(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィセチン、ルテオリン、ケルセチン、およびそれらの配糖体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの筋肉の糖取り込み促進剤。
【請求項２】
前記化合物が、植物抽出物由来である、請求項１に記載の筋肉の糖取り込み促進剤。
【請求項３】
フィセチン、ルテオリン、ケルセチン、およびそれらの配糖体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含有する植物抽出物を有効成分として少なくとも１種含有する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの筋肉の糖取り込み促進剤。
【請求項４】
フィセチン、ルテオリン、ケルセチン、およびそれらの配糖体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの筋肉のＧＬＵＴ４活性化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋肉の糖取り込み促進剤、および筋肉の糖取り込み促進剤を含有する高血糖改善剤または高血糖改善食品用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液中のグルコース濃度（血糖値）は、さまざまなホルモンの作用によって常に一定範囲内に調節されている。日本糖尿病学会の糖尿病診断基準では、空腹時血糖値１１０ｍｇ／ｄＬ未満、および食後２時間血糖値１４０ｍｇ／ｄＬ未満が正常範囲と定められている。血糖値が上昇すると、膵臓から血液中にインスリンが分泌され、インスリンは血液中の過剰な糖を細胞が取り込むように細胞を刺激し、血糖値が低下する。このような血糖降下作用を有するホルモンはインスリンだけである。そのため、インスリンの分泌や感受性に異常がある場合には、血糖値が常に高値を示すようになる。
【０００３】
インスリンが作用する筋肉や脂肪組織の細胞にはＧＬＵＴ（グルコーストランスポーター（glucose transporter）：糖輸送体）１、ＧＬＵＴ３、およびＧＬＵＴ４の３つのアイソフォームの発現が認められている。ＧＬＵＴ１やＧＬＵＴ３はインスリンの有無に関わらず大半が細胞膜上に存在し、細胞の維持に必要な糖取り込みを行っている。これに対しＧＬＵＴ４は、インスリン非存在下ではほとんどが細胞内に局在し、糖取り込みには関与していない。ところが、インスリン刺激が加わると、ＧＬＵＴ４は細胞内から細胞膜上に急激に移動し、糖取り込み活性を発揮するようになる。この細胞内局在の変化はＧＬＵＴ４のトランスロケーション（translocation）と呼ばれている。筋肉や脂肪組織において、インスリンによる糖取り込みの顕著な増加は、主としてＧＬＵＴ４の細胞膜移行によるものと考えられている。
【０００４】
食べ過ぎや運動不足でカロリー摂取過剰になると、エネルギーバランスがくずれ、肥満となる。肥満に伴って脂肪細胞の大きさや数が増大し、脂肪細胞を多く含む肝臓や骨格筋で中性脂肪が過剰に蓄積すると、これらの細胞や組織は、インスリン刺激に抵抗を示すインスリン抵抗性の状態となる。この過程で、インスリン感受性を亢進させるアディポネクチンの分泌が減少し、インスリン感受性を低下させるＴＮＦ−αやレジスチンが増加する。肝臓や骨格筋がインスリン抵抗性を示す場合、食後、これらの組織に糖が流入しても、細胞に糖がうまく取り込まれず、急激に上昇した血糖値がなかなか下がらなくなる。この状態が長期間続くと、膵臓はインスリン分泌をさらに増やしてこれらの細胞による血液中の糖の取り込みを促す。膵臓にかかる負担が限度を超えると、膵臓のインスリン分泌機能が急激に衰え、糖尿病となる。
【０００５】
このような糖尿病の治療・改善組成物として、前駆脂肪細胞を脂肪細胞に分化促進し、糖代謝を図るものが知られている（特許文献１）。また、糖尿病患者では骨格筋における糖の取り込み量が減少していることが明らかにされており（非特許文献１〜３）、筋肉細胞の糖取り込み促進作用を指標とした糖尿病治療薬のスクリーニングも行われ（非特許文献４）、筋肉細胞の糖取り込み促進作用を有する組成物が提案されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第３０６９６８６号公報
【特許文献２】特開２００９−５１７５１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】The Journal of clinical investigation，1985年，76巻，149-155頁
【非特許文献２】Diabetologia，2000年，43巻，821-835頁
【非特許文献３】Biochemical Society transactions，2005年，33巻，354-357頁
【非特許文献４】J. Med. Chem.，1998年11月5日，41巻，23号，4556-4566頁
【非特許文献５】Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2007年，71巻，9号，2343-2346頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、筋肉、特に、骨格筋および心筋の糖取り込み促進剤、およびこれを含有する高血糖改善剤または高血糖改善食品用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究した結果、特定のポリフェノール化合物に、骨格筋細胞の糖取り込みを促進する活性を見出し、さらに、これらのポリフェノール化合物が、筋肉細胞において糖輸送体ＧＬＵＴ４（４型糖輸送体：glucose transporter 4）の細胞膜移行を誘導することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は、フィセチン、ルテオリン、ケルセチン、およびそれらの配糖体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する、筋肉の糖取り込み促進剤を提供する。
【００１１】
１つの実施態様では、上記化合物は、植物抽出物由来である。
【００１２】
本発明はまた、フィセチン、ルテオリン、ケルセチン、およびそれらの配糖体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含有する植物抽出物を少なくとも１種含有する、筋肉の糖取り込み促進剤を提供する。
【００１３】
本発明はまた、上記筋肉の糖取り込み促進剤を含有する、高血糖改善剤を提供する。
【００１４】
本発明はまた、上記高血糖改善剤を含有する、糖尿病または糖尿病合併症の予防または治療剤を提供する。
【００１５】
本発明はまた、上記筋肉の糖取り込み促進剤を含有する、高血糖改善食品用組成物を提供する。
【００１６】
本発明はまた、上記高血糖改善食品用組成物を含有する、糖尿病または糖尿病合併症の予防または改善のための飲食品を提供する。
【００１７】
さらに、本発明は、フィセチン、ルテオリン、ケルセチン、およびそれらの配糖体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する、ＧＬＵＴ４活性化剤を提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の糖取り込み促進剤および高血糖改善剤は、骨格筋および心筋の筋肉細胞において糖取り込みを促進することができる。本発明によれば、優れた糖取り込み促進作用により、高血糖症、糖尿病または糖尿病合併症の予防または治療剤を提供することができる。また、高血糖を改善し、糖尿病または糖尿病合併症を予防または改善する飲食品を提供することができる。さらに、本発明によれば、ＧＬＵＴ４を活性化し、ＧＬＵＴ４の細胞膜移行を誘導するＧＬＵＴ４活性化剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】種々のポリフェノール類によるＬ６骨格筋細胞の糖取り込み促進活性を示すグラフである（実施例１）。
【図２】種々のポリフェノール類のＬ６骨格筋細胞に対する毒性を示すグラフである（実施例２）。
【図３】フィセチンおよびルテオリンのＧＬＵＴ４細胞膜移行誘導作用を示すグラフおよびウェスタンブロッティングの写真である（実施例３）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の糖取り込み促進剤は、フィセチン、ルテオリン、ケルセチン、またはそれらの配糖体を含む。フィセチン（Fisetin）は、フラボノール類の一種で、３，３’，４’，７−テトラヒドロキシフラボン（3,3',4',7-tetrahydroxyflavone）であり、下記の式（Ｉ）で表される。
【００２１】
【化１】
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【００２２】
ルテオリン（Luteolin）は、フラボン類の一種で、３’，４’，５，７−テトラヒドロキシフラボン（3',4',5,7-tetrahydroxyflavone）であり、下記の式（ＩＩ）で表される。
【００２３】
【化２】
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【００２４】
ケルセチン（quercetin）は、フラボノール類の一種で、３，３'，４'，５，７−ペンタヒドロキシフラボン（3,3’,4’,5,7-pentahydroxyflavone）であり、下記の式（ＩＩＩ）で表される。
【００２５】
【化３】
0005594719.tif 000004
【００２６】
本発明で用いられるフィセチン、ルテオリンまたはケルセチンは、天然由来であっても、化学合成あるいは半合成により得られたものであっても良い。人体に対する毒性や安全性を考慮して、天然の植物から抽出して得られたものであることが好ましい。また、フラボノイドは植物中で配糖体として存在し、体内に吸収される際に糖が脱離することは公知であることから、配糖体を用いてもよい。配糖体とは、上記の化合物の水酸基と、任意の糖（例えば、グルコース、フコース、ガラクトース、６−デオキシグルコース、ラムノース）の水酸基との縮合体である。例えば、ケルセチン配糖体としては、ルチン、ケルシトリンなどが挙げられる。
【００２７】
本発明において、これらの化合物の抽出に用いる植物としては、イチゴ（果実）、リンゴ（果実）、カキ（果実）、タマネギ（鱗茎）、ブドウ（果実）、ピーマン（果実）、シシトウ（果実）、セロリ（茎葉）、シソ（葉）、シュンギク（葉）、アシタバ（茎・葉）、ダイコン（葉）、モロヘイヤ（葉）、オクラ（果実）、セリ（茎葉）、アスパラガス（茎葉）、茎ニンニク（花茎）などが挙げられ、ルテオリンにおいては、イチゴ（果実）、リンゴ（果実）、ピーマン（果実）、シシトウ（果実）、シソ（葉）、シュンギク（葉）、ダイコン（葉）、モロヘイヤ（葉）が好ましい。これらの化合物は、植物から公知の方法にしたがって抽出され、例えば、植物またはその乾燥物もしくは粉砕物にエタノールやメタノールなどの極性有機溶媒またはこれらと水との混合物を加え、例えば約４℃〜１００℃の温度で攪拌または静置することにより行われる。得られた抽出物は、濃縮または乾燥して用いる。
【００２８】
本発明においては、糖取り込み促進剤として、フィセチン、ルテオリン、ケルセチンまたはそれらの配糖体を含む植物抽出物をそのまま用いても良く、抽出物からの精製物を用いても良い。精製方法としては、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、限外ろ過、電気泳動や高速液体クロマトグラフィーなどが挙げられる。また、必要に応じてこれらの方法を組み合わせて精製を行ってもよい。
【００２９】
（高血糖改善剤）
本発明の高血糖改善剤は、上記糖取り込み促進剤の優れた糖取り込み促進作用によって、血糖値を低下させる。したがって、高血糖症、糖尿病、糖尿病関連疾患（例えば、肥満、高脂血症、高コレステロール血症、脂質代謝異常、高血圧症、脂肪肝、メタボリックシンドローム、浮腫、心不全、狭心症、心筋梗塞、動脈硬化症、高尿酸血症、痛風）、または糖尿病合併症（例えば、網膜症、腎症、神経障害、白内障、足壊疽、感染症、ケトーシス）の予防または治療剤として用いることができる。
【００３０】
本発明の高血糖改善剤の投与経路は、経口投与または非経口投与のいずれであってもよい。その剤形は、投与経路に応じて適宜選択される。例えば、注射液、輸液、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、腸溶剤、トローチ、内用液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、外用液剤、湿布剤、点鼻剤、点耳剤、点眼剤、吸入剤、軟膏剤、ローション剤、坐剤、経腸栄養剤などが挙げられる。これは、症状に応じてそれぞれ単独でまたは組み合わせて用いることができる。これらの製剤には、必要に応じて、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤などの医薬の製剤技術分野において通常用いられる補助剤が用いられる。
【００３１】
本発明の高血糖改善剤の投与量は、投与の目的や投与対象者の状況（性別、年齢、体重など）に応じて異なる。通常、成人に対して、フィセチン、ルテオリンおよび／またはケルセチンとして、経口投与の場合、１日あたり０．０１ｍｇ〜５０００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ、さらに好ましくは１ｍｇ〜２００ｍｇ、一方、非経口投与の場合、１日あたり０．００１ｍｇ〜２５００ｍｇ、好ましくは０．０１ｍｇ〜５００ｍｇ、さらに好ましくは０．１ｍｇ〜１００ｍｇで投与され得る。
【００３２】
本発明の高血糖改善剤は、上記のような医薬品としてだけでなく、医薬部外品、化粧品などとして用いることができる。医薬部外品または化粧品として用いる場合、必要に応じて、医薬部外品または化粧品などの技術分野で通常用いられている種々の補助剤とともに用いられ得る。また、溶液状、懸濁液状、シロップ状、顆粒状、クリーム状、ペースト状、ゼリー状などの所望の形状で、あるいは必要に応じて成形して使用してもよい。これらに含まれる割合は、特に限定されず、使用目的、使用形態、および使用量に応じて適宜選択することができる。
【００３３】
（高血糖改善食品用組成物）
本発明の高血糖改善食品用組成物は、上記薬理効果を備えた健康食品・健康飲料・特定保健用食品・機能性食品・栄養補助剤、その他ヒト以外の動物に対する薬剤や飼料などに用いることができる。中でも、糖類を多く含んだ飲食物素材に本発明の高血糖改善食品組成物を添加した場合には、筋肉細胞の糖取り込み促進作用による効率的なエネルギー供給効果を奏し、また、それに伴う筋肉組織の活性化・増強・増大や肉体疲労軽減、運動能力の向上などの効果を奏することから、優れたエネルギー補助食品を提供することができる。
【００３４】
本発明の高血糖改善食品用組成物を飲食物に用いる場合、必要に応じて、例えば、甘味料、香辛料、調味料、防腐剤、保存料、殺菌剤、酸化防止剤などの食品に通常用いられる添加剤とともに使用してもよい。また、溶液状、懸濁液状、シロップ状、顆粒状、クリーム状、ペースト状、ゼリー状などの所望の形状で、あるいは必要に応じて成形して使用してもよい。これらに含まれる割合は、特に限定されず、使用目的、使用形態、および使用量に応じて適宜選択することができる。
【００３５】
本発明の高血糖改善食品用組成物へのフィセチン、ルテオリンまたはケルセチンの配合量は、例えば、組成物を飲料などとして用いる場合は、上記特定の化合物が約０．００００１〜１０質量％、好ましくは約０．００１〜１質量％含まれるように設定するのが望ましい。また、組成物が食品や食品素材などとして、固形状、粉末状、顆粒状、ペースト状等の形態で経口投与用として用いられる場合は、上記特定の化合物が約０．０１〜８０質量％、好ましくは約０．１〜２０質量％含まれるように設定するのが望ましい。また、組成物を非経口投与用として用いる場合は、上記特定の化合物が約０．００００１〜１０質量％、好ましくは約０．０００１〜１質量％含まれるように設定するのが望ましい。
【００３６】
本発明の糖取り込み促進剤は、ＧＬＵＴ４活性化剤としても用いることができる。本発明のＧＬＵＴ４活性化剤は、筋肉細胞において糖輸送体ＧＬＵＴ４の細胞膜移行を誘導することができ、筋肉細胞の糖取り込みを促進することができる。
【実施例】
【００３７】
以下に実施例および製造例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３８】
（調製例１：Ｌ６骨格筋細胞の作製）
Ｌ６筋芽細胞（DS Pharma Biomedical社製）を２×１０４／ｍＬの細胞密度になるようにＭＥＭ培地（１０％(v/v)牛胎児血清含有）で調製し、９６穴組織培養プレートに移し（１穴当たり２００μＬ）、３７℃の５％炭酸ガス培養器にて２日間培養した。細胞がコンフルエントになった時点で、培地をＭＥＭ培地（２％(v/v)牛胎児血清含有）に置換し、さらに細胞を３７℃の５％炭酸ガス培養器にて５日間培養した（Ｌ６骨格筋細胞の作製）。次いで、培地をＭＥＭ培地（０．２％(w/v)牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有）に置換し、さらに細胞を３７℃の５％炭酸ガス培養器にて１８時間培養した。このように培養したＬ６骨格筋細胞を、糖取り込み試験（実施例１）および細胞毒性試験（実施例２）に用いた。
【００３９】
Ｌ６筋芽細胞を３×１０４／ｍＬの細胞密度になるようにＭＥＭ培地（１０％(v/v)牛胎児血清含有）で調製し、６０ｍｍディッシュに移し（１枚当たり４ｍＬ）、上記と同様にしてＬ６骨格筋細胞を作製した。次いで、培地をＭＥＭ培地（０．２％(w/v)牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有）に置換し、３７℃の５％炭酸ガス培養器にて１８時間培養した。このように培養したＬ６骨格筋細胞を、ウェスタンブロット解析（実施例３）に用いた。
【００４０】
（実施例１：Ｌ６骨格筋細胞における糖取り込み試験）
フィセチン、ルテオリン、ケルセチン、アピゲニン、バイカレイン、ユーパチリンおよびロビネチン（ユーパチリンはPhytoLab社製、他の化合物はExtrasynthese社製）の存在下でのＬ６骨格筋細胞における糖取り込みを調べた。アピゲニン、バイカレイン、ユーパチリンおよびロビネチンの化学構造式を以下に示す。
【００４１】
【化４】
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【００４２】
【化５】
0005594719.tif 000006
【００４３】
【化６】
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【００４４】
【化７】
0005594719.tif 000008
【００４５】
上記ポリフェノール類をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させ、ＭＥＭ培地（０．２％(w/v)ＢＳＡ含有）にて１００倍希釈した。この溶液をそれぞれ０μＭ、１０μＭおよび３０μＭ含有するＭＥＭ培地を調製した。陰性対照および陽性対照として、１％(v/v)ＤＭＳＯを含有するＭＥＭ培地、およびインスリンを１００ｎＭ含有するＭＥＭ培地をそれぞれ用いた。調製例１のＬ６骨格筋細胞の培養プレートの培地を、これらの培地に置換し（１穴当たり１００μＬ）、さらにプレートを３７℃の５％炭酸ガス培養器にて４時間静置した。次いで、０．１％(w/v)ＢＳＡを含有するＫＲＨ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、４．８ｍＭ  ＫＣｌ、１．８５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．３ｍＭ  ＭｇＳＯ４）を１穴当たり１００μＬ用いて各穴を２回洗浄した後、１ｍＭ  ２ＤＧ（２−デオキシグルコース）および０．１％(w/v)ＢＳＡを含有するＫＲＨ緩衝液を１穴当たり１００μＬ添加し、プレートを３７℃の５％炭酸ガス培養器にて２０分間静置した。次いで、０．１％(w/v)ＢＳＡを含有するＫＲＨ緩衝液を１穴当たり１００μＬ用いて各穴を２回洗浄した後、０．１Ｎ  ＮａＯＨを１穴当たり５０μＬ添加し、プレートを６０℃の乾熱滅菌器にて１０分間静置した。プレートをマイクロプレートミキサーで撹拌して、細胞を溶解させた後、プレートを８５℃の乾熱滅菌器にて５０分間静置して乾燥させた。１Ｎ  ＨＣｌを１穴当たり５０μＬ添加し、次いで２００ｍＭトリエタノールアミン（ＴＥＡ）溶液（ｐＨ８．１）を１穴当たり５０μＬ添加し、プレートをマイクロプレートミキサーで撹拌した。プレートの各穴中の混合物について２ＤＧ量を下記の通りに測定し、陰性および陽性対照区の測定値と比較することにより、糖取り込み促進作用を評価した。
【００４６】
２ＤＧの測定は、次のように行った。まず、上記の混合物を９６穴プレートに１穴当たり１０μＬ添加し、アッセイカクテル（５０ｍＭ  ＴＥＡ、ｐＨ８．１、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０２％(w/v)ＢＳＡ、０．１ｍＭ  ＮＡＤＰ、２μＭ  レザズリン、２ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  ジアホラーゼ、１５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）を１穴当たり１００μＬ添加した。このプレートをマイクロプレートミキサーで撹拌し、３７℃の５％炭酸ガス培養器にて５０分間静置した。プレートの各穴について、マイクロプレートリーダー（Wallac 1420 ARVOsx、Parkin Elmar社製）にて蛍光値（励起波長：５３０ｎｍ、測定波長：５７０ｎｍ）を測定した。２ＤＧ−６−リン酸（Sigma社製）を標準物質として検量線を作成し、プレートの各穴について、２ＤＧ取り込み量を算出し、各穴の２ＤＧ取り込み量の陰性対照区の２ＤＧ取り込み量に対する比を算出した。結果を図１に示す。図１において、＊は、有意水準５％で有意差があったことを示す。
【００４７】
図１からわかるように、上記ポリフェノール類のうち、フィセチン、ルテオリンおよびケルセチンが顕著な糖取り込み促進作用を示し、フィセチンおよびルテオリンの糖取り込み促進作用はインスリンに匹敵するものであった。
【００４８】
（実施例２：細胞毒性試験）
上記ポリフェノール類をＭＥＭ培地（０．２％(w/v)ＢＳＡ含有）にて１００倍希釈し、ポリフェノール類を３０μＭ含有するＭＥＭ培地を調製した。陰性対照として、１％(v/v)ＤＭＳＯを含有するＭＥＭ培地を用いた。調製例１のＬ６骨格筋細胞の培養プレートに、これらの培地を１穴当たり１００μＬ添加し、プレートを３７℃の５％炭酸ガス培養器にて２４時間静置した。次いで、ＷＳＴ−１試薬（Roche Diagnostics社製）を１穴当たり１０μＬ添加し、プレートを３７℃の５％炭酸ガス培養器にて１時間静置した。プレートの各穴について、生細胞により還元されて生じたホルマザン色素の吸光度（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）をプレートリーダーにて測定した。さらに、細胞をクリスタルバイオレット染色し、吸光度（測定波長５７０ｎｍ）をプレートリーダーにて測定し、細胞密度を算出した。結果を図２に示す。
【００４９】
図２からわかるように、いずれの化合物も、実施例１で糖取り込み促進作用の評価に用いた濃度の最高値（３０μＭ）において細胞毒性を示さなかった。
【００５０】
（実施例３：ＧＬＵＴ４の細胞膜移行の確認）
実施例１において、特に顕著な糖取り込み促進作用を示したフィセチンおよびルテオリンについて、ＧＬＵＴ４の細胞膜移行を確認する試験を行った。フィセチンおよびルテオリンをＤＭＳＯに溶解し、１０μＭフィセチンまたは１０μＭルテオリンを含有するＭＥＭ培地（０．２％(w/v)ＢＳＡ含有）を調製した。陰性対照および陽性対照として、０．１％(v/v)ＤＭＳＯを含有するＭＥＭ培地（０．２％(w/v)ＢＳＡ含有）、および１００ｎＭインスリンを含有するＭＥＭ培地（０．２％(w/v)ＢＳＡ含有）をそれぞれ用いた。調製例１のＬ６骨格筋細胞の培養ディッシュに、これらの培地を１枚当たり４ｍＬ添加し、ディッシュを３７℃の５％炭酸ガス培養器にて１５分間静置した。ＫＲＨ緩衝液をディッシュ１枚当たり１ｍＬ用いて各ディッシュを２回洗浄した後、非特許文献５に記載の方法にて細胞膜画分を調製した。得られた細胞膜画分のタンパク質量を測定し、その２μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してタンパク質を分離した。分離後のタンパク質をポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写した。このＰＶＤＦ膜をブロッキング  ワン（ナカライテスク株式会社製）でブロッキングし、ＴＢＳＴ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）溶液で数回洗浄した後、ＰＶＤＦ膜に１次抗体として抗ＧＬＵＴ４抗体または抗ＧＬＵＴ１抗体（いずれもSanta Cruz Biotechnology社製）を、２次抗体としてホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した抗ヤギＩｇＧ抗体（Santa Cruz Biotechnology社製）を反応させた。膜上の免疫複合体をＬｕｍｉＬｉｇｈｔ  Ｐｌｕｓウェスタンブロッティング基質（Roche Diagnostics社製）と反応させた後、ＰＶＤＦ膜を用いてＸ線フィルムを露光させてＧＬＵＴ４のバンドのシグナルを検出した。バンド強度は、画像解析ソフト「Ｓｃｉｏｎ  ｉｍａｇｅ」（Scion社製）を用いて解析した。ＧＬＵＴ１を内部標準としてＧＬＵＴ４のバンド強度を補正した後、ＤＭＳＯ処理細胞のＧＬＵＴ４レベルを基準として、相対値を算出した。結果を図３に示す。
【００５１】
図３からわかるように、糖取り込み促進作用を示したフィセチンおよびルテオリンは、細胞膜画分におけるＧＬＴＵ４レベルを増加させた。ＤＭＳＯ処理細胞のＧＬＵＴ４レベルを基準とした場合、インスリン処理細胞では８倍、フィセチン処理細胞では５倍、およびルテオリン処理細胞では１０倍に、ＧＬＵＴ４レベルが増加していた。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明の糖取り込み促進剤および高血糖改善剤は、骨格筋および心筋の筋肉細胞において優れた糖取り込み促進作用を有する。したがって、本発明の糖取り込み促進剤および高血糖改善剤を用いることによって、高血糖症、糖尿病、または糖尿病合併症の予防または治療剤、および高血糖、糖尿病または糖尿病合併症を予防または改善する飲食品を提供することができる。
【図１】
0005594719.tif 000009
【図２】
0005594719.tif 000010
【図３】
0005594719.tif 000011