダメージ抑制剤、及びフィラグリン産生促進剤は、優れたメラニン産生抑制作用、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現抑制作用、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現抑制作用、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現抑制作用、グルタチオン産生促進作用、過酸化水素に対するダメージ抑制作用、及びフィラグリン産生促進作用を有し、かつ安全性にも優れるので、例えば、皮膚化粧料、美容用飲食品中の成分や、研究用の試薬として好適に利用可能である。