(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析物イムノアッセイにおいて異好性抗体による干渉を低減する方法であって、
（ａ）全血試料に、非ヒトＩｇＭ又はその断片を含む乾燥試薬を溶解させることによって、前記試料を乾燥試薬で改質し、少なくとも２０μｇ／ｍＬの非ヒトＩｇＭ濃度又は同等の断片濃度を有する、改質された試料を得るステップと、
（ｂ）前記改質された試料に対して電気化学的イムノアッセイを実施することによって、前記試料中の前記分析物の濃度を求めるステップであって、ここで改質された試料は十分に異好性抗体をその中に隔離しているステップと
を含む上記方法。
【請求項２】
（ｃ）ＩｇＧ又はその断片を用いて全血試料を改質するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
全血試料が、ＩｇＭを用いて改質される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
全血試料が、ＩｇＭ  Ｆ（ａｂ’）２断片を用いて改質される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
全血試料が、ＩｇＭ  Ｆａｂ断片を用いて改質される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
全血試料が、ＩｇＭ  Ｆｃ断片を用いて改質される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
分析物が心血管マーカーである、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
イムノアッセイが、トロポニンＩ（ＴｎＩ）、トロポニンＴ（ＴｎＴ）、クレアチンキナーゼ（ＣＫＭＢ）、ミオグロビン、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｎ端フラグメント（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）、及び脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体（ｐｒｏＢＮＰ）の群から選択される分析物についてのものである、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
試料が、１分〜３０分の範囲の所定期間改質される、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
乾燥試薬が、緩衝液、塩、界面活性剤、安定化剤、単純炭水化物、複合炭水化物、及びこれらの組合せからなる群から選択される成分をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＩｇＧ及びＩｇＭが、マウス、ヤギ、又はこれらの組合せのものである、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
電気化学的イムノアッセイが酵素結合サンドイッチイムノアッセイである、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
電気化学的イムノアッセイが、免疫センサーによって実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
電気化学的イムノアッセイが、免疫センサー及び免疫参照センサーによって実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
乾燥試薬が、前記分析物に対する酵素標識抗体をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
（ｄ）改質された試料を、前記分析物に対する酵素標識抗体を用いて、前記改質された試料中に前記酵素標識抗体を含む第２の乾燥試薬を溶解させることによって改質するステップであって、前記第２の乾燥試薬は、前記ＩｇＭ又はその断片を含有する乾燥試薬と別個のものである上記ステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
電気化学的アッセイが、電極上の分析物に対する固定化抗体を用いて実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
改質された試料が、前記分析物に対する酵素標識抗体をさらに含み、前記分析物に対する固定化抗体と接触することによって、前記固体化抗体と標識抗体の間に前記分析物のサンドイッチを形成し、前記方法が、前記試料を廃棄物チャンバーに流すステップと、前記酵素と反応することによって、電気化学的に検出することができる生成物を形成することができる基質に前記サンドイッチを曝すステップとをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
ポイントオブペイシェントケアで実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
電気化学的イムノアッセイが酵素結合免疫吸着アッセイである、請求項２に記載の方法。
【請求項２１】
イムノアッセイが、免疫センサー、導管、試料流入ポート、及び試料保持チャンバーを備えるカートリッジ内で実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項２２】
前記試料流入ポート、前記試料保持チャンバー、前記導管、及び前記免疫センサーのうちの少なくとも１つの少なくとも一部が、前記乾燥試薬でコーティングされる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
乾燥試薬が前記ＩｇＧをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
分析物がＴｎＩであり、前記乾燥試薬が試料中に溶解することによって、２０〜２００μｇ／ｍＬのＩｇＭ濃度、及び５０〜５０００μｇ／ｍＬのＩｇＧ濃度が得られる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
分析物がＴｎＩであり、前記乾燥試薬が試料中に溶解することによって、２０〜６０μｇ／ｍＬのＩｇＭ濃度、及び５００〜１０００μｇ／ｍＬのＩｇＧ濃度が得られる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
分析物がＢＮＰであり、前記乾燥試薬が試料中に溶解することによって、２０〜２００μｇ／ｍＬのＩｇＭ濃度、及び５０〜５０００μｇ／ｍＬのＩｇＧ濃度が得られる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
分析物がＢＮＰであり、前記乾燥試薬が試料中に溶解することによって、２０〜６０μｇ／ｍＬのＩｇＭ濃度、及び５００〜１０００μｇ／ｍＬのＩｇＧ濃度が得られる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
心臓トロポニンＩイムノアッセイにおいて異好性抗体による干渉を低減する方法であって、
（ａ）全血試料を、
（ｉ）非ヒトＩｇＧ又はＩｇＧ断片、及び（ｉｉ）非ヒトＩｇＭ又はＩｇＭ断片を含む混合物を用いて改質して、
少なくとも２０μｇ／ｍＬの非ヒトＩｇＭ濃度又は同等のＩｇＭ断片濃度を有する改質された試料を得るステップと、
（ｂ）前記改質された試料に対して電気化学的イムノアッセイを実施するステップと
を含む上記方法。
【請求項２９】
脳性ナトリウム利尿ペプチドイムノアッセイにおいて異好性抗体を低減する方法であって、
（ａ）試料を、前記試料中のいずれの異好性抗体も実質的に隔離するのに十分な、（ｉ）非ヒトＩｇＧ又はＩｇＧ断片、及び（ｉｉ）非ヒトＩｇＭ又はＩｇＭ断片を含む混合物を用いて改質するステップであって、前記改質された試料中の前記非ヒトＩｇＭ濃度は、少なくとも２０μｇ／ｍＬ又は同等のＩｇＭ断片濃度である上記ステップと
（ｂ）前記改質された試料に対して電気化学的イムノアッセイを実施するステップと
を含む上記方法。
【請求項３０】
異好性抗体による干渉が低減された、血液試料中の分析物のイムノアッセイを実施するためのデバイスであって、筐体、電気化学的免疫センサー、導管、及び試料流入ポートを備え、前記導管は、血液試料が流入ポートから前記免疫センサーに進むのを可能にし、前記筐体、前記流入ポート、及び前記導管のうちの少なくとも１つは、非ヒトＩｇＭ又はその断片、及び任意選択によりＩｇＧ又はその断片を含む乾燥試薬を含み、前記乾燥試薬は、前記血液試料中に溶解することによって少なくとも２０μｇ／ｍＬのＩｇＭ濃度又は同等の断片濃度を生じ、前記試料中のいずれの異好性抗体も実質的に隔離することができる上記デバイス。
【請求項３１】
乾燥試薬が、非ヒトＩｇＭ又はその断片及びＩｇＧ又はその断片を含む、請求項３０に記載のデバイス。
【請求項３２】
最初の血液試料を計量することによって、計量された血液試料を形成するための計量システムをさらに備える、請求項３１に記載のデバイス。
【請求項３３】
免疫参照センサーをさらに備える、請求項３１に記載のデバイス。
【請求項３４】
分析物が心血管マーカーである、請求項３１に記載のデバイス。
【請求項３５】
イムノアッセイが、ＴｎＩ、ＴｎＴ、ＣＫＭＢ、ミオグロビン、ＢＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、ｐｒｏＢＮＰ、β−ＨＣＧ、ＴＳＨ、Ｄ−二量体、及びＰＳＡの群から選択される分析物のためのものである、請求項３１に記載のデバイス。
【請求項３６】
試料が、１分〜３０分の範囲内の所定期間改質される、請求項３１に記載のデバイス。
【請求項３７】
使い捨てカートリッジである、請求項３１に記載のデバイス。
【請求項３８】
乾燥試薬が、分析物に対する酵素標識抗体をさらに含む、請求項３１に記載のデバイス。
【請求項３９】
分析物に対する酵素標識抗体を含む第２の乾燥試薬をさらに含み、前記第２の乾燥試薬は、ＩｇＭ又はその断片を含む乾燥試薬と別個のものである、請求項３１に記載のデバイス。
【請求項４０】
乾燥試薬が、緩衝液、塩、界面活性剤、安定化剤、単純炭水化物、複合炭水化物、及びこれらの組合せからなる群から選択される成分をさらに含む、請求項３１に記載のデバイス。
【請求項４１】
非ヒトＩｇＧ又はその断片及びＩｇＭ又はその断片が、マウス、ヤギ、又はこれらの組合せのものである、請求項３１に記載のデバイス。
【請求項４２】
免疫センサーが、電気化学的酵素結合サンドイッチイムノアッセイを実施する、請求項３１に記載のデバイス。
【請求項４３】
免疫センサーが、電極上に分析物に対する固定化抗体を含む、請求項３１に記載のデバイス。
【請求項４４】
分析物がＴｎＩであり、前記乾燥試薬が試料中に溶解することによって、２０〜２００μｇ／ｍＬのＩｇＭ濃度、及び５０〜５０００μｇ／ｍＬのＩｇＧ濃度が得られる、請求項３１に記載のデバイス。
【請求項４５】
分析物がＴｎＩであり、前記乾燥試薬が試料中に溶解することによって、２０〜６０μｇ／ｍＬのＩｇＭ濃度、及び５００〜１０００μｇ／ｍＬのＩｇＧ濃度が得られる、請求項３１に記載のデバイス。
【請求項４６】
分析物がＢＮＰであり、前記乾燥試薬が試料中に溶解することによって、２０〜２００μｇ／ｍＬのＩｇＭ濃度、及び５０〜５０００μｇ／ｍＬのＩｇＧ濃度が得られる、請求項３１に記載のデバイス。
【請求項４７】
分析物がＢＮＰであり、前記乾燥試薬が試料中に溶解することによって、２０〜６０μｇ／ｍＬのＩｇＭ濃度、及び５００〜１０００μｇ／ｍＬのＩｇＧ濃度が得られる、請求項３１に記載のデバイス。
【請求項４８】
前記試料を廃棄物チャンバーに流すことができる洗浄流体をさらに含む、請求項３１に記載のデバイス。
【請求項４９】
前記免疫センサーにおいて反応することによって、電気化学的に検出することができる生成物を形成することができる基質を含む洗浄流体をさらに含む、請求項３１に記載のデバイス。
【請求項５０】
分析物イムノアッセイにおいて異好性抗体による干渉を低減する方法であって、
（ａ）生体試料を、ＩｇＭ又はその断片、及び任意選択によりＩｇＧ又はその断片を用いて改質し、少なくとも２０μｇ／ｍＬの非ヒトＩｇＭ濃度又は同等の断片濃度を有する改質された試料を得るステップと、
（ｂ）前記改質された試料に対してイムノアッセイを実施することによって、前記試料中の前記分析物の濃度を求めるステップであって、ここで改質された試料は十分に異好性抗体をその中に隔離しているステップと
を含む上記方法。
【請求項５１】
（ｃ）ＩｇＧ又はその断片を用いて生体試料を改質するステップをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
生体試料が、全血、血清、血漿、尿、及びこれらの希釈形態からなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
生体試料が、ＩｇＭを含む乾燥試薬を前記試料中に溶解させることによって改質される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
生体試料が、ＩｇＭ断片を含む乾燥試薬を前記試料中に溶解させることによって改質される、請求項５１に記載の方法
【請求項５５】
生体試料が、ＩｇＭ又はその断片を含む溶液を添加することによって改質される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
イムノアッセイ法が、電気化学、電流測定、電位差測定、吸光度、蛍光、及び発光からなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
分析物イムノアッセイデバイスにおいて異好性抗体干渉を低減する方法であって、
（ａ）ＩｇＭ又はその断片、及びＩｇＧ又はその断片を生体試料に、前記試料中のいずれの異好性抗体も実質的に隔離するのに十分な量で添加し、改質された試料を形成するステップであって、前記ＩｇＭ又はその断片、及び前記ＩｇＧ又はその断片は、前記試料に対して０．００４超の重量比で添加されるステップと、
（ｂ）前記改質された試料に対して電気化学的イムノアッセイを実施することによって、前記改質された試料中の分析物の濃度を求めるステップと
を含む上記方法。
【請求項５８】
前記重量比が０．０２超である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記重量比が０．０５超である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
ステップ（ａ）が、前記生体試料にＩｇＭを添加することを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
添加するステップの後に、ＩｇＭが少なくとも２０μｇ／ｍＬの濃度で前記試料中に存在する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
ステップ（ａ）が、ＩｇＭ断片を前記生体試料に添加することを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
添加するステップの後に、ＩｇＭ断片が少なくとも２０μｇ／ｍＬのＩｇＭ濃度と同等の濃度で前記試料中に存在する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
添加するステップが、イムノアッセイデバイス内に含まれる乾燥試薬コーティングから、ＩｇＭ又はその断片を前記試料中に溶解させるステップを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６５】
添加するステップが、試料収集デバイス上に含まれる乾燥試薬コーティングから、ＩｇＭ又はその断片を前記試料中に溶解させるステップを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６６】
添加するステップが、前記試料を、前記ＩｇＭ又は前記その断片を含む液体と混合することによって、改質された混合物を形成することを含み、前記方法は、イムノアッセイデバイス内に前記改質された混合物を導入するステップをさらに含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６７】
異好性抗体による干渉が低減された、血液試料中の分析物のイムノアッセイを実施するためのデバイスであって、筐体、電気化学的免疫センサー、導管、及び試料流入ポートを備え、前記導管は、血液試料が流入ポートから前記免疫センサーに進むのを可能にし、前記筐体、前記流入ポート、及び前記導管のうちの少なくとも１つは、非ヒトＩｇＭ又はその断片及びＩｇＧ又はその断片を、前記試料に対して０．００４超の重量比で含む乾燥試薬を含む、上記デバイス。
【請求項６８】
重量比が０．０２超である、請求項６７に記載のデバイス。
【請求項６９】
重量比が０．０５超である、請求項６７に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、その全体が参照により組み込まれている、２００９年３月２５日に出願された、「異好性抗体免疫センサー干渉の改善（Ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｐｈｉｌｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）」という表題の米国出願第１２／４１１，３２５号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、液体試料中の分析物の存在又は濃度を判定するためのデバイス及び方法における、異好性抗体免疫センサー干渉の低減又は排除に関する。特に、本発明は、γグロブリンタンパク質、例えば、ＩｇＭ及びその断片などを用いて生体試料を改質（ａｍｅｎｄ）することによる、異好性抗体免疫センサー干渉の低減又は排除に関する。
【背景技術】
【０００３】
対象とする分析物についての実験室イムノアッセイ試験の多数は、診断、スクリーニング、疾患の病期分類、法医学的分析、妊娠検査、薬物検査、及び他の理由のために生体試料に対して実施される。妊娠検査などのいくつかの定性的検査は、患者が家庭で使用するための単純なキットに変えられている一方で、定量的検査の大部分は、洗練された機器を使用して、実験室設定下で、訓練された技術者の専門知識を依然として必要とする。実験室検査は、分析の費用を増やし、結果を遅らせる。例えば、心筋梗塞及び心不全を示すマーカーの分析などの多くの状況において、遅延は、患者の状態又は予後に有害となり得る。これらの状況及び同様の極めて重要な状況において、そのような分析を、ポイントオブケアで、正確に、安価に、且つ遅延を最小にして実施することが有利である。
【０００４】
サンドイッチ型イムノアッセイとも呼ばれる２サイトイムノアッセイは、生物学的検査試料中の分析物濃度を求めるのにしばしば使用され、例えば、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ  Ｉｎｃ．によって、ｉ−Ｓｔａｔ（登録商標）システムとして開発されたポイントオブケア分析物検出システムにおいて使用される。一般的な２サイト酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）では、１つの抗体が、固体支持体に結合されることによって、「固定化抗体」を形成し、第２の抗体が、酵素などのシグナル生成試薬とコンジュゲート又は結合されることによって、「シグナル抗体」を形成する。測定される分析物を含有する試料と反応すると、分析物は、固定化抗体とシグナル抗体の間で「サンドイッチされた」状態になる。試料及び任意の非特異的に結合した試薬を洗い流した後、固体支持体上に残っているシグナル抗体の量が測定され、これは、試料中の分析物の量に比例するはずである。
【０００５】
多くの型のイムノアッセイデバイス及びプロセスが説明されている。血液の試料中の分析物を首尾よく測定するための１つの使い捨て検出デバイスが、米国特許第５，０９６，６６９号においてＬａｕｋｓによって開示されている。凝固時間についての他のデバイスが、米国特許第５，６２８，９６１号及び同第５，４４７，４４０号においてＤａｖｉｓらによって開示されている。これらのデバイスは、時間の関数として血液の試料中の分析物濃度及び粘度変化を測定する目的のために、読取装置及びこの読取装置に適合するカートリッジを使用する。米国特許第５，０９６，６６９号、同第５，６２８，９６１号、及び同第５，４４７，４４０号は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０００６】
分析物の結合が、電極に隣接する電気活性種の活性の変化を直接又は間接的に引き起こす電気化学的検出も、イムノアッセイに適用されている。電気化学的イムノアッセイの概説については、Ｌａｕｒｅｌｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、７３巻、「電気イムノアッセイ（Ｅｌｅｃｔｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、３３９、３４０、３４６〜３４８（１９８１）を参照されたい。
【０００７】
微細加工技法（例えば、フォトリソグラフィー及びプラズマ蒸着）は、限定された空間において多層センサー構造を構築するのに魅力的である。例えば、シリコン基板上に電気化学的免疫センサーを微細加工するための方法は、Ｃｏｚｚｅｔｔｅらの米国特許第５，２００，０５１号に開示されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。これらには、調合方法、光形成された層及び微粒子ラテックスを含む表面に生物学的試薬、例えば抗体を結合させるための方法、並びに電気化学的アッセイを実施するための方法が含まれる。
【０００８】
電気化学的免疫センサーでは、分析物がその同族抗体に結合することにより、電極における電気活性種の活性の変化が生じ、これは、適当な電気化学的な電位で釣り合うことによって、電気活性種の酸化又は還元を引き起こす。これらの条件を満たすための多くの機構が存在する。例えば、電気活性種は、分析物に直接結合することができ、又は抗体は、電気不活性な基質から電気活性種を生成し、若しくは電気活性な基質を破壊する酵素に共有結合することができる。電気化学的免疫センサーの概説については、Ｍ．Ｊ．Ｇｒｅｅｎ（１９８７）Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３１６：１３５〜１４２を参照されたい。
【０００９】
示差電流（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ）測定の概念は、電気化学の技術分野で周知であり、例えば、共同所有のＣｏｚｚｅｔｔｅ、米国特許第５，１１２，４５５号を参照されたい。さらに、示差電流センサー組合せのバージョンは、共同所有のＣｏｚｚｅｔｔｅ、米国特許第５，０６３，０８１号に開示されている。この特許はまた、電気化学的センサーのために選択透過性層を使用すること、及び生理活性分子を固定化するために膜形成ラテックスを使用することを開示しており、参照により本明細書に組み込まれている。センサーの製造においてポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）を使用することは、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，０３０，８２７号に記載されている。Ｖｉｋｈｏｌｍ（Ｕ．Ｓ．２００３／００５９９５４Ａ１）は、生体分子忌避コーティング、例えば、ＰＶＡを含む表面、すなわち、抗体同士間のギャップ内の表面に直接結合した抗体を教示し、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ（米国特許第５，６５６，５０４号）は、抗体が上に固定された固相、例えば、ＰＶＡを教示している。米国特許第６，０３０，８２７号及び同第６，３７９，８８３号は、ポリ（ビニルアルコール）層をパターン形成するための方法を教示しており、その全体が参照により組み込まれている。
【００１０】
ＵＳ２００６０１６０１６４は、免疫参照電極（ｉｍｍｕｎｏ−ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）を有するイムノアッセイデバイスを記載し、ＵＳ２００５００５４０７８は、試料閉じ込めが改善されたイムノアッセイデバイスを記載し、ＵＳ２００４００１８５７７は、多重ハイブリッドイムノアッセイを記載し、ＵＳ２００３０１７０８８１（ＵＳ７，４１９，８２１として交付された）は、分析物測定及びイムノアッセイのための装置及び方法を記載しており、これらのすべては、共同所有されており、参照により本明細書に組み込まれている。
【００１１】
電流測定に関しては、シグナルの非ファラデー成分のウェイトを低減し、したがって感度を増大させるための、当技術分野で公知のいくつかの手段が存在する。これらには、例えば、クロノアンペロメトリーの代わりに矩形波ボルタンメトリーを使用する、より新しい電気化学的方法、及び化学的手段、例えば、電極表面を不動態化するためのアルキルチオール試薬が含まれる。
【００１２】
しかし、従来のアッセイ構成の１つの制限は、検査試料中に存在し得る異好性抗体によって引き起こされる干渉に対する感受性である。例えば、Ｌ．Ｋｒｉｃｋａ、「免疫アッセイにおけるヒト抗動物抗体干渉（Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉ−Ａｎｉｍａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓａｙｓ）」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５：７、９４２〜９５６（１９９９）を参照されたい。市販のイムノアッセイにおいて使用される抗体は、多くの場合、動物又は動物起源の培地において調製され、又は「産生される」。さらに、多くの個体は、動物タンパク質に対する、天然に存在する非特異的抗体、すなわち、「内因性抗体」を内部に持ち、これは、イムノアッセイにおいて使用される動物抗体試薬に結合し、誤った結果に至る場合がある。例えば、アッセイ試薬の１つ又は複数に結合することができる内因性抗体は、試薬を架橋して偽陽性の結果に導き、又は試薬を隔離して偽陰性の結果に導くことによって、誤った検査結果を生じさせる電位をもたらす。
【００１３】
例えば、放射標識されたマウスモノクローナル抗体を用いた癌療法は、患者においてヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）を産生させる場合があることが判明している。こうした患者から採取される血清試料中にＨＡＭＡが存在することにより、癌マーカーについてのサンドイッチ型酵素イムノアッセイにおいて使用される試薬のマウスモノクローナル抗体が架橋される場合があることが引き続いて示された（Ｂｏｓｃａｔｏら、異好性抗体：すべてのイムノアッセイに関する問題（Ｈｅｔｅｒｏｐｈｉｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｐｒｏｂｌｅｍ  ｆｏｒ  ａｌｌ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ３４、２７〜３３、１９８８）。さらに、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら（免疫グロブリン阻害試薬（ＩＩＲ）：ＨＡＭＡによって引き起こされるＣＡ１２５の偽上昇を排除するための新規方法の評価（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＩＩＲ）：Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ｓｐｕｒｉｏｕｓ  ｅｌｅｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＣＡ１２５  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ＨＡＭＡ）、Ｉｎｔｌ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｍａｒｋｅｒｓ  １１、４６〜４９、１９９６）は、ＣＡ１２５アッセイにおけるＨＡＭＡ干渉を排除するためにＩＩＲ（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ  Ｉｎｃ、ＮＹ）を使用して、有益な結果を実証した。ＩＩＲ物質は、いくつかの種に由来する免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ）、主に、Ｂａｌｂ／ｃマウスに由来するマウスＩｇＧ（サブタイプＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３）のある程度精製された配合物を含むことが報告されている。
【００１４】
ＵＳ６，１０６，７７９は、ある特定のアッセイ試薬の互いの、及びデバイスコンポーネントへの非特異的結合は、診断アッセイにおいて問題である場合が多いことを教示している。これは、抗体が、その抗原ではない分子の領域を認識する場合、特に問題である。その時これは、高いバックグラウンド反応及び偽陽性（又は陰性）アッセイの結果に導く場合がある。この問題のために使用することができる非特異的結合阻害剤には、ウシＩｇＧが含まれる。
【００１５】
ＵＳ２００８０２６１２４２では、内因性ヒト異好性抗体及びヒト抗動物抗体が論じられており、これらは、他の種の免疫グロブリンに結合する能力を有し、患者の１０％超の血清又は血漿中に存在する。これらの循環異好性抗体は、イムノアッセイ測定に干渉する場合がある。サンドイッチイムノアッセイでは、これらの異好性抗体は、捕捉抗体及び検出（診断用）抗体を架橋し、それによって、偽陽性シグナルを生成する場合があり、又はこれらは、診断用抗体の結合を遮断し、それによって、偽陰性シグナルを生成する場合がある。さらに、競合的なイムノアッセイでは、異好性抗体は、分析用抗体に結合し、分析物への分析用抗体の結合を阻害する場合がある。これらはまた、特に、抗種抗体が分別システムにおいて使用される場合、遊離分析物から抗体−分析物複合体の分別を阻止又は増強する場合がある。結果として、これらの異好性抗体干渉のインパクトは、予測困難である場合が多い。
【００１６】
試料から異好性抗体を除去するためのいくつかの追加の方法も公知であり、これらには、（ｉ）ｐＨ５．０の酢酸ナトリウム緩衝液中での、摂氏９０度で１５分間の検体の加熱、その後の１２００ｇで１０分間の遠心分離、（ｉｉ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用する沈降、及び（ｉｉｉ）プロテインＡ又はプロテインＧを用いた免疫抽出が含まれる。異好性抗体問題に対処するための臨床的な指針は、臨床検査標準協会（ＣＬＳＩ）（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）内因性抗体によるイムノアッセイ干渉；提案指針（Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｙ  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ｐｒｏｐｏｓｅｄ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ）によっても提供されている。ＣＬＳＩ文書Ｉ／ＬＡ３０−Ｐ（ＩＳＢＮ  １−５６２３８−６３３−６）。
【００１７】
一般に、イムノアッセイ製造者は、（ａ）試料から干渉性の免疫グロブリンを除去又は不活性化し、（ｂ）アッセイ抗体を改良することによって、これらが異好性抗体と反応する傾向を少なくさせ、（ｃ）干渉を低減する遮断剤（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（ほとんどＩｇＧ）を使用することによって、異好性干渉を低減するように努めている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
しかし、少なくとも以下の分野において異好性抗体を改善するために、プロセスを改善する必要が残っている：（ｉ）最も特に、ポイントオブケア検査との関連で、免疫センサー干渉、（ｉｉ）電気化学的イムノアッセイ、（ｉｉｉ）免疫参照センサーと併せた免疫センサーの使用、（ｉｖ）全血イムノアッセイ、（ｖ）使い捨てカートリッジベースのイムノアッセイ、（ｖｉ）１回の洗浄ステップのみを伴う、非連続イムノアッセイ、及び（ｖｉｉ）乾燥試薬コーティング。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、電気化学的免疫センサー又は他の配位子／配位子受容体ベースバイオセンサーを使用する、血液などの生体試料中の分析物の判定に関する。具体的には、本発明は、例えば、心血管マーカーイムノアッセイを含めた様々なアッセイにおいて異好性抗体による干渉を低減する方法の改善に関する。この手法では、試料、例えば、血液試料を収集し、次いで、例えば、選択された非ヒトＩｇＭ（免疫グロブリンＭ）若しくはその断片、又は非ヒトＩｇＧ及び非ヒトＩｇＭ、若しくはこれらの断片の規定された混合物のいずれかを含む乾燥試薬を溶解させることによって、試料を改質する。
【００２０】
本発明では、試料中に存在する任意の異好性抗体を実質的に隔離するために、十分な量の免疫グロブリンが使用される。試薬の量は、これが、集団の大部分において異好性抗体が生じる濃度の異好性抗体に結合するのに十分であることを保証するように、一般に選択される。或いは、試薬の量は、所定の閾値濃度値を超える異好性抗体が、実質的に除去され、すなわち、添加される免疫グロブリンに結合され、したがって、アッセイに干渉するのを防止するのを保証するように選択することができる。この結合ステップを起こさせるための期間の後に、改質された試料に対してイムノアッセイ、例えば、電気化学的イムノアッセイを実施することが可能である。本発明はさらに、免疫参照センサー及び免疫センサーの両方と併せたこれらの隔離試薬の使用に関する。本発明は、ベッドサイド検査及びニアペイシェント検査とも呼ばれる、ポイントオブケア血液検査に特に有用である。
【００２１】
第１の実施形態では、本発明は、分析物イムノアッセイにおいて異好性抗体による干渉を低減する方法であって、全血試料を、非ヒトＩｇＭ又はその断片を用いて、少なくとも２０μｇ／ｍＬの非ヒトＩｇＭ濃度又は同等の断片濃度を生じるように試料中に乾燥試薬を溶解させることによって改質するステップと、改質された試料に対して電気化学的イムノアッセイを実施することによって、試料中の分析物の濃度を求めるステップとを含む方法に対するものである。好適な態様では、この方法は、ＩｇＧ又はその断片を用いて全血試料を改質するステップも含む。非ヒトＩｇＧ及びＩｇＭは、マウス、ヤギ、又はこれらの組合せのものであることが好ましい。
【００２２】
分析物は、多種多様となり得るが、好ましくは、ＴｎＩ、ＴｎＴ、ＣＫＭＢ、ミオグロビン、ＢＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、及びｐｒｏＢＮＰの群から選択される。好適な実施形態では、試料は、約１分〜約３０分の範囲の所定期間改質される。乾燥試薬は、緩衝液、塩、界面活性剤、安定化剤、単純炭水化物、複合炭水化物、及びこれらの組合せからなる群から選択される成分をさらに含むことが好ましい。乾燥試薬は、分析物に対する酵素標識抗体（シグナル抗体）をさらに含むことができる。別の態様では、この方法は、改質された試料を、分析物に対する酵素標識抗体（シグナル抗体）を用いて、改質された試料中に酵素標識抗体を含む第２の乾燥試薬を溶解させることによって改質するステップであって、第２の乾燥試薬は、ＩｇＭ又はその断片を含有する乾燥試薬と別個のものであるステップをさらに含む。例えば、乾燥試薬は、非ヒトＩｇＧをさらに含むことができる。
【００２３】
電気化学的イムノアッセイは、好ましくは酵素結合サンドイッチイムノアッセイであり、好ましくは免疫センサーによって実施される。したがって、電気化学的アッセイは、電極上の分析物に対する固定化抗体を用いて実施されることが好ましい。改質された試料は、好ましくは、分析物に対する酵素標識抗体をさらに含み、分析物に対する固定化抗体と接触させることによって、固定化抗体と標識抗体の間に分析物のサンドイッチを形成し、この方法は、試料を廃棄物チャンバーに流すステップと、酵素と反応することによって、電気化学的に検出することができる生成物を形成することができる基質にこのサンドイッチを曝すステップとをさらに含む。一実施形態では、電気化学的イムノアッセイは、免疫センサー及び免疫参照センサーによって実施される。別の実施形態では、電気化学的イムノアッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイである。この方法は、ポイントオブペイシェントケア（ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｃａｒｅ）で実施されるのに特によく適している。例えば、イムノアッセイは、免疫センサー、導管、試料流入ポート、及び試料保持チャンバーを備えるカートリッジ内で実施することができる。この態様では、試料流入ポート、試料保持チャンバー、導管、及び免疫センサーのうちの少なくとも１つの少なくとも一部を、乾燥試薬でコーティングすることができる。
【００２４】
別の実施形態では、本発明は、心臓トロポニンＩイムノアッセイにおいて異好性抗体による干渉を低減する方法であって、全血試料を、試料中のいずれの異好性抗体も実質的に隔離するのに十分な、（ｉ）非ヒトＩｇＧ又はＩｇＧ断片、及び（ｉｉ）非ヒトＩｇＭ又はＩｇＭ断片を含む混合物を用いて改質するステップであって、改質された試料中の非ヒトＩｇＭ濃度は、少なくとも約２０μｇ／ｍＬ又は同等のＩｇＭ断片濃度であるステップと、改質された試料に対して電気化学的イムノアッセイを実施するステップとを含む方法を対象とする。
【００２５】
別の実施形態では、本発明は、脳性ナトリウム利尿ペプチドイムノアッセイにおいて異好性抗体による干渉を低減する方法であって、試料を、試料中のいずれの異好性抗体も実質的に隔離するのに十分な、（ｉ）非ヒトＩｇＧ又はＩｇＧ断片、及び（ｉｉ）非ヒトＩｇＭ又はＩｇＭ断片を含む混合物を用いて改質するステップであって、改質された試料中の非ヒトＩｇＭ濃度は、少なくとも約２０μｇ／ｍＬ又は同等のＩｇＭ断片濃度であるステップと、改質された試料に対して電気化学的イムノアッセイを実施するステップとを含む方法を対象とする。
【００２６】
別の実施形態では、本発明は、異好性抗体による干渉が低減された、血液試料中の分析物のイムノアッセイを実施するためのデバイス、例えば、使い捨てカートリッジであって、筐体、電気化学的免疫センサー、導管、及び試料流入ポートを備え、導管は、血液試料が流入ポートから免疫センサーに進むのを可能にし、筐体、流入ポート、及び導管のうちの少なくとも１つは、非ヒトＩｇＭ又はその断片、及び任意選択によりＩｇＧ又はその断片を含む乾燥試薬コーティングを含み、この乾燥試薬は、血液試料中に溶解することによって少なくとも約２０μｇ／ｍＬのＩｇＭ濃度又は同等の断片濃度を生じ、試料中のいずれの異好性抗体も実質的に隔離することができるデバイスに対するものである。この態様では、デバイスは、最初の血液試料を計量することによって、計量された血液試料を形成するための計量システムをさらに備えることが好ましい。デバイスは、免疫参照センサーも備えることができる。免疫センサーは、電極上に分析物に対する固定化抗体を含むことが好ましい。
【００２７】
一態様では、乾燥試薬は、緩衝液、塩、界面活性剤、安定化剤、単純炭水化物、複合炭水化物、及びこれらの組合せからなる群から選択される成分をさらに含む。任意選択により、乾燥試薬は、分析物に対する酵素標識抗体をさらに含む。代替の実施形態では、デバイスは、分析物に対する酵素標識抗体を含む第２の乾燥試薬をさらに含み、第２の乾燥試薬は、ＩｇＭ又はその断片を含む乾燥試薬と別個のものである。デバイスは、試料を廃棄物チャンバーに流すことができる洗浄流体をさらに含むことが好ましい。この洗浄流体は、免疫センサーにおいて反応することによって、電気化学的に検出することができる生成物を形成することができる基質を含むことができる。
【００２８】
別の実施形態では、本発明は、分析物イムノアッセイにおいて異好性抗体による干渉を低減する方法であって、生体試料を、ＩｇＭ又はその断片、及び任意選択によりＩｇＧ又はその断片を用いて、少なくとも２０μｇ／ｍＬの非ヒトＩｇＭ濃度又は同等の断片濃度を生じるように改質するステップと、改質された試料に対してイムノアッセイを実施することによって、試料中の分析物の濃度を求めるステップとを含む方法を対象とする。例えば、生体試料は、ＩｇＭ、ＩｇＭ断片、ＩｇＧ、又はＩｇＧ断片のうちの１つ又は複数を含む乾燥試薬を試料中に溶解させることによって改質することができる。この方法は、ＩｇＧ又はその断片を用いて生体試料を改質するステップをさらに含むことが好ましい。生体試料は、例えば、全血、血清、血漿、尿、及びこれらの希釈形態からなる群から選択することができる。イムノアッセイ法は、電気化学、電流測定、電位差測定、吸光度、蛍光、及び発光からなる群から選択されることが好ましい。
【００２９】
別の実施形態では、本発明は、分析物イムノアッセイデバイスにおける分析物中の異好性抗体干渉を低減する方法であって、試料中のいずれの異好性抗体も実質的に隔離するのに十分な量で、生体試料にＩｇＭ又はその断片及びＩｇＧ又はその断片を添加し、改質された試料を形成するステップであって、ＩｇＭ又はその断片及びＩｇＧ又はその断片は、０．００４超、例えば、０．０２超、０．０５超、又は０．１超の重量比で添加されるステップと、改質された試料に対して電気化学的イムノアッセイを実施することによって、改質された試料中の分析物の濃度を求めるステップとを含む方法に対するものである。添加ステップの後、ＩｇＭは、例えば、少なくとも２０μｇ／ｍＬの濃度で試料中に存在することができる。或いは、ＩｇＭ断片は、少なくとも約２０μｇ／ｍＬのＩｇＭ濃度に同等の濃度で試料中に存在する。一態様では、添加するステップは、イムノアッセイデバイス内に含まれる乾燥試薬コーティングから、ＩｇＭ又はその断片を試料中に溶解させるステップを含む。或いは、添加するステップは、試料収集デバイス上に含まれる乾燥試薬コーティングから、ＩｇＭ又はその断片を試料中に溶解させるステップを含むことができる。さらに別の態様では、添加するステップは、試料をＩｇＭ又はその断片を含む液体と混合することによって、改質された混合物を形成することを含み、この方法は、イムノアッセイデバイス中に改質された混合物を導入するステップをさらに含む。
【００３０】
別の実施形態では、本発明は、異好性抗体による干渉が低減された、血液試料中の分析物のイムノアッセイを実施するためのデバイスであって、筐体、電気化学的免疫センサー、導管、及び試料流入ポートを備え、前記導管は、血液試料が流入ポートから前記免疫センサーに進むのを可能にし、前記筐体、前記流入ポート、及び前記導管のうちの少なくとも１つは、非ヒトＩｇＭ又はその断片及びＩｇＧ又はその断片を、０．００４超、例えば、０．０２超、又は０．０５超の重量比で含む乾燥試薬を含むデバイスに対するものである。
【００３１】
別の実施形態では、本発明は、筐体、電気化学的免疫センサー、導管、又は試料流入ポートのうちの１つ又は複数において、液体試薬カクテルを堆積させることによって、上記デバイスのいずれかを形成するための方法であって、試薬カクテルは、非ヒトＩｇＭ又はその断片、及び任意選択によりＩｇＧ又はその断片を含む方法を対象とする。この方法は、試薬カクテルを乾燥させることによって乾燥試薬を形成し、デバイスをアセンブルするステップをさらに含む。
【００３２】
本発明の方法及びデバイスのいくつかの好適な実施形態では、分析物は、ＴｎＩ又はＢＮＰであり、乾燥試薬は、試料中に溶解することによって、約２０〜約２００μｇ／ｍＬ、例えば、２０〜約６０μｇ／ｍＬのＩｇＭ濃度（又は同等のＩｇＭ断片濃度）、及び約５０〜約５０００μｇ／ｍＬ、例えば、約５００〜約１０００μｇ／ｍＬのＩｇＧ濃度（又は同等のＩｇＧ断片濃度）を与える。
【００３３】
本発明のこれら及び他の目的、特徴、及び利点は、具体的な実施形態の以下の詳細な説明に記載され、以下の図面に例示されている。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】免疫センサーカートリッジカバーの等尺上面図である。
【図２】免疫センサーカートリッジカバーの等尺下面図である。
【図３】免疫センサーカートリッジ用テープガスケットの構成の上面図である。
【図４】免疫センサーカートリッジベースの等尺上面図である。
【図５】免疫センサーカートリッジの構成の概略図である。
【図６】乾燥試薬で流体を改質するための場所を含む、免疫センサーカートリッジ内の流体及び空気の経路の概略図である。
【図７】電気化学的免疫センサーの動作の原理を例示する図である。
【図８】電気化学的免疫センサーの構成の側面図であり、抗体標識粒子は縮尺通りに描かれていない。
【図９】免疫センサーカートリッジ用電気伝導度測定電極及び免疫センサー電極のためのマスク設計の上面図である。
【図１０】異好性抗体改善試薬を含むＴｎＩ及びＢＮＰカートリッジ並びに含まないＴｎＩ及びＢＮＰカートリッジについてのデータを要約する表を示す図である。
【図１１】時間に対するＴｎＩ免疫センサー及び免疫参照センサー応答を示す図である。
【図１２】時間に対するＢＮＰ免疫センサー応答及び免疫参照センサーを示す図である。
【図１３】電気活性種の酵素再生の略図である。
【図１４】セグメント形成手段を例示する図である。
【図１５】好適な実施形態の免疫センサーカートリッジの上面図である。
【図１６】免疫センサーカートリッジの好適な実施形態の流体工学の概略図である。
【図１７Ａ】免疫センサーでの、異好性抗体を含む様々なトロポニン試料についての用量応答を示す図である。
【図１７Ｂ】付随した免疫参照センサーでの、異好性抗体を含む様々なトロポニン試料についての用量応答を示す図である。
【図１７Ｃ】免疫参照センサーシグナルから減じられた免疫センサーシグナルでの、異好性抗体を含む様々なトロポニン試料についての用量応答を示す図である。
【図１８】閉じた位置での、試料流入ポートを閉じるためのスライド可能な密封エレメントを有するカートリッジデバイスを例示する図である。
【図１９】開いた位置での、試料流入ポートを閉じるためのスライド可能な密封エレメントを有するカートリッジデバイスを例示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、以下の分野における、異好性抗体の存在によって引き起こされる干渉の低減又は排除に関する。（ｉ）最も特に、ポイントオブケア検査との関連で、免疫センサー、（ｉｉ）電気化学的イムノアッセイ、（ｉｉｉ）免疫参照センサーと併せた免疫センサーの使用、（ｉｖ）全血イムノアッセイ、（ｖ）使い捨てカートリッジベースのイムノアッセイ、（ｖｉ）１回の洗浄ステップのみを伴う、非連続イムノアッセイ、及び（ｖｉｉ）非特異的結合（ＮＳＢ）阻害剤を含む乾燥試薬コーティング。しかし、当業者によって理解されるように、一般的な概念は、多くのイムノアッセイ法及びプラットフォームに適用可能である。
【００３６】
本発明は、分析物センサーのアレイ、及び免疫センサー又は分析物アレイに改質された試料を順次提示するための手段を有するカートリッジを使用して、分析物の迅速なインサイツ判定を可能にする。カートリッジは、好ましくは読取デバイスとともに稼動するように設計され、例えば、ともにその全体が本明細書に参照により組み込まれている、１９９２年３月１７日に交付された、Ｌａｕｋｓらの米国特許第５，０９６，６６９号、又は２００８年９月２日に交付された米国特許第７，４１９，８２１号に開示されたものなどである。本発明は、この脈絡において最良に理解される。その結果として、ポイントオブケアイムノアッセイシステムを稼動するのに適したデバイス及び方法が最初に記載され、異好性抗体干渉を低減又は排除するのに、システムを最良に適応させることができる方法が記載される。
【００３７】
一実施形態では、本発明は、試料中の分析物の存在又は量を判定するのに液体試料を処理するためのカートリッジ及びその使用方法を提供する。カートリッジは、好ましくは計量手段を含み、これにより、未計量体積の試料を導入することが可能になり、この手段から、計量された量が、カートリッジ及びその付随した読取装置によって処理される。したがって、医師又はオペレーターは、測定前に試料の体積を正確に測定することから解放され、時間、努力を節約し、精度及び再現性を増大させる。計量手段は、一実施形態では、キャピラリーストップを境界とし、長さに沿って空気流入ポイントを有する長い試料チャンバーを備える。空気流入ポイントでかけられる空気圧により、計量された体積の試料が、キャピラリーストップを通過させられる。計量される体積は、空気流入ポイントとキャピラリーストップの間の試料チャンバーの体積によって予め設定される。
【００３８】
カートリッジは、気密様式で試料ポートを密封するための閉鎖デバイスを有することができる。この閉鎖デバイスは、好ましくは、カートリッジの本体に対してスライド可能であり、ポートの領域内に位置したいずれの過剰の試料も追い出すせん断作用をもたらし、流入ポートとキャピラリーストップの間の保持チャンバー中の試料部分を確実に密封する。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、公開された米国特許出願公開第２００５／００５４０７８Ａ１号を参照されたい。カートリッジは、例えば、過剰の流体試料を試料流れ口から追い出し、内部流体試料保持チャンバー内の、ある体積の流体試料を密封し、流体試料が内部キャピラリーストップを尚早に突き破るのを抑制する様式で、カートリッジの表面上で密封エレメントをスライド可能なように動かすことによって密封することができる。このスライド可能な閉鎖デバイスによって得られる密封は、非可逆性であることが好ましく、過剰の血液がカートリッジ内に貯まることを防止し、その理由は、閉鎖デバイスは、血液がカートリッジに入る流れ口の面内を移動し、流入ポートの面より下の血液を密封するせん断作用をもたらし、それによって、過剰の血液、すなわち、流れ口の面より上の血液を流入ポートから離し、任意選択により廃棄物チャンバーに移すためである。
【００３９】
１つの例示的な閉鎖デバイスは、図１に示されており、カバー１の一体化したエレメント２、３、４、及び９を備える。この実施形態では、閉鎖デバイス２は、フック３がパチンと閉まって試料流入ポート４を遮断するまでヒンジの周りを回転する。図１のカバー１の一体化したエレメント２、３、４、及び９を備える閉鎖デバイスの代替案が、図１８及び１９中に、別個のスライド可能なエレメント２００として示されている。図１８及び１９は、別個のスライド可能な閉鎖エレメント２００とともに、図３に示された介在する接着性層２１を伴った、図４中の底部と同様の底部に取り付けられた図１のカバーの改良版を備えるカートリッジデバイスを示す。図１９は、開いた位置での閉鎖デバイス２００を示し、この場合、試料流入ポート４は、試料、例えば、血液を受け入れることができる。図１８は、閉じた位置での閉鎖デバイス２００を示し、この場合、これは、気密様式で試料流入ポートを密封する。稼動中、試料、例えば、血液が流入ポートに添加され、これが保持チャンバー３４に入った後、エレメント２００は、開いた位置から閉じた位置に手動で動かされる。示した実施形態では、流入ポートの領域内のいずれの過剰の血液も、オーバーフローチャンバー２０１、又は隣接する保持領域若しくは空洞に移動される。このチャンバー又は領域は、過剰の試料、例えば、血液を保持するための流体吸収パッド又は物質を含むことができる。
【００４０】
試料流入ポート４は、図１９に示したような円形、又は楕円形である流れ口とすることができ、流れ口の直径は一般に、０．２〜５ｍｍ、好ましくは１〜２ｍｍの範囲内であり、又は楕円形の周囲長が１〜１５ｍｍである。流れ口の周囲の領域は、適用される試料の液滴形状を制御することによって、流入ポート中への流入を促進するために、疎水性又は親水性であるように選択することができる。図１８及び１９に示された閉鎖デバイスの１つの利点は、これは、試料が保持チャンバー３４の端部のキャピラリーストップエレメント２５を越えて押されるのを防止することである。キャピラリーストップを越えて少量の試料、例えば血液が存在することは、分析物のバルク濃度を測定する検査に有意でなく、したがって、試料体積に依存しない。しかし、試料の計量が一般に有利であるイムノアッセイ用途について、密封エレメントは、デバイスの計量精度を改善し、分析器により試料がカートリッジ導管内に動かされるとき、試料のアッセイされるセグメントが免疫センサーに対して適切に配置されるのを確実にする。
【００４１】
稼動中、試料、例えば、血液がカートリッジに添加されるとき、これは、キャピラリーストップへと移動する。したがって、キャピラリーストップから試料流入ポートまでの領域、すなわち、保持チャンバー３４が試料を含むとき、アッセイに十分な試料が存在する。保持チャンバーを満たすプロセスの間、一部の試料が、流入ポートの流れ口の面の上に残る場合がある。密封エレメントが、開いた位置から閉じた位置に移動されるとき、流入ポートの上にあるいずれの試料も、閉鎖の動作の際に追加の試料を取り込むことなくせん断されて除かれ、したがって、試料がキャピラリーストップ２５を越えて移動しないことを確実にする。好適な実施形態では、密封エレメント２００は、図３のテープガスケット２１の表面の上の数千分の１インチ以内に配置される。流入ポートは、密封エレメントが、ロック機構２１２及び２１３に噛み合うとき、２００の表面が接着性テープガスケットまで引き続いて低下することによって密封される。テープは、本質的に非圧縮性であり、流れ口の直径は小さいので、ユーザーによって密封エレメントにかけられるいずれの不意の圧力も、キャピラリーストップを越えて試料を移動させることにならない。
【００４２】
数滴の試料を使用する、ある特定のカートリッジの実施形態では、気泡は、アッセイに影響し得るので、保持チャンバー内でまったく形成しないことが望ましい。したがって、１滴を超える試料、例えば、血液を、気泡を中に閉じ込めることなく保持チャンバー３４内に導入するための信頼できる手段が開発された。試料流入ポートは、コロナ及び／又は試薬カクテルを用いて保持チャンバーを最初に処理することによって、次の液滴が、取り込まれた気泡を保持チャンバー３４内に形成させることなく、複数の液滴の試料を受け入れるように設計することができる。
【００４３】
使い捨て医療用デバイスにコロナ処理を使用することは、当技術分野で周知であり、実質的に任意の物質、例えば、金属化表面、ホイル、紙、板紙原料、又はプラスチック、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ビニル、ＰＶＣ、及びＰＥＴなどの表面活性を増大させる有効な方法である。この処理は、これらをインク、コーティング、及び接着剤に対してより受容性にする。実際には、処理されている物質は、放電、又は「コロナ」に曝される。放電範囲内の酸素分子が壊れて原子になり、処理されている物質中の分子に結合し、化学的に活性化された表面をもたらす。コロナ処理のための適当な装置は市販されている（例えば、Ｃｏｒｏｔｅｃ  Ｃｏｒｐ．、Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ、Ｃｏｎｎ．）。プロセス変数には、物質を処理するのに必要とされるパワー量、物質速度、幅、処理される面の数、及びコロナ処理に対する特定の物質の応答性が含まれ、これらの変数は、熟練したオペレーターによって求めることができる。コロナ処理を組み込むための一般的な場所は、プリント、コーティング、又はラミネートプロセスとインラインである。別の一般的な設置は、インフレーションフィルム又はキャストフィルム押出機の直接上であり、その理由は、新鮮な物質は、コロナ処理に対してより受容性であるためである。
【００４４】
上述したように、サンドイッチイムノアッセイ形式は、最も広く使用されるイムノアッセイ法であり、本明細書に論じられる分析デバイス、例えば、カートリッジにおいても好適な形式である。この実施形態では、１つの抗体（固定化抗体）は、固体支持体又は免疫センサーに結合され、第２の抗体（シグナル抗体）は、酵素、例えば、アルカリホスファターゼなどのシグナル生成試薬にコンジュゲート／結合される。シグナル生成試薬（例えば、シグナル抗体）は、以下に記載するように、分析デバイス中の乾燥試薬コーティングの一部とすることができ、好ましくは、試料が免疫センサーに到達する前に生体試料中に溶解する。試料及び非特異的に結合した試薬を洗い流した後、固体支持体上に残っているシグナル生成試薬（例えば、シグナル抗体）の量は、試料中の分析物の量に、原理上は比例するはずである。しかし、アッセイ構成の１つの制限は、生体試料中に存在する場合のある異好性抗体によって引き起こされる干渉（単数又は複数）に対する感受性である。具体的には、アッセイ試薬の１つ又は複数に結合することができる内因性抗体は、試薬を架橋し（偽陽性）、又は試薬を隔離する（偽陰性）ことによって、誤った検査結果を生じさせる電位をもたらす。
【００４５】
多くの異好性干渉は、マウスＩｇＧを添加することによって軽減されるが、ＩｇＧは、ある特定の試料について、異好性干渉を軽減するのに効果的でないことが意外にも判明した。これらの試料において、システムは、ＩｇＧの存在下でさえ、試料の誤りを認識し、結果として、デバイス中のアルゴリズムは、デバイスが誤った結果を報告するのを抑制させる。これは、かなりの量のＩｇＧの存在下でさえ、いくつかの試料について見出された。
【００４６】
これらのシステムは、動物種から単離されたＩｇＭクラスの免疫グロブリン又はその断片の追加の存在下でのみ正確な結果を生じることが今では発見されている。本明細書で使用する場合、用語「断片」は、指定された分子に由来する任意のエピトープ担持断片を指す。したがって、ＩｇＭ断片は、例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、又はＦｃ断片を含むことができ、これらは、ＩｇＭ分子のエピトープ担持断片である。さらに、「ＩｇＭ又はその断片」とは、ＩｇＭ単独、ＩｇＭ断片単独（すなわち、ＩｇＭのＦ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、及び／若しくはＦｃ断片の１つ若しくは複数）、又はＩｇＭとＩｇＭ断片の組合せを意味する。
【００４７】
好適な実施形態では、ＩｇＭ又はその断片は、乾燥試薬コーティング中に組み込まれ、このコーティングは、いくつかの実施形態では、シグナル生成試薬（例えば、シグナル抗体）を含有する同じ乾燥試薬コーティングとすることができる。したがって、一実施形態では、分析デバイスは、（ａ）異好性抗体の効果を改善するのに適した成分、例えば、ＩｇＭ若しくはその断片、及び好ましくはＩｇＧ若しくはその断片、並びに／又は（ｂ）シグナル抗体のいずれか、又は両方を含む乾燥試薬コーティングを含む。乾燥試薬コーティングは、試薬カクテルから形成することができ、これも、（ａ）異好性抗体の効果を改善するのに適した成分、例えば、ＩｇＭ若しくはその断片、及び好ましくはＩｇＧ若しくはその断片、並びに／又は（ｂ）シグナル抗体のいずれか、又は両方を含むことが好ましい。試薬カクテルが堆積されることになる表面は、最初にコロナ処理されることによって、プリントされるカクテルが行き渡るのを促進する帯電表面基を施すことが好ましい。
【００４８】
一般に、乾燥試薬コーティングを形成するのに使用される試薬カクテルは、水溶性タンパク質、アミノ酸、ポリエーテル、ヒドロキシル基を含有するポリマー、糖又は炭水化物、塩、及び任意選択により色素分子をさらに含むことができる。各成分の１つ又は複数を使用することができる。一実施形態では、カクテルは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、グリシン、塩、メトキシポリエチレングリコール、スクロース、及び任意選択によりプリントプロセスの視覚化を補助する色を提供するブロモフェノールブルーを含有する。一実施形態では、１〜２０μＬのカクテルが、分析デバイスの、例えば、保持チャンバー又は他の導管内の所望の表面上にプリントされ、デバイスのカバーとともに組み立てられる前に、空気乾燥させられる（又は加熱乾燥される）。
【００４９】
別の実施形態では、検査カートリッジは、複数の乾燥試薬コーティングを含むことができる（この場合、コーティングは、これらを区別するためにそれぞれ、第１の試薬コーティング、第２の試薬コーティングなどと呼ばれる場合がある）。例えば、ＩｇＭ又はその断片を、第１の試薬コーティング中に含めることができ、この第１の試薬コーティングは、例えば、シグナル生成成分、例えば、シグナル抗体を含有する第２の試薬コーティングに隣接することができる。この態様では、第２の試薬コーティングは、第１の試薬コーティングの上流又は下流に位置することができるが、シグナル抗体を含有する試薬コーティングは、異好性抗体干渉を阻害するための成分を含有する試薬コーティングの下流に位置することが好ましい。好適な実施形態では、保持チャンバーは、ＩｇＧ又はその断片及びＩｇＭ又はその断片を含む第１の試薬コーティングでコーティングされる。この態様では、シグナル抗体を含む第２の試薬コーティングは、保持チャンバーの下流、例えば、免疫センサーのすぐ上流に位置されることが好ましい。
【００５０】
さらに他の実施形態では、ＩｇＭ又はその断片は、分析デバイス、例えば、カートリッジの一部でなくてもよい。例えば、ＩｇＭ又はその断片及び好ましくはＩｇＧ又はその断片を含む第１の試薬コーティングは、試料収集デバイス、例えば、キャピラリー又はシリンジ内に組み込むことができる。例えば、第１の試薬コーティングは、キャピラリー又はシリンジの内壁上に形成することができる。
【００５１】
別の実施形態では、異好性干渉を改善するための成分（単数又は複数）は、溶液中に含め、生体試料、例えば、血液と混合することができ、得られる改質された試料は、分析デバイス、例えば、カートリッジ中に導入される。一実施形態では、例えば、血液試料は、ＩｇＭ又はその断片（及び好ましくはＩｇＧ又はその断片）を含む液体と混合されることによって、ＩｇＭで改質された試料を形成することができ、次いでこれは、分析デバイス、例えば、カートリッジ中に導入される。別の態様では、デバイスは、ＩｇＭ又はその断片（及び好ましくはＩｇＧ又はその断片）を含む液体を含むポーチをその中に含み、これは、デバイス中で生体試料と混合され、次いで概ね本明細書に記載されるように、処理されることによって分析物検出のためのサンドイッチアッセイを形成する。
【００５２】
別の実施形態では、ＩｇＭ又はその断片及び好ましくはＩｇＧ又はその断片含む第１の液体を、血液などの液体生体試料と混合するのに、エレクトロウェッティングが使用される。この実施形態では、液滴を操作するための装置が提供される場合がある。この装置は、例えば、すべての導電性エレメントが、液滴が操作される１つの表面上に含まれる、片面の電極設計を有することができる。操作される液滴を入れる目的のために、第１の表面と平行に追加の表面を提供することができる。液滴は、エレクトロウェッティングに基づく技法を実施することによって操作され、この技法において、第１の表面上に含まれ、又はこの表面中に埋め込まれた電極が、制御された様式で順次電圧を印加され、電圧を切られる。装置は、２つの液滴を一緒に合わせ、混合すること、１つの液滴を２つ以上の液滴に分割すること、流れから個々に制御可能な液滴を形成することによって連続する液体の流れを試料採取すること、及び所望の混合比を得るために液滴を繰り返して二成分混合又はデジタル混合することを含めた、いくつかの液滴操作プロセスを可能にすることができる。このようにして、ＩｇＭ又はその断片を含む第１の液体の液滴は、液体生体試料、例えば、血液を慎重に且つ制御可能に合わせ、混合することができる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第６，９１１，１３２号を参照されたい。
【００５３】
本発明は、イムノアッセイシステムに広く適用可能であるが、上記に引用された共同所有の係属中及び発行済み特許に記載されているように、ｉ−ＳＴＡＴ（商標）イムノアッセイシステム（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）との関連で最良に理解される。いくつかの実施形態では、システムは、アッセイの間に起こるＮＳＢの程度を評価する目的で、免疫参照センサー（その全体が参照により本明細書に組み込まれている、ＵＳ２００６／０１６０１６４Ａ１を参照）を使用する。ＮＳＢは、不十分な洗浄、又は干渉の存在のために発生し得る。アッセイからの正味のシグナルは、免疫参照センサーから生じる非特異的シグナルを減じることによって補正された、分析物免疫センサーから生じる特異的シグナルを含む。免疫参照センサーにおけるシグナルの量は、品質管理アルゴリズムによって定義される限界に支配される。
【００５４】
一実施形態では、本発明は、ｉ−ＳＴＡＴイムノアッセイ形式の、内因性抗体による干渉に対する耐性を改善するが、これは、標準的なＥＬＩＳＡ形式にも同様に適用可能である。具体的には、本発明は、ＩｇＭクラスの免疫グロブリンの使用を含み、これは、ある特定の検査試料中の異好性抗体によって引き起こされる干渉を実質的に低減することが見出されている。
【００５５】
上記に示したように、動物種から単離された、ＩｇＭクラスの免疫グロブリン（又はその断片）を、好ましくはＩｇＧクラスの免疫グロブリン（又はその断片）と組み合わせて用いて試料を改質することにより、異好性抗体干渉が低減又は排除されることが今では発見されている。実験では、マウス免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が、ｉ−ＳＴＡＴ（商標）イムノアッセイ形式において使用される、試料コンディショニングプリントカクテル（ｓａｍｐｌｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｐｒｉｎｔ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）に添加された。次いで、異好性抗体による干渉のために現場で以前は確実に分析することができなかった、既知の患者の血漿試料が検査された。上記に示したように、ｉ−ＳＴＡＴ（商標）システムは、免疫参照センサーで偽シグナルを検出し、エラーコードでユーザーに警告し、結果が表示されるのを抑制するフェールセーフアルゴリズムを含むので、これらの試料について以前に不正確な結果を報告しなかったことが注目されるべきである。これは、信頼できるポイントオブケア検査に必要とされる品質システムの一部の例である。
【００５６】
意外にも、マウスＩｇＭで改良された新規のカートリッジが試験され、結果が従来のカートリッジと比較されたとき、得られた結果は、ＩｇＭで改良されたカートリッジが使用される場合、以前に問題であった血漿試料が、現在では正確に分析することができることを実証する。
【００５７】
図１０中のデータは、検査結果を要約し、この中で、既知の異好性抗体干渉を示す２つのそれぞれの試料（試料１及び２）中の、２つの心臓マーカー、すなわち、心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）及び脳型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の測定におけるマウスＩｇＭの効力が求められた。図１０において、「平均の結果」は、正味のシグナルの差（分析物センサーにおけるシグナル−参照センサーにおけるシグナル）から計算された分析物濃度を指し、「カートリッジの数」は、実施されたアッセイの数を指し、「エラーの数」は、所与の形式について、試料に対して実施されたアッセイの中で、参照センサーにおける過剰なＮＳＢによって抑制された結果の数を指す。
【００５８】
図１０に記載されたｃＴｎＩ検査において、一連の９つの検査が、ＩｇＭで改良された新規のカートリッジ（ＭＯＤ）を用いて血液試料（試料１）に対して実施された。平均の結果は０．２３ｎｇ／ｍＬであり、識別されたシステムエラーはまったくなかったが、標準的な（ＳＴＤ）デバイスについては、９つすべてのカートリッジは、システムによって報告されたエラーを与え、平均の結果は、無意味な「負の」濃度（−０．２１ｎｇ／ｍＬ）であった（この脈絡における「負」の値の原因は、以下に説明される）。したがって、本発明のＭＯＤカートリッジを用いると、９つすべての試料は、内部システムクオリティーチェックを通過し、意味のある結果を生じたが、ＳＴＤカートリッジはすべて、試料に関連するエラーを認識し、結果の報告を抑制した。
【００５９】
ＢＮＰ検査セットにおいて、一連の３つの検査が、新規ＩｇＭ  ＭＯＤカートリッジ及びＳＴＤカートリッジを用いて第２の試料（試料２）に対して実施された。本発明のＭＯＤカートリッジについて、平均の結果は−２７ｐｇ／ｍＬであり、識別されたシステムエラーはまったくなかったが、ＳＴＤデバイスについては、３つすべての検査は、システムによって報告されたエラーを与え、平均の結果は−１５７ｐｇ／ｍＬであった。やはり、この脈絡における「負の」値の原因は、以下に説明される。
【００６０】
さらに洞察するために、図１１及び１２は、図１０における、異好性干渉を含む２つの試料（試料１及び２）について要約された測定に関連する、実際の未処理の過渡的な電気化学的免疫センサー応答及び免疫参照センサー応答を例示する。
【００６１】
試料１（図１０及び１１）は、臨床業務において生じ、ｃＴｎＩについて陽性であると判定された。使用された検査カートリッジは、ｉ−ＳＴＡＴ（商標）心臓トロポニンＩカートリッジであり、心臓トロポニンＩについてのセンサー（実線、図１１）、及び抗ｃＴｎＩコンジュゲート試薬のＮＳＢの程度を評価するのに使用された免疫参照センサーを含んでいた。ＵＳ２００６／０１６０１６４Ａ１を参照されたい。
【００６２】
図１１は、マウスＩｇＭを取り込んだ後の、異好性抗体活性を含む試料についての電気化学的免疫センサー応答の変化を示す。実線は、ＩｇＭで処理する前（薄い実線）及び後（濃い実線）の、抗ｃＴｎＩ抗体を担持するｃＴｎＩについての、免疫センサーにおける電流応答を示す。点線は、ＩｇＭで処理する前（薄い点線）及び後（濃い点線）の、抗ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）抗体を担持するＨＳＡについての、免疫参照センサーにおける電流応答を示す。矢印は、ＩｇＭ添加後の応答の変化を示す。
【００６３】
ＮＳＢは、洗浄ステップに伴う問題のため、又は干渉（単数又は複数）の存在のために発生する場合がある。使用された免疫参照センサーは、抗ＨＳＡ抗体標識微粒子のコーティングを有する電極を含んでいた。これは、試料に曝されるとＨＳＡでコーティングされた状態になる（ＨＳＡは、試料から自然に生じることに注意）。図１１を検分すると、ｃＴｎＩ免疫センサー（実線）から生じるシグナルは、マウスＩｇＭを添加すると増大する（濃い線）ことを示す。したがって、ＩｇＭの非存在下で、トロポニン濃度は、異好性干渉（単数又は複数）の存在のために過小評価された。これは、試料は、免疫センサー上に固定化された免疫試薬（抗−ｃＴｎＩ抗体）、又は酵素アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）にコンジュゲートされた抗ＨＳＡの１つ又は複数に結合することができる干渉物質を含み、それによって、分析物との相互作用に関するその利用可能性を減少させたことを示す。マウスＩｇＭを添加する前に（薄い線）、免疫参照センサー（点線）は、マウスＩｇＭを添加すると著しく減少した、かなりのシグナルを示したことも図１１から明白である。したがって、ＩｇＭは、抗ｃＴｎＩコンジュゲート試薬（動物抗ｃＴｎＩ抗体を含有する）を、抗ＨＳＡ試薬（免疫参照センサー上の）と架橋することができる干渉物質を軽減するように作用する。
【００６４】
従来のサンドイッチアッセイは、これらの場合において誤った結果を生じる一方で、ｉ−ＳＴＡＴシステムアッセイは、臨界値より下である参照センサーからのシグナルを要求するエラー検出アルゴリズムによりエラーコードを生じることは注目すべきである。誤って結果を報告するのとは対照的に、結果を報告しないことが臨床的に高度に望ましいので、これははるかに優れている。このようにして、分析システムの品質及び完全性が維持される。
【００６５】
一般に、市販のアッセイは、そのような参照測定、例えば、免疫参照センサーに基づく測定を含まず、代わりに、測定される試料中に干渉物質が存在しないこと、又はこの試料中の干渉物質の適切な中和に依拠する。この参照測定の非存在下で、試料１（図１０）は、０．００ｎｇ／ｍＬを報告したであろう。−０．２１という実際の値は、より小さい分析物センサー電流から相対的に大きい免疫参照センサー電流を減じることから生じることに注意されたい。これは明らかに非物理的（無意味な値又は結果）であり、ゼロとして報告される。真の試料値は、ＩｇＭの存在下で得られるように、トロポニンについて実際には正である（０．２３ｎｇ／ｍＬ）。試料１は、非常に低いｃＴｎＩ濃度を有していたことも注意されたい。したがって、実際の免疫センサー（ＩＳ）シグナルは、低いことが予期される。さらに、免疫参照センサー（ＩＲＳ）におけるシグナルは、ＩＳシグナルよりわずかに高い場合があり、ＩＲＳシグナルは、ＩＳシグナルから減じられるので、負の値をもたらすことは予期されないことではない。ここで、本発明者らは、本質的に低い分析物濃度を有する試料に対する異好性抗体の効果を評価することに特に興味があり、この場合、試料に対する異好性抗体の相対的な効果は、重要となり得る。実際の分析物濃度が範囲のより高い側である試料では、異好性抗体の相対的な効果は、一般にあまり顕著でない。トロポニンの追加の試験に対するさらなる詳細は、図１７（Ａ〜Ｃ）に示されており、これは、（ａ）免疫センサー、（ｂ）付随した免疫参照センサー、及び（ｃ）免疫参照センサーシグナルから減じられる免疫センサーシグナルにおける、異好性抗体を有する様々なトロポニン試料についての用量応答プロットを与える。図１７の詳細な説明は、以下の例５に含まれている。
【００６６】
図１２は、マウスＩｇＭを取り込んだ後の、異好性抗体活性を含む試料についての電気化学的ＢＮＰ免疫センサー応答の変化を示す。実線は、ＩｇＭで処理する前（薄い実線）及び後（濃い実線）の、抗ＢＮＰ抗体を担持するＢＮＰについての免疫センサーにおける電流応答を示す。点線は、ＩｇＭで処理する前（薄い点線）及び後（濃い点線）の、抗ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）抗体を担持するＨＳＡについての、免疫センサーにおける電流応答を示す。矢印は、ＩｇＭ添加後の応答の変化を示す。
【００６７】
試料２（図１０及び１２）は、通常の名目上健康な個体の集団において生じた。これは、実際に、低いＢＮＰ濃度を有する。検査カートリッジ（ｉ−ＳＴＡＴ脳型ナトリウム利尿ペプチド、ＢＮＰ）は、ＢＮＰについての免疫センサー（実線、図１２）、及び抗ＢＮＰコンジュゲート試薬のＮＳＢの程度を評価するのに使用された免疫参照センサーを含んでいた。上記に示したように、ＮＳＢは、洗浄ステップの不十分さのため、又は干渉（単数又は複数）の存在のために発生する場合がある。免疫参照センサーは、抗ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）抗体標識微粒子のコーティングを有する電極を含んでおり、試料に曝されるとＨＳＡでコーティングされた状態になる（ＨＳＡは、試料から自然に生じる）。図１２を検分すると、ＢＮＰ免疫センサー（実線）から生じるシグナルは、マウスＩｇＭを添加すると減少する（濃い線）ことを示す。したがって、ＩｇＭの非存在下で、ＢＮＰ濃度は、異好性干渉の存在のために、このセンサーにおいて過剰評価される。マウスＩｇＭを添加する前に（薄い線）、免疫参照センサー（点線）は、マウスＩｇＭを添加すると著しく減少する（濃い線）、かなりのシグナルを示すことも図１２から明白である。したがって、ＩｇＭは、抗ＢＮＰコンジュゲート試薬（動物抗ＢＮＰ抗体を含有する）、及び抗ＢＮＰ又は抗ＨＳＡ試薬（分析物及び免疫参照センサー表面上の）を架橋することができる干渉物質を軽減するように作用する。
【００６８】
免疫参照センサー又はＩｇＭの非存在下で、ＢＮＰセンサー（薄い実線、図１２）から観察されるシグナルは、誤って上昇した結果に対応する。免疫参照センサー（薄い点線、図１２）上の干渉で誘発されたシグナルは、ｉ−ＳＴＡＴ（商標）アッセイ形式において、（ＩｇＭで軽減する前）結果を抑制させた。したがって、ＩｇＭを含めることにより、正しい結果（０ｐｇ／ｍＬのＢＮＰ）が報告されることが可能になる。見かけ上負の結果の発生は、上記のｃＴｎＩの例についてと同じタイプの説明に従う。
【００６９】
上述したように、カートリッジ中に任意選択によりプリントされるＩｇＭを含む新規の乾燥試薬に関して、試薬は、マウスＩｇＧ及びヤギＩｇＧ、並びにマウスＩｇＭなどの干渉排除試薬を含有する水溶液として形成されることが好ましい。上記に論じたように、生体試料、例えば、血液を導入すると、試料は、アッセイの第１のステップで試薬と混合することが好ましい。試薬は、化学特性及び流体特性に関してアッセイ性能を最適化するために、無機塩及び界面活性剤も含むことができる。他の任意選択の添加剤には、十分な抗凝固を保証するためのヘパリン、及びプリント後の試薬の位置を視覚化するための色素が含まれる。微生物の増殖を阻害するためのアジ化ナトリウムなどの安定剤、及びタンパク質を安定化するためのラクチトールとジエチルアミノエチル−デキストランの混合物（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．、Ｍｏｎｍｏｕｔｈ  Ｈｏｕｓｅ、Ｍａｍｈｉｌａｄ  Ｐａｒｋ、Ｐｏｎｔｙｐｏｏｌ、ＮＰ４  ０ＨＺ  ＵＫ）も任意選択により存在する。
【００７０】
異好性抗体干渉を低減するために、マウスＩｇＭは、例えば、試料が、好適な範囲が２５〜４０μｍ／ｍＬである、約１０μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬのＩｇＭの濃度にされる量で組み込むことができる。液体試薬は、１重量％の固体〜３０重量％の固体の範囲の濃度で調製されることが好ましく、好適な濃度は５〜７重量％の固体の範囲である。デバイス中に堆積させたら、堆積した試薬は、例えば、温空気のストリームの中で３０〜６０分間乾燥させることができる。一実施形態では、試薬は、自動化プリント機器を使用してデバイスの試料入口内にプリントされ、乾燥されて、ＩｇＭ含有試薬コーティング層を形成する。
【００７１】
好適な実施形態では、心臓トロポニンＩイムノアッセイにおいて実施される場合、ベースプリントカクテルは、１リットル（Ｌ）のバッチについて以下のように調製される。タンパク質安定化溶液（ＰＳＳ、ＡＥＴ  Ｌｔｄ．、５０％の固体、１００．０ｇ）が、塩化ナトリウム（８．００ｇ）及びアジ化ナトリウム（０．５００ｇ）の水溶液２００〜２５０ｍＬに添加され、得られた溶液は、１Ｌ容のフラスコに移される。マウスＩｇＧの溶液は、マウスＩｇＧ（０．９ｇ）を脱イオン水７５ｍＬに添加することによって調製され、溶解が完全になるまで１５〜６０分間撹拌される。ヤギＩｇＧの同様に濃縮された溶液も同一の様式で調製され、両溶液は、１．２μＭのフィルターを通して濾過される。マウスＩｇＭは、供給者（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）から液体として得られる。３つの免疫グロブリン（Ｉｇ）原液のそれぞれのタンパク質濃度は、２８０ｎｍで、分光光度法で測定される。マウスＩｇＧ（０．７５ｇ）、ヤギＩｇＧ（０．７５ｇ）、及びマウスＩｇＭ（２５ｍｇ）を提供するのに必要とされるこれらのＩｇ溶液の質量が計算され、これらの量がプリント溶液（ｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に添加される。ジエチルアミノエチル−デキストラン（ＤＥＡＥ−デキストラン）の溶液は、ＤＥＡＥ−デキストラン（２．５ｇ）を脱イオン水５０〜１００ｍＬに添加することによって調製され、３０分間撹拌される。このＤＥＡＥ−デキストラン溶液は、プリント溶液に添加される。これに、ナトリウムヘパリン（１０，０００ＩＵ／ｍＬ、３．００ｍＬ）、Ｔｗｅｅｎ−２０（３．００ｇ）、及びローダミンの５％（重量／体積）の水溶液（２００μＬ）が添加される。得られた溶液は、脱イオン水で１．０００Ｌに希釈され、使用されるまでフリーザー又は冷蔵庫内で貯蔵される。
【００７２】
カートリッジコンポーネント上に乾燥試薬コーティングを形成するために、これらの流体及び同様の流体をプリントするステップは、好ましくは、米国特許第５，５５４，３３９号に開示されているように、自動化され、コンポーネントを整列させるためのカメラ及びコンピューターシステムを含むマイクロディスペンシングシステムに基づく。この特許において、ウエハーチャックは、プラスチックカートリッジのベースをディスペンシングヘッドに送るためのトラックに取り替えられる。トラックは、所定の配向でベースをヘッドに差し出すことによって、一貫した位置での分注を保証する。
【００７３】
免疫センサーの好適な実施形態のウエハーレベルの微細加工は、以下の通りである。ベース電極（図９の９４）は、１５μｍの中心上に、７μｍの金ディスクの正方形アレイを備える。アレイは、直径が約６００μｍの円形領域を覆い、Ｓｉ／ＳｉＯ２／ＴｉＷ／Ａｕを含む一連の層でできた基板上に、厚さ０．３５μｍのポリイミドの薄層を光パターン形成することによって実現される。７μｍの微小電極のアレイは、電気活性種の高収集効率をもたらし、露出した金属の電気容量に関連する任意の電気化学的バックグラウンド電流からの寄与が低減される。金属上にＰＶＡ層を含めることにより、バックグラウンド電流の低減が著しく増強される。
【００７４】
多孔質ＰＶＡ層は、ウエハー上の微小電極の上に、ＰＶＡとスチルビゾニウム（ｓｔｉｌｂｉｚｏｎｉｕｍ）光活性架橋剤の水性混合物をスピンコーティングすることによって調製される。スピンコーティング混合物は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を任意選択により含む。次いでこれは、光パターン形成されることによって、アレイの上及び周囲の領域のみを覆い、好ましくは、約０．６μｍの厚さを有する。
【００７５】
示差測定法の一般的な概念は、電気化学分野及びセンシング分野において公知である。電気化学的免疫センシングシステムにおいて干渉シグナルを低減するための新規手段が、これから説明される。しかし、これは、電流測定電気化学的センサーの組について記載されるが、これは、電位差測定センサー、電界効果トランジスタセンサー、及び電気伝導度測定センサーを含めた、他の電気化学的センシングシステムにおいても等しく有用なものである。これは、光学センサー、例えば、エバネッセント波センサー、及び光導波路、並びに音波センシング及び温度測定センシングを含む他のタイプのセンシングなどにも適用可能である。理想的には、免疫センサー（ＩＳ）からのシグナルは、固定化抗体（Ａｂ１）、分析物、及び標識されたシグナル抗体（Ａｂ２）を含むサンドイッチの構造からもっぱら由来し、スキーム（１）で以下に示されるように、標識（例えば、酵素）は基質（Ｓ）と反応することによって、検出可能な生成物（Ｐ）を形成する。
表面−Ａｂ１−分析物−Ａｂ２−酵素；酵素＋Ｓ→Ｐ    （１）
【００７６】
スキーム（２）及び（３）で以下に示されるように、シグナル抗体（Ａｂ２）の一部は、表面に非特異的に結合する場合があり、洗浄ステップの間に、免疫センサーの領域（最大約１００ミクロン離れた）から完全に洗い流されない場合があり、表面−Ａｂｌ−分析物−Ａｂ２−酵素イムノアッセイサンドイッチ構造の機能ではない、検出される生成物全体の一部を生じ、それによって干渉シグナルを作り出すことが知られている。
表面−Ａｂ２−酵素；酵素＋Ｓ→Ｐ    （２）
表面−分析物−Ａｂ２−酵素；酵素＋Ｓ→Ｐ    （３）
【００７７】
上記に示したように、免疫参照センサー（ＩＲＳ）として作用し、主免疫センサー上で起こるのと同じ（又は予想通りに関係した）程度のＮＳＢを与える第２の免疫センサーを、カートリッジ内に任意選択により配置することができる。干渉は、この免疫参照センサーのシグナルを、主免疫センサーのシグナルから減じることによって低減することができ、すなわち、以下のスキーム（４）に示されるように、シグナルのＮＳＢ成分が除去され、アッセイの性能を改善する。この補正は、追加のオフセット値の減算又は加算を任意選択により含んでもよい。
補正されたシグナル＝ＩＳ−ＩＲＳ    （４）
【００７８】
免疫参照センサーは、分析物（例えば、ｃＴｎＩ）のための捕捉抗体が、高い濃度で試料（正常及び病理学的の両方）において自然に発生する血漿タンパク質に対する抗体によって差し替えられていることを除いて、主免疫センサーと、すべての重要な観点（例えば、寸法、多孔質スクリーニング層、ラテックス粒子コーティング、及び金属電極組成）において同じであることが好ましい。免疫センサー及び参照免疫センサーは、図９に示されるように、シリコンチップ上に、それぞれ隣接する構造９４及び９６として作製することができる。好適な実施形態が、トロポニンＩ及びＢＮＰアッセイについて記載されているが、この構造は、例えば、トロポニンＴ、クレアチンキナーゼＭＢ、プロカルシトニン、ｐｒｏＢＮＰ、ミオグロビンなどを含めた他の心臓マーカーアッセイ、並びに臨床診断において使用される他のサンドイッチアッセイ、例えば、ＰＳＡ及びＴＳＨにも有用である。
【００７９】
血漿タンパク質に結合する適当な抗体の例には、ヒト血清アルブミン、フィブリノーゲン、及びＩｇＧ  ｆｃ領域に対する抗体が含まれ、アルブミンが好適である。しかし、適切な抗体が入手可能である場合、約１００ｎｇ／ｍＬ超の濃度で発生する任意の天然タンパク質又は血液成分を使用することができる。ただし、タンパク質は、分析物アッセイを実施するのに必要な時間と比較して急速にセンサーをコーティングするのに十分な量で存在するべきである。好適な実施形態では、タンパク質は、血液試料と接触して約１００秒以内に、参照免疫センサー上の利用可能な抗体の５０％超に結合するのに十分な濃度で血液試料中に存在する。一般に、第２の固定化抗体は、約１×１０−７〜約１×１０−１５Ｍの親和定数を有する。例えば、血液試料中のアルブミンのモル濃度が約１×１０−４Ｍと高いために、約１×１０−１０Ｍの親和定数を有するアルブミンに対する抗体が好適である。
【００８０】
試料に由来する天然アルブミンによって覆われた表面を提供することにより、存在し得る他のタンパク質及び細胞物質の結合が著しく低減されることが見出された。この方法は、ＮＳＢを最小限にするために従来の遮断剤を使用する従来のイムノアッセイより一般に優れており、その理由は、これらの作用剤は、一般にドライダウンされ、使用するまで数カ月間又は数年間安定なままでなければならず、この時間の間にこれらは劣化する場合があり、望まれるより粘着性の表面を作り出し、古くなるとともに上昇するＮＳＢをもたらすためである。対照的に、ここに記載される方法は、使用時に新鮮な表面を提供する。
【００８１】
ＮＳＢの効果を低減するのに示差測定法を実施するための、参照−免疫センサーを伴った、心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）についての免疫センサーが次に説明されている。抗ｃＴｎＩ及び抗ＨＳＡでコーティングされた、カルボキシレートで修飾されたラテックス微粒子（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．又はＳｅｒａｄｙｎ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｉｎｃ．によって供給された）はともに、同じ方法によって調製される。粒子は、遠心分離によって最初に緩衝液交換され、その後抗体が添加され、これは、粒子上に受動的に吸着させられる。次いで粒子上のカルボキシル基は、ｐＨ６．２のＭＥＳ緩衝液中で、ＥＤＡＣで活性化されることによって、抗体にアミド結合を形成する。いずれのビーズ凝集物も遠心分離によって除去され、完成したビーズは凍結して貯蔵される。
【００８２】
抗ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）抗体について、ラテックスビーズを飽和被覆すると、ビーズ質量が約７％増加することが判明した。コーティングされたビーズは、抗ＨＳＡ  ７ｍｇ及びビーズ１００ｍｇを含む混合物から、共有結合を使用して調製された。この配合物を使用して、脱イオン水中に約１％の固体を含む約０．４ｎＬの液滴が、光パターン形成された多孔質ポリビニルアルコール選択透過性層カバーセンサー９６上に微量分注され（その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，５５４，３３９号の方法及び装置を使用して）、乾燥させられた。乾燥した粒子は多孔質層に接着し、血液試料又は洗浄流体中にこれらが溶解するのを実質的に防止した。
【００８３】
トロポニン抗体について、ラテックスビーズ表面を飽和被覆すると、ビーズの質量が約１０％増加した。したがって、抗ＴｎＩ  １０ｍｇをカップリング試薬とともにビーズ１００ｍｇに添加することによって、飽和被覆が実現された。次いでこれらのビーズは、センサー９４上に微量分注された。
【００８４】
別の実施形態では、免疫センサー９４は、血漿タンパク質抗体、例えば、抗ＨＳＡ、及び分析物抗体、例えば、抗ｃＴｎＩの両方を有するビーズでコーティングされる。ビーズ１００ｍｇ当たり抗ＨＳＡ約２ｍｇ以下で作製され、次いで抗ｃＴｎＩで飽和コーティングされたラテックスビーズは、免疫センサーにおいて優れたＮＳＢ特性を示した。利用可能な分析物（抗原）を捕捉するのに、ビーズ上に十分な抗ｃＴｎＩが存在するので、トロポニンアッセイの勾配（シグナル対分析物濃度）は、実質的に影響されないことが見出された。様々な抗体についてのビーズの飽和濃度、及び標的分析物に対する抗体のみを含むビーズを有する免疫センサーの勾配を求めることによって、抗体の組合せの適切な比を、所与の分析物及び血漿タンパク質の両方に対する抗体を有するビーズについて求めることができる。
【００８５】
参照免疫センサーを有する免疫センサーの重要な態様は、血漿タンパク質、好ましくはＨＳＡ／抗ＨＳＡの組合せの層によって作り出される表面の「ヒト化」である。これは、ビーズの、抗体−酵素コンジュゲートのＮＳＢへの傾向を少なくすると思われる。これはまた、ビーズばらつきを低減するように思われる。理論によって束縛されることなく、センサーが試料によって覆われるにつれて、抗ＨＳＡ表面のために、これらは天然アルブミンで急速にコーティングされると思われる。これは、製造中にドライダウンされ、一般に長い期間貯蔵された後に再水和される従来の遮断物質と比較して優れた結果を与える。センサー表面を「ヒト化する」ことの別の利点は、これが、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）及び他の異好性抗体の干渉に対する耐性の追加の機序をもたらすことである。ＨＡＭＡのイムノアッセイに対する効果は周知である。
【００８６】
本発明のデバイス及び方法において使用することができる免疫参照センサーの別の用途は、分析サイクルの間に得られる洗浄効率をモニターすることである。上述したように、バックグラウンドノイズの１つの源は、依然として溶液中にある、又はセンサー上に非特異的に吸収され、洗浄ステップによって除去されない少量の酵素コンジュゲートである。本発明のこの態様は、例２に述べられているように、空気セグメントを導入することによって、小体積の洗浄流体を使用して、効率的な洗浄ステップを実施することに関する。
【００８７】
電流測定の電気化学的システムである好適な実施形態を稼動する際、ＡＬＰの活性から生じる、免疫センサー９４及び免疫参照センサー９６におけるｐ−アミノフェノールの酸化に関連する電流が、分析器によって記録される。免疫センサー及び免疫参照センサーにおける電位は、銀−塩化銀参照電極に対して同じ値に保たれる。干渉の効果を除去するために、分析器は、上記式（４）に従って、免疫センサーのシグナルから免疫参照センサーのシグナルを減じる。２つのセンサーの間に特徴的な一定のオフセットが存在する場合、これも減じられる。免疫参照センサーが、免疫センサーとすべて同じ非特異的特性を有することは必要でなく、これは、アッセイの洗浄部分及びＮＳＢ部分の両方において一貫して比例しているべきであるだけであることが認識されるであろう。分析器に組み込まれたアルゴリズムは、２つのセンサー間の任意の他の本質的に一定の差異を捕らえることができる。
【００８８】
免疫センサー単独ではなく、免疫センサーと免疫参照センサーの示差的組合せの使用は、アッセイに以下の改善をもたらす。好適な実施形態では、カートリッジの設計により、約１０μＬの血液試料中に溶解した約４０〜５０億の酵素コンジュゲート分子を生じる乾燥試薬が提供される。結合ステップ及び洗浄ステップの最後で、センサーにおける酵素分子の数は、約７０，０００である。好適な実施形態を用いた実験では、非特異的に結合したバックグラウンドとして、免疫センサー及び参照免疫センサー上に、平均で約２００，０００（±約１５０，０００）の酵素分子が存在した。免疫参照センサーを用いた示差測定法を使用して、不確定度の約６５％が除去され、アッセイの性能を著しく改善した。他の実施形態は、他の程度の改善を有することができるが、アッセイ性能の全体的な改善のための根本的なことが残っている。
【００８９】
任意選択の免疫参照センサーの追加の用途は、不適切に抗凝固性の試料などの異常な試料状態を検出することであり、これは、導管全体にわたって物質を堆積させ、免疫センサー及び免疫参照センサーの両方で、測定される電流を増大させる。この作用は、非特異的に吸着された酵素、及び測定ステップの間に、センサー上の洗浄流体の薄層中に残っている酵素の両方に関連する。
【００９０】
任意選択の免疫参照センサーの別の用途は、洗浄効率についてシグナルを補正することである。ある特定の実施形態では、免疫センサーにおけるシグナルのレベルは、洗浄の程度に依存する。例えば、より多くの流体／空気セグメントの移行を用いたより長い洗浄は、特異的に結合したコンジュゲートの一部が洗い流されるために、より低いシグナルレベルを与える場合がある。これは、相対的に小さい作用、例えば、５％未満である場合があるが、補正は、アッセイの全体的な性能を改善することができる。補正は、センサーにおける相対的なシグナルに基づいて、又は空気セグメント／流体の移行を検出し、その数を計数するためのセンサーとして作用する、センサーに隣接する導管内に配置された伝導率センサーとともに実現することができる。これは、分析器に組み込まれたアルゴリズム補正手段のためのインプットを提供する。
【００９１】
内因性タンパク質、例えば、ＨＳＡを用いた参照免疫センサーの別の実施形態では、外因性タンパク質、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に対する抗体でコーティングされた免疫参照センサーを有することによって同じ目的を実現することが可能である。この場合、センサーに接触させる前に、追加の試薬として提供される、試料中のＢＳＡの一部を溶解させるステップが必要である。この溶解ステップは、カートリッジの試料保持チャンバー内、又は外部収集デバイス、例えば、ＢＳＡでコーティングされたシリンジ内で、乾燥試薬としてＢＳＡを用いて行うことができる。この手法は、ある特定の利点を提供し、例えば、表面電荷、特異的な表面基、グリコシル化の程度などについてタンパク質を選択することができる。これらの特性は、内因性タンパク質の利用可能な選択肢中に必ずしも存在しなくてもよい。
【００９２】
塩に加えて、他の試薬もイムノアッセイにおける全血精度（ｗｈｏｌｅ−ｂｌｏｏｄ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）を改善することができる。これらの試薬は、迅速な溶解を促進するように血液試料に差し出されるべきである。血液保持チャンバー（又は別の導管）の壁上にコーティングされる、セルロース、ポリビニルアルコール、及びゼラチン（又はこれらの混合物）を含めた支持基質は、例えば、１５秒未満以内に９０％超完了する迅速な溶解を促進する。
【００９３】
ＩｇＭ又はその断片を含めることに加えて、他の任意選択の添加剤を、カートリッジ内に含め、又はアッセイとともに使用することができる。試料が、ヘパリン化された管内に収集されなかった、又はヘパリン化された管内で適切に混合されなかった場合に、性能を改善するために抗凝血性ヘパリンを添加することができる。新鮮なヘパリン化されていない血液が、カートリッジのアッセイサイクルの間、一般に２〜２０分の範囲内で、凝血しないままであるように、十分なヘパリンが添加される。イムノアッセイの分野で周知の異好性抗体問題に対処するためにヤギＩｇＧ及びマウスＩｇＧを添加することができる。Ｐｒｏｃｌｉｎ、ＤＥＡＥデキストラン、Ｔｒｉｓ緩衝液、及びラクチトールを、試薬安定剤として添加することができる。Ｔｗｅｅｎ  ２０を添加することによって、タンパク質が、カートリッジに好適な物質であるプラスチックに結合するのを低減することができる。これはまた、試薬がプラスチック表面をより均等にコーティングするのを可能にし、糖がガラスのままであるように、ラクチトールなどの糖の結晶化を最小限にする不純物として作用する。アジ化ナトリウムを添加することによって、細菌増殖を阻害することができる。
【００９４】
本発明のカートリッジは、試料及び第２の流体が、アッセイシーケンスの間の異なる時間にセンサーアレイに接触することができるという利点を有する。試料及び第２の流体はまた、それぞれの導管内に乾燥コーティングとして最初に存在する他の試薬又は化合物を用いて独立して改質することができる。カートリッジ内の液体の制御された動きはさらに、試料又は流体が導管の新しい領域に移されるときはいつでも、１つを超える物質が各液体中に改質されるのを可能にする。このようにして、各流体への複数の改質のための対応がなされ、実施することができる自動化されたアッセイの複雑性を大いに拡張し、したがって、本発明の有用性を増強する。
【００９５】
使い捨てカートリッジでは、含まれる液体の量は、費用及びサイズを最小限にするために、少なく維持されることが好ましい。したがって、本発明では、導管内のセグメントは、少なくとも１回すすがれるセンサーアレイ上のセグメント又は他の領域の空気−液体界面を通過させることによって、導管の掃除及びすすぎを補助するのに使用することもできる。より多い量の流体による連続的なすすぎと比較して、より少ない流体を使用するより効率的なすすぎが本方法によって実現されることが見出された。
【００９６】
導管内の制約は、本発明におけるいくつかの目的を果たす。試料保持チャンバーと第１の導管の間に位置したキャピラリーストップは、十分な圧力がかけられることによって、キャピラリーストップの抵抗を克服するまで、保持チャンバー内の試料が移動するのを防止することによって、保持チャンバー内で試料計量を促進するのに使用される。第２の導管内の制約は、流体が狭窄部に到達するとき、廃棄物チャンバーに向かう代替経路に沿って洗浄流体をそらすのに使用される。ガスケット中の小さい穴が、疎水性コーティングと一緒に提供されることによって、十分な圧力がかけられるまで、第１の導管から第２の導管までの流れを防止する。本発明の導管内及び導管同士間の液体の流れを制御する機能は、本明細書で一括してバルブと呼ばれる。
【００９７】
したがって、本発明の一実施形態は、分析物センサー又は分析物センサーのアレイを含む第１の導管に試料保持チャンバーが接続された使い捨てカートリッジを提供する。流体をある程度含む第２の導管は、第１の導管に接続され、第２の導管内の流体中に空気セグメントを導入することによって、これを区分することができる。ポンプ手段が第１の導管内の試料を移動させるのに提供され、これは、流体を第２の導管から第１の導管へと移動させる。したがって、１つ又は複数のセンサーは、試料に最初に接触し、次いで第２の流体に接触することができる。
【００９８】
別の実施形態では、カートリッジは、第１の導管と廃棄物チャンバーの間に位置した閉鎖可能な（ｃｌｏｓｅａｂｌｅ）バルブを含む。この実施形態は、第１の導管に接続された唯一のポンプ手段を使用して、第２の導管から第１の導管への流体の移動を可能にする。この実施形態はさらに、本発明のカートリッジの導管を効率的に洗浄することを可能にし、これは、小さい使い捨てカートリッジの重要な機能である。稼動中、試料は移動されてセンサーに接触し、次いで閉鎖可能なバルブを通じて廃棄物チャンバーへと移動される。濡れると、閉鎖可能なバルブは、廃棄物チャンバーへの開口部を密封し、気密シールをもたらし、これは、第１の導管に接続されたポンプ手段のみを使用して、第２の導管内の流体が引き込まれてセンサーに接触するのを可能にする。この実施形態では、閉鎖可能なバルブは、流体がこのようにして移動するのを可能にし、廃棄物チャンバーから第１の導管に空気が入るのを防止する。
【００９９】
別の実施形態では、閉鎖可能なバルブ、及び導管中にセグメントを導入するための手段の両方が提供される。この実施形態は、多くの利点、その中でも、センサー又はセンサーのアレイ上で区分された流体を往復運動させる能力を有する。したがって、第１のセグメント又は一連のセグメントがセンサーをすすぐのに使用され、次いで新鮮なセグメントが、測定を行うためにこれを差し替える。１つのポンプ手段（第１の導管に接続された）だけが必要とされる。
【０１００】
別の実施形態では、分析物測定は、分析物センサーをコーティングする液体の薄膜中で実施される。そのような薄膜判定は、電流測定で実施されることが好ましい。このカートリッジは、試料がバルブを通じて追い出されるとき密封される閉鎖バルブ、及び導管内の換気口であって、少なくとも１つの空気セグメントが測定流体中に引き続いて導入されることを可能にし、それによって、試料がセンサーからすすがれる効率を増大させ、さらに、測定前にセンサーから実質的にすべての液体を除去することを可能にし、なおさらに、精度を改善し、再現性を内部チェックするために、センサー全体に新鮮な液体のセグメントが運ばれるのを可能にすることによって、連続した、繰り返しの測定を可能にする換気口の両方を有することにおいて、前述の実施形態と異なる。
【０１０１】
低濃度の免疫活性分析物を検出するための分析スキームは、上記に論じたように、酵素標識抗体／分析物／表面結合抗体「サンドイッチ」複合体の形成に依拠する。試料中の分析物の濃度は、酵素の比例した表面濃度に変換される。酵素は、基質を検出可能な生成物に変換することによって、分析物の化学的なシグナルを増幅することができる。例えば、アルカリホスファターゼが酵素である場合、１個の酵素分子は、１分当たり約９０００の検出可能な分子を生成することができ、電気活性種がアルカリホスファターゼの代わりに抗体に結合されるスキームと比較して、分析物の検出性が数桁改善される。
【０１０２】
免疫センサーの実施形態では、センサーを最初に試料と、次いで、センサーからの応答を記録する前に洗浄流体と接触させるのが有利である。特定の実施形態では、試料は、試料内の対象とする分析物に結合する抗体−酵素コンジュゲート（シグナル抗体）で改質され、その後、改質された試料はセンサーに接触する。試料中の結合反応により、分析物／抗体−酵素複合体が生成される。センサーは、電極表面付近に付着される分析物に対する固定化抗体を含む。センサーに接触すると、分析物／抗体−酵素複合体は、電極表面付近で固体化抗体に結合する。この時点で、可能な限り多くの非結合抗体−酵素コンジュゲートを電極の近傍から除去することによって、センサーからのバックグラウンドシグナルを最小にすることが有利である。抗体−酵素複合体の酵素は、有利には、流体中に供給される基質を変換することによって、電気化学的に活性な種を生成することができる。この活性種は電極付近で生成され、適当な電位が印加されるとき、電極での酸化還元反応から電流をもたらす（電流測定動作）。或いは、電気活性種がイオンである場合、これは、電位差測定で測定することができる。電流測定では、電位は、測定の間固定するか、又は所定の波形にしたがって変更することができる。例えば、サイクリックボルタンメトリーの周知技法において使用されるように、限度間で電位をスイープするのに三角波を使用することができる。或いは、矩形波などのデジタル技法を使用することによって、電極に隣接する電気活性種の検出の感度を改善することができる。電流又は電圧測定から、試料中の分析物の量又は存在が計算される。これら及び他の分析的電気化学的方法は、当技術分野で周知である。
【０１０３】
カートリッジが免疫センサーを含む実施形態では、免疫センサーは、有利には、非反応性金属、例えば、金、白金、又はイリジウムなどのベースセンサー、及び微粒子、例えば、ラテックス粒子に付着された生理活性層を重ね合わされた多孔質選択透過性層から微細加工される。微粒子は、電極表面を覆う多孔質層上に分配され、接着した、多孔質生理活性層を形成する。生理活性層は、対象とする分析物に特異的に結合する特性、又は分析物が存在するとき、検出可能な変化を現す特性を有し、分析物に対する固定化抗体であることが最も好ましい。
【０１０４】
図面を参照すると、本発明のカートリッジは、カバー（図１及び２）、ベース（図４）、及びベースとカバーの間に配置された薄膜接着性ガスケット（図３）を備える。次に図１を参照すると、カバー１は、剛性の物質、好ましくはプラスチックでできており、ひびが入ることなく、可動性のヒンジ領域５、９、１０で繰り返し変形することができる。カバーは、可動性ヒンジ９によってカバーの本体に取り付けられた蓋２を備える。稼動中、試料を試料保持チャンバー３４内に導入した後、蓋は、試料流入ポート４の入口上に固定され、試料の漏れを防止することができ、蓋は、フック３によって所定の位置に保持される。カバーは、２つのパドル６、７をさらに備え、これらは、カバーの本体に対して移動することができ、可動性のヒンジ領域５、１０によって本体に取り付けられている。稼動中、ポンプ手段によって操作されるとき、パドル６は、薄膜ガスケット２１によって覆われた、空洞４３を備える空気ブラダー（ａｉｒ  ｂｌａｄｄｅｒ）に力をかけることによって、カートリッジの導管内の流体を移動させる。第２のポンプ手段によって操作されるとき、パドル７は、ガスケット２１に力をかけ、これは、その中に切られたスリット２２のために変形することができる。カートリッジは、読取装置内に挿入するように適応されており、したがって、この目的のために複数の機械的及び電気的接続を有する。カートリッジを手動で操作することが可能であることも明らかであるはずである。したがって、読取装置内にカートリッジを挿入すると、ガスケットは、空洞４２内に位置した、分析／洗浄液（「流体」）約１３０μＬで満たされた流体の入ったホイルパック上に圧力を伝達し、スパイク３８上でパッケージを破裂させ、短い、横断する導管を介してセンサーの導管に接続された導管３９内に流体を排出する。分析流体は、最初に分析導管の前部を満たし、キャピラリーストップとして作用するテープガスケット中の小さい開口部上に流体を押しつける。カートリッジに施される分析器の機構の他の動作は、分析導管内の制御された位置で、１つ又は複数のセグメントを分析流体中に投入するのに使用される。これらのセグメントは、最少の流体を用いてセンサー表面及び周囲の導管の洗浄を補助するのに使用される。
【０１０５】
カバーは、薄い柔軟膜８によって覆われた穴をさらに備える。稼動中、膜にかけられる圧力は、ガスケット中の小さい穴２８を通して、導管２０内に１つ又は複数の空気セグメントを排出する。
【０１０６】
図２を参照すると、ベースの下方の表面は、第２の導管１１、及び第１の導管１５をさらに備える。第２の導管１１は狭窄部１２を含み、これは、流体の流れに抵抗をもたらすことによって流量を制御する。任意選択のコーティング１３、１４は、疎水性表面を与え、これらは、ガスケットの穴３１、３２と一緒に、第２及び第１の導管１１、１５の間の流量を制御する。ベース内の陥凹１７は、導管３４内の空気をガスケット中の穴２７を通して導管３４に送るための経路を提供する。
【０１０７】
図３を参照すると、薄膜ガスケット２１は、ベース及びカバー内の導管同士間の流体の移動を促進し、必要な場合、圧力下でガスケットを変形させるための様々な穴及びスリットを備える。したがって、穴２４は、流体が導管１１から廃棄物チャンバー４４内に流れるのを可能にし、穴２５は、導管３４と１５の間にキャピラリーストップを備え、穴２６は、陥凹１８と導管４０の間で空気が流れるのを可能にし、穴２７は、陥凹１７と導管３４の間に空気の移動をもたらし、穴２８は、流体が導管１９から、任意選択の閉鎖可能バルブ４１を介して廃棄物チャンバー４４に流れるのを可能にする。穴３０及び３３は、それぞれカッタウェイ３５及び３７内に収容された複数の電極が、導管１５内で流体に接触するのを可能にする。特定の実施形態では、カッタウェイ３７は、接地電極、及び／又は対参照電極を収容し、カッタウェイ３５は、少なくとも１つの分析物センサー、及び任意選択により電気伝導度測定センサーを収容する。図３において、テープ２１は、機器が、バーブ３８上のエレメント４２内のカリブラントポーチ（ｃａｌｉｂｒａｎｔ  ｐｏｕｃｈ）を破裂させるために下向きの力をかけるとき、３つの切れ目２２によって囲まれたテープが変形するのを可能にするための２２におけるスリットである。このテープはまた、２３において切れ目であり、これは、機器が下向きの力を与えるとき、テープがエレメント４３内に下向きに曲がるのを可能にし、チャンバー４３から空気を排出し、導管１５を通してセンサーに試料流体を移動させる。図３中のエレメント２９は、テープ内の開口部として作用し、カバー図２内の領域を、ベース図４と接続している。
【０１０８】
図４を参照すると、導管３４は、組み立てられたカートリッジ内で、試料流入ポート４を第１の導管１１に接続する試料保持チャンバーである。カッタウェイ３５は、任意選択の１つ又は複数の電気伝導度測定センサーと一緒に、１つ若しくは複数のセンサー、又は分析物応答性表面を収容する。カッタウェイ３７は、電気化学的センサーのための戻り電流経路として必要な場合、接地電極を収容し、任意選択の電気伝導度測定センサーを収容することもできる。カッタウェイ３６は、ガスケットの穴３１と３２の間の流体経路を提供し、その結果流体は、第１と第２の導管の間を通過することができる。陥凹４２は、読取装置内に挿入された後にパドル７上にかけられる圧力のために、スパイク３８によって穴を開けられる組み立てられたカートリッジ内に、流体を含むパッケージ、例えば、破裂可能なポーチを収容する。穴を開けられたパッケージからの流体は、３９で第２の導管内に流れる。空気ブラダーは陥凹４３を備え、これは、ガスケット２１によってその上面で密封される。空気ブラダーは、ポンプ手段の一実施形態であり、パドル６にかけられる圧力によって作動し、これは、導管４０内の空気を移動させ、それによって、試料を試料チャンバー３４から第１の導管１５内に移動させる。
【０１０９】
空気が、ブラダーから試料保持チャンバー（ガスケットの穴２７）に入る位置、及びキャピラリーストップ２５は、試料保持チャンバーの所定の体積を一緒に画定する。パドル６が押し下げられるとき、この体積に対応する量の試料が第１の導管内に移動する。したがって、この配置は、計量された量の未計量試料をカートリッジの導管内に送るための計量手段の１つの可能な実施形態である。
【０１１０】
本カートリッジでは、試料セグメントを計量するための手段は、ベースのプラスチック部分に提供される。セグメントのサイズは、ベース内のコンパートメントのサイズ、並びにキャピラリーストップ及びテープガスケット中の空気パイプ穴の位置によって制御される。この体積は、２〜２００μＬに容易に変更することができる。試料サイズのこの範囲の拡大は、本発明の脈絡の範囲内で可能である。
【０１１１】
流体は、試料がセンサー導管１９に差し出される前に、試薬（例えば、粒子、可溶性分子、又はＩｇＭ若しくはその断片）を改質するのに使用することができる分析前用導管１１を通して、試料中に押し出される。或いは、改質試薬は、部分１６を越えて部分１５内に位置することができる。分析前用導管を通して試料を押し出すことはまた、ダイヤフラムポンプパドル７に張力を導入する機能を果たし、これは、流体移動の始動に対するその応答性を改善する。
【０１１２】
いくつかのアッセイでは、分析物の定量化が要求される場合、計量は有利である。カートリッジの外表面の汚染を防止するために、導管から排出される試料及び／又は流体のための廃棄物チャンバー４４が提供される。廃棄物チャンバーを外部の大気に接続する排出口４５も提供される。カートリッジの１つの望ましい特徴は、試料が装填されると、オペレーター又は試料に接触する他のものを伴わずに、分析を完了し、カートリッジを廃棄することができることである。
【０１１３】
次に図５を参照すると、カートリッジ及びコンポーネントの特徴の概略図が提供されており、５１〜５７は、試料又は流体を改質するための乾燥試薬で任意選択によりコーティングすることができる、導管及び試料チャンバーの一部である。試料又は流体は、乾燥試薬の上を少なくとも１回通過することによって、乾燥試薬を溶解させる。試料を改質するのに使用される試薬は、以下のうちの１つ又は複数を含むことができる。抗体−酵素コンジュゲート（シグナル抗体）、ＩｇＭ及び／又はその断片、ＩｇＧ及び／又はその断片、並びにアッセイ化合物の中で特異的又は非特異的結合反応を防止する他の遮断剤。可溶性でないが、カートリッジの内表面にアッセイ成分が非特異的に吸着するのを防止するのに役立つ表面コーティングも提供することができる。
【０１１４】
特定の実施形態では、閉鎖可能なバルブが、第１の導管と廃棄物チャンバーの間に提供される。一実施形態では、このバルブ５８は、不浸透性物質でコーティングされた、乾燥スポンジ物質を含む。稼動中、スポンジ物質が試料又は流体と接触すると、スポンジが膨潤することによって、空洞４１（図４）を塞ぎ、それによって廃棄物チャンバー４４への液体のさらなる流れが実質的に遮断される。さらに、濡れたバルブは、第１の導管と廃棄物チャンバーの間の空気の流れも遮断し、これにより、試料チャンバーに接続された第１のポンプ手段が、第２の導管内の流体を移動させ、以下の様式で第２の導管から第１の導管へと流体を移動させることが可能になる。
【０１１５】
次に免疫センサーカートリッジの概略の構成を例示する図６を参照すると、３つのポンプ６１〜６３が提供されている。これらのポンプは、特定の実施形態の観点から記載されているが、ポンプ６１〜６３のそれぞれの機能を実施することができる任意のポンピングデバイスを、本発明の範囲内で使用することができることが容易に理解されるであろう。したがって、ポンプ１の６１は、試料保持チャンバーから第１の導管内に試料を移動させることができるべきであり、ポンプ２の６２は、第２の導管内の流体を移動させることができるべきであり、ポンプ３の６３は、少なくとも１つのセグメントを第２の導管内に挿入することができるべきである。本願に想定される他のタイプのポンプとして、それだけに限らないが、圧力が空気袋にかけられる気圧力学手段と接触している空気袋、可動性ダイヤフラム、ピストンとシリンダー、電磁ポンプ、及び音波ポンプが挙げられる。ポンプ３の６３を参照すると、用語「ポンプ」は、１つ又は複数のセグメントが第２の導管内に挿入されるすべてのデバイス及び方法、例えば、空気袋から空気を移動させるための気圧力学手段、溶解するとガスを生じる乾燥化学物質、又は電流源に作動可能に接続された複数の電気分解電極などを含む。特定の実施形態では、セグメントは、１つを超える空気ブラダー又はチャンバーを有することができる機械的なセグメント生成ダイヤフラムを使用して生成される。示したように、ウェル８は、１つの開口部を有し、これは、内側のダイヤフラムポンプとセグメントが注入される、流体が満たされた導管２０を接続する。ダイヤフラムは、複数のセグメントを生成するために区分することができ、それぞれのセグメントは、流体で満たされた導管内の特定の位置に注入される。図６において、エレメント６４は、免疫センサーが、捕捉反応を実施することによって、固定化抗体、分析物、及びシグナル抗体を含むサンドイッチを形成する領域を示す。
【０１１６】
代替の実施形態では、セグメントは、受動的な機能を使用して注入される。カートリッジのベース内のウェルは、テープガスケットによって密封される。ウェルを覆うテープガスケットは、いずれかの端部に２つの小さい穴を有する。一方の穴は開いているが、他方は、流体と接触すると湿るフィルター物質で覆われている。このウェルは、目の粗い親水性物質、例えば、セルロース繊維フィルター、紙フィルター、又はガラス繊維フィルターなどで満たされている。この親水性の物質は、キャピラリー作用を介してベースのウェル内に液体を引き込み、先にウェル内にあった空気を移動させる。空気は、テープガスケット中の開口部を通じて排出され、体積が、ウェルの体積及び目の粗い親水性物質の空隙体積によって決定されるセグメントを作り出す。ベース内のウェルへの入口の一方を覆うのに使用されるフィルターは、流体がウェルを満たす速度を計測し、それによってセグメントが、カバー内の導管中に注入される速度を制御するように選択することができる。この受動的な機能は、任意の数の制御されたセグメントが、流体経路内の特定の位置に注入されることを可能にし、最小の空間で済む。
【０１１７】
本開示に基づくと、本方法は、分析物イムノアッセイにおいて異好性抗体による干渉を低減又は排除する方法を提供し、この場合、試料、例えば、全血試料が最初に収集され、次いで、ＩｇＭ又はその断片を含む乾燥試薬を試料中に溶解させることによって改質されることが明らかである。これは、少なくとも約２０μｇ／ｍＬの溶解した非ヒトＩｇＭ濃度を伴う試料を生じ、これは、試料中のいずれの異好性抗体も実質的に隔離するのに十分である。このステップが完了すると、改質された試料に対してイムノアッセイ、例えば、電気化学的イムノアッセイを実施することによって、分析物の濃度を求めることが可能である。
【０１１８】
乾燥試薬の溶解、及びサンドイッチ形成ステップは、同時に、又は段階的な様式で行うことができることに注意されたい。この方法は、心血管マーカー、例えば、ＴｎＩ、ＴｎＴ、ＣＫＭＢ、ミオグロビン、ＢＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、及びｐｒｏＢＮＰである分析物を主に対象とするが、他のマーカー、例えば、β−ＨＣＧ、ＴＳＨ、Ｄ−二量体、及びＰＳＡなどに使用することもできる。異好性抗体の大部分が検出ステップの前に隔離されることを保証するために、試料改質ステップは、約１分〜約３０分の範囲内の選択された所定の期間のものであることが好ましい。
【０１１９】
この方法は、免疫センサー、導管、試料流入ポート、及び試料保持チャンバーを備え、これらのエレメントの少なくとも１つの少なくとも一部が、乾燥試薬でコーティングされているカートリッジ内で実施されることが好ましい。乾燥試薬は、緩衝液、塩、界面活性剤、安定化剤、単純炭水化物、複合炭水化物、及び様々な組合せを含むことができることに注意されたい。さらに、乾燥試薬は、分析物に対する酵素−標識抗体（シグナル抗体）も含むことができる。
【０１２０】
ＴｎＩ及びＢＮＰアッセイについて、乾燥試薬は、試料中に溶解することによって、少なくとも２０μｇ／ｍＬ、例えば、少なくとも３０μｇ／ｍＬ、少なくとも４０μｇ／ｍＬ、又は少なくとも５０μｇ／ｍＬのＩｇＭ濃度（又は同等のＩｇＭ断片濃度）を与えることが好ましい。範囲の観点から、乾燥試薬は、試料中に溶解することによって、約２０μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬ、好ましくは約２０μｇ／ｍＬ〜約６０μｇ／ｍＬのＩｇＭ濃度（又は同等のＩｇＭ断片濃度）を与えることが好ましい。
【０１２１】
好適な実施形態では、例えば、ＴｎＩ及びＢＮＰアッセイでは、ＩｇＧ又はその断片が、ＩｇＭ又はＩｇＭ断片と組み合わせて使用される。したがって、例えば、乾燥試薬コーティングは、試料中に溶解することよって、約５０μｇ／ｍＬ超、例えば、約１００μｇ／ｍＬ超、約２５０μｇ／ｍＬ超、又は約５００μｇ／ｍＬ超のＩｇＧ濃度又は同等のＩｇＧ断片濃度が得られるのに十分な量でＩｇＧ又はＩｇＧの断片をさらに含むことができる。範囲の観点から、ＩｇＧ又はその断片を用いた改質により、約５０μｇ／ｍＬ〜約５０００μｇ／ｍＬ、好ましくは約５００μｇ／ｍＬ〜約１０００μｇ／ｍＬのＩｇＧ濃度又は同等のＩｇＧ断片濃度を生じることが好ましい。したがって、いくつかの好適な実施形態では、乾燥試薬は、試料中に溶解することによって、約２０〜約２００μｇ／ｍＬ、好ましくは約２０μｇ／ｍＬ〜約６０μｇ／ｍＬのＩｇＭ濃度、及び約５０〜約５０００μｇ／ｍＬ、好ましくは約５００μｇ／ｍＬ〜約１０００μｇ／ｍＬのＩｇＧ濃度が得られる。
【０１２２】
生体試料、例えば、全血が、ＩｇＧ又はその断片及びＩｇＭ又はその断片の両方を用いて改質される実施形態では、ＩｇＭ又はその断片及びＩｇＧ又はその断片は、０．００４超、例えば、０．０２超、０．０５超、又は０．１超の重量比で添加されることが好ましい。範囲の観点から、ＩｇＭ又はその断片とＩｇＧ又はその断片の重量比は、０．００４〜４、例えば、０．０２〜２、又は０．０５〜０．１５であることが好ましい。これらの重量比は、所望の改質化媒体、例えば、乾燥コーティング層に、並びに得られた改質された試料中に当てはまる。
【０１２３】
上記に示したように、個々のモノマーが、Ｆ（ａｂ’）２領域に結合されたＦｃ領域から形成され、その結果として２つのＦａｂ領域を含む五量体を含む全ＩｇＭ分子の使用に加えて、又はその代わりに、ＩｇＭの断片を使用することも可能である。ＩｇＭ断片化は、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、及び／又はＦｃ断片のいくつかの組合せを作り出すために、ジスルフィド結合の還元（−Ｓ−Ｓ−から−ＳＨ  ＨＳ−）、及び酵素のペプチン又はパパイン消化の組合せを使用して、様々に実現することができる。これらの断片は、別個に使用するためにクロマトグラフィーによって分離し、又は組合せで使用することができる。例えば、遮断部位がＦｃ断片上にある場合、これは、全ＩｇＭ分子の代わりに使用することができる。同じことが、Ｆａｂ断片及びＦ（ａｂ’）２断片にも当てはまる。この手法が使用される場合、本質的な断片モル濃度は、天然ＩｇＭ五量体のモル濃度と同様、例えば、等価であることが望ましい。先に述べたように、本発明の好適な実施形態は、少なくとも約２０μｇ／ｍＬの濃度でＩｇＭを使用する。ＩｇＭ（五量体）の分子量は約９００ＫＤであるので、これは、約２２．２ｎＭのＩｇＭ濃度と等価である。ＩｇＭ断片が使用される場合、実質的に同じレベルの遮断を得るために、Ｆｃ及びＦ（ａｂ’）２において５倍のモル差、並びにＦａｂ断片において１０倍のモル差となることが望ましい。
【０１２４】
実際のアッセイステップでは、固定化抗体とシグナル抗体の間でサンドイッチが形成されたら、試料媒質を引き続いて廃棄物チャンバーへと洗浄し、その後、酵素と反応して電気化学的検出可能な生成物を形成することができる基質にこのサンドイッチを曝すことが好適である。好適な形式は、電気化学的酵素結合免疫吸着アッセイである。
【０１２５】
好ましくは、デバイスは、異好性抗体による干渉が低減された、試料、例えば、血液試料中の分析物のイムノアッセイを実施するものである。デバイスは、電気化学的免疫センサー、導管、及び試料流入ポートを含む筐体であり、導管は、試料が、制御された様式で流入ポートから免疫センサーに進むのを可能にする。一態様では、筐体の少なくとも一部は、乾燥試薬でコーティングされており、この試薬は、非ヒトＩｇＭ及び／又はその断片、又は非ヒトＩｇＧ及び非ヒトＩｇＭ及び／若しくはこれらの断片の混合物を含むことができる。重要な特徴は、乾燥試薬が、少なくとも約２０μｇ／ｍＬのＩｇＭ濃度又は同等のＩｇＭ断片濃度を生じるように、試料中に溶解することができることである。これは一般に、試料中のいずれの異好性抗体も隔離するのに十分である。好適な実施形態では、デバイスは免疫参照センサーも備える。免疫センサーは、心血管マーカー、例えば、ＴｎＩ、ＴｎＴ、ＣＫＭＢ、ミオグロビン、ＢＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、及びｐｒｏＢＮＰなどの分析物を検出するのを対象とすることが好ましい。このデバイスが稼動するシステムは、一般に、試料が、所定の期間、例えば、１〜３０分間、試薬と接触したままになることを可能にする。デバイスは、例えば、１つの試料で満たされ、検査のために１回使用され、次いで廃棄される使い捨てカートリッジであることが好ましい。一般に、このデバイスは、試料を廃棄物チャンバーへと洗浄することができる洗浄流体、及び免疫センサーにおいて酵素サンドイッチと反応することによって、電気化学的検出に適した生成物を形成することができる基質を含む。
【０１２６】
より広くには、本発明は、任意の生体試料、例えば、全血、血清、血漿、尿、及びこれらの希釈形態を含む試料についての分析物イムノアッセイにおいて異好性抗体による干渉を低減することに関する。さらに、所与の非ヒトＩｇＭ濃度を得るのに試料を改質するための方法は、乾燥試薬の溶解に基づくもの、又はＩｇＭを含有する溶液の添加によるものとすることができる。さらに、選択された分析物の濃度を求めるために、改質された試料に対してイムノアッセイを実施するステップは、電気化学的技法、例えば、電流測定及び電位差測定、並びにまた光学技法、例えば、吸光度、蛍光及び発光を含めた様々な技法に基づくことができる。
【０１２７】
本発明は、以下の非限定的な例を考慮して、より良好に理解されるであろう。
【０１２８】
（例１）
図７は、心臓機能のマーカーであるトロポニンＩ（ＴｎＩ）の存在及び量を求めるための、本発明の特定の実施形態による電流測定イムノアッセイの原理を例示する。血液試料を、本発明のカートリッジの試料保持チャンバー内に導入し、試料保持チャンバー内にコーティングされた乾燥試薬の溶解によって改質した。乾燥試薬は、上述したようにＩｇＭ  ７７を含み、これは、試料中に溶解すると、試料中に含まれる場合のある相補性異好性抗体７８に選択的に結合する。示していない他の実施形態では、ＩｇＭに由来する断片を使用することによって、試料中に含まれる異好性抗体を隔離することができる。示したように、乾燥試薬はＩｇＧ  ７９も含み、これも、試料中に溶解した後、相補性抗体７８に選択的に結合する。他の実施形態では、ＩｇＧに由来する断片を使用することによって、試料中に含まれる異好性抗体を隔離することができる。
【０１２９】
さらに、ポリクローナル抗トロポニンＩ抗体（ａＴｎＩ）７１（シグナル抗体）に共有結合しているアルカリホスファターゼ酵素（ＡＰ）を含むコンジュゲート分子も、試料中に溶解させた。このコンジュゲートは、血液試料中でＴｎＩ、７０に特異的に結合し、ＡＰ−ａＴｎＩコンジュゲートに結合したＴｎＩから構成される複合体を生成する。捕捉ステップにおいて、この複合体は、免疫センサーに付着又は近接した捕捉ａＴｎＩ抗体７２（固定化抗体）に結合する。センサーチップは伝導率センサーを有し、これは、試料がセンサーチップに到達した時をモニターするのに使用される。流体の到達時間を使用することによって、カートリッジ内の漏れを検出することができる。すなわち、到達の遅延が漏れを知らせる。センサー導管内の試料セグメントの位置は、位置マーカーとして流体の縁部を使用して能動的に制御することができる。試料／空気界面が伝導率センサーを横切る際、正確なシグナルが生成され、これは、流体マーカーとして使用することができ、このマーカーから、制御された流体の往復運動を実施することができる。流体セグメントは、センサー上を、縁部から縁部まで優先的に往復されることによって、免疫センサー表面に試料全体を提示する。第２の試薬を、センサーチップを越えたところにあるセンサー導管内に導入することができ、これは、流体の往復の間に均一に分布された状態になる。
【０１３０】
センサーチップは、対象とする分析物のための、抗体でコーティングされた１つ又は複数の捕捉領域を含む。これらの捕捉領域は、ポリイミドの疎水性環、又は別のフォトリソグラフィーで作製された層によって画定される。何らかの形態での、例えば、ラテックス微小球に結合した抗体を含有する微小滴又はいくつかの微小滴（サイズが約５〜４０ナノリットル）を、センサーの表面上、又はセンサー上の選択透過性層上に分注する。感光された（ｐｈｏｔｏｄｅｆｉｎｅｄ）環は、この水性液滴を含み、抗体がコーティングされた領域を数ミクロンの精度まで局在させる。捕捉領域は、０．０３〜約２平方ミリメートルのサイズで作製することができる。このサイズの上限は、本実施形態における導管及びセンサーのサイズによって制限され、本発明の限界ではない。
【０１３１】
したがって、金電極７４は、ＴｎＩ／ＡＰ−ａＴｎＩ複合体が結合する、共有結合した抗トロポニンＩ抗体を含むバイオ層７３でコーティングされる。それによって、ＡＰは、試料中に最初に存在するＴｎＩの量に比例して、電極付近に固定化される。特異的結合に加えて、酵素−抗体コンジュゲートは、センサーに非特異的に結合する場合がある。ＮＳＢは、センサーからのバックグラウンドシグナルをもたらし、これは、望ましくなく、最小限にされることが好ましい。上述したように、すすぎプロトコールにより、特に、センサーをすすぐために区分された流体を使用することにより、このバックグラウンドシグナルを最小限にするために効率的な手段が提供される。すすぎステップの後の第２のステップにおいて、例えば、アルカリホスファターゼにより加水分解されることによって、電気活性生成物７６を生成する基質７５がセンサーに提示される。特定の実施形態では、基質は、リン酸化フェロセン又はｐ−アミノフェノールを含む。電流測定電極は、直接基質ではなく、加水分解された基質の生成物を酸化又は還元するのに十分な、一定の電気化学的電位で保たれるか、又は電位が、適切な範囲で１回若しくは複数回掃引される。任意選択により、第２の電極を１つの層でコーティングすることができ、この層で、製造の間にＴｎＩ／ＡＰ−ａＴｎＩの複合体が作られることによって、測定のための参照センサー又は較正手段として作用する。
【０１３２】
本例では、センサーは、２つの電流測定電極を備え、これらは、４−アミノフェニルホスフェートと酵素標識アルカリホスファターゼの反応から酵素的に生成される４−アミノフェノールを検出するのに使用される。電極は、好ましくは、ポリイミドの感光された層でコーティングされた金表面から作製される。絶縁ポリイミド層中の規則正しく配置された開口部は、小さい金電極のグリッドを画定し、ここで４−アミノフェノールは、１分子当たり２電子の反応で酸化される。センサー電極は、バイオ層をさらに備える一方で、参照電極は、例えば、バイオ層を欠いた金電極から、又は銀電極、若しくは他の適当な物質から構築することができる。異なるバイオ層は、各電極に異なる分析物を検知する能力をもたらすことができる。
【０１３３】
ｐ−アミノフェノール種などの基質は、基質と生成物のＥ（１／２）が実質的に異なるように選択することができる。好ましくは、基質のボルタンメトリー半波電位Ｅ（１／２）は、生成物のそれより実質的に高い（より正である）。条件が満たされれば、生成物は、基質の存在下で、選択的に電気化学的に測定することができる。
【０１３４】
電極のサイズ及び間隔は、感度及びバックグラウンドシグナルを決定することにおいて重要な役割を果たす。グリッドにおける重要なパラメータは、露出した金属の百分率及び活性電極同士間の間隔である。電極の位置は、抗体捕捉領域の真下であっても、制御された距離によって捕捉領域からずれていてもよい。電極の実際の電流測定シグナルは、抗体捕捉場所に対するセンサーの位置決め、及び分析の間の流体の動きに依存する。電極での電流が記録され、これは、センサー近傍における電気活性生成物の量に依存する。
【０１３５】
この実施例におけるアルカリホスファターゼ活性の検出は、４−アミノフェノール酸化電流の測定に依拠する。これは、Ａｇ／ＡｇＣｌ接地チップに対して約＋６０ｍＶの電位で実現される。使用される検出の正確な形態は、センサー構成に依存する。センサーの１つの型では、金微小電極のアレイが、抗体捕捉領域の真下に配置される。分析流体がこのセンサー上に引き寄せられるとき、捕捉場所上に位置した酵素が、酵素律速反応で、４−アミノフェニルホスフェートを４−アミノフェノールに変換する。４−アミノフェニルホスフェートの濃度は、過剰、例えば、Ｋｍ値の１０倍であるように選択される。分析溶液は、９．８のｐＨに緩衝された、ジエタノールアミン、１．０ＭのＮａＣｌ中０．１Ｍである。さらに、分析溶液は、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有し、これは、酵素のための補助因子である。或いは、炭酸塩緩衝液は、所望の特性を有する。
【０１３６】
別の電極の幾何学的配置の実施形態では、電極は、捕捉領域から数百ミクロン離して配置される。分析流体の新鮮なセグメントが、捕捉領域上に引き寄せられるとき、酵素生成物が、電極反応により無損失で形成する。しばらくして、溶液は、検出器電極上の捕捉領域から徐々に引き寄せられ、電流スパイクを生じ、これから酵素活性を求めることができる。
【０１３７】
アルカリホスファターゼ活性の高感度な検出における重要な考慮事項は、金センサーにおいて起こるバックグラウンドの酸化及び還元に関連する非４−アミノフェノール電流である。金センサーは、これらの電位で、塩基性緩衝液中でかなりの酸化電流を与える傾向がある。バックグラウンド電流は、緩衝液濃度、金電極の面積（露出面積）、表面前処理、及び使用される緩衝液の性質に大部分は依存する。ジエタノールアミンは、アルカリホスファターゼについての特に良好な活性化緩衝液である。モル濃度で、酵素速度は、炭酸塩などの非活性化緩衝液に対して約３倍増大する。
【０１３８】
代替の実施形態では、抗体又は他の分析物結合分子にコンジュゲートした酵素は、ウレアーゼであり、基質は尿素である。アンモニウム感受性電極を使用することによって、尿素の加水分解で生成されるアンモニウムイオンが、この実施形態では検出される。アンモニウム特異的電極は、当業者に周知である。適当な、微細加工されたアンモニウムイオン選択的電極は、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，２００，０５１号に開示されている。基質と反応してイオンを生じる他の酵素は、それとともに使用される他のイオンセンサーと同様に、当技術分野で公知である。例えば、アルカリホスファターゼ基質から生成されるリン酸は、リン酸イオン選択的な電極において検出することができる。
【０１３９】
次に図８を参照すると、微細加工された免疫センサーの実施形態の構成が例示されている。好ましくは、平面の非導電基板８０が提供され、その上に、従来の手段又は当業者に公知の微細加工によって、導電層８１が堆積される。導電物質は、金又は白金などの貴金属であることが好ましいが、イリジウムなどの他の非反応性金属も使用することができ、同様に、グラファイト、導電性ポリマー、又は他の物質の非金属電極も使用することができる。電気的な接続部８２も提供される。バイオ層８３は、電極の少なくとも一部に堆積される。本開示では、バイオ層は、対象とする分析物に結合することができ、又は測定可能な変化をもたらすことによって、そのような分析物の存在に応答することができる十分な量の分子８４を表面上に含む多孔質層を意味する。任意選択により、米国特許第５，２００，０５１号に記載されているように、電気化学的干渉物質をスクリーニングするために、電極とバイオ層の間に選択透過性スクリーニング層を介在させることができる。
【０１４０】
特定の実施形態では、バイオ層は、約０．００１〜５０ミクロンの範囲内の特定の直径のラテックスビーズから構築される。ビーズは、バイオ層の上記定義に一致する任意の適当な分子の共有結合によって修飾されている。タンパク質のリシン又はＮ末端アミン基の容易なカップリングのために、アミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を提供することを含めて、多くの結合方法が当技術分野で存在する。特定の実施形態では、生体分子は、イオノフォア、補助因子、ポリペプチド、タンパク質、糖ペプチド、酵素、免疫グロブリン、抗体、抗原、レクチン、神経化学受容体、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は適当な混合物の中から選択される。最も特定の実施形態では、生体分子は、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、トロポニンＩ、トロポニンＴ、トロポニンＣ、トロポニン複合体、クレアチンキナーゼ、クレアチンキナーゼサブユニットＭ、クレアチンキナーゼサブユニットＢ、ミオグロビン、ミオシン軽鎖、又はこれらの修飾断片の１つ又は複数に結合するように選択される抗体である。そのような修飾断片は、天然部分又は合成部分を用いた化学修飾を含めて、少なくとも１つのアミノ酸の酸化、還元、欠失、付加、又は修飾によって生成される。好ましくは、生体分子は、分析物に特異的に結合し、分析物リガンドに結合するための親和定数が約１０−７〜１０−１５Ｍである。
【０１４１】
一実施形態では、適当な分子によって共有結合的に修飾された表面を有するビーズを含むバイオ層は、以下の方法によってセンサーに固定される。マイクロディスペンシング針が使用されることによって、修飾されたビーズの懸濁液の、好ましくは約２０ｎＬの小液滴がセンサー表面上に堆積される。液滴を乾燥させ、これにより表面上にビーズがコーティングされ、これは、使用中移動しにくい。
【０１４２】
バイオ層が電流測定センサーに対して固定された位置にある免疫センサーに加えて、本発明は、バイオ層が、可動性である粒子上にコーティングされる実施形態も想定する。カートリッジは、分析物と相互作用することができる可動性微粒子、例えば、捕捉ステップの後で電流測定電極に局在化し、それによって磁力が、測定用電極に粒子を集めるのに使用される磁性粒子を含むことができる。本発明における可動性微粒子の１つの利点は、試料又は流体中のその動きが結合反応を加速し、アッセイの捕捉ステップをより速くすることである。非磁性可動性微粒子を使用する実施形態については、電極でビーズを捕らえるのに多孔質フィルターが使用される。
【０１４３】
次に図９を参照すると、１つの基板上のいくつかの電極のためのマスク設計が例示されている。マスキング及びエッチング技法によって、独立した電極及びリードを堆積することができる。したがって、複数の免疫センサー、９４及び９６、並びに電気伝導度測定センサー、９０及び９２が、読取装置への電気的接続を行うための、そのそれぞれの接続パッド９１、９３、９５、及び９７と一緒に、低コストでコンパクトな範囲に提供される。原理上は、それぞれが異なる分析物に感受性であり、又は対照センサー若しくは参照免疫センサーとして作用するセンサーの非常に大きいアレイをこのようにしてアセンブルすることができる。
【０１４４】
具体的には、免疫センサーは以下のように作製される。シリコンウエハーを熱酸化することによって、約１ミクロンの絶縁酸化物層が形成される。チタン／タングステン層が、１００〜１０００オングストロームの間の好ましい厚さまで、酸化物層上にスパッタされ、その後、最も好ましくは８００オングストロームの厚さである金の層がスパッタされる。次に、フォトレジストがウエハー上にスピニングされ、乾燥され、適切にベーキングされる。次いで、図９中に例示したものに対応するマスクなどのコンタクトマスクを使用して、表面が露光される。潜像が現像され、ウエハーが金エッチャントに曝される。パターン形成された金層が感光性ポリイミドでコーティングされ、適切にベーキングされ、コンタクトマスクを使用して露光され、現像され、Ｏ２プラズマ中で浄化され、好ましくは３５０℃で５時間イミド化される。抵抗性加熱素子として作用するために、ウエハーの裏面の任意選択のメタライゼーションを実施することができ、この場合、免疫センサーは、サーモスタットで調節された形式で使用されるべきである。次いで表面が、抗体でコーティングされた粒子でプリントされる。好ましくは体積が約２０ｎＬであり、脱イオン水中、１％の固体含量を含む液滴がセンサー領域上に堆積され、空気乾燥によって、定位置で乾燥される。任意選択により、抗体安定化試薬（ＳｕｒＭｏｄｉｃａ  Ｃｏｒｐ．又はＡＥＴ  Ｌｔｄによって供給された）が、センサー上にオーバーコートされる。
【０１４５】
粒子の乾燥は、基質を含有する試料又は流体中に溶解するのを防止する様式で、粒子を表面に接着させる。この方法は、センサーチップを大量に製造するのに適した、信頼でき、再現可能な固定化プロセスを提供する。
【０１４６】
（例２）
カートリッジの使用方法に関して、未計量の流体試料が、試料流入ポート４を通じて、カートリッジの試料保持チャンバー３４中に導入される。キャピラリーストップ２５は、この段階で試料が導管１５へと通過するのを防止し、保持チャンバー３４は、試料で満たされる。蓋２又はエレメント２００は、カートリッジから試料が漏れるのを防止するために閉じられている。次いでカートリッジは、参照により本明細書に組み込まれている、Ｚｅｌｉｎの米国特許第５，８２１，３９９号に開示されているものなどの、読取装置内に挿入される。読取装置内にカートリッジを挿入することにより、４２に位置した流体を含むパッケージに、このパッケージがスパイク３８に対して押されたとき、穴を開ける機構が作動する。それによって流体は、第２の導管内に排出され、３９、２０、１２及び１１に順に到達する。１２における狭窄部は、流体のさらなる移動を防止し、その理由は、流体が第２の導管部分１１を介して廃棄物チャンバー４４内に流れることによって、残留する静水圧が放散されるためである。第２のステップでは、ポンプ手段を稼動することにより、空気ブラダー４３に圧力をかけ、導管４０を通じ、カッタウェイ１７及び１８を通じて、導管３４内に所定の位置２７で空気を押し込む。キャピラリーストップ２５及び位置２７は、元の試料の計量された部分を区切る。試料が試料保持チャンバー３４内にあるとき、試料は、チャンバーの内表面上の、ＩｇＭ（及び／又はその断片）並びに他の物質を含む乾燥試薬コーティングで改質される。次いで試料の計量された部分は、空気ブラダー４３内で生じる空気圧によって、キャピラリーストップを通じて排出される。試料は導管１５内を通り、カッタウェイ３５内に位置した１つ又は複数の分析物センサーに接触する。
【０１４７】
カットアウト３５内に位置した免疫センサーを使用する実施形態では、試料は、センサーに到達する前に、例えば、酵素−抗体コンジュゲート（シグナル抗体）、及びＩｇＭ試薬又はその断片によって改質される。分析物がセンサーに効率的に結合するのを促進するために、分析物を含有する試料は、任意選択により、往復性の動きでセンサー上を繰り返して通される。好ましくは、約０．２と２Ｈｚの間の往復振動数が使用され、最も好ましくは０．７Ｈｚである。こうして、シグナル抗体に付随するシグナル酵素は、試料中に存在する分析物の量に比例して、電流測定電極表面のごく近くに運ばれる。
【０１４８】
分析物／酵素−抗体コンジュゲート複合体が免疫センサーに結合する機会が提供された後、試料は、空気ブラダー４３にかけられるさらなる圧力によって排出され、試料は廃棄物チャンバー４４に進む。次に洗浄ステップにより、非特異的に結合した酵素−コンジュゲートが、センサーチャンバーから除去される。第２の行為（ｃｏｎｄｕｃｔ）における流体は、ポンプ手段４３によって移動されてセンサーと接触する。分析流体は、第１の空気セグメントが伝導率センサーで検出されるまで、徐々に引き寄せられる。
【０１４９】
１つ又は複数の空気セグメントは、それだけに限らないが、（１）図１４に示し、以下に記載されるような受動的な手段、（２）空気がフラップ又はバルブを通じて導管内に引き寄せられるポンプを使用する、導管内の圧力の一過性の低下を含めた能動的な手段、又は（３）導管内で流体と接触するとガスを遊離する、導管内に予め配置された化合物であって、カーボネート、ビカーボネートなどを挙げることができる化合物を溶解させることによるものを含めた、任意の適当な手段によって導管内に作製することができる。このセグメントは、試料が混入した流体を導管１５から一掃することにおいて極めて有効である。センサー領域をすすぐ効率は、説明したように、１つ又は複数の空気セグメントを第２の導管中に導入することによって大いに増強される。空気セグメントの先頭縁部及び／又は後縁部は、センサー上を１回又は複数回通過することによって、試料から堆積する場合のある異質の物質をすすぎ、再懸濁する。異質の物質には、特異的に結合した分析物又は分析物／抗体−酵素コンジュゲート複合体以外の任意の物質が含まれる。しかし、すすぎが、それほど長引かず、又はセンサーからの、特異的に結合した分析物若しくは分析物／抗体−酵素コンジュゲート複合体の解離を促進するほど活発であることは、本発明の目的である。
【０１５０】
流体中に空気セグメントを導入することの第２の利点は、流体を区分することである。例えば、流体の第１のセグメントが、センサーをすすぐのに使用された後、次いで第２のセグメントは、２つのセグメントの混合を最小にして、センサー上に配置される。この機能は、非結合の抗体−酵素コンジュゲートをより効率的に除去することによって、センサーからのバックグラウンドシグナルをさらに低減する。先端洗浄（ｆｒｏｎｔ  ｅｄｇｅ  ｗａｓｈｉｎｇ）の後、分析流体は、第１の空気セグメントが伝導率センサーにおいて検出されるまで徐々に引き寄せられる。このセグメントは、第１の分析流体試料と混合された、試料が混入した流体を一掃することにおいて極めて有効である。測定のために、流体の新しい部分がセンサー上に配置され、操作のモードに適切な場合、電流又は電位が時間の関数として記録される。
【０１５１】
（例３）
次に図１５を参照すると、免疫センサーカートリッジの上面図が示されている。カートリッジ１５０は、好ましくはプラスチックで構築されたベース及び頂部部分を備える。２つの部分は、薄い接着性ガスケット又は薄い柔軟な膜によって接続されている。先の実施形態と同様に、組み立てられたカートリッジは、試料保持チャンバー１５１を備え、この中に、対象とする分析物を含有する試料が、試料入口１６７を介して導入される。試料の計量された部分は、カートリッジの２つの部分を接続するガスケット又は膜中に、０．０１２インチ（０．３ｍｍ）のレーザーカットされた穴によって好ましくは形成されたキャピラリーストップ１５２と、試料ダイヤフラム１５６上を押しつけるパドルなどのポンプ手段の作用によって空気が導入される試料保持チャンバー内の所定箇所に位置した流入点１５５との合わせた作用によって、以前と同様に試料導管１５４（第１の導管）を介してセンサーチップ１５３に送達される。結合することが可能になるようにセンサーと接触した後、試料は、排出口１５７に移動され、この排出口はウィッキング材を含み、これは、試料を吸収し、それによって、液体又は空気のさらなる通過に対して排出口を閉じて密封する。ウィッキング材は、綿繊維物質、セルロース物質、又は孔を有する他の親水性物質であることが好ましい。この物質は、以下に記載される試料ダイヤフラム作動手段を引き続いて引っ込めることと釣り合った時間内でバルブが閉じ、その結果試料が、センサーチップの領域内に引き続いて引き戻されないほど十分に吸収性である（すなわち十分なウィッキング速度を有する）ことが、本願において重要である。
【０１５２】
示した特定の実施形態と同様に、一端で排出口１５９に、他端で、排出口１５７とセンサーチップ１５３の間に位置した試料導管のある箇所１６０の試料導管に接続された洗浄導管（第２の導管）１５８が提供される。読取装置内にカートリッジを挿入すると、流体は、導管１５８に導入される。好ましくは、流体は、ホイルポーチ（ｆｏｉｌ  ｐｏｕｃｈ）１６１内に最初に存在し、これは、作動手段によりポーチに圧力がかけられるとき、ピンによって穴を開けられる。ガスケット１６３中の小さい開口部を介して流体を導管１５４に接続する短い導管１６２も提供される。第２のキャピラリーストップは、流体がキャピラリーストップ１６０に到達するのを最初に防止し、その結果、流体は導管１５８内に保持される。
【０１５３】
排出口１５７が閉じられた後、ポンプが作動され、導管１５４内に圧力低下を作り出す。振動することによって断続的な空気のストリームをもたらす、ガスケット又は膜中にカットされた小さいフラップを好ましくは備える換気口１６４は、空気が第２の排出口１６５を介して導管１５８に入るための手段を提供する。第２の排出口１６５も、湿ったとき排出口を閉じることができるウィッキング材を好ましくは含み、これは、必要に応じて、試料ダイヤフラム１５６を引き続いてへこませることによって排出口１６５を閉じることを可能にする。試料ダイヤフラム１５６の作動と同時に、流体は、導管１５８からキャピラリーストップ１６０を通じて導管１５４に引き寄せられる。流体の流れが排出口１６４に入る空気によって妨害されるので、少なくとも１つの空気セグメント（セグメント又はセグメントのストリーム）が導入される。
【０１５４】
試料ダイヤフラム１５６がさらに引っ込むと、少なくとも１つの空気セグメントを含有する液体が引き戻され、センサーチップ１５３の感知表面を横切る。液体内に空気−液体の境界が存在することにより、残っている試料を除去するためのセンサーチップ表面のすすぎが増強される。好ましくは、試料ダイヤフラム１５６の運動は、分析物センサーに隣接するセンサーチップ内に収容された伝導率電極から受信されるシグナルと連動して制御される。このようにして、センサー上の液体の存在が検出され、別個のステップにおける流体の動きによって、複数の読み取りを実施することができる。
【０１５５】
流体の薄膜が、センサー、接地チップ１６５、及びセンサーと接地電極の間の導管１５４の壁の接触部分を覆うときのみ、分析物測定を実施することが、この実施形態では有利である。適当な膜は、センサーの隣に位置した電気伝導度測定センサーが、バルクの流体は、導管１５４のその領域内にもはや存在しないことを示すまで、試料ダイヤフラム１５６を操作することにより、流体を引き抜くことによって得られる。測定は、非常に低い（ｎＡ）電流で実施することができ、（バルクの流体と比較して）接地チップとセンサーチップの間の薄膜の抵抗を増大させることによって生じる電位降下は、重要でないことが判明した。
【０１５６】
接地チップ１６５は、銀／塩化銀であることが好ましい。二酸化ケイ素の表面などのより親水性の領域が点在した銀／塩化銀の小さい領域として接地チップをパターン形成するのに、相対的に疎水性の塩化銀表面上に容易に形成する空気セグメントを回避することが有利である。したがって、好適な接地電極構成は、高密度に配置され、二酸化ケイ素が点在した銀／塩化銀の正方形のアレイを含む。銀／塩化銀の領域がある程度くぼんでいる場合、意図していないセグメントを回避することにさらなる利点が存在する。
【０１５７】
次に図１６を参照すると、免疫センサーカートリッジの好適な実施形態の流体工学の概略図が示されている。領域Ｒ１〜Ｒ７は、特定の運転機能に関連する導管の特定の領域を表す。したがって、Ｒ１は試料保持チャンバーを表し、Ｒ２は試料導管を表し、それによって試料の計量された部分が捕捉領域に移され、試料が、導管の壁上にコーティングされた物質で任意選択により改質され、Ｒ３は、電気伝導度測定センサー及び分析物センサーを収容する捕捉領域を表し、Ｒ４及びＲ５は、第１の導管の部分を表し、これらは、導管壁上にコーティングされた物質で流体をさらに改質するのに任意選択により使用され、それによってより複雑なアッセイスキームが実現され、Ｒ６は、第２の導管の部分を表し、カートリッジが読取装置内に挿入されると、その中に流体が導入され、Ｒ７は、キャピラリーストップ１６０と１６６の間に配置された導管の部分を備え、その中でさらなる改質を行うことができ、Ｒ８は、箇所１６０と排出口１５７の間に配置された導管１５４の部分を表し、これは、その中に含まれる液体を改質するのにさらに使用することができる。
【０１５８】
（例４）
分析シーケンスの間の、流体工学と分析物測定の調整に関しては、ユーザーは、カートリッジ内に試料を入れ、分析器内にカートリッジを配置し、１〜２０分で、１つ又は複数の分析物の定量的な測定が実施される。ここでは、分析の間に起こる事象のシーケンスの非限定例である。
（１）２５〜５０μＬ試料が試料入口１６７中に導入され、カバーとベースコンポーネントを一緒に保持している接着性テープ中の０．０１２インチ（０．３ｍｍ）のレーザーカットされた穴によって形成されたキャピラリーストップ１５１まで満たされる。異好性干渉を改善するためのＩｇＭ及び／若しくはその断片、並びに好ましくはシグナル抗体を含む１つ又は複数の乾燥試薬コーティングが試料中に溶解される。ユーザーは、スナップフラップ上に取り付けられたラテックスゴムディスクを回して試料入口１６７を閉じ、カートリッジを分析器内に配置する。
（２）分析器はカートリッジと接触し、モーター駆動のプランジャーが、ホイルポーチ１６１の上を押し、洗浄／分析流体を中心の導管１５８へと強制的に外に出す。
（３）別個のモーター駆動のプランジャーは、試料ダイヤフラム１５６と接触し、試料の測定されたセグメントを試料導管に沿って（試薬領域Ｒ１からＲ２に）押す。試料は、伝導率センサーを介してセンサーチップ１５３で検出される。センサーチップは、捕捉領域Ｒ３内に配置される。
（４）試料は、試料ダイヤフラム１５６によって、所定の制御された様式で、制御された時間、Ｒ２とＲ５の間を往復されることによって、センサーへの結合を促進する。
（５）試料は、カートリッジの廃棄物領域（Ｒ８）に向けて押され、セルロース又は同様の吸収性芯の形態での受動的ポンプ１５７と接触する。この芯を湿らす作用は、空気の流れに対して芯を密封し、したがって試料ダイヤフラム１５６によって生じる過剰の圧力を逃すその能力を排除する。能動的な排出口は、図１６の「制御された換気口」になる。
（６）試料導管の迅速な排気（試料ダイヤフラム１５６からモーター駆動のプランジャーを取り外すことによって行われる）は、空気（排出口からの）と第２の導管からの洗浄／分析流体の混合物を、図１６中のＲ５とＲ４の間に位置した入口へと強制的に移動させる。試料導管の迅速な排気の繰り返しによって、一連の空気で分離された流体セグメントが生成され、これは、センサーチップを横切って試料入口に向けて引き寄せられる（Ｒ４から、Ｒ３、Ｒ２及びＲ１に）。これは、過剰の試薬を含まないセンサーを洗浄し、センサーを分析に適切な試薬で湿らせる。ホイルポーチに由来する洗浄／分析流体は、中心の洗浄／分析流体導管内のＲ７及びＲ６において試薬を添加することによってさらに改質することができる。
（７）洗浄／分析流体セグメントは、試料入口に向けてより遅い速度で引き寄せられることによって、分析流体の薄層のみを含むセンサーチップを生じる。この箇所で電気化学的な分析が実施される。分析の好適な方法は電流測定であるが、電位差測定又はインピーダンス検出も使用される。
（８）機構が後退し、カートリッジを分析器から取り出すことを可能にする。
【０１５９】
（例５）
いくつかの実施形態では、デバイスは、アッセイの間に起こるＮＳＢの程度を評価する目的で免疫参照センサーを使用する。免疫参照センサーは、分析物免疫センサーとほぼ同じように作製され、例外は、免疫試薬が抗分析物抗体ではなく抗ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）抗体であるということである。ヒト全血又は血漿試料に曝されると、参照センサーは、すべてのヒト血液試料中に存在する豊富な内因性タンパク質である、特異的に結合したＨＳＡでコーティングされ、したがって、本イムノアッセイ形式を使用して行われるすべての個々の検査についての共通の参照をもたらす。不十分な洗浄により、又は干渉の存在により生じるＮＳＢは、この第２のセンサーによってモニターすることができる。
【０１６０】
アッセイからの正味のシグナルは、参照センサーから生じる非特異的なシグナルを減じることによって、例えば、上記式４に示したような、正味のシグナル＝分析物センサーシグナル−参照センサーシグナル−オフセットによって補正された分析物免疫センサーから生じる特異的なシグナルを含む。「オフセット」は、ＮＳＢに曝される２つのセンサーの傾向の差異を計上する係数である。実際には、これは、コンジュゲートを非特異的に結合するその能力に関して、各センサーの相対的な「粘性」を計上し、分析物が無く、干渉の無い試料の応答に基づいて確立される。これは、独立した実験によって行われる。
【０１６１】
参照センサーにおいて許容されるシグナルの量は、品質管理アルゴリズムによって定義される制限を受け、このアルゴリズムは、低分析物濃度での結果の完全性を保護することを追求し、低分析物濃度では、ＮＳＢの作用は、臨床的環境における意思決定を変更し得る様式でアッセイ結果に大きな影響を与える可能性がある。本質的な主要なことは、参照センサーにおける過剰なシグナルの存在が、不十分な洗浄ステップ又は干渉によるＮＳＢの存在に関するフラグとして作用することである。
【０１６２】
図１７は、２つが高レベルの異好性抗体活性を有し（ドナーＡ及びＢ）、１つが低異好性抗体活性（ドナーＣ）を有する３つの正常な健康なドナーについての、乾燥試薬をプリントされた試料入口（試料保持チャンバー）内のＩｇＭ濃度の関数としての免疫センサー応答を示す。具体的には、図１７Ａは、ｃＴｎＩ免疫センサーのシグナルの応答を示し、図１７Ｂは、関連する免疫参照センサーを示し、図１７Ｃは、正味のアッセイシグナル（分析物シグナル−参照シグナル）を示す。試料中に溶解した０〜１００μｇ／ｍＬのＩｇＭの範囲にわたってすべてのデータが収集される。約２０μｇ／ｍＬを越えるＩｇＭ濃度は、これらの試料に対する異好性抗体の作用を実質的に改善することが、これらの図から明らかである。
【０１６３】
当業者は、分析物センサー及び参照センサーにおけるシグナルの減少は、ＩｇＭを添加した後、これらの試料において明白であり、動物種で産生される抗体から調製される免疫試薬に対する抗動物／異好性抗体の作用に関連する相対的な非特異性を実証することを認識するであろう。さらに、使用された試料は、臨床的環境外の正常な、名目上健康な個体において得られたので、これは、一般的な集団におけるこれらの干渉の比較的遍在する性質の証である。
【０１６４】
ドナーＡ及びＢからの試料中で、相対的に極端な干渉が観察されたドナープールのサイズ（約２００の個体）に基づくと、個体の約１％が、マウスＩｇＭを用いて軽減することができる有意な異好性干渉を有することを推定することができる。
【０１６５】
異好性干渉は一般に、すなわち、軽減のためにＩｇＭを必要とするもの以外に、集団の４０％もの多くにおいて様々に起こることが推定される。臨床検査標準協会（ＣＬＳＩ）内因性抗体によるイムノアッセイ干渉；提案指針（Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｙ  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ｐｒｏｐｏｓｅｄ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ）；ＣＬＳＩ文献Ｉ／ＬＡ３０−Ｐ（ＩＳＢＮ  １−５６２３８−６３３−６）を参照されたい。
【０１６６】
異好性干渉を示す試料を用いた本発明者らの試験では、これらの大部分は、ＩｇＧ単独で中和することができるが、より小さいサブセット、おそらく１０〜２０％は、本明細書に記載されるように、軽減のためにＩｇＭを必要とすることが示された。しかし、製造者は、すべての場合において、高い完全性の検査結果を提供しようと努力することを考慮すると、このサブセットは、干渉の中和／軽減の展望から対処されるべきであることが必要である。さらに、（ｉ）内因性の抗体干渉の試験及び軽減は、適当な試料の入手可能性によって制限され、（ｉｉ）無干渉結果を生じさせるために、ますます高くなる濃度の干渉排除試薬を必要とするレベルで異好性干渉を抱える個体が存在する可能性が、見込みがあるとまでいかなくても、存在することが認識されるべきである。
【０１６７】
異好性軽減試薬のインパクトは、干渉を示す別個の試料において最も劇的である一方で、これらの干渉の遍在する性質は、軽減の改善は、個体の集団に適用されるとき、イムノアッセイにおけるばらつきの全般的な低下に関連し得ることを示す。個々の対象のアレイが、検査結果のばらつきを増大させるが、品質管理アルゴリズムによって検出されないような、十分に穏やかである、多様であるが別個のレベルの異好性干渉を有する場合、干渉の減少により、集団の測定に付随する全体的なばらつきが減少することが予期される。例えば、心臓トロポニンレベルについての、健康な個体の参照集団の測定は、異好性干渉が測定の過程の間に中和される程度に対する何らかの依存性を有することが予期される。それぞれ、検出不可能な心臓トロポニンが循環している、１８０の名目上健康な個体の集団を、干渉排除試薬の２つの製剤を使用して測定した。１つの製剤は、３７５μｇ／ｍＬのＩｇＧを含んでいた一方で、第２の製剤は、７５０μｇ／ｍＬのＩｇＧ及び２５μｇ／ｍＬのＩｇＭを含んでいた。この集団に由来する血漿試料の５４０測定の標準偏差は、それぞれ低Ｉｇ製剤及び高Ｉｇ製剤について、０．０１０３ｎｇ／ｍＬ及び０．００８８ｎｇ／ｍＬであった。
【０１６８】
上述したような本発明は一般に、全血試料を用いた分析物イムノアッセイにおいて異好性抗体による干渉を低減又は排除することを対象とするが、これは、他のタイプの生体試料、例えば、血漿、血清、及び尿、並びにまた、希釈された試料、例えば、緩衝液で希釈された血液、血漿、血清、及び尿中で実施されるイムノアッセイにも適用可能である。さらに、本発明は一般に、試料中に乾燥試薬を溶解させることによって試料を改質することを対象とするが、これは、分析の間、又は試料収集の間に試料に液体として試薬を添加することも、他の実施形態では実用的である。本発明は、電気化学的検出手法、例えば、電流測定及び電位差測定手法の観点から本明細書に記載されているが、これは、他の検出様式、特に、光学手法、例えば、発光、蛍光、及び吸光度に基づく手法などにも同様に適用可能であることも明らかである。
【０１６９】
本発明を様々な好適な実施形態の観点から説明してきたが、当業者は、本発明の精神から逸脱することなく、様々な改変、置換、省略、及び変更を行うことができることを認識するであろう。したがって、本発明の範囲は、特許請求の範囲によって、もっぱら限定されることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９】
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