(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−アシル化ペプチド又はタンパク質を得るためのペプチド又はタンパク質のアミノ基のアシル化方法であって、以下のステップ：
（ａ）少なくとも１つの遊離アミノ基をもつペプチド又はタンパク質を以下の一般式（Ｉ）：
【化１】
0005551670.tif 000009
｛式中、
ｎは０〜８であり；
Ｒ１はＣＯＯＲ４であり；
Ｒ２は、０．１ｍｇ／水１００ｍｌ〜２５０ｍｇ／水１００ｍｌの範囲における２０℃の水に対する溶解度を有することによって特徴づけられる親油性部分であり；
Ｒ３は、Ｒ３がそれに付着されているところのカルボニル基と一緒になって、カルボン酸基の形態に官能性をもたせたエステルであり、アミノ基のアシル化に用いられる、反応性エステル又は反応性Ｎ−ヒドロキシ・イミド・エステルを表し；そして
Ｒ４は水素である。｝
により表されるアシル化剤と、塩基性条件下、非プロトン極性溶媒と水の混合物中で反応させること
を含み、ここで、前記ペプチド又はタンパク質は、Ａｒｇ２６−ＧＬＰ−１（７−３７）；Ａｒｇ３４−ＧＬＰ−１（７−３７）；Ｌｙｓ３６−ＧＬＰ−１（７−３７）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６−ＧＬＰ−１（７−３７）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３９−ＧＬＰ−１（７−３９）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４０−ＧＬＰ−１（７−４０）；Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３６−ＧＬＰ−１（７−３７）；Ａｒｇ３４Ｌｙｓ３６−ＧＬＰ−１（７−３７）；Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３９−ＧＬＰ−１（７−３９）；Ａｒｇ３４Ｌｙｓ４０−ＧＬＰ−１（７−４０）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６，３９−ＧＬＰ−１（７−３９）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６，４０−ＧＬＰ−１（７−４０）；Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６−ＧＬＰ−１（７−３７）；Ｇｌｙ８Ａｒｇ３４−ＧＬＰ−１（７−３７）；Ｇｌｙ８Ｌｙｓ３６−ＧＬＰ−１（７−３７）；Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６−ＧＬＰ−１（７−３７）；Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３９−ＧＬＰ−１（７−３９）；Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４０−ＧＬＰ−１（７−４０）；Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３６−ＧＬＰ−１（７−３７）；Ｇｌｙ８Ａｒｇ３４Ｌｙｓ３６−ＧＬＰ−１（７−３７）；Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３９−ＧＬＰ−１（７−３９）；Ｇｌｙ８Ａｒｇ３４Ｌｙｓ４０−ＧＬＰ−１（７−４０）；Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６，３９−ＧＬＰ−１（７−３９）；Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６，４０−ＧＬＰ−１（７−４０）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３９ＧＬＰ−１（７−３９）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４０ＧＬＰ−１（７−４０）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４１ＧＬＰ−１（７−４１）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４２ＧＬＰ−１（７−４２）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４３ＧＬＰ−１（７−４３）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４４ＧＬＰ−１（７−４４）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４５ＧＬＰ−１（７−４５）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（１−３８）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３９ＧＬＰ−１（１−３９）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４０ＧＬＰ−１（１−４０）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４１ＧＬＰ−１（１−４１）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４２ＧＬＰ−１（１−４２）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４３ＧＬＰ−１（１−４３）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４４ＧＬＰ−１（１−４４）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４５ＧＬＰ−１（１−４５）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（２−３８）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３９ＧＬＰ−１（２−３９）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４０ＧＬＰ−１（２−４０）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４１ＧＬＰ−１（２−４１）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４２ＧＬＰ−１（２−４２）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４３ＧＬＰ−１（２−４３）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４４ＧＬＰ−１（２−４４）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４５ＧＬＰ−１（２−４５）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（３−３８）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３９ＧＬＰ−１（３−３９）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４０ＧＬＰ−１（３−４０）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４１ＧＬＰ−１（３−４１）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４２ＧＬＰ−１（３−４２）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４３ＧＬＰ−１（３−４３）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４４ＧＬＰ−１（３−４４）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４５ＧＬＰ−１（３−４５）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（４−３８）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３９ＧＬＰ−１（４−３９）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４０ＧＬＰ−１（４−４０）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４１ＧＬＰ−１（４−４１）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４２ＧＬＰ−１（４−４２）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４３ＧＬＰ−１（４−４３）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４４ＧＬＰ−１（４−４４）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４５ＧＬＰ−１（４−４５）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（５−３８）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３９ＧＬＰ−１（５−３９）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４０ＧＬＰ−１（５−４０）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４１ＧＬＰ−１（５−４１）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４２ＧＬＰ−１（５−４２）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４３ＧＬＰ−１（５−４３）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４４ＧＬＰ−１（５−４４）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４５ＧＬＰ−１（５−４５）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（６−３８）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３９ＧＬＰ−１（６−３９）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４０ＧＬＰ−１（６−４０）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４１ＧＬＰ−１（６−４１）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４２ＧＬＰ−１（６−４２）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４３ＧＬＰ−１（６−４３）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４４ＧＬＰ−１（６−４４）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４５ＧＬＰ−１（６−４５）；Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（１−３８）；Ａｒｇ３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（１−３８）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６，３８ＧＬＰ−１（１−３８）；Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）；Ａｒｇ３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６，３８ＧＬＰ−１（７−３８）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）；Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３９ＧＬＰ−１（１−３９）；Ａｒｇ３４Ｌｙｓ３９ＧＬＰ−１（１−３９）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６，３９ＧＬＰ−１（１−３９）；Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３９ＧＬＰ−１（７−３９）；Ａｒｇ３４Ｌｙｓ３９ＧＬＰ−１（７−３９）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６，３９ＧＬＰ−１（７−３９）；Ａｒｇ２６−ＧＬＰ−１（７−３７），Ａｒｇ３４−ＧＬＰ−１（７−３７），Ｌｙｓ３６−ＧＬＰ−１（７−３７），Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６−ＧＬＰ−１（７−３７），Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３６−ＧＬＰ−１（７−３７），Ａｒｇ３４Ｌｙｓ３６−ＧＬＰ−１（７−３７），Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６−ＧＬＰ−１（７−３７），Ｇｌｙ８Ａｒｇ３４−ＧＬＰ−１（７−３７），Ｇｌｙ８Ｌｙｓ３６−ＧＬＰ−１（７−３７），Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６−ＧＬＰ−１（７−３７），Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３６−ＧＬＰ−１（７−３７）；Ｇｌｙ８Ａｒｇ３４Ｌｙｓ３６−ＧＬＰ−１（７−３７）；Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１（７−３８），Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１（７−３８），Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６，３８−ＧＬＰ−１（７−３８），Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１（７−３８）；Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６，３８−ＧＬＰ−１（７−３８）；Ｇｌｙ８，Ａｒｇ２６，３４，Ｇｌｕ３７，Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１（７−３８），Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３９−ＧＬＰ−１（７−３９），Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６，３９−ＧＬＰ−１（７−３９），Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３９−ＧＬＰ−１（７−３９）；Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６，３９−ＧＬＰ−１（７−３９）；Ａｒｇ３４Ｌｙｓ４０−ＧＬＰ−１（７−４０），Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６，４０−ＧＬＰ−１（７−４０），Ｇｌｙ８Ａｒｇ３４Ｌｙｓ４０−ＧＬＰ−１（７−４０）、及びＧｌｙ８Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６，４０−ＧＬＰ−１（７−４０）から選ばれる、前記方法。
【請求項２】
Ｒ３が、Ｒ３がそれに付着されているところのカルボニル基と一緒になって、カルボン酸基の形態に一級アミンのアシル化に好適な官能性をもたせたエステルを表す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ３が、Ｒ３がそれに付着されているところのカルボニル基と一緒になって、反応性エステルを表す、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記反応性エステルが、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール・エステルである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ３が、Ｒ３がそれに付着されているところのカルボニル基と一緒になって、反応性Ｎ−ヒドロキシ・イミド・エステルを表す、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
Ｎ−ヒドロキシ・イミド・エステルのイミド部が、サクシンイミド（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）又はフタルイミド（ｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
非プロトン溶媒と水の混合物が１：５〜５：１のＮ−メチル−２−ピロリドンと水の混合物である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
非プロトン極性溶媒が、無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトン、ジクロロメタン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジオキサン、ジメチルアセトアミド、及びＮ−メチル−２−ピロリドン、並びにそれらの混合物から選ばれる、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
非プロトン極性溶媒が、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、及びＮ−メチル−２−ピロリドンから選ばれる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
非プロトン極性溶媒がＮ−メチル−２−ピロリドンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ａ）における前記反応混合物のｐＨが９〜１３の範囲内である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ａ）における前記反応混合物のｐＨが９．５〜１２．５の範囲内である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ａ）における前記反応混合物のｐＨが１０〜１２の範囲内である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ａ）における前記反応混合物の温度が０〜５０℃の範囲内である、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
Ｒ２が、０．３ｍｇ／水１００ｍｌ〜７５ｍｇ／水１００ｍｌの範囲における２０℃の水に対する溶解度を有することによって特徴づけられる、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
Ｒ２がＣ３−３９−アルキル、Ｃ３−３９−アルケニル、Ｃ３−３９−アルカジエニル、及びステロイド性残基から選ばれる、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
Ｒ２が、ヘプチル、ノニル、ウンデカニル、トリデカニル、ペンタデカニル、ヘプタデカニル、ノナデカニル、リトコロイル、デオキシコロイル、及びコロイルから選ばれる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
Ｒ２が、ヘプチル、ノニル、ウンデカニル、トリデカニル、ペンタデカニル、ヘプタデカニル、及びノナデカニルから選ばれる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
Ｒ２がＣ７−２５−アルキルから選ばれる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
以下の一般式（Ｉ）：
【化２】
0005551670.tif 000010
｛式中、
ｎは０〜８であり；
Ｒ１はＣＯＯＨであり；
Ｒ２は、親油性の部分であり；そして
Ｒ３は、Ｒ３がそれに付着されているところのカルボニル基と一緒になって、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール・エステル、又は反応性Ｎ−ヒドロキシ・イミド・エステルを表す｝
で表される化合物。
【請求項２１】
１−ヒドロキシベンゾトリアゾール・エステルが、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム・テトラフルオロボレートである、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
ｎが０又は１であり、Ｒ３が、Ｒ３がそれに付着されているところのカルボニル基と一緒になって、反応性Ｎ−ヒドロキシ・イミド・エステルを表す、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｒ２がＣ３−３９−アルキル、Ｃ３−３９−アルケニル、Ｃ３−３９−アルカジエニル及びステロイド性残基から選択される、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はペプチド又はタンパク質への１つ以上のアシル基の導入方法に関する。より特に、本発明は天然のＧＬＰ−１又はそのアナログに含まれるリジン残基のεアミノ基の改良したアシル化方法に関する。さらには、本発明は前記方法においてアシル化剤として有効な化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドは医療の現場で広く用いられ、そしてそれらを組換えＤＮＡ技術によって製造できるので、それらの重要性がこれからも増大すると予想される。天然のペプチド又はそれらのアナログが治療に使用される場合、それらが高いクリアランスを持つことが広く見うけられる。治療薬の高いクリアランスは、繰返されてきた投与が必要となったとき以降にも長期間にわたるそれらの高い血中濃度の維持することが望まれる場合に不便である。高いクリアランスをもつ天然型のペプチドの例は：ＡＣＴＨ、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、アンギオテンシン、カルシトニン、エキセンジン、エキセンジン−３、エキセンジン−４、インシュリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１、グルカゴン様ペプチド−２、インシュリン様成長因子−１、インシュリン様成長因子−２、ガストリック・インヒビトリー・ペプチド、成長ホルモン放出因子、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド、セクレチン、エンテロガストリン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、副甲状腺ホルモン、トロンボポエチン、エリスロポエチン、視床下部ホルモン放出因子、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、エンドルフィン、エンケファリン、バソプレッシン、オキシトシン、オピオイド及びそれらのアナログ、スーパーオキサイド・ディスムターゼ、インターフェロン、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニン・デアミナーゼ、アデノシン・デアミナーゼ、並びにリボヌクレアーゼである。
【０００３】
天然ペプチド又はそのアナログへの親油性アシル基の導入は、天然ペプチド（又は改変されていないアナログ）に関連する延長された作用特性をもつアシル化されたペプチドを導く。この現象は、当該出願者の先の出願、ＧＬＰ−１及びアナログのアシル化を開示するＷＯ９８／０８８７１、ＧＬＰ−２及びアナログのアシル化を開示するＷＯ９８／０８８７２、並びにエキセンジン及びアナログのアシル化を開示するＷＯ９９／４３７０８において完全に記載されそして論証されている。さらには親油性基に隣接する負電荷をもちうる基、例えばカルボン酸基の包含が有利でありうることが提唱されている。
【０００４】
欧州特許出願第９２１０７０３５．５号（Ｋｕｒａｒａｙ社）はタンパク質への長鎖カルボン酸の調製のための長鎖ジカルボン酸の反応性モノエステルを記載する。
【０００５】
モノ−又はジペプチド・スペーサーを介したＧＬＰ−１への親油性アシル基の導入は特に興味深く、そしてＷＯ９８／０８８７１中に提唱されそして例示されている。アスパラギン酸及びグルタミン酸が好適なリンカーとして挙げられた。しかしながら、このようなモノ−又はジペプチド・スペーサーは、補足的なカルボン酸基を含むため、保護及びその後の脱保護ステップが必要であると考えられた。脱保護は、前記ペプチド（ＧＬＰ−１）の崩壊を一定の度合いで導く酸性条件下でおこなわれた。よって、それらの変異体の調製のための代替の方法が望ましい。
【０００６】
よって、α−アミノ−α，ω−ジカルボン酸スペーサーを介したペプチドへの親油性残基の導入のための代替方法の提供が本発明の目的である。前記方法は改変されたペプチドの調製を容易にするであろう。電荷をもちうるカルボン酸基は、親油性残基の近くに導入され、このとき上記親油性残基に対して直接作用することはない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明はＮ−アシル化されたペプチド（Ｎ−アシル化されたタンパク質）を得るためのペプチド（又はタンパク質）の１つ以上のアミノ基のアシル化方法であって、以下のステップ：
（ａ）少なくとも遊離アミノ基をもつペプチド（又はタンパク質）を以下の一般式（Ｉ）：
【０００８】
【化１】
0005551670.tif 000002
【０００９】
｛式中、
ｎは０〜８であり；
Ｒ１はＣＯＯＲ４であり；
Ｒ２は親油性部分であり、例えばＣ３−３９−アルキル、Ｃ３−３９−アルケニル、Ｃ３−３９−アルカジエニル、及びステロイド性残基から選ばれ；
Ｒ３は、Ｒ３がそれに付着されているところのカルボキシル基と一緒になって、反応性エステル又は反応性Ｎ−ヒドロキシ・イミド・エステルを表し；そして
Ｒ４は水素、Ｃ１−１２−アルキル、及びベンジルから選ばれる。｝
により表されるアシル化剤と、塩基性条件下、非プロトン極性溶媒と水の混合物中で反応させ；及び
（ｂ）Ｒ４が水素でない場合、塩基性条件下、上記のアシル化したペプチド・エステル基（ＣＯＯＲ４）をケン化する；
を含む前記方法を提供する。
【００１０】
塩基性条件下における前記アシル化されたペプチド・エステル（ここではＲ４はアルキル基又はベンジル基）のケン化は、上記ペプチド及び上記スペーサーのさまざまなα−アミノ酸断片のごくわずかなラセミ化又は無ラセミ化において可能である。本出願には副産物、例えば分解産物の純度及び抑制に関連するあらかじめ用いた酸性的加水分解に関して確かな利点が発見された。
【００１１】
塩基性条件下における遊離酸（ここではＲ４は水素）としてのアシル化剤を用いたアシル化もまた発見された。前記アシル化は、本質的に副産物なしにそして脱保護のステップによらず、望ましい産物であるアシル化されたペプチドを直接的に誘導する。
【００１２】
本発明は前述の方法においてアシル化剤として有効な新規化合物もまた提供し、上記の新規化合物は以下の一般式（Ｉ）：
【００１３】
【化２】
0005551670.tif 000003
【００１４】
｛式中、
ｎは０〜８であり；
Ｒ１はＣＯＯＨであり；
Ｒ２は親油性部分であり、例えばＣ３−３９−アルキル、Ｃ３−３９−アルケニル、Ｃ３−３９−アルカジエニル、及びステロイド性残基から選ばれ；そして
Ｒ３は、Ｒ３がそれに付着されているところのカルボキシル基と一緒になって反応性エステル又は反応性Ｎ−ヒドロキシ・イミド・エステルを表す。｝
により表される。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
ペプチド及びタンパク質
本発明がインビボにおけるクリアランス速度を低下させるためのいくつかのペプチド（又はタンパク質）への親油性アシル基の導入にとって有効であることは一般的に理解される。前記ペプチド及びタンパク質の例はＡＣＴＨ、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、アンギオテンシン、カルシトニン、エキセンジン及びそのアナログ、インシュリン及びそのアナログ、グルカゴン及びそのアナログ、グルカゴン様ペプチド−１及びそのアナログ、グルカゴン様ペプチド−２及びそのアナログ、インシュリン様成長因子−１、インシュリン様成長因子−２、ガストリック・インヒビトリー・ペプチド、成長ホルモン放出因子、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド、セクレチン、エンテロガストリン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、副甲状腺ホルモン、トロンボポエチン、エリスロポエチン、視床下部ホルモン放出因子、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、エンドルフィン、エンケファリン、バソプレッシン、オキシトシン、オピオイド及びそれらのアナログ、スーパーオキサイド・ディスムターゼ、インターフェロン、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニン・デアミナーゼ、アデノシン・デアミナーゼ、並びにリボヌクレアーゼである。
【００１６】
前記ペプチド（又はタンパク質）は少なくとも１つの遊離アミノ基、ここで上記アミノ基はＮ−末端アミノ基又は側鎖のアミノ基をもつであろうことは理解されるであろう。特に興味深いものはリジン及びオルニチンアミノ酸残基のアミノ基である。前記方法は特にリジン残基のε−アミノ基のＮ−アセチル化に関する。着目の前記ペプチド又はタンパク質が、本発明に従いＮ−アシル化されうる２つ以上のペンダント・アミノ基をもちうることもまた理解されるであろう。
【００１７】
本発明がＧＬＰ−１及びそのアナログの改変にとって特に好適であることは必然的に理解される。本発明に従いＮ−アシル化されうるＧＬＰ−１及びアナログの例は、ＧＬＰ−１及び切断型アナログ、例えば
【００１８】
【化３】
0005551670.tif 000004
【００１９】
である。
【００２０】
それらのＧＬＰ−１アナログ及び切断型アナログのそれぞれは本発明の他の態様を構成する。
【００２１】
本発明はＧＬＰ−２及びそのアナログの改変にとっても特に好適であることは必然的に理解される。本発明に従いＮ−アシル化されうるＧＬＰ−２及びアナログの例は、ＧＬＰ−２アナログ及び切断型アナログ、例えばＬｙｓ２０ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｌｙｓ２０Ａｒｇ３０ＧＬＰ−２（１−３３）；Ａｒｇ３０Ｌｙｓ３４ＧＬＰ−２（１−３４）；Ａｒｇ３０Ｌｙｓ３５ＧＬＰ−２（１−３５）；Ａｒｇ３０，３５Ｌｙｓ２０ＧＬＰ−２（１−３５）；及びＡｒｇ３５ＧＬＰ−２（１−３５）である。それらのＧＬＰ−２アナログ及び切断型アナログのそれぞれは本発明の他の態様を構成する。
【００２２】
本発明はエキセンジン（ｅｘｅｎｄｉｎ）及びそのアナログの改変にとっても特に好適であることは必然的に理解される。本発明に従いＮ−アシル化されうるエキセンジン及びアナログの例は、エキセンジン・アナログ及び切断型アナログ、例えばエキセンジン−３及びエキセンジン−４である。それらのエキセンジン・アナログ及び切断型アナログのそれぞれは本発明の他の態様を構成する。
【００２３】
本発明のさらなる態様において前記Ｎ−アシル化はリジン残基のε−アミノ基において起こる。
【００２４】
ＧＬＰ−１及びそのアナログの作用はＷＯ９８／０８８７１に全て記載されている。
【００２５】
ＧＬＰ−２及びそのアナログの作用はＷＯ９８／０８８７２に全て記載されている。
【００２６】
エキセンジン及びそのアナログの作用はＷＯ９９／４３７０８に全て記載されている。
【００２７】
アシル化剤
本発明の方法において、少なくとも１つの遊離アミノ基をもつペプチド（又はタンパク質）は一般式（Ｉ）のアシル化剤と反応する。
【００２８】
【化４】
0005551670.tif 000005
【００２９】
一般式（Ｉ）中の整数ｎは好ましくは０〜８、特に０〜６であり、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などに相当する。好ましくはｎは０〜４、例えば０〜２、０（アスパラギン酸）又は１（グルタミン酸）である。それらの整数及び範囲のそれぞれは本発明の他の態様を構成する。
【００３０】
式（Ｉ）中のＲ１は遊離の酸性基（ＣＯＯＨ）又はエステル基（ＣＯＯＲ４）を表す。Ｒ１がエステル基である場合において、Ｒ４は塩基性条件下で加水分解によって（アルコールに相当するものとして）遊離されうる基から選ばれる。前記の基の例はＣ１−１２−アルキル、例えばメチル、エチル、ｐｒｏｐ−１−イル、ｐｒｏｐ−２−イル、ｂｕｔ−１−イル、ｂｕｔ−２−イル、２−メチル−ｐｒｏｐ−１−イル、２−メチル−ｐｒｏｐ−２−イル（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ）、ｈｅｘ−１−イルなど、及びベンジルである。それらの基のそれぞれは本発明の他の態様を構成する。
【００３１】
式（Ｉ）中のＲ２は前記ペプチド又はタンパク質中に取り込まれている親油性の部分を表す。前記の親油性の部分はＣ３−３９−アルキル、Ｃ３−３９−アルケニル、Ｃ３−３９−アルカジエニル、及びステロイド性残基から典型的に選ばれる。Ｃ３−３９−アルキルの具体的な例はヘプチル、ノニル、ウンデカニル、トリデカニル、ペンタデカニル、ヘプタデカニル、及びノナデカニルである。それらの親油性の部分のそれぞれは本発明の他の態様を構成する。
【００３２】
前記の親油性置換基又は部分は、約０．１ｍｇ／水１００ｍｌ〜約２５０ｍｇ／水１００ｍｌの範囲、好ましくは約０．３ｍｇ／水１００ｍｌ〜約７５ｍｇ／水１００ｍｌの範囲における２０℃の水に対してもっている溶解度によって特徴づけられる。例えば、オクタン酸（Ｃ８）は２０℃の水に対して６８ｍｇ／１００ｍｌの溶解度をもち、デカン酸（Ｃ１０）は２０℃の水に対して１５ｍｇ／１００ｍｌの溶解度をもち、そしてオクタデカン酸（Ｃ１８）は２０℃の水に対して０．３ｍｇ／１００ｍｌの溶解度をもつ。それらの親油性置換基の範囲のそれぞれは本発明の他の態様を構成する。
【００３３】
前記用語「Ｃ３−３９−アルキル（Ｃ３−３９−ａｌｋｙｌ）」、「Ｃ３−３９−アルケニル（Ｃ３−３９−ａｌｋｅｎｙｌ）」、及び「Ｃ３−３９−アルカジエニル（Ｃ３−３９−ａｌｋａｄｉｅｎｙｌ）」は直鎖及び分岐鎖、好ましくは直鎖、飽和、モノ−不飽和、ジ−不飽和、３〜３９炭素原子の炭化水素ラジカルのそれぞれを包含することを意図している。Ｃ３−３９−アルキルの具体的な例はヘプチル、ノニル、ウンデカニル、トリデカニル、ペンタデカニル、ヘプタデカニル、及びノナデカニルである。
【００３４】
本明細書において使用した場合、前記用語「ステロイド性残基（ｓｔｅｒｏｉｄａｌ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ）」は、ステロイド性カルボン酸から得られるＲ２が付着されるところのカルボニル基をともなう親油性基を意味することを意図する、例えばトリ−、テトラ−、及びペンタサイクリック、完全飽和又は部分的不飽和Ｃ１６−３６−炭化水素である。前記の基Ｒ２−Ｃ（＝Ｏ）−の例は、リトコロイル（ｌｉｔｈｏｃｈｏｌｏｙ）、デオキシコロイル（ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｏｙｌ）、及びコロイル（ｃｈｏｌｏｙｌ）である。
【００３５】
前記親油性基の中で先に挙げた、Ｃ７−２５−アルキル、Ｃ７−２５−アルケニル、Ｃ７−２５−アルカジエニル、及びステロイド性残基は特に関連がある。特に興味深い例はヘプチル、ノニル、ウンデカニル、トリデカニル、ペンタデカニル、ヘプタデカニル、ノナデカニル、リトコロイル、デオキシコロイル、及びコロイルである。それらの親油性基のそれぞれは本発明の他の態様を構成する。
【００３６】
式（Ｉ）中のＲ３は、Ｒ３がそれに付着されているところのカルボキシル基と一緒になって反応性エステル又は反応性Ｎ−ヒドロキシ・イミド・エステルを表す。それらのエステルのそれぞれは本発明の他の態様を構成する。反応性エステル又は反応性Ｎ−ヒドロキシ・イミド・エステルは、アミノ、チオ、及びヒドロキシ基のアシル化に用いられる反応基として有機化学の分野（特にペプチド化学）にて周知である。本発明の文脈中の用語「反応性エステル又は反応性Ｎ−ヒドロキシ・イミド・エステル」は、カルボン酸基の形態にアミン、好ましくは一級アミンのアシル化に好適な官能性をもたせたエステルを意味することを意図する。よって、一級アミンのアシル化の選択性はヒドロキシ及びチオ基のアシル化までおよぶことが好まれることは理解されるであろう。反応性Ｎ−ヒドロキシ・イミド・エステルは特に好まれる。
【００３７】
反応性エステルの例は１−ヒドロキシベンゾトリアゾール・エステル及び誘導体である。カルボン酸の前記活性化されたエステル形成のための高い効果をもつ多くの試薬、例えば２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１イル）−１，１，３，３−テトラメチルロニウム・テトラフルオロボレートが知られている。前記反応性エステルは塩基、例えば有機塩基であるトリアルキルアミンが存在することによりその場で典型的に形成される。
【００３８】
Ｎ−ヒドロキシ・イミド・エステルの前記イミド部の例は、欧州特許出願第９２１０７０３５．５号の１３ページ３行目から１７ページ１０行目までに明確に記載されているものである（これを本明細書に援用する）。それらの中で特に興味深いイミド部の例は、サクシンイミド（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）、フタルイミド（ｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ）などである。それらのイミド部のそれぞれは本発明の他の態様を構成する。
【００３９】
前記式（Ｉ）の反応性Ｎ−ヒドロキシ・イミド・エステルは、対応する酸（すなわちＮ−アシル化されたα−カルボキシ保護された二酸（Ｎ−ａｃｙｌａｔｅｄ  α−ｃａｒｂｏｘｙ  ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｄｉａｃｉｄ）（Ｒ４は水素ではない））と等モル量（例えば０．９５〜１．０５モル、好ましくは１．０モル）の対応するイミドのＮ−ヒドロキシ−イミドの縮合によって調製されうる。（前記Ｎ−アシル化されたα−カルボキシ保護された二酸は一方で対応する親油性の部分のα−カルボキシ保護された、α−アミノジアシド、及びベンゾトリアゾール・エステルから典型的には調製される。このベンゾトリアゾール・エステルは、例えばＷＯ９８／０２４６０（実施例１〜３）に記載のＤＣＣ共役によって塩素酸とベンゾトリアゾールから又は遊離酸とベンゾトリアゾールから調製される。）前記縮合は塩基性条件下、例えば共役剤、例えばカルボジイミド共役剤（例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ））の存在において典型的におこなわれる。この場合、前記共役剤は好ましくは酸に対して等モル量添加される。前記反応は極性非プロトン溶媒、例えば無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、無水アセトン、無水ジクロロメタン、無水ジオキサン、無水ジメチルアセトアミド又は無水Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）中にて典型的にはおこなわれる。前記反応は０〜５０℃、例えば５〜３０℃、例えば室温の範囲の温度にて、１〜９６時間、例えば４〜３６時間の期間において典型的にはおこなわれる。試薬と条件の１つの実行可能な組合せは以下の：前記Ｎ−ヒドロキシ−イミド（サクシンイミド又はフタルイミド）と着目の前記酸をおよそ１：１のモル比において無水ＴＨＦ又は無水ＤＭＦ（又はそれらの混合物）中に溶解し、そして等モル量のＤＣＣを上記溶液に添加する。Ｎ−ヒドロキシ−イミドと酸の間の反応完了の後、上記産物を従来法、例えばろ過（ＤＣＣを共役剤として使用した場合には沈澱させたジシクロヘキシルウレア（ＤＣＵ）のろ過）、結晶化、再結晶化、クロマトグラフィーなどにより分離及び精製する。１つの実行可能な精製経路はろ過、減圧下における溶媒の蒸発、前記産物の再溶解、例えばアセトンに再溶解しろ過、非極性溶媒の添加によって結晶化、例えばヘキサンに再溶解し、場合によっては再結晶化及び／又は洗浄により沈澱させた使用した共役剤の除去を含む。前記産物は前記式（Ｉ）のアシル化剤として本発明の方法に直ちに使用されうる。
【００４０】
前記式（Ｉ）のアシル化剤が遊離αカルボン酸（Ｒ４＝水素）として使用される場合には、Ｒ４が選択的に除かれる基であるところの上記式（Ｉ）の化合物はＲ４が水素であるところの対応する化合物に転化する。前記カルボン酸保護基は接触水素化によって除かれうるベンジル基又は選択的に除かれうるアリル基でありうる。ベンジル保護基は非プロトン極性溶媒中の接触水素化によって、例えばアセトン中で室温にて炭素上パラジウムと水素によって除かれうる。前記反応は激しい撹拌のもとで水素ガス雰囲気の閉ざされた容器（典型的には０．１〜１０ａｔｍ）中でも起こりうる。前記反応はパラジウム触媒の品質に依存して０．５〜１２時間で典型的には完了する。従来法を応用する。
【００４１】
Ｒ４が水素であるところの前記式（Ｉ）の化合物は新規物質として、そしてそれによってそれらの化合物が本発明の特殊な側面から成ることが理解される。よって、本発明は以下の一般式（Ｉ）：
【００４２】
【化５】
0005551670.tif 000006
【００４３】
｛式中、
ｎは０〜８であり；
Ｒ１はＣＯＯＨであり；
Ｒ２は親油性の部分であり、好ましくはＣ３−３９−アルキル、Ｃ３−３９−アルケニル、Ｃ３−３９−アルカジエニル、及びステロイド性残基から選ばれ；そして
Ｒ３は、Ｒ３がそれに付着されているところのカルボキシル基と一緒になって、反応性エステル又は反応性Ｎ−ヒドロキシ・イミド・エステルを表す。｝
により表される新規化合物をも提供する。
【００４４】
反応条件
前記式（Ｉ）のアシル化剤と前記ペプチド又はタンパク質の間の反応は、非プロトン極性溶媒と水の混合物において塩基性条件下でおこなわれる。
【００４５】
前記式（Ｉ）のアシル化剤は前記ペプチド又はタンパク質のアミノ基の数に関連してわずかな過剰量にて典型的には使用される。前記割合は典型的には前記ペプチドのアミノ基数の値を考慮して１：１〜１：２０と余分のアシル化剤、好ましくは１：１．２〜１：５である。
【００４６】
前記ペプチドが十分なＮ−アシル化であるか又は一部だけのＮ−アシル化であるかは使用したアシル化剤の量と前記反応条件に依存しうることは理解されるであろう。前記Ｎ−アシル化が実質的に化学量論的であることは好ましい。
【００４７】
典型的には、非プロトン極性溶媒は無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトン、ジクロロメタン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジオキサン、ジメチルアセトアミド又はＮ−メチル−２−ピロリドン及びそれらの混合物から選ばれ、中でもジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、及びＮ−メチル−２−ピロリドンが好まれ、そしてＮ−メチル−２−ピロリドンが特に好まれる。前記非プロトン極性溶媒と水（例えばＮ−メチル−２−ピロリドンと水）の割合は典型的には１：１０〜１０：１、とりわけ１：５〜５：１、特に１：１〜３：１である。
【００４８】
前記温度は典型的には−１０〜５０℃の範囲、好ましくは０〜２５℃の範囲に維持される。
【００４９】
前記反応の円滑な進行のために前記溶媒混合物のｐＨ値が７〜１４の範囲、例えば９〜１３、好ましくは９．５〜１２．５であることが重要である。収量及び純度に関する結果は、前記溶媒混合物のｐＨ値が１０〜１２の範囲である場合に一般的に至適である。望ましいｐＨ値はアルカリ金属の水酸化物、例えば水酸化ナトリウム及び水酸化カリウム、並びに／又は有機塩基、例えばトリアルキルアミン（トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンなど）の添加によって得られる。
【００５０】
典型的な例として、ステップ（ａ）の反応は前記タンパク質と前記式（Ｉ）のアシル化剤の１：１〜１：５のモル比における使用によりおこなわれる。前記ペプチドは典型的には−１０〜３０℃、例えば０〜２５℃、そしてｐＨをアルカリ金属水酸化物（例えば水酸化ナトリウム又は水酸化カリウム）を用いて望ましいレベルに調整した水に事前に溶解されている。前記ｐＨ値は酸、例えば酢酸及び塩基、例えばトリアルキルアミンを用いてさらに調整されうるが、前記温度は好ましくは先の範囲内である。前記非プロトン極性溶媒（又は溶媒混合物）はその後に添加される。前記反応は、水と酸、例えばｐＨ６．５〜９．０までの酢酸の添加前、０．２〜４時間、例えば０．２〜１時間で典型的に得られる縮合（ＨＰＬＣによって観察される）を典型的には進行させる。前記産物は典型的にはＨＰＬＣ又は等電点のｐＨにより沈澱させること又は精製の前に加水分解させること（ステップ（ｂ））によって分離され、そして精製される。
【００５１】
Ｒ４が水素である前記式（Ｉ）のアシル化剤を使用した場合、Ｎ−アシル化されたペプチド又は親油性の部分及び遊離カルボン酸基をもつタンパク質が直接的に得られる。よって、Ｒ４が水素である変異体は本発明の方法の好ましい態様を表す。
【００５２】
あるいは、すなわち前記Ｒ４がＣ１−１２−アルキル又はベンジルである場合、前記Ｎ−アシル化されたペプチド・エステル（又はタンパク質・エステル）は、Ｎ−アシル化されたペプチド又はＮ−アシル化されたタンパク質を得るために塩基性条件下にてケン化される。ケン化は典型的にはアルカリ金属水酸化物、例えばナトリウム又は水酸化カリウムの０．０１〜４．０Ｍ溶液中にておこなわれる。前記溶液のｐＨは典型的には１０〜１４である。前記反応は典型的には０．１〜１２時間、好ましくは０．５〜４時間、０〜４０℃、例えばおよそ室温にて進行させる。反応後、前記産物は、例えば等電点のｐＨでの沈澱及び／又は予備的なＨＰＬＣによって精製される。よって、Ｒ４がＣ１−１２−アルキル又はベンジルである変異体は本発明の方法の他の好ましい態様を表す。
【００５３】
本発明は以下の側面にも関する：
側面１．Ｎ−アシル化ペプチドを得るためのペプチド又はタンパク質のアミノ基のアシル化方法であって、以下のステップ：
（ａ）少なくとも１つの遊離アミノ基をもつペプチドを以下の一般式（Ｉ）：
【００５４】
【化６】
0005551670.tif 000007
【００５５】
｛式中、
ｎは０〜８であり；
Ｒ１はＣＯＯＲ４であり；
Ｒ２は親油性部分であり；
Ｒ３は、Ｒ３がそれに付着されているところのカルボキシル基と一緒になって、反応性エステル又は反応性Ｎ−ヒドロキシ・イミド・エステルを表し；そして
Ｒ４は水素、Ｃ１−１２−アルキル、及びベンジルから選ばれる。｝
により表されるアシル化剤と、塩基性条件下、非プロトン極性溶媒と水の混合物中で反応させ；及び
（ｂ）Ｒ４が水素でない場合、塩基性条件下、上記のアシル化されたペプチド・エステル基（ＣＯＯＲ４）をケン化する；
を含む前記方法。
【００５６】
側面２．Ｒ４が水素である、側面１に記載の方法。
【００５７】
側面３．Ｒ４がＣ１−８−アルキル及びベンジルから選ばれる、側面１に記載の方法。
【００５８】
側面４．前記Ｒ３は、Ｒ３がそれに付着されているところのカルボキシル基と一緒になって、反応性Ｎ−ヒドロキシ・イミド・エステルを表す、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【００５９】
側面５．前記非プロトン極性溶媒と水の混合物が１：５〜５：１までのＮ−メチル−２−ピロリドンと水の混合物である、側面１〜４のいずれかに記載の方法。
【００６０】
側面６．ステップ（ａ）における前記反応混合物のｐＨが９〜１３の範囲内である、側面１〜５のいずれかに記載の方法。
【００６１】
側面７．ステップ（ａ）における前記反応混合物の温度が０〜５０℃の範囲内である、側面１〜６のいずれかに記載の方法。
【００６２】
側面８．前記アシル化したペプチド・エステルが１０〜１４の範囲内のｐＨ値においてケン化される、側面３〜７のいずれかに記載の方法。
【００６３】
側面９．Ｒ２がＣ３−３９−アルキル、Ｃ３−３９−アルケニル、Ｃ３−３９−アルカジエニル、及びステロイド性残基から選ばれる、側面１〜８のいずれかに記載の方法。
【００６４】
側面１０．以下の式（Ｉ）：
【００６５】
【化７】
0005551670.tif 000008
【００６６】
｛式中、
ｎは０〜８であり；
Ｒ１はＣＯＯＨであり；
Ｒ２は親油性部分であり；そして
Ｒ３は、Ｒ３がそれに付着されているところのカルボキシル基と一緒になって、反応性エステル又は反応性Ｎ−ヒドロキシ・イミド・エステルを表す。｝
により表される化合物。
【００６７】
側面１１．ｎは０又は１そしてＲ３は、Ｒ３がそれに付着されているところのカルボキシル基と一緒になって反応性エステル又は反応性Ｎ−ヒドロキシ・イミド・エステルを表す、側面１０に記載の化合物。
【００６８】
側面１２．Ｒ２がＣ３−３９−アルキル、Ｃ３−３９−アルケニル、Ｃ３−３９−アルカジエニル、及びステロイド性残基から選ばれる、側面１０又は１１に記載の化合物。
【実施例】
【００６９】
出発物質の調製
実施例１  Ｎ−ヘキサデカノイルグルタミン酸α−ベンジル・エステルの調製
グルタミン酸α−ベンジル・エステル（４．７５ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）をＮ−メチル−２−ピロリドン（１００ｍｌ）に２０〜２５℃にて溶解した。トリエチルアミン（２．５３ｇ、２５．０ｍｍｏｌ）と同時に１−ヘキサデカノイルベンゾトリアゾール（７．１５ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）を加えた。前記反応混合物を２０〜２５℃にて２２時間撹拌した。前記生成物溶液に対し０．２Ｍ塩酸（２５０ｍｌ）を加えた。前記生成物懸濁液を０℃にて３時間冷却した。前記産物をろ過により分離し、水（５０ｍｌ×４）により洗浄し、そして４０℃の減圧下において恒量まで乾燥した。
【００７０】
収量：９．１５ｇ（９６％）の白色物質、９０．０℃（ピーク値）における融解を示差熱分析器（ＤＳＣ）によって測定した。
【００７１】
実施例２  Ｎ−ヘキサデカノイルグルタミン酸α−メチル・エステルの調製
実施例１の記載と類似した反応条件下において８．０６ｇ（５０．０ｍｍｏｌ）のグルタミン酸α−メチル・エステルを使用して、Ｎ−ヘキサデカノイルグルタミン酸α−メチル・エステルを調製した。
【００７２】
収量：１７．７０ｇ（８８％）の白色物質、９５．４℃（ピーク値）における融解をＤＳＣによって測定した。
【００７３】
実施例３  Ｎ−ヘキサデカノイルグルタミン酸α−ベンジル・エステルγ−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド・エステルの調製
Ｎ−ヘキサデカノイルグルタミン酸α−ベンジル・エステル（２３．７８ｇ、５０．０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２００ｍｌ）に２０〜２５℃にて溶解した。Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（５．７５ｇ、５０．０ｍｍｏｌ）と同時にジシクロヘキシルカルボジイミド（１０．３２ｇ、５０．０ｍｍｏｌ）を加えた。前記反応混合物を２０〜２５℃にて２０時間撹拌した。前記生成物懸濁液をろ過し、そして前記ろ液を減圧下の乾燥により蒸発させた。前記結晶性の残渣を４０℃にてアセトン（１００ｍｌ）に溶解し、そしてろ過によって不純物を除いた。ろ液に対しｎ−ヘプタン（３００ｍｌ）を加えた。前記生成物懸濁液を２０〜２５℃にて４時間撹拌し、その後０℃にて１／２時間冷却した。前記産物をろ過により分離し、ｎ−ヘプタン（５０ｍｌ×３）により洗浄し、そして４０℃の減圧下において恒量まで乾燥した。
【００７４】
収量：２３．７５ｇ（８３％）の白色物質、９８．６℃（ピーク値）における融解をＤＳＣによって測定した。
【００７５】
実施例４  Ｎ−ヘキサデカノイルグルタミン酸α−メチル・エステルγ−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド・エステルの調製
実施例３の記載と類似した反応条件下において８．００ｇ（２０ｍｍｏｌ）のＮ−ヘキサデカノイルグルタミン酸α−メチル・エステルを使用して、Ｎ−ヘキサデカノイルグルタミン酸α−メチル・エステルγ−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド・エステルを調製した。
【００７６】
収量：６．４５ｇ（６５％）の白色物質、１０６．０℃（ピーク値）における融解をＤＳＣによって測定した。
【００７７】
実施例５  Ｎ−ヘキサデカノイルグルタミン酸γ−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド・エステルの調製
Ｎ−ヘキサデカノイルグルタミン酸α−ベンジル・エステルγ−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド・エステル（５．７３ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）をアセトン（１００ｍｌ）に２０〜２５℃にて溶解した。１０％パラジウム含有カーボン・ペースト（乾燥物として約０．２５ｇ）を加えた。前記懸濁液を水素の消費がなくなるまで水素雰囲気下で撹拌した（水素２９０ｍｌ、４５分間）。前記触媒をろ過によって除き、そして前記ろ液を２０〜２５℃にて減圧下の乾燥により蒸発させた。前記残渣を２０〜２５℃にてアセトン（２５ｍｌ）に溶解し、そしてろ過によって不純物を除いた。ろ液に対しｎ−ヘプタン（２００ｍｌ）を加えた。前記生成物懸濁液を２０〜２５℃にて１時間撹拌した。前記産物をろ過により分離し、ｎ−ヘプタン（５０ｍｌ×２）により洗浄し、そして４０℃の減圧下において恒量まで乾燥した。
【００７８】
収量：４．２０ｇ（８７％）の白色物質、１００．８℃（ピーク値）における融解をＤＳＣによって測定した。
【００７９】
アシル化されたＧＬＰ−１アナログの調製
実施例６  Ａｒｇ３４Ｌｙｓ２６−［Ｎ−ε−（γ−Ｇｌｕ（Ｎ−ヘキサデカノイル））］−ＧＬＰ−１７−３７の調製
Ａｒｇ３４−ＧＬＰ−１７−３７（等電点沈澱させたペプチドの凍結物質５．０ｇ、約０．１５ｍｍｏｌ）を水（２５ｍｌ）に０〜５℃にて溶解した。前記溶液のｐＨを１．０Ｍ水酸化ナトリウム（２．２５ｍｌ）の添加により１２．５に調整した。２分後、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（５０ｍｌ）と１．０Ｍ酢酸（１．２５ｍｌ）を温度を１５℃に保ちながら加えた。トリエチルアミン（０．２ｍｌ）そして同時にＮ−ヘキサデカノイルグルタミン酸γ−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド・エステル（９７．０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を加えた。３０分後１５℃の水（５０ｍｌ）を加え、そしてｐＨを１．０Ｍ酢酸（１．７０ｍｌ）の添加により８．０に調整した。
【００８０】
収量：分析用ＲＰ−ＨＰＬＣにより前記反応混合物がＡｒｇ３４Ｌｙｓ２６−［Ｎ−ε−（γ−Ｇｌｕ（Ｎ−ヘキサデカノイル））］−ＧＬＰ−１７−３７を（エリアにおいて）７７％含有することを示した。
【００８１】
前記産物の最終精製はカラム・クロマトグラフィーによっておこなった。
【００８２】
実施例７  Ａｒｇ３４Ｌｙｓ２６−［Ｎ−ε−（γ−Ｇｌｕ−ＯＭｅ（Ｎ−ヘキサデカノイル））］−ＧＬＰ−１７−３７の調製
実施例６の記載と類似した反応条件下においてＮ−ヘキサデカノイルグルタミン酸α−メチル・エステルγ−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド・エステルを使用してＡｒｇ３４−ＬＰ−１７−３７をアシル化した。
【００８３】
収量：分析用ＲＰ−ＨＰＬＣにより前記反応混合物がＡｒｇ３４Ｌｙｓ２６−［Ｎ−ε−（γ−Ｇｌｕ−ＯＭｅ（Ｎ−ヘキサデカノイル））］−ＧＬＰ−１７−３７を（エリアにおいて）６４％含有することを示した。前記産物は１Ｍ酢酸を用いて前記反応混合物のｐＨを６．０に調整することによって沈澱として分離できた。あるいは前記反応混合物は次の実施例８に記載のとおり直ちに使用できる。
【００８４】
実施例８  Ａｒｇ３４Ｌｙｓ２６−［Ｎ−ε−（γ−Ｇｌｕ（Ｎ−ヘキサデカノイル））］−ＧＬＰ−１７−３７の調製
実施例７において得られた産物を含む反応混合物を、１Ｍ水酸化ナトリウムを用いてｐＨを１２〜１３に調整することによって塩基性加水分解に供した。反応混合物の温度を８〜１８℃に維持した。２時間後前記反応を完了し、そして前記反応混合物のｐＨを１Ｍ酢酸の添加により７．４５に調整した。
【００８５】
収量：分析用ＲＰ−ＨＰＬＣにより前記反応混合物がＡｒｇ３４Ｌｙｓ２６−［Ｎ−ε−（γ−Ｇｌｕ（Ｎ−ヘキサデカノイル））］−ＧＬＰ−１７−３７を（エリアにおいて）６５％含有することを示した。
【００８６】
前記産物の最終精製はカラム・クロマトグラフィーによっておこなった。
【００８７】
実施例９
以下の：
Ａｒｇ２６，３４，Ｌｙｓ３６−［Ｎ−ε−（γ−Ｇｌｕ（Ｎ−ヘキサデカノイル））］−ＧＬＰ−１７−３６、Ａｒｇ２６，Ｌｙｓ３４−［Ｎ−ε−（γ−Ｇｌｕ（Ｎ−ヘキサデカノイル））］−ＧＬＰ−１７−３７、及びＧｌｙ８，Ａｒｇ２６，３４，Ｇｌｕ３７，Ｌｙｓ３８−［Ｎ−ε−（γ−Ｇｌｕ（Ｎ−ヘキサデカノイル））］−ＧＬＰ−１７−３８
の化合物は調製される実施例６の化合物に対するアナログであり、前記産物の最終精製はカラム・クロマトグラフィーによっておこなわれる。