(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
術後の癒着防止における使用のための、脱アセチル化したゲランからなるバイオマテリ
アルであって、脱アセチル化したゲランが、硫酸化ヒアルロン酸、または
Ａ）５〜６５％のエステル化の百分率を有するＨＡのエステル、
Ｂ）１〜１５％の内部エステル化の百分率を有するＨＡの内部エステル、
Ｃ）１〜５０％の過カルボキシル化の百分率を有するＨＡの過カルボキシ誘導体
から選択される、ヒアルロン酸の硫酸化ヒアルロン酸誘導体
と組み合わせられる、バイオマテリアル。
【請求項２】
術後の癒着が、術後の脊柱癒着である、請求項１に記載のバイオマテリアル。
【請求項３】
前記硫酸化ヒアルロン酸またはその硫酸化ヒアルロン酸誘導体が０．５〜３．５の硫酸
化の程度を有する、請求項１または２に記載のバイオマテリアル。
【請求項４】
前記硫酸化ヒアルロン酸またはその硫酸化ヒアルロン酸誘導体が３に等しい硫酸化の程
度を有する、請求項３に記載のバイオマテリアル。
【請求項５】
前記硫酸化ヒアルロン酸またはその硫酸化ヒアルロン酸誘導体が１０，０００〜１×１
０６Ｄａの範囲の分子量を有する、請求項４に記載のバイオマテリアル。
【請求項６】
前記硫酸化ヒアルロン酸またはその硫酸化ヒアルロン酸誘導体が１００，０００〜２５
０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する、請求項５に記載のバイオマテリアル。
【請求項７】
薬学的におよび／または生物学的に活性のある物質と組み合わせた、請求項１〜６のいずれか一項に記載のバイオマテリアル。
【請求項８】
スポンジ、ゲルまたはハイドロゲル、気泡、または粉末の形態で調製される、請求項１
〜７のいずれか一項に記載のバイオマテリアル。
【請求項９】
脱アセチル化したゲランと硫酸化ヒアルロン酸もしくはその硫酸化ヒアルロン酸誘導体
との重量比が２：１．５〜２：１の範囲にある、請求項１〜８のいずれか一項に記載のバイオマテリアル。
【請求項１０】
重量比が１．５：１〜２：１の範囲にある、請求項９に記載のバイオマテリアル。
【請求項１１】
重量比が２：１に等しい、請求項９または１０に記載のバイオマテリアル。
【請求項１２】
薬学的に許容され得る媒体および／または賦形剤と組み合わせた、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のバイオマテリアルを含有する薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腹部手術、骨盤手術、特に脊柱手術における術後癒着を防止するための非常に効果的なバリアーとして使用するための、硫酸化ヒアルロン酸とゲラン（他のポリマーと結合していなかったゲランも）との組み合わせからなる新たなバイオマテリアルに関する。
【背景技術】
【０００２】
術後癒着の形成は、腹部または骨盤の手術後の場合の最高７０〜９０％（Holmdahl L. et al., Eur J Surg 1997, 163(3):169-174）、および脊柱手術の場合の最高４０％（Einhaus SL et al., Spine 1997, 22(13):1440-1447）において生じる極めて一般的な合併症である。
【０００３】
機械的外傷、術後出血、虚血性および炎症性現象の惹起、起こりうる細菌感染などの多くの因子が、術後癒着の形成を決定しおよび／またはそれに影響を及ぼす。
【０００４】
手術外傷の結果として形成する漿液性滲出液は、迅速に再吸収されない場合、隣接する組織間の癒着形成の原因となるコラーゲン分子蓄積の結果として顕著な線維芽細胞の動員を決定しうる。
【０００５】
結果的に、術後癒着の形成は、炎症過程の直接的な結果であるように見える。
【０００６】
脊柱手術の分野において、硬膜外線維症の形成は、術後の主要リスクである。実際、椎弓切除術および／または椎間板切除術の後、線維性星状細胞（グリア特有の細胞）は、グリオーシス性瘢痕組織を生じ、グリオーシス性瘢痕組織の機能は、脊髄を覆う髄膜の最も外側であり線維性結合組織によって形成される硬膜マトリックスからの、ニューロン性物質の漏れを防止するものである。
【０００７】
このことは、損傷を受けた脊柱組織の治癒過程における正常な現象であるが、術後の炎症過程において、この全体的に弾力性のない癒着組織は、過剰に生じ、神経根および硬膜マトリックスの運動神経支配の過程に干渉し、隣接する組織および解剖学的構造を粉砕し、従って脊髄および四肢の正常な動きに疼痛を生じうる。
【０００８】
いずれかのその後の手術は、より複雑であり、より長期の入院およびあまり楽観的ではない予後を必要とするであろう。
【０００９】
上述の理由のため、術後癒着、特に硬膜外線維症の防止および／または阻害は、医学的および薬学的科学研究において主要な目標になってきた。
【００１０】
効果的な抗癒着バリアーの不可欠な特徴は、生分解性および生体適合性、毒性が低いかまたは全くないこと、すぐれた接着性および取り扱い、損傷を受けた組織の自然治癒過程に干渉しないこと、しかしとりわけ、腹部または脊柱の手術に供した隣接する組織間に形成しうる癒着を防止する能力である。
【００１１】
テレフタル酸ポリエチレン（Ｄａｃｒｏｎ（登録商標））、メタクリラート、ポリ乳酸（Klopp LS et al., Neurosurg Focus 2004, 16(3):E2）、ポリテトラフルオロエチレン（Ｇｏｒｅｔｅｘ（登録商標））（Llado A et al., Eur Spine 1999, 8(2):144-150）の合成膜または半合成膜などの可能性のある新たな抗癒着物質として、多くの異なる材料が（インビトロおよびインビボの両方で）テストされてきた。
【００１２】
他の実験は、ステロイド剤および非ステロイド剤で灌注する効果を研究したが、これらの材料は、臨床上の実践において効果的かつ安全に使用できる抗癒着物質について必要とされる（上述の）必要条件の全ては満たしていない。
【００１３】
米国特許第５，０１７，２２９号、第５，５２７，８９３号、および第５，７６０，２００号は、ヒアルロン酸（ＨＡ）およびカルボキシメチルセルロースなどの二つの化学的に結合したポリマーからなる抗癒着膜（Ｓｅｐｒａｆｉｌｍ（登録商標））の新しいタイプを開示する。しかしながら、新しいバリアーの効能は、前記二つのポリマー間の化学的結合の形成に必要なカルボジイミドなどの活性化剤の使用と連結した毒性問題によって低減される。
【００１４】
米国特許第５，６０５，９３８号は、ブタゼラチンおよび硫酸デキストランで構成される吸収性で押し出し可能なゲルからなる抗癒着医用デバイス（ＡＤＣＯＮ（登録商標）−Ｌ）を記載する。前記ＡＤＣＯＮ（登録商標）−Ｌゲルは、術後癒着の防止に非常に効果的であることを立証し、この理由のため、以下に記載される動物実験においてコントロールデバイスとして本出願人によって使用された。
【００１５】
逆に、欧州特許第１３２３４３６号は、１：（０．２〜５）の重量比のカルボキシメチルセルロースとゲランとの組み合わせから派生する新たな抗癒着バリアーを開示する。この場合のセルロース誘導体は、癒着防止過程における活性剤を表すが、本発明の主題である新たな抗癒着バリアーにおける活性剤である硫酸化ヒアルロン酸（ＳＨＡ）（欧州特許第０７０２６９９Ｂ１号）とは異なり、抗炎症性特性および／または抗菌特性を全く持たないことが公知である。
【００１６】
抗癒着バリアーとしてのその特性を研究する、化学的に修飾されていないヒアルロン酸に関する研究も実施されている（米国特許第４，１４１，９７３号）が、ポリマーが簡単に水和され、そして生分解されるため、その場での残留時間は、癒着の完全な防止を可能にするにはあまりにも短すぎる。
【００１７】
この理由のため、ヒアルロン酸は、損傷部位におけるポリマーの残余時間を著しく延長することによって腹部癒着と骨盤癒着の両者を防止する（ＡＣＰ（登録商標）ゲルに基づいたＨｙａｌｏｂａｒｒｉｅｒ（登録商標）ゲル）上で効果的になる分子（欧州特許第０３４１７４５Ｂ１号）の内側で、エステル結合を形成するよう修飾されてきた（欧州特許第０８５００７４号）。
【００１８】
ヒアルロン酸のエステル（欧州特許第０２１６４５３Ｂ１号）、特にそのベンジルエステル（Ｈｙａｆｆ（登録商標）−１１）は、同様に術後癒着を防止する上で効果的であることを立証し、特に不織フェルトなどの固体構造を作製するのに使用される場合そうである（欧州特許第０６１８８１７Ｂ１号）。
【００１９】
しかしながら、脊柱手術における修飾されたヒアルロン酸の有効性は、まだテストされていない。
【００２０】
本発明は、硫酸化ヒアルロン酸とゲランとの組み合わせから派生する新たなバイオマテリアルに関し、同様に、前記ゲランポリマーによってのみ形成される新たなバイオマテリアルにも関する。本発明のバイオマテリアルは、腹部と骨盤の両者において術後癒着を防止する上で非常に効果的であることを立証し、特に椎弓切除術および椎間板切除術などの脊柱手術後に形成する癒着の全体的な防止において特に効果的であることを立証した。
【００２１】
発明の詳述
本発明は、腹部および骨盤の両者の術後癒着、および特に脊柱手術後に形成する癒着の完全な防止のための新たな医用デバイスとしての、硫酸化ヒアルロン酸またはヒアルロン酸の他の硫酸化誘導体とゲランとの組み合わせからなる新たなバイオマテリアル、同様に、ゲラン単独によって形成される新たなバイオマテリアルに関する。
【００２２】
実際、本発明の目的であるバイオマテリアルは、椎弓切除術／椎間板切除術のための手術後に、またはさまざまな種類の脊柱手術の結果として頻繁に形成する癒着を完全に防止する上で効果的であることを立証した。
【００２３】
硫酸化ヒアルロン酸は、癒着を防止する上で基本的な役割を担っていることが見出されてきた。実際、多糖類のカルボキシ基の存在はその硫酸化基とともに、線維芽細胞に関して強い静電反発力を決定し、従って、損傷を受けた脊柱組織の細胞浸潤を阻害する。一方、ゲランは、治療された組織による硫酸化ヒアルロン酸の吸収を制御できる構造マトリックスとして作用しながら、抗癒着バリアーとしての役割を果たすことを効果的に行う限り初期濃度を維持する（好ましくはゲルの形態にある）バイオマテリアルのための支持体として作用する。
【００２４】
硫酸化ヒアルロン酸、関連した調製過程、および抗癒着デバイスとしてのその使用は、欧州特許第０７０２６９９Ｂ１号に記載され請求される。しかしながら、ＳＨＡの化学的−物理的特徴は、該ポリマーのみによって構成されるゲルが、化学的に修飾されていないＨＡのそれに匹敵する粘度を有することのようである。実際、ＳＨＡは、硫酸化されていない多糖類よりも容易に水和され、同一の生分解性を有することを立証した。これらの理由のため、ＳＨＡ自体は、術後癒着の防止のためのバイオマテリアルとして使用できず、その理由は、その場でのその残留時間が、癒着の完全な防止に総じて不十分であるためである。
【００２５】
一方、治療されていないコントロールとＡＤＣＯＮ（登録商標）−Ｌデバイス（臨床の実際において使用される抗癒着長ズボン）の両者に関して、硬膜マトリックス髄膜の周りの線維状組織の形成が治療されていないコントロールのそれと比較してごくわずかであり、結果的に、硬膜マトリックスに対する瘢痕組織の癒着も圧迫もないことを、動物に関して実施された実験が示したため、硫酸化ヒアルロン酸とゲランとの組み合わせは最適であることを立証した。
【００２６】
欧州特許第０７０２６９９Ｂ１号は、新たな医用デバイスの調製のために、特異的抗凝集特性および抗血栓特性により（種々の程度に硫酸化し得る）硫酸化ヒアルロン酸の分子の形成にいたる多糖類の硫酸化の過程によって得られる新たなヒアルロン酸誘導体を開示する。
【００２７】
さらに、本出願人は、本発明のバイオマテリアルにおいてヒアルロン酸へ化学的に結合する硫酸基の存在が正常な凝血過程に干渉しないことを示した。
【００２８】
さらに、本発明のバイオマテリアルは、抗炎症性特性及び抗菌特性も有し、従って、効果的な抗癒着剤に必要な特徴を全て有することを立証する。
【００２９】
ゲランは、好気的発酵によってスフィンゴモナスエロデア（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｅｌｏｄｅａ）微生物から産生される微生物起源のエキソポリサッカライドである。ネイティブのゲランは、２：１：１のモル比でグルコース、グルクロン酸およびラムノースからなる反復する四糖類単位の連結から生じるヘテログリカンである。
【００３０】
（塩基性加水分解による）ゲランの脱アシル化は、本発明においてそのまま使用されるか、硫酸化ヒアルロン酸またはその硫酸化誘導体との組み合わせで使用される、商品Ｇｅｌｒｉｔｅ（登録商標）を生じる。
【００３１】
その自然な状態において、ゲランは、弱いが弾性があり柔軟性のあるゲルを形成する一方、脱アセチル化したゲランは、同一条件においてコンパクトなゲルを形成する。
【００３２】
ゲランは、食料品、バイオテクノロジー、医薬品の分野において使用できる。食品においては増粘剤および安定剤として使用され、植物バイオテクノロジーにおいては細菌培養物を生育させるための基質（固体）として使用される。医薬品産業においては、ゲランは、陽イオンの存在においてゲルを形成するその能力により、徐放性マイクロカプセルの形成に使用される。
【００３３】
ヒアルロン酸は、Ｄ−グルクロン酸およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの交互の残基で構成されるヘテロ多糖類である。ヒアルロン酸は、それが得られる原料およびそれを調製するのに使用される方法に従って、５０，０００〜１３×１０６ダルトン（Ｄａ）で変動する分子量を有する直鎖ポリマーである。ヒアルロン酸は、本来細胞周囲のゲルに、（主要成分の１つである）脊椎動物の結合組織の必要な物質中に、関節の滑液中に、硝子体体液および臍帯中に存在する。
【００３４】
ＨＡは、生物体において、特に皮膚、腱、筋肉、および軟骨などの多くの組織の細胞のための機械的支持体として重要な役割を果たす。さらに、ＨＡは、細胞外マトリックスの主要成分であるため、組織の水和、関節の潤滑、細胞遊走、および分化などの他の生物学的機能において役割を果たすかおよび／または貢献する。
【００３５】
ＨＡの生物癒着性／粘膜癒着性特性および組織適合性特性のため、ヒアルロン酸およびその塩（特に、おそらく適切に誘導体化されるナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、およびカルシウム塩）は、薬物の徐放性のためのおよび補綴などの医用デバイスの調製のための両者のシステムとして提唱されてきた。
【００３６】
本発明において使用されるＨＡは、任意の原料に由来することができ、例えば、ＨＡは、発酵（欧州特許第０７１６６８８Ｂ１号）によって、または技術的手段によって得られる雄鶏のとさか（欧州特許第０１３８５７２Ｂ１号）から抽出され得、ＨＡは、４００〜３×１０６Ｄａの、特に１０，０００〜１×１０６Ｄａ、より特別には１００，０００〜２５０，０００Ｄａの範囲の分子量を有し得る。
【００３７】
ヒアルロン酸とその誘導体の硫酸化のための過程は、当業者に公知の方法で実施できるが、好ましくは欧州特許第０７０２６９９Ｂ１号に開示されているとおりに実施できる。
【００３８】
硫酸化過程において使用できるＨＡ誘導体は以下に列挙される。
１．  ５０〜７３０ＫＤａの分子量を有する（欧州特許第０１３８５７２Ｂ１号）か７５０〜１２３０ＫＤａの高分子量を有し（欧州特許第５３５２００Ｂ１号）、好ましくは１００〜２５０ＫＤａの分子量を有する有機塩基および／または無機塩基で塩化したＨＡ。
２．  Ｈｙａｆｆ（登録商標）：脂肪族、アラリファティックな（ａｒａｌｉｐｈａｔｉｃ）、環状脂肪族、芳香族、環状、および複素環式シリーズのアルコールを有するＨＡのエステル（欧州特許第２１６４５３Ｂ１号）；その後に硫酸化を受けるヒアルロン酸のエステル化の百分率は、結果として生じる生成物が水溶性でなければならないため、使用されるアルコールのタイプおよび長さに従って５〜６５％で変動しうる。
３．  ＡＣＰ（登録商標）：ＨＡの内部エステル（欧州特許第０３４１７４５Ｂ１号）；その後に硫酸化を受けるヒアルロン酸の内部エステル化の割合は、結果として生じる生成物が水溶性でなければならないため、１〜１５％で変動しうる。
４．  Ｈｙｏｘｘ（登録商標）：Ｎ−アセチル−グリコサミン画分の一次ヒドロキシルの酸化によって得られる過カルボキシル化ＨＡ誘導体であり、その後に硫酸化を受けるヒアルロン酸の過カルボキシル化の割合は、１〜５０％で変動しうる。
【００３９】
ＨＡの遊離カルボキシ基は全て、有機塩基および／または無機塩基で塩化されうる。
【００４０】
上述に列挙されたヒアルロン酸および／またはその誘導体の硫酸化の程度は、繰り返し単位当たりの硫酸化された基の数の点において、０．５〜３．５で変動し得、好ましくは３であるべきである。
【００４１】
多くの薬理学的および／または生物学的に活性のある物質は、その抗癒着効能を増強させるため、本発明のバイオマテリアルの主要成分と場合により結合され得る。特に、インターロイキン（ＩＬ）−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１、ＴＮＦ、およびインターフェロンなどのタンパク質阻害剤として分類される抗生物質および薬物である。
【００４２】
本発明の抗癒着デバイスは、さまざまな形態で作製でき、スポンジ、ゲルもしくはハイドロゲル、気泡、または粉末であり、好ましい形態はゲルもしくはハイドロゲルである。
【００４３】
ゲラン（Ｇ）とＳＨＡとの（またはＧとＨＡの硫酸化誘導体との）重量比は、１．５：１〜２：１、最終的には２：１．５で変動し得、２：１の重量比が好ましい。あるいは、上述のように、ゲランは、新たな抗癒着バイオマテリアルとして、好ましくはゲルもしくはハイドロゲルの形態でそれ自体使用されうる。
【００４４】
以下において、本発明の抗癒着バイオマテリアルの調製のいくつかの実施例が、インビボ実験からの結果とともに報告される。
【００４５】
実施例１
２：１の重量比で硫酸化Ｈａと組み合わせたゲランからなるハイドロゲルの形態のバイオマテリアルの調製。
【００４６】
ＨＡを、３の硫酸化の程度で、欧州特許第０７０２６９９Ｂ１号に従って硫酸化する。
【００４７】
加熱し（７５〜８５℃）、０．９％のＮａＣｌ５０ｍｌ中にゲラン１ｇを溶解することによって、脱アセチル化したゲラン（Ｇｅｌｒｉｔｅ（登録商標））２０ｍｇ／ｍｌの溶液を調製する。一度可溶化が完了すると、硫酸化ＨＡ５００ｍｇを添加し、完全に溶解するよう放置する。次に、後で蒸留滅菌できるハイドロゲルを得るまで、混合物を室温に冷却する。
【００４８】
実施例２
１．５：１の重量比で硫酸化ＨＡと組み合わせたゲランからなるハイドロゲルの形態のバイオマテリアルの調製。
【００４９】
ゲラン７５０ｍｇおよび硫酸化ＨＡ５００ｍｇを可溶化し、実施例１のように進行させる。
【００５０】
実施例３
２５％エステル化、２：１の重量比で硫酸化ＨＡベンジルエステルと組み合わせたゲランからなるハイドロゲルの形態のバイオマテリアルの調製。
【００５１】
ゲラン溶液を実施例１に記載のとおり調製する。次に、硫酸化ＨＡベンジルエステル５００ｍｇを添加し、可溶化が完了するまで放置する。次に、後で蒸留滅菌できるハイドロゲルを付与する室温まで冷却するよう放置する。
【００５２】
実施例４
２：１の重量比で硫酸化ＨＡと組み合わせたゲランからなる粉末の形態のバイオマテリアルの調製。
【００５３】
実施例１のように進行させるが、硫酸化ＨＡの可溶化後、まだ温かい溶液を、４℃へ冷却した無水エタノールへとゆっくり注ぐ。次に、結果として生じる沈殿をろ過により溶媒から分離する。結果として生じる粉末を高真空システムにより乾燥させる。
【００５４】
実施例５
２：１の重量比で硫酸化ＨＡと組み合わせたゲランからなるスポンジの形態のバイオマテリアルの調製。
【００５５】
実施例１のように進行させる。次に、室温へ冷却した後に得られる最終的な溶液を凍結乾燥周期へ供する。従って、スポンジの形態の３次元構造を得る。
【００５６】
実施例６
ゲランによって独占的に構成されるハイドロゲルの形態のバイオマテリアルの調製。
【００５７】
０．９％のＮａＣｌ５０ｍｌ中にゲランであるＫｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標）ＣＧ−ＬＡ（粘度３２Ｃｐ）１ｇを溶解した後加熱する（７５〜８５℃）ことによって、脱アセチル化ゲランの２０ｍｇ／ｍｌ溶液を調製する（濃度は、１〜５０ｍｇ／ｍｌで変動しうる）。完全な可溶化は通常、３〜５分かかる（ゲラン粉末が溶解するのにかかる時間はその粘度に依存し、粘度は２６〜３９Ｃｐで変動しうる）。蒸留滅菌できるハイドロゲルが得られるまで、溶液を室温へ冷却するために放置する。
【００５８】
前臨床実験
本発明の新たなバイオマテリアルの完全な効能および安全性を示すため、実験動物に関して実験を実施した。
【００５９】
検査される抗癒着デバイス
実験動物に関して検査されるバイオマテリアルは、
・ブタゼラチンおよび硫酸化デキストランから構成されるゲル形態の医用デバイスであり、コントロールとして使用される臨床効能の立証された抗癒着物質である、ＡＤＣＯＮ（登録商標）−Ｌ、
・５％内部エステル化したＨＡの内部エステルからなり、６０ｍｇ／ｍｌの濃度で塩類溶液中で調製されるＡＣＰ（登録商標）ゲル、
・５０％の程度までエステル化され、７０ｍｇ／ｍｌの濃度で塩類溶液中で調製されるＨＡのベンジルエステルである、Ｈｙａｆｆ（登録商標）−１１ゲル、
・ゲランと硫酸化ＨＡとの重量比が２：１で塩類溶液中で調製される、ＧおよびＳＨＡの組み合わせによって形成されるＧ／ＳＨＡゲル（実施例１参照）、
・１．５：１の重量比で塩類溶液中で調製されるゲランおよび硫酸カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ−Ｓ）の組み合わせからなるＧ／ＣＭＣ−Ｓゲル、
・５：１の重量比でのポリマー間の結合として塩類溶液中で調製され、ＡＣＰ（登録商標）およびＳＨＡによって形成される、ＡＣＰ（登録商標）／ＳＨＡゲル、
・実施例６に従って調製されるゲランゲル、
である。
【００６０】
脊柱手術後の術後癒着の形成の実験モデル
平均２．５ｋｇの体重の２４匹のニュージーランドウサギを使用した。ゾレチル（Ｚｏｒｅｔｉｌ）／ロンパン（Ｒｏｍｐｕｎ）／塩類溶液の溶液（１：０．５：３．５ｖ／ｖ／ｖ、０．２５ｍｌ／ｋｇ）を静脈内投与することによって各動物を麻酔した。動物を全て、腰仙部レベルで、少なくとも二つの別々の脊椎部位、すなわちＬ２およびＬ４について全ての動物を手術した。
【００６１】
対応する領域の有棘突起に沿って５ｃｍの切開を実施した後、次に、下にある筋膜を切開し、どんな過剰の出血も焼灼法によって止血した。その後、椎弓切除術をＬ２およびＬ４の腰椎のレベルで実施し（５×１０ｍｍのサイズ）、従って硬膜マトリックスおよび、脊髄の対応する領域から出る神経根を露出した。
【００６２】
手術のこの時点で、上述の列挙した抗癒着デバイスを適用し、筋膜およびその上に重なる皮膚をしかるべきところに縫い合わせた。
【００６３】
３匹の動物をネガティブコントロールとして供した。その動物は、同一の方法で手術したが、硬膜マトリックスに関して形成する線維状組織の癒着および圧迫のレベルを査定するために、いずれの抗癒着処置も受けなかった。
【００６４】
総計２４匹の動物を２つの異なる部位で手術し、７個のデバイスを分析した。ネガティブコントロールを考慮に入れると、１個のデバイスにつき総計６個の脊椎部位について、各デバイスを３匹の動物に関して検査した。
【００６５】
分析
プロトロンビン時間（ＰＴ）
手術１ヶ月後、動物を全て屠殺した。特異的血行力学検査（ＰＴ）のために３匹のネガティブコントロール動物ならびに手術３日前および処置の２１日目のＧ／ＳＨＡゲルで処置した３匹の動物から血液試料を採取し、処置した動物由来の血液を未処置のコントロールの血液と比較することによって、凝血に及ぼすＳＨＡ任意の効果を評価した（Mennmeyer ST et a;., JAMA 1993, 269(8):1030-1033）。
【００６６】
組織学的分析
Ｇ／ＳＨＡで処置した動物およびＡＤＣＯＮ（登録商標）−Ｌで処置した動物の有棘突起、（Ｌ２領域またはＬ４領域）から、同様にネガティブコントロール群に属する動物から試料を採取した。次に、試料を組織学的分析のために調製した。試料を１０％ホルマリンで固定した後、ホルマリン／硝酸／蒸留水（１０：５：８５）からなる脱灰溶液中に浸漬した。次に、試料をアルコールで脱水し、パラフィン中に包埋した後、厚さ５μｍの切片へスライスし、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。
【００６７】
その後の分析は、次のような試料全部の分析後のスコアの点で表される線維状組織の形成および線維状組織の硬膜マトリックスへの癒着を評価した。
・等級０＝硬膜マトリックス近くに線維状組織が存在しない。
・等級１＝新たに形成される瘢痕組織と硬膜マトリックスとの間に薄い線維状組織が見える。
・等級２＝椎弓切除術によって処置される領域のほぼ２／３に影響する硬膜マトリックスへ癒着する線維状組織の存在。
・等級３＝圧縮を生じ、硬膜マトリックスへ完全に癒着し、椎弓切除術によって処置される領域の２／３を上回る領域に影響を及ぼす線維状組織の存在。
【００６８】
解剖学的観察
屠殺後、全ての動物を椎弓切除術の部位で検査した。次に、硬膜マトリックスおよび神経根を再度露出し、次のスコアリングシステムの点で癒着および圧迫の存在を査定した。
・等級０＝硬膜マトリックス近くに線維状組織が見えない。
・等級１＝線維状組織の薄い層が硬膜マトリックスへ癒着しているのが見える。
・等級２＝硬膜マトリックスへ中程度に癒着する線維状組織の存在。
・等級３＝硬膜マトリックスに対して著しく圧迫および癒着する線維状組織の存在。
・等級４＝手術によって影響を受ける空間全体を占拠するのに十分な量の線維状組織の存在。
【００６９】
得られた結果
プロトロンビン時間（ＰＴ）の評価
表１は、Ｇ／ＳＨＡで処置した動物と未処置のコントロールから採取した血液試料のＰＴ値を示す。
【００７０】
【表１】
0005385532.tif 000002
【００７１】
本結果は、コントロールまたは処置した動物のいずれにおいても術前および術後にＰＴの変化がなかったことを示し、従って、抗癒着バイオマテリアルとして使用される、ゲランと組み合わせたＳＨＡは、処置した動物における凝血時間にどのような方法での影響しなかったことを示す。
【００７２】
組織学的査定
表２は、上述の処置した試料ならびに、ネガティブコントロールとして果たした未処置の試料に付与されたスコアを示す。
【００７３】
【表２】
0005385532.tif 000003
【００７４】
本結果は、本発明のバイオマテリアルが硬膜マトリックス髄膜へ、および結果的に脊髄から出る神経根へも癒着し圧迫する線維状組織の形成を防止する上で、総じて効果的であることを明白に示す。
【００７５】
解剖学的観察
図は、検査される抗癒着デバイス全部の、および関連する未処置のコントロールの、０〜４のスコアとして表される解剖学的査定から得られる結果を示す。
【００７６】
図から明らかにわかるように、本発明の新たな抗癒着剤であるＧ／ＳＨＡおよびゲラン自体、術後脊柱癒着の形成を完全に防止し、立証された効能を考慮して臨床上の実際において標準的に使用されるＡＤＣＯＮ（登録商標）−Ｌデバイスよりもさらによい結果を付与する。
【００７７】
最後に、前述のグラフは、ＳＨＡもその等価物もＣＭＣ−Ｓなどのその他の半合成硫酸化ポリマーによって置換できないことを示す。実際、ゲランとのその組み合わせ（Ｇ／ＣＭＣ−Ｓ）は、特にＧ／ＳＨＡゲルで得られるものと比較するとき、決定的に負の結果を付与する。
【００７８】
従って、本発明が記載されるように、本発明の対照であるバイオマテリアルの調製の実施例がさまざまな方法で修飾できることは明白である。このような修飾は、本発明の精神および目的からの逸脱として考慮されるべきではなく、当業者に明白に見えるであろういずれのこのような修飾も上述の請求項の範囲内に収まる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図は、検査される抗癒着デバイス全部の、および関連する未処置のコントロールの、０〜４のスコアとして表される解剖学的査定から得られる結果を示す。
【図１】
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