(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エピクロロヒドリン又はジクロロヒドリンの架橋剤で架橋された、粒子径５０μｍ以上の架橋セルロース粒子が水を含んでなる多孔性セルロースゲルであって、内径２．２ｃｍのクロマトグラフィー用カラムに高さ１７．５±２．５ｃｍまで充填した場合、２０℃の水を流したときの圧力０．４ＭＰａにおける線速度が２４００ｃｍ／時間以上である、多孔性セルロースゲル。
【請求項２】
エピクロロヒドリン又はジクロロヒドリンの架橋剤で架橋された、粒子径５０μｍ以上の架橋セルロース粒子が水を含んでなる多孔性セルロースゲルであって、内径２．２ｃｍのクロマトグラフィー用カラムに高さ１７．５±２．５ｃｍまで充填した場合、２０℃の水を流したときの最大の線速度が２４００ｃｍ／時間以上である、多孔性セルロースゲル。
【請求項３】
架橋セルロース粒子の粒子径が２０００μｍ以下である、請求項１または２に記載の多孔性セルロースゲル。
【請求項４】
ポリエチレングリコールによる排除限界分子量が１，０００，０００〜５，０００，０００である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の多孔性セルロースゲル。
【請求項５】
架橋セルロース粒子の膨潤度が５〜２０ｍＬ／ｇである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の多孔性セルロースゲル。
【請求項６】
架橋セルロース粒子の再膨潤率が８０〜１００％である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多孔性セルロースゲル。
【請求項７】
未架橋セルロース粒子の懸濁液に、セルロースモノマーのモル数の６〜２０倍量の塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩及びホウ酸塩からなる群から選ばれる少なくとも１種の無機塩の存在下、セルロースモノマーのモル数の４〜１２倍量のエピクロロヒドリン又はジクロロヒドリンの架橋剤と、架橋剤のモル数の０．１〜１．５倍量のアルカリとを３時間以上かけて連続滴下または分割添加する工程を含み、粒子径５０μｍ以上の架橋セルロース粒子が水を含んでなる多孔性セルロースゲルを製造する、多孔性セルロースゲルの製造方法。
【請求項８】
架橋剤の使用量がセルロースモノマーのモル数の４〜９倍量である、請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
請求項７記載の架橋剤及びアルカリの合計使用量をｎ回（ここで、ｎは２〜４の整数である。）に分割して前記工程をｎ回繰り返すことにより請求項１〜６のいずれか１項に記載の多孔性セルロースゲルを得る、多孔性セルロースゲルの製造方法。
【請求項１０】
架橋剤の合計使用量がセルロースモノマーのモル数の６〜１２倍量である、請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
未架橋セルロース粒子の懸濁液の初期アルカリ濃度が１重量％以下である、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の多孔性セルロースゲルを含む、クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の多孔性セルロースゲル中の水酸基の少なくとも一部が硫酸基またはスルホン酸基含有基で置換されてなる、多孔性セルロースゲル誘導体。
【請求項１４】
請求項１３に記載の多孔性セルロースゲル誘導体を含む、クロマトグラフィー用充填剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、架橋セルロース粒子を基材とする多孔性セルロースゲル及びその製造方法に関する。特に本発明は、クロマトグラフィー用充填剤に好適に用いられる多孔性セルロースゲルに関する。
【背景技術】
【０００２】
多孔性セルロースゲルはセルロース粒子のセルロース分子が形成する網目構造に溶媒が充填されてなり、各種クロマトグラフィー用充填剤としてその有用性が高く評価されている。近年、抗体医薬に代表されるタンパク質製剤は、大量発酵、高発酵力価により生産性が向上しており、それに伴って、クロマトグラフィーなどの精製工程の生産性向上が求められている。しかし、従来の多孔性セルロースゲルは、その強度が不足し、カラム内で粒子の圧密化が生じやすく、高流速での使用は事実上困難である。このため、架橋処理を施すことによりセルロースゲルの強度を改善する試みがなされている。
【０００３】
セルロース粒子の架橋方法は種々知られているが、架橋操作の容易さ、架橋後の架橋部分の安定性、セルロース粒子が非イオン性であることなどから、アルカリ性物質の存在下、架橋剤を作用させる方法が一般的である。例えば、特公昭４３−１００５９号公報（特許文献１）では、セルロース粒子の粉末を水酸化ナトリウム溶液で処理してアルカリセルロースとし、次いで、エピクロロヒドリンで処理する方法が記載されている。しかし、この方法では、セルロース粒子の結晶構造が破壊されるために、粒子の機械的強度が著しく低下してしまうという問題がある。
【０００４】
一方、アガロースゲルの架橋方法として、例えば、特表２０００−５０８３６１号公報（特許文献２）では、アガロースをアリルグリシジルエーテルのエポキシ基と反応させてゲルを形成した後、アリルグリシジルエーテルのアリル基を活性化して、該多糖類と架橋させることにより、架橋アガロースゲルの機械的強度を改善できることが記載されている。さらに、特開昭６０−３９５５８号公報（特許文献３）では、第一工程で６〜１２鎖長の二官能性または多官能性架橋剤で架橋し、第二工程で２〜５鎖長の二官能性架橋剤で架橋することにより、架橋アガロースゲルの機械的強度を改善できることが記載されている。
しかし、セルロースゲルにおいて、タンパク質製剤の生産工程における障害を十分に解消しうる程度に機械的強度を高める方法は知られていなかった。
【特許文献１】特公昭４３−１００５９号公報
【特許文献２】特表２０００−５０８３６１号公報
【特許文献３】特開昭６０−３９５５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような背景の下、高流速での使用が可能な機械的強度の高い多孔性セルロースゲル及びその製造方法の提供が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、原料セルロース粒子の懸濁液に、所定のモル比で架橋剤とアルカリとを所定時間以上かけて添加することにより、機械的強度が高く、耐流速性に優れた多孔性セルロースゲルが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下に示した多孔性セルロースゲル、その製造方法及びその用途等にかかるものである。
［１］架橋セルロース粒子が溶媒を含んでなる多孔性セルロースゲルであって、内径２．２ｃｍのクロマトグラフィー用カラムに高さ１７．５±２．５ｃｍまで充填した場合、２０℃の水を流したときの圧力０．４ＭＰａにおける線速度が２４００〜４５００ｃｍ／時間である、多孔性セルロースゲル。
［２］架橋セルロース粒子が溶媒を含んでなる多孔性セルロースゲルであって、内径２．２ｃｍのクロマトグラフィー用カラムに高さ１７．５±２．５ｃｍまで充填した場合、２０℃の水を流したときの最大の線速度が２４００〜５５００ｃｍ／時間である、多孔性セルロースゲル。
［３］架橋セルロース粒子の粒子径が１〜２０００μｍである、［１］または［２］に記載の多孔性セルロースゲル。
［４］ポリエチレングリコールによる排除限界分子量が１，０００，０００〜５，０００，０００である、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の多孔性セルロースゲル。
［５］架橋セルロース粒子の膨潤度が５〜２０ｍＬ／ｇである、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の多孔性セルロースゲル。
［６］架橋セルロース粒子の再膨潤率が８０〜１００％である、［１］〜［５］のいずれか１項に記載の多孔性セルロースゲル。
［７］未架橋セルロース粒子の懸濁液に、セルロースモノマーのモル数の６〜２０倍量の塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩及びホウ酸塩からなる群から選ばれる少なくとも１種の無機塩の存在下、セルロースモノマーのモル数の４〜１２倍量の架橋剤と、架橋剤のモル数の０．１〜１．５倍量のアルカリとを３時間以上かけて連続滴下または分割添加する工程を含む、多孔性セルロースゲルの製造方法。
［８］架橋剤の使用量がセルロースモノマーのモル数の４〜９倍量である、［７］記載の製造方法。
［９］［７］記載の架橋剤及びアルカリの合計使用量をｎ回（ここで、ｎは２〜４の整数である。）に分割して前記工程をｎ回繰り返すことにより［１］〜［６］のいずれか１項に記載の多孔性セルロースゲルを得る、多孔性セルロースゲルの製造方法。
［１０］架橋剤の合計使用量がセルロースモノマーのモル数の６〜１２倍量である、［９］記載の製造方法。
［１１］未架橋セルロース粒子の懸濁液の初期アルカリ濃度が１重量％以下である、［７］〜［１０］のいずれか１項に記載の製造方法。
［１２］［１］〜［６］のいずれか１項に記載の多孔性セルロースゲルを含む、クロマトグラフィー用充填剤。
［１３］［１］〜［６］のいずれか１項に記載の多孔性セルロースゲル中の水酸基の少なくとも一部が硫酸基またはスルホン酸基含有基で置換されてなる、多孔性セルロースゲル誘導体。
［１４］［１３］に記載の多孔性セルロースゲル誘導体を含む、クロマトグラフィー用充填剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、機械的強度が高く、耐流速性に優れた多孔性セルロースゲルを提供することができる。本発明の好ましい態様によれば、本発明の多孔性セルロースゲルは、架橋セルロース粒子の粒子径が１〜２０００μｍであり、ポリエチレングリコールによって測定される排除限界分子量が１，０００，０００以上であるので、クロマトグラフィー用充填剤として用いたときにタンパク質などの生体高分子の分離精製能に優れている。
【０００９】
また、本発明の好ましい態様によれば、本発明の多孔性セルロースゲルは機械的強度に優れているため、各種反応に供することができ、該ゲル中の水酸基を様々な反応性官能基で置換することができる。多孔性セルロースゲルに所望の反応性官能基を導入することにより、特定の化合物への親和性を付与できるため、得られる多孔性セルロースゲル誘導体はクロマトグラフィー用充填剤として好適に用いることができる。
【００１０】
また、本発明の好ましい態様によれば、本発明の多孔性セルロースゲルは再膨潤率が１００％に近いため、ゲルを乾燥させて水を嫌う反応を有機溶媒中で容易に行うことができる。また、ゲルを保存する場合にゲルを乾燥させることができるため、菌の繁殖を抑えることなどが容易になる。
【００１１】
このような本発明の多孔性セルロースゲルは、本発明の方法に従うことにより簡便な方法で製造することができる。本発明の好ましい態様によれば、所望の機械的強度を達成しつつ、架橋による排除限界分子量の低下を抑制して所望の排除限界分子量を有する多孔性セルロースゲルを製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の多孔性セルロースゲル、その製造方法及びその用途等について詳細に説明する。
【００１３】
１．多孔性セルロースゲル
まず、本発明の多孔性セルロースゲルについて説明する。本発明の多孔性セルロースゲルは、線速度の規定方法の違いにより次の２つの態様がある。本発明の第１の態様の多孔性セルロースゲルは、架橋セルロース粒子が溶媒を含んでなり、内径２．２ｃｍのクロマトグラフィー用カラムに高さ１７．５±２．５ｃｍまで充填した場合、２０℃の水を流したときの圧力０．４ＭＰａにおける線速度が２４００〜４５００ｃｍ／時間であることを特徴とする。また、本発明の第２の態様の多孔性セルロースゲルは、内径２．２ｃｍのクロマトグラフィー用カラムに高さ１７．５±２．５ｃｍまで充填した場合、２０℃の水を流したときの最大の線速度が２４００〜５５００ｃｍ／時間であることを特徴とする。
【００１４】
上記のとおり、本発明の多孔性セルロースゲルは、所定の方法で測定した場合に一定の線速度を示すことを特徴としている。ここで「線速度」とは、クロマトグラフィー用充填剤に用いられるゲルの強度を表す指標の一つであり、この線速度が大きいものほど、クロマトグラフィー用充填剤として用いた場合にクロマトグラフィーの処理速度を高めることができる。一般に、クロマトグラフィーでは、分析物の分離精製能や処理速度を高めるために、粒径の小粒径化や、流速の高速化が行われ、その結果カラム内が加圧される。このとき、軟質なゲルほど、遅い線速度で圧密化が観察され、圧密化する線速度以上には線速度の値は増加せず、圧力のみが増加する。他方、硬質なゲルほど、高い線速度でも圧密化は起こらず、圧力の増加とともに線速度の値も増加する。すなわち、加圧した際に圧密化を生じずに線速度が向上していくものほど、ゲルの機械的強度が高くクロマトグラフィー用充填剤として好適であるということができる。本発明では、所望の機械的強度を有する多孔性セルロースゲルを、圧力０．４ＭＰａにおける線速度及び最大の線速度によって規定する。
【００１５】
本発明の多孔性セルロースゲルは、架橋セルロース粒子が溶媒を含んでなる。ここで「架橋セルロース粒子が溶媒を含んでなる」とは、架橋されたセルロース分子が三次元的な網目構造を形成し、その内部に溶媒を吸収して膨潤してなることをいう。セルロース粒子内の架橋は、通常それぞれのセルロース粒子内セルロース分子の遊離ヒドロキシル基と架橋剤の官能基との間で行われる。
【００１６】
本発明の多孔性セルロースゲルにおいて、架橋セルロース粒子中に含まれる溶媒は特に制限されない。例えば、本発明の多孔性セルロースゲルをクロマトグラフィー用充填剤として用いる場合は、移動相に用いる溶媒と同じものであることが好ましい。なお、例えば、後述する本発明の多孔性セルロースゲルの製造方法を用いて多孔性セルロースゲルを製造する場合、架橋セルロースに吸収されている溶媒は、通常水であるが、液置換などによって、架橋セルロースに吸収される溶媒を種々の溶媒に置換することが可能である。
【００１７】
本発明の第１の態様において、多孔性セルロースゲルは、内径２．２ｃｍのクロマトグラフィー用カラムに高さ１７．５±２．５ｃｍまで充填した場合、２０℃の水を流したときの圧力０．４ＭＰａにおける線速度が２４００〜４５００ｃｍ／時間である。該線速度は、好ましくは２４５０〜４４００ｃｍ／時間であり、より好ましくは２５００〜４２００ｃｍ／時間である。実施例１で示したように、同じ条件における未架橋セルロースゲルの線速度は１０００ｃｍ／時間程度である。これに対して、本発明の多孔性セルロースゲルは、この未架橋セルロースゲルの倍以上の線速度を有しているため、クロマトグラフィーの処理速度を飛躍的に改善することができる。
【００１８】
あるいはまた、本発明の多孔性セルロースゲルは、第２の態様で述べたとおり、内径２．２ｃｍのクロマトグラフィー用カラムに高さ１７．５±２．５ｃｍまで充填した場合、２０℃の水を流したときの最大の線速度によって特徴づけることもできる。すなわち、本発明の第２の態様において、多孔性セルロースゲルは、内径２．２ｃｍのクロマトグラフィー用カラムに高さ１７．５±２．５ｃｍまで充填した場合、２０℃の水を流したときの最大の線速度が２４００〜５５００ｃｍ／時間である。該線速度は、好ましくは２５５０〜５４５０ｃｍ／時間であり、より好ましくは２６００〜５４００ｃｍ/時間である。なお、最大の線速度を達成するために通常はゲルベッドを加圧していくが、この圧力が高すぎると粒子がつぶれてしまい、圧密化が生じてクロマトグラフィー用充填剤として機能し得なくなる。このため、最大の線速度を得るためにゲルベッドに加える圧力は０．５〜０．８ＭＰａ程度であることが好ましい。
【００１９】
本発明では、多孔性セルロースゲルをカラムの高さ１７．５±２．５ｃｍまで充填し、これを初期ゲルベッドとして線速度を測定する。初期ゲルベッドの高さは「１７．５±２．５ｃｍ」としているが、２．５ｃｍの誤差範囲であればほぼ同等の線速度が得られる。なお、初期ゲルベッドの高さが増すほど線速度は低下する傾向にあり、高さ１ｃｍ当たりの線速度を算出することに技術的な意味はないが、初期ゲルベッド高さに対してより厳密に線速度の値を算出するとすれば、この初期ゲルベッドの高さ１ｃｍ当たりの線速度は１４０〜３５０であることが好ましく、より好ましくは１４５〜３００ｃｍ／時間、さらに好ましくは１５０〜２９０ｃｍ／時間、特に好ましくは１６０〜２８０ｃｍ／時間である。すなわち、本発明の多孔性セルロースゲルの好ましい線速度は、初期ゲルベッドの高さ１ｃｍ当たりの線速度×初期ゲルベッドの高さということになる。
【００２０】
上述した本発明の多孔性セルロースゲルが示す、圧力０．４ＭＰａにおける線速度または最大の線速度は、硬質なゲルとして知られているＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製の「ＭａｂＳｅｌｅｃｔ」（登録商標）（アガロースゲルを原料とする）と同等またはそれ以上であるため、本発明の多孔性セルロースゲルの有用性は非常に高い。
【００２１】
本発明においてゲル充填カラムの線速度の測定は、Ｊｏｎａｔｈａｎ  Ｊ．  Ｓｔｉｃｋｅｌ，Ａｌｘａｎｄｒｏｓ  Ｆｏｔｏｐｏｕｌｏｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌ．Ｐｒｏｇ．２００１，１７，７４４−７５１，”Ｐｒｅｓｓｕｒｅ−Ｆｌｏｗ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｆｏｒ  Ｐａｃｋｅｄ  Ｂｅｄｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｂｌｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｍｅｄｉａ  ａｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｃａｌｅ”に記載された方法を用いることができる。具体的な測定方法は、実施例に示したとおりである。
【００２２】
本発明の多孔性セルロースゲルは上記のように優れた線速度を示すものであるが、該ゲルを構成する架橋セルロース粒子の粒子径及びゲルの排除限界分子量もまた、クロマトグラフィー用充填剤として所望の範囲を有するものであることが好ましい。
【００２３】
本発明の多孔性セルロースゲルにおける架橋セルロース粒子の粒子径は、１〜２０００μｍが好ましく、より好ましくは１０〜５００μｍ、さらに好ましくは２０〜２００μｍ、特に好ましくは５０〜１００μｍである。また、該架橋セルロース粒子の平均粒子径は、３０〜１０００μｍが好ましく、より好ましくは４０〜２００μｍ、さらに好ましくは５０〜１００μｍである。
【００２４】
本発明において、架橋セルロース粒子の粒子径は、電気抵抗法を用いて測定された粒子径（算術径）から算出することができる。電気抵抗法は、粒子が感応領域を通過する際に生じる２電極間の電気抵抗の変化を利用する方法である。電気抵抗は粒子の体積に比例することから、電気抵抗の変化を測定し、これを粒子径に換算することによって、架橋セルロースの粒子径を測定することができる。
また、本発明において、架橋セルロース粒子の平均粒子径は、このように測定された「算術径」値の全データを平均して求めることできる。測定装置としては、ベックマンコールター株式会社の精密粒度分布測定装置（製品名「Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ  ３」）などを用いることができる。
【００２５】
あるいは、光学顕微鏡で撮影した画像の粒子径を、ノギスなどを用いて計測して、撮影倍率から元の粒子径を求めることができる。そして、光学顕微鏡写真から求めたそれぞれの粒子径の値から、下記の式によって平均粒子径を算出することができる。
個数平均粒子径（ＭN）  ＝  Σ（ｎｄ）／Σ（ｎ）
体積平均粒子径（ＭV）  ＝  Σ（ｎｄ4）／Σ（ｎｄ3）
［式中、ｎｄは光学顕微鏡写真から求めたそれぞれの粒子径の値を表し、ｎは、測定した粒子の個数を表す。］
【００２６】
また、本発明の多孔性セルロースゲルのポリエチレングリコールによる排除限界分子量は、１，０００，０００〜５，０００，０００が好ましく、より好ましくは１，０００，０００〜４，０００，０００、さらに好ましくは１，０００，０００〜３，０００，０００である。本発明の多孔性セルロースゲルは１，０００，０００以上の排除限界分子量を有するものであるので、クロマトグラフィー用充填剤として用いたときに高い分離能及び吸着容量を示すことができる。
【００２７】
排除限界分子量は、分子量と標準物質の溶出体積またはカラム体積の関係から求めることができる。排除限界分子量の測定方法は、例えば、生物化学実験法１１「ゲル濾過法」第２版（学会出版センター）やＡｍａｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（現ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）の資料「Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」に記載されている。具体的な測定方法は、実施例に示したとおりである。
【００２８】
また、本発明の多孔性セルロースゲルの膨潤度（容積／固形分重量：ｍＬ／ｇ）は、５〜２０ｍＬ／ｇが好ましく、より好ましくは７〜１７ｍＬ／ｇ、さらに好ましくは１０〜１５ｍＬ／ｇである。さらに、本発明の多孔性セルロースゲルを乾燥させた後、水に対する再膨潤率は８０〜１００％が好ましく、より好ましくは８５〜１００％、さらに好ましくは９５〜１００％である。本発明の好ましい態様によれば、本発明の多孔性セルロースゲルは、再膨潤率が１００％に近いため、ゲルを乾燥させて脱水して、水を嫌う反応を有機溶媒中で容易に行うことができる。また、ゲルを保存する場合に乾燥させることができるため、菌の繁殖を抑えることなどが容易になる。
【００２９】
ゲルの膨潤度は、水に膨潤したゲルをメスシリンダーに入れて、その容積が一定になるまで時々振動を与えながら放置した後、容積を測定し、次いで、ゲルの全量を乾燥させゲルの乾燥重量を測定することにより、次式から求めることができる。
膨潤度（ｍＬ／ｇ）＝  ゲルの容積（ｍＬ）÷  ゲルの乾燥重量（ｇ）
ゲルの乾燥方法は特に限定されるものではないが、たとえば、８０℃の恒温槽中で１日〜２日乾燥させてゲルを乾燥させればよい。
【００３０】
また、ゲルの再膨潤率は、膨潤度の測定に用いた乾燥ゲルを再び水に膨潤させ、その容積を膨潤度の測定方法と同様にして測定することにより、次式から求めることができる。
再膨潤率（％）＝  乾燥後再膨潤させたゲルの容積÷乾燥前のゲルの容積×１００
【００３１】
なお、ゲルの膨潤度及び再膨潤率の測定において、ゲルの容積の測定は同重量の乾燥ゲルを用いて行うことができる。
【００３２】
本発明の多孔性セルロースゲルの製造方法は特に限定されるものではないが、例えば、次の方法で製造することができる。
【００３３】
２．多孔性セルロースゲルの製造方法
本発明の多孔性セルロースゲルの製造方法は、未架橋セルロース粒子の懸濁液に、セルロースモノマーのモル数の６〜２０倍量の塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩及びホウ酸塩からなる群から選ばれる少なくとも１種の無機塩の存在下、セルロースモノマーのモル数の４〜１２倍量の架橋剤と、架橋剤のモル数の０．１〜１．５倍量のアルカリとを３時間以上かけて連続滴下または分割添加する工程を含むものである。ここで、「セルロースモノマー」とは、セルロースの構成単位であるグルコースユニットを意味し、セルロースモノマーのモル数（すなわち、重合度）は、グルコース１ユニットから水分を引いた量、すなわち分子量１６２を１モルとして、セルロースの乾燥重量から計算する。
【００３４】
本発明の方法では、所定量の架橋剤とアルカリとを時間をかけて徐々に添加しながら架橋反応を行うことにより、安定したセルロース粒子の架橋構造を形成し、それにより得られる多孔性セルロースゲルの機械的強度を高めることができ、優れた耐流速性が得られるものと考えられる。
【００３５】
本発明の方法で用いられる未架橋セルロース粒子は、特に制限されなく、公知のものを用いることができる。中でも、機械的強度が比較的高い球状セルロース粒子を用いることが好ましい。特に真球度が０．８〜１．０の球状セルロース粒子を用いることが好ましい。
【００３６】
本発明に用いられる未架橋セルロース粒子の製造方法は種々提案されており、特に制限されない。例えば、球状セルロース粒子の製造方法は、特公昭５５−３９５６５号公報、特開昭５５−４４３１２号公報、特開昭５１−５３６１号公報等を参照することができる。また、市販品を用いることもできる。例えば、チッソ（株）から市販されている「セルファイン」（登録商標）シリーズＧＣ−１５、ＧＨ−２５、ＧＣ−１００、ＧＣ−２００、旭化成ケミカルズ（株）から市販されている「セオラス」（登録商標）のＰＨグレード、ＫＧグレードなどが挙げられる。また、ビスコースからの再生セルロース粒子としてレンゴー（株）から市販されている「ビスコパール」（登録商標）、Ｉｏｎｔｏｓｏｒｂ社から市販されている「Ｐｅｒｌｏｚａ  ＭＴ」シリーズ、Ｓｉｇｍａ社から市販されている「Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，Ｂｅａｄｅｄ」（カタログコードＣ８２０４）などを使用することもできる。
【００３７】
本発明の方法では、まず、未架橋セルロース粒子を溶媒に分散させて懸濁液を調製する。溶媒は、未架橋セルロース粒子を分散できるものであれば特に制限されなく、水、有機溶媒または水と有機溶媒との混合物のいずれを用いても良い。有機溶媒としては、炭素数１〜８のアルコール類、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、オクタノールなど；炭素原子数４〜１０のエーテル類、例えば、エチルエーテル、プロピルエーテル、イソプロピルエーテル、ブチルエーテル、イソブチルエーテル、ｎ−アミルエーテル、イソアミルエーテル、メチルプロピルエーテル、メチルイソプロピルエーテルなど；炭素原子数３〜５のケトン類、例えば、アセトン、エチルメチルケトン、メチルプロピルケトン、メチルイソプロピルケトン、ジエチルケトンなど；炭素原子数６〜１０の脂肪族炭化水素、例えば、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカンなど；炭素原子数５〜１０の脂環式炭化水素、例えば、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘキセンなど；芳香族炭化水素、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレンなど；その他、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、リグロインなどが挙げられる。これらの溶媒の中でも、水溶性溶媒が好ましく、特に水が好ましい。
溶媒の使用量は特に制限されないが、懸濁液中の未架橋セルロース粒子の含有量が５０容積％以上であることが好ましい。
【００３８】
架橋反応の効率を上げるために、上記懸濁液には塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩及びホウ酸塩からなる群から選ばれる少なくとも１種の無機塩を共存させることが望ましい。好適な無機塩としては、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸リチウム、塩化カリウム、塩化リチウムなどのアルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩が挙げられる。特に硫酸ナトリウムは安価であり、架橋剤との反応性も乏しく好ましい。このとき、上記無機塩の使用量は、セルロース粒子のモル数に対して、通常６〜２０倍量であり、６〜１２倍量が好ましく、６〜１０倍量がより好ましい。
【００３９】
また、未架橋セルロース粒子の懸濁液に架橋剤とアルカリを添加する前に、還元処理の目的で、予め、少量のアルカリと水素化ホウ素ナトリウムを添加しておくことが好ましい。初期アルカリ濃度は、懸濁液に対して１重量％以下が好ましく、０．６５〜１重量％が特に好ましい。また、水素化ホウ素ナトリウムの添加量は、セルロースの乾燥重量の０．1から１０重量％が好ましい。アルカリと水素化ホウ素ナトリウムを添加する前に、懸濁液は、通常３５〜７０℃、好ましくは４０〜５０℃で、約０．２５〜１時間、攪拌処理しておくことが好ましい。攪拌処理により、未架橋セルロース粒子が均一に分散した懸濁液を得ることができ、架橋反応を均一に行うことができる。
【００４０】
次いで、上記懸濁液に架橋剤とアルカリとを添加する。
【００４１】
本発明の方法で用いられる架橋剤は、二官能または多官能のものであれば特に制限されない。セルロースとの結合が化学的に安定であり、反応の際に望ましくない吸着作用を生じうる荷電した基が導入されないことから、エピクロロヒドリン、ジクロルヒドリン、ビスエポキシド類（Ｘ−Ｒ−Ｙ（ここで、Ｘ及びＹはそれぞれ独立してハロゲンまたはエポキシを示し、Ｒは１〜１０個の炭素原子を含有する脂肪族残基を示す）で表されるものが１組以上含まれている化合物）、エピブロモヒドリン、エピフロロヒドリン、２−（４−フロロフェニル）オキシラン、［（４−フルオロフェノキシ）メチル］オキシランなどが好ましく挙げられる。ビスエポキシド類の具体例としては、例えば、特開昭６０−３９５５８号公報、米国特許第４６６５１６４号明細書などに記載されている化合物が挙げられる。これらは１種単独でも２種以上を組み合わせて使用することもできる。これらの中でも、入手が容易で、安価であることから、本発明においては、エピクロロヒドリン、ジクロルヒドリン、エピブロモヒドリンを用いることが好ましい。
【００４２】
架橋剤の使用量は、セルロースモノマーのモル数の４〜１２倍量であり、４〜１１倍量が好ましく、４〜１０倍量がより好ましく、４〜９倍量がさらに好ましい。架橋剤の使用量の合計がセルロースモノマーのモル数の４倍量以上であると、一段階の架橋処理でも所望の耐流速性を得ることができる。
【００４３】
また、本発明の方法で用いられるアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属の水酸化物、水酸化カルシウムなどのアルカリ土類金属の水酸化物が挙げられる。中でも、アルカリ金属の水酸化物は溶解性が良好であることから、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが好ましく、水酸化ナトリウムが特に好ましい。
【００４４】
アルカリの使用量は、上記架橋剤のモル数の０．１〜１．５倍量であり、０．５〜１．２５倍量が好ましく、０．７５〜１倍量がより好ましい。アルカリは、水で希釈して水溶液として用いることが好ましい。アルカリ水溶液中のアルカリ含有量は１〜５０重量％が好ましく、２０〜５０重量％がより好ましく、４０〜５０重量％がさらに好ましい。
【００４５】
本発明では、未架橋セルロース粒子の懸濁液に架橋剤とアルカリとを３時間以上かけて連続滴下または分割添加する。ここで、連続滴下するとは、架橋剤とアルカリとを連続的に滴下することであり、分割添加するとは、架橋剤とアルカリとをそれぞれ複数回に分けて添加することである。
【００４６】
本発明において、架橋剤とアルカリとを連続滴下または分割添加するのに要する時間は３時間でも十分であるが、同量の架橋剤とアルカリとを用いて、より効果的に多孔性セルロースゲルの機械的強度を向上させるためには、６時間以上が好ましい。但し、生産効率の観点から２４時間以下であることが好ましい。
【００４７】
分割添加する場合は、１０〜１２０分の間隔で架橋剤とアルカリとを少なくとも４分割して添加することが好ましい。添加の間隔と回数は、添加時間によって適宜調整すればよい。例えば、３時間で分割添加する場合には、必要量の架橋剤とアルカリとをそれぞれ、１３分割した量を１５分間隔で添加することが好ましい。また、６時間で分割添加する場合には、必要量の架橋剤とアルカリとをそれぞれ、４分割した量を１２０分間隔で添加することが好ましい。あるいは、６時間で分割添加する場合には、必要量の架橋剤とアルカリとをそれぞれ、２５分割した量を１５分間隔で添加することが好ましい。
【００４８】
架橋剤とアルカリの一回当たりの添加量は特に制限されなく、一定時間に一定量がバランスよく添加されることが好ましい。添加の間隔は一定である必要はないが、ほぼ一定間隔で添加することが好ましい。添加量も均一である必要はないが、ほぼ均一な量で添加することが好ましい。なお、操作の簡便性の観点からは、架橋剤とアルカリとを同時に添加することが好ましい。
【００４９】
あるいは、添加の間隔を短くすることもでき、必要量の架橋剤とアルカリとをそれぞれ所定の時間かけて均等に滴下するように連続滴下してもよい。
【００５０】
架橋剤とアルカリとを添加する間、反応混合物中の温度は３５〜７０℃、好ましくは４０〜５０℃に維持し、かつ、攪拌を継続することが好ましい。
【００５１】
必要量の架橋剤とアルカリの添加終了後は、反応混合物中の温度を３５〜７０℃、好ましくは４０〜５０℃に維持し、攪拌を続けながら、さらに１〜２４時間反応を行うことが好ましい。
【００５２】
反応終了後、温度を４０℃以下に冷却し、反応混合物に酢酸、蟻酸、乳酸、アスパラギン酸、安息香酸、コハク酸、シュウ酸、クエン酸、プロピオン酸などの弱酸を加えて中和する。その後、生成物を濾過などによって回収し、溶媒で洗浄して、目的の多孔性セルロースゲルを得ることができる。
【００５３】
あるいは、前述した架橋剤及びアルカリの合計使用量をｎ回（ここで、ｎは２〜４の整数である。）に分割して前記工程をｎ回繰り返すことにより、前記「１．多孔性セルロースゲル」の項において述べたような特性を満たす多孔性セルロースゲルを得ることもできる。前記工程を繰り返す回数は２〜４回であり、２〜３回であることが好ましく、２回であることがより好ましい。例えば、２回に分割して行う場合、架橋剤とアルカリの使用量を２分割して、これを３時間以上かけて添加する工程を２回繰り返すことにより、得られる多孔性セルロースゲルの線速度が顕著に向上する。
【００５４】
前記工程をｎ回繰り返し行う場合、架橋剤の合計使用量は、セルロースモノマーのモル数の４〜１２倍量であり、６〜１２倍量が好ましく、６〜１０倍量がより好ましく、６〜９倍量がさらに好ましい。アルカリの合計使用量は、上記架橋剤のモル数の０．１〜１．５倍量であり、０．５〜１．２５倍量が好ましく、０．７５〜１倍量がより好ましい。
【００５５】
本発明によれば、このようにして多孔性セルロースゲルを得ることができる。本発明の好ましい態様によれば、上記のようにして得られる多孔性セルロースゲルは、前記「１．本発明の多孔性セルロースゲル」の項において述べたような特性を有することができる。
【００５６】
３．多孔性セルロースゲルの用途
このようにして得られる本発明の多孔性セルロースゲルは機械的強度が高く、耐流速性に優れていることから、クロマトグラフィー用充填剤として好適に用いることができる。  本発明のクロマトグラフィー用充填剤は、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、キレートクロマトグラフィー、共有結合クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーに利用できる。中でも、ポリエチレングリコールによる排除限界分子量が１，０００，０００以上の多孔性セルロースゲルは、タンパク質や核酸などの高分子物質の分離能が高く、しかも、それらとの非特異的吸着が少なく、安全性にも優れていることから、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーの充填剤、キレートクロマトグラフィー、共有結合クロマトグラフィーとして特に好適である。
【００５７】
また、本発明の多孔性セルロースゲルは各種反応に耐えうる機械的強度を有しているため、本発明によれば、多孔性セルロースゲルをベースゲルとして、多孔性セルロースゲル中の水酸基の少なくとも一部を反応性官能基で置換してなる多孔性セルロースゲル誘導体を提供することができる。なお、反応性官能基で置換されうるゲル中の水酸基は、セルロース及び架橋剤由来のものが挙げられる。本発明によれば、反応性官能基の種類やその導入量に応じて、目的の化合物に対する親和性を付与できるため、得られる多孔性セルロースゲル誘導体は、クロマトグラフィー用充填剤として好適に用いられる。
【００５８】
例えば、本発明の一態様において、本発明の多孔性セルロースゲルが有する水酸基の少なくとも一部を硫酸化処理して、該多孔性セルロースゲルに硫酸基を導入することにより、リゾチーム、免疫グロブリン、血液凝固因子などのタンパク質の分離または精製に好適なクロマトグラフィー用充填剤を提供することができる。
【００５９】
本発明の多孔性セルロースゲルに硫酸基を導入する方法、すなわち、硫酸化多孔性セルロースゲルを得る方法は、特に限定されるものではないが、例えば、次のようにして行うことができる。
まず、反応容器に硫酸化剤を準備する。本発明に用いる硫酸化剤は、該ゲル中の水酸基と反応して、多孔性セルロースゲルに硫酸基を導入できるものであれば特に限定されなく、そのような硫酸化剤としては、例えば、クロルスルホン酸−ピリジン錯体、ピペリジン−Ｎ−硫酸、無水硫酸−ジメチルホルムアミド錯体、三酸化硫黄−ピリジン錯体、三酸化硫黄−トリメチルアミン錯体、硫酸−トリメチルアミン複合体等を挙げることができる。硫酸化剤の使用量は、目的とする硫酸基の導入率及び反応条件によって任意に選択すればよく、例えば、多孔性セルロースゲル中の水酸基に対し、０．００１〜１当量を用いるのが適当である。
【００６０】
次に、乾燥させた多孔性セルロースゲルを硫酸化剤中に加え、硫酸化反応を行う。反応温度及び反応時間は、溶媒や硫酸化剤の種類によっても異なるが、不活性ガス中で、通常０〜１００℃、好ましくは２０〜８５℃で、好ましくは０．５〜２４時間、より好ましくは０．５〜１０時間行う。
反応終了後、反応混合物にアルカリ水溶液、例えば水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和してもよい。
その後、得られた反応混合物を濾過または遠心分離することにより、生成物を回収し、水で中性になるまで洗浄して、目的の硫酸化多孔性セルロースゲルを得ることができる。硫酸化多孔性セルロースゲル中の硫酸基の導入量は、硫酸化剤の使用量を変更することなどによって調整することができ、クロマトグラフィー充填剤の用途などに応じて適宜決定すればよい。
【００６１】
また、本発明の他の態様においては、本発明の多孔性セルロースゲル中の水酸基の少なくとも一部をスルホン化処理して、該ゲル中にスルホン酸基含有基を導入することにより、免疫グロブリン、リゾチームなどのタンパク質の分離または精製に好適な強カチオンイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を提供することができる。
【００６２】
本発明の多孔性セルロースゲル中に導入することができるスルホン酸基含有基は、スルホン酸基を含有する炭化水素基であれば特に制限されなく、スルホン酸含有基に含まれる水素原子が、水酸基、ハロゲン原子、エポキシなどの置換基で更に置換されていてもよい。中でも、本発明に導入されるスルホン酸基含有基としては、置換基を有していてもよい炭素数１〜５のスルホアルキル基であることが好適である。
【００６３】
本発明の多孔性セルロースゲル中にスルホン酸基含有基を導入する方法は、多糖類のスルホン化処理に一般に用いられるものであれば特に制限されない。例えば、本発明の多孔性セルロースゲルを、３−クロロ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸ナトリウム、３−ブロモプロパンスルホン酸ナトリウムなどのハロアルカンスルホン酸塩、あるいは本実施例で用いた１，４−ブタンスルトン、１，３−プロパンスルトンまたは１，２−エポキシエタンスルホン酸などのエポキシドを有するスルホン酸などのスルホン化剤を用いて処理する方法が挙げられる。
スルホン酸化多孔性セルロースゲル中のスルホン酸基含有基の導入量は、スルホン化剤やアルカリの使用量を変更することなどによって調整することができ、クロマトグラフィー充填剤の用途などに応じて適宜決定すればよい。
多孔性セルロースゲルのスルホン化処理方法の詳細は、実施例１０−１〜１０−３に示したとおりである。また、特開２００１−３０２７０２号公報または特開平９−２３５３０１号公報などを参照しながら、実験条件を適宜設計変更することにより、目的のスルホン酸基含有基を目的の量だけ導入することができる。
【００６４】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００６５】
実施例１では、架橋剤及びアルカリの添加方法を変えた場合に多孔性セルロースゲルの耐流速性がどのように変化するのかについて調査した。
【００６６】
１．球状セルロース粒子の調製
まず、試験例１において、多孔性セルロースゲルの原料となる球状セルロース粒子を製造した。
【００６７】
（試験例１）球状セルロース粒子の製造
球状セルロース粒子の製造は、特開昭５５−４４３１２号公報に記載された方法に従い、次のように実施した。
（１）１０００ｇのチオシアン酸カルシウム６０重量％水溶液に６４ｇの結晶性セルロース（旭化成ケミカルズ株式会社製「セオラス」（登録商標）ＰＨ１０１）を加え、１１０〜１２０℃に加熱して溶解した。
（２）この溶液を、１３０〜１４０℃に予め加熱した、界面活性剤（ソルビタンモノオレエート）６ｇを含むｏ−ジクロロベンゼン溶液４８００ｍＬ中に滴下し、２００〜３００ｒｐｍにて攪拌分散した。
（３）次いで、上記分散液を４０℃以下まで冷却し、メタノール１９００ｍＬ中に注ぎ、粒子の懸濁液を得た。
（４）この懸濁液を濾過分別し、粒子をメタノール１９００ｍＬにて洗浄し、濾過分別した。この洗浄操作を数回行った。
（５）さらにこれを大量の水で洗浄した後、目的とする球状セルロース粒子を得た。
（６）次いで、球状セルロース粒子をふるいにかけて、所望の粒子サイズ間隔（５０〜１００μｍ）にした。得られた球状セルロース粒子は、水で膨潤したゲル状物であり、その膨潤度は１６ｍＬ／ｇであった。
【００６８】
２．多孔性セルロースゲルの製造
次に、得られた球状セルロースを用いて、架橋剤の使用量をセルロースモノマーのモル数の６倍量とし、アルカリの使用量を架橋剤のモル数の１．５倍量として、添加時間と添加間隔を変えたこと以外は同様にして多孔性セルロースゲルを製造した。
【００６９】
（実施例１−１）多孔性セルロースゲルＡの製造
（１）試験例１で得られた球状セルロース粒子１００ｇを、１３２ｇの純水に６３ｇのＮａ2ＳＯ4を溶解した液に加え撹拌した。温度を５０℃にして２時間撹拌を継続した。
（２）次に、４５重量％のＮａＯＨ水溶液３．５ｇとＮａＢＨ4０．６ｇとを加え撹拌した。初期アルカリ濃度［ＮａＯＨ］は０．６９％Ｗ／Ｗであった。
（３）５０℃で撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ水溶液４８ｇと、エピクロロヒドリン（ＥＣＨ）３３ｇとをそれぞれ２５等分した量を、１５分置きにおよそ６時間かけて添加した。
（４）添加終了後、温度５０℃で１６時間反応させた。
（５）温度４０℃以下に冷却した後、酢酸１４ｇを加え中和した。
（６）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、目的の多孔性セルロースゲルＡ１０３ｇを得た。
【００７０】
（実施例１−２）多孔性セルロースゲルＢの製造
（１）試験例１で得られた球状セルロース粒子１００ｇを、１３２ｇの純水に６３ｇのＮａ2ＳＯ4を溶解した液に加え撹拌した。温度を５０℃にして２時間撹拌を継続した。
（２）次に、４５重量％のＮａＯＨ水溶液３．５ｇと、ＮａＢＨ4０．６ｇとを加え、撹拌した。
（３）５０℃で撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ水溶液４８ｇと、ＥＣＨ３３ｇとをそれぞれ１３等分した量を、１５分置きにおよそ３時間かけて添加した。
（４）添加終了後、温度５０℃で１６時間反応させた。
（５）温度４０℃以下に冷却し、酢酸１４ｇを加え中和した。
（６）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、目的の多孔性セルロースゲルＢ１０３ｇを得た。
【００７１】
（実施例１−３）多孔性セルロースゲルＣの製造
（１）試験例１で得られた球状セルロース粒子１００ｇを、１３２ｇの純水に６３ｇのＮａ2ＳＯ4を溶解した液に加え撹拌した。温度を５０℃にして２時間撹拌を継続した。
（２）次に、４５重量％のＮａＯＨ水溶液３．５ｇと、ＮａＢＨ4０．６ｇとを加え、撹拌した。
（３）５０℃で撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ４８ｇと、ＥＣＨ３３ｇとをそれぞれ７等分した量を、６０分置きにおよそ６時間かけて添加した。
（４）添加終了後、温度５０℃で１６時間反応させた。
（５）温度４０℃以下に冷却し、酢酸１４ｇを加え中和した。
（６）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、目的の多孔性セルロースゲルＣ９９ｇを得た。
【００７２】
（実施例１−４）多孔性セルロースゲルＤの製造
（１）試験例１で得られた球状セルロース粒子１００ｇを、１３２ｇの純水に６３ｇのＮａ2ＳＯ4を溶解した液に加え撹拌した。温度を５０℃にして２時間撹拌を継続した。
（２）次に、４５重量％のＮａＯＨ水溶液３．５ｇと、ＮａＢＨ4０．６ｇとを加え、撹拌した。
（３）５０℃で撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ４８ｇと、ＥＣＨ３３ｇとをそれぞれ４等分した量を、１２０分置きにおよそ６時間かけて添加した。
（４）添加終了後、温度５０℃で１６時間反応させた。
（５）温度４０℃以下に冷却し、酢酸１４ｇを加え中和した。
（６）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、目的の多孔性セルロースゲルＤ１０３ｇを得た。
【００７３】
（実施例１−５）多孔性セルロースゲルＥの製造
（１）試験例１で得られた球状セルロース粒子１００ｇを、１３２ｇの純水に６３ｇのＮａ2ＳＯ4を溶解した液に加え撹拌した。温度を５０℃にして２時間撹拌を継続した。
（２）次に、４５重量％のＮａＯＨ水溶液３．５ｇとＮａＢＨ4０．６ｇとを加え撹拌した。初期アルカリ濃度［ＮａＯＨ］は０．６９％Ｗ／Ｗであった。
（３）５０℃で撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ水溶液４８ｇと、ＥＣＨ３３ｇとをそれぞれ２５等分した量を、１５分置きにおよそ３時間かけて（１２回）添加し、その３０分後、残分を一度に添加した。
（４）添加終了後、温度５０℃で１６時間反応させた。
（５）温度４０℃以下に冷却した後、酢酸１４ｇを加え中和した。
（６）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、目的の多孔性セルロースゲルＥ１０１ｇを得た。
【００７４】
（比較例１）
（１）試験例１で得られた球状セルロース粒子１００ｇを、１３２ｇの純水に６３ｇのＮａ2ＳＯ4を溶解した液に加え撹拌した。温度を５０℃にして２時間撹拌を継続した。
（２）次に、４５重量％のＮａＯＨ水溶液３．５ｇと、ＮａＢＨ4０．６ｇとを加え、撹拌した。
（３）５０℃で撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ４８ｇと、ＥＣＨ３３ｇとをそれぞれ５等分した量を、１５分置きにおよそ１時間かけて添加した。
（４）添加終了後、温度５０℃で１６時間反応させた。
（５）温度４０℃以下に冷却し、酢酸１４ｇを加え中和した。
（６）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、目的の多孔性セルロースゲル１０４ｇを得た。
【００７５】
（比較例２）
（１）試験例１で得られた球状セルロース粒子１００ｇを、１３２ｇの純水に６３ｇのＮａ2ＳＯ4を溶解した液に加え撹拌した。温度を５０℃にして２時間撹拌を継続した。
（２）次に、４５重量％のＮａＯＨ水溶液３．５ｇと、ＮａＢＨ4０．６ｇとを加え、撹拌した。
（３）５０℃で撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ４８ｇと、ＥＣＨ３３ｇとをそれぞれ添加した。
（４）添加終了後、温度５０℃で１６時間反応させた。
（５）温度４０℃以下に冷却し、酢酸１４ｇを加え中和した。
（６）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、多孔性セルロースゲル１０３ｇを得た。
【００７６】
（比較例３）
（１）試験例１で得られた球状セルロース粒子１００ｇを、１３２ｇの純水に６３ｇのＮａ2ＳＯ4を溶解した液に加え撹拌した。温度を５０℃にして２時間撹拌を継続した。
（２）次に、４５重量％のＮａＯＨ水溶液３．５ｇとＮａＢＨ4０．６ｇとを加え撹拌した。初期アルカリ濃度［ＮａＯＨ］は０．６９％Ｗ／Ｗであった。
（３）５０℃で撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ水溶液４８ｇと、エピクロロヒドリン３３ｇとをそれぞれ２５等分した量を、１５分置きにおよそ１時間かけて（４回）添加し、その３０分後残分を一度に添加した。
（４）添加終了後、温度５０℃で１６時間反応させた。
（５）温度４０℃以下に冷却した後、酢酸１４ｇを加え中和した。
（６）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、目的の多孔性セルロースゲル１０１ｇを得た。
【００７７】
（比較例４）
（１）試験例１で得られた球状セルロース粒子１００ｇを、０．３５ｇの界面活性剤（化合物名：テトラデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド）、３０ｍｇのＮａＢＨ4を含む１２５ｍＬのヘプタン溶液に加え、撹拌して分散させ、温度を３０℃にした。
（２）２９重量％のＮａＯＨ水溶液２８ｇを加え、３０℃で２時間撹拌した。初期アルカリ濃度［ＮａＯＨ］は７％Ｗ／Ｗであった。
（３）温度を４０℃に上昇させ、ＥＣＨ１７ｇを加え、更に温度を５０℃にして１６時間反応させた。
（４）５０重量％のＮａＯＨ水溶液１６ｇを加え、５０℃で２時間撹拌した。
（５）１７ｇのＥＣＨを加えて、５０℃で４時間反応させた。
（６）５０重量％のＮａＯＨ水溶液１６ｇを加え、５０℃で２時間撹拌した。
（７）１７ｇのＥＣＨを加えて、５０℃で４時間反応させた。
（８）温度４０℃以下に冷却し、酢酸５ｇを加えて中和した。
（９）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水でヘプタン臭が無くなるまで濾過洗浄し、多孔性セルロースゲルを得た。
【００７８】
（比較例５）
（１）試験例１で得られた球状セルロース粒子１００ｇを、０．７５ｇの界面活性剤、炭酸ナトリウム１３ｇ、１００ｍｇのＮａＢＨ4を含む３５０ｍＬのヘプタン溶液に加え撹拌して分散させ、温度を３０℃にした。
（２）７重量％のＮａＯＨ水溶液２４６ｇを加え、３０℃で２時間撹拌した。初期アルカリ濃度［ＮａＯＨ］は５％Ｗ／Ｗであった。
（３）温度を４０℃に上昇させ、１７ｇのＥＣＨを加え、更に温度を５０℃にして４時間反応させた。
（４）温度４０℃以下に冷却し、酢酸５ｇを加えて中和した。
（５）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水でヘプタン臭が無くなるまで濾過洗浄し、多孔性セルロースゲル１０６ｇを得た。
【００７９】
３．多孔性セルロースゲルの圧力と線速度の関係
実施例１−１〜１−５及び比較例１〜５で得られた多孔性セルロースゲルの圧力と線速度の関係を次のように求めた。なお、比較のため、試験例１で得られた球状セルロース粒子とＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製「ＭａｂＳｅｌｅｃｔ」についても圧力と線速度の関係を求めた。
【００８０】
［圧力と線速度の関係］
内径２．２ｃｍのポリカーボネート製クロマトグラフィー用カラム（東京理化器械（株）製、品名「低圧液クロ用樹脂カラム」カタログ番号「１６６１７０」）に実施例及び比較例で得られた多孔性セルロースゲルをそれぞれ１７．５±２．５ｃｍ充填した。このカラムに２０℃の純水を通液し、その際のカラム入口とカラム出口の圧力を測定した。なお、通液は初期においては、２０ｍＬ／分以下の流速から始めて、その後流量を段階毎に増加させ、３分から５分通液を継続した後、圧力を測定した。圧力はカラム入口の圧力からカラム出口の圧力を差し引いて求めた。線速度を、下記の式により算出した。
線速度（ｃｍ／時間）＝  測定時の流量（ｍＬ／時間）／カラム断面積（ｃｍ2）
【００８１】
結果を図１に示した。図１から明らかなように、３時間かけて分割添加することにより硬質の多糖ゲルとして知られているＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製「ＭａｂＳｅｌｅｃｔ」と同等以上の線速度が得られた。６時間かけて分割添加した場合では、線速度が顕著に向上した。他方、比較例１〜５の多孔性セルロースゲルは、所望の線速度を示さず、原料より線速度が低下するものもあった。
【００８２】
なお、実施例１−１〜１−５、比較例１〜３における架橋剤及びアルカリの使用量と滴下方法を表１にまとめた。
【表１】
0005504596.tif 000002
【実施例２】
【００８３】
実施例２では、架橋剤及びアルカリの仕込み量を変化させた場合に多孔性セルロースゲルの耐流速性がどのように変化するのかについて調査した。
【００８４】
１．多孔性セルロースゲルの製造
架橋剤の使用量をセルロースモノマーのモル数の３〜１２倍量とし、架橋剤に対するアルカリのモル比（アルカリ/架橋剤）を０．５〜１．６倍量として、これを２５等分した量を１５分間隔で６時間かけて分割添加して多孔性セルロースゲルを製造した。
【００８５】
（実施例２−１）多孔性セルロースゲルＦの製造
（１）試験例１で得られた球状セルロース粒子１００ｇを、１３２ｇの純水に６３ｇのＮａ2ＳＯ4を溶解した液に加え撹拌した。温度を５０℃にして２時間撹拌を継続した。
（２）次に、４５重量％のＮａＯＨ水溶液３．５ｇとＮａＢＨ4０．６ｇとを加え撹拌した。初期アルカリ濃度［ＮａＯＨ］は０．６９％Ｗ／Ｗであった。
（３）５０℃で撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ水溶液９６ｇと、エピクロロヒドリン６６ｇとをそれぞれ２５等分した量を、１５分置きにおよそ６時間かけて添加した。
（４）添加終了後、温度５０℃で１６時間反応させた。
（５）温度４０℃以下に冷却した後、酢酸２９ｇを加え中和した。
（６）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、目的の多孔性セルロースゲルＦ１０３ｇを得た。
【００８６】
（実施例２−２）多孔性セルロースゲルＧの製造
（１）試験例１で得られた球状セルロース粒子１００ｇを、１３２ｇの純水に６３ｇのＮａ2ＳＯ4を溶解した液に加え撹拌した。温度を５０℃にして２時間撹拌を継続した。
（２）次に、４５重量％のＮａＯＨ水溶液３．５ｇとＮａＢＨ4０．６ｇとを加え撹拌した。初期アルカリ濃度［ＮａＯＨ］は０．６９％Ｗ／Ｗであった。
（３）５０℃で撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ水溶液６４ｇと、エピクロロヒドリン６７ｇとをそれぞれ２５等分した量を、１５分置きにおよそ６時間かけて添加した。
（４）添加終了後、温度５０℃で１６時間反応させた。
（５）温度４０℃以下に冷却した後、酢酸２．６ｇを加え中和した。
（６）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、目的の多孔性セルロースゲルＧ１０５ｇを得た。
【００８７】
（実施例２−３）多孔性セルロースゲルＨの製造
（１）試験例１で得られた球状セルロース粒子１００ｇを、１３２ｇの純水に６３ｇのＮａ2ＳＯ4を溶解した液に加え撹拌した。温度を５０℃にして２時間撹拌を継続した。
（２）次に、４５重量％のＮａＯＨ水溶液３．５ｇとＮａＢＨ4０．６ｇとを加え撹拌した。初期アルカリ濃度［ＮａＯＨ］は０．６９％Ｗ／Ｗであった。
（３）５０℃で撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ水溶液４８ｇと、エピクロロヒドリン５０ｇとをそれぞれ２５等分した量を、１５分置きにおよそ６時間かけて添加した。
（４）添加終了後、温度５０℃で１６時間反応させた。
（５）温度４０℃以下に冷却した後、酢酸２．６ｇを加え中和した。
（６）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、目的の多孔性セルロースゲルＨ１０３ｇを得た。
【００８８】
（実施例２−４）多孔性セルロースゲルIの製造
（１）試験例１で得られた球状セルロース粒子１００ｇを、１３２ｇの純水に６３ｇのＮａ2ＳＯ4を溶解した液に加え撹拌した。温度を５０℃にして２時間撹拌を継続した。
（２）次に、４５重量％のＮａＯＨ水溶液３．５ｇとＮａＢＨ4０．６ｇとを加え撹拌した。初期アルカリ濃度［ＮａＯＨ］は０．６９％Ｗ／Ｗであった。
（３）５０℃で撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ水溶液３２ｇと、エピクロロヒドリン３３ｇとをそれぞれ２５等分した量を、１５分置きにおよそ６時間かけて添加した。
（４）添加終了後、温度５０℃で１６時間反応させた。
（５）温度４０℃以下に冷却した後、酢酸２．６ｇを加え中和した。
（６）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、目的の多孔性セルロースゲルI１００ｇを得た。
【００８９】
（実施例２−５）多孔性セルロースゲルＪの製造
（１）試験例１で得られた球状セルロース粒子１００ｇを、１３２ｇの純水に６３ｇのＮａ2ＳＯ4を溶解した液に加え撹拌した。温度を５０℃にして２時間撹拌を継続した。
（２）次に、４５重量％のＮａＯＨ水溶液３．５ｇとＮａＢＨ4０．６ｇとを加え撹拌した。初期アルカリ濃度［ＮａＯＨ］は０．６９％Ｗ／Ｗであった。
（３）５０℃で撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ水溶液３２ｇと、エピクロロヒドリン２２ｇとをそれぞれ２５等分した量を、１５分置きにおよそ６時間かけて添加した。
（４）添加終了後、温度５０℃で１６時間反応させた。
（５）温度４０℃以下に冷却した後、酢酸１１ｇを加え中和した。
（６）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、目的の多孔性セルロースゲルＪ１０３ｇを得た。
【００９０】
（実施例２−６）多孔性セルロースゲルＫの製造
（１）試験例１で得られた球状セルロース粒子１００ｇを、１３２ｇの純水に６３ｇのＮａ2ＳＯ4を溶解した液に加え撹拌した。温度を５０℃にして２時間撹拌を継続した。
（２）次に、４５重量％のＮａＯＨ水溶液３．５ｇとＮａＢＨ4０．６ｇとを加え撹拌した。初期アルカリ濃度［ＮａＯＨ］は０．６９％Ｗ／Ｗであった。
（３）５０℃で撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ水溶液２４ｇと、エピクロロヒドリン３３ｇとをそれぞれ２５等分した量を、１５分置きにおよそ６時間かけて添加した。
（４）添加終了後、温度５０℃で１６時間反応させた。
（５）温度４０℃以下に冷却した後、酢酸１ｇを加え中和した。
（６）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、目的の多孔性セルロースゲルＫ１０４ｇを得た。
【００９１】
（実施例２−７）多孔性セルロースゲルＬの製造
（１）試験例１で得られた球状セルロース粒子１００ｇを、１３２ｇの純水に６３ｇのＮａ2ＳＯ4を溶解した液に加え撹拌した。温度を５０℃にして２時間撹拌を継続した。
（２）次に、４５重量％のＮａＯＨ水溶液３．５ｇとＮａＢＨ4０．６ｇとを加え撹拌した。初期アルカリ濃度［ＮａＯＨ］は０．６９％Ｗ／Ｗであった。
（３）５０℃で撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ水溶液１６ｇと、エピクロロヒドリン３３ｇとをそれぞれ２５等分した量を、１５分置きにおよそ６時間かけて添加した。
（４）添加終了後、温度５０℃で１６時間反応させた。
（５）温度４０℃以下に冷却した後、酢酸１ｇを加え中和した。
（６）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、目的の多孔性セルロースゲルＬ９９ｇを得た。
【００９２】
（比較例６）
（１）試験例１で得られた球状セルロース粒子１００ｇを、１３２ｇの純水に６３ｇのＮａ2ＳＯ4を溶解した液に加え撹拌した。温度を５０℃にして２時間撹拌を継続した。
（２）次に、４５重量％のＮａＯＨ水溶液３．５ｇとＮａＢＨ4０．６ｇとを加え撹拌した。初期アルカリ濃度［ＮａＯＨ］は０．６９％Ｗ／Ｗであった。
（３）５０℃で撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ水溶液２４ｇと、エピクロロヒドリン１６ｇとをそれぞれ２５等分した量を、１５分置きにおよそ６時間かけて添加した。
（４）添加終了後、温度５０℃で１６時間反応させた。
（５）温度４０℃以下に冷却した後、酢酸１８．８ｇを加え中和した。
（６）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、目的の多孔性セルロースゲル１０２ｇを得た。
【００９３】
（比較例７）
（１）試験例１で得られた球状セルロース粒子１００ｍＬを、１３２ｇの純水に６３ｇのＮａ2ＳＯ4を溶解した液に加え撹拌した。温度を５０℃にして２時間撹拌を継続した。
（２）次に、４５重量％のＮａＯＨ水溶液３．５ｇとＮａＢＨ4０．６ｇとを加え撹拌した。初期アルカリ濃度［ＮａＯＨ］は０．６９％Ｗ／Ｗであった。
（３）５０℃で撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ水溶液６４ｇと、エピクロロヒドリン３３ｇとをそれぞれ２５等分した量を、１５分置きにおよそ６時間かけて添加した。
（４）添加終了後、温度５０℃で１６時間反応させた。
（５）温度４０℃以下に冷却した後、酢酸２６ｇを加え中和した。
（６）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、目的の多孔性セルロースゲル９７ｇを得た。
【００９４】
２．多孔性セルロースゲルの圧力と線速度の関係
実施例１と同様にして実施例２−１〜２−７及び比較例６、７で得られた多孔性セルロースゲルの圧力と線速度の関係を求めた。結果を図２に示した。また、比較のため、試験例１で得られた球状セルロース粒子及びＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製「ＭａｂＳｅｌｅｃｔ」についても図示した。
図２に示されるように、架橋剤のセルロースモノマーに対するモル比を４倍〜１２倍とし、かつ、アルカリ／架橋剤のモル比を１．５以下とすることにより、線速度が向上した。
【００９５】
なお、実施例２−１〜２−７、比較例６〜７で用いたアルカリ及び架橋剤の使用量を表２に示した。
【表２】
0005504596.tif 000003
【実施例３】
【００９６】
実施例３では、初期アルカリ濃度を変えた場合に多孔性セルロースゲルの耐流速性がどのように変化するのかについて調査した。
【００９７】
１．多孔性セルロースゲルの製造
初期アルカリ濃度を変えたこと以外は同様にして多孔性セルロースゲルを製造した。
【００９８】
（実施例３−１）多孔性セルロースゲルＭの製造
（１）試験例１で得られた球状セルロース粒子１００ｇを、１３２ｇの純水に６３ｇのＮａ2ＳＯ4を溶解した液に加え撹拌した。温度を５０℃にして２時間撹拌を継続した。
（２）次に、４５重量％のＮａＯＨ水溶液５ｇとＮａＢＨ4０．６ｇとを加え撹拌した。初期アルカリ濃度［ＮａＯＨ］は１％Ｗ／Ｗであった。
（３）５０℃で撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ水溶液４６ｇと、エピクロロヒドリン３３ｇとをそれぞれ２５等分した量を、１５分置きにおよそ６時間かけて添加した。
（４）添加終了後、温度５０℃で１６時間反応させた。
（５）温度４０℃以下に冷却した後、酢酸１４ｇを加え中和した。
（６）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、目的の多孔性セルロースゲルＭ９７ｇを得た。
【００９９】
（比較例８）
（１）試験例１で得られた球状セルロース粒子１００ｇを、１３２ｇの純水に６３ｇのＮａ2ＳＯ4を溶解した液に加え撹拌した。温度を５０℃にして２時間撹拌を継続した。
（２）次に、４５重量％のＮａＯＨ水溶液１０ｇとＮａＢＨ4０．６ｇとを加え撹拌した。初期アルカリ濃度［ＮａＯＨ］は２％Ｗ／Ｗであった。
（３）５０℃で撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ水溶液４１ｇと、エピクロロヒドリン３３ｇとをそれぞれ２５等分した量を、１５分置きにおよそ６時間かけて添加した。
（４）添加終了後、温度５０℃で１６時間反応させた。
（５）温度４０℃以下に冷却した後、酢酸１４ｇを加え中和した。
（６）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、目的の多孔性セルロースゲル１０１ｇを得た。
【０１００】
２．多孔性セルロースゲルの圧力と線速度の関係
実施例１と同様にして実施例３−１及び比較例８で得られた多孔性セルロースゲルの圧力と線速度の関係を求めた。結果を図３に示した。図３では、比較のため、初期アルカリ濃度が異なること以外は実施例３−１と同じ方法で製造した実施例１−１で得られた多孔性セルロースゲル、試験例１で得られた球状セルロース粒子及びＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製「ＭａｂＳｅｌｅｃｔ」の結果も示した。図３に示されるように、初期アルカリ濃度１重量％以下で非常に良好な線速度が得られた。
【０１０１】
なお、実施例３−１、比較例８及び実施例１−１における初期アルカリ濃度を表３にまとめた。
【表３】
0005504596.tif 000004
【実施例４】
【０１０２】
実施例４では、反応時に共存させる硫酸ナトリウムの影響について調査した。
【０１０３】
１．多孔性セルロースゲルの製造
硫酸ナトリウムのセルロースモノマーに対するモル比を変えたこと以外は同様にして多孔性セルロースゲルを製造した。
【０１０４】
（実施例４−１）多孔性セルロースゲルＮの製造
（１）試験例１で得られた球状セルロース粒子１００ｇを、１３２ｇの純水に５１ｇのＮａ2ＳＯ4を溶解した液に加え撹拌した。温度を５０℃にして２時間撹拌を継続した。
（２）次に、４５重量％のＮａＯＨ水溶液３．５ｇとＮａＢＨ4０．６ｇとを加え撹拌した。初期アルカリ濃度［ＮａＯＨ］は０．６９％Ｗ／Ｗであった。
（３）５０℃で撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ水溶液４８ｇと、エピクロロヒドリン３３ｇとをそれぞれ２５等分した量を、１５分置きにおよそ６時間かけて添加した。
（４）添加終了後、温度５０℃で１６時間反応させた。
（５）温度４０℃以下に冷却した後、酢酸１４ｇを加え中和した。
（６）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、目的の多孔性セルロースゲルＮ１０４ｇを得た。
【０１０５】
（実施例４−２）多孔性セルロースゲルＯの製造
（１）試験例１で得られた球状セルロース粒子１００ｇを、１３２ｇの純水に８５ｇのＮａ2ＳＯ4を溶解した液に加え撹拌した。温度を５０℃にして２時間撹拌を継続した。
（２）次に、４５重量％のＮａＯＨ水溶液３．５ｇとＮａＢＨ4０．６ｇとを加え撹拌した。初期アルカリ濃度［ＮａＯＨ］は０．６９％Ｗ／Ｗであった。
（３）５０℃で撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ水溶液４８ｇと、エピクロロヒドリン３３ｇとをそれぞれ２５等分した量を、１５分置きにおよそ６時間かけて添加した。
（４）添加終了後、温度５０℃で１６時間反応させた。
（５）温度４０℃以下に冷却した後、酢酸１４ｇを加え中和した。
（６）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、目的の多孔性セルロースゲルＯ８８ｇを得た。
【０１０６】
（比較例９）
（１）試験例１で得られた球状セルロース粒子１００ｇを、１３２ｇの純水に３４ｇのＮａ2ＳＯ4を溶解した液に加え撹拌した。温度を５０℃にして２時間撹拌を継続した。
（２）次に、４５重量％のＮａＯＨ水溶液３．５ｇとＮａＢＨ4０．６ｇとを加え撹拌した。初期アルカリ濃度［ＮａＯＨ］は０．６９％Ｗ／Ｗであった。
（３）５０℃で撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ水溶液４８ｇと、エピクロロヒドリン３３ｇとをそれぞれ２５等分した量を、１５分置きにおよそ６時間かけて添加した。
（４）添加終了後、温度５０℃で１６時間反応させた。
（５）温度４０℃以下に冷却した後、酢酸１４ｇを加え中和した。
（６）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、目的の多孔性セルロースゲル１０９ｇを得た。
【０１０７】
２．多孔性セルロースゲルの圧力と線速度の関係
実施例１と同様にして実施例４−１、４−２及び比較例９で得られた多孔性セルロースゲルの圧力と線速度の関係を求めた。結果を図４に示した。図４では、硫酸ナトリウム量が異なること以外は同じ方法で製造した、実施例１−１で得られた多孔性セルロースゲル及び試験例１で得られた球状セルロースの結果も示した。
【０１０８】
図４のとおり、硫酸化ナトリウムはセルロースのモノマーのモル比の６倍以上で良好な線速度が得られた。
【０１０９】
なお、実施例４−１、４−２及び比較例９におけるセルロースモノマーに対する硫酸化ナトリウムのモル比を表４に示した。
【表４】
0005504596.tif 000005
【実施例５】
【０１１０】
実施例５では、架橋処理を繰り返し行った場合に多孔性セルロースゲルの耐流速性がどのように変化するのかについて調査した。
【０１１１】
１．多孔性セルロースゲルの製造
比較例６で得られた多孔性セルロースゲルをさらに同じ方法で架橋処理を繰り返し行った。
【０１１２】
（実施例５−１）多孔性セルロースゲルＰの製造
比較例６で得られた多孔性セルロースゲル１００ｇを比較例６と同様の方法で再度架橋処理を行い、同様の方法でゲルを回収し、純水で濾過洗浄して、目的の多孔性セルロースＰを得た。
【０１１３】
（実施例５−２）多孔性セルロースゲルＱの製造
実施例５−１で得られた多孔性セルロースゲル１００ｇを実施例１−１と同様の方法で再度架橋処理を行い、同様の方法でゲルを回収し、純水で濾過洗浄して、目的の多孔性セルロースＱを得た。
【０１１４】
（実施例５−３）多孔性セルロースゲルＲの製造
（１）試験例１で得られた球状セルロース粒子１００ｇを、１３２ｇの純水に６３ｇのＮａ2ＳＯ4を溶解した液に加え撹拌した。温度を５０℃にして２時間撹拌を継続した。
（２）次に、４５重量％のＮａＯＨ水溶液３．５ｇとＮａＢＨ4０．６ｇとを加え撹拌した。初期アルカリ濃度［ＮａＯＨ］は０．６９％Ｗ／Ｗであった。
（３）５０℃で撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ水溶液２４ｇと、エピクロロヒドリン１６ｇとをそれぞれ２５等分した量を、１５分置きにおよそ６時間かけて添加した。
（４）添加終了後、温度５０℃で１６時間反応させた。
（５）温度４０℃以下に冷却した後、酢酸９ｇを加え中和した。
（６）中和後、５０℃まで昇温した。
（７）５０℃で撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ水溶液２４ｇと、エピクロロヒドリン１６ｇとをそれぞれ２５等分した量を、１５分置きにおよそ６時間かけて添加した。
（８）添加終了後、温度５０℃で１６時間反応させた。
（９）温度４０℃以下に冷却した後、酢酸９ｇを加え中和した。
（１０）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、目的の多孔性セルロースゲルＲ１０３ｇを得た。
【０１１５】
２．多孔性セルロースゲルの圧力と線速度の関係
実施例１と同様にして実施例５−１〜５−３で得られた多孔性セルロースゲルの圧力と線速度の関係を求め、試験例１で得られた球状セルロースの結果と比較した。結果を図５に示した。
【０１１６】
図５から明らかなように、架橋処理を繰り返し行うことにより、多孔性セルロースゲルの線速度が顕著に向上することがわかった。
【０１１７】
なお、実施例５−１〜５−２における架橋剤の使用量及びその合計量と、実施例５−３の連続した２回の架橋反応に用いた架橋剤の使用量及びその合計量を表５に示した。
【表５】
0005504596.tif 000006
【実施例６】
【０１１８】
実施例６では、反応温度を変えた場合に多孔性セルロースゲルの耐流速性がどのように変化するのかについて調査した。
【０１１９】
１．多孔性セルロースゲルの製造
反応温度を４０℃に変えたこと以外は同様にして実施例１−１と同様にして多孔性セルロースゲルを製造した。
【０１２０】
（実施例６−１）多孔性セルロースゲルＳの製造
（１）試験例１で得られた球状セルロース粒子１００ｇを、１３２ｇの純水に６３ｇのＮａ2ＳＯ4を溶解した液に加え撹拌した。温度を４０℃にして２時間撹拌を継続した。
（２）次に、４５重量％のＮａＯＨ水溶液３．５ｇとＮａＢＨ4０．６ｇとを加え撹拌した。初期アルカリ濃度［ＮａＯＨ］は０．６９％Ｗ／Ｗであった。
（３）４０℃で撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ水溶液４８ｇと、エピクロロヒドリン（ＥＣＨ）３３ｇとをそれぞれ２５等分した量を、１５分置きにおよそ６時間かけて添加した。
（４）添加終了後、温度４０℃で１６時間反応させた。
（５）反応終了後、酢酸１４ｇを加え中和した。
（６）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、目的の多孔性セルロースゲルＳ１０７ｇを得た。
【０１２１】
２．多孔性セルロースゲルの圧力と線速度の関係
実施例１と同様にして実施例６−１で得られた多孔性セルロースゲルの圧力と線速度の関係を求めた。結果を図６に示した。図６では、比較のため、反応温度が異なること以外は実施例６−１と同じ方法で製造した、実施例１−１で得られた多孔性セルロースゲルの結果も示した。
【０１２２】
図６に示されるように、反応温度が４０℃であっても、５０℃であっても、多孔性セルロースゲルの流速特性に変化は無かった。
【０１２３】
実施例１〜６で得られた多孔性セルロースゲルの圧力０．４ＭＰａにおける線速度、初期ゲルベッド高さ１ｃｍ当たりの線速度、最大圧力、最大線速度、平均粒子径及び初期ゲルベッド高さ１ｃｍ当たりの最大線速度を表６にまとめた。なお、平均粒子径の測定方法は、以下の方法で行った。
まず、顕微鏡用スチールシートゲージＮＨＷ−０６（株式会社ナディック）の１ｍｍの目盛りをマイクロスコープＶＨ−８０００Ｃ（株式会社キーエンス）を用い、２５０倍率で撮影した。スライドガラス上に均一に分散させたサンプル粒子をマイクロスコープＶＨ−８０００Ｃ（株式会社キーエンス）を用い、２５０倍率で撮影した。撮影したゲージの写真をプリントアウトし、ゲージ１ｍｍの長さを定規で測定した。撮影したサンプルの写真をプリントアウトし、粒子の直径を定規で測定し、ゲージより算出した係数を用いて実際の粒子直径を算出した。１００個以上の粒子を測定して、その平均を算出した値を平均粒子径とした。
【表６】
0005504596.tif 000007
【０１２４】
表６のとおり、本発明の多孔性セルロースゲルは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔと同等以上の耐流速性を示すことがわかった。
【０１２５】
また、実施例１−１及び実施例５−１の方法を１５倍の仕込みで製造して得られた多孔性セルロースゲルを、内径９ｃｍのアクリル製カラム（日本ミリポア株式会社製、カタログ番号８７０１２０１）[販売中止]に高さ２０ｃｍまで充填した場合、２０℃の水を流したときの圧力に対する線速度の関係は図７のとおりになった。また、比較のために球状セルロース粒子と比較例５の多孔性セルロースゲルについても、必要量を合成し同様に測定した。図７のとおり、内径が９ｃｍになっても、本発明の多孔性セルロースゲルは良好な線速度を示し、カラムが大型になっても流速特定が維持されていることがわかる。
【実施例７】
【０１２６】
実施例７では、上記実施例及び比較例で得られた多孔性セルロースゲルの排除限界分子量を測定した。測定は次のようにして行った。
【０１２７】
［排除限界分子量］
内径１１ｍｍのカラムにゲルをおよそ２０ｃｍの高さに充填し、純水を通液して平衡化しゲルベッドを安定化させた。
ゲルを充填したカラムを、株式会社島津製作所製のＨＰＬＣシステム（ＣＬＡＳＳ−ＶＰ）にセットして純水を流し平衡化した。なお、検出器として示差屈折計（ＲＩ）を使用した。
流速０．４ｍＬ／分で、下記に示した分子量標準１０μＬを注入してそれぞれの溶出時間を調べ、Ｋａｖ値を計算した。分子量標準試薬は、表７に示した濃度で純水に溶解した。Ｄｅｘｔｒａｎ２０００を排除体積（Ｖｏ）を求めるために使用した。その他の分子量標準品はエチレングリコールの重合体であるポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコールを用いた。それぞれの分子量は表７に記載した。
【表７】
0005504596.tif 000008
【０１２８】
Ｋａｖ値の計算は、下記の式によって行った。
Ｋａｖ  ＝  （Ｖｅ  −  Ｖｏ）／（Ｖｔ  −  Ｖｏ）
ここで、ＶｏはＤｅｘｔｒａｎ２０００の溶出体積、Ｖｔはカラムベッドの体積（カラム断面積×ゲル高さ）、Ｖｅは分子量標準の溶出体積である。
【０１２９】
排除限界分子量の算出
図８に分子量標準の分子量値の対数をＸ軸、Ｋａｖ値をＹ軸にプロットして、高分子量側で直線領域を示すデータポイントについて、最小二乗法で一次式の当てはめを行い、下記の式を得た。
Ｋａｖ  ＝  ａ・Ｌｏｇ  ＭＷ  ＋  ｂ
【０１３０】
排除限界分子量は、Ｘ軸と上記一次式の直線が交わる点であるので、Ｋａｖ＝０の時のＬｏｇ  ＭＷ値であり、下記の式から求められる。
排除限界分子量の対数値  ＝  ｂ／−ａ
【０１３１】
分子量標準の分子量値の対数をＸ軸、Ｋａｖ値をＹ軸にプロットしたグラフを図８に示した。また、上記の式から得られた排除限界分子量を表８に示した。
【表８】
0005504596.tif 000009
【０１３２】
表８のとおり、本発明の多孔性セルロースゲルは、同等の線速度を示すＭａｂ  Ｓｅｌｅｃｔに比べて高い排除限界分子量を有していた。
【実施例８】
【０１３３】
実施例８では、上記実施例及び比較例の膨潤度と再膨潤率について調べた。測定は次のようにして行った。
【０１３４】
[膨潤度の測定]
およそ１０ｇのゲルを純水で濾過洗浄し、純水に懸濁させおよそ３０分間、減圧脱気した。この懸濁液をメスシリンダーに入れて、一日２回程度のタッピングを行いつつ、ゲルの沈降体積が変わらなくまで、約５〜７日静置させ、そのゲルの沈降体積を測定する。沈降体積測定後、ゲルの全量をビーカーに移し取り、８０℃の恒温槽中で１日〜２日乾燥させて、ゲルの乾燥重量を測定した。
膨潤度（ｍＬ／ｇ）  ＝  ゲルの容積（ｍＬ）÷ゲルの乾燥重量（ｇ）
【０１３５】
[再膨潤率の測定]
ゲルの再膨潤率は、膨潤度測定に用いた乾燥ゲルを再び、水に膨潤させ、その容積を膨潤度の測定方法と同様にして測定し、その測定値を用いて下記式で求めることができる。
再膨潤率（％）  ＝  乾燥後再膨潤させたゲルの容積÷乾燥前のゲルの容積×１００
なお、膨潤度及び再膨潤率の測定において、ゲル容積の測定には同重量の乾燥ゲルを使用した。結果を表９に示した。
【表９】
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表９のとおり、本発明の多孔性セルロースゲルは１００％に近い再膨潤率を示した。
【実施例９】
【０１３６】
実施例９では、多孔性セルロースゲルに硫酸基を導入した硫酸化多孔性セルロースゲルを製造した。
【０１３７】
１．硫酸化多孔性セルロースゲルの製造
（実施例９−１）硫酸化多孔性セルロースゲルＡの製造
（１）実施例２−３で得られた多孔性セルロースゲルＨにメタノールを加えて攪拌した後、濾過してゲルを回収した。この洗浄操作を６回行った。
（２）洗浄したゲルを乾燥機にて５０℃で減圧乾燥させた。
（３）ピリジン３００ｍＬを攪拌しながら１０℃以下まで冷却した後、これにクロロスルホン酸３．５ｇを滴下した。
（４）クロロスルホン酸を滴下終了後、１０℃以下で１時間反応させた。その後、この反応混合物を６５℃まで加熱した。
（５）反応混合物が６５℃に到達した後、（２）で得られた乾燥させたゲル１５ｇを投入し、攪拌しながら０．５時間反応させた。
（６）反応終了後、２０％ｗ／ｗＮａＯＨ水溶液を添加して中和した。
（７）得られた反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で中性になるまで洗浄し、目的の硫酸化多孔性セルロースゲルＡ１１８ｇを得た。
（８）下記に従って測定したリゾチームの吸着量は、硫酸化多孔性セルロースゲルＡ１ｍＬ当たり２８ｍｇであった。
【０１３８】
＜リゾチーム吸着量の測定＞
内径７ｍｍのカラムに、硫酸化多孔性セルロースゲルＡを２ｍＬ充填し、０．０１Ｍリン酸バッファー液及び０．１５ＭＮａＣｌ水溶液を用いて、ｐＨ７で平衡化させた。リゾチームの濃度が３．３３ｍｇ／ｍＬになるように、リゾチーム（生化学工業株式会社製）に０．０１Ｍリン酸バッファー及び０．１５ＭＮａＣｌ水溶液（ｐＨ７）を加え、溶解させた。濃度３．３３ｍｇ／ｍＬのリゾチーム溶液３０ｍＬをカラムに１時間循環させた。
循環終了後、カラムに吸着していないリゾチームを０．０１Ｍリン酸バッファー及び０．１５ＭＮａＣｌ水溶液（ｐＨ７）で洗い流した。
その後、カラムに吸着したリゾチームを０．０１Ｍリン酸バッファー及び０．６ＭＮａＣｌ水溶液（ｐＨ７）で溶出させ、溶出したリゾチーム量を吸光度法により求めた。リゾチームの吸着量は、下記の式により算出した。
リゾチーム吸着量＝溶出リゾチーム量（ｍｇ）
【０１３９】
（実施例９−２）硫酸化多孔性セルロースゲルＢの製造
クロロスルホン酸の使用量を５ｇに変更したことを除いては、実施例９−１と同様にして、硫酸化多孔性セルロースゲルＢを製造した。硫酸化多孔性セルロースゲルＢのリゾチーム吸着量は、硫酸化多孔性セルロースゲルＢ１ｍＬ当たり３８ｍｇであった。このように硫酸化剤であるクロロスルホン酸の使用量を変更することにより、リゾチーム吸着能を調整することができる。
【０１４０】
（比較例１０）
試験例１の球状セルロース粒子を実施例９−１と同様にして乾燥させたところ、該球状セルロース粒子は収縮したままで、その後の反応に用いることができるまでに再膨潤しなかった。
【０１４１】
２．硫酸化多孔性セルロースゲルの圧力と線速度の関係
実施例１と同様にして実施例９−１及び９−２で得られた硫酸化多孔性セルロースゲルの圧力と線速度の関係を求めた。結果を図９に示した。図９では、比較のため、原料として用いた多孔性セルロースゲルＨの結果も示した。
図９から明らかなとおり、多孔性セルロースゲルに比べて若干低下するが、硫酸化多孔性セルロースゲルは、依然として高い流速特性を維持していた。
【実施例１０】
【０１４２】
実施例１０では、多孔性セルロースゲルにスルホン酸基を導入したスルホン化多孔性セルロースゲルを製造した。
【０１４３】
１．スルホン化多孔性セルロースゲルの製造
（実施例１０−１）スルホン化多孔性セルロースゲルＡの製造
（１）実施例２−３で得られた多孔性セルロースゲルＨ１００ｇ、テトラデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド（日本油脂株式会社製）０．４９ｇ、水素化ホウ素ナトリウム（ＲＯＨＭ  ＡＮＤ  ＨＡＡＳ社製）０．０５ｇ及び２０％（ｗ／ｗ）の水酸化ナトリウム水溶液２１５．４ｇを、５００ｍＬのセパラフラスコに添加した後、２０℃に保温した。
（２）フラスコ内が２０℃になったら、直ちに１，４−ブタンスルトン（和光純薬社製）４１．３ｇを加え、フラスコ内を２０℃に維持したまま１６時間攪拌した。
（３）その後、約１時間をかけて５０℃まで昇温し、さらに４時間攪拌を続けた後、フラスコ内を４０℃以下に冷却した。液温が４０℃以下になったとき、酢酸７２．８ｇを液温が４０℃を超えないようにしながら加えた。
（４）酢酸を投入した後、反応混合物を直ちに濾過し、生成物をその後２００ｍＬの温水(３０℃)で５回洗浄し、さらに２００ｍＬの０．５Ｎ塩酸にて１回洗浄した。
（５）その後、濾液が中性になるまで純水で洗浄し、２００ｍＬの０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液にて１回洗浄し、再び濾液が中性になるまで純水で洗浄し、目的のスルホン化多孔性セルロースゲルＡを得た。
【０１４４】
ＩＣＰ分析（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｐｌａｓｍａ：誘導結合プラズマ）によるスルホン化多孔性セルロースゲルＡの乾燥ゲル中の硫黄含量は４％であり、下記の方法によって求めた免疫グロブリンの吸着量は６６．９ｍｇ/ｍＬ湿ゲルであった。さらに、実施例1と同様にして、圧力と線速度の関係を求めたところ、圧力０．３ＭＰａの時の線速度は１２００ｃｍ/ｈであった。
【０１４５】
＜免疫グロブリンの測定法＞
内径７ｍｍのカラムにゲルを２ｍＬ充填し０．０１Ｍ酢酸バッファー及び０．０５Ｍ ＮａＣｌ水溶液を用いて、ｐＨ４．３で平衡化した。免疫グロブリンの濃度が１０ｍｇ／ｍＬになるように、ウシガンマグロブリン（ｂｏｖｉｎｅ  ｇａｍｍａ  ｇｌｏｂｕｌｉｎ）（Ｃｅｌｌｉａｎｃｅ製）に０．０１Ｍ酢酸バッファー及び０．０５ＭＮａＣｌ水溶液（ｐＨ４．３）を加え、溶解させた。
調製したウシガンマグロブリン溶液１０ｍＬをカラムに流した。流し終わった後、更にカラムを１５ｍＬの０．０１Ｍ酢酸バッファー及び０．０５ＭＮａＣｌ水溶液（ｐＨ４．３）で洗浄し、その液を素通し液とした。免疫グロブリンの吸着量は、下記の式により算出した。
免疫グロブリン吸着量＝１００ｍｇ−素通し液中のウシガンマグロブリン量
【０１４６】
（実施例１０−２）スルホン化多孔性セルロースゲルＢの製造
スルホン化剤を１，４−ブタンスルトンから３７．０ｇの１，３−プロパンスルトン（和光純薬社製）に変更したこと以外は、実施例１０−１と同様にしてスルホン化多孔性セルロースゲルＢを製造した。
得られたスルホン化多孔性セルロースゲルＢの乾燥ゲル中の硫黄含量は１．７％であり、免疫グロブリンの吸着量は４３．７ｍｇ/ｍＬ湿ゲル、であった。また、圧力０．３ＭＰａの時の線速は１４３０ｃｍ/ｈであった。
【０１４７】
（実施例１０−３）スルホン化多孔性セルロースゲルＣの製造
（１）５００ｍＬのセパラフラスコ内に、実施例２−３で得られた多孔性セルロースゲルＨ１００ｇ及び純水８０ｍＬを加え、フラスコ内を３０℃に保温し、３０分間攪拌した。
（２）その後、７％（ｗ／ｗ）の水酸化ナトリウム水溶液１４４．７ｇを加え、フラスコ内を３０℃に保温したまま１時間攪拌した。
（３）次に、フラスコ内に３−ブロモプロパンスルホン酸ナトリウム塩（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）１５３．５ｇを投入し、さらに３０℃にて２時間攪拌した。
（４）その後、反応混合物を濾過し、純水で濾液が中性になるまで洗浄し、目的のスルホン化多孔性セルロースゲルＣを得た。
【０１４８】
得られたスルホン化多孔性セルロースゲルＣの乾燥ゲル中の硫黄含量は０．８％であり、免疫グロブリンの吸着量は３９．３ｍｇ/ｍｌ湿ゲル、であった。また、圧力０．３ＭＰａの時の線速は３３４０ｃｍ/ｈであった。
【０１４９】
（比較例１１）
試験例１の球状セルロース粒子を実施例１０−１と同様に１，４−ブタンスルトン（和光純薬社製）を用いてスルホン化したところ、球状セルロース粒子は粒子形状を留めず、クロマトグラフィー用充填剤としての使用できないものであった。
【０１５０】
以上のように、本発明の多孔性セルロースゲルは、硫酸基またはスルホン酸基などの反応性官能基導入のための反応に耐えうる強度を有しているため、目的に応じた反応性官能基を導入することが可能であり、またその導入量も適宜調整可能である。したがって、本発明によれば、目的の用途に応じた機能を有するクロマトグラフィー用充填剤を提供することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１５１】
本発明の多孔性セルロースゲルは、各種のクロマトグラフィー用充填剤として好適に用いることができる。本発明の多孔性セルロースゲルを用いることにより、核酸やタンパク質などの高分子物質の生産効率が向上する。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】実施例１で得られた多孔性セルロースゲルの圧力と線速度の関係を示したグラフである。
【図２】実施例２で得られた多孔性セルロースゲルの圧力と線速度の関係を示したグラフである。
【図３】実施例３で得られた多孔性セルロースゲルの圧力と線速度の関係を示したグラフである。
【図４】実施例４で得られた多孔性セルロースゲルの圧力と線速度の関係を示したグラフである。
【図５】実施例５で得られた多孔性セルロースゲルの圧力と線速度の関係を示したグラフである。
【図６】実施例６で得られた多孔性セルロースゲルの圧力と線速度の関係を示したグラフである。
【図７】カラム内径を９ｃｍにした場合の多孔性セルロースゲルの圧力と線速度の関係を示したグラフである。
【図８】実施例１〜６で得られた多孔性セルロースゲルの分子量標準の分子量値の対数をＸ軸、Ｋａｖ値をＹ軸にプロットしたグラフである。
【図９】実施例９で得られた硫酸化多孔性セルロースゲルの圧力と線速度の関係を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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