(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
（ａ）水溶性のウイルス多糖及び水溶性の細菌の多糖からなる群から選ばれる少なくとも１つの第１成分を、１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）で活性化して活性化された炭水化物を形成する工程、ここで、該活性化を、８〜１０のｐＨ、及び該多糖該１００ｋＤａ当たり１００：１〜５００：１モルの該ＣＤＡＰの比で、実施する、
（ｂ）タンパク質、ペプチド、及びハプテンからなる群から選ばれる第２成分を、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）、２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ’ｓ試薬）、ヨードアセチルプロピオネートＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＳＩＡＰ）、Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）、Ｅ−マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）、及びアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）から選ばれるチオール又はヒドラジド求核基で誘導体化する工程、及び
（ｃ）前記活性化された第１成分を前記誘導体化された第２成分にカップリングして、免疫応答を刺激することができる免疫原性構築物を形成する工程、ここで、該カップリングを、７〜９のｐＨで実施する、
を含む免疫原性構築物の製造方法。
【請求項２】
前記第１成分及び第２成分が水溶性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記活性化工程（ａ）をトリエチルアミンの存在下で実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１成分を２官能性又はヘテロ官能性のスペーサー試薬に共有結合的に結合し、かつ前記誘導体化された第２成分を該スペーサー試薬に共有結合的に結合することによって前記カップリング工程工程（ｃ）を間接的に実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記スペーサー試薬がエチレンジアミン、１，６−ヘキサンジアミン、アジピン酸ジヒドラジド、シスタミン、グリシン、及びリジンからなる群から選ばれる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第１成分が多糖であり、そして前記第２成分がタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記多糖が、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）多糖、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）多糖、グループＡストレプトコッカス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）多糖、グループＢストレプトコッカス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）多糖、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）多糖、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖、及び髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）多糖からなる群から選ばれる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第２成分が水溶性タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第２成分が、ウシ血清アルブミン、百日咳トキソイド、破傷風トキソイド、マラリア誘導ペプチド、トキソイド、及びリポタンパク質からなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
百日咳トキソイド−肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）莢膜多糖（ＰＴ−Ｐｎ）、百日咳トキソイド−インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）多糖（ＰＴ−ＰＲＰ）、破傷風トキソイド−肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）莢膜多糖（ＴＴ−Ｐｎ）、抗体−デキストラン、及びペプチド−破傷風トキソイド−肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）莢膜多糖（ペプチド−ＴＴ−Ｐｎ）からなる群から選ばれる複合体である第１成分と第２成分の対を含む免疫原性構築物の製造方法であって、以下の工程：
（ａ）前記第１成分を、１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）で活性化して活性化された炭水化物を形成する工程、ここで、該活性化を、８〜１０のｐＨ、及び該多糖該１００ｋＤａ当たり１００：１〜５００：１モルの該ＣＤＡＰの比で、実施する、
（ｂ）前記第２成分を、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）、２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ’ｓ試薬）、ヨードアセチルプロピオネートＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＳＩＡＰ）、Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）、Ｅ−マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）、及びアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）から選ばれるチオール又はヒドラジド求核基で誘導体化する工程、及び
（ｃ）前記活性化された第１成分を前記誘導体化された第２成分にカップリングして、免疫応答を刺激することができる免疫原性構築物を形成する工程、ここで、該カップリングを、７〜９のｐＨで実施する、
を含む前記方法。
【請求項１１】
前記求核基が、ＥＭＣＨとＡＤＨから選ばれるヒドラジド求核基である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記カップリング工程（ｃ）を８未満のｐＨで実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記カップリング工程（ｃ）を８未満のｐＨで実施する、請求項４に記載の方法。
【請求項１４】
前記誘導体化された第２成分を２官能性又はヘテロ官能性のスペーサー試薬に共有結合的に結合し、かつ前記活性化された第１成分を該スペーサー試薬に共有結合的に結合することによって前記カップリング工程工程（ｃ）を間接的に実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
タンパク質、ペプチド、及びハプテンからなる群から選ばれる前記第２成分は、ＡＤＨで誘導体化される時又はそれ以前に、１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）で活性化される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関係する出願に対する相互参照
これは１９９５年３月２２日提出の米国特許出願第０８／４０８，７１７号の一部継続出願であり、後者は１９９３年９月２２日提出の米国特許出願第０８／１２４，４９１号の一部継続出願である。
【０００２】
政府の権利
本発明は、米国政府の目的のために、特許所有権者に特許使用料を払わないで製造し、実施許諾し、そして使用されることができる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ある種の物質、例えば、破傷風トキソイドは免疫応答を固有に誘発することができ、そして修飾せずにワクチンで投与することができる。しかしながら、他の重要な物質は免疫原性ではなく、そして免疫原性の分子または構築物に変換された後、免疫応答を誘発することができる。
【０００４】
本発明は、一般に、免疫原性構築物を製造する有利な方法に関する。本発明は、また、得られる免疫原性構築物およびそれから製造されたワクチン、およびこのような免疫原性構築物の使用に関する。
【０００５】
さらに詳しくは、本発明は免疫原性構築物の製造において使用するために炭水化物含有抗原を活性化する方法に関する。免疫原性構築物は、炭水化物含有成分を有機シアン化剤、例えば、１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）で活性化することによって非常に好都合に製造される。
【０００６】
種々のシアン化試薬は、例えば、アフィニティークロマトグラフィーのゲルを製造するために不溶性粒子を活性化するための試薬として、それ自体知られている。参照、Ｗｉｌｃｈｅｃｋ、ｅｔ  ａｌ．、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１０４Ｃ：３−５５。Ｗａｋｅｌｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｃ．Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．、１９７６：２１（１９７６）は、ＣＤＡＰがタンパク質のシステイン基を修飾するために使用できる温和な試薬であることを報告している。Ｋｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１５：３７５（１９８１）は、アガロース、すなわち、不溶性多糖樹脂の活性化剤として、ＣＤＡＰ、Ｎ−シアノトリエチル−アンモニウムテトラフルオロボレート（ＣＴＥＡ）、およびｐ−ニトロフェニルシアネート（ｐＮＰＣ）を比較した。他の研究者らは、他のタイプの不溶性粒子、例えば、セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）およびグリセリル制御孔ガラスを活性化するためにＣＤＡＰを使用した。参照、例えば、Ｃａｒｐｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、５７３：１３２−１３５（１９９２）。
【０００７】
米国特許第３，７８８，９４８号明細書（Ｋａｇｅｄａｌ  ｅｔａｌ．）には、一般に、第一級または第二級アミノ基を含有する有機化合物を１または２以上のヒドロキシルおよび／または第一級および／または第二級アミノ基を含有するポリマーに結合させるために、例えば、水溶性酵素を水不溶性ポリマーに結合させるために、有機シアネート化合物を使用する方法を一般に記載している。Ｋａｇｅｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．は、ある種の有機シアネート化合物、例えば、臭化シアンよりすぐれた利点を有するｐＮＰＣを使用する方法を記載している。
【０００８】
同様に、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、４７：４３９−４４４（１９９１）は、タンパク質との結合前に、可溶性多糖を活性化するためにＣＤＡＰを使用することを報告している。ここで、シアネートで活性化された低分子量４０ｋＤのデキストランに表皮成長因子（ＥＧＦ）が直接結合され、そしてデキストラン−ＥＧＦ複合体を製造するために、ほぼ５０：１（重量／重量）の非常に高いデキストラン／ＥＧＦの比が使用されており、そして培養された細胞へのこの複合体の結合が研究されている。
【０００９】
しかしながら、Ｋａｇｅｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．およびＡｎｄｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．は免疫原性構築物に関するものではない。事実、低分子量デキストランとのタンパク質の複合体は、免疫原性が低いか、または非免疫原性であることが報告された。Ｔ．Ｅ．Ｗｉｌｅｍａｎ、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、３８：２６４（１９８５）。
【００１０】
免疫原性の程度は、もちろん、ワクチン接種の目的のために免疫原性構築物の重要な性質である。ワクチン接種法は、病気を引き起こさないが、病気に対して保護する抗体、細胞、および他の因子の形成を刺激する抗原で体を免疫化することによって、侵入因子に対してそれ自体を保護する体の生得的能力を使用する。例えば、死んだ微生物を注射して、細菌性疾患、例えば、腸チフスおよび百日咳に対して保護し、トキソイドを注射して破傷風およびジフテリアに対して保護し、そして減衰した微生物を注射してウイルス疾患、例えば、ポリオおよび麻疹に対して保護する。
【００１１】
しかしながら、外来因子の注射により抗体形成を刺激することは常に可能であるというわけではない。ワクチン調製物は免疫原性でなくてはならない、すなわち、免疫応答を誘発することができなくてはならない。免疫応答は一般に下記のように記載することができる複雑な系列の反応である：（ｉ）抗原は体の中に入り込み、抗原提示細胞と出会い、抗原提示細胞は抗原をプロセシングし、それらの表面上に抗原の断片を保持する；（ｉｉ）抗原提示細胞上に保持された抗原断片は、Ｂ細胞を助けるＴ細胞により認識される；および（ｉｉｉ）Ｂ細胞は刺激されて増殖し、抗原に対する抗体を分泌する抗体形成細胞に分割する。
【００１２】
大部分の細菌多糖に対する抗体は、莢膜細菌の感染に対する保護を提供する。新生児および乳児は、多糖により例示されるようなＴ細胞依存性（ＴＩ）抗原に対する活力のある応答を装備することができないので、これらの微生物による生命を脅かす感染に対して極めて感受性である。このＴＩ抗原に対する免疫応答の障害は、Ｔ細胞のエピトープを多糖に結合し、これによりそれらをＴ細胞依存性（ＴＤ）抗原に変換することによって克服することができる。
【００１３】
免疫原性多糖構築物の製造に一般に使用される２つの結合法が存在する：（１）炭水化物とタンパク質との直接的結合；および（２）２官能性リンカーまたはスペーサー試薬を介する炭水化物とタンパク質との間接的結合。一般に、直接的結合および間接的結合の双方は、誘導化の前に炭水化物成分の化学的活性化を必要とする。
【００１４】
化学的活性化は、追加の化学的反応、例えば、官能基の付加または大きい成分、例えば、タンパク質の付加を実行できる形成に官能基を変換することを意味する。誘導化は、タンパク質への１または２以上の官能的化学的基またはスペーサー試薬の付加である。
【００１５】
不都合なことには、活性化法を使用して結合を介して免疫原性構築物を形成するとき、ある数の問題に当業者は直面する。例えば、複合ワクチンの生産は、むずかしい課題であった。なぜなら、一成分、多糖およびタンパク質を分解しないか、またはそれらの免疫原性エピトープを崩壊させない条件下に、多糖を活性化しそしてタンパク質を結合することが困難であるからである。免疫原性構築物の製造において、使用する方法は重要な抗原部位、すなわち、エピトープを分子上に保持するために十分に温和であるべきである。したがって、構造の完全性を維持しかつこれらの化合物におけるエピトープを保存することが望ましい。不都合なことには、この分野において現在使用されている製造工程はしばしば温和ではなく、自然の炭水化物および／またはタンパク質の構造を破壊することがある。
【００１６】
そのうえ、炭水化物を修飾する既知の技術の多くは無水条件を必要とする。しかしながら、不都合なことには、炭水化物は有機溶媒中にしばしば不溶性である。Ｍａｒｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １０８：５２８２（１９８６）。
【００１７】
こうして、炭水化物の修飾を記載する多数の化学文献が存在するが、それらの多くは水性抗原とともに使用するためには不適当である。１つのアプローチは、有機溶媒中の多糖の溶解度を増大するように多糖を修飾することであった。例えば、ある種の酸性多糖上の酸性水素を疎水性テトラブチルアンモニウム対イオンで置換することによって、Ｍａｒｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．は有機溶媒中に多糖を可溶化し、かつカルボニルジイミダゾール、すなわち、乾燥溶媒中で使用しなくてはならない試薬、でヒドロキシルを活性化することができた。この方法は多糖、例えば、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ＰＲＰおよび肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）多糖６Ｂおよび１９Ｆ型とともに使用される。タンパク質のカップリングは、また、還元性アミド化により、アルデヒドを使用して達成することができ、このアルデヒドは多糖の還元性末端上に存在するか、または炭水化物の酸化によりつくられる。これらのアプローチの双方は固有の制限を有し、こうして、高分子量の多糖について、還元性末端を介するカップリングは通常遅く、非効率的であり、そして酸化はしばしば多糖の切断を生ずるか、またはそうでなければ抗原に影響を与える。
【００１８】
ある種の炭水化物は、結合前にいっそう容易に活性化または誘導化することができる基、例えば、アミノまたはカルボキシル基を含有する。例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｆｉｓｈｅｒ  Ｉ型中のアミノ基はヨードアセチル基で容易に誘導化され、チオール化タンパク質に結合させることができる。炭水化物、例えば、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）ＩＩＩ型中のカルボキシル基は、水溶性カーボジイミド、例えば、ＥＤＣで活性化させ、次いでタンパク質に直接カップリングさせることができる。しかしながら、不都合なことには、炭水化物のこの基は制限される。
【００１９】
他の炭水化物は、末端の還元性末端に、誘導化および結合に利用できるアルデヒド基を有する。また、酸化試薬、例えば、過ヨウ素酸ナトリウムを使用してアルデヒド基をつくることができる。アルデヒド基をタンパク質上のアミノ基と、または２官能性リンカー試薬と縮合させることができる。しかしながら、この縮合反応、特に高分子量多糖の末端の還元性末端との縮合反応は、しばしば非常にゆっくりかつ非効率的に進行する。したがって、この方法を使用するとき、収率はしばしば非常に低い。そのうえ、過ヨウ素酸ナトリウムは炭水化物を小さい断片に破壊しおよび／またはエピトープを崩壊し、これらは望ましくないことがある。
【００２０】
大部分の炭水化物は結合前に活性化しなくてはならず、そして臭化シアンは活性化剤としてしばしば選択される。参照、例えば、Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｆ．。＆  Ｉｍｍ．、４０：２４５（１９８３）、およびＤｉｃｋおよびＢｅｒｒｅｔ、″Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ″、Ｃｏｎｊｕｇｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｊ．Ｍ．ＣｒｕｓｅおよびＲ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ（編）、ｖｏｌ．１０、４８−１１４（１９８９）。最初の実施許諾された複合ワクチンは、ＣＮＢｒでＨＩＢ  ＰＲＰを活性化し、次いでこれを酸性ジヒドラジドで誘導化し、水溶性カーボジイミドを使用して破傷風トキソイドにカップリングさせることによって製造された。
【００２１】
ＣＮＢｒ活性化法を簡単に要約すると、臭化シアンを炭水化物と高いｐＨ、典型的にはｐＨ１０〜１２において反応させる。この高いｐＨにおいて、炭水化物のヒドロキシル基とシアネートエステルを形成する。引き続いて、シアネートエステルを２官能性試薬、通常ジアミンまたはジヒドラジドと反応させる。次いで、これらの誘導化された炭水化物を２官能性基を介して結合させることができる。ある種の制限された場合において、シアネートエステルをまたタンパク質と直接反応させることができる。
【００２２】
高いｐＨはヒドロキシル基をイオン化するために必要とされる。なぜなら、この反応はシアネートイオン（ＣＮ-）に対するヒドロキシルイオンの求核性攻撃を必要とするからである。その結果、臭化シアンは多数の副反応を生成し、副反応のいくつかはネオ抗原を多糖に付加する。Ｍ．Ｗｉｌｃｈｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １０４Ｃ：３−５５。より重要なことには、多数の炭水化物または成分、例えば、ＨＩＢ  ＰＲＰおよびＰｎ６は、臭化シアンの活性化の実行に必要な高いｐＨにより、加水分解するか、または損傷されることがある。
【００２３】
ＣＮＢｒ活性化法を使用するときの他の問題は、形成したシアネートエステルが高いｐＨにおいて不安定であり、急速に加水分解し、誘導化された炭水化物の収率を減少し、それゆえ、タンパク質に結合した炭水化物の全体の収率を減少することである。多数の他の非生産的副反応、例えば、カルバメートまたは線状イミドカーボネートを生成する副反応は高いｐＨにより促進される。Ｋｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１５：３７５（１９８１）。そのうえ、臭化シアンそれ自体は高度に不安定であり、高いｐＨにおいて自発的に加水分解し、全体の収率をさらに減少させる。
【００２４】
さらに、臭化シアンの活性化は実行することが困難であり、そして信頼性がない。臭化シアンは高度に毒性であり、潜在的に爆発性である。生産において使用されるときのように大量を使用して作業するとき、極端な注意を払わなくてはならない。すべての操作を適当なフュームフード中で実施しなくてはならない。また、臭化シアンのあるバッチはよくはたらくが、あるものははたらかないので、活性化は再現性がないことはこの分野において知られている。臭化シアンは、また、水中によく溶けないので、炭水化物との反応に有効な炭水化物の量をコントロールすることは困難となる。臭化シアンの同一のバッチおよび明らかに同一の反応条件を使用してさえ、必ずしも同一の結果が得られるわけではない。
【００２５】
これらの欠点に加えて、臭化シアンを使用することによって達成される炭水化物の活性化の程度をコントロールすることは非常に困難である。また、この方法を使用して高いレベルの炭水化物の活性化を達成することは非常に困難である。臭化シアンの存在量を増加することは、無効であり、活性化を増加しないで、副反応を増加するだけである。Ｋｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ． ９：２８５（１９８４）。
【００２６】
したがって、臭化シアンの活性化は非常に有効な試薬であることが証明されたが、ある数の制限を有する。例えば、ヒドロキシルをシアネートイオンと反応させるために十分に求核性とするために、臭化シアンは高いｐＨ（１０〜１２）を必要とする。しかしながら、ＣＮＢｒおよびシアネートイオンのいずれも高いｐＨにおいて安定ではなく、結局試薬の大部分は加水分解するか、または非生産的副反応または不必要な副反応を行う。こうして、多糖の活性化効率は低い。さらに、活性化に要求される高いｐＨは多数のｐＨ感受性多糖を加水分解または損傷させることがある。さらに、ＣＮＢｒは毒性であり、そして少量で作業することが困難である。
【００２７】
そのうえ、前述したように、他の結合法は種々の欠点に悩まされる。例えば、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）および肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）の多糖３およびＶＩ型抗原のような多糖はタンパク質へのカップリングのための調製においてカーボジイミドで活性化できるカルボキシル基を有し、そしてシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｆｉｓｈｅｒ  ＩＩＩ型のような多糖は好都合に使用できるアミノ基を有し、これらの抗原はすべての多糖の比較的制限された基を形成する。したがって、多糖の大部分を活性化または官能化するために、他のアプローチを必要とする。
【００２８】
１つの提案された解決法は還元アミン化方法であり、この方法において、制限された数の反応性アルデヒドが生成し、アミンにカップリングされる。参照、Ｐ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎ． ３９、２３３−２３８（１９８３）。他の解決法はヘテロライゲーション、例えば、Ｍａｒｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．の２種類のスペーサー方法であり、この方法は、加水分解のとき独特のアミノ酸を生ずる、チオール−エーテル結合を使用する。参照、Ｍａｒｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １０８：５２８２（１９８６）。しかしながら、この方法は多糖が乾燥有機溶媒中に溶解すること必要とする。
【００２９】
制限された数のスペーサー基、例えば、ヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジヒドラジドの付加による制限された誘導化がまた提案された。次いで、これらを、例えば、臭化シアン法により付加することができる。この方法において、タンパク質のカルボキシルをカーボジイミドで活性化し、アミンまたはヒドラジドと反応させる。しかしながら、この方法はタンパク質と多糖との高度の架橋およびタンパク質の重合を引き起こす。
【００３０】
したがって、温和であり、炭水化物およびタンパク質の構造の完全性を維持し、化合物中のエピトープを保存し、実施が容易であり、信頼性があり、容易に再現可能であり、容易に大規模化可能であり、そして広範な種類の多糖を使用して作業することができる、免疫原性構築物の製造方法がこの分野において要求されている。
【発明の概要】
【００３１】
発明の要約
本発明の目的は、免疫原性構築物を製造する温和な方法を達成することである。他の目的は、炭水化物およびタンパク質の構造の完全性を維持しかつ化合物中のエピトープを保存する免疫原性構築物を作る方法を達成ことである。追加の目的は、実施が容易であり、信頼性があり、そして容易に再現可能である免疫原性構築物を製造する方法を達成することである。他の目的は、種々の多糖とともに使用できる免疫原性構築物を製造する方法を開発することである。追加の目的は、可溶性複合ワクチンを製造する好都合な方法を得ることである。他の目的は、容易に大規模化される方法を達成することである。本発明のこれらおよび他の目的は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。
【００３２】
本発明は、安全であり、容易であり、費用がかからず、そして炭水化物に対して温和である、炭水化物の活性化法を使用する結合法により、上記目的を達成し、これにより免疫原性構築物を製造する既知の方法の問題および欠点を克服する。そのうえ、この方法は均質反応を好都合に使用する。
【００３３】
本発明の方法は、好都合には、有機シアン化試薬、最も好ましくは１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）を使用して、炭水化物含有成分を活性化する。本発明の方法を使用すると、多糖のみが修飾され、タンパク質を回収可能とする、多糖とタンパク質との複合体を製造することができる。そのうえ、水溶性成分および／または界面活性剤可溶性成分の複合体を本発明に従い容易に製造することができる。
【００３４】
１つの好ましい態様において、本発明は活性化された炭水化物含有成分を第２成分、例えば、水溶性タンパク質に直接結合することを含む。他の好ましい態様において、本発明の方法は、官能性（２官能性またはヘテロ官能性）試薬を活性化された炭水化物含有成分に共有結合させ、さらに官能性試薬を第２成分、例えば、Ｔ依存性抗原と反応させて、炭水化物含有成分およびＴＤ成分が官能性試薬により形成されたスペーサーまたはリンカーにより結合されている、複合免疫原性構築物を形成することを含む。
【００３５】
他の好ましい態様において、免疫原性構築物は関係する米国特許出願第０７／８３４，０６７号（１９９２年２月１１日提出）、およびその一部継続出願第０８／０５５，１６３号（１９９３年２月１０日提出）（それらの明細書は引用することによって本明細書の一部とされる）に記載されている型の二重担体の構築物である。このような構築物の典型的な一次担体は、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）１４型（Ｐｎ１４）およびＤＮＡポリマーを包含する。
【００３６】
他の好ましい態様において、低いｐＫａを有する求核物質を形成するように誘導化された第２成分、例えば、タンパク質に、本発明は活性化された炭水化物含有成分を結合することを含む。このような誘導化に典型的な求核物質は、ヒドラジンおよびチオールを包含する。
【００３７】
本発明は、ＣＤＡＰで活性化後、タンパク質に直接的に結合できるか、またはスペーサーまたはリンカーを介してタンパク質に間接的に結合できる、広範な種類の可溶性炭水化物含有成分に適用可能である。本発明は、既知の方法を使用して製造された免疫原性構築物よりも効率よい、安価な、いっそう有効な免疫原性構築物の製造を可能とする。
【００３８】
そのうえ、ＣＤＡＰおよび反応条件は非常に温和であるので、炭水化物の構造の破壊、それゆえ、天然に存在するエピトープの破壊の危険は大きく減少する。さらに、この方法は、最近採用されている臭化シアンを使用する方法と比較して、下記表１に要約する利点を有する。
【００３９】
【表１】
0005594612.tif 000002
【００４０】
ＣＤＡＰを使用することに対する追加の利点は、ＣＤＡＰを前以て製造し、数カ月間溶液中に貯蔵することができ、そして活性試薬の濃度を３０１ｎｍにおける吸収から容易に測定できることである（Ｋｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１５：３７５（１９８１））。これにより、試薬濃度を標準化し、炭水化物の誘導化をいっそう再現可能とすることができ、これはワクチンの製造において使用するために重要である。
【００４１】
本発明の他の利点は、ｐＨのコントロールによる炭水化物とタンパク質との選択的または優先的カップリングを包含する。タンパク質およびペプチドの中に存在する共通の求核基の多数は比較的高いｐＫａを有するので、低いｐＨにおいて低いｐＫａを有する基を活性化された炭水化物にこれらの他の基の存在において選択的に結合することができる。
【００４２】
低いｐＨにおける選択的または優先的カップリングはある数の利点を有する。活性化された炭水化物は低いｐＨにおいていっそう安定であり、加水分解をより少なくすることができる。そのうえ、低いｐＨにおいて、炭水化物のヒドロキシル基は低い求核性（反応性）を有し、環状中間体の形成を最小にし、なかでも、シアネートエステルとの鎖間および鎖内の架橋を最小にする。加水分解がより低くかつ副反応がより少ないので、全体のカップリング反応の効率は増加し、炭水化物の活性化に要する試薬の量は少なくなり、それゆえ修飾は少なくなり、こうして、抗原性および免疫原性は増加する。
【００４３】
さらに、制限された数の低いｐＫａの求核物質でタンパク質を容易に誘導化することができ、こうしてタンパク質の変更を最小とすることができる。低いｐＨにおいて誘導化タンパク質上の反応性基の数は少ないので、低いｐＨにおける活性化された炭水化物への誘導化タンパク質のカップリングはタンパク質−多糖の結合の数を減少する。
【００４４】
そのうえ、ヒドラジドによるタンパク質の誘導化は、ヒドラジン中間体（例えば、ＴＮＢＳ、放射性プローブ、およびその他）の特性決定の容易さを包含する追加の利点を有する。これにより、カップリング前の誘導化の程度ならびに抗原性および免疫原性が変更された程度の測定は容易となり、品質のコントロールおよび誘導化を最適にする機会はいっそうよくなる。さらに、カップリング前後の遊離ヒドラジドの数を測定することによって、タンパク質−多糖の結合の数を決定することができる。さらに、遊離ヒドラジドの数の増加をモニターし、複合体中の結合が加水分解されていることを示すことができるので、品質のコントロールを改良することができる。
【００４５】
追加の利点は、カルボキシル基またはアミン基の選択的修飾を包含する、タンパク質の中へヒドラジンを導入する非常に多数の方法を包含する。したがって、この方法は比較的わずかのアミンを有し、一般にカップリング程度が低いトキソイドのカップリングに対して特に有利であることがある。そのうえ、ヒドラジンとシアネートエステルとの反応生成物は生理的ｐＨにおいて帯電していないが、アミンとシアネートエステルとの反応生成物は帯電している。
【００４６】
前述の利点は、炭水化物へのタンパク質の直接的結合およびスペーサーを介する間接的結合の双方に適用される。本発明の追加の目的および利点は、詳細な説明及び図面から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、有機シアン化試薬を使用する炭水化物の活性化の一般化スキームの１例を描写する。
【図２】図２は、タンパク質への活性化された炭水化物の結合の典型的なスキームを描写し、直接的結合は下部の左側に示されており、そして２官能性試薬を使用する間接的結合は下部の右側に示されている。
【図３】図３は、免疫原性構築物のモデルを示す。
【図４】図４は、デキストランの中へのＮＨ2 基の組込み／１０ｍｇ／ｍｌのデキストランにおいてデキストランの１モル当たり添加されたＣＤＡＰのモル数を図解する。
【図５】図５は、Ｓ４００ＳＦゲル濾過カラムからの 3Ｈ−ＢＳＡ−デキストラン複合体の溶離のプロフィルを図解する。
【図６】図６は、Ｓ４００ＳＦゲル濾過カラムから溶離された、本発明の方法に従い製造された免疫原性構築物のＯＤ２８０吸収を図解する。
【図７】図７は、Ｓ４００ＳＦゲル濾過カラムからのＨδa ／１−（ＣＤＡＰ）−デキストラン複合体の溶離のプロフィルを図解する。
【図８】図８は、Ｈδa ／ＮＨ2 −（ＣＤＡＰ）−デキストランを負荷したＳ４００ＳＦゲル濾過カラムから溶離されたＯＤ２８０およびＯＤ４３０値を図解する。
【図９】図９は、本発明の方法を使用して製造された免疫原性構築物の免疫反応性を図解する。
【図１０】図１０は、１．６ｍｇ／ｍｌのデキストラン（ｄｅｘ）におけるヘキサンジアミンおよびＣＤＡＰによるデキストランの誘導化の結果（ＮＨ2 ／１００ｋＤａ  ｄｅｘ／ｍｇ  ＣＤＡＰ／ｍｇ  ｄｅｘ）を示す。
【図１１】図１１は、ＣＤＡＰ活性化効率／多糖濃度のグラフである。
【図１２】図１２は、ＣＤＡＰ活性化についての種々のＣＤＡＰ／多糖の比におけるデキストランへのＢＳＡの直接的結合を示す。
【図１３】図１３は、ＢＳＡ／デキストランの比／ＣＤＡＰ活性化デキストランへのタンパク質の添加時間のプロットである。
【図１４】図１４は、水中のＣＤＡＰの安定性を示す。
【図１５】図１５は、ＣＤＡＰ活性化多糖へのタンパク質のカップリングの反応速度を図解する。
【図１６】図１６は、ＣＤＡＰ活性化へのｐＨの効果を示す。
【図１７】図１７は、ＣＤＡＰ活性化デキストランへのＢＳＡのカップリングに対するｐＨおよび種々の緩衝剤の効果を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
詳細な説明および好ましい態様
有機シアン化試薬（これは一般に式Ｒ−ＣＮまたは｛Ｒ+ −ＣＮ｝Ｘ- で表すことができ、ここでＲは有機成分であり、そしてＸは対イオンである）を使用する炭水化物の活性化についての一般化スキームは、第１図に示されている。第２図は、タンパク質への活性化された炭水化物の結合を図解する。
【００４９】
本明細書おいて使用するとき、「免疫原性構築物」は免疫応答を刺激できる実在物を意味する。免疫原性構築物は少なくとも１つの第２成分に結合した少なくとも１つの第１成分を含んでなる。本明細書おいて使用するとき、「成分」は、それ自体で、またはカップリングされたとき、免疫系を刺激するために使用できる物質である。
【００５０】
典型的な成分は、炭水化物、ペプチド、他の抗原、アジュバント分子、ハプテン、ＤＮＡ、およびそれらの組み合わせおよび誘導体を包含する。ハプテンは小さい分子、例えば、化学物質、ダスト、およびアレルゲンを意味し、それらはそれら自体で抗体の応答を引き出すことができないが、それらがいったん担体、例えば、ＴＮＰにカップリングされると、前記応答を引き出すことができる。抗原は、正しい環境下に、抗体の形成を誘発することができる分子である。これらのハプテンおよび抗原は、細菌、リケッチア、真菌、ウイルス、寄生生物、薬物、または化学物質から誘導することができるが、これらに限定されない。それらは、例えば、小さい分子、例えば、ペプチド、オリゴ糖（例えば、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）インフルエンザ菌のポリリボシル−リビトールーホスフェートオリゴマー）、ＤＮＡオリゴマー、脂質、トキソイド、エンドトキシン、およびその他を包含することができる。好ましい成分は水溶性であるか、または界面活性剤中で可溶化される。
【００５１】
好ましい態様において、第１成分は炭水化物含有成分である。本明細書おいて使用するとき、「炭水化物」は、任意の可溶性の単糖、二糖、オリゴ糖、または多糖を意味する。好ましくは、第１成分は多糖、より好ましくは水溶性多糖である。好ましい多糖は、下記の典型的なワクチンのチャートに列挙されているものを包含する。
【００５２】
炭水化物含有成分は好ましくは天然に存在する、半合成、または完全に合成の高分子量の分子である。好ましい態様において、少なくとも１つの炭水化物含有成分は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）多糖、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）多糖、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）多糖（Ｐｎ）、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ＰＲＰ、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、リポ多糖、グループＡおよびグループＢのストレプトコッカス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、およびそれらの組み合わせから選択される。
【００５３】
特に好ましい態様において、炭水化物含有成分はデキストランである。本明細書おいて使用するとき、「デキストラン」（ｄｅｘ）は単一の糖から構成された多糖を意味し、これは任意の数の源（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から入手することができる。他の好ましい炭水化物含有成分はフィコールであり、これは不活性の、半合成の、非イオン化、高分子量ポリマーである。
【００５４】
炭水化物含有成分は、有機シアン化試薬を使用して活性化される。好ましい有機シアン化試薬は、１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）、Ｎ−シアノトリエチルアンモニウムテトラフルオロボレート（ＣＴＥＡ）、およびｐ−ニトロフェニルシアネート（ｐＮＰＣ）である。これらの試薬のうちで、ＣＤＡＰは最も好ましい。シアネート基、必要に応じて種々の対イオンとの他の有機複合体を使用することができる。特に好ましい有機シアン化試薬は、非求核性対イオンを有するもの、例えば、テトラフルオロボレートである。
【００５５】
有機シアン化試薬による活性化後、第１成分を第２成分に結合する。好ましくは、第２成分はタンパク質であり、これはウイルス、細菌、寄生生物、動物、および真菌のタンパク質から選択することができる。特に好ましい第２成分は、リポタンパク質、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、百日咳トキソイド（ＰＴ）、ジフテリアトキソイド、ジフテリアトキソイド百日咳トキソイド（ＤＴ）、熱ショックタンパク質、Ｔ細胞超抗原、および細菌の外膜タンパク質を包含し、それらのすべては生化学または製剤の供給会社から入手できるか、または標準的方法により製造することができる（参照、例えば、Ｊ．Ｍ．ＣｒｕｓｅおよびＲ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ（編）、Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．１０（１９８９）（これは引用することによって本明細書の一部とされる）。他の適当なタンパク質は、この分野において知られているものから選択することができる。
【００５６】
第２成分の他の好ましい態様は、アルブミン、トキソイド、ペプチド、Ｔ細胞またはＢ細胞のアジュバント、またはＴ細胞の促進を活性化しかつレスキューすることができる任意の他の化合物である。第２成分は第３図に表されているようなＴ依存性抗原であることができる。
【００５７】
本発明の第２成分は、少なくとも１つの炭水化物含有成分に結合することができる。第２成分は炭水化物含有成分と反応できるか、または炭水化物含有成分と反応できるように化学的に修飾することができる官能基を含有することができる。本発明の特に好ましい態様において、第２成分を誘導化して、選択的カップリングのために十分に低いｐＫａを有する求核物質を形成する。本明細書おいて使用するとき、用語「十分に低いｐＫａ」は、カップリングのために選択されたｐＨにおいて反応するとき、求核物質がプロトン化されないが、他の反応性基がプロトン化されるように十分な程度に、求核物質のｐＫａがタンパク質またはペプチド中の他の反応性基のｐＫａより低いことを意味することを意図する。換言すると、求核物質は、タンパク質またはペプチド中の他の反応性基が反応性である程度が低い（すなわち、実質的にプロトン化される）特定のｐＨにおいて反応するように、選択される。したがって、カップリングに適当なｐＨは、他の因子の中でも、使用する特定の求核物質に基づいて選択される。好ましくは、選択するｐＨは約８より低い。適当な求核物質の例示的例は、ヒドラジドおよびチオールを包含する。
【００５８】
特に好ましい態様において、タンパク質またはペプチドの官能基はヒドラジドを形成するように誘導化される。ヒドラジドを当業者に知られている方法に従いタンパク質またはペプチドに付加することができる。
【００５９】
例えば、ポリペプチドの１または２以上のカルボキシル基を、高濃度のビスヒドラジド、例えば、アジピン酸ヒドラジドの存在において、カーボジイミド、例えば、ＥＤＡＣで活性化することができる。メチルイミダゾールおよび／またはＮＨＳの添加により、副反応を抑制できる。カーボジイミド／ポリペプチドのモル比により、誘導化の程度をコントロールできる。
【００６０】
同様に、タンパク質上のアミンをトラウト（Ｔｒａｕｔ）試薬、ＳＰＤＰまたはＳＡＴＡ（引き続いて脱保護を行う）を使用してチオール化し、次いでヘテロ２官能性試薬、例えば、ＥＭＣＨ（チオール反応性マレイミドおよびヒドラジドを含有する２官能性）と反応させることができる。誘導化の程度は初期のチオール化によりコントロールされる。また、標準的ヘテロライゲーション技術を使用してタンパク質をチオール反応性基（求電子試薬、例えば、マレイミドまたはヨードアセチル）で誘導化し、次いでチオールヒドラジドと反応させることができる。また、アミンを種々のビシナルヒドロキシル基含有試薬と反応させることができる。次いで、生ずる生成物を過ヨウ素酸ナトリウムで切り放し、ビスヒドラジドと反応させることができる。
【００６１】
グリコシル化タンパク質を、適当な試薬、例えば、過ヨウ素酸ナトリウムでｐＨ５において酸化することができる。次いで酸化生成物をビスヒドラジドと反応させて、本発明において使用するために所望の誘導体を形成できる。
【００６２】
合成の間に、ヒドラジドおよびチオールのような求核物質をタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチドおよび多数の薬物の中に混入することができる。また、システイン残基を所望の位置に配置し、引き続いてＥＭＣＨと反応させることによって、ヒドラジドを付加することができる。同様に、まず所望の部位にα−ハロケトン基を含有するペプチドを合成することによって、ヒドラジドを付加することができる。次いでこの基をチオールヒドラジドとの反応によりヒドラジドに変換することができる。参照、Ｂ．Ｉｖａｎｏｖｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６、２６９（１９９５）。
【００６３】
活性化後、第１成分を第２成分に結合する。特定の第２成分の多数のコピーならびに種々の第２成分を炭水化物含有成分に結合することができる。第１成分への第２成分の多数のコピーのカップリングは、第２成分に対する抗体の産生を有意に増強する。
【００６４】
本発明の方法は、免疫原性構築物の物理的性質および化学的性質の有利なコントロールを可能とする。本発明によれば、当業者は有利に：第１成分および第２成分上の電荷を変更することができ（カチオン化されたタンパク質がいっそう免疫原性であることができるという証拠に照らして有利である）；炭水化物含有成分の大きさを変化させることによって構築物の大きさをコントロールすることができ；鎖間または鎖内の構築物の架橋の程度を選択することができ（３次元のマトリックスの大きさおよびそれを変化させるために）；炭水化物含有成分に結合した第２成分のコピー数をコントロールすることができ；そして選択された細胞集団をターゲッティングする（例えば、マクロファージをターゲッティングして抗原提示を増強する）ことができる。ＤｉｃｋおよびＢｅｕｒｒｅｔ、″Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ″、Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｊ．Ｍ．ＣｒｕｓｅおよびＲ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ（編）、ｖｏｌ．１０、４８−１１４（１９８９）。
【００６５】
免疫調節因子および／または細胞ターゲッティング成分の添加により、本発明の構築物の免疫応答をさらに増強することができる。これらの実在物は、例えば、下記のものを包含する：（１）解毒されたリポ多糖または誘導体、（２）ムラミルジペプチド、（３）細胞表面の決定因子と相互作用して構築物を免疫学的に関係する細胞にターゲッティングすることができる炭水化物、脂質、およびペプチド、（４）インターロイキン、（５）抗体、および（６）ＤＮＡオリゴマー。
【００６６】
したがって、別の態様において、第３成分を１または２以上の第１成分および／または第２成分に、本明細書において記載するＣＤＡＰ活性化のような方法または他の既知の技術により、結合することができる。米国特許出願第０７／８３４，０６７号および同第０８／０５５，１６３号明細書に、第３成分に対する増強された抗体の応答を促進する構築物が記載されている。第１成分または第２成分に種々の成分を結合するある種の技術は、当業者によく知られており、例えば、利用可能な官能基（例えば、アミノ、カルボキシル、チオおよびアルデヒド基）を介するカップリングを包含する。参照、Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、およびＢｒｅｎｋｅｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、″Ｂｒｉｅｆ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒ  Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  Ｗｉｔｈ  Ｄｙｅｓ，Ｈｐａｔｅｎｓ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ″、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３：１（Ｊａｎ．１９９２）（これらは引用することによって本明細書の一部とされる）。こうして、１官能性試薬を第３成分として使用して、例えば、電荷を変更し、疎水性を変化させ、構築物を標識化し、およびその他をなすことができる。
【００６７】
本発明の方法において、有機シアン化試薬を使用して炭水化物含有成分を活性化する。有機シアン化試薬は好ましくはＣＤＡＰであり、これはシアネートの求電子性を増加しそして、炭水化物含有成分と反応するとき、シアノ基を炭水化物のヒドロキシル基に移し、こうして、それをそれ以上の反応、すなわち、タンパク質への直接的または間接的結合のために準備する。活性化反応は中性のｐＨにおいてまたは温和に塩基性の条件（例えば、約８〜約１０のｐＨ）下に実施することができ、これは多糖および活性中間体の安定性および完全性を改良する。
【００６８】
ＣＤＡＰは高度に安定性でありかつ比較的安全であるので、有利である。ＣＤＡＰは水溶性有機シアン化試薬であり、その中のシアノ基の求電子性が増加されており、温和な条件下にシアン化反応の実施を好都合に可能とする。さらに、ＣＤＡＰを使用して広範な種類の多糖を活性化することができ、次いで活性化された多糖をジアミンまたはジヒドラジドで官能化することができる。高い活性化およびＣＤＡＰシアン化反応の温和な条件のために、ワンポット反応においてタンパク質を多糖に直接的に結合することができ、これにより、スペーサー分子の非存在においてさえ、多糖およびタンパク質成分の双方に対する抗体の応答を誘発する複合ワクチンの製造は簡素化される。ＣＤＡＰは使用容易であるので、種々の条件下のタンパク質−多糖複合体の製造が促進され、こうして複合ワクチンの免疫原性の重要なパラメーターの研究が可能となる。そのうえ、ＣＤＡＰ活性化多糖を使用して種々の他の有用な免疫学的試薬、例えば、ビオチニル化多糖および抗体連鎖デキストラン、例えば、Ｈδa ／１を製造することができる。
【００６９】
活性化は好ましくは約６〜約１０、より好ましくは約９〜約１０のｐＨにおいて実施される。ｐＨは種々の技術（例えば、緩衝液の使用、ＮａＯＨの添加、およびその他）により調節して、製造される特定の構築物に適合させることができる。例えば、活性化は、種々の溶媒中で、この分野において知られている種々の適当な非求核性緩衝剤の１または２以上を使用して、実施することができる。適当な溶媒は、生理食塩水、水、およびいくつかの有機溶媒を包含する。適当な非求核性緩衝剤の例は、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、リン酸塩、炭酸塩、およびホウ酸塩である。
【００７０】
本発明の好ましい態様において、ＣＤＡＰを乾燥アセトニトリル中において１００ｍｇ／ｍｌ濃度または水中において７５ｍｇ／ｍｌまでの濃度で貯蔵液中に溶解する。使用する炭水化物含有成分の特質および所望の活性化の程度に依存して、ＣＤＡＰの種々の量が最適であろう。
【００７１】
好ましい態様において、炭水化物含有成分の濃度は１〜２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１〜１５ｍｇ／ｍｌである。活性化反応は約１００ｍｇ／ｍｌまでの濃度で首尾よく実施することができる。好ましくは、タンパク質の直接結合のためのＣＤＡＰ／炭水化物含有成分の比は約１００：１〜約５００：１モルのＣＤＡＰ／１００ｋＤａの炭水化物含有成分である。他の好ましい態様において、スペーサーを使用するタンパク質の間接結合のためのＣＤＡＰ／炭水化物含有成分は約１０：１〜約５００：１モルのＣＤＡＰ／１００ｋＤａの炭水化物含有成分である。成分の特質および使用する条件に依存して、異なる成分の比が最適であることがある。
【００７２】
未反応のＣＤＡＰおよび反応の副生物、例えば、ジメチルアミノピリジンは、誘導化またはタンパク質へのカップリングの前に、好ましくは酸性条件下に、適当な精製技術、例えば、透析、限外濾過、または適当なバイオプロセシングビーズ、例えば、ＳＭ４ビーズ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して除去することができる。精製された活性化多糖は、また、沈降、例えば、冷エタノールを使用する沈降により調製可能である。
【００７３】
好ましい態様において、ＣＤＡＰで活性化された炭水化物含有成分を第２成分に直接的に結合して免疫原性構築物を製造する。本発明の好ましい態様において、活性化された炭水化物含有成分を適当な２官能性試薬またはヘテロ官能性試薬に共有結合させる。このような官能性試薬の例は、エチレンジアミン、１，６−ヘキサンジアミン、アジピン酸ジヒドラジド、シスタミン、リジン、グルタミン酸、チオールヒドラジド、およびチオールアミンであり、必要に応じて適当に保護される。参照、Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、″Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ″、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）。次いで、既に他の末端において炭水化物含有成分に共有結合されている官能性試薬に、第２成分を共有結合させる。
【００７４】
カップリング反応のために好ましいｐＨ範囲は、約７〜約９、最も好ましくは約７〜約８．５である。デキストランのような多糖を結合するために、ｐＨは好ましくは約７．４〜約８である。第２成分を誘導化してジヒドラジドのような求核物質を形成するとき、カップリング反応のためにｐＨは好ましくは約８より小さく、より好ましくは約７より小さい。
【００７５】
１つの好ましい態様において、ＣＤＡＰを使用して、多糖をタンパク質に約１：１〜約３：１、例えば、１：１の比において結合させる。最適な結果のためには、高い多糖濃度を回避する。好ましい構築物は、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）多糖に結合した破傷風トキソイドおよびインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ＰＲＰ結合した破傷風トキソイドを包含する。本発明に従い製造された他の好ましい複合体は、ＴＴ−ＰＲＰ、Ｐｎ１４−ＴＴ、Ｐｎ２３−ＴＴ、マラリア誘導ペプチド−Ｐｎ１４、ＤＴ−Ｐｎ１４、Ｐｎ６−ＴＴ、Ｐｎ１９−ＴＴ、およびペプチド−ＴＴ−Ｐｎを包含する。
【００７６】
好ましい態様において、トリエチルアミン（ＴＥＡ）を使用して、中間体フォン・ブラウン（Ｖｏｎ  Ｂｒａｕｎ）複合体の形成を介して先行することがある、シアン化反応を促進させる。ＴＥＡの代わりに、フォン・ブラウン複合体を形成できる他の第三級アミン使用することができる。Ｊ．Ｖｏｎ  Ｂｒａｕｎ、Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ． ３３：１４３８（１９００）。
【００７７】
ある種の結合反応のために、グリシン、アミノエタノール、または他のアミノ含有試薬を使用して反応をクエンチすることができる。また、複合体の電荷を変更する１つの方法として、このようなクェンチング試薬を使用することができる。
【００７８】
他の態様において、本発明は、免疫原性構築物と、薬学上許容される媒質またはデリバリーベヒクルとから構成されたワクチンに関する。このようなワクチンは、患者への適切な投与の形態を提供するために、有効治療量の免疫原性構築物と、適当量のベヒクルとを含有するするであろう。これらのワクチンは、明礬または他のアジュバントを含んでなることができる。
【００７９】
典型的な薬学上許容される媒質またはベヒクルは、無菌の液体、例えば、水および油、例えば、石油、動物、植物または合成由来のもの、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油、およびその他である。医薬組成物を静脈内に投与するとき、生理食塩水は好ましいベヒクルである。また、水性デキストランおよびグリセロール溶液を液状ベヒクルとして、特に注入用溶液のために、使用することができる。適当な製剤用ベヒクルは、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（引用することによって本明細書の一部とされる）に記載されている。
【００８０】
本発明に従い製造できるワクチンは、下記のものを包含するが、これらに限定されない：
チャート
ジフテリアワクチン
破傷風（サブユニット）ワクチン
破傷風ワクチン
インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型（リン酸ポリリボース）
肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、すべての血清型
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンドトキシンまたはＪ５抗原（ＬＰＳ、脂質Ａ、およびゲンタビオース）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｏ多糖（血清型特異的）
クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、多糖（血清型特異的）
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、５および８型（血清型特異的および普通の防御抗原）
表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、血清型多糖Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ（および普通の防御抗原）
髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清型特異的または
【００８１】
防御抗原
ポリオワクチン
おたふくかぜ、麻疹、風疹のワクチン
ＲＳウイルス
狂犬病
Ａ、Ｂ、Ｃ型肝炎、およびその他
ヒト免疫不全ウイルスＩおよびＩＩ（ＧＰ１２０、ＧＰ４１、ＧＰ１６０、ｐ２４、およびその他）
単純ヘルペス１および２型
ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）
ＥＢＶ（エプスタイン−バールウイルス）
水痘／帯状ヘルペス
マラリア
結核
カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、他のカンジダニューモシティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）
マイコプラズマ
インフルエンザウイルスＡおよびＢ
アデノウイルス
グループＡストレプトコッカス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）
グループＢストレプトコッカス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、
【００８２】
血清型、Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、およびＩＩＩ
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（血清型特異的）
ライノウイルス
パラインフルエンザエ、１、２、および３型
コロナウイルス
サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）
シゲラ［赤痢菌］（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）
ロタウイルス
エンテロウイルス
トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）およびニューミニエ（ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＴＷＡＲ）クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）
【００８３】
本発明は、また、免疫刺激量のワクチンを投与することによる患者の治療に関する。用語「患者」は、治療が有益である任意の被検体を意味し、そして哺乳動物、特にヒト、ウマ、雌牛、イヌ、およびネコ、ならびに他の動物、例えば、ニワトリを包含する。「免疫刺激量」は、疾患の予防、改善、または治療のために患者の免疫応答を刺激することができるワクチンの量を意味する。本発明のワクチンは、任意の適当なルートにより投与できるが、好ましくは静脈内、筋肉内、鼻内、または皮下の注射により投与される。
【００８４】
本発明は、また、患者を前述のワクチンで免疫化し、こうしてドナーがワクチンに対して向けられた抗体を生産するようにすることによって、細菌、ウイルス、寄生生物、または化学物質により引き起こされる感染に対する免疫治療因子を調製する方法に関する。抗体は単離するか、またはＢ細胞を取得した後、骨髄腫細胞と融合してモノクローナル抗体をつくることができる。モノクローナル抗体をつくる方法は、一般に、この分野において知られている（参照、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）（詳しくは引用することによって本明細書の一部とされる）。本明細書において使用するとき、「免疫治療因子」は、患者の受動的治療において使用するための特定の免疫原に対して向けられた抗体の組成物を意味する。血漿ドナーは、ワクチン中に含有されている免疫原に対する抗体を産生するためのワクチンで注射される任意の被検体である。
【実施例】
【００８５】
実施例１
スペーサーを使用する炭水化物含有成分の誘導化
材料：
ＣＤＡＰ、ピリジン、ヘキサンジアミン、ホウ酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、およびトリエチルアミン（ＴＥＡ）をアルドリッヒ（Ａｌｄｒｉｃｈ）（ウィスコンシン州ミルウォーキー）から購入した。炭水化物含有成分、Ｔ２０００デキストラン（平均分子量２０００ｋＤａを有する）は、ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（ニュージャージイ州パルシパニイ）から入手した。
【００８６】
乾燥アセトニトリル中のＣＤＡＰの１００ｍｇ／ｌの貯蔵液を−２０℃において貯蔵し、使用するとき、氷上に保持した。Ｔ２０００デキストランを生理食塩水＋０．０２％のアジド中において１０．５ｍｇ／ｍｌで調製した。水性トリエチルアミンの貯蔵液を０．２Ｍで調製し、使用の間、氷上に保持した。
【００８７】
ヘキサンジアミンを０．１Ｍのホウ酸ナトリウム中において０．５Ｍで調製した。
トリニトロベンゼンスルホネート（ＴＮＢＳ）および１１，０００ｍ-1の吸光係数を３６６ｎｍにおいて使用して、アミノ基を測定した。Ｆｒａｎｃｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、８６：１５５（１９８６）。Ｍ．Ｍｏｎｓｉｇｎｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、１７５：５２５（１９８８）の方法により、標準としてＴ２０００デキストランを使用して、炭水化物をアッセイした。
【００８８】
コントロール反応：
下記の実施例により、本発明の誘導化反応において使用する化合物の重要性を証明する。最終の複合体中のアミノ基は炭水化物に共有結合されており、そしてアミノ基の存在は人工物または最終生成物の中への試薬の「キャリオーバー」のためではないことを、結果は示す。実施した実験について、試薬の省略または置換は表２に示す通りであった。
【００８９】
すべての試薬を使用する手順において（表２の第１行）、ＣＤＡＰを３００μｌのデキストラン（３．１ｍｇ）の撹拌溶液に添加し、氷のバケツに戻した。３０秒後、ＴＥＡを撹拌溶液に添加した。ＣＤＡＰの添加後２分に、２００μｌのジアミンを添加し、この溶液を氷上にさらに１時間保持した。試料を一夜透析し、ミレックス（Ｍｉｌｌｅｘ）ＧＶフィルターで濾過し、さらに１×１５ｃｍのＰ６ＤＧカラム（ＢｉｏＲａｄ）上で脱塩した。
【００９０】
下記表２に示すように、アミノ基はデキストラン、ＣＤＡＰ、ＴＥＡ、およびヘキサンジアミンの存在においてデキストランの中に最適に取込まれた。表２のデータがさらに示すように、検出されたアミノ基は最終生成物の中への未結合試薬のキャリオーバーのためではない。これらの結果はＴＥＡが誘導化のために不必要であることを示すが、ＴＥＡが存在しないとき、誘導化の程度は低いことが示される（後述するように、多分低いｐＨのためである）。
【００９１】
【表２】
0005594612.tif 000003
【００９２】
ヘキサン１，６−ジアミンによるＴ２０００デキストランの誘導化
この実験は、炭水化物を誘導化してアミノ基を高い比および低い比で導入するためにＣＤＡＰを使用できることを証明する。デキストランＴ２０００をモデルの炭水化物として使用した。デキストランはグルコースモノマーから構成されたポリマーである。
【００９３】
多数の複合ワクチンの製造における第１工程はスペーサーの添加である（ＤｉｃｋおよびＢｅｕｒｒｅｔ、″Ｇｌｙｃｏｃｎｊｕｇａｔｅｓ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ″、Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｊ．Ｍ．ＣｒｕｓｅおよびＲ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ（編）、ｖｏｌ．１０、ｐｐ．４８−１１４（１９８９））。この系列の実験は、表３に要約されており、スペーサーを多糖に容易に添加できることを強調している。
【００９４】
【表３】
0005594612.tif 000004
【００９５】
この実験を２つの温度において実施した。表３の第１〜７および１１行に要約する実験において、すべての試薬を氷冷し、そして第８〜１０行に要約する実験において、試薬は室温であった。手順および試薬を表２に要約する実験について前述したように使用し、そして試薬の添加量は表３に示す通りであった。第１１行に表す実験において、ジアミンを０．１５ＭのＨＥＰＥＳ中の溶液として添加した。この反応は低いｐＨにおいて効率がわずかに低かった。他の実験において、ヘキサンジアミンを０．１Ｍのホウ酸塩、ｐＨ９、中で調製した。
【００９６】
効率は、百分率として表した、使用したＣＤＡＰの１モル当たり取込まれたスペーサー基のモル数として定義される。最後の列（誘導化％）は、スペーサーで修飾されたデキストランのグルコースモノマー単位の百分率である。
【００９７】
結果はさらに第４図に図解されており、第４図は取込まれたアミノ基の合計数（例えば、添加されたスペーサー試薬）／デキストランの１モル当たり添加されたＣＤＡＰのモル数／デキストランのモル数を示す。このデータをＮＨ2 の取込み／ＣＤＡＰのモル数／デキストランの１モル当たり添加されたＣＤＡＰのモル数に変換したとき、１より小さいＣＤＡＰ／グルコース比は高いレベルのＮＨ2 の取込みのために十分であることが明らかである。したがって、高いＮＨ2 基の取込みのために、デキストラン多糖の最小の修飾が必要である。
【００９８】
さらに、活性シアネートエステルの未決定量がスペーサー添加なしで加水分解されるので、ＣＤＡＰ／グルコース比はポリマーの修飾度の過大評価である。したがって、実際の修飾度は計算されたＣＤＡＰ／グルコース比より低い。
【００９９】
試験した最低の試薬投与量（第１行）３．１％におけるスペーサー基の取込みの程度を、複合ワクチンの合成に使用されたそれと比較する（Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｆ．＆  Ｉｍｍ．、４０：２４５（１９８３）；ＤｉｃｋおよびＢｅｕｒｒｅｔ、″Ｇｌｙｃｏｃｎｊｕｇａｔｅｓ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ″、Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｊ．Ｍ．ＣｒｕｓｅおよびＲ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ（編）、Ｖｏｌ．１０、ｐｐ．４８−１１４（１９８９）。
【０１００】
表および図面は、スペーサー試薬を添加するためのＣＤＡＰ反応の高い効率を証明する。反応条件のさらに最適化すると、効率を増加することができる。また、ＣＤＡＰを使用して可能である、多糖の中へのスペーサー基の非常に高い取込みレベルが示されている。最大のＣＤＡＰの添加量（第７行）において、グルコース単位の５のうちのほぼ１がスペーサーで修飾された（２０％）。臭化シアンでこの程度のスペーサーの取込みを得ることができない（ＫａｇｅｄａｌおよびＡｋｅｒｓｔｒｏｍ、Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃａｎ．、２５：１８５５（１９７１））。
【０１０１】
反応の間に、デキストラン多糖の明らかな沈降が存在した。対照的に、多糖の凝集および沈降は臭化シアン法を使用するときの１つの問題であることがある（ＫａｇｅｄａｌおよびＡｋｅｒｓｔｒｏｍ、Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃａｎ．、２５：１８５５（１９７１））。
【０１０２】
これらの反応は小さい体積（＜１ｍｌ）で実施され、こうして多数の試験的実験を好都合に実施することができた。価値ある炭水化物およびタンパク質を浪費しないで手順を最適化するとき、これは重要である。したがって、小さい体積の例示された試薬ならびに本明細書において記載する他の情報から、当業者は商業的使用のために大規模化するとき所望のように多い量を使用して本発明を容易に実施することができる。対照的に、非常に少量の臭化シアンを使用して好都合に作業することは困難である。なぜなら、臭化シアンは水溶性が低く、効力および毒性が不確実であるからである。
【０１０３】
そのうえ、表３の第８〜１０行をだい１〜７および１１行と比較すると、カップリング反応を０℃または室温において実施したとき、デキストラン中へのアミノ基の取込みレベルはほぼ同一であったように思われる。
【０１０４】
ＣＤＡＰを使用する結合反応の効率の証明および放射性標識化タンパク質を使用する結合の証明
ＣＤＡＰを使用する結合反応はタンパク質濃度を推定するために通常使用される波長２８０ｎｍにおいて多少の吸収を引き起こしたので、放射性標識化タンパク質をデキストランに直接結合させた。タンパク質の収率および回収を決定した。
【０１０５】
特にＢｒｕｎｓｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４０：３３６４（１９８８）に開示されているように、ＢＳＡをＮ−ヒドロキシスクシンイミド（3Ｈ−２，３）−プロピオネート（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で放射性標識化した。放射性標識化ＢＳＡをＰＢＳ＋０．０２％アジドの中に完全に透析し、Ｓ１００ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上のゲル濾過クロマトグラフィーにかけて凝集を除去し、そしてＹＭ３０フィルター（Ａｍｉｃｏｎ）を使用して限外濾過した。ＢＳＡ濃度は、２８０ｎｍ（４４，０００Ｍ-1）におけるその吸光係数から決定して、２１ｍｇ／ｍｌであった。液体シンチレーション計数により決定された貯蔵液の比活性は５．４８×１０12ｃｐｍ／モルであった。
【０１０６】
他の試薬は下記の通りであった：Ｔ２０００デキストラン（ほぼ２０００ｋＤａ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を１０．５ｍｇ／ｍｌにおいて水中に溶解した。ＣＤＡＰを乾燥アセトニトリル中において１００ｍｇ／ｍｌで調製し、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）を水中において０．２Ｍで調製した。グリシン（ｐＨ５．０）を水中において１Ｍで調製した。
【０１０７】
プロトコール：試薬を氷上に保持し、そしてすべての反応を氷上で実施した。反応混合物を各添加の間に撹拌した。２５μｌのＣＤＡＰを０．５ｍｌのデキストラン（５．２５ｍｇ）に添加し、３０秒後、２５μｌのＴＥＡを添加した。合計２．５分後、５．２５ｍｌの放射性ＢＳＡを添加した。３０分後、反応を１００μｌのグリシンの添加によりクエンチし、４℃において一夜放置した。次いでスピン（Ｓｐｉｎ）−Ｘ膜（ＣＯＳＴＡＲ）を使用して、０．６ｍｌのアリコートを濾過した。濾過前後における放射性アリコートを比較すると、放射能の本質的１００％がフィルターの中に回収されたことが証明された。生理食塩水＋０．０２％のアジドと平衡化させた１×５７ｃｍのＳ４００ＳＦゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に５００μｌのフィルターを適用し、０．２ｍｌ／分において展開させた。０．８９ｍｌの画分を集め、分析した。Ｍｏｎｓｉｇｎｙ  ｅｔ  ａｌ．の方法により４８０ｎｍにおける吸収を使用して、デキストラン濃度を測定した。各管から採った５０μｌのアリコートの放射能を液体シンチレーション計数により測定し、そして 3Ｈ−ＢＳＡ濃度をその比活性を使用して計算した。カラムの溶離における未結合ＢＳＡの位置を独立のカラムの展開において決定した。
【０１０８】
第５図に示すように、ＢＳＡの大きい部分（ｃｐｍで表わされる）は高分子量の形態であり、これはデキストランと同一位置において展開し、ＯＤ４８０で表わされる。未結合タンパク質を表す小さい残留ＢＳＡピークが存在する。表４は精製データを含む。
【０１０９】
【表４】
0005594612.tif 000005
【０１１０】
このカラムは、未結合タンパク質からデキストラン−ＢＳＡ複合体をきれいに分離しなかった。これは異常である。なぜなら、高分子量ポリマーはゲル濾過カラムにおいてテイリングをしばしば引き起こすからである。さらに、Ｔ２０００デキストランは未分画であったので、ある範囲の大きさを有した。遊離ＢＳＡおよび結合ＢＳＡがオーバーラップする領域における結合したＢＳＡの量を推定するために、結合ＢＳＡ／デキストランの一定比を仮定した。合計の結合ＢＳＡ（ＢＳＡ／デキストラン比×デキストランの合計のモル量から計算された）は２．５５ｍｇとして決定された。これにより示されるように、タンパク質の８７％が結合した形態に変換された。
【０１１１】
【表５】
0005594612.tif 000006
【０１１２】
このＢＳＡ−デキストランの実験結果を表５（第１行）に、異なる量のＣＤＡＰおよびＴＥＡを使用する３つの他の試験（第２〜４行）と一緒に要約する。ＴＥＡの量およびＣＤＡＰの量の双方は、直接的結合により高いタンパク質／多糖の比を得ることを促進する。この方法は少量を使用して好都合な実験を可能とするので、試薬の最適な量を容易に決定することができる。
【０１１３】
カーボジイミドまたはヘテロライゲーションのカップリング法と異なり、直接的結合反応は未結合タンパク質を修飾せず、またそれは苛酷な条件を使用しないことを強調すべきである。したがって、それ以上の使用のために未結合タンパク質を回収できるであろう。多数のタンパク質抗原が価値があるので、これは直接的結合法の１つの主要な利点である。
【０１１４】
実施例２Ａ
ＰＴ−Ｐｎ１４複合体の製造
これらの実験の目的は下記の通りである：（１）低分子量の形態から高分子量の形態へのタンパク質の転換が炭水化物へのタンパク質の直接的結合の結果であることを証明すること；（２）１つの特定の組の条件下に、タンパク質の結合に必要なシアン化試薬の最小量を決定すること；および（３）臨床的に関係する複合体を本発明の方法を使用して製造できることを証明すること。
【０１１５】
百日咳トキソイド（ＰＴ）（Ｍａｓｓ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｂｉｏｌ．Ｌａｂｓ、マサチュセッツ州ボストンから入手した）を０．５ＭのＮａＣｌ、０．０２Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．８、中に０．２８９ｍｇ／ｌにおいて溶解した。ＰＴの１００ｍｌ当たり０．１ｍｌの０．１Ｍのホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．１、または０．７５ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、を添加した。肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）１４型（Ｐｎ１４）（ＡＴＣＣロット８３９０９）を０．１５Ｍの生理食塩水＋０．０２％のアジド中に５ｍｇ／ｍｌにおいて溶解した。トリエチルアミン（ＴＥＡ）水中に０．２Ｍにおいて溶解した。ＣＤＡＰをアセトニトリル中に１００ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌにおいて溶解した（−２０℃において調製しかつ貯蔵した）。グリシンを１．０Ｍ、ｐＨ５．０において調製した。グリシン／ＨＣｌの代わりに、アミノエタノールまたは他のアミノ試薬を使用できる。
【０１１６】
実験１−直接的結合による有効な条件下に構築物の合成：ＰＴ−Ｐｎ１４
各管は氷上において２５０μｇのＰｎ１４（５０μｌ）を含有した。時間ゼロにおいて、表に示す種々の量のＣＤＡＰを添加し、３０秒後、２５μｌのＴＥＡを添加した。２分後、１ｍｌのＰＴを添加した。約１時間後、１００μｌのグリシン溶液を添加した。
【０１１７】
試料を４℃に一夜保持した。次の日に、試料をコスター（Ｃｏｓｔａｒ）０．４５ミクロンの回転フィルターで濾過し、ＨＰＬＣＴＳＫ−ゲル濾過カラム上で０．２ＭのＫＣｌ中で展開させた。ＨＭＷ％は高分子量ＯＤ２８０複合体ピークの面積／未結合成分を示すＯＤ２８０ピークの面積である。それは（空隙体積のピークの面積％）／（空隙体積のピークの面積％＋未結合成分のピークの面積％）により定義される。ＨＰＬＣ展開から得られた面積％は、下記の通りであった：
【０１１８】
【表６】
0005594612.tif 000007
【０１１９】
ＰＴ対照は２２％のＨＭＷを有するので、反応条件により引き起こされるＰＴの凝集が少量で存在することがある。この組のデータは、また、ＣＤＡＰ／多糖（Ｐｓ）回転を変化させることによって、最終複合体におけるタンパク質／炭水化物の比をコントロールできることを示す。
【０１２０】
実験２−ＰＴへの単糖の結合
この系列において、Ｐｎ１４多糖の代わりに１５０μｌの１０ｍｇ／ｍｌのモノマーのグルコースの溶液を使用した。実施例１に類似する条件を使用したが、ただしホウ酸塩の代わりにＰＴをＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５、０．０７５Ｍ）中で調製した。また、２５μｌのＴＥＡの代わりに２０μｌを使用した。これらの条件は下記のものを生じた：
【０１２１】
＃ 条件 ＨＭＷの
形態％
１    ＰＴのみ、ＣＤＡＰまたはＴＥＡなし            ＜２０％
２    ＣＤＡＰ、ＴＥＡ（グルコースなし）；＋ＰＴ    約０
３    グルコース、ＣＤＡＰ、ＴＥＡ；＋ＰＴ          約０
【０１２２】
Ｎｏ．２および３は、ＣＤＡＰが百日咳トキソイドそれ自体を重合しないこと、したがって、ＰＴの高分子量形態への変換が高分子量多糖へのそのカップリングのためであり、タンパク質の重合のためでないことを示す。ＨＰＬＣの展開から、ＰＴの分子量のわずかの増加が存在したので、グルコースがＰＴに結合したことが明らかであった。
【０１２３】
実験３−スペーサーを介する有効なワクチン構築物の合成：ＰＴ−Ｐｎ１４
ヘキサンジアミンで誘導化されたＰｎ１４を下記のようにして調製した。１０μｌのＣＤＡＰ（アセトニトリル中の１００ｍｇ／ｍｌ）を添加した（１９３モルのＣＤＡＰ／１００ｋＤａの多糖）。３０秒後、；２０μｌのＴＥＡ（０．２Ｍ）を添加した。合計２．５分後、３００μｌの０．１Ｍのホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．１）中の０．５Ｍのヘキサンジアミンを添加した。１時間後、この溶液を水中に透析し、濾過し、Ｐ６ＤＧ（ＢｉｏＲａｄ）カラム上で生理食塩水中に脱塩した。空隙体積をプールし、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）３０装置（Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮した。それは３３アミノ基／１００ｋＤａのＰｎ１４多糖を有することが決定された。
【０１２４】
百日咳トキソイドをヘテロライゲーション化学を使用してアミノ−Ｐｎ１４に結合した（Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．）。５０μｌの０．７５ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）を０．４４ｍｌのアミノ−Ｐｎ１４に添加した。それを１０μｌの０．１ＭのヨードアセチルプロピオネートＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＳＩＡＰ）でヨードアセチル化した。百日咳トキソイドを２０倍モル過剰量のＳＡＴＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カリフォルニア州ラジョラ）でチオール化した。各々を生理食塩水中に脱塩し、混合し、１／９体積の０．７５ＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、および０．５Ｍのヒドロキシルアミンを含有する緩衝液を添加した。最終体積は１．１ｍｌであった。一夜インキュベートした後、この溶液をメルカプトエタノール中で１時間０．２ｍＭとし、次いでヨードアセタミド中で１０分間１０ｍＭとし、次いでそれをＳ４００ＳＦゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で分画した（第６図参照）。百日咳トキソイドのほぼ５０％が結合した形態で回収された。最終複合体は０．７モルのＰＴ／１００ｋＤａのＰｎ１４多糖を含有した。ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイ（ＢｉｏＲａｄ）により標準としてＰＴを使用して、複合体中のタンパク質濃度を決定した。Ｍｏｎｓｉｇｎｙ  ｅｔ  ａｌ．の方法により標準としてＰｎ１４を使用して、多糖濃度を決定した。
【０１２５】
実施例２Ｂ
ＣＴＥＡを使用するＰｎ１４へのタンパク質の直接的結合：
Ｋｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１５：３７５（１９８１）に記載されているように、ＣＴＥＡは副反応がＣＤＡＰより少ないという利点を提供し、より純粋な生成物に導く。その欠点は、それが湿分感受性であり、閉じた容器中で秤量しなくてはならず、そして貯蔵液として生ずる調製できないということである。
【０１２６】
１ｍｌの肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）１４型多糖（Ｐｎ１４）（生理食塩水中の５ｍｇ／ｍｌ）を０℃に保持する。ＣＴＥＡ（入手先、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ウイスコンシン州ミルウォーキー）を乾燥窒素下に貯蔵する。２ｍｇのＣＴＥＡを閉じた秤量容器中で秤量し、冷却し、激しく混合したＰｎ１４に添加する。２０μｌのＴＥＡ（水中の０．２Ｍ）を混合しながら直ちに添加する。６０秒後、５ｍｇの百日咳トキソイド（１．５ｍｇ／ｍｌ）を撹拌した溶液に添加する。３０分後、反応を２００μｌの１Ｍのグリシン（ｐＨ５．０）クエンチする。さらに１時間後、この溶液を濾過し、生理食塩水と平衡化させたＳ４００ＳＦゲル濾過カラム上に通過させる。１：１複合体が生成する。
【０１２７】
ＣＴＥＡを使用する肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）１４型多糖へのスペーサー試薬の添加：
１ｍｌのＰｎ１４（生理食塩水中の５ｍｇ／ｍｌ）を０℃に保持する。ＣＴＥＡ（入手先、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ウイスコンシン州ミルウォーキー）を乾燥窒素下に貯蔵する。１ｍｇのＣＴＥＡを閉じた秤量容器中で秤量し、冷却し、激しく混合したＰｎ１４に添加する。直ちに２０μｌをＴＥＡ（水中の０．２Ｍ）に混合しながら添加する。１時間後、この溶液を生理食塩水中に完全に透析し、滅菌濾過する。１８７モルのＣＴＥＡ／１００ｋＤａのＰｎ１４の比を使用するので、ほぼ１８アミン／１００ｋＤａのＰｎ１４を有する複合体が生成する。
【０１２８】
実施例３
インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）多糖（ＰＲＰ）への百日咳トキソイドの直接的結合
平均分子量３５０ｋＤａのＰＲＰを、マサチュセッツ・パブリック・ヘルス・バイロジカル・ラボラトリー（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から入手した。百日咳トキソイドを同一源から入手した。１５μｌのＣＤＡＰ（１００ｍｇ／ｍｌ）を氷上の１００μｌ（２ｍｇ）のＰＲＰに添加した。３０秒後、３０μｌのＴＥＡを添加した。これは３１９モルのＣＤＡＰ／１００ｋＤのＰＲＰを表した。さらに２分後、０．７５ｍｌの百日咳トキソイド（１．１ｍｇ）を添加した。４０分後、２００μｌの１Ｍのグリシン（ｐＨ５．０）を添加して反応をクエンチした。さらに１時間後、この溶液を生理食塩水と平衡化させたＳ４００ＳＦゲル濾過カラム上に通過させた（第７図参照）。空隙体積をプールし、滅菌濾過した。生成物は１．１のＰＴ／１００ｋＤａのＰＲＰを有すると決定され、全体の収率は６８％であった。
【０１２９】
Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆ．＆  Ｉｍｍ．４０：２４５（１９８３）によりワクチンを調製し、このワクチンは３７７モルの臭化シアン／１００ｋＤａのＰＲＰを使用し、そして１．４〜２．１のＰＴ／１００ｋＤａのＰＲＰの比を有し、収率は５０％より低かった。したがって、本発明の直接的結合法は同様な複合体を生じたが、より少ない作業で、より高い収率を生じ、毒性の試薬を使用しなかった。
【０１３０】
ＰＲＰ複合体を製造する多数の発表されたプロトコールはスペーサーを使用して誘導化されたＰＲＰで開始する（Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１５２：３６１（１９８０）；ＤｉｃｋおよびＢｅｕｒｒｅｔ、″Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ″、Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｊ．Ｍ．ＣｒｕｓｅおよびＲ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ（編）、Ｖｏｌ．１０、ｐｐ．４８−１１４（１９８９））ので、ＣＤＡＰが、また、スペーサーをＰＲＰに添加するために使用された。使用される条件は前述した通りであったが、百日咳トキソイドの代わりに１００μｌの０．１Ｍのホウ酸塩中の０．１Ｍのヘキサンジアミンが添加された。生成物を生理食塩水中に透析した。それは１０２アミノ基／１００ｋＤａのＰＲＰを有することが決定された。これは発表された手順において使用されたより高い比であるので、なおさらに少ないＣＤＡＰを使用できたであろう。
【０１３１】
実施例４
ＣＤＡＰ化学を使用して製造されたワクチンとして有効な免疫原性構築物ＣＤＡＰおよび２官能性試薬を使用する結合
簡単に述べると、配偶子特異的タンパク質ｐｆｓ２５からのマラリア誘導ペプチド、ｐ２８（ＣＮＩＧＫＰＮＶＱＤＤＱＮＫ）を破傷風トキソイド（ＴＴ）に結合した。ｐ２８はマラリア伝達ブロッキング抗体を誘導することが示された。次いでＣＤＡＰを使用してｐ２８−ＴＴを肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）１４型（Ｐｎ１４）多糖に結合した。
【０１３２】
ＦＤＡ承認破傷風トキソイドをＨＥＰＥＳ中に一夜透析し、そして３０倍モル過剰のヨードアセチル化剤（ＳＩＡＰ）と反応させた。３時間後、試薬をマクロセプ（Ｍａｃｒｏｓｅｐ）３０（Ｆｉｌｔｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用する限外濾過により除去し、新鮮なＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ、ｐＨ７．５、緩衝液中に洗浄した。おだやかに撹拌しながら、トリチウム標識化ｐ２８を固体として誘導化ＴＴに添加した。４℃において一夜反応性させた後、混合物を０．２ｍＭのメルカプトエタノールで処理して残留する活性基をブロックし、次いでＨＥＰＥＳ緩衝液と平衡化したＰ６ＤＧカラム上で脱塩した。ペプチドの特異的活性から、生成物は２０モルのｐ２８ペプチド／モルのＴＴを含有することが決定された。複合体を生理食塩水中に透析し、滅菌濾過した。
【０１３３】
ＣＤＡＰを使用する直接的結合
Ｐｎ１４（入手先、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｙｐｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＴＣ）は高分子量を有した（約１０6 ダルトン）。ｐ２８−ＴＴを下記のようにしてＰｎ１４に直接的に結合した。ＣＤＡＰ（アセトニトリル中の１００ｍｇ／ｍｌの貯蔵液から１０μｌ）をＰｎ１４（１５０μｌの生理食塩水中の１．１ｍｇ）。３０秒後、２０μｌのトリエチルアミン（０．５Ｍ）を添加した。２分後、０．５５ｍｇ（０．８ｍｌの生理食塩水中の）のｐ２８−ＴＴを添加し、そして１時間後、反応を２００μｌの１．０Ｍのグリシン（ｐＨ５）でさらに１時間クエンチした。次いで生理食塩水と平衡化させたＳ４００ＳＦゲル濾過カラム上に複合体を通し、複合体を含有する空隙体積をプールした。第９図は、ｐ２８−ＴＴの事実上すべてが空隙体積の中に複合体の形態で見出されたことを示す。
【０１３４】
免疫原性構築物の免疫活性
５匹のＤＢＡ／２マウスのグループを生理食塩水中の１０μｇのｐ２８−ＴＴまたは（ｐ２８−ＴＴ）−Ｐｎ１４複合体で静脈内免疫化し、３週後に採血し、そして血清をＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノアッセイ）により組換えｐｆｓ２５タンパク質に対する活性についてアッセイした。ペプチドｐ２８をｐｆｓ２５から誘導化する。マウスの他の組をアジュバントの明礬（Ｉｍｊｅｃｔ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、イリノイ州ロックフォード）で沈降させた同一抗原で免疫化した。
関係する出願と一致して、表７は高分子量の複合体のみがすぐれた抗タンパク質力価引き出したことを示す。
【０１３５】
【表７】
0005594612.tif 000008
【０１３６】
これが証明するように、ＣＤＡＰ法を使用して有効なワクチン構築物を調製することができる。また、それは有効な複合体を容易に製造できることを示す。
【０１３７】
実施例５
ＣＤＡＰを使用して製造した生物学的に活性な多価タンパク質複合体
ＣＤＡＰを使用してタンパク質を多糖に直接カップリングして製造した複合体が多価生成物（これは関係する出願に記載されているように増強された免疫原性を有する）を生ずることができること、およびこの方法が生物学的活性を保存するために十分に温和であることができることを証明するために、モノクローナル抗体とデキストランとの種々の複合体を製造した。これらの実験において、Ｂリンパ球上の膜ＩｇＤと架橋しそして増殖を誘発する抗ＩｇＤ抗体とともにモノクローナル抗体Ｈδa ／１を使用した（Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：３３６４（１９８８））。Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．が記載するように、高分子量ポリマー、例えば、２０００ｋＤａのデキストランへのＨδa ／１の多数のコピーの結合（Ｈδa ／１−ＡＥＣＭデキストラン）は１０００倍低い濃度においてＢ細胞の増殖を誘発し、そして未結合Ｈδa ／１より高いレベルの増殖を誘発した。Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．簡単な、わかりやすいが、多工程の、多くの日数を要する手順を複合体の製造に必要とした。アミノエチルカルボキシメチルデキストラン（ＡＥＣＭデキストラン）をまずＢｒｕｎｓｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．に記載されているように製造し、次いでヘテロライゲーション化学を使用してＨδa ／１を炭水化物にカップリングした。
【０１３８】
下記のようにしてＣＤＡＰを使用する直接的結合およびスペーサーとＣＤＡＰとを使用する間接的結合の双方により、Ｈδa ／１−デキストランを製造した。
【０１３９】
直接的結合：０．３ｍｌの生理食塩水中の３．２ｍｇのＴ２０００デキストラン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の撹拌溶液に、１５μｌのＣＤＡＰを添加した（アセトニトリル中の１００ｍｇ／ｍｌの貯蔵液から）。３０秒後、撹拌しながら１５μｌの０．２ＭのＴＥＡを添加した。さらに２分後、おだやかに撹拌しながら６ｍｇのＨδa ／１（３６２μｌの０．０５Ｍのホウ酸ナトリウムおよび０．０７５ＭのＮａＣｌ中の）を添加した。１５分後、１００μｌの１．０Ｍのグリシン、ｐＨ５．０の添加により反応混合物をクエンチし、生理食塩水と平衡化させたＳ４００ＳＦゲル濾過カラム（１×５９ｃｍ）上に通した。カラムの溶離を第９図に示す。空隙体積のピークをプールし、ミレックス（Ｍｉｌｌｅｘ）ＧＶフィルターで滅菌した。この生成物をＨδa ／１−（ＣＤＡＰ）−デキストランと呼ぶ。この手順はほぼ３時間を要した。
【０１４０】
スペーサー：デキストランを前述したようにＣＤＡＰで活性化した（３ｍｌの生理食塩水および２５μｌのＣＤＡＰ中の３１．５ｍｇのＴ２０００デキストラン、次いで２５μｌのＴＥＡ、１モルのＣＤＡＰ／０．０６モルのグルコースモノマー）。３ｍｌの０．１Ｍのホウ酸ナトリウム中の０．５モルの１，６−ジアミノヘキサンを添加した。この溶液を水中に完全に透析し、次いでＳ４００ＨＲゲル濾過カラム上で分画した。空隙体積をプールし、濃縮した。このアミノ−デキストランは１４７アミノ基／２０００ｋＤａのデキストランを有することが決定された。この生成物をＮＨ2 −（ＣＤＡＰ）−デキストランと呼ぶ。透析を含めて、これは２日の手順であった。対照的に、ＡＥＣＭ−デキストランはＢｒｕｎｓｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．の方法を使用して製造するのに通常約１週を要する。
【０１４１】
Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．に記載されているヘテロライゲーション技術を使用して、Ｈδa ／１をＡＥＣＭ−デキストランおよびＮＨ2 −（ＣＤＡＰ）−デキストランに結合した。これらの複合体を、それぞれ、Ｈδa ／１−ＡＥＣＭ−デキストランおよびＨδa ／１−ＮＨ2 −（ＣＤＡＰ）−デキストランと呼ぶ。ＡＣＥＭ−デキストランを使用する結合は２日の手順であった。
【０１４２】
１０，０００細胞／ウェルを使用するＢ細胞の増殖アッセイをＢｒｕｎｓｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．に記載されているように実施した。表８はそれらのアッセイの結果を提供し、計数／分／ウェルとしてＢ細胞の中へのトリチウム化チミジンの取込みを詳しく示す。
【０１４３】
【表８】
0005594612.tif 000009
【０１４４】
Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．において反復されているように、Ｈδa ／１単独はこれらの濃度において取込みを引き起こさなかった。１０〜１００μｇ／ｍｌのＨδa ／１における最大の取込みはほぼ３０００ｃｐｍである。
【０１４５】
このデータが示すように、スペーサーを使用するか、または使用しないで、ＣＤＡＰを使用して製造された複合体は、増殖を誘発するそれらの能力において、Ｈδa ／１−ＡＥＣＭデキストランに本質的に等しい。多価抗体のみが低い投与量において高いレベルの増殖を誘発するので、すべての複合体は多価でなくてはならない。したがって、ＣＤＡＰを使用する直接的結合は抗体の生物学的活性に影響を与えなかった。直接的結合手順は、スペーサーを使用して製造した複合体よりも製造が顕著に速かった。さらに、スペーサーの添加およびＣＤＡＰを使用する結合はＡＥＣＭデキストランを製造よりも非常に速かった。したがって、この実験は（１）ＣＤＡＰを使用する多価構築物の高い収率および（２）複合体、特に直接的複合体の製造の容易さおよび速度を示す。ＣＤＡＰおよび２官能性試薬を使用する結合は４８時間以下を要し、そして直接的結合は３時間以下を要した。
【０１４６】
実施例６
特記しない限り、これらの実験におけるプロトコールは一般に下記の通りであった。トリエチルアミン（ＴＥＡ）、アセトニトリル、硫酸（Ｈ2 ＳＯ4 ）、レゾルシノール、ヘキサンジアミン、ホウ酸ナトリウム、およびＨＥＰＥＳをアルドリッヒ（Ａｌｄｒｉｃｈ）から入手し、そしてそれらは試薬等級またはそれよりすぐれていた。Ｎ−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）をシグマ（Ｓｉｇｍａ）またはリサーチ・オーガニックス（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ）（オハイオ州クレブランド）から購入した。トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＳＳ）をコッダック・ケミカルス（Ｋｏｄａｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から入手した。ミレックス（Ｍｉｌｌｅｘ）フィルターをミリポア・コーポレーション（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）から入手した。
【０１４７】
デキストランＴ２０００をファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から入手した。肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）１４型多糖をＡＴＴＣ（マリイランド州ロックビレ）から入手した。アミノエチルカルバミルデキストランをＢｒｕｎｓｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．に記載されているようにして製造した。低エンドトキシンのコーヘン（Ｃｏｈｅｎ）画分ＶＢＳＡ（Ｓｉｇｍａカタログ＃Ａ９３０６）から２．６ｃｍ×９７ｃｍのＳ１００ＨＲカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（生理食塩水＋アジドと平衡化した）上のゲル濾過により、モノマーのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を調製した。この生成物は、分析用ＨＰＬＣにより、０．５％より少ない二量体および０．１％より少ない高分子量の質量の物質を有することが示された。ＢＳＡをＨＰＬＣで周期的にチェックしてそのモノマー状態を確実した。ＢＳＡについて４４，０００Ｍ-1の吸光係数を使用した。
【０１４８】
多糖をＣＤＡＰを下記のようにして活性化した。ＣＤＡＰをアセトニトリル中で１００ｍｇ／ｍｌにおいて調製し、−２０℃において１カ月まで貯蔵した。ＣＤＡＰを水中の多糖の撹拌溶液にピペットでゆっくり入れ、３０秒後、使用したＣＤＡＰの体積に等しい体積の０．２モルのＴＥＡを添加した。２．５分において、１／５体積の０．１Ｍのホウ酸ナトリウム中の０．５Ｍのヘキサンジアミン（ｐＨ９．３）を添加した。反応を４℃において一夜進行させた。反応生成物を生理食塩水中で平衡化させたＰ６ＤＧまたはＰ６カートリッジ（ＢｉｏＲａｄ）上で脱塩し、次いで生理食塩水中にさらに透析した。いくつかの試料をセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）３０装置（Ａｍｉｃｏｎ）ｄｅ濃縮し、再び脱塩して遊離ジアミンの除去を確実にした。この一般的手順の変法を下記に示す。第一級アミンについてＴＮＢＳアッセイを使用して、ヘキサンジアミンを使用する誘導化の程度を測定した。１１，０００Ｍ-1吸光係数を使用して３６６ｎｍにおいて吸収を測定した。ジアミンの代わりにエタノールアミンで誘導化された、ＣＤＡＰ活性化デキストランは、このアッセイにおいてＴＮＢＳ陰性であることが見出された。Ｍｏｎｓｉｇｎｙ  ｅｔ  ａｌ．、に記載されているように、多糖濃度を測定した。特記しない限り、結果をアミンのモル数／１００ｋＤａの多糖として表す。
【０１４９】
Ｌｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｖａｃｃｉｎｅ、１２（３）：１１６０、１９９４に記載されているように、チオ−エーテル結合を介するアミノ−デキストランへのタンパク質の結合を実施した。アミンを使用する活性化について前述したように、ポリマーをＣＤＡＰで活性化することによって、タンパク質を多糖に直接結合した。ＣＤＡＰを導入した後２．５分において、タンパク質（０．１５モルのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５中の１０ｍｇ／ｍｌ）をおだやかに撹拌する溶液に急速に添加した。生理食塩水と平衡化させたＳ３００ＨＲまたはＳ４００ＨＲカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上のゲル濾過の少なくとも１時間前に、ほぼ１／５体積の０．７５モルのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５中の０．５モルのエタノールアミンで反応をクエンチした。標準としてＢＳＡを使用してブラッドフォード法（ＢｉｏＲａｄ試薬）により、空隙体積からのピーク管をタンパク質についてアッセイした。標準としてデキストランを使用してＭｏｎｓｉｇｎｙ  ｅｔ  ａｌ．の方法により、多糖濃度を測定した。特記しない限り、結果（下記において説明する）をタンパク質のｍｇ／ｍｇ多糖として表す。
【０１５０】
ＣＤＡＰを使用する多糖の活性化：
従来報告された方法よりも急速、温和、好都合、そして安全である条件下に、多糖のＣＤＡＰ活性化を使用して複合体を製造できるかどうかを決定するために、実験を実施した。プロトタイプの多糖として、高分子量デキストラン（Ｔ２０００デキストラン、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を種々の実験条件下にＣＤＡＰで活性化した。
【０１５１】
１００ｍｇ／ｍｌの貯蔵液から、ある体積のＣＤＡＰを水中のＴ２０００デキストランの溶液の中にピペットでゆっくり入れた（第４図に示すように１．６ｍｇ／ｍｌ、または第１０図に示すように１０ｍｇ／ｍｌ）。３０秒において、ＣＤＡＰの体積に等しい体積の０．２モルのＴＥＡを添加し、そして１２０秒後、大きい体積のホウ酸ナトリウム中のヘキサンジアミン（ｐＨ９．３）を急速に添加した。Ｐ６ＤＧカラム上で脱塩し、次いで完全に透析して未結合試薬を除去した後、高いレベルの多糖が見出された（第４図および第１０図参照）。この同一手順後、しかしＣＤＡＰ、デキストラン、またはデキストランのそれぞれの非存在において、ＴＮＢＳアッセイによりアミンを検出することができた。さらに、ヘキサンジアミンの代わりにモノアミン（エタノールアミン）と反応させたＣＤＡＰ活性化デキストランはＴＮＢＳ陰性であった。すべての低分子量物質を確実に除去するために、誘導化多糖を限外濾過により濃縮し、Ｐ６ＤＧカラム上で第２回目の脱塩を行った。アミン比はこの手順後において未変化であった。
【０１５２】
誘導化の程度は、第４図および第１０図参照に示すように、ＣＤＡＰの量−−多糖上に置換したアミノ基の絶対数の増加に導くＣＤＡＰ／デキストランの比に依存した。誘導化の程度は、同一のＣＤＡＰ／デキストランのモル比についての多糖の濃度に依存した。したがって、１．６ｍｇ／ｍｌのデキストランにおいて、効率はＣＤＡＰの１モル当たり置換したアミンのモル数に基づいて０．７〜２．４％であったが、１０ｍｇ／ｍｌのデキストランにおいてＣＤＡＰの１モル当たり０．２モル程度に多くのアミンが置換された（２０％の効率）。
【０１５３】
この２分子反応の効率を改良するために、固定量のＣＤＡＰを使用して、多糖濃度を１から５０ｍｇ／ｍｌに増加した（第１１図参照）。使用した最高の多糖濃度において、使用したＣＤＡＰの１モル当たり０．４モルより多いアミノ基が添加された。ＣＤＡＰ活性化で到達された置換の高いレベルと対照的に、ＣＮＢｒ活性は通常抗体１〜２％の最大効率を生ずる。
【０１５４】
ＴＥＡの非存在において、ジアミンによる誘導化は顕著に減少した。第三級アミン、例えば、ＴＥＡの存在がＣＤＡＰによる可溶性多糖の活性化に必須であるかどうかを決定するために、ＴＥＡを使用する活性化の効率を無機緩衝剤またはＮａＯＨを使用する効率と比較した。
【０１５５】
１００μｌのＣＤＡＰ溶液（アセトニトリル中の１００ｍｇ／ｍｌ）を、室温において、２ｍｌのＴ２０００デキストラン（水中の１０ｍｇ／ｍｌ）の撹拌溶液にゆっくり添加した。３０秒後、１ＮのＮａＯＨをゆっくり添加してｐＨ約９を維持した。１．５分後、０．５ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、中の１ｍｌのＢＳＡ、２０ｍｇ／ｍｌ、を添加した。反応を４℃において１８時間進行させた後、１００μｌの０．７５ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、中の０．５Ｍのエタノールアミンの添加により反応をクエンチした。分析のために、３００μｌの生成物を生理食塩水およびアジドと平衡化させた１ｃｍ×５０ｃｍのＳ４００ＨＲゲル濾過カラム上でゲル濾過した。空隙体積のピーク管をバイオラド（ＢｉｏＲａｄ）アッセイによりタンパク質について、そしてレゾルシノールアッセイにより多糖についてアッセイし、デキストランの１ｍｇ当たり０．４５ｍｇのＢＳＡを有することが見出された。
【０１５６】
下記表９に示すように、種々の緩衝剤を使用して誘導化が生じた。事実、１ＮのＮａＯＨを注意して添加してｐＨを約９に上昇させて、すぐれたレベルの置換が得られた。
【０１５７】
【表９】
0005594612.tif 000010
【０１５８】
デキストランでは、８〜１０のｐＨ範囲にわたって誘導化のレベルの有意な差は存在しなかったが、他の多糖は活性化ｐＨにいっそう依存することが見出された（下記を参照）。前述したように、ＴＥＡを省略しかつｐＨ上昇させない場合、デキストランはなお活性化されるが、非常に低い程度に誘導化される。したがって、ＣＤＡＰ活性化またはカップリングはＴＥＡの存在に依存しないか、または反応混合物が十分にアルカリ性であるように、適当な手段を使用するｐＨを上昇させることができる。
【０１５９】
表１０はＣＤＡＰを使用する活性化の反応速度を示す。この実験において、１００μｌのＣＤＡＰ（１００ｍｇ／ｍｌアセトニトリル）を１ｍｌのデキストラン（２０ｍｇ／ｍｌ）に３０秒において添加し、１ｍｌの０．１Ｍのホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．８、を添加し、２分後、０．７５ＭのＨＥＰＥＳ中の０．５ｍｌのヘキサンジアミンを添加した。アリコートを示した時間において生理食塩水と平衡化させたＰ６カートリッジ上で脱塩し、次いで分析前に完全に透析した。多糖およびＣＤＡＰの高い濃度において、溶液はゲル化した。したがって、１０〜２０ｍｇ／ｍｌの多糖溶液を使用して作業することはいっそう好都合である。
【０１６０】
【表１０】
0005594612.tif 000011
【０１６１】
表１０に示すように、誘導化反応は急速であり、１５分以内に本質的完結する。３または２４時間において、誘導化の程度の増加は認められなかった。
【０１６２】
再現性肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）１４型多糖（Ｐｎ１４）をＣＤＡＰで活性化し、ヘキサンジアミンで誘導化した。１ｍｌのＰｎ１４の撹拌溶液（水中の１０ｍｇ／ｍｌ）に、３０μｌのＣＤＡＰ（アセトニトリル中の１００ｍｇ／ｍｌ）（０．３ｍｇのＣＤＡＰ／ｍｇのＰｎ１４）を添加した。３０秒後、３０μｌのＴＥＡ（水中の０．２Ｍ）を添加した。２分後、０．５ｍｌのヘキサンジアミン（０．７５ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、中の０．５Ｍ）を添加した。１．５時間後、生成物をＰ６カートリッジで脱塩し、限外濾過により濃縮し、再び脱塩し、次いでＴＮＢＳでアミンについて、そしてレゾルシノール／硫酸でＰｎ１４についてアッセイした。表１１に示すように、１年にわたって実施された３回の実験において、検出されたアミンのモル数／使用したＣＤＡＰの１モルに基づいて１３〜１５％の効率が得られた。
【０１６３】
【表１１】
0005594612.tif 000012
【０１６４】
上記表中の結果は、フリーザー中のＣＤＡＰ試薬の安定性、再現性、および高い効率を示す。比較すると、ＣＮＢｒ溶液は安定ではなく、ＣＮＢｒ活性化法は再現することが困難であり、そして約２％の効率を有する。
【０１６５】
ＣＤＡＰ活性化多糖へのタンパク質の直接的結合：
アミンによる誘導化のように、多糖に対するタンパク質の結合の程度は多糖の活性化に使用されたＣＤＡＰの量に依存した。第１２図に示すように、１０ｍｇ／ｍｌのデキストランの濃度において、ＣＤＡＰ／デキストランの比は生成物のＢＳＡ／デキストランの比とともに直線的に増加した。タンパク質および／または多糖の濃度が増加した場合、より低いＣＤＡＰ／デキストラン比においてさえ同様なＢＳＡ／デキストラン比をまた観察することができた。
【０１６６】
対照反応をデキストランの非存在において実施し、そしてゲル濾過により分析すると、ＣＤＡＰそれ自体は凝集しないか、またはＢＳＡ（タンパク質）を重合させなかった。ＣＤＡＰ処理試料（０．５ｍｌの水＋２５μｌのアセトニトリル中の１００ｍｇ／ｍｌのＣＤＡＰ＋５０μｌの０．２ＭのＴＥＡ＋０．５ｍｌの０．５ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、中の１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）および対照試料（０．５７５ｍｌの水＋０．５ｍｌの０．５ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、中の１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（モノマー））を調製した。これらの試料を一夜反応させ、１００ｍｌのＨＥＰＥＳ中の０．５Ｍのエタノールアミンでクエンチした。１時間クエンチした後、試料を生理食塩水およびアジド中のＳ４００の１ｃｍ×５０ｃｍのカラム上で０．７５ｍｌ／分において展開させた。カラム上のＯＤ２８０を合計し、ＢＳＡピークに先行する管上のＯＤ２８０の合計に分割した。ＣＤＡＰ処理試料は０．６％のポリマーのＢＳＡを示し、そして対照試料は０．７％のポリマーのＢＳＡを示した。したがって、高分子量タンパク質は自己重合または凝集のためではない。
【０１６７】
そのうえ、通常の条件下に、ＣＤＡＰは多糖を架橋しない。これは下記のＨＰＬＣ実験により確証された。この実験において、７０ｋＤａのデキストランを活性化させ、次いでエタノールアミンと反応させ、そしてゲル濾過カラム上で展開させた。詳しくは、２．５ｍｇのＴ７０デキストラン（１０ｍｇ／ｍｌ）を２０μｌのＣＤＡＰ（１００ｍｇ／ｍｌ）と一緒にした。３０秒後、２０または６０μｌの０．２ＭのＴＥＡを添加し、２分において、１００μｌの０．７５ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、中の０．５Ｍのエタノールアミンを添加した。１時間後、試料を０．２ＭのＮａＣｌ中のＧ４０００ＰＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈａａｓ）またはＳＥＣ３０００（Ｂｅｃｋｍａｎ）上で展開させ、屈折率により検出した（各カラムの空隙体積は約５分であり、塩を約１０分において溶離した）。高分子量へのシフトの証拠は観察されなかった。
【０１６８】
下記の比較実験が示すように、ＣＤＡＰが多糖を架橋するのを防止するために、極端な条件は回避すべきである。１ｍｌのＴ２０００デキストラン（１００ｍｇ／ｍｌ水）を１７６μｌのＣＤＡＰ（１００ｍｇ／ｍｌ）と一緒にした。３０秒後、１７６μｌの０．２ＭのＴＥＡを添加し、これは２分以内にゲルを生じた。
【０１６９】
最適活性化時間を決定しかつＣＤＡＰ活性化多糖の安定性を検査するために、ＣＤＡＰおよびＴＥＡを添加した後５〜３００秒においてタンパク質（ＢＳＡ）を添加し、そして生成物のＢＳＡ／デキストラン比を測定した。第１３図に示す結果が示唆するように、最適活性化時間は約２分であり、そして活性化された多糖はこの期間にわたって安定である。タンパク質を１時間において添加する場合、反応の収率は約１／３だけ減少する。
【０１７０】
ＣＤＡＰと多糖との水性混合物は、第１４図において反映されるように、安定であることが見出された。６０μｌのＣＤＡＰ（１００ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌの水に添加し、このＣＤＡＰ溶液の１００μｌのアリコートを１００μｌの多糖（デキストラン、２０ｍｇ／ｍｌ）と第１４図に示すように１０〜３００秒の期間にわたる種々の時間において一緒にし、次いで１５μｌのＴＥＡ溶液（０．２Ｍ）と一緒にした。ＴＥＡと一緒にした後２分において、１００μｌのＢＳＡ（３０ｍｇ／ｍｌ）を添加した。
【０１７１】
添加時間の全体の範囲にわたって最終のタンパク質／多糖比において有意差は見出せなかった。第１４図に示す結果は、酸性溶液中のＣＤＡＰの安定性、およびＣＤＡＰの水溶液が酸性となるという観察と一致する。したがって、試薬溶液を同じ日に使用する場合、有機溶媒の代わりに水を使用することができる。また、ＣＤＡＰを固体として多糖溶液に添加することができる。少量のＣＤＡＰを使用して作業するとき、固体状試薬を使用して作業するより溶液を使用して作業することは好都合であることがわかった。さらに、ＣＤＡＰのアセトニトリル溶液の急速添加は時には多糖を沈澱させることがあるが、ＣＤＡＰの水溶液を使用する場合、沈澱を回避することができる。ＣＤＡＰの水性貯蔵液を７５ｍｇ／ｍｌまでの濃度において調製することができる。
【０１７２】
第１５図は、多糖へのタンパク質の結合が比較的急速であり、３時間以内に、８０％の最大結合が達成されたことを示す。タンパク質濃度、多糖濃度、および／またはＣＤＡＰ濃度を増加することによって、なおいっそう急速なカップリングを達成できるであろう。
【０１７３】
第１６図に示すように、多糖の活性化の間の反応溶液のｐＨはＣＤＡＰによる多糖の活性化における他の重要なパラメーターである。活性化工程の間のｐＨが７．０から８．３に増加するにつれて、カップリング効率の顕著な増加により反映されるように、多糖の活性化が増加した。ｐＨが７．０から８．３に増加するにつれて、複合体のＢＳＡ／デキストラン比は４倍に増加した。８．３より高いｐＨにおいて、この比はほとんど増加しないか、またはまったく増加しなかった。ＣＤＡＰ活性化のｐＨ依存性は、ＴＥＡの非存在において前に観察された低い誘導化レベルを説明する。なぜなら、ＣＤＡＰ水溶液のｐＨは最初にほぼ中性であり、そしていっそう酸性となるからである。
【０１７４】
アミンによる多糖の誘導化について前述したように、タンパク質の直接的結合のための多糖の活性化の間において、第三級アミン緩衝剤は不必要である。したがって、多糖へのタンパク質の直接的結合は、例えば、活性化工程の間においてｐＨを上昇させるためにｐＨスタットまたは自動滴定装置を使用して、実施することができる。これはワクチン複合体の製造において好都合であることがある。
【０１７５】
第１７図は、活性化多糖へのタンパク質のカップリングの間の反応溶液のｐＨがタンパク質とＣＤＡＰとの直接的結合における重要なパラメーターであることを示す。第１７図に結果を報告した実験において、広い範囲のｐＨ値にわたって、かつ低いタンパク質／多糖比において、いくつかの緩衝剤を試験した。プロトコールは下記の通りであった。
【０１７６】
４ｍｌのＴ２０００デキストラン（水中の１０ｍｇ／ｍｌ）に、１３３μｌのＣＤＡＰ溶液（新しく調製したアセトニトリル中の１００ｍｇ／ｍｌ）を添加した（０．３３ｍｇのＣＤＡＰ／ｍｇのｄｅｘ）。３０秒後、２６６μｌのＴＥＡ（０．２Ｍの貯蔵液から）を添加し、そしてｐＨを９．６の最大に到達させた。２．５分後、６０μｌの１ＭのＮａＡｃ（酢酸ナトリウム）を使用してｐＨを５．０に調節した。２００μｌのＢＳＡ（１５ｍｇ／ｍｌ）（０．８ｍｇのＢＳＡ／ｍｇのｄｅｘ）および１００μｌの緩衝液（１ＭのＮａＡｃ、ｐＨ４．７、５．７；０．５ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．９４、７．４３、８．１５；０．１ＭのＮａＰＯ4 、ｐＨ８．０、８．６７；５０ｍＭのホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．０、９．６）（イオン強度についてコントロールしなかった）を含有する管に、４００μｌの活性化デキストランを移した。移してから１時間後、管の３５０μｌの溶液を１００μｌの新しく調製した０．７５ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中の０．５Ｍのエタノールアミンと一緒にした。２０時間後、１００μｌのエタノールアミンを残りの溶液に添加した。反応を少なくとも２時間クエンチし、生理食塩水＋アジドと平衡化させたＳ３００ＨＲまたはＳ４００ＨＲカラム上に生成物を展開させた。ピーク空隙体積をバイオラド（ＢｉｏＲａｄ）アッセイによりＢＳＡについて、そしてレゾルシノールアッセイにより多糖についてアッセイした。
【０１７７】
第１７図に示すように、タンパク質の大部分は７．４程度に低いｐＨにおいて多糖にカップリングし、６．９程度に低いｐＨにおいて実質的な量がカップリングし、そして５．７程度に低いｐＨにおいてさえ少量であるが、有意な量がカップリングした。この実験の条件について、約８のｐＨは最適であるように思われた。結果はカップリング工程のｐＨが重要であることを示すが、カップリングを広いｐＨ範囲にわたって実施できることを示す。しかしながら、ｐＨ５においてカップリング反応は非常に非効率的であるので、クェンチングはｐＨ約７〜８において実施すべきである。
【０１７８】
タンパク質／多糖比、多糖濃度、および／またはＣＤＡＰの使用量を増加することによって、低いｐＨにおいてさえカップリングの量を増加することができる。例えば、より多い試薬またはより多いタンパク質を使用することによって、ｐＨ７においてさえ収率を高くすることができる。したがって、多糖を活性化するためにＣＤＡＰを使用して、ほぼ中性のｐＨにおいて、タンパク質の直接的カップリングを達成することができる。
【０１７９】
第１７図は、リン酸塩がまたカップリング反応に対して阻害的であることを示し、これはイオンの相互作用のためであるか、またはリン酸塩がわずかに求核性であるためであろう。しかしながら、カップリングの間のＣＤＡＰの量およびｐＨを増加すると、結合比／収率は増加するであろう。ＣＤＡＰの活性化の間にリン酸塩が存在する場合、ジアミンの添加は禁止される。
【０１８０】
下記の実験により示されるように、ＰＲＰおよびＰｎ６のリン酸塩は阻害を引き起こすことがある。２０μｌのＣＤＡＰ（アセトニトリル中の１００ｍｇ／ｍｌ）を、２ｍｇのＰｎ６（肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）６型、リン酸ポリリビトール多糖）（水中の１０ｍｇ／ｍｌ）の撹拌溶液に添加した。３０秒後、緩衝液（１００μｌの０．１Ｍのホウ酸ナトリウムまたは４０μｌの０．２ＭのＴＥＡ）を添加した。２分後、１００μｌの０．５ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８、中のＢＳＡ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加した。４℃において一夜インキュベートした後、反応を１００μｌの０．７５ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、中の０．５Ｍのエタノールアミンでクエンチし、次いで生理食塩水＋０．０２％のアジドと平衡化させたＳ４００ＨＲカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上でゲル濾過した。ピーク空隙体積の管をタンパク質および多糖についてアッセイした。比較の目的で、試験４において、デキストランを同一方法において誘導化した。結果を下記表１２に報告する。
【０１８１】
【表１２】
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【０１８２】
Ｐｎ６およびＴＥＡ緩衝液（試験１）について、収率は非常に低かった。ｐＨをホウ酸ナトリウムで増加させると（試験２および３）、収率は増加した。同一条件はデキストランについて非常に高い収率を与える（例えば、試験４参照）。したがって、リン酸塩に基づく多糖、例えば、Ｐｎ６は、すぐれた収率で複合体を製造するためには、ｐＨおよび／またはＣＤＡＰ比の調節を必要とする。
【０１８３】
次の実験は、ＣＤＡＰ活性化により形成されたイソ尿素結合が安定でありかつ耐久性であることを示す。この実験において、ε−ＴＮＰ−リジンをＣＤＡＰを介して誘導化にカップリングさせた。試料１〜５は下記のようにして調製した：
１：  ４００μｌのＴＮＰ／ＣＤＡＰ／ｄｅｘ＋１００μｌの生理食塩水（対照）
２：  ４００μｌのＴＮＰ／ＣＤＡＰ／ｄｅｘ＋１００μｌの２ＭのＮａＣｌ
３：  ４００μｌのＴＮＰ／ＣＤＡＰ／ｄｅｘ＋１００μｌの９ＭのＧｕＨＣｌ
４：  ４００μｌのＴＮＰ／ＣＤＡＰ／ｄｅｘ＋１００μｌの生理食塩水（３７℃においてインキュベーター中で反応させた）
５：  ４００μｌのＴＮＰ／ＣＤＡＰ／ｄｅｘ＋１００μｌの生理食塩水（対照）
【０１８４】
試料４（これは示すように反応させた）を除外して、試料を暗所で一夜反応させた。次いで試料を１０ｍＭのホウ酸ナトリウム中でＰ６カートリッジ上で１．０ｍｌ／分において脱塩した。画分をＯＤ３６６において読み、そして空隙画分のピーク管をアッセイした。結果を下記表１３に示す。
【０１８５】
【表１３】
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【０１８６】
各試料について、ＴＮＰ／デキストラン比は未変化であり、イソ尿素結合が試験条件下に安定であることを示した。
複合体の生物学的活性
多糖のＣＤＡＰ活性化が抗体の応答を誘発するその能力に有害効果を有するかどうかを決定するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるその生物学的活性を試験した。ＢＳＡをＣＤＡＰ活性化肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）１４型多糖に直接的に結合するか、またはヘキサンジアミンで活性化された肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）１４型多糖にカップリングし、次いでヨードアセチル化し、チオール化タンパク質と反応させた（Ｌｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．）。各複合体はＢＳＡのｍｇ／Ｐｎ１４のｍｇのある比を有した。同系交配ＤＢＡ／２マウスをアジュバントの非存在において５０μｇのＢＳＡで、遊離または多糖複合体として、皮下免疫化した。血清を１４および２８日後に集め、抗ＢＳＡおよび抗Ｐｎ１４抗体力価をＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１８７】
未結合ＢＳＡまたは未結合Ｐｎ１４のいずれも検出可能な一次応答を刺激しなかった。対照的に、ＢＳＡ−Ｐｎ１４複合体は、タンパク質がスペーサーを使用する間接的結合により、または直接的結合によりカップリングされているかにかかわらず、タンパク質および多糖の双方の成分に対して有意な抗体の応答を誘発した。スペーサーまたはＣＤＡＰ活性化デキストランへの直接的カップリングを使用して調製されたＢＳＡ−デキストランで免疫化されたマウスは、複合体を他の化学的方法で調製したとき得られた力価に匹敵する力価を与えた。そのうえ、ＣＤＡＰ活性化を使用して調製されたＴＴ−ＰＲＰ複合体は、複合体で免疫化されたラットにおいて、ＣＮＢｒ活性化を使用して調製されたＴＴ−ＰＲＰ複合体で免疫化されたラットにおいて示された応答に匹敵する抗ＰＲＰ応答を示した。さらに、ＣＤＡＰ活性化Ｐｎ１４に直接的に結合された破傷風トキソイドは、高い抗破傷風抗体および抗Ｐｎ１４抗体の応答を有した；オプソニンアッセイはこれらの抗体が保護的であることを示した。
【０１８８】
実施例７
ＣＤＡＰ活性化多糖へのヒドラジド誘導化タンパク質のカップリング（アミノ基上で誘導化されたタンパク質）
ＢＳＡ上の制限された数のアミンを下記のようにしてヒドラジドで誘導化した。２０ｍｇのＢＳＡ（７５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ５、中の２４ｍｇ／ｍｌ）を２０倍モル過剰のＳＰＤＰ（Ｐｒｏｃｈｅｍ）と反応させた。８時間後、２００μｌの１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）を添加し、次いで２５μｌの１ＭのＤＴＴを添加してチオールを脱保護した。この溶液を直列の２つのＰ−６カートリッジ（１０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．１ＭのＮａＣｌおよび２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐ５）と平衡化させた）上で脱塩し、そして空隙体積のタンパク質をセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）３０装置で１．０５ｍｌの体積に濃縮した。エルマン（Ｅｌｌｍａｎ）試薬を使用して、３．２遊離チオール／ＢＳＡが存在することが測定された。５ｍｇのチオール−ＢＳＡを貯蔵し、そして残部を５０μｌの１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ６）の添加によりｐＨ６とした。１００μｌのジメチルホルムアミド中の０．１ＭのＥ−マレイミドカプロン酸ヒドラジド−ＨＣｌ（マレイミド−ヒドラジドヘテロ官能性試薬；ＥＭＣＨ、Ｐｒｏｃｈｅｍ、イリノイ州ロックフォード）を添加した。一夜反応させた後、タンパク質を脱塩し、再び濃縮した。タンパク質濃度を吸収から測定した。ＴＮＢＳアッセイを使用して、遊離ヒドラジド基の存在を証明した（例えば、５４０ｎｍにおける吸収が存在し、自然タンパク質において存在しなかった）。
【０１８９】
わずかに４．２チオール／ＢＳＡが存在したので、最終生成物は理論的にその数以下の遊離ヒドラジドを含有できた。ＢＳＡは合計６０アミノ基を有する；したがって、ＢＳＡは最小に修飾された。この物質をＢＳＡ−Ｓ−Ｈｚと表示した。
ＢＳＡ−Ｓ−ＨｚまたはモノマーのＢＳＡ（比較；Ｓ１００ＨＲカラム上のゲル濾過により調製された）を、下記のようにして、ＣＤＡＰ活性化デキストランと反応させた。１５μｌのＣＤＡＰ（アセトニトリル中の１００ｍｇ／ｍｌ）を添加することによって、４００μｌのＴ２０００デキストラン（Ｈ2 Ｏ中の１０ｍｇ／ｍｌ）を活性し、次いで３０秒後、３０μｌの０．２ＭのＴＥＡを添加した。２．５分後、２００μｌの１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）を添加して、反応混合物のｐＨを５にした。次いで３００μｌのＣＤＡＰ活性化デキストランを２ｍｇのＢＳＡ−Ｓ−ＨｚまたはモノマーのＢＳＡに添加した（１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液中の２２．３ｍｇ／ｍｌにおいて９０μｌ）。最終ｐＨは５．１であった。一夜反応させた後、試料を０．７５ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中の０．５Ｍのエタノールアミンでクエンチし、次いでＳ３００ＨＲカラム（１×５０ｃｍ、生理食塩水およびアジドと平衡化させた）上のゲル濾過により分画した。タンパク質および多糖の分析により、ｐＨ５において、ＢＳＡ−Ｓ−Ｈｚは０．５１ｍｇのＢＳＡ／ｍｇのデキストランと複合体を生じたが、モノマーのＢＳＡは結合生成物を生じないことが示された。
【０１９０】
ＣＤＡＰ活性化肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）１４型（Ｐｎ１４）へのヒドラジド誘導化ジフテリアトキソイド（ＤＴ）の結合
カルボキシル基上で誘導化されたＤＴ：ＤＴを下記のようにしてＡＤＨでカルボキシル基において誘導化した。０．５Ｍの１−メチルイミダゾール（ｐＨ６）中の６．９５ｍｇのＤＴに、０．５ｍｌの同一緩衝液中の０．５Ｍのアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を添加し、次いで混合しながら１５ｍｇの１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カーボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を添加した。一夜インキュベートした後、タンパク質を直列の２つのＰ−６カートリッジ（１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）と平衡化させた）上で脱塩し、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）５０装置で１７．１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ＴＮＢＳアッセイはヒドラジドの存在を示した。この物質をＤＴ／ＥＤＣ／Ｈｚと表示した。
【０１９１】
肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）１４型（入手先、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）を、Ｓ４００ＨＲカラム（２．６×１００ｃｍ、０．１Ｍのリン酸カリウム、ｐＨ７．２、と平衡化させた）上のゲル濾過により分画した。極端に高いおよび低い分子量の画分を分離し、中央カットを濃縮し、生理食塩水中に透析した。この物質をＰｎ１４（Ｍ）と表示した。
【０１９２】
２５０μｌのＰｎ１４（Ｍ）（１０．１ｍｇ／ｍｌ）を１５μｌのＣＤＡＰ（アセトニトリル中の１００ｍｇ／ｍｌ）の添加により活性化し、次いで３０秒後、３０μｌの０．２ＭのＴＥＡを添加した。２．５分後、１５０μｌの１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）を添加してｐＨを低下させ、次いで１５０μｌのＤＴ／ＥＤＣ／Ｈｚ（２．５ｍｇ）を添加した。一夜反応させた後、反応混合物を１００μｌの０．７５ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中の０．５Ｍのエタノールアミンでクエンチし、次いでＳ３００ＨＲカラム（１×５０ｃｍ、生理食塩水と平衡化させた）上でゲル濾過した。分析はＤＴがカップリングしたことを示した。
【０１９３】
アミノ基上で誘導化されたＤＴ：ＤＴをＢＳＡ−Ｓ−Ｈｚと同様な方法において誘導化した。５ｍｇのＤＴ（１３．９ｍｇ／ｍｌ）を２０倍モル過剰量のＳＰＤＰと反応させ、脱塩し、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）３０装置で濃縮し、５０ｍＭのＤＴＴでｐＨ５において１時間処理し、次いで脱塩し、再び濃縮した。エルマン（Ｅｌｌｍａｎ）試薬を使用する分析は、遊離チオール基の存在を示した。次いでチオール化トキソイドを大過剰のＥＭＣＨと反応させ、脱塩し、再び濃縮した。ＴＮＢＳアッセイはヒドラジドの存在を示した。この物質をＤＴ−Ｓ−Ｈｚと表示した。
【０１９４】
ＤＴ−Ｓ−Ｈｚを下記のようにして大きさ分画Ｐｎ１４にカップリングさせた。１．６ＭのＨＣｌ中の４ｍｇのＰｎ１４（Ｍ）を２０μｌのＣＤＡＰ（アセトニトリル中の１００ｍｇ／ｍｌ）で活性化し、次いで３０秒後、４０μｌの０．２ＭのＴＥＡを添加した。２．５分後、５０μｌの１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）を添加した。次いで３．９ｍｇのＤＴ−Ｓ−Ｈｚ（７７ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５中の）を添加した；ｐＨメーターを使用して最終ｐＨが５．１であることが測定された。４℃において一夜反応させた後、反応を１００μｌの０．７５ＭのＨＥＰＥＳ中の０．５Ｍのエタノールアミンでクエンチし、次いでＳ４３００ＨＲカラム（１×５０ｃｍ、生理食塩水およびアジドと平衡化させた）上でゲル濾過した。分析はＤＴがカップリングしたことを示した。
【０１９５】
低いｐＨにおけるヒドラジドとアミンとの反応
５ｍｇのＣＤＡＰ（アセトニトリル中の１００ｍｇ／ｍｌ）を５ｍｇのＰｎ１４（水中の１０ｍｇ／ｍｌ）に添加することによって、ＣＤＡＰ活性化多糖を調製した。３０秒後、３００μｌの０．２ＭのＴＥＡを添加した。２分後、１００μｌのＮａＡｃ、ｐＨ５、の添加により、ｐＨを約５に低下させた。次いでＣＤＡＰ活性化多糖を０．２ＭのＡＤＨまたはヘキサンジアミンに約ｐＨ５において添加した。一夜反応させた後、この溶液を酢酸塩緩衝液（ｐＨ）中で脱塩し、ＴＮＢＳによりアミンまたはヒドラジドについてアッセイした。ヒドラジドを含有する溶液のみがＴＮＢＳ陽性であった。この試料をセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）５０装置で濃縮し、２回目にＰ６カートリッジ上で脱塩した。ヒドラジド／デキストラン比は未変化であり、未反応試薬のみが除去されたことを示した。ヘキサンジアミン試料がＴＮＢＳ陽性であったという事実は、誘導化が起こらなかったことを示した。
【０１９６】
対照として、ＣＤＡＰ活性化デキストランをＡＤＨまたはヘキサンジアミンと０．７５ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中で反応させた。双方の試料はＴＮＢＳ陽性であった。
【０１９７】
要約：
ＣＤＡＰを利用する本発明の方法は、あるものが高いｐＨに対して感受性である、種々の臨床的に関係する多糖を活性化するために使用できる再現性あるアプローチを提供する。活性化は急速であるので、高いｐＨにおける消費時間は最小である。この方法は、タンパク質および多糖の双方の成分に対する体液性抗体をマウスにおいてアジュバントの非存在においてさえ刺激できる、高度に免疫原性のタンパク質−多糖複合体を生産する。
【０１９８】
多糖の活性化の程度に深遠に影響を及ぼすことが見出された変数は、ＣＤＡＰおよび多糖の濃度、およびｐＨである。結合のために好ましいｐＨは約６〜約９、より好ましくは約７．４〜約８．０であり、これは大部分の多糖が安定である範囲である。他のｐＨ範囲、例えば、約７〜約１０の範囲は他の多糖についていっそう適当である。
【０１９９】
多糖および／またはＣＤＡＰの濃度を操作することによって、誘導化の効率は、ＣＮＢｒを使用するとき見出された１〜２％に比較して、５０％に増加させることができる。さらに、多糖の１００ｋＤａ当たり５０より多いＮＨ2 基を有する生成物は好ましい条件下に得ることができる。本発明の方法は、ＣＤＡＰを使用して実験した従来の研究者らが記載したように、第三級アミンの存在に依存しない。多糖の活性化は急速である。同様に、活性化された多糖へのタンパク質の結合は急速である。
【０２００】
本発明は、再現性、急速な反応性、および多分最も顕著には、タンパク質／多糖比を容易に操作する能力という利点を提供する。例えば、ＣＤＡＰの濃度および／または多糖濃度および／またはタンパク質濃度を変更することによって、種々のタンパク質／多糖比を有する複合体を得ることができる。これは複合体に対する抗体の応答の大きさに影響を及ぼすタンパク質／多糖比の役割ばかりでなく、かつまた所定のタンパク質／多糖比における今日まで構造の役割を研究するアプローチを提供することができる。
【０２０１】
ＣＤＡＰを使用して製造されたタンパク質−多糖複合体の免疫原性は、未結合成分のいずれかが示した応答より有意に大きい。さらに、生産される抗体は未結合タンパク質と反応性であり、そして応答は未結合タンパク質ならびに結合したタンパク質を使用して促進することができる。これが示唆するように、結合の間のタンパク質の化学的変更は、自然タンパク質に対する反応性を有する抗体を刺激するその能力に対して有害作用を示さず、また、未結合タンパク質に対する反応性を有するＢ細胞を刺激するその能力に対して有害作用を示さない。
【０２０２】
さらに、ＣＤＡＰ活性化多糖は抗Ｉｇ抗体の結合のための調製において使用することができる。抗Ｉｇデキストラン複合体は、未結合Ｉｇに比較して、約１００〜１００倍大きい活性化を誘発する。ＣＤＡＰ活性化デキストランへの直接的結合を使用して製造された抗Ｉｇデキストラン複合体は、ＡＥＣＭデキストランへの他のヘテロライゲーションカップリングを使用して製造された複合体と同様に有効なＢ細胞刺激試薬である。
【０２０３】
ＣＤＡＰはＥＬＩＳＡのための種々の免疫学的試薬、例えば、ビオチニル化多糖、およびモデルのＴｉ−２抗原のためのＥＬＩＳＡスポット抗原およびＴＮＰ−多糖（例えば、ＴＮＰ−ｄｅｘ、ＴＮＰフィコール）の製造に有用である。
【０２０４】
したがって、免疫原性構築物、例えば、多糖に基づく複合体を製造するためにＣＤＡＰを使用する本発明の方法は、免疫原性構築物を製造する現在利用可能な技術に多数の利点を提供する。本発明の範囲および本質から逸脱しないで本発明の方法および態様において種々の変更が可能であることは当業者にとって明らかであろう。したがって、本発明は詳細な説明および図面により限定されず、添付された請求の範囲により限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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